(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃ含有ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含み、操作されたＮ連結型グリコシル化部位が、ａ）Ｓ３６４ＮおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、ｂ）Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、ｃ）Ｓ３６４ＮおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓ、ならびにｄ）Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓからなる群から選択され、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり、ここで、アミノ酸残基の番号はＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームに基づくものである、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド。
【請求項２】
組換えによって連結した少なくとも２つの請求項１に記載の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドであって、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において同一のまたは異なる操作されたＮ連結型グリコシル化部位を有する、ポリペプチド。
【請求項３】
ＣＨ２−ＣＨ２界面において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位をさらに含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＣＨ２ドメインにおけるアミノ酸修飾が、Ｓ２３９Ｎ−Ｘ−Ｆ２４１Ｓ、Ｓ２３９Ｎ−Ｘ−Ｆ２４１Ｔ、Ｆ２４１Ｎ−Ｘ−２４３Ｔ、Ｆ２４１Ｎ−Ｘ−２４３Ｓ、Ｅ２５８Ｎ、Ｅ２５８Ｎ−Ｘ−Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｔ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６２Ｎ−Ｘ−Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６２Ｎ−Ｘ−Ｖ２６４Ｔ、Ｋ２８８Ｔ、Ｋ２８８Ｓ、Ｋ２８８Ｎ−Ｋ２９０Ｔ、Ｋ２８８Ｎ−Ｋ２９０Ｓ、Ｖ３０５Ｎ、およびＶ３０５−Ｘ−Ｔ３０７Ｓからなる群から選択され、ここで、アミノ酸残基の番号はＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームに基づくものである、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｆａｂをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項７】
各Ｆｃ含有ポリペプチドが、Ｃ−Ｎ末端連結を介して、またはリンカーを介して、組換えによって連結している、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
リンカーが、ｎ＝１〜１０である、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを含む、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
組換えによって連結した２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含み、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、各ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において同一の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を有し、さらに、操作されたＮ連結型グリコシル化部位が、Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔであり、ここで、アミノ酸残基の番号はＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームに基づくものである、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｎ連結型グリコシル化によって安定化される、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドもしくは請求項１２に記載のベクターを含む、または、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の宿主細胞を培養するステップを含み、ポリペプチドを回収するステップを含んでいてもよい、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産するための方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表への参照
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に出願されるものであり、電子的に提出されたテキスト形式の配列表を含む。テキストファイルは、２０１２年１２月７日に作成され、１７３ＫＢのサイズを有する、「ＰＣ０７１９６２＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＰＲＯＪＥＣＴ＿ＦＩＬＥ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というタイトルの配列表を含む。このテキストファイルに含まれる配列表は明細書の一部であり、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む、操作された単量体抗体断片（例えば、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド）に関する。本発明はまた、このような操作された単量体抗体断片を作製するための方法、ならびに診断法および治療法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗体およびＦｃ融合生物製剤は、過去１０年で、様々な疾患の治療のための治療用分子として用いられている。市場にあるほとんどの抗体は、それらの半減期が長いために患者における投薬頻度が少なくてすむという理由から、完全長抗体（例えばＩｇＧ）である。例えば、Ｌｏｂｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３、２６４５〜２６６８（２００４）を参照されたい。完全長ＩｇＧは、２つの同一なヒンジ領域を介して二量体形態のＦｃ断片によって接続されている、２つの同一なＦａｂ断片から構成される。Ｆａｂ領域は抗原の標的化に関与するが、ＩｇＧのＦｃ領域は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）リサイクリング経路を介して血清における抗体の生存時間を延ばすことに関係している。例えば、Ｂｒａｍｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０３、１３５２〜１３５４（１９６４）およびＲａｇｈａｖａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４、１４６４９〜１４６５７（１９９５）を参照されたい。各Ｆａｂによる一価結合についての固有会合定数は、通常、抗体のアフィニティーと呼ばれ、一方、無傷ＩｇＧ抗体における２つのＦａｂの二価結合能力は、抗体のアビディティーと呼ばれる。一部のケースにおいて、ＩｇＧのアビディティーに起因する見かけの平衡結合は、Ｆａｂのアフィニティーと比較して最大１００倍まで増大し得る。例えば、Ｗａｙｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２１６、４２３〜４３２（１９８３）を参照されたい。しかし治療目的では、ＩｇＧの二価性は、常に必要または望ましいわけではない。例えば、治療用ＩｇＧは、標的が単量体可溶性分子である場合、アビディティーの利点を生かさない。さらに、標的が多量体可溶性分子である場合、ＩｇＧの二量体性質は、血漿における架橋したネットワークの形成をもたらし得、その結果、凝集体の形成を導く。例えば、Ｍａｒｒａｃｋ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９、３６９〜３８６（１９５５）を参照されたい。さらに、拮抗対象の標的が細胞表面上にある場合、単一のＩｇＧによる２つの細胞表面標的の結合は、架橋または抗体による２つの分子の合体を介して、望ましくないアゴニスト活性をもたらし得る。例えば、Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１  ９Ｐｔ２）、２３７〜２４７（１９９８）を参照されたい。さらに、一部のフルサイズのＩｇＧもまた、組織、特に充実性腫瘍内への弱い浸透、および閉塞した一部の抗原の領域への弱い結合を示すか、または結合を示さず、より小さいサイズの分子によってのみアクセスされ得る。Ｙｉｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１２）を参照されたい。したがって、治療用抗体および二量体Ｆｃ融合タンパク質の二価性に関連する潜在的な欠点を克服するために、「ワンアーム」抗体、「ワンアーム」Ｆｃ融合タンパク質、またはより小さいサイズの様々な抗体断片が、最近、治療用分子の生物学的活性、生物学的利用能、および／または薬物動態を向上させるために、様々な治療標的について探究されている。例えば、Ｄｅｍｉｇｎｏｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０、２９３６〜２９４２（１９９０）、およびＤｕｍｏｎｔら、ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２０、１５１〜１６０（２００６）を参照されたい。したがって、単量体免疫グロブリンＦｃ分子、一価抗体、���よび抗体Ｆｃ分子が記載されている。例えば、ＵＳ２００６／００７４２２５、ＷＯ２００７／０５９７８２、ＷＯ２００８／１４５１３９、ＷＯ２０１１／００５６２１、およびＷＯ２０１１／０６３３４８を参照されたい。抗体およびＦｃ分子、ならびにそれらを含むタンパク質の単量体形態が治療用分子の開発において特定の利点をもたらすであろうという認識にもかかわらず、安定であるが、増大した免疫原性を示さないか、または安定な単量体タンパク質の獲得に必要なタンパク質操作の他の欠点を有さない、単量体抗体および融合タンパク質が、長年にわたって依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Ｎ−グリコシル化は、タンパク質の安定性、プロテアーゼへの感受性、および免疫原性に対して、ならびに治療的タンパク質のインビボでの生物活性に対して、影響を有し得る。例えば、Ｓｏｌａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９８、１２２３〜１２４５（２００９）、およびＥｌｌｉｏｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１、４１４〜４２１（２００３）を参照されたい。アスパラギン連結型グリコシル化（Ａｓｎ連結型またはＮ連結型グリコシル化）は、真核生物におけるタンパク質の翻訳後修飾の最も一般的な形態の１つである。通常、修飾は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのコンセンサス配列の第１の位置におけるアスパラギン残基で生じ、式中、第２の位置「Ｘ」は、プロリンを除く任意のアミノ酸であり、第３の位置は、セリンまたはスレオニンのいずれかであり、その結果、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒおよびＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒが、哺乳動物タンパク質における基準の（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）潜在的グリコシル化部位であると考えられる。Ｓｈａｋｉｎ−Ｅｓｈｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、６３６３〜６３６６（１９９６）。非変性ヒトＩｇＧ抗体は、ＦｃドメインのＣＨ２領域上のＡｓｎ２９７にＮ−グリカンを有する。Ｆｃドメインの結晶構造によって、糖質が、ＣＨ２ドメインによって囲まれた内部空間内に包まれていることも明らかになった。２つのポリペプチド鎖に由来するＣＨ２ドメインは、糖質部分に起因して、直接的な相互作用を行わないが、ＣＨ３ドメインは、大きな疎水性界面を介して互いに会合する。したがって、Ｎ−グリコシル化操作アプローチを用いて、インビボでの半減期が延び、かつ他の向上した薬物動態学を有する、Ｆｃドメインの安定な単量体形態であって、操作されたグリカンが、ＣＨ３−ＣＨ３界面を分離することができるだけではなく、ＣＨ３ドメインの暴露された疎水性表面を覆って、凝集および潜在的免疫原性を回避することができる、単量体形態を生成することが望ましい。本発明は、この要求を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書において開示される発明は、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面においてまたはＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面とＣＨ２−ＣＨ２界面との両方において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む、単量体抗体断片（例えば、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド）を目的としている。１つの態様において、本発明は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃ含有ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含み、操作されたＮ連結型グリコシル化部位が、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのコンセンサス配列を有する少なくとも１つの、さらに好ましくは２つのアミノ酸修飾を含み、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸である、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを提供する。
【０００６】
１つの変形形態において、本発明は、組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドであって、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において同一のまたは異なる操作されたＮ連結型グリコシル化部位を有する、ポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、各Ｆｃ含有ポリペプチドは、各ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において同一の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を有し、さらに、操作されたＮ連結型グリコシル化部位は、Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６およびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔである。一部の実施形態において、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面におけるアミノ酸修飾は、Ｑ３４７Ｎ−Ｘ−Ｙ３４９Ｔ、Ｑ３４７Ｎ−Ｘ−Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｎ−Ｘ−Ｌ３５１Ｔ、Ｙ３４９Ｎ−Ｘ−Ｌ３５１Ｓ、Ｌ３５１Ｎ−Ｘ−Ｐ３５３Ｔ、Ｌ３５１Ｎ−Ｘ−Ｐ３５３Ｓ、Ｓ３５４Ｎ−Ｘ−Ｄ３５６Ｔ、Ｓ３５４Ｎ−Ｘ−Ｄ３５６Ｓ、Ｄ３５６Ｎ−Ｘ−Ｌ３５８Ｔ、Ｄ３５６Ｎ−Ｘ−Ｌ３５８Ｓ、Ｅ３５７Ｎ−Ｘ−Ｔ３５９Ｓ、Ｋ３６０Ｎ−Ｘ−Ｑ３６２Ｔ、Ｋ３６０Ｎ−Ｘ−Ｑ３６２Ｓ、Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｔ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｓ、Ｋ３７０Ｎ−Ｘ−Ｆ３７２Ｔ、Ｋ３７０Ｎ−Ｘ−Ｆ３７２Ｓ、Ｋ３９２Ｎ−Ｘ−Ｔ３９４Ｓ、Ｖ３９７Ｎ−Ｘ−Ｄ３９９Ｔ、Ｖ３９７Ｎ−Ｘ−Ｄ３９９Ｓ、Ｓ４００Ｎ−Ｘ−Ｇ４０２Ｔ、Ｓ４００Ｎ−Ｘ−Ｇ４０２Ｓ、Ｄ４０１Ｎ−Ｘ−Ｓ４０３Ｔ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｔ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｓ、Ｙ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、Ｙ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓ、Ｋ４０９Ｎ−Ｘ−Ｔ４１１Ｓ、Ｋ４３９Ｎ−Ｘ−Ｌ４４１Ｔ、Ｋ４３９Ｎ−Ｘ−Ｌ４４１Ｓ、Ｓ４４４Ｎ−Ｘ−Ｇ４４６Ｔ、およびＳ４４４Ｎ−Ｘ−Ｇ４４６Ｓからなる群から選択される。他の実施形態において、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面におけるアミノ酸修飾は、Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｔ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｔ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｓ、Ｙ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、およびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓからなる群から選択される。
【０００７】
別の態様において、本発明は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃ含有ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において２つの操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含み、操作されたＮ連結型グリコシル化部位が、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのコンセンサス配列を有する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸である、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを提供する。１つの変形形態において、本発明は、組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドであって、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において同一のまたは異なる操作されたＮ連結型グリコシル化部位を有する、ポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面におけるアミノ酸修飾は、ａ）Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６およびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、ｂ）Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、ｃ）Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６およびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓ、ならびにｄ）Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓからなる群から選択される。
【０００８】
別の態様において、本発明は、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、または組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドであって、ＣＨ２−ＣＨ２界面において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位をさらに含む、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドまたはポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、ＣＨ２ドメインにおけるアミノ酸修飾は、Ｓ２３９Ｎ−Ｘ−Ｆ２４１Ｓ、Ｓ２３９Ｎ−Ｘ−Ｆ２４１Ｔ、Ｆ２４１Ｎ−Ｘ−２４３Ｔ、Ｆ２４１Ｎ−Ｘ−２４３Ｓ、Ｅ２５８Ｎ−Ｘ−Ｔ２６０、Ｅ２５８Ｎ−Ｘ−Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｔ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６２Ｎ−Ｘ−Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６２Ｎ−Ｘ−Ｖ２６４Ｔ、Ｎ２８６−Ｘ−Ｋ２８８Ｔ、Ｋ２８８Ｓ、Ｋ２８８Ｎ−Ｋ２９０Ｔ、Ｋ２８８Ｎ−Ｘ−Ｋ２９０Ｓ、Ｖ３０５Ｎ−Ｘ−Ｔ３０７、およびＶ３０５−Ｘ−Ｔ３０７Ｓからなる群から選択される。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は、少なくとも１つの操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む単量体Ｆｃ含有ポリペプチドであって、操作されたＮ連結型グリコシル化部位が、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸である、Ｅ２５８Ｎ−Ｘ−Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｔ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｓ、Ｖ３０５Ｎ、Ｖ３０５Ｎ−Ｘ−Ｔ３０７Ｓ、Ｑ３４７Ｎ−Ｘ−Ｙ３４９Ｔ、Ｑ３４７Ｎ−Ｘ−Ｙ３４９Ｓ、Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｎ−Ｘ−Ｌ３６８Ｔ、Ｔ３６６Ｎ−Ｘ−Ｌ３６８Ｓ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｔ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｓ、Ｄ４０１Ｎ、Ｄ４０１Ｎ−Ｘ−Ｓ４０３Ｔ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｔ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｓ、Ｙ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、Ｙ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓ、およびＫ４０９Ｎ−Ｘ−Ｔ４１１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを提供する。１つの変形形態において、本発明は、組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドであって、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、同一のまたは異なる操作されたＮ連結型グリコシル化部位を有する、ポリペプチドを提供する。
