(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーダイマーの増幅を低減する方法であって、
（ａ）第１タグ（ｔ１）と、二本鎖の第１標的核酸断片の一方の鎖に相補的な第１フォワードプライマー（Ｆ１）とを含む第１核酸配列を得ること；
（ｂ）第２タグ（ｔ２）と、前記二本鎖の第１標的核酸断片の他方の鎖に相補的な第１リバースプライマー（Ｒ１）とを含む第２核酸配列を得ること；
（ｃ）第３タグ（ｔ３）と、二本鎖の第２標的核酸断片の一方の鎖に相補的な第２フォワードプライマー（Ｆ２）とを含む第３核酸配列を得ること；
（ｄ）第１タグ（ｔ１）と、前記二本鎖の第２標的核酸断片の他方の鎖に相補的な第２リバースプライマー（Ｒ２）と、前記第１タグ（ｔ１）と前記第２リバースプライマー（Ｒ２）との間に前記第１フォワードプライマーの５’末端部分配列（Ｆ１＾）または完全配列とを含む第４核酸配列を得ること
ここで、前記第１フォワードプライマー（Ｆ１）および前記第２リバースプライマー（Ｒ２）は、それらの３’末端において相補的な領域を有し、Ｆ１＾はＦ１配列の５’末端からＦ１配列の３〜３０塩基又は４０〜９０％の塩基を有する；
（ｅ）第１標的核酸断片と、第２標的核酸断片と、第１核酸配列と、第２核酸配列と、第３核酸配列と、第４核酸配列と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するのに必要な有効量の試薬とを混合すること；並びに、
（ｆ）ＰＣＲを実施すること；を含む、前記方法。
【請求項２】
工程（ｆ）は、
（ｆ１）（ｅ）の混合物中でＤＮＡポリメラーゼを活性化しＤＮＡを変性させること；および、
（ｆ２）（ｆ１）の混合物を、変性、アニーリング、及びプライマー伸長工程のＰＣＲサイクルに複数回かけて増幅産物を得ること；を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｆ）は、
（ｆｉ）（ｅ）の混合物中でＤＮＡポリメラーゼを活性化しＤＮＡを変性させること；
（ｆｉｉ）（ｆｉ）の混合物を、変性、アニーリング、及びプライマー伸長工程のＰＣＲサイクルに少なくとも２回かけること；および
（ｆｉｉｉ）工程（ｆｉｉ）におけるものよりも高いアニーリング温度にて、（ｆｉｉ）の混合物を、変性、アニーリング、及びプライマー伸長工程のＰＣＲサイクルに複数回かけて増幅産物を得ること；を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｆｉｉｉ）におけるアニーリング温度は、工程（ｆｉｉ）におけるアニーリング温度よりも４〜３５℃高い、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第３タグ（ｔ３）と前記第２タグ（ｔ２）は同一の配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第３タグ（ｔ３）の配列と前記第２タグ（ｔ２）の配列はいずれも前記第１タグ（ｔ１）の配列と異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｆ１＾はＦ１配列の５’末端からＦ１配列の３〜３０塩基を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｆ１＾はＦ１配列の５’末端からＦ１配列の３〜３０塩基を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
Ｆ１＾はＦ１配列の５’末端からＦ１配列の４０〜９０％の塩基を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｆ１＾はＦ１配列の５’末端からＦ１配列の４０〜９０％の塩基を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
