(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインの生成の調節異常を患っている患者の器官特異的および全身性の自己免疫性疾患を治療するための医薬製剤の製造における、サキナビルの硝酸エステルの前記器官特異的および全身性の自己免疫性疾患治療用の有効成分としての使用方法。
【請求項２】
前記疾患が眼科疾患である、請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
前記疾患がブドウ膜炎である、請求項２に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫系の障害により引き起こされる疾患の治療において用いるためのサキナビルの硝酸エステルに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓａｑと省略されるサキナビル（（（２Ｓ）−Ｎ−［（２Ｓ，３Ｒ）−４−［（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル）−デカヒドロイソキノリン−２−イル］−３−ヒドロキシ−１−フェニルブタン−２−イル］−２−（キノリン−２−イルホルムアミド）ブタンジアミド）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロテアーゼ阻害剤であり、これは、通常、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の構成要素として用いられている。その強力な抗レトロウイルス効果に加えて、この薬剤は、また、腫瘍細胞に強力に影響する（Ｔｏｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。さらに、Ｓａｑの適用はその毒性故に制限されており（Ｆｌｅｘｎｅｒ，１９９８）、副作用を低減させながらＳａｑの抗癌特性を得るという考えにより、その薬剤の酸化窒素（ＮＯ）−修飾型、すなわちサキナビル−ＮＯ（Ｓａｑ−ＮＯ）の生成が開始された。この薬剤は、親薬物へのＮＯの共有結合により生成され（Ｍａｋｓｉｍｏｖｉｃ−Ｉｖａｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００９およびＷＯ２０１０／０１２４６６（特許文献１））、綿密な研究によって、それが、Ｓａｑと比べて、メラノーマ、星状細胞腫、前立腺癌細胞および種々のヒト多剤耐性腫瘍細胞系を含む種々の腫瘍に対して優れた抗癌特性を有するが、処理に付されたマウスにおいて毒性を呈さないことが示された（Ｍａｋｓｉｍｏｖｉｃ−Ｉｖａｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｍｉｊａｔｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｒｏｔｈｗｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｄｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｍｏｊｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。また、Ｓａｑ−ＮＯは、その親薬剤の抗ＨＩＶ効能を維持している（Ｃａｎｄｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。これらの研究は、Ｓａｑ−ＮＯが、抗腫瘍および抗ＨＩＶ療法としての性能を有することを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０１２４６６号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
式Ｉ：
【０００５】
【化１】
0006283680.tif 000002
【０００６】
で示されるサキナビルの硝酸エステル（以下、ＮＯ−サキナビル、Ｓａｑ−ＮＯまたはＯＸ−１００１と表示される）は、興味深い免疫調節特性を有しており、多クローン的に活性化され抗原刺激されたＴ細胞における種々のサイトカインの生成を調節する効能があることが分かった。Ｓａｑ−ＮＯは、Ｔｈ１、Ｔｈ２、炎症促進性および抗炎症性サイトカインの生成を調節することができる。その効果は、免疫細胞（ＳＰＣおよびＬＮＣ）または精製Ｔ細胞（ＣＤ４陽性細胞）の多クローン的に刺激された混合集団、および抗原刺激されたＴ細胞（脳炎誘発性ＭＢＰ−特異的細胞）において、等しく有効である。健康個体の抹消血単核細胞（Ｄｅｌｍｏｎｔｅ，２００７）、およびＳａｑで予め処理されたマウスの脾臓細胞（Ｐａｃｉｆｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）を用いて、試験管内および生体外条件でＳａｑの免疫調節特性が研究され、対立する結果が得られてきたと述べるべきである。ＰＭＡとイオノマイシンで刺激したヒトＰＢＭＣ（Ｄｅｌｍｏｎｔｅ，２００７）において研究された３種のサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファにおいて、Ｓａｑは、ＴＮＦ−アルファの生成に影響を与えることなく、１０〜２０μＭの範囲の濃度でＩＬ−２の合成およびＩＦＮ−ガンマの生成を下方制御することが分かった。同時に、Ｓａｑは、５〜２０ｍＭの範囲の濃度でＰＨＡまたは抗−ＣＤ３−誘発増殖を阻害した。これに対して、マウスにおいて行われた生体外研究において、Ｓａｑで予め処理したマウスから得られた脾臓細胞は、対照マウスの脾臓よりも、多くのＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−２を分泌した（Ｐａｃｉｆｉｃｉ，１９９７）。逆に、生体内でのＳａｑへの暴露によって、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−アルファの生成は調節されなかった。