(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．０１ＭＰａ／分以下の速度で、および／または、ペプチド溶液の大きい表面積が空気と接触する条件下で、圧力を低下させることによって、水溶液中の自己集合性ペプチドを含む混合物が脱気される、第１の脱気工程と、
滅菌フィルタを通して前記混合物を濾過する工程と、
滅菌条件下で、振動、および圧力を低下させることによって、前記濾液が脱気される、第２の脱気工程と、
を含む、
均一に混合された、滅菌溶液を得るための方法。
【請求項２】
前記滅菌フィルタは、０．２２μｍ未満の平均細孔径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己集合性ペプチドは、ＲＡＤＡ１６−Ｉ（配列番号１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記自己集合性ペプチドは、ＩＥＩＫ１３（配列番号３９）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の脱気工程は、０．０１ＭＰａ／分未満の速度で、前記混合物の前記圧力を低下させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１および／または第２の脱気工程は、少なくとも０．０９５ＭＰａ、前記圧力を低下させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記圧力を低下させた後、前記圧力が少なくとも３０分間維持される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の脱気工程は、１５０回転／分で前記混合物を振動させることを含み、前記振動運動の偏心距離は、−１０ｃｍ〜１０ｃｍの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の脱気工程の前に、前記ペプチドを溶媒と混合することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶媒は水である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の脱気工程の後に、前記混合物で物品を無菌充填することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記物品は、前記第２の脱気工程の少なくとも５時間後に充填される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記物品は、注射器、パウチ、バイアル、チューブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記充填工程後に、ガス透過性材料で充填された物品を包装することと、滅菌工程とをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ガス滅菌は、エチレンオキサイドガスまたは過酸化水素ガスによって実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記物品を包装することは、単一包装または二重包装で実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記濾過は、０．５ＭＰａの圧力で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記濾過は、周囲温度前後で実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記フィルタは、以下：セルロースナイトレート、セルロースアセテート、ビニルポリマー、フッ化炭素、ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン、ポリプロピレン、ＥＶＡコポリマーおよびαオレフィン、メタロセンオレフィンポリマー、ＰＦＡ、ＭＦＡ、ＰＴＦＥ、ポリカーボネート、ビニルコポリマー、ポリアミド、ナイロン、ポリエステル、セルロース、セルロースアセテート、再生セルロース、セルロース複合体、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリルスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、およびそれらのブレンドからなる群より選択される材料から構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記フィルタは、ポリエーテルスルホンから構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記濾過工程は、第１の圧力で前記フィルタを充填し、次いで、前記濾過を実施するために前記圧力を上昇させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記フィルタは、完全性試験の前に洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記フィルタは、完全性試験の前に水で洗浄され、任意に、前記フィルタは、温水および／または高圧水で洗浄される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記濾過を実施するための圧力源として前記圧力を保持するために、圧力源と濾過供給タンクとの間に追加のタンクが配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
スクレーパが、濾過供給タンクからフィルタにほぼ全ての前記溶液を供給するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記濾過工程は、濾過を補助するためのピグの使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記濾過工程は、並列に動作される２つのフィルタで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
蒸気を前記濾過および脱気装置に添加することを含む、洗浄工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
配列表
本明細書は、２０１３年７月３日に「２００４８３７−００３２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＿ＳＴ２５」に指定されたＡＳＣＩＩ．ｔｘｔファイルとして電子書式で提出された配列表に言及する。ｔｘｔファイルは、２０１３年６月１０日に作成され、１１ＫＢのサイズである。
【０００２】
精製タンパク質および／またはペプチド混合物は、種々の治療的使用のために患者に投与され得る。患者への適用のために調製されるペプチド溶液は、使用前に滅菌されなければならない。ペプチドおよび一般的なバイオテクノロジー製品の精製および包装は非常に困難であり得る。製品は複雑であり、光、温度、圧力、ｐＨ、放射線、機械的擾乱に敏感であり得、そうでなければ環境条件に敏感であり得る。さらに、製品は、理想的な処理条件下でさえ、物理的に容易に変化またはする可能性がある。一部のタンパク質（オリゴペプチドを含む）のための好適な滅菌過程は、ペプチド溶液の濾過を含む。フィルタは、タンパク質が膜を通過することが可能である一方で、微粒子、微生物、およびウイルスを保持する（すなわち、ペプチド溶液から除去する）ようにサイズ決定され得る。
【０００３】
したがって、ペプチドを実質的に損傷しない方法であるが、それでもなお経時的に適切に高い処理スループット（すなわち、濾過速度）を可能にする方法で、ペプチド溶液を濾過および包装する方法を開発することが望ましい。加えて、ペプチドの実質的な損傷／損失を被ることなく、効率的な速度で、一般的なペプチドが濾過（例えば、滅菌濾過）され得るように、概して任意のタンパク質に適用可能な濾過方法を開発することが望ましい。
【発明の概要】
【０００４】
