(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
様々な角度（αｉ）、ｉ＝１、．．．、Ｎ、からのサンプル（２）の画像スタックの顕微鏡による取得を準備および実施する方法であって、ここでＮが自然数であり、
−  該サンプル（２）が、サンプル・ホルダ（３）内に保持されるとともに、該サンプル・ホルダ（３）が検出座標系（ＸＤ、ＹＤ、ＺＤ）によって囲まれた空間内で並進させることができ、かつサンプル座標系（ＸＰ、ＹＰ、ＺＰ）の軸（ＹＰ）に対して平行な少なくとも１つの回転軸（Ｒ）の周りを回転させることができるように該サンプル・ホルダ（３）内にはサンプル座標系（ＸＰ、ＹＰ、ＺＰ）が画定され、顕微鏡の検出方向（Ｄ）が、該検出座標系（ＸＤ、ＹＤ、ＺＤ）の軸（ＺＤ）に対して平行に位置し、該２つの座標系の互いに対する位置が既知であり、
−  少なくとも２つの角度（α１、α２）に対して、いずれの場合も、照明光のサンプル（２）への照射により生成された投影画像が最初に該検出座標系内で取得されると同時に、
−  第１の角度（α１）が設定され、
ａ）検査すべきサンプル領域が選択され、画像視野の寸法は、該検査すべきサンプル領域が、該検出方向（Ｄ）に沿った投影に関して、少なくとも部分的に該画像視野の領域内に配置されるように選択され、
ｂ）少なくとも部分的に該画像視野と重複する該第１の角度（α１）における第１の当該領域（ＲＯＩ１）が画定され、
ｃ）該検出方向（Ｄ）に直交する平面内で、該画像視野中心の位置が該検出座標系内で決定され、
ｄ）該第１の当該領域（ＲＯＩ１）の形状に応じて、該画像視野内、したがって該検出座標系内で該第１の当該領域（ＲＯＩ１）の位置および寸法を明確に画定するのに十分な１組の座標が、該検出座標系内で決定され、
ｅ）該投影画像の該画像視野中心の該位置、該１組の座標、および該第１の当該領域（ＲＯＩ１）に直交する検出方向（Ｄ）の座標から第１のサンプル体積（Ｖ１）が該サンプル座標系内で決定され、
−  第２の角度（α２）が設定され、該サンプルが、該２つの角度間の差（α２−α１）だけ該回転軸（Ｒ）の周りを回転させられ、任意選択で、該検出座標系内で値（ΔｘＲ、ΔｚＲ、）だけ並進させられ、その結果、該検出方向（Ｄ）に沿った投影に関して、該検査すべきサンプル領域が、少なくとも部分的に該画像視野の該領域内に配置され、
−  工程ａ）〜ｄ）が該第２の角度（α２）およびで実施され、該第２の角度（α２）における第２の当該領域（ＲＯＩ２）が画定され、該画像視野中心の該位置および該検出座標系内のさらなる１組の座標が決定され、
−  該投影画像の該画像視野中心の該位置、該１組の座標、および該第２の当該領域（ＲＯＩ２）に直交する検出方向（Ｄ）の座標から第２のサンプル体積（Ｖ２）が、該サンプル座標系内で決定され、
−  該２つのサンプル体積（Ｖ１）および（Ｖ２）が重複する部分体積が、該サンプル座標系内で決定され、
−  該角度（αｉ）に対して、該部分体積を参照して、該画像スタックの取得に必要なパラメータが、該サンプル座標系内で決定され、該サンプル（２）が、この決定に対応して該検出座標系内で位置決めされ、該画像スタックの取得が実施される、方法。
【請求項２】
前記当該領域（ＲＯＩ１）、（ＲＯＩ２）が、方形に形成され、座標（ｘ１ｂ、ｙ１ｂ）、（ｘ２ｂ、ｙ２ｂ）が、いずれの場合も、前記検出座標系内に該方形の中心点を指定し、いずれの場合も、該方形の寸法が、座標（ｘ１ｃ、ｙ１ｃ）、（ｘ２ｃ、ｙ２ｃ）内に記憶されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２つの角度間の差（α２−α１）が９０°であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
様々な角度（αｉ）、ｉ＝１、．．．、Ｎ、からのサンプル（２）の画像スタックの顕微鏡による取得を準備および実施する方法であって、ここでＮが自然数であり、
−  該サンプル（２）が、サンプル・ホルダ（３）内に保持されるとともに、該サンプル・ホルダ（３）が検出座標系（ＸＤ、ＹＤ、ＺＤ）によって囲まれた空間内で並進させることができ、かつサンプル座標系（ＸＰ、ＹＰ、ＺＰ）の軸（ＹＰ）に対して平行な少なくとも１つの回転軸（Ｒ）の周りを回転させることができるように該サンプル・ホルダ（３）内にはサンプル座標系（ＸＰ、ＹＰ、ＺＰ）が画定され、顕微鏡の検出方向（Ｄ）が、該検出座標系（ＸＤ、ＹＤ、ＺＤ）の軸（ＺＤ）に対して平行に位置し、該２つの座標系の互いに対する位置が既知であり、
−  少なくとも１つの角度（α１）に対して、照明光のサンプル（２）への照射により生成された投影画像が最初に該検出座標系内で取得されると同時に、
−  第１の角度（α１）が設定され、
ａ）検査すべきサンプル領域が選択され、画像視野の寸法は、該検査すべきサンプル領域が、該検出方向（Ｄ）に沿った投影に関して、少なくとも部分的に該画像視野の領域内に配置されるように選択され、
ｂ）少なくとも部分的に該画像視野と重複する該第１の角度（α１）における第１の当該領域（ＲＯＩ１）が画定され、
ｃ）該画像視野中心の位置が、該検出方向（Ｄ）に直交する平面内で、該検出座標系内で決定され、
ｄ）該第１の当該領域（ＲＯＩ１）の形状に応じて、該画像視野内、したがって該検出座標系内で該第１の当該領域（ＲＯＩ１）の位置および寸法を明確に画定するのに十分な１組の座標が、該検出座標系内で決定され、
ｅ）この角度（α１）で、第１の画像スタック取得の該検出方向（Ｄ）に関する初期および最終パラメータが決定され、
ｆ）該投影画像の該画像視野中心の該位置、該１組の座標、ならびに該第１の画像スタック取得の該検出方向（Ｄ）に関する該初期および最終パラメータから、サンプル体積（ＶＰ）が該サンプル座標系内で決定され、
