(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３９および１４６〜３８６からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｂ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０および１４６〜３８６からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｃ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１および１４６〜３８６からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｄ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２および１４６〜３８６からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｅ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４３および１４６〜３８６からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｆ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０および１４６〜３８４からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｇ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１および１４６〜３８４からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｈ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２および１４６〜３８４からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、ならびに
（ｉ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４３および１４６〜３８４からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質
からなる群から選択される2つ以上の組換えＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物。
【請求項２】
（ａ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３９および１４６〜３９８からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｂ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０および１４６〜３９８からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｃ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１および１４６〜３９８からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｄ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２および１４６〜３９８からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｅ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０および１４６〜３９９からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｆ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１および１４６〜３９９からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、ならびに
（ｇ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２および１４６〜３９９からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質
からなる群から選択される2つ以上の組換えＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物。
【請求項３】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が、β−ヒドロキシＡｓｐ６３およびＯ−結合型ヘキソースを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が９、１０または１１個のＧｌａ残基を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が、さらに９、１０または１１個のＧｌａ残基を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が９つのＧｌａ残基を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が１０個のＧｌａ残基を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が１１個のＧｌａ残基を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の重鎖が、１つまたは２つのコア１型Ｏ−結合型グリカンを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
１つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが、一シアル化、または二シアル化されている、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
１つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが、一シアル化されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
１つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが、二シアル化されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
２つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが存在する場合に、それぞれが一シアル化されている、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
２つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが存在する場合に、それぞれが二シアル化されている、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
２つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが存在する場合に、そのうちの１つが一シアル化されており、他の１つが二シアル化されている、請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の組成物であって、請求項１の（ａ）ないし（ｉ）からなる群から選択される、３、４、５、６、７、８、または９つの組換えＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物。
【請求項１７】
請求項２に記載の組成物であって、請求項２の（ａ）ないし（ｇ）からなる群から選択される、３、４、５、６、または７つの組換えＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物。
【請求項１８】
（ａ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３９および１４６〜３８６からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｂ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０および１４６〜３８６からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｃ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１および１４６〜３８６からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｄ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２および１４６〜３８６からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｅ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４３および１４６〜３８６からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｆ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０および１４６〜３８４からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｇ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１および１４６〜３８４からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｈ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２および１４６〜３８４からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｉ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４３および１４６〜３８４からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｊ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３９および１４６〜３９８からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｋ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０および１４６〜３９８からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｌ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１および１４６〜３９８からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｍ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２および１４６〜３９８からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｎ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０および１４６〜３９９からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
（ｏ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１および１４６〜３９９からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、および
（ｐ）軽鎖および重鎖のタンパク質配列がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２および１４６〜３９９からなる組換えＦＸａバリアントタンパク質、
からなる群から選択される2つ以上の組換えＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物。
【請求項１９】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が、β−ヒドロキシＡｓｐ６３およびＯ−結合型ヘキソースを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が９、１０または１１個のＧｌａ残基を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が更に９、１０または１１個のＧｌａ残基を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が、９個のＧｌａ残基を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が、１０個のＧｌａ残基を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖が、１１個のＧｌａ残基を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＦＸａバリアントタンパク質の重鎖が、１つまたは２つのコア１型Ｏ−結合型グリカンを含むアルファ型重鎖を有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２６】
１つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが、一シアル化、または二シアル化されている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
１つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが一シアル化されている、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
１つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが二シアル化されている、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
２つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが存在する場合に、それぞれが一シアル化されている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３０】
２つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが存在する場合に、それぞれが二シアル化されている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３１】
２つのコア１型Ｏ−結合型グリカンが存在する場合に、一つは一シアル化されており、もう一つは二シアル化されている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１に記載の組成物、および２に記載の組成物を含む組成物。
【請求項３３】
請求項１に記載の組成物であって、ＦＸａバリアントタンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のそれぞれが１０個のＧｌａ残基を含み、それらの相対的な量が、マススペクトルを用いて測定された場合に（ｂ）＞（ｃ）＞（ａ）＞（ｄ）となっている、組成物。
【請求項３４】
請求項２に記載の組成物であって、ＦＸａバリアントタンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｆ）のそれぞれが１０個のＧｌａ残基および１つのコア１型Ｏ−結合型グリカンを含み、それらの相対的な量が、マススペクトルを用いて測定された場合に（ｂ）＞（ｃ）＞（ｆ）＞（ａ）となっている、組成物。
