(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板、
前記基板に形成された第１のチャネルであって、第１の投入部から第１の排出部まで長手寸法に沿って延び、第１の短手寸法に沿って延びる第１のチャネル、
前記基板に形成された第２のチャネルであって、第２の投入部から第２の排出部まで同じ長手寸法に沿って延び、第２の短手寸法に沿って延びる第２のチャネル、
第１のチャネルと第２のチャネルの間の一連のカラム、
前記第１と第２のチャネルの間の流体連通路を作っている所定の分離距離により一連のカラムを長手方向に分離する一連の間隙であって、前記一連の間隙が、目的とする生体組成物を産生できる生体材料を選択的に捕捉するようなサイズにされている間隙、
前記第１の投入部に接続された第１のソースであり、前記第１のチャネル内に少なくとも１種類の第１の生体組成物を第１のチャネル流量で選択的に導入するように構成される第１のソースであって、少なくとも１種類の前記第１の生体組成物は前記第１の生体材料を含む第１のソース、および
前記第２の投入部に接続され、前記第２のチャネル内に少なくとも１種類の第２の生体組成物を第２のチャネル流量で選択的に導入するように構成される第２のソースを備え、
前記第１と第２のチャネル流量を、一連のマイクロチャネルに関する前記生体材料を選択的に捕捉し、かつ捕捉した生体材料から目的の生体物質の産生を開始する第２のチャネルに沿って生理的ずり速度を生じさせる第１と第２のチャネルの間の差異を生じさせるように構成されるバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項２】
前記一連の間隙および前記一連のカラムは、フィルム、膜、およびメッシュのうちの少なくとも１つで形成されている請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項３】
前記一連の間隙および前記一連のカラムは、前記第１のチャネルと前記第２のチャネルの間に延びる一連の孔を形成している請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項４】
前記一連の間隙は、前記第１のチャネルと前記第２のチャネルの間に延びるマイクロチャネルを形成している請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項５】
前記所定の分離距離は、複数の血小板前駆細胞を前記一連の間隙内に捕捉するようなサイズにされている請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項６】
前記複数の血小板前駆細胞は、巨核球を含む請求項５に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項７】
前記第１および前記第２の生体組成物は、半固体、固体、液体、および細胞の集まりのうちの少なくとも１種類を含む請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項８】
前記生理的ずり速度を、複数の血小板の産生を誘導するために５００ｓ−１から２５００ｓ−１の範囲内となるように生じさせる請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項９】
前記生理的ずり速度は、少なくとも、前記第１のチャネル流量、前記第２のチャネル流量、前記長手寸法、前記第１のチャネル短手寸法、前記第２のチャネル短手寸法、前記第１の生体組成物、および前記第２の生体組成物によって決定される請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項１０】
前記生理的ずり速度の範囲は、１００ｓ−１から１０，０００ｓ−１である請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項１１】
さらに、前記第１の投入部から上流方向に配置された第１のろ過素子、および前記第２の投入部から上流方向に配置された第２のろ過素子を備え、上流方向が、少なくとも１種類の前記第１の生体組成物及び少なくとも１種類の前記第２の生体組成物に向かう方向に対して定められている請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項１２】
さらに、第１の投入部と第１のろ過素子の間に配置される第１の流れ抵抗素子、および第２の投入部と第２のろ過素子の間に配置される第２の流れ抵抗素子を備える請求項１１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項１３】
前記長手寸法は、１０００マイクロメートルから３０，０００マイクロメートルである請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項１４】
前記第１および前記第２の短手寸法が、１００マイクロメートルから３，０００マイクロメートルである請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項１５】
前記カラムは、１マイクロメートルから２００マイクロメートルの長手方向距離を有している請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項１６】
前記所定の分離距離は、０．１マイクロメートルから２０マイクロメートルである請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項１７】
前記所定の分離距離は、前記間隙のサイズが異なるように、ある範囲の所定距離にわたって異なっている請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項１８】
前記一連のカラムを構成する各カラムの長手寸法が１マイクロメートルから２００マイクロメートルである請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項１９】
前記一連のカラムを構成する各カラムの短手寸法が１マイクロメートルから２００マイクロメートルである請求項１に記載のバイオミメティック・マイクロ流体系。
【請求項２０】
以下の工程を含む生体物質を産生するための方法。
基板、
前記基板に形成された第１のチャネルであって、第１の投入部から第１の排出部まで長手寸法に沿って延び、第１の短手寸法に沿って延びる、第１のチャネル、
前記基板に形成された第２のチャネルであって、第２の投入部から第２の排出部まで長手寸法に沿って延び、かつ第２の短手寸法に沿って延びる第２のチャネルにおいて、少なくとも前記第１および第２のチャネルの一部が平行に延びている第２のチャネル、
カラム同士は所定の分離距離だけ長手方向に分離されている前記第１のチャネルと前記第２のチャネルの間の一連のカラム、
一連のカラムの間を通る流体連通路によって前記第１のチャネルと前記第２のチャネルを連通する一連のマイクロチャネル、
前記第１の投入部に接続された第１のソース、
前記第２の投入部に接続された第２のソース
を備えるバイオミメティック・マイクロ流体系を提供する工程；
第１の生体組成物を第１のソースにより第１のチャネル流量で前記第１のチャネルに導入する工程であって、少なくとも１つの前記第１の生体組成物は目的とする生体物質を産生することができる生体材料を含む工程； 
第２の生体組成物を第２のソースにより第２のチャネル流量で前記第２のチャネルに導入する工程；
前記第１および第２のチャネル流量を、一連のマイクロチャネルに関して前記生体材料を選択的に捕捉し、かつ捕捉した生体材料から目的の生体物質の産生を開始する第２のチャネルに沿って生理的ずり速度を生じさせる第１のチャネルと第２のチャネルの間の差異を生じさせて流量を制御する工程；および
産生した目的の生体物質を回収するために前記第２の生体組成物により探索する工程。
【請求項２１】
前記所定の分離距離は、複数の血小板前駆細胞が概ね前記一連のマイクロチャネル内に捕捉されるのを可能にするようなサイズにされている請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１および第２の生体組成物は、半固体、固体、液体、および細胞の集まりのうちの少なくとも１種類を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、捕捉した巨核球から血小板を産生するための前記生理的ずり速度を、５００ｓ−１から２５００ｓ−１の範囲内となるように差異を生じさせる工程を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記生理的ずり速度は、少なくとも、前記第１のチャネル流量、前記第２のチャネル流量、前記長手寸法、前記第１のチャネル短手寸法、前記第２のチャネル短手寸法、前記第１の生体組成物、および前記第２の生体組成物によって決定される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記所定の分離距離は、０．１マイクロメートルから２０マイクロメートルである請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的の生体物質は、血小板を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
以下の工程を含む血小板を生成するための方法。
基板、
前記基板に形成された第１のチャネルであって、第１の投入部から第１の排出部まで長手寸法に沿って延び、第１の短手寸法に沿って延びる、第１のチャネル、
前記基板に形成された第２のチャネルであって、第２の投入部から第２の排出部まで長手寸法に沿って延び、かつ第２の短手寸法に沿って延びる第２のチャネルにおいて、前記第１および第２のチャネルとが平行に延びる第２のチャネル、
第１のチャネルから第２のチャネルの間の一連のカラム、および第１のチャネルから第２のチャネルまで延びて一連のカラムの間を通る流体連通路を作り、カラム同士は所定の分離距離だけ長手方向に分離されている一連のマイクロチャネル、
前記第１の投入部に接続された第１のソース、および
前記第２の投入部に接続された第２のソースと
を備えるバイオミメティック・マイクロ流体系を提供する工程；
第１の生体組成物を第１のソースにより第１のチャネル流量で前記第１のチャネルに導入する工程であって、少なくとも１つの前記第１の生体組成物は血小板を産生することができる巨核球を含む工程； 
第２の生体組成物を第２のソースにより第２のチャネル流量で前記第２のチャネルに導入する工程；
第１のチャネルで、前記一連のマイクロチャネルと一連の間隙により、少なくとも１種類の巨核球を選択的に捕捉し、マイクロチャネルを通って第２のチャネルに伸長させた前記少なくとも１種類の巨核球から産生された血小板前駆細胞を放出し、かつ血小板前駆細胞から血小板の産生を開始する第２のチャネルに沿って生理的ずり速度を生じさせる第１のチャネルと第２のチャネルの間の差異を生じさせて流量を制御する工程；および
