(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鶏抗体の軽鎖可変部位に含まれている配列番号１〜４および重鎖可変部位に含まれている配列番号５〜８のフレームワークに存在するシステイン以外のアミノ酸のうちの一つ以上がシステインに置換された変異フレームワークを含む抗体であって、
前記システインに置換されるアミノ酸の位置が
配列番号１のアミノ酸配列中のカバット番号として５番、６番、７番、１４番、１８番位置、
配列番号２のアミノ酸配列中のカバット番号として３７番、４５番位置、
配列番号３のアミノ酸配列中のカバット番号として５７番、５８番、６１番、６３番、６４番、６５番、６６番、６９番、７０番、７６番、８３番、８７番位置、
配列番号４のアミノ酸配列中のカバット番号として１０２番、および１０６番位置、
配列番号５のアミノ酸配列中のカバット番号として１番、５番、６番、７番、１１番、１２番、１３番、１６番、１８番、１９番、２４番、２５番位置、
配列番号６のアミノ酸配列中のカバット番号として４２番、４８番位置、
配列番号７のアミノ酸配列中のカバット番号として６９番、７２番、７４番、７５番、７７番、８３番、８４番、８５番、８７番、８９番位置、および
配列番号８のアミノ酸配列中のカバット番号として１１０番、および１１３番位置からなる群より選択された一つ以上であり、
前記置換されたシステインの両側に位置する二つのアミノ酸のうちの一つ以上のアミノ酸が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択された１種以上の負電荷を持つアミノ酸に置換されたものである、抗体。
【請求項２】
前記置換されたシステインの両側に位置する二つのアミノ酸のうちの一つのアミノ酸が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択されたアミノ酸に置換され、他の一つのアミノ酸がアルギニンまたはリシンに置換されたものである請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記変異フレームワークは配列番号２０、２１、２３、２４、３６、３７、３９、４０、５２、５３、５５および５６のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むものである請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記変異フレームワークは配列番号６８、６９、７１、７２、８４、８５、８７、および８８のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記鶏抗体の軽鎖可変部位に存在するフレームワークで、システインに置換されるアミノ酸の位置が
配列番号１のアミノ酸配列中のカバット番号として５番、６番、７番、１４番、１８番位置、
配列番号２のアミノ酸配列中のカバット番号として３７番、４５番位置、
配列番号３のアミノ酸配列中のカバット番号として５７番、５８番、６１番、６３番、６４番、６５番、６６番、６９番、７０番、７６番、８３番、８７番、および
配列番号４のアミノ酸配列中のカバット番号として１０２番、および１０６番位置からなる群より選択された１つ以上のアミノ酸位置であり
前記鶏抗体の重鎖可変部位に存在するフレームワークで、システインに置換されるアミノ酸の位置が
配列番号５のアミノ酸配列中のカバット番号として１番、５番、６番、７番、１１番、１２番、１３番、１６番、１８番、１９番、２４番、２５番、
配列番号６のアミノ酸配列中のカバット番号として４２番、４８番
配列番号７のアミノ酸配列中のカバット番号として６９番、７２番、７４番、７５番、７７番、８３番、８４番、８５番、８７番、８９番、および
配列番号８のアミノ酸配列中の１１０番、および１１３番位置からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸位置である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項６】
前記鶏抗体の軽鎖可変部位に存在するフレームワークで、システインに置換されるアミノ酸の位置が配列番号１のアミノ酸配列中のカバット番号として５番、６番および７番位置からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸位置であり、
前記鶏抗体の重鎖可変部位に存在するフレームワークで、システインに置換されるアミノ酸の位置が配列番号５のアミノ酸配列中のカバット番号として１３番および１６番からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸位置である請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記軽鎖可変部位の変異フレームワークは配列番号２０、２１、２３、２４、３６、３７、３９、４０、５２、５３、５５および５６のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含み、
前記重鎖可変部位の変異フレームワークは配列番号６８、６９、７１、７２、８４、８５、８７、および８８のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むものである請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記システイン置換抗体が
システイン置換された抗体をコーディングする核酸配列を突然変異誘発させること；
システイン置換された抗体を発現させること；および
システイン置換された抗体を単離および精製すること
を含む方法によって製造されるものである、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１または２による抗体に、薬物、酵素、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、毒素、親和性リガンド、および検出標識からなる群より選択された１種以上の接合化合物を結合した複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システイン残基で変更された操作された鶏の抗体に関するものであって、より具体的には疾病の治療的または診断的適用を伴った抗体に関するものである。システイン変更された抗体は、化学療法薬物、毒素、ペプチドおよび親和性リガンド、例えばビオチン、および検出標識、例えば放射性同位元素および蛍光団と接合させることができ、疾病の診断または治療用途に用いられ得る。
【背景技術】
【０００２】
