(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ、ヒツジ、ブタ又はウマのアルファサブユニットポリペプチドであって、
ここにおいて、挿入若しくは置換がない、ウシの野生型アルファサブユニットポリペプチド（配列番号２）、ヒツジの野生型アルファサブユニットポリペプチド（配列番号３）、ブタの野生型アルファサブユニットポリペプチド（配列番号５）、または、ウマの野生型アルファサブユニットポリペプチド（配列番号４）に対して、以下の：
（Ａ）１５位の野生型のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）で置換されている、
（Ｂ）１７位の野生型のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）で置換されている、
（Ｃ）１８位の野生型のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、もしくは、ヒスチジン（Ｈ）で置換されている、
（Ｄ）２０位の野生型のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）で置換されている、および、
（Ｅ）２４位の野生型のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）で置換されている、
１つまたはそれより多くの置換が生じている、そして、
ここにおいて、挿入若しくは置換がない、ウシの野生型アルファサブユニットポリペプチド（配列番号２）、ヒツジの野生型アルファサブユニットポリペプチド（配列番号３）、ブタの野生型アルファサブユニットポリペプチド（配列番号５）、または、ウマの野生型アルファサブユニットポリペプチド（配列番号４）に対して、６位の位置の直後に、以下の：
（ａ）アスパラギン−バリン−スレオニン−イソロイシン−アスパラギン−バリン（ＮＶＴＩＮＶ）（配列番号１）；
（ｂ）スレオニン−アスパラギン−バリン−スレオニン−イソロイシン−アスパラギン−バリン（ＴＮＶＴＩＮＶ）（配列番号１２）；
（ｃ）バリン−アスパラギン−バリン−スレオニン−イソロイシン−アスパラギン−バリン−スレオニン（ＶＮＶＴＩＮＶＴ）（配列番号２０）；
（ｄ）アスパラギン−バリン（ＮＶ）；および
（ｅ）スレオニン−アスパラギン−バリン（ＴＮＶ）
ポリオペプチドの１つが挿入されている、
前記ウシ、ヒツジ、ブタ又はウマのアルファサブユニットポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のアルファサブユニットポリペプチド、および、黄体ホルモン（ＬＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）もしくは甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニット、を含む、修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項３】
請求項１のアルファサブユニットポリペプチド、および、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のベータサブユニット、を含む、修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項４】
非ヒト動物において糖タンパク質受容体を刺激するための方法であって、請求項１のアルファサブユニットポリペプチドを含む修飾糖タンパク質ホルモンを、当該動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項５】
非ヒト動物において糖タンパク質受容体を刺激するための方法であって、請求項２又は請求項３の修飾糖タンパク質ホルモンを、当該動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項６】
非ヒト動物において排卵を刺激するための方法であって、請求項１のアルファサブユニットポリペプチドを含む修飾糖タンパク質ホルモンを、当該動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項７】
非ヒト動物において排卵を刺激するための方法であって、請求項２又は請求項３の修飾糖タンパク質ホルモンを、当該動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
当該非ヒト動物が、ウシ、ヒツジ、ウマまたはブタである、請求項４、請求項５、請求項６または請求項７の方法。
【請求項９】
当該アミノ酸挿入がＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）であり、そして、１５位、１７位、１８位、２０位及び２４位の位置の野生型アミノ酸がアルギニン（Ｒ）でそれぞれ置換されている、請求項１のアルファサブユニットポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号７のウシアルファサブユニットポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、一般的に、スーパーアゴニスト活性を有する修飾糖タンパク質ホルモン、および糖タンパク質ホルモン活性と関連する状態の治療におけるその使用に関する。より具体的には、本発明は、野生型アルファサブユニットに比較した際、アルファサブユニットにおいて、アミノ酸置換および１またはそれより多い挿入されたペプチドを含有する、修飾糖タンパク質分子であって、野生型糖タンパク質に比較した際、増進された薬理学的特性を示す、前記修飾分子を指す。
【背景技術】
【０００２】
[0002]ゴナドトロピンであるフォリトロピン（卵胞刺激ホルモン、ＦＳＨ）および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、ルトロピン（黄体ホルモン、ＬＨ）、およびチロトロピン（甲状腺刺激ホルモン、ＴＳＨ）は、糖タンパク質ホルモンファミリーを構成する。各ホルモンは、２つの非共有結合サブユニット：アルファおよびベータのヘテロ二量体である。同じ種内で、アルファサブユニットのアミノ酸配列は、すべてのホルモンにおいて同一であり、一方、ベータサブユニットの配列はホルモン特異的である（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５０：４６５−４９５（１９８１））。サブユニットの配列が、魚類から哺乳動物まで非常に保存されているという事実は、これらのホルモンが、共通の祖先タンパク質から発展してきたことを暗示する（Ｆｏｎｔａｉｎｅ，  Ｇｅｎ．  Ｃｏｍｐ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ３２：３４１−３４７（１９７７））。
【０００３】
[0003]修飾糖タンパク質ホルモンを用いた以前の研究は、有望なデータを明らかにしてきた。例えば、活性が増加した修飾糖タンパク質ホルモンを提供することに加えて、さらなる突然変異は、受容体アフィニティ結合の増加を示してきている（例えば、ＷＯ  ２００５／０８９４４５およびＷＯ  ２００５／１０１０００を参照されたい）。しかし、アフィニティが増加する一方、研究によって、修飾糖タンパク質ホルモンが野生型対応物よりも速くはないとしても同程度に迅速に一掃されることが立証された。活性が増進した臨床的に有用なスーパーアゴニストを生成するため、修飾糖タンパク質スーパーアゴニストは、改善された受容体結合アフィニティに加えて、改善された生物学的半減期を持たなければならない。しかし、糖タンパク質ホルモンをさらに修飾して、半減期を増加させ、そして生物学的利用能を増加させようとする以前の試みは、満足のいくものではなく、そしてその代わり、修飾糖タンパク質ホルモンは、減弱された反応しか示さなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ  ２００５／０８９４４５
【特許文献２】ＷＯ  ２００５／１０１０００
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｉｅｒｃｅ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５０：４６５−４９５（１９８１）
【非特許文献２】Ｆｏｎｔａｉｎｅ，  Ｇｅｎ．  Ｃｏｍｐ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ３２：３４１−３４７（１９７７）
【発明の概要】
【０００６】
[0004]本発明は、糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのＱ１３、Ｅ１４、Ｐ１６またはＱ２０での少なくとも１つの保存的塩基性アミノ酸置換、ならびにＤ３およびＱ５の間のＶＮＶＴＩＮＶＴ（配列番号２０）の挿入を含むアミノ酸配列を含む、修飾糖タンパク質ホルモンを提供する。
【０００７】
[0005]いくつかの態様において、修飾糖タンパク質ホルモンは、Ｑ１３、Ｐ１６およびＱ２０での少なくとも２つまたは少なくとも３つの塩基性アミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、修飾糖タンパク質ホルモンは、Ｅ１４での塩基性アミノ酸置換をさらに含む。いくつかの態様において、塩基性アミノ酸はアルギニンである。
【０００８】
[0006]いくつかの態様において、アルファサブユニットは、配列番号１１に少なくとも８５％同一性を持つアミノ酸配列を含み、そして黄体ホルモン（ＬＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む。いくつかの態様において、アルファサブユニットはヒトアルファサブユニット（配列番号６）に由来する。
【０００９】
[0007]本発明は、糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのＫ１５、Ｋ１７、Ｋ２０またはＫ２４での少なくとも１つの保存的塩基性アミノ酸置換、ならびにＦ６およびＴ７の間のＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）の挿入を含むアミノ酸配列を含む、修飾糖タンパク質ホルモンを含む。
【００１０】
[0008]いくつかの態様において、修飾糖タンパク質ホルモンは、Ｋ１５、Ｋ１７、Ｋ２０およびＫ２４での少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つの塩基性アミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、修飾糖タンパク質ホルモンは、Ｅ１８での塩基性アミノ酸置換をさらに含む。いくつかの態様において、塩基性アミノ酸はアルギニンである。
【００１１】
[0009]いくつかの態様において、アルファサブユニットは、配列番号７に少なくとも８５％同一性を持つアミノ酸配列を含み、そして黄体ホルモン（ＬＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む。いくつかの態様において、アルファサブユニットはウシ、ブタ、またはヒツジアルファサブユニット（それぞれ、配列番号２、配列番号５、配列番号３）に由来する。
【００１２】
[0010]本発明は、糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのＫ１５、Ｅ１８、Ｋ２０またはＫ２４での少なくとも１つの保存的塩基性アミノ酸置換、ならびにＦ６およびＴ７の間のＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）の挿入、またはＦ６およびＴ７の間のＮＶの挿入に加えてＴ７およびＴ８の間のＩＮＶの挿入を含むアミノ酸配列を含む、修飾糖タンパク質ホルモンを含む。
【００１３】
[0011]いくつかの態様において、修飾糖タンパク質ホルモンは、Ｋ１５、Ｅ１８、Ｋ２０およびＫ２４での少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つの塩基性アミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、修飾糖タンパク質ホルモンには、アルファサブユニットのＦ６およびＴ７の間のＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）の挿入が含まれる。いくつかの態様において、修飾糖タンパク質ホルモンには、アルファサブユニットのＦ６およびＴ７の間のＮＶの挿入に加えてＴ７およびＴ８の間のＩＮＶの挿入が含まれる。いくつかの態様において、塩基性アミノ酸はアルギニンまたはヒスチジンである。いくつかの態様において、塩基性アミノ酸はアルギニンである。
【００１４】
[0012]いくつかの態様において、アルファサブユニットは、配列番号４に少なくとも８５％同一性を持つアミノ酸配列を含み、そして黄体ホルモン（ＬＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む。いくつかの態様において、アルファサブユニットはウマアルファサブユニット（配列番号４）に由来する。
【００１５】
[0013]本発明はまた、上述の修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与する工程を含む、動物において糖タンパク質受容体を刺激するための方法も含む。本発明はまた、上述のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与する工程を含む、動物において排卵を刺激するための方法も含む。いくつかの態様において、動物は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタまたはウマである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】[0014]図１は、一過性トランスフェクションによって産生される選択されたｂＦＳＨ類似体でのＣＨＯ−ＦＳＨＲ細胞におけるｃＡＭＰ刺激を示す。図１Ａは、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖ（ｐＦＳＨ）、ｂＦＳＨ−ＷＴ（野生型）とｂＦＳＨ−５Ｒ類似体の比較を示す。図１Ｂは、２つのＮ末端伸長（ＡＮＩＴＶ、ＮＩＴＶ）および１つの内部ネオグリコシル化（Ｖ７８Ｎ）によるｈＦＳＨ−ＴＲ４４０２類似体（一過性４４０２）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性の減弱を示す（ＳＰＡ  ｃＡＭＰアッセイ）。図１Ｃは、ｂＦＳＨ−５Ｒ類似体と挿入物１（５Ｒ＋挿入物１）および挿入物２（５Ｒ＋挿入物２）の比較を示す。
【図１−２】[0014]図１は、一過性トランスフェクションによって産生される選択されたｂＦＳＨ類似体でのＣＨＯ−ＦＳＨＲ細胞におけるｃＡＭＰ刺激を示す。図１Ａは、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖ（ｐＦＳＨ）、ｂＦＳＨ−ＷＴ（野生型）とｂＦＳＨ−５Ｒ類似体の比較を示す。図１Ｂは、２つのＮ末端伸長（ＡＮＩＴＶ、ＮＩＴＶ）および１つの内部ネオグリコシル化（Ｖ７８Ｎ）によるｈＦＳＨ−ＴＲ４４０２類似体（一過性４４０２）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性の減弱を示す（ＳＰＡ  ｃＡＭＰアッセイ）。図１Ｃは、ｂＦＳＨ−５Ｒ類似体と挿入物１（５Ｒ＋挿入物１）および挿入物２（５Ｒ＋挿入物２）の比較を示す。