【請求項３５】
第Ｘ因子ａ（ＦＸａ）バリアントタンパク質であって、請求項１の（ａ）ないし（ｉ）、および請求項２の（ａ）ないし（ｇ）からなる群から選択されるＦＸａバリアントタンパク質を精製するための方法であって、
（ｉ）混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）媒体を、ＦＸａバリアントタンパク質を含有する、ろ過済み細胞培養培地と接触させるステップと、
（ｉｉ）ＭＭＣクロマトグラフィー媒体に結合しているＦＸａバリアントタンパク質を溶出するステップと、
（ｉｉｉ）アニオン交換クロマトグラフィー媒体を、ステップ（ｉｉ）で溶出したＦＸａバリアントタンパク質と接触させるステップと、
（ｉｖ）アニオン交換クロマトグラフィー媒体に結合しているＦＸａバリアントタンパク質を溶出するステップと、
（ｖ）カチオン交換クロマトグラフィー媒体を、ステップ（ｉｖ）で溶出したＦＸａバリアントタンパク質と接触させるステップと、
（ｖｉ）カチオン交換クロマトグラフィー媒体に結合しているＦＸａバリアントタンパク質を溶出すると
を含む方法。
【請求項３６】
混合モードクロマトグラフィー媒体が、タンパク質と、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合およびチオフィリックな相互作用を介して相互作用することが可能である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ウイルスを不活性化または除去するための、少なくとも１つの追加のステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
混合モードクロマトグラフィー媒体が、Ｃａｐｔｏ（登録商標）  ＭＭＣであり、アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗであり、カチオン交換クロマトグラフィー媒体が、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
精製ＦＸａバリアントタンパク質を濃縮するための限外ろ過および透析ろ過のステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１から３４のいずれか一項に記載された組成物を含む、止血を必要とする患者を治療するための医薬組成物。
【請求項４１】
止血を必要とする患者が血友病Ａを有する、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
止血を必要とする患者が血友病Ｂを有する、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
止血を必要とする患者が外傷を有する、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
止血を必要とする患者が制御不能な出血を有している、請求項４０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により組み込まれている２０１３年９月２４日出願の米国仮特許出願第６１／８８１，８３４号の利益を主張する。
【０００２】
配列表の参照
米国特許法規則集第１．８２１条に従って、ファイル名ＰＣ７２０４９＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔのコンピュータ可読書式（ＣＲＦ）でＥＦＳ−Ｗｅｂを介して本明細書と同時に提出した配列表は、本明細書に参照により組み込まれている。配列表の電子コピーは、２０１４年９月１０日に作成され、３１キロバイトのファイルサイズを有していた。
【背景技術】
【０００３】
出血を医学的または外科的な介入により適切に制御することができない様々な臨床状態においては、過剰な出血を制御するのに有効な療法が必要である。この満たされていない必要性は、血友病を有する患者、とりわけ、インヒビター抗体の生成に起因して因子補充療法の効能が低下している患者において、特に決定的に重要である。
【０００４】
活性化された凝固第Ｘ因子（ＦＸａ）は、凝固カスケードにおいて内因性凝固経路と外因性凝固経路とが収束するところで中心的位置を占める。膜結合型ＦＸａは、その補因子の第Ｖａ因子（ＦＶａ）の存在下で、プロトロンビンをトロンビンに変換し、トロンビンは、血小板を活性化し、フィブリノーゲンをフィブリンに変換して、血栓を形成する。原理上は、ＦＸａを直接投与する補充療法が出血を矯正し得るであろう。しかし、ＦＸａを治療に用いる可能性は限定的であり、このことは、ＦＸａの血漿半減期が非常に短いこと、およびその他の凝固因子の活性化により過剰な凝固が誘発される恐れがあることに起因する。
【０００５】
より早期の研究により、野生型ＦＸａ重鎖のアミノ末端（キモトリプシンの番号付けスキーム中の１６位）においてロイシンによりイソロイシンが置き換えられたＦＸａバリアント（Ｉ１６Ｌバリアント）が同定された。置換は、ＦＸａバリアントにチモーゲン様の特徴をもたらした。Ｔｏｓｏ，Ｒ．ら、Ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ  ｚｙｍｏｇｅｎ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｔａｔｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｅｘｏｓｉｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３、１８６２７〜１８６３５（２００８）；Ｉｖａｎｃｉｕ  Ｌ．ら、Ａ  ｚｙｍｏｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃｏｒｒｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ．  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１０２８〜３３（２０１１）。
【０００６】
プロトロンビナーゼ複合体がその補因子の第Ｖａ因子（ＦＶａ）と共に取り込まれない場合、ＦＸａのＩ１６Ｌバリアントは、顕著な触媒活性を有さず、血清プロテアーゼインヒビターによる不活性化から、野生型ＦＸａと比較してより良好に保護された。結果として、バリアントは、野生型ＦＸａと比較してより長い血清半減期を有していた。しかし、プロトロンビナーゼ中でＦＶａに結合すると、チモーゲン様の状態から活性を示す立体構造への移行がバリアントに生じ、それにより、プロトロンビンからトロンビンへの変換を触媒するバリアントの能力、したがって、その凝血原活性が修復された。血友病Ａおよび血友病Ｂのマウスモデルにおいて、傷害前にＦＸａのＩ１６Ｌバリアントを投与すると、尾部のクリッピング後の血液の喪失が用量依存的様式で低下した。これらの実験の結果は、ＦＸａのＩ１６Ｌバリアントが血友病を有するヒトにおいて制御不能の出血を治療するのに有用であり得ることを示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、より早期の研究で使用されたＦＸａのＩ１６Ｌバリアントは、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から少量作製され、続いて、ＦＸタンパク質は、ラッセルクサリヘビ毒プロテアーゼＲＶＶＸを使用して活性化された。Ｔｏｓｏ，Ｒ．、Ｚｈｕ，Ｈ．およびＣａｍｉｒｅ，Ｒ．Ｍ．  Ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ  ｚｙｍｏｇｅｎ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｔａｔｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｅｘｏｓｉｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３、１８６２７〜１８６３５（２００８）。このアプローチは、小規模の研究には有用であるが、臨床研究および最終的な患者への供給に必要な多量の精製ＦＸａバリアントタンパク質を生成するためには適さない。したがって、当技術分野では、臨床治験で試験し、承認されたら、止血を必要とする対象に提供することができるような量および純度で作製されるＦＸａのＩ１６Ｌバリアントタンパク質の調製物に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、止血を必要とする対象への供給を可能にするのに十分な純度および量で生成されたＦＸａバリアントタンパク質の組成物を提供することによって、上記した当技術分野で満たされていない必要性に取り組む。種々の実施形態では、これらの組成物は、ＦＸａバリアントタンパク質の異なるアイソフォームおよび翻訳後修飾を含む。
【０００９】
一実施形態では、組成物は、ベータ型のＦＸａバリアントタンパク質を含み、ここで、軽鎖および重鎖のタンパク質配列はそれぞれ、いずれも配列番号１のアミノ酸配列の、アミノ酸１〜１３９および１４６〜３８６、アミノ酸１〜１４０および１４６〜３８４、アミノ酸１〜１４０および１４６〜３８６、アミノ酸１〜１４１および１４６〜３８４、アミノ酸１〜１４１および１４６〜３８６、アミノ酸１〜１４２および１４６〜３８４、アミノ酸１〜１４２および１４６〜３８６、アミノ酸１〜１４３および１４６〜３８４、ならびにアミノ酸１〜１４３および１４６〜３８６からなる。
【００１０】
別の実施形態では、組成物は、アルファ型のＦＸａバリアントタンパク質を含み、ここで、軽鎖および重鎖のタンパク質配列はそれぞれ、いずれも配列番号１のアミノ酸配列の、アミノ酸１〜１３９および１４６〜３９８、アミノ酸１〜１４０および１４６〜３９８、アミノ酸１〜１４０および１４６〜３９９、アミノ酸１〜１４１および１４６〜３９８、アミノ酸１〜１４１および１４６〜３９９、アミノ酸１〜１４２および１４６〜３９８、ならびにアミノ酸１〜１４２および１４６〜３９９からなる。
【００１１】
上記のＦＸａバリアントタンパク質のベータアイソフォームおよびアルファアイソフォームの実施形態の任意の１つまたは複数において、タンパク質の軽鎖を、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソース、および９、１０または１１個のＧｌａ残基を含むように改変することができる。いくつかの実施形態では、９つのＧｌａ残基が存在する。その他の実施形態では、１０個のＧｌａ残基が存在する。また、さらにその他の実施形態では、１１個のＧｌａ残基が存在する。
【００１２】
上記のＦＸａバリアントタンパク質のベータアイソフォームの実施形態の任意の１つまたは複数において、重鎖を、１または２つのコア１型Ｏ−結合型グリカンを含むように改変することができる。いくつかの実施形態では、第１のコア１型Ｏ−結合型グリカンのみ、第２のコア１型Ｏ−結合型グリカンのみまたは両方のコア１型Ｏ−結合型グリカンが、非シアル化、一シアル化（ｍｏｎｏ−ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）、または二シアル化（ｄｉ−ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）され得る。いくつかの実施形態によれば、シアル酸基は存在しない。その他の実施形態では、１つのシアル酸基が存在する。さらにその他の実施形態では、２つのシアル酸基が存在する。さらなる実施形態では、３つのシアル酸基が存在する。また、なおさらなる実施形態では、総数４つのシアル酸基が存在する。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、ＦＸａバリアントタンパク質の組成物は、本開示の表２に列挙するＦＸａバリアントタンパク質種の少なくとも１つを含む。その他の実施形態では、本開示の組成物は、表２に列挙するＦＸａバリアントタンパク質種の少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、または少なくとも６０個を含む。
【００１４】
その他の実施形態によれば、ＦＸａバリアントタンパク質の組成物は、少なくとも１つのＦＸａバリアントタンパク質を含み、ここで、軽鎖は、本開示の表３に列挙する種である。また、さらにその他の実施形態では、ＦＸａバリアントタンパク質の組成物は、少なくとも１つのＦＸａバリアントタンパク質を含み、ここで、重鎖は、本開示の表４に列挙する種である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本開示のＦＸａバリアントタンパク質の任意の１つまたは複数は、存在し得るその他の種に対して様々な平均存在量で組成物中に存在する可能性がある。例えば、特定の種が、存在するその他の種と比較して多量、少量または微量の存在量で存在する可能性がある。代わって、特定の種が、存在するその他の種と比較して高い存在量、中程度の存在量、低い存在量または非常に低い存在量で存在する可能性がある。
【００１６】
本開示はまた、ＦＸａバリアントタンパク質を作製および精製する核酸、ベクター、宿主細胞および方法も提供する。
【００１７】
例えば、天然の活性化ペプチド（ＡＰ）配列のＰＡＣＥプロセシング部位による置換えを含み、それにより、凝固因子の細胞内活性化を可能にするＦＸバリアントタンパク質をコードする核酸配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＡＰ配列は、完全に除去され、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇで置き換えられている。いくつかの実施形態によれば、ＦＸバリアントタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、配列番号４の核酸配列により提供され、それによりコードされるアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸配列により示す。ＰＡＣＥ（または類似のプロテアーゼ）およびＦＸバリアントタンパク質を同時発現する宿主細胞を増殖し、次いで、宿主細胞が生成し、プロセシングし、分泌したＦＸａバリアントタンパク質を精製することによって、ＦＸａバリアントタンパク質を作製するための関連の方法を提供する。また、これらの方法に従って生成されるＦＸａバリアントタンパク質も開示する。これらの方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００１８】
ＦＸａバリアントタンパク質の精製を、クロマトグラフィーにより実施することができ、これは、タンパク質を含む溶液を、（例えば、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ媒体を使用する）混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラムに通し、続いて、洗浄および溶出するステップと、次いで、タンパク質を、（例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ媒体を使用する）第１のイオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、続いて、洗浄および溶出するステップと、次いで、タンパク質を、（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３−媒体を使用する）第２の異なるイオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、続いて、洗浄および溶出するステップとを含む。ＦＸａバリアントタンパク質を精製するためのその他の方法もまた可能である。
【００１９】
精製方法は、ウイルス不活性化のステップ、および限外ろ過のステップおよび透析ろ過のステップを任意選択で含むことができる。ＦＸａバリアントタンパク質を精製し、場合によっては濃縮した後に、その他の成分、例えば、緩衝剤または賦形剤を任意選択で含有する薬学的に許容できる希釈剤中に希釈することができる。
【００２０】
