(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（ＩＥＫＭ）、配列番号２（ＶＥＫＦ）、配列番号３（ＩＥＫＩ）、配列番号４（ＩＱＫＩ）、配列番号５（ＩＫＫＷ）、配列番号６（ＩＫＫＶ）または配列番号７（ＩＫＫＬ）からなるテトラペプチドを含む、哺乳動物において皮膚の創傷の治癒または炎症性皮膚症状の処置に使用するための組成物。
【請求項２】
前記テトラペプチドが、Ｌ−およびＤ−アミノ酸エナンチオマーのいずれかもしくは両方を含むか、あるいは担体分子に結合されているか、アミド化されているか、または脂質付加されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記テトラペプチドのＣ末端が遊離酸形態であり、前記テトラペプチドのＮ末端が脂質付加されているか修飾されていない、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
製薬上許容可能な担体を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記テトラペプチドが０．１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、または０．１μｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
エアゾール、乳濁液、液体、ローション、溶液、ゲル、マイクロカプセル封入物、クリーム、ペースト、軟膏、粉末もしくは発泡体の形態であるか、または皮膚の表面もしくは皮膚組織下への適用のために適合されたデバイス中に組み入れられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記創傷が、擦過傷、水疱、熱傷、裂傷、潰瘍、打撲傷、発疹、皮膚伸展線条、瘢痕、伸展裂創、または加齢もしくは環境性曝露の作用、に起因するものであるか、あるいは前記炎症性症状が、乾癬、アトピー性皮膚炎、酒さ、脱毛、または懸垂繊維腫の除去、に起因するものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
スキンケア処置に用いるための請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
化粧品に用いるための請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
皮膚または関連粘膜組織の創傷または炎症性症状を処置するための医薬品の製造における、配列番号１（ＩＥＫＭ）、配列番号２（ＶＥＫＦ）、配列番号３（ＩＥＫＩ）、配列番号４（ＩＱＫＩ）、配列番号５（ＩＫＫＷ）、配列番号６（ＩＫＫＶ）または配列番号７（ＩＫＫＬ）からなるテトラペプチドの使用。
【請求項１１】
前記創傷が、擦過傷、水疱、熱傷、裂傷、潰瘍、打撲傷、発疹、皮膚伸展線条、瘢痕、伸展裂創、または加齢もしくは環境性曝露の作用、に起因するものであるか、あるいは前記炎症性症状が、乾癬、アトピー性皮膚炎、酒さ、脱毛、または懸垂繊維腫の除去、に起因するものである、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６１／８３５，４２４号（２０１３年６月１４日出願）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明は、生物学的、美容的および治療的活性を有するテトラペプチドに関する。特に、本発明は、いくつかのＣ−Ｘ−Ｃケモカインの保存領域に由来するテトラペプチドに関する。これらのペプチドは、細胞移動、血管形成を促進し、ＬＴＡなどの細菌細胞構成成分が誘発する炎症誘発シグナルを中和し、正常上皮皮膚代用物を刺激する活性を示している。本発明はさらに、創傷修復を促進し、皮膚およびその他の関連身体表面、例えば口腔に影響を及ぼす種々の傷害を処置するためにこれらのペプチドを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ケラチノサイトおよび皮膚内皮細胞は、皮膚創傷および潰瘍の治癒を調節する可溶性因子の主要供給源である。例えば増殖因子産生、血管形成応答、マクロファージ機能、コラーゲン蓄積、表皮バリア機能、ならびにケラチノサイトおよび繊維芽細胞移動および増殖を含む活性の減少による異常は、すべて不完全な創傷治癒の一因となる。増殖因子およびサイトカインは、創傷を処置するために臨床現場で用いられてきた。例としては、限定されないが、種々の創傷および多様な病因の慢性皮膚潰瘍、例えばヒドロキシ尿素関連下肢潰瘍（Ｓｔａｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）、静脈性下肢潰瘍（Ｄａ  Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）、異常ヘモグロビン症関連潰瘍（Ｖｏｓｋａｒｉｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）、および切断に起因する創傷（Ｇａｃｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）に罹患している患者における創傷治癒に及ぼす有益な作用を発揮することが示されているＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子（Ｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９９））およびＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）が挙げられる。さらにまた、皮膚病変を有するライ患者へのＧＭ−ＣＳＦの皮内投与は、創傷治癒の増強ならびにケラチノサイトの数および層の増大をもたらす（Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２；Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）。
【０００４】
増殖因子およびサイトカインはともに、タンパク質である。表皮創傷を処置するためのタンパク質療法の使用に伴う困難は、しばしば、関与するタンパク質のサイズが大きいことに関連する。天然タンパク質の複雑な構造および製造経費は、広範な臨床的使用を妨げている。製剤中のこのような天然タンパク質の安定性および相溶性も大きな懸念である。天然タンパク質が大型であるゆえの、皮膚の標的層に到達するのに不十分な浸透は、しばしば、その効力を低減し、タンパク質療法の有益な作用が不首尾に終わる原因となっている。これらの問題を克服するために、大型タンパク質の活性を保有する短いペプチドが、より低経費で、費用効果の高い生産、ならびに簡易な取り扱いおよび操作という必要性を満たすであろう。さらに、短い生物活性ペプチドは、プロテアーゼに対する低感受性のため、創傷組織によってより良好に吸収され保持される。短い生物活性ペプチドの吸収特質の利点によりまた、それらは、急性または慢性創傷の看護を越えた使用のための、例えば老化および日光曝露に関連した皮膚の問題の処置のための実行可能な選択肢となる。
【０００５】
ケモカインは、構造的に関連し、多様な生物学的活性を保有する８〜１５０ｋｄのタンパク質の大型スーパーファミリーである。それらは、通常は細胞刺激時に分泌されて、ホメオスタシス中の、ならびに炎症中の白血球動態を制御し、そして先天免疫および適応免疫間の連携のために必要である。接着分子、例えばインテグリンおよびセレクチンとともに、ケモカインおよびそれらの受容体は、標的組織の微小環境中への、およびその環境からの特定細胞型の選択的移動を助長する複雑な分子ネットワークの一部として主に作用する（Ｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。ケモカインは、好中球、マクロファージおよびリンパ球の領域特異的動員を選択的に媒介する。走化性因子であるほかに、ケモカインは、ホメオスタシスの保持、血管形成／血管新生抑制、細胞分化および活性化、創傷治癒、腫瘍増殖および転移、リンパ球ホーミングおよびリンパ系組織の発達においても重要な役割を果たし、ならびに免疫応答の全体的１型／２型平衡に影響を及ぼす（Ｂｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１２;Ｇｉｌｌｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００１;Ｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１;Ｒｏｍａｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，２００４;Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。
【０００６】
