(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  ０．５〜４５μｍのサイズ分布を持っており、生物活性ガラスの総重量の１０〜３０重量％含まれている生物活性ガラス粉末と、
（ｂ）  １００と４０００μｍとの間にサイズ分布を持っており、ペースト中の生物活性ガラスの総重量の９０〜７０重量％含まれている生物活性ガラス顆粒と、
（ｃ）  ２００〜７００ｇ／ｍｏｌの分子量の範囲を有している低分子量ポリエチレングリコールと、
（ｄ）  ７００〜２５００ｇ／ｍｏｌの分子量の範囲を有している中分子量ポリエチレングリコールと、
（ｅ）  ２５００〜８０００ｇ／ｍｏｌの分子量の範囲を有している高分子量ポリエチレングリコールと
（ｆ）  グリセロールと、を含み、
前記生物活性ガラスの組成がＳｉＯ２  ４５〜５５重量％、Ｎａ２Ｏ  ２０〜２５重量％、ＣａＯ  １８〜２５重量％、及びＰ２Ｏ５  ３〜６重量％であって、
但し、低分子量ポリエチレングリコールの分子量と中分子量ポリエチレングリコールの分子量とは少なくとも８０ｇ／ｍｏｌ互いに相違し、そして中分子量ポリエチレングリコールと高分子量ポリエチレングリコールの分子量は少なくとも３００ｇ／ｍｏｌ互いに相違する移植可能なペースト。
【請求項２】
さらに、
（ｇ）  治療的に活性のある剤、
を含む請求項１に記載のペースト。
【請求項３】
前記生物活性ガラス顆粒が、
（ｂ）  １２５〜３１５μｍのサイズ分布を持っている、請求項１又は２に記載のペースト。
【請求項４】
前記生物活性ガラス顆粒が、
（ｂ）  ３１５〜５００μｍのサイズ分布を持っている、請求項１乃至３の何れか一項に記載のペースト。
【請求項５】
前記生物活性ガラス顆粒が、
（ｂ）  ５００〜８００μｍのサイズ分布を持っている、請求項１乃至４の何れか一項に記載のペースト。
【請求項６】
前記生物活性ガラス顆粒が、
（ｂ）  １０００〜２０００μｍのサイズ分布を持っている、請求項１乃至５の何れか一項に記載のペースト。
【請求項７】
前記生物活性ガラスの総重量はペーストの総重量の５０〜８０重量％である請求項１乃至６のいずれか一項に記載のペースト。
【請求項８】
２００〜７００ｇ／ｍｏｌの分子量の範囲を有している低分子量ポリエチレングリコール（ｃ）の量が２〜１５重量％、
７００〜２５００ｇ／ｍｏｌの分子量の範囲を有している中分子量ポリエチレングリコール（ｄ）の量がペーストの総重量の８〜４８重量％、
高分子量ポリエチレングリコール（ｅ）の量がペーストの総重量の１〜１０重量％である、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のペースト
【請求項９】
ポリエチレングリコールの総量がペーストの総重量の２０〜５０重量％、
グリセロ−ル（ｆ）の量がペーストの総重量の１０重量％までである、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のペースト。
【請求項１０】
前記治療的に活性のある剤（ｇ）がペーストの総重量の３０重量％までである、請求項２乃至９のいずれか一項に記載のペースト。
【請求項１１】
前記生物活性ガラスの組成物はＳｉＯ２  ４５〜５５重量％、Ｎａ２Ｏ  ２２〜２５重量％、ＣａＯ  １９〜２５重量％、及びＰ２Ｏ５  ３．５〜６重量％である請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のペースト。
【請求項１２】
前記生物活性ガラスの組成物はＳｉＯ２  ５３重量％、Ｎａ２Ｏ  ２３重量％、ＣａＯ  ２０重量％、及びＰ２Ｏ５  ４重量％であるか、又は、ＳｉＯ２  ４５重量％、Ｎａ２Ｏ  ２４．５重量％、ＣａＯ  ２４．５重量％、及びＰ２Ｏ５  ６重量％である請求項１１に記載のペースト。
【請求項１３】
骨形成又はインプラントのコーティングに使用するための請求項１乃至１２の何れか一項に記載のペーストの使用。
【請求項１４】
請求項１乃至１２の何れか一項に記載のペーストでコーティングされたインプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インプラントとしてあるいはインプラントのコーティングとして使用する生物活性ガラスを含むインプラント可能なペーストに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物活性ガラスは生物活性及び生体適合性がある材料として知られている。何十年間も生物活性ガラスは化学的にも骨と結合しうる骨の充填材料として開発されてきた。生物活性ガラスの優良性に関する近年の発見は、この材料を適用することについての関心をより深めてきた。生物活性ガラスは、商業的には、例えば、ＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）、ＮｏｖａＢｏｎｅ（登録商標）及びＢｉｏｇｒａｎ（登録商標）の商標で市販されている。生物活性ガラスは、整形外科及び頭蓋顎顔面（cranio-maxillofacial）の骨腔充填材（bone cavity filling）及び骨の復元材用の顆粒及び板のような医療用の適用材として種々の形状で使用されてきた。
【０００３】
骨移植組織代替材として生物活性ガラスを使う主な利点は、二次的な領域からの骨移植組織の採取を避けうることである。ある特定の構成の範囲内で生物活性ガラスは骨の成長を促進し、バクテリア増殖抑制特性を示す。
【０００４】
ガラスが生物活性であって、そして前記の特性を持つためには、ガラスは、ある特定の組成を有することと同様に、溶解し、及び、ある特定の溶解レートを有している必要がある。組成と生物活性との関係は、Hench.L「Theory and clinical applications」(Bioceramics)に記載されている。Bioceramics（1994;7:3-14)の中の記載は当業者に生物活性ガラスを設計するのに十分な手段を与える。
【０００５】
溶解レート及びそれによるガラス粒子の総分解時間に影響を与えている要因の一つは、粒子サイズ、又は体積に対する表面積（Ａ／Ｖ）である。換言すれば、粒子が小さくなれば、それだけＡ／Ｖレートがより高くなり、分解がより速くなり、及び総分解時間がより短くなる。例えば、商業的に入手可能なガラス４５Ｓ５／Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）は９０〜７１０μｍのサイズ範囲で利用可能であり、そしてそれは１年以内で体内で分解されると言われている。商標名ＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）で売られているガラスＳ５３Ｐ４は、ＳｉＯ２  ５３重量％、Ｎａ２Ｏ  ２３重量％、ＣａＯ  ２０重量％とＰ２Ｏ５  ４重量％の化学組成を有している。そしてそれは、ＳｉＯ２  ４５重量％、Ｎａ２Ｏ  ２４．５重量％、ＣａＯ  ２４．５重量％及びＰ２Ｏ５  ６重量％の組成を有している４５Ｓ５ガラスより明らかにゆっくり溶解するガラスである。
【０００６】