−  さらなる角度（αｉ）に対して、該サンプル体積ＶＰを参照して、さらなる画像スタックの該取得に必要なパラメータが、該サンプル座標系内で決定され、該サンプル（２）が、その決定に対応して該検出座標系内で位置決めされ、該画像スタックの取得が実施される、方法。
【請求項５】
前記当該領域（ＲＯＩ１）が、方形に形成され、座標（ｘ１ｂ、ｙ１ｂ）が、前記検出座標系内に該方形の中心点を指定し、該方形の寸法が、座標（ｘ１ｃ、ｙ１ｃ）内に記憶されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記画像視野内の前記平面が、焦点面に対応することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出座標系内の画像視野中心の位置に対する前記回転軸（Ｒ）の位置が、前記取得に先行する較正工程で決定されることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
画像スタックの前記取得が、顕微鏡サンプル分析の枠組み内で行われ、該顕微鏡サンプル分析中、前記サンプル（２）に光シートで照明が当てられ、前記光シートの面が、前記検出方向（Ｄ）に実質上直交することを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
部分体積の決定が、自動化された形で行われることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な配向角度αｉ、ｉ＝１、．．．、Ｎ、からのサンプルの画像スタックの顕微鏡による取得を準備および実施する方法に関し、ここでＮは自然数であり、すなわち、いわゆる「多視点」画像の取得に関する。そのような方法では、サンプルは、サンプル・ホルダ内に保持される。サンプル・ホルダ自体は、サンプル座標系ＸＰ、ＹＰ、ＺＰを画定する。サンプル・ホルダは、検出座標系ＸＤ、ＹＤ、ＺＤによって囲まれた空間内で並進させることができ、少なくとも１つの回転軸Ｒの周りを回転させることができる。さらに、たとえば顕微鏡撮像方法で使用される検出用対物レンズの光軸に対応する検出方向Ｄが事前に定義される。一般性を失うことなく、少なくとも１つの回転軸Ｒは、サンプル座標系の軸ＹＰに対して平行に位置するものであり、検出方向Ｄは、検出座標系の軸ＺＤに対して平行に位置するものである。さらに、軸ＹＰおよびＹＤも同様に、平行に位置するものである。これらの詳述は、記述性および考察性を改善する働きをするだけであり、決して強制的なものではない。原則的に、回転軸Ｒはまた、検出座標系または同じくサンプル座標系に関して、任意の他の方向を指すことができ、いくつかの回転軸を提供することもできる。しかし、これらのより一般的な場合、装置にかかる費用はより高くなる。２つの座標系の互いに対する位置は知られており、たとえば較正測定を用いることで、またはデバイス・パラメータを参照することによって、事前に決定することができる。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡下でのサンプルの分析中は、光学コントラスト方法を使用して、たとえば蛍光方法を使用して、異なる方向から、すなわち異なる配向角度で、サンプルを観察することを目的とすることが多い。これは、たとえば、励起光および／または検出光が異なる配向に対して異なる形で生じるとき、すなわち具体的には異なる強度を有するとき、有利となり得る。これはたとえば、サンプル内の散乱工程によって引き起こされる可能性がある。加えて、サンプルの空間的な印象を受け取るために、光学断面方法によってサンプルの取得を分析することが一般的になってきた。このため、検出方向Ｄ、軸ＺＤに沿って隔置された様々な平行な平面の画像スタックが、各配向角度に対して取得される。次いで、この画像スタックから、空間的な印象を伝えるサンプルの画像を生成することができる。サンプルは、モータ式の位置決めユニットによって、検出方向Ｄに直交するように、方向ＸＤおよびＹＤに動かすことができる。サンプルの異なる配向を生じさせるために、サンプルは、上記のように、少なくとも１つの回転軸Ｒの周りを回転可能に支持される。
【０００３】
これらのいわゆる多視点取得はまた、ＳＰＩＭ方法（選択的／単一面照明顕微鏡検査）を使用してより大きなサンプルを検査する際にも特に重要である。この方法では、サンプルには、静的または動的に生成することができる光シートによって、たとえば点走査によって、検出方向Ｄに直交して、したがってここではＸＤ−ＹＤ平面内で照明が当てられる。この観察は、広い視野で実施することができ、その結果、より大きなサンプル領域を捕獲することができるが、サンプルが大きな体積の中で退色することはない。とりわけこの理由のため、そのようなＳＰＩＭ方法の意味は、サンプルの蛍光顕微鏡検査分析にとってさらに重要になってきた。これはたとえば、非特許文献１の記事から知ることができる。この方法の主な特徴は、たとえば特許文献１にも記載されている。
【０００４】
共焦点レーザ走査顕微鏡検査と同様に、ＳＰＩＭ方法では、広視野の観察方法として、空間的に拡大させた対象を光学断面の形で取得することが可能であり、その利点は、とりわけ、速度、サンプルが退色するレベルが低いこと、ならびに浸入深さが広くなることからなる。反射光または透過光方法を使用する顕微鏡検査における従来の蛍光コントラスト方法（たとえば、ここでは落射蛍光、共焦点レーザ走査顕微鏡検査、および多光子顕微鏡検査を挙げることができる）とは異なり、サンプル内の蛍光体は、１つまたはいくつかの光シートの形でレーザ光を使用して励起される。光シートは、上述のように、走査機構によって生成することができるが、静的に、たとえば円柱レンズを用いて生成することもできる。原則として、サンプルは、すべての空間方向に動かすことができるサンプル・ホルダによって位置決めユニット上で保持され、加えてサンプル・ホルダはまた、回転軸を有する。サンプルはまた、ゲルの中に支持することもでき、その結果、位置決め可能なサンプル・ホルダに対して動かすことができなくなる。