抗体は診断用と治療用として広く使用されている。抗体は薬物、酵素、ｄｙｅ、ペプチド、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）、毒素（ｔｏｘｉｎ）、アイソトープ（ｉｓｏｔｏｐｅ）などとの化学的な結合を通じて機能が向上するか、または新たな機能が追加され得る。このような物質との化学的結合には抗体チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅｓ）残基のＯＨ基、リシン（ｌｙｓｉｎｅｓ）残基のＮＨ３基あるいはアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）のカルボキシル（ｃａｒｂｏｘｙｌ）基のような官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ）が用いられる（文献［Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．（１９７８）２９８：１３８４−１３８６；Ｒａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ（１９８３）２：９３４−９３８；ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８１）２０：４８３６−４８４２］）。
【０００３】
しかし、このような官能基が抗原結合部位にも存在するので、抗原結合部位の残基が化学的結合に関与する場合、抗体の抗原との親和度に影響を与えることがある。また、システインを用いた結合反応は抗体分子の鎖（ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ））内部あるいは鎖間の二硫化結合の還元を前提とし、これは蛋白質活性に影響を与えることがある（文献［Ｓｔｉｍｍｅｌ  Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７３：３０４４５−３０４５０］）。また、蛋白質はミスフォールディングまたは三次構造の損失によって不活性または非特異的になることがある（文献［Ｚｈａｎｇ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００２）３１１：１−９］）。
【０００４】
部位特異的接合は、これが生物学的活性の完全な保有を促進し添加された補欠分子団の可能な数に対する制御を許す、結合部位から遠く離れた部位の化学的変形を可能にするので、無作為アミノ変形より好ましい。システイン操作された抗体は新しく導入されたシステイン残基のチオール基でリンカーを通じてチオール−反応性リンカー試薬および薬物−リンカー試薬と接合されて坑癌特性を有するシステイン操作された抗体薬物接合体、例えば抗−ＭＵＣ１６（ＵＳ２００８／０３１１１３４）、抗−ＣＤ２２（ＵＳ２００８／００５０３１０）、抗−ＲＯＢＯ４（ＵＳ２００８／０２４７９５１）、抗−ＴＥＮＢ２（ＵＳ２００９／０１１７１００）、抗−ＣＤ７９Ｂ（ＵＳ２００９／００２８８５６；ＵＳ２００９／００６８２０２）チオＡＤＣを製造する。しかし、ヒトあるいはその他の動物の場合、抗体重鎖および軽鎖可変部位遺伝子がそれぞれ１つ以上存在し、その結果、抗体のフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）は各抗体ごとに多様な配列で構成されるので、抗体のそれぞれに対してシステイン残基を導入する位置を個別的に最適化しなければならないという問題点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一例は、重鎖可変部位または軽鎖可変部位に存在するフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）領域にシステイン残基が導入された鶏抗体のフレームワーク断片、前記フレームワーク断片を含む重鎖可変部位または軽鎖可変部位、または前記重鎖可変部位または軽鎖可変部位を含む抗体を提供する。
【０００６】
本発明の他の例は、前記鶏抗体のフレームワーク断片、前記フレームワーク断片を含む重鎖可変部位または軽鎖可変部位、または前記重鎖可変部位または軽鎖可変部位を含む鶏の抗体に存在する導入されたシステイン残基に、化学療法薬物、酵素、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、毒素、親和性リガンド、または検出標識のような接合化合物を接合した抗体またはその抗原結合断片と接合化合物を含む複合体を提供する。
【０００７】
本発明の他の例は、抗体またはその抗原結合断片と接合化合物を含む複合体を用いて、疾病の診断または治療のための用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鶏抗体の重鎖可変部位および軽鎖可変部位においてフレームワーク領域に存在する多様なアミノ酸残基のうちのシステインに変更されても抗体活性および親和度が維持される残基を選別して、特定アミノ酸がシステインに変更された鶏抗体の重鎖可変部位および軽鎖可変部位のフレームワーク断片、前記フレームワークを含む重鎖可変部位または軽鎖可変部位、および前記重鎖可変部位または軽鎖可変部位を含む抗体またはその抗原結合断片を提供した。
【０００９】
好ましくは、前記導入されたシステインの位置は抗体分子間の二硫化結合形成を誘導しなくて二量体が形成されないか、少量のみ形成されながら、システインの反応性を維持し、このようなシステインが導入された抗体またはその抗原結合断片は化学療法薬物、酵素、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、毒素、親和性リガンド、または検出標識のような接合化合物を容易に結合することができるため、疾病の診断または治療に多様に適用され得る。
【００１０】
また、本発明によるシステイン変更されたフレームワーク、前記フレームワークを含む重鎖可変部位または軽鎖可変部位、および前記重鎖可変部位または軽鎖可変部位を含む抗体またはその抗原結合断片は、鶏の抗体に由来したものであり、鶏の抗体はヒトあるいはその他の動物の抗体とは異なり、抗体可変領域遺伝子が重鎖１つ、軽鎖１つのみ存在し、その結果、全ての抗体が同一のフレームワークを有しており、本発明によるシステイン操作フレームワークまたはこれを含む抗体は同一の位置でシステインが位置するので、鶏から生産する全ての抗体に同一に適用できる長所がある。
【００１１】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明の一実施形態による抗体は、鶏の抗体に由来した重鎖可変部位および軽鎖可変部位においてフレームワーク領域に存在する一つ以上のアミノ酸残基がシステインに置換されたフレームワークを含む抗体に関するものである。
【００１２】
本発明のまた他の例による抗体は、前記鶏の抗体に由来した重鎖可変部位および軽鎖可変部位においてフレームワーク領域に存在する一つ以上のアミノ酸残基がシステインに置換され、追加的に前記置換されたシステインの両側に位置する二つのアミノ酸のうちの一つ以上のアミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニンおよびリシンからなる群より選択された１種以上の荷電アミノ酸に追加的に置換されたものであり得る。
