(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシスシグナル伝達感受性細胞のアポトーシスによる、アポトーシスシグナル伝達抵抗性である、幹細胞、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に非感受性の免疫細胞、前駆細胞、またはそれらの組合わせの選択用の装置であって、
生体適合材料からなる容器と、表面に固定化された生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドとを含み、
前記アポトーシス誘導リガンドが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、Ｔｒａｉｌ、またはＴｗｅａｋからなる群から選択される単一の剤である、
装置。
【請求項２】
前記表面が前記容器の内表面、または前記表面が前記容器内に存在するビーズの表面である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記生体適合材料が、ポリプロピレン、ポリスチレン、シリコーン、ポリ塩化ビニルまたはその組合せを含む群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
細胞集団からアポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、前記細胞集団がアポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞とアポトーシスシグナル伝達感受性細胞とを含み、
（ａ）細胞集団を含む試料を、生体適合材料からなる容器と、表面に固定化された生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドとを含み、前記アポトーシス誘導リガンドが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、Ｔｒａｉｌ、またはＴｗｅａｋからなる群から選択される単一の剤である装置内に導入する段階と、
（ｂ）前記装置内で前記細胞をインキュベートする段階と
からなることによって、
細胞集団からアポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞を選択する方法であって、
前記アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞が、幹細胞、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に非感受性の免疫細胞、前駆細胞またはその組み合わせである、
方法。
【請求項５】
（ａ）生体適合材料からなる容器と、表面に固定化された生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドとを含み、前記アポトーシス誘導リガンドが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、Ｔｒａｉｌ、またはＴｗｅａｋからなる群から選択される単一の剤である細胞選択装置と、
（ｂ）前記装置内のアポトーシス誘導リガンドの完全性および活性を維持する溶液と
を含む、幹細胞、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に非感受性の免疫細胞、前駆細胞またはその組み合わせを選択するためのキット。
【請求項６】
追加のアポトーシス誘導リガンドをさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）移植の臨床転帰を改善するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ）幹／前駆細胞を含む細胞集団を含む試料を準備する段階と、
（ｂ）前記細胞集団とＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）とを１〜２４時間接触させる段階と、または前記細胞集団と腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）とを２４〜４８時間接触させる段階と、
（ｃ）段階（ｂ）の細胞を回収する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）の細胞を移植する段階と
を含むことによって、
造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）移植の臨床転帰を改善し、
生体適合材料からなる容器と、表面に固定化された生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドとを含み、前記アポトーシス誘導リガンドが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、Ｔｒａｉｌ、またはＴｗｅａｋからなる群から選択される単一の剤である装置を用いて段階（ｂ）を実施する、
方法。
【請求項８】
前駆細胞移植片を含む組成物中の悪性細胞を排除するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ）前駆細胞移植片を含む組成物を準備する段階と、
（ｂ）前記組成物とアポトーシス誘導リガンドとを約２４時間接触させる段階と
を含むことによって、
前駆細胞移植片を含む組成物中の悪性細胞を排除し、
生体適合材料からなる容器と、表面に固定化された生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドとを含み、前記アポトーシス誘導リガンドが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、Ｔｒａｉｌ、またはＴｗｅａｋからなる群から選択される単一の剤である装置を用いて段階（ｂ）を実施する、
方法。
【請求項９】
移植片対腫瘍（ＧｖＴ）活性を保持しながら移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ）ＨＳＰＣと免疫細胞とを含む細胞集団を含む試料を準備する段階と、
（ｂ）前記細胞集団とアポトーシス誘導リガンドとを２〜１６時間接触させる段階と、
（ｃ）段階（ｂ）の細胞を回収する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）の細胞を移植する段階と
を含むことによって、
移植片対腫瘍（ＧｖＴ）活性を保持しながら移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防し、
生体適合材料からなる容器と、表面に固定化された生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドとを含み、前記アポトーシス誘導リガンドが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、Ｔｒａｉｌ、またはＴｗｅａｋからなる群から選択される単一の剤である装置を用いて段階（ｂ）を実施する、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医療装置の分野に関するものであり、より具体的にはアポトーシスシグナル伝達に抵抗性の細胞を選択することを目的とする装置、その装置の使用方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞とは、分裂して多様な特殊化した細胞型に分化し、かつ自己複製してさらに幹細胞を作ることができる細胞のことである。哺乳動物では、幹細胞は胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚性幹細胞または種々の組織にみられる成体幹細胞のいずれかとしてみられる。成体生物では、幹細胞および前駆細胞が体の修復系の役割を果たし、成体組織を補充する。
【０００３】
外科的介入または生理活性を調節する薬物に依存する現在のいずれの治療法とも異なり、幹細胞は機能不全に陥った組織や変性した組織を置き換えるものである。したがって、置換療法に幹細胞を使用すれば、現時点では治療できない多くの疾患の予後を劇的に変化させ、損傷器官の機能を回復させ、先天性の代謝障害および欠損を治療することができるであろう。成体および／または胚誘導の両方の幹細胞増幅に関連する技術の重要性は、様々な疾患の治療に幹細胞が前臨床的および臨床的に多用されていることによって説明される。
【０００４】
近年の進歩により、造血区画内にある造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）および間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を含めた数種類の幹細胞には免疫−造血系以外の細胞型に分化する能力があることが示されており、多岐にわたる変性障害、末端器官不全および機能障害の組織修復および再生にこのような細胞型を使用したり、場合によっては臓器移植を細胞療法で代替したりする機会が生まれている。
