(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異を原因とする栄養障害性表皮水疱症（ＤＥＢ）を患っている対象を治療するための、（ｉ）アミノグリコシドと、（ｉｉ）ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）又はミニＣ７若しくは双方とを含む組成物であって、
有効量の（ｉ）アミノグリコシドと、（ｉｉ）Ｃ７、ミニＣ７又は双方を含有する前記組成物は、局所適用により前記対象に投与され、
前記アミノグリコシドが、Ｇ４１８、ゲンタマイシン、及びパロモマイシンからなる群から選択され、
投与されるアミノグリコシドの量は、正常なヒトケラチノサイトにおいて観察されるＣ７の少なくとも１０％のレベルにおいてＣ７の発現を誘導するのに有効であり、アミノグリコシド誘発のＣ７がケラチノサイト過移動性を低下させる、組成物。
【請求項２】
前記アミノグリコシドがＧ４１８である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
投与されるアミノグリコシドの量は、正常なヒトケラチノサイトにおいて観察されるＣ７の１０％〜３５％のレベルにおいてＣ７の発現を誘導するのに有効である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異を原因とするＤＥＢを患っている対象における皮膚創傷治癒を強化するための組成物であって、該組成物は、アミノグリコシドと、Ｃ７又はミニＣ７若しくは双方と、薬学的に許容可能な担体を含有し、
前記アミノグリコシドが、Ｇ４１８、ゲンタマイシン、及びパロモマイシンからなる群から選択され、
投与されるアミノグリコシドの量は、正常なヒトケラチノサイトにおいて観察されるＣ７の少なくとも１０％のレベルにおいてＣ７の発現を誘導するのに有効であり、アミノグリコシド誘発のＣ７がケラチノサイト過移動性を低下させる、組成物。
【請求項５】
上記アミノグリコシドがＧ４１８である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
投与されるアミノグリコシドの量は、正常なヒトケラチノサイトにおいて観察されるＣ７の１０％〜３５％のレベルにおいてＣ７の発現を誘導するのに有効である、請求項４〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２０１０年５月６日出願のＵＳ仮出願番号６１／３３２，１０８号の利益を主張する。上記出願は参照によりここに取り込まれる。
【０００２】
連邦支援の研究開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約番号Ｒ０１ ＡＲ４７９８１およびＲＯ１  ＡＲ３３６２５の下で政府支援を用いてなされた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、概して、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異を患っている対象の治療に関する。より詳しくは、本発明は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異に起因する栄養障害性表皮水疱症の治療のための組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
表皮水疱症（ＥＢ）は、皮膚が非常に脆弱となり容易に水疱を生じさせる遺伝性疾患の一群です。ＥＢを患う患者は、すれたりひっかくなどの軽傷や摩擦に反応して水疱が容易に形成され、皮膚腐食が生じ得る。栄養障害性表皮水疱症（ＤＥＢ）は、ＥＢの主形態の一つである。この疾患の兆候と症状は、罹患者の間で大きく異なっている。軽症の場合は、水疱形成が主として手、足、ひざ、及びひじに生じる。重症の場合は、広範囲に及んだ水疱形成が、失明をもたらしたり、醜い跡となったり、あるいは他の深刻な医学的問題をもたらし得る。
