(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から一本鎖ＤＮＡを除去する方法であって、前記方法は、前記試料をエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と、前記試料中に存在する任意の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させ、その後、エキソヌクレアーゼ処理試料を加熱して、前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化することを含み、前記エキソヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のアミノ酸配列またはこれに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有し、前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片は、
（ｉ）５５℃の温度で１０分間、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ2から構成されるバッファー中で加熱することにより少なくとも９０％不可逆的に不活性化され；
（ｉｉ）同じ条件下で、二本鎖ＤＮＡに対する活性が、等しい量の一本鎖ＤＮＡに対する活性の１５%以下であり；ならびに
（ｉｉｉ）３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を有する、
方法。
【請求項２】
試料から一本鎖ＤＮＡを除去する方法であって、前記方法は、前記試料をエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と、前記試料中に存在する任意の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させ、その後、エキソヌクレアーゼ処理試料を加熱して、前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化することを含み、前記エキソヌクレアーゼは、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１またはこれに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２またはこれに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３またはこれに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４またはこれに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、または（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５またはこれに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片は
（ｉ）５５℃の温度で１０分間、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ2から構成されるバッファー中で加熱することにより少なくとも９０％不可逆的に不活性化され；
（ｉｉ）同じ条件下で、二本鎖ＤＮＡに対する活性が、等しい量の一本鎖ＤＮＡに対する活性の１５%以下であり、ならびに
（ｉｉｉ）３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を有する、
方法。
【請求項３】
前記エキソヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１〜５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１１〜１５のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料は生体高分子の試料である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料は核酸、タンパク質、炭水化物ポリマーまたは脂質を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記試料は、二本鎖核酸、対象となるＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖または組換えにより生成されたタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料は核酸増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸増幅反応は、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＳＤＡ、ＬＡＲ／ＬＣＲ、およびＬＡＭＰから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
核酸増幅の方法であって、前記方法は、核酸増幅反応の生成物を請求項１〜３のいずれか一項で規定されるエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と、前記生成物中に存在する任意の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させ、その後、混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化する工程を最終増幅工程後に含む、方法。
【請求項１０】
前記生成物は前記最終増幅工程の直接生成物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法はさらに、前記増幅反応の生成物を前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と接触させる前に、これと同時に、またはその後に、前記生成物中に存在する任意の取り込まれないヌクレオチド三リン酸の脱リン酸を可能にする条件下で、アルカリホスファターゼを前記生成物と接触させることを前記最終増幅工程後に含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
一以上の逆転写工程を含む逆転写の方法であって、前記方法は、逆転写反応の生成物と請求項１〜３のいずれか一項で規定されるエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片とを、前記生成物中に存在する任意の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させ、その後、混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化する工程を最終逆転写工程の後に含む、方法。
【請求項１３】
前記生成物は、前記最終逆転写工程の直接生成物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法はさらに、前記逆転写反応の生成物を前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と接触させる前に、これと同時に、またはその後に、前記生成物中に存在する任意の取り込まれないヌクレオチド三リン酸の脱リン酸を可能にする条件下でアルカリホスファターゼを前記生成物と接触させる工程を前記最終逆転写工程、の後に含む、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
一以上の第二鎖ｃＤＮＡ合成工程を含み、最終第二鎖ｃＤＮＡ合成工程の後に、その生成物中に存在する任意の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で前記最終第二鎖ｃＤＮＡ合成工程の生成物と請求項１〜３のいずれか一項で規定されるエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片とを接触させ、その後、混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記生成物が前記最終第二鎖ｃＤＮＡ合成工程の直接生成物である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
最終第二鎖ｃＤＮＡ合成工程の後であって、前記生成物と前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片とを接触させる前に、これと同時に、またはその後に、さらに前記生成物中に存在する任意の取り込まれないヌクレオチド三リン酸の脱リン酸を可能にする条件下で、アルカリホスファターゼと前記最終第二鎖ｃＤＮＡ合成工程の生成物とを接触させる工程をさらに含む、
請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸配列解析の方法であって、前記方法は、解析工程前に試料調製の工程を含み、前記試料調製の工程は、解析される前記試料を請求項１〜３のいずれか一項で規定されるエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と、前記試料中に存在する任意の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させ、その後、混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化することを含む、方法。
【請求項１９】
前記試料調製の工程はさらに、アルカリホスファターゼを解析される前記試料と、前記試料を前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と接触させる前に、これと同時に、またはその後に、前記試料中に存在する任意の取り込まれないヌクレオチド三リン酸の脱リン酸を可能にする条件下で接触させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸配列解析は、シークエンシング技術またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブに基づく技術である、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、易熱性エキソヌクレアーゼおよび一本鎖ＤＮＡを生体分子、特に核酸増幅または逆転写反応の生成物（例えば二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖）を含む試料から除去するためのその使用に関する。発明はそのため、特に、一本鎖ＤＮＡを除去することによる、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を含む試料の精製に関連するとして考えることができる。より特定的には、発明は、核酸増幅または逆転写反応の生成物からの過剰オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーの除去に関する。核酸増幅反応の生成物からの過剰オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーの除去は、過剰オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーからの妨害が低減されるので、そのような生成物の下流配列解析を増強させることができる。そのため、本発明はさらに、例えば、核酸シークエンシングまたはオリゴヌクレオチドプローブアレイによる、核酸増幅または逆転写反応の生成物の配列解を最適化するための方法に関する。核酸増幅反応から得られたものではない核酸の配列解析を最適化するための方法もまた、提供される。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマーの糖−リン酸バックボーンにおけるホスホジエステル結合を分解する酵素である。ヌクレアーゼは非常に多様な酵素の群である。作用様式は、それらの標的機能によって、非常に特異的であるか、または非常に一般的なものとすることができる。ヌクレアーゼは一本鎖（ｓｓ）ポリマーまたは二本鎖（ｄｓ）ポリマーを好み得る。いくつかのヌクレアーゼは特定のヌクレオチド配列で切断し（例えば制限エンドヌクレアーゼ）、一方、他のヌクレアーゼは、ヌクレオチド配列に依存しないポリマー中の位置で切断する。細胞内では、ヌクレアーゼは様々な機能を有し、ＲＮＡおよびＤＮＡの重複断片の分解に加えて、ＤＮＡ複製、組換え、突然変異、転写および修復に関与する。ヌクレアーゼはまた、宿主防御機構においてある役割を果たし得る。
【０００３】
全てのヌクレアーゼは、それらの触媒メカニズムに２つ、１つの金属イオンが関与する、または金属イオンが関与しないに基づき、３つの主要なクラスに分割することができる（２金属イオン依存性、１金属イオン依存性および金属非依存性ヌクレアーゼスーパーファミリー）。これらのクラスの各々は、多くの異なるファミリーおよびスーパーファミリーを含む。ヌクレアーゼ分類についての詳細については、Ｙａｎｇ，  Ｗ．，  ２０１１，  “Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．”  Ｑ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ４４（１）：  １−９３を参照されたい。
【０００４】
基質選択性に基づき、ヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅｓ）またはリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅｓ）、すなわち、それぞれ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかのホスホジエステル結合を切断する酵素として分類することができる。ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー内の切断される結合の位置に基づき、ヌクレアーゼはさらに、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼとして分類され得る。エンドヌクレアーゼは、ポリマー内の位置にあるＤＮＡまたはＲＮＡのホスホジエステル結合を切断し、一方、エキソヌクレアーゼは、ＲＮＡおよびＤＮＡポリマーの端をトリミングし、鎖内の最外側のホスホジエステル結合を切断するのに関与する。エキソヌクレアーゼは、さらに５’→３’対３’→５’極性により、２つの群に分割することができる。ヌクレアーゼはまた、一本鎖核酸と二本鎖核酸の間で特異性を示し得る。特定のヌクレアーゼは厳密に一本鎖−特異的、一本鎖−選択的、厳密に二本鎖−特異的、二本鎖−選択的であってもよく、あるいは両方を切断するヌクレアーゼであってもよい。
【０００５】
多くのエキソヌクレアーゼ酵素が知られており、それらの中で、大腸菌酵素が最もよく特徴付けられたものである。エキソヌクレアーゼに対する共通する特徴は、単一結合イベントにおいて１０００までのヌクレオチドを分解して、モノヌクレオチドを放出する、それらの高い処理能力である。エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）、エキソヌクレアーゼＶＩＩ（ＥｘｏＶＩＩ）およびＲｅｃＪエキソヌクレアーゼは全て、ＤＮＡ修復に関与するｓｓＤＮＡ−特異的エキソヌクレアーゼであると報告されている。しかしながら、それらの作用の極性は異なる。ＥｘｏＩは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するが、ＲｅｃＪは５’→３’活性のみを有する。他のエキソヌクレアーゼと対照的に、ＥｘｏＶＩＩは５’→３’および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性両方を有する。
【０００６】
核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡにおけるヌクレオチドの配列の決定は、現代分子生物学において重要な目標となっている。解析することにより、核酸の起源に関するそのような配列情報を得ることができる。例えば、ある進化的に可変の遺伝要素のヌクレオチド配列は、これが由来する生物の同一性についての指標を提供することができる。したがって、試料中での特定の微生物の特徴となるヌクレオチド配列を有する核酸の検出は試料における微生物の存在を示すことができ、または、さらには、試料中のそのような生物の量を定量することができる。配列解析はまた、高等生物の分類学的分類を補助することができ、これは、農業および獣医科学などの技術分野において重要となり得る。ヒトでは、ヌクレオチド配列解析は、個体およびそれらの系列を同定することができ、よって、法医学的適用を有し、医学的にまたは生理的に関連する遺伝子型、例えば突然変異を同定することができる。標的細胞または細胞群（例えば、組織、腫瘍または培養物）のＲＮＡ転写物のシークエンシングは標的のトランスクリプトームに関する情報を与えることができ、これは、ひいては、医学および科学分野において多くの適用を有することができる。特有のヌクレオチド配列を有する、核酸に基づく同定タグもまた使用可能であり、その検出には、タグのヌクレオチド配列の解析が必要とされる。他の代表的な適用では、当業者は、おそらく、操作が成功したか確認するために、または新規分子の構成を理解するために、彼／彼女が扱う核酸のヌクレオチド配列を確認することを望む可能性がある。
【０００７】
核酸配列解析はシークエンシング技術の形態をとることができる。Ｓａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチドシークエンシング法は、核酸のシークエンシングをするためのよく知られた、広く使用される技術である。しかしながら、最近になって、いわゆる「次世代」または「第二世代」シークエンシングアプローチ（「第一世代」アプローチとしてのＳａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド法に関連して）が広まっている。これらのより新しい技術は、例えば、並行、例えば大規模並行シークエンシング反応の使用の結果として、またはより時間のかからない工程により、ハイスループットにより特徴付けられる。様々なハイスループットシークエンシング法は、単一分子シークエンシングを提供し、ピロシーケンス、可逆ターミネーターシークエンシング、ライゲーションによる切断プローブシークエンシング、ライゲーションによる非切断プローブシークエンシング、ＤＮＡナノボール、およびリアルタイム単一分子シークエンシングなどの技術を使用する。