【０００５】
幹細胞の主な臨床使用例のひとつが造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を用いるものである。この方法では、レシピエントの免疫および造血系を再構築する目的でドナー由来の多数の細胞をレシピエントに移植する。このような移植を実施するなかで、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫など多数の化学療法耐性癌および多数の固形腫瘍の治療には免疫の再構築が実際最も優れた治療法であることがわかった。腫瘍学で使用する以外にも、ＨＳＣＴによって自己免疫疾患（例えば、１型糖尿病、ＳＬＥおよびクローン病）、先天性の代謝障害および酵素欠損、異常ヘモグロビン症または先天性および後天性免疫不全などの非悪性障害を治療できる可能性が秘められている。ＨＳＣＴは癌以外の適応症にも使用されており、有意に良好な結果が示されている。それにもかかわらず、この方法には移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が最も重篤とされる重度の毒性作用があるため、現時点では生命にかかわる病態に用いられている。
【０００６】
この方法を癌治療に用いる場合、移植片拒絶反応を予防するため、攻撃的な放射線化学療法で免疫−造血系を根絶することによる骨髄破壊的移植前治療の後にこの方法を実施することが最も多かった。近年では、移植前に宿主の免疫−造血系を根絶する必要はないという認識が大幅に進んだため、骨髄破壊的移植前治療が非骨髄破壊的移植前治療および強度軽減移植前治療（ＲＩＣ）に置き換えられている。非骨髄破壊的移植前治療を使用することにより、生命にかかわる器機能不全、生着不全および難治性感染症によって引き起こされる致命的な状況がまだ十分とは言えないが、大幅に改善されている。宿主の造血系がＲＩＣによって根絶されないことから、ドナー細胞が生着できない場合に宿主の造血系が回復することが可能である。時間の経過とともにドナー移植片が優勢になってくると、移植片対腫瘍（ＧｖＴ）および移植片対自己免疫（ＧｖＡ）反応の発生を促進する過程により、患者はまた別にＧｖＨＤによる重篤な発病および死亡の可能性にさらされる。
【０００７】
１型膜貫通タンパク質／接着分子、シアロムチンＣＤ３４が造血幹細胞のマーカーとして同定されたことにより、移植目的で造血幹細胞を濃縮する手段としてＣＤ３４＋細胞選択を用いることができるようになった。ＣＤ３４マーカーは一部の幹細胞には存在せず、なおかつ種々のサブタイプの血液前駆細胞体にもみられる。このようなポジティブ選択法を用いると有益な幹細胞が一部失われる。さらに、この方法では、幹細胞と一部後期前駆細胞になった前駆細胞とが混ざり合った細胞集団が得られる。このような混合細胞集団を移植すると移植成功率が低くなる［Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００６；１：８５−９４］。したがって、造血系再構築に必要な細胞をすべて保持するとともに有害作用を引き起こす細胞を廃棄する選択方法が必要とされるようになった。体細胞とは異なり、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、間葉系間質細胞および神経前駆細胞（ＮＰ）は損傷因子、例えば放射線化学療法および常在する造血細胞の大量死によって骨髄腔内に放出される二次因子の両方によってもたらされる損傷因子などに対して非感受性であることが報告されている。ＨＳＰＣは特に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリー受容体によって伝達され最も初期の前駆細胞では増殖シグナルを伝えるのに利用されるアポトーシスシグナルに対して抵抗性である。マウスモデルでは、損傷およびストレス条件下で造血前駆細胞が数種類のＴＮＦファミリー受容体を急激にアップレギュレートすることが示されている。移植状況下では、この生理学的機序がアポトーシス感受性のドナー細胞よりも初期の前駆細胞の生着を優先させる。したがって、ＦａｓＬ、Ｔｒａｉｌ、ＴｗｅａｋまたはＴＮＦ−αなどのＴＮＦファミリーアポトーシス誘導リガンドに移植集団を曝露すると、ＴＮＦ−ファミリーリガンドが誘導するアポトーシスに感受性の細胞集団がアポトーシスを経て移植集団から除去されるため、幹細胞集団がネガティブ選択される。マウスでのこのような方法の使用は特許出願、国際公開第２００７／１３８５９７号に開示されている。
【０００８】
ドナー移植片の組成は幹細胞移植の重要なパラメータである。確実に生着させるためには、ある閾値数の前駆細胞が必要であることが示されている。さらに、非幹細胞のサブセットがいくつか存在すると生着率が実質的に向上するため、純化した前駆細胞を移植するよりも不均一な細胞混合物を移植する方が効果的である。ドナー移植片の中で最も重要なサブセットは（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）Ｔ細胞であり、それはこのサブセットが拒絶反応を打ち消し骨髄微小環境内での造血前駆細胞生着を補助することが示されているからである。しかし、免疫が一部抑制されたレシピエントへの同種異系Ｔ細胞の移植は恒久的な生着を補助するものの、致命的となり得る移植片対宿主反応（ＧｖＨ）または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を仲介する。成熟ドナーＴ細胞がこの反応を仲介するのに対して、移植後にｄｅ  ｎｏｖｏ発生するドナーＴ細胞は宿主に対して寛容性を示す。ＧｖＨを仲介するＴ細胞サブセットと生着を補助するＴ細胞サブセットとを分離するのに多大な労力がつぎ込まれてきたが、実験的な証拠はこれまでのところ、決定的なものではない。
【０００９】
移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）には移植後通常１００日以内にみられる急性期反応およびこれより進行が緩慢であるが同様に有害な結果をもたらす慢性反応が含まれる。両反応とも、移植後数日以内に成熟ドナーＴ細胞が仲介する初期の炎症によって引き起こされるということが重要である。急性ＧｖＨＤは通常、造血系再構築に負の効果を及ぼす免疫抑制療法によって治療されるが、慢性反応には現時点で効果的な治療法はない。ＧｖＨＤを予防するための従来の方法は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などの細胞表面マーカーを用いて、ドナー接種材料から成熟Ｔ細胞を時にはＢリンパ球とともに除去することからなる。細胞表面マーカーを用いてより選択性の高いＴ細胞除去（ＴＣＤ）を達成しようと試みる多大な努力は失敗に終わっている。
【００１０】
宿主抗原に対するｅｘ  ｖｉｖｏ感作後にアポトーシスシグナルを用いて反応性Ｔ細胞サブセットを排除することによって、より特異的な除去が妥当な結果で達成されている。感作Ｔ細胞は活性化に関連する分子のレパートリーを発現し、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に対して感受性になり、速い速度で増殖するという特異的除去に用いられる特徴を示す。しかし、選択的な除去のためのこの方法には大きな困難がいくつかある。第一に、Ｔ細胞の感作は抗原への曝露を繰り返す工程であり、３〜７日間のｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーションを必要とする。したがって、移植の少なくとも３日前にＴ細胞の活性化を実施しなければならない。第二に、感作および活性化によって周期の速いＴ細胞がＡＩＣＤに対して感受性になるが、同時にエフェクター／記憶Ｔ細胞の発生および増幅が誘導され、これらの細胞の持続的な同種異系反応性がＧｖＨＤを惹起し伝播させ得る。エフェクター／記憶Ｔ細胞は、本来カスパーゼ３が低レベルであることをひとつの理由に、Ｆａｓ架橋に対して比較的抵抗性があり、培養したＴ細胞を注入後に患者に急性および慢性ＧｖＨＤが発生しやすいアポトーシス抵抗性の表現型を生じる。第三に、最も効果的なｅｘ  ｖｉｖｏ感作は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の構成要素に対するものであり、その不一致は移植状況下で優性の同種異系反応を生じさせる。しかし、ＧｖＨＤ反応は主として副組織適合複合体抗原（ｍｉＨＡ）によって刺激され、主に組織特異抗原（ＴＳＡ）を標的とするものである。移植前治療および炎症によって生じる損傷により、正常な組織エピトープおよび異常な組織エピトープが明らかになる。ＧｖＨＤを誘発するＴ細胞を選択的に除去すると同時にＧｖＴおよび移植片生着を補助する細胞のサブセットを保持するのに効果的な方法は未だ見出されていない。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、受容体仲介性アポトーシスに抵抗性の細胞の選択に適した装置およびキットならびにその装置およびキットの使用方法を開示する。この装置は、装置内に導入された不均一な細胞集団から移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を誘発する成熟免疫細胞をネガティブ選択することを可能にするものである。この装置は、市販品による簡便で安価な設定で効率的な細胞選択、すなわち現時点で存在しない解決方法を可能にするものである。本発明はさらに、この装置の使用を開示する。
