(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトケラチンと特異的に結合する抗体、ビメンチンと特異的に結合する抗体、ＣＤ３１と特異的に結合する抗体、ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体、フィブロネクチン−１と特異的に結合する抗体、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体、コラーゲンＩと特異的に結合する抗体、コラーゲンＩＶと特異的に結合する抗体、ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体、及びＣＡＩＸと特異的に結合する抗体で標識化した、大腸直腸癌組織試料を含む組織試料アレイであって、
前記アレイは、
ビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した複数の組織試料と、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体、及びＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した複数の組織試料と、
ビメンチンと特異的に結合する抗体、及びＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した複数の組織試料と、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した複数の組織試料と、を含み、
ビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料は、ＴＥＭ−１と特異的に結合する抗体でも標識化されており、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体及びＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料は、ＴＥＭ−１と特異的に結合する抗体でも標識化されており、
ビメンチンと特異的に結合する抗体及びＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料は、ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体でも標識化されており、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料は、コラーゲンＩＶと特異的に結合する抗体でも標識化されており、
ビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料は、フィブロネクチン−１と特異的に結合する抗体でも標識化されている、組織試料アレイ。
【請求項２】
前記組織試料のうちの１つ以上が核ラベルで標識される、請求項１に記載の組織試料アレイ。
【請求項３】
前記核ラベルがＤＡＰＩである、請求項２に記載の組織試料アレイ。
【請求項４】
前記アレイの前記組織試料が同じ腫瘍から得られる、請求項１〜３の何れか１項に記載の組織試料アレイ。
【請求項５】
前記アレイの前記組織試料が異なる腫瘍から得られる、請求項１〜３の何れか１項に記載の組織試料アレイ。
【請求項６】
前記組織試料が組織学的切片（histological sections）である、請求項１〜５の何れか１項に記載の組織試料アレイ。
【請求項７】
組織試料アレイを標識化する方法であって、
複数の大腸直腸癌組織試料と、サイトケラチンと特異的に結合する抗体及びＣＤ３１と特異的に結合する抗体を接触させることと、
複数の大腸直腸癌組織試料と、ビメンチンと特異的に結合する抗体及びＣＤ３１と特異的に結合する抗体を接触させることと、
複数の大腸直腸癌組織試料と、サイトケラチンと特異的に結合する抗体を接触させることと、を含み、
前記ビメンチンと特異的に結合する抗体と接触した少なくとも１つの大腸直腸癌組織試料が、ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体とも接触しており、
前記サイトケラチンと特異的に結合する抗体及び前記ＣＤ３１と特異的に結合する抗体と接触した少なくとも１つの大腸直腸癌組織試料が、ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体とも接触しており、
前記ビメンチンと特異的に結合する抗体及び前記ＣＤ３１と特異的に結合する抗体と接触した少なくとも１つの大腸直腸癌組織試料が、ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体とも接触しており、
前記サイトケラチンと特異的に結合する抗体と接触した少なくとも１つの大腸直腸癌組織試料が、コラーゲンＩＶと特異的に結合する抗体とも接触しており、
前記ビメンチンと特異的に結合する抗体と接触した少なくとも１つの大腸直腸癌組織試料が、フィブロネクチン−１と特異的に結合する抗体とも接触しており、
前記組織試料アレイが標識度で評価される、方法。
【請求項８】
前記腫瘍組織試料が組織学的切片（histological sections）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アレイの腫瘍組織試料が同じ腫瘍から得られる、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アレイの腫瘍組織試料が異なる腫瘍から得られる、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１５日に提出された米国特許仮出願第６１／７９３，５６５号の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、大腸直腸癌と診断された被験体が大腸直腸癌を再発するリスクを決定する、及び大腸直腸癌と診断された被験体の臨床転帰を予測するために役立つ発現レベルである、１組のバイオマーカーを提供する。
【背景技術】
【０００３】
２０１３年に、米国の約１４３，０００人が大腸直腸癌と診断される。同じ年、米国で大腸直腸癌によって約５０，８３０人が死亡するだろう。大腸直腸癌は、皮膚癌、前立腺癌及び肺癌に次いで、男性に４番目に多く見られる癌である。それは、皮膚癌、乳がん癌及び肺癌に次いで、女性に４番目に多く見られる癌である。大腸直腸癌患者の再発のリスク又は予後を判定する方法は、これらの患者の治療上の決定を導くため大いに有益になるであろう。それぞれに重要な、大腸直腸癌のマルチ−マーカー予後判定法の作製を本明細書に記載する。前記データは、大腸直腸癌の予後評価を改善する際のマルチ−マーカー分析の可能性を示す。本明細書記載の方法は、大腸直腸癌の診断時に、被験体を再発のリスクが高いグループ又は低いグループに割り当てるのを可能にする。前記方法は、患者及び医師が、補助介入、又は少なくとも積極的経過観察調査の必要性を決定するのに役立つ。本明細書で記載される方法の目的は、残りの患者をアジュバント療法又は疾患再発のモニタリングに伴う危険及び費用にさらさずに、リスクの高い患者群の全生存期間を改善することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
大腸直腸癌と診断された被験体が、バイオマーカー、特に被験体から得られた腫瘍組織試料の組織区画のパネルの遺伝子発現プロファイリングに基づいて、本疾患を再発するリスクを判定する方法が、本明細書に記載される。バイオマーカー、特に被験体から得られた腫瘍組織試料の腫瘍区画のパネルの遺伝子発現プロファイリングに基づいて、大腸直腸癌と診断された被験体の臨床転帰を予測する方法も記載されている。更に、大腸直腸癌と診断された被験体を、ＴＥＭ１発現大腸直腸癌のリスクが高いカテゴリ又はリスクが低いカテゴリに分類する、割り当てを可能にする鑑別診断の方法が、本明細書において開示される。大腸直腸癌の発生と関連するさまざまなリスクを予測するため組織試料の分析を可能にする、検出剤で標識化した組織試料アレイを産生するための材料及び方法も記載されている。記載されている組織試料アレイは、大腸直腸癌と診断された個人の有益な治療コース決定を助けるために、組織試料を分析するのに用いることもできる。本明細書で示す、組織試料又は組織アレイを標識化するのに適切な試薬を備えたキットも、本明細書に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】生体区画マスキング及び代表的なバイオマーカーパネルを示す。（Ａ）ＡＱＵＡ（登録商標）分析の間、生体区画マスクを生成するために用いた、各蛍光チャネルからの代表的な画像の例。核マスクを生成するためＤＡＰＩを使用し、サイトケラチンを標識化して腫瘍細胞質を識別するためにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を使用し、ビメンチンを標識化して間質を識別するためにＣｙ３を使用し、脈管構造を識別するためにＣＤ３１を、及び腫瘍脈管構造を決定するためにサイトケラチンを、及び間質脈管構造を識別するためにビメンチンを標識化するためにＣｙ７を使用した。（Ｂ）７つのバイオマーカーパネル（Ｃｙ５）の代表的な画像例。
【図２−１】ＴＡＰＰＳスコアが大腸直腸癌の予後を高度に表すことを示す。（Ａ）ＹＴＭＡ８でのＴＡＰＰＳスコア分布のヒストグラム図（ｎ＝２６５）。点線は、生存分析に使用される三分位値カットポイントを表す。（Ｂ）５年の無病生存期間があった全事例のカプラン・マイヤー生存分析。低ＴＡＰＰＳ（時間６０か月の上部の濃い灰色の線）ｎ＝８８、事象＝１５、中間ＴＡＰＰＳ（時間６０ヵ月の中央の薄い灰色の線）ｎ＝９９、事象＝３５、高ＴＡＰＰＳ（時間６０ヵ月の一番下の黒い線）ｎ＝７３、事象＝５１。（Ｃ）５年の無病生存期間があった、リンパ節転移陰性事例のみのカプラン・マイヤー生存分析。低ＴＡＰＰＳ（時間６０ヵ月の上部の濃い灰色の線）ｎ＝４４、事象＝４、中間ＴＡＰＰＳ（時間６０ヵ月の中央の薄い灰色の線）ｎ＝５０、事象＝９、高ＴＡＰＰＳ（時間６０ヵ月の一番下の黒い線）ｎ＝２６、事象＝１５。
【図２−２】ＴＡＰＰＳスコアが大腸直腸癌の予後を高度に表すことを示す。（Ｃ）５年の無病生存期間があった、リンパ節転移陰性事例のみのカプラン・マイヤー生存分析。低ＴＡＰＰＳ（時間６０ヵ月の上部の濃い灰色の線）ｎ＝４４、事象＝４、中間ＴＡＰＰＳ（時間６０ヵ月の中央の薄い灰色の線）ｎ＝５０、事象＝９、高ＴＡＰＰＳ（時間６０ヵ月の一番下の黒い線）ｎ＝２６、事象＝１５。（Ｄ）５年の無病生存期間があった、リンパ節転移陽性事例のみのカプラン・マイヤー生存分析。低ＴＡＰＰＳ（時間６０ヵ月の中央の薄い灰色の線）ｎ＝２７、事象＝６、中間ＴＡＰＰＳ（時間６０ヵ月の上部の濃い灰色の線）ｎ＝３７、事象＝２４、高ＴＡＰＰＳ（時間６０ヵ月の一番下の黒い線）ｎ＝４１、事象＝３２。
【図３】注目バイオマーカーを無監督階層型クラスタ化により識別した、２つの主要な患者クラスタの概略図を示す。
【図４−１】組織区画（腫瘍、間質血管、腫瘍血管又は間質）によるマーカー発現のグラフ図を示す。（Ａ）はＴＥＭ１の発現を示す。（Ｂ）はＨＩＦ２αの発現を示す。（Ｃ）はＰＤＧＦＲーβの発現を示す。（Ｄ）はＣＡＩＸの発現を示す。
【図４−２】組織区画（腫瘍、間質血管、腫瘍血管又は間質）によるマーカー発現のグラフ図を示す。（Ｅ）はフィブロネクチンの発現を示す。（Ｆ）はコラーゲンＩの発現を示す。（Ｇ）はコラーゲンＩＶの発現を示す。
【図５】Ａ〜Ｄは、すべての区画のエンドシアリン／ＴＥＭー１発現用バリデーションセットのカプラン・マイヤー生存分析を示す。
【図６】（Ａ）低、中及び高リスク打ち切りグループ、（Ｂ）低及び高リスク打ち切りグループ、（Ｃ）ステージＩＩの大腸直腸癌患者、（Ｄ）ステージＩＩＩ／ＩＶの大腸直腸癌患者のカプラン・マイヤー生存分析を示す。
【図７】（Ａ）すべての症例及び（Ｂ）ステージＩＩの大腸直腸癌患者の３つの可変パラメータだけを含むモデルの、カプラン・マイヤー生存分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
別段の規定がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．２００６），ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．２００７）は、当業者に、本出願において使用する多くの用語の一般的な指針を提供する。
【０００７】
当業者は、本明細書に記載されているものと類似である又は同じである、多くの方法及び材料を認識し、それは本発明の実施において使用されるだろう。実際、本発明は、記載されている方法及び材料に何ら制限しない。本発明の目的のために、以下の用語を次のとおり定める。
【０００８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示被験体を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」への言及は、２つ以上の細胞の組み合わせ等を包含する。
【０００９】
本明細書において使用する場合、「約（about）」（「〜」記号でも示される）という用語は、量、一時的な持続期間等の測定可能な値について言及するとき、既定値から最大±１０％の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示される方法を実行するために適切である。別段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される、成分の量、分子量等の特性、反応条件等を表すすべての数字は、すべての場合に、「約」という用語によって修飾されると理解されるものとする。したがって、それとは反対に指示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。最低限でも、そして特許請求の範囲と等価物の原則を制限しようとするものではないが、各数値パラメータは、報告された有効数字の数値を考慮し、及び通常のまるめ方を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広範囲を示す数値的範囲及びパラメータは、近似値であるが、具体例な実施例に記載される数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値も、本質的に、それらそれぞれの試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる、ある誤差を含む。
【００１０】
「発現する」及び「産生する」という用語は、本明細書において同義的に使用され、遺伝子産物の生合成を指す。これらの用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。これらの用語は、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの転写も包含し、すべての天然に存在する転写後及び翻訳後修飾を更に包含する。
【００１１】
本明細書において、「抗体」という用語は、各アイソタイプの様々な単量体及び高分子体を含む、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、並びＩｇＹ）のすべてのアイソタイプを指し、並びに、抗原結合フラグメント、ダイアボディ及び一本鎖分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆａｂｃ及びＦｖ分子、一本鎖（Ｓｃ）抗体、個別の抗体軽鎖、個別の抗体重鎖、抗体鎖又はＣＤＲと他のタンパク質との間のキメラ融合、タンパク質足場、重鎖単量体又は二量体、軽鎖単量体又は二量体、１つの重鎖及び１つの軽鎖からなる二量体等を包含すると理解されるべきである。
【００１２】
抗原結合フラグメントは、特定の抗原に対する結合親和性を呈し得る、任意のタンパク質性構造である。いくつかの抗原結合フラグメントは、親抗体分子の抗原結合特異性を保持する、無傷の抗体の一部分からなる。例えば、抗原結合フラグメントは、特定の抗原に結合することが知られている抗体の少なくとも１つの可変領域（重鎖若しくは軽鎖可変領域のいずれか）又は１つ以上のＣＤＲを含んでもよい。好適な抗原結合フラグメントの例としては、限定されないが、ダイアボディ及び一本鎖分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆａｂｃ、及びＦｖ分子、一本鎖（Ｓｃ）抗体、個別の抗体軽鎖、個別の抗体重鎖、抗体鎖又はＣＤＲと他のタンパク質との間のキメラ融合、タンパク質足場、重鎖単量体又は二量体、軽鎖単量体又は二量体、１つの重鎖及び１つの軽鎖からなる二量体等が挙げられる。すべての抗体アイソタイプは、抗原結合フラグメントを産生するために使用されてもよい。加えて、抗原結合フラグメントは、タンパク質足場等の関心対象の所与の抗原に対する親和性を付与する配向で、ポリペプチドセグメントを成功裏に組み込み得る、非抗体タンパク質性フレームワークを含んでもよい。抗原結合フラグメントは、組み換え産生され得るか、又は無傷の抗体の酵素若しくは化学切断によって産生され得る。「抗体又はその抗原結合フラグメント」という句は、所与の抗原結合フラグメントが、その句において言及される抗体の１つ以上のアミノ酸セグメントを組み込むことを示すために使用されてもよい。
【００１３】
「特異的結合」は、抗体又は抗体フラグメントの文脈において使用されるとき、分子の混合個体群を含有する試料中の他の分子に優先的に結合することなく、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによってコードされるドメインを介して、関心対象のタンパク質の１つ以上のエピトープに結合することを表す。通常、抗体は、表面プラズモン共鳴分析又は細胞結合分析によって測定される、約１×１０−８  Ｍ未満のＫｄでコグネイト抗原に結合する。「［抗原］特異的」抗体（例えば、ＴＥＭ１特異的抗体）という句は、列挙される抗体が、列挙される抗原に特異的に結合することを伝えることを意味する。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「腫瘍」という用語は、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖、並びにすべての前癌性並びに癌細胞及び組織を指す。
【００１５】
