(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料培地の時間分解蛍光画像化のための装置であって、
培地に向けて励起パルスを生成するように構成される発光素子と、
伝送ラインを介して発光素子に接続されるパルス発生器と、
伝送ラインに接続される遅延ラインと、を備え、
遅延ラインは、励起パルスの減衰プロファイルを成形するために伝送ラインに向けて反射パルスを生成するように構成され、
遅延ラインからの反射パルスは、制御された直線形減衰照明プロファイルを有する励起パルスを生成するように構成される装置。
【請求項２】
遅延ラインは、発光素子中の立ち下がり時の電荷を失わせるための受動的な負のループバックとして機能する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
遅延ラインは、スタブラインを備える、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
スタブラインの形状および大きさは、減衰照明プロファイルの形状を制御するように構成される、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
発光素子は、ＬＥＤを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
培地は、ヒト組織を備え、
放射される励起パルスは、０．５ｎｓよりも大きいパルス幅を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
放射される励起パルスは、１ｎｓから２０ｎｓの範囲のパルス幅を有する、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
放射される励起パルスは、約１０ｎｓのパルス幅を有する、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
培地の時間分解蛍光画像化を実行するためのシステムであって、
（ａ）照明源であって、前記照明源が、
（ｉ）培地に向けて励起パルスを生成するように構成される発光素子と、
（ｉｉ）伝送ラインを介して発光素子に接続されるパルス発生器と、
（ｉｉｉ）伝送ラインに接続される遅延ラインと、を備え、
（ｉｖ）遅延ラインが、励起パルスの減衰プロファイルを成形するために伝送ラインに向けて反射パルスを生成するように構成され、
（ｖ）遅延ラインからの反射パルスは、制御された直線形減衰照明プロファイルを有する励起パルスを生成するように構成される、照明源と、
（ｂ）励起された培地からの一以上の信号を受信するように構成される検出器と、
（ｃ）検出器に接続されるプロセッサと、
（ｄ）プロセッサ上で実行可能とされ、励起された培地からの一以上の信号を分析するように構成されるプログラミングと、
を備えるシステム。
【請求項１０】
遅延ラインは、発光素子中の立ち下がり時の電荷を失わせるための受動的な負のループバックとして機能する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
遅延ラインは、スタブラインを備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
スタブラインの形状および大きさは、減衰照明プロファイルの形状を制御するように構成される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
発光素子は、ＬＥＤを備える、請求項９に記載のシステム。
【請求項１４】
放射される励起パルスは、０．５ｎｓよりも大きいパルス幅を有する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１５】
放射される励起パルスは、１ｎｓから２０ｎｓの範囲のパルス幅を有する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
プログラミングは、さらに、
培地の第１画像を生成するステップであって、前記第１画像が少なくとも培地の第１成分に対応する第１蛍光体および培地の第２成分に対応する第２蛍光体に関連するデータを備え、第１蛍光体が第２蛍光体よりも長い蛍光寿命を有するステップと、
前記第１画像から特定の時間後に培地の第２画像を生成するステップであって、前記第２画像が少なくとも第１蛍光体に関連するデータを備えるステップと、
培地に含まれる第１成分および第２成分の差異を特定するために、第１画像および第２画像の関数としての第３画像を生成するステップと、
を実行するように構成される、請求項９に記載のシステム。
【請求項１７】
第２画像は、第２蛍光体に関連するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２蛍光体の減衰後に生成され、
第３画像を生成するステップは、第１蛍光体に関するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２画像から第１画像を減算するステップを備える、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
第２画像から第１画像を減算する前に、第２画像が第１画像の強度に正規化される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
第２画像は、第１蛍光体および第２蛍光体がいまだ減衰している間に生成され、
第２画像は、第２蛍光体に関連するデータをさらに備え、
第３画像を生成するステップは、第２画像を第１画像で除算するステップを備える、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２０】
プログラミングは、第３画像に定数を乗算するステップをさらに実行するように構成される、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
試料培地の時間分解蛍光画像化のための方法であって、
パルス発生器を伝送ラインを介して発光素子に接続するステップと、
伝送ラインに向けてパルスを生成するステップと、
受動的な反射パルスと生成されたパルスとを結合させるステップと、
発光素子から励起パルスを放射するステップと、を備え、
反射パルスは、励起パルスの減衰プロファイルを成形するように構成され、
反射パルスは、制御された直線形減衰照明プロファイルを有する励起パルスを生成するように構成される方法。
【請求項２２】
反射パルスは、伝送ラインに接続される遅延ラインから生成され、