従って、我々の試験管内研究の結果は、ＮＯ−混成が、Ｓａｑの大きな免疫薬理学的修飾を誘導し、それに続いて、非分画脾臓細胞および／または精製マウスＣＤ４Ｔ細胞からのＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の試験管内阻害を含む大きな程度の免疫修飾が起こることを示している（図２および３）。Ｓａｑ−ＮＯの効果は、Ｓａｑの、および、２．５および５ｍＭの濃度において既に観察することができる一部のサイトカインについての効果よりも、強力で規模が大きかった。精製ＣＤ４陽性Ｔ細胞からのＩＬ−１７の分泌に対する阻害効果を除いて、Ｓａｑについて、これらの濃度で、効果は見られなかった（図３）。さらに、分子研究により、Ｓａｑではなく、Ｓａｑ−ＮＯが、Ｓ６キナーゼのリン酸化を阻害することが示された（図４）。統合すると、これらのデータは、Ｓａｑ−ＮＯが、Ｓａｑとは異なりＳａｑよりも通常は強力な免疫調節効果を付与された新規化学物質であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、種々の濃度のＳａｑ−ＮＯの存在下においてＣｏｎＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激したラットＬＮＣの生存性およびサイトカイン発生への、Ｓａｑ−ＮＯの影響を示す。
【図２】図２は、マウスＳＰＣの生存性およびサイトカイン発生への、Ｓａｑ−ＮＯおよびＳａｑの影響を示す。種々の濃度のＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯの存在下においてＣｏｎＡ（２．５μｇ／ｍｌ）で刺激したＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスから単離。
【図３】図３は、種々の濃度のＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯの存在下において抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８（いずれも、１μｇ／ｍｌ）で刺激したＣ５７ＢＬ／６マウスＳＰＣから精製されたマウスＣＤ４陽性細胞の生存性およびサイトカイン発生への、Ｓａｑ−ＮＯおよびＳａｑの影響を示す。
【図４】図４は、ＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯの存在下または不存在（対照）において抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８（いずれも、１μｇ／ｍｌ）で刺激したまたは未処理（媒体）のＣ５７ＢＬ／６マウスから精製されたマウスＣＤ４陽性細胞におけるＳ６リン酸化への、Ｓａｑ−ＮＯおよびＳａｑの影響を示す。
【図５】図５は、ＭＢＰ−特異的Ｔ細胞の生存性およびＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−１７発生への、Ｓａｑ−ＮＯおよびＳａｑの影響を示す。
【図６】図６は、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチドと百日咳毒素とで免疫化すると共に、後期予防または治療型において１０ｍｇ／ｋｇのＳａｑ−ＮＯ、Ｓａｑまたはビヒクルで処理したＣ５７Ｂｌ６マウスにおけるＭＯＧ−誘発ＥＡＥにおける臨床経過および体重増加への、Ｓａｑ−ＮＯでの後期予防的（Ａ）または治療的（Ｂ）処理の効果を示す。
【図７】図７は、Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＭＯＧ−誘発ＥＡＥの進行への、試験化合物の効果を示す。
【図８】図８は、ＳＪＬマウスにおけるＰＬＰ−誘発ＥＡＥにおける臨床経過および体重増加への、Ｓａｑ−ＮＯによる後期予防的処理の効果を示す。
【図９】図９は、ブドウ膜炎の実験モデルを示す（１．１１および２．７を参照）：  Ａ／  免疫化の１４日後におけるＥＡＵ群の組織学的網膜部分であり、光受容体の変性を伴い全網膜層に影響する損傷はあまり無い構造破壊を示している  Ｂ／  対照群からの組織学的部分であり、典型的な層状形態と規則正しい網膜層を示している。ＧＣＬ：ガングリオン細胞層；ＩＰＬ：内網状層；ＯＰＬ：外網状層；ＩＮＬ：内顆粒層；ＯＮＬ：外顆粒層；ＰＩＳ：光受容体内節；ＰＯＳ：光受容体外節  Ｃ／  Ｓａｑ−ＮＯ処理群からの組織学的部分であり、免疫化後のＳａｑ−ＮＯ処理ラット１４において正常網膜形態が見られる。
【図１０】図１０は、ブドウ膜炎モデルにおける組織病理学スコアを示しており、１０μｇ／ｋｇのＳａｑ−ＮＯでの処理が、病理組織学的スコアを著しく改善した。＊Ｐ＜０．０５。
【図１１】図１１は、ブドウ膜炎モデルにおける生体内での酸化窒素生成を示す。全身性亜硝酸塩生成は、対照ラットと比較して、ＥＡＵ群において著しく増加した量を示した。（＊＊＊ｐ＜０．００１）。しかしながら、Ｓａｑ−ＮＯでラットを処理すると、ＥＡＵ群と比較して、全身性酸化窒素生成が減少した。Ｐ＝０．５１。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
より具体的には、自己免疫性疾患の発病に含まれる炎症促進性サイトカインの生成、具体的には、マウスＳＰＣ、ラットＬＮＣおよび精製マウスＣＤ４陽性細胞におけるＩＮＦ−ガンマ、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＮＦの発生を、Ｓａｑ−ＮＯが下方制御することが発見された。
【０００９】