【０００８】
核酸配列解析はまた、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブに基づくアプローチの形態をとることができ、この場合、標的ヌクレオチド配列の存在が、プローブとその標的の間の特定のハイブリダイゼーショイベントを検出することにより確認される。これらのアプローチでは、オリゴヌクレオチドプローブはしばしば、より広いアレイ、例えば固定化核酸マイクロアレイの一部として提供される。
【０００９】
さらなるアプローチは使用可能であり、将来開発される可能性があるが、共通のテーマとして、必須ではないが、各々が核酸増幅反応で増幅された、または逆転写（ＲＴ）反応により合成された核酸について実施されることが典型的である。増幅は典型的には、確実に、配列解析のために十分な核酸試料を存在させるために必要とされる。そのような技術としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ増幅反応（ＬＡＲ；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）としても知られている）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ；３ＳＲ（自家持続配列複製）としても知られている）が挙げられ、逆転写反応が先行され得る。これらの増幅技術および逆転写技術ではしばしば、最終生成物中に非標的一本鎖ＤＮＡが存在することになり、これは主に、過剰の一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーがしばしば最初に供給されるが、一本鎖ＤＮＡアンプリコンもまた、重合が不完全であると生じ得るからである。そのような一本鎖ＤＮＡは、他の試薬、例えばオリゴヌクレオチドプローブと競合し、それ自体がシークエンシングを受け、これにより、反応により出力されるシークエンシング情報を汚染することにより、増幅生成物の配列解析を妨害する。これは潜在的に解析の感度および正確さを低下させる。
【００１０】
そのうな妨害を軽減するために、核酸増幅反応または逆転写反応の生成物を、エキソヌクレアーゼで処理して、一本鎖ＤＮＡ（例えば取り込まれないプライマー）を分解してもよい。全ての取り込まれないＮＴＰ（例えばｄＮＴＰ）の脱リン酸を実施するための処理、例えばアルカリホスファターゼ、例えば熱−不安定性エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）による処理を含むこともまた可能である。今日、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）が、そのような反応において最も一般的に使用されるエキソヌクレアーゼである。エキソヌクレアーゼＩ反応は典型的には、核酸増幅または逆転写反応の生成物に酵素を添加し、１５分間、３７℃でインキュベートすることにより実施される。しかしながら、エキソヌクレアーゼが下流プロセス、例えば配列解析を妨害するのを防ぐために、酵素を不活性化することが、通常必要である。大腸菌由来の一般的に使用されるエキソヌクレアーゼＩを使用する場合、不活性化には、８０℃で１５〜２０分間の酵素のインキュベーションが必要とされる。長い不活性化時間および比較的高い不活性化温度により、時間のかかる、対象となる試料に対し比較的厳しいプロセスとなる。
【００１１】
ＲｅｃＪおよびＥｘｏＶＩＩもまた、そのような使用のために提案されているが、一般的に使用されていない。というのも、ＲｅｃＪは低い比活性を有し、ＥｘｏＶＩＩは、２つの異なるポリペプチド鎖から構成されるからである。推奨される不活性化条件は、ＲｅｃＪに対して６５℃での２０分インキュベーション、ＥｘｏＶＩＩに対して、９５℃での１０分インキュベーションを含む。
【００１２】
そのため、１５分未満で一本鎖ＤＮＡを特異的に分解することができ、および／または６５℃未満の温度でおよび／または１５〜２０分未満で本質的に不可逆的に不活性化され得る酵素を提供することが必要である。そのような易熱性（これは同じ意味で、本明細書では熱−不安定性（ＨＬ）として示される）酵素は、分子生物学技術を著しくより時間効率の良いものとし、対象となる試料分子に対しより穏やかにすることにより、これを改善するであろう。
【００１３】
他の状況では試料から一本鎖ＤＮＡを除去することが望ましい場合がある。例えば、核酸結合タンパク質が結合される一本鎖ＤＮＡを消化させるため。これらの状況では、１５分未満で一本鎖ＤＮＡを特異的に分解することができる、および／または６５℃未満の温度でおよび／または１５〜２０分未満で本質的に不可逆的に不活性化され得る酵素が、上記時間効率および穏やかな処理の同じ理由で、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ、ＲｅｃＪおよびＥｘｏＶＩＩよりも有利となるであろう。
【発明の概要】
【００１４】
冷水ニッチで見出されるシュワネラ属、ハロモナス属、ビブリオ属、サイクロモナス属およびモリテラ属の種（例えばモリテラ・ビスコーサおよびビブリオ・ウォダニス）から得られる大腸菌ｓｂｃＢ遺伝子（大腸菌エキソヌクレアーゼＩをコードする）のホモログが驚くべきことにこれらの有利な特性を有することが見出された。
【００１５】
よって、第１の態様では、エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片が提供され、前記エキソヌクレアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のアミノ酸配列またはこれに少なくとも約５０％同一なアミノ酸配列を有し、ここで前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片は、
（ｉ）１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中で、約５５℃の温度で１０分間加熱することにより、実質的に不可逆的に不活性化され；
（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡに実質的に特異的であり；ならびに
（ｉｉｉ）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００１６】
「少なくとも約５０％」により、配列同一性が少なくとも４９％、４９．５％または４９．９％であり得ることが意味される。好ましい実施形態では、発明のエキソヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％、例えば少なくとも９８％または９９％または９９．５％同一なアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、エキソヌクレアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １のアミノ酸配列から構成される。その酵素的に活性な断片もまた、提供される。
【００１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を有するエキソヌクレアーゼは、冷水ニッチで見出される原核生物から得られ得る。「原核生物」により、細胞核を欠く任意の生物、すなわち細菌および古細菌ドメイン由来の任意の生物が意味される。好ましくは、生物は細菌である。好ましくは、生物は真核生物、例えば分類学的な動物界、植物界、真菌界または原生生物界に分類される生物ではない。より好ましくは、生物は、シュワネラ属、ハロモナス属、ビブリオ属、サイクロモナス属およびモリテラ属から選択される。
【００１８】
ある一定の実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に少なくとも約５０％同一なアミノ酸配列を有するエキソヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２（ハロモナス種由来のＳｂｃＢホモログ）、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３（ビブリオ・ウォダニス由来のＳｂｃＢホモログ）、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４（サイクロモナス種由来のＳｂｃＢホモログ）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５（モリテラ・ビスコーサ由来のＳｂｃＢホモログ）から選択され得る。
【００１９】
このように、発明の別の態様では、エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片が提供され、前記エキソヌクレアーゼは、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１またはこれに少なくとも６５％同一なアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２またはこれに少なくとも６５％同一なアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３またはこれに少なくとも６５％同一なアミノ酸配列、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４またはこれに少なくとも６５％同一なアミノ酸配列、または
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５またはこれに少なくとも６５％同一なアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片は、
（ｉ）１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中で、約５５℃の温度で１０分間加熱することにより、実質的に不可逆的に不活性化され；
（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡに実質的に特異的であり、ならびに
（ｉｉｉ）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００２０】
発明のこの態様の好ましい実施形態では、エキソヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、３、４または５に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％、例えば少なくとも９８％または９９％または９９．５％同一なアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、エキソヌクレアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、３、４および５からなる群より選択されるアミノ酸配列から構成される。その酵素的に活性な断片もまた、提供される。
【００２１】
本発明によるパーセンテージ配列同一性は、広く使用されているアルゴリズムのいずれかを用いて、例えばＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２多重配列アライメントプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌＷ２）を使用し、デフォルトパラメータ（ＤＮＡギャップ開始ペナルティ＝１５．０；ＤＮＡギャップ伸長ペナルティ＝６．６６；ＤＮＡマトリクス＝同一性；タンパク質ギャップ開始ペナルティ＝１０．０；タンパク質ギャップ伸長ペナルティ＝０．２；タンパク質マトリクス＝Ｇｏｎｎｅｔ；タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ＝−１；タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ＝４）を使用して計算することができる。
【００２２】
上記ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏのバリアントは、前記ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏの１つ以上のアミノ酸が保存的置換を受けているアミノ酸配列、または前記１つ以上のアミノ酸の修飾バージョンもしくは天然起源ではないアミノ酸（例えば前記１つ以上のアミノ酸のＤ異性体）で置き換えられているアミノ酸配列を含む。好ましくは、そのような置換および修飾は、発明のエキソヌクレアーゼの修飾形態が非修飾形態と同じ酵素特性および不活性化特性を有するという点で、サイレントな置換および修飾である。
【００２３】
エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖の１つ以上の末端から、ヌクレオチド配列特異性を伴わずに、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を加水分解することにより、ヌクレオチドを切断することができる酵素である。典型的には、エキソヌクレアーゼは、５’末端から（そのため、５’−３’エキソヌクレアーゼとして、または５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するとして特徴付けられる）、または３’末端から（そのため、３’−５’エキソヌクレアーゼとして、または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するとして特徴付けられる）ヌクレオチドを切断する。発明によれば、エキソヌクレアーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、発明のエキソヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡに対して実質的に５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、これにより、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中０．１〜１．０Ｕ／μｌの濃度では、発明のエキソヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡに対して、１時間のインキュベーションの過程にわたり、ほとんど、無視できるほどしか、または本質的に全く５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないことが意味される。数量的に表すと、１０％未満、例えば５％、４％、３％、２％または１％未満の一本鎖ＤＮＡ基質（例えば約５ｐｍｏｌの前記基質、これは、例えばオリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよい）がそのような条件下で、５’−３’方向で分解されるであろう。好ましくは、そのような濃度では、検出可能な５’−３’エキソヌクレアーゼ活性はないであろう。
【００２４】
当業者であれば、相対的な５’−３’および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を測定するために好適なアッセイを考案することができるであろう。例えば、実施例に記載される、ゲルに基づくエキソヌクレアーゼアッセイは５’（ＦＡＭ）標識一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを使用して、３’末端からの分解をモニターする。というのも、そのような活性により、３’末端から短くされた様々な長さの検出可能な断片が得られるからである。５’末端からの分解では、単一の標識ヌクレオチドしか得られないであろう。これらの結果を確認するために、同じアッセイを、代わりに、３’標識一本鎖ＤＮＡ基質を用いて実施することができ、反対のゲルパターンが観察されるはずである。
【００２５】
「一本鎖ＤＮＡに実質的に特異的な」により、同じ条件下（例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中、約０．１Ｕ／μｌの酵素濃度および約５ｐｍｏｌの核酸基質、１０分以下のインキュベーション時間および約３０℃のインキュベーション温度を用いる）で、二本鎖ＤＮＡに対する発明のエキソヌクレアーゼの活性は、等しい量の一本鎖ＤＮＡに対する活性の１５％以下であることが意味される。他の実施形態では、二本鎖ＤＮＡに対する発明のエキソヌクレアーゼの活性は、同じ条件下で、等しい量の一本鎖ＤＮＡに対する活性の１０％以下、例えば８％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％または０．０５％以下である。
【００２６】
さらにより特定的な実施形態では、「一本鎖ＤＮＡに実質的に特異的な」はまた、一本鎖ＲＮＡに対する発明のエキソヌクレアーゼの活性は、同じ条件下（例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中、約０．１Ｕ／μｌの酵素濃度および約５ｐｍｏｌの核酸基質、１０分以下のインキュベーション時間および約３０℃のインキュベーション温度を用いる）で、等しい量の一本鎖ＤＮＡに対する活性の１５％以下であることを意味する。他の実施形態では、一本鎖ＲＮＡに対する発明のエキソヌクレアーゼの活性は、同じ条件下で、等しい量の一本鎖ＤＮＡに対する活性の１０％以下、例えば８％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％または０．０５％以下である。
【００２７】
ある一定の実施形態では、「一本鎖ＤＮＡに実質的に特異的な」により、発明のエキソヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡを分解するが、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中約０．１Ｕ／μｌの濃度では、約１０分のインキュベーションの過程にわたり、約５ｐｍｏｌの好適な二本鎖ＤＮＡ基質（例えば二本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド）の検出可能な分解はほとんど、無視できるほどしか、または本質的に全くないことが意味される。数量的に表すと、好適な二本鎖ＤＮＡ基質の１５％以下、例えば１０％、８％、５％、４％、３％、２％または１％以下がそのような条件下で分解されるであろう。好ましくは、そのような濃度下では、二本鎖ＤＮＡ基質の検出可能な分解はない。