テトラシステインモチーフにより定義され、ケモカインはそれらのアミノ末端でのシステイン残基の立体配置により４つの異なるファミリーに細分される。２つの大きいサブファミリー、すなわちＣＣＬサブファミリー（ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８）およびＣＸＣＬサブファミリー（ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１６）、ならびに２つの小さいサブファミリー、すなわちＸＣＬサブファミリー（ＸＣＬ１〜ＸＣＬ２）およびＣＸ３ＣＬ１サブファミリー（Ｂａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３）が存在する。ケモカインのＣＸＣサブファミリーは、多様なプロセス、例えば炎症、創傷治癒、増殖調節、血管形成、および腫瘍形成において重要な役割を果たす（Ｋｅｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００８；２０１１）。多数のケモカインが、内皮細胞上および細胞外マトリクスのプロテオグリカンのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）部分と相互作用する（Ｈａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。硫酸ヘパリンのモデル化合物であるヘパリンは、身体中のほぼすべての細胞において発現される最も普遍的クラスのＧＡＧである。すべてのケモカインはヘパリンＧＡＧと相互作用する。
【０００７】
我々の研究において、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは二次構造が高度に保存されているがそれらの一次アミノ酸配列においていくつかの配列類似性を示す、ということに我々は注目した。９つのヒトＣ−Ｘ−Ｃケモカインの一次アミノ酸配列の試験は、「本発明の詳細な説明の第一段落」で以下で示される各ケモカインのＮＣＢＩ寄託番号を用いて、ＧＡＧ結合に関与するＣ末端部分に位置する高度保存領域を明示する。ＧＡＧ結合領域からテトラペプチドを生成し、生物活性を試験した。意外にも、テトラペプチドは多様な生物活性を示し、例えばケラチノサイト移動を促し、ヒト臍帯静脈内皮細胞における血管形成を誘導し、ＬＴＡ誘発性炎症誘発サイトカインを中和し、細胞増殖および増殖因子産生を調節することを示した。テトラペプチドは、種々の皮膚状態を改善するための薬品および化粧品として有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、哺乳動物における創傷治癒を促すために有用である短い生物活性ペプチドに関する。好ましくは単離ペプチドにより標的とされる創傷は、皮膚および関連粘膜表面に影響を及ぼすものである。いかなる特定の機序にも限定されないが、本発明のペプチドは、細胞移動および血管形成を刺激することにより創傷治癒をもたらし得る。本発明のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方のやり方で有用であり、ケラチノサイトにおける上記活性を誘導し得る。
【０００９】
本発明の一実施形態は、式（ＩまたはＶ）−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２（ここで、Ｘ１はＥ、ＱおよびＫから選択され得るし、Ｘ２はＭ、Ｆ、Ｉ、Ｗ、ＶおよびＬから選択され得る）の単離テトラペプチドに関する。単離ペプチドは、アミノ酸のＬまたはＤ−エナンチオマー型、あるいはその組合せを含有し得る。本発明のさらに別の実施形態によれば、単離ペプチドは、担体タンパク質と共役され、あるいはＣ末端アミド化または脂肪酸でのＮ末端アシル化（脂質付加）により修飾され得る。これらの付加は、皮膚およびその創傷に適用される場合、ペプチドの生物活性を増強する。
【００１０】
本発明のある好ましい実施形態によれば、単離ペプチドはすべて、位置３にリシンを含有する。単離ペプチドの具体的実施形態は配列番号１、２、３、４、５、６および７を含み、このすべてが、細胞移動に向かう刺激活性を示し、創傷修復をもたらす。
【００１１】
以下で示される得られたテトラペプチドは、式（ＩまたはＶ）−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２（ここで、Ｘ１はＥ、ＱおよびＫから選択され得るし、Ｘ２はＭ、Ｆ、Ｉ、Ｗ、ＶおよびＬから選択され得る）に適合する。
【表１】
0006416240.tif 000002
【００１２】
本発明の別の実施形態は、薬学的または美容的に許容可能な担体、ならびに上記ペプチドのうちの１つ以上を含有する治療用または美容用組成物に関する。上記の組成物は、哺乳動物の皮膚創傷を治癒する用途に用いるための医薬品または化粧品組成物の製造に有用である。このような組成物中のペプチドは、好ましくは約０．１μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ、または約０．１μｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度の範囲である。組成物の好ましい形態は、エアゾール、乳濁液、液体、溶液、ローション、クリーム、ペースト、軟膏、粉末、ゲルおよび発泡体である。
【００１３】
さらに、本発明のペプチドおよびそれらを含有する組成物は、一般的スキンケアおよび化粧品製剤、例えば種々の皮膚用化粧品、スキンクリーム、ローション、日焼け止め剤、およびレーザー手法後のケアのための抗ざ瘡製剤などの治療用ローションまたはクリーム中に包含するための有用な特徴を提供し得る。
【００１４】
本発明は、哺乳動物における創傷を治癒するための上記の組成物の使用方法にも関する。典型的には、処置方法は、有効量のペプチド含有組成物を創傷および／または炎症性症状、特に皮膚（表皮）および関連粘膜組織の創傷および／または炎症性症状に対して、有効な時間の間、投与することを伴う。このような創傷としては外科手術創傷、擦過傷、水疱、熱傷、裂傷、潰瘍、打撲傷、発疹、瘢痕、伸展裂創、ならびに加齢および環境性曝露の内在的および外在的作用による皮膚傷害が挙げられ、皺、皮膚のたるみおよび光傷害を含む。炎症性皮膚症状としては乾癬、アトピー性皮膚炎および酒さ、ならびに脱毛から生じる炎症が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の詳細な説明
ケモカインは、創傷治癒、炎症／抗炎症および血管形成／血管新生抑制活性を調節する。それらは、白血球上のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）クラスの受容体および標的組織における細胞表面グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合することにより、それらの機能を発揮する。ＧＡＧへのケモカインの結合は、ＧＡＧ上の負電荷鎖とケモカイン中の塩基性残基のクラスターとの相互作用により生成されるイオン力により媒介される（Ｈａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、状況はより複雑であり、ケモカインは固定化勾配または走触性勾配を生成することにより働き、これが、炎症の部位への細胞の移動を導くと考えられている（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，２００６）。ＧＡＧ−ケモカイン相互作用は細胞外マトリクスに沿った勾配の確立において極めて重要な役割を果たしており、ケモカインがそれらのＧタンパク質共役受容体へと結合することを助長し得る。ＧＡＧまたは硫酸ヘパリン（ＨＳ）プロテオグリカンは、シグナル伝達のための機能性ケモカイン共受容体としても振る舞い、ＧＡＧ／ケモカインとケモカイン受容体との三元複合体の形成をもたらし得る（Ｈａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。特定のケモカインについての研究により、ケモカインに対するＧＡＧの結合部位がマッピングされた。ＧＲＯ−アルファ前駆体（ＣＸＣＬ−１）、ケモカイン２前駆体（ＣＸＣＬ−２）、ケモカイン３前駆体（ＣＸＣＬ−３）、ケモカイン４前駆体（ＣＸＣＬ−４）、ケモカイン５前駆体（ＣＸＣＬ−５）、ケモカイン６前駆体（ＣＸＣＬ−６）、ＩＬ−８前駆体（ＣＸＣＬ８）、ケモカイン９前駆体（ＣＸＣＬ−９）、ケモカイン１１前駆体（ＣＸＣＬ−１１）を含む９つのヒトＣ−Ｘ−Ｃケモカイン前駆体タンパク質の保存ＧＡＧ結合部位の一次アミノ酸配列の詳細な試験において、特に興味深い保存テトラペプチド領域を見出した。この試験において定義された保存テトラペプチド範囲は、部分的ＧＡＧ結合領域内に位置する。以下は、選定したヒトＣ−Ｘ−Ｃケモカイン前駆体のＣ末端配列のアラインメントの模式図であり、保存された短テトラペプチドを強調している。アラインメントは、ＮＣＢＩのウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上の多重タンパク質配列アラインメントのためのＣＯＢＡＬＴプログラムを用いて生成される。アラインメント中の各ケモカインのＣ末端部分のみが示されており、数字は配列中の開始残基と終端残基である。Ａ．  ＧＲＯ−アルファ前駆体（ＮＣＢＩ寄託番号Ｐ０９３４１．１）；Ｂ．  ケモカイン２前駆体（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００２０８０．１）；Ｃ．  ケモカイン３前駆体（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００２０８１．２）；Ｄ．  ケモカイン４前駆体（ＮＣＢＩ寄託番号Ｐ８０１６２．４）；Ｅ．  ケモカイン５前駆体（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００２９８５．１）；Ｆ．  ケモカイン６前駆体（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００２９８４．１）；Ｇ．  ＩＬ−８前駆体（ＮＣＢＩ寄託番号）；Ｈ．  ケモカイン９前駆体（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００２４０７．１）；Ｉ．  ケモカイン１１前駆体（ＮＣＢＩ寄託番号ＥＡＸ０５７７４．１）。