【００１２】
一態様では、本発明は生体適合材料で作られた容器と、表面に固定化された生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドとを含み、細胞選択に適した装置を開示する。
【００１３】
一実施形態では、生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドが固定化される表面は容器の内表面である。
【００１４】
別の実施形態では、生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドが固定化される表面は、容器内に存在するビーズの表面である。
【００１５】
別の実施形態では、容器はバッグ、カラム、チューブ、ボトル、バイアルおよびフラスコを含む群から選択される。
【００１６】
また別の実施形態では、装置を構成する生体適合材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、シリコーン、ポリ塩化ビニルまたはその組合せを含む群から選択される。
【００１７】
また別の実施形態では、固定化されたアポトーシス誘導リガンドは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、Ｔｒａｉｌ、Ｔｗｅａｋまたはその任意の組合せを含む群から選択される。
【００１８】
別の態様では、本発明は不均一な細胞集団からアポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞を選択する方法を開示し、不均一な細胞集団はアポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞とアポトーシスシグナル伝達感受性細胞とを含む。この方法は、不均一な細胞集団を含む試料を本発明の装置内に導入することと、装置内で細胞をインキュベートし、細胞集団からアポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞を選択することとからなる。
【００１９】
別の実施形態では、選択されるアポトーシス抵抗性細胞は、臍帯血幹細胞、動員末梢血幹細胞、骨髄幹細胞、癌幹細胞および神経幹細胞を含む群から選択される幹細胞である。
【００２０】
別の実施形態では、選択されるアポトーシス抵抗性細胞は、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に非感受性の免疫細胞である。また別の実施形態では、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に非感受性の免疫細胞はＴ細胞である。
【００２１】
別の実施形態では、選択されるアポトーシス抵抗性細胞は前駆細胞である。
【００２２】
また別の実施形態では、この方法に使用する細胞集団は骨髄、前駆細胞動員末梢血または臍帯血（ＵＣＢ）に由来するものである。
【００２３】
また別の実施形態では、装置内でのインキュベーション時間は２時間〜７２時間である。
【００２４】
また別の態様では、本発明は、本発明の装置と装置内のアポトーシス誘導リガンドの完全性および活性を維持する溶液とを含む、細胞選択キットを開示する。いくつかの実施形態では、キットは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、Ｔｒａｉｌ、Ｔｗｅａｋまたはその任意の組合せからなる群から選択されるアポトーシス誘導リガンドをさらに含む。
【００２５】
別の実施形態では、アポトーシス誘導リガンドの完全性および活性を維持する溶液は緩衝液または培地である。
【００２６】
また別の態様では、本発明は上記装置および方法の使用方法を開示する。この方法は造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）移植の臨床転帰を改善する方法である。この方法では、細胞集団を含む試料を準備し、この細胞集団は幹／前駆細胞を含む。この集団とアポトーシス誘導リガンドとを接触させ、残った細胞を回収し移植に使用する。さらなる実施形態では、本発明の装置内で接触を実施する。
【００２７】
別の実施形態では、この方法の細胞集団は骨髄、前駆細胞動員末梢血または臍帯血（ＵＣＢ）に由来するものである。
【００２８】
別の実施形態では、この方法を用いて選択される幹細胞は、臍帯血幹細胞、動員末梢血幹細胞、骨髄幹細胞、癌幹細胞および神経幹細胞を含む群から選択されるものである。
【００２９】
別の実施形態では、細胞の集団をＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）とともに２１〜２４時間、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）とともに２４〜４８時間インキュベートする。
【００３０】
別の実施形態では、この方法により回収された細胞を自己移植片、同種異系移植片またはハプロタイプ一致移植片のいずれかに使用する。
【００３１】
別の実施形態では、この方法で回収した細胞は、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に非感受性の免疫細胞をさらに含む。また別の実施形態では、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に非ヒト感受性の免疫細胞はＴ細胞である。
【００３２】
また別の態様では、本発明は、上記装置および方法の別の使用方法を開示する。この方法は、前駆細胞移植片を含む組成物中の悪性細胞を排除する方法である。この方法では、前駆細胞移植片を含む組成物を準備し、次いでアポトーシス誘導リガンドと接触させる。さらなる実施形態では、本発明の装置内で接触を実施する。
【００３３】
別の実施形態では、組成物とアポトーシス誘導リガンドのＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）とを約２４時間接触させる。
【００３４】
別の実施形態では、前駆細胞移植片を自己移植片として使用する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、上記装置および方法のまた別の使用方法を開示する。この方法は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防すると同時に移植片対腫瘍（ＧｖＴ）活性を保持する方法である。この方法では、細胞集団を含む試料を準備し、細胞集団はＨＳＰＣと免疫細胞とを含む。この集団とアポトーシス誘導リガンドとを接触させ、残った細胞を回収し移植に使用する。さらなる実施形態では、本発明の装置内で接触を実施する。
【００３６】
別の実施形態では、組成物とアポトーシス誘導リガンドのＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）とを２〜１６時間接触させる。
【００３７】
以下に記載する詳細な説明および図面から、さらなる実施形態、特徴、利点および本発明の適用性な全範囲が明らかになるであろう。しかし、詳細な説明は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、当業者には本発明の趣旨および範囲内にある種々の変更および改変がこの詳細な説明から明らかになることから、これが単なる例示を目的として記載されるものであることに留意するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏの受容体仲介性アポトーシスに対するＵＣＢ細胞の感受性を示す一連のグラフである。（Ａ）ケモカインを添加しない培地で新鮮なＵＣＢ細胞の試料を様々な時間インキュベートし（ｎ＝３５）、ＦａｓＬオリゴマー５０ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝２１）およびＴＮＦ−アルファ２０ｎｇｍｌ（ｎ＝１８）に曝露した。単核細胞（ＭＮＣ）およびゲートをかけたＣＤ３４＋前駆細胞のアネキシンＶ取込みからアポトーシスを決定した。（Ｂ）新鮮なＵＣＢ単核細胞、ゲートをかけたＣＤ３４＋および単離系列陰性（ｌｉｎ−）前駆細胞におけるＦａｓ受容体およびＴＮＦ受容体の発現。（Ｃ）同族リガンドの影響下におけるＦａｓ受容体およびＴＮＦ受容体を発現するゲートをかけたＣＤ３４＋前駆細胞のアポトーシスを時間の関数として測定した（ｎ＝１５〜２１）。（Ｄ）同族リガンドとともにインキュベートしたＦａｓ受容体およびＴＮＦ受容体を発現するＭＮＣおよびゲートをかけたＣＤ３４＋前駆細胞の増殖速度（ｎ＝６）。ＭｏｄＦｉｔソフトウェアを用いてＣＦＳＥ希釈から増殖を測定した。（Ｅ）新鮮なＵＣＢ試料のＴ細胞（ＣＤ３＋）、Ｂリンパ球（ＣＤ１９＋）および骨髄細胞（ＣＤ３３＋）におけるＦａｓ受容体およびＴＮＦ受容体の発現（ｎ＝８〜１３）。（Ｆ）ＦａｓＬおよびＴＮＦ−□に４８時間曝露した単球／マクロファージ（ＣＤ１４＋）を含む系列陽性ＵＣＢサブセットのアネキシンＶから決定されたアポトーシス（ｎ＝６〜１４）。
