(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質が、
（ａ）配列番号９のアミノ酸２１〜５０６
（ｂ）配列番号９のアミノ酸２２〜５０６
（ｃ）配列番号９のアミノ酸２３〜５０６
（ｄ）配列番号９のアミノ酸２１〜５０５
（ｅ）配列番号９のアミノ酸２２〜５０５
（ｆ）配列番号９のアミノ酸２３〜５０５
（ｇ）配列番号１１のアミノ酸２１〜５０６
（ｈ）配列番号１１のアミノ酸２２〜５０６
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸２３〜５０６
（ｊ）配列番号１１のアミノ酸２１〜５０５
（ｋ）配列番号１１のアミノ酸２２〜５０５
（ｌ）配列番号１１のアミノ酸２３〜５０５
（ｍ）配列番号１３のアミノ酸２１〜５０９
（ｎ）配列番号１３のアミノ酸２２〜５０９
（ｏ）配列番号１３のアミノ酸２３〜５０９
（ｐ）配列番号１３のアミノ酸２１〜５０８
（ｑ）配列番号１３のアミノ酸２２〜５０８
（ｒ）配列番号１３のアミノ酸２３〜５０８
（ｓ）配列番号３１のアミノ酸２１〜５２８
（ｔ）配列番号３１のアミノ酸２２〜５２８
（ｕ）配列番号３１のアミノ酸２３〜５２８
（ｖ）配列番号３１のアミノ酸２１〜５２７
（ｗ）配列番号３１のアミノ酸２２〜５２７
（ｘ）配列番号３１のアミノ酸２３〜５２７、および
（ｙ）（ａ）〜（ｘ）のうちのいずれか１つの前記アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、アミロイドに結合することが可能である変異体またはバリアント
から選択されるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
（ｙ）の変異体またはバリアントが、（ａ）〜（ｘ）のうちいずれか１つの前記アミノ酸配列と比較して１０個以下のアミノ酸相違を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
（ｙ）の変異体またはバリアントが、（ａ）〜（ｘ）のうちのいずれか１つの前記アミノ酸配列と比較して、最大で５個のアミノ酸置換を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記融合タンパク質が、配列番号１３のアミノ酸２１〜５０９、または最大で５個のアミノ酸置換を有するその変異体またはバリアントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記融合タンパク質が、配列番号１３のアミノ酸２２〜５０９、または最大で５個のアミノ酸置換有するその変異体またはバリアントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記融合タンパク質が、配列番号１３のアミノ酸２３〜５０９、または最大で５個のアミノ酸置換有するその変異体またはバリアントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記融合タンパク質が、配列番号１３のアミノ酸２１〜５０８、または最大で５個のアミノ酸置換有するその変異体またはバリアントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記融合タンパク質が、配列番号１３のアミノ酸２２〜５０８、または最大で５個のアミノ酸置換有するその変異体またはバリアントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、配列番号１３のアミノ酸２３〜５０８、または最大で５個のアミノ酸置換有するその変異体またはバリアントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記融合タンパク質が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号３１よりもヒトにおいて免疫原性が低い、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の治療有効量の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
治療を必要とする患者において、治療を行うための医薬の製造のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１３】
患者において疾患または状態を治療するための医薬の製造のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用であって、前記疾患または状態は、アルツハイマー病、早発性アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、発症前アルツハイマー病、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイド症、シスタチンＣ、遺伝性アイスランド症候群、老衰；多発性骨髄腫；プリオン病、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、またはＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイドーシス、前頭側頭葉型認知症、イギリス型／デンマーク型認知症、および家族性脳症から選択される、使用。
【請求項１４】
バイオマーカーが陽電子放出断層撮影において造影剤として使用されるとき、前記患者がバイオマーカーフロルベタピルに対して陽性である、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記疾患または状態が、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病である、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１７】
配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号３２から選択される、請求項１６に記載の核酸配列。
【請求項１８】
請求項１６または請求項１７に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞が、ピキア細胞、サッカロミセス細胞、アスペルギルス細胞、大腸菌細胞、ＮＳＯ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞、ＣＯＳ細胞、およびＨｅＬａ細胞からなる群より選択される、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＨＥＫ２９３由来細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞またはＣＨＯ由来細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１８に記載のベクター内の核酸によってコードされる融合タンパク質を発現することと、前記発現されたタンパク質を単離することと、を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を作製する方法。
【請求項２４】
治療を必要とする患者において、治療を行うための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む組成物。
【請求項２５】
患者において疾患または状態を治療するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む組成物であって、前記疾患または状態は、アルツハイマー病、早発性アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、発症前アルツハイマー病、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイド症、シスタチンＣ、遺伝性アイスランド症候群、老衰；多発性骨髄腫；プリオン病、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、またはＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイドーシス、前頭側頭葉型認知症、イギリス型／デンマーク型認知症、および家族性脳症から選択される、組成物。
【請求項２６】
バイオマーカーが陽電子放出断層撮影において造影剤として使用されるとき、前記患者がバイオマーカーフロルベタピルに対して陽性である、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記疾患または状態が、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病である、請求項２５または２６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、糸状バクテリオファージｇ３ｐのタンパク質のアミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質、またはこのようなアミロイド結合フラグメントの変異体またはバリアント形態に関する。このような融合タンパク質をコードする核酸分子および構築物、このような核酸分子で形質転換された細胞、およびこのような融合タンパク質を組み換えにより作製する方法が包含される。加えて、本発明は、本明細書で開示されている融合タンパク質を含む薬学的組成物と、全身性および限局性アミロイド病、神経変性タウオパチーを含む神経変性疾患、伝達性海綿状脳症（プリオン関連疾患）などの、関連するアミロイド負荷を減少させるためのこのような組成物の治療的および予防的な使用に関する。これらの疾患と関連するアミロイド負荷の蓄積を予防するためのこれらの組成物の使用、およびアミロイドを検出し、故にこのような疾患を診断するための診断としてのこれらの組成物の使用も包含される。
【０００２】
糸状バクテリオファージＭ１３および関連糸状ファージは、タンパク質ミスフォールディング病の動物モデルにおいて有用性を示し、したがって、タンパク質ミスフォールディング病に対する潜在的な治療分類を表す。その全体が参照により本明細書に援用される米国特許公開第２０１１／０１４２８０３号を参照されたい。特に、糸状バクテリオファージは、脳において既に形成されたアミロイドのクリアランスを媒介する能力を有することが発見されている。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される国際公開第ＷＯ２００６０８３７９５号および国際公開第ＷＯ２０１００６００７３号を参照されたい。
【０００３】
Ｍ１３ファージ（ファージのＦｆファミリーメンバー）は、４０６個のアミノ酸の成熟型ｇ３ｐを有する。ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿５１０８９１．１は、１８残基のアミノ末端のシグナル配列を含む参照配列を提供する。公開された配列と比較してアミノ酸相違を有する変異が一般的である。Ｉファミリーの糸状ファージは、Ｆｆファミリーメンバーと異なるｇ３ｐを有するが、ファミリーｇ３ｐ間でさえ依然高度に保存されている（Ｓｔａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ（１９９２）３４：１４１−５２）。
ｇ３ｐの結晶構造は入手可能である（Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９８）７（６）７１１−７２２）。タンパク質は、可撓性のグリシンに富むリンカー配列により分離される３個の折り畳みドメインを含む。相互作用してＮ１−Ｎ２複合体を形成する、２６２個のアミノ酸を含む２個のアミノ末端ドメインであるＮ１およびＮ２が存在する。カルボキシ末端（ＣＴ、Ｎ３とも呼ばれる）ドメインは、１４６個のアミノ酸であり、それは、ｇ８ｐとの疎水性相互作用によりファージ粒子においてアンカーｇ３ｐに作用する（Ｍａｒｖｉｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）８：１５０−１５８）。Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２８８（４）：６４９−５７のＮ１−Ｎ２ドメイン融合タンパク質２ｇ３ｐを用いて調製される公的に利用可能なリボン構造が、図１に提示される。
【０００４】
大抵のタンパク質とは異なり、Ｎ１およびＮ２ドメインの潜在的な「ロックされた」形態からのアンフォールディングは、天然の生物学的活性を獲得するためにｇ３ｐに必要とされる（Ｅｃｋｅｒｔ  ＆  Ｓｃｈｍｉｄ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７）３７３：４５２−４６１）。感染の初期ステップにおいて、Ｎ２は、細菌のＦ−線毛にＮ２の外縁上の残基を介して結合する（Ｄｅｎｇ  ＆  Ｐｅｒｈａｍ，２００２）。Ｎ２によるこの初期結合は、Ｎ１−Ｎ２複合体を「開口すること」によりｇ３ｐを「アンロック」し、次いで、Ｎ１が共受容体ＴｏｌＡに結合することを可能にする。ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２フラグメントにおいて、Ｎ２が展開する初期アンロックステップのための熱転移は融点（ＴＭ）４８．１℃で生じる。プロセスの一部は、Ｇｌｎ２１２−Ｐｒｏ２１３ペプチド結合での異性化を含む。Ｐｒｏ２１３変換は、アンロックされた状態でトランスある。Ｎ１は、ＴＭ６０．２℃で生じる第２のステップまで安定的に折り畳まれたままである（Ｅｃｋｅｒｔ  ＆  Ｓｃｈｍｉｄ，２００７において概説される）。
Ｎ１−Ｎ２フラグメントにおける変異を用いて、種々の変異体の安定性および感染性が研究されてきた（Ｅｃｋｅｒｔ  ＆  Ｓｃｈｍｉｄ，２００７）。「３Ａ」と命名された１つのバリアントは、線毛結合を害し、Ｎ２ドメインの安定性を減少させた。この変異のため、ＴＭは４２．６℃まで下げられる。３Ａは、次の変異：Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、およびＦ１９４Ａを担持する。Ｎ２における別の変異体Ｇ１５３Ｄは、Ｎ２を不安定化し、ＴＭを４４．４℃まで低減した。Ｑ１２９Ｈ変異体は、Ｎ２を安定化し、ＴＭを５１．４℃まで増大させた。ＩＹバリアントは、ヒンジにおける変異Ｔ１０１ＩおよびＤ２０９Ｙを含有し、Ｎ１−Ｎ２フラグメントの安定性を増大させる（ＴＭ＝５６．５℃）。ＩＨＹは、変異Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、およびＤ２０９Ｙを含有する（ＴＭ＝６０．１℃）。ＩＩＨＹは、変異Ｔ１３Ｉ、Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、およびＤ２０９Ｙを含有する（ＴＭ＝６１．８℃）。Ｑ１２９Ｙ変異およびＴ１３Ｉ変異の両方が安定化し、これらの変異の追加は更に融点ＴＭを増大させる。ファージ感染性は、ｇ３ｐ内のドメイン相互作用の強さと逆に変動した（Ｅｃｋｅｒｔ  ＆  Ｓｃｈｍｉｄ，２００７）。Ｎ２ドメインの欠損（ファージｆｄ（ΔＮ２））は、ＴｏｌＡのＮ１結合に対するＮ２ドメインの阻止効果を除去することにより、感染性を増大させた（同上）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００６／０８３７９５号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０６００７３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｔａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ（１９９２）３４：１４１−５２
【非特許文献２】Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９８）７（６）７１１−７２２
【非特許文献３】Ｍａｒｖｉｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）８：１５０−１５８
【非特許文献４】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２８８（４）：６４９−５７
【非特許文献５】Ｅｃｋｅｒｔ  ＆  Ｓｃｈｍｉｄ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７）３７３：４５２−４６１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
最近、ｇ３ｐはまた、ファージが細菌を感染させるプロセスに類似する方法でアミロイドに対する糸状ファージの結合を媒介することが発見された。国際公開第ＷＯ２０１３／０８２１１４号は、ファージｇ３ｐがアミロイド線維と直接結合すること、およびファージ媒介脱凝集がこの初期結合ステップに依存することを開示している。Ｇ３Ｐが結合糸状ファージ媒介アミロイドに関与するという認識は、治療および診断の新しい分類のための基礎を提供する。本発明は、これらの治療用および診断用組成物、ならびに、アミロイド凝集に関連する疾患および障害の発症を検出、診断、治療、予防、または遅らせるためにそれらを使用する方法を提供する。
【０００８】
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質であって、ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸２１〜２３８、配列番号９のアミノ酸２２〜２３８、または配列番号９のアミノ酸２３〜２３８、
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸２１〜２３８、配列番号１１のアミノ酸２２〜２３８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜２３８、
（ｃ）配列番号１３のアミノ酸２１〜２３８、配列番号１３のアミノ酸２２〜２３８、または配列番号１３のアミノ酸２３〜２３８、
（ｄ）配列番号３１のアミノ酸２１〜２９６、配列番号３１のアミノ酸２２〜２９６、または配列番号３１のアミノ酸２３〜２９６、および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の前記アミノ酸配列の変異体またはバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
（項目２）
ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のうちのいずれかにおいて、対応するｇ３ｐアミノ酸と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
融合タンパク質であって、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントと、免疫グロブリンのＦｃフラグメントであって、
（ａ）配列番号９のアミノ酸２１〜５０６、配列番号９のアミノ酸２２〜５０６、配列番号９のアミノ酸２３〜５０６、配列番号９のアミノ酸２１〜５０５、配列番号９のアミノ酸２２〜５０５、または配列番号９のアミノ酸２３〜５０５、
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸２１〜５０６、配列番号１１のアミノ酸２２〜５０６、配列番号１１のアミノ酸２３〜５０６、配列番号１１のアミノ酸２１〜５０５、配列番号１１のアミノ酸２２〜５０５、配列番号１１のアミノ酸２３〜５０５、
（ｃ）配列番号１３のアミノ酸２１〜５０９、配列番号１３のアミノ酸２２〜５０９、配列番号１３のアミノ酸２３〜５０９、配列番号１３のアミノ酸２１〜５０８、配列番号１３のアミノ酸２２〜５０８、または配列番号１３のアミノ酸２３〜５０８、
（ｄ）配列番号３１のアミノ酸２１〜５２８、配列番号３１のアミノ酸２２〜５２８、配列番号３１のアミノ酸２３〜５２８、配列番号３１のアミノ酸２１〜５２７、配列番号３１のアミノ酸２２〜５２７、または配列番号３１のアミノ酸２３〜５２７、および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の前記アミノ酸配列の変異体またはバリアントから選択される、免疫グロブリンのＦｃフラグメントと、を含む、融合タンパク質。
（項目４）
ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号３１、または配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のＮ、Ｃ、もしくはＮおよびＣ末端切断形態のうちのいずれかにおいて、対応するアミノ酸と比較して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸置換を有する、項目１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目５）
ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが、配列番号９のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２３８、配列番号１１のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２３８、配列番号１３のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２３８、または配列番号３１のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２９６を含む、項目４に記載の融合タンパク質。
（項目６）
前記融合タンパク質が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号３１のＮ、Ｃ、もしくはＮおよびＣ末端切断形態よりもヒトにおいて免疫原性が低い、項目１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目７）
ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが、前記融合タンパク質の治療成分である、項目１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目８）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質であって、ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが配列番号１３のアミノ酸２１〜２３８を含む、融合タンパク質。
（項目９）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質であって、ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが配列番号１３のアミノ酸２２〜２３８を含む、融合タンパク質。
（項目１０）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質であって、ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが配列番号１３のアミノ酸２３〜２３８を含む、融合タンパク質。
（項目１１）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントと、免疫グロブリンのＦｃフラグメントと、を含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２１〜５０９を含む、融合タンパク質。
（項目１２）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２２〜５０９を含む、融合タンパク質。
（項目１３）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２３〜５０９を含む、融合タンパク質。
（項目１４）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２１〜５０８を含む、融合タンパク質。
（項目１５）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２２〜５０８を含む、融合タンパク質。
（項目１６）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２３〜５０８を含む、融合タンパク質。
（項目１７）
配列番号１３のアミノ酸２３〜５０８からなる融合タンパク質。
（項目１８）
項目１〜１７のいずれか一項に記載の治療有効量の前記融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
（項目１９）
アミロイドの低減、アミロイド形成の阻害、アミロイド凝集の阻害、または毒性オリゴマー形成の除去および／もしくは予防を必要とする患者において、それらを行う際に使用される、項目１８に記載の薬学的組成物。
（項目２０）
アルツハイマー病（早発性アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、および発症前アルツハイマー病を含む）、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイド症、シスタチンＣ、遺伝性アイスランド症候群、老衰、多発性骨髄腫、プリオン病（クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含む）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、またはＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイドーシス、前頭側頭葉型認知症、イギリス型／デンマーク型認知症、および家族性脳症から選択される疾患または状態を治療する際に使用される、項目１８または１９に記載の薬学的組成物。
（項目２１）
バイオマーカーが陽電子放出断層撮影において造影剤として使用されるとき、前記患者が前記バイオマーカーフロルベタピル（ｆｌｏｒｂｅｔａｐｉｒ）に対して陽性である、項目１８〜２０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
（項目２２）
前記疾患または状態が、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病である、項目１８〜２１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
（項目２３）
前記疾患または状態が、アルツハイマー病である、項目２２に記載の薬学的組成物。
（項目２４）
前記疾患または状態が、プリオン病である、項目１９に記載の薬学的組成物。
（項目２５）
前記プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、致死性家族性不眠症、およびゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群から選択される、項目２４に記載の薬学的組成物。
（項目２６）
アミロイドの減少を必要とする患者においてアミロイドを減少させる方法であって、前記患者に、項目１８に記載の有効量の前記薬学的組成物または項目１〜１７のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質を投与することを含む、方法。
（項目２７）
前記患者が、アミロイドの存在に関連する神経変性疾患の症状を呈する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
バイオマーカーが陽電子放出断層撮影において造影剤として使用されるとき、前記患者が前記バイオマーカーフロルベタピル（ｆｌｏｒｂｅｔａｐｉｒ）に対して陽性である、項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９）
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病である、項目２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記患者が、プリオン媒介疾患の症状を呈する、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
前記プリオン媒介疾患が、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、致死性家族性不眠症、およびゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群から選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のうちのいずれかにおいて、対応するアミノ酸と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、核酸配列。
（項目３４）
ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸２１〜２３８、配列番号９のアミノ酸２２〜２３８、または配列番号９のアミノ酸２３〜２３８、
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸２１〜２３８、配列番号１１のアミノ酸２２〜２３８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜２３８、
（ｃ）配列番号１３のアミノ酸２１〜２３８、配列番号１３のアミノ酸２２〜２３８、または配列番号１３のアミノ酸２３〜２３８、
（ｄ）配列番号３１のアミノ酸２１〜２９６、配列番号３１のアミノ酸２２〜２９６、または配列番号３１のアミノ酸２３〜２９６、および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のアミノ酸配列の変異体またはバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、項目３３に記載の核酸配列。
（項目３５）
（ａ）配列番号９のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０５もしくは５０６；配列番号１１のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０５もしくは５０６；配列番号１３のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０８もしくは５０９；または配列番号３１のアミノ酸２１、２２、または２３〜５２７もしくは５２８のうちのいずれか１つをコードし、５’末端で融合され、かつシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に対してインフレームで融合される核酸配列、または
（ｂ）（ａ）の前記核酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一の核酸配列を含む、（ａ）の前記核酸配列の変異体もしくはバリアント、
（ｃ）前記核酸によってコードされるｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号３１、または配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号３１のＮ、Ｃ、もしくはＮおよびＣ末端切断形態のうちのいずれかにおいて、対応するアミノ酸と比較して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸置換を有する、（ａ）の前記核酸の変異体またはバリアントを含む、項目３３または３４に記載の核酸配列。
（項目３６）
（ａ）配列番号２６、２７、２８、および３２の前記核酸、
（ｂ）配列番号２６、２７、２８、および３２と同一のポリペプチドに対して変性であるが、それらをコードする核酸配列、
（ｃ）前記シグナル配列をコードする前記核酸が除外される、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号３２の前記ヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２６または２７のうちのいずれかのヌクレオチド６１、６４、もしくは６７〜１５２１、配列番号２８のヌクレオチド６１、６４、もしくは６７〜１５２７、または配列番号３２のヌクレオチド６１、６４、もしくは６７〜１５８７、および
（ｅ）配列番号２６、２７、２８、および３２と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一の核酸配列を含む、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の核酸配列の変異体またはバリアントから選択される、項目３３〜３５のいずれか一項に記載の核酸配列。
（項目３７）
前記コードされた融合タンパク質が、配列番号９のアミノ酸２１〜５０６、配列番号１１のアミノ酸２１〜５０６、配列番号１３のアミノ酸２１〜５０９、または配列番号３１のアミノ酸２１〜５２８、または配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号３１のＮ、Ｃ、もしくはＮおよびＣ末端切断形態のうちのいずれか１つのバリアントであり、前記バリアントが、前記融合タンパク質の前記ｇ３ｐ部分に１〜２０個のアミノ酸置換を有することのみ、その対応するアミノ酸配列と異なる、項目３５または３６に記載の核酸配列。
（項目３８）
項目３３〜３７のいずれか一項の核酸配列を含む、ベクター。
（項目３９）
項目３８に記載の前記ベクターを含む、宿主細胞。
（項目４０）
前記宿主細胞が、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、動物細胞株、およびトランスジェニック動物細胞から選択される、項目３９に記載の宿主細胞。
（項目４１）
アミロイドに結合する融合タンパク質を作製する方法であって、項目３８に記載の前記ベクター内の前記核酸によってコードされる前記融合タンパク質を発現することと、前記発現されたタンパク質を単離することと、を含む、方法。
（項目４２）
項目３８に記載の前記ベクター内の前記核酸によってコードされる前記融合タンパク質を発現し、かつ前記発現されたタンパク質を単離することによって産生される、アミロイドに結合する融合タンパク質。
（項目４３）
前記融合タンパク質が、項目３９または項目４０に記載の前記宿主細胞を培養することによって発現される、項目４２に記載の融合タンパク質。
（項目４４）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが配列番号１３のアミノ酸２１〜２３８を含む、核酸配列。
（項目４５）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが配列番号１３のアミノ酸２２〜２３８を含む、核酸配列。
（項目４６）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ｇ３ｐの前記アミロイド結合フラグメントが配列番号１３のアミノ酸２３〜２３８を含む、核酸配列。
（項目４７）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２１〜５０９を含む、核酸配列。
（項目４８）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２２〜５０９を含む、核酸配列。
（項目４９）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２３〜５０９を含む、核酸配列。
