(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病的な軟骨代謝回転を決定するための方法であって、
サンプル中で、哺乳動物軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質ＣＯＭＰの少なくとも１種のネオエピトープの存在を検出するステップであって、該少なくとも１種のネオエピトープが該哺乳動物ＣＯＭＰを切断することによって形成され、該少なくとも１種のネオエピトープの存在を検出するステップが、
該サンプルと単離された抗体とを接触させるステップであって、該単離された抗体が哺乳動物ＣＯＭＰを切断することによって形成されるネオエピトープに特異的に結合する上記ステップと、
該単離された抗体に基づいて、該サンプル中で、該少なくとも１種のネオエピトープの存在を検出するステップと
を含み、
該単離された抗体が
【表１】
0006389168.tif 000005
からなる群から選択されるＮ-末端ネオエピトープに特異的に結合し、
又は
該単離された抗体が
【表２】
0006389168.tif 000006
からなる群から選択されるＣ-末端ネオエピトープに特異的に結合する、
上記方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種のネオエピトープの検出に基づいて、病的な軟骨代謝回転と良性の軟骨代謝回転とを区別するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記病的な軟骨代謝回転が、変形性関節症、関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、心臓血管疾患、腱の疾患、骨粗鬆症、骨軟化症、骨折修復、動脈硬化症、強皮症、線維症の皮膚、外傷、及び関節の外傷からなる群から選択される疾患によって引き起こされる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが、軟骨サンプル、及び体液サンプルからなる群から選択される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記体液サンプルが、滑液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、及び尿サンプルの少なくとも一つから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質ＣＯＭＰを切断することにより形成された少なくとも１種のネオエピトープに特異的に結合する抗体の産生方法であって、
該哺乳動物ＣＯＭＰを切断することによって形成されるＮ−末端ネオエピトープに対応するＮ−末端アミノ酸配列を有するペプチド又は該哺乳動物ＣＯＭＰを切断することによって形成されるＣ−末端ネオエピトープに対応するＣ−末端アミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体を発生させるステップと、
Ｎ-末端ネオエピトープ又はＣ-末端ネオエピトープに特異的に結合する該抗体を単離するステップとを含み、
ここで該Ｎ-末端ネオエピトープが
【表３】
0006389168.tif 000007
からなる群から選択され、
及び該Ｃ-末端ネオエピトープが
【表４】
0006389168.tif 000008
からなる群から選択される、
上記方法。
【請求項７】
単離された抗体が、哺乳動物軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質ＣＯＭＰを切断することによって形成されるＮ−末端ネオエピトープに対応するＮ−末端アミノ酸を有するペプチドに特異的に結合し、該Ｎ-末端ネオエピトープが、
【表５】
0006389168.tif 000009
からなる群から選択され、
又は
単離された抗体が、哺乳動物軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質ＣＯＭＰを切断することによって形成されるＣ−末端ネオエピトープに対応するＣ−末端アミノ酸を有するペプチドに特異的に結合し、該Ｃ-末端ネオエピトープが、
【表６】
0006389168.tif 000010
からなる群から選択される、
上記単離された抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本実施形態は、一般的に、病的な軟骨代謝回転を決定、検出又はモニターすることに関し、特に、病的な軟骨代謝回転と良性の又は正常な軟骨代謝回転とを区別できる選択された軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の断片化ネオエピトープの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば軟骨分解などの組織分解を引き起こす病的状態が、主な医学的、社会的、及び経済的な問題となっている。６５歳を超える高齢者のうち、西欧諸国ではその人口の約５０％が関節炎を有する。組織分解過程は、その構成成分の破壊による組織の破壊を特徴とする。組織の構成成分は、ほとんどの場合はプロテアーゼなどの酵素により分解されるか、又は毒性化合物によって分解される。この理由のために、診断、疾患のモニター、処置などの目的での組織分解過程の決定は、多数の方法によって行うことができる。例えば関節炎の状態、動脈硬化症、変性性の関節の状態などの結合組織疾患における分解過程を決定する１つの方法は、結合組織成分の分解産物の形成及び存在の検出である。これは、例えば関節炎の状態などの関節病の診断で広く採用されている例えば組織の損失、炎症、自己免疫性の自己抗体の増加及び存在などの間接的な方法と比較して、分解過程の直接的な検出を可能にする。
【０００３】
従来、関節炎の臨床診断は、患者の病歴、身体検査、放射線写真、及び自己抗体を誘発する炎症の測定に基づいている。関節炎を有する患者の予後、処置、及び臨床転帰は、連続的な判断により査定される。しかしながら、軟骨変性を含む病的状態によって引き起こされる永続的な組織の損傷を最小化するためには、このような状態を初期段階で診断できるようにすることが重要である。したがって、この１０年間、病的な軟骨変性の早期発見を可能にする好適な生物学的なマーカーを発見しようとする努力がなされてきた。
【０００４】
これまでに、ＣＯＭＰの高い血清レベルが、関節リウマチにおける進行中の関節破壊と関連付けられている（Ｍａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ（１９９５）、９５巻、１０７７〜１０７７頁；Ｗｏｌｌｈｅｉｍら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９７）、３６巻、８４７〜８４９頁；Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９８）、３７巻、４６〜５０頁）。関節リウマチ及び他の形態の炎症性関節炎を有する患者からの滑液において、有意な量のＣＯＭＰのフラグメントが見出されている（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９７）、３６巻、１１５１〜１１６０頁）。
【０００５】
また、哺乳動物において関節炎の状態を予防及び／又は処置する医薬組成物を調製するためのＣＯＭＰ若しくはＣＯＭＰをコードする核酸配列を使用することも示唆されている（ＷＯ９８／４６２５３）。したがって、ＣＯＭＰは、様々な形態の関節炎を診断及び／又は処置する際の主要な化合物とみなすことができる。
【０００６】
ＣＯＭＰは、これまで軟骨代謝回転のマーカーとしてとして使用されてきた（Ｓａｘｎｅら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９２）、３１巻、５８３〜５９１頁）。Ｌａｉら（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（２０１２）、２０巻、８５４〜８６２頁）は、関節炎の進行をモニターするために血清ＣＯＭＰフラグメントを使用したサンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。彼らは、関節炎患者と関節炎ではない対照の対象との間に血清ＣＯＭＰレベルの差があること示している。
【０００７】
ネオエピトープの検出により組織分解過程を決定する方法は、ＷＯ２００５／１１６６５８に開示されており、それによれば、ＣＯＭＰのアミノ酸配列の６２５〜６２６のＣＯＭＰの切断後に出現するネオエピトープを使用している。
【０００８】
Ｓｏｄｅｒｌｉｎ  Ｍ．（２００３）の博士論文「スウェーデン南部における初期関節炎の集団ベースの研究。発生率、先に起こる感染、診断マーカー、及び経済的負担。（Ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｅａｒｌｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｓｗｅｄｅｎ．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ，ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｂｕｒｄｅｎ．）」、リンシェーピング大学分子臨床医学部（Ｌｉｎｋｏｐｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）において、ＣＯＭＰはマーカーとして使用されているが、異なる診断グループ間の統計学的差異をまったく示すことができず、患者の対照グループにおいてさえも１８％が高いＣＯＭＰレベルを有していた。
【０００９】
例えば関節炎などの疾患を診断及びモニターするために今日使用されている方法の結果は、正常な組織代謝回転に起因する高いバックグラウンドの結果として、疾患を有する患者と疾患ではない患者との間にかなりのオーバーラップを示す。
【００１０】
先行の方法及び技術に関する主な欠点は、これらは、正常な軟骨代謝回転に起因するバックグラウンドレベルが高いために、病的な軟骨代謝回転と正常な代謝回転とを区別できないことである。したがって、当技術分野においてなお向上の余地がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
全般的な目的は、サンプル中の病的な軟骨代謝回転を決定することである。
【００１２】
特定の目的は、病的な軟骨代謝回転と正常な又は良性の軟骨代謝回転との区別を可能にする方法及びツールを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これら及び他の目的は、本明細書において定義される実施形態によって満たされる。
【００１４】
本実施形態の態様は、病的な軟骨代謝回転を決定する方法に関する。本方法は、サンプル中で、哺乳動物軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の少なくとも１種のネオエピトープの存在を検出するステップを含む。少なくとも１種のネオエピトープは、配列番号１で定義された前記哺乳動物ＣＯＭＰのアミノ酸配列の77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）、710位（N710）〜711位（V711）；及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位又はそれらの任意の組み合わせで哺乳動物ＣＯＭＰを切断することによって形成される。本方法はまた、サンプル中で少なくとも１種のネオエピトープが検出される場合、病的な軟骨代謝回転の存在を決定するステップも含む。
【００１５】