種々の実施形態では、本発明は、ペプチド溶液を製造および精製するための方法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、圧力を低下させることによって、ペプチドを含む混合物が脱気される、第１の脱気工程と、滅菌フィルタを通して混合物を濾過することと、振動、および圧力を低下させることによって、濾液が脱気される、第２の脱気工程とを含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチド溶液を製造および精製するための方法は、滅菌フィルタを通して混合物を濾過することを含まない。実際には、いくつかの実施形態では、本発明の一態様は、ある特定のペプチド溶液が、それらを他のペプチド溶液に有効であるかまたはない可能性がある特定の調製方法に適したものにする特徴を有し得ることを認識することである。いくつかの実施形態では、濾過を利用しない方法が望ましい。あるいはまたは加えて、いくつかの実施形態では、本発明のペプチド溶液を製造および精製するための提供された方法は、濾過なしの加熱滅菌を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、濾過を必要としないある特定のペプチド溶液が、加熱滅菌を含む、および／または濾過を含まない方法を使用した製造および／または精製に適していることを認識することを包含する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、濾過工程を含む方法は、約０．４５μｍ未満の平均細孔径を有する滅菌フィルタを利用する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、第１の脱気工程は、約−０．１ＭＰａ／分未満の速度で、混合物の圧力を低下させることを含む。いくつかの実施形態では、第１の脱気工程は、少なくとも約−０．０５ＭＰａで圧力を低下させることを含む。いくつかの実施形態では、低圧は、少なくとも約３０分間維持される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、第２の脱気工程は、１５０回転／分で混合物を振動させることを含み、振動運動の偏心距離は、位置番号６と８との間である。いくつかの実施形態では、第２の脱気工程は、少なくとも約−０．０５ＭＰａで圧力を低下させることを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、方法は、第１の脱気工程の前にペプチドを溶媒と混合することをさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、利用されたペプチド溶液は、ＲＡＤＡ−１６（配列番号１）ペプチド溶液である。いくつかの実施形態では、利用されたペプチド溶液は、ＩＥＩＫ１３（配列番号３９）ペプチド溶液であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、利用されたペプチド溶液は、表１に見られるペプチドの溶液である。いくつかの実施形態では、利用されたペプチド溶液は、表２に見られるペプチドの溶液である。いくつかの実施形態では、利用されたペプチド溶液は、２つ以上のペプチドの溶液である。
【００１１】
いくつかの特定の実施形態では、本発明は、１つ以上の濾過工程が欠けている、ＩＥＩＫ１３（配列番号３９）を製造および精製するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、いかなる濾過工程も含まないＩＥＩＫ１３（配列番号３９）を製造および精製するための方法を提供する。本発明の１つの特徴は、少なくともある特定のＩＥＩＫ１３（配列番号３９）溶液に対して、このような濾過が滅菌に必要ではない場合があることを認識することである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、溶媒は水である。いくつかの実施形態では、方法は、第２の脱気工程後に、混合物で物品を無菌充填することをさらに含む。いくつかの実施形態では、物品は、第２の脱気工程の少なくとも５時間後に充填される。いくつかの実施形態では、物品は、少なくとも約２個の物品／分、約３個の物品／分、約４個の物品／分、約５個の物品／分、約６個の物品／分、約７個の物品／分、約８個の物品／分、約９個の物品／分、約１０個の物品／分、約１１個の物品／分、約１２個の物品／分、約１３個の物品／分、約１４個の物品／分、約１５個の物品／分、約１６個の物品／分、約１７個の物品／分、約１８個の物品／分、約１９個の物品／分、もしくは約２０個の物品／分、またはそれらの倍数の速度で充填され、いくつかの実施形態では、物品は、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または約１０００個以上の物品／時の速度で充填される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、高速充填機（例えば、ＦＬＳ  ３０００、Ｂｏｓｃｈ；１Ｉ／１Ｆ／１Ｉ１ＶＩ０ＣＹ、８Ｉ／８Ｆ／８ＩＳ−ＣＹまたは１０Ｉ／１０ＦＦ／１０Ｉ、（ＫＴ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）など）が物品を充填するために利用され、いくつかの実施形態では、高速充填機は、複数の充填ノズル（例えば、２、３、４、５個など）であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、機械は、各ノズルが、少なくとも約２個の物品／分、約３個の物品／分、約４個の物品／分、約５個の物品／分、約６個の物品／分、約７個の物品／分、約８個の物品／分、約９個の物品／分、約１０個の物品／分、約１１個の物品／分、約１２個の物品／分、約１３個の物品／分、約１４個の物品／分、約１５個の物品／分、約１６個の物品／分、約１７個の物品／分、約１８個の物品／分、約１９個の物品／分、もしくは約２０個の物品／分の速度で、または約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは約１０００個以上の物品／時の速度で、物品を充填する能力を有するように、配設および構成され、および／または機械は、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、もしくは少なくとも約１５０００個の物品／時の速度で、物品を充填するように、（例えば、いくつかの実施形態では、複数のノズルの存在によって）配設および構成される。いくつかの実施形態では、提供された方法は、高速ファイリング機（ｈｉｇｈ  ｓｐｅｅｄ  ｆｉｌｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ）を、その能力の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも１００％で利用する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、物品は、注射器、パウチ、バイアル、チューブである。いくつかの実施形態では、方法は、充填工程後に、充填された物品をガス透過性材料で包装すること、および滅菌工程をさらに含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ガス滅菌は、エチレンオキサイドガスによって実施される。いくつかの実施形態では、ガス滅菌は、過酸化水素ガスによって実施される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、物品は、単一包装で実施される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、物品は、二重包装で実施される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、濾過は、約０．１〜０．６メガパスカル（ＭＰａ）の圧力で実施される。いくつかのある特定の実施形態では、濾過は、約０．１ＭＰａ、約０．２ＭＰａ、約０．３ＭＰａ、約０．４ＭＰａ、約０．５ＭＰａ、または約０．６ＭＰａの圧力で実施される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、濾過は、周囲温度前後で実施される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、フィルタは、以下：セルロースナイトレート、セルロースアセテート、ビニルポリマー、フッ化炭素、ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン、ポリプロピレン、ＥＶＡコポリマーおよびαオレフィン、メタロセンオレフィンポリマー、ＰＦＡ、ＭＦＡ、ＰＴＦＥ、ポリカーボネート、ビニルコポリマー、ポリアミド、ナイロン、ポリエステル、セルロース、セルロースアセテート、再生セルロース、セルロース複合体、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリルスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、およびそれらのブレンドからなる群より選択される材料から構成される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、フィルタは、ポリエーテルスルホンから構成される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、濾過工程は、第１の圧力でフィルタを充填し、次いで濾過を実施するために圧力を上昇させる工程を含む。いくつかの実施形態では、濾過を実施するための圧力源として圧力を保持するために、圧力源と濾過供給タンクとの間に追加のタンクが配置される。いくつかのある特定の実施形態では、フィルタを充填するための第１の圧力は、比較的弱い。いくつかの実施形態では、第１の圧力は、約０．０１ＭＰａ未満である。いくつかの実施形態では、第１の圧力は、約０．０５ＭＰａである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、フィルタは、完全性に関して試験される。