（項目５０）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２１〜５０８を含む、核酸配列。
（項目５１）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２２〜５０８を含む、核酸配列。
（項目５２）
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２３〜５０８を含む、核酸配列。
（項目５３）
融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸２３〜５０８からなる、核酸配列。
本発明の更なる目的および利点は、一部は以下の記載で説明されるか、その記載から明らかであるか、または本発明の実施により獲得され得る。本発明の目的および利点は、添付の請求の範囲において具体的に指摘された要素および組み合わせにより実現され、達成される。前述の概要および次の詳細な記載は共に例示および説明のみであり、特許請求される本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ｇ３ｐのＮ１およびＮ２ドメイン、ならびにヒンジのリボン構造を表す。
【図２Ａ】異なる供給源由来のｇ３ｐのアライメントを表す。図２Ａは、共通配列（配列番号：４）を含む、ファージＭ１３（配列番号：１）、Ｆｄ（配列番号：２）、およびＦ１（配列番号：３）由来のｇ３ｐのアライメントである。図２Ｂは、Ｉ２−２とＩｋｅ（配列番号：７）間の共通配列に沿った、ファージＩ２−２（配列番号：５）およびＩｋｅ（配列番号：６）由来のｇ３ｐのアライメントを示す。図２Ｃは、ファージＩｆ（配列番号：８）由来のｇ３ｐのアミノ酸配列を表す。
【図２Ｂ】異なる供給源由来のｇ３ｐのアライメントを表す。図２Ａは、共通配列（配列番号：４）を含む、ファージＭ１３（配列番号：１）、Ｆｄ（配列番号：２）、およびＦ１（配列番号：３）由来のｇ３ｐのアライメントである。図２Ｂは、Ｉ２−２とＩｋｅ（配列番号：７）間の共通配列に沿った、ファージＩ２−２（配列番号：５）およびＩｋｅ（配列番号：６）由来のｇ３ｐのアライメントを示す。図２Ｃは、ファージＩｆ（配列番号：８）由来のｇ３ｐのアミノ酸配列を表す。
【図２Ｃ】異なる供給源由来のｇ３ｐのアライメントを表す。図２Ａは、共通配列（配列番号：４）を含む、ファージＭ１３（配列番号：１）、Ｆｄ（配列番号：２）、およびＦ１（配列番号：３）由来のｇ３ｐのアライメントである。図２Ｂは、Ｉ２−２とＩｋｅ（配列番号：７）間の共通配列に沿った、ファージＩ２−２（配列番号：５）およびＩｋｅ（配列番号：６）由来のｇ３ｐのアライメントを示す。図２Ｃは、ファージＩｆ（配列番号：８）由来のｇ３ｐのアミノ酸配列を表す。
【図３】ファージ結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）調査を表す。Ａβ原線維への結合を、Ａβモノマーへの結合と、バイオセンサーチップを横切って流した１０１４ファージ／ｍＬを用いて比較した。図３Ｂは、図３Ａに示すＳＰＲデータから計算したＫａ、Ｋｄ、およびＫＤを示す。
【図４】結合研究を提示する。図４は、増加モル量のｆＡβ４２を用いた２種のファージ用量（１０１１／ｍＬおよび１０１２／ｍＬ）についての直接結合アッセイを示す。図４Ｂは、結合競合研究であり、Ｍ１３結合のＫＤを決定する代替方法を提供する。構築物１を用いた。
【図５】アミロイド線維結合競合アッセイにおいて加熱変性（四角−９０℃、１０分間）対天然の構造（丸）Ｍ１３（構築物１）を用いた結合競合結果を示す。
【図６】２種の濃度のＭ１３ファージ（構築物１）の存在下または不在下でインキュベーションしたｆＡβ４２を用いたチオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光アッセイを示す。（構築物１）
【図７】ＴｈＴ脱凝集アッセイにおいて個々のアッセイパラメーターを変動する効果を示す。図７Ａは、２種の塩濃度（０．１５Ｍおよび１．５Ｍ）の存在下での脱凝集パーセンテージを示す。図７Ｂは、２種の温度（４℃および３７℃）で残存するｆＡβのパーセンテージを示す。構築物１を用いた。
【図８】ｆＡβ４２を用いたＭ１３アミロイド結合アッセイを表す。図８Ａは、Ｍ１３結合は、温度１８℃〜５８℃、３時間のインキュベーションを用いて報告された。図８Ｂは、３７℃対５０℃でのインキュベーションについての結合速度論を示す。
【図９−１】ファージとアミロイドの相互作用におけるｇ３ｐのタンパク質分解除去の効果を示す。タンパク質分解酵素ＡｒｇＣを用いて、ｇ３ｐをＭ１３ファージから取り出した（Ｍ１３Δｇ３ｐ）。図９Ａは、天然（ＡｒｇＣ処置ファージと同一であるが、タンパク質分解酵素処置なしで処置した）ファージと比較した、Ｍ１３Δｇ３ｐファージを用いたＡβ結合競合研究の結果を示す。図９Ｂは、天然ファージと比較したＭ１３Δｇ３ｐファージの感染性に対するＡｒｇＣ処置の効果を示す。図９Ｃは、脱凝集アッセイにおいて、ＡｒｇＣ処置ファージを天然ファージと比較する。
【図９−２】ファージとアミロイドの相互作用におけるｇ３ｐのタンパク質分解除去の効果を示す。タンパク質分解酵素ＡｒｇＣを用いて、ｇ３ｐをＭ１３ファージから取り出した（Ｍ１３Δｇ３ｐ）。図９Ａは、天然（ＡｒｇＣ処置ファージと同一であるが、タンパク質分解酵素処置なしで処置した）ファージと比較した、Ｍ１３Δｇ３ｐファージを用いたＡβ結合競合研究の結果を示す。図９Ｂは、天然ファージと比較したＭ１３Δｇ３ｐファージの感染性に対するＡｒｇＣ処置の効果を示す。図９Ｃは、脱凝集アッセイにおいて、ＡｒｇＣ処置ファージを天然ファージと比較する。
【図１０Ａ】本明細書において、組み換え可溶性Ｎ１Ｎ２（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）；「構築物３」）としても参照されるｇ３ｐのＮ１−Ｎ２フラグメント、Ｍ１３Δｇ３ｐ（ＡｒｇＣ処置）と、ｆＡβ４２への標識Ｍ１３結合の競合相手としてのＭ１３とを用いた結合競合アッセイの結果を示す。図１０Ｂは、競合アッセイの繰り返しを示す。
【図１０Ｂ】本明細書において、組み換え可溶性Ｎ１Ｎ２（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）；「構築物３」）としても参照されるｇ３ｐのＮ１−Ｎ２フラグメント、Ｍ１３Δｇ３ｐ（ＡｒｇＣ処置）と、ｆＡβ４２への標識Ｍ１３結合の競合相手としてのＭ１３とを用いた結合競合アッセイの結果を示す。図１０Ｂは、競合アッセイの繰り返しを示す。
【図１１】ファージｆｄ、ＩＩＨＹ、ＡＡＡ、およびＭ１３について競合データを示す。ファージｆｄ、ＡＡＡ、およびＩＩＨＹを、５０℃、１．５時間で予め活性化し、次いで、活性化および非活性化Ｆｄ、ＡＡＡ、およびＩＩＨＹを、３７℃、４５分間のインキュベーション中にＡβへの結合について標識Ｍ１３と競合する能力について比較した。
【図１２Ａ】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）の概略図を示す。図１２Ｂは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）についてのイオン交換プロファイルを示す。図１２Ｃは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を用いたゲル濾過アッセイの結果を示す。図１２Ｄは、ｇ３ｐおよびｇ８ｐ対照を伴った、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）のウエスタンブロットを示す。Ｍ１３ファージを、レーン１および２において陽性対照として泳動し、ｇ８ｐおよびｇ３ｐの両方を検出するポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。精製ｒｓ−ｇ３ｐを、レーン３および４において泳動し、同一のポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。
【図１２Ｂ】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）の概略図を示す。図１２Ｂは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）についてのイオン交換プロファイルを示す。図１２Ｃは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を用いたゲル濾過アッセイの結果を示す。図１２Ｄは、ｇ３ｐおよびｇ８ｐ対照を伴った、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）のウエスタンブロットを示す。Ｍ１３ファージを、レーン１および２において陽性対照として泳動し、ｇ８ｐおよびｇ３ｐの両方を検出するポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。精製ｒｓ−ｇ３ｐを、レーン３および４において泳動し、同一のポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。
【図１２Ｃ】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）の概略図を示す。図１２Ｂは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）についてのイオン交換プロファイルを示す。図１２Ｃは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を用いたゲル濾過アッセイの結果を示す。図１２Ｄは、ｇ３ｐおよびｇ８ｐ対照を伴った、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）のウエスタンブロットを示す。Ｍ１３ファージを、レーン１および２において陽性対照として泳動し、ｇ８ｐおよびｇ３ｐの両方を検出するポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。精製ｒｓ−ｇ３ｐを、レーン３および４において泳動し、同一のポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。
【図１２Ｄ】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）の概略図を示す。図１２Ｂは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）についてのイオン交換プロファイルを示す。図１２Ｃは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を用いたゲル濾過アッセイの結果を示す。図１２Ｄは、ｇ３ｐおよびｇ８ｐ対照を伴った、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）のウエスタンブロットを示す。Ｍ１３ファージを、レーン１および２において陽性対照として泳動し、ｇ８ｐおよびｇ３ｐの両方を検出するポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。精製ｒｓ−ｇ３ｐを、レーン３および４において泳動し、同一のポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。
【図１３】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）を用いたＳＰＲデータを示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）は、ｆＡβ４２にＫＤ約１６０ｎＭで強力に結合するが、モノマーと結合しない。
【図１４】所定の試料中に存在するアミロイドを測定するために用いられるＴｈＴ蛍光アッセイを示す。１０μＭのＡβ４２モノマーを、５種類の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）の存在下または不在下、３７℃で３日間インキュベーションした。３日目の終わりに形成された線維の量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定した。ＩＣ５０は約２０ｎＭであり、これは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）がＡβ４２線維の形成を強力に阻害することを示している。図はまた、結合が用量依存性であることを示す。繰り返された実験は、２０ｎＭ〜１００ｎＭの間でＩＣ５０’を示す。
【図１５Ａ】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）の存在下または不在下でのｆＡβ４２のインキュベーションの透過電子ミクロ組織検査（ＴＥＭ）結果を示す。図１５Ｂは、３７℃で７日間インキュベーションしたＡβ４２および２μＭのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）を用いたＴｈＴ蛍光アッセイの結果を示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）はｆＡβ４２の形成を阻止する。
【図１５Ｂ】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）の存在下または不在下でのｆＡβ４２のインキュベーションの透過電子ミクロ組織検査（ＴＥＭ）結果を示す。図１５Ｂは、３７℃で７日間インキュベーションしたＡβ４２および２μＭのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）を用いたＴｈＴ蛍光アッセイの結果を示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）はｆＡβ４２の形成を阻止する。
【図１６】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）がα−シヌクレイン線維の形成を強力に阻害することを実証する。２５μＭα−シヌクレインを、３００ｒｐｍ、４日間、３７℃での撹拌により構築した（バー１を参照）。グラフ上の第２のバーは、３７℃で３日間振盪したα−シヌクレインモノマーおよび１×１０−１３５量体Ｍ１３ファージを表す。バー２に示される結果は、５量体Ｍ１３がα−シヌクレイン線維の構築を阻止することを示す。グラフ上の第３のバーは、α−シヌクレインモノマーおよび８３ｎＭのｒｓｇ３ｐモノマーを表す。バー３に示される結果は、モノマーが、５量体Ｍ１３よりα−シヌクレイン線維形成の阻害においてあまり有効でないことを示す。バー４は、時間０でのα−シヌクレインモノマーを示す陰性対照である。バー５において、α−シヌクレイン線維のないｇ３ｐモノマーは、ｇ３ｐがｐＴＡＡに結合し、線維への結合から染料を隔離するかどうかを決定するために示される。バー５に示される結果は、ｇ３ｐがｐＴＡＡに結合しないことを示した。
【図１７】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）、Ｍ１３（構築物２）、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質（構築物４）、およびＩｇＧ４−Ｆｃ陰性対照についての競合結合データを示す。
【図１８】Ｍ１３（構築物２；四角形）、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３；三角形）、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質（構築物４；上下逆の三角形）、および組み換えＩｇＧ４−Ｆｃ陰性対照（菱形）を比較した競合結合データを示す。
【図１９】５種類の濃度のＡβ４２線維＋または−、２種の濃度のＭ１３（構築物２）、８００ｎＭのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）、および３種の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質（構築物４）を比較するフィルタートラップアッセイを示す。
【図２０】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３；「モノマー」）およびストレプトアビジン複合化ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（「ＳＡ［ｇ３ｐＮ１Ｎ２］ｎ＝２−４」；「ＳＡ−ｇ３ｐ」；「テトラマー」）についての競合結合データを示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）およびＳＡ−ｇ３ｐを、３７℃での３時間のインキュベーション中のＡβへの結合について、標識Ｍ１３と競合するそれらの能力について比較した。
【図２１】５種類の濃度のｆＡβ４２＋または−、２種の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３；「モノマー」）、および２種の濃度のＳＡ−ｇ３ｐ（「テトラマー」）を比較するフィルタートラップアッセイを示す。
【図２２】時間０でのｆＡβ４２のＴＥＭ（図２２Ａ）、およびＳＡ−ｇ３ｐとのインキュベーションの３日後（図２２Ｂ）のＴＥＭを示す。
【図２３】１つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ構築物「構築物４」のアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。「構築物４」のＮ１Ｎ２領域は、「構築物１」のＮ１Ｎ２領域からもたらされる（配列番号：１０）。
【図２４】別のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ構築物「構築物５」のアミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。「構築物５」のＮ１Ｎ２領域は、「構築物２」のＮ１Ｎ２領域からもたらされる（配列番号：１２）。
【図２５】１つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ構築物「構築物６」のアミノ酸配列（配列番号：１３）を示す。「構築物６」のＮ１Ｎ２領域は、「構築物２」のＮ１Ｎ２領域からもたらされる。
【図２６】ｆｄ（配列番号：１４）、ｆ１（配列番号：１５）、Ｍ１３（配列番号：１６）、Ｉｋｅ（配列番号：１７）、Ｉ２−２（配列番号：１８）、およびＩｆ１（配列番号：１９）由来のＮ２のアミノ酸配列アライメントを示す。アスタリスク「＊」は、単一の完全に保存された残基を有する位置を示す。コロン「：」は、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ  ２５０マトリックスにおいて０．５より高い値を示す非常に類似する特性の群間の保存を示す。ピリオド「．」は、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ  ２５０マトリックスにおいて０．５以下の値を示す若干類似する特性の群間の保存を示す。
【図２７Ａ】構築物３の概略図を示す。図２７Ｂは、構築物３のｇ３ｐ部分のＤＮＡ配列（配列番号：２３）を示す。図２７Ｃは、構築物３のｇ３ｐ部分のアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【図２７Ｂ】構築物３の概略図を示す。図２７Ｂは、構築物３のｇ３ｐ部分のＤＮＡ配列（配列番号：２３）を示す。図２７Ｃは、構築物３のｇ３ｐ部分のアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【図２７Ｃ】構築物３の概略図を示す。図２７Ｂは、構築物３のｇ３ｐ部分のＤＮＡ配列（配列番号：２３）を示す。図２７Ｃは、構築物３のｇ３ｐ部分のアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【図２８】アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、アミロイドβを低減する能力について２つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ＩｇＧ融合タンパク質を試験する実験の結果を示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（構築物５）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の両方が、アルツハイマー病マウスの海馬においてアミロイドβのレベルを有意に低減した。
【図２９】アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、アミロイドβを低減するそれらの能力について、２つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ＩｇＧ融合タンパク質を試験する実験の結果を示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（構築物５）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の両方が、アルツハイマー病マウスの大脳皮質においてアミロイドβのレベルを有意に低減することができた。
【図３０】Ａβ４２のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）でのアセンブリ阻害を示す。図３０Ａは、ＳＤＳを用いないで作った「天然」アガロースゲルを示す。試料を、ＳＤＳを含まず、ボイルしていないＴＥＡバッファ中で泳動した。結果は、構築物６がｆＡβ４２のアセンブリを阻害できることを示す。図３０Ｂは、所定の試料中に存在するアミロイドを測定するために用いられるＴｈＴ蛍光アッセイを示す。１０μＭのＡβ４２モノマーを、２種類の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の存在下または不在下、３７℃で１日間インキュベーションした。１日目の終わりに形成された線維の量を、結合されたＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定した。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図はまた、構築物６での線維形成の阻害が用量依存であることを示す。
【図３１Ａ】Ａβ４２アセンブリがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体およびβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間でのＡβ４２＋構築物３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。構築物３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間での構築物３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリを阻害する構築物３の能力を確認する。
【図３１Ｂ】Ａβ４２アセンブリがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体およびβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間でのＡβ４２＋構築物３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。構築物３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間での構築物３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリを阻害する構築物３の能力を確認する。
【図３１Ｃ】Ａβ４２アセンブリがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体およびβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間でのＡβ４２＋構築物３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。構築物３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間での構築物３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリを阻害する構築物３の能力を確認する。
【図３１Ｄ】Ａβ４２アセンブリがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体およびβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間でのＡβ４２＋構築物３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。構築物３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、およびＴ＝４８時間での構築物３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリを阻害する構築物３の能力を確認する。
【図３２】Ｍ１３（構築物２）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）が、Ｎ２ａ細胞のオリゴマーにより誘導される毒性を阻止することを示す代表的なデータを示す。例えば、Ｓｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１３）：１１６１２−１１６２２  ａｎｄ  Ｓｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｒｉｋ  Ｄ．Ｒｏｂｅｒｓｏｎ（ｅｄ．）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６７０：１３−３２．を参照されたい。処置前４８時間の血清飢餓状態により、Ｎ２ａ細胞を分化させた。Ａβ４２オリゴマー（２μＭ）を、Ｎ２ａ細胞に添加する前に、構築物２および構築物６と、３７℃で３時間プレインキュベーションした。時間ゼロ（「ＴＯ」）複合体はプレインキュベーションしなかった。インキュベーションの２４時間後、アデニル酸キナーゼ（「ＡＫ」）放出をモニタリングした。培地中へのＡＫ放出は細胞死／溶解を示す。Ａβ４２オリゴマーをＳｔｉｎｅ  ｅｔ．ａｌ．，２０１１により記載される通り作成した。結果は、Ｍ１３およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃが、毒性オリゴマーの強力な阻害剤であることを示す。
【図３３】６種類の濃度のＡβ４２線維＋または−、１ｘ１０１２／ｍｌ  Ｍ１３（構築物２）、８０ｎｍおよび８００ｎＭのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ構築物（構築物５）、ならびに８０ｎｍおよび８００ｎＭのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）を比較するフィルタートラップアッセイを示す。Ａβ４２線維を、構築物２、５、および６と３７℃で３日間インキュベーションし、その後、濾過遅延した。フィルターを、フィルターにトラップされたＡβ４２線維を認識するｍＡｂ６Ｅ１０（１：１５０００）によりプローブした。８００ｎＭの構築物５または構築物６は、分子モル濃度５ｘ１０１４／ｍｌの構築物２と同等である。結果は、構築物２、５、および６がβ−アミロイド線維を強力に脱凝集させることを示す。
【図３４】ｆタウとのプレインキュベーションの３時間後、ｆＡβ４２に結合したＭ１３（構築物２）の量を測定するために用いた代表的アッセイを示す。構築物２に結合した、５μＭのＡβ４２モノマーを、４種類の濃度のｆタウの存在下または不在下、３７℃で３時間インキュベーションした。ｆＡｂｅｔａ：Ｍ１３−Ａｌｅｘａ４８８はペレット形成するが、ｆタウ：Ｍ１３−Ａｌｅｘａ４８８はペレット形成せず、ペレット形成された物質からの蛍光の消失の測定は、ｆタウがｆＡｂｅｔａ結合と競合することを示す。ここで、３時間後に形成されたＭ１３−ｆＡβの量を、ペレット形成結合競合反応におけるＡｌｅｘａ４８８蛍光を定量化することにより測定した。結果は、ｆタウが、ｆＡβ４２結合に対してＭ１３−Ａｌｅｘａ４８８（構築物２）と競合できることを示す。
【図３５】ｆタウに結合するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（構築物４）の能力を試験する１つの代表的ＳＰＲアッセイの結果を示す。結果は、構築物４がｆタウと強力に結合することを示す。
【図３６Ａ】ｆタウを脱凝集させるｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す。４０μＭのタウの微小管結合反復領域（「ＭＴＢＲ」）を５０ｍＭのスーパーオキシドジスムターゼ（「Ｓｏｄ」）に希釈することにより、タウ線維を調製した。種々の濃度の構築物６および予め調製したｆタウを、酢酸バッファ中、ｐＨ７．０、３７℃、７２時間インキュベーションした。ＴｈＴ蛍光を、５倍を超えるＴｈＴの存在下で記録した。図３６Ａは、ｆタウを脱凝集させる構築物６の能力を示す代表的ＴｈＴアッセイの結果を示す。図３６Ｂは、タウを脱凝集させる構築物６の能力を確認する別の代表的な実験を示す。図３６Ａおよび３６Ｂは、構築物６によるｆタウの脱凝集が用量依存性であることも示す。
【図３６Ｂ】ｆタウを脱凝集させるｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す。４０μＭのタウの微小管結合反復領域（「ＭＴＢＲ」）を５０ｍＭのスーパーオキシドジスムターゼ（「Ｓｏｄ」）に希釈することにより、タウ線維を調製した。種々の濃度の構築物６および予め調製したｆタウを、酢酸バッファ中、ｐＨ７．０、３７℃、７２時間インキュベーションした。ＴｈＴ蛍光を、５倍を超えるＴｈＴの存在下で記録した。図３６Ａは、ｆタウを脱凝集させる構築物６の能力を示す代表的ＴｈＴアッセイの結果を示す。図３６Ｂは、タウを脱凝集させる構築物６の能力を確認する別の代表的な実験を示す。図３６Ａおよび３６Ｂは、構築物６によるｆタウの脱凝集が用量依存性であることも示す。
【図３７Ａ】経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋または−で、種々の濃度の構築物３および構築物６を凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは、結果を概説する。
【図３７Ｂ】経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋または−で、種々の濃度の構築物３および構築物６を凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは、結果を概説する。
【図３７Ｃ】経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋または−で、種々の濃度の構築物３および構築物６を凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは、結果を概説する。
【図３７Ｄ】経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋または−で、種々の濃度の構築物３および構築物６を凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは、結果を概説する。
【図３８Ａ】ＰｒＰのＰｒＰ−Ｓｃへの変換を阻止するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す実験の結果を示す。構築物６およびＩｇＧ細胞溶解物を、超遠心分離の対象にし、可溶性（上清）および不溶性（ペレット）ＰｒＰ種を分離させた。ＰｒＰ種を、抗ＰｒＰモノクローナル抗体（６Ｄ１１）で生化学的に視覚化した。ＩｇＧの存在下、可溶性および不溶性分画の両方にＰｒＰを分配する。構築物６の存在下、可溶性ＰｒＰ中に限定される。データはｎ＝４を表す。
【図３８Ｂ】ＰｒＰのＰｒＰ−Ｓｃへの変換を阻止するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す実験の結果を示す。構築物６およびＩｇＧ細胞溶解物を、超遠心分離の対象にし、可溶性（上清）および不溶性（ペレット）ＰｒＰ種を分離させた。ＰｒＰ種を、抗ＰｒＰモノクローナル抗体（６Ｄ１１）で生化学的に視覚化した。ＩｇＧの存在下、可溶性および不溶性分画の両方にＰｒＰを分配する。構築物６の存在下、可溶性ＰｒＰ中に限定される。データはｎ＝４を表す。
【図３９Ａ】プリオン病の細胞培養モデルにおける、ＰｒＰＳｃの蓄積および凝集を低減するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す実験の結果を示す。図３９Ａは、構築物６およびＩｇＧでの処置後、生化学的に溶解された未切断およびＰＫ切断Ｎ２ａ２２ＬＳｃ細胞溶解物を示す。ＰｒＰＳｃレベルの有意な低減が、増加濃度の構築物６で処理した細胞において明確に見られる。ＰｒＰＳｃレベルの約５０％低減を、〜０．０８μｇ／ｍｌ構築物６の処置で達成する。１０μｇ／ｍｌの構築物６での処理は、ＰｒＰＳｃを５．７２５％、ｐ＜０．０００１まで低減する。ＰｒＰＳｃレベルの顕著な変化は、１μｇ／ｍｌマウスＩｇＧで処理したＮ２Ａ２２ＬＳｃ細胞において見られなかった。図３９Ｂは、Ｘ線フィルムを、続いてデジタル化し、１００％であると見なされる同一の継代由来のＩｇＧ処理Ｎ２ａ２２ＬＳｃ細胞における効果に対して最初に正規化した。次いで、ＰＫ切断ブロット由来の濃度測定データを、等しくブロットした未切断の溶解物に対して分析し、パーセント変化ＰｒＰＳｃ／ＰｒＰｃとして発現された。データはｎ＝４を表す。
【図３９Ｂ】プリオン病の細胞培養モデルにおける、ＰｒＰＳｃの蓄積および凝集を低減するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す実験の結果を示す。図３９Ａは、構築物６およびＩｇＧでの処置後、生化学的に溶解された未切断およびＰＫ切断Ｎ２ａ２２ＬＳｃ細胞溶解物を示す。ＰｒＰＳｃレベルの有意な低減が、増加濃度の構築物６で処理した細胞において明確に見られる。ＰｒＰＳｃレベルの約５０％低減を、〜０．０８μｇ／ｍｌ構築物６の処置で達成する。１０μｇ／ｍｌの構築物６での処理は、ＰｒＰＳｃを５．７２５％、ｐ＜０．０００１まで低減する。ＰｒＰＳｃレベルの顕著な変化は、１μｇ／ｍｌマウスＩｇＧで処理したＮ２Ａ２２ＬＳｃ細胞において見られなかった。図３９Ｂは、Ｘ線フィルムを、続いてデジタル化し、１００％であると見なされる同一の継代由来のＩｇＧ処理Ｎ２ａ２２ＬＳｃ細胞における効果に対して最初に正規化した。次いで、ＰＫ切断ブロット由来の濃度測定データを、等しくブロットした未切断の溶解物に対して分析し、パーセント変化ＰｒＰＳｃ／ＰｒＰｃとして発現された。データはｎ＝４を表す。
【図４０】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（構築物５）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）での処置後、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、海馬におけるシナプトフィジンレベルでのそれらの効果について、２つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ＩｇＧ融合タンパク質を試験する実験の結果を示す。両方の構築物は、アルツハイマー病マウスの海馬においてシナプトフィジンのレベルを有意に増大した。
