(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１グループＯから分離された逆転写酵素活性をもつ蛋白質をコードし、高温での安定性が高く、複写忠実度を維持しつつ７５℃を超える温度で親酵素より活性が高いポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、アミノ酸配列が、配列番号１の親配列において、
−  配列番号１の位置３５８で、オリジナルのアミノ酸リシン（Ｋ）がアミノ酸アルギニン（Ｒ）で置換（変異Ｋ３５８Ｒ）され、
−  配列番号１の位置３５９で、オリジナルのアミノ酸アラニン（Ａ）がアミノ酸グリシン（Ｇ）で置換（変異Ａ３５９Ｇ）され、
−  配列番号１の位置３６０で、オリジナルのアミノ酸セリン（Ｓ）がアミノ酸アラニン（Ａ）で置換（変異Ｋ３６０Ａ）されており、３箇所の前記変異のみを有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
その配列が、配列番号３に対応することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
さらに、Ｎ−末端にＭＮＳフランキング配列を、Ｃ−末端にヒスチジンテイルを有し、そのアミノ酸配列が配列番号１３に対応することを特徴とする請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
高温での安定性が高く、７５℃を超える温度で複写忠実度を維持しつつ親酵素より活性が高いＨＩＶ−１グループＯから分離された逆転写酵素活性をもつポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであって、請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を有していることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号４、配列番号１４に対応することを特徴とする請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項４又は５に記載のポリヌクレオチド又は請求項６に記載のベクターを含み、請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドを生成可能であることを特徴とするホスト細胞。
【請求項８】
細菌であることを特徴とする請求項７に記載のホスト細胞。
【請求項９】
前記細菌が、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項８に記載のホスト細胞。
【請求項１０】
ａ）請求項６のベクターを適切なホスト細胞に導入する、
ｂ）前記ホスト細胞を適切な培地中で培養する、
ｃ）逆転写酵素活性のあるポリペプチドを精製する、
のステップを含んでなることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドを得るための方法。
【請求項１１】
請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドを得るための、請求項４又は５に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１２】
請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドを得るための、請求項７乃至９のいずれかに記載のホスト細胞の使用。
【請求項１３】
テンプレート核酸を逆転写するための、請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項１４】
テンプレート核酸を増幅するための、請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項１５】
テンプレート核酸を配列決定するための、請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項１６】
前記テンプレート核酸がｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１３乃至１５のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項１７】
ａ）テンプレート核酸を請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドと混合する、
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を、テンプレート核酸に相補的なＤＮＡを合成できる条件で培養する、
を含んでなることを特徴とするテンプレート核酸の逆転写方法。
【請求項１８】
ａ）核酸を、請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドと少なくとも１つのＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと混合し、
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を、テンプレート核酸に相補的なＤＮＡの増幅を可能にする条件で培養する、
を含んでなることを特徴とするテンプレート核酸の増幅方法。
【請求項１９】
ａ）核酸を、請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドと接触させる、
ｂ）この混合物を、テンプレート核酸に相補的なＤＮＡの集合を合成できる条件で培養する、
ｃ）相補ＤＮＡの分子集合を分離し、ヌクレオチド配列を決定する、
を含んでなることを特徴とする核酸の配列決定方法。
【請求項２０】
前記テンプレート核酸が、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１７に記載のテンプレート核酸の逆転写方法。
【請求項２１】
前記テンプレート核酸が、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１８に記載のテンプレート核酸の増幅方法。
【請求項２２】
前記テンプレート核酸が、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１９に記載の核酸の配列決定方法。
【請求項２３】
ａ）請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチド、
ｂ）ｉ）バッファー、ｉｉ）プライマー、ｉｉｉ）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、及びｉｖ）ヌクレオチド、からの少なくとも１つの成分、
を含んでなることを特徴とする請求項１７に記載のテンプレート核酸の逆転写方法を実施するために必要な成分を含むキット。
【請求項２４】
ａ）請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチド、
ｂ）ｉ）バッファー、ｉｉ）プライマー、ｉｉｉ）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、及びｉｖ）ヌクレオチド、からの少なくとも１つの成分、
を含んでなることを特徴とする請求項１８に記載のテンプレート核酸の増幅方法を実施するために必要な成分を含むキット。
【請求項２５】
ａ）請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチド、
ｂ）ｉ）バッファー、ｉｉ）プライマー、ｉｉｉ）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、及びｉｖ）ヌクレオチド、からの少なくとも１つの成分、
を含んでなることを特徴とする請求項１９に記載の核酸の配列決定方法を実施するために必要な成分を含むキット。
【請求項２６】
請求項１７に記載のテンプレート核酸の逆転写方法を実施するための、請求項２３に記載のキットの使用。
【請求項２７】
請求項１８に記載のテンプレート核酸の増幅方法を実施するための、請求項２４に記載のキットの使用。
【請求項２８】
請求項１９に記載の核酸の配列決定方法を実施するための、請求項２５に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーの分野にある。特に、バクテリア中で発現、精製され、ヒト免疫不全ウィルスタイプ１グループＯ（ＨＩＶ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列の種々の位置で改変させた逆転写酵素に関するものである。これらのポリメラーゼは、高い温度（６０℃以上）で非変異酵素より高い活性を有している。さらに、７０℃以上の温度でＤＮＡ合成能力を保持している。これらの酵素の複写正確性は、非変異逆転写酵素と大きく異ならない。
【背景技術】
【０００２】
レトロウイルスにおけるレトロ転写酵素（ＲＴ）（又は逆転写酵素）は、ウイルスゲノムを複写する酵素である。ＲＴは、一本鎖ＲＮＡゲノムを、ホスト細胞のゲノムに一体化できる二本鎖ＤＮＡに変換する［ｒｅｖｉｓａｄｏ  ｐｏｒ  Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１２；２８７：４０８５０−４０８５７．］。これは、テンプレートとしてＲＮＡ或いはＤＮＡのいずれかを使用してＤＮＡを合成することができるポリメラーゼである。ＲＴは、さらにエンドヌクレアーゼ活性（リボヌクレアーゼＨ）であり、ＲＮＡ依存型ＤＮＡ合成プロセスでＲＮＡテンプレートを分解可能にしている。
【０００３】
レトロウイルスＲＴは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）或いはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得るに有用な酵素であり、従来技術（例えばＰＣＲ）によって増幅すると、有機体または組織での遺伝子表現を検知するに使用できる。ＲＴ効率は、多くのバイオテクノロジー分野での適用において重要である。例えば、ｍＲＮＡの検知、リアルタイムＰＣＲによる定量、“マイクロアレイ”を用いた遺伝子発現の解析、さらに大規模配列決定技術を用いたトランスクリプトーム研究に使用できる。しかしながら、ＲＮＡ中の２次構造の存在がこれら技術の有効性を下げている。ＲＴを高温度でＤＮＡ合成できるようにすることは、増幅プロセスでの効率を上げる上で有用であろう。
【０００４】
方法論的観点から、商業上増幅反応で最も使用されるＲＴは、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）［Ｃｏｔｅ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈ；Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２００８；１３４：１８６−２０２］、及びヒト免疫不全ウィルスタイプ１（ＨＩＶ−１）の変異体ＲＴ［ｒｅｖｉｓａｄｏ  ｅｎ  Ｈｉｚｉ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｃｈｈｏｒｎ；Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２００８；１３４：２０３−２２０］である。ＡＭＶとＭＬＶのＲＴは、ＲＴ−ＰＣＲ試験で最も一般的に使用され、ＡＭＶは、４２〜５２℃の温度範囲で熱安定性がより優れている［Ｇｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２；３０：３１１８−３１２９］。高い温度での酵素活性として市販されているアフィニティスクリプト（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｃｒｉｐｔ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）またはスーパースクリプトＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのＭＬＶ−ＲＴ変異体がある［Ａｒｅｚｉ  ａｎｄ  Ｈｏｇｒｅｆｅ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００９；３７：４７３−４８１］。