「癌」及び「癌性」という用語は、無秩序な細胞成長によって通常特徴づけられる哺乳類の生理的状態を意味する、又は表す。癌の一例は、大腸直腸癌である。
【００１６】
癌の「病状」は、患者の健康を損なう、すべての現象を含む。これには、異常な又は制御不能の細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、異常なレベルのサイトカイン又は他の分泌物の放出、炎症性若しくは免疫性反応の抑制又は悪化、腫瘍、前悪性、悪性、周囲若しくは遠隔組織又は器官（例えばリンパ節）への侵襲などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
「大腸直腸癌」という用語は広い意味で使用され、並びに、（１）大腸及び／若しくは直腸の上皮細胞から生じる、癌のすべての段階並びにすべての形態、並びに／又は（２）大腸及び／若しくは直腸の内膜に影響を及ぼす、癌のすべての段階並びにすべての形態を指す。大腸直腸癌分類で使用するステージングシステムにおいて、結腸及び直腸は１つの器官とみなされる。
【００１８】
米国対がん合同委員会（ＡＪＣＣ）の腫瘍、リンパ節、転移（ＴＮＭ）ステージングシステム（Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ．７ｔｈ  Ｅｄ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２００９）によれば、大腸直腸癌のさまざまな段階は以下のとおり定義される。
腫瘍：Ｔ０：原発腫瘍なし、Ｔ１：腫瘍が粘膜下層に侵襲する、Ｔ２：腫瘍が固有筋層に侵襲する、Ｔ３：腫瘍が固有筋層を介して、漿膜下層に、又は結腸周囲若しくは直腸周囲組織に侵襲する、Ｔ４：腫瘍が直接、他の器官若しくは組織に侵襲する、及び／又は穿孔する。
リンパ節：Ｎ０：局所リンパ節転移がない、Ｎ１：１〜３つの局所リンパ節転移、Ｎ２：４つ以上の局所リンパ節転移、
転移：Ｍ０：遠隔転移がない、Ｍ１：遠隔転移が存在する、
ステージ分類：ステージＩ：Ｔ１  Ｎ０  Ｍ０、Ｔ２  Ｎ０  Ｍ０、ステージＩＩ：Ｔ３  Ｎ０  Ｍ０、Ｔ４  Ｎ０  Ｍ０、ステージＩＩＩ：ＴのどれかＮ１〜２、Ｍ０、ステージＩＶ：ＴのどれかＮのどれかＭ１、
【００１９】
修正デュークステージングシステムによれば、大腸直腸癌のさまざまな段階は以下のとおり定義される。
ステージＡ：腫瘍が腸壁の粘膜に侵入するが、それ以上ではない、
ステージＢ：腫瘍が固有筋層に侵入して通過する、
ステージＣ：腫瘍が固有筋層に侵入するが通過せず、リンパ節に大腸直腸癌の病理学的証拠がある、又は腫瘍が固有筋層に侵入して通過し、リンパ節に癌の病理学的証拠がある、
ステージＤ：腫瘍がリンパ節の範囲を超えて、肝臓、肺若しくは骨などの他の器官にまで広がっている。
【００２０】
予後因子は、大腸直腸癌の自然経過に関連した変数のようなものであり、大腸直腸癌が発症すると、それは患者の再発率及び転帰に影響する。より悪い予後と関連する臨床パラメータは、例えばリンパ節病変及び高度の腫瘍を含む。予後因子は、患者を、異なるベースライン再発リスクのあるサブグループに分類するために多用されている。
【００２１】
「予後」という用語は本明細書において、癌に起因する死、又は、再発、転移及び薬剤耐性を含む、大腸直腸癌のような腫瘍性疾患の進行の可能性の予測を意味して使用される。
【００２２】
「予測」という用語が本明細書において、肯定的又は否定的に関わらず、患者は特定の臨床転帰を有するという可能性を意味して使用される。本発明の予測方法は、特定の患者の最適な治療法を選択することによって治療上の決定をするために、臨床的に使用可能である。本発明の予測方法は、患者が外科的処置のような治療計画に好ましい反応をするか予測する際の有益な手段である。前記予測は、予後因子を含むことができる。
【００２３】
「肯定的臨床転帰」という用語は、当該技術分野で通常使用される手段を含む、無再発期間（ＲＦＩ）持続の延長、全生存期間（ＯＳ）の延長、無病生存期間（ＤＦＳ）持続の延長、無遠隔転移期間（ＤＲＦＩ）の延長などの、患者の状態のすべての指標の改善を意味する。
【００２４】
「リスク分類」という用語は、被験体が特定の臨床転帰を経験する、リスクのレベル又は予測を意味する。被験体は、本発明の予測方法に基づいて、リスク群に分類される、又はリスクのレベルで分類することができる。「リスク群」とは、特定の臨床転帰のリスクが同程度である、被験体又は個人の一群である。
【００２５】
「被験体」又は「患者」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を指し、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類などの哺乳類並びに非哺乳類を含む。記載される方法の多くの実施形態において、被験体はヒトである。
【００２６】
「処置する」又は「処置」という用語は、症状の軽減、寛解、減退等の任意の客観的又は主観的パラメータを含む、傷害、病理、若しくは状態の減衰若しくは軽減、状態を患者にとってより耐えられるものにすること、変性若しくは減少速度を減速すること、変性の最終点をあまり衰弱性にしないこと、被験体の心身の健康を改善すること、又は生存期間を延長することにおける任意の成功又は成功のしるしを指す。処置は、身体検査、神経学的検査又は精神医学的評価の結果を含む、客観的又は主観的パラメータによって評価されてもよい。
【００２７】
「長期」生存という用語は、少なくとも３年間、より好ましくは少なくとも５年間生存することを意味するために、本明細書で使用される。
【００２８】
「無再発期間（ＲＦＩ）」という用語は、再発がみられず、第１の事象又は死亡としての第２の原発性癌をくい止めている、第１の大腸直腸癌再発の時間を意味するために、本明細書で使用される。
【００２９】
「無憎悪生存期間（ＰＦＳ）」という用語は、大腸直腸癌の一次処置から疾患の進行又は死亡までの時間で、その間に疾患は存在するが更に悪化しないことを意味するために、本明細書で使用される。
【００３０】
「全生存期間（ＯＳ）」という用語は、手術から、事象からの死亡までの時間を意味するために、本明細書で使用される。
【００３１】
「無病生存期間（ＤＦＳ）」という用語は、大腸直腸癌再発、又は事象から死亡までの時間を意味するために、本明細書で使用される。
【００３２】
「無遠隔転移期間（ＤＲＦＩ）」という用語は、手術から最初の解剖学的遠隔癌再発までの時間を意味するために、本明細書で使用される。
【００３３】
本発明の文脈において、特定の遺伝子セットで表示されている、遺伝子の「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ」などは、記載されている遺伝子のどれか１つ又はあらゆる組合せを意味する。
【００３４】
「リンパ節転移陰性」大腸直腸癌のような「リンパ節転移陰性」癌という用語は、リンパ節で検出されなかった、及び／又はリンパ節まで広がらなかった癌を意味するために、本明細書で使用される。「リンパ節転移陽性」大腸直腸癌のような「リンパ節転移陽性」癌という用語は、リンパ節まで広がった、及び／又はリンパ節で検出された癌を意味するために、本明細書で使用される。
【００３５】
方法
大腸直腸癌と診断された被験体が、バイオマーカー、特に患者から得られた腫瘍組織試料の腫瘍区画パネルの遺伝子発現プロファイリングに基づいて、本疾患を再発するリスクを判定する方法が、本明細書に記載される。バイオマーカー、特に被験体から得られた腫瘍組織試料の腫瘍区画のパネルの遺伝子発現プロファイリングに基づいて、大腸直腸癌と診断された被験体の臨床転帰を予測する方法も記載されている。更に、大腸直腸癌と診断された被験体を、ＴＥＭ１発現大腸直腸癌のリスクが高いカテゴリ又はリスクが低いカテゴリに分類する、割り当てを可能にする鑑別診断の方法が、本明細書において開示される。
【００３６】
被験体は、大腸直腸癌のリンパ節転移陽性、又はリンパ節転移陰性でもよい。患者の大腸直腸癌は、ほとんどの場合ステージＩ、ステージＩＩ又はステージＩＩＩの癌であるが、いかなるステージであってもよい。
【００３７】
腫瘍組織試料は、固定した、固定してパラフィン埋め込まれている又は作成直後であってもよい。いくつかの態様において腫瘍組織試料は、患者から得られる生体試料の組織生検、細針吸引試料、外科的に切除された腫瘍組織又は組織学的調製物から得られる。いくつかの実施形態において、腫瘍組織試料は原発性大腸直腸癌腫瘍からのものである。他の実施形態において、腫瘍組織試料は転移性大腸直腸癌腫瘍からのものである。
【００３８】
マーカーパネルは、腫瘍内皮マーカ−１（ＴＥＭ１、別名エンドシアリン又はＣＤ２４８）、低酸素誘導因子２α（ＨＩＦ２α）、炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸ）、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲβ）、フィブロネクチン（ＦＮ）、コラーゲンＩ（ＣＯＬＩ）、コラーゲンＩＶ（ＣＯＬＩＶ）及びＣＤ３１のうちの少なくとも２つを含む。好ましい実施形態において、マーカーパネルは、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１のうちの３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は全８つを含む。いくつかの実施形態では、マーカーパネルは、少なくともＴＥＭ１及びＣＡＩＸを含む。いくつかの実施形態では、マーカーパネルは、少なくともＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ及びＰＤＧＦＲβを、より好ましくはＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、フィブロネクチン及びＰＤＧＦＲβを、並びに、いくつかの実施形態では、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１を含む。
【００３９】
マーカーは、純粋な間質（脈管構造が実質的に又は完全にない間質）、腫瘍、間質血管及び腫瘍血管のうちの少なくとも３つを含む、腫瘍区画のパネルに配置される。前記配置は、被験体からの腫瘍組織試料の少なくとも３つの区画を識別する、及び／又は標識化することを含んでもよい。好ましい実施形態において、バイオマーカーが配置される腫瘍区画のパネルは、純粋な間質、腫瘍、間質血管及び腫瘍血管を含む。
【００４０】
いくつかの態様において、本明細書記載の方法は、以下のバイオマーカー及び腫瘍区画の組合せのうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つの発現レベルを測定することを含む：腫瘍間質のＴＥＭ１の発現レベル、腫瘍血管のＴＥＭ１の発現レベル、間質血管のＨＩＦ２αの発現レベル、腫瘍間質のＨＩＦ２αの発現レベル、腫瘍血管のＣＡＩＸの発現レベル、腫瘍間質のＰＤＧＦＲβの発現レベル及び腫瘍間質のフィブロネクチン（例えば、フィブロネクチン−１）の発現レベル。本明細書の方法の好ましい実施形態において、腫瘍間質のＴＥＭ１の発現レベル、腫瘍血管のＴＥＭ１の発現レベル、間質血管のＨＩＦ２αの発現レベル、腫瘍間質のＨＩＦ２αの発現レベル、腫瘍血管のＣＡＩＸの発現レベル、及び腫瘍間質のＰＤＧＦＲβの発現レベルが、測定される。本明細書の方法のいくつかの好ましい実施形態において、腫瘍間質のＴＥＭ１の発現レベル、腫瘍血管のＴＥＭ１の発現レベル、間質血管のＨＩＦ２αの発現レベル、腫瘍間質のＨＩＦ２αの発現レベル、腫瘍血管のＣＡＩＸの発現レベル、腫瘍間質のＰＤＧＦＲβの発現レベル、及び腫瘍間質のフィブロネクチンの発現レベルが、測定される。本明細書の方法のいくつかの実施形態において、間質のＴＥＭ１の発現レベル、腫瘍血管のＴＥＭ１の発現レベル、間質血管のＨＩＦ２αの発現レベル、腫瘍のＣＯＬＩＶの発現レベル及び間質のフィブロネクチンの発現レベルが、測定される。本明細書の方法のいくつかの実施形態において、間質のＴＥＭ１の発現レベル、腫瘍のＣＯＬＩＶの発現レベル及び間質のフィブロネクチンの発現レベルが、測定される。本明細書の方法において、少なくとも１つの細胞内区画（例えば、細胞核、細胞質、核膜、細胞膜、ミトコンドリア、小胞体、ペルオキシソーム及びリソソーム）も、識別又は標識化することができる。
【００４１】
バイオマーカーの発現レベルは、当該技術分野において周知の任意の方法によって測定することができる。遺伝子発現プロファイリングの方法は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成分析に基づく方法、ポリヌクレオチドのシークエンシングに基づく方法、及びプロテオミクスに基づく方法を含む。試料のｍＲＮＡ発現の定量化のため、最も一般的に使用されている、当該技術分野において既知の方法は、ノーザンブロット法及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ  ＆  Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７〜２８３（１９９９））、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２〜８５４（１９９２））、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３〜２６４（１９９２））のようなＰＣＲに基づく分析を含む。別の方法としては、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む、配列特異的二本鎖を認識できる抗体を用いてもよい。シーケンシングに基づく遺伝子発現分析の代表的な方法は、遺伝子発現の逐次分析法（ＳＡＧＥ）及び超並列型シーケンシング（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析を含む。バイオマーカーの発現レベルは、免疫組織化学法並びに自動化された組織マイクロアレイ分析（例えば、本明細書に参照として組み込まれる、米国特許第２０１２００９３３８７号及び第２０１１０３１１１２３号参照）によって、測定することもできる。
【００４２】
本明細書で開示される方法は、全体又は一部を自動化することができる。いくつかの実施形態では、前記方法は、患者の大腸直腸癌腫瘍の試料の、マーカーパネルの定量的免疫蛍光（ＱＩＦ）信号を含む。多数の定量的画像解析法は、当該技術分野において周知である。発現レベルを測定するために用いることができる定量的画像解析法の例は、発行済み米国特許第７，２１９，０１６号及び米国特許出願公開第２００９／００３４８２３号に記載されている、自動化定量分析（ＡＱＵＡ（登録商標））技術であり、これらの特許はそれぞれ、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。ＡＱＵＡ（登録商標）技術は、分析中の組織試料内の所与のマーカーのための蛍光信号だけの定量化ではなく、分子的に定義済みの腫瘍及び細胞内区画内の区分化も可能にする。
【００４３】
被験体の腫瘍区画パネル内のバイオマーカー発現レベルは、患者のＴＥＭ１−関連経路予後型（ＴＡＰＰＳ）スコアの測定を可能にする（本明細書で使用する場合、「ＴＡＰＰＳ」という用語は、下記の実施例部分で述べるように、本来定義されたＴＡＰＰＳスコアの正確な表現「Ｒ−ＴＡＰＰＳ」という用語の代わりに、使用することもできる）。被験体のＴＡＰＰＳスコアは、被験体のバイオマーカー発現レベルを、ＴＡＰＰＳ式の腫瘍区画のパネル内に組み入れることによって生成される。ＴＡＰＰＳ方程式は、一変量カットポイントを採用する変数減少を用いた多変量コックス比例ハザードモデルで、大腸直腸癌と診断された被験体の母集団の、腫瘍区画パネルのバイオマーカーパネルの発現プロファイルを調べて、所望のｐ値レベルを満たす予後モデルを提供することによって、生成される。このモデルから、係数が各マーカーに対して導出され、これらの係数を用いて、全体のリスクスコアを提供するＴＡＰＰＳ式が作られる。いくつかの実施形態では、ＴＡＰＰＳ式は、大腸直腸癌患者の母集団を包含した中から選択された腫瘍区画の各マーカーの係数Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどを決定して、許容可能なｐ値を有する予後モデルを提供することによって、決定される。いくつかの実施形態で、ＴＡＰＰＳ式は、
（〜Ａ＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜Ｂ＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（〜Ｃ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍脈管構造）＋（〜Ｄ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍）であり、
式中、係数Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、予後モデルを大腸直腸癌患者の所与の母集団に提供するために、一変量カットポイントを採用する変数減少を用いた多変量コックス比例ハザードモデルで、各腫瘍区画の各マーカー用に導出された係数である。他の実施形態で、ＴＡＰＰＳ式は、
（〜Ａ＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜Ｂ＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（〜Ｃ＊ＨＩＦ２α＿間質脈管構造）＋（〜Ｄ＊ＨＩＦ２α＿間質）＋
（〜Ｅ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍脈管構造）＋（〜Ｆ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍）＋（〜Ｇ＊ＰＤＧＦＲβ＿間質）＋
（〜Ｈ＊フィブロネクチン＿間質）であり、
式中、係数Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨは、最適な予後モデルを大腸直腸癌患者の所与の母集団に提供するために、一変量カットポイントを採用する変数減少を用いた多変量コックス比例ハザードモデルで、各腫瘍区画の各マーカー用に導出された係数である。いくつかの実施形態で、ＴＡＰＰＳ式は以下のとおりである。