本開示はまた、止血を必要とする対象を、１つまたは複数の本開示のＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物の止血有効量を投与することによって治療する方法も提供する。その他の実施形態では、対象は、出血が生じる前に、１つまたは複数の本開示のＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物の止血有効量を投与され、出血を起こしやすい対象において制御不能の出血を予防の目的で防止する。いくつかの実施形態では、対象を、血友病Ａについて治療する。その他の実施形態では、対象を、血友病Ｂについて治療する。また、さらにその他の実施形態では、対象を、外傷またはその他のタイプの制御不能の出血について治療する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−１】図１Ａ：成熟ＦＸバリアントタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図であり、この中では、１４６位の野生イソロイシン残基が、太字で示すロイシンで置換されている。１４６位は、キモトリプシンの番号付けシステムにおける１６位に対応する。可能性のあるγ−カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ）は、下線を付され、斜体で示されている。予測される鎖内および鎖間のジスルフィド結合を、連結されるシステイン間に引いた線により示す。予測されるβ−ヒドロキシル化部位は、実線のボックスで囲まれている。活性化ペプチドを置き換えるために操作したＰＡＣＥ認識部位および切断部位は、破線のボックスで囲まれている。重鎖のベータ型のカルボキシ末端アミノ酸を形成するリジン（Ｌｙｓ３８６）は、実線の楕円で囲まれている。
【図１−２】図１Ｂ：成熟ＦＸバリアントタンパク質の軽鎖の予測されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。    図１Ｃ：ＦＸａバリアントタンパク質の重鎖の予測されるアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図１−３】図１Ｄ：シグナル配列およびプロペプチドを含むＦＸバリアントタンパク質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）を示す図である。
【図２】インタクトなＦＸａバリアントタンパク質の精製調製物の還元、アルキル化、およびＬｙｓ−Ｃでのタンパク質分解性消化から得られたペプチドの質量スペクトルを示す図である。ペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ分析後の質量スペクトルに基づくピークの帰属を使用して、タンパク質のアミノ酸配列を確認し、本明細書の表１および他の箇所に記載されている特定の翻訳後修飾を同定する。ピークに付いている印を、以下に示す。「Ｌ」は、それに番号を続けて、軽鎖に由来する特定のペプチドを指す。「Ｈ」は、それに番号を続けて、重鎖に由来する特定のペプチドを指す。「Ｈ２０１」：２つの二シアル化コア１型Ｏ−グリカンを含有するＬｙｓ３９９で終わるＨ鎖のＣ末端のアルファ型。「Ｈ２０２」：１つの二シアル化コア１型Ｏ−グリカンを含有するＬｙｓ３９９で終わるＨ鎖のＣ末端のアルファ型。「Ｈ２０３」：１つの二シアル化コア１型Ｏ−グリカンを含有するＬｅｕ３９８で終わるＨ鎖のＣ末端のアルファ型。「Ｌ４１Ｇｌａ」：１つのγ−カルボキシグルタミン酸残基を含有する４番のＬ鎖ペプチド。「Ｌ１０ｇｌｃ」：可能性のあるＯ−結合型グルコース（ヘキソース）を含有する１０番のＬ鎖ペプチド。「Ｌ１２Ｇｌａ」：２つのγ−カルボキシグルタミン酸残基を有する１番のＬ鎖ペプチド。「Ｌ３６−８Ｇｌａ」：６、７または８つのγ−カルボキシグルタミン酸残基を有する３番のＬ鎖ペプチド。「Ｌ８ｂ−ＯＨ」：β−ヒドロキシＡｓｐを含有する８番のＬ鎖ペプチド。「ｄ」：脱アミド化。「Ｒ」：試薬のピーク、すなわち、試薬ブランクと一致する、緩衝液に関連する生成物。「＊」：過剰アルキル化。
【図３】インタクトなＦＸａバリアントタンパク質の精製調製物のＨＰＬＣクロマトグラムを示し、調製物中にＦＸａバリアントタンパク質の異なるアイソフォームが存在することを示している図である。
【図４】インタクトなＦＸａバリアントタンパク質の精製調製物のＨＰＬＣクロマトグラムを示し、調製物中にＦＸａバリアントタンパク質の異なるアイソフォームが存在することを示している図である。調製物はまた、質量分析によって分析した。
【図５】精製調製物から得られた、インタクトなＦＸａバリアントタンパク質の質量スペクトルを示す図である。質量スペクトルから、２つの多量のアイソフォーム、すなわち、アルファおよびベータの存在、ならびにＰＡＣＥ切断部位における多様な消化および翻訳後修飾の異なるタイプの存在に起因する広範な質量の不均一性が確認される。図中、主たるピークを、観察された質量（ダルトン）により同定する。ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ分析後の質量スペクトルに基づくピークの帰属を使用して、タンパク質のアイソフォームのアミノ酸配列を確認し、本明細書の表２および他の箇所に記載されている特定の翻訳後修飾を同定する。「＊」の印が付いているピークは、軽鎖Ｇｌａドメイン中に１１個のＧｌａ残基が存在していることを示す。
【図６】鎖間および鎖内のジスルフィド結合を排除することによって軽鎖および重鎖を分離するために、ＦＸａバリアントタンパク質の精製調製物を還元およびアルキル化した後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムは、ＦＸａバリアントタンパク質の異なるアイソフォームが存在することを示している。調製物はまた、質量分析によって分析した。
【図７−１】図７Ａ：タンパク質の精製調製物の還元およびアルキル化の後のＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖の質量スペクトルを示す図である。質量スペクトルは、ＰＡＣＥ切断部位における多様な消化、および翻訳後修飾の異なるタイプが存在することに起因する広範な質量の不均一性を示している。図中、主たるピークを、観察された質量（ダルトン）により同定する。ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ分析後の質量スペクトルに基づくピークの帰属を使用して、タンパク質のアイソフォームのアミノ酸配列を確認し、本明細書の表３および他の箇所に記載されているように、特定の翻訳後修飾を同定する。
【図７−２】図７Ｂ：タンパク質の精製調製物の還元およびアルキル化の後のＦＸａバリアントタンパク質の重鎖の質量スペクトルを示す図である。質量スペクトルは、翻訳後修飾の異なるタイプが存在することに起因する広範な質量の不均一性を示している。図中、主たるピークを、それらの観察された質量（ダルトン）により同定する。ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ分析後の質量スペクトルに基づくピークの帰属を使用して、タンパク質のアイソフォームのアミノ酸配列を確認し、本明細書の表４および他の箇所に記載されているように、特定の翻訳後修飾を同定する。「＊」の印が付いているピークは、重鎖の過剰アルキル化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書は、臨床治験で試験し、止血を必要とする対象に提供するのに十分な純度および量で生成されたＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物を記載する。また、ＦＸａバリアントタンパク質を作製および精製する方法も記載する。
【００２３】
特定の実施形態では、句「ＦＸバリアントタンパク質」、「ＦＸａバリアントタンパク質」および類似の用語はそれぞれ、（そうでないことが文脈から明らかでない限り）ヒト第Ｘ因子（ＦＸ）または活性化された第Ｘ因子（ＦＸａ）を指し、これらの中では、重鎖中の活性化ペプチド配列の直後のイソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）が、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）で置換されている。ＦＸａ重鎖とキモトリプシンの触媒ドメインとの間の配列アライメントに基づいて、この置換はまた、キモトリプシンの番号付けスキームを使用してＩ１６Ｌ置換突然変異とも呼ばれている。この位置は、配列番号１中のアミノ酸１４６および配列番号３中のアミノ酸１に対応する。上記で論述したように、この突然変異を含むＦＸａは、野生型ＦＸａと比較してより長い期間血中を循環するのが可能になるチモーゲン特性を有するが、プロトロンビナーゼ複合体中に取り込まれた場合には、プロトロンビンを高い率で切断することもできる。
【００２４】
その他の実施形態によれば、ＦＸバリアントタンパク質およびＦＸａバリアントタンパク質はそれぞれ、ヒトのＦＸまたはＦＸａを指し、これらの中では、配列番号１中の１４６位（キモトリプシンの番号付けスキームでは１６位）に対応するアミノ酸が、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ａｓｐ（Ｄ）またはＧｌｙ（Ｇ）で置換されている。さらにその他の実施形態によれば、ＦＸバリアントタンパク質およびＦＸａバリアントタンパク質はそれぞれ、ヒトのＦＸまたはＦＸａを指し、これらの中では、配列番号１中の１４７位（キモトリプシンの番号付けスキームでは１７位）に対応するバリン（ＶａｌまたはＶ）が、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ａｌａ（Ａ）またはＧｌｙ（Ｇ）で置換されている。また、その他の実施形態では、ＦＸバリアントタンパク質およびＦＸａバリアントタンパク質はそれぞれ、ヒトのＦＸまたはＦＸａを指し、これらの中では、配列番号１中の３２９位（キモトリプシンの番号付けスキームでは１９４位）に対応するアミノ酸が、Ａｓｎ（Ｎ）またはＧｌｕ（Ｅ）で置換されている。
【００２５】
野生型第Ｘ因子は通常、ジスルフィド結合により１つになって保持された不活性な二本鎖チモーゲンとして血中を循環する。二本鎖チモーゲンは、成熟ＦＸ（すなわち、シグナルペプチドおよびプロペプチドを欠く）から、アミノ酸１４０〜１４２として成熟タンパク質中に存在するペプチドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇのタンパク質分解による除去の後に形成される。しかし、活性化には、血餅形成の前の第ＩＸａ因子もしくは第ＶＩＩａ因子による、またはその他のプロテアーゼ、例えば、ＲＶＶＸによる活性化ペプチド（ＡＰ）の除去が必要となる。ＡＰは、成熟単鎖ＦＸ中のアミノ酸１４３〜１９４に対応する。二本鎖チモーゲン中で、ＡＰは、重鎖のアミノ末端の端部に存在する。Ｍ．Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ、Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．８（１）：５６〜６２（１９９４）。
【００２６】
例示的な実施形態では、第Ｘ因子バリアントタンパク質の配列を、活性化ペプチドを除去し、これをアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（単一文字コードではＲＫＲ）で置き換えることによって改変して、対塩基性アミノ酸切断酵素（ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）（ＰＡＣＥ；また、フーリンとも呼ばれている）のための認識部位および切断部位を製作した。ＦＸａを別個のステップで活性化するのではなく、ＡＰの置換えにより、ＰＡＣＥを宿主細胞中で同時発現させると、ＦＸバリアントタンパク質の細胞内活性化が可能になる。こうすることによって、細胞が生成したＦＸバリアントを最初に精製し、タンパク質を、プロテアーゼ（例えば、ＲＶＶＸ）を使用して別個に活性化し、次いで、バリアントＦＸａを精製する必要性が回避される。これらの余分なステップを回避することによって、ＦＸａバリアントを、より純粋な形態でかつより多量に生成することができる。
【００２７】
成熟第Ｘ因子バリアントのアミノ酸配列を、図１Ａに示し（配列番号１）、ここでは、Ｉ１６Ｌロイシンの置換が１４６位のアミノ酸（太字）に出現し、活性化ペプチドを置き換えているＲＫＲ配列が１４３〜１４５位に出現し、ＰＡＣＥプロセシング部位が１４０〜１４５位（破線で示すボックス）に出現する。図１Ｂおよび図１Ｃはそれぞれ、ＰＡＣＥ部位における切断の後のＦＸａバリアントの軽鎖（配列番号２）および重鎖（配列番号３）の予測されるアミノ酸配列を示す。
【００２８】
本開示の方法に従って生成したＦＸａバリアントタンパク質の複数の調製物を分析すると、タンパク質配列および翻訳後修飾に関して、予測された構造と比較して予想外の程度の不均一性が示された。にもかかわらず、ＦＸａバリアントタンパク質の構造的に不均一な集団を含むそのような組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、強力な凝血原として作用することができた。下記にさらに記載するように、不均一性は、一方、他方または両方の鎖中に存在する軽鎖および重鎖のアミノ酸配列および翻訳後修飾の変動に起因した。
【００２９】
操作についてのいずれか特定の理論により拘束される意図はないが、構造的不均一性の１つの源は、活性化ペプチドを置き換えるために操作されたＰＡＣＥ／フーリンプロテアーゼの認識部位および切断部位における多様な切断に起因すると考えられている。非限定的な実施形態では、ＰＡＣＥ部位のアミノ酸配列は、ＦＸバリアントタンパク質中に、天然のＡＰのアミノ酸配列を残基ＲＫＲで置き換えることによって操作された（単一文字コードで示す）ＲＫＲＲＫＲ（配列番号５）であり、残基ＲＫＲは、軽鎖の最後の３つの残基と共に、タンパク質分解のための認識部位ＲＫＲＲＫＲ（配列番号５）を形成する。その他のＰＡＣＥ認識部位（例えば、ＲＫＲ単独）も使用することができ、また、ＰＡＣＥ／フーリン以外のプロテアーゼのための認識部位および切断部位も使用することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＰＡＣＥ部位はタンパク質分解により切断されて、軽鎖からその部位は完全に除去され、後には残基が残らない（ＡＮＳ．．．ＴＬＥＲ１３９／ＲＫＲＲＫＲ／）（それぞれ、配列番号６および配列番号５、軽鎖およびペプチド断片）。この段落に記載する上記および以下の実施形態では、斜線の印（「／」）は、隣接するアミノ酸の間の可能な切断部位を示し、上付きの数値は、切断後の軽鎖のカルボキシ末端のアミノ酸の（図１Ａ；配列番号１に基づく）位置を示す。その他の実施形態では、ＰＡＣＥ部位は、タンパク質分解により切断され、軽鎖のＣ末端のその最初の残基が残る（ＡＮＳ．．．ＴＬＥＲＲ１４０／ＫＲＲＫＲ／）（それぞれ、配列番号７および配列番号８、軽鎖およびペプチド断片）。その他の実施形態では、ＰＡＣＥ部位は、タンパク質分解により切断され、軽鎖のＣ末端にその最初の２つの残基が残る（ＡＮＳ．．．ＴＬＥＲＲＫ１４１／ＲＲＫＲ／）（それぞれ、配列番号９および配列番号１０、軽鎖およびペプチド断片）。その他の実施形態では、ＰＡＣＥ部位は、タンパク質分解により切断され、軽鎖のＣ末端にその最初の３つの残基が残る（ＡＮＳ．．．ＴＬＥＲＲＫＲ１４２／ＲＫＲ／）（配列番号１１）。その他の実施形態では、ＰＡＣＥ部位は、タンパク質分解により切断され、軽鎖のＣ末端にその最初の４つの残基が残る（ＡＮＳ．．．ＴＬＥＲＲＫＲＲ１４３／ＫＲ／）（配列番号１２）。その他の実施形態では、ＰＡＣＥ部位は、タンパク質分解により切断され、軽鎖のＣ末端にその最初の５つの残基が残る（ＡＮＳ．．．ＴＬＥＲＲＫＲＲＫ１４４／Ｒ／）（配列番号１３）。また、さらにその他の実施形態では、ＰＡＣＥ部位は、タンパク質分解により切断され、軽鎖のＣ末端にその全体の配列が残る（ＡＮＳ．．．ＴＬＥＲＲＫＲＲＫＲ１４５／）（配列番号２）。
【００３１】
その他の実施形態ではまた、軽鎖中の構造的不均一性はまた、特定のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化の程度の変動に起因するＧｌａドメイン中の種々の数のＧｌａ残基の存在も含み得る。特定の実施形態では、Ｇｌａ残基の数は、９、１０または１１個である。Ｇｌａドメイン中の、グルタミン酸のγ−カルボキシル化の可能性のある部位は、図１Ａ中に同定されている。その他の実施形態によれば、軽鎖の構造的不均一性をもたらす追加の潜在的原因としては、Ａｓｐ６３におけるβ−ヒドロキシ化アスパラギン酸残基の有無（図１Ａ；配列番号１）、およびＯ−結合型ヘキソースの有無が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｏ−結合型ヘキソースは、グルコースであるが、その他の実施形態では、異なるアルドヘキソースであっても、または環状ヘミアセタール、ケトヘキソースもしくはその他のＯ−結合型ヘキソースであってもよい。