Ｆ１、Ｒ１、Ｆ２、Ｒ２は、遺伝子特異的プライマーである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーダイマーの増幅を低減する方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して作成日が２０１６年６月１６日でサイズが３．１４キロバイトであるＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔというファイル名の、ＡＳＣIIフォーマット済テキストファイルとして明細書と共に同時に提出されている。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してファイルされた配列表は、本明細書の一部であり、そして参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
マルチプレックスＰＣＲは、単一のＰＣＲ混合物において異なるＤＮＡ配列に対して特異的なアンプリコンを生成するための複数のプライマーセットから構成される。一度に複数の遺伝子を標的にすることにより、追加的な情報が単一のテストランから得られる。さもなくば、数回実行するための試薬及び努力が必要であろう。
【０００４】
マルチプレックスＰＣＲの分析感度を低減しかねない主な障害の１つは、プライマーダイマー（ＰＤ）の蓄積である。ＰＤは、互いにハイブリダイズするプライマー分子から構成される。これは特にプライマーの３’末端の塩基が相補的であるために起こる。マルチプレックスＰＣＲ反応では多くのプライマー対が非常に高濃度で存在するので、プライマーダイマーの形成の機会が高くなる。一旦形成されると、短いＰＤは非常に効率的に増幅される傾向があり、プライマーその他の試薬を大量に消費することにより所望するＤＮＡ配列の増幅を阻害しかねない。ＰＤ形成は、様々なアプローチ、例えば特殊なプライマー設計及び修飾法、ホットスタートＴａｇポリメラーゼ、ＰＣＲ添加剤及び最適化ＰＣＲサイクリング条件を組み合わせて使用することにより低減し得る。
【０００５】
ＰＤ形成を低減するために種々なプライマー設計及び修飾法が報告されている。Brownie et al. (Nucleic Acids Res, 25(16): 3235-41, 1997）には、ＨＡＮＤＳ（Homo-Tag Assisted Non-Dimer System）が記載されている。ＨＡＮＤＳ  ＰＣＲにおいては、すべての標的特異的プライマーは低濃度で５’末端に共通テール配列を含み、高濃度の単一テール特異的プライマーと混合される。少なくとも２サイクルの標的特異的ＰＣＲの後、次の増幅サイクルのためにアニーリング温度を上げる。次の増幅サイクルはテール特異的プライマーにより完全に駆動される。従って、所望のアンプリコン及びＰＤ等の副産物を含む全ＰＣＲ産物由来の一本鎖は、相補的な５’及び３’末端を有し、これにより同じステムループ構造の形成へとつながる。テール配列の濃度は局所的に高いため、ＰＤなどの短い産物で形成されるステムループ構造は非常に安定であり、続くテール特異的プライマーのアニーリングよりも強いので、ＰＤ増幅が阻害される。しかしながら、全てのプライマーの各末端のテール配列が同一なので、この方法では、標的アンプリコンの長さが、真の標的産物におけるステムループの阻害効果が最小になるのに十分であることが必要である。高マルチプレックスＰＣＲにおける標的アンプリコンの長さ及び組成により、各アンプリコンのステムループの緊密度は異なるので、著しく不均衡な増幅となってしまう。さらに、ステムループは、長いプライマー間のＰＤ形成を阻害するのに十分なほど安定ではない。
【０００６】