【図４１】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（構築物５）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）での処置後、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルの海馬において、Ｉｂａ−１レベルでのそれらの効果について２つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ＩｇＧ融合タンパク質を試験する実験の結果を示す。両方の構築物は、アルツハイマー病マウスの海馬においてＩｂａ−１のレベルを有意に増大した。
【図４２】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（構築物５）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）での処置後、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルの海馬において、ＧＦＡＰレベルでのそれらの効果について２つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ＩｇＧ融合タンパク質を試験する実験の結果を示す。いずれの構築物も、アルツハイマー病マウスの海馬においてＧＦＡＰのレベルを有意に変更しなかった。
【図４３】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（構築物５）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）と比較するために考案された結合実験の結果を表す。構築物は、類似のＫＤ’の（〜１１）を有するｆＡβに強力に結合する。
【図４４Ａ】タウのアセンブリを阻止するために、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）の能力を示す。図４４Ａにおいて、１μＭのタウを単独でインキュベートするか、または１μＭの構築物３と共にインキュベートし、５日後、ＴＥＭによって分析した。構築物３は、タウのアセンブリを阻止する。図４４Ｂは、３種の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）の存在下または不在下でインキュベートしたｆタウを用いたＴｈＴ蛍光アッセイの結果を示す。構築物３は、タウのアセンブリを用量依存的に阻止する。
【図４４Ｂ】タウのアセンブリを阻止するために、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）の能力を示す。図４４Ａにおいて、１μＭのタウを単独でインキュベートするか、または１μＭの構築物３と共にインキュベートし、５日後、ＴＥＭによって分析した。構築物３は、タウのアセンブリを阻止する。図４４Ｂは、３種の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）の存在下または不在下でインキュベートしたｆタウを用いたＴｈＴ蛍光アッセイの結果を示す。構築物３は、タウのアセンブリを用量依存的に阻止する。
【図４５】ｆＡβ４２とｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）との間の相互作用を分析するための実験の概略図を示す。
【図４６】ｆＡβ４２とｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）との間の相互作用を分析するためのＮＭＲ研究の結果を示す。Ｈは水素を表し、Ｄは重水素を意味する。Ａβ線維の水素は経時的に重水素と交換され、その速度は線維に対する構築物３の結合によって影響される。この結果は、ｆＡβ４２の残基１７−２２および３３−４０における構築物３とｆＡβ４２との間の分子の反復を示す。
【図４７】７４４時間のインキュベーション後、構築物３の脱凝集の代表的なＴＥＭがｆＡβ４２を実施したことを示す。図４７Ａは、単独でのｆＡβ４２を示す。図４７Ｂは、ｆＡβ４２および構築物３を示す。図４７Ｃは、図４７Ａと比較して、増大した倍率で単独でのｆＡβ４２を示す。図４７Ｄは、図４７Ｂと比較して、より高い倍率でのｆＡβ４２および構築物３を示す。
【図４８】ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）がｆタウと強力に結合することを示す代表的ＳＰＲアッセイの結果を示す。
【図４９Ａ】ｆタウを脱凝集させる構築物６の能力を示す代表的なＴｈＴアッセイの結果を示す。図４９Ｂは、図４９Ａの実験の図表表現を示す。図４９Ａおよび４９Ｂは、構築物６によるｆタウの脱凝集が用量依存性であることも示す。
【図４９Ｂ】ｆタウを脱凝集させる構築物６の能力を示す代表的なＴｈＴアッセイの結果を示す。図４９Ｂは、図４９Ａの実験の図表表現を示す。図４９Ａおよび４９Ｂは、構築物６によるｆタウの脱凝集が用量依存性であることも示す。
【図５０Ａ】Ａβ原線維と結合するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｉｆ１−Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（構築物８）のＳＰＲ研究を表す。この結果は、構築物８が、Ａβ原線維と強力に結合（ＫＤ〜３６ｎＭ）すること示す。（Ｆｃドメインにリンクされない）ｇ３ｐのＮ１Ｎ２フラグメントはより弱い結合（ＫＤ〜３６ｎＭ）を示した。
【図５０Ｂ】ｆＡβ１−４２と結合するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｉｆ１−Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物８）の能力を示す結合競合アッセイの結果を表す。（Ｆｃドメインに結合されない）ｇ３ｐのＮ１Ｎ２フラグメントは、より弱い結合を示した。
【図５１】Ｉｆ１  ｇ３ｐ（配列番号２９）とｆｄ  ｇ３ｐ（配列番号３０）との間のアミノ酸比較を示す。ｇ３ｐのＮ１ドメインにおいてＩｆ１とｆｄとの間で同一であるアミノ酸は、影付きである。Ｎ１ドメインは、四角で囲まれている。
【図５２Ａ】アルツハイマー病のインビボでのモデルにおいて脳への直接注射後、Ａβ沈着およびタウ線維を有意に低減する、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す実験の結果を表す。図５２Ａにおいて、Ａβのレベルは、対照と比較して構築物６を受け取ったマウスにおいて有意に低減される。図５２Ｂにおいて、タウのレベルは、対照と比較して構築物６を受け取ったマウスにおいて有意に低減される。
【図５２Ｂ】アルツハイマー病のインビボでのモデルにおいて脳への直接注射後、Ａβ沈着およびタウ線維を有意に低減する、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す実験の結果を表す。図５２Ａにおいて、Ａβのレベルは、対照と比較して構築物６を受け取ったマウスにおいて有意に低減される。図５２Ｂにおいて、タウのレベルは、対照と比較して構築物６を受け取ったマウスにおいて有意に低減される。
【図５３】脳への直接注射よりもむしろ全身的に与えられるときにＡＤを処置するためのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す実験の結果を表す。図５３Ａおよび５３Ｂは、構築物６を受け取ったＡＤマウスは、対照を与えられたマウスと比較して多動性を低減させたことを示す。
【図５４】脳への直接注射よりもむしろ全身的に与えられるときにＡＤを処置するためのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す実験の結果を表す。図５４において、旋回するためのＡＤマウスの能力は、対照と比較して構築物６を受け取ったマウスにおいて低減される。
【図５５】脳への直接注射よりもむしろ全身的に与えられるときにＡＤを処置するためのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す実験の結果を表す。図５５において、ＡＤマウスのコーナー跳躍は、対照と比較して構築物６を受け取ったマウスにおいて有意に低減される。
【図５６】脳への直接注射よりもむしろ全身的に与えられるときにＡＤを処置するためのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の能力を示す実験の結果を表す。図５６において、構築物６を受け取るＡＤマウスは、高齢マウスにおいて対照ＰＢＳ受け取るマウスに対して、Ｙ−迷路におけるアームエントリーのより自発的な交替を有意に呈した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
【表１】
0006283366.tif 000002
本発明は、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントまたはそれらの変異体またはバリアントを含む融合タンパク質を提供する。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域のＦｃフラグメントを更に含む。これらの実施形態の一態様において、融合タンパク質は可溶性である。これらの実施形態の別の態様において、融合タンパク質は、例えば、脱凝集によってアミロイドを低減し、および／またはアミロイドの凝集（例えば、アミロイドプラーク）を予防するまたは阻害する。本発明の融合タンパク質は、アミロイドと結合する。いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、毒性オリゴマーの形成を除去するおよび／または阻害する。
【００１１】
本発明は、本発明の融合タンパク質の薬学的組成物、ならびにアミロイドと結合して、それを低減するためのそれらの使用を提供する。アミロイドを低減させることは、例えば、アミロイドを脱凝集する、アミロイドの凝集を予防するおよび／または阻害する、かつ毒性オリゴマーの形成を除去する、および／または予防することを包含する。アミロイド沈着を検出し、アミロイドによって特徴付けられる疾患および障害を診断するための組成物の使用が包含される。
定義
【００１２】
用語「ｇ３ｐ」は、単独、または「ｇ３ｐ−由来」などの用語において用いられるとき、任意の野生型または組み換え糸状ファージｇ３ｐタンパク質（ｇ３ｐのフラグメント、バリアント、および変異体を含む）を指す。用語は、任意の具体的な糸状バクテリオファージからもたらされるｇ３ｐに限定されると解されるべきではない。例示のため、用語「ｇ３ｐ」は、配列番号１、および図２に示される関連タンパク質を含む。
【００１３】
用語「ドメイン」は、例えば、ポリペプチド鎖の１つの部分からなる独立して折り畳まれた構造を含む、いくつかの独特の物理的特徴または役割を有するポリペプチド（タンパク質を含む）の領域を意味する。ドメインは、ポリペプチドの独特の物理的特性である配列を含有し得るか、またはその結合特徴を保持する（すなわち、第２のドメインに結合することができる）、物理的特性のフラグメントを含有し得る。ドメインは別のドメインと関連し得る。言い換えると、第１のドメインは、第２のドメインに天然で結合し得る。例えば、ｇ３ｐＮ２ドメインはＦ−ｐｉｌｉに結合し、ｇ３ｐＮ１ドメインはＴｏｌＡに結合する。
【００１４】
本明細書において用いられる、用語「アミロイド」、「アミロイド原線維」、および「アミロイド線維」は、いくつかの異なるタンパク質のうちのいずれかの凝集により形成され、線維軸に垂直に積み重なったβシートの規則正しい配置からなる３次構造の属名である（Ｓｕｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）２７３：７２９−３９）。１つの例示的なアミロイドは、アルツハイマー病において形成されたアミロイド−βの凝集体であり、ベータ−アミロイドペプチド「βＡ」からなり、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）から切断された３９〜４３個のアミノ酸内部フラグメントである。短い形態（例えば、Ａβ４０）、および長い形態（例えば、より線維素生成ＡβアイソフォームであるＡβ４２）が存在する。他の例示的なアミロイドタンパク質は、（パーキンソン病と関連する）ミスフォールドα−シヌクレイン、（ハンチントン病と関連する）ハンチンチン、（アルツハイマー病と関連する）タウ、およびプリオンタンパク質の異常構造ＰｒＰＳｃを含む。更なる例が明細書を通じて提供され、当業者に知られている（例えば、Ａｇｕｚｚｉ（２０１０），ａｎｄ  Ｅｉｃｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｄｆｏｒｄ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０１１）４３：８−１８を参照されたい）。したがって、タンパク質またはペプチドが特定されない限り、用語「アミロイド」、「アミロイド原線維」、または「アミロイド線維」の使用は、任意の具体的なタンパク質または疾患に限定されると解されるべきではない。
【００１５】
用語「ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント」は、アミロイドと結合するための能力を維持するｇ３ｐのフラグメントを指す。用語「ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント」はまた、アミロイドと結合するための能力を維持するｇ３ｐのＮ−、Ｃ−、またＮ−およびＣ−末端切断を含む、ｇ３ｐの変異体またはバリアントを指す。
【００１６】
用語「ベータアミロイドペプチド」は、「β−アミロイドペプチド」、「βＡＰ」、「βＡ」、および「Ａβ」と同義である。これらの用語の全てが、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）からもたらされるアミロイド形成ペプチドを指す。
【００１７】
「脱凝集すること」または「脱凝集を媒介すること」として記載される本発明の融合タンパク質または組成物は、既に形成された凝集体を低減する。脱凝集はフィルタートラップアッセイにより測定され得る（Ｗａｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９９）３０９：３７５−８６）。フィルタートラップアッセイは、本明細書に記載され、これを用いて凝集体を検出し、本発明の組成物により媒介される脱凝集をモニタリングし得る。脱凝集は、増加濃度の脱凝集化剤の存在下での染色の低下により示される、フィルター上のアミロイド保持の減少として検出される。
【００１８】
本明細書で用いられるとき、「アミロイドを低減する」または「アミロイド負荷を減少させる」融合タンパク質または組成物は、次の１つ以上を行う：アミロイド形成を阻害する、アミロイド脱凝集を引き起こす、アミロイドクリアランスを促進する、アミロイド凝集を阻害する、毒性アミロイドオリゴマーの形成を阻止するおよび／もしくは予防する、ならびに／または毒性アミロイドオリゴマーのクリアランスを促進する。
【００１９】
「神経細胞のアミロイド損傷からの保護」としての本発明の産生物または組成物のうちのいずれかは、新たなアミロイドの蓄積を予防し、および／または毒性アミロイドオリゴマーの形成を予防する。「神経細胞のアミロイド損傷からの保護」として記載される本発明の産生物または組成物は、予防的に摂取され得る。産生物または組成物が神経細胞をアミロイド損傷から保護するかどうかは、本明細書に記載される神経細胞培養細胞毒アッセイにより測定され得る。
【００２０】
本明細書で用いられる「ＰｒＰタンパク質」、「ＰｒＰ」、および「プリオン」は、適切な条件下で、タンパク質ミスフォールディング病に関与する凝集体の形成を誘導することができるポリペプチドを指す。例えば、正常な細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰｃ）は、このような条件下で、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、または狂牛病、猫海綿状脳症、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）（これらに限定されない）などの疾患に関与する、対応するスクレイピーアイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）に変換される。
【００２１】
融合タンパク質または融合タンパク質のｇ３ｐ部分のアミロイド結合フラグメントと組み合わせて本明細書で用いられる、用語「バリアント」は、参照物質と比較して、少なくとも１個のアミノ酸相違（置換、挿入、または欠損）を含有する対応するアミノ酸配列を指す。ある種の実施態様において、「バリアント」は、参照配列と比較して、高いアミノ酸配列相同性、および／または保存的アミノ酸置換、欠損、および／または挿入を有する。いくつかの実施態様において、バリアントは、参照配列と比較して、７５、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下のアミノ酸相違を有する。「保存的置換」は、第１のアミノ酸の第２のアミノ酸による置換を指し、これは、タンパク質、ポリペプチド、またはｇ３ｐタンパク質またはｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントなどの、アミノ酸配列の化学的、物理的、および／または機能的特性を実質的に変えない（例えば、ｇ３ｐタンパク質またはアミロイド結合フラグメントは、同一の電荷、構造、極性、疎水性／親水性を保持し、および／またはアミロイドを認識し、結合し、および／または低減する能力などの機能を保存する）。このような保存的アミノ酸修飾は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づく。種々の前述の特徴を考慮した例示的な保存的置換は、当業者に公知であり、アルギニンおよびリジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、セリンおよびスレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。用語「ｇ３ｐバリアント」または「ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントのバリアント」はまた、野生型ｇ３ｐまたはそれらに対応するフラグメントと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、ポリペプチドを包含する。
【００２２】
用語「変異体」は、融合タンパク質、または治療上または診断上の有効性を調節するために１個以上のアミノ酸において変異誘発されている融合タンパク質のｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを指す。ある種の実施態様において、変異体は、アミロイドと相互作用することが知られているアミノで置換、欠損、および／または挿入を含有する。他の実施態様において、変異体は、野生型ｇ３ｐまたはそのアミロイド結合フラグメント中に存在する保存アミノ酸であるアミノでの置換、欠損、および／または挿入を含有する。いくつかの実施形態において、変異体は、参照配列と比較して、７５、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下のアミノ酸相違を有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、保存的置換である。用語「バリアント」および「変異体」は、「変異体」が典型的には天然の非組み換えである一方で、「変異体」は典型的には組み換えであることを除き、本明細書において同義的に用いられる。用語「変異体ｇ３ｐ」または「ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントの変異体」はまた、野生型ｇ３ｐまたはそれらの対応するフラグメントと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含有する。
【００２３】
「融合タンパク質」は、少なくとも２つのポリペプチドドメインを含む天然に存在しないタンパク質である。本発明の融合タンパク質は、ポリペプチドの第２のタンパク質に結合され、融合され、または複合化される、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む。特定の実施形態において、融合タンパク質は、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む。
【００２４】
用語「活性化合物」、「活性剤」、および「有効成分」は、融合タンパク質の生物学的活性を提供する融合タンパク質の部分を指して、本明細書において同義的に使用される。本発明の融合タンパク質のｇ３ｐ部分は、「活性化合物」、「活性剤」、または「有効成分」である。同様に、本発明の融合タンパク質のｇ３ｐ部分は、生物学的に活性なまたは治療的に有効な部分である。本発明の融合タンパク質のｇ３ｐ部分は、融合パートナーのタンパク質フォールディングを容易にするためには使用されず、国際公開第ＷＯ２００４／０１８６８５号に記載されるｇ３ｐに関係しない治療薬剤として作用する。米国特許第２００９／１０５０９０号に記載されるファージディスプレーのために使用される本発明の融合タンパク質ではない。
【００２５】
用語「免疫原性である」は、組成物に曝露された哺乳類における免疫応答を引き起こすために、組成物の能力を指して、本明細書で使用される。
【００２６】
本明細書で用いられるとき、「構築物１」は、野生型Ｍ１３からもたらされる（Ｇｅｎｂａｎｋファイル：ＮＣ＿００３２８７．２、バージョンＧＩ：５６７１８４６３を参照されたい）。構築物１において、野生型Ｍ１３と比較して、Ｓｅｒ３７８（ＡＧＣ）はＧｌｙ（ＧＧＣ）に変更され、Ｉｌｅ８７（ＡＴＴ）はＡｓｎ（ＡＡＣ））に変更される。したがって、野生型Ｍ１３において、核酸番号２７１０に「Ｇ」が存在するが、構築物１において、この位置に「Ａ」が存在する。同様に、野生型Ｍ１３において、核酸番号４４７９に「Ａ」が存在するが、構築物１において、この位置に「Ｔ」が存在する。最終的に、野生型Ｍ１３において、核酸番号４４８０に「Ｃ」が存在するが、構築物１において、この位置に「Ｔ」が存在する。構築物１は配列番号１０の核酸を含む。
【００２７】
「構築物２」は野生型Ｍ１３単離物である（ＧｅｎＢａｎｋ  ＪＸ４１２９１４．１）。構築物２は、配列番号１２の核酸を含む。
【００２８】
「構築物３」は、配列番号：２０のアミノ酸を含むｇ３ｐのＮ１およびＮ２ドメインを含む組み換え可溶性ｇ３ｐフラグメント（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２））である。
【００２９】
「構築物４」は、配列番号：９のアミノ酸を含む組み換え可溶性ｇ３ｐフラグメントＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ）である。「構築物４」のＮ１Ｎ２領域は、「構築物１」のＮ１Ｎ２領域からもたらされる。「構築物４」をコードした核酸配列は、配列番号２６に記載されている。
【００３０】
配列番号９に記載されている最初の２１個のアミノ酸は、組み換え産生中にアミノ酸２０と２１との間で切断されたシグナル配列を表す。配列番号９のアミノ酸２１におけるメチオニンは、（Ｎ１−Ｎ２配列にシグナル配列を融合するために使用される複数のクローニング部位によってコードされる）クローニングの人工物であり、また、ときおり組み換え中に切断される。配列番号９のアミノ酸２２のアラニンは、Ｍ１３ファージから単離されたｇ３ｐのＮ−末端アミノ酸に対応する。配列番号９のアミノ酸２２においてアラニンはまた、ときおり組み換え中に切断される。配列番号９のアミノ酸５０６におけるＣ−末端リジンはまた、ときおり真核生物細胞内で組み換え産生中に切断される。上で特定されたＮ−およびＣ−末端欠損のうちの１個以上を含有する産生物は、本発明の一部である。
【００３１】
したがって、いくつかの実施形態において、「構築物４」として説明されるｇ３ｐ融合タンパク質は、「構築物４の成熟形態」であり、配列番号９のアミノ酸２１〜５０６を含む。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸２２〜５０６を含む（「構築物４のＮ−末端Ｍｅｔ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸２３〜５０６を含む（「構築物４のＮ−末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸２１〜５０５を含む（「構築物４のＣ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸２２〜５０５を含む（「構築物４のＮ−末端Ｍｅｔ−切断、Ｃ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸２３〜５０５を含む（「構築物４のＮ−末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−切断、Ｃ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。
【００３２】
同様に、構築物４の全長のＮ−、Ｃ−、ならびにＮ−およびＣ−末端切断形態をコードする核酸が、本明細書で説明されるように包含される。一実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号２６のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質をコードする核酸は、シグナル配列をコードするヌクレオチドを除く（すなわち、配列番号９のアミノ酸１〜２０、１〜２２、または１〜２３をコードするヌクレオチドを除く）、ｇ３ｐ部分またはｇ３ｐ−Ｉｇ部分をコードする配列番号２６の一部分である。
【００３３】
「構築物５」は、配列番号：１１のアミノ酸を含む組み換え可溶性ｇ３ｐフラグメントＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ）である。「構築物５」のＮ１Ｎ２領域は、「構築物２」のＮ１Ｎ２領域からもたらされる。「構築物５」をコードする核酸配列は、配列番号２７に記載されている。
【００３４】
配列番号１１に記載されている最初の２１個のアミノ酸は、組み換え産生中にアミノ酸２０と２１との間で切断されたシグナル配列を表す。配列番号１１のアミノ酸２１におけるメチオニンは、（Ｎ１−Ｎ２配列にシグナル配列を融合するために使用される複数のクローニング部位によってコードされる）クローニングの人工物であり、また、ときおり組み換え産生中に切断される。配列番号１１のアミノ酸２２のアラニンは、Ｍ１３ファージから単離されたｇ３ｐのＮ−末端アミノ酸に対応する。配列番号１１のアミノ酸２２におけるアラニンはまた、ときおり組み換え中に切断される。配列番号１１のアミノ酸５０６におけるＣ−末端リジンはまた、ときおり組み換え産生中に切断される。上で特定されたＮ−およびＣ−末端欠損のうちの１個以上を含有する産生物は、本発明の一部である。
【００３５】
したがって、一実施形態において、「構築物５」として説明されるｇ３ｐ融合タンパク質は、「構築物５の成熟形態」であり、配列番号１１のアミノ酸２１〜５０６を含む。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸２２〜５０６を含む（「構築物５のＮ−末端Ｍｅｔ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸２３〜５０６を含む（「構築物５のＮ−末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸２１〜５０５を含む（「構築物５のＣ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番１１のアミノ酸２２〜５０５を含む（「構築物５のＮ−末端Ｍｅｔ−切断、Ｃ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸２３〜５０５を含む（「構築物５のＮ−末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−切断、Ｃ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。
【００３６】
同様に、構築物５の全長のＮ−、Ｃ−、ならびにＮ−およびＣ−末端切断形態をコードする核酸が、本明細書で説明されるように包含される。一実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号２７のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質をコードする核酸は、シグナル配列をコードするヌクレオチドを除く（すなわち、配列番号１１のアミノ酸１〜２０、１〜２２、または１〜２３をコードするヌクレオチドを除く）、ｇ３ｐ部分またはｇ３ｐ−Ｉｇ部分をコードする配列番号２７の一部分である。
【００３７】
「構築物６」は、配列番号：１３のアミノ酸を含む組み換え可溶性ｇ３ｐフラグメントＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ）である。「構築物６」のＮ１Ｎ２領域は、「構築物２」のＮ１Ｎ２領域からもたらされる。「構築物６」をコードする核酸配列は、配列番号２８に記載されている。
【００３８】
配列番号１３に記載されている最初の２１個のアミノ酸は、組み換え産生中にアミノ酸２０と２１との間で切断されたシグナル配列を表す。配列番号１３のアミノ酸２１におけるメチオニンは、（Ｎ１−Ｎ２配列にシグナル配列を融合するために使用される複数のクローニング部位によってコードされる）クローニングの人工物であり、また、ときおり組み換え中に切断される。配列番号１３のアミノ酸２２におけるアラニンは、Ｍ１３ファージから単離されたｇ３ｐのＮ−末端アミノ酸に対応する。配列番号１３のアミノ酸２２におけるアラニンはまた、ときおり組み換え中に切断される。配列番号１３のアミノ酸５０９におけるＣ−末端リジンはまた、ときおり組み換え産生中に切断される。Ｃ−末端リジンの除去は、抗体および関連融合タンパク質の組み換え産生において珍しくない（Ｊ  Ｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２０１２  Ｓｅｐ；１０９（９）：２３０６−１５）。上で特定されたＮ−およびＣ−末端欠損のうちの１個以上を含有する産生物は、本発明の一部である。
【００３９】
したがって、いくつかの実施形態において、「構築物６」として説明されるｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸２１〜５０９を含む「構築物６の成熟形態」である。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸２２〜５０９を有する（「構築物６のＮ−末端Ｍｅｔ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸２３〜５０９を含む（「構築物６のＮ−末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸２１〜５０８を含む（「構築物６のＣ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸２２〜５０８を含む（「構築物６のＮ−末端Ｍｅｔ−切断、Ｃ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸２３〜５０８を含む（「構築物６のＮ−末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−切断、Ｃ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。
【００４０】
同様に、構築物６の全長のＮ−、Ｃ−、ならびにＮ−およびＣ−末端切断形態をコードする核酸が、本明細書で説明されるように包含される。一実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号２８のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質をコードする核酸は、シグナル配列をコードするヌクレオチドを除く（すなわち、配列番号１３のアミノ酸１〜２０、１〜２２、または１〜２３をコードするヌクレオチドを除く）、ｇ３ｐ部分またはｇ３ｐ−Ｉｇ部分をコードする配列番号２８の一部分である。
【００４１】
「構築物８」は、配列番号：３１のアミノ酸を含む、組み換え可溶性ｇ３ｐフラグメントＩｇＧ  １Ｆｃ融合タンパク質（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｉｆ１Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ）である。「構築物８」のｇ３ｐ領域は、Ｉｆ１からもたらされる。「構築物８」をコードする核酸配列は、配列番号３２に記載されている。
【００４２】
配列番号３１は以下に列挙され、構築物８のアミノ酸を示す。ある特定のＩｆ１ファージは、以下に強調／四角によって示されているようにトリプトファン（Ｗ）に対してシステイン（Ｃ）を有する場合を除いて、ｇ３ｐ  Ｎ１ドメインはＩｆ１由来であり、以下に示されているが、最初の２１個のアミノ酸は、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＦＵＳＥ  Ｉｇ融合ベクターの一部であるＩＬ２分泌配列に対応する。アミノ酸の次の拡張は、太字で下線が引かれ、Ｉｆ１のｇ３ｐ  Ｎ１ドメインと対応する。Ｃ→Ｗのアミノ酸の変化が強調され、四角で囲まれていることに留意されたい。下線が引かれているアミノ酸の次の拡張は、ｇ３ｐ  Ｉｆ１のＮ１ドメインとＮ２ドメインとの間に見出されるリンカー配列である。Ｉｆ１のｇ３ｐ  Ｎ２ドメインは、斜体で表示されている。ｇ３ｐ  Ｎ２ドメインに続いて、Ｉｆ１においてＮ２ドメインおよびＮ３ドメインに結合する第２のリンカー配列がある（斜体および下線で示されている）。最終的に、太字、斜体、および下線のアミノ酸は、ｐＦＵＳＥベクター由来のＩｇＧ１−Ｆｃ配列である。
【化１】
0006283366.tif 000003
【００４３】
配列番号３１に記載されている最初の２１個のアミノ酸は、組み換え産生中にアミノ酸２０と２１との間で切断されたシグナル配列を表す。配列番号３１のアミノ酸２１におけるメチオニンは、（Ｎ１−Ｎ２配列にシグナル配列を融合するために使用される複数のクローニング部位によってコードされる）クローニングの人工物であり、また、ときおり組み換え中に切断される。配列番号３１のアミノ酸２２のアラニンは、Ｍ１３ファージから単離されたｇ３ｐのＮ−末端アミノ酸に対応する。配列番号３１のアミノ酸２２におけるアラニンはまた、ときおり組み換え産生中に切断される。配列番号３１のアミノ酸５２８におけるＣ−末端リジンはまた、ときおり組み換え産生中に切断される。Ｃ−末端リジンの除去は、抗体および関連融合タンパク質の組み換え産生において珍しくない（Ｊ  Ｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２０１２  Ｓｅｐ；１０９（９）：２３０６−１５）。上で特定されたＮ−およびＣ−末端欠損のうちの１個以上を含有する産生物は、本発明の一部である。
【００４４】