【００３２】
重鎖もまた、構造的不均一性を示す場合がある。特定の実施形態によれば、変異が重鎖の長さに生じ得る。例えば、いくつかの重鎖は、Ｋ３９９で終止する、より長いアルファアイソフォームである（配列番号３）（上付きの数値は、図１Ａ；配列番号１に基づく重鎖のカルボキシ末端のアミノ酸の位置を示す）が、その他の場合には、末端のリジンは存在せず、したがって、タンパク質はＬ３９８で終わる（配列番号１４）。その他の実施形態では、重鎖は、Ｋ３８６またはＫ３８４で終止する、より短いベータ型である（それぞれ、配列番号４６および配列番号４５）。
【００３３】
重鎖中の不均一性のさらに別の源は、Ｏ−結合型グリコシル化の程度である。したがって、いくつかの実施形態では、重鎖は、非グリコシル化されている。その他の実施形態では、重鎖は、１または２つのコア１型Ｏ−グリカンを含む。コア１型Ｏ−グリカンは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が、セリンまたはスレオニンに付着しており、ガラクトース（Ｇａｌ）が、ＧａｌＮＡｃに付着しているＯ−グリカンである。本開示のいくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ糖は存在するが、Ｇａｌ糖は存在しない。さらにその他の実施形態によれば、２つのコア１型Ｏ−結合型グリカンのそれぞれが別個に、未シアル化、一シアル化または二シアル化され得、したがって、重鎖は、全部で０〜４つのシアル酸基を保有し得る。シアル酸基が存在する場合、それらは、ＧａｌＮＡｃもしくはＧａｌのいずれか、または両方の糖に付着することができる。
【００３４】
その他の実施形態によれば、軽鎖と重鎖との異なる対形成が可能であり、それにより、異なる鎖長および翻訳後修飾を有する二本鎖チモーゲンの大型のコンビナトリアルセットが得られる。
【００３５】
その他の実施形態では、ＦＸａバリアントタンパク質の異なる種の相対的な存在量が変動し得る。一実施形態では、種々の種の存在量を、質量スペクトル中でインタクトなＦＸａバリアントタンパク質のピークの高さを比較することによって検出することができる。代わって、インタクトなタンパク質を還元およびアルキル化して、鎖間および鎖内のジスルフィド結合を排除してから、軽鎖および重鎖の存在量を、質量分析により別個に分析することもできる。下記の実施例に記載するように、異なるＦＸａバリアントの種の存在量を、質量スペクトル中で最も高いピークを比較することによって、多量、少量または微量とスコア化することができる。
【００３６】
しかし、質量ピークの高さの比較が、存在量を測定する唯一の方法ではない。構造的な種の絶対的または相対的な存在量を測定するためのその他の方法は、当業者の知識に属する。相対的な存在量を類別するための別の方法の非限定的な例では、種は、その質量スペクトルのピークの高さが、最も豊富に存在する種（すなわち、質量スペクトル中の最も高いピーク）の高さの少なくとも約５０％である場合に、高い存在量で存在すると考えられる。種は、そのピークが、最も豊富に存在する種のピークの約１０〜５０％の間である場合には、中程度の存在量で存在する。種は、そのピークが、最も豊富に存在する種のピークの約２〜１０％の間である場合には、低い存在量で存在し、そのピークが、最も豊富に存在する種のピークの約２％未満である場合には、非常に低い存在量で存在する。種の相対的な存在量を比較するためのその他の従来技法もまた可能である。
【００３７】
ＦＸａバリアントタンパク質の軽鎖、重鎖およびそれらの組合せ中の構造的不均一性の特定の非限定的な実施形態を、下記に記載する。
【００３８】
本開示の実施形態は、ＰＡＣＥ部位における多様な切断に起因して、軽鎖のカルボキシ末端が異なるアミノ酸で終わるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態は、Ｇｌａ残基、ならびに翻訳後修飾、例えば、アスパラギン酸残基およびＯ−結合型ヘキソースのβ−ヒドロキシル化が種々の数で存在することを含む。これらの実施形態のいくつかを、下記に記載する。
【００３９】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３９からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００４０】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００４１】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００４２】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００４３】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４３からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００４４】
本開示の実施形態は、重鎖のカルボキシ末端が、異なるアミノ酸で終わるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態は、種々の程度のシアル化を含むＯ−結合型グリカンの種々の数を含む。これらの実施形態のいくつかを、下記に記載する。
【００４５】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８４からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。本開示の組成物は、本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかをさらに含むことができる。
【００４６】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８６からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。本開示の組成物は、本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかをさらに含むことができる。
【００４７】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９８からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００４８】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９９からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００４９】
本開示の実施形態は、軽鎖のカルボキシ末端がＰＡＣＥ部位における多様な切断に起因して異なるアミノ酸で終わり、重鎖のカルボキシ末端もまた異なるアミノ酸で終わるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態は、軽鎖中に、Ｇｌａ残基ならびに翻訳後修飾、例えば、アスパラギン酸残基およびＯ−結合型ヘキソースのβ−ヒドロキシル化の種々の数を含み、重鎖中に、種々の程度のシアル化を含むＯ−結合型グリカンの種々の数を含む。これらの実施形態のいくつかを、下記に記載する。
【００５０】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３９からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８４からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００５１】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３９からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８６からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００５２】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３９からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９８からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。その他の関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。さらなるその他の関連の実施形態では、軽鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれが、重鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれと組み合わされる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００５３】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３９からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９９からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。その他の関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。さらなるその他の関連の実施形態では、軽鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれが、重鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれと組み合わされる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００５４】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８４からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００５５】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８６からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００５６】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９８からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。その他の関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。さらなるその他の関連の実施形態では、軽鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれが、重鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれと組み合わされる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００５７】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４０からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９９からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。その他の関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。さらなるその他の関連の実施形態では、軽鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれが、重鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれと組み合わされる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００５８】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８４からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００５９】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８６からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００６０】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９８からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。その他の関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。さらなるその他の関連の実施形態では、軽鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれが、重鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれと組み合わされる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００６１】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４１からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９９からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。その他の関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。さらなるその他の関連の実施形態では、軽鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれが、重鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれと組み合わされる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００６２】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８４からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００６３】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８６からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００６４】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９８からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。その他の関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。さらなるその他の関連の実施形態では、軽鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれが、重鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれと組み合わされる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００６５】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４２からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９９からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。その他の関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。