【００１３】
本発明ではシステインに置換されたフレームワークを含む変異抗体の製造を抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子が各一つのみ存在する鶏の抗体を用いて行うことによって、抗体重鎖および軽鎖可変部位遺伝子がそれぞれ多数存在するヒトあるいはその他の動物の抗体とは異なり、シスチン残基を導入する位置を個別的に最適化する必要なく速やかにシステインに変形された抗体を製造することができる。
【００１４】
本発明において、前記鶏の抗体に由来した重鎖可変部位および軽鎖可変部位においてフレームワーク領域に存在する一つ以上のアミノ酸残基がシステインに置換された抗体（Ｃｙｓ）は一つのアミノ酸だけでなく２つ以上のアミノ酸をシステインに置換することによって、２つの接合化合物を接合させるか、または互いに異なる種類の２以上の接合化合物を接合して様々な機能を有する複合体を製造することができる長所を有する。
【００１５】
また、本発明による変異抗体において、前記システイン置換だけでなく、置換されたシステインのすぐ隣接した二つのアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸をアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニンおよびリシンからなる群より選択された１種以上の荷電アミノ酸に置換することによって反対の電荷を帯びている物質との共有結合を効果的に誘導することができ、同一局所荷電システイン変形抗体間の二硫化結合形成を抑制して抗体の沈殿（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を抑制することができ、負荷電アスパラギン酸、グルタミン酸に置換した場合にマレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）結合瓦解を抑制することができる長所がある（文献［Ｓｈｅｎ  Ｂ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２）３０：１８４−１８９］）。
【００１６】
本発明において、システインに置換可能なアミノ酸位置はシステインでないアミノ酸であり、前記フレームワーク内に位置した全てのアミノ酸を置換することができるが、システインに変更しても抗体活性および親和度が維持される残基でなければならない。
【００１７】
前記条件を満たす置換アミノ酸の位置は鶏の抗体中の軽鎖可変部位に存在するフレームワーク内に位置し、配列番号１のフレームワーク１、配列番号２のフレームワーク２、配列番号３のフレームワーク３、および配列番号４のフレームワーク４を含み、これらフレームワーク構造は図１ａに詳しく示されている。
【００１８】
本発明の一例で、前記変異抗体は、軽鎖可変部位の変異フレームワーク単独、重鎖可変部位の変異フレームワーク単独、または軽鎖可変部位の変異フレームワークと重鎖可変部位の変異フレームワークを全て含む抗体であり得る。
【００１９】
前記鶏の抗体中の軽鎖可変部位に存在するフレームワークで、システインに置換されるアミノ酸の位置が
配列番号１のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として３番、４番、５番、１２番、１６番位置（カバット番号として５番、６番、７番、１４番、１８番位置に相応する）、
配列番号２のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として３１番、４０番位置（カバット番号として３７番、４５番位置に相応する）、
配列番号３のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として５２番、５３番、５６番、５８番、５９番、６０番、６１番、６４番、６５番、７１番、７８番、８２番位置（カバット番号として５７番、５８番、６１番、６３番、６４番、６５番、６６番、６９番、７０番、７６番、８３番、８７番に相応する）、および
配列番号４のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として９８番、および１０２番位置（カバット番号として１０２番、および１０６番）からなる群より選択された１つ以上のアミノ酸位置であり得る。
【００２０】
前記軽鎖可変部位に存在するフレームワークで、システインに置換可能なアミノ酸位置を表１ａに示した。
【００２１】
【表１】
0006389880.tif 000002
【００２２】
また、前記条件を満たす置換アミノ酸の位置は鶏の抗体中の重鎖可変部位に存在するフレームワーク内に位置し、配列番号５のフレームワーク１、配列番号６のフレームワーク２、配列番号７のフレームワーク３、および配列番号８のフレームワーク４を含み、これらフレームワーク構造は図１ａに詳しく示されている。
【００２３】
前記置換アミノ酸の位置は、鶏の抗体中の重鎖可変部位に存在するフレームワークでシステインに置換されるアミノ酸の位置が配列番号５のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として１番、３番、５番、６番、７番、１１番、１２番、１３番、１６番、１８番、１９番、２４番、２５番（カバット番号として１番、３番、５番、６番、７番、１１番、１２番、１３番、１６番、１８番、１９番、２４番、２５番に相応する）、
配列番号６のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として４２番、４８番（カバット番号として４２番、４８番に相応する）、
配列番号７のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として７０番、７３番、７５番、７６番、７８番、８７番、８８番、８９番、９１番、９３番（カバット番号として６９番、７２番、７４番、７５番、７７番、８３番、８４番、８５番、８７番、８９番に相応する）、および
配列番号８のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として１２３番、および１２６番位置（カバット番号として１１０番、および１１３番位置に相応する）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸位置であり得る。
【００２４】
前記重鎖可変部位に存在するフレームワークで、システインに置換可能なアミノ酸位置を表１ｂに示した。
【００２５】
【表２】
0006389880.tif 000003
【００２６】