【００１０】
一部の実施形態において、ＣＨ３領域および／またはＣＨ２領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  ＣＨ２領域および／またはＣＨ３領域である。一部の実施形態において、ＣＨ３領域および／またはＣＨ２領域は、ヒトＩｇＧ  ＣＨ３領域および／またはＣＨ２領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  ＣＨ３領域および／またはＣＨ２領域）を含む。
【００１１】
一部の実施形態において、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、Ｆａｂをさらに含む。一部の実施形態において、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質である。
【００１２】
一部の実施形態において、組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドにおける各単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、Ｃ−Ｎ末端連結を介して、またはリンカーを介して、組換えによって連結している。一部の実施形態において、リンカーは、ｎ＝１〜１０である、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号８９）を含む。
【００１３】
一部の実施形態において、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、Ｎ連結型グリコシル化によって安定化される。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドもしくはベクターを含む宿主細胞、または本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを発現する細胞系を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、宿主細胞を培養するステップを含み、ポリペプチドを回収するステップを含んでいてもよい、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを生産するための方法を提供する。本発明はまた、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬組成物／製剤を提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において状態、障害、または疾患を治療するための方法であって、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ：ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの野生型ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインのＣＨ２−ＣＨ２界面（図１Ａ）内に存在するアミノ酸残基の略図である。    図１Ｂ：ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの野生型ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインのＣＨ３−ＣＨ３界面（図１Ｂ）内に存在するアミノ酸残基の略図である。
【図２】ヒトおよびマウスＩｇＧアイソタイプのＣＨ３ドメインの配列アラインメントを示す図である。ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４、ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２Ａ、ｍＩｇＧ２Ｂ、およびｍＩｇＧ３は、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８に対応する。アスタリスク「＊」は、本発明によるＮ−グリコシル化のために合理的に選択された位置を示す。
【図３】ヒトおよびマウスＩｇＧアイソタイプのＣＨ２ドメインの配列アラインメントを示す図である。ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４、ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２Ａ、ｍＩｇＧ２Ｂ、およびｍＩｇＧ３は、それぞれ、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６に対応する。アスタリスク「＊」は、本発明による潜在的なＮ−グリコシル化部位を示す。
【図４】Ｓ３６４Ｎ（Ｓ３６４Ｎ−Ｌ３６５−Ｔ３６６）およびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ（Ｙ４０７Ｎ−Ｓ４０８−Ｋ４０９Ｔ）でＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面におけるアミノ修飾を有する、操作された単量体Ｆｃ含有ポリペプチド（「ＣＨ２３−Ｎ３６４／４０７」）の得られた結晶構造のグラフィック表示である。
【図５】Ｆａｂに融合した単量体Ｆｃ含有ポリペプチド変異体の様々な構築物を説明する図面である。図５Ａ：図５Ａは、両Ｆａｂアーム、ヒンジ領域、およびそれぞれが各ＣＨ２上に基準のＡｓｎ２９７（Ｎ−２９７）グリカンを含む２つのＦｃドメインを示す、無傷ＩｇＧ１抗体であって、グリカンが、ＣＨ２ドメインによって囲まれた内部空間内に包まれており、２つのポリペプチド鎖に由来するＣＨ２ドメインが、糖質部分に起因して、直接的な相互作用を行わない、無傷ＩｇＧ１抗体の図面を示す。    図５Ｂ：図５Ｂは、単一のＦａｂを含み、かつＣＨ２ドメイン内の基準のＡｓｎ２９７グリカンおよびＣＨ３ドメイン内の２つの操作されたグリコシル化部位を含む、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを説明する図面を示す。    図５Ｃ：図５Ｃは、組換えによって連結した２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含む、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドであって、各Ｆｃドメインが、ＣＨ２ドメイン内に基準のＡｓｎ２９７グリカンを含むことに加え、各ＣＨ３ドメイン内に２つの操作されたグリコシル化部位を含む、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを説明する図面を示す。
【図６】ＫＬＨ由来抗体に由来するＦａｂに融合した単量体Ｆｃ含有ポリペプチド変異体（本明細書において、「Ｆａｂ−ＣＨ２３」と呼ばれ、これはまた、Ｆａｂ−ＣＨ２３［Ｎ３６４／Ｎ４０７］とも呼ばれる）の薬物動態学的特徴を実証するグラフを示す図である。黒塗りの丸は、ヒトＩｇＧ１を示し、黒塗りの四角は、Ｆａｂ−ＣＨ２３−ＨＥＫ（ＨＥＫ２９３一過性発現系から生産されたＦａｂ−ＣＨ２３［Ｎ３６４／Ｎ４０７］）のＰＫを示し、黒塗りの三角は、Ｆａｂ−ＣＨ２３［Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ］（ＦｃＲｎノックアウト変異体）を示し、上下反対の黒塗りの三角は、Ｆａｂ−ＣＨ２３−ＨＥＫ＋マンナン（マンノース受容体の天然阻害剤）を示し、黒塗りの菱形は、安定なＣＨＯ細胞系から生産されたＦａｂ−ＣＨ２３［Ｎ３６４／Ｎ４０７］を示し、白抜きの丸は、Ｆａｂ−ＣＨ２３［Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｌ］（ＦｃＲｎ増強変異体）を示し、白抜きの四角は、Ｆａｂ−ＣＨ２３−ＣＨ２３（２つの操作されたＣＨ２３［Ｎ３６４／Ｎ４０７］を有する二量体またはタンデム構築物）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、疎水性ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面における、または疎水性ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面とＣＨ２−ＣＨ２界面との両方における、１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位によって安定化された、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを提供する。本発明者らは、Ｆｃ含有ポリペプチドの特異的部位でのＮ−グリコシル化の組み込みが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面を破壊し得、ＣＨ３ドメインの暴露された疎水性表面をマスクし得、Ｆｃ二量体を単量体化し得、抗体のＦｃドメインの安定な単量体形態を提供し得、かつ／またはＦｃ単量体の物理化学的特性（例えば、溶解度および安定性）を向上させ得ることを発見した。さらに、操作されたグリカン部分もまた、突然変異したアミノ酸残基を立体的に遮蔽し得、潜在的な免疫認識または抗薬剤抗体の結合をマスクし得た。単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合アフィニティーを、ｐＨ依存的に維持する。本明細書において提供される開示を知れば、当業者には、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの結晶構造が糖質による安定化とＦｃＲｎ介在性のリサイクルのための分子認識とについての論拠を提供することが理解されよう。本明細書において開示されているデータは、さらに、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドがまた、抗体Ｆａｂドメインのインビボでの半減期を延ばすことを実証する。本発明者らは、さらに、疎水性ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面における、または疎水性ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面とＣＨ２−ＣＨ２界面との両方における、１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位によってそれぞれ安定化された、組換えによって連結した少なくとも２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドが、操作されたＮ連結型グリコシル化部位の不存在下での同一のポリペプチドよりも高いＦｃＲｎに対するアフィニティーおよび長い半減期を有することを発見した。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドによって実証された、増大したアフィニティーは、酸性ｐＨでエンドソームにおけるＦｃＲｎからのポリペプチドの解離が減速し、それによってポリペプチドがリソソームにおける分解経路に入ることが妨げられたことに起因する可能性がある。
【００１９】
通常の技術および定義
本明細書において別段の規定がない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらに、文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。全体として、本明細書において記載される、細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名と、これらの技術とは、当技術分野において周知であり、一般的に用いられている。
【００２０】
本発明の方法および技術は、別段の指示がない限り、当技術分野において周知の従来の方法に従って、かつ本明細書の全体にわたり引用および議論される様々な一般的な参考文献およびさらに具体的な参考文献において記載されているように、一般的に実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）；ならびにＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様に従って、当技術分野において一般的に行われるように、または本明細書において記載されるように、行われる。本明細書において記載される、分子生物学、生化学、免疫学、分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学に関連して用いられる命名と、これらの実験手順および実験技術とは、当技術分野において周知であり、一般的に用いられている。本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変型は、言及された整数または整数群を含むことを含意するがいかなる他の整数または整数群も排除するものではないことが理解される。
【００２１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、あらゆる長さの、好ましくは比較的短い（例えば、１０〜１００アミノ酸）のアミノ酸鎖を指すために、本明細書において区別せずに用いられる。鎖は、直鎖状または分枝鎖状であり得、これは、修飾されたアミノ酸を含み得、かつ／または非アミノ酸によって中断され得る。この用語はまた、天然にまたは介入によって修飾されている、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはあらゆる他の操作もしくは修飾、例えば標識構成要素とのコンジュゲーションによって修飾されている、アミノ酸鎖を含む。同様にこの定義に含まれるものは、例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）および当技術分野において知られている他の修飾を含有するポリペプチドである。ポリペプチドが一本鎖または会合鎖として生じ得ることが理解される。
【００２２】
本明細書において用いられる用語「Ｆｃ含有ポリペプチド」は、免疫グロブリン重鎖のカルボキシル末端のポリペプチド配列を含むポリペプチド（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）を指す。Ｆｃ含有ポリペプチドは、非変性Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域（すなわち配列）を含み得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ４ドメインを含んでいてもよい。Ｆｃ含有ポリペプチドは、野生型ヒンジ配列の一部または全てを含み得る（通常、そのアミノ末端に）。Ｆｃ含有ポリペプチドは、あらゆる適切な免疫グロブリンから、例えば、様々なＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプの少なくとも１つから、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭから、得ることができるか、またはそれに由来し得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得、例えば、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｇｌｕ２１６位のアミノ酸残基から、またはＡｌａ２３１から、そのカルボキシル末端まで延びると定義される。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの番号付けである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。
【００２３】
本明細書において用いられる「操作されたＮ連結型グリコシル化部位」は、天然アミノ酸配列ではＮ連結型グリコシル化部位が存在していなかったタンパク質配列内に導入されている、グリコシル化部位を意味する。すなわち、操作されたＮ連結型グリコシル化部位は、基準のＮ連結型グリコシル化配列、すなわち、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸であるＮ−Ｘ−ＳまたはＴが、このような配列が存在していなかったタンパク質内に導入されている場合を包含する。１つの実施形態において、Ｎ−Ｘ−ＳまたはＴの１つの位置でアミノ酸をＮと置換するアミノ酸置換によって、第２のアミノ酸残基がプロリンではなく、さらに第３のアミノ酸残基が既にセリン残基またはスレオニン残基である、グリコシル化部位が生じる。別の実施形態において、第１のアミノ酸は既にアスパラギンであり、第２のアミノ酸はプロリンではなく、その結果、第３のアミノ酸のみがセリンまたはスレオニンによって置換されればよい。さらに別の実施形態において、第１のアミノ酸残基はアルギニンによって置換される必要があり、第２のアミノ酸はプロリンではなく、別の非プロリンアミノ酸によって置換される必要はないが置換されてもよく、第３のアミノ酸残基は、セリンまたはスレオニンによって置換される。別の実施形態において、第３のアミノ酸はセリンであり得、スレオニンによって置換され、または逆の場合も同様である。上記のあらゆる順列が本発明に包含される。
【００２４】
本明細書において用いられる用語「組換えによって連結した」は、複数のタンパク質またはペプチド（例えば、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド）の、１本のポリペプチド鎖としての連結を指す。複数のタンパク質またはペプチド（例えば、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド）の連結は、タンパク質／ペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを介して直接的に行われ得る。複数のタンパク質またはペプチド（例えば、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド）の連結は、また、一続きのグリシンおよびセリンなどの非機能的なポリペプチドスペーサーを介して間接的に行われ得る。複数のタンパク質は、単一の核酸から組換えによって発現されて、複数のポリペプチドを１本のポリペプチド鎖として含む融合タンパク質を提供し得る。あるいは、各ポリペプチドは、カルボキシル−アミノ（Ｃ−Ｎ）末端の化学的コンジュゲーションを介して化学的に連結されて、複数のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供し得る。両方法は、本明細書において用いられる「組換えによって連結した」タンパク質を提供する。
【００２５】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合し得る、免疫グロブリン分子である。本明細書において用いられる場合、この用語は、別段の特定がない限り、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、特異的結合について無傷抗体と競合するあらゆるその抗原結合部分、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された立体構造も含む。抗原結合部分には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ、例えば、サメ抗体およびラクダ抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む断片、一本鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ならびにポリペプチドへの特異的な抗原結合を付与するために十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチが含まれる。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭなどのあらゆるクラス（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００２６】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分のみを含み、ここで、前記部分は、無傷抗体内に存在する場合に前記部分と通常関連している機能の少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたは全てを、好ましくは保持している。
【００２７】
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖およびＣＨ１および１つの重鎖の可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成し得ない。
【００２８】
本願における残基の指定は、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームに基づく（Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、第５版）。
【００２９】
「二価抗体」は、分子（例えばＩｇＧ）１個当たり２つの抗原結合部位を含む。一部の場合において、２つの結合部位は同一の抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異的であり得る。
【００３０】
「一価抗体」または「単量体抗体」は、分子（例えばＩｇＧ）１個当たり１つの抗原結合部位を含む。一部の場合において、一価抗体または単量体抗体は、２つ以上の抗原結合部位を有し得るが、これらの結合部位は異なる抗原に由来する。
【００３１】
「多重特異的抗体」は、２つ以上の抗原またはエピトープを標的化するものである。「二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異的（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、または「二機能性」抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、多重特異的抗体の一種であり、限定はしないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む、様々な方法によって生産することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ（１９９０）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１；ならびにＫｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３を参照されたい。二重特異的抗体の２つの結合部位は、同一のまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。