【図２】[0015]図２Ａおよび２Ｂは、マウスにおける単回皮下注射後の多様なｂＦＳＨ類似体のＰＫスクリーニングアッセイを示す。各実験において、各調製に５匹のマウスを用いた。注射２４時間後、３２時間後および４８時間後、血液試料を採取し、血漿レベルを推論し、そしてデータを注射用量の％（％ＩＤ）として表した。ＦＳＨ  ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｄｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて血漿試料中のＦＳＨレベルをアッセイした。
【図３】[0016]図３Ａ〜Ｄは、ＴＲ５５６０１産生の異なるロットの分析を示す。図３Ａは、ＩＥＦ後、ウェスタンブロットを用いた、電荷不均一性分析を例示する。ロット３（レーン２および３）の準最適なシアル化は、ロット４（レーン５および６）において検出される最適な非常に酸性のアイソフォームとの明確な対照を示した。レーン１、ＩＥＦ  ３〜１０マーカー；レーン２、ＴＲ５５６０１／ロット３（８μｇ）；レーン３、ＴＲ５５６０１／ロット３（４μｇ）；レーン４および８、ＴＲ４４０１（１μｇ）；レーン５、ＴＲ５５６０１／ロット４（８μｇ）；レーン６、ＴＲ５５６０１／ロット４（４μｇ）；レーン８、ＩＥＦ  ３〜１０マーカー。図３Ｂは、ノイラミニダーゼ（コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ））、ＩＥＦおよびウェスタンブロットを用いた荷電アイソフォームの分析を例示する。未処理ＴＲ５５６０１／ロット４試料（レーン２および３）および３〜１０  ＩＥＦゲルに適用する前にノイラミニダーゼで処理したＴＲ５５６０１／ロット４試料（レーン４〜６）。レーン１、ＩＥＦ  ３〜１０マーカー；レーン２、未処理ＴＲ５５６０１／ロット４（８μｇ）；レーン３、未処理ＴＲ５５６０１／ロット４（４μｇ）；レーン４、処理ＴＲ５５６０１／ロット４（４μｇ）；レーン５、処理ＴＲ５５６０１／ロット４（２μｇ）；レーン６、処理ＴＲ５５６０１／ロット４（１μｇ）。ノイラミニダーゼで消化したアイソフォームのＩＥＦプロファイルは、７．８から１０．０のｐＩ範囲にシフトした。ｐＩの平均シフトは約５  ｐＨ単位であり、そして多数のバンド（１０バンドに近い）が１つの主要なバンド（ｐＩ〜９．５）および３つの微量のバンド（ｐＩ  ７．８〜１０．０）に変換され、観察された電荷不均一性の大部分（図３Ａ−ロット４）が、脱アミド化および／またはタンパク質分解的分解などの他の修飾の微量の構成要素とともに、末端シアル酸残基に依存することが示される。３Ｂに示す残った塩基性バンド（ｐＩ  ４．８〜５．５）は非特異的であり、ノイラミニダーゼ調製に由来する。図３Ｃは、ｐＩ勾配ゲル中のＩＥＦ  ３〜１０（ＩＥＦ  ３〜１０）後のウェスタンブロッティングによって、ＴＲ５５６０１−ロット５の荷電アイソフォームの分析を示す。レーン１、ＩＥＦ  ３〜１０マーカー；レーン２、ＴＲ５５６０１−ロット５（４μｇ）；レーン３、ＴＲ５５６０１−ロット５（４μｇ）；レーン４、ＴＲ５５６０１−ロット４（４μｇ）；レーン５、ＴＲ５５６０１−ロット４（８μｇ）；レーン６、ＴＲ５５６０１−ロット３（４μｇ）；レーン７、ＴＲ５５６０１−ロット３（８μｇ）。図３Ｄは、ＴＲ５５６０１、ロット４およびＦｏｌ−Ｖに比較した、ＴＲ５５６０１、ロット５のＳＤＳ−ウェスタンブロット分析を例示する。レーン１、タンパク質マーカー；レーン２：ロット４、５００ｎｇ；レーン３：ロット５、１μｌ；レーン４：空レーン；レーン５：ロット４、４μｇ；レーン６：ロット５、１５μｌ；レーン７：Ｆｏｌ−Ｖ、６７３ｎｇ；レーン８：タンパク質マーカー。
【図４】[0017]図４は、未成熟（２２日齢）スプレーグ・ドーリー雌ラットにおける卵巣重量のｈＣＧ増大を伴う古典的Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙバイオアッセイ由来の結果を示す。投薬７２時間後に卵巣重量を測定した。データを２つの卵巣の平均総卵巣重量＋ＳＥＭ（群あたり用量あたりｎ＝５）として提示する。ラットを、４０ＩＵのｈＣＧを補った、試験物品またはビヒクルの１回の単回注射で刺激した。以下の投薬群を用いた：群１は、ｈＣＧのみを投与され（ＦＳＨなし）、群２〜５はＴＲ５５６０１、ロット４（左から右に、それぞれ、０．３３μｇ、１．０μｇ、３．３３μｇ、および１０μｇ）を投与され、群６〜８は、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（登録商標）（左から右に、それぞれ、３，３３３μｇ、１０，０００μｇ、および３０，０００μｇ）を投与され、そして群９〜１０はＴＲ４４０１（１．０μｇおよび３．３３μｇ）を投与された。
【図５】[0018]図５は、過排卵、排卵の誘導および固定時間人工的精子注入のための卵胞波同調プロトコルを示す。Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−ＶＲ（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ）の８回の注射をＴＲ５５６０１の単回または二重注射に置き換える。
【図６】[0019]図６は、単回Ｉ．Ｍ．注射によって投与される６０μｇのｒＦＳＨまたは４日間に渡って１日２回のＩ．Ｍ．注射で投与される３００ｍｇのＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）で治療された肉用牛における超刺激（ｓｕｐｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）治療中の卵胞（直径３〜５ｍｍ）の平均数を示す（３つの実験を併せたもの）。
【図７】[0020]図７は、単回Ｉ．Ｍ．注射によって投与される６０μｇのｒＦＳＨまたは４日間に渡って１日２回のＩ．Ｍ．注射で投与される３００ｍｇのＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）で治療された肉用牛における超刺激治療中の直径６〜８ｍｍの卵胞の平均数を示す（３つの実験を併せたもの）。
【図８】[0021]図８は、単回Ｉ．Ｍ．注射によって投与される６０μｇのｒＦＳＨまたは４日間に渡って１日２回のＩ．Ｍ．注射で投与される３００ｍｇのＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）で治療された肉用牛における超刺激治療中の直径＞９ｍｍの卵胞の平均数を示す（３つの実験を併せたもの）。
【図９】[0022]図９は、単回Ｉ．Ｍ．注射によって投与される６０μｇのｒＦＳＨまたは４日間に渡って１日２回のＩ．Ｍ．注射で投与される３００ｍｇのＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）で治療された肉用牛における超刺激治療中の直径≧３ｍｍのすべての卵胞の平均直径プロファイルを示す（３つの実験を併せたもの）。
【図１０】[0023]図１０Ａは、ヒトアルファサブユニットにおける挿入物（Ａ２）、アミノ末端バリンを含まない挿入物（挿入物２）、挿入物を含まない５アルギニン置換のみ（５Ｒ）および培地のみの対照に関するｃＡＭＰ産生の比較を示す。図１０Ｂは、試験した３つの構築物に関するＥＣ５０を示す。
【図１１】[0024]図１１Ａは、配列番号１の挿入物を含むヒト修飾アルファサブユニットおよび挿入物を欠くウシ修飾アルファサブユニットに反応したｃＡＭＰ産生の比較を示す。図１１Ｂは、多様な挿入物を含みそして含まないヒト修飾アルファサブユニットおよびウシサブユニットに反応したｃＡＭＰ産生の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[0025]本発明は、野生型対応物に比較した際、驚くほど増進された強度および増加した生物学的半減期を示す、修飾超活性糖タンパク質ホルモン分子を提供する。「修飾される」は、タンパク質が野生型糖タンパク質ホルモンと異なるアミノ酸配列を含有する一方、配列は別の種の既知の糖タンパク質ホルモン配列に同一ではないように変化していることを意味する。超活性は、強度および有効性を含む、多様なパラメータにしたがって評価可能である。強度（ｐｏｔｅｎｃｙ）は、最大半量反応を測定することによって決定される生物活性のパラメータである。強度の相違は、野生型糖タンパク質ホルモンのものに対するベースラインおよび最大の間の半分である類似体の糖タンパク質ホルモン反応の値（ＥＣ５０）を比較することによって、決定される。糖タンパク質ホルモン反応を、精製タンパク質を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定してもよいし、または修飾タンパク質をコードする核酸を一過性にトランスフェクションした後、概算してもよい。糖タンパク質ホルモン反応はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでも、すなわち前記糖タンパク質ホルモン類似体に反応性である動物においても測定可能である。こうした反応は、受容体に対する糖タンパク質ホルモン結合の、任意の既知の細胞性または生物学的および定量的または定性的反応、例えばｃＡＭＰ産生、プロゲステロンなどのタンパク質の合成、受精率、胚盤胞形成率、受精卵母細胞あたりの胚発生などを含む。有効性（Ｖｍａｘ）または最大反応は生物活性の別のパラメータである。本明細書で論じるように、生物活性のパラメータは、アッセイ細胞株における受容体数および受容体カップリングに応じて多様でありうる。より少ない受容体数または損なわれたカップリングを持つ系においては、Ｖｍａｘ（有効性）に関して相違はより認識されうる。受容体が過剰発現されている系においては、強度の相違はより可視化される。
【００１８】
[0026]例えば、修飾糖タンパク質ホルモンが、修飾ＦＳＨまたはＣＧ分子である例において、ｉｎ  ｖｉｖｏ定量的および定性的パラメータ、例えば卵母細胞の量、受精率、ならびに胚盤胞および胚形成率を、卵母細胞数に関する最大有効用量で測定してもよい。卵母細胞数に関する最大有効用量は、卵母細胞品質および量の両方に関する、超活性ＦＳＨの最適量である。卵母細胞数に関する最大有効用量は、動物の体重および代謝速度に応じる。例えば、代謝速度がより緩慢であるより大きい動物に関する最大有効用量は、より高い代謝速度を持つより小さい動物に関する最大有効用量よりも大きい。最大有効用量は、各動物に関して経験的に決定される。
【００１９】
[0027]しかし、本発明の修飾超活性糖タンパク質ホルモンタンパク質は、用いる系に関わらず、野生型対応物に比較して、強度の少なくとも約２〜１０倍の増加、または強度の少なくとも約２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍もしくはさらに１００倍の増加、あるいは野生型対応物に比較して、最大有効性の約２〜１０％の増加、または少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはさらに１００％の増加を示すことも可能である。本発明の超活性類似体はまた、野生型ＦＳＨに比較した際、強度の約５〜１０倍の増加、または最大有効性の５％〜１０％の増加を提供することも可能である。本発明の修飾タンパク質のいくつかは、野生型に比較した際、強度の３０〜５０倍の増加または最大有効性の３０％〜５０％の増加を示すことも可能である。したがって、本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、受容体数が少ないかまたは受容体反応に欠損を有する被験体を治療するために有用である可能性もあり、これは、本発明の修飾タンパク質が、少ない受容体数または反応を有する系においてさえ、強度の少なくとも１０倍の増加または最大有効性の１０％の増加を維持しうるためである。
【００２０】
[0028]修飾超活性糖タンパク質ホルモンの吸収速度は、作用の期間増加を生じうる。吸収速度が減少し、そして作用期間が増加した修飾糖タンパク質ホルモン類似体は、低感受性被験体、例えば受胎障害を患う被験体にとって有益でありうる。吸収速度は、Ｋａによって測定される。排出速度は、Ｋｅによって測定される。
【００２１】
[0029]本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子には、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネズミ、ラット、ウサギ、霊長類等からなる群より選択される種の修飾タンパク質が含まれる。魚類糖タンパク質ホルモン（ＧＴＨ−１としてもまた知られる）を水産養殖において用いてもよく、すなわち絶滅が危惧される魚種または他の捕獲されている魚種の成長を補助するために用いてもよい。修飾糖タンパク質ホルモンの他の種を、農業育種において、そしてさらに多様な雄および雌糖タンパク質ホルモン関連状態に対する異なる併合突然変異の影響を試験するための実験室設定において、用いてもよい。
【００２２】
[0030]他の種の修飾糖タンパク質ホルモン分子は、本明細書に開示する修飾ヒト（例えば表１）、ウシ（表２を参照されたい）、ヒツジ、ウマおよびブタ糖タンパク質ホルモン分子におけるものに対応する位で置換を有し、こうした置換は、限定されるわけではないが、ＤＮＡＳＩＳ、ＡＬＩＯＮｍｅｎｔ、ＳＩＭおよびＧＣＧプログラム、例えばＧａｐ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＦｒａｍｅＡｌｉｇｎおよびＣｏｍｐａｒｅを含む、任意の整列プログラムを用いて同定可能である。
【００２３】
[0031]本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子は、少なくとも１つの修飾アルファサブユニットを含み、ここでアルファサブユニットは、リジン残基などの少なくとも２つの塩基性アミノ酸を含む。ヒトアルファサブユニットにおいて、塩基性アミノ酸は、野生型ヒトアルファサブユニットの１３、１４、１６および２０位に導入されてもよい（配列番号６）。他の種において、塩基性アミノ酸は、野生型ウシアルファ（配列番号２）、野生型ブタアルファ（配列番号５）および野生型ヒツジアルファ（配列番号３）の１５、１７、２０および２４位、そして野生型ウマアルファ（配列番号４）の１５、２０および２４位に対応する位に導入されてもよい。１８位のグルタミン酸残基（ウシ、ブタ、ヒツジおよびウマ）もまた、塩基性アミノ酸で置換されてもよい。いくつかの態様において、塩基性アミノ酸は、アルギニンまたはヒスチジンであってもよい。いくつかの態様において、塩基性アミノ酸はアルギニンであってもよい。
【００２４】
[0032]配列ＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）またはＴＮＶＴＩＮＶ（配列番号１２）またはＶＮＶＴＩＮＶＴ（配列番号２０）を持つペプチドを、ヒトアルファサブユニット（配列番号６）のアミノ酸Ｄ３およびＱ５の間に、そしてウシ、ブタ、ヒツジおよびウマアルファサブユニットのＦ６およびＴ７の間に、挿入してもよい。あるいはウシ、ブタ、ヒツジまたはウマの修飾糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットには、Ｆ６およびＴ７の間のＮＶの挿入に加えて、Ｔ７およびＴ８の間のＩＮＶの挿入が含まれることも可能である。本発明の修飾タンパク質はまた、さらなる置換、特にタンパク質の増進された特性を改変しない保存的置換を含有してもよい。しかし、典型的には、こうした修飾タンパク質は、上に列挙したもの以外の位では、５未満の置換しか含有せず、そして上に列挙した位以外の位においては、対応する野生型糖タンパク質ホルモンアルファと完全なアミノ酸配列同一性を示すことも可能である。
【００２５】
[0033]塩基性アミノ酸は、アミノ酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジン、ならびにこれらの３つのアミノ酸いずれかに対する修飾であってもよい任意の他の塩基性アミノ酸、天然には通常見られない合成塩基性アミノ酸、または中性ｐＨで正に荷電する任意の他のアミノ酸を含む。塩基性アミノ酸は、とりわけ、リジンおよびアルギニンからなる群より選択される。