また、前記軽鎖可変部位のシステインに置換可能なアミノ酸の好ましい位置は配列番号１のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として３番、４番および５番（カバット番号として５番、６番および７番に相応する）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸である。前記重鎖可変部位のシステインに置換可能なアミノ酸の好ましい位置は配列番号５のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として１３番および１６番位置（カバット番号として１３番および１６番位置に相応する）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸であり得る。
【００２７】
本発明の一例で、前記好ましい位置のアミノ酸がシステインに置換されると共に、置換位置の両側に位置した２つのアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニンおよびリシンからなる群より選択された１種以上の荷電アミノ酸に置換されたものであり得る。例えば、変異抗体が軽鎖可変部位のシステインで置換可能なアミノ酸の好ましい位置は配列番号１のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として３番、４番および５番からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸であり、または前記重鎖可変部位のシステインで置換可能なアミノ酸の好ましい位置は配列番号５のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として１３番および１６番からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸である場合、両側に位置したアミノ酸が荷電アミノ酸に置換されたフレームワークは下記表３ａおよび表３ｂの変異配列を含むことができる。
【００２８】
【表３】
0006389880.tif 000004
【００２９】
【表４】
0006389880.tif 000005
【００３０】
したがって、システイン置換と共に隣接アミノ酸の置換を共に含む変異抗体は、配列番号５７乃至配列番号８８のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含む変異軽鎖可変部位を含むか、配列番号５７乃至配列番号８８のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含む変異重鎖可変部位を含むか、前記変異軽鎖可変部位と変異重鎖可変部位の両方とも含む抗体であり得る。
【００３１】
別に言及されない限り、本願に使用された下記の用語および語句は下記の意味を有するように意図される。本願の用語“抗体”は最も広範囲な意味で使用され、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および好ましい生物学的活性を示す抗体断片が含まれる。抗体はマウス、ヒト、ヒト化、キメラ抗体であり得るか、または他の種に由来したものであり得る。抗体は、全長イムノグロブリン分子または全長イムノグロブリン分子の免疫学的活性部分、即ち、標的抗原（このような標的は、癌細胞、または自己免疫疾患と関連する自己免疫抗体を生成する細胞を含むが、これに制限されない）またはその一部と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を含む。本願に開示されたイムノグロブリンは、イムノグロブリン分子の類型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのうちのいずれかであり得る。イムノグロブリンは任意の種から誘導され得る。
【００３２】
本明細書で、“抗体断片”は、全長抗体の一部、一般にはその抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ジアボディ；線状抗体；ミニボディ（文献［Ｏｌａｆｓｅｎ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌ．（２００４）１７：３１５−３２３］）、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片、抗−ＥＤＯタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、および癌細胞抗原、ウイルス抗原または微生物抗原に免疫特異的に結合する上記中の任意のもののエピトプ−結合断片、単一−鎖抗体分子、抗体断片から形成された多重特異的抗体を含む。
【００３３】
本発明において、前記システイン置換抗体が、１）システイン置換された抗体をコーディングする核酸配列を突然変異誘発させること；２）システイン置換された抗体を発現させること；および３）システイン置換された抗体を単離および精製することを含む方法によって製造されるものであり得る。また、システインの両側に位置するアミノ酸の置換も前記システイン置換と同様な方法で製造されたものであり得る。
【００３４】
本発明の他の実施形態で、本発明による変異抗体に化学療法薬物、酵素、ペプチド、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、毒素、親和性リガンド、または検出標識のような接合化合物を接合した抗体またはその抗原結合断片と接合化合物を含む複合体を提供する。前記接合化合物の種類によって、前記複合体は疾病の診断または治療に多様に適用され得る。
【００３５】
本発明の他の例で、ペプチドと化学的に結合した抗体はその受容体を通じて血液脳関門（ｂｌｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）を効果的に通過できるなどペプチドの親和度に寄与する機能を追加的に有し得る（文献［Ｃｈａｃｋｏ  Ａ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．（２０１３）１０：９０７−２６；特許：ＥＰ２  ２３３  １５６  Ｂ１］）。
【００３６】
前記接合化合物は、リガンド親和度、抗体／抗原結合、またはイオン複合体形成を調整するために（ｉ）検出可能な信号を提供するか、（ｉｉ）第２標識と相互作用して第１または第２標識によって提供される検出可能な信号を変形させて、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を生成させるか；（ｉｉｉ）抗原またはリガンドとの相互作用を安定化するかこれらとの結合親和度を増加させるか、（ｉｖ）移動性、例えば電気泳動移動性、または細胞−透過度に電荷、疎水性、形態または他の物理的パラメータによる影響を与えるか、または（ｖ）捕獲モイエティを提供する機能を果たすことができる。
【００３７】
