(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｅｍａ５Ａタンパク質を有効成分とし、高等脊椎動物に対して用いられる、感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引促進剤。
【請求項２】
前記Ｓｅｍａ５Ａタンパク質が、Ｎ末端に分泌シグナルペプチドを有する、請求項１に記載の伸長又は誘引促進剤。
【請求項３】
Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸を含むベクターを有効成分とし、高等脊椎動物に対して用いられる、感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引促進剤。
【請求項４】
前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項３に記載の伸長又は誘引促進剤。
【請求項５】
前記核酸が、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする領域の５’側に、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列を有する、請求項３又は４に記載の伸長又は誘引促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引促進剤、神経疾患又は損傷の治療剤及び足場デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
高等脊椎動物の胚の発生において、後根神経節の神経線維はその末梢標的に向かって伸長する。この過程には誘引性の又は寛容性の制御機構が存在すると考えられている。しかしながら、この神経線維の伸長を制御する分子機構はほとんど未解明である。
【０００３】
ところで、神経疾患又は損傷は、患者に重大な影響を及ぼすものであるにもかかわらずその治療は困難な場合が多い。また、神経疾患は高齢化社会においても非常に関心の高い問題である。
【０００４】
特許文献１には、ノギン又はノギンをコードする核酸を含み細胞中でノギンを発現することができる組換えベクターを有効成分として含有する軸索伸長促進剤が開示されており、大脳皮質の神経細胞の軸索の伸長を促進できることについて記載されている。
【０００５】
非特許文献１には、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質が、辺縁系の機能に関連する間脳の神経線維である反屈束の軸索に対する誘引効果を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２５５０７１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kantor D. B., et al., Semaphorin 5A is a bifunctional axon guidance cue regulated by heparan and chondroitin sulfate proteoglycans, Neuron, 44(6), 961-75, 2004. (2004年12月16日)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、感覚性の末梢神経線維の誘引促進剤については、知られていなかった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］Ｓｅｍａ５Ａタンパク質を有効成分とし、高等脊椎動物に対して用いられる、感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引促進剤。
［２］前記Ｓｅｍａ５Ａタンパク質が、Ｎ末端に分泌シグナルペプチドを有する、［１］に記載の伸長又は誘引促進剤。
［３］Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸を含むベクターを有効成分とし、高等脊椎動物に対して用いられる、感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引促進剤。
［４］前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、［３］に記載の伸長又は誘引促進剤。
［５］前記核酸が、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする領域の５’側に、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列を有する、［３］又は［４］に記載の伸長又は誘引促進剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（Ａ）実施例１におけるステージ２５のニワトリ胚由来の脊髄後根神経節（ＤＲＧ）とＳｅｍａ５Ａタンパク質を発現するヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞を、コラーゲンゲルに並置して埋め込んだ際のＤＲＧから出る神経線維の挙動を示す画像である。（Ｂ）（Ｃ）実施例２におけるＳｅｍａ５ＡのＤＮＡを含むベクター（Ｓｅｍａ５Ａ−ｐＳｅｃＴａｇ２）を脊髄に導入したステージ２５のニワトリ胚での、ＤＲＧから出る神経線維の走行を示す画像及びその拡大画像である。