【図２】図２Ａはスキームであり、図２Ｂ〜２ＧはＵＣＢ前駆細胞が受容体仲介性アポトーシスに抵抗性であることを示すグラフである。（Ａ）ＮＯＤ．ＣＩＤマウスを２用量の２５μｇ／ｇブスルファンで前処置し、２日後、異なる条件下でインキュベートした同数のＵＣＢ細胞を移植した。１２週間後、選択的ヒトおよびマウス抗ＣＤ４５抗体を用いて骨髄中のヒトキメリズムを測定した。（Ｂ）新鮮なＵＣＢ細胞および培地でのインキュベーション、ＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとのインキュベーションおよびＴＮＦ−α  ２０ｎｇ／ｍｌとのインキュベーションの２４時間後の同じＵＣＢ単位由来の細胞の生着。データは異なる７つのＵＣＢ試料の代表的なものである。（Ｃ）培地でのインキュベーション、ＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとのインキュベーションおよびＴＮＦ−α  ２０ｎｇ／ｍｌとのインキュベーションの４８時間後の同じＵＣＢ単位由来の細胞の生着（６つのＵＣＢ試料の代表的なもの）。（Ｄ）同じＵＣＢ単位由来の細胞を７２時間、培地でインキュベートしても、ＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとともにインキュベートしても、ＴＮＦ−α  ２０ｎｇ／ｍｌとともにインキュベートしても生着率が低下する（５つのＵＣＢ試料の代表的なもの）。（Ｅ）培地でのインキュベーション、ＦａｓＬとのインキュベーションおよびＴＮＦ−αとのインキュベーションの４８時間後の単核細胞（ＭＮＣ）、ゲートをかけたＣＤ３４＋および単離系列陰性ｌｉｎ−）前駆細胞の増殖速度（ｎ＝４〜７）。（Ｆ）ヨウ化プロピジウムの核内取込みから決定されたＧ０／Ｇ１細胞周期段階にある有糸分裂が静止したＵＣＢサブセットの割合（ｎ＝５〜８）。（Ｇ）ＵＣＢ細胞１０３個を間葉系間質細胞層で５週間平板培養し、次いで半固形メチルセルロース培養に移行した後に決定された長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）の頻度。全培養期間を通してＦａｓＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）が存在するようにし、１週間間隔で培地を半分交換することにより新しくした（ｎ＝８〜１３）。データは１つのＵＣＢ単位を培養条件間で比較したものを表す。
【図３】図３Ｂはスキームであり、図３Ａおよび３Ｃは、ＵＣＢ細胞をデスリガンドに曝露することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏの前駆細胞頻度およびｉｎ  ｖｉｖｏの脊髄分化が増大することを示すグラフである。（Ａ）新鮮なＵＣＢ細胞における系列マーカーの発現：前駆細胞（ＣＤ３４）、Ｔ細胞（ＣＤ３）、Ｂリンパ球（ＣＤ１９）および骨髄細胞（ＣＤ３３）。ＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌおよびＴＮＦ−α  ２０ｎｇ／ｍｌに曝露して２４時間および４８時間インキュベーションすると、生存細胞の組成が変化し、前駆細胞の割合の増加がみられる（ｎ＝１７〜３１）。（Ｂ）様々な時間インキュベーションした後、フィコール勾配での遠心分離によって死細胞を排除し、同数の生存細胞を半固形メヒルセルロース（ｍｅｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）培養で平板培養し、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で刺激した。１４日後、コロニー形成細胞の頻度（生存細胞１０３個当たりで表したＣＦＵ）を決定した。（Ｃ）新鮮なＵＣＢ試料（対照）および培地でのインキュベーションインキュベーション後、ＦａｓＬとのインキュベーション後およびＴＮＦ−αとのインキュベーション後の相対ＣＦＵ頻度（ｎ＝１２〜２７）。
【図４】図４Ａはスキームであり、図４Ｂ〜４ＤはデスリガンドのＵＣＢ細胞に対する複合効果を示すグラフである。（Ａ）ＴＮＦ−α  ２０ｎｇ／ｍｌとともに２４時間インキュベートすることによりＦａｓの発現を刺激した後、ＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとともに、またはＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌを添加せずに細胞をさらに２４時間インキュベートした。（Ｂ）種々のインキュベーション条件下における単核細胞（ＭＮＣ）およびゲートをかけたＣＤ３４＋前駆細胞のＦａｓ発現（ｎ＝６〜９）。（Ｃ）ＴＮＦ−αとともに４８時間インキュベートしＦａｓＬを添加した、およびＴＮＦ−αとともに４８時間インキュベートしＦａｓＬを添加しなかったＦａｓ陽性ＭＮＣ、ゲートをかけたＣＤ３４＋前駆細胞および単離系列陰性（ｌｉｎ−）前駆細胞のアポトーシス（ｎ＝５〜１２）。（Ｄ）フィコールでの遠心分離によって死細胞を排除後、種々のインキュベーション後のバルク細胞懸濁液のＣＦＵ頻度が増加している（ｎ＝７〜１５）。
【図５】図５Ｃはスキームであり、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｄは、デスリガンドがＵＣＢ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増幅時の前駆細胞頻度を増加させることを示すグラフである。（Ａ）免疫磁気分離法によりＣＤ３４＋前駆細胞を単離し、臨床的に認められているプロトコルの下、液体培養で３週間増幅させた。増幅時に新鮮なＵＣＢ試料に比べてＣＤ３４＋前駆細胞の割合が増加し、培養の第３週および最終週にＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌを添加することによってさらに増加した（ｎ＝４）。（Ｂ）総細胞数１０３個に正規化した、３週間の増幅後の培養物中のＣＤ３４＋細胞の絶対数。（Ｃ）２用量の２５μｇ／ｇブスルファンで前処理したＮＯＤ．ＳＣＥＤマウス（Ｈ２Ｋｇ７）に同数の新鮮なＵＣＢ細胞および増幅ＵＣＢ細胞（同じ試料に由来）を移植した。（Ｄ）１２週間後、骨髄および脾臓におけるヒト造血キメリズムを決定した。データは、新鮮な細胞、培養最終週にＦａｓＬを添加した増幅前駆細および培養最終週にＦａｓＬを添加しなかった増幅前駆細を比較した６つ独立したＵＣＢ単位の代表的なものである。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、ｍＰＢ細胞の短時間培養時の細胞死受容の発現およびアポトーシス感度を示すグラフである。２〜７年間凍結保存したｍＰＢ試料を解凍し、過剰なＤＭＳＯを除去し、ＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌまたはＴＮＦ−α  ２９ｎｇ／ｍｌを添加して、あるいはいずれも添加せずに細胞を４時間あるいは１６時間インキュベートした。（Ａ）単核（ＭＮＣ）ｍＰＢ細胞およびゲートをかけたＣＤ３４＋前駆細胞におけるＦａｓ受容体およびＴＮＦ受容体の（ｎ＝７〜１１）。（Ｂ）系列陽性Ｔ細胞（ＣＤ３）、Ｂリンパ球（ＣＤ１９）および骨髄細胞におけるＦａｓ受容体およびＴＮＦ受容体発現の比較解析（ｎ＝７〜１１）。（Ｃ）全サブセットで１６時間の培養の間にＦａｓ発現が大幅に減少している（ｎ＝５〜９）。（Ｄ）Ｂリンパ球（ＣＤ１９）および骨髄細胞（ＣＤ３３）に培養時のＴＮＦ−Ｒ２のアップレギュレーションが最も顕著にみられた（ｎ＝７〜１１）。（Ｅ）解凍したｍＰＢ試料をＦａｓＬまたはＴＮＦ−αを添加して、あるいはいずれも添加せずに４時間あるいは１６時間インキュベートした（ｎ＝５〜１１）。アネキシンＶ取込みからアポトーシスを決定した。（Ｆ）解凍したｍＰＢにデスリガンドを添加して、または添加せずに４時間または１６時間インキュベートした後のゲートをかけたＣＤ３４＋前駆細胞とＣＤ３＋Ｔ細胞のアポトーシス率の比較。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、凍結保存した動員末梢血（ｍＰＢ）の移植においてデスリガンドがＧｖＨＤを予防することを示すグラフである。（Ａ）２用量の２５μｇ／ｇで前処置し、２日後、培地で４時間インキュベートしたｍＰＢ細胞、ＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとともに４時間インキュベートしたｍＰＢ細胞またはＴＮＦα  ２０ｎｇ／ｍｌとともに４時間インキュベートしたｍＰＢ細胞を１．５×１０７個移植したＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスの生存率（各グループｎ＝１０）。（Ｂ）ＦａｓＬとともにプレインキュベートした同じｍＰＢ試料（ｎ＝１０）またはＦａｓＬとともにプレインキュベートしていない同じｍＰＢ試料（ｎ＝７）に由来する細胞を移植した１２週間後、骨髄におけるヒト異種キメリズムを測定した。（Ｃ）解凍細胞（ｎ＝１８）、ＦａｓＬ（ｎ＝９）またはＴＮＦα（ｎ＝１０）を添加し４時間インキュベートした解凍細胞およびいずれも添加せずに培地で４時間インキュベートした解凍細胞（ｎ＝１２）のレシピエントの移植３週間後の体重。１２週間の実験時点で、培地でインキュベートした細胞およびＦａｓＬを添加してインキュベートした細胞を移植したマウスを（Ｄ）パラメータ：１．皮膚疾患および脱毛、２．脱力、３．足蹠の過角化および４．下痢の臨床スコアの正常（０）および異常（１）による臨床スコア；ならびに（Ｅ）０−浸潤なし、１−わずかな浸潤、２−まだらな浸潤、３−拡散した浸潤、４−組織下部構造の崩壊によって採点した肝組織像について評価した。