本実施形態の他の態様は、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメントに関する。この態様において、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸７７であり、フラグメントは、配列番号１８のＣ末端から始まり配列番号１８のＮ末端に向かって伸長する配列番号１８の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸８８であり、フラグメントは、配列番号１９のＣ末端から始まり配列番号１９のＮ末端に向かって伸長する配列番号１９の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸９０であり、フラグメントは、配列番号２０のＣ末端から始まり配列番号２０のＮ末端に向かって伸長する配列番号２０の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸１０４であり、フラグメントは、配列番号２１のＣ末端から始まり配列番号２１のＮ末端に向かって伸長する配列番号２１の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸１９０であり、フラグメントは、配列番号２２のＣ末端から始まり配列番号２２のＮ末端に向かって伸長する配列番号２２の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸１９４であり、フラグメントは、配列番号２３のＣ末端から始まり配列番号２３のＮ末端に向かって伸長する配列番号２３の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸２２６であり、フラグメントは、配列番号２４のＣ末端から始まり配列番号２４のＮ末端に向かって伸長する配列番号２４の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸５３１であり、フラグメントは、配列番号２５のＣ末端から始まり配列番号２５のＮ末端に向かって伸長する配列番号２５の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸５５４であり、フラグメントは、配列番号２６のＣ末端から始まり配列番号２６のＮ末端に向かって伸長する配列番号２６の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸５７４であり、フラグメントは、配列番号２７のＣ末端から始まり配列番号２７のＮ末端に向かって伸長する配列番号２７の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸５７７であり、フラグメントは、配列番号２８のＣ末端から始まり配列番号２８のＮ末端に向かって伸長する配列番号２８の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸６５７であり、フラグメントは、配列番号２９のＣ末端から始まり配列番号２９のＮ末端に向かって伸長する配列番号２９の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸６９１であり、フラグメントは、配列番号３０のＣ末端から始まり配列番号３０のＮ末端に向かって伸長する配列番号３０の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸７１０であり、フラグメントは、配列番号３１のＣ末端から始まり配列番号３１のＮ末端に向かって伸長する配列番号３１の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、又は
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸７２５であり、フラグメントは、配列番号３２のＣ末端から始まり配列番号３２のＮ末端に向かって伸長する配列番号３２の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む。
【００１６】
本実施形態のさらなる態様は、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメントに関する。この態様において、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸７８であり、フラグメントは、配列番号３３のＮ末端から始まり配列番号３３のＣ末端に向かって伸長する配列番号３３の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸８９であり、フラグメントは、配列番号３４のＮ末端から始まり配列番号３４のＣ末端に向かって伸長する配列番号３４の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸９１であり、フラグメントは、配列番号３５のＮ末端から始まり配列番号３５のＣ末端に向かって伸長する配列番号３５の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸１０５であり、フラグメントは、配列番号３６のＮ末端から始まり配列番号３６のＣ末端に向かって伸長する配列番号３６の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸１９１であり、フラグメントは、配列番号３７のＮ末端から始まり配列番号３７のＣ末端に向かって伸長する配列番号３７の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸１９５であり、フラグメントは、配列番号３８のＮ末端から始まり配列番号３８のＣ末端に向かって伸長する配列番号３８の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸２２７であり、フラグメントは、配列番号３９のＮ末端から始まり配列番号３９のＣ末端に向かって伸長する配列番号３９の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸５３２であり、フラグメントは、配列番号４０のＮ末端から始まり配列番号４０のＣ末端に向かって伸長する配列番号４０の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸５５５であり、フラグメントは、配列番号４１のＮ末端から始まり配列番号４１のＣ末端に向かって伸長する配列番号４１の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸５７５であり、フラグメントは、配列番号４２のＮ末端から始まり配列番号４２のＣ末端に向かって伸長する配列番号４２の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸５７８であり、フラグメントは、配列番号４３のＮ末端から始まり配列番号４３のＣ末端に向かって伸長する配列番号４３の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸６５８であり、フラグメントは、配列番号４４のＮ末端から始まり配列番号４４のＣ末端に向かって伸長する配列番号４４の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸６９２であり、フラグメントは、配列番号４５のＮ末端から始まり配列番号４５のＣ末端に向かって伸長する配列番号４５の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸７１１であり、フラグメントは、配列番号４６のＮ末端から始まり配列番号４６のＣ末端に向かって伸長する配列番号４６の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、又は
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸７２６であり、フラグメントは、配列番号４７のＮ末端から始まり配列番号４７のＣ末端に向かって伸長する配列番号４７の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む。
【００１７】
本実施形態のさらなる他の態様は、少なくとも１種の哺乳動物ＣＯＭＰのネオエピトープに対する抗体の産生に使用されるように構成されたコンジュゲートに関する。少なくとも１種のネオエピトープは、配列番号１で定義された哺乳動物ＣＯＭＰのアミノ酸配列の77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）、710位（N710）〜711位（V711）；及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位又はそれらの組み合わせで哺乳動物ＣＯＭＰを切断することによって形成される。本コンジュゲートは、ペプチド担体にカップリングした、又はペプチド担体と混合した、上記に係る少なくとも１つの単離されたＣ末端短縮フラグメント、及び／又は上記に係る少なくとも１つの単離されたＮ末端短縮フラグメントを含む。
【００１８】
本実施形態のさらなる態様は、配列番号１で定義された哺乳動物ＣＯＭＰのアミノ酸配列の77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）、710位（N710）〜711位（V711）；及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位又はそれらの組み合わせで哺乳動物ＣＯＭＰを切断することにより形成された少なくとも１種のネオエピトープに特異的に結合する抗体を産生するための、上記に係る単離されたＣ末端短縮フラグメント、上記に係る単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又は上記に係るコンジュゲートの使用に関する。
【００１９】
本実施形態のさらにその他の態様は、配列番号１で定義された哺乳動物ＣＯＭＰのアミノ酸配列の77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）、710位（N710）〜711位（V711）；及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位又はそれらの組み合わせで哺乳動物ＣＯＭＰを切断することにより形成された少なくとも１種のネオエピトープに特異的に結合する抗体の産生方法に関する。本方法は、上記に係る単離されたＣ末端短縮フラグメント、上記に係る単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又は上記に係るコンジュゲートに対する抗体を発生させるステップと、抗体を単離するステップとを含む。
【００２０】
本実施形態のさらなる態様は、上記に係る単離されたＣ末端短縮フラグメント、上記に係る単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又は上記に係るコンジュゲートに対する単離された抗体に関する。単離された抗体は、配列番号１で定義された哺乳動物ＣＯＭＰのアミノ酸配列の77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）、710位（N710）〜711位（V711）；及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位又はそれらの組み合わせで哺乳動物ＣＯＭＰを切断することにより形成された少なくとも１種のネオエピトープに特異的に結合する。
【００２１】
本実施形態の関連する態様は、病的な軟骨代謝回転の決定で使用するための上記に係る単離された抗体を定義する。
【００２２】
本実施形態は、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象からのサンプル中の病的な軟骨代謝回転の存在を決定したり、又は検出したりすることができる。より詳細には、本実施形態は、正常で健康な個体と、病的な軟骨を有する個体からの正常な軟骨代謝回転及び疾患によって引き起こされるＣＯＭＰ代謝回転とを区別するのに使用できる。
【００２３】
本実施形態は、添付の図面と一緒に以下の説明を参照することにより、それらのさらなる目的及び利点と共に最もよく理解することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＣＯＭＰの切断抗体の力価を示す図である。
【図２】切断ネオエピトープを含有する滑液に放出されたＣＯＭＰフラグメントのアッセイの結果を示す図である。
【図３】検出のためにネオエピトープ抗体を使用した、ＰＥＧ６０００で沈殿した滑液サンプルのウェスタンブロットによる分析を示す図である。
【図４】ＰＥＧ６０００で沈殿した滑液のＭＲＭ分析を使用したネオエピトープの検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本実施形態は、一般的に、病的な軟骨代謝回転を決定、検出又はモニターすることに関する。本実施形態は、特に、病的な軟骨又は病原性の軟骨代謝回転に特異的な哺乳動物軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の特殊なネオエピトープの使用に関する。
【００２６】
したがって、本実施形態のネオエピトープは、病的な軟骨代謝回転を引き起こす疾患に罹患した対象、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象と、正常な軟骨代謝回転を有する対象とを区別できる。