【００２８】
さらにより特定的な実施形態では「一本鎖ＤＮＡに実質的に特異的な」はまた、発明のエキソヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡを分解するが、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中約０．１Ｕ／μｌの濃度では、約１０分のインキュベーションの過程にわたり、約５ｐｍｏｌの好適な一本鎖ＲＮＡ基質（例えば、一本鎖オリゴリボヌクレオチド）の検出可能な分解はほとんど、無視できるほどしか、または本質的に全くないことを意味する。数量的に表すと、好適な一本鎖ＲＮＡ基質の１５％以下、例えば１０％、８％、５％、４％、３％、２％または１％以下がそのような条件下で分解されるであろう。好ましくは、そのような濃度下では一本鎖ＲＮＡ基質の検出可能な分解はない。
【００２９】
ある一定の実施形態では「一本鎖ＤＮＡに実質的に特異的な」はまた、発明のエキソヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡを分解するが、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中０．１〜１．０Ｕ／μｌ（好ましくは０．１Ｕ／μｌ）の濃度では、１時間のインキュベーションの過程にわたり、非一本鎖ＤＮＡ核酸基質の検出可能な分解はほとんど、無視できるほどしか、または本質的に全くないことを意味する。本明細書では、「非一本鎖ＤＮＡ核酸基質」という用語は、いくつかの実施形態では、二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖非ＤＮＡ核酸の両方を示すが、好ましい実施形態では、その用語は二本鎖核酸（例えば二本鎖ＤＮＡ）のみを示す。数量的に表すと、（例えば約５ｐｍｏｌの）好適な非一本鎖ＤＮＡ基質（すなわち二本鎖核酸および／または一本鎖非ＤＮＡ核酸）の１０％未満、例えば５％、４％、３％、２％または１％未満が、そのような条件下で分解されるであろう。好ましくは、そのような濃度では、非一本鎖ＤＮＡ核酸基質（すなわち二本鎖核酸および／または一本鎖非ＤＮＡ核酸）の検出可能な分解はない。
【００３０】
当業者であれば、容易に、一本および二本鎖核酸に対する相対的なヌクレアーゼ活性の比較をするための実験を考案することができるであろう。例えば、試験下のエキソヌクレアーゼを、放射性標識ＰＣＲ生成物（例えば、約５ｐｍｏｌの前記ＰＣＴ生成物）の２つの試料（１つは生成物が変性されており（すなわち一本鎖）、もう一方は生成物が変性されていない（すなわち二本鎖））と、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中で、０．１〜１．０Ｕ／μｌ（好ましくは０．１Ｕ／μｌ）の濃度で１０分間インキュベートさせることができる。酸可溶性ヌクレオチドの放出はその後、実施例８および９で記載されるように分析することができる。
【００３１】
あるいは、試験下のエキソヌクレアーゼを、ＰＣＲ生成物（例えば約５ｐｍｏｌの前記ＰＣＴ生成物）の上記試料と、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中で、０．１〜１．０Ｕ／μｌ（好ましくは０．１Ｕ／μｌ）の濃度で１時間インキュベートさせることができ、その後、生成物を、好適な電気泳動ゲル、例えばアガロース上で分離することができる。一本鎖および／または二本鎖核酸に対する活性は、未処理対照に対するバンドの位置により観察可能となる。
【００３２】
別のアプローチは、フルオロフォアＦＡＭ（フルオレセイン）により５’末端で、およびＴＡＭＲＡにより３’末端で標識されたオリゴヌクレオチドからの蛍光の増加を測定する。２つの標識が近接する場合、ＦＡＭからの放出光はＴＡＭＲＡにより吸収される（消光される）。試験下のエキソヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの切断により、ＦＡＭのＴＡＭＲＡからの分離、およびＦＡＭからの蛍光の増加が得られ、これは、蛍光光度計において励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍを用いて測定することができる。二本鎖基質は、標識オリゴヌクレオチドを、標識オリゴヌクレオチドに相補的な第２のオリゴヌクレオチドと混合することにより、調製することができる。当然、他の好適なフルオロフォア対が同様に使用され得る。実施例７は好適なアッセイをより詳細に記載する。
【００３３】
ホスホジエステル結合されたデオキシリボ−リン酸バックボーンを保持するＤＮＡの修飾物は、ＤＮＡという用語に含まれる。一本鎖ＤＮＡの一般的に遭遇する例としては、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブおよびＤＮＡアプタマーが挙げられる。核酸同定タグおよび標識もまた一本鎖ＤＮＡであり得る。一本鎖ＤＮＡはまた、逆転写中に、ならびにＤＮＡ複製およびＤＮＡ転写中の二本鎖巻き戻しで、生じる。核酸増幅反応および逆転写反応において、一本鎖ＤＮＡは、部分的に伸長されたプライマー、および伸長されず、完全に合成された二本鎖中に統合されていない過剰のプライマーから生じ得る。
【００３４】
さらなる実施形態では、発明のエキソヌクレアーゼは実質的にエンドヌクレアーゼ活性を有さない。「実質的にエンドヌクレアーゼ活性を有さない」により、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中０．１〜１．０Ｕ／μｌの濃度では、発明のエキソヌクレアーゼは、１時間のインキュベーションの過程にわたり、環状一本鎖核酸または環状二本鎖核酸に対して、ヌクレアーゼ活性をほとんど、無視できるほどしか、または本質的に全く示さないことが意味される。数量的に表すと、（例えば約５ｐｍｏｌの）一本鎖または二本鎖核酸基質の１０％未満、例えば５％、４％、３％、２％または１％未満がそのような条件下で断片化される（例えば、オリゴヌクレオチドに）。好ましくは、そのような濃度では検出可能なエンドヌクレアーゼ活性はない。
【００３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜５の酵素的に活性な断片およびバリアントは、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜５の酵素の酵素機能の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９９％を示す。他のどこかで記載されるように、エキソヌクレアーゼの活性は、ルーチン技術を使用して容易に評価することができる。
【００３６】
以下の記載では、発明のエキソヌクレアーゼへの言及はまた、別段の指示がない限り、その酵素的に活性な断片への言及となる。
「実質的に不可逆的に不活性化される」により、特定の温度まで特定の時間の間、特定のバッファー条件下で加熱すると、酵素が少なくとも９０％不活性化され、好ましくは９５％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％不活性化されることが意味される。パーセンテージ不活性化は、例えば実施例５および６に示されるように、好適に標識された（例えば５’ＦＡＭ標識された）一本鎖ＤＮＡ試料（例えば、標準ＰＣＲプライマー、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２１−ＧＣＴＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣのヌクレオチド配列を有するデオキシリボ核酸プライマー）を、３０分間、不活性化されたエキソヌクレアーゼまたは不活性化されていないエキソヌクレアーゼと共に好適なバッファー（例えばＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ）中、好適なｐＨ（例えばｐＨ７．５）、好適な温度（例えば３０℃）で、Ｍｇ２＋（例えば５ｍＭ）の存在下にてインキュベートし；反応生成物を好適なゲル（例えばアクリルアミド／尿素ゲル）上で電気泳動により分離し、ＤＮＡバンドの蛍光の相対強度をＵＶ光下で測定することにより、便利に推定することができる。別の方法が、不活性化されたエキソヌクレアーゼおよび不活性化されていないエキソヌクレアーゼの相対的な活性を測定するために当業者により考案され得、特に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファーが使用され得る。
【００３７】
反応混合物の温度が室温に戻った時でも、発明のエキソヌクレアーゼは活性を回復せず、すなわち残存活性は実質的になく；特定的には、１０％未満、好ましくは５％、２％、１％、０．５％または０．１％未満であり、最も好ましくは検出可能なエキソヌクレアーゼ活性は残っていない。
【００３８】
実質的に不可逆的な不活性化は、特定のバッファー条件における、５５℃または約５５℃、例えば５３〜５７℃の温度でのインキュベーションの１０分以内に起こる。例えば、７、８または９分の、約５５℃でのインキュベーション。実施例５に示されるように、他の実施形態では、発明のエキソヌクレアーゼは、特定のバッファー条件において５５℃または約５５℃、例えば５３〜５７℃の温度で、５分以内に、例えば２、３または４分で、実質的に不可逆的に不活性化される。さらなる実施形態では、発明のエキソヌクレアーゼは、特定のバッファー条件において、５０℃または約５０℃、例えば４８〜５３℃の温度で、１０分以内、例えば、７、８または９分で実質的に不可逆的に不活性化される。さらに別の実施形態では、発明のエキソヌクレアーゼは、特定のバッファー条件において５０℃または約５０℃、例えば４８〜５３℃の温度で、５分以内、例えば２、３または４分で実質的に不可逆的に不活性化される。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１および４により表されるエキソヌクレアーゼならびにそのバリアントはこれらの後者の実施形態の例である。
【００３９】
他の実施形態では、発明のエキソヌクレアーゼの実質的に不可逆的な不活性化は、特定のバッファー条件における、８０℃または約８０℃、例えば７０〜９０℃、７５〜８５℃、７８〜８２℃または７９〜８１℃の温度でのインキュベーションの１分以内に起こる。例えば、約８０℃での少なくとも約３０、４０、５０または５５秒のインキュベーションにおいて。
【００４０】
使用時に、発明のエキソヌクレアーゼは、酵素が使用される条件（例えば５５℃で５分間または５０℃で５〜１５分、例えば１０〜１５分間）によって、より低い温度でまたはより短い期間にわたって実質的に不可逆的に不活性化され得るが、発明によれば、１０分間約５５℃で、特定のバッファー条件において加熱することは、酵素を実質的に不可逆的に不活性化するのに十分であるはずである。これらの２つのパラメータのうちの１つの調整は、もう一方を調整することにより補償することができることは、当業者には容易に明らかになるであろう。例えば、不活性化温度を増加させると、インキュベーションの持続期間を低減させることができる。反対に、インキュベーションの持続期間を増加させると、より低い不活性化温度を使用することができる。もちろん、当業者に明らかであり、実施例で示されるように、発明のエキソヌクレアーゼが発明の方法において使用される場合、実用的であれば、１０分より長いインキュベーションの持続期間が使用され得、かつ約５５℃を超える不活性化温度が使用され得る（例えば、不活性化は、８０℃で１分間、６０℃で５〜１０分間、５５℃で１５分間または５０℃で１５分間、で起こり得る）。しかしながら、発明によれば、エキソヌクレアーゼは、５５℃または約５５℃の温度で１０分間、特定のバッファー条件においてインキュベートされる場合、実質的な不活性化を示さなければならない。
【００４１】
発明のエキソヌクレアーゼに対する不活性化温度および時間は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２から構成されるバッファー中で、エキソヌクレアーゼをインキュベートすることにより評価されるべきである。エキソヌクレアーゼは約０．１〜１．０Ｕ／μｌ、好ましくは０．１〜１．５Ｕ／μｌ、０．１〜５Ｕ／μｌまたは０．１Ｕ／μｌ〜１０Ｕ／μｌで存在すべきである。
【００４２】
最も好ましい実施形態では、発明のエキソヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５のアミノ酸配列を有し（またはこれから構成され）得る。
【００４３】
発明の別の態様では、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５のアミノ酸配列を有する（またはこれから構成される）エキソヌクレアーゼが提供される。アミノ酸配列により完全に規定されることは、上記の特定の機能的特徴が、この態様に必ずしもあてはまらないことを意味する。それにもかかわらず、実施例に示されるように、これらの特定のエキソヌクレアーゼの各々は、本明細書で記載される発明の方法において有用性が見出される。
【００４４】
発明のエキソヌクレアーゼは、修飾形態で、例えば、エキソヌクレアーゼの単離、可溶化および／または精製または同定のためのプロセスにおいて有用なアミノ酸モチーフとの融合タンパク質として、提供され得る。そのようなアミノ酸モチーフ（タンパク質タグとしても知られている）としては、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグが挙げられるが、それらに限定されない。発明のポリヒスチジンでタグ付けされたエキソヌクレアーゼの例はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１１〜１５で列挙される。そのような酵素は発明のさらなる態様を形成する。
【００４５】
さらなる修飾としては、ポリペプチドの利用可能原子への小さな化学基、例えば、ＮおよびＣ末端またはポリペプチド内の非必須アミノ酸残基のＲ−基に対する保護基、の導入が挙げられる。他の実施形態では、発明のエキソヌクレアーゼは、固体支持体、例えば、粒子、ペレット、ビーズ、シート、ゲル、フィルタ、メンブレン、繊維、キャピラリー、チップ、マイクロタイターストリップ、スライド、チューブ、プレートまたはウェルなどから選択される固体支持体上に固定化されて提供され得る。好ましくは、支持体は磁性（好ましくは常磁性または超常磁性）であり、例えば磁性粒子、例えば磁気ビーズおよびペレットである。さらなる修飾形態としては、発明のエキソヌクレアーゼの二量体または三量体が挙げられる。そのような実体は、それらのモノマー組成において均一または不均一であってもよい。
【００４６】
発明はまた、発明のエキソヌクレアーゼおよびその酵素的断片をコードする核酸分子を提供する。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜５のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６〜１０で開示され、発明の核酸はこれらのヌクレオチド配列を含み得る。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１〜１５のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６〜２０で開示され、発明の核酸はこれらのヌクレオチド配列を含み得る。遺伝コードの縮重は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６〜１０および１６〜２０の各々が、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜５および１１〜１５のアミノ酸配列をコードする多くの可能なヌクレオチド配列の各１つにすぎないことを意味する。したがって、発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６〜１０および１６〜２０の縮重バージョンであるヌクレオチド配列を含む核酸分子まで拡張する。発明の核酸分子は核酸ベクター、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであってもよい。好ましいベクターは、細菌および／または酵母細胞と適合可能なプラスミドである。
【００４７】
発明のエキソヌクレアーゼの酵素活性および不活性化特性により、そのような酵素は、生体高分子（特に、核酸増幅または逆転写反応の生成物、例えば二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖）を含む試料からの一本鎖ＤＮＡの除去にとりわけ適している。
【００４８】
このように、さらなる態様では、一本鎖ＤＮＡを試料、好ましくは生体高分子の試料から除去する方法が提供され、前記方法は、試料を上記で規定されるエキソヌクレアーゼと接触させることを含む。
【００４９】
発明のエキソヌクレアーゼは、このように、試料中に存在する一本鎖ＤＮＡを分解するために使用される。特に、方法は、試料を発明のエキソヌクレアーゼと、試料中に存在する一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させること、その後、任意で試料を加熱して前記エキソヌクレアーゼを不活性化することを含む。消化および不活性化のこれらの工程は、典型的にはインキュベーションであり、本明細書で、特に実施例において記載される。試料中の一本鎖ＤＮＡの消化を達成するための好適なインキュベーション条件は当技術分野で知られており、便利にも、１０〜４５℃（例えば２０〜４０℃もしくは３０℃、または２０〜４０℃付近もしくは３０℃付近）で１〜３０分（例えば１〜２０分、１〜１５分または１〜１０分、好ましくは約５分以下）のインキュベーションを含み得る。これらの範囲の上限の温度が使用される場合、インキュベーションの持続期間は、これらの範囲の下限であってもよく、逆の場合も同じである。不活性化条件は、上記のそのようなパラメータの記載に基づいてもよい。
【００５０】