【図２】（Ａ）（Ｂ）参考例１におけるＴｕｊ１抗体を用いた染色により、胎生１０．５日目及び１２．５日目のマウス胚でのＤＲＧの位置及びその神経線維の走行を示す画像である。（Ｃ）（Ｄ）参考例１におけるジゴキシゲニンで標識されたＳｅｍａ５ＡのｍＲＮＡに対するｃＲＮＡプローブを用いた染色により、胎生１０．５日目又は１２．５日目のマウス胚の間葉組織でのＳｅｍａ５ＡのｍＲＮＡの発現を示す画像である。（Ｅ）（Ｆ）参考例１におけるジゴキシゲニンで標識されたＳｅｍａ５ＡのｍＲＮＡに対するｃＲＮＡプローブを用いた染色及びＩｓｌｅｔ−１／２抗体を用いた染色により、胎生１０．５日目又は１２．５日目のマウス胚での間葉組織でのＳｅｍａ５ＡのｍＲＮＡの発現及びＤＲＧを形成する神経細胞及と脊髄後根侵入部（ＤＲＥＺ）に隣接する細胞を示す画像である。（Ｇ）（Ｈ）参考例１におけるジゴキシゲニンで標識されたＳｅｍａ５ＢのｍＲＮＡに対するｃＲＮＡプローブを用いた染色により、胎生１０．５日目又は１２．５日目のマウス胚でのＳｅｍａ５ＢのｍＲＮＡの発現を示す画像である。
【図３】参考例２におけるジゴキシゲニンで標識されたＳｅｍａ５ＡのｍＲＮＡに対するｃＲＮＡプローブを用いた染色及びＩｓｌｅｔ−１／２抗体を用いた染色により、ステージ２２及び２９のニワトリ胚の間葉組織でのＳｅｍａ５ＡのｍＲＮＡの発現及びＤＲＧを形成する神経細胞とその隣接細胞を示す画像である。
【図４】参考例３におけるＣｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ抗体（ＣＳ−５６、倉敷紡績社製）を用いた染色により、ステージ２４のニワトリ胚でのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ：ＣＳＰＧｓ）の発現を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［軸索の伸長又は誘引促進剤］
≪第一実施形態≫
一実施形態において、本発明は、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質、又はＳｅｍａ５Ａタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ軸索を伸長させる又は軸索を誘引する活性を有するタンパク質、を有効成分とする、感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引促進剤を提供する。
【００１３】
本実施形態の伸長又は誘引促進剤によれば、感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引を促進することができる。
【００１４】
本明細書において、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質とは、セマフォリンファミリーに属し、セマフォリンドメイン及びいくつかのトロンボスポンジン−タイプ１の繰り返しを有する膜タンパク質を意味する。また、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質は神経の発生初期における軸索ガイダンスに係るものであることが知られている。
本発明者は、鋭意研究の結果、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質が感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引を促進することを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
配列番号１はニワトリＳｅｍａ５Ａタンパク質のＮ末端から数えて１番目から１０７６番目までのアミノ酸配列を、配列番号２はマウスＳｅｍａ５Ａタンパク質のＮ末端から数えて１番目から１０７４番目までのアミノ酸配列を、配列番号３はヒトＳｅｍａ５Ａタンパク質のＮ末端から数えて１番目から１０７４番目までのアミノ酸配列をそれぞれ示している。ニワトリＳｅｍａ５Ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）とマウスＳｅｍａ５Ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）とは、８７％の相同性、９７％の類似性を有している。また、ニワトリＳｅｍａ５Ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）とヒトＳｅｍａ５Ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）とは、８８％の相同性、９８％の類似性を有している。このことから、ＳｅｍａＡタンパク質は、高等脊椎動物において高度に保存されていることが推察できる。
【００１６】
本実施形態の感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引促進剤は、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質を含む。Ｓｅｍａ５Ａタンパク質は、高等脊椎動物のＳｅｍａ５Ａタンパク質であれば特に制限されず、例えば配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質等が挙げられる。Ｓｅｍａ５Ａタンパク質は、軸索を伸長させる又は軸索を誘引する活性を有する。また、本実施形態の軸索の伸長又は誘引促進剤は、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質のみからなる伸長又は誘引促進剤であっても、軸索を伸長させる又は軸索を誘引する活性を有する。
【００１７】
本明細書において、「神経線維」とは、神経細胞の細胞体から延びる細長い突起を示し、軸索とも言う。
【００１８】
本明細書において、「神経線維の伸長又は誘引促進」とは、神経結合を成立させる標的細胞付近までの神経線維の伸長又は誘引を促進させることを意味する。本実施形態の伸長又は誘引促進剤において、伸長又は誘引を促進される神経線維としては、例えば、運動性の神経線維、感覚性の神経線維、中枢神経線維、末梢神経線維等が挙げられ、中でも、感覚性の末梢神経線維であることが好ましい。Ｓｅｍａ５Ａタンパク質は、神経栄養因子以外で、感覚性の末梢神経線維を伸長又は誘引を促進させる因子として、本発明者により初めて発見された。