米国特許第５，７９２，６０７号（Backman et. al.）及び米国特許出願公開番号第２０１４０３２９２４５号は、特異的プライマー鋳型ハイブリダイゼーションにおいてプライマーを活性化するために、プライマーの修飾非伸長性３’を切断するエンドヌクレアーゼＩＶを使用する方法を開示する。Dobosy et al.（BMC Biotechnol. 11: 80, 2011）は、プライマー鋳型特異的ハイブリダイゼーションにおいてプライマーを活性化するために、ブロックされたプライマーの３’末端の近くに位置する単一のＲＮＡ塩基を切断するＲＮＡｓｅＨを用いる、ＲＮａｓｅＨ−依存性ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）法を報告している。この方法は、ＩＤＴ（Integrated DNA Technologies）により、最近商品化された（米国特許出願公開番号第２００９／０３２５１６９号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３０４１３）。それらのアプローチは全て、プライマーにおける塩基の修飾及びプライマー活性化のための追加の酵素を必要とし、それらが高い費用をもたらす。
【０００７】
Peleg et al.（Appl. Environ. Microbiol., 75: 6393-6398, 2009；国際公開第２００９／００４６３０号）は、ＰＣＲにおけるＤＮＡ−ＲＮＡキメラプライマーがＰＤ形成を低減することを報告している。二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）プライマー（Seegene Technologies）は、ＰＣＲのＰＤ形成を低減することが報告されている（Chun et al., Nucleic Acids Res. 35(6): e40, 2007）。ＤＰＯは、ポリデオキシイノシンリンカーにより結合される２つの別々のプライミング領域（５’末端安定化因子及び３’末端決定因子）から構成される。ＰＤ等のプライマー非特異的ハイブリダイゼーションは、ポリデオキシイノシンリンカーの弱い水素結合から構成される「バブル（ｂｕｂｂｌｅ）様構造」のために、ＤＰＯプライマーの３’末端で低減される。キメラプライマーの上記ＲＮＡ塩基及びＤＰＯプライマーにおけるポリデオキシイノシンリンカーにより、プライマー構造が非常に複雑になり費用が非常に高くなる。
【０００８】
Scatterfield（J. Mol. Diagn., 16: 163-173, 2013）は、ポリエチレンブリコールリンカーを介して５’と５’又は５’と３’の何れかで連結される２つのＤＮＡ配列から構成される協同的プライマー（cooperative primers）を報告している。その結果は、協同的プライマーを用いるシングルプレックスＰＣＲ反応により、プライマープライマー増幅が非常に低減しプライマーダイマーは付加的にしか存在しないことを示唆する。
【０００９】
それらの努力にもかかわらず、ＰＤ形成は、未だマルチプレックスＰＣＲの大きな課題である。特に、次世代シーケンシング（next generation sequencing：ＮＧＳ）の適用において、数百又はさらに数千のプライマーが同じＰＣＲ反応プールに存在すると標的富化のためのマルチプレックスレベルは非常に高い。それらのプライマーは全てプライマーダイマーを形成しうる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、ｔ１Ｆ１、ｔ２Ｒ１、ｔ３Ｆ２、及びｔ１Ｆ１＾Ｒ２をプライマーとして使用する２つの標的配列を増幅するためのＰＣＲの第１サイクルと第２サイクルを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｆ１とＲ２との相互作用、プライマーダイマーの形成、増幅、及び阻害を示す。
【００１１】
【図２】図２は、３’末端において７個の相補的な塩基を有し、プライマーダイマーを形成するＦ１とＲ２を示す。
【００１２】