（〜−１．０６３＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜０．４７８＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（〜−１．０９５＊ＨＩＦ２α＿間質脈管構造）＋（〜０．４０７＊ＨＩＦ２α＿間質）＋
（〜−１．０９６＊ＣＡＩＸ＿腫瘍脈管構造）＋（〜０．９１２＊ＣＡＩＸ＿腫瘍）＋（〜０．６００＊ＰＤＧＦＲβ＿間質）＋（〜０．７１４＊フィブロネクチン＿間質）。
【００４４】
いくつかの実施形態で、ＴＡＰＰＳ式は、
（〜Ａ＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜Ｂ＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（〜Ｃ＊ＨＩＦ２α＿間質脈管構造）＋（〜Ｄ＊ＣＯＬＩＶ＿腫瘍）＋（〜Ｅ＊ＦＮ間質）であり、
式中、係数Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、予後モデルを大腸直腸癌患者の所与の母集団に提供するために、一変量カットポイントを採用する変数減少を用いた多変量コックス比例ハザードモデルで、各腫瘍区画の各マーカー用に導出された係数である。いくつかの実施形態で、ＴＡＰＰＳ式は、
（〜−０．８９＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜１．１９＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（〜−０．７６＊ＨＩＦ２α＿間質脈管構造）＋（〜０．６２＊ＣＯＬＩＶ＿腫瘍）＋
（〜０．８３＊ＦＮ間質）であり、
式中、係数Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、予後モデルを大腸直腸癌患者の所与の母集団に提供するために、一変量カットポイントを採用する変数減少を用いた多変量コックス比例ハザードモデルで、各腫瘍区画の各マーカー用に導出された係数である。いくつかの実施形態で、ＴＡＰＰＳ式は、
（〜Ａ＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜Ｂ＊ＣＯＬＩＶ＿腫瘍）＋（〜Ｃ＊ＦＮ間質）であり、
式中、係数Ａ、Ｂ及びＣは、予後モデルを大腸直腸癌患者の所与の母集団に提供するために、一変量カットポイントを採用する変数減少を用いた多変量コックス比例ハザードモデルで、各腫瘍区画の各マーカー用に導出された係数である。いくつかの実施形態で、ＴＡＰＰＳ式は、
（〜０．８９＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜０．６２＊ＣＯＬＩＶ＿腫瘍）＋（〜０．８３＊ＦＮ間質）であり、
式中、係数Ａ、Ｂ及びＣは、予後モデルを大腸直腸癌患者の所与の母集団に提供するために、一変量カットポイントを採用する変数減少を用いた多変量コックス比例ハザードモデルで、各腫瘍区画の各マーカー用に導出された係数である。ＴＡＰＰＳ式の係数が、大腸直腸癌と診断された被験体の母集団に応じて、いくらか変動する可能性があることは当業者にわかる。
【００４５】
次に被験体のＴＡＰＰＳスコアが、大腸直腸癌と診断された被験体の母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較される。被験体は、ＴＡＰＰＳスコアのいかなる特定の値でもサブグループに分割することが可能であり、そこで、所与の範囲の値を有するすべての患者を、特定のリスク群又は特定の臨床転帰と関連する群に属するとして分類できる。分析結果は、報告書にまとめることが可能である。この情報は、患者及び医師にとって、患者に対する観察対アジュバント療法の、リスク対効果を評価するために有用である。例えば、被験体が大腸直腸癌再発のリスクが高いと判断される場合、更なる療法が選ばれる又は行うことができる。このような療法は、ＴＥＭ１標的療法（例えば、ＭＯＲＡｂ−００４）、化学療法、放射線療法、及び／又は疾患再発若しくは進行のモニタリングを含む。
【００４６】
いくつかの態様において、大腸直腸癌と診断される被験体が大腸直腸癌の再発するリスクを決定する方法は、ａ）被験体からの腫瘍組織試料の腫瘍区画パネルで、マーカーパネルの各マーカーの発現レベルを決定することと、該マーカーパネルは、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１のうちの少なくとも２つを含み、並びに、該腫瘍区画パネルは、純粋な間質、腫瘍、間質血管及び腫瘍血管の少なくとも３つの腫瘍区画を含み、ｂ）被験体のＴＡＰＰＳスコアを決定することと、ｃ）被験体のＴＡＰＰＳスコアと大腸直腸癌と診断された被験体の母集団のＴＡＰＰＳスコアを比較することと、と含む。被験体は、被験体のＴＡＰＰＳスコアが母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して低い場合、大腸直腸癌の再発のリスクが低い群に割り当てられる。被験体は、被験体のＴＡＰＰＳスコアが母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して高い場合、大腸直腸癌の再発のリスクが高い群に割り当てられる。いくつかの態様において、被験体の大腸直腸癌がリンパ節転移陰性であって、及び被験体のＴＡＰＰＳスコアが母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して中間である場合、被験体は大腸直腸癌の再発のリスクが低い群に割り当てられる。いくつかの態様において、被験体の大腸直腸癌がリンパ節転移陽性であって、及び被験体のＴＡＰＰＳスコアが母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して中間である場合、被験体は大腸直腸癌の再発のリスクが高い群に割り当てられる。
【００４７】
いくつかの態様において、大腸直腸癌と診断された被験体の臨床転帰を予測する方法は、ａ）被験体からの腫瘍組織試料の腫瘍区画パネルで、マーカーパネルの各マーカーの発現レベルを決定することと、該マーカーパネルは、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１のうちの少なくとも２つを含み、並びに、該腫瘍区画パネルは、純粋な間質、腫瘍、間質血管及び腫瘍血管の少なくとも３つの腫瘍区画を含み、ｂ）被験体のＴＡＰＰＳスコアを決定することと、ｃ）被験体のＴＡＰＰＳスコアと大腸直腸癌と診断された被験体の母集団のＴＡＰＰＳスコアを比較することと、と含む。母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して、低いＴＡＰＰＳスコアの被験体は、肯定的臨床転帰が予測される。母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して、高いＴＡＰＰＳスコアの被験体は、不良臨床転帰が予測される。被験体の大腸直腸癌がリンパ節転移陰性である場合、母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して、中間のＴＡＰＰＳスコアの被験体は、肯定的臨床転帰が予測される。被験体の大腸直腸癌がリンパ節転移陽性である場合、母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して、中間のＴＡＰＰＳスコアの被験体は、不良臨床転帰が予測される。臨床転帰は、無憎悪生存期間（ＰＦＳ）、無再発期間（ＲＦＩ）、全生存期間（ＯＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、又は無遠隔転移期間（ＤＲＦＩ）という用語で表すことができる。
【００４８】
不良臨床転帰が被験体に予測される場合、被験体は、ＴＥＭ１標的療法（例えば、ＭＯＲＡｂ−００４）、化学療法、放射線療法、及び／若しくは、疾患再発若しくは進行のためのモニタリングなどの更なる療法を選ぶ、又は受けることができる。
【００４９】
本明細書で開示された方法で、大腸直腸癌の再発、又は不良臨床転帰が予測される高いリスクが決定された被験体は、例えば、ＴＥＭ１標的療法、化学療法及び／若しくは放射線療法といった大腸直腸癌の療法が施される、大腸直腸癌の処置の方法も、本明細書において開示される。本明細書で記載されている方法の臨床応用は、既存の基準に対して相補的である、患者の疾患再発の可能性の客観的な評価を提供するだろう。この情報に基づいて、アジュバント療法から、又はより積極的な疾患再発モニタリングから利益を得る可能性が高い患者を、識別できる。逆に、現在の予後基準に基づくアジュバント療法の候補になることができるが、本分析に基づき再発の危険性が低いと識別された患者は、既存のアジュバント療法に伴う不必要なリスクを回避できる。
【００５０】
本明細書に記載されている方法で、大腸直腸癌と診断された被験体を、再発のリスクが高い群若しくはリスクが低い群に、又は肯定的臨床転帰が予測される群若しくは不良臨床転帰が予測される群に、割当てることができる。前記方法は、患者及び医師が、補助介入、又は少なくとも積極的経過観察調査の必要性を決定するのに役立つ。本明細書で記載される方法の目的は、残りの患者をアジュバント療法又は疾患再発のモニタリングに伴う危険及び費用にさらさずに、リスクの高い患者群の全生存期間を改善することである。例えば、本明細書の方法で、高リスク試験結果があると識別されたリンパ節転移陰性の患者は、アジュバント療法を選ぶように促されるかもしれない。
【００５１】
大腸直腸癌腫瘍組織試料内にマーカーパネルを配置するためのコンピュータで実行される方法も、本明細書に記載されている。前記方法によれば、腫瘍組織試料（例えば、その１つ以上の断面）は、純粋な間質、腫瘍、間質血管及び腫瘍血管の少なくとも３つの腫瘍区画を特異的に標識化する、標識パネルで培養される。腫瘍組織試料（例えば、その１つ以上の断面）も、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１のうちの少なくとも２つを含むマーカーパネルを標識化する標識パネルで、培養される。いくつかの好ましい実施形態において、マーカーパネルは、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１の４つ、５つ、６つ、７つ、又は全８つを含む。好ましい実施形態において、マーカーパネルは、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ及びＰＤＧＦＲβを含む。別の好ましい実施形態において、マーカーパネルは、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、フィブロネクチン及びＰＤＧＦＲβを含む。一実施形態において、マーカーパネルは、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、コラーゲンＩＶ及びフィブロネクチンを含む。腫瘍組織試料の各ラベルの高分解能画像は、光学撮像装置を使用して得られる。各腫瘍区画の画像及び各マーカーの画像が、生成される。次いで画素位置が、その画素位置で腫瘍区画を特異的に標識化するラベルの強度値に基づいて、各腫瘍区画に割り当てられる。そして各マーカーの画像が、各腫瘍区画に割り当てられた画素位置で分析されて、マーカーラベルの存在を示す強度値を有する画素位置を識別し、これにより腫瘍組織試料のマーカーパネルの各マーカーを配置する。
【００５２】
大腸直腸癌腫瘍組織試料内にマーカーパネルを配置するための、コンピュータ実行方法のいくつかの実施形態において、腫瘍組織試料は、細胞核、細胞質、核膜、細胞膜、ミトコンドリア、小胞体、ペルオキシソーム及びリソソームの２つ以上の細胞内区画を特異的に標識化する標識パネルで、更に培養される。次いで、細胞内区画を特異的に標識化する各ラベルの高分解能画像は、各細胞内区画の画像を得るための光学撮像装置を使用して得られる。そして画素位置が、その画素位置で細胞内区画を特異的に標識化するラベルの強度値に基づいて、各細胞内区画に割り当てられる。
【００５３】
本明細書に記載されている方法（大腸直腸癌腫瘍組織試料内にマーカーパネルを配置するコンピュータ実行方法、大腸直腸癌と診断された被験体の臨床転帰を予測する方法、大腸直腸癌と診断された被験体が大腸直腸癌を再発するリスクを測定する方法、鑑別診断の方法及び処置の方法を含む）のいくつかの態様において、組織試料は、固定されている、固定してパラフィン埋め込まれている、若しくは新鮮である、及び／又は生検から得られる。いくつかの態様において、大腸直腸癌腫瘍組織試料は、組織マイクロアレイである。いくつかの実施形態において、腫瘍組織試料は厚さ約５ミクロンである。
【００５４】
本明細書で開示された方法のいくつかの実施形態によれば、大腸直腸癌は、リンパ節転移陰性又はリンパ節転移陽性である。いくつかの態様において、大腸直腸癌は、ステージＩ、ステージＩＩ、又はステージＩＩＩの癌である。本明細書で記載されている方法は、大腸直腸癌の診断に応じて、大腸直腸癌の外科的切除の後、又は、ＭＯＲＡｂ−００４による処置などの大腸直腸癌の処置の後、実施することができる。
【００５５】
本明細書に記載されている方法（大腸直腸癌腫瘍組織試料内にマーカーパネルを配置するコンピュータ実行方法、大腸直腸癌と診断された被験体の臨床転帰を予測する方法、及び大腸直腸癌と診断された被験体が大腸直腸癌を再発するリスクを測定する方法を含む）で使用されるラベルは、容易に当業者に周知である。例えば適切なラベルは、抗体（例えば、検出可能な標識抗体）、放射線標識、蛍光物質、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団若しくは発色性標識（例えば、３，３−ジアミノベンジジン）、ＥＣＬ標識又は酵素を含むが、これらに限定されると見なすべきではない。より具体的には、本明細書で記載されているラベルは、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びβ−ガラクトシダーゼ、ポリ−ヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン色素、シアニン染料、蛍光染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料などを含む。蛍光物質の例は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はシアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７及びＣｙ７．５）を含む。いくつかの実施形態において、ラベルは、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、酵素、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、及びβ−ガラクトシダーゼ、若しくはポリ−ヒスチジン、又は当該技術分野で既知の類似のそのようなラベルで標識化された抗体を含む。信号増幅システム（例えば、チラミド信号増幅）を、ラベルで使うことができる。腫瘍区画を定めるラベルは、ＣＤ３１、ＣＤ３４、サイトケラチン、βカテニン、αカテニン及びビメンチンのマーカーと反応できるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、任意の腫瘍区画マーカー又はバイオマーカーと反応するラベルは、抗体を含む。
【００５６】
組織試料アレイ
１つ以上の被験体の癌組織から産生された組織試料アレイが本明細書に記載されており、該組織試料は、癌細胞の発現を変化させ得る細胞又は細胞外タンパク質と特異的に結合する１つ以上の抗体で標識化されている。本明細書に記載されているアレイの組織試料は、単一又は複数の被験体からのものであり得、及び単一の腫瘍又は複数の腫瘍からのものであり得る。例えば、本明細書に記載されている組織アレイは、個々の被験体から得られる単一の腫瘍試料の複数の組織学的切片（histological sections）から産生することができる。あるいは、本明細書に記載されているアレイの癌組織は、被験体の複数の腫瘍から得られることが可能である。複数の腫瘍が組織学的試料をアレイに提供する、いくつかの実施形態において、腫瘍は、同じ種類、ステージ又はグレードの腫瘍でもよい。アレイの組織試料は、非癌細胞よりも癌細胞若しくは特定の癌細胞で示差的発現をする、１つ以上の細胞タンパク質又は細胞外タンパク質を検出するために、１つ以上の抗体で標識化することができる。いくつかの実施形態において、アレイの１つ以上の組織試料は、複数の抗体で標識化されて、複数のタンパク質の検出を可能にし、この標識化されたタンパク質のうちの少なくとも１つは、癌細胞で示差的発現をしない。
【００５７】