標識されたシステイン置換抗体は、例えば、特異的細胞、組織、または血清から関心抗原の発現を検出するための診断分析において有用であり得る。診断用途のために、抗体は典型的に検出可能なモイエティで標識される。数多くの標識が利用可能であり、これらは一般に下記のカテゴリーに分類される。
【００３８】
（ａ）放射性同位元素（放射性核種）、例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、または２１３Ｂｉ。放射性同位元素標識された抗体は、受容体標的化された画像化実験に有用である。放射性同位元素金属に結合するかキレート化されるかまたは他の方式に複合体化し抗体の操作されたシステインチオールと反応性であるリガンド試薬で標識され得る。
【００３９】
（ｂ）蛍光標識、例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインなどをはじめとするフルオレセイン類型、ＴＡＭＲＡなどをはじめとするローダミン類型；ダンシル；リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）およびこれらの類似体などを含む。蛍光染料および蛍光標識試薬は、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン所在）およびピアスバイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，米国イリノイ州ロックフォード所在）で市販するものを含む。
【００４０】
（ｃ）多様な酵素−基質標識が利用可能であるか、文献に開示されている（ＵＳ４２７５１４９）。酵素は、一般に多様な技術を用いて測定できる発色基質の化学的変更を触媒する。例えば、酵素は基質での色変化を触媒することができ、これは分光学的に測定することができる。酵素は基質の蛍光または化学発光を変更させることができる。蛍光の変化を定量する技術は前述に記載されている。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼなどを含む。酵素を抗体に接合させる技術は通常の方法で遂行することができる。
【００４１】
本発明の他の例で、システイン置換された抗体は、放射性核種、蛍光染料、生物発光−触発基質モイエティ、化学発光−触発基質モイエティ、酵素、および診断、薬力学および治療的適用を用いる画像化実験で他の検出標識を有するシステインチオールを通じて標識され得る。一般に、標識されたシステイン操作された抗体、即ち、“バイオマーカー”または“プローブ”は生きている有機体、例えば、ヒト、げっ歯類、または他の小さい動物、かん流された器官、または組織サンプルに注射、かん流、または経口摂取によって投与される。プローブの分布を時間経過にわたって検出し、画像で示す。
【発明の効果】
【００４２】
本発明による鶏抗体のフレームワーク断片、前記フレームワーク断片を含む重鎖可変部位または軽鎖可変部位、または前記重鎖可変部位または軽鎖可変部位を含む抗体は抗体の二硫化結合形成を誘導しないか形成を抑制しながら抗体の活性および反応性を維持し、このようなシステインが導入された抗体またはその抗原結合断片は化学療法薬物、酵素、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、毒素、親和性リガンド、または検出標識のような接合化合物を容易に結合することができるので、哺乳動物細胞または関連した疾病の診断または治療に多様に適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１ａ】本研究に用いられた鶏抗体の野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）と生殖系列の塩基配列を比較し、順次的番号付け方式（上部列）、カバット番号付け方式（下部列）を示す。
【図１ｂ】吸光度検出のための固定されたＰＳＡでのＣｙｓ変異抗体ファージ結合と抗−ファージＨＲＰ抗体の結合をカートゥーン図面で示す。
【図１ｃ−１ｄ】Ｃｙｓ変異抗体ファージの４０５ｎｍでの吸光度の検出を用いる結合測定を示す。軽鎖変異体は上段にあり、重鎖変異体は下段にある。
【図１ｅ】Ｘ線結晶座標によって由来した鶏抗体断片の３次元表現を示す。重鎖および軽鎖の操作された５種類Ｃｙｓ変異残基の構造的位置を示す。
【図２】チオール反応性を有する二つのシステイン残基が含まれている抗体ファージの４０５ｎｍでの吸光度の検出を用いる結合測定を示す。
【図３ａ−３ｂ】陽イオンアミノ酸が追加されたＣｙｓ変異抗体ファージの４０５ｎｍでの吸光度の検出を用いる結合測定を示す。軽鎖変異体は上段にあり、重鎖変異体は下段にある。
【図３ｃ−３ｄ】陰イオンアミノ酸が追加されたＣｙｓ変異抗体ファージの４０５ｎｍでの吸光度の検出を用いる結合測定を示す。軽鎖変異体は上段にあり、重鎖変異体は下段にある。
【図４ａ】接合のための細胞培養から発現されたＣｙｓ変異一本鎖（ｓｉｇｌｅ  ｃｈａｉｎ）Ｆｖ（ｓｃＦｖ）形態抗体をクマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色で示す。
【図４ｂ】接合のための細胞培養から発現された陽イオンおよび陰イオンＣｙｓ変異ｓｃＦｖ形態抗体をクマシーブルー染色で示す。
【図５ａ】接合のための細胞培養から発現されたＣｙｓ変異全ＩｇＧ（ｆｕｌｌ  ＩｇＧ）形態抗体をクマシーブルー染色で示す。
【図５ｂ】接合のための細胞培養から発現された陽イオンおよび陰イオンＣｙｓ変異全ＩｇＧ形態抗体をクマシーブルー染色で示す。
【図６】Ｃｙｓ変異抗体にマレイミド活性化されたＰＥＧ接合方法をカートゥーン図面で示す。
【図７ａ】マレイミドＰＥＧが接合されたｓｃＦｖをクマシーブルー染色で示す。
【図７ｂ】マレイミドＰＥＧが接合されたｓｃＦｖをアイオダイン染色で示す。
【図７ｃ】マレイミドＰＥＧが接合されたｓｃＦｖを免疫ブロット方法を用いて示す。
【図８ａ】マレイミドＰＥＧが接合された全ＩｇＧ（ｆｕｌｌ  ＩｇＧ）をクマシーブルー染色で示す。
【図８ｂ】マレイミドＰＥＧが接合された全ＩｇＧをアイオダイン染色で示す。
【図８ｃ】マレイミドＰＥＧが接合された全ＩｇＧを免疫ブロット方法を用いて示す。
【図９ａ】陽イオンおよび陰イオン残基が添加されたｓｃＦｖにマレイミドＰＥＧを接合させた形態をクマシーブルー染色で示す。
【図９ｂ】陽イオンおよび陰イオン残基が添加されたｓｃＦｖにマレイミドＰＥＧを接合させた形態をアイオダイン染色で示す。
【図９ｃ】陽イオンおよび陰イオン残基が添加されたｓｃＦｖにマレイミドＰＥＧを接合させた形態を免疫ブロット方法を用いて示す。
【図１０ａ】陽イオンおよび陰イオン残基が添加された全ＩｇＧにマレイミドＰＥＧを接合させた形態をクマシーブルー染色で示す。
【図１０ｂ】陽イオンおよび陰イオン残基が添加された全ＩｇＧにマレイミドＰＥＧを接合させた形態をアイオダイン染色で示す。
【図１０ｃ】陽イオンおよび陰イオン残基が添加された全ＩｇＧにマレイミドＰＥＧを接合させた形態を免疫ブロット方法を用いて示す。