【００２７】
また正常な軟骨代謝回転は、本明細書では、良性又はバックグラウンドの軟骨代謝回転とも称される。このような良性の軟骨代謝回転は、一般的には全ての軟骨組織で起こっており、負荷及び環境に対するこれらの組織の正常な適応の一環である。したがって、この良性の軟骨代謝回転は、有害な組織破壊又は疾患に起因するのではなく、むしろ対象において起こる自然の過程である。
【００２８】
背景の章で論じられたＣＯＭＰ及びＣＯＭＰネオエピトープを使用する従来技術は、正常な良性の軟骨代謝回転と病的な軟骨代謝回転とを区別できないことに関する短所を有する。例えば、Ｓａｘｎｅら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９２）、３１巻、５８３〜５９１頁、及びＬａｉら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（２０１２）、２０巻、８５４〜８６２頁は、対照の対象においてさえもバックグラウンドシグナルを検出している。これらの従来技術とは明らかに異なり、本実施形態は、正常な軟骨破壊中に存在しない所定のネオエピトープを利用する。したがって、これらの固有なネオエピトープは、病的な軟骨代謝回転又は破壊を検出又はモニターするための極めて優れたツールを提供する。さらに、ＷＯ２００５／１１６６５８は、組織分解過程を決定するために、ＣＯＭＰのアミノ酸配列の６２５〜６２６のＣＯＭＰの切断後に出現するネオエピトープを使用している。しかしながら、ＷＯ２００５／１１６６５８に記載のネオエピトープは、正常なＣＯＭＰ又は軟骨代謝回転と病的なＣＯＭＰ又は軟骨代謝回転とを区別するのに使用できない。したがって、ＷＯ２００５／１１６６５８に記載のネオエピトープは、一般的には組織分解を決定するのに使用され、病的な軟骨代謝回転の特定のモニターには使用できない。
【００２９】
関節病及び組織破壊を診断及びモニターするための一般的なエピトープを標的とする体液中のＣＯＭＰの近年におけるアッセイに関連する１つの問題は、とりわけ全ての軟骨組織において負荷及び環境に対するこれらの組織の正常な適応の一環であるバックグラウンドの代謝回転が存在することである。結果として、疾患において特定の関節軟骨で起こる破壊の増加は、正常な代謝回転をバックグラウンドとしてしか観察することができない。したがって、このような増加は、既存のレベルよりも上の部分だけである。しかしながら、病的なものと正常に存在するものとを区別するフラグメントを同定することが望ましい。本明細書に記載の実施形態は、正常な軟骨代謝回転には存在しないネオエピトープに的を絞ることによりこの問題を解決する。
【００３０】
したがって、本発明者らは、驚くべきことに、病的な軟骨代謝回転中に、正常な軟骨代謝回転中には存在しない特異的な切断部位が存在することを示した。これは、正常な場合にはＣＯＭＰ上に露出しない新しいエピトープが、病的な軟骨代謝回転を引き起こす疾患に罹患した対象においてタンパク質切断後に出現することを意味する。しかしながら、これらの新しいエピトープ又はネオエピトープは、良性の軟骨代謝回転しか示さない健康な対象では形成されない。それゆえに、本実施形態のこれらの新しいネオエピトープは、疾患における病的な軟骨代謝回転を決定、検出、及びモニターするために改善された方法及び技術で使用することが可能である。
【００３１】
本明細書において、病的な／良性の軟骨代謝回転及び病的な／良性のＣＯＭＰは同じ意味で使用され、どちらも軟骨が破壊されてＣＯＭＰの血清レベルの増加を引き起こす病的／正常な過程を伴う。
【００３２】
本実施形態は、病的な軟骨又はＣＯＭＰ代謝回転を決定、測定又はモニターする方法を開示する。検出、測定又はモニターされた特異的な断片化からのネオエピトープは、正常な代謝回転の結果として存在しないことが本実施形態の特徴であり、この特徴により、正常な代謝回転と疾患における代謝回転とを区別することが可能になる。これは、これらに限定されないが、変形性関節症（ＯＡ）、関節リウマチ（ＲＡ）、反応性関節炎（ＲｅＡ）、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、心臓血管疾患、腱の疾患、骨粗鬆症、骨軟化症、骨折修復、動脈硬化症、強皮症、線維症の皮膚、又は関節の外傷のような外傷等の疾患を診断する場合、有用なツールである。
【００３３】
本実施形態のネオエピトープは、正常な非疾患個体に実質的に存在しないため、これは、疾患経過の新規の初期の診断を可能にすると予想される。それゆえに、本実施形態は、病的な軟骨代謝回転を検出又はモニターする方法に関し、さらにこの方法を、病的な代謝回転を有する患者と、正常な軟骨代謝回転を有する非罹患個体とを区別するのに使用することにも関する。本方法は、サンプル中で、特異的なＣＯＭＰ断片化ネオエピトープの存在を検出又はモニターするステップを含む。これは、患者内の疾患の進行を長期的に追跡するのに使用できる疾患の経過の新規の初期の診断をもたらすと予想される。また本実施形態は、考えられる様々な処置に対する有効性を追跡するのにも使用できる。
【００３４】
したがって、病的な軟骨代謝回転を引き起こす疾患に罹患した対象において、本実施形態のネオエピトープは、特異的な位置でＣＯＭＰのアミノ酸配列（配列番号１）を切断することにより形成される。本明細書で使用されるネオエピトープ（Ｎｅｏｐｅｔｉｏｐｅ）は、正常にはＣＯＭＰ上に露出しないがタンパク質切断によるタンパク質変化の後に出現するエピトープである。ネオエピトープ（ｎｅｏｐｉｔｏｐｅ）は、例えば、切断後に出現したＣＯＭＰフラグメントの一次、二次及び／又は三次構造によって形成できる。
【００３５】
以下に示す配列はヒトＣＯＭＰからの配列であるが、本実施形態はまた、例えばウマ、イヌ、マウス、ラット、モルモット、及び霊長類などのヒト以外の哺乳動物対象も包含する。これらのヒト以外の哺乳動物からのＣＯＭＰ配列はヒトＣＯＭＰと類似しているため、ヒトＣＯＭＰ中のネオエピトープに対する抗体は、ヒト以外の哺乳動物ＣＯＭＰ中の対応するネオエピトープと交差反応する可能性があり、逆もまた同様である。
【００３６】
ヒトＣＯＭＰの配列を以下に示すが、配列番号１でも確認できる。
【化１】
0006389168.tif 000002
【００３７】
本実施形態は、サンプル中で、本明細書で示された特異的なＣＯＭＰ断片化ネオエピトープの存在を検出又はモニターするステップを含む、病的な代謝回転と正常な軟骨代謝回転とを区別する方法を開示する。これらのネオエピトープを検出又はモニターするために、これらに限定されないが、例えば多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、ＥＬＩＳＡ又は当業界で知られているその他の任意の好適なイムノアッセイなどの可能性のある任意の方法を使用できる。
【００３８】
本実施形態はさらに、切断によって作製された特異的なネオエピトープ及びこれらの新規のネオエピトープに対する抗体を開示する。
【００３９】
本発明者らは、驚くべきことに正常な軟骨破壊ではネオエピトープが存在しないか又は有意に低いレベルでしか検出されないというＣＯＭＰの新しい切断部位（配列番号１）を開示する。これは、実際に疾患と非疾患とを区別するための固有なツールを提供する。
【００４０】
病的な軟骨代謝回転中に存在するが正常な軟骨代謝回転中には存在しないＣＯＭＰの特異的な切断ネオエピトープは、77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）；710位（N710）〜711位（V711）及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位でＣＯＭＰを切断することにより形成される。
【００４１】
したがって、本実施形態の態様は、病的な軟骨代謝回転を決定する方法に関する。本方法は、サンプル中で、少なくとも１種の哺乳動物ＣＯＭＰ、好ましくはヒトＣＯＭＰのネオエピトープの存在を検出するステップを含む。少なくとも１種のネオエピトープは、配列番号１で定義された哺乳動物ＣＯＭＰの、好ましくはヒトＣＯＭＰのアミノ酸配列の77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）、710位（N710）〜711位（V711）；及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位及びそれらの任意の組み合わせで哺乳動物ＣＯＭＰ、好ましくはヒトＣＯＭＰを切断することによって形成される。本方法はまた、サンプル中で少なくとも１種のネオエピトープが検出される場合、病的な軟骨代謝回転の存在を決定するステップも含む。
【００４２】
したがって、上記で定義したＣＯＭＰを特異的な切断部位で切断することにより形成される少なくとも１つのネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｔｉｏｐｅ）の存在は、サンプル中における病的な軟骨及びＣＯＭＰ代謝回転のインジケーターである。
【００４３】
この態様の変形は、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象において病的な軟骨代謝回転を検出する方法に関する。本方法は、哺乳動物対象からのサンプルを、本実施形態に係る哺乳動物ＣＯＭＰの少なくとも１種のネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｔｉｏｐｅ）に特異的に結合する少なくとも１種の抗体と接触させるステップを含む。本方法はまた、サンプル中で、少なくとも１種の抗体に基づいて、少なくとも１種のネオエピトープの存在を検出するステップも含む。この方法において、少なくとも１種のネオエピトープの存在は、哺乳動物対象が、軟骨代謝回転を有するか、又は軟骨代謝回転に罹患していることを指し示す。
【００４４】
この態様の他の変形は、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象において病的な軟骨代謝回転を検出する方法に関する。本方法は、哺乳動物対象からのサンプルを、本明細書において定義される哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント若しくは本明細書において定義される哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメントに対する少なくとも１種の抗体、本明細書において定義されるコンジュゲート、又はそれらの任意の組み合わせと接触させるステップを含む。本方法はまた、サンプル中で、及び少なくとも１種の抗体に基づいて、本明細書において定義される哺乳動物ＣＯＭＰを切断することにより形成された少なくとも１種のフラグメントの存在を検出するステップも含む。この方法において、少なくとも１種のフラグメントの存在は、哺乳動物対象が、軟骨代謝回転を有するか、又は軟骨代謝回転に罹患していることを指し示す。
【００４５】
この態様のさらに他の態様は、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象において病的な軟骨代謝回転を検出する方法に関する。本方法は、哺乳動物対象からのサンプルを、哺乳動物ＣＯＭＰのネオエピトープに対する少なくとも１種の抗体と接触させるステップを含む。ネオエピトープは、配列番号１で定義された哺乳動物ＣＯＭＰの、好ましくはヒトＣＯＭＰのアミノ酸配列の77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）、710位（N710）〜711位（V711）；及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位又はそれらの任意の組み合わせで哺乳動物ＣＯＭＰ、好ましくはヒトＣＯＭＰを切断することによって形成される。本方法はまた、サンプル中で、及び少なくとも１種の抗体に基づいて、ネオエピトープの存在を検出するステップも含む。この方法において、ネオエピトープの存在は、哺乳動物対象が、軟骨代謝回転を有するか、又は軟骨代謝回転に罹患していることを指し示す。
【００４６】
一実施形態において、検出ステップは、イムノアッセイによって実行される。このイムノアッセイは、好ましくは多重反応モニタリング（ＭＲＭ）及び／又は酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）である。
【００４７】