【表２】
0006416240.tif 000003
【００１６】
アラインメントにおいて示されているのは、ＣＸＣケモカインの中でも高度に保存された短いテトラペプチドモチーフである。＊は、ケモカインの部分的ＧＡＧ結合部位を示す。テトラペプチドは保存された主鎖のＩ−Ｋ−を示す。バリン（Ｖ）を有するＩＬ−８を除いて、他はすべて、テトラペプチドモチーフの位置１にイソロイシン（Ｉ）を、位置３にリシン（Ｋ）を有する。したがって、（ＩまたはＶ）−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２式は、生成され表１に示されたテトラペプチドを表すために用いられ得る。ほとんどのＣＸＣケモカインは単量体および二量体として可逆的に存在するためケモカインのＧＡＧ結合領域は二量体形成にも関与し、したがって、動員プロフィールは単量体−二量体平衡定数によってだけでなく、単量体および二量体の好中球上の受容体との結合相互作用および細胞表面のＧＡＧとの結合相互作用ならびに標的組織中の間質空間によっても影響を及ぼされる、ということに注目する価値がある（Ｇａｎｇａｖａｒａｐｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。
【００１７】
以下で示される得られたテトラペプチドは、式Ｉ（Ｖ）−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２（ここで、Ｘ１はＥ、ＱおよびＫから選択され得るし、Ｘ２はＭ、Ｆ、Ｉ、Ｗ、ＶおよびＬから選択され得る）に適合する。
【表３】
0006416240.tif 000004
Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは、多数の細胞型に対するそれらの走化性活性に関してよく知られている。新規に得られたテトラペプチドがケラチノサイト移動を刺激する活性を保有するか否かを査定するために、配列番号１、２、３、４、５、６、７および８を、活性化合物がｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞移動および創傷閉鎖を誘導する能力を評価するために広く認められているアッセイである引掻き傷試験に付した。実験は、細胞増殖を抑止するために補足物の非存在下にて無血清ケラチノサイト増殖培地中で実施した。示した時間において創傷領域を位相差顕微鏡により調べた。表１に示されるように、テトラペプチドは引掻き傷閉鎖を有意に誘導する。２０μｇ／ｍｌでは、配列番号１、２、３、４、５、６および７により誘導される創傷閉鎖のパーセンテージは、ＰＢＳ処置を１００％として比較すると、１６５％〜２４０％の範囲である（表１）。無作為に生成されたペプチド配列番号８は、細胞移動および引掻き傷閉鎖を誘導しない。ペプチドが引掻き傷閉鎖に関して試験された濃度でケラチノサイトに対して毒性でないことを確認するために、すべてのペプチドをＭＴＴ細胞傷害性試験に付した。いずれのペプチドもｉｎ  ｖｉｔｒｏで５００ｕｇ／ｍｌまでの濃度において２４時間インキュベーション後に正常皮膚ケラチノサイトに対し細胞傷害性ではなかった。結論として、テトラペプチド配列番号１〜７による処置は、ＰＢＳ処置対照細胞の場合と比較した７時間処置後の創傷領域の閉鎖のパーセンテージにより示されるように、引掻き領域への正常ヒト表皮ケラチノサイト細胞の移動を有意に誘導した。
【００１８】
既存の血管網からの新規の毛細管の形成である血管形成は、創傷修復の必須ステップである。本発明で生成されるペプチドである配列番号１〜７は、毛細管形成も刺激する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ血管形成アッセイは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて、新規毛細管の形成をもたらす一連の事象を測定する。誘導時に、ＨＵＶＥＣは移動を経て整列され、次いで、個々の細胞から出芽する。出芽事象は新規の毛細管の形成をもたらし、これはさらに発達して閉鎖多角形を形成する。最後に複雑な網目様構造が創り出される。ヒトカテリシジンペプチドＬＬ−３７は、血管形成を促進する十分に研究された一例である。それは評価において陽性対照として用いられる。新規毛細管の出芽は、ＬＬ−３７での処置のちょうど３時間後に可視的になる（表２）。ＬＬ−３７で５時間処置後、閉鎖多角形が形成される。ＬＬ−３７と比較して、配列番号１、２、３、４、５、６および７は、ＨＵＶＥＣにおける類似の変化を誘導して、３および５時間処置で新規毛細管形成および複雑な多角形構造を生じた（表２）。これに対比して、無作為に生成したペプチド配列番号８（ＫＭＧ）およびＰＢＳは、血管形成活性がＬＬ−３７および本発明のペプチドに関して観察された時点でこのような変化を誘導しない（表２）。
【００１９】
グラム陽性細胞壁構成成分であるペプチドグリカン（ＰＧＮ）は、炎症誘発性サイトカイン発現を刺激することがよく知られている。リポタイコ酸（ＬＴＡ）はＰＧＮにおける重要な分子であり、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、ＩＬ−１ベータ、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−６上方調節を含む炎症誘発性シグナルの濃度依存的および時間依存的増大を引き起こす（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）。したがって、本発明のペプチドでＬＴＡを前処置し、次いで、ヒト皮膚ケラチノサイトとの接触時のＩＬ−６刺激活性を評価する。表３に示されるように、配列番号１、２、３、４、５、６および７によるＬＴＡの前処置は、ヒトケラチノサイト培養におけるＬＴＡ刺激性ＩＬ−６発現のレベルを有意に低減し、これらのペプチドが遊離ＬＴＡの毒性作用を中和し得ることを示唆している。テトラペプチドの正電荷残基が負電荷ＬＴＡに結合し、したがってＬＴＡとその受容体との相互作用を遮断する、ということは大いにあると思われる。これは、細菌細胞壁構成成分が炎症性皮膚症状、例えばざ瘡、酒さ、アトピー性皮膚炎等に関与しているので、重要である。
【００２０】
細胞増殖の調節は、創傷修復における別の重要なステップである。ヒト皮膚ケラチノサイトにおける増殖活性に関して、本発明のペプチドを試験した。引掻き試験で測定される走化性活性、血管形成およびＬＴＡ誘導性ＩＬ−６発現の遮断と比較して、本発明のペプチドは、ケラチノサイト増殖の調節において多様であるがわずかな活性を示した。配列番号１（ＨＢ２２３３）はケラチノサイト増殖における抑制活性を示したが、このような抑制活性は配列番号３（ＨＢ２２７０）に関しても観察された。配列番号６はケラチノサイト増殖を刺激するようであるが、このような活性はほんのわずかに過ぎない。ケラチノサイト増殖における抑制活性を見出したことにより、ＴＧＦ−β１発現を試験することにする。なぜならこの増殖因子は細胞増殖を抑制することが周知であるからである。表４に示されるように、配列番号１および３はともに、培養ケラチノサイトにおける中等度レベルのＴＧＦ−β１発現を誘導した。
【００２１】
ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｓｈｌａｎｄ  ＭＡ）により開発されたＳＯＲ−３００−ＦＴは、正常ヒト由来ケラチノサイトおよび乾癬性繊維芽細胞からなる高度に分化したｉｎ  ｖｉｔｒｏ乾癬組織である。形態学的には、この組織は均一厚を有し、増大したレベルの過増殖化細胞ならびに炎症誘発性マーカー、例えばソリアジン、エラフィン、ヒトベータ−デフェンシン−２、およびＬＬ−３７等を発現する（Ａｙｅｈｕｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。この組織の炎症誘発性症状により、本発明のペプチドを試験してそれらが炎症性応答を調節するか否かを見ることにする。組織モデルの高経費のため、代表的なペプチド配列番号１、ＨＢ２２３３を、ＳＯＲ−３００−ＦＴ組織モデルを用いた概念研究の実証として選択した。ＳＯＲ−３００−ＦＴ組織を、２００μｇ／ｍｌにて二重反復実験においてＨＢ２２３３で処置した。感染症状に関連する全体で１２の遺伝子マーカーを試験する。並行してカルシポトリオールでの試験を実行した。ｑＰＣＲ分析により、７２時間処置後に配列番号１（ＨＢ２２３３）が炎症化乾癬皮膚で過剰発現されるＬＬ−３７の発現レベル（３．７倍）を有意に下方調節する、ということが明らかになった（表５）。乾癬薬カルシポトリオールは、ＨＢＤ−２（９．０倍）およびソリアジン（２．３倍）を有意に下方調節する。ＨＢ２２３３およびカルシポトリオールはともに、乾癬皮膚におけるケラチノサイトの過増殖および早期成熟の原因であるＫｉ６７発現を下方調節する。さらに、配列番号１（ＨＢ２２３３）は、健常皮膚と比較して乾癬皮膚においてともに有意に上方調節されるＣＸＣＬ１（ＧＲＯアルファ）およびＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）発現も下方調節する（Ａｙｅｈｕｎｉｅ  Ｓ．，２０１２）が、カルシポトリオールは両遺伝子のレベルに影響を及ぼすようには見えない。これは、ＨＢ２２３３が、乾癬のような炎症性皮膚症状の処置のための一般的薬剤カルシポトリオールとは異なる機序により機能する、新規の治療薬であり得ることを明らかに示唆している。