【０００５】
多視点取得の場合、サンプルは回転させられ、いくつかの方向からいくつかの配向角度で画像が取得される。大部分の適用分野は発生生物学の分野で見られるため、これらの取得は、数時間から最大で数日までの期間にわたって分散させることができるいくつかの時点で行われる。場合によっては、第１の時点はとりわけ特に重要であり、いかなる重要な発生段階も見逃さないように、顕微鏡内のサンプル準備期間を可能な限り短く保つために努力がなされる。この理由のため、このタイプの取得の自動化は重要であり、特にこれらの取得の準備に関する。
【０００６】
現況技術では、一般に、多視点取得を準備および実施するために、以下の工程が実施される。
１．第１の配向角度が設定される。
【０００７】
２．当該サンプルまたはサンプル領域が画像視野領域内へ動き、さらにサンプルの少なくとも一部が鮮鋭な鮮明度で撮像されるように、すなわち焦点面がサンプル内に位置するように、サンプル・ホルダおよびサンプルを有する位置決めユニットが設定される。
【０００８】
３．ＺＤ方向の画像スタックの取得の範囲を画定するために、第１のｚ位置が求められて記憶され、当該サンプル領域が検出用対物レンズの焦点面のすぐ前または後ろに配置される。
【０００９】
４．当該サンプル領域が検出用対物レンズの焦点面のすぐ後ろまたは前に配置されるように位置決めユニットが設定されたとき、第２のｚ位置が記憶される。
５．両方のｚ位置が、初期または最終パラメータとして、ＸＤ−ＹＤ平面内のサンプルの配向角度および位置とともに記憶され、その結果、画像スタックを画定するためのパラメータが既知となる。
【００１０】
６．次いで、次の配向角度が設定され、工程２〜５が繰り返される。
７．工程２〜６は、所望の数の配向角度に到達するまで繰り返される。
最後に、各配向角度に対して検出方向Ｄに沿って画像スタックを取得するための座標を画定する１組のパラメータが得られる。
【００１１】
この方法に伴う問題は、特に、特に画像視野の寸法が小さい場合、またはサンプルとサンプルが回転する回転軸との間の距離が大きい場合に、新しい配向角度を設定した後で当該サンプル領域を見出すことである。正確には後者の場合、当該サンプル領域はまた、場合によっては、角運動が非常に小さい場合でも画像視野の領域から出る。なぜなら、サンプルの位置が、回転のため、集束された画像視野中心に対して軸ＸＤおよびＺＤの方向に、すなわち検出座標系に関連して変化するからである。サンプルを焦点の中心および画像視野の中心へ戻すには、サンプル・ホルダの位置、すなわち原則としてサンプル・ホルダが取り付けられた位置決めユニットのモータ位置を、量Δｘ、Δｚだけ変化させなければならない。その理由は、サンプルが原則として回転軸Ｒ上に正確に位置していないからである。それによって、多視点取得を準備および実施するのがさらに困難になる。
【００１２】
代替手段は、サンプルを最初により小さい倍率で観察し、別の配向角度で新しい画像スタックの取得を準備することであり、その結果、回転中、サンプルは回転軸に直交する平面内でそれほど急には画像視野から出なくなる。これは、たとえば、回転する対物レンズ・ホルダ上で対物レンズを変更することによって、または対物レンズとは独立して照明ビーム経路内に組み込まれたズーム・システムによって、実行することができる。しかし、これは、追加の作業工程を実施しなければならないことを意味する。さらに、スタック取得のためには、各配向角度の設定およびＺＤ軸上の境界値の画定などの残りの作業工程も実施しなければならない。
【００１３】
回転中のサンプル・テーブルまたはサンプル・ホルダの自動化された追跡は、特定の簡易化を提供するが、これは、回転軸Ｒの位置、すなわち検出座標系の位置に関連するサンプル座標系の位置が既知であるときにのみ可能である。次いで、サンプルは画像視野内に残したまま、サンプル・ホルダ全体と、それとともにサンプル座標系とを、検出座標系内で移動させることができ、したがってサンプル・ホルダが並進的に追跡される。これらのいわゆるモータ座標内（すなわち、検出座標系内でもある）の回転軸の位置が既知である場合、簡単な変換行列、最も好ましい場合は純回転行列を用いて、各角運動に対して追跡を決定し、それに対応して設定することができる。しかし、この場合でも、ＺＤ方向に画像スタックを制限してそれぞれ個別の角度を設定するための最適のパラメータに対する手動の検索は不可欠である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００４／０５３５５８号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ピーター  エー  サンティ（Ｐｅｔｅｒ  Ａ．  Ｓａｎｔｉ）、“Ｌｉｇｈｔ  Ｓｈｅｅｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”、ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｚｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．５９、ｐｐ．１２９〜１３８、２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、本発明の目的は、多視点取得の準備および実施をより容易にすることであり、可能な限り幅広い自動化が有利であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この目的は、最初に記載したタイプの方法において、最初にいずれの場合も少なくとも２つの配向角度α１、α２に対して検出座標系内で１つの投影画像を取得し、すべての配向角度に対するこれらの取得を参照して、画像スタックの取得に必要なパラメータを決定することによって実現される。