特定の実施形態において、本方法はまた、サンプル中で検出された少なくとも１つのネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｔｉｏｐｅ）に基づいて、病的な軟骨代謝回転と良性の軟骨代謝回転とを区別するステップも含む。したがって、サンプル中で少なくとも１種のネオエピトープが検出される場合、又は閾値を超える量若しくは濃度で検出される場合、そのような軟骨代謝回転はいずれも、病的な軟骨代謝回転に起因すると決定される。それに対応して、サンプル中で本実施形態のネオエピトープが検出されない場合、又は極めて低い量若しくは濃度、すなわち閾値未満の量若しくは濃度でしか検出されない場合、そのような軟骨代謝回転はいずれも、良性の軟骨代謝回転に起因すると決定される。
【００４８】
したがって、病的な軟骨代謝回転と良性の軟骨代謝回転とを区別することは、一実施形態において、サンプル中で検出された少なくとも１種のネオエピトープの量が閾値を超える場合、病的な軟骨代謝回転の存在を決定することを含む。それに対応して、少なくとも１種のネオエピトープの量が閾値を超えない場合、又はサンプル中でこのようなネオエピトープが検出されない場合、良性の軟骨代謝回転の存在が決定される。
【００４９】
上記に係る特定の実施形態で使用される閾値は、病的な軟骨代謝回転を引き起こす疾患と診断された患者グループ中の少なくとも１種のネオエピトープ（ｎｅｏｐｉｔｏｐｅ）の量を測定すること、及び任意選択で健康な対象を含む対照グループ中の少なくとも１種のネオエピトープの量も測定することによって決定できる。
【００５０】
一実施形態において、病的な軟骨代謝回転は、変形性関節症、関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、心臓血管疾患、腱の疾患、骨粗鬆症、骨軟化症、骨折修復、動脈硬化症、強皮症、線維症の皮膚、及び関節の外傷のような外傷からなる群から選択される疾患によって引き起こされる。
【００５１】
本方法で使用されるサンプルは、好ましくは、軟骨サンプル、並びに滑液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、及び尿サンプルのような体液サンプルからなる群から選択される。
【００５２】
一実施形態において、少なくとも１種のネオエピトープの存在を検出するステップは、サンプルと本実施形態に係る抗体とを接触させるステップを含み、これは、本明細書においてさらに説明される。サンプル中の少なくとも１種のネオエピトープの存在は、抗体に基づいて検出される。この実施形態において、病的な軟骨代謝回転の存在を決定するステップは、サンプル中で検出された少なくとも１種のネオエピトープの存在に基づいて、病的な軟骨代謝回転の存在を決定するステップを含む。
【００５３】
本実施形態の任意のネオエピトープの存在は、タンパク質フラグメントを検出することに関する分野において公知の様々な技術に従って決定できる。非限定的な、ただし好ましいこのような技術としては、本実施形態に係るネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｔｉｐｅ）に特異的に結合する抗体を使用して、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって、サンプル中で、少なくとも１種のネオエピトープを検出することが挙げられる。
【００５４】
特定の実施形態において、本方法はまた、サンプルから哺乳動物ＣＯＭＰを単離するステップも含む。これは、例えば本明細書でさらに開示されている技術などの様々な技術に従って行うことができる。したがって、例えばＣＯＭＰの親和性の強化は、アフィニティーカラム及び抗ＣＯＭＰ抗体を使用して行うことができる。
【００５５】
本方法は、特定の実施形態において、本実施形態のいずれかのネオエピトープ（ｎｅｏｐｅｉｔｏｐｅ）の存在を検出する前に、消化酵素により単離されたＣＯＭＰを処置するステップをさらに含む。単離されたＣＯＭＰを処理するのに使用される消化酵素は、好ましくは、トリプシン、キモトリプシン、及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎからなる群から選択される。消化酵素により単離されたＣＯＭＰを処理して、ＣＯＭＰフラグメントのサンプルを産生する。次いでネオエピトープの検出は、好ましくは、ＣＯＭＰフラグメントのサンプルで行われる。
【００５６】
以下に、本実施形態に係るＣＯＭＰ中のネオエピトープの同定に関する議論を記載する。
【００５７】
ＣＯＭＰ中のネオエピトープの同定
軟骨サンプル及び滑液サンプルの両方に対して、ＣＯＭＰ（配列番号１）中のネオエピトープの同定を以下で説明するようにして行った。また例えば血液、血清などの他のサンプル源でもよい。本実施形態の目的は疾患と非疾患とを区別することであるため、正常な軟骨代謝回転中に存在するネオエピトープを除外した。
【００５８】
軟骨サンプル
この例では、３つの患者グループ及び１つの参照グループからの軟骨を研究した：
グループ１：関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者であり、その関節軟骨組織は、関節置換（臀部及び膝）のための外科手術のときに入手し、以下このような患者をＲＡ患者と呼ぶ。
【００５９】
グループ２：変形性関節症（ＯＡ）を有する患者であり、その軟骨は、主に臀部軟骨の関節置換（後期ＯＡ）のための外科手術のときに入手し、以下このような患者をＯＡ患者と呼ぶ。
【００６０】
グループ３：臨床的に健康な関節を有するが、脚の一部の近位に癌があるために膝の上で切断しなければならない患者である。膝は、腫瘍の影響を受けていない。５５〜７５歳の範囲の数人の患者は、肉眼での調査では（場合によっては顕微鏡で検証）正常な膝関節軟骨を有する。同じ年齢範囲のうち数人の個体は、単一の線維化領域を有する。以前のこれらの関節からの軟骨の研究において、本発明者らは、この軟骨においてマトリックスタンパク質合成及び全体の組成に極めて明らかな変化がみられたこと、さらにこれらの変化は、大規模な組織破壊を起こすＯＡ後期に特徴的な変化と同じ特徴を有すること、それゆえにこれらの変化は、過程の初期段階の典型であることを示してきた。そこで本発明者らは、細胞外マトリックス分子の分解に的を絞って分子の変化を同定するために、このような軟骨中の部位からのサンプルを使用した。
【００６１】
参照グループ：個体が健康障害ではなく他の理由で死亡した司法解剖のケースから、正常な軟骨を入手した。正常な軟骨を、ＯＡが普及する年齢よりも十分に低い年齢の、膝と脛骨との間、臀部と大腿骨との間、肩と上腕骨との間、半月板、線維輪、並びに髄核（年齢範囲は３６〜５１歳）、加えて気管及び肋骨（年齢は２４〜３６歳）から得た。それゆえにこれらの情報から、正常な組織代謝回転過程によって形成されて組織に保持されたフラグメントに関する情報が得られる。
【００６２】
例えばアグリカンの一部の断片化並びにＩ型及びＩＩ型コラーゲンの破壊における第一のステップは、病的な代謝回転と正常な代謝回転とで同じであるが、レベルが異なっていることが予想できる。この例において、本発明者らは、正常組織と病的組織とを比較することにより、どの固有な切断が病的過程の結果であるかを推定することを可能にした。
【００６３】
データ検索は、ＣＯＭＰに存在するアミノ酸配列を示し、どちらかの末端でトリプシンに典型的な切断を示すが、他方の末端が抽出前に組織中でプロテイナーゼ活性によって達成される不規則な切断を示し、さらに進行中の破壊的な過程を反映するペプチドに的を絞った。トリプシンによる切断を示さない部位をネオエピトープと称する。
【００６４】
正常な軟骨でも見出されるネオエピトープは正常な軟骨代謝回転を示すと予想されることから、それらをさらなる分析から排除した。
【００６５】
軟骨サンプルの調製
切開、粉砕、及び抽出：
全体厚さがおよそ１×１ｃｍの軟骨断片を各組織から解剖で取り出した。目で見て正常な関節軟骨サンプルを底から採取した。関節軟骨の同じ部分（負荷をかけた領域）をそれぞれの個体において解剖で取り出した。正常な対照については、以下の軟骨組織：関節軟骨（大腿骨骨頭（Ｆ）、上腕骨頭（Ｈ）、及び脛骨内側顆（ｋｎｅｅ  ｍｅｄｉａｌ  ｔｉｂｉａｌ  ｃｏｎｄｙｌｅ）（Ｋ））、椎間板（線維輪（ＡＦ）及び髄核（ＮＰ））、及び最後に半月板（Ｍ）（３６〜５１歳）をそれぞれ５人の個体から抽出した。上記で説明した個体とは異なる個体（２４〜３６歳）から気管（Ｔ）及び肋骨（Ｒ）の軟骨サンプル（ｎ＝６）を得た。
【００６６】
進行中の変形性関節症からの臀部関節軟骨サンプルを関節置換術で得て、同様に関節リウマチからのサンプルも得た。これらのサンプルは合計約３〜７ｍｇであった。
【００６７】
タイプ３０１のミキサーミル（Ｒｅｔｓｃｈ、Ｈａａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた冷却した金属製チューブ中で、解剖し凍結した清潔な軟骨サンプルを液体窒素中で粉砕した。形成された粒子の目視検査を光学顕微鏡で行い、ステップ間に３０分の冷却を行って設定（２５Ｈｚで３×６０秒）を最適化することにより、組織１つあたり１００ｍｇ前後の均一な粉末を得た。凍結したサンプルの重さを量り、１５体積（ｖ／ｗ）のカオトロピック抽出緩衝液（４ＭのＧｕＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＡｃ、１００ｍＭの６−アミノカプロン酸、５ｍＭのベンズアミジン、５ｍＭのＮ−エチルマレイミド、ｐＨ５．８）を使用して、オービタルシェーカーで＋４℃で２４時間にわたり抽出した。１３２００ｒｐｍ及び＋４℃で３０分遠心分離した後に抽出物を収集した。
【００６８】
初期の変形性関節症を有する個体の大腿骨顆からの、限定された病変部位を境界とした軟骨サンプルは、下肢の上部における骨肉腫のために外科的切断で得られた単一の線維領域を示すサンプルであった。抽出のために、−２０℃のクライオスタットで組織を分断して２０μｍの切片にし、これを５ｍｌのステライリンチューブ（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｉｌｉｎ  Ｌｔｄ、Ｓｔｏｎｅ、Ｓｔａｆｆｓ、ＵＫ）中に収集し、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのベンズアミジン塩酸塩、０．１Ｍの６−アミノヘキサン酸、及び５ｍＭのＮ−エチルマレイミドも含有する５ｍｌの４Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、０．０５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）を用いて４℃で２４時間抽出した。ガラス繊維フィルターでのろ過により残留物から抽出物を分離した。
【００６９】
定量用サンプルの調製：
典型的には、体積２００μｌの抽出物を２ｍｌのチューブに移し、４ｍＭのＤＴＴで還元し（＋５６℃で３０分振盪）、１６ｍＭのＩＡＡでアルキル化した（暗所で室温で１時間）。抽出物をエタノール（９：１）により＋４℃で一晩沈殿させ、その後、遠心分離（１３２００ｒｐｍ、＋４℃で３０分）を行い、続いて−２０℃で４時間エタノール洗浄を行うことにより、残留したＧｕＨＣｌ及び他の塩を除去した。サンプルをＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥させ、１００μｌの０．１Ｍの炭酸水素トリエチルアンモニウム（ｐＨ８．５）に懸濁し、その後、振盪機で、２μｇのトリプシンゴールドにより＋３７℃で約１６時間消化した。５０μｌのアリコートを乾燥させ、ｉＴＲＡＱでの標識付けに使用した。
【００７０】
同重核の４単位のｉＴＲＡＱ標識を使用して、サンプルセット１つあたり最大３サンプル及び参照サンプルの混合を可能にした。相対的な定量化で可能な限り多くのタンパク質を提示させるため、参照サンプルは大腿骨骨頭、肋骨、半月板、及び髄核に由来する軟骨抽出物の混合物であった。全てのサンプルをこの参照サンプルと比較し、サンプルと参照との比率を計算した。標識付けステップを以下のようにして実行した：サンプルを３０μｌの０．５Ｍの炭酸水素トリエチルアンモニウム（ｐＨ８．５）中に再溶解させた。ｉＴＲＡＱ試薬を室温にして、７０μｌのエタノール中に再溶解させ、ボルテックスで混合し、サンプルに添加する直前に遠心分離した。室温で１時間インキュベーションを行った。１００μｌの水を添加することにより反応を止めた。標識付けの効率を調べるために、標識されたサンプルのアリコート（０．５％）をイオントラップＬＣ−ＭＳに注入した。データベース検索において可変性のｉＴＲＡＱ修飾を使用することにより、得られたデータを不完全な標識付けに関してチェックした。標識された消化物をＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥させ、塩を除去するために５００μｌの０．１％のギ酸中の５０％アセトニトリルで２回洗浄し、次いで再度乾燥させた。標識されたサンプルを１００μｌの２％ギ酸中に再溶解させた。サンプルを１：１：１の比率で参照サンプルと共に混合し、イオン交換カラムに注入する前に陽イオン交換開始緩衝液で５００μｌになるまで希釈した。全ての分析で同じ参照を使用したため、参照に対して標準化することにより全てのサンプルデータを比較することができた。本発明者らは、関節軟骨（大腿骨骨頭、上腕骨頭、及び脛骨内側顆）はほとんど類似していると予想されることから、それらを１つの混合物（ＦＨＫ）として分析することを選択した。他の混合物（ＭＡＮ）は、円板構造の線維輪及び髄核と共に含む半月板であり、最後の混合物は、肋骨と気管とを様々に組み合わせたものであった。他のサンプルセットでは、それぞれ各患者の代表的な（初期ＯＡの軟骨−１、初期ＯＡの軟骨−２、初期ＯＡの軟骨−３、初期ＯＡの軟骨−４、初期ＯＡの軟骨−５、初期ＯＡの軟骨−６、後期ＯＡの軟骨−７、初期ＯＡの軟骨−８、ＲＡの軟骨−１、ＲＡの軟骨−２、ＲＡの軟骨−３、ＲＡの軟骨−４）、ＲＡの軟骨−５、ＲＡの軟骨−６、及び正常な軟骨のサンプルを分析した。異なるＩＴＲＡＱレポーターでタグ付けされた３つのサンプルを参照サンプルと混合し、これを４番目のＩＴＲＡＱレポーターでタグ付けした。全ての分析セットで同じ参照サンプルを使用することにより、全てのサンプル間の定量的な比較が可能になると予想される。
