(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過冷却活性が氷核形成物質としてのヨウ化銀に対して−４〜−１２℃である、ポリソルベート、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールモノステアレート、ヤシ油脂肪酸ソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミド、茶種子由来サポニン、あるいはセタノールから選ばれる分子量が２００〜３０００である非イオン性界面活性剤、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ステアリルアミンアセテートから選ばれるカチオン性界面活性剤及びオレイン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、５−スルホイソフタル酸ジメチルナトリウム、リン酸モノドデシルナトリウムから選ばれるアニオン性界面活性剤から選ばれる界面活性剤からなり、モル凝固点降下によらず、凝固点降下にほとんど影響を与えないような低濃度の添加によって氷核の結晶成長を抑制するのではなく、氷核の形成そのものを阻害することにより水の過冷却を促進する、０．００２〜１０ｇ／Ｌの濃度で水に溶解するための過冷却促進剤を、氷核形成物質としてヨウ化銀を含有する水、氷核形成物質を含有しない純水及び氷核形成物質を含有しないで凍害防止剤としてエチレングリコールを含有する水から選ばれる水（ただし、水からグリセリンを含有する水を除く。）に溶解させてなる不凍性液体。
【請求項２】
前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリエチレングリコールモノステアレート、茶種子由来サポニンから選ばれる分子量が２００〜３０００である非イオン性界面活性剤であり、前記カチオン性界面活性剤がヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリドから選ばれるカチオン性界面活性剤であり、前記アニオン性界面活性剤がコール酸ナトリウムであり、前記水が、氷核形成物質としてヨウ化銀を含有する水である請求項１に記載の不凍性液体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は過冷却促進剤を含有する不凍性液体に関する。
【背景技術】
【０００２】
水を氷点下で長期間、安定的に凍らせない物質があれば様々な産業への応用が期待される。現在、各種の産業において応用が期待できるようなレベルで、低濃度の添加により、水を少なくとも１０℃程度、また1日以上過冷却させるような物質が求められている。
【０００３】
水を凍結させにくくする物質としては、一般的に不凍タンパク質が知られている。不凍タンパク質とは、氷晶の成長を阻害することで水の凍結温度を低下させるタンパク質と考えられており、これらの物質は、低温環境下で生息している生物種によって生産される。それらの生物種とは、例えば、南極海などに生息する魚、寒冷地で越冬する昆虫の幼虫などが挙げられる。
しかしながら、これらの不凍タンパク質の活性温度はせいぜい−５℃程度であり、より低温での活性がなく、また、安定的な供給が困難であること、さらに高価格であることなどから、広く産業に応用されるには至っていない。
【０００４】
一方、寒冷地に生育する樹木の細胞水は、極低温で液体状態を保持することが知られている。これらの樹木は、木部柔細胞内の水が、外界から分離された水滴のために水の物理的特性によって−４０℃程度まで過冷却すると考えられている（非特許文献１参照）。
木部柔細胞を取り囲む細胞壁は、細胞からの脱水及び細胞外の氷が細胞内に侵入することを防ぐため、細胞外に氷ができても、細胞内の水が外界から孤立した水滴として振舞って過冷却すると考えられる。
また、越冬植物に含まれるフェノール化合物は、凍結防御物質として働くことが示唆されている（非特許文献２参照）。これらの物質は、生殖細胞等を培養するための凍結培地（特許文献１参照）や、内燃機関等の冷却液として用いる不凍液の一成分（特許文献２参照）として使用することが開示されている。
【０００５】
本発明者らは、寒冷地に生育する樹木がその細胞水を氷点下でも液体状態に保持することができるメカニズムを解明するための研究を開始した。その過程において、細胞内に存在する何らかの物質が−２０℃程度の過冷却を引き起こすことを見出している（非特許文献３）。
さらに研究を推進し、その原因物質の一つとして、フラボノール配糖体が過冷却活性を有することを見出し、先に特許出願している（特許文献３）。
【０００６】
しかしながら、上記のフラボノール配糖体を得るためには、樹木などの生物体からの抽出、或いは複雑な化学合成が必要であり、容易に入手することができないという課題が残されており、現在のところ、広く応用されるには至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０００−５００３２７（ＷＯ９７／１４７８５）
【特許文献２】ＷＯ２００４／０７４３９７
【特許文献３】ＷＯ２００８／００７６８４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】化学と生物ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．  ５，２８０−２８２（２００５）
