(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
（ｉ）配列番号１によって定義される重鎖可変領域、または配列番号８、９、１０もしくは１１によって定義されるそのヒト化型、および
（ｉｉ）配列番号２によって定義される軽鎖可変領域、または配列番号１５、１６もしくは１７によって定義されるそのヒト化型
を含む前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
以下の特性：
ａ）２００ｐＭまたはそれ以上のヒトＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫD）；
ｂ）カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性；
ｃ）ＩＬ１シグナル伝達に対する阻害作用；
ｄ）１種またはそれ以上の癌細胞株においてＡＤＣＣを誘導する能力；および
ｅ）１種またはそれ以上の癌細胞株との結合の際のインターナリゼーションの能力
を示す、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
重鎖可変領域配列番号１と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１５のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域；
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１５のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１５のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域；
ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１５のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域；
ｅ）配列番号８のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域；
ｆ）配列番号９のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域；
ｇ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域；
ｈ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域；
ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１７のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域；
ｊ）配列番号９のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１７のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域；
ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１７のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域；または
ｌ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域および配列番号１７のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域
を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
重鎖定常領域またはその一部と、軽鎖定常領域またはその一部を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
Ｆｃ領域を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
細胞傷害性部分および／または検出可能な部分をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項９】
医薬において使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
対象における腫瘍性障害の治療において使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片であって、該腫瘍性障害が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
請求項１０に記載の腫瘍性障害の治療において使用するための抗体またはその抗原結合断片であって、該腫瘍性障害が腫瘍性血液学的障害である、または対象の身体内での固形腫瘍の形成と関連する、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
請求項１１に記載の腫瘍性障害の治療において使用するための抗体またはその抗原結合断片であって、該腫瘍性障害が、（ａ）慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または（ｂ）前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳／ＣＮＳ癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭部／頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌および肉腫からなる群から選択される、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
ＩＬ−１シグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性である疾患または状態の治療において使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合
断片。
【請求項１４】
対象における癌細胞の検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）試験される対象に由来する細胞のサンプルを用意する工程；
（ｂ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を、該サンプル中に存在する細胞と接触させる工程；および
（ｃ）該抗体またはその抗原結合断片が該細胞と結合するか否かを決定する工程
を含み、
該抗体またはその抗原結合断片の該細胞との結合は、対象の組織における癌細胞の存在を示す、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片による治療が有益であろう癌を有する患者を同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）試験される患者に由来する癌細胞のサンプルを用意する工程；
（ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を、該サンプル中に存在する細胞と接触させる工程；および
（ｃ）該抗体またはその抗原結合断片が該細胞と結合するか否かを決定する工程
を含み、
該抗体またはその抗原結合断片の該癌細胞との結合が、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片による治療が有益であろう患者を示す、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）の前に、工程（ａ）で用意されたサンプル中に存在する細胞を抽出および／または精製する工程（ａ’）をさらに含む、請求項１４または１５に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１バイオマーカー（具体的には、ＩＬ１ＲＡＰ）と関連する、および／またはＩＬ−１シグナル伝達の阻害に応答する疾患および状態の治療および診断のための抗体ベースの薬剤に関する。特に、それだけには限らないが、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および固形腫瘍形成と関連する癌（メラノーマ、肺癌および乳房の癌のような）を含めた癌の治療および診断のための抗体ベースの薬剤が提供される。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１の生物学
インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、感染および炎症に応じて、単核ファゴサイトを含めた種々の細胞型によって産生される強力な炎症性サイトカインである。ＩＬ−１ファミリーは、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βを含めた７種のアゴニストならびにＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を含めた３種の天然に存在する受容体アンタゴニストからなる（非特許文献１）。２種のＩＬ−１受容体、ＩＬ−１ＲＩ型およびＩＬ−１ＲＩＩ型が同定されている。両受容体とも、ＩＬ−１ファミリー分子の３種の形態すべてと相互作用できる。ＩＬ−１ＲＩは、ＩＬ−１誘導性細胞活性化の媒介に関与している。しかし、ＩＬ−１／ＩＬ−１ＲＩ複合体は、それ自体ではシグナル伝達できず、第２の受容体鎖、ＩＬ−１Ｒアクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）との会合に依存している（非特許文献１）。ＩＬ−１ＲＩとは対照的に、ＩＬ−１ＲＩＩは、ＩＬ−１との結合の際に細胞活性化を誘導せず、したがって、ＩＬ−１ＲＩＩは、調節性おとり受容体として機能し、ＩＬ−１ＲＩと結合するために利用可能なＩＬ−１の正味の低減につながる。
【０００３】
ＩＬ１−シグナル伝達に加えて、ＩＬ１ＲＡＰは、ＳＴ２／ＩＬ１ＲＡＰ複合体によるＩＬ３３の、およびＩＬ１Ｒｒｐ２／ＩＬ１ＲＡＰ複合体によるＩＬ３６の効果の媒介にとって重要である（非特許文献２）。
【０００４】
ＩＬ−１は、局所感染または炎症の部位で誘導され、種々の生理学的および細胞性事象の調節に関与する強力な炎症性サイトカインである（非特許文献３および非特許文献４に要約されている）。白血球および内皮細胞を含めたいくつかの細胞型を活性化することができる。ＩＬ−１は、接着分子、サイトカイン、ケモカインならびにプロスタグランジンＥ２および一酸化窒素（ＮＯ）のようなその他の炎症性メディエーターの産生および発現を促進することによって、免疫学的応答を誘導し、増幅する。結果として、局所炎症が増幅され、持続される。さらに、炎症性メディエーターのＩＬ−１誘導性産生は、発熱、頭痛、低血圧症および体重減少をもたらす。さらに、ＩＬ−１は、造血因子であり、骨髄移植の際に患者において白血球および血小板の最低値を低下させることがわかっている。ＩＬ−１はまた、血管内皮細胞増殖因子の産生を誘導し、それによって、リウマチ関節におけるパンヌス形成および血液供給を促進することによって血管新生を促進することもわかっている。最後に、ＩＬ−１は、リウマチ疾患において骨および軟骨分解を促進することがわかっている。
【０００５】
疾患におけるＩＬ−１の役割
ＩＬ−１は、
・リウマチ関節炎および変形性関節症のような、関節、骨および筋肉疾患；
・家族性地中海熱のような遺伝性全身性自己炎症性疾患；
・全身性若年性特発性関節炎および成人発症スチル病のような全身性自己炎症性疾患；
・痛風および２型糖尿病のような一般的な炎症性疾患；
・心筋梗塞のような急性発症虚血性疾患および
・癌
を含めた、痛風から癌にわたる幅広い疾患および状態に関与している（総説については、参照によって開示内容を本明細書に組み入れる、非特許文献５および非特許文献６を参照のこと）。
【０００６】
ＩＬ−１活性を遮断するためのいくつかの療法が承認されており、また開発中である。ＩＬ−１を標的とすることは、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ；Ａｍｇｅｎ）、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方の活性を遮断する、天然に存在するＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の組換え形態の導入によって１９９３年に始まった；以来、この治療薬は、多数の疾患におけるＩＬ−１の役割を実証するために使用されてきた（上記を参照のこと）。アナキンラは、現在、良好な安全記録、短い半減期および複数の投与経路のためにＩＬ−１治療薬の分野で優位に立っている。抗体または可溶性受容体を用いてＩＬ−１を中和することも有効であると証明されており、可溶性おとり受容体リロナセプト（Ａｒｃａｌｙｓｔ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）および抗ＩＬ−１β中和モノクローナル抗体カナキヌマブ（Ｉｌａｒｉｓ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が現在承認されている。ＩＬ−１α中和、ＩＬ−１βを標的とする治療用ワクチンおよびキメラＩＬ−１Ｒａを含めたその他の治療アプローチは、初期臨床治験にある。さらに、カスパーゼ１阻害剤のようなＩＬ−１産生の経口活性小分子阻害剤が開発され、試験中である。
【０００７】
腫瘍性障害のバイオマーカーとしてのＩＬ１ＲＡＰ
腫瘍バイオマーカーとは、その量または修飾が、腫瘍状態、進行特徴および療法に対する反応を示す、内因性タンパク質または代謝産物である。それらは、腫瘍組織または体液中に存在し、転写因子、細胞表面受容体および分泌タンパク質を含め、さまざまな分子を包含する。有効な腫瘍マーカーには、それらが、初期段階での癌の診断を促進することによって、および治療を個別化するよう役立つことによって、癌死亡率を低下させる可能性を有するので大きな需要がある。過去１０年の間に、発癌および腫瘍進行の理解の改善によって、多数の可能性ある腫瘍マーカーが示された。組織マイクロアレイ、抗体アレイおよび質量分析のような現在の技術の適用によって、近い将来、より多くのものが発見されると予測される。
【０００８】
インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）は、これまでに、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）のような血液学的腫瘍性障害と関連する細胞表面バイオマーカーとして同定されている（例えば、開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｃａｎｔａｒｇｉａ  ＡＢの特許文献１、非特許文献７、非特許文献８および非特許文献９を参照のこと）。より最近は、メラノーマのような固形腫瘍の診断用および治療用バイオマーカーとしてのＩＬ１ＲＡＰの有用性も示されている（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｃａｎｔａｒｇｉａ  ＡＢの特許文献２を参照のこと）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０２１０１４
【特許文献２】ＷＯ２０１２／０９８４０７
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，ＣＡ、Ｂｌｏｏｄ  １９９６年、第８７巻（６号）：２０９５〜１４７頁
【非特許文献２】Ｇａｒｌａｎｄａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３年１２月１２日；第３９巻（６号）：１００３〜１８頁
【非特許文献３】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＣＡ、ＣＨＥＳＴ、２０００年、第１１８巻：５０３〜５０８頁
【非特許文献４】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，ＣＡ、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２００２年、第２０巻（５号付録２７）：Ｓ１−１３
【非特許文献５】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏら、２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  第１１巻：６３３〜６５２頁
【非特許文献６】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ、２０１４年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第２０巻（付録１）：Ｓ４３−Ｓ５８
【非特許文献７】Ｊａｒａｓら、２０１０年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  第１０７巻（３７号）：１６２８０〜５頁
【非特許文献８】Ａｓｋｍｙｒら、２０１３年、Ｂｌｏｏｄ．第１２１巻（１８号）：３７０９〜１３頁
【非特許文献９】Ｂａｒｒｅｙｒｏら、２０１２年、Ｂｌｏｏｄｄ第１２０巻（６号）：１２９０〜８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明は、ＩＬ１ＲＡＰバイオマーカーと関連する、ならびに／またはＩＬ−１および／もしくはＩＬ−３３シグナル伝達の阻害に応答する疾患および状態の診断および治療において使用するための改善された抗体を提供しようと努めるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様は、インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（「ＩＬ１ＲＡＰ」）に対して結合特異性を有する抗体またはその抗原結合断片（「抗体ポリペプチド」）であって、参照抗体「ＣＡＮ０４」のヒトＩＬ１ＲＡＰとの結合を阻害することができる抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１３】
「インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質」、「ＩＬ１ＲＡＰ」および「ＩＬ１−ＲＡＰ」は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ８４０５９、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２１７３．１およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＮＰＨ３−１に記載されるヒトＩＬ１ＲＡＰタンパク質を具体的に含む（また、開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｈｕａｎｇら、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第９４巻（２４号）、１２８２９〜１２８３２頁も参照のこと）。ＩＬ１ＲＡＰはまた、科学文献において、ＩＬ１Ｒ３、Ｃ３ｏｒｆ１３、ＦＬＪ３７７８８、ＩＬ−１ＲＡｃＰおよびＥＧ３５５６としても知られている。
【００１４】
したがって、本発明の抗体ポリペプチドは、ＩＬ１ＲＡＰに対する特異性を有する。「特異性」は、抗体ポリペプチドが、ＩＬ１ＲＡＰとｉｎ  ｖｉｖｏで、すなわち、ヒト身体内でＩＬ１ＲＡＰが存在する生理学的条件下で結合することができることを意味する。好ましくは、抗体ポリペプチドは、任意のその他のタンパク質とｉｎ  ｖｉｖｏで結合しない。このような結合特異性は、ＩＬ１ＲＡＰを発現するトランスフェクトされた細胞を使用する、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫沈降、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリーのような当技術分野で周知の方法によって決定される。抗体ポリペプチドは、ＩＬ１ＲＡＰと選択的に結合することができる、すなわち、任意のその他のタンパク質よりも少なくとも１０倍強力にＩＬ１ＲＡＰと結合することが有利である。
【００１５】
「参照抗体「ＣＡＮ０４」」は、それぞれ、配列番号１および２のアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を含むインタクトなＩｇＧ抗体を含む。別に明記されない限り、「ＣＡＮ０４」への本明細書における言及は、（ａ）配列番号１によって定義される可変領域および配列番号１９によって定義される定常領域を含む重鎖と、（ｂ）配列番号２によって定義される可変領域および配列番号１８によって定義される定常領域を含む軽鎖とを含むインタクトなＩｇＧ抗体を指す。あるいは、ＣＡＮ０４のヒト化型（「ｈＣＡＮ０４」）が、参照抗体として使用される。例えば、参照抗体は、（ａ）配列番号８〜１１のいずれか１つによって定義される可変領域および配列番号１９によって定義される定常領域を含む重鎖と、（ｂ）配列番号１５〜１７のいずれか１つによって定義される可変領域および配列番号１８によって定義される定常領域を含む軽鎖とを含むインタクトなＩｇＧ抗体であり得る。
【００１６】
以下に論じられるように、参照抗体「ＣＡＮ０４」は、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２と結合する。したがって、本発明の抗体または抗原結合断片はまた、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２と結合することが認められよう。
【００１７】
「参照抗体「ＣＡＮ０４」のヒトＩＬ１ＲＡＰとの結合を阻害することができる」は、本発明の抗体ポリペプチドの存在が、「ＣＡＮ０４」のヒトＩＬ１ＲＡＰとの結合を全体的に、または幾分か阻害することを意味する。このような競合的結合阻害は、当技術分野で周知のアッセイおよび方法を使用して、例えば、固定化されたＩＬ１ＲＡＰを有するＢＩＡｃｏｒｅチップを使用することならびに試験される抗体ポリペプチドとともにおよび伴わずに、参照抗体「ＣＡＮ０４」とともにインキュベートすることによって決定することができる。あるいは、参照抗体「ＣＡＮ０４」を、ＢＩＡｃｏｒｅチップの表面に固定化し、固定化した抗体にＩＬ１ＲＡＰ抗原を結合し、次いで、第２の抗体を同時ＩＬ１ＲＡＰ−結合能について試験するペアワイズマッピングアプローチを使用できる（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、「ＢＩＡｃｏｒｅ  Ａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２９−０１９４−００  ＡＡ  ０５／２０１２を参照のこと）。
【００１８】
さらなる代替法では、競合的結合阻害は、フローサイトメトリーを使用して決定することができる。例えば、試験抗体が、ＣＡＮ０４参照抗体の細胞表面抗原との結合を阻害できるか否かを調べるために、抗原を発現する細胞を、試験抗体とともに２０分間プレインキュベートすることができ、その後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって検出されるフルオロフォアにコンジュゲートされた参照ＣＡＮ０４抗体とともにインキュベートする。試験抗体ととものプレインキュベーションが、フローサイトメトリーにおいて参照ＣＡＮ０４抗体の検出を低減する場合には、試験抗体が、参照抗体の細胞表面抗原との結合を阻害する。試験される抗体が、ＩＬ１ＲＡＰに対する高親和性を示す場合には、短縮したプレインキュベーション期間を使用できる（またはさらにプレインキュベーションが全くない）。
【００１９】
さらなる代替案では、競合的結合阻害は、ＥＬＩＳＡを使用して決定することができる（例えば、実施例Ｊに記載されるように）。
【００２０】
「抗体またはその抗原結合断片」は、実質的にインタクトな抗体分子、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体、単離されたヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体ならびにそれらの抗原結合断片および誘導体を含む。適した抗原結合断片および誘導体として、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ）２断片）、単一の可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、単一および二重形式［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）が挙げられるが、必ずしもこれに限定されない。全抗体ではなく抗体断片を使用することの可能性ある利点は、数倍である。より小さい大きさの断片は、固体組織のより良好な浸透のような薬理学的特性の改善につながり得る。さらに、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片のような抗原結合断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から発現され、分泌され、したがって、多量の前記断片の容易な産生を可能にする。
【００２１】
語句「抗体またはその抗原結合断片」はまた、抗体模倣物（例えば、高度の安定性を有するが、特定の位置に可変性が導入されることを可能にする非抗体スキャフォールド構造）を包含するものとする。生化学の当業者は、Ｇｅｂａｕｅｒ  ＆  Ｓｋｅｒｒａ、２００９年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  第１３巻（３号）：２４５〜２５５頁（その開示内容は、参照によって本明細書に組み入れる）において論じられるような、多数のこのような分子に精通しているであろう。例示的抗体模倣物として、アフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｙ）（トリネクチン（Ｔｒｉｎｅｃｔｉｎ）とも呼ばれる；Ｎｙｇｒｅｎ、２００８年、ＦＥＢＳ  Ｊ、第２７５巻、２６６８〜２６７６頁）；ＣＴＬＤ（テトラネクチンとも呼ばれる；Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６年）、２７〜３０頁）；アドネクチン（モノボディーとも呼ばれる；Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第３５２巻（２００７年）、９５〜１０９頁）；アンチカリン（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ（２００５年）、第１０巻、２３〜３３頁）；ＤＡＲＰｉｎｓ（アンキリン；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４年）、第２２巻、５７５〜５８２頁）；アビマー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５年）、第２３巻、１５５６〜１５６１頁）；マイクロボディー（ＦＥＢＳ  Ｊ、（２００７年）、第２７４巻、８６〜９５頁）；ペプチドアプタマー（Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５年）、第５巻、７８３〜７９７頁）；Ｋｕｎｉｔｚドメイン（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２００６年）第３１８巻、８０３〜８０９頁）；アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）（Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５年）、第２３巻、５１４〜５２２頁）；アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）（Ａｖａｃｔａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｅｔｈｅｒｂｙ、ＵＫ）が挙げられる。