【００３２】
本明細書において用いられる用語「モノクローナル抗体」は、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、微量で存在し得る考えられる天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原に対するものである。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００３３】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、特定の実施形態において、所望の生物学的活性を示す限りの、「キメラ」抗体が具体的に含まれ得、この「キメラ」抗体において、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列に同一または相同であるが、鎖の残り部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列に同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。
【００３４】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えばマウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、アフィニティー、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域（ドナー抗体）の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。ヒト化抗体は、さらに、レシピエント抗体またはドナー抗体において見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに高めるために行われる。通常、ヒト化抗体は、全てまたはほぼ全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつ全てまたはほぼ全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインのほぼ全てを含む。ヒト化抗体はまた、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含んでいてよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。また、以下の総説およびそれにおいて引用される参考文献も参照されたい：ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５〜１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５〜１０３８（１９９５）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８〜４３３（１９９４）。
【００３５】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、および／または本明細書において開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを用いて作製されたものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に排除する。
【００３６】
本明細書において用いられる場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」、例えば、受容体、リガンド、または酵素）の「結合ドメイン」と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター構成要素とを組み合わせる、抗体様分子または免疫グロブリン様分子を指す。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識および結合部位（抗原結合部位）以外の（すなわち「異種の」）、望ましい結合特異性を有するアドヘシンアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、あらゆる免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭから得ることができる。
【００３７】
本明細書において用いられる「Ｆｃ融合タンパク質」は、１つまたは複数のポリペプチドがＦｃポリペプチド（例えば、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチド）に機能可能に連結しているタンパク質を意味する。Ｆｃ融合体は、免疫グロブリンのＦｃ領域（例えば、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチド）と、通常はあらゆるタンパク質、ポリペプチド、または低分子であり得る融合パートナーとを組み合わせる。事実上、あらゆるタンパク質または低分子が、Ｆｃに連結されてＦｃ融合体を生成し得る。タンパク質融合パートナーには、限定はしないが、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、または一部の他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれ得る。低分子融合パートナーには、Ｆｃ融合体を治療標的に向ける、あらゆる治療用物質が含まれ得る。このような標的は、あらゆる分子、例えば、限定はしないが、疾患に関与する細胞外受容体であり得る。
【００３８】
本明細書において用いられる「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」、およびその変型には、当技術分野において知られている意味が含まれ、それは、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、ＮＹ）（第４版、１９９９）；Ｂｌｏｏｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）６：４０７〜４１５；Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）、２０９：１９３〜２０２において説明されている。
【００３９】
本明細書において用いられる用語「ベクター」は、自らが連結している別の核酸を輸送し得る核酸分子を指すことを意図したものである。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをその中にライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ファージベクターである。別のタイプのベクターは、その中でさらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内にライゲーションすることができる、ウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性の哺乳動物ベクター）における自律的な複製が可能である。他のベクター（例えば、非エピソーム性の哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能可能に連結している遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単純に「組換えベクター」）と呼ばれる。通常、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられるベクター形態であるため、区別せずに用いられ得る。
【００４０】
本明細書において区別せずに用いられ得る「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、多量体の、単離されている可能性のある、少なくとも１０塩基長のヌクレオシドまたはヌクレオチドの形態を指す。この用語には、一本鎖形態および二本鎖形態が含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、あるいは、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼによってまたは合成反応によって多量体内に組み込まれ得る、あらゆる基質であり得る。
【００４１】
ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびその類似体などの、修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、多量体のアセンブリの前または後に行われ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、合成後に、標識とのコンジュゲーションなどによって、さらに修飾され得る。他のタイプの修飾には、例えば、「キャップ」、類似体での天然ヌクレオチドの１つまたは複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）でのヌクレオチド間修飾、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｏｌｙ−Ｌ−リジンなど）などの懸垂部分を含有するヌクレオチド間修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）でのヌクレオチド間修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するヌクレオチド間修飾、アルキル化剤を含有するヌクレオチド間修飾、修飾された連結（例えば、アルファアノマー核酸など）でのヌクレオチド間修飾、ならびに未修飾形態のポリヌクレオチドが含まれる。さらに、糖内に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えばホスホネート基、リン酸基によって置換され得るか、標準的な保護基によって保護され得るか、またはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を準備するために活性化され得るか、または固体もしくは半固体の担体にコンジュゲートされ得る。５’末端および３’末端のＯＨは、リン酸化され得るか、またはアミンもしくは１から２０炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、当技術分野において一般に知られている類似の形態のリボース糖またはデオキシリボース糖を含有し得、これには、例えば、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−アリルリボース、２’−フルオロリボース、または２’−アジドリボース、炭素環式の糖類似体、アルファアノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース、もしくはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替的な連結基によって置換することができる。これらの代替的な連結基には、限定はしないが、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、ＲまたはＲ’のそれぞれは、独立して、Ｈであるか、または、エーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含有していてよい、置換されたもしくは置換されていないアルキル（１〜２０Ｃ）である）によって置換されている実施形態が含まれる。ポリヌクレオチド内の全ての連結が同一である必要はない。先の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００４２】
本明細書において用いられる「オリゴヌクレオチド」は、短い、通常は一本鎖の、通常は合成のポリヌクレオチドを通常指し、これは通常、約２００ヌクレオチド未満の長さであるが、必ずしもそうではない。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドに等しくかつ完全に適用可能である。
【００４３】
本明細書において用いられるヌクレオチド配列についての言及は、別段の特定がない限り、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸への言及は、文脈によって別段の規定がない限り、その相補配列を有するその相補鎖を包含すると理解される。
【００４４】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチドインサートの組み込みのためのベクターのレシピエントであり得るか、またはそれである、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して、必ずしも元の親細胞に完全に同一である必要はない（形態学的に、またはゲノムＤＮＡ相補体において）。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチドでインビボでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
【００４５】
「個体」または「対象」は、哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。哺乳動物にはまた、限定はしないが、家畜、スポーツ用動物、ペット、霊長類、馬、犬、猫、マウス、およびラットが含まれる。
【００４６】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる添加剤」には、活性成分と組み合わされるとその活性成分に生物学的活性を保持させ、かつ対象の免疫系と非反応性である、あらゆる材料が含まれる。例には、限定はしないが、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤のいずれかが含まれる。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい賦形剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または通常の（０．９％）生理食塩水である。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５を参照されたい）。
【００４７】
当技術分野において用いられる場合、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。好ましいＦｃＲは、非変性配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体を結合するもの（ガンマ受容体）であり、対立遺伝子変異体を含むＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体、またあるいはこれらの受容体のスプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれる。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２、１９９１；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４、１９９４；およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１、１９９５において概説されている。「ＦｃＲ」にはまた、胎児への母親のＩｇＧの移入に関与する新生児受容体、ＦｃＲｎが含まれる（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７、１９７６；およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９、１９９４）。
【００４８】
「機能的Ｆｃ領域」は、非変性配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有する。典型的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑの結合、相補体依存性の細胞傷害性、Ｆｃ受容体の結合、抗体依存性の細胞介在性細胞傷害性、食作用、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方調節などが含まれる。このようなエフェクター機能には、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることが必要であり、このような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野において知られている様々なアッセイを用いて評価することができる。
【００４９】
本明細書における「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体に向けられた実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」と言及する記載には、「Ｘ」の記載が含まれる。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。「約」または「およそ」は、計数可能な数値変数に関して用いられる場合、示された変数値と、示された値の実験誤差内（例えば、平均の９５％信頼区間内）または示された値の１０パーセント内のいずれか大きい方の、全ての変数値とを指す。
【００５０】
実施形態が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語を用いて本明細書において記載されているところではどこでも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語で記載されている他の類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
【００５１】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュグループまたは選択肢の他のグルーピングの用語で記載されている場合、本発明は、列挙されるグループ全体をまとめて含むだけではなく、グループの各メンバーおよびも個別に含み、メイングループの全ての考えられるサブグループも含み、また、グループメンバーの１つまたは複数が欠けたメイングループも含む。本発明はまた、特許請求の範囲に記載の発明におけるグループメンバーのいずれかの、１つまたは複数を明確に排除することを想定する。
【００５２】
別段の規定がない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。典型的な方法および材料が本明細書において記載されるが、本明細書において記載されるものに類似または同等の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において用いることができる。本明細書において言及される全ての刊行物および他の参考文献は、参照することによってその全体が組み込まれる。矛盾するケースでは、定義を含み、本明細書が優先される。多くの文献が本明細書において引用されるが、この引用は、これらの文献のいずれかが当技術分野における共通の一般知識の一部を形成することの承認を構成するものではない。本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変型は、言及された整数または整数群を含むことを含意するが、いかなる他の整数または整数群も排除するものではないことが理解される。文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。
【００５３】
典型的な方法および材料が本明細書において記載されるが、本明細書において記載されるものに類似または同等の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において用いることができる。材料、方法、および例は、説明のためのものにすぎず、限定することを意図したものではない。
【００５４】
単量体Ｆｃ含有ポリペプチド
１つの態様において、本発明は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃ含有ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含み、操作されたＮ連結型グリコシル化部位が、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸であるＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのコンセンサス配列を提供するための少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを提供する。
【００５５】
本明細書において用いられるＰｒｏを除く任意のアミノ酸には、天然アミノ酸残基、例えばＭｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、およびＨｉｓが含まれる。一部の態様において、Ｘは、プロリンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。一部の態様において、Ｘは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、およびＨからなる群から選択される。一部の態様において、Ｘは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、およびＨからなる群から選択される。一部の態様において、ＸはＧである。一部の態様において、ＸはＡである。一部の態様において、ＸはＩである。一部の態様において、ＸはＬである。一部の態様において、ＸはＶである。一部の態様において、ＸはＭである。一部の態様において、ＸはＦである。一部の態様において、ＸはＷである。一部の態様において、ＸはＳである。一部の態様において、ＸはＴである。一部の態様において、ＸはＣである。一部の態様において、ＸはＹである。一部の態様において、ＸはＮである。一部の態様において、ＸはＱである。一部の態様において、ＸはＤである。一部の態様において、ＸはＥである。一部の態様において、ＸはＫである。一部の態様において、ＸはＲである。一部の態様において、ＸはＨである。先の記載は、明らかに別のことが指示されていない限り、または技術的に禁止されていない限り、明細書におけるＸの全ての参照に適用される。
【００５６】
Ｎ連結型グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ）を疎水性ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面のどこに組み込むかを決定するために用いられる方法（図１を参照されたい）は、実施例１において記載されており、１）結晶構造に基づいてＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面上に位置する残基を同定し（例えば、ヒトガンマ１Ｆｃ）、Ｆｃ二量体とＦｃ二量体の一方の鎖（本発明者らの知る限りでは、本発明の前には単量体Ｆｃについて結晶構造は誘導されていなかったため、理論的Ｆｃ単量体）との両方における各残基のアクセス可能な表面のパーセント（％ＡＳＡ）を計算すること、２）タンパク質の構造的フレームワークの維持において重要な役割を有するアミノ酸残基（例えば、プロリン残基、グリシン残基、およびシステイン残基）の突然変異生成を避けること、３）ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面における同定されたアミノ酸残基で、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸であるＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのコンセンサス配列を組み込むこと、ならびに４）Ｆｃドメインの一方の鎖の三次元構造上にマッピングされたアミノ酸残基を手作業で調べ、操作されたＮ連結型グリコシル化部位がＣＨ３−ＣＨ３界面を分離するためにほとんど影響を有し得ない位置（例えば、Ｌｅｕ２５６および２７６Ａｓｐ）を排除すること、を含む。