【図３】図３は、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動の結果を、一段階ＰＣＲ増幅は上部に、二段階ＰＣＲ増幅は下部に示す。レーン１：１プレックスアンプリコン１。レーン２：１プレックスアンプリコン２。レーン３〜８：プライマーｔ１＿Ｆ１＾ｘ＿Ｒ２を用いた２プレックス（ｘはそれぞれ０、３、６、９、１２、１５塩基である）。レーンＭ：５０塩基のＤＮＡラダー
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
「アンプリコン（アンプリコン）」とは、天然又は人工の増幅又は複製源及び／又は複製産物である、ＤＮＡ又はＲＮＡの一片である。これに関して、「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、遺伝子断片又は標的配列、特に１コピー又は２コピー以上のアンプリコンの生成を意味する。増幅反応産物として、アンプリコンは、一般的な実験用語、例えばＰＣＲ産物と互換的に使用される。
【００１４】
「プライマーダイマー（ｐｒｉｍｅｒ  ｄｉｍｍｅｒ）」（ＰＤ）は、ＰＣＲにおける副産物である。ＰＤは、プライマーにおける相補的塩基のために互いにハイブリダイズされるプライマー分子から構成される。
【００１５】
本発明は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーダイマーの増幅を低減する方法に関する。第１フォワードプライマー（Ｆ１）と第２リバースプライマー（Ｒ２）が３’末端に相補的な領域を有する場合、プライマーダイマー形成が起こり得る。プライマーの濃度が高い場合、相補的な領域が２〜３塩基程度に短くても、プライマーダイマー増幅が起こり得る。相補的な領域が少なくとも４〜５塩基の場合、望ましくないプライマーダイマー増幅はほぼ確実に起こる。
【００１６】
本方法は、第１フォワードプライマー（Ｆ１）と第２リバースプライマー（Ｒ２）が３’末端に相補的な領域を有する場合のプライマーダイマー形成の問題を低減する。本方法は、（ａ）第１タグ（ｔ１）と、第１標的核酸断片に相補的な第１フォワードプライマー（Ｆ１）とを含む第１核酸配列を得ること；（ｂ）第２タグ（ｔ２）と、前記第１標的核酸断片に相補的な第１リバースプライマー（Ｒ１）とを含む第２核酸配列を得ること；（ｃ）第３タグ（ｔ３）と、第２標的核酸断片に相補的な第２フォワードプライマー（Ｆ２）とを含む第３核酸配列を得ること；（ｄ）第１タグ（ｔ１）と、前記第２標的核酸断片に相補的な第２リバースプライマー（Ｒ２）と、前記第１タグ（ｔ１）と前記第２リバースプライマー（Ｒ２）との間に前記第１フォワードプライマーの５’末端部分配列（Ｆ１＾）または完全配列とを含む第４核酸配列を得ること；（ｅ）第１標的核酸断片と、第２標的核酸断片と、第１核酸配列と、第２核酸配列と、第３核酸配列と、第４核酸配列と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するのに必要な有効量の試薬とを混合すること；並びに、（ｆ）ＰＣＲを実施すること；を含む。
【００１７】
Ｆ１、Ｒ１、Ｆ２、Ｒ２は、ゲノムＤＮＡ（標的ＤＮＡ又はアンプリコン）の特異的領域に相補的な遺伝子特異的プライマーである。これらのプライマーの長さは、当業者によって選択できる。一般的には、遺伝子特異的プライマーは、６〜４０、１０〜５０、又は１０〜１００塩基長である。例えば、遺伝子特異的プライマーは、１５〜３０塩基長であり得る。
【００１８】
Ｆ１＾は、Ｒ２プライマーの５’末端がタグ付けされたＦ１プライマー配列の５’部分である。Ｆ１＾はＦ１の完全配列又は部分配列であり得る。Ｆ１＾の長さは相補的な塩基にハイブリダイズする融解点に影響するＧＣ含量に依存する。一実施形態では、Ｆ１＾の部分配列はＦ１よりも１〜２０、１〜１０、又は１〜５塩基短い。一実施形態では、Ｆ１＾の部分配列はＦ１配列の１０〜５０、２０〜８０、３０〜７０、４０〜９０、又は５０〜９０％を含む。別の一実施形態では、Ｆ１＾の部分配列は３〜３０、又は５〜２０、又は８〜１５塩基を含む。
