(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ少なくとも１つのリン酸カルシウム結晶を含有する個別の多孔質顆粒を含む、多孔質粒状リン酸カルシウム材料であって、ここで、
（ｉ）前記多孔質顆粒の結晶の少なくとも９０％が１０〜１００ｎｍの範囲の結晶サイズであり、ここで、前記結晶サイズは、断面ＳＥＭにおいて見られる結晶の最長の寸法であり、前記多孔質顆粒の結晶の少なくとも９０％が、断面ＳＥＭにおいて観察したときに、５０ｎｍ以下の少なくとも１つの寸法を有し、前記多孔質顆粒の結晶が非焼結状態にあり、かつ各結晶の最長の寸法の、各結晶の最短の寸法に対する比の平均が、１〜１０の範囲であり、
（ｉｉ）前記多孔質顆粒の細孔の少なくとも９０％が１０〜５００ｎｍの範囲の細孔径を有し、ここで、前記細孔径は、断面ＳＥＭにおいて見られる細孔の最長の寸法であり、
（ｉｉｉ）前記多孔質顆粒において１０〜５００ｎｍの範囲の細孔径を有する細孔の平均細孔径が水銀圧入ポロシメトリーで測定して３０〜９０ｎｍの範囲であり、
（ｉｖ）アルキメデスの原理を用いて測定した前記多孔質顆粒の全体積多孔性が少なくとも６０％であり、および
（ｖ）ＢＥＴ法で測定した前記多孔質顆粒の表面積が１０〜７０ｍ２／ｇの範囲である、多孔質粒状リン酸カルシウム材料。
【請求項２】
前記結晶の少なくとも９０％が、断面ＳＥＭにおいて観察したときに、２０〜４０ｎｍの範囲の少なくとも１つの寸法を有する、請求項１に記載のリン酸カルシウム材料。
【請求項３】
各結晶の最長の寸法の、各結晶の最短の寸法に対する比の平均が、１．５〜３の範囲である、請求項１に記載のリン酸カルシウム材料。
【請求項４】
前記多孔質顆粒中の少なくとも５０％の細孔が１０〜１００ｎｍの範囲の細孔径を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のリン酸カルシウム材料。
【請求項５】
前記多孔質顆粒において１０〜５００ｎｍの範囲の細孔径を有する前記細孔の平均細孔径が３０〜７０ｎｍの範囲である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリン酸カルシウム材料。
【請求項６】
前記多孔質顆粒の全体積孔隙率が７０〜９０％の範囲である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のリン酸カルシウム材料。
【請求項７】
前記多孔質顆粒の表面積が２０〜４０ｍ２／ｇの範囲である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のリン酸カルシウム材料。
【請求項８】
前記多孔質顆粒リン酸カルシウムまたは各リン酸カルシウムが、
化学量論のヒドロキシアパタイト、
カルシウム欠損ヒドロキシアパタイト、
１以上のイオンが部分的にまたは完全に置換されている、化学量論のヒドロキシアパタイトまたはカルシウム欠損ヒドロキシアパタイト、
リン酸三カルシウム、および
ヒドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウム相からなる二相性リン酸カルシウム、から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のリン酸カルシウム材料。
【請求項９】
哺乳動物の非骨部に移植されるときに骨誘導性を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のリン酸カルシウム材料。
【請求項１０】
骨補填材、骨置換材または骨代用材としての請求項１〜９のいずれか１項に記載のリン酸カルシウム材料の使用。
【請求項１１】
骨誘導により骨修復において使用するための請求項１〜９のいずれか１項に記載のリン酸カルシウム材料。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のリン酸カルシウム材料を前記骨成長が起こる部分に配置することを含む、骨成長による非ヒト哺乳動物の治療方法。
【請求項１３】
（ａ）液相中、リン酸カルシウム結晶の分散材を調製する工程、
（ｂ）部分的に前記液相を除去し、前記リン酸カルシウム結晶を含む濡れたコンパクトな塊を得る工程、
（ｃ）段階（ｄ）で加熱処理する前に、前記液相を除去し、前記リン酸カルシウム結晶を含む乾燥したコンパクトな塊であって、前記乾燥したコンパクトな塊が、アルキメデスの方法により測定したとき、６０％以上の全孔隙率を有する形態で乾燥材料を得るため段階（ｂ）において得られる前記濡れたコンパクトな塊を乾燥する工程、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた前記乾燥した材料を２００〜１０００℃の範囲の温度で加熱処理し、前記結晶の焼結を避ける工程、および
（ｅ）段階（ｄ）の前または後に、前記乾燥したコンパクトな塊を顆粒に分離する工程、
の段階を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のリン酸カルシウム材料の作製方法。
【請求項１４】
段階（ｄ）は、段階（ｃ）で得られた前記乾燥した材料を７００〜９００℃の範囲の温度で加熱処理し、前記結晶の焼結を避ける工程を含む、請求項１３に記載のリン酸カルシウム材料の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質粒状リン酸カルシウム材料、特に、体組織修復、特に、骨修復および骨置換において有用な材料に関し、ならびに、そのような材料の使用方法および作製方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
外科医は、疾患または外傷に起因して骨組織の置換を必要とする。外科医は、骨移植（自家移植もしくは同種移植）または合成材料を用い、外科手術中に骨を置換し得る。骨を置換するために用いられる合成材料の種類の中で、外科医は、プレートを固定するために、金属（例えば、ステンレス鋼の腰インプラントまたは膝インプラント）、ポリマー（例えば、骨臼カップのポリエチレン）、セラミックス（例えば、マクロ多孔性骨移植片としてのヒドロキシアパタイト）または無機有機複合体（例えば、ヒドロキシアパタイト−ポリ乳酸複合材）を用いる。
【０００３】