重要なことに、Ｓａｑ−ＮＯは、ＭＢＰ−特異的Ｔ細胞におけるＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−１７の生成を阻害することができ、この発見は、中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫におけるＳａｑ−ＮＯの治療的適用を支持している。ＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−１７を生成する細胞であるＴｈ１およびＴｈ１７細胞は、それぞれ、多発性硬化症（ＭＳ）およびその動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発病における重要な病原性集団である（Ｅｌ−ｂｅｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。重要なことに、Ｓａｑ−ＮＯは、生体外再刺激ＤＬＮＣにおけるＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−１７の発生を阻害したが、生体内再刺激ＳＣＣにおいても阻害し、これは、成熟中および成熟したエフェクターであるＴｈ１およびＴｈ１７細胞の両方の抑制において有効であることを意味している。ＤＬＮＣおよびＳＣＣの生存性へのその効果は、ＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−１７の放出へのその効果と比べると限定的であるが、この効果は、ＣＮＳ炎症の制限に貢献することが理由で、ＣＮＳ自己免疫におけるＳａｑ−ＮＯの治療的特性も支持する。Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞は、関節リウマチ、呼吸器炎症、全身性エリテマトーデスおよび同種移植片拒絶を含む他の器官特異的および全身性の自己免疫および炎症性疾患にも重要である（Ａｆｚａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００１０】
Ｓａｑ−ＮＯはＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＳ６リン酸化を低下させ、一方、Ｓａｑの効果はかなり弱いが、それは、Ｔ細胞におけるサイトカイン発生へのそれぞれの効果に対応している。観察されたＳ６リン酸化低下は、Ｓａｑ−ＮＯがＳ６Ｋ活性化に影響すること、および、この効果が、サイトカイン生成へのその影響に重要であることを意味している。実際、Ｓ６Ｋ活性およびＳ６リン酸化は、免疫細胞におけるサイトカイン発生に関係している（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｍｅｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００１１】
Ｓａｑ−ＮＯは、例として与えられる以下に記載の実験部分に報告されているように、多発性硬化症のよく知られている２つのモデルにおいて強力な予防的および治療的効果となる強い免疫調節効能を有している。
【００１２】
その結果、Ｓａｑ−ＮＯは、サイトカインの生成の調節異常が含まれる器官特異的および全身性自己免疫性疾患の治療における使用に有用である。
【００１３】
前記疾患としては、例えば、特発性アジソン病、自己免疫性肝炎、胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ギランバレー症候群、多発性硬化症、視神経炎、橋本甲状腺炎、乾癬、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病およびブドウ膜炎が挙げられる。
【００１４】
Ｓａｑ−ＮＯは、虚血−再かん流および移植片対宿主病の治療、および、移植片拒絶、内毒素および外毒素血症および通風性関節炎の予防における使用にも有用である。
【００１５】
本発明は、適当なキャリア／賦形剤と混合してＳａｑ−ＮＯを含む医薬組成物も提供する。本発明の組成物は、いかなる既知の経路によって、特に、経口、非経口、局所（眼投与を含む）、経皮または直腸経路によって投与してもよい。
【００１６】
投与量は、治療すべき疾患、患者の体重、性別および年齢に従って、広い制限内で変化してよい。それは、とにかく、通常、一日１０〜１０００ｍｇの範囲であり、単回投与である、または一日２回または３回の投与に分割される。５〜５００ｍｇ、特に１００〜２５０ｍｇの単位投与量を用いてよい。
【００１７】
ブドウ膜炎の治療には、点眼剤が好ましい投与型である。局所／眼科用製剤における有効成分の濃度は０．０１〜１０％、好ましくは０．１〜２％である。ヒアルロン酸塩、タマリンド種子多糖等のような適切な賦形剤が都合よく用いられる。あるいは、滅菌溶液の硝子体内投与を用いてよい。適切な投与量は、注射当たり０．１〜１０ｍｇの範囲である。
【００１８】
他の投与型、例えば、経口または非経口製剤用の投与量は、毒物学的、薬物動態的および薬力学的特性に従って、並びに、患者の症状（病気の重症度および進行の程度）、体重、年齢および性別に従って、当業者により容易に決められる。投与量は、通常、親化合物であるサキナビルについて臨床診療において既に知られているものと同程度である。
【００１９】
Ｓａｑ−ＮＯの代わりに、Ｓａｑ−ＮＯの非毒性塩、溶媒和物または結晶／多形型を用いても良い。
【実施例】
【００２０】
（実施例部分）
１．材料および方法
１．１  試薬
ＲＰＭＩ−１６４０媒体およびウシ胎仔血清（ＦＣＳ）は、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）から得た。ＤＭＳＯは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。Ｓａｑは、Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅから購入した。Ｓａｑ−ＮＯは、ＯｎｃｏＮｏｘ（コペンハーゲン、デンマーク）から得て、先に記載のように合成した（Ｍａｋｓｉｍｏｖｉｃ−Ｉｖａｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００２１】
１．２  細胞および細胞培養