遅延ラインは、発光素子中の立ち下がり時の電荷を失わせるための受動的な負のループバックとして機能する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
遅延ラインは、スタブラインを備える、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
スタブラインの形状および大きさは、減衰照明プロファイルの形状を制御するように構成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
発光素子は、ＬＥＤを備える、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
培地は、ヒト組織を備え、
放射される励起パルスは、０．５ｎｓよりも大きいパルス幅を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
放射される励起パルスは、１ｎｓから２０ｎｓの範囲のパルス幅を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
培地の第１画像を生成するステップであって、前記第１画像が少なくとも培地の第１成分に対応する第１蛍光体および培地の第２成分に対応する第２蛍光体に関連するデータを備え、第１蛍光体が第２蛍光体よりも長い蛍光寿命を有するステップと、
前記第１画像から特定の時間後に培地の第２画像を生成するステップであって、前記第２画像が少なくとも第１蛍光体に関連するデータを備えるステップと、
培地に含まれる第１成分および第２成分の差異を特定するために、第１画像および第２画像の関数としての第３画像を生成するステップと、
をさらに備える、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
第２画像は、第２蛍光体に関連するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２蛍光体の減衰後に生成され、
第３画像を生成するステップは、第１蛍光体に関するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２画像から第１画像を減算するステップを備える、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
第２画像から第１画像を減算する前に、第２画像が第１画像の強度に正規化される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第２画像は、第１蛍光体および第２蛍光体がいまだ減衰している間に生成され、
第２画像は、第２蛍光体に関連するデータをさらに備え、
第３画像を生成するステップは、第２画像を第１画像で除算するステップを備える、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願へのクロスリファレンス］
本出願は、２０１２年３月２日に出願された米国仮出願（番号６１／６０５，８４４）の正規出願であり、その仮出願の全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
［連邦によって後援された研究または開発に関する声明文］
適用なし。
【０００３】
［コンパクトディスクで提出されるものの参照による援用］
適用なし。
【０００４】
［著作権で保護されるものについての注意］
本特許文書のなかの一部は米国および他の国の著作権法の下で著作権保護の対象となる。特許文書または特許開示が米国特許商標庁において公に供されるファイルまたは記録に現れた場合に、著作権者はその特許文書または特許開示がだれに複製されたとしてもそれに反対するものではない。しかしながらそうでない場合はいかなる場合でも全ての著作権を留保する。ここで著作権者は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．１４にしたがう権利を非限定的に含む権利のいずれをも、この特許文書を秘密にしておくために放棄するものではない。
【０００５】
１．本発明の分野
【０００６】
本発明は、広く時間分解蛍光画像化に関し、特に、寿命フィッティングを用いない時間分解蛍光画像化に関する。
【背景技術】
【０００７】
２．関連技術の記載
【０００８】
今まで、時間分解蛍光画像は、試料の寿命パターンの取得により得られていた。時間分解蛍光画像化（ＴＲＦＩ；time-resolved fluorescence imaging）における最近の製品では、蛍光の減衰信号から蛍光寿命を正確に抽出するための数学的なアルゴリズムの開発に主に注力している。蛍光信号データが得られた後、その蛍光データが分析され、測定データに減衰モデルをフィッティングすることで蛍光寿命が推定される。時間分解蛍光データは、たいてい複雑であり、図式的に分析することが難しい。１９７０年代以降、研究者らは、これらを分析するための多くの方法およびアルゴリズムを提案してきた。今日、非線形最小二乗法（ＮＬＬＳ；nonlinear least squares）が生物医学データのフィッティングおよび分析において、最も一般的な方法の一つである。その概念は、初期値パラメータから始め、初期値パラメータを調整して測定データと計算データとの間でのベストマッチを見つけるための反復的なコンボリューションを用いて蛍光寿命を推定するモデルである。
【０００９】
蛍光体の時間分解蛍光信号は、たいてい単一の指数関数曲線である。しかしながら、試料には一種類よりも多い蛍光体が一般に存在するため、たいていの場合、強度の減衰曲線は複数の指数減衰曲線の組み合わせとなり、式１により示すことができる。
【数１】
0006389763.tif 000002
ここで、ａは振幅であり、τは減衰定数または蛍光寿命である。
【００１０】
このマルチ指数関数曲線からの寿命抽出は、複雑であり時間もかかる。さらに複雑になると、蛍光画像を得るための寿命抽出は信頼できないかもしれない。いかなる蛍光減衰フィッティング方法および寿命推定方法であっても、分解能の限界を有する。二以上の蛍光寿命が空間的に近接している場合、ＮＬＬＳは制限されることとなる。
【００１１】
図１Ａおよび図１Ｂは、二つの蛍光寿命で構成されるマルチ指数減衰曲線（それぞれ、線形スケールおよび対数スケール）を示す。二つの線は、二つの異なる組み合わせの寿命により構成されているが、ほとんど完全に重複している。したがって、正確に寿命を抽出するために、長い計算時間を必要とする複雑なアルゴリズムが開発される。蛍光信号に寿命抽出の信頼性を低下させるノイズが存在する場合（これは一般的なケースである）、この状況はより悪化するかもしれない。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、寿命計算を用いない低演算量の計算を通じて時間分解蛍光画像を得ることにより、寿命抽出に基づくＴＲＦＩの制約を克服することにある。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の一態様は、寿命フィッティングを必要としない時間分解蛍光画像化（ＴＲＦＩ）システムである。寿命を正確に抽出する代わりに、本発明のシステムおよび方法では、時間分解蛍光画像化のための寿命抽出を用いることなく蛍光画像を得るためのシンプルで正確な方法を可能とする蛍光体分布の画像を取得することに主眼を置く。