【０００５】
研究者はＤＥＢを三つの主要病型、すなわち、常染色体劣性栄養障害性表皮水疱アロポー・シーメンス型（ＲＤＥＢ−ＨＳ）、非アロポー・シーメンス型常染色体劣性表皮水疱症（非ＨＳ  ＲＤＥＢ）、及び、常染色体優性型表皮水疱症（ＤＤＥＢ）に分類している。これらの方は重症度の点で異なるが、実質的に重複する臨床徴候を有しており、同じ遺伝子における突然変異により生じる。
【０００６】
３つの病型の中でＲＤＥＢ−ＨＳが、症状が最も重度で典型的な形態である。これを罹患する乳児は、出生時の外傷の結果、広範囲に及ぶ水疱と、欠落した皮膚部分を有して生まれることが多い。ほとんどの場合、水疱が全身に現れ、口及び消化管の濡れた内面などの粘膜を侵し得る。水疱が治癒するとき、重い瘢痕が残る。口及び食道における瘢痕は、乳児が食べ物を咀嚼し飲み込むことを困難として慢性的な栄養失調をもたらし、成長発育遅延となり得る。進行性の瘢痕の更なる合併症には、指及び足指の融着、指の爪及び足指の爪の損失、動きを制限する関節変形（拘縮）、及び、失明をもたらす目の炎症が含まれ得る。更に、この典型的なＤＥＢの形態を患う若年成人は、扁平上皮細胞癌と呼ばれ、通常悪性となる傾向にあり、命にかかわることの多い皮膚癌の形態を発現する危険性が極めて高い。
【０００７】
非ＨＳ  ＲＤＥＢは、ＨＳ  ＲＤＥＢよりは比較的軽度である。非ＨＳ  ＲＤＥＢは、更に小分類され得る。軽症の場合、水疱形成は手、足、ひざ、及びひじに限られるが、重症の場合、水疱形成は広範囲に及び得る。罹患者は奇形の指爪及び足指爪を有することが多い。非ＨＳ  ＲＤＥＢは、水疱が生じる領域における瘢痕を含むが、この疾患の形態は、ＨＳ  ＲＤＥＢの特徴である重い瘢痕をもたらさない。
【０００８】
ＤＤＥＢは、ＲＤＥＢより軽度となる傾向にあり、水疱形成が手、足、ひざ、及びひじに限られることが多い。水疱は治癒する際に瘢痕を伴うが、重いものではない。この病気の罹患者の多くは、奇形の指爪と足指爪を有する。罹患者の爪は長い間失われ得るが、最も軽度の患者においては異常な爪が症状の唯一の兆候である。
【０００９】
ＤＥＢのすべての病型の発症率は、米国の新生児１００万人当たり６．５人と推定される。この疾患の重症な常染色体劣性型は新成人１００万人当たり１人より少ない。
【００１０】
上述したように、すべてのＥＢは遺伝子における遺伝性突然変異により引き起こされる。ＤＥＢの３つの病型のすべてについて、突然変異はＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるものである。この遺伝子は、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を組み立てるために使用されるタンパク質を形成するための指示を提供する。コラーゲンは、体中の皮膚、腱及び靭帯などの結合組織に構造と強度を付与する分子である。ＶＩＩ型コラーゲンは、皮膚を強化し安定させる上で重要な機能を果たす。ＶＩＩ型コラーゲンは、表皮と呼ばれる皮膚の最表層を真皮と呼ばれる下層に固着する、アンカーリングフィブリルという構造の主要成分である。
【００１１】
ＣＯＬ７Ａ１変異は、Ｃ７の構造を変え、あるいはＣ７の生成を崩壊させ、これは表皮が真皮に結合するのを助ける性能を減させる。特に、ＤＥＢ疾患の約２５％が中途終止コドン（ＰＴＣ）をもたらすナンセンス突然変異により引き起こされ、これはＣ７を無くすか、不完全Ｃ７を生じさせる。Ｃ７が異常であるか欠損する場合、摩擦又は他の軽度の外傷により二つの皮膚層が分離され得る。この分離により水疱が形成され得、水疱が治癒する時に広範囲に及ぶ瘢痕を引き起こし得る。
【００１２】
