(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１
【化１】
0006425809.tif 000083
［式中、
ｎは１又は２であり、
Ａは−ＣＨ２−、−ＮＨ−、及び−Ｏ−から選択され、
ＥはＣＨ又はＮであり、
ＸはＮ又はＣＨであり、
ＲはＨ、−ＣＨ３、Ｆ、及びＣｌから選択され、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立してＨ又はＣＨ３であり、
Ｇは
【化２】
0006425809.tif 000084
から選択され、
ただし、Ｇが
【化３】
0006425809.tif 000085
であるとき、ＥはＣＨであり、Ａが−ＮＨ−又は−Ｏ−であるとき、ＸはＣＨである］
で示される化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式２
【化４】
0006425809.tif 000086
［式中、
ｎは１又は２であり、
Ａは−ＣＨ２−、−ＮＨ−、及び−Ｏ−から選択され、
ＸはＮ又はＣＨであり、
ＲはＨ、−ＣＨ３、Ｆ、及びＣｌから選択され、
各Ｒ１は独立してＨ又はＣＨ３であり、
Ｇは
【化５】
0006425809.tif 000087
から選択され、
ただし、Ａが−ＮＨ−又は−Ｏ−であるとき、ＸはＣＨである］
で示される化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
ｎが１である、請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
ＥがＮである、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
ｎが１である、請求項４に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
ＲがＨ、−ＣＨ３、及びＦから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
Ａが−Ｏ−又は−ＣＨ２−である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
Ｇが
【化６】
0006425809.tif 000088
である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
Ｘが−ＣＨ−である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
以下の式
【化７】
0006425809.tif 000089
で示される、請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
前記薬学的に許容される塩がナトリウム塩である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤の少なくとも一つを含む医薬組成物。
【請求項１３】
治療に使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。
【請求項１４】
関節炎又は変形性関節症に関連する疼痛又は炎症の治療に使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。
【請求項１５】
関節炎又は変形性関節症に関連する疼痛又は炎症を治療するための薬剤を製造するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規カルボン酸化合物、当該化合物を含む医薬組成物、関節炎に関連する疼痛及び／又は炎症を治療するために当該化合物を使用する方法、当該化合物の合成に有用な中間体及びプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節炎は関節の炎症を含み、疼痛及びこわばりを伴うことが多い。変形性関節症は、関節炎の最も多い形態であり、関節軟骨、骨、滑膜及び関連する線維性連結組織を含む関節周囲の構造の進行性の破壊、並びに様々な程度の炎症を特徴とする複雑な変性疾患である。非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）及びシクロオキシゲナーゼ-2阻害薬（COX-2阻害剤）を使用する既存の治療薬は、変形性関節症に関連する疼痛を軽減することができるが、経時的に中程度の効果しかなく、それぞれ様々なリスク／ベネフィットの考慮を有する。
【０００３】
NSAID及びCOX-2阻害剤は、COX-2酵素の阻害によって炎症及び疼痛を軽減する。炎症促進性の刺激に応答して、COX-2酵素は、アラキドン酸をプロスタグランジンH２（PGH２）に代謝する。PGH２はさらに様々な酵素によって、プロスタグランジンE２（PGE２）、プロスタグランジンI２（PGI２）、プロスタグランジンF２α（PGF２α）、プロスタグランジンD２（PGD２）及びトロンボキサンA2（TXA２）を含むその他のエイコサノイドに代謝される。これらの代謝物は、生理学的及び病態生理学的効果を誘発することが知られている。PGI２とTXA２との薬剤介在の不均衡が、NSAID及びCOX-2阻害剤が、消化器及び心血管の有害な副作用を生じさせる理由を説明しうると考えられている。結果的に、これらのクラスの薬剤は、既存の又は緊急性の心血管及び／又は消化器官の病態によって、多くの患者に禁忌となりうる。さらに、患者は、経時的に特定の薬剤治療に難治性を示す可能性がある。
【０００４】
アラキドン酸代謝物のうち、PGE２は、変形性関節症に関連する病態、例えば、発熱、疼痛及び炎症の重要なメディエーターとして識別されている。プロスタグランジンE２は、ミクロソームプロスタグランジンE２シンターゼ-1（mPGES-1）によって、PGH２の代謝を通じて特に産生される。mPGES-1を選択的に阻害することは、関節炎をり患している患者の新しい治療選択肢をもたらしうると考えられている。
【０００５】
公報、国際特許第2013／146970号は、三置換キノリン化合物を開示し、当該開示化合物が、特に炎症性疾患の治療に有用でありうることを示している。しかしながら、前記公報は当該出願で請求されている化合物を開示していない。
【０００６】
関節炎に関連する炎症を治療し、疼痛を緩和する追加の選択肢が必要とされている。本発明は、mPGES-1を阻害する新規化合物を提供し、当該新規化合物は関節炎、特に変形性関節症をり患している患者の治療に利益となりうる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、式1又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、
【化１】
0006425809.tif 000002
式中、nは1又は2であり、Aは、-CH２-、-NH-及び-O-から選択され、Eは-CH-又はNであり、XはN又はCHであり、Rは、H、-CH3、F及びClから選択され、R1及びR2は独立してH又は-CH3であり、Gは、
【化２】
0006425809.tif 000003
から選択され、 
ただし、Gが
【化３】
0006425809.tif 000004
であるとき、EはCHであり、Aが-NH-又は-O-であるとき、XはCHである。
【０００８】
本発明は、式2に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、 
【化４】
0006425809.tif 000005
式中、nは1又は2であり、Aは、-CH2-、-NH-及び-O-から選択され、XはN又はCHであり、Rは、H、-CH3、F及びClから選択され、各R1は独立してH又は-CH3であり、Gは、
【化５】
0006425809.tif 000006
から選択され、ただし、Aが-NH-又は-O-であるとき、XはCHである。
【０００９】
別の形態では、本発明は、式1又2に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、式中nは1である。
【００１０】
別の形態では、本発明は、式1に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、式中EはNである。
【００１１】
別の形態では、本発明は、式1又2に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、式中Rは、H、-CH3及びFから選択される。本発明のより好ましい化合物について、RはHである。
【００１２】
別の形態では、本発明は、式1又2に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、式中Aは-O-又は-CH2-である。本発明のより好ましい化合物について、Aは-CH２-である。
【００１３】
別の形態では、本発明は、式1又2に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、Gは、
【化６】
0006425809.tif 000007
から選択される。
【００１４】
本発明のより好ましい化合物について、Gは、 
【化７】
0006425809.tif 000008
から選択される。
【００１５】
本発明のより好ましい化合物について、Gは、 
【化８】
0006425809.tif 000009
である。
【００１６】
別の形態では、本発明は、式1又2に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、式中Xは-CH-である。
【００１７】
別の形態では、本発明は、式1又2に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、式中R1及びR2はHである。
【００１８】
別の形態では、本発明は、式3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【化９】
0006425809.tif 000010
【００１９】
別の形態では、本発明は、式1、2又は3に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩を提供し、当該薬学的に許容可能な塩は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム等の塩基を追加することによって調製される。一つの実施形態では、式1、2、又は3の化合物はナトリウム塩として提供される。
【００２０】
別の形態では、本発明は、式1、2、又は3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤を含む薬学的に許容可能な組成物を提供する。
【００２１】
本発明は、関節炎に関連する疼痛の治療を必要とする患者を治療する方法も提供する。当該方法は、有効量の式1、2、又は3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、患者に投与することを含む。本発明は、変形性関節症に関連する疼痛を治療する方法をさらに提供する。当該方法は、有効量の式1、2、又は3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、患者に投与することを含む。
【００２２】
本発明は、関節炎に関連する炎症の治療を必要とする患者を治療する方法も提供し、当該方法は、当該患者に、有効量の式1、2又は3に記載の化合物又は薬学的に許容可能な塩を投与することを含む。本発明は、変形性関節症に関連する炎症を治療する方法も提供する。当該方法は、有効量の式1、2、又は3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、治療を必要とする患者に投与することを含む。
【００２３】
本発明は、関節炎に関連する疼痛又は炎症の治療を必要とする患者を治療する方法も提供する。当該方法は、有効量の式1、2、又は3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、患者に投与することを含む。 
【００２４】
本発明は、変形性関節症に関連する疼痛又は炎症の治療を必要とする患者を治療する方法も提供する。当該方法は、有効量の式1、2、又は3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、患者に投与することを含む。
【００２５】
本発明は、薬剤を調製するために、式1、2又3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩も提供する。
【００２６】
本発明は、治療に使用するために、式1、2又3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩も提供する。
【００２７】
本発明は、関節炎に関連する疼痛の治療に使用するために、式1、2又3に記載の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩も提供する。別の形態では、本発明は、変形性関節症に関連する疼痛の治療に使用するために、式1、2又3に記載の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩も提供する。
【００２８】
本発明は、関節炎に関連する炎症の治療に使用する、式1、2又は3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩も提供する。別の形態では、本発明は、変形性関節症に関連する炎症の治療に使用するために、式1、2又3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００２９】
本発明は、薬剤を製造するために、式1、2又3に記載の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩も提供する。一つの実施形態では、薬剤は、関節炎に関連する疼痛を治療するためにある。別の実施形態では、薬剤は、変形性関節症に関連する疼痛を治療するためにある。
【００３０】