したがって、いくつかの実施形態において、「構築物８」として説明されるｇ３ｐ融合タンパク質は、「構築物８の成熟形態」であり、配列番号３１のアミノ酸２１〜５２８を含む。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号３１のアミノ酸２２〜５２８を含む（「構築物８のＮ−末端Ｍｅｔ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号３１のアミノ酸２３〜５２８を含む（「構築物８のＮ−末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号３１のアミノ酸２１〜５２７を含む（「構築物８のＣ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号３１のアミノ酸２２〜５２７を含む（「構築物８のＮ−末端Ｍｅｔ−切断、Ｃ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、配列番号３１のアミノ酸２３〜５２７を含む（「構築物８のＮ−末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−切断、Ｃ−端末Ｌｙｓ−切断成熟形態」）。「構築物８」をコードする核酸配列は、配列番号３２に記載されている。
【００４５】
構築物８の全長のＮ−、Ｃ−、ならびにＮ−およびＣ−末端切断形態をコードする核酸が、本明細書で説明されるように包含される。一実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号３２のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質をコードする核酸は、シグナル配列をコードするヌクレオチドを除く（すなわち、配列番号３１のアミノ酸１−２０、１−２２、または１−２３をコードするヌクレオチドを除く）、ｇ３ｐ部分またはｇ３ｐ−Ｉｇ部分をコードする配列番号３２の一部分である。
【００４６】
構築物４、５、６、および８、ならびにそれらの変異体またはバリアントは、本発明の例示的なｇ３ｐ融合タンパク質である。
Ｇ３ｐ融合タンパク質
【００４７】
本発明のｇ３ｐ融合タンパク質は、活性剤、有効成分、活性化合物、生物学的に活性な部分、治療的に有効な部分、および／または各融合の治療的に有効な部分であるｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む。変異体、バリアント、およびフラグメントｇ３ｐを含む融合タンパク質が、本発明によって包含される。一態様において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、アミロイドと結合するｇ３ｐのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質は、ｇ３ｐのＮ１Ｎ２ドメイン、またはそれらの変異体、バリアント、もしくはフラグメントを含み、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントは、少なくとも１つの非ｇ３ｐタンパク質に結合される、融合される、複合化される、連結される、またはそれと関連する。特定の実施形態において、非ｇ３ｐタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃフラグメントである。融合タンパク質のｇ３ｐ部分は、国際公開第ＷＯ２００４／０１８６８５号に記載されている治療融合パートナーの促進タンパク質フォールディングのために、または米国特許第２００９／１０５０９０号に記載されているファージディスプレーのためには提供されない。
【００４８】
他の態様において、融合タンパク質は、アミロイドと結合し、ｇ３ｐのＮ２ドメイン、またはそれらの変異体、バリアント、もしくはを含むｇ３ｐポリペプチドを含み、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントは、少なくとも１つの非ｇ３ｐタンパク質と結合される、融合される、複合化される、連結される、またはそれと関連する。特定の実施形態において、非ｇ３ｐタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃフラグメントである。依然として他の態様において、融合タンパク質は、アミロイドと結合してｇ３ｐのＮ１Ｎ２ドメインを含むｇ３ｐポリペプチドを含み、ｇ３ｐのＮ２ドメインは、ｇ３ｐのＮ１ドメインを安定化する変異体、バリアント、またはフラグメントｇ３ｐのＮ２を含むか、あるいはそれ以外の場合、ｇ３ｐ  Ｎ１ドメインをｇ３ｐ結合に適する構造に置く。
【００４９】
融合タンパク質のｇ３ｐ部分は、それが通常関連しない、少なくとも１つの追加のタンパク質またはタンパク質ドメインと結合される、融合される、複合化される、連結される、またはそれと関連する。ある種の実施態様において、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質の非ｇ３ｐ部分は、免疫グロブリンのＦｃラグメントを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含む第２のドメインに結合されたｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含むｇ３ｐ融合タンパク質である。別の実施形態において、融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃフラグメントに結合されるｇ３ｐタンパク質のアミロイド結合フラグメントからなる。上述したように、本発明のいくつかの融合タンパク質は、アミロイド線維に結合する、変異誘発されるまたは変更されるＮ１Ｎ２もしくはＮ２ドメインなどの、ｇ３ｐの変異誘発されるまたは変更されるアミロイド結合フラグメントを含む。したがって、これらの変異誘発または変更形態を含む融合タンパク質はまた、本発明の一部である。
【００５０】
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび融合パートナーポリペプチドは、直接的にもしくは短いペプチドリンカーを通って、ｇ３ｐのＮ末端もしくはＣ末端のどちらか、またはアミロイド結合フラグメントポリペプチドと結合される融合パートナーポリペプチドを有する連続アミノ酸配列の一部であり得る。このような場合において、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび融合パートナーポリペプチドは、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントおよび融合パートナーポリペプチドの両方をコードするコード配列由来の単一のポリペプチドとして翻訳され得る。
Ａ．ｇ３ｐ融合タンパク質のＧ３ｐ部分
【００５１】
Ｇ３ｐは、Ｎ１−Ｎ２複合体を形成するために相互作用する２個のアミノ末端ドメインＮ１もしくはＮ２、および１個のカルボキシ末端ドメインＮ３（「ＣＴ」とも呼ばれる）を有する。ヒンジは、Ｎ１とＮ２の間での会合および閉合を可能にする。ときおり、ヒンジはＮ２の一部と考えられ、一方、他の例では別個のエレメントとして処理される。Ｎ１およびＮ２はまた、可撓性のグリシンに富むリンカー配列により結合される。Ｎ１内において、Ｃｙｓ７とＣｙｓ３６との間、およびＣｙｓ４６とＣｙｓ５３との間に２つのジスルフィド架橋が存在する。Ｃｙｓ１８８とＣｙｓ２０１との間のＮ２に単一のジスルフィド架橋が存在する。カルボキシ末端ドメインにおいて、Ｃｙｓ３５４とＣｙｓ３７１との間にジスルフィド架橋が存在する（Ｍａｒｖｉｎ，１９９８）。ｇ３ｐにおいてドメイン間ジスルフィド架橋は存在しない。
【００５２】
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントの例としては、ヒンジを有するもしくはヒンジを有しないＮ２ドメイン、および介在性リンカー配列を有するもしくは有しない、またはヒンジを有するもしくは有しないＮ１−Ｎ２ドメインを含む。前述の例のうちのいずれかにおいて、Ｎ２またはＮ１Ｎ２フラグメントは、野生型糸状バクテリオファージにおいて見出されるＮ２もしくはＮ１Ｎ２、または組み換えＮ２もしくはＮ１Ｎ２であり得る。前述の例のうちのいずれかにおいて、Ｎ２またはＮ１Ｎ２フラグメントは、野生型糸状バクテリオファージ配列の変異体またはバリアントであり得る。
【００５３】
ｆｄ、ｆ１、Ｍ１３、Ｉｋｅ、Ｉ２−２、およびＩｆ１由来のＮ２の１次構造アライメントは、図２６として示される。ｆｄのアミノ酸は配列番号１４に、ｆ１は配列番号１５に、Ｍ１３は配列番号１６に、Ｉｋｅは配列番号１７に、Ｉ２−２は配列番号１８に、Ｉｆ１は配列番号１９に示される。この図およびアライメントをガイドとして用いて、本発明の一実施態様は、アミロイドに結合され、ｇ３ｐのＮ２ドメインまたはｇ３ｐのＮ２ドメインのフラグメントを含む、ｇ３ｐポリペプチドを含む、融合タンパク質を包含する。いくつかの態様において、ｇ３ｐのＮ２ドメインは、組成物においてｇ３ｐのアミロイド結合部分を安定化する。ｇ３ｐのＮ２ドメインを含む任意のｇ３ｐ融合タンパク質は、ｇ３ｐのＮ２の変異体、バリアント、およびフラグメントを含む。ｇ３ｐのＮ２のフラグメントは、Ｎ−またはＣ−末端のうちのどちらかまたは両方に少なくとも１つの切断を有する任意の全長のｇ３ｐのＮ２ドメインである。Ｇ３ｐのＮ２ポリペプチドは、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、または１９のアミノ酸、ならびにそれらのフラグメント、バリアント、および変異体によって例証される。
【００５４】
ｆｄ、ｆ１、およびＭ１３の１次構造アライメントは図２Ａとして示され、Ｉｋｅ、Ｉ２−２、Ｉｆ１は図２Ｂとして示される。このアライメントをガイドとして用いて、本発明の一実施態様は、アミロイドに結合され、ｇ３ｐのＮ１Ｎ２ドメインまたはｇ３ｐのＮ１Ｎ２ドメインのフラグメントを含む、ｇ３ｐポリペプチドを含む、融合タンパク質を包含する。ｇ３ｐのＮ１Ｎ２ドメインを含むｇ３ｐ融合タンパク質は、ｇ３ｐのＮ１Ｎ２の変異体、バリアント、およびフラグメントを含む。ｇ３ｐのＮ１Ｎ２のフラグメントは、Ｎ−またはＣ−末端のうちのどちらかまたは両方に少なくとも１つの切断を有する任意の全長のｇ３ｐのＮ１Ｎ２である。Ｇ３ｐ  Ｎ１Ｎ２ポリペプチドは、配列番号１〜９、１１、１３、２０、２４、および２９〜３１、それらのフラグメント、バリアント、および変異体のうちのいずれかのアミノ酸によって例証される。
Ｂ．ｇ３ｐ融合タンパク質の非ｇ３ｐ部分
【００５５】
本発明の融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域のＦｃフラグメントを第２のドメインとして含み得る。融合タンパク質は、目的のタンパク質またはそれらのフラグメントに結合される免疫グロブリン定常領域を含み、以下に説明される（例えば、米国特許第５，４８０，９８１号および同第５，８０８，０２９号；Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２９３６；Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９：３４７；Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６６７；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：１６４；Ａｒｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３；Ｌｉｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１；Ｌｉｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３；Ｐｅｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３；Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３０６０；Ｋｕｒｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９３５４；Ｃｈａｌｕｐｎｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０３６０；Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ，１９９１，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１４４８；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５４：５５９０）を参照されたい。これらの分子は、通常、結合した対象分子と関連する生物学的活性、ならびにエフェクター機能の両方、または免疫グロブリン定常領域と関連する他の所望の特徴（例えば、生物学的安定性、細胞分泌）を有する。
【００５６】
Ｆｃ発現カセットは商業的に購入することができる。Ｆｃフラグメントは、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインと、免疫グロブリンのヒンジ領域とからなり得る。Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃフラグメントであり得る。特定の一実施態様において、免疫グロブリン定常領域の一部は、ＩｇＧ１のＦｃフラグメントである。別の実施態様において、免疫グロブリン定常領域の一部は、ＩｇＧ４のＦｃフラグメントである。更に別の実施態様において、免疫グロブリン定常領域の一部は、ＩｇＭのＦｃフラグメントである。
【００５７】
したがって、一実施態様において、ｇ３ｐの組み換え可溶性アミロイド結合フラグメントは、標準的分子生物技術を用いて、免疫グロブリンＦｃドメインに融合される。ｇ３ｐの組み換え可溶性アミロイド結合フラグメントは、変異誘発されるか、または変更され得る。例えば、Ｎ１Ｎ２ドメインまたはＮ２ドメインなどのｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントは、ＩｇＧＦｃ融合発現ベクターにクローン化され得る。例示的なＩｇＧＦｃ融合ベクターは、例えば、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手可能なｐＦＵＳＥ−Ｆｃベクターの１つを含む。いくつかの実施態様において、得られた２価（例えば、ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ＩｇＧＦｃまたはｇ３ｐ（Ｎ２）−ＩｇＧＦｃ）融合タンパク質は、依然２価であるため、組み換え可溶性ｇ３ｐより高いアミロイド結合に対する活性を有する。
【００５８】
他の実施形態において、融合タンパク質は、ｇ３ｐの少なくとも２個のアミロイド結合フラグメントを含む。他の実施形態において、融合タンパク質は、ｇ３ｐの３個以上のアミロイド結合フラグメントを含む。他の実施形態において、融合タンパク質は、ｇ３ｐの５個のアミロイド結合フラグメントを含む。このようなダイマーおよび多量体融合タンパク質は、それらがｇ３ｐの２個以上のアミロイド結合フラグメントを含むため、より高い親和性相互作用を提供する。
【００５９】
ある種の実施態様において、融合タンパク質はアルブミンを含む。例えば、米国特許第６，６８６，１７９号を参照されたい。
Ｃ．本発明の例示的なｇ３ｐ融合タンパク質
【００６０】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む第１のドメインと、例えば、免疫グロブリンのＦｃフラグメントなどの、非ｇ３ｐタンパク質を含む第２のドメインとを含む。ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む第１のドメインは、有効成分であり、融合タンパク質に治療生物学的活性を与える。いくつかの態様において、本明細書で説明されるように、融合タンパク質のｇ３ｐ部分は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号３１のｇ３ｐ部分、または配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号３１のＮ、Ｃ、もしくはＮおよびＣ末端欠損のうちのいずれかと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。この実施形態の一態様として、融合タンパク質のｇ３ｐ部分は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のｇ３ｐ部分と同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ｇ３ｐ部分は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１に列挙される任意のｇ３ｐ部分と比較して、変異体、バリアント、フラグメントであり得、アミロイドと結合することが可能である。別の態様において、融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸２１〜５０６、配列番号９のアミノ酸２２〜５０６、配列番号９のアミノ酸２３〜５０６、配列番号９のアミノ酸２１〜５０５、配列番号９のアミノ酸２２〜５０５、配列番号９のアミノ酸２３〜５０５、配列番号１１のアミノ酸２１〜５０６、配列番号１１のアミノ酸２２〜５０６、配列番号１１のアミノ酸２３〜５０６、配列番号１１のアミノ酸２１〜５０５、配列番号１１のアミノ酸２２〜５０５、配列番号１１のアミノ酸２３〜５０５、配列番号１３のアミノ酸２１〜５０９、配列番号１３のアミノ酸２２〜５０９、配列番号１３のアミノ酸２３〜５０９、配列番号１３のアミノ酸２１〜５０８、配列番号１３のアミノ酸２２〜５０８、配列番号１３のアミノ酸２３〜５０８、配列番号３１のアミノ酸２１〜５２８、配列番号３１のアミノ酸２２〜５２８、配列番号３１のアミノ酸２３〜５２８、配列番号３１のアミノ酸２１〜５２７、配列番号３１のアミノ酸２２〜５２７、または配列番号３１のアミノ酸２３〜５２７から選択されるか、またはこれらの融合タンパク質のうちのいずれかの変異体またはバリアントである。
【００６１】
別の態様において、融合タンパク質のｇ３ｐ部分は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のうちのいずれかの対応するｇ３ｐ部分と比較して、１〜２０個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む変異体ｇ３ｐであり、融合タンパク質は、その未修飾の対応物よりもヒトにおいて免疫原性が低い。これらの実施形態のいくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のうちのいずれかの対応するｇ３ｐ部分と比較して、１〜１０個のアミノ酸置換を有する。他の態様において、融合タンパク質は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のうちのいずれかの対応するｇ３ｐ部分と比較して、１〜５個のアミノ酸置換を有する。更に他の態様において、アミノ酸置換は、融合タンパク質のｇ３ｐ部分に存在する（例えば、配列番号９のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２３８、配列番号１１のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２３８、配列番号１３のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２３８、または配列番号３１のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２９６）。
【００６２】
他の実施形態において、免疫原性のより低い融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０５もしくは５０６、配列番号１１のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０５もしくは５０６、配列番号１３のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０８もしくは５０９、または配列番号３１のアミノ酸２１、２２、または２３〜５２７もしくは５２８のバリアントであり、該バリアントは、それぞれ、配列番号９のアミノ酸２２もしくは２３〜２３８、配列番号１１のアミノ酸２２もしくは２３〜２３８、配列番号１３のアミノ酸２２もしくは２３〜２３８、または配列番号３１のアミノ酸２２もしくは２３〜２９６の領域において１〜２０個のアミノ酸置換を有することのみ、列挙されたアミノ酸配列と異なる。これらの実施形態のいくつかの態様において、融合タンパク質は、１〜１０個のアミノ酸置換を有する。他の態様において、融合タンパク質は、１〜５個のアミノ酸置換を有する。
【００６３】
上で参照される免疫原性のより低い融合タンパク質は、公知の脱免疫プロセスを用いて特定することができる。典型的には、融合タンパク質のｇ３ｐ部分は、それらがＴ細胞エピトープを含有する場所を決定するためにスクリーニングされる。このような潜在的なＴ細胞エピトープは、一般的に、ＭＨＣ分類ＩＩ分子と結合するための能力を有する任意のアミノ酸残基配列として定義される。他の実施形態において、融合タンパク質全体が、Ｔ細胞エピトープについてスクリーニングされる。
【００６４】
当該技術分野において、実験的に決定されたＴ細胞エピトープ中において認識される配列モチーフのためのスキャニングの計算手段によって、またはあるいは、ＭＨＣ分類ＩＩ−結合ペプチドおよび具体的にはＤＲ−結合ペプチドを予想するための計算技術を用いて、方法がＴ細胞エピトープの検出を可能にするための方法が提供される。例えば、国際公開第ＷＯ９８／５２９７６号および同第ＷＯ００／３４３１７号は、ヒトＭＨＣ分類ＩＩ  ＤＲアロタイプのサブセットに結合する可能性を有するポリペプチド配列を特定することに対する計算スレッド化のアプローチを教示する。国際公開第ＷＯ０８／０４４０３２号は、既知のＴ細胞エピトープのデータベースに対して１次アミノ酸配列をスクリーニングして、その配列においてＴ細胞エピトープを特定することを教示する。
【００６５】
あるいは、脱免疫されるべきタンパク質のペプチド部分（例えば、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３のｇ３ｐ部分）は、それらがＭＨＣ分子（例えば、米国特許第７，２０８，１４７号を参照されたい）と結合するかどうかを決定するために、シリコにおいて、または細胞アッセイにおいて、またはインビボで、合成されて試験され得る。
【００６６】
一旦予想したＴ細胞エピトープが特定されると、本発明の融合タンパク質のｇ３ｐ部分の１次配列内の慎重なアミノ酸置換は、免疫原性を減少させる試みにおいて使用される。配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、および配列番号３１のｇ３ｐ部分のこれらの予想される脱免疫変異体は、次いで、活性を保持するものを特定するために、活性および免疫原性の両方について再スクリーニングされるが、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３のうちのいずれかのｇ３ｐ部分と比較して、低減された免疫原性を有するか、またはそれを有さない。典型的には、これは１〜約２０個のアミノ酸の置換を必要とする。
【００６７】
全ての例において、本発明の融合タンパク質におけるｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントは、それらの変異体またはバリアントを包含する。
【００６８】
一般に、融合タンパク質は、ｇ３ｐの対応する非結合アミロイド結合フラグメントと少なくとも同等に有効に、アミロイドに結合する。適用可能なとき、融合タンパク質は、アミロイドの脱凝集の媒介、アミロイドクリアランスの促進、アミロイドの凝集の阻害、および／または毒性オリゴマー形成の除去もしくは予防において、少なくともｇ３ｐの対応する非結合アミロイド結合フラグメントと同等に有効である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、アミロイドの脱凝集の媒介、アミロイドクリアランスの促進、アミロイド凝集の阻害、および／または毒性オリゴマー形成の除去もしくは予防において、配列番号：１を含む組み換え可溶性ｇ３ｐと少なくとも同等に有効である。更に他の実施形態において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、アミロイドの脱凝集の媒介、アミロイドクリアランスの促進、アミロイド凝集の阻害、および／または毒性オリゴマー形成の除去もしくは予防において、少なくともファージＭ１３と同等に有効である。更に他の実施形態において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、アミロイドの脱凝集の媒介、アミロイドクリアランスの促進、アミロイド凝集の阻害、および／または毒性オリゴマー形成の除去もしくは予防において、ファージＭ１３より有効である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、タンパク質ミスフォールディング病におけるアミロイドの低減において、少なくともファージＭ１３と同等に有効である。更に他の実施形態において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、タンパク質ミスフォールディング病におけるアミロイドの低減において、ファージＭ１３より有効である。更に他の実施形態において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、アミロイド形成の予防において、少なくともファージＭ１３と同等またはより有効である。
【００６９】
融合タンパク質は、当該技術分野において公知の技術を用いて合成され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、細胞中で組み換え的に合成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。あるいは、本発明の融合タンパク質は、固相合成などの既知の合成方法を用いて合成され得る。合成技術は当該技術分野において公知である（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９７３，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎａｙｏｔｉｓ  ｅｄｓ．）ｐｐ．３３５−６１；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  １９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４；Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９７６，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｄ  ｅｄ．）２：１０５；Ｅｒｉｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９７６，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｄ  ｅｄ．）２：２５７；米国特許第３，９４１，７６３号を参照されたい）。あるいは、最終構築物は、組み換え的に産生された融合タンパク質と同一の機能を本質的に共有し得るが、ライゲーション化学などの非組み換え技術を用いて単純に産生され得る。融合タンパク質の成分は、ｇ３ｐ発現およびｇ３ｐ変異について記載されたのと同一の一般的な方法論を用いて、調製され得る。
Ｄ．ｇ３ｐの融合タンパク質をコードする核酸
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明は、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を提供し、融合タンパク質のｇ３ｐ部分が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のｇ３ｐ部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有するｇ３ｐの変異体またはバリアントのアミロイド結合フラグメントを含む。これらの実施形態の一態様において、核酸配列は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号３２（それぞれ、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、および配列番号３１をコードする実際の核酸配列）、または同一のポリペプチドに対して変性であるが、前述のうちのいずれか１つと同一のポリペプチドをコードする核酸配列から選択される。これらの実施形態の別の態様において、核酸配列は、その５’末端およびシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に対してインフレームで融合された、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号３２の部分（すなわち、配列番号９のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０５もしくは５０６、配列番号１１のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０５もしくは５０６、配列番号１３のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０８もしくは５０９、配列番号３１のアミノ酸２１、２２、または２３〜５２７もしくは５２８のうちのいずれか１つをコードする核酸配列）、または同一のポリペプチドに対して変性であるが、前述のうちのいずれか１つと同一のポリペプチドをコードする核酸配列をコードするｇ３ｐ−Ｉｇから選択される。いくつかの実施形態において、シグナル配列は哺乳類のものである。
【００７１】
これらの実施形態の別の態様において、核酸配列は、その５’末端およびシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に対してインフレームで融合された、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号３２の部分（すなわち、配列番号９のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２３８、配列番号１１のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２３８、配列番号１３のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２３８、または配列番号３１のアミノ酸２１、２２、もしくは２３〜２９６のうちのいずれか１つをコードする核酸配列）、または同一のポリペプチドに対して変性であるが、前述のうちのいずれか１つと同一のポリペプチドをコードする核酸配列をコードするｇ３ｐから選択される。いくつかの実施形態において、シグナル配列は哺乳類のものである。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号３２を含み、シグナル配列をコードする核酸（すなわち、配列番号９、１１、１３、または３１のうちのいずれかのアミノ酸１〜２０、１〜２１、または１〜２２）は除かれる。ある種の実施態様において、ｇ３ｐ融合タンパク質をコードするが、シグナル配列をコードするヌクレオチドを除く核酸が、ｉ）配列番号２６もしくは２７のいずれかのヌクレオチド６１、６４、または６７〜１５２１、ｉｉ）配列番号２８のヌクレオチド６１、６４、または６７〜１５２７、およびｉｉｉ）配列番号３２のヌクレオチド６１、６４、または６７〜１５８７、から選択される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、ｇ３ｐのＮ１Ｎ２ドメイン、またはそれらの変異体、バリアント、もしくはフラグメントをコードする。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のうちのいずれかのｇ３ｐ部分と比較して、１〜２０個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を提供し、融合タンパク質は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のうちのいずれかのｇ３ｐ部分よりもヒトにおいて免疫原性が低い。これらの実施形態のいくつかの態様において、核酸配列は、融合タンパク質をコードし、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のｇ３ｐ部分と比較して、１〜１０個のアミノ酸置換を有する。これらの実施形態の他の態様において、核酸配列は、融合タンパク質をコードし、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１のｇ３ｐ部分と比較して、１〜５個のアミノ酸置換を有する。これらの実施形態の更に他の態様において、核酸配列はポリペプチドをコードし、アミノ酸置換はすべて、融合タンパク質のｇ３ｐ部分（例えば、配列番号９のアミノ酸２１、２２または２３〜２３８、配列番号１１のアミノ酸２１、２２または２３〜２３８、配列番号１３のアミノ酸２１、２２、または２３〜２３８、または配列番号３１のアミノ酸２１、２２、または２３〜２９６、またはそれらの変異体、バリアント、もしくはフラグメント）に存在する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号９のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０５もしくは５０６、配列番号１１のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０５もしくは５０６、配列番号１３のアミノ酸２１、２２、または２３〜５０８もしくは５０９、または配列番号３１のアミノ酸２１、２２、または２３〜５２７もしくは５２８のうちのいずれか１つのバリアントであり、かつ配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号３１よりも免疫原性が低い、融合タンパク質をコードする核酸配列を提供し、このバリアントは、ｇ３ｐ領域において１〜２０個のアミノ酸置換を有することのみ、その対応するアミノ酸配列と異なる（すなわち、それぞれ、配列番号９のアミノ酸２１、２２、または２３〜２３８、配列番号１１のアミノ酸２２もしくは２３〜２３８、配列番号１３のアミノ酸２２もしくは２３〜２３８、または配列番号３１のアミノ酸２２もしくは２３〜２９６）。これらの実施形態のいくつかの態様において、核酸配列は、融合タンパク質をコードし、１〜１０個のこのようなアミノ酸置換を有する。他の態様において、核酸配列は、融合タンパク質をコードし、１〜５個のアミノこのような酸置換を有する。
Ｅ．変異体ｇ３ｐ融合タンパク質
【００７５】
別の態様において、本発明は、ｇ３ｐの変異体アミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質に関する。ｇ３ｐの変異体アミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質が、本出願に記載される薬学的組成物の治療上の有効性に寄与する特性のため、産生されるか、または選択され得る。例えば、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントは、組み換え的に変異誘発されるか、あるいはそれ以外の場合、Ｍ１３のｇ３ｐに関連する以下の特性の１つ以上を有するよう選択され得る：アミロイド結合の親和性の増大、ヒンジＴＭの低減、結合活性の増大（結合活性が、ｇ３ｐが１個以上のアミロイド結合部位を含む全ての利用可能なアミロイド結合の和を記載するために用いられる点で、結合活性は親和性と区別される）、アミロイド凝集体を脱凝集させる能力の増大、またはアミロイド原線維の凝集を防ぐ能力の増大。あるいは、または加えて、ｇ３ｐの変異体アミロイドフラグメントは、本明細書中の他の箇所に記載される他の有用な特性を取り込み得る。