分子レベルにおいて、Ｃ７は３つの同一のα鎖から構成され、各々は、大きな１４５ｋＤａアミノ末端基が位置する１４５ｋＤａ主要コラーゲン三重螺旋セグメント、非コラーゲンドメイン（ＮＣ１）、及び、小さな３４ｋＤａカルボキシ末端非コラーゲンドメイン（ＮＣ２）からなる（非特許文献１及び２参照、これらの内容は参照により本開示に取り込まれる。）。細胞外空間内において、Ｃ７分子は、横方向に集まってアンカーリングフィブリルを形成する逆平行二量体を形成する。正常な皮膚において、Ｃ７は、表皮真皮境界部（ＥＤＪ）から発し真皮乳頭層に垂直に広がる、サイズが約２００〜７００ｎｍの範囲のアンカーリングフィブリルを形成する。ＤＥＢ患者においては、ＥＤＪにおいて正常なアンカーリングフィブリルが不足しているという特徴を有する。疾患の根本的な原因論に基づき、疾患の治療のための一つの論理的方法は、遺伝子治療を介して遺伝子欠損を治すことにある。
【００１３】
近年において、ＤＥＢを治療するためのいくつかの試みが報告されている。Ｏｒｉｔｚ−Ｕｒｄａ等による研究では、ＣＯＬ７Ａ１  ｃＤＮＡが、劣性ＤＥＢ（ＲＤＥＢ）患者からＣ７−ヌルケラチノサイトに、生体外でφＣ３１インテグラーゼ系非ウイルス遺伝子導入手段を用いてうまく且つ安定的に組み込まれた（非特許文献３参照、この内容は参照により本開示に取り込まれる。）。重症の複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のマウスに、これらの遺伝子修正細胞を含むヒトの皮膚と同等のものを移植することにより、遺伝子導入後にＲＤＥＢ特性が治ったことが示された。
【００１４】
他の試みにおいて、ＲＤＥＢケラチノサイト及び線維芽細胞（Ｃ７は存在しなかった）において、Ｃ７を発現するために最小のレンチウイルスベクターが開発された。この構築物は、その後、ＲＤＥＢ細胞表現型の転換を明示するために使用された(非特許文献４参照,この内容は参照により本開示に取り込まれる。)。この実験において、遺伝子修正ＲＤＥＢ細胞と、天然の未修正ＲＤＥＢ細胞は、ヒトの皮膚と同等の複合材料を形成するために使用され、この複合材料は次いでＳＣＩＤマウスに移植された。遺伝子修正ＲＤＥＢ細胞を用いて形成された、移植されたヒトの皮膚は、ＥＤＪにおいてＣ７を示し、ＲＤＥＢ皮膚表現型が治されたことが示された（しかし、対照の未修正ＲＤＥＢ細胞では示されなかった）。さらに、遺伝子修正細胞から構成される皮膚同等物において、トランス遺伝子由来のＣ７はまた、表皮と真皮の間に位置する基底膜領域（ＢＭＺ）内に正確に組織されたアンカーリングフィブリル構造を形成した（しかし、遺伝子未修正細胞においては形成されなかった）。
【００１５】
しかしながら、これらの生体外手段のタイプは、患者の皮膚の外科的に用意された部位に遺伝子修正細胞を移植することを必要とする。ヒトの創傷への移植のための培養ケラチノサイト自家移植片を使用する経験は、技術的困難性を伴うことが多いことがわかった。
したがって、これらのタイプの生体外遺伝子治療（すなわち、培養液中で細胞を遺伝子修正し、次いでその細胞をＤＥＢ患者へ皮膚同等物として移植する）は、論理上は可能であるが、技術的困難性により、非効率的で、ロジスティカルに困難で、費用が高く、労力がかかり、限られた効果しかないものとなっている。
【００１６】
別の手段として、より直接的な「ダイレクト・インヴィヴォ遺伝子治療」も報告されている。この手段では、ＤＥＢ創傷皮膚に、遺伝子修正ＲＤＥＢ線維芽細胞が皮内注射を介して直接注入される。経皮注入された遺伝子修正細胞は次いでＤＥＢ皮膚において滞留し、ＤＥＢ皮膚に欠損しているＣ７を合成し分泌する。驚くべきことに、細胞外皮膚組織において分泌されたＣ７は、ＤＥＢ皮膚のＢＭＺに結合し、アンカーリングフィブリル構造内に正しく組織化する。以前はＣ７及びアンカーリングフィブリルを欠損していたＤＥＢ皮膚は、これらの要素を有し、これからＤＥＢ皮膚表現型は治される。これは、ＤＥＢのための「細胞治療」と呼ばれる。
【００１７】
更に別の手段において、全長又は「ミニＣ７」がＤＥＢ皮膚に経皮注入された場合に同じ現象が生じ得ることも報告されている。この場合において、注入されたＣ７はＤＥＢ皮膚のＢＭＺと結合し、正しく組織されたアンカーリングフィブリルを形成し、ＤＥＢ皮膚表現型を治し得る。これはＤＥＢのための「タンパク療法」と呼ばれる。