【００１９】
タグｔ１、ｔ２、及びｔ３は、標的ＤＮＡに結合しないユニバーサルタグ配列である。一実施形態では、タグｔ２とｔ３は同一の配列を有する。別の一実施形態では、ｔ２とｔ３は異なる、つまり、１００％同一ではない。タグｔ２とｔ３はいずれもタグｔ１と異なる。各タグは、遺伝子特異的プライマーの５’末端に存在する。本発明では、タグ配列は少なくとも３塩基長であり、５〜１００、３〜４０、又は１０〜３０塩基長であり得る。タグは典型的には少なくとも５℃〜タグ付けされていない遺伝子特異的なプライマーの融解温度で添加するように設計されている。タグ配列は、修飾又は非修飾の核酸であり得る。多くの修飾塩基（例えば、ロックされた核酸又はペプチド核酸）は、対応する天然塩基よりも高いアニーリング温度を有する。種々の理由により短いタグ配列が望ましい場合、天然塩基に代えて修飾塩基を使用し得る。
【００２０】
図１Ａと１Ｂは例示目的で使用され、本発明を限定する意味では使用されない。図１Ａは、重複する領域を有さない２つの標的配列を用いた典型的なＰＣＲ増幅を示す。図１ＢはＦ１とＲ２プライマーによるＰＤ形成、及びステムループ構造によるＰＤ蓄積の阻害を示す。
【００２１】
図１Ｂは、如何にして本発明がプライマーダイマーの対数的増幅を防止するか図示する。図１Ｂでは、フォワードプライマーＦ１とリバースプライマーＲ２がそれぞれの３’末端において相補的な領域を有する。サイクル１後、ＰＤ鎖１とＰＤ鎖２が形成される。サイクル２の左側において、ＰＤ鎖２は、ｔ１とＦ１＾がそれぞれ相補的な相手とアニーリングしてステムを形成し残りの塩基がループを形成するステムループ構造を形成する。ｔ１およびＦ１＾はそれぞれ相補的な相手に対し局所的に濃度が高い、つまり、それらは同じＰＤ鎖２上にあり互いに近くに存在するので、別個に存在するｔ１Ｆ１プライマーとアニーリングするよりもステムループの形成が起こりやすい。従って、更なるプライマーのアニーリングがブロックされ、ＰＤ鎖２の更なる増幅産物が得られなくなる。Ｆ１＾の存在は、プライマー（ｔ１＿Ｆ１）がＰＤ鎖２へアニーリングし、ＰＤ鎖２が増幅されるのを完全にブロックするに重要である。Ｆ１＾が無いと、プライマーｔ１＿Ｆ１は、ｔ１のみを含有するステム構造に打ち勝ち、ＰＤ鎖２にアニーリングしてしまう可能性がある。Ｆ１＾を加えると、プライマーｔ１＿Ｆ１はｔ１＿Ｆ１＾を含有するステム構造にもはや打ち勝てずＰＤ鎖２にアニーリングできなくなる。
【００２２】
図１Ｂのサイクル２の右側において、ＰＤ鎖２と同様に、ＰＤ鎖１も、ｔ１とＦ１＾がそれぞれ相補的な相手とアニーリングしてステムを形成し残りの塩基がループを形成するステムループ構造を形成する。タグ付けされたＲ２プライマー（ｔ１＿Ｆ１＾＿Ｒ２）の長さのほうが長く融解点も高いので、このプライマーはステムにおけるｔ１＿Ｆ１＾に打ち勝ちアニーリングし、ＰＤ鎖１をリニアに増幅してしまう可能性がある。図１Ｂは、ｔ１Ｆ１及びｔ１＿Ｆ１＾＿Ｒ２のプライマー設計を用いる本発明では、多くとも１本の鎖についてリニアに増幅されてしまうことがあっても、ＰＤが累積的に増幅されることはないことを示す。
【００２３】
本方法の工程（ｆ）では、ＰＣＲを一段階（１つのサイクル条件）又は二段階（２つの異なるサイクル条件）として実施できる。二段階ＰＣＲでは、アニーリング温度を第２サイクル条件において上げ、更にプライマーダイマー形成を低減する。
【００２４】
一段階ＰＣＲでは、ＰＣＲは（ｆ１）（ｅ）の混合物中でＤＮＡポリメラーゼを活性化しＤＮＡを変性させること；及び（ｆ２）（ｆ１）の混合物を、変性、アニーリング、及びプライマー伸長工程のＰＣＲサイクルに複数回かけて増幅産物を得ることを含む。
【００２５】