【００２２】
また、本発明の範囲内に、キメラＴ−細胞受容体（キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体およびキメラ抗原受容体またはＣＡＲとしても知られる）も含まれる（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｐｕｌｅら、２００３年、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  第５巻（３号）：２１１〜２６頁を参照のこと）。これらは、免疫エフェクター細胞に任意の特異性をグラフトする遺伝子操作された受容体である。通常、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性をグラフトするためにＣＡＲが使用され、そのコード配列の導入は、レトロウイルスベクターによって容易にされる。このような分子の最も一般的な形態は、ＣＤ３−ζ膜貫通およびエンドドメインに融合された、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む融合物である。Ｔ細胞がこの融合分子を発現する場合には、それらは、導入されたモノクローナル抗体特異性を発現する標的細胞を認識し、死滅させる。
【００２３】
当業者であれば、本発明はまた、現在存在するか、将来存在するかに関わらず、抗体およびその抗原結合断片の修飾された形、例えば、ポリエチレングリコールまたは別の適したポリマーの共有結合によって修飾されたものも包含するということをさらに認識するであろう（以下を参照のこと）。
【００２４】
抗体および抗体断片を作製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、抗体は、抗体分子のｉｎ  ｖｉｖｏ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９年  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８６巻：３８３３〜３８３７頁；Ｗｉｎｔｅｒら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ  第３４９巻：２９３〜２９９頁）または培養中の細胞株によるモノクローナル抗体分子の作製を使用するいくつかの方法のうちのいずれか１つによって作製することができる。これらとして、それだけには限らないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術が挙げられる（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５年  Ｎａｔｕｒｅ  第２５６巻：４９５０４９７；Ｋｏｚｂｏｒら、１９８５年Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  第８１巻：３１〜４２頁；Ｃｏｔｅら、１９８３年  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第８０巻：２０２６〜２０３０頁；Ｃｏｌｅら、１９８４年  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第６２巻：１０９〜１２０頁）。
【００２５】
モノクローナル抗体の産生のための適した方法はまた、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｈ  Ｚｏｌａ  （開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８年）に、および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ  Ｇ  Ｒ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２年）に開示されている。
【００２６】
同様に、抗体断片は、当技術分野で周知の方法を使用して得ることができる（例えば、開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。例えば、本発明の抗体断片は、抗体のタンパク質分解性加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは哺乳動物細胞における発現によって調製できる（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養またはその他のタンパク質発現系）。あるいは、抗体断片は、従来法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。
【００２７】
本発明の抗体は、マウス由来抗体の可変領域を参照することによって定義され、「ＣＡＮ０４」と呼ばれ、
（ａ）配列番号１：
Q V Q L Q Q S G P E L L K P G A S V K I S C K A S
G Y A F S S S W M N W V K Q R P G K G L E W I G
R I Y P G D G N T H Y S G K F K G K A T L T A D K
S S S I A Y M Q L S S L T S E D S A V Y F C G E G
Y L D P M D Y W G Q G T S V T V S S      ［配列番号１］
のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号２：
D I Q M T Q T T S S L S A S L G D R V T I S C S A
S Q G I N N Y L N W Y Q Q K P D G T V K L L I H Y
T S G L H A G V P S R F S G S G S G T D Y S L T I
S N L E P E D V A T Y Y C Q Q Y S I L P W T F G
G G T K L E I K R                    ［配列番号２］
のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む。
【００２８】
用語「アミノ酸」とは、本明細書において、標準の２０種の遺伝子によってコードされるアミノ酸および「Ｄ」形態の（天然の「Ｌ」形態と比較して）その対応する立体異性体、ω−アミノ酸およびその他の天然に存在するアミノ酸、非通常性アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）および化学的に誘導体化されたアミノ酸を含む（以下を参照のこと）。
【００２９】
「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」のようなアミノ酸が具体的に列挙されている場合には、この用語は、別に明確に記載されない限りＬ−アラニンおよびＤ−アラニンの両方を指す。所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、その他の非通常性アミノ酸も、本発明のポリペプチドの適した成分であり得る。示されるペプチドについて、コードされるアミノ酸残基は各々、適当な場合には、従来のアミノ酸の慣用名に対応する一文字記号表示によって表される。
【００３０】
一実施形態では、本明細書において定義される抗体ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含む、またはそれからなる。
【００３１】
当業者には、上記の可変領域を含む任意のインタクトなＩｇＧ抗体を、参照抗体として使用して、ＩＬ１ＲＡＰとのＣＡＮ０４結合を競合的に阻害する本発明の抗体ポリペプチドを同定することができるということは認められよう。
【００３２】
したがって、一実施形態では、決定された競合的結合剤に対する参照として使用されるＣＡＮ０４抗体は、
（ａ）マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ定常領域にグラフトされた配列番号１の可変ドメインを含む重鎖と、
（ｂ）マウスκ定常領域にグラフトされた配列番号２の可変ドメインを含む軽鎖と
を含むインタクトなＩｇＧ抗体である。
【００３３】
あるいは、参照抗体は、
（ａ）ヒトＩｇＧ１定常領域にグラフトされた配列番号１の可変ドメインを含む重鎖（例えば、ｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクター  ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡによってコードされるような）と、
（ｂ）ヒトκ定常領域にグラフトされた配列番号２の可変ドメインを含む軽鎖（例えば、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋベクター  ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡによってコードされるような）と
を含む、キメラのインタクトなＩｇＧ抗体であり得る。
【００３４】
競合的結合は、通常、試験抗体が、参照抗体と結合する抗原上のエピトープ（この場合には、ＣＡＮ０４）と、または少なくともそれに極めて近接して結合するので起こる。しかし、当業者には、競合的結合はまた、立体的干渉によって起こることもあるということは認められよう；したがって、試験抗体は、参照抗体が結合するものとは異なるエピトープで結合することもあるが、やはり、参照抗体の抗原との結合を妨げる十分な大きさまたは立体配置ものであり得る。
【００３５】
本発明の抗体および抗原結合断片は、それらを癌の診断薬および治療薬として特に適したものにする提示特性に基づく、多数の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の広範囲に及ぶスクリーニング後に同定される。
【００３６】
したがって、一実施形態では、抗体または抗原結合断片は、以下の特性：
（ａ）２００ｐＭまたはそれ以上、すなわちＫＤ≦２００ｐＭのヒトＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫＤ）（例えば、実施例Ａにおいて決定されるような）；
（ｂ）カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性（例えば、実施例Ｄにおいて決定されるような）；
（ｃ）ＩＬ１シグナル伝達に対する阻害作用（ＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１β；例えば、実施例Ｅにおいて決定されるような）；
（ｄ）１種またはそれ以上の癌細胞株（ＣＭＬ、ＡＬＬおよび／またはメラノーマ細胞株のような）において抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導する能力（例えば、実施例Ｆにおいて決定されるような）；および／または
（ｅ）１種またはそれ以上の癌細胞株（ＣＭＬ、ＡＭＬおよび／またはメラノーマ細胞株のような）との結合の際のインターナリゼーションの能力（例えば、実施例Ｇにおいて決定されるような）
のうちの１つまたはそれ以上を示す。
【００３７】
抗体または抗原結合断片が、上記の特性のすべてを示すことが有利である。
【００３８】
代替実施形態では、抗体または抗原結合断片は、上記の特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）のうちの１つまたはそれ以上を示すが、ＡＤＣＣを誘導することはできない。
【００３９】
一実施形態では、抗体または抗原結合断片は、参照抗体ＣＡＮ０４が結合することができるＩＬ１ＲＡＰ上のエピトープと少なくとも部分的に重複する、ＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメイン上のエピトープと結合することができる。したがって、抗体または抗原結合断片は、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２に／内に（参照によって開示内容を本明細書に組み入れるＷａｎｇら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１１巻：９０５〜９１２頁を参照のこと）、すなわち、ＩＬ１ＲＡＰのアミノ酸１３５〜２３４内に（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ内の受託番号Ｑ９ＮＰＨ３を参照のこと）位置するエピトープと結合することができる可能性がある。例えば、抗体または抗原結合断片が、ＩＬ１ＲＡＰのアミノ酸１３５〜１５４、１５５〜１７４、１７５〜１９４、１９５〜２１４内またはアミノ酸２１５〜２３４の間に位置付けられるエピトープ。しかし、エピトープは、非線形であり得るということは認められよう。
【００４０】
一実施形態では、本発明の抗体ポリペプチドは、インタクトな抗体（ＩｇＧ１抗体のような）を含む、またはそれからなる。
【００４１】
代替実施形態では、本発明の抗体ポリペプチドは、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ）２断片）およびドメイン抗体（例えば、単一のＶＨ可変ドメインまたはＶＬ可変ドメイン）からなる群から選択される抗原結合断片を含む、またはそれからなる。
【００４２】
さらなる実施形態では、上記で論じられるように、本発明のポリペプチドは、アフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、テトラネクチン（ＣＴＬＤ）、アドネクチン（モノボディー）、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎｓ（アンキリン）、アビマー、ｉＭａｂｓ、マイクロボディー（ｍｉｃｒｏｂｏｄｙ）、ペプチドアプタマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインおよびアフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）を含む、またはそれからなる群から選択される抗体模倣物を含む、またはそれからなる。
【００４３】
好ましい実施形態では、本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲ：
ａ）ＧＹＡＦＳＳＳ［配列番号３］もしくはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｂ）ＹＰＧＤＧＮ［配列番号４］もしくはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；および／または
ｃ）ＧＹＬＤＰＭＤＹ［配列番号５］もしくはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む。
【００４４】
したがって、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３、４および５の各ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含み得る。
【００４５】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＡＮ０４参照抗体、すなわち、配列番号１の対応する領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。
【００４６】
しかし、ＣＤＲ配列内の低レベルの突然変異（通常、わずか１個または２個のアミノ酸）は、ＩＬ１ＲＡＰに対する抗体または抗原結合断片の特異性を喪失せずに許容されるということは認められよう。
【００４７】
同一性パーセントは、例えば、Ｅｘｐａｓｙ機関のサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）で、パラメータとして、グローバルアラインメント選択肢、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、オープニングギャップペナルティー−１４、伸長ギャップペナルティー−４を使用して、ＬＡＬＩＧＮプログラム（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１年）第１２巻：３３７〜３５７頁）によって決定することができる。あるいは、２種のポリペプチド間の配列同一性パーセントは、適したコンピュータプログラム、例えば、ウィスコンシン大学Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。同一性パーセントは、その配列が最適にアラインされているポリペプチドに関して算出されるということは認められよう。
【００４８】
アラインメントは、別法として、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（参照によって本明細書に組み入れる、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．第２２巻：４６７３〜４６８０頁に記載される）を使用して実施することができる。使用されるパラメータは、以下の通りであり得る：
−  Ｆａｓｔペアワイズアラインメントパラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティー；３、トップダイアゴナル数；５。スコアリング法：ｘパーセント。
−  マルチプルアラインメントパラメータ：ギャップオープンペナルティー；１０、ギャップ伸長ペナルティー；０．０５。
−  スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【００４９】
あるいは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用して、局所配列アラインメントを決定することができる。
【００５０】
さらに好ましい実施形態では、本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲ：
ａ）ＧＹＡＦＳＳＳＷＭＮ［配列番号６］またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｂ）ＲＩＹＰＧＤＧＮＴＨＹＳＧＫＦＫＧ［配列番号７］またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；および
ｃ）ＧＹＬＤＰＭＤＹ［配列番号５］またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む。
【００５１】
例えば、抗体ポリペプチドは、配列番号６、７および５の各ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含み得る。
【００５２】
上記で示されるように、ＣＡＮ０４参照抗体は、マウス抗体である。しかし、この抗体の成分重鎖および軽鎖は、例えば、その低減した免疫原性のためにヒトにおいて使用するのにより適した抗体ポリペプチドを産生するために、ヒト化することができる。例えば、配列番号３、４および５のＣＤＲ（または配列番号６、７および５のＣＤＲ）を、ヒト可変領域フレームワーク中に移植することができる。
【００５３】
当業者には、ヒト療法のために、ヒトまたはヒト化抗体が使用されることが好ましいということは認められよう。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化型は、好ましくは、非ヒト抗体に由来する最小部分を有する遺伝子操作されたキメラ抗体または抗体断片である。ヒト化抗体は、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、所望の機能性を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）の相補性決定領域に由来する残基によって置き換えられている抗体を含む。いくつかの例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも移入される相補性決定領域またはフレームワーク配列中にも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、相補性決定領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト抗体のものに対応し、フレームワーク領域すべてまたは実質的にすべてが、関連ヒトコンセンサス配列のものに対応する、少なくとも１つの、通常、２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体はまた、通常、ヒト抗体に由来するＦｃ領域のような、抗体定常領域の少なくとも一部も含むことが最適である（例えば、開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｊｏｎｅｓら、１９８６年．Ｎａｔｕｒｅ  第３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ  第３３２巻：３２３〜３２９頁；Ｐｒｅｓｔａ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．第２巻：５９３〜５９６頁を参照のこと）。
【００５４】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で周知である。全般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、移入された残基と呼ばれることが多く、通常、移入された可変ドメインからとられる。ヒト化は、本質的に、ヒト相補性決定領域を対応するげっ歯類相補性決定領域と置換することによって、記載されたように実施することができる（例えば、開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ  第３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９８８年  Ｎａｔｕｒｅ  第３３２巻：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２３９巻：１５３４〜１５３６ｌ頁；米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に無傷未満のヒト可変ドメインが、非ヒト種に由来する対応する配列によって置換されているキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、通常、いくつかの相補性決定領域残基および可能性あるいくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体中の類似の部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体であり得る。
【００５５】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含めた当技術分野で公知の種々の技術を使用して同定することができる（例えば、開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２２７巻：３８１頁；Ｍａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２２２巻：５８１頁；Ｃｏｌｅら、１９８５年、Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ、７７頁；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１年Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４７巻：８６〜９５頁を参照のこと）。
【００５６】
したがって、本発明の抗体またはその抗原結合断片をヒト化することができ、例えば、それは、以下の、配列番号８〜１１のいずれか１つのアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る：
a) Q V Q L V Q S G A E V K K P G S S V K V S C K
A S G Y A F S S S W M N W V R Q A P G Q G L E
W M G R I Y P G D G N T H Y A Q K F Q G R V T
L T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V
Y Y C G E G Y L D P M D Y W G Q G T L V T V S
S                                ［配列番号８］；
b) Q V Q L V Q S G A E V K K P G S S V K V S C K
A S G Y A F T S S W M N W V R Q A P G Q G L E
W M G R I Y P G D G N T H Y A Q K F Q G R V T
L T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V
Y Y C G E G Y L D P M D Y W G Q G T L V T V S 
S                                ［配列番号９］；
c) Q V Q L V Q S G A E V K K P G S S V K V S C K
A S G Y T F T S S W M N W V R Q A P G K G L E
W M G R I Y P G D G Q T H Y A Q K F Q G R V T
L T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V
Y Y C G E G Y L D P M D Y W G Q G T L V T V S
S                              ［配列番号１０］；または
d) Q V Q L V Q S G A E V K K P G S S V K V S C K
A S G Y T F T S S W M N W V R Q A P G K G L E
W M G R I Y P G D G Q T H Y A Q K F Q G R V T
I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V
Y Y C G E G Y L D P M D Y W G Q G T L V T V S
S                              ［配列番号１１］。
