(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織片の血液の量における時変による変化を測定する医療機器の作動方法であって、
照明する手段が、前記血液の瞬間モル濃度を有する、前記血液中の蛍光媒介を励起させる工程と、
取得する手段が、前記組織片を通過する前記血液の脈動流において、前記蛍光媒介によって放射される光を前記医療機器に設けられた受光部で受光することによって、時変の蛍光強度信号を取得する工程であって、
前記脈動流は、従来のフォトプレチスモグラフィのように拡張期と収縮期とを含み、
前記取得した蛍光強度信号は、拡張期の最低時における、前記組織片の前記血液中の前記蛍光媒介によって放射される第１の蛍光強度を含み、
前記取得した蛍光強度信号は、収縮期の最高時における、前記組織片の前記血液中の前記蛍光媒介によって放射される第２の蛍光強度を含み、
前記第１及び第２の蛍光強度は、前記拡張期及び前記収縮期中の血液量の測定にそれぞれ関連付けられる、工程と、
導出する手段が、前記第１及び第２の蛍光強度に基づいて、前記組織片の総血液量レイヤの厚みの変化を導出する工程と、を含むことを特徴とする医療機器の作動方法。
【請求項２】
取得する手段が、血管へ適量の前記蛍光媒介が投与された前記組織片の血管造影画像のシーケンスを取得する工程を含む蛍光画像化プロトコルをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の医療機器の作動方法。
【請求項３】
前記蛍光媒介はＩＣＧであるか又はＩＣＧを含むことを特徴とする請求項２に記載の医療機器の作動方法。
【請求項４】
前記ＩＣＧは、２５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬまでの間の濃度で投与されることを特徴とする請求項３に記載の医療機器の作動方法。
【請求項５】
前記血管造影画像は、毎秒２０フレームから３０フレームのフレームレートで取得されることを特徴とする請求項２に記載の医療機器の作動方法。
【請求項６】
前記血管造影画像は、近赤外蛍光画像化システムによって取得されることを特徴とする請求項２に記載の医療機器の作動方法。
【請求項７】
前記近赤外蛍光画像化システムは、ＩＣＧの励起用のレーザと、前記ＩＣＧによって放射される蛍光の画像を捉えるためのカメラと、を備えることを特徴とする請求項６に記載の医療機器の作動方法。
【請求項８】
前記蛍光強度は、前記蛍光媒介の濃度の増加に従った蛍光消光に起因して減少することを特徴とする請求項１に記載の医療機器の作動方法。
【請求項９】
組織片を通過する絶対血流を定量化する医療機器の作動方法であって、
取得する手段が、血管へ適量の蛍光媒介が投与された前記組織片の血管造影画像のシーケンスを取得する工程と、
算出する手段が、前記組織片の血管造影画像の前記シーケンスに対する平均蛍光強度を算出する工程と、
生成する手段が、時変平均蛍光強度のレプリゼンテーションを生成する工程と
を含むことを特徴とする医療機器の作動方法。
【請求項１０】
前記蛍光媒介は、インドシアニン・グリーン（ＩＣＧ）であるか又はＩＣＧを含むことを特徴とする請求項９に記載の医療機器の作動方法。
【請求項１１】
前記ＩＣＧは、２５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬまでの間の濃度で投与されることを特徴とする請求項１０に記載の医療機器の作動方法。
【請求項１２】
前記組織片は皮膚組織を備えることを特徴とする請求項９に記載の医療機器の作動方法。
【請求項１３】
前記血管造影画像は、毎秒２０フレームから３０フレームのフレームレートで取得されることを特徴とする請求項９に記載の医療機器の作動方法。
【請求項１４】
前記血管造影画像は、近赤外蛍光画像化システムによって取得されることを特徴とする請求項９に記載の医療機器の作動方法。
【請求項１５】
前記近赤外蛍光画像化システムは、前記蛍光媒介の励起用のレーザと、前記蛍光媒介によって放射される蛍光の画像を捉えるためのカメラと、を備えることを特徴とする請求項１４に記載の医療機器の作動方法。
【請求項１６】
前記蛍光強度は、前記蛍光媒介の濃度の増加に従った蛍光消光に起因して減少することを特徴とする請求項９に記載の医療機器の作動方法。
【請求項１７】
組織片の血液の量における時変による変化を測定する医療機器であって、
前記血液の瞬間モル濃度を有する、前記血液中の蛍光媒介を励起させるべく、照明する手段と、
前記組織片を通過する前記血液の脈動流において、前記蛍光媒介によって放射される光を前記医療機器に設けられた受光部で受光することによって、時変の蛍光強度信号を取得する手段であって、
前記脈動流は、従来のフォトプレチスモグラフィのように拡張期と収縮期とを含み、
前記取得した蛍光強度信号は、拡張期の最低時における、前記組織片の前記血液中の前記蛍光媒介によって放射される第１の蛍光強度を含み、
前記取得した蛍光強度信号は、収縮期の最高時における、前記組織片の前記血液中の前記蛍光媒介によって放射される第２の蛍光強度を含み、
前記第１及び第２の蛍光強度は、前記拡張期及び前記収縮期中の血液量の測定にそれぞれ関連付けられる、手段と、
前記第１及び第２の蛍光強度に基づいて、前記組織片の総血液量レイヤの厚みの変化を導出する手段と
を備えることを特徴とする医療機器。
【請求項１８】
組織片を通過する絶対血流を定量化する医療機器であって、
前記組織片を供給する血管へ適量の蛍光媒介が投与された前記組織片の血管造影画像のシーケンスを取得する手段と、
前記組織片の血管造影画像の前記シーケンスに対する平均蛍光強度を算出する手段と、
時変平均蛍光強度のレプリゼンテーションを生成する手段と
を備えることを特徴とする医療機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、組織の血液かん流の光学評価の分野に関連し、特に、組織の絶対血液かん流の定量的評価に関連する。
【背景技術】
【０００２】
組織（例えば、皮膚）の血液かん流の評価の定量化は、多くの外科及び非外科の専門にわたる応用において、臨床の中で急成長する関心事であり続けている。単一のバイナリ評価（フロー対非フロー）はいくつかの臨床応用については十分であるかもしれないが、いくつかの基準に関連する定量化が多くの他の臨床応用について必要とされる。ますます、絶対的な定量化（例えば、流れの測定として量／時間）が注目の対象となっている。しかしながら、組織の絶対血液かん流の定量的評価は、臨床評価のツールとして、理解しにくいものである。
【０００３】
フォトプレチスモグラフィ（ＰＰＧ）は微小血管内の血液量の変化を検出するために使用される光学技術である。ＰＰＧでの観測波形は心拍と相関し、ＰＰＧベース技術は、酸素飽和度、血圧、及び心拍出量などのパラメータを測定するための商業的に利用可能な医療デバイスで展開されている。
【０００４】
ＰＰＧ検出に基づいた医療デバイスの比較的広範囲での展開にも関わらず、ＰＰＧは組織の血液かん流の絶対測定のルーチン決定を容易にするために有効に利用されていない。
【０００５】
量／時間／領域の範囲を有する組織の血液かん流の測定におけるルーチン取得を可能とするため、そのような性能での手法は臨床医への有意義な値となるであろう。そのような範囲を有する測定のみが、有効な、直接のサイト間及び被験者間の比較を許容する。したがって、組織における絶対血液かん流の定量的評価に対する方法及びシステムが必要とされる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第一の形態によれば、例えば皮膚組織などの注目組織の血管を通過する総血流を決定する方法を提供する。本方法は、組織片端部の断面積を測定する工程と、血液量レイヤの厚みの増加を測定する工程と、パルスデューティサイクルを決定する工程と、単一の血圧パルスの継続期間を決定する工程と、Ｆ＝（Ａ）（ΔＬ）（ＰＤＣ）／Δｔの式で総血流Ｆを導出する工程とを含む。上記式のＦにおいて、ΔＶ＝（組織片端部の断面積Ａ）×（血液量レイヤＬの厚みの増加ΔＬ）であり、ＰＤＣはパルスデューティサイクルであり、Δｔは単一の血圧パルスの継続時間である。