本発明は、薬剤を製造するために、式1、2又3に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の使用も提供する。一つの実施形態では、薬剤は、関節炎に関連する炎症を治療するためにある。別の実施形態では、薬剤は、変形性関節症に関連する炎症を治療するためにある。 
本発明は、式4に記載の化合物も提供し、
【化１０】
0006425809.tif 000011
式中、R、X、A、E及びGは上述のとおりであり、R2はC1-4アルキル、-CH２CH=CH２、C1-4ハロアルキル、C3-6シクロアルキル、C1-4アルキル-C3-6シクロアルキル、フェニル、又はC1-5アルキルフェニル及びテトラヒドロピランから選択される。 
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「治療」又は「治療すること」という用語は、既存の症状又は障害、特に関節炎又は好ましくは変形性関節症に関連する疼痛及び炎症の重症度を止める又は軽減することを含む。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「患者」は、ヒト、及びマウス、モルモット、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ又はアヒル等の家禽を指す。好ましい患者はヒトである。
【００３３】
本発明の例示的な化合物は、許容可能な治療に従った医薬組成物に製剤化することができる。薬学的に許容可能な担体、賦形剤、及び希釈剤の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co. Easton Pa.1990に見つけることができる。非限定的な例として、スターチ、糖類、マンニトール及びシリカ誘導体、カルボキシメチルセルロース及びその他のセルロース誘導体、グリセロールモノステアレート等の結合剤、カオリン及びベントナイト等の吸着性担体、タルク、カルシウム及びステアリン酸マグネシウム、及び固体ポリエチルグリコールが挙げられる。一つの形態では、医薬製剤は、pH8の500mMのリン酸塩バッファに20%のCaptisol（商標）を含む。
【００３４】
好ましい医薬組成物は、経口投与のための錠剤又はカプセルとして、又は注入可能な溶液として製剤化することができる。錠剤、カプセル、又は溶液は、治療を必要とする患者を治療するために有効量の本発明の化合物を含む。   
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「有効量」という用語は、本発明の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩の量又は投与量を指し、患者に単回投与又は複数回投与するときに、診断又は治療中の患者の疼痛及び／又は炎症を軽減又は取り除く等、望ましい効果をもたらす。
【００３６】
有効量は担当医、獣医、又はその他の診断医によって、既知の技術を使用し、類似の状況下で得られる結果を観察することによって、容易に決定することができる。患者のために有効量を決定する際に、以下に限定されないが、哺乳動物、家禽又は家畜の種、その大きさ、年齢、健康状態、関係する特定の疾患又は障害、例えば、関節炎又は変形性関節症に関連する疼痛及び／又は炎症、疾患又は障害の程度又は関与又は重症度、個々の患者の奏功、投与様式、選択した用法で調合された製剤として、式1の化合物又はその薬学的に許容可能な塩のバイオアベイラビリティ特性、併用する薬剤の使用、及びその他の関連する状況が挙げられる。
【００３７】
一つの実施形態では、有効量は体重の約0.0005mg／kg〜約100mg／kgでありうる。より好ましくは、有効量は約0.001mg／kg〜約50mg／kgでありうる。より好ましくは、有効量は約0.001mg／kg〜約20mg／kgでありうる。
【００３８】
本発明の化合物は、その他の治療法及び／又は治療薬、好ましくは関節炎及び／又は変形性関節症のための薬剤と組み合わせることができる。NSAID又はイブプロフェン、アスピリン、アセトアミノフェン、セレコキシブ、ナプロキセン、及びケトプロフェン等のCOX-2阻害剤、並びにヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、及びプレドニゾン等のコルチコステロイドが挙げられる。 
【００３９】
例示的な化合物及び追加の治療薬は、同じ投与経路及び単一の丸薬、カプセル、錠剤、又は溶液等のデバイスによって一緒に投与するか、又は別個の送達デバイスで同時投与、若しくは逐次投与することができる。
【００４０】
本発明の化合物は、薬学的に許容可能な塩として提供することができる。「薬学的に許容可能な塩」は、臨床及び／又は獣医学的使用に許容できると考えられる本発明の化合物の塩を指す。薬学的に許容可能な塩及びその一般的な調製方法は、当該技術分野で既知である。例えば、P. Stahl, et al., Handbook of Pharmaceutical Salts： Properties, Selection and Use,（VCHA/Wiley-VCH, 2002）; S.M.Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977を参照のこと。
【００４１】
本発明の化合物又はその塩は、当該技術分野で既知の様々な方法で調製することができ、そのいくつかを以下のスキーム、調製及び実施例で説明する。当業者は、記載のそれぞれの経路の特定の合成ステップを異なる方法で組み合わせ、又は異なるスキームからのステップと併せて、本発明の化合物又はその塩を調製することができることを認識している。以下のスキームの各ステップの産生物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、濾過、研和及び結晶化を含む通常の方法によって回収又は精製することができる。
【００４２】
個別の異性体、エナンチオマー又はジアステレオマーは、選択的結晶化技術又はキラルクロマトグラフィー等の方法によって、合成の都合の良い時点で、当業者によって分割されたり、溶解されてもよい（例えば、J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, and E.L.Eliel and S.H.Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994を参照のこと）。さらに、以下の調製に記載の中間体は、窒素及び酸素保護基を含む。保護及び脱保護条件は当業者に既知であり、文献に記載されている（例えば、"Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M.Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007を参照のこと）。
【００４３】
当業者は通常、試薬及び出発物質を容易に入手することができる。その他の試薬及び出発物質は、有機及び複素環化学の標準的な手技並びに以下の調製及び実施例に記載の手順によって作製することができる。
【００４４】
以下に説明されるように、線を通る線との結合の描写は、置換基と残りの分子との結合点を示している。
【化１１】
0006425809.tif 000012
【００４５】
交差した結合
【化１２】
0006425809.tif 000013
の描写は、E、Zジアステレオマーの混合物を示している。
【００４６】
本明細書で使用される略語は、Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984に従って規定されている。その他の略語は以下の通りである。「δ」はテトラメチルシランからの100万分率低磁場を指し、「ATCC」はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関を指し、「BOP」は（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩を指し、「BSA」はウシ血清アルブミンを指し、「CDI」は1,1’-カルボニルジイミダゾールを指し、「DCC」は1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミドを指し、「DIC」は1,3-ジイソプロピルカルボジイミドを指し、「DMSO」はジメチルスルホキシドを指し、「EDCI」は1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩を指し、「EDTA」はエチレンジアミン四酢酸を指し、「EIA」は酵素免疫検定法を指し、「EIMS」は電子イオン化質量分析を指し、「ESMS」はエレクトロスプレー質量分析を指し、「EtOAc」は酢酸エチルを指し、「HATU」は（1-[ビス（ジメチルアミノ）メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート）を指し、「HBTU」は（1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）（ジメチルアミノ）-N,N-ジメチルメタンイミニウムヘキサフルオロリン酸塩を指し、「HOAT」は1-ヒドロキシ-7-アゾベンゾトリアゾールを指し、「HOBT」は1-ヒドロキシルベンゾトリアゾール水和物を指し、「IC５０」は薬剤について可能な最大阻害反応の50％を生み出す当該薬剤の濃度を指し、「LPS」はリポ多糖を指し、「NSAID」は非ステロイド性抗炎症薬を指し、「PBS」はリン酸緩衝食塩水を指し、「PGE２」はプロスタグランジンE2を指し、「PGH２」はプロスタグランジンH2を指し、「PGI２」はプロスタグランジンI2を指し、「PyBOP」は（ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩）を指し、「PyBrOP」はブロモ（トリ-ピロリジニル）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸を指し、「rhIL-1β」は組み換えヒトインターロイキン1βを指し、「SFC」は超臨界流体クロマトグラフィーを指し、「TBME」はt-ブチルエーテルメチルエーテルを指し、「tＲ」は保持時間を指す。 
【００４７】
以下のスキーム、調製及び実施例は本発明をさらに説明している。  
スキーム1
【化１３】
0006425809.tif 000014
【００４８】
スキーム1、ステップ1では、第一級アルコールの酸化は、当該技術分野で既知の条件下、例えば、酸化剤としてDess-Martin Periodinane（商標）を使用して達成し、ステップ1のアルデヒド産生物を得ることができる。「PG」は、カルバミン酸、アミド、及びエステル等のアミノ又はカルボキシ基のために開発された保護基である。当該保護基は当該技術分野で知られており、認識されている。あるいは、酸化剤として2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-N-酸化物を臭化カリウムと共に使用することができ、当該混合物を約−10℃に冷却し、次に次亜塩素酸ナトリウムを添加し、ステップ1のアルデヒド産生物を得ることができる。A=CH２であるとき、アルデヒドはカリウムtert-ブトキシド等の塩基と共に適切なWittig試薬で反応させ、ステップ2のアルケン産生物を得ることができる。ステップ2のWittig産生物は、適切な（5-置換-2-保護カルボキシ）ベンジル又は臭化トリフェニルホスホニウムピリジルを、約0℃の温度で、強塩基で処理し、次にカルバミン酸2-ホルミルシクロアルキルを滴下することによって調製することができる。あるいは、ステップ4では、A=Nであるとき、アルデヒドを還元的アミノ化条件下、酢酸等の酸源及びトリアセトキシホウ水素化ナトリウム等の還元剤を有する適切なアニリンで、約0℃から室温で、約60℃に加熱する、又は加熱せずに、処理し、ステップ4、サブステップ1の結合産生物を得ることができる。当該産生物は、アミン保護基を除去するためのヨードトリメチルシランを使用する等、当該技術分野で既知の条件下、又は1,4-ジオキサン中の4MのHCl溶液を使用する等、酸性条件下で脱保護し、ステップ4、サブステップ2の産生物を得ることができる。ステップ3、サブステップ1では、A=CH２であるとき、ステップ2の産生物の二重結合は、EtOAc及び／又はメタノール等の溶媒中、約101〜413kPaで、5%〜10%のPd／C又は5%のPt／Cの触媒で還元し、ステップ3の産生物を得ることができる。当業者は二重結合を還元するために使用することができる異なるPd触媒、溶媒条件、酸化条件を認識している。ステップ3、サブステップ1の産生物は、スキーム1、サブステップ2に記載のサブステップ2に記載のように、サブステップ2で脱保護し、ステップ3、サブステップ2の産生物を得ることができる。
【００４９】
スキーム2
【化１４】
0006425809.tif 000015
あるいは、スキーム2では、ステップ1、スキーム1のアルデヒドを、メタノール等の溶媒中、1-ジアゾ-1-ジメトキシホスホリル-プロパン-2-オン及び炭酸カリウム等の無機塩基で三重結合に変換し、ステップ5の産生物を得ることができる。ステップ5の産生物は、ヨウ化銅（I）のテトラヒドロフラン等の溶媒及びビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）塩化物等のパラジウム触媒中、ヨード安息香酸等の任意に置換されたハロ安息香酸で、パラジウム条件下で結合し、ステップ6の産生物を得ることができる。三重結合は酸化条件下で、スキーム1、ステップ3、サブステップ1に記載のように還元し、ステップ7、サブステップ1の産生物を得ることができる。アミンは、スキーム1、ステップ4、サブステップ2に記載のように脱保護し、ステップ7、サブステップ2の産生物を得ることができる。
【００５０】
スキーム3
【化１５】
0006425809.tif 000016