【００１４】
別の態様は、励起パルスを成形するＴＲＦＩ用の照明源回路である。一実施の形態において、照明源は、直線形の減衰プロファイルを生成するために構成されるＬＥＤおよびスタブラインを備える。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、本明細書の以下において明らかにされるであろう。本明細書の以下における詳細な記述は、限定ではなく、本発明の好ましい実施の形態の十分な開示を目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明は、例示のみを目的とする以下の図面を参照して、より十分に理解されるであろう。
【００１７】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、二つの蛍光寿命で構成されるマルチ指数減衰曲線（それぞれ、線形スケールおよび対数スケール）を示す。
【００１８】
【図２】寿命フィッティングを用いないＴＲＦＩを実行するための本発明の減算ベースの方法の概要を示すフローチャートである。
【００１９】
【図３】図２の方法に用いられる二画像のそれぞれに対応する短寿命および長寿命を持つ蛍光信号を示す概略図である。
【００２０】
【図４】図２の方法に用いるために取得される画像を概略的に示す図である。
【００２１】
【図５】寿命フィッティングを用いないＴＲＦＩを実行するための本発明の除算ベースの方法の概要を示すフローチャートである。
【００２２】
【図６】図５の方法に用いられる二画像のそれぞれに対応する短寿命および長寿命を持つ蛍光信号を示す概略図である。
【００２３】
【図７】図５の方法に用いるために取得される画像を概略的に示す図である。
【００２４】
【図８】本発明に係る寿命フィッティングを用いないＴＲＦＩ向けの方法を実装するための例示的なシステムを示す図である。
【００２５】
【図９】図９Ａから図９Ｃは、図２の方法に係るサンプリング画像および正規化画像を示す。
【００２６】
【図１０】図１０Ａから図１０Ｃは、図５の方法に係るサンプリング画像および正規化画像を示す。
【００２７】
【図１１】図１１Ａから図１１Ｃは、光学濃度により部分的に覆われた図５の方法に係るサンプリング画像および正規化画像を示す。
【００２８】
【図１２】本発明に係る例示的なＬＥＤベースの光源を模式的に示す回路図である。
【００２９】
【図１３】２ｎｓおよび２．５ｎｓの指数減衰係数を有する二つのサンプルに加えて、指数関数形パルス（減衰係数１０ｎｓ）および直線形パルス（傾き１０ｎｓ）のプロットを示す図である。
【００３０】
【図１４】ＦＬＩＭシステムの実測信号を模擬する二つのサンプルの励起パルスのそれぞれのコンボリューション積のプロットを示す図である。
【００３１】
【図１５】直線形減衰および指数形減衰の双方を有する励起パルスに対して図５の方法に係る正規化をした後の二つのサンプルのプロットを示す図である。
【００３２】
【図１６】直線形減衰および指数形減衰の双方を有する励起パルスに対して、図２の方法に係る同じ励起源からの二つの信号を減算したプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
図２〜図４は、寿命フィッティングを用いないＴＲＦＩを実行するための本発明の第１の方法１０を示す。図２〜図４に示される例において、試料中に、蛍光寿命の長い蛍光体（図３の曲線３４）と蛍光寿命の短い別の蛍光体（図３の曲線３６）の二つの蛍光体が存在することを仮定する。したがって、寿命の長い蛍光体の蛍光強度は、よりゆっくりと減衰するであろう。本発明の方法１０において、二つの蛍光画像３０および３２は、ステップ１２において光源により試料を励起した後、蛍光信号が減衰する間に仕切り（ゲート）を入れてサンプリングされる。図８に示す励起パルス３８の曲線は、詳細を後述するように、直線形のプロファイルを有するように成形されうる。
【００３４】
第１画像３０は、ステップ１４にて蛍光信号３４および３６の双方がいまだ減衰している間に記録される。第２画像３２は、ステップ１６にて寿命の短い蛍光体３６の蛍光発光が終了している間に記録され、その結果、寿命の長い蛍光体３４の画像のみが記録される（図３参照）。
【００３５】
寿命の短い蛍光体３６の分布を得るために、第２画像３２の強度は、ステップ１８にて、まず第１画像３０の強度に正規化され、寿命の長い蛍光体３４の正規化画像４０が生成される。次にステップ２０にて、正規化された第２画像４０から第１画像３０が減算される。ステップ２２にて、出力画像４２は、寿命の短い蛍光体３６の分布のみを含み、寿命の長い蛍光体３４のパターンは失われる。このようにして、本発明の方法１０は、励起された蛍光体の減衰寿命を決定するのではなく、培地の構成物質の差異を通じてターゲット培地についての個々の情報を得る。
【００３６】
図５〜図７は、寿命フィッティングを用いないＴＲＦＩを実行するための本発明の第２の方法５０を示す。方法５０において、減衰強度は、蛍光体６４および６６の双方がいまだ減衰している間に二回ゲートを入れてサンプリングされる（図６参照）。図５および図６を参照すると、ステップ５２における励起パルスの後、二つの画像が取得される。第１画像７２は、ステップ５４にてパルス６８の後に取得され、その結果、高い蛍光強度を有する。第２画像７４は、ステップ５６にて第１画像７２の後に所定の間隔をあけて取得され、その結果、第１画像７２よりも低い強度を有する。
【００３７】
ステップ５８にて、第２画像７４は、第１画像７２により除算され、ステップ７６にて、二つの画像の比率を示す新しい画像７６が生成される。同じ種類の蛍光体の領域では、初期強度の値がいかなる値であったとしても、その比率は同じであろう。ステップ６２にて、画像処理ソフトウェアを通じて全ての画素に定数を乗算（例えば、図７では１００倍）することにより画像７８が生成されて相違点が強調される。画像７２における左側の領域は、寿命の短い蛍光体の領域を表す一方で、右側の二つの領域は寿命の長い蛍光体の分布である。画像７２および７４における全ての円形領域は異なる強度を有していることがわかるにも関わらず、単純な除算および増強の後において、これらの領域を明確に分類することができる。