第２の生体組成物により産生された血小板を探索する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
本願は、２０１３年１月３日出願の「ヒト血小板を生成するためのバイオミメティック・デバイス」と題される米国特許仮出願第６１／８４８，４２４号に基づき、その優先権を主張し、またその全容を本明細書中で参考として援用するものである。
【０００２】
（米国政府の助成を受けた研究）
本発明は、米国国立保健研究所によって与えられた１Ｋ９９ＨＬ１１４７１９−０１Ａ１のもとで米国政府の助成を受けて行われたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、広くは、マイクロ流体デバイスを含む流体系、そのようなデバイスを含んだ系、およびそのようなデバイスおよび系を用いる方法に関する。より詳細には、本開示は、バイオミメティック・プラットフォームを土台として機能的生体材料、物質、または製剤を生成するためのデバイス、系、および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
血小板（ＰＬＴ）は、止血、血管新生、および自然免疫にとって不可欠であり、その個数が低レベルにまで下がった血小板減少症として知られる状態では、患者は出血のため死に至るおそれがある。血小板数が低下するいくつかの原因として、手術、癌、癌治療、再生不良性貧血、毒性物質、アルコール、ウイルス、感染、妊娠、および突発性免疫性血小板減少症が挙げられる。
【０００５】
そのような状態を治療するための補充ＰＬＴは、免疫原性およびそれに伴う敗血症のリスクから重大な臨床的問題があるにもかかわらず、一般には完全にヒトのドナー由来である。しかし、ＰＬＴ輸血の需要の増大と、ドナーのプールはほぼ変化がなく、細菌検査や劣化のせいで寿命が短いことからも補充ＰＬＴは不足しており、医療専門家にとって患者に十分な治療を提供することはますます困難になっている。さらに、人工血小板代用品などの代替品も、今のところは生理的血小板製品の代用にはなっていない。
【０００６】
生体内ではＰＬＴは巨核球（ＭＫ）として知られている前駆細胞によって産生される。骨髄（ＢＭ）内で血管の外側に存在するＭＫは、長い分岐状細胞構造（血小板前駆細胞（ｐｒｏＰＬＴ））を洞様血管内へと伸長させ、そこでずり速度を受けて、ＰＬＴを循環血中に放出する。機能的ヒトＰＬＴが試験管内で増殖されているが、今日の細胞培養法ではｐｒｏＰＬＴの生産率は約１０％、ヒトＭＫ１個あたりＰＬＴ１０〜１００個の収率でしかない。ところが、体内循環するＰＬＴの個数に相当するには、ヒトのほぼすべての成熟ＭＫがそれぞれおよそ１，０００〜１０，０００個のＰＬＴを産生しなければならない。このことは、血小板輸血ユニットを生体外で製造するにあたり大きな障害になっている。第二世代細胞培養法によりＰＬＴ放出の生理的ドライバーについての見識は深まったが、完全なＢＭ微小環境は再現できておらず、細胞外基質（ＥＣＭ）組成、ＢＭ剛性、内皮細胞との接触、または血管ずり速度の制御は個別の限定的なものになっており、また、ｐｒｏＰＬＴを同期的に産生されておらず、ＰＬＴは６〜８日かけて不均一に放出されている。そのうえ、生理的に相当する条件下で高分解能生細胞顕微鏡観察によりｐｒｏＰＬＴの伸長と放出を解決することができないことから、ＰＬＴ産生の細胞骨格機構を同定して薬物開発を可能にし血小板減少症の新たな治療法を樹立しようという努力が著しく妨げられている。したがって、ＰＬＴ調達および保管に関するリスクを除去し、増大する輸血の需要に応えられるように、臨床的に有意味な個数の機能的ヒトＰＬＴを生成することができる、効率のよいドナー非依存性ＰＬＴ系が必要とされている。
【０００７】
上記を考慮すると、血管生理を再現して機能的ヒト血小板の高効率な産生に影響を及ぼすプロセス、機構、および条件を正確に反映することができるプラットフォームを用いたデバイス、系、および方法は依然として明白に必要である。そのようなプラットフォームは、輸注用ヒト血小板を効率よく生成するという目的、ならびに開発の前臨床段階で薬物効果および相互作用を樹立するために極めて有用であることが判明しよう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、たとえば生理的に正確な条件、環境、構造、および動的流れを体現したプラットフォームを用いて機能的ヒト血小板を生成するためのバイオミメティック流体系および方法を提供することによって、上述の欠点を克服するものである。このアプローチは、血小板減少症などの血小板欠乏状態の輸注治療、ならびに薬物開発用途に適している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様によると、基板を含んだバイオミメティック・マイクロ流体系が提供される。この系はまた、第１の投入部から第１の排出部まで長手寸法に沿って延び、第１の短手寸法に沿って延びる、基板に形成された第１のチャネルを含んでいる。この系はまた、第２の投入部から第２の排出部まで同じ長手寸法に沿って延び、第２の短手寸法に沿って延びる、基板に形成された第２のチャネルを含んでいる。第１のチャネルと第２のチャネルとは実質的に平行に延びている。この系はさらに、第１のチャネルから第２のチャネルまで延びて一連のカラムの間を通る流体連通路を作る一連の間隙を含んでいる。カラム同士は所定の分離距離だけ長手方向に分離されている。なお、所定の距離は、均等であってもよいし、間隙が異なる幅を有するように所定距離の範囲内で異なっていてもよい。この系はまた、第１の投入部に接続され、第１のチャネル内に少なくとも１種類の第１の生体組成物を第１のチャネル流量で選択的に導入するように構成された、第１のソースを含んでいる。次いでこの系は、第２の投入部に接続され、第２のチャネル内に少なくとも１種類の第２の生体組成物を第２のチャネル流量で選択的に導入するように構成された、第２のソースを含んでいる。第１のチャネル流量と第２のチャネル流量は、第２のチャネルに沿って所定範囲内に制限された生理的ずり速度が生じて一連の間隙を通じて第１のチャネル内の流れに影響を及ぼすようにされた差異を生じる。
【００１０】
本発明の別の態様では、少なくとも骨髄と血管構造のうちの１つの物理モデルを生産する方法が開示されている。この方法は、基板、および第１の投入部から第１の排出部まで長手寸法に沿って延び、第１の短手寸法に沿って延びる、基板に形成された第１のチャネルを含む、バイオミメティック・マイクロ流体系を含んでいる。この系はまた、第２の投入部から第２の排出部まで同じ長手寸法に沿って延び、第２の短手寸法に沿って延びる、基板に形成された第２のチャネルを含んでいる。第１のチャネルと第２のチャネルとは実質的に平行に延びている。この系はさらに、第１のチャネルから第２のチャネルまで延びて一連のカラムの間を通る流体連通路を作る一連の間隙を含んでいる。カラム同士は所定の分離距離だけ長手方向に分離されている。この系はまた、第１の投入部に接続された第１のソース、および第２の投入部に接続された第２のソースを含んでいる。この方法は、第１のソースを用いて第１の生体物質を上部チャネル内に第１のチャネル流量で導入し、第２のソースを用いて第２の生体物質を下部チャネル内に第２のチャネル流量で導入して、それによって第１のチャネル流量と第２のチャネル流量との間に差異を生じさせて第２のチャネルに沿って所定範囲内に制限された生理的ずり速度を生じさせることを含んでいる。この方法はまた、生理的ずり速度によって間隙に近接して産生された目的の生体物質を回収することを含んでいる。
【００１１】
本発明の前述のおよびその他の態様および利点は以下の説明から明らかになる。以下の説明では、本明細書の一部をなし、例示によって本発明の好ましい実施形態を示す添付図面を参照する。そのような実施形態はしかし、必ずしも本発明の全範囲を代表するものではなく、したがって本発明の範囲を解釈するには請求項および本明細書を参照する。
【００１２】
次に本発明を添付図面を参照して説明するが、図面では類似の要素を同じ参照番号で表すものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明によるバイオミメティック・マイクロ流体系の概略図である。
【図２Ａ】本発明による、細胞外基質（ＥＣＭ）の組成を再現するための骨髄および血管タンパク質での各マイクロ流体チャネルのコーティングを示す顕微鏡画像図である。
【図２Ｂ】本発明による、３次元のＥＣＭ組織および生理的骨髄（ＢＭ）剛性をモデルするアルギン酸ゲル（白い矢印）に選択的に埋め込んだ間隙またはマイクロチャネル内に捕捉された、巨核球（ＭＫ）を示す顕微鏡画像図である。
【図２Ｃ】本発明による、機能的血管を作るためにフィブリノゲンでコーティングした第２のチャネル内で選択的に培養されるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の顕微鏡画像図である。
【図２Ｄ】完全系の複合画像図である。
【図２Ｅ】本発明によるバイオミメティック・マイクロ流体系内のずり速度の模擬的分布を図式的に表した図である。
【図２Ｆ】本発明による、いくつかの注入量について第１のチャネルからの短手（軸方向）距離の関数としてのずり速度を図式的に表した図である。
【図２Ｇ】本発明による、閉塞したマイクロチャネル（スリットまたは孔）の数の関数としてのずり速度を図式的に表した図である。
【図３Ａ】本発明による、培養したＭＫの０時間と１８時間での径分布を図式的に表した図である。
【図３Ｂ】本発明による、精製後６時間のｐｒｏＰＬＴ産生を説明する、静置培養中のＭＫの顕微鏡画像図である。
【図３Ｃ】本発明による、捕捉直後のｐｒｏＰＬＴ産生を説明する、生理的ずり下のＭＫの顕微鏡画像図である。
【図３Ｄ】本発明による、生理的ずり下のｐｒｏＰＬＴ産生ＭＫの割合（％）が静置培養物よりも高いことを図式的に表した図である。
【図３Ｅ】本発明による、生理的ずり下のｐｒｏＰＬＴ伸長速度が、静置培養物と比較して有意に増加することを図式的に表した説明図である。
【図４Ａ】本発明による、ＭＫが３μｍ幅のマイクロチャネルをくぐり抜け、血管ＰＬＴ産生モデルが支持されたことを説明する顕微鏡画像図である。
【図４Ｂ】本発明による、ＭＫが３μｍ幅のマイクロチャネルを通って巨大断片を伸長させ、血管ＰＬＴ産生モデルが支持されたことを説明する顕微鏡画像図である。
【図４Ｃ】本発明による、ｐｒｏＰＬＴ伸長を説明する顕微鏡画像図である。
【図４Ｄ】本発明による、ｐｒｏＰＬＴの軸に沿って異なる位置でのｐｒｏＰＬＴの伸長および切断イベントを説明する顕微鏡画像図である。
【図４Ｅ】本発明による、切断の結果端部となったｐｒｏＰＬＴの先端に新たにＰＬＴ大の膨張が形成され、この膨張はその後伸長して放出され、このサイクルが繰り返されることを説明する顕微鏡画像図である。