【図１１ａ】Ｃｙｓ変異抗体にＧＭＢＳ−コチニン接合方法をカートゥーン図面で示す。
【図１１ｂ】吸光度検出のための固定されたＰＳＡでのＧＭＢＳコチニンが接合されたＣｙｓ変異抗体に抗−コチニンＨＲＰ抗体の結合をカートゥーン図面で示す。
【図１２】Ｃｋａｐｐａが融合されたＣｙｓ変異ｓｃＦｖにＧＭＢＳ−コチニンの結合を４５０ｎｍでの吸光度の検出で示す。抗−コチニンＩｇＧ−ＨＲＰによる検出は上段にあり、抗−ＣｋａｐｐａＩｇＧ−ＨＲＰによる検出は下段にある。
【図１３ａ】コチニン−Ｃｙｓ変異抗体のマウスへの注入時間と採血時間を図面で示す。
【図１３ｂ】コチニン−Ｃｙｓ変異抗体のマウスへの注入前後の血清でのコチニン−Ｃｙｓ変異抗体の有無を４５０ｎｍでの吸光度の検出で示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、本発明を具体的な実施例によってより詳しく説明する。しかし、本発明は下記の実施例に限定されたものではなく、本発明の思想と範囲内での様々な変形または修正が可能であるのはこの分野で当業者に明白である。したがって、添付された請求項は広く本発明の思想と範囲に合致するように解釈されなければならない。
【実施例】
【００４５】
実施例１：一つのＣｙｓ変異抗体の製造
１−１．変異抗体ファージの製造
実施例で用いた抗体はＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）に対する鶏抗体であり、図１ａで抗ＰＳＡ抗体（野生型）と鶏生殖系列（ｃｈｉｃｋｅｎ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ）のフレームワーク塩基配列（［文献［Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０００）２４２：１５９−１８１］）を示している。カバット番号付けは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／で提供するシステムを用いた。
Ｃｙｓ変異抗体製造は先ず文献［Ｃｈｕｎｇ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（２００４）１８：３６１−３８３］方法によって軽鎖ドメインフレームワーク（ＶＬ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）７８個残基、重鎖ドメインフレームワーク（ＶＨ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）８４個残基をランダム化させるためにＮＮＫ（Ｎ：Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｋ：Ｇ／Ｔ）を各残基に挿入するＰＣＲを行った。その後、Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載された方法によって、確保したｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）ＤＮＡをファージミドベクター（ｐｈａｇｅｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ）であるｐｃｏｍｂ３Ｘに挿入し、これを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８に形質転換させた。その後、各残基ごとに９２個コロニーを選定してファージ（ｐｈａｇｅ）に接合（ｄｉｓｐｌａｙ）されたｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）形態が含まれている培養上清液（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を確保した。
【００４６】
１−２．変異抗体選別および抗原に対する親和度測定
抗体ファージが含まれている培養上清液を用いて図１ｂに描写された方法のような酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）を行った。プレート（マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ））に抗原であるＰＳＡをコーティングした後、ファージが含まれている培養上清液を添加し、１時間静置（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）と３回の洗浄過程を経た後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が接合されたａｎｔｉ−Ｍ１３抗体を添加した。１時間静置後に３回の洗浄過程を経てＨ２Ｏ２が添加されたＡＢＴＳを添加して発色を確認した後、吸光度を４０５ｎｍで測定した。対照群としては野生型ファージを用いた。軽鎖の２１個、重鎖の２７個残基はシステインに置換された後にも野生型抗体と類似の親和度を示した（図１ｃおよび図１ｄ）。表１ａおよび表１ｂではＣｙｓ変異体の順次的番号付けとカバット番号付け、各変異体の野生型塩基配列を示している。
【００４７】
【表５】
0006389880.tif 000006
【００４８】
【表６】
0006389880.tif 000007
【００４９】
選別されたＣｙｓ変異体の表面接近容易性を確認するために溶媒接近表面積（Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｒｅａ）をＸ線結晶座標によって由来した鶏抗体断片の３次元構造（文献［Ｓｈｉｈ  Ｈ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１２）２８７：４４４２５−４４４３４；ＰＤＢ  ＩＤ：４ＧＬＲ］）を通じて確認し、表２ａおよび表２ｂで示している。そのうちの５種の塩基（ＬＦ１−２、ＬＦ１−３、ＬＦ１−４、ＨＦ１−１３、ＨＦ１−１６）残基の構造的位置を図１ｅで示している。
【００５０】
【表７】
0006389880.tif 000008
【００５１】
【表８】
0006389880.tif 000009
【００５２】
実施例２：二つのＣｙｓ変異抗体の製造
順次的番号付けによって軽鎖（Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５）と重鎖（Ｈ１３、Ｈ１６）の残基のうちの軽鎖部分の一つの残基と重鎖部分の一つの残基をシステインに置換し組み合わせて総６種類（Ｌ３Ｈ１３、Ｌ３Ｈ１６、Ｌ４Ｈ１３、Ｌ４Ｈ１６、Ｌ５Ｈ１３、Ｌ５Ｈ１６）の二つの反応性システインが添加されたＣｙｓ変異抗体遺伝子をＰＣＲを通じて製作した。その後、実施例１のようにファージに接合（ｄｉｓｐｌａｙ）されたｓｃＦｖ形態に発現させた後、酵素結合免疫吸着分析法でＰＳＡ抗原に対する親和度を測定した（図２）。
【００５３】