【００３８】
図２から図７に示される方法１０および５０は、二つの蛍光体の画像化について示している。しかしながら、方法１０および５０は、複数回の減算を用いることにより、二以上の蛍光体で構成される試料に対しても用いることができることが理解される。単純化のため、例として蛍光体が二つの試料が単に用いられる。
【００３９】
図８は、本発明に係る寿命フィッティングを用いないＴＲＦＩの方法１０、５０を実装するための例示的なシステム１００を示す。システム１００は、励起パルス（例えば、図２のパルス３８および図６のパルス６８）を生成するように構成され、所望のターゲット培地（例えば、細胞組織）の蛍光体を励起するための特定の照明プロファイルを生成するように構成される光源１０２を備える。好ましい実施の形態において、詳細を後述するように、光源１０２はＬＥＤを備える。光源１０２は、遅延生成器１０８およびコンピュータ１０４に接続される。コンピュータ１０４は、励起される培地または試料１２０からの信号を受信するためのＣＣＤアレイ１１２に接続され、プロセッサは、アプリケーションソフトウェア１０６を実行するように構成される。
【００４０】
アプリケーションソフトウェア１０６は、光源１０２からのパルスを成形するとともに、励起される培地から取得される画像を評価してＴＲＦＩを実行するための方法１０および／または５０の工程を実行するように構成されるアルゴリズム／プログラミングを備える。光源１０２は、一連のフィルタ／レンズ１１８およびミラー１１６を介して、ターゲット試料１２０に向けて励起パルスを生成する。励起された試料１２０からの蛍光信号は、ＣＣＤアレイ１１２により検出される。一実施の形態において、ゲート付き光学画像増強器（ＧＯＩ；gated optical image intensifier）１１０およびＣＣＤカメラ１１２の組み合わせとして機能するｉＣＣＤカメラにより蛍光信号はゲートを入れられ、増強され、記録される。ＣＣＤからのデータは、その後、画像処理のためにコンピュータ１０４に転送され、表示のためにモニタ１１４に転送される。
【００４１】
図９Ａ〜図１１Ｃに参照されるように、ターゲット培地の試料成分としてフルオレセイン（Fluorescein）およびローダミンＢ（Rhodamine-B）を用いて本発明の方法１０、５０がテストされた。フルオレセインの寿命がｐＨ７．５のリン酸緩衝液の溶媒中において約４．０ｎｓである一方、ローダミンＢの寿命は水において約１．６８ｎｓである。しかしながら、寿命の値は、溶媒や濃度などの様々な要因で変化しうる。二つの材料は、隣り合って配置され、最初に本発明に係る減算方法１０を用いて画像化された。データに示されるように、二つのサンプリング画像の正規化および減算により他方の蛍光体から一方の蛍光体を検出することに成功した。図９Ａおよび図９Ｂは、二つのサンプリング画像を示し、図９Ａは蛍光体の双方がいまだ蛍光発光しているときに取得した画像であり、図９ＢはローダミンＢがゼロに減衰してフルオレセインのみがいまだ蛍光発光しているときに取得した画像である。図９Ｃは、図９Ａおよび９Ｂに対して正規化、減算および増強をした後の画像である。
【００４２】
方法５０についても同じ組み合わせの試料でテストした。二つの蛍光画像は、蛍光体の双方がいまだ蛍光発光している間に記録された。励起後の２６ｎｓおよび４０ｎｓにてサンプリングした画像がそれぞれ図１０Ａおよび図１０Ｂに示される。図１０Ｂの画像を図１０Ａの画像で除算し、定数を乗算することにより、図１０Ｃに示す画像を得た。図１０Ｃのデータ点は、図１０Ａおよび図１０Ｂの定数倍された比率を表す。
【００４３】
この比率の値は蛍光体の蛍光寿命に依存するため、蛍光信号の強度が均一に分布していない場合であっても異なる成分を識別できる。方法５０の能力は、さらに図１１Ａ〜１１Ｃに示される。試料を部分的に覆うために光学濃度（optical density）を用いた。その結果、蛍光信号の強度は、図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、サンプリング画像の両端において不均一となっている。しかしながら、本発明に係る方法５０を用いることにより、蛍光強度の不均一性の影響なしに、フルオレセインおよびローダミンＢを明瞭に区別する図１１Ｃの画像を取得した。
【００４４】
図１２は、本発明に係る例示的なパルス成形光源１０２を示す回路図である。照明源または照明回路１０２は、伝送ライン１４０、１４２を介してパルス発生器１３４に接続され、既存のＴＲＦＩシステムと同様に本発明の方法１０、５０に最適化された特定の照明強度プロファイルを生成（すなわち、パルス成形）するように構成される発光素子１３０を備える。回路１０２は、好ましくは、スタブライン１３６と、ＬＥＤ（light-emitting diode）ベースの発光素子１３０と、抵抗素子１３２と、を備える。
【００４５】
スタブライン１３６は、遅延ライン、つまり、負のループバックとして機能し、照明回路１０２の端子１４０、１４２に接続される。最終的な光学インパルスは、短絡スタブ１３６から反射されたパルスと、短絡スタブ１３６および伝送ライン１４０、１４２の間の分岐を越えて伝達されたパルスとの結合により形成される。
【００４６】
上述のパルス成形の構成を用いることにより、直線的に減衰する照明プロファイルの照明源、特に、ＬＥＤ１３０を備える照明源１０２を実現することができる。直線形の減衰パルスは、パルスの減衰の傾きがはっきりと定義されて限定されるため、好都合である。これにより、非線形な減衰形状と比較して、光学パルスのデコンヴォリューションをより容易な作業とすることができる。好ましい実施の形態において、パルスは、パルス幅よりも長い周期を有するように構成される。
【００４７】
回路が図１２に示すようなスタブラインを有するように構成されることが好ましいことが理解される。しかしながら、上述のコンセプトを用いたパルス成形が可能となる、いかなる要素を用いることができることが理解される。ＬＥＤ１３０の照明特性は、ＬＥＤのｐｎ接合の空乏領域における電子ホール対の再結合に支配される。所定の矩形パルスを用いる場合、ＬＥＤ強度の減衰は、再結合時間係数、つまり、指数減衰関数により記述される。制御されたリニア照明減衰プロファイル（または、他の形状）は、例えば、受動的な遅延ラインとして機能し、回路およびｐｎ接合における電荷を失わせるスタブライン１３６により実現することができる。スタブライン１３６（例えば、形状、長さおよび材料）および／またはパルスの特性を制御することにより、直線形の減衰照明プロファイルを実現できる。
【００４８】
以下に示す式２にしたがってスタブラインをモデル化しうる場合、所望の反射係数は、
【数２】
0006389763.tif 000003