【００２２】
同一ペプチドが健常皮膚組織に如何に影響を及ぼすかをよりよく理解するために、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｓｈｌａｎｄ  ＭＡ）から購入したＥＰＩＤＥＲＭ（商標）正常ヒト皮膚代替物を用いて、Ｓｕｎｎｙ  Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｓａｎｔａ  Ｐａｕｌａ，ＣＡ）により実施された遺伝子プロファイリング試験に配列番号、ＨＢ２２３３を用いた。２４時間の二重反復実験におけるペプチドまたは水対照での処置の前に、皮膚代替物を一晩平衡化させた。処置終了時にＲＮＡを抽出してＰＣＲアレイ分析に付した。表６に示されるように、配列番号１、ＨＢ２２３３は、ＥＣＭ合成に関与する遺伝子（コラーゲンおよびインテグリン）を刺激する。予測通り、それはケモカイン（ＣＸＣＬ１１およびＭＡＰＫ３等）および増殖因子（ＴＧＦ−β１およびＶＥＧＦ等）を調節する。遺伝子プロファイリング試験は、本発明のペプチドが細胞増殖、血管形成および創傷治癒活性を調節するというｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された活性を支持する。
【００２３】
本発明に含まれるペプチドはすべて、標準Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）固相化学を用いて合成した。ペプチドは、標準アミノ酸を用いて、アミド化または遊離酸配列として調製され得る。カルボキシ末端のアミド化は、遊離酸形態に比して、本発明のペプチドをプロテアーゼ分解に対して低感受性にさせて、かつそれらの可溶性を増大し、したがって強化された治療効力を提供し得る。ペプチドはＬ−またはＤ−アミノ酸エナンチオマーを含んでよく、１つのエナンチオマー型または両型の組合せの残基を含有し得る。ペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端の両方で修飾され得る。例えば、Ｎ末端の脂質付加またはアセチル化は、ペプチドの生物活性機能を変更することなく皮膚を横断するペプチド浸透を改善し得る、ということが考察されている（Ｓａｍａｈ，２０１１）。したがって、ペプチドはまた脂質付加され、これが皮膚浸透の増強を提供し得る。本発明の化合物のＣ１２〜１８脂質構成成分を提供するために用いられ得る飽和または不飽和脂肪酸の例としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリストオレイン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸およびリノール酸が挙げられる。ペプチドのカルボキシ末端は、酸性（−ＣＯＯＨ）またはアミド化（例えば、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲまたは−ＣＯＮＲ２）で修飾され得る。カルボキシ末端のアミド化は、遊離酸形態に比して、本発明のペプチドをプロテアーゼ分解に対して低感受性にさせて、かつそれらの極性を増大し、したがって強化された治療効力を提供し得る。また、典型的に修飾され得るペプチド官能基としては、ヒドロキシル、アミノ、グアニジニウム、カルボキシル、アミド、フェノール、イミダゾール環またはスルフヒドリルが挙げられる。
【００２４】
ペプチドはまた、可溶性または不溶性担体分子と共役されて、必要に応じてそれらの可溶性特性を修飾し、標的組織中のペプチドの局所濃度を増大し得る。可溶性担体分子の例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリビニルピロリドンのポリマーが挙げられ;不溶性ポリマーの例としては、限定されないが、シリケート、ポリスチレン、およびセルロースが挙げられる。ペプチドは、それらの安定性を増強するために、そして制御化放出のために、リポソーム技法を用いて、またはナノ技法を介して、マイクロカプセル封入され得る。上記のプロトコールに全般的に、ペプチドは、当業者に既知の任意の方法、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．８５：２１４９，１９６３）;Ｃａｒｐｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．５１：３７３２，１９８６）;Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．３８：１９０５，１９６６）;またはＫｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．［Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｏｎ  Ａｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｉｎ：ＰＥＰＴＩＤＥＳ  １９８４（Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ，ｅｄ．）Ａｌｍｑｖｉｓｔ  ａｎｄ  Ｗｉｋｓｅｌｌ  Ｉｎｔ．，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ（Ｓｗｅｄｅｎ），ｐｐ．１８５−１８８］（これらすべての記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に開示された方法を用いて生成され得る。
【００２５】
本発明は、例えば製剤における、または治療薬としての、上記のペプチドの使用方法に関する。これらの方法は、単一ペプチドの、または組み合わせた多数のペプチドの使用を包含し得る。ある場合には、本発明の組成物は、皮膚の上、中または下に置かれるデバイス内に配置され得る。このようなデバイスとしては、受動的または能動的放出機序により皮膚または毛包と接触するようなやり方で物質を放出する経皮パッチ、インプラント、および注入物が挙げられる。本明細書中に記載される方法においてペプチドを送達するために用いられる組成物は、エアゾール、乳濁液、液体、ローション、溶液、ゲル、マイクロカプセル封入物、クリーム、ペースト、軟膏、粉末、発泡体、またはその他の製薬上許容可能な製剤の形態であり得る。さらに、ペプチドは、より複雑でない製剤、例えば脱イオン水／蒸留水、ＰＢＳまたは標準医療用生理食塩溶液を用いて送達され得る。
【００２６】
製剤は、任意に美容的アピールを有し得るし、および／または他の作用物質、例えばレチノイド、ビタミンＣまたは本発明のペプチドの治療作用に関してアジュバントとして作用し得るその他のペプチドを含有し得る。感染を防ぎ、それにより最大治癒過程を生じさせるために、抗生物質も製剤に添加され得る。
【００２７】
製剤はプロテアーゼ阻害剤を含有し得る。プロテアーゼ阻害剤は、選択した生物活性ペプチドを分解すると予測されるプロテアーゼを特に標的とするために選択され得る。このような選択は、生物活性ペプチドの長さおよび／または配列に基づいて決定される。しかしながら、プロテアーゼ阻害剤は、必ずしもある特定の方法で選択される必要はない。例えば、２つ以上の阻害剤を含有するプロテアーゼ阻害剤カクテルが、本発明において用いられ得る。以下の型のプロテアーゼ阻害剤が本発明に組み入れられ得る:セリンプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、アスパルテートプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、チオールプロテアーゼ阻害剤およびトレオニンプロテアーゼ阻害剤。本発明に用いられるプロテアーゼ阻害剤は、ペプチドまたはタンパク質または化学薬品であり得る。このような阻害剤の非限定例は、セルピン、例えばアルファ−１−アンチトリプシン、補体１−阻害剤、アンチトロンビン、アルファ−１−アンチキモトリプシン、プラスミノーゲン活性剤阻害剤１、およびニューロセルピンであり、あるいは化学薬品、例えば、限定されないが、本発明のペプチドの治療作用のためのアジュバントとして作用し得るウルソール酸およびトラネキサム酸が挙げられる。
【００２８】