【００１８】
重症のＤＥＢを患っている患者は、損傷が広範囲に及び、仙骨、腰、足、口、頭皮、背下部及び手など、外傷となりやすい部位の広範囲に広がる多数の創傷を有するため、上掲に概説した３つの直接的な皮内注射の手段のいずれかを用いたＤＥＢ患者の治療においては、多数の創傷部位への多数の注入を必要とし得る。したがって、上掲で概説した治療薬の皮内注射（遺伝子修正細胞、Ｃ７又はＣ７発現ベクターの組み換え型）は、１以上の皮内注射による、それぞれの、並びに、すべての創傷の部位特異的治療を必要とし得る。これはすることは可能であるが、そのような面倒な治療方法はなお大いに所望されたままである。
【００１９】
上述した進展にもかかわらず、ＤＥＢを治療するための有効かつ単純な方法はいまだ存在しない。特に、ＤＥＢがＣＯＬ７Ａ１遺伝子における突然変異のＰＴＣタイプに起因する場合、ＰＴＣ表現型を回復に向かわせ得る単純な治療を患者に提供することが理想的である。
【００２０】
したがって、一般的な皮膚創傷、特にＤＥＢを治療するより良好な方法に対する重大な必要性がなお存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Burgeson, J Invest Dermatol 101: 252−255 (1993)
【非特許文献２】Sakai等、J Cell Biol 103: 1577−1586 (1986)
【非特許文献３】Ｏｒｉｔｚ−Ｕｒｄａ等、Nat Med 8: 1166−1170 (2002)
【非特許文献４】Chen 等、 Nat Genet 32: 670−675 (2002)
【発明の概要】
【００２２】
上記を考慮し、本発明の目的は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子における中途終止コドン突然変異の損傷効果を克服するためのより効果的な方法を提供することである。
【００２３】
また本発明の目的は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子における中途終止コドン突然変異に起因するＤＥＢを治療するための組成物を提供することである。
【００２４】
本発明のこれらの目的および他の目的は、リボソームが突然変異をリードスルーして、全長Ｃ７を発現させ、もしくは不完全Ｃ７の発現を増大させることを誘発することにより、アミノグリコシドがナンセンス突然変異の効果に反撃し得るという予期せぬ発見により満たされる。本発明の予期せぬ発見に基づき、創傷治癒を強化するための様々な方法および組成物が考案された。
【００２５】
一態様において、本発明は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異を含む細胞における、全長Ｃ７の発現を誘発するための、もしくは不完全Ｃ７の発現を強化するための方法を提供する。本発明のこの態様の形態に係る方法は、細胞をアミノグリコシドに接触させる工程を通常含み得る。
【００２６】
他の態様において、本発明は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異に起因するＤＥＢを患う対象を治療するための方法を提供する。本発明のこの態様に係る方法は、対象に有効量のアミノグリコシドを含有する組成物を投与する工程を通常含み得る。
【００２７】
更なる他の態様において、本発明はまた、ＤＥＢを治療するための組成物を提供する。
本発明のこの態様に係る形態は、通常、アミノグリコシドと、Ｃ７またはミニＣ７もしくは双方と、薬学的に許容可能な担体を含有し得る。
【００２８】
本発明の方法および組成物は、投与しやすく、部位特異的適用を必要とせず、費用がかからず、効果的であるという利点を少なくとも有し得る。
【００２９】