【図８】図８Ｂはスキームであり、図８Ａ、８Ｃ、８Ｄおよび８Ｅは、デスリガンドに曝露しても抗原刺激および移植片対腫瘍反応性が低下しないことを示すグラフである。（Ａ）凍結保存ｍＰＢを解凍し、ＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｇまたはＴＮＦ−α  ２０ｎｇ／ｇとともに４時間または１６時間インキュベートした。生存細胞分画内でのＣＤ３４＋前駆細胞、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、Ｂリンパ球（ＣＤ１９＋）および骨髄細胞（ＣＤ３３＋）の相対的分布はこれらのサブセットのアポトーシスに対する感受性の変動を示している。（Ｂ）ｍＰＢ試料をデスリガンドとともに４時間または１６時間インキュベートし、フィコールでの遠心分離により死細胞を排除し、同数の生存細胞を半固形メチルセルロース培養で平板培養した。（Ｃ）培地でのインキュベーション、ＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌまたはＴＮＦ−α  ２０ｎｇ／ｍｌとのインキュベーション後（各グループｎ＝７〜１１）のｍＰＢ細胞のコロニー形成細胞（ＣＦＵ）頻度として表したコロニー形成活性。（Ｄ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、ＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｇとともに４時間インキュベートしたｍＰＢを放射線照射した同種異系ｍＰＢ刺激細胞とともにインキュベートした。ＣＦＳＥ希釈から応答細胞の増殖を判定し、ＭｏｄＦｉｔソフトウェアを用いて定量化した。（Ｅ）ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにヒト結腸癌ＨＴ２９を皮下接種し、培地で４時間プレインキュベートした細胞またはＦａｓＬとともに４時間プレインキュベートした細胞３×１０７個を静脈内に注入した。ｍＰＢ細胞の注入により、ＦａｓＬへの曝露に関係なく、（ｍｍ３＝長さ×幅２×０．４）に従って測径器で測定される腫瘍成長速度が減少した。
【図９】図９Ａおよび９Ｅはスキームであり、図９Ｂ〜９Ｄおよび図９Ｆ〜９Ｈは、移植前のアポトーシス感受性細胞の除去がＧｖＨＤを予防することを示すグラフである。（Ａ〜Ｄ）前感作したＧｖＨＤエフェクターのＦａｓＬによる排除。（Ａ）Ｈ２Ｋｂマウスを３日置きにＨ２Ｋｄ脾細胞１０７個で２回免疫化した。２回目の免疫感作の３日後、脾細胞（ｉｍＨ２Ｋｂ）を培地でおよびＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとともに２４時間培養した。（Ｂ）Ｈ２Ｋｄ免疫化Ｈ２Ｋｂマウスから回収した脾細胞を培地で（ｎ＝６）およびＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとともに（ｎ＝５）２４時間インキュベートした。ゲートをかけたＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるアポトーシスおよび細胞死をそれぞれアネキシンＶおよび７−ＡＡＤ取込みにより測定した。（Ｃ）免疫化マウスの脾細胞では、放射線照射した（３０００ｒａｄ）同種異系刺激細胞（Ｈ２Ｋｄ）に対する応答がサードパーティー刺激細胞（Ｈ２Ｋｋ）よりも増強されている。ＦａｓＬとともに２４時間インキュベートすることにより、同種異系反応が有意に抑制されるが、サードパーティー刺激に対する応答性は維持される。ＣＦＳＥ希釈から増殖指数を決定した（各インキュベーションはｎ＝５）。（Ｄ）培地でのｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーションおよびＦａｓＬとのｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーション後、致死線量未満の放射線を照射した（６５０ｒａｄ）Ｆ１レシピエントに免疫化ドナーの生存脾細胞（１．５×１０６）を養子移入した（Ｈ２Ｋｂ→Ｈ２Ｋｂ／ｄ）。第７日、リポ多糖（ＬＰＳ）１０μｇの投与により生存率を二極化させた（各グループｎ＝８）。（Ｅ〜Ｈ）ＦａｓＬによる未刺激ドナー脾細胞の除去。（Ｅ）致死線量未満の放射線を照射した（６５０ｒａｄ）Ｆ１レシピエント（Ｈ２Ｋｂ／ｄ）に培地でまたはＦａｓＬとともに２４時間プレインキュベートした半同種異系脾細胞（Ｈ２Ｋｂ）を注入した。（Ｆ）ゲートをかけたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのアポトーシスを測定するため、未刺激脾細胞を培地で（ｎ−７）およびＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとともに（ｎ−９）２４時間インキュベートした。（Ｇ）ＦａｓＬとともに２４時間インキュベートした未刺激脾細胞（Ｈ２Ｋｂ）、ＦａｓＬを添加せずに２４時間インキュベートした未刺激脾細胞（Ｈ２Ｋｂ）ともに放射線照射した同種異系刺激細胞（Ｈ２Ｋｄ）に応答する。（Ｈ）未刺激ドナーの生存脾細胞（１．５×１０６個）を、培地でのｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーション（ｎ＝１０）およびＦａｓＬとのｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーション（ｎ＝１０）後、致死線量未満の放射線を照射した（６５０ｒａｄ）Ｆ１レシピエントに養子移入した（Ｈ２Ｋｂ→Ｈ２Ｋｂ／ｄ）。第７日、マウスにＬＰＳ  １０μｇの抗原を投与した（静脈内）。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｅは、Ｆａｓによる未刺激脾細胞の除去により、ハプロタイプが一致する免疫細胞および同種異系免疫細胞のＧｖＨＤ活性が減少することを示すグラフである。致死線量未満の放射線を照射した（６５０ｒａｄ）Ｆ１レシピエント（Ｈ２Ｋｂ／ｄ）に培地で２４時間またはＦａｓＬとともに２４時間プレインキュベートした様々な個数（１．５〜４．５×１０６個）の半同種異系脾細胞を注入した。（Ａ）ＦａｓＬとともにインキュベートした脾細胞およびＦａｓＬを添加せずにインキュベートした脾細胞のレシピエントについて、（Ｄ）パラメータ：１．皮膚疾患および脱毛、２．脱力、３．足蹠の過角化および４．下痢の正常（０）および異常（１）によって臨床的に採点した。（Ｂ）ＦａｓＬとともにインキュベートした、またはＦａｓＬを添加せずにインキュベートした様々な個数のドナー脾細胞のレシピエントの体重減少（各グループｎ＝５〜１０）。（Ｃ〜Ｄ）ＦａｓＬとともに２４時間またはＦａｓＬを添加せずに２４時間インキュベートした後の脾細胞３×１０６個のハプロタイプ一致移植と同種異系移植（Ｈ２Ｋｂ→Ｈ２Ｋｄ）との比較（各グループｎ＝６〜１０）。１週間後、臨床スコア（Ｃ）および体重減少（Ｄ）を測定した。（Ｅ）放射線照射後１週間の間に脾臓のＴリンパ球およびＢリンパ球含有量が徐々に減少する（各グループｎ＝５）。リポ多糖（ＬＰＳ）抗原投与後も生存していた個体ではこれらのサブセットの著明な刺激がみられる（ＬＰＳ注入の２日後）、未刺激脾細胞をＦａｓＬで前処理することによって抑制される（ｎ＝７）。