いくつかの実施形態では、フィルタは、完全性試験計器（例えば、ＩＮＴＥＧＲＩＴＥＳＴ（登録商標）４  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＰＡＬＬＴＲＯＮＩＣ（登録商標）ＡｑｕａＷＩＴ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｔｅｓｔ  ＳｙｓｔｅｍまたはＰＡＬＬＴＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆｌｏｗｓｔａｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｔｅｓｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ；Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．；Ｍｅｉｓｓｎｅｒ’ｓ  ＡＣＣＵＦＬＵＸ（登録商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｔｅｓｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓなど）を使用して使用して、完全性に関して試験される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、フィルタは、完全性試験の前に洗浄される。いくつかのある特定の実施形態では、フィルタは、完全性試験の前に水で洗浄される。いくつかのある特定の実施形態では、フィルタは、完全性試験の前に温水で、および／または高圧水によって洗浄される。いくつかのある特定の実施形態では、フィルタは、完全性試験の前に蒸気で、および／またはオートクレーブによって洗浄される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、濾過供給タンクからフィルタにほぼ全ての溶液を供給するために、スクレーパが使用される。いくつかの実施形態では、濾過工程は、濾過を補助するためのピグの使用を含む。いくつかの実施形態では、濾過工程は、並列に動作される２つのフィルタで実施される。いくつかの実施形態では、方法は、濾過および脱気装置に蒸気を添加することを含む、洗浄工程をさらに含む。
定義
【００２６】
「相補的な」とは、骨格中の隣接ペプチドから親水性残基間のイオンまたは水素結合相互作用を形成することが可能であることを意味し、ペプチド中の各親水性残基は、隣接ペプチド上の親水性残基と水素結合またはイオン対を形成するか、あるいは溶媒に曝露される。
【００２７】
「構造的に適合性の」とは、骨格形成を可能にするために十分に一定のペプチド内距離を維持することが可能であることを意味する。本発明のある特定の実施形態では、ペプチド内距離の変動は、４、３、２、または１オングストローム未満である。また、十分な安定力が存在する場合、ペプチド内距離のより大きい変動が、骨格形成を阻止しない可能性があることも考えられる。この距離は、分子モデリングに基づき、またはすでに報告されている簡易方法（米国特許第５，６７０，４８３号）に基づき計算されてもよい。この方法において、ペプチド内距離は、対中の各アミノ酸の側鎖上の非分岐原子の数を合計することによって計算される。例えば、リシン−グルタミン酸イオン対に対するペプチド内距離は、５＋４＝９個の原子であり、グルタミン−グルタミン水素結合対に対する距離は、４＋４＝８個の原子である。３オングストローム／原子の換算係数を用いて、リシン−グルタミン酸対およびグルタミン−グルタミン対（例えば、９対８個の原子）を有するペプチドのペプチド内距離の変動は、３オングストロームである。
【００２８】
用語「純粋」は、本明細書に記載されるペプチドが、対象のペプチドの欠失付加物および異なる長さのペプチドを含む、他の化学種を有しない程度を示すために使用される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、ペプチドヒドロゲルなどのヒドロゲルは、機械的撹拌に供されるとき、それが物理的撹拌前にヒドロゲルを特徴付けた物理的特性（弾性、粘性など）を実質的に保持する場合、「機械的または物理的撹拌に対して安定」している。ヒドロゲルは、機械的撹拌に供されるとき、その形状またはサイズを維持する必要はなく、より小さい片に分離し得るが、それでもなお機械的または物理的撹拌に対して安定していると言われる。用語「安定した」は、この語句で使用される場合を除いて、この意味を有しない。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「ナノファイバ」は、ナノスケール寸法の直径を有するファイバを指す。典型的には、ナノスケールファイバは、５００ｎｍ以下の直径を有する。本発明のある特定の実施形態では、ナノファイバは、１００ｎｍ未満の直径を有する。本発明のある特定の他の実施形態では、ナノファイバは、５０ｎｍ未満の直径を有する。本発明のある特定の他の実施形態では、ナノファイバは、２０ｎｍ未満の直径を有する。本発明のある特定の他の実施形態では、ナノファイバは、１０〜２０ｎｍの間の直径を有する。本発明のある特定の他の実施形態では、ナノファイバは、５〜１０ｎｍの間の直径を有する。本発明のある特定の他の実施形態では、ナノファイバは、５ｎｍ未満の直径を有する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
ペプチドおよび一般的なバイオテクノロジー製品の精製および包装は非常に困難であり得る。製品は複雑であり、光、温度、圧力、ｐＨ、放射線、機械的擾乱に敏感であり得、そうでなければ環境条件に敏感であり得る。さらに、製品は、理想的な処理条件下でさえ、物理的に容易に変化または分解する可能性がある。
【００３２】
我々は、自己集合性ペプチド混合物を含む、ペプチド混合物の滅菌および包装を可能にするための一連の過程を発見した。提供された方法は、ペプチドを分解させ得るため、滅菌のために熱的、化学的、および放射線方法を利用しない。本発明によると、濾過は、ペプチド混合物の滅菌の特に有用な方法である。
【００３３】
一態様では、本発明は、物理的滅菌方法への依存がペプチド混合物のレオロジーに基づく問題を引き起こすという認識を包含する。例えば、ペプチド混合物の粘性は、経時的に変化する可能性があるか、または単純にゲルのように見えるなど、非常に高くなる可能性がある。提供された技術は、特定の問題を引き起こす可能性がある自己集合性ペプチドの精製において、特に有用である。本発明は、（ａ）滅菌ペプチド混合物を生成し、（ｂ）パッケージ（例えば、注射器）、ペプチド混合物を充填および滅菌し、および／または（ｃ）処理装置を医薬品適正製造基準（ｃＧＭＰ）まで洗浄する、一連の動作および動作条件の発見を包含する。いくつかの実施形態では、本発明の濾過装置は、ミクロンサイズのフィルタを利用する（例えば、０．２ミクロンのポリエーテルスルホンフィルタであるが、他のサイズおよび構成材料も適用可能である）。いくつかの実施形態では、提供された濾過方法は、フィルタを「プレコーティングすること」を含む（すなわち、活性濾過のための圧力を上昇させる前に、低圧でフィルタ筐体中の空気を除去することによって、フィルタ表面を完全に被覆するための媒体で、フィルタを充填すること）。いくつかの実施形態では、提供された濾過方法は、最大量のペプチド混合物がフィルタを通過することを確実にするために、配管補助（例えば、「ピグ」）または何らかの他の機械的手段（例えば、スクレイピング）の使用を伴う。いくつかの実施形態では、脱気工程（例えば、圧力減少による脱気）が提供された濾過方法に先行する。いくつかの実施形態では、提供された濾過方法の後に、脱気工程（例えば、振動による脱気）が続く。いくつかの実施形態では、提供された濾過方法は、濾過後に滅菌フィルタの完全性試験手順を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド混合物が充填された注射器の表面の滅菌は、注射器中のペプチド溶液の分解を防止するために、殺菌性ガス（例えば、エチレンオキサイド、過酸化水素）の使用を含む。
自己集合性ペプチド
【００３４】
本発明での使用に適切なペプチド配列は、米国特許第５，６７０，４８３号および同第５，９５５，３４３号、ならびに米国特許出願第０９／７７８，２００号に報告されるものを含み、それらの全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。これらのペプチド鎖は、一価の陽イオンなど、電解質の存在下で、非常に安定したβシート巨視的構造を形成するために、自己集合することが可能である交互の親水性および疎水性アミノ酸からなる。ペプチド鎖は、相補的であり、構造的に適合性がある。構造中のペプチド鎖の側鎖は、２つの面、電荷イオン性側鎖を有する極性面およびアラニンまたは他の疎水性基を有する非極性面に分離する。これらのイオン性側鎖は、正電荷を持つおよび負電荷を持つアミノ酸残基が相補的イオン対を形成することができるという点で、互いに自己相補的である。したがって、これらのペプチド鎖は、イオン性自己相補的ペプチドまたはタイプＩ自己集合性ペプチドと呼ばれる。イオン性残基が１つの正電荷を持つおよび１つの負電荷を持つ残基と交互する場合（−＋−＋−＋−＋）、ペプチド鎖は、「係数Ｉ」と記載され、イオン性残基が２つの正電荷を持つおよび２つの負電荷を持つ残基と交互する場合（−−＋＋−−＋＋）、ペプチド鎖は、「係数ＩＩ」と記載される。本発明で使用するための例示的なペプチド配列は、表１に列挙されるものを含む。いくつかの実施形態では、本発明で使用するためのペプチド配列は、少なくとも１２個または１６個のアミノ酸残基を有する。Ｄ−およびＬ−アミノ酸の両方がペプチド鎖を生成するために使用されてもよい。それらは、同一鎖中で混合されてもよく、またはそれら自体がＤ−およびＬ−アミノ酸のみを含む個々の鎖の混合物を有する、ペプチド組成物が調製されてもよい。