骨移植片材料として用いられるリン酸カルシウムセラミック（ヒドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウムなど）は、典型的には、海綿骨の多孔質構造に似た多孔質構造を形成することにより製造される。そのような骨移植片は、マクロ孔（０．１〜１ｍｍの大きさ）および、当該マクロ孔と相互に連結されたマイクロ孔（０．５〜１０μｍ）の混合物として存在する孔を全孔隙率（６０〜９０％）の大きな値で有する。これらの骨移植片は、多孔質海綿の構造を形成するリン酸カルシウムを密集状態とする製造プロセスの一部として、通常高い焼結温度、典型的には、１１００〜１３００℃を必要とする。典型的には、粒形において用いられるマクロ多孔性骨移植片のようなものは、骨格として作用し、骨を、そのマクロ多孔性骨移植片に沿って成長させることを可能とすることを意味する骨伝導性の骨移植片として分類される。自家移植と異なり、ほとんどの合成リン酸カルシウム骨移植片は、骨誘導性の骨移植片ではない。骨誘導性は、未分化の間葉系幹細胞を管理することにより、骨を分離かつ形成する新しい骨形成をもたらす能力である。最近、いくつかのグループは、骨誘導性であるリン酸カルシウムに基づく合成骨移植の開発を報告している。骨誘導性に許容される試験は、骨補填材を好適な動物モデルにおいて非骨性（骨のない）部位（皮下または筋肉内に）に埋め込み、この部位に骨が形成されるかどうかの組織学的検査および組織形態計測を用いることである。唯一骨誘導性である骨補填材は、この部位に骨を形成しないが、骨誘導性材料は骨を形成する。骨誘導性の骨がヒトの骨欠陥に移植されたとき、骨誘導性の骨移植の利点は、骨がインプラントとホスト骨とのインターフェースで骨伝導性の応答により、かつインプラント全体にわたり骨誘導性の応答により形成し得るので、骨修復の加速された速度を有する。全体にわたって新しい骨を形成するため、骨伝導性の骨移植はインプラント後より長い時間を必要とする。新しい骨は、全体にわたって形成するため、インプラントおよびホスト骨の界面から骨移植の全体にわたって移行するので、骨伝導性の骨移植は移植後に長時間を必要とする。
【０００４】
骨誘導性リン酸カルシウムセラミックは特許文献１に開示されており、０．１〜１．５ｍｍの大きさのマクロ孔および０．０５〜２０μｍの大きさのマイクロ孔、２０〜９０％の全孔隙率、および５０ｎｍ〜２０μｍの大きさの結晶の混合物であるリン酸カルシウムセラミックを記載している。これらの骨誘導性セラミックは、１０００〜１２７５℃、好ましくは１１５０〜１２５０℃の高温を用いて形成された。セラミック材料は塊として移植される。
【０００５】
実質的にマイクロ孔のみを有する微小粒子からなる骨誘導性リン酸カルシウムは特許文献２に記載されており、０．１〜１．５μｍの大きさ、顆粒の全表面の１０〜４０％の表面積のマイクロ孔（％）および０．１〜１．５μｍの粒（結晶）径を有する。これらの骨誘導性セラミックは１０５０〜１１５０℃の高温を用いて形成された。当該特許文献において、骨誘導性リン酸カルシウムが、最少のマイクロ孔および粒（結晶）径を有する犬の筋肉に移植されたとき、骨誘導性応答を示した顆粒の例は、１０５０℃で焼結され、マイクロ孔を２４．２％の表面積を有する０．５８μｍ細孔径および０．７６μｍ粒径として報告されている。
【０００６】
一緒に焼結されるよりむしろ一緒に緩やかに拘束される微結晶を有する無機の再吸収可能な骨置換材料は特許文献３に記載されている。この材料は、ナノメートルの範囲に、数ミクロンの範囲に、および１００〜１０００μｍの範囲に、細孔を有する３つの異なる大きさからなる多孔性を有する。さらなる開示である特許文献４は特許文献５に記載されている材料を述べ、リン酸カルシウムをシリカキセロゲルと混合して、キセロゲルを含まない材料より強固であった無機の再吸収可能な骨置換材料を形成する。シリカキセロゲルは１〜１０００μｍの顆粒サイズを有し、リン酸カルシウムは１０〜２０００ｎｍの結晶サイズを有する。当該シリカキセロゲルは、０．５〜２０ｎｍの範囲の細孔を有し、１０〜６０％の多孔性を示す。
【０００７】
特許文献６は、新しい骨の形成を刺激するため、溶液中に浸した高濃度のケイ素を放出する機能を有する。無機ケイ素置換リン酸カルシウムヒドロキシアパタイトについて開示する。ＣａＰのモル比は２．０５〜２．５５の範囲にあり、Ｃａ／（Ｐ＋Ｓｉ）のモル日は１．６６未満である。当該ヒドロキシアパタイトは焼結されず、粉末またはコンパクトな粉末として用いられる。当該ヒドロキシアパタイトの懸濁液を濾過し、ウェット濾過ケーキを乾燥し、ドライケーキをすりつぶして微粒子にし、９００℃でその微粒子を加熱して生成される。骨誘導性は試験されない。
【０００８】
特許文献７（Ｔｕａｎら）は、ヒドロキシルアパタイト粉末の調製方法に関する。ヒドロキシルアパタイト粉末は、魚の鱗を６００℃、７００℃、または９００℃を包含する温度に加熱して、有機成分を除去し、無機粉末を凝集して得られた。当該開示は、さらに、ヒドロキシルアパタイト粉末を焼結して得られるヒドロキシルアパタイト多孔質体に関する。骨誘導性は試験されなかった。
【０００９】
非特許文献１は、従来にない極低温（Ｔ＜３００℃）でナノ結晶アパタイトを凝固してナノ結晶上に存在する表面の水和層を保存とするために使われる、放電プラズマ焼結法に関する。
【００１０】
特許文献８（Ｗａｈｌｉｇら）は、再吸収可能な骨のインプラント材料およびその製造方法に関する。インプラント材料の粉末成分は、実質的にヒドロキシアパタイト粉末および硫酸カルシウム粉末の混合物からなり、ヒドロキシアパタイト粉末は、合成的に調製され、１０〜２０ｎｍ幅および５０〜６０ｎｍ長さの結晶サイズを有すると報告されている結晶性ナノ粒子が沈殿することからなる。ナノ結晶の特定の吸収ＢＥＴ表面積は、報告によれば、好ましくは１００〜１５０ｍ２／ｇである。
【００１１】
特許文献９（Ｙｉｎｇら）は、ナノ結晶質アパタイトの合成方法に関する。本開示は、回収製品の特性をあつらえるように意図的に調整されうる一連の具体的な反応パラメータを報告する。１５０ｎｍ未満の平均結晶サイズを有する微粒子アパタイト組成物は、報告により提供される。製品は少なくとも４０ｍ２／ｇの表面積を有し得ると述べられている。組成物の所定の用途は、歯科用インプラントおよび歯科用インプラント用コーティングである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，５１１，５１０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０／００３４８６５号明細書（米国特許第７，９４２，９３４号明細書）