【非特許文献２】化学と生物ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．１２，７７８−７８０（１９９９）
【非特許文献３】Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ｔｏ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｓｕｐｅｒｃｏｏｌｉｎｇ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙｉｎ  ｂｅｅｃｈ  （Ｆａｇｕｓ ｃｒｅｎａｔａ）  ｘｙｌｅｍ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ  ｃｅｌｌｓ．  ＣｒｙｏＬｅｔｔｅｒｓ， ２７  （５），  ３０５−３１０  （２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、前述のフラボノール配糖体の物資以外で、高い過冷却活性を有し、より入手が容易な物質を見出し、より実用的な凍らない水を作成するための、新たな過冷却促進剤を含有する不凍性液体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、特定の界面活性剤が過冷却活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。従来から界面活性剤は、多くの化合物が知られており、広く産業に利用されているが、界面活性剤が凝固点降下にほとんど影響を与えないような低濃度の添加によって水の過冷却を促進することは知られていなかった。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記［１］〜［２］の界面活性剤からなる水の過冷却促進剤に関する。
［１］．過冷却活性が氷核形成物質としてのヨウ化銀に対して−４〜−１２℃である、ポリソルベート、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールモノステアレート、ヤシ油脂肪酸ソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミド、茶種子由来サポニン、あるいはセタノールから選ばれる分子量が２００〜３０００である非イオン性界面活性剤、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ステアリルアミンアセテートから選ばれるカチオン性界面活性剤及びオレイン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、５−スルホイソフタル酸ジメチルナトリウム、リン酸モノドデシルナトリウムから選ばれるアニオン性界面活性剤から選ばれる界面活性剤からなり、モル凝固点降下によらず、凝固点降下にほとんど影響を与えないような低濃度の添加によって氷核の結晶成長を抑制するのではなく、氷核の形成そのものを阻害することにより水の過冷却を促進する、０．００２〜１０ｇ／Ｌの濃度で水に溶解するための過冷却促進剤を、氷核形成物質としてヨウ化銀を含有する水、氷核形成物質を含有しない純水及び氷核形成物質を含有しないで凍害防止剤としてエチレングリコールを含有する水から選ばれる水（ただし、水からグリセリンを含有する水を除く。）に溶解させてなる不凍性液体。
【００１２】
［２］．前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリエチレングリコールモノステアレート、茶種子由来サポニンから選ばれる分子量が２００〜３０００である非イオン性界面活性剤であり、前記カチオン性界面活性剤がヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリドから選ばれるカチオン性界面活性剤であり、前記アニオン性界面活性剤がコール酸ナトリウムであり、前記水が、氷核形成物質としてヨウ化銀を含有する水である前項［１］に記載の不凍性液体。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の水の過冷却促進剤は、水が凍結する際に形成する氷核の形成を阻害することで、過冷却を促進すると考えられる。この結果、水の凍結温度を本来水が凍結する温度より１０℃前後低下させることができる。この水の過冷却促進剤は、バルクの水を低温で長期にわたって安定的に過冷却させることが可能である。
また、本発明の水の過冷却促進剤を水と混合することで、−１０℃前後で使用できる不凍性液体となり、この不凍性液体中で、例えば、生物材料等を長期間低温保存することが可能である。
【００１４】
本発明の水の過冷却促進剤は、水や用途に応じた種々の添加物を含んだ水溶液、及び水を含んだ物質に溶解させることで、これらの溶液の氷晶の大きさを制御する、凍結制御剤として使用することができる。本発明の水の過冷却促進剤の添加によって過冷却が促進され、凍結開始温度が低下するため、形成される氷晶の大きさを小さくできる。このため、本発明の水の過冷却促進剤を添加した水溶液を、冷却速度や添加物の組成、濃度を変化させて凍結することで、氷の大きさを様々に変化させる凍結制御剤として使用することができる。
