(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＢＨＤ２遺伝子の発現を抑制するための次の（ａ）及び（ｂ）を含む二本鎖核酸分子を有効成分として含む前立腺癌の予防又は治療剤。
（ａ）配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９又は２１に示される、配列番号２〜８のいずれかに示される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖
【請求項２】
二本鎖核酸分子の各鎖の３´末端が、２塩基〜６塩基突出した突出末端である請求項１に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
【請求項３】
二本鎖核酸分子の長さが、２３塩基から２９塩基の少なくともいずれかである請求項１または２に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
【請求項４】
二本鎖核酸分子が二本鎖ＲＮＡである請求項１〜３のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
【請求項５】
二本鎖核酸分子がｓｉＲＮＡである請求項４に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
【請求項６】
前立腺癌細胞の増殖を抑制するための請求項１〜５のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌の判定、治療選択方法、予防又は治療剤に関する。さらに詳しくはＡＢＨＤ２（Ａｂｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２；ＡＢＨＤ２（以下、単にＡＢＨＤ２と示す場合がある））遺伝子の発現に基づく、前立腺癌の判定、治療選択方法や、この発現の抑制による前立腺癌の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化及び人口の高齢化に伴い、日本においても前立腺癌の患者数が飛躍的に増加している。前立腺癌の治療技術には、臨床的には前立腺摘出術を始めとする外科的治療、抗癌剤による化学療法及び放射線治療が広く利用されている。
治療方法のうちでも外科的治療が第一に選択されるが、すでに癌が進行した状態で診断された場合や、外科手術後の再発などにより外科的手術が困難な場合においてはその他の治療法が選択される。
【０００３】
一般に前立腺癌細胞はアンドロゲンによって刺激され、増殖することが知られている。そのためアンドロゲンの産生や機能を阻害するホルモン療法もしばしば行われている。これは、精巣を両側とも摘除する手術や、ＬＨＲＨアナログを用いて精巣から分泌される血液中の男性ホルモン値を低下させ、さらに、微量に分泌されている副腎由来アンドロゲンを内服薬で除去するものである。
このホルモン療法は、効果が極めてよいものの、数年以内にアンドロゲン非依存性前立腺癌（Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，ＣＲＰＣ）として再燃することが問題となっており、前立腺癌の治療において、このアンドロゲン非依存性前立腺癌の制御が最も重要な課題となっている。
【０００４】
アンドロゲン非依存性前立腺癌は、アンドロゲンレセプター（Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＡＲ（以下、単にＡＲと示す場合がある））の変異あるいは増幅により、超低濃度のアンドロゲン、抗アンドロゲン剤、その他のステロイドホルモンなどに感受性を示すことが示唆されている。しかし、このメカニズム等はいまだ不明であり、現状ではドセタキセルを用いた抗がん剤療法が唯一の治療法とされている。しかし、この治療法によって、効果を示す症例は限定的であり、事前にその効果を予測することもできないことから、効果の予測に有用なマーカーの提供が望まれている。
【０００５】
また、アンドロゲン非依存性前立腺癌への進行を妨げるべく、アンドロゲン依存性の前立腺癌に対してホルモン療法以外の有効な治療法の提供も望まれている。
ＡＲを発現している前立腺癌細胞が、アンドロゲン応答遺伝子の発現を亢進していることから、近年では、アンドロゲン応答遺伝子に対してアンチセンス核酸等を投与して、これらの遺伝子の発現を不安定化することにより、前立腺癌を治療する方法等が開発されている。しかし、アンチセンス核酸等は生体内で分解され易く、不安定であるため、前立腺癌の治療において十分な方法とはいえなかった。
【０００６】
そこで、本発明者らは、生体内においても安定性が高いＰＩポリアミドに着目し、アンドロゲン応答遺伝子であるＴＭＰＲＳＳ２と転写制御因子であるＥＴＳ  ｆａｍｉｌｙのＥＧＲ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制するＰＩポリアミド（特許文献１、参照）等を開発し、前立腺癌の予防、治療等への有用性を確認している。
【０００７】
本発明者らはさらに、網羅的な前立腺癌の予防、治療等を可能とすることを目的として検討を行った結果、本発明において、新たなＡＲの標的遺伝子の一つとして、ＡＢＨＤ２遺伝子を見出した。
ＡＢＨＤ２遺伝子はリン脂質代謝に関わり、肺胞構造の構築に影響を及ぼしている事が知られているが、その詳細な機能は不明である。また、特許文献２において、前立腺癌（ＰＲＣ）細胞において過剰発現している遺伝子を網羅的に解析した結果、その遺伝子の一つとしてＡＢＨＤ２遺伝子が挙げられているものの、前立腺癌との具体的な関連については不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１３−２３４１３５号公報
【特許文献２】特表２００６−５００９５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。