【００７１】
オフラインの陽イオン交換クロマトグラフィー
強陽イオン交換（ＳＣＸ）カラム（内径２．１ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍのポリスルホエチルアスパルトアミド、孔サイズ３００Å、ポリＬＣ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用したマイクロ−ＬＣシステム（ＳＭＡＲＴ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎ）で最初のイオン交換分離を行った。溶出は、９９．５％の溶媒Ａ（１０ｍＭのリン酸カリウム、２０％のアセトニトリル、ｐＨ２．８）及び０．５％の溶媒Ｂ（１ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのリン酸カリウム、２０％のアセトニトリル、ｐＨ２．８）の均一濃度を用いて１３分、続いて塩濃度を１３０ｍＭに増加させる直線的な濃度勾配で６０分で行われた。その後、濃度勾配を１５分かけて３８５ｍＭのＫＣｌまで高めて、最後に６分かけて１Ｍの塩まで高めた。３００〜５００μｌの画分を、０．５ｍｌのエッペンドルフチューブ（Ｓａｆｅｌｏｃｋ（商標）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に集めた。
【００７２】
マススペクトロメトリー
オフラインＳＣＸ分離からの画分を乾燥させ、６０μｌの０．２％のギ酸中に再溶解させ、そのうち１０μｌを精製し、厚さ４ディスク分の自社製逆相チップを使用して濃縮した（Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３）、７５巻、６６３〜６７０頁）。０．１％のギ酸中の５０％のアセトニトリル１０μｌを使用して保持されたペプチドをオートサンプラー用ガラスバイアル（Ｑｓｅｒｔ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に溶出させた。ＳｐｅｅｄＶａｃを使用して有機溶媒を蒸発させ、ペプチドを１０μｌの０．２％ギ酸中に再溶解させ、その後、様々なＬＣ−ＭＳシステム上に注入した。サンプルをサンプルセットに混合する前に各サンプルの少量のアリコートをイオントラップＬＣ−ＭＳシステムに注入することによって標識付けの効率を試験した。
【００７３】
Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ−ＭＳ
Ｑ−ｔｏｆ  ＭＳ（Ｑ−ＴＯＦマイクロ、Ｗａｔｅｒｓ）を、上記で説明したのと同じタイプのプレカラム及びＷａｔｅｒｓのＳｙｍｍｅｔｒｙ、Ｃ１８、３．５μｍの粒子、長さ１５０ｍｍ×内径７５μｍの分析カラムを備えたＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）に連結した。分析カラムをＰｉｃｏＴｉｐ（商標）ニードル（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）と組み合わせた。約２５０ｎｌ／分の流速、及び５％のＢ（イオントラップＬＣ−ＭＳの場合と同様の移動相）から５１％のＢの６０分での直線的な濃度勾配、続いて９５％のＢでの６分の洗浄、及び１２分の初期条件への再調節を使用して、オンラインの逆相分離を行った。画分間の交差汚染を最小化するために、以前と同様にしてブランクの試行を行った。それらが多価である場合と同等の長さの時間にわたり（ＭＳＭＳの場合は２秒以内に）最も強いイオン４種を選択することによるデータ依存性取得を使用して、機器を操作した。
【００７４】
データベース検索
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｙｎｘ２．１（Ｗａｔｅｒｓ）及び較正物質として７１６．４５Ｄａにおけるエリスロマイシンのピークを使用したナノロックスプレーによる補正を使用して、マススペクトロメトリーの生データを加工した。加工済みファイルを、ＭＡＳＣＯＴを以下の検索パラメーター：ｉＴＲＡＱ（Ｎ−ターム）、ｉＴＲＡＱ（Ｋ）及び固定された修飾としてカルバミドメチル化（Ｃ）を使用して検索した。一方で、可変の修飾としてマンノシル化（Ｗ）、ｉＴＲＡＱ（Ｙ）、脱アミド（Ｎ、Ｑ）、酸化（Ｍ、Ｐ）を考慮した。他のＭＡＳＣＯＴ検索パラメーターは：モノアイソトピック質量、±０．２Ｄａのペプチド質量許容差、±０．２ＤａのＭＳＭＳフラグメント質量許容差、２の最大切断ミス、対象となるイオンスコア＞２０であり、最高位のペプチドのみが一致し、分類学的にヒトであった。使用される酵素から予測される一方の末端にだけ部位を含有する半様式的な切断を、単離の前に起こる内因性の（生物学的な）切断を含有するペプチドを同定するための検索基準に適用した。
【００７５】
データ分析
ｉＴＲＡＱ定量化パラメーターは、有意な閾値がｐ＜０．０５であり、重みつき比率、標準化なし、ペプチドの最小数１、最小の前駆体の電荷２、少なくとも０．０５の相同性であり、各レポーターのソフトウェアの補正係数も包含した。
【００７６】
滑液サンプル
アフィニティーカラム：
親和性を強化するために、１ｍｇのＣＯＭＰ抗体Ｐ２Ｄ３又は０．７５ｍｇのＣＯＭＰ抗体１２ａ１１をＭｉｎｉＬｅａｋ（ＫｅｍＥｎＴｅｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のゲルアリコートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。未結合抗体を０．１５ＭのＮａＣｌで洗浄して落とした。未反応の部位をブロックするために、ゲルを０．２Ｍのエタノールアミンと共に室温で３時間インキュベートした。カップリング効率は、抗体Ｐ２Ｄ３の場合、３９％（結合した抗体が３９０μｇであることに対して）及び抗体１２ａ１１の場合、７６％（結合した抗体が５７０μｇであることに対して）と決定された。
【００７７】
滑液からのＣＯＭＰの親和性の強化
ＲＡと診断された患者（罹患期間９ヶ月）からの滑液（８ｍｌ）及びＯＡと診断された患者からの滑液（５ｍｌ）を５ｍＭのＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド（ｅｔｈｙｌｍａｌｅｍｉｄｅ））と共にインキュベートし、その後、１０００ｇ、室温で２０分遠心分離した。急性外傷を有する患者からの滑液を、２０ｍＭのホスファート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．８％ｗ／ｖのＳＤＳで２倍の体積に希釈し、室温で２時間インキュベートした。１倍量の４％トリトン−Ｘ１００のＰＢＳ溶液の添加により過量のＳＤＳを中和し、室温で一晩インキュベートした。まず、非特異的な結合物質を除去するために、抗体を用いずにＭｉｎｉＬｅａｋカラムにサンプルを通過させた。次いで未結合のサンプルをＰ２Ｄ３カラムに入れて、Ｐ２Ｄ３カラムからのフローを直接１２ａ１１カラムに入れた。両方のカラムを１５ｍｌのＨＢＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄し、続いて２ｍｌの高塩濃度緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄し、最後に５ｍｌのＨＢＳで洗浄した。溶出させるために、８００μｌの０．１Ｍシトラート（ｐＨ３）の画分をカラムに添加した。排水画分を２００μｌの１．５Ｍのトリス（ｐＨ８．８）で即座に中和した。
【００７８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びマススペクトロメトリー用のサンプル調製
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、溶出したサンプルをエタノール（９：１）を用いて＋４℃で一晩沈殿させ、その後、遠心分離（１３２００ｒｐｍ、＋４℃で３０分）し、続いて−２０℃で４時間エタノール洗浄を行った。沈殿したペレットを、還元剤を用いずにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）、２２７巻、６８０〜６８５頁）に溶解させ、濃度勾配４〜１６％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離した。各バンドを３種の異なる酵素で消化できるように、各サンプルを３連で実験した。ブルーシルバー染色で一晩染色した後（Ｃａｎｄｉａｎｏら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２００４）、２５巻（９）、１３２７〜３３頁）、対象のバンドを切り出し、１０ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）で５６℃で３０分還元し、５０ｍＭのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で３０分アルキル化した。２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の２０ｎｇ／μｌのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の５０ｎｇ／μｌのキモトリプシン（Ｒｏｃｈｅ）、又は５０ｍＭのホスファート（ｐＨ８）中の４０ｎｇ／μｌのＡｓｐ−Ｎ（Ｒｏｃｈｅ）のいずれかを用いてバンドを３７℃で一晩消化した。１％ＴＦＡ、０．１％ＴＦＡ中の５０％アセトニトリルで２回、及び１００％のアセトニトリルでペプチドを連続的に抽出した。乾燥後、抽出したペプチドを１０μｌの０．１％ＴＦＡに溶解させ、上記で説明したＣ１８ステージチップで精製した。
【００７９】
マススペクトロメトリー
精製したペプチドサンプルを１０μｌの０．２％のギ酸に溶解させ、サンプル（８μｌ）をＥｓｑｕｉｒｅ  ＨＣＴイオントラップ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ  ＧｍｂＨ）に注入した。このイオントラップには、Ｐｅｐｍａｐ（商標）ナノ−プレカラム（ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ、Ｃ１８、内径３００μｍ及び長さ５ｍｍ）及びＡｔｌａｎｔｉｓ（商標）分析カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｃ１８、３μｍの粒子、内径１５０μｍ×長さ１５０ｍｍ）を有するアルティメットＨＰＬＣシステム（ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ）が備えられていた。分析カラムを、マイクロフローネブライザーを介してＭＳ機器に組み合わせた。前の章で説明したようにしてオンラインの逆相分離を行った。データベース検索設定は、ＩＴＲＡＱ修飾以外はこれまでに述べた設定と同じであった。ペプチド及びフラグメントの質量許容差は±０．４Ｄａに設定した。
【００８０】
使用される酵素から予測される一方の末端にだけ部位を含有する半様式的な切断を、単離の前に起こる内因性の（生物学的な）切断を含有するペプチドを同定するための検索基準に適用した。
【００８１】
結果
以下の表２に、病的なＣＯＭＰ代謝回転で同定された切断部位を示す同定されたネオエピトープを列挙する。表２において、太字で表示される切断部位の一部は、ＭＳによって同定された配列に属し、（切断位置を示す）ネオエピトープの末端アミノ酸を包含する。
【表１−１】
0006389168.tif 000003
【表１−２】