更に、凍結防止剤を高濃度で含有するガラス化液に本発明の水の過冷却促進剤を添加すると、ガラス化液の濃度を低下させることができ、ガラス化液への浸漬による毒性を軽減することができる。従って、超低温のガラス体中で、これまでガラス保存が困難だった生物材料等を保存することも可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】各種界面活性剤の過冷却活性を測定した結果を示す。
【図２】１０質量％濃度のエチレングリコール水溶液と、そこにｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを０．０１質量％濃度添加した時のＤＳＣ(示差走査熱量計)チャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明における、界面活性剤とは親水基と疎水基からなる両親媒性物質で、表（界）面張力を低減し、ミセル形成能を有する物質を指す。これらの界面活性剤は化学合成によっても得られるが、レシチン、サポニン等の天然に存在する物質も含まれる。また、界面活性剤は水中で電離するかしないかによって、非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤に大別できる。さらに、イオン性界面活性剤は水に溶解した時のイオンの種類によってカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤に分類できる。
これらの界面活性剤のうち、本発明の水の過冷却促進剤である特定の界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤である。
【００１７】
本発明に係る非イオン性界面活性剤は親水基の構造によって、さらにエーテル型、エステル型、エステルエーテル型、アルカノールアミド型、高級アルコール型に分類できる。
非イオン性界面活性剤の具体例としては、一般式（１）で表されるポリオキシアルキレンモノエーテル、一般式（２）で表されるポリオキシアルキレンモノエステル、一般式（３）で表されるポリオキシアルキレンアミドなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００１８】
Ｒ１−Ｏ−（Ｒ２−Ｏ）ｍ−Ｈ              （１）
（式中、Ｒ１は炭素数８〜２２のアルキル基又はアルケニル基、あるいは炭素数６〜１２のアルキル基又はアルケニル基を有するフェニル基を示し、Ｒ２は炭素数２〜４のアルキレン基を示し、ｍは１〜１００の整数を示す。ｍが２以上である場合は、Ｒ２は１種単独であってもよし、２種以上であってもよく、Ｒ２が２種以上の場合の（Ｒ２−Ｏ）ｍはブロック構造であってもよいし、ランダム構造であってもよい。）
一般式（１）において、Ｒ２は炭素数２〜４のアルキレン基であるが、炭素数２〜３のアルキレン基が好ましい。ｍは１〜１００の整数であるが、１〜３０が好ましく、１〜２０がより好ましい。
【００１９】
Ｒ３ＣＯＯ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｒ５              （２）
（式中、Ｒ３は炭素数８〜２２のアルキル基又はアルケニル基を示し、Ｒ４は炭素数２〜４のアルキレン基を示し、Ｒ５は水素原子又はソルビタン残基を示し、ｎは１〜１００の整数を示す。ｎが２以上である場合は、Ｒ４は１種単独であってもよし、２種以上であってもよく、Ｒ４が２種以上の場合の（Ｒ４−Ｏ）ｎはブロック構造であってもよいし、ランダム構造であってもよい。）
一般式（２）において、Ｒ４は炭素数２〜４のアルキレン基であるが、炭素数２〜３のアルキレン基が好ましい。また、Ｒ５のソルビタン残基は、ソルビタンの一つの水酸基を除いた残りの部分をいう。ｎは１〜１００の整数であるが、１〜３０が好ましく、１〜２０がより好ましい。
【００２０】
【化１】
0006319932.tif 000002
（式中、Ｒ６は炭素数７〜２１のアルキル基、アルケニル基又は脂肪酸基を示し、Ｒ７は水素原子又はメチル基を示し、ｐは１〜２０の整数を示し、ｑは０〜２０の整数を示す。）
一般式（３）において、ｐは１〜２０の整数であるが、１〜１０が好ましく、ｑは１〜２０の整数であるが、１〜１０が好ましい。
【００２１】
また、非イオン性界面活性剤としては、上記一般式（１）〜（３）の非イオン性界面活性剤の他に、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、高級アルコール、天然由来のサポニンなどが挙げられる。
ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステルにおいては、オキシアルキレン基は炭素数２〜３のオキシアルキレン基が好ましく、炭素数２のオキシエチレン基がより好ましい。ソルビタンに置換するポリオキシアルキレン基の数は、１であってもよいし、２又は３であってもよい。また、ソルビタンに置換する脂肪酸基の炭素数は８〜２２が好ましく、１２〜１８がより好ましい。ソルビタンに置換する脂肪酸基の数は、１であってもよいし、２又は３であってもよい。
【００２２】
ソルビタン脂肪酸エステルにおいては、ソルビタンに置換する脂肪酸基の炭素数は８〜２２が好ましく、１２〜１８がより好ましい。ソルビタンに置換する脂肪酸基の数は、１であってもよいし、２又は３であってもよい。
