(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２中の少なくとも１２個の連続するアミノ酸残基と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号１または配列番号２と同一のアミノ酸配列を含む、前記ポリペプチド。
【請求項２】
１μＭ〜１０００μＭの濃度で、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの胞子発芽を半数阻害する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
２μＭの濃度で、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの胞子発芽を半数阻害する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ属および／またはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属の生物の生育阻害に有効である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｎ末端が、部分的なもしくは完全なアルキル化またはアシル化により、誘導体化されている、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｃ末端が、アミド化またはエステル化により誘導体化されている、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ペプチド鎖が、ＰＥＧ化またはＨＥＳ化により誘導体化されている、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
以下の配列を有する、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載のポリペプチド：
Ｚ１−ＱＨＧＹＧＡＧＧＨＧＱＱＧＹＧＳＱＨＳＳＨＡＰＱＧＧＨＶＶＲＥＱＧＦＳＧＨＶＨＥＱＱＡＧＨＨＨＥＡＧＨＨＥＱＡＧＨＨＥＱＳＧＱＱＶＨＧＱＧＨＧＹＫ−Ｚ２
（式中、
Ｚ１は、前記ポリペプチドのＮ末端、前記ポリペプチドの末端アミノ基の誘導体、または１０個以下の任意のアミノ酸の鎖であり；
Ｚ２は、前記ポリペプチドのＣ末端、前記ポリペプチドの末端カルボキシ基の誘導体、または１０個以下の任意のアミノ酸の鎖である）。
【請求項９】
Ｚ２がＳＨＧＹ−Ｚ３で表されるアミノ酸配列を有し、式中、Ｚ３が前記ポリペプチドのＣ末端、前記ポリペプチドの末端カルボキシ基の誘導体、または６個以下の任意のアミノ酸の鎖である、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
部分的にＤ−アミノ酸を有するか、Ｄ−アミノ酸のみからなるか、またはＤ−レトロ−インベルソペプチド構造を有する、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属および／またはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属の生物に対する防除剤。
【請求項１３】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ属および／またはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属の生物を防除するための、
請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用、または、
前記ポリペプチドをコードし、配列番号３のヌクレオチド残基１〜２３１及び配列番号４のヌクレオチド残基１８〜２５１からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチドの使用。
【請求項１４】
前記防除が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属および／またはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属の生物の殺滅、生育阻害、コロニー形成防止、及び／又は胞子発芽防止を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
化学的ペプチド合成工程、または
形質転換細胞における異種発現工程を含む、
請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドを発現するための核酸で形質転換された細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の細胞を含むトランスジェニック作物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌に有効なポリペプチド、特に植物の病気を引き起こす真菌および農産物にコロニー形成する真菌に有効なポリペプチドに関する。本発明は更に、そのようなポリペプチドを製造するプロセスおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸に関する。更に、本発明は、本発明に係るポリペプチドを用いて植物を処置するためのプロセスおよび標品ならびに真菌によるダメージから保護された作物を作製するための本発明に係る核酸の使用に関する。
【０００２】
真菌によるヒトの感染症は、今日まで信頼し得る抗糸状菌活性薬がわずかしか知られていないため、とりわけ免疫不全患者にとって、大きな問題である。最も多用されるものとしては、他の化合物（例えばアムホテリシンＢ）と比べて毒性が低く、したがって、しばしば真菌感染症の治療法の唯一の可能性となる、クロトリマゾールまたはケトコナゾール等のアゾール誘導体が挙げられる。
【０００３】
ヒトおよび動物における感染症に加え、真菌は植物にも著しいダメージを与え得る。真菌による作物の感染症による産生量の減少は現代の農業の最大の問題の１つである。植物の病気を引き起こし得る８０００を超える真菌種が知られている。例えば、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属の種はジャガイモ植物を腐敗させ、その結果、全世界で１年にジャガイモの収穫の２０％が失われている。特に重要であるのは、コムギ、トウモロコシ、およびオオムギ等の穀類植物に感染するＦｕｓａｒｉｕｍ属の種である。例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍは、これらの植物において、茎（ｓｔａｌｋ）上の眼点病（ｅｙｅ  ｓｐｏｔ）、葉の壊死、または根のダメージ、およびトウモロコシの穂軸の腐敗として現れる疾患を生じさせる。１９９２〜２００１年に米国のコムギ栽培においてＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍによって生じた損害は２６億米国ドル超に達する（Schisler et al. Biological control of Fusarium head blight of wheat and deoxynivalenol levels in grain via use of microbial antagonists; Adv Exp Med Biol. 2002; 504: 53-69）。感染した穀類における高い収量および品質の低下に加え、真菌は更に毒性代謝物（マイコトキシン）により穀物を著しく汚染し、これは摂取されると、大きな健康上の問題を伴う重度の中毒（中毒症）を引き起こす。これにより、畜産分野において大きな経済的損害が生じる。今日まで、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属種により生産される約１００種類の毒素が同定されており、そのうち、トリコテセン類のグループに由来するデオキシニバレノールおよびニバレノールが穀類栽培において最も重大なマイコトキシンである。これらの強力なタンパク質合成阻害剤の作用としては、高等動物における皮膚毒性ならびに神経系および消化系への有害作用が含まれる。したがって、これらの物質はヒトおよび家畜の両方にとって重大な脅威である。