【００１９】
Ｓｅｍａ５Ａタンパク質は、天然物由来のタンパク質であってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされないが、天然物由来のタンパク質である場合は、細胞毒性等の悪影響がない場合が多いため好ましい。
天然物由来のタンパク質としては、天然に存在するオリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、又はこれらを断片化した状態のもの等が挙げられる。天然物由来のタンパク質は、天然物から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術により、当該タンパク質をコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）及びＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）等を用いた無細胞タンパク質合成系により当該タンパク質を産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。
また、化学合成タンパク質は、公知のタンパク質合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のタンパク質合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてタンパク質を精製することができる。
【００２０】
本実施形態の伸長又は誘引促進剤は、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質として、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ軸索を伸長させる又は軸索を誘引する活性を有するタンパク質を含む。
【００２１】
Ｓｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
さらに、上記タンパク質は、軸索を伸長させる又は軸索を誘引する活性を有する。
【００２２】
ここで、基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸の数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致したアミノ酸の数／対象アミノ酸配列のアミノ酸の総数×１００  （１）
【００２３】
本実施形態において、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質、又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又はこれらの組み合わせからなるものであってもよい。Ｌ−アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であり、Ｄ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸残基のキラリティーが反転しているものである。また、軸索を伸長させる又は軸索を誘引する活性を増加させるために、又は他の物性を最適化するために化学的修飾を受けていてもよい。
即ち、本実施形態の伸長又は誘引促進剤は、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質、又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質とともに、又はそれに代えて、上記のＳｅｍａ５Ａタンパク質、又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質の誘導体を含んでいてもよい。
【００２４】
誘導体としては、例えば、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質が化学修飾されたもの、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質のＮ末端に分泌シグナルペプチドが付加されたもの等が挙げられる。化学修飾物質としては、例えば、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
分泌シグナルペプチドとは、目的のタンパク質を輸送し、目的のタンパク質の膜透過を指示する配列を有するペプチドであり、例えば配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｂ細胞表面の免疫グロブリンであるＩｇκ鎖）等が挙げられる。
【００２５】
本実施形態の伸長又は誘引促進剤は、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質、上記のＳｅｍａ５Ａタンパク質又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質の誘導体、上記のＳｅｍａ５Ａタンパク質又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質の塩若しくはエステル、又は、上記のＳｅｍａ５Ａタンパク質又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質の誘導体の塩若しくはエステルを含んでいてもよい。
【００２６】
塩としては、医薬として生理学的に許容される酸付加塩、塩基性塩又は重金属塩が好ましい。
酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸との塩；酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩が挙げられる。
塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム等の無機塩基との塩；カフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩が挙げられる。
重金属塩としては、例えば、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム等）、遷移金属（例えば、鉄、銅、亜鉛等）、アルミニウム、スズ等の２価、３価又は４価の金属との塩が挙げられる。
エステルとしては、例えば、カルボキシル基を有する場合の当該カルボキシル基における医薬として許容され得る慣用的なものが好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基等の低級アルキル基とのエステル；アリル基、２−ブテニル基等の低級アルキル基とのエステル；メトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基等の低級アルコキシ低級アルキル基とのエステル等が挙げられる。ここで低級アルキル基とは、炭素数１〜６のアルキル基を意味する。
【００２７】
≪第二実施形態≫
一実施形態において、本発明は、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸を含むベクター、又はＳｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ軸索を伸長させる又は軸索を誘引する活性を有するタンパク質をコードする核酸を含むベクター、を有効成分とする、感覚性の末梢神経線維伸長又は誘引促進剤を提供する。
【００２８】
本実施形態の伸長又は誘引促進剤によれば、感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引を促進することができる。
【００２９】
Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸の具体例としては、配列番号５で表される塩基配列（ニワトリＳｅｍａ５Ａタンパク質をコードする塩基配列）からなる核酸、配列番号６で表される塩基配列（マウスＳｅｍａ５Ａタンパク質をコードする塩基配列）からなる核酸、配列番号７で表される塩基配列（ヒトＳｅｍａ５Ａタンパク質をコードする塩基配列）からなる核酸等が挙げられる。
【００３０】
本実施形態の伸長又は誘引促進剤は、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸のみを含むベクターからなるものであってもよいし、又は、当該核酸の一部を含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（例えば、転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター配列等）を含むベクターであってもよい。また、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする領域の５’側に、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列を有していてもよい。分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列としては、例えば配列番号８で表される塩基配列等が挙げられる。
【００３１】
また、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸の代わりに、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ軸索を伸長させる又は軸索を誘引する活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。
【００３２】
Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸と機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００３３】
ここで、基準塩基配列に対する、対照塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（２）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００  （２）
【００３４】
＜ベクター＞
本実施形態のベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウィルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。中でも、高等脊椎動物の体内に直接投与する観点から、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又はレンチウイルスのベクターであることが好ましい。
【００３５】
上述の発現ベクターにおいて、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質、又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質の発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等の動物細胞を宿主とした発現用のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＲＥＦ（ｒｕｂｂｅｒ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター等の植物細胞を宿主とした発現用のプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等の昆虫細胞を宿主とした発現用のプロモーター等を使用することができる。これらプロモーターは、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質、又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質を発現する宿主に応じて、適宜選択することができる。