使用を促進するため、及び、生物活性ガラスの外科用の有効範囲を広げるために、変形可能なペースト又はパテタイプの組成物が開発されてきた。理想的なケースでは、パテ組成物は、接触汚染、流出あるいは超過投薬のリスクなしで、投薬、骨の欠陥の処置及び直接的な管理が容易になるべきである。実際は、医師は、薬物投与及びパテの形成に彼らの手を使用し、骨洞の充填のために指及び／又はへら又はそれに類するものを使用してきた。しかしながら、このような形式は、例えば、患者あるいは医師にとって最善でないコンタミネーションリスク等の多くの実際的な不利を有している。
【０００７】
ある合成パテ／ペースト組成物はUS2008/0226688において知られていて、そして商業的にはＮｏｖａＢｏｎｅ（登録商標）パテとして知られている。文献は、骨空のフィラータイプのペースト又はパテ、すなわち、水性媒体溶液中で、骨の欠陥箇所に適用可能な生物活性ガラス粒子で構成されている殺菌された成形可能なインプラント組成物を開示している。生物活性ガラス粒子は約６８％から約７６％（ｗｔ／ｗｔ）の濃度範囲で粘着性の媒体に加えられている。媒体は、ポリエチレングリコールに対するグリセロールの割合が約４５：５５から約６５：３５である、２４％から３２％（ｗｔ／ｗｔ）の範囲のグリセロールと中分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との混合物を含む。。
【０００８】
完全に合成された骨腔フィラーパテ又はペーストに加えて、同種移植骨（allograft bones）、鉱物質除去骨マトリックス（demineralised bone matrix）、及び、ウシコラーゲン／ハイドロキシアパタイトの混合物のような、パテ又はペースト状の特定の半合成混合物は、その分野において広く使用されてきた。しかしながら、このような同種移植組成物（allograft formulations）は、病気の進行のリスクという最も大きくそして決して完全に除外できない多くの不利益を有する。
【０００９】
さらに、人工関節感染（PJIs）及び他の非生物的インプラントの感染は、医療制度の重要な関心事であり、長期の入院や複雑なリスクに関連した追加の手術及び長期間の抗菌処理のような、患者にとっての多くの不都合と結びつく。比較的低いPJIsの発生率（１-２％）にも関わらず、関連する経済的影響は大きいままである。広い範囲の微生物（microorganism）は、多くの場合、致命的な一連の治療の原因となり、人工関節の材質上にバイオフィルム（biofilm）を作り出すことが可能である。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（coagulase negative staphylococci）及びグラム陰性桿状菌（gram-negative rods）は一般的には最もPJIsに関係する病原体である。
【００１０】
PJIsにおける発症の第一段階はバクテリア細胞のインプラントへの癒着、そして、それに続くバイオフィルムマトリックスの形成である。バイオフィルムは、微生物と非生物的表面との間に、細胞付着力によって接着されたマトリックスで囲まれた微生物の集団である。バイオフィルムの形成は、非常に古くからある統合的な原核細胞サイクルの要素で、バクテリアの環境中での存続のための重要な要素である。バイオフィルム関連の感染の共通点は、宿主免疫、典型的な抗菌剤及び殺虫剤に対する本質的な耐性である。バイオフィルムの構造中に包囲されたバクテリアは、実際、対応する浮遊生物の最小阻害濃度より１０から１０００倍高い抗生物質の許容レベルであることが知られている。
【００１１】
バクテリア感染と関係があるさらなる一般的な問題は、抗生物質への耐性ができるというバクテリアの能力である。それは最近の現象ではないが、今日重大な健康問題となっている。数十年にわたって、さまざまな程度に、感染性の高いバクテリアがそれぞれの新しい抗生物質に対する耐性を発達させてきており、US及び世界保健機構の疫病管理予防センターによれば、抗菌耐性が世界的な健康的脅威となってきた。
【００１２】
実際、耐性菌からの感染は現在あまりにも頻繁であり、いくつかの病原体は複数タイプ又はクラスの抗生物質に対してさえ耐性ができてきた。今日、抗生物質耐性がほとんどの病院で見られ、そしてすべてのバクテリアの７０％が２０２０年までに抗生物質に対する耐性を有するであろうと推定されている。慢性骨髄炎に感染した患者から分離されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin resistant S. aureus,MRSA)、メチシリン耐性表皮ブドウ球菌(methicillin resistant Staphylococcus epidermidis ,MRSE)、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）及びアシネトバクター（Acinetobacter baumannii ）に対するインビトロにおけるＢＡＧ  Ｓ５３Ｐ４のバクテリア増殖阻害活性は示されてきた（Drago L, Romano D, De Vecchi E, et al.Bioactive glass BAG-S53P4 for the adjunctive treatment of chronic osteomyelitis of the long bones.An in vitro and prospective clinical study.BMC Infect.Dis.10、13:584(2013)）。しかしながら、この生物活性ガラスの小粒子が抗菌性効果を持っていることは知られているものの。それらと他のコンポーネントとの実用上の相互作用については知られていない。
【００１３】
文献「Antibacterial effect of bioactive glasses on clinically important anaerobic bacteria in vitro」(J.Mat. Sc. in Medicine、 Vol. 19、 No. 2,2007/7/10)は、同等あるいは４５μｍ以下の大きさを持っている生物活性ガラスＳ５３Ｐ４の粉末が良好な抗菌性効果を有することを開示している。本願出願人の文献EP2322134は、異なったタイプのポリエチレングリコールと生物活性ガラス球体とを有するインプラントペーストを開示している。しかしながら、以下に示すように、これらのペーストは抗菌性ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０２２６６８８号明細書
【特許文献２】欧州特許第２３２２１３４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
（定義）
本出願において使用される用語は、もし、それが定義されていない場合には、１９８７年と１９９２年に生物材料に関するコンセンサス会議で同意されているものである。
参照：Williams,DF(ed.):Definitions in biomaterials: Proceedings of a consensus conference of the European Society for Biomaterials, Chester, England.March 3-5, 1986.Elsevier, Amsterdam 1987, and Williams DF, Black J, Doherty PJ.Second consensus conference on definitions in biomaterials.