【００５７】
したがって、一部の実施形態において、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面におけるアミノ酸修飾は、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸である、Ｑ３４７Ｎ−Ｘ−Ｙ３４９Ｔ、Ｑ３４７Ｎ−Ｘ−Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｎ−Ｘ−Ｌ３５１Ｔ、Ｙ３４９Ｎ−Ｘ−Ｌ３５１Ｓ、Ｌ３５１Ｎ−Ｘ−Ｐ３５３Ｔ、Ｌ３５１Ｎ−Ｘ−Ｐ３５３Ｓ、Ｓ３５４Ｎ−Ｘ−Ｄ３５６Ｔ、Ｓ３５４Ｎ−Ｘ−Ｄ３５６Ｓ、Ｄ３５６Ｎ−Ｘ−Ｌ３５８Ｔ、Ｄ３５６Ｎ−Ｘ−Ｌ３５８Ｓ、Ｅ３５７Ｎ−Ｘ−Ｔ３５９Ｓ、Ｋ３６０Ｎ−Ｘ−Ｑ３６２Ｔ、Ｋ３６０Ｎ−Ｘ−Ｑ３６２Ｓ、Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｔ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｓ、Ｋ３７０Ｎ−Ｘ−Ｆ３７２Ｔ、Ｋ３７０Ｎ−Ｘ−Ｆ３７２Ｓ、Ｋ３９２Ｎ−Ｘ−Ｔ３９４Ｓ、Ｖ３９７Ｎ−Ｘ−Ｄ３９９Ｔ、Ｖ３９７Ｎ−Ｘ−Ｄ３９９Ｓ、Ｓ４００Ｎ−Ｘ−Ｇ４０２Ｔ、Ｓ４００Ｎ−Ｘ−Ｇ４０２Ｓ、Ｄ４０１Ｎ−Ｘ−Ｓ４０３Ｔ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｔ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｓ、Ｙ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、Ｙ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓ、Ｋ４０９Ｎ−Ｘ−Ｔ４１１Ｓ、Ｋ４３９Ｎ−Ｘ−Ｌ４４１Ｔ、Ｋ４３９Ｎ−Ｘ−Ｌ４４１Ｓ、Ｓ４４４Ｎ−Ｘ−Ｇ４４６Ｔ、およびＳ４４４Ｎ−Ｘ−Ｇ４４６Ｓからなる群から選択される。
【００５８】
一部の実施形態において、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面におけるアミノ酸修飾は、Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｔ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｔ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｓ、Ｙ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、およびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面におけるアミノ酸修飾は、Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６Ｓ、Ｙ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、またはＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓである。
【００５９】
一部の実施形態において、ＣＨ３領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  ＣＨ３領域である。一部の実施形態において、ＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧ  ＣＨ３領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  ＣＨ３領域および／またはＣＨ２領域）を含む。本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの例は、配列番号１７〜５２に示されている。
【００６０】
別の態様において、本発明はまた、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃ含有ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において２つの操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含み、操作されたＮ連結型グリコシル化部位が、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのコンセンサス配列を有する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸である、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを提供する。
【００６１】
したがって、一部の実施形態において、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面におけるアミノ酸修飾は、ａ）Ｓ３６４ＮおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、ｂ）Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、ｃ）Ｓ３６４ＮおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓ、ならびにｄ）Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓからなる群から選択される。２つの操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む本発明の典型的な単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号５３〜５８に示されている。
【００６２】
別の態様において、本発明はさらに、ＣＨ２−ＣＨ２界面において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含み、操作されたＮ連結型グリコシル化部位は、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのコンセンサス配列を有する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、ＣＨ２ドメインにおけるアミノ酸修飾は、Ｓ２３９Ｎ−Ｘ−Ｆ２４１Ｓ、Ｓ２３９Ｎ−Ｘ−Ｆ２４１Ｔ、Ｆ２４１Ｎ−Ｘ−Ｆ２４３Ｔ、Ｆ２４１Ｎ−Ｘ−Ｆ２４３Ｓ、Ｅ２５８Ｎ、Ｅ２５８Ｎ−Ｘ−Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｔ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６２Ｎ−Ｘ−Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６２Ｎ−Ｘ−Ｖ２６４Ｔ、Ｋ２８８Ｔ、Ｋ２８８Ｓ、Ｋ２８８Ｎ−Ｋ２９０Ｔ、Ｋ２８８Ｎ−Ｋ２９０Ｓ、Ｖ３０５Ｎ、およびＶ３０５−Ｘ−Ｔ３０７Ｓからなる群から選択される。他の実施形態において、ＣＨ２ドメインにおけるアミノ酸修飾は、Ｅ２５８Ｎ、Ｅ２５８Ｎ−Ｘ−Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｔ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｓ、Ｋ２８８Ｔ、Ｋ２８８Ｓ、Ｖ３０５Ｎ、およびＶ３０５−Ｘ−Ｔ３０７Ｓからなる群から選択される。ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面とＣＨ２−ＣＨ２界面との両方において操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの例は、配列番号５９〜６６に示されている。
【００６３】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む単量体Ｆｃ含有ポリペプチドであって、操作されたＮ連結型グリコシル化部位が、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸である、Ｅ２５８Ｎ−Ｘ−Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｔ、Ｔ２６０Ｎ−Ｘ−Ｖ２６２Ｓ、Ｖ３０５Ｎ、Ｖ３０５Ｎ−Ｘ−Ｔ３０７Ｓ、Ｑ３４７Ｎ−Ｘ−Ｙ３４９Ｔ、Ｑ３４７Ｎ−Ｘ−Ｙ３４９Ｓ、Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｎ−Ｘ−Ｌ３６８Ｔ、Ｔ３６６Ｎ−Ｘ−Ｌ３６８Ｓ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｔ、Ｌ３６８Ｎ−Ｘ−Ｋ３７０Ｓ、Ｄ４０１Ｎ、Ｄ４０１Ｎ−Ｘ−Ｓ４０３Ｔ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｔ、Ｆ４０５Ｎ−Ｘ−Ｙ４０７Ｓ、Ｙ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ、Ｙ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｓ、およびＫ４０９Ｎ−Ｘ−Ｔ４１１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを提供する。
【００６４】
別の態様において、本発明は、組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドであって、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面においてまたはＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面とＣＨ２−ＣＨ２界面との両方において、同一のまたは異なる操作されたＮ連結型グリコシル化部位を有する、ポリペプチドを提供する。
【００６５】
単量体Ｆｃ含有ポリペプチドのそれぞれは、カルボキシル−アミノ（Ｃ−Ｎ）末端連結を介して直接的に、またはリンカーもしくはスペーサーを介して間接的に、別の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドに組換えによって連結し得る。一部の実施形態において、リンカーまたはスペーサーは、短い連結ペプチドであり得る。連結ペプチドの例は、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号８９）であり、式中、ｎは、１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５のいずれかであり得る。例えば、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のいずれかであり得る。リンカーまたはスペーサーの他の例は、設計および使用されている（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６（１９８８））。リンカーまたはスペーサーは、短い柔軟なポリペプチドであり、好ましくは、約２０未満のアミノ酸残基を含む。リンカーまたはスペーサーは、次いで、さらなる機能、例えば、薬剤の付着または固体担体への付着のために、修飾され得る。
【００６６】
したがって、一部の実施形態において、本発明は、組換えによって連結した少なくとも２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドであって、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において同一の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含み、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、リンカーを介して組換えによって連結している、ポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、各Ｆｃ含有ポリペプチドは、操作されたＮ連結型グリコシル化部位Ｓ３６４Ｎ、および、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸（例えば、ＬｅｕおよびＳｅｒ）であるＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔを含む。他の実施形態において、各Ｆｃ含有ポリペプチドは、操作されたＮ連結型グリコシル化部位Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔを含む。一部の実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号８９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９２）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９３）である。組換えによって連結した少なくとも２つの同一の本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドの例は、配列番号７９〜８８に示されている。
【００６７】
他の実施形態において、本発明は、組換えによって連結した少なくとも２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドであって、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において、異なる操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含み、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、リンカーを介して組換えによって連結している、ポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、第１のＦｃ含有ポリペプチドは、操作されたＮ連結型グリコシル化部位Ｓ３６４ＮおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔを含み、第２のＦｃ含有ポリペプチドは、操作されたＮ連結型グリコシル化部位Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔを含み、式中、Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸（例えば、ＬｅｕおよびＳｅｒ）である。一部の実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号８９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９２）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９３）である。
【００６８】
別の実施形態において、本発明は、組換えによって連結した少なくとも２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドであって、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面において、同一のまたは異なる操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含み、各Ｆｃ含有ポリペプチドが、Ｃ−Ｎ末端を介して直接的に組換えによって連結している、ポリペプチドを提供する。したがって、一部の実施形態において、各Ｆｃ含有ポリペプチドは、操作されたＮ連結型グリコシル化部位Ｓ３６４ＮおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔ（例えば、配列番号７７〜７８を参照されたい）またはＳ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔを含む。一部の実施形態において、第１のＦｃ含有ポリペプチドは、操作されたＮ連結型グリコシル化部位Ｓ３６４ＮおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔを含み、第２のＦｃ含有ポリペプチドは、操作されたＮ連結型グリコシル化部位Ｓ３６４Ｎ−Ｘ−Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｎ−Ｘ−Ｋ４０９Ｔを含む。
【００６９】
組換えによって連結した２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドは、操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含まない野生型ＩｇＧのアフィニティーに類似の高いアフィニティーでＦｃＲｎに結合する。実施例５を参照されたい。本明細書において記載されるこのようなポリペプチドはまた、酸性ｐＨでＦｃＲｎに堅く結合し、中性ｐＨでＦｃＲｎから効率的に解離し１つの操作された単量体Ｆｃを含むポリペプチドよりも少なくとも２倍長い血清半減期を示す。例えば、実施例５〜６を参照されたい。したがって、一部の実施形態において、組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドは、２つの操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む１つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドによって示される血清半減期よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、および９倍のいずれか長い血清半減期を有する。
【００７０】
Ｆｃドメインを含むいかなる分子も、本発明の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含み得る。例えば、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、例えばＦａｂまたは異種ポリペプチド配列（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）に連結、コンジュゲート、または融合し得る。したがって、一部の実施形態において、Ｆａｂは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面においてまたはＣＨ２−ＣＨ２界面とＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面との両方において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む単量体Ｆｃ含有ポリペプチドに融合する。例えば、実施例５および６を参照されたい。他の実施形態において、Ｆａｂは、組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドに融合する。例えば、実施例５および６を参照されたい。
【００７１】
他の実施形態において、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、別のポリペプチドまたは分子作用物質に連結した単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの全てまたは一部を含む融合抗体またはイムノアドヘシンを作製することなどによって、修飾または誘導体化され得る。本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、より安定な融合分子を生産することによって、かつ／または、一般的に「ペグ化」と呼ばれる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生体適合性ポリマーでの処理によって、または当技術分野において周知の多くの他の操作方法のいずれかによって、例えばインビボ半減期をさらに延ばすために、修飾または誘導体化され得る。
【００７２】
単量体Ｆｃ含有融合タンパク質は、周知の技術を用いて、限定はしないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基またはエチル基、エステル、糖質基などを含む、化学基で誘導体化され得る。これらの化学基（および、インビボで治療用化合物を安定化するために用いられている、それに類似の他のもの）は、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの生物学的特徴を向上させるため、例えば血清半減期および生物活性を増大させるために、有用である。
【００７３】
単量体Ｆｃ含有融合タンパク質はまた、当技術分野において知られている多数の方法のいずれかを用いて標識され得る。本明細書において用いられる場合、用語「標識する」または「標識された」は、抗体内への別の分子の組み込みを指す。１つの実施形態において、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み、またはマーカー付けされたアビジン（例えば、光学的方法または比色分析方法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの付着である。別の実施形態において、標識またはマーカーは、治療用のもの、例えば、薬剤コンジュゲートまたは毒素であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が、当技術分野において知られており、使用され得る。ポリペプチドの標識の例には、限定はしないが、放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、第２のレポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、磁気作用物質、例えばガドリニウムキレート、毒素、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにその類似体またはホモログが含まれる。一部の実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームによって付着される。
【００７４】
本発明の別の態様において、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、例えばＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において記載されているもののような既知の技術を用いて、対象に投与する際の免疫原性を低減するために脱免疫化され得る。
【００７５】