【表１】
0006389170.tif 000002
Ｎ／Ａは、該当なしを示す
＊これらのペプチドは、ＮａＣｌを含有する溶液中でインキュベートされるとき、βシートを形成するが、それらは、巨視的骨格を形成するように自己集合することが観察されていない。
【００３５】
ＥＡＫ１６、ＫＡＥ１６、ＲＡＤ１６、ＲＡＥ１６、およびＫＡＤ１６など、多くの係数ＩおよびＩＩの自己相補的ペプチド配列がすでに分析されている（表１）。ＥＡＫ１６−ＩＶ、ＫＡＥ１６−ＩＶ、ＤＡＲ１６−ＩＶ、およびＲＡＤ１６−ＩＶなど、１６個のアミノ酸を含有する係数ＩＶのイオン性自己相補的ペプチド配列もまた、研究されている。これらの自己集合性ペプチド鎖中の電荷残基が置換されている（すなわち、正電荷リシンが正電荷を持つアルギニンによって置き換えられ、負電荷を持つグルタミン酸塩が負電荷を持つアスパラギン酸塩によって置き換えられる）場合、自己集合過程に対して本質的に有意な効果はない。しかしながら、正電荷を持つ残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）、リシン、およびアルギニンが負電荷を持つ残基、アスパラギン酸塩、およびグルタミン酸塩によって置き換えられる場合、ペプチド鎖はもはや巨視的骨格を形成するように自己集合することはできない。しかしながら、それらはなお、塩の存在下でβシート構造を形成することができる。水素結合を形成するアスパラギンおよびグルタミンなどの他の親水性残基は、電荷残基の代わりに、またはそれに加えて、ペプチド鎖に組み込まれてもよい。ペプチド鎖中のアラニンが、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、またはチロシンなどのより疎水性の残基に変化させられる場合、これらのペプチド鎖は、高められた強度でペプチドマトリクスを自己集合および形成する傾向がより大きい。上記のペプチド鎖と同様の組成物および長さを有する一部のペプチドは、βシートよりもαヘリックスおよびランダムコイルを形成し、巨視的構造を形成しない。したがって、自己相補性に加えて、鎖長、分子間相互作用の程度、互い違いの配列を形成する能力など、他の要因が巨視的骨格の形成に重要である可能性が高い。
【００３６】
他の自己集合性ペプチド鎖は、単一のアミノ酸残基によって、または複数のアミノ酸残基によって、任意の自己集合性ペプチド鎖のアミノ酸配列を変化させることによって生成されてもよい。加えて、ＲＧＤまたはＲＡＤなどの特異的細胞認識リガンドのペプチド骨格への組み込みは、カプセル化細胞の増殖を促進し得る。インビボにおいて、これらのリガンドはまた、細胞を骨格外から骨格へ誘引し得、そこでそれらは、骨格に侵入し得るか、または別様にカプセル化細胞と相互作用し得る。得られた骨格の機械的強度を高めるために、システインがジスルフィド結合の形成を可能にするようにペプチド鎖に組み込まれてもよく、または芳香環を有する残基が紫外線への曝露によって組み込まれ、架橋されてもよい。骨格のインビボの半減期はまた、骨格へのプロテアーゼ切断部位の組み込みによって調節され、骨格が酵素分解されることを可能にし得る。上記の変化のいずれの組み合わせもまた、同一のペプチド骨格に対して行われ得る。
【００３７】
自己集合したナノスケール構造は、様々な程度の剛性または弾性を有して形成され得る。いかなる理論によっても束縛されることを望まないが、低弾性は、細胞が骨格中に移動し、いったん骨格中に存在すると、互いと連絡することを可能にすることにおいて重要な要因であり得る。本明細書に記載されるペプチド骨格は典型的には、標準的なコーンプレートレオメータで測定されるように、１〜１０ｋＰａの範囲の低い弾性係数を有する。１〜１０ｋＰａの範囲の低い値は、細胞収縮の結果として骨格変形を可能にし、この変形は、細胞間連絡のための手段を提供し得る。加えて、低い弾性係数は、骨格がその中に移動する細胞に生理学的ストレスを伝達し、微細構造が瘢痕組織よりも天然組織により近い組織を生成するように細胞を刺激することを可能にする。骨格剛性は、ペプチド配列の変化、ペプチド濃度の変化、およびペプチド長さの変化を含む、種々の手段によって制御され得る。ビオチン分子をペプチド鎖のアミノもしくはカルボキシ末端に、またはアミノとカルボキシ末端との間に付着させることによって（それらは次いで架橋され得る）など、剛性を高めるための他の方法もまた使用され得る。
【００３８】
結合されたペプチド鎖は、標準的なｆ−ｍｏｃ化学を使用して合成され、高圧液体クロマトグラフィを使用して精製されてもよい。最初の合成後に、ペプチド鎖は、凍結乾燥による保管のために保存されてもよい。ペプチド骨格の形成は、本明細書に記載されるように、電解質の添加によって開始されてもよい。芳香族側鎖を有する疎水性残基は、紫外線照射への曝露によって架橋されてもよい。架橋程度は、紫外線への曝露の所定の長さおよび所定のペプチド鎖濃度によって正確に制御されてもよい。架橋程度は、標準的な方法を使用した光散乱、ゲル濾過、または走査電子顕微鏡法によって決定されてもよい。さらに、架橋程度はまた、マトリクスメタロプロテアーゼなどのプロテアーゼ消化後に、骨格のＨＰＬＣまたは質量分析によって検査されてもよい。骨格の材料強度は、本明細書に記載されるように、架橋前後に決定されてもよい。
【表２】
0006389170.tif 000003
【００３９】
所望に応じて、ペプチド骨格はまた、所定の形状または体積を有して形成されてもよい。所望の形状または寸法を有する骨格を形成するために、水性ペプチド溶液が予め形状付けられた鋳型に添加され、ペプチド鎖は、本明細書に記載されるように、電解質の添加によって骨格に自己集合するように誘発される。巨視的ペプチド骨格の得られた形状または寸法は、適用されるペプチド溶液の濃度および量、骨格の集合を誘発するために使用される電解質の濃度、ならびに鋳造器の寸法によって制御される。
【００４０】
所望に応じて、ペプチド骨格は、円偏光二色性（ＣＤ）、動的光散乱、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）、原子間力顕微鏡法（ＡＴＭ）、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、および透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）など、種々の生物物理学的および光学的器具を使用して特徴付けられてもよい。例えば、生物物理学的方法は、ペプチド骨格中のβシート二次構造の程度を決定するために使用されてもよい。加えて、フィラメントおよび細孔径、繊維径、長さ、弾性、ならびに体積分率が、スキャンの定量的画像解析および透過電子顕微鏡法を使用して決定されてもよい。骨格はまた、膨張の程度、骨格形成に対するｐＨおよび電解質濃度の効果、種々の条件下での水和レベル、ならびに引張強度を測定するためのいくつかの標準的な機械的試験技術を使用して検査されてもよい。
【００４１】
自己集合するペプチドの水溶液は、ゲル状になるまで粘性があり、その粘度は時によって異なる。ペプチド溶液の粘度は、溶液に何の力（例えば、せん断）も与えられていないとき、ますます高くなる。自己集合性ペプチド溶液の低粘度を保持するために、連続的な力を必要とする。自己集合性ペプチドの本質は、形成を大部分の液体形成よりも困難にする。製造過程は、以下に記載されるように、医学的使用に対する規制上の要件を満たすように、かつ産業規模の製造における製品の損失を低減するように、自己集合性ペプチドに対して設計されるべきである。
溶解
【００４２】
合成されたペプチドは、製造業者によって調製（例えば、合成）され、合成後に乾燥（例えば、凍結乾燥）形態で保管される。最終精製／滅菌および／または包装に対して、乾燥ペプチドは、最終的な使用／投与に好適な濃度で、溶媒（例えば、水）中に溶解されるべきである。
【００４３】
溶解工程は、フィル−フィニッシュ過程を開始する。最も範囲の広い実施形態において、溶解は、粉末ペプチド（例えば、フリーズドライまたは凍結乾燥ペプチド）を水と混合することによって開始する。いくつかの実施形態では、水は、注射用の静菌性水である。いくつかの実施形態では、水は、滅菌、脱イオン、および／または蒸留水である。ペプチドは、ペプチドの濃度が約０．１重量％〜約５重量％の間（例えば、約０．２重量％、約０．３重量％、約０．４重量％、約０．５重量％、約０．７５重量％、約１．０重量％、約１．２５重量％、約１．５重量％、約１．７５重量％、約２．０重量％、約２．２５重量％、約２．５重量％、約２．７５重量％、およびそれらの間の範囲）になるように溶解される。いくつかの実施形態では、この濃度は、最終用途および／または最終使用のための溶液中のペプチドの濃度である。ペプチド溶液の最終用途または最終使用は、ペプチドが溶液中に溶解される濃度に影響を及ぼすか、またはそれを決定し得る。いくつかの実施形態では、ペプチド溶液は、約１重量％〜約３重量％の間のペプチドの濃度を有する。重量％の計算において、ペプチド粉末の含水量が構成されてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドパワーの含水量は、ペプチド粉末の約１重量％〜約１０重量％の間（例えば、約５重量％）である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ペプチドパワーは、予め測定された量の水に添加される。いくつかの実施形態では、ペプチドパワーは、ペプチドの１回の添加が、次の量のペプチドパワーが添加される前に完全に溶解されるように、ゆっくりまたは段階的に添加される。本明細書に記載されるフィル−フィニッシュ過程の１つの目的が、ペプチド溶液の滅菌であるため、細菌汚染を防止するために適切な対処が行われるべきである。溶解に使用される機器は、可能であればオートクレーブされるもしくは蒸される、またはオートクレーブが特定の機器に好適ではない場合、放射（例えば、紫外線放射）によって消毒されるべきである。