【００１８】
投影画像の取得における工程は次のとおりである。最初に、第１の配向角度α１が設定される。次いで、工程ａ）で、取得に使用すべき顕微鏡内で、検査すべきサンプル領域がサンプルから選択される。画像視野の寸法は、検査すべきサンプル領域が、検出方向Ｄに沿った投影において、少なくとも部分的に画像視野の領域内に配置されるように選択されなければならず、したがって検査すべきサンプル領域はまた、画像視野の領域内に完全に配置することもできる。照明は、最も簡単な場合、サンプルの輪郭が画像視野内で単に概略的に再現される場合は十分であるため、顕微鏡の検出用対物レンズに対向するように配置された光源によって実施することができる。透過光画像では、これは原則として、サンプルが焦点面の領域内で単におおまかに配置され、十分な倍率が選択されている（対物レンズまたはズーム・システムによって）場合に当てはまり、その場合、サンプルは、少なくとも部分的に画像視野内に位置する。検出用対物レンズの焦点面は、必ずしもサンプル内に位置する必要はない。しかし、観察者による捕獲をより簡単にするという意味では、一方では画像視野の縁部によって、他方では検出軸または軸ＺＤによって囲まれた体積内に、検査すべきサンプル領域が完全に配置されている場合が有利である。対応するズーム・レンズ・システムを用いると、これを大きな費用をかけずに設定することができる。他方では、たとえば手動設定が実施される場合、検査すべきサンプル領域を画像視野より大きくすることもできる。
【００１９】
次に、工程ｂ）で、この第１の配向角度α１で、少なくとも部分的に画像視野と重複する第１の当該領域ＲＯＩ１が画定される。この領域は、投影に関してサンプル体積が画像視野によって完全に捕獲される場合、好ましくは画像視野の一部分である。自動化された決定中、原則としてこれが当てはまるが、強制的な必要条件ではない。したがって、たとえば、選択は、使用者が実施することもでき、使用者は、当該領域を画定するための対応するパラメータ、たとえば中心点および寸法を特定の画像部分に入力する。この入力はまた、検査すべき領域の一部のみが画像視野内に見えている場合でも実施することができ、そのとき当該領域はまた、実際に選択された可視の画像視野を越えて突出することができる。対応するズーム設定では、この当該領域ＲＯＩ１はまた、画像視野全体に対応することができるが、画像視野の一部分のみが当該領域ＲＯＩ１として選択されることが多い。なぜなら、ほとんどの場合、サンプルの概略画像が表されており、可能な限り最良のズーム倍率を見つけるのは時間がかかりすぎるはずであるからである。最も簡単な場合、当該領域ＲＯＩ１は、箱形または円形に形成されるが、三角形、正方形、六角形の領域などの他の形状を、当該領域として形成することも可能である。原則的に、あらゆる形状を考えることができる。しかし、すなわち検出座標系内で座標を指定することによって、または簡単な生成規則によって、当該領域を幾何学的な対象として表し、数学的に記述することができることが重要である。それにもかかわらず、原則的には、たとえばレーザ走査顕微鏡が使用されるとき、当該領域または検査すべきサンプル領域を走査曲線によって画定することも考えることができ、ここでは軌道が範囲を反映する。画面上でマウスを用いた手書きによる手動選択も同様に考えることができ、そのとき領域は、画素の数量を介して画定される。しかし、当該領域がより簡単に形成される場合、それに関連する変換計算は、それにもかかわらず、より簡単かつ迅速に処理されるべきである。第１の当該領域ＲＯＩ１の選択は、操作者が手動で実施することができるが、自動化された方法では、たとえばカメラで記録された画像強度の評価によって実施することもできる。ここでサンプルは、強度を低減させることによって透過光の中で見えるようになるはずであるが、他方では、暗視野コントラストの取得の場合、強度は、周囲より明るくするべきである。自動化された構造認識方法を使用することもできる。したがって、たとえば、区分化アルゴリズムによって、比較的複雑な形状の第１の当該領域ＲＯＩ１を得ることができる。
【００２０】
第１の当該領域ＲＯＩ１が画定されたとき、次の工程で、検出方向Ｄに直交する平面内で、画像視野中心の位置が検出座標系内で決定される。この位置は、たとえば座標（ｘ１ａ、ｙ１ａ）を有することができる。この座標は、検出座標内で、すなわちたとえば検出用対物レンズの光軸およびそれに直交する平面に関連して、サンプル・テーブルまたはサンプル・ホルダの現在の位置を記述しており、テーブルまたはホルダのモータ座標に対応することができる。たとえば軸ＹＤに対して平行な軸の周りのサンプル・ホルダの回転が可能である場合、Ｘ方向に対する検出座標系の原点は、回転軸Ｒまたは軸ＹＰが正確にＸＤ軸上のｘ＝０に位置するように選択することができる。
【００２１】
次いで、次の工程ｄ）で、第１の当該領域ＲＯＩ１の形状に応じて、１組の座標が検出座標系内で決定される。この１組の座標は、少なくとも、画像視野内、したがって検出座標系内で、第１の当該領域ＲＯＩ１の位置および寸法を明確に画定するのに十分な数の値を含む。方形の領域の場合、これらの座標は、たとえば、画像視野内で方形の角を画定する座標とすることができる。ここで、明確な決定には、検出座標系のＸＹ平面内の３対の座標が必要とされるはずであり、第４の座標は、他の座標から導出することができる。別法として、これらの座標は、ベクトル表記で同等に指定することもでき、第３の座標がベクトルの始点を指定する。さらに代替の形態では、同様に同等と見なされるように、これらの座標は、それぞれの場合において、検出座標系内の方形の中心点を示し、他の座標では、方形の寸法、すなわち幅および高さに対応する値が記憶される。唯一重要なことは、方形の位置および寸法を検出座標系内で明確に記述することができることである。円形の当該領域の場合、円の中心点座標および半径を指定すれば、この領域の位置および寸法を明確に画定するのに十分である。他の幾何学的な構造の場合、それに対応して他の組の座標を決定することができる。
