(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する単離されたE. coli株と、食事上許容されるキャリアとを含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２】
組成物が、凍結乾燥形態であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
組成物が、凍結形態であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が、動物へと腸内デリバリーするためのものであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
腸内デリバリーが経口投与を含むことを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
動物が豚であることを特徴とする、請求項4又は5に記載の組成物。
【請求項７】
動物が離乳後の豚であることを特徴とする、請求項4又は5に記載の組成物。
【請求項８】
組成物が、F4線毛を発現する単離された生きた非病原性E. coliをさらに含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
F4線毛を発現する前記非病原性E. coliが、カナダ国際寄託当局に2005年1月21日に寄託され、アクセッション番号IDAC 210105-01に帰属する株である、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
組成物が、用量当たり、少なくとも5×107 CFUの量の、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する単離されたE. coli株を含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が、用量当たり、5×106〜3×1010 CFUの範囲内の量の、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する単離されたE. coli株を含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
動物においてF18病原性E. coli腸管感染を予防するための組成物であって、動物へと腸内デリバリーするための組成物の製造における、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する生きたE. coli株の有効量の使用。
【請求項１３】
前記腸内デリバリーが、生きたE. coli株の経口投与により得られることを特徴とする、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
前記組成物が凍結乾燥形態であることを特徴とする、請求項12又は13に記載の使用。
【請求項１５】
前記組成物が凍結形態であることを特徴とする、請求項12又は13に記載の使用。
【請求項１６】
前記生きたE. coli株が、食事上許容されるキャリアと関連することを特徴とする、請求項12〜15のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記動物が豚であることを特徴とする、請求項12〜16のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
動物においてF18病原性E. coli感染により引き起こされる浮腫病又は下痢を予防するための、請求項12〜17のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記組成物が、F18 E. coliチャレンジ株による腸管感染を予防することができることを特徴とする、請求項12〜17のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
動物が離乳後の豚であることを特徴とする、請求項12〜19のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
組成物が、用量当たり、少なくとも5×107 CFUの量の、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する単離されたE. coli株を含むことを特徴とする、請求項12〜20のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
組成物が、用量当たり、5×106〜3×1010 CFUの範囲内の量の、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する単離されたE. coli株を含むことを特徴とする、請求項12〜20のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2012年7月20日に出願された米国仮出願第61/674,179号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本願は、非病原性F18 E. coli株及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
浮腫病及び下痢は、典型的には、ブリーダーにより育てられる動物の間でよく見られる疾患である。例えば、離乳子豚における浮腫病が、典型的には、志賀毒素2e型（Stx2e）をコードする志賀毒素エンコーディング大腸菌（shiga toxin-encoding Escherichia coli）（STEC）株により引き起こされる一方（MacLeod et al., 1991, Vet Pathol 28:66-73）、新生及び離乳子豚における分泌性下痢は、典型的には、耐熱性（STa、STb、EAST1）及び／又は易熱性（LT）エンテロトキシンをコードする腸管毒素原性大腸菌株（ETEC）により引き起こされる（Gyles and Fairbrother, 2010, Escherichia coli. In: Pathogenesis of bacterial infections in animals, ed. Gyles CL, Prescott JF, Songer G, Thoen CO, 4th ed., pp 267-308. Blackwell Publishing, Ames, IA; Nagy et al., 1997, Microb Pathog 22:1-11）。病原性株のいくつかは、Stx2e遺伝子とエンテロトキシン遺伝子の両方を発現しており、それゆえ、同じ動物において浮腫病の症状と下痢の症状とが引き起こされ得るのかもしれない（STEC/ETEC）（Barth et al., 2007, Berl Munch Tierarztl Wochenschr 120:307-316）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