【００３６】
上述の発現ベクターは、さらに、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【００３７】
［神経疾患又は損傷の治療剤］
一実施形態において、本発明は、上記の伸長又は誘引促進剤を有効成分とする、神経疾患又は損傷の治療剤を提供する。
【００３８】
本実施形態の治療剤によれば、神経疾患又は損傷を効果的に治療することができる。
【００３９】
本明細書において、「神経疾患」としては、例えば、細菌性髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脳脊髄炎、頭蓋内及び脊椎管内の膿瘍及び肉芽腫、頭蓋内及び脊椎管内の静脈炎及び血栓(性)静脈炎、中枢神経系の炎症性疾患の続発又は後遺症等の中枢神経系の炎症性疾患；ハンチントン病、遺伝性運動失調（症）、脊髄性筋萎縮症及び関連症候群、癌性ニューロミオパチー、辺縁系脳炎等の中枢神経系を障害する系統萎縮症；パーキンソン病、続発性パーキンソン症候群、ジストニー、振戦、ミオクローヌス、中毒性小脳失調症、スティフ・マン症候群、下肢静止不能症候群、線条体障害、錐体外路系疾患、錐体外路症候群等の錐体外路障害及び異常運動；アルツハイマー病、限局性脳萎縮症、前頭側頭葉型認知症、前頭側頭葉変性症、老人性脳変性、アルコール性小脳性運動失調症、アルコール性脳症、アルコール性脳症、アルコール性脳変性等の神経系の変性疾患；多発性硬化症、急性播種性脱髄疾患、広汎性硬化症、脳梁の中心性脱髄、橋中心（部）髄鞘崩壊症、亜急性壊死性脊髄炎、バロー病、アラン・ハーンドン・ダドリー症候群、髄鞘形成不全症等の中枢神経系の脱髄疾患；てんかん、片頭痛、頭痛症候群、一過性脳虚血発作及び関連症候群、脳血管疾患における脳の血管性症候群、睡眠障害等の挿間性及び発作性障害；三叉神経障害、顔面神経障害、嗅神経障害、舌咽神経障害、迷走神経障害、舌下神経障害、多発性脳神経障害、多発性脳神経麻痺、帯状疱疹後神経痛、腕神経叢障害、腰仙神経叢障害、頚髄、胸髄又は腰仙髄の神経根障害、幻肢、求心路遮断痛、神経根及び神経叢の圧迫、単ニューロパチー等の神経、神経根及び神経叢の障害；遺伝性及び特発性ニューロパチー、炎症性多発性ニューロパチー、薬物誘発性多発性ニューロパチー、アルコール性多発性ニューロパチー等の多発性ニューロパチー；重症筋無力症及びその他の神経筋障害、原発性筋障害、ミオパチー、イートン・ランバート症候群、糖尿病性筋萎縮症等の神経筋接合部及び筋の疾患；脳性麻痺、片麻痺、対麻痺及び四肢麻痺、馬尾症候群、ジャクソン症候群、ブラウン・セカール症候群等の麻痺；特発性末梢性自律神経ニューロパチー、ライリー・デイ症候群、ホルネル症候群、シャイ・ドレーガー症候群、自律神経過敏症、交感神経緊張亢進、自律神経失調症等の自律神経障害等が挙げられる。中でも、感覚性の末梢神経系の疾患である、神経、神経根及び神経叢の障害、麻痺に対して、適用することが好ましい。
また、本明細書において、「神経損傷」とは、切り傷、すり傷、圧迫、打撲、牽引などの物理的作用、高熱、低温、電気、放射線などの化学的作用等の原因によって受けた神経の損傷を意味し、これらの損傷により、神経の部分的又は完全な切断、神経の麻痺等が起こる。
【００４０】
本明細書において、「有効成分として含有する」とは、治療的に有効量のタンパク質又は遺伝子を含有することを意味する。
【００４１】
本実施形態の治療剤は、他の成分として、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液；アジ化ナトリウム、グリセロール等の添加剤を含んでいてもよい。
【００４２】
本実施形態の治療剤を用いて、上述の神経疾患又は損傷の治療方法を提供することができる。
治療対象として限定はされず、ヒト又は非ヒト動物を含む哺乳動物が挙げられ、ヒトが好ましい。
【００４３】
［神経疾患又は損傷の治療剤の投与量］
本実施形態の神経疾患又は損傷の治療剤の投与量は、被検動物（ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト）の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
例えば、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸を含むベクター、又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を含むベクターを注射剤により皮下注射する場合、被検動物（好ましくはヒト）に対し、１回の投与において１μｇ以上のベクターＤＮＡの量を投与することが好ましく、１０μｇ〜３ｍｇのベクターＤＮＡの量を投与することがより好ましく、２５μｇ〜１ｍｇのベクターＤＮＡの量を投与することが特に好ましい。
また、例えば、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質又はＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質を注射剤により皮下注射する場合、被検動物（好ましくはヒト）に対し、１回の投与において１ｋｇ体重当たり、１００μｇ以上のペプチドの量を投与することが好ましく、２００μｇ〜３ｍｇのペプチドの量を投与することがより好ましく、４００μｇ〜１ｍｇのペプチドの量を投与することが特に好ましい。