スキーム3では、E=NHであるとき、3-置換カルボキシ保護されたピペリジンを、様々な条件下で、ハロゲン置換G基で、求核性芳香族置換を実施する。例えば、炭酸カリウム等の無機塩基又はN,N-ジイソプロピルエチルアミン又はピリジン等の有機塩基、約130〜150℃に加熱し、ステップ8、サブステップ1の産生物を得る。次に、メタノール及びテトラヒドロフラン等の溶媒中、水酸化ナトリウム水溶液又は水酸化リチウム等の無機塩基で、標準条件下、ピペリジンカルボキシ基を脱保護し、ステップ8、サブステップ2の産生物を得ることができる。1,4-ジオキサン、又は硫酸水溶液中、1NのHCl、4MのHCl等の酸性条件を使用して、保護されたカルボキシ基を脱保護することもできる。求核性芳香族置換をマイクロ波を使用し、約200℃に加熱する整然とした条件下で達成し、ステップ8、サブステップ1の産生物を得ることもできる。あるいは、置換された4-カルボキシピペリジンを、還流条件下、パラジウム、ナトリウム tert-ブトキシド等の塩基、及び（2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル）[2-（2'-アミノ-1,1'-ビフェニル）]パラジウム（II）メタンスルホン酸塩を使用して結合し、カルボン酸が保護されていないステップ8の産生物を得ることができる。
【００５１】
スキーム4
【化１６】
0006425809.tif 000017
スキーム4では、E=CHOHのとき、中間体4-カルボキシ保護シクロヘキサノールを、ジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基を使用して臭化ベンジルでアルキル化して、E=CH（OCH２）であるステップ9の産生物を得ることができる。
【００５２】
スキーム5
【化１７】
0006425809.tif 000018
ステップ8及びステップ9の産生物を、スキーム1、ステップ4、サブステップ2、スキーム1、ステップ3、サブステップ2、又はスキーム2、ステップ7、サブステップ2の適切な酸性物と、ジイソプロピルエチルアミン等の塩基、1-プロパンホスホン酸環状無水物等のカップリング試薬を使用して、アミド化条件下で反応させ、ステップ10、サブステップ1の産生物を得ることができる。当業者は、カルボン酸及びアミンの反応から得られるアミド形成について、いくつかの方法及び試薬を認識している。例えば、ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミン等の有機塩基のある場合又はない場合のカップリング試薬の存在下で、アミン化合物を適切なカルボン酸と反応させることで、式1の化合物を得ることができる。カップリング試薬として、DCC、DIC、EDCI等のカルボジイミド、又はCDI等のカルボニルジイミダゾールが挙げられる。1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物及びHOAt等のアミドカップリング添加物も反応を高めるために使用することができる。さらに、HBTU、HATU、BOP、PyBOP、及びPyBrOP等の非求核性アニオンのウロニウム又はホスホニウム塩を、より伝統的なカップリング試薬の代わりに使用することができる。反応を高めるために、DMAP等の添加物を使用してもよい。ステップ10、サブステップ1の産生物は、スキーム3、ステップ8、サブステップ2に記載のように、塩基条件下で、脱保護し、式1の化合物を得ることができる。
【００５３】
塩酸塩等の本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩は、例えば、当該技術分野で既知の標準条件下、ジエチルエーテル等の適切な溶媒中、式1、2又は3の適切な遊離塩基及び塩酸等の適切な薬学的に許容可能な酸を反応させることによって、形成することができる。さらに、当該塩の形成は、窒素保護基の脱保護と同時に生じる。当該塩の形成は当該技術分野で既知であり、認識されている。例えば、Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33： 201-217（1986）;  Bastin, R.J., et al."Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4： 427-435（2000）; and Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66： 1-19,（1977）を参照のこと。
【００５４】
以下の調製及び実施例は本発明をさらに説明している。
【００５５】
調製1
（5-クロロ-2-（メトキシカルボニル）ベンジル）トリフェニルホスホニウム臭化物
【化１８】
0006425809.tif 000019
トルエン（1.1L）中、2-（ブロモメチル）-5-クロロ安息香酸メチル（120g、455mmol）とトリフェニルホスフィン（131g、501mmol）とを合わせる。混合物を加熱し、攪拌しながら一晩還流する。不均一な混合物を室温に冷却する。混合物を濾過し、白色の沈殿物を回収する。順にフィルターケークをトルエン（500mL）及びヘキサン（500mLを2回）で洗浄する。固体を真空下で乾燥させ、白色固体として表題化合物を得る（225g、94%）。ESMS（m／z）445（M+）
【００５６】
調製2
（5-フルオロ-2-（メトキシカルボニル）ベンジル）トリフェニルホスホニウム臭化物
AVH-E12672-005
【化１９】
0006425809.tif 000020
本質的に調製1の方法によって表題化合物を調製する。1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ 7.84（dd, J =8.8, 5.8 Hz, 1 H）、7.80-7.56（m, 16H）、7.07-6.99（m, 1H）、6.20（d, J = 15.4 Hz, 2 H）、3.48（s, 3H）
【００５７】
調製3
tert-ブチル（（1S,2R）-2-ホルミルシクロペンチル）カルバミン酸 
【化２０】
0006425809.tif 000021
tert-ブチル（（1S,2R）-2-（ヒドロキシメチル）シクロペンチル）カルバミン酸(Hanselmann, R. Zhou, J. Ma, P. Confalone, P.N.J. Org.Chem.2003,68 (22) 8739-8741)（65g、0.30mol）をジクロロメタン（1.3L）に溶解する。当該溶液を−5℃に冷却し、3,3,3-トリアセトキシ-3-ヨードフタリド（185g、436mmol）を分けて添加する。添加後、反応混合物をジクロロメタン（2L）で希釈する。順に混合物を20重量％のNa2S2O3水溶液（2Lを3回）、NaHCO3飽和水溶液（2Lを2回）で洗浄する。ジクロロメタン混合物をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、溶媒を減圧下で濃縮し、灰白色の固体として表題化合物を得る（65g、100%）。ESMS（m／z）213（M+）
【００５８】
調製4
メチル2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）ビニル）-4-クロロ安息香酸）
【化２１】
0006425809.tif 000022
（5-クロロ-2-メトキシカルボニル）ベンジル）トリフェニルホスホニウムブロミド（225g、428mmol）をテトラヒドロフラン（1.6L）に懸濁する。懸濁液を0℃に冷却し、カリウムtert-ブトキシド（45g、401mmol）を2分かけて分けて添加する。得られた黄色の溶液の温度を0℃で保持する。反応物の温度を5℃以下に保持しながら、テトラヒドロフラン（300mL）中、溶液としてtert-ブチル（（1S,2R）-2-ホルミルシクロペンチル）カルバミン酸（65g、305mmol）を20分かけて滴下する。反応混合物を室温に温め、一晩攪拌する。反応混合物をNaHCO3飽和水溶液（2L）で希釈し、EtOAcで抽出する（1.5Lを2回）。有機抽出物を合わせ、合わせた抽出物を水（3L）で洗浄する。有機層をNa２SO４で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮し、粗残渣を得る。残渣を2部に分ける。ジクロロメタン中、25%〜50%のヘキサン：10%のTMBEの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーを使用して粗残渣の第一の部分を精製する。第二の部分はジクロロメタン中、25%〜35%のヘキサン：10%のTMBEの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーを使用して精製し、放置すると白色固体に凝固する黄色の油として表題化合物の4：1のE：Z混合物を得る（99.5g、262mmol、86%）。ESMS（m／z）402（M+Na）+
【００５９】
表1の以下の化合物は、適切に置換した臭化トリフェニルホスホニウムを使用して調製4の方法によって、本質的に調製することができる。
表1
【表１】
0006425809.tif 000023
【００６０】
調製9
2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）ビニル）-4-メチル安息香酸メチル
【化２２】
0006425809.tif 000024
メチル4-ブロモ-2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）ビニル）安息香酸（0.73g、1.72mmol）及び1,4-ジオキサン（20mL）を、マイクロ波容器に添加し、容器に窒素を30分間注入する。炭酸カリウム（310mg、2.24mmol）、メチルボロン酸（514mg、8.59mmol）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（115mg、0.099mmol）を添加する。マイクロ波中で、容器を150℃、45分間加熱する。得られた粗混合物を2つの追加のロットと合わせ、同じ手順によって本質的に調製し、合わせた理論値の収率は5.13mmolである。合わせた混合物をEtOAcと水に分け、有機相を水性相から分離する。順に有機相を飽和炭酸水素ナトリウム（2回）、塩化ナトリウム飽和水溶液で洗浄する。有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、濃縮乾固する。得られた黒い油を10／90〜40／60のEtOAc／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、白色固体として表題化合物を得る（1.13g、3.14mmol、全体収率61%）。ESMS（m／z）382（M+Na）+
【００６１】
調製10
2-（（（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）メチル）アミノ）-4-クロロ安息香酸メチル
【化２３】
0006425809.tif 000025
2-アミノ-4-クロロ安息香酸メチル（1.9g、10mmol）とNa2SO4（1.4g、9.8mmol）とを合わせる。1,2-ジクロロエタン（30mL）中、溶液としてtert-ブチル（（1S,2R）-2-ホルミルシクロペンチル）カルバミン酸（2.0g、9.4mmol）を添加する。攪拌溶液を0℃に冷却し、トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（4g、19mmol）を分けて添加する。酢酸（0.9mL、16mmol）を滴下する。反応物を室温に温め、一晩攪拌する。反応混合物を水（50mL）及び炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（200mL）で希釈し、混合物をジクロロメタンで抽出する（300mLを2回）。有機抽出物を合わせ、Na2SO4で乾燥する。混合物を濾過し、濾液を回収し、濾液を濃縮する。得られた残渣を、ヘキサン中の0〜100%のEtOAcで溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーに供し、白色固体として表題化合物（1.8g、50%）を得る。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）383／385（M+H）+
【００６２】
調製11
N-[（1S,2R）-2-ホルミルシクロヘキシル]カルバミン酸ベンジル
【化２４】
0006425809.tif 000026
N-[（1S,2R）-2-（ヒドロキシメチル）シクロヘキシル]カルバミン酸ベンジル（4.312g、16.37mmol）（Peter, M.; Van Der Eycken, J.; Bernath, G.; Fueloep, F.Tet.Asymm.1998, 9 (13) 2339-2347）をジクロロメタン（5.57mL）に溶解する。2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-N-酸化物（0.0259g、0.0164mmol）及び臭化カリウム（0.197g、1.64mmol）を添加する。混合物を−10℃に冷却する。次亜塩素酸ナトリウム（水中0.77M、23.36mL、18.01mmol）を15分かけて滴下し、混合物を1.5時間攪拌する。ジクロロメタン（50mL）を添加し、混合物を30分間攪拌する。室温に温め、混合物を一晩攪拌する。次亜塩素酸ナトリウム（水中0.77M、15mL、11.55 mmol）を10分かけて滴下し、混合物を20分間攪拌する。相分離し、水性相をジクロロメタンで抽出する（100mLを2回）。有機抽出物を合わせる。1MのHCl水溶液（150mL）中のヨウ化カリウム（1g）を溶解することによって、塩化水素／カリウム水素ヨウ化物溶液を調製する。合わせた有機抽出物を塩化水素／カリウムヨウ化物溶液で洗浄し、次に2Mのチオ硫酸ナトリウム水溶液（100mL）、水（100mL）で洗浄する。相分離する。有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮する。得られた粗物質を、5%のジクロロメタン／ヘキサン〜75％のジクロロメタン／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに30分かけて供し、白色固体として表題化合物を得る（3.563g、84%）。ESMS（m／z）262（M+H）+、284（M+Na）+
【００６３】
調製12