【図４Ｆ】本発明による、生理的範囲内でずり速度が増加してもｐｒｏＰＬＴ伸長速度は増加しないことを説明する図式化した図である。
【図４Ｇ】本発明による、レトロウイルスのトランスフェクションによりＧＦＰ−β１チューブリンを発現するようにされたＭＫがｐｒｏＰＬＴ伸長を示し、ＰＬＴ大の端部でコイルを形成する末梢ＭＴで構成されていたことを説明する顕微鏡画像図である。
【図４Ｈ】本発明による、５μＭのＪａｓｐｌａｎｋｉｎｏｌｉｄｅ（Ｊａｓ、アクチン安定化剤）と１ｍＭのエリスロ−９−（３−［２−ヒドロキシノニル］（ＥＨＮＡ、細胞質ダイニン阻害剤）によって、ずり誘発性ｐｒｏＰＬＴ産生が阻害されることを説明する図式化した図である。
【図４Ｉ】本発明による、生理的ずり下でｐｒｏＰＬＴ産生が薬物により阻害されることを説明する顕微鏡画像図である。
【図５Ａ】本発明による、マイクロ流体デバイス由来のｍＦＬＣ−ＰＬＴに血小板の構造的および機能的特性が現れていることを説明する図式化した図である。
【図５Ｂ】本発明による、培養４日目に単離してからマイクロ流体デバイス内に注入したＧＰＩＸ＋ｍＦＬＣ−ＭＫ、および注入から２時間後にマイクロ流体デバイスから回収した流出液のバイオマーカーの発現ならびに前方／側方散乱および相対濃度を説明する図式化した図である。
【図５Ｃ】本発明による、ずりを与えることで、ＧＰＩＸ＋産物は、静置培養の上澄みと比べて、よりＰＬＴ大に近い細胞になることを説明する図式化した図である。
【図５Ｄ】本発明による、マイクロ流体デバイス内でｍＦＬＣ−ＭＫは２時間かけてＰＬＴに変換されることを説明する顕微鏡画像図である。
【図５Ｅ】本発明による、ずりを与えることで、産物は、静置培養の上澄みと比べて、よりＰＬＴ大に近いβ１チューブリン＋Ｈｏｅｓｃｈｔ−細胞になることを説明する図式化した図である。差込は、流出液中の自由核の定量化を示す。
【図５Ｆ】本発明による、マイクロ流体デバイスのｍＰＬＴは、マウス血小板と超微細構造的に類似し、皮質性ＭＴコイル、開放小管系、暗調小管系、ミトコンドリア、および特徴的分泌顆粒を含んでいることを説明する顕微鏡画像図である。
【図５Ｇ】本発明による、マイクロ流体デバイスのｍＰＬＴおよびＰＬＴ中間体は、マウス血小板と形態的に類似し、同等のＭＴおよびアクチン発現を示すことを説明する顕微鏡画像図である。
【図６Ａ】本発明による、マイクロ流体デバイス由来のｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは血小板の構造的および機能的特性を現し、ここでｈｉＰＳＣ−ＭＫは培養１５日目に最大径（２０〜６０μｍ）に達することを説明する図式化した図である。
【図６Ｂ】本発明による、ｈｉＰＳＣ−ＭＫは、初代ヒトＭＫと超微細構造的に類似し、分葉核、陥入膜系、グリコーゲン貯蔵、細胞小器官、および特徴的分泌顆粒を含んでいることを説明する顕微鏡画像図である。
【図６Ｃ】本発明による、静置培養中ｈｉＰＳＣ−ＭＫは精製後６時間でｐｒｏＰＬＴ産生を開始し、１８時間で最高ｐｒｏＰＬＴ産生率に達することを説明する顕微鏡画像図である。
【図６Ｄ】本発明による、生理的ずり（約５００ｓ-1）下のｈｉＰＳＣ−ＭＫは捕捉直後からｐｒｏＰＬＴ産生を開始し、培養開始から２時間以内にｐｒｏＰＬＴの伸長／放出が行われることを説明する顕微鏡画像図である。
【図６Ｅ】本発明による、生理的ずり下のｐｒｏＰＬＴ産生ｈｉＰＳＣ−ＭＫの割合（％）が、静置培養物と比較して有意に増加することを図式的に表した説明図である。
【図６Ｆ】本発明による、生理的ずり下のｐｒｏＰＬＴ伸長速度が約１９μｍ／分であることを図式的に表した説明図である。
【図６Ｇ】本発明による、マイクロ流体デバイス由来ｈＰＬＴは、ヒト血小板と超微細構造的に類似し、皮質性ＭＴコイル、開放小管系、暗調小管系、ミトコンドリア、および特徴的分泌顆粒を含んでいることを説明する顕微鏡画像図である。右上の差込は末梢ＭＴコイルを示すものである。
【図６Ｈ】本発明による、マイクロ流体デバイス由来ｈＰＬＴは、ヒト血小板と形態的に類似し、同等のＭＴおよびアクチン発現を示すことを説明する顕微鏡画像図である。
【図６Ｉ】本発明による、マイクロ流体デバイス由来ｍＰＬＴは活性化するとフィロポディア／ラメリポディアを形成し、ガラス表面で伸展することを説明する顕微鏡画像図である。
【図７】本発明による、Ｔ−ＤＭ１が、異常なチューブリン構造を誘発することによってＭＫ分化を阻害しｐｒｏＰＬＴ形成を中断させることを説明する生細胞顕微鏡画像図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
血小板（ＰＬＴ）は、血餅の形成および血管損傷の修復を刺激する重要な役割を果たす。低ＰＬＴ数による出血を原因とする罹患率および死亡率は、化学療法または放射線治療、外傷、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、臓器移植術、重度の熱傷、敗血症、および遺伝的疾患を含む多数の状態における重大な臨床的問題である。免疫原性とそれに付随するリスクにより医学的に深刻な問題があり、また高い需要と短い保存寿命のせいで在庫不足であるにもかかわらず、米国内で行われるＰＬＴ輸血は全部で年間１０００万ユニットを上回る。
【００１５】
ＰＬＴの産生には巨核球（ＭＫ）の分化が関与しており、ＭＫは骨髄（ＢＭ）内の洞様血管の外側に存在し、長い分岐状細胞構造（ｐｒｏＰＬＴと呼ばれる）を循環血中に伸ばす。ｐｒｏＰＬＴは血管のずりを受け、ＰＬＴ産生の組立てラインとして機能し、細い細胞質の橋によって縦ならびにつながるＰＬＴ大の膨張を含んでいる。ｐｒｏＰＬＴの詳細な特徴付けは未だ不完全であるが、前記の構造は試験管内および生体内の両方で確認されており、培養中ｐｒｏＰＬＴ産生ＭＫは、血小板と構造的および機能的に似たＰＬＴを産出する。ＰＬＴはｐｒｏＰＬＴの先端部から順次放出される。この機構は、細胞の分子支柱および梁として機能するチューブリンおよびアクチン繊維の複雑なネットワークに高度に依存している。微小管（ＭＴ）の束がｐｒｏＰＬＴの軸に平行に走り、ＭＴが互いの上を摺動することでｐｒｏＰＬＴの伸長が促される。ｐｒｏＰＬＴが成熟する間、細胞小器官および分泌顆粒はＭＴレール上を遠位に移動して行きｐｒｏＰＬＴ先端部で捕捉される。アクチンがｐｒｏＰＬＴの分岐およびＰＬＴ端部の増幅を促進する。マウスＭＫの生細胞顕微鏡観察がこの知見にとって非常に重要となっているが、今日まで大半の研究は試験管内で静置ＭＫ培養について行われている。
【００１６】
トロンボポエチン（ＴＰＯ）はＭＫ分化の主要な制御因子として特定されており、培養中高密度のＭＫを産生するのに用いられている。ある参照資料では、試験管内でｐｒｏＰＬＴ産生ＭＫから生成されたヒトＰＬＴが機能的であった、ということが示された。それ以来、ＭＫは、胎児肝細胞（ＦＬＣ）、臍帯血幹細胞（ＣＢＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む複数の供給源から分化されている。しかし、現在の２Ｄの液体ＭＫ培養物では、生体内でＭＫ１個あたり約２０００個生成されると推定される個数には遥かに及ばない。さらに最近では、流体の連続的流れ下でモジュール式３Ｄ編みポリエステルの足場を用いて、培養中１００万個のＣＤ３４+ヒト臍帯血細胞から１日あたり最高６×１０6個のＰＬＴを産生している。それらの３Ｄ灌流バイオリアクターは、臨床的に有用なＰＬＴ数が得られ得ることを示唆するものであるが、ＢＭ微小環境の複雑な構造および流体特徴を正確に再現するものではなく、閉鎖モジュール設計であるためｐｒｏＰＬＴ産生を可視化できず、ＰＬＴ放出機構についての見識はほとんど提供されない。代わりに、ＢＭ洞様毛細血管を再現し、試験管内でＭＫ分化およびＰＬＴ産生を研究するために、ＥＣＭコーティングした絹製管に隣接する３Ｄポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）バイオチップが提案されている。そのようなデバイスは、ＭＫが成熟する間の遊走を再現するものではあるが、高分解能生細胞顕微鏡検査には適しておらず、ＭＫの分化を促すのに必要な内皮細胞との接触を再現することはできない。
【００１７】
ＭＫ分化は培養中で研究されているが、特に生体内でのｐｒｏＰＬＴ産生を刺激する条件は依然としてよくわかっていない。ＭＫはＢＭニッチに見られ、ＢＭ間質の細胞−細胞、細胞−細胞基質、および可溶性因子の相互作用が、ｐｒｏＰＬＴ形成およびＰＬＴ放出に寄与していることを示唆するいくつかの証拠がある。実際、ケモカインＳＤＦ−１と増殖因子ＦＧＦ−４がＭＫを洞様内皮細胞に動員する。細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質はＢＭ血管ニッチの別の主要構成員であり、膜貫通糖タンパク質（ＧＰ）受容体を介するシグナル伝達によってｐｒｏＰＬＴの形成、ＰＬＴの個数および大きさが制御される、と示唆する証拠がある（その異常が、たとえばＢｅｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ症候群、グランツマン血小板無力症などに見られる）。コラーゲンＩＶおよびビトロネクチンはｐｒｏＰＬＴ産生を促進するが、それらの複合インテグリン受容体ＧＰＩｂαに対する抗体により阻害される場合がある。同様に、フィブリノゲンは、ＧＰＩＩｂｌｌｌａを介してｐｒｏＰＬＴの形成およびＰＬＴの放出を制御する。これらの発見はｐｒｏＰＬＴ産生の環境的決定因子を解明するものであるが、還元主義的アプローチによって制限されている。したがって、ＭＫからＰＬＴへの生理的制御を解明するために、ＢＭ間質の複雑さを定義する特性を組み入れた新しいモデルが必要とされている。
【００１８】
ＢＭ内で、ｐｒｏＰＬＴは１００から１０，０００ｓ-1の、またはより具体的には、５００から２５００ｓ-1の壁面ずり速度を受ける。連続的な血流がＰＬＴの血栓形成に及ぼす役割については研究されているが、意外にもずり力がＰＬＴ放出を制御する機構に着目したものはほとんどない。研究した場合も、実験では生理的再現をしていない。いくつかの予備研究では、ＭＫをＥＣＭコーティングしたスライドガラス表面に灌流しているが、これらはＥＣＭとの接触による活性化とずりとを区別せずに固定化／接着ＭＫを選別するものである。あるいは、放出されたｐｒｏＰＬＴをインキュベーターシェーカー内で求心的に撹拌しているが、それは循環的ずり層流を再現するものではなく、血管ずり速度を精密に制御しておらず、高分解能生細胞顕微鏡観察に適さない。これらの主要な制限はあるものの、ＭＫを高いずり速度に晒すとｐｒｏＰＬＴ産生が加速されるようであり、ずりなしで培養されたｐｒｏＰＬＴは、流体ずり応力下に維持されたものよりもＰＬＴ放出数が少ないようである。
【００１９】