【００４４】
投与回数としては、１週間平均当たり、１回〜数回投与することが好ましい。
投与形態としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法が挙げられ、皮下注射が好ましい。
注射剤は、非水性の希釈剤（例えば、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤、又は乳濁剤として調製することもできる。このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって、無菌の固体組成物とし、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００４５】
［医薬組成物］
本実施形態の医薬組成物は、治療的に有効量の神経疾患又は損傷の治療剤、及び薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容されうる担体又は希釈剤は、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、又はシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、ペプチドの生体内安定性を高める効果や、特定の臓器、組織、又は細胞へ、ペプチドの移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質を挙げることができ、特定の臓器、組織、又は細胞へ、タンパク質又はベクターを効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞が好ましい。
【００４６】
本発明の医薬組成物における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体又は希釈剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
【００４７】
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００４８】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【００４９】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００５０】
［足場デバイス］
一実施形態において、本発明は、上記の伸長若しくは誘引促進剤又は上記の治療剤を含有する基材を備える、足場デバイスを提供する。
【００５１】
本実施形態の足場デバイスによれば、感覚性の末梢神経線維を伸長又は誘引することができる。さらに、本実施形態の足場デバイスを、神経疾患又は損傷の患者の神経疾患部又は神経損傷部に投与することにより、神経疾患又は損傷を容易に治療することができる。
【００５２】
本実施形態において、基材としては、神経疾患又は損傷の患者の神経疾患部又は神経損傷部に直接投与できる生体適合性材料で作製されたものであれば、特別な限定はない。基材の素材は、例えば、シリコンゴム、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ酪酸、ポリプロプレン、ポリエステル、ポリアミド等が挙げられる。また、基材の形状は、例えば、チューブ状、シート状等が挙げられる。
【００５３】
［治療方法］
また、本発明の一側面は、神経疾患又は損傷の治療のためのＳｅｍａ５Ａタンパク質、或いはＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質、それら誘導体、又はこれらの塩若しくはエステルを提供する。
また、本発明の一側面は、神経疾患又は損傷の治療のためのＳｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸を含むベクター、或いはＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量のＳｅｍａ５Ａタンパク質、或いはＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質、それら誘導、又はこれらの塩若しくはエステル、及び薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量のＳｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸を含むベクター、或いはＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を含むベクター、及び薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、上記医薬組成物を含む、神経疾患又は損傷の治療剤を提供する。
また、本発明の一側面は、神経疾患又は損傷の治療剤を製造するためのＳｅｍａ５Ａタンパク質、或いはＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質、それら誘導体、又はこれらの塩若しくはエステルの使用を提供する。
また、本発明の一側面は、神経疾患又は損傷の治療剤を製造するためのＳｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸を含むベクター、或いはＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を含むベクターの使用を提供する。