本発明の他の態様並びに利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】アミノグリコシドが、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異を含む細胞において全長Ｃ７の発現を誘発することができることを示す図。
【図２】ナンセンス突然変異を含む細胞における全長Ｃ７の発現を誘発するアミノグリコシドが、用量依存性であることを示す図。
【図３】アミノグリコシドが、ナンセンス突然変異を含む細胞における全長Ｃ７の持続した発現を誘発することができることを示す図。
【図４】アミノグリコシドが、ＲＤＥＢケラチノサイトにおける全長Ｃ７の持続した発現を誘発することができることを示す図。
【図５】アミノグリコシド誘発の全長Ｃ７の発現が、ケラチノサイト過移動性（hypermobility）をリバースすることもできることを示す図。
【図６】部位特異的突然変異誘発法を使用する実験モデルのＣＯＬ７Ａ１遺伝子の中に導入されたナンセンス突然変異を概略的に示す図。
【図７】ナンセンス突然変異のリードスルー、および、様々なナンセンス突然変異における全長Ｃ７の生成を誘発することができる二つの典型的なアミノグリコシドを示す図。
【図８】ナンセンス突然変異を含む多数の細胞が、不完全Ｃ７を発現することができ、アミノグリコシドがこれらの細胞における不完全Ｃ７の発現レベルを強化することができることを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
添付の図面において説明される特定の形態に言及することにより、ここに本発明を詳細に説明する。以下の記載は、典型的な形態および例の観点からのものであるが、ここに記載される形態は例証目的に過ぎず、様々な就職および変形が、添付の特許請求の範囲に記載される通りの本発明の精神および範囲から離れることなしに当業者によりなされ得ることが理解されよう。
【００３２】
定義
他に言及のない限り、ここで使用されるすべての用語は以下に示される意味を有し、本発明の技術における当業者に対して当該用語が有する同じ意味と通常一致する。実践者は特に、当該技術の定義および用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）、分子クローニング：A Laboratory Manual（第２版）、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.、および、Ausubel F M等（１９９３）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.に向けられる。本発明が、記載された特定の手順、プロトコル、および試薬に限定されるものではなく、これらは変化し得ることが理解されよう。
【００３３】
ここで使用される場合の頭字語「Ｃ７」は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子によりコードされるＶＩＩ型コラーゲンを表す。
【００３４】
ここで使用される場合の頭字語「Ｃ７Ｍ」は、Ｃｈｅｎ等（J. Biol. Chem. 275(32):24429-24435 (2000)、この内容は参照によりここに取り込まれる。）により記載される「ミニＣ７」を表す。本発明の目的のために、「Ｃ７Ｍ」及び「ミニＣ７」は、互いに代替可能に使用される。つまり、Ｃ７Ｍは、野生型Ｃ７から一部を選択的に取り除くことにより形成される。野生型Ｃ７は、２９４４のアミノ酸残基からなるタンパク質である。これは更に、非コラーゲンＮＣ１ドメイン（残基１−１２５３）、主要コラーゲン螺旋ドメイン（残基１２５４−２７８３）、及び、カルボキシ末端ＮＣ２ドメイン（残基２７８４−２９４４）に分けることができる。Ｃ７Ｍは主要コラーゲンドメイン内の残基１９２０−２６０３を取り除くことにより形成される。
【００３５】
ここで使用される場合の「ＲＤＥＢ」は、劣性栄養障害性表皮水疱症を意味し、アロポー・シーメンス型ＲＤＥＢ（ＨＳ−ＲＤＥＢ）及び非アロポー・シーメンス型ＲＤＥＢ（非ＨＳ  ＲＤＥＢ）の双方を包含する。