【０００７】
他の形態において、本方法は、前記注目組織領域を供給する前記血管へ適量の蛍光染料を投与する工程と、前記注目組織領域の血管造影画像のシーケンスを取得する工程とを含む蛍光画像化プロトコルを含む。他の形態において、前記蛍光染料はＩＣＧであり、２５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬまでの間の濃度で投与される。さらに他の形態において、前記血管造影画像は、毎秒２０フレームから３０フレームのフレームレートで取得され、そのような画像は、近赤外蛍光画像化システムによって取得される。種々の形態において、近赤外蛍光画像化システムは、前記ＩＣＧの励起用のレーザと、前記ＩＣＧによって放射される前記蛍光の画像を捉えるためのカメラと、を備える。
【０００８】
本発明の他の形態によれば、組織片を通過する絶対血流を定量化する方法を提供する。本方法は、前記組織片を供給する前記血管へ適量の蛍光染料を投与する工程と、前記組織片の血管造影画像のシーケンスを取得する工程と、前記組織片の血管造影画像の前記シーケンスに対する平均蛍光強度を算出する工程と、時変平均蛍光強度のプロットを生成する工程とを含む。種々の形態において、前記蛍光染料は、インドシアニン・グリーン（ＩＣＧ）であり、前記ＩＣＧは、２５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬまでの間の濃度で投与され、前記組織片は皮膚組織を備える。種々の他の形態において、前記血管造影画像は、毎秒２０フレームから３０フレームのフレームレートで取得され、前記血管造影画像は、近赤外蛍光画像化システムによって取得される。種々の形態において、前記近赤外蛍光画像化システムは、前記ＩＣＧの励起用のレーザと、前記ＩＣＧによって放射される前記蛍光の画像を捉えるためのカメラと、を備える。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
添付の図面は本発明の種々の実施形態を示す。
【図１】従来のフォトプレチスモグラフィ（ＰＰＧ）を用いて単一の血圧パルス中の指先の血液量の総計を測定する様子を示す図である。
【図２】本実施形態に係る、蛍光強度の変化を検出することによって、表面領域Ａを有する組織の容積（一片）における時間経過による血液量の変化を測定するために、蛍光媒介フォトプレチスモグラフィ（ＦＭ−ＰＰＧ）の使用を示す図である。
【図３】血管を通過するインドシアニン・グリーン（ＩＣＧ）の移動中におけるＩＣＧ濃度と、蛍光強度との間の時間経過による変化の関係を概略的に示す図である。
【図４】０．０３ｍｇ／ｍｌ濃度のＩＣＧ溶液を含む毛細血管の蛍光画像と、毛細血管の直径と蛍光強度との線形関係の結果のグラフとを示す図である。
【図５】ＩＣＧ溶液の肘脈への注入後に続いて、人の前腕皮膚の領域から放射される時変平均蛍光強度のプロットを示す図である。
【図６】肘脈の厚みの関数として、０．０３ｍｇ／ｍｌ濃度のＩＣＧ溶液を含む毛細血管から放射される蛍光強度のプロットに従ったＰＰＧの一連の流れを示す図である。
【図７】モル濃度の関数として血中のＩＣＧによって放射される約８５０ｎｍ及び９００ｎｍを中心とした波長帯域の強度における比率の関係を示す図である。
【図８】本発明のＦＭ−ＰＰＧ手法を実行するための、一実施形態に係る光学コンポーネントの構成を備える画像化システムの例示を示す図である。
【図９】本明細書に含まれる本発明の所定の動作例示から時変平均強度グラフのセグメントを示す図である。
【図１０】エタノール中のＩＣＧに対して構成される２波長レシオメトリックキャリブレーション曲線上のサンプル厚みの結果を示す図である。
【図１１】人の血液中のＩＣＧに対して構成される２波長レシオメトリックキャリブレーション曲線上のサンプル厚みの結果を示す図である。
【図１２】５つのデータポイントから補間されたキャリブレーション曲線を示す図である。
【図１３】人の血液中のＩＣＧに対するベレジン実験データを示す図である。
【図１４】（図１３から）人の血液中のＩＣＧに対するベレジン実験データとともに、（図１２から）本発明のＦＭ−ＰＰＧの例示の方法及びシステムを用いて生成されたデータの比較を示す図である。
【図１５】赤毛猿の目からの検証データ、特に、各シーケンスの分析に対する、画像輝度（トータル強度）対画像番号の時間プロットを示す図である。
【図１６】赤毛猿の目からの検証データ、特に、画像４９０−５６５に対して生成されたプロットを示し、２つの連続した血流パルス間の谷部が選択され（シーケンス）、表が各パルスにおける算出した血液量と平均流量とを示す図である。
【図１７】赤毛猿の目からの検証データと関連して第２の血管造影のシーケンスを示す図である。
【図１８】画像３００−３８１に対して生成されたプロットを示し、５つの連続する血流パルス間の谷部が選択され（シーケンス）、表が各パルスにおける算出した血液量と平均流量とを示す図である。
【図１９】赤毛猿の目からの検証データと関連して第３の血管造影のシーケンスを示す図である。
【図２０】画像２６０−２９０に対して生成されたプロットを示し、２つの連続する血流パルス間の谷部が選択され（シーケンス）、表が各パルスにおける算出した血液量と平均流量とを示す図である。
【図２１】明細書で説明するように、Ａｉｍ及びＢｉｌｌによって使用される、人の目の血管造影からの画像（図２１Ａ）と、複数のサルの１匹の左目から平坦にマウントした脈絡の血管造影にボックスを重ねるように表現した網膜領域（図２１Ｂ）とである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下では、本発明の種々の実施例及び実施形態や、変形例について、添付の図面に示される例示について詳細に説明する。
【００１１】
従来のフォトプレチスモグラフィ（ＰＰＧ）は、組織（一般的には、指先）を通じて送信される近赤外光の量の変化、光路における血液量の増大や光吸収量の増大を検出することによって、組織片における血液量の時変の相対変化を測定している。単一の血圧パルス中における総指先血液量の従来のＰＰＧ測定を示す図１に示すように、血管内圧のパルス拡張中では、指先の血管における総量が最も小さく、収縮中では、総量が最も多い。
【００１２】
これに対して、本発明の種々の形態によれば、蛍光媒介フォトプレチスモグラフィ（ＦＭ−ＰＰＧ）は、組織の塊（例えば、皮膚）から放射された近赤外光の量の変化を検出することによって、組織塊（組織片）の血液量の時変の相対変化を測定する。ＦＭ−ＰＰＧにおいて、種々の実施形態によれば、蛍光強度は、血液内に存在する蛍光染料（例えば、インドシアニン・グリーン（ＩＣＧ）染料）の総量に直接的に比例し、これにより、血液量を測定する。種々の実施形態において、組織の絶対血流の定量化に対するＦＭ−ＰＰＧの実装は、血管造影シーケンスにおいて１つの画像（又は複数の画像）の取得中における、対象の循環血液での蛍光染料の重量モル濃度の決定を可能にする。
【００１３】
種々の実施形態によれば、ＦＭ−ＰＰＧ及び投与した蛍光染料の所定の特性、例えば、濃度蛍光消光と、濃度及び２波長レシオメトリックの蛍光測定の線形関係などは、量／時間／領域の絶対項で、組織（例えば、皮膚）における血流の決定を行うことができる。種々の実施形態において、本発明の方法及びシステムは、組織（例えば、皮膚及び２つの眼底）領域の幅サイズの範囲、例えば、約１ｃｍ２より小さく約１／４ｍ２までのサイズ範囲にわたって適用されうる。
【００１４】