高級アルコールとしては、炭素数１２〜２４アルキル基又はアルケニル基を有するアルコールなどが挙げられ、具体的にはセタノールなどが挙げられる。
非イオン性界面活性剤の好適な具体例としては、例えば、ポリソルベート、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールモノステアレート、ヤシ油脂肪酸ソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミド、茶種子由来サポニン、あるいはセタノールなどが挙げられる。
【００２３】
また、非イオン性界面活性剤の分子量は、特に制限ないが、好ましくは２００〜３０００であり、さらに好ましくは４００〜２０００である。なお、好ましい範囲以外の分子量であっても、ある程度の効果が期待できる。
【００２４】
また、カチオン性界面活性剤は親水基の構造によってさらに、４級アンモニウム塩型、アルキルアミン塩型に分類でき、４級アンモニウム塩型の方が、水の過冷却促進剤としてより好ましい。
４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤としては、窒素原子の４つの置換基の少なくとも１つが炭素数１〜２４のアルキル基又はアルケニル基、或いは炭素数１〜２４のアシルアミノアルキル基であり、他の置換基は炭素数１〜５のアルキル基である４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤、窒素原子の４つの置換基の少なくとも１つが炭素数１〜２４のアルキル基又はアルケニル基であり、置換基の少なくとも１つがベンジル基であり、他の置換基は炭素数１〜５のアルキル基である４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤などが挙げられる。
【００２５】
アルキルアミン塩型カチオン性界面活性剤としては、炭素数８〜２４の脂肪酸と炭素数１〜５のアルキル基を１つ又は２つ有するアミンの塩、炭素数８〜２４の脂肪酸とトリエタノールアミンの塩などが挙げられる。
カチオン性界面活性剤の好適な具体例としては、例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ステアリルアミンアセテートなどが挙げられる。
また、カチオン性界面活性剤の分子量は、特に制限ないが、好ましくは２００〜４００である。なお、好ましい範囲以外の分子量であっても、ある程度の効果は得られる。
【００２６】
また、アニオン性界面活性剤は親水基の構造によってさらに、カルボン酸塩型、スルホン酸塩型、硫酸エステル塩型、リン酸エステル塩型に分類できる。
カルボン酸塩型アニオン性界面活性剤としては、炭素数６〜２４の脂肪酸塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩）、ナフテン酸塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アルカノールアミン塩）、炭素数１０〜２０のアルキル基を有し、エチレンオキシドを０．５〜８モル付加させたアルキルポリエトキシカルボン酸塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩）、ロジン酸セッケン、脂肪酸サルコシドなどが挙げられる。
【００２７】
スルホン酸塩型アニオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１６のアルキル基を有するアルキルベンゼンスルホン酸塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、アンモニウム塩）、炭素数１０〜２０のアルカンスルホン酸塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、アンモニウム塩）、石油スルホン酸塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩）、炭素数１０〜２０のα−オレフィンスルホン酸塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アルカノールアミン塩、アンモニウム塩）、炭素数１０〜２０のスルホ脂肪酸塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、アルカノールアミン塩）、炭素数２〜８のアルキル基を有するアルキルナフタリンスルホン酸塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、アンモニウム塩）などが挙げられる。
【００２８】
硫酸エステル塩型アニオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜２０のアルキル基を有し、エチレンオキシド及び／又はプロピレンオキシドを０．５〜８モル付加させたポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩）、炭素数１０〜２０のアルキル基又はアルケニル基を有するアルキル又はアルケニル硫酸エステル塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩）、炭素数１０〜２０の長鎖アルコールの硫酸エステル塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩）、炭素数１０〜２０の脂肪酸の炭素数１〜５のアルキルエステル、アミド、アニリド又はアルカノールアミドの硫酸エステル塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩）などが挙げられる。