「一本鎖ＤＮＡを除去する」により、試料中の一本鎖ＤＮＡの量がある程度低減されることが意味される。一本鎖ＤＮＡの量が検出可能なレベル未満まで低減される実施形態、ならびに一本鎖ＤＮＡの量がより少ないが、依然として検出可能な量まで低減される実施形態が包含される。好ましくは一本鎖ＤＮＡの量は、関連する状況、例えば、核酸配列解析反応におけるその使用、により規定される試料の品質を改善するために、十分低減される。数量的に表すと、試料中の一本鎖ＤＮＡの量は、少なくとも１０％、例えば少なくとも、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％または１００％低減され得る。実際的な言い方をするなら、一本鎖ＤＮＡを試料から除去すること、または試料中の一本鎖ＤＮＡの量を低減することは、発明によれば、試料中に存在する一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部を分解することである。「少なくとも一部」という用語は前記に沿って解釈されるべきである。
【００５１】
好ましい実施形態では、試料は、対象となる核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）、例えば二本鎖核酸またはＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖；対象となるタンパク質、例えば、組換えにより生成された対象となるタンパク質、例えば酵素；炭水化物ポリマー；または脂質を含む調製物である。あるいは、対象となるタンパク質は分析物または開始材料から精製するのが望ましい他のタンパク質であってもよい。対象となるタンパク質は抗体または抗体断片であってもよい。タンパク質（例えば抗体）は、診断または治療方法において有用となり得る。よって、上記方法は、診断または治療タンパク質が汚染一本鎖ＤＮＡを含まないことを確保するために使用することができ、よって、投与しても安全となり得る。対象となるタンパク質はＤＮＡ結合タンパク質、または核酸、特に一本鎖ＤＮＡ、と溶液中で結合する他のタンパク質であってもよい。したがって、調製物は細胞溶解物または組織試料または体液に由来してもよく、および／または核酸増幅または逆転写反応の生成物であってもよい。よって、発明の方法は、一本鎖ＤＮＡを除去することにより、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を含む試料を精製または濃縮するための方法を包含すると考えることができる。そのような方法は試料を上記で規定されるエキソヌクレアーゼと接触させることを含むであろう。
【００５２】
好ましい実施形態では、試料は、核酸増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物であり、よって、発明は、核酸増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物から一本鎖ＤＮＡを除去する方法を提供し、前記方法は上記で規定されるエキソヌクレアーゼの使用を含む。方法は、典型的には、核酸増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物を上記で規定されるエキソヌクレアーゼと接触させることを含む。
【００５３】
発明のエキソヌクレアーゼは、このように、核酸増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物中に存在する一本鎖ＤＮＡを分解するために使用される。特に、方法は、核酸増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物を発明のエキソヌクレアーゼと、その中に存在する一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させること、および任意で混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼを不活性化することを含む。消化および不活性化の工程の特徴は上述されている。
【００５４】
「核酸増幅反応」という用語は、核酸の標的配列またはその相補的配列のコピー数を増加させるための任意のインビトロ手段を示す。好ましくは、増幅方法は「熱サイクル」を含み、すなわち高温サイクルを含む。増幅方法としては、ＰＣＲおよびその改変、３ＳＲ、ＳＤＡ、ＬＡＲまたはＬＣＲならびにＬＡＭＰおよびその改変が挙げられるが、それらに限定されない。ＰＣＲおよびＬＣＲならびにそれらの改変は熱サイクル方法である。方法により、標的配列のコピー数の直線的または指数関数的な増加が得られ得る。「改変」は、リアルタイム増幅、定量的および半定量的増幅、競合的増幅、ホットスタートＰＣＲ、などを包含するが、それらに限定されない。逆転写は、必要に応じて他の核酸増幅反応と組み合わせてもよい。
【００５５】
好ましくは、核酸増幅方法は、核酸合成のイニシエーターとしてのオリゴヌクレオチドプライマーの使用に基づく方法、例えば、ＰＣＲ、ＬＡＲ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰおよびＮＡＳＢＡである。
【００５６】
増幅反応のための標的核酸は、選択した増幅方法によってＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。例えば、ＰＣＲでは、標的はＤＮＡであるが、逆転写工程と組み合わせる場合、標的はＲＮＡ配列であると考えることができる。３ＳＲはＲＮＡ標的配列を直接増幅する。
【００５７】
「逆転写」は一本鎖ＲＮＡ鋳型が相補的一本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写されるプロセスである。これらの核酸鎖は、変性条件が適用されるまで、二本鎖として存在する。一本鎖ＤＮＡはまた、その後に、いわゆる第二鎖ｃＤＮＡ合成工程において二本鎖ｃＤＮＡを形成するための鋳型として使用され得る。いくつかの核酸ポリメラーゼ酵素は、第一ｃＤＮＡ鎖を生成し、第二鎖を合成して二本鎖ｃＤＮＡを形成することができ、他のものは２つの工程のうちの１つに対してだけ特異的である。
【００５８】
よって、「核酸増幅反応の生成物」は、問題になっている反応の最終増幅工程から直接得られる成分を全て本質的に含むと考えられる。他の成分を添加してもよく、または一定の成分は、いくらかの修飾または加工処理を受けてもよいが、成分、または少なくとも核酸成分は本質的に全く除去されていない。好ましくは核酸増幅反応の生成物は最終増幅工程の直接生成物であり；しかしながら、核酸増幅反応の生成物は、任意の取り込まれないＮＴＰの脱リン酸を実施する処理、例えば、アルカリホスファターゼ、好ましくは易熱性アルカリホスファターゼ、例えば熱−不安定性エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）による処理を、発明のエキソヌクレアーゼによる処理の前に受けることが好ましい。本明細書でのＮＴＰへの言及は、特定的には、別段の指示がない限り、ｄＮＴＰへの言及を含む。他の実施形態では、ＮＴＰの脱リン酸は、発明のエキソヌクレアーゼによる処理後に、または同時に起きてもよい。有利な組換えＳＡＰはＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ（商標）ＡＳから入手可能である。
【００５９】
したがって、核酸増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物から一本鎖ＤＮＡを除去する、上記で規定される方法は、さらに、エキソヌクレアーゼを使用して一本鎖ＤＮＡを除去する前に、これと同時に、またはその後に、すなわち、増幅または逆転写反応の生成物をエキソヌクレアーゼと接触させる工程の前に、これと同時に、またはその後に、アルカリホスファターゼ、好ましくは易熱性アルカリホスファターゼを使用して任意の取り込まれないＮＴＰを脱リン酸することを含む。特に、これらの方法においてアルカリホスファターゼを使用することは、増幅／逆転写反応の生成物を発明のエキソヌクレアーゼと接触させる前に、これと同時に、またはその後に、アルカリホスファターゼを前記生成物と接触させることを含む。
【００６０】
好ましくは、任意のアルカリホスファターゼ処理は、任意の熱不活性化工程に先行し得る。そうでない実施形態では、さらなる熱不活性化工程が使用され得る。
構造的観点では、発明による核酸増幅反応の生成物は鋳型核酸およびＮＴＰ、典型的には、加えて、ポリメラーゼおよび少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー（部分的に伸長され得る）を含む。また、典型的には生成物の大半は、好適な核酸増幅バッファー、例えば本明細書で例示されるバッファーから構成されるであろう。核酸増幅反応の好ましい生成物はこれらの要素の全てを含む。
【００６１】
これらの実施形態では、発明の処理は、必要に応じて、過剰の伸長されないＤＮＡプライマー、部分的に伸長されたＤＮＡプライマー、一本鎖ＤＮＡ鋳型、一本鎖ＤＮＡアンプリコン、変性されたＤＮＡアンプリコンなどを除去する（すなわち分解する）。
【００６２】
「逆転写反応の生成物」は、逆転写反応が、ただ１つのＲＮＡ依存性核酸重合工程を有し、任意で１つ以上の第二鎖ｃＤＮＡ合成工程（複数可）を有し得るということを考慮しつつ、核酸増幅反応の生成物の定義に従って解釈されるべきである。好ましくは、発明のエキソヌクレアーゼが適用される逆転写反応の生成物は、ｃＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖および／または二本鎖ｃＤＮＡを含む生成物である。
【００６３】
本発明のさらなる態様では、核酸増幅法が提供され、前記方法は、本明細書で規定されるエキソヌクレアーゼを使用して一本鎖ＤＮＡを核酸増幅反応の生成物から除去する工程を最終増幅工程後に含む。典型的には、一本鎖ＤＮＡを除去する工程は、核酸増幅反応の生成物、好ましくは最終増幅工程の直接生成物を本明細書で規定されるエキソヌクレアーゼと接触させることを含む。前記方法は、さらに、エキソヌクレアーゼを使用して一本鎖ＤＮＡを除去する前に、これと同時に、またはその後に、すなわち増幅反応生成物をエキソヌクレアーゼと接触させる工程の前に、これと同時に、またはその後に、アルカリホスファターゼ、好ましくは易熱性アルカリホスファターゼを使用して核酸増幅反応の生成物中の任意の取り込まれないＮＴＰを脱リン酸する工程を最終増幅工程後に含み得る。特に、これらの方法においてアルカリホスファターゼを使用することは、増幅反応の生成物を発明のエキソヌクレアーゼと接触させる前に、これと同時に、またはその後に、アルカリホスファターゼを前記生成物と接触させることを含む。
【００６４】
本発明のさらなる態様では、逆転写の方法が提供され、前記方法は、本明細書で規定されるエキソヌクレアーゼを使用して一本鎖ＤＮＡを逆転写反応の生成物から除去する工程を最終逆転写工程、および／または、存在すれば、最終第二鎖ｃＤＮＡ合成工程、の後に含む。典型的には、一本鎖ＤＮＡを除去する工程は、逆転写反応の生成物を、好ましくは最終逆転写工程の直接生成物を、および／または、存在すれば、最終第二鎖ｃＤＮＡ合成工程の直接生成物を、本明細書で規定されるエキソヌクレアーゼと接触させることを含む。好ましくは、そのような生成物は、ｃＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖および／または二本鎖ｃＤＮＡを含む生成物である。前記方法は、さらに、エキソヌクレアーゼを使用して一本鎖ＤＮＡを除去する前に、これと同時に、またはその後に、すなわち逆転写反応の生成物をエキソヌクレアーゼと接触させる工程の前に、これと同時に、またはその後に、アルカリホスファターゼ、好ましくは易熱性アルカリホスファターゼ、を使用して逆転写反応の生成物中の任意の取り込まれないＮＴＰを脱リン酸する工程を最終逆転写工程、および／または、存在すれば、最終第二鎖ｃＤＮＡ合成工程、の後に含み得る。特に、これらの方法においてアルカリホスファターゼを使用することは、逆転写反応の生成物を発明のエキソヌクレアーゼと接触させる前に、これと同時に、またはその後に、アルカリホスファターゼを前記生成物と接触させることを含む。
【００６５】
発明のエキソヌクレアーゼは、このように、核酸増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物中に存在する一本鎖ＤＮＡを分解するために使用される。特に、方法は、核酸増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物を発明のエキソヌクレアーゼと、その中に存在する一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させること、および任意で混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼを不活性化することを含む。消化および不活性化の工程の特徴は上述されている。好ましくは、任意のアルカリホスファターゼ処理は、熱不活性化工程に先行し得る。そうでない実施形態では、さらなる熱不活性化工程が使用され得る。
【００６６】
逆転写を１つ以上の核酸増幅反応と組み合わせることは普通である。複数の核酸増幅反応を組み合わせて単一の多段階プロトコルとすることも普通である。これらの多段階プロトコルの各部分はそれ自体で発明の核酸増幅法または逆転写の方法と考えることができ、よって、発明のエキソヌクレアーゼは、そのような多段階プロトコルのいずれかまたは全ての部分で発明に従って使用され得ることがすぐに分かるであろう。
【００６７】
本発明のさらなる態様では、核酸配列解析を最適化する方法が提供され、前記方法は、本明細書で規定されるエキソヌクレアーゼを使用して一本鎖ＤＮＡを解析される試料から除去することを含む。方法は典型的には、試料を本明細書で規定されるエキソヌクレアーゼと接触させることを含む。
【００６８】
好ましくは、この態様では、試料は、例えば上記で規定されるような、増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物であるが、他の試料、例えば生物材料から直接調製されるもの、または生物材料、例えば微生物、体液、真核細胞、培養物、腫瘍および組織を含むもの、が使用され得る。好ましくは、試料は、前述の試料の少なくとも部分的に精製された核酸調製物、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ調製物、である。
【００６９】
「最適化」という用語は、核酸（例えば、核酸増幅または逆転写反応の生成物）の配列解析の正確さおよび／または感度の改善を包含する。発明によれば、この改善は、少なくとも部分的には、配列解析反応を妨害および／またはこれと競合する可能性があり標的鋳型に対するそれらの有効性を低減させる一本鎖ＤＮＡ、および／またはそれ自体が配列決定され、そのため、システムにおけるバックグラウンドノイズの原因となり、よって出力シグナルの解析の感度をより低くしてしまう一本鎖ＤＮＡの除去の結果である。
【００７０】
本発明のさらなる態様では、核酸配列解析の方法が提供され、前記方法は、解析工程（複数可）の前に、本明細書で規定されるエキソヌクレアーゼを使用して一本鎖ＤＮＡを解析される試料から除去する試料調製の工程を含む。方法は典型的には試料を本明細書で規定されるエキソヌクレアーゼと接触させることを含む。
【００７１】
試料が増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物であるこれらの後者の態様では、試料はまた、任意の取り込まれないＮＴＰを脱リン酸するためにアルカリホスファターゼ、好ましくは易熱性アルカリホスファターゼ、による処理を受けてもよい。したがって、核酸配列解析の上記で規定される方法は、エキソヌクレアーゼを使用して一本鎖ＤＮＡを除去する前に、これと同時に、またはその後に、すなわち解析される試料をエキソヌクレアーゼと接触させる工程の前に、これと同時に、またはその後に、アルカリホスファターゼを使用して任意の取り込まれたＮＴＰを脱リン酸するさらなる試料調製工程を含み得る。特に、これらの方法においてアルカリホスファターゼを使用することは、前記生成物を発明のエキソヌクレアーゼと接触させる前に、これと同時に、またはその後にアルカリホスファターゼを解析される試料と接触させることを含む。
【００７２】
これらの後者の態様では、発明のエキソヌクレアーゼは、このように、解析される試料、例えば上記の試料中に存在する一本鎖ＤＮＡを分解するために使用される。特に、方法は、試料を発明のエキソヌクレアーゼと、その中に存在する一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させること、および任意で混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼを不活性化することを含む。消化および不活性化の工程の特徴は上述されている。好ましくは、任意のアルカリホスファターゼ処理は、熱不活性化工程に先行し得る。そうでない実施形態では、さらなる熱不活性化工程が使用され得る。
【００７３】
好ましくはこれらの後者の態様では、核酸配列解析はシークエンシング技術、例えばＳａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチドシークエンシング法または「次世代」もしくは「第二世代」シークエンシングアプローチ（例えば、ピロシーケンス、可逆ターミネーターシークエンシング、ライゲーションによる切断プローブシークエンシング、ライゲーションによる非切断プローブシークエンシング、ＤＮＡナノボール、およびリアルタイム単一分子シークエンシングを含むもの）または標的ヌクレオチド配列の存在がプローブとその標的の間の特異的ハイブリダイゼーションイベントを検出することにより確認されるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブに基づくアプローチである。
【００７４】
核酸配列解析は、生物の遺伝子型判定において（例えば、分類、同定、定量化、予後、診断および／または法医学的用途に対して）有用な、または細胞または細胞群のトランスクリプトームのプロファイリングにおいて（例えば予後、診断および／または研究用途に対して）有用な情報を提供することができる。発明は、そのような目的のための、本明細書で記載される方法における本明細書で規定されるエキソヌクレアーゼの使用を包含する。
【００７５】
発明はまた、一本鎖ＤＮＡを試料から除去するための、より特定的には、本明細書で記載される方法における、本明細書で規定されるエキソヌクレアーゼの使用を提供する。