浮腫病及び／又は下痢性疾患の症状を伴う腸管細菌感染症のための、従来の治療的又は予防的な組成物及び方法の多くと関連する欠陥は、それらの低い信頼性又は有効性である。従って、浮腫病及び／又は下痢性疾患のための、改善された治療的又は予防的な組成物及び方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
非限定的な広範な一側面では、カナダ国際寄託当局（International Depositary Authority of Canada（IDAC））に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する、単離された大腸菌（Escherichia coli）株を提供する。
【０００６】
非限定的な別の広範な側面では、動物において病原性F18大腸菌（E. coli）腸管感染を予防するための方法であって、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する、生きたE. coli株の有効量を動物へと腸内デリバリーすることを含む、方法を提供する。
【０００７】
非限定的な別の広範な側面では、動物において病原性F18大腸菌（E. coli）感染により引き起こされる浮腫病又は下痢を予防するための方法であって、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する、生きたE. coli株の有効量を動物へと腸内デリバリーすることを含む、方法を提供する。
【０００８】
非限定的な一実施態様において、生きたE. coli株は凍結乾燥形態である。非限定的な別の実施態様において、生きたE. coli株は、食事上許容されるキャリア（feed acceptable carrier）と関連するものであり、例えば、生きたE. coli株は、食事上許容されるキャリアで希釈されてよく、該キャリアに組み込まれてよく、或いは該キャリアに懸濁されてよい。非限定的な別の実施態様において、生きたE. coli株は、凍結形態（frozen form）である。
【０００９】
本発明のこれら及び他の側面並びに特徴は、本発明の特定の実施態様に関する以下の説明を添付の図面とともにレビューすることにより、当業者に明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の実施態様の詳細な説明を、下記の添付の図面を参照して、本明細書において以下に提供する：
【００１１】
【図１】図1は、生きた非病原性F18株を可変的投与量に従って投与した後の非病原性F18株の糞便中排泄を、対数のコロニー形成単位（CFU）の平均のインバースlogとして示して例示する、非限定的なグラフである。
【図２】図2は、F18-STEC病原性チャレンジ株の糞便中排泄を例示する非限定的なグラフである：組み合わせ組成物で処置（treated）されている動物とコントロール動物との比較。
【図３】図3は、異なる腸セグメントにおけるF18-STEC病原性チャレンジ株によるコロニー形成（colonization）を例示する非限定的なグラフである：組み合わせ組成物で処置されている動物とコントロール動物との比較。
【図４】図4は、血清学的サンプルにおける、F18線毛に対するIgMの免疫学的検出を例示する非限定的なグラフである：組み合わせ組成物で処置されている動物とコントロール動物との比較。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
実施態様の詳細な説明
一般に、豚のSTEC及び多くの豚のETEC株は、F18デターミナント（determinant）を発現する。F18デターミナントは、腸の粘膜表面の細菌コロニー形成（colonization）を促進する線毛である（Fairbrother et al. 2006, Postweaning Escherichia coli diarrhea and edema disease. In: Diseases of swine, ed. Straw B, Zimmermann JJ, D’Allaire S, Taylor DJ, 9th ed., pp. 649-662. Blackwell Publishing, Ames, IA）。F18線毛は、小腸の腸細胞によってそれらの頂端部細胞膜上に暴露される腸細胞受容体、ECF18R受容体へのF18発現細菌細胞の付着を媒介すると考えられている（Vogeli et al. 1996, Anim Genet 27:321-328; Waddell et al. 1996, Infect Immun 64:1714-1719）。
【００１３】
いくつかの豚のSTEC及びSTEC/ETEC株は、F18線毛に加えて、他の細胞付着性（cytoadhesive）線毛又は線毛以外のアドヘシン（nonfimbrial adhesins）、特にF4若しくはF5線毛、又は「拡散付着に関与するアドヘシン（adhesin involved in diffuse adherence）」（AIDA）を発現し得る（Barth et al., 2007, Berl Munch Tierarztl Wochenschr 120:307-316; DebRoy et al. 2009, J Vet Diagn Invest 21:359-364; Fairbrother et al.,上記; Niewerth et al.: 2001, Clin Diagn Lab Immunol 8:143-149）。AIDAアドヘシンが、両方の病原体に頻発する一方、F4又はF5線毛は、これらの株では稀である。
【００１４】
ファームにおいて、イノシシ属の動物（swine）における離乳後下痢（PWD）及び浮腫病（ED）は、一般に、離乳後最初の2週間で生じ、PWDについては病原性F4又はF18腸管毒素原性E. coli（ETEC）株による感染と、EDについては病原性F18志賀毒素産生性E. coli（STEC）株による感染と関連する。両方の株について、線毛（すなわち、F4又はF18）は、小腸絨毛に位置する特異的受容体への細菌の付着と、それに続く該細菌の分裂及び腸のコロニー形成を可能にする。
【００１５】
PWDにおいて、F4受容体は、豚（pigs）の約30〜40％で発現し、F18受容体は豚の約70〜80％で検出される。病原体株は、LT、STa及びSTbなどのいくつかの毒素の組み合わせを産生する。ETEC-F4に感染した豚は、一般に、非常に高い罹患率、成長の遅れ、水様性及び噴出性（projectile）の下痢を示し、これにより、多くの場合、感染動物の死がもたらされる。
【００１６】
EDについて、F18受容体は、豚の約70〜80％で検出される。STECと関連する毒素はStx2eであり、これは、血管内皮細胞に作用し、浮腫とそれに続く神経学的兆候（運動失調、横臥（decumbency）を含む）をもたらし、最終的には、PWDについてと同様に、多くの場合、感染動物の死をもたらす、バソトキシン（vasotoxin）である。
