(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のポリペプチド；及び
（ｂ）配列番号２の変異体であって、配列番号２のポリペプチドにおいて１つのアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失を含む変異体
からなる群から選択される、イソプレノイドの微生物学的ヒドロキシル化のための、ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記ヒドロキシラーゼ活性が、［ベータ］−カロテンを［ベータ］−クリプトキサンチンおよび／もしくはゼアキサンチンに変換すること、または、カンタキサンチンをアドニルビンおよび／もしくはアスタキサンチンに変換することである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項４】
配列番号１および配列番号３において示される配列からなる請求項３に記載の単離核酸。
【請求項５】
発現宿主細胞における前記ポリペプチドの産生を指示する１つ以上の（いくつかの）コントロール配列に作動可能に連結された、請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクター。
【請求項６】
請求項３または４に記載の核酸が発現される形質転換微生物（宿主細胞）。
【請求項７】
カロテノイド代謝が野生型のものとは異なる、請求項６に記載の形質転換微生物。
【請求項８】
前記微生物が、油産生株である、請求項７に記載の形質転換微生物。
【請求項９】
前記油産生株が、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株である、請求項８に記載の形質転換微生物。
【請求項１０】
１つ以上の調節シグナルに機能的に連結された、配列番号１において示される配列からなる核酸または核酸構築物を導入するステップを含む、請求項６に記載の形質転換微生物を産生するためのプロセス。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドの存在下において、［ベータ］−イオノンを３−ヒドロキシ−［ベータ］−イオノンにおよび／または４−ケト−［ベータ］−イオノンを３−ヒドロキシ−４−ケト−［ベータ］−イオノン構造エレメントに変換するステップを含む、カロテノイドまたはカロテノイド誘導体の調製のためのプロセス。
【請求項１２】
（ａ）カロテノイドの産生を促す条件下で請求項６〜９のいずれか一項に記載の形質転換微生物を培養するステップ；および
（ｂ）前記カロテノイドまたはカロテノイド誘導体を回収するステップ
を含む、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のポリペプチドを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
本発明は、新規なヒドロキシラーゼ、そのためにコードする核酸配列、この配列を含む発現構築物およびベクター、それにより形質転換された微生物、イソプレノイドの微生物学的ヒドロキシル化のためのプロセス、たとえばベータ−カロテンをゼアキサンチンまたはベータ−クリプトキサンチンにおよびカンタキサンチンをアスタキサンチンに変換するためのプロセスに関する。
【０００２】
カロテノイドは、光合成生物（たとえば植物、藻類、シアノバクテリア）およびいくつかの真菌を含む、ある生物によって天然に産生される黄色から赤色までの色の範囲にわたる有機顔料である。
【０００３】
ルテイン、ゼアキサンチン、またはアスタキサンチンなどのカロテノイドは、着色物質およびビタミンＡ誘導体の前駆物質としてヒトおよび家畜の食物において重要な添加物となる。そのうえ、カロテノイドは、免疫応答の増強などの健康促進作用と、それらの酸化防止特性により、栄養補助食品としてのそれらの使用を興味深いものにする癌予防作用とを有する。カロテノイドおよびカロテノイド含有量を増加させた食品を調製する実利的なプロセスは、そのため、非常に重要である。カロテノイドを調製するための、特に実利的なプロセスは、カロテノイド生成生物からの、カロテノイド生合成のタンパク質および生合成遺伝子を利用する生物工学的プロセスである。
【０００４】
［ベータ］−クリプトキサンチンを介したゼアキサンチンへの［ベータ］−カロテンの酵素的変換を触媒する原核生物［ベータ］−カロテンヒドロキシラーゼおよびこれらのタンパク質をコードする遺伝子は、細菌エルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）（Ｍｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０，６７０４−６７１２；欧州特許第３９３６９０  Ｂ１号明細書）、エルウイニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（国際公開第９１１３０７８号パンフレット）、アグロバクテリウム・オウランティアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（Ｍｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５，６５７５−６５８４；欧州特許第７３５１３７  Ａ１号明細書）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種ＰＣ−１（欧州特許第７３５１３７  Ａ１号明細書）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｉｕｍ）種株Ｒ１５３４（Ｐａｓａｍｏｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１９９７，１８５：３５−４１；欧州特許第７４７４８３  Ａ２号明細書）、およびシアノバクテリアシネコシスティス（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種ＰＣＣ６８０３（Ｍａｓａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９８，３９（５）：５６０−５６４）から知られている。
【０００５】
アグロバクテリウム・オウランティアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、およびエルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）由来の原核生物［ベータ］−カロテンヒドロキシラーゼが、そのうえ、カンタキサンチンをアドニルビンを介してアスタキサンチンに変換することができることもまた、知られている（Ｍｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５，６５７５−６５８４；Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２：６１２８−６１３５）。
【０００６】
真核生物の供給源からは、３つの植物［ベータ］−カロテンヒドロキシラーゼが、［ベータ］−カロテンの、［ベータ］−クリプトキサンチンを介したゼアキサンチンへの酵素的変換を触媒することが知られている。対応するｃＤＮＡは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１：２４３４９−２４３５２、国際公開第９７３６９９８号パンフレット）およびトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ  Ｌ．）（Ｂｏｕｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９９８，１３９１：３２０−３２８）から単離された。
【０００７】
真核生物起源の遺伝子は、植物などのより高等なトランスジェニック生物においてそれらが一層よく発現されるという、原核生物の遺伝子にまさる長所を有する。しかしながら、生物に真核生物の核酸を組み込むことによって、カロテノイド誘導体またはカロテノイド含有量が増加した食品を調製するための実利的なプロセスのためにカロテノイド生産性を改善し、かつ増加させる必要性がなおある。
【０００８】
そのうえ、先行技術における適切な真核生物［ベータ］−カロテンヒドロキシラーゼは、それらが狭い基質範囲しか有さず、その結果、ヒドロキシラーゼによって変換することができず、ヒドロキシラーゼに阻害作用を及ぼし得る代謝産物が蓄積するという不都合を有する。
【０００９】
［発明の概要］
本発明は、先行技術について記載される欠点を改善することおよび特性が改善した真核生物カロテンヒドロキシラーゼを提供することを目的とする。
【００１０】
本発明者らは、上記の目的が、驚いたことに、配列番号２のアミノ酸配列を含む、イソプレノイド、たとえば［ベータ］−カロテンまたはカンタキサンチンをヒドロキシル化するための酵素活性を有するタンパク質によって実現されることを発見した。
【００１１】
そのため、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失によってこの配列から誘導され、配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも５０％の相同性を有する配列を含むタンパク質またはポリペプチドに関する。
【００１２】