適切な場合には、発明のエキソヌクレアーゼは、自然源から単離され得、例えば、上記の生物の抽出物から単離され、または宿主細胞において組換えにより生成され、それから精製され得る。よって、発明のエキソヌクレアーゼは組換え酵素であってもよく、特に単離された組換え酵素であってもよい。ある一定の実施形態では、エキソヌクレアーゼは、そのエキソヌクレアーゼが天然で見出される生物と同じ生物ではないか、これに由来しない宿主細胞、すなわち異種宿主細胞、において組換え技術により生成される。あるいは、無細胞発現系がエキソヌクレアーゼの生成のために使用され得る。これらのアプローチにより、グリコシル化パターンの変化が得られ得る。
【００７６】
本明細書で記載されるエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片の単離および精製のための方法は、本発明のさらなる態様を表す。よって、この態様では、発明はそのような方法を提供し、前記方法は、エキソヌクレアーゼが発現される細胞を培養すること、および、その後に、エキソヌクレアーゼを前記細胞および／または前記細胞が培養された培地から分離することを含む。好ましくは、方法は、前記エキソヌクレアーゼを好適な異種宿主細胞（例えば大腸菌、バチルスおよびピキア・パストリス）において発現させること、および、その後に、エキソヌクレアーゼを前記宿主細胞および／または前記細胞が培養された培地から分離することを含む。前記エキソヌクレアーゼの発現は、好適な宿主細胞に、前記ヌクレアーゼをコードする発現ベクター、例えばＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜５または１１〜１５のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子（例えばＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６〜１０または１６〜２０のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子）を含む発現ベクター、を組み入れることにより達成することができる。これらの発現ベクターおよび核酸分子を含む宿主細胞は発明に包含される。
【００７７】
エキソヌクレアーゼ酵素は、当技術分野で知られている、および文献において広く記載されているタンパク質のための精製技術のいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを用いて、宿主細胞／培地から分離または単離することができる。そのような技術としては、例えば、沈殿、限外濾過、透析、様々なクロマトグラフィー技術、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離などが挙げられる。上記のように、発明のエキソヌクレアーゼはアミノ酸モチーフまたは他のタンパク質または非タンパク質タグ、例えばポリヒスチジンタグを有するように修飾することができ、単離、可溶化および／または精製または同定が補助される。発明のポリヒスチジンでタグ付けされたエキソヌクレアーゼの例は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１１〜１５に列挙される。
【００７８】
同様に、宿主細胞の抽出物はまた、当技術分野でよく知られている技術、例えばホモジェナイズ、凍結−融解などを用いて調製することができ、この抽出物から、発明のエキソヌクレアーゼが精製され得る。
【００７９】
発明のエキソヌクレアーゼの冷凍保存は、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（２５℃）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％グリセロールの保存バッファーを用いて便利に達成され得るが、他のバッファーも使用され得る。
【００８０】
本発明はまた、少なくとも本発明によるエキソヌクレアーゼまたは本発明によるエキソヌクレアーゼをコードする核酸を含むキットを提供する。キットはまた、核酸増幅および／または逆転写および／または配列解析反応を実施するために必要とされる試薬、バッファー、酵素などのうちのいくつかまたは全てを含み得る。より特定的には、キットは、ヌクレオチド三リン酸（ＳＤＡのためのｄＮＴＰαＳを含む）、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは熱安定性ポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼもしくはＢｓｔポリメラーゼ（およびそのホットスタートバージョン）または、ＬＡＲの場合にはＤＮＡリガーゼ（好ましくは熱安定性ＤＮＡリガーゼ、例えばＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）、または、ＵＳ６２８０９９８号で開示される、パイロコッカス・フリオサスから単離されるもの）、アルカリホスファターゼ、好ましくは易熱性アルカリホスファターゼ（例えばＳＡＰ）、または制限酵素（好ましくは、熱安定性制限酵素、例えばＢｓｏＢ１）を含み得る。発明のエキソヌクレアーゼおよびアルカリホスファターゼ（好ましくは易熱性アルカリホスファターゼ（例えばＳＡＰ））、例えば本明細書で開示されるもののいずれか、を含むキットは注目すべきである。
【００８１】
本発明はまた、発明のエキソヌクレアーゼと核酸増幅および／または逆転写および／または配列解析の反応および方法を実施するための１つ以上の必要な試薬（例えば上記で記載されるそれらの成分）とを含む組成物を提供する。典型的には、そのような組成物は水性であり、標準バッファー、例えばＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、などで緩衝される。本発明はまた、発明のエキソヌクレアーゼをバッファー中に含む組成物を提供する。
【００８２】
下記図面を参照して、本発明を以下で非限定的な例により説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】シュワネラ種エキソヌクレアーゼのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）。
【図２】ハロモナス種エキソヌクレアーゼのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）。
【図３】ビブリオ・ウォダニスエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）。
【図４】サイクロモナス種エキソヌクレアーゼのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）。
【図５】モリテラ・ビスコーサのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）。
【図６−１】ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアライメントツールを用いて作成された、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１〜５の、大腸菌エキソヌクレアーゼＩのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２２）とのアライメントを示す。コンセンサス配列を１番下に示す。＊、全ての配列において同一の残基；配列間で高度に保存された残基；配列間で弱く保存された残基。
【図６−２】ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアライメントツールを用いて作成された、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１〜５の大腸菌エキソヌクレアーゼＩのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２２）とのアライメントを示す。コンセンサス配列を１番下に示す。＊、全ての配列において同一の残基；配列間で高度に保存された残基；配列間で弱く保存された残基。
【図６−３】ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアライメントツールを用いて作成された、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１〜５の大腸菌エキソヌクレアーゼＩのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２２）とのアライメントを示す。コンセンサス配列を１番下に示す。＊、全ての配列において同一の残基；配列間で高度に保存された残基；配列間で弱く保存された残基。
【図７−１】シュワネラエキソヌクレアーゼのＨｉｓタグ付けされたバージョンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６）。
【図７−２】シュワネラエキソヌクレアーゼのＨｉｓタグ付けされたバージョンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６）。
【図８−１】ハロモナスエキソヌクレアーゼのＨｉｓタグ付けされたバージョンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７）。
【図８−２】ハロモナスエキソヌクレアーゼのＨｉｓタグ付けされたバージョンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７）。
【図９−１】ビブリオ・ウォダニスエキソヌクレアーゼのＨｉｓタグ付けされたバージョンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８）。
【図９−２】ビブリオ・ウォダニスエキソヌクレアーゼのＨｉｓタグ付けされたバージョンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８）。
【図１０−１】サイクロモナスエキソヌクレアーゼのＨｉｓタグ付けされたバージョンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）。
【図１０−２】サイクロモナスエキソヌクレアーゼのＨｉｓタグ付けされたバージョンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）。
【図１１−１】モリテラ・ビスコーサエキソヌクレアーゼのＨｉｓタグ付けされたバージョンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）。
【図１１−２】モリテラ・ビスコーサエキソヌクレアーゼのＨｉｓタグ付けされたバージョンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）。
【図１２−１】一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと様々な熱−不安定性（ＨＬ）エキソヌクレアーゼとの間の様々な反応の生成物が分離された、いくつかのポリアクリルアミドゲルの画像を示し、よって、一本鎖ＤＮＡに対する酵素の活性が示される。実施例２で記載されるバッファー条件。（−）Ｃｏｎｔ−陰性対照。図１２ａ：異なる温度（２０〜３７℃）、異なる時間間隔（１〜１０分）でのＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｈａ）活性。インキュベーション時間によって異なる希釈係数（１〜５分に対し４×および１０分に対し１０×）。図１２ｂ：異なる温度（２０〜３７℃）、異なる時間間隔（１〜１０分）でのＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｐｓ）活性。インキュベーション時間によって異なる希釈係数（１分に対して３×、５分に対し８×および１０分に対し１２×）。図１２ｃ：異なる温度（２０〜３７℃）、異なる時間間隔（１〜１０分）でのＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）活性。異なる希釈（１分および５分に対し４×および１０分に対し１０×）。図１２ｄ：異なる温度（２０〜３７℃）、異なる時間間隔（１〜１０分）でのＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｖ）活性。インキュベーション時間によって異なる希釈係数（１分および５分に対し１×ならびに１０分に対し２×）。
【図１２−２】一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと様々な熱−不安定性（ＨＬ）エキソヌクレアーゼとの間の様々な反応の生成物が分離された、いくつかのポリアクリルアミドゲルの画像を示し、よって、一本鎖ＤＮＡに対する酵素の活性が示される。実施例２で記載されるバッファー条件。（−）Ｃｏｎｔ−陰性対照。図１２ａ：異なる温度（２０〜３７℃）、異なる時間間隔（１〜１０分）でのＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｈａ）活性。インキュベーション時間によって異なる希釈係数（１〜５分に対し４×および１０分に対し１０×）。図１２ｂ：異なる温度（２０〜３７℃）、異なる時間間隔（１〜１０分）でのＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｐｓ）活性。インキュベーション時間によって異なる希釈係数（１分に対して３×、５分に対し８×および１０分に対し１２×）。図１２ｃ：異なる温度（２０〜３７℃）、異なる時間間隔（１〜１０分）でのＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）活性。異なる希釈（１分および５分に対し４×および１０分に対し１０×）。図１２ｄ：異なる温度（２０〜３７℃）、異なる時間間隔（１〜１０分）でのＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｖ）活性。インキュベーション時間によって異なる希釈係数（１分および５分に対し１×ならびに１０分に対し２×）。
【図１３】一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと様々な熱処理されたエキソヌクレアーゼとの間の様々な反応の生成物が分離されたポリアクリルアミドゲルの画像を示し、よって、一本鎖ＤＮＡに対する酵素の活性が示される。実施例３で記載されるバッファー条件。（−）Ｃｏｎｔ−陰性対照。４つの市販の大腸菌ＥｘｏＩ酵素（ＥｘｏＩＡ−Ｄ）、１つの市販の酵素ＰＣＲクリーンアップキットおよびＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）を熱不活性化の容易さの観点から比較した。試料を１分間、８０℃でインキュベートし、その後、基質添加および残存活性インキュベーションを実施した。
【図１４ａ】実施例４のシークエンシング反応からの代表的なシークエンシング結果を示す。図１４ａ：ＧｏＴａｑ  ＰＣＲバッファーに基づく反応−ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴは実施例４で記載される３０分プロトコルに対応し、ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）／ＳＡＰは、実施例４で記載される５分プロトコルに対応する。図１４ｂ：それぞれ、図１４ａの通りであるが、ＴＥＭＰａｓｅ  Ｅｘｔｒａ  ＰＣＲバッファーをＧｏＴａｑの代わりに使用した。図１４ｃ：図１４ａの通りであるが、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴおよびＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）／ＳＡＰは、実施例４で記載される５分プロトコルに対応する。
【図１４ｂ】実施例４のシークエンシング反応からの代表的なシークエンシング結果を示す。図１４ａ：ＧｏＴａｑ  ＰＣＲバッファーに基づく反応−ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴは実施例４で記載される３０分プロトコルに対応し、ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）／ＳＡＰは、実施例４で記載される５分プロトコルに対応する。図１４ｂ：それぞれ、図１４ａの通りであるが、ＴＥＭＰａｓｅ  Ｅｘｔｒａ  ＰＣＲバッファーをＧｏＴａｑの代わりに使用した。図１４ｃ：図１４ａの通りであるが、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴおよびＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）／ＳＡＰは、実施例４で記載される５分プロトコルに対応する。
【図１４ｃ】実施例４のシークエンシング反応からの代表的なシークエンシング結果を示す。図１４ａ：ＧｏＴａｑ  ＰＣＲバッファーに基づく反応−ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴは実施例４で記載される３０分プロトコルに対応し、ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）／ＳＡＰは、実施例４で記載される５分プロトコルに対応する。図１４ｂ：それぞれ、図１４ａの通りであるが、ＴＥＭＰａｓｅ  Ｅｘｔｒａ  ＰＣＲバッファーをＧｏＴａｑの代わりに使用した。図１４ｃ：図１４ａの通りであるが、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴおよびＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）／ＳＡＰは、実施例４で記載される５分プロトコルに対応する。