【特許文献３】独国特許発明第１００６００３６号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００７／００５９３７９号明細書（米国再発行特許発明第２００８／０１５２７２３号明細書）
【特許文献５】独特特許発明第１００６００３６号明細書
【特許文献６】国際公開第２０１０／０７９３１６号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００５／０１９１２２６（Ａ１）号明細書
【特許文献８】米国特許第６，６８９，３７５（Ｂｌ）号明細書
【特許文献９】米国特許第６，０１３，５９１号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｇｒｏｓｓｉｎら、“Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ａｐａｔｉｔｅ  ｓｉｎｔｅｒｅｄ  ａｔ  ｖｅｒｙ  ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｂｙ  ｓｐａｒｋ  ｐｌａｓｍａ  ｓｉｎｔｅｒｉｎｇ：  Ｐｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓｐｅｃｔｓ”、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ、２０１０年、第６巻（第２号）、ｐ５７７−５８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、骨誘導性を示し容易に製造されるリン酸カルシウム材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、新しい組織形成、特に骨修復を刺激する定義されたナノスケール構造を有す粒状材料の知見に基づく。当該材料は、骨伝導性、骨刺激性および骨誘導性である。特に、材料は非骨性の（すなわち、骨のない）部位（筋肉内にまたは皮下など）に移植されたときに骨誘導性であり、新しい組織を形成すること、特に新しい骨形成を誘導する。本発明の組成物の骨誘導性特性は、非骨性部位に移植されたとき、より迅速に新しい骨形成／修復をもたらし、新しい骨は、（骨伝導性骨移植として知られているように）既存の骨と接触している骨移植塊の端でよりむしろ骨移植塊の全体にわたって形成するだろう。
【００１６】
本願明細書に記載されている材料を含む骨誘導のプロセスは、新しい骨形成の前および間に細胞による高レベルのＢＭＰ−２発現と関連付けられてよい。特に、本願明細書に記載されている材料を伴って、血管周皮細胞による高レベルのＢＭＰ−２発現は骨の形成前に観測されてよい。本願明細書に記載されている材料を用いた骨形成の間、顆粒の周りの骨芽細胞、骨細胞および線維芽細胞による高ベルのＢＭＰ−２発現は観測されてよい。ＢＭＰ−７の比較的低い発現は、新しい骨形成の前および／または間に顆粒の周りの細胞により観測されてよい。
【００１７】
１つの態様において、本発明は、それぞれ少なくとも１つのリン酸カルシウム結晶（微結晶、結晶粒）を含有する個別の多孔質顆粒を含む、多孔質粒状リン酸カルシウム材料を提供し、ここで、
（ｉ）顆粒の結晶の少なくとも９０％は１０〜１００ｎｍの範囲の結晶サイズであり、ここで、結晶サイズは、断面ＳＥＭにおいて見られる結晶の最長の寸法であり、
（ｉｉ）顆粒における細孔の少なくとも９０％は、１０〜５００ｎｍの範囲の細孔径を有し、ここで、細孔径は、断面ＳＥＭにおいて見られる細孔の最長の寸法であり、
（ｉｉｉ）顆粒において１０〜５００ｎｍの範囲の細孔径を有する細孔の平均細孔径は、水銀圧入ポロシメトリーで測定して３０〜９０ｎｍの範囲であり、
（ｉｖ）アルキメデスの原理を用いて測定した顆粒の全体積多孔性が少なくとも５０％であり、および
（ｖ）ＢＥＴ法で測定した顆粒の表面積は１０〜７０ｍ２／ｇの範囲である、多孔質粒状リン酸カルシウム材料。
【００１８】
好ましくは、少なくとも９０％の結晶は断面ＳＥＭにおいて見られるような最大５０ｎｍの少なくとも１つの寸法を有する。好ましくは、少なくとも９０％は、断面ＳＥＭにおいて観察したときに、２０〜４０ｎｍの範囲の少なくとも１つの寸法を有する。
【００１９】
好ましくは、各結晶の最長の寸法の、各結晶の最短の寸法に対する平均比は１〜１０、好ましくは１．５〜３の範囲である。
【００２０】
好ましくは、顆粒中の少なくとも５０％の細孔は１０〜１００ｎｍの範囲の当該細孔径を有する。好ましくは、顆粒において１０〜５００ｎｍの範囲の細孔径を有する細孔の上記平均細孔径は３０〜７０ｎｍの範囲にある。
【００２１】
好ましくは、顆粒の全体積孔隙率は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％、より好ましくは７０〜９０％の範囲にある。
【００２２】
好ましくは、顆粒の表面積は、１０〜６０ｍ２／ｇ、または２０〜４０ｍ２／ｇの範囲にある。
【００２３】
好ましくは、上記顆粒の結晶は、実質的に非焼結状態にある。
【００２４】
別の態様において、本発明は、骨補填材、骨置換材または骨代用材として上記の本発明のリン酸カルシウム材料の使用に存する。
【００２５】
さらに、本発明は、骨誘導により骨修復において使用するための上記の本発明のリン酸カルシウム材料であり、骨成長が起こる部分に上記の本発明のリン酸カルシウム材料を配置することを含む、骨成長による哺乳動物の治療方法でもある。
【００２６】
本発明は、
（ａ）液相中、リン酸カルシウム結晶の分散材を調製する工程、
（ｂ）部分的に液相を除去して、リン酸カルシウム結晶を含む濡れたコンパクトな塊を得る工程、
（ｃ）段階（ｄ）で加熱処理する前に、液相を除去し、リン酸カルシウム結晶を含む乾燥したコンパクトな塊であって、乾燥したコンパクトな塊が、アルキメデスの方法により測定したとき、５０％以上の全孔隙率を有する形態で乾燥材料を得るため段階（ｂ）において得られる上記濡れたコンパクトな塊を乾燥する工程、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた上記乾燥した材料を２００〜１０００℃、好ましくは７００〜９００℃の範囲の温度で加熱処理し、実質的に、結晶の焼結を避ける工程、および
（ｅ）段階（ｄ）の前または後に、乾燥したコンパクトな塊を顆粒に分離する工程、
の段階を含む、上記のとおりのリン酸カルシウム材料の作製方法もて提供する。