【００５７】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８〜１１のいずれか１つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。
【００５８】
関連の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲ：
ａ）ＳＡＳＱＧＩＮＮＹＬＮ［配列番号１２］もしくはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、８０％もしくは９０％配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｂ）ＹＴＳＧＬＨＡ［配列番号１３］もしくはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；および／または
ｃ）ＱＱＹＳＩＬＰＷＴ［配列番号１４］もしくはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む。
【００５９】
したがって、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１２、１３および１４の各ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含み得る。
【００６０】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、マウスＣＡＮ０４参照抗体の対応する領域のアミノ酸配列、すなわち、配列番号２を有する軽鎖可変領域を含み得る。
【００６１】
上記で詳述される重鎖可変領域の場合におけるように、本発明の抗体ポリペプチドの軽鎖可変領域を、ヒトにおいて使用するのにより適した薬剤を製造するためにヒト化することができるということが認められよう。例えば、配列番号１２、１３および１４のＣＤＲを、ヒト可変領域フレームワーク中に移植することができる。
【００６２】
したがって、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域を含み得る：
a) D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C S
A S Q G I N N Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L
I H Y T S G L H A G V P S R F S G S G S G T D
Y T L T I S S L Q P E D V A T Y Y C Q Q Y S I L
P W T F G G G T K V E I K R      ［配列番号１５］；
b) D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C Q
A S Q G I N N Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L
I H Y T S G L H A G V P S R F S G S G S G T D
Y T L T I S S L E P E D V A T Y Y C Q Q Y S I L
P W T F G G G T K V E I K R      ［配列番号１６］；または
c) D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C Q
A S Q G I N N Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L
I H Y T S G L H A G V P S R F S G S G S G T D
F T L T I S S L E P E D V A T Y Y C Q Q Y S I L
P W T F G G G T K V E I K R      ［配列番号１７］。
【００６３】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５〜１７のいずれか一項のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み得る。
【００６４】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、またはそれからなるマウス重鎖可変領域および配列番号２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、またはそれからなるマウス軽鎖可変領域を含む。
【００６５】
あるいは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８〜１１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、またはそれからなるヒト化重鎖可変領域および配列番号１５〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、またはそれからなるヒト化軽鎖可変領域を含み得る。
【００６６】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１５のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域；
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１５のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１５のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域；
ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１５のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域；
ｅ）配列番号８のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域；
ｆ）配列番号９のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域；
ｇ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域；
ｈ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域；
ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１７のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域；
ｊ）配列番号９のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１７のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域；
ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１７のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域；または
ｌ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる重鎖可変領域および配列番号１７のアミノ酸配列を含む、もしくはからなる軽鎖可変領域
を含み得る。
【００６７】
当業者には、上記で定義される本発明のヒト化抗体または抗原結合断片は、重鎖定常領域またはその一部をさらに含み得る（以下を参照のこと）ということは認められよう。
【００６８】
一実施形態では、抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖のような）のＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域を含む。したがって、抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ１重鎖由来の定常領域の一部またはすべてを含み得る。例えば、抗体ポリペプチドは、それぞれ、上記で定義された重鎖および軽鎖可変領域のいずれかと組み合わせて、ＣＨ１およびＣＬ定常領域を含むＦａｂ断片であり得る。
【００６９】
同様に、上記で定義された本発明の抗体または抗原結合断片は、軽鎖定常領域またはその一部をさらに含み得る（以下を参照のこと）。例えば、抗体ポリペプチドは、κまたはλ軽鎖由来のＣＬ領域を含み得る。
【００７０】
例えば、抗体ポリペプチドは、以下の定常領域：
（ａ）Ｉｇκ鎖Ｃ領域（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））（ＵｎｉｔＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８３４）
TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN 
SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS 
FNRGEC                                  ［配列番号１８］
（ｂ）Ｉｇγ−１鎖Ｃ領域（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））（ＵｎｉｔＰｒｏｔ受託番号  Ｐ０１８５７）
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP 
KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS 
HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 
EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC 
LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK        ［配列番号１９］
を含み得る。
【００７１】
代替実施形態では、上記の定常領域の天然に存在する変異体を利用することができる（例えば、開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ＆  Ｌｅｆｒａｎｃ、２００９年、ＭＡｂｓ  第１巻（４号）：３３２〜８頁を参照のこと）。例えば、軽鎖定常領域は、Ｗ４０Ｒおよび／またはＶ８３Ｌ突然変異体を有する配列番号１８を含み得る、もしくはからなり得、ならびに／または重鎖定常領域は、Ｋ９７Ｒ、Ｄ２３９Ｅおよび／もしくはＬ２４１Ｍ突然変異体を有するか、もしくはＣ末端リシン／Ｋを含まない配列番号１９を含み得る、もしくはからなり得る（ここで、アミノ酸突然変異体の位置は、配列番号１８および１９における番号付けとは異なるＥｕ番号付けスキームを使用して定義される；開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第６３巻：７８〜８５頁を参照のこと）。
【００７２】
したがって、本発明の例示的抗体ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１、８、９、１０または１１の可変領域を、配列番号１９の定常領域と一緒に含む重鎖および
（ｂ）配列番号２、１５、１６または１７の可変領域を、配列番号１８の定常領域と一緒に含む軽鎖を含む。
【００７３】
関連実施形態では、抗体ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２およびＣＨ３領域）を含み得る。当業者には、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ抗体に、または異なるクラスの抗体（ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥのような）に由来し得るということは認められよう。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体に由来する。
【００７４】
Ｆｃ領域は、天然に存在する場合も（例えば、内因性に産生された抗体の一部）、人工的である場合もある（例えば、天然に存在するＦｃ領域に対する１つまたはそれ以上の点突然変異を含む）。
【００７５】
当技術分野では十分に実証されているであろうが、抗体のＦｃ領域は、その血清半減期ならびに補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）のようなエフェクター機能を媒介する。
【００７６】
治療用モノクローナル抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域を遺伝子操作することによって、それらに求められる薬理学活性に、より良好に適している分子の作製が可能となる（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｓｔｒｏｈｌ、２００９年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  第２０巻（６号）：６８５〜９１頁）。
【００７７】
（ａ）半減期の増大のために遺伝子操作されるＦｃ領域
治療用抗体の有効性を改善するための１つのアプローチとして、その血清持続性を増大させ、それによって、より高い循環レベル、より頻繁でない投与および用量の低減を可能にすることがある。
【００７８】
ＩｇＧの半減期は、新生児受容体ＦｃＲｎとのそのｐＨ依存性結合に応じて変わる。内皮細胞の表面に発現されるＦｃＲｎは、ＩｇＧとｐＨ依存的に結合し、それを分解から保護する。
【００７９】
ｐＨ６．０ではＦｃＲｎと選択的に結合するが、ｐＨ７．４では選択的に結合しないいくつかの抗体は、種々の動物モデルにおいてより高い半減期を示す。
【００８０】
Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｈｉｎｔｏｎら、２００４年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．第２７９巻（８号）：６２１３〜６頁）およびＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｖａｃｃａｒｏら、２００５年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第２３巻（１０号）：１２８３〜８頁）のようなＣＨ２とＣＨ３ドメイン間の界面に位置するいくつかの突然変異は、ＦｃＲｎに対する結合親和性およびｉｎ  ｖｉｖｏでのＩｇＧ１の半減期を増大するとわかっている。
【００８１】
（ｂ）エフェクター機能の変更のために遺伝子操作されるＦｃ領域
治療用抗体またはＦｃ融合タンパク質適用に応じて、エフェクター機能（ＡＤＣＣのような）を低減または増大することが望まれる場合がある。
【００８２】
細胞表面分子、特に、免疫細胞のものを標的とする抗体については、特定の臨床適応症のためにエフェクター機能を抑制することが必要とされる場合がある。
【００８３】
逆に、腫瘍学使用のために意図される抗体については（白血病および固形腫瘍の治療におけるような；以下を参照のこと）、エフェクター機能を増大させることは、治療活性を改善し得る。
【００８４】
４種のヒトＩｇＧアイソタイプは、活性性Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体および異なる親和性を有し、極めて異なるエフェクター機能をもたらす補体の第１の成分（Ｃ１ｑ）と結合する（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｂｒｕｈｎｓら、２００９年、Ｂｌｏｏｄ．第１１３巻（１６号）：３７１６〜２５頁）。
【００８５】
ＩｇＧのＦｃγＲまたはＣ１ｑとの結合は、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメイン中に位置する残基に応じて変わる。ＣＨ２ドメインの２つの領域は、ＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合にとって重要であり、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４中の独特の配列を有する。位置２３３〜２３６のＩｇＧ２残基ならびに位置３２７、３３０および３３１のＩｇＧ４残基のヒトＩｇＧ１への置換は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを大幅に低減するとわかった（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ａｒｍｏｕｒら、１９９９年、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２９巻（８号）：２６１３〜２４頁；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．第２７６巻（９号）：６５９１〜６０４頁）。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、Ｋ３２２を含む異なる位置のアラニン置換が、補体活性化を大幅に低減したことを実証した（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２０００年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６４巻（８号）：４１７８〜８４頁）。同様に、マウスＩｇＧ２ＡのＣＨ２ドメイン中の突然変異は、ＦｃγＲＩおよびＣ１ｑとの結合を低減するとわかった（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｓｔｅｕｒｅｒら、１９９５年Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５５巻（３号）：１１６５〜７４頁）。
【００８６】
ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインでは、多数の突然変異が行われており、ＡＤＣＣおよびＣＤＣに対するその効果が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験されている（上記で引用された参考文献を参照のこと）。特に、位置３３３のアラニン置換は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方を増大すると報告された（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１年、前掲；Ｓｔｅｕｒｅｒら、１９９５年、前掲）。Ｌａｚａｒらは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する高い親和性およびＦｃγＲＩＩｂに対する低い親和性を有し、結果として、ＡＤＣＣの増強をもたらす三重突然変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）を記載した（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｌａｚａｒら、２００６年、ＰＮＡＳ  第１０３巻（１１号）：４００５〜４０１０頁）。同一突然変異を使用して、ＡＤＣＣが増大した抗体を作製した（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｒｙａｎら、２００７年、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．第６巻：３００９〜３０１８頁）。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、マクロファージによる標的細胞の食作用の増強を媒介する、ＦｃγＲＩＩＩａ親和性およびＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比が改善された、わずかに異なる三重突然変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ）を研究した（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｒｉｃｈａｒｄｓら、２００８年  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．第７巻（８号）：２５１７〜２７頁）。
【００８７】
ＩｇＧ４抗体は、そのエフェクター機能の欠如のために、細胞枯渇を伴わない受容体遮断（すなわち、ＩＬ−１シグナル伝達の阻害）のための好ましいＩｇＧサブクラスに相当する。ＩｇＧ４分子は、Ｆａｂアーム交換と呼ばれる動的プロセスにおいて半分子を交換できる。この現象はまた、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４の間でｉｎ  ｖｉｖｏで起こり得る。
【００８８】
Ｓ２２８Ｐ突然変異は、この組換えプロセスを妨げ、あまり予測できない治療用ＩｇＧ４抗体の設計を可能にするとわかっている（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｌａｂｒｉｊｎら、２００９年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第２７巻（８号）：７６７〜７１頁）。
【００８９】
遺伝子操作されたＦｃ領域の例が、以下の表１および実施例Ｊに示されている。
【００９０】
【表１】
0006396488.tif 000002
【００９１】
表１の参考文献
1.  Hinton et al 2004 J. Biol. Chem. 279(8):6213-6)
2.  Vaccaro et al. 2005 Nat Biotechnol. 23(10):1283-8)
3.  Zalevsky et al 2010 Nat. Biotechnology 28(2):157-159
4.  Armour KL. et al., 1999. Eur J Immunol. 29(8):2613-24
5.  Shields RL. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604
6.  Masuda et al. 2007, Mol Immunol. 44(12):3122-31
7.  Bushfield et al 2014, Leukemia 28(11):2213-21
8.  Okazaki et al. 2004, J Mol Biol. ;336(5):1239-49
9.  Idusogie et al., 2000. J Immunol. 164(8):4178-84
10.  Datta-Mannan A. et al., 2007. Drug Metab. Dispos. 35: 86 - 94
11.  Steurer W. et al., 1995. J Immunol. 155(3):1165- 74
12.  Richards et al. 2008 Mol Cancer There. 7(8):2517-27
13.  US 7,960,512 B2
14.  EP 2 213 683
15.  Labrijn AF. et al., 2009. Nat Biotechnol. 27(8):767-71
【００９２】
さらなる実施形態では、Ｆｃ領域のエフェクター機能は、そのＣＨ２ドメイン内の炭水化物部分の修飾によって変更される。
【００９３】
例えば、Ｆｃ領域においてフコース残基を欠くまたはそれが少ない治療用抗体は、ヒトにおいてＡＤＣＣ活性の増強を示し得るということは知られている（例えば、Ｐｅｉｐｐら、２００８年、Ｂｌｏｏｄ  第１１２巻（６号）：２３９０〜９頁、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ＆  Ｓａｔｏｈ、２００９年、ＭＡｂｓ  第１巻（３号）：２３０〜２６頁、Ｉｉｄａら、２００９年、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  第９巻；５８を参照のこと（それらの開示内容を参照によって本明細書に組み入れる）。低フコース抗体ポリペプチドは、キフネンシンのようなマンノシダーゼの阻害薬を含有する培地において培養された細胞における発現によって産生することができる（以下の実施例Ｉを参照のこと）。
【００９４】
抗体のグリコシル化を低フコース形式に修飾するためのその他の方法として、ラムノースを代謝できない細胞における細菌酵素ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘクスローズレダクターゼの使用が挙げられる（例えば、ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ  ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、ＧｅｒｍａｎｙのＧｌｙｍａｘＸ（登録商標）技術を使用する）。
【００９５】
低フコース抗体を作製するための別の方法は、抗体産生細胞におけるα−（１，６）−フコシルトランスフェラーゼの阻害または枯渇（例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ技術を使用する）によってである。
【００９６】
上記のように、本発明の抗体ポリペプチドは、任意のＦｃ媒介性エフェクター機能に加えて、またはその非存在下で、ＩＬ−１シグナル伝達に対する阻害作用を発揮し得る。
【００９７】
一実施形態では、本発明の抗体ポリペプチドは、それだけには限らないが、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６を含めたＩＬ−１スーパーファミリー内の１種またはそれ以上のさらなる（または代替）サイトカインに対する阻害作用を発揮し得る。
【００９８】
インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）は、２型サイトカインを製造するようヘルパーＴ細胞、肥満細胞、好酸球および好塩基球を誘導する。このサイトカインは、以前は、ＮＦ−ＨＥＶ「高内皮細静脈（ＨＥＶ）中の核因子（ＮＦ）」と名付けられていたが、これは、これらの特殊化された細胞において最初に同定されたからである。ＩＬ−３３は、受容体ＳＴ２（ＩＬ１ＲＬ１としても知られる）およびＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）と相互作用し、極性Ｔｈ２細胞からの２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）の製造を駆動するＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路において、細胞内分子を活性化することによってその生物学的効果を媒介する。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−３３による２型サイトカインの誘導は、ＩＬ−３３の投与後に粘膜臓器において重度の病的変化を誘導すると考えられる。
【００９９】