特に、本発明によるヒドロキシラーゼは、選択された、またはたとえばゼアキサンチンもしくはアスタキサンチンとして特定のカロテノイドを産生することができる株において発現される場合、本発明によるタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子により形質転換されない株と比較して、これらのカロテノイドのレベルを増加させる。
【００１３】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、組換え発現ベクター、および組換え宿主細胞、ならびにポリペプチドを産生するための方法にも関する。
【００１４】
本発明はまた、カロテノイドの生物学的産生のための改善された系をも提供する。好ましい一実施例では、本発明は、１つ以上のカロテノイドを産生する油産生真菌（たとえば酵母を含む）を提供する。本発明はまた、そのような酵母および真菌を構築する方法、カロテノイドを産生するためにそのような酵母および真菌を使用する方法、ならびにそのような油産生酵母または真菌において産生されたカロテノイドを使用して食品添加物もしくは飼料添加物または栄養補給剤などのカロテノイド含有組成物を調製する方法をも提供する。特に、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する酵母および真菌を生成するための系および方法を提供する。
【００１５】
［配列表の概要］
配列番号１は、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）由来の低頻度（ｌｏｗ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）カロテンヒドロキシラーゼをコードする非最適化ＤＮＡ配列である。
【００１６】
配列番号２は、配列番号１から推定されるアミノ酸配列である。
【００１７】
配列番号３は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために最適化されるヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）由来の低頻度カロテンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ配列である。
【００１８】
配列番号４は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために最適化されるクロノバクター・パルベリス（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ）（以前はエンテロバクター・パルベリス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ））（Ｅｐ）由来のカロテンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ配列である。
【００１９】
配列番号５は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために最適化されるエンテロバクテリアセアエ・バクテリウム（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＤＣ４０４（Ｄｃ）由来のカロテンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ配列である。
【００２０】
［定義］
単離ポリペプチド：用語「単離ポリペプチド」は、自然界に見つけられるそのポリペプチドに比べて、人の手によって修飾されるポリペプチドを意味する。一態様では、ポリペプチドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、少なくとも１％純粋、たとえば少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、および少なくとも９０％純粋である。
【００２１】
実質的に純粋なポリペプチド：用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、それが本来または組換えで関連している、多くても１０重量％、多くても８重量％、多くても６重量％、多くても５重量％、多くても４重量％、多くても３重量％、多くても２重量％、多くても１重量％、および多くても０．５重量％の他のポリペプチド材料しか含有しない調製物を意味する。好ましくは、ポリペプチドは、調製物中に存在する総ポリペプチド材料のうちで、少なくとも９２重量％純粋、たとえば少なくとも９４重量％純粋、少なくとも９５重量％純粋、少なくとも９６重量％純粋、少なくとも９７重量％純粋、少なくとも９８重量％純粋、少なくとも９９重量％純粋、少なくとも９９．５重量％純粋、および１００重量％純粋である。本発明のポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態をしている。これは、たとえば、よく知られている組換え方法によってまたは古典的な精製方法によってポリペプチドを調製することによって達成することができる。
【００２２】
配列同一性：２つのアミノ酸配列の間のまたは２つのヌクレオチド配列の間の関連性は、パラメーター「配列同一性」によって説明される。
【００２３】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０００，１６：２７６−２７７）に実装されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４３−４５３）を使用して決定される。使用される任意選択のパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティー、０．５のギャップエクステンションペナルティー、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅが表示する「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）の出力は、同一性パーセントとして使用され、以下のように計算される。
（同一残基×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数）
【００２４】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列の間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、前掲）に実装されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、前掲）を使用して決定される。使用される任意選択のパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティー、０．５のギャップエクステンションペナルティー、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅが表示する「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）の出力は、同一性パーセントとして使用され、以下のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数）
【００２５】
断片：用語「断片」は、成熟ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端から欠失した１つ以上の（いくつかの）アミノ酸を有するポリペプチドを意味する；ここで、断片はヒドロキシラーゼ活性を有する。
【００２６】
対立遺伝子変異体：用語「対立遺伝子変異体」は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかを意味する。対立遺伝子の変異は、突然変異を通して天然に発生し、集団内で多型をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントとすることができ（コードポリペプチドにおいて変化はない）、または改変アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるポリペプチドである。
【００２７】
単離ポリヌクレオチド：用語「単離ポリヌクレオチド」は、自然界に見つけられるそのポリヌクレオチドに比べて、人の手によって修飾されるポリヌクレオチドを意味する。一態様では、単離ポリヌクレオチドが、アガロース電気泳動法によって決定されるように、少なくとも１％純粋、たとえば少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、および少なくとも９５％純粋である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、またはその任意の組み合わせであってもよい。