【図１５】一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと発明のＨＬ−ＥｘｏＩとの間の様々な反応の生成物が分離されたいくつかのポリアクリルアミドゲルの画像を示し、よって、一本鎖ＤＮＡに対する熱処理後の酵素の残存活性が示される。実施例５で記載されるバッファー条件。１５ａ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｈａ）；１５ｂ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）；１５ｃ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｐｓ）；１５ｄ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｖ）；１５ｅ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｖｗ）。（−）Ｃｏｎｔ−陰性対照。試料を５分、１０分または１５分間、異なる温度（４０℃−６０℃）でインキュベートし、その後、基質添加および残存活性インキュベーションを実施し、残存活性インキュベーションは３０℃で３０分間、その後２分間９５℃で実施した。
【図１６】一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと発明のＨＬ−ＥｘｏＩの間の様々な反応の生成物が分離されたいくつかのポリアクリルアミドゲルの画像を示し、よって、増加する希釈度での一本鎖ＤＮＡに対する試験ＥｘｏＩの活性が示される。実施例６で記載されるバッファー条件。１６ａ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｈａ）；１６ｂ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）；１６ｃ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｐｓ）；１６ｄ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｖ）；１６ｅ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｖｗ）。（−）Ｃｏｎｔ−陰性対照。１００％−無希釈酵素、１０％−１０倍に希釈された酵素、１％−１００倍に希釈された酵素、０．１％−１０００倍に希釈された酵素、０．０１％−１０，０００倍に希釈された酵素。試料を３０分間３０℃で、その後２分間９５℃でインキュベートした。
【図１７】ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｈａ、Ｐｓ、Ｓｈ、Ｖｗ、Ｍｖ）ならびに大腸菌ＥｘｏＩの３’→５’方向性を示す。アッセイ条件は、実施例１１で記載される。ＦＡＭが５’端に標識された場合、部分的なかすかなおよび強い中間生成物バンドのラダーが見られ、ＥｘｏＩが基質を３’端から分解することが示される。オリゴが３’端でＦＡＭ−標識された場合、フルオロフォアが直ちに切り取られ、３’ＦＡＭモノマーのみが生成された。（−）Ｃｏｎｔ−陰性対照。ＥｘｏＩ−大腸菌ＥｘｏＩ。
【図１８】２．５Åの分解能でのｓｓＤＮＡ（ｄＴ１３）と複合したＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｖ）の結晶構造を示す。実験設定は、実施例１２で記載される。活性部位残基Ａｓｐ２３、Ｇｌｕ２５およびＡｓｐ１９４はスティックとして示される。ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｖ）の３次元構造では、ｄＴ１３の３’−端は酵素の活性部位に明確に位置する。
【図１９】ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｐｓ、Ｓｈ、Ｖｗ、Ｍｖ）および大腸菌ＥｘｏＩの活性および不活性化を比較したポリアクリルアミドゲルを示す。バッファー条件および反応設定は実施例１２で記載される通りである。全ての酵素について、活性を３０℃で１５分間試験し、ならびに残存活性を８０℃で１分間のインキュベーションの後に同じ時間および温度の条件下で試験した。ポストＰＣＲクリーンアップアッセイを模倣するために、反応をポストＰＣＲバッファー中で実施した。
【図２０】ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）および大腸菌ＥｘｏＩの活性および不活性化を比較したポリアクリルアミドゲルを示す。バッファー条件および反応設定は実施例１２で記載される通りである。全ての酵素を８０℃で１、５、１０または２０分間インキュベートし、その後、基質添加および３０℃で１５分間のインキュベーションを実施した。ポストＰＣＲクリーンアップアッセイ模倣するために、反応をポストＰＣＲバッファー中で実施した。８０℃での１分のインキュベーションの後に、ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）では、残存活性は検出されなかったが、実質的な残存活性が２つの市販の大腸菌ＥｘｏＩで５分後に観察され、さらに、ＥｘｏＩＡの場合には８０℃での２０分のインキュベーションの後にも観察された。
【図２１−１】実施例１４のシークエンシング反応からの代表的なシークエンシング結果を示す（Ａ：陰性対照；Ｂ：ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ；Ｃ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）／ＳＡＰ；Ｄ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｐｓ）／ＳＡＰ；Ｅ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｗ）／ＳＡＰ；Ｆ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｖｗ）／ＳＡＰ。全ての画像は、ＰＣＲクリーンアップ前の過剰のリバースプライマーの添加後に得られたクロマトグラムを示す。全てのシークエンシング結果はＧｏＴａｑ  ＰＣＲバッファーに基づいた。ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴは、３０分プロトコルに対応し、一方、ＨＬ−ＥｘｏＩ／ＳＡＰは、５分プロトコルに対応し、どちらも実施例１４で記載される。
【図２１−２】実施例１４のシークエンシング反応からの代表的なシークエンシング結果を示す（Ａ：陰性対照；Ｂ：ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ；Ｃ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）／ＳＡＰ；Ｄ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｐｓ）／ＳＡＰ；Ｅ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｗ）／ＳＡＰ；Ｆ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｖｗ）／ＳＡＰ。全ての画像は、ＰＣＲクリーンアップ前の過剰のリバースプライマーの添加後に得られたクロマトグラムを示す。全てのシークエンシング結果はＧｏＴａｑ  ＰＣＲバッファーに基づいた。ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴは、３０分プロトコルに対応し、一方、ＨＬ−ＥｘｏＩ／ＳＡＰは、５分プロトコルに対応し、どちらも実施例１４で記載される。
【図２１−３】実施例１４のシークエンシング反応からの代表的なシークエンシング結果を示す（Ａ：陰性対照；Ｂ：ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ；Ｃ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）／ＳＡＰ；Ｄ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｐｓ）／ＳＡＰ；Ｅ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｗ）／ＳＡＰ；Ｆ：ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｖｗ）／ＳＡＰ。全ての画像は、ＰＣＲクリーンアップ前の過剰のリバースプライマーの添加後に得られたクロマトグラムを示す。全てのシークエンシング結果はＧｏＴａｑ  ＰＣＲバッファーに基づいた。ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴは、３０分プロトコルに対応し、一方、ＨＬ−ＥｘｏＩ／ＳＡＰは、５分プロトコルに対応し、どちらも実施例１４で記載される。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００８４】
実施例１−エキソヌクレアーゼのクローニング、組換え発現および部分精製
モリテラ・ビスコーサ（ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｖ））、ビブリオ・ウォダニス（ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｖｗ））、ハロモナス（ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｈａ））、サイクロモナス（ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｐｓ））およびシュワネラ（ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ））ｇＤＮＡ由来のｓｂｃＢエキソデオキシリボヌクレアーゼＩ（ｅｘｏＩ）遺伝子を、大腸菌ＴＯＰ１０における発現用のｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター中にクローン化遺伝子を挿入することによりＣ末端Ｈｉｓ−タグを用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲクローニング（Ｂｒｙｋｓｉｎ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，  ２０１０，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ４８  （６），  ４６３−４６５）によりクローン化した。使用したプライマーを表１に列挙する。遺伝子源材料を、ノルウェー沖合の海水から単離した細菌から入手した。
【００８５】
【表１】
0006316505.tif 000002
【００８６】
ｐＴｒｃ９９Ａ−ｅｘｏＩベクターを、Ｚ−コンピテント細胞のためのプロトコルに従い、大腸菌ＴＯＰ１０にトランスフォームさせた（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）。細胞をバッフル付振盪フラスコ中で、テリフィックブロス（ＴＢ）培地において増殖させ；およそ１．５％の一晩前培養物を、１０００ｍｌ増殖フラスコ中の１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２５０ｍｌのＴＢ培地に移し、３７℃、２００ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．４〜０．６に到達するまでインキュベートした。温度を１５℃まで低下させ、細胞を３０分間インキュベートし、その後、それらを４時間、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。細胞を遠心分離により収集し、細胞ペレットを、−２０℃で凍結させた。
【００８７】
２５０ｍｌ培養物からの細胞ペレットを氷上で解凍し、４０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、５ｍＭイミダゾール、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、１０％グリセロール、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を添加し、混合物を氷水浴中で１０分間（２５％振幅、０．１秒オン、０．２秒オフ）、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒを使用して超音波処理した。ライセートを５０ｍｌ管中で２５，０００ｇにて２０分間遠心分離し、上清を、０．４５μＭフィルタに通して濾過した。濾過したライセートを、５０ｍｌの溶解バッファーで希釈し９０ｍｌの総体積にした。全ての精製工程は、氷冷バッファーおよび氷上で冷却したカラムを用いて実施した。９０ｍｌのライセートを、１ｍｌ／分の流速を使用して溶解バッファー中で平衡化させたＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  １ｍｌカラムに適用した。カラムを、５カラム体積（ＣＶ）の溶解バッファーおよび１０ＣＶのバッファーＡ２（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（２５℃でｐＨ７．５）、５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄した。タンパク質をその後、２０ＣＶの（バッファーＡ２に対して）０〜３０％勾配のバッファーＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（２５℃でｐＨ７．５）、５００ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて１ｍｌ画分で溶出した。ＥｘｏＩ活性を含む画分をプールし、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、または１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡのどちらかかに対して透析し、その後１００％グリセロールで１：１希釈し、−２０℃で保存した。
【００８８】
さらに２つのエキソヌクレアーゼＩ配列（開示されず）を試験したが、活性を有するように発現させ、単離することはできなかった。
実施例２−エキソヌクレアーゼの活性プロファイリング：触媒活性のための最適温度
実施例１からの異なる組換えＨＬ−ＥｘｏＩをよりよく特徴付けるために温度プロファイルを作成した。異なるＨＬ−ＥｘｏＩをゲル上での基質分解間の区別を可能にする濃度まで希釈した。異なる希釈係数のために、試料を直接互いに比較することはできなかったが、活性における相対的な温度依存性の差は推定することができた。試料を様々な時間間隔の間インキュベートし、酵素が設定温度をより長い時間維持することができるかどうか決定した。
【００８９】
詳細な方法
ＨＬ−ＥｘｏＩを、試料間で最もよい区別を与えると考えられるものまで希釈した（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）。ＰＣＲクリーンアッププロトコルを模倣するために、ポストＰＣＲ溶液を反応バッファーとして使用した。ロバスト性は、実験を並行で、２つの異なるＰＣＲバッファー（ＧｏＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＴＥＭＰａｓｅ  Ｋｅｙ（ＶＷＲ））に基づくポストＰＣＲ溶液を用いて実行することにより達成した。基質として、５ｐｍｏｌの５’ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド（ＧＣＴＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２１）を各反応に添加した。ＥｘｏＩの添加の後、各試料の総体積は７μｌであった。試料を熱サイクラー中で１分、５分または１０分間、２０℃、２５℃、３０℃または３７℃でインキュベートし、続いて５分８０℃でインキュベートした。ＴＢＥ−Ｕｒｅａサンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加し、試料をキャスト２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルに適用し、１８０Ｖでおよそ４５分間実行した。全ての試薬は特に指定がない限り全プロトコルの間、氷上で維持され、ワークフローは冷却ブロック上で実施された。
【００９０】
結果
結果を図１２に示す。一般に、全てのＨＬ−ＥｘｏＩはポストＰＣＲ試料を調製するために使用された２つのバッファー中で同様に作用し、観察された効果はＰＣＲバッファーの組成に特異的ではなかったことが示される。
【００９１】
ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｈａ）は３７℃まで全般的に活性の増加を示し、この温度に少なくとも１０分間耐えることができた（図１２ａ）。より低い温度での良好な全体活性も見られた。
【００９２】
ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｐｓ）は、３０℃で全般的に最良の活性を示し、３７℃をインキュベーション温度として使用すると活性が減少した（図１２ｂ）。より低い温度での良好な全体活性も見られた。
【００９３】
ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）は、３７℃で全般的に最良の活性を示し、少なくとも１０分間この温度に耐えることができた（図１２ｃ）。全ての温度での良好な全体活性も見られた。
【００９４】
ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｖ）は、３０℃で全般的に最良の活性を示したが、３７℃でのインキュベーションでは活性の減少が生じた（図１２ｄ）。より低い温度での良好な活性も見られた。
【００９５】
活性プロファイリングのためにＰＡＧＥを使用することは、ＨＬ  ＥｘｏＩが温度によって経時的にどのように挙動するかについて、良好な推定を提供すると考えられた。
実施例３−エキソヌクレアーゼの活性プロファイリング：触媒活性に対する不活性化温度
この実施例では、ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）の熱不活性化特性を様々な市販の大腸菌ＥｘｏＩと比較した。
【００９６】