【０００４】
量的割合に基づくと、農業で使用される最も重要な殺真菌剤はジチオカルバマートおよびチウラムジスルフィドであり、次いでアゾールである。ジチオカルバマートおよびチウラムジスルフィドの適用は、特にこれらによる水質汚染の可能性およびほとんど特異的でない作用機序のため、懐疑的に考えられている（Bayerisches Landesamt fur Wasserwirtschaft, Leaflet No. 4.5/14、２００５年７月２５日現在）。植物保護におけるプロピコナゾールまたはトリコナゾール等のアゾールの使用における主な問題は、同じ作用機序（真菌特異的ラノステロール−１４ａ−デメチラーゼの阻害）の化学的に関連する物質が医薬品でも使用されていることである。したがって、環境中における潜在的にヒト病原性を有する真菌における耐性選択により、医学的に使用されているアゾール抗真菌薬の有効性が低減するという危険がある（２００１年６月７日のReport of the German Federal Institute for Health-Related Consumer Protection and Veterinary Medicine）。アゾールに対する耐性の形成は比較的ゆっくり進むので植物保護の観点からは中程度のリスクと考えられるが、今日でも耐性のない状況を回復することはできないと考えられている。それにも関わらず、今日、アゾールは集中的植物栽培の不可欠な要素と考えられている。
【０００５】
生育中の栽培物の感染に加えて、真菌は、種子、穀類、果実、および他の農産物の貯蔵およびストック化においても重大な問題である。真菌のコロニー形成は、生産物が廃棄される場合の即時的損失につながるだけでなく、マイコトキシンにより汚染された食物および飼料が摂取された場合の重度な中毒のリスクも有する。しかし、ストック保護における殺真菌剤の使用は、原則的に可能であり且つ経済的な観点から望ましいが、非常に制限されている。植物保護においては、農薬の散布と収穫の間には通常充分な時間が経過しているので、活性物質は分解され得る。対照的に、保存された作物では、それらの販売または消費がいつ何時にも起こり得る。したがって、多くの非常に効果的な農薬は、衛生的または毒性的理由によりストックの保護に適用することができない。その他の標品は、許容可能な最大レベルが認められる薄めた濃度でのみ使用することができる。そのため、制御の成功が減り、処置の繰り返しが必要になり、経済的な点から処置の目的が疑問視されている。例えば、現在、ドイツおよびオーストリアでは、ストック保護における使用に認可されている殺真菌剤はない。したがって、ストックされた生産物における真菌毒産生性（ｍｙｃｏｔｏｘｉｃｏｇｅｎｉｃ）真菌を制御するための満足な解決策は存在しない。
【０００６】
主に植物保護の分野において、この状況を改善するために、合成低分子量殺真菌剤の種々の代替物が研究され、一部は既に使用されている。可能性の一つは、一部研究が不完全な機構により真菌有害生物と競合してこれを殺すかその生育を阻害する非病原性土壌真菌と共に作物栽培物を制御して播種することである。菌寄生（ｍｙｃｏｐａｒａｓｉｔｉｓｍ）、抗生作用、シデロフォアの放出、生息地および栄養素の競合、全身抵抗（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）機構の誘導、ならびに植物生長の促進がこれに関連して考察されている。今日まで、主に、南アメリカでＭｏｎｉｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（ｓｙｎ．  Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ）  ｐｅｒｎｉｃｉｏｓａにより生じる天狗巣病を制御するためのココア栽培物の処置で良好な成績が達成できている。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｔｒｏｍａｔｉｃｕｍに基づいて製剤化された標品が２０１２年２月にブラジルで認可された。共生性または内部寄生性の菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種（Ｔ．  ｍａｒｔｉａｌｅ、Ｔ．  ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ）に基づくその他の標品が、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｓ  ｐａｌｍｉｖｏｒａにより生じるココアの黒腐れに対して、ココアのモニリア果実腐敗病を引き起こす病原菌であるＭｏｎｉｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒｏｒｅｒｉに対して使用するために開発中である。
【０００７】
まだ医学または農業での実施に入っていない、有害な真菌を制御するためのもう１つの可能な戦略は、いわゆる抗微生物ペプチドの適用である。これらは、典型的には、直鎖中に一緒に連結された、タンパク質を構成する１５〜４５個のアミノ酸からなる、遺伝子にコードされたオリゴペプチドを含む（Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 2002, 415: 389-95; Boman, H.G. Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts. J Intern Med. 2003, 254: 197-215）。抗微生物ペプチドは、大部分の多細胞生物で見出されており、ヒトを含む哺乳動物の免疫系の重要な構成要素でもある。抗微生物ペプチドは、適応免疫系を有さない昆虫および他の節足動物のような生物の免疫防御に最も重要である。公知の抗微生物ペプチドのほとんどは両親媒性構造を有し、親水性部分は正の電荷を有する。これにより、ペプチドは、典型的には負に荷電している細菌の膜と相互作用することおよび膜に埋め込まれた後にポア様構造を形成することができる。真核生物の膜は通常負の電荷を有さないか、弱い負の電荷しか有さないので、ほとんどの抗微生物ペプチドの活性は主に抗細菌的であり、有効性はしばしば、グラム陽性またはグラム陰性細菌のいずれかに対して、より顕著である。αヘリックス構造を特徴とするペプチドのセクロピン、ザルコトキシン、およびストモキシン（ｓｔｏｍｏｘｙｎ）等の少数の抗微生物ペプチドは、幅広い活性を示し、真菌、原生動物、および腫瘍細胞に対しても様々な程度の活性を有する。しかし、そのような抗微生物ペプチドの生体膜との非特異的相互作用の傾向はしばしば溶血活性も生じ、哺乳動物にとって毒性となる。多くの抗微生物ペプチドの実用的応用に対する更なる制限事項は、より高い塩濃度による、しばしば１５０ｍＭの生理学的ＮａＣｌ濃度でさえ生じる、その活性の低減によるものである（Marr et al. Antibacterial peptides for therapeutic use: obstacles and realistic outlook. Curr Opin Pharmacol. 2006, 6: 468-72）。これは、標的膜との静電相互作用の中和によって説明される。一部の抗微生物ペプチドでは、主にまたはもっぱら殺真菌活性が報告されている。これらの抗微生物ペプチドとしては、ガレリマイシン（ｇａｌｌｅｒｉｍｙｃｉｎ）、ヘリオマイシン（ｈｅｌｉｏｍｉｃｉｎ）、テルマイシン（ｔｅｒｍｉｃｉｎ）、Ａｌｏ３、ドロソマイシン（ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）、ＰｓＤ１、およびＮａＤ１が挙げられる（Lobo et al. Antifungal Pisum sativum defensin 1 interacts with Neurospora crassa cyclin F related to the cell cycle. Biochemistry. 2007, 46: 987-96; van der Weerden et al. The plant defensin, NaD1 enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J Biol Chem. 2008, 283: 14445-52）。