【００２８】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：用語「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、他の外来のまたは望まれないヌクレオチドがない、遺伝子操作されたポリペプチド産生系内での使用に適した形態をしているポリヌクレオチド調製物を意味する。したがって、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、それが本来または組換えで関連している、多くても１０重量％、多くても８重量％、多くても６重量％、多くても５重量％、多くても４重量％、多くても３重量％、多くても２重量％、多くても１重量％、および多くても０．５重量％の他のポリヌクレオチド材料しか含有しない。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモーターおよびターミネーターなどの天然に存在する５’および３’非翻訳領域を含んでいてもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、少なくとも９０重量％純粋、たとえば少なくとも９２重量％純粋、少なくとも９４重量％純粋、少なくとも９５重量％純粋、少なくとも９６重量％純粋、少なくとも９７重量％純粋、少なくとも９８重量％純粋、少なくとも９９重量％純粋、および少なくとも９９．５重量％純粋である。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態をしている。
【００２９】
コード配列：用語「コード配列」は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定され、これは、通常、ＡＴＧ開始コドンまたはＧＴＧおよびＴＴＧなどの代替の開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧ、およびＴＧＡなどの終止コドンで終了する。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、または組換えポリヌクレオチドであってもよい。
【００３０】
ｃＤＮＡ：用語「ｃＤＮＡ」は、真核細胞から得られる成熟、スプライス、ｍＲＮＡ分子から逆転写によって調製することができるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠く。最初の一次ＲＮＡ転写物は、成熟スプライスｍＲＮＡとして現われる前に、スプライシングを含む一連のステップを通してプロセシングされる、ｍＲＮＡに対する前駆物質である。
【００３１】
核酸構築物：用語「核酸構築物」は、天然に存在する遺伝子から単離されるもしくはそうでなければ自然界に存在しないであろう形で核酸のセグメントを含有するように修飾されるまたは合成である、一本鎖または二本鎖の核酸分子を意味する。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要とされるコントロール配列を含有する場合、用語「発現カセット」と同義となる。
【００３２】
コントロール配列：用語「コントロール配列」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な、すべての構成成分を意味する。それぞれのコントロール配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して本来のものもしくは外来性のものであってもよく、または互いに本来のものもしくは外来性のものであってもよい。そのようなコントロール配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含むが、これらに限定されない。最低でも、コントロール配列は、プロモーターならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。コントロール配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域とのコントロール配列のライゲーションを容易にする特異的な制限部位を導入する目的のためにリンカーが提供されてもよい。
【００３３】
作動可能に連結された：用語「作動可能に連結された」は、コントロール配列がコード配列の発現を指示するように、コントロール配列がポリヌクレオチドのコード配列に関して適切な位置に配置される構成を意味する。
【００３４】
発現：用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。
【００３５】
発現ベクター：用語「発現ベクター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、その発現をもたらすさらなるヌクレオチドに作動可能に連結された直鎖または環状ＤＮＡ分子を意味する。
【００３６】
宿主細胞：用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入、およびその他同種のものに感受性の任意の細胞型を意味する。用語「宿主細胞」は、複製の間に起こる突然変異により親細胞と同一でない、親細胞の任意の子孫を包含する。
【００３７】
変異体：用語「変異体」は、１つ以上の（いくつかの）位置に１つ以上の（いくつかの）アミノ酸残基の改変、すなわち置換、挿入、および／または欠失を含む、ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換は、ある位置を占めるアミノ酸の、異なるアミノ酸との置換を意味し；欠失は、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；挿入は、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して１〜３つのアミノ酸を追加することを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】親株ＭＬ６８０４とその代表的な形質転換体を示す。
【図２】親株ＭＬ９８６３およびＭＬ１１９５６とそれらの代表的な形質転換体を示す。
【図３】親株ＭＬ５２５２とその代表的な形質転換体を示す。
【００３９】
［発明の詳細な説明］
カロテンヒドロキシラーゼは、以後、本発明によるタンパク質またはポリペプチド、すなわち、たとえば、［ベータ］−カロテンをゼアキサンチンにまたはカンタキサンチンをアスタキサンチンに変換するための酵素活性を有し、配列番号２のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失によってこの配列から誘導され、配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも５０％の相同性を有する配列を含むタンパク質を意味する。
【００４０】
配列番号２において示されるアミノ酸配列は、配列番号１において示されるｃＤＮＡ配列の翻訳から誘導される。配列番号１の最適化配列は、配列番号３において示される。
【００４１】
置換は、１つ以上のアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の交換を意味する。交換は、好ましくは、保存的と呼ばれるものであり、交換されるアミノ酸は、もとのアミノ酸に類似する特性を有し、たとえば、ＡｓｐによるＧｌｕ、ＡｓｎによるＧｌｎ、ＩｌｅによるＶａｌ、ＩｌｅによるＬｅｕ、ＴｈｒによるＳｅｒの交換である。
【００４２】
欠失は、直接的な連結によるアミノ酸の交換である。欠失のための好ましい位置は、ポリペプチドの末端および個々のタンパク質ドメインの間の連結である。
【００４３】
挿入は、ポリペプチド鎖の中へのアミノ酸の導入であり、その点で、形式上、１つ以上のアミノ酸による直接的な連結の交換となる。
【００４４】
２つのタンパク質の間の相同性は、それぞれのタンパク質の全長にわたるアミノ酸の同一性を意味し、これは、以下のパラメーターを設定して、コンピュータープログラムＧＡＰの支援による比較によって計算される（ＵＷＧＣＧ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，ｐｒｏｇｒａｍ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｏｆ  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４３−４５３）。
Ｇａｐ  Ｗｅｉｇｈｔ：１２
Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ：４
Ａｖｅｒａｇｅ  Ｍａｔｃｈ：２．９１２
Ａｖｅｒａｇｅ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ：−２．００３
【００４５】
配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも５０％の相同性を有するタンパク質は、上記のセットのパラメーターによる上記のプログラムアルゴリズムを使用する配列番号２の配列とのその配列の比較において、少なくとも５０％、好ましくは６０％、特に好ましくは７０％の同一性を有するタンパク質を意味する。
【００４６】
本発明によるタンパク質は、［ベータ］−カロテンのゼアキサンチンへの、［ベータ］−カロテンの［ベータ］−クリプトキサンチンへの、［ベータ］−クリプトキサンチンのゼアキサンチンへの、エキネノンの３’−ヒドロキシエキネノンへの、３−ヒドロキシエキネノンのアドニキサンチン（４−ケトゼアキサンチン）への、［アルファ］−カロテンの［アルファ］−クリプトキサンチンへの、もしくは４０個までのＣ原子を有し、かつ［ベータ］−イオノン環を含有する他の化学化合物の、対応する３−ヒドロキシ−［ベータ］−イオノン化合物への変換など、［ベータ］−イオノン構造エレメントの３−ヒドロキシ−［ベータ］−イオノン構造エレメントへの変換またはカンタキサンチンのアスタキサンチンへの、カンタキサンチンのフェニコキサンチン（アドニルビン）への、フェニコキサンチン（アドニルビン）のアスタキサンチンへの、エキネノンの３−ヒドロキシエキネノンへの、３’−ヒドロキシエキネノンのアドニキサンチン（４−ケトゼアキサンチン）への、もしくは４０個までのＣ原子を有し、かつ４−ケト−［ベータ］イオノン環を含有する他の化学化合物の、対応する３−ヒドロキシ−４−ケト−［ベータ］−イオノン化合物への変換など、４−ケト−［ベータ］−イオノン構造エレメントの３−ヒドロキシ−４−ケト−［ベータ］−イオノン構造エレメントへの変換を触媒することができる。