インターロイキン−３６（ＩＬ−３６）は、ＩＬ−３６受容体を介して天然ＣＤ４＋Ｔ細胞に主に作用するサイトカインである。ＮＦ−κＢおよびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼを活性化して、皮膚病理において役割を果たすと知られている。また、Ｔ細胞増殖を活性化し、ＩＬ−２を放出するとわかっている。
【０１００】
当業者には、本発明の抗体ポリペプチドは、ＩＬ−１、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６シグナル伝達を全部または一部阻害し得るということは認められよう。例えば、シグナル伝達は、本発明のポリペプチドの非存在下でシグナル伝達を少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、７５％またはそれ以上阻害される。
【０１０１】
本発明のポリペプチドによるＩＬ−１、ＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６シグナル伝達の阻害の程度は、当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。
【０１０２】
例えば、ＩＬ−１シグナル伝達の阻害は、以下の実施例Ｅに記載されるように測定することができる。
【０１０３】
同様に、ＩＬ−３３シグナル伝達の阻害は、実施例Ｅに記載されるように測定することができる。
【０１０４】
ＩＬ−３６シグナル伝達の阻害は、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。例えば、滑膜線維芽細胞のＩＬ−３６刺激は、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼ活性化につながる。あるいは、ＩＬ−３６−α、−βおよびγは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激に応じてＴ−細胞増殖を増大する（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｖｉｇｎｅら、２０１２年、Ｂｌｏｏｄ  第１２０巻（１７号）：３４７８〜８７頁）。
【０１０５】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、それだけには限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸およびデキストランのような、抗体または抗原結合断片のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増大するための部分をさらに含み得る。このようなさらなる部分は、当技術分野で周知の方法を使用して、コンジュゲートされるか、そうでなければ、組み合わされる。
【０１０６】
この目的のために、タンパク質の半減期を改善する以下の公知の方法のうちの任意の１つまたはそれ以上を使用することができる：
【０１０７】
（ａ）ペグ化
タンパク質の半減期を改善するための広く使用される方法は、タンパク質へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の共有結合による連結である。ＰＥＧは、その大きな水力学的容量のためにペグ化薬物の周囲の遮蔽物を増大する水溶性ポリマーである［開示内容を参照により本明細書に組み入れる、Ｍｏｌｉｎｅｕｘ，Ｇ．、Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ：ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ、２００２年  第２８巻付録Ａ：１３〜６頁］。ペグ化タンパク質は、腎クリアランスおよびタンパク質分解の低減、毒性の低減、免疫原性の低減および溶解度の増大を示す［Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．およびＪ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００２年  第５４巻（４号）：４５３〜６頁、Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．Ｐ．、ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００２年  第５４巻（４号）：５３１〜４５頁］。ペグ化は、第１のペグ化分子アスパラギナーゼおよびアデノシンデアミナーゼを含め、いくつかのタンパク質ベースの薬物のために使用されてきた［開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．およびＪ．Ｍ．  Ｈａｒｒｉｓ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００２年  第５４巻（４号）：４５３〜６頁、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．およびＧ．  Ｐａｓｕｔ、ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ、ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ、２００５年  第１０巻（２１号）：１４５１〜８頁］。
【０１０８】
半減期が最大に増大され、生物活性が保持された、成功裏にペグ化されたタンパク質を得るために、結果に影響を及ぼし得るいくつかのパラメータが重要であり、考慮されなければならない。ＰＥＧ分子は、異なり得、タンパク質のペグ化に使用されてきたＰＥＧ変異体として、ＰＥＧおよびモノメトキシＰＥＧが挙げられる。さらに、それらは、直鎖または分岐のいずれかであり得る［Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｓ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ｂ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００２年  第５４巻（４号）：５４７〜７０頁］。使用されるＰＥＧ分子の大きさは、変わり得、１から４０ｋＤａの間の大きさの範囲のＰＥＧ部分が、タンパク質に連結されてきた［Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｓ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ｂ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００２年  第５４巻（４号）：５４７〜７０頁、Ｓａｔｏ，Ｈ．、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００２年  第５４巻（４号）：４８７〜５０４頁、Ｂｏｗｅｎ，Ｓ．ら、Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ａｎｄ  ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｔｅｉｎ．  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、１９９９年  第２７巻（３号）：４２５〜３２頁、Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．Ｐ．ら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈａｌｆ−ｌｉｖｅｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９年  第１７巻（８号）：７８０〜３頁］。さらに、タンパク質に結合されるＰＥＧ部分の数は変わり得、タンパク質に結合されている１〜６の間のＰＥＧユニットの例が報告されている［Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｓ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ｂ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００２年  第５４巻（４号）：５４７〜７０頁、Ｂｏｗｅｎ，Ｓ．ら、Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ａｎｄ  ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｔｅｉｎ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、１９９９年  第２７巻（３号）：４２５〜３２頁］。さらに、コンジュゲーションのためのＰＥＧおよび種々の反応性基の間のリンカーの有無が利用されてきた。したがって、ＰＥＧは、Ｎ末端アミノ基に、または反応性アミノもしくはヒドロキシル基を有するアミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒ）に直接に、またはリンカーとしてγ−アミノ酪酸を使用することによって連結される。さらに、ＰＥＧは、カルボキシル（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｃ末端）またはスルフヒドリル（Ｃｙｓ）基にカップリングされる。最後に、Ｇｌｎ残基は、酵素トランスグルタミナーゼを使用して特異的にペグ化され、ＰＥＧのアルキルアミン誘導体が記載されている［Ｓａｔｏ，Ｈ．、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００２年  第５４巻（４号）：４８７〜５０４頁］。
【０１０９】
ペグ化の程度を増大することは、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増大をもたらすとわかっている。しかし、当業者には、ペグ化プロセスは、特定の抗体ポリペプチドのために個々に最適化される必要があろうということは認められよう。
【０１１０】
ＰＥＧは、開示内容を参照によって本明細書に組み入れるＷＯ２００５／００７１９７に記載されるように、天然に存在するジスルフィド結合でカップリングされる。ジスルフィド結合は、タンパク質の三次構造を含まない化学的架橋の付加によって安定化することができる。これによって、ＰＥＧの部位特異的結合のための架橋を作製するために利用されるジスルフィド結合を含む２つの硫黄のコンジュゲーティングチオールの選択性が可能となる。それによって、標的分子との結合のためにペプチド中に残基を遺伝子操作する必要性が回避される。
【０１１１】
種々の代替ブロックコポリマーもまた、開示内容を参照によって本明細書に組み入れるＷＯ２００３／０５９９７３に記載されるように、共有結合によってコンジュゲートすることができる。治療用ポリマーコンジュゲートは、改善された熱的特性、結晶化、接着、膨化、コーティング、ｐＨ依存性コンホメーションおよび体内分布を示し得る。さらに、それらは、循環の延長、飲細胞作用によるコンジュゲートの細胞性取り込み後の二次リソソームのタンパク質分解性および酸性環境における生物活性物の放出ならびに大きな分子の特徴によるより好都合な物理化学的特性（例えば、生物学的流体における薬物溶解度の増大）を達成し得る。親水性および疎水性ブロックを含むコブロックコポリマーは、溶液中で高分子ミセルを形成する。ミセル解離すると、個々のブロックコポリマー分子は、安全に排出される。
【０１１２】
（ｂ）融合タンパク質
本発明が、抗体模倣物（上記を参照のこと）の使用を含む、またはそうでなければ、使用にある場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏで半減期を延長するのに以下の種類の融合タンパク質が有用であり得る。
【０１１３】
ＩｇＧ融合タンパク質
ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子は、およそ２０日の循環半減期を有する。ＩｇＧ分子のＦｃ部分は、Ｆｃ部分および治療的使用されるタンパク質からなる融合タンパク質の作製のために広く使用されている。このような融合タンパク質は、そのＦｃを欠く対応物と比較して延長された半減期を示す。例えば、この戦略は、エタネルセプト、可溶性ヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体およびヒトＩｇＧのＦｃ部分間の融合タンパク質からなる抗リウマチ薬の開発のために使用された［開示内容を参照によって本明細書に組み入れるＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｍ．、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｒｕｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ，  ａｃｔｉｖｅ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ、１９９９年  第２１巻（１号）：７５〜８７頁；考察１〜２］。
【０１１４】
Ｆｃが連結されたタンパク質は、標準遺伝子工学プロトコールによって対象のポリペプチドのＦｃおよび抗原結合領域間の融合タンパク質を作製することによって製造される。Ｆｃ基は、対象のタンパク質のＣ末端に融合される。ＩｇＧのヒンジ領域におけるシステイン残基の存在のために、Ｆｃ融合タンパク質は、ジスルフィド結合ホモ二量体として発現される。これは、その有効な大きさおよび循環半減期をさらに増大する。さらに、ホモ二量体構築物は、その受容体／リガンドに対する改善された結合活性のために、対応する単量体形態と比較して増大した機能活性を有し得る。
【０１１５】
ヒト血清アルブミン融合タンパク質
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、循環中で最も豊富な天然に存在する血液タンパク質であり、１９日の半減期を有する［開示内容を参照によって本明細書に組み入れるＯｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、２００２年  第３０３巻（２号）：５４０〜８頁］。したがって、ＨＳＡは、半減期が改善した融合タンパク質の作製のための適した融合パートナーである。ＨＳＡ融合タンパク質は、ＨＳＡの、タンパク質分解に対してタンパク質を安定化し、身体における滞留時間を増大する能力のために、半減期の延長を示す［Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．およびＪ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００２年  第５４巻（４号）：４５３〜６頁］。ＩＬ−２、ＩＦＮ−αおよび−βならびに成長ホルモン（ＧＨ）を含むＨＳＡ融合タンパク質が製造されており、改善された薬物動態特性を有すると示された。アルブフェロン（ＨＳＡ−ＩＦＮ−α）およびアルブトロピン（ａｌｂｕｔｒｏｐｉｎ）（ＨＳＡ−ＧＨ）は、それぞれ、ＨＳＡ基を欠くそれぞれの対応物よりも、カニクイザルにおいて１８および６倍長い半減期を示す［Ｏｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、２００２年  第３０３巻（２号）：５４０〜８頁、Ｏｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ら、Ａｌｂｕｔｒｏｐｉｎ：ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｋｅｙｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２００２年  第４５６巻（１−３号）：１４９〜５８頁］。
【０１１６】
ＨＳＡが連結されたタンパク質は、標準遺伝子工学プロトコールによってＨＳＡおよび対象のタンパク質の間で融合タンパク質を作製することによって製造される。ＨＳＡ基は、ＮまたはＣ末端のいずれかに付加することができる。修飾は、タンパク質の末端に付加されるので、タンパク質の構造を、ひいては、その機能を干渉するリスクは、タンパク質の内部におけるペグ化のような修飾と比較してかなり低い。さらに、タンパク質の活性部位を干渉することを避ける機会は、どちらが生物活性が維持された融合タンパク質をもたらす可能性が高いかに応じて、ＨＳＡ基が対象のタンパク質のＮまたはＣ末端のいずれかに付加されるという事実によって増大される［Ｏｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、２００２年  第３０３巻（２号）：５４０〜８頁、Ｏｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ら、Ａｌｂｕｔｒｏｐｉｎ：ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｋｅｙｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２００２年  第４５６巻（１−３号）：１４９〜５８頁、Ｓｙｅｄ，Ｓ．、Ｋ．Ｅ．ＫｅｌｌｙおよびＷ．Ｐ．Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｂｙ  ｈｉｒｕｄｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｏｒ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ、１９９６年  第８４巻（６号）：４１９〜２９頁］。したがって、アルブフェロンおよびアルブトロピン（ａｌｂｕｔｒｏｐｉｎ）の場合には、ＨＳＡのＣ−末端は、それぞれ、ＩＦＮ−αまたはＧＨのＮ−末端と融合され、機能的に活性なヒルジン−ＨＳＡ融合タンパク質の作製の場合には、ＨＳＡ基は、ヒルジンのＣ−末端に融合されなければならなかった。これらの結果は、標的タンパク質の特性が、Ｎ−またはＣ−末端の融合が最適であるか否かを左右することを示す。
【０１１７】
（ｃ）グリコシル化
タンパク質への新規シアル酸含有炭水化物の導入（糖質工学）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  半減期を改善すると示されている。この方法は、天然にグリコシル化されたタンパク質のために、または普通はグリコシル化を欠くタンパク質のために使用することができる［開示内容を参照によって本明細書に組み入れるＥｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．ら、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００３年  第２１巻（４号）：４１４〜２１頁］。
【０１１８】
タンパク質のグリコシル化は、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物の形態であり得る。Ｎ結合型炭水化物は、通常、コンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）に結合される。Ｏ−グリコシル化は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基で起こる。
【０１１９】
グリコシル化タンパク質の製造のために、新規グリコシル化部位の導入が必要であり得る。グリコシル化が起こるために、発現が酵母、昆虫または哺乳動物細胞系において実施される。しかし、酵母細胞におけるグリコシル化パターンは、哺乳動物細胞とは異なり、免疫原性の増大のリスクと関連するハイパーグリコシル化タンパク質が生じる。対照的に、昆虫細胞は、細胞周期がより短く、したがって、発現プロセスがより迅速であるが、グリコシル化パターンが哺乳動物細胞のものと同様であるので好ましいものであり得る。ダルベポエチン−αは、ＣＨＯ細胞において発現される修飾されたヒトエリスロポエチンの一例である。２つの余分なＮ−グリコシル化部位を含有し、３倍改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ半減期をもたらす［Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．ら、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００３年  第２１巻（４号）：４１４〜２１頁］。
【０１２０】
グリコシル化の代替法は、タンパク質への炭水化物基の化学的付加である。この方法では、タンパク質は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において裸で発現される。発現および精製後、タンパク質は、十分に合成的な細胞不含プロセスにおいてグリコシル化される。方法は、付加される炭水化物の数、大きさおよび種類の点で大きな柔軟性を与える。
【０１２１】
（ｄ）脂肪酸アシル化／ミリストイル化
脂肪酸は、ＨＳＡ結合の高親和性および高い能力を有する。この特徴を、タンパク質の半減期を改善するために利用することができる。したがって、脂肪酸アシルが、タンパク質のアミノ酸に結合され、このようにして、脂肪酸アシルアシル化タンパク質が作製される。循環に到達すると、脂肪酸アシル基は、循環ＨＳＡと結合することができ、タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の改善をもたらす。
【０１２２】
この方法は、ジメチルホルムアミド／ＤＭＳＯ中の脂肪酸ヒドロキシル−スクシンイミドエステルを用いるインスリンの処理によって、ＬｙｓＢ２９でミリスチン酸を用いてアシル化された脂肪酸アシルであるインスリンデテミルの開発のために使用された［開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ，Ｐ．ら、Ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎｓ  ａｃｙｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｇａｎｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、１９９５年  第３１２巻（Ｐｔ３）：７２５〜３１頁、Ｈａｍｉｌｔｏｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ，Ｍ．ら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐｒｏｔｒａｃｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｃｙｌａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ，ＮＮ３０４，ｉｎ  ｄｏｇｓ：  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＮ３０４  ｂｙ  ａｌｂｕｍｉｎ．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、１９９９年  第４２巻（１０号）：１２５４〜６３頁］。これによって、ＨＳＡの結合のためにｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が増大したインスリン類似体が生じた。
【０１２３】
（ｅ）デキストラン
デキストランは、タンパク質の固定化をもたらし、遅延放出をもたらし、それによってタンパク質の半減期を改善する。デキストラン−ストレプトキナーゼは、血栓溶解療法のためにロシアにおいて販売されてきた。さらに、デキストランにコンジュゲートされたインスリン、ソマトスタチン（ソマトスタチン受容体を発現する腫瘍の療法および診断のために使用される）およびリボソーム不活性化薬物トリコサンチンは、大幅に改善された半減期を有していた［開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｂａｕｄｙｓ，Ｍ．ら、Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｄｅｘｔｒａｎ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ、１９９８年  第９巻（２号）：１７６〜８３頁、Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｌ．ら、Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ｄｅｘｔｒａｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１９９９年  第５７巻（８号）：９２７〜３４頁、Ｗｕｌｂｒａｎｄ，Ｕ．ら、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ａｌｌ  ｆｉｖｅ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ、２００２年  第９４巻（付録４）：１２９３〜７頁］。
【０１２４】
タンパク質ベースの医薬に加えて、抗生物質および細胞傷害性薬物の半減期を改善するためにデキストランが使用されてきた［開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｙｕｒａ，Ｈ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｏｆ  Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ  （ＦＫ５０６）、ＦＫ５０６−ｄｅｘｔｒａｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．
Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９９年  第５７巻（１号）：８７〜９９頁、Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．ら、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｌａｓｍａ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎｓ．  Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ、１９９９年  第２２巻（７号）：７５６〜６１頁、Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．、Ｙ．Ｊ．ＪｕｎｇおよびＹ．Ｍ．Ｋｉｍ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｅｘｔｒａｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ、２００１年  第２７巻（１号）：９７〜１０１頁］。
【０１２５】