種々の実施形態において、適切な蛍光染料は、蛍光染料が蛍光を発するのに十分な量の光エネルギにさらされた場合に蛍光を発する毒性のない染料を含む。種々の実施形態において、染料は、放射エネルギの適切な波長が適用された際に蛍光が検出されるように、適切な濃度で投与されうる。所定の実施形態において、染料は、赤外線スペクトルの光を放射する蛍光染料である。所定の実施形態において、染料は、インドシアニン・グリーン（ＩＣＧ）などのトリカルボシアニン色素である。他の実施形態において、染料は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オルトフタルアルデヒド、フルオレスカミン、ローズベンガル、トリパンブルー、フルオロゴールド、又はそれらの組み合わせから選択される。上記染料は、所定の実施形態においいて、混合又は結合されてもよい。いくつかの実施形態において、染料の類似物が使用されてもよい。染料の類似物は、化学的に改良された染料を含むものの、適切な波長の放射エネルギにさらされた場合に蛍光を発する能力を維持するものである。
【００１５】
いくつかの実施形態において、染料は、対象（哺乳類）に対して、例えばボーラス注入のように、画像化のための適切な濃度で静脈内へ投与される。種々の実施形態において、染料は静脈又は動脈へ注入される。複数の染料が使用される実施形態において、それらは、同時に例えば単回ボーラスで、又は、連続して例えば個別の複数のボーラスで投与されうる。いくつかの実施形態において、染料は、カテーテルによって投与されうる。種々の実施形態において、染料は、凍結乾燥粉末又は凍結乾燥固体として提供されてもよい。所定の実施形態において、消毒済みの注射器で適切な濃度に再構成することを許容するように、小瓶、例えば消毒した小瓶で提供されてもよい。適切なキャリア又は希釈剤を用いて再構成されうる。キャリア及び希釈剤の例示は以下に記載する。染料は、投与の直前に例えば水で再構成されてもよい。
【００１６】
所定の実施形態において、染料は、画像を取得する前の１時間未満に対象へ投与されてもよい。いくつかの実施形態において、染料は、画像を取得する前の３０分未満に対象へ投与されてもよい。さらに他の実施形態において、染料は、画像を取得する前の少なくとも３０秒前に投与されてもよい。さらに他の実施形態において、染料は、画像を取得するのと同時に投与されてもよい。
【００１７】
種々の実施形態において、溶液中で染料を維持する希釈剤又はキャリアが使用されてもよい。例示として、染料がＩＣＧである所定の実施形態において、染料は、水で再構成されてもよい。染料がＩＣＧである他の実施形態において、染料はアルコール、例えば、エチルアルコールで再構成されてもよい。いくつかの実施形態において、染料が再構成されるとすぐに、追加の希釈剤やキャリアと混合されてもよい。いくつかの実施形態において、染料は、溶解度を高めるか、又は、安定度を高めるために、他の分子、例えば、プロテイン、ペプチド、アミノ酸、合成高分子、又は、糖類などに結像されてもよい。所定の実施形態で使用されうる希釈剤及びキャリアの追加の例示は、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎｓ、リポソーム、アミノ酸、レシチン、硫酸ドデシル、リン脂質、デオキシコール酸塩、大豆油、植物油、サフラワー油、ごま油、ピーナッツ油、綿実油、ソルビトール、アカシア、モノステアリン酸アルミニウム、ポリオキシエチレン脂肪酸、及びそれらの混合物を含む。Ｔｒｉｓ、ＨＣ１、ＮａＯＨ、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳを含む追加の緩衝剤が選択的に追加されてもよい。
【００１８】
種々の実施形態によれば、ＦＭ−ＰＰＧは、蛍光染料（例えばＩＣＧ）の対象への投与に続いて、組織片から放射される近赤外蛍光の量の変化を検出することによって、組織の塊（一片）の血液量の時間変化を測定する。蛍光強度は、血液に含まれる蛍光染料（例えば、ＩＣＧ）の総量に比例する。
【００１９】
図２Ａに示される皮膚組織（組織の一片）の矩形量内において、個別のＩＣＧで満たされた血管セグメントが図２Ｂに概略的に表され、血管セグメントは脈圧拡張期（左）と、収縮期のピーク（右）とで示される。（断面積Ａをそれぞれが有する）各組織片の表面の矢印は拡張期から収縮期へ血圧が上昇するにつれて、個別の血管セグメントの直径が増加した際に、発生するＩＣＧ蛍光強度の増加を示す。図２Ｃは、個別の血管セグメントの総量が単一の立方体の体積によって表されることを除いて、図２Ｂで示される幾何学的関係を示す。さらに、拡張期圧と収縮期圧との間に発生する血液量増加の最大量がΔＶで示される。
【００２０】
単一の脈圧振動中における矩形組織片を通過する血流の総量は、パルス曲線下で当該領域に比例する。脈圧が矩形波であれば、単一のパルス中における総流量はΔＶとなる。しかしながら、実際のパルス曲線下で当該領域が矩形波領域の一部であれば、脈圧曲線は矩形波でない。
【００２１】
したがって、仮のパルスデューティサイクル（ＰＤＣ）が実際のパルス曲線下での領域によって占有される矩形波下の領域の一部として定義されてもよい。よって、１脈圧サイクル中の組織片を通過する実際の血流Ｆは、
Ｆ＝（ΔＶ）（ＰＤＣ）／Δｔ、ここで、
ΔＶ＝（組織片端部の断面積Ａ）×（血液量レイヤＬの厚みの増加ΔＬ）であり、
Δｔ＝単一の脈圧の継続時間であり、
したがって、Ｆ＝（Ａ）（ΔＬ）（ＰＤＣ）／Δｔ（１）となる。
【００２２】
絶対値がＡ、ＰＤＣ、Δｔに対して決定されうるものの、規定通りにΔＬを決定する臨床的に許容可能な方法はこれまで実証されていない。ΔＬが長さ／時間の単位で定量的に決定されうる例示のアルゴリズムの形態について以下で説明する。
【００２３】
一実施形態において、蛍光染料（例えば、ＩＣＧ）によって表示される濃度依存の蛍光消光が、ΔＬが長さ／時間の単位で定量的に決定されうる方法を提供する。
【００２４】
濃度依存の蛍光消光は溶液中の所定の染料によって現れる現象であり、溶液から放射される蛍光強度は、さらなる濃度の増加が蛍光減少をもたらすポイントに到達するまで、染料濃度に沿って増加する。例えば、血液中のＩＣＧに関し、最大蛍光は、０．０２５ｍｇ／ｍｌで発生する（Flower, R. W.及びHochheimer, B. F.：”眼血管における指標染料濃度の定量化（Quantification of Indicator Dye Concentration in Ocular Blood Vessels）”Exp. Eye Res., Vol. 25: 103, Aug. 1977を参照）。当該濃度の上下では、血管を通過するＩＣＧの移動中にＩＣＧ濃度と蛍光強度の時変関係を概略的に示す図３Ａに示すように、蛍光減少がかなり激しく発生している。図３Ｂは、血管内の固定位置における、血管を通過するＩＣＧ染料ボーラスの移動中のＩＣＧ濃度（実線曲線）と蛍光強度（点線曲線）との間の時変関係を概略的に示す。
【００２５】
図３は、図３Ａ及び図３Ｂの両方において染料濃度が０．０２５ｍｇ／ｍｌでの複数のポイントを示し、当該ポイントは、濃度が大きく増大し蛍光消光が起こるポイントである（例えば、この例では、約１０に増大したポイント）。図３Ｂは、ＩＣＧボーラスが血管を移動し、染料濃度が増加し（実線曲線）、ＩＣＧ蛍光もまた増加し（点線）、染料濃度が０．０２５ｍｇ／ｍｌｌに到達した際に（左側矢印）最大強度に到達することを示す。さらに濃度が増大し、濃度の蛍光消光に起因して蛍光強度が減少し、濃度がその最大（本例では約０．２５０）に到達した際に最小強度に到達する（真ん中矢印）。その後、濃度が減少し、再び０．０２５ｍｇ／ｍｌの最大レベルに到達するまで蛍光強度が増大し（右側矢印）、その後、濃度が継続して減少し、蛍光強度も再び減少し始める。
【００２６】
種々の実施形態において、十分に高濃度で完全な量のＩＣＧボーラスの移動中に発生する同等の最大蛍光強度の特徴のあるダブルピークは、図２Ｃに示されるように、絶対項で、血液量の厚みΔＬの増加を決定することを許容する。ピークが０．０２５ｍｇ／ｍｌの濃度で発生し、何れかのピークが発生する正確な時間に既知の領域（Ａ）から放射される蛍光強度が決定されうるため、照明及び倍率について同一の条件下で同一の蛍光強度を発光する０．０２５ｍｇ／ｍｌのＩＣＧを含む血液のレイヤの厚みもまた、経験的に決定されうる。