本発明の別の態様において、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、ポリペプチドの特徴（例えば、ＰＫ、免疫原性、凝集、または血清半減期）を改変するためにさらなる突然変異および／または修飾を含み得る。例えば、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、４２８位にロイシン、および４３４位にセリンをさらに含み得る。例えば、米国特許第８，０８８，３７６号を参照されたい。
【００７６】
核酸、ベクター、および細胞
本発明はまた、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドをコードする核酸分子および核酸配列を包含する。一部の実施形態において、異なる核酸分子が、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの１つもしくは複数または一部をコードする。他の実施形態において、同一の核酸分子が、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドをコードする。
【００７７】
本発明の核酸分子には、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、例えば、本発明の核酸配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％、またはそれ以上同一な核酸が含まれる。
【００７８】
核酸配列の文脈における用語「配列同一性パーセント」は、最大の対応でアラインされた場合に同一である、２つの配列における残基を意味する。配列同一性の比較の長さは、一続きの少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約１８ヌクレオチド、さらに通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、さらに典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約３６、４８、またはそれ以上のヌクレオチドにわたり得る。ヌクレオチド配列の同一性を測定するために用いることができる、当技術分野において知られている多くの異なるアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、マディソン、ウィスコンシン州のプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較することができる。例えばプログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡは、クエリー配列とサーチ配列との間の最良のオーバーラップの領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３〜９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５〜２１９（２０００）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７〜２５８（１９９６）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７６：７１〜８４（１９９８））。別段の特定がない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムのデフォルトパラメータが用いられる。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、参照することによって本明細書に組み込まれる、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメータ（語長６およびスコアリングマトリクスのためのＮＯＰＡＭ因子）と共に用いて、またはＧａｐをＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１において提供されているそのデフォルトパラメータと共に用いて、決定することができる。
【００７９】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの１つまたは複数または一部をコードする核酸配列を含むベクターを提供する。
【００８０】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの１つまたは複数または一部を発現するために適切なベクターを提供する。
【００８１】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、特異的アミノ酸配列、例えば、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン領域などの特異的抗体配列のためのプローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられる。例えば、核酸は、診断方法におけるプローブとして、または有用な配列をコードするさらなる核酸分子をとりわけ単離するために用いられ得る、ＤＮＡの領域を増幅するためのＰＣＲプライマーとして、用いることができる。一部の実施形態において、核酸分子は、オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、目的の抗体の重鎖のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン領域に由来する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの修飾されたＣＨ３領域の１つまたは複数の全てまたは一部をコードする。
【００８２】
本発明の組換え発現ベクターは、一部の実施形態において、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有し得る。当業者には、調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要素に応じ得ることが、理解されよう。哺乳動物宿主細胞の発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマに由来する、プロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびに強力な哺乳動物プロモーター、例えば非変性免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターが含まれる。ウイルスの調節エレメントのさらなる説明およびその配列については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、米国特許第４，５１０，２４５号、および米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。プロモーターおよびベクターの説明、ならびに植物の形質転換を含む、植物において抗体を発現させるための方法は、当技術分野において知られている。例えば、ＵＳ６，５１７，５２９を参照されたい。細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞においてポリペプチドを発現させるための方法もまた、当技術分野において周知である。
【００８３】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択マーカー遺伝子を有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号、および米国特許第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。例えば、選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞におけるメトトレキサート選択／増幅との使用のため）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８の選択のため）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子が含まれる。
【００８４】
本明細書において用いられる用語「発現制御配列」は、ポリヌクレオチド配列であって、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを生じさせるために必要である、ポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を増強させる配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強させる配列、ならびに望ましい場合は、タンパク質の分泌を増強させる配列が含まれる。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なり、原核生物においては、このような制御配列には、通常、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が含まれ、真核生物においては、通常、このような制御配列には、プロモーターおよび転写終結配列が含まれる。用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現およびプロセシングに必須の全構成要素を含むことが意図され、また、その存在が有利であるさらなる構成要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。
【００８５】
単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを生産する方法
１つの態様において、本発明は、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、または組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドを生産する方法を提供する。
【００８６】
一部の実施形態において、ａ）ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃ含有ポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養するステップであって、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面においてまたはＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面とＣＨ２−ＣＨ２界面との両方において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含み培養された宿主細胞が単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを発現する、ステップ、ならびに、場合により、ｂ）宿主細胞培養物から単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを回収するステップを含む、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを生産する方法が提供される。一部の実施形態において、操作されたＮ連結型グリコシル化部位は、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸であるＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのコンセンサス配列を有する、１つまたは複数の（例えば２つの）アミノ酸修飾を含む。
【００８７】
一部の実施形態において、ａ）ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む第１の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに第１の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドと同一のまたは異なる操作されたＮ連結型グリコシル化部位を有する第２の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドをコードする同一のまたは異なる核酸分子を含む宿主細胞を培養するステップであって、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面においてまたはＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面とＣＨ２−ＣＨ２界面との両方において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含み、培養された宿主細胞が、第１およびの第２の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを発現する、ステップ、ならびにｂ）ポリペプチドを回収するステップを含む、組換えによって連結した少なくとも２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドを生産する方法が提供される。一部の実施形態において、操作されたＮ連結型グリコシル化部位は、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸であるＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのコンセンサス配列を有する、１つまたは複数の（例えば２つの）アミノ酸修飾を含む。一部の実施形態において、第１および第２の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、Ｃ−Ｎ末端連結を介して、または本明細書において開示されているリンカーを用いてリンカーを介して、組換えによって連結されている。
【００８８】
一部の実施形態において、ａ）ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む第１の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを第１の宿主細胞において発現させるステップであって、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面においてまたはＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面とＣＨ２−ＣＨ２界面との両方において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む、ステップ、ｂ）第１の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドと同一のまたは異なる操作されたＮ連結型グリコシル化部位を有する第２の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを第２の宿主細胞において発現させるステップ、ｃ）ステップａ）の第１の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドおよびステップｂ）の第２の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを単離するステップ、ならびにｄ）ポリペプチドの形成のために（例えば、組換えによって連結した少なくとも２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチド）、ステップｃ）の２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを適切な条件下でインキュベートするステップを含む、組換えによって連結した少なくとも２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドを生産する方法が提供される。一部の実施形態において、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸であるＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのコンセンサス配列を有する、操作されたＮ連結型グリコシル化部位は、１つまたは複数の（例えば２つの）アミノ酸修飾を含む。一部の実施形態において、ステップｃ）の２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、本明細書において開示されているリンカー（例えば、ｎが１〜１０である（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号８９））の存在下でインキュベートされる。
【００８９】
一部の実施形態において、ａ）ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む第１の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを提供するステップであって、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面においてまたはＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面とＣＨ２−ＣＨ２界面との両方において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む、ステップ、ｂ）ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む第２の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを提供するステップであって、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面においてまたはＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面とＣＨ２−ＣＨ２界面との両方において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む、ステップ、ｃ）第１の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを、第２の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドと組換えによって連結させるステップを含む、組換えによって連結した少なくとも２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドを生産する方法が提供される。一部の実施形態において、第１の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、第２の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドと同一であるか、または異なる。一部の実施形態において、操作されたＮ連結型グリコシル化部位は、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸であるＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのコンセンサス配列を有する１つまたは複数の（例えば２つの）アミノ酸修飾を含む。一部の実施形態において、第１および第２の単量体Ｆｃ含有ポリペプチドは、Ｃ−Ｎ末端連結を介して、または本明細書において開示されているリンカーを用いてリンカーを介して、組換えによって連結されている。
【００９０】
一部の実施形態において、本明細書において記載される方法は、さらに、クロマトグラフィーによる精製ステップを含む。
【００９１】
クロマトグラフィーには、限定はしないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、液相クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ（高性能（または圧力）液体クロマトグラフィー）およびＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー））、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに弱分配クロマトグラフィーが含まれる。アフィニティークロマトグラフィーのためのカラムの例には、プロテインＡ（合成、組換え、または非変性）カラム、およびプロテインＧ（合成、組換え、または非変性）カラムが含まれる。
【００９２】
当業者であれば、周知の技術を用いて、本明細書において開示されている方法に従って用いるための分子または抗体の相対量を容易に決定することができる。
【００９３】
本明細書において開示される方法において、インキュベーションは、さまざまな温度で行うことができる。このような温度は、当業者によって認識され、例えば、混合された分子または抗体において変性または分解などの有害な物理的変化が生じないインキュベーション温度を含む。特定の実施形態において、インキュベーションは、３７℃で行われる。
【００９４】
多くの宿主細胞のいずれも、本発明の方法において用いることができる。このような細胞は、当技術分野において知られている（そのうちの一部は本明細書において記載されている）か、または、当技術分野において知られている通常の技術を用いて、本発明の方法において用いるための適合性に関して経験的に決定され得る。特定の実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態において、大腸菌は、内因性プロテアーゼ活性を欠いている株のものである。一部の実施形態において、大腸菌宿主細胞の遺伝子型は、ｄｅｇＰ遺伝子およびｐｒｃ遺伝子を欠いており、突然変異ｓｐｒ遺伝子を有する。
【００９５】
一部の実施形態において、本発明の方法は、さらに、宿主細胞において発現すると本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの収量を増強させる分子をコードするポリヌクレオチドまたは組換えベクターを宿主細胞において発現させることを含む。例えば、このような分子は、シャペロンタンパク質であり得る。１つの実施形態において、前記分子は、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＧ、およびＦｋｐＡからなる群から選択される原核生物ポリペプチドである。これらの方法の一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤｓｂＡとＤｓｂＣとの両方をコードする。
【００９６】
非ハイブリドーマ宿主細胞およびタンパク質を組換えによって生産する方法
１つの態様において、本発明は、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの組換え発現を可能にする組換え宿主細胞を提供する。このような組換え宿主細胞におけるこのような組換え発現によって生産された抗体断片は、本明細書において、「組換え抗体断片」と呼ばれる。本発明はまた、このような宿主細胞の子孫細胞、およびこの子孫細胞によって生産される抗体を提供する。本明細書において用いられる用語「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」が、特定の対象細胞だけではなく、このような細胞の子孫も意味することが理解される。特定の修飾が、突然変異または環境的影響のいずれかに起因して、後の世代において生じ得るため、このような子孫は、実際には、親細胞に同一ではない可能性があるが、本明細書において用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。このような細胞は、上記のような本発明に従ったベクターを含み得る。
【００９７】