【図１１】図１１Ｃはスキームであり、図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｄ〜１１Ｆは、Ｆａｓ架橋がＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスのＧｖＨＤを改善することを示すグラフである。（Ａ）培地でインキュベートした脾細胞およびＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとともにインキュベートした脾細胞に自発性アポトーシス（薄い色のバー）およびＦａｓ仲介性アポトーシス（濃い色のバー）のレベルの変動がみられる。インキュベーションの２４時間および４８時間後、ゲートをかけたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットについてアネキシンＶ取込みによりアポトーシスを測定した（ｎ＝７〜９）。（Ｂ）インキュベーション前、培地での４８時間のインキュベーション後およびＦａｓＬとの４８時間のインキュベーション後における生存ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞ならびにＢリンパ球（Ｂ２２０＋）の部分分布。（Ｃ）培地でまたはＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとともにインキュベートしたＣ５７ＢＬ／６ドナー由来脾細胞を同種異系ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに注入した（Ｈ２Ｋｂ→Ｈ２Ｋｇ７）：２４時間および４８時間インキュベートしたナイーブ脾細胞をそれぞれ３×１０６個および１０７個注入した。（Ｄ）対照培地でプレインキュベートした脾細胞（ｎ＝９）およびＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとともにプレインキュベートした脾細胞（ｎ＝１０）を生存していたＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに注入した。ＬＰＳ  １０μｇの静脈内注射によって致命的ＧｖＨＤを発生させた。３週間後、胃腸管病変（ＧＩ）の発生に関する臨床スコア（Ｅ）および体重減少（Ｆ）によりマウスを評価した。
【図１２】図１２Ａはスキームであり、図１２Ｂおよび１２Ｃはグラフであり、図１２Ｄは写真およびグラフであり、ハプロタイプ一致骨髄移植におけるＦａｓ感受性ナイーブ免疫細胞の除去を示している。（Ａ）８５０ｒａｄで放射線を照射したＦ１レシピエント（Ｈ２Ｋｂ／ｄ）にＢＭＣ（Ｈ２Ｋｂ、ＣＤ４５．１）５×１６個および様々な個数のドナー脾細胞（Ｈ２Ｋｂ、ＣＤ４５．２、ＧＦＰ）を移植した。移植３週間後、培地で４８時間インキュベートした脾細胞およびＦａｓＬとともに４８時間インキュベートした脾細胞のレシピエント（各グループｎ＝８）を胃腸管病変（ＧＩ）の発生に関する臨床スコア（Ｂ）および体重減少（Ｃ）について評価した。（Ｄ）移植３週間後、培地でインキュベートした脾細胞３×１０６個およびＦａｓＬとともにインキュベートした脾細胞３×１０６個のレシピエントにおける皮膚および肝臓の組織学的評価のためにマウスを屠殺した（ｎ＝５）：０−浸潤なし、１−わずかな浸潤、２−まだらな浸潤、３−拡散した浸潤、４−組織下部構造の崩壊。
【図１３】図１３ＡはグラフおよびＦＡＣＳスキャンであり、図１３Ｂおよび１３ＤはＦＡＣＳスキャンであり、図１３Ｃはグラフであり、ハプロタイプ一致骨髄移植におけるＦａｓ感受性ナイーブ免疫細胞の選択的除去後の免疫再構築を示している。（Ａ）８５０ｒａｄで放射線を照射したＦ１レシピエント（Ｈ２Ｋｂ／ｄ）にＢＭＣ（Ｈ２Ｋｂ、ＣＤ４５．１）５×１０６個および様々な個数のドナー脾細胞（Ｈ２Ｋｂ、ＣＤ４５．２、ＧＦＰ）を移植した。移植３週間後、末梢血のドナー（Ｈ２Ｋｂ）／宿主（Ｈ２ｂ／ｄ）キメリズムを決定した（ｎ＝５）。移植３週間後、マウスを屠殺し、（Ｂ）脾臓再構築への主要な寄与が、この時点で注入脾細胞（ＣＤ４５．２，ＧＦＰ＋）がほとんど存在しない骨髄（ＣＤ４５．１、ＧＦＰ＋）によるものであることを明らかにした。データは、５つの独立した測定の代表的なものである。（Ｃ）ＭＬＲアッセイにおけるサードパーティー（Ｈ２Ｋｋ）の放射線を照射した刺激細胞に対する応答（応答細胞：刺激細胞の比は１：３）。培地でインキュベートした未刺激脾細胞およびＦａｓＬとともにインキュベートした未刺激脾細胞のレシピエントにおいて、ＣＦＳＥ希釈から増殖を決定した（ｎ＝４）。（Ｄ）致死線量未満の放射線を照射した（６５０ｒａｄ）野生型レシピエントへの移植後２４時間における腸間膜リンパ節中のＧＦＰ＋ドナー脾細胞。データは、４つの独立した測定の代表的なものである。
【図１４】図１４Ａ、１４Ｃおよび１４Ｅはスキームであり、図１４Ｂ、１４Ｄおよび１４Ｆは、ＦａｓＬによる未刺激リンパ球の除去が造血細胞生着を補助することを示すグラフである。（Ａ）全骨髄細胞（ｗＢＭＣ）をＦａｓＬ  ５０ｎｇ／ｍｌとともに、またはＦａｓＬを添加せずに２４時間インキュベートし、致死線量未満で放射線照射した（８００ｒａｄ）同種異系宿主に細胞２×１０６個を移植した（Ｈ２Ｋｄ→Ｈ２Ｋｂ）。（Ｂ）３週間後の末梢血キメリズムはＦａｓＬとのインキュベーションによる影響を受けなかった（ｎ＝６）。（Ｃ）培地で２４時間プレインキュベートして後（ｎ＝５）およびＦａｓＬとともに２４時間プレインキュベートした後（ｎ＝６）、放射線照射した（８００ｒａｄ）同種異系宿主への系列陰性ＢＭＣ  １０６個（ｎ＝７）の移植（Ｈ２Ｋｄ→Ｈ２Ｋｂ）にＧｖＨＤ活性のないＦ１ドナー（Ｈ２Ｋｂ／ｄ）由来の脾細胞１０６個を補った。（Ｄ）ＦａｓＬへの曝露に関係なく、脾細胞の追加により造血細胞生着が改善した。（Ｅ）７５０ｒａｄで放射線照射した同種異系レシピエント（Ｈ２Ｋｄ→Ｈ２Ｋｂ）にｌｉｎ−  ＢＭＣ  ５×１０５個を移植することによって混合キメリズムを誘導した（対照、ｎ＝６）。１０日後、マウスに同種異系リンパ球（Ｈ２Ｋｄ）１０６個を注入した（ＤＬＩ）。（Ｆ）培地で２４時間プレインキュベートしたＤＬＩおよびＦａｓＬとともにプレインキュベートしたＤＬＩ（ｎ＝６）の３週間後、ドナーキメリズムのレベルがリンパ球を注入しなかったマウス（対照）よりも増大した。
【図１５】図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｅおよび１５Ｇはスキームであり、図１５Ｂ、１５Ｄ、１５Ｆおよび１５Ｈは、ＦａｓＬにより未刺激リンパ球を除去した移植で移植片対宿主活性が保持されることを示すグラフである。（Ａ）皮下同種異系（Ｈ２Ｋｄ）ＣＴ２６結腸癌腫瘍を有するＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（Ｈ２Ｋｇ７）に５週齢の宿主適合ＮＯＤドナー（Ｈ２Ｋｇ７）由来の脾細胞１．５×１０７個を注入した（腫瘍移植１日後）。（Ｂ）培地で２４時間プレインキュベートしたか、ＦａｓＬとともにプレインキュベートしたか（ｎ−８）に関係なく、リンパ球の注入によりＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（ｎ＝１０）の腫瘍成長が抑制された。（Ｃ）ＭＨＣ適合皮下神経芽腫（Ｎｅｕｒｏ−２ａ、Ｈ２Ｋａ）腫瘍を有するＨ２Ｋａマウスに致死線量未満の放射線を照射し（７５０ｒａｄ）、同種異系ドナー（Ｈ２Ｋｂ）の系列陰性骨髄細胞２×１０６個を移植した。（Ｄ）ＧＶＨ活性のないＦ１ドナー（Ｈ２Ｋｂ／ｄ）のリンパ球を注入しても、腫瘍成長に対して何ら有意な影響はみられなかった（ｎ＝１７）。培地で２４時間インキュベートした同種異系脾細胞（Ｈ２Ｋｂ）を注入すると腫瘍成長速度が低下したが（ｎ＝１０）、マウスの８０％が重度のＧｖＨＤのため３週間以内に死亡した。ＦａｓＬとともにプレインキュベートした脾細胞を注入すると腫瘍成長が同程度低下したが、全マウスが生存していた（ｎ＝１１）。（Ｅ）致死線量未満の放射線を照射した（７５０ｒａｄ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに同系（Ｈ２Ｋｄ）骨髄細胞５×１０６個とＡ２０リンパ芽球腫細胞２×１０５個との混合物（Ｈ２Ｋｄ）を注入した。細胞混合物を培地で２４時間およびＦａｓＬとともに２４時間インキュベートした。（Ｆ）培地でインキュベートした骨髄およびＡ２０細胞のレシピエントが播種性腫瘍を致死的な転帰に至った（ｎ＝１０）のに対して、ＦａｓＬとともにインキュベートした細胞のレシピエントは生存していた（ｎ＝１０）。（Ｇ）同系ＮＯＤドナー（Ｈ２Ｋｇ７）の骨髄細胞を培地で４８時間またはＦａｓＬタンパク質５０ｎｇ／ｍｌとともに４８時間インキュベートした後、６５０ｒａｄで放射線を照射した免疫抑制状態のＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（Ｈ２Ｋｇ７）に５×１０７個養子移入した。２００ｍｇ／ｄｌを上回る空腹時血糖値が２回測定された場合、高血糖症であるとした。（Ｈ）培地でプレインキュベートした全骨髄細胞およびＦａｓＬタンパク質とともにプレインキュベートした全骨髄細胞（ｎ＝１０）の養子移植後における高血糖症の発症。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（本発明の詳細な説明）
一実施形態では、本発明はアポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞を選択する装置を開示する。別の実施形態では、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞は幹細胞、前駆細胞および免疫細胞を含む群から選択される。別の実施形態では、本発明の免疫細胞はＴ細胞のサブセットである。別の実施形態では、本発明の細胞は造血細胞である。別の実施形態では、本発明の細胞は表面表現型、例えばＣＤ３４＋に基づいて同定される。別の実施形態では、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞は本発明の細胞である。