実験動物（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉラット）は、セルビア国ベオグラードのｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｕｓｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ「Ｓｉｎｉｓａ  Ｓｔａｎｋｏｖｉｃ」から得た。脾臓細胞（ＳＰＣ）は、マウス脾臓から単離し、リンパ節細胞（ＬＮＣ）は、未処理動物のラット頸部リンパ節から得た。流入領域リンパ節細胞（ＤＬＮＣ）は、ミエリン塩基性タンパク質（モルモットＭＢＰ、独国ゲッティンゲン大学のＡｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｆｌｕｅｇｅｌ教授から贈与）および完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ，Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）でラットを免疫化した８〜１０日後に膝窩リンパ節から得た。器官を機械的に破壊し、４０μｍナイロンメッシュフィルターを通過させ、得られる懸濁液を遠心分離により集めた。脾臓から得られた単個細胞浮遊液からの赤血球は、ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて溶解した。ＣＤ４陽性細胞は、ＣＤ４に特異的なビオチン接合抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＩＭａｇ  ＳＡｖ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｌｕｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、ＳＰＣから精製した。ＣＤ４集団の得られた純度は、フローサイトメトリーにより決定して９７％を超えていた。ＳＰＣおよびＬＮＣは、２４穴型プレートに５×１０６／ｍｌ／ウエルで、ＤＬＮＣは、２．５×１０６／ｍｌ／ウエルで、およびＣＤ４陽性細胞は、１×１０６／ｍｌ／ウエルで接種した。脊髄（ＳＣ）浸潤細胞は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の重症臨床症状をラットが示した時点でＭＢＰ＋ＣＦＡで免疫化したラットのＳＣから得た。ラットに滅菌ＰＢＳを浸み込ませ、ＳＣを均質化し、３０％パーコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に調整し、７０％パーコールグラジエントに乗せた。８７０ｇで５０分間の遠心分離に続いて、ＳＣ細胞（ＳＣＣ）を４０％／７０％パーコールインターフェースから回収し、ＲＰＭＩ−１６４０媒体において洗った。ＳＣＣを、９６穴型プレートに０．５×１０６／２００μｌ／ウエルで接種した。ＳＰＣおよびＬＮＣは２．５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激し、ＤＬＮＣはＭＢＰ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、ＣＤ４陽性細胞は抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８抗体（各１μｇ／ｍｌ、いずれもｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）で刺激し、および、ＳＣＣは未処理で放置した。
【００２２】
１．３  細胞生存性アッセイ
ミトコンドリア活性アッセイによりＳＰＣ、ＬＮＣ、ＤＬＮＣおよびＳＣＣの生存性を評価するために、我々は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−フェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）からホルマザンへのミトコンドリア依存的還元を用いた。適切な処理の最後に、ＳＰＣおよびＬＮＣを試験管中に集め、遠沈し、上澄みを除去し、細胞ペレットを、０．５μｇ／ｍｌのＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液に溶解した。ＭＴＴとのインキュベーションは３７℃で３０分間続け、細胞をもう一度遠心分離した。ＤＭＳＯをペレットに加えて、ホルマザン結晶を溶解させた。ＭＴＴアッセイにおける吸光度は、自動マイクロプレートリーダー（ＬＫＢ  ５０６０−００６，ＬＫＢ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて、５７０および５４０ｎｍで測定し、６９０ｎｍで補正した。
【００２３】
１．４  アポトーシス細胞の検出
マウスＳＰＣ中のアポトーシスの検出は、製造者の指示に従ってアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて細胞を染色することにより行った。アネキシンＶ−ＦＩＴＣに陽性の細胞は、アポトーシスしていると考えた。染色された細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により捕捉し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【００２４】
１．５  ＥＬＩＳＡ
細胞培養上澄み中のサイトカイン濃度は、製造者の指示に従って、抗サイトカイン対抗体およびＭａｘｉＳｏｒｐ  ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｉｌｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡにより決めた。マウス／ラットＩＬ−１７、マウスＩＬ−１０、マウスＴＮＦ、マウスＩＬ−４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、マウスＩＦＮ−γ、ラットＩＦＮ−γ、ラットＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ラットＩＬ−１０およびラットＴＮＦ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）について、サンプルを２回分析した。結果は、適当な組み換えサイトカインの既知の濃度に基づいて作られた標準曲線を用いて計算した。