【００１７】
本明細書で使用する場合、表現「F18 E. coli」又は「F18株」は、F18デターミナント（線毛）を発現するE. coli株に関する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、表現「F4 E. coli」又は「F4株」は、F4デターミナント（線毛）を発現するE. coli株に関する。
【００１９】
当業者ならば、本明細書に記載の非病原性F18株が、過度の努力なしに、その変異株又はバリアント株、本明細書に記載の株の特定できる特徴全てを有する株を得るために、操作されてよいことを理解するだろう。変異体又はバリアントを作製する方法は、当分野で一般的であり周知である。例えば、米国特許第7,371,558号（参照によりその全体が本明細書に援用される）は、「その変異体又はバリアント」を作製するためのいくつかの方法の要旨を開示する。放射線又は化学剤を用いて変異体を作製するための具体的な方法も当分野において、文書で十分に裏付けられている。例えば、Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass., or Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227 (1992)を参照されたい。その変異株又はバリアント株はまた、高ストリンジェンシー条件下、本明細書に記載の株のゲノムとハイブリダイズするゲノム又はその有意な部分を有するものとして同定されてもよい。当業者ならば、所与の株が「その変異体又はバリアント」であるかどうかを考慮するために、ゲノムの部分がどれほど有意でなければならないかを認識できるだろう。そのようなものとして、当業者ならば、本発明が、過度の努力なしに、かかるそのバリアント又は変異体を用いて実施されてよいことを合理的に予測するだろう。
【００２０】
本明細書で使用する場合、表現「有効量」は、組織、システム又は動物の所望の生物学的応答を引き出すであろう量に関する。本明細書に記載の生きたF18 E. coli株のかかる有効量は、例えば、腸管細菌感染を予防するため、細菌排泄物を最小限にするため、腸管細菌感染により引き起こされる疾患を予防するためなどに十分な量であり得るが、これらに限定されない。使用されるべき有効量は、いくつかの因子に応じて変動してよい。例えば、いくつかの因子は、動物の種類、動物の初期体重、動物の成長期、環境、生きた株と関連する食事上許容されるキャリア、すなわち、動物施設、生産のタイプ及び管理、施設の衛生状態、離乳又は孵化後の動物のストレス、使用される食事及びサプリメント、動物の健康及び合併症又は治療などから選択されてよい。例えば、有効量は、約5×106〜約3×1010 CFUの範囲内から選択される任意の量であり得るが、これらに限定されない。当業者ならば、過度の努力なしに、適した有効量を決定できるだろう。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語「動物」は、本発明に従って使用されるのに適した任意の若年又は成体の動物をいう。非限定的な一実施態様において、用語「動物」は、イノシシ属の動物（swine）をいう。非限定的な一実施態様において、用語「動物」は、豚（pig）をいう。非限定的な一実施態様において、豚は離乳前の豚である。非限定的な別の実施態様において、豚は離乳後の豚である。当業者ならば、過度の努力なしに、適した動物を決定できるだろう。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「腸内デリバリー（intestinal delivery）」は、株を最終的には消化管に、より好ましくは腸に到達可能な投与様式をいう。非限定的な一実施態様において、腸内デリバリーは、株の経口投与により実施される。非限定的な別の実施態様において、腸内デリバリーは、直腸投与により、例えば坐剤を介して実施される。当業者ならば、過度の努力なしに、適した投与様式を決定できるだろう。
【００２３】
本明細書で使用する場合、表現「食事上許容されるキャリア（feed acceptable carrier）」は、本明細書に記載の株と適合し、副作用なく動物に与えることができる任意のキャリア、希釈剤又は賦形剤をいう。当分野で公知の適した食事上許容されるキャリアは、水、食塩水（saline）、グルコース、デキストロース、緩衝溶液などを含むが、これらに限定されない。かかるキャリアは、有利には、株に対して非毒性であり、動物に対して害を及ぼさない。それはまた、生分解性であってもよい。キャリアは、固体又は液体の食事上許容されるキャリアであってよい。適した固体の食事上許容されるキャリアは、非毒性の摂取可能（ingestable）なキャリアである。例えば、この固体の食事上許容されるキャリアは、一般的な固体飼料であってよく、例えば、少量の例えば、フェザーミール、シーウィードミール、ボーンミール、ボーンフラワー（bone flour）、チョーク、塩、尿素及びビタミンなどと一緒に、シリアル製品（例えば、大麦の粗引き粉、ひき割りトウモロコシ又は小麦の飼料（feed）など）、ナッツ及びシード製品（例えば、樹皮を取り除いたピーナッツケーキ（decorticated ground nut cake）又はコットンシードケーキ、又は抽出されたコットンシードケーキなど）からなる典型的な動物食事成分などであってよく；又はそれは、栄養的価値のない不活性の固体の希釈剤又はキャリア、例えば、カオリン、タルク、炭酸カルシウム、フラー土、アタパルガスクレー（attapulgus clay）、粉砕（ground）オイスターシェル、又は粉砕ライムストーンなどであってよく；又はそれは、スターチ又はラクトースであってよい。別の特定の実施において、固体の食事上許容されるキャリアは、粉砕コーン、大豆ミール、ホエー、動物性脂肪などであってよい。適した液体の食事上許容されるキャリアは、例えば、水、及び好ましくは飲料水；ミルク、例えば、ホール又はスキムミルク；又は培養培地、例えば、トリプソンソイブロス（trypsone soy broth）（TSB）などである。当業者ならば、過度の努力なしに、適した食事上許容されるキャリアを決定できるだろう。
【００２４】
特許請求の範囲は、以下の実施例に記載の好ましい実施態様に限定されるべきでなく、全体として本説明と一致する最も広範な解釈を与えるべきである。
【実施例】
【００２５】
実施例1
a）非病原性F18 E. coli株
カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属するE. coli株は、Dr. J.M. Fairbrotherにより、Faculte de medicine veterinaire (FMV), Universite de Montreal (UdeM), Saint-Hyacinthe, Quebec, Canadaにおいて、大腸菌に関するOIEリファレンスラボラトリー（EcL）にて、1996年、豚の糞便から単離された。