となる。ここで、ΓＬは負荷の反射係数であり、ｌはライン長であり、βは位相定数（周波数に依存する）である。距離の計算において、スミスチャートを用いることができる。
【００４９】
直線形の減衰プロファイルが有利である一方で、パルス分離（pulse splitting）や様々な減衰プロファイルも実現できるように、本発明のシステムおよび方法が直線形の減衰に限られないことが理解される。
【００５０】
照明回路１０２は、発光素子１３０としてＬＥＤだけでなく、半導体レーザや非線形な光度減衰プロファイルを示すその他の半導体光源などの照明素子を駆動するために用いられてもよい。このようなシステムでは、明確に定義された線形に減衰する傾きを有する限定された光学パルスの実現は難しい。
【００５１】
ＬＥＤ１３０の動作は、空乏領域において本質的に指数的に減衰する特性を有するため、所定の矩形波の電気入力信号であっても、照明プロファイルの指数的な減衰が観察されるであろう。例えば、スタブライン１３６を介して、回路での立ち下がり時の電荷を失わせるために遅延ラインループを用いることは非常に効率的であり、ディスクリートもしくはモジュール化されたパルス照明システムへの展開も容易である。スタブライン１３６の長さおよび抵抗の調整能力は、パルスの初期強度において犠牲を払うことなく、立ち下がりの強度のみ直線形プロファイルへと減少させるという利点を有し、減衰プロファイルの形状の制御を理想的とする。
【００５２】
付属のパルス発生器１３４は、パルスの設定値を調整可能として照明回路１０２を駆動する能力を有し、例えば、パルスの長さ、強度および繰り返し周波数が調整可能である。ＴＲＦＩを実行するための本発明の方法１０および５０に用いる場合、回路１０２から生成されるパルス幅は、主に０．５ナノ秒（ｎｓ）以上の範囲であり、好ましくは、１ｎｓ〜２０ｎｓの範囲であり、より好ましくは、約１０ｎｓである。このパルス幅の範囲は、蛍光寿命測定用（一般的にピコ秒の範囲）の典型的なレーザーパルスシステムよりも著しく長く、ＬＥＤのような比較的高価ではない光源の使用を可能とする。この範囲は、評価される培地（例えば、細胞組織の種類やデューティサイクルやパワーなどの他の要素／パラメータ）にしたがって変化しうることが理解される。一般的に、パルスを短くすると、画像化にかかる時間が長くなる。したがって、既存のパルスレーザシステムでは多くの場合に１分以上かかる一方で、本発明の方法１０、５０は、ＬＥＤのような「高性能」ではない照明源を用いるにも関わらず、１秒未満で培地を対比しうる。
【００５３】
蛍光寿命顕微法（ＦＬＩＭ；fluorescence lifetime imaging microscopy）に関して、本発明のパルスＬＥＤ回路１０２を用いる蛍光寿命の測定は、既存のパルスレーザーシステムに対する安価な代替手段を提供する。ＦＬＩＭに本発明のパルスＬＥＤ回路１０２を用いることで、より良い測定を与えるためのパルス分析を単純化することにより優れた分析を実現し、蛍光寿命を計算する場合のデコンボリューション誤差を克服する。本発明のパルスＬＥＤ回路１０２から生成される直線形の光度減衰プロファイルは、生画像においてより良い対比を実現し、分析を単純化し、画像処理に必要な計算能力を減少させる。
【００５４】
図１３〜図１６に参照されるように、従来技術として用いられる典型的な指数形減衰励起パルスを用いる場合に対して、ＬＥＤパルス回路１０２を用いて生成される直線形減衰プロファイルが持つ優位性を示すための一連の実験がなされた。テストは、二つの既知の試料の測定パルスをシミュレーションすることにより実施された。
【００５５】
図１３は、それぞれ２ｎｓおよび２．５ｎｓの指数減衰係数を有する二つのサンプルとともに、第１の指数関数形パルス（減衰係数１０ｎｓ）と、第２の直線形パルス（傾き１０ｎｓ）の二つの励起パルスのプロットを示す。全ての信号は、強度のばらつきを除外し、寿命の違いによる影響のみの変化を強調するために正規化されている。
【００５６】
図１４は、二つの試料のそれぞれの励起パルスのコンボリューション積を示しており、ＦＬＩＭシステムにて実際に測定される信号を模擬した四つの減衰曲線を形成する。
【００５７】
図１５は、本発明の方法５０にしたがって正規化した後の二つの試料のプロットを示し、直線形減衰と指数形減衰の双方を有する。図１５は、それぞれの時間点における初期強度に対する蛍光発光の比率を得るために、減衰のそれぞれの点を初期（最大）強度により除算した結果を示している。寿命の違いのみに起因した四つの比率がプロットとして示されており、プロットのそれぞれの点は、最大強度が１であり、正規化画像を形成する除算の結果である。これにより、強度の相違を除外することができ、それぞれの信号の寿命特性の違いのみが示される。
【００５８】
図１６は、直線形および指数形の減衰の双方を有する励起パルスのための本発明の方法１０に係る同じ励起源から得られた二つの信号の減算のプロットを示す。図１６は、それぞれの励起源の間の差の比率を示し、二つのグラフとして示されている。それぞれのグラフは、同じ励起関数（例えば、直線形と指数形）を有する二つの比率の減算の結果である。より差異の明確な画像を生成するためには、より大きな相違であることが好ましい。図１６に示されるように、光源１０２からの直線形励起パルス（グラフの実線）の差は、指数形励起パルス（グラフの破線）よりも、信号対雑音比が高い状態となる範囲（４ｎｓ〜１２ｎｓ）において明確に大きい。絶対値において、指数形減衰パルスは、本発明のシステムから生成される直線形減衰パルスをいかなる時間においても上回ることができない。これにより、ＦＬＩＭシステムにおける指数関数形パルスに対する、本発明の直線形変調の励起パルスを用いることの優位性が示される。
【００５９】
上述したように、本発明の方法は、蛍光寿命の抽出を必要としない時間分解蛍光画像を取得する能力を有する。ＴＲＦＩシステムにおいて、追加の調整は必要としない。しかしながら、本発明のパルス成形光源は、本発明の方法を実行する上で特に有益となりうる。従来のＴＲＦＩと比較して、本発明のシステムおよび方法は、信頼性があり、シンプルで、直接的で、かつ、時間を節約する。
【００６０】
本発明の一態様においては、本発明のシステムおよび方法は、特に生物医学的な応用での画像化に適している。このような応用として、（１）内視鏡的および顕微鏡的な広範囲の画像検査に使われるがん検出、（２）コラーゲンやエラスチンの比率を決定するための美容的応用、および、（３）法医学における未知物質の特定を含みうるが、これらに限られるものではない。
【００６１】