【００２５】
１．６  免疫ブロット
６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ６．８）、２％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０％グリセロール、５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．０１％ｗ／ｖブロモフェノールブルー、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライドまたはフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍｌアプロチニンおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液中に全細胞溶解液を調製し、タンパク質２０μｇ（Ｌｏｗｒｙタンパクアッセイにより測定）を含むサンプルを、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。サンプルは、セミドライ・ブロッティング・システム（Ｆａｓｔｂｌｏｔ  Ｂ４３，Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｕｅｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、５ｍＡ／ｃｍ２にて、ポリビニリデンジフルオライド膜に電気的移動させた。ブロットを、ＰＢＳ  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０中の５％ｗ／ｖ無脂肪粉乳で遮断し、１：５００希釈で、Ｓ６およびリン酸化Ｓ６への特異抗体（Ｓｅｒ２４０／２４４）（いずれも、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて調べ、続いて、１：１００００希釈で、二次抗体を用いてインキュベーションした（ＥＣＬロバ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）。化学発光（ＥＣＬ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により測定を行い、Ｘ−線フィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）により写真を撮った。Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ａｌｐｈａ  ４．０．３．２（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて密度測定を行った。
【００２６】
１．７  動物
７〜８週齢雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスおよび６〜７週齢雌ＳＪＬマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｓｒｌ，Ｓａｎ  Ｐｉｅｔｒｏ  ａｌ  Ｎａｔｉｓｏｎｅ，Ｕｄｉｎｅ，Ｉｔａｌｙ）を実験で用いた。それらは、食物（Ｈａｒｌａｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｄｉｅｔ  ２０１８）および水を自由に摂取させる標準的実験室条件（非特異的病原体を含まない）下に保ち、研究を始める前に、少なくとも一週間その環境に適合させた。
【００２７】
動物を、非特異的病原体を含まない条件下で、出入り制限げっ歯類施設に収容した。自動制御環境条件を設定して、温度を２０〜２４℃に維持し、相対湿度（ＲＨ）を３０〜７０％、１時間当たり１０〜３０回の換気、および、天然の明暗サイクルとした。
【００２８】
１．８  ＭＯＧ誘発ＥＡＥの誘導
ＭＯＧ３５−５５は、Ｇｅｎｅｍｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）により合成された。１：１エマルジョンを作るようにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）１ｍｇを用いてＣＦＡ中に乳化させたＭＯＧの２００μｇで、マウスを免疫化した。各マウスは、エマルジョン２００μｌを皮下注射し、腋窩リンパ節に流入する２つの部位に分けた。百日咳毒素（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を共アジュバントとして用いて、免疫化後の０および２日目に２００ｎｇ／マウスの投与量で腹腔内投与した。マウスを、免疫化後３０日目まで、体重およびＥＡＥの臨床症状を測定することにより、毎日観察した。これらの臨床的等級付けは、処理のことを知らない観察者によって行った：０＝疾患の兆候無し；０．５＝部分的尾麻痺；１＝尾麻痺；１．５＝尾麻痺＋部分的片側後肢麻痺；２＝尾麻痺＋後肢虚弱または部分的後肢麻痺；２．５＝尾麻痺＋部分的後肢麻痺（骨盤低下）；３＝尾麻痺＋完全後肢麻痺；３．５＝尾麻痺＋完全後肢麻痺＋失禁；４＝尾麻痺＋後肢麻痺＋前肢の虚弱または部分的麻痺；５＝瀕死または死亡。
【００２９】
研究は、各々動物１０匹の４つの群を含んでいた。全ての群を、前述した免疫化手順に従って、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチドと百日咳毒素とで免疫化し、以下の処理に割り当てた。
【００３０】
【表１】
0006283680.tif 000003
【００３１】