【０００５】
グループＭ（サブタイプＢ）に属すると分類されるＨＩＶ−１のＲＴで行われた研究では、これらの酵素が、系統学的に別個で、グループＯに属すると分類されるＨＩＶ−１からの“野生型”変異体ＲＴが優れていたが、ＭＬＶ  ＲＴより高い活性と熱安定性を持っていることを示した［Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００９；３９２：８７２−８８４；特許ＷＯ２０１０１３０８６４（Ａ１）］。  チューブリンメッセンジャーＲＮＡの発現に適用されるＲＴ−ＰＣＲ試験では、グループＯ或いはサブタイプＢの“野生型”ＲＴは、６６〜６８℃での増幅の最初のみではあるが６４℃以上で活性であったが、ＭＬＶ  ＲＴは、５２℃を超える温度で増幅しなかった［Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００９；３９２：８７２−８８４］。  ＨＩＶ−１のＲＴは、５６０のアミノ酸（ｐ６６として知られている）と４４０のアミノ酸（ｐ５１として知られている）の２つのサブユニットからなるヘテロダイマーである。ｐ５１の配列は、ｐ６６のアミノ酸１−４４０の配列と同じである。ＨＩＶ−１グループＯのＲＴは、サブタイプＢの“野生型”プロトタイプと比較して約２０％のアミノ酸配列の違いがある［Ｑｕｉｎｏｎｅｓ−Ｍａｔｅｕ  ｅｔ  ａｌ．；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７；２３６：３６４−３７３］。グループＯの様々なＲＴは、“例えば、変異Ｖ７５Ｉ、Ｋ６５ＲおよびＫ６５Ｒ／Ｖ７５Ｉのキャリアーのような“野生型”ＲＴより高い複写忠実度を持っているとされてきた。これらのＲＴは、“野生型”ＲＴで示されたものと同じ熱安定性および高温度での触媒効率を有している［Ｂａｒｒｉｏｌｕｅｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０１１；４３６：５９９−６０７；特許ＷＯ２０１２０８０５４１（Ａ１）］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１３０８６４号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０８０５４１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】レ  グライス（Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ．）によるレビュー；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１２年；２８７巻：ｐ．４０８５０−４０８５７．
【非特許文献２】コテ及びロス（Ｃｏｔｅ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈ）；Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２００８年；１３４巻：ｐ．１８６−２０２．
【非特許文献３】ヒジ及びハーシュホーン（Ｈｉｚｉ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｃｈｈｏｒｎ）によるレビュー；Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２００８；１３４：２０３−２２０．
【非特許文献４】ジェラード（Ｇｅｒａｒｄ）ら；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２年；３０巻：ｐ．３１１８−３１２９．
【非特許文献５】アレジ及びホグレフェ（Ａｒｅｚｉ  ａｎｄ  Ｈｏｇｒｅｆｅ）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００９年；３７巻：ｐ．４７３−４８１．
【非特許文献６】アルバレス（Ａｌｖａｒｅｚ）ら；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００９年；３９２巻：ｐ．８７２−８８４．
【非特許文献７】キノネス−マテウ（Ｑｕｉｎｏｎｅｓ−Ｍａｔｅｕ）ら；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７年；２３６巻：ｐ．３６４−３７３．
【非特許文献８】バリオルエンゴ（Ｂａｒｒｉｏｌｕｅｎｇｏ）ら；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０１１年；４３６巻：ｐ．５９９−６０７．
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ヒト免疫不全ウィルスタイプ１グループＯ（ＨＩＶ−１）から分離され、１つ以上の位置で改変されて、複写忠実度（ファイデリティ：ｆｉｄｅｌｉｄａｄ）を維持しつつもオリジナル酵素より高い耐熱性を有する逆転写酵素、及び逆転写を行うための使用、核酸テンプレートの増幅或いは配列決定に関するものである。
【０００９】
本発明の第１の対象は、ＨＩＶ−１グループＯから分離されたＲＴ活性をもつ蛋白質をコードし、高温での安定性が高く、複写忠実度を維持しつつ７５℃を超える温度で親酵素より活性が高いポリペプチドであって、そのポリペプチドは、アミノ酸配列が、配列番号１の親配列と少なくとも５０％が同じで、アミノ酸配列の変化（例えば、置換、削除及び／又は挿入）が、以下の位置である。
−この配列の位置３５８と相同の位置に、オリジナルのアミノ酸リシン（Ｋ）をアミノ酸アルギニン（Ｒ）で置換（変異Ｋ３５８Ｒ）
−この配列の位置３５９に、オリジナルのアミノ酸アラニン（Ａ）をアミノ酸グリシン（Ｇ）で置換（変異Ａ３５９Ｇ）
−この配列の位置３６０に、オリジナルのアミノ酸セリン（Ｓ）をアミノ酸アラニン（Ａ）で置換（変異Ｋ３６０Ａ）。
【００１０】
その他の逆転写酵素変異体は、組合せＫ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（全てに共通）に追加の変化をして、テンプレートとしてＲＮＡを使用して、高い温度でＤＮＡの合成能力があるＷＴ−ＲＴの耐熱性を改善するものである。これらのアミノ酸変化変更および挿入は、説明として、および本発明の範囲の制限することなしに、次のグループのものがある。
ａ）  配列番号１の位置６９と相同の位置に、アミノ酸トレオニン（Ｔ）を２つのアミノ酸セリンと１つのグリシン（ＳＳＧ）を挿入して置換（変異Ｔ６９ＳＳＧ）
ｂ）  配列番号１の位置３５５と相同の位置に、アミノ酸トレオニン（Ｔ）をアミノ酸アラニン（Ａ）で置換（変異Ｔ３５５Ａ）
ｃ）  配列番号１の位置３５７と相同の位置に、アミノ酸グルタミン（Ｑ）をアミノ酸メチオニン（Ｍ）で置換（変異Ｑ３５７Ｍ）
ｄ）  配列番号１の位置４７８と相同の位置に、オリジナルのアミノ酸グルタミン酸（Ｅ）をアミノ酸グルタミン（Ｑ）アルギニン（Ｒ）で置換（Ｅ４７８Ｑ）。
【００１１】
この発明は、発明の特別の対象として、出発点として使用され、既に記載した変異があるＨＩＶ−１のグループＯ逆転写酵素の種々の変異体を含んでいる。ここで、特別のポリペプチド配列は、配列番号３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９に対応するものであり、これらに対応するヌクレオチド配列（配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０）も同様である。
【００１２】
本発明の別の対象は、本発明の逆転写酵素をコードしているポリヌクレオチドを含んでなるベクターである。
【００１３】
本発明の別の対象は、本発明の逆転写酵素をコードしているポリヌクレオチドを含む細胞である。好ましくは、この細胞はバクテリアであり、より好ましくはエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００１４】
本発明の別の対象は、次のステップを含む本発明のポリペプチドを得る方法である。
１）本発明のベクターを適切なホスト細胞（本発明のホスト細胞）に導入する、
２）適切な媒体中で本発明のホスト細胞を培養する、
３）ＲＴ活性のある本発明のポリペプチドを精製する。
【００１５】
本発明の別の対象は、本発明のポリヌクレオチドを使用して逆転写酵素活性で本発明のポリペプチドを得るポリヌクレオチドの使用に関することである。
【００１６】
本発明の別の対象は、発明のホスト細胞を使用して本発明のポリペプチドを得るホスト細胞の使用に関することである。
【００１７】
本発明の別の対象は、核酸、むしろ好ましくはｍＲＮＡの逆転写、増幅及び配列決定の方法における本発明のポリペプチドの使用に関することである。
【００１８】
本発明の別の対象は、この記述において記載した方法の各々を実施するために必要なキットであって、好ましくは、
ａ）本発明のポリペプチド、
ｂ）ｉ）バッファー、ｉｉ）プライマー、ｉｉｉ）ＤＮＡ依存のＤＮＡポリメラーゼ、及びｉｖ）ヌクレオチドからの少なくとも１つの成分、を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】マウス肝臓の全ＲＮＡから、アクチンをコードしているＲＮＡフラグメント（およそ５００と９５０の塩基対）のＲＴ−ＰＣＲによる増幅である。増幅は、以下の酵素で行った。  （Ａ）ＨＩＶ−１グループＯ“野生型”のＲＴ（ＲＴＯ＿ＷＴ＊）（ウェル：７）、変異体Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（ＲＴＯ＿３Ｍ＊）（ウェル：１）、Ｔ３５５Ａ／Ｑ３５７Ｍ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（ＲＴＯ＿５Ｍ＊）（ウェル：２）、Ｋ６５Ｒ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（ウェル：３）、Ｋ６５Ｒ／Ｖ７５Ｉ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（ウェル：４）、Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ／Ｅ４７８Ｑ（ＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ＊）（ウェル：５）、及びＫ６５Ｒ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ／Ｅ４７８Ｑ（ウェル：６）。  示した温度は、ＤＮＡ複写合成反応のものである。ウェルｍとｃは、それぞれ低分子量マーカー（ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐｈｉ２９ファージのＤＮＡ）と、ネガティブコントロール（ｃＤＮＡなし）を示している。示した変異はすべて、ＲＴＯ＿ＷＴ配列に導入した。