マイクロ流体デバイスは、流体の動的流れを発生させ精密調整し、かくして血管条件を模倣して細胞に化学的キューを送るための優れたプラットフォームを提供する。マイクロ流体ネットワークを含細胞ハイドロゲルに埋め込むと、３Ｄ足場を通して可溶性因子の高効率な対流輸送が支持されることが示されている。アガロース被包肝細胞、初代軟骨細胞を播種したアルギン酸カルシウムのハイドロゲル、および３Ｄ管状ポリ（エチレングリコール）ハイドロゲルに埋め込んだ内皮細胞で構成される生存可能な３Ｄ組織コンタクト（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｔａｃｔｓ）が製造されている。したがって、この技術は、肝臓、腎臓、腸、および肺を含む臓器オンチップの開発に適用されている。さらに、最近開発されている微小血管系オンチップの各種モデルは、試験管内での心臓血管生物学および病理生理学の研究に使用されている。これらの研究から、細胞性および生理的発生の研究には生物の物理的微小環境および天然化学的キューの模倣が重要であることが強調されている。たとえば、このことは特に、薬物媒介性ＰＬＴ産生阻害にとって重要である。ｐｒｏＰＬＴ産生ＭＫはＢＭ内で血管のすぐ外側に存在し、ＢＭの半固体ＥＣＭ微小環境と循環血の流体微小環境の両方と相互作用するので、バイオミメティック・マイクロ流体バイオチップは、薬物性血小板減少症をもたらすものなど関連の生理的機構を解明するためのモデル系を実現する可能性がある。
【００２０】
次に図１を参照すると、本発明の様々な実施形態によるバイオミメティック系１００の一例を説明する概略図が示されている。系１００は、基板１０１、第１のチャネル１０２、および第２のチャネル１０４を含み、各チャネルは、限定ではないがたとえば粒子、細胞、物質、微粒子、材料、組成物などを輸送するかまたはそれらからなるあらゆる流体媒質の流れを運ぶように構成されている。一実施形態では、系１００および／または基板１０１は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの細胞不活性シリコン系有機ポリマーで作製することができる。
【００２１】
第１のチャネル１０２は、第１のチャネル投入部１０６および第１のチャネル排出部１０８を含んでいる。同様に、第２のチャネル１０４は、第２のチャネル投入部１１０および第２のチャネル排出部１１２を含んでいる。第１のチャネル１０２および第２のチャネル１０４は、実質的に長手方向に延び、後述するように、生理的系にあるような所望の流れプロファイル、流速または流量が得られるような長手方向および短手方向の寸法を有している。一態様では、チャネルを説明する長手１３０寸法と短手１３２寸法のサイズは、骨髄や血管の場合などの解剖学的もしくは生理的構造、集まり、構成、または配置と一致する範囲内であり得る。一例として、長手１３０寸法は、１０００から３０，０００マイクロメートルの範囲、またはより具体的には、１０００から３０００マイクロメートルの範囲であり得、短手１３２寸法は、１００から３，０００マイクロメートルの範囲、またはより具体的には、１００から３００マイクロメートルの範囲であり得るが、他の値も可能である。別の態様では、各チャネルは、横断中の流体媒質からたとえば粒子、細胞、物質、微粒子、材料、組成物などを受け、限局化し、捕捉し、または集積するように調製し、調節し、または製造することができる。
【００２２】
系１００はまた、第１のチャネル１０２と第２のチャネル１０４を分離する一連のカラム１１４も含んでいる。カラム１１４の長軸線はチャネルの長手１３０寸法とほぼ平行になるように配置され、一連のカラム１１４はチャネルの長手１３０寸法と実質的に等しい距離を延びている。カラム１１４は複数の間隙で分離されているが、例示のように、これらの間隙は第１のチャネル１０２から第２のチャネル１０４へと延びて、カラム１１４の間を通って部分的流体連通路を作るマイクロチャネル１１６となり得る一連の間隙を作っている。しかし、「マイクロチャネル」という用語は、間隙を指す場合は特定の幅を含意するものではない。たとえば、間隙は、マイクロメートル範囲よりかなり大きくても小さくてもよい。一実施形態では、カラム１１４およびマイクロチャネル１１６は、粒子、細胞、物質、微粒子、材料、組成物などが、カラム１１４およびマイクロチャネル１１６に概ね近い部位に結合、接着、またはそれ以外で固定され、それによってマイクロチャネル１１６に近接する部位から回収されるような寸法とされる。一例として、カラム１１４の長手１３０寸法および短手１３２寸法は、１から２００マイクロメートルの範囲であり得、一方でマイクロチャネル１１６の長手１３０寸法は、カラム１１４間の分離距離または間隙により画定され、０．１から２０マイクロメートルの範囲であり得るが、他の値も可能である。
【００２３】
第１のチャネル１０２内の流れは、第１の媒質を送達するように構成された第１のソースまたは投入部１１８、および第１の流体媒質を抽出するように構成された第１の出口１２０を通って成立する。同様に、第２のチャネル１０４内の第２の流体媒質の流れは、第２のソースまたは入口１２２から第２の出口１２４を通って成立する。第１の投入部またはソース１１８および入口１２２の第２のソースは、ポンプまたは他の系を含んで、流れを制御して送るように構成され得る。ある構成では、第１の出口１２０または第２の出口１２４は、たとえばヒト血小板または栓球など、第１または第２の流体媒質から所望の材料または物質を捕捉し、保存し、かつ／または分離するように設計された素子、コンポーネント、デバイス、または系が装着されるかまたは後続することができる。すなわち、第１のチャネル投入部１０６と第１のチャネル排出部１０８の間の第１の流体媒質の流速または流量、および、第２のチャネル投入部１１０と第２のチャネル排出部１１２の間の第２の流体媒質の流速または流量は、任意の数のマイクロ流体ポンプなどのソースおよびドレインによる系１００の流体連通によって設定することができ、任意の所望または必要な時間だけ維持することができる。流れの制御および操作は、バルブ、ソース、およびドレインなどの素子を系１００と一体化することによって実現することができ、または系１００を流体駆動および流れ制御用の様々なコンポーネントと外部連絡または連結することによって実現することができる。
【００２４】
後述するように、第１のチャネル１０２内の流速または流量と第２のチャネル１０４内の流速または流量とは、所望どおりに、またはたとえば骨髄や血管内に見られるような生理的要素、構成要素、および条件の再現、モデル、または複製に必要なように、互いに大きく異なるように構成され得る。別の実施形態では、流速または流量は、血管ずり速度およびプロファイルなどの生理的ずり速度およびプロファイルを複製するような方法で制御され得る。
【００２５】
系１００はまた、ろ過素子１２６を含み、このろ過素子は、どのような形状または形態であってもよく、第１の流体媒質と第２の流体媒質それぞれの流路に沿って配置され、横断中の流体媒質からあらゆる種類のデブリ、塵、および他の任意の汚染物質または望ましくない材料、成分、または微粒子を捕捉または除去するように設計されている。ある構成では、ろ過素子１２６は、第１の入口１１８および第２の入口１２２に近接して配置されている。系１００は、さらに、流れ抵抗素子１２８を含み、この流れ抵抗素子は、あらゆる形状または形態であり得、第１の流体媒質と第２の流体媒質それぞれの流路に沿って配置され、流れ力を制御するかまたは流量の変動を抑えるように設計されている。ある構成では、流れ抵抗素子１２８は、第１の流体媒質と第２の流体媒質それぞれの流路に沿って、それぞれのろ過素子１２６に続いて配置され得る。
【００２６】
ある構成では、ヒト骨髄（ＢＭ）の血管ニッチの生体外での再現は、骨粉、Ｃｌ、ＣＩＶ、ＦＧ、ＦＮ、ＶＮ、ＬＮおよびＶＷＦなどのタンパク質、アガロース、アルギン酸、およびマトリゲルなどのゲル、またはＰＢＳ、ＨＢＳなどの溶液、ＤＭＥＭ、ＥＧＭもしくは他の培地を単独かまたは組み合わせたものを第１のチャネル１０２に選択的に詰めることによって、実現することができる。あるいは、バイオチップを表面スライドに接着する前にタンパク質マイクロ／ナノスタンプによって、または、マイクロ流体デバイスの組立後にマイクロ流体平行流によって、ガラス表面にＥＣＭタンパク質で直接パターン形成してもよい。アラインメントと３Ｄ構成に重点を置いて、注入中にマイクロ流体流の流量を制御することにより、局所成分濃度を調節することができる。
【００２７】
別の構成では、ヒトＢＭ血管系の再現は、第２のチャネル１０４を内皮細胞とともに３７℃、５％ＣＯ2で培養することによって選択的にコーティングすることで実現可能である。内皮細胞は、４％ホルムアルデヒドで固定し、細胞バイオマーカーを探索して、細胞局在化および構造（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を決定することができる。内皮化ＢＭバイオチップの第２のチャネル１０４は、ＦＩＴＣ−デキストランなどの蛍光または比色培地かまたはビーズで灌流し、生細胞顕微鏡観察により可視化して、試料／細胞／分子の拡散を評価し血管透過性を決定することができる。
【００２８】
本発明による系１００は、バイオミメティック・マイクロ流体デバイスを用いてヒト細静脈に見られる寸法、環境、および条件を複製することによって、ヒトＢＭのものなど生理的条件を再現するプラットフォームを提供することができる。互いに接近して離間しているカラムで分離され、制御された環境および流れ条件を受けているマイクロ流体チャネルは、本物そっくりの生理的モデルを体現しており、機能的ＰＬＴの産生に利用することが可能である。こうすれば、ＭＫ捕捉、ＢＭ剛性、ＥＣＭ組成、マイクロチャネルのサイズ、血管の血行動態性のずり、および内皮細胞との接触を、試験管内でのヒトＢＭ産生に合わせて調整することができる。
【００２９】
このアプローチで用いられる材料や方法の具体的な例を以下に詳述する。なお、例は、例示目的のみで提供するものであり、本発明の範囲をいかようにも限定するものではない。実際、本明細書に示し記載するものに加えて、血液脳関門のモデルや別々の培地間での分子拡散研究への本発明の適用など本発明の様々な変形が、先の説明および以下の例から当業者には明白になるであろうし、それらも添付の請求項の範囲内である。たとえば、具体的な寸法、構成、材料、細胞種、微粒子、流れ媒質および流量、作製法およびレシピ、ならびに画像法、プロセスおよび解析の方法などが提供されるが、それら以外を使用することも可能であることを理解されたい。
【実施例】
【００３０】
（マイクロ流体デバイスの設計および作製）
図１に示すように、気泡や塵を捕捉するパッシブ・フィルターと、これに続く動作中に生じる流量の変動を抑えるのに使用される流体抵抗器とを内蔵する２つのチャネルで構成されるマイクロ流体デバイスを、ソフトリソグラフィーを使用して作製した。２つのチャネルは、長さ１３００マイクロメートル、幅１３０マイクロメートル、深さ３０マイクロメートルの長方形領域と合体し、互いに３マイクロメートル離間している一連のカラム（幅１０マイクロメートル、長さ９０マイクロメートル）によって分離されている。細胞培養の間高効率のガス交換を保証し、高分解能生細胞顕微鏡観察を支持するため、マイクロ流体デバイスは、スライドガラスに結合させた細胞不活性シリコン系有機ポリマーで作製した。