【００２７】
好ましくは、段階（ｃ）において、乾燥したコンパクトな塊の上記全孔隙率が６０％以上、より好ましくは７０％以上である。
【００２８】
したがって、本発明の材料は、各粒子の具体的な構造を有するリン酸カルシウム顆粒を含む。特に、顆粒を作る結晶のサイズ（ＣＳ）、顆粒全体にわたる細孔のサイズ（ＰＳ）、顆粒の全孔隙率（ＴＰ）および顆粒の表面積（ＳＡ）は、顆粒の製造中加工パラメータの制御により制御され、これらの４つのパラメータ（ＣＳ、ＰＳ、ＴＰおよびＳＡ）は値の範囲を定義した。顆粒サイズは好適に制御されてもよい。これは、付与されたリン酸カルシウム材料のため、顆粒の製造中の加工パラメータは最適化され、適切な値を有する顆粒を製造し得る。
【００２９】
本発明の材料は、ヒトが介入して人工的に合成された、または言い換えれば、生物学的起源の材料（例えば、うろこ）ことを意味する合成品であるだろう。これは、本願明細書で定義されている結晶、細孔および顆粒のパラメータのより精密な制御を可能とする。
【００３０】
本発明の材料のため、所望の特性に重要であるパラメータは、顆粒を作る結晶のサイズ（ＣＳ）、顆粒全体にわたる細孔のサイズ（ＰＳ）、顆粒の全孔隙率（ＴＰ）および顆粒の表面積（ＳＡ）である。顆粒のサイズ（ＧＳ）は、例えば、規定されたサイズのふるいを通して材料をふるいにかけることにより、顆粒のサイズ（ＧＳ）範囲を選抜する構築された方法によって決定されてよい。
【００３１】
本発明において、結晶の形態学は、好ましくは、結晶の１つの寸法が他の寸法より長い、幾分か針状の形態である。顆粒を形成する結晶のサイズ（最長寸法）（ＣＳ）は、１０〜１００ｎｍ、または任意に１０〜８０、または１０〜９０ｎｍのサイズ範囲にあり、好ましくは、５０ｎｍ未満のサイズの結晶の少なくとも１つの寸法を有する。好ましくは、結晶の少なくとも１つの寸法は２０〜４０ｎｍの範囲のサイズを有する。最短の寸法に対する最長の寸法の割合（最短の寸法は、最長の寸法に垂直な方向にある）は、１〜１０、好ましくは１．５〜３の範囲であるだろう。結晶サイズおよび形態学は、走査電子顕微鏡法を用いて、特にＳＥＭの断面において決定され得る（ここで、結晶は、２つの寸法において見られる。）。上で述べたように、上記結晶の好ましくは少なくとも９０％、または少なくとも９５％がこのサイズ範囲を有する。
【００３２】
本発明において、顆粒全体にわたって最高の典型的なサイズ（最大寸法）（ＰＳ）は１０〜５００ｎｍのサイズ範囲である。無作為に選んだ少なくとも９０％の細孔はこのサイズ範囲にある。好ましくは、その大多数（無作為に選んだ少なくとも５０％）は１０〜１００ｎｍのサイズ範囲にある。
【００３３】
平均細孔径は、３０〜９０ｎｍ、好ましくは３０〜７０ｎｍの範囲にある。細孔の大多数は３０〜９０ｎｍのこのサイズ範囲内にあり、典型的には、細孔の６０〜１００％、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上はこのサイズ範囲にある。一方、本発明の材料は、この範囲内に９５％以上の細孔を有し、実際いくつかより大きな細孔であってよい。平均細孔径および細孔径分布は水銀圧入ポロシメトリーを用いて測定される。
【００３４】
顆粒の中に、５００ｎｍより大きいサイズ、例えば、１μｍ以上のサイズの細孔または空隙があるかもしれない。そのような大きな細孔または空隙は、平均細孔径の算出から排除される。
【００３５】
本発明において、顆粒の全孔隙率（ＴＰ）は、体積に関して、顆粒のより大きな体積は材料より多孔性であるようである。顆粒の全孔隙率は典型的には６０％より大きく、好ましくは全孔隙率の７０〜９０％の範囲にある。明確にするため、上記の例は、与えられた顆粒のため、７０％の顆粒は、平均３０〜７０ｎｍの細孔径を有する細孔を有し、１０〜１００ｎｍ、または任意に１０〜８０もしくは１０〜９０ｎｍの範囲の直径を有する結晶からなる顆粒の材料成分（この例において、残り３０％の体積）を有し、２０〜４０ｎｍの範囲の大きさを有する結晶の少なくとも１つの寸法を有する多孔性である。この全孔隙率（ＴＰ）は、ＡＳＴＭ  Ｃ３７３に記載されるようにアルキメデスの原理を用いて測定される。
【００３６】
本発明において上記のとおりＣＳ、ＰＳおよびＴＰの値は高い比表面積（ｍ２／ｇで表現される）を有する材料となることに起因して、顆粒の表面積（ＳＡ）は、公知のリン酸カルシウム骨移植片材料より大きい。本発明の、ＣＳ、ＰＳおよびＴＰの値を上記のとおり有するリン酸カルシウム材料は、１０〜７０ｍ２／ｇ、好ましくは１０〜６０ｍ２／ｇ、より好ましくは２０〜４０ｍ２／ｇの比表面積を有する。比表面積（ＳＡ）は、材料の表面へのＮ２の吸着を利用するＢＥＴ方法を用いて測定される。
【００３７】
本発明において、上記の他の４つのパラメータ（ＣＳ、ＰＳ、ＴＰおよびＳＡ）を伴う材料の顆粒のサイズ（ＧＳ）は典型的には５０μｍ〜１０ｍｍの範囲にある。この範囲内において、より狭い粒径範囲は用途に応じて選択されてよく、例えば、骨移植系としての材料の臨床用途に応じて、１００〜５００μｍ、５００〜１０００μｍ、１〜２ｍｍ、２〜５ｍｍ、５〜１０ｍｍのより狭い範囲であってよい。一方で、顆粒サイズ範囲は典型的にはこれらの範囲にあり、本発明の材料はより狭い範囲、例えば２００〜３００μｍを有していてもよく、または本発明の材料が一緒に封入される方法に影響を及ぼすサイズスケールの粒径を有していてもよい。例えば、二峰性の分布は特定の利用、例えば、２００〜３００μｍおよび１〜２ｍｍの範囲のサイズを有する顆粒などであってよく、これらの相対的割合は封入を最適化するために設定されてよい。
【００３８】
顆粒の物理パラメータの本願明細書に含有される上限および下限、顆粒中のリン酸カルシウムの具体的な結晶サイズ、顆粒の多孔性特徴部および顆粒の表面積は、顆粒材料は、骨に形成を誘導するタンパク質を吸収する効果を有するために選択される。当該結果は、多孔性の顆粒の全体にわたって新しい骨が形成することである。結晶サイズは、ナノスケールの多孔性特徴部を得るために重要である。顆粒の大きな表面積は、顆粒の体積の全体にわたって骨の成長のための部位の可能性を増加させる。顆粒サイズは、本願明細書に記載されるように、意図された使用に応じて選択され得る。選択されたサイズを有する顆粒またはサイズは、骨成長が欲される部位にこの顆粒（微粒子）型において送達するため、互いに結合されず、別々である。
【００３９】