【００２９】
リン酸エステル塩型アニオン性界面活性剤としては、炭素数６〜１６のアルキル基を有するアルキルリン酸エステル塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、アルカノールアミン塩）、炭素数１０〜２０のアルキル基を有し、エチレンオキシド及び／又はプロピレンオキシドを０．５〜８モル付加させたポリオキシアルキレンアルキルエーテルリン酸エステル塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、アルカノールアミン塩）、炭素数６〜１６のアルキル基を有し、エチレンオキシド及び／又はプロピレンオキシドを０．５〜８モル付加させたポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテルリン酸エステル塩（塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、アルカノールアミン塩）などが挙げられる。
【００３０】
アニオン性界面活性剤の好適な具体例としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、５−スルホイソフタル酸ジメチルナトリウム、リン酸モノドデシルナトリウムなどが挙げられる。さらに、レシチンなどのリン脂質もアニオン性界面活性剤に分類することができる。
また、アニオン性界面活性剤の分子量は、特に制限ないが、好ましくは２００〜４００である。なお、好ましい範囲以外の分子量であっても、ある程度の効果は得られる。
【００３３】
次に、本発明の作用について説明する。
従来のエチレングリコールなどの不凍液は、濃度依存のモル凝固点降下によるものである。それに対し、本発明に係る界面活性剤からなる水の過冷却促進剤は、モル凝固点降下によらず、極微量の添加によって過冷却を促進する。これは、本発明の界面活性剤からなる水の過冷却促進剤が、水が凍結する際に形成される氷核の形成そのものを阻害することによるものと考えられる。
【００３４】
すなわち、本発明に係る水の過冷却促進剤は、凝固点降下にほとんど影響を与えない濃度、例えば、１容積％以下、または１質量％以下の低濃度で水に添加することで、添加濃度依存による束一的な凝固点降下をはるかに上回る過冷却促進を示すものである。
塩、糖、糖アルコールなどの一般的な物質では、凝固点降下度の２倍程度の過冷却促進を示すが、本発明に係る水の過冷却促進剤は１０倍以上、条件によっては１００倍以上の過冷却促進を示す。
【００３５】
また、特異的に水の凍結温度を低下させる物質として、不凍タンパク質が知られているが、これらは形成された氷核の結晶成長を抑制するものであり、氷核の形成そのものを阻害するものではないと考えられている。これに対して、本発明に係る過冷却促進物質は、氷核の形成そのものを阻害するものと考えられ、不凍タンパク質とは、その性質が大きく異なる物質であると推測される。
【００３６】
一般的に水の凍結には、氷核形成物質と呼ばれる物質が大きく関わっているとされており、それらの働きによって氷核が形成され、氷核が結晶成長することで水の凍結が起こると考えられている。氷核形成物質としては、種々の物質が知られているが、本発明の後述する実施例においては、無生物由来のヨウ化銀（ＡｇＩ）を用いて界面活性剤の過冷却活性を測定し評価した。
【００３７】
本発明の界面活性剤からなる水の過冷却促進剤は、ＡｇＩに対して−４℃〜−１２℃程度の過冷却活性を示す。
特に、カチオン性界面活性剤は高い活性を示し、ＡｇＩに対して最大で約−１２℃の過冷却活性を示す。
また、本発明の界面活性剤からなる水の過冷却促進剤は、ＡｇＩ以外の他の物質に対しても優れた過冷却活性を示す。例えば、水中では、様々な異物が氷核となり水の凍結が起こると考えられており、これらの異物は、非常に多種にわたる。場合によっては、容器のヒビ等も氷核形成の開始点となり得る。このように、実用的には、同定できない様々な氷核形成物質が含有される水に対しても、本発明の界面活性剤からなる水の過冷却促進剤は、優れた過冷却活性を示す。
【００３８】
また、本発明の界面活性剤からなる水の過冷却促進剤は、純水に対しても過冷却活性を有する。つまり、−２℃〜−１０℃程度の過冷却活性を有している。一例をあげると、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、つまりオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（分子量  ６５０）は超純水（ＭｉｌｌｉＱ  Ｗａｔｅｒ）に対して−３．５℃の過冷却活性を示す。さらに、界面活性剤からなる水の過冷却促進剤は、フラボノイド配糖体等と比較して、はるかに安価で容易に、かつ大量に入手できるため、大容量の水（例えば、石油備蓄設備での消火用水など）に対しても利用できる。また、人体に対する影響が少ない界面活性剤は、−１０℃程度での飲料や薬品などが作製できる。
【００３９】
また、本発明に係る界面活性剤の過冷却活性は、例えば、以下のような他の過冷却促進物質といわれるものの過冷却活性と比較しても、優れている。