実施例３：Ｃｙｓ周囲のアミノ酸残基が置換された変異抗体
効率的な接合のための実施例１−１で製造したＣｙｓ変異体５種（ＬＦ１−２、ＬＦ１−３、ＬＦ１−４、ＨＦ１−１３そしてＨＦ１−１６）の両側アミノ酸を陽イオンアミノ酸（アルギニン、リシン）あるいは陰イオンアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）に置換するために各残基に該当ＤＮＡ塩基配列（アルギニン；ＣＧＴ、リシン；ＡＡＧ、アスパラギン酸；ＧＡＴ、グルタミン酸；ＧＡＡ）をＰＣＲを通じて挿入した。その後、確保したｓｃＦｖ  ＤＮＡをファージミドベクター（ｐｈａｇｅｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ）であるｐｃｏｍｂ３Ｘに挿入し、これを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８に形質転換させた。その後、ファージに接合されたｓｃＦｖ形態でＳＢ培養液で培養した。陽イオンおよび陰イオン残基を添加したＣｙｓ変異体塩基配列は表３ａおよび表３ｂに示した。
【００５４】
抗原の親和度測定は、プレート（マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ））に抗原であるＰＳＡをコーティングした後、ファージが含まれている培養上清液を添加した１時間以後、３回の洗浄過程を経て、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が接合されたａｎｔｉ−Ｍ１３抗体を添加した。１時間静置後、３回の洗浄過程を経てＨ２Ｏ２が添加されたＡＢＴＳを添加して発色を確認した後、吸光度を４０５ｎｍで測定した。陽イオンＣｙｓ変異体結果は図３ａおよび図３ｂに、陰イオンＣｙｓ変異体結果は図３ｃおよび図３ｄに示した。
【００５５】
【表９】
0006389880.tif 000010
【００５６】
【表１０】
0006389880.tif 000011
【００５７】
実施例４：Ｃｙｓ変異ｓｃＦｖ抗体
４−１．Ｃｙｓ変異ｓｃＦｖ抗体発現および精製
Ｃｙｓ変異ｓｃＦｖのヒトＣｋａｐｐａを含む融合蛋白質を製造するためにヒトＣｋａｐｐａを含む哺乳類発現ベクターであるｐＣＥＰ４ベクターにクローニング過程を通じて挿入し、これをＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現を誘導した後に最終培養液を確保した。培養液でｓｃＦｖ−Ｃｋａｐｐａ融合蛋白質の精製は、カッパセレクトビーズ（ｋａｐｐａ  ｓｅｌｅｃｔ  ｂｅａｄ）を用いて精製した。精製後、蛋白質をポリアクリールアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ）にローディングした後に電気泳動し、クマシー染色を通じて発現および精製を確認した。図４ａは野生型、ＬＦ１−２、ＬＦ１−３、ＬＦ１−４、ＨＦ１−１３、そしてＨＦ１−１６ｓｃＦｖ蛋白質発現、精製結果を示す。
４−２．Ｃｙｓ周囲のアミノ酸残基が置換されたＣｙｓ変異ｓｃＦｖ抗体発現および精製
Ｃｙｓ周囲のアミノ酸残基が陽イオンまたは陰イオン性アミノ酸に変更されたＣｙｓ変異抗体で抗原に対する親和度が維持されるクローンを実施例４−１のようにヒトＣｋａｐｐａを含む融合蛋白質としてＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現を誘導した後、カッパセレクトビーズ（ｋａｐｐａ  ｓｅｌｅｃｔ  ｂｅａｄ）を用いて精製した。その後、ポリアクリールアミドゲルで電気泳動を実施し、クマシー染色を通じて発現および精製を確認した。図４ｂは野生型、ＨＦ１−１３、Ｒ１３ＣＫ、Ｄ１３ＣＥ、Ｅ１３ＣＤ、Ｅ１３ＣＥ  ｓｃＦｖ−Ｃｋａｐｐａ融合蛋白質の発現および精製を確認した結果である。
【００５８】
実施例５：Ｃｙｓ変異全ＩｇＧ抗体
５−１．Ｃｙｓ変異全抗体発現および精製
鶏−ヒトキメラ全ＩｇＧ形態の蛋白質を製造するために、実施例１で製造したＣｙｓ変異抗体可変領域の軽鎖と重鎖ＤＮＡをＰＣＲを通じて確保した後、これをＩｇＧ発現用ベクターに挿入し、これをＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現および培養した。その後、プロテインＡビーズ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｂｅａｄ）を用いて全ＩｇＧ抗体を精製した。精製した蛋白質は電気泳動した後、クマシー染色を通じて発現および精製を確認した。図５ａは野生型、ＬＦ１−２、ＬＦ１−３、ＬＦ１−４、ＨＦ１−１３、そしてＨＦ１−１６全ＩｇＧ蛋白質の発現および精製結果を示した。
５−２．Ｃｙｓ周囲のアミノ酸残基が置換されたＣｙｓ変異全ＩｇＧ抗体発現および精製
実施例３で製造されたＣｙｓ周囲のアミノ酸残基が置換されたＣｙｓ変異抗体を実施例５−１のように鶏−ヒトキメラ全ＩｇＧ形態の抗体として発現するために抗体遺伝子をＩｇＧ発現用ベクターに挿入し、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現および培養した。その後、培養液でプロテインＡビーズ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｂｅａｄ）を用いて全ＩｇＧ抗体を精製し、ポリアクリールアミドゲルに精製された蛋白質をローディングした後に電気泳動を実施した。その後、ゲルをクマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色を行って蛋白質の発現と精製を確認した。図５ｂは、Ｒ１３ＣＫ、Ｅ１３ＣＤ、Ｅ１３ＣＥ全ＩｇＧ蛋白質の発現および精製結果である。
【００５９】
実施例６：ＰＥＧ接合された変異抗体
６−１．ＰＥＧ接合によるＣｙｓ変異抗体−ＰＥＧ製造および検定
文献［Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９２５−３２］に記載された方法によって、実施例１で製造されたＣｙｓ変異抗体の１０倍ＴＣＥＰを添加して還元させた後、ＴＣＥＰ除去過程を経て、ＴＣＥＰ量の２倍のＤＨＡを添加して部分的酸化させる。その後、抗体の１０倍のマレイミドＰＥＧを添加し４℃で１２時間以上静置させて抗体へのＰＥＧ接合を誘導した。図６はマレイミドＰＥＧがスルフヒドリル抗体に接合される過程をカートゥーン図面で説明した。
抗体−ＰＥＧはポリアクリールアミドゲルにローディングした後、電気泳動を実施した。その後、ゲルをクマシーあるいはアイオダイン（Ｉｏｄｉｎｅ）染色、免疫ブロット方法を用いて抗体へのＰＥＧ接合の有無を確認した。クマシー染色はクマシーブリリアントブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）Ｒ２５０で染色した後、メタノール、酢酸が含まれている脱色溶液で脱色させた後、当該蛋白質を確認した。図７ａは野生型、ＬＦ１−２、ＬＦ１−３、ＬＦ１−４、ＨＦ１−１３、ＨＦ１−１６ｓｃＦｖ、図８ａは野生型、ＬＦ１−２、ＬＦ１−３、ＬＦ１−４、ＨＦ１−１３、ＨＦ１−１６全ＩｇＧの結果を示す。