【００２２】
最後に、工程ｅ）で、投影画像の画像視野中心の位置および第１の当該領域ＲＯＩ１を記述する１組の座標から、第１のサンプル体積Ｖ１がサンプル座標系内で決定される。この第１のサンプル体積Ｖ１は、検出座標系内で、ＸＹ平面内の第１の当該領域ＲＯＩ１の寸法によって、またそれに直交して検出方向によって決定され、したがって原則的に、検出方向に沿って無限であるが、いずれにせよ、検出方向Ｄに直交する平面内より大幅に遠くまで延びる。また、検出座標系に対するサンプル座標系の位置を考慮する対応する変換行列を介して、サンプル体積Ｖ１の位置および寸法も、サンプル座標系内で同様に示すことができる。当然ながら、これには、検出座標系に対するサンプル座標系の位置が既知であることが必要条件であり、これは、対応する較正によって実現することができる。サンプル座標系は、サンプル・ホルダに結合され、すなわちサンプル・ホルダは、検出座標系内で回転または並進し、したがってサンプル座標系内のサンプルの座標は変化しない。
【００２３】
第１のサンプル体積Ｖ１が決定されたとき、第２の配向角度α２が設定される。サンプルは、２つの配向角度間の差α２−α１だけ回転軸Ｒの周りを回転させられ、サンプル（基準である）が画像視野内に位置しなくなった場合、任意選択で、検出座標系内で値（ΔｘＲ、ΔｚＲ）だけ並進させられ、その結果、検出方向に沿った投影の場合、検査すべきサンプル領域は、再び完全に画像視野の領域内に配置される。
【００２４】
次いで、サンプル体積を決定するのに必要な前の工程が、この配向角度で繰り返され、すなわち第２の当該領域ＲＯＩ２が画定され、画像視野中心の位置と、第２の当該領域ＲＯＩ２の位置および寸法を明確に画定する１組の座標とが、検出座標系内で決定され、次いで、そこから、第２のサンプル体積Ｖ２がサンプル座標系内で決定される。
【００２５】
したがって、サンプル座標系内の第１のサンプル体積Ｖ１と第２のサンプル体積Ｖ２の両方の位置が既知となる。回転軸Ｒがサンプル座標系内で軸ＹＰに対して平行に位置しており、サンプル座標系内の回転軸Ｒの位置が既知であるため、この回転軸Ｒに対する２つの体積Ｖ１およびＶ２の位置も既知となる。また、どちらの体積Ｖ１およびＶ２も、検査すべきサンプル領域の一部を含み、したがって互いに重複する。
【００２６】
どちらのサンプル体積も、原則的に一方向に無限に延びる。しかし、これらのサンプル体積はどちらも、検査すべきサンプル領域を含み、検査すべきサンプル領域は、いずれの場合もＲＯ１，２によって密閉されているため、これらのサンプル体積は、同じく検査すべき当該サンプル領域を含む領域内で重複する。次に、２つのサンプル体積が重複するこの部分体積が、サンプル座標系内で決定される。したがって、回転軸Ｒに対するこの部分体積の位置も既知となる。２つの配向角度間の差がちょうど９０°である場合、部分体積を最良に密閉することができ、または部分体積が最も小さくなるため、特に有利である。
【００２７】
次いで、この部分体積を参照して、画像スタックの取得に必要なパラメータが、配向角度α１、α２を含むすべての配向角度に対してサンプル座標系内で決定され、すなわち検出方向に沿ったスタック取得のための初期位置および最終位置が決定される。これは、検出座標系に移され、サンプルはその決定に対応して検出座標系内で位置決めされ、画像スタックの取得が、検出方向、したがってＺＤ方向に実施される。
【００２８】
サンプル座標系内の部分体積の位置および寸法が既知であるため、これらのパラメータは、大きな費用をかけずに計算することができ、変換規則を用いて検出座標系内の値に移すことができる。後者はとりわけ、ＺＤ方向における画像スタックの取得に必要である。
【００２９】
鮮鋭な鮮明度で画像を得るには、画像視野中心または焦点内でどの位置に回転軸が配置されているかが既知であることがさらに必要であり、これはたとえば、デバイス・パラメータに基づいて事前に定義され、または別個の較正工程で決定することができる。画像スタック取得を積み重ねるために、または特にこの取得のためのパラメータの事前に必要な定義のために、操作者が各配向角度を設定したり、スタック取得の初期値および最終値を起動させたりする必要はなくなり、むしろ、これらのパラメータは、評価ユニットを用いて自動的に決定される。
【００３０】
この方法の修正形態では、第２の配向角度で第２の当該領域ＲＯＩ２を選択するのではなく、対応する体積は、第１の当該領域ＲＯＩ１に加えて、同じく第１の配向角度α１で第１の画像スタック取得の初期および最終パラメータを決定することによって、１つの配向角度のみを参照して決定される。第１の当該領域ＲＯＩ１はまた、ここでも方形に形成することができる。上述のように、これは、ＺＤ方向の範囲、すなわちその間に第１の当該領域ＲＯＩ１が配置される２つのｚ位置を画定することである。第１の画像スタック取得のこの初期および最終位置は、現況技術で知られているように、手動で画定することができる。別法として、たとえば個々の画像の鮮鋭度の評価を用いて、自動化された決定も可能である。次いで、これらの２つのパラメータならびに第１の当該領域ＲＯＩ１から、サンプル体積ＶＰが決定される。第１の当該領域ＲＯＩ１と初期および最終パラメータ間の距離とはどちらも有限であるため、サンプル体積ＶＰもまた有限であり、したがってこの場合、部分体積の決定を省くことができる。さらなる配向角度に対して、変換規則を用いてサンプル体積ＶＰを参照して、さらなる画像スタックの取得に必要なパラメータが、サンプル座標系内で決定される。次いで、この修正された方法では、サンプルはまた、その決定に対応して検出座標系内で位置決めされる。最後に、画像スタックの取得が実施される。