【図１Ｂ】マウス肝臓の全ＲＮＡから、アクチンをコードしているＲＮＡフラグメント（およそ５００と９５０の塩基対）のＲＴ−ＰＣＲによる増幅である。増幅は、以下の酵素で行った。  （Ｂ）ＨＩＶ−１グループＯの変異体ＲＴ：Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（ＲＴＯ＿３Ｍ＊）（ウェル：１）、Ｔ６９ＳＳＧ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊）（ウェル：２）、Ｖ１４８Ｉ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（ウェル：３）、及びＦ６１Ａ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（ウェル：４）。  示した温度は、ＤＮＡ複写合成反応のものである。ウェルｍとｃは、それぞれ低分子量マーカー（ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐｈｉ２９ファージのＤＮＡ）と、ネガティブコントロール（ｃＤＮＡなし）を示している。示した変異はすべて、ＲＴＯ＿ＷＴ配列に導入した。
【図２】ＨＩＶ−１グループＭサブタイプＢ  ＢＨ１０（ＢＨ１０）及びグループＯから分離した野生型ＲＴ（ＲＴＯ＿ＷＴ＊；図ではＲＴＯと示している）について、本特許の対象である変異体、ＲＴＯ＿３Ｍ＊（３Ｍ）、ＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ＊（３Ｑ）、ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊（ＳＧ）、及び３Ｍ、Ｋ６５ＲとＶ７５Ｉの特徴的変化をもつ参照変異体（Ｋ６５Ｒ／Ｖ７５Ｉ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ、ＫＶ）と共に、リアルタイムＰＣＲによって推定した逆転写効率を示している。（ＡＣＴＢ）は、アクチンのメッセンジャーＲＮＡの増幅を、（ＧＡＰＤＨ）は、グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼのメッセンジャーＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡの増幅を表わしている。逆転写反応を行った温度は、それぞれのヒストグラムの右上に示している。
【図３】ＲＴ変異体のミスペアー末端（Ｇ：Ｔ、Ｇ：Ｇ及びＧ：Ａ）の拡張効率を示す。ＲＴＯ＿３Ｍ＊（３Ｍ）、ＲＴＯ＿５Ｍ＊（５Ｍ）、ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊（ＳＧ）、及びＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ＊（３Ｑ）を、ＲＴＯ＿ＷＴ＊（Ｏ＿ＷＴ）と比較している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
レトロウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）は、例えば、増幅するときベクター中でクローンできるメッセンジャーＲＮＡから相補的なＤＮＡを得るに有用な酵素である。この目的に使用されるＲＴは、ＲＮＡ中の２次構造レベルが小さくなり、増幅プロセスを改善するので、熱的に安定であることが望ましい。しかしながら、ＲＴは、プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を欠き、したがってエラー割合が比較的高い酵素であり、そこで、この目的に使用するには、複写忠実度を高めることが望ましい。
【００２１】
ＨＩＶ−１グループＭサブタイプＢ（例えば、ＢＨ１０或いはＨＸＢ２）のＲＴとグループＯのＲＴとの間に配列相同性が存ることからスタートして、発明者は、ファイル１ＲＴＤ（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）として蛋白質データバンクに登録された結晶学的構造に基づいて、テンプレート−プライマー複合体に結合した後者の分子モデルを構築した。この構造は、ただ一つ可能なもので、ＨＩＶ−１のＲＴ（ＨＸＢ２株の場合）が、二本鎖ＤＮＡ（テンプレート−プライマー）と入ってくるヌクレオチド（この場合、ｄＴＴＰ）の３元複合体を形成しているようにみえる。これはまた、完全な構造で、よい解決である。配列相同に基づいた分子模型からスタートして、キーとなる位置は、両酵素中でのテンプレート−プライマーとの相互作用で確認できた。この情報は、核酸に対して高い親和性をもつグループＯのＲＴ（ＲＴＯ）変異体の設計に使用された。  そこで、発明者は、特定部位変異誘発により、ＨＩＶ−１グループＯのＲＴの４つの新しい変異体を得た。これらは、変異Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ、Ｔ３５５Ａ／Ｑ３５７Ｍ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ、Ｔ６９ＳＳＧ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ及びＫ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ／Ｅ４７８Ｑであり、それぞれＲＴＯ＿３Ｍ、ＲＴＯ＿５Ｍ、ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ、ＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍと記す。
【００２２】
これらの酵素は、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で発現され、精製されて国際特許公開ＷＯ２０１０１３０８６４号に記載されたと同じ方法で同定された。グループＯの“野生型”ＲＴ（ＲＴＯ＿ＷＴ）との比較で、これら４つの酵素は、７５℃を超える温度でのＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ増幅反応で、定量試験（図１）と定性試験（図２）の両方でより高いＤＮＡポリメラーゼ活性を有していることを観察した。これらの酵素を用いた忠実度試験で、複写忠実度は、ＲＴＯ＿ＷＴの複写忠実度を維持していることを示した（表２及び３；図３）。
【００２３】
本発明は、タイプ１のヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）のグループＯから分離され、１つ以上の位置で改変されて複写忠実度を維持したままＷＴ酵素より高い耐熱性を持つＲＴ、及びテンプレート核酸の逆転写、増幅或いは配列決定を行うその使用に関するものである。
【００２４】
出発点は、抗レトロウィルス薬で治療されたことがなく、かつＨＩＶ−１グループＯ（ＥＳＰ４９株）によって感染した患者で同定されたＲＴであった［Ｑｕｉｎｏｎｅｓ−Ｍａｔｅｕ  ｅｔ  ａｌ．；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７；２３６：３６４−３７３；Ｍｅｎｅｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１；２７６：２７４７０−２７４７９］（配列番号１のポリペプチド配列を有するＲＴＯ＿ＷＴ）。このＲＴのｐ６６サブユニットのヌクレオチド配列は、適切な制限部位とＣ−末端でのヒスチジンテイルを有する発現ベクターにクローン化され、次いで、終了コドンで酵素を得て精製する［Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００９；３９２：８７２−８８４］（配列番号２のヌクレオチド配列を有する）。  この構築の使用と、特定部位変異誘発プロセスで、スタートに使用した酵素（ＲＴＯ＿ＷＴ）と比較して、耐熱性が高く、複写忠実度を維持した４つの変異体を得た。このＲＴの適応は、困難なＲＮＡの増幅、すなわち２次構造及び／又はＧ：Ｃ塩基対が多い配列のＲＮＡの増幅に潜在的に有用である。
【００２５】
本発明に記載したポリヌクレオチドとポリペプチド配列を、表１にまとめて示す。
【００２６】
【表１】
0006416885.tif 000002
【００２７】
そこで、本発明の第１の対象は、ＨＩＶ−１グループＯから分離されたＲＴ活性をもつ蛋白質をコードし、高温での安定性が高く、複写忠実度を維持しつつ７５℃を超える温度で親酵素より活性が高いポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、配列番号１の親配列と少なくとも５０％が同じで、次の位置にアミノ酸配列の変更（例えば、置換、削除及び／又は挿入のような）がある特徴がある。
−この配列の位置３５８と相同の位置に、オリジナルのアミノ酸リシン（Ｋ）をアミノ酸アルギニン（Ｒ）で置換（変異Ｋ３５８Ｒ）
−この配列の位置３５９と相同の位置に、オリジナルのアミノ酸アラニン（Ａ）をアミノ酸グリシン（Ｇ）で置換（変異Ａ３５９Ｇ）
−この配列の位置３６０と相同の位置に、オリジナルのアミノ酸セリン（Ｓ）をアミノ酸アラニン（Ａ）で置換（変異Ｋ３６０Ａ）。
【００２８】
本発明の好ましい対象では、本発明のポリペプチド中の置換は、Ｋ３５８Ｒ、Ａ３５９Ｇ及びＳ３６０Ａ（逆転写酵素ＲＴＯ＿３Ｍ）である。特に、本発明の特別の実施形態では、本発明のポリペプチドが、配列番号３に対応する。
【００２９】
ＲＴが最大ＤＮＡポリメラーゼ活性（ＲＮＡまたはＤＮＡに依存して）を持つ温度は、最適温度と呼ばれる。この温度以上では、部分的にはＲＴの熱変性により触媒活性が下がる。用語“耐熱性”は、高い温度、例えば少なくとも５０℃、好ましくは少なくとも６３℃、より好ましくは少なくとも６８℃、さらにより好ましくは少なくとも７５℃になったときに、ＲＴが示す安定性を意味している。
【００３０】
本発明のＲＴの耐熱性は、異なるタイプの試験で決定することができる。例えば、限定するものではないが、定性的であっても或いは定量的であってもよいが、ＲＴ−ＰＣＲ中のメッセンジャーＲＮＡテンプレートを用いるＤＮＡ合成で得られた生成物の量を分析することで評価することができる。このためには、逆転写酵素の最初の反応を高い温度で行う。次に、得られた相補ＤＮＡを、ＰＣＲで増幅する。これらの反応で得られた生成物量は、逆転写酵素反応が行なわれた温度でのＲＴの安定性の測定となる。アガロースゲル中の生成物を分析することで、反応効率の定性的評価が可能になる。  同様に、逆転写段階の生成量は、ΔＣｔ＝Ｃｔ−Ｃｔ（ｒｅｆ）としてΔＣｔの値を決定するリアルタイムＰＣＲで測定できる。ここで、Ｃｔは顕著な増幅が観察されるサイクルで、Ｃｔ（ｒｅｆ）は参照として使用されたＲＴで得られたＣｔ値の平均である。
【００３１】
本発明の記載に使用する“高温度での合成反応”は、少なくとも５０℃、好ましくは少なくとも６３℃、より好ましくは少なくとも６８℃、より好ましくは少なくとも７５℃、さらにより好ましくは少なくとも７８℃の温度で行われる反応、より好ましくは逆転写反応を意味している。
【００３２】
耐熱性が“増加した”或いは“高くなった”ＲＴは、（統計的な基準に合わせて）  耐熱性が、比較をしたＲＴの耐熱性の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、さらにより好ましくは少なくとも３倍、さらにより好ましくは少なくとも４倍に増加した或いは高くなったＲＴとして定義される。
【００３３】
用語“複写忠実度”は、ＲＴによる触媒作用で進行するＤＮＡ重合の忠実度を意味し、テンプレートとして機能する核酸と相補的なＤＮＡの合成の間に、ヌクレオチド或いはテンプレート−プライマー複合体のいずれかの正しい基材と正しくない基材を識別する能力に影響される。
【００３４】
本発明のＲＴの上記忠実度は、例えば、制限するものではないが、細胞培養中での忠実度試験（ファイデリティ  アッセイ：ｅｎｓａｙｏｓ  ｄｅ  ｆｉｄｅｌｉｄａｄ）、或いは“インビトロ”忠実度試験（遺伝子的或いは生化学的に）など種々のタイプの試験で分析される。
【００３５】