二段階ＰＣＲでは、ＰＣＲは（ｆｉ）（ｅ）の混合物中でＤＮＡポリメラーゼを活性化しＤＮＡを変性させること；（ｆｉｉ）（ｆｉ）の混合物を、変性、アニーリング、及びプライマー伸長工程のＰＣＲサイクルに少なくとも２回かけること；および（ｆｉｉｉ）工程（ｆｉｉ）におけるものよりも高いアニーリング温度にて、（ｆｉ）の混合物を、変性、アニーリング、及びプライマー伸長工程のＰＣＲサイクルにかけて増幅産物を得ること；を含む。
【００２６】
二段階ＰＣＲでは、工程（ｆｉｉ）において、核酸と試薬の混合物を、変性、アニーリング、及びプライマー伸長工程のＰＣＲサイクルに少なくとも２回、例えば２回〜５回かける。（ｆｉｉｉ）工程では、（ｆｉｉ）におけるものよりも高いアニーリング温度にて、（ｆ）の混合物を、変性、アニーリング、及びプライマー伸長工程のＰＣＲサイクルにより多い回数かける。例えば、工程（ｆｉｉｉ）におけるアニーリング温度は、工程（ｆｉｉ）におけるアニーリング温度よりも約４〜３５℃、又は５〜２５℃、又は６〜２０℃、又は６〜１５℃高い。例えば、第１サイクル（工程ｆｉｉ）のアニーリング及び伸長の第１温度が５８〜６２℃、例えば６０℃の場合、第２サイクル（工程ｆｉｉｉ）のアニーリング及び伸長の第２温度は６６〜７０℃、例えば６８℃である。
【００２７】
二段階ＰＣＲでは、第二段階（工程ｆｉｉｉ）におけるアニーリング温度を上昇させてプライマーダイマーの開始が繰り返されるのを防ぐ。ＰＣＲの第一段階（工程ｆｉｉ）後、各増幅標的配列の産物の両端にタグ付けすることで伸長し、これにより、アニーリング領域はタグの分長くなる。従って、第二段階でアニーリング温度を上昇させてもプライマーが特異的標的ＤＮＡにアニーリングするのに影響しない。しかし、第二段階でアニーリング温度を上昇させると相補的な領域が同じ長さのままであるプライマーダイマーの開始が低減される。
【００２８】
下記の実施例により本発明を更に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２９】
表１は、以下の実施例で使用するオリゴヌクレオチド配列を示す。
【００３０】
【表１】
0006310099.tif 000002
【００３１】
表１におけるオリゴ１〜４は、タグ配列が付されていないＢＲＣＡ１遺伝子アンプリコン１とアンプリコン２の標的特異的プライマーである。アンプリコン１とアンプリコン２は重複する配列を有さない。オリゴ５〜６はＩｌｌｕｍｉｎａＴＳＣＡタグ配列から得たタグ配列である。オリゴ７〜１５は実施例１〜３で使用したタグ付けされたプライマーである。
【００３２】
Ｆ１とＲ２は３’末端において７個の相補的な塩基を有し、図２に示すようなヘテロダイマーを形成する。
【００３３】
表２は、ＰＤを含むアンプリコンのサイズとヒト第１９染色体における位置を示す。
【００３４】
【表２】
0006310099.tif 000003
【００３５】
表３は実施例１、２、及び３におけるプライマーの組み合わせ情報を示す。
【００３６】
【表３】
0006310099.tif 000004
【００３７】
実施例１：一段階ＰＣＲ増幅
遺伝子特異的ＰＣＲのＰＣＲ反応混合物２５μＬには、典型的に以下のものが含まれる：２μＬのヒトゲノムＤＮＡ（ＰｒｏｍｅｇａＣａｔ＃Ｇ３０４１（低ＴＥ緩衝液（ＵＳＢＣａｔ＃７５７９３））を用いて５ｎｇ／μＬに希釈）、１２．５μＬの２×ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＱｉａｇｅｎＣａｔ＃２０６４１３）、８．５μＬヌクレアーゼフリー水、及び２μＬの遺伝子特異的プライマーミックス（各２．５μＭ、表３のミックス情報および表１のオリゴヌクレオチド配列を参照のこと）。
【００３８】
１プレックスと２プレックスＰＣＲ反応のいずれもサーマルサイクラーにて以下のように実施した。
１サイクル    ９５℃  １５分  酵素活性化と初回ＤＮＡ変性
３０サイクル  ９５℃  ３０秒  変性