別の態様において、本発明は、上記のような単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを作製するための方法を提供する。１つの実施形態によると、前記方法は、上記のようなベクターでトランスフェクトまたは形質転換された細胞を培養すること、およびその前記単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを回収することを含む。単量体Ｆｃ含有ポリペプチドをコードする核酸分子、およびこれらの核酸分子を含むベクターは、適切な哺乳動物宿主細胞、植物宿主細胞、細菌宿主細胞、または酵母宿主細胞のトランスフェクションに用いることができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するためのあらゆる既知の方法によるものであり得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入するための方法は、当技術分野において周知であり、デキストラン介在性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内でのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションを含む。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞内に導入することができる。細胞を形質転換する方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，９１２，０４０号、米国特許第４，７４０，４６１号、および米国特許第４，９５９，４５５号を参照されたい。植物細胞を形質転換する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、アグロバクテリウム介在性の形質転換、微粒子銃形質転換、直接的な注入、エレクトロポレーション、およびウイルス形質転換を含む。細菌細胞および酵母細胞を形質転換する方法もまた、当技術分野において周知である。
【００９８】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当技術分野において周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系を含む。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および多くの他の細胞系が含まれる。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有するかを決定することを介して選択される。用いることができる他の細胞系は、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞などの昆虫細胞系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞内に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、またはさらに好ましくは宿主細胞が成長する培養培地内への抗体の分泌を可能にするために十分な一定期間にわたって宿主細胞を培養することによって生産される。抗体（例えば、単量体抗体断片）は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培養培地から回収することができる。適切な植物宿主細胞には、例えば、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アオウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどが含まれ得る。適切な細菌宿主細胞には、例えば、大腸菌およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種が含まれ得る。適切な酵母宿主細胞には、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれ得る。
【００９９】
生産細胞系からの本発明のポリペプチドまたはその一部分の発現は、多くの既知の技術を用いて増強させることができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下での発現を増強させるための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、欧州特許第０２５６０５５号、欧州特許第０３２３９９７号、および欧州特許第０３３８８４１号に関連して、全体または一部が論じられている。
【０１００】
単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを使用する方法
本発明はまた、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、および組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドのための、様々な治療用途を提供する。１つの態様において、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、またはこのようなＦｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドは、充実性腫瘍もしくは他の閉塞抗原内への、フルサイズの抗体と比較して良好な浸透およびアクセスを提供するため、またはフルサイズの抗体もしくは本明細書において記載される特異的な操作されたＮ連結型グリコシル化部位を有さない単量体Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して凝集および不安定性を低減させるために用いることができる。
【０１０１】
医薬組成物
１つの態様において、本発明は、薬学的に許容できる担体内に、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、または組換えによって連結した少なくとも２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドを含む、医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、中性形態（両性イオン形態を含む）で、または正もしくは負に荷電した種として、存在し得る。一部の実施形態において、本明細書において記載されるポリペプチドは、対イオンと複合して「薬学的に許容できる塩」を形成し得、この塩は、１つまたは複数のポリペプチドおよび１つまたは複数の対イオンを含む複合体を指し、対イオンは、薬学的に許容できる無機および有機の酸および塩基に由来する。
【０１０２】
単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、または組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドは、単独で、または１つもしくは複数の他の本発明のポリペプチドと組み合わせて、または１つもしくは複数の他の薬剤と組み合わせて（または、そのあらゆる組み合わせとして）投与することができる。本発明の医薬組成物、方法、および使用は、したがって、以下に詳述するように、他の活性物質との組み合わせ（同時投与）の実施形態も包含する。
【０１０３】
本明細書において用いられる場合、本発明の単量体抗体断片および１つまたは複数の他の治療物質に関する、用語「同時投与」、「同時投与された」、および「と組み合わせて」は、（ｉ）単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、または組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドと、治療物質とのこのような組み合わせの、治療を必要としている患者への同時の投与（このような構成要素が、前記構成要素を実質的に同時に前記患者に放出する単回投薬形態に、共に製剤される場合）、（ｉｉ）単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、または組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドと、治療物質とのこのような組み合わせの、治療を必要としている患者への、実質的に同時の投与（このような構成要素が、前記患者によって実質的に同時に摂取され、その際、前記構成要素が前記患者に実質的に同時に放出される、分離した投薬形態に、互いに分かれて製剤される場合）、（ｉｉｉ）単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、または組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドと、治療物質とのこのような組み合わせの、治療を必要としている患者への、連続投与（このような構成要素が、各投与の間に十分な時間間隔を置いて前記患者によって連続的な時点で摂取され、その際、前記構成要素が実質的に異なる時点で前記患者に放出される、分離した投薬形態に、互いに分かれて製剤される場合）、ならびに（ｉｖ）単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、または組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドと、治療物質とのこのような組み合わせの、治療を必要としている患者への、連続投与（このような構成要素が、前記構成要素を制御された様式で放出し、その際、構成要素が、同一のおよび／または異なる時点で、同時に、連続して、および／または重複して、前記患者に放出され、各部分が、同一のまたは異なる経路によって投与され得る、単回投薬形態に、共に製剤される場合）を意味することを意図したものであり、かつこれを指し、かつこれを含む。
【０１０４】
通常、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、または組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドは、１つまたは複数の薬学的に許容できる添加剤を伴う製剤として投与されるのに適している。用語「添加剤」は、本発明の化合物以外のあらゆる成分を記載するために、本明細書において用いられる。添加剤の選択は、特定の投与態様、溶解度および安定性に対する添加剤の効果、ならびに投薬形態の性質などの要素に大きく依存する。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容できる添加剤」には、生理学的に適合するあらゆるおよび全ての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容できる添加剤の一部の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組み合わせである。多くのケースにおいて、組成物内に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。薬学的に許容できる物質のさらなる例は、湿潤剤または微量の補助物質、例えば、抗体の保存期間または有効性を増強させる、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤、または緩衝剤である。
【０１０５】
本発明の医薬組成物およびそれを調製するための方法は、当業者に容易に明らかとなろう。このような組成物およびそれを調製するための方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２１版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２００５）において見ることができる。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件の下で製造される。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、単回単位用量として、または複数の単回単位用量として、バルクで、調製、包装、または販売され得る。本明細書において用いられる場合、「単位用量」は、所定の量の活性成分を含む、医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、通常、対象に投与される活性成分の投与量、またはこのような投与量の都合の良い画分、例えばこのような投与量の２分の１もしくは３分の１に等しい。当技術分野において許容される、ペプチド、タンパク質、または抗体を投与するためのいかなる方法も、本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドに適切に採用され得る。
【０１０７】
本発明の医薬組成物は、典型的には、非経口投与に適している。本明細書において用いられる場合、医薬組成物の「非経口投与」には、対象の組織の物理的破損、および組織における破損を介する医薬組成物の投与によって特徴付けされ、その結果、血流内、筋肉内、または内臓内への直接的な投与を通常もたらす、あらゆる投与経路が含まれる。非経口投与には、したがって、限定はしないが、組成物の注入による、外科的切開を介する組成物の適用による、組織を貫通する非外科的創傷を介する組成物の適用による、およびそれに類するものによる、医薬組成物の投与が含まれる。具体的には、非経口投与には、限定はしないが、皮下の、腹腔内の、筋肉内の、胸骨内の、静脈内の、動脈内の、髄腔内の、脳室内の、尿道内の、頭蓋内の、滑液嚢内の注入または点滴、および腎臓透析点滴技術が含まれることとする。好ましい実施形態には、静脈内経路および皮下経路が含まれる。
【０１０８】
非経口投与に適切な医薬組成物の製剤は、典型的には、通常、薬学的に許容できる担体、例えば滅菌水または無菌等張生理食塩水と組み合わされた活性成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適切な形態で調製、包装、または販売され得る。注入可能な製剤は、単位投与形態で、例えば、アンプルで、または防腐剤を含有する多回用量容器で、調製、包装、または販売され得る。非経口投与のための製剤には、限定はしないが、懸濁剤、液剤、油性媒体または水性媒体内の乳剤、パスタ剤などが含まれる。このような製剤は、さらに、限定はしないが、懸濁化剤、安定化剤、または分散剤を含む、１つまたは複数のさらなる成分を含み得る。非経口投与のための製剤の１つの実施形態において、活性成分は、適切な媒体（例えば、発熱性物質を含まない滅菌水）で再構成し、その後、再構成された組成物を非経口投与するために、乾燥（すなわち、粉末または粒状）形態で提供される。非経口製剤にはまた、塩、糖質、および緩衝化剤（好ましくは、３から９のｐＨまで）などの添加剤を含有し得る水溶液が含まれるが、一部の適用では、非経口製剤は、無菌非水溶液として、または発熱性物質を含まない滅菌水などの適切な媒体と組み合わせて用いるための乾燥形態として、より適切に製剤され得る。典型的な非経口投与形態には、無菌水溶液中の溶液または懸濁液、例えば、プロピレングリコール水溶液またはデキストロース水溶液が含まれる。このような投薬形態は、必要に応じて、適切に緩衝され得る。他の有用な非経口投与可能な製剤には、微晶質形態の、またはリポソーム調製物中の活性成分を含むものが含まれる。非経口投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出されるように製剤され得る。調節放出製剤には、制御放出製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、標的放出製剤、およびプログラム放出製剤が含まれる。例えば、１つの態様において、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを、適切な溶媒中に所要の量で、上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要に応じて、その後、濾過滅菌することによって、無菌注入可能溶液を調製することができる。通常、分散体は、活性化合物を、塩基性分散媒質および上記に列挙されたものからの所要の他の成分を含有する無菌媒体中に組み込むことによって調製される。無菌注入可能溶液の調製のための無菌粉末のケースでは、好ましい調製方法は、先に滅菌濾過された溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤を用いることによって、分散体のケースでは所要の粒子サイズを維持することによって、および界面活性を用いることによって、維持することができる。注入可能組成物の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって、もたらされ得る。
【０１０９】
典型的な、非限定的な本発明の医薬組成物は、約５．０から約６．５の範囲のｐＨを有し、約１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、約１ミリモルから約１００ミリモルのヒスチジン緩衝液、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、約１００ミリモルから約４００ミリモルのトレハロース、および約０．０１ミリモルから約１．０ミリモルのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を含む、無菌水溶液として製剤される。
【０１１０】
投薬レジメンは、最適な所望の応答をもたらすように調整され得る。例えば、単回ボーラスが投与され得るか、複数回の分割用量が経時的に投与され得るか、または、用量は、治療状況の緊急的要件によって指示されるように比例的に低減もしくは増大し得る。投与を容易にするため、および投薬の均一性のために、非経口組成物を投薬単位形態で製剤することが特に有利である。本明細書において用いられる投薬単位形態は、治療される患者／対象のための単位投与量として適している物理的に個別の単位を指し、各単位は、所要の薬学的担体を伴って所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形態についての仕様は、（ａ）化学療法剤の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療的または予防的効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療のためのこのような活性化合物の配合の分野に固有の制限によって、通常決定され、またそれに直接的に左右される。
【０１１１】
したがって、当業者には、本明細書において提供される開示に基づいて、用量および投薬レジメンが、治療分野において周知の方法に従って調整されることが理解されよう。すなわち、最大耐用量は容易に確立することができ、検出可能な治療利益を患者に提供する有効量はまた、検出可能な治療利益を患者にもたらすために各作用物質を投与するための時間的要求を決定することができるように、決定することができる。したがって、特定の用量および投与レジメンが本明細書において例示されるが、これらの例は、本発明の実施において患者に提供され得る用量および投与レジメンを限定するものでは決してない。
【０１１２】
投与量の値は、軽減するべき状態のタイプおよび重症度に応じて変化し得、単回投与または複数回投与を含み得ることに留意されたい。あらゆる特定の対象に対して、具体的な投薬レジメンが、個体の要求および投与する人または組成物の投与を監督する人の専門的な判断に従って経時的に調整されるべきであること、ならびに本明細書において示される投与量の範囲は典型的なものにすぎず、特許請求の範囲に記載の組成物の範囲または実施を限定することを意図したものではないことがさらに理解される。さらに、本発明の組成物を用いる投薬レジメンは、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および採用される特定の抗体を含む様々な要素に基づき得る。したがって、投薬レジメンは広く変化し得るが、標準的な方法を用いて通常通り決定することができる。例えば、用量は、毒性効果などの臨床効果および／または臨床検査値を含み得る薬物動態学的パラメータまたは薬力学的パラメータに基づいて調整することができる。したがって、本発明は、当業者によって決定される、患者内での用量増加を包含する。適切な投与量およびレジメンの決定は、関連分野において周知であり、本明細書において開示されている教示がひとたび提供された当業者には、包含されていることが理解される。
【０１１３】
ヒト対象への投与では、単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、または組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドの一月総用量は、当然のことながら投与態様に応じて、典型的には、患者当たり約０．５から約１５００ｍｇの範囲である。例えば、静脈内の一月用量は、患者当たり約１から約１０００ｍｇを要し得る。一月総用量は、単回用量または分割用量で投与することができ、また、医師の裁量で、本明細書において示される典型的範囲から逸脱してもよい。
【０１１４】
単量体Ｆｃ含有ポリペプチド、または組換えによって連結した少なくとも２つの本明細書において記載される単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドの治療的または予防的に有効な量の、例示的な非限定的範囲は、一月当たり、患者当たり約１から約１０００ｍｇである。特定の実施形態において、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドまたはそれを含むポリペプチドは、一月当たり、患者当たり約１から約２００、または約１から約１５０ｍｇで投与され得る。
【実施例】
【０１１５】
以下の実施例は、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面においてまたはＣＨ３−ＣＨ３二量体化界面とＣＨ２−ＣＨ２界面との両方において１つまたは複数の操作されたＮ連結型グリコシル化部位を含む、単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの生成および特徴付けを記載する。組換えによって連結した少なくとも２つの単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを含むポリペプチドの生成および特徴付けもまた提供される。以下に提供される実施例は、本発明の方法および材料を説明するためのものである。当業者に自明の、当技術分野において通常遭遇する記載された条件およびパラメータの適切な変更および適合は、本発明の趣旨および範囲のうちにある。
【０１１６】
（実施例１）
ＣＨ３−ＣＨ３界面内にＮ−グリコシル化部位を組み込むことによる、本来は二量体であるＦｃの単量体化