【００２６】
[0034]塩基性アミノ酸置換およびペプチド挿入物を有する例示的な修飾アルファ分子を配列番号１１（ヒト）、配列番号７（ウシ）、配列番号８（ヒツジ）、配列番号１０（ブタ）、および配列番号９（ウマ）に示す。本発明は、配列番号７〜１１のいずれかと、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を持つアミノ酸配列を持つ修飾糖タンパク質を提供する。
【００２７】
[0035]本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の修飾アルファサブユニットはまた、２、３、４または５の塩基性アミノ酸置換を含むアルファサブユニットを有することも可能である。置換アミノ酸は、リジン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基またはグルタミン残基であってもよい。例えば、野生型ウシアルファサブユニットにおいて、１５、１７、２０および２４位のリジンの１またはそれより多く、ならびに１８位のグルタミン酸が、塩基性アミノ酸、例えばアルギニンおよびヒスチジンで置換されていてもよい。野生型ヒトアルファサブユニットにおいて、１３および２０位の１またはそれより多くのグルタミン、ならびに１４位のグルタミン酸および１６位のプロリンが、塩基性アミノ酸、例えばアルギニンおよびヒスチジンで置換されていてもよい。野生型ブタアルファサブユニットにおいて、１５、１７、２０および２４位のリジンの１またはそれより多く、ならびに１８位のグルタミン酸が、塩基性アミノ酸、例えばアルギニンおよびヒスチジンで置換されていてもよい。野生型ヒツジアルファサブユニットにおいて、１５、１７、２０および２４位のリジンの１またはそれより多く、ならびに１８位のグルタミン酸が、塩基性アミノ酸、例えばアルギニンおよびヒスチジンで置換されていてもよい。野生型ウマアルファサブユニットにおいて、１５、２０および２４位のリジンの１またはそれより多く、ならびに１８位のグルタミン酸が、塩基性アミノ酸、例えばアルギニンおよびヒスチジンで置換されていてもよい。
【００２８】
[0036]例えば、さらなる修飾ウシアルファサブユニットが、配列番号１３〜１９および２２に示すような配列中に提示される。本発明は、配列番号１３〜１９および２２のいずれかと、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を持つアミノ酸配列を持つ修飾糖タンパク質を提供する。
【００２９】
[0037]例えば、さらなる修飾ウマアルファサブユニットが、配列番号３８〜４２に示すような配列中に提示される。本発明は、配列番号４３〜４５のいずれかと、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を持つアミノ酸配列を持つ修飾糖タンパク質を提供する。
【００３０】
[0038]さらなる修飾アルファサブユニットは、関心対象のアルファサブユニットのアミノ酸配列を他の種のものに比較して、他の種のタンパク質中の対応する塩基性残基を同定することによって、設計可能である。こうした方法は、その全体が本明細書に援用される、米国特許６，３６１，９９２に開示される。比較および置換のためにどの種を選択するべきかに関して、多様な種由来の糖タンパク質ホルモンの相対的生物学的活性に関してもまた、考慮してもよい。さらに、関連糖タンパク質ホルモンの構造に基づく相同性モデリングは、表面曝露アミノ酸残基を同定するために有用である。さらなるアミノ酸位を修飾するため、標準コンピュータソフトウェアプログラム、例えばＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）、または限定されるわけではないが、ＡＬＩＯＮｍｅｎｔ、ＳＩＭおよびＧＣＧプログラム、例えばＧａｐ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＦｒａｍｅＡｌｉｇｎおよびＣｏｍｐａｒｅを含む、上に列挙する任意の他の整列プログラムを用いて、ヒトおよび非ヒト由来の糖タンパク質ホルモン配列を整列させてもよい。次いで、上述の技術の１つを用いて、ヒトおよび非ヒト糖タンパク質ホルモン間で異なるアミノ酸残基を置換し、そして本明細書に言及するアッセイの１つを用いて、その強度に関して、生じた糖タンパク質ホルモンをアッセイしてもよい。
【００３１】
[0039]したがって、本発明はまた、本明細書に記載する修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型ＦＳＨよりも増加した強度を有する修飾ＦＳＨタンパク質も提供する。
【００３２】
[0040]本発明はまた、本明細書に記載する修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型ＬＨよりも増加した強度を有する修飾ＬＨタンパク質も提供する。
【００３３】
[0041]本発明はまた、本明細書に記載する修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型ＴＳＨよりも増加した強度を有する修飾ＴＳＨタンパク質も提供する。
【００３４】
[0042]本発明はまた、本明細書に記載する修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型ＣＧよりも増加した強度を有する修飾ＣＧタンパク質も提供する。
【００３５】
[0043]本発明はまた、スーパーアゴニストまたはアンタゴニスト活性のいずれかを有する、本明細書記載の類似体の断片も含む。例えば、本発明の修飾アルファ鎖の断片を、単独で、あるいは断片または全長ベータ鎖のいずれかと組み合わせて用いて、スーパーアゴニスト化合物を生成してもよい。いくつかの場合、本発明の修飾アルファサブユニット分子の断片をアンタゴニストとして用いて、例えば投与された後、糖タンパク質ホルモン療法剤の活性期間を限定してもよい。
【００３６】
[0044]本発明はまた、本明細書記載の修飾タンパク質ホルモンをコードする核酸配列も提供する。本発明はまた、保存的アミノ酸置換を持つポリペプチドをコードする核酸も提供する。本発明の核酸は、糖を輸送するポリペプチドをコードしてもよい。単離核酸は、上に同定する配列と、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有してもよい。単離核酸は、上に同定する寄託番号によってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。輸送因子をコードする、単離された核酸は、上に同定する核酸配列にハイブリダイズ可能である。
【００３７】
[0045]修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質をコードする核酸を、発現のため、発現調節配列に遺伝子融合させてもよい。適切な発現調節配列には、ターゲット宿主生物に適用可能なプロモーターが含まれる。こうしたプロモーターは、原核および真核生物由来の多様な宿主に関して、当業者に周知であり、そして文献に記載される。例えば、こうしたプロモーターを天然存在遺伝子から単離してもよいし、あるいはこうしたプロモーターは、合成またはキメラプロモーターであってもよい。
【００３８】
[0046]本発明はまた、ターゲット核酸分子内に修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質をコードする核酸を挿入するための発現カセット、例えばベクターも提供する。この目的のため、発現カセットは、５’および３’隣接領域に、特定の配列位からの除去および特定の配列位内への挿入を容易にするヌクレオチド配列、例えば制限酵素認識部位、または例えばレコンビナーゼによって触媒されるような相同組換えのためのターゲット配列とともに提供される。本発明の核酸分子または発現カセットに加えて、ベクターは、適切な宿主細胞において、そして適切な条件下で、前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含有してもよい。一般的に、ベクターはまた、１またはそれより多い複製起点を含有する。ベクターはまた、本発明の輸送因子をコードする核酸を超えた長さの転写を制限するターミネーター配列も含んでもよい。
【００３９】
[0047]都合よくは、ベクター中に含有される核酸分子は、原核または真核細胞において、発現を可能にする、すなわち翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を確実にする、発現調節配列に、機能可能であるように連結されている。
【００４０】
[0048]用語「単離された」は、巨大分子の天然供給源中に存在する、他の細胞／組織構成要素（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）から分離された分子を指す。用語「単離された」は、本明細書において、また、組換えＤＮＡ技術によって産生された際には細胞性物質、ウイルス物質、および培地を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成された際には、化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まない、核酸またはペプチドも指す。さらに、単離された核酸またはペプチドには、断片として天然には存在せず、そして天然状態では見出されないであろう核酸またはペプチド断片も含まれてもよい。
【００４１】
[0049]プラスミドは、ベクターの最も一般的に用いられる型であるため、用語「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。しかし、本発明は、同等の機能を提供し、そして続いて当該技術分野に知られるようになる、発現ベクターのこうした他の型も含むと意図される。ベクターは、異なる遺伝的環境間の輸送のため、または宿主細胞における発現のため、制限および連結によって、所望の配列を挿入可能な、多くの核酸のいずれであってもよい。ベクターは、典型的には、ＤＮＡで構成されるが、ＲＮＡベクターもまた利用可能である。ベクターには、限定されるわけではないが、プラスミドおよびファージミドが含まれる。クローニングベクターは、宿主細胞において複製可能なものであり、そして１またはそれより多いエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられ、こうした制限部位でベクターは決定可能な様式で切断され、そして新規組換えベクターが宿主細胞中で複製する能力を保持するように、該ベクターの中に、所望のＤＮＡ配列を連結することも可能である。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドが宿主細菌内のコピー数を増加させるにつれて何度も起こることも可能であるし、または有糸分裂によって宿主が複製する前に、宿主あたり１回だけ起こることも可能である。ファージの場合、複製は、溶菌期中に能動的に、または溶原期中に受動的に起こることも可能である。
【００４２】
[0050]ベクターはさらに、プロモーター配列を含有してもよい。プロモーターには、核酸転写を開始するための部位を含有する、コード領域の上流に通常位置する非翻訳核酸配列が含まれてもよい。プロモーター領域にはまた、遺伝子発現の制御因子として働く他の要素も含まれてもよい。本発明のさらなる態様において、発現ベクターは、発現ベクターが取り込まれている細胞の選択を補助する、さらなる領域を含有する。プロモーター配列には、しばしば、３’末端に転写開始因子が結合して（包括的に）おり、そして上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで、転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基または要素が含まれる。プロモーター配列内で、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核プロモーターは、常にではないがしばしば、ＴＡＴＡボックスおよびＣＡＴボックスを含有するであろう。プロモーターの活性化は、特定の細胞または組織に特異的である可能性もあり、例えばこれは特定の組織においてのみ発現される転写因子により、あるいはプロモーターは普遍的であり、そして大部分の細胞または組織において発現が可能であることも可能である。
【００４３】
[0051]ベクターは、該ベクターで形質転換またはトランスフェクションされている細胞の同定および選択において使用するために適した１またはそれより多くのマーカー配列をさらに含有してもよい。マーカーには、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加させるかまたは減少させるタンパク質をコードする遺伝子、当該技術分野に知られる標準的アッセイによってその活性が検出可能である酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクション細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に目に見える影響を及ぼす遺伝子が含まれる。ベクターは、機能可能であるように連結されたＤＮＡセグメント中に存在する構造遺伝子産物の自律性複製および発現を可能にするものであってもよい。発現ベクターは、制御配列に機能可能であるように連結されるかまたは機能可能であるように関連し、そしてｍＲＮＡ転写物として発現されうるように、制限および連結によって、所望の核酸配列が挿入されてもよいものである。発現は、細胞における、内因性遺伝子、導入遺伝子またはコード領域の転写および／または翻訳を指す。
【００４４】
[0052]コード配列および制御配列は、これらが、制御配列の影響下または調節下で、コード配列の発現または転写が行われるような方式で、共有結合されている場合、機能可能なように連結されている。コード配列を、機能するタンパク質に翻訳することが望ましい場合には、５’制御配列中のプロモーターの誘導が、コード配列の転写を生じる場合、そして２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入を生じないか、（２）プロモーター領域が、コード配列の転写を指示する能力に干渉しないか、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質へと翻訳される能力に干渉しない場合、２つのＤＮＡ配列は、機能可能であるように連結されているという。したがって、プロモーター領域は、生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドへと翻訳可能であるように、そのＤＮＡ配列の転写を達成可能である場合、コード配列に機能可能であるように連結されているであろう。
【００４５】
[0053]本発明のいくつかの側面には、核酸の形質転換および／またはトランスフェクションが含まれる。形質転換は、原核細胞内部への外因性または異種核酸の導入である。トランスフェクションは、真核細胞内部への外因性または異種核酸の導入である。形質転換またはトランスフェクション核酸は、染色体ＤＮＡ内に組み込まれて（共有結合されて）、細胞ゲノムを構成してもよいし、組み込まれなくてもよい。原核生物において、例えば、形質転換核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのエピソーム要素上に維持されてもよい。真核細胞に関しては、安定トランスフェクション細胞は、トランスフェクション核酸が、染色体複製を通じて娘細胞に遺伝するように、染色体内にトランスフェクション核酸が組み込まれるようになったものである。この安定性は、細胞株、またはトランスフェクションされた核酸を含有する娘細胞集団で構成されるクローンを、真核細胞が樹立する能力によって立証される。
【００４６】