デキストランコンジュゲーションは、過ヨウ素酸によって活性化されたデキストランを使用する還元アミノ化によって、または臭化シアンの使用によって実施される［開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｗｕｌｂｒａｎｄ，Ｕ．ら、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ａｌｌ  ｆｉｖｅ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ、２００２年  第９４巻（付録４）：１２９３〜７頁、Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．、Ｙ．Ｊ．ＪｕｎｇおよびＹ．Ｍ．Ｋｉｍ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｅｘｔｒａｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ、２００１年  第２７巻（１号）：９７〜１０１頁］。使用されるデキストランは、大きさが変わり得、９〜８２ｋＤａの範囲のデキストランが使用されている［開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．、Ｙ．Ｊ．ＪｕｎｇおよびＹ．Ｍ．Ｋｉｍ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｅｘｔｒａｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ、２００１年  第２７巻（１号）：９７〜１０１頁、Ｂｅｈｅ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，  ｂｌｏｏｄ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ，  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ−ｄｅｘｔｒａｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．  Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ、２００１年  第１８巻（１号）：５９〜６４頁］。
【０１２６】
薬物の半減期を改善することに加えて、デキストランコンジュゲーションはまた、免疫原性も低減し得る［開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｌ．ら、Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ｄｅｘｔｒａｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１９９９年  第５７巻（８号）：９２７〜３４頁］。
【０１２７】
したがって、本発明の第１の態様の一実施形態では、本発明のポリペプチドは、「融合」ポリペプチドである、またはそれを含む。
【０１２８】
薬物動態特性を改善するためにある部分に融合されていることに加えて、本発明のポリペプチドはまた、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはプロテインＡのようなポリペプチドに、前記ポリペプチドの精製を容易にするために融合されるということが認められよう。このような融合の例は、当業者には周知である。同様に、前記ポリペプチドは、Ｈｉｓ６のようなオリゴ−ヒスチジンタグに、または周知のＭｙｃタグエピトープのような抗体によって認識されるエピトープに融合される。前記ポリペプチドの任意の変異体または誘導体との融合もまた、本発明の範囲内に含まれる。ＩＬ−１Ｒ結合特性またはｉｎ  ｖｉｖｏ半減期のような望ましい特性を保持または改善する融合物（または変異体、誘導体またはその融合物）が好ましいということは認められよう。
【０１２９】
したがって、融合物は、上記に詳述されるアミノ酸配列を、本発明の前記ポリペプチドに望ましい特徴を付与するさらなる部分と一緒に含み得る；例えば、部分は、ポリペプチドの検出もしくは単離、またはポリペプチドの細胞性取り込みの促進において有用であり得る。部分は、当業者に周知のように、例えば、ビオチン部分、放射活性部分、蛍光部分、例えば、小さいフルオロフォアまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）フルオロフォアであり得る。部分は、当業者に公知のように、免疫原性タグ、例えば、Ｍｙｃタグであり得るか、または当業者に公知のように、親油性分子もしくはポリペプチドの細胞性取り込みを促進することができるポリペプチドドメインであり得る。
【０１３０】
本発明の抗体ポリペプチドは、修飾または誘導体化されている１個またはそれ以上のアミノ酸を含み得る、またはからなり得るということは当業者には認められよう。
【０１３１】
１個またはそれ以上のアミノ酸の化学誘導体は、官能的側基との反応によって達成することができる。このような誘導体化された分子として、例えば、遊離アミノ基が、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するよう誘導体化されている分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、塩、メチルおよびエチルエステルまたはその他の種類のエステルおよびヒドラジドを形成するよう誘導体化することができる。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成するよう誘導体化することができる。また、化学誘導体として、２０種の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドが含まれる。例えば：４−ヒドロキシプロリンは、プロリンと置換され；５−ヒドロキシリシンは、リシンと置換され；３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンと置換され；ホモセリンは、セリンと置換され、オルニチンは、リシンと置換される。誘導体はまた、必要な活性が維持される限り、１つまたはそれ以上の付加または欠失を含有するペプチドを含む。その他の含まれる修飾として、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンを用いる）および同様の末端修飾がある。
【０１３２】
当業者には、ペプチド模倣化合物もまた有用であり得るということはさらに認められよう。用語「ペプチド模倣」とは、治療薬として特定のペプチドのコンホメーションおよび望ましい特徴を模倣する化合物を指す。
【０１３３】
例えば、前記ポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）連結によって接続されている分子だけでなく、ペプチド結合が反転している分子も含む。このようなレトロ−インベルソペプチド模倣物は、例えば、参照によって本明細書に組み入れるＭｅｚｉｅｒｅら（１９９７年）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５９巻、３２３０〜３２３７頁に記載されるもののような当技術分野で公知の方法を使用して作製できる。このアプローチは、側鎖の配向ではなく主鎖が絡む変更を含有する偽ペプチドを作製することを含む。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ−インベルソペプチドは、タンパク質分解に対してかなりより耐性である。あるいは、前記ポリペプチドは、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が、従来のアミド結合の代わりに−ｙ（ＣＨ２ＮＨ）−結合によって連結しているペプチド模倣化合物であり得る。
【０１３４】
さらなる代替法では、ペプチド結合は、アミノ酸残基の炭素原子間の間隔を保持する適当なリンカー部分が使用される限り、全体に分配され；リンカー部分にとって、ペプチド結合と実質的に同一の電荷分布および実質的に同一の平面性を有することが有利であり得る。
【０１３５】
前記ポリペプチドは、エキソタンパク質分解性消化に対する感受性を低減するのに役立つよう、そのＮ−またはＣ−末端で遮断されることが好都合であり得るということも認められよう。
【０１３６】
Ｄ−アミノ酸およびＮ−メチルアミノ酸のような種々の非コードまたは修飾アミノ酸も、哺乳動物ペプチドを修飾するために使用されてきた。さらに、環化のような従来の修飾によって、またはラクタムもしくはその他の種類の架橋を組み込むことによって、推測される生理活性コンホメーションを安定化することができる。例えば、参照によって本明細書に組み入れる、Ｖｅｂｅｒら、１９７８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第７５巻：２６３６頁およびＴｈｕｒｓｅｌｌら、１９８３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．第１１１巻：１６６頁を参照のこと。
【０１３７】
本発明の抗体ポリペプチドは、例えば、診断（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング）薬または治療薬としてのその意図される使用を容易にするよう、機能的部分を用いて増強することができる。したがって、一実施形態では、抗体ポリペプチドは、治療部分と直接的または間接的に連結される。
【０１３８】
一実施形態では、前述の特許請求の範囲のいずれか１つに従う抗体またはその抗原結合断片は、治療（例えば、細胞傷害性）部分をさらに含む。
【０１３９】
任意の適した治療部分を使用することができる。適した治療部分として、成長を低減もしくは阻害することができる、または、特に、癌細胞（または関連する幹細胞または前駆体細胞）を死滅させることができるものがある。例えば、治療薬は、細胞傷害性部分であり得る。細胞傷害性部分は、１種またはそれ以上の放射性同位元素を含み得る、またはからなり得る。例えば、１種またはそれ以上の放射性同位元素は、各々独立に、β放射体、オージェ放射体、変換電子放射体、α放射体および低光子エネルギー放射体からなる群から選択される。１種またはそれ以上の放射性同位元素が、各々独立に薬剤の近くに高吸収線量を生じる局所吸収されるエネルギーの放射パターンを有することが望まれる場合がある。例示的放射性同位元素として、９０Ｙ、３２Ｐ、１８６Ｒｅ／１８８Ｒｅ；１６６Ｈｏ、７６Ａｓ／７７Ａｓ、８９Ｓｒ、１５３Ｓｍのようなロングレンジβ放射体；１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、１６１Ｔｂ、１０５Ｒｈのようなミドルレンジβ放射体；４５Ｃａまたは３５Ｓのような低エネルギーβ放射体；５１Ｃｒ、６７Ｇａ、９９Ｔｃｍ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、２０１Ｔｌのような変換またはオージェ放射体；ならびに２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ａｃ、２２５Ａｃ、２１２Ｐｂ、２５５Ｆｍ、２２３Ｒａ、１４９Ｔｂおよび２２１Ａｔのようなα放射体を挙げることができる。その他の放射性核種が利用可能であり、療法のために使用することが可能であろう。
【０１４０】
１つの好ましい実施形態では、抗体ポリペプチドは、放射性同位元素１７７Ｌｕに連結される（またはそうでなければ、それで標識される）。
【０１４１】
あるいは、治療用成分は、１種またはそれ以上の治療用（細胞傷害性のような）薬物、例えば、細胞分裂停止薬物；抗アンドロゲン薬物；コルチゾンおよびその誘導体；ホスホネート；テストステロン−５−α−レダクターゼ阻害薬；ホウ素付加物；サイトカイン；タプシガーギンおよびその代謝産物；毒素（サポリンまたはカリケアマイシンのような）；化学療法薬（代謝拮抗物質のような）；または癌の治療において有用な任意のその他の治療用もしくは細胞傷害性薬物を含み得る、またはからなり得る。
【０１４２】
例示的治療用／細胞傷害性薬物として、例えば、以下が挙げられる：
・細胞分裂停止薬、特に、それだけには限らないが、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｐｈａｎｅ）、ロムスチン、タキサン、エストラムスチンホスフェートおよびその他のナイトロジェンマスタード、抗生物質（ドキソルビシン、カリケアミシンおよびエスペラミシンを含む）、ビンカアルカロイド、アザリジン、白金含有化合物、エンドスタチン、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、酵素、置換尿素、メチル−ヒドラジン誘導体、ダウノルビシン、両親媒性アミンを含めた用量制限副作用を有するもの、
・フルタミドおよびビカルタミドおよびその代謝産物のような抗アンドロゲン；
・コルチゾンおよびその誘導体；
・ジホスホネートおよびブホスホネート（ｂｕｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）のようなホスホネート；
・テストステロン−５−α−レダクターゼ阻害剤；
・ホウ素付加物；
・サイトカイン；
・タプシガーギンおよびその代謝産物。
【０１４３】
あるいは、細胞傷害性部分は、光量子放射化療法、中性子放射化療法、中性子誘導性オージェ電子療法、シンクロトロン照射療法または低エネルギーＸ線光量子放射化療法のような放射化療法における使用に適した１種またはそれ以上の部分を含み得る、またはからなり得る。
【０１４４】
例えば、本発明の抗体ポリペプチドを用いた場合、外部Ｘ線照射からの局所エネルギー付与が、予め投与された高Ｚ腫瘍標的化薬剤との相互作用によって癌組織において増強される、いわゆる、光活性化放射線療法（ＰＡＴ）に主に焦点を合わせる、放射線療法の前進のために、シンクロトロン照射（または低エネルギーＸ線）を使用するという可能性がある。
【０１４５】
ＰＡＴ治療様式は、グレノーブルの欧州シンクロトロン放射光施設（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（ＥＳＲＦ）でＩＤ１７生物医学ビームラインによって提供されるもの、新スウェーデンシンクロトロン施設、Ｍａｘ−ＩＶのようなその他の施設で将来利用可能であると予測されるもののような、シンクロトロン供給源からの単色Ｘ線を利用する。
【０１４６】
ルンドの有望な欧州核破砕中性子源（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｐａｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）（ＥＳＳ）で実施される予定の「誘導されるオージェ電子腫瘍療法」に関する研究は、さらなる可能性ある治療様式を提供する。反応器によって生じた熱および半熱中性子は、前臨床実験のため、ならびに誘導されたα粒子および高度に局所的に吸収されるエネルギーを生じる反跳核（７Ｌ）を用いる脳腫瘍の治療の両方ための、ホウ素中性子捕捉療法（Ｂｏｒｏｎ−Ｎｅｕｔｒｏｎ−Ｃａｐｔｕｒｅ−Ｔｈｅｒａｐｙ）、ＢＮＣＴのために長く使用されてきた。同様のアプローチとして、中性子および中性子の高断面を有する安定な核を用いて標識された適した腫瘍標的化分子を使用することがある。抗体またはペプチドを、例えば、安定なガドリニウム（１５７Ｇｄ）を用いて標識することができ、これらは、Ｇｄ−核、いわゆる、ガドリニウム中性子捕捉療法（Ｇａｏｌｉｎｉｕｍ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）（ＧｄＮＣＴ）によって捕捉される中性子の標的分子として作用する。モンテカルロ技術によって、腫瘍および周囲組織における線量分布が、ガドリニウムまたはその他の可能性ある元素からのγ−光量子、中性子、核反跳ならびに特徴的なＸ線、内部変換およびオージェ電子に起因するので算出される。
【０１４７】
場合により、本発明の抗体ポリペプチドは、検出可能な部分をさらに含み得る。例えば、検出可能な部分は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ，８９Ｚｒ、１２３Ｉおよび２０１Ｔｌからなる群から選択される放射性同位元素のような放射性同位元素を含み得る、またはからなり得る。場合により、薬剤は、８６Ｙ／９０Ｙまたは１２４Ｉ／２１１Ａｔのような、検出可能な放射性核種および細胞傷害性放射性核種の対を含み得る。あるいは、抗体ポリペプチドは、検出可能な部分としても、また細胞傷害性部分としても集学的に同時に作用することができ、いわゆる「集学的セラグノスティックス（Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｔｈｅｒａｇｎｏｓｔｉｃｓ）」を提供する放射性同位元素を含み得る。したがって、結合部分は、放射性核種または化学療法薬のような細胞傷害性薬物を使用する治療能力と一緒に、マルチイメージング（例えば、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学的または超音波）の能力を有するナノ粒子にカップリングされる。
【０１４８】
あるいは、検出可能な部分は、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅからなる群から選択される常磁性同位元素のような常磁性同位元素を含み得る、またはからなり得る。
【０１４９】
抗体ポリペプチドが、検出可能な部分を含む場合には、検出可能な部分は、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学的または超音波イメージングのようなイメージング技術によって検出可能であり得る。
【０１５０】
治療用部分および／または検出可能な部分（放射性同位元素、細胞傷害性部分などのような）は、抗体またはその断片に直接的にまたは間接的に連結することができる。適したリンカーは、当技術分野で公知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ−スクシミジル−ベンゾエート；ドデカボレートの誘導体）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体および１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、３，６，９，１５−テトラアザビシクロ［９．３．１］−ペンタデカ−１（１５），１１，１３−トリエン−４−（Ｓ）−（４−イソチオシアナト−ベンジル）−３，６，９−三酢酸（ＰＣＴＡ）の誘導体、５−Ｓ−（４−アミノベンジル）−１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−４，７，１０−トリス（酢酸）（ＤＯ３Ａ）の誘導体およびその他のキレート化部分のような大環状および非環状キレーター両方のキレート化部分が挙げられる。
【０１５１】
１つの好ましいリンカーとして、例えば、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−［本発明の抗体ポリペプチド］において使用されるＤＴＰＡがある。さらに好ましいリンカーとして、例えば、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−［本発明の抗体ポリペプチド］において使用されるデフェロキサミンＤＦＯがある。
【０１５２】
しかし、当業者には、本発明の抗体ポリペプチドのいくつかの医学的使用は、細胞傷害性または診断用部分の存在を必要としないということは認められよう。
【０１５３】
したがって、本発明の抗体の治療効果が、ＩＬ−１シグナル伝達（またはＩＬ−３３および／またはＩＬ−３６シグナル伝達）の阻害によって媒介される場合には、「裸の」抗体ポリペプチドが適していることがある。例えば、治療効果が、免疫細胞に対する、例えば、炎症を低減する本発明の抗体の直接効果によって媒介される場合には、抗体が任意の細胞傷害性活性を欠くことが有利であり得る。
【０１５４】
上記で論じられるように、本発明の抗体ポリペプチドの産生のための方法は、当技術分野で周知である。
【０１５５】
抗体ポリペプチドは、組換えポリペプチドである、またはそれを含むことが好都合である。このような組換えポリペプチドを産生するための適した方法は、原核生物または真核生物宿主細胞における発現のように当技術分野において周知である（例えば、関連開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【０１５６】
本発明の抗体ポリペプチドはまた、ウサギ網状赤血球ライセートまたはコムギ胚芽ライセート（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）のような市販のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用して産生することができる。翻訳系は、ウサギ網状赤血球ライセートであることが好ましい。翻訳系は、ＴＮＴ転写−翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）のような転写系にカップリングされることが好都合である。この系は、翻訳と同一反応においてコード化ＤＮＡポリヌクレオチドから適したｍＲＮＡ転写物を産生する利点を有する。
【０１５７】
当業者には、本発明の抗体ポリペプチドは、別の方法として人工的に、例えば、周知の液相または固相合成技術（ｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ固相ペプチド合成のような）を使用して合成できるということは認められよう。
【０１５８】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の抗体または抗原結合断片またはその成分ポリペプチド鎖をコードする単離された核酸分子を提供する。「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖であり得る、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたは相補ＤＮＡ）およびｍＲＮＡ分子を含む。「単離された」とは、本発明者らは、核酸分子が、細胞内に位置しないか、そうでなければ、提供されないことを意味する。
【０１５９】
一実施形態では、核酸分子は、ｃＤＮＡ分子である。
【０１６０】
核酸分子は、特定の宿主細胞における抗体ポリペプチドの発現のために、例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化することができるということは当業者には認められよう（例えば、開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ａｎｇｏｖ、２０１１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．第６巻（６号）：６５０〜６５９頁を参照のこと）。
【０１６１】
本発明の範囲内に以下も含まれる：
（ａ）本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に従う核酸分子を含むベクター（発現ベクターのような）を提供する；
（ｂ）本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様に従う核酸分子または本発明の第３の態様に従うベクターを含む宿主細胞（哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞、例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞のような）を提供する；
（ｃ）本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様に従う抗体ポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドが発現される条件下で本発明の第４の態様に従う宿主細胞の集団を培養する工程、およびそれからポリペプチドを単離する工程を含む方法を提供する。
【０１６２】
本発明の第６の態様は、薬学的に有効な量の本発明の第１の態様に従う抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される希釈剤、担体、アジュバントまたは賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【０１６３】
ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ＥＧＴＡまたはグルタチオンのようなキレート化剤を含むさらなる化合物も、医薬組成物中に含まれるということは当業者には認められよう。
【０１６４】
医薬組成物は、十分に貯蔵安定性であり、ヒトおよび動物への投与に適している当技術分野で公知の方法で調製できる。例えば、医薬組成物は、例えば、フリーズドライすること、噴霧乾燥すること、噴霧冷却することによって、または超臨界粒子形成からの粒子形成の使用によって凍結乾燥できる。
【０１６５】
「薬学的に許容される」は、本発明の抗体ポリペプチドのＩＬ１ＲＡＰ結合活性の有効性を低減しない非毒性材料を意味する。このような薬学的に許容されるバッファー、担体または賦形剤は、当技術分野で周知である（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０年）およびｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ａ．Ｋｉｂｂｅ編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）を参照のこと）。
【０１６６】
用語「バッファー」は、ｐＨを安定化する目的で酸−塩基混合物を含有する水溶液を意味するものとする。バッファーの例として、Ｔｒｉｚｍａ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯおよびＴＥＳがある。
【０１６７】
用語「希釈剤」は、医薬調製物中に抗体ポリペプチドを希釈する目的の水性または非水性溶液を意味するものとする。希釈剤は、１種またはそれ以上の生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールまたはオイル（ベニバナオイル、コーンオイル、ピーナッツオイル、綿実油またはゴマ油のような）であり得る。
【０１６８】
用語「アジュバント」は、本発明の抗体ポリペプチドの生物学的効果を増大するよう製剤に付加される任意の化合物を意味するものとする。アジュバントは、１種またはそれ以上の、種々の陰イオンを有する亜鉛、銅または銀塩、例えば、それだけには限らないが、種々のアシル組成物のフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩および酢酸塩であり得る。アジュバントはまた、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステルのようなカチオン性ポリマー、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー、ポリ（ビニルイミダゾール）のようなカチオン性合成ポリマーならびにポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニンおよびこれらのアミノ酸を含有するペプチドのようなカチオン性ポリペプチドであり得る。
【０１６９】