【００４７】
カロテンヒドロキシラーゼは、天然のまたは遺伝的に操作された生物からのこれらのタンパク質をコードする適切な核酸の遺伝子発現によって、以後説明されるように、調製することができる。
【００４８】
本発明は、カロテノイドおよびカロテノイド誘導体の調製のためのプロセスであって、本発明によるタンパク質の存在下において、［ベータ］−イオノン構造エレメントを３−ヒドロキシ−［ベータ］−イオノン構造エレメントにおよび／または４−ケト−［ベータ］−イオノン構造エレメントを３−ヒドロキシ−４−ケト−［ベータ］−イオノン構造エレメントに変換するステップを含むプロセスにさらに関する。
【００４９】
カロテノイドおよびカロテノイド誘導体は、たとえばゼアキサンチン、［ベータ］−クリプトキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、アドニキサンチン（４−ケトゼアキサンチン）、アスタキサンチン、フェニコキサンチン（アドニルビン）、［アルファ］−クリプトキサンチン、もしくはルテインまたはたとえば３−ヒドロキシ−６−ビニル−［ベータ］−イオノン、３−ヒドロキシ−４−ケト−６−ビニル−［ベータ］−イオノン、３−ヒドロキシレチノール、３−ヒドロキシ−４−ケトレチノール、３−ヒドロキシレチナール、３−ヒドロキシ−４−ケトレチナール、３−ヒドロキシレチン酸、もしくは３−ヒドロキシ−４−ケトレチン酸など、分子中に４０個までのＣ原子を有し、かつ少なくとも１つの３−ヒドロキシ−［ベータ］−イオノンもしくは少なくとも１つの３−ヒドロキシ−４−ケト−［ベータ］−イオノン構造エレメントを含有するその誘導体である。
【００５０】
本発明によるプロセスにおいて、［ベータ］カロテンがβ−クリプトキサンチンを介してゼアキサンチンに、［ベータ］−カロテンが［ベータ］−クリプトキサンチンに、［ベータ］−クリプトキサンチンがゼアキサンチンに、エキネノンが３’−ヒドロキシエキネノンもしくは３−ヒドロキシエキネノンに、３−ヒドロキシエキネノンもしくは３’−ヒドロキシエキネノンがアドニキサンチン（４−ケトゼアキサンチン）に、［アルファ］カロテンがゼイノキサンチンもしくは［アルファ］−クリプトキサンチンに、または４０個までのＣ原子を有し、かつ［ベータ］−イオノン環を含有する化学化合物が対応する３−ヒドロキシ−［ベータ］−イオノン化合物になど、［ベータ］−イオノン構造エレメントが３−ヒドロキシ−［ベータ］−イオノン構造エレメントに、またはカンタキサンチンがアドニルビンを介してアスタキサンチンに、カンタキサンチンがフェニコキサンチン（アドニルビン）に、フェニコキサンチン（アドニルビン）がアスタキサンチンに、エキネノンが３−ヒドロキシエキネノンに、３’−ヒドロキシエキネノンがアドニキサンチン（４−ケトゼアキサンチン）に、もしくは４０個までのＣ原子を有し、かつ４−ケト−［ベータ］イオノン環を含有する化学化合物が対応する３−ヒドロキシ−４−ケト−［ベータ］−イオノン化合物になど、４−ケト−［ベータ］−イオノン構造エレメントが３−ヒドロキシ−４−ケト−［ベータ］−イオノン構造エレメントに、本発明によるタンパク質の存在下において変換される。
【００５１】
本発明はまた、本発明によるヒドロキシラーゼをコードする核酸配列にも関する。好ましい核酸は、配列番号１の配列および配列番号３の配列を有する。
【００５２】
本発明は、個々のまたは複数のヌクレオチドの追加、置換、挿入、および／または欠失によって得られ、所望の特異性を有するヒドロキシラーゼをさらにコードする、配列番号１および配列番号３による核酸の機能的なアナログにさらに関する。
【００５３】
本発明はまた、いわゆるサイレント突然変異を含むまたは特定の起源または宿主生物のコドン使用頻度に従って、特に言及される配列と比較して修飾される核酸配列およびそのような核酸配列の天然に存在する変異体をも包含する。
【００５４】
本発明はまた、遺伝子コードの縮退によって得られる、核酸配列の修飾体（すなわち対応するアミノ酸配列においていかなる変化をも伴わない）または保存的ヌクレオチド置換（すなわち、対応するアミノ酸が、電荷、サイズ、極性、および／もしくは溶解性が同じである他のアミノ酸と交換される）ならびにヌクレオチド追加、挿入、逆位、または欠失によって修飾される配列をも包含し、これらの配列は、「修飾基質プロファイル」を有する、本発明によるヒドロキシラーゼおよび対応する相補的配列をコードする。
【００５５】
本発明は、調節核酸配列の遺伝的コントロール下に本発明による核酸配列を含む発現構築物；およびこれらの発現構築物の少なくとも１つを含むベクターにさらに関する。
【００５６】
好ましくは、本発明による構築物は、対象コード配列の５’上流のプロモーターおよび３’下流のターミネーター配列ならびに任意選択で、さらに通常の調節エレメントを包含し、それぞれのケースで、コード配列と適切に作用するように連結される。適切に作用する連結は、調節エレメントのそれぞれが、コード配列の発現に際してその意図される機能を果たすことができるような形をした、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および適切な場合、他の調節エレメントの一連の配置を意味するとして理解されたい。適切に作用するように連結することができる配列の例は、標的配列またはその他には翻訳エンハンサー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびその他同種のものである。さらなる調節エレメントは、選択マーカー、増幅シグナル、複製開始点、およびその他同種のものを包含する。
【００５７】
人工調節配列に加えて、天然の調節配列は、実際の構造遺伝子の上流になお存在することができる。必要な場合、この天然の調節は、遺伝子修飾によってスイッチを切られてもよく、遺伝子の発現は、増強させてもよいまたは低下させてもよい。しかしながら、遺伝子構築物はまた、構造がより単純であってもよい、すなわち、さらなる調節シグナルは、構造遺伝子の上流に挿入されず、それを調節する天然のプロモーターは除去されない。その代わりに、調節がもはや起こらず、遺伝子発現を増加させるまたは低下させるように、天然の調節配列を突然変異させる。核酸配列の１つ以上のコピーが遺伝子構築物中に存在してもよい。
【００５８】
適したプロモーターの例は、グラム陰性菌において有利に用いられるｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、Ｉｐｐ、ｌａｃ、Ｉｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃｌｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、ｌ−ＰＲ、またはｌ−ＰＬプロモーター；ならびにグラム陽性プロモーターａｍｙおよびＳＰＯ２、酵母プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、Ａｃ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ１または植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、Ｉｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓまたはユビキチンもしくはファゼオリンプロモーターである。特に好ましくは、ＰｒＰ１プロモーターなどの誘発性プロモーター、たとえば光、特に、温度誘発性プロモーターの使用である。
【００５９】
原則として、それらの調節配列を有する天然のプロモーターはすべて使用することができる。そのうえ、合成プロモーターもまた、有利な方法で使用されてもよい。
【００６０】
上記に言及される調節配列は、核酸配列およびタンパク質発現の標的発現を可能にすることが意図される。宿主生物に依存して、これは、たとえば、誘発が起こった後のみ遺伝子が発現されるもしくは過剰発現されるまたはそれが即時におよび／もしくは恒常的に発現されるおよび／もしくは過剰発現されることを意味してもよい。
【００６１】
調節配列または因子は、好ましくは、発現に対して陽性の効果を有することができ、このように、後者を増加させるまたは低下させることができる。したがって、調節エレメントの増強は、プロモーターおよび／または「エンハンサー」などの強力な転写シグナルを使用することによって転写レベルで有利に行われてもよい。そのうえ、翻訳はまた、たとえばｍＲＮＡ安定性を改善することによって増強されてもよい。
【００６２】
発現カセットは、適したヒドロキシラーゼヌクレオチド配列およびターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルと適したプロモーターを融合することによって生成される。この目的のために、通常の組換えおよびクローニング技術は、たとえばＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）においてそれらが説明されるように、使用される。
【００６３】