一般的に、製薬上許容可能な製剤は、ヒト皮膚に用いるのに適した任意の担体を含む。このような薬学的および美容的に許容可能な担体としては、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、シリカ、アルミナ、デンプン、ならびに等価の担体および希釈剤が挙げられる。製剤は、任意に美容的アピールを有してよく、および／または他の作用物質、例えばレチノイドまたは本発明のペプチドの治療作用に関してアジュバントとして作用し得るその他のペプチドを含有し得る。感染を防ぎ、それにより最大治癒過程を生じさせるために、抗生物質も製剤に添加され得る。組成物中のペプチドの濃度は、約０．１μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬまたは約０．１μｇ／ｍＬ〜約１０％であり得る。しかしながら、用いられる最終濃度は、創傷／組織症状の性質、本発明のペプチドの生物活性、ならびに増強された組成物吸収を得るための任意のアジュバントまたは技法の使用によって、これらの範囲外で変わり得る。ＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９２）は、スキンケア産業で一般に用いられる広範な種々の非限定的な美容的成分および薬学的成分を記載するが、これらは本発明の組成物中で用いるのに適している。これらの成分クラスの例としては、以下のものが挙げられる：研磨剤、吸収剤、審美的構成成分、例えば芳香剤、顔料、彩色剤／着色剤、精油、皮膚知覚剤、収斂剤等（例えば、クローブ油、メントール、カンファー、ユーカリ油、オイゲノール、乳酸メンチル、ハマメリス水）、抗ざ瘡剤、固化防止剤、消泡剤、抗菌剤（例えば、ヨードプロピルブチルカルバメート）、酸化防止剤、結合剤、生物学的添加物、緩衝剤、嵩高剤、キレート剤、化学的添加物、化粧品用殺生物剤、変性剤、薬物収斂剤、外用鎮痛剤、皮膜形成剤または材料、不透明剤、ｐＨ調節剤、噴射剤、還元剤、金属イオン封鎖剤、皮膚漂白剤および美白剤（例えば、ヒドロキノン、コウジ酸、アスコルビン酸、リン酸アスコルビルマグネシウム、アスコルビルグルコサミン）、皮膚状態調節剤（例えば、保湿剤）、皮膚平滑および／または治癒剤（例えば、パンテノールおよびその誘導体、アロエベラ、パントテン酸およびその誘導体、アラントイン、ビサボロール、およびグリシルリチン酸二カリウム）、皮膚処置剤、増粘剤、ならびにビタミンおよびその誘導体。
【００２９】
本発明のペプチドおよび関連組成物の投与は、ヒトおよび動物、例えばすべての哺乳動物に対してなされ得る。適用はまた、典型的および／または実験的材料、例えば組織移植片、皮膚代替物、組織培養生成物および創傷被覆材と組み合わせてなされ得る。例としては、限定されないが、ガーゼ（織物および不織物、含浸、非接着性、詰め物、創傷清拭材）；圧迫包帯およびシステム;創傷充填剤および洗浄剤；接触層;コラーゲン；羊膜；無細胞ヒト真皮;無細胞マトリクスおよび組合せ生成物;ならびに種々の一般的に用いられる包帯が挙げられる。
【００３０】
一般的に用いられる包帯の一覧表
【表４】
0006416240.tif 000005
【００３１】
概して、組成物は、局所的に、経口的に、経皮的に、全身的に、または標的組織に本発明のペプチドを送達するために有用であることが当業者に既知の任意のその他の方法により、投与され得る。組成物はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またはｅｘ  ｖｉｖｏで、例えば培養中で増殖する細胞または患者移植片に適用され得る。
【００３２】
本発明の組成物は、スキンケア活性を発揮する１つ以上の付加的作用物質を含有し得る。生物活性ペプチド構成成分のほかに、本発明は、その他の活性作用物質、例えばヒアルロン酸、ナイアシンアミド、フィタントリオール、ファルネソール、ビサボロール、サリチル酸、レチノール、レチノイン酸、アルファヒドロキシ酸、アスコルビン酸およびアルグロニック酸を含有し得る。ある付加的活性作用物質は生物活性ペプチド構成成分と相乗的に作用し、あるいは製剤の保存寿命を増強すると予測される。
【００３３】
さらに、アミノ酸に関する略語は、慣用的用法に従う：
【表５】
0006416240.tif 000006
【００３４】
医薬品の処方および投与のための技法に関する詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．）の最新版に見出され得る。局部局所送達が望ましいが、その他の送達手段、例えば経口、非経口、エアゾール、筋肉内、皮下、経皮、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内投与が存在する。本発明は、多数の担体ビヒクル中で、例えばスプレー;エアゾール、水および油型エマルジョン;油および水型エマルジョン;顔用クリームまたは身体用クリーム；日焼け用ローションまたは日焼け後ローション;あるいはその他の局所投与ビヒクル中で処方され得る。さらに、本発明のペプチド、およびそれらを含有する組成物は、全身スキンケアおよび美容用製剤、例えば種々の皮膚用化粧品、皮膚用クリーム、ローション、日焼け止め剤、ならびに治療用ローションまたはクリーム、例えば抗ざ瘡製剤中に含入するための有用な特徴を提供し得る。
【００３５】
適用領域
本発明のペプチドは、皮膚の創傷を治癒するために用いられ得る。皮膚および粘膜組織傷害は、表皮層が、例えば裂傷、熱傷または水疱により破損されると生じる。損傷は、押し潰しまたは打撲も伴い得るが、これらは表皮の併発性亀裂を伴わない組織傷害を包含する。皮膚感染ならびにある種の慢性疾病、例えば癌および自己免疫疾患も、表皮表面の犠牲を強要し得る。潰瘍、例えば糖尿病に影響を及ぼす潰瘍または褥瘡に関連する潰瘍は、別の型の皮膚傷害である。これらの創傷は、しばしば、全く難治性で、炎症化しており、感染傾向があり、かつ長い治癒過程を要する。潰瘍またはその他の型の慢性創傷の持続性は、血管形成に関する能力減損による治癒および新規血管生成に関与する細胞性過程の不全のためである。血管形成は、低酸素またはその他の刺激に応答した新規毛管網（微小血管）の形成の過程である（Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。この過程は、内皮増殖および新血管の出芽を誘導する低酸素内皮および支持周皮細胞の両方からの血管新生因子の局所分泌を伴う。不十分な血管形成は、創傷治癒減損および皮膚潰瘍の一因である（Ｇａｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。創傷治癒の不全は、一部には、創傷縁でのケラチノサイトが傷を閉鎖するかまたは被覆するために移動しないという事実のために、病変を上皮化することができない結果でもあり得る（Ｅｎｏｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒｉｃｅ，２００４）。皮膚および粘膜創傷の治癒は、一部は、基底ケラチノサイトの活性化により調整される。活性化時に、創傷周囲に配置されたケラチノサイトは移動して、上皮形成と呼ばれる過程において創傷の上に単一層を形成する。慢性創傷の非治癒縁でのケラチノサイトは過増殖性であるが非移動性であり、移動の欠如が上皮形成をできなくして慢性潰瘍の病因における重要な役割を果たしていることが示されている（Ｈａｒｓｈａ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。本発明は、皮膚および粘膜組織におけるケラチノサイトに関連した傷害を処置するためにも用いられ得る。「関連粘膜組織」という用語は、皮膚と同様に編成される任意の組織に関し、上皮細胞／ケラチノサイト、例えば、限定されないが、口、鼻、喉、耳、肛門、生殖器および眼の眼瞼結膜に関連した内張り表面を含有する。これらの組織に影響を及ぼし得る、そして本発明のペプチドでの処置を受けることができる創傷または病変／損傷の例は、擦過傷、水疱、熱傷、裂傷、穿刺、潰瘍、打撲傷、発疹および瘢痕である。術後傷も本ペプチドで処置され得る。
【００３６】
別の型の表皮傷害は潜在性で、長期間に亘って生じ、最終的には皮膚機能を低下させる、いわゆる老化皮膚である。皮膚老化を誘導する２つの主な過程が存在する。すなわち、太陽から保護された皮膚における内在的過程（経時的老化）と、太陽にさらされた領域における外在的過程（光老化）である。内在的老化は、遺伝的背景を反映し、時間に依存する。それとは関係なく、老化皮膚は以下のうちの１つ以上を共有する：皺、微細線、色素沈着過剰、紅斑、光輝、平滑性、堅固性、皮膚の色調明瞭性および平坦性の損失、ならびに孔外観の変更。これらの可視的徴候の根底にあるのは、遺伝的素因のほかに、紫外線（ＵＶ）および汚染などの環境的刺激の短期的または長期的曝露により誘導される種々の組織学的および細胞学的変化である。美容的問題、例えば皺、乾燥、痩せ、たるみおよびアザになり易さは、老化のほかに、紫外線および汚染のような傷害作因への長期曝露のために早期にも起こり得る表皮傷害の通常の外的徴候である。したがって、開示ペプチドは、内在的および外在的刺激の両方により引き起こされる皮膚老化に関連した問題に対して用いられて、傷害を防止および修復し、したがって健常皮膚組織を再生して老化の作用を逆転し得る。同様にして、ペプチドは、日光などの種々の外的作因への曝露により傷害された組織に適用され得るであろう。本発明は、より若い外観および肌理を供給するためにこれらの点で化粧品としても用いられ得る。短いペプチドは変更なくそれ自体で、または化学的修飾および／または特異的送達により、表皮を通して透過されて、皮膚を痩せさせ、皺を作り、脆くしかつ粗くするか／硬くする過程とは逆の過程に影響を及ぼし得る。ケラチノサイトは表皮表面の主要構成成分であり、老化および傷害された皮膚において減少するので、ペプチド刺激によるその補充は、上記の問題を逆方向に変えると予測される。
【００３７】