賦形剤は、１種またはそれ以上の、炭水化物、ポリマー、脂質およびミネラルであり得る。炭水化物の例として、例えば、凍結乾燥を容易にするために組成物に付加されるラクトース、グルコース、スクロース、マンニトールおよびシクロデキストリンが挙げられる。ポリマーの例として、例えば、粘度制御のために、生体接着を達成するために、または脂質を化学的およびタンパク質分解性分解から保護するために組成物に付加される、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギネート、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホネート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシド共重合体、種々の加水分解程度のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテートおよびポリビニルピロリドン、種々の分子量のすべてが挙げられる。脂質の例として、ポリマーのものと同様の理由で組成物に付加される、脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−およびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質および糖脂質、種々のアシル鎖の長さおよび飽和度のすべて、卵レシチン、大豆レシチン、水素添加卵および大豆レシチンがある。ミネラルの例として、脂質蓄積の低減または有利な色素特性のような利益を得るために組成物に付加される、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛および酸化チタンがある。
【０１７０】
本発明の抗体ポリペプチドは、その送達に適していると当技術分野で公知の任意の種類の医薬組成物に製剤化される。
【０１７１】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、リポソームの形態であり得、これでは、抗体ポリペプチドは、その他の薬学的に許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単層および結晶として凝集形態で存在する脂質のような両親媒性の薬剤と組み合わされる。リポソーム製剤に適した脂質として、制限するものではないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。適した脂質としてまた、血流循環時間を延長するために極性頭部においてポリ（エチレングリコール）によって上記のように修飾された脂質が挙げられる。このようなリポソーム製剤の調製は、例えば、開示内容を参照によって本明細書に組み入れるＵＳ４，２３５，８７１に見出すことができる。
【０１７２】
本発明の医薬組成物はまた、生分解性ミクロスフェアの形態であり得る。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡおよびＰＧＡの共重合体（ＰＬＧＡ）またはポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）およびポリ酸無水物のような脂肪族ポリエステルは、ミクロスフェアの製造において生分解性ポリマーとして広く使用されてきた。このようなミクロスフェアの調製は、開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、ＵＳ５，８５１，４５１に、およびＥＰ０２１３３０３に見出すことができる。
【０１７３】
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物は、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギネート、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホネート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレン酸化物共重合体、種々の加水分解程度のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテートおよびポリビニルピロリドンのようなポリマーが、薬剤を含有する溶液の増粘のために使用されるポリマーゲルの形態で提供される。ポリマーはまた、ゼラチンまたはコラーゲンを含み得る。
【０１７４】
あるいは、抗体ポリペプチドは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールまたはオイル（ベニバナオイル、コーンオイル、ピーナッツオイル、綿実油またはゴマ油のような）、トラガカントゴムおよび／または種々のバッファーに簡単に溶解される。
【０１７５】
本発明の医薬組成物は、活性抗体ポリペプチドの作用の増強のためのイオンおよび既定のｐＨを含み得るということは認められよう。さらに、組成物は、滅菌法のような従来の医薬操作に付され、および／または保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、バッファー、増量剤などのような従来のアジュバントを含有し得る。
【０１７６】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の任意の適した経路によって投与することができる。したがって、可能性ある投与経路として、非経口（静脈内、皮下および筋肉内）、局所、眼内、鼻腔、肺内、頬側、経口、非経口、膣および直腸が挙げられる。また、埋込錠からの投与もあり得る。
【０１７７】
１つの好ましい実施形態では、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内に、側脳室内に、関節内に、動脈内に、腹膜内に、くも膜下腔内に、脳室内に、胸骨内に、頭蓋内に、筋肉内に、もしくは皮下に投与されるか、またはそれらは注入技術によって投与される。それらは、その他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有し得る滅菌水溶液の形態で使用されることが好都合である。水溶液は、必要に応じて、適宜緩衝されなければならない（好ましくは、３〜９のｐＨに）。滅菌条件下での適した非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準医薬技術によって容易に達成される。
【０１７８】
非経口投与に適した製剤として、抗酸化剤、バッファー、静菌剤および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量または複数用量容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアル中で提示され、使用の直前に、滅菌液体担体、例えば、注射水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存される。即時注射溶液および懸濁液は、先に記載された種類の滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製される。
【０１７９】
したがって、本発明の医薬組成物は、非経口、例えば、静脈内投与に特に適している。
【０１８０】
あるいは、医薬組成物は、鼻腔内に、または吸入によって（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ３または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ３）のようなヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素またはその他の適したガスのような適した噴射剤を用いて、加圧された容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーからエアゾールスプレー形の形態で）投与される。加圧されたエアゾールの場合には、投与量単位は、計量された量を送達するバルブを提供することによって決定される。加圧された容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、さらに、滑沢剤、例えば、トリオレイン酸ソルビタンを含有し得る溶媒としてエタノールおよび噴射剤の混合物を使用する、活性ポリペプチドの溶液または懸濁液を含有し得る。吸入器または吹送器において使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチン製の）は、本発明の化合物およびラクトースまたはデンプンのような適した散剤基剤の散剤混合物を含有するよう製剤化される。
【０１８１】
エアゾールまたは乾燥粉末製剤は、各計量された用量または「パフ」が、患者へ送達するために少なくとも１ｍｇの本発明の化合物を含有するように準備されることが好ましい。エアゾールを用いる全体的な１日用量は、患者毎に変わり、単回用量で、より通常は、１日を通して分割用量で投与されるということは認められよう。
【０１８２】
あるいは、本発明の抗体ポリペプチドは、坐剤またはペッサリーの形態で投与され、またはそれらは、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形態で局所適用される。本発明の化合物はまた、例えば、皮膚パッチの使用によって経皮的に投与される。それらはまた、眼の経路によって投与される。
【０１８３】
眼部使用のために、本発明の抗体ポリペプチドは、場合により、塩化ベンジルアルコニウムのような防腐剤と組み合わせた、等張性の、ｐＨ調整された、滅菌生理食塩水中の微粒子化された懸濁液として、または好ましくは、等張性の、ｐＨ調整された、滅菌生理食塩水中の溶液として製剤化される。あるいは、それらは、ワセリンのような軟膏に製剤化される。
【０１８４】
皮膚への局所適用のために、本発明の抗体ポリペプチドを、例えば、以下：鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水のうちの１つまたはそれ以上のとの混合物に懸濁または溶解された活性化合物を含有する適した軟膏として製剤化することができる。あるいは、それらを、例えば、以下：鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水のうちの１つまたはそれ以上の混合物に懸濁または溶解された適したローションまたはクリームとして製剤化することができる。
【０１８５】
医薬組成物は、患者に薬学的に有効な用量で投与される。「治療有効量」または「有効量」または「治療上有効な」とは、本明細書において、所与の状態および投与計画のために治療効果を提供する量を指す。これは、必要な添加物および希釈剤、すなわち、担体または投与ビヒクルと関連して所望の治療効果をもたらすよう算出された活性材料の予め決定された量である。さらに、宿主の活性、機能および反応の臨床上有意な欠損を低減、最も好ましくは、防ぐのに十分な量を意味するよう意図される。あるいは、治療有効量は、宿主における臨床上有意な状態の改善を引き起こすのに十分である。当業者には認識されるように、化合物の量は、その特異的活性に応じて変わり得る。適した投与量は、必要な希釈剤と関連して所望の治療効果をもたらすよう算出された所定量の活性組成物を含有し得る。本発明の組成物の製造のための方法および使用では、活性成分の治療有効量が提供される。治療有効量は、当技術分野で周知のように、年齢、体重、性別、状態、合併症、その他の疾患などのような患者の特徴に基づいて当業の医療従事者または獣医学従事者によって決定することができる。薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位あるいはいくつかのより小さい用量単位の形態の単回投与によって、また特定の間隔での細分された用量の複数の投与の両方によって実施される。あるいは、用量は、長期にわたる連続注入として提供される。
【０１８６】
本発明の抗体ポリペプチドの診断的使用に関連して、「薬学的に有効な量」または「有効量」または「診断上有効な」とは、本明細書において、診断のために、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング目的で検出可能なシグナルを提供する量を指す。
【０１８７】
抗体ポリペプチドは、使用されているポリペプチドの有効性／毒性に応じて種々の濃度で製剤化される。例えば、製剤は、０．１μＭから１ｍＭの間、より好ましくは、１μＭから５００μＭの間、５００μＭから１ｍＭの間、３００μＭから７００μＭの間、１μＭから１００μＭの間、１００μＭから２００μＭの間、２００μＭから３００μＭの間、３００μＭから４００μＭの間、４００μＭから５００μＭの間、５００μＭから６００μＭの間、６００μＭから７００μＭの間、８００μＭから９００μＭの間または９００μＭから１ｍＭの間の濃度の活性な抗体ポリペプチドを含み得る。通常、製剤は、３００μＭから７００μＭの間の濃度の活性な抗体ポリペプチドを含む。
【０１８８】
通常、ヒト患者における抗体ポリペプチド（治療部分を伴う、または伴わない）の治療用量は、投与あたり１００μｇ〜１ｇの範囲となる（７０ｋｇの体重に基づいて、例えば、投与あたり３００μｇ〜７００ｍｇの間）。例えば、最大治療用量は、投与あたり０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば、０．１から５ｍｇ／ｋｇの間または１から５ｍｇ／ｋｇの間または０．１から２ｍｇ／ｋｇの間であり得る。このような用量は、腫瘍学者／医師によって決定される種々の間隔で投与される；例えば、用量は、毎日、週に２回、毎週、２週に１回または毎月投与されるということは認められよう。
【０１８９】
当業者には、本発明の医薬組成物は、単独でまたは代謝拮抗薬、アルキル化剤、アントラサイクリンおよびその他の細胞傷害性抗生物質、ビンカアルカロイド、エトポシド、白金化合物、タキサン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、抗増殖性の免疫抑制剤、副腎皮質ステロイド、性ホルモンおよびホルモンアンタゴニストおよびその他の治療用抗体（トラスツズマブのような）のような癌の治療において使用されるその他の治療薬と組み合わせて投与されるということは認められよう。
【０１９０】
当業者には、本発明のポリペプチドおよび医薬製剤が、医学および獣医学の分野の両方において有用性を有するということはさらに認められよう。したがって、本発明の方法は、ヒトおよび非ヒト動物（ウマ、イヌおよびネコのような）の両方の治療において使用される。しかし、患者はヒトであることが好ましい。
【０１９１】
獣医学的使用のために、本発明の化合物は、正常な獣医学的実行に従って適宜許容される製剤として投与され、獣医学的外科医は、特定の動物にとって最も適当となる投与計画および投与経路を決定する。
【０１９２】
本発明の第７の態様は、医薬における使用のための本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１９３】
一実施形態では、本発明の抗体ポリペプチドおよび製剤は、ＩＬ１ＲＡＰがバイオマーカーである疾患または適応症を患っている、またはそれを患うリスクがある患者または対象を治療するために使用される。
【０１９４】
したがって、本発明の関連する第８の態様は、対象における腫瘍性障害と関連する病理学的細胞またはその幹細胞もしくは前駆体細胞の細胞死の誘導ならびに／または成長および／もしくは増殖の阻害において使用するための、本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片であって、細胞がＩＬ１ＲＡＰを発現する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１９５】
本発明のさらなる関連する第９の態様は、対象における腫瘍性障害の治療および／または診断において使用するための、本発明の第１の態様に従う抗体または抗原結合断片であって、腫瘍性障害がＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する、抗体または抗原結合断片を提供する。
【０１９６】
「治療」は、患者の治療的処置および予防的処置の両方を含む。用語「予防的」は、患者または対象における腫瘍性障害の見込みまたは癌細胞の蔓延、散在もしくは転移を防ぐまたは低減する、本明細書に記載される薬剤またはその製剤の使用を包含するよう使用される。用語「予防的」はまた、腫瘍性障害について先に治療されていた患者において腫瘍性障害の再発を防ぐための、本明細書に記載される薬剤またはその製剤の使用を包含する。
【０１９７】
「診断」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（すなわち、患者の身体内）またはｅｘ  ｖｉｖｏ（すなわち、患者の身体から採取した組織または細胞サンプル内）のいずれかでの癌性細胞の検出を含む。
【０１９８】
「ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する腫瘍性障害」は、障害と直接的または間接的に関与している病理学的細胞が、細胞表面にＩＬ１ＲＡＰを発現するような障害を含む。ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞は、それ自体、癌細胞、例えば、腫瘍細胞であり得るということは認められよう。さらに、このような細胞は、病理学的幹細胞（すなわち、癌幹細胞またはＣＳＣ）および個体における腫瘍性障害の発達に直接的または間接的に関与している前駆体細胞を含む。ＣＳＣの例は、開示内容を参照によって本明細書に組み入れるＶｉｓｖａｄｅｒ  ＆  Ｌｉｎｄｅｍａｎ、２００８年、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅ  ｒ第８巻：７５５〜７６８頁に開示されている。
【０１９９】
あるいは、またはさらに、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞は、腫瘍性障害と間接的に関連している場合があり、例えば、それらは、腫瘍性細胞が生存するのに必要な細胞プロセスを媒介し得る。本発明の抗体剤は、この事象では、腫瘍の血液供給（血管新生）に必須の細胞または悪性細胞に対する有益な免疫応答を阻害する細胞（例えば、抑制性マクロファージまたはＴ細胞）を標的とし得る。
【０２００】
ＩＬ１ＲＡＰを発現する標的細胞を死滅させることが治療上望ましいか否かに応じて、ＡＤＣＣを誘導することができる、本発明の第１の態様に従う抗体または抗原結合断片が使用される。例えば、標的細胞ＩＬ１ＲＡＰが、癌細胞（ＣＭＬ、ＡＭＬ、ＡＬＬ、メラノーマ、肺癌細胞などのような）である場合には、抗体または抗原結合断片が、このような細胞を排除するためにＡＤＣＣを誘導することができることは有利であり得る。しかし、治療上の利益はまた、ＡＤＣＣ活性を欠く抗体または抗原結合断片を使用して、例えば、腫瘍の近くの血管新生の低減につながるＩＬ−１（またはＩＬ−３３またはＩＬ−３６）シグナル伝達の阻害によっても達成されるということは認められよう。
【０２０１】
一実施形態では、腫瘍性障害は、腫瘍性血液学的障害である。
【０２０２】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群から選択される腫瘍性障害の治療および／または診断において使用するためのものであり得る。
【０２０３】
さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、対象の体内での固形腫瘍の形成に関連する腫瘍性障害の治療および／または診断において使用するためのものである。
【０２０４】
したがって、抗体またはその抗原結合断片は、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳／ＣＮＳ癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭部／頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌および肉腫からなる群から選択される腫瘍性障害の治療において使用するためのものであり得る。
【０２０５】
本発明の治療的および予防的態様に関連して、当業者には、抗体ポリペプチドの腫瘍性障害と関連する細胞の表面に存在するＩＬ１ＲＡＰとの結合は、ＩＬ１ＲＡＰの生物活性の調節（すなわち、増大または低減）につながり得るということは認められよう。しかし、このような調節効果は、必須ではなく；例えば、本発明の抗体ポリペプチドは、簡単に、順に免疫系が細胞死を誘導することを引き起こし得る（例えば、ＡＤＣＣによって、および／または細胞傷害性／放射活性部分の薬剤内の存在によって）、固形腫瘍と関連する細胞の表面のＩＬ１ＲＡＰとの結合によって治療的および予防的効果を誘発し得る。
【０２０６】
「ＩＬ１ＲＡＰの生物活性」は、腫瘍性障害と関連する細胞上のＩＬ１ＲＡＰが絡む任意の相互作用またはシグナル伝達事象を含む。例えば、一実施形態では、抗体ポリペプチドは、１種またはそれ以上の共受容体のＩＬ１ＲＡＰ（ＩＬ１Ｒ１、ＳＴ２、Ｃ−ＫＩＴおよび／またはＩＬ１ＲＬ２のような）との結合を遮断することができる。
【０２０７】
本発明の抗体ポリペプチドによるＩＬ１ＲＡＰの生物活性のこのような阻害は、全部または一部であり得る。例えば、薬剤は、ＩＬ１ＲＡＰの生物活性を、抗体ポリペプチドに対して曝露されていない腫瘍性障害と関連する細胞におけるＩＬ１ＲＡＰの生物活性と比較して、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、最も好ましくは、１００％阻害し得る。好ましい実施形態では、抗体ポリペプチドは、抗体ポリペプチドに対して曝露されていない腫瘍性障害と関連する細胞におけるＩＬ１ＲＡＰの生物活性と比較して、ＩＬ１ＲＡＰの生物活性を５０％またはそれ以上阻害することができる。
【０２０８】
同様に、腫瘍性障害と関連する細胞の成長および／または増殖の阻害は、全部または一部であり得るということが認められよう。例えば、抗体ポリペプチドは、抗体ポリペプチドに曝露されていない腫瘍性障害と関連する細胞の成長および／または増殖と比較して、腫瘍性障害と関連する細胞の成長および／または増殖を少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、最も好ましくは、１００％阻害し得る。
【０２０９】
本発明の第１０の態様は、対象における腫瘍性障害の治療または診断のための医薬の調製における本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片の使用であって、腫瘍性障害がＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２１０】
一実施形態では、腫瘍性障害は、腫瘍性血液学的障害である。
【０２１１】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群から選択される腫瘍性障害の治療および／または診断において使用するためのものであり得る。
【０２１２】
さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、対象の身体内の固形腫瘍の形成と関連する腫瘍性障害の治療および／または診断において使用するためのものである。
【０２１３】
したがって、抗体またはその抗原結合断片は、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳／ＣＮＳ癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭部／頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌および肉腫からなる群から選択される腫瘍性障害の治療において使用するためのものであり得る。
【０２１４】
本発明の第１１の態様は、対象における腫瘍性障害の治療または診断の方法であって、対象に有効量の本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含み、腫瘍性障害がＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する、方法を提供する。
【０２１５】
一実施形態では、腫瘍性障害は、腫瘍性血液学的障害である。
【０２１６】
例えば、方法は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群から選択される腫瘍性障害の治療および／または診断において使用するためのものであり得る。
【０２１７】
さらなる実施形態では、方法は、対象の体内での固形腫瘍の形成に関連する腫瘍性障害の治療および／または診断において使用するためのものである。
【０２１８】
したがって、方法は、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳／ＣＮＳ癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭部／頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌および肉腫からなる群から選択される腫瘍性障害の治療において使用するためのものであり得る。
【０２１９】
さらなる実施形態では、本発明の抗体ポリペプチドおよび製剤は、ＩＬ−１（またはＩＬ−３３またはＩＬ−３６）シグナル伝達の阻害薬による治療に対して感受性である疾患または状態を患っている、または患うリスクがある患者または対象を治療するために使用することができる。
【０２２０】
したがって、本発明の第１２の態様は、ＩＬ−１シグナル伝達の阻害薬による治療に対して感受性である疾患または状態の治療において使用するための本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２２１】
このような状態または疾患状態は、当技術分野で周知であり（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏら、２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  第１１巻：６３３〜６５２頁およびＤｉｎａｒｅｌｌｏ、２０１４年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第２０巻（付録１）：Ｓ４３〜Ｓ５８頁）それだけには限らないが、以下が挙げられる：
【０２２２】
リウマチ関節炎、全身性発症若年性特発性関節炎（ＳＯＪＩＡ）を含めたすべての種類の若年性関節炎、変形性関節症、家族性感冒自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、マックル・ウェルズ疾患、新生児発症多系統炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・ざ瘡（ＰＡＰＡ）症候群、成人発症スチル疾患、高ＩｇＤ症候群、２型糖尿病、マクロファージ活性化症候群、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、ブラウ疾患、強直性脊椎炎、スウィート病、ループス関節炎、アルツハイマー病、乾癬、喘息、アテローム性動脈硬化症、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、Ｉ型糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ピロリ菌胃炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、Ｃ型肝炎、虚血・再灌流障害、多発性硬化症、ナイセリアまたは肺炎球菌髄膜炎、結核、ベーチェット症候群、敗血性ショック、移植片対宿主病、喘息、Ｉ型糖尿病、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満症および肥満症関連疾患（例えば、メタボリックシンドローム、心肥大、うっ血性心不全、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、脂肪肝疾患、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、慢性腎不全、卒中および高尿酸血症）、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー／アトピー性皮膚炎および痛風。