即ち、本発明は、アンドロゲン依存性の前立腺癌に対して有効な新たな治療法の提供を課題とする。また、アンドロゲン非依存性前立腺癌の治療による効果を予測するために有用なマーカーを提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、新たなＡＲの標的遺伝子の一つとして見出されたＡＢＨＤ２遺伝子に着目するに至った。
本発明者らは本発明において、前立腺癌の診断を目的として生検した検体にＡＢＨＤ２遺伝子が高発現している場合、その後の治療経過において有意にドセタキセル治療に反応せず、前立腺癌の再燃（ＰＳＡ再発）を起こすことを見出した。そこで、このＡＢＨＤ２遺伝子の発現をマーカーとすることで、前立腺癌の治療による効果が事前に予測できることを見出し、本発明を完成するに至った。
また、本発明者らは、このＡＢＨＤ２遺伝子が、前立腺癌の進行を促進させ、現在進行性前立腺癌（去勢抵抗性前立腺癌）の唯一の治療薬であるドセタキセルに抵抗性を持つ遺伝子である事を見出したことから、このＡＢＨＤ２遺伝子の発現を抑制し得るｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子を作製し、これによって前立腺癌の進行が抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は次の（１）〜（９）に記載の前立腺癌の予防又は治療剤や、前立腺癌の治療効果を判定するためのマーカー等に関する。
（１）ＡＢＨＤ２遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子を有効成分として含む前立腺癌の予防又は治療剤。
（２）二本鎖核酸分子が次の（ａ）及び（ｂ）を含む二本鎖核酸分子である上記（１）に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（ａ）配列番号２〜８のいずれかに示される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖
（３）二本鎖核酸分子の各鎖の３´末端が、２塩基〜６塩基突出した突出末端である上記（２）に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（４）二本鎖核酸分子の長さが、２３塩基から２９塩基の少なくともいずれかである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（５）二本鎖核酸分子が二本鎖ＲＮＡである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（６）二本鎖核酸分子がｓｉＲＮＡである上記（５）に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（７）前立腺癌細胞の増殖を抑制するための上記（１）〜（６）のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（８）被験動物由来の生物学的試料におけるＡＢＨＤ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸を前立腺癌の判定マーカーとする、被験動物における前立腺癌のリスクを判定する方法。
（９）ＡＢＨＤ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸からなる前立腺癌の判定マーカー。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の判定マーカーの提供により、新たな前立腺癌の診断、治療選択法を提供することも可能となる。さらに、本発明のＡＢＨＤ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子の提供により、前立腺癌の治療において有用な新たな治療剤、治療方法等の提供が可能となる。また、本発明の二本鎖核酸分子と、前立腺癌の治療に有効とされるＰＩポリアミド等を組み合わせることにより、前立腺癌の網羅的な治療等も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）前立腺癌組織内におけるＡＢＨＤ２遺伝子の発現と癌特異的生存率との関連性を評価した結果を示した図である（実施例１）。（Ｂ）前立腺癌組織内におけるＡＢＨＤ２遺伝子の発現とドセタキセル導入後のＰＳＡ非再発率との関連性を評価した結果を示した図である（実施例１）。（Ｃ）根治的前立腺全摘術により得られた前立腺癌検体における免疫染色の結果を示した図である（実施例１）。（Ｄ）経直腸的前立腺生検術で得られた前立腺癌検体における免疫染色の結果を示した図である（実施例１）。
【図２】二本核酸分子によるＡＢＨＤ２遺伝子発現抑制効果の検討結果を示した図である（実施例３）。
【図３】二本核酸分子によるＬＮＣａＰ細胞増殖抑制効果の検討結果を示した図である（実施例４）。
【図４】ドセタキセルとの併用における二本核酸分子によるＬＮＣａＰ細胞の増殖抑制効果の検討結果を示した図である（実施例５）。
【図５】二本核酸分子によるＬＮＣａＰ細胞の遊走能抑制効果の検討結果を示した図である（実施例６）。
【図６】二本核酸分子による腫瘍増殖抑制効果の検討における写真を示した図である（実施例７）。
【図７】二本核酸分子による腫瘍増殖抑制効果の検討結果を示した図である（実施例７）。
【図８】二本核酸分子による腫瘍増殖抑制効果の検討におけるＡＢＨＤ２蛋白量の解析結果を示した図である（実施例７）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」とは、ＡＢＨＤ２遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子を有効成分として含む剤であり、この二本鎖核酸分子により、ＡＢＨＤ２遺伝子の発現を抑制することにより前立腺癌を予防又は治療できる剤のことをいう。
前立腺癌の予防又は治療が可能な剤であれば、有効成分の他にその他の成分や医薬として許容される担体等を含んでいても良い。