本明細書で記載されている組織試料アレイは、広範な実施形態に存在し得る。いくつかの実施形態において、組織試料アレイは、組織構造と関連していることが周知であるタンパク質と特異的に結合する、少なくとも１つの抗体で標識化された複数の組織腫瘍試料からなることができ、それによって関連する構造が標識化され、少なくともアレイのいくつかの該組織試料は、異なるタンパク質と特異的に結合する少なくとも１つの抗体で標識化されており、それは構造タンパク質であっても又はでなくてもよい。いくつかの実施形態において、アレイ試料は、構造タンパク質のために、サイトケラチン、ビメンチン及びＣＤ３１のどれか１つと特異的に結合する１つ以上の抗体で標識化することができ、その一方で、アレイ試料は、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α又はＣＡＩＸのどれか１つと特異的に結合する抗体で標識化することもできる。いくつかの実施形態において、アレイ試料は、構造タンパク質のために、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のどれか１つと特異的に結合する１つ以上の抗体で標識化することができ、その一方で、アレイ試料は、ＴＥＭ１、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶ、及びＨＩＦ２と特異的に結合する抗体で標識化することもできる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本明細書記載のアレイは、アレイの各組織試料を異なる抗体の組み合わせで標識化するような方法で調製されて、さまざまな個々の組織構造をアレイ間で標識化することが可能になり、一方で同じ組織試料は、異なるタンパク質用に、１つ以上の抗体で同時に標識化することができ、そうすることで種々のタンパク質発現プロファイルが、アレイ間で同時に評価され得る。このようにアレイを使用することで、目的のタンパク質の発現に関するパラメータの組合せが、目的の組織又は腫瘍のために、アレイ間の複数のクエリパラメータを利用することによって得られるようになる。例えば一態様において、アレイの単一組織試料は、目的のタンパク質（例えばＴＥＭ１）を検出するために標識化することができ、並びに、サイトケラチン、ビメンチン及びＣＤ３１を検出して目的の特定の細胞又は組織構造を示すためにも標識化することができ、更に、核のような細胞の他の要素も、ＤＮＡと結合できるラベルを使用して検出することができる。同じアレイの他の組織試料は、同様の方法で標識化することが可能であるが、ただし、ＴＥＭ１用のラベルが、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α又はＣＡＩＸといった、目的の異なるタンパク質用のラベルと置き換えられる場合は除く。次いで、互いと関連する、及び、各試料の標識構成要素に関連する、目的の標識タンパク質の発現レベルを評価することができた。したがって例えば、単一の腫瘍のＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α及びＣＡＩＸの任意の組合せの発現レベルも決定すること、互いに関連するこれらのタンパク質の発現レベルを評価すること、更にアレイの各試料の標識構成要素と関連するそれらの発現位置を測定することができた。標識タンパク質の検出は、免疫組織化学的な手段によって達成され得る。例えば、標識化された第１の抗体又は標識化された第２の抗体を使用する、蛍光物質を利用した標識化、及び蛍光検出器を使用する検出である。
【００５９】
前述したことを考慮すると、以下に記載の実施形態は、本明細書に開示される組織試料アレイの更なる理解を提供できる。一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料における細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出、並びに、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、及びＣＡＩＸのうちの１つ以上の検出を可能にし、該標識タンパク質は、組織学的スライドの細胞における配置及び定量を可能にする方法で標識化される。一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料における細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上で標識化された少なくとも１つの細胞も、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つ以上の抗体で標識化されており、該標識タンパク質は、組織学的スライドの細胞のそれらの配置及び定量を可能にする方法で標識化される。
【００６０】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料における細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上に特異的な抗体で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化され、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化され、コラーゲンＩに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化され、コラーゲンＩＶに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；並びにサイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライドを含み、該標識タンパク質は、組織学的スライドの細胞のそれらの配置及び定量を可能にする方法で標識化される。
【００６１】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料における細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びにサイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、コラーゲンＩに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；
ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、コラーゲンＩに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、コラーゲンＩＶに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；並びに、ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、コラーゲンＩＶに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；を含む。
【００６２】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料の細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、以下の標識組み合わせのうちのいずれか１つ以上を含む：ビメンチンに特異的な抗体であり、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；サイトケラチンに特異的な抗体であり、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体であり、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体であり、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体であり、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；ビメンチンに特異的な抗体であり、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；サイトケラチンに特異的な抗体であり、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体であり、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；ビメンチンに特異的な抗体であり、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体であり、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；ビメンチンに特異的な抗体であり、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；ビメンチンに特異的な抗体であり、コラーゲンＩに特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体であり、コラーゲンＩに特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；ビメンチンに特異的な抗体であり、コラーゲンＩＶに特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体；又は、ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体であり、コラーゲンＩＶに特異的な１つの抗体でも標識化されている、抗体。
【００６３】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料における細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；並びに、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライドを含む。
【００６４】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料における細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライド；並びに、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織学的スライドを含む。
【００６５】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料における細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；並びに、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライドを含む。
【００６６】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料の細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライド；並びに、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、２〜５の組織学的スライドを含む。
【００６７】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料における細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；サイトケラチンに特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；並びに、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみを含む。
【００６８】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料の細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみ；並びに、ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドのみを含む。
【００６９】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料における細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、ビメンチンに特異的な抗体のみで標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体のみで標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体のみで標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体のみで標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体のみで標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体のみで標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体のみで標識化され、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；並びに、ビメンチンに特異的な抗体のみで標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドを含む。
【００７０】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、腫瘍の複数の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料の細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、ビメンチンに特異的な抗体のみで標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体のみで標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体のみで標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体のみで標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体のみで標識化され、ＰＤＧＦＲβに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；並びに、ビメンチンに特異的な抗体のみで標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドを含む。
【００７１】
一実施形態において、本明細書の方法に記載の組織試料アレイは、複数の腫瘍の組織学的スライドを含むことができ、大多数の該組織学的スライドは標識化されて、組織試料における細胞の核の検出、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちの１つ以上の検出を可能にし、並びに、サイトケラチン、ビメンチン、及びＣＤ３１のうちのいずれか１つ以上で標識化された少なくとも１つの組織学的スライドが、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α、又はＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されており、それによりアレイは全体として、ビメンチンに特異的な抗体のみで標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体のみで標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体のみで標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；サイトケラチンに特異的な抗体のみで標識化され、コラーゲンＩＶに特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライド；ビメンチンに特異的な抗体のみで標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、組織学的スライドを含む。
【００７２】
当業者には明らかであるように、本明細書記載の、抗原検出パラメータの他の実施形態は、実質的に類似の結果を、記載されている方法によって提供されるもの又は組織アレイにもたらすために使用され得る。例えば、上で別途に記載されている特定の標識化条件を単に結合することができたが、異なる検出条件を使用して、追加ラベルによって違ったふうに生じる干渉を回避できた。当業者には周知のその他のこのような修正は、記載されている検出方法を避けるために用いられることもできるが、しかしながら、本開示の観点から考えた場合、このような代替例は当業者の知識の範囲内で考慮されなければならない。
【００７３】
キット
本発明の方法で使用される材料は、周知の手順にしたがって作成したキットの調製に適している。このように本発明は、予後転帰を予測するために開示されたマーカーパネルの発現を検出及び／又は定量化するための薬剤を含むキットを提供し、それは、マーカーパネルに特異的なラベル、例えば、ＴＥＭ１に特異的なラベル、ＰＤＧＦＲβに特異的なラベル、ＨＩＦ２αに特異的なラベル、ＣＡＩＸに特異的なラベル、フィブロネクチンに特異的なラベル、コラーゲンＩに特異的なラベル、コラーゲンＩＶに特異的なラベル、及びＣＤ３１に特異的なラベルのうちの少なくとも２つのラベルを含むことができる。ＴＥＭ１に特異的なラベルは、ＴＥＭ１に対する抗体を含むことができる（例えば、抗体９Ｇ５（９Ｇ５抗体を産生する抗体産生細胞は、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９にある米国菌培養収集所に２０１２年２月１６日に預けられ、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５４７を割り当てられた）。ＰＤＧＦＲβに特異的なラベルは、ＰＤＧＦＲβに対する抗体を含むことができる。ＨＩＦ２αに特異的なラベルは、ＨＩＦ２αに対する抗体を含むことができる。ＣＡＩＸに特異的なラベルは、ＣＡＩＸに対する抗体を含むことができる。フィブロネクチンに特異的なラベルは、フィブロネクチンに対する抗体を含むことができる。コラーゲンＩに特異的なラベルは、コラーゲンＩに対する抗体を含むことができる。コラーゲンＩＶに特異的なラベルは、コラーゲンＩＶに対する抗体を含むことができる。腫瘍区画を定めるラベルは、ＣＤ３１、ＣＤ３４、サイトケラチン、βカテニン、αカテニン及びビメンチンのマーカーと反応できるが、これらに限定されない。バイオマーカー及び腫瘍区画マーカーのためのラベルは、容易に当業者に周知である。例えば適切なラベルは、抗体（例えば、検出可能な標識抗体）、放射線標識、蛍光物質、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団若しくは発色性標識（例えば、３，３−ジアミノベンジジン）、ＥＣＬ標識又は酵素を含むが、これらに限定されると見なすべきではない。より具体的には、本明細書で記載されているラベルは、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びβ−ガラクトシダーゼ、ポリ−ヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン色素、シアニン染料、蛍光染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料などを含む。蛍光物質の例は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はシアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７及びＣｙ７．５）を含む。いくつかの実施形態において、ラベルは、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、酵素、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、及びβ−ガラクトシダー���、若しくはポリ−ヒスチジン、又は当該技術分野で既知の類似のそのようなラベルで標識化された抗体を含む。信号増幅システム（例えば、チラミド信号増幅）をラベルで使うことができ、したがって本明細書記載のキットに含まれることができる。