３または４個のジスルフィド架橋により安定化されるコンパクトな三次元構造がそのような抗微生物ペプチドの特徴である。そのような構造的特徴を有する抗微生物ペプチドは、それらの活性の範囲およびそれらを生産する生物とは関係なく、デフェンシンと呼ばれる。Ａｌｏ３は、他のデフェンシンで見られるαヘリックス部分を有さず、３個のβ鎖のみからなる唯一の公知のデフェンシンであるので、特殊なケースである。真菌膜の認識は、電荷とは無関係に、少なくともいくつかのケースでは中性グリコシルセラミドへの特異的結合により起こる（Aerts et al. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell Mol Life Sci. 2008, 65: 2069-79）。ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｗｉｎについては真菌およびとりわけグラム陽性細菌の両方に対する活性が更に報告されている（Levashina et al. Metchnikowin, a novel immune-inducible proline-rich peptide from Drosophila with antibacterial and antifungal properties. Eur J Biochem. 1995, 233: 694-700）。このプロリンリッチペプチドは２６アミノ酸残基からなり、膜溶解活性を欠いている点で、典型的な抗微生物ペプチドと異なる。主にグラム陰性細菌に対する活性を有するより短いプロリンリッチ抗微生物ペプチドが、生体膜を破壊せずに生体膜を貫通し、細胞内部のシャペロンタンパク質ＤｎａＫを阻害する（Kragol et al. The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assisted protein folding. Biochemistry. 2001, 40: 3016-26）。この作用機序がｍｅｔｃｈｎｉｋｏｗｉｎにも当てはまるかどうかは不明である。
【０００８】
医薬品および化粧品へは、とりわけ、例えば粉末、クリーム、ゲル、ローション、シャンプー、スプレー、マウスウォッシュ、または練り歯磨き（ｔｏｏｔｈｐａｓｔｅ）の形態で皮膚または粘膜に塗布することにより殺真菌活性ペプチドを適用することが妥当であると考えられる。更に、例えば命を脅かす急性感染症の場合に、経口投与または注射の可能性がある。例えば粉末製剤を噴霧または散布することによる、植物保護およびストック保護の分野における外部的適用も可能である。活性ペプチドの製造は、合成により、主に固相合成により、または種々の宿主生物中での対応する核酸の異種発現によりなされ得る。純粋な形態のオリゴペプチドおよびポリペプチドの製造は複雑であるので、主に植物保護に適用するために、代替的な適用形態が求められる。少なくとも研究分野でよく確立されている方法の１つは、生産すべき活性ペプチドをコードする核酸が導入された、遺伝子操作された植物の生産にある。植物によるそのような活性物質の一貫した生産は場合によっては望ましくないので、核酸を、真菌感染によってまたはそれに関連する植物によるストレス反応によって直接活性化されるプロモーターの制御下で発現されるように導入することが好ましいであろう。
【０００９】
デフェンシンのヘリオマイシンおよびドロソマイシンをコードする核酸をタバコ植物に導入することで、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに対する小さいが統計的に有意な耐性が媒介された（Banzet et al. Expression of insect cysteine-rich antifungal peptides in transgenic tobacco enhances resistance to a fungal disease. Plant Sci. 2002, 162: 995-1006）。同様に、タバコ植物にガレリマイシンをコードする核酸を導入することにより、うどん粉病菌Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍおよびＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｍｉｎｏｒに対する耐性を実現することができた（Langen et al. Transgenic expression of gallerimycin, a novel antifungal insect defensin from the greater wax moth Galleria mellonella, confers resistance to pathogenic fungi in tobacco. Biol Chem. 2006, 387: 549-57）。真菌に特異的な活性を有するこれらのデフェンシンに加え、より幅広い活性を有する抗微生物ペプチドを生産する遺伝子操作された植物も作製された。例えば、セクロピンＡをコードする外来遺伝子をコメ中で発現させることにより、イネイモチ病病原菌Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａに対する耐性が増大した（Coca et al. Enhanced resistance to the rice blast fungus Magnaporthe grisea conferred by expression of a cecropin A gene in transgenic rice. Planta 2006, 223: 392-406）。ミツバチ毒液中で生じるメリチンの配列エレメントおよびセクロピンの配列エレメントからなる人工ハイブリッドペプチドをコードする遺伝子のジャガイモおよびタバコ植物中での異種発現によりＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉに対する耐性増大が達成された（Osusky et al. Transgenic plants expressing cationic peptide chimeras exhibit broad-spectrum resistance to phytopathogens. Nat Biotechnol. 2000, 18: 1162-6; Yevtushenko et al. Pathogen-induced expression of a cecropin A-melittin antimicrobial peptide gene confers antifungal resistance in transgenic tobacco. J Exp Bot. 2005, 56: 1685-95）。オオムギで、ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｗｉｎの外来遺伝子の導入後、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍおよびＢｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓに対する耐性増大が観察された（Rahnamaeian et al. Insect peptide metchnikowin confers on barley a selective capacity for resistance to fungal ascomycetes pathogens. J Exp Bot. 2009, 60: 4105-14）。
【００１０】