【００２７】
例えば、ダブルピークの蛍光強度が取得された高速の血管造影画像を取得するために使用される、同一の光学デバイスと蛍光励起照明とを用いて、蛍光画像は、例えば図４に示されるように、０．０２５ｍｇ／ｍｌのＩＣＧ／エタノール溶液で満たされた微細なテーパー状の毛細血管から成る蛍光画像が取得される。当該画像（図４Ａ）から、毛細血管の直径ΔＬと蛍光強度との間の線形関係のグラフが生成される（図４Ｂ）。
【００２８】
ｍｌ／ｓｅｃを単位として、領域Ａ下に位置する皮膚組織の一片を通過する絶対血液量を解くことを可能にする方程式Ｆ＝（Ａ×ΔＬ）／Δｔの全ての項において絶対値が現在知られている。したがって、本実施形態は、これまで臨床医に利用可能でなかった、組織の一片における血流（例えば皮膚の血流）の絶対定量化における方法を示す。
【００２９】
他の実施形態において、５０ｍｇ／ｍｌの含水ＩＣＧ染料における０．４０ｍｌの急速な肘脈注入に続き、直後に、急速な５．０ｍｌの等張生理食塩水洗浄を行い、人体内側の前腕皮膚における２５０ｍｍ２の領域の高空間解像度の血管造影画像が、２３／ｓｅｃのレート（速度）で取得された。血管造影シーケンスにおける個々の画像が、フレーム間での腕の動きを除くために再登録され、それらの画像のそれぞれから、組織領域における平均蛍光強度が各画像に対して計算された。
【００３０】
それらのデータは、その後、時変の平均蛍光強度のプロットを生成するために使用され、その一部（およそ画像番号１００を中心としたもの）が図５に示される。
【００３１】
高周波”ＰＰＧ”の振動が、２５０ｍｍ２の表面領域下での皮膚組織の一片の中に含まれる総血管容量の染料注入に関連する蛍光強度曲線の低周波成分上に乗ってはっきりと見える。図６に示すように、画像番号１００を中心とした３つのＰＰＧ振動（及び４つ目の一部）が図４Ｂからの毛細血管の直径対蛍光データのグラフの横に対比するように並置されている。両方のグラフは、図の右に示される同一の蛍光強度のスケール上に基づく。
【００３２】
ＰＰＧ蛍光強度の振動の最小（点線）及び最大（実線）によって定義されるエンベロープが蛍光強度対毛細血管の直径のグラフ上の横座標に投影されている。後者の投影幅は、血液量レイヤの増加の厚み、ΔＬ＝０．００１ｍｍを示す。
【００３３】
本例において３つの蛍光強度の振動に対する平均パルスデューティサイクル（ＰＤＣ）は、４０％に決定され、１パルスの平均継続期間はΔｔ＝０．６８０秒に決定された。
【００３４】
Ｆ＝（Ａ）（ΔＬ）（ＰＤＣ）／Δｔ      （１）
＝（２５０ｍｍ２）（０．００１ｍｍ）（０．４０）／（０．６８０）
＝０．１４７ｍｍ３／ｓｅｃ、又は０．１４７ｍｌ／ｓｅｃとなる。
【００３５】
これらは、確実な測定手順を利用できないことに起因する、腕の皮膚における絶対血流に関する先行技術で利用可能な僅かな情報であることが現れている。非常にラフな近似値が以下の平均血液循環値及び解剖学的値を用いて作成されうる。
【００３６】
総心拍出量＝５Ｌ／ｍｉｎ＝８３．３３ｍｌ／ｓｅｃ
皮膚への心拍出量の一部＝２０％又は１６．６７ｍｌ／ｓｅｃ
皮膚領域（ｍ２）＝｛［高さ（ｉｎ）×重さ（ｌｂｓ）］／３１３１｝１／２＝｛［６８×１５４］／３１３１｝１／２＝１．８３ｍ２
＝１．８３×１０６ｍｍ２となる。
【００３７】
したがって、１ｍｍ２の皮膚への総血流＝（１６．６７ｍｌ／ｓｅｃ）／（１．８３×１０６）
＝９．１１×１０６ｍｌ／ｓｅｃ
よって、２５０ｍｍ２の皮膚への血流＝２５０×９．１１×１０６ｍｌ／ｓｅｃ
＝０．００２３ｍｌ／ｓｅｃとなる。
【００３８】
後者の２５０ｍｍ２の皮膚への血流の近似値は、上記例に示されるように、本発明の蛍光媒介のＰＰＧ方法及びシステムを用いて導出された０．１４７ｍｌ／ｓｅｃの約１／６０よりも小さい。しかし、結果としてそのような不一致は、血液循環／生理学的近似値に基づく算出において血流が体全体の皮膚領域のあらゆる場所で均一に分散することと、ＦＭ−ＰＰＧの例示において毛細血管の直径／蛍光強度のデータが血液よりもむしろエタノールのＩＣＧを用いて蓄積され、かつ、目測での毛細血管の直径の測定がデジタル手法よりもむしろ二重のスケールで行われるということとの本来の前提を考慮すれば、説明されうるものである。
【００３９】
種々の実施形態において、少量の高濃度染料ボーラス（例えば、ＩＣＧ）の急速な静脈注入に続いて、生理食塩水洗浄を行い、３８μＭを超えて循環ピーク染料濃度に到達することは、先行するキャリブレーション方法に必要とされるように、選択した臨床実施に適しているかもしれない。
【００４０】
本発明の他の実施形態において、代替のキャリブレーション方法が、所定の臨床での使用で遭遇するピーク染料（例えば、ＩＣＧ）濃度の範囲を調整するために開発された。
【００４１】
例えば、通常のＩＣＧの投与は、約２５ｍｇ／ｍｌの３ｍｌの水溶液を注入し、続いて、５ｍｌの生理食塩水洗浄が行われる。注入した染料ボーラスの約４００から６００倍の希釈が、種々の注目場所への血管内を移動する中で発生し、結果として、およそ５．４から８μＭのピーク染料濃度の範囲となる。ピーク染料濃度の変動を調整するために、追加の蛍光波長データが血管造影画像と同時に取得され、それらのデータは各画像が取得された時点で、血管内の染料濃度を決定するための２波長レシオメトリック分析に使用される。
【００４２】
上記実施形態で説明したキャリブレーション方法はＩＣＧ蛍光血管造影シーケンスを除いて、他のデータを必要としないという利点がある一方で、本実施形態で説明する代替のキャリブレーション方法は、通常の注入技術が必要とされることからは逸脱しないという点において、全体的にユーザに分かり易いことが利点である。しかし、本実施形態に関連して、記録デバイスの画像化光学系が、画像形成に使用されるよりも長い２つの近赤外波長を同時に計測するようにするために変更される。
【００４３】
上記実施形態において説明したキャリブレーション方法と同様に、代替のキャリブレーション方法において、図２Ｃに示す血液量レイヤＬのΔＬである厚みの増加が決定される。再度、これを行うデータが、単一の血圧パルスの振動中に、矩形組織片におけるＩＣＧ染料入りの総血液量の照明により生成される蛍光に組み込まれる。矩形組織片の表面領域Ａが８０５ｎｍの波長レーザ光で照明された場合、生成される蛍光の総計Ｆは、励起蛍光強度の関数であり、８０５ｎｍでのＩＣＧモル吸収係数£、ＩＣＧモル濃度Ｃ、ＩＣＧ量子効率Φ、及び総ＩＣＧ入り血液量のレイヤの厚みＬとなる。つまり、
Ｆ＝ｆ（Ｉｅ，ε，Ｃ，Φ，Ｌ）          （２）となる。
【００４４】
しかし、ＩＣＧ入り血液量が移動するにつれて励起光が吸収されることを考慮すると、ランベルト・ベールの法則に説明されるように、発光した蛍光強度は、
Ｉｆ＝ＩｅΦ（１−ｅ−εＣＬ）          （３）
解決式（３）に対し、Ｌは、
Ｌ＝ｌｎ［ＩｅΦ／（ＩｅΦ−Ｉｆ）］（εＣ）−１          （４）
となる。
【００４５】
ここで、瞬間ＩＣＧモル濃度Ｃ以外の全てのパラメータに対する値が既知である。
【００４６】
しかしながら、種々の実施形態において、染料（例えば、ＩＣＧ）モル濃度が、染料（例えば、ＩＣＧ）蛍光画像を形成するために使用される波長帯域を超える２つの適切な近赤外波長のレシオメトリック分析によって決定されうる。例えば、図７は、染料モル濃度の関数として血液中のＩＣＧによって放射される約８５０ｎｍと９００ｎｍとの波長を中心とした波長帯域の強度比の関係を示す（なお、モル濃度の範囲は、形成外科医によって使用される現行のＩＣＧ染料の投与法によって生じる５．４から８μＭのマージン幅での範囲に含まれる。）。
【００４７】