適した宿主生物における発現については、組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、宿主における最適な遺伝子発現を可能にする宿主特異的なベクターに有利に挿入される。ベクターは、当業者によく知られており、たとえば「Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）において見ることができる。ベクターは、プラスミドだけではなく、たとえばファージ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス、およびアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、プラスミド、コスミド、ならびに直鎖または環状ＤＮＡなど、当業者に知られている他のすべてのベクターもまた意味するとして理解されたい。これらのベクターは、宿主生物においてまたは染色体で自律的に複製することができる。
【００６４】
本発明によるベクターは、たとえば、本発明による少なくとも１つのベクターにより形質転換されるまたは突然変異体を産生するために使用することができる組換え微生物の生成を可能にする。本発明による上記の組換え構築物は、適した宿主生物の中に有利に導入され、発現される。対象の発現系における上述の核酸の発現をもたらすために当業者に知られている通常のクローニングおよびトランスフェクション方法を使用することが好ましい。適した系は、たとえばｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ１９９７において記載される。
【００６５】
適した宿主生物は、原則として、本発明による核酸、それらの対立遺伝子変異体、およびそれらの機能的均等物または誘導体の発現を可能にするすべての生物である。好ましい出発生物（ｉｎｉｔｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）は、カロテノイドを天然に合成することができる生物である。しかしながら、カロテノイド生合成遺伝子の導入のためにカロテノイドを合成することができる出発生物もまた、適している。出発生物は、たとえば微生物または植物などの原核生物または真核生物を意味する。好ましい微生物は、細菌、酵母、藻類、または真菌である。
【００６６】
そのため、本発明は、下記に記載される遺伝子修飾生物を調製するためのプロセスにさらに関し、本発明によるカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子は、出発生物のゲノムの中に導入される。出発生物とは、本発明による遺伝子修飾の前の生物を意味する。
【００６７】
本発明によるカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子は、原則として、下記に記載される出発生物の中に、当業者に知られているすべての方法によって導入することができ、これらはそれによって遺伝子修飾される。
【００６８】
それらは、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションによって、いわゆる粒子銃を使用して、またはマイクロインジェクションによって、出発生物またはその細胞の中に有利に導入される。
【００６９】
当業者は、テキストブックＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．１，（１９９５），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ  ０１９−９６３４７６−９）、Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、またはＧｕｔｈｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓにおいて微生物についての適切な方法を見つけることができる。
【００７０】
言及されてもよい有利な方法の例は、独国特許出願公開第１９８０１  １２０．２号明細書において記載されるように、たとえばＵＲＡ３遺伝子、特にアシュビア（Ａｓｈｂｙａ）由来のＵＲＡ３遺伝子を使用する相同もしくは非相同組換えによるおよび／または下記に記載されるＲＥＭＩ方法（＝「制限酵素媒介性の統合」）によるＤＮＡの導入などの方法である。
【００７１】
ＲＥＭＩ技術は、ある生物の中への、ＤＮＡ構築物のこの制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）に使用された制限エンドヌクレアーゼとの、同じ制限エンドヌクレアーゼにより両端でカットされた直鎖ＤＮＡ構築物の同時形質転換に基づく。次いで、制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ構築物が制限酵素と一緒に導入された生物のゲノムＤＮＡをカットする。これは細胞自体の修復メカニズムの活性化に至る。これらの修復メカニズムは、エンドヌクレアーゼによって引き起こされたゲノムＤＮＡ中の鎖の切れ目を修復し、この間に、ゲノムの中に、ある頻度で、同時形質転換ＤＮＡ構築物をさらに組み込む。通常、制限切断部位は、この間にＤＮＡの両端に保持される。
【００７２】
この技術は、真菌の挿入突然変異誘発についてＢｏｅｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５，２４８：５４７−５５２）によって記載された。この方法は、非相同組換えがサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）にあるかどうかを見つけ出すために、Ｖｏｎ  Ｓｃｈｉｅｓｔｌ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８：７５８５−７５８９）によって使用された。この方法は、誘発性レポーター遺伝子の安定した形質転換および発現の調節について、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９６，２５１：７５−８０）によって記載された。
【００７３】
ＲＥＭＩ方法を使用して、ゲノム中の転写活性部位に本発明による核酸断片または本発明による前述のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子を位置させることが可能である。
【００７４】
ゲノムの中に導入されるＤＮＡ構築物の中に少なくとも１つのレポーター遺伝子と一緒に核酸をクローニングすることが可能であり、また、有利である。このレポーター遺伝子は、成長、蛍光、化学、もしくは生物発光アッセイによってまたは光度測定によって、検出性を容易にするはずである。レポーター遺伝子について言及されてもよい例は、抗生物質抵抗性遺伝子、ヒドロラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、生物発光遺伝子、グルコシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、［ベータ］−ガラクトシダーゼ遺伝子、ｇｆｐ遺伝子、リパーゼ遺伝子、エステラーゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、［ベータ］−ラクタマーゼ遺伝子、アセチル−、ホスホ−、またはアデニルトランスフェラーゼ遺伝子である。これらの遺伝子は、転写活性、したがって遺伝子の発現を容易に測定し、定量化するのを可能にする。これは、生産性が２倍まで異なる、ゲノム中の部位を同定することが可能であることを意味する。
【００７５】
生物の中に、たとえば、カロテノイド生合成のさらなる遺伝子などの複数の遺伝子を導入することが意図される場合、それらはすべて、単一のベクター中にレポーター遺伝子と一緒に導入することができ、またはレポーター遺伝子を有するそれぞれの個々の遺伝子は、生物の中に、それぞれのケースで１つのベクター中に導入することができ、様々なベクターを同時にまたは連続的に導入することができる。ＲＥＭＩ技術を使用して、それぞれの活性をコードする遺伝子断片を挿入することもまた可能である。
【００７６】
出発生物のゲノムの中に本発明によるカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子または核酸構築物を統合するのに原則として適した制限酵素はすべて、当業者に知られている。制限切断部位として４つの塩基対しか認識しない制限酵素は、それらが、ゲノムまたは統合されることになっているベクターをあまりに頻繁に切り込むため、それほど好ましくなく、好ましい酵素は、可能な酵素のうちのほんの一部しか言及しないが、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｌＩ、ＣｌａＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＰｓｔＩ、ＢｐｎＩ、ＮｏｔＩ、ＳｒｆＩ、またはＳｆｉＩなど、切断部位として６つ、７つ、８つ、またはそれを超える塩基対を認識する。使用される酵素が、導入されることになっているＤＮＡ中に切断部位をもはや有しない場合、有利であり、これは統合の効率を増加させる。通常、５〜５００Ｕ、好ましくは１０〜２５０、特に好ましくは１０〜１００Ｕの酵素が、ＲＥＭＩ混合物中に使用される。酵素は、スクロース、トレハロース、もしくはグルコースなどの糖、グリセロールもしくはポリエチレングリコールなどのポリオール、ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、もしくはＰＩＰＥＳなど、ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８、特に好ましくは７〜８の範囲の有利な緩衝作用を有するバッファーなど、浸透圧の安定化のための物質および／またはＭｇ、Ｃｕ、ＣＯ、Ｆｅ、Ｍｎ、もしくはＭｏの無機もしくは有機塩などの核酸を安定化する物質を含有する水溶液中で有利に用いられる。適切な場合、ＥＤＴＡ、ＥＤＤＡ、ＤＴＴ、［ベータ］−メルカプトエタノール、またはヌクレアーゼ阻害剤などの他の物質が存在することもまた、可能である。しかしながら、これらの追加を伴うことなくＲＥＭＩ技術を実行することもまた可能である。