2-（（（（1S,2S）-2-（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）シクロヘキシル）メチル）アミノ）-4-クロロ安息香酸メチル
【化２５】
0006425809.tif 000027
2-アミノ-4-クロロ安息香酸メチル（0.799g、4.22mmol）及びベンジルN-[（1S,2R）-2-ホルミルシクロヘキシル]カルバマート（1.16g、4.44mmol）をジクロロメタン（10mL）に溶解する。酢酸（2mL、34.90mmol）を添加し、30分間攪拌する。トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（1.96g、8.89mmol）を一部添加し、一晩攪拌する。氷（約15g）を混合物に添加し、氷が溶けるまで攪拌する。ジクロロメタンで混合物を抽出する（50mLを3回）。合わせた有機抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（50mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、濃縮乾固する。粗物質を、35%のEtOAC／ヘキサンの勾配で溶出する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに供し、無色の油として、表題化合物を得る（1.15g、60%）。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）431／433（M+H）+
【００６４】
調製13
2-[[（1S,2S）-2-アミノシクロヘキシル]メチルアミノ]-4-クロロ安息香酸メチル
【化２６】
0006425809.tif 000028
2-（（（（1S,2S）-2-（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）シクロヘキシル）メチル）アミノ）-4-クロロ安息香酸メチル（1.15g、2.66mmol）をアセトニトリル（20mL）に溶解する。ヨードトリメチルシラン（0.42mL、2.92mmol）を添加し、混合物を35分間攪拌する。ヨードトリメチルシラン（0.42mL、2.92mmol）を添加し、混合物を30分間攪拌する。追加のヨードトリメチルシラン（0.42mL、2.92mmol）を添加し、混合物を5分間攪拌する。EtOAc（50mL）で混合物を希釈する。有機物を2Mのチオ硫酸ナトリウム水溶液（20mL）で洗浄する。相分離する。EtOAc（15mLを2回）で水性層を抽出する。有機相と有機抽出物とを合わせ、2Mのチオ硫酸ナトリウム水溶液（20mL）で洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウム（50mL）で洗浄する。MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、濾液を濃縮する。残渣を、10%のメタノール／ジクロロメタンの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに25分かけて供し、白色固体として表題化合物を得る（0.472g、60%）。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）297／299（M+H）+
【００６５】
調製14
2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）エチル）-4-クロロ安息香酸メチル 
【化２７】
0006425809.tif 000029
PARR（商標）反応容器に、EtOAc（100mL）中の5%のPt／C（1.1g、0.71mmol）を懸濁し、その後、2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）ビニル）-4-クロロ安息香酸）（45g、26mmol）及び追加のEtOAc（100mL）を添加する。容器を密封し、混合物をパージし、水素ガスで207kPaに圧力をかける。30分後、反応混合物を開孔し、濾過する。濾液を回収する。当該濾液を、45g、5g及び5gの2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）ビニル）-4-クロロ安息香酸メチル）から出発する類似の手順によって作製した物質と合わせる。溶媒を減圧下で合わせた溶液から取り除き、白色固体として表題化合物を得る（99g、バッチ−比例に基づいて計算して全収率99%）。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）404／406（M+Na）+
【００６６】
調製15
2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル
【化２８】
0006425809.tif 000030
本質的に調製14の方法に従って表題化合物を調製する。ESMS（m／z）370（M+Na）+
【００６７】
調製16
2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）エチル）ニコチン酸エチル
【化２９】
0006425809.tif 000031
窒素雰囲気下、10%のPd／C（501mg、0.471mmol）を、最小容量のEtOAcで処理し、当該固体を自由に懸濁する。2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）ビニル）ニコチン酸（1.7g、4.9mmol）及びメタノール（47mL）を添加する。容器を密封し、水素ガスでパージし、水素雰囲気下で攪拌する。1時間後、容器を窒素でフラッシュし、混合物を濾過する。固体をEtOAcで洗浄する。濾液を回収し、濃縮し、無色の油として約90%の純度の表題化合物を得る（1.76g、4.37mmol、93%）。ESMS（m／z）363（M+H）+
【００６８】
調製17
2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）エチル）-4-フルオロ安息香酸メチル
【化３０】
0006425809.tif 000032
10%のPd／C（0.17g）を圧力容器に添加し、固体をメタノール（50mL）で覆う。メタノール（50mL）中の2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）ビニル）-4-フルオロ安息香酸メチル（1.7g、4.7mmol）の溶液を添加する。容器を窒素でパージし、その後水素でパージする。水素で容器に413kPaまで圧力をかけ、一晩攪拌する。圧力を抜き、混合物を濾過し、微粒子を除去する。濾液を濃縮し、無色の油として表題化合物を得る（1.7g、4.7mmol、100%）。ESMS（m／z）388（M+Na）+
【００６９】
調製18
2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）エチル）-4-メチル安息香酸メチル
【化３１】
0006425809.tif 000033
10%のPd／C（0.23g）を最小容量のEtOAcに懸濁し、その後、メタノール（63mL）中、溶液として2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）ビニル）-4-メチル安息香酸メチル（1.13g、3.14mmol）を懸濁する。容器を水素でフラッシュし、水素雰囲気下で4時間攪拌する。分けた圧力容器に、10％のパラジウム炭素（0.67g）を、最終容量のメタノールで処理し、当該固体を自由に懸濁する。窒素下、最初の反応混合物を湿潤したばかりのパラジウムに添加する。容器を順に窒素、水素でフラッシュする。周囲温度で当該溶液を413kPa以下の水素下で1時間攪拌する。ケイ藻土によって反応物を濾過し、フィルターケークをメタノール及びEtOAcで洗浄する。濾液を濃縮し、無色の油として表題化合物を得る（0.85g、2.35mmol、75%）。ESMS（m／z）384（M+Na）+
【００７０】
調製19
（±）-tert-ブチルN-（trans-2-エチニルシクロペンチル）カルバミン酸 
【化３２】
0006425809.tif 000034
1-ジアゾ-1-ジメトキシホスホリル-プロパン-2-オン（1.49mL、6.98mmol）を、メタノール（50mL）中の（±）-tert-ブチルN-[cis-2-ホルミルシクロペンチル]カルバミン酸（1.24g、5.81mmol）及び炭酸カリウム（1.61g、11.63mmol）の混合物に添加する。混合物を室温で4時間攪拌する。減圧下で混合物を濃縮し、粗残渣を得る。粗残渣をEtOAc（100mL）で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（50mL）で洗浄し、相分離し、有機層を回収する。有機層をMgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮する。残渣を、ヘキサン中0%〜100%のEtOAcの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに供し、白色固体として表題化合物を得る（0.66g、54%）。1H NMR（400MHz, d6-DMSO）δ6.92（d, J = 7.8 Hz, 1H）、3.71（app quint J = 7.3 Hz, 1H）、2.84（s, 1H）、1.95-1.70（m, 2H）、1.60-1.46（m, 3H）、1.36（s, 9H）、1.37-1.29（m, 2H）
【００７１】
調製20
2-（（trans-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）エチニル）-4-クロロ安息香酸メチル
【化３３】
0006425809.tif 000035
テトラヒドロフラン（12mL）中の（±）-tert-ブチルN-（trans-2-エチニルシクロペンチル）カルバミン酸（0.65g、3.11mmol）及び4-クロロ-2-ヨード安息香酸メチル（1.11g、3.73mmol）の溶液に、ジイソプロピルアミン（0.44mL、3.11mmol）を添加する。当該溶液を窒素で5分間パージする。ヨウ化銅（I）（11.8mg、0.062mmol）及びビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）クロリド（43mg、0.062mmol）を添加する。混合物を室温で一晩攪拌する。反応を水（50mL）でクエンチし、EtOAcで抽出する（50mLを3回）。有機抽出物を合わせ、ブライン（50mL）で洗浄し、有機層を回収し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮する。得られた粗物質を、ヘキサン中0%〜50%のEtOAcの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに供し、淡黄色の固体として表題化合物を得る（0.57g、49%）。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）400／402（M+Na）+
【００７２】
調製21
2-（2-（trans-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）エチル）-4-クロロ安息香酸メチル
【化３４】
0006425809.tif 000036
EtOAc（20mL）中の2-（（trans-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）エチニル）-4-クロロ安息香酸メチル（0.57g、1.51mmol）の溶液に、10%のパラジウム炭素（0.40g、0.38mmol）を添加する。溶液を水素でパージし、水素雰囲気下で1.5時間攪拌する。ケイ藻土によって反応混合物を濾過する。濾液を減圧下で濃縮し、1H NMRによって約90%の純度の白色固体として表題化合物を得る（0.56g、87%）。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）404／406（M+Na）+
【００７３】
調製22
2-（2-（（1S,2S）-2-アミノシクロペンチル）エチル）-4-クロロ安息香酸メチル塩酸塩
【化３５】
0006425809.tif 000037
2-（2-（（1S,2S）-2-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）シクロペンチル）ビニル）-4-クロロ安息香酸）（99g、260mmol）を1,4-ジオキサン（500mL）に溶解し、塩化水素（1,4-ジオキサン中4.0Mの溶液、1.0L、4.0mol）を添加する。混合物を室温で一晩攪拌する。溶液をTBME（500mL）で希釈し、濾過し、得られた白色沈殿物を回収する。沈殿物をTBMEで洗浄する（300mLを3回）。濾液を回収し、濃縮し、追加の量の白色固体を得る。混合物を濾過し、白色固体を回収し、当該固体をTBMEで洗浄する（300mLを3回）。白色固体の両方の回収物を合わせ、表題化合物を得る（67.4g、96%）。ESMS（m／z）282（M+H）+
【００７４】
表2の以下の化合物は、本質的に調製22の手順に従って調製される。
表2
【表２】
0006425809.tif 000038
【００７５】
調製30
2-（2-（（1S,2S）-2-アミノシクロペンチル）エチル）安息香酸メチル
【化３６】
0006425809.tif 000039
5%のPd／C（0.82g、0.4mmol）をPARR（商標）フラスコ中のメタノール（20mL）に懸濁し、2-（2-（（1S,2S）-2-アミノシクロペンチル）エチル）-4-クロロ安息香酸メチル塩酸塩（8.0g、25mmol）、メタノール（180mL）、及びトリエチルアミン（14mL、99mmol）を懸濁液に添加する。フラスコを密封し、水素ガスでフラスコに427kPaまで圧力をかける。必要に応じて、水素でフラスコに再加圧する。3時間後、反応混合物を濾過する。濾液を減圧下で濃縮する。残渣を水（100mL）で希釈し、ジクロロメタンで抽出する（250mLを3回）。合わせた有機層をNa２SO４で乾燥し、濾過し、濾液を回収し、濾液を濃縮し、白色固体として、97％の純度の表題化合物を得る（65g、26mmol、105%）。ESMS（m／z）248（M+H）+