【００３６】
ここで使用される場合の「不完全Ｃ７」は、ナンセンス突然変異を含むＣＯＬ７Ａ１遺伝子から発現したタンパク質を表す。ナンセンス突然変異がＣＯＬ７Ａ１遺伝子において生じ得る多数の潜在的な場所がある。この突然変異した遺伝子が発現する場合、生じるタンパク質は、突然変異に対応する位置において中途終止する短縮された種類である。したがって、この文脈において、不完全Ｃ７は、ナンセンス突然変異による可能な短縮Ｃ７のすべての集合を包含するものととらえられる。
【００３７】
全長Ｃ７の発現を誘発するための、もしくは、不完全Ｃ７の発現を強化するための方法
本発明は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異を含む細胞における、全長Ｃ７の発現を誘発するための、もしくは、不完全Ｃ７の発現を強化するための方法を提供する。本発明のこの態様の形態に係る方法は、細胞をアミノグリコシドに接触させる工程を通常含む。
【００３８】
アミノグリコシドはアミノ修飾糖である。その多くは、抗生物質として機能が知られている。当業者は商業的な筋から入手することができる。典型的なアミノグリコシドにはゲンタマイシン及びパロモマイシンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
好ましい形態において、アミノグリコシドは、Ｇ４１８、ゲンタマイシン及びパロモマイシンからなる群から選択される。より好ましい形態において、アミノグリコシドはＧ４１８である。
【００４０】
細胞は好ましくはケラチノサイトであり、より好ましくはＤＥＢ又はＲＤＥＢケラチノサイトである。
【００４１】
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異によるＤＥＢを治療するための方法
他の態様において、本発明はＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異に起因するＤＥＢを患っている対象を治療するための方法を提供する。本発明のこの態様に係る方法は、有効量のアミノグリコシドを含有する組成物を対象に投与する工程を通常含む。
【００４２】
典型的なアミノグリコシドには、限定するものではないが、ゲンタマイシン及びパロモマイシンが含まれ得る。好ましい形態において、アミノグリコシドはＧ４１８である。
【００４３】
組成物は、創傷治癒を更に補強するために、Ｃ７又はミニＣ７もしくは双方を更に含有し得る。
【００４４】
投与形態の多くは、限定されるものではないが、特定のアミノグリコシドに最も一般的な方法であることが好ましい。好ましい形態において、組成物はＣ７又はｍｉｎ−７、若しくは双方を含有するものであり、投与形態は局所適用である。
【００４５】
ＤＥＢを治療するための組成物
更なる他の態様において、本発明はまた、ＤＥＢを治療するための組成物を提供する。
本発明のこの態様に係る形態は、通常、アミノグリコシドと、Ｃ７又はミニＣ７若しくは双方と、薬学的に許容可能な担体を含有し得る。
【００４６】
好ましい形態において、アミノグリコシドは、Ｇ４１８、ゲンタマイシン及びパロモマイシンから選択され、より好ましくはＧ４１８である。
【００４７】
本発明を更に説明するために、以下の具体例が提供される。
【実施例】
【００４８】
［アミノグリコシドは、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異を含む細胞において、全長Ｃ７の発現を誘発することができる。］