【００３１】
ＡｕｔｏＣＡＤのＡｕｔｏＤｅｓｋソフトウェアを用いて所望の２Ｄパターンを設計し、フォトリソグラフィー用クロムマスク上にプリントした。シリコンウエハ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗａｆｅｒｓ社  マサチューセッツ州ボストン）にＳＵ−８  ３０２５フォトレジスト（Ｍｉｃｈｒｏｃｈｅｍ社  マサチューセッツ州ニュートン）をスピン塗布してフィルム厚さを３０マイクロメートルにし（Ｌａｕｒｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社  ペンシルバニア州ノースウェールズ）、６５℃で１分間と、９５℃で５分間焼き付けてから、クロムマスク越しに３０秒間紫外線曝露した（約１０ｍＪ／ｃｍ-2）。未結合のＳＵ−８フォトレジストは基板をプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートに７分間浸漬して除去した。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）をシリコンウエハのパターン形成面に注ぎ、脱ガスし、６５℃で約１２時間かけて架橋結合させた。硬化後、ＰＤＭＳ層を型から剥がし、０．７５ｍｍ生検パンチで入口と出口の穴を開けた。酸素プラズマ処理（ＰｌａｓｍａＰｒｅｐ  ２、ＧａＬａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ  ＧｍｂＨ社  ドイツ国バートシュバルバッハ）してから、ＰＤＭＳスラブをカバーガラス（＃１．５、０．１７×２２×５０ｍｍ、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社  ベルギー国スネッフ）に結合させて、チャネルを密封した。２７ゲージ針を取り付けた１ｍＬシリンジ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社  ニュージャージー州フランクリンレイクス）を用いてＰＥ／２管（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｍｏｄｉｔｉｅｓ社  アリゾナ州レイクハバスシティ）を介して試料をマイクロ流体デバイスに注入した。液体の流量は、シリンジポンプ（ＰＨＤ  ２０００、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社  マサチューセッツ州ホリストン）により制御した。
【００３２】
（マイクロ流体デバイスの操作）
デバイスを０．２２μｍのろ過済み１０％ＢＳＡ溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社  マサチューセッツ州ビレリカ）で３０分かけてコーティングして、細胞がガラスと直接接触しないようにした。初代ＭＫと培地を、２シリンジマイクロ流体ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社  マサチューセッツ州ホリストン）を用いて１２．５μＬ／時の速度で第１の入口１１８と第２の入口１２２にそれぞれ注入した。第１の出口１２０が閉じると、投入溶液を両方とも第２の出口１２４に向けて、初代ＭＫが捕捉されるようにした。
【００３３】
（細胞外基質組成モデル（２Ｄ））
ローダミン結合フィブリノゲン（１ｍｇ／ｍＬ）またはフィブロネクチン（５０μｇ／ｍＬ、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｏｎ社  コロラド州デンバー）をチャネル内に３０分間灌流させることによって、マイクロ流体デバイスを細胞外基質タンパク質で選択的にコーティングした。試料を両入口から並行して灌流させ、両出口から回収して、層流が混合されないようにした。デバイスを１×ＰＢＳで洗ってから０．２２μｍのろ過済み（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社  マサチューセッツ州ビレリカ）１０％ＢＳＡ溶液（Ｒｏｃｈｅ社  カリフォルニア州南サンフランシスコ）で３０分かけてコーティングして、ガラスの曝露されている残りの部分をすべてコーティングした。
【００３４】
（ＢＭ剛性モデル（３Ｄ））
初代ＭＫを、培地中、平均分子量１５０〜２５０ｋＤの１％滅菌アルギン酸（Ｐｒｏｎｏｖａ  ＳＬＧ１００、ＦＭＣ  ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ社  ノルウェー国）中に再懸濁させ、ＭＫが捕捉されるまでマイクロ流体デバイス全体（第１の入口１１８、第２の出口１２４）に灌流させた。次いで第２のチャネルを１×ＰＢＳで選択的に灌流して、このチャネルからアルギン酸を除去した。均質なアルギン酸ゲルを作るために、３０ｍＭのナノ粒子炭酸カルシウム（ｍｋＮＡＮＯ社、カナダ国）をカルシウム源として用い、６０ｍＭのゆっくり加水分解するＤ−グルコノ−δ−ラクトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社  ミズーリ州セントルイス）中に溶解させて、カルシウムを溶液中に放出させた（審査中  Ｋｈａｖａｒｉ  ｅｔ  ａｌ  ＮＪＰ  ２０１３）。この炭酸カルシウム懸濁液を、第１のチャネル内に保持されているアルギン酸溶液が重合するまで、第２のチャネルに灌流した（約２０分）。次に第２のチャネルを１×ＰＢＳで選択的に洗い、培地と置き換えた。アルギン酸ゲルの機械的特性を決定するために、０．２５％、０．５％、１．０％、および２．０％のアルギン酸ゲルをそれぞれ調製し、それらの振動数依存性ずり弾性率を３７℃でレオロジー測定した（Ａｒｅｓ  Ｇ２  ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社  デンバー州ニューキャッスル）。
【００３５】
（洞様血管接触モデル（３Ｄ））
マイクロ流体デバイスを上述のように５０μｇ／ｍＬフィブロネクチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｏｎ社  コロラド州デンバー）と１０％ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ社  カリフォルニア州サンフランシスコ）で選択的にコーティングし、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターに移した。ＥＢＭ培地中ＨＵＶＥＣ１０，０００，０００個／ｍＬ（Ｌｏｎｚａ社、スイス国バーゼル）を、フィブロネクチンをコーティングしたチャネルに１２．５ｕＬ／時で播種し、３時間放置してこの表面に接着させた。入口の試料を細胞を含まないＥＢＭ培地と入れ換え、ＨＵＶＥＣがコンフルエントになるまでチャネル内を灌流させた（２〜８日）。細胞を５μＭ  ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄおよび１μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｓｃｈｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  カリフォルニア州カールスバッド）で４５分かけて着色し、新鮮培地中で洗うかまたは４％ホルムアルデヒドで固定し、共焦点蛍光顕微鏡により可視化した。
【００３６】
（血管ずり速度モデル（３Ｄ））
ＭＫに及ぼされるずり応力は、マイクロ流体デバイス内流体力学の計算モデルにより推定した。市販の有限要素法ソフトウェア（ＣＯＭＳＯＬ）を用いてナビエ−ストークス方程式を解いた。非圧縮性流れの定常状態のナビエ−ストークス流れ方程式は、以下のとおりである。
【数１】
0006429794.tif 000002
【００３７】
式中、ρは流体密度、
【数２】
0006429794.tif 000003
は流れ速度、ｐは圧力、μは流体粘度、ｆは流体に作用する体積力である。方程式（１）は、マイクロ流体デバイスの寸法を正確に複製する３次元計算ドメインで解いた。デバイス内の流体は水の粘度（０．００１Ｐａ  ｓ）および密度（１０００ｋｇ／ｍ3）を有すると想定した。チャネルの壁面ではｎｏ  ｓｌｉｐ境界条件を想定した。注入流量は１２．５〜２００μＬ／時の範囲であった。三角メッシュをスリットではより細かくしてドメイン離散化に用いた。モデルの自由度は３１５，３１７であった。１０％未満のずり速度間の差を得て確認されたメッシュ独立性の自由度は、２５１，１０１から４１５，３０９の間に見出された。定常状態の解は、ＵＭＦＰＡＣＫ線形系ソルバーを用いて得た。
【００３８】
（初代マウス巨核球培養）
マウスＦＬＣはＷＴ  ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、マサチューセッツ社ウィルミントン）から採取し、ＭＫを培養した。
【００３９】
（電子顕微鏡法）
巨核球投入液とバイオリアクター流出液を、０．１−Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中１．２５％パラホルムアルデヒド、０．０３％ピクリン酸、２．５％グルタルアルデヒドで１時間かけて固定し、１％四酸化オスミウムで後固定し、一連のアルコール類により脱水し、酸化プロピレンで浸潤し、エポキシ樹脂に包理した。超薄切片を染色し、Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴｗｉｎ電子顕微鏡（オレゴン州ヒルスボロ）により加速電圧８０ｋＶで検査した。画像はＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ社（ＡＭＴ）の２−Ｋ電荷結合素子カメラで、ＡＭＴデジタル取得および解析ソフトウェアを用いて記録した（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ社、マサチューセッツ州ダンバース）。
【００４０】
（免疫蛍光顕微鏡法）