生化学的試験では、精製されたＲＴが、特定条件（ｐＨ、基材濃度など）でのＲＮＡまたはＤＮＡテンプレートの動力学定数を決定するに使用される。このようにして、ＲＴのＤＮＡ合成（ＲＮＡ−またはＤＮＡ−依存の）の忠実度の動力学パラメーターが、定常状態及び前定常状態の両方で得ることができる。定常状態での正しくない挿入の生化学的試験は、プライマーの３′末端でのヌクレオチド挿入の動力学定数（ｋｃａｔとｋｍ）の決定と、ヌクレオチドのＲＴ選択性の推定に基づいている。  動力学パラメーターの決定は、ＲＴ／テンプレート−プライマーの二元複合体を形成した後に、異なる濃度のｄＮＴＰの存在下、５′末端を予め［γ３２Ｐ］ＡＴＰでラベルしたプライマーの３′末端でのヌクレオチド挿入を測定することにより行われる。その結果の生成物は、ポリアクリルアミドゲル上電気泳動によって分析される。  ミカエリス‐メンテン式に適合して得られたデータと、パラメーターｋｃａｔ（挿入速度）及びｋｍミカエリス‐メンテン定数）から、正しい及び正しくないヌクレオチドを決定する。誤挿入率（ｆｉｎｃ）は、正しくないヌクレオチドで得られた触媒効率（ｋｃａｔ／ｋｍ）と、正確なヌクレオチドで得られた触媒効率の間の比率として定義される。したがって、ＲＴのより高い忠実度は、誤挿入の効率が低いことを意味している。
【００３６】
固定される生成したばかりのＤＮＡ中のエラーのために、正しくないヌクレオチドの挿入が十分でなく、ＲＴは、この誤った挿入の結果として生成するミスペアー末端を拡張することができなければならない。この忠実度測定は、ミスペアー拡張試験によって行われる。これらの試験では、２つのタイプ、すなわち正しいペアーの３′末端との複合物とミスペアーになった３′末端との複合物について、テンプレート−プライマー複合物上の正しいヌクレオチドの挿入のために定常状態での動力学定数が計算される。ミスペアーの拡張効率（ｆｅｘｔ）は、ミスペアー末端の拡張で得られたｋｃａｔ／ｋｍと、正しくペアーされた末端の拡張で得られたｋｃａｔ／ｋｍとの比率として定義される。
【００３７】
前定常状態での生化学的試験は、ＲＴが、短時間（例えば、ミリ秒のオーダーで）でｄＮＴＰと結合及び組込む能力を評価するものである。このようにして、ｄＮＴＰとＲＴ／テンプレート−プライマー二元複合物の間の相互作用の親和定数（Ｋｄ）、及びポリメリゼーション定数（ｋｐｏｌ）を計算することができる。  誤りの挿入とミスペアー末端の拡張効率は、正しいヌクレオチドと正しくないヌクレオチドの挿入で得られたｋｐｏｌ／Ｋｄの値、或いはペアーの或いはミスペアーの３′−ＯＨ末端をもつテンプレート−プライマー複合物への正しいヌクレオチドの挿入で得られたｋｐｏｌ／Ｋｄの値から決定される。
【００３８】
最も一般に使用される遺伝子試験、即ち“フォワード変異試験”は、しばしば、ＤＮＡ合成反応のテンプレート−プライマーとしてＭ１３ｍｐ２ファージの二本鎖ＤＮＡを用い、その鎖の１つからｌａｃＺ遺伝子に対応する配列を除いてから行われる。ＤＮＡ合成反応は、ＲＴと高濃度のｄＮＴＰｓの存在下で行われる。反応生成物でバクテリアの形質転換後、変異体を、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）及びＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を含む培養媒体中で青／白プラークで同定する。  このようにして、ＤＮＡ合成反応におけるエラーがなければ、その結果は暗青色プラークである。反対に、１つ以上のエラーがあると、部分的に或いは完全にアルファ相補性がなく、淡青色或いは白色のプラークになる。これらのプラークから回収されたＤＮＡは、配列決定されて、ＲＴで導入された変異のゲノム中での数、タイプ及び位置を正確に決定できる。
【００３９】
複写忠実度が“増した”或いは“増加した”ＲＴは、複写忠実度が、改変されていないＲＴと比較して典型的に少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、さらにより好ましくは少なくとも３倍、さらにより好ましくは少なくとも４倍に増した、或いは高くなったＲＴとして定義される。  例えば、ヌクレオチド挿入の生化学的試験では、改変ＲＴで得られた値が、非改変ＲＴの値より有意に増加した（統計基準を当てはめて）、典型的に少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、さらにより好ましくは少なくとも３倍、及びより好ましくは少なくとも４倍になったとき、忠実度が増したと考える。  例えば、遺伝子試験（“フォワード変異試験”）で、改変ＲＴで得られた変異の頻度が有意に増加した（統計基準を当てはめて）、典型的に少なくとも５０％（１．５倍）、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、及びより好ましくは少なくとも４倍になったとき、忠実度が増している。
【００４０】
Ｋ３５８Ｒ、Ａ３５９Ｇ及びＳ３６０Ａの変更を伴うＲＴに加えて、ＨＩＶ−１グループＯのＲＴの別な変異体であるＲＴＯ＿３Ｍは、Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ組合せ（すべてに共通）に追加の変更を含んでおり、ＷＴ−ＲＴ、すなわちテンプレートとしてＲＮＡを使用する高い温度でのＤＮＡ合成能力の耐熱性を改善する。これらのアミノ酸は、実例として及び本発明の技術範囲を制限することなく、次のグループで変更し、挿入される。
ａ）配列番号１の６９に相当する位置で、アミノ酸トレオニン（Ｔ）を２つのアミノ酸セリン及びグリシン（ＳＳＧ）を挿入して置き換える（変異Ｔ６９ＳＳＧ）。
ｂ）配列番号１の３５５に相当する位置で、アミノ酸トレオニン（Ｔ）をアミノ酸アラニン（Ａ）で置き換える（変異Ｔ３５５Ａ）。
ｃ）配列番号１の３５７に相当する位置で、アミノ酸グルタミン（Ｑ）をアミノ酸メチオニン（Ｍ）で置き換える（変異Ｑ３５７Ｍ）。
ｄ）配列番号１の４７８に相当する位置で、アミノ酸グルタミン酸（Ｅ）をアミノ酸グルタミン（Ｑ）で置き換える（Ｅ４７８Ｑ）。
【００４１】
本発明の別の好ましい対象は、本発明のポリペプチドが、アミノ酸Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａの変化と置換Ｔ３５５Ａ及びＱ３５７Ｍ（逆転写酵素ＲＴＯ＿５Ｍ）がある。特別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号５に対応する。
【００４２】
本発明の別の好ましい対象では、本発明のポリペプチドが、アミノ酸Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０ＡとさらにＴ６９ＳＳＧ（逆転写酵素ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ）で変化している。  特別の実施形態では、本発明のポリペプチドが配列番号７に対応する。
【００４３】
本発明の別の好ましい対象では、本発明のポリペプチドは、アミノ酸Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａの変化とさらに置換Ｅ４７８Ｑ（逆転写酵素ＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ）がある。  特別の実施形態では、発明のポリペプチドは、配列番号９に対応する。
【００４４】
さらに、本発明のポリペプチドは、小さなポリペプチドフラグメントによりフランクされ、その存在は、適切なベクター中でポリペプチドの発現に必要及び／或いは有益であり、現在技術で知られている。これらの中で、Ｎ−末端に３つのアミノ酸（ＭＮＳ、つまりメチオニン−アスパラギン−セリン）があり、この配列は、翻訳の開始を促進し、エンドヌクレアーゼ認識サイトの制限に対応して、逆転写酵素を含む表現ベクターの構築に有用である。  また、好ましくは少なくとも６つのヒスチジン残基からなるとき、Ｃ−末端に、ヒスチジン残基テイルのようなポリペプチドの精製を改善できる配列がある。本発明のポリペプチドのフランキング残基は、本発明のポリペプチドを含み、その逆転写酵素活性を維持する新しいポリペプチド配列を生じさせる。
【００４５】
そこで、本発明の別の好ましい対象では、この逆転写酵素ＲＴＯ＿３Ｍ、ＲＴＯ＿５Ｍ、ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ及びＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍは、Ｎ−末端にＭＮＳフランキング配列を、Ｃ−末端にヒスチジンテイルを有し、逆転写酵素活性をもつポリペプチドを生じさせる。ＲＴＯ＿３Ｍ＊、ＲＴＯ＿５Ｍ＊、ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊、及びＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ＊は、特別の対象で、それぞれポリペプチド配列配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１９に対応している。
【００４６】
ＨＩＶ−１グループＯをから分離されたＲＴの“野生型”ポリペプチド配列に導入された上記の変異は、例えば、特定部位変異で或いはランダムにＲＴをコードして配列を変異させるような遺伝子工学または組み換えＤＮＡの技術によって、或いは、変異のあるＲＴのｐ６６サブユニットをコードしているヌクレオチド配列の化学合成によって得ることができる。
【００４７】
この記載に使用する用語“変異”は、あるアミノ酸を互に異なるアミノ酸に置き換えることを意味している。配列中の個々のアミノ酸は、ＸＮと表記した。ここで、Ｘは配列中のアミノ酸（国際的に認められたアミノ酸命名法の文字コードで示す）、Ｎは配列中の位置である。アミノ酸配列中での変異の置換部分は、Ｘ１ＮＸ２と表記した。ここで、Ｘ１は非変異蛋白質配列中のアミノ酸、Ｘ２は変異蛋白質配列中の新しいアミノ酸、そしてＮはアミノ酸配列中の位置である。
【００４８】
さらに、ここの情報で、当分野の熟練者は、本発明に述べた変異を組み合わせて、高い温度で同様或いはさらに改善された活性のある新しいＲＴ変異体を生み出すことができるであろう。１つの可能性は、既に述べた位置にあるアミノ酸の僅かな置き換えである。例えば、この僅かな置き換えとして、置き換えられたアミノ酸の極性及び電荷特性を維持するものである。例えば、リシンとアルギニンは、側鎖が中性ｐＨで正に電荷したアミノ酸であり、そこでリシンをアルギニンに変える、或いはその逆に変えるのは僅かな置き換えである。  天然にある全ての蛋白質の塩基を構成する２０のアミノ酸は、性状で次のグループに分類される：（ｉ芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（ｉｉ）脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン）；（ｉｉｉ）塩基性イオン化アミノ酸（ヒスチジン、リシン、アルギニン）；（ｉｖ）酸性イオン化アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（ｖ）アミド性アミノ酸（アスパラギン、グルタミン）；（ｖｉ）水酸基アミノ酸（セリン、トレオニン）である。ある人は、システインをこの最後のグループに入れている。
【００４９】
本発明に記載した本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、ＨＩＶ−１グループＯ（配列番号２）株から分離したＲＴをコードする領域の特定部位変異によって得られた変異体である。これらのポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードしている配列でなるヌクレオチド配列であり、以降、本発明のポリヌクレオチドとする。