後期予防的治療は、免疫化の７日目に開始し３０日目まで続け、治療型は、疾患の発症時に開始し、連続して２３日間続けた。
【００３２】
１．９  ＥＡＥの誘導および臨床スコア
ＰＬＰ（１３９−１５１）は、Ｇｅｎｅｍｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）により合成された。ＥＡＥは、Ｊ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（４）により記載されているように誘導した。１：１エマルジョンを作るように６ｍｇ／ｍｌのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）を用いてＣＦＡ中に乳化されたＰＬＰ７５μｇで、マウスを免疫化した。各マウスに、エマルジョン２００μｌを皮下注射し、腋窩および鼠径リンパ節に流入する４つの部位に分けた。百日咳毒素（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を共アジュバントとして使い、免疫化後０および２日目に２００ｇ／マウスの投与量で腹腔内投与した。マウスは、免疫化後３０日目まで体重およびＥＡＥの臨床症状を測定することにより、毎日観察した。これらの臨床的等級付けは、処理のことを知らない観察者により行われた：０＝疾患の兆候無し；０．５＝部分的尾麻痺；１＝尾麻痺；１．５＝尾麻痺＋部分的片側後肢麻痺；２＝尾麻痺＋後肢虚弱または部分的後肢麻痺；２．５＝尾麻痺＋部分的後肢麻痺（骨盤低下）；３＝尾麻痺＋完全後肢麻痺；３．５＝尾麻痺＋完全後肢麻痺＋失禁；４＝尾麻痺＋後肢麻痺＋前肢の虚弱または部分的麻痺；５＝瀕死または死亡。
【００３３】
７〜８匹のマウスの４つの群を、７日目から３０日目まで、後期予防型にて、以下のように処理した
第１群：サキナビル  １０ｍｇ／Ｋｇ（腹腔内、毎日一回）
第２群：Ｓａｑ−ＮＯ  １０ｍｇ／Ｋｇ（皮下注射、毎日一回）
第３群：Ｓａｑ−ＮＯ  ２０ｍｇ／Ｋｇ（腹腔内、毎日一回）
第４群：ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ（ビヒクル）（腹腔内、毎日一回）。
【００３４】
１．１０  統計的分析
統計的分析のためにスチューデントｔ検定を行った。０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であると考えた。
【００３５】
１．１１  ウィスターラットにおける実験的自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ＥＡＵ）の進行に対するサキナビル−ＮＯ（ＯＸ−１００１）の効果
材料および方法：
動物
雌ウィスターラット（ｎ＝２８）（８週齢）を、Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ａｌｇｉｅｒｓ，Ａｌｇｅｒｉａ）から購入した。これらのラットは、実験の開始前に、新しい環境に１週間慣らされ、１２時間の明暗サイクルを有し食物および水を自由に摂取できる通常条件下に維持された。
【００３６】
これらの動物は、４つの群に分けられた
対照群（ｎ＝６）は、非処理動物のものであった
ビヒクル群（ｎ＝６）は、免疫化の日から始めて、毎日、ＤＭＳＯを２０％腹腔内注射した
網膜粗抽出物免疫化ラット（ＥＡＵグループ（ｎ＝８）と呼ぶ）は、完全フロイントアジュバントＣＦＡ中に乳化（ｖ／ｖ）された網膜粗抽出物２００μＬを単回皮下注射し、未処理で放置した
Ｓａｑ−ＮＯ（参照）処理ラット（ｎ＝８）は、免疫化の日から始めて、毎日、Ｓａｑ−ＮＯを１０μｇ／ｋｇで腹腔内注射した。
【００３７】
網膜粗抽出物の調製：
新選なウシ眼球（ｎ＝２０）を実験で用いた。それらを、鋸状線の直ぐ後方で切断し、次に、硝子体を、網膜剥離を起こすことなく除去した。網膜を注意深く除去し、ｐＨ７．４のＰＢＳに入れた。次に、これらを、網膜抗原を放出させるために、３回連続して熱衝撃（−２０℃および＋３７℃）に付した。４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、網膜粗抽出物が得られ、さらに利用するまで−２０℃で保存した。
【００３８】
実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）の誘導：
合計体積が２００μｌとなるように、百日咳毒素は含まずにＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａを１ｍｇ／ｍＬ含む完全フロイントアジュバントＣＦＡの等体積で乳化した網膜粗抽出物１００μｌで、動物を皮下的に免疫化した。動物を、免疫化後１４日目に犠牲にした。同時に、各グループからの全てのラットも犠牲にした。
【００３９】
血漿採取
各実験グループから、心穿刺により、血液をＥＤＴＡ含有管に採取した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、血漿を採取し、グリース反応による亜硝酸塩決定まで−４５℃で貯蔵した。
【００４０】
組織学的研究のための眼球採取
病理組織学的分析のために、各グループから眼球を摘出し、１０％リン酸塩緩衝ホルムアルデヒド中で固定した。厚さ５μｍの組織部分を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。標準的顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いてその部分を調べ、デジタルカメラを４０倍の解像度で用いて画像を得た。組織学的基準は、構造の変化の程度に基づく。組織学的スコアを、以下のように顕微鏡的試験により半定量的に評価した。
【００４１】
形態変化無し，０；網膜における外核層（ＯＮＬ）の最低形態変化，１；ＩＮＬの萎縮，２；ＩＮＬの消失，３；および全網膜層の損傷，４。
【００４２】
亜硝酸塩濃度測定：