種々の実施形態において、レシオメトリック染料（例えば、ＩＣＧ）モル濃度の決定の実行は、蛍光画像化の経路への光学コンポーネントや電子コンポーネントの追加を含む。一実施形態に係るそれらのコンポーネントの挿入の例示が、カナダのミシサーガのノバダックテクノロジーズによるＳＰＹ（登録商標）画像化システムとの関連で図８に概略的に示される。図８は、組織４０からの蛍光ライトを蛍光画像化するための、ＣＣＤビデオカメラ１２と対物レンズ１４とを含む画像化システム１０を概略的に示す。図８の実施形態に示すように、蛍光画像化経路への光学コンポーネントや電子コンポーネント（例えば、コンポーネント１６）の追加は、ＳＰＹ対物レンズ１４とＣＣＤビデオカメラ１２との間にそのようなコンポーネントを追加することを含む。図８に示す２つのＳｉフォトディテクタ２０、２２からの信号出力は、図７の関係を利用してリアルタイムで解析され、各血管造影画像に対して決定された、結果のモル濃度がそのＴＩＦＦヘッダに埋め込まれ、その後循環血液における瞬間染料モル濃度を決定するために必要とされ抽出される。例示のハードウェア実装に関連して以下では図８の実施形態についてより詳細に説明する。
【００４８】
種々の実施形態において、血圧パルス中において発生する血液量レイヤΔＬの厚みの増加が、数式（４）を用いて血圧パルスのピークＬｐとパルス最小Ｌｍでのレイヤの厚みを決定し、その後２つの間の差分を計算することによって、血管造影シーケンス中の任意の時間で決定されうる。
【００４９】
ΔＬ＝Ｌｐ−Ｌｍ＝ｌｎ［（ＩｅΦ−Ｉｍ）／（ＩｅΦ−Ｉｐ）］（εＣ）−１          （５）
ここで、Ｉｐ及びＩｍはパルスピークとパルス最小で測定されたそれぞれの蛍光強度であり、
Ｌ＝ｌｎ［ＩｅΦ／（ＩｅΦ−Ｉｆ）］（εＣ）−１ここで、
Ｌ＝領域Ａ下の全血管の血液量レイヤの厚みの総計
（ｃｍ）Ｉｅ＝励起光強度（Ｗｃｍ−２）
Ｉｆ＝発光した蛍光ライトの強度（Ｗｃｍ−２）
ε＝ＩＣＧモル吸収濃度（Ｍ−１ｃｍ−１）
Φ＝ＩＣＧ量子効率
（０．１３）
Ａ＝注目領域（ｃｍ２）
Ｃ＝ＩＣＧモル濃度（Ｍ）であり、
Ｌは、血流パルス（ＬＳ）の収縮ピークと、拡張最小（ＬＤ）で決定され、その後、注目組織領域を通過する流れ（Ｆｌｏｗ）が以下のように計算され、
Ｆｌｏｗ＝Ａ（ＬＳ−ＬＤ）／時間であり、時間は血流パルスの継続期間として計算される。
【００５０】
種々の実施形態において、蛍光強度ＩＰ及びＩＭは、例えば、図６に示す例示のアルゴリズムを使用し、同一のデータを用いて決定され、ここで、血管造影画像からの血圧パルスについてのエンベロープを形成する平均強度レベルが点線の水平線で表される。しかし、本例において、それらの２つの水平線は、グラフの右側に相対蛍光強度のスケールで投影され、一方の線は１１００で縦座標を遮断し、他方の線は１０３５で遮断する。
【００５１】
種々の実施形態において、ＩＰ及びＩＭに対するそれらの相対強度レベルを実際の光強度レベル（μＷ／ｃｍ）へ変換するために、ＣＣＤビデオカメラは、制御した染料（例えば、ＩＣＧ）の蛍光強度入力レベルに対して、カメラのグレイスケール出力をキャリブレーションすることによって露出計として使用される。
【００５２】
キャリブレーション方法は、蛍光強度の総計（Ｉｆ、数式３）が球状に放射されることと、カメラによって検出される画分が画像化システムの開口直径と発光源からの距離とに依存することとを考慮して、考案されている。カメラの出力は、以下に示すように、およそ５０から２５００μＷまでの線形に現れ、
ｌｆ（μＷ）＝（ａｖｇ．ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ−１００）／４１３．０１２            （６）
したがって、ＩＰ＝２．９０５μＷ、及び、Ｉｍ＝２．７４９μＷ、
なお、図６に示されるように、血管造影データの取得中では、Ｉｅ＝４．０Ｗとなり、
数式（５）はΔＬ＝ｌｎ［（（４０００  ×１０−３×０．１３）−（２．７４９×１０−３））／（（４０００×１０−３×０．１３）−（２．９０５×１０−３）］（εＣ）−１
＝０．０００５ｍｍ
ΔＬの値を数式（１）に挿入すると、Ｆ＝（Ａ）（ΔＬ）（ＰＤＣ）／Δｔ
＝（２５０ｍｍ２）（０．０００５ｍｍ）（０．４０）／（０．６８０）
＝０．０７３５ｍｍ３／ｓｅｃ、又は、０．０７３５ｍｌ／ｓｅｃとなる。
【００５３】
この血流（０．０７３５ｍｌ／ｓｅｃ）は、全身の生理パラメータに基づくおよそ０．００２３ｍｌ／ｓｅの近似値へ近づける、第一実施例で使用される上記方法（０．１４７ｍｌ／ｓｅｃ）によって算出された半分である。
【００５４】
多くの生理パラメータにおける変化だけでなく、大気温度による変化によっても皮膚の血流の変動が誘発される。そのような変動の大きさを決定するために、上記例のように、人の前腕皮膚における同一の２５０ｍｍ２の領域における２つのＩＣＧ血管造影を、それぞれ２５ｍｇ／ｍｌのＩＣＧの０．３３ｍｌの急速注入に続いて５ｍｌの生理食塩水洗浄を反対側の区切りの静脈へ行い、３２分間記録する実験を実行した。第１の血管造影は約７０°Ｆの周囲室温で記録され、第２の血管造影は６インチの距離で２４Ｗ石英ハロゲン電球から約１分間放射した露光直後に記録されたものであり、この温度の感覚は数インチの距離で口を通過する息の急速排気によって生じるのと同様のものである。
【００５５】
図９は、時間グラフ（下の行）に関してそれぞれ第１の導関数とともに、２つの実験からの時変平均強度グラフ（上の行）の複数のセグメントを示す。当該実験がＦＭ−ＰＰＧアルゴリズムのキャリブレーション部分の実行前に実施され、図の下の行に算出した皮膚領域の血流は、ｍｌ／ｓｅｃの絶対項というよりむしろ相対項である。それにもかかわらず、血流が周囲室温と比較して僅かな昇温で約１．４倍超である事実は、データ収集の時点での気温と他の生理パラメータが考慮されていないにもかかわらず、ＦＭ−ＰＰＧ血流測定で予期されうる通常の皮膚組織における変動の範囲を示す。
【００５６】
本発明のＦＭ−ＰＰＧ方法及びシステムの実施形態によれば、ＩＣＧは、注目組織場所を通過する移動中においてピーク染料濃度が０．０２５ｍｇ／ｍｌ（最大強度、濃度蛍光消光が以下で詳細に説明するように開始する濃度）を超える十分に高濃度のＩＣＧ染料ボーラスを注入することによって対象の静脈内に投与される。それらの条件下で、染料の抽出レベルが血管造影の記録中において定数であり、蛍光強度対ＣＣＤカメラグレイスケール出力が既知であることを想定すると、染料の移動を記録する血管造影画像のサブシーケンスは、画像グレイスケール強度の関数として、全体シーケンスの各画像に対するＩＣＧモル濃度を決定するために必要とされる情報を含む。
【００５７】
種々の実施形態において、リアルタイムでＩＣＧ染料の蛍光消光を弱めるために、循環血液中のＩＣＧモル濃度の決定のために２波長レシオメトリック方法が開発された。それは、特別な準備を必要とせず、施術者の通常の染料注入の手法から逸脱せず、さらに、注目組織を通過する染料の移動過程を記録する必要もないものの、蛍光励起強度が画像取得中において既知の一定水準を維持し、循環血液が染料で飽和した状態では血管造影が実行されず、即ち、十分な血管の染色が発生した状態で実行される。種々の実施形態において、波長レシオメトリック方法の実行は、近赤外波長の二帯域の強度を、各画像の取得と同時に決定するために、かつ、対応する画像ヘッダーにそれらのデータを埋め込むために、追加の光学素子、ハードウェア及びソフトウェアを含む。血管造影の取得が関連する限り、それらの追加やイベントは、それらを組み込む任意のデバイスの操作者にとって全体的にわかりやすいものである。種々の実施形態において、追加のキャリブレーションステップは、通常の臨床での使用に取り入れる前に各デバイス上で実行される。
【００５８】
＜ハードウェア実装の一例＞