４つの異なる市販の大腸菌ＥｘｏＩおよび１つの市販の酵素ＰＣＲクリーンアップキットの熱不活性化特性をＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）と比較した。観察された効果がいずれも、反応バッファーの選択に関係ないことを確認するために、２つの異なるポストＰＣＲ溶液を反応バッファーとして使用した（ＴＥＭＰａｓｅ  Ｋｅｙ、ＴＥＭＰａｓｅ  Ｅｘｔｒａ、ＶＷＲ）。全ての反応は、ＥｘｏＩ活性と熱不活性化の容易さの間の比較を可能にするために、約１０ＵのＥｘｏＩが添加された。ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）のエキソヌクレアーゼ活性を実施例８で記載されるように計算した。市販のＥｘｏＩでは、エキソヌクレアーゼ活性は、製造者により述べられたものと解釈された。各反応に対する最終体積は７μｌとした。試料を８０℃で１分間インキュベートし、その後、冷却し、５ｐｍｏｌの５’ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド（ＧＣＴＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２１）を添加した。試料をさらに、３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＴＢＥ−Ｕｒｅａサンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加し、試料を、キャスト２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルに適用し、１８０Ｖで約４５分間実行した。全ての試薬を全プロトコルの間、氷上で維持し、ワークフローは、特に指定がない限り、冷却ブロック上で実施した。
【００９７】
結果を図１３に示す。大腸菌ＥｘｏＩは全て、８０℃での１分のインキュベーションの後に十分な活性を有し、全ての基質を完全に分解した。ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）は、完全に不活性化された唯一のＥｘｏＩであり、残存活性の徴候を示さなかった。
【００９８】
実施例４−核酸シークエンシング前の迅速ＰＣＲクリーンアップにおけるＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）の有用性の証明
ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）は迅速ＰＣＲクリーンアップシナリオにおいて満足のいくように作用することができることを確認するために、実験を設定した。比較および陽性対照のために、並行試料を、一流ブランドの酵素ＰＣＲクリーンアップ試薬ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で処理した。
【００９９】
ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）は５分の酵素ＰＣＲクリーンアッププロトコルを可能にしたことを確認するために、実験を、プロトコル限界をストレス試験にかけるように設計した。このように、試験下の全てのポストＰＣＲ溶液に、ＰＣＲ後に過剰のプライマーまたはｄＮＴＰを添加した。シークエンシング反応前に除去されていないままである場合、残存プライマーは反対方向の配列反応となり、よって、反応の長さおよび品質を著しく損ない、ｄＮＴＰは高品質配列を得ることができないｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰ比となってしまう。ロバスト性は、異なるＰＣＲ試薬およびアンプリコンを使用することにより達成した。
【０１００】
ＰＣＲ後、１０ｐｍｏｌプライマーまたは４０ｎｍｏｌ  ｄＮＴＰをポストＰＣＲ溶液に添加した。
ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴで処理される試料は、製造者プロトコルに従い取り扱った。リバースプライマーまたはｄＮＴＰのいずれかをＰＣＲ溶液に添加した後、試料に２μｌのクリーンアップ試薬を添加し、最終体積を７μｌとした。試料を１５分、３７℃で、続いて１５分、８０℃でインキュベートした。試料を、２つの異なるＰＣＲバッファーを用いて設定し、全ての試料を３連で設定した。
【０１０１】
ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）で処理される試料は、上記と同じ量の添加プライマーおよびｄＮＴＰが添加され、その後、１μｌのＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）（１０Ｕ／μｌ、実施例８で計算される通り）および１μｌのＳＡＰ（２Ｕ／μｌ）が添加された。陽性対照のように、試料の最終体積を７μｌとした。試料を４分、３７℃で、続いて１分、８０℃でインキュベートした。試料を、２つの異なるＰＣＲバッファーを用いて設定し、全ての試料を３連で設定した。
【０１０２】
ＨＬ−ＥｘｏＩと同一なプロトコルが与えられるとどのようにＥｘｏＳＡＰ−ＩＴが作用するか評価するために、試料にリバースプライマーを添加し、その後に２μｌのＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ  ＰＣＲクリーンアップ試薬を添加した。試料を２連で設定した。
【０１０３】
陰性対照として、試料にはリバースプライマーまたはｄＮＴＰが添加されたが、酵素クリーンアップ溶液の代わりに、試料には２μｌの水が添加された。試料を２連で設定した。
【０１０４】
【表２】
0006316505.tif 000003
【０１０５】
【表３】
0006316505.tif 000004
【０１０６】
ＰＣＲクリーンアップ処理後、試料を直ちに氷上で冷却した。調製したシークエンシング反応マスターミックスを別々の管にアリコートした。合計２．５μｌの各処理／未処理溶液を、その後のシークエンシング反応において鋳型として使用されるように各管に添加した。試料を直ちに熱サイクラーに移し、シークエンシングプログラムを開始した。
【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
【表５】
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【０１０９】
配列をトロムソ大学のＤＮＡシークエンシングコア施設に、精製およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザを使用するシークエンシングのために配達した。結果を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ１．０（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）を用いて解析した。
【０１１０】
選択した結果を図１４に示す。ｄＮＴＰが添加された配列から、全体的に良好な配列長さおよび品質が得られ、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴまたはＨＬ−ＥｘｏＩ／ＳＡＰで処理された試料間の差は検出できなかった（結果は示さず）。図１４ａの配列プロットは、リバースプライマーがＧｏＴａｑ  ＰＣＲバッファー中で添加された配列からの結果の例である。陰性対照から、機能的ＰＣＲクリーンアップの欠如は配列の長さおよび品質を著しく損なったことが明らかであった。ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（３０分プロトコル）またはＨＬ−ＥｘｏＩ／ＳＡＰ（５分プロトコル）のいずれかで処理した試料は非常に良好な配列品質を示した。これらの画像は全ての複製物の代表であった。
【０１１１】
図１４ｂの配列プロットは、リバースプライマーがＴＥＭＰａｓｅ  Ｅｘｔｒａ  ＰＣＲバッファー中で添加された配列からの結果の例である。添加されたリバースプライマーを有する試料は、ＰＣＲクリーンアップ溶液のいずれかによる処理で、非常に良好な配列長さおよび品質を示した。ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ−処理試料（３０分プロトコル）またはＨＬ−ＥｘｏＩ／ＳＡＰ−処理試料（５分プロトコル）間で有意の差はなかった。ＰＣＲクリーンアップ処理の欠如により、より品質の低いより短い配列が得られた。これらの画像は全ての複製物の代表であった。
【０１１２】
他方、図１４ｃは、ＨＬ−ＥｘｏＩ／ＳＡＰ−プロトコルと同じ５分プロトコルを実施しなければならない場合、どのようにＥｘｏＳＡＰ−ＩＴクリーンアップ溶液が作用したかを示す。図から明らかなように、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴによる処理では、高品質の配列は得られなかった。これは、おそらく、添加したプライマーの不十分な分解ならびにシークエンシングプライマーを分解する残存ＥｘｏＩ活性の組み合わせのためである。室温で反応設定を使用することは、シークエンシングプライマーを分解する残存ＥｘｏＩ活性によるこれらの結果をさらに損なうであろう可能性がある。ＨＬ−ＥｘｏＩ／ＳＡＰで処理した試料は、全体的に優れた配列長さおよび品質を示した。
【０１１３】
実施例５−発明のある一定の熱−不安定性エキソヌクレアーゼに対する最小不活性化時間および温度を決定するための不活性化実験
最小不活性化温度および時間を、試験下の各ＨＬ−ＥｘｏＩについて、所与のアッセイ条件下で決定した。これは、ＨＬ−ＥｘｏＩを異なる温度で異なる時間間隔の間インキュベートすることにより達成した。熱処理後、５’標識一本鎖ＤＮＡを添加し、基質分解の程度を視覚化した（図１５）。基質分解の量を、図１６の結果と比較し、熱処理後の残存活性を推定した。
【０１１４】
無希釈ＨＬ−ＥｘｏＩを反応バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に添加し、最終体積を９μｌとした。試料を５分、１０分または１５分間４０℃、４５℃、５０℃または５５℃で、あるいは５分または１０分間６０℃でインキュベートした。試料の冷却後、５ｐｍｏｌの５’ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド（ＧＣＴＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２１）を添加した。試料をさらに、３０℃で３０分間、その後２分間、９５℃でインキュベートした。ＴＢＥ−Ｕｒｅａサンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加し、試料を、プレキャスト２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルに適用し、１８０Ｖでおよそ４５分間実行した。全ての試薬を全プロトコルの間、氷上で維持し、特に指定がない限り、ワークフローを冷却ブロック上で実施した。ＰＡＧＥの結果を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＰｈａｒｏｓＦＸシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて画像化した。
【０１１５】
結果を図１５に示し、これにより、様々な程度の基質分解が熱−インキュベーションの温度および時間間隔に応じて観察されることが示される。全体的に、ＨＬ−ＥｘｏＩのいずれも、５５℃で１０分以上の間のインキュベーション後に、基質分解の徴候を示さなかった。５５℃で５分間または５０℃で１０分間のＨＬ−ＥｘｏＩの全てのインキュベーションは本質的に全く、またはせいぜい１〜１０％の基質分解しか示さなかった。
【０１１６】
実施例６−エキソヌクレアーゼの希釈系列について基質分解の程度を測定することによる、不活性化実験についての感度閾値の決定
上記の実施例の様々なＨＬ−ＥｘｏＩについての最小不活性化温度を決定するために、実施例５の不活性化アッセイについての感度閾値を決定した。半定量的アッセイを、エキソヌクレアーゼの段階希釈を用い、各希釈についての基質分解の程度を推定して準備した。比較測定のために、不活性アッセイに使用されたのと同じアッセイ条件および反応設定をここでも適用した。
【０１１７】
試験用の各ＨＬ−ＥｘｏＩを１、１０、１００、２００、１０００および１０，０００倍希釈し、これは１００％、１０％、１％、０．５％、０．１％および０．０１％活性に相当した。反応バッファーとして使用されるのと同じバッファーを、希釈バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）としても使用した。反応バッファーおよび５ｐｍｏｌのＦＡＭ−標識基質（ＧＣＴＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２１）を、ＨＬ−ＥｘｏＩ添加前に予混合した。反応の総体積は１０μｌとした。試料を３０分間３０℃で、続いて２分、９５℃でインキュベートした。ＴＢＥ−Ｕｒｅａサンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加し、試料を、プレキャスト２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルに適用し、１８０Ｖで約４５分間実行した。全ての試薬を全プロトコルの間、氷上で維持し、特に指定がない限り、ワークフローを冷却ブロック上で実施した。ＰＡＧＥの結果を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＰｈａｒｏｓＦＸシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して画像化した。
【０１１８】
結果を図１６に示し、エキソヌクレアーゼの活性は所与のアッセイ条件においておよそ１％活性まで検出できたことが示される。
実施例７−二本鎖および一本鎖エキソヌクレアーゼ活性を決定するためのアッセイ
試験エキソヌクレアーゼ酵素をおよそ２０ヌクレオチドの短い５’−ＦＡＭ−ＤＮＡ−ＴＡＭＲＡ−３’標識一本鎖または二本鎖基質と共にインキュベートすることによりエキソヌクレアーゼ活性を測定する。エキソヌクレアーゼが基質を分解することができる場合、これは直ちに開始し、フルオロフォアが放出されるであろう。活性は、経時的に追跡することができ、というのも、放出されたフルオロフォアは光励起すると光を再放射することができるからである。
【０１１９】
特定的には、アッセイ混合物は１μｌの１０μＭ  ｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡ、１０μｌの５×ＴＤＢ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０％グリセロール）および２９μｌのＭｉｌｉＱ  Ｈ２Ｏから構成される。４０μｌのアッセイ混合物を、黒色平底９６−ウェルプレートのウェルに移し、５μｌのＭｉｌｉＱ  Ｈ２Ｏまたは希釈バッファー（陰性対照として）および酵素試料をウェルに添加する。マルチチャンネルピペットを使用して５μｌの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加することにより反応を開始させ、反応の最終体積を５０μｌにする。蛍光をただちに測定し（励起４８５ｎｍおよび発光５２０ｎｍ）、その後適切な時間間隔で、振盪工程を含み、反応を１５分間進行させる。蛍光の増加は、基質の分解が起きていることを示す。
【０１２０】
実施例８−一本鎖エキソヌクレアーゼ活性を定量するためのアッセイ
一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を、変性させた３Ｈ−ｄＡＴＰ組み込みＰＣＲ生成物と酵素をインキュベートすることにより測定した。エキソヌクレアーゼが基質を分解することができる場合、エキソヌクレアーゼは酸可溶性ヌクレオチドを放出し、これは、シンチレーションカウンターで検出することができる。過剰の高分子量基質ＤＮＡは、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させる。このアッセイでは、１単位（１Ｕ）は、３０℃にて３０分で、２０μｌの最終体積において１０ｎｍｏｌの酸可溶性ヌクレオチドの放出を触媒する酵素の量として規定される。
【０１２１】
特定的には、アッセイ混合物は、４μｌの５×エキソヌクレアーゼバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ）、５μｌの変性させた基質（３分間１００℃でのインキュベーション、および３分間の氷水浴への直ちの移動により変性させる）および６μｌのＭｉｌｉＱ  Ｈ２Ｏから構成された。１５μｌを氷上の１．５ｍｌ微量遠心管に移した。試験用の酵素を必要とあれば希釈し、５μｌの、酵素試料、対照およびブランクの各々をアッセイ混合物に添加し、上下にピペッティングすることにより混合した。試料を３０℃の水浴中で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、反応物を氷上に置き、２０μｌの氷冷子ウシ胸腺ＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）および２５０μｌの氷冷１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡを直ちに添加した。試料をその後、氷上で１５分間インキュベートし、４℃で１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清（２００μｌ）を、２４−ウェルプレートに移し、０．８ｍｌのＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ  ＸＲシンチレーション流体をその後添加した。ウェルをシーリングテープで密閉し、試料を振盪により完全に混合した。試料をＭｉｃｒｏＢｅｔａ２プレートカウンターで５分間カウントした。
【０１２２】
実施例９−二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を定量するためのアッセイ
二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を、ＰＣＲ基質が酵素とのインキュベーション前に変性されないことを除き、実施例８と同じように測定する。
【０１２３】
実施例１０−発明の熱に不安定なエキソヌクレアーゼの二本鎖および一本鎖エキソヌクレアーゼ活性の比較