【００１５】
前記「ＡＢＨＤ２遺伝子」は、リン脂質代謝に関わり、肺胞構造の構築に影響を及ぼしている事が知られている。本発明において「ＡＢＨＤ２遺伝子」は、そのｍＲＮＡ配列が前記二本鎖核酸分子の標的となり、前記二本鎖核酸分子によってその発現が抑制されることから、前記二本鎖核酸分子の「標的遺伝子」と示されることがある。
なお、参考として、ヒトの前記「ＡＢＨＤ２遺伝子」の塩基配列を配列番号１に示す。
【００１６】
本発明の「二本鎖核酸分子」とは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖の核酸分子のことをいう。
本発明の「二本鎖核酸分子」は、ＡＢＨＤ２遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖核酸分子であれば、いずれのヌクレオチド配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖からなる「二本鎖核酸分子」であっても良い。
本発明のこのような「二本鎖核酸分子」は、次の（ａ）及び（ｂ）を含む二本鎖核酸分子であることが特に好ましい。
（ａ）配列番号２〜８のいずれかに示される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖
これらのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ＲＮＡ鎖であってもよく、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ鎖等であってもよい。これらのセンス鎖とアンチセンス鎖が互いにハイブリダイズすることで本発明の「二本鎖核酸分子」を形成することができる。
【００１７】
本発明の「二本鎖核酸分子」は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ等であってもよい。
「二本鎖ＲＮＡ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡ配列からなる二本鎖核酸分子のことをいう。また、「二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡとＤＮＡとのキメラ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいう。
【００１８】
本発明の「二本鎖核酸分子」が二本鎖ＲＮＡである場合、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）であることが特に好ましい。
「ｓｉＲＮＡ」とは、１８〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、標的遺伝子のｍＲＮＡに対して相補的な配列を有するアンチセンス鎖（ガイド鎖）が、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
本発明における「ｓｉＲＮＡ」は、ＡＢＨＤ２遺伝子を標的遺伝子とし、この標的遺伝子の発現を抑制し得るものであれば、その末端構造に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明の「ｓｉＲＮＡ」は、平滑末端を有するものであってもよく、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
本発明の「ｓｉＲＮＡ」は、特に、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端が２〜６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。
【００１９】
また、本発明の「二本鎖核酸分子」が二本鎖ＲＮＡである場合、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であってもよい。
「ｓｈＲＮＡ」とは、１８〜２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３〜９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであり、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
本発明における「ｓｈＲＮＡ」の末端構造も、本発明の「ｓｉＲＮＡ」と同様に目的に応じて適宜選択することができ、平滑末端を有するものであってもよく、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
【００２０】
さらに、本発明の「二本鎖核酸分子」が「二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ」である場合、これはキメラｓｉＲＮＡであることが特に好ましい。
「キメラｓｉＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ配列の一部がＤＮＡに変換された、１８〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラをいう。特に、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’側の８塩基、及び、アンチセンス鎖の５’側の６塩基がＤＮＡに変換された、２１〜２３塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラであることが好ましい。
本発明における「キメラｓｉＲＮＡ」の末端構造も、本発明の「ｓｉＲＮＡ」と同様に目的に応じて適宜選択することができ、平滑末端を有するものであってもよく、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
【００２１】