本実施形態によれば、ＩＣＧモル濃度のレシオメトリック方法の評価に関し、プロトタイプＦＭ−ＰＰＧシステム、例えば図８に示す画像化システムなどのＩＣＧ蛍光画像化光学パスは、図８に示すように、対物レンズ１４とＣＣＤビデオカメラ１２との間のビームスプリッタ１６の挿入によって修正される。本実施形態において、ビームスプリッタ１６は、画像捕捉に対して使用されるＩＣＧ蛍光波長３０のバンドを送信し（バンドパスフィルタ２３によってフィルターされるおよそ８１５から８４５ｎｍ波長）、光がさらにおよそ８７５ｎｍ（波長３４）より小さい波長と、およそ８７５ｎｍ（波長３６）より大きい波長とへ、第２のビームスプリッタ１８によって分割される、全ての高波長３２（例えば、波長＞８４５ｎｍ）をパラレルパス（リレイレンズ１７を含む）へそらす。それらの後者のパス経路には、近赤外感知Ｓｉディテクタ（例えば、Ｓｉディテクタ２０、２２）（ソーラボ、モデルＰＤＡ３６Ａ  Ｓｉ切替可能ゲインディテクタ）が配置される。まず、８５０ｎｍ（フィルタ２４）及び９００ｎｍ（フィルタ２６）を中心とした狭帯域幅フィルタがそれぞれ、レシオメトリック方法に基づく２波長を決定するために使用される２、４、８、１６、３２μＭのＩＣＧ（セントルイス、ワシントン大学のベレジン実験室による契約下で生成された）を含む全ての血液サンプルからの前面励起蛍光放射スペクトルデータに近似させるために、ディテクタ２０、２２のそれぞれの前に挿入される。後続の分析は、他のバリエーションとして、実質的に同一のレシオメトリック識別が非常に広い帯域を用いて行われうることを示す。したがって、本実施形態では、狭帯域フィルタが取り外され、これにより、Ｓｉディテクタ上に作用する光強度が増加する。各Ｓｉディテクタに作用する光が各血管造影画像に記録されるビューの全体のフィールドから生じるように計算されることに注目すべきである。しかしながら、分析機器の可能性のある限定に起因して、後方の第２のビームスプリッタの光路とＳｉディテクタ上への光のフォーカスが厳密には検証されていない。
【００５９】
＜ソフトウェア実装の一例＞
＜データ取得＞
本実施形態において、各Ｓｉディテクタ増幅器の出力は、高解像度のデジタイザ（Ａｄｖａｎｔｅｃｈ  １０Ｍ、１２ｂｉｔ、４ｃｈ同時アナログ入力カード、モデルＰＣＩ−１７１４ＵＬ−ＢＥ）の２つの入力チャネルの１つへ接続され、ＣＣＤビデオカメラからのトリガ出力がデジタイザのトリガ入力チャネルへ接続される。各チャネルからのデジタル化した出力は、記録した各血管造影画像のヘッダにλリンクソフトウェアによって挿入される。デジタイザは、３つの入力チャネルのそれぞれから同等の位置で周期的に導出される、毎秒５００ｋデータサンプルの集合を継続的に取得する。λリンクがカメラトリガチャネルの１．５ボルト閾値を上回ったことを検知すると（８０５ｎｍレーザからの励起光の５ｍｓｅｃパルスの１セットを示す）、他の２つのチャネルからのデータサンプルのカウントと記録が開始される。まず８５０ｎｍチャネルから３００サンプルが除外され（レーザパルスの立ち上がり時間に関連する副作用を避けるために）、次に６００サンプルが記録され（最適量を実験的に決定するために）、残りは除外される。同一の取得アルゴリズムが９００ｎｍチャネルからのサンプルに適用される。トリガチャネル電圧がレーザパルスの終わりに１．５ボルト以下に落ちると、プログラムが閾値レベルを超える次の電圧増大を行うように準備する。
【００６０】
＜データ分析＞
λリンクソフトウェアの分析部は、ファイモーションモードで、各記録した血管造影画像に同時に埋め込まれる８５０ｎｍ、９００ｎｍの波長帯域からの強度データを抽出するように構成され、Ｓｉディテクタ増幅器からのデジタル電圧の２つのストリームを生成する。各ストリームは、励起レーザパルスごと（即ち、画像ごと）に６００データサンプルを含み、従ってトータルで１２００データサンプルが各画像ヘッダに格納される。８５０ｎｍチャネルからの電圧サンプルの平均レベルが９００ｎｍチャネルからのサンプルの平均レベルによって分割され、絶対組織かん流を計算するために使用されるＩＣＧ（Ｃ）のμＭ濃度へ変換される（キャリブレーション曲線を介して）比率を生成する。
【００６１】
２つのチャネルからのデジタル出力だけでなく２つの波長比が、６小数位でレポートされる。４０の連続画像からの回転平均比（およそ１．７秒で記録された番号）は３小数位で安定することが実験的に決定され、したがって最後３つは計算上切り捨てられ、レポートされる。
【００６２】
＜２波長比対Ｃキャリブレーション曲線の構築＞
例示のプロトタイプシステムに関連するキャリブレーション曲線は、電子コンポーネント及び光学コンポーネント（例えば、レンズアパーチャ、励起レーザパワー、Ｓｉディテクタ増幅器など）の両方に関連するパラメータの特定の組み合わせに対して固有であり、それらの多くは実験的な経験により最適化されている。曲線の必要な特性は、単調であり、血液中のＩＣＧ濃度を決定するための適切な解像度を許容するために十分に急激な傾斜（正数又は負数）を有し、デバイスパラメータの所定の固定セットに対して再生可能であり、本質的にサンプル厚みとは独立していることである。
【００６３】
＜実験的設定及びデータ取得＞
プロトタイプシステムにおけるキャリブレーション曲線の構築は、新たに取得したサンプル、新たに再構成したＩＣＧ染料の２、４、８、１２、１６μＭの濃度を含む抗凝固の保存血液に基づく。３ミリリッターの各サンプルが蓋のないペトリ皿に置かれ、デバイスの視野を完全に満たすために十分に大きい領域で１．７６４ｍｍの厚みの層を生成する。
【００６４】
一つずつ、５つのサンプルのそれぞれが画像化システム１０の対物レンズ１４下に位置し、およそ５秒長い血管造影画像のシーケンスが記録され、プラズマに懸濁した赤血球の沈殿を避けるように素早く本手順は２回以上繰り返される。血液の０．５ミリリッターが各サンプルから除かれ、０．２９４ｍｍまで血液レイヤの厚みが減少し、再度、５つのサンプルの血管造影シーケンスの３つのセットが記録される。その後、追加の０．５ｍｌの血液が各サンプルから除かれ、血管造影シーケンスの最後の３つのセットが記録される。このように、レシオメトリックデータの９つのセットが５つのＩＣＧ／血液サンプルのそれぞれから取得され、３つのセットは３つの異なるサンプル厚みからなる。
【００６５】
比較を目的とし、レシオメトリックデータの同一のシーケンスがＩＣＧ／血液サンプルと同一のＩＣＧ濃度の範囲を有するエタノールのＩＣＧの５つのサンプルから取得される。しかしながら、この場合、３つの代わりにただ１つの血管造影シーケンスがサンプルレイヤの厚みごとに５つのサンプルのそれぞれから記録される。ＩＣＧ／血液プロトコルからの逸脱が、励起光エネルギの吸収が実質的により高濃度のＩＣＧ濃度サンプルとともに、エタノールの蒸発を加速させ、これにより、サンプルレイヤの厚みの減少だけでなくサンプル濃度を増加させるという事実により余儀なくされる。
【００６６】
図１０及び図１１は、それぞれエタノールと人の血液とのＩＣＧに対して構成された２波長レシオメトリックキャリブレーション曲線上にサンプル厚みの結果を示す。ＩＣＧ濃度の関数として、全血、血清、及びエタノールのＩＣＧの溶液が発光した蛍光強度に関して同様の反応を見せるものの、図１０及び図１１の曲線は、２波長レシオメトリックキャリブレーション曲線を構成するために使用される発光波長の帯域の強度間での関係に関して、血液とエタノールの溶液間での異なる反応を有意に示す。ＩＣＧと２つの溶質の間での化学的相互作用の差分に関連するランベルト・ベールの法則のブレイクダウンが当該差分の主な原因となる。血液中のＩＣＧにおける実験的に導出したキャリブレーション曲線は本明細書で上述した現在理解されている必要特性を満足する。
【００６７】
組織かん流を計算するソフトウェア実装のアルゴリズムと連結してキャリブレーション曲線を使用するために、本実施例において、５つのデータポイントのみから構成されるにもかかわらずデジタルフォーマットにアクセス可能であり、連続関数としてソフトウェアに現れなければならない。これは、全ての５つのポイントを通過する滑らかな曲線を描く数式を見いだすことによって達成されうる。残念なことに、非線形又は第２のオーダの多項式が満足のいくように見いだされ、全ての５つのポイントを通過するように手動でグラフが構成され、それから、１２の追加のデータポイントが導出され、結果として図１２の曲線のようになった。ソフトウェアプログラムは、トータル１７のデータポイント間を補間する。キャリブレーション曲線を図１２に示す。図１３に示すように、曲線に沿った比率データの平均変動は平均すると＋／−０．０１４となる。