In:Doherty PJ, Williams RL, Williams DF, Lee AJ (eds).Biomaterial-Tissue Interfaces. Amsterdam:Elsevier,1992.
【００１６】
本出願において、生物活性材料とは、生物活性を引き出すか、あるいは調整するように設計されてきた材料を意味する。生物活性材料は、しばしば哺乳動物の組織と化学的結合が可能な表面活性材料である。
【００１７】
文章中の吸収性の(resorbable)という用語は、材料が崩壊されること、すなわち、哺乳類の体内に入れられ、及び生理的環境に接した際に、長期移植において分解されることを意味する。特に、吸収性ガラス、(resorbable glass)という用語は、生理的環境と接していない時にその表面でヒドロキシルカーボネートアパタイト層（hydroxyl-carbonate apatite layer）を形成しないシリカリッチなガラスを意味する。吸収性ガラスは体から再吸収によって消え、その分解プロセスの間には、細胞若しくは細胞増殖を著しく活性化しない。
【００１８】
生物材料（biomaterial）とは、評価、処理、拡張、あるいは体のいかなる組織、器官または機能を入れ替えをするための生物システムのインターフェースとして意図された材料を意味する。生物的適合性（biocompatibility）とは、特定の位置において適切な宿主反応を引き起すことによって、安全そして十分に機能する医療用器具に使用される材料の性能を意味する。吸収（resorption）とは、単純な崩壊による生物材料の分解を意味する。複合物（composite）とは、ガラスのように、少なくとも２つの異なった構成要素、例えば有機ポリマー及びセラミック材料等、を有する材料を意味する。
【００１９】
本発明の目的は、容易且つ安全に処理でき、そして、抗菌性と同時に望ましい骨充填効果のある特質を有する骨腔フィラーとして有用な混合物を供給することである。別の本発明の目的は、インプラントの表面上のバイオフィルムの形成を防ぐのに有用な合成物を供給することにある。本発明の目的は、従って、局所的な感染を防ぐためのインプラント手術での使用のための材料を提供することでもある。本発明の更なる目的は、耐性を獲得しないであろう材料を提供することでもある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、０．５〜４５μｍのサイズ分布と、１００〜４０００μｍのサイズ分布を有する生物活性ガラス顆粒を有するインプラントペーストに関する。
生物活性ガラスの組成物はＳｉＯ２  ４５〜５５重量％、Ｎａ２Ｏ  ２０〜２５重量％、ＣａＯ  １８〜２５重量％及びＰ２Ｏ５  ３〜６重量％である。ペーストは、さらに、２００〜７００ｇ／ｍｏｌ、低分子量ポリエチレングリコール、７００〜２５００ｇ／ｍｏｌの中分子量ポリエチレングリコール、２５００〜８０００ｇ／ｍｏの高分子量ポリエチレングリコール、及びグリセロールを有する。但し、低分子量ポリエチレングリコールの分子量と中分子量ポリエチレングリコールの分子量とは少なくとも８０ｇ／ｍｏｌ互いに相違し、そして中分子量ポリエチレングリコールと高分子量ポリエチレングリコールの分子量は少なくとも３００ｇ／ｍｏｌ互いに相違する。
【００２１】
本発明は、骨形成への使用のための本発明のインプラントの製造に使用されるペーストの使用にも関する。
本発明は、さらに、本発明のインプラントのコーティングに関するペーストの使用にも関する。
本発明は、さらに、本発明のペーストで覆われたインプラントに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、
（ａ）  ０．５〜４５μｍのサイズ分布を持っている生物活性ガラス粉末と、
（ｂ）  １００と４０００μｍとの間にサイズ分布を持っている生物活性ガラス顆粒と、
（ｃ）  ２００〜７００ｇ／ｍｏｌの分子量の範囲を有している低分子量ポリエチレングリコールと、
（ｄ）  ７００〜２５００ｇ／ｍｏｌの分子量の範囲を有している中分子量ポリエチレングリコールと、
（ｅ）  ２５００〜８０００ｇ／ｍｏｌの分子量の範囲を有している高分子量ポリエチレングリコールと
（ｆ）  グリセロールと、を含み、
前記生物活性ガラスの組成がＳｉＯ２  ４５〜５５重量％、Ｎａ２Ｏ  ２０〜２５重量％、ＣａＯ  １８〜２５重量％、及びＰ２Ｏ５  ３〜６重量％である、移植可能なペーストに関する。但し、低分子量ポリエチレングリコールの分子量と中分子量ポリエチレングリコールの分子量とは少なくとも８０ｇ／ｍｏｌ互いに相違し、そして中分子量ポリエチレングリコールと高分子量ポリエチレングリコールの分子量は少なくとも３００ｇ／ｍｏｌ互いに相違する。
【００２３】
本発明は、従って、骨誘導性（osteoconductive）、生物活性、耐菌性及び変形可能な組成物を提供する。ペーストは粘着性の有機媒体溶液又はマトリックス中の生物活性ガラス顆粒を有する。ペーストは、従って、粒子用の一時的な結合剤として働くポリエチレングリコールから構成された合成バインダーで混合されたカルシウム−リン−ナトリウム−ケイ酸塩（calcium-phosphorous-sodium-silicate）粒子から構成されている。粒子とバインダーは典型的にプレミックスされた結合材料（cohesive material）として提供される。移植において、バインダーは、粒子間での組織浸透を許すように、そして粒子に結合された骨の通常の治癒プロセス（生物活性ガラスと骨再生の再吸収）を許すように吸収される。バインダーが移植の直後に吸収されると、生物活性ガラス粒子のみが残る。これらのすべてのコンポーネントは公知であり、そして広く使用されており、食品及び飲料の分野と同様に、医学、製薬及び化粧品の分野で許可されている。
【００２４】
少なくとも前述の目的の一部は、少なくとも前述の目的の一部は、すべてではないとしても、本発明及びその種々の実施形態によって達成される。実際、微細な生物活性粒子の粉末は、ポリエチレングリコール混合物と結びついた時、骨の内部成長促進と同時に、結果物の材料は驚くべき抗菌性を生じる。
【００２５】
欧州特許EP2322134は、生物活性ガラスの球と、異なるポリエチレングリコール（低、中、そして高分子量ＰＥＧ）の混合物とを含む類似の組成物を開示する。しかしながら、生物活性ガラスがＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）生物活性ガラスであるような組成物は際立った抗菌性効果を有していないことが見られていた。他方、ＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）生物活性ガラスは、それ自身が抗生物質耐性菌に対してさえ、その粒子サイズにかかわらず抗バクテリア効果を有することが示されてきた。しかしながら、その反応速度があまりにも高く、危険性も高い可能性があるため、微細な生物活性粒子（４５μｍ未満の平均直径）は、単独では実際の哺乳動物の組織に取り入れられることができない。また、それはその高い反応速度のために骨の成長促進もしないであろう。