【００７６】
調製31
1-（8-メチルキノリン-2-イル）ピペリジン-4-カルボン酸エチル
【化３７】
0006425809.tif 000040
DMSO（400mL）中の2-クロロ-8-メチル-キノリン（50g、281mmol）及びピペリジン-4-カルボン酸（67g、426mmol）を合わせる。炭酸カリウム（80g、579mmol）を添加し、混合物を130℃に加熱し、130℃で一晩攪拌する。反応混合物を室温に冷却し、水（2.0L）で希釈し、EtOAcで抽出する（1.5Lを2回）。抽出物を合わせ、Na２SO４で乾燥し、濾過し、固体を除去し、濾液を回収し、濃縮し、残渣を得る。残渣を10／90〜20／80のヘキサン／TBMEの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、粘度のあるオレンジ色の油として表題化合物を得る（75.5g、収率90%）。ESMS（m／z）299（M+H）+
【００７７】
調製32
1-（8-メチルキノリン-2-イル）ピペリジン-4-カルボン酸
【化３８】
0006425809.tif 000041
1-（8-メチルキノリン-2-イル）ピペリジン-4-カルボン酸エチル（75.5g、253mmol）、テトラヒドロフラン（1.0L）及びメタノール（500mL）を合わせ、5Mの水酸化ナトリウム水溶液（510mL、2.55mol）を溶液に添加する。混合物を室温で一晩攪拌する。反応混合物を減圧下で濃縮し、水（500mL）で希釈し、得られた混合物を5℃に冷却する。混合物を5MのHCl水溶液でpH6〜7に酸性化し、沈殿を誘導する。固体を濾過により単離する。固体を水で完全に洗浄する。真空オーブンで固体を40℃で一晩乾燥させ、灰白色固体として表題化合物を得る（65g、95%）。ESMS（m／z）271（M+H）+
【００７８】
調製33
1-（4-（トリフルオロメトキシ）フェニル）ピペリジン-4-カルボン酸
【化３９】
0006425809.tif 000042
ピペリジン-4-カルボン酸（1.00g、7.74mmol）、p-ブロモフェニルトリフルオロメチルエーテル（1.87g、7.74mmol）、ナトリウムtert-ブトキシド（1.86g、19.4mmol）及び1,4-ジオキサン（77mL）を合わせる。窒素を30分間注入する。（2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル）[2-（2'-アミノ-1,1'-ビフェニル）]パラジウム（II）メタンスルホン酸塩を添加し、一晩還流する。反応物を室温に冷却する。混合物を水とEtOAcに分ける。3NのHClで水性層をpH4に酸性化し、EtOAc（100mLを3回）で抽出する。合わせた有機層をNaCl飽和水溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、濃縮し、表題化合物を得る（1.39g、4.81mmol、62%）。ESMS（m／z）290（M+H）+
【００７９】
調製34
trans-4-ヒドロキシシクロヘキサン-1-カルボン酸メチル
【化４０】
0006425809.tif 000043
（トリメチルシリル）ジアゾメタン（ヘキサン中2.0M、7.6mL、15mmol）を、無水トルエン（30mL）及びメタノール（10mL）中のtrans-4-ヒドロキシシクロヘキサン-1-カルボン酸の溶液（2.0g、13.8mmol）に、15分かけて分けて添加する。混合物を10分間攪拌し、その後、酢酸（1.0mg、0.017mmol）を添加する。混合物を濃縮し、油を得る。当該油を減圧下で一晩乾燥させ、表題化合物を得る（2.14g、97%、H1 NMR（400MHz, d6-DMSO）：δ4.54（d, J = 4.3 Hz, 1H）、3.54（s, 3H）、3.30（m, 1H）、2.17（m, 1H）、1.83-1.75（m, 4H）、1.30（m, 2H）、1.15（m, 2H）。
【００８０】
調製35
trans-4-（ベンジルオキシ）シクロヘキサン-1-カルボン酸
【化４１】
0006425809.tif 000044
trans-4-ヒドロキシシクロヘキサン-1-カルボン酸メチル（1.0g、6.3mmol）、ベンジルブロミド（0.76mL、6.4mmol）及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン（2.5mL、14mmol）の密閉混合物を150℃に1時間加熱する。1NのHCl（25mL）を得られた不均一な混合物に添加し、EtOAcで抽出する（3回）。合わせた有機物をMgSO4で乾燥させ、オレンジ色の油に濃縮する。残りのオレンジ色の油とメタノール（10mL）及びテトラヒドロフラン（10mL）に溶解する。5Nの水酸化ナトリウム（3.0mL）を添加する。混合物を一晩攪拌する。5NのHCl（3.0mL）で溶液を中性化し、濃縮乾固する。得られた固体をEtOAc及び水に溶解する。相分離し、水性相をEtOAcで抽出する（2回）。合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、濾過し、濾液を回収し、濃縮し、固体として、表題化合物を得る（1.16g、4.95mmol、78%）。ESMS（m／z）233（M-H）
【００８１】
調製36
1-（5-フルオロピリジン-2-イル）ピペリジン-4-カルボン酸エチル
【化４２】
0006425809.tif 000045
ピペリジンエチル4-カルボン酸塩（2.8mL、18mmol）、2,5-ジフルオロピリジン（2.0mL、25mmol）及びピリジン（2.0mL）を容器で合わせる。容器を密封し、200℃に1時間加熱する。混合物を室温に冷却し、混合物を水（15mL）及びEtOAc（50mL）で希釈し、相分離する。EtOAc層をNaCl飽和水溶液（15mL）で洗浄する。EtOAc層をNa２SO４で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、溶液を濃縮し、茶色の油を得る。茶色の油を90：10〜70：30のヘキサン：酢酸エチルで溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーに供し、無色の油として表題化合物を得る（2.32 g、9.2mmol、収率52%）。ESMS（m／z）253（M+H）+
【００８２】
調製37
1-（5-フルオロピリジン-2-イル）ピペリジン-4-カルボン酸
【化４３】
0006425809.tif 000046
テトラヒドロフラン（9mL）及びメタノール（18mL）中の1-（5-フルオロ-2-ピリジル）ピペリジン-4-カルボン酸エチル（2.32g、9.2mmol）の溶液に、2.0Mの水酸化ナトリウム水溶液（12mL、24mmol）を添加する。溶液を周囲温度で5時間攪拌する。溶液を濃縮し、残渣を5NのHCl水溶液（4.8mL、24mmol）で処理し、沈殿を誘導する。懸濁液を濾過し、白色の懸濁液を回収し、減圧下で乾燥し、白色固体として表題化合物を得る（1.9g、84mmol、92%）。ESMS（m／z）225（M+H）+
【００８３】
調製38
1-（p-トリル）ピペリジン-4-カルボン酸
【化４４】
0006425809.tif 000047
1,4-ジオキサン（60mL）に窒素ガスを10分間注入する。イソニペコチン酸（750mg、5.81mmol）、4-ブロモトルエン（1.0g、5.85mmol）及びナトリウムtert-ブトキシド（1.4g、13mmol）を混合物に添加する。再度、混合物に窒素を注入する。（2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル）[2-（2'-アミノ-1,1'-ビフェニル）]パラジウム（II）メタンスルホン酸塩を混合物に添加し、窒素雰囲気下で一晩還流する。溶液をEtOAcと水とに分ける。水性層を3NのHClでpH＝4に酸性する。水性層をEtOAc（35mLを3回）で抽出する。合わせた有機抽出物をNaCl飽和水溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾液を回収し、濃縮し、表題化合物を得る（545mg、2.49mmol、43%）。ESMS（m／z）220（M+H）+
【００８４】
調製39
1-（6-（トリフルオロメチル）ピリジン-3-イル）ピペリジン-4-カルボン酸エチル
【化４５】
0006425809.tif 000048
ピペリジンエチル4-カルボン酸塩（0.93mL、6.1mmol）及び5-フルオロ-2-（トリフルオロメチル）ピリジン（1.0g、6.1mmol）を添加する。混合物を窒素で5分間パージし、その後、BIOTAGE（商標）イニシエーターマイクロ波で200℃に90分間加熱する。反応混合物を、ヘキサン中100%のヘキサンから40%のEtOACの勾配で溶出する、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、無色の油として、表題化合物を得る（1.27g、4.2mmol、69%）。ESMS（m／z）303（M+H）+
【００８５】
調製40
1-（6-（トリフルオロメチル）ピリジン-3-イル）ピペリジン-4-カルボン酸
【化４６】
0006425809.tif 000049
1-（6-（トリフルオロメチル）ピリジン-3-イル）ピペリジン-4-カルボン酸エチル（1.27g、4.20mmol）を、メタノール（2mL）、テトラヒドロフラン（10mL）及びNaOH水溶液（5M、1.68 mL、8.40mmol）に溶解する。混合物を室温で一晩攪拌する。混合物を濃縮し、白色固体を得て、水で希釈し（20mL）、5NのHClでpH5に調整する。溶液を濃縮し、白色固体を得る。エタノール（100mL）の固体をスラリーし、濾過し塩を除去する。濾液を減圧下で濃縮し、白色固体として表題化合物を得る（1.10g、4.01mmol、95%）。ESMS（m／z）278（M+H）+
【００８６】
調製41
O1-tert-ブチル-O4-メチル3,3-ジメチル-2,6-ジヒドロピリジン-1,4-ジカルボン酸 
【化４７】
0006425809.tif 000050
メカニカルスターラー付きの2-L PARR（商標）オートクレーブに、酢酸パラジウム（II）（4.40g、20.0mmol）、1,1'-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン（13.3g、22.8mmol）、tert-ブチル3,3-ジメチル-4-（トリフルオロメチルスルホニルオキシ）-2,6-ジヒドロピリジン-1-カルボン酸（72.0g、150mmol）、無水アセトニトリル（850mL）、無水メタノール（570mL）及びトリエチルアミン（36.0mL、245mmol）を添加する。反応器を密封し、パージし、一酸化炭素で689kPaに圧力をかける。混合物を65℃に2.25時間加熱し、混合物を室温に冷却し、反応容器を注意深く開孔する（注意！毒ガス発生！）。減圧下で濃縮する。当該物質を同様のスケールの同じ手順によって本質的に調製した5つの他の物質のバッチと合わせ、合わせた物質を、ヘキサン中の0%〜20%の勾配のTBMEで溶出し、質量の約83％の純度の黄色の油として表題化合物を得る（260g、88%）。ESMS（m／z）214（M-t-Bu+2H）+
【００８７】
調製42
O1-tert-ブチル-O4-メチル3,3-ジメチルピペリジン-1,4-ジカルボン酸
【化４８】
0006425809.tif 000051
メタノール（700mL）中のパラジウム（炭素に対し10重量%、5.4g、5.1mmol）を懸濁し、メタノール（700mL）中のO1-tert-ブチル-O4-メチル3,3-ジメチル-2,6-ジヒドロピリジン-1,4-ジカルボン酸の溶液（130g、396mmol）を添加する。容器中の混合物を密封し、次に容器を窒素でパージし、その後水素でパージする。容器に水素で414kPaまで圧力をかけ、室温で1.5時間攪拌する。圧力を逃し、混合物を濾過し、触媒を除去する。濾液を、同様の手順によって調製した別の反応の濾液と合わせ、減圧下で揮発性溶媒を除去し、質量の約85％の純度の黄色の油として、表題化合物を得る（240g、95%）。ESMS（m／z）216（M-t-Bu + 2H）+
【００８８】
調製43
3,3-ジメチルピペリジン-4-カルボン酸メチル塩酸塩
【化４９】
0006425809.tif 000052
HCl（1,4-ジオキサン中の4.0M溶液、2.0L、8.0mol）を、1,4-ジオキサン（500mL）中のO1-tert-ブチル-O4-メチル3,3-ジメチルピペリジン-1,4-ジカルボン酸（240g、752mmol）の溶液に添加する。得られた混合物を室温で一晩攪拌し、減圧下で濃縮する。残渣をTBME（500mL）で希釈し、濾過により得られた固体を単離する。TBMEでフィルターケークをリンスし（400mLを2回）、固体を真空オーブンで35℃で一晩乾燥させ、白色固体として表題化合物を得る（144g、92%）。ESMS（m／z）172（M+H）+
【００８９】
調製44
（4S）-3,3-ジメチル-1-（8-メチル-2-キノリル）ピペリジン-4-カルボン酸（-）-メチル
【化５０】
0006425809.tif 000053