【００２６】
株の同定は、APIシステムを用いて実施した。マスターシードに対するAPI 20Eコードは、5004552である。株のセロタイピングにより、O141:K94:H-のセロタイプが明らかとなった。
【００２７】
株のビロタイピング（virotyping）は、コロニーハイブリダイゼーション及び／又はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により実施した。ビロタイピングの結果より、株が、F18及びAIDAに対して陽性である一方、以下の毒素に対しては陰性であったことが示された：STa、STb、LT、EAST1、Stx1、Stx2、CNF、F4、F5、F6、F17、F41、P、AFA、Eae、Paa、Tsh、Aerobactin遺伝子。従って、この株は、非病原性E. coli株である。
【００２８】
株は、以下の抗菌剤：アモキシシリン、アンピシリン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、スルファクロルピリダジン、スルファジメトキシン、スルファチアゾール、チアムリン、チルミコシン、テトラサイクリン（クロル及びオキシ）及びタイロシンに耐性がある一方、以下の抗菌剤：アプラマイシン、セフチオフル、コリスチン（colistine）、ダノフロキサシン、エンロフロキサシン及びゲンタマイシンに感受性である。
【００２９】
b）非病原性F4 E. coli株
非病原性F4 E. coli株は、本明細書に記載の非病原性F18株と組み合わせて使用されてもよい。非限定的な一実施態様において、非病原性F4 E. coli株は、F4デターミナントを発現する任意の非病原性株である。非限定的な一実施態様において、非病原性F4 E. coli株は、組換え株、例えば、pMK005株（Kehoe et a;., J Bacteriol. 1983 Sep;155(3):1071-7）である。非限定的な別の実施態様において、非病原性F4 E. coli株は、天然の株、例えば、U.S. 7,981,411（その全体の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されるように、カナダ国際寄託当局に2005年1月21日に寄託され、アクセッション番号IDAC 210105-01に帰属する株である。
【００３０】
実施例2
広範な側面において、この研究の目的は、異なる経口用量の本明細書に記載の非病原性F18株が、その糞便中排泄及び抗F18全身性液性応答に及ぼす影響を評価することであった。
【００３１】
下表1は、一般に、研究スケジュールを要約する：
【００３２】
【表１】
0006278960.tif 000002
【００３３】
I - 研究デザイン
a）動物
50匹の哺乳（nursing）子豚の血液サンプルをF18受容体ステータス検出分析のために採取し、子豚に耳標をつけた。17〜20日齢の選択された離乳豚（オス及びメス）は、Monteregie, Quebec, Canadaに位置する地元ファームから購入した。動物を隔離施設に運んだ。選択したファームは、最近（6ヶ月未満）、豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）及び離乳後疾患エピソードを示さなかった。豚は健康な豚であり、4〜6 kgの体重であった。F18受容体ステータスに対して陽性である、全部で二十一（21）匹の豚を使用し、耳標番号を用いて、7匹の動物の三（3）つのグループにランダムに分けた（3つの異なるF18組成物用量）。離乳後2日目に、糞便サンプルを採取し、PCRを用いて、F4陽性及びF18陽性株を有する既存のコロニー形成（colonisation）を測定した。離乳後2日目において、F4陽性又はF18陽性細菌のいずれかに対して陽性である動物は見られなかった。
【００３４】
b）飼育及び給餌
処置（treatment）グループは、別々の部屋に置いた。動物は、研究の間、自由に水を飲み、1日に2回餌を与えられた。動物の食餌は、米国特許US 6,355,859（その全体の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されるような高大豆ミールから構成された。研究の間、いずれの併用薬物又はワクチン接種も投与しなかった。
【００３５】
c）株の調製及び投与
その最適収量を得るために非病原性F18株により必要とされる時間を評価するために、2つの増殖曲線を同じように作成した。ワーキングシード（WS）を用いて、F18組成物を調製するために使用される増殖曲線及び培養物を調製した。1ミリリットルのWSを用いて、動物由来の材料を含まないトリプティックソイブロス（TrypticSoy Broth）（500 mL）を接種した。培養物を撹拌（180 rpm）しながら37℃でおよそ6.5時間インキュベートした。生菌数測定を実施して、F18株培養物の収量を評価し、PCR反応を用いて、適切な株がアッセイの間に使用されたことを実証した。この結果に基づき、動物由来の材料を含まない滅菌TSBを用いて、培養物を調整して、試験されるべき用量を満たした：グループ1、5×108 CFU/用量；グループ2、1×109 CFU/用量；及びグループ3、5×109 CFU/用量。
【００３６】
九（9）つの用量の非病原性F18株組成物を、各組成について調製し、いずれかの組成物の喪失を補うために、子豚の数よりも2多く処置した。六（6）mLのF18組成物をすべての子豚に経口投与した。食道管を用いて、離乳後5日目にF18組成物を投与した。
【００３７】
II - 観察及び評価
a）全体的な健康
全体的な健康について1日に2回、子豚を観察した：挙動、脱水、食欲及び全身的な身体状態。移動及び毛の様子についても評価した。
【００３８】
b）下痢
糞便の硬さ（consistency）を以下のように毎日スコア化した：0、正常；1、ペースト状；2、液体が存在するが、液体よりも固体粒子の方が多い；3、固体粒子よりも多い液体の存在；及び4、全体的に液体。
【００３９】
c）投与された非病原性F18株の排泄
離乳後2日目及び5〜19日目に、各グループにおいて、投与された非病原性F18株の存在を評価するために、ルリア-ベルトーニ（Luria-Bertoni）（LB）ブロスで濃縮後、PCR（多重：LT、STa、STb及びF4；F18、Stx2e及びAIDA）により糞便を試験した。F18に対して陽性のサンプルは、投与された非病原性F18株に対して陽性と考えられた。離乳後5〜8、10、12、14、16、18及び19日目に、トリプティックソイアガーII（Tryptic Soy Agar II（TSA II） - 5％ヒツジ血液を用いて、糞便サンプルに対し生菌数測定を実施して、投与された非病原性F18株の、投与後に排泄されたレベルを評価した。典型的なE. coliの形態を有する溶血性コロニーのみをカウントした。
【００４０】
d）免疫評価