[0054]核酸挿入物の発現に有用であることが一般の当業者に知られる、多くの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターがある。使用に適した他の微生物宿主には、バチルス、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、および他の腸内細菌科、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、および多様なシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種が含まれる。これらの原核宿主において、典型的には、宿主細胞と適合する発現調節配列（例えば複製起点）を含有するであろう発現ベクターを作製することも可能である。さらに、任意の数の多様な周知のプロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼ・プロモーター系、またはファージ・ラムダ由来のプロモーター系が存在するであろう。プロモーターは、場合によってオペレーター配列とともに、典型的には発現を調節し、そして例えば転写および翻訳を開始し、そして完了するために、リボソーム結合部位配列を有するであろう。必要な場合、Ｍｅｔコドンを、５’に、そして下流核酸挿入物とインフレームで挿入することによって、アミノ末端メチオニンを提供してもよい。また、標準的オリゴヌクレオチド突然変異誘発法を用いて、核酸挿入物のカルボキシル末端伸長を除去してもよい。
【００４７】
[0055]さらに、酵母発現を用いてもよい。酵母発現系にはいくつかの利点がある。第一に、酵母分泌系で産生されるタンパク質は、正しいジスルフィド対形成を示すという証拠が存在する。第二に、酵母分泌系によって、翻訳後グリコシル化が効率的に行われる。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プレプロアルファ因子リーダー配列（ＭＦ”−１遺伝子によってコードされる）は、酵母からのタンパク質分泌を指示するためにルーチンに用いられる（Ｂｒａｋｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８１：４６４２−４６４６（１９８４））。プレプロアルファ因子のリーダー領域は、シグナルペプチド、およびＫＥＸ２遺伝子にコードされる酵母プロテアーゼの認識配列を含むプロセグメントを含有する：この酵素は、Ｌｙｓ−Ａｒｇジペプチド切断シグナル配列のカルボキシル側で、前駆体タンパク質を切断する。ＦＳＨコード配列を、インフレームで、プレプロアルファ因子リーダー領域に融合させてもよい。次いで、この構築物を強い転写プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーターまたは解糖プロモーターの調節下に置く。核酸コード配列の後に、翻訳終結コドンが続き、その後に、転写終結シグナルが続く。あるいは、核酸コード配列を、第二のタンパク質コード配列、例えばＳｊ２６またはベータ−ガラクトシダーゼに融合させてもよく、こうしたタンパク質は、アフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の精製を容易にするために使用可能である。融合タンパク質の構成要素を分離する、プロテアーゼ切断部位の挿入は、酵母における発現に用いられる構築物に適用可能である。効率的な翻訳後グリコシル化および組換えタンパク質の発現はまた、バキュロウイルス系においても達成可能である。
【００４８】
[0056]哺乳動物細胞は、フォールディングおよびシステイン対形成、複合糖質構造の付加、および活性タンパク質の分泌などの重要な翻訳後修飾を支持する環境において、タンパク質の発現を可能にする。哺乳動物細胞における活性タンパク質の発現に有用なベクターは、強いウイルスプロモーターおよびポリアデニル化シグナルの間にタンパク質コード配列を挿入することによって特徴付けられる。ベクターは、ハイグロマイシン耐性、ゲンタマイシン耐性、あるいは選択可能マーカーとして使用するのに適した他の遺伝子または表現型、あるいは遺伝子増幅のためのメトトレキセート耐性を与える遺伝子を含有してもよい。メトトレキセート耐性コードベクターを用いるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、または適切な選択マーカーを用いる他の細胞株に、キメラタンパク質コード配列を導入してもよい。形質転換細胞におけるベクターＤＮＡの存在をサザンブロット分析によって確認してもよい。挿入物コード配列に対応するＲＮＡの産生をノーザンブロット分析によって確認してもよい。損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ヒトタンパク質を分泌することが可能な、多くの他の適切な宿主細胞株が当該技術分野において開発されてきており、そしてこれには、ＣＨＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、Ｊｕｒｋａｔ細胞などが含まれる。これらの細胞用の発現ベクターには、発現調節配列、例えば複製起点、プロモーター、エンハンサー、および必要な情報をプロセシングする部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列が含まれてもよい。例示的な発現調節配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。関心対象の核酸セグメントを含有するベクターを、細胞宿主のタイプに応じて多様である、周知の方法によって、宿主細胞内にトランスファーしてもよい。例えば、塩化カルシウム形質転換は、原核細胞のために一般的に利用され、一方、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、またはリポフェクチン仲介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーションは、他の細胞宿主のために使用可能である。
【００４９】
[0057]哺乳動物細胞における遺伝子発現のための別のベクター、ヒト・ガンマ−インターフェロン、組織プラスミノーゲン活性化因子、凝固因子ＶＩＩＩ、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、プロテアーゼＮｅｘｉｎｌ、および好酸球主要塩基性タンパク質の発現のために開発されたものと同様のものを使用してもよい。さらに、ベクターには、哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ−７）において挿入された核酸の発現のために利用可能な、ＣＭＶプロモーター配列およびポリアデニル化シグナルが含まれていてもよい。
【００５０】
[0058]遺伝子またはハイブリッド遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれによってもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ合成は、ベクターの宿主細胞として働きうる原核または真核細胞を形質転換する工程を含む。あるいは、遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系で生じてもよい。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系は、商業的に入手可能であり、これをルーチンに用いて、比較的多量のｍＲＮＡを合成する。こうしたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系において、糖タンパク質ホルモンをコードする核酸を、転写プロモーターに隣接して、発現ベクター内にクローニングする。例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩクローニングおよび発現ベクターは、強い原核転写プロモーターが隣接する、多数のクローニング部位を含有する（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。ＤＮＡテンプレートからＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成するために必要な試薬をすべて含有するキット、例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が入手可能である。このような系によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたＲＮＡを、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳して、望ましい糖タンパク質ホルモン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を産生してもよい。
【００５１】
[0059]糖タンパク質ホルモンを産生する別の方法は、タンパク質化学技術によって、２つのペプチドまたはポリペプチドを連結することである。例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学反応（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを用いて、現在利用可能な実験室装置を用い、ペプチドまたはポリペプチドを化学的に合成することも可能である。当業者は、ハイブリッド糖タンパク質ホルモンに対応するペプチドまたはポリペプチドを、標準的化学反応によって合成可能であることを容易に認識しうる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成して、そして合成樹脂から切断しなくてもよく、一方、ハイブリッドペプチドのもう一方の断片を合成し、そして続いて樹脂から切断し、それによって、もう一方の断片上に官能的にブロッキングされる末端基を曝露してもよい。ペプチド縮合反応によって、これらの２つの断片を、それぞれそのカルボキシル末端およびアミノ末端で、ペプチド結合を通じて、共有結合させて、ハイブリッドペプチドを形成してもよい（Ｇｒａｎｔ，  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  （１９９２）  ａｎｄ  Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９３））。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドを、上述のように、ｉｎ  ｖｉｖｏで独立に合成してもよい。ひとたび単離されたら、類似のペプチド縮合反応を通じて、これらの独立のペプチドまたはポリペプチドを連結して、糖タンパク質ホルモンを形成してもよい。例えば、クローニングまたは合成ペプチドセグメントの酵素的または化学的連結は、比較的短いペプチド断片が連結されて、より長いペプチド断片、ポリペプチドまたは全タンパク質ドメインが産生されることを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３０：４１５１（１９９１）；  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６６：７７６−７７９（１９９４））。
【００５２】
[0060]本発明の修飾糖タンパク質ホルモンは、ポリペプチド断片を産生することが可能な発現系において、ポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることによって得られる、組換えタンパク質であってもよい。例えば、ベータサブユニットと一緒に、糖タンパク質ホルモン受容体と相互作用し、そして糖タンパク質ホルモンと関連して生物学的効果を引き起こすことが可能な、修飾アルファサブユニットの活性ドメインを決定することも可能である。１つの例において、糖タンパク質ホルモンの活性または結合特異性またはアフィニティのいずれにも寄与しないことが見出されたアミノ酸は、それぞれの活性の喪失を伴うことなく欠失させることも可能である。
【００５３】
[0061]例えば、アミノまたはカルボキシル末端アミノ酸を、天然または修飾糖タンパク質ホルモンのいずれかから連続して除去して、そして上述の多くの利用可能なアッセイの１つにおいて、それぞれの活性を試験することも可能である。別の例において、本発明の修飾タンパク質では、アミノ末端またはカルボキシル末端アミノ酸のいずれかの部分、あるいはさらにホルモンの内部領域が、修飾糖タンパク質ホルモンの精製を容易にしうるポリペプチド断片または他の部分、例えばビオチンで置換されていてもよい。例えば、ペプチド化学反応を行うか、またはコード領域の発現がハイブリッドポリペプチドを生じるような、２つのポリペプチド断片をコードするそれぞれの核酸を発現ベクター内にクローニングするか、いずれかを通じて、修飾糖タンパク質を、マルトース結合タンパク質に融合させてもよい。アミロースアフィニティカラム上を通過させることによって、ハイブリッドポリペプチドをアフィニティ精製してもよく、そして次いで、特異的プロテアーゼ因子Ｘａでハイブリッドポリペプチドを切断することによって、修飾糖タンパク質をマルトース結合領域から分離してもよい。
【００５４】
[0062]また、本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子の活性断片を直接合成してもよいし、あるいはより大きい糖タンパク質ホルモンの化学的または機械的破壊によって得ることも可能である。活性断片は、天然存在アミノ酸配列由来の少なくとも約５つの連続アミノ酸のアミノ酸配列であって、適切な活性、例えば結合または制御活性を有する前記アミノ酸配列と定義される。他の配列に付着していてもまたはいなくても、断片にはまた、修飾糖タンパク質ホルモンに比較して、ペプチドの活性が有意に改変されるか損なわれない限り、特定の領域または特定のアミノ酸残基の、挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾が含まれていてもよい。これらの修飾は、いくつかのさらなる特性を提供してもよく、例えばジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去／付加する、生物学的寿命を増加させるなどが可能である。いかなる場合においても、ペプチドは、生物活性特性、例えば結合活性、結合ドメインでの結合の制御等を所持しなければならない。ホルモンの特異的領域の突然変異誘発の後、発現させ、そして発現されたポリペプチドを試験することによって、糖タンパク質ホルモンの機能的領域または活性領域を同定することも可能である。
【００５５】
[0063]本発明はまた、例えば、ＦＳＨ糖タンパク質への融合を含む、本明細書記載の突然変異を含む、融合タンパク質およびキメラタンパク質も含む。当該技術分野に知られる方法によって、適切なコードフレームで、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を、互いに連結し、そして上述の任意の手段によって、融合タンパク質を発現させることによって、こうした融合タンパク質を作製することも可能である。あるいは、例えばペプチド合成装置を用いて、タンパク質合成技術によって、こうした融合タンパク質を作製してもよい。本発明の一本鎖類似体およびキメラタンパク質は、アルファおよびベータサブユニット間に、またはキメラタンパク質の異なる部分間に、ペプチドリンカーを取り込んでもよい。
【００５６】
糖タンパク質ホルモンスーパーアゴニストの特徴付け
[0064]本明細書記載の野生型糖タンパク質ホルモンに対する単数または複数の修飾の影響は、任意のいくつかの方法で確認可能である。例えば、修飾糖タンパク質ホルモンをコードする核酸でトランスフェクションされた細胞内での二次メッセンジャー系に対する変化を測定して、そしてこれを野生型糖タンパク質ホルモンをコードする核酸でトランスフェクションされた類似の細胞に比較してもよい。あるいは、修飾糖タンパク質ホルモンの活性を受容体結合アッセイから、チミジン取り込みアッセイから、プロゲステロン産生アッセイから、またはＴ４分泌アッセイから決定してもよい。当業者は、野生型または修飾糖タンパク質ホルモンのいずれかの活性を決定するために使用するのに適した任意のアッセイを容易に決定可能である。