3,3-ジメチルピペリジン-4-カルボン酸メチル塩酸塩（144g、693mmol）、2-クロロ-8-メチルキノリン（125g、704mmol）、DMSO（1.4L）及びK2CO3（210g、1.52mol）を合わせる。得られた混合物を131±1℃で一晩攪拌する。混合物を室温に冷却し、濾過し固体を除去し、水（2L）で希釈し、EtOAcで抽出する（3Lを2回）。合わせた有機抽出物を水で洗浄し（1.5Lを3回）、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮する。得られた粗物質を、ヘキサン中の25%〜30%の勾配（DCM中10%のTBME）で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに供し、ラセミ体として表題化合物を得る。前記物質をメタノール（7.5L）に溶解し、溶液を濾過する。「溶液A」として濾液にラベルを付ける。流速400g／分で、移動相としてCO2中の15%（i-PrOH中0.2%のジメチルエチルアミン）を使用して、当該物質の全てが消費されるまで、95秒ごとに5mLの溶液Aを注入することによって、前記物質をキラルSFC（Chiralpak OJ-H、50mm×250mm×5μm）に供する。各注入について、第一の画分を回収し、溶出し（SFC方法1によってtR=2.57分）、第二の画分を捨てる（SFC方法1によってtＲ=3.17分）。回収した画分と以前の反応から単離した画分とを合わせて、揮発物を除去し、98gの粗3,3-ジメチルピペリジン-4-カルボン酸メチル塩酸塩を得る。物質を熱いエタノール（1.38L）から再結晶化し、濾過により結晶を単離し、40℃の真空オーブンで、一晩乾燥させ、白色の結晶固体として表題化合物を得る（156g、バッチ−比例に基づいて計算して全収率43%）。ESMS（m／z）313（M+H）+、[α]２０D-45°（c 0.21, CH２Cl２）。SFC方法1によって決定されたee=>99%。SFC方法1についてDaicel ChiralPak OJ-Hカラム（長さ100mm、内径4.6mm、粒径5μm）で分析を行う。使用する移動相は、8%（i-PrOH中20mMのNH3）及び100barの圧力で92%のCO２（scf）である。35℃の温度、流速3mL／分でSFCを実施する。UV（DAD）取得は220nmの波長で行う。
【００９０】
調製45
（-）-（4S）-3,3-ジメチル-1-（8-メチル-2-キノリル）ピペリジン-4-カルボン酸
【化５１】
0006425809.tif 000054
（4S）-3,3-ジメチル-1-（8-メチル-2-キノリル）ピペリジン-4-カルボン酸メチル（154g、493mmol）を硫酸（水中10%v／v、2.31L、2.75mol）で処理する。混合物を加熱し、攪拌しながら一晩還流する。混合物を室温に冷却し、pHが13に達するまでNaOH（水中50重量%）を添加する。TBME（500mL）を添加し、三相の混合物を得る。上部から下部にかけて、「層A」、「層B」、「層C」と標識を付ける。層Cを除去する。層A及びBに水（600mL）を添加し、有機層を取っておく。水性層を層Cと合わせる。抽出層CをTBME（500mL）で抽出し、有機層は取っておく。pHが6.5になるまで、層CにHCl（水中5.0M）を添加する。層CをTBMEで抽出する（400mLを2回）。有機抽出物は全て合わせて、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮し、96%の純度の白色固体（145g、95％）として表題化合物を得る。ESMS（m／z）299（M+H）+、[α]20D-59.6°（c 3.12, CH3OH）
【００９１】
調製46
2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（8-メチルキノリン-2-イル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル
【化５２】
0006425809.tif 000055
2-（2-（（1S,2S）-2-アミノシクロペンチル）エチル）安息香酸メチル（6.5g、26mmol、純度97%）及び1-（8-メチルキノリン-2-イル）ピペリジン-4-カルボン酸（7.8g、29mmol）をジクロロメタン（350mL）に溶解する。混合物を0℃に冷却し、ジイソプロピルエチルアミン（10mL、57mmol）を添加する。1-プロパンホスホン酸環状無水物（EtOAc中50重量％、25mL、41.6mmol）をある速度で添加し、反応物の内部温度を0℃〜4℃に保持する。反応物を室温に一晩温める。混合物をNaHCO3水溶液（1.0L）に注意深く注ぐ。相分離し、水性層をジクロロメタン（500mL）で抽出する。有機層を合わせ、合わせた有機層をNaCl飽和水溶液（200mL）で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、濾液を回収し、濾液を濃縮し、残渣を得る。残渣を、ジクロロメタンとヘキサンの1：1混合物中の20〜29%のTBMEの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーに供する。ジクロロメタンからジクロロメタン中の25%のTBMEへの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーによって混合した画分を再精製し、表題化合物を得る（10.8g、84%）。ESMS（m／z）500（M+H）+
【００９２】
調製47
4-フルオロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル
【化５３】
0006425809.tif 000056
2-（2-（（1S,2S）-2-アミノシクロペンチル）エチル）-4-フルオロ安息香酸メチル塩酸塩（0.15g、0.50mmol）、1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボン酸（0.14g、0.52mmol）及びEtOAc（5mL）を合わせる。ジイソプロピルエチルアミン（0.26mL、1.5mmol）及び1-プロパンホスホン酸環状無水物（EtOAc中50%の溶液、0.51mL、0.99mmol）を添加する。反応物を室温で一晩攪拌する。反応物をNaHCO3飽和水溶液で希釈し、30分間攪拌する。有機層をEtOAc（10mL）で希釈し、分ける。有機物をNaHCO3飽和水溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、白色固体に濃縮する。残渣を、ジクロロメタン中10%〜50%のEtOAcの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに供し、表題化合物を得る（0.127mg、0.24mmol、49%）。ESMS（m／z）521（M+H）+
【００９３】
調製48
4-メチル-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル
【化５４】
0006425809.tif 000057
本質的に調製48に記載の方法によって表題化合物を調製する。ESMS（m／z）（M+1）+ 517
【００９４】
調製49
4-クロロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（p-トリル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル
【化５５】
0006425809.tif 000058
ジクロロメタン（5mL）及びトリエチルアミン（0.150mL、1.08mmol）中の2-（2-（（1S,2S）-2-アミノシクロペンチル）エチル）-4-クロロ安息香酸メチル塩酸塩（100mg、0.314mmol）、1-（p-トリル）ピペリジン-4-カルボン酸（75mg、0.342mmol）及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（12mg、0.087mmol）を合わせ、スラリーを得る。EDCI（100mg、0.52mmol）を添加する。混合物を室温で一晩攪拌する。混合物を、50／50のEtOAc／ヘプタンで溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーに供し、表題化合物を得る（95mg、0.196mmol、62%）。白色固体としてESMS（m／z）483（M+H）+。
【００９５】
表3の以下の化合物は、本質的に調製49について上述に挙げた手順に従って調製される。
表3
【表３】
0006425809.tif 000059
【００９６】
調製54
2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル
【化５６】
0006425809.tif 000060
安息香酸2-（2-（（1S,2S）-2-アミノシクロペンチル）エチル）メチル塩酸塩（0.25g、0.88mmol）、1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボン酸（0.25g、0.88mmol）及びジメチルホルムアミド（4.4mL）を合わせる。BOP（0.52g、1.1mmol）及びトリエチルアミン（0.43mL、3.1mmol）を添加する。混合物を室温で一晩攪拌する。水で希釈し、EtOAcで抽出する（20mLを3回）。合わせた有機物を塩化ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、MgSO４で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮する。濃縮した残渣を10／90〜75／25のEtOAc／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーに供し、表題化合物を得る（0.3g、70%）。ESMS（m／z）503（M+H）+
【００９７】
表4の以下の化合物は、本質的に調製54について上述に挙げた手順に従って調製される。
表4
【表４−１】
0006425809.tif 000061
【表４−２】
0006425809.tif 000062
【００９８】
シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーの実施後、残渣を、0.1%のギ酸で改変したアセトニトリル及び水で溶出する逆相クロマトグラフィーによって精製し、表題化合物を得る。
【００９９】
7  溶出剤として100：0〜85：15のジクロロメタン：酢酸エチルを使用してカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を2回精製する。100：0〜10：90のジクロロメタン：EtOAcの勾配を使用するカラムクロマトグラフィーによって得られた残渣を再び精製する。
【０１００】
調製62
（（1R,2S）-2-アミノシクロペンタン）メタノール塩酸塩
【化５７】
0006425809.tif 000063
tert-ブチル（（1S,2R）-2-（ヒドロキシメチル）シクロペンチル）カルバミン酸（1.15g、5.34mmol）とHCl（ジオキサン中4.0M、62mL）を合わせる。溶液を室温で2時間攪拌し、その後、減圧下で濃縮し、白色固体として表題化合物を得る（802mg、5.29mmol）。1H NMR（400MHz, d6-DMSO）δ3.00（dd, J = 11.2, 4.9 Hz, 1H）、2.94-2.84（m, 2H）、1.61-1.51（m, 1H）、1.49-1.29（m, 1H）、1.14-0.72（m, 5 H）
【０１０１】
調製63
N-（（1S,2R）-2-（ヒドロキシメチル）シクロペンチル）-1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド
【化５８】
0006425809.tif 000064
（（1R,2S）-2-アミノシクロペンチル）メタノール塩酸塩（200mg、1.3mmol）をジメチルホルムアミド（6.6mL）に溶解し、1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボン酸（360mg、1.32mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（1.38mL、7.91mmol）及びO-（7-アゾベンゾトリアゾール-1-イル）-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（601mg、1.58mmol）を添加する。混合物を周囲温度で一晩攪拌する。混合物をEtOAcで希釈し、得られた混合物を順に1NのHCl水溶液、NaHCO3飽和水溶液、5%のLiCl水溶液、及びNaCl飽和水溶液で洗浄する。有機相をNa２SO４で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮し、黄褐色の固体として表題化合物を得る（600mg、98%）。ESMS（m／z）371（M+H）+
【０１０２】
実施例1
2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（8-メチルキノリン-2-イル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸
【化５９】
0006425809.tif 000065
2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（8-メチルキノリン-2-イル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル（10.7g、21.4mmol）をテトラヒドロフラン（150mL）及びメタノール（100mL）に溶解する。5Mの水酸化ナトリウム水溶液（45mL、225mmol）を混合物に滴下する。反応混合物を室温で一晩攪拌する。反応混合物を35℃に温め、さらに8時間攪拌する。混合物を室温に冷却し、減圧下で濃縮する。残渣を水（500mL）で希釈し、得られた混合物を1NのHClでpH6〜7に酸性化する。濾過により懸濁した固体を単離し、濾過ケークを水で完全に洗浄する。固体を乾燥させ、灰白色固体として表題化合物を得る（10g、96%）。ESMS（m／z）486（M+H）+
【０１０３】
実施例2
2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメトキシ）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸
【化６０】
0006425809.tif 000066