【００７４】
これ以外にもキットは任意に、識別説明若しくはラベル、又は本明細書記載の方法での使用に関連する説明書のある試薬を含むことができる。キットは、本方法で利用する、１つ以上のさまざまな試薬（通常は濃縮された形態）入りの容器を含むことができる。予後若しくは予測情報を推定する、又は定量化するために用いる数学的アルゴリズムも、当然ながらキットの潜在的構成要素である。
【００７５】
いくつかの態様において、ＴＥＭ１に特異的なラベル、ＰＤＧＦＲβに特異的なラベル、ＨＩＦ２αに特異的なラベル、及びＣＡＩＸに特異的なラベルを含む、大腸直腸癌のマーカーパネルを配置又は定量化するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットを使用するための説明書が含まれる。
【００７６】
いくつかの態様において、ＴＥＭ１に特異的なラベル、コラーゲンＩＶに特異的なラベル、ＨＩＦ２αに特異的なラベル、及びフィブロネクチン−１に特異的なラベルを含む、大腸直腸癌のマーカーパネルを配置又は定量化するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットを使用するための説明書が含まれる。
【００７７】
本明細書記載のキットは、１つ以上の細胞核に特異的なラベル、腫瘍細胞質に特異的なラベル、腫瘍間質に特異的なラベル、脈管構造に特異的なラベル、腫瘍脈管構造のラベル、及び腫瘍間質脈管構造のラベルも含み得る。例えば、腫瘍細胞質に特異的なラベルはサイトケラチンと反応でき、腫瘍間質に特異的なラベルはビメンチンと反応でき、及び、脈管構造に特異的なラベルはＣＤ３１と反応できる。
【００７８】
本明細書記載のキットのいくつかの実施態様において、ＴＥＭ１に特異的なラベルはＴＥＭ１に対する抗体を含み、ＰＤＧＦＲβに特異的なラベルはＰＤＧＦＲβに対する抗体を含み、ＨＩＦ２αに特異的なラベルはＨＩＦ２αに対する抗体を含み、ＣＡＩＸに特異的なラベルはＣＡＩＸに対する抗体を含み、フィブロネクチンに特異的なラベルはフィブロネクチンに対する抗体を含み、コラーゲンＩに特異的なラベルはコラーゲンＩに対する抗体を含み、及びコラーゲンＩＶに特異的なラベルはコラーゲンＩＶに対する抗体を含む。
【００７９】
報告
本明細書記載の方法は、大腸直腸癌再発の可能性、臨床転帰の予測、若しくはマーカーの配置の、報告又は概要を作成する場合がある。本明細書記載の方法は及び報告は更に、報告をデータベースに記憶することを含むことができる。あるいは前記方法は更に、被験体のためのデータベースの記録をを作成することができて、該記録にデータを入れることができる。一実施例において報告は紙の報告であり、別の実施形態例では報告は音声による報告であり、別の実施形態では報告は電子記録である。報告は、医師及び／又は患者に提供されると考えられる。報告の受領は更に、データ及び報告を含むサーバーコンピュータにネットワーク接続を確立することと、並びにサーバーコンピュータからデータ及び報告を要請することとを含む。
【００８０】
選択された態様
本明細書記載の主題の選択された態様は、記載されている主題がどのように用いられているか、又は適用されているかを例示するために提供される。この選択された態様は、実例として提供されており、及び、いかなる意味においても本開示を制限することを意図しない。
【００８１】
以下の態様が提供される。
１．大腸直腸癌と診断される被験体が大腸直腸癌の再発するリスクを決定する方法であって、ａ）被験体からの腫瘍組織試料の腫瘍区画パネルで、マーカーパネルの各マーカーの発現レベルを測定することであって、該マーカーパネルは、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１のうちの少なくとも２つを含み、並びに、腫瘍区画パネルは、純粋な間質、腫瘍、間質血管及び腫瘍血管の少なくとも３つの腫瘍区画を含む、ことと、ｂ）前記被験者のＴＡＰＰＳスコアを決定することと、ｃ）被験体のＴＡＰＰＳスコアと大腸直腸癌と診断された被験体の母集団のＴＡＰＰＳスコアを比較することであって、該被験体は、被験体のＴＡＰＰＳスコアが母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して低い場合、大腸直腸癌の再発のリスクが低く、及び該被験体は、被験体のＴＡＰＰＳスコアが母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して高い場合、大腸直腸癌の再発のリスクが高い、ことと、を含む方法。
２．各前記マーカーパネルのマーカーの発現レベルが、自動化病理システムを使用して測定される、態様１に記載の方法。
３．各前記マーカーパネルのマーカーの発現レベルが、定量的画像解析システムを使用して測定される、態様１又は２に記載の方法。
４．前記大腸直腸癌がリンパ節転移陰性である、態様１〜３のいずれか一つに記載の方法。
５．前記被験体は、被験体のＴＡＰＰＳスコアが母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して中間の場合、大腸直腸癌の再発のリスクが低い、態様４に記載の方法。
６．前記大腸直腸癌がリンパ節転移陽性である、態様１〜３のいずれか一つに記載の方法。
７．前記被験体は、被験体のＴＡＰＰＳスコアが母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して中間の場合、大腸直腸癌の再発のリスクが高い、態様６に記載の方法。
８．前記大腸直腸癌が、ステージＩ、ステージＩＩ又はステージＩＩＩの癌である、態様１〜７のいずれか一つに記載の方法。
９．被験体から腫瘍組織試料の、少なくとも３つの区画を識別することを更に含む、態様１〜８のいずれか一つに記載の方法。
１０．腫瘍細胞核及び腫瘍細胞細胞質のうちの少なくとも１つを識別することを更に含む、態様１〜９のいずれか一つに記載の方法。
１１．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１のうちの３つを含む、態様１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１のうちの４つを含む、態様１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
１３．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡ９、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１のうちの５つを含む、態様１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１４．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１のうちの６つを含む、態様１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１５．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１及びＣＡＩＸを含む、態様１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１６．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、及びＰＤＧＦＲβを含む、態様１２に記載の方法。
１７．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、フィブロネクチン、及びＰＤＧＦＲβを含む、態様１３に記載の方法。
１８．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、フィブロネクチン、及びコラーゲンＩＶを含む、態様１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１９．前記腫瘍区画パネルが、間質及び腫瘍のうちの１つ以上を含む、態様１〜１８のいずれか一つに記載の方法。
２０．前記腫瘍区画パネルが、間質、腫瘍、間質血管、及び腫瘍血管のうちの１つ以上を含む、態様１〜１９のいずれか一つに記載の方法。
２１．工程ａ）が、腫瘍間質のＴＥＭ１の発現レベルを測定することと、腫瘍血管のＴＥＭ１の発現レベルを測定することと、腫瘍血管のＣＡＩＸの発現レベルを測定することと、腫瘍のＣＡＩＸの発現レベルを測定することと、を含む、態様１〜２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．工程ａ）が、腫瘍間質のＴＥＭ１の発現レベルを測定することと、腫瘍血管のＴＥＭ１の発現レベルを測定することと、間質血管のＨＩＦ２α発現レベルを測定することと、腫瘍間質のＨＩＦ２αの発現レベルを測定することと、腫瘍のＣＡＩＸの発現レベルを測定することと、腫瘍血管のＣＡＩＸの発現レベルを測定することと、腫瘍間質のＰＤＧＦＲβの発現レベルを測定することと、を含む、態様１〜２０のいずれか一つに記載の方法。
２３．工程ａ）が、腫瘍間質のフィブロネクチンの発現レベルを測定することを更に含む、態様２２に記載の方法。
２４．前記リスクをまとめた報告を作成する工程を含む、態様１〜２３のいずれか一つに記載の方法。
２５．前記被験体が大腸直腸癌再発のリスクが高いと決定される場合、前記被験体が更なる療法を受ける、態様１〜２４のいずれか一つに記載の方法。
２６．前記更なる療法が、ＴＥＭ１標的療法、化学療法及び／又は放射線療法を含む、態様２５に記載の方法。
２７．前記ＴＥＭ１標的療法がＭＯＲＡｂ−００４を含む、態様２６に記載の方法。
２８．前記被験体が大腸直腸癌再発のリスクが高いと決定される場合、前記被験体が疾患再発又は進行のためのモニタリングを受ける、態様１〜２７のいずれか一つに記載の方法。
２９．腫瘍組織試料が、固定してパラフィン埋め込まれている、態様１〜２８のいずれか一つに記載の方法。
３０．腫瘍組織試料が新鮮である、態様１〜２９のいずれか一つに記載の方法。
３１．腫瘍組織試料が組織生検から得られる、態様１〜３０のいずれか一つに記載の方法。
３２．前記被験体がヒトである、態様１〜３１のいずれか一つに記載の方法。
３３．ＴＡＰＰＳ式が、大腸直腸癌患者母集団を包含した中から選択された腫瘍区画の各マーカーの係数Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどを測定することによって、決定される、態様１に記載の方法。
３４．ＴＡＰＰＳ式が、大腸直腸癌患者母集団の係数Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを測定することによって、以下のＴＡＰＰＳ式：
（〜Ａ＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜Ｂ＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（〜Ｃ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍脈管構造）＋（〜Ｄ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍）であり、
（〜Ａ＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜Ｂ＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋（〜Ｃ＊ＨＩＦ２α＿間質脈管構造）＋（〜Ｄ＊ＣＯＬＩＶ＿腫瘍）＋（〜Ｅ＊ＦＮ間質）、
又は
（〜Ａ＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜Ｂ＊ＣＯＬＩＶ＿腫瘍）＋（〜Ｃ＊ＦＮ間質）のうちのいずれか１つを提供し、
及び、該ＴＡＰＰＳ式を使用している被験体のＴＡＰＰＳスコアを測定することによって、決定される、態様１に記載の方法。
３５．ＴＡＰＰＳ式が、大腸直腸癌患者母集団の係数Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ，Ｆ、Ｇ及びＨを測定することによって、ＴＡＰＰＳ式：
（〜Ａ＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜Ｂ＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（〜Ｃ＊ＨＩＦ２α＿間質脈管構造）＋（〜Ｄ＊ＨＩＦ２α＿間質）＋
（〜Ｅ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍脈管構造）＋（〜Ｆ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍）＋（〜Ｇ＊ＰＤＧＦＲβ＿間質）＋（〜Ｈ＊フィブロネクチン＿間質）を提供し、
及び、該ＴＡＰＰＳ式を使用している被験体のＴＡＰＰＳスコアを測定することによって、決定される、態様１に記載の方法。
３６．被験体のＴＡＰＰＳスコアが、以下のＴＡＰＰＳ式：
（〜−１．０６３＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜０．４７８＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（〜−１．０９５＊ＨＩＦ２α＿間質脈管構造）＋（〜０．４０７＊ＨＩＦ２α＿間質）＋
（〜−１．０９６＊ＣＡＩＸ＿腫瘍脈管構造）＋（〜０．９１２＊ＣＡＩＸ＿腫瘍）＋（〜０．６００＊ＰＤＧＦＲβ＿間質）＋（〜０．７１４＊フィブロネクチン＿間質）、
（〜−０．８９＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜１．１９＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
【００８２】
（〜−０．７６＊ＨＩＦ２α＿間質脈管構造）＋（〜０．６２＊ＣＯＬＩＶ＿腫瘍）＋（〜０．８３＊ＦＮ間質）
又は
（〜０．８９＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜０．６２＊ＣＯＬＩＶ＿腫瘍）＋（〜０．８３＊ＦＮ間質）、のいずれか一つを使用して測定される、態様１に記載の方法。
３７．大腸直腸癌と診断された被験体の臨床転帰を予測する方法であって、ａ）被験体からの腫瘍組織試料の腫瘍区画パネルで、マーカーパネルの各マーカーの発現レベルを測定することであって、該マーカーパネルは、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１のうちの少なくとも２つを含み、並びに、該腫瘍区画のパネルは、純粋な間質、腫瘍、間質血管及び腫瘍血管の少なくとも３つの腫瘍区画を含むことと、ｂ）前記被験者のＴＡＰＰＳスコアを決定することと、ｃ）被験体のＴＡＰＰＳスコアと大腸直腸癌と診断された被験体の母集団のＴＡＰＰＳスコアを比較することであって、母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して低いＴＡＰＰＳスコアの被験体は肯定的臨床転帰が予測され、及び母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して高いＴＡＰＰＳスコアの被験体は不良臨床転帰が予測されることと、を含む方法。
３８．各前記マーカーパネルのマーカーの発現レベルが、自動化病理システムを使用して測定される、態様３７に記載の方法。
３９．各前記マーカーパネルのマーカーの発現レベルが、定量的画像解析システムを使用して測定される、態様３７又は３８に記載の方法。
４０．前記大腸直腸癌がリンパ節転移陰性である、態様３７〜３９のいずれか一つに記載の方法。
４１．前記母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して中間の前記被験体のＴＡＰＰＳスコアは、前記被験体の肯定的臨床転帰を予測する、態様３４に記載の方法。
４２．前記大腸直腸癌がリンパ節転移陽性である、態様３７〜３９のいずれか一つに記載の方法。
４３．前記母集団のＴＡＰＰＳスコアと比較して中間の前記被験体のＴＡＰＰＳスコアは、前記被験体の不良臨床転帰を予測する、態様４２に記載の方法。
４４．前記大腸直腸癌が、ステージＩ、ステージＩＩ、又はステージＩＩＩの癌である、態様３７〜４３のいずれか一つに記載の方法。
４５．前記被験体から腫瘍組織試料の、少なくとも２つの区画を識別することを更に含む、態様３７〜４４のいずれか一つに記載の方法。
４６．腫瘍細胞核及び腫瘍細胞細胞質のうちの少なくとも１つを識別することを更に含む、態様３７〜４５のいずれか一つに記載の方法。
４７．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１の３つを含む、態様３７〜４６のいずれか一つに記載の方法。
４８．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１の４つを含む、態様３７〜４６のいずれか一つに記載の方法。
４９．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１の５つを含む、態様３７〜４６のいずれか一つに記載の方法。
５０．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１の６つを含む、態様３７〜４６のいずれか一つに記載の方法。