また、本発明の一側面は、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質、或いはＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質、それら誘導体、又はこれらの塩若しくはエステルの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、神経疾患又は損傷の治療方法を提供する。
また、本発明の一側面は、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸を含むベクター、或いはＳｅｍａ５Ａタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を含むベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、神経疾患又は損傷の治療方法を提供する。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５５】
［実施例１］ステージ２５のニワトリ胚由来の脊髄後根神経節（ＤＲＧ）を埋めたコラーゲンゲルを用いたＳｅｍａ５Ａタンパク質による軸索伸長又は誘引確認試験
まず、市販のコラーゲンゲル（倉敷紡績社製）にステージ２５のニワトリ胚由来の脊髄後根神経節（ＤＲＧ）を埋め込んだ。続いて、分泌シグナルペプチドをＮ末端に有するように、ニワトリＳｅｍａ５Ａタンパク質をコードする核酸を挿入したｐＳｅｃＴａｇ２ベクター（Ｓｅｍａ５Ａ−ｐＳｅｃＴａｇ２ベクター）（インビトロゲン社製）をヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞にトランスフェクションし、ニワトリＳｅｍａ５Ａタンパク質を発現するＨＥＫ細胞（ＨＥＫ−ニワトリＳｅｍａ５Ａ細胞）を調製した。調製したＨＥＫ−ニワトリＳｅｍａ５Ａ細胞の凝集体を上記のＤＲＧが埋め込まれたコラーゲンゲルに埋め込み、２４時間後に顕微鏡を用いて観察した。結果を図１Ａに示す。図１Ａ中、点線は、ＤＲＧ及びＨＥＫ−ニワトリＳｅｍａ５Ａ細胞の境界を示しており、矢頭は、誘引された神経線維を示している。
【００５６】
図１Ａから、ＤＲＧを形成している神経細胞の軸索が、ＨＥＫ−ニワトリＳｅｍａ５Ａ細胞の凝集体がある方向に伸長し、誘引されることが明らかになった。
【００５７】
［実施例２］ステージ２５のニワトリ胚を用いたＳｅｍａ５Ａタンパク質による軸索伸長又は誘引確認試験
まず、ステージ２５のニワトリ胚に、実施例１で用いたＳｅｍａ５Ａ−ｐＳｅｃＴａｇ２ベクター（インビトロゲン社製）と、ＧＦＰ−ｐＡＰｔａｇ−５ベクターとを電気穿孔法（エレクトロポレーション法）を用いて導入した。続いて、導入したニワトリ胚を２日間培養後、横断面でスライスし、Ｔｕｊ１抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて染色した。続いて、蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を図１Ｂ及びＣに示す。なお、Ｔｕｊ１抗体は、神経細胞及び線維を標識するマーカーであり、神経線維中の微小管の構成タンパク質である β−ＴｕｂｕｌｉｎのクラスＩＩＩに対する抗体である。図１Ｂ及びＣにおいて、ＤＲＧはｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎの略称で、脊髄後根神経節を表し、ＳＣはｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄの略称で、脊髄を表し、ＤＲＥＺはＤｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｅｎｔｒｙ  ｚｏｎｅの略称で、脊髄後根侵入部を表す。また、点線は、脊髄の境界を示しており、矢頭は、ＤＲＧを形成している神経細胞の軸索の誤った伸長を示している。
【００５８】
図１Ｂ及びＣから、Ｓｅｍａ５Ａタンパク質が脊髄にて高発現しており、ＤＲＧを形成している神経細胞の軸索が脊髄のほうに誤って伸長し、誘引されることが明らかになった。
【００５９】
［参考例１］胎生１０．５日目及び１２．５日目のマウス胚でのＳｅｍａ５Ａ及びＳｅｍａ５ＢのｍＲＮＡの発現パターンの確認
胎生１０．５日目及び１２．５日目のマウス胚を横断面でスライスし、Ｔｕｊ１抗体、ジゴキシゲニンで標識されたＳｅｍａ５Ａ又はＳｅｍａ５ＢのｍＲＮＡに対するｃＲＮＡプローブ、Ｉｓｌｅｔ−１／２抗体（３９．４Ｄ５、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ社製）を用いて染色し、顕微鏡で観察した。なお、Ｉｓｌｅｔ−１／２抗体は、運動性の神経細胞を標識するマーカーであり、インスリン遺伝子の発現調節領域（プロモーター領域）に作用する因子であるＩｓｌｅｔ−１又はＩｓｌｅｔ−２に対する抗体である。また、ＤＲＧを形成する神経細胞及びＤＲＥＺに隣接する細胞は、Ｉｓｌｅｔ−１／２陽性であることが知られている。
染色した結果を図２に示す。図２中、ａはａｆｆｅｒｅｎｔ ｆｉｂｅｒｓの略称で、求心性の神経線維（中枢神経の方向へ伸びる神経線維）を表し、ＤＨはｄｏｒｓａｌ  ｈｏｒｎの略称で、後角を表し、ｄｒはｄｏｒｓａｌ  ｒａｍｕｓの略称で、後枝を表し、ＤＲＧはｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎの略称で、脊髄後根神経節を表し、ｅはｅｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｉｂｅｒｓの略称で、遠心性の神経線維（末梢神経の方向へ伸びる神経線維）を表し、ｍはｍｏｔｏｒ  ｆｉｂｅｒｓの略称で、運動性の神経線維を表し、ＭＮはｓｐｉｎａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓの略称で、脊髄運動性神経細胞を表し、ＮＣはｎｏｔｏｃｈｏｒｄの略称で、脊索を表し、ＳＣはｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄの略称で、脊髄を表し、ｖｒはｖｅｎｔｒａｌ  ｒａｍｕｓの略称で、前枝を表す。また、図２中、点線は、脊髄の境界を示しており、黒矢頭はＤＲＥＺに隣接するＩｓｌｅｔ−１／２陽性細胞を示す。