用語「リン酸カルシウム」は、本願明細書、特許請求の範囲において用いられ、本技術分野において通常であるリン酸カルシウムに基づく多くの材料を含む。具体的な材料は以下で議論されているが、用語「リン酸カルシウム」は、本願明細書において以下の非限定的なリストの材料を包含する。
α−およびβ−リン酸酸カルシウム
アパタイト
リン酸二水素カルシウムおよびその水和物
リン酸水素カルシウム、無水物および水和物
ヒドロキシアパタイト（カルシウム欠乏性のヒドロキシアパタイトを包含している）
炭酸アパタイト
第二リン酸カルシウム、無水物および脱水物
フルオロアパタイト
リン酸一カルシウム、無水物および一水和物のリン酸オクタカルシウム
【００４０】
２以上のリン酸カルシウムは、本発明の材料の顆粒もしくは異なる顆粒または各顆粒の混合物において用いられてよい。
【００４１】
特に好ましい再吸収可能なリン酸カルシウム材料は、限定されず、１．６６７のＣａ／Ｐモル比を有する化学量論のヒドロキシアパタイト、１．５０〜１．６６７のＣａ／Ｐモル比を有するカルシウム欠損アパタイト、１以上のイオンが別のイオンまたは複数のイオンで部分的にまたは完全に置換された化学的に修飾されたヒドロキシアパタイト、および１以上のイオンが別のイオンまたは複数のイオンで部分的にまたは完全に置換された化学的に修飾されたカルシウム欠損アパタイトを包含する。これらの１つの例は、カーボネートイオンがリン酸イオンおよび／またはヒドロキシルイオンを置換するカーボネート置換されたヒドロキシアパタイトである。さらなる例は、ケイ酸イオンがリン酸イオンを置換するケイ酸置換されたヒドロキシアパタイトである。ある場合には、これらのイオン置換は、結果的に、荷電平衡を保持するためヒドロキシルまたはカルシウムイオンの喪失のようなヒドロキシアパタイトの組成物中の同時変化になる。別の例は、ケイ酸イオンがリン酸イオンを置換し、Ｃａ／（Ｐ＋Ｓｉ）モル比は１．６６７未満であるシリカ置換カルシウム欠損アパタイトである。多くの他のイオン置換は、ヒドロキシアパタイト中で生成され、またはカルシウム欠乏性のヒドロキシアパタイト材料は最新の発明の材料中で生成され得る。これらは、限定されないが、ストロンチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウム、リチウム、亜鉛、銀、チタン、コバルト、銅、ニッケル、鉄、硝酸塩、硫酸塩、フッ化物および塩化物を包含する。上記のイオンは単独または組み合わせて置換してよい。いくつかのイオンは様々な価数状態に置換してよく、これは、例えば、Ｓｉ０４４−、Ｓｉ２０７６−、ＳｉＯ３２−、などのケイ酸イオンの置換を、単独または組み合わせて包含してよい。
【００４２】
本発明において用いられる他の好ましいリン酸カルシウムは、限定されないが、ヒドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウムの相の混合物からなるβ−またはα−多形、または二相性のリン酸カルシウム（ＢＣＰ）のいずれかに存在し得るリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）を包含する。リン酸三カルシウムの場合に、製造プロセスは、ＴＣＰのβ−多形の形状を好む上記の４つのパラメータ（ＣＳ、ＰＳ、ＴＰおよびＳＡ）の値を有する材料になると本願明細書に記載される。しかしながら、α−多形は、ある場合には、他のイオンの添加により通常の高温より低い温度で得られるかもしれない（Ｎｕｒｓｅ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９の相図に記載されている。）。リン酸三カルシウム相は変性されてよく、それにより１以上のイオンは、上記のとおり置換されたヒドロキシアパタイトおよびイオン置換カルシウム−不足ヒドロキシアパタイトのイオンの場合に別のイオンまたは複数のイオンに部分的にまたは完全に置換される。ＢＣＰの場合において、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）およびリン酸三カルシウム相の相対的割合は実質的に０％のＨＡ〜１００％のＨＡに変動し得る。ＢＣＰにおけるＨＡおよび／またはリン酸三カルシウム相は変更されてよく、それによって１以上のイオンは、イオン置換ヒドロキシアパタイトおよびイオン置換されたカルシウム欠損ヒドロキシアパタイトのため、上記のとおり、別のイオンまたは複数のイオンによって部分的にまたは完全に置換される。
【００４３】
他のリン酸カルシウムは最新の発明において用いられうる。例えば、オクタリン酸カルシウム、非晶リン酸カルシウム、ブルシャイト、モネタイトおよびテトラリン酸カルシウムは単独で用いられ得、または上位において追加の層として用いられうる。リン酸カルシウムは非結晶性であり、本願明細書における結晶サイズの参考は材料のナノ粒子の大きさへの言及である。
【００４４】
他の相は、顆粒中の上記のリン酸カルシウムに添加されてよい。そのような他の相は、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸カルシウムガラス、ケイ酸カルシウムベースガラス、リン酸カルシウムガラス、リン酸カルシウムベースガラス、ケイ酸カルシウムベースガラスセラミック、リン酸カルシウムベースガラスセラミック、生理活性ガラス、生理活性ガラスセラミック、生体適合性ガラス、生体適合性ガラスセラミック、アルミナおよびジルコニアを包含する。このリストにおいてリン酸カルシウムベース材料は骨成長において活性ではなく、好ましくは存在しない。そのような他の相の量は、好ましくは５０重量％未満、より好ましくは３重量％未満である。しかしながら、本発明において、顆粒はリン酸カルシウムの全体的にまたは実質的に全体的に含む（例えば、＞９９重量％）。
【００４５】
本発明の材料を製造する方法において、リン酸カルシウムは好ましくは液相中に分散されるべきである。この分散は、水溶液沈殿などのリン酸カルシウム材料の合成の結果であり得、またはリン酸カルシウム粉末は好適な溶媒、典型的には水または水ベース溶媒に分散され得る。分散系中のリン酸カルシウムは、１００ｎｍ未満の、または任意に８０または９０ｎｍ未満のの小さな一次結晶サイズを有し、上記のとおり４つのパラメータ（ＣＳ、ＰＳ、ＴＰおよびＳＡ）の値を有する材料を形成する。リン酸カルシウムは、一次結晶としておよび／または一次結晶の塊として分散系に存在してよい。
【００４６】
もし、１以上の他の相は、顆粒中に追加の非リン酸カルシウム材料を取り込むのが望ましい場合、分散系に包含されてよい。