さらなるその他の関連の実施形態では、軽鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれが、重鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれと組み合わされる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００６６】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４３からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８４からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００６７】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４３からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３８６からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００６８】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４３からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９８からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。その他の関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。さらなるその他の関連の実施形態では、軽鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれが、重鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれと組み合わされる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００６９】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、軽鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１４３からなり、重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜３９９からなるＦＸａバリアントタンパク質を含む。関連の実施形態では、軽鎖は、９つのＧｌａ残基、１０個のＧｌａ残基または１１個のＧｌａ残基をさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、Ｏ−結合型ヘキソースまたはこれらの翻訳後修飾の両方をさらに含むことができる。その他の関連の実施形態では、重鎖は、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る１つのコア１型グリカン、またはそれぞれが独立に、非シアル化、一シアル化もしくは二シアル化され得る２つのコア１型グリカンをさらに含む。さらなるその他の関連の実施形態では、軽鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれが、重鎖の翻訳後修飾の可能な置換形態のそれぞれと組み合わされる。本開示の組成物は、この段落に記載するＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかを、単独で含む場合があり、またはそのように記載するその他と組み合わせて、および本開示のその他のＦＸａバリアントタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて含む場合がある。
【００７０】
本開示は、ＦＸバリアントタンパク質をコードする核酸配列を含む単離核酸をさらに提供する。例示的、非限定的な実施形態に従って、ＦＸバリアントタンパク質をコードする相補的ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を、本明細書では配列番号４として開示する。当業者であれば理解するであろうが、ＦＸバリアントタンパク質をコードする多くのその他の核酸配列が、遺伝暗号の縮重に照らして可能である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＦＸバリアントタンパク質をコードする核酸は、ＦＸタンパク質のアミノ末端に位置するシグナルペプチドおよび／またはプロペプチド（すなわち、リーダー配列）をコードする配列を備えることができ、これらのペプチドは、その他の潜在的な機能の中でも特に、新たに合成されたタンパク質を分泌コンパートメントに導く。次いで、翻訳後のプロセシングによりリーダーが除去されてから、細胞から成熟タンパク質が分泌される。いくつかの実施形態では、これらの配列は、天然のヒトＦＸに由来する。非天然のリーダー配列、例えば、ヒトプロトロンビンに由来する配列を使用することができる。（非ヒトの起源のタンパク質を含めて）その他のタンパク質に由来するリーダー配列も使用することができる。配列番号４の核酸配列の実施形態では、アミノ末端のリーダー配列は、ヒトプロトロンビンに由来する。
【００７２】
その他の実施形態によれば、ＦＸバリアントタンパク質をコードする核酸を改変して、凝固因子の細胞内活性化を可能にし、ＦＸａバリアントタンパク質をもたらすことができる。
【００７３】
上記で示したように、ＦＸは通常、二本鎖チモーゲンとして循環し、このチモーゲン中では、５２個のアミノ酸の活性化ペプチドがＦＸの重鎖のアミノ末端に位置する。プロトロンビナーゼ複合体中で凝血原として機能することができるＦＸａを形成するための活性化には、ＡＰが、内因性または外因性の凝固系に由来するプロテアーゼ、例えば、活性化されたＦＩＸまたは活性化されたＦＶＩＩによりタンパク質分解により除去されることが必要になる。以前の研究では、類似する活性化の方法が使用された。具体的には、ＦＸバリアントタンパク質を細胞中で発現させ、次いで、別個のステップにおいてラッセルクサリヘビ毒（ＲＶＶＸ）を用いて処理することによって活性化し、その後、ＦＸａバリアントタンパク質を精製し、続いて、分析した。
【００７４】
原理上は、活性化されたＦＸバリアントタンパク質を、類似の方法を使用して産業規模で生成することができるが、このやり方は、非常に非効率的で、費用がかかる。例えば、綿密に精製して、残余のＲＶＶＸを全て排除することが必要である。これらの不都合を回避するために、天然のＡＰを除去し、細胞内で発現し、機能することができるプロテアーゼの認識部位および切断部位で置き換えることができる。このようにすれば、追加の処理のステップを必要とせず、ＦＸバリアントタンパク質を細胞内で活性化することが可能になる。次いで、宿主細胞が増殖培地中に分泌した活性化されたＦＸバリアントタンパク質を精製することができる。
【００７５】
ＡＰ配列がＰＡＣＥの認識および切断の部位で置き換えられている、ＦＸバリアントをコードする核酸配列の非限定的な例を、配列番号４に示す。この例示的なｃＤＮＡ配列がコードする成熟ＦＸバリアントタンパク質のタンパク質配列を、配列番号１に示す。これらの実施形態では、ＡＰを構成するアミノ酸（野生型ＦＸタンパク質の配列のアミノ酸１４３〜１９４）が、配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（単一文字コードではＲＫＲ）で置き換えられている。この配列を、軽鎖配列の最後の３つの残基（ＲＫＲとも；配列番号１のアミノ酸１４０〜１４２）と組み合わせると、対塩基性アミノ酸切断酵素（ＰＡＣＥ）のための認識部位および切断部位（すなわち、ＲＫＲＲＫＲ）（配列番号５）が製作される。したがって、改変ＦＸバリアントタンパク質を発現する同じ宿主細胞中で可溶性ＰＡＣＥ酵素を同時発現させることによって、凝固因子を細胞内で活性化させることができる。
【００７６】
ＰＡＣＥと類似する認識部位を有する酵素を宿主細胞が自然に発現するいくつかの実施形態では、外因性プロテアーゼの同時発現は必要でない場合がある。むしろ、天然のプロテアーゼが、細胞中で発現したＦＸバリアントタンパク質を活性化するのに十分である場合があり、それにより、活性化されたＦＸバリアントタンパク質が生成され、分泌される。
【００７７】
その他の実施形態では、また、ＰＡＣＥとは異なるが、細胞内で機能することもできるプロテアーゼの認識部位および切断部位を使用しても、ＡＰのアミノ酸配列を置き換えることができる。そのような酵素をＦＸバリアントタンパク質と同じ宿主細胞中で同時発現させて、改変凝固因子を活性化させることができる。操作した部位を切断することができる天然の酵素が、宿主細胞中で十分なレベルで生成する場合には、外因性プロテアーゼの同時発現は必要でない場合がある。
【００７８】
本開示のＦＸバリアントタンパク質をコードする核酸配列を、当業者に周知の技法を使用してベクター中に取り込むことができる。
【００７９】
ベクターは、特定の実施形態において、一般的にはプラスミド、細菌性のプラスミド、真核生物のエピソーム、酵母の人工染色体、およびウイルスゲノムを含む。例示的、非限定的なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ならびに植物のウイルス、例えば、カリフラワーモザイクウイルスおよびタバコモザイクウイルスが挙げられる。その他のタイプのベクターも可能である。いくつかの実施形態では、ベクターは、適切な宿主中で自律的に複製することができる。その他の実施形態では、ベクターは宿主中に染色体外で維持されるか、または宿主のゲノム中にベクターが組み入れられるようになして、ベクターが宿主のゲノムと共に複製するのを可能にすることができる。遺伝子ならびに遺伝子の転写および翻訳を維持するのに十分な制御配列を含むベクターは、発現ベクターと呼ばれている。当業者の知識に従って、本開示に従うベクターを選択または設計して、細菌細胞、その他の原核細胞、酵母細胞、その他の真菌細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、ＣＨＯ細胞およびヒト細胞等を含めた、ＦＸバリアントタンパク質の発現を支援することができる任意の細胞型中で機能させることができる。
【００８０】
ベクターは、１つまたは複数の制御配列を任意選択で含有することができる。特定の制御配列、例えば、複製開始点により、複製が可能になる。その他の制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結部位により、転写が制御または調節される。プロモーターまたはエンハンサーの非限定的な例が、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））またはポリオーマウイルスに由来するものである。追加の例として、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、構成性に活性を示すプロモーターおよびエンハンサー、ならびに誘導性のプロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。その他のプロモーターおよびエンハンサーもまた、可能である。さらなるその他の制御配列、例えば、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル、またはｍＲＮＡの安定性を増加もしくは減少させるシグナルにより、転写後のＲＮＡプロセシングが制御または調節される。その他の制御配列、例えば、翻訳開始配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）により、タンパク質の翻訳、翻訳後のプロセシングまたはタンパク質の安定性が制御または調節される。
【００８１】
ベクターはまた、ベクターを取り込んでいる宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含むこともできる。非限定的な例として、薬物耐性の表現型をもたらす選択マーカー遺伝子、例えば、（メトトレキサートを使用する選択を可能にするＤＨＦＲ−宿主細胞中で使用するための）ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、（Ｇ４１８または類似の薬物を用いる選択を可能にする）ｎｅｏ遺伝子、（ハイグロマイシンＢを用いる選択を可能にする）ｈｐｈ遺伝子、および（メチオニンスルホキシミンを用いる選択を可能にする）グルタミン酸シンテターゼ遺伝子が挙げられる。
【００８２】
本開示のＦＸバリアントタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを、ＦＸバリアントタンパク質の発現を支援することができる１つまたは複数のタイプの宿主細胞中に導入することができる。適切な宿主細胞中にベクターを導入するための方法は、当業者に周知である。非限定的な例として、標的宿主細胞に対する一過性および安定なトランスフェクション、形質転換、形質導入およびウイルス感染が挙げられる。その他の例として、デキストラン媒介型トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介型トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドの封入、および核内へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。植物細胞、細菌細胞および酵母細胞を形質転換するための方法もまた、当技術分野で周知である。
【００８３】
ＦＸバリアントタンパク質またはＦＸａバリアントタンパク質を、その他のタンパク質と共に発現させて、ＦＸバリアントタンパク質またはＦＸａバリアントタンパク質の発現または翻訳後プロセシングを最適化することができる。非限定的な例では、γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むベクターを、宿主細胞中にＦＸバリアントタンパク質をコードするベクターと共にコトランスフェクトして、軽鎖Ｇｌａドメイン中のグルタミン酸のカルボキシル化を増加させることができる。こうすることによって、Ｇｌａドメイン中のカルボキシル化およびＧｌａ残基形成の程度を増加させ、それにより、細胞が生成する、活性凝固因子の収率を向上させることができる。上記の別の実施形態では、改変して、天然のＡＰのアミノ酸配列をＰＡＣＥ切断部位で置き換えたＦＸバリアントタンパク質を、同じ宿主細胞中で可溶性ＰＡＣＥ酵素と共に同時発現させることができる。次いで、同時発現したＰＡＣＥは、細胞内でＦＸバリアントタンパク質を切断して、活性化されたＦＸバリアントタンパク質を形成させることができ、その後、これが、細胞から分泌される。上記で示したように、このアプローチにより、別個のステップでＦＸバリアントタンパク質を活性化する必要性が回避され、このアプローチをとらなければ、非常に非効率的で、費用がかかる。
【００８４】
ＦＸバリアントタンパク質および活性型のＦＸバリアントタンパク質の発現を最適化するのに有用なその他のタンパク質を発現することができる細胞には、哺乳動物細胞が含まれる。タンパク質の発現のための宿主として適切な哺乳動物細胞株は、ヒト、ラット、マウスおよびその他の哺乳動物に由来するものを含めて、当技術分野で公知である。例示的、非限定的な例には、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）またはその他の供給元から入手可能な特定の不死化細胞株があり、それらとして、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＶ−１またはベロ細胞）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、ジャーカット細胞等が挙げられる。当業者の知識に従って、その他の哺乳動物細胞も、タンパク質の発現のための宿主細胞として使用し得る。
【００８５】
その他の実施形態では、昆虫、植物、細菌または真菌に由来する細胞株を使用することができる。例示的、非限定的な昆虫細胞として、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞が挙げられ、これらはしばしば、バキュロウイルスベクター発現系と併せて使用される。例示的、非限定的な植物細胞として、タバコ、シロイヌナズナ、ウキクサ、トウモロコシ、小麦およびジャガイモの種に由来するものが挙げられる。例示的、非限定的な細菌として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびストレプトミセス属の菌株が挙げられる。例示的、非限定的な真菌として、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリベロミセス属酵母の菌株、およびカンジダ属酵母の菌株が挙げられる。当業者の知識に従って、その他の昆虫、植物、細菌および真菌の細胞も、タンパク質の発現のための宿主細胞として使用し得る。