本発明の「二本鎖核酸分子」は、目的に応じて、適宜修飾を有するものであってもよい。例えば、「二本鎖核酸分子」に、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ化修飾や、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）修飾等を施し、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性の付与や、培養液や生体中における安定性を向上させることができる。
また、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、又は３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施し、細胞への導入効率を高めることもできる。
このような修飾は、従来知られているいずれかの方法によって、適宜行うことができる。
【００２２】
このような、本発明の「二本鎖核酸分子」は、従来知られているいずれかの方法によって、適宜作成することができる。例えば、「二本鎖核酸分子」が「ｓｉＲＮＡ」である場合、センス鎖及びアンチセンス鎖に相当する１８〜２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を利用する等して化学的に合成し、これらをアニーリングすることによって作製することができる。
また、本発明における「ｓｉＲＮＡ」は、合成受託会社に合成を依頼して作製されたものであっても良く、市販品の二本鎖ｓｉＲＮＡであっても良い。さらに、ｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、この発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用して作製した「ｓｉＲＮＡ」であっても良い。
本発明の「二本鎖核酸分子」が「キメラｓｉＲＮＡ」である場合は、例えば、キメラ核酸分子であるセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ化学的に合成し、これらをアニーリングすることによって作製することができる。
【００２３】
このような本発明の「二本鎖核酸分子」のうち、前記「（ａ）配列番号２〜８のいずれかに示される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖」として、例えば、配列番号９，１１、１３、１５、１７、１９又は２１に示されるセンス鎖を挙げることができる。
また、「（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖」としては、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０又は２２に示されるアンチセンス鎖を挙げることができる。
さらに本発明の「二本鎖核酸分子」として、ＡＢＨＤ２遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖核酸分子である、配列番号２３、２５、２７に示されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、その相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖として、配列表２４、２６、２８に示されるアンチセンス鎖を挙げることもできる。
【００２４】
このような本発明の「二本鎖核酸分子」を有効成分として含むことで本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」を得ることができる。
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」はこの有効成分のみからなる剤であってもよく、この有効成分以外にその他の成分を含むものであっても良い。
「その他の成分」としては、本発明の有効成分の効果を維持又は向上できる成分であれば、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明の「二本鎖核酸分子」を所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤や、対象とする細胞内に導入（トランスフェクト）するためのトランスフェクション試薬などが挙げられる。
これらのその他の成分の含有量も、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２５】
また、「その他の成分」として、例えば、医薬として許容され得る担体を含むことができ、このような担体としても、特に制限はなく、剤型等に応じて適宜選択することができ、その含有量も、目的に応じて適宜選択することができる。
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」の医薬としての剤型は、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。このような剤型として、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、又は吸入散剤などが挙げられる。
これらの剤には、目的に応じて、従来知られている賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、基剤、湿潤剤、保存剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等の添加剤を加えることができ、各剤型も従来知られている方法によって製造することができる。
【００２６】
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」は、投与対象動物に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトを対象とすることが特に好ましい。