【００７７】
プロセスは、５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃、特に好ましくは２０〜４０℃の範囲の温度で実行される。細胞膜を不安定化するための他の知られている方法は、たとえばエレクトロポレーション、負荷された小胞との融合、またはリチウム塩が好ましいが、リチウム塩、ルビジウム塩、もしくはカルシウム塩などの様々なアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩による不安定化などのプロセスに適している。
【００７８】
本発明は、同様に遺伝子修飾された生物にさらに関し、本発明によるカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子の発現は、遺伝子修飾によって、出発生物がカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子を含有するケースにおいて野生型生物と比較して増加しているか、または出発生物がカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子を含有しないケースで引き起こされる。
【００７９】
遺伝子修飾生物は、本発明によるカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子または核酸構築物が、好ましくは上記に記載される方法のうちの１つによって挿入された生物を意味する。
【００８０】
遺伝子修飾生物は、本発明による少なくとも１つのカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子または本発明による少なくとも１つの核酸構築物を含有する。出発生物に依存して、核酸は染色体の内部にまたは外部に存在してもよい。
【００８１】
遺伝子修飾生物におけるカロテノイド代謝は、好ましくは、野生型と比較して改変される。
【００８２】
好ましい生物は、組換え真菌および酵母である。特定の実施形態では、組換え真菌は、それがその乾燥細胞重量の少なくとも約２０％まで脂質を蓄積することができるという点で油産生真菌であり；アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルビン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β，ψ−カロテン、δ−カロテン、ε−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキシキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコピン、ミクソバクトン（ｍｙｘｏｂａｃｔｏｎｅ）、ネオキサンチン（ｎｅｏｘａｎｔｈｉｎ）、ノイロスポレン、ヒドロキシノイロスポレン、ペリジニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケトン−ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、４−ケトン−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケトン−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセタート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチン、Ｃ３０カロテノイド、およびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのカロテノイドを産生し、その乾燥細胞重量の少なくとも約１％まで、産生カロテノイドを蓄積することができる。好ましくは、組換え真菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラケスレア（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クスダマカビ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）（ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ））、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ヒゲカビ（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）（ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ））、プクキニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）、フハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、ロドスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スクレロティウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、キサントフィロマイセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）（ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ））、およびヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から選択される属のメンバーであり、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、カンジダ・ジャポニカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、カンジダ・プルチェリマ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、セルコスポラ・ニコチアナエ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、クリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クンニンハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）、クンニンハメラ・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）（ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ））、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、リポマイセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ）、リポマイセス・リポフェラス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、モルティエラ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、モルティエラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、モルティエラ・ビナセア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｖｉｎａｃｅａ）、ムーコル・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、フィコマイセス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、プクキニア・ディスティンクタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔａ）、フィチウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドトルラ・ムチラギノーザ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・ピニコーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｐｉｎｉｃｏｌａ）、ロドトルラ・グラシリス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、白絹病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）（ファフィア・ロドザイマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ））、およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群か���選択される種である。