【０２２３】
ＩＬ−１シグナル伝達の遮断もまた、心筋梗塞の治療において有益であると考えられる。大規模な臨床治験が、心筋梗塞後のＩＬ１Ｂ抗体遮断（カナキヌマブを使用する）の有効性を現在確認しようとしている（ＣＡＮＴＯＳトレイル；開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｒｉｄｋｅｒら、２０１１年、Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  第１６２巻（４号）：５９７〜６０５頁を参照のこと）。
【０２２４】
このような適応症については、治療上の利益はまた、ＩＬ１ＲＡＰと結合し、それによって、免疫細胞と関連するＩＬ−１（またはＩＬ−３３またはＩＬ−３６）シグナル伝達を遮断する抗体または抗原結合断片を使用して達成することができるということが認められよう。このような抗体は、ＡＤＣＣ活性を欠くよう修飾することができる。
【０２２５】
本発明の第１３の態様は、ＩＬ−１（またはＩＬ＿３３またはＩＬ−３６）シグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性である疾患または状態の治療のための医薬の調製における、本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する
【０２２６】
本発明の第１４の態様は、対象におけるＩＬ−１（またはＩＬ＿３３またはＩＬ−３６）シグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性である疾患または状態の治療のための方法であって、対象に有効量の本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む方法を提供する。
【０２２７】
本発明の第１５の態様は、対象におけるＩＬ−１（またはＩＬ−３３またはＩＬ−３６）シグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性である疾患もしくは状態のＡＤＣＣ媒介性治療または増強のための方法であって、対象に有効量の、ＡＤＣＣを誘導することができる本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む方法を提供する。
【０２２８】
本発明の第１６の態様は、対象における癌細胞の検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）試験される対象に由来する細胞（例えば、白血幹／前駆体細胞または生検組織）のサンプルを用意する工程；
（ｂ）場合により、サンプル中に存在する細胞を抽出および／または精製する工程；
（ｃ）本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片を、サンプル中に存在する細胞と接触させる工程；および
（ｄ）抗体ポリペプチドが細胞と結合するか否かを決定する工程
を含み、
抗体ポリペプチドの細胞との結合は、対象の組織における癌細胞の存在を示す、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
【０２２９】
本発明の第１７の態様は、本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片による治療が有益であろう癌を有する患者を同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）試験される患者に由来する癌細胞のサンプル（例えば、白血幹／前駆体細胞または生検組織）を用意する工程；
（ｂ）場合により、サンプル中に存在する細胞を抽出および／または精製する工程；
（ｃ）本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片を、サンプル中に存在する細胞と接触させる工程；および
（ｄ）抗体ポリペプチドが細胞と結合するか否かを決定する工程
を含み、
抗体ポリペプチドの癌細胞との結合は、本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片による治療が有益であろう患者を示す、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
【０２３０】
当業者ならば、このようなアッセイを実施するための多数の方法があるということは認めるであろう。例えば、イムノアッセイは、均一、またはより好ましくは、不均一のいずれかであり得る。アッセイはまた、競合的、またはより好ましくは、非競合的形式のいずれかで実施することができる。
【０２３１】
一実施形態では、患者から得た血液サンプル（白血病）または生検（固形腫瘍）でのＩＬ１ＲＡＰ発現は、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学を使用して測定され、閾値を上回る発現は、本発明の第１の態様に従う抗体またはその抗原結合断片による治療が有益であろう患者を示す。
【０２３２】
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法の好ましい実施形態では、工程（ｄ）は、フローサイトメトリー、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡによって実施される。
【０２３３】
しかし、抗体−抗原相互作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出するのに適したその他のアッセイを使用することができる。
【０２３４】
本発明の第１８の態様は、癌を有する患者を治療するための方法であって、本発明の第１６または第１７の態様に従う方法を使用して癌を有すると同定された対象に、前記癌の治療に有効な治療薬を投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、例としての治療薬として、本発明の第１の態様に従う抗体ポリペプチドがある。
【０２３５】
一実施形態では、方法は、
（ａ）本発明の第１６または第１７の態様に従う方法を使用して、閾値基準を上回るＩＬ１ＲＡＰを発現する癌細胞の存在について試験される対象に由来する細胞のサンプル（例えば、白血幹／前駆体細胞または生検組織）を準備する工程；
（ｂ）工程（ａ）において試験されるその細胞のサンプルが、閾値基準を上回るＩＬ１ＲＡＰ発現を有する癌細胞を含有する治療対象を選択する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において選択された対象に、前記癌の治療において有効な治療薬、例えば、本発明の第１の態様に従う抗体ポリペプチドを投与する工程
を含む。
【０２３６】
関連実施形態では、方法は、
（ａ）対象から細胞のサンプル（例えば、白血幹／前駆体細胞または生検組織）を得る工程、
（ｂ）本発明の第１６または第１７の態様に従う方法を使用して、閾値基準を上回るＩＬ１ＲＡＰを発現する癌細胞の存在について前記細胞を試験する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において試験されるその細胞のサンプルが、閾値基準を上回るＩＬ１ＲＡＰ発現を有する癌細胞を含有する治療対象を選択する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）において選択された対象に、前記癌の治療において有効な治療薬、例えば、本発明の第１の態様に従う抗体ポリペプチドを投与する工程
を含む。
【０２３７】
本発明の所与の態様、特徴またはパラメータの優先および選択肢は、文脈が別に示さない限り、本発明のすべてのその他の態様、特徴およびパラメータのありとあらゆる優先および選択肢と組み合わせて開示されていると見なされなければならない。例えば、一実施形態では、本発明は、ＡＭＬの治療において使用するための、配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むインタクトなＩｇＧ１抗体を提供する。
【０２３８】
本明細書における一見したところ先に公開された文書の一覧または考察は、必ずしも、その文書が最先端の一部である、または普通の一般知識であるという承認ととられてはならない。
【０２３９】
単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、特許請求の範囲および／または本明細書において、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用される場合、「１つ」を意味し得るが、「１以上の」、「少なくとも１の」および「１または１以上の」の意味とも一致する。
【０２４０】
本発明のこれらのおよびその他の実施形態は、上記の説明および添付の図面とともに考慮される場合により良好に認めら、理解されるであろう。しかし、上記の説明は、本発明の種々の実施形態およびその多数の具体的な詳細を示すが、例示として与えられるのであって、制限ではないということは理解されなければならない。その趣旨から逸脱することなく本発明の範囲内で多数の置換、修飾、付加および／または再構成を行うことができ、本発明は、すべてのこのような置換、修飾、付加および／または再構成を含む。
【０２４１】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、１つまたはそれ以上のこれらの図面を参照することによってより良好に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】間接ＥＬＩＳＡにおける例示的抗体の、ヒトＩＬ−１ＲＡＰとの結合を示す図である。本発明の例示的抗体、ＣＡＮ０４は、ヒトＩＬ−１ＲＡＰに対して最高の親和性を有するとわかった。
【図２】本発明の例示的抗体（ＣＡＮ０４）の、ヒトＣＭＬおよびＡＭＬ細胞との結合を示す図である。（Ａ）グラフは、０．１μｇ／ｌｍＬの濃度の、ＩＬ１ＲＡＰを標的とするモノクローナル抗体を用いて染色したＫＵ８１２細胞のＭＦＩ値を示し、ＣＡＮ０４が比較された抗体のうち最高ＭＦＩを有することを示す。（Ｂ）ＣＡＮ０４は、５種の主なＡＭＬサンプルとの特異的結合を示す。（Ｃ）３種の主なＣＭＬサンプルでは、ＣＡＮ０４は、特異的結合を示す。
【図３】抗体ＣＡＮ０４の例示的ヒト化変異体はすべて、ＩＬ１ＲＡＰ発現性ＢＶ１７３細胞と結合し、変異体６は、最高の平均蛍光強度を示す。
【図４−１】例示的抗体ＣＡＮ０４の、（Ａ）ＩＬ−１β（Ｂ）ＩＬ−１αおよび（Ｃ）ＩＬ−３３シグナル伝達を遮断する能力を示す図である。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】対照および参照抗体の両方と比較して、例示的抗体ＣＡＮ０４を用いてＩＬ１ｂの存在下での主な原始的ＣＭＬ細胞の総細胞増殖は大幅に低減される。グラフは、抗体を伴わずに、またはアイソタイプ対照抗体とともに培養することからなる、対照に対して正規化された３種の個々の患者サンプルから得られた組み合わされた結果を示す。
【図６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイは、例示的抗体ＣＡＮ０４が、ＣＭＬ細胞の特異的細胞死滅を誘導することを示す。（Ａ）ＫＵ８１２、ＬＡＭＡ８４およびＢＶ１７３細胞は、０．１μｇ／ｍＬのＣＡＮ０４の添加によって特異的に死滅された。（Ｂ）例示的抗体ＣＡＮ０４によって媒介される細胞死滅は、ＢＶ１７３標的細胞で示されるように用量依存性である。（Ｃ）２人のＣＭＬ急性転化患者から得た一次細胞の細胞死滅が、１μｇ／ｍＬのＣＡＮ０４によって誘導された。（Ｄ）Ｔ３１５Ｉ突然変異を保持する３番目のＣＭＬ急性転化患者から得た細胞は、ＣＡＮ０４によって媒介されるＡＤＣＣ効果に対して感受性であった。各実験は、異なるドナーから得たＮＫ細胞を用いて少なくとも２回実施し、提示されたデータは、各々からの１つの代表的な実験を示す。
【図７】例示的ＣＡＮ０４抗体が、メラノーマ細胞（ＳＫＭＥＬ５細胞株）における特異的細胞死滅の誘導において効率的であることを示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを示す図である。０．１μｇ／ｍＬほどの低い試験したすべての濃度で、ＣＡＮ０４は、高い特異的死滅を示す。実験は、異なるドナーから得たＮＫ細胞を用いて少なくとも２回実施し、提示されたデータは、１つの代表的な実験を示す。
【図８】（Ａ）ＣＡＮ０４−ＡＦ４８８がコンジュゲートされた抗体（緑色）とともに氷上で２時間、もしくは３７℃で２時間インキュベートされた、またはＣＡＮ０４−ＡＦ４８８がコンジュゲートされた抗体（緑色）とともに３７℃で１６時間インキュベートされたＬＡＭＡ細胞を示す共焦点像（１光学断面、約０．９μｍ厚）を示す図である。氷上で２時間インキュベートした後に（「Ｉｃｅ  ２ｈ」）、細胞の大部分の細胞膜との明確に定義された抗体結合を観察することができる。３７℃でＣＡＮ０４−ＡＦ４８８がコンジュゲートされた抗体（緑色）とともに２時間インキュベートした後に、膜結合に加えて、抗体が細胞に入り始め（内部移行）、ここでサイトゾル中にも局在している。３７℃で１６時間インキュベートした後、細胞膜結合は依然として存在しており、抗体内部移行は、細胞の大部分におけるＣＡＮ０４−ＡＦ４８８抗体の蓄積をもたらした。スケールバー（右の像）は、すべての像において２０μｍを表す。（Ｂ）ＣＡＮ０４特異的結合および内部移行の対照：共焦点像（１光学断面、約０．９μｍ厚）は、ＡＦ４８８がコンジュゲートされたアイソタイプ対照抗体とともに氷上で、もしくは３７℃で２時間、または３７℃で１６時間インキュベートされたＬＡＭＡ細胞を示す。アイソタイプ対照抗体は、これらの条件のいずれでも特異的結合を示さなかった。細胞片および壊死細胞とのわずかな結合（弱い緑色）が示された。スケールバー（右の像）は、すべての像において２０μｍを表す。
【図９】ＣＡＮ０４による治療が、白血病負荷を大幅に低減することを示す図である。（Ａ）末梢血における白血病性細胞の頻度は、移植の３６日後にアイソタイプ対照と比較して、例示的抗体ＣＡＮ０４を用いて治療されたマウスにおいて低かった（１．２％対２２．７％、ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）血小板（ＰＬＴ）数は、ＣＡＮ０４を用いた場合、正常レベルのままであった（ｐ＝０．０００１）。（Ｃ）屠殺時に、骨髄における白血病性細胞の頻度は、ＣＡＮ０４を用いた場合低減した（３８．７％対９１．５％；ｐ＜０．０００１）。（Ｄ）脾臓における白血病性細胞の頻度は、アイソタイプ対照と比較してＣＡＮ０４を用いて治療されたマウスにおいて低かった（２７．６％対７０．４％；ｐ＝０．００６３）。
【図１０Ａ】ＳＫＭＥＬ５細胞を使用して決定されるような、ＡＤＣＣ活性に対する低フコースおよびＦｃ突然変異の効果を示す図である。（Ａ）ＣＡＮ０４（Ｆｃ−１）正常フコース、ＣＡＮ０４（Ｆｃ−１）低フコース、Ｆｃ−４およびＦｃ−７のＳＫＭＥＬ−５におけるＡＤＣＣ活性。
【図１０Ｂ】ＳＫＭＥＬ５細胞を使用して決定されるような、ＡＤＣＣ活性に対する低フコースおよびＦｃ突然変異の効果を示す図である。（Ｂ）ＣＡＮ０４（Ｆｃ−１）正常フコース、ＣＡＮ０４（Ｆｃ−１）低フコース、Ｆｃ−２およびＦｃ−３のＳＫＭＥＬ−５におけるＡＤＣＣ活性。
【図１０Ｃ】ＳＫＭＥＬ５細胞を使用して決定されるような、ＡＤＣＣ活性に対する低フコースおよびＦｃ突然変異の効果を示す図である。（Ｃ）ＣＡＮ０４（Ｆｃ−１）正常フコース、ＣＡＮ０４（Ｆｃ−１）低フコース、Ｆｃ−５、Ｆｃ−６およびＦｃ−８のＳＫＭＥＬ−５におけるＡＤＣＣ活性。
【発明を実施するための形態】
【０２４３】
〔実施例〕
Ａ．ＩＬ１−ＲＡＰタンパク質に対する本発明の例示的抗体の結合親和性
（ｉ）マウス起源のビアコア研究−抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体
材料＆方法
捕捉キットの技術マニュアルおよびビアコアＴ２００の標準操作原理（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に従って、ヤギ抗マウスＩｇＧを、ＣＭ５チップ上に固定化した。
【０２４４】
結合分析サイクルは、３つの工程：（ｉ）固定化された抗マウス抗体によるチップ表面でのリガンドの捕捉；（ｉｉ）分析物の捕捉されたリガンドとの結合；および（ｉｉｉ）結合している分析物の解離からなっていた。
【０２４５】
製造業者に推奨される条件を使用して、各結合サイクル後に捕捉分子表面を再生した。
【０２４６】
すべての結合サイクルは、２５℃で実施した。
【０２４７】
開始の５サイクルの後、サイクルの開始で、各抗体（１００ｎＭ）を３０μｌ／分の流速で１２０秒間注入し、次いで、分析物（１００ｎＭ）を３０μｌ／分の流速で１２０秒間注入し、続いて、解離相を３００秒間モニタリングした。
【０２４８】
本発明の１種の例示的抗体（ＣＡＮ０４）を、２種の比較物抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体（ＣＡＮ０１およびＣＡＮ０３）とともに試験した。
【０２４９】
結果＆結論
結果は、以下の表２に示されている：
【０２５０】
【表２】
0006396488.tif 000003
【０２５１】
本発明の例示的抗体、ＣＡＮ０４は、ヒトＩＬ１ＲＡＰに対して最高の親和性を示した。
【０２５２】
（ｉｉ）ＥＬＩＳＡ研究−マウス起源の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体
材料＆方法
間接ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。すべてのサンプルを二連で分析した。Ｎｕｎｃ−ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６  Ｍｉｃｒｏ  Ｗｅｌｌ（商標）プレートを、０．０１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４に希釈した１００ｎｇの組換えｈＩＬ１ＲＡＰ  ２１−３６７（１００μｌ／ウェル）を用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０１Ｍ  ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いて洗浄し、１５０μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を使用するブロッキング工程を続けた。撹拌しながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファーを使用してプレートを再度洗浄した。サンプルをＥＬＩＳＡブロッキング溶液で３倍段階希釈（１０００ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｎｇ／ｍｌの範囲）に希釈し、次いで、ＥＬＩＳＡプレートに移した、１００μｌ／ウェル。プレートを撹拌しながらＲＴで１時間インキュベートし、次いで、ＥＬＩＳＡ洗浄溶液を用いて洗浄した。１００μｌ／ウェルの、アルカリホスファターゼ（ＤＡＫＯ、１：１０００）にコンジュゲートされたウサギ抗マウスＩｇＧを添加し、撹拌しながらＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、続いて、基質（４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物、ＳＩＧＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ）、１００μｌ／ウェルを添加した。その後、プレートを撹拌しながらＲＴでインキュベートし、４０５ｎｍの吸光度を３０分間連続して測定した。０分での吸光度をバックグラウンドシグナルととった。
【０２５３】
結果＆結論
結果は、図１に示されている。
【０２５４】
本発明の例示的抗体、ＣＡＮ０４は、ヒトＩＬ１ＲＡＰに対して最高の結合シグナルを有するとわかった。
【０２５５】
（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡ研究−例示的「ＣＡＮ０４」抗体のヒト化型
材料＆方法
ＣＡＮ０４（ｈＣＡＮ０４）の１６種のヒト化変異体の重鎖および軽鎖可変ドメインを、ヒト定常ドメイン：
−  ＶＬドメインに対してκ定常ドメイン［配列番号１８］
−  ＶＨドメインに対してＩｇＧ１ｚａ重鎖定常［配列番号１９］
を含有するベクターにサブクローニングした。
【０２５６】
抗体を、２００ｍｌの容量（シェーカーフラスコ）でＣＨＯＫ１ＳＶ細胞において一時的に発現させた。
【０２５７】
抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。
【０２５８】
精製した抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０２５９】
間接ＥＬＩＳＡアッセイを、サンプルを、３．５ｎＭで出発する３倍段階希釈で希釈し、四連で実施したという変更を行い、上記のように実施した。
【０２６０】
結果＆結論
結果は、表３に示されている。
【０２６１】
【表３】
0006396488.tif 000004
【０２６２】
ＣＡＮ０４の１６種のヒト化型のうちの４種が、ＩＬ１ＲＡＰとの最小の結合を示すか、または結合を示さなかった（示されていないデータ）。
【０２６３】
Ｂ．本発明の例示的抗体のＩＬ１ＲＡＰ発現細胞との結合
（ｉ）フローサイトメトリー研究−マウス起源の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体
材料＆方法
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株ＫＵ８１２細胞を、ＩＬ１ＲＡＰに対して作製された抗体または関連アイソタイプ対照を用いて染色した。検出のために、二次抗ｍＩｇ−ＡＰＣを使用した。
【０２６４】
本発明の１つの例示的抗体（ＣＡＮ０４）を、７種の比較物抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体（ＣＡＮ０１、ＣＡＮ０２、ＣＡＮ０３、ＣＡＮ０５、ＣＡＮ０７、ＣＡＮ０８およびＣＡＮ０９）とともに試験した。アイソタイプ陰性対照抗体もまた含まれていた。
【０２６５】
一次白血病性細胞の分析のために、３種のＣＤ３４濃縮ＣＭＬ患者サンプルおよび単核細胞について濃縮された５種の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者サンプルを、それぞれ、１μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬの濃度のＣＡＮ０４−ＰＥを用いて、またはＰＥがコンジュゲートしているアイソタイプ対照を用いて染色した。細胞をＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して分析した。
【０２６６】
結果＆結論
ＩＬ１ＲＡＰ発現性ＫＵ８１２白血病細胞の染色は、アイソタイプ対照およびＩＬ１ＲＡＰを標的とするその他の比較物抗体と比較して、ＣＡＮ０４に対してより高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す（図２Ａ）。ＣＡＮ０４を使用する５種のＡＭＬおよび３種のＣＭＬ患者に由来する一次細胞の標識は、フローサイトメトリー分析においてアイソタイプ対照を上回る染色をもたらす（図２Ｂ〜Ｃ）。本研究は、ＣＡＮ０４がＩＬ１ＲＡＰと特異的に結合し、ＣＭＬ細胞株上のその他の試験されたモノクローナル抗体よりも高いＭＦＩを有することおよびＣＡＮ０４はまた、一次ＣＭＬおよびＡＭＬ細胞とも結合することを示す。
【０２６７】
（ｉｉ）フローサイトメトリー研究−「ＣＡＮ０４」抗体のヒト化型
材料＆方法
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株ＢＶ１７３細胞を、１μｇ／ｍＬの試験抗体または関連アイソタイプ対照を用いて染色した。検出のために、二次抗ｈＩｇＧ−ＰＥを使用した。細胞をＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して分析した。
【０２６８】
試験抗体は、１種のキメラ抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体（「キマリ（ｃｈｉｍａｒｙ）」）および本発明の例示的ＣＡＮ０４抗体の１２種の異なるヒト化型（「Ｖａｒ１」〜「Ｖａｒ１２」）を含んでいた。
【０２６９】
結果＆結論
ＩＬ１ＲＡＰ発現性ＢＶ１７３白血病細胞の染色は、種々の強度を有するヒト化ＣＡＮ０４変異体染色を示したが、すべてアイソタイプ対照を上回るレベルであった（図３を参照のこと。ＣＡＮ０４ヒト化変異体１、２、５、６、９および１０（表３を参照のこと）は、最強の標識を示す。
【０２７０】
Ｃ．本発明の例示的抗体のエピトープ／ドメインマッピング
材料＆方法
ＩＬ１ＲＡＰ上で異なる抗体クローンが結合する場合を理解するために、タンパク質の構造分析が実施され、受容体の細胞外部分が、本明細書において以下、ドメイン１、２および３（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）とも呼ばれる３つの別個のドメインに分割されることが示された（開示内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｗａｎｇら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１１巻：９０５〜９１２頁を参照のこと）。異なる抗体クローンのドメイン−結合パターンを調べるために、一連の受容体構築物を作製し、これらとの結合を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。
【０２７１】
間接ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。すべてのサンプルを二連で分析した。Ｎｕｎｃ−ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６  Ｍｉｃｒｏ  Ｗｅｌｌ（商標）プレートを、０．０１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４に希釈した、１００ｎｇの、Ｒｅｃ  ｈＩＬ１ＲＡＰ  ドメイン１２３（ａａ２１−３６７）（陽性対照）、Ｒｅｃ  ｈＩＬ１ＲＡＰ  ドメイン１２（ａａ２１−２３４）、ドメイン１（ａａ２１−１３４）またはＲｅｃ  ｈＩＬ１ＲＡＰドメイン３（ａａ２３５−３６７）（１００μｌ／ウェル）を用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０１Ｍ  ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いて洗浄し、１５０μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を使用するブロッキング工程を続けた。撹拌しながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファーを使用してプレートを再度洗浄した。ＣＡＮ０１、ＣＡＮ０３、ＣＡＮ０４、ＣＡＮ０５、ＣＡＮ０７、ＣＡＮ０８およびＫＭＴ−１（陽性対照）を、ＥＬＩＳＡブロッキング溶液で３倍段階希釈（１０００ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｎｇ／ｍｌの範囲）し、次いで、ＥＬＩＳＡプレートに移した、１００μｌ／ウェル。プレートを撹拌しながらＲＴで１時間インキュベートし、次いで、ＥＬＩＳＡ洗浄溶液を用いて洗浄した。１００μｌ／ウェルの、アルカリホスファターゼ（ＤＡＫＯ、１：１０００）にコンジュゲートされたウサギ抗マウスＩｇＧを添加し、撹拌しながらＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、続いて、基質（４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物、ＳＩＧＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ）、１００μｌ／ウェルを添加した。その後、プレートを撹拌しながらＲＴでインキュベートし、４０５ｎｍの吸光度を３０分間連続して測定した。０分での吸光度をバックグラウンドシグナルととった。