【００６０】
図２Ａから、胎生１０．５日目のマウス胚において、ＤＲＧを形成する神経細胞がＤＲＥＺに向かって、求心性の神経線維を拡げていることが確かめられた。
図２Ｂから、胎生１２．５日目のマウス胚において、ＤＲＧを形成する神経細胞の求心性の神経線維が脊髄に入り、体軸方向に背角を形づくるように伸長していることが確かめられた。
図２Ｃから、胎生１０．５日目のマウス胚において、Ｓｅｍａ５ＡのｍＲＮＡがＤＲＧの周りの間葉組織及びＤＲＧを形成する神経細胞の神経線維による遠心性経路で検出されたが、ＤＲＧを形成する神経細胞の神経線維による求心性経路では検出されないことが確かめられた。
図２Ｅから、胎生１０．５日目のマウス胚において、Ｓｅｍａ５ＡのｍＲＮＡの発現パターンと、Ｉｓｌｅｔ−１／２により染色されたＤＲＧを形成する神経細胞及びＤＲＥＺに隣接する細胞の局在パターンは、重複していないことが確かめられた。
図２Ｄ及びＦから、胎生１２．５日目のマウス胚においても、同様に、Ｓｅｍａ５ＡのｍＲＮＡの発現パターンと、Ｉｓｌｅｔ−１／２により染色されたＤＲＧを形成する神経細胞及びＤＲＥＺに隣接する細胞の局在パターンは、重複しておらず、Ｓｅｍａ５ＡのｍＲＮＡは、伸長が進行したＤＲＧを形成する神経細胞の遠心性の神経線維の存在部においての発現していることが確かめられた。
図２Ｇから、胎生１０．５日目のマウス胚において、Ｓｅｍａ５ＢのｍＲＮＡは脊髄内で広く発現していることが確かめられた。
図２Ｈから、胎生１２．５日目のマウス胚において、Ｓｅｍａ５ＢのｍＲＮＡは脊髄内の心室に分化する領域の側面に限られて発現していることが確かめられた。
【００６１】
［参考例２］ステージ２２及び２９のニワトリ胚でのＳｅｍａ５ＡのｍＲＮＡの発現パターンの確認
ステージ２２及び２９のニワトリ胚の胸郭部分を、参考例１と同様に、ジゴキシゲニンで標識されたＳｅｍａ５ＡのｍＲＮＡに対するｃＲＮＡプローブ、Ｉｓｌｅｔ−１／２抗体（３９．４Ｄ５、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ社製）を用いて、それぞれ染色した。なお、ステージ２２のニワトリ胚は、胎生１０．５日目のマウス胚に相当し、ステージ２９のニワトリ胚は、胎生１２．５日目のマウス胚に相当する。染色した結果を図３に示す。図３中、ＭＮはｓｐｉｎａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓの略称で、脊髄運動性神経細胞を表し、ＮＣはｎｏｔｏｃｈｏｒｄの略称で、脊索を表し、ＳＣはｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄの略称で、脊髄を表す。また、図３中、点線は、脊髄及び脊索の境界を示しており、黒矢頭はＤＲＥＺに隣接するＩｓｌｅｔ−１／２陽性細胞を示す。
【００６２】
図３Ａから、参考例１の図２Ｃ及びＥと同様に、ステージ２２のニワトリ胚において、Ｓｅｍａ５ＡのｍＲＮＡがＤＲＧの周りの間葉組織及びＤＲＧを形成する神経細胞の神経線維による遠心性経路で検出されたが、ＤＲＧを形成する神経細胞の神経線維による求心性経路では検出されないことが確かめられた。また、Ｓｅｍａ５ＡのｍＲＮＡの発現パターンと、Ｉｓｌｅｔ−１／２により染色されたＤＲＧを形成する神経細胞及びＤＲＥＺに隣接する細胞の局在パターンは、重複していないことが確かめられた。
図３Ｂから、参考例１の図２Ｄ及びＦと同様に、ステージ２９のニワトリ胚において、Ｓｅｍａ５ＡのｍＲＮＡの発現パターンと、Ｉｓｌｅｔ−１／２により染色されたＤＲＧを形成する神経細胞及びＤＲＥＺに隣接する細胞の局在パターンは、重複しておらず、Ｓｅｍａ５ＡのｍＲＮＡは、伸長が進行したＤＲＧを形成する神経細胞の遠心性の神経線維の存在部においてのみ発現していることが確かめられた。
【００６３】
［参考例３］ステージ２４のニワトリ胚でのＣＳＰＧｓの発現パターンの確認
ステージ２４のニワトリ胚の胸郭部分を、Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ（ＣＳ）抗体（ＣＳ−５６、倉敷紡績社製）を用いて、染色した。なお、ＣＳ抗体は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ：ＣＳＰＧｓ）に対する抗体である。染色した結果を図４に示す。図４中、ＮＣはｎｏｔｏｃｈｏｒｄの略称で、脊索を表し、ＳＣはｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄの略称で、脊髄を表す。また、図４中、黒矢頭は脊索周囲の間葉組織でＣＳＰＧｓの発現が検出されていることを示す。
【００６４】
図４から、脊索周囲の間葉組織でＣＳＰＧｓが発現されていることが確かめられた。ＣＳＰＧｓは、Ｓｅｍａ５Ａを誘引因子から間脳の神経線維である反屈束の軸索に対する反発因子へと切り替えることができることが知られている。
今回の結果から、脊索周囲の間葉組織において、ＣＳＰＧｓは、Ｓｅｍａ５Ａを誘引因子からＤＲＧを形成する神経細胞の神経線維に対する反発因子へと切り替えていると推察される。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明によれば、感覚性の末梢神経線維の伸長又は誘引促進剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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