【００４７】
液相中に分散されるリン酸カルシウムは加工され、上記のとおり４つのパラメータ（ＣＳ、ＰＳ、ＴＰおよびＳＡ）の値を有する材料を形成する。液相に分散されたリン酸カルシウムは懸濁液として記載され得る。液相（リットル、Ｌ）に分散される固相（リン酸カルシウム）の量（グラム、ｇ）は、１５００ｇ／Ｌ〜０．１ｇ／Ｌ、好ましくは１５０ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌで変動し得る。
【００４８】
第一加工段階は、典型的には大多数の液相を除去し、濡れたコンパクトな塊の固相を残すように加工される分散系を含む。この段階に好適な方法は、減圧濾過であり、例えば、ブフナー漏斗、ろ紙および真空ポンプ（コンパクトな塊の固相の濾過にかけられる質量／力を有しまたは有さず）、フィルタープレス（懸濁液に圧密圧力をかけ、コンパクトな塊の固相から水を効果的に絞りだすことを有するまたは有しない）または遠心分離を用いる。この段階において、液相の除去および固相の塊の圧縮は、続く乾燥段階の後に適切な全孔隙率（ＴＰ）を保持するように制御される。コンパクトな塊は過度にコンパクトにされる場合、全孔隙率は６０％未満または５０％未満のレベル、好ましい範囲の７０〜９０％の全孔隙率に落ちついてよく、液相を除去するプロセスは制御されなければならない。これは、減圧濾過の間に真空力の間に真空力を高くかけすぎないこと（または、真空濾過の間にかけられる質量／力を制御すること）、フィルタープレスの間にかけられる圧縮力を制御すること、または遠心分離の間に遠心力および継続期間を制御することを意味する。これらのパラメータは用いられる装置、分散系中のリン酸カルシウムの量、用いられる液相の種類および用いられるリン酸カルシウムの種類に応じてかなり変動し得、第一段階で用いられている加工条件の好適な設定は、乾燥後の固相のコンパクトな塊の全孔隙率は、例えば、これらに限定されないが、５０〜１５０℃の間で、ＡＳＴＭ  Ｃ３７３を用いで測定した後、５０％超、好ましくは６０％超、より好ましくは７０〜９０％超の全孔隙率であるということである。
【００４９】
典型的には、これらに限定されないが、５０〜１５０℃での乾燥段階は、固相の濡れたコンパクトな塊からさらに水を除去して、さらなる加工工程の固相の乾燥したコンパクトな塊を製造するまでさらに水を除去する工程である。
【００５０】
懸濁液内に、液相中の分散したリン酸カルシウム結晶の相互作用は、固相のコンパクトな塊内の結晶の包装を変化するように変更され得る。そのような変更は、液相のｐＨ、または界面活性剤の添加を変更することによりなされ得、結晶の表面電荷およびそれゆえ結晶の間の静電的な電荷を変更するかもしれない。これは、本願明細書に記載される骨移植系の全孔隙率（ＴＰ）および表面積（ＳＡ）を変更および／または制御する別の方法である。
【００５１】
次の加工段階は、好適な温度で乾燥したコンパクトな塊の固相を加熱することを含み、任意の揮発性の成分を除去し、乾燥したコンパクトな塊の固相における結晶サイズ（ＣＳ）および細孔径（ＰＳ）を制御して、上記の範囲の値とする。この第二段階は、第一加工段階、または乾燥したコンパクトな塊の固相がさらなる小片に破壊され得、または上記のとおりの所望の顆粒サイズ（ＧＳ）の範囲の大きさにされた後に得られる乾燥したコンパクトな塊の固相上で直接行われ得る。サンプルを加熱するために用いられる温度は、結晶成長および焼結のプロセスのいずれも回避されまたはちょうど始まるのみであるように制御される。これは、乾燥したコンパクトな塊の固相の結晶サイズ（ＣＳ）、細孔径（ＰＳ）および表面積（ＳＡ）は上記の範囲内の値を維持することを保証する。典型的には、この熱処理に用いられる温度は２００〜１０００℃、好ましくは、７００〜９００℃である。この温度での熱処理の継続期間は、典型的には１〜４時間であるが、結晶成長および焼結のプロセスがいずれも回避されまたはちょうど始まるのみである場合に、より短い時間または長い時間は適切である。加熱するための雰囲気は空気であり得、または適切な水蒸気を包含している気体の豊富な雰囲気であってよい。２００〜１０００℃、好ましくは７００〜９００℃での熱処理を行うことにより、固相のコンパクトな塊の中の結晶は焼結せず、そのため最終生成物はセラミックと分類されないことを成し遂げることができる。セラミックは、高温の熱処理の間に高密度化した無機材料と関連し、密度および結晶サイズにおける増加ならびに全孔隙率および細孔径における減少に関連する。セラミックは、隣接する粒または結晶の間の「ネック（ｎｅｃｋｓ）」の形成とも関係し、これらの隣接する粒または結晶は共に融合しており、これはＳＥＭ分析を用いて観測され得る。これは他の先行技術（米国特許第６，５１１，５１０号および米国特許第７，９４２，９３４号）への異なるアプローチであり、高温、つまり、それぞれ１０００〜１２７５℃（好ましくは１１５０〜１２５０℃）および１０５０〜１１５０℃）を用いてセラミックを形成する。
【００５２】
本願明細書に記載される本発明の粒状リン酸カルシウム材料は、エチレンオキシドなどまたはエチレンオキシドの標準的な工業方法を用いて滅菌され得る。イオン化滅菌方法、γ照射、電子線およびＸ線滅菌も用いられる。
【００５３】
本願明細書に記載される本発明の粒状リン酸カルシウム材料は、骨欠陥、骨の外傷および骨の癒着の範囲を治療するために使用することができる。例えば、骨移植系の顆粒は、骨欠陥に包装されまたは新しい骨を必要とする部分に置換されて、後側部の脊椎固定術または椎体間固定固定術においてなど形成する。これらの顆粒は、直接移植され得、または移植の前に水、生理食塩水、血液または骨髄穿刺液、または別の適切な媒体と混合され得る。顆粒はペーストとしても運ばれてよく、または適切な溶解性担体（限定されないが、吸収性ポリマー（カルボキシメチルセルロースまたはエチレンオキシド／プロピレンオキシドブロック共重合体など）、または天然ポリマー（コラーゲンまたはフィブリンなど））と混合することによるペーストであってもよい。
【００５４】
加えて、本願明細書に記載される本発明の粒状リン酸カルシウム材料は、成長因子タンパク質｛骨形成タンパク質など）、抗生物質（ゲンタマイシンなど）または他の調合薬、サイトカインまたは抗体などの活性な生体分子と混合されてよい。
【００５５】