【００８３】
これらの天然に油産生の株のうちで、いくつかはまたカロテノイドをも天然に産生し、いくつかは産生しない；これらの株は、そのうえ、米国特許第７８５１１９９号明細書において開示されるカロテノイド生合成遺伝子の導入によって宿主細胞として利用されてもよい。
【００８４】
他の実施形態では、本発明は、カロテノイドを産生するための方法であって、カロテノイドの産生を可能にする条件下で真菌を培養するステップ；および産生されたカロテノイドを単離するステップを含む方法を提供する。
【００８５】
本発明による遺伝子修飾生物の培養は、適切な野生型の培養など、たとえば微生物の場合には、たとえば寒天プレート上などの適した培地においてもしくは浮遊培養においてまたは植物の場合には、土壌もしくは適宜適した培養液において、それ自体知られている方法で行われる。採取とは、微生物の場合には、微生物の単離および植物の場合には、植物または適切な場合、カロテノイドを含有する特定の植物の一部の切り取りを意味する。カロテノイドは、たとえば生物細胞の破壊、カロテノイドの抽出および抽出またはクロマトグラフィーなどの化学的または物理的分離方法によるカロテノイドの続く精製によって、それ自体知られている方法で単離される。
【００８６】
以下の実施例は、本発明を例証する。
【００８７】
［実施例］
下記の表１は、以下の例証において使用される、あるヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を記載する。
【００８８】
【表１】
0006319697.tif 000002
【００８９】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＭＬ５２５２、ＭＬ６８０４、ＭＬ９８６３、およびＭＬ９３３５は、米国特許第７，８５１，１９９号明細書において記載されるように、ＭＬ３５０およびＡＴＣＣ２０１２４９から始めて、数世代の異種交配を伴う、内因性ＴＥＦ１プロモーターのコントロール下での異種遺伝子の導入によって構築した。ＧＧＳ遺伝子および切断型ＨＭＧ遺伝子（「ＨＭＧ−ｔｒ」）は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）配列に由来し、天然のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼおよびヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子にそれぞれ対応する。ｃａｒＲＰおよびｃａｒＢ遺伝子は、ムーコル・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）に由来し、それらは、二機能性のフィトエンシンターゼ／リコピンシクラーゼおよびフィトエンデヒドロゲナーゼをそれぞれコードする。ｃｒｔＷ遺伝子は、パルブラルキュラ・ベルムデンシス（Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａ  ｂｅｒｍｕｄｅｎｓｉｓ）のカロテンケトラーゼをコードするように合成した（米国特許出願公開第２０１２／０１５６７１８号明細書）。
【００９０】
ｃｒｔＺ遺伝子は、キサントバクター・オートトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｘａ）から増幅し、またはクロノバクター・パルベリス（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ）（以前はエンテロバクター・パルベリス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ））（Ｅｐ）（配列番号４）、エンテロバクテリアセアエ・バクテリウム（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＤＣ４０４（Ｄｃ）（配列番号５）、またはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｒ１５３４（Ｆｂ）のカロテンヒドロキシラーゼをコードするように合成した（米国特許第６，０８７，１５２号明細書）。これらの遺伝子は、常にではないが、時に、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＵＲＡ２、ＬＹＳ１、ＡＤＥ１）またはｌｏｘＰ部位、ＨｙｇＲ（ハイグロマイシン抵抗性）もしくはＮａｔＲ（ノーセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）抵抗性）マーカーの残りに関連する。
【００９１】
【表２】
0006319697.tif 000003
【００９２】
本明細書において記載される基本的な分子生物学およびＤＮＡ操作手順はすべて、全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ）．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（ｅｄｓ．）．１９９８．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従って実行する。
【００９３】
［実施例１ａ：Ｈ．プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）ＬＦカロテンヒドロキシラーゼをコードするｐＭＢ６４８６（ＨｙｇＲｔｅｆ−ＨｐＬＦ−ｃｒｔＺ）の産生。］
ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（ＵＴＥＸ  Ｎｏ．２５０５）を使用するｍＲＮＡ配列分析の結果として、発明者らは、驚いたことに、ＨｐＬＦ−ＣｒｔＺ（Ｈ．プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）ＬＦ（低頻度）ヒドロキシラーゼ）と命名した新しいβ−カロテンヒドロキシラーゼを発見した。
【００９４】
コドン最適化カロテンヒドロキシラーゼ（ＨｐＬＦ−ＣｒｔＺ）ＯＲＦ配列は、配列番号３において指定されるように、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドンバイアスを使用して、Ｈ．プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）遺伝子の推定されるタンパク質配列に基づいてデノボ合成した。デノボ合成の間に、ＮｈｅＩ制限部位を含有する配列５’−ＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡおよび効率的な翻訳を可能にするための典型的なコザック配列を、ＡＴＧのすぐ上流に追加した。ＭｌｕＩ制限部位を含む配列ＡＣＧＣＧＴ−３’を、終止コドンのすぐ下流に追加した。この配列は、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩを使用して切断し、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩによりカットしたｐＭＢ６１５７にライゲーションし、ｐＭＢ６４８６を産生した。ｐＭＢ６４８６の結果として生じるコードＨｐＬＦ−ＣｒｔＺタンパク質は、配列番号２において指定される。
【００９５】
［実施例１ｂ：Ｃ．パルベリス（Ｃ．ｐｕｌｖｅｒｉｓ）（以前はＥ．パルベリス（Ｅ．ｐｕｌｖｅｒｉｓ））カロテンヒドロキシラーゼをコードするｐＭＢ６０５６（ＨｙｇＲｔｅｆ−ｃｒｔＺ−Ｅｐ）の産生。］
コドン最適化カロテンヒドロキシラーゼ（Ｅｐ−ＣｒｔＺ）ＯＲＦ配列は、配列番号４において指定されるように、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドンバイアスを使用して、以前はエンテロバクター・パルベリス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ）（ＥＭＢＬ受入番号ＣＡＺ９０６２１．１）として知られているクロノバクター・パルベリス（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ）遺伝子の推定されるタンパク質配列に基づいてデノボ合成した。デノボ合成の間に、ＮｈｅＩ制限部位を含有する配列５’−ＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡおよび効率的な翻訳を可能にするための典型的なコザック配列を、ＡＴＧのすぐ上流に追加した。ＭｌｕＩ制限部位を含む配列ＡＣＧＣＧＴ−３’を、終止コドンのすぐ下流に追加した。この配列は、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩを使用して切断し、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩによりカットしたｐＭＢ６１５７にライゲーションし、ｐＭＢ６０５６を産生した。
【００９６】
［実施例１ｃ：フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｒ１５３４カロテンヒドロキシラーゼをコードするｐＭＢ６４８７（ＨｙｇＲｔｅｆ−ｃｒｔＺ−Ｆｂ）の産生。］