しかしながら、本発明のシステムおよび方法が、時間分解蛍光法が予期されるいかなる用途、特に培地中での差異を得ることが目的となる用途にも用いられうることが理解される。このような使用は、燃焼やガスなどへの分光といった非生物医学的な用途を含みうる。ＣＣＤ１１２は、望遠鏡、顕微鏡、一眼レフ（ＳＬＲ；single lens reflex）カメラ、または、多くの異なる用途における同様のもの等の様々な対象と接続されうる。
【００６２】
本発明のシステムおよび方法は、時間分解蛍光画像を得るための、より早く、より単純で、かつ、より信頼性のある手段を提供する。蛍光寿命を抽出するための減衰曲線の調整は難しく、時間がかかり、かつ、信頼性が低い。本発明の方法は、蛍光寿命の値を抽出する代わりに、画像の範囲内で相対的な寿命の高速決定を提供する。これは、画像の全ての点においてＸ線が吸収または透過される能力を相対的に見るＸ線の画像化と同様である。
【００６３】
本発明の実施の形態は、本発明の実施の形態に係る方法およびシステムを示すフローチャート、および／または、アルゴリズム、数式、もしくは、コンピュータプログラム製品としても実装されうるその他の計算表現により記述されうる。その場合、フローチャートのそれぞれのブロックまたはステップ、および、フローチャート、アルゴリズム、数式または計算表現におけるブロック（および／またはステップ）の組み合わせは、ハードウェハ、ソフトウェア、および／または、コンピュータにて読取可能なプログラム・コード・ロジックに具体化される一以上のコンピュータプログラム指令などの様々な方法で実装することができる。理解されるであろうように、このようなコンピュータプログラム指令は、限定されない汎用コンピュータもしくは特殊用コンピュータを含むコンピュータ、または、その他のプログラム可能な処理装置に読み込まれ、そのコンピュータプログラム指令がコンピュータまたは他のプログラム可能な処理装置上で実行されてフローチャートのブロックに特定される機能を実現するための手段を生成するような機構を生み出す。
【００６４】
したがって、フローチャートのブロック、アルゴリズム、数式または計算表現は、特定の機能を実行する手段の組み合わせ、特定の機能を実行するステップの組み合わせ、および、コンピュータにて読取可能なプログラム・コード・ロジック手段に具体化されるもの等の特定の機能を実行するコンピュータプログラムをサポートする。フローチャートに示されるそれぞれのブロック、アルゴリズム、数式もしくは計算表現、および、ここに記載するこれらの組み合わせは、特定の機能もしくはステップを実行する特殊用途のハードウェアベースのコンピュータシステムまたは特殊用途のハードウェアおよびコンピュータにて読取可能なプログラム・コード・ロジック手段の組み合わせにより実装できることも理解されるであろう。
【００６５】
さらに、コンピュータにて読取可能なプログラム・コード・ロジックに具体化されるもの等のこれらのコンピュータプログラム指令は、コンピュータにて読取可能なメモリにも記憶され、コンピュータまたはプログラム可能な処理装置が特定の方法で機能するように指令し、コンピュータにて読取可能なメモリに記憶されるその指令がフローチャートのブロックにて特定される機能を実装する指令手段を含む製品を生み出すようにする。コンピュータプログラム指令は、コンピュータまたは他のプログラム可能な処理装置にも読み込まれ、コンピュータまたは他のプログラム可能な処理装置にて一連の動作ステップが実行されるようにし、コンピュータまたは他のプログラム可能な処理装置にて実行される指示がフローチャートのブロック、アルゴリズム、数式もしくは計算表現にて特定される機能を実行するためのステップを提供するように、コンピュータにより実行されるプロセスを生み出す。
【００６６】
上述の記載から、本発明は、以下の態様を含む、様々な態様に具現化されることが理解されるであろう。
【００６７】
１．試料培地を画像化する方法であって、この方法は、試料培地を励起光パルスで励起するステップと、培地の第１画像を生成するステップであって前記第１画像が少なくとも培地の第１成分に対応する第１蛍光体および培地の第２成分に対応する第２蛍光体に関連するデータを備え、第１蛍光体が第２蛍光体よりも長い蛍光寿命を有するステップと、前記第１画像から特定の時間後に培地の第２画像を生成するステップであって前記第２画像が少なくとも第１蛍光体に関連するデータを備えるステップと、培地に含まれる第１成分および第２成分の差異を特定するために第１画像および第２画像の関数としての第３画像を生成するステップと、を備える。
【００６８】
２．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、第２画像は、第２蛍光体に関連するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２蛍光体の減衰後に生成され、第３画像を生成するステップは、第１蛍光体に関するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２画像から第１画像を減算するステップを備える。
【００６９】
３．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、第２画像から第１画像を減算する前に、第２画像が第１画像の強度に正規化される。
【００７０】
４．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、第２画像は、第１蛍光体および第２蛍光体がいまだ減衰している間に生成され、第２画像は、第２蛍光体に関連するデータをさらに備え、第３画像を生成するステップは、第２画像を第１画像で除算するステップを備える。
【００７１】
５．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、この方法は、第３画像に定数を乗算するステップをさらに備える。
【００７２】
６．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、試料培地は、ヒト組織を備える。
【００７３】
７．試料培地を画像化するシステムであって、このシステムは、（ａ）プロセッサと、（ｂ）前記プロセッサ上で実行されるプログラミングであって、（ｉ）試料培地を励起光パルスで励起するステップと、（ｉｉ）培地の第１画像を生成するステップであって、前記第１画像が少なくとも培地の第１成分に対応する第１蛍光体および培地の第２成分に対応する第２蛍光体に関連するデータを備え、第１蛍光体が第２蛍光体よりも長い蛍光寿命を有するステップと、（ｉｉｉ）前記第１画像から特定の時間後に培地の第２画像を生成するステップであって、前記第２画像が少なくとも第１蛍光体に関連するデータを備えるステップと、（ｉｖ）培地に含まれる第１成分および第２成分の差異を特定するために、第１画像および第２画像の関数としての第３画像を生成するステップと、を実行するように構成されるプログラミングと、を備える。