メタノール（2.0mL）及びテトラヒドロフラン（2.0mL）中の安息香酸2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメトキシ）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）メチル（135mg、0.260mmol）の溶液に、2Nの水酸化ナトリウム水溶液（0.70mL、1.4mmol）を添加する。混合物を70℃に加熱する。3時間後、2Nの水酸化ナトリウム水溶液（0.70mL、1.4mmol）を添加する。混合物を70℃でさらに1時間加熱する。5NのHCl水溶液（0.56mL）を添加する。混合物を濃縮乾固する。少量のメタノールで固体を研和し、その後水を添加する。真空濾過によって固体を回収し、白色固体としてLCMSによる純度93%の表題化合物を得る（114mg、0.20mmol、81%）。ESMS（m／z）505（M+H）+
【０１０４】
実施例3
2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（5-（トリフルオロメチル）ピリジン-2-イル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸
【化６１】
0006425809.tif 000067
メタノール（10mL）及びテトラヒドロフラン（10mL）中の2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（5-（トリフルオロメチル）ピリジン-2-イル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル（700mg、1.39mmol）の溶液に、5Nの水酸化ナトリウム水溶液（2mL、10mmol）を添加する。混合物を70℃に加熱する。3時間後、5Nの水酸化ナトリウム水溶液（2mL、10mmol）を添加する。反応をさらに2時間70℃で加熱する。5NのHCl（4mL）を添加し、濃縮乾固する。少量のメタノールで固体を研和し、その後水を添加する。真空濾過によって固体を回収し、白色固体として表題化合物を得る（551mg、1.13mmol、82%）。ESMS（m／z）490（M+H）+
【０１０５】
実施例4
2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸
【化６２】
0006425809.tif 000068
2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル（0.3g、0.6mmol）をメタノール（3mL）及びテトラヒドロフラン（10mL）に溶解する。水酸化リチウム（水中0.5M、5mL、2mmol）を添加する。混合物を45℃で一晩加熱する。混合物を室温に冷却し、ロータリー・エバポレーターで揮発物を除去する。5NのHClで溶液を酸性化し、沈殿を誘導する。沈殿物を回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥させ、表題化合物を得る（0.31g、0.63mmol、100%）。ESMS（m／z）489（M+H）+
【０１０６】
実施例5
2-（2-（（1S,2S）-2-（（trans）-4-（ベンジルオキシ）シクロヘキサン-1-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）-4-クロロ安息香酸
【化６３】
0006425809.tif 000069
メタノール（5mL）及びテトラヒドロフラン（4mL）中の2-（2-（（1S,2S）-2-（（trans）-4-（ベンジルオキシ）シクロヘキサン-1-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）-4-クロロ安息香酸メチル（518mg、1.04mmol）の溶液に、4Nの水酸化ナトリウム水溶液（2.0mL）を添加する。混合物を70℃に加熱する。3時間後、5NのHCl水溶液（2mL）を添加し、濃縮乾固する。少量のメタノールで固体を研和し、その後水を添加する。固体を濾過によって回収し、白色固体として表題化合物を得る（425mg、0.878mmol、84%）ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）484／486（M+H）+
【０１０７】
実施例6
4-クロロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（5-フルオロピリジン-2-イル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸
【化６４】
0006425809.tif 000070
テトラヒドロフラン（1.0mL）及びメタノール（2mL）中の安息香酸4-クロロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（5-フルオロピリジン-2-イル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）メチル（80mg、0.16mmol）の溶液に、2.0Mの水酸化ナトリウム水溶液（0.4mL、0.8mmol）を添加する。混合物を52℃で6.5時間加熱する。反応混合物を冷却し、減圧下で濃縮する。混合物を氷で処理し、1.0NのHClを使用してpH4に酸性化する。混合物をNaCl飽和水溶液（15mL）で希釈し、EtOAc（20mL）で抽出する。有機抽出物をNa２SO４で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮する。得られたゴムを最小容量のジエチルエーテルで研和し、得られた白色固体を濾過によって単離し、表題化合物を得る（77mg、0.16mmol、100%）。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）474／476（M+H）+
【０１０８】
実施例7
4-クロロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（p-トリル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸
【化６５】
0006425809.tif 000071
メタノール（2mL）及びテトラヒドロフラン（2mL）中の4-クロロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（p-トリル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル(95mg、0.196mmol)の溶液に、5.0Nの水酸化ナトリウム水溶液（1.0mL、5.0mmol）を添加する。混合物を70℃で4時間加熱する。5NのHCl水溶液（1.0mL）を添加し、揮発物を除去し、固体を得る。少量のメタノールで固体を研和し、その後水を添加する。ベージュ色の固体を濾過により回収し、表題化合物を得る（60mg、0.13mmol、65%）。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）469／471（M+H）+
【０１０９】
実施例8
4-クロロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペニル）エチル）安息香酸
【化６６】
0006425809.tif 000072
4-クロロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル（1.4g、2.61mmol）をテトラヒドロフラン（26mL）に溶解する。LiOH水溶液（0.5M、21mL）を添加する。混合物を110℃で2時間加熱し、100℃で3.5時間加熱する。混合物を周囲温度に放冷し、一晩攪拌する。出発物質が消費されるまで、混合物を100℃で加熱する（約5時間）。反応物を室温に冷却し、溶媒を蒸発させる。残渣を5NのHCl水溶液でpH5に酸性化する。得られた白色の沈殿物を回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥させ、表題化合物を得る（1.34g、2.56mmol、98%）。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）523／525（M+H）+
【０１１０】
実施例9
4-クロロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（6-（トリフルオロメチル）ピリジン-3-イル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸
【化６７】
0006425809.tif 000073
メタノール（3.0mL）中4-クロロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（6-（トリフルオロメチル）ピリジン-3-イル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル（58mg、0.11mmol）の溶液に、NaOH水溶液（1.0M、0.5mL）を添加する。混合物を50℃に加熱し、一晩攪拌する。HCl水溶液（5M、0.5mL）を添加する。減圧下で濃縮する。共沸によりトルエンで水を除去する。20%のテトラヒドロフラン中の残渣をEtOAc（10mL）に懸濁し、NaCl飽和水溶液（10mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮し、表題化合物を得る（51mg、0.097mmol、90%）。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）524／526（M+H）+
【０１１１】
実施例10
4-クロロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（（S）-3,3-ジメチル-1-（8-メチルキノリン-2-イル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸
【化６８】
0006425809.tif 000074
4-クロロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（（S）-3,3-ジメチル-1-（8-メチルキノリン-2-イル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル（284mg、0.505mmol）をメタノール（3mL）及びテトラヒドロフラン（3mL）に溶解する。LiOH水溶液（0.5M、5mL）を添加する。混合物を50℃で一晩加熱する。溶液を濃縮する。1NのHCl水溶液を使用してpH1に水性混合物を酸性化する。混合物を水（20mL）で希釈し、30分間攪拌する。濾過によりわずかに黄色の沈殿物を単離し、フィルターケークによって空気を引くことによって乾燥させ、表題化合物を得る（174mg、0.318mmol、63%）。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）548／550（M+H）+。1H NMR（400.13 MHz, d-6-DMSO）δ 7.91（d, J= 9.2 Hz, 1H）、7.70-7.68（m, 2H）、7.47（d, J = 8.0 Hz, 1H）、7.35（d, J =9.1 1H）、7.23-7.17（m, 3H）、7.05（t, J = 7.5 Hz, 1H）、4.63-4.60（m, 1H）、4.23-4.20（m, 1H）、4.09（d, J = 13.4 Hz, 1H）、3.03-3.00（m, 2H）、2.83-2.82（m, 2H）、2.39-2.27（m, 1H）、1.89-1.87（m, 11H）、0.96（s, 3H）、0.91（s, 3H）
実施例11
2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）ニコチン酸
【化６９】
0006425809.tif 000075
【０１１２】
2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）ニコチン酸エチル（146mg、0.282mmol）をテトラヒドロフラン（3mL）及びメタノール（1mL）に溶解する。0.5Mの水酸化リチウム水溶液（1.5mL、0.75mmol）を添加する。容器を密封し、密封した容器を45℃で一晩加熱する。混合物を室温に冷却し、濃縮し、揮発性の有機物を除去する。1NのHCl水溶液で混合物をpH3に酸性化し、得られた白色の沈殿物を濾過により回収する。濾液をpH1にさらに酸性化し、黄色のゴムを得る。全溶液及び単離物を合わせ、濃縮する。残渣を、10mMの（NH４）２CO３及び5%のメタノールで改変した10%〜55%のアセトニトリル及び水の勾配で溶出する逆相カラムクロマトグラフィーに供し、白色固体として表題化合物を得る（50mg、0.10mmol、36%）。ESMS（m／z）490（M+H）+
【０１１３】
実施例12
4-メチル-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸
【化７０】
0006425809.tif 000076
テトラヒドロフラン（30mL）及びメタノール（10mL）に、4-メチル-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸エチル（369mg、0.714mmol）を溶解する。水酸化リチウム水溶液（0.5M、15mL）を添加する。混合物を45℃で加熱し、一晩攪拌する。22時間後、温度を1時間で70℃に上昇させ、その後、加熱が再開するまで、混合物を4℃で保管する。反応物を55℃で5時間加熱する。混合物を濃縮し、5NのHClを添加し、混合物をpH1に酸性化する。20分間攪拌する。濾過により白色の沈殿物を単離する。固体を40℃の真空チャンバーで乾燥させ、表題化合物を得る（338mg、0.672mmol、94%）。ESMS（m／z）503（M+H）+
【０１１４】
実施例13
4-フルオロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸
【化７１】
0006425809.tif 000077