【００８６】
活性化されたＦＸバリアントタンパク質を生成するために宿主細胞を培養するための方法、試薬および条件は当業者の知識に属し、これらを限定する意図はない。非限定的な例では、ＦＸａバリアントタンパク質を、ビタミンＫを補充した血清を含有しない培地からなる５００リットルの培養液中で生成することができる。別の非限定的な例では、本開示のＦＸａバリアントタンパク質を、産業規模、例えば、２５００リットルの発酵タンクまたはさらにより大きな体積中、発現および回収を最適化するように設計された条件下で生成することができる。
【００８７】
ＦＸバリアントタンパク質の発現および細胞内活性化を支援する培養液条件下で宿主細胞を増殖した後、細胞増殖培地を処理して、細胞増殖の間に分泌されたＦＸａバリアントタンパク質を単離および精製することができる。その他の実施形態では、特に、哺乳動物以外の宿主細胞を使用する場合には、例えば、機械により、酵素より、または洗剤を用いて細胞を破壊して開くことによって、細胞中に残存するＦＸａバリアントタンパク質を放出させることができる。
【００８８】
細胞培養培地を遠心分離し、かつ／またはろ過して、細胞およびデブリを除去することができ、これは、例えば、深層ろ過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）のみを行うか、または続いて、例えば、０．４５μｍ、０．２μｍもしくは何らかのその他の孔径の平均孔径を有するメンブランフィルターを通すメンブランろ過も行う。細胞のデブリを遠心分離および／またはろ過により除去した後、培地を処理して、ＦＸａバリアントタンパク質をさらに精製することができる。続く精製のステップに応じて、浄化した上清またはろ液を希釈し、かつ／または緩衝液で交換するのが望ましい場合がある。
【００８９】
タンパク質を精製するための方法は、当技術分野で周知である。タンパク質を精製する例示的、非限定的な方法として、塩沈殿、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、ＦＸａバリアントタンパク質を特異的に認識する抗体を精製カラムに固定化して、周囲の培地または緩衝液からタンパク質を可逆的に捕捉することができる。親和性カラムを洗浄して、夾雑物を除去し、その後、結合しているＦＸａバリアントタンパク質を溶出させることができる。
【００９０】
部分的に精製されているＦＸａバリアントタンパク質に対して、例えば、ウイルスの除去または不活性化を含めた、医薬品の製造および品質管理に関する基準またはその他の規制要件に従う処理のステップを行うことができる。当業者の知識に従って、限外ろ過によりウイルスを除去すること、またはアルコールおよび／もしくは洗剤を用いて試料を処理することによってウイルスを不活性化することができる。例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能なＶｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）名を有するウイルスフィルターを使用しても、また、その他の製造元から入手可能なフィルターを使用してもよい。ウイルスを除去または不活性化するためのその他の方法も可能である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＦＸａバリアントタンパク質を精製するために、混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を単独でまたはその他の精製ステップと組み合わせて使用することができる。ＭＭＣはまた、多様式クロマトグラフィーとも呼ばれており、これは、リガンド成分と試料成分との間の２つ以上のタイプの相互作用をもたらすクロマトグラフィー媒体を使用することを指す。相互作用の例示的なタイプとして、静電的相互作用（アニオン交換体またはカチオン交換体）、疎水性相互作用、パイ−パイ相互作用、水素結合およびチオフィリックな相互作用が挙げられる。これらの相互作用は、協働する場合も、または独立に働く場合もある。ＭＭＣ媒体の特定の非限定的な例として、Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ  ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００が挙げられ、これらは全て、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ出版のＭｕｌｔｉｍｏｄａｌ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（２０１３）に詳しく記載されている。例えば、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣは、チオフィリックな特性、疎水性の特性、水素結合の特性、およびカチオン交換体の静電的特性をもたらす。その他の供給元からのＭＭＣ媒体もまた、使用し得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＦＸａバリアントタンパク質を精製するために、イオン交換クロマトグラフィーを単独でまたはその他の精製のステップと組み合わせて使用することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、それらの正味の表面電荷の差に基づいて、分子の分離を可能にするクロマトグラフィー媒体を使用することを指し、正味の表面電荷は、ｐＨ、塩およびその他の条件で変化し得る。タンパク質の等電点を上回るｐＨでは、タンパク質は正に荷電した媒体（アニオン交換体）に結合し、一方、その等電点を下回るｐＨでは、タンパク質は負に荷電した媒体（カチオン交換体）に結合する。精製しようとするタンパク質（例えば、ＦＸａバリアントタンパク質）が媒体に選択的に結合するように、イオン交換媒体および緩衝液の条件（例えば、塩濃度、ｐＨ等）を選び、夾雑物を、同じ条件下でより弱く結合させて、洗い流すことができ、その後、クロマトグラフィーカラムから目的のタンパク質を溶出させることができる。イオン交換クロマトグラフィーについての追加の情報が、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ出版のＩｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ＆  Ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（２０１０）に詳しく記載されている。
【００９３】
イオン交換体を、強いイオン交換体または弱いイオン交換体に分類することができ、これにより、ｐＨを変化させた場合にイオン交換体が荷電した状態を維持する程度が示される。強い交換体は、広いｐＨ範囲にわたり荷電した状態を維持するが、弱い交換体はそうではない。アニオン交換体の官能基の例として、強い四級アンモニウム（Ｑ）、ならびに弱いと考えられるジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）およびジエチルアミノプロピル（ＡＮＸ）が挙げられる。カチオン交換体の官能基の例として、その両方が強いと考えられるスルホプロピル（ＳＰ）およびメチルスルホン酸（Ｓ）、ならびに弱いカルボキシメチル（ＣＭ）が挙げられる。
【００９４】
一実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーのステップを単独で、または続いて、カチオン交換クロマトグラフィーのステップも使用して、ＦＸａバリアントタンパク質を精製することができる。別の実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィーのステップを単独で、または続いて、アニオン交換クロマトグラフィーのステップも使用して、ＦＸａバリアントタンパク質を精製することができる。
【００９５】
イオン交換媒体の特定の、非限定的な例として、Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ  ＳＰ  ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、ＳＯＵＲＣＥ１５Ｑ、ＳＯＵＲＣＥ１５Ｓ、ＳＯＵＲＣＥ３０Ｑ、ＳＯＵＲＣＥ３０Ｓ、ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ、ＭａｃｒｏＣａｐ  Ｑ、Ｍｉｎｉ  Ｑ  ＰＣ、Ｍｉｎｉ  Ｓ  ＰＣ、Ｍｉｎｉ  Ｑ  ＰＥ、Ｍｉｎｉ  Ｓ  ＰＥ、ＨＲ  Ｍｏｎｏ  Ｑ、ＨＲ  Ｍｏｎｏ  Ｓ、ＰＣ  Ｍｏｎｏ  Ｑ、ＰＣ  Ｍｏｎｏ  Ｓ、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＧＬ、Ｍｏｎｏ  Ｓ  ＧＬ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｃｅｌ、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−５０、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０、ＱＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５、ＱＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−５０、ＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ）、ＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （Ｌｏｗ  Ｓｕｂ）、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｇｒａｄｅ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、およびＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬが挙げられ、これらは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。その他のイオン交換媒体を、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手することができ、これらとして、例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）シリーズまたはＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）シリーズに属するものが挙げられる。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）シリーズに属する例として、ＴＭＡＥ樹脂、ＴＭＡＥ  Ｈｉｃａｐ樹脂、ＴＭＡＥ  Ｍｅｄｃａｐ樹脂、ＤＥＡＥ樹脂、ＤＭＡＥ樹脂、ＳＯ３−樹脂、ＳＥ  Ｈｉｃａｐ樹脂、およびＣＯＯ−樹脂が挙げられる。Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）シリーズに属する例として、ＣＰＸ樹脂、Ｓ樹脂、Ｑ樹脂、およびＨＣＸ樹脂が挙げられる。その他の供給元からのイオン交換媒体もまた、使用することができる。
【００９６】
ＦＸａバリアントタンパク質を十分に精製するに至ったら、精製タンパク質を限外ろ過および透析ろ過を使用して濃縮し、包装またはさらなる処理のための調製物となすことができる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、精製し、濃縮したＦＸａバリアントタンパク質を、対象に投与するのに適切な緩衝液およびその他の成分を含有する水溶液中に希釈し、次いで、送達までの長期保存のために包装することができる。追加の処理のステップを行うことができる。例えば、ＦＸａバリアントタンパク質、賦形剤、緩衝液およびその他の薬学的に許容できる成分を含む組成物を、長期保存のために凍結乾燥することができる。
【００９８】
本開示のＦＸａバリアントタンパク質を、下記の実施例に記載する方法に従って生成した場合であっても、その他の方法により生成した場合であっても、当業者が精通している方法を使用して分析して、構造的不均一性の存在および程度を決定することができる。
【００９９】
例えば、いくつかの実施形態では、インタクトなタンパク質またはそこから調製されたタンパク質分解断片を、例えば、エドマン分解を使用する直接的なタンパク質の配列決定により分析することができる。タンパク質またはペプチドはまた、逆相ＬＣ（ＲＰ−ＬＣ）を含めた、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、およびアミノ酸配列の変動および特定の翻訳後修飾の存在を検出するためのエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間質量分析（ＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ）を含めた、質量分析により分析することができる。さらに、荷電した基、例えば、γ−カルボキシル化グルタミン酸残基（Ｇｌａ）の存在も、アニオン交換液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）を使用して検出することができる。
【０１００】
炭水化物部分の存在が疑われる場合は、特定のグリコシダーゼを用いてそれらを除去することによって、それらの存在を確認することができる。その後、グリコシダーゼにより除去した炭水化物を欠くはずである、処理したタンパク質を、例えば、質量分析により再度分析して、存在していると仮定した炭水化物の同一性を確認することができる。
【０１０１】
当業者が精通しているその他の分析技法を使用して、ＦＸａバリアントタンパク質中の構造的不均一性の程度および同一性を検出することができる。
【０１０２】
本開示のＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物を、凝血原活性について試験することができる。非限定的な例では、凝固活性を、第ＶＩＩＩ因子欠損ヒト血漿を基質として使用する一段階の凝固アッセイを用いて測定する。１つのそのようなアッセイが、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイとして既知であるが、その他のアッセイを、当業者の知識に従って使用することができる。ＡＰＴＴアッセイは、Ｋａｍａｌ，Ａ．Ｆ．ら、Ｈｏｗ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔ  ａｎｄ  ｐｕｒｓｕｅ  ａｎ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｉｍｅ，ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ  ｔｉｍｅ，ａｎｄ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｔｉｍｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ．８２（７）：８６４〜８７３（２００７）により詳細に記載されている。
【０１０３】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」のＦＸａバリアントタンパク質を含む。「治療有効量」は、所望の治療結果、例えば、制御不能の出血の止血を達成するのに必要な投与量で、かつ必要な期間にわたり、効果を示す量を指す。ＦＸａバリアントの治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重ならびにＦＸａバリアントの、個体中で所望の応答を惹起する能力等の要因に従って変化し得る。治療有効量はまた、治療に有益な作用が、ＦＸａバリアントの毒性のまたは有害ないずれの作用にも勝る量でもある。「予防有効量」は、所望の予防的結果、例えば、出血を起こしやすい対象における制御不能の出血の予防を達成するのに必要な投与量で、かつ必要な期間にわたり効果を示す量を指す。例えば、計画されている手術の前に投与することができる。出血を起こしやすい対象の例として、因子を補充する製品に対する阻害性抗体を生成する対象を含めた、血友病Ａまたは血友病Ｂが挙げられる。