【００２６】
同様の粒子サイズの生物活性ガラス粉末と比べると、ポリエチレングリコールを含む本材料は、チューブを通しても適用可能であり、小切開手術にも使用可能であるという、さらなる利点を有している。材料は粘着性であって、そして、流動自在な乾燥した粉末とは対照的に、制御された緩やかな方法で欠陥に充填される。従って、欠陥へのペーストの安定した供給をコントロールすることが可能である。
【００２７】
小さい粒子サイズの粉末からより大きい顆粒形状の生物活性ガラスを組み合わせることも可能であり、それは骨の内部成長特性と材料の流動特性との両方に影響を与えるであろう。ポリエチレングリコールの選択は、流動性特性のための要求を満たすように適用されるだろう。
【００２８】
本明細書中、略語ｗｔ％は重量パーセントを意味し、典型的には総重量の重量パーセントとして表現される。分子量は平均分子量（the mean molecular weight）を意味し、それはここで数平均分子量（the number average molecular weight）であって、ｇ／ｍｏｌと表される。生物活性ガラス粒子のサイズ分布はふるいにかけることによって決定される。
【００２９】
顆粒については、球形以外のいかなる規則的なあるいは不規則な形状の粒子をも意味する。生物活性ガラスの粉末は、顆粒からも構成される。
【００３０】
望ましい実施形態によれば、ペーストは、
（ｇ）  治療的に活性のある剤、
を含む。
【００３１】
一の実施形態によれば、生物活性ガラス顆粒は５００〜８００μｍのサイズ分布を有している。他の実施形態によれば、生物活性ガラス顆粒は１００〜３５０μｍのサイズ分布を有している。さらに他の実施形態によれば、生物活性ガラス顆粒は３１５〜５００μｍのサイズ分布を有している。別の実施形態によれば、生物活性ガラス顆粒は、１０００と２０００μｍの間にサイズ分布を有している。組成物は、例えば３１５〜５００μｍのサイズ分布を持っている粉末及び顆粒の形状での生物活性ガラスを含んでいてもよい。このような組成物は例えば口腔外科用として有用である。他の可能な組み合わせは、５００〜８００μｍのサイズ分布を有する粉末と顆粒である。この組成物は頭蓋顎顔面（craniomaxillofacial）及び手の手術に有益である。さらなる可能な組み合わせは１０００〜２０００μｍのサイズ分布を持つ顆粒の粉末である。この組成物は整形外科用、外傷及び脊髄手術用として有用である。
【００３２】
組成物は、従って、例えば１〜４４μｍのサイズ分布を有する顆粒中の、粉末形状の生物活性ガラスを含んでいてもよい。サイズ分布は、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５あるいは４０μｍから、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０あるいは４５μｍまで、を取りうる。さらに、組成物は、例えば１００〜３５０μｍ、あるいは１００〜２００μｍ、あるいは１５０〜２５０μｍ、あるいは２００〜３００μｍ、あるいは２５０〜３５０μｍのサイズ分布を有していてもよい。これより大きい顆粒のサイズ分布は、例えば３１５〜５００μｍ、あるいは３５０〜５００μｍ、あるいは４００〜５００μｍであってもよい。さらに、より大きい顆粒のサイズ分布は、例えば５００〜８００μｍ、あるいは５００〜７００μｍ、あるいは５５０〜８００μｍ、あるいは６００〜８００μｍ、あるいは６５０〜７５０のμｍであってもよい。サイズ分布は、同じく、いくつかの実施形態では、例えば１０００〜２０００μｍ、あるいは１０００〜１５００μｍ、あるいは１３００〜１８００μｍ、あるいは１５００〜２０００μｍ、あるいは２０００〜３１５０μｍであってもよい。ガラスの顆粒のサイズ分布はふるいにかけることによって決定される。
【００３３】
ガラスの顆粒のサイズ分布は、また、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２９００、３０００あるいは３１５０μｍから、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２９００、３０００、３１００、３１５０、３２００、３３００、３４００、３４５０、３５５０、３６００、３７００、３８００、３９００あるいは４０００μｍまでであってもよい。
【００３４】
ポリエチレングリコール（PEG）は、繰り返し単位(-CH2CH2O-)を含むポリエチレン酸化物として公知であり、反応性水素原子を含んでいる組成物にエチレン酸化物を順次附加することで得られる。ポリエチレングリコールは二官能基ポリエチレン構造HO(CH2CH2O)nHを構成するようにエチレングリコールにエチレン酸化物を附加することで得られ、ここで、ｎはポリエチレングリコールの分子量に合わせた整数である
【００３５】
本発明で使用されるポリエチレングリコールは１００から８０００ｇ／ｍｏｌの分子量を持つ一般的な直鎖状ポリエチレングリコールである。ペーストの粘性を低減するため、あるいは、調整するために、分岐ポリエチレングリコールも使用されうる。ポリエチレングリコールは典型的には数字と共にＰＥＧと示され、数字は平均分子量をｇ／ｍｏｌで意味している。従って、ＰＥＧ４００は、分子量４００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコールを意味し、ＰＥＧ２０００は、分子量２０００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコールを意味する。
【００３６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ）は、生物活性ガラス粒子を結合し、そして濡らすことによってペースト状の材料を形成するために使用される。ペーストの適当な粘性を達成するために、少なくとも２つのＰＥＧｓが混合される。ＰＥＧｓの適切な分子量を選択する際には、低分子量ＰＥＧ（＜６００ｇ／ｍｏｌ）は室温で液体であるが、より高分子量のＰＥＧｓは蝋状あるいは固体であることに留意すべきである。
【００３７】