【００４５】
溶解中、溶液は撹拌される。この場合もやはり粘度および溶解速度のため、撹拌速度および時間が制御される。いくつかの実施形態では、使用されるミキサは、軸もしくは放射状流羽根車および／またはプロペラ、パドルもしくはタービン型羽根車を含む。いくつかの実施形態では、ミキサは、約５００ｒｐｍ以上の速度で動作されるが、停止された速度からゆっくりその速度まで上げられる。例えば、ミキサは、ペプチドパワーが添加されるとき、約２００ｒｐｍの速度で開始する。いったん粉末の全てが溶解されると、ミキサ速度は、約５００ｒｐｍまで上げられる。ミキサの回転速度（最初の粉末添加に対する、または溶解された粉末の混合に対する）は、約３０ｒｐｍ〜約１０００ｒｐｍ（例えば、約５０ｒｐｍ、約６０ｒｐｍ、約７５ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、約１２０ｒｐｍ、約１８０ｒｐｍ、約２４０ｒｐｍ、約３６０ｒｐｍ、約４８０ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約７２０ｒｐｍ、約８４０ｒｐｍ、約９６０ｒｐｍ、およびそれらの間の範囲）に及び得る。当業者は、ミキサの速度が主に混合容器の体積によって、かつ羽根車の速度に従って決まり、それは羽根車の直径によって決まることを理解するであろう。ｖ＝羽根車の速度、およびｄ＝羽根車の直径、ｒ＝回転速度である場合、速度は、ｖ＝π＊ｄ＊ｒによって計算され得、容器サイズが増大されると比例するように保持されるべきである。
【００４６】
いったんこの速度になると、混合は約３０分（例えば、約３０分、約４０分、約４５分、約６０分、およびそれらの間の値）継続する。ミキサ速度の率は、溶液の液滴がバルク溶液から生成され、混合容器の壁に対して投げられる程度まで、溶液がそらされないように、維持される。溶液の表面は、連続的であるべきだが、平坦または平面である必要はない（例えば、混合中に渦が生じる可能性がある。しかしながら、その表面は、連続表面であるべきである）。
【００４７】
撹拌および溶解中、試料は混合タンクから採取され、溶解を監視するために検査される。試料は、任意の同伴ガスを除去するために遠心分離される。試料は次いで、ペプチドの溶解を確実にするために目視検査され、同様に光度計によって溶解されたペプチドの含有量で検査され得る。検査が不溶解粉末を示す場合、撹拌時間は延長され得る。検査がペプチド粉末の溶解を示す場合、溶液は、フィル−フィニッシュ過程の次の段階に移され得る。
【００４８】
溶液が実質的に完全に溶解される場合、フィル−フィニッシュ過程の次の工程は、溶液を脱気（例えば、ガス抜き）することである。我々の研究は、実質的にガス抜きまたは脱気される溶液が、より効率的な方法で、廃棄物が少なく、および／またはフィルタ中の詰まりの頻度が少なく、濾過を通る。
第１の脱気
【００４９】
本明細書で使用される場合、脱気は、溶解または同伴ガス（例えば、空気）が液体から除去されるガス抜き、または低減される液体中のその量に等しい。第１の脱気工程は、任意の許容される脱気方法によって実施される。例えば、真空、遠心分離、振動、液体−ガス膜分離、または溶液を自然にガス抜きさせることによって実施される。いくつかの実施形態では、脱気工程は、真空によって（例えば、溶液に対する圧力を変化させることによって）実施される。いくつかの実施形態では、印加された真空は、少なくとも−０．０１ＭＰａ、−０．０１５ＭＰａ、−０．０２ＭＰａ、−０．０２５ＭＰａ、−０．０３，ＭＰａ、−０．０３５ＭＰａ、−０．０４ＭＰａ、−０．０４５ＭＰａ、−０．０５ＭＰａ、−０．０５５ＭＰａ、−０．０６ＭＰａ、−０．０６５ＭＰａ、−０．０７ＭＰａ、−０．０７５ＭＰａ、−０．０８ＭＰａ、−０．０８５ＭＰａ、−０．０９ＭＰａ、−０．０９５ＭＰａ、−０．０９８ＭＰａ、−０．０９９ＭＰａ、−０．１ＭＰａまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、印加された真空は、約−０．１ＭＰａである。特に、本発明は、圧力の低下（または真空の上昇）の速度が脱気過程ならびに最終的な濾過過程の有効性および効率性をもたらすという認識を包含する。いくつかの実施形態では、圧力低下速度は、約−０．０１ＭＰａ／分以下（例えば、約−０．００５ＭＰａ／分、約−０．００２５ＭＰａ／分、約−０．００１ＭＰａ／分、およびそれらの間の範囲）である。いくつかの実施形態では、圧力低下速度は、脱気される溶液の総体積によって決まる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、脱気装置は、ペプチド溶液を一時的に保持するための脱気チャンバ、および脱気チャンバ中の圧力を低下させるための吸引装置が備わっている。吸引装置は、真空を生成するための任意の設計または動作を有してもよい。いくつかの実施形態では、装置は、水ジェットの動的圧力を使用してもよく、または任意の種類の真空ポンプであってもよく、または同様のものが吸引装置として使用されてもよい。
【００５１】
脱気チャンバ内のペプチド溶液の大きい表面積が空気と接触していることが好ましい。したがって、脱気チャンバの形状および寸法は、空気とのペプチド溶液の接触表面積を最大化するようなものであり得る。さらに、脱気チャンバへの流入は、ペプチド溶液がチャンバの内壁に沿って循環し、接触表面積を最大化するようなものであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチド溶液のチャンバへの流入は、脱気チャンバの内壁に沿った薄膜のようなものであり得る。この場合もやはり、高い表面積（およびペプチド溶液の表面積対体積比）は、脱気効率性を補助することができる。しかしながら、いくつかの実施形態では、ペプチド溶液が単純に脱気チャンバに流入されることが十分にあり得る。いくつかの特定の実施形態では、高粘度（例えば、約１５．０パスカル秒［Ｐａ・ｓ］を超える粘度を有する）溶液が、脱気チャンバに流入される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、溶液は、通気中に撹拌される。いくつかの実施形態では、溶液は、約５０ｒｐｍ、１００ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ、２００ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ、３００ｒｐｍ、３５０ｒｐｍ、４００ｒｐｍ、または５００ｒｐｍの速度で撹拌される。いくつかの実施形態では、ペプチド溶液が脱気チャンバに導入されるときに、加熱されていることが好ましい。脱気チャンバに導入されるときの加熱は、溶液の粘度を低減し、脱気効率性を改善し得る。一部のペプチドは加熱による分解を受け、したがって、加熱が全ての状況において適切であるとは限らはない可能性があるため、加熱に注意が払われるべきである。
【００５３】
撹拌は、粘性ペプチド混合物から効率的に脱気するために、圧力低下と組み合わされ得るが、高速撹拌は、混合物中に泡を生じさせ得る。ペプチド混合物から脱気するために、ミキサが約３００ｒｐｍ以上の速度で動作される。自己集合性ペプチド混合物は、撹拌が同時に行われない場合、脱気中ゲル状溶液になる。自己集合性ペプチド溶液の混合は、溶液が効果的に脱気されるように低粘度を維持する。
【００５４】
脱気工程は、少なくとも約３０分（例えば、約１５分、約２０分、約４０分、約４５分、約６０分）持続する（すなわち、真空が維持される時間）。脱気の最終的な時間の長さは、例えば、混合物が実質的に溶解ガスまたはガス気泡を含まないという結果によって決まる。脱気中、溶液の試料が採取され、溶解ガスまたは気泡に関して検査される。溶解ガスまたはガス気泡がまだ存在する場合、脱ガス過程が継続される。溶液が十分に溶解ガスまたは気泡を含まない場合、フィル−フィニッシュ過程は進むことができる。
濾過
【００５５】
開示された方法に従った使用に好適なフィルタは、特に限定されず、表層フィルタ、例えば、デッドエンドフィルタ（すなわち、濾過される流体がフィルタ表面に垂直に接近する）、およびクロスフローフィルタ（すなわち、濾過される流体がフィルタ表面に平行に移動する）を含むことができる。例えば、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．７８８−８５３（「Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ」）（４ｔｈ  ｅｄ．，１９９３）を参照されたい。フィルタはまた、それらの分類サイズに対して特に限定されない（すなわち、分散材料がフィルタ上に保持されるサイズ、および分散材料が濾液中に入るサイズ）。いったんフィルタ分類サイズが特定の適用に対して選択されると（すなわち、保持される分散材料対濾液中に入る分散材料）、フィルタは、濾過されている特定のタンパク質のせん断感度に対する、フィルタを通って流動する担体液体によって生成されるせん断量を考慮して動作されるべきである。