加えて、本願明細書に記載される本発明の粒状リン酸カルシウム材料は、細胞と混合されてよい。これは手術室においてなされてよく、移植の直前にまたは細胞が移植の前の顆粒における時間の間培養されてよい。そのような細胞は、限定されないが、自生間充織幹細胞，同種異系間充織幹細胞、骨芽細胞前駆細胞、骨芽細胞細胞、内皮細胞、およびこれらの組み合わせを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の実施例２の骨移植系を、後述するようにヒツジの筋肉に移植した後の組織学的な部分の光学顕微鏡画像である。
【図２】実施例２の骨移植系の移植された顆粒の表面における新しい骨形成の領域における細胞のアルカリホスファターゼ発現を示す光学顕微鏡画像である。
【図３】コントロールとして用いられる先行技術の系の移植された顆粒の近くにアルカリホスファターゼ発現のないことを示す光学顕微鏡画像である。
【図４】実施例２の骨移植系における顆粒の表面を示す走査電子顕微鏡画像（ＳＥＭ）である。
【図５】比較のヒドロキシアパタイト焼結セラミック材料の顆粒の表面のＳＥＭ画像である。
【実施例】
【００５７】
本発明の実施形態および実験データ
本発明は、以下の限定を意図しない実施形態および添付図面を参照して説明される。
【００５８】
実施例１〜４は、本発明の粒状材料の製造を記載している。これらの材料のそれぞれの平均細孔径は、水銀ポロシメトリーによって３０〜７０ｎｍの範囲で測定される。細孔は、顆粒のＳＥＭ断面に見られるように、１０〜１００ｎｍの大きさで、少なくとも５０％の細孔を有する１０〜５００ｎｍの範囲のサイズである。
【００５９】
実施例１
骨移植系１（ヒドロキシアパタイト，ＨＡ）の製造
５００ｍｌのアルカリ水溶液（添加された１０ｍｌのアンモニア溶液を含む水溶液）中に、およそ５０ｇのＨＡ結晶を分散させてなるヒドロキシアパタイト（ＨＡ）懸濁液を、従来の水溶液沈殿反応により調製する。この実施例の目的のため、これは、水酸化カルシウム懸濁液へリン酸溶液を、Ｃａ／Ｐモル比が１．６６７となるように添加し、ｐＨを１０〜１１で維持したことを含み、しかし、他の合成方法は適切である。固相の濡れたコンパクトな塊（ヒドロキシアパタイト）を、真空ポンプに接続されたサイドアームを有する三角フラスコに設置されているブフナー濾過ロートでろ紙にヒドロキシアパタイト懸濁液を通すことにより、水溶液を除去し、固相を集めて得る。この段階の臨界制御は、液相の除去および固相の塊の圧縮を制御して、高レベルの全孔隙率（ＴＰ）を保持することである。真空ポンプを、フラスコ中に真空を創造するために用い、その真空を、水の約８０〜９０質量％を除去する期間想像し、これにより、水相の除去の間に固相を凝縮する必要はない。進行中の実施例において、真空を３０分間のみ創造した。濡れたコンパクトな固相をその後８０℃でさらに乾燥した。
【００６０】
固相を乾燥したコンパクトな塊（ヒドロキシアパタイト）を、乳鉢および乳棒を用いてより小さいサイズに破砕し、１〜２ｍｍの大きさの顆粒を一連のふるいを用いて選抜した。この方法において調製したいくつかのサンプルにおける顆粒の全孔隙率を、ＡＳＴＭ  Ｃ３７３に記載されている方法を用いて測定し、値は７４〜８４％の範囲だった。顆粒を加熱炉中、７００℃で１時間加熱した。加熱された顆粒の全孔隙率は、６６〜７６％の範囲であり、７１％の平均値だった。
【００６１】
顆粒の表面積（ＳＡ）は、ＢＥＴ方法によって測定して、２７ｍ２／ｇだった。顆粒の表面をＳＥＭを用いて観測し、結晶の寸法（ＣＳ）は、最長の寸法で５０〜９０ｎｍの範囲であるが、結晶の最短の寸法（幅）は２０〜４０ｎｍであった。
【００６２】
実施例２
骨移植系２（ケイ素置換ヒドロキシアパタイト、Ｓｉ−ＨＡ）の製造
５００ｍｌのアルカリ水溶液（添加された１０ｍｌのアンモニア溶液を含む水溶液）中に、およそ５０ｇのＳｉ−ＨＡ結晶を分散させてなるヒドロキシアパタイト（ＨＡ）懸濁液を、従来の水溶液沈殿反応により調製する。この実施例の目的のため、これは、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）を含有する水酸化カルシウム懸濁液へリン酸溶液を、Ｃａ／Ｐモル比が２．４５およびＣａ／（Ｐ＋Ｓｉ）モル比１．６４となるように添加し、ｐＨを１０〜１１で維持したことを含み、しかし、他の合成方法は適切である。実施例１に関しては、固相（ケイ素置換ヒドロキシアパタイト）の濡れたコンパクトな塊は、真空ポンプに接続されたサイドアームを有する三角フラスコに設置されているブフナー濾過ロートでろ紙にケイ素置換ヒドロキシアパタイト懸濁液を通すことにより、水溶液を除去し、固相を集めて得る。真空ポンプを、フラスコ中に真空を創造するために用い、その真空を、水の約８０〜９０質量％を除去する期間創造し、これにより、水相の除去の間に固相を凝縮する必要はない。進行中の実施例において、真空を３０分間のみ創造した。濡れたコンパクトな固相をその後、オーブン中８０℃でさらに乾燥した。
【００６３】
固相を乾燥したコンパクトな塊（ケイ素置換ヒドロキシアパタイト）を、乳鉢および乳棒を用いてより小さいサイズに破砕し、１〜２ｍｍの大きさの顆粒を一連のふるいを用いて選抜した。顆粒の全孔隙率をＡＳＴＭ  Ｃ３７３に記載されている方法を用いて測定し、値は７３〜８２％の範囲だった。顆粒を加熱炉中、９００℃で１時間加熱した。加熱された顆粒の全孔隙率は、７１〜７８％の範囲であり、７５％（ｎ＝５）の平均値だった。
【００６４】
顆粒の表面積（ＳＡ）は、ＢＥＴ方法によって測定して、２８ｍ２／ｇだった。顆粒の表面をＳＥＭを用いて観測し、結晶（ＣＳ）の最長の寸法は５０〜８０ｎｍの範囲であり、結晶の最短の寸法（幅）は２０〜４０ｎｍの範囲であった。
【００６５】
実施例３
骨移植系３（β−リン酸三カルシウム、β−ＴＣＰ）の製造
実施例１および２に記載されている方法を用い、５００ｍｌのアルカリ水溶液（添加された１０ｍｌのアンモニア溶液を含む水溶液）中に、１．５８のＣａ／Ｐモル比を有するおよそ５０ｇのアパタイト結晶を分散させてなるカルシウム欠損アパタイト懸濁液を、従来の水溶液沈殿反応により調製する。この実施例の目的のため、これは、水酸化カルシウム懸濁液へ、リン酸溶液を、Ｃａ／Ｐのモル比１．５０となるように滴下添加し、ｐＨを７〜８の間で維持することを含み、しかし、他の合成方法は適切である。固相の濡れたコンパクトな塊（カルシウム欠損アパタイト）が得られ、乾燥したコンパクトな塊、次いで、実施例１および２に記載されているような同じプロセスにより顆粒へ変形される。６５％超の全孔隙率を有する顆粒を、７５０℃で１時間加熱する。Ｘ線回析分析により、当該相組成物はβ−多形のリン酸三カルシウムであることがわかった。加熱した顆粒の全孔隙率は６５〜７７％（ｎ＝５）の範囲であった。