ペーストをその使用温度（部屋と体温）でペースト状に維持させるためには、少なくとも３つのＰＥＧｓを混合し、典型的には高温にしておく。より高い分子量ＰＥＧｓが結晶材料である場合、それらは、ペーストの粘性を上げ、そして室温の保管庫中での生物活性ガラス粒子の沈澱を防ぐことと同様に、ペーストの使用温度の上限を上げることができる。使用温度の下限レベルを下げるためには、すなわち、使用温度領域を広げるためには、高分子量PEGｓは低温で結晶化しやすいため、低分子量ＰＥＧｓがペーストの固化、すなわちペーストの低温での硬化を避けるために有益である。
【００３８】
一種類の分子量のワックス状若しくは固体状のＰＥＧが使用される場合には、使用温度の範囲は実際的な使用のためには狭くなりすぎるかもしれない。ＰＥＧ６００（すなわち、分子量６００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコール）は、約１７から２２℃の溶融範囲を示すので、室温では液状になり、より低温の環境温度ではペースト状になるであろう。一方、平均分子量８００から２０００のＰＥＧｓは低溶融範囲を有するペースト状の材料である。平均分子量３０００より上の場合、ポリエチレングリコールは典型的には固体である。
【００３９】
グリセロール、すなわち、プロパン‐１，２，３‐トリオール、は、通常、グリセリン（glycerin又はglycerine）と呼ばれる。製剤で広く使用されるものは、無色、無臭、粘着性の液体である。グリセロールは平滑性を改善するため、及び、温度上昇によるさらなる潤滑性とＰＥＧｓ及びグリセロールの間の物理的な相互作用に起因する粘性とを与えるために添加されてもよい。ＰＥＧｓとグリセロールは互いに併用されうる。
【００４０】
ＰＥＧ４００はグリセロールに対してすべての性質において混和性を有するが、モル濃度の増加に従ってグリセロール中でのＰＥＧの分解力と溶解性は低下する。しかしながら、これらの特性の両方ともが穏やかな加熱によって改善でき、そして室温でＰＥＧ４００に溶解する物質は、溶解したＰＥＧ４０００（すなわち、６０〜７０℃において）にもおよそ同程度溶解する。
【００４１】
本発明の一の実施形態によれば、生物活性ガラスの総量はペーストの総重量の５０〜８０ｗｔ％である。０．５〜４５のμｍのサイズ分布を持っている生物活性ガラスの総量（ａ）は、生物活性ガラスの１０〜３０ｗｔ％であり、１００〜４０００μｍのサイズ分布を持っている生物活性ガラス顆粒の総量（ｂ）は、ペースト中の生物活性ガラスの総重量の９０〜７０ｗｔ％である。
【００４２】
好ましくは、ポリエチレングリコールの総量はペーストの総重量の２０〜５０ｗｔ％である。例えば、低分子量ＰＥＧの総量（ｃ）は２〜１５ｗｔ％であり、そして中分子量ＰＥＧの総量（ｄ）は、ペーストの総重量の８〜４８ｗｔ％である。高分子量ＰＥＧの総量（ｅ）はペーストの総重量の１〜１０ｗｔ％である。
【００４３】
グリセロールが使用される実施形態では、その総量はペーストの総重量の最高１０ｗｔ％である。いくつかの適切なペーストは以下のような配合である。
ＰＥＧｓ（ｃ＋ｄ＋ｅ）２３〜４５ｗｔ
グリセロール（ｆ）０〜１０ｗｔ％
生物活性ガラス（ａ＋ｂ）５５〜６７ｗｔ％
【００４４】
いくつかの好ましいペーストは以下のような配合の範囲である。
低分子量ＰＥＧ（ｃ）４〜１０ｗｔ％
中分子量ＰＥＧ（ｄ）１３〜１８ｗｔ％
高分子量ＰＥＧ（ｅ）１〜８ｗｔ％
グリセロール（ｆ）８〜１０ｗｔ％
小さい生物活性ガラスの顆粒（ａ）８〜１２ｗｔ％
より大きい生物活性ガラス顆粒（ｂ）４８〜５２ｗｔ％
【００４５】
発明の実施形態によれば、治療的に活性のある剤（治療的な活性剤）の総量（ｇ）は、ペーストの総重量の最高３０ｗｔ％である。治療的な活性剤は、成長要因、タンパク質、ペプチド、抗生物質、ヒアルロン酸等のムコ多糖類、非人間由来の幹細胞（すなわち、人幹細胞以外のもの）、過酸化物及びそれらの混合物から構成される群から選択されうる。そして、活性剤は、骨の成長を促進させ、抗菌効果のようなさらなる反菌性を獲得させるために使用されうる。本材料は、しかしながら、抗生物質がない状態でも有効であることが見いだされた。
【００４６】
本発明の実施形態によれば、生物活性ガラスの組成物はＳｉＯ２  ４５〜５４重量％、Ｎａ２Ｏ  ２２〜２５重量％、ＣａＯ  １９〜２５重量％及びＰ２Ｏ５  ３．５〜６重量％である。別の本発明の実施形態によれば、生物活性ガラス製品の組成物はＳｉＯ２  ５３重量％、Ｎａ２Ｏ  ２３重量％、ＣａＯ  ２０重量％及びＰ２Ｏ５  ４重量％である。このような生物活性ガラスは、Ｓ５３Ｐ４としても公知であり、そして商品名ＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）としても市販されている。本実施形態は、Ｓ５３Ｐ４顆粒及び粉末（生物活性ガラスと骨再生の再吸収）と結合する通常の骨の治療プロセスを許容する生体内に速やかに溶解するバインダー組成物を提供する。Ｓ５３Ｐ４生物活性ガラス組成物の分解速度の遅さと粒子のサイズによって、長期の骨の成長効果が自然に達成されうる。さらに別の実施形態によれば、生物活性ガラス組成物はＳｉＯ２  ４５重量％、Ｎａ２Ｏ  ２４．５重量％、ＣａＯ  ２４．５重量％及びＰ２Ｏ５  ６重量％である。この生物活性ガラスは４５Ｓ５としても公知であり、ＮｏｖａＢｏｎｅ（登録商標）として市販されている。
【００４７】
範囲の両端の部分における成分から構成されるペーストは、必ずしも最適な流動性と製品の特性を与えるものではない。例えば、十分な低分子ＰＥＧ及び／又はグリセロールが存在しない状態での高濃度の高分子量ＰＥＧの組み合わせは、高い粘性を製品に与えるが、室温又は体温における移植には適していない。しかしながら、当業者であれば、望ましい特性のそれぞれの組み合わせのために、若干の容易な実験を通して成分の理想的な割合を見出し得る。適当な組み合わせのいくつかの例は以下に述べる実施例のパートでも提供される。
【００４８】
本発明は、抗菌特性を有する変形可能な骨の空隙の充填ペーストの製造方法も提供し、それは、冷却、包装及び最終製品の調整と同様に、調整を制御された原材料を溶融及び混合することも含む。
【００４９】
ペーストは、典型的には、２５から９０℃、保護ガス又は真空状態又は大気圧雰囲気のバッチミキサー中で５から６０分間、材料を混合及び／又は溶融することで製造される。混合物は、それから、２５〜４５の℃まで冷却され、そしてアプリケーターへ移され、及び／又はさらなる使用のために貯蔵される。代わりに、混合、溶融、及び／又は移送は、例えば、開放又は閉鎖バッチミキサー（an open or closed batch mixer）、連続攪拌槽反応槽又はミキサー（continuous stirring tank reactor or mixer）、押出機（extruder）、射出成型機（injection moulding machine）、チューブ反応槽（tube reactor）、または他の標準的なメルトプロセッサー又はメルトミキサー（melt processing or melt mixing equipment）等、本技術分野で公知のいかなるタイプの混合装置をも使用することで実施しうる。