【００７６】
変異体ｇ３ｐタンパク質は、ファージの変異誘発により、またはＰＣＲに基づく部位指定変異誘発もしくはランダム変異誘発などの組み換え技術により産生され得る。
【００７７】
ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント（例えば、Ｎ１Ｎ２ドメインまたはＮ２ドメイン）はまた、組み換え技術を用いて変異誘発され、本発明の融合タンパク質に取り込まれ得る。例えば、ｇ３ｐまたはそのアミロイド結合フラグメント（例えば、Ｎ１Ｎ２またはＮ２）を有する、本明細書に記載されるベクターが、ＰＣＲに基づく変異誘発ストラテジーを用いて変異誘発され得る。次いで、コード化された変異体タンパク質が発現され、変異体のアミロイド結合および親和性が、記載の通り評価される。
【００７８】
ｇ３ｐの変異体アミロイド結合フラグメントはまた、変異体ｇ３ｐからもたらされ得る。例えば、ｇ３ｐを変異誘発し、および／または所望の特性を有する変異体ｇ３ｐについて選択し、次いで、そこから所望のアミロイド結合フラグメントを得ることによって（例えば、タンパク質分解および続く精製によって）。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質は、Ｍ１３由来の対応する未変異ｇ３ｐフラグメント、または対応する未変異ｇ３ｐ融合タンパク質の結合より少なくとも３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００高い親和性でアミロイドに結合するｇ３ｐの変異体アミロイド結合フラグメントを含む。他の実施形態において、変異体ｇ３ｐアミロイド結合フラグメントを有する融合タンパク質は、Ｍ１３由来の対応する未変異アミロイド結合ｇ３ｐフラグメント、または対応する未変異ｇ３ｐ融合タンパク質の結合との強さの少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％であるアミロイド結合を保持する。いくつかの実施形態において、対応する未変異形態より低いアミロイド結合親和性を示す変異体ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントはまた、対応する未変異形態と比較して改良された、別の所望の生物学的（例えば、アミロイドを脱凝集させるより高い能力、アミロイド原線維の凝集を予防するより高い能力）、または薬学的（例えば、より高い代謝安定性、好ましい薬物動態特性、より高い溶解性）特性も有する。アミロイド結合は、実施例に記載される通り、表面プラズモン共鳴により、または競合的ＥＬＩＳＡにおいて評価され得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ｇ３ｐのアミロイドフラグメントのバリアントおよび／または変異体は、Ｍ１３ｇ３ｐへのハイブリダイゼーションを用いてＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより特定され、高度なストリンジェンシーまたは中程度のストリンジェンシー条件下のいずれかで、Ｍ１３ｇ３ｐにハイブリダイゼーションする関連ＤＮＡを選択し得る。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ｇ３ｐの変異体アミロイドフラグメントを含む本発明のｇ３ｐ融合タンパク質は、組み換え的に産生され、少なくとも１つのアミノ酸残基で未変異ｇ３ｐポリペプチドと異なるが依然アミロイドに結合するｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む。いくつかの実施態様において、個々の点変異は、ｇ３ｐポリペプチドの特定の残基で未変異ｇ３ｐのアミノ酸を提供すること、および該残基でアミノ酸を置換することによって特定される。例えば、「Ｆ１９４Ａ」は、成熟型Ｍ１３配列（配列番号：１）の位置１９４のフェニルアラニンがアラニンに変更されていることを意味する。他の実施形態において、変異体ｇ３ｐは、具体的なアミノ酸配列に類似のパーセントアミノ酸を特定することにより記載される（但し、変異体ｇ３ｐはアミロイド原線維に結合する）。これらの実施形態において、本発明の融合タンパク質の変異体３ｐ部分は、配列番号１の対応する部分の全長に渡り、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有する。本発明のそれらの実施形態において、変異体ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含むことに関して、変異体アミロイド結合フラグメントは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号３１の対応するフラグメントの全長にわたって、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有する。
【００８２】
実際に、任意の特定のポリペプチドが、少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、従来、既知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム）を用いて決定され得る。特定の配列が、本発明による参照配列と例えば９５％同一であることを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは他の配列アライメントプログラムを用いるとき、パラメーター（当然、同一性のパーセンテージはクエリー配列に相同な参照アミノ酸配列の部分の全長に渡り計算される）が設定される。
【００８３】
種々の態様のいくつかの実施態様において、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質のｇ３ｐ部分の変異体アミロイド結合フラグメントは、Ｆｆファミリー、Ｉ−ファミリー、またはＦｆおよびＩ−ファミリーの両方のｇ３ｐの対応する部分間で保存されるアミノ酸残基での変異を含まない。他の実施形態において、ｇ３ｐの変異体アミロイド結合フラグメントは、Ｆｆファミリー、Ｉ−ファミリー、またはＦｆおよびＩ−ファミリーの両方のｇ３ｐの対応する部分間で保存される１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基での最大変異を含む。更に他の実施形態において、ｇ３ｐの変異体アミロイド結合フラグメントは、Ｆｆファミリー、Ｉ−ファミリー、またはＦｆおよびＩ−ファミリーの両方のｇ３ｐの対応する部分間で保存されない０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基での最大変異を含む。更に別の実施形態において、ｇ３ｐの変異体アミロイド結合フラグメントは、Ｉ２２、Ｉｋｅ、およびＩｆ１のうちの１個以上の対応する部分間で保存されない０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基での最大変異を含む。更に他の実施形態において、ｇ３ｐの変異体アミロイド結合フラグメントは、Ｆｆファミリー、Ｉ−ファミリー、またはＦｆおよびＩ−ファミリーの両方のｇ３ｐの対応する部分間で保存されない１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基での最大変異を含む。いくつかの実施形態において、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異は、Ｎ１ドメイン内に位置する。いくつかの実施形態において、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異は、Ｎ２ドメイン内に位置する。いくつかの実施形態において、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異は、Ｎ２ドメイン内に位置するが、ヒンジ領域内に位置しない。
【００８４】
部位指定変異誘発は、ｇ３ｐ、Ｎ１Ｎ２、またはＮ２ドメインの安定性に重要であることが知られている残基を標的にし得る。例えば、Ｄ９４およびＴ９５、Ｅ１１５、Ｎ１２２、Ｌ１２５、Ｅ１２６およびＥ１２７、Ｅ１２７およびＥ１２８、Ｑ１２９、Ｑ１４５、Ｔ１５４およびＴ１５６、Ｑ１５７、Ｔ１５９およびＤ１６０、Ｋ１６３およびＴ１６４、Ｙ１６６、ならびにＥ１９６およびＤ１９７でのアラニン置換変異は、Ｆ−ｐｉｌｉへのファージ結合に有意に影響しないことが既に示されている（Ｄｅｎｇ  ＆  Ｐｅｒｈａｍ，２００２）。したがって、これらの位置は変異に寛容であり、これらの位置のうちの１つ以上での変異は、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質において、アミロイド結合能力を増強するか、またはそれに対して中立の効果を有し得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、（配列番号１に関する）Ｄ９４、Ｔ９５、Ｅ１１５、Ｎ１２２、Ｌ１２５、Ｅ１２６、Ｅ１２７、Ｅ１２８、Ｑ１２９、Ｑ１４５、Ｔ１５４、Ｔ１５６、Ｑ１５７、Ｔ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６３、Ｔ１６４、Ｙ１６６、Ｅ１９６、またはＤ１９７のうちの１個以上で変異誘発されたｇ３ｐアミロイド結合フラグメントを含むｇ３ｐ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、変異は、Ｄ９４、Ｔ９５、Ｅ１１５、Ｎ１２２、Ｌ１２５、Ｅ１２６、Ｅ１２７、Ｅ１２８、Ｑ１２９、Ｑ１４５、Ｔ１５４、Ｔ１５６、Ｑ１５７、Ｔ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６３、Ｔ１６４、Ｙ１６６、Ｅ１９６、またはＤ１９７のうちの１個以上に存在し、アラニンに対する変異に限らない。
【００８５】
Ｆ１９４、Ｆ１９０およびＨ１９１、Ｋ１８４、Ｒ１８６、ならびにＤ１８７、Ｒ１４２およびＲ１４４でのアラニン置換変異は、Ｆ−ｐｉｌｉへの結合を減少させることを既に示した（Ｄｅｎｇ  ＆  Ｐｅｒｈａｍ，２００２）。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質のｇ３ｐ部分における異変は、次の残基：Ｒ１４２、Ｒ１４４、Ｗ１８１、Ｋ１８４、Ｒ１８６、Ｄ１８７、Ｆ１９０、Ｈ１９１、またはＦ１９４（配列番号１に関連した番号）のうちの１個以上を含まない変異から選択される。しかしながら、Ｒ１４２、Ｒ１４４、Ｗ１８１、Ｋ１８４、Ｒ１８６、Ｄ１８７、Ｆ１９０、Ｈ１９１、またはＦ１９４の非アラニン残基での置換は、アミロイド結合を増大し得る。したがって、一実施形態において、変異は、Ｒ１４２、Ｒ１４４、Ｗ１８１、Ｋ１８４、Ｒ１８６、Ｄ１８７、Ｆ１９０、Ｈ１９１、またはＦ１９４のうちの１個以上で非アラニン変異である。一実施形態において、変異はＦ１９４での非アラニン変異である。別の実施形態において、変異はＦ１９０およびＨ１９１での非アラニン変異である。別の実施形態において、変異は、Ｋ１８４、Ｒ１８６、およびＤ１８７での非アラニン変異である。別の実施形態において、変異はＷ１８１での非アラニン変異である。別の実施形態において、変異は、Ｒ１４２およびＲ１４４での非アラニン変異である。ある種の実施態様において、変異は、Ｔ１３Ｉ、Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、Ｇ１５３Ｄ、Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、Ｆ１９４Ａ、およびＤ２０９Ｙのうちの１つ、いくつか、または全てに限らない。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質のｇ３ｐ部分の変異は、Ｆ−ｐｉｌｉに結合するｇ３ｐの部分であるＮ２ドメインの表面上に位置する１個以上の残基においてである。一実施形態において、変異は、Ｎ２ドメインの外縁上に位置する１個以上の残基においてである。他の実施形態において、変異は、ＴｏｌＡに結合するｇ３ｐの部分である、Ｎ１ドメインの表面上に位置する１個以上の残基においてである。一実施形態において、本発明の融合タンパク質のｇ３ｐ部分の変異は、Ｎ１ドメインの外縁上に位置する１個以上の残基においてである。別の実施形態において、変異は、ｇ３ｐ上の１個以上の溶媒によりアクセス可能な残基においてである。更に別の実施形態において、変異（複数を含む）は、Ｐｒｏ２１３でのｃｉｓ／ｔｒａｎｓ平衡を５０、６０、７０、８０、９０、または９５％より高いｔｒａｎｓにシフトする。したがって、いくつかの実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質は、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも９５％トランスである、Ｐｒｏ２１３でのｃｉｓ／トランス平衡を有する変異体ｇ３ｐを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質のｇ３ｐ部分のｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントは、構造的に保存された残基での変異を含まない。構造的に保存された残基の例は、可能性のある配列挿入に関わらず、ＦｆおよびＩ−ファミリーメンバーの両方においてドメイン構造を提供する際に関与する残基を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質のｇ３ｐ部分において生じた任意の変異はアミロイド結合を保存する。他の実施形態において、変異は、プロリン残基を置換しない。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質のｇ３ｐ部分において生じた任意の変異はアミロイド結合を保存し、システイン残基を置換しない。いくつかの実施形態において、変異は、ｇ３ｐ内に見られるジスルフィド架橋のうちの全て、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全てを保存する。したがって、１つの実施態様において、任意の変異は、Ｃｙｓ７とＣｙｓ３６との間、およびＣｙｓ４６とＣｙｓ５３との間のＮ１における２つのジスルフィド架橋を保存する。別の実施形態において、任意の変異は、Ｃｙｓ７とＣｙｓ３６との間、およびＣｙｓ４６とＣｙｓ５３との間のＮ１におけるジスルフィド架橋のうちのいずれかを保存するが、それらの両方は保存しない。一実施形態において、Ｃｙｓ１８８とＣｙｓ２０１との間のジスルフィド架橋は保存される。いくつかの実施形態において、ジスルフィド架橋Ｃｙｓ７およびＣｙｓ３６、Ｃｙｓ４６およびＣｙｓ５３、ならびにＣｙｓ１８８およびＣｙｓ２０１の各々が保存される。一実施形態において、変異は、Ｃｙｓ３５４とＣｙｓ３７１との間のジスルフィド架橋を保存する。いくつかの実施形態において、変異は、Ｃｙｓ７とＣｙｓ３６との間、Ｃｙｓ４６とＣｙｓ５３との間、Ｃｙｓ１８８とＣｙｓ２０１との間、およびＣｙｓ３５４とＣｙｓ３７１との間のジスルフィド架橋を保存する。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質のｇ３ｐ部分において生じた任意の変異は、アミロイド結合を保存し、Ｎ１Ｎ２の融点（ＴＭ）を低減する。ＴＭは、実施例に記載の方法のうちのいずれかを用いて測定され得る。Ｎ１Ｎ２のＴＭを減少させる変異体は、Ａβへの良好な結合を呈し、Ａβアセンブリをより広範囲に阻害し、脱凝集アッセイにおいてＭ１３のｇ３ｐと少なくとも同等に有効であることが予測される。したがって、ｇ３ｐのこれらの変異体アミロイド結合フラグメントを含むこのような融合タンパク質は、１つ以上のタンパク質ミスフォールディング病の処置において、Ｍ１３中で対応する配列、ｇ３ｐの対応する未変異アミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質、およびインタクトなＭ１３とそれぞれ少なくとも同等に治療上有効であることが予測される。
【００９１】
ｇ３ｐの変異体アミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質はまた、ターゲティング配列を含むように設計され得る。このようなターゲティング配列は、Ｎ１Ｎ２間またはＮ２間で可撓性リンカー領域、およびＮ２融合タンパク質中の別のドメインに挿入され得る。ターゲティング核局在化配列（ＮＬＳ）は、ハンチントン病において有益であり得る。エンドソームのターゲティングは、パーキンソン病において有益であり得る。
【００９２】
細胞中の特定の領域のターゲティングに加え、ターゲティング配列を用いて、異なる種類のアミロイドが標的にされ得る。核形成配列は、親和性を増大し、変異体タンパク質を特定のアミロイドに向け得る。それ自体の上で沈殿する疎水性であるペプチド配列を含む、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質のｇ３ｐの他の変異体アミロイド結合フラグメントが調製される。例えば、複数のＡＶＶＡＩ配列は、ｇ３ｐおよび／もしくはそのアミロイド結合フラグメント（例えば、Ｎ２およびＮ１Ｎ２）ならびに／またはその融合タンパク質に添加され、増強した複数の結合配列を有する化学タンパク質を産生することができる。アミロイドと結合して、ｇ３ｐの変異体または化学アミロイド結合フラグメントと、ｇ３ｐのこれらの変異体または化学アミロイド結合フラグメントを含む融合タンパク質との中に取り込まれ得るペプチドのいくつかの例は、Ｓａｔｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）４５：５５０３−１６に記載されるＧｘＦｘＧｘＦ（配列番号２１）フレームワークに基づくペプチド阻害剤、およびＴｊｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：８５４５−４８に記載されるＫＬＶＦＦ（配列番号２２）ペプチドである。他のターゲティング部分が知られており、本発明においても用いられ得る。例えば、Ｓｃｉａｒｒｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２００６）４１３：２７３−３１２を参照されたい。用語「バリアント」および「変異体」は、「変異体」が典型的には天然の非組み換えである一方で、「変異体」は典型的には組み換えであることを除き、本明細書において同義的に用いられる。
組み換え技術
【００９３】
一般的に、ｇ３ｐ融合タンパク質（ならびにその変異体およびバリアント）をコードするＤＮＡは、従来の組み換えＤＮＡ技術（例えば、ｇ３ｐ遺伝子のクローニング、直接的ＤＮＡ合成、または例えばＭ１３配列をプローブとして用いて、対応するＤＮＡをライブラリーから単離すること）を用いて調製される。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【００９４】
組み換え産生のため、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質、またはそのアミロイド結合フラグメントをコードする核酸配列は、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメント、またはＲＮＡウイルスベクターの場合、複製および翻訳に必要なエレメントを含有する適切な発現ベクターに挿入される。コード核酸は、適切なリーディングフレームでベクターに挿入される。
【００９５】
したがって、本発明は、その変異体およびバリアントを含めて、本明細書に記載されるｇ３ｐ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ｇ３ｐまたはｇ３ｐ融合分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。このようなベクターは、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
【００９６】
組み換え発現のための例示的細胞型としては、バキュロウイルス系などの昆虫細胞、ピキア、サッカロミセス、およびアスペルギルス細胞を含む真菌細胞、大腸菌細胞を含む細菌細胞、ＮＳＯ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、または任意の他の確立された動物細胞株を含む動物細胞株、およびトランスジェニック動物細胞（例えば、ヤギ）が挙げられる。
【００９７】
いくつかの実施態様において、ＣＨＯまたはＣＨＯ由来細胞中でのポリペプチドの発現に最適化されたベクターが選択される。例示的なこのようなベクターは、例えば、Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２００４）２０：８８０−８８９に記載される。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ベクターは、ヒトを含む動物におけるｇ３ｐ、そのアミロイド結合フラグメント、および／またはｇ３ｐ融合分子のインビボ発現のため選択される。いくつかのこのような実施態様において、ポリペプチドの発現は、組織特異的方法で機能するプロモーターの制御にある。
【００９９】
発現ベクターは、ポリペプチドを発現する好適な標的細胞にトランスフェクションまたはコトランスフェクションされる。非限定的な例示的トランスフェクションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に記載される。核酸は、当該技術分野において知られた方法により、所望の宿主細胞に一過性または安定的にトランスフェクションされ得る。様々な宿主−発現ベクター系を用いて、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかを含む、本明細書に記載のタンパク質が発現され得る。これらは、適切なコード配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌）などの微生物；適切なコード配列を含有する組み換え酵母または真菌発現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌；適切なコード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）でインフェクションされた昆虫細胞系；適切なコード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス）でインフェクションされたか、または組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞；または哺乳動物の細胞（例えば、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ、またはＨＥＫ−２９３細胞）を含む動物細胞系を含むが、これらに限定されない。タンパク質はまた、ウキクサにおいて組み換え的に産生され得る。例えば、米国特許第８，０２２，２７０号を参照されたい。
【０１００】
形質転換に用いられるベクターは、通常、形質転換体を特定するために用いられる選択可能なマーカーを含有する。細菌系において、これは、アンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子を含み得る。培養哺乳動物細胞において用いるための選択可能なマーカーは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を確かにする遺伝子を含む。選択可能なマーカーは、増殖可能な選択可能なマーカーであり得る。１つの増殖可能な選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子である。別の増殖可能な選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲｒ  ｃＤＮＡ（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），（１９８３）８０：２４９５）である。選択可能なマーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ）により概説され、選択可能なマーカーの選択は、十分に当業者の範囲内である。
【０１０１】
発現系の発現エレメントは、その強さおよび特異性において変動する。用いられる宿主／ベクター系に依存して、恒常的および誘導可能なプロモーターを含む、多数の好適な転写および翻訳エレメントのいずれかが、発現ベクター中で用いられ得る。例えば、細菌系にクローニングされるとき、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの誘導可能なプロモーターが用いられ得る；昆虫細胞系にクローニングされるとき、バキュロウイルス多面体プロモーターなどのプロモーターが用いられ得る；植物細胞系にクローニングされるとき、植物細胞のゲノムからもたらされるプロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット用プロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質用プロモーター）、または植物ウイルスからもたらされるプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）が用いられ得る；哺乳動物細胞系にクローニングされるとき、哺乳動物細胞のゲノムからもたらされるプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスからもたらされるプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が用いられ得る；複数コピーの発現産物を含有する細胞株を産生するとき、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−、およびＥＢＶ−に基づくベクターが適切な選択可能なマーカーと共に用いられ得る。
【０１０２】
植物発現ベクターが用いられる場合、本発明の発現産物の直線形態または非環状形態をコードする配列の発現は、多数のプロモーターのうちのいずれかによりもたらされ得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：５１１−５１４）、またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）６：３０７−３１１）が用いられ得るか、あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーター（Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８４）３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２４：８３８−８４３）またはヒートショックプロモーター、例えば、大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：５５９−５６５）が用いられ得る。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを用いて植物細胞に導入され得る。このような技術の概説については、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  １９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３；ａｎｄ  Ｇｒｉｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｏｒｅｙ  １９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈ．７−９を参照されたい。
【０１０３】
本発明のタンパク質を産生するために用いられ得る１つの昆虫発現系において、オートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、外来遺伝子を発現させる。ウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞において成長する。コード配列は、ウイルスの非本質的領域（例えば、多面体遺伝子）にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、多面体プロモーター）の制御下に置かれる。コード配列の十分な挿入は、多面体遺伝子の不活性化と、非閉鎖組み換えウイルス（すなわち、多面体遺伝子によりコードされるタンパク質コートを欠くウイルス）の産生とをもたらす。次いで、これらの組み換えウイルスを用いて、スポドプテラ・フルギペルダ細胞（ここで、挿入遺伝子が発現する）を感染させる（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８３）４６：５８４；米国特許第４，２１５，０５１号を参照されたい）。この発現系の更なる例は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにおいて見られ得る。
【０１０４】
哺乳動物宿主細胞において、多数の、ウイルスに基づく発現系が用いられ得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合において、コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３分子リーダー配列）にライゲーションされ得る。次いで、この融合遺伝子は、インビトロまたはインビボ組み換えによりアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非本質的領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、感染宿主において生存可能で、かつペプチドを発現する能力がある組み換えウイルスをもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８４）８１：３６５５を参照されたい）。あるいは、ワクシニア７．５Ｋプロモーターが用いられ得る（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８２）７９：７４１５；Ｍａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８４）４９：８５７；Ｐａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８２）７９：４９２７を参照されたい）。他のウイルス発現系は、アデノ関連ウイルスおよびレンチウイルスを含む。
【０１０５】
ＤＮＡ構築物を含有する宿主細胞は、適切な成長培地中で成長する。本明細書で用いられるとき、用語「適切な成長培地」は、細胞の成長に必要な栄養分を含有する培地を意味する。本発明の組み換え的に産生されたタンパク質は、当該技術分野における従来の技術を用いて培養培地から単離され得る。
インビトロアッセイ
【０１０６】
いくつかの実施形態において、アミロイドの脱凝集は、チオフラビンＴ蛍光（ＴｈＴ）アッセイを用いてモニタリングされ得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、脱凝集は、本発明の融合タンパク質または組成物の存在下または不在下での界面活性剤可溶化をモニタリングすることにより調べられる。例えば、凝集したα−シヌクレインは、本発明の組成物を用いて処理され得る。凝集したα−シヌクレインを脱凝集する融合タンパク質または組成物は、α未処理の線維と比較して、α−シヌクレイン線維をＳＤＳなどの界面活性剤中でより速く可溶化させる。アミロイド線維の可溶性形態へのこの変換は、標識（例えば、Ｃｙ５）α−シヌクレインモノマーの一部を凝集中に取り込むことにより、モニタリングされ得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、毒性アミロイドオリゴマーの形成の予防は、神経細胞培養細胞毒アッセイにより調べられる。このアッセイにおいて、分化したＮ２ａ神経芽腫細胞または同等物は、Ａβ４２オリゴマーと共培養される。オリゴマーは膜に結合し、膜摂動と細胞質内酵素の培地への漏出とを引き起こす。高濃度のオリゴマーとの長期インキュベーションは細胞を殺傷する。オリゴマーは、細胞とインキュベーションする前に、ファージまたはｇ３ｐと予め処置されるとき、オリゴマーは少なくとも毒性がより低く、時に無毒性である。この中和効果は、アデニル酸キナーゼの放出と、膜摂動後に神経細胞により放出される１つの例示的な細胞質内酵素とを測定することにより定量化され得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、本発明のｇ３ｐの融合タンパク質または組成物は、タンパク質ミスフォールディング環状増幅（ＰＭＣＡ）アッセイにおいて、可溶性プリオンタンパク質のタンパク分解酵素Ｋ抵抗性コンフォーマーへの変換を阻害する。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０１０）３２７：１１３２−３５．このアッセイにおいて、組み換えＰｒＰは、本発明の融合タンパク質または組成物の存在下または不在下で脂質ＰＯＰＧおよびＲＮＡと混合される。次いで、物質は、３０秒間の超音波処理、続いて２９．５分間のインキュベーションの複数（例えば、４８）サイクルの対象にされる。次いで、反応混合物の分画を用いて別の基質チューブに播種し、このサイクルを繰り返した。それぞれのラウンドを、ＰｒＰ由来の感染の指標である、タンパク分解酵素Ｋ抵抗性物質の存在について調べた。本発明の組成物の存在下でのタンパク分解酵素Ｋ抵抗性物質の低減は、融合タンパク質または組成物が、ＰＫ抵抗性コンフォーマーの形成を阻害することを示す。
【０１１０】
上で示される通り、例えば、酵母プリオンタンパク質ＮＭなどのある種のプリオンタンパク質のアミロイド形態はまた、フィルタートラップアッセイにおいても検出され得る。したがって、プリオンタンパク質に依存して、いくつかの実施態様において、本発明の融合タンパク質または組成物のプリオンタンパク質凝集を脱凝集させる能力は、フィルタートラップアッセイにおいて試験され得る。
インビボ機能アッセイ
【０１１１】
インビトロアッセイにおいて実証され得る、アミロイドの増大した結合親和性、またはＴＭの低下などの活性に加え、本発明の融合タンパク質または組成物はまた、いくつかのインビボアッセイの１つにおいて、アミロイドを低減し得る。インビボでのアミロイド低減を決定する１つの方法は、処置前および後のイメージング剤フロルベタピル（Ｆ１８−ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）でのポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて、β−アミロイドの数および／または分布を比較する。当然、更なるバイオマーカーが特定されるなら、それらを用いて、アミロイドの低減をも測定し得る。
【０１１２】
本発明のｇ３ｐ融合タンパク質または組成物がインビボでアミロイドを低減するかどうかを決定する別の方法では、ｈＡＰＰマウスモデルを用いる（Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．（２００１）６６（４）：５７３−８２）。これらのマウスは、若年齢（３〜４ヶ月）で高レベルのβ−アミロイドを発展させる。本発明の融合タンパク質または組成物のアミロイドを低減する能力は、マウスに本発明の組成物を注射し、次いで、マウス中のアミロイドレベルを非注射対照と比較することにより、決定され得る。本発明の融合タンパク質または組成物をｈＡＰＰマウスの半球のみに注射することも可能であり、これにより同一マウス中の注射半球と非注射半球との間のアミロイドレベルの比較が可能になる。