ＲＤＥＢケラチノサイトが、Ｇ４１８（８μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（２００μｇ／ｍＬ）、パロモマイシン（２００μｇ／ｍＬ）、アミカシン（１ｍｇ／ｍＬ）、又はＰＴＣ１２４（２０μｇ／ｍＬ）で４８時間処理された。次いで細胞が溶解され、抗ＮＣ１抗体又は抗βチューブリン抗体（ローディングコントロール）を用いてイムノブロット解析された。図１において、Ｇ４１８及びゲンタマイシンを用いた処理は、ＥＢ５Ｋ及びＤＧ１６ケラチノサイトの双方において全長Ｃ７の生成を誘発したことに留意すべきである。パロモマイシンはＤＧ１６細胞のみにリードスルーを誘発したが、アミカシン及びＰＴＣ１２４はケラチノサイトラインのいずれにもリードスルーを生じなかった。治療薬の単回投与によりリードスルーがもたらされ、正常なヒトケラチノサイト（ＩＫＣ）において観察されるＣ７の１０−３５％のレベルにおいてＣ７を生成したことに留意すべきである。
【００４９】
［ナンセンス突然変異を含む細胞における全長Ｃ７の発現を誘発するアミノグリコシドは、用量依存性である。］
ＲＤＥＢケラチノサイトは、Ｇ４１８及びゲンタマイシンの濃度を変えて処理された。
細胞が溶解され、抗ＮＣ１又は抗βチューブリン抗体（ローディングコントロール）を用いてイムノブロット解析された。図２において、Ｇ４１８及びゲンタマイシンの双方が、ＥＢ５Ｋ及びＤＧ１６ラインの双方において用量依存性において全長Ｃ７生成を誘発したことに留意すべきである。
【００５０】
［アミノグリコシドは、ナンセンス突然変異を含む細胞において全長Ｃ７の持続的な発現を誘発することができる。］
ＥＢ５Ｋ及びＤＧ１６ケラチノサイトが、Ｇ４１８（８μｇ／ｍＬ）又はゲンタマイシン（２００μｇ／ｍＬ）で処理された。処理後の３日、５日又は８日において細胞が溶解され、抗ＮＣ１又は抗βチューブリン抗体を用いてイムノブロット解析された。図３において、ゲンタマイシン及びＧ４１８の双方において持続するＣ７生成が誘発されたことに留意すべきである。
【００５１】
［アミノグリコシドは、ＲＤＥＢケラチノサイトにおいて全長Ｃ７の持続的な発現を誘発することができる。］
ＤＧ１６及びＥＢ５Ｋケラチノサイトが、図４に示されるように、Ｇ４１８（８μｇ／ｍＬ）又はゲンタマイシン（２００μｇ／ｍＬ）で処理された。免疫蛍光染色が、多クローン性の抗ＮＣ１抗体を用いて実施された。正常なヒトケラチノサイト（ＩＫＣ）は、同時に染色された。Ｇ４１８又はゲンタマイシン処理されたＤＧ１６及びＥＢ５ＫケラチノサイトにおいてＣ７染色を示したことに留意すべきである。これとは対照的に、未処理の親ケラチノサイトはＣ７発現が完全に欠落していた。
【００５２】
［アミノグリコシド誘発の全長Ｃ７の発現は、ケラチノサイト過移動性を食い止めることもできる。］
図５は、アミノグリコシド誘発の全長Ｃ７の発現が、ケラチノサイト過移動性を食い止めることができることを示し、これは創傷治癒を強化するのに有効であるという重要な特徴である。図５Ａにおいて、ケラチノサイトは未処理であるか、あるいは、Ｇ４１８（８μｇ／ｍＬ）又はゲンタマイシン（２００μｇ／ｍＬ）で４８時間処理され、次いで、マトリクスとしてコラーゲンを用いた金塩コロイド遊走アッセイが施された。典型的なフィールドが、暗視野光学において４０×で写真に撮られた。図５Ｂにおいて、遊走指数は遊走行路により破壊された全フィールド領域の百分率を表す。エラーバー、３つの異なる実験のＳＤ。ＥＢ５Ｋ及びＤＧ１６ケラチノサイトは、正常なヒトケラチノサイト（ＩＫＣ）と比べて過移動性を示し、これとは対照的に、アミノグリコシド処理は、その過移動性表現型を正常にリバースしたことに留意すべきである。
【００５３】
［部位特異的突然変異誘発法によるＣＯＬ７Ａ１ナンセンス変異体の構成］
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子に異なるナンセンス突然変異を含む細胞を用いた実験に関し、部位特異的突然変異誘発法によりＲＤＥＢと関係する３０のナンセンス突然変異を導入するためにＣ７発現ベクターを使用した。図６は、新たに導入された突然変異体各々の位置を示すＣ７分子の概略である。
【００５４】
［アミノグリコシドは、様々なナンセンス突然変異においてナンセンス突然変異のリードスルー及び全長Ｃ７の生成を誘発することができる。］