５１．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、コラーゲンＩＶ、及びフィブロネクチンを含む、態様４８に記載の方法。
５２．前記腫瘍区画パネルが、ａ）間質、腫瘍血管、間質血管及び腫瘍、又はｂ）間質及び腫瘍のどちらかを含む、態様５１に記載の方法。
５３．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ及びＰＤＧＦＲβを含む、態様４８に記載の方法。
５４．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、フィブロネクチン及びＰＤＧＦＲβを含む、態様４９に記載の方法。
５５．前記マーカーパネルが、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ及びＣＤ３１を含む、態様３７〜４６のいずれか一つに記載の方法。
５６．前記腫瘍区画パネルが、純粋な間質、腫瘍、間質血管及び腫瘍血管を含む、態様３７〜５５のいずれか一つに記載の方法。
５７．工程ａ）が、腫瘍間質のＴＥＭ１の発現レベルを測定することと、腫瘍血管のＴＥＭ１の発現レベルを測定することと、間質血管のＨＩＦ２α発現レベルを測定することと、腫瘍間質のＨＩＦ２αの発現レベルを測定することと、腫瘍のＣＡＩＸの発現レベルを測定することと、腫瘍血管のＣＡＩＸの発現レベルを測定することと、腫瘍間質のＰＤＧＦＲβの発現レベルを測定することと、を含む、態様３７〜５６のいずれか一つに記載の方法。
５８．工程ａ）が、腫瘍間質のフィブロネクチンの発現レベルを測定することを更に含む、態様５７に記載の方法。
５９．前記予測をまとめた報告を作成する工程を含む、態様３７〜５８のいずれか一つに記載の方法。
６０．不良臨床転帰が前記被験体に予測される場合、前記被験体は更なる療法を受ける、態様３７〜５８のいずれか一つに記載の方法。
６１．前記更なる療法が、ＴＥＭ１標的療法、化学療法及び／又は放射線療法を含む、態様６０に記載の方法。
【００８３】
６２．前記ＴＥＭ１標的療法がＭＯＲＡｂ−００４を含む、態様６１に記載の方法。
６３．不良臨床転帰が前記被験体に予測される場合、前記被験体は疾患再発又は進行のモニタリングを受ける、態様３７〜６２のいずれか一つに記載の方法。
６４．腫瘍組織試料が、固定してパラフィン埋め込まれている、態様３７〜６３のいずれか一つに記載の方法。
６５．腫瘍組織試料が新鮮である、態様３７〜６４のいずれか一つに記載の方法。
６６．腫瘍組織試料が組織生検から得られる、態様３７〜６５のいずれか一つに記載の方法。
６７．前記被験体がヒトである、態様３７〜６６のいずれか一つに記載の方法。
６８．前記臨床転帰が、無憎悪生存期間（ＰＦＳ）、無再発期間（ＲＦＩ）、全生存期間（ＯＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、又は無遠隔転移期間（ＤＲＦＩ）という用語で表すことができる、態様３７〜６７のいずれか一つに記載の方法。
６９．ＴＡＰＰＳ式が、大腸直腸癌患者母集団を包含した中から選択された腫瘍区画の各マーカーの係数Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどを測定することによって、決定される、態様３７に記載の方法。
７０．ＴＡＰＰＳ式が、大腸直腸癌患者母集団の係数Ａ、Ｂ、Ｃを測定することによって、ＴＡＰＰＳ式：
（〜Ａ＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜Ｂ＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（〜Ｃ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍脈管構造）＋（〜Ｄ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍）が提供され、
及び、該ＴＡＰＰＳ式を使用している被験体のＴＡＰＰＳスコアを測定することによって、決定される、態様３７に記載の方法。
７１．ＴＡＰＰＳ式が、大腸直腸癌患者母集団の係数Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ，Ｆ、Ｇ、及びＨを測定することによって、ＴＡＰＰＳ式：
（〜Ａ＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜Ｂ＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（〜Ｃ＊ＨＩＦ２α＿間質脈管構造）＋（〜Ｄ＊ＨＩＦ２α＿間質）＋
（〜Ｅ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍脈管構造）＋（〜Ｆ＊ＣＡＩＸ＿腫瘍）＋（〜Ｇ＊ＰＤＧＦＲβ＿間質）＋（〜Ｈ＊フィブロネクチン＿間質）が提供され、
及び、該ＴＡＰＰＳ式を使用している被験体のＴＡＰＰＳスコアを測定することによって、決定される、態様３７に記載の方法。
７２．被験体のＴＡＰＰＳスコアが、以下のＴＡＰＰＳ式：
（〜−１．０６３＊ＴＥＭ１＿間質）＋（〜０．４７８＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（〜−１．０９５＊ＨＩＦ２α＿間質脈管構造）＋（〜０．４０７＊ＨＩＦ２α＿間質）＋
（〜−１．０９６＊ＣＡＩＸ＿腫瘍脈管構造）＋（〜０．９１２＊ＣＡＩＸ＿腫瘍）＋（〜０．６００＊ＰＤＧＦＲβ＿間質）＋（〜０．７１４＊フィブロネクチン＿間質）を使用して測定される、態様３７に記載の方法。
７３．ＴＥＭ１に特異的なラベル、ＰＤＧＦＲβに特異的なラベル、ＨＩＦ２αに特異的なラベル、ＣＡＩＸに特異的なラベル、フィブロネクチンに特異的なラベル、コラーゲンＩに特異的なラベル、コラーゲンＩＶに特異的なラベル、及びＣＤ３１に特異的なラベルからなる群から選択される、少なくとも２つのラベル、並びにキット使用のための説明書を含むキット。
７４．ＴＥＭ１に特異的なラベル、ＰＤＧＦＲβに特異的なラベル、ＨＩＦ２αに特異的なラベル、ＣＡＩＸに特異的なラベル、及びキット使用の説明書を含む、態様７３に記載のキット。
７５．細胞核に特異的なラベル、腫瘍細胞質に特異的なラベル、腫瘍間質に特異的なラベル、脈管構造に特異的なラベル、腫瘍脈管構造のラベル、及び腫瘍間質脈管構造のラベルのうちの１つ以上を更に含む、態様７３又は７４に記載のキット。
７６．腫瘍細胞質に特異的なラベルがサイトケラチンと反応し、腫瘍間質に特異的なラベルがビメンチンと反応し、及び脈管構造に特異的なラベルがＣＤ３１と反応する、態様７５に記載のキット。
７７．ＴＥＭ１に特異的な前記ラベルはＴＥＭ１に対する抗体を含み、ＰＤＧＦＲβに特異的な前記ラベルはＰＤＧＦＲβに対する抗体を含み、ＨＩＦ２αに特異的な前記ラベルはＨＩＦ２αに対する抗体を含み、ＣＡＩＸに特異的な前記ラベルはＣＡＩＸに対する抗体を含み、フィブロネクチンに特異的な前記ラベルはフィブロネクチンに対する抗体を含み、コラーゲンＩに特異的な前記ラベルはコラーゲンＩに対する抗体を含み、及びコラーゲンＩＶに特異的な前記ラベルはコラーゲンＩＶに対する抗体を含む、態様７３に記載のキット。
７８．ＴＥＭ１に対する前記抗体が、ＡＴＣＣに寄託された受託番号ＰＴＡ−１２５４７のハイブリドーマにより産生される、態様７７に記載のキット。
７９．前記ラベルのそれぞれが、放射線標識、蛍光物質、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、酵素、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、及びβ−ガラクトシダーゼ、又はポリ−ヒスチジンを含む、態様７３に記載のキット。
８０．蛍光物質が、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、及びシアニン染料からなる群から選択される、態様７９に記載のキット。
８１．サイトケラチン、ビメンチン、ＣＤ３１、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α又はＣＡＩＸと特異的に結合する、１つ以上の抗体で標識化した腫瘍組織試料を含む、組織試料アレイであって、該各アレイは、サイトケラチン、ビメンチン、ＣＤ３１、ＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α又はＣＡＩＸと特異的に結合する、少なくとも１つの抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料を含む、組織試料アレイ。
８２．前記組織試料のうちの１つ以上が核ラベルで標識化される、態様８０に記載の組織試料アレイ。
８３．前記核ラベルがＤＡＰＩである、態様８２に記載の組織試料アレイ。
８４．前記アレイが、サイトケラチン、ビメンチン又はＣＤ３１のいずれか１つと特異的に結合する抗体、及びＴＥＭ１、フィブロネクチン−１、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ＨＩＦ２α又はＣＡＩＸのいずれか１つと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料を含む、態様８０〜８３のいずれか一つに記載の組織試料アレイ。
８５．前記アレイがサイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した複数の組織試料を含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、フィブロネクチン−１と特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩと特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩＶと特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体を更を含む、態様８０〜８４のいずれか一つに記載の組織試料アレイ。
８６．前記アレイがビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した複数の組織試料を含み、
ビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体を更に含み、
ビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、フィブロネクチン−１と特異的に結合する抗体を更に含み、
ビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体を更に含み、
ビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩと特異的に結合する抗体を更に含み、
ビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩＶと特異的に結合する抗体を更に含み、
ビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体を更に含み、
ビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体を更に含む、態様８０〜８４のいずれか一つに記載の組織試料アレイ。
８７．前記アレイがＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した複数の組織試料を含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、フィブロネクチン−１と特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩＶと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体を更に含む、態様８０〜８４のいずれか一つに記載の組織試料アレイ。
８８．前記アレイが、ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した複数の組織試料を含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、フィブロネクチン−１と特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩＶと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体を更に含む、態様８０〜８４のいずれか一つに記載の組織試料アレイ。
８９．前記アレイが、ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びサイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した複数の組織試料を含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びサイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びサイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、フィブロネクチン−１と特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びサイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びサイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びサイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩＶと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びサイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体を更に含み、
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体及びサイトケラチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体を更に含む、態様８０〜８４のいずれか一つに記載の組織試料アレイ。
９０．前記アレイが、サイトケラチンと特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した複数の組織試料を含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、フィブロネクチン−１と特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩと特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、コラーゲンＩＶと特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体を更に含み、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体及びビメンチンと特異的に結合する抗体で標識化した少なくとも１つの組織試料が、ＣＡＩＸと特異的に結合する抗体を更に含む、態様８０〜８４のいずれか一つに記載の組織試料アレイ。
９１．前記アレイが複数の組織試料を含み、いずれか１つ以上が態様８５〜９０の標識の組み合わせのいずれか１つで標識化される、態様８０に記載の組織試料アレイ。
９２．前記アレイが、
ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織試料；
サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＴＥＭ１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織試料；
ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織試料；
ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織試料；
サイトケラチンに特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織試料；
サイトケラチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＣＡＩＸに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織試料；
ビメンチンに特異的な抗体、ＣＤ３１に特異的な抗体で標識化され、ＨＩＦ２αに特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織試料；及び
ビメンチンに特異的な抗体で標識化され、フィブロネクチン−１に特異的な１つの抗体でも標識化されている、少なくとも１つの組織試料；を含む、態様８０に記載の組織試料アレイ。
９３．前記アレイが、
ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体、
ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体、
ＣＡＩＸと特異的に結合する抗体、及び
ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体、のうちの１つ以上で標識化された複数の組織試料を含む、態様８０に記載の組織試料アレイ。
９４．前記アレイが複数の組織試料を含み、
アレイの少なくとも１つの組織試料がＴＥＭ１と特異的に結合する抗体で標識化されており、
アレイの少なくとも１つの組織試料がＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体で標識化されており、
アレイの少なくとも１つの組織試料がＣＡＩＸと特異的に結合する抗体で標識化されており、
アレイの少なくとも１つの組織試料がＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体で標識化されている、態様９３に記載の組織試料アレイ。