巨核球、放出されたｐｒｏＰＬＴ、またはバイオリアクター流出液を精製してからプローブした。試料は、５μＭ  ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）とともに４５分間インキュベートした後、新鮮培地中で洗浄し生細胞蛍光顕微鏡観察による可視化か、または４％ホルムアルデヒドで固定し、ポリ−Ｌ−リジン（１μｇ／ｍＬ）をコーティングしたカバーガラス上で遠心分離、のいずれかに供した。細胞骨格成分を解析するために、試料を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で透過処理し、免疫蛍光ブロッキング緩衝液（５０ｍｌの１×ＰＢＳ中、０．５ｇ  ＢＳＡ、０．２５ｍｌの１０％アジ化ナトリウム、５ｍｌ  ＦＣＳ）中で一晩かけてブロックしてから抗体標識（５５）した。微小管の細胞骨格を明示させるために、試料をマウスまたはヒトβ１−チューブリンに対するウサギポリクローナル一次抗体とともにインキュベートした。アクチンの細胞骨格を明示させるために、試料をＡｌｅｘａ  ５６８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）とともにインキュベートした。細胞核を１μｇ／ｍＬのＨｏｅｓｃｈｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）で標識した。バックグラウンドの蛍光および非特異的抗体標識を修正するために、スライドを二次抗体のみとともにインキュベートして、全画像を調節した。試料は１０×（開口数０．３０）Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ空気対物レンズおよび６３×（開口数１．４）Ｐｌａｎ−ＡｐｏＣｈｒｏｍａｔ油浸対物レンズ搭載Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、ニューヨーク州ソーンウッド）で検査し、画像をＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社、マサチューセッツ州ボストン）で取得した。画像はＭｅｔａｍｏｒｐｈバージョン７．７．２．０画像解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社  米国カリフォルニア州サニーベール）およびＩｍａｇｅＪバージョン１．４７ｐソフトウェア（国立衛生研究所ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．ｅｚｐ−ｐｒｏｄ１．ｈｕｌ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｉｊ／）を用いて解析した。
【００４１】
（細胞の大きさおよび形態の決定）
細胞を個別に閾値処理し、細胞質面積および周囲長のハイコンテンツな測定を、研究者がコード化したソフトウェアを用いてＩｍａｇｅＪで実施した。概要を以下に述べる。解析はすべての試料を手作業で検査して確認し、閾値処理が不適当な細胞は解析から除外した。ＭＫの直径は、面積測定値から計算して非円形細胞を記述した。条件ごとに２０００個を超える細胞を勘定し、少なくとも３つの独立試料についてＭＫ面積および流出液組成の解析を実施した。試料対のスチューデント両側ｔ検定を行って統計的有意さを確定した。エラーバーは平均値を中心とする１標準偏差を表している。
【００４２】
（生細胞顕微鏡法）
ずり培養物は、ＭＫを「裸の」マイクロ流体デバイス（ＢＳＡのみコーティング）にロードし、注入速度を１２．５μＬ／時から２倍ずつ漸増させ２時間かけて２００μＬ／時とした。静置培養物は、３％ＢＳＡをコーティングしたカバーガラスを１ｃｍ穴を有する１０ｍｍシャーレに載せて作製したチャンバ内に、単離したＭＫをピペットで移し、２４時間培養した。静置培養物もずり培養物も３７℃、５％ＣＯ2を維持し、１０×（開口数０．３０）Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ空気対物レンズ搭載Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、ニューヨーク州ソーンウッド）で検査した。ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社、マサチューセッツ州ボストン）を用いて２秒（ずり培養物）または２０分（静置培養物）の間隔で微分干渉（ＤＩＣ）画像を取得した。画像はＭｅｔａｍｏｒｐｈバージョン７．７．２．０画像解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社  米国カリフォルニア州サニーベール）およびＩｍａｇｅＪソフトウェアのバージョン１．４７ｐを用いて解析した。ｐｒｏＰＬＴの伸長速度は、少なくとも３つの独立試料から２００個以上のＭＫについて手作業で決定した。ＰＬＴの伸展実験ではマイクロ流体デバイスから２時間後に流出液を回収し、上述のコーティングしていない静置培養チャンバにピペットで移した。ＰＬＴは、放置して引力により沈降させガラスと接触させ、伸展を５秒間隔で５分間撮影した。
【００４３】
（ＧＦＰ−β１チューブリンのレトロウイルストランスフェクション）
Ｄｅｎｄｒａ２融合β１チューブリンをｐＭＳＣＶプラスミドにクローン化した。ＨＥＫ２９３細胞をパッケージする細胞を、１０％ウシ胎児結成（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で３０〜５０％コンフルエントになるまで培養した。ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションは、ｐＭＳＣＶベクター内でｇａｇ／ｐｏｌ、ｖｓｖＧ、およびＤｅｎｄｒａ２と融合させたβ１チューブリンをコードするＤＮＡプラスミド２μｇを用いて実施した。翌日培地を交換してから細胞を７２時間インキュベートしてウイルス産生した。上澄みを０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社  マサチューセッツ州ビレリカ）でろ過し、アリコートを−８０℃で保存した。培養２日目、上述の胎児肝臓培養物から単離したＭＫを１０％ＦＢＳ、８μｇ／ｍＬポリブレン（Ｓｉｇｍａ社）、およびレトロウイルス上澄み液を含むＤＭＥＭ中に再懸濁させた。試料を６ウェルプレートに移し、８００ｘｇで９０分２５℃で遠心分離してから３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベート後、ＭＫを遠心分離で洗い、１０％ＦＢＳおよびＴＰＯを含む新鮮なＤＭＥＭ中に再懸濁させた。ＭＫを培養４日目まで放置して成熟させ、次いで上述したようにＢＳＡグラジエントで単離した。
【００４４】
（フローサイトメトリー）
静置ＭＫ培養物またはバイオリアクター流出液の放出ｐｒｏＰＬＴ画分から血小板を回収し、静止条件下で検査した。試料を抗ＣＤ４２ａまたはＣＤ４１／６１  ＦＩＴＣ結合抗体（Ｅｍｆｒｅｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社  ドイツ国アイベルシュタット）を用いてプローブし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で解析した。ＰＬＴは、検出器を通過するときの前方または側方散乱特徴によってゲート処理し、ＦＩＴＣ結合ＩｇＧ抗体特異性コントロールを除してから全体の蛍光強度を計算した（Ｅｍｆｒｅｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社）。ＰＬＴ収量の定量化は、流出液回収期間の純ＧＰ  ＩＸ＋ＰＬＴ産生を純ＧＰ  ＩＸ＋ＭＫ減失で割って決定し、少なくとも３つの独立試料について実施した。結果はＧＰ  ＩＩｂＩＩＩａ＋細胞について一致した。
【００４５】
（画像解析）
Ｍｅｔａｍｏｒｐｈで取得したデジタル画像をＩｍａｇｅＪおよびＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ３（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社  カリフォルニア州サンノゼ）を使用して解析した。分割線は、異なる画像間または同一画像の別々の領域を明白に分離する。画像内の特定の特性の強調、ぼかし、移動、除去、または挿入はせず、また、明度、コントラスト、色バランスの調節は画像全体に線形適用した。
【００４６】
＜マイクロ流体デバイスはヒトＢＭの生理的特徴をモデルする＞
生理的条件を再現するために、各チャネルを、ＢＭのＥＣＭ組成を再現するためフィブリノゲンと、血管微小環境を再現するためフィブロネクチンとで、選択的にコーティングした（図２Ａに示す）。マイクロ流体デバイス全体に流れを送ることによって、第１のチャネルに沿って注入された初代ＭＫは順次カラム間に捕捉され、ｐｒｏＰＬＴを第２のチャネル内に伸長させることになり（図２Ｂに示す）、生理的ｐｒｏＰＬＴ伸長が再現される。３ＤのＥＣＭ組織および生理的ＢＭ剛性（２５０Ｐａ）をモデルするため、マイクロ流体デバイス内で重合させた１％アルギン酸溶液にＭＫを注入し、第１のチャネル内でアルギン酸ゲルにＭＫを選択的に埋め込み、第２のチャネル内の血管の流れは保持した。アルギン酸はｐｒｏＰＬＴ産生を阻害せず、第２のチャネルからのＭＫ距離は制御可能であった。
【００４７】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を第２のチャネルに沿って選択的に播種し、コンフルエントになるまで増殖させて、機能的血管を作った（図２Ｃ）。加えて、ＭＫの振舞を高分解能生細胞顕微鏡の拡大率１０×〜１５０×で監視し、放出されたＰＬＴを流出液から回収した。図２Ｄは動作を説明する完全系を示す。層流ずり速度を特徴付け（図２Ｅに示す）、２つのマイクロ流体ポンプ（第１のチャネルと第２のチャネルに１つずつ）を用いて厳密に制御した。デバイス内のずり速度は注入速度と線形比例しており、生理的範囲内（５００〜２５００ｓ-1）であるように調節した。空のマイクロチャネル接合部ではずり速度は第１のチャネルからの距離に応じて増大したが（図２Ｆに示す）、ＭＫが捕捉されると、流れは次の空いている間隙に向け直されるので、ＭＫは引き続き生理学的な（７６０〜７８０ｓ-1）ずり速度をこれらの部位で受けることができた（図２Ｇに示す）。
【００４８】
＜血管のずりによって、ｐｒｏＰＬＴの産生、生理的伸長、および放出が引き起こされる＞
生体内のＢＭのＭＫは血流の方向にｐｒｏＰＬＴを伸長させ、ＰＬＴ、ｐｒｏＰＬＴ、巨大細胞質断片（ｐｒｅＰＬＴ）、そして全ＭＫをも洞様血管中に放出し、全ＭＫは肺微小血管床（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｅｄ）内に捕捉されるか、あるいは血流中で成熟する場合がある。生理的ずりがＰＬＴ産生に及ぼす影響を決定するため、マウス胎児肝臓培養物由来（ｍＦＬＣ）ＭＫを培養４日目に単離し、マイクロ流体デバイスに注入する前に大きさと倍数性によって特徴付けた（図３Ａに示す）。
【００４９】
輸血用ＰＬＴを試験管内で産生する際の主要な難点の１つは、ｐｒｏＰＬＴ産生を引き起こす要因の特定である。静置条件下ではＭＫは単離後約６時間でｐｒｏＰＬＴを産生し始め、１８時間で最高ｐｒｏＰＬＴ産生率に達する（図３Ｂに示す）。これと比較して、生理的ずり（およそ５００ｓ-1時を図３Ｃに示す）下のＭＫは、捕捉後数秒内にｐｒｏＰＬＴを産生し始め、培養開始から２時間以内に最高ｐｒｏＰＬＴ産生率およびバイオチップ飽和に達した。生理的ずり下で培養したＭＫは、より少ない、より長いｐｒｏＰＬＴを産生し、静置培養物と比べて分岐に富んでいなかった。ずり培養物中のｐｒｏＰＬＴは下部チャネル内へと均等に伸長し、血管チャネル壁に対する流れの方向に揃って、生理的ｐｒｏＰＬＴ産生を再現していた。生理的ずり下のｐｒｏＰＬＴ産生ＭＫの割合（％）は、静置培養物の倍であり、およそ９０％に上った（図３Ｄに示す）。