【００５７】
[0065]本発明の１つの態様において、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンの強度より増加した強度を有する。上述の技術のいずれかによって、または当業者に容易に決定されるような任意の他の適切なアッセイによって、この増加した強度を評価してもよい。増加した強度は、アッセイ間、または細胞株間で一貫している必要はなく、これはこれらがもちろん、多様であろうためである。
【００５８】
[0066]本発明の別の態様において、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンの最大有効性よりも増加した最大有効性を有する。上述の技術のいずれかによって、または当業者に容易に決定されるような任意の他の適切なアッセイによって、この増加した最大有効性を評価してもよい。増加した最大有効性は、アッセイ間、または細胞株間で一貫している必要はなく、これはこれらがもちろん、多様であろうためである。
【００５９】
[0067]本明細書記載の類似体を特徴付けるために適した他のアッセイが、本明細書にその全体が援用されるＰＣＴ／ＵＳ９９／０５９０８に記載される。例えば、限定されるわけではないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）アッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫放射線測定アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集反応、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等などの技術を用いた、競合的および非競合的アッセイ系を含む、多様なイムノアッセイを用いてもよい。
【００６０】
[0068]例えば、ベータサブユニットがＦＳＨのものである場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって、卵母細胞の品質および量の改善を評価することも可能である。超活性ＦＳＨを用いて、限定されるわけではないが、ヒト、マウス、ラット、霊長類、ウサギ、ブタ、ウマ、ヒツジ、およびイヌを含む動物由来の卵母細胞の品質および量を改善することも可能である。好ましくは、超活性ＦＳＨをヒトまたは任意の動物に投与する。卵母細胞形成、卵母細胞受精、および胚盤胞形成などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精プロセスの異なる終点を用いて、卵母細胞量および品質の改善を決定することが一般的である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精実験は、「過排卵プロトコル」にしたがうことも可能であり、該プロトコルにおいて、被験体を本発明記載の超活性ＦＳＨ類似体で治療し、これによって多数の卵母細胞の放出および成熟が導かれる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精実験において、ＦＳＨ（超活性ＦＳＨおよび組換え野生型ＦＳＨ）をｈＣＧとともに投与して、排卵を誘発してもよい。ｈＣＧまたは妊娠雌馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）のみを投与される対照動物を用いてもよい。動物において、卵母細胞の受精率を増加させることによって、卵母細胞の品質を改善することも可能である。超活性ＦＳＨで達成された受精率を、同じ量の組換え野生型ＦＳＨで達成された受精率に比較することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、超活性卵胞刺激ホルモンの受精率を決定することも可能である。ｈＣＧを投与される対照動物もまた用いてもよい。卵母細胞総数あたりに発生する２細胞胚の割合によって、受精率を測定してもよい。受精がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる場合、２細胞胚を受精プレート中で計数してもよい。マウスにおいて、２細胞胚は、受精のおよそ２４時間後に発生する。受精率は、投与した超活性ＦＳＨの量に基づいて多様である。動物は、多数の用量の超活性ＦＳＨを投与されてもよい。受精率は、卵母細胞数に関して、最大有効用量で、超活性ＦＳＨの投与の結果として、少なくとも約１０パーセント増加する。受精率は、卵母細胞数に関して、最大有効用量で、超活性ＦＳＨの投与の結果として、少なくとも約２０パーセント、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加することも可能である。超活性卵胞刺激ホルモンは、受精卵母細胞あたりの胚盤胞形成率を改善することによって、卵母細胞の品質を改善することも可能である。胚盤胞を形成する２細胞胚の割合を決定することによって、胚盤胞形成率を測定することも可能である。胚盤胞形成率は、胚盤胞がｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれで形成されても増加する。胚盤胞形成率は、投与した超活性卵胞刺激ホルモンの量に応じる。胚盤胞形成率は、卵母細胞数に関して、最大有効用量で、超活性卵胞刺激ホルモンの投与の結果として、少なくとも約１０パーセント増加する。胚盤胞形成率は、卵母細胞数に関して、最大有効用量で、超活性ＦＳＨの投与の結果として、少なくとも約２０パーセント、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加することも可能である。
【００６１】
[0069]超活性卵胞刺激ホルモンは、受精卵母細胞あたりの胚総数を増加させることによって、卵母細胞の品質を改善することも可能である。受精卵母細胞あたりの胚総数は、受精がｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれで行われても増加する。受精卵母細胞あたりの胚総数の増加は、投与した超活性卵胞刺激ホルモンの量に応じる。受精卵母細胞あたりの胚総数は、卵母細胞数に関して、最大有効用量で、超活性卵胞刺激ホルモンの投与の結果として、少なくとも約１０パーセント増加する。受精卵母細胞あたりの胚総数は、卵母細胞数に関して、最大有効用量で、超活性ＦＳＨの投与の結果として、少なくとも約２０パーセント、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加することも可能である。
【００６２】
[0070]例えば、ベータサブユニットがＣＧのものである場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏバイオアッセイによって、強力な黄体ホルモン（ＬＨ）様活性を評価することも可能である。超活性ＣＧは、排卵を誘導し、黄体の寿命を延長させ、プロゲステロン合成を増加させ、そして特定の種において、付属黄体（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｃｏｒｐｏｒａ  ｌｕｔｅａ）の形成を促進する。こうした作用は、より有効な卵母細胞収集、特定の種における卵母細胞品質の増加、妊娠および妊娠維持率の増加を生じる。
【００６３】
増加した血清半減期を持つ糖タンパク質ホルモン類似体
[0071]本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質はまた、野生型対応物に比較した際、血漿半減期が増加するようにさらに修飾されていることも可能である。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、Ｎ−グリコシル化および／またはＯ−グリコシル化部位を含む配列を含む、潜在的なグリコシル化部位をさらに含んでもよい。例えば、アルファサブユニットにペプチドＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）またはＶＮＶＴＩＮＶＴ（配列番号２０）を配置すると、アルファサブユニットの潜在的なグリコシル化部位が提供される。配列番号２０または配列番号１のペプチドを、ヒト野生型配列において、Ｄ３およびＱ５の間に配置してもよい。配列番号２０または配列番号１のペプチドを、ウシ、ウマ、ブタおよびヒツジ野生型配列において、Ｆ６およびＴ７の間に配置してもよい。挿入されるペプチドは、アミノ末端にさらなるスレオニン残基をさらに含んでもよい。グリコシル化を改変するために挿入されるべきさらなるペプチドには、ＮＶ、ＩＮＶ、およびＴＮＶペプチド、ならびにＴＮＶＴＩＮＶ（配列番号１２）が含まれる。例えば、糖ホルモンの修飾アルファサブユニットには、Ｆ６およびＴ７の間のＮＶの挿入に加えて、Ｔ７およびＴ８の間のＩＮＶの挿入が含まれてもよい。また、ＰＥＧ化または他の適切な化学基のコンジュゲート化によって、あるいは増加した半減期を有する融合タンパク質を構築するかまたは任意の他の方法によっても、増加した半減期が提供されうる。こうした方法は当該技術分野に知られ、例えば、米国特許５，６１２，０３４、米国特許６，２２５，４４９、および米国特許６，５５５，６６０に記載される通りであり、これらの特許は各々、その全体が本明細書に援用される。
【００６４】
[0072]分子内の負に荷電した残基数、例えばグルタミン酸および／またはアスパラギン酸残基数を増加させることによってもまた、半減期を増加させることが可能である。こうした改変は、部位特異的突然変異誘発によって達成可能である。こうした改変はまた、修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質内に１またはそれより多い負に荷電した残基を含有するアミノ酸配列を挿入することを通じてもまた達成可能である。
【００６５】
[0073]タンパク質の半減期は、タンパク質安定性の測定値であり、そしてタンパク質濃度の１／２の減少に必要な時間を示す。長期に渡って被験体由来の試料中のホルモンレベルを測定するのに適した任意の方法によって、例えば、限定されるわけではないが、抗体を用いて、修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の投与後の期間に渡って採取される血清試料中のレベルを測定する、イムノアッセイによって、または標識糖タンパク質ホルモンの投与後に被験体から採取される試料中の標識ホルモン分子、すなわち放射標識分子の検出によって、本明細書記載の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の血清半減期を決定してもよい。
【００６６】
治療法
[0074]本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質を用いて、糖タンパク質ホルモン活性に関連する任意の状態を治療することも可能である。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質を用いて、治療が必要な被験体を治療することも可能である。被験体は、動物、例えば哺乳動物、爬虫類、魚類、鳥類および両生類であってもよい。被験体は、哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ブタまたはウマであってもよい。動物には、家畜および家庭飼育ペット、例えばイヌおよびネコが含まれる。被験体は、糖タンパク質ホルモン活性の改善が必要な、ヒト患者または動物であってもよい。糖タンパク質ホルモン活性に関連する状態は、改変された糖タンパク質ホルモン反応性によって完全にまたは部分的にのいずれかで引き起こされるもの、あるいは糖タンパク質ホルモンの投与から利益を受けるものである。例えば、こうした状態には、限定されるわけではないが、排卵機能不全、黄体期欠損、未解明の不妊、男性要因不妊、時間限定受胎、低ＦＳＨ受容体発現、低ＦＳＨ受容体感受性、ＦＳＨ受容体結合不全、ＦＳＨ受容体カップリング不全、低テストステロン産生、男性型脱毛症、および下垂体不全または傷害が含まれる。
【００６７】
[0075]例えば、動物に、本明細書に記載するような超活性ＦＳＨ類似体を投与することによって、卵母細胞の量および品質を改善することも可能である。例えば、出願者らは、驚くべきことに、修飾アルファサブユニットを含有する超活性ＦＳＨを投与することによって、卵母細胞量および品質に劇的な増加が得られることを見出した。卵母細胞量および品質に対する超活性ＦＳＨの効果は、超活性ＦＳＨのＦＳＨ血清半減期を増加させることによって、さらに増進可能である。超活性ＦＳＨをさらに修飾することによって、ＦＳＨ血清半減期を増加させることも可能である。限定されるわけではないが、先に記載するものを含むさらなる修飾を用いて、ＦＳＨ血清半減期を増加させることも可能である。
【００６８】
[0076]本発明の修飾ＦＳＨ、ＣＧ、ＬＨ、またはＴＳＨ糖タンパク質ホルモンタンパク質はまた、男性または女性被験体のいずれかにおいて、補助生殖医療の療法措置（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ    ｂｒｅｇｉｍｅｎ）において用いてもよく、該措置は、被験体に修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の補助量を投与する工程を含む。こうした方法において、類似体を、単独で、または例えば限定されるわけではないが、クエン酸クロミフェンおよびＧｎＲＨ（ゴナドトロピン放出ホルモン）を含む他の療法剤と組み合わせて投与してもよい。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質を、１またはそれより多い糖タンパク質の組み合わせとして投与してもよい。例えば、修飾アルファサブユニットをＦＳＨベータサブユニット、ＣＧベータサブユニット、ＴＳＨベータサブユニット、および／またはＬＨベータサブユニットと、一緒に、または別個に、組み合わせてもよく、そして次いで、修飾糖タンパク質を被験体に投与する。例えば、孤立性ゴナドトロピン不全（ＩＧＤ）を持つ被験体において、修飾ＦＳＨ、ＣＧ、ＴＳＨ、およびＬＨを被験体に投与して、正常性腺機能を回復することも可能である。当該技術分野において、糖タンパク質ホルモン、例えばＦＳＨ、ＣＧ、ＴＳＨ、ＬＨは、女性生殖生理において不可欠であり、そしてこれらの糖タンパク質ホルモンを被験体に投与して、多くの生殖障害を克服し、そしてそれによって生殖を補助することも可能である。
【００６９】
[0077]単回および多数回注射投薬措置を、修飾ウマＣＧ糖タンパク質に関して試験する。ウマ、ウシ、またはブタにおけるｅＣＧ類似体を用いた超刺激のため、単回または２：１スプリットｅＣＧ類似体注射を用いる。ｅＣＧ類似体のための用量範囲決定研究には、３０、４５、６０、７５、９０、１０５および１２０ｍｃｇの単回ｉｍ．注射が含まれる。最適用量を２：１比で試験して、そして場合による第二のスプリット用量は、第６日または別の日付のＰＥＧ２アルファ治療と同時に行われるであろう。修飾ｅＣＧでの治療は、ウマ、ウシ、およびブタにおいて、過排卵を生じる。
【００７０】
[0078]当業者は、投与すべき糖タンパク質ホルモンの有効量を容易に決定可能であり、そしてこれは、体重、大きさ、特定の状態の重症度および被験体自身のタイプなどの要因に応じるであろう。療法的有効量は、ルーチンの最適化法によって容易に決定可能である。本発明は、野生型糖タンパク質ホルモンに比較して増加した強度を持つ糖タンパク質ホルモンを提供する。これらの修飾糖タンパク質ホルモンは、当業者が、野生型糖タンパク質ホルモンに比較して、より少ない用量の修飾糖タンパク質ホルモンを投与して、類似の療法的効果を達成することを可能にするか、あるいは、野生型糖タンパク質ホルモンの用量と類似の用量の修飾糖タンパク質ホルモンを投与して、増加した療法効果を達成することを可能にするであろう。