【０１１３】
別の実施例では、本発明の融合タンパク質または組成物は、米国特許第２０１１／０１４２８０３号、Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７４：９９−１０２，ｏｒ  Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（２００８）１１５：５−３８に記載されるアルツハイマー病（ＴｇＡＤ）のトランスジェニックマウスモデルにおいて試験される。簡単に言うと、野生型、ならびにトランスジェニックマウスが検証される。脱凝集剤として作用する本発明の融合タンパク質または組成物の可能性を評価するために、組成物は、トランスジェニックマウスの頭蓋内または全身的に注射される（Ｔａｃｏｎｉｃ，ＡＰＰＳＷＥ（２５７６）、１０ヶ月齢）。例えば、頭蓋内注射について、本発明の融合タンパク質を含む組成物は、１つの半球に注射され得るが、反対側に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を対照として適用した。次いで、処置マウスを異なる時間に屠殺し、脳を一晩４％パラホルムアルデヒドにおいて前固定し、ミクロトームを用いて切断した。チオフラビン−Ｓ（ＴｈＳ）染色は、アミロイド負荷を評価するために行われる。切片は、メイヤーヘマトキシリンで染色し、核自動蛍光をクエンチし、洗浄後、ＴｈＳ溶液（１％）を３分間適用した。分化を１％酢酸を用いて２０分間行い、洗浄後、切片を乾燥させ、抗フェード封入剤で封入した。アミロイド負荷は、ＬＥＩＣＡ  Ｑｗｉｎプログラムを用いて計算される。あるいは、アミロイド負荷は、抗アミロイド抗体で評価され得る。
【０１１４】
放射活性（例えば、Ｉ１２５）または蛍光標識融合タンパク質もしくは組成物、または非標識融合タンパク質もしくは組成物の体内分布も測定され、本発明の融合タンパク質または組成物がインビボでアミロイドに結合することが示し得る。例えば、融合タンパク質は、放射性または蛍光標識付けされ得る。ＢＡＬＢ／ｃマウスは２群に分けられる。次いで、各マウスに融合タンパク質を１時間かけて鼻腔内投与する。第１群のマウスは、４％パラホルムアルデヒドを用いた心臓内灌流の投与の１時間後に屠殺される。第２の群は、処置の３時間後に屠殺され、第３の群は２４時間後に屠殺される。灌流後、脳ならびに抹消器官が取り出され、標識が測定される。あるいは、非標識融合タンパク質または組成物は、類似の方法だが、脳部分をアミロイドを認識する染料と組成物またはファージを認識する染料との共染色を用いて、結合について評価され得る。
【０１１５】
タンパク質ミスフォールディング病の他のトランスジェニックモデルを用いて、本発明の融合タンパク質または組成物がアミロイドを低減することも実証され得る。非限定的な例は、「Ｄライン」α−シヌクレインマウス（パーキンソン病のモデル、Ｍａｓｌｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１２６５−１２６９）、Ｔｇ２５７６マウス（アルツハイマー病のモデル、Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７４：９９−１０２およびＤｕｙｃｋａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（２００８）１１５：５−３８  ａｔ  ９）、パーキンソン病研究用の種々のＪａｘ（登録商標）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病ためのものを含む、ＪＳＷ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅから入手可能なマウスおよびラットモデルを含む。
薬学的組成物
【０１１６】
別の態様において、本発明は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号３１、またはそれらのフラグメント、変異体もしくはバリアントの融合タンパク質を含む、上に記載されたｇ３ｐの融合タンパク質のうちのいずれかを含む薬学的に許容される組成物を提供する。具体的には、本発明の薬学的組成物は、配列番号９のアミノ酸２１〜５０６、配列番号９のアミノ酸２２〜５０６、配列番号９のアミノ酸２３〜５０６、配列番号９のアミノ酸２１〜５０５、配列番号９のアミノ酸２２〜５０５、または配列番号９のアミノ酸２３〜５０５、または上に記載されたこれらの配列のうちのいずれかの変異体もしくはバリアントを含み得る。他の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、配列番号１１のアミノ酸２１〜５０６、配列番号１１のアミノ酸２２〜５０６、配列番号１１のアミノ酸２３〜５０６、配列番号１１のアミノ酸２１〜５０５、配列番号１１のアミノ酸２２〜５０５、または配列番号１１のアミノ酸２３〜５０５、配列番号１３のアミノ酸２１〜５０８、配列番号１３のアミノ酸２２〜５０８、配列番号１３のアミノ酸２３〜５０８、配列番号１３のアミノ酸２１〜５０７、配列番号１３のアミノ酸２２〜５０７、または配列番号１３のアミノ酸２３〜５０７、または配列番号３１のアミノ酸２１〜５２８、配列番号３１のアミノ酸２２〜５２８、配列番号３１のアミノ酸２３〜５２８、配列番号３１のアミノ酸２１〜５２７、配列番号３１のアミノ酸２２〜５２７、または配列番号３１のアミノ酸２３〜５２７、または上に記載されたこれらの配列のうちのいずれかの変異体もしくはバリアントを含み得る。
【０１１７】
「薬学的組成物」は、融合タンパク質のｇ３ｐ部分が融合タンパク質の治療効果に関与する、生理学的に好適な担体および／または賦形剤を有する、本明細書に記載される治療有効量のｇ３ｐ融合タンパク質を指す。薬学的組成物は、生物に有意な刺激を引き起こさない。互換的に用いられ得る、語句「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」は、生物に有意な刺激を引き起こさず、投与される組成物の生物学的活性および特性を抑止しない担体または希釈剤を指す。
【０１１８】
用語「賦形剤」は、有効成分の投与を更に促進するために薬学的組成物に加えられる不活性な物質を指す。非限定な例としては、例えば、食塩水、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、および例えば、ポリソルベート２０を含む、スターチ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および界面活性剤の様々な種類が挙げられる。
【０１１９】
本発明に従い使用するための薬学的組成物は、従来の方法で、ｇ３ｐ有効成分の組成物中への処理を促進し、薬学的に用いられ得る、賦形剤および助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を用いて、製剤化され得る。適切な製剤化は、選択される投与経路およびデリバリーされる組成物の性質に依存する。
【０１２０】
本発明の薬学的組成物に好適な投与経路は、例えば、経粘膜、特に経鼻デリバリー；筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を含む非経腸デリバリー；経口；または直腸デリバリーを含む。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、薬学的組成物は、全身性の方法よりむしろ局所で投与される（例えば、薬学的組成物の患者の脳への直接注射を介して）。いくつかの実施態様において、注射技術は、血管脳関門を回避する任意の技術である（例えば、直接的髄内、くも膜下腔内、または脳室内注射による）。
【０１２２】
注射のため、本発明の有効成分は、水溶液中に、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩緩衝液などの生理学的に適合するバッファ中に製剤化され得る。経粘膜投与のため、透過されるべき関門に適切な浸透性が、製剤化中に用いられる。このような浸透性は、一般に、当該技術分野において既知である。
【０１２３】
いくつかの実施態様において、本発明の薬学的組成物は、鼻腔内投与を介して投与される。鼻腔内デリバリーは、ウイルスおよび高分子の脳脊髄液（ＣＳＦ）またはＣＮＳへの直接的移行を可能にすることが報告されている（Ｍａｔｈｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｄｒａｇｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０１２４】
鼻腔内経路による投与のため、組成物は、従来、適当な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタン、または二酸化炭素）を用いて、圧縮パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態でデリバリーされる。圧縮エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量をデリバリーするためのバルブを用意することにより、決定され得る。化合物の粉末混合物、およびラクトースまたはスターチなどの好適な粉末基剤を含有する、ディスペンサーにおいて使用するための例えばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジが製剤化され得る。
【０１２５】
薬学的組成物の成分として本明細書に記載される種々の融合タンパク質はまた、嗅覚受容体神経細胞をデリバリーのポイントとして用いて、脳へデリバリーされ得る。例えば、それらのタンパク質のうちのいずれかをコードする遺伝子を含むアデノウイルスベクターが、嗅覚受容体神経細胞を介してデリバリーされ得る（Ｄｒａｇｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０１２６】
本明細書に記載される組成物は、例えば、ボーラス注射または持続点滴による非経腸投与のために製剤化され得る。非経腸投与用の薬学的組成物は、水溶性形態の組成物の水溶液を含む。さらに、有効成分の懸濁液は、油性または水ベース注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビークルは、ゴマ油などの脂肪油、またはエチルオレート、トリグリセリド、またはリポソームなどの合成脂肪酸エステルを含む。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上昇させる物質（ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランなど）を含有し得る。任意に、懸濁液はまた、有効成分の溶解性を増大して、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする、好適な安定剤または剤（例えば、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ２０）などの界面活性剤）を含有し得る。タンパク質ベースの剤（例えば、アルブミン）を用いて、Ｍ１３のデリバリー表面（すなわち、ＩＶバック、カテーテル、針など）への吸着が予防され得る。
【０１２７】
経口投与のため、組成物は、有効な化合物を、当該技術分野で公知の薬学的に許容される担体と組み合わせることにより容易に製剤化され得る。
【０１２８】
製剤は、単位投薬形態（例えば、任意に、加えられた保存剤と共に、バイアル、アンプル剤中、またはマルチドーズ容器中）で提示され得る。組成物は、油性または水性ビークル中の懸濁液、溶液、または乳液であり得、調合剤（例えば、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤）を含有し得る。１回投薬形態は、液体または固体形態であり得る。１回投薬形態は、改変することなく患者に直接投与され得るか、または投与前に希釈されるか、または再構築され得る。ある種の実施態様において、１回投薬形態は、ボーラス形態（例えば、１回注射用量、複数の錠剤、カプセル剤、ピルなどを含む経口用量を含む１回経口用量）で投与され得る。代替の実施態様において、１回投薬形態は、例えば、注入により、または移植ポンプ（ＩＣＶポンプなど）を介して経時的に投与され得る。後者の実施態様において、１回投薬形態は、融合タンパク質を予め充填した注入バックまたはポンプリザーバーであり得る。あるいは、注入バックまたはポンプリザーバーは、患者に投与される直前に、１回用量の融合タンパク質を注入バックまたはポンプリザーバー溶液と混合することにより、調製され得る。
【０１２９】
本発明の別の態様は、本発明の薬学的組成物の調製方法を含む。薬物の製剤化技術は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎにおいて見られる。
【０１３０】
本発明の前後関係における使用に適した薬学的組成物は、ｇ３ｐ有効成分が、意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。本発明の薬学的組成物は、ｇ３ｐ融合タンパク質を含み、融合タンパク質のｇ３ｐ部分は、アミロイドの低減、アミロイド形成の阻害、アミロイド凝集の阻害、または毒性オリゴマー形成の除去および／もしくは予防を必要とする患者において、それらを行うために有効な量である。この組成物は、バクテリオファージを含まない。
【０１３１】
治療上または診断上有効な量の決定は、特に、本明細書において提供される詳細な開示に照らし、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１３２】
投薬量および間隔は、具体的な脳疾患、異常、または状態を処置もしくは診断するのに十分である（最小有効濃度、ＭＥＣ）、ファージディスプレービークルの脳レベルを提供するために、個々に調節され得る。ＭＥＣは、各調製について変動するが、インビトロデータから推定され得る。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、個々の特徴に依存する。
【０１３３】
投薬間隔はまた、ＭＥＣ値を用いて決定され得る。調製物は、１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％の時間、ＭＥＣより上の脳レベルを維持する、投薬計画を用いて投与されるべきである。
【０１３４】
処置されるべき状態の重症度および応答性に依存して、用量は、数日から数週間に渡る処置コースで、または治癒が行われるか、または疾患状態の軽減が達成されるまで、１回または複数回の投与であり得る。
【０１３５】
投与されるべき組成物の量は、当然、処置または診断される対象、苦痛の重篤度、医師の判断などに依存する。
【０１３６】
本明細書に記載されるｇ３ｐ融合タンパク質またはその変異体もしくはバリアントを含む本発明の組成物は、所望であれば、パックまたはＦＤＡ承認キットなどのディスペンサーデバイス中に存在し、それは、有効成分を含有する１つ以上の単位投薬形態を含有し得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックはくを含む。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与の指示書が付随され得る。パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形態で、容器と関連した注意によって提供され得、この注意は、組成物形態、またはヒト、または獣医投与の形態の、機関による承認についてである。このような注意は、例えば、処方薬用、または承認された製品挿入物である、米国の食品医薬品局により承認された標識付けであり得る。適合可能な薬学的担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物はまた、上でさらに詳述されるように、調製され、適当な容器内に置かれ、指定された状態の処置について標識付けされ得る。
【０１３７】
前述および後述の記載はいずれも、例示および説明に過ぎず、特許請求される本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
治療上の使用
【０１３８】
本発明の別の態様は、ｆＡβ４２、ｆαｓｙｎ、ｆＮＭ、またはｆタウのうちのいずれかに関与する疾患を含むが、これらに限定されない、タンパク質ミスフォールディング病の処置および／または予防における、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質または組成物のいずれかの使用に関する。
【０１３９】
本発明の別の態様は、アミロイドの低減、アミロイド形成の阻害、アミロイド凝集の阻害、または毒性オリゴマー形成の除去および／もしくは予防を必要とする患者において、それらを行うための、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質または組成物のいずれかの使用に関する。
【０１４０】
処置および／または予防の前後関係において、用語「患者」、「対象」、および「レシピエント」は、同義的に用いられ、ヒトならびに他の動物を含む。いくつかの実施態様において、患者は、タンパク質ミスフォールディング病と関連するバイオマーカーに対して陽性であるヒトである。一実施形態において、患者は、フロルベタピルを用いたＰＥＴ画像診断により検出されるβ−アミロイド沈着を呈する。
【０１４１】
用語「処置すること」は、疾患の１つ以上の臨床症状を呈する患者において、疾患の進行を低減すること、遅延させること、または逆転させることを意味する。「処置すること」はまた、疾患の１つ以上の臨床症状を呈する患者において疾患の症状を低減すること、遅延させること、または逆転させることを意味することが意図される。一実施態様において、患者は、フロルベタピルを用いたＰＥＴ画像診断により検出されるβ−アミロイド沈着を呈し、β−アミロイド沈着の数が処置により低減される。一実施態様において、患者は、本発明のｇ３ｐ組成物により検出されるβ−アミロイド沈着を呈し、β−アミロイド沈着の数は、処置により低減されるか、または維持される。別の実施態様において、患者は、ＰＥＴ画像診断により検出されるあらゆる種のアミロイド沈着を呈し、患者の認知機能は、処置により改善される。認知機能の改善は、ＭｃＫｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ＆Ｄｅｍｅｎｔｉａ（２０１１）Ｍａｙ；７（３）：２６３−９の方法および検査によりアッセイされ得る。
【０１４２】
「予防」は処置と異なり、任意の臨床症状の発症前の個体への組成物の投与を指す。本明細書使用されるとき、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質または組成物の「予防的な」使用は、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質または組成物の「予防的な」使用と同義である。本発明の融合タンパク質または組成物のいずれかを使用する予防が包含される。予防は、疾患の増大したリスクがあることが知られた個体、または１種以上の遺伝子マーカーに基づき、疾患を必ず発症する個体において関連し得る。多くの遺伝子マーカーが、種々のタンパク質ミスフォールディング病について特定されている。例えば、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）におけるスウェーデン型変異、インディアナ型変異、またはロンドン型変異の１つ以上を有する個体は、早発性アルツハイマー病を発症する増大したリスクにさらされ、故に予防の対象である。同様に、ハンチンチン遺伝子においてトリヌクレオチドＣＡＧリピート（特に、３６以上のリピート）を有する個体は、最終的に、ハンチントン病を発症し、故に予防の対象である。
【０１４３】
用語「タンパク質ミスフォールディング」は、タンパク質（アミロイド形成ペプチド）（例えば、β−アミロイド、血清アミロイドＡ、システインＣ、ＩｇＧカッパー軽鎖、またはプリオンタンパク質（これらに限定されない））を凝集させることによるアミロイドタンパク質の形成により特徴付けられる疾患を指す。誤って折り畳まれたおよび／または凝集されたアミロイドタンパク質と関連することが知られている疾患としては、早発性アルツハイマー病、後発性アルツハイマー病、および発症前アルツハイマー病を含むアルツハイマー病、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイド症、シスタチンＣ、遺伝性アイスランド症候群、老衰、多発性骨髄腫、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ疾患（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクレイピー、およびウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含むがこれらに限定されないプリオン病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１）、（ＳＣＡ３）、（ＳＣＡ６）、（ＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイドーシス、前頭側頭葉型認知症、イギリス型／デンマーク型認知症、および家族性脳症が挙げられる。本発明のｇ３ｐ融合タンパク質および組成物を用いて、「タンパク質ミスフォールディング」疾患が処置され得る。
【０１４４】
これらの誤って折り畳まれたおよび／または凝集されたアミロイドタンパク質疾患の多くは、中枢神経系（ＣＮＳ）において生じる。ＣＮＳにおいて生じる疾患のいくつかの例として、パーキンソン病；アルツハイマー病；行動の変体ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、進行性非能弁的失語（ＰＮＦＡ）および語義痴呆（ＳＤ）の臨床的症候群を有する患者を含む前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）；前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）；およびハンチントン病が挙げられる。本発明のｇ３ｐ融合タンパク質または組成物を用いて、中枢神経系（ＣＮＳ）において生じる、誤って折り畳まれたおよび／または凝集されたアミロイドタンパク質により特徴付けられる疾患が処理され得る。
【０１４５】
タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集は、ＣＮＳ外でも生じ得る。アミロイドーシスＡ（ＡＡ）（前駆体タンパク質が血清急性期アポリポタンパク質である、ＳＡＡ）、および多発性骨髄腫（前駆体タンパク質免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖）は、ＣＮＳ外で生じる２つの広く知られたタンパク質ミスフォールディングおよび／または凝集タンパク質疾患である。他の例としては、β２−ミクログロブリンにより形成されるアミロイドに関与する疾患、トランスサイレチン（家族性アミロイド性多発性神経障害［ＦＡＰ］、家族性アミロイド性心筋症［ＦＡＣ］、および老人性全身性アミロイドーシス［ＳＳＡ］）、（アポ）血清ＡＡ、アポリポタンパク質ＡＩ、ＡＩＩ、およびＡＩＶ、ゲルゾリン（家族性アミロイド性多発性神経障害のフィンランド型）、リゾチーム、フィブリノーゲン、シスタチンＣ（脳アミロイド血管症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、アイスランド型）、（プロ）カルシトニン、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰアミロイドーシス）、心房性ナトリウム利尿因子、プロラクチン、インスリン、ラクタドヘリン、ケラト−エピセリン、ラクトフェリン、歯性エナメル芽細胞関連タンパク質、およびセメノゲリンＩが挙げられる。本発明のｇ３ｐ融合タンパク質または組成物を用いて、ＣＮＳ外で生じるタンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集に関与する疾患が処置され得る。
【０１４６】
神経変性疾患はまた、タウ損傷に関与し得る（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１２１−１５９において概説される）。タウタンパク質は、中枢性および抹消性神経系神経細胞の両方の軸において発現される微小管関連タンパク質である。神経変性タウオパチー（ときおり、タウオパチーとして参照される）が包含され、本明細書に記載されるｇ３ｐ融合タンパク質および組成物によって処置され得る。タウオパチーの例としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム−認知症合併症、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー痴呆、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、染色体１７に結びついたパーキソニズムを伴う前頭側頭型認知症を含む前頭側頭型認知症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性汎脳炎、および神経原線維変化型認知症（Ｔａｎｇｌｅ  ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）が挙げられる。これらの疾患のいくつかはまた、原線維アミロイドβペプチドの沈着も含む。例えば、アルツハイマー病は、アミロイドβ沈着およびタウ損傷の両方を呈する。同様に、クロイツフェルト・ヤコブ病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病などのプリオンにより介在される疾患はまた、タウ損傷を有し得る。したがって、疾患が「タウオパチー」であるとの徴候は、この疾患を他の神経変性疾患分類またはグループ化を除外すると解釈されるべきではなく、これは単に便宜的に提供されるに過ぎない。本発明のｇ３ｐ融合タンパク質または組成物を用いて、神経変性疾患、ならびにタウ損傷に関与する疾患が処置され得る。
【０１４７】
一実施形態において、本明細書に記載されるｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物、または製剤は、アミロイドの存在と関連する症状を呈するか、またはタンパク質ミスフォールディング病と関連するバイオマーカー（フロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）など）に対して陽性である患者において、アミロイドを低減する方法において使用するためのものである。一実施形態において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、または鼻腔内デリバリーから選択される。
【０１４８】
一実施形態において、本明細書に記載されるｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物、または製剤は、アミロイドの存在と関連する症状を呈するか、またはタンパク質ミスフォールディング病と関連するバイオマーカー（フロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）など）に対して陽性である患者において、アミロイドレベルの維持方法において使用するためのものである。患者は、有効量の本明細書に記載のｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物、または製剤を投与される。一実施形態において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、または鼻腔内デリバリーから選択される。
【０１４９】
一実施形態において、本明細書に記載されるｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物、または製剤は、アミロイドを有する患者に有効量の本明細書に記載のｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物、または製剤を投与することを含む、患者におけるアミロイドの脱凝集方法において使用するためのものである。一実施形態において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、または鼻腔内デリバリーから選択される。
【０１５０】
一実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物、または製剤は、必要とする患者の脳に有効量の本明細書に記載の薬学的組成物を直接注射し、これにより、脳におけるβ−アミロイド沈着の低減を引き起こすことを含む、脳におけるβ−アミロイド沈着の脱凝集を引き起こす方法において使用するためのものである。
【０１５１】
一実施形態において、ｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物または製剤は、脳におけるアミロイド形成の低減方法において使用するためのものである。脳におけるアミロイド形成の低減は、タンパク質−ミスフォールディングまたは神経変性疾患の症状もしくは重症度を予防、処置、または低減し得る。一実施形態において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、または鼻腔内デリバリーから選択される。
【０１５２】
一実施形態において、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物、または製剤は、脳におけるアミロイドクリアランスの促進方法において使用するためのものである。アミロイドクリアランスの促進は、タンパク質−ミスフォールディングまたは神経変性疾患の症状もしくは重症度を予防、処置、または低減し得る。一実施形態において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、または鼻腔内デリバリーから選択される。
【０１５３】
一実施形態において、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物、または製剤は、脳におけるアミロイド凝集の阻害方法において使用するためのものである。脳におけるアミロイド凝集の阻害は、タンパク質−ミスフォールディングまたは神経変性疾患の症状もしくは重症度を予防、処置、または低減し得る。一実施形態において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、または鼻腔内デリバリーから選択される。
【０１５４】
一実施形態において、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物または製剤は、脳における毒性アミロイドオリゴマーの排除方法において使用するためのものである。脳における毒性アミロイドオリゴマーの排除は、タンパク質−ミスフォールディングまたは神経変性疾患の症状もしくは重症度を予防、処置、または低減し得る。一実施形態において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、または鼻腔内デリバリーから選択される。
【０１５５】
一実施形態において、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物、または製剤は、脳における毒性アミロイドオリゴマーの形成の予防方法において使用するためのものである。脳における毒性アミロイドオリゴマーの形成の予防は、タンパク質−ミスフォールディングまたは神経変性疾患の症状もしくは重症度を予防、処置、または低減し得る。一実施形態において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、または鼻腔内デリバリーから選択される。
【０１５６】
一実施形態において、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物、または製剤は、神経細胞をアミロイド損傷から保護する方法において使用するためのものである。神経細胞のアミロイド損傷からの保護は、タンパク質−ミスフォールディングまたは神経変性疾患の症状もしくは重症度を予防、処置、または低減し得る。一実施形態において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、または鼻腔内デリバリーから選択される。一実施形態において、神経細胞のアミロイド損傷からの保護において使用するための本発明のｇ３ｐ融合タンパク質、薬学的組成物、または製剤は、予防的に付与される。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、患者は、タンパク質ミスフォールディングおよび／または凝集疾患と関連するバイオマーカーに対して陽性である。．一実施形態において、バイオマーカーはフロルベタピル（ＡＶ４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）である。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、患者は、アミロイドの存在と関連する神経変性疾患の症状を呈している。種々の実施態様において、アミロイドは、ｆＡβ４２、ｆαｓｙｎ、ｆＮＭ、またはｆタウのうちのいずれかである。
【０１５９】
ある種の実施態様において、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病である。一実施形態において、神経変性疾患はアルツハイマー病である。一実施形態において、神経変性疾患はアルツハイマー病であり、患者は、イメージング剤フロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）により検出されるβ−アミロイドを呈する。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、患者はプリオン媒介疾患の症状を呈している。
【０１６１】
ある種の実施態様において、プリオン媒介疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ疾、クールー病、致死性家族性不眠症、またはゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病から選択される。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、患者は、アルツハイマー病以外の神経変性タウオパチーの症状を呈している。ある種の実施態様において、処置されるべき疾患は、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、ボクサー痴呆、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、染色体１７に結びついたパーキソニズムを伴う前頭側頭型認知症を含む前頭側頭型認知症、ハラーホルデン・スパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性汎脳炎、および神経原線維変化型認知症から選択される。
診断
【０１６３】
本発明の別の態様において、本明細書に記載されるｇ３ｐ融合タンパク質および組成物は、本明細書に記載の種々の疾患と関連する診断上の適用においてインビトロおよび／またはインビボで用いられる。例えば、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質または組成物の結合は、インビボまたはインビトロのいずれかでイメージング剤として用いられるとき、記載のタンパク質ミスフォールディング病の１つの診断の一部であり得る。
【０１６４】