【００６６】
顆粒の表面積（ＳＡ）は、ＢＥＴ方法によって測定して、２５ｍ２／ｇであった。顆粒の表面をＳＥＭを用いて観測し、結晶（ＣＳ）の最長の寸法は５０〜９０ｎｍの範囲であり、結晶の最短の寸法（幅）は２０〜５０ｎｍの範囲であった。
【００６７】
実施例４
骨移植系４（二相性リン酸カルシウム、ＢＣＰ）の製造
実施例１、２および３に記載されている方法を用いるは、５００ｍｌのアルカリ水溶液（添加された１０ｍｌのアンモニア溶液を含む水溶液）中に、１．５８のＣａ／Ｐモル比を有するおよそ５０ｇのアパタイト結晶を分散させてなるカルシウム欠損アパタイト懸濁液を、従来の水溶液沈殿反応により調製する。この実施例の目的のため、これは、水酸化カルシウム懸濁液へ、リン酸溶液を、Ｃａ／Ｐのモル比１．５８となるように滴下添加し、ｐＨを８〜１０の間で維持することを含みし、しかし、他の合成方法は適切である。固相の濡れたコンパクトな塊（カルシウム欠損アパタイト）が得られ、乾燥したコンパクトな塊、次いで、実施例１および２に記載されているような同じプロセスにより顆粒へ変形される。６５％超の全孔隙率を有する顆粒を、８００℃で１時間加熱する。Ｘ線回析分析により、当該相組成物はβ−多形のリン酸三カルシウムとヒドロキシアパタイトとの（およそ５０％：５０％の割合にある）２相性の混合物であることがわかった。加熱した顆粒の全孔隙率は、６８〜７９％（ｎ〜５）の範囲であり、７３％（ｎ＝５）の平均値だった。
【００６８】
顆粒の表面積（ＳＡ）は、ＢＥＴ方法によって測して、２２ｍ２／ｇであった。顆粒の表面をＳＥＭを用いて観測し、結晶（ＣＳ）の最長の寸法は５０〜８０ｎｍの範囲であり、結晶の最短の寸法（幅）は２０〜４０ｎｍの範囲であった。
【００６９】
実施例５
骨移植系の１〜４に対するタンパク質の付着
結晶および細孔径の効果、および実施例１〜４の骨移植系の表面積の高い値を試験するため、２４時間浸した後０．５ｇの顆粒に付着する１％ウシ胎児血清の３ｍｌ溶液からの血清蛋白質の量の測定を行った。比較として、実施例１〜４の顆粒と同様の全孔隙率であるが結晶サイズはおよそ１μｍで、細孔径は１μｍより大きく、１．５ｍ２／ｇの表面積を有する多孔質ヒドロキシアパタイト顆粒（コントロール顆粒と称される）を試験した。初期の１％のウシ胎児血清溶液中および顆粒を浸した後の溶液中に存在するタンパク質の量を測定するためのビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを用い、顆粒に吸収した血清タンパク質の量をこれらの２つの値の差として計算し得る。実施例１〜４により製造される顆粒に吸収した血清タンパク質の量は、オリジナルの１％ウシ胎児血清溶液中の全タンパク質の３９％＋５％であり、一方で、コントロール顆粒は、タンパク質から９％±３％を吸収した。
【００７０】
実施例６
骨移植系の骨誘導性の実施
実施例２に記載されている骨移植系を、１８月齢のヒツジの背中の筋肉における小さい欠陥に移植した。６週間後、外植された見本／部分は、組織学的検査のために滑降され、新しい骨形成を同定するために染色（テトラクローム）する。イメージは、顆粒の周りに形成されている新しい骨（青く染色される）と全体にわたってある欠陥を示した（図１）。比較用の非骨誘導性の合成骨移植（ＰｒｏＯｓｔｅｏｎ  ２００Ｒとして購入可能）は、この移植時間の後の新しい骨がなく、顆粒の周りの緻密線維組織の存在のみを示した。
【００７１】
図１は、実施例２に記載されている骨移植系のテトラクローム染色された組織学的検査は、骨移植系の脱灰された顆粒（Ｇ）を示す６週間のヒツジにおける筋肉内への移植を示し、インプラント部位内の顆粒の周りに形成されるホスト筋肉（Ｍ）と新しい骨（ＮＢ）を示す。
【００７２】
脱灰する組織学スライドは免疫組織化学を用いて染色され、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の正の発現、骨芽細胞の細胞分化およびそれゆえ骨形成の具体的なマーカー、ＡＰのため正に染色された細胞はブラウンを表す。そのような染色された区分は図２に示され、ＡＰの正に染色された細胞（骨芽細胞）は、実施例６における実験において顆粒（Ｇ）の表面で、新しい骨形成（ＮＢ）の配置で現れる。これは、新しい骨は筋肉内移植部位への宿主間葉系幹細胞の補充により形成され、骨芽細胞へ分化することを示し、ここで、それらは新しい骨を製造する。これらの区分において軟骨細胞／軟骨組織の重要な領域の存在の証拠はなく、そのため新しい骨は、軟骨内骨形成に観察されるように軟骨中間体相を介するより、直行ルートから形成することを表す。
【００７３】
対照的に、非骨誘導性の合成骨移植（ＰｒｏＯｓｔｅｏｎ  ２００Ｒ）は、この移植期間の後ＡＰ用の正に染色された骨芽細胞の細胞を示さず、顆粒の周りの緻密線維組織（線維芽細胞）の存在のみを示した（図３）。
【００７４】
図２は、実施例２に記載されている、６週間ヒツジの筋肉内に移植されるナノスケールの骨移植系の顆粒（Ｇ）の表面で、新しい骨形成（ＮＢ）の領域で細胞（ブラウンに染色された）によるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現を示す顕微鏡イメージ（ｘ２０）である。
【００７５】
図３は、６週間ヒツジの筋肉内に移植される骨伝導性のコントロールとして用いられるＰｒｏＯｓｔｅｏｎ  ２００Ｒの顆粒（Ｇ）の近くの細胞（ブラウンに染色を不足）によりアルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現を示さない顕微鏡イメージ（ｘ２０）である。
【００７６】
図４は、顆粒を作製する結晶のナノスケール構造（サイズおよび形状を包含する）を示す、実施例２に記載されているナノスケールの骨移植系の顆粒の表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージを示す。
【００７７】
図５は、顆粒を作製する共に焼結する大きな結合したグレインの存在およびナノスケールの細孔構造の欠乏を示す比較的多孔質ヒドロキシアパタイトセラミック材料の粒子の表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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