【００３１】
どちらの変形形態でも、サンプルはまた、いくつかの軸の周りで回転可能に支持することができ、それに対応して変換行列でこれを考慮に入れることができる。加えて、画像視野内の平面、すなわち画像視野平面が、焦点面にすでに対応する場合、焦点面に対する回転軸の位置も直接決定することができるため、有利となり得る。画像捕獲が自動化された形で行われる場合、操作者が所望の配向角度および増分値を開始時に示した場合には、部分体積の決定は、可能な限り自動化された形で、すなわち使用者による介入なしで行うことができる。自動化された方法で増分値および配向角度を画定することも考えることができ、これは、増分値の場合、スタック取得のための初期平面および最終平面が異なる配向角度で異なる距離を有する場合、理にかなっていることが多い。加えて、２つの配向角度α１およびα２は、必ずしも、画像スタック取得が行われるそのような配向角度である必要はない。
【００３２】
この方法の特に好ましい実施形態では、画像スタックの取得は、顕微鏡サンプル分析の枠組み内で行われ、顕微鏡サンプル分析中、サンプルには光シートで照明が当てられ、光シートの拡張面は、検出方向に実質上直交する。特に、ここでは、使用される倍率およびこれに関連する光シート・パラメータを参照して、増分値情報も決定することができる。他の顕微鏡検査方法では、深さの区別をこのためのパラメータとして使用することもできる。
【００３３】
走査顕微鏡方法の使用において、現在取得している画像の寸法が、カメラ・パラメータではなく走査パラメータによって決定されるという特定の場合も存在する。ここでは、原則的に任意の形状をスキャナで再現することができるため、サンプル体積の輪郭（当該領域の一部分に基づく）を非常に複雑に設計することができる。しかし、この走査運動は既知であるため、輪郭はまた、運動曲線を参照して数学的に記述することもできる。
【００３４】
当然ながら、３つ以上の投影画像を取得して部分体積を決定することを考えることもでき、すなわち投影画像を取得するために３つ以上の配向角度が設定される。これは、たとえば部分体積の決定が高い正確さで行われるとき、３つ以上の配向角度が使用される場合に得られる情報は部分的に冗長であるため、有利となり得る。
【００３５】
上記の特徴および後述する特徴は、記載の組合せだけではなく、本発明の範囲から逸脱することなく、他の組合せまたは単独で使用することができることが理解される。
本発明について、同じく本発明に本質的な特徴を開示する添付の図面を参照して、例として以下でさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＳＰＩＭ方法に適した顕微鏡の典型的な構造の図。
【図２】新しい配向角度で繰り返し集束させるために回転させたときの検出座標系内のサンプルの移動の図。
【図３】サンプル空間の上面図における２つの配向角度に対するサンプル体積の決定の図。
【図４】画像視野におけるこれらのサンプル体積の決定の図。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
最初に、サンプル分析のための顕微鏡システムの構造を図１に示す。このシステムでは、サンプルに光シートで照明を当てることができ、光シートの拡張面は、検出方向に実質上直交しており、サンプルの分析は、いわゆるＳＰＩＭ方法を使用して行われる。たとえばアガロースなどのゲルの中に埋め込まれたサンプル２が、サンプル・チャンバ１内に支持される。サンプル・チャンバ１は、サンプル・ホルダ３上に取り付けられる。サンプル・チャンバ１、したがってサンプル２は、ここでは検出座標系のＹ軸ＹＤに対応するサンプル・ホルダ３の軸の周りを回転させることができ、３つすべての空間方向に並進させることができる。この検出座標系を左側に示し、ＹＤ軸の周りの回転性を、円形の矢印で表す。サンプル・ホルダ３は、軸ＸＰ、ＹＰ、ＺＰを有するサンプル座標系を囲む。この場合、軸ＹＤおよびＹＰは平行に位置し、その結果、サンプル座標系が検出座標系に対して回転させられたとき、軸ＸＰおよびＸＤまたはＺＰおよびＺＤ間の角度だけが変化する。これにより、この場合の表現がより容易になるが、これは強制的な必要条件ではない。他の構造では、他の軸またはいくつかの軸の周りのサンプルの回転も、完全に実現することができる。
【００３８】
ＳＰＩＭ技術では、光シートは、ＸＤ−ＹＤ平面内に生成され、この場合、このために照明用対物レンズ４が使用される。光シートは、たとえば円柱レンズを使用して静的に生成することができ、または１本の線に沿ったサンプルの点走査を用いて、動的もしくは準静的に生成することができる。後者の場合、たとえばレーザ走査顕微鏡検査から周知の走査デバイスを使用することができる。検出は、軸ＺＤに対して平行に位置する検出方向Ｇに沿って行われ、これに対して検出用対物レンズ５が設けられる。検出座標系に対するサンプル座標系の位置は、較正を介して、またはサンプル・チャンバ１をサンプル・ホルダ３の上に位置決めするための機械パラメータの知識を用いて既知となる。検出用対物レンズ５の焦点面に対する回転軸ＹＰ（Ｒとも示される）の位置は、較正によって、または機械パラメータを参照して、事前に決定することができる。サンプル・ホルダ３、したがってサンプル・チャンバ１の回転性のため、この構造は、いわゆる多視点取得に特によく適しており、画像スタックは、いくつかの配向角度αｉ、ｉ＝１、．．．、Ｎ、から取得される。ここでＮは自然数である。
【００３９】
