(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチトールまたはソルビトールを遺伝子組換えを行わずに、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）に資化させることを特徴とする、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖アルコールであるマルチトールとソルビトールを糖源（炭素源）として酵母を培養する、酵母菌体の製造法に関する。さらには、糖アルコール製造工程液を培地に用いて酵母を培養する、酵母菌体の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肥満や生活習慣病の予防や、虫歯や口臭の予防といったオーラルケアへの関心が高まり、低カロリー・非齲蝕性などの機能性を持つ糖アルコールが、各種シュガーレス食品の原料として注目され、需要が伸びている。糖アルコールはトウモロコシやイモの澱粉などを原料として得られる種々の糖、水飴に水素を添加して製造されるが、その製造過程でマルチトールやソルビトールを多く含む混合液を生じる。このうちソルビトールは、これを資化できる微生物は多種の糖や糖アルコールを酸化する能力に長けているGluconobactor属細菌などに限定される。また、もう一つの主要成分であるマルチトールに至っては、微生物により資化できるといった報告はされていない。
【０００３】
ところで他方、調味料等の原料となる酵母菌体を取得するために、酵母の培養が多く行われているが、その培地に添加する糖としてはグルコースが一般的であり、それが酵母菌体生産コストの一部を占めている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Soemphol W. et al. : Characterization of genes involved in D-sorbitol oxidation in thermotolerant Gluconobacter frateurii. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 76(8), 1497-505. 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、マルチトール又はソルビトールを糖源として酵母菌体の製造を行うこと、及びマルチトールやソルビトールを含む混合液を糖源に用いて、酵母菌体の製造を行うことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、糖アルコール廃液の主要な成分であるマルチトールやソルビトールを、食用酵母であるキャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）が資化できること、すなわちそれらを糖源として酵母菌体の培養ができることを見出し、本発明に到達した。
すなわち本発明は、
（１）  マルチトールまたはソルビトールをキャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）に資化させることを特徴とする、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）の培養方法、
（２）  上記（１）の培養方法により得られた、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）の菌体
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、これまで微生物による資化が困難とされていたマルチトールやソルビトールを、キャンディダ・ユーティリスの培養糖源として用いうるようになった。これにより、糖アルコール製造工程で生じる、マルチトールやソルビトールを含む混合液でも、培地用グルコースの代替をすることが可能となる。さらに、マルチトールやソルビトールを資化できる微生物がほとんど無いことから、他の糖源を用いた場合と比較して酵母の培養において最も問題となる汚染のリスクを軽減できる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において用いるマルチトール、ソルビトールは、糖アルコールに属する化合物である。
工業的に糖アルコールを製造する過程において、マルチトールやソルビトールを含む混合液が生じる。
本発明は、酵母の一種であるキャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）に、マルチトール、ソルビトールを資化させるものである。
【０００９】
酵母には、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Candida属、Yarrowia属、Pichia属、Hansenula属、Kluyveromyces属等の種類が知られている。
いわゆる食用酵母には、通称ビール酵母（Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces cerevisiae）、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）、トルラ酵母（Candida utilis）と呼ばれるものがある。そのうち調味料用の酵母エキスに一般的に用いられている酵母菌株には、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）とキャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）がある。
【００１０】
本発明は、上述した多種多様の酵母菌株のうち、食用酵母であるキャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）に、マルチトール及びソルビトールを資化する能力があることを見出したものである。本発明に用いるキャンディダ・ユーティリス菌株は、特に遺伝子組み換えや形質転換等を行う必要はなく、一般的に用いられている菌株でよい。
【００１１】
本発明においては、マルチトール、ソルビトールを、キャンディダ・ユーティリスの培養の際に、糖源の一部または全部として、培地に添加することができる。
添加する糖アルコールは、販売されている精製品のマルチトール、ソルビトールでもよいし、糖アルコール製造工程から得られたマルチトールとソルビトールを含む混合液でもよい。マルチトールとソルビトールを含む混合液を糖源として用いる場合、マルチトールとソルビトールの混合比は任意でよく、含有量も培地組成時に調整できるため、任意でよい。
【００１２】
本発明で培養に使用する培地組成には、これらの糖源の他に、窒素源、硫黄源、リン酸塩、ミネラルが含まれていればよい。
【００１３】
本発明において、糖アルコールの資化性を有する菌株とは、酵母を糖アルコール含有培地、例えば、SM培地（0.67w/v%イーストニトロゲンベース、2w/v％マルチトール、ｐHを６．５に調製） にて3日間培養したとき、菌体の生育が見られたもののことを言う。
【実施例】
【００１４】
以下に実施例および比較例を用いて、本発明を具体的に説明する。
本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１５】