これらのデータから、抗微生物真菌が植物およびストックの保護における真菌感染の制御に原則的に好適であるということは確立された事実であると見なされるべきである。しかし、現在これらのペプチドのうち、真菌全般に対するおよび特に植物病原性真菌に対する特異的活性を有するものはごくわずかしか知られていない。幅広い活性を有するペプチドの使用には、有用細菌、例えば共生生物として植物に付随する細菌の生育が妨げられるというリスクがある。更に、ヒトまたは動物による摂取が意図される生産物中におけるそのようなペプチドの存在は、天然の腸内細菌叢に干渉し得、したがって、健康に悪影響を与え得る。公知の抗微生物ペプチドの大部分は生理学的ｐＨ値で正の実効電荷を有することから、更なる問題が生じる。そのために生じる、種々の負に荷電した生物学的ポリマーとの非特異的相互作用により、予測が困難な毒作用が生じ得る。強い陽イオン性を有する物質との接触後のマスト細胞によるヒスタミン放出のリスクがある（Vaara, M. New approaches in peptide antibiotics. Curr Opin Pharmacol. 2009, 9: 571-6）。更に、公知の抗微生物ペプチドの多くは、溶血活性として測定可能な、哺乳動物細胞の生体膜中に埋め込まれる傾向のある両親媒性構造を有し、そのため、更なる毒性の可能性がある。
【００１１】
欧州特許公開第０７９８３８１（Ａ２）号は、双翅目のハエに由来するポリペプチドおよびＦｕｓａｒｉｕｍに対する耐性が増大したトランスジェニック動物を作製するためのその使用を開示している。２０１１年３月１日のデータベースＥＭＢＬ（オンライン）中のエントリー、ＥＢＩアクセッション番号ＪＧ４０７４４１は、Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃｕｐｒｉｎａに由来するポリヌクレオチドを開示している。このポリヌクレオチドに関連する機能は開示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、一群のポリペプチドが殺真菌活性を有することが見出された。本発明に係るポリペプチドは、配列番号２中の少なくとも１２連続アミノ酸残基と同一であること、特に配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列相同性を有することを特徴とする。
【００１４】
典型的には、１〜１０００μＭ、特に２μＭの濃度の本発明に係るポリペプチドへの暴露により、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの胞子発芽が最大数の半数阻害される（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）。
【００１５】
一実施形態では、本発明に係るポリペプチドは配列番号１または配列番号２と同一である。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属および／またはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属の生物の生育阻害に有効である。
【００１７】
本発明に係るポリペプチドは、特にＮ末端、Ｃ末端、および／またはペプチド鎖中において、誘導体化されていてよい。Ｎ末端の誘導体化は、部分的または完全なアルキル化、アシル化、または別のＮ修飾を含み得る。Ｃ末端の誘導体化は、アミド化、エステル化、または末端カルボキシ基の別の修飾を含み得る。ポリペプチド鎖の誘導体化は、特に、本発明に係るポリペプチドの特性を向上させるための修飾、例えば、ＰＥＧ化、ＨＥＳ化（ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ）、または同様のものを含み得る。所望であれば、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドが使用される対象の生物の細胞構造に対する結合親和性を有する構造単位とカップリングされてもよい。ポリペプチドの修飾された特性を実現するための好適な誘導体化は当業者に公知である。前述の活性を有する本発明に係るポリペプチドの誘導体も本発明で請求される。
【００１８】
特に、本発明は、以下の配列を有するポリペプチドに関する：
Ｚ１−ＱＨＧＹＧＡＧＧＨＧＱＱＧＹＧＳＱＨＳＳＨＡＰＱＧＧＨＶＶＲＥＱＧＦＳＧＨＶＨＥＱＱＡＧＨＨＨＥＡＧＨＨＥＱＡＧＨＨＥＱＳＧＱＱＶＨＧＱＧＨＧＹＫ−Ｚ２、
式中、
Ｚ１は、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドの末端アミノ基の誘導体、または最大１０個の任意のアミノ酸の鎖であり；
Ｚ２は、ポリペプチドのＣ末端、ポリペプチドの末端カルボキシ基の誘導体、または最大１０個の任意のアミノ酸の鎖である。
【００１９】
特に、Ｚ２は、ＳＨＧＹ−Ｚ３のアミノ酸配列を有してもよく、式中、Ｚ３は、ポリペプチドのＣ末端、ポリペプチドの末端カルボキシ基の誘導体、または最大６個の任意のアミノ酸の鎖である。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、ペプチド鎖中に部分的にまたは完全にＤ−アミノ酸またはＤ−レトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチド構造を有し得る。
【００２１】
本発明は更に、本発明に係るポリペプチドを生産するためまたは真菌を制御するための本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用に関し、前記ポリヌクレオチドは、洗浄に０．２×ＳＳＣ、４２℃を用いるストリンジェンシー条件下で以下の群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズする配列を有する：
配列番号３のヌクレオチド残基１〜２３１に対する相補鎖；
配列番号３のヌクレオチド残基１〜１０２に対する相補鎖；
配列番号３のヌクレオチド残基１０３〜３３１に対する相補鎖；
配列番号４のヌクレオチド残基１８〜２５１に対する相補鎖；
配列番号４のヌクレオチド残基１８〜１１９に対する相補鎖；
配列番号４のヌクレオチド残基１２０〜２５１に対する相補鎖。
【００２２】
本発明は更に、真菌、特に植物の病気を引き起こす真菌；Ｆｕｓａｒｉｕｍ属および／またはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属の生物；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ綱の生物を制御するための、本発明に係るポリペプチドのまたはそのようなポリペプチドをコードする本発明に係る核酸の使用に関する。
【００２３】
更に、本発明は、本発明に係るポリペプチドを生産するプロセスに関する。
【００２４】
本発明は更に、Ｌｕｃｉｌｉａ  ｓｅｒｉｃａｔａの野生型細胞を除く、本発明に係るポリペプチド（、特に配列番号１または配列番号２のポリペプチド）を発現するための核酸を含む細胞に関する。
【００２５】
本発明は更に、本発明に係る細胞を含むトランスジェニック作物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１−１】完全に合成的に製造されたタンパク質ＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の逆相クロマトグラフィーによる分析結果を示す図である。
【図１−２】完全に合成的に製造されたタンパク質ＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の質量分析法による分析結果を示す図である。
【図２】チオレドキシン、ヘキサヒスチジン配列、第Ｘａ因子認識配列、およびＬｓｅｒＦＣＰ１−７７からなる融合ポリペプチドを生産するように遺伝子操作された大腸菌細胞のＩＰＴＧを用いた誘導から種々の期間後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図３】チオレドキシン、ヘキサヒスチジン配列、第Ｘａ因子認識配列、およびＬｓｅｒＦＣＰ１−７７からなる融合ポリペプチドを精製するための固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーの結果ならびに関連するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図４】チオレドキシン、ヘキサヒスチジン配列、第Ｘａ因子認識配列、およびＬｓｅｒＦＣＰ１−７７からなる融合ポリペプチドを第Ｘａ因子で処理した後に得られた切断産物の分離のＭｏｎｏ−Ｑクロマトグラフィーの結果および関連するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図５】組換え型で製造されたポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の逆相クロマトグラフィーおよび質量分析法による分析の結果を示す図である。