【００５０】
本発明は、骨腔フィラーペースト等の骨の欠陥部における骨の形成に使用するためのインプラント製造における本ペーストの使用も提供する。実際、本ペーストは、インプラントの表面にバイオフィルムを形成することを予防し、処理する能力を有するように決定されてきた。それは、人工器具の感染の最も問題となるバクテリアに対する抗菌性効果を有するため、バイオフィルムに関連した人工器具の感染の処理に使用されうる。さらに、本明細書のペーストは、開口している傷の上につけられて、そして覆うことで、傷の治療に使用されうる。
【００５１】
本発明は本ペーストでコーティングされたインプラントをも提供する。インプラントは、例えば腰のインプラント、ひざのインプラントあるいは他のいかなる人工ジョイント、あるいは哺乳類に採用されるいかなる他のインプラントとしても採用されうる。インプラントは、人あるいは動物の体中に移植される前に本ペーストでコーティングされる。
【００５２】
加えて、本発明は、上述したような治療的な活性を有する剤（活性剤）を含む抗菌性の骨成長促進組成物を提供する。活性剤は、人間あるいは動物に使用するいかなる製薬的な活性剤であってもよい。
【００５３】
本発明の異なる実施形態は以下の実施例のパートでより多く説明される。
【実施例】
【００５４】
（パテのための一般的な製造方法）
グリセロールとＰＥＧ４００とを混合速度１００ｐｒｍ（反応／分）の反応槽（６０℃）に加え、続いてＰＥＧ１５００及びＰＥＧ３０００を添加した。ＰＥＧｓはClariantによって提供されるもので、グリセロールはUniqemaあるいはSigma-Aldrichによって提供されるものであった。生物活性ガラスの顆粒が溶けた混合物に添加され、そして、混合物が均一になるまで混合された。得られたパテは混合しながら室温（RT）まで冷却された。そして容器は外され、さらなる使用と試験のために乾燥機に入れられて貯蔵された。
【００５５】
（生物活性ガラスの抗菌活性）
生物活性ガラス単独と、参照例として本明細書に記載のマトリックス中に存在する場合との殺菌性能を試験した。試験で使われた細菌を表１に示す。ＭｅｔＲはメチシリン耐性を意味する。試験された種々のガラスを表２に示す。ガラスＳ５３Ｐ４とＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）ガラスは、上述したように、同じ組成である。
【００５６】
ＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）パテ組成物
グリセロール                          １６ｇ
ＰＥＧ４００                          １２．８ｇ
ＰＥＧ１５００                        ２５．６ｇ
ＰＥＧ３０００                        ９．６ｇ
５００〜８００μｍ  Ｓ５３Ｐ４顆粒状  ７６．８ｇ
９０〜４２５μｍ  Ｓ５３Ｐ４球状      ９．２ｇ
【００５７】
ＰＥＧはポリエチレングリコールを意味し、末尾の数字は平均分子量ｇ／ｍｏｌを示す。グリセリン、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１５００及びＰＥＧ３０００の同様の混合物（すなわちペースト状のバインダー）は、そしてＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）パテに対する参照サンプルであるパテ１〜パテ６に使用された。
【００５８】
【表１】
0006417424.tif 000002
【００５９】
【表２】
0006417424.tif 000003
【００６０】
パテ１からパテ６のパテ組成物は表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）で試験され、他のすべての組成物は、表１に記載のすべての株で試験された。
【００６１】
インビトロの試験（比較例１〜４、１１〜１４）
バクテリアは、滅菌されたトリプトン大豆培地（カゼイン酵素分解物、大豆ミール酵素分解物、塩化ナトリウム、リン酸二カリウム、及び、ブドウ糖からなるＴＳＢ）中で、異なる製品とともに培養された（５ｍｌの滅菌された試験管、Becton Dickinson）。試験で使用される製品の濃度を表３に示す。
顆粒、比較例の材料及びコントロールは計量され（Mettler AE 50）、そして適切に２ｍｌのＴＳＢと混合された。各パテ製品の６つの複製を除いた３つの複製は計量された。パテ製品の３つの複製は、室温で２時間培養され、その後、溶解されたポリマーと共に、ＴＳＢは新たな２ｍｌのＴＳＢのバッチに置き換えられた。最終的にはバクテリアの接種材料（吸光度計、hermo GeneSys 20によって測定された公知の量）が混合物に加えられた。製品と純ＴＳＢが添加されていないバクテリア培養液は、コントロールとされた。Ｓ５３Ｐ４の粉末はポジティブなコントロールとしての役割を果たすが、それは近年の研究から１００ｍｇ／ｍｌの濃度の粉末はバクテリア阻害効果には効果的であることが知られている。Iittalaガラスとリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）は比較の材料に添加された。不活性なIittalaの非生物活性ガラスは、試験に先立ち細かい顆粒（正確な粒子サイズは不明）に粉砕された。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
異なった製品と共に培養されたバクテリア懸濁液の生存能力は、市販の固体の血漿寒天プレート（Trypticase Soy Agar II with 5 % Sheep Blood, Becton Dickinson）を使用して評価された。連続する２４時間培養の時点で懸濁液から直接採取された１０μｌのサンプルは培養(plate）された（Vuorenoja K, Jalava J, Lindholm L. et al. (2011) Detection of Streptococcus pneumoniae carriage by the Binax NOW test with nasal and nasopharyngeal swabs in young children. Eur J Clin Microbial Infect. EPub PMID: 21800217に記載のように）。加えて、1：1000のサンプルの希釈液及びバクテリアのコントロールは定量性、単一コロニーを確認するべく培養(plate）された。