（１）種々の植物（桃など）の種子から抽出した未同定の粗抽出物は、−２．６〜−８．１℃の水の過冷却活性を示すことが記載されている（Ｃａｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｃｒｙｏｌｅｔｔｅｒｓ，４，５９−６４）。しかし、この値は冷却速度１℃／ｍｉｎと本発明における水の過冷却促進剤の冷却速度０．２℃／ｍｉｎより非常に速く、一時的な過冷却を起こしやすい条件下での評価であるため、これらの粗抽出物は、本発明の水の過冷却促進剤の過冷却活性には及ばない。
（２）様々な不凍タンパク質は、最大−７．８℃の水の過冷却活性を示すことが記載されている（Ｄｕｍａｎ（２００２）  Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏ１．，１７２，１６３−１６８．)。しかし、この文献では、この最大値が得られる不凍タンパク質の添加濃度が不明であるとともに、０．５Ｍという高濃度のクエン酸を添加した時に得られた値であり、不凍タンパク質単独では−１．２℃の過冷却を促進するのみである。
【００４０】
本発明の界面活性剤からなる水の過冷却促進剤は、通常、水に０．００２ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．００５〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１〜１．０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１．０ｇ／Ｌ溶解させて不凍性液体として用いることができる。
この不凍性液体は、通常は界面活性剤を水に溶解させることで得られるが、水の代わりに用途に応じた添加物を含む水溶液を用いてもよい。このような添加物としては、例えば、動植物細胞の培地成分、生物材料の保存液成分、あるいは防錆剤、酸化防止剤などが挙げられる。水溶液中の添加物の濃度は、用途に応じて適宜定めることができる。
【００４１】
また、この不凍性液体は、このほかの過冷却促進剤や凍害防止剤を含んでもよい。
凍害防止剤を含む場合は、凍害防止剤を１種単独または２種以上組み合わせて１〜４０溶積％、好ましくは１〜２０容積％含有させることができる。
凍害防止剤とは、生物材料やこれらを浸漬させた水溶液に添加することで、凍結による障害を軽減する物質をいい、いずれも濃度依存の凝固点降下をもたらす、氷晶の形成量を軽減する、凍結材料の塩濃度の上昇を軽減する、ガラス化を容易にするなどの効果のうち、一つあるいは複合的な効果を有するものを指す。
【００４２】
このような凍害防止剤として、例えば、メタノール、エタノール、アセトアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアルデヒド、エチレングリコール、プロピレングリコール、プロリン、グルコース、ソルビトール、シュークロース、トレハロース、ポリエチレングリコール、デキストラン１０−１５０、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アルブミン、フイコール、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）などが挙げられる。
【００４３】
このような不凍性液体は、凍害防止剤を全く加えない場合、あるいは凝固点降下には殆ど影響を与えない濃度（１質量％以下程度）で凍害防止剤などの添加物を加えた場合には、長期間（例えば、１〜２週間）−１０℃付近まで液体状態を保持できる。
この不凍性液体中に生物材料（植物や動物の細胞や組織、食用または観賞用等の魚介類、野菜などの植物、及びその一部などを指す。）を入れて冷却することで、通常５℃以下の低温で用いられるが、０℃以下、特に０〜−１０℃の温度範囲で凍結を起こさずに、長期低温保存が可能となる。この不凍性液体は、過冷却により凍結開始温度が下がることで、氷晶を小さく制御することができ、また単独または凍害防止剤などとの併用によって、凍結乾燥により調製する医薬品や食品などの凍結制御剤としても使用できると考えられる。
【００４４】
一方、上記の凍害防止剤を高濃度で含有する水溶液は「ガラス化液」と呼ばれ、超低温（例えば、液体窒素温度）においても、結晶を形成せず、ガラス体（非晶質の氷）となる（新野孝男ら編「植物超低温保存マニュアル」農業生物資源研究所発行２００６年）。
ガラス化液とは、上記凍害防止剤を１種単独または２種以上組み合わせて２０〜９０容積％、好ましくは４０〜９０容積％含有し、残余が水である溶液のことを指す。この水として、動植物培養液などの溶媒を用いてもよい。動植物の培養や保存に用いる場合には、水や動植物培養液を３０容積％以上、特に好ましくは４０容積％以上混合することが望ましい。
【００４５】
最も一般的なガラス化液の一例としては、１５容積％のエチレングリコール、１５容積％のＤＭＳＯ、０．４Ｍのシュークロースを培地溶液に添加したものがある。培地溶液の種類や濃度は、培養または保存する材料によって適宜変更することができる。