0006389168.tif 000004
【００８２】
結果から、病的な軟骨代謝回転中に存在する固有なネオエピトープが示される。
【００８３】
固有なネオエピトープの検出又はモニターは、病的な軟骨破壊を検出する新しい方法の一例である。この方法は、これらに限定されないが、ＲＡ、ＯＡ、ＲｅＡ、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、心臓血管疾患、腱の疾患、骨粗鬆症、骨軟化症、骨折修復、動脈硬化症、強皮症、線維症の皮膚、又は関節の外傷のような外傷等の疾患に罹患した患者を診断するのに使用できる。この方法は特にこのような疾患の早期診断において有用である。
【００８４】
本明細書で開示した方法は、疾患における病的な軟骨及びＣＯＭＰ代謝回転を検出及びモニターすると予想される。これは、病的な軟骨破壊に固有な特異的ＣＯＭＰネオエピトープが同定されたことにより可能になる。
【００８５】
本実施形態の他の態様は、哺乳動物ＣＯＭＰ、好ましくはヒトＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメントに関する。この態様によれば、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸７７であり、フラグメントは、配列番号１８のＣ末端から始まり配列番号１８のＮ末端に向かって伸長する配列番号１８の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸８８であり、フラグメントは、配列番号１９のＣ末端から始まり配列番号１９のＮ末端に向かって伸長する配列番号１９の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸９０であり、フラグメントは、配列番号２０のＣ末端から始まり配列番号２０のＮ末端に向かって伸長する配列番号２０の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸１０４であり、フラグメントは、配列番号２１のＣ末端から始まり配列番号２１のＮ末端に向かって伸長する配列番号２１の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸１９０であり、フラグメントは、配列番号２２のＣ末端から始まり配列番号２２のＮ末端に向かって伸長する配列番号２２の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸１９４であり、フラグメントは、配列番号２３のＣ末端から始まり配列番号２３のＮ末端に向かって伸長する配列番号２３の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸２２６であり、フラグメントは、配列番号２４のＣ末端から始まり配列番号２４のＮ末端に向かって伸長する配列番号２４の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸５３１であり、フラグメントは、配列番号２５のＣ末端から始まり配列番号２５のＮ末端に向かって伸長する配列番号２５の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸５５４であり、フラグメントは、配列番号２６のＣ末端から始まり配列番号２６のＮ末端に向かって伸長する配列番号２６の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸５７４であり、フラグメントは、配列番号２７のＣ末端から始まり配列番号２７のＮ末端に向かって伸長する配列番号２７の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸５７７であり、フラグメントは、配列番号２８のＣ末端から始まり配列番号２８のＮ末端に向かって伸長する配列番号２８の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸６５７であり、フラグメントは、配列番号２９のＣ末端から始まり配列番号２９のＮ末端に向かって伸長する配列番号２９の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸６９１であり、フラグメントは、配列番号３０のＣ末端から始まり配列番号３０のＮ末端に向かって伸長する配列番号３０の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸７１０であり、フラグメントは、配列番号３１のＣ末端から始まり配列番号３１のＮ末端に向かって伸長する配列番号３１の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、又は
フラグメントのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸７２５であり、フラグメントは、配列番号３２のＣ末端から始まり配列番号３２のＮ末端に向かって伸長する配列番号３２の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む。
【００８６】
「所定のアミノ酸配列のＣ末端から始まり所定のアミノ酸配列のＮ末端に向かって伸長する所定のアミノ酸配列の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含むフラグメント」は、本明細書で使用される場合、そのフラグメントが、少なくとも所定のアミノ酸配列のＣ末端におけるアミノ酸と；所定のアミノ酸配列のＮ末端方向に向かって、所定のアミノ酸配列のＣ末端から１つ手前のアミノ酸と、所定のアミノ酸配列のＣ末端から２つ手前のアミノ酸とを含むことを意味する。例えば、所定のアミノ酸配列が、配列番号１８、すなわちＧＭＱＱＳであると仮定する。このような場合、フラグメントは少なくともＱＱＳを含む。
【００８７】
特定の実施形態において、フラグメントは、配列番号１８〜３２のいずれかのＣ末端から始まり（表２の第４列を参照）配列番号１８〜３２のいずれかのＮ末端に向かって伸長する、配列番号１８〜３２のいずれかにおけるアミノ酸配列の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含む。
【００８８】
他の特定の実施形態において、フラグメントは、配列番号１８〜３２のいずれかのＣ末端から始まり（表２の第４列を参照）配列番号１８〜３２のいずれかのＮ末端に向かって伸長する配列番号１８〜３２のいずれかにおけるアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸を含む。したがって、この実施形態において、フラグメントは、配列番号１８〜３２のいずれかにおけるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、フラグメントは、配列番号１８〜３２のいずれかにおけるアミノ酸配列からなる。
【００８９】
他の変形は、５つより多くのアミノ酸、例えば６、７、８、９、１０、１１又は１２個のアミノ酸を含む、単離されたＣ末端短縮フラグメントであり得る。このような場合において、Ｃ末端短縮フラグメントは、配列番号１のアミノ酸７７、８８、９０、１０４、１９０、１９４、２２６、５３１、５５４、５７４、５７７、６５７、６９１、７１０又は７２５であるＣ末端を有し、さらに、配列番号１のアミノ酸７７、８８、９０、１０４、１９０、１９４、２２６、５３１、５５４、５７４、５７７、６５７、６９１、７１０又は７２５から始まり配列番号１のＮ末端に向かって伸長する、配列番号１中の６、７、８、９、１０、１１又は１２個のアミノ酸に対応するアミノ酸配列を有する。
【００９０】
特定の実施形態において、単離されたＣ末端短縮フラグメントは、配列番号２、６、８、９、１２、１３、１５、１６、１８〜３２のいずれかで定義されたアミノ配列を有し、好ましくは配列番号１８〜３２のいずれかで定義されたアミノ配列を有する。
【００９１】
本実施形態の他の態様は、哺乳動物ＣＯＭＰ、好ましくはヒトＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメントに関する。この態様によれば、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸７８であり、フラグメントは、配列番号３３のＮ末端から始まり配列番号３３のＣ末端に向かって伸長する配列番号３３の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸８９であり、フラグメントは、配列番号３４のＮ末端から始まり配列番号３４のＣ末端に向かって伸長する配列番号３４の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸９１であり、フラグメントは、配列番号３５のＮ末端から始まり配列番号３５のＣ末端に向かって伸長する配列番号３５の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸１０５であり、フラグメントは、配列番号３６のＮ末端から始まり配列番号３６のＣ末端に向かって伸長する配列番号３６の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸１９１であり、フラグメントは、配列番号３７のＮ末端から始まり配列番号３７のＣ末端に向かって伸長する配列番号３７の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸１９５であり、フラグメントは、配列番号３８のＮ末端から始まり配列番号３８のＣ末端に向かって伸長する配列番号３８の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸２２７であり、フラグメントは、配列番号３９のＮ末端から始まり配列番号３９のＣ末端に向かって伸長する配列番号３９の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸５３２であり、フラグメントは、配列番号４０のＮ末端から始まり配列番号４０のＣ末端に向かって伸長する配列番号４０の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸５５５であり、フラグメントは、配列番号４１のＮ末端から始まり配列番号４１のＣ末端に向かって伸長する配列番号４１の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸５７５であり、フラグメントは、配列番号４２のＮ末端から始まり配列番号４２のＣ末端に向かって伸長する配列番号４２の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸５７８であり、フラグメントは、配列番号４３のＮ末端から始まり配列番号４３のＣ末端に向かって伸長する配列番号４３の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸６５８であり、フラグメントは、配列番号４４のＮ末端から始まり配列番号４４のＣ末端に向かって伸長する配列番号４４の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸６９２であり、フラグメントは、配列番号４５のＮ末端から始まり配列番号４５のＣ末端に向かって伸長する配列番号４５の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸７１１であり、フラグメントは、配列番号４６のＮ末端から始まり配列番号４６のＣ末端に向かって伸長する配列番号４６の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、又は
フラグメントのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸７２６であり、フラグメントは、配列番号４７のＮ末端から始まり配列番号４７のＣ末端に向かって伸長する配列番号４７の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「所定のアミノ酸配列のＮ末端から始まり所定のアミノ酸配列のＣ末端に向かって伸長する所定のアミノ酸配列の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含むフラグメント」は、そのフラグメントが、少なくとも所定のアミノ酸配列のＮ末端におけるアミノ酸と；所定のアミノ酸配列のＣ末端方向に向かって、所定のアミノ酸配列のＮ末端の次のアミノ酸と、所定のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸とを含むことを意味する。例えば、所定のアミノ酸配列が、配列番号３３、すなわちＶＲＴＧＬであると仮定する。このような場合、フラグメントは、少なくともＶＲＴを含む。