皮膚は相対的に弾性であるが、伸張するその能力には限界がある。伸展裂創または線条は、オフカラー色調を有する皮膚上の瘢痕の一形態である。それらは真皮の断裂により引き起こされ、これは経時的に縮小し得るが、完全に消失するわけではない。それらは先ず赤みを帯びたまたは紫色の線として現れるが、次第により薄い程度に弱まる傾向がある。伸展裂創は、しばしば、急速な成長または急速な体重減少に関連した皮膚の急速な伸張の結果である。伸展裂創は、顕著なまたは過剰な伸張または膨張を全く受けていない身体部位のどこにでも出現し得る。最も一般的な場所は、腹部、胸部、上腕、前腕、背部、大腿部、腰部、および臀部である。伸展裂創は、しばしば、生涯のいくつかの重要段階、例えば思春期および妊娠期間のホルモン変化により引き起こされるが、しかしコルチコステロイド処置、肥満、美容整形手術および集中的なボディビルが伸展裂創をもたらすことがある。コルチコステロイドの作用下では、ケラチノサイトおよび繊維芽細胞の両方の増殖は著しく損なわれ、その結果、コラーゲンＩおよびＩＩＩの合成ならびにフィブロネクチン合成も、正常皮膚と比較して９０％を上回る程度にまで著しく低減される（Ｒｏｇａｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。高用量コルチコステロイドおよび抗血管内皮増殖因子（抗血管形成）療法の組合せは線条状態を悪化し得るし、回避されるべきであることが示されている（Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。真皮／表皮区域におけるケラチノサイトの機能の修復および回復は、伸展裂創補正の鍵であり得るであろう。したがって、引掻き傷閉鎖を促して創傷治癒に不可欠な血管形成を刺激する本発明のペプチドは、伸展裂創の処置のために理想的である。
【００３８】
ケラチノサイトは抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）を産生し分泌するが、これらは内因性抗生物質として、ならびに皮膚自然免疫系内のシグナル伝達分子として機能する。ＡＭＰは宿主自然免疫防御系の重要構成成分であり、病原性微生物の防御および死滅の第一選択を提供する。さらに、それらは種々の機序により宿主炎症応答を調節および改変もする。しかしながら、これらのペプチドの異常発現は炎症性皮膚疾患の病因に関連付けられている。近年の研究はＬＬ−３７が乾癬および酒さの病因において重要な役割を果たし得ることを示唆している。
【００３９】
乾癬は、一般集団の約２％に影響を及ぼす慢性炎症性皮膚疾患である（Ｌｏｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。乾癬は、Ｔｈ１型Ｔ細胞および好中球の蓄積、ケラチノサイトの過増殖および分化、ならびにＡＭＰの表皮産生増強により特性化される。乾癬病変では、多数のＡＭＰ、例えばカテリシジン（ＬＬ−３７）、β−デフェンシン、Ｓ１００タンパク質、ケモカイン、ＲＮアーゼ７、リゾチーム、エラフィン、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン等が高度発現される。特に、カテリシジンＬＬ−３７は乾癬における炎症化皮膚で過剰発現され、死にかけている細胞から放出される細胞外自己ＤＮＡに結合して、自己ＤＮＡを形質細胞様樹状細胞の強力な刺激に転化させる（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。乾癬におけるＬＬ−３７の役割についての議論ではあるが、このペプチドが培養ケラチノサイトにおけるケラチノサイト増殖および炎症誘発性サイトカインの産生を誘導することは明白である。乾癬のほかに、ＬＬ−３７は、近年、全身性紅斑性狼瘡および関節リウマチ（ＲＡ）の発症と関連づけられている。ＬＬ−３７は、全身性紅斑性狼瘡患者の皮膚において高度発現される（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＲＡでは、好中性顆粒球が、細胞傷害性作因、ＡＭＰ、プロテアーゼおよびその他の炎症メディエーターを放出することにより、関節における炎症を促進して組織を傷害する。動物モデルでＬＬ−３７が健常関節と比較した場合、関節炎を有するラットからのＲＡ滑膜ならびに関節において強力に上方調節されることが示された（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＨＢ２２３３がＬＬ−３７ならびに炎症に密接に関連するいくつかの他の因子の発現を有意に下方調節するという観察は、本発明のペプチドが、炎症性症状、例えば、限定されないが、乾癬、全身性紅斑性狼瘡および関節リウマチに関する潜在的治療薬であり得るということを示唆する。
【００４０】
酒さは、成人の最も一般的な皮膚疾患の１つである。既知の臨床的トリガー因子、例えばＵＶ照射、熱、寒冷、ストレス、辛い食べ物、および微生物は、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達を調節し、活性酸素種を誘導し、ならびにＡＭＰおよび神経ペプチド産生を増強する、ということを最新概念は示唆している（Ｋｅｎｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｙａｍａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＬＬ−３７形態の過剰なカテリシジンが酒さにおいて報告されたが、これは、ＴＬＲによる自然免疫パターン認識の異常機能、およびｈＣＡＰ１８を切断するプロテアーゼに起因すると思われる（Ｙａｍａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；２０１１）。乾癬および全身性紅斑性狼瘡と同様に、酒さにおけるＬＬ−３７の過剰存在は、形質細胞様樹状細胞およびケラチノサイトの両方による自己核酸の認識を可能にし、これが炎症を悪化させ、したがって自己炎症性シグナル伝達を許すことにより疾患に寄与していると推測されている（Ｇｉｌｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８;Ｇａｎｇｕｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。本発明のペプチドによるＳＯＲ−３００−ＦＴ皮膚組織におけるＬＬ−３７の下方調節は、酒さにおけるＬＬ−３７関連炎症性症状を改善するための見込みのある且つ潜在的に有用な処置を支持する。
【００４１】
炎症性皮膚症状のほかに、高レベルのＬＬ−３７は、いくつかの侵攻性の固形腫瘍型にも関連する。ＬＬ−３７は、グリソン・スコアが増大するにつれてヒト前立腺腫瘍において、および骨転移において、漸進的に過剰発現されることが示された（Ｊｏｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。同様の臨床的観察は、卵巣癌（Ｃｏｆｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、乳癌（Ｈｅｉｌｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）および肺癌（ｖｏｎ  Ｈａｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）の癌腫でなされた。ＬＬ−３７は、普通は好中球プロテアーゼ３によりその前駆体であるヒトカテリシジン抗菌タンパク質−１８（ｈＣＡＰ−１８）から切断されて活性化されるようになるが、証拠は、癌細胞も酵素を産生して好中球とは関係なくそれらの分泌ｈＣＡＰ−１８をタンパク質分解的に切断する、ということを示唆している（Ｓφｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。これは、癌におけるＬＬ−３７のレベル増大を説明し得る。癌におけるＬＬ−３７の関与は依然として明らかにされていないが、増殖、血管形成、アポトーシスからの保護、および上皮−間葉転換を増大するＬＬ−３７の特性は、すべて、癌のホールマークとなり得るし、形質転換細胞／悪性細胞により利用されて腫瘍増殖および転移を助長し得る。本発明のペプチド、例えばＨＢ２２３３によるＬＬ−３７の下方調節は、ＬＬ−３７のレベルを低減するための有効な方法を提供し、したがって癌細胞伝播を防止し得る。癌薬剤と組み合わせると、潜在的利益はさらに増強され得る。
【００４２】
細菌による感染は敗血症を引き起こし、難治性低血圧症ならびに最終的には多臓器不全および死により特性化される敗血症性ショックをもたらし得る（Ｕｌｅｖｉｔｖｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。グラム陽性敗血症は、重要な臨床症状として認識されている（Ｕｌｅｖｉｔｖｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。その作因は、グラム陽性細菌の細胞壁構成成分、例えばペプチドグリカン（ＰＧＮ）およびリポタイコ酸（ＬＴＡ）である。敗血症性ショックのほかに、ＬＴＡは他の炎症性症状の作因でもある。アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、一般的慢性炎症性皮膚疾患である。ＡＤの病因は完全に理解されているわけではなく、カテリシジン（ＬＬ−３７）発現のレベルならびに湿疹の疾患重症度とのその関連は論争の的であった。ＡＤ患者はスタフィロコッカス皮膚感染に特に感受性であり、これは、彼らの皮膚症状の悪化に関連する。スタフィロコッカス細菌がＡＤを悪化させる機序は未だ明らかでないが、直接感染あるいはケラチノサイトまたは免疫細胞による細菌構成成分または破砕屑との相互作用に続くサイトカイン産生が、重要な役割を果たしていると思われる（Ｂｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。黄色ブドウ球菌感染は皮膚炎症に関する既知のトリガーであり、細菌による直接侵襲かまたは細菌生成物によって免疫応答を調節し得る。研究は、ＡＤ皮膚病変上の高レベルの黄色ブドウ球菌ＬＴＡを示している（Ｔｒａｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＡＤ病変由来の洗浄液は、ネズミ骨髄由来ＤＣによるＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、および腫瘍壊死因子−α産生を誘導することが見出されている（Ｔｒａｖｅｒｓ  ＪＢ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。本発明のペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏでスタフィロコッカスＬＴＡへの高レベルの結合を示し、このような活性は、感染中に放出されるグラム陰性細菌からのＬＴＡまたはＬＰＳの毒性作用を中和するための見込みのある処置、あるいは敗血症性ショックおよびＡＤ皮膚と関連する症状を改善するための抗生物質処置を提供し得る。