【００５０】
用語“ポリヌクレオチド”、“ヌクレオチド配列”、“ヌクレオチドの配列”、“核酸”、及び“オリゴヌクレオチド”は、ここでは相互に交換して使用され、生化学的に改変できる或いは改変できない長さのヌクレオチドの重合体を意味している。
【００５１】
そこで、本発明の第２の対象は、本発明のポリペプチドをコードし、オリジナル酵素の複写忠実度を維持しつつ６８℃を超える温度でＷＴ酵素より活性が高いポリヌクレオチド配列、以降本発明のポリヌクレオチドであり、その配列が配列番号２の親配列と少なくとも５０％同じで、ポリペプチドが上記したそのアミノ酸配列の変化をコードしていることに特徴がある。
【００５２】
本発明の好ましい対象は、アミノ酸Ｋ３５８Ｒ、Ａ３５９Ｇ及びＳ３６０Ａの変化がある本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである（逆転写酵素ＲＴＯ＿３Ｍ）。特に、本発明の特別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４に対応している。
【００５３】
本発明の別の好ましい対象は、アミノ酸Ｋ３５８Ｒ、Ａ３５９Ｇ及びＳ３６０の変化と、さらに置換Ｔ３５５ＡとＱ３５７Ｍがある本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである（逆転写酵素ＲＴＯ＿５Ｍ）。特別の実施形態で、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６に対応している。
【００５４】
そこで、本発明の別の好ましい対象は、アミノ酸Ｋ３５８Ｒ、Ａ３５９Ｇ及びＳ３６０Ａの変化と、さらにＴ６９ＳＳＧがある本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである（逆転写酵素ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ）。特別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号８に対応している。
【００５５】
本発明の別の好ましい対象は、アミノ酸Ｋ３５８Ｒ、Ａ３５９Ｇ及びＳ３６０Ａの変化と、さらに置換Ｅ４７８Ｑがある本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである（逆転写酵素ＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ）。特別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１０に対応している。
【００５６】
そこで、本発明の別の好ましい対象で、逆転写酵素ＲＴＯ＿３Ｍ、ＲＴＯ＿５Ｍ、ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ及びＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍは、Ｎ−末端にＭＮＳフランキングポリペプチド配列と、Ｃ−末端にヒスチジンテイルをコードしているヌクレオチド配列を有し、それぞれ、特別の対象であるヌクレオチド配列配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、及び配列番号２０に対応した逆転写酵素ＲＴＯ＿３Ｍ＊、ＲＴＯ＿５Ｍ＊、ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊、及びＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ＊をコードしているポリヌクレオチドを生じさせる。
【００５７】
ＲＴが、異なる繰り返しの変種で、ＨＩＶから分離されたものであり、発生的に類似していることを考えれば、コードしている遺伝子の５０％或いはそれ以上、より好ましくは配列番号２（ＲＴＯ＿ＷＴ）に対応するポリヌクレオチド配列レベルで６０％或いはそれ以上の全体的同一性があることが望まれる。さらに、本発明の対象であるＲＴのアミノ酸配列と他の同様のＲＴの配列の間の同一あるい相同の程度は、従来技術で公知の方法、例えば、推定ＲＴのアミノ酸配列とこの文書のＲＴＯ＿３Ｍに対応するアミノ酸配列の整列から決定できる。
【００５８】
この文書で使用する用語“相同（ｈｏｍｏｌｏｇｉａ）”は、共通の発生系統と、特に、２つ以上のポリヌクレオチドにおける等価な位置のヌクレオチド間が類似または同一であることによる２つの構造間の類似性を意味している。
【００５９】
この文書で使用する用語“同一性（ｉｄｅｎｔｉｄａｄ）”は、２つの比較されるポリヌクレオチド間の同一ヌクレオチドの割合を意味している。配列を比較する方法は、従来技術で知られており、制限するものではないが、ＢＬＡＳＴＰ或いはＢＬＡＳＴＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、及びＦＡＳＴＡプログラムがある。２つの蛋白質が、同じ発生源を持っている、或いは機能と構造で類似性があれば、相同と考えられるが、一般に類似性または同一性の値が３０％以上であるとき、相同構造とする。それ故、我々は、同一性パーセントが少なくとも８０％では、同じポリペプチド性状を持っていると考えることができる。
【００６０】
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）は、ヒトにおけるＡＩＤＳの病原体である。これらは、レトロビリデ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）科（レトロウイルス）のレンチウィルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）属に属し、その主要な特性のうちの１つが巨大な遺伝多様性である。ＨＩＶ−１は、Ｍ、Ｏ、Ｎ及びＰの４つのグループに分類されてきた。ＨＩＶ−１グループＯは、１９８７年に感染した患者から最初に分離して得られ、そのヌクレオチド配列は、３年後に公表された［Ｄｅ  Ｌｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９０；６４：１２０７−１２１６］。  現在では、ＨＩＶ−１グループＯの変異体（例えば、ＭＶＰ５１８０／９１株）は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ研究＆参照試薬プログラム（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｉｄｓｒｅａｇｅｎｔ．ｏｒｇ）（ジャーマンタウン、メリーランド州、アメリカ合衆国）から入手できる。本発明に含まれた情報により、この分野の熟練者が、異なる系統のＲＴ配列からスタートして、オリジナル酵素より高い耐熱性をもったＲＴの変異体を生成することができるであろう。
【００６１】
この文書で使用する用語“分離された”は、１）それらに通常伴う或いはそれらと天然に影響し合う成分が実質的にない、或いは２）天然界で見出されるならば、ヒトの介在によって合成的に（天然でなく）改変された、及び／又はそれらに通常含んでいない細胞に導入されたヌクレオチドまたはペプチドを意味している。  例えば、天然のポリヌクレオチドは、ヒトの介在（例えば、制限するものではないが、特定部位変異、挿入及び／又は削除を加えるといった手段で）によって改変されたならば、“分離”となる。同様に、天然のポリヌクレオチドは、天然でない手段でこのポリヌクレオチドにとって天然でない有機体が導入（移入）されれば、“分離”となる。それ故、後者の場合では、用語“分離”は、用語“異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏ）”と同じである。
【００６２】
本発明で提供した情報で、当分野の熟練者は、本発明のＲＴと同じ特徴を有するＲＴをコードしている本発明に記載したものと相同のヌクレオチド配列を識別することができるであろう。それ故、本発明のポリヌクレオチドは、記載されたＨＩＶ−１グループＯから分離され、活性が改善されたＲＴの変異体をコードしている配列でなっている。ここで、ヌクレオチド配列が次のものに対応している。
ａ）分離されたポリヌクレオチド配列、或いはその相補的鎖の核酸分子、
ｂ）相補的鎖がポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる核酸分子、或いは、
ｃ）遺伝コードの変質により、配列が（ａ）及び／又は（ｂ）と異なる配列である核酸分子。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチドは、そのまま、或いはポリヌクレオチドが適切なホスト細胞中に増殖できるベクター成分として分離される。それ故、別の対象で本発明は、上記したような本発明のポリヌクレオチドを含む本発明のベクター、以降、本発明のベクター、に関するものである。
【００６４】
このベクターは、例えば、クローニングベクター或いは発現ベクターであることができる。好ましくは、このベクターは、本発明のＲＴの発現及び精製に適したプラスミドである。
【００６５】
この記載で使用する用語“クローニングベクター”は、ＤＮＡの別のフラグメントが、自己複製能力を失うことなく一体化できるＤＮＡ分子を意味している。発現ベクターの例は、制限するものではないが、プラスミド、コスミド、ＤＮＡファージ、或いは人工イースト染色体がある。
【００６６】
この記載で使用する用語“発現ベクター”は、ホスト細胞と呼ばれる細胞に導入された後に、細胞中にクローン化された核酸を発現するために適したクローニングベクターを意味している。この核酸は、一般に、操作上コントロール配列に結合されている。
【００６７】
用語“発現”は、ポリヌクレオチドからスタートしてポリペプチドが合成されるプロセスを意味している。それは、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、及びｍＲＮＡの蛋白質或いはポリペプチドへの転写を含んでいる。
【００６８】
この記載で使用する用語“ホスティング細胞”或いは“ホスト細胞”は、発現又はクローニングベクターのレシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｅ）、或いは他のＤＮＡ分子のレシピエントである原核生物または真核生物を意味している。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチドの挿入に適したベクターは、以下に示すような原核生物の蛋白質発現に使用されるプラスミドである。実例として、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプト及びデリバティブ、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、Ｃｏ１Ｅ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージ及びｐＳＡ３とｐＡＴ２８のような“シャトル”；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２ミクロンプラスミドのようなイースト中の発現ベクター、一体化プラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミド、及び類似物；ｐＡＣのベクターのような昆虫細胞中の発現ベクター、ｐＶＬシリーズ発現ベクター；ｐｉＢｉ、ｐアーリィゲート（ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ）、ＰＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ＰＧＳＡ、ＰＧＷＢ、ＰＭＤＣ、ＰＭＹ、胞子及び類似物のような植物中の発現ベクター、従来技術で利用可能なシステムを使用して昆虫細胞の移入に適したバキュロウィルスを含めた真核生物細胞に使用される蛋白質の発現プラスミド、がある。