【０２７２】
本発明の１つの例示的抗体（ＣＡＮ０４）を、９種の比較物抗ＩＬ１ＲＡＰモノクローナル抗体（陽性対照としてのポリクローナル抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体（ＫＭＴ−１）と一緒に、ＣＡＮ０１、ＣＡＮ０２、ＣＡＮ０３、ＣＡＮ０５、ＣＡＮ０７、ＣＡＮ０８、ＣＡＮ１０およびＣＡＮ１１）とともに試験した。
【０２７３】
結果＆結論
標的検証のために試験された抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の大部分は、ドメイン３（Ｄ３）と結合する。しかし、本発明の例示的ＣＡＮ０４抗体は、ドメイン２（Ｄ２）と結合する点で別個である。全ドメインマッピングデータは、以下の表４に要約されてみることができる。
【０２７４】
【表４】
0006396488.tif 000005
【０２７５】
Ｄ．本発明の例示的抗体の特異性／交差反応性
材料＆方法
良好なリード候補抗体の重要な特徴は、関連毒性学種における相同タンパク質と同等またはほぼ同等の効力で交差反応するということである。一般的な規制ガイドラインにしたがって、１種のげっ歯類および１種の非げっ歯類との結合が、好ましいシナリオであろうが、抗体については、これは稀な例であり、代わりに、多数の研究室は、霊長類を除く任意の関連毒性学種を同定するよう取り組んでいる。
【０２７６】
本研究については、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（アカゲザル）またはカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）のような非ヒト霊長類に対する交差反応性が予測されたが、これはこれらの種におけるＩＬ１ＲＡＰタンパク質は、ヒトＩＬ１ＲＡＰタンパク質に対して９９％相同性を共有するからである。
【０２７７】
いくつかの可能性あるリード抗体を選択し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて組換えカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＩＬ１ＲＡＰ（ａａ２１−３６７）との結合について試験した。
【０２７８】
本発明の１種の例示的抗体（ＣＡＮ０４）を、８種の比較物抗ＩＬ１ＲＡＰモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ製のＣＡＮ０１、ＣＡＮ０２、ＣＡＮ０３、ＣＡＮ０７、ＣＡＮ０８、ＣＡＮ０９、Ｍａｂ６７６およびポリクローナル抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体（ＫＭＴ−１）とともに試験した。
【０２７９】
結果＆結論
驚くべきことに、試験された比較物抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のうちの一部、中でも、市販のＲ＆Ｄ製の参照抗体ｍＡｂ６７６は、カニクイザルＩＬ１ＲＡＰと交差反応しないとわかった、表５。
【０２８０】
【表５】
0006396488.tif 000006
【０２８１】
Ｅ．本発明の例示的抗体によるＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−３３シグナル伝達の阻害
（ｉ）ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞株におけるＩＬ−１シグナル伝達に対するＣＡＮ０４の効果
材料＆方法
ＩＬ１ＲＡＰは、ＩＬ−１受容体複合体の機能的部分であるので、ＩＬ１ＲＡＰとの抗体結合はまた、ＩＬ−１シグナル伝達を阻害し得る。いくつかの腫瘍細胞型は、増殖因子としてＩＬ−１を使用すると示されているので、これは、抗腫瘍効果を媒介するための重要なさらなる機序であり得る。
【０２８２】
ＩＬ−１シグナル伝達を遮断するための可能性あるリード候補抗体の能力を試験するために、ＩＬ−１依存性リポーター遺伝子アッセイを設定した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、ＩＬ−１シグナル伝達に対して、比色アッセイによって定量化できるアルカリホスファターゼの放出によって応答する。リード候補ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞の阻害能力を試験するために、細胞を５００００個細胞／ウェルでプレーティングし、試験抗体とともに４５分間インキュベートし、その後、各リガンドについて、０．３ｎｇ／ｍｌのアッセイにおける最終濃度のＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたはＩＬ−３３を用いて刺激した。抗体の最終アッセイ濃度は、１００ｎＭ〜０．０１ｎＭであった。対照ウェルでは、抗体をＰＢＳと置き換えた。細胞を３７ｏＣで一晩インキュベートし、その後、放出されたアルカリホスファターゼの量を測定した。抗体をまた、高濃度の抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）の存在下、さらなる刺激の非存在下でインキュベートすることによって可能性あるアゴニスト効果について試験した。このように、任意のＩＬ−１Ｒアゴニスト効果を、アルカリホスファターゼの放出として記録した。
【０２８３】
本発明の１種の例示的抗体（ＣＡＮ０４）を、２種の比較物抗ＩＬ１ＲＡＰモノクローナル抗体（ＣＡＮ０１およびＣＡＮ０３）およびアイソタイプ陰性対照抗体とともに試験した。
【０２８４】
結果＆結論
図４（Ａ）に表されるように、例示的抗体ＣＡＮ０４は、ＩＬ−１βシグナル伝達の明白な阻害を誘導した。比較物抗体ＣＡＮ０３はまた、検出可能な阻害をもたらしたが、ＣＡＮ０４よりも大幅に少なかった。比較物ＣＡＮ０１もアイソタイプ対照も、ＩＬ１シグナル伝達の測定可能な阻害を全くもたらさなかった。
【０２８５】
ＩＬ−１βを遮断することに加えて、ＣＡＮ０４はまた、ＩＬ−１αおよびＩＬ−３３シグナル伝達の強力な阻害剤でもある；それぞれ、図４（Ｂ）および（Ｃ）を参照のこと。
【０２８６】
試験した候補のうち、何らかのアゴニスト効果を示したものはなかった。
【０２８７】
（ｉｉ）一次ＣＭＬ細胞における効果
材料＆方法
慢性相の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の３人の患者から、骨髄吸引液または末梢血を採取した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ上での遠心分離によって単核細胞を単離し、抗ＣＤ３４抗体および磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃｈ．）を使用してＣＤ３４＋細胞についてサンプルを濃縮した。ＣＤ３４＋細胞を使用まで液体窒素中で維持し、それらを解凍した時点で、ＣＤ３４およびＣＤ３８に対する抗体を用いて染色した。ヨウ化プロピジウムを生存力マーカーとして使用した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａセルソーターを使用して、生存可能ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞を、ウェルあたり２５００個細胞の密度で、１００μｌの、栄養補助剤を含まない無血清Ｓｔｅｍｓｐａｎ培養培地を含有する９６ウェル組織培養処理プレート中に選別して入れた。選別した後、合計１００μｌのＳｔｅｍｓｐａｎのＩＬ１ｂおよび試験抗体をウェルに添加し、０〜０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ１ｂおよび０〜１０μｇ／ｍＬの抗体を有するウェルあたり２００μｌの最終容量を生成した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートし、その後、ＣｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔカウントビーズおよびＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏを使用して、生存（７ＡＡＤ−）細胞の数をカウントした。
【０２８８】
本発明の１種の例示的抗体（ＣＡＮ０４）を、１種の比較物抗ＩＬ１ＲＡＰモノクローナル抗体（ＣＡＮ０１）およびアイソタイプ陰性対照抗体とともに試験した。
【０２８９】
結果＆結論
図５に示されるように、ＩＬ１ｂの存在下でＣＤ３４＋ＣＤ３８−一次慢性相ＣＭＬ細胞を培養することは、細胞増殖の増大をもたらす。細胞増殖におけるＩＬ１誘導性増大は、培養物への例示的ＣＡＮ０４抗体の添加の際に有意に低減された（ｐ＜０．０００１）。また、別のＩＬ１ＲＡＰを標的とする抗体との比較では、ＣＡＮ０１、ＣＡＮ０４は、総細胞増殖の低減において有意より有効である（ｐ＝０．００２２）。本発明者らは、ＣＡＮ０４のＩＬ１ＲＡＰとの結合は、一次原始的ＣＭＬ細胞におけるＩＬ１によって誘導される細胞増殖における細胞刺激を干渉すると結論付けた。
【０２９０】
Ｆ．本発明の例示的抗体のＡＤＣＣ効果
（ｉ）慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株
材料＆方法
急性転化にあるＣＭＬの３人の患者に由来する慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株ＫＵ８１２、ＬＡＭＡ８４およびＢＶ１７３または一次細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて標的細胞として使用した。手短には、標的細胞を、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を製造業者の使用説明書に従って用いて標識し、ウェルあたり５，０００〜１０，０００個細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。続いて、ウェルに、本発明の例としての抗体、ＣＡＮ０４またはアイソタイプ対照抗体を種々の濃度で添加し、３０分間インキュベートし、その後、各ウェルに１００，０００個のＮＫエフェクター細胞を添加した。ＮＫ細胞陰性細胞単離キットを製造業者の使用説明書に従って使用することによって、インフォームドコンセント後に健常ボランティアからＮＫ細胞を抽出した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。非特異的ヒトＩｇＧ１抗体を、実験においてアイソタイプ陰性対照として使用した（Ｅｕｒｅｋａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）。細胞死の程度を、ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して７−ＡＡＤ陽性細胞の検出によって評価した。各実験は、異なるドナーから得たＮＫ細胞を用いて少なくとも２回実施した。
【０２９１】
結果＆結論
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイは、本発明の例示的抗体、ＣＡＮ０４が、ＮＫ細胞に、ＣＭＬ細胞株ＫＵ８１２、ＬＡＭＡ８４およびＢＶ１７３をアイソタイプ対照よりも高い程度に死滅させるようにすることを示す（図６Ａ）。ＢＶ１７３標的細胞を使用するＣＡＮ０４の用量滴定は、細胞死滅に対する効果が、用量依存性であり、ＣＡＮ０４濃度を増大するにつれ、より高い程度の細胞死滅を有することを示す（図６Ｂ）。急性転化に進行した慢性骨髄性白血病は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる治療に対して一過性の効果しか示さず、したがって、大きな治療問題を課す。２人の個別のＣＭＬ急性転化患者から得た一次細胞を用いるＡＤＣＣアッセイは、細胞が、ＣＡＮ０４およびＮＫ細胞によって誘導される細胞性細胞毒性に対して感受性であったことを示す（図６Ｃ）。さらに、いくつかのチロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を引き起こすＴ３１５Ｉ突然変異を有する第３のＣＭＬ急性転化患者から得た一次細胞は、同様の感受性を示す（図６Ｄ）。結局、実験は、ＣＡＮ０４が、ＮＫ細胞にＣＭＬ細胞株および一次急性転化ＣＭＬ細胞の特異的細胞死滅に向かわせる能力を有することならびにＣＡＮ０４によって誘導される細胞傷害性効果が用量依存性であることを示す。
【０２９２】
（ｉｉ）メラノーマ細胞株
材料＆方法
悪性メラノーマ細胞株ＳＫＭＥＬ−５を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイの標的として使用した。手短には、標的細胞をＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用い、製造業者の使用説明書に従って標識し、ウェルあたり５，０００〜１０，０００個細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。続いて、ウェルに、ＣＡＮ０４またはアイソタイプ対照抗体を種々の濃度で添加し、３０分間インキュベートし、その後、各ウェルに１００，０００個のＮＫエフェクター細胞を添加した。ＮＫ細胞陰性細胞単離キットを製造業者の使用説明書に従って使用することによって、インフォームドコンセント後に健常ボランティアからＮＫ細胞を抽出した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。非特異的ヒトＩｇＧ１抗体を、実験において対照として使用した（Ｅｕｒｅｋａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）。細胞死の程度を、ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して７−ＡＡＤ陽性細胞の検出によって評価した。各実験は、異なるドナーから得たＮＫ細胞を用いて少なくとも２回実施した。
【０２９３】
結果＆結論
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイは、ＣＡＮ０４が、ＮＫ細胞に、ＳＫＭＥＬ−５細胞株を対応するアイソタイプ対照よりもかなり高い程度に死滅させるようにすることを示す（図７）。ＣＡＮ０４の用量滴定は、ＣＡＮ０４が、ＡＤＣＣの誘導において低濃度で有効であることを示した（図７）。要約すると、これらのデータは、ＣＡＮ０４が、用量およびそのＣＡＮ０４依存的に、ＮＫ細胞にＳＫＭＥＬ−５の特異的細胞死滅に向かわせる能力を有することを実証する。
【０２９４】
Ｇ．本発明の例示的抗体のインターナリゼーション
材料＆方法
細胞および培養条件：ＬＡＭＡ−８４細胞、急性転化にある慢性骨髄性白血病の患者から確立された細胞株を、ＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得、供給業者の推奨に従って培養した。手短には、細胞を、１０％ＦＢＳ、１％グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ  １６４０中、５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。細胞培養物を、２〜３日毎に０．５×１０６個細胞／ｍｌの密度に分割した。細胞を、ＤＳＭＺから受け取った後、最大１２継代の間使用した。
【０２９５】
懸濁液細胞株ＬＡＭＡ−８４に由来する細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補給したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、Ｓｉｇｍａ製の５％ヒトＡＢ＋血清を補給したＰＢＳ−ＢＳＡに再懸濁し、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）標識したＩＬ−１ＲＡＰ選択的抗体ＣＡＮ０４またはアイソタイプ対応対照抗体を、１０μｇ／ｍｌの最終濃度に添加した。細胞を、氷上に、または３７℃で２または１６時間静置（インキュベート）した。
【０２９６】
共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ  Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡）を用いる画像解析のために、細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡで２回洗浄し、短時間遠心沈殿させ、続いて、３％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）固定に２０分間再懸濁した（４℃で）。次いで、細胞を遠心沈殿させ、０．００１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＴＸ）および核マーカー（ＤＡＰＩ）に再懸濁し、ＲＴで５分間インキュベートさせた。短時間遠心分離した後、細胞をＰＢＳ−ＴＸに再懸濁し、ガラス底顕微鏡ウェルに入れた。次いで、細胞を１時間接着させた。細胞の中心を通る薄い光学切片におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８蛍光の高解像度像を提供する（核マーカーによって表される）細胞の共焦点スキャニングによって画像データを集めた。細胞膜との抗体結合および／またはインターナライズされた抗体のさらなる分析を、ソフトウェア画像分析（Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎ２０１０）によって実施した。
【０２９７】
結果＆結論
細胞膜とのＣＡＮ０４結合およびその細胞に侵入（インターナライズ）する能力の構造的関係が、共焦点レーザースキャニング顕微鏡によって記録された高解像度イメージングデータを用いて、およびこのデータの画像分析によって実証された。
【０２９８】
画像データ表示が、図８に示されている。
【０２９９】
Ｈ．本発明の例示的抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの治療効力
材料＆方法
非条件づけＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ＭＬＬ／ＡＦ９融合物および活性化されたＮＲＡＳ遺伝子の発現を指示するｃＤＮＡのレトロウイルス組込みによるヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞の形質転換によって先に作製された致死量のＭＡ９Ｒａｓ細胞を移植した。白血病マウスを、ＩＬ１ＲＡＰを標的とする例示的ＣＡＮ０４抗体または対応するアイソタイプ対照抗体を用いて治療した。抗体を、実験を通じて週に２回の腹膜内注射によって投与し、最初の治療は、移植の３日後に施した。抗体の各用量は、１０００μｇのボーラスとして投与した第１を除いて５００μｇとした。せむし様の、乱雑な毛皮および固形腫瘍による移動性の低減によって判断されるような重症疾患の徴候の際にはマウスを屠殺した。
【０３００】
結果＆結論
免疫不全マウスにヒト白血病性細胞を移植し、ＣＡＮ０４、ＩＬ１ＲＡＰを標的とするモノクローナル抗体を用いて治療した。末梢血における白血病性細胞の頻度は、移植の３６日後に大幅に低減し、血小板数は、アイソタイプ対照抗体と比較してＣＡＮ０４を施されたマウスにおいて正常のままであり、これは、より機能的な造血を示す（図９Ａ〜Ｂ）。ＣＡＮ０４治療は、骨髄および脾臓において白血病性細胞の大幅な低減をもたらした（図９Ｃ〜Ｄ）。本発明者らは、抗ＩＬ１ＲＡＰ免疫療法は、ＭＡ９Ｒａｓ異種移植片モデルにおける末梢血、骨髄および脾臓においてヒト白血病を低減すると結論付けている。結果は、ＡＭＬの新規の有望な治療戦略として抗ＩＬ１ＲＡＰ免疫療法を支持する。
【０３０１】
Ｉ．ＡＤＣＣ活性に対する（ａ）低フコース抗体および（ｂ）Ｆｃ突然変異の効果
材料＆方法
ＣＡＮ０４のヒト化重鎖可変ドメイン変異体（配列番号９を含む）を、ヒト定常ドメイン（配列番号１９）を含有するベクターにサブクローニングした。
【０３０２】
ＣＡＮ０４のヒト化軽鎖可変ドメイン変異体（配列番号１６を含む）を、κヒト定常ドメイン（配列番号１８）を含有するベクターにサブクローニングした。
【０３０３】
低フコースの効果を調べるために、ｈＣＡＮ０４抗体「Ｆｃ−１」（以下を参照のこと）を、得られたベクターの、キフネンシンを含有する培地で培養されたＨＥＫ２９３細胞への同時トランスフェクションによって一過性に発現させた。キフネンシンの非存在下での発現によって産生された抗体Ｆｃ−１を、「正常フコース」対照として使用した。
【０３０４】
ｈＣＡＮ０４のどのようにさまざまにＦｃが遺伝子操作された突然変異体が、ＡＤＣＣ活性に影響を及ぼすかに取り組むために、遺伝子操作されたｈＣＡＮ０４変異体を以下の通りに作製した：
Ｆｃ−１＝（野生型Ｆｃを有するヒト化ＣＡＮ０４；すなわち、表３におけるｈＣＡＮ０４変異体６）
Ｆｃ−２＝（Ｆｃ−１として、突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅを有する）
Ｆｃ−３＝（Ｆｃ−１として、突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを有する）
Ｆｃ−４＝（Ｆｃ−１として、突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅを有する）
Ｆｃ−５＝（Ｆｃ−１として、突然変異Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａを有する）
Ｆｃ−６＝（Ｆｃ−１として、突然変異Ｎ２９７Ｑを有する）
Ｆｃ−７＝（Ｆｃ−１として、突然変異Ｎ２９７Ｓを有する）
Ｆｃ−８＝（Ｆｃ−１として、突然変異Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑを有する）
ここで、アミノ酸突然変異の位置は、上記の配列番号１８および１９における番号付けとは異なるＥｕ番号付けスキームを使用して定義される；Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第６３巻：７８〜８５を参照のこと）。
【０３０５】
抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。
【０３０６】
ＡＤＣＣアッセイは、ＳＫＭＥＬ５細胞株を使用して実施した。
【０３０７】
結果＆結論
キフネンシンの存在下で生成されたｈＣＡＮ０４の低フコース変異体は、正常フコースＣＡＮ０４−変異体よりも優れていた（図１０）。
【０３０８】
ＡＤＣＣ活性に対するＦｃ突然変異の効果は、作製された突然変異（単数および複数）に依存性であった。したがって：
（ａ）ヒト化ＣＡＮ０４のＦｃ−６およびＦｃ−７変異体のＡＤＣＣ−活性は、完全に抑制された；
（ｂ）ヒト化ＣＡＮ０４のＦｃ−３、Ｆｃ−４およびＦｃ−５変異体のＡＤＣＣ−活性は、ＣＡＮ０４の低フコース変異体に対してでさえ増強された；
（ｃ）ヒト化ＣＡＮ０４のＦｃ−８変異体のＡＤＣＣ−活性は、ＣＡＮ０４の低フコース形態のものと同様であった。
（ｄ）ヒト化ＣＡＮ０４のＦｃ−２変異体のＡＤＣＣ−活性は、ＣＡＮ０４の正常フコース形態のものと同様であった。
【０３０９】
〔実施例Ｊ〕
ＥＬＩＳＡによる競合的結合の分析
プロトコール
・すべてのサンプルは、二連で分析されなければならない。
・Ｎｕｎｃ−ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６  Ｍｉｃｒｏ  Ｗｅｌｌ（商標）プレートを、０．０１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４で希釈した１００μｌ／ウェルの組換えｈＩＬ１ＲＡＰ  ２１−３６７（１μｇ／ｍｌ）を用いてコーティングする。
・プレートを４℃で一晩インキュベートする。
・プレートをＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０１Ｍ  ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）を用いて洗浄する。
・１５０μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）を添加する。
・プレートを撹拌しながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベートする。
・プレートをＥＬＩＳＡ洗浄バッファーを用いて洗浄する。
・ウェルに試験項目のサンプル（例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２）を添加する（１００μｌ／ウェル、１０μｇ／ｍｌ）
・プレートをＲＴで１時間インキュベートする。
・プレートをＥＬＩＳＡ洗浄溶液を用いて洗浄する。
・すべてのウェルに参照抗体ＣＡＮ０４の溶液を添加する（１００μｌ／ウェル、１μｇ／ｍｌ）。
・プレートをＲＴで１時間インキュベートする。
・プレートをＥＬＩＳＡ洗浄バッファーを用いて洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの、アルカリにコンジュゲートされた適した二次抗体、アルカリホスファターゼにコンジュゲートされたウサギ抗マウスＩｇＧを添加する（試験項目がヒト抗体である場合には、適した二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−アルカリホスファターゼ抗体、ＳＩＧＭＡ、Ａ１４１８となる）。
・プレートを撹拌しながらＲＴで１時間インキュベートする。
・プレートを洗浄バッファーを用いて洗浄する。
・ウェルあたり１００μｌのｐＮＰＰ基質を添加する（４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物、ＳＩＧＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ）。
・プレートを撹拌しながらＲＴでインキュベートし、４０５ｎｍの吸光度を３０分間連続して測定する。０分での吸光度をバックグラウンドシグナルととらなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【配列表】
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