【００９３】
特定の実施形態において、フラグメントは、配列番号３３〜４７のいずれかのＮ末端から始まり（表２の第４列を参照）配列番号３３〜４７のいずれかのＣ末端に向かって伸長する配列番号３３〜４７のいずれかにおけるアミノ酸配列の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含む。
【００９４】
他の特定の実施形態において、フラグメントは、配列番号３３〜４７のいずれかのＮ末端から始まり（表２の第４列を参照）配列番号３３〜４７のいずれかのＣ末端に向かって伸長する配列番号３３〜４７のいずれかにおけるアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸を含む。したがって、この実施形態において、フラグメントは、配列番号３３〜４７のいずれかにおけるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、フラグメントは、配列番号３３〜４７のいずれかにおけるアミノ酸配列からなる。
【００９５】
他の変形は、５つより多くのアミノ酸、例えば６、７、８、９、１０、１１又は１２個のアミノ酸を含む、単離されたＮ末端短縮フラグメントであり得る。このような場合において、Ｎ末端短縮フラグメントは、配列番号１のアミノ酸７８、８９、９１、１０５、１９１、１９５、２２７、５３２、５５５、５７５、５７８、６５８、６９２、７１１又は７２６であるＮ末端を有し、さらに、配列番号１のアミノ酸７８、８９、９１、１０５、１９１、１９５、２２７、５３２、５５５、５７５、５７８、６５８、６９２、７１１又は７２６から始まり配列番号１のＣ末端に向かって伸長する配列番号１中の６、７、８、９、１０、１１又は１２個のアミノ酸に対応するアミノ酸配列を有する。
【００９６】
特定の実施形態において、単離されたＮ末端短縮フラグメントは、配列番号３〜５、７、１０、１１、１４、１７、３３〜４７のいずれかで定義されたアミノ配列、好ましくは配列番号３３〜４７のいずれかで定義されたアミノ配列を有する。
【００９７】
またより長いフラグメントも、末端アミノ酸が表２に記載のペプチド（表２の「位置」の下のアミノ酸で示される）の末端アミノ酸と同一である限りは使用が可能である。
【００９８】
ペプチドは、それ自体が抗原性ではない場合がある。それゆえに、ペプチドは、外来タンパク質又はペプチド担体とカップリングすることが多く、それによってハプテンとして作用する。通常、このようなペプチド担体は、調査される任意の種で発生しないでこのペプチド担体への抗体の反応が回避されるように選ばれる。この方式では、反応性は、短いペプチド上のネオエピトープに限定されると予想される。
【００９９】
本実施形態のさらなる態様は、少なくとも１種の哺乳動物ＣＯＭＰ、好ましくはヒトＣＯＭＰのネオエピトープに対する抗体の産生に使用されるように構成されたコンジュゲートに関する。少なくとも１種のネオエピトープは、配列番号１で定義された前記哺乳動物ＣＯＭＰのアミノ酸配列の77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）、710位（N710）〜711位（V711）；及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位又はそれらの組み合わせで哺乳動物ＣＯＭＰを切断することによって形成される。本コンジュゲートは、ペプチド担体にカップリングした、又はペプチド担体と混合した、上記に係る少なくとも１つの単離されたＣ末端短縮フラグメント、及び／又は上記に係る少なくとも１つの単離されたＮ末端短縮フラグメントを含む。
【０１００】
一実施形態において、少なくとも１つの単離されたＣ末端短縮フラグメントは、そのＮ末端を介してペプチド担体にカップリングし、少なくとも１つの単離されたＮ末端短縮フラグメントは、そのＣ末端を介してペプチド担体にカップリングしている。
【０１０１】
特定の実施形態において、ペプチド担体は、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）及びオバルブミンからなる群から選択される。
【０１０２】
またペプチド担体は、ペプチド又はフラグメントに共有結合でカップリングさせないで使用することもでき、すなわちフラグメントと混合して提供されてもよい。
【０１０３】
インビトロでの単離されたＣ末端短縮及び／又はＮ末端短縮フラグメントの調製は、発現させようとするフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ発現ベクターを使用してフラグメントを発現させる方法によって行うことができる。次いで、宿主細胞によりフラグメントが発現されるように、適合性のある原核性又は真核性の宿主細胞を発現ベクターで形質転換する。フラグメントを産生するのに好適な増殖培地中で形質転換宿主細胞を培養する。
【０１０４】
本実施形態のさらなる態様は、上記に係る単離されたＣ末端短縮フラグメント、及び／又は上記に係る単離されたＮ末端短縮フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、このような単離されたポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター、及びこのような組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【０１０５】
本実施形態のさらなる態様は、配列番号１で定義された哺乳動物ＣＯＭＰのアミノ酸配列の77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）、710位（N710）〜711位（V711）；及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位又はそれらの組み合わせで哺乳動物ＣＯＭＰを切断することにより形成された少なくとも１種のネオエピトープに特異的に結合する抗体を産生するための、上記に係る単離されたＣ末端短縮フラグメント、上記に係る単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又は上記に係るコンジュゲートの使用に関する。
【０１０６】
本実施形態の関連する態様は、配列番号１で定義された哺乳動物ＣＯＭＰのアミノ酸配列の77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）、710位（N710）〜711位（V711）；及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位又はそれらの組み合わせで哺乳動物ＣＯＭＰを切断することにより形成された少なくとも１種のネオエピトープに特異的に結合する抗体の産生方法を定義する。本方法は、上記に係る単離されたＣ末端短縮フラグメント、上記に係る単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又は上記に係るコンジュゲートに対する抗体を発生させるステップと、抗体を単離するステップとを含む。
【０１０７】
本実施形態の他の関連する態様は、上記に係る単離されたＣ末端短縮フラグメント、上記に係る単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又は上記に係るコンジュゲートに対する単離された抗体を定義する。単離された抗体は、配列番号１で定義された哺乳動物ＣＯＭＰのアミノ酸配列の77位（S77）〜78位（V78）；88位（L88）〜89位（L89）；90位（H90）〜91位（C91）；104位（Q104）〜105位（T105）；190位（N190）〜191位（C191）；194位（N194）〜195位（S195）；226位（Q226）〜227位（R227）；531位（F531）〜532位（R532）；554位（L554）〜555位（N555）；574位（Y574）〜575位（T575）；577位（F577）〜578位（N578）；657位（T657）〜658位（G658）；691位（Q691）〜692位（V692）、710位（N710）〜711位（V711）；及び725位（F725）〜726位（C726）からなる群から選択される少なくとも１つの切断部位又はそれらの組み合わせで哺乳動物ＣＯＭＰを切断することにより形成された少なくとも１種のネオエピトープに特異的に結合する。
【０１０８】
本実施形態のさらなる関連する態様は、病的な軟骨代謝回転の決定で使用するための、上記に係る単離された抗体を定義する。
【０１０９】
フラグメント又はコンジュゲートに対する抗体は、本実施形態に係る１種若しくは複数のフラグメント、１種若しくは複数のペプチド、及び／又は１種若しくは複数のコンジュゲートで動物を免疫化することにより得てもよい。免疫動物は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヒト以外の霊長類、ヤギ、ウマ、及びトリからなる群から選択できる。
【０１１０】
また本実施形態に係る抗体は、本実施形態に係る１種若しくは複数のフラグメント、１種若しくは複数のペプチド、及び／又は１種若しくは複数のコンジュゲートを使用するインビトロでの免疫化方法により得てもよい。
【０１１１】
本発明に係る抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、又はモノクローナル抗体であってもよい。
【０１１２】
本発明に係る抗体の産生は、ファージディスプレイアプローチを含んでいてもよい。ファージディスプレイアプローチで抗体を生成する場合、抗体は、リガンド、抗体の１種若しくは複数のフラグメント、例えばＦａｂ（フラグメント抗原結合）フラグメント若しくはＦ（ａｂ）’２フラグメント（２つのＦａｂを含有するフラグメント）、又は無傷の抗体である可能性がある。
【０１１３】
本発明に係る抗体は、本実施形態のネオエピトープの検出に使用することができ、したがって例えば、哺乳動物対象が、病的な軟骨代謝回転を有するか、又は病的な軟骨代謝回転に罹患しているかどうかを決定する目的のために、サンプル中でこのようなネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｔｉｏｐｅｓ）を検出することに使用できる。
【０１１４】
本実施形態のさらにその他の態様は、サンプル中で、上記に係る哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、上記に係る哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、上記に係るコンジュゲート、又はそれらの任意の組み合わせの存在を検出する方法に関する。本方法は、試薬が、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又はコンジュゲートと選択的に相互作用すると予想される条件下で、サンプルと、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又はコンジュゲートと選択的に相互作用する好適な試薬とを接触させるステップを含む。本方法はまた、試薬と、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又はコンジュゲートとの相互作用を検出し、それによってサンプル中の哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又はコンジュゲートを検出するステップも含む。
【０１１５】
一実施形態において、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又はコンジュゲートと選択的に相互作用する試薬は、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又はコンジュゲートに特異的に結合する抗体若しくはそれらのフラグメントである。
【０１１６】
さらなる態様は、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象からのサンプル中で、上記に係る哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、上記に係る哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又は上記に係るコンジュゲートの存在を検出する方法に関する。本方法は、サンプルと、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又はコンジュゲートに特異的に結合する抗体若しくはそれらのフラグメントとを接触させるステップを含む。本方法はまた、抗体又はそれらのフラグメントと、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又はコンジュゲートとの複合体を検出し、それによってサンプル中の哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び／又はコンジュゲートを検出するステップも含む。