分光光度計を用いて、血漿中におけるＮＯ生成の指標として亜硝酸塩濃度を決めるためにグリース反応を用いた。簡単に説明すると、各サンプル１００μｌを、グリース試薬５０μｌ（５％スルファニルアミド、０．５％ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩、および２０％ＨＣｌ）と混合した。これらのサンプルを室温で２０分間インキュベーションし、５４３ｎｍでの吸光度を分光光度計により読んだ。亜硝酸塩濃度は、０〜２００μｍｏｌ／ｍｌの間で亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）を用いて作った標準曲線を用いて決めた。
【００４３】
２．結果
２．１  Ｓａｑ−ＮＯは、ラットＬＮＣおよびマウスＳＰＣにおけるサイトカインの発生を阻害する
免疫細胞中におけるサイトカイン生成を調節するＳａｑ−ＮＯの能力を調べるために、ラットＬＮＣを、種々の濃度のＳａｑ−ＮＯの存在下にＣｏｎＡで２４時間刺激し、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、ＩＬ−１０およびＴＮＦの濃度を、細胞を含まない培養上澄み中において決めた。対照未処理細胞と比べると、Ｓａｑ−ＮＯは、ＩＬ−４を除いて、試験したサイトカインの全ての放出を投与量依存的に阻害した（図１）。ＬＮＣ生存性は、Ｓａｑ−ＮＯの最高投与量の場合のみ影響されたが、その相違は、未処理対照と比較して統計的に有意な水準には至らなかった（図１）。サイトカイン発生へのＳａｑ−ＮＯの効果は、マウスＳＰＣでも行った。ここで、Ｓａｑ−ＮＯを、Ｓａｑと並行して適用し、サイトカイン発生および細胞生存性へのそれらの影響を比較した。さらに、２つの系のマウス、すなわち、それぞれ、原型的なＴｈ２およびＴｈ１マウスであるＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた（Ｌｏｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。Ｓａｑ−ＮＯは、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、ＩＬ−１０およびＴＮＦの放出に対して、Ｓａｑよりも強力な効果を有しており、その影響は、ＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスとの間では区別できなかった（図２）。Ｓａｑ−ＮＯは、ミトコンドリア活性アッセイにより決められるように、統計的に有意にＳＰＣ生存性を阻害したが、その効果は、サイトカインの発生に対する観察された影響と比べると小さなものであった。さらに、サイトカインに対するＳａｑ−ＮＯの影響は、ＳＰＣ生存性に効果が無い薬剤の濃度において明らかであった（図２）。アネキシンＶ染色およびサイトフローメトリーにより測定される、ＳＰＣに対するＳａｑ−ＮＯおよびＳａｑのアポトーシス促進性影響は同程度であり、適用された最高薬剤投与量であっても統計的に有意ではなかった（表２）。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
Ｓａｑ−ＮＯおよびＳａｑで処理したマウスＳＰＣにおけるアポトーシス
興味深いことに、Ｓａｑ−ＮＯは、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７およびＴＮＦの生成を阻害したが、マウスＳＰＣにおけるＩＬ−１０の生成を刺激した。これらの結果は、Ｓａｑ−ＮＯが、免疫細胞におけるサイトカイン発生に影響を与える性能があることを示している。主に、免疫抑制効果を有するが、薬剤の種−およびサイトカイン−特異的効果もある。
【００４６】
２．２  Ｓａｑ−ＮＯは、マウスＣＤ４陽性細胞におけるサイトカインの生成を阻害する
ＣＤ４陽性細胞をＣ５７ＢＬ／６  ＳＰＣから精製し、種々の濃度のＳａｑ−ＮＯの存在下に、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８  抗体で２４時間刺激した。Ｓａｑ−ＮＯの、サイトカイン発生への影響を、ＣＤ４陽性細胞の生存性へのその影響と、および同じパラメーターへのＳａｑの影響と比べた。Ｓａｑ−ＮＯは、ＣＤ４陽性細胞におけるＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４およびＩＬ−１７の発生を、Ｓａｑよりも効果的に阻害した（図３）。ＩＬ−１０に対するＳａｑ−ＮＯおよびＳａｑの影響は同様に有効であるが、いずれの薬剤も、ＴＮＦ放出は調節しなかった（図３）。Ｓａｑ−ＮＯは、細胞生存性を統計的に有意に阻害したが、その効果は、サイトカイン発生に対する効果よりは小さかった。すなわち、Ｓａｑ−ＮＯは、Ｔ細胞のサイトカイン生成を直接影響する。
【００４７】
２．３  Ｓａｑ−ＮＯは、Ｓ６リン酸化を阻害する
サイトカイン発生へのＳａｑ−ＮＯの観察された影響の原因となるかも知れない細胞内信号を決めようとして、Ｓ６キナーゼ活性の尺度としてのＳ６リン酸化の水準を、免疫ブロットにより検出した。ＣＤ４陽性細胞を、Ｓａｑ−ＮＯまたはＳａｑの存在下に抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で２４時間刺激し、続いて、細胞溶解物を得、分析した。ＳａｑではなくＳａｑ−ＮＯがＣＤ４陽性細胞におけるＳ６リン酸化を低下させ（図４）、このことは、Ｓ６キナーゼ活性が、Ｔ細胞中においてＳａｑ−ＮＯ特異的であってサイトカインの発生に関連する標的であるかも知れないことを意味している。
【００４８】
２．４  Ｓａｑ−ＮＯは、サイトカインＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−１７のＭＢＰ特異的生成を阻害する