【００６４】
バクテリアの成長は、寒天プレートの上での培養（３７℃で１６時間）の後に、コントロールサンプルとの比較によって評価された。プレート上での成長の不存在はバクテリアのコロニー発生を防止するという製品に与えられた性能の指標であった。粘性物質の形成によって１０μｌサンプルの正確な収集が阻害されるため５日間を超えることができないと考えられるP.aeruginosa以外については、インビトロ(In vitro)での培養は７日間実施された。
【００６５】
サンプルのｐＨは、ｐＨペーパーを使用することで試験管から測定された（ｐＨ７．５〜１４の範囲、Merck Alkalit 81.09532及びｐＨ６．４〜８．０の範囲Nacherey-Nagel, REF 90210）。ペーパーは、培養液に浸されて、製造者によって提供されているスケール用の色紙と比較することでｐＨ値は測定された。ｐＨ測定は、S.aureusとS.epidermidisでは８日、MRSAでは７日、P.aeruginosaでは５日の培養の後に実施された。
【００６６】
インビトロ試験（参照例５〜１０）
Staphylococcus epidermidisの１つの株とPseudomonasの１つの株が使われた。各製品（最終濃度４００ｍｇ/ｍｌ）の３７℃４８時間の成長媒体中での培養を通じて調整された。ｐＨ値は一定間隔で測定された。１０より等しいか、あるいはより高いｐＨ値が最適な調整条件であると想定された。
【００６７】
抗菌活性は死滅曲線（killing curves）を用いて評価された。バクテリア懸濁液の一部は調整された製品が入っている試験管に接種された。増殖調整は成長媒体のみへのバクテリア接種で実施された。管は好気雰囲気の３７℃で培養された。微生物のカウントは、３７℃で２４時間培養されたバクテリア懸濁液の適切な希釈液を０、２４、４８及び７２時間培養することで実施された。
【００６８】
比較材料（比較例）の結果（参照例１〜４、１１〜１４）
ネガティブコントロールは、培養後にカウントするには多すぎる結果を一貫して示した。これは全ての系及びすべての時点で見られ、バクテリアが試験期間を通じて生存可能であったことを示した。接種材料のない純ＴＳＢが、全ての作業が無菌状態で行われたことを示すコントロールとして使用された。いかなる時点でも純ＴＳＢにおいてバクテリア増殖はなかった。
【００６９】
試験したすべてのＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）顆粒は単独でバクテリアの増殖に影響を与えた。効果を得るために必要な時間とレベルはグラニュール大きさによってばらつきがあった。効果もバクテリアの種によって異なっていた。＜４５μｍの粒子サイズにされた粉末は、すべての試験されたバクテリアの増殖に対して対抗性があった。ＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）のパテ製品は試験された病原体のいずれの増殖にも影響を与えなかった。S.epidermidis、S.aureus MetRとP.aeruginosaの結果は、試験期間の途中で、わずかな効果を示したが、ＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）のパテはS.aureus ATCC 29213には影響を与えなかった。試験期間中日ごとのばらつきが存在した。純粋な重合体（パテバインダー）は、試験期間の終わりには、S.aureus MetRとP.aeruginosaに対していくらかの効果を持っていたが、増殖には日ごとのばらつきがあった。ＴＣＰはいかなる日においてもgram negative P.aeruginosaに対して影響はなく、試験期間の終わりにも、S.aureus ATCC 29213に対しても影響はなかった。２つの他のグラム陰性菌にはわずかな影響が観察された。
【００７０】
ＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）のパテ製品は試験期間中４つの臨床的に重要な病原体のコロニー形成を阻止することができなかったと言える。パテと重合体の日ごとのばらつきと不確定な結果は少なくとも部分的にはインビトロの試験によって説明されうる。加えて、重合体及び重合体の化学的特徴は、ピペッティングの質にいずれかの影響を与えるかもしれない。
【００７１】
バクテリア増殖の結果は表４〜７に示した。示されている数値は、バクテリアのコントロールと、培養されたバクテリアとの差（ｌｏｇ１０）をサンプル（０＝バクテリアコントロールに対する差はなし、１＝バクテリアコントロールに対するｌｏｇ１０の差、５＝４ｌｏｇ以上の差）で示している。０は、バクテリア成長への阻害性はないことを意味する。
【００７２】
【表４】
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【００７３】
【表５】
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【００７４】
【表６】
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【００７５】
【表７】
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【００７６】
表８は、培養期間の終わり（S.epidermidisとS.aureusは８日、S.aureus MetRは７日、P.aeruginosaは５日）のｐＨ値を示す。
【００７７】
【表８】
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【００７８】
参照例  ５〜１０
比較例５〜１０の結果を表９に示した。パテ組成物はわずかなｐＨの変化（ｐＨ８）を示したが、S.aureusそしてP.aeruginosaに対する抗菌性効果は共に有していなかった。
【００７９】
【表９】
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【００８０】
本発明のペーストの抗菌活性
表１０に示す配合のペースト（組成物１）は抗菌活性について試験された。比較のサンプルは、上述のガンマ殺菌を施した４５μｍのサイズ分画の生物活性ガラス粉末（組成物２）及び５００〜８００μｍのサイズ分画の生物活性ガラス顆粒（組成物３）を含むものであった。
【００８１】