様々な配向角度からそのような画像スタックを取得する基本的な手順を、２つの配向角度に関して例として図２に表す。配向角度α１＝０°に対する状況を図２ａ）に表し、配向角度α２＝９０°に対する状況を図２ｂ）に表す。紙面に直交する観察方向は、軸ＹＤに対応しており、軸ＹＤは、サンプル・ホルダ３、したがってサンプル・チャンバ１およびサンプル２の回転軸ＹＰに対して平行である。サンプル２は、アガロースの円柱６内に埋め込まれているが、回転軸ＹＰ上で中心に位置していない。図２ａ）では、配向角度α１＝０°の場合、サンプル２は、少なくとも部分的に検出用対物レンズ５の焦点面７の中に配置されるが、これは強制的ではない。サンプルまたは検査すべきサンプル領域の輪郭を認識することができる限り、焦点面が画像面または光シート面に近接して配置される場合は十分であり、画像視野平面も焦点面に対応することができることが有利である。撮像レンズ・システム８を介して、サンプル２の画像が検出ユニット上へ投影される。ここでは検出ユニットは、たとえば、ＣＭＯＳまたはＣＣＤカメラ・チップ９の形で空間的に分解する表面検出器からなる。
【００４０】
配向角度の各設定に対して、現況技術では通常、ＺＤ軸に沿って画像スタックが取得され、この軸に対して平行な検出軸Ｄに沿ってサンプル２が移動される。このため、初期位置および最終位置がサンプル座標系内で決定され、次いで、サンプル・ホルダ３上のサンプル・チャンバ１が、それに対応して、制御可能な位置決めユニットによって検出方向Ｄに沿って動かされる。
【００４１】
別の配向角度の場合、α２＝９０°の例では、サンプルは、正確にこの角度でＹＰ軸の周りを回転させなければならない。通常、特に倍率が大きい場合、すなわち集束された画像視野中心に対する検出座標系内のサンプル２のｘおよびｚ座標は、回転のために変化するため、サンプル２はすでに画像視野から出る。次いで、サンプル２を集束された画像視野中心内へ戻すには、モータ位置、すなわちサンプル・ホルダ３またはサンプル・チャンバ１の位置を、量Δｘ、Δｚだけ並進させなければならない。言い換えれば、サンプル２と、軸ＹＰに対応する回転軸Ｒとの間の距離のため、再びサンプル２を焦点面内および検出Ｄとの重複領域内で受け取るには、サンプル２を追跡しなければならない。現況技術で使用される方法では、新しく設定された各配向角度に対してサンプル追跡を行わなければならないが、図３および図４を参照して後述する方法では、２つの配向角度だけで特定の工程を実施すれば十分であり、このとき、これらの２つの配向角度から、これらの配向角度およびさらなる配向角度に対する画像スタック取得のためのパラメータを導出することができる。たとえばいくつかの検出用対物レンズ５を具備するＳＰＩＭ顕微鏡で、いくつかの観察角度から同時にサンプル２を観察できる可能性が存在する場合、後述する方法工程を、配向角度α１およびα２の両方に対して同時に実施することもできる。方法の正確さを改善するために、３つ以上の配向角度を最初に測定することもできる。
【００４２】
最も簡単な場合、サンプル２の照明は、図３に示すように、光源１０を介して行われる。光源１０は、検出用対物レンズ５に対向するように配置されており、たとえばＳＰＩＭ顕微鏡の場合は接続可能に設計することができる。最初に検出座標系内で、いずれの場合も少なくとも２つの配向角度に対して、１つの投影画像が取得される。上述のように、これらの取得は同時に行うこともできる。このため、工程ａ）で、検査すべきサンプル領域が最初に選択され、画像視野の寸法は、検査すべきサンプル領域が、検出方向Ｄに沿った投影の場合、少なくとも部分的に画像視野の領域内に配置されるように選択される。これは、他の方向からの画像スタックに対する取得パラメータの決定に重要である。図示の例では、検査すべきサンプル領域はさらに、画像視野内に完全に配置されている。これは、サンプルの輪郭が単に概略的に再現される場合は十分である。これは原則として、透過光画像において、サンプル２が焦点面７の領域内にすでにおおまかに配置され、十分な倍率が選択されている場合に当てはまる。適当な検出用対物レンズで可能なように、倍率を設定するために、ズーム・システムを使用することもできる。図４では、画像視野は、いずれの場合も、より太く示されている外側の方形によって示される。
【００４３】
当然ながら、従来の画像スタック取得をここで必要に応じて行うこともでき、次いで、そこから投影画像が導出される。透過光照明の代わりに、図３に概略的に示すように、あらゆる他の可能なコントラスト方法、たとえば蛍光方法を使用することもできる。次いで、工程ｂ）で、少なくとも部分的に画像視野と重複する第１の当該領域ＲＯＩ１が画定される。図示の例では、当該領域ＲＯＩ１は、画像視野の一部分である。これは、たとえば操作者が、画像上に当該領域を作製することによって実施することができる。図４では、２つの選択された配向角度に対する当該領域が、画像視野内に方形として表されているが、円または多角形など、簡単な式で幾何学的に記述することができるあらゆる他の構造も考えることができる。画像視野の一部分の画定はまた、たとえばコントラストを分析する画像処理方法を用いて、自動化された形で行うことができる。当該領域ＲＯＩ１およびＲＯＩ２はまた、完全な画像視野に対応することができ、または複雑な形状を呈することもできる。
【００４４】
これは投影画像であるため、当該領域ＲＯＩ１またはＲＯＩ２はまた、実際には第３の寸法を有し、図４で選択された図では、第３の寸法は、いずれの場合も、検出軸Ｄまたは軸ＺＤの方向に位置する。しかし、検出軸Ｄまたは軸ＺＤは同様に、図３に示すように、サンプル座標系内では、選択された配向角度で互いに対して９０°の角度を含む。
【００４５】
次に、サンプル座標系内で２つの当該領域の互いに対する位置を記述し、互いに対する位置を設定することができるように、検出方向Ｄに直交する平面内の検出座標系内で、画像視野中心の位置が最初に決定される。図４では、画像視野中心は、それぞれ図４ａ）および図４ｂ）内の座標ｘ１ａ、ｙ１ａおよびｘ２ａ、ｙ２ａに対応する。回転軸がＹＤ軸に対して平行である場合、ｙ１ａとｙ２ａは同一である。これは、図２に関連して説明したように、サンプルを画像視野内へ戻すためにサンプルの移動が行われるため、ｘ座標には当てはまらない。