【００７１】
[0079]糖タンパク質ホルモンを経口、非経口、または別の方式で投与するかに応じて、プロスタグランジンの投与は、固形、半固形、または液体投薬型であってもよく、例えば錠剤、丸剤、カプセル、粉末、液体、クリーム、および懸濁物等であってもよく、好ましくは、正確な投薬量の送達に適した単位投薬型である。糖タンパク質ホルモンには、薬学的に許容されうるキャリアーと組み合わせた、有効量の選択された糖タンパク質ホルモンが含まれてもよく、そしてさらに、他の薬剤、薬学的剤、キャリアー、アジュバント、希釈剤等も含まれてもよい。「薬学的に許容されうる」によって、生物学的にまたは別の意味で望ましくないものではない物質を意味し、すなわち物質は、許容しえない生物学的影響を引き起こすか、または糖タンパク質ホルモンと許容しえない方式で相互作用することなく、選択された糖タンパク質ホルモンと一緒に個体に投与可能である。こうした投薬型を調製する実際の方法が知られているか、または当業者には明らかになるであろう；例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）を参照されたい。
【００７２】
[0100]本発明を説明し、そして例示するため、以下の実施例を提供する。こうしたものとして、これらは、本発明の範囲を限定すると見なされてはならない。当業者は、多くの他の態様もまた、上記に、そして請求項に記載されるため、本発明の範囲内に属することを認識するであろう。
【実施例】
【００７３】
アルファサブユニット類似体の設計
[0101]野生型β−サブユニットを伴う、Ｑ１３Ｒ＋Ｅ１４Ｒ＋Ｐ１６Ｒ＋Ｑ２０Ｒでα−サブユニットに修飾を含む、ヒトＦＳＨスーパーアゴニスト糖タンパク質（ヒト４Ｒ）は、その野生型対応物に勝る有意な結合優位性を示した。
【００７４】
[0102]表１は、ヒトアルファ野生型（ＷＴ）および選択されたｈＦＳＨスーパーアゴニスト一次アミノ酸構造の比較を示す。ヒトアルファ野生型および突然変異型のＮ末端部分（９２総残基のアミノ酸残基１〜２８）を示す。アルギニン（Ｒ）への４つのスーパーアゴニスト置換の位置は、影の領域に示される。１または２のさらなるＮ連結炭水化物鎖を導入する選択された４つの異なる挿入物は、野生型配列のアミノ酸Ｄ３およびＱ５の間に示される。
【００７５】
[0103]表１．
【００７６】
【表１】
0006429774.tif 000002
【００７７】
[0104]表１中のセグメントは以下のように列挙される：配列番号４３：  ｈＦＳＨ  ＷＴ；配列番号３３、ｈＦＳＨアルファ（４Ｒ）；配列番号３４、ｈＦＳＨアルファ（４Ｒ＋Ｉｎｓ１）；配列番号３５、ｈＦＳＨアルファ（４Ｒ＋Ｉｎｓ２）；配列番号３６、ｈＦＳＨアルファ（４Ｒ＋Ｉｎｓ３）；配列番号３７、ｈＦＳＨアルファ（４Ｒ＋Ｉｎｓ４）。
【００７８】
[0105]いくつかの態様におけるウシＦＳＨ（ｂＦＳＨ）置換は、ヒトＦＳＨアルファサブユニットにおいて先に突然変異誘発された残基に非常に類似であり、そしてこれには「５Ｒ」と称される５つの突然変異の組み合わせ（Ｋ１５Ｒ＋Ｋ１７Ｒ＋Ｅ１８Ｒ＋Ｋ２０Ｒ＋Ｋ２４Ｒ）が含まれる。例えば、配列番号７。導入されたグリコシル化認識配列（ＮＸＴまたはＮＸＳ）が、Ｎ連結炭水化物鎖の付着を導く可能性を増加させるため、１８の異なるウシアルファサブユニット構築物を確立し、そして先に開発された発現ベクター内にクローニングした。１２の構築物は、Ｎ末端伸長ペプチド配列、ＡＮＩＴＶ、ＡＮＴＴＡ、ＡＮＴＳＡ、ＡＮＩＴＶＮＩＴＹ、ＡＮＴＳＡＮＴＴＡおよびＡＮＴＳＡＮＴＳＡを含有した。
【００７９】
[0106]表２は、ウシアルファ野生型（ＷＴ）および選択されたｈＦＳＨスーパーアゴニスト一次アミノ酸構造の比較を示す。ウシアルファ野生型および突然変異ウシアルファのＮ末端部分（９６総残基のアミノ酸残基１〜３２）を示す。アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）への５つのスーパーアゴニスト置換の位置は、アミノ酸Ｃ１４およびＰ２５の間の影の領域に示され、５Ｒまたは４Ｒ＋１Ｋとコードされる。１または２のさらなるＮ連結炭水化物鎖を導入する選択された４つの異なる挿入物は、野生型配列のアミノ酸Ｆ６およびＴ８の間に示される。
【００８０】
[0107]表２中のセグメントは以下のように列挙される：配列番号４４、ＷＴ  ｂＦＳＨ；配列番号２３、ｂＦＳＨアルファ（５Ｒ）；配列番号２４、ｂＦＳＨアルファ（４Ｒ＋１Ｋ）；配列番号２５、ｂＦＳＨアルファ（５Ｒ＋Ｉｎｓｌ）；配列番号２６、ｂＦＳＨアルファ（５Ｒ＋Ｉｎｓ２）；配列番号２７、ｂＦＳＨアルファ（５Ｒ＋Ｉｎｓ３）；配列番号２８、ｂＦＳＨアルファ（５Ｒ＋Ｉｎｓ４）；配列番号２９、ｂＦＳＨアルファ（４Ｒ＋１Ｋ＋Ｉｎｓｌ）；配列番号３０、ｂＦＳＨアルファ（４Ｒ＋１Ｋ＋Ｉｎｓ２）；配列番号３１、ｂＦＳＨアルファ（４Ｒ＋１Ｋ＋Ｉｎｓ３）；配列番号３２、ｂＦＳＨアルファ（４Ｒ＋１Ｋ＋Ｉｎｓ４）。
【００８１】
[0108]表２
【００８２】
【表２】
0006429774.tif 000003
【００８３】
[0109]突然変異を含むウマ糖タンパク質アルファサブユニットもまた産生し、そしていくつかの態様には、Ｋ１５Ｒ、Ｅ１８Ｒ、Ｋ２０Ｒ、およびＫ２４Ｒの置換が含まれる。例えば、配列番号９；配列番号３８〜４０。さらに、Ｋ１５Ｒ、Ｅ１８Ｈ、Ｋ２０Ｒ、およびＫ２４Ｒを有するウマ糖タンパク質アルファサブユニットもまた生成した（例えば配列番号４１；配列番号４２）。これらの突然変異アルファサブユニットはまた、サブユニットのＦ６およびＴ７の間にＮＶＴＩＮＴの挿入（例えば配列番号９、４０、および４２）またはＦ６およびＴ７の間にＮＶ挿入に加えて、Ｔ７およびＴ８の間にＩＮＶ（例えば配列番号３８、３９、および４１）を含有する。
【００８４】
[0110]ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いたｂＦＳＨ類似体の一過性トランスフェクションは、リポフェクタミンに基づく方法に比較した際、ｂＦＳＨ類似体発現の３．７〜４．５倍の増加を生じた（データ未提示）。ヘテロ二量体特異的ＥＬＩＳＡに基づく多様なＦＳＨ類似体の発現レベルは、ＦＳＨ二量体形成の大きな損失はまったく示さず、そして高レベル発現を達成するには、単一鎖構築物が必要であるという先の主張を支持しない。
【００８５】
[0111]一過性発現されたｂＦＳＨ類似体の選択には、ｃＡＭＰに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイおよびＰＫスクリーニングアッセイが含まれた（図１および２を参照されたい）。ブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ−Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖ）およびｂＦＳＨ対照に比較した際、５Ｒ置換を持つｂＦＳＨの強度は有意に３〜４倍増加した（図１Ａ）。顕著なことに、多くの先の研究とは対照的に（図１Ｂ）（Ｈｅｉｋｏｐｐ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６１：８１−８４，  １９９９；  Ｔｒｏｕｓｄａｌｅ，  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．  ９１：２６５−２７０，  ２００９）、新規ネオグリコシル化挿入物は、ウシＦＳＨ  ５Ｒ類似体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を減少させないことが見出されてきている（図１Ｃ）。同一のネオグリコシル化部位をＮ末端に付加すると、ｂＦＳＨのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性は減少し、これは、エリスロポエチンの生得的活性に対するネオグリコシル化の減弱効果（Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３２：１１４６−１１５５，  ２００４；  Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１：４１４４−４２１，  ２００３；  Ｓｉｎｃｌａｉｒ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ９４：１６２６−１６３５，  ２００５）、および部位特異的ＰＥＧ化を含む半減期アプローチの多くの他の延長の影響（Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ９７：４１６７−４１８３，  ２００８；  Ｕｃｈｉｙａｍａ，  Ｖｅｔ．  Ｊ．  １８４：２０８−２１１，  ２０１０）と同様であった。マウスにおける２日間のＰＫスクリーニング研究によって、すべてのネオグリコシル化ウシＦＳＨ「５Ｒ」類似体は、ｂＦＳＨ−ＷＴおよびＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖに比較した際、増加した最終半減期を有した（図２Ａおよび２Ｂ）。ＰＫスクリーニングアッセイ由来のデータによって、１つまたは２つの導入されたネオグリコシル化部位（挿入物１および２）でのグリコシル化のため、ｂＦＳＨ−ＷＴ、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−ＶおよびＴＲ４４０１対照に比較した際、血漿半減期が非常に延長されたことが示された。観察されるレベルは、２９アミノ酸リンカーおよび４−５  Ｏ連結炭水化物鎖を持つｂＦＳＨ−一本鎖分子と匹敵した。組み合わせスーパーアゴニストおよびネオグリコシル化挿入物として作製された、「挿入物１および２」と称される、２つの最初に試験された類似体は、５Ｒスーパーアゴニスト対照単独に匹敵するｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有し（図１Ｃ）、そしてなお、マウスにおいて、延長された半減期を有した（図２Ｂ）。スーパーアゴニスト活性の減少を伴わない、こうした長期作用性類似体は、前例がなく、そしてこれは、ウシにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで、期待される印象的な成績を収めた。
【００８６】
[0112]フラスコ、振盪装置、ローラーボトルおよびバイオリアクターを用いて、ＣＨＯ細胞で、数百ミリグラムの多様なヒトＦＳＨおよびＴＳＨを組換え的に産生した（ｒＦＳＨまたはｒＴＳＨ）。最初の研究中、二シストロン性レトロウイルスベクター系を、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞におけるＦＳＨおよびＴＳＨ類似体の高レベル発現のために最適化した。ヒトｒＦＳＨ調製を試験した。単回６０μｇ用量のｒＦＳＨは、卵胞発達を誘導し、多量の優れた品質の胚を生じ、先に最適化された、４日間に渡って１日２回投与されるＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖ（３００ｍｇ）の８回の注射に一致し、Ｉ．Ｍ注射後の吸収遅延、ならびに増進されたＦＳＨ受容体常住時間などのユニークな特性をさらに支持した。図３および５〜８を参照されたい。１０μｇ用量のｒＦＳＨスーパーアゴニストは、１２日間に渡って、成長中の卵胞、特にヒトにおいてはＦＳＨ受容体数が少ないこともまた知られる３〜５ｍｍサイズの範囲の卵胞の増進されたプールを補充し、そして維持する例外的な能力を示した（データ未提示）。ｒＦＳＨによる小さい卵胞のこの予期されぬ増進および補助は、対照Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖの先に最適化された投薬では観察されず、これによって、周期のランダムな段階のＦＳＨ反応性卵胞を補充し、そしてＦＳＨ受容体数または機能の減少によって引き起こされる劣った反応者の多くにおいて、ＩＶＦおよび過排卵に成功する潜在的可能性を増進させる新規方法が提供される（Ｐｅｒｅｚ  Ｍａｙｏｒｇａ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５２：３２６８−３３６９，  ２０００；  Ｌｅｖａｌｌｅｔ，  Ａｒｃｈ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｄ．  ３０：４８６−４９４，  １９９９；  Ｒａｎｎｉｋｋｏ，  Ｍｏｌ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ８：３１１−３１７，  ２００２；  Ｃａｉ，  Ｆｅｒｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．  ８７：１３５０−１３５６，  ２００７）。しかし、４つのアルギニン置換を含むウシＦＳＨおよびヒトＦＳＨに基づくアルファサブユニットの間には、４０アミノ酸の相違があるため、同じウシにおいて、ｒＦＳＨでの以前の治療からのある程度の持ち越し効果があり、これはウサギおよびアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）におけるヒトＦＳＨの免疫原性特性を示す先のデータ研究とも一致した（Ｃａｉ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３０：１５３−１６１，  ２０１１；  Ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ，  Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ７２：６５５−６６２，  ２００９）。
【００８７】
[0113]アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）残基を、共通のアルファサブユニットの選択された修飾許容性領域に導入すると、発展中の糖タンパク質ホルモンの活性が調節され（Ｓｚｋｕｄｌｉｎｓｋｉ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：１２５７−１２６３，  １９９６；  Ｓｚｋｕｄｌｉｎｓｋｉ，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ８２：４７３−５０２，  ２００２）、そして糖タンパク質ホルモン受容体のヒンジ領域中に位置する負に荷電したクラスターとの静電相互作用において、重要な役割を果たす（Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ２１：１１１−１２２，  ２０１０；  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８４：１６３１７−１６３２４，  ２００９；  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １５２：３２６８−３２７８，  ２０１１）ことが以前示されてきている。特異的ｂＦＳＨスーパーアゴニスト発展には、本明細書のデータ、ならびにｈＦＳＨおよび他の糖タンパク質ホルモン類似体に関する他の研究（Ｓｚｋｕｄｌｉｎｓｋｉ，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ８２：４７３−５０２，  ２００２）に示されるように、より強力で、そして有効な分子であって、作用期間が増加するように、吸収遅延が伴うことも可能な分子を生じる、４〜５のＲおよび／またはＫへの最小限の置換が含まれる。増加したスーパーアゴニスト強度／有効性を減少させることなく、半減期を増加させて、単回注射類似体を産生する、１または２の炭水化物ネオグリコシル化部位を含有する最小限の長さのアミノ酸挿入物もまた、調べられてきている（図４を参照されたい）。さらなる分析のため、野生型配列のアミノ酸６および８の間に位置するペプチド挿入物ＮＶＴＩＮＶ、ＮＶＴＩＮＶＴ、ＮＶおよびＮＶＴを含有する８つの構築物が使用可能である。本明細書のデータに示すように、そして先のネオグリコシル化およびＰＥＧ化研究（Ｔｒｏｕｓｄａｌｅ，  Ｆｅｒｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．  ９１：２６５−２７０，  ２００９；  Ｕｃｈｉｙａｍａ，  Ｖｅｔ  Ｊ．  １８４：２０８−２１１，  ２０１０；  Ｐｅｒｌｍａｎ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８８：３２２７−３２３５，  ２００３）とは対照的に、複合糖質を含有する最小限の長さのアミノ酸挿入物を操作して、増加したスーパーアゴニスト強度／有効性を減少させることなく、半減期を増加させることが可能である。ＰＥＩおよびローラーボトルを用いた最適化高発現系を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において、一過性トランスフェクションによって、これらの新規類似体を発現させることも可能である。