また、この投与方法も、特に制限はなく、剤型、前立腺癌患者の状態等に応じて、本発明の剤を腫瘍部位等に直接投与する局所投与や、経口投与等により、全身投与することもできる。
この剤の投与量は、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。例えば、成人を投与対象とする場合は、１日の投与あたり、有効成分（二本鎖核酸分子）の量が１０〜１５ｍｇとなることが好ましい。
また、この剤の投与回数も、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果等に応じて、適宜選択することができる。
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」は、前立腺癌の予防又は治療を対象として投与時期を適宜選択することができる。
【００２７】
また、本発明の「被験動物における前立腺癌のリスクを判定する方法」とは、例えば、ヒトを被験動物とした際に、そのヒト由来の前立腺組織や該組織から抽出したタンパク質、核酸等を生物学的試料とし、該試料に含まれるＡＢＨＤ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸を定性的又は定量的に測定することにより、前立腺癌のリスクを判定する方法のことをいう。
上記のような生物学的試料に含まれるＡＢＨＤ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸の量が多いほど、前立腺癌に罹患するリスクや、既に罹患しているリスクが高く、罹患している場合は将来、治療抵抗性前立腺癌になるリスクが高いと判定することができる。
この判定にあたり、「ＡＢＨＤ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸」を前立腺癌の「判定マーカー」として用いることができる。
この「判定マーカー」が「ＡＢＨＤ２蛋白質もしくはその断片」である場合は、ＡＢＨＤ２抗体等を用いて、定性的又は定量的に測定することができる。また、「判定マーカー」が「これらをコードする核酸」である場合は、この核酸に相補的な核酸を含むプローブや、この核酸をＲＴ-ＰＣＲ等で増幅可能なプライマーを用いて増幅することにより、定性的又は定量的に測定することができる。
この「被験動物における前立腺癌のリスクを判定する方法」によって得られた結果から、前立腺癌の治療方法を選択することも可能となる。
【００２８】
本発明において、手術不能な進行性前立腺癌患者から得られた検体のうち、ホルモン抵抗性進行性前立腺癌に対するドセタキセル導入後のＰＳＡ再発率が高い検体において、特にＡＢＨＤ２の染色強度が強いことが確認されており、該検体を生物学的試料とし、該試料に含まれる判定マーカーであるＡＢＨＤ２タンパク質の存在を定性的、定量的に調べることにより、将来の治療抵抗性前立腺癌になるリスクを予測できることが確認されている。
また、ＡＢＨＤ２遺伝子の発現によって得られたＡＢＨＤ２遺伝子のｍＲＮＡを判定マーカーとして、定性的、定量的に調べることにより、将来の治療抵抗性前立腺癌になるリスクを予測することも可能である。
本発明の「被験動物における前立腺癌のリスクを判定する方法」において、被験動物となる動物は前立腺癌になり得る動物であればその種類は問わず、いずれの動物も対象とすることができる。また、判定マーカーを定性的、定量的に調べるために、従来知られているいずれの機器、方法等も用いることができる。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明の実施例、比較例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
【００３０】
［実施例１］
１−１．臨床検体を用いた免疫染色及び前立腺癌患者におけるＡＢＨＤ２遺伝子の発現と癌特異的生存率との関連性の評価
ＡＢＨＤ２遺伝子の前立腺癌組織における発現を検証するため、１０２例の根治的前立腺全摘術により得られた前立腺癌検体及び、３７例の経直腸的前立腺生検術で得られた前立腺癌検体を用いて免疫染色を行った。
経直腸的前立腺生検術で得られた前立腺癌検体は、手術不能な進行性前立腺癌患者から得られた検体であり、これらの患者に関しては全例、初期のホルモン療法後ドセタキセルが導入されており、後にホルモン抵抗性（ＣＲＰＣ）に進行し、ドセタキセル化学療法を施行されている。
【００３１】
各検体から得た５ｍｍスライスのパラフィン切片についてそれぞれ脱パラフィン処理を行った後、電子レンジで加熱処理し、抗原を賦活化した。
０．３％Ｈ２Ｏ２で内因性ペルオキシダーゼ除去を行い、ウエスタンブロットで用いたＡＢＨＤ抗体（Ａｂｃａｍ；  １：２００希釈）をオーバーナイトで反応させ、２次抗体（ビオチン化抗体）を１時間反応させ、３，３０−ジアミノベンジジン２０９（ＤＡＢ）溶液（１ｍＭのＤＡＢ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．６２１０、および０．００６％Ｈ２Ｏ２）を用いて可視化した。
ＡＢＨＤ２遺伝子発現の定量的評価は、発現強度と発現の割合をスコアリングしたものを用いた。即ち、して、染色強度を３段階に、１視野における発現の割合を４段階に分類し、それぞれ加算した。
【００３２】
上記の定量的評価の結果から、前立腺全摘除術症例１０２例において、ＡＢＨＤ２遺伝子の発現と癌特異的生存率との関連性を評価した。
また、経直腸的前立腺生検術で得られた３７例において、ＡＢＨＤ２遺伝子の発現とドセタキセル導入後のＰＳＡ再発率との関連性を評価した。この評価はそれぞれカプランマイヤー法ならびにＬｏｇ−Ｒａｎｋ検定により行った。さらに、主な患者背景因子との関連性を評価した。
【００３３】
１−２．結果
図１（Ａ）に、前立腺全摘除術症例１０２例における、前立腺癌組織内におけるＡＢＨＤ２遺伝子の発現と癌特異的生存率との関連性を評価した結果を示した。１０２例のうち、ＡＢＨＤ２遺伝子の強発現群（３６例）では、ＡＢＨＤ２遺伝子の弱発現群（６６例）と比べて前立腺全摘術後の癌特異的生存率が有意に低かった。