糖鎖工学戦略を用いて、抗体のＦｃドメインの安定な単量体形態を操作した。さらに具体的には、嵩高い親水性の糖質部分を、Ｆｃの二量体形態を単量体形態に分離していたＣＨ３−ＣＨ３界面内に導入した。驚くべきことに、この糖鎖工学はまた、ＣＨ３ドメインの暴露された界面を安定化させた。４つの基準を採用して、（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの基準のＮ連結型グリコシル化シグナル配列を生じさせるために）どこにＮ−グリコシル化突然変異部位を組み込むかを決定した。第一に、Ｉｇドメイン核内に埋まっている残基、または溶媒に暴露されている残基が選択されることを回避するために、ＣＨ３−ＣＨ３の界面上に位置する残基を同定した（図１）。ヒトガンマ１Ｆｃ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＨＺＨ）の結晶構造を用いて、プログラムＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）で、両Ｆｃ二量体（非変性形態）における、およびＦｃ二量体の一方の鎖（すなわち、仮想のＦｃ単量体）における各残基のアクセス可能な表面のパーセント（％ＡＳＡ）を計算した。より高い％ＡＳＡ（二量体）を有する残基は、溶媒に暴露されている残基である。高い％ＡＳＡ（単量体）値を有する残基ほど、溶媒に暴露されているかまたはＣＨ３−ＣＨ３界面内に埋まっている可能性が高いと仮定された。したがって、界面の関与の程度を、ΔＡＳＡ＝％ＡＳＡ（単量体）−％ＡＳＡ（二量体）としてＦｃ二量体の％ＡＳＡから単量体の％ＡＳＡを差し引くことによって決定し、ΔＡＳＡが閾値である１０％を超えた２２の界面残基を選択した。表１を参照されたい。第二に、プロリン残基、グリシン残基、およびシステイン残基は通常、タンパク質の構造的フレームワークの維持において重要な役割を有するため、これらの残基の突然変異生成を回避した。第三に、グリコシル化の占有の可能性を考慮した。残基Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｙを、Ｘ（ＡｓｎとＳｅｒ／Ｔｈｒとの間に位置するアミノ酸）もＹ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒの次に位置するアミノ酸）もプロリン残基ではない領域内に組み込み、それは、これらの位置にあるプロリンはグリコシル化効率を強力に阻害するためである。Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの基準のＮ連結型グリコシル化シグナル配列の第３の位置（すなわち、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）にある残基が突然変異していなくてはならない場合、スレオニンがセリンよりも選択され、それは、第３の位置にあるスレオニンが第３の位置にあるセリンよりもアスパラギン残基でのより高いグリカン占有をもたらすことが示されているためである。最後に、残基をＦｃドメインの一方の鎖の三次元構造上でマッピングし、手作業で調べ、操作された糖質がＣＨ３−ＣＨ３界面を分離するためにほとんど影響を有し得なかった位置（Ｌｅｕ２５６およびＡｓｐ２７６）を排除した。したがって、全部で９つの位置を、Ｎ−グリコシル化のために合理的に選択した。これらの選択された残基は、ヒトＩｇＧの全アイソタイプ（１、２、３、および４）ならびにマウスＩｇＧ（２、２ａ、２ｂ、および３）アイソタイプの間でよく保存されている（図２）。個々のＮ−グリコシル化突然変異体は、ヒンジ領域（Ｇｌｙ２２６からＬｙｓ４９７）を有さないヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４のＦｃドメインを鋳型とし��用いることによって構築した。これらのペプチドをコードする核酸を、ＨＥＫ２９３細胞において一過性発現させた。Ｎ−グリコシル化の発現および効率を評価するために、培地上清を、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウェスタンブロット分析にかけた。全ての突然変異体の発現レベルは、３６６位の突然変異体の発現が弱かったことを除いて、野生型Ｆｃドメインに類似していた。Ｎ−グリコシル化変異体はおよそ２５ｋＤａの分子量に対応する移動度で移動したが、非グリコシル化変異体はおよそ２２ｋＤａ移動したようであった。５つの部位（３６４、３６６、３６８、４０５、および４０７）は効率的なＮ−グリコシル化を示したが、４つの部位（３４７、３９０、４０１、４０９）はＮ−グリカンのおよそ５０％以下の組み込みを示した。ＩｇＧ１突然変異体およびＩｇＧ４突然変異体の発現およびグリコシル化のプロファイルは類似であったため、ＩｇＧ１突然変異体をさらなる研究のために用いた。
【０１１７】
【表１】
0006396313.tif 000002
【０１１８】
（実施例２）
Ｎ−グリコシル化変異体の特徴付け
完全なＮ−グリコシル化を有する４つの突然変異体（３６４位、３６８位、４０５位、および４０７位）を、さらなる精製および特徴付けのために選択した。ＣＨ２３−Ｎ３６４（Ｆｃ−Ｓ３６４Ｎ）、ＣＨ２３−Ｎ３６８（Ｆｃ−Ｌ３６８Ｎ／Ｋ３７０Ｔ）、ＣＨ２３−Ｎ４０５（Ｆｃ−Ｆ４０５Ｎ／Ｙ４０７Ｔ）、およびＣＨ２３−Ｎ４０７（Ｆｃ−Ｙ４０７Ｎ／Ｋ４０９Ｔ）として示されるこれらのＮ−グリコシル化突然変異体を、本明細書の他の箇所に記載されるように精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断される９５％超の純度を得た。精製タンパク質の収量は、培地１リットル当たり２０〜３０ｍｇの範囲であった。各位置でのグリコシル化変異体および非グリコシル化変異体の相対的収量を評価するために、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの処理を行わない、および行う、精製タンパク質のキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）アッセイを行った。本明細書において開示されているデータは、これらの４つの突然変異体が最大１０％の非グリコシル化変異体を含有することを示唆しており、これは、野生型Ｆｃに類似している（表２）。分析用サイズ排除カラム（ＳＥＣ）を用いて、Ｎ−グリコシル化変異体の見かけの分子量を推定した。４つの突然変異体の全ては、野生型Ｆｃ（約４８ｋＤａ）よりも低い見かけの分子量（２５〜３０ｋＤａ）を示し、このことは、組み込まれたＮ−グリコシル化がＦｃ二量体のＣＨ３−ＣＨ３界面を破壊するのに成功したことを示唆する。Ｎ−グリコシル化突然変異体はＳＥＣによって単量体であると思われたが、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器）を用いて、これらの突然変異体のオリゴマー種の分布のさらに厳密な分析を行った。屈折率のシグナル全体にわたる光散乱により決定された分子量は、ＣＨ２３−Ｎ４０５が完全に単量体であることを示したが、ＣＨ２３−Ｎ３６４、ＣＨ２３−Ｎ４０５、およびＣＨ２３−Ｎ４０７は単量体形態と二量体形態との混合物であることが分かった。これらの４つのＮ−グリコシル化突然変異体の熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によってさらに特徴付けした。野生型Ｆｃのサーモグラムは、７２℃および８３℃の融解温度での２つの転移を示した。これらの値は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの融解に割り当てられている７０．８℃および８３．３℃の値と同程度であった。逆に、個々のＮ−グリコシル化突然変異体は、より低い融解温度での単一の転移を示した（表２）。
【０１１９】
【表２】
0006396313.tif 000003
【０１２０】
（実施例３）
複数のＮ−グリコシル化部位の組み合わせ
各変異体の非グリコシル化部分をさらに最小にするために、ＣＨ３ドメイン内の２つのＮ−グリコシル化部位を、３６４位、３６８位、４０５位、および４０７位での個々の突然変異を介して導入し、その結果、グリコシル化の９０％から９５％の占有を得た。図３は、ＣＨ３ドメインの界面におけるＳｅｒ３６４、Ｌｅｕ３６８、Ｐｈｅ４０５、およびＴｙｒ４０７の特別なアラインメントを強調する。これらの所見に基づいて、３６８、４０５、および４０７のうちの２つの部位にある２つの糖質部分が構造をさらに不安定化させることが仮定され、それは、これらの３つの残基が互いにごく接近して位置しているためである。したがって、これらのＮ連結型部位の３つの組み合わせ、すなわち、Ｎ３６４およびＮ３６８、Ｎ３６４およびＮ４０５、ならびにＮ３６４およびＮ４０７を、２つのＮ−グリコシル化部位の組み込みのために選択した。これらの３つの二重Ｎ−グリコシル化突然変異体、すなわち、ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ３６８、ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０５、およびＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７を、ＨＥＫ２９３細胞において発現させ、ウェスタンブロットによって発現およびグリコシル化について試験した。単一Ｎ−グリコシル化突然変異体と比較したサイズの増大が、ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ３６８およびＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７で観察され、一方、ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０５は検出可能なレベルで分泌されなかった。ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０５は細胞によって発現されるが排出はされないことが分かったため、この二重突然変異はタンパク質の分泌を無効にし得るか、またはタンパク質構造の不安定性を生じさせ得ると仮定される。ＰＮＧａｓｅ  Ｆの処理の結果、Ｆｃドメインの還元形態に対応する分子サイズが生じたため、ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ３６８およびＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７のサイズの増大は、各分子上の複数のＮ連結型グリカンの存在に寄与した。ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ３６８タンパク質およびＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７タンパク質を精製し、オリゴマー状態、非グリコシル化分子の収量、および熱安定性を、本明細書の他の箇所に記載されるように調べた。ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ３６８とＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７との両方の非グリコシル化分子を、検出不可能なレベルまで減少させた（表２）。生産されたＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７は、ＣＨ２３−Ｎ３６４およびＣＨ２３−Ｎ４０７の個々の突然変異体が検出可能な量の二量体を形成したにもかかわらず、完全に単量体であった。注目すべきことに、ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ３６８は、凝集傾向ならびにＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析およびＤＳＣ分析に基づく熱安定性の減少を示した。それにもかかわらず、３６４位および４０７位での二重突然変異は、安定性、グリコシル化効率、および単量体傾向に関して、単量体Ｆｃの特性を向上させた（表２）。グリコシル化はまた、（タンパク質構成要素にのみ感受性の）２８０ｎＭでのＵＶ検出器、および（タンパク質構成要素と糖質構成要素との両方に感受性の）ＲＩ検出器を用いる分析的ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって確認された。
【０１２１】
ＣＨ２ドメインは、Ａｓｎ２９７でのＮ−グリコシル化を天然に含有する（図１）。ＣＨ３ドメイン内の２つの操作されたグリカンは単量体形態で安定化されていることが示されたため、Ａｓｎ２９７の天然のＮ−グリコシル化に加えて、ＣＨ２ドメイン内のグリコシル化部位をさらに調べた。第一に、２５８位、２６０位、２８６位、および３０５位にあるＣＨ２内の潜在的な操作されたグリコシル化部位を同定した（図１）。これらの４つの残基は、ヒトＩｇＧの全てのアイソタイプ（１、２、３、および４）の間で全て保存されており、マウスＩｇＧ（２、２ａ、２ｂ、および３）アイソタイプの間でほとんど保存されている（図３）。個々の操作されたＮ−グリコシル化部位を、ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７内に導入し、三重Ｎ−グリコシル化突然変異体をＨＥＫ２９３細胞において発現させた。したがって、これらの突然変異体は、Ｎ２９７にある天然のグリコシル化部位、ならびに３つの操作されたグリコシル化部位、すなわちＣＨ２ドメイン内の１つおよびＣＨ３ドメイン内の２つを含む。突然変異体の全てを精製し、非グリコシル化収量、単量体状態、および熱安定性について、先に記載したように調べ、結果を表１に示す。ＣＨ２３−Ｎ２５８／Ｎ３６４／Ｎ４０７およびＣＨ２３−Ｎ２８６／Ｎ３６４／Ｎ４０７は、単量体であり、完全にグリコシル化されていることが分かったが、一方、ＣＨ２３−Ｎ２６０／Ｎ３６４／Ｎ４０７およびＣＨ２３−Ｎ３０５／Ｎ３６４／Ｎ４０７は、単量体であったが、およそ５〜１０％の非グリコシル化分子をもたらした。
【０１２２】
（実施例４）
ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７の結晶構造
ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７の結晶を成長させ、これは、１．９Åに対して回折した。構造を、Ｆｃ二量体の一方のポリペプチド鎖の座標（３ＤＴＳ）をサーチモデルとして用いて、分子置換によって解明した。データの収集項目、ならびにデータセットおよびモデルについての精密化統計を、表３に示す。ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７の実験マップは、Ｇｌｙ２２４からＳｅｒ４４７までの骨格全体についての明らかな密度をもたらし、側鎖の９５％超は、電子密度にフィットした。Ｓ３６４Ｎ、Ｙ４０７Ｎ、およびＫ４０９Ｔの置換は、ＣＨ３ドメイン上ではっきりと見ることができた。Ａｓｎ２９７に接続している糖質鎖のトポロジーを、その電子密度から決定した。８つの糖残基（ＧｌｃＮＡｃ１〜ＧｌｃＮＡｃ５、Ｍａｎ７、ＧｌｃＮＡｃ８、およびＦｕｃ）を同定した。逆に、各糖残基のみが、操作されたＡｓｎ３６４残基およびＡｓｎ４０７残基上で同定された。その電子密度に従ってＡｓｎ３６４側鎖に付着したＧｌｃＮＡｃ１を、位置決定した。しかし、密度マップはＡｓｎ４０７側鎖にごく接近して、水分子よりも大きな重原子が存在することを示唆していたが、Ａｓｎ４０７に付着したＧｌｃＮＡｃ１は、電子密度が低いために位置付けることができなかった。それでも、ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７結晶の非対称の単位内容物は、２つの同一のグリコシル化ポリペプチド鎖の二量体として存在する正規のＦｃドメインの１つのみの単量体単位を示した（図４）。これらの結晶学的データは、ＣＨ３−ＣＨ３界面上の操作されたグリコシル化がＦｃドメインの単量体形態を安定化させ得ることを実証する。
【０１２３】
【表３】
0006396313.tif 000004
【０１２４】
（実施例５）
Ｆａｂ−ＣＨ２３変異体の生産およびインビトロでの特徴付け
ＣＨ２３の血清寿命におけるＦｃＲｎの関与を解明するために、抗ＫＬＨ抗体に由来するＦａｂ断片をＣＨ２３に融合した（本明細書において「Ｆａｂ−ＣＨ２３」と呼ばれ、これはまた、Ｆａｂ−ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７（Ｓ３６４Ｎ−Ｌ３５５−Ｔ３６６およびＹ４０７Ｎ−Ｓ４０８−Ｋ４０９Ｔ（例えば、配列番号７１）とも呼ばれる）。同一のＦａｂ断片をまた、ＦｃＲｎノックアウト変異体（Ｆａｂ−ＣＨ２３［Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ］（例えば、配列番号７５））およびＦｃＲｎ増強変異体（Ｆａｂ−ＣＨ２３［Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ］（例えば、配列番号７３））にも融合した。２つの操作されたＦｃポリペプチドを含むタンデムＣＨ２３構築物（Ｆａｂ−ＣＨ２３−ＣＨ２３（例えば、配列番号８５））、および正規のＩｇＧ１フォーマット対照（すなわち、抗ＫＬＨ抗体）もまた構築して、アビディティーがＣＨ２３の薬物動態学的特性を向上させ得るという仮説を試験した（図５）。全ての構築物をＣＨＯ細胞内にトランスフェクトし、タンパク質をプロテインＧカラムクロマトグラフィーによって精製した。対照として、ＨＥＫ２９３細胞一過性発現系において生産されるＦａｂ−ＣＨ２３（「Ｆａｂ−ＣＨ２３−ＨＥＫ」と呼ばれる）を生産した。１対１の結合フォーマット（ＢＩＡｃｏｒｅチップの表面に結合した「Ｆｃ変異体」およびチップ表面に浮遊する可溶性ＦｃＲｎ）と、アビディティーフォーマット（ＢＩＡｃｏｒｅチップ表面に結合したマウスＦｃＲｎタンパク質およびチップ表面に浮遊する各Ｆｃ変異体）との両方のこれらの構築物のＦｃＲｎの結合を調べた。平衡結合データを表４にまとめる。Ｆａｂ−ＣＨ２３またはＦａｂ−ＣＨ２３−ＨＥＫの１対１の結合アフィニティー（表４）は、ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７の結合アフィニティー（表１）に類似しており、このことは、Ｆａｂ融合がＦｃＲｎへのＦｃの結合に影響しなかったことを示唆する。予想した通り、Ｆａｂ−ＣＨ２３［Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ］でＦｃＲｎへのより高い結合アフィニティーが観察されたが、一方、ＦｃＲｎの結合は、Ｆａｂ−ＣＨ２３［Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ］では観察されなかった。１対１の結合アッセイにおいて、チップ表面上に局在化したＦａｂ−ＣＨ２３−ＣＨ２３は、ＦｃＲｎへのＦａｂ−ＣＨ２３の結合アフィニティーと類似の結合アフィニティーを示した。驚くべきことに、しかし、アビディティーアッセイ（チップ表面上に局在化したＦｃＲｎ）において、Ｆａｂ−ＣＨ２３−ＣＨ２３は、Ｆａｂ−ＣＨ２３よりもおよそ４０倍高い、ＦｃＲｎへのアフィニティー結合を示した。ＩｇＧ  ＦｃおよびタンデムＣＨ２３−ＣＨ２３のアーキテクチャは異なるが、Ｆａｂ−ＣＨ２３−ＣＨ２３は、単一Ｆｃドメインを含むＩｇＧのアフィニティーに類似の、バイオセンサー表面上に局在化するＦｃＲｎに高いアフィニティーで結合することが分かった。Ｆａｂ−ＣＨ２３−ＣＨ２３が中性ｐＨでＦｃＲｎから解離したことを評価するために、解離相の間にｐＨ７．４およびｐＨ６．０で結合したＦａｂ−ＣＨ２３−ＣＨ２３のパーセントを測定した。Ｆａｂ−ＣＨ２３−２３とＩｇＧとの両方の結合％がほとんど同一であることが観察された。これらの結果は、Ｆａｂ−���Ｈ２３−ＣＨ２３が、酸性ｐＨでＦｃＲｎに堅く結合するだけではなく、野生型ＩｇＧ  Ｆｃに類似して、中性ｐＨで効率的にＦｃＲｎから解離することを実証する。
【０１２５】
【表４】
0006396313.tif 000005
【０１２６】
（実施例６）
マウスにおけるＦａｂ−ＣＨ２３変異体の薬物動態学
Ｂａｌｂ／ｃ雄マウスにおいて、二価抗体、または抗体と同一のＦａｂを含む単量体Ｆｃ含有ポリペプチドの、５ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ用量後の、平均血漿濃度のプロファイルを決定し、データを図６に示し、ＰＫパラメータを表５にまとめる。対象間のばらつきはＦａｂ−ＣＨ２３で比較的高く、血漿濃度の有意な低下が投薬の９６時間後に観察され、このことは、免疫原性（例えば、構築物に対するマウス抗ヒト抗体、ＡＨＡによるクリアランス）の可能性を示唆する。Ｆａｂ−ＣＨ２３についてのクリアランス（ＣＬ）は低く、０．３ｍＬ／時間／ｋｇでの典型的なＩｇＧのＣＬと同程度であり、Ｔ１／２は１７３時間（約７．２日）であった。１８および１４ｍＬ／時間／ｋｇでのＦａｂ−ＣＨ２３−ＨＥＫおよびＦａｂ−ＣＨ２３［Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ］についてのＣＬ率は、それぞれ、０．３ｍＬ／時間での野生型ＩｇＧについてのＣＬ率よりもはるかに高かった。結果として、Ｔ１／２は、１２時間および１１時間でのこれらの２つの変異体について、それぞれ、野生型ＩｇＧ（１７３時間）と比較して、はるかに短かった。Ｆａｂ−ＣＨ２３−ＨＥＫを、腹腔内経路を介して１０ｍｇのマンナン（マンノース受容体の天然阻害剤）と同時投与すると、ＣＬはマンナンを伴わないＦａｂ−ＣＨ２３と比較して２倍増大し、このことは、マンノース受容体介在性のクリアランスがＦａｂ−ＣＨ２３−ＨＥＫの主要なクリアランスメカニズムであることを示す。Ｆａｂ−ＣＨ２３およびＦａｂ−ＣＨ２３［Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ］は、ＣＬが約９ｍＬ／時間／ｋｇでありＴ１／２がそれぞれ３２時間および４２時間であるＦａｂ−ＣＨ２３−ＨＥＫおよびＦａｂ−ＣＨ２３［Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ］よりも向上したＰＫを有していた。タンデムＦａｂ−ＣＨ２３−ＣＨ２３は、全ての単量体Ｆａｂ融合体の間で、最も遅いＣＬ（３ｍＬ／時間／ｋｇ）および最も長いＴ１／２（９７時間）を有していた。野生型ＩｇＧに類似して、Ｆａｂ−ＣＨ２３−ＣＨ２３の血漿濃度もまた、投薬の９６時間後に劇的に低下し、このことは、潜在的な免疫原性もまたＦａｂ−ＣＨ２３−ＣＨ２３のクリアランスに関与し得ることを示す。
【０１２７】
【表５】
0006396313.tif 000006
【０１２８】
（実施例７）
実験手順
プラスミドの構築およびタンパク質の発現
野生型Ｆｃ断片のための発現プラスミドを、Ｇｌｙ２３６で始まるヒトガンマ１定常領域の前にあるＮ末端ヘキサヒスチジンタグとして構築した。全てのプラスミド構築および突然変異生成は、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎドライダウンＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）で行った。突然変異構築物は、所望のアミノ酸置換を生じさせるプライマーを用いてＰＣＲによって生成した。得られたＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングエンハンサーで処理し、その後、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）で処理した発現ベクター内に挿入した。Ｆａｂ−ｍｏｎｏＦｃ変異体の発現ベクターを、抗ＫＬＨ抗体のＦａｂ断片およびｍｏｎｏＦｃをコードする構築物のＰＣＲ増幅によって構築した。Ｎ−グリコシル化Ｆｃ変異体のタンパク質生産のために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬を用いることによって発現プラスミドで一過的にトランスフェクトし、製造者のプロトコルに従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培地において成長させた。馴化培地を、トランスフェクションの６日後に、２０００×ｇで１０分間の遠心分離によって回収した。ＩｇＧ変異体およびＦａｂ−ｍｏｎｏＦｃ変異体のために、ＣＨＯ細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、グランドアイランド、ニューヨーク州）によって発現プラスミドをトランスフェクトした。安定なクローンを、５０ｕｇ／ｍＬのＧ４１８および５０ｎＭのメトトレキサートで２から３週間、選択した。馴化培地を遠心分離によって回収し、上清を、その後の精製のために、０．２ｕｍのフィルターによって濾過した。発現を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、その後、抗Ｈｉｓ  Ｇ  ＨＲＰコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、グランドアイランド、ニューヨーク州）または抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）でブロットした。