類似のサイズの不活性ガラス（透明、R1350、Iittala、フィンランド）の３サンプルは、ネガティブなコントロールとして使用された。ＰＥＧ及びグリセロールと＜４５μｍの顆粒（比較例１）、４５μｍの顆粒（比較例２）、及び５００〜８００μｍの顆粒（比較例３）を表９に示した。すべてのサンプルはトリプトン大豆培地（ＴＳＢ；Biomerieux、Marcyl’ Etoile、フランス）中に最終的に４００ｍｇ/ｍｌの濃度（臨床用希釈標準溶液の５％に対応）になるように準備されれ、各溶液４．８ｍｌが滅菌済みの６ウェルのポリスチレン製のマイクロプレート（Jet Biofil;  広州、中国）に入れられた。生物活性ガラスのサンプルは、組成物１は３７℃で４時間、組成物２は７時間、組成物３は２４時間培養された。ｐＨ値は一定間隔でイオン放出とｐＨ変化を提示された条件下ｐＨメーターで測定された。ｐＨ値は１１以上が適切な提示された条件であると考えられる。最適な条件に到達されると、それぞれのウェルの内容物は使用される準備ができた。
【００８２】
【表１０】
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【００８３】
メチシリン耐性のS.aureusの一つの株と、P.aeruginosaの１つの株が使用された。それは、Microbiology Laboratory of IRCCS Galeazzi Orthopaedic Instituteにおいて分離されたものであり、インプラント修正のための研究所であるthe Center for Reconstructive Surgery of Osteoarticular Infections (C.R.I.O.)に関連する患者の膝の人工骨からものである。これらの株は、インビトロで、人工骨材料の上にバイオフィルムを形成する強い能力の機能において選択された。
【００８４】
直径２５ｍｍ、厚さ５ｍｍの殺菌処理及びサンドブラスト処理されたチタンディスク(Adler Ortho, Cormano (Milan), Italy; BATCH J04051)がバイオフィルムの形成及び成長のための被着体として使用された。一晩培養されたS.aureusとP.aeruginosaはＴＳＢ及び各希釈標準溶液の一部（２００μｌ）中に最終密度１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌで再懸濁され、チタンディスクと４．８ｍｌの新しいＴＳＢが入れられた滅菌済みの６ウェルのポリスチレン製のマイクロプレートに接種された。２４時間、３７℃で好気的な培養の後、消耗した非粘性バクテリアを含む増殖媒体は取り除かれ、新鮮な５ｍｌの媒体と置き換えられた。プレートは、成熟したバイオフィルムを得るためにさらに４８時間培養され、残存している非粘着性バクテリアが存在している場合にはそれを、殺菌された生理的食塩水で３回の洗浄で除去した。
【００８５】
調整時間後に、バクテリアのバイオフィルムで覆われたチタンディスクは、調整済みの生物ガラス又はネガティブコントロール（不活性ガラス）が入れられた、新しい滅菌済みの６ウェルのポリスチレン製のマイクロプレートに入れられた。各チタンディスク上のバイオフィルムの量は２４，４８及び７２時間の培養後に計測された。
【００８６】
クリスタル・バイオレット・アッセイ
クリスタル・バイオレット・アッセイは最適配合及びS.aureus 及びP.aeruginosaに対するバイオフィルムの最適培養時間を評価するための一次試験として使用された。バイオフィルム組織上の試験されたガラスの効果を評価するために、Christensen et al.(Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, et al.Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices.J. Clin Microbiol 22(6)、996-1006(1985))に記載されているような処理後にそれぞれのディスク上に存在しているバイオマス量が測定された。培養時間の終わりに、チタンディスク上に成長したバイオフィルムはエアで乾燥され、１５分間、５％のクリスタルバイオレット溶液にディスクを浸漬し、着色された。さらに、数度の洗浄後、ディスクは再びエアで乾かされ、そしてバイオフィルムに結合したクリスタルバイオレットを３ｍｌの９６％エタノールに入れて抽出した。各エタノール〜染料溶液の３つのアリコット（１００μｌ）が96マルチウェルプレートに入れられ、９５８ｎｍの吸光度がミクロプレートリーダ（Multiskan FC, Thermo Scientific; ミラノ  イタリア）で読みとられた。
【００８７】
統計的分析
クリスタル・バイオレット・アッセイの測定によるバイオフィルムの量は平均標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示された。統計的分析は適切に２要因ＡＮＯＶＡ法、そしてその後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法のｔ−検定及びＳｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ−検定を使って行なわれた。ｐ値の重要な範囲は０．０５以下に設定された。
【００８８】
結果
Ｓ５３Ｐ４の耐バイオフィルム活性を、２つのバクテリアの５９５ｎｍにおける吸光度として、表１１及び１２に示した。すべてのチタンディスク上に存在しているバイオフィルムの量は、Ｓ５３Ｐ４処理済みディスク及び不活発ガラスの処理済みディスク（コントロール）とは際立って相違していた（Ｐ＜０．０５）。生物活性ガラスに対する露出時間はバイオフィルムの量への影響を与えないようであったが、２４及び４８時間後の観察に比べると、７２時間の処理後にはバイオフィルムの減少が観察された。Ｓ５３Ｐ４の耐バイオフィルム能力は試験された３つの配合の間で際立った差はみられなかった。
【００８９】
【表１１】
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【００９０】
【表１２】
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【００９１】
結果は、グリコールとＰＥＧｓと混合された場合には、生物活性ガラス自身の抗微生物活性には関連性がなく、０．５〜４５μｍのサイズ分布を有する粉末状のものを使用しない限り抗生物効果は有していなかった。従って、この生物活性ガラス（例えば、粉末）のみが驚くべき効果を有するため、EP2322134が教示する組みわせ、及び、生物活性ガラスが抗微生物活性を有するという事実は当業者には自明ではない。