９５．ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、又はＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体で標識化した前記組織試料が、
ビメンチンと特異的に結合する抗体、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体、又は
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体、のうちのいずれか１つ以上を更に含む、態様９４に記載の組織試料アレイ。
９６．アレイの少なくとも１つの組織試料が列挙される抗体の２つの組み合わせで標識化される、態様９３又は９４に記載の組織試料アレイ。
９７．アレイの少なくとも１つの組織試料が列挙される抗体の３つの組み合わせで標識化される、態様９３又は９４に記載の組織試料アレイ。
９８．アレイの少なくとも１つの組織試料が列挙される抗体の４つの組み合わせで標識化される、態様９３又は９４に記載の組織試料アレイ。
９９．アレイの少なくとも１つの組織試料が列挙される抗体の５つの組み合わせで標識化される、態様９３又は９４に記載の組織試料アレイ。
１００．アレイの少なくとも１つの組織試料が列挙される抗体の６つの組み合わせで標識化される、態様９３又は９４に記載の組織試料アレイ。
１０１．アレイの少なくとも１つの組織試料が列挙される７つすべての抗体で標識化される、態様９３又は９４に記載の組織試料アレイ。
１０２．前記アレイが複数の組織試料を含み、該アレイが、
ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体、
ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体、
ＣＡＩＸと特異的に結合する抗体、及び
ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体、のうちのいずれか３つで標識化される、態様８０に記載の組織試料アレイ。
１０３．前記アレイが、
ビメンチンと特異的に結合する抗体、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体、又は
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体、のうちの１つ以上を更に含む、態様１０２に記載の組織試料アレイ。
１０４．前記アレイが複数の組織試料を含み、該アレイが、
ＴＥＭ１と特異的に結合する抗体、
ＨＩＦ２αと特異的に結合する抗体、
ＣＡＩＸと特異的に結合する抗体、及び
ＰＤＧＦＲβと特異的に結合する抗体、のうちのいずれか３つで標識化される、態様８０に記載の組織試料アレイ。
１０５．前記アレイが、
ビメンチンと特異的に結合する抗体、
サイトケラチンと特異的に結合する抗体、又は
ＣＤ３１と特異的に結合する抗体、のうちのいずれか１つ以上を更に含む、態様９４に記載の組織試料アレイ。
１０６．
フィブロネクチン−１と特異的に結合する抗体、
コラーゲンＩと特異的に結合する抗体、及び
コラーゲンＩＶと特異的に結合する抗体、のうちの１つ以上を更に含む、態様１０３〜１０５のいずれか一つに記載の組織試料アレイ。
１０７．前記アレイの腫瘍組織試料が同じ腫瘍から得られる、態様８０〜１０６のいずれか一つに記載の組織試料アレイ。
１０８．前記アレイの腫瘍組織試料が異なる腫瘍から得られる、態様８０〜１０６のいずれか一つに記載の組織試料アレイ。
１０９．前記腫瘍組織試料が組織学的切片である、態様１０７又は１０８に記載の組織試料アレイ。
１１０．前記腫瘍組織試料が大腸直腸癌の被験体から得られる組織学的切片である、態様１０９に記載の組織試料アレイ。
【００８４】
本発明を記述したので、同様のことが、例示として提供され、かついかなる意味においても制限することを意図していない、以下の実施例を参照してより容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００８５】
実施例１：バイオマーカーパネルの第１の配置
バイオマーカーに関連する、推定上のＴＥＭ１の細胞配置及び発現プロファイルは、組織試料を使用して評価された。これらの試験のための組織試料は、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）で構築された、腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）からなる、Ｙａｌｅ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｈｏｒｔ（ＹＴＭＡ８）から得られた。ＴＭＡは、１９７０〜１９８１年にＹａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）で得られた、ホルマリン固定、パラフィン埋め込み腫瘍試料の、原発性大腸直腸癌腫（ＣＲＣ）５９９つを含んだ。各腫瘍試料ブロックは区分されて、最初にヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色されて、それにより浸潤性癌の部分が識別されて丸で囲まれた。丸で囲まれた部分は、０．６ｍｍのコアがとられた最初のブロックに転写された。各コアは１ｍｍ間隔の格子の受容体ブロックに配列されて、厚さ５ミクロンの切片が調製された。このコーホート用の臨床病理変数は、Ｔ−ステージ、Ｎ−ステージ、組織学的グレード、器官部位、性別、及び年齢を含む。全コーホート（すべての利用できる臨床情報）用、及び、本調査の多変量解析で使用する完全なデータを有する事例だけ用の各臨床病理変数の、５年の疾患特異的生存に基づく一変量コックス比例ハザードモデリングを、表１に見ることができる。
【００８６】
各推定上のＴＥＭ１関連バイオマーカー（ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン（ＦＮ）、コラーゲンＩ（ＣＯＬＩ）及びコラーゲンＩＶ（ＣＯＬＩＶ））は、目的のすべての細胞並びに細胞内区画において、定量的免疫組織化学（ＩＨＣ）分析法（ＡＱＵＡ（登録商標）技術、ＨｉｓｔｏＲｘ、Ｉｎｃ）を用いて、定量化された。各ＴＥＭ１関連のバイオマーカーは、核を識別するＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、腫瘍細胞質を識別する蛍光標識サイトケラチン、間質を識別する蛍光標識ビメンチン、及び、脈管構造を識別する蛍光標識ＣＤ−３１の存在下で、分析された。次いで、標識組織試料が、最新の画像解析アルゴリズムを使用して分析されて、目的の各組織学的区画から含まれる、又は除外される各ピクセルを識別する２値化画像を生成した。図１Ａは、本試験で使用する、各ターゲット及び各区画の実施例を提供する。図１Ｂは、テストした各潜在的バイオマーカーを用いて見られる、ラベル配置の実施例を提供する。目的の各バイオマーカーの量は目的の組織区画ごとに決定されて、及び、これらの値は各バイオマーカーのＡＱＵＡ（登録商標）スコアに変換された。目的の４つの組織区画である、腫瘍（膜／細胞質）、腫瘍脈管構造、純粋なストロマ（脈管構造に寄与することのない間質）、及び間質脈管構造が、評価された。平均値及び各区画のＡＱＵＡ（登録商標）スコアに対する９５％の信頼区間が、最高の発現のある組織区画を決定するためにプロットされた。これらのデータに基づいて、並びに次の統計解析を目的として、すべての区画のＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α用間質及び間質脈管構造、ＣＡＩＸ用腫瘍及び腫瘍脈管構造、ＰＤＧＦＲβ用間質及び間質脈管構造、ＦＮ用間質、ＣＯＬＩ用間質及び間質脈管構造、並びにＣＯＬＩＶ用間質及び間質脈管構造のために含まれた。
【００８７】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
ＡＱＵＡ（登録商標）分析のための免疫蛍光染色は、米国特許第７，２１９，０１６号に、及び米国特許出願公開番号第２００９／００３４８２３号に記載されており、それぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。要約すると、事前にカットされたパラフィン被覆の組織マイクロアレイスライドが脱パラフィンされて、並びに、スライドをＴＥＭ１及びＣＡＩＸ用に染色する抗原賦活化が、１０倍ＤＩＶＡバッファ、ｐＨ  ６．２で、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＤＶ２００４ＭＸ）を使用して行われた。スライドは、加圧培養が０．１０〜０．１４ＭＰａ（１５〜２０ＰＳＩ）で３０秒間、最高１２５℃に達し、続いて１５分間９５℃まで冷却されるチャンバ内で、１５分間インキュベートされた。ＰＤＧＦＲβ、フィブロネクチン、ＨＩＦ２α、コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶ用に染色されるスライドの抗原賦活化は、３倍ＥＤＴＡバッファ、ｐＨ９で、ＰＴ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）で行われた。染色は、前述のプロトコルにしたがって、ＬａｂＶｉｓｉｏｎ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）で実施された。スライドは、ＴＥＭ１、ＣＡＩＸ、フィブロネクチン、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ用のマウス抗−ＣＤ−３１（ＤＡＫＯ、ｃｌｏｎｅ  ＪＣ７０Ａ、ロット番号０００７９２６７）と、又はＨＩＦ２α用のウサギ抗−ＣＤ−３１（Ａｂｃａｍ、ロット番号ＧＲ−６１７５９−４）と、１時間室温でインキュベートされた。ＣＤ−３１抗体培養の後、スライドは、１倍ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄され、次いで、マウスＥｎｖｉｓｉｏｎ（商標）Ｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）、又はウサギＥｎｖｉｓｉｏｎ（商標）Ｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）と、室温で３０分間インキュベートされた。それからスライドは、１倍ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄されて、ビオチン化チラミド（ＴＳＡ  ｐｌｕｓ  Ｂｉｏｔｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）と、１０分間室温でインキュベートされた。スライドは１倍ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄されて、これに続いて、安息香酸ヒドラジド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と８分間、過酸化水素と７分間、インキュベートされた。スライドは１倍ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄されて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０ストレプトアビジンとインキュベートされた。この後に、一次抗体ＴＥＭ１ラット（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ、ｃｌｏｎｅ  ９Ｇ５、ロット番号２６０８９Ｃ）、又はフィブロネクチン−１ウサギ（Ａｂｃａｍ、ロット番号ＧＲ１６４６５−１）、又はＰＤＧＦＲβウサギ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃｌｏｎｅ  ２８Ｅ１、ロット番号３１６９Ｓ）、又はコラーゲンＩウサギ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、ロット番号７０Ｒ−ＣＲ００７ｘ）、又はコラーゲンＩＶウサギ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、ロット番号７０Ｒ−ＣＲ０１３ｘ）、又はＨＩＦ２αマウス（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ｃｌｏｎｅ  ｅｐ１９０ｂ、ロット番号Ｊ−３）、又はＣＡＩＸラット（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ、ｃｌｏｎｅ  １６５Ｆ３）と、１���間室温でインキュベートされた。一次抗体は、ニワトリ抗ビメンチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ロット番号２０２８２９１、１：２００）入りカクテルに含まれた。一次抗体培養の後、スライドは、１倍ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄されて、次いで、二次抗体Ｉｍｍｐｒｅｓｓ抗−ラット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＴＥＭ１及びＣＡＩＸ）、又はＩｍｍｐｒｅｓｓ抗−ウサギ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、フィブロネクチン、ＰＤＧＦＲβ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ）、又はＩｍｍＰＲＥＳＳ（商標）抗−マウス（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＨＩＦ２α）と、３０分室温でインキュベートされた。それからスライドは、抗−ニワトリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ２１４３７，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，１：２００）共役Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５カクテルと、３０分間室温でインキュベートされた。続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染色スライドは、マウスＩｇＧブロック（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、ＮＣ４９４  Ｈ）と、次いでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８パンサイトケラチン、ＡＥ１／ＡＥ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５３−９００３−８２）と、３０分間室温でインキュベートされた。それからスライドは、１０分間のＣｙ５  ｔｙｒａｍｉｄｅ増幅システム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＳＡＴ７０５Ａ、増幅バッファで１：５０希釈、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）とインキュベートされて、各ヒストスポット内の核の識別用ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ３６９３１、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）入りＰｒｏｌｏｎｇ退色防止剤とマウントされて、一晩乾燥することができた。
【００８８】
撮像及び画像解析
細胞内区画の中の相対的タンパク質濃度は、ＡＱＵＡ（登録商標）分析システムを使用して高精度で測定することができる。要約すると、ＦＩＴＣを有するサイトケラチン、Ｃｙ３を有するビメンチン、ＤＡＰＩでの核染色、Ｃｙ５でのバイオマーカーパネル染色、及びＣｙ７を有するＣＤ−３１の、高分解能、１２ビット（獲得した画像の１ピクセルにつき離散強度４０９６になる）のデジタル画像は、アレイのヒストスポットごとに、ＰＭ２０００エピ−蛍光顕微鏡システム（ＨｉｓｔｏＲｘ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）を用いてキャプチャされて保存した。統計解析の前に、画像は、ＤＡＰＩ及びＣｙ３信号の質（例えば、不良組織、飽和性、焦点及び他のアーチファクト）並びに信号強度をチェックした。パン−サイトケラチン信号は、上皮の「マスク」を作って、正常及び腫瘍両サンプル内で間質成分から上皮組織部位を識別するために使用された。ビメンチンは、全間質に特異的マスクを作るため使用された。ＣＤ−３１は、脈管構造に特異的マスクを作るために使用された。これらのマスクの組み合わせを用いて、腫瘍脈管構造、間質脈管構造及び純粋な間質（間質脈管構造を除く全間質）区画が、生成された。
【００８９】
【表１】
0006417602.tif 000002
【００９０】
統計解析
教師なし階層型クラスタ化は、ＴＭ４  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＳｕｉｔｅのＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｖｉｅｗｅｒを用いて実施された（Ｓａｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４（２）：３７４−８（２００３））。クラスタ化は、パーソンの非中心相関による、平均連結クラスタ化を使用して実施された。すべての分析は、ＳＰＳＳ  ｖ１７以降を用いて実施された（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）。すべてのバイオマーカーのＡＱＵＡ（登録商標）スコアは偏った分布を示し、すなわち、常用対数２転換スコアが、次のパラメータの分析（すなわち手段比較）のために使用された。しかしながら、線形比較を提供するために、未加工のＡＱＵＡ（登録商標）スコアデータが報告されることがある。臨床特徴間の平均スコアの違いは、一元配置の分散分析に基づく一般的な線形モデリングにより評価された。５年の疾患特異的生存に対するバイオマーカーのための、最適カットポイント及びカプラン・マイヤー分析は、Ｍｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏシミュレーション使用の多比較を修正する、Ｘ−Ｔｉｌｅ（商標）（Ｃａｍｐ参照）を用いて実行された。Ｘ−Ｔｉｌｅ（商標）用に、２つのｐ値、未修正ｐ値及びＭｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏシミュレーションにより修正されたＰ値が、報告される。未修正ｐ値が有意（＜０．０５）でもよいが、修正Ｐ値は、発見の更なるバリデーションに対する必要性を示す有意でなくてもよい。コックス比例ハザードモデリングは、最適分析モデルを決定するＷａｌｄ統計によって、変数減少を用いた多変量設定で実行された。対数尤度カイ二乗比（ＬＲ−χ２）は、モデルを比較するために用いられた。すべての生存分析は、５年の疾患特異的生存に基づいた。カプラン・マイヤー生存は、ログランク統計を使用して比較された。