【００４０】
別の実施形態では、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞はＴＮＦ−αに抵抗性である。別の実施形態では、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞はＦａｓリガンドに抵抗性である。別の実施形態では、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞はＴＲＡＩＬに抵抗性である。別の実施形態では、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞はＴｗｅａｋに抵抗性である。別の実施形態では、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞はＴＮＦ−α、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ、Ｔｗｅａｋまたはその任意の組合せに抵抗性である。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、幹細胞または「幹細胞性」を同定する細胞染色法に伴う困難および不正確性を克服する方法および装置を提供する。別の実施形態では、従来技術が通常、幹細胞を同定する方法を提供するのに対して、本発明は培養物から幹細胞を選択する手段を提供し、この培養物は非幹細胞を含めた種々の細胞型を含むものである。別の実施形態では、選択を１段階で実施する。
【００４２】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が以下の説明で記載される詳細または実施例によって例示される詳細にその適用が限定されるものではないことを理解するべきである。本発明は他の実施形態が可能であり、また種々の方法で実践または実施することも可能である。このほか、本明細書で使用される表現および用語は説明を目的とするものであり、限定するものと見なされるべきではないことを理解するべきである。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の装置は容器を含み、容器の内表面にアポトーシス誘導リガンドが固定化されている。別の実施形態では、本発明の装置は容器を含み、容器内に導入されるビーズの表面にアポトーシス誘導リガンドが固定化されている。別の実施形態では、本発明の装置は容器を含み、装置内の含まれるビーズの表面にアポトーシス誘導リガンドが固定化されている。別の実施形態では、本発明の装置は、単一の段階を用いて幹細胞を選択するために使用される。別の実施形態では、単一の段階は、容器内での不均一な細胞集団のインキュベーションを含む。別の実施形態では、インキュベーションにより細胞集団を本明細書で提供されるアポトーシスリガンドに曝露する。別の実施形態では、インキュベーションにより幹細胞などのアポトーシス抵抗性細胞の生存およびアポトーシス感受性細胞型のアポトーシス死が生じる。
【００４４】
別の実施形態では、特に限定されないが癌、免疫疾患，化学療法耐性癌または先天性もしくは後天性免疫不全などの疾患の治療過程で、選択されたアポトーシス抵抗性細胞（幹細胞など）の集団を移植に使用する。別の実施形態では、当業者が本発明のアポトーシス抵抗性細胞の使用を容易に決定することができる。
【００４５】
別の実施形態では、容器は少なくとも１種類の生体適合材料で作られたものである。別の実施形態では、生体適合材料は、特に限定されないが、ポリプロピレン、ポリスチレン、シリコーン、ポリ塩化ビニルまたはその組合せを含む。別の実施形態では、生体適合材料は、特に限定されないが、その内表面へのアポトーシス誘導リガンド固定化の耐久性もしくは促進能または透明度などのパラメータに従って選択される。別の実施形態では、生体適合材料は、その治療法のレシピエントまたは受益者の望ましくないあらゆる局所効果または全身効果の誘発に関して不活性であるが、その特定の状況下で最も適切で有益な細胞反応または組織反応を生じさせ、その治療法の臨床的に重要な効能を最大限に高めるものである（生体適合材料については、米国特許第５，９９８，０２４号、米国特許第６，５２６，９８４号および米国特許第４，９７９，９５９号に具体例が記載されている）。別の実施形態では、生体適合材料は、本発明のアポトーシス抵抗性細胞の生存を促進する少なくとも１つの層でコーティングされた疎水性ポリマーを含む。
【００４６】
別の実施形態では、容器はバッグである。別の実施形態では、容器はカラムである。別の実施形態では、容器はチューブである。別の実施形態では、容器はボトルである。別の実施形態では、容器はバイアルである。別の実施形態では、容器はフラスコである。別の実施形態では、容器は、当該技術分野で公知であり、装置の特定の使用目的に適した任意の他の容器である。
【００４７】
一実施形態では、装置は細胞集団を導入する単一の容器からなる。別の実施形態では、容器は、細胞残屑およびタンパク質から全細胞を分離するようになっているフィルター装置によって隔てられた２つの連結したチャンバを含む。別の実施形態では、細胞集団を一方のチャンバに導入し、そのチャンバ内でインキュベートし、インキュベーション後にフィルターを用いて、選択された細胞を溶液中の細胞残屑およびタンパク質からさらに単離し得る。
【００４８】
別の実施形態では、容器はカラムの形態であり、このカラム内で細胞集団をインキュベートし、全細胞または特異的に幹細胞をカラムに付着させる。別の実施形態では、インキュベーション後、残りの細胞残屑およびタンパク質を廃棄し、選択された細胞をカラムから単離する。このようなカラムの使用は米国特許第５，０９８，８４２号および米国特許出願公開第２０１１／０２５６５８１号に例示されている。
【００４９】
別の実施形態では、アポトーシス抵抗性細胞を選択するためのアポトーシス誘導剤として腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーを使用する。別の実施形態では、本発明に従って使用するＴＮＦ−ファミリーのアポトーシス誘導リガンドは、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、Ｔｒａｉｌ（Ａｐｏ２リガンド）またはＴｗｅａｋ（Ａｐｏ３リガンド）である。別の実施形態では、アポトーシス促進剤は組換えタンパク質である。
【００５０】
別の実施形態では、生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドは、容器の内表面に固定化されてもアポトーシス誘導作用が有効なリガンドである。別の実施形態では、生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドは、少なくともそれぞれの受容体と結合可能な活性部分を含み、固定化された形態でアポトーシスを誘導するＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、ＴｒａｉｌおよびＴｗｅａｋのいずれかである。
【００５１】
別の実施形態では、アポトーシス誘導リガンドは哺乳動物入手源に由来するものである。別の実施形態では、アポトーシス誘導リガンドはヒトアポトーシス誘導リガンドである。別の実施形態では、アポトーシス誘導リガンドはげっ歯類アポトーシス誘導リガンド．
【００５２】
別の実施形態では、生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドを容器の内表面に固定化する。別の実施形態では、生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドを容器内のビーズに固定化する。別の実施形態では、生物学的に活性なアポトーシス誘導リガンドを、リガンドと容器内に含まれる細胞とが自由に相互作用できるような方法で固定化する。
【００５３】
タンパク質を表面に固定化するための当該技術分野で公知の方法が多数存在する。ほとんどの固定化方法では、表面特性を変化させたり、タンパク質が結合する官能基を与えたりするために、表面をしかるべき物質で修飾またはコーティングする。一方、修飾を施さない露出した表面にタンパク質を固定化するには、特定の表面に特異的な親和性ペプチドを用いる必要がある。別の実施形態では、本発明のアポトーシス誘導リガンドと適合性のあるキレート剤を用いて固定化を達成する。別の実施形態では、当業者が適切なキレート剤を容易に特定できるであろう。別の実施形態では、キレート剤は本発明のアポトーシス誘導リガンドと適合性があり、かつその生物活性を維持するものである。別の実施形態では、キレート剤は本発明のアポトーシス誘導リガンドと適合性があり、かつその生物活性を促進するものである。
【００５４】