離乳後5、10、12、15及び19日目に血液サンプルを集めて、投与された非病原性F18株の投与量に従って最適な免疫応答をELISAにより評価した。
【００４１】
III - 剖検
a）剖検
最初の剖検は、ランダムに選択した2匹の動物に対して、ワクチン接種後3日目、離乳後8日目に実施し、全体的な異常を評価した。2回目の剖検は、残りの動物全てに対して、ワクチン接種後14日目である研究の最後に、すなわち離乳後19日目に実施した。
【００４２】
b）腸内容物の硬さ
腸内容物の硬さを、以下のように、空腸、回腸、盲腸、結腸及び直腸においてスコア化する：0、正常；1、ペースト状；2、液体が存在するが、液体よりも固体粒子の方が多い；3、固体粒子よりも多い液体の存在又は全体的に液体。
【００４３】
c）ワクチン株による回腸のコロニー形成（colonization）
回盲部に10 cm近い、回腸の2センチメートル部分をサンプリングした。TSA II - 5％ヒツジ血液を用いて生菌計数を実施し、ここでは、典型的なE. coliの形態を有する溶血性コロニーのみをカウントした。
【００４４】
IV - 結果
研究を通して、処置及びコントロール動物の両方においていずれの死亡も観察されなかった。選択した豚はすべて、PCR-RFLP方法により、F18受容体に対して陽性であった。一般に、研究にわたって子豚は健康であった。移動の低下を示した動物はごく少数しかおらず、これは、非病原性F18株の投与前であるか又は負傷に起因すると思われ、従って、非病原性F18の投与とは関連しなかった。
【００４５】
この研究の間、2以上のスコアは下痢とみなした。21匹の動物において、F18投与後に5匹が一過性の軽度の下痢を示した。1匹の動物（グループ3の豚5）は、2日連続で下痢（スコア3）をした（表2a、2b及び2c）。
【００４６】
PCRにより糞便サンプルを毎日試験して、F18投与株の存在を検出した；グループ2（1×109 CFU/用量）では、最も遅くてワクチン接種後11日目に、3匹の動物がF18投与株に対して陽性であり、ここで、グループ3（5×109 CFU/用量）は、ワクチン接種後10日目に1匹、8日目に1匹、7日目に3匹の子豚が陽性であった。グループ1（5×108 CFU/用量）については、ワクチン接種後8日目に1匹の子豚が非病原性F18投与株に対して陽性であり、ワクチン接種後7日目に1匹の子豚が、6日目に2匹の子豚が陽性であった（表2a、2b及び2c）。
【００４７】
【表２ａ】
0006278960.tif 000003
【００４８】
【表２ｂ】
0006278960.tif 000004
【００４９】
【表２ｃ】
0006278960.tif 000005
【００５０】
*1  糞便の硬さは以下のようにスコア化する：0、正常；1、ペースト状；2、液体が存在するが、液体よりも固体粒子の方が多い；3、固体粒子よりも多い液体の存在；及び4、全体的に液体；
*2  5日目：F18投与株の投与；
*3  下痢の期間（ワクチン接種後の期間；6〜19日目について、2以上のスコアを有する日数）；
*4  下痢の重症度（ワクチン接種後の期間；6〜19日目について、累積下痢スコア）；
*5  下痢スコアの中央値。
縦の太線は、F18（ワクチン株）がPCRにより検出された最後の日を示す。
ND：実施せず
E：空（empty）
D：死亡（剖検に供する）
【００５１】
また、非病原性F18投与株の糞便排泄を、5〜8、10、12、14、16、18及び19日目に糞便サンプルから細菌計数により評価した。図1は、投与後の株の排泄を示す。より低い用量（5×108 CFU）での排泄された細菌レベルは他の2つよりも劣っており、最も高い排泄は、1×109 CFUの用量で投与されたグループ2由来の動物で観察される。
【００５２】
内臓器官について全体的な異常は観察されなかった。腸内容物の硬さは、液体貯留について評価した。
【００５３】
この研究において、2以上のスコアを、剖検日における腸セグメントでの液体貯留とみなした。表3a、3b及び3cは、グループ1において1匹の動物が、液体貯留（スコア2）を有する2の連続セグメントを呈したことを示す。他の動物は液体貯留を示さなかった。
【００５４】
非病原性F18株の投与と関連する好ましくない事象は研究の間に観察されず、これにより、試験した投与量が一般に安全であったことが示される。
【００５５】
株の排泄評価に基づき、PCRと細菌計数の両方により、1×109 CFU/用量が、この株の長期にわたる糞便中排泄を得るために適した投与量であることが示唆された。両方の試験は、1×109 CFU/用量での非病原性F18株の投与が、試験した他の投与量よりも長期間排泄されることを実証した。
【００５６】
【表３ａ】
0006278960.tif 000006
【００５７】
【表３ｂ】
0006278960.tif 000007
【００５８】
【表３ｃ】
0006278960.tif 000008
【００５９】
*1  腸内容物の硬さは、空腸、回腸、盲腸、結腸及び直腸において以下のようにスコア化する：0、正常；1、ペースト状；2、液体が存在するが、液体よりも固体粒子の方が多い；3、固体粒子よりも多い液体の存在又は全体的に液体。
*2  腸における液体貯留の程度（2以上のスコアを有する腸セグメントの数）
*3  下痢の重症度（腸セグメントについて累積的な硬さ腸内容物スコア）
*4  腸内容物硬さスコアの中央値
ND：実施せず
【００６０】
実施例3
広範な側面において、この研究の目的は、本明細書の記載の非病原性F4及びF18 E. coli株を含む組み合わせ組成物（combined composition）の有効性を評価することであった。
【００６１】
下表4は、一般に、研究スケジュールを要約する：
【００６２】
【表４】
0006278960.tif 000009
【００６３】
I - 研究デザイン
a）動物
50匹の哺乳子豚の血液サンプルをF18受容体検出分析のために採取し、子豚に耳標をつけた。17〜21日齢の選択された離乳豚（オス及びメス）は、Monteregie area, Quebec, Canadaに位置する営利ファームから購入した。動物を隔離施設に運んだ。ファームは、最近（6ヶ月未満）、豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）及び離乳後疾患エピソードを示さなかった。豚は健康な豚であり、4〜6 kgの体重であった。
【００６４】
全部で二十（20）匹の豚を使用し、耳標番号を用いてランダムに分けた。ランダマイザーソフトウェアを用いて、20匹の動物を、10匹の動物の二（2）つのグループにランダムに分配した（コントロール及び投与グループ）。離乳後1日目に、糞便サンプルを採取し、PCR分析を用いて、ファームに由来する病原性F4-ETEC陽性株及びF18-ETEC/STEC陽性株を有する既存のコロニー形成を測定した。標的遺伝子は、STa、STb、LT、F4、Stx2及びF18である。離乳後1日目において、F4-ETEC又はF18-ETEC/STEC細菌のいずれかに対して陽性である動物は見られなかった。