【００５６】
混合物が十分に脱気された後、濾過工程は進行する。上記の通り、我々は、ペプチドを分解させ得るため、滅菌のために熱的、化学的、および放射線方法を利用しない、滅菌を可能にするための一連の過程を発見した。本発明によると、濾過は、ペプチド混合物の滅菌の特に有用な方法である。濾過は、ペプチドの分解をもたらさない方法で、残りの破片および他の小粒子を除去すること、ならびにペプチド溶液を滅菌することに有効である。フィルタは、フィルタと汚染物質粒子との間の２つの主な種類の相互作用を使用して汚染物質を保持する。粒子は、それらのサイズによって保持され、かつフィルタ材料への吸着によっても保持され得る。粒子とフィルタ材料との間の分子および／または電気力は、フィルタ内にこれらの物質を誘引および保持する。
【００５７】
概して、フィルタの細孔は、ペプチド溶液中に含有される汚染物質の少なくとも一部分を除去し、除去された分散汚染物質をフィルタの上流側（例えば、注入口側）上に保持し、汚染物質を実質的に含まない濾液を得るようにサイズ決定される。具体的に、濾液は、精製ペプチド溶液の使用に悪影響を及ぼす量の汚染物質を含有するべきではない。例えば、分散汚染物質が微生物を含む場合、フィルタは、医学的使用に対して無菌性保証レベル（ＳＡＬ：１０−６）である、溶液中に元々存在する微生物の少なくとも９９．９９９９％を除去することが可能であるべきである。
【００５８】
フィルタは概して、種々のサイズ（すなわち、フィルタ表面積、例えば約０．００１ｍ２〜約１０ｍ２に及ぶ）および構成（例えば、フィルタディスク、フィルタカートリッジ）で利用可能である。フィルタの構成材料は、ペプチド混合物に適合するように選択される（例えば、溶液との付着および過剰な摩擦を防止する）。多孔質膜は、セルロースナイトレート、セルロースアセテート、ビニルポリマー、フッ化炭素、超高分子量ポリエチレンを含むポリエチレン、ポリプロピレン、ＥＶＡコポリマーおよびαオレフィンなどのオレフィン、メタロセンオレフィンポリマー、ＰＦＡ、ＭＦＡ、ＰＴＦＥ、ポリカーボネート、ＰＶＣなどのビニルコポリマー、ナイロンなどのポリアミド、ポリエステル、セルロース、セルロースアセテート、再生セルロース、セルロース複合体、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリルスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、およびそれらのブレンドなどの材料から形成され得る。混合物に応じて、フィルタは、親水性または疎水性であってもよい。好ましいフィルタは、親水性であり、タンパク質／ペプチド結合が低い。
【００５９】
いくつかの実施形態では、濾過工程は、特定の細孔径（例えば、約０．２マイクロメートル）を有するフィルタを通した濾過によって実施される。多孔質膜は、概して、液体混合物から除去される分散汚染物質のサイズに応じて選択される、高度に均一なサイズを有する細孔を含む。例えば、（タンパク質がフィルタ膜を通過して濾液に入ることを可能にすると同時に）微生物を除去することを目的とする、滅菌濾過動作において、細孔は好ましくは、約０．１マイクロメートル〜約０．５マイクロメートルの範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、細孔径は、約０．１５マイクロメートル、約０．１マイクロメートルである。好適な濾過システムはまた、例えば０．２マイクロメートルの細孔径を有する主要なフィルタ、ならびにスループットを改善し、より細かいフィルタ内での蓄積を制限するために、より粗い前置フィルタを含むことができる。より粗い前置フィルタは、約０．４マイクロメートル〜約１０マイクロメートルの範囲の細孔径を有することができる（例えば、約０．４マイクロメートル、約０．４５マイクロメートル、約０．５マイクロメートル、約０．６マイクロメートル、約０．７マイクロメートル、約０．８マイクロメートル、約１．０マイクロメートル、約１．５マイクロメートル、約１００．０マイクロメートル）。前置フィルタシステムは、ペプチド混合物が前置フィルタ（複数を含む）中でほとんどが失われ得るように、２つ以上のフィルタを必要とする。加えて、直列前置濾過システムは、滅菌フィルタ中の圧力を低下させ、最初の高圧は、前置フィルタによって低下させられる。自己集合性ペプチドなど、高度に粘性のペプチド混合物は、濾過のために高圧（０．５以上のメガパスカル（ＭＰａ））を必要とするため、前置フィルタおよび滅菌フィルタの直列接続は、粘性の自己集合性ペプチドの製造過程に好適ではない。
【００６０】
種々の実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．３〜０．７の範囲内（両端値を含む）、例えば、約０．３０ＭＰａ、０．３１ＭＰａ、０．３２ＭＰａ、０．３３ＭＰａ、０．３４ＭＰａ、０．３５ＭＰａ、０．３６ＭＰａ、０．３７ＭＰａ、０．３８ＭＰａ、０．３９ＭＰａ、０．４０ＭＰａ、０．４１ＭＰａ、０．４２ＭＰａ、０．４３ＭＰａ、０．４４ＭＰａ、０．４５ＭＰａ、０．４６ＭＰａ、０．４７ＭＰａ、０．４８ＭＰａ、０．４９ＭＰａ、０．５０ＭＰａ、０．５１ＭＰａ、０．５２ＭＰａ、０．５３ＭＰａ、０．５４ＭＰａ、０．５５ＭＰａ．；０．５６ＭＰａ、０．５７ＭＰａ、０．５８ＭＰａ、０．５９ＭＰａ、０．６０ＭＰａ、０．６１ＭＰａ、０．６２ＭＰａ、０．６３ＭＰａ、０．６４ＭＰａ、０．６５ＭＰａ、０．６６ＭＰａ、０．６７ＭＰａ、０．６８ＭＰａ、０．６９ＭＰａ、０．７０ＭＰａの圧力で実施される。いくつかの実施形態では、濾過は、約０．４〜０．６ＭＰａの範囲内（両端値を含む）で実施される。いくつかの実施形態では、濾過は、約０．５〜０．６ＭＰａの範囲内（両端値を含む）で実施される。いくつかの実施形態では、濾過は、約０．５〜０．５５ＭＰａの範囲内（両端値を含む）で実施される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．４０ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．４１ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．４２ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．４３ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．４４ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．４５ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．４６ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．４７ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．４８ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．４９ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．５０ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．５１ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．５２ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．５３ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．５４ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．５５ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．５６ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．５７ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．５８ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．５９ＭＰａの圧力で実施され、いくつかの実施形態では、本発明に従った濾過は、約０．６０ＭＰａの圧力で実施される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、圧力は、濾過中に監視される。圧力が濾過中に監視されるいくつかの実施形態では、圧力を所望の範囲内に維持するように調整が行われてもよい。いくつかの実施形態では、圧力は散発的に監視される。いくつかの実施形態では、圧力は定期的に監視される。いくつかの実施形態では、圧力は連続的に監視される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、圧力は、真空装置に対する制御を介して選択される。圧力が真空装置に対する制御を介して選択されるいくつかの実施形態では、実際の印加圧力は別々に監視されない。圧力が真空装置に対する制御を介して選択されるいくつかの実施形態では、実際の印加圧力は別々に監視される。