【０１１７】
実施形態において、サンプルは、軟骨サンプル、体液サンプル、又はそれらの任意の組み合わせである。特定の実施形態において、体液サンプルは、滑液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、尿サンプル、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０１１８】
一実施形態において、サンプルは、病的な軟骨代謝回転を有する疑いのある対象からのサンプルである。
【０１１９】
一実施形態において、サンプル中で哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＣ末端短縮フラグメント、哺乳動物ＣＯＭＰの単離されたＮ末端短縮フラグメント、及び又はコンジュゲートの存在を検出する場合、対象は、病的な軟骨代謝回転を有すると診断される。
【実施例】
【０１２０】
（例１）
表２に表示された、ＣＯＭＰ（配列番号１）の病的な切断によって生成したネオエピトープを示すペプチドを合成し、標準的なプロトコールに従ってウサギを免疫化するのに使用する。配列中のその番号で表示される切断部位によって切り離された最も末端にある非置換アミノ酸と、３つのグリシン残基の配列と、続いて逆の末端にシステインとを含む、表２（第３列）に表示された５つの末端アミノ酸を含有するペプチドを合成した。これらのペプチドをそれらの末端のシステインを介してキーホールリンペットヘモシニアン（Ｋｅｙ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に連結し、標準的なプロトコールによってウサギを免疫化するのに使用する。ペプチド合成及び抗体産生は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌｔｄ（Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ）によって提供される標準的な方法を使用する顧客サービスである。
【０１２１】
産生された抗体の力価を固相アッセイにより評価した。切断部位に相当する末端アミノ酸を有し、タンパク質の天然配列の隣接する７つのアミノ酸を包含するペプチドを使用して、ＰＢＳ緩衝液中１μｇ／ｍｌでポリスチレン製マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）をコーティングした。コーティングしたペプチドそれぞれに抗血清を様々な希釈率（５段階で１：２００から１：２５０００）で添加し、当業界で知られている標準的な方法に従って、ブタ抗ウサギアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体により結合した抗体を検出した。
【０１２２】
図１に力価曲線を示す。
【０１２３】
（例２）
関節の吸引により滑液を収集して、即座に遠心分離して細胞や任意の粒子を除去する。滑液を、血清サンプルのようなサンプル希釈剤で１：１０に希釈する。
【０１２４】
競合ＥＬＩＳＡアッセイをネオエピトープ用に開発し、これを適用して、ＲＡ又はＯＡを有する患者からの滑液サンプル及び健康なドナーからの対照血液サンプル中のそれぞれのＣＯＭＰフラグメントを定量した。
【０１２５】
湿潤したチャンバー中で、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄ  Ｌｔｄ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７）中２５ｎｇ／ｍｌの８アミノ酸のＣＯＭＰペプチドＣＥＶＴＬＴＤＦ５３１（５０μｌ）と共に室温で一晩コーティングした。プレートを０．１５Ｍの塩化ナトリウム及び０．０５％（ｗ／ｖ）トゥイーン２０ですすいだ後、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１２０μｌでポリスチレン表面の遊離の結合部位を室温で１時間ブロックした。
【０１２６】
ＣＯＭＰペプチドＣＥＶＴＬＴＤＦを標準として使用して検量線を作成した。０．５％ＢＳＡ、０．８％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１Ｍ塩化ナトリウム中１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）の溶液で標準を希釈した（０．２４４ｎｇ／ｍｌから２５０ｎｇ／ｍｌに）。滑液及び血清のサンプルを、０．８％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で１０倍に希釈した。湿潤したチャンバーで、３０マイクロリットルの希釈した標準及びサンプルを、ステライリンプレート（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｉｌｉｎ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）中で室温で一晩インキュベートした。次の日、ステライリンプレートに、１０ｍＭのリン酸塩（ＮａＨ２ＰＯ４）（ｐＨ７．５）中の４％トリトンで希釈した抗体（１：１５０００の抗ＣＥＶＴＬＴＤＦ）３０μｌを添加した。室温で１時間プレインキュベートした後、５０μｌのこの混合物をヌンクプレートのコーティング済みウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを上述したようにしてすすぎ、２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中のアルカリホスファターゼとコンジュゲートしたブタ抗ウサギＩｇＧ（ＤＡＫＯＡ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の１：１０００希釈液５０μｌを添加することによって結合した抗体を検出した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを上述したようにしてすすぎ、１００μｌの基質（０．５ＭのＭｇＣｌ２を含有する１Ｍジエタノールアミン（ｐＨ９．８）中の１ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェニルホスファート）を添加した。４０５ｎｍで各サンプル及び標準の吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｅｘｐｅｒｔ９６、ＡｓｙｓＨｉｔｅｃｈ、Ａｕｓｔｒｉａ）により二連で測定した。Ｍｉｋｒｏｗｉｎ２００ソフトウェアプログラム（ＡｓｙｓＨｉｔｅｃｈ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、検量線をプロットして、分析したサンプル中のＣＯＭＰネオエピトープの含量を計算した。図２に、ＲＡ及びＯＡそれぞれからの滑液中の測定されたＣＯＭＰフラグメントのレベルを示す。
【０１２７】
（例３）
滑液サンプル（５０μｌ）を、１倍量の１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ＭのＮａＣｌで希釈した。希釈した滑液に、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．５ＭのＮａＣｌ中の５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレン−グリコール６０００（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｇｅｒｍａｎｙ）３５μｌを添加した。この混合物を室温で６０分インキュベートし、次いで１２０００ｇ、４℃で１５分遠心分離した。収集されたペレットを２００μｌの２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、７５μｌのプロテインＡセファロースを含有するチューブに移した。この混合物を１５分インキュベートし、チューブを３００ｇで２分遠心分離した。上清を収集し、９倍量の９５％エタノールで沈殿させた。沈殿したタンパク質を、還元のための１０％の２−メルカプトエタノール含有又は非含有の電気泳動サンプル緩衝液（２％ＳＤＳ、０．１２５Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．００２％ブロモフェノールブルー、及び２０％グリセロール）に溶解させ、１００℃で４分沸騰させ、４％スタッキングゲルを含む濃度勾配ポリアクリルアミド（４〜１６％）スラブゲル上で分離した。分離したタンパク質をニトロセルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。免疫ブロッティング用に、メンブレンを、０．０５％トゥイーン２０含有トリス緩衝食塩水（ｐＨ７．２）中の３％ウシ血清アルブミン中で４℃で一晩ブロックし、次いでトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．２）中３％のウシ血清アルブミンで１：２０００に希釈した抗体と共に室温で１時間インキュベートした。０．０５％トゥイーン２０含有トリス緩衝食塩水（ｐＨ７．２）で３回洗浄した後、一次抗体として同じ溶液で１：２５０００に希釈した抗ウサギＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でシグナルを発生させ、Ａｇｆａ  Ｃｒｏｎｅｘ５フィルムを使用して検出した。図３に、ネオエピトープ抗体のうち１種を用いたウェスタンブロットを示す。
【０１２８】
（例４）
プロテインＡセファロースステップの後に１２．５％のＰＥＧ６０００を用いて２回目の沈殿ステップを行いサンプル体積を少なくしたことを除いては、例３で説明されているようにして滑液サンプルを調製した。ペレットをトリス緩衝液食塩水（ｐＨ７．２）に再懸濁して、滑液の元の体積にした。サンプルのアリコートを還元し（１０ｍＭのジチオスレイトール、ＤＴＴ）、アルキル化し（５０ｍＭのヨードアセトアミド、ＩＡＡ）、その後、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３７℃で一晩消化した。トリプシン処理したサンプルを、脱塩のために３０ｋＤａのスピンフィルター（Ｎａｎｏｓｅｐ  ３０ｋ、ＰＡＬＬ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、続いてＣ１８スピンフィルター（ＳＳ１８Ｖ、Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に通過させてろ過した。１．２５μｌの滑液サンプルに相当する注入体積を、トリプル四重極型質量分析計（ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に注入し、ネオエピトープペプチド（Ｓ１９５ＶＣＩＮＴＲ）に関して多重反応モニタリング（ＭＲＭ）実験を行った。ペプチド前駆体（４２５．２２、２＋）からフラグメントイオンｙ４、ｙ５、及びｙ６が測定された。図４に示されたこれらのフラグメントのシグナル（転位）の合計によれば、二重の注入（ａ、ｂ）は、それぞれ２つの急性外傷サンプル及び２つの関節リウマチサンプルに関してなされた。急性外傷サンプルは、ＲＡサンプルよりも高いレベルのネオエピトープを含有していたが、それでもなお試験された全てのサンプルでネオエピトープが検出された。この例におけるサンプルは、ネオエピトープを発見するためのサンプルとは異なることに留意されたい。加えて、実際の切断部位の相補側は、初期ＯＡの組織からの組織サンプル（上述したように、グループ３）で検出された。
【０１２９】
上記で説明した実施形態は、本発明の説明に役立ついくつかの例として理解されるものとする。本発明の範囲から逸脱することなく本実施形態に様々な改変、組み合わせ、及び変化をなすことができることが当業者であれば理解できるであろう。特に、技術的に可能であれば、異なる実施形態における異なる部分の溶液を他の構成で組み合わせてもよい。しかしながら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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