図１（Ｂ）に、経直腸的前立腺生検術で得られた３７例における、前立腺癌組織内におけるＡＢＨＤ２遺伝子の発現とドセタキセル導入後のＰＳＡ再発率との関連性を評価した結果を示した。３７例のうち、ＡＢＨＤ２遺伝子の強発現群（２７例）では、ＡＢＨＤ２遺伝子の弱発現群（１０例）と比べて、ホルモン抵抗性進行性前立腺癌に対するドセタキセル導入後のＰＳＡ再発率が有意に高かった。
【００３４】
また、図１（Ｃ）に根治的前立腺全摘術により得られた前立腺癌検体における免疫染色の結果を示し、図１（Ｄ）に経直腸的前立腺生検術で得られた前立腺癌検体における免疫染色の結果を示した。
これらの免疫染色結果のうち、図１（Ｄ）左の手術不能な進行性前立腺癌患者から得られた検体のうち、ホルモン抵抗性進行性前立腺癌に対するドセタキセル導入後のＰＳＡ再発率が高い検体において、特にＡＢＨＤ２の染色強度が強いことが確認された。
従って、これらの結果から、前立腺癌の診断を目的として採取した前立腺癌組織におけるＡＢＨＤ２タンパク質を免疫染色やウエスタンブロット等によって定性的、定量的に調べることにより、将来の治療抵抗性前立腺癌になるリスクを予測できることが示唆された。
【００３５】
また、表１、２に示されるように、前立腺全摘患者（１０２例）において、ＡＢＨＤ２遺伝子の発現が、有意にＧｌｅａｓｏｎ  Ｓｃｏｒｅと相関し、多変量解析において、有意な予後因子となることが認められた。
さらに、表３、４に示されるように、手術不能な進行性前立腺癌症例においては、臨床病期との相関性は認められないものの、多変量解析において有意なドセタキセル抵抗因子となり得ることが認められた。
従って、これらの結果より、ＡＢＨＤ２遺伝子の発現は、前立腺癌の進行に加え、ドセタキセル治療抵抗性に関与していることが示唆された。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
【表２】
0006425942.tif 000003
【００３８】
【表３】
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【００３９】
【表４】
0006425942.tif 000005
【００４０】
［実施例２］
二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）の作製
ＡＢＨＤ２遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）を、次のようにして準備した。
ＡＢＨＤ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＢＨＤ２）＃１〜７は、それぞれのｓｉＲＮＡの標的配列（表５、配列表配列番号２〜８）に対応するヌクレオチド配列（表６、センス鎖、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１）と、その相補的なヌクレオチド配列（表６、アンチセンス鎖、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２）を、３´末端が２塩基オーバーハングするような二本鎖ＲＮＡとして合成した（ＲＮＡｉ社）。
また、ネガティブコントロールとして、２０μＭ  ネガティブコントロール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｈｉｇｈ  ＧＣ  ｄｕｐｌｅｘ，  ＃１１５１４８４）を使用した。
【００４１】
【表５】
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【００４２】
【表６】
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【００４３】
［実施例３］
二本核酸分子によるＡＢＨＤ２遺伝子発現抑制効果の検討
２−１．細胞培養
ＡＲ陽性のヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ細胞（以下、単にＬＮＣａＰ細胞と示す）を用いた。
ＬＮＣａＰ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｓｉｇｍａ社）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）を細胞培養液として、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。
【００４４】
２−２．トランスフェクション
上記１．にて培養したＬＮＣａＰ細胞を６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに３×１０５個／ｗｅｌｌになるように播いた。その後２４時間以内に、実施例２にて作製した５０μＭ  ｓｉＡＢＨＤ２  ＃１〜＃７（７種類）、又はネガティブコントロールの２０μＭ  ｓｉＲＮＡを、それぞれ１０ｎＭになるように調製して各ウェルに加え、トランスフェクションを行った。
トランスフェクション後７２時間以内に、細胞からＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）によって全ＲＮＡを回収し、そのうちの５００ｎｇのＲＮＡから、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ）によってｃＤＮＡを合成した。
【００４５】
２−３．定量的Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法
上記２．にて合成したｃＤＮＡを１０倍希釈し、そのうちの２μｌを定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲに使用した。内部コントロールにはＧＡＰＤＨを用いて補正を行い、発現レベルの解析を行った。