【００６４】
濾過を開始するために、フィルタは、ガスが溶液中に同伴されず（例えば、プレコート）、空気の全部がフィルタ容器から押し出されるように、ゆっくり充填される。いくつかの実施形態では、フィルタは、フィルタ筐体への混合物の自動および／または手動添加によって、ペプチド混合物で事前充填される。フィルタ筐体へのペプチド混合物自動添加は、０．０５ＭＰａ以下で行われ得る。いくつかの実施形態では、主要な濾過ポンプとは異なるポンプが、濾過容器を充填するために使用される。重力、圧縮ガス（例えば、空気）を含むがこれらに限定されない、圧力を生成するためのさらなる方法が使用され得る。
【００６５】
フィルタ、膜、または別の方法は、デッドエンドもしくは全量（ＮＦ）形式または接線流（ＴＦＦ）形式で動作してもよい。典型的には、全量は、適切な滅菌を確実にし、濾過工程の有効性を最大化するために好ましくあり得る。選択は、多くの要因、主に使用者の選好または取り付けられた濾過によって決まる。ＴＦＦ過程および装置は、ＴＦＦがＮＦ方法ほど詰まりまたは汚染を受けにくいため、大量のペプチドが回収される場合に好ましくあり得る。
【００６６】
濾過中の温度もまた任意に制御され得る。ペプチド溶液の粘度は、温度および粘性に基づき変化し、それは濾過効率性および有効性に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、濾過中の温度は、約０℃〜約４０℃に及ぶ（例えば、約１０、２０、３０℃）。濾過中の温度はまた、ペプチドの分解を防止するために任意に制御され得る（例えば、温度は１００℃を超えるべきではない）。
【００６７】
フィルタおよび関連装置は全て、加圧滅菌可能である、および／または蒸気処理され得る。滅菌濾過された溶液を維持するために、溶液は、ファイバから滅菌バッグ（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｏｂｉｕｓ）またはフィルタの排出口に接続される滅菌ステンレスタンク中に捕捉される。さらなる使い捨て装置（すなわち、図形培地、筐体など）が滅菌を確実にするために採用されてもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ペプチド混合物の実質的に全部がフィルタに供給されることを確実にするために、タンクの表面に付着する任意のペプチド混合物を除去するためのスクレーパが、濾過供給タンク内で使用される。スクレーパが自己集合性ペプチド混合物に対して使用されない場合、混合物は、圧縮されたペプチド混合物がゲル状になるため、タンク中にすり鉢状に残る。あるいは、配管補助が用いられてもよい（例えば、パイプピグ）。ペプチド混合物は、約０．１〜約１ＭＰａの間（例えば、約０．５ＭＰａ）の圧力でフィルタを通して濾過される。濾過の流速は、約０．５〜約５リットル／分の間である。我々の研究は、流速によって変化し得る濾過中の圧力が、濾過動作の有効性により大きな影響を及ぼすように思われることを明らかにした。
【００６９】
フィルタは、大気よりも大きいフィルタの排出口における圧力をもたらす、逆圧モードで動作され得る。フィルタに逆圧を効果的に印加し、かつ圧力が低下されることを回避するために、圧縮ガスの圧力が濾過供給タンクの空隙中の膨張により低下するため、圧力源と濾過供給タンクとの間に追加のタンクが利用可能であってもよい。逆圧は、任意の好適な源、例えば、従来の弁、流れ収縮部（例えば、オリフィス板）、圧力調整器によって印加され得る。正圧（例えば、注入口圧力>排出口圧力）は、ペプチド溶液をフィルタに通す。いくつかの実施形態では、圧力差は低くてもよく、好適な最大圧力差は、濾過されるペプチドの濃度および種類を含む、種々の要因によって決まる。いくつかの実施形態では、圧力差は、約０．０１ＭＰａ〜約１ＭＰａの間（例えば、約０．５ＭＰａ）である。
【００７０】
約０．０１ＭＰａ〜約１ＭＰａの間のような差圧において、フィルタにわたる流速は、溶液中のペプチドを実質的に損傷しない低せん断環境をもたらすのに十分低い。さらに、低せん断環境は、濾過過程を制限（例えば、粘性効果、フィルタ中の詰まりまたは空洞部分の生成によって、濾過効率性または有効性を制限）しない。
【００７１】
濾過後、フィルタは、高圧によって損傷されている可能性がある。多くの実施形態では、損傷が滅菌の質を損なった可能性があるかどうかを評価するために、完全性試験によってフィルタを検査することが適切または所望である。多くの実施形態では、フィルタは、完全性試験の前に洗浄される（例えば、水によって、具体的には例えば、温水によって、および／または高圧水によって）。いくつかの実施形態では、完全性試験の前のフィルタの洗浄は、フィルタ中に残った可能性がある溶液を除去するか、または除去する可能性があり、フィルタ中に残った溶液は時に、試験データに影響を及ぼす可能性があることが理解される。いくつかの実施形態では、フィルタは、蒸気で、および／またはオートクレーブによって洗浄される。いくつかの実施形態では、フィルタを洗浄するために利用される過程は、フィルタ中に残っているペプチドを分解し得る。例えば、いくつかの実施形態では、方法（例えば、水［例えば、高圧および／または温水］による洗浄、蒸気、オートクレーブによる洗浄などを含む）は、フィルタ中に残っているペプチドを分解するための条件下で、かつ十分な時間にわたって実施される。いくつかの実施形態では、フィルタは、完全性試験の前に、約７０℃〜８０℃の範囲内（両端値を含む）の温度を有する水で洗浄される。いくつかのある特定の実施形態では、フィルタは、完全性試験の前に、約７０℃の温度を有する水で洗浄される。
第２の脱気
【００７２】
濾過後、ペプチド溶液は、ガス抜き工程を受ける。この第２のガス抜き工程において、今では滅菌の混合物が、駆動部分からの金属微粒子など、任意の汚染から保護されるべきである。したがって、第２のガス抜きは、さらなる装置（例えば、回転羽根車）がペプチド溶液と接触することなく実施され得る。いくつかの実施形態では、溶液は、上記のガス抜き方法（例えば、減圧／真空、振動、沈降）によってガス抜きされる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、混合物は、ペプチド混合物の粘度を低下させるために振動によってガス抜きされる。いくつかの実施形態では、振動は、オービタルシェーカーによって誘発され得る。いくつかの実施形態では、ガス抜き振動運動は、二次元以上である。例えば、滅菌ペプチド溶液を含有する容器は、ｘ軸およびｙ軸（ならびに／または任意にｚ軸）に移動する。これは、単純な一次元（または単軸）振動（すなわち、シェイキング）とは対照的である。いくつかの実施形態では、圧力低下は、効果的な脱気のために振動と組み合わされ得る。
【００７４】
装置の振動運動は、装置が任意の特定の方向に移動する回転速度および距離の両方を変化させるための手段が提供される。いくつかの実施形態では、振動数は、約５０サイクル／分および任意の特定の方向である。いくつかの実施形態では、振動数は、約２０サイクル／分〜約３６０回転／分の間（例えば、約３０、４０、５０、６０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、３００、３６０）に及ぶ。振動の円周方向は、時計回り、もしくは反時計回り、または両方の組み合わせである。いくつかの実施形態では、振動運動の距離は、約−２０ｃｍ〜約２０ｃｍの間である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、脱気工程は、真空によって実施される。溶液の圧力は、少なくとも約−０．０５ＭＰａ（例えば、−０．０１ＭＰａ、−０．０１５ＭＰａ、−０．０２ＭＰａ、−０．０２５ＭＰａ）低下される。我々は、圧力の低下（または真空の上昇）の速度が脱気過程の有効性および効率性をもたらすことを認識した。いくつかの実施形態では、圧力低下速度は、約−０．０１ＭＰａ／分以下（例えば、約−０．００５ＭＰａ／分、約−０．００２５ＭＰａ／分、約−０．００１ＭＰａ／分、およびそれらの間の範囲）である。いくつかの実施形態では、圧力低下速度は、脱気される溶液の総体積によって決まる。
【００７６】
第２の脱気工程はまた、均一に混合された溶液をもたらす。
【００７７】
例示的な振動ガス抜き装置としては、Ｍｅｄｉｃａｌ&Ｆｏｏｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．からの装置モデル（ＪＰＯ特許出願第２０１０−１６１０５２号；公開第２０１２−１１３６４号）が挙げられる。
充填
【００７８】
第２のガス抜き工程後、ペプチド混合物は、注射器への充填に好適である。注射器は、任意のサイズ、例えば、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬであってもよい。さらに、注射器は、任意の構成材料（例えば、ガラス、ポリエチレンなど）であってもよい。適切な充填は、目視検査、計量に基づき決定される。各注射器の目標体積は、溶液の粘度によって決まる。
【００７９】