【図６−１】チオレドキシン、ヘキサヒスチジン配列、エンテロキナーゼ認識配列、およびＬｓｅｒＦＣＰ１−７７からなる融合ポリペプチドをエンテロキナーゼで処理した後に得られた切断産物の分離のＭｏｎｏ−Ｑクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図６−２】得られたポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７３の質量分析の結果を示す図である。
【図７】水対照と比較した記載濃度でのＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの胞子発芽の阻害に係るポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の試験結果を示す図である。
【図８】ＬｓｅｒＦＣＰ１−７７によるＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの胞子発芽の阻害に係る用量効果関係を示す図である。
【図９】水対照と比較した記載濃度でのＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの胞子発芽の阻害に係るポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７３の試験結果を示す図である。
【図１０】水対照と比較した記載濃度でのＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａの胞子発芽の阻害についてのポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明において、「殺真菌活性」という用語は、真菌の殺滅、真菌生育の阻害、および真菌胞子の発芽の防止を意味すると理解される。これらの効果は完全または部分的に明白であり得る。
【００２８】
本発明において、「真菌の制御」という用語は、真菌の殺滅、存在する真菌の生育阻害および真菌コロニー形成の防止、ならびに真菌胞子の発芽の防止を意味すると理解される。
【００２９】
本発明において、「真菌」は、口語的に真菌（またはカビ）と呼ばれる生物も、これらは系統発生に関する科学的な証拠を正確に反映していないが、意味すると理解される。特に、本発明に係る「真菌」は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属を含むＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ綱（以前の名称でＯｏｍｙｃｏｔａまたはＯｏｍｙｃｅｔｅｓ）の代表例を含むことが意図される。
【００３０】
本発明に係るポリペプチドは、健康に関連する損害または経済的損害を引き起こす真菌の制御に適している。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、植物病または農産物の貯蔵中のダメージを引き起こす真菌を制御するために使用される。
【００３２】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属およびＦｕｓａｒｉｕｍ属の真菌を制御するために使用される。
【００３３】
本発明に係るポリペプチドは、純粋な形態または種々の製剤の形態で真菌を制御するために使用され得る。外部的適用では、ポリペプチドは、０．０１〜３０ｍｇ／ｍｌの各ポリペプチドを含む液体溶液または懸濁液を形成するように希釈されてよく、または粉塵もしくは粉末として適用するために固体増量剤と混合されてもよい。特定の作物および病原体への適用に一般的な方法を適合させる方法が文献に記載されている（Methods for Evaluating Pesticides for Control of Plant Pathogens, K. D. Hickey, Ed., The American Phytopathological Society, 1986）。適用方法としては、植物または植物部分への１回または定期的に行われる水性噴霧および非水性噴霧、種子コーティング、および噴霧システムへの組込みが含まれる。製剤に添加され得る補助添加剤としては、安定剤、溶解能を改善するための薬剤、および湿潤剤、ならびにマイクロカプセル化を可能にする薬剤が含まれる。
【００３４】
真菌の特に効果的な制御のために、本発明に係るポリペプチドは、他の殺真菌活性物質と組み合わせて用いることができる。更に、植物保護において一般的な殺菌性、抗ウイルス性、抗線虫性、殺虫性、および他の活性を有する物質との組合せが可能である。肥料、植物ホルモン、および成長調節物質との組合せも可能である。本発明に係るポリペプチドを用いた真菌制御の可能性の１つは、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を形質転換として知られるプロセスにより植物の遺伝材料中に導入することにより該植物を遺伝子操作することである。本発明に係るそのような遺伝子操作植物の作製方法は当業者に公知である（Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach, H. Weissbach, Eds., Saunders College Publishing/Harcourt Brace, June 1988; Methods in plant molecular biology and biotechnology, B. R. Glick, J. E. Thompson, CRC Press, Boca Raton, FL, 1993）。本発明の好ましい変形例では、ＤＮＡでコーティングされた微粒子を用いた弾撃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、いわゆるフローラルディップ法、またはアグロバクテリウム媒介形質転換により、好適に改変されたベクターの人工遺伝子コンストラクトが植物、植物部分、または植物細胞に組み込まれる。その他の可能な方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、化学的透過処理（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、および細胞、ミニ細胞、プロトプラスト、またはリポソーム等のＤＮＡ含有単位との原形質体融合が含まれる。本発明の別の好ましい変形例では、それぞれ１アミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットを遺伝子操作植物の好ましいコドン使用頻度に合わせて、本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子が合成的に製造される。更に、公知の方法に従い傷害およびオーキシン活性により活性化可能なプロモーターの制御下に移入すべき外来遺伝子を配置することが可能であり、これにより、真菌コロニー形成後の発現増強が達成される（Rahnamaeian. Insect peptide metchnikowin confers on barley a selective capacity for resistance to fungal ascomycetes pathogens. J Exp Bot. 2009, 60: 4105-14）。本発明の好ましい実施形態では、トウモロコシおよび／またはジャガイモ植物が、本発明に係るポリペプチドを生産するように遺伝子操作される。
【００３５】
配列番号１または配列番号２に対応するポリペプチドを真菌の制御に用いることができる。更に、配列の切り詰めまたは更なるアミノ酸残基の付加により生じるポリペプチドまたはオリゴペプチドを用いることもできる。
【００３６】