【００５０】
輸液用に臨床使用できる個数のＰＬＴを産生する際の別の難点は、試験管内培養物は、生体内で観察されているよりもかなり遅い速度でｐｒｏＰＬＴを伸長させることである。発明者らのマイクロ流体デバイスにおいて生理的ずりを与えると、ｐｒｏＰＬＴ伸長速度は静置培養コントロールの１０倍増加しておよそ３０μｍ／分となり（図３Ｅに示す）、これは生体顕微鏡を用いた生体マウスの研究結果のｐｒｏＰＬＴ伸長速度の生理的推定値と一致し、試験管内のＰＬＴ産生増大を支持するものである。
【００５１】
ヒトおよびマウス両者の初期の組織学的研究では、全ＭＫならびにＭＫ断片は、ＢＭ血管の裏張りの血管内皮の間隙または小孔をくぐり抜けて、肺血管床（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｂｅｄ）内に捕捉されるのでは、と予測されている。ｐｒｅＰＬＴと呼ばれる巨大ＰＬＴ中間体が最近血液中に発見され、マウスにｍＢＭおよびＦＬＣ由来ＭＫならびにｐｒｅＰＬＴを静脈内注射すると、ＰＬＴが生体内産生される。本研究では、１００μｍ＋径のＭＫが３μｍ（図４Ａに示す）および１．５μｍの間隙をくぐり抜けること、または巨大ＭＫ断片を伸長させること（図４Ｂに示す）が常時観察され、血管ＰＬＴ産生モデルが支持された。加えて、切断イベントが高分解能生細胞顕微鏡観察により常時捉えられ、切断はｐｒｏＰＬＴの軸に沿って様々な位置で生じ、ｐｒｅＰＬＴ大の中間体（３〜１０μｍ径）およびＰＬＴ（１．５〜３μｍ径）の両方（図４Ｃおよび図４Ｄに示す）が放出されていた。各切断の結果ｐｒｏＰＬＴの端部となった部分は先端に新たにＰＬＴ大の膨張を形成し、これは次に伸長して放出され、このサイクルが繰り返された（図４Ｅに示す）。
【００５２】
ずり速度を一定にしたが、ｐｒｏＰＬＴ伸長速度は軸の各位置で異なり、制御下の細胞骨格駆動ｐｒｏＰＬＴ伸長機構が予示された（図４Ｃに示す）。生理的範囲内でマイクロ流体ずり速度を増加させても、培養中ｐｒｏＰＬＴ伸長速度の中央値またはｐｒｏＰＬＴ伸長速度の分布は影響を受けず（図４Ｆに示す）、レトロウイルス組み換えによりＧＦＰ−β１を発現するＭＫのｐｒｏＰＬＴの突起はＰＬＴ大の端部でコイルを形成した末梢微小管（ＭＴ）で構成されていた（図４Ｇに示す）。ｐｒｏＰＬＴは５ｍｍを上回る長さに達し試験管内で最高１０００ｓ-1のずり速度に抵抗し、こうして生体内顕微鏡観察によるｐｒｏＰＬＴ産生の生理的例が再現され、切断イベントの原因はずりではないことが示された。ずり誘発性ｐｒｏＰＬＴ伸長が細胞骨格により駆動されたことを確認するために、ＭＫを５μＭ  Ｊａｓｐｌａｎｋｉｎｏｌｉｄｅ（Ｊａｓ、アクチン安定化剤）または１ｍＭ  エリスロ−９−（３−［２−ヒドロキシノニル］（ＥＨＮＡ、細胞質ダイニン阻害剤）とともにインキュベートしてからマイクロ流体デバイスに注入した。ＪａｓとＥＨＮＡの両方が、静置条件と生理的ずり条件の両方で、ずり誘発性ｐｒｏＰＬＴ産生を阻害し（図４Ｈおよび図４Ｉに示す）、ＰＬＴ放出を阻害した。
【００５３】
＜由来ＰＬＴは血小板の構造的および機能的特性を示す＞
ＰＬＴは無核の直径約１〜３μｍの円板状細胞であり、その表面にバイオマーカーＧＰ  ＩＸおよびＧＰ  ＩＩｂＩＩＩａを発現し、アクチンベースの細胞骨格ネットワークを囲む６〜８個のＭＴの皮質性ＭＴコイルを特徴とする。ＰＬＴ収率を決定するために、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＸ＋  ｍＦＬＣ−ＭＫのバイオマーカー発現、ならびに前方／側方散乱および相対濃度を、培養４日目に、発明者らのマイクロ流体デバイスに注入する直前にフローサイトメトリーで測定した（図５Ａに示す）。注入２時間後に流出液を回収し、ｍＦＬＣ−ＭＫ投入分と比較した（図５Ｂに示す）。投入ＭＫと流出ＰＬＴの両方が表面にＧＰ  ＩＸおよびＧＰ  ＩＩｂＩＩＩａを発現し、特徴的な前方／側方散乱を示した。ずりを与えたことで、流出液の細胞組成は、培養５日目に単離した静置培養の上澄みと比べて、よりＰＬＴ大に近いＧＰＩＸ＋細胞になった（図５Ｃに示す）。ＭＫの８５±１％が２時間でＰＬＴに変換され、これは発明者らのｐｒｏＰＬＴ産生率（％）（図３Ｄ）の定量化結果と一致しており、静置培養物と比べて大幅に改良されている（図５Ｄ）。発明者らのマイクロ流体デバイスでおよそ５００ｓ-1のずりで２時間にわたり連続灌流した結果、ＭＫ１個につきおよそ２１個のＰＬＴが得られ、同数のＰＬＴをより長期間（６〜８日）で生成する既存の培養法よりもＰＬＴ産生率が大きく前進したことになる。
【００５４】
発明者らの産物の形態学的組成を定量化するため、発明者らのマイクロ流体デバイスの流出液をβ１チューブリン（ＰＬＴ特異的チューブリンアイソフォーム）およびＨｏｅｓｃｈｔ（核染色）についてプローブし、免疫蛍光顕微鏡法で解析した。細胞を形態と大きさ別に貯蔵し、静置ＭＫ培養の上澄みと比較した。ずりを与えると、流出液の細胞組成はよりＰＬＴ大に近いβ１チューブリン＋Ｈｏｅｓｃｈｔ−細胞になり（図５Ｅに示す）、このことはフローサイトメトリーデータ（図５Ｃ）と一致し、組成が全血中のＰＬＴ中間体の分布により類似した産物が得られた。流出液中の自由核を定量化すると、マイクロ流体デバイスが媒介したＰＬＴ産生量は静置培養物よりも高いことが確認され、ＭＫ１個あたりのＰＬＴ収量はおよそ２０±１２個と決定されたが、これはフローサイトメトリーデータと一致している。
【００５５】
休止ＰＬＴは、開放小管系を形成する特徴的な表面膜の陥入、暗調小管系を形成する残余小胞体の閉鎖チャネルネットワーク、細胞小器官、特殊な分泌顆粒を含んでおり、ガラスと接触して活性化すると扁平化／伸展する。マイクロ流体デバイスで生成したＰＬＴは、薄切片透過型電子顕微鏡ではマウス血小板と超微細構造的に区別できず、（図５Ｆに示すように）皮質性ＭＴコイル、開放小管系、暗調小管系、ミトコンドリア、α顆粒および濃染顆粒を含んでいた。マイクロ流体デバイスで生成したＰＬＴおよびＰＬＴ中間体は、免疫蛍光顕微鏡によって（図５Ｇに示すように）マウス血小板と共通するＭＴおよびアクチン構造が示され、ガラスと接触して活性化して正常に伸展し、フィロポディアとラメリポディアの両方を形成した。
【００５６】
＜マイクロ流体デバイスのヒトＰＬＴ産生への適用＞
ヒトＰＬＴを生成するため、発明者らのマイクロ流体デバイスのｍＦＬＣ−ＭＫをｈｉＰＳＣ由来ＭＫに置き換えたが、これは実質的に輸注用に無限のＭＫソースを提供するものである。ｈｉＰＳＣ−ＭＫは培養１５日目に単離したが、これらはかつて最大径２０〜６０μｍに達しており（図６Ａに示す）、超微細構造的に初代ヒトＭＫに類似していた（図６Ｂに示す）。静置培養中、ｈｉＰＳＣ−ＭＫは単離後６時間でｐｒｏＰＬＴを産生し始め、１８時間で最高ｐｒｏＰＬＴ産生率に達した（図６Ｃに示す）。これと比較して、生理的ずり（約５００ｓ-1）下のｈｉＰＳＣ−ＭＫは捕捉直後からｐｒｏＰＬＴを産生し始め、培養開始から２時間以内にｐｒｏＰＬＴを伸長／放出した（図６Ｄに示す）。ずり下のｐｒｏＰＬＴ産生ｈｉＰＳＣ−ＭＫの割合（％）は、静置培養（約１０％）と比べて、（図６Ｅに示すように）およそ９０％と大幅に増加した。
【００５７】
ｐｒｏＰＬＴ伸長速度はｍＦＬＣ−ＭＫコントロールよりもわずかに遅く（約１９μｍ／分対３０μｍ／分）（図６Ｆに示す）、生理的コントロールにより近似していた。マイクロ流体デバイスで生成したＰＬＴは、ヒト血小板の特徴的な前方および側方散乱ならびに表面バイオマーカー発現を示し、薄切片透過型電子顕微鏡ではヒト血小板と超微細構造的に区別できず（図６Ｇに示す）、免疫蛍光顕微鏡によってヒト血小板に匹敵するＭＴおよびアクチン発現が示され（図６Ｈに示す）、ガラスと接触し活性化して正常に伸展し、フィロポディアとラメリポディアの両方を形成した（図６Ｉに示す）。これらのデータを総合すると、ｈｉＰＳＣ−ＭＫを発明者らのバイオミメティック・マイクロ流体デバイスに応用し、潜在的に無限個の機能的ヒトＰＬＴを生成することが可能であることが示される。
【００５８】
＜マイクロ流体デバイスの薬物開発への適用＞
血小板減少症は、突然、また多くの場合は予期せず発症する場合があり、大量出血および死亡の原因になり得る。血小板減少症は、抗体および細胞性自己免疫応答によりもたらされることが示されている。加えて、血小板減少症は、ダサチニブなどの癌の薬を含む広範にわたる投薬によっても引き起こされ得る。一般に動物モデルではヒトの投薬治療の安全性および有効性の予測因子としては乏しく、臨床試験は時間がかかり、高価で、潜在的に有害性がある。ヒトＢＭを模倣するように設計されたマイクロ流体デバイスは、臨床的に重要な新機軸分野の代表であり、ＢＭおよびＭＫ生物学に様々な投薬治療が及ぼす影響を調査するための高効率かつ実物のようなプラットフォームを提供する。
【００５９】
ＰＬＴの生存およびクリアランス速度は、通常はフローサイトメトリーを用いてインフュージョン試験により測定する。しかし、ｐｒｏＰＬＴ産生の速度および量の定量化はこの方法には適しておらず、また直接可視化することで血小板減少症がどの段階で影響を受けているかを決定する必要がある。一方マイクロ流体デバイスを用いれば、薬物効果がＰＬＴ産生に及ぼす影響を研究するための優れたプラットフォームが提供され、このようなプラットフォームはＰＬＴ産生の新たな制御因子の特定を容易にし、臨床的に重要な薬物性血小板減少症の機構を明らかにするかもしれない。
【００６０】
概念実証として、ハイコンテンツな生細胞顕微鏡法を用いてＧＦＰ・Ｐ１チューブリン発現の機構を特定した（生細胞顕微鏡観察）が、乳癌用に現在臨床開発中の抗体薬物コンジュゲートであるトラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）は、この機構によりＰＬＴ産生に影響を与えるものである。これらの研究から、Ｔ−ＤＭ１は、（図７に示すように）異常なチューブリン構造を誘発することによってＭＫ分化を阻害し、ｐｒｏＰＬＴ形成を中断させることが明らかになった。Ｔ−ＤＭ１などの治療薬がＭＫ成熟およびｐｒｏＰＬＴ産生に影響を及ぼす経路を特定することによって、薬物性血小板減少症を管理し、また生体内でＰＬＴ産生を制御するための戦略が生み出される可能性がある。
【００６１】