コドン最適化カロテンヒドロキシラーゼ（Ｆｂ−ＣｒｔＺ）は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドンバイアスを使用して、米国特許第６，０８７，１５２号明細書において指定されるように、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｒ１５３４のタンパク質配列に基づいてデノボ合成した。デノボ合成の間に、ＮｈｅＩ制限部位を含有する配列５’−ＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡおよび効率的な翻訳を可能にするための典型的なコザック配列を、ＡＴＧのすぐ上流に追加した。ＭｌｕＩ制限部位を含む配列ＡＣＧＣＧＴ−３’を、終止コドンのすぐ下流に追加した。配列は、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩを使用して切断し、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩによりカットしたｐＭＢ６１５７にライゲーションし、ｐＭＢ６４８７を産生した。
【００９７】
［実施例２Ａ：アスタキサンチンを産生するための、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）カンタキサンチン産生株ＭＬ６８０４への３つのカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子の導入］
ＨｐＬＦＣｒｔＺのヒドロキシル化潜在力を試験し、それをＦｂ  ＣｒｔＺおよびＥｐ  ＣｒｔＺと比較するために、株ＭＬ６８０４を３つの異なる構築物により形質転換した：
１）ｔｅｆ１ｐのコントロール下のフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｃｒｔＺ遺伝子およびハイグロマイシン抵抗性マーカーＨｙｇＲを内部に持つｐＭＢ６４８７のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片；
２）ｔｅｆ１ｐのコントロール下のクロノバクター・パルベリス（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ）（以前はエンテロバクター・パルベリス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ））ｃｒｔＺ遺伝子およびハイグロマイシン抵抗性マーカーＨｙｇＲを内部に持つｐＭＢ６０５６のＰｖｕＩＩ断片；
３）ｔｅｆ１ｐのコントロール下のＨ．プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）「低頻度」ｃｒｔＺ遺伝子およびハイグロマイシン抵抗性マーカーＨｙｇＲを内部に持つｐＭＢ６４８６のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片。
【００９８】
形質転換体は、３０℃での３〜４日間の成長後に１００ｍｇ／ＬハイグロマイシンによりＹＰＤ上で選択した。それぞれの構築物由来の１０個の形質転換体をＹＰＤ中で４日間、振盪フラスコにおいて成長させた。形質転換体はすべてアスタキサンチンを産生した。それぞれの形質転換由来の代表的な形質転換体を親株ＭＬ６８０４の横に図１において示す。フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｒ１５３４  ｃｒｔＺ遺伝子を含有する株ＭＬ１２４７１は、３％のアスタキサンチンおよび９％のアドニルビンを産生した（全カロテノイドのパーセンテージとして）。クロノバクター・パルベリス（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ）（以前はエンテロバクター・パルベリス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ））ｃｒｔＺ遺伝子を含有する株ＭＬ１１６２２は、７％のアスタキサンチンおよび１１％のアドニルビンを産生した。また、Ｈ．プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）ＬＦ  ｃｒｔＺ遺伝子を含有する株ＭＬ１２４６６は、１２％のアスタキサンチンおよび２２％のアドニルビンを産生した。
【００９９】
［実施例２Ｂ．アスタキサンチン純度を増加させるための、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アスタキサンチン産生株へのＨ．プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）ＬＦカロテンヒドロキシラーゼの導入］
株ＭＬ９８６３およびＭＬ１１９５６は、ｔｅｆｌプロモーター、ＨｐＬＦ  ｃｒｔＺ遺伝子、およびハイグロマイシン抵抗性についての選択可能マーカー、ＨｙｇＲを内部に持つｐＭＢ６４８６のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片により形質転換した。３０℃での成長の３〜４日後に、形質転換プレート上（１００ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシンを有するＹＰＤ）で親よりも濃く見えたそれぞれの株由来の２０個のＨｙｇＲ形質転換体を選んだ。形質転換体をＹＰＤ中で４日間、振盪フラスコにおいて成長させた。代表的な２つの形質転換体を図２中に示し、それらの親株と比較する。
【０１００】
ＭＬ１２５６２はＭＬ９８６３に由来し、ＭＬ１２５６６はＭＬ１１９５６に由来する。全カロテノイドのパーセンテージとして、ＭＬ１２５６２およびＭＬ１２５６６は、それらの親よりも３倍（４０％対１３％）および２倍（２７％対１３％）のより多くのアスタキサンチンをそれぞれ産生した（図２）。
【０１０１】
［実施例２Ｃ．β−クリプトキサンチンを産生するための、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）β−カロテン産生株へのＨ．プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）ＬＦヒドロキシラーゼの導入：］
株ＭＬ５２５２を３つの異なる構築物により形質転換した：
１）ｔｅｆ１ｐのコントロール下のフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種Ｒ１５３４ｃｒｔＺ遺伝子およびハイグロマイシン抵抗性マーカーＨｙｇＲを内部に持つｐＭＢ６４８７のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片；
２）ｔｅｆ１ｐのコントロール下のクロノバクター・パルベリス（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ）（以前はエンテロバクター・パルベリス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ））ｃｒｔＺ遺伝子およびハイグロマイシン抵抗性マーカーＨｙｇＲを内部に持つｐＭＢ６０５６のＰｖｕＩＩ断片；
３）ｔｅｆ１ｐのコントロール下のＨ．プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）ＬＦ  ｃｒｔＺ遺伝子およびハイグロマイシン抵抗性マーカーＨｙｇＲを内部に持つｐＭＢ６４８６のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片。
【０１０２】
形質転換体は、３０℃での３〜４日間の成長後に１００ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシンによりＹＰＤ上で選択した。それぞれの構築物由来の１０個の形質転換体をＹＰＤ中で４日間、振盪フラスコにおいて成長させた。形質転換体はすべて、ゼアキサンチンおよびβ−クリプトキサンチンを産生した。代表的な形質転換体を図３中に示し、親株ＭＬ５２５２と比較する。フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｃｒｔＺ遺伝子を含有する株ＭＬ１２４５８は、６％のβ−クリプトキサンチンおよび６％のゼアキサンチンを産生した（全カロテノイドのパーセンテージとして）。クロノバクター・パルベリス（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ）（以前はエンテロバクター・パルベリス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ））ｃｒｔＺ遺伝子を含有する株ＭＬ１０３４１は、３％のβ−クリプトキサンチンおよび３９％のゼアキサンチンを産生した（全カロテノイドのパーセンテージとして）。また、Ｈ．プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）ＬＦ  ｃｒｔＺ遺伝子を含有する株ＭＬ１２４５３は、２１％のβ−クリプトキサンチンおよび４％のゼアキサンチンを産生した（全カロテノイドのパーセンテージとして）。
【０１０３】
［ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞からの抽出およびＨＰＬＣによるカロテノイド産生の定量化］
生成された株の振盪フラスコ試験およびカロテノイド分析は、米国特許第７，８５１，１９９  Ｂ２号明細書において以前に記載された方法に従って実行した。
【図１】
0006319697.tif 000004
【図２】
0006319697.tif 000005
【図３】
0006319697.tif 000006
【配列表】
0006319697000001.app