図７は、アミノグリコシドがナンセンス突然変異のリードスルーを誘発することができ、全長Ｃ７の発現をもたらすことを示す。ナンセンス突然変異構築物でトランスフェクトされたヒトの上皮（２９３細胞）が、（図７Ａ）Ｇ４１８（８μｇ／ｍＬ）及び（図７Ｂ）ゲンタマイシン（２００μｇ／ｍＬ）で４８時間処理され、溶解され、抗ＮＣ１抗体又は抗βチューブリン抗体（ローディングコントロール）を用いてイムノブロット解析された。Ｇ４１８及びゲンタマイシンの双方が、表示された突然変異構築物を含む細胞ラインにおいて、ＰＴＣリードスルー及び全長Ｃ７生成を誘発したことに留意すべきである。
【００５５】
［ナンセンス突然変異を含む多数の細胞が不完全Ｃ７を発現することができ、アミノグリコシドがこれらの細胞における不完全Ｃ７の発現レベルを強化することができる。］
図８は、構築されたすべてのナンセンス変異体が不完全Ｃ７を発現するという驚くべき発見を示す。これは、従来の見解では、ナンセンス突然変異は細胞中に発現をもたらし得ないと予測されていたため、予期し得ないものである。図８Ａにおいて、表示された変異体構築物でトランスフェクトされた２９３の細胞が溶解され、抗ＮＣ１抗体を用いてイムノブロット解析された。処理なしにおいて、ＰＴＣ突然変異を抱いている細胞は不完全Ｃ７を生成したことに留意すべきである。
【００５６】
図８Ｂにおいて、表示された変異体構築物でトランスフェクトされた２９３の細胞は、処理されないか、あるいはＧ４１８（８μｇ／ｍＬ）を用いて４８時間処理され、溶解され、抗ＮＣ１抗体又は抗βチューブリン抗体（ローディングコントロール）を用いてイムノブロット解析された。アミノグリコシドで処理された細胞は、未処理の細胞と比べて、不完全及び全長Ｃ７の生成のレベルが驚異的に高いことに留意すべきである。
[付記]以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異を患っている細胞における、全長Ｃ７の発現を誘発するための、又は、不完全Ｃ７の発現を強化するための方法であって、該細胞を、アミノグリコシドを含有する有効量の組成物と接触させることを含む方法。
［２］
前記アミノグリコシドが、Ｇ４１８、ゲンタマイシン、及びパロモマイシンからなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［３］
前記アミノグリコシドがＧ４１８である、［２］に記載の方法。
［４］
前記細胞がＲＤＥＢケラチノサイトである、［１］に記載の方法。
［５］
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異を原因とするＤＥＢを患っている対象を治療するための方法であって、前記対象に、有効量のアミノグリコシドを含有する組成物を投与することを含む方法。
［６］
上記アミノグリコシドがＧ４１８、ゲンタマイシン、及びパロモマイシンからなる群から選択される、［５］に記載の方法。
［７］
上記アミノグリコシドがＧ４１８である、［５］に記載の方法。
［８］
上記組成物が更に、Ｃ７又はｍｉｎＣ７若しくは双方を含有し、上記投与が局所適用である、［５］に記載の方法。
［９］
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子におけるナンセンス突然変異を原因とするＤＥＢを患っている対象における皮膚創傷治癒を強化するための組成物であって、アミノグリコシドと、Ｃ７又はミニＣ７若しくは双方と、薬学的に許容可能な担体とを含有する組成物。
［１０］
アミノグリコシドがＧ４１８、ゲンタマイシン、及びパロモマイシンからなる群から選択される、［９］に記載の組成物。
［１１］
上記アミノグリコシドがＧ４１８である、［９］に記載の組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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