【００７０】
この文書で使用するように、用語“ホスト細胞”或いは“ホスティング細胞”は、細胞中に天然では含有しないＤＮＡの導入によって改変できる培養可能な細胞であり、以降、本発明のホスト細胞とする。
【００７１】
好ましくは、ホスト細胞は、本発明のポリヌクレオチドが発現することができ、ポスト−翻訳的に改変され、適切なサブ細胞室内にある安定なポリペプチドを生じさせるものである。適切なホスト細胞の選択は、検知シグナルの選択によって影響を受けることがある。例えば、レポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、チミジン・キナーゼ、或いは緑色蛍光蛋白質“ＧＦＰ”）を用いた構築を用いて、蛋白質規制転写に応答して対象遺伝子の転写を活性化或いは阻止することで選択可能なシグナルを出すことができる。最適の選択を行う、或いは“スクリーニング”するには、ホスト細胞の表現型を考慮すべきである。
【００７２】
本発明のホスト細胞は、原核生物細胞と真核生物細胞を含むものである。原核生物細胞は、グラム陽性（例えば、エシェリシア・コリ）又はグラム陰性（例えば、バチルス属細菌）生物体を含んでいる。原核生物細胞は、好ましくは本発明のポリヌクレオチドを含むベクターの転写コントロール配列の増殖に使用され、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターのコピー数を増やすことができる。  このベクターの形質転換に適した原核生物ホスト細胞は、例えば、制限するものではないが、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属等のその他の種が含まれる。  真核生物ホスト細胞は、イースト細胞、植物細胞、菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞及び寄生有機体（例えば、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ））の細胞がある。  この文書で使用されるように、用語イーストは、厳密な分類上の単細胞有機体だけでなくイーストに似た多細胞の菌類及び繊維状菌類も含んでいる。本発明のポリアミノ酸配列の生成に使用できるその他イーストは、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）及びハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）がある。  哺乳類ホスト細胞を用いての培養システムは、ＣＯＳ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、好ましい細胞としてのＢＫＨ、ＨｅＫ或いはヒーラ（ＨｅＬａ）の胚幹細胞など確立された株化細胞がある。
【００７３】
本発明の別の対象は、本発明のポリペプチドを得る次の方法であって、
１）本発明のベクターを適切なホスト細胞（本発明のホスト細胞）に導入する、
２）本発明のホスト細胞を適切な培地中で培養する、
３）ＲＴ活性のある本発明のポリペプチドを精製する、を含んでなる。
【００７４】
ホスト細胞の培養は、ホスト細胞を保持し成長させるプロセスを意味している。細胞培養は、生存と細胞分割を可能にするために、温度、ｐＨ、ガスパーセント（酸素と二酸化炭素）、そして適切な栄養の存在が必要である。細胞培養は、懸濁液中の多量の細胞を培養できる寒天のような固体培地或いは液体培地中で行うことができる。
【００７５】
この記載に使用する用語“精製する”は、本発明のポリペプチドの分離及び本発明のホスト細胞の培地中に存在する他のポリペプチドからの濃縮を意味している。
ＲＴの分離は、溶解性差異技術、クロマトグラフィー、電気泳動、或いは等電点分画法で行うことができる。クロマトグラフィーの技術は、分子量、イオン電荷（操作条件でのアミノ酸の電離状態に基づく）、クロマトグラフィーマトリックス或いはカラムに対する蛋白質の親和性、或いは精製タグに基いており、カラム、紙またはプレートで行うことができる。蛋白質の分離は、例えば、精製時間の顕著な短縮及び精製収率を高める自動システムを使用して、硫酸アンモニウムを用いる析出、高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、或いは高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で行うことができる。
【００７６】
この記載に使用する用語“精製タグ”或いは“親和性タグ”は、精製を容易にするために蛋白質に組込んだ（一般に遺伝子工学によって）ある種のアミノ酸配列を意味している。  タグは、別の蛋白質或いはアミノ酸の短い配列で、例えば親和性クロマトグラフィーによって、蛋白質の精製を可能にする。公知の精製タグは、例えば、制限するものではないが、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、酵素グルタチオンＳ−トランスファーゼ（ＧＳＴ）、或いはヒスチジン残基のテイルがある。
【００７７】
本発明の別の対象は、本発明のポリヌクレオチドを得る方法であり、以降本発明の方法とする。この方法は、例えば、制限するものではないが、非変異ポリヌクレオチドからスタートする特定部位或いはランダムの変異誘発、完全ポリヌクレオチドの化学合成、或いは得られる配列の異なる部位をコードしているＤＮＡフラグメントの組み立てによって行われる。
【００７８】
本発明の別の対象は、ＲＴ活性をもつ本発明のポリペプチドを得る本発明のポリヌクレオチドの使用である。
【００７９】
本発明の別の対象は、本発明のポリペプチドを得るための本発明のホスト細胞の使用である。好ましくは、本発明のホスト細胞は、細菌（ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、より好ましくはエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００８０】
本発明のポリペプチドのような高い温度で安定なＲＴは、２次構造を含む及び／又はＧ：Ｃ塩基対に富む配列の困難なＲＮＡの増幅などの適用に有用である。
【００８１】
そこで、本発明の別の対象は、現在技術で既に知られた適用或いは方法における本発明のポリペプチドの使用である。
【００８２】
本発明の特別の対象は、核酸テンプレート、好ましくはｍＲＮＡ或いはｍｉＲＮＡの逆転写方法であって、
ａ）テンプレート核酸を、本発明のＲＴと混合し、
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を、テンプレート核酸に相補的なＤＮＡの合成を可能にする条件で培養する、を含んでなる。
【００８３】
本発明の特別の対象は、核酸テンプレート、好ましくはｍＲＮＡ或いはｍｉＲＮＡの増幅方法であって、
ａ）核酸と本発明のＲＴ及びＤＮＡ−依存型ポリメラーゼを混合し、
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を、核酸テンプレートに相補的なＤＮＡの増幅を可能にする条件で培養する、を含んでなる。
【００８４】
本発明の特別の対象は、核酸、好ましくはｍＲＮＡ或いはｍｉＲＮＡの配列決定方法であり、次のステップを含んでなる。
ａ）核酸を、本発明のＲＴと接触させる、
ｂ）この混合物を、テンプレート核酸に相補ＤＮＡ分子集合の合成を可能にする条件で培養する、
ｃ）相補ＤＮＡ分子の集合を分離し、ヌクレオチド配列を決定する。
【００８５】
この記載に使用する用語“逆転写”或いは“レトロ転写”は、ＲＮＡに相補的なＤＮＡの合成を意味している。
【００８６】
この記載に使用する用語“増幅”は、テンプレート核酸のコピー数の増加を意味している。好ましい実施形態では、増幅は、ＰＣＲによって起きる。
【００８７】
この記載に使用する用語“配列決定”は、テンプレート核酸のヌクレオチドの順序決定を意味している。
【００８８】
この記載に使用する用語“テンプレート核酸”或いは“テンプレート”は、逆転写、転写或いは配列決定される１本鎖或いは２本鎖核酸分子を意味している。
【００８９】
表現“相補ＤＮＡの合成を可能にする条件”は、ヌクレオチドを、テンプレート核酸と相補的な塩基によって生成したＤＮＡに加える条件を意味している。
【００９０】
ＤＮＡ合成は、一般に次の条件で行われる。（ａ）テンプレート核酸を、プライマー、二価のカチオン例えばＭｇ２＋、及びヌクレオチドを含む混合物中で、本発明のＲＴと接触させ、（ｂ）この混合物を充分な温度にして、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば本発明のＲＴが、テンプレート核酸と相補的な塩基によって、ヌクレオチドのプライマーへの挿入を開始させ、異なる大きさの相補ＤＮＡ分子の集合を作る。  この相補ＤＮＡ分子の集合の分離により、テンプレート核酸のヌクレオチド配列を決定することが可能になる。
【００９１】
相補ＤＮＡの合成の際に、不良ペアーを作ったヌクレオチドの挿入は、１つ以上のミスマッチ塩基となる。従って、合成されたＤＮＡ鎖は、テンプレート核酸と正確に相補的でないことがある。
【００９２】
表現“テンプレート核酸と相補ＤＮＡの集合を合成可能にする条件”は、配列決定が行われる条件を意味し、一般に、（ａ）テンプレート核酸を、プライマー、二価のカチオン例えばＭｇ２＋、及びヌクレオチド一般にｄＮＴＰｓ、及び少なくとも１つのｄｄＮＴＰを含む混合物中で、本発明のＲＴと接触させ、（ｂ）この混合物を充分な温度にして、ＤＮＡポリメラーゼ例えば本発明のＲＴが、テンプレート核酸と相補的な塩基によってヌクレオチドのプライマーへの挿入を開始させ、異なる大きさの相補ＤＮＡ分子の集合を作ることを含んでいる。  相補ＤＮＡ分子集合の分離は、一般に電気泳動によって行われ、これによりテンプレート核酸のヌクレオチド配列を決定できる。
【００９３】
ここに使用される用語“プライマー”は、テンプレート核酸とハイブリダイズしてＤＮＡ合成の出発点として機能できるオリゴヌクレオチドを意味している。好ましくは、プライマーは、デオキシリボースのオリゴヌクレオチドである。
【００９４】
プライマーは、例えば、制限するものではないが、適切な配列のクローニングと規制、及び直接の化学合成など適切な方法で製造できる。プライマーは、テンプレート核酸中の特定核酸配列とハイブリダイズする（特定プライマー）、或いはランダムに合成できる（任意プライマー）ようにデザインされる。
【００９５】
この記載に使用する用語“特定プライマー”は、配列が、逆転写、増幅、或いは配列決定されるテンプレート核酸中の特定のヌクレオチド配列と相補的なプライマーを意味している。
【００９６】
用語“任意プライマー”は、配列がランダムに合成され、逆転写、増幅、或いは配列決定されるテンプレート核酸中のランダム位置でＤＮＡ合成を始めるに使用されるプライマーを意味している。異なる任意プライマーの集合は、しばしば使用される。この用語“任意プライマー”は、配列がランダムに合成され、逆転写、増幅、或いは配列決定されるテンプレート核酸のランダム位置でＤＮＡ合成を始めるに使用される１セットのプライマーを意味している。
【００９７】
この記載に使用する用語“ハイブリダイゼーション”は、相補的な一本鎖核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）の２分子がペアーになって二本鎖分子になることを意味している。好ましくは、相補性が１００％である。すなわち、相補性の領域では、２つの核酸分子のうちの１つのヌクレオチドそれぞれが、別の核酸分子中のヌクレオチドと水素結合を形成することができる。然しながら、通常の実経験では、相補性領域が１００％以下の核酸分子２つでもハイブリダイズすることができることを認識するであろう。