本発明においては、このガラス化液に本発明に用いる界面活性剤からなる水の過冷却促進剤を通常、０．００２ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．００５〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１〜１．０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１．０ｇ／Ｌ添加する。このようなガラス化液は、ガラス化液の凍結温度以下、例えば−１０℃以下、特に−６０〜−２７３℃の温度範囲で非晶質の状態を保持させることが可能である。
【００４６】
ガラス化による凍結保存では、通常予め保存したい材料を室温あるいは０℃以上の温度で、短時間浸漬処理する。この前処理によって、材料中の水は高濃度のガラス化液で脱水されると共に、ガラス化液が材料内水分と置換される。
このため、これらの材料を液体窒素に投入すると材料内外の水は氷晶を形成せずにガラス化する。植物などの生物材料をガラス化液に入れて液体窒素に投入すると、生物材料内外の水はガラス体（非晶質の氷）になる。ガラス状態では凍結による傷害が起こらないため、生物材料を超低温のガラス化液中で凍結保存することができるようになる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの例は本発明を限定することを意図するものではない。
下記実施例１〜８における過冷却活性（氷核阻害活性）は、以下の方法で測定した。
すなわち、氷核物質を含有する緩衝液に被測定物を任意の割合で混合した溶液の２μＬの液滴を多数、温度コントロールができる銅板上に静置し、銅板を０．２℃／ｍｉｎで冷却した。その冷却過程において、凍結する液滴数を肉眼で観察し、５０％の液滴が凍結した温度（ＩＮＴ５０（℃））を凍結温度とし、被測定物と氷核物質を含む溶液と、氷核物質と緩衝液のみからなる溶液（ｃｏｎｔｒｏｌ）のそれぞれの凍結温度の差を過冷却活性とした。緩衝液は５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
下記の実施例１〜８では氷核物質として１０ｍＭのヨウ化銀（ＡｇＩ）（ナカライ製）を、超純水（ＭｉｌｌｉＱ  Ｗａｔｅｒ）はミリポア社製超純水装置を通したものを用いた。
【００４８】
（実施例１）
エステルエーテル型の親水基を持つ非イオン性界面活性剤、ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、分子量１３００）を０．１ｇ／Ｌの濃度で添加した溶液の過冷却活性を測定した。ＩＮＴ５０は−１４．５℃となり、Ｃｏｎｔｒｏｌとの差、すなわち過冷却活性は−１０．１℃であった。
（実施例２）
エーテル型の親水基を持つ非イオン性界面活性剤、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、分子量  ６５０）を０．１ｇ／Ｌの濃度で添加した溶液の過冷却活性を測定した。ＩＮＴ５０は−１１．５℃となり、Ｃｏｎｔｒｏｌとの差、すなわち過冷却活性は−７．１℃であった。
【００４９】
（実施例３）
エーテル型の親水基を持つ非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル（分子量１４００）を０．１ｇ／Ｌの濃度で添加した溶液の過冷却活性を測定した。ＩＮＴ５０は−１６．１℃となり、Ｃｏｎｔｒｏｌとの差、すなわち過冷却活性は−１１．７℃となった。
（実施例４）
エステルエーテル型の親水基を持つ非イオン性界面活性剤、ポリエチレングリコールモノステアラート（分子量２０００）を０．１ｇ／Ｌの濃度で添加した溶液の過冷却活性を測定した。ＩＮＴ５０は−１４．１℃となり、Ｃｏｎｔｒｏｌとの差、すなわち過冷却活性は−９．７℃となった。
【００５０】
（実施例５）
４級アンモニウム塩型の親水基を持つカチオン性界面活性剤、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(分子量３６０)を０．１ｇ／Ｌの濃度で添加した溶液の過冷却活性を測定した。ＩＮＴ５０は−１６．２℃となり、Ｃｏｎｔｒｏｌとの差、すなわち過冷却活性は−１１．８℃であった。
（実施例６）
４級アンモニウム塩型の親水基を持つカチオン性界面活性剤、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド(分子量３２０)を０．１ｇ／Ｌの濃度で添加した溶液の過冷却活性を測定した。ＩＮＴ５０は−１６．３℃となり、Ｃｏｎｔｒｏｌとの差、すなわち過冷却活性は−１１．９℃であった。
【００５１】
（実施例７）
カルボン酸塩型の親水基を持つアニオン性界面活性剤、コール酸ナトリウム(分子量４３０)を０．１ｇ／Ｌの濃度で添加した溶液の過冷却活性を測定した。ＩＮＴ５０は−８．５℃となり、Ｃｏｎｔｒｏｌとの差、すなわち過冷却活性は−４．０℃であった。
【００５２】
（実施例８）
天然の界面活性剤であり、ノニオン性界面活性剤に分類することが可能な、茶種子由来サポニン（分子量）を０．１ｇ／Ｌの濃度で添加した溶液の過冷却活性を測定した。ＩＮＴ５０は−９．８℃となり、Ｃｏｎｔｒｏｌとの差、すなわち過冷却活性は−５．３℃であった。
実施例１〜８の結果を図１にまとめた。
【００５３】
（実施例１０）
超純水に対する界面活性剤の過冷却活性について、測定を行った。測定方法は実施例１〜９と概ね同様であるが、ヨウ化銀は用いずに測定を実施し、Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液は超純水とした。