【００７４】
８．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、第２画像は、第２蛍光体に関連するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２蛍光体の減衰後に生成され、第３画像を生成するステップは、第１蛍光体に関するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２画像から第１画像を減算するステップを備える。
【００７５】
９．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、第２画像から第１画像を減算する前に、第２画像が第１画像の強度に正規化される。
【００７６】
１０．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、第２画像は、第１蛍光体および第２蛍光体がいまだ減衰している間に生成され、第２画像は、第２蛍光体に関連するデータをさらに備え、第３画像を生成するステップは、第２画像を第１画像で除算するステップを備える。
【００７７】
１１．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、プログラミングは、第３画像に定数を乗算するステップをさらに実行するように構成される。
【００７８】
１２．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、試料培地は、ヒト組織を備える。
【００７９】
１３．試料培地の時間分解蛍光画像化のための装置であって、この装置は、培地に向けて励起パルスを生成するように構成される発光素子と、伝送ラインを介して発光素子に接続されるパルス発生器と、伝送ラインに接続される遅延ラインと、を備え、遅延ラインは、励起パルスの減衰プロファイルを成形するために伝送ラインに向けて反射パルスを生成するように構成される。
【００８０】
１４．上述のいずれかの実施の形態に係る装置であって、遅延ラインは、発光素子中の立ち下がり時の電荷を失わせるための受動的な負のループバックとして機能する。
【００８１】
１５．上述のいずれかの実施の形態に係る装置であって、遅延ラインは、スタブラインを備える。
【００８２】
１６．上述のいずれかの実施の形態に係る装置であって、遅延ラインからの反射パルスは、制御された直線形減衰照明プロファイルを有する励起パルスを生成するように構成される。
【００８３】
１７．上述のいずれかの実施の形態に係る装置であって、スタブラインの形状および大きさは、減衰照明プロファイルの形状を制御するように構成される。
【００８４】
１８．上述のいずれかの実施の形態に係る装置であって、発光素子は、ＬＥＤを備える。
【００８５】
１９．上述のいずれかの実施の形態に係る装置であって、培地は、ヒト組織を備え、放射される励起パルスは、０．５ｎｓよりも大きいパルス幅を有する。
【００８６】
２０．上述のいずれかの実施の形態に係る装置であって、放射される励起パルスは、１ｎｓから２０ｎｓの範囲のパルス幅を有する。
【００８７】
２１．上述のいずれかの実施の形態に係る装置であって、放射される励起パルスは、約１０ｎｓのパルス幅を有する。
【００８８】
２２．培地の時間分解蛍光画像化を実行するためのシステムであって、このシステムは、（ａ）照明源であって、前記照明源が、（ｉ）培地に向けて励起パルスを生成するように構成される発光素子と、（ｉｉ）伝送ラインを介して発光素子に接続されるパルス発生器と、（ｉｉｉ）伝送ラインに接続される遅延ラインと、を備え、（ｉｖ）遅延ラインが、励起パルスの減衰プロファイルを成形するために伝送ラインに向けて反射パルスを生成するように構成される、照明源と、（ｂ）励起された培地からの一以上の信号を受信するように構成される検出器と、（ｃ）検出器に接続されるプロセッサと、（ｄ）プロセッサ上で実行可能とされ、励起された培地からの一以上の信号を分析するように構成されるプログラミングと、を備える。
【００８９】
２３．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、遅延ラインは、発光素子中の立ち下がり時の電荷を失わせるための受動的な負のループバックとして機能する。
【００９０】
２４．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、遅延ラインは、スタブラインを備える。
【００９１】
２５．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、遅延ラインからの反射パルスは、制御された直線形減衰照明プロファイルを有する励起パルスを生成するように構成される。
【００９２】
２６．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、スタブラインの形状および大きさは、減衰照明プロファイルの形状を制御するように構成される。
【００９３】
２７．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、発光素子は、ＬＥＤを備える。
【００９４】
２８．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、放射される励起パルスは、０．５ｎｓよりも大きいパルス幅を有する。
【００９５】
２９．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、放射される励起パルスは、１ｎｓから２０ｎｓの範囲のパルス幅を有する。
【００９６】
３０．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、プログラミングは、さらに、培地の第１画像を生成するステップであって前記第１画像が少なくとも培地の第１成分に対応する第１蛍光体および培地の第２成分に対応する第２蛍光体に関連するデータを備え、第１蛍光体が第２蛍光体よりも長い蛍光寿命を有するステップと、前記第１画像から特定の時間後に培地の第２画像を生成するステップであって前記第２画像が少なくとも第１蛍光体に関連するデータを備えるステップと、培地に含まれる第１成分および第２成分の差異を特定するために第１画像および第２画像の関数としての第３画像を生成するステップと、を実行するように構成される。
【００９７】
３１．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、第２画像は、第２蛍光体に関連するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２蛍光体の減衰後に生成され、第３画像を生成するステップは、第１蛍光体に関するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２画像から第１画像を減算するステップを備える。