更に、例えば組換え形態での製造においてより高い収量を達成するためまたは精製を容易にするために、更なる配列エレメントが付加された、ポリペプチドのバリアントを用いることができる。
【００３７】
場合によっては、配列番号１の少なくとも１２連続アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを用いることが好ましいことがある。更に、個々のアミノ酸残基を除去するかそれらを異なるアミノ酸残基で置換することが好ましいことがある。更なるアミノ酸残基の挿入も可能である。そのような変更は、切り詰められたまたは延長されたポリペプチドバリアントを基に行う場合にも可能である。特に、個々のアミノ酸残基を同様な物理化学的特性を有するもので置換することが好ましいことがある。主にアミノ酸残基は以下のグループ内で相互に交換可能である：
アルギニンおよびリジン；
グルタミン酸およびアスパラギン酸；
グルタミン、アスパラギン、およびスレオニン；
グリシン、アラニン、およびプロリン；
ロイシン、イソロイシン、およびバリン；
チロシン、フェニルアラニン、およびトリプトファン；
セリンおよびスレオニン。
【００３８】
配列番号１に由来するポリペプチドの同定は例えば、Sambrook and Russell 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NJ等に記載されている公知の方法を用いた、ゲノムライブラリーおよび／またはｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーのスクリーニングにより行うことができる。遺伝子ライブラリーは、例えば受容生物として細菌またはバクテリオファージを用いて作製することができる。更に、遺伝子ライブラリーは、特に核酸分子の分子的クローニングを用いない次世代シークエンシングとして知られる技術によりデータが作製された場合、好適な媒体に電子的に保存可能な配列データの形態であり得る。スクリーニングのためのプローブとして、特に、配列番号３もしくは配列番号４の相補鎖またはこれらの配列の断片の相補鎖に相当するヌクレオチド配列が用いられ得る。これらのプローブの配列は、遺伝暗号の縮重の範囲内で異なってよく、水素結合能を高めるために、タンパク質をコードする核酸中に天然に生じないイノシン等のヌクレオシドを含んでもよい。
【００３９】
スクリーニングは、配列番号１、配列番号２、またはこれらの配列の断片に相当するポリペプチドに対して作製された抗体を用いて行うこともできる。
【００４０】
本発明に係るポリペプチドは、比較的サイズが小さいため、化学的ペプチド合成法によって製造することができる（実施例１）。これは、例えばB. Merrifieldに従う公知の固相法の使用を含み得る。合成は、ＦｍｏｃまたはＢｏｃ保護基戦略を用いて、自動ペプチド合成装置の助けを借りるかまたは手作業で行われ得る。より小さな断片を後から繋ぎ合わせることでポリペプチドを合成することができる。
【００４１】
本発明に係るポリペプチドの製造は、種々の受容生物および受容細胞中においての好適な核酸コンストラクトの異種発現によりなされてもよい。必要な遺伝子操作の方法は、Sambrook and Russell 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NJに記載されている。原核生物のシステム（例えば、大腸菌または蛍光菌）または真核生物のシステム（例えば、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞）を用いることができる。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に係るポリペプチドを切り分けるために特異的プロテアーゼ認識配列が付与された、チオレドキシンおよびヘキサヒスチジン配列との融合ポリペプチドとして、大腸菌中で調製が行われる（実施例２、３、および４）。
【００４３】
異種発現により得られる本発明に係るポリペプチドは、複数の公知の方法により、遺伝子操作された生物または細胞の細胞溶解物または上清から精製することができる。特に好適な方法としては、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および逆相クロマトグラフィー（実施例３）が含まれる。
【実施例】
【００４４】
実施例１
ポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の合成による調製
配列番号１に係るアミノ酸配列を有するポリペプチドを完全に高分子担体樹脂上での固相合成により調製した。メタノール水溶液の上昇勾配を用いた逆相クロマトグラフィー（カラム：Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ；フィッシャーサイエンティフィック社（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））による生成物の分析により、本質的に均質なピークが得られ、純度は少なくとも８０％と想定することができた（図１）。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）による更なる分析中、主要な分子イオンはｍ／ｚ  ７４６．５０に観察され、これは１１回プロトン化された標的分子に相当する（図１）。
【００４５】
実施例２
大腸菌中におけるＬｓｅｒＦＣＰ１−７７およびＬｓｅｒＦＣＰ１−７３の組換え調製のためのプラスミドの構築
大腸菌中での異種発現のために、ポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の配列（配列番号１）をコードする合成遺伝子を作製した。コドン使用頻度は受容生物大腸菌Ｋ１２のものに合わせた。遺伝子合成は契約に基づきＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ社（Ａｎｚｉｎｇｅｒｓｔｒ．  ７ａ，  ８５５６０  Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により行われた。ベクターｐＡＳＫ−ＩＢＡ３３ｐｌｕｓへの挿入を可能にする更なる配列をコード配列の５’末端および３’末端に付加した。したがって、この完全に合成的に製造されたポリヌクレオチドは、配列番号４に示される配列を有した。この合成遺伝子を、２つのＢｓａｌ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を用いて方向付けてベクターｐＡＳＫ−ＩＢＡ３３ｐｌｕｓに挿入した。このようにして得られたコンストラクトを大腸菌細胞のＴＯＰ１０株およびＢＬ２１株の形質転換に用いた。
【００４６】
ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３３ｐｌｕｓに基づくコンストラクトから進めた更なる実験で、合成遺伝子をベクターｐＥＴ−３２ａ（＋）に再クローニングした。再クローニングを行って、チオレドキシン、ヘキサヒスチジン配列、プロテアーゼ認識配列、およびポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７からなる融合ポリペプチドをコードするプラスミドを得た。このプラスミドの２つのバリアントを作製した。一方は、コードされる認識配列がエンテロキナーゼに特異的であり、他方は、凝固第Ｘａ因子に特異的であった。そのため、それらのプラスミドをｐＥＴ−３２−ＦＣＰ−ＥＫおよびｐＥＴ−３２−ＦＣＰ−Ｘａと命名した。
【００４７】
これらのプラスミドの構築のために、合成遺伝子をＰＣＲで増幅し、新規ベクターへの挿入に必要な付加配列をプライマーを用いて付加した。ｐＥＴ−３２− ＦＣＰ−ＥＫは、ＫｐｎＩ制限酵素部位、連結配列、エンテロキナーゼ認識配列をコードする配列、およびポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の第１アミノ酸残基をコードする特異的配列からなるフォワードプライマー１を用いて構築した。ｐＥＴ−３２−ＦＣＰ−Ｘａは、ＫｐｎＩ制限酵素部位、連結配列、第Ｘａ因子認識配列をコードする配列、およびポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の第１のアミノ酸残基をコードする特異的配列からなるフォワードプライマー２を用いて構築した。両方のコンストラクトで、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位、終止コドン、およびポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７最後のアミノ酸残基をコードする特異的配列からなるリバースプライマー３を用いた。