【００４３】
ケラチノサイトにおけるＴＧＦ−β（形質転換増殖因子ベータ）発現を調節する本発明のペプチドの可能性は、特に興味深い。ＴＧＦ−βは、細胞の増殖、分化、アポトーシス、マトリクスリモデリング、接着、侵襲および移動を調節する多面的サイトカイン／増殖因子である。一般的に、ＴＧＦ−β１は多数の異なる細胞型により産生され得る。ＴＧＦ−βアイソフォームはすべて、繊維芽細胞による細胞外マトリクスタンパク質の合成および代謝回転を刺激することが判明している。
【００４４】
毛包は皮膚の不可欠な構成成分であり、各毛は毛包の角質化産物である。各々およびすべての毛包は活動周期を経る：毛は最大長に成長し、次いで成長は止まり、毛は抜け落ちて置換される。毛成長周期の時期は、発育期（長期の成長）；退行期（成長から休止までの２〜４週間継続する移行期間）；休止期（２〜４週間継続する不活発期間）として記載されている。ヒトにおける直接的証拠は欠けているが、マウスでの試験は、ケラチノサイト増殖の抑制およびＴＧＦ−β１産生の誘導は退行期回帰と直接結びつけられることを示唆する（Ｆｏｉｔｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。単離し、臓器培養したラットおよびヒトの退行期毛包がＴＧＦ−β１により成長抑制される、というｉｎ  ｖｉｔｒｏ観察は、いくつかの局面において退行期様転換の早期段階と類似する。ケラチノサイト増殖およびＴＧＦ−β１発現の調節を抑制する配列番号１  ＨＢ２２３３の活性は、本発明のペプチドが望ましくない毛の脱毛のための有用な治療薬としての可能性を有することを示唆し得る。さらに、ＴＧＦ−βの上方調節は、ＭＩＴＦならびに白髪を生じるメラニン形成遺伝子の下方調節によるメラノサイト未熟とも関連付けられている（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。したがって、本発明のペプチドは、シミの色素脱失または美白のような用途のための大きな可能性も有する。
【００４５】
懸垂繊維腫（ＳＴ）、軟性繊維腫、繊維上皮性ポリープ、またはアクロコルドンはすべて、周囲皮膚から突出する皮膚の小部分からなる一般的良性皮膚症状を記載するための代替的用語である。組織学的には、ＳＴは、上に重なる軽度肥厚皮膚、軽度の慢性炎症を示す疎性浮腫性繊維血管性コアおよび神経のない真皮を有するポリープ状病変である。懸垂繊維腫は、皮膚の最も一般的な繊維性病変とみなされる。正確な病因は十分に理解されていないが、肥満症、真性糖尿病、摩擦、先端巨大症、臓器移植、ヒト乳頭腫ウィルスおよびその他の症状との関連が報告されている（Ｚａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。増殖因子およびホルモンならびにそれらの受容体は、懸垂繊維腫形成において重要な役割を果たすことが示唆されている（Ｓａｆｏｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ａｂ）。懸垂繊維腫が表皮ケラチノサイトおよび真皮繊維芽細胞増殖を刺激する因子により引き起こされるという事実は、細胞増殖を抑止する本発明のペプチドのような化合物が、懸垂繊維腫の進行を遅らせ形成を防止するために潜在的に有用であり得る。
【００４６】
本発明のある好ましい実施形態を示すために、以下の実施例が包含される。
実施例
【００４７】
実施例１：細胞移動および引掻き傷閉鎖を刺激するペプチドの同定
５ｎｇ／ｍｌのヒト組換え上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）を補足した無血清ケラチノサイト増殖培地中で、ヒト皮膚ケラチノサイト（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４０４）を増殖させた。細胞を１２−ウェルプレート上に植え付けて、１００％集密に到達させた。細胞単一層を２４時間飢餓状態にし、次いで、Ｐ２００（２００μｌ）ピペット先端を用いて引掻き傷を作った。引掻き傷を洗浄し、０時間目に写真撮影した。２０μｇ／ｍｌの最終濃度で、ペプチドを添加した。画像を室温で短時間撮影する際以外は、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で湿度＞９０％にてインキュベーター中に保持する。引掻き傷閉鎖は７〜８時間処置後に観察し、結果を表１に示す。
【表６】
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【００４８】
実施例２：正常ヒト皮膚ケラチノサイトにおける細胞傷害性
ペプチドが細胞に対して細胞傷害性でないことを確かめるために、正常ヒト表皮ケラチノサイトを９６−ウェルプレートに植え付けた。プレートを５％ＣＯ２の存在下で、３７℃でインキュベートして、細胞を＞９５％集密に増殖させた。ペプチドを、５０、１００、２００および５００μｇ／ｍｌの濃度でストック溶液中に希釈する。細胞培地を、種々の濃度でペプチドを含有する新鮮な培地と取り替えて、次に、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。処理終了時に、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）から購入したＭＴＴアッセイキットを用いて、細胞生存度を測定した。結果を表１に示す。５０〜５００μｇ／ｍｌの濃度では、ＭＴＴアッセイを用いて測定した場合、ペプチドは細胞生存度を変えない。
【００４９】
実施例３：血管形成を刺激するペプチドの同定
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入したｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成アッセイキット（Ｉｎ  Ｖｉｔｒａ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）を用いて、血管形成アッセイを実施した。要するに、メーカーの使用説明書に従って、ＥＣＭＡＴＲＩＸ（商標）溶液を用いてマトリクス層を調製した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、０．１ｍｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、３０ｕｇ／ｍｌのＥＣＧＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０％ウシ胎仔血清（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を補足した完全Ｆ１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で培養した。細胞を収集し、完全培地中に再懸濁した。ペプチドを、９６−ウェルプレート中で約５×１０３〜１×１０４細胞／ウェルで細胞と混合した後、重合ＥＣＭＡＴＲＩＸ（商標）溶液の表面に細胞を植え付けた。プレートを３０℃、５％ＣＯ２で９〜１２時間までの間インキュベートした。倒立光学顕微鏡下で管形成を定期的に検査し、３および５時間間隔で写真撮影して、以下に示すように各パターンに数値を割り当てた。
【表７】
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【００５０】
表２に示されるように、配列番号１〜７は、ヒト臍帯静脈内皮細胞における毛細管形成を有意に刺激する。予測通り、ＬＬ−３７は陽性対照として用いられ、血管形成も刺激する。ＰＢＳは陰性対照として用いられ、細胞は移動し始めて、集合して整列するが、５時間では出芽または形成された閉多角形は認められない。
【表８】
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【００５１】
実施例４：ＬＴＡ誘導性ＩＬ−６発現を遮断するためのペプチドの同定
ヒト表皮ケラチノサイトにおける黄色ブドウ球菌ＬＴＡ誘導性ＩＬ−６刺激。ヒトケラチノサイトを、無血清ケラチノサイト培地中で＞８０％集密に増殖させた。黄色ブドウ球菌ＬＴＡ  １０ｕｇ／ｍｌを、室温で３０分、各ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）とともに予備インキュベートし、次いで混合物をケラチノサイト培養に移した。処理は２４時間行った。上清を取り出した。考え得る細胞破砕屑を除去するために短時間スピン後、メーカーの使用説明書に従って、ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）から購入したＥＬＩＳＡキットを用いて、上清をＩＬ−６試験に付した。表３に示されるように、配列番号１〜７はＬＴＡの作用を明らかに中和し、または拮抗してヒト皮膚ケラチノサイトにおけるＩＬ−６発現を刺激する。