【００６８】
＜現在のキャリブレーションデータとベレジン研究室からのデータとの比較＞
レシオメトリックキャリブレーション曲線の構築用に最適な波長を決定するために使用されるＩＣＧの種々の濃度を含む人の血液からの蛍光データの生成は、ワシントン大学医学部（セントルイス、ＭＯ）のベレジン研究室に委託された。ベレジン研究室は、２波長レシオメトリック方法及びシステムをベースとした、オリジナルデータを確認するために必要とされる高解像度のデータを生成するために近赤外領域へ十分に離れたスペクトル範囲を有する利用可能な蛍光分光計を有する数少ない施設の１つである。
【００６９】
プロトタイプシステムが２つの個別のパス経路を有し、２つの異なるでディテクタだけでなく２つの異なる信号増幅器等を使用する一方で、ベレジンデバイスが単一の光学パス経路（チャネル）を効果的に有し、全ての波長データを取得するために同一のディテクタを使用するため、２つのキャリブレーション曲線がノイズレベル及び解像度に関して異なることが予期される。両方のデバイスは、その曲線が異なるように見える場合であっても、本明細書で上述したように最小の必要特性を満足するキャリブレーション曲線を生成することが可能である。
【００７０】
図１２の曲線と図１３の曲線とを比較すると（データポイントの交差で）、それらは、全く異なり、両方とも単調であるものの、それらの傾斜は、反対であり、ベレジンデータの比率範囲が約５倍大きい。しかし、それらはプロトタイプシステムからの曲線を無効にするものではない。実際に、ベレジン曲線の比率スケールをプロトタイプの比率スケールへ正規化し（信号強度と増幅に関連付けられた差分を相殺する）、ベレジンデータの比率スケールの向きを変更することによって（曲線を反転させ、それにより、その傾斜を変更する）、図１４に示す結果の曲線（データポイントとしての周期とともに）は、図１４に示すようにプロトタイプシステムの曲線に厳密に一致する。
【００７１】
ベレジンデータ比率スケールを正規化するために使用される変換関数を以下に示す。
【００７２】
Ｒ１＝（Ｒ０／５．７９６）＋１．８５８
ここで、Ｒ０がベレジン比率スケール上のオリジナルデータポイント値であり、
Ｒ１がプロトタイプデバイス比率スケール上にプロットされる変換されたポイント値であり、
５．７９６はベレジン比率データ範囲（２μＭと１６μＭとの比率値の間の差分）とプロトタイプデバイスよりどれくらい大きいかを示し、
１．８５８は、１６μＭのベレジンサンプルにおけるＲ１が、プロトタイプデバイスの２μＭデータポイントの位置に対応するように生成するために、プロトタイプデバイスのスケールにシフト（ベレジン曲線が反転した後に）するための量を示す。
【００７３】
プロトタイプシステムデータにおけるコンピュータで生成した第２のオーダの多項式曲線（”パワー”でラベル付けされた）は上手く適合せず、これは８μＭ又は１６μＭ濃度の両方における”＋”のデータポイントの拡散を通過する歪みによって強調される。
【００７４】
それでもなお、ベレジンデータにおける有意義な”パワー”の変換かつ反転した曲線は、データポイントの拡散の輪郭を表現すると、全体的にプロトタイプデバイスの”パワー”曲線の平均変動のエンベロープ内にある。これは、ベレジン及びプロトタイプデバイスのデータの両方における相互点の関係における絶対値が本質的に同一であることを実証している。したがって、現行の利用可能な最良の測定によって、血液中のＩＣＧ濃度の手動やソフトウェアによる決定が、最適化され、被験者評価を適切にすることが現れている。
【００７５】
＜絶対組織かん流アルゴリズムの検証＞
種々の組織を通過する絶対血流レベルに関する発行データの不足に起因して、組織かん流の分析プログラムの検証は、基本的な卓上での実験を超える難しいものである。比較のために容易にアクセス可能な組織に関する利用可能なデータがなく、生きている組織のアルゴリズム及びプロトタイプデバイスの概念実証は、従来では内側前腕から取得される血管造影データの分析と関連している。
【００７６】
優れた比較基準として供給されうる侵襲的方法ではなくアクセス可能な組織から絶対項で表現した血流データのみがＡｌｍ及びＢｉｌｌによって赤毛猿の眼組織から抽出された（例えば、Ｅｙｅ  Ｒｅｓ，１５：１５−２９，１９７３）。それらのデータは、放射性標識マイクロスフェア注入の定評のある方法を用いて、導出され、ｍｇ／ｍｉｎ／ｍｍ２に関して表現される。μＬ／ｓｅｃ／ｍｍ２へのそれらのデータの変換は、血液の平均強度が１．０６×１０３ｋｇ／ｍ３であることのみを認識している必要があり、以下の関係が容易に導出され、
Ｘ（ｍｇ／ｍｉｎ／ｍｍ２）／６３．６＝Ｘ（μＬ／ｓｅｃ／ｍｍ２）
となる。
【００７７】
本実施形態によれば、眼組織からの血管造影データの取得に関し、眼底カメラが使用されてもよい。しかし、眼底カメラは、循環血液（Ｃ）のＩＣＧの濃度のレシオメトリック決定に必要とされる追加２波長データの同時取得の供給を行うことができない。しかしながら、ＩＣＧボーラスの移動中に３２．２μＭの濃度に到達し、同時に記録した画像の短いシーケンスをＦＭ−ＰＧＧアルゴリズムによって分析する場合に、Ａｌｍ及びＢｉｌｌのものと比較されうる結果を決定する代替の方法がある。
【００７８】
１つの代替方法は、溶液のＩＣＧ染料によって示される現象である濃度蛍光消光に基づくものであり、ここで、溶液からの放射される蛍光強度は、蛍光減少となる濃度増加を超えるポイントに到達するまで、染料濃度に沿って増加する。血液中のＩＣＧに関し、最大蛍光が、０．０２５ｍｇ／ｍｌの濃度で発生し、当該濃度の上下で蛍光減少が等しくかつ急激に発生する。注入したＩＣＧボーラスは、血管のネットワークを移動し、染料濃度が増加すると、ＩＣＧ蛍光も増加し、染料濃度が０．０２５ｍｇ／ｍｌに到達すると最大強度に到達する。濃度増加が継続すると、濃度蛍光消光に起因して蛍光が減少し、濃度がその最大に到達したときに最小強度に到達する。その後、濃度が減少し、０．０２５ｍｇ／ｍｌの最大レベルに再び到達するまで、蛍光強度を増加させ、その後濃度現象が継続すると、蛍光が再び減少を開始する。このように、全体の画像輝度対消光が発生するＩＣＧ眼底血管造影のシーケンスにおける画像番号のプロットにおいて、同等の蛍光強度の典型的なダブルピークを含むことになる。そのような消光は、染料注入と直後の適量の食塩水洗浄が急速に行われるだけで、十分に高濃度でかつ完全な量のＩＣＧボーラスを注入することによって眼底血管に誘導される。
【００７９】
第２の代替方法は、眼血管への移動中に行われた肘脈へ注入した染料ボーラスの前回決定した希釈量に基づくものであり（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌ．１２：８８１−８９５，１９７３）、平均的な大人の赤毛猿の３１０倍であり、平均的な大人の人の６００倍である。再度、全体の画像輝度対ＩＣＧ眼血管造影のシーケンスにおける画像番号のプロットが使用され、今回は単にピーク輝度中に取得された血管造影画像のサブセットを決定するものである。その結果、当該ピーク輝度は、注入した染料ボーラス濃度の１／６００（人の）又は１／３１０（赤毛猿の）のＩＣＧ濃度に関連付けられる。
【００８０】
＜赤毛猿の眼からの検証データ＞
本実施例において、対象は、８．７９ｋｇの赤毛猿（カニクイザルとほとんど等しい）の拡張した右目である。３つの血管造影シーケンスが以下のように記録される。
【００８１】
シーケンス１−−伏在静脈へ０．１ｍｌの注入（２５ｍｇ／０．７ｍｌのＩＣＧ溶液）に続いて、急速の３．０ｍｌの食塩水洗浄を行う。
【００８２】
シーケンス２−−３．０分後まで追加の染料を注入しない。
【００８３】