【００４８】
プライマー１（フォワード）：
５’−ｔｇａｇｇｔａｃｃｇａｃｇａｃｇａｃｇａｃａａｇｃａｇｃａｔｇｇｃｔａｔｇｇａｇｃｇｇ−３’
プライマー２（フォワード）：
５’−ｔｇａｇｇｔａｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｃｔｃｃｇｇｔａｔｔｇａｇｇｇｔｅｇｃｃａｇｅａｔｇｇｃｔａｔｇｇａｇｃｇｇ−３’
プライマー３（リバース）：
５’−ｔｃａｇａａｔｔｅｔｔａａｔａｃｃｃｇｔｇｅｇａｔｔｔｇｔａｇ−３’
【００４９】
ＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を介してベクターｐＥＴ−３２ａ（＋）に挿入し、得られたコンストラクトを、ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社／メルク社）の大腸菌細胞の形質転換に用いた。形質転換細胞の同定は、アンピシリン含有栄養培地上での選択によってなされた。使用した大腸菌株はそのゲノムＤＮＡ中に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にある溶原性ラムダファージを含む。発現プラスミド上でＴ７プロモーター制御下にあるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現およびしたがって外来遺伝子の発現は、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導される。誘導の後から種々の時点における対応する融合ポリペプチドの形成をＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびその後のクーマシーブルー染色により検出した（図２）。
【００５０】
実施例３
大腸菌中での組換えポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の生産
ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社／メルク社）の大腸菌細胞を、実施例２に記載したように構築したプラスミドｐＥＴ−３２−ＦＣＰ−Ｘａで形質転換し、３００ｍｇ／ｌのアンピシリンを追加したＬＢ培地４００ｍＬをそれぞれ含む６個の１リットルバッフル付き三角フラスコ中、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら培養した。濁度測定による測定で６００ｎｍの吸光度の値が０．４に達した後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して誘導を行った。培養を３時間続けた後、細菌細胞を遠心により回収した（１０，０００×ｇ、１０分、４℃）。ペレットを２００ｍｌのバッファーＡ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、高圧ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ  Ｍ  １１０ＰＳ、マイクロフルイディクス社（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）；３０  Ｏｓｓｉｐｅｅ  Ｒｏａｄ，  Ｎｅｗｔｏｎ，  ＭＡ  ０２４６４  Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて剪断力により細胞を溶解した。遠心（７０，０００×ｇ、３０分、４℃）後、上清を０．２２ｍｍメンブレンでろ過した。細胞溶解物を４ｍｌ／分の流速で、Ｃｏ２＋イオンがローディングされた固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーカラム（１６×１００ｍｍ、ＴＡＬＯＮ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｒｅｓｉｎ、クロンテックラボラトリーズ社；１２９０  Ｔｅｒｒａ  Ｂｅｌｌａ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ  ９４０４３，Ｕ．Ｓ．Ａ．）にチャージした。カラムは予めバッファーＡで平衡化しておいた。サンプルをチャージした後、２８０ｎｍでの検出が一定の値になるまでカラムをバッファーＡで洗浄した。溶出は、イミダゾールを含むバッファーＡの３０ｍＭから１００ｍＭのステップ勾配で行った。融合ポリペプチドの主な量は、１００ｍＭイミダゾールステップで溶出された。ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびその後のクーマシーブルー染色による分析の結果、純度は９０％超であった（図３）。
【００５１】
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ  ２６／１０、ＧＥヘルスケア社；Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）により融合ポリペプチドを１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中で再度緩衝した。１０マイクログラムの融合ポリペプチドを、５００単位の第Ｘａ因子（メルク社）が入った１０ｍｌの切断バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中、室温で１６時間インキュベートした。反応産物を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８で平衡化した強力なイオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ  ５／５０  ＧＬ、ＧＥヘルスケア社）に流速１ｍｌ／分でチャージし、カラムを同じバッファーで洗浄した。溶出は、０から３００ｍＭのＮａＣｌの勾配を用いて２０分間かけて行った。切断産物として得られ、１１分に溶出された、ポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７が、残りのポリペプチド成分から完全に分離されていることが、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析により示された（図４）。クロマトグラムにおける対応するピークは、紫外吸収によってのみ見ることができ、蛍光測定では見ることができなかった。これは、ポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７のアミノ酸配列中にトリプトファン残基がないことによって説明することができる。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析では、ＬｓｅｒＦＣＰ１−７７は、予想される８．２ｋＤａではなく明確な３０ｋＤａの分子量を示した。この典型的でない電気泳動的挙動はおそらく、ポリペプチドへのＳＤＳ分子の結合が効果的でないことにより説明される。ＥＳＩ質量分析装置（ａｍａＺｏｎ  ＥＴＤ、ブルカー・ダルトニクス社；Ｆａｈｒｅｎｈｅｉｔｓｔｒ．  ４，Ｄ−２８３５９  Ｂｒｅｍｅｎ）に直接注入する逆相クロマトグラフィー（カラム：ＢｉｏＢａｓｉｃ  ８、２×１５０ｍｍ、ダイオネクス社；勾配：０．１％ギ酸を含む１０〜８０％アセトニトリル水溶液）により、ポリペプチドのアイデンティティーを確認した。ｍ／ｚ  ６８４に観察された主要な分子イオンは、１２回プロトン化された標的分子に相当した（図５）。
【００５２】
実施例４