本発明のアプローチは、極めて新規なマイクロ流体設計を利用してヒトＢＭおよび血管生理を生体外で再現し、輸液用機能的ヒトＰＬＴの代替ソースを生成するものである。増大する輸血の需要に応え、血小板の調達および保管に関する今日のリスクを除去するのに臨床的に望ましい一方で、治療用ドナー非依存性ＰＬＴの開発にはこれまで（１）ＰＬＴ輸血の１ユニット（約３×１０11個のＰＬＴ）の製造を支持するのに十分な個数（３×１０8）のヒトＭＫを生成すること、および（２）ＭＫ１個あたり生理的個数の機能的ヒトＰＬＴ（約１０3〜１０4個）を生成すること、の２点の主要な量的問題が残っている。ヒト胚性幹細胞培養物（ｈＥＳＣ）の開発、およびより最近ではヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の開発により、試験管内でヒトＭＫに分化させることができる前駆細胞の潜在的に無限のソースが提供されており、第１の量的問題には対処できる。実際、ＰＬＴは無核なので、ＰＬＴマイクロ流体デバイス由来ユニットは輸注前に照射して、ｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣｓ由来細胞産物が発癌性または催奇性であり得るという問題に対処することが可能である。
【００６２】
ＰＬＴ産生の環境的ドライバーを研究しようという試みには還元主義アプローチによる制約があり、２Ｄ液体培地の主要な制限としては、３ＤのＢＭ組成および剛性、ｐｒｏＰＬＴ伸長の方向性、および静脈内皮との近接性を説明できないことがある。同様に、洞様血管に侵入するｐｒｏＰＬＴ産生ＭＫは、壁面で５００〜２５００ｓ-1のずり速度を受けるが、ＭＫをＥＣＭコーティングしたスライドガラス上に灌流させることによって血管の流れをモデルする試みは、固定化／接着ＭＫを選別するものであり、ＥＣＭとの接触による活性化とずりとの区別はできていない。あるいは、放出されたｐｒｏＰＬＴをインキュベーターシェーカー内で求心的に撹拌しているが、これはＢＭ血管内のずり層流を再現するものではなく、血管ずり速度を精密に制御しておらず、高分解能生細胞顕微鏡観察に適していない。しかし、これらの制限はあるものの、ＭＫを高いずり速度（１８００ｓ-1）に晒すとｐｒｏＰＬＴ産生が加速され、ずりなしで培養されたｐｒｏＰＬＴのＰＬＴ放出量は、約０．５Ｐａの流体ずり応力下に２時間維持されたものよりも大幅に少なかった。さらには、多光子生体内顕微鏡の最近の進歩により生体内でのｐｒｏＰＬＴ産生の分解能は高くなりつつあり、ｐｒｏＰＬＴの伸長およびＰＬＴの放出にとって血管の流れが重要であることが確認されている。これらの研究は生体内ｐｒｏＰＬＴ産生の生理学的に正確な例を提供しているが、分解能が低く微小環境の制御も限られていたせいで、ＢＭ微小環境がＰＬＴ放出にどのように貢献しているかを詳細には研究できていない。
【００６３】
細胞−細胞接触、細胞外基質（ＥＣＭ）組成および剛性、血管ずり速度、ｐＯ２／ｐＨ、可溶性因子の相互作用、および温度がｐｒｏＰＬＴ形成およびＰＬＴ放出に貢献しているという証拠の蓄積から、３Ｄマイクロ流体培養系内でＢＭおよび血管の微小環境を再現することが、臨床的に有意味な個数の機能的ヒトＰＬＴを得るのに必要であることが示唆されている。実際、流体の連続的流れ下でモジュール式３Ｄ編みポリエステルの足場を用いて、培養中１×１０6個のＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞から１日あたり最高６×１０6個のＰＬＴが産生されている。３Ｄ灌流バイオリアクターは、培養由来ヒトＰＬＴの臨床的に有用な個数が得られ得ることを示唆するものであるが、ＢＭ微小環境の複雑な構造および流体特徴を正確に再現しておらず、閉鎖モジュール設計であるためｐｒｏＰＬＴ産生を可視化できず、ＰＬＴが放出される機構についての見識はあまり提供していない。代わりに、ＢＭ洞様毛細血管を再現し、試験管内でＭＫ分化およびＰＬＴ産生を研究するために、ＥＣＭコーティングした絹製管に隣接する３ＤのＰＤＭＳバイオチップが提案されている。この設計は、ＭＫが成熟する間の遊走を再現することはできるが、高分解能生細胞顕微鏡検査には適しておらず、ＭＫの分化を促すのに必要な内皮細胞との接触を再現しない。
【００６４】
それと比べ、本発明のマイクロ流体デバイス設計は完全なパッケージを提供し、ＰＬＴ放出までの時間を大きく改善し全体ＰＬＴ収量を増加させることを可能にする。また、マイクロ流体デバイス内で血管ずり速度を与えることにより、ｐｒｏＰＬＴ産生が誘発され、生理的ｐｒｏＰＬＴ伸長および放出が再現される。さらに、ＭＫは小さい間隙をくぐり抜けて血流に侵入し、生理的流れ条件下でｐｒｅＰＬＴ中間体を放出することができる。本発明のマイクロ流体デバイスにおいて連続的にＭＫを灌流して得られる産物は、生理的ＰＬＴ濃度に近づき、血小板の構造および機能両方の特性を示した。最後に、ＰＬＴマイクロ流体デバイスは、ヒトＭＫ培養物に用いて機能的ヒトＰＬＴを産生することができる。ＭＫ１個あたりのＰＬＴ収量は理論的推定値に満たなかったが、観察によるとＭＫ培養物は巨大ＭＫ断片（ｐｒｅＰＬＴ、ｐｒｏＰＬＴ）ならびにＭＫ自体を流出液チャネル内に常時放出していたことから、実際のＰＬＴ数は、ＰＬＴ中間体が肺や循環血などの補完的微小環境においてＰＬＴにさらに分化することに依存している可能性が示唆される。実際、ｍＦＬＣ由来ｐｒｏＰＬＴをマウスに注入すると、１２〜２４時間ですぐにＰＬＴに変換された。興味深いことには、本研究のＣＭＦＤＡ標識したＰＬＴは血液中に容易に検出されたが、より大きいｐｒｅＰＬＴ中間体は検出されず、肺の微小血流中に捕捉されている可能性が示唆された。同様に、ｍＦＬＣおよびＢＭ由来ＭＫをマウスに注入すると、それらはもっぱら肺に局在し、最初の２時間以内にＰＬＴを放出した。いずれの場合も、血管ずり速度、血液中の可溶性因子の相互作用、および内皮細胞との接触によりこのプロセスが制御されたことはほぼ確実であり、これらの組織の局部微小環境が最終的ＰＬＴ産生にいかに貢献するかを調査することは、将来の研究を確実なものにする。
【００６５】
３ＤのＥＣＭ組成および剛性、細胞−細胞接触、血管ずり速度、ｐＯ２／ｐＨ、可溶性因子の相互作用、および温度を含むＢＭ生理の主要要素を１つのマイクロ流体系内で組み合わせることによって、本発明のアプローチは、薬物開発のための生体外での前例のない微小環境の制御およびバイオミメティック・プラットフォームを提供するものである。さらには、高分解能生細胞顕微鏡法のおかげで培養中細胞を直接可視化できるようになり、上手く特徴付けがなされていない生理的プロセスに対する方法を提供する。最後に、マイクロ流体デバイスの設計は、中心チャネルの両側に流出液チャネルを対称的に配置したり、デバイスを細長くしてより多数のカラムを支持させたり、より大型のマイクロ流体デバイス・マトリックス内に複数のユニットを平行に配置したりして、容易に変形させることができる。より細長いデバイスでｈｉＰＳＣ−ＭＫを連続回収すれば、臨床的に有意味な個数のＰＬＴにより、結果的にたとえば従来のＰＬＴ機能の凝集性試験、および免疫抑制マウスで生体内異種間輸血してＰＬＴ数の増加を測定する研究など、１件の研究におよそ１０8個のＰＬＴが必要な研究を実施できる可能性がある。
【００６６】
要約すると、本発明は、高分解能画像法に適したアプローチで、ヒトＢＭおよび洞様血管の微小環境を再現してヒト血小板を生成するための系および方法を示している。バイオミメティック・マイクロ流体系は、一連のカラムにより分離されたマイクロ流体チャネルを含む構成でガラスに結合させたＰＤＭＳを用いて作製することができる。チャネルは、ＥＣＭおよびヒト内皮細胞で選択的にコーティングして、本物そっくりの生理的条件を模倣することができる。片方のチャネルに沿って注入された丸いまたはｐｒｏＰＬＴ産生ＭＫは、順次カラム間に捕捉され、血小板を産生する血小板前駆細胞を他方のチャネル内に伸長させる。制御可能な生理的ずり速度および制御された微小環境に刺激され、放出されて流体路に入ったＰＬＴは、流出液から回収することができ、また、このプロセスは高分解能生細胞顕微鏡法で可視化することが可能である。
【００６７】
上記の様々な構成は単なる例であり、本開示をいかようにも制限するものではない。本明細書に記載した構成の変形は当業者には明白であり、そのような変形は本願の所期の範囲内である。具体的には、上述の諸構成のうちの１つまたは複数の特性を選択して、以上に明示はしなかったかもしれない特性の副次的組合せを含む代替構成を作製することができる。加えて、上述の諸構成のうちの１つまたは複数の特性を選択し組み合わせて、以上に明示はしなかったかもしれない特性の組合せを含む代替構成を作製することができる。そのような組合せおよび副次的組合せに適した特性は、本願全体を読めば当業者には容易に明らかになるはずである。本明細書に記載のおよび記載の請求項における主題は、技術のあらゆる好適な諸変化を網羅し包含するものとする。
【図１】
0006429794.tif 000004
【図２Ａ】
0006429794.tif 000005
【図２Ｂ】
0006429794.tif 000006
【図２Ｃ】
0006429794.tif 000007
【図２Ｄ】
0006429794.tif 000008
【図２Ｅ】
0006429794.tif 000009
【図２Ｆ】
0006429794.tif 000010
【図２Ｇ】
0006429794.tif 000011
【図３Ａ】
0006429794.tif 000012
【図３Ｂ】
0006429794.tif 000013
【図３Ｃ】
0006429794.tif 000014
【図３Ｄ】
0006429794.tif 000015
【図３Ｅ】
0006429794.tif 000016
【図４Ａ】
0006429794.tif 000017
【図４Ｂ】
0006429794.tif 000018
【図４Ｃ】
0006429794.tif 000019
【図４Ｄ】
0006429794.tif 000020
【図４Ｅ】
0006429794.tif 000021
【図４Ｆ】
0006429794.tif 000022
【図４Ｇ】
0006429794.tif 000023
【図４Ｈ】
0006429794.tif 000024
【図４Ｉ】
0006429794.tif 000025
【図５Ａ】
0006429794.tif 000026
【図５Ｂ】
0006429794.tif 000027
【図５Ｃ】
0006429794.tif 000028
【図５Ｄ】
0006429794.tif 000029
【図５Ｅ】
0006429794.tif 000030
【図５Ｆ】
0006429794.tif 000031
【図５Ｇ】
0006429794.tif 000032
【図６Ａ】
0006429794.tif 000033
【図６Ｂ】
0006429794.tif 000034
【図６Ｃ】
0006429794.tif 000035
【図６Ｄ】
0006429794.tif 000036
【図６Ｅ】
0006429794.tif 000037
【図６Ｆ】
0006429794.tif 000038
【図６Ｇ】
0006429794.tif 000039
【図６Ｈ】
0006429794.tif 000040
【図６Ｉ】
0006429794.tif 000041
【図７】
0006429794.tif 000042