診断剤（あるいはそれ以外の場合、本明細書において診断用組成物を指す）は、包含され、上述の本発明の融合タンパク質または組成物のいずれかを含み得る．診断剤は、検出可能な標識を更に含むか、あるいはそれ以外の場合、インビボで検出され得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物は、アミロイドイメージング剤として用いられる。イメージング剤は、アミロイドを検出することができ、アミロイドと関連する疾患を診断することができる。本発明の融合タンパク質および組成物は、線維の種類に関わらずアミロイドに結合するため、全て単一のイメージング剤を用いて任意のアミロイド凝集体（Ａβ、タウ、α−シヌクレインなど）を画像化することができるという点で有利である。現時点で、ＣＮＳにおけるタウまたはアルファシヌクレイン凝集体に許容されるイメージング剤／方法は存在しない。β−アミロイドに対するイメージング剤が存在する一方、認知機能と画像結果との相関の改良をもたらし得、および／または疾患の悪化対安定性をより良く予想する更なる剤が依然必要である。概説については、Ｒｅｓｎｉｃｋ  ＆  Ｓｏｊｋｏｖａ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．（２０１１）３（１）：３を参照されたい。
【０１６６】
本発明の診断用ｇ３ｐ融合タンパク質および組成物は、β−アミロイドに特異的なイメージング剤（例えば、Ｆ１８−ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙなど）と組み合わせてイメージング剤として用いられ得る。現在、非β−アミロイド凝集体に対して既知のイメージング剤は存在しないため、β−アミロイド特異的イメージング剤と一緒に本発明の診断用組成物を使用することは、分別検出に基づく非β−アミロイド凝集体の検出をもたらす。したがって、一実施形態において、本発明の診断用ｇ３ｐ融合タンパク質または組成物を、β−アミロイドイメージング剤と組み合わせてイメージング剤として用いて、非β−アミロイド凝集体を検出する。
【０１６７】
別の実施形態において、本発明の診断用組成物をイメージング剤として用いて、脳を含むＣＮＳにおいてβ−アミロイドを検出する。
【０１６８】
本発明の診断用組成物は、一般に、イメージング剤として用いられたとき、アミロイド結合融合タンパク質成分が１つ以上の検出可能な標識に結合することを必要とする。種々の標識は、タンパク質標識の標準的技術を用いて、診断用組成物のアミロイド結合成分に結合され得る。例としては、蛍光標識、および放射性標識が挙げられる。用いられ得る広範な放射性標識が存在するが、一般的に、標識は、１８Ｆ、１１Ｃ、および１２３Ｉを含むが、これらに限定されない放射性標識から多くの場合選択される。これらおよび他のラジオアイソトープは、公知の化学を用いてタンパク質に結合され得る。一実施形態において、標識は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて検出される。しかしながら、ラジオアイソトープの検出に適した他の任意の技術を用いて、放射性トレーサも検出し得る。
【０１６９】
本発明の診断用組成物は、治療用組成物について記載されたのと同一の経路を用いて投与され得る。一実施形態において、くも膜下腔内投与が、診断用組成物の投与経路として用いられる。別の実施形態において、静脈内投与が、診断用組成物の投与経路として用いられる。
【実施例】
【０１７０】
結合剤および抗凝集剤としての糸状ファージの証明された治療上の有効性は、作用の任意の具体的なメカニズムに付随しないが、メカニズムを理解することは、より高い治療上の有効性を伴うファージ設計を可能にする。加えて、それは、更なる抗凝集剤を調製するための基礎として作用する。
【０１７１】
先に示された通り、Ｍ１３は、少なくとも４種類の異なるアミロイド線維：アミロイド−β１〜４２線維（ｆＡβ４２）、α−シヌクレイン線維（ｆαｓｙｎ）、酵母プリオンＮＭ線維（ｆＮＭ）、およびタウ線維（ｆタウ）に結合し、それらを脱凝集させることが示された。これらのアミロイド線維を作り出す４個のタンパク質は、１次アミノ酸配列と関係しないが、全４種が基準のアミロイド折り畳みに誤って折り畳まれる（Ｅｉｃｈｎｅｒ  ＆  Ｒａｄｆｏｒｄ，２０１１）。Ｍ１３のこれらの各々の脱凝集に結合し、それらを媒介する能力は、Ｍ１３が構造上のモチーフ（クロスベータシート構造など）または構造上の特性（疎水性グローブなど）を認識することを示し、これら両方が、全アミロイド線維の特徴を定義する。
【０１７２】
しかしながら、アミロイド脱凝集は、全てのファージの一般的な性質ではない。例えば、構造上異なる正二十面体ファージＴ７は、Ｔ７がｆＡβ４２と３日間３７℃でインキュベーションされたときでさえ、ｆＡβ４２の脱凝集を媒介しない。バクテリオファージＴ７は、Ｍ１３が７０％を超える共インキュベーションされたアミロイド線維を解離する濃度でさえ、解離活性を全く示さない。対照的に、Ｍ１３と比較してｇ８ｐ中に負に電荷したアミノ酸を担持するバクテリオファージｆｄ（したがって、ｇ８ｐのコピー数を付与されたＭ１３よりも更に負の２８００個の電荷／ファージを示す）は、Ｍ１３に類似するｆＡβ４２に結合し、それを脱凝集した。アミロイド脱凝集はまた、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、大腸菌線維、およびＴ４のテールチューブ（これら全てがらせん状シリンダー形および繰り返し単位を有する（米国特許第２０１１／０１８２９４８号を参照））により媒介され得るとの知見に加えて、これらの初期研究は、それがアミロイド線維−解離活性に決定的なファージの形状であることを示唆した。
【０１７３】
しかしながら、以下の実施例は、報告された結合および糸状ファージの抗凝集特性についての代替（しかしながら、相互排他的ではない）メカニズムを説明する。これらの実施例、およびそれらがサポートする作用のメカニズムに基づき、アミロイドへの改良された結合を有するｇ３ｐ融合タンパク質が提供される。
実施例１：Ｍ１３ファージはＡβ原線維に優先的に結合する
【０１７４】
Ｍ１３のＡβ原線維対Ａβモノマーへの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定した。
【０１７５】
Ｍ１３ファージはＡβ原線維に優先的に結合し、Ａβモノマーに結合しない。固定化ｆＡβを有するバイオセンサーチップに渡り流した１０１４ファージ／ｍＬを用いた表面プラズモン共鳴研究が、図３にて報告される。図３は、Ｍ１３結合のＫＤが約４ｎＭであり、モノクローナル抗体による結合と比較可能であることを示す。この高親和性相互作用は、特異的結合プロセスがファージとアミロイド線維間で生じることを示す。
実施例２：Ｍ１３のＡｂ原線維への結合は用量依存性である
【０１７６】
ｆＡβ４２へのＭ１３結合も用量依存性である。図４Ａにおいて、２つのファージ用量と増加モル量のｆＡβ４２との結合を比較した。このＭ１３−アミロイド線維結合アッセイにおいて、Ｍ１３−Ａｌｅｘａ４８８をＡβ（ｆＡβ）と２〜３時間混合して、複合体を形成させ、次いで、複合体を７５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により沈殿させた。ペレット中の蛍光は、アミロイドへのＭ１３結合に比例した。このアッセイは、ファージのｆＡβへの結合の定量的測定、および結合に対して他の剤がファージと競合する能力の評価系を提供する。図４Ｂは、Ｍ１３結合競合のＫＤが、表面プラズモン共鳴を用いて結合について観察したものと類似することを示す。
実施例３：Ｍ１３のＡβ原線維への結合は天然構造を必要とする
【０１７７】
Ｍ１３ファージを９０℃で１０分間加熱したとき、結合に対して競合するその能力は、本質的に抑止される。図５は、アミロイド線維競合結合アッセイにおいて加熱処理（四角）対天然構造（丸）Ｍ１３を用いた結合競合結果を示す。
実施例４：温度はＭ１３−アミロイド相互作用と相関する
【０１７８】
Ｍ１３はアミロイド線維を強力に脱凝集する。図６は、ｆＡβを用いたチオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光アッセイを示す。Ｍ１３の存在下で、ｆＡβ４２は脱凝集する。
【０１７９】
図７Ａは、ＴｈＴ蛍光中の塩濃度の１０倍（０．１５〜１．５Ｍ）変化が、脱凝集するｆＡβの割合において２〜３倍の差に過ぎない結果をもたらす。これは、疎水性相互作用が観察された脱凝集のほとんどに関与することを示す。
【０１８０】
塩濃度の比較的わずかな効果と対照的に、図７Ｂは、４℃から３７℃の温度変化が、脱凝集において８〜１０倍の差となることを示す。
【０１８１】
これらの結果は、Ｍ１３脱凝集が、温度が高いほどより活性であり、アッセイにおける塩の効果と比較的影響を受けにくく、疎水性相互作用を示唆するタンパク質に依存することを示す。ファージｇ３ｐはこの説明と合致する。そのＮ１およびＮ２ドメインは、「開口して」、続いてＮ２が細菌のＦ−線毛に結合する可動性グリシンに富むリンカーにより結合される。次いで、Ｎ１は、感染プロセスの一部として、細菌の共受容体に結合するために利用可能である。脱凝集アッセイにおいて温度を上昇させることは、ｇ３ｐのＮ２およびＮ１ドメインを「開口する」と予測される。
【０１８２】
高温（９０℃、１０分、図５を参照されたい）でのＭ１３の不活性化は結合を抑止する一方、Ｍ１３−アミロイド結合アッセイにおけるインキュベーション温度の上昇は、結合に対してポジティブな効果を有する。図８Ａは、温度を１８℃から５８℃に上昇させることが、最大約５０℃（この温度ポイントで結合が減少し始める）のヒンジアンフォールディングＴＭまで次第に良好な結合をもたらすことを示す。この最適な結合温度は、４８．１℃である、ｇ３ｐにおけるＮ１−Ｎ２アンフォールディングの温度（いわゆる、融点、またはＴＭ）と一致する。５０℃対３７℃へのインキュベーション温度の上昇もまた、Ｍ１３のｆＡβ４２へのより急速な結合をもたらす。図８Ｂ。
実施例５：ｇ３ｐはＭ１３−β−アミロイド相互作用に必要である
【０１８３】
ｇ３ｐがＭ１３−β−アミロイド相互作用に必要であるかどうかを直接試験するために、ｇ３ｐを、Ａβ結合に対して再度折り畳まれたファージと比較したＡｒｇＣ（Ｍ１３Δｇ３ｐ）およびＭ１３Δｇ３ｐファージでのタンパク分解処理によりファージから除去した。バチルスのタンパク質分解酵素であるＡｒｇＣでの処理は、ｇ３ｐサブユニットをファージから選択的に除去する。結果を図９Ａに示す。再度折り畳まれたＭ１３は、低減したレベルにも関わらず、競合結合アッセイにおいて野生型Ｍ１３と依然競合する。しかしながら、１５倍のＭ１３Δｇ３ｐでさえ、仮に野生型Ｍ１３とであっても、不十分に競合した。この野生型Ｍ１３と競合しない能力は、Ｍ１３Δｇ３ｐファージにおける感染性の消失と一致する。図９Ｂ。ＡｒｇＣ処理はまた、脱凝集活性の消失を引き起こした。図９Ｃ。
【０１８４】
ｇ３ｐが、感染におけるその役割と類似する方法で結合を媒介する場合、感染に重要であるＮ１およびＮ２ドメインはまた、結合についてＭ１３と競合するに違いない。これを試験するため、組み換え可溶性Ｎ１Ｎ２（「ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）」；「構築物３」）を調製し、競合アッセイにおいて試験した。図１０Ａおよび１０Ｂに示す通り、Ｍ１３は、ｆＡβ４２への結合に対して標識Ｍ１３と競合するが、Ｍ１３Δｇ３ｐは競合しない。対照的に、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）はＭ１３と競合でき、このことは、ｇ３ｐのＮ１およびＮ２ドメインがβ−アミロイド結合に十分であることを示す。類似の結果を、競合アッセイの繰り返しにおいて得た。図１０Ｂ。
実施例６：ｇ３ｐヒンジアンフォールディング変異はアミロイド結合を調節する
【０１８５】
ｇ３ｐのＮ１とＮ２ドメイン間のヒンジを開合する能力に影響する変異は、これらの変異を生じるファージの、Ａβへの結合に対して野生型Ｍ１３と競合する能力に作用する。Ｅｃｋｅｒｔ＆Ｓｃｈｍｉｄ，２００７に、この仮説を試験するために用いたいくつかのバリアントファージが記載されている。バリアント「ＡＡＡ」（「３Ａ」としても知られる）は、線毛結合を損ない、Ｎ２ドメインの安定性を低減する。ＡＡＡは、ｇ３ｐにおける変異であるＷ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、およびＦ１９４Ａを担持する。ＩＩＨＹは、変異Ｔ１３Ｉ、Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、およびＤ２０９Ｙを含有し、そしてそれはＮ２ドメインを安定化し、ＴＭを増大する。
【０１８６】
結合競合を、Ｎ１およびＮ２ドメイン中のＭ１３ｇ３ｐと同一のアミノ酸配列を有するファージｆｄについて評価した（図２）；Ｍ１３より高いヒンジＴｍを有するＩＩＨＹ、およびＡＡＡ。ファージｆｄ、ＡＡＡ、およびＩＩＨＹを、５０℃１．５時間で予め活性化し、次いで活性化および非活性化Ｆｄ、ＡＡＡ、およびＩＩＨＹを、標識Ｍ１３と競合する能力について比較した。図１１は結果を示す。野生型ｆｄは、加熱により活性化したとき、良好な競合相手であった。対照的に、加熱は、より高いヒンジＴｍを有するＩＩＨＹに対する効果をほとんど有しない。Ｍ１３に対して相対的に低減したＮ２ドメイン安定性を有するＡＡＡは、加熱事前処理を伴うまたは伴わない良好な競合相手であった。
【０１８７】
これらのデータは、Ｍ１３のβ−アミロイドとの相互作用が、Ｍ１３が細菌に感染するものと同様のメカニズムを介するものであるとの結論を支持する。第１に、これらは、疎水性相互作用がＭ１３−β−アミロイド相互作用に重要であることを示す。第２に、Ｍ１３結合および脱凝集活性化の温度依存性は、Ｎ１−Ｎ２ヒンジアンフォールディングＴｍを反映する。第３に、ｇ３ｐの選択的タンパク質分解は、Ｍ１３−β−アミロイド相互作用を抑止する。
実施例７：ｇ３ｐフラグメントはアミロイドに選択的かつ強力に結合するが、モノマーに結合しない
【０１８８】
ｇ３ｐフラグメントがアミロイドに結合する能力を保持するかどうかを評価するために、Ｎ１およびＮ２を含むｇ３ｐフラグメントを調製し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、Ａβ原線維対Ａβモノマーに結合するその能力について評価した。結果は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）がＡβ原線維に優先的に結合し、Ａβモノマーに結合しないことを示す。４μＭ  ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を用いた表面プラズモン共鳴研究を図１３に報告し、そしてこれは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）結合のＫＤが約１６０ｎＭであることを示す。この高い親和性相互作用は、特異的結合プロセスが、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）とアミロイド線維との間で生じることを示す。
【０１８９】
更なる構築物をＳＰＲにより評価した。以下の表は結果を要約する。
【表２】
0006283366.tif 000004
実施例８：組み立てに対するｇ３ｐフラグメントはＡβ４２線維の能力を強力に阻止する
【０１９０】
ｇ３ｐフラグメントがアミロイド線維のアセンブリを阻止できるかどうかを試験するために、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を、ｆＡβ４２原線維のアセンブリを予防する能力について、ＴｈＴ蛍光アッセイにおいて試験した。結果は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）がｆＡβ４２のアセンブリを強力に阻止することを示す。図１４Ａは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）がｆＡβ４２のアセンブリを用量に依存した方法で予防するという、この実験の結果を示す。図１４Ｂは、約２０ｎＭであるＩＣ５０を示す。
【０１９１】
別の実験において、Ａβ４２を、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を伴いまたは伴わずに、濃度２μＭで７日間３７℃でインキュベーションし、Ａβ４２線維の強度を透過型電子顕微鏡により評価した。図１５Ａは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）がＡβ４２のアミロイド線維内に組み込まれる能力を阻止するという、この実験の結果を示す。図１５Ｂは、これらの同一の試料に対するＴｈＴアッセイの結果を示す。
実施例９：ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）は、α−シヌクレイン、ｆタウ、およびＡβアセンブリを阻止し、ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質はアセンブリを阻止し、かつＡβの凝集を阻害する
【０１９２】
ｇ３ｐが、α−シヌクレイン線維アセンブリを阻止し得るかどうか、および原子価（すなわち、ｇ３ｐのコピー数）が役割を果たすかどうかを決定するために、５量体ｇ３ｐ（５コピーのｇ３ｐ）およびモノマーｇ３ｐ（１コピーのｇ３ｐ）のα−シヌクレイン活性を阻止する能力を試験するアッセイを行った。結果は、ｇ３ｐがα−シヌクレイン線維アセンブリを阻止し、５量体ｇ３ｐがこの活性でモノマーｇ３ｐより有効であることを示す。図１６を参照されたい。
【０１９３】
ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）、代表的なｇ３ｐ融合タンパク質、およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の、Ａβ４２のアセンブリを阻害する能力も評価した。図３０および図３１に示す通り、構築物３および構築物６は、ｆＡβ４２のアセンブリを用量に依存した方法で阻害することが可能である。図３７に示すとおり、構築物３および構築物６は、ｆＡβ４２凝集を阻害することが可能である。
【０１９４】
ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）のｆタウのアセンブリを阻害する能力も評価した。図４４Ａおよび図４４Ｂに示されるように、構築物３は、用量に依存した方法でｆタウのアセンブリを阻害することが可能である。
実施例１０：ｇ３ｐ融合タンパク質はＡβに結合し、それを脱凝集する
【０１９５】
ｇ３ｐ原子価がアミロイドへのｇ３ｐ結合の効力において役割を果たすかどうかを評価するために、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（「ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合」）について２価であるＩｇ融合タンパク質を作成し、Ａβ線維に結合する能力について５価のＭ１３と比較した。図１７に示す通り、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合は、Ｍ１３に類似する親和性かつｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）のみより強力にＡβに結合し、このことは、ｇ３ｐの原子価が重要であり得ることを示している。類似の結果を、競合アッセイの繰り返しにおいて得た。図１８。図１８において、四角形は、構築物２（Ｍ１３）を表し；三角形は構築物３（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２））を表し；上下逆の三角形は構築物４（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合）を表し；菱形はｒ−ＩｇＧ４Ｆｃ陰性対照を表す。
【０１９６】
本発明のｇ３ｐ融合タンパク質は、非アミロイドタンパク質およびポリマー（例えば、疎水性タンパク質およびタンパク質ポリマーなど）に非特異的に結合しないことを確認するために、構築物６（５０ｎＭまたは２００ｎＭ）を、非アミロイドタンパク質／ポリマーカゼイン（疎水性）、ゼラチン（ポリマー）、エラスチン（コラーゲンポリマー）、およびウシ血清アルブミン（疎水性の血清タンパク質）への結合について試験した。Ａβ４２線維を陽性対照として使用した。ＥＬＩＳＡ形式を用い、ここでは、１００ｎｇの各試験タンパク質を、高吸着マイクロタイターウェル（試験された２つの種類）に固定化し、続いて、構築物６または関係のないＩｇＧ１抗体陰性対照（２００ｎＭ）と３７℃で１時間インキュベーションした。結合構築物６の検出またはＩｇＧ１陰性対照を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合化された抗ヒト−Ｆｃ抗体を用いた阻止および洗浄ステップ後、実行した。定量は、ＨＲＰの顕色剤を加えた後、４０５ｎｍでの吸光度によるものであった。この結果は、構築物６が、非アミロイドタンパク質ポリマーまたは疎水性タンパク質と比較して、アミロイド線維に優先的に結合する。構築物６は、非アミロイドタンパク質への結合は、関係のないｈＩｇＧ１−陰性対照抗体と比較可能であった。
【０１９７】
原子価が脱凝集においても役割を果たすかどうかを評価するため、２価ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合（「構築物４」）を、フィルタートラップアッセイにおいて５価のＭ１３と比較した。図１９。結果は、２価ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合と５価Ｍ１３の両方がβ−アミロイド線維を強力に脱凝集させることを示す。また、原子価が脱凝集の効力に重要であり得ることが示され、４０ｎＭのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合に類似したレベルで、１．７ｎＭ５価Ｍ１３の凝集体を低減する能力により示される。図１９。
【０１９８】
類似のアッセイにおいて、１ｘ１０１２／ｍｌのＭ１３（構築物２）；８０ｎｍおよび８００ｎＭのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（構築物５）；および８０ｎｍおよび８００ｎＭのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）を、フィルタートラップアッセイにおいてＡβ４２線維を脱凝集させる能力についてアッセイした。構築物２、５、および６は、β−アミロイド線維を強力に脱凝集させる。図３３。したがって、ｇ３ｐ融合タンパク質は、アミロイドが存在するあらゆる疾患または障害を処置するために治療的にまたは予防的に使用され得る。
実施例１１：テトラマーストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］タンパク質は、ｆＡβに結合し、脱凝集させる
【０１９９】
アミロイドに結合し、脱凝集させるｇ３ｐの能力に対する原子価の役割を更に評価するために、ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）に複合化したテトラマーストレプトアビジンを、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）をビオチン−Ｌｙｓ−ＮＴＡと、ＮｉＳＯ４の存在下で組み合わせることにより調製した。ＭＷＣＯ３ＫＤａメンブレンを用いて、過剰のリガンドを除去した。ストレプトアビジンを加え、過剰のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ビオチンをＭＷＣＯ１００ＫＤａメンブレンを用いて除去した。得られたｇ３ｐ構築物、ストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］は、４つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）部分を有する。ストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］を、結合アッセイにおいて、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（「構築物３」）と比較した。図２０。テトラマーストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］は、モノマーｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）より強力にｆＡβに結合し、これは、原子価が結合の効力に重要であることを更に示す。図２０。しかしながら、モノマーｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）でさえ治療上許容されるレベルでｆＡβに結合する。
【０２００】
原子価が脱凝集においても役割を果たすかどうかを評価するために、モノマーｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を、フィルタートラップアッセイにおいてテトラマーストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］と比較した。図２１。結果は、モノマーｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）およびテトラマーストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］の両方がｆＡβ線維を強力に脱凝集させることを示す。また、原子価が脱凝集の効力に重要であることが示され、２．５μＭモノマーｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）によるＡβの低減した脱凝集と比較して、最大２００ｎｇのｆＡβ凝集体を抑止する３６０ｎＭのテトラマーストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］の優れた能力により示される。例えば、図２１、列４に比較した列２。
【０２０１】
ストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］によるＡβの脱凝集も、ＴＥＭにより評価した。ストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］は、インキュベーションの３日後、ｆＡβ４２を完全に脱凝集した。図２２。
実施例１２：ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質はアルツハイマー病のマウスモデルにおいて既存のＡβプラークを有意に低減する
【０２０２】
アルツハイマー病の研究のための公知のマウスモデル（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７４：９９−１０２；Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（２００８）１１５：５−３８）を用いて、オスＴｇ２５７６マウスを５００日より長く加齢させ、Ｎ１Ｎ２−Ｉｇ融合（７．８μｇ／注射での構築物５、および８．２μｇ／注射での構築物６）または陰性対照としての食塩水の２種の異なる調製物を海馬の両側に注射（２μＬ／注射）し、７日目に屠殺した。脳組織を回収し、薄切し、抗アミロイドベータモノクローナル抗体（８２Ｅ１；ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅのカタログ番号ＭＢＳ４９０００５−ＩＪ１０３２３）を用いて、プラーク負荷定量について染色した。図２８に示す通り、両Ｎ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質は、食塩水で処置したマウスと比較して、海馬において測定したプラーク負荷を有意に低減した。図２９に示す通り、両Ｎ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質は、食塩水で処置したマウスと比較して、大脳皮質において測定したプラーク負荷を有意に低減した。
【０２０３】
シナプトフィジンのレベルは、シナプスでの神経細胞の成分を、構築物５および６での処置後、Ｔｇ２５７６マウスの海馬において測定した。抗シナプトフィジンＳＹ３８抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｔｅ）を用いた。シナプトフィジンのレベルは、シナプス密度と相関することが知られており、したがって、増加した発現は、以前のプラークの損傷からの回復を示している。ＤａＲｏｃｈａ−Ｓｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７０（５）：３６０−３７６を参照されたい。図４０に示されるように、両方のＮ１Ｎ２−ＩｇＧ融合タンパク質は、アルツハイマー病マウスの海馬においてシナプトフィジンのレベルを有意に増加させた。この結果は、プラークのレベルを低減することに加えて、アルツハイマー病のマウスをＮ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質で処置することは、更なる生理学的利益をもたらすことを示している。
【０２０４】
同様に、Ｉｂａ−１のレベル、プラーククリアランスに必要であると考えられている小膠細胞の活性化のマーカー（例えば、Ｗｉｌｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４（２７）：６１４４−６１５１を参照されたい）を、抗−Ｉｂａ−１抗体を用いた構築物５および６での処置後、Ｔｇ２５７６マウスの海馬において測定した。図４１に示されるように、両方のＮ１Ｎ２−ＩｇＧ融合タンパク質は、処置後７日目／週目に試験されたとき、アルツハイマー病マウスの海馬においてＩｂａ−１のレベルを有意に増加させた。この結果、アルツハイマー病のマウスをＮ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質で処理することがプラークのクリアランスをもたらすことを確認する。
【０２０５】
グリア線維性酸性タンパク質のレベル（ＧＦＡＰ）、星状細胞活性化のマーカー、および脳の炎症を、抗−ＧＦＡＰ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＡＢ５８０４）を用いた構築物５および６での処置後、Ｔｇ２５７６マウスの海馬において測定した。ＧＦＡＰレベルは、脳への損傷を増大させることが知られている。例えば、ＤａＲｏｃｈａ−Ｓｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７０（５）：３６０−３７６  ａｔ  ｐａｇｅ  ３７４を参照されたい。したがって、ＧＦＡＰは、処置がＧＦＡＰレベルを上昇させる（これは処置が脳を損傷し得ることを示す）かどうかを評価するために、任意の具体的な処置後のマーカーとして使用され得る。図４２に示されるように、いずれのＮ１Ｎ２−ＩｇＧ融合タンパク質もアルツハイマー病マウスの海馬においてＧＦＡＰのレベルを有意に上昇させず、これは、アルツハイマー病のマウスをＮ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質で処置することが海馬を損傷することを示唆した。したがって、ｇ３ｐ融合タンパク質は、処置するアルツハイマー病を処置するために、治療的または予防的に使用され得る。
実施例１３：ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ａβオリゴマーにより誘導される細胞毒性を阻止する
【０２０６】
Ａβオリゴマーは、神経細胞において、ある種の毒性酵素の放出を引き起こす。酵素をアッセイして、化合物がＡβオリゴマーにより誘導される細胞毒性を阻害し得るかどうかを決定することができる。図３２は、Ｍ１３（構築物２）およびｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）が、Ｎ２ａ細胞に対するオリゴマーにより誘導される毒性を阻止することを示す代表的なデータを示す。したがって、ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ａβオリゴマーにより誘導される細胞毒性の強力な阻害剤である。
実施例１４：ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質は、高齢３ｘＴｇマウスおよび高齢タウトランスジェニックマウスにおいて、タウに結合し、それを脱凝集させ、Ａβプラークおよびｐ−タウを低減する。
【０２０７】
ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質がタウに結合するかどうかを評価するために、Ｎ１およびＮ２を含むｇ３ｐフラグメント−Ｉｇ融合タンパク質を調製し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりｆタウに結合する能力について評価した。図３５は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（構築物４）がｆタウに強力に結合することを示す１つの代表的ＳＰＲアッセイの結果を示す。図４８は別の代表的なＳＰＲアッセイの結果を示し、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）がｆタウに強力に結合することを示す。
【０２０８】
ｇ３ｐフラグメントがタウを脱凝集させ得るかどうかを試験するために、Ｎ１およびＮ２を含むｇ３ｐフラグメント−Ｉｇ融合タンパク質を、予め形成したｆタウを低下させる能力についてＴｈＴ蛍光アッセイにおいて試験した。結果は、ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質がｆタウを強力に脱凝集させることを示す。図３６Ａ、図３６Ｂ、図４９Ａ、および図４９Ｂを参照されたい。
【０２０９】
ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質がインビボで有効化どうかを試験するために、アルツハイマー病のモデルとして認識される（Ｓｔｅｒｎｉｃｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １３４８：１３９；Ｓｔｅｒｎｉｃｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １３４８：１４９を参照されたい）１９〜２０ヶ月齢のオスおよびメスの３ｘＴｇマウスに、脳の海馬領域内へのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）の直接注射または対照を与えた。脳組織を注射の７日後に回収した。切片を、抗アミロイドβモノクローナル抗体を用いてＡβプラークのために（８２Ｅ１；ｃａｔ．＃  ＭＢＳ４９０００５−ＩＪ１０３２３  ｆｒｏｍ  ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）、または抗−ＰＨＦ１抗体を用いてｐ−タウのために免疫染色した（Ｋｏｓｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３（１１）：４０４４；ＰＨＦ＝ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔ（ｓ）を参照されたい）。対のらせん状フィラメントは、神経原線維変化として知られる大きな細胞質の凝集体に蓄積するタウ含有線維の１ファミリーであり、タウのためのマーカーとして認識される。この結果は、構築物６は、対照と比較して、処置されたマウスの海馬においてＡβプラークレベルを有意に減少させることを示す。図５２Ａを参照されたい。結果はまた、構築物６は、対照と比較して、処置されたマウスの海馬において、タウレベルを有意に減少させる。図５２Ｂを参照されたい。片側ダネット検定（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）を用いた。