4-フルオロ-2-（2-（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル（127mg、0.244mmol）を、テトラヒドロフラン（3mL）、メタノール（1mL）及び水酸化リチウム水溶液（0.5M、1.5mL）に溶解する。溶液を45℃で一晩加熱する。溶液を部分的に濃縮し、有機物を除去し、当該水溶液をHClでpH1にする。濾過により白色の沈殿物を単離し、沈殿物によって空気を引くことによって乾燥させ、表題化合物を得る（116mg、0.229mmol、94%）。ESMS（m／z）507（M+H）+
【０１１５】
実施例14
4-クロロ-2-（（（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）メチル）アミノ）安息香酸
【化７２】
0006425809.tif 000078
4-クロロ-2-（（（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）メチル）アミノ）安息香酸メチル（0.25g、0.46mmol）をテトラヒドロフラン（10mL）及びメタノール（1mL）に溶解する。5.0Mの水酸化ナトリウム水溶液（0.19mL、0.93mmol）を添加する。容器を密封し、Biotage Initiator（商標）マイクロ波で100℃で30分間加熱する。混合物を水（50mL）で希釈し、類似の方法で調製した第二のロットの4-クロロ-2-（（（（1S,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）メチル）アミノ）安息香酸（0.29g、0.52mmol）を添加する。pH7に達するまで、溶液を強く攪拌しながら、1.0NのHCl水溶液を添加する。濾過により沈殿物を単離し、白色固体として表題化合物を得る（0.50g、0.95mmol、全収率84%）。ESMS（m／z）（35Cl／37Cl）537／539（M+H）+
【０１１６】
実施例15
4-メチル-2-（（（1R,2S）-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）メトキシ）安息香酸
【化７３】
0006425809.tif 000079
2-フルオロ-4-メチル安息香酸（50mg、0.32mmol）及びN-（（1S,2R）-2-（ヒドロキシメチル）シクロペンチル）-1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド（141mg、0.324mmol）、及びテトラヒドロフラン（3.24mL）を合わせる。水酸化ナトリウム（鉱油中60%、97mg、2.43mmol）を分けて添加する。混合物を還流で一晩加熱する。混合物を周囲温度に冷却する。EtOAcで希釈し、有機相及び水性相を分離する。有機相をNa２SO４で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮する。残渣を、水中10%〜100%のアセトニトリルで溶出する逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーに供する。所望の画分を回収する。溶媒を除去し、得られた残渣を真空下50℃で乾燥させ、淡黄色の固体として表題化合物を得る（59.4mg、0.117mmol、36%）。ESMS（m／z）505（M+H）+
【０１１７】
表5の以下の化合物は、本質的に実施例15について上述に挙げた手順に従って調製される。
表5
【表５】
0006425809.tif 000080
【０１１８】
実施例18
4-クロロ-2-[[（1S,2S）-2-[[1-[3-（トリフルオロメチル）フェニル]ピペリジン-4-カルボニル]アミノ]シクロヘキシル]メチルアミノ]安息香酸
【化７４】
0006425809.tif 000081
4-クロロ-2-[[（1S,2S）-2-[[1-[3-（トリフルオロメチル）フェニル]ピペリジン-4-カルボニル]アミノ]シクロヘキシル]メチルアミノ]安息香酸メチル（0.046g、0.083mmol）を、テトラヒドロフラン（2mL）及びメタノール（1mL）に溶解する。水中の5Nの水酸化ナトリウム（1.00mL、5.00mmol）を添加する。一晩攪拌する。1Nの塩化水素水溶液を使用して混合物をpH7に酸性化する。混合物を減圧下で約3mLの容量になるまで濃縮する。固体を濾過により回収し、水で固体を洗浄する。固体を真空で50℃で一晩乾燥させ、白色固体として表題化合物を得る（0.032g、71%）。ESMS（m／z）（３５Cl／３７Cl）538／540（M+H）+
【０１１９】
実施例19
（±）-4-クロロ-2-（2-（trans-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸
【化７５】
0006425809.tif 000082
4-クロロ-2-（2-（trans-2-（1-（4-（トリフルオロメチル）フェニル）ピペリジン-4-カルボキサミド）シクロペンチル）エチル）安息香酸メチル（0.046g、0.085mmol）を、テトラヒドロフラン（2mL）及びMeOH（0.5mL）に溶解する。5Mの水酸化ナトリウム水溶液（0.034mL、0.17mmol）を添加する。混合物を室温で一晩攪拌する。水（5mL）で希釈し、0.1MのHCl水溶液を滴下することによって、pH4に調整する。水性層をEtOAcで抽出する（10mLを3回）。有機抽出物を合わせ、ブライン（25mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を回収し、減圧下で濃縮し、白色固体として表題化合物を得る（0.041g、89%）。ESMS（m／z）（３５Cl／３７Cl）523／525（M+H）+
【０１２０】
生物学的アッセイ
ヒトmPGES-1酵素阻害アッセイ
ヒトmPGES-1（Invitrogen（商標）（カタログ番号97002RG、クローンID 6374722））をpcDNA3.1にサブクローニングし、HEK-293E細胞に一過性に発現する。ミクロソームを公開されている方法に基づいて細胞ペレットから調製する（Oullet et al., Purification and characterization of recombinant microsomal prostaglandin E synthase-1, Protein Expression and Purification, 26 pp 489-495（2002）; and Thoren et al., Human Microsomal Prostanglandin E Synthase-1, J. Biol Chem.278（25）pp 22199-22209（2003））。端的には、ペレットを均質バッファ（15mMのトリス-HCl、pH8.0、0.25Mのスクロース、0.1mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1mMのグルタチオン）の中で育成し、氷上で5×30秒、超音波処理する。ホモジネートを4℃で5,000×gで10分間遠心分離にかける。上清画分をデカントし、Beckman Quick-Seal（登録商標）管に充填し、4℃で150,000×gで90分間遠心分離にかける。上清画分をデカンテーションによって捨て、ペレットをアッセイバッファ（10mMのリン酸ナトリウム、pH7.0、10%のグリセロール、2.5mMのグルタチオン、Complete Protease Inhibitor Cocktail（商標）（Roche））中に再懸濁する。タンパク質濃度をPierce Coomassie Plus（商標）試薬を使用して決定する。
【０１２１】
酵素アッセイについて、ミクロソームをアッセイバッファに希釈し、14μL／ウェルの得られた溶液を384ウェルのアッセイプレートに添加する。化合物の希釈プレート（Nunc Cat#249944）をTecan_MC384（商標）上に生成し、4μL／ウェルをアッセイプレートに添加する。使用前にプロスタグランジンH２（PGH２）を直ぐにアッセイバッファに希釈し、14μL／ウェルをアッセイプレートに添加する。最終濃度は、6.52μg／mLのミクロソーム及び1.67μMのPGH２である。室温で2.5分間インキュベーションを行った後、0.5NのHCl中の2.5μL／ウェルの1mg／mLのSnCl２を添加し、反応を停止させる。5μLの反応停止溶液を、45μLの0.1％のギ酸を含む384ウェルのプレートに移動し、プレートを−80℃に保管する。PGE２について標準LC／MS分析を行うために、プレートをAgilent Technologies、前Biocius Lifesciences（Wakefield、MA 01880）に送る。データを使用してIC５０（μM）を計算する。実施例の化合物は、100nM未満のIC５０μM値を有するヒトmPGES-1を阻害する。この結果は、実施例1の化合物が、単離された酵素の調製において、mPGES-1酵素の強力な阻害剤であることを示している。
【０１２２】
エイコサイド選択性を測定するための細胞ベースアッセイ
ヒト上皮肺癌細胞株A549をATCC（CCL-185）から得て、標準5%のCO２加湿雰囲気下、37℃で、細胞増殖培地（KaighnF12細胞培養培地＋10%のウシ胎仔血清（FBS）で保持する。当該細胞を週に2回、1：3で継代培養する。  
【０１２３】
アッセイのために、リン酸緩衝食塩水（PBS）で1回、その後トリプシン-EDTAで1回、細胞を洗浄することによって、フラスコから細胞を回収する。37℃で3〜5分後、細胞を細胞増殖培地に懸濁し、2,000rpm、25℃、5分間遠心分離にかける。上清を吸引し、細胞ペレットを細胞増殖培地に再懸濁する。細胞数は、血球計数器上で、PBS及びTrypanブルーに希釈されている一定分量の細胞を数えることによって決定する。処理前の24時間で、96ウェルのFalconプレートに、細胞を40,000個／ウェル蒔く。Screen Mates管中、化合物を、100倍の最終濃度までDMSOに希釈する。培地を細胞から取り除き、新鮮な培地（90μL／ウェル）を細胞に添加する。化合物を1μL／ウェル、n=2に添加し、それぞれ7つの濃縮物を得る。細胞を、37℃、5%のCO２で30分間化合物で前処理する。プロスタグランジンE2産生が、細胞増殖培地で10倍の最終濃度に希釈された組み換えヒトインターロイキン1β（rhIL-1β）を添加することにより、誘発される。10μL／ウェルのアリコットを添加し、最終濃度0.1ng／mLのrhIL-1βを得る。処理時間は約18時間である。条件づけされた培地は、v底ポリプロピレンプレートに除去される。条件づけされた培地を、製造者のプロトコル（Cayman）に従って、特定の酵素免疫アッセイ（EIA）によってPGE２及びプロスタグランジンI2（PGI2）のレベルのアッセイを行う。端的には、条件づけされた培地（1μL）を、捕捉抗体でコーティングされ、製造者から供給されたEIAバッファ（49μL）を含む96ウェルプレートの各ウェルに添加する。トレーサーをEIAバッファ（50μL）で希釈する。検出抗体をEIAバッファ（50μL）で希釈する。プレートを接着性のある封止フィルムで覆い、100rpmでオービタルシェーカーで、室温で1時間インキュベートする。洗浄バッファをMILLIPORE精製水に希釈し、プレートを、プレートウォッシャーを使用して350μLを5回／ウェル洗浄する。基質（Ellmanの試薬）をMILLIPORE精製水で希釈し、プレートに200μL／ウェルで添加する。100rpmでオービタルシェーカーで、室温で約90〜120分でインキュベートした後、プレートをプレートリーダーのA412で読み取る。PGE２の標準曲線を使用してサンプルを較正する。実施例1は、当該アッセイで、0.0053μMのIC５０でPGE2形成を阻害している。 
【０１２４】
ヒト全血アッセイ
健常なボランティアのドナーからの血液をヘパリンナトリウムVACUTAINER管に回収する。提供から2週間以内にNSAID、アスピリン、Celebrex（登録商標）又はグルココルチコイドを投与されていないことを確認して、部分的にドナーを選択する。全ての管／ドナーを、250mLのCorning円錐形の遠心管に保管し、436.5μL／ウェルを深い皿のポリプロピレンプレートに分ける。化合物を、100倍の最終濃度であり4.5μL／ウェルに、二つ組又は三つ組で、DMSOに希釈し、7点曲線を得る。血液を、加湿雰囲気下、37℃、5％のCO２で化合物で前処理し、MicroClime Environmental Microplateの蓋で覆い、1mg／mLのBSA／PBS中、5mg／mLのリポ多糖（LPS、Sigma、血清型0111：B4）の溶液を9μL／ウェル添加してから30分後に最終濃度100μg／mLのLPSを得る。プレートを加湿雰囲気下、37℃、5％のCO2で20〜24時間インキュベートする。プレートをアルミニウムホイルの蓋できつく封止し、氷上で約1時間冷却する。その後、プレートをEppendorf 5810R遠心分離機で、1,800×g、10分、4℃で遠心分離にかける。無菌フィルターチップ付きのRainin L200を使用して細胞層から血漿を除去し、v底ポリプロピレンプレートに移動する。100マイクロリットルをCostarクラスターチューブブロックに定量で移動し、400μL／ウェルのメタノール停止試薬及び内部標準、d４-PGE２、d4-PGF２α、及びd４-TXA２βを添加する。サンプルを5分間ボルテックスし、−20℃で少なくとも1時間放置する。サンプルをEppendorf 5810Rで4000rpmで10分間遠心分離にかける。  
【０１２５】
固体相の抽出は、真空マニホルドのWaters HLB 30 mg／bedの96ウェルプレートを使用して行う。ステップ1、マトリックスをメタノール（1mL）、次に水中0.1％のギ酸（1mL）で洗浄する。ステップ2、400μLのサンプルを水中0．1％のギ酸（900μL）に沿って適用し、5分間結合させる。ステップ3、マトリックスを水中0.1％のギ酸（600μL）で洗浄し、次に80／20の水／メタノール（600μL）で洗浄する。ステップ4、産生物を2〜500μLの容量のEtOAcで溶離する。ステップ5、サンプルを窒素下で乾燥させ、0.1％のギ酸を有する75／25の水／アセトニトリル（50μL）で再構築する。産生物をLC／MS／MSによって分析する。実施例1は、当該アッセイで、0.0059±0.0034のIC５０、n=6、>95%の信頼区間でPGE2形成を阻害する。当該結果は、実施例1がヒト全血において、PGE2合成を阻害することを支持している。