Ｓｔｅｐ  ｏｎｅ（登録商標）ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）ならびにＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて、各ＳｉＲＮＡをトランスフェクションしたＬＮＣａＰ細胞のＡＢＨＤ２遺伝子及び内部コントロールであるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルを測定した。
ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する発現レベルをＣｙｃｌｅ数からΔΔＣｔ法を用いて計算して補正を行い、ＡＢＨＤ２遺伝子の発現レベルを調べた。
【００４６】
２−４．結果
図２に示したように、ｓｉＡＢＨＤ２  ＃１〜＃７をトランスフェクションした細胞では、いずれもＲｅａｇｅｎｔ（ブランク）やネガティブコントロールと比べてｍＲＮＡレベルでＡＢＨＤ２遺伝子の発現がノックダウンされており、ｓｉＡＢＨＤ２  ＃１〜＃７のいずれをトランスフェクションした場合でも高い効果が得られることが確認された。
【００４７】
［実施例４］
二本核酸分子によるＬＮＣａＰ細胞の増殖抑制効果の検討
３−１．ＭＴＳ  ａｓｓａｙ
実施例３の２−１．と同様に培養したＬＮＣａＰ細胞を９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに３×１０３個／ｗｅｌｌとなるよう播いた。その後２４時間以内に、実施例２で作製した各ｓｉＲＮＡとネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを実施例３の２−２．と同様の濃度となるように調製してそれぞれ各ウェルに加え、トランスフェクションを行った。
その後、１日、４日、５日又は６日経過後にＣｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて２時間反応させた。その後、マイクロプレートリーダーにて吸光度４９０ｎｍで生細胞数を測定し、細胞増殖能を調べた。
【００４８】
３−２．結果
図３に示したように、ｓｉＡＢＨＤ２＃２、同＃３、同＃４、同＃５、同＃７をトランスフェクションした細胞では、いずれもＲｅａｇｅｎｔ（ブランク）やネガティブコントロールと比べて有意に細胞増殖が抑えられていた。特にｓｉＡＢＨＤ２＃５及び同＃７をトランスフェクションした細胞では、４日後以降の増殖が強く抑制されていることが観察された。
【００４９】
［実施例５］
ドセタキセルとの併用における二本核酸分子によるＬＮＣａＰ細胞増殖抑制効果の検討
４−１．ＭＴＳ  ａｓｓａｙ
実施例３の２−１．と同様に培養したＬＮＣａＰ細胞を９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに３×１０３個／ｗｅｌｌとなるよう播いた。その後２４時間以内に、実施例２で作製した各ｓｉＲＮＡ＃１又は同＃７とネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを実施例３の２−２．と同様の濃度となるように調製してそれぞれ各ウェルに加え、トランスフェクションを行った。
トランスフェクションしてから約１２時間後に、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を１ｎＭ又は１０ｎＭになるように各ウェルに加え、１日、２日又は４日経過後Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）  を加えて１時間反応させた。その後、マイクロプレートリーダーにて吸光度４９０ｎｍ  で生細胞数を測定し、細胞増殖能を測定した。
【００５０】
４−２．結果
図４にドセタキセルを１ｎＭ加えた場合の結果を示した。図４に示したように、ｓｉＡＢＨＤ２＃１、同＃７をトランスフェクションした細胞において、ドセタキセルを併用することにより、ドセタキセルを併用しない場合と比べて有意に細胞増殖が抑制されていることが観察された。
【００５１】
［実施例６］
二本核酸分子によるＬＮＣａＰ細胞遊走能の抑制効果
５−１．細胞遊走能の評価
実施例２で作製した各ｓｉＲＮＡのうちｓｉＡＢＨＤ２＃１又は同＃７をそれぞれ導入した細胞、又はネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｈｉｇｈ  ＧＣ  ｄｕｐｌｅｘ，  ＃１１５１４８４）を導入した細胞を培養し、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｅｒ  Ｉｎｓｅｒｔと、８．０μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ＰＥＴ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いてＣｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイによって各細胞の遊走能を検討した。
即ち、培養皿にＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ製）を３０分間作用させ、下層フィルターを作成した後、下層チャンバーにフェノールレッド含有培地ＲＰＭＩ  １６４０培地を７００μｌ加えた。
各ｓｉＲＮＡを５μＭとなるように添加したフェノールレッド含有培地で３日間培養したＬＮＣａＰ細胞を５×１０４細胞ごとに分け、各細胞を３００μｌのフェノールレッド含有培地に懸濁したものをそれぞれ上層チャンバーに加えた。これを、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した後、フィルターを剥がした。