【００９１】
実施例２：臨床病理変数との関連
分析は、利用可能な臨床病理変数、Ｔ−ステージ、Ｎ−ステージ、組織学的グレード、性別、腫瘍部位及び年齢（表示されないデータ）を有する各バイオマーカーの、一次配置区画のＡＱＵＡ（登録商標）スコアとの関連を測定するために、実施された。要約すると、所見は、間質ＴＥＭ１が高分化型腫瘍の発現を著しく増加させたことと、ＣＡＩＸ腫瘍脈管構造発現は、若い患者で著しく高かったことと、間質及び間質脈管構造両方のＰＤＧＦＲβ発現は、男性で著しく高かったことと、ＦＮ発現は、リンパ節転移陽性事例で著しく高かったことと、ＨＩＦ２α間質脈管構造発現は、低分化型腫瘍で著しく高かったことと、ＨＩＦ２α間質脈管構造発現が、リンパ節転移陰性の事例で著しく高かったことと、コラーゲンＩ間質脈管構造発現は、リンパ節転移陽性事例で著しく高かったことと、を示した。
【００９２】
実施例３：一変量生存分析
評価された各バイオマーカーの腫瘍関連の発現及び定量が、評価される試料の臨床転帰を考慮して分析された。最適カプラン・マイヤー生存カットポイントが、最適カットポイント分析用Ｘ−Ｔｉｌｅを使用する連続ＡＱＵＡ（登録商標）スコアデータの範囲内で定められた。ＴＥＭ１発現と関連した５年の無病生存期間データが、表２にまとめられる。
【００９３】
【表２】
0006417602.tif 000003
【００９４】
これらの分析結果は、ＴＥＭ１、特に間質発現が著しく、ＣＲＣの良好な（増加した）５年の疾患特異的生存と関連することを示した。ＣＡＩＸ腫瘍血管発現が、良好な（増加した）５年の疾患特異的生存と著しく関連する一方で、間質ＦＮ、コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶ発現は悪化した（減少した）疾患特異的生存と著しく関連する。生存との有意な関連は、ＰＤＧＦＲβ又はＨＩＦ２αでは観察されなかった。
【００９５】
実施例４：ＴＡＰＰＳスコアモデル及び予後値の生成
選択されたバイオマーカー（間質のＴＥＭ１、腫瘍のＴＥＭ１、間質血管のＴＥＭ１、腫瘍血管のＴＥＭ１、間質血管のＨＩＦ２α、間質のＨＩＦ２α、腫瘍血管のＣＡＩＸ、腫瘍のＣＡＩＸ、間質血管のＰＤＧＦＲβ、間質のＰＤＧＦＲβ、間質のフィブロネクチン、間質血管のコラーゲンＩ、間質のコラーゲンＩ、間質血管のコラーゲンＩＶ、及び間質のコラーゲンＩＶ）の発現プロファイルを、一変量カットポイントを使用する多変量コックス比例ハザードモデルで、一緒に調べた。全体で、これら１５つの二値変数（低発現対高発現）は、Ｗａｌｄ統計に基づき０．１０に設定されたαを有する変数減少を使用するコックス比例ハザードモデルに入れられて、最適予後モデルを提供した。結果が表３に示され、モデルに含まれる各標識／生体区画の、最適モデル及び最適ＡＱＵＡ（登録商標）スコアカットポイントのｐ＝３．９２×１０−１０が示される。
【００９６】
【表３】
0006417602.tif 000004
【００９７】
このモデルから各マーカーの係数が導出されて、その結果、これらの係数を用いて、ＴＥＭ１−関連経路予後型すなわちＴＡＰＰＳと称される、全体のリスクスコアを提供する式が作られた。
【００９８】
このコーホート用のＴＡＰＰＳスコア式は、以下のとおりである。
（−１．０６３＊ＴＥＭ１＿間質）＋（０．４７８＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（−１．０９５＊ＨＩＦ２α＿間質脈管構造）＋（０．４０７＊ＨＩＦ２α＿間質）＋
（−１．０９６＊ＣＡＩＸ＿腫瘍脈管構造）＋（０．９１２＊ＣＡＩＸ＿腫瘍）＋（０．６００＊ＰＤＧＦＲβ＿間質）＋（０．７１４＊フィブロネクチン＿間質）
【００９９】
概念実証として、このＣＲＣコーホートの各患者のＴＡＰＰＳスコアが生成された。図２ＡがＴＡＰＰＳスコア配布であり、ＴＡＰＰＳスコアのほぼ正規分布を示す。次いで患者母集団が、三分位値（図２Ａ）に分けられた。ＴＡＰＰＳスコアは、−１．７５〜２．１０の範囲である。リスクの低い群のＴＡＰＰＳスコア範囲は−１．７５〜０．００であり、中間の群のＴＡＰＰＳスコア範囲は０．００〜０．９１であり、及び、高い群のＴＡＰＰＳスコア範囲は０．９１〜２．１０である。予想通りカプラン・マイヤー生存率分析は、高いＴＡＰＰＳスコアの患者は中間のＴＡＰＰＳスコアの患者と比較して著しく減少した５年生存があること、中間のＴＡＰＰＳスコアの患者は低いＴＡＰＰＳスコアの患者と比較して著しく減少した予後があることを示した（ｐ＜０．０００１、図２Ｂ）。興味深いことに、リンパ節転移陰性患者だけの同じ三分位値ＴＡＰＰＳスコアカットポイントを使用する場合、中間又は低いＴＡＰＰＳスコア母集団一方と比較したとき、高いＴＡＰＰＳスコアが、著しく減少した予後のリンパ節転移陰性患者の一部を識別できることが見いだされた（ｐ＜０．０００１、図２Ｃ）。そのうえリンパ節転移陰性患者だけの同じ分析は、中間又は高いＴＡＰＰＳスコアの患者一方と比較したとき、低いＴＡＰＰＳスコアの患者が著しく生存を増加させたことを示した（ｐ＜０．０００１、図２Ｄ）。表４に示すように、コックス比例ハザードモデリングは、すべて事例の完全なデータ（左）又はリンパ節転移陰性患者のみ（右）の一方の連続変数として、ＴＡＰＰＳスコアの独立した予後値を決定するために用いられた。連続ＴＡＰＰＳスコアは、すべての患者の結節病変の病期（Ｎ−ステージ）、Ｔ−ステージ及び組織学的グレード用に（ハザード比２．７、ｐ＜０．００１）調整したコックス比例ハザード多変量モデルにおいて独立して及び重要であり、並びに、リンパ節転移陰性患者だけのＴ−ステージ及び組織学的グレード用（ハザード比３．７、ｐ＜０．００１）では独立している。
【０１００】
【表４】
0006417602.tif 000005
【０１０１】
選択されたバイオマーカー（間質のＴＥＭ１、腫瘍のＴＥＭ１、間質血管のＴＥＭ１、腫瘍血管のＴＥＭ１、間質血管のＨＩＦ２α、間質のＨＩＦ２α、腫瘍血管のＣＡＩＸ、腫瘍のＣＡＩＸ、間質血管のＰＤＧＦＲβ、間質のＰＤＧＦＲβ、間質のフィブロネクチン、間質血管のコラーゲンＩ、間質のコラーゲンＩ、間質血管のコラーゲンＩＶ、及び間質のコラーゲンＩＶ）の同じセットの発現プロファイルが、一変量カットポイントを使用する多変量コックス比例ハザードモデルで一緒に調べられた、追加モデルが生成された。全体で、これら１５つの二値変数（低発現対高発現）は、Ｗａｌｄ統計に基づき０．１０に設定されたαを有する変数減少を使用するコックス比例ハザードモデルに入れられて、追加の予後モデルを提供した。結果を表５に示す。
【０１０２】
【表５】
0006417602.tif 000006
【０１０３】
このモデルから、係数が各マーカー用に導出されて、その結果、これらの係数を用いて別のＴＡＰＰＳ式が作られた。
【０１０４】
このコーホート用の別のＴＡＰＰＳスコア式は、以下のとおりである。
（−０．７９６＊ＴＥＭ１＿間質）＋（０．３１２＊ＴＥＭ１＿腫瘍脈管構造）＋
（−１．０７１＊ＣＡＩＸ＿腫瘍脈管構造）＋（０．９０５＊ＣＡＩＸ＿腫瘍）
【０１０５】
実施例５：全発現分析
１９７０〜１９８１年にＹａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）で得られた、ホルマリン固定、パラフィン埋め込み腫瘍試料の、原発性大腸直腸癌腫（ＣＲＣ）５９９つを含むＴＭＡは、他で詳細にて説明したように（参照：Ｒｉｍｍ  ＴＭＡレビュー）、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）で構築された。５９９つの事例のうち、４９４つはバイオマーカーデータ及び臨床データの両方を有した。コーホートは、診断日付（トレーニングセットに２事例及びバリデーションセットに１事例）からの連続登録に基づく、トレーニング（６７％）及びバリデーション（３３％）セットに分裂した。
【０１０６】
このコーホートに利用可能な臨床変数は、デュークステージング、組織学的グレード、性別及び年齢を含む。カイ二乗分析は、トレーニングとバリデーションセットの間に臨床変数の比率に有意差を示さなかった（表６）。疾患特異的経過観察中央値は、６８年の中央年齢を有する２４か月であった。各臨床変数の５年の疾患特異的生存に基づくコックス比例ハザードモデリングは、進行期及び男性の生存の予想低下を示すが、有意差は組織学的グレード及び年齢で観察されない（表６）。
【０１０７】
すべてのＴＥＭ１関連のバイオマーカー（ＴＥＭ１、ＨＩＦ２α、ＣＡＩＸ、ＰＤＧＦＲ−β、フィブロネクチン（ＦＮ）、コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶ）が腫瘍及び間質細胞区画両方の推定の発現を示したので、実験が、ＣＲＣコーホートの全組織レベル発現を調べるために行われた（表６）。教師なし階層型クラスタ化が、２つの主患者クラスタを明らかにした（図３）。「遺伝子」クラスタ１において、すべての患者は比較的低濃度の全タンパク質を発現し、一方、クラスタ２で、すべての患者試料はＣＡＩＸを除く、比較的高濃度の全タンパク質を発現した。バイオマーカー（「アレイ」）クラスタ化で、エンドシアリン／ＴＥＭ１は、最も密接にＰＤＧＦＲ−β、コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶとクラスタ化した。これは、０．６２、０．４３及び０．３１それぞれの、有意の（ｐ＜０．００１）スピアマンの順位相関係数を有する二変量相関分析においても、実証した。完全な二変量相関分析が、表７に提供される。ＣＡＩＸはテストされた他のバイオマーカーのいずれともクラスター化せず、したがって最小程度関連がある。生存転帰は全発現に対して調べられたが、すべてのマーカーは、有意に（ｐ＜０．１０）生存を予測する、トレーニングセットの最適カットポイントを示し、バリデーションセットで確認されるこれらのカットポイントはなかった。
【０１０８】
【表６】
0006417602.tif 000007
【０１０９】
【表７】
0006417602.tif 000008
【０１１０】
実施例６：細胞区画に特異的なバイオマーカー表示
目的のバイオマーカーが細胞発現を変化させることができるのは知られているので、区画特異的「マスク」が特に、腫瘍、間質、間質特異的脈管構造、及び腫瘍特異的脈管構造を、識別して分離するために開発された。要約すると、各エンドシアリン／ＴＥＭ１関連バイオマーカーは、核を識別するためにＤＡＰＩと結合し、腫瘍細胞質を識別するためにサイトケラチンと結合し、間質を識別するためにビメンチンと結合し、及び脈管構造を識別するためにＣＤ−３１と結合する。次いで高度な画像解析アルゴリズムが、目的の各区画に含まれる又は区画から除外される、いずれかとして、各ピクセルを識別する２値化画像を生成するために用いられた。各バイオマーカーのＡＱＵＡスコアが、目的の４つの生体区画である、腫瘍（膜／細胞質）、腫瘍血管、間質（脈管構造に寄与し間質）及び間質血管のために、生成された。手段解析は、区画によって、重要な示差的発現を示した（図４Ａ〜Ｇ）。すべてのマーカーは、ＣＡＩＸを除いて、腫瘍と比較して、間質及び／又は脈管構造で著しくより高レベルの発現を示した。逆に、ＣＡＩＸは、間質区画と比較して、腫瘍及び腫瘍血管でより高レベルの発現を示した。利用可能な臨床変数に対する発現は、最小限の関連（示されないデータ）だけを示した。すなわち、ＰＤＧＦＲ−β及びコラーゲンＩＶは、女性と比較して男性の著しく増大した発現を示し、間質フィブロネクチン及びコラーゲンＩは、疾患の進行期に応じて増大発現を示した。
【０１１１】
実施例７：一変量生存分析
最適なカプラン・マイヤー生存カットポイントは、トレーニングセット（表６）の最適カットポイント分析のＸ−Ｔｉｌｅを使用する連続ＡＱＵＡスコアデータ内で定められて、その後、バリデーションセットに適用された。バイオマーカーは、有意性（ｐ＜０．０５）がトレーニングセット及びバリデーションセットの両方で達したかどうかを検証すると考えられる。個々のマーカー／区画の各組合せの５年の無病生存期間データが、表８にまとめられる。すべてのマーカーが生存（トレーニングｐ＜０．２０）との関連の傾向を示したが、腫瘍血管及び間質ＴＥＭ−１発現、並びに間質血管コラーゲンＩ及びＨＩＦ２αが、一変量設定で確認するための最適なバイオマーカーだった。腫瘍血管及び間質ＴＥＭ１、並びに間質容器ＨＩＦ２αの高発現は、増大した５年の疾患特異的生存と関連しており（それぞれＨＲ＝０．４７／ｐ＝０．０３、ＨＲ＝０．４９／ｐ＝０．０３、及びＨＲ＝０．３３／ｐ＝０．０２）、一方で間質血管コラーゲンＩ高発現は、５年の生存の減少と関連する（ＨＲ＝２．３１／ｐ＝０．００８）。すべての区画のエンドシアリン／ＴＥＭ１発現のバリデーションセットのカプラン・マイヤー生存分析が、図５Ａ〜Ｄに示されて、差別的な生存有益性、及び遠隔細胞区画のバイオマーカー発現を定量化する正当性を示す。
【０１１２】
実施例８：Ｒ−ＴＡＰＰＳスコアの生成
本明細書に記載するマーカー（図５）、及び、それらがｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂを介して、生存及びエンドシアリン／ＴＥＭ１標的療法への潜在的反応の両方に、一括して有することができる、推定上の影響の関連性のため、一変量カットポイントを使用する多変量コックス比例ハザードモデルに、マーカーを一緒に組み込んだ。モデルへの最初の登録の基準は、トレーニングセット及びバリデーションセット両方の２０％の優位水準であった。（表８で太字で強調されるバイオマーカー、ｎ＝１３）。トレーニングセットでＷａｌｄ統計に基づく変数減少モデリングを用いることによって、１３つのバイオマーカーの出発モデルは、５つのバイオマーカー（表９）、ＴＥＭ１間質、ＴＥＭ１腫瘍血管、ＨＩＦ２α間質血管、コラーゲンＩＶ腫瘍、及びＦＮ間質まで絞り込める。この全体のモデルは、９．０×１０−８のｐ値とかなり有意性があった。
【０１１３】
【表８】
0006417602.tif 000009
【０１１４】
マーカーごとにモデルに係数を持つことで、「洗練されたＴＡＰＰＳ」（ＴＥＭ１関連経路予後型）スコアと称される、全体のリスクスコアを提供する式が作られた。Ｒ−ＴＡＰＰＳスコアは、以下のとおり定義される。
Ｒ−ＴＡＰＰＳ＝（ＴＥＭ１間質（０／１）＊−０．８９）＋（ＴＥＭ１腫瘍血管（０／１）＋１．１９）＋（ＨＩＦ２α間質血管（０／１）＊−０．７６）＋（コラーゲンＩＶ腫瘍（０／１）＊０．６２）＋（ＦＮ間質（０／１）＊０．８３）
【０１１５】
【表９】
0006417602.tif 000010
【０１１６】
得られたＲ−ＴＡＰＰＳスコアは、中央スコア１．１３の、−０．８９〜３．８８の範囲だった。訓練セットの連続変数として、予想どおり、Ｒ−ＴＡＰＰＳスコアは減少した生存と著しく関連した［ＨＲ＝１．７６（９５％  ＣＩ：１．４４〜２．１５；ｐ＝４．３×１０−９；表３］、が、有意性のあるバリデーションセットに適用された［ＨＲ＝１．３８（９５％ＣＩ：１．０２〜１．８８；ｐ＝０．０４；表３］。周知の臨床変数を有する高度な有意モデルに入れられるとき（ＬＲ−χ２＝４９．７）、Ｒ−ＴＡＰＰＳスコアは独立しており、及び、有意な付加的予後値を提供した［ＨＲ＝１．６６（９５％ＣＩ：１．３７〜２．０３）；ｐ＜０．００１、ＬＲ−χ２＝６７．２］。
【０１１７】
Ｒ−ＴＡＰＰＳスコアが臨床現場の診断として使用されるために、リスク群（すなわち、オンコタイプＤＸ）は、患者の分類を可能にするために、連続リスクスコアの関数として設定されなければならない。したがってＲ−ＴＡＰＰＳスコアは、３つのグループ、推定的に低いリスク（Ｒ−ＴＡＰＰＳ＜０．３）、中間のリスク（Ｒ−ＴＡＰＰＳ  ０．３〜１．８６）、及び、高いリスク（Ｒ−ＴＡＰＰＳ＞１．８６）を表す三分位値に分けられた。しかしながら、生存がカプラン・マイヤーによって調べられたとき、高度に有意性（Ｐ＜０．０００１）があるにもかかわらず、中間及び高いリスク群に大きな違いがなかった（図６Ａ）。このように中間及び高いリスク群は、１つの高いリスク群を形成するために統合された（図６Ｂ）。
【０１１８】
ＣＲＣ処置の重要な臨床問題は、化学療法をステージＩＩの患者に提供するべきかどうかということであり、したがって分析は、ステージＩＩの患者のＲ−ＴＡＰＰＳリスク群関連の検査が実施された。得られた所見は、生存との高い有意的関連（ｐ＝０．００６）を示した（図６Ｃ）。ステージＩＩＩ／ＩＶ患者の有意な関連を観察した（図６Ｄ）。
【０１１９】
アッセイのバリデーションのため、及び、少しのマーカーで役立つ結果研究を得られるかどうか判断することが、モデルのマーカー数を減らすために実施された。血管マーカーを除去することは、アッセイの可動部分、すなわち、ＣＤ３１（脈管構造）区画に必要とされている部分を除去することである。したがってＴＥＭ１間質、コラーゲンＩＶ腫瘍及びＦＮ間質だけを有するモデルが、テストされた（図７）。この最小モデルが同程度の予後的価値を提供しなかった（最小モデルＬＲ−χ２＝３２．２対最高モデルＬＲ−χ２＝３７．２）が、それは非常に有意的であった［ＨＲ＝２．７（９５％ＣＩ：１．９〜３．８；ｐ＝２．５×１０−８）。
【図１】
0006417602.tif 000011
【図２−１】
0006417602.tif 000012
【図２−２】
0006417602.tif 000013
【図３】
0006417602.tif 000014
【図４−１】
0006417602.tif 000015
【図４−２】
0006417602.tif 000016
【図５】
0006417602.tif 000017
【図６】
0006417602.tif 000018
【図７】
0006417602.tif 000019