【００４６】
したがって、検出座標系内のｘ座標の差は、検出座標系内のＸＤ方向に沿ったサンプル・ホルダ３の移動に対応する。ＺＤ方向の移動は、画像視野内では直接見えないが、必要な場合、新しく設定される可能性がある集束によって見ることができる。
【００４７】
当該領域ＲＯＩ１およびＲＯＩ２の形状に応じて、１組の座標が検出座標系内で決定される。この１組の座標は、画像視野内、したがって、検出座標系内でこの当該領域の位置および寸法を明確に画定するのに十分である。ここに示すように、方形の当該領域ＲＯＩ１およびＲＯＩ２の場合、これらの座標は、画像視野内のそれぞれの当該領域の中心位置を指定する座標ｘ１ｂおよびｙ１ｂならびにｘ２ｂおよびｙ２ｂと、画像視野内、したがって検出座標系内の当該領域の寸法を反映する値ｘ１ｃ、ｙ１ｃならびにｘ２ｃ、ｙ２ｃとである。自動のマーキングでは、回転軸ＲがＹＤ軸に対して平行に位置する場合、ｙ座標は原則として同一であり、手動のマーキングでは、これらの値は原則として互いに異なる。
【００４８】
他のタイプの座標鮮明度も、たとえば方形の角座標を指定することによって、または１つの角および２つのベクトルを指定することによって可能である。その１組の座標が画像視野内のそれぞれの当該領域の寸法の位置を画定するのに十分でなければならないいずれの場合も、それらの座標を大きく決定することができる。
【００４９】
次に、これらの値から、すなわち投影画像の画像視野中心の位置および１組の座標から、対応する変換を用いて、図４内の当該領域ＲＯＩ１およびＲＯＩ２が、投影のため、検出方向Ｄに沿って０とは異なる範囲、すなわち有限またはさらには無限の範囲を有することを考慮して、第１のサンプル体積Ｖ１および第２のサンプル体積Ｖ２がサンプル座標系内で決定される。体積は、図４では、いずれの場合も、画像平面に直交して延び、箱形であるが、図３では、２つの当該領域またはサンプル体積の実際の位置が、サンプル座標系内の変換を考慮して表されている。２つの当該領域ＲＯＩ１およびＲＯＩ２の互いに対するこの相対的な位置により、サンプル２が２つの定義した当該領域間で２つの配向角度間の差だけ回転させられ、回転後にサンプル２が再び画像視野内に配置されない場合、検出座標系内で量Δｘ、Δｚだけ並進させられ、その結果、並進後、検査すべきサンプル領域が再び完全に画像視野の領域内に配置されるようになる。体積Ｖ１およびＶ２を画定する２つの当該領域ＲＯＩ１およびＲＯＩ２の位置から、回転軸Ｒ、すなわち軸ＹＰに対するこれらの２つの体積の部分体積の位置が既知となることによって、部分体積をサンプル座標系内で決定することができる。
【００５０】
次いで、この部分体積を参照して、これらの配向角度ならびに他の配向角度に対して、画像スタック取得に必要なパラメータをサンプル座標系内で決定することができる。次いで、サンプルは、それに対応して検出座標系内に位置決めされ、画像スタック取得を実施することができる。画像スタック取得に必要なパラメータは、ＺＤ方向の画像スタック取得の開始および終了、ならびに各配向角度に対するＸＤ方向の位置決めからなる。２つの座標系の互いに対する位置が既知である場合、画像視野中心内または焦点内でサンプル・ホルダ３のどの位置に回転軸Ｒが配置されているかも既知となり、そこから、焦点面に対するＲＯＩからの当該体積の位置を決定することができる。画像中心位置の知識から、回転軸の位置に対する対応する体積の位置を決定することができる。
【００５１】
別法として、第１の配向角度α１で、第１の当該領域ＲＯＩ１に加えて、この配向角度における第１の画像スタック取得の初期および最終パラメータを決定することによって、第２の当該領域ＲＯＩ２の選択を回避することもできる。このようにして、第１の当該領域ＲＯＩ１とともに、有限のサンプル体積ＶＰが決定され、部分体積を決定する必要がなくなる。さらなる配向角度に対して、変換規則を用いてサンプル体積ＶＰを参照して、さらなる画像スタックの取得に必要なパラメータが、サンプル座標系内で決定される。次いで、この修正された方法では、サンプルはまた、それに対応して検出座標系内で位置決めされる。最後に、画像スタックの取得が実施される。対応する較正を用いて、サンプル座標系と検出座標系との間の変換に対する変換規則が事前に決定される。したがって、検出座標系内でサンプル体積ＶＰの位置が配向角度に対して既知である場合、サンプル座標系内でも同様に既知となり、すべての所望の配向角度に対して、検出座標系内でさらに決定することができる。
【００５２】
このようにして、多視点取得を手で入念に積み重ねることが不要になり、これは、特に数日間続くこともある発生生物学の観察の場合、大きな利点である。
【符号の説明】
【００５３】
１  サンプル・チャンバ
２  サンプル
３  サンプル・ホルダ
４  照明用対物レンズ
５  検出用対物レンズ
６  アガロースの円柱
７  焦点面
８  撮像レンズ・システム
９  カメラ・チップ
１０  光源
【図１】
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【図２】
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【図３ａ）】
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【図３ｂ）】
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【図４】
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