下層フィルター上の細胞を３０分間メタノールで固定した後、ＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｍｓａ’ｓ  ｓｔａｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）で３０秒間インキュベートした。その後、細胞を２００倍率の顕微鏡で観察し、細胞数を数えることで、細胞遊走能を評価した。
【００５２】
５−２．結果
図５に細胞遊走能の評価結果を示した。その結果、ｓｉＡＢＨＤ２＃１又は同＃７等の本発明のｓｉＲＮＡを導入することにより、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを導入した場合と比べて顕著に細胞の遊走が抑制されることが認められた。
【００５３】
［実施例７］
二本核酸分子による腫瘍増殖抑制効果の検討
６−１．ヌードマウスへの癌細胞皮下移植
オスの８週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本クレア社）（二十匹）を用いた。
ヌードマウス一匹あたり、実施例３の２−１．と同様に培養したＬＮＣａＰ細胞が１ｘ１０７個になるようにＰＢＳ  １００μｌと混合し、さらに、これとマトリゲル（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１００μｌを混合し、２５Ｇ注射針を用いて各マウスへ皮下注射した。
【００５４】
６−２．二本鎖核酸分子の投与
上記６−１．の皮下注射後５〜８週経過し、各マウスにおける腫瘍体積が１００ｍｍ３を超える大きさに達したところで二本鎖核酸分子の投与を行った。
二本鎖核酸分子は、実施例２で作製したうちのｓｉＡＢＨＤ２＃７を用い、ＢａｎｎｏＮｅｇａＣｏｎ（株式会社RNAi）（５’−ＧＵＡＣＣＧＣＡＣＧＵＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣ−３’）をネガティブコントロールとした。
ｓｉＲＮＡ又はネガティブコントロール各５μｇをＲＮＡｉ  ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１５μｌとｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ−ｆｒｅｅ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭを混合し、各ｓｉＲＮＡ溶液を得た。このｓｉＲＮＡ溶液１００μｌを各マウスの腫瘍内へ局所注入により投与した。この投与は２回／週を４週間繰り返し、マウスの腫瘍径を週１回測定した。
マウスの腫瘍径は、長径（ｒ１）、及び短径（ｒ２，ｒ３）を２か所計測し、ｒ１×ｒ２×ｒ３／２の公式にて腫瘍の大きさを計測した。また、投与開始５週間後、アバチンにて麻酔をかけ、腫瘍の大きさが分かるように写真撮影をした。
さらに、ＬＮＣａＰ細胞の移植から８週間後、腫瘍は皮下より摘出した。腫瘍は重量を計測した後、一部はＩＳＯＧＥＮによりＲＮＡを摘出し、一部はＮＰ４０  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒにより溶解しタンパク質を抽出した。タンパク質の抽出は、腫瘍を５〜１０ｍｍ３の大きさに分け、５００μｌ  ＮＰ４０  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加え、ホモジナイザーですりつぶした後、その溶液を１５，０００ｒｐｍ，４℃，３０分で遠心し、上清を回収することで行った。
【００５５】
６−３．Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法
上記４−２．より、マウス皮下より抽出したタンパク質を８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌで泳動しＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−Ｐ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）にブロットした。
一次抗体としてａｎｔｉ−ＡＢＨＤ２（Ａｂｃａｍ，１：５００）を用いて一晩反応させ、ペルオキシダーゼの結合した抗ラビットＩｇＧ抗体を１時間反応させた。また、ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ，１：１０００）を用いて一晩反応させ、ペルオキシダーゼの結合した抗マウスＩｇＧ抗体を１時間反応させた。
抗原抗体複合体をＩｍｍｕｎｏＣｒｕｚ（登録商標）  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を用いて反応させＸ線フィルムへ撮影した。
【００５６】
６−４．結果
写真撮影の結果を図６に示した。
また、ｓｉＲＮＡ又はネガティブコントロール投与後の腫瘍の大きさの変化を図７に示した。図７に示されるように、本発明のｓｉＡＢＨＤ２を投与することにより、腫瘍の増殖を有意に抑制できることが確認された。
さらに、ウエスタンブロット法によるＡＢＨＤ２蛋白量の解析結果を図８に示した。図８に示されるように、ｓｉＲＮＡを腫瘍内に投与することにより、ＡＢＨＤ２遺伝子の発現レベルが抑制されることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の判定マーカーの提供により、新たな前立腺癌の診断、治療選択法を提供することが可能となる。また、本発明のＡＢＨＤ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子の提供により、前立腺癌の治療において有用な新たな治療剤、治療方法方等の提供が可能となる。また、本発明の二本鎖核酸分子と、前立腺癌の治療に有効とされるＰＩポリアミド等を組み合わせることにより、前立腺癌の網羅的な治療等も可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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