シーケンス３−−３．０分後、伏在静脈へ０．１ｍｌの注入（２５ｍｇ／０．５ｍｌのＩＣＧ溶液）に続いて、急速の３．０ｍｌの食塩水洗浄を行う。
【００８４】
各シーケンスの解析に関し、画像輝度（トータル強度）対画像番号の時間プロットが、図１５に示されるように、第１のシーケンスに対して構成される。当該プロットから、画像４９０−５６５のシーケンスがピーク輝度であることが決定される。ダブルピークが検出されないため、上述したように、循環血液中のＩＣＧ濃度を決定するための第２の代替方法が使用される。つまり、注入した第１のＩＣＧボーラスの濃度が２５ｍｇ／０．７ｍｌ＝３５．７ｍｇ／ｍｌであり、３１０倍に希釈され、目への移動中に０．１１５ｍｇ／ｍｌの濃度になる。したがって、眼血管中の染料のピーク濃度（画像４９０−５６５に対応）が１４８μＭであり、当該値が、利用可能な２波長レシオメトリックデータを有する代わりに、解析ウィンドウ上で適切なボックスに入力される。
【００８５】
画像４９０−５６５における第２のプロットが生成され、２つの連続血流パルス間の谷部が選択される（緑の四角）。図１６に示すように、同時に、各パルスにおける計算した血流を示すテーブルだけでなく、平均フロー（０．０５８μＬ／ｓｅｃ／ｍｍ２）も生成される。一般的には、同一の手順が図１７に示すように第２の血管造影シーケンスに対して行われる。このプロットから、画像３００−３８１のサブセットが選択され、対応するＩＣＧ染料濃度（Ｃ）が当該サブセット（０．０２０４）のパルス強度に基づいて計算され、第１のシーケンスのピーク輝度の強度と比較される（１４８μＭ濃度に対応する０．０５９５）。したがって、１４８μＭ／０．０５９５＝Ｃ／０．０２０４であり、Ｃ＝５０．７μＭとなる。
【００８６】
第２のプロットが画像３００−３８１に対して生成され、５つの連続血流パルス間の谷部が選択される（四角）。図１８に示すように、同時に、各パルスに対して計算された血流を示すテーブルだけでなく、平均フロー（０．０５５μＬ／ｓｅｃ／ｍｍ２）も生成される。最後に、同一の手順が第３のシーケンスに適用され、プロットとテーブルを生成し、当該プロットが図１９に示される。
【００８７】
再び、当該プロットから、画像２６０−２９０のシーケンスが、移動中の希釈が計算された後の循環血液中のＩＣＧのピーク輝度と濃度であると決定される。ここでは、注入されたＩＣＧボーラスの濃度が２５ｍｇ／０．５ｍｌ＝５０．０ｍｇ／ｍｌであり、３１０倍に希釈され、眼への移動中に０．１６１ｍｇ／ｍｌの濃度となる。したがって、眼血管の染料のピーク濃度（画像２６０−２９０に対応する）は２０７μＭとなる。
【００８８】
画像２６０−２９０に対して第２のプロットが生成され、２つの連続血流パルス間の谷部が選択される（緑の四角）。同時に、各パルスに対して計算された血流を示すテーブルだけでなく、平均フロー（０．１０５μＭ／ｓｅｃ／ｍｍ２）も図２０に示すように生成される。
【００８９】
同じ目からの３つの連続血管造影の上記分析は、０．０５８、０．０５５、及び０．１０５μＬ／ｓｅｃ／ｍｍ２の脈絡血流を生み出し、Ａｌｍ及びＢｉｌｌによってレポートされ、以下の最後のセクションで説明するように、それらの全ては０．０８６６μＬ／ｓｅｃ／ｍｍ２優れた標準フローと比較される。
【００９０】
＜カニクイザルの眼からの放射性標識マイクロスフェア（”ゴールドスタンダード”）＞
図２１の左側の画像（図２１Ａ）は人の眼の血管造影からの画像である。右側の画像（図２１Ｂ）では、左側画像（図２１Ａ）に示される網膜領域が、それらの実験においてＡｌｍ及びＢｉｌｌによって使用される猿１匹の左目からの平坦にマウントした脈絡膜の放射能写真上にボックスを重ねるように表現される。真ん中の穴は視神経を除いたことによるものである。ブラックスポットは、閉じ込められたマイクロスフェアを表現し、スポットの濃さは、血流速度の測定である。赤いボックスによって囲んだ領域は、中心窩及び視神経乳頭の領域を含み、それらの１７対象の結果によれば、それぞれが６．４９及び４．５３ｍｇ／ｍｉｎ／ｍｍ２の血流を有する。それらのデータは、囲んだ領域について、０．８６６μＬ／ｓｅｃ／ｍｍ２の平均血流速度へ変換される。
【００９１】
このように、種々の実施形態によれば、物理的な関係が素材（例えば、組織）の光の吸収と、素材の吸収濃度との間で利用され、当該関係が血流を定量化するための手段として使用される。種々の実施形態によれば、上述した全ての変数が独立して決定され、そのような決定から、吸収の時間の経過による変化が血流（絶対血流）の表示を与えるために（例えば、ベールの法則、ランベルト・ベールの法則又はランベルトブーゲーの法則として知られたランベルト・ベールの法則を用いて）決定されうる。種々の実施形態において、ランベルト・ベールの法則が、血流の測定時間を用いて血液中の蛍光染料の濃度の指標として、蛍光染料（ここで、蛍光は吸収の指標を与える）の使用に適用される。
【００９２】
種々の実施形態において、上述した全ての変数は独立して決定される。しかし、最も難しい側面は任意の時間での血液の瞬間濃度の決定に関するものである。種々の実施形態によれば、瞬間濃度えお決定する例示のアプローチは蛍光比率を用いることを含む。例えば、２つの異なる波長帯の比率が使用されうる。本実施形態によれば、２つの異なる波長帯は、注目波長帯（例えば、画像化を実行するために使用される帯域）を一括りにまとめ、蛍光が３つの帯域へ分割される。種々の実施形態において、蛍光比率の決定に対して２つの波長帯域をとり、同時に、画像への全体スペクトル（例えば、時分割多重）を用いることによって、低信号の制限が追加されてもよい。種々の他の実施形態において、蛍光を検査する代わりに、蛍光染料の吸収を検査することによって評価が行われてもよい。本実施形態において、高信号が検知されてもよい。
【００９３】
詳細に図示し説明した種々の実施形態と関連して本発明を図示し、説明したが、示した詳細へ限定する意図はなく、したがって、種々の変形が構成の変更が本発明の範囲から任意の方法で逸脱することなく生成されうる。説明した複数の形態の、形式の種々の変形、コンポーネントの構成、ステップ、詳細及び動作のオーダだけでなく、本発明の他の形態が本発明の範囲から任意の方法で逸脱することなく生成され、本説明を参照することにより当業者には明らかとなるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は発明の真の範囲内に落とし込まれるように、そのような変形及び形態をカバーするものであることが熟考される。
【００９４】
本出願は、２０１３年６月１４日に出願のＵＳ仮出願６１／８３５，４０８号の優先権を主張し、その開示は参照によりここに組み込まれるものとする。
【図１】
0006310550.tif 000002
【図２】
0006310550.tif 000003
【図３】
0006310550.tif 000004
【図４】
0006310550.tif 000005
【図５】
0006310550.tif 000006
【図６】
0006310550.tif 000007
【図７】
0006310550.tif 000008
【図８】
0006310550.tif 000009
【図９】
0006310550.tif 000010
【図１０】
0006310550.tif 000011
【図１１】
0006310550.tif 000012
【図１２】
0006310550.tif 000013
【図１３】
0006310550.tif 000014
【図１４】
0006310550.tif 000015
【図１５】
0006310550.tif 000016
【図１６】
0006310550.tif 000017
【図１７】
0006310550.tif 000018
【図１８】
0006310550.tif 000019
【図１９】
0006310550.tif 000020
【図２０】
0006310550.tif 000021
【図２１】
0006310550.tif 000022