【００９８】
この記載に使用する用語“ヌクレオチド”は、ペントース、窒素塩基、及びリン酸基と共有結合を形成する有機分子を意味している。用語ヌクレオチドは、例えば、制限するものではないが、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、或いはそれらの誘導体などのデオキシリボヌクレオシドトリフォスフェート（ｄＮＴＰｓ）がある。用語ヌクレオチドは、さらに、例えばｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄｌＴＰ、ｄｄＴＴＰ、或いはそれらの誘導体などのジデオキシリボ核酸三燐酸塩（ｄｄＮＴＰｓ）がある。本発明に従えば、“ヌクレオチド”或いは“プライマー”は、従来技術でよく知られた技術で標識或いはラベルを付すことができる。検知できるラベルは、例えば、放射性同位体、蛍光性ラベル、化学発光ラベル、生物発光ラベル、或いは酵素的ラベルがある。
【００９９】
この記載に使用する用語“ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ”は、テンプレート核酸としてＤＮＡを使用するデオキシリボヌクレオチドの重合触媒となり得るＤＮＡポリメラーゼを意味している。  本発明の増幅方法で使用できるＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼの例は、制限するものではないが、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ））、サーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ））、サーモトガ・ネアポリターナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ））、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ））、サーモコッカス・リテラ／イス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａ／Ｉｓ（Ｔｌｉ  ｏ  ＶｅｎｔＴＭ））、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ））、パイロコッカス種，ＧＢ−Ｄ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＧＢ−Ｄ（Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭ））、パイロコッカス・ワーシィ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａａｓｉｉ（Ｐｗｏ））、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ））、バチルス・カルダフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄａｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ））、スルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ））、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ））、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ））、サーマス・ルベル（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ））、サーマス・ブロッキアナス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤｙＮＡｚｙｍｅ））、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ））、マイコバクテリウム種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．（Ｍｔｂ，Ｍｌｅｐ））がある。
【０１００】
本発明の別の対象は、上記した方法を行うために必要な成分を含むキットであり、以降、本発明のキットとする。
【０１０１】
本発明のこの対象の好ましい実施形態は、上記した方法を行う本発明のキットであり、
ａ）本発明のＲＴ、及び
ｂ）ｉ）バッファー、ｉｉ）プライマー、ｉｉｉ）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ｉＶ）ヌクレオチド、の群からの少なくとも１つの成分、を含んでなる。
【０１０２】
本発明の特別の対象は、テンプレート核酸、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）或いはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）或いはｍｉＲＮＡプレカーサーであるテンプレート核酸の逆転写、増幅或いは配列決定を行うための本発明のキットの使用に関するものである。
【０１０３】
詳細な説明及び請求の範囲を通して、単語“含む”及びその変形は、他の技術的特性、添加物、成分或いはステップを排除するものではない。  この分野の熟練者にとっては、本発明の他の対象、利点及び特性は、部分的にはこの記載から、及び部分的には本発明を実施して明らかとなろう。以下の本発明の実施例と図面は、本発明の説明のためであり、本発明を制限することを意図したものではない。
【実施例】
【０１０４】
〔ＨＩＶ−１グループＯのＲＴの異なる変異体を使用してのＲＴ−ＰＣＲ反応効率に及ぼす逆転写反応温度の影響〕
異なる温度での逆転写反応の効率を、得られたＤＮＡ複写のＰＣＲによる増幅の後に測定した。３７〜７８℃の範囲の異なる温度で行なった逆転写反応におけるアクチン遺伝子由来の凡そ５００と９５０塩基対のＲＮＡフラグメントの増幅で、変異体Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（ＲＴＯ＿３Ｍ＊）、Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ／Ｅ４７８Ｑ（ＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ＊）、Ｔ３５５Ａ／Ｑ３５７Ｍ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（ＲＴＯ＿５Ｍ＊）、及びＴ６９ＳＳＧ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ（ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊）は、ＨＩＶ−１グループＯの“野生型”ＲＴ及び他の変異体ＲＴより有効であった（図１）。
【０１０５】
これらの結果は、リアルタイムＰＣＲ反応でのアクチン或いはグリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のメッセンジャーＲＮＡに由来した配列の増幅で得られたものと一致した。  両方の場合で、７５〜７８℃の温度での変異体ＲＴＯ＿３Ｍ＊とＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ＊の逆転写の効率は、“野生型”ＲＴの効率より著しく高いことを観測した（図２）。変異体ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊の場合には、増幅効率は、ＧＡＰＤＨのＲＮＡの“野生型”酵素より高く、アクチンのＲＮＡと同等であることを観測した。
【０１０６】
〔高い温度での最大活性をもつ変異体の複写忠実度〕
逆転写酵素ＲＴＯ＿３Ｍ＊、ＲＴＯ＿５Ｍ＊、及びＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ＊は、一本鎖ヌクレオチドの挿入試験で、“野生型”酵素（ＲＴＯ＿ＷＴ＊）と同じ触媒活性を示し（表２）、変異体ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊の触媒効率（ｋｐｏｌ／Ｋｄ）は、野生型酵素より僅かに低かった。３’ミスペアーＧ：Ｔ末端の拡張試験で検討した酵素の間に顕著な差異は見出されなかった。Ｇ：ＡとＧ：Ｇ末端の拡張では、全てのＲＴが“野生型”酵素と同じ効率を示し、変異体ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊は、他よりＧ：Ｇ或いはＧ：Ａ末端を拡張する傾向が大きかった（図３）。
【０１０７】
表２：ＨＩＶ−１グループＯの“野生型”ＲＴ（ＲＴＯ＿ＷＴ＊）と変異体ＲＴＯ＿３Ｍ＊、ＲＴＯ＿５Ｍ＊、ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊、ＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ＊について、テンプレート−プライマー複合体３１Ｔ／２１Ｐ上のミスペアー末端の拡張動力学パラメーターを、前定常状態で決定した。最後の欄に示した数字は、ミスペアー末端の拡張効率間の係数について、ＲＴＯ＿ＷＴ＊と比較した忠実度の増加を示している。
【０１０８】
【表２】
0006416885.tif 000003
【０１０９】
ｌａｃＺ遺伝子をもつＭ１３ｍｐ２ファージの誘導体を用いる相補性試験で、これら酵素のうちのいくつかの複写忠実度を測定した。合成プロセスが異なる再結合ＲＴで行われた時に変異体を得る頻度を決定した。これらの試験では、変異体と“野生型”酵素の複写忠実度の間に有意な違いが観察されなかった（表３）。まとめると、これらのデータは、ここに記載した変異体によって示した高温での逆転写効率が大きくなっても、酵素の複写忠実度にはマイナス効果とならないことを示している。
【０１１０】
表３：変異体ＲＴＯ＿３Ｍ＊、ＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊及びＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ＊の複写忠実度を、ＲＴＯ＿ＷＴ＊のそれと比較し、遺伝子相補性試験（Ｍ１３ｍｐ２  ｌａｃＺα“フォワード変異試験”）により評価した。２つの独立した実験から得られたＲＴＯ＿ＷＴ＊のデータは、過去に公表されている［Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１３；４１：４６０１−４６１２］。
【０１１１】
【表３】
0006416885.tif 000004
【０１１２】
〔材料及び方法〕
〔グループＯのＲＴとその変異体の発現及び精製〕
ＲＴの発現及び精製は、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）耐性遺伝子を含み、ＨＩＶ−１グループＯのＲＴのｐ６６サブユニットをコードしている領域がクローン化されているｐ６６ＲＴＢプラスミド改変版［Ｂｏｒｅｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１；２９２：１３９−１４７；Ｍａｔａｍｏｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００５；３４９：４５１−４６３］で行った［Ｍｅｎｅｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１；２７６：２７４７０−２７４７９；Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２００９；３９２：８７２−８８４；特許ＷＯ２０１０１３０８６４］。  ＲＴ精製は、細菌溶解と均質化のステップ、次いでイオン交換クロマトグラフィー（リン酸セルロース中）と親和性クロマトグラフィー（Ｎｉ２＋−ニトリロ酢酸アガロースカラムで）のステップを行うボレット（Ｂｏｒｅｔｔｏ）らの記載している方法に従って行った［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１；２９２：１３９−１４７］。