【０２１０】
異なるインビボモデルにおいてタウを低減するための、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質の能力を評価するために、高齢タウ（Ｐ３０１Ｌ）トランスジェニックマウスを研究した。タウ（Ｐ３０１Ｌ）マウスはタウを過剰発現し、アルツハイマー病を研究するためのモデルとして認識される。Ｌｅｗｉｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５：４０２−４０５を参照されたい。高齢Ｐ３０１Ｌマウスは、タウ病理に関連する表現型としてマークされた自発運動の抑制を呈する。（約２ｍｇ／Ｋｇでの）構築物６を、移植されたくも膜下腔内ポンプを介して１４日間慢性的にタウ（Ｐ３０１Ｌ）マウス（Ｎ＝７）の脊柱に注入した。１４日後、マウスを、盲検方式で運動活性（１０分間に渡る移動距離）について観察した。構築物６は、ＰＢＳ処置マウスではないマウスを処置したが、有意により大きい運動活性を示した。構築物６は、野生型マウス（Ｎ＝１０）への効果を有さない。したがって、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質は、タウが存在するあらゆる疾患または障害において、治療的におよび／または予防的に使用され得る。
実施例１５：ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質は、プリオン病の細胞培養モデル（Ｎ２ａ２２ＬＳｃ）においてＰｒＰＳｃ蓄積、凝集、およびＰｒＰＳｃ形成を阻害する。
【０２１１】
プリオン病は、正常な細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰｃ）のタンパク質分解酵素抵抗性病理形態ＰｒＰＳｃへの変換により特徴付けられる。ＰｒＰＳｃは、タンパク質分解酵素抵抗性に基づきＰｒＰｃと区別される：タンパク質分解酵素は、ＰｒＰＳｃを部分的に低減して、分子量１９〜２１ｋＤａの未グリコシル化形態を有するタンパク質分解酵素抵抗性Ｃ末端コアフラグメント（ＰｒＰｒｅｓ）を形成した。ＰｒＰＳｃの阻害、逆転、および低減は、いくつかの変性疾患の処置への価値ある治療上のアプローチを構成する。
【０２１２】
Ｎ１およびＮ２を含むｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質が、プリオン疾患のインビトロモデルにおける病理学的プリオン配座異性体（ＰｒＰＳｃ）の形成と干渉するかどうかを決定するため、かつ脱凝集、またはｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質の存在下もしくは不在下でのＮ２ａ２２ＬＳｃ細胞におけるＰｒＰの溶解性の変化を検証するために、細胞を、２４時間、１μｇ／ｍｌ構築物６またはＩｇＧの不在下もしくは存在下で培養し、溶解バッファ中に回収した。総タンパク質１００μｇを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  ＴＬ超遠心機中、ＴＬＡ１００．１ローターにて、４℃で９０分間５５，０００ｒｐｍで超遠心した。可溶化ペレットおよび上清の試料２５μｌを、抗ＰｒＰ抗体６Ｄ１１ｍＡｂでのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび下流分析の対象にした。増大した界面活性剤不溶性は、ＰｒＰＳｃまたはＰｒＰ変異体によるタンパク質分解酵素Ｋ（ＰＫ）抵抗性の獲得に先行し、したがって、ＰｒＰ溶解性を変えるｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質の能力を評価した。構築物６により処理した細胞は、ＩｇＧで処理したＮ２ａ２２ＬＳｃ細胞と比較して、有意に低減した量の凝集／不溶性ＰｒＰを呈した。図３８Ａおよび図３８Ｂを参照されたい。
【０２１３】
図３８Ａおよび３８Ｂについて、Ｎ２ａ２２ＬＳｃ細胞を、既に記載された（Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００６）２３：２６３５−２６４７）通りに生成した。簡単に言うと、マウス適応２２Ｌプリオン株に感染した末期のＣＤ−１マウスの脳を、冷リン酸緩衝食塩水および５％デキストロース中、無菌条件下での超音波処理（１０％波長／容量）によりホモジェナイゼーションした。注入のため、脳ホモジェネートを、更に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で２％まで希釈し、サブコンフルエントの６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に１０−ｃｍ２ウェル当たり１ｍＬで加えた。５時間後、通常のＭＥＭ１ｍＬを加え、細胞を感染脳ホモジェネートの存在下で更に１２時間インキュベーションした。細胞を洗浄し、標準ＭＥＭ成長培地を加えた。細胞をコンフルエントまで成長させ、次いで、１：２希釈に分け、２５−ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。１つのフラスコにおいて成長させた細胞を、４日毎に１：２に分けて、その後継代し、一方で別のフラスコで成長した細胞を回収し、ホモジェネートして、ＰｒＰＳｃのレベルをモニターした。従前の研究に基づき、摂取により誘導したＰｒＰＳｃの存在を１代および２代においてのみで検出し、４代（Ｐ４）細胞を、全ての後続の研究のために利用した。細胞を、（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、１ｍＭのＮａ３Ｖ０４、１ｍＭのＮａＦ、２．５ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７、１ｍＭのβ−グリセロリン酸、１％のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．５ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのロイペプチン、１ｍＭのペプスタチンＡ、またはＰＫ切断用１ｍＭのＰＭＳＦを伴わない）からなるホモジェナイゼーションバッファ中、５分間、４℃で溶解し、可溶性物質を１０，０００ｇ、１０分間、４℃での遠心分離により除去した。細胞の分画のため、タンパク質１００μｇを、５５，０００ｒｐｍで９０分間遠心し、その後、ペレットを開始容量に再構成させた。２０％両ペレットおよび上清を溶解し、生化学的に特徴付けた。
【０２１４】
ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質が、脱凝集または物理化学的特性を変化させることにより、ＰｒＰＳｃの増殖を用量依存的に変更するかどうかに取り組むために、Ｎ２ａ２２ＬＳｃを、２４時間、増加濃度の構築物６またはＩｇＧの不在下または存在下で培養し、溶解バッファ中に回収した。ＰＫ処理を伴うまたは伴わない溶解細胞アリコートを、抗ＰｒＰ抗体６Ｄ１１および６Ｈ４ｍＡｂでのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび下流分析の対象にした。対照ＩｇＧおよび構築物６由来の生化学的に溶解したＰＫ切断および未切断溶解物におけるＰｒＰ免疫反応性を評価した。処置は、Ｎ２ａ２２ＬＳｃ＋１０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．３３３μｇ／ｍｌ、０．１１１μｇ／ｍｌ、０．０３７μｇ／ｍｌ、０．０１２μｇ／ｍｌ、および０．００４μｇ／ｍｌ構築物６、またはＮ２ａ２２ＬＳｃ＋１μｇ／ｍｌのｍＩｇＧを含む。
【０２１５】
結果は、構築物６の存在下でのＰｒＰＳｃの有意な用量依存性低減を示し、これは、１μｇ／ｍｌのＩｇＧと比較して、５０％未満のＰｒＰＳｃが０．０８μｇ／ｍｌ構築物６の存在下で生じることを示す。図３９Ａおよび図３９Ｂを参照されたい。実験を繰り返し、これらの結果を確認した。
【０２１６】
ＰｒＰのタンパク質分解酵素Ｋ（ＰＫ）抵抗性配座異性体を評価するために、従前の方法（Ｐｅｒｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（２００４）８４：４５４−４６３，Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００６）２３：２６３５−２６４７）に従い、溶解細胞のアリコートをＰＫ（ｌμｇ／μｇ）１：５０希釈、３７℃、３０分間処理した。インキュベーション後、ＰＭＳＦを４ｍＭに加えることにより、切断を停止させた。
【０２１７】
タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。試料を、試料バッファ（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５０％グリセロール、０．０２％クーマシーブルーＧ２５０）中に希釈し、５分間煮沸した。処理した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元条件下で溶解した。
【０２１８】
抗ＰｒＰモノクローナル抗体６Ｄ１１（Ｓａｄｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．３４（２）：２６７−２７８を参照されたい）および６Ｈ４（Ｃｏｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３３７：１０６−１２０を参照されたい）、ならびに抗アクチンを用いて、試料を特徴付けた。抗原−抗体複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて検出し、ＥＣＬシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて、製造元の指示に従い視覚化した。タンパク質バンドの定量を、フィルム（Ｉｍａｇｅ  Ｊ、ＮＩＨ）の濃度測定分析により行った。
【０２１９】
まとめると、図３８Ａおよび３８Ｂ、ならびに図３９Ａおよび３９Ｂに示される結果は、ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質の、インビトロでのＰｒＰＳｃ形成を直接阻害する能力を実証する。したがって、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質は、プリオンが存在するあらゆる疾患または障害において治療的および／または予防的に使用され得る。
実施例１６：ＮＭＲ研究
【０２２０】
ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（構築物３）と相互作用するｆＡβ４２上の残基を評価するために、ｆＡβ４２の水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換行動を１５Ｎ−ＨＳＱＣ  ＮＭＲを用いて分析した。例えば、Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３３：６５０５−０８を参照されたい。骨格アミド水素の水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換は、線維由来のＡβ分子の解離速度を確定し、アミロイド線維上に呈される結合部分を決定し、線維構造が構築物３の結合によって乱されたかをモニタリングするために測定された。
【０２２１】
一様に１５Ｎ−標識Ａβモノマー由来の成熟したアミロイド線維（ｆＡβ４２）を産生して、構築物３の存在下および不在下、０〜７４４時間（０〜３１日）３７℃でＤ２Ｏに曝露した。構築物３への曝露に続き、線維を凍結乾燥の対象にして、この凍結乾燥された物質をジメチルスルホキシド／ジクロロ酢酸（ＤＭＳＯ／ＤＣＡ）溶媒中で溶解した。次いで、各アミノ酸に関連したＨのＤに対する比率を１５Ｎ−ＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトルを用いて測定した。いくらかの更なるＨ／Ｄ交換がＤＭＳＯ／ＤＣＡ溶液中に発生したとき、線維をＤ２Ｏに曝露度に、ＤＭＳＯ／ＤＣＡ溶液中のＨ〜Ｄ比率の時間依存を測定し、データをＤＭＳＯ／ＤＣＡ中での溶解の時間に外挿した。例えば、Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４４：４４３４−４１  ａｎｄ  Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３３：６５０５−０８を参照されたい。
【０２２２】
Ｈ／Ｄ交換実験を構築物３の存在下および不在下、構築物３：ｆＡβ４２の化学量論比１：３（２５：７５μＭ）で実施した。１０倍の過剰分を飽和結合を確実にするために使用した。
【０２２３】
この結果は、Ｈ／Ｄ交換がＡβ線維および他のアミロイドについて先に観察されたように単相プロセスに合致しないこと示す（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ３３８：５５９−５７１；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を参照されたい。構築物３の不在下では、交換プロフィールは、Ａβ１〜４２配列の２つの広がり、残基１７〜２７および３１〜４０が、Ｈ／Ｄ交換から比較的保護されることを示した。構築物３の追加は、残基１７〜２２および３３〜４０のための保護を増大した。したがって、結果は、構築物３がＡβ線維を疎水性コア残基を通じて認識することを示している。残基１８、３２、３６、および４１は、シグナル重複のため分析から省略され、残基２、７、８、１４、３０、および３８は、ＤＭＳＯ／ＤＣＡ溶解不感時間内に交換され、したがって、これらの残基への効果が報告され、それらの寄与は、隣接するアミノ酸のデータから推論することができるに過ぎないことに留意されたい。
【０２２４】
この結果はまた、保護が強力に抑制されている交換の遅い段階で主に明示されることを示している。
【０２２５】
構築物３とｆＡβ４２との間の相互作用も、ＴＥＭによって分析した。この結果は、７４４時間実施されたｆＡβ４２を有する構築物３のインキュベーションが、非晶質凝集を増加させ、よって、実施されたｆＡβ４２を脱凝集させることを示している。ｐＨ２．０で産生されたｆＡβ４２のＴＥＭは、線維の緻密なネットワークを一貫して示し、１０倍希釈は、形態を明確に決定するためにしばしば必要であった。この線維は、それらのＡβ４２についての先に観察されたものに類似する、観察された捩れた小さい横関連を有する独特の個々の線維であった（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２８１：４７７−８３）ａｎｄ  ｔｗｉｓｔｅｄ  Ａβ４０（Ｐｅｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０７：２６２−６５）。非結晶凝集は、比較的まれであったが、一方でオリゴマー構造は、軽微な背景種としてほとんどの画像において観察された。少量の線維に加えてオリゴマーおよび非晶質凝集が、最大１９００００ＲＣＦでの遠心分離後に残った上清の画像中でより頻繁に観察された。
【０２２６】
Ｈ／Ｄ交換時間（ｐＨ７．４のバッファ）の経過中に採取されたが遠心分離されていない試料のＴＥＭは、元の調製に対して増加量の非晶質凝集を示した。非晶質凝集は、ｆＡβ４２で遠心分離しなかった。７４４時間後、遠心分離されない物質は、構築物３が存在するとき、より少ない線維を含有した。したがって、７４４時間で、構築物３は、実施されたｆＡβ４２を脱凝集させる。
【０２２７】
実験の概略が図４５に示される。図４６構築物３と相互作用するｆＡβ４２上の残基のグラフ表示を示す。図４７は、実施されたｆＡβ４２を７４４時間脱凝集する構築物３の代表的なＴＥＭを示す。
実施例１７：Ｉｆ１  Ｎ１Ｎ２融合タンパク質は、ｆＡβ４２に強力に結合する
【０２２８】
Ｉｆ１ファージおよびＭ１３ファージは、ｇ３ｐのＮ１ドメインに渡って約３０％の同一性を共有するが、Ｎ２ドメインに渡って同一性を事実上有さない。ｇ３ｐのＮ１Ｎ２領域がＩｆ１ファージ（構築物８、配列番号３１および３２）由来であるとき、ｇ３ｐのＮ１Ｎ２−ＩｇＧ−Ｆｃ融合構築物を産生した。構築物８は、Ａβ線維に対してその結合親和性を決定するためにＳＰＲによって分析された。１００μＭのＡβ４２線維（３日間１０ｍＭのＨＣｌ中で組み立てられたｒペプチドＡβ１〜４２）を１０ｍＭのＮａＡｃ  ｐＨ  ５．０と１：１で混合し、ＣＭ３表面上に固定化した。ランニングバッファ［１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＰ２０］における約２μＭの構築物３（Ｎ１Ｎ２  ｇ３ｐ非融合タンパク質）および構築物８は、１０〜１２分間５μｌ／分でバイオチップの表面を通過した。全ての試料を２５℃で調製した。この結果は、図５０Ａに表される。構築物８は、Ａβ原線維を〜３６ｎＭのＫＤと強力に結合する。（Ｆｃドメインにリンクされない）ｇ３ｐのＮ１Ｎ２フラグメントはより弱い結合（ＫＤ〜３６ｎＭ）を示した。
【０２２９】
次に、別のアミロイド線維結合アッセイは、ｆＡβに結合するために、Ｉｆ１  Ｎ１Ｎ２  ｇ３ｐおよびＭ１３  Ｎ１Ｎ２  ｇ３ｐの能力を比較するために行われた。このアッセイにおいて、複合体を形成することを可能にするために、Ｍ１３−Ａｌｅｘａ４８８を２〜３時間Ａβ（ｆＡβ）と混合し、試験構築物（Ｉｆ１  Ｎ１Ｎ２  ｇ３ｐおよびＭ１３  Ｎ１Ｎ２  ｇ３ｐ、両方がＦｃドメインを伴わない）を追加し、次いで、複合体を７５００ｘｇで１０分間の遠心分離によって沈殿させた。ペレット中の蛍光は、アミロイドへのＭ１３結合に比例した。このアッセイは、ファージのｆＡβへの結合の定量的測定、および結合に対して他の剤がファージと競合する能力の評価系を提供する。図５０Ｂは、Ｉｆ１  Ｎ１Ｎ２  ｇ３ｐが、Ｍ１３  Ｎ１Ｎ２  ｇ３ｐより約４倍良好に結合することを示す結果を表す。
実施例１８：ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質は、全身的に投与されるとき、アミロイドを低減して、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおけるアルツハイマー病と関連する行動を改善する。
【０２３０】
ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質が、全身的に投与されるときにアルツハイマー病を処置する際に有効であるかどうかを決定するために、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）またはＰＢＳの１０ｍｇ／ｋｇを、高齢Ｔｇ２５７６マウス（２１〜２３ヶ月の高齢の退役ブリーダ）の腹腔内に投与した。全てのマウスは、全身的に投与されるｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（構築物６）に応じて潜在的な末梢免疫を抑制するために、抵−ＣＤ４事前処置（０．５ｍｇ−ＩＰ）を受け取った。
【０２３１】
３週目に、運動協調および対照（脳幹、小脳、運動皮質）に関与する海馬、線条体、および領域の機能を評価する、マウスをミオクローヌスコーナージャンプについて評価した。Ｌａｌｏｎｄｅ  ＆  Ｓｔｒａｚｉｅｌｌｅ，２０１２，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ，７４（２）：６９を参考にされたい。この行動は、後期アルツハイマー病患者に見られるミオクローヌスに類似している。Ｌａｌｏｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２３（４）：３６３を参考にされたい。新しい環境で５分の期間に渡って、マウスの連続ジャンプの発作の数および／またはケージの隅に対して後ろ足で立ちながら登る行動を観察した。結果は、構築物６を受け取ったマウスは、対照ＰＢＳを受け取るマウスと比較して、有意により少ないミオクローヌスコーナージャンプエピソードを呈した。図５５を参照されたい。
【０２３２】
６週目に、マウスを、総走行距離（図５３Ａおよび図５３Ｂを参照にされたい）、および旋回活性（図５４を参考にされたい）を評価することにより多動性について評価した。これらのアッセイは、新しい環境で総移動距離を測定することにより多動性の改善（ａｍｅｌｉｏｒｉｚａｔｉｏｎ）を試験する。これらの行動アッセイは、ＡＤ患者において日常的に観察される高められた撹拌をモデル化する。Ｍｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４６：１３０；ａｎｄ  Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，１０３：１４５を参照されたい。マウスを４０ｃｍｘ４０ｃｍの広場アリーナに１０分間置き、自発移動および行動をビデオ追跡システムでリアルタイムに点数付けした。結果は、構築物６を受け取ったマウスが、対照ＰＢＳを受け取るマウスと比較して、自発運動活性を有意に低減したことを示す。図５３Ａおよび５３Ｂを参照されたい。構築物６を受け取ったマウスはまた、対照ＰＢＳを受け取るマウスと比較して、旋回行動を低減した。図５４を参照されたい。
【０２３３】
９週目に、マウスを、齧歯類における短期空間記憶およびノベルティ探査を評価するＹ−迷路における自発的な交替について評価した。Ｈｕｇｈｅｓ，２００４  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ＆  Ｂｉｏｂｅｈａｖ  Ｒｅｖ，２８：４９７を参照されたい。図５６を参照されたい。Ｔｇ２５７６マウスモデルなどの、短期記憶を害されたマウスは、通常の短期記憶を有するマウスに対して相対的に低い自発的な交替を呈する。この作業では、ＡＤを有する患者に見られる短期記憶および空間記憶における障害を模倣する。マウスをＹ−迷路に１０分間置き、アームエントリーを自動ビデオベース追跡システムを用いて追跡した。構築物６を受け取るマウスは、改善された記憶を示す対照ＰＢＳを受け取るマウスに対してＹ−迷路においてアームエントリーの有意により自発的な交替を呈した。以下は、ＰＢＳまたは６（矢印）の注射のタイミング、ならびに行動評価（アスタリスク）のためのタイミングを示す概略図である。
【化２】
0006283366.tif 000005
【０２３４】
１０週目に、構築物６で処置されたマウス、およびＰＢＳ−処置マウスを屠殺し、抗−Ａβ抗体染色によっておよびチオフラビンＳ染色によってＡβプラーク負荷低減を評価した。結果は、全身的に投与されるｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質は、アルツハイマー病を有するマウスの海馬内のＡβプラーク負荷を有意に低減することを示す。
【０２３５】
別の実験において、構築物６を、Ｔｇ２５７６アルツハイマー病の１９ヶ月齢を超えるモデルマウスに１０週間、３つの投薬群（０．２ｍｇ／Ｋｇ、Ｎ＝１３；２ｍｇ／Ｋｇ、Ｎ＝１２；および２０ｍｇ／Ｋｇ、Ｎ＝１３）で毎週、腹腔内に（ｉ．ｐ．）デリバリーした。ＰＢＳ−処置群（Ｎ＝１３）は、陰性対照として作用した。構築物６−処置マウスの自発的な交替試験は、２０ｍｇ／Ｋｇを受け取る群が有意に改善されるように、空間記憶において用量依存性改善を示した。
【０２３６】
組み合わせられて、これらの結果は、ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質が、中期から後期アルツハイマー病ならびに脳内に低減されたアミロイドを有する患者において観察された症状に類似するＴｇ２５７６マウスの多くの精神運動表現型および認知障害を改善することを示す。したがって、全身的に投与されるｇ３ｐ融合タンパク質は、アルツハイマー病を処置するために治療的または予防的に使用され得る。
実施例１９：構築物６のクローニング、発現、および精製
【０２３７】
Ｍ１３  ｓｓＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ＃２７７０４）によって抽出した。Ｍ１３  ｇ３ｐ（ｇ３ｐＮ１Ｎ２）のＮ１−リンカー−Ｎ２−リンカードメインを、順方向プライマー
【化３】
0006283366.tif 000006
を有するＰＣＲによって増幅した。（配列番号１３のアミノ酸２２−２７７をコードした）ｇ３ｐＮ１Ｎ２  ＰＣＲ生成物およびｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｃａｔ＃ｐｆｕｓｅ−ｈｇｌｆｃ２）は、制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔ＃Ｒ３１０１）およびＮｃｏＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ＃Ｒ３１９３）によって切断された。このベクターは、ＩＬ２シグナル配列（配列番号１３のアミノ酸１〜２０）、複数のクローニング部位、およびヒトＩｇＧ１−Ｆｃ２（配列番号１３のアミノ酸２８７〜５０９）をコードする。切断されたベクターを脱リン酸化し、切断された挿入とライゲーションした。ライゲーション生成物を、ＮＥＢ  ５−アルファコンピテント大腸菌に形質転換した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔ＃Ｃ２９８７）。ライゲーション生成物は、ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクターにおいて複数のクローニング部位の使用のために、シグナル配列とｇ３ＰＮ１Ｎ２の第１のアミノ酸との間のメチオニン（配列番号１３のアミノ酸２１）をコードすると予想されている。単一コロニーの形質転換体を採取し、プラスミド調製のために成長させた。プラスミドを抽出し、制限消化およびアガロースゲル電気泳動により挿入サイズについて試験した。ＩｇＧ１Ｆｃ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）のプラスミド対象は、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２３８】
プラスミドを、エンドトキシンフリーマキシキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製し、濾過滅菌した。下記に記載されるようにＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ＃Ａ１４６３５）を用いて、高収率のタンパク質の発現を行った。
【０２３９】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞を、製造業者の指示に従って培養した。トランスフェクションを、振とうフラスコ中の３０ｍｌ〜０．５リットルのバッチにおいて行った。トランスフェクションの前日に細胞を、２ｘ１０６細胞／ｍｌまで希釈した。３０ｍｌの細胞懸濁液（２．５ｘ１０６細胞／ｍｌ）トランスフェクションのために、３０μｇプラスミドＤＮＡを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で希釈して、８０μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３Ｒｅａｇｅｎｔを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で希釈した。各混合物を、プラスミドＤＮＡをＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３Ｒｅａｇｅｎｔに添加する前に５分間インキュベートし、続いて、更に２０〜３０分間インキュベーションした。ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３Ｒｅａｇｅｎｔ混合物を、ゆるやかに撹拌しながら細胞にゆっくり添加した。１５０μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションＥｎｈａｎｃｅｒ  Ｉ、および１．５ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションＥｎｈａｎｃｅｒ  ＩＩを添加する前に、細胞を約１６時間インキュベートした。媒介物を回収する前に、更に５〜６日間、細胞をインキュベートした。細胞媒介を１０，０００ｘｇで３０分間の遠心分離により収集して、４ｏＣの単位精製で無菌を保った。
【０２４０】
発現された融合タンパク質の精製を、ＨｉＴｒａｐ（商標）ｒタンパク質  Ａ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。カラムを、溶離バッファ０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌバッファｐＨ３で再度生成して、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファｐＨ７で平衡し、試料を製造業者の推薦に従って添加した。２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファｐＨ７で洗浄した後、タンパク質を、Ｔｒｉｓ−バッファｐＨ９を含有する菅内へ０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌバッファｐＨ３で溶離した。融合タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で確認し、続いて、クマシー染色し、その後、タンパク質をＰＢＳ  ｐＨ  ７内に透析して、濃縮して、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ３０ｋスピンフィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）およびＵｌｔｒａｆｒｅｅ  ＣＬスピンカラムをそれぞれ用いて濾過滅菌した（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）。全てのタンパク質を使用前に４ｏＣで貯蔵した。
【０２４１】
結果として得られた融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸２１〜５０９に対応すると予想された。精製された融合タンパク質のペプチド配列決定は、配列番号１３のアミノ酸２３〜５０８に対応するアミノ酸配列を明らかにし、Ｍｅｔ２１、Ａｌａ２２、およびＬｙｓ５０９を組み換え精製中にＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞によって除去したことを示した。類似の処理が、他の真核生物または非真核生物発現系での組み換え生成において発生するかどうか、発生する場合、どの程度であるかは不明である。このような処理（またはその欠如）は、発現された融合タンパク質が結合し、アミロイドの脱凝集を引き起こす能力に影響するとは予測されない。
実施例２０：ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）中でアミロイドを低減する。
【０２４２】
ｇ３ｐ融合タンパク質が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）においてアミロイドを低減する際に有益であるかどうかを決定するために、代表的なｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質（構築物６）を、ＡＬＳの病理に関与するＳＯＤ−１線維アセンブリと干渉する能力について試験した。ＳＯＤ−１モノマー（ＰＢＳ中の３．５μＭのアポ酵素、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのβＭＥ）は、構築物６（１．５μＭ、０．７５μＭ、０．１５μＭ）の存在下または不在下で２４時間１００ｒｐｍで撹拌した。線維形成（すなわち、線維内へのモノマーの凝集）を、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光によって測定した。ＳＯＤ−１モノマーは、構築物６の不在下で線維を形成した。しかしながら、構築物６は、ＳＯＤ−１線維形成を〜０．７５μＭのＩＣ５０で阻害した。したがって、本発明のｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質は、ＡＬＳのためのモデルにおいてアミロイドを低減し、したがって、ＡＬＳを処置するために治療的および／または予防的に使用され得る。
実施例２１：ｇ３ｐ−Ｉｇ融合タンパク質は、パーキンソン病におけるα−シヌクレインを低減する
【０２４３】
本発明のｇ３ｐ融合タンパク質の有効性について試験するために、パーキンソン病（ＰＤ）インビボモデルにおいて、８ヶ月齢のヒトα−シヌクレイン過剰発現マウス（ライン６１，Ｅ．Ｍａｓｌｉａｈ、Ｎ＝９／群）に２μＬの構築物６（５．３ｍｇ／ｍＬ）またはＰＢＳを尾形の両側に注射した。非トランスジェニックマウス（Ｎ＝５）に更なる対照としてＰＢＳも注射した。マウスを注射の１４日後に屠殺し、脳を神経病理学的および生化学的分析のために回収した。線条体ホモジネート中のプロテイナーゼＫ耐性α−シヌクレインについての測定は、構築物６処置マウスが有意に低いα−シヌクレイン凝集体およびチロシンヒドロキシラーゼの有意に上昇したレベル（ドーパミン合成酵素）（この両方が臨床的改善について測定する）を有することを示した。したがって、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質は、パーキンソン病のためのモデルにおいてアミロイドを低減し、したがって、パーキンソン病を処置するために治療的および／または予防的に使用され得る。
実施例２２：ｇ３ｐ融合タンパク質は、アミロイドーシスを処置することに成功する
【０２４４】
凝集されたトランスサイレチン（ｔｔｒ）は、アミロイドーシスの品質証明である。本発明のｇ３ｐ融合タンパク質はアミロイドーシスを処置することが可能であることを確認するために、代表的なｇ３ｐ融合タンパク質を凝集されたｔｔｒに結合する能力について試験した。大腸菌から発現され、純度＞９０％まで精製されたＴｔｒを、撹拌（３５０ｒｐｍ）を伴いまたは伴わずに、凝集バッファ（１００ｎＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｎＭのＥＤＴＡ、ｐＨ４．３）中で３７℃、０．２ｍｇ／ｍＬでのインキュベーションによって凝集した。ＴｈＴ蛍光および透過電子顕微鏡法により確認された、結果として得られた線維を、ウエスタンブロット分析のためのニトロセルロース膜上で連続希釈した。この膜を、結合を定量化するために、構築物６、本発明の代表的なｇ３ｐ融合タンパク質（１００ｎＭ）、または抗−ｔｔｒ抗体のうちのいずれかで、インキュベートした。天然ｔｔｒ（テトラマー）およびＡβ４２線維を対照として使用した。構築物６をＨＲＰ−複合化ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体で検出した。結果は、構築物６が、撹拌を伴いまたは伴わずに作られたｔｔｒ線維を定量的に結合するが、天然ｔｔｒを認識しないことを示す。抗−ｔｔｒ抗体で処置された膜は、結合対照として作用し、凝集されたｔｔｒプレップおよび天然ｔｔｒプレップの両方が膜を定量的に保持し、かつ抗−ｔｔｒ抗体がＡβ４２線維対照を認識しないことを示した。したがって、構築物６を含むｇ３ｐ融合タンパク質は、アミロイドーシスの病態生理に関与し、天然ｔｔｒ、正常な生理学的テトラマーに結合しない凝集されたｔｔｒを強力に結合する。このデータは、本発明のｇ３ｐ融合タンパク質が、ｔｔｒのアミロイド構造に結合し、したがって、アミロイドーシスを処置する際、治療的および予防的に有用であることを確認する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【配列表】
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