大腸菌中における組換えポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７３の生産
ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社／メルク社）の大腸菌細胞を、実施例２に記載したように構築したプラスミドｐＥＴ−３２−ＦＣＰ−ＥＫで形質転換した。細胞培養および細胞溶解物の処理は、融合ポリペプチドの切断に０．１単位のエンテロキナーゼ（ノバジェン社）を用いたこと以外は実施例３の操作と同様に行った。この場合にも、陰イオン交換クロマトグラフィーにより標的分子を分離することができた（図６）。しかし、質量分析（ｍｉｃｒＯＴＯＦ  ＩＩ、ブルカー・ダルトニクス社、Ｆａｈｒｅｎｈｅｉｔｓｔｒ．  ４，  Ｄ−２８３５９  Ｂｒｅｍｅｎ）により、予想されるポリペプチドＬｓｅｒＦＣＰ１−７７は形成されなかったことが示された（図６）。データは、形成されたポリペプチドが分子量７７５５ＤａのＬｓｅｒＦＣＰ１−７３であったことを明確に示ししていた。これは、おそらくはエンテロキナーゼの非特徴的活性により、ＬｓｅｒＦＣＰ１−７７配列の最後の４アミノ酸残基が切断されたことにより説明されると考えられる。
【００５３】
実施例５
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍに対するＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の活性の決定
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ（ＩＦＡ  ６５株）
供給源：Ｉｎｔｅｒｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｕｌｌｎ，  Ａｕｓｔｒｉａ
参照文献：Steiner B, Kurz H, Lemmens M, Buerstmayr H. Differential gene expression of related wheat lines with contrasting levels of head blight resistance after Fusarium graminearum inoculation. Theor Appl Genet. 2009 Feb; 118(4): 753-64
【００５４】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍを胞子形成までＳＮＡ寒天プレート上、室温で培養した。胞子をプレートから水で流し取り、２０，０００胞子／ｍｌの密度に調整し、その後の使用まで４℃で保存した。試験を行うために、９６ウェルのマイクロタイトレーション用プレートのウェル中で、それぞれ０．０５ｍｌの胞子懸濁液をそれぞれ０．０５ｍｌの様々の濃度のＬｓｅｒＦＣＰ１−７７溶液と混合した。室温で２４時間インキュベートした後、４倍および１０倍の拡大率の対物レンズを用いて顕微鏡で胞子の発芽を調べた。結果を写真で示した（図７）。発芽胞子と非発芽胞子の比率をカウントし、得られたデータを用いて用量効果関係をグラフで表した（図８）。このようにして確立された、最大数の半数に発芽阻害が生じた濃度は１．６μＭであった。更に、発芽胞子によって形成された菌糸の長さを、阻害の半定量的尺度として観察した（図７）。
【００５５】
実施例６
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍに対するＬｓｅｒＦＣＰ１−７３の活性の決定
実施例５に記載の試験システムを用いて、水対照と比しての濃度１００μＭにおけるＬｓｅｒＦＣＰ１−７３の有効性が確定された。ＬｓｅｒＦＣＰ１−７３による胞子発芽の完全な阻害が観察された（図９）。
【００５６】
実施例７
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対するＬｓｅｒＦＣＰ１−７７の活性の決定
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ（単離株３２９）
供給源：ＩＮＲＡ（ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ）、フランス
参照文献：Keller H, Pamboukdjian N, Ponchet M, Poupet A, Delon R, Verrier JL, Roby D, Ricci P. Pathogen-induced elicitin production in transgenic tobacco generates a hypersensitive response and nonspecific disease resistance. Plant Cell. 1999 Feb; 11(2): 223-35
【００５７】
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａをＲｙｅ  Ｂ寒天プレート上で２５℃にて８日間培養した。胞子嚢を水で洗い流し、得られた胞子嚢懸濁液を４℃で４時間インキュベートして遊走子の形成を誘導した。ＲＰＭＩ  １６４０培地中での１：５０希釈後、胞子密度を測定し、２０，０００胞子／ｍｌに調整した。実施例５に記載の方法を用いて試験を更に実施した。この結果もグラフで示した（図１０）。
【００５８】
配列表
アミノ酸はＩＵＰＡＣの命名法に従い以下のように略した。
アラニン  Ａ、アルギニン  Ｒ、アスパラギン  Ｎ、アスパラギン酸  Ｅ、システイン  Ｃ、グルタミン酸  Ｄ、グルタミン  Ｑ、グリシン  Ｇ、ヒスチジン  Ｈ、イソロイシン  Ｉ、ロイシン  Ｌ、リジン  Ｋ、メチオニン  Ｍ、フェニルアラニン  Ｆ、プロリン  Ｐ、セリン  Ｓ、スレオニン  Ｔ、トリプトファン  Ｗ、チロシン  Ｙ、バリン  Ｖ
【００５９】
配列番号１−ＬｓｅｒＦＣＰ１−７７
ＱＨＧＹＧＡＧＧＨＧＱＱＧＹＧＳＱＨＳＳＨＡＰＱＧＧＨＶＶＲＥＱＧＦＳＧＨＶＨＥＱＱＡＧＨＨＨＥＡＧＨＨＥＱＡＧＨＨＥＱＳＧＱＱＶＨＧＱＧＨＧＹＫＳＨＧＹ
配列番号２−ＬｓｅｒＦＣＰ１−７３
ＱＨＧＹＧＡＧＧＨＧＱＱＧＹＧＳＱＨＳＳＨＡＰＱＧＧＨＶＶＲＥＱＧＦＳＧＨＶＨＥＱＱＡＧＨＨＨＥＡＧＨＨＥＱＡＧＨＨＥＱＳＧＱＱＶＨＧＱＧＨＧＹＫ
配列番号３−ＬｓｅｒＦＣＰ１−７７をコードするＬ．  ｓｅｒｉｃａｔａのｃＤＮＡ
５’−ＣＡＡＣＡＣＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＡＧＣＣＡＡＣＡＴＡＧＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＴＡＧＴＧＧＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＡＡＣＡＡＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＧＴＣＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＴＡＡＡＡＧＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴ−３’
配列番号４−ＬｓｅｒＦＣＰ１−７７をコードする、大腸菌に合わせたコドン使用頻度の合成遺伝子
クローニングのために付加された非コード配列セグメントを斜体で示す。
0006396330.tif 000002
【図１−１】
0006396330.tif 000003
【図１−２】
0006396330.tif 000004
【図２】
0006396330.tif 000005
【図３】
0006396330.tif 000006
【図４】
0006396330.tif 000007
【図５】
0006396330.tif 000008
【図６−１】
0006396330.tif 000009
【図６−２】
0006396330.tif 000010
【図７】
0006396330.tif 000011
【図８】
0006396330.tif 000012
【図９】
0006396330.tif 000013
【図１０】
0006396330.tif 000014
【配列表】
0006396330000001.app