一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を、変性させた３Ｈ−ｄＡＴＰ組み込みＰＣＲ生成物と試験酵素をインキュベートすることにより測定した。二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を、変性されていない３Ｈ−ｄＡＴＰ組み込みＰＣＲ生成物と酵素をインキュベートしたことを除き、同様に測定した。エキソヌクレアーゼが基質を分解することができる場合、エキソヌクレアーゼはシンチレーションカウンターで検出することができる酸可溶性ヌクレオチドを放出する。過剰の高分子量基質ＤＮＡは、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させる。このアッセイでは、１単位（１Ｕ）は、３０℃にて３０分で、２０μｌの最終体積において１０ｎｍｏｌの酸可溶性ヌクレオチドの放出を触媒する酵素の量として規定される。特定的には、アッセイ混合物は、４μｌの５×バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、２５０ｍＭ  ＫＣｌおよび２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、５μｌの基質（ｓｓＤＮＡを得るために、ｄｓＤＮＡ基質を３分間１００℃でのインキュベーションにより変性させ、直ちに、３分間の氷水浴に移した）および３μｌのＭｉｌｉＱ  Ｈ２Ｏから構成された。アッセイ混合物（１２μｌ）を氷上の１．５ｍｌ微量遠心管に移した。試験用の酵素を希釈し、８μｌの酵素試料をアッセイ混合物に添加し、上下にピペッティングすることにより混合した。対照およびブランクもまた、構成に含めた。試料を３０℃の水浴で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、反応物を氷上に置き、２０μｌの氷冷子ウシ胸腺ＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）および２５０μｌの氷冷１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡを直ちに添加した。試料をその後、氷上で１５分間インキュベートし、４℃で１０分間１３，０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清（２００μｌ）を２４−ウェルプレートに移し、０．８ｍｌのＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ  ＸＲシンチレーション流体を添加した。ウェルをシーリングテープで密閉し、試料を振盪により完全に混合した。試料をＭｉｃｒｏＢｅｔａ２プレートカウンターにおいて５分間カウントした。
【０１２４】
結果を、表４においてまとめて示す。発明のＨＬ−ＥｘｏＩは、一本鎖ＤＮＡに対する活性に比べ、二本鎖ＤＮＡに対してほとんど活性を示さないことが示される。しかしながら、二本鎖ＤＮＡに対する低い量の活性が酵素それ自体の特性に関連するのか単に酵素の汚染により引き起こされるのかを結論づけるのは困難である。試験した２つの市販のＥｘｏＩ（ＥｘｏＩ  ＡおよびＥｘｏＩ  Ｂ）もまた、二本鎖ＤＮＡに対して非常に低い活性を示した。
【０１２５】
【表６】
0006316505.tif 000007
【０１２６】
実施例１１−エキソヌクレアーゼの活性プロファイリング：尿素ポリアクリルアミドゲルを用いた方向性決定
発明のＨＬ−ＥｘｏＩが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示し、実質的な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないことを確認するためにこの実験を実施した。基質特異性を５’ＦＡＭまたは３’ＦＡＭ−標識オリゴヌクレオチド（ＧＣＴＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２１）のいずれかを使用してポリアクリルアミドゲル上で分析した。
【０１２７】
試験用の各ＨＬ−ＥｘｏＩを、約０．１Ｕ／μｌの最終濃度まで希釈した。２つのマスターミックスを調製した。１つは５’ＦＡＭ−標識オリゴ用、１つは３’ＦＡＭ−標識オリゴ用とした。マスターミックスは反応バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）および個々のＦＡＭ−標識基質を含み、最終量を０．２５ｐｍｏｌ基質／反応とした。酵素溶液の代わりに希釈バッファーを含む陰性対照、および大腸菌由来のＥｘｏ  Ｉを使用する陽性対照のどちらも含めた。酵素を、予め冷却した反応管中にピペッティングし、その後、反応バッファーおよび基質を有するマスターミックスを添加した。全ての反応物は１０μｌの最終体積から構成され、これを３０℃で１時間インキュベートした。反応を、２．５μｌの試料ローディングバッファー（９５％ホルムアミド、１０ｍＭＥＤＴＡ、キシレン）を添加することにより停止させ、９５℃で５分間インキュベートした。解析のために、６μｌの試料を１２％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上にロードした。ゲルを、５０Ｗで１時間４５分の間実行した。反応の設定の間、全ての試薬および試料を氷上で維持した。
【０１２８】
結果を図１７に示す。５’ＦＡＭ−標識基質と３’ＦＡＭ−標識基質間の明確な差が観察され、異なるＨＬ−ＥｘｏＩの、ならびに大腸菌ＥｘｏＩ対照の、３’→５’方向性が示される。ＦＡＭが５’端で標識された場合、部分的なかすかなおよび強い中間生成物バンドのラダーが見られ、ＥｘｏＩが基質を３’端から分解することが示された。オリゴが３’端でＦＡＭ−標識された場合、フルオロフォアは直ちに切断され、３’ＦＡＭモノマーのみが生成した。
【０１２９】
実施例１２−エキソヌクレアーゼの活性プロファイリング：結晶化構造での方向性
さらに、３’−５’方向性を有する発明のＨＬ−ＥｘｏＩＩ酵素の方向性を裏付けるために、ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｖ）をｓｓＤＮＡと共に結晶化し、複合体の構造を決定した。
【０１３０】
タンパク質結晶化を５．４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を用いて実施した。脱塩された１３ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ｄＴ１３）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、タンパク質に１．２モル過剰で添加した。エキソヌクレアーゼＩによるｓｓＤＮＡの分解を阻害するために、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した。ドロップを、９６ウェルフォーマットでＭＲＣ２ウェル結晶化プレート（Ｓｗｉｓｓｃｉ、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）においてＰｈｅｎｉｘ（ＡｒｔＲｏｂｂｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、シッティングドロップ蒸気拡散技術を使用して、自動的に構築した。ドロップサイズは０．４μｌ（０．２μｌ＋０．２μｌ）とし、リザーバ溶液の体積は６０μｌとした。結晶化プレートを４℃でインキュベートした。
【０１３１】
ｄＴ１３／ＥＤＴＡと共結晶化させた結晶は、２０．０２％ＰＥＧ  ＭＭＥ５０００、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．５および０．０９Ｍ酢酸カルシウムと共に成長した。Ｘ線回折実験を、グルノーブル（フランス）におけるＥＳＲＦで実施した。結晶を２．５Å分解能まで回折させた。構造決定を、探索モデルとしての大腸菌ＥｘｏＩとの分子置換（ＰＤＢ：１ＦＸＸ）により実施した。
【０１３２】
精製の初期段階で、ｓｓＤＮＡについての電子密度は視認可能になり、全てのヌクレオチドをはめ込むことができた。ｓｓＤＮＡは大腸菌Ｅｘｏ  Ｉで見られるのと同様に、活性部位において３’端と結合し（Ｋｏｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０１３，４１（１１）：５８８７−９７）、ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｍｖ）３’−５’方向性の構造的証拠が提供される。
【０１３３】
実施例１３−エキソヌクレアーゼの活性プロファイリング：８０℃での発明のある一定のＨＬ−ＥｘｏＩの迅速不活性化
発明のある一定のＨＬ−ＥｘｏＩが迅速ＰＣＲクリーンアップシナリオにおいて満足のいくように作用することができることを確認するためにこの実験を実施した。この実験では、８０℃での試験用のＨＬ−ＥｘｏＩの熱不活性化特性を２つの市販の大腸菌ＥｘｏＩ（ＥｘｏＩ  ＡおよびＥｘｏＩ  Ｂ）と比較した。
【０１３４】
１×アッセイ混合物が６７ｍＭグリシン−ＫＯＨ、ｐＨ９．５、６３．５ｍＭ  ＮａＣｌ、９．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ（３Ｈ  ｄＡ−標識ＤＮＡを含む）から構成されたことを除き、実施例８で記載されるように、ｓｓＤＮＡに対する発明のＨＬ−ＥｘｏＩの活性を計算した。市販の大腸菌ＥｘｏＩでは、活性は、製造者により述べられたものと解釈された。ＰＣＲクリーンアップセッティングにおける構成を模倣するために、ポストＰＣＲバッファーを反応バッファーとして使用した。反応バッファーの組成は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５（２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＤｙＮＡｚｙｍｅＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、以前はＦｉｎｎｚｙｍｅｓ（商標））および残存ｄＮＴＰ（ＰＣＲ−反応を実行する前は、それぞれ開始時２００μＭ）、残存プライマー（ＰＣＲ−反応を実行する前は、開始時２００ｎＭの各プライマー）および鋳型であった。
【０１３５】
各反応物は１０Ｕ  ＥｘｏＩが添加され、最終反応体積を７μｌとした。実験は全ＥｘｏＩに対する活性対照、ならびに熱インキュベーション後の残存活性に対するチェックの両方を含んだ。活性対照では、反応バッファー、ＥｘｏＩおよび５ｐｍｏｌの基質（ＧＣＴＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２１）を混合し、１５分間３０℃で、続いて９５℃で２０分間インキュベートした。８０℃での不活性化に関して解析される試料では、８０℃での１分のインキュベーションおよびその後の冷却に続いて基質を添加した。これらの試料をその後、１５分間３０℃で、続いて９５℃で２０分間インキュベートした。全てのインキュベーション工程後、ＴＢＥ−Ｕｒｅａサンプルバッファーを添加し、試料を、プレキャスト２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルに適用し、１８０Ｖでおよそ４５分間実行した。
【０１３６】
結果を図１９に示す。このアッセイでは、全てのＥｘｏ  Ｉは十分な活性を有した。ＨＬ−ＥｘｏＩのみが、８０℃での１分のインキュベーション後に不活性化されたが、２つの市販の大腸菌Ｅｘｏ  Ｉは、１００％の基質を分解する十分な残存活性を示した。市販のＥｘｏＩではなく、ＨＬ−ＥｘｏＩは、迅速５分ＰＣＲクリーンアッププロトコルと適合した。
【０１３７】
さらに、ＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）の不活性化の容易さを、２つの市販の大腸菌ＥｘｏＩと比較するために、１０Ｕの各ＥｘｏＩを１、５、１０または２０分間８０℃でインキュベートし、その後、冷却し、５ｐｍｏｌの５’ＦＡＭ標識基質（ＧＣＴＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２１）を添加した。試料をさらに、１５分間３０℃で、続いて２０分間９５℃でインキュベートした。反応設定はその他の点では、上記実験に同一であり、同じポストＰＣＲバッファーを反応バッファーとして使用した。活性対照を３つのＥｘｏＩのために含め、これらの試料は３０℃で１５分間のインキュベーションの前に、熱インキュベーションに供さなかった。上記のように、残存活性を尿素−ＰＡＧＥゲル上で視覚化した。
【０１３８】
結果を図２０に示す。実質的な残存活性が両方の市販のＥｘｏＩで、ほぼ全ての持続時間について８０℃での熱処理後に観察された。比較して、残存活性は、８０℃でたった１分間処理したＨＬ−ＥｘｏＩ（Ｓｈ）で処理した試料では検出できなかった。
【０１３９】
実施例１４−核酸シークエンシング前の、迅速ワンチューブＰＣＲクリーンアップにおけるＨＬ−ＥｘｏＩの有用性の証明
ＰＣＲクリーンアップ状況での発明のある一定のＨＬ−ＥｘｏＩの機能性を示すために、この実施例を実施した。実験設定は、実験４に非常に類似した。実施例４のように、試験用のポストＰＣＲ溶液に、ＰＣＲ後に過剰のプライマー（１０ｐｍｏｌ）を添加した。しかしながら、実施例４とは異なり、たった１つのＰＣＲバッファー（ＧｏＴａｑ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、ＨＬ−ＥｘｏＩで処理した試料に対するインキュベーション温度を３７℃から３０℃まで低減させ、通常の３０分プロトコルのみをＥｘｏＳＡＰ−ＩＴについて試験した。
【０１４０】
実験を開始する前に、各ＨＬ−ＥｘｏＩの活性を、１×アッセイ混合物が６７ｍＭグリシン−ＫＯＨ、ｐＨ９．５、６３．５ｍＭ  ＮａＣｌ、９．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ（３ＨｄＡ−標識ＤＮＡを含む）で構成されたことを除き、実施例８で記載されるように計算した。ＨＬ−ＥｘｏＩで処理した試料には、上記の量のプライマーが添加され、その後、２μｌの予混合したＨＬ−ＥｘｏＩ（１０〜２０Ｕ／μｌ）およびＳＡＰ（１．５Ｕ／μｌ）を添加した。各クリーンアップ反応物の総体積は７μｌとした。試料を４分、３０℃で、続いて１分８０℃でインキュベートした。試料を３連で設定した。
【０１４１】
比較および陽性対照のために、試料を一流ブランドの酵素ＰＣＲクリーンアップ；ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標））で処理した。ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴで処理した試料を製造者プロトコルに従い、取り扱った。プライマーのＰＣＲ溶液への添加の後、試料には２μｌのＰＣＲクリーンアップ試薬が添加され、最終体積を７μｌとした。ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ−処理試料を、１５分、３７℃で、続いて１５分、８０℃でインキュベートした。試料を３連で設定した。
【０１４２】
陰性対照を設定し、これらには処理試料と同じ量のプライマーが添加された。酵素クリーンアップ溶液の代わりに、これらの試料には２μｌの水が添加された。試料を３連で設定した。
【０１４３】
より詳細については実施例４を参照すべきである。
配列は、精製およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３５００ｘｌジェネティックアナライザを使用したシークエンシングのために、トロムソ大学のＤＮＡシークエンシングコア施設に配達した。結果を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２．０（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）を用いて解析した。
【０１４４】
選択した結果を図２１に示す。ここで、配列プロットは、ＧｏＴａｑ  ＰＣＲバッファーにおいてリバースプライマーが添加された配列からの結果の代表例である。陰性対照から、機能的ＰＣＲクリーンアップの欠如が配列の長さおよび品質を著しく損なうことが明らかになった。ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（３０分プロトコル）またはＨＬ−ＥｘｏＩ／ＳＡＰ（５分プロトコル）のいずれかで処理した試料は非常に良好な配列品質を示した。
【図１】
0006316505.tif 000008
【図２】
0006316505.tif 000009
【図３】
0006316505.tif 000010
【図４】
0006316505.tif 000011
【図５】
0006316505.tif 000012
【図６−１】
0006316505.tif 000013
【図６−２】
0006316505.tif 000014
【図６−３】
0006316505.tif 000015
【図７−１】
0006316505.tif 000016
【図７−２】
0006316505.tif 000017
【図８−１】
0006316505.tif 000018
【図８−２】
0006316505.tif 000019
【図９−１】
0006316505.tif 000020
【図９−２】
0006316505.tif 000021
【図１０−１】
0006316505.tif 000022
【図１０−２】
0006316505.tif 000023
【図１１−１】
0006316505.tif 000024
【図１１−２】
0006316505.tif 000025
【図１２−１】
0006316505.tif 000026
【図１２−２】
0006316505.tif 000027
【図１３】
0006316505.tif 000028
【図１４ａ】
0006316505.tif 000029
【図１４ｂ】
0006316505.tif 000030
【図１４ｃ】
0006316505.tif 000031
【図１５】
0006316505.tif 000032
【図１６】
0006316505.tif 000033
【図１７】
0006316505.tif 000034
【図１８】
0006316505.tif 000035
【図１９】
0006316505.tif 000036
【図２０】
0006316505.tif 000037
【図２１−１】
0006316505.tif 000038
【図２１−２】
0006316505.tif 000039
【図２１−３】
0006316505.tif 000040
【配列表】
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