【０１０４】
本開示の組成物を、ヒト患者を含めた、不十分な凝固または過剰な出血を特徴とする任意の状態のための治療またはその予防を必要とする対象に投与することができる。そのような状態の非限定的な例として、血友病Ａ、血友病Ｂ、阻害性抗体を伴う血友病Ａまたは血友病Ｂ、凝固因子の欠損、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１の欠損、ガンマ−カルボキシラーゼの欠損、外傷、傷害、血栓、血小板減少、脳卒中、凝固障害、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、過剰抗凝固治療障害、ベルナール−スーリエ症候群、グラツマン血小板無力症および貯蔵プール欠乏症（ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｏｏｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）に伴う出血が挙げられる。また、不十分な凝固または過剰な出血を特徴とするその他の障害の治療または予防も考えられる。
【０１０５】
投与レジメンを、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的な応答）をもたらすように調整することができる。例えば、単一のボーラスを投与してもよいし、いくつかに分割した用量を長期にわたり投与してもよいし、または治療する状況が示唆する緊急性に相応させて用量を低下もしくは増加させてもよい。いくつかの実施形態によれば、非経口用組成物を投与単位剤型に製剤化して、投与を簡便にし、投与量を一様にする。投与単位剤型は、統一された投与量として、治療しようとする対象に用いるための物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位が、適切な薬学的担体と共同して所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物の所定の量を含有する。
【０１０６】
特定の実施形態では、ＦＸａバリアントタンパク質の治療有効量または予防有効量は、約０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇである。関連の実施形態によれば、ＦＸａバリアントタンパク質の治療または予防に有効な血清濃度は、約０．０００３〜３００ｎＭ、約０．００３〜３００ｎＭ、約０．０３〜３００ｎＭ、約０．００３〜３０ｎＭ、約０．０３〜３０ｎＭ、または約０．３〜３ｎＭである。ＦＸａバリアントの血清濃度は、当技術分野で公知の任意の方法により測定することができる。
【０１０７】
本開示の組成物の単位用量を調製して、ＦＸａバリアントタンパク質の治療有効量または予防有効量の対象への投与を好都合に可能にすること、またはそのような対象中でそのようなタンパク質の所望の血清濃度を達成することができる。
【０１０８】
いずれの特定の対象に対しても、治療している対象の必要性および組成物の投与または組成物の投与の監督に関与する個人の専門的判断に従って、特定の投与レジメンまたは投与量の範囲を経時的に調整することができる。したがって、本明細書に記載する投与レジメンおよび投与量の範囲は、例示的なものに過ぎず、本開示の組成物の範囲および実行を限定するものではない。
【０１０９】
さらに、例えば、本開示の組成物の１つまたは複数の単位用量を含むキットも提供する。そのような単位用量は、液体形態で、または凍結乾燥物として存在してもよい。組成物を凍結乾燥された形態で包装する場合には、キットは、乾燥ペレットを再懸濁するために、希釈剤、例えば、滅菌水または生理食塩水が充填された容器をさらに含むことができる。キットはまた、例えば、皮下注射器またはチューブおよび翼状針等を含めた、投与のために使用すべき物品も含むことができる。キットは、使用のための指示、皮膚を滅菌するためのアルコールパッド、またはその他の構成成分をさらに含むことができる。
【０１１０】
ＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物を、当業者の知識に従って、出血が停止するまたは適切な凝固が達成されるまで１または複数回投与することができる。複数回の投与を使用する場合、１時間に１回、１日１回、週１回、またはその他の間隔で投与することができる。投与は、１０分に１回、１５分に１回、２０分に１回、３０分に１回、１時間に１回、２時間に１回、３時間に１回、４時間に１回、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、および週１回等のスケジュールに従うことができる。ＦＸａバリアントはまた、連続的に、例えば、ミニポンプを介して投与することもできる。ＦＸａバリアントは、非経口経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内）を介して投与することができる。ＦＸａバリアントは、１もしくは２回以上、または少なくとも、有効な凝固を達成するのに必要な期間にわたり投与することができる。
【０１１１】
別の実施形態では、ＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物を、異なるＦＸａバリアント（例えば、アミノ酸番号１４６においてロイシンとは異なる置換を有するもの）、第ＩＸ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、ＦＥＩＢＡまたはプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）を含めた、別の凝血原と共に同時投与することができる。
【０１１２】
ＦＸａバリアントタンパク質を含む組成物は、薬学的に許容できる担体またはビヒクルをさらに含むことができ、これらは、生理的に適合性である溶媒、分散媒体、抗細菌剤および抗真菌剤、等張な薬剤および吸収遅延剤等であり得る。薬学的に許容できる担体のいくつかの例が、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組合せであるが、これらは単なる例示でしかない。等張化剤、例えば、塩（例えば、塩化ナトリウム）、糖（例えば、スクロース）またはポリアルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）もまた、組成物中に含めることができる。薬学的に許容できる物質の追加の例が、湿潤剤、乳化剤、保存剤または緩衝剤であり、これらにより、本組成物の安定性またはその他の属性が増強される。
【０１１３】
本開示に従って使用するための組成物を、対象に投与するのに適切な任意の形態、例えば、注射または注入のための液体とすることができる。形態は、意図する投与様式および治療の適用によって異なる。
【０１１４】
治療用組成物は通常、製造および保存の条件下で無菌かつ安定である。組成物を、液剤、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソームまたは高い薬物濃度に適切なその他の秩序ある構造として製剤化することができる。適切な溶媒中に必要な量の本開示のＦＸａバリアントタンパク質を上記の成分の１つまたは組合せと共に取り込み、続いて、ろ過滅菌することによって、無菌の注射用液剤を調製することができる。無菌の注射用液剤を調製するための無菌の散剤の場合には、調製の方法は、真空乾燥するまたは凍結により乾燥（凍結乾燥）するステップを含み、このステップにより、活性成分と任意の追加の所望の成分とからなる散剤が、それらの前もって無菌ろ過した溶液から得られる。
【０１１５】
以下の実施例は、例示のためのものに過ぎず、いかなる場合であっても、特許請求の範囲および本明細書に開示するその他の発明の範囲を限定するものであると解釈されないものとする。
【実施例】
【０１１６】
（実施例１）
組換えＦＸａバリアントタンパク質の発現および精製
標準的な分子生物学の技法および試薬を使用して、Ｉ１６Ｌ突然変異を含むＦＸバリアントタンパク質をコードするｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡ中では、天然の第Ｘ因子活性化ペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＫＲ（単一文字コード）で置き換えられており、このＲＫＲは、軽鎖のＣ末端のＲＫＲ配列と共に、アミノ酸配列ＲＫＲＲＫＲ（配列番号５）を有するＰＡＣＥのタンパク質切断部位を形成した。ｃＤＮＡおよびそれがコードする成熟タンパク質の配列をそれぞれ、図１Ｄ（配列番号４）および図１Ａ（配列番号１）に記載する。このようにして、ＦＸａバリアントのＦＸ前駆体を、凝固因子と共に同時発現させたＰＡＣＥ酵素による細胞内タンパク質切断によって活性化させることができた。さらに、ヒトＦＸの天然のシグナル配列およびプロペプチドも、ヒトプロトロンビンのもので置き換えた。
【０１１７】
ＦＸバリアントをコードするｃＤＮＡを、構成性プロモーターの制御下で発現ベクター中にサブクローニングした。このベクターはまた、安定なトランスフェクタントの抗生物質による選択を可能にするネオマイシン耐性遺伝子も発現した。第２のベクターを、可溶性形態のＰＡＣＥ酵素を発現するように製作した。
【０１１８】
ＣＨＯ  Ｋ１宿主細胞を、無血清懸濁液中で増殖するように順応させ、直線化ベクターをリポフェクションによりコトランスフェクトして、ＦＸａバリアントおよび可溶性ＰＡＣＥを発現させた。トランスフェクトされた細胞を、Ｇ４１８抗生物質およびビタミンＫ１を補充した培地中で増殖することによって選択した。抵抗性のクローンを、組換えＦＸａバリアントタンパク質の発現および活性についてスクリーニングした。組換えＦＸａバリアントタンパク質の比較的高い発現および活性を示すクローンを、無血清懸濁培養液中で増殖するように順応させた。１つのクローンを選択し、使用して、プレマスター細胞バンク、次いで、マスター細胞バンクを、動物またはヒトに由来する構成成分を含有しない合成培地を使用して確立した。
【０１１９】
さらなる研究のための原薬を生成するために、ＦＸａバリアントを発現する細胞を、５００リットル（Ｌ）または２５００Ｌの規模で合成培地を使用して増殖させた。最初に、細胞バンクから得られた細胞のバイアルを、解凍し、培養し、動物の構成成分を含有しない合成培地を使用して、槽体積を増加させて段階的に拡大増殖した。拡大が完了したら、小さな撹拌タンクのバイオリアクター中に培養物を維持した。生成のためには、５００Ｌまたは２５００Ｌの規模のバイオリアクター中で、採取するまで培養を継続した。採取するためには、細胞培養培地を遠心分離して、細胞およびデブリを除去した。深層ろ過および０．２μｍのフィルターを通すろ過により、培地をさら浄化した。
【０１２０】
次いで、ろ過した培地を、緩衝液を用いて希釈し、Ｃａｐｔｏ混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に充填した。洗浄後、生成物をカラムから溶出した。次いで、部分的に精製した生成物を、洗剤溶液中に希釈して、ウイルスを不活性化した。ウイルス不活性化の後、生成物を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に充填し、洗浄し、カラムから溶出した。次いで、溶出した生成物を、緩衝液を用いて希釈し、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３−クロマトグラフィーカラム（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に充填し、洗浄し、カラムから溶出した。次いで、溶出した生成物を、Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＣＰＶフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してろ過して、存在している可能性がある残余のウイルスを全て除去した。ウイルスをろ過した後、精製した生成物を、限外ろ過および透析ろ過を使用して濃縮した。次いで、精製した原薬を試験して、ＣＨＯ細胞が生成したＦＸａバリアントタンパク質を特徴付けた。
【０１２１】
（実施例２）
末端のアミノ酸配列
エドマン分解によるＦＸａバリアントのアミノ末端の配列決定を使用して、軽鎖のアミノ末端および重鎖のアミノ末端の両方の最初の１０個の残基を確認した。ＦＸａバリアントを、非還元性条件および還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブラン上にエレクトロブロットした後に、自動化エドマン分解により分析を行った。
【０１２２】
軽鎖アミノ末端の配列は、ＡＮＳＦＬ（Ｘ）（Ｘ）ＭＫＫ（単一文字コード）（配列番号１５）であった。残基６および７において、シグナルは発生せず（Ｘで示す）、このことは、それらの位置に、ガンマカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基が存在することと一致する。重鎖アミノ末端の配列は、ＬＶＧＧＱＥ（Ｚ）ＫＤＧ（配列番号１６）であった。残基７において、シグナルは発生せず（Ｚで示す）、このことは、その位置に、システインが存在することと一致する。これらの結果から、理論的な配列と比較して、軽鎖および重鎖の両方が予想されたアミノ末端配列であることが確認された。
【０１２３】
（実施例３）
一次構造を確認し、翻訳後修飾を同定するためのペプチドマッピング
一次アミノ酸配列を確認するため、および翻訳後修飾を検出するために、実施例１の記載に従って生成したＦＸａバリアントタンパク質を、ペプチドマッピングにより分析した。具体的には、タンパク質を還元し、アルキル化し、Ｌｙｓ−Ｃリジルエンドペプチダーゼ（アクロモバクター・ライティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼ１）を用いて消化し、その後、逆相高速液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間質量分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ）により、断片を分析した。
【０１２４】
得られたペプチドマップのプロファイルの例を、図２に示し、図中、図１Ｂに示す軽鎖および図１Ｃに示す重鎖の理論的な配列に関して、推測されるそれらの相対的な位置に従ってペプチドに印が付いている。文字「Ｌ」の印が付いているピークは、軽鎖ペプチドを示し、文字「Ｈ」の印が付いているピークは、重鎖ペプチドを示す。緩衝液に関連する生成物を示す少量のピークには、「Ｒ」の印が付いている。脱アミド化（ｄ）ペプチドまたは過剰アルキル化ペプチドを示す微量レベルのいくつかのピークにはそれぞれ、「ｄ」および「＊」の印が付いている。
【０１２５】
ペプチドマッピングにより検出したペプチド、それらの理論的な質量および観察された質量、ならびにアミノ酸配列を、下記の表１に示す。アミノ酸の番号付けは、図１Ａ（配列番号１）に基づく。
【０１２６】
【表１−１】
0006429885.tif 000002
【０１２７】
【表１−２】
0006429885.tif 000003
【０１２８】
【表１−３】
0006429885.tif 000004
【０１２９】
ＰＡＷＳ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて、理論的な質量を計算した。観察された質量は、質量スペクトル中に最も豊富に存在する多重荷電イオンから計算した。全ての観察された質量が、理論的な質量と１０ｐｐｍの範囲内で一致した。ペプチド全体での配列包括度は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）についてそれぞれ、およそ９４および９８％であった。Ｌ鎖に由来する３つのペプチド（Ｌ２、Ｌ５、Ｌ７）、および重鎖に由来する２つのペプチド（Ｈ１４、Ｈ１９）は検出されなかった。理論的なペプチドの質量と観察されたペプチドの質量との間の計算された差から、特定の翻訳後修飾が存在することが推測され得る。修飾を受けやすいことが見出されたそれらの残基を、表１の第５列中、下線により示す。
【０１３０】
軽鎖中のＮ末端のＧｌａドメインは、総数９〜１１個のガンマカルボキシル化グルタミン酸（Ｇｌａ）残基を含有していた。軽鎖の多量の種は、１０個のＧｌａ残基を含有していた。ペプチドＬ１は常にカルボキシル化されているが、不均一性が、ペプチドＬ３およびＬ４において検出された。具体的には、Ｌ３ペプチドは、６、７または８つのＧｌａ残基を伴って観察され、Ｌ４ペプチドは、Ｇｌａ残基を伴わずにまたは１つのＧｌａ残基を伴って観察された。表１を参照されたい。