【表９】
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【００５２】
実施例５：ヒト皮膚ケラチノサイトにおける細胞増殖およびＴＧＦ−β発現を調節するためのペプチドの同定
５ｎｇ／ｍｌのヒト組換え上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）を補足した無血清ケラチノサイト増殖培地中で、正常ヒト皮膚ケラチノサイト（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４０４）を増殖させた。細胞を顕微鏡で毎日観察する。培養が５０〜７５％集密になったら、プレート中の培地を吸引し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを添加する。細胞が丸くなり剥がれるようになったら、新しい培地を添加することによりトリプシンを中和する。次いで、細胞を遠心分離し、ペレットを新しい培地中に再懸濁する。血球計算器を用いて細胞懸濁液を計数し、各ウェルに１００μｌの細胞懸濁液を添加することにより、細胞の総数を約５００〜１０００細胞／ウェルに調整する。典型的には、中央の６０ウェルを用い、外側のウェルには新しい培地を充填して蒸発を最小限にする。６〜８時間のインキュベーション後に各ウェル中に細胞が付着したら、ＰＢＳまたは２×所望濃度のペプチドを含有する新しい培地１００μｌを、三重反復で添加する。次に、マイクロプレートを、３７℃、５％ＣＯ２で４８〜７２時間インキュベートする。
【００５３】
インキュベーション終了時にメーカーの使用説明書に従って細胞をＣＹＴＯＳＣＡＮ（商標）ＳＲＢ細胞傷害性アッセイ（ＧＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に付す。要するに、細胞を固定した後スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）染色を施す。広範な洗浄の後、可溶化緩衝液を用いて染料を可溶化する。マイクロプレート読取器で５６５ｎｍでの吸光度を測定した。表５に示した結果は、三重反復処理の平均値であり、対照の±１０％を超える値は有意とみなした。
【００５４】
ＴＧＦ−β刺激はＳｕｎｎｙ  Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂ（Ｓａｎｔａ  Ｐａｕｌａ，ＣＡ）により実施された。要するに、正常新生児ヒト皮膚ケラチノサイトをｃｅｌｌｎＴｅｃケラチノサイト増殖培地（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で増殖させた。培地は、培地供給元に従ってＴＧＦ−βを含有しなかった。実験の当日に、増殖培地を再び新しくして、細胞を三重反復で７２時間、５０μｇ／ｍｌのペプチドで処理した。処理終了時に上清を取り出し、活性化し、ＬＥＧＥＮＤ  ＭＡＸＴＭ総ＴＧＦ−β１ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｍ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて定量した。
【表１０】
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【００５５】
実施例６：ＳＯＲ−３００−ＦＴヒト乾癬組織構築物に及ぼす代表的ペプチドの作用
ＳＯＲ−３００−ＦＴ（商標）組織を、０．９ｍｌのあらかじめ温めたアッセイ培地を含有する６−ウェルプレートに移し、標準培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）に１時間平衡化した。１時間平衡後、以下のように組織に新しい培地を再添加した：１）２４時間の時点に関しては、組織に０．９ｍｌの培地を添加し、２）＞２４時間の時点に関しては、細胞培養挿入物を洗浄装置（パート＃ＥＰＩ−ＷＳＨＲ、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の上部に載せることにより、５ｍｌの培地を組織に添加した。次に、５０μｌの試験品目を乾癬組織（ｎ＝３）に局所適用して、スポンサーにより選択された３つの濃度で、試験品目を培地に添加した。２４および４８時間時点で、ａ）組織を３００〜４００μＬのＰＢＳで３回、局所的にすすぎ、ｂ）組織を含有する挿入物を滅菌鉗子でしっかり保持し、ＰＢＳ中に挿入物を浸漬することにより試験品目を穏やかにすすぎ、挿入物から培地をデカントして、ｃ）すすぎおよびデカント直後に新しい試験品目を組織に再適用した（局所的に５０μｌ）。ｔ＝７２時間の時点で分析を実施した（３×反復適用）。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＴ２  第一標準キット（カタログ番号３３０４０１）を用いて、ｃＤＮＡを生成した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＴ２  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（カタログ番号３３０５０２）およびＱｉａｇｅｎ  ＲＴ２プライマーを用いて、相対的な遺伝子発現を測定した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸソフトウェアを用いて、解析を実行した。
【表１１】
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【００５６】
実施例７：正常ヒト皮膚代替物に関する遺伝子プロファイリング解析
細胞外マトリクスおよび接着分子をコードする８４の遺伝子を、Ｓｕｎｎｙ  Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｉｎｃ（Ｓａｎｔａ  Ｐａｕｌａ，ＣＡ）により実行されたＰＣＲアレイを用いて解析した。要するに、ＥＰＩＤＥＲＭ（商標）皮膚代替物（カタログ番号＃ＥＰＩ−２１２）をＭａｔＴｅｋ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）から入手し、メーカーの使用説明書に従って取り扱った。一晩の平衡化後、培地を交換して、ＨＢ２２３３（３３０ｕｇ／ｍｌ）または水対照を二重反復で皮膚組織の上部に適用し、２４時間処理させた。処理終了時に組織を収集してＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）中に保存した。ＲＮＡをＩｌｌｕｓｔｒａミニＲＮＡｓｐｉｎキット（カタログ番号＃９５０１７−４８９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で抽出して精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計で、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにて精製総ＲＮＡを評価した。試料を通してＲＮＡの濃度を一律にして、ＰＣＲアレイＰＡＨＳ−１２１Ａを１ｓｔ標準合成キット、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎマスターミックスおよびＰＣＲ実行条件（Ｑｉａｇｅｎから）とともに用いて、ＢｉｏＲａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍでリアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子の発現を測定した。効率比較Ｃｔ（ΔΔＣｔ）法を結果の定量のために用い、５つのハウスキーピング遺伝子に対する遺伝子発現の正規化後、ＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイデータ解析バージョン３．５ソフトウェアを用いて実行した。発現のレベルが合理的に高く（３０サイクル未満で検出）、かつ高低が各二重反復シリーズで１．５以上であった場合、遺伝子は示差的に発現したとみなされた。
【表１２】
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【００５７】
本明細書中に開示され、特許請求された組成物または方法はすべて、本発明の開示に鑑みて、過度の実験なしに製造され、遂行され得る。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱しない限り、本明細書中に記載される組成物および／または方法に、ならびに方法のステップまたはステップの順序において変更が適用され得ることは、当業者には明らかである。さらに具体的には、同一または類似の結果が達成される限り、化学的および生理学的の両方で関連するある作用物質が本明細書中に記載される作用物質と置き換えられ得ることは明らかである。当業者に明らかなこのような類似の代替物および修正は、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００５８】
本出願において同定される特許および出版物はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。
【００５９】
参考文献
【表１３】
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