【０１１３】
〔ＨＩＶ−１グループＯのＲＴ中に変異があるプラスミドの構築〕
変異体ＲＴ、ＲＴ  ＲＴＯ＿３Ｍ＊、ＲＴＯ＿Ｅ４７８Ｑ＿３Ｍ＊、ＲＴＯ＿５Ｍ＊、及びＲＴＯ＿Ｔ６９ＳＳＧ＿３Ｍ＊を発現するプラスミドは、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からの“迅速変化特定部位変異誘発”キットを用い、製造者の説明書に従って特定部位変異誘発により得た。
【０１１４】
次の変異誘発オリゴヌクレオチドを使用した。
ａ）変異Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａの導入には：
５′−ＧＧＧＡＡＡＴＡＴＡＣＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧＧＣＧＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＴＧＡＣ−３′
５′−ＧＴＣＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＡＧＴＡＴＡＴＴＴＣＣＣ−３′
ｂ）Ｔ３５５Ａには：
５′−ＡＣＡＧＧＧＡＡＡＴＡＴＧＣＴＡＧＧＡＴＧＡＧＧＧＧＣＧＣＣ−３′
５′−ＧＧＣＧＣＣＣＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＣＡＴＡＴＴＴＣＣＣＴＧＴ−３′
ｃ）Ｑ３５７Ｍには：
５′−ＧＧＧＡＡＡＴＡＴＡＣＴＡＧＧＡＴＧＡＧＧＧＧＣＧＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＴＧＡＣ−３′
５′−ＧＴＣＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＣＣＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＴＡＴＡＴＴＴＣＣＣ−３′
ｄ）Ｅ４７８Ｑには：
５′−ＣＣＡＡＴＣＡＡＡＡＧＧＣＴＣＡＡＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧ−３′
５′−ＣＴＧＣＣＡＴＴＡＡＴＴＧＡＧＣＣＴＴＴＴＧＡＴＴＧＧ−３′
ｅ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙの挿入と変更Ｔ６９Ｓを導入するために：
５′−ＧＣＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＧＡＣ−３′
５′−ＧＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＣＴＡＣＴＡＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＣ−３′
【０１１５】
“野生型”ＨＩＶ−１グループＯのｐ６６をコードしている配列のプラスミドキャリアーを、上記したようにＫ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ導入のテンプレートとして使用した［Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００９；３９２：８７２−８８４；特許ＷＯ２０１０１３０８６４］。  変異Ｔ３５５ＡとＥ４７８Ｑ、及び変異Ｔ６９Ｓ（挿入ＳＧと関係して）は、Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａのプラスミドキャリアーに別々に導入し、変異体：Ｔ３５５Ａ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ、Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａ／Ｅ４７８Ｑ、及びＴ６９ＳＳＧ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａを得た。最後に、変更Ｑ３５７Ｍを、変更Ｔ３５５Ａ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａの発現プラスミドキャリアーに導入し、変異体Ｔ３５５Ａ／Ｑ３５７Ｍ／Ｋ３５８Ｒ／Ａ３５９Ｇ／Ｓ３６０Ａを得た。  全ての場合において、変異誘導の後に、これらのプラスミドにｐ６６をコードしている配列領域が正しく、導入された変異のみ含んでいることを確かめた。
【０１１６】
〔ＰＣＲによる増幅での共役逆転写反応効率に及ぼす変異の影響〕
逆転写反応は、異なる温度で行い、次いでその反応生成物（ｃＤＮＡ）を標準条件でＰＣＲにより増幅させた［Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００９；３９２：８７２−８８４］。  典型的に、逆転写反応は、３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び５０ｍＭのジチオスレイトールを含む２５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（２５℃で、ｐＨが８．３）を４μＬマウス肝臓から分離した全ＲＮＡを１μＬ（１μｇ／μＬ）；４つのｄＮＴＰｓ混合物を４μＬ（それぞれ２．５ｍＭ）；オリゴ（ｄＴ）１６を１μＬ（１００μＭ）；リボヌクレアーゼインヒビターを０．５μＬ（４０ユニット／μＬ）；凡そ１５０ｎＭ濃度でＲＴ；そして残部を水で２０μＬとした。最初に、ＲＮＡとオリゴｄＴを、６８℃で３分間保持した。次いで、他の反応成分（ＲＴを含む）を加え、所定温度で１時間保持し、ｃＤＮＡを得た。最後に、９２℃に１０分保持して酵素を不活性にして反応を止めた。ｃＤＮＡを、Ｔａｑポリメラーゼ或いは他の同様の酵素（例えば、エクスパンド・ハイ・ファイデリティ・ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を使用する標準条件で、ＰＣＲによって増幅させた。
【０１１７】
〔リアルタイムＰＣＲ〕
ＲＴの逆転写効率は、リアルタイムＰＣＲによって、様々な温度（３７、５０、６８、７５及び７８℃）で決定した。これをするために、それぞれの実験で３つの独立した反応を行った。  全ての反応を、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのジチオスレイトール、１Ｕ／μＬのリボヌクレアーゼインヒビター（ＲＮａｓｉｎ（Ｒ）Ｐｌｕｓ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、５μＭのオリゴ（ｄＴ）１６、５０ｎｇ／μＬのマウス肝臓の全ＲＮＡ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、及び１５０ｎＭの対応するＲＴを含む５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ：８．３）中、容量２０μＬで行った。テンプレートＲＮＡのオリゴ（ｄＴ）１６、とのハイブリダイゼーション、及びｃＤＮＡ合成反応は、前項に記載した条件で行った。
【０１１８】
逆転写の効率は、β−アクチン及びグリセルアルデヒド３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のメッセンジャーＲＮＡから生成したｃＤＮＡの相対量を計算する定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定した。これを行うに、アクチンではオリゴヌクレオチド５′−ＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧ−３′と５′−ＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡ−３′を、ＧＡＰＤＨでは５′−ＣＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＧ−３′と５′−ＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＧＡＣＡＡ−３′を用いた。  ＰＣＲ反応による増幅は、全ＲＮＡ５ｎｇと等しい量のｃＤＮＡ、２５０ｎＭのそれぞれのオリゴヌクレオチド（“プライマー”）、及び５μＬの  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＮ  ４３６７６５９））、アンプリタック・ゴールド（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｒ））ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、及びＰＣＲ反応を行うに必要なその他試薬を用いて最終容量１０μＬで三通りに行った。バーコードを付したマイクロアンプ・オプチカル・３８４（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（Ｒ）  Ｏｐｔｉｃａｌ  ３８４）−ウェル反応プレート（アプライド・バイオシステムズ  ＰＮ  ４３０９８４９）を使用した。  ９５℃で初期変性ステージの後、サンプルを４０増幅サイクル（９５℃で１５秒、さらに６０℃で１分）行った。６０〜９５℃（２％の傾斜）の変性カーブは、ＰＣＲ特異性を確認するプログラムの終わりに行った。蛍光は、６０℃のステップとＡＢＩ−７９００ＨＴ定量ＰＣＲ装置（アプライド・バイオシステムズ）での変性時に測定した。すべてのプレートで、ネガティブコントロールと遺伝子増幅効率コントロール曲線を含んだ。
【０１１９】
データ分析は、ＳＤＳ  ２．２．１プログラム（アプライド・バイオシステムズ）で行った。ΔＣｔの値は、各サンプルそれぞれについてΔＣｔ＝Ｃｔ−Ｃｒｅｆとして計算した。ここで、Ｃｔは大きな増幅が観察されたサイクルであり、ＣｒｅｆはＢＨ１０クローンのＷＴ  ＲＴで得られたＣｔ値の平均である。  得られたｃＤＮＡの相対量は、２ΔＣｔとして計算し、その値は、それぞれの各実験で計算された３つの値の平均値±標準偏差として表した。
【０１２０】
〔複写忠実度試験〕
ＲＴの複写忠実度は、ミスペアー拡張動力学試験により決定した。正しく或いは不正確に対になったテンプレート−プライマー複合物を拡張する種々のＲＴの能力を決めるために、全て前定常的条件で行った［Ｍａｔａｍｏｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００８；３７５：１２３４−１２４８；Ｂａｒｒｉｏｌｕｅｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０１１；４３６：５９９−６０７］。  さらに、遺伝子試験は、Ｍ１３ｍｐ２ファージ中のｌａｃＺα遺伝子の発現に基づいて行った［Ｂｅｂｅｎｅｋ  ａｎｄ  Ｋｕｎｋｅｌ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９５；２６２：２１７−２３２；Ｂａｒｒｉｏｌｕｅｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０１１；４３６：５９９−６０７］。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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