【００６５】
b）飼育及び給餌
処置及びコントロールグループは、別々の部屋に置いた。動物は、研究の間、自由に水及び食餌を与えられた。動物の食餌は、US 6,355,859に記載されるような高大豆ミールから構成された。研究の間、いずれの併用薬物又はワクチン接種も投与しなかった。
【００６６】
c）株の調製及び投与
水で戻した（rehydrated）組み合わせ組成物を、最小で6-mL用量当たり5×108CFU/株を得るために希釈した。プラセボは、6 mLの滅菌水から構成された。組み合わせ組成物及びプラセボを、ゴム管を有するシリンジを用いて経口投与した。
【００６７】
d）チャレンジ株（F18-STEC EcL14724）の調製及び投与
このチャレンジ株は、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年7月9日に寄託され、アクセッション番号090713-01に帰属した。
【００６８】
子豚1匹当たり1×1011 CFUの感染用量を得るために培養物を調製した。10 mLの炭酸カルシウム1.2％（CaCO3）を投与後、五（5）mLのチャレンジ株を、食道管を用いて全ての子豚に経口投与した。チャレンジ株は、連続三（3）日間、すなわち、離乳後12日目、13日目及び14日目に、毎日1×1011 CFU/用量の濃度で投与した。
【００６９】
e）観察及び評価
全体的な健康について1日に2回、子豚を観察した：挙動、食欲、全身的な身体状態、移動及び毛の様子を評価した。脱水及び体温を1日に1回観察した。チャレンジ株の排泄をPCR及び生菌数測定（CFU）により評価した。特異的な酵素結合免疫吸着法（ELISA）を用いて血液サンプルを分析した。結果は、ポジティブコントロールに対する陽性パーセンテージ（PP％）として示した。
【００７０】
II - 剖検
チャレンジ株による回腸及び盲腸のコロニー形成を以下のように測定した。回盲部に10 cm近い、回腸の2センチメートル部分及び盲腸部分をサンプリングした。TSA II - 5％ヒツジ血液を用いて生菌計数を実施し、ここでは、37℃で12〜18時間インキュベーション後、典型的なE. coliの形態を有する溶血性コロニーのみをカウントした。
【００７１】
III - 結果
a）一般的な情報
試験した50匹の子豚から、30匹がF18株の付着を起こしやすく、20匹の動物を試験のためにランダムに選択した。一般に、子豚は、チャレンジ前に健康であった。 
【００７２】
下表5は、処置及びコントロール動物の糞便からの排泄されたチャレンジ株のPCR結果を示す：
【００７３】
【表５】
0006278960.tif 000010
【００７４】
表5で実証するように、組み合わせ組成物の投与は、プラセボを受けた豚と比較して、チャレンジ株の排泄を低下させた。プラセボ動物の半分超（56％）は、最終チャレンジから5日後（研究の終了）においても依然としてチャレンジ株を排泄していた一方、組み合わせ組成物で処置された動物においては、早くも最終チャレンジ4日後にチャレンジ株は検出されなかった。
【００７５】
図2は、処置及びコントロール動物の糞便からの、排泄されたチャレンジ株の生菌数（CFU）/gを示す。排泄されたチャンレジ株の濃度におけるピークは、処置及びコントロール動物の両方について離乳後14日目（チャレンジ後0日目）で見られる。処置動物では、糞便中のチャレンジ株の濃度は、最終チャレンジ後2日目（離乳後16日目）で減少し始め、最終チャレンジ後4及び5日目に、プラセボと比較して更なる減少が観察された。これらの結果はPCRの結果と一致する。より正確には、組み合わせ組成物の投与は、最終チャレンジ後5日目（研究の終了）において、チャレンジ株の排泄レベルを約2 log低下させた。
【００７６】
b）チャレンジ株による回腸及び盲腸のコロニー形成
処置及びプラセボ動物間の腸管コロニー形成の差が、両方の腸組織セグメント（回腸及び盲腸）で観察された。図3は、組み合わせ組成物の投与が、チャレンジ株による腸のコロニー形成を有意に低下させたことを実証する。より正確には、組み合わせ組成物の投与は、最終チャレンジ後5日目（研究の終了）において、回腸及び盲腸のチャレンジ株のコロニー形成を約2 log低下させた。
【００７７】
c）免疫応答の評価
F18線毛に対する全身性IgMの存在を、特異的なELISAを用いて血清サンプルにて評価した。組み合わせ組成物で処置した動物は、投与後7日目すぐに特異的な免疫応答を示した（図4）。
【００７８】
結果として生じる、チャレンジ株のコロニー形成の低下、排泄の低下、及び特異的な抗F18抗体の刺激に基づき、この研究により、本明細書に記載の非病原性F18株を含む組成物の腸内デリバリーが、F18 E. coli腸管細菌感染を予防できることが示唆される。
【００７９】
実施例4
広範な側面において、この研究の目的は、本明細書に記載の非病原性F18 E. coli株の有効性を評価することであった。
【００８０】
I - 研究デザイン
a）動物
動物を施設に入れる前に、10匹の同腹仔の10匹の哺乳子豚（全部で100匹の子豚）をDNA単離のために分娩ユニットにてサンプリングし、RFLP-PCR方法によりF18受容体（RF18+）ステータスについてスクリーニングした。三十（30）匹のRF18+子豚を同腹仔によりブロッキングすることによりグループ間にランダムに分配した（1：1の比率）（n＝6のブロックサイズの生成）。子豚は、以下のグループの1つに割り当てられた：非病原性F18試験株を投与されたT1（n＝15）；及びプラセボを投与されたT2（n＝15）。
【００８１】
チャレンジ段階まで、処置グループ（T1）の動物は、実験室の檻へと混合し、プラセボグループ（T2）の動物は別の実験室の檻へと混合した。チャレンジの日、すなわち、非病原性F18株又はプラセボの投与から11日後に、T1（n＝15）及びT2（n＝15）グループの動物を、チャレンジ前に、チャレンジ室に位置する2つの別個の檻へと移動させた。特定の処置グループの15匹の豚全てをそれぞれの檻へと混合した。ワクチン接種前に水を与えなかった期間を除いて、研究にわたって、動物は自由に水を飲む。動物は、1日に2回、薬の入っていない（non-medicated）高大豆ミール（U.S. 6,355,859）の食餌を与えられる。
【００８２】
離乳後1日目に、糞便サンプルを採取し、PCR分析を用いて、ファームに由来する病原性F4-ETEC陽性株及びF18-ETEC/STEC陽性株を有する既存のコロニー形成を測定した。標的遺伝子は、STa、STb、LT、F4、Stx2及びF18である。離乳後1日目において、F4-ETEC又はF18-ETEC/STEC細菌のいずれかに対して陽性である動物は見られなかった。T1グループの三（3）匹の動物を、動物保護の理由のために研究から取り下げた。これらの有害事象は、非病原性F18株の投与と関連しないものと考えられた。
【００８３】
下表6は、一般に、使用動物を要約する：
【００８４】
【表６】
0006278960.tif 000011