【００８８】
[0114]ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いた捕捉工程の後、ＭｏｎｏＱイオン交換クロマトグラフィで類似体を選択した後、ゲル濾過を用いた最終精錬を用いて、一過性トランスフェクションによって発現させた選択される４〜６の類似体の精製を行うことも可能である。ｂＦＳＨ類似体の純度は、９８％より高い可能性もある。累積回収は、５０％に到達する可能性もあり、総合すると５０倍の精製になることも可能である。すべての類似体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、ＣＨＯ−ＦＳＨＲ細胞株を用いたロバストｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃＡＭＰバイオアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル分析によって、特徴付け可能である。また、逆相ＨＰＬＣによる厳密な定量化、炭水化物組成分析、ならびに安定性および凝集状態の評価によって、選択された精製類似体を分析してもよい。
【００８９】
[0115]さらなる実験は、アルファサブユニットの１５Ｋ、１７Ｋ、１８Ｋ、２０Ｋ、および２４Ｋにおけるアルギニン（Ｒ）への置換、ならびにアルファサブユニットの６Ｆおよび７Ｔの間のＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）挿入を含む、ウシＦＳＨ類似体ＴＲ５５６０１（アルファサブユニット：配列番号７）を生じた。ＴＲ５５６０１のいくつかのロットを生成し、そしてＩＥＦおよびウェスタンブロット分析を用いて試験した。図３Ａ〜Ｄは、分析の例示的な結果を示す。図３Ａ〜３Ｄは、部分的に、ＴＲ５５６０１／ロット４およびロット５が、最適な分布を示すことを立証し、そしてこのロットにおける突然変異の有効性を検証する。ロット４および５ならびに類似のスクリーニング結果を有するロットを動物治療に用いた。例えば、ＩＥＦ−ウェスタンブロット分析は、図３Ａ〜Ｃのロット４およびロット５のＴＲ５６００１の最適化酸性アイソフォームを例示する。一方、図３Ａおよび３Ｃに示すように、ロット３は、完全には検証されず、そして動物治療には用いられなかった。ｂＦＳＨ類似体、および特にＴＲ５５６０１の試料もまた、マウスにおけるＰＫスクリーニングアッセイで研究した。選択されたｂＦＳＨ試料をマウスに皮下注射し、そして注射２４時間後、３２時間後、および４８時間後に、血液試料を採取した。血漿を単離し、そしてｂＦＳＨ  ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）で分析した。ＴＲ５５６０１試料のロット４の延長された半減期を、ＰＫスクリーニングアッセイで確認した。データ未提示。
【００９０】
[0116]選択された候補類似体の完全薬物動態学的プロファイルを、ラットあたり１０μｇの単回用量のｓｃ投与、ならびに分布期および排出期の両方に渡る、１０の異なる血液収集時間（１、５、１５、３０分、ならびに１、２、６、２４および４８時間）によって実行することも可能である。ｂＦＳＨ−ＥＬＩＳＡを用いて、血漿において、ウシＦＳＨ血漿レベルを定量化することも可能である。全ＰＫ分析を行ってもよい。
【００９１】
[0117]大規模産生、精製およびウシにおける過排卵研究のため、二シストロン性発現ベクターを構築し、そして調製中のＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において類似体発現を選択し、そして増幅するため、類似体を選択した。ＣＨＯ−ＤＨＦＲ（−）ＤＧ４４細胞を発現ベクターで同時トランスフェクションし、そしてメトトレキセート（ＭＴＸ）の段階的増分を含有する培地中、遺伝子増幅に供した。多角形形態を再獲得した後（２〜３週）、次の増幅工程のため、細胞を特定した。＞２ｐｇ／細胞／日の分泌レベルを提示するクローンを、第二の処理に供し、ＧＳマーカー遺伝子（ＭＳＸ）を増幅するよう指示してもよい。最大１０ｐｇ／細胞／日の分泌レベルに到達する、さらなる２〜５倍の増加を得ることも可能である。
【００９２】
調製およびアルファサブユニット類似体を用いた実験
[0118]ｒＦＳＨが単回筋内（Ｉ．Ｍ．）注射後、過排卵反応を誘導し、そして６０μｇが最適用量に非常に近いようであるが、ウシをｒＦＳＨに３回またはそれより多く曝露した際、過排卵反応には有意な減少があった。したがって、「５Ｒ」置換、ならびにＦ６およびＴ７の間にＮＶＴＩＮＴの挿入を有するアルファサブユニット（配列番号７）を含む、ＴＲ５５６０１  ｒＦＳＨと呼ばれる新規ｒＦＳＨ配合物を試験する実験を設計した。目的は、まず、肉用牛において、過排卵反応を誘導する、ｒＦＳＨでの単回またはスプリット用量治療の効果を決定し、そして次いで、ｒＦＳＨの単回注射の過排卵反応をさらに評価し、そしてウシをｒＦＳＨに２または３回曝露した際、過排卵反応が高いままであるかどうかを決定することであった。
【００９３】
[0119]ＴＲ５５６０１  ＦＳＨ試料を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ラットにおいて、古典的Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ  ＦＳＨバイオアッセイで分析した（Ｓｔｅｅｌｍａｎら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ５３：６０４−６１６，  １９５３）。雌スプレーグ・ドーリーラット（２００〜２２０ｇ）に単回用量の試験物品（例えばｂＦＳＨ）またはビヒクルを注射し、４０ＩＵのｈＣＧを補った。投薬の７２時間後、卵巣重量を測定した。図４を参照されたい。各群をｈＣＧで治療して、ベースラインを提供した。ＴＲ５５６０１  ｂＦＳＨは、すべての濃度で、卵巣重量を有意に増加させる。
【００９４】
[0120]図５は、過排卵、排卵の誘導および固定時間人工的精子注入のための卵胞波同調プロトコルを示し、ここでＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−ＶＲ（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ）の８回の注射をＴＲ５５６０１の単回または二重注射に置き換える。治療には、プロゲステロン（Ｐ４）放出膣内デバイスの挿入、および第０日の安息香酸エストラジオール（ＢＥ）の投与が含まれた。単回または二重注射として投与されるＴＲ５５６０１を用いて、過排卵治療を第４日に開始した。第二のスプリット用量注射は、第６日のＰＧＦ２α治療と同時であった。プロゲステロンデバイスを、第７日の最後のＦＳＨ注射とともに除去した。第８日、ドナーには、ブタＬＨを投与し、そして発情期検出なしに、１２時間後および２４時間後に、または第８日（ｐＬＨの１６時間後）に１回、精子注入した。卵子／胚を、非外科的に第１５日に収集した（２、３）。Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（登録商標）を対照として用いた；総量３００ｍｇ＊を、４日間に渡って１日２回、８回の筋内（ＩＭ）注射で投与した（非常に不純なＮＩＨ−ＦＳＨ−Ｐ１参照標準に基づいて、ｍｇ＊）。
【００９５】
[0121]特に、以前の胚産生歴に基づいて、３０頭の非泌乳Ｒｅｄ  Ａｎｇｕｓウシを階層化し、そしてブロック化し、そして３つの治療群の１つにランダムに割り当てた。対照群のウシ（ｎ＝１０）には、３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖを、４日間の期間に渡って投与される１日２回減少用量プロトコルで、Ｉ．Ｍ．投与した。具体的には：第４日、３．０ｍＬ（午前および午後）；第５日、２．５ｍＬ（午前および午後）；第６日、１．５ｍＬ（午前および午後）および第７日、０．５ｍＬ（午前および午後）。ｒＦＳＨ  ６０μｇ治療群にいるウシには、６０μｇ  ｒＦＳＨの単回Ｉ．Ｍ．注射を投与し、そしてｒＦＳＨ  ４０−２０μｇ治療群のウシには、第４日に４０μｇ  ｒＦＳＨのＩ．Ｍ．注射を投与し、その後、第６日に２０μｇ  ｒＦＳＨの別のＩ．Ｍ．注射を投与した。
【００９６】
[0122]次いで、３０頭のウシのうち２５頭を、再び、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）または６０μｇのｒＦＳＨの単回注射で、超刺激した。対照群の動物（ｎ＝１０）は、対照群のままであり、そして実験１において、ｒＦＳＨ  ６０μｇの１０頭のウシのうち８頭を、ｒＦＳＨの単回Ｉ．Ｍ．注射によって再び治療した。さらに、ｒＦＳＨのスプリット−単回注射で先に治療した１０頭のウシのうち７頭を、ｒＦＳＨの単回Ｉ．Ｍ．注射で治療した。胚収集の間の間隔は、２９日間であった。
【００９７】
[0123]第二の実験に用いた２５頭のウシのうち２４頭を、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）または６０μｇのｒＦＳＨの単回注射で超刺激した。再び、対照ウシは、対照群のままであり、そしてｒＦＳＨウシはｒＦＳＨ群のままであった。胚収集の間の間隔は、３０日間であった。
【００９８】
[0124]第０日（実験開始）、すべての動物に、５ｍｇエストラジオール１７βに加えて、５０ｍｇのプロゲステロン、およびプロゲステロンに含浸させた膣内デバイス（Ｃｕｅ−Ｍａｔｅ，  Ｂｉｏｎｉｃｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）を投与した。第４日（卵胞波出現の予期される日）、上述の群にしたがって、すべてのウシを超刺激した。単回Ｉ．Ｍ．注射ｒＦＳＨの６０μｇ用量は、７．５ｍＬを構成し、そしてＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖを減少用量プロトコルで８回のＩ．Ｍ．注射で投与した。すべての動物には、５００μｇのクロプロステノール（Ｃｙｃｌａｓｅ、Ｓｙｎｔｅｘ、アルゼンチン）を、第６日、朝および夕方にＩ．Ｍ．注射した。Ｃｕｅ−ｍａｔｅを第６日の夕方に取り除いた。第８日の朝、ウシに、１００μｇのゴナドレリン（Ｇｏｎａｓｙｎ、Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）を投与し、そして１２時間後および２４時間後に精子注入した。すべてのウシに、同じ雄ウシ由来の凍結精子を精子注入した。第１５日、非外科的に、卵子／胚を収集し、そしてＩＥＴＳ推奨にしたがって評価した。
【００９９】
[0125]ＣＬの存在ならびに卵胞サイズおよび数に関して、第０日、第４日、第６日および第８日に、すべてのウシを超音波検査し、そして卵胞成長プロファイルを決定した。第１５日、超音波検査および直腸触診によって、ＣＬおよび直径＞１０ｍｍの卵胞の数を計数することによって、排卵反応を確認した。
【０１００】
[0126]各実験において、分散の正規性および均一性に関して、データポイントをまず評価した。分散は群間で異なるため、平方根によってデータを変換し、そして一方向ＡＮＯＶＡによって分析した。３回の実験を完了した後、全体の反応の分析を二方向ＡＮＯＶＡによって行い、実験番号および治療ならびにその相互作用の影響を検出するであろう。保護つきＬＳＤ検定によって平均を比較した。ＭＩＸＥＤ法によって卵胞データを分析して、治療の影響、日、ならびに卵胞数および成長プロファイルに対するその相互作用を検出した。Ｉｎｆｏｓｔａｔ分析ソフトウェア（コルドバ国立大学、アルゼンチン）を用いてすべての分析を行った。
【０１０１】
[0127]過排卵反応および卵子／胚データを表３に要約する。ＣＬ平均数および卵子／胚収集の日に２≦ＣＬであるウシは、群間で異ならなかったが、ｒＦＳＨのスプリット注射は、より多数の非排卵卵胞（Ｐ＜０．０５）を生じた。総卵子／胚、受精卵およびトランスファー可能な胚（グレード１、２および３）の平均数もまた、異ならなかった。
【０１０２】
[0128]表３は、ＴＲ５５６０１（ｒＦＳＨ）の単回またはスプリット単回用量での過排卵を示す。
【０１０３】
[0129]表３：  ｒＦＳＨ（ＴＲ５５６０１）の単回（６０μｇ）またはスプリット単回（４０−２０μｇ）Ｉ．Ｍ．注射、あるいは１日２回４日間に渡ってＩＭ注射によって投与される３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（登録商標）（対照）で治療した肉用牛における、黄体（ＣＬ）の平均（±ＳＥＭ）数、直径＞１０ｍｍの卵胞、卵子／胚収集時点で≦２  ＣＬであるウシの数、卵子／胚の数、受精卵、ならびにグレード１、２、および３の胚（トランスファー可能な胚）。
【０１０４】
【表３】
0006429774.tif 000004
【０１０５】
[0130]第二の投薬に関する過排卵反応および卵子／胚データを表４および５に要約する。ＣＬの平均数、＞１０ｍｍの卵胞、および卵子／胚収集日に≦２  ＣＬであるウシは、群間で異ならなかった。総卵子／胚、受精卵およびトランスファー可能な胚（グレード１、２および３）もまた、群間で異ならなかった。
【０１０６】
[0131]表４および５は、ＴＲ５５６０１（ｒＦＳＨ）の単回用量での過排卵を示す。
【０１０７】
[0132]表４．  ＣＬの平均（±ＳＥＭ）数、直径＞１０ｍｍの卵胞、および卵子／胚収集時点で≦２  ＣＬであるウシの数。ウシを、ｒＦＳＨの単回（６０μｇ）Ｉ．Ｍ．注射、または１日２回４日間に渡ってＩ．Ｍ．注射で投与される３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）で治療した。
【０１０８】
【表４】
0006429774.tif 000005
【０１０９】
[0133]表５．  ｒＦＳＨ（ＴＲ５５６０１）の単回（６０μｇ）Ｉ．Ｍ．注射、または１日２回４日間に渡ってＩＭ注射で投与される３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（登録商標）（対照）で治療した肉用牛における、卵子／胚の平均（±ＳＥＭ）数、受精卵、ならびにグレード１、２、および３の胚（トランスファー可能な胚）。
【０１１０】
【表５】
0006429774.tif 000006
【０１１１】
[0134]今回は、最終投薬実験に関して、卵胞データのみが入手可能である。卵胞成長プロファイル、および精子注入前日の卵胞数には、ｒＦＳＨおよびＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ群間で、有意な相違はなかった。排卵および卵子／胚データは、まもなく入手可能であろうし、そして実験３に関して別個に提示され、そして次いで実験１および２と組み合わせられるであろう。実験３の卵胞データが入手可能であり、そして実験１および２のものと組み合わされており、そして表６に提示される。