【００９８】
３２．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、第２画像から第１画像を減算する前に、第２画像が第１画像の強度に正規化される。
【００９９】
３３．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、第２画像は、第１蛍光体および第２蛍光体がいまだ減衰している間に生成され、第２画像は、第２蛍光体に関連するデータをさらに備え、第３画像を生成するステップは、第２画像を第１画像で除算するステップを備える。
【０１００】
３４．上述のいずれかの実施の形態に係るシステムであって、プログラミングは、第３画像に定数を乗算するステップをさらに実行するように構成される。
【０１０１】
３５．試料培地の時間分解蛍光画像化のための方法であって、この方法は、パルス発生器を伝送ラインを介して発光素子に接続するステップと、伝送ラインに向けてパルスを生成するステップと、受動的な反射パルスと生成されたパルスとを結合させるステップと、発光素子から励起パルスを放射するステップと、を備え、反射パルスは、励起パルスの減衰プロファイルを成形するように構成される。
【０１０２】
３６．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、反射パルスは、伝送ラインに接続される遅延ラインから生成され、遅延ラインは、発光素子中の立ち下がり時の電荷を失わせるための受動的な負のループバックとして機能する。
【０１０３】
３７．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、遅延ラインは、スタブラインを備える。
【０１０４】
３８．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、反射パルスは、制御された直線形減衰照明プロファイルを有する励起パルスを生成するように構成される。
【０１０５】
３９．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、スタブラインの形状および大きさは、減衰照明プロファイルの形状を制御するように構成される。
【０１０６】
４０．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、発光素子は、ＬＥＤを備える。
【０１０７】
４１．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、培地は、ヒト組織を備え、放射される励起パルスは、０．５ｎｓよりも大きいパルス幅を有する。
【０１０８】
４２．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、放射される励起パルスは、１ｎｓから２０ｎｓの範囲のパルス幅を有する。
【０１０９】
４３．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、この方法は、培地の第１画像を生成するステップであって前記第１画像が少なくとも培地の第１成分に対応する第１蛍光体および培地の第２成分に対応する第２蛍光体に関連するデータを備え、第１蛍光体が第２蛍光体よりも長い蛍光寿命を有するステップと、前記第１画像から特定の時間後に培地の第２画像を生成するステップであって前記第２画像が少なくとも第１蛍光体に関連するデータを備えるステップと、培地に含まれる第１成分および第２成分の差異を特定するために第１画像および第２画像の関数としての第３画像を生成するステップと、をさらに備える。
【０１１０】
４４．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、第２画像は、第２蛍光体に関連するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２蛍光体の減衰後に生成され、第３画像を生成するステップは、第１蛍光体に関するデータが第２画像に存在しないこととなるように第２画像から第１画像を減算するステップを備える。
【０１１１】
４５．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、第２画像から第１画像を減算する前に、第２画像が第１画像の強度に正規化される。
【０１１２】
４６．上述のいずれかの実施の形態に係る方法であって、第２画像は、第１蛍光体および第２蛍光体がいまだ減衰している間に生成され、第２画像は、第２蛍光体に関連するデータをさらに備え、第３画像を生成するステップは、第２画像を第１画像で除算するステップを備える。
【０１１３】
上述の内容は多くの詳細を含むが、これらは発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではなく、本発明の現時点において好ましい実施の形態のいくつかを説明するものと解釈されるべきである。したがって、本発明の範囲は当業者にとって明らかとなりうる他の実施の形態を完全に包含し、その結果、本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定され、請求項において単数形の要素への言及は、明白に言及する場合を除いて唯一であることを意味するのではなく、むしろ、一以上であることを意味することが意図されることが理解されよう。上述した好ましい実施の形態の要素と構造的、化学的および機能的に等価であると当業者に知られているものの全ては、参照により明示的に本明細書に組み込まれ、本請求項に包含されることが意図される。さらに、本発明により解決されるべき課題のそれぞれおよび全てに対して装置または方法が対処する必要はなく、本請求項によりそれが包含される必要もない。さらに、本開示における要素、構成または方法のステップが請求項に明白に列挙されているか否かにかかわらず、全ての要素、構成または方法のステップは、公衆一般に捧げることを意図しない。本明細書における請求項の要素はいずれも、その要素が"means for"の語を用いて明白に列挙されていない限り、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条第６項が適用されないと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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