【０１２９】
タンパク質の精製
野生型Ｆｃドメインおよび操作されたＮ−グリコシル化Ｆｃ変異体の精製のために、馴化培地を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、および２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．２）で事前に平衡化したＨｉＴｒａｐキレート化カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）にロードした。非特異的結合タンパク質を、緩衝液Ａ（１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、および２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．６）で洗浄除去し、タンパク質を、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、および２．７ｍＭのＫＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．６）への線形勾配で溶出した。プールした画分を、ＰＢＳ緩衝液で事前に平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）にロードし、プロテインＡ溶出緩衝液（５０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．３）で溶出した。得られたタンパク質溶液を、１Ｍのｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）によって中和し、緩衝液をＰＢＳに交換し、濃縮し、−８０℃で保存した。純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％線形勾配ゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、グランドアイランド、ニューヨーク州）によって確認した。Ｆａｂ−ｍｏｎｏＦｃ変異体のために、馴化培地を、ＰＢＳ緩衝液で事前に平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）にロードし、プロテインＧ溶出緩衝液（１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ２．５）で溶出した。プールした画分を、１Ｍのｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）で中和し、１０ｍＬまで濃縮し、ＰＢＳ緩衝液で事前に平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ｈｉｌｏａｄ  ２６／６０  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）にロードした。純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、Ｎ−グリコシル化タンパク質の単量体状態を、１０×３００ｍｍのカラムを用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）によって評価した。精製タンパク質溶液を、０．２２ｕｍのフィルターによって滅菌し、−８０℃で保存した。タンパク質の定量を、２８０ｎｍでの吸光度を測定すること、およびＰａｃｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．４、２４１１〜２４２３（１９９５）に従ったモル吸光係数を用いて濃度を計算することによって達成した。
【０１３０】
生物物理学的特徴付け
サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）：野生型Ｆｃドメインおよび操作されたＮ−グリコシル化Ｆｃ変異体の平均モル質量およびオリゴマー化状態を、ＳＥＣ−ＭＡＬＳを用いて決定した。タンパク質試料を、ＰＢＳ緩衝液中で４．５〜７．０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で調製した。各試料（２００μｇ）を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ系（フォスターシティー、カリフォルニア州）に接続した分析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に注入した。サイズ決定カラム上で分解されたタンパク質ピークを、ＨＰＬＣ系に一列に接続されたＷｙａｔｔ’ｓ  ＭｉｎｉＤａｗｎ  ３角度光散乱検出器およびＯｐｔｉｌａｂ−ＲＥＸ屈折計（サンタバーバラ、カリフォルニア州）を用いて分析した。クロマトグラフィー分析および光散乱分析は、２５℃で行った。ＭｉｎｉＤａｗｎ光散乱系を、製造者の指示に従ってトルエンで校正し、ウシ血清アルブミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、イリノイ州）を用いて正規化した。データの収集および分析は、タンパク質についてのΔｎ／Δｃ値が０．１８５ｍｌ／ｇであるＷｙａｔｔ’ｓ  Ａｓｔｒａソフトウェアを用いて行った。グリカン質量の寄与を、糖部分についての近似Δｎ／Δｃ値０．１４ｍｌ／ｇを用いて、Ａｓｔｒａソフトウェアにおいてタンパク質コンジュゲーション鋳型を適用することによって決定した。
【０１３１】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）：野生型Ｆｃドメインおよび操作されたＮ−グリコシル化Ｆｃ変異体の熱安定性を、ＭｉｃｒｏＣａｌ’ｓキャピラリーＤＳＣ系、ＶＰ−ＤＳＣ（ノーサンプトン、マサチューセッツ州）を用いて分析した。タンパク質および緩衝溶液を遠心分離し、脱気し、その後、機器にロードした。ＰＢＳ緩衝液中に０．０２ｍＭの濃度のタンパク質試料を、試料セル内に置いた。両セルを、１時間当たり１００℃のスキャン速度で、１０℃から１００℃まで加熱した。試料セルと参照セルとの間の熱能力の差を、ＭｉｃｒｏＣａｌのＯｒｉｇｉｎ７．０ソフトウェアを用いて記録し、分析した。ベースラインのサーモグラムを、試料セルと参照セルとの両方におけるＰＢＳ緩衝液で作成した。データを用いて、タンパク質変性に関連しない、あらゆる系の熱を差し引いた。
【０１３２】
キャピラリーゲル電気泳動  −  各タンパク質試料におけるグリコシル化種および非グリコシル化種の相対的パーセンテージを、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ（ホプキントン、マサチューセッツ州）を用いて、還元条件下で測定した。脱グリコシル化対照を、タンパク質とグリカナーゼＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ、ヘイワード、カリフォルニア州）とを３時間、３７℃で、ＰＢＳ緩衝液においてインキュベートすることによって調製した。Ｃａｌｉｐｅｒアッセイのための試料を、製造者の指示に従って調製した。簡潔に述べると、２μｌのタンパク質試料（４．５〜７．０ｍｇ／ｍＬ）を７μｌのＳＤＳ試料緩衝液と混合し、１００℃で５分間、９６ウェルプレート上でインキュベートした。試料容積を、脱イオン水で、４０μｌの最終容積に調整した。タンパク質のロード、分離、染色、および脱染を、ＬａｂＣｈｉｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓプログラムに従って、マイクロチャネルでフォトエッチングされた石英チップ上で行った。電気泳動図を、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  ｖ．３．０ソフトウェアを用いて、各試料について作成し、分析した。
【０１３３】
ＦｃＲｎ結合アッセイ
ＦｃＲｎ結合アッセイを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて行った。センサーチップＣＭ５、界面活性剤Ｐ２０、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から購入した。ＳＰＲ実験を、２５℃で、０．００５％のＰ２０を有するＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．０）において行った。マウスＦｃＲｎタンパク質を、ＡＲＶＹＳ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｉｎｃ．（スタンフォード、コネティカット州）から購入した。全ての実験は、３回反復した。
【０１３４】
１対１の結合アッセイ  −  ＣＭ５センサーチップ上への操作されたＮ−グリコシル化Ｆｃ変異体またはＦａｂ−ｍｏｎｏ操作されたＮ−グリコシル化Ｆｃ変異体の固定を、アミンカップリング方法によって行った。簡潔に述べると、２０μＭのタンパク質溶液を、１０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）中に２０回希釈し、２００ｍＭのＥＤＣおよび５０ｍＭのＮＨＳの１：１混合物の２０ｕＬの注入で事前に活性化されたバイオセンサー表面上に注入し、その後、１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を注入した。参照表面では、１つのフローセルをＥＤＣ−ＮＨＳ混合物によって活性化し、タンパク質を有さないエタノールアミンによって不活性化した。平衡結合を、１５０ｕＬの可溶性マウスＦｃＲｎタンパク質を５ｕＬ／分の流量で注入することによって測定した。センサー表面を、ランニングＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）によって１分間、再生した。本発明者らは、各濃度の結合曲線の全てが注入の最後（３０分）では安定状態に達することを観察した。定常状態のＲＵを注入の最後（２８分）に記録し、平衡解離定数（Ｋｄ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて計算した。
【０１３５】
アビディティーアッセイ：分析物（移動相内の分子）のアビディティーを評価するために、ＳＰＲベースの「アビディティーアッセイフォーマット」を、以前に記載されているように行った。例えば、Ｚａｌｅｖｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８、１５７〜１５９；Ｙｅｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２、７６６３〜７６７１（２００９）；およびＳｕｚｕｋｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４、１９６８〜１９７６（２０１０）を参照されたい。すなわち、マウスＦｃＲｎタンパク質を、上記のように、アミンカップリング方法によってＣＭ５センサーチップ上に固定した。平衡結合を、３０μＬのＦａｂ−ｍｏｎｏＦｃ変異体を２μＬ／分の流量でＦｃＲｎ表面上に注入することによって測定した。センサー表面を、１００ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を１分間ランさせることによって再生した。定常状態のＲＵを注入の最後（１４分）に記録し、平衡結合定数（Ｋｄ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて計算した。
【０１３６】
ｐＨスイッチアッセイ：中性ｐＨでのＦｃＲｎからのＦａｂ−ｍｏｎｏＦｃ変異体の解離効率を評価するために、先に報告された方法から変更した「ｐＨスイッチアッセイ」を採用した。例えば、Ｗａｎｇら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３９、１４６９〜１４７７（２０１１）を参照されたい。このアッセイにおいて、マウスＦｃＲｎタンパク質を、アミンカップリング方法によってＣＭ５センサーチップ上に固定した。結合を、ランニング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ６．０）中の１００ｕＭのＦａｂ−ｍｏｎｏＦｃ変異体を注入し、その後、ランニング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ６．０）または中性緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）を単独でＦｃＲｎ表面上に５０μＬ／分の流量で注入することによって測定した。
【０１３７】
結晶化および構造の決定
タンパク質を、ｍｏｎｏＦｃの結晶化試験のために（Ｆｃ−ＣＨ２３−Ｎ３６４／Ｎ４０７）、ｔｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中に３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。結晶化は、貯蔵器溶液に対して平衡化された０．２μＬのタンパク質溶液および０．２μＬの貯蔵器溶液を含有する滴剤を用いて、ハンギングドロップ蒸気拡散方法を１８℃で用いて行った。大きな三方晶系結晶が、２．２Ｍの硫酸アンモニウムおよび２００ｍＭのフッ化ナトリウムを沈殿剤として用いて得られた。結晶を、母液中の２０％グリセロールの存在下で凍結防止処理し、液体窒素中で即座にフラッシュ冷却した。Ｘ線回折データを、ＳＥＲ−ＣＡＴビームライン２２−ＩＤ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）、アルゴンヌ、イリノイ州で、最大１．９Åの分解能まで、単結晶から回収した。データにインデックスを付け、積分し、ＨＫＬ２０００でスケーリングした（統計を表２に示す）。結晶は、格子定数がａ＝ｂ＝６４．２２Åでありｃ＝１４６．９４Åである空間群Ｐ３１２に属していた。構造を、突然変異したＡＤＣＣ増強ヒトＦｃドメイン（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＱＬ１）（Ｏｇａｎｅｓｙａｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５、１８７２〜１８８２（２００８））の結晶構造をサーチモデルとして用いて、ＰＨＡＳＥＲでの分子置換によって解明した。ｍｏｎｏＦｃ単量体を位置決定した後、最初のモデルをＢＵＳＴＥＲでの最小化にかけ、ＣＯＯＴ（分子グラフィックスプログラム）を用いてさらに再構成した。再校正を伴う数回の精密化改変によって、０．２５のＲｃｒｙｓｔおよび０．２５９のＲｆｒｅｅに対応する最終精密化モデルが得られた（精密化統計を表６に示す）。
【０１３８】
【表６】
0006396313.tif 000007
【０１３９】
マウスにおける薬物動態学的研究
動物研究  −  雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（約８週齢の雄）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入した。全ての研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈの動物資源のケアおよび使用についてのガイドに従って行った。１群当たり６頭のマウスに、単回用量のＦａｂ−ｍｏｎｏＦｃ変異体を静脈内経路を介して投与した。５ｍｇ／ｋｇの投与用量は、最近の予定体重に基づくものであった。試験試料をＰＢＳ中に調製し、投薬容積は４ｍＬ／ｋｇであった。投薬の０分、１０分、６時間、２４時間、２日、３日、４日、７日、１４日、および２１日後、１０μＬの血液試料を毛細管を介して尾静脈から回収し、９０μｌのＲｅｘｘｉｐ  Ａ緩衝液（Ｇｙｒｏｓ  ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）中に即座に希釈した。試料を３０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を別の試験管に移し、今後の分析のために−８０℃で凍結した。
【０１４０】
試料分析  −  試験試料を、ストレプトアビジン被覆ビーズ（Ｇｙｒｏｌａｂ  ＣＤ微細構造のアフィニティー捕捉カラム）上に捕捉されたビオチン化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて定量した。参照標準および質対照をＲｅｘｘｉｐ  Ａ緩衝液中に調製し、研究試料を定量のアッセイ範囲に希釈した。アフィニティー捕捉カラム上に捕捉された後、結合したＦａｂ−ｍｏｎｏＦｃ変異体または二価野生型ＩｇＧは、Ａｌｅｘａ６４７で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（分子プローブ）で検出された。カラム上の蛍光シグナルによって、結合した変異体の検出が可能になった。応答単位を、１％光電子増倍管の設定で、Ｇｙｒｏｌａｂ機器によって読み取った。試料濃度を、ワトソン（バージョン７．４）の１／ｙ２応答重み付けにフィットする５パラメータロジスティック曲線を用いてフィットした標準曲線からの補間によって決定した。Ｆａｂ−ｍｏｎｏＦｃ変異体についての定量のアッセイ範囲は、１００％Ｂａｌｂ／ｃマウス血漿中に１０．０μｇ／ｍＬから４１．０ｎｇ／ｍＬであった。二価ＩｇＧ変異体についての定量のアッセイ範囲は、１００％Ｂａｌｂ／ｃマウス血漿中に４．０μｇ／ｍＬから１６．３ｎｇ／ｍＬであった。
【０１４１】
薬物動態学的分析  −  Ｆａｂ操作されたＮ−グリコシル化ｍｏｎｏＦｃ変異体についての血漿薬物動態学的パラメータを、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）（バージョン７．４）を活用する非区画方法を用いて計算した。終点のログ線形位相におけるデータを線形回帰によって分析して、終点の速度定数（ｋ）および半減期（Ｔ１／２＝０．６９３／ｋ）を推定した。少なくとも最後の３つの時点を用いて、ｋを計算した。総ＡＵＣｉｎｆを、ＡＵＣ０−ｌａｓｔとＡＵＣｅｘｔｒａｐとの合計として決定し、ここで、ＡＵＣ０−ｌａｓｔは、線形台形公式を用いて０から最後の測定可能な濃度（Ｃｌａｓｔ）を有する最後の時点（Ｔｌａｓｔ）まで計算し、ＡＵＣｅｘｔｒａｐは、Ｃｌａｓｔ／ｋを用いる、Ｔｌａｓｔから無限までの面積の外挿部分であった。血漿濃度に基づく総ボディークリアランス（ＣＬ）を用量／ＡＵＣｉｎｆとして計算し、定常状態（Ｖｄｓｓ）での分布の容積を、ＣＬ×ＡＵＭＣ／ＡＵＣとして計算し、式中、ＡＵＭＣは、一次モーメント曲線下面積であった。対象間のばらつきは、他の構築物よりもＩｇＧで比較的高かった。
【０１４２】
配列表
配列番号１〜８において、太字の残基は、本発明に従ったＮ−グリコシル化について合理的に選択された位置を指す。配列番号１７〜８８において、太字の残基は、アミノ酸／核酸の変化を指し、第１の下線を引かれた領域はシグナル／リーダー配列であり、存在する場合、第２の下線を引かれた領域はリンカーを指す。
【０１４３】
【表７−１】
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【０１４４】
【表７−２】
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【０１４５】
【表７−３】
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【０１４６】
【表７−４】
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【０１４７】
【表７−５】
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【０１４８】
【表７−６】
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【０１４９】
【表７−７】
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【０１５０】
【表７−８】
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【０１５１】
【表７−９】
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【０１５２】
【表７−１０】
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【０１５３】
【表７−１１】
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【０１５４】
【表７−１２】
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【０１５５】
【表７−１３】
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【０１５６】
【表７−１４】
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【０１５７】
【表７−１５】
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【０１５８】
【表７−１６】
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【０１５９】
【表７−１７】
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【０１６０】
【表７−１８】
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【０１６１】
開示された教示は、様々な適用、方法、および組成に関して記載されているが、本明細書における教示および以下の特許請求の範囲に記載の発明から逸脱しない限り、様々な修正および変更がなされ得ることが理解される。先の実施例は、開示された教示をより良く説明するために提供され、本明細書において示される教示の範囲を限定することを意図したものではない。本教示は、これらの典型的な実施形態に関して記載されているが、当業者には、これらの典型的な実施形態の多くの変型および変更が、不必要な試験を行うことなく可能であることが容易に理解されよう。全てのこのような変型および変更は、現教示の範囲内である。
【０１６２】
特許、特許出願、文書、教科書など、およびそれにおいて引用されている参考文献を含む、本明細書において引用される全ての参考文献は、それらが既に組み込まれていない限りにおいて、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。限定はしないが、定義された用語、用語の使用方法、記載された技術などを含む、組み込まれた文献および類似の材料の１つまたは複数が本願と異なるかまたは矛盾する事象においては、本願が優先される。
【０１６３】
先の記載および実施例は、本発明の特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らによって検討された最良の態様を記載する。しかし、先の記載が文章上いかに詳述されているように見えても、本発明は多くの方法で実施することができ、本発明は添付の特許請求の範囲およびそのあらゆる同等物に従って解釈されるべきであることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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