【００８５】
下表7は、一般に、研究デザインを要約する：
【００８６】
【表７】
0006278960.tif 000012
【００８７】
II - 手順及び評価
T1グループ及びT2グループの動物は、処置動物をプラセボコントロールとは別々に飼育する必要がある試験産物（すなわち、生きたワクチン）の特性に起因して、混合することができなかった。非病原性F18株及びプラセボ溶液は、動物段階に関与しない人により調製された。コード「A」及び「B」を非病原性F18株及びプラセボ溶液にランダムに割り当てた。部屋を、処置に対してランダムに割り当て、部屋1及び2として特定した。各部屋は、単一の檻に混合された全てのT1グループ又は全てのT2グループの動物を有した。動物段階に関与し、実験室の分析を行う人は、処置及び部屋の割り当てを見なかった。剖検段階について、剖検される動物の順序はランダムに割り当てられ、動物をA〜ADとして再度特定した。剖検を実施する人は、豚の同定及び処置を見なかった。ランダム化コードは、責任のある生物統計学者（biostatistician）により封をした封筒の中で保管された。
【００８８】
a）非病原性F18株の調製及び投与
非病原性F18株を発酵槽中で培養し、次いで、200の名目用量（nominal doses）を含む10 mLのガラスバイアル中、-78℃で細菌を凍結し、保存した。凍結した細菌は、使用前に室温にて水で希釈した。
【００８９】
離乳後1日目（0日目）にて、2-mLの用量当たりおよそ3×108 CFUにて、用量を1回投与した。ゴム管を備えるシリンジを用いて用量を経口投与した。コントロール動物は、同量のプラセボ溶液（水）を受けた。
【００９０】
b）チャレンジ株（F18-STEC株EcL 14724）
このアッセイで使用したチャレンジ株は、以前にEcL 14724株（Stx2、F18ab、AIDA及びPaaに対して陽性）でチャレンジされた子豚（#381）から再度単離された。チャレンジ株を、研究の11、12及び13日目の連続3日間、豚1匹当たりおよそ1×1010CFUにて1回経口投与した。各チャレンジ用量は、食道挿管の代わりとしてゼラチンカプセルを用いて投与した。志賀毒素の放出を誘発するために、チャレンジ株の投与直後に、カルバドックス（志賀毒素の放出を刺激する抗生物質）をゼラチンカプセルにて経口投与した。
【００９１】
c）全体的な健康の評価
全体的な健康について、チャレンジ期間の前に1日に1回豚を観察した。最初のチャレンジ後、減退（depression）、脱水、食欲を含む全体的な健康、及び浮腫病と関連するいずれかの臨床的兆候：運動失調、顔面又は手足の浮腫、突然死について、1日に2回動物をモニタリングした。
【００９２】
d）チャレンジ株の排出（shedding）の評価
チャレンジ株の糞便排出を、F18線毛のFedA主要タンパク質をコードする遺伝子を標的とする最確数-PCR（Most-Probable-Number PCR（MPN-PCR））方法を用いて定量化した。
【００９３】
e）剖検
最初のチャレンジ後7日目に剖検を実施した。チャレンジ株による盲腸のコロニー形成を、F18線毛のFedA主要タンパク質をコードする遺伝子を標的とする最確数-PCR方法を用いて、およそ2 cm2の組織部分を使用して定量化した。
【００９４】
III - 結果
PCR分析により、チャレンジF18志賀毒素産生病原性株の排泄を予防するための、非病原性F18株の投与の有効性が実証された。最後のチャレンジ後4日目に、プラセボ動物と比較して処置動物について約2.5 logの糞便排出の低下が観察された（表8）。最後のチャレンジ後4日目において、プラセボ動物の93％が、糞便サンプル1グラム当たり1×105 CFU超のチャレンジ株を排出した一方、処置動物でそうしたのはわずか42％であった（表9）。
【００９５】
下表8は、最後のチャレンジ後4日目におけるチャレンジ株の排出を示す：
【００９６】
【表８】
0006278960.tif 000013
【００９７】
下表9は、最後のチャレンジ後4日目における、異なる細菌負荷にてチャンレジ株を排出する豚の割合を示す：
【００９８】
【表９】
0006278960.tif 000014
【００９９】
最後のチャレンジ後5日目に、プラセボ動物と比較して処置動物（非病原性F18株を投与された）について、盲腸で検出されたチャレンジ株の約1 logの低下が観察された（表10）。最後のチャレンジ後5日目において、プラセボ動物の53％超が、盲腸組織1グラム当たり1×105 CFU超のチャレンジ株を排出した一方、処置動物でそうしたのはわずか8％であった（表11）。最後のチャレンジ後5日目において、処置動物の50％と比較して、プラセボ動物の80％超が、盲腸1グラム当たり1×104 CFU超のチャレンジ株により盲腸においてコロニー形成された（表11）。
【０１００】
下表10は、最後のチャレンジ後5日目における、チャレンジ株による盲腸のコロニー形成を示す：
【０１０１】
【表１０】
0006278960.tif 000015
【０１０２】
下表11は、最後のチャレンジ後5日目における、異なる細菌負荷にてチャンレジ株により盲腸がコロニー形成された豚の割合を示す：
【０１０３】
【表１１】
0006278960.tif 000016
【０１０４】
結果として生じる、チャレンジ株のコロニー形成の低下、及び排泄の低下に基づき、この研究により、非病原性F18株を含む組成物の腸内デリバリーが、F18 E. coli浮腫を引き起こす腸管細菌感染を予防できることが示唆される。
【０１０５】
以下の項は、本発明に従った、非限定的な実施態様例の更なる説明を提供する：
【０１０６】
項：
項1：カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する、単離されたE. coli株。
項2：凍結乾燥形態である、項1に記載の単離されたE. coli株。
項3：凍結形態である、項1に記載の単離されたE. coli株。
項4：株が食事上許容されるキャリアと関連する、項1に記載の単離されたE. coli株。
項5：項1〜3のいずれか一項に記載の単離されたE. coli株、及び食事上許容されるキャリアを含む、組成物。
項6：F4線毛を発現する単離された生きた非病原性E. coliをさらに含む、項5に記載の組成物。
項7：F4線毛を発現する前記非病原性E. coliが、カナダ国際寄託当局に2005年1月21日に寄託され、アクセッション番号IDAC 210105-01に帰属する株である、項6に記載の組成物。
項8：動物においてF18病原性E. coli腸管感染を予防するための方法であって、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する生きたE. coli株の有効量を動物へと腸内デリバリーすることを含む、方法。
項9：前記腸内デリバリーが、生きたE. coli株の経口投与により得られる、項8に記載の方法。
項10：前記生きたE. coli株が凍結乾燥形態である、項8又は9に記載の方法。