注射器は、ファイリング（ｆｉｌｉｎｇ）ステーションに配置され、滅菌ペプチド溶液は、所望の体積で注射器に注入される。いくつかの実施形態では、次いで、ペプチド溶液が導入された後であるが、プランジャーが追加される前に、真空が注射器に印加される。真空速度は部分的に、ペプチド溶液の粘度および沸点によって決まる。真空印加速度は、その印加がペプチド溶液中に気泡を導入しないように選択され得る。注射器を充填するさらなる態様は、注射器中にプランジャーを配置することを含む。プランジャーは、ペプチド混合物とプランジャーとの間に空気を封入することなく、かつ溶液が注射器内で跳ねるか、または空気がペプチド混合物中に組み込まれる程度まで、ペプチド混合物を乱すことなく、それがペプチド混合物と接触するように配置されるべきである。
【００８０】
注射器が充填された後、それは、（ａ）任意の異物または可視汚染物質、（ｂ）注射器自体の任意の欠陥、損傷、または不具合、および（ｃ）任意の漏れに対して目視検査される。工程中、検査は、紫外線分光法を用いて測定されるペプチド濃度および／または総窒素含量、ＨＰＬＣ、質量スペクトログラム、ｐＨ、ゲル化および／または粘度、細菌汚染および内毒素、重金属測定、残留溶媒測定を含むがこれらに限定されない。これらの検査パラメータは、過程全体を通して繰り返し、かつフィル−フィニッシュ過程が最終品質管理として完了した後に実施され得る。注射器は次いで、プランジャー、グリップの追加、およびラベルの添付を含んでもよい、最終組み立てを受ける。注射器は、配送および保管のために復号包装（例えば、１、２、３、４、５などの単位のピローまたはブリスターパック）に包装されてもよい。手術室での使用前に、注射器表面の細菌汚染を回避するために、二重包装も利用可能である。
【００８１】
包装後、パックは、エチレンオキサイドガス（「ＥＯＧ」）または過酸化水素ガス滅菌によって滅菌される。各工程後、またはペプチド溶液のバッチが処理された後、処理装置は、ｃＧＭＰ基準に従って洗浄され得る。装置は、所定の位置で洗浄され得るか、または分解され、１つ１つ洗浄され得る。加えて、処理装置は、一般的な滅菌技術（例えば、オートクレーブ、照射、ＥＯＧなど）によって滅菌され得る。
洗浄装置
【００８２】
高粘性ペプチド混合物はしばしば、タンクおよび配管の表面に付着する。ｃＧＭＰに従って全ての装置を洗浄することは、粘性のペプチド混合物に対して大変難しいため、製造業者らは、効果的な洗浄方法を探し求めている。ペプチドは概して、高温（例えば、１２１℃）への曝露によって分解されるため、タンクおよび配管の表面からペプチド混合物を除去するために、蒸気または温水が利用可能である。定置洗浄（ＣＩＰ）における蒸気への曝露、および別々の装置のオートクレーブが装置を洗浄するのに効果的である。自己集合性ペプチドはまた、蒸気またはオートクレーブによって分解可能であるため、蒸気またはオートクレーブへの曝露後のペプチドは、水ですすぐことによって除去可能であり得る。装置上に残っているペプチドは、全有機体炭素（ＴＯＣ）測定によってチェックされ得、洗浄効率性は、ｃＧＭＰに従って、ＴＯＣによって検証され得る。
実施例
自己集合性ペプチド溶液の例示的な生成検証
【００８３】
本実施例は、圧力を低下させることによって、ペプチド溶液が脱気される、第１の脱気工程と、滅菌フィルタを通して混合物を濾過することと、振動、および圧力を低下させることによって、濾液が脱気される、第２の脱気工程とを含む方法を採用した、自己集合性ペプチド溶液の生成を例示する。
【００８４】
簡潔に、未加工のペプチドＡｃ−（ＲＡＤＡ）４−ＮＨ２（ロット番号１２１０３００１）を使用して、２．５％ペプチド溶液を１０Ｌのバッチスケールで生成した。例示的な生成条件は以下の通りであった。
【００８５】
溶解（６０分）：１０ｋｇの注射用水、２５６．７グラムのペプチド、および３００〜５００ｒｐｍの羽根車回転速度。
【００８６】
第１の脱気工程（６０分）：−０．０９９ＭＰａ〜−０．１００ＭＰａの空気真空、および２５０ｒｐｍの羽根車回転速度。
【００８７】
濾過工程：２０"カートリッジ、０．２μｍメッシュ滅菌フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＦ）、０．０５ＭＰａの事前充填圧力、０．５ＭＰａの逆濾過圧力、３５ｃｍのスクレーパ直径（溶解タンクのものと同様）、４０Ｌの容量を有する圧力源タンク、および完全性試験器具（ＩＮＴＥＧＲＩＴＥＳＴ（登録商標）４  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した完全性試験（３０分間、１００℃〜１３０℃での純粋蒸気）のための洗浄フィルタ。フィルタ上のペプチド溶液は、完全性試験前に洗浄される（例えば、水によって、具体的には例えば、温水によって、および／または高圧水によって）。
【００８８】
第２の脱気工程（６０分）：０．０９９ＭＰａ〜−０．１００ＭＰａの空気真空、１００ｒｐｍの円形回転速度、および１０ｃｍの振動モード距離。
【００８９】
高速充填機を使用して物品を充填するために、得られたペプチド溶液を採用した。例えば、２つの充填ノズルを利用して、１０００個の物品／時の速度で、１０Ｉ／１０ＦＦ／１０Ｉ機械（ＫＴ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して、注射器を充填した。１ｍＬ（５７４個の物品）、３ｍＬ（１１６４個の物品）、および５ｍＬ（２５０個の物品）のバリエーションの生成を、最終滅菌のためにエチレンオキサイドガスに供した。
【００９０】
総合すると、本実施例は、本明細書に記載されるペプチド溶液を製造および精製するための方法が、ペプチド混合物の任意の分解または物理的変化なく、種々の科学的および医学的用途のために適切に包装されたペプチド溶液を効果的に提供することを実証する。
【００９１】
したがって、本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様を記載してきたが、当業者が種々の変更物、修正物、および改良物を容易に想到することが理解されるべきである。種々の変更物、修正物、および改良物は、本開示の一部であるよう意図され、本発明の精神および範囲内に入るよう意図される。したがって、上記の記載および図面は、ほんの一例であり、本発明は、以下に続く特許請求の範囲によって詳述される。
【００９２】
請求項要素を修飾するための、特許請求の範囲における「第１の」、「第２の」「第３の」などの序数用語の使用は、それ自体で、いかなる優先度、優先順位、または１つの請求項要素の別の請求項要素に対する順序、または方法の動作が実行される時間的順序も含意せず、請求項要素を区別するために、ある特定の名前を有する１つの請求項要素を、（序数用語の使用以外）同一の名前を有する別の請求項要素と区別するためのラベルとして単に使用される。
【００９３】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、それとは反対の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことが理解されるべきである。群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲および発明を実施するための形態は、反対の指示がない限り、または別様に文脈から明白でない限り、群メンバーの１つ、２つ以上、または全てが所与の製品または過程に存在する、採用される、または別様に関連する場合、満たされているとみなされる。本発明は、群のちょうど１つのメンバーが所与の製品または過程に存在する、採用される、または別様に関連する実施形態を含む。本発明はまた、２つ以上、または全ての群メンバーが所与の製品または過程に存在する、採用される、または別様に関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じ得ることが当業者に明らかではない限り、列挙される請求項のうちの１つ以上からの１つ以上の制限、要素、付記、記述用語などが、同一の基礎請求項（または関連性がある場合には、任意の他の請求項）に従属する別の請求項に導入される全ての変化形、組み合わせ、および順列を包含すると理解されるべきである。要素がリストとして（例えば、マーカッシュ群または同様の形式で）示される場合、要素の各部分群も開示されており、任意の要素（複数を含む）が群から除去され得ることが理解されるべきである。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むと言及される場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様がこのような特定の要素、特徴などからなるまたは本質的になることが理解されるべきである。単純化を目的として、それらの実施形態は、本明細書において、どんな場合においても多くの言葉で具体的に記載されているわけではない。また、特定の除外が本明細書において列挙されているかどうかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様は、請求項から明白に除外され得ることも理解されるべきである。本発明の背景を記載するために、かつその実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照される出版物、ウェブサイト、および他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【配列表】
0006389170000001.app