次に、我々は、ＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−１７の脳炎誘発物質特異的発生へのＳａｑ−ＮＯの影響を測定した。ラットを、ＭＢＰ＋ＣＦＡで免疫化し、ＤＬＮＣおよびＳＣＣを、それぞれ、ＥＡＥの誘導期およびピークにおいて動物から単離した。ＤＬＮＣを試験管内でＭＢＰで再刺激したが、ＳＣＣは刺激せず、両方の細胞集団を、種々の濃度のＳａｑ−ＮＯまたはＳａｑの存在下にインキュベーションした。その結果、Ｓａｑ−ＮＯは、ＤＬＮＣにおけるＳａｑよりも、ＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−１７の放出を、より高度に阻害した（図５）。Ｓａｑ−ＮＯは、ＤＬＮＣ生存性にも影響を与えたが、その効果は、ＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−１７の生成に対する影響よりもかなり小さかった（図５）。
【００４９】
Ｓａｑ−ＮＯは、ＳＣＣからのＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−１７の放出も阻害する性能があった（図５）。すなわち、Ｓａｑ−ＮＯは、Ｔ細胞の抗原特異的サイトカイン発生を効率的に調節した。
【００５０】
２．５  Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＭＯＧ−誘発ＥＡＥの発生に対する試験化合物の効果
試験化合物による長期間の腹腔内処理は、マウスの臨床的状態により判断されるように、良好に寛容されるようであった。体重の変動は、疾患の臨床スコアに起因する（図６Ａ−Ｂ）。
【００５１】
ＭＯＧ−ＥＡＥモデルは、良好に作用した。免疫化後１２日以内にビヒクルで処理した対照においてＥＡＥの標準的兆候が表れ、ＥＡＥの標準的進行兆候を伴った（図７Ａ−Ｂ参照）。
【００５２】
１０ｍｇ／Ｋｇの投与量でのＳａｑ−ＮＯによる後期予防的処理は、疾患の臨床経過を改善し、そのように処理されたマウスは、ビヒクルで処理されたマウスと比較して、かなり低い累積スコアと疾患の持続を示した（図７Ａ）。全治療型での１０ｍｇ／Ｋｇの投与量でのＳａｑ−ＮＯにより処理されたマウスも、疾患の臨床経過の改善を示し、ビヒクルで処理されたマウスと比較して、累積スコアおよび疾患の持続が著しく低下している（図７Ｂ）。これに対して、サキナビルでの処理は、対照と比較して、疾患の経過を僅かに減少させた。後期予防的処理の中断において、マウスをさらに１１日間観察し、ビヒクルおよびサキナビルで処理したマウスは同じ疾患重症度を維持し、Ｓａｑ−ＮＯで処理したマウスは、ビヒクルで処理したマウスの臨床スコアに処理中断後９日以内に到達する強力な疾患を発生させた（図７Ａ−Ｂ）。
【００５３】
２．６  ＳＪＬマウスにおけるＰＬＰ−誘発ＥＡＥの発生に対する試験化合物の効果
試験化合物での長期間の腹腔間処理は、マウスの臨床状態により判断されるように、良好に寛容されるようであった。体重変動は、疾患の臨床的スコアに起因する（図８Ａ）。
【００５４】
ＰＬＰ−ＥＡＥモデルは良好に作用した。免疫化後１５日以内にビヒクルで処理した対照においてＥＡＥの古典系兆候が表れ、ＥＡＥの古典的進行兆候が生じ、続いて研究中に再発および寛解を伴う（図８Ｂ参照）。
【００５５】
１０ｍｇ／Ｋｇの投与量でのＳａｑ−ＮＯによる晩期予防的処理は、疾患の臨床経過を改善し、そのように処理されたマウスは、ビヒクルで処理されたマウスと比較して、著しく低い累積スコアと疾患の持続を示した（図８Ｂ）。高投与量のＳａｑ−ＮＯ（２０ｍｇ／Ｋｇ）で処理およびサキナビルで処理したマウスは、ビヒクルで処理したマウスと比較して、疾患の穏やかな経過を呈し、低いが著しくない累積スコアと持続を示した。処理の中断時、マウスをさらに２０日間観察した。ビヒクルで処理したマウスは、疾患の再発する寛解経過を続けたが、全ての試験化合物で処理したマウス、および最も明確には、１０ｍｇ／Ｋｇの投与量でＳａｑ−ＮＯで処理したマウスは、ビヒクルで処理したマウスの臨床スコアに処理中断後５日間以内に既に達する強力な疾患を発生させた（図８Ｂ）。
【００５６】
２．７  Ｓａｑ−ＮＯの投与が、実験的自己免疫性ブドウ膜炎を改善した
未処理で放置された網膜抗原で免疫化したラットにおいて、全網膜層に影響を与える損傷および光受容体変性により特徴付けられる網膜組織の主な構造的破壊が観察された（図９）。ビヒクルで処理された免疫化ラットの群において、重ね合わせることができる組織的変化が観察された（データ示されず）。これに対して、Ｓａｑ−ＮＯの投与は組織学的構造を著しく改善し、対照ラットにおいて観察されるものに近い網膜組織の層状外観を示す（図９）。
【００５７】
Ｓａｑ−ＮＯ（一日１０μｇ／ｋｇ）での処理は、ブドウ膜炎の臨床スコアを著しく向上させ、疾患の病理学的兆候を改善した（Ｐ＜０．０５）（図１０）。
【００５８】
２．８  Ｓａｑ−ＮＯの投与は、ＥＡＵ中の循環亜硝酸塩濃度に影響を与えない
全ての群において、その最終的代謝産物である亜硝酸塩を測定することにより、生体内での酸化窒素を評価した。結果は、対照動物と比較して、誘発ＥＡＵ中における亜硝酸塩の著しく高い生成を示した（６．０８±０．６４対１０．４２±１．８４）。１０μｇ／ｋｇのＳａｑ−ＮＯを毎日投与すると、ＥＡＵグループと比較して、著しい減少ではないが、亜硝酸塩ＮＯの循環濃度が僅かに減少した（図１１）。
【００５９】
これらのデータは、ＯＸ−１００１（Ｓａｑ−ＮＯ）による予防的処理が、ウィスターラットにおけるＥＡＵの進行を防止することを示している。これらのデータは、ヒトにおける幾つかの型の免疫炎症性ブドウ膜炎の治療用の新規薬剤としてのＯＸ−１００１（Ｓａｑ−ＮＯ）の使用を保証する。
【００６０】
参考文献
【００６１】
【表３−１】
0006283680.tif 000005
【００６２】
【表３−２】
0006283680.tif 000006
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006283680.tif 000015
【図１０】
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【図１１】
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