項11：前記生きたE. coli株が凍結形態である、項8又は9に記載の方法。
項12：前記生きたE. coli株が、食事上許容されるキャリアと関連する、項8又は9に記載の方法。
項13：前記有効量が、少なくとも5×107CFUのものである、項8〜12のいずれか一項に記載の方法。
項14：前記動物が豚である、項8〜12のいずれか一項に記載の方法。
項15：動物においてF18病原性E. coli感染により引き起こされる浮腫病又は下痢を予防するための方法であって、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する生きたE. coli株を動物へと腸内デリバリーすることを含む、方法。
項16：前記腸内デリバリーが、生きたE. coli株の経口投与により得られる、項15に記載の方法。
項17：前記生きたE. coli株が凍結乾燥形態である、項15又は16に記載の方法。
項18：前記生きたE. coli株が凍結形態である、項15又は16に記載の方法。
項19：前記生きたE. coli株が、食事上許容されるキャリアと関連する、項15又は16に記載の方法。
項20：前記有効量が、少なくとも5×107CFUのものである、項15〜19のいずれか一項に記載の方法。
項21：前記動物が豚である、項15〜20のいずれか一項に記載の方法。
項22：動物においてF18病原性E. coli腸管感染を予防するための、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する生きたE. coli株であって、動物における腸内デリバリーに適合した株の有効量の有効量の使用。
項23：動物におけるF18病原性E. coli腸管感染の予防に使用するための組成物であって、動物における腸内デリバリーに適合した組成物の製造における、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する生きたE. coli株の有効量の使用。
項24：動物においてF18病原性E. coli感染により引き起こされる浮腫病又は下痢を予防するための、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する生きたE. coli株であって、動物における腸内デリバリーに適合した株の有効量の有効量の使用。
項25：動物におけるF18病原性E. coli感染により引き起こされる浮腫病又は下痢の予防に使用するための組成物であって、動物における腸内デリバリーに適合した組成物の製造における、カナダ国際寄託当局（IDAC）に2013年6月20日に寄託され、アクセッション番号200613-01に帰属する生きたE. coli株の有効量の有効量の使用。
項26：前記生きたE. coli株が、経口投与に適合する、項22〜25のいずれか一項に記載の使用。
項27：前記生きたE. coli株が凍結乾燥形態である、項22〜26のいずれか一項に記載の使用。
項28：前記生きたE. coli株が凍結形態である、項22〜26のいずれか一項に記載の使用。
項29：前記生きたE. coli株が、食事上許容されるキャリアと関連する、項22〜26のいずれか一項に記載の使用。
項30：前記有効量が、少なくとも約5×107CFUのものである、項22〜29のいずれか一項に記載の使用。
項31：前記動物が豚である、項22〜30のいずれか一項に記載の使用。
項32：動物におけるF18病原性E. coli腸管感染の予防に使用するための、動物における腸内デリバリーに適合した、項1〜4のいずれか一項に記載の単離されたE. coli株。
項33：動物におけるF18病原性E. coli腸管感染の予防に使用するための組成物であって、動物における腸内デリバリーに適合した組成物の製造に使用するための、項1〜4のいずれか一項に記載の単離されたE. coli株。
項34：動物におけるF18病原性E. coli感染により引き起こされる浮腫病又は下痢の予防に使用するための、動物における腸内デリバリーに適合した、項1〜4のいずれか一項に記載の単離されたE. coli株。
項35：動物におけるF18病原性E. coli感染により引き起こされる浮腫病又は下痢の予防に使用するための組成物であって、動物における腸内デリバリーに適合した組成物の製造に使用するための、項1〜4のいずれか一項に記載の単離されたE. coli株。
【０１０７】
タイトル又はサブタイトルは、本発明にわたって読み手の便宜のためであってよく、本発明の範囲を決して限定すべきでないことに留意されたい。さらに、特定の理論が提案され、本明細書に開示される；しかしながら、それらが正しかろうと間違っていようと、本発明が、いずれかの特定の理論又は作用スキームに関係なく、本発明の開示に従って実施される限り、それらは本発明の範囲を決して限定すべきでない。
【０１０８】
本明細書にわたって、用語の前に使用される用語「一つの（a）」は、その用語が言及するものを1つ以上含む実施態様を包含することが当業者に理解されるだろう。また、本明細書にわたって、用語「含む（comprising）」は、「含む（including）」、「含む（containing）」又は「により特徴付けられる（characterized by）」と同義であり、これは包括的又はオープンエンドなものであって、記載されていない追加の要素又は方法の工程を排除するものではないことも当業者に理解されるだろう。
【０１０９】
特段定義されない限り、本明細書において使用される科学及び技術用語は全て、本発明が関連する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が統制する。
【０１１０】
本明細書に記載の研究は離乳豚を使用しているが、当業者ならば、処置される豚は、その代わりに、離乳前の豚であってよいことを容易に理解するだろう。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「約（around）、「約（about）」又は「およそ（approximately）」は、一般に、所与の値又は範囲の20パーセント以内、好ましくは10パーセント以内、より好ましくは5パーセント以内を意味するものとする。本明細書で与える数量は一般におよそである；用語「約（around）、「約（about）」又は「およそ（approximately）」は、明確に記載されていなければ、推測され得ることを意味する。
【０１１２】
本明細書にわたって引用される文献は全て、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１１３】
特許請求の範囲は、実施例に記載の好ましい実施態様に限定されるべきでなく、全体として本説明と一致する最も広範な解釈を与えるべきである。
【図１】
0006278960.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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