【０１１２】
[0135]表６は、３０日間隔のＴＲ５５６０１（ｒＦＳＨ）での３回の過排卵を示す。
【０１１３】
[0136]表６．  ｒＦＳＨ（ＴＲ５５６０１）の単回（６０μｇ）またはスプリット単回（４０−２０μｇ）Ｉ．Ｍ．注射、あるいは１日２回４日間に渡ってＩＭ注射で投与される３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（登録商標）（対照）で治療した肉用牛における、ＣＬの平均（±ＳＥＭ）数、直径＞１０ｍｍの卵胞、卵子／胚収集時点で≦２  ＣＬであるウシの数、卵子／胚の数、受精卵、ならびにグレード１、２、および３の胚（トランスファー可能な胚）。〜３０日間隔で、３回連続してウシを治療した（３つの実験を組み合わせる）。
【０１１４】
【表６】
0006429774.tif 000007
【０１１５】
[0137]治療開始時から、人工的精子注入直前までの卵胞特性を表７および図６〜９に示す。
【０１１６】
[0138]表７は、非泌乳ウシの過排卵モデルにおける卵胞数を示す。単回ｉ．ｍ．注射によって投与される６０μｇのｒＦＳＨ、または１日２回４日間に渡ってｉ．ｍ．注射で投与される３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖ（対照）で治療した肉用牛の超音波検査によって、卵胞発生（平均±ＳＥＭ）を検出した。
【０１１７】
[0139]表７．
【０１１８】
【表７】
0006429774.tif 000008
【０１１９】
[0140]直径３〜５ｍｍの卵胞数は、治療群間で異ならなかった（図６）。直径６〜８ｍｍの卵胞数（図７）、＞９ｍｍの卵胞数（図８）または治療日に渡る平均卵胞直径（図９）もまた異ならなかった。
【０１２０】
[0141]この一連の実験で得た結果を解釈すると、ｒＦＳＨ産物が肉用牛において、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖのものと異ならない過排卵反応を誘導することが示唆されうる。ウシを連続３回治療した際、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖに比較して、過排卵反応の減少を示す証拠もまたない。最終投薬における過排卵反応は、最初の２回と同様であるようであり、そしてこれは、続く卵子／胚収集で確認されるであろう。ｒＦＳＨで治療したウシにおいて、非排卵（＞１０ｍｍ）卵胞がより多数であることに関しては懸念があり（主に２頭のウシにおいて非排卵卵胞が多数であったことによる）、これはさらに調べる必要がある。肉牛および乳牛を過排卵させるためのｒＦＳＨの最適投薬量を決定するため、そして３回より多くｒＦＳＨで連続治療した長期影響を決定するためにもまた、より多くの研究が必要である。
【０１２１】
半減期改善に関する挿入物の特異性
[0142]観察された半減期改善が、配列番号１の挿入物の配列に特異的であるかどうかを決定するため、挿入物を含むヒトアルファサブユニットを修飾して、アミノ末端バリンを取り除いた。次いで、２つを、挿入物を欠く類似体とともに、ｃＡＭＰを産生する能力に関して試験した。研究によって、挿入物が配列特異的であり、そしてアルファサブユニットに対して優れた結合および半減期を与えることが示された（図９を参照されたい）。次いで、多様な増殖条件において、産生状態を調べて、最大産生に関して最適化した（表８を参照されたい）。
【０１２２】
[0143]表８はヒトアルファサブユニット産生の最適化を示す。
【０１２３】
【表８】
0006429774.tif 000009
【０１２４】
[0144]次いで、ウシ対応物とともに挿入物を調べ、そして半減期増加が挿入物の配列に特異的であることが確認される（図１１を参照されたい）。  本発明は非限定的に以下の態様を含む。
［態様１］
糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのＱ１３、Ｅ１４、Ｐ１６およびＱ２０での少なくとも１つの保存的塩基性アミノ酸置換、ならびにＤ３およびＱ５の間のＶＮＶＴＩＮＶＴ（配列番号２０）の挿入を含むアミノ酸配列を含む、修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様２］
Ｑ１３、Ｐ１６およびＱ２０での少なくとも２つの塩基性アミノ酸置換を含む、態様１の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様３］
Ｑ１３、Ｐ１６およびＱ２０での３つの塩基性アミノ酸置換を含む、態様１の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様４］
Ｅ１４での塩基性アミノ酸置換をさらに含む、態様１〜３のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様５］
塩基性アミノ酸がアルギニンである、態様１〜４のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様６］
アルファサブユニットが、配列番号１１に少なくとも８５％の同一性を持つアミノ酸配列を含む、態様１の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様７］
黄体ホルモン（ＬＨ）のベータサブユニットをさらに含む、態様１の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様８］
絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）のベータサブユニットをさらに含む、態様１の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様９］
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む、態様１の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様１０］
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む、態様１の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様１１］
アルファサブユニットがヒトアルファサブユニット（配列番号６）に由来する、態様１の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様１２］
態様１〜１１のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与する工程を含む、動物において糖タンパク質受容体を刺激するための方法。
［態様１３］
態様１〜１１のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与する工程を含む、動物において排卵を刺激するための方法。
［態様１４］
動物がヒトである、態様１２〜１３のいずれかの方法。
［態様１５］
糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのＫ１５、Ｋ１７、Ｋ２０およびＫ２４での少なくとも１つの保存的塩基性アミノ酸置換、ならびにＦ６およびＴ７の間のＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）の挿入を含むアミノ酸配列を含む、修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様１６］
Ｋ１５、Ｋ１７、Ｋ２０およびＫ２４での少なくとも２つの塩基性アミノ酸置換を含む、態様１５の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様１７］
Ｋ１５、Ｋ１７、Ｋ２０およびＫ２４での少なくとも３つの塩基性アミノ酸置換を含む、態様１５の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様１８］
Ｋ１５、Ｋ１７、Ｋ２０およびＫ２４での４つの塩基性アミノ酸置換を含む、態様１５の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様１９］
Ｅ１８での塩基性アミノ酸置換をさらに含む、態様１５〜１８のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様２０］
塩基性アミノ酸がアルギニンである、態様１５〜１９のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様２１］
アルファサブユニットが、配列番号７に少なくとも８５％同一性を持つアミノ酸配列を含む、態様１５の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様２２］
黄体ホルモン（ＬＨ）のベータサブユニットをさらに含む、態様１５の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様２３］
絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）のベータサブユニットをさらに含む、態様１５の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様２４］
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む、態様１５の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様２５］
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む、態様１５の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様２６］
アルファサブユニットがウシアルファサブユニット（配列番号２）に由来する、態様１５の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様２７］
アルファサブユニットがブタアルファサブユニット（配列番号５）に由来する、態様１５の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様２８］
アルファサブユニットがヒツジアルファサブユニット（配列番号２）に由来する、態様１５の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様２９］
態様１５〜２８のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与する工程を含む、動物において糖タンパク質受容体を刺激するための方法。
［態様３０］
態様１５〜２８のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与する工程を含む、動物において排卵を刺激するための方法。
［態様３１］
動物がウシ、ヒツジ、またはブタである、態様２９〜３０のいずれかの方法。
［態様３２］
糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのＫ１５、Ｅ１８、Ｋ２０およびＫ２４での少なくとも１つの保存的塩基性アミノ酸置換、ならびにＦ６およびＴ７の間のＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）の挿入、またはＦ６およびＴ７の間のＮＶの挿入に加えてＴ７およびＴ８の間のＩＮＶの挿入を含むアミノ酸配列を含む、修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様３３］
アミノ酸配列に、糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのＦ６およびＴ７の間のＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）の挿入が含まれる、態様３２の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様３４］
アミノ酸配列に、糖タンパク質ホルモンのＦ６およびＴ７の間のＮＶの挿入に加えてＴ７およびＴ８の間のＩＮＶの挿入が含まれる、態様３２の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様３５］
Ｋ１５、Ｅ１８、Ｋ２０およびＫ２４での少なくとも２つの塩基性アミノ酸置換を含む、態様３２の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様３６］
Ｋ１５、Ｅ１８、Ｋ２０およびＫ２４での少なくとも３つの塩基性アミノ酸置換を含む、態様３２の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様３７］
Ｋ１５、Ｅ１８、Ｋ２０およびＫ２４での４つの塩基性アミノ酸置換を含む、態様３２の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様３８］
塩基性アミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンである、態様３２〜３７のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様３９］
塩基性アミノ酸がアルギニンである、態様３８の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様４０］
アルファサブユニットが、配列番号４に少なくとも８５％の同一性を持つアミノ酸配列を含む、態様３２の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様４１］
黄体ホルモン（ＬＨ）のベータサブユニットをさらに含む、態様３２の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様４２］
絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）のベータサブユニットをさらに含む、態様３２の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様４３］
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む、態様３２の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様４４］
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む、態様３２の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様４５］
アルファサブユニットがウマアルファサブユニット（配列番号４）に由来する、態様３２の修飾糖タンパク質ホルモン。
［態様４６］
態様３２〜４５のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与する工程を含む、動物において糖タンパク質受容体を刺激するための方法。
［態様４７］
態様３２〜４５のいずれかの修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与する工程を含む、動物において排卵を刺激するための方法。
［態様４８］
動物がウマである、態様４７〜４８のいずれかの方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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