界面活性剤としてはｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、分子量  ６５０）を用い、超純水に０．１ｇ／Ｌの濃度で添加した溶液の過冷却活性を測定した。
ＩＮＴ５０は−２４．８℃となり、Ｃｏｎｔｒｏｌとの差、すなわち過冷却活性は−３．５℃となった。
【００５４】
以下に示す実施例１１、１２においては、凍結防止剤として、エチレングリコールを含む超純水に界面活性剤を添加した場合の過冷却活性について測定を行った。
本実施例における過冷却活性は、下記に記載する方法で測定した。
すなわち、示差走査熱量計（ＤＳＣ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  社製、Ｑ２０））を用いて、各溶液の凍結温度を測定した。冷却速度は１．０℃／ｍｉｎとして、冷却過程で現れる発熱ピークのピークトップ温度を凍結温度とし、Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液との差を過冷却活性とした。Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液には、エチレングリコールを１０容積％の濃度で含有する超純水を用いた。また、窒素ガスを５０ｍｌ／ｍｉｎでパージし、不活性状態で測定を実施した。
ここで、図２は、ＤＳＣ(示差走査熱量計)チャートを示す。
【００５５】
横軸は温度（℃）、縦軸は熱流（Ｈｅａｔ  Ｆｌｏｗ、Ｗ／ｇ）を示し、上方向が発熱を示す。空のアルミ容器とアルミ容器に測定試料を秤量したものとを同一炉内で同時に冷却した際に生じるそれぞれの温度差から、熱流を算出することで、図２に示すチャートを得た。チャートに現れるピークは、溶液が凍結する際の発熱ピークであると考えられるため、それぞれのピークトップ温度を凍結温度とし、エチレングリコール水溶液とそこに水の過冷却促進剤を添加した試料との凍結温度の差を過冷却活性として評価した。
【００５６】
（実施例１１）
界面活性剤として、ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）を用いて、Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液に０．１ｇ／Ｌ添加し、過冷却活性の測定を実施した。過冷却活性は−５．５℃であった。
（実施例１２）
界面活性剤として、ヘキサデシルトリメチルアンモウムブロミドを用いて、Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液に０．１ｇ／Ｌ添加し、過冷却活性の測定を実施した。過冷却活性は−７．５℃であった。
実施例１１、１２についてＤＳＣのチャートを図２に示した。
【００５７】
（実施例１３）
超純水に非イオン性界面活性剤、ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）を０．１ｇ／Ｌ、凍害防止剤である市販ロングライフクーラント（ＬＬＣ）（トヨタ製、スーパーロングライフクーラント）を添加し、過冷却活性の測定を行った。本実施例で用いたＬＬＣは、エチレングリコール（８７〜９０質量％）と防錆剤からなる。測定は示差走査熱量計を用いて、実施例１１、１２と同様の方法で行った。
超純水に上記ＬＬＣを１０容量％添加したものをＣｏｎｔｒｏｌとし、そこへｔｗｅｅｎ８０を０．１ｇ／Ｌの濃度で添加した溶液を被測定溶液とした。
その場合の過冷却活性は−５．０℃となり、防錆剤などの添加剤が含まれると考えられる不凍性液体においても、過冷却活性を示した。
【００５８】
（比較例１）
実施例１に記載の方法と同様の方法で、同濃度（０．１ｇ／Ｌ濃度）の食塩（ＮａＣｌ）を添加した溶液の過冷却活性を測定した。しかし、Ｃｏｎｔｒｏｌ溶液との差は見られず、ＮａＣｌは極微量の添加で発現するような過冷却活性は持たないことが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の水の過冷却促進剤は、溶液に添加し、不凍性液体やガラス化液として使用することができる。この不凍性液体中に、植物や動物などの細胞や組織、食用の魚介類、野菜などの生物材料を入れて、冷却することで、０℃以下、特に０〜−１０℃の温度範囲で凍結を起こさず、長期低温保存が可能となる。また、過冷却飲料としての応用も可能である。
例えば、魚や肉などの生鮮食品の保存、ジュースなどの食品原料の輸入などを凍結保存から過冷却保存へと変換することが可能で、エネルギーの削減が可能となる。
ｔｒｏｌとの差、すなわち過冷却活性は−１１．９℃であった。
【００６０】
また、臓器移植時の臓器保存液としての利用等、臓器保存への適用も可能である。コンピューター、車のエンジン冷却液など、石油系に代わる冷却剤としての応用も可能である。    また、冷凍庫などの着霜防止、車窓ガラスの曇り防止、トンネル結露防止などの目的で材料表面を塗装して結氷を防止することも可能である。さらに、植物への低温耐性の付与により氷点下で凍結しないで生長する植物の作出も可能となる。また雲への散布によって氷晶化を抑制し、降雪量を調整することも可能である。その他、凍結制御剤として凍結保存への応用が可能である。また。氷蓄熱、輸送システムによる電力利用の平準化にも寄与できる。
【図１】
0006319932.tif 000003
【図２】
0006319932.tif 000004