【０１３１】
電荷の不均一性を測定するためのアニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）を使用して、ガンマ−カルボキシル化についての不均一性を確認した。ＦＸａバリアントタンパク質をＡＥＸ−ＨＰＬＣにより分離することによって、アイソフォームが９、１０および１１個のガンマカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基を含有することが決定された。ＦＸａバリアントの軽鎖内のＧｌａ残基の数の相対頻度は、試験した精製ＦＸａバリアントタンパク質の７つの調製物の間で一貫性を示した。特に、ピークの相対的な分布に基づくと、９つのＧｌａ残基の出現頻度は、１０％〜１７％（平均＝１２．１％、ＳＤ＝２．５％）の範囲に及び、１０個のＧｌａ残基の出現頻度は、４１％〜４６％（平均＝４３．０％、ＳＤ＝１．８％）の範囲に及び、１１個のＧｌａ残基の出現頻度は、３６％〜４６％（平均＝４２．１％、ＳＤ＝３．３％）の範囲に及んだ。
【０１３２】
精製した１０および１１個のＧｌａのアイソフォームは、ＡＰＴＴに基づく凝固アッセイにおいて等しい活性を示し、一方、９つのＧｌａのアイソフォームは、活性の低下を示した（質量について正規化した場合、１０および１１個のＧｌａのアイソフォームの活性のおよそ２０％）。
【０１３３】
軽鎖のその他の翻訳後修飾も検出された。特に、ペプチドＬ８の質量は、６３位においてベータ−ヒドロキシル化アスパラギン酸残基が存在する場合（Ａｓｐ６３）（配列番号１）と一致することが観察された。さらに、ペプチドＬ１０には、質量に差があることも観察され、このことは、Ｏ−結合型ヘキソースの付加を示している。
【０１３４】
重鎖もまた、Ｏ−結合型グリコシル化を受けやすい。ペプチドマップ中、重鎖のアルファアイソフォームのＣ末端の多量の形態は、アミノ酸Ｌ３９８で終わることが観察され、Ｃ末端の少量の形態は、アミノ酸Ｋ３９９で終わることが観察された。これらのペプチドの両方が、１または２つの二シアル化コア１型Ｏ−グリカンを含有することが観察され、両方のペプチドの優勢の種は、１つの二シアル化コア１型Ｏ−グリカンを含有していた。ペプチドマップのプロファイルにおいて、「Ｈ２０３」の印が付いているピークは、Ｌ３９８で終わるＨ２０ペプチドに対応し、「Ｈ２０２」の印が付いているピークは、Ｋ３９９で終わるＨ２０ペプチドに対応し、それぞれが、１つのＯ−結合型グリカンを含有する。「Ｈ２０１」の印が付いているピークは、Ｋ３９９で終わるＨ２０ペプチドに対応し、２つのＯ−結合型グリカンを含有する。２つのＯ−結合型グリカンを有する、Ｌ３９８で終わるＨ２０ペプチドを微量レベルで検出し、図２中、これには印が付いていない。ベータ脱離、続いて、ＭＳ断片化を行うと、Ｈ２０中のＯ−グリカンは、Ｔｈｒ３９４およびＳｅｒ３９５に局在していた。
【０１３５】
（実施例４）
高速液体クロマトグラフィーにより決定した構造的不均一性
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して、インタクトな精製ＦＸａバリアントタンパク質の１つの調製物中で構造的不均一性を測定した。精製タンパク質を、逆相カラム上に注入し、酸性化アセトニトリルの勾配を用いて溶出した。ＦＸａバリアントは、重鎖のＣ末端において構造的不均一性を含有し、２つの多量の構造上のアイソフォーム、すなわち、アルファ（Ｌｙｓ３９９で終止する）およびベータ（Ｌｙｓ３８６で終止する）を生じさせ、このことは、ペプチドマッピング分析から得られた観察結果と一致した。Ｌｙｓ２８１またはＡｒｇ２８３後の重鎖のクリッピングに起因して、ガンマと呼ばれている追加の少量のアイソフォームが観察された。これらの実験から得られたＨＰＬＣクロマトグラムを、図３に示す。
【０１３６】
多量の構造上のアイソフォームの相対頻度は、試験した精製ＦＸａバリアントタンパク質の７つの調製物の間で一貫性を示した。特に、ピークの相対的な分布に基づくと、アルファアイソフォームの出現頻度は、５４％〜７４％（平均＝６６．９％、ＳＤ＝７．０％）の範囲に及び、ベータアイソフォームの出現頻度は、２４％〜４２％（平均＝３１．４％、ＳＤ＝６．５％）の範囲に及び、ガンマアイソフォームの出現頻度は、１％〜３％（平均＝２．０％、ＳＤ＝０．８％）の範囲に及んだ。
【０１３７】
アルファアイソフォームおよびベータアイソフォームを、分子ふるいＨＰＬＣを使用して精製し、標準的なＡＰＴＴに基づく凝固アッセイにおいて活性について試験した。ベータアイソフォームは、（１００％として正規化した）アルファアイソフォームと比較して若干より低い活性（７９％）を示した。少量のガンマの種の活性は、試験しなかった。
【０１３８】
（実施例５）
質量分析により決定したインタクトなタンパク質の構造的不均一性
精製タンパク質の１つの調製物に由来するインタクトなＦＸａバリアントの分子質量（Ｍｒ）を、ＲＰ−ＨＰＬＣ、続いて、高解像度ハイブリッド四重極飛行時間質量解析装置を使用する質量分析（ＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ）により分析した。Ｍｒ値を、Ｗａｔｅｒｓ  ＭａｘＥｎｔ−１ソフトウエアを用いて、多重荷電データのデコンボリューション後のゼロ電荷の質量スペクトルから決定した。多量および少量の種の、理論的な質量の値と観察された質量の値との間の相対誤差は全て、±６０ｐｐｍの範囲内であり、これは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｑ−ＴｏＦ質量分光計の性能規格と一致する。ＨＰＬＣクロマトグラムを、図４に示す。インタクトなＦＸａバリアントタンパク質の質量スペクトルを、図５に示し、質量スペクトルに基づくピークの帰属を、下記の表２に列挙する。アミノ酸の番号付けは、図１Ａ（配列番号１）に基づく。１ＡＮＳ．．．ＬＥＲ１３９は、配列番号６に対応し；１ＡＮＳ．．．ＥＲＲ１４０は、配列番号７に対応し；１ＡＮＳ．．．ＲＲＫ１４１は、配列番号９に対応し；１ＡＮＳ．．．ＲＫＲ１４２は、配列番号１１に対応し；１ＡＮＳ．．．ＫＲＲ１４３は、配列番号１２に対応し；１４６ＬＶＧ．．．ＬＰＫ３８４は、配列番号４５に対応し；１４６ＬＶＧ．．．ＫＡＫ３８６は、配列番号４６に対応し；１４６ＬＶＧ．．．ＳＰＬ３９８は、配列番号１４に対応し；１４６ＬＶＧ．．．ＰＬＫ３９９は、配列番号３に対応する。
【０１３９】
【表２−１】
0006429885.tif 000005
【０１４０】
【表２−２】
0006429885.tif 000006
【０１４１】
ＨＰＬＣはここでも、ＦＸａバリアントタンパク質の構造的不均一性を示している（図４）。Ａの印が付いているピークは、ガンマ種に対応する。Ｂの印が付いているピークは、２つのＯ−グリカンを含むアルファ型のタンパク質に対応する。Ｃの印が付いているピークは、１つのＯ−グリカンを含むアルファ型のタンパク質に対応する。Ｄの印が付いているピークは、ベータ型のタンパク質に対応し、この場合、重鎖は、Ｋ３８６で終止する。Ｅの印が付いているピークは、ベータ型のタンパク質に対応し、この場合、重鎖は、Ｋ３８４で終止する。
【０１４２】
３つの領域が、質量スペクトル中に観察された（図５）。第１の領域が、質量スペクトルのより低い端（左）にあり、重鎖のベータアイソフォームを含有するインタクトなＦＸａバリアントタンパク質に対応する。この領域はまた、いわゆる多量の種を含有し、これらは、相対ピーク強度に基づくと、その他と比較してより大きな存在率で発生する。多量の種は、Ｋ３８６で終止するベータ型の重鎖を含有するものを含み、この場合、ＰＡＣＥ切断部位における多様な切断に明らかに起因して、軽鎖のカルボキシ末端の残基は、Ｒ１３９、Ｒ１４０またはＫ１４１であった。同様に多様な切断に明らかに起因して、軽鎖がＲ１４２で終止する種もまた、少量の種として存在した。これらの多量および少量の種の間では、軽鎖は、β−ヒドロキシＡｓｐ６３およびＯ−結合型ヘキソース、ならびに１０または１１個のＧｌａ残基を含んだ。
【０１４３】
より大きな質量の２つの領域もまた、質量スペクトル中に出現し、これらの両方が、重鎖のアルファアイソフォーム（Ｌ３９８またはＫ３９９で終止する）を含有するインタクトなＦＸａバリアントタンパク質の少量の種に対応する。そのような種の１つの群は、単一のＯ−グリカンをさらに含み、第２の群は、２つのＯ−グリカンの翻訳後修飾をさらに含む（それぞれ、図５中、中央および右）。
【０１４４】
図５中に明示した帰属は、インタクトなＦＸａバリアントタンパク質の種に対応し、これらの場合、軽鎖は、１０個のＧｌａ残基、β−ヒドロキシＡｓｐ６３、およびＯ−結合型グルコースを含有していた。「＊」の印が付いている、スペクトル中の隣接するピークは、１１個のＧｌａ残基を含有する種を示し、これら、質量が、４４．０Ｄａだけ増加する。
【０１４５】
表２に、上記の、質量スペクトルから同定された多量の種および少量の種、ならびに質量スペクトルのデータから同定された多数のその他の少量の種および微量の種を列挙する。表２では、表中の類似の等重（ｉｓｏｂａｒｉｃ）なアイソフォームと区別することができなかった、同じＭｒ値を観察した種には、「＊」を付した。異なる種の見かけの存在量を、質量スペクトルのデータから得られた相対ピーク強度に基づいて、多量、少量および微量とした。「Ｏ−グリカン」の見出しを有する列に、表中の同定された種々のＦＸａバリアントタンパク質の種の、重鎖のグリコシル化の状況を列挙する。本明細書の他の箇所で論述したように、軽鎖は、Ｏ−結合型ヘキソースを含有する。表中、「０」は、重鎖中にＯ−結合型グリカンが存在しないことを示し；「１＋１ＮｅｕＡｃ」は、１つのコア１型一シアル化Ｏ−グリカンが存在することを示し；「１＋１ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ」は、１つのコア１型一シアル酸化Ｏ−グリカンが存在し、末端ガラクトース（Ｇａｌ）は存在しないことを示し；「１＋２ＮｅｕＡｃ」は、１つのコア１型二シアル化Ｏ−グリカンが存在することを示し；「２＋２ＮｅｕＡｃ」は、２つのコア１型Ｏ−グリカンが存在し、これらのうち、１つが二シアル化されているか、または両方が一シアル化されていることを示し；「２＋３ＮｅｕＡｃ」は、２つのコア１型Ｏ−グリカンが存在し、これらのうち、一方が一シアル化されており、他方が二シアル化されていることを示し；「２＋４ＮｅｕＡｃ」は、２つのコア１型Ｏ−グリカンが存在し、これらのそれぞれが二シアル化されていることを示す。
【０１４６】
（実施例６）
還元し、アルキル化したタンパク質の、質量分析により決定した構造的不均一性
上記の分析結果を確認するために、精製したインタクトなＦＸａバリアントタンパク質を還元し、アルキル化して、鎖間および鎖内のジスルフィド結合を排除した。次いで、分離された軽鎖および重鎖を、ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳにより分析して、それらのアミノ酸の構造および翻訳後修飾を決定した。
【０１４７】
ＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示し、図中、軽鎖および重鎖を明示する。重鎖のアルファアイソフォームおよびベータアイソフォームが、複数のクロマトグラフィーのピークとして溶出する。微量レベルのガンマ種（アミノ酸Ｋ２８１またはＲ２８３の後でトランケートされているベータ重鎖）が、クロマトグラム中で、およそ４８〜５０分において重鎖の直前に溶出するのが観察された。
【０１４８】
軽鎖のゼロ電荷の質量スペクトルを図７Ａに示し、スペクトルから同定された種を、それらの相対的な存在量を多量、少量または微量として含めて、下記の表３に列挙する。アミノ酸の番号付けは、図１Ａ（配列番号１）に基づく。１ＡＮＳ．．．ＬＥＲ１３９は、配列番号６に対応し；１ＡＮＳ．．．ＥＲＲ１４０は、配列番号７に対応し；１ＡＮＳ．．．ＲＲＫ１４１は、配列番号９に対応し；１ＡＮＳ．．．ＲＫＲ１４２は、配列番号１１に対応し；１ＡＮＳ．．．ＫＲＲ１４３は、配列番号１２に対応する。
【０１４９】
【表３】
0006429885.tif 000007
【０１５０】
インタクトなＦＸａバリアントタンパク質に関して見られたのと同様に、全て軽鎖の種がＡｓｐ６３のβ−ヒドロキシル化およびＯ−結合型ヘキソースを含むことが観察された。しかし、Ｇｌａドメイン中のグルタミン酸のカルボキシル化、およびＰＡＣＥによる切断は多様であり、９、１０または１１個のＧｌａ残基およびＰＡＣＥ部位における不規則な切断により生成されたカルボキシ末端の不均一性を有する軽鎖の種が生じた。
【０１５１】
重鎖のゼロ電荷の質量スペクトルを図７Ｂに示し、スペクトルから同定された種々の種を、それらの相対的な存在量を多量、少量または微量として含めて、下記の表４に列挙する。アミノ酸の番号付けは、図１Ａ（配列番号１）に基づく。１４６ＬＶＧ．．．ＬＰＫ３８４は、配列番号４５に対応し；１４６ＬＶＧ．．．ＫＡＫ３８６は、配列番号４６に対応し；１４６ＬＶＧ．．．ＳＰＬ３９８は、配列番号１４に対応し；１４６ＬＶＧ．．．ＰＬＫ３９９は、配列番号３に対応する。
【０１５２】
【表４】
0006429885.tif 000008
【０１５３】
質量スペクトル中、重鎖は、ベータアイソフォームおよびアルファアイソフォームに対応する３つの優勢な領域として観察された。最も豊富に存在する重鎖アイソフォームの観察されたＭｒ（２７６８３．９Ｄａ）は、９つのシステイン残基全てがアルキル化されている、重鎖のベータアイソフォームの理論的な質量（２７６８４．３Ｄａ；１４６ＬＶＧ．．．ＫＡＫ３８６）と十分に匹敵する。追加の質量の不均一性は、アルファアイソフォームのカルボキシ末端の残基およびＯ−グリコシル化の変動に起因した。具体的には、特定のピークは、Ｌ３９８またはＫ３９９で終止するアルファアイソフォームに対応し、一方、その他のピークは、多様に非シアル化、一シアル化または二シアル化されているコア１型Ｏ−グリカンを１または２つ有する重鎖に対応した。図７Ｂ中、「＊」の存在は、重鎖の過剰アルキル化を示し、これは、ＦＸａバリアントタンパク質のペプチドマッピングにより観察されたピークと一致する（実施例３を参照されたい）。
【０１５４】
還元およびアルキル化の後に軽鎖および重鎖中に観察された構造的不均一性は、インタクトなＦＸａバリアントタンパク質を使用して観察された結果と一致する。
【０１５５】
ＰＡＷＳソフトウエア（２０００．０６．０８、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて、理論的な質量を計算した。観察された質量は、Ｗａｔｅｒｓ  ＭａｘＥｎｔ−１ソフトウエアを用いて、多重荷電データのデコンボリューション後のゼロ電荷の質量スペクトルから決定した。多量および少量の種の、理論的な質量の値と観察された質量の値との間の相対誤差は全て、６０ｐｐｍ未満であり、これは、インタクトな糖タンパク質の分析についてのＷａｔｅｒｓ  Ｑ−ＴｏＦ質量分光計の性能規格と一致する。多量、少量および微量の種の帰属は、それぞれのピーク強度に基づき、これらは、アイソフォームの存在量と相関する。
【０１５６】
（実施例７）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固アッセイ
ＦＸａバリアントタンパク質の７つの異なる調製物の凝固活性を、第ＶＩＩＩ因子欠損ヒト血漿を基質として使用する一段階の凝固アッセイ（ＡＰＴＴアッセイ）を使用して決定した。凝固活性（ｍｇ／ｍｌ）をタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）で割ることによって、比活性を決定した。平均凝固活性は調製物全体で１．５２ｍｇ／ｍｌであり、標準偏差は０．０９であった。平均比活性は１０１．３％であり、標準偏差は５．９であった。
【０１５７】
本開示は、本明細書に記載する特定の実施形態により、範囲を限定するものではない。実際に、本明細書に記載するものに加えて、本開示の種々の改変形態が、上記の記載および添付する図から当業者に明らかになるであろう。そのような改変形態は、添付の特許請求の範囲に属するものとする。
【０１５８】
特許出願、特許および技術的刊行物を含めた、種々の参考文献を、本明細書に引用する。本明細書においては、それぞれのそのような参考文献の開示が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【配列表】
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