＜マルチトールを資化できる菌株＞
＜実施例１＞
Candida utilis NBRC0988を５ ｍｌのYPD培地（酵母エキス１ｗ/ｖ％、ポリペプトン２ｗ/ｖ％、グルコース２ｗ/ｖ％）で一晩前培養した培養液を、１００ｍｌのSD培地（0.67w/v%イーストニトロゲンベース、2w/v%グルコース、pHを6.5に調整）とSM培地（0.67w/v%イーストニトロゲンベース、2w/v％マルチトール、ｐHを６．５に調整）にそれぞれ０．５ｖ/ｖ％植菌し、３０℃、２２５ｒｐｍで培養した。SD培地の糖源はグルコース、SM培地の糖源はマルチトールである。それぞれについて、菌体増殖の指標として培養液のOD６００を測定し、その経時変化をプロットしたグラフを図１Aに示す。
【００１６】
＜比較例１＞
実施例１において、Candida utilisの代わりにSaccharomyces cerevisiae NBRC101557を用いたこと以外は実施例１と同様に行った。その結果を図１Bに示す。
【００１７】
＜比較例２＞
実施例１において、Candida utilisの代わりにPichia pastoris NBRC0948を用いたこと以外は実施例１と同様に行った。その結果を図１Cに示す。
【００１８】
＜比較例３＞
実施例１において、Candida utilisの代わりにKluyveromyces marxianus  NBRC1777を用いたこと以外は実施例１と同様に行った。その結果を図１Dに示す。
【００１９】
＜比較例４＞
実施例１において、Candida utilisの代わりにSchizosaccharomyces pombe   NBRC0340を用い、前培養にYPD培地の代わりにYE培地（酵母エキス０．５％、グルコース３％）を用いたこと以外は実施例１と同様に行った。その結果を図１Eに示す。
【００２０】
実施例１〜比較例４の結果、図１Ａ〜図１Ｅのグラフから明らかなように、 Candida utilisは高いマルチトール資化能力を示した。それに対して、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces marxianus、Schizosaccharomyces pombeはいずれもマルチトールを資化することができなかった。
【００２１】
＜マルチトール資化の特異性＞
＜実施例２＞
Candida utilis  NBRC0988を５ ｍｌのYPD培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）で一晩前培養した培養液を１００ｍｌのSM培地（0.67w/v%イーストニトロゲンベース、2w/v％マルチトール、ｐHを６．５に調整）に０．５％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃、２２５ｒｐｍで培養し、その培養液のOD６００を測定し、経時変化を見た。
【００２２】
＜比較例５＞
実施例２において、SM培地のマルチトールの代わりに、各々グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースを配合した培地を用い、実施例２と同様に試験を行った。
培養開始から４８時間後のOD６００を測定し、その結果を表１に示す。実施例２のマルチトール、比較例５のグルコース、フルクトース、スクロース、マルトースともに増殖は見られたが、糖１ｇあたりのOD６００はマルチトールが一番高く、Candida utilisの糖アルコール資化能力が高いことを示す結果となった。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
＜多様な糖アルコール資化性＞
＜実施例３＞
Candida utilis NBRC0988を５ ｍｌのYPD培地で一晩前培養した培養液を、１００ｍｌのSM培地（0.67w/v%イーストニトロゲンベース、2w/v％マルチトール、ｐHを６．５に調整）に０．５ｖ/ｖ％植菌し、３０℃、２２５ｒｐｍで培養し、その培養液のOD６００を測定し、経時変化を見た。
【００２５】
＜比較例６＞
実施例３において、SM培地のマルチトールの代わりに、各々ソルビトール、マンニトールを用いたこと以外は実施例３と同様に試験を行った。
培養開始から４８時間後のOD600を測定し、その結果を表２に示す。糖アルコールの種類によって菌体の増殖に差は見られたものの、いずれの糖アルコールでも増殖は確認できた。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
＜菌株間の増殖速度の差異＞
＜実施例４＞
Candida utilis NBRC0987とCandida utilis NBRC0988を５ ｍｌのYPD培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）で一晩前培養した培養液を１００ｍｌのSD培地とSM培地に０．５％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃、２２５ｒｐｍで培養し、その培養液のOD６００を測定し、経時変化を見た。
なお、この２菌株ともCandida utilisのスタンダードな菌株であり、NBRCから入手できる。
【００２８】
図２AにCandida utilis NBRC0987の増殖の経時変化を、図２BにCandida utilis NBRC0988の増殖の経時変化を示す。糖源がマルチトールの時、NBRC0987はNBRC0988より増殖の立ち上がりが遅れたが、いずれの菌株もマルチトールを資化していることから、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）に属する菌株は概ねマルチトールの資化性を保有していることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】実施例１、Candida utilisにおいて糖源がグルコースとマルチトールの場合の増殖を対比したグラフ。
【図１Ｂ】比較例１、Saccharomyces cerevisiae において糖源がグルコースとマルチトールの場合の増殖を対比したグラフ。
【図１Ｃ】比較例２、Pichia pastoris において糖源がグルコースとマルチトールの場合の増殖を対比したグラフ。
【図１Ｄ】比較例３、Kluyveromyces marxianus において糖源がグルコースとマルチトールの場合の増殖を対比したグラフ。
【図１Ｅ】比較例４、Schizosaccharomyces pombesにおいて糖源がグルコースとマルチトールの場合の増殖を対比したグラフ。
【図２Ａ】実施例４、Candida utilis NBRC0987においてマルチトールを糖源とした増殖のグラフ。
【図２Ｂ】実施例４、Candida utilis NBRC0988においてマルチトールを糖源とした増殖のグラフ。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
以上説明してきたように、本発明によると、キャンディダ・ユーティリスはマルチトールやソルビトールを資化できることから、それらを多く含む糖アルコール工程液を糖源として、培養することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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