アイオダイン染色はポリアクリールアミドゲルを蒸溜水に１５分間洗浄させた後、５％ＢｌＣｌ２に１５分間静置させる。その後、ゲルを０．１Ｍアイオダインで１０分間染色し、蒸溜水で１０分間脱色してＰＥＧのみ検出させて確認した。図７ｂは野生型、ＬＦ１−２、ＬＦ１−３、ＬＦ１−４、ＨＦ１−１３、ＨＦ１−１６ｓｃＦｖ、図８ｂは野生型、ＬＦ１−２、ＬＦ１−３、ＬＦ１−４、ＨＦ１−１３、ＨＦ１−１６全ＩｇＧの結果を示す。
免疫ブロット方法を用いた確認は、ポリアクリールアミドゲルで 蛋白質大きさ別に分離した後、ＮＣメンブレン（ＮＣ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に全ＩｇＧは移動させ、ｓｃＦｖ−Ｃｋａｐｐａ融合蛋白質と全ＩｇＧ軽鎖部分はＨＲＰが接合された抗−Ｃｋａｐｐａ抗体を、全ＩｇＧ重鎖部分はＨＲＰが接合された抗−ヒトＦｃ抗体を用いて確認した。図７ｃは野生型、ＬＦ１−２、ＬＦ１−３、ＬＦ１−４、ＨＦ１−１３、ＨＦ１−１６ｓｃＦｖ、図８ｃは野生型、ＬＦ１−２、ＬＦ１−３、ＬＦ１−４、ＨＦ１−１３、ＨＦ１−１６全ＩｇＧの結果を示す。
６−２．ＰＥＧ接合によるＣｙｓ周囲のアミノ酸残基が置換されたＣｙｓ変異抗体−ＰＥＧ製造および検定
陽イオンあるいは陰イオン残基が追加された抗体も実施例６−１のようにＴＣＥＰを用いて還元させた後、ＤＨＡを添加して部分的酸化させた。その後、抗体にＰＥＧを添加して抗体にＰＥＧ接合を誘導し、抗体−ＰＥＧ接合検定はクマシーブルー染色、アイオダイン染色、免疫ブロット方法を行って実施した。
図９ａは野生型、ＨＦ１−１３、Ｒ１３ＣＫ、Ｄ１３ＣＥ、Ｅ１３ＣＤ、Ｅ１３ＣＥｓｃＦｖにＰＥＧが接合された結果を、図１０ａは野生型、ＨＦ１−１３、Ｒ１３ＣＫ、Ｅ１３ＣＥ全ＩｇＧにＰＥＧが接合された結果をクマシーブルー染色で示す。
図９ｂは野生型、ＨＦ１−１３、Ｒ１３ＣＫ、Ｄ１３ＣＥ、Ｅ１３ＣＤ、Ｅ１３ＣＥ  ｓｃＦｖにＰＥＧが接合された結果を、図１０ｂはＨＦ１−１３、Ｒ１３ＣＫ、Ｅ１３ＣＥ全ＩｇＧ結果をアイオダイン染色で示す。
図９ｃは野生型、ＨＦ１−１３、Ｒ１３ＣＫ、Ｄ１３ＣＥ、Ｅ１３ＣＤ、Ｅ１３ＣＥ  ｓｃＦｖにＰＥＧが接合された結果を、図１０ｃはＨＦ１−１３、Ｒ１３ＣＫ、Ｅ１３ＣＥ全ＩｇＧ結果を免疫ブロットで示す。
【００６０】
実施例７：コチニン接合による抗体−コチニン製造および検定
実施例１で製造したＣｙｓ変異抗体の１０倍ＴＣＥＰを添加して還元させた後、ＴＣＥＰ除去過程を経て、ＴＣＥＰ量の２倍のＤＨＡを添加して部分的酸化させる。その後、抗体の１０倍のＧＭＢＳ−コチニンを添加し４℃で１２時間以上静置させて抗体へのコチニン接合を誘導した。図１１ａはＧＭＢＳコチニンがスルフヒドリル抗体に接合される過程をカートゥーン図面で説明した。
抗体−コチニンは酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検定した（図１１ｂ）。ＰＳＡ抗原をプレートにコーティングした後、抗体−コチニンを添加して１時間静置させた。その後、３回の洗浄過程を経て、ＨＲＰが接合された抗−コチニンＩｇＧあるいは抗−ＣｋａｐｐａＩｇＧ抗体を添加した。１時間静置後に３回の洗浄過程を経てＴＭＢ（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を添加して発色を確認した後、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ吸光度を４５０ｎｍで測定した。図１２の結果でコチニンが接合されたかどうかは抗−コチニンＩｇＧによって確認され、抗−ＣｋａｐｐａＩｇＧはコチニン結合と関係なく抗体のみを測定する抗体として使用された。
【００６１】
実施例８：抗体−コチニンのマウス注入およびコチニン−抗体検定
６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスを無作為に３つのグループ（ＨＦ１−１３、Ｅ１３ＣＤ、Ｅ１３ＣＥ）に分けた後、眼窩静脈叢からの採血を実施した。２４時間以後、実施例７で製造されたコチニン−ｓｃＦｖ抗体Ｃｋａｐｐａ融合蛋白質３種類（ＨＦ１−１３、Ｅ１３ＣＤ、Ｅ１３ＣＥ）１００μｇを各マウスに静脈注射で注入した。コチニン−抗体注入１時間後に、マウス眼窩静脈叢から採血した後、遠心分離機で血清を分離した。分離された血清にコチニン−抗体の有無を確認するために血清を５０倍希釈して実施例９のように酵素結合免疫吸着分析法を実施した。マウスを用いた全ての遂行過程は苦痛を最少化するために吸入麻酔させた後に実施した。
【図１ａ】
0006389880.tif 000012
【図１ｂ】
0006389880.tif 000013
【図１ｃ】
0006389880.tif 000014
【図１ｄ】
0006389880.tif 000015
【図１ｅ】
0006389880.tif 000016
【図２】
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【図３ａ】
0006389880.tif 000018
【図３ｂ】
0006389880.tif 000019
【図３ｃ】
0006389880.tif 000020
【図３ｄ】
0006389880.tif 000021
【図４ａ】
0006389880.tif 000022
【図４ｂ】
0006389880.tif 000023
【図５ａ】
0006389880.tif 000024
【図５ｂ】
0006389880.tif 000025
【図６】
0006389880.tif 000026
【図７ａ】
0006389880.tif 000027
【図７ｂ】
0006389880.tif 000028
【図７ｃ】
0006389880.tif 000029
【図８ａ】
0006389880.tif 000030
【図８ｂ】
0006389880.tif 000031
【図８ｃ】
0006389880.tif 000032
【図９ａ】
0006389880.tif 000033
【図９ｂ】
0006389880.tif 000034
【図９ｃ】
0006389880.tif 000035
【図１０ａ】
0006389880.tif 000036
【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１ａ】
0006389880.tif 000039
【図１１ｂ】
0006389880.tif 000040
【図１２】
0006389880.tif 000041
【図１３ａ】
0006389880.tif 000042
【図１３ｂ】
0006389880.tif 000043
【配列表】
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