６０℃  ９０秒  アニーリング／伸長
１サイクル    ７２℃  ５分    最終的な伸長
１サイクル      ８℃  保持
【００３９】
本実施例では、サイクルにおけるアニーリング温度と伸長温度は一定のままなので一段階ＰＣＲ増幅と称する。
【００４０】
実施例２：二段階ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ反応ミックスは実施例１で使用したものと同じだが、二段階ＰＣＲはサーマルサイクラ−のサイクルプロトコルが異なる。最初の５サイクルのアニーリングと伸長は、実施例１と同じ６０℃で実施した。これに続く２５サイクルのアニーリングと伸長は、プライマーダイマー形成の開始を阻害するために温度を上げて６８℃で実施した。
【００４１】
二段階ＰＣＲプロトコルを以下に示す。
１サイクル    ９５℃  １５分  酵素活性化と初回ＤＮＡ変性
５サイクル    ９５℃  ３０秒  変性
６０℃  ９０秒  アニーリング／伸長
２５サイクル  ９５℃  ３０秒  変性
６８℃  ９０秒  上昇させた温度にてアニーリング／伸長
１サイクル    ７２℃    ５分  最終的な伸長
１サイクル      ８℃          保持
【００４２】
実施例３：アガロースゲル電気泳動
ＰＣＲ産物をＥ−Ｂａｓｅデバイス（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。２μＬの各ＰＣＲ産物を１８μＬのヌクレアーゼフリー水と混合し、２％Ｅゲルに直接載せた。希釈ＰＣＲ産物と５０ｂｐＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃１０４８８〜０４３）のＤＮＡ電気泳動を行った。泳動の最後にゲルのデジタル画像をＥ−ｇｅｌＩｍａｇｅｒ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で撮影した。結果を図３に示す。
【００４３】
図３において、上図は一段階ＰＣＲプロトコル（実施例１）の結果を示し、下図は二段階ＰＣＲプロトコル（実施例２）の結果を示す。レーン１と２は１プレックスＰＣＲであり、それぞれ標的アンプリコン１と２のサイズを示す。残りの反応は全て２プレックスＰＣＲである（レーン３〜８）。これらの２つのアンプリコンが一緒にマルチプレックスされた場合、Ｆ１とＲ２の３’末端における強い相互作用により、Ｆ１＋Ｒ２ダイマーアンプリコンが形成され一段階と二段階ＰＣＲ条件の両方のＰＣＲ反応において優勢になる（レーン３に示すように）。レーン４〜８に示すＰＤにおいて形成されるステム構造は、それぞれＦ１配列の５’末端部分の３、６、９、１２及び１５塩基とｔ１配列（２０ｎｔ）を含む。部分Ｆ１配列を導入するとレーン４〜８にて検出されるダイマー量がレーン３（Ｆ１配列無）に比べて低かった。ダイマー増幅が十分に阻害されると、標的アンプリコンが検出可能になる（上図のレーン６および下図のレーン５）。両図のレーン７〜８のようにダイマー増幅がほぼ完全に阻害されると、標的アンプリコンの２つの産物が反応で優勢になる。
【００４４】
本発明ならびにその製造及び使用の方法及び工程は、当業者にとってその製造及び使用が可能なほど十分、明確、簡潔、且つ正確な用語で記載されている。本明細書は本発明の好ましい実施形態を記載し、そしてその改変は特許請求の範囲に記載される発明の範囲から逸脱することなく、本明細書中で行われ得ることが理解されるべきである。本発明に関する主題を特定し明確に請求すべく以下の特許請求の範囲をもって本明細書を完了する。
【図１Ａ】
0006310099.tif 000005
【図１Ｂ】
0006310099.tif 000006
【図２】
0006310099.tif 000007
【図３】
0006310099.tif 000008
【配列表】
0006310099000001.app