別の実施形態では、物理的吸着、Ｈｉｓ−６とＮｉ＋イオンとの間の相互作用、ヘテロ二量体Ｌｅｕジッパー対のコイルドコイル結合、ＳＨ基の化学吸着、アルデヒド基とアミノ基との間のシッフ塩基結合、ＴＧアーゼによるアシル転移反応、ストレプトアビジン−ビオチン間の親和性、ＦＬＡＧと抗ＦＬＡＧ抗体との間の親和性、グルタチオンとＧＳＴとの間の親和性またはＰＳ親和性ペプチドと融合したタンパク質と親水性ポリスチレンとの結合によってアポトーシス誘導リガンドの固定化を達成する（固定化の種々の方法については、米国特許第６，０４０，１８２号、米国特許第４，８８５，２３４号、米国特許出願公開第２０１０／０２０９９４５号および米国特許出願公開第２００６／０００９６２３号に具体例が記載されている）。
【００５５】
別の実施形態では、アポトーシス誘導リガンドは完全タンパク質の誘導体または類似体である。別の実施形態では、アポトーシス誘導リガンドは有機小分子である。別の実施形態では、アポトーシス誘導リガンドは完全タンパク質の変異体、誘導体、修飾型または短縮型である。別の実施形態では、ＦａｓＬは配列番号１で表されるＦａｓＬのようなヒトＦａｓＬである。別の実施形態では、本発明のヒトＴＮＦ−αは配列番号２を含む。別の実施形態では、本発明のヒトＴｒａｉｌは配列番号３を含む。別の実施形態では、本発明のヒトＴｗｅａｋは配列番号４を含む。
【００５６】
本明細書に開示されるタンパク質は、組換え法または化学合成法によって作製することができる。
【００５７】
別の実施形態では、不均一な細胞集団の中からアポトーシス抵抗性細胞を選択する方法が本明細書に提供され、この方法では、不均一な細胞集団はアポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞とアポトーシスシグナル伝達感受性細胞とを含む。別の実施形態では、この方法は装置内への不均一な細胞集団の導入と、その装置内でのインキュベーションとからなる。別の実施形態では、この方法は装置内への不均一な細胞集団の導入と、その装置内でのインキュベーションとを含む。
【００５８】
別の実施形態では、本明細書で使用される「選択（すること）」という用語は、不均一な細胞集団の中から選択された細胞のみが生存する方法を指す。別の実施形態では、生存細胞はアポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞である。
【００５９】
別の実施形態では、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞は幹細胞である。別の実施形態では、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞は、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に非感受性の免疫細胞である。別の実施形態では、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞は前駆細胞である。別の実施形態では、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞は幹細胞、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に非感受性の免疫細胞、前駆細胞またはその任意の組合せである。
【００６０】
別の実施形態では、幹細胞は臍帯血幹細胞である。別の実施形態では、幹細胞は動員末梢血幹細胞である。別の実施形態では、幹細胞は骨髄幹細胞である。別の実施形態では、幹細胞は癌幹細胞である。別の実施形態では、幹細胞は神経幹細胞である。別の実施形態では、幹細胞は臍帯血幹細胞、動員末梢血幹細胞、骨髄幹細胞、癌幹細胞、神経幹細胞またはその組合せである。
【００６１】
別の実施形態では、本明細書で使用される「活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に非感受性の免疫細胞」は、活性化した後にアポトーシスを経ない免疫系の細胞を指す。別の実施形態では、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に非感受性の免疫細胞は非活性化Ｔ細胞である。
【００６２】
治療目的での幹細胞の回収には、自己の幹細胞またはドナーの幹細胞を含む組織を摘出し、次いで、幹細胞とともに移植した場合に有害な作用を及ぼし得る他の細胞集団から幹細胞を単離することが必要である。
【００６３】
別の実施形態では、語句「アポトーシス抵抗性」とは「受容体仲介性アポトーシス抵抗性」のことである。別の実施形態では、本発明の細胞選択法は、受容体仲介性アポトーシス抵抗性の細胞型の単一段階ネガティブ選択法である。別の実施形態では、本発明の方法により、のちに例示する通り、装置の１回の使用で幹細胞と移植の臨床転帰を補助する免疫細胞とを同時に単離することが可能となる。
【００６４】
別の実施形態では、本発明の方法に使用し得る細胞集団は、特に限定されないが、骨髄、臍帯血（ＵＣＢ）および前駆細胞動員末梢血（ｍＰＢ）に由来するものである。しかし、細胞集団はこのほか、アポトーシス抵抗性細胞を含む他の成体組織に由来するものであってもよいことが当業者には明らかである。別の実施形態では、細胞集団は胚組織に由来するものである。
【００６５】
別の実施形態では、不均一な細胞集団は器官または組織に由来するものである。別の実施形態では、不均一な細胞集団は胚に由来するものである。別の実施形態では、不均一な細胞集団は胚細胞、幹細胞、免疫細胞またはその任意の組合せを含む組織に由来するものである。別の実施形態では、不均一な細胞集団は骨髄に由来するものである。別の実施形態では、不均一な細胞集団は、骨髄間質から吸引により機械的に取り出すことによって、あるいは分子アンカーの活性化および破壊により末梢血（ｍＰＢ）中に動員してからアフェレーシスによって得られるものである。別の実施形態では、不均一な細胞集団は末梢血に由来するものである。
【００６６】
別の実施形態では、不均一な細胞集団から幹細胞を選択する。別の実施形態では、本明細書で使用される「不均一な細胞集団」という語句は、上で定義した幹細胞と少なくとも１種類のアポトーシス感受性細胞とを含む細胞型の混合物を指す。別の実施形態では、不均一な細胞集団は任意の生物に由来するものである。別の実施形態では、不均一な細胞集団は哺乳動物入手源に由来するものである。別の実施形態では、不均一な細胞集団はヒト入手源に由来するものである。
【００６７】
別の実施形態では、不均一な細胞集団は系列陽性細胞と幹細胞との混合物を含む。別の実施形態では、本明細書で使用される「系列陽性細胞」は成熟細胞系列マーカーを発現する細胞を指す。別の実施形態では、成熟細胞系列マーカーは分化クラスター（ＣＤ）タンパク質である。
【００６８】
別の実施形態では、本発明の方法を用いて系列除去を実施する。
【００６９】
別の実施形態では、不均一な細胞集団は組織またはその一部分である。別の実施形態では、不均一な細胞集団は細胞凝集体である。別の実施形態では、不均一な細胞集団は単細胞懸濁液である。別の実施形態では、不均一な細胞集団は初代培養物である。別の実施形態では、不均一な細胞集団は細胞試料である。別の実施形態では、不均一な細胞集団は、本発明のアポトーシス促進剤に接触可能なアリ集団を含む。
【００７０】
別の実施形態では、装置内でのインキュベートは２時間〜７２時間続く。別の実施形態では、装置内でのインキュベートは２時間〜４時間続く。別の実施形態では、装置内でのインキュベートは４時間〜１０時間続く。別の実施形態では、装置内でのインキュベートは１０時間〜２４時間続く。別の実施形態では、装置内でのインキュベートは１２時間〜３６時間続く。別の実施形態では、装置内でのインキュベートは２４時間〜４８時間続く。別の実施形態では、装置内でのインキュベートは３６時間〜７２時間続く。別の実施形態では、装置内でのインキュベートは４８時間〜７２時間続く。
【００７１】
本発明者らは予想外にも、アポトーシス誘導リガンドを様々に組み合わせて様々な時間でインキュベートすると、機能的に異なる臨床転帰がもたらされ得ることを発見した。したがって、本明細書でのちに例示する通り、インキュベーション時間は特定の用途に応じたものとなる。
【００７２】
別の実施形態では、本発明は細胞選択キットを開示する。別の実施形態では、キットは、アポトーシス誘導リガンドの完全性および活性を維持する溶液をさらに含む本発明の装置を含む。別の実施形態では、キットは、本発明の方法に従って細胞選択を実施するための指示が記された挿入物をさらに含む。別の実施形態では、アポトーシス誘導リガンドの完全性および活性を維持する溶液は溶液である。別の実施形態では、アポトーシス誘導リガンドの完全性および構造を維持しながらその活性を可能にする溶液は緩衝液または培地である。別の実施形態では、溶液の成分は使用するアポトーシス誘導リガンドによって異なる。別の実施形態では、溶液はプロテアーゼ阻害剤を含む。別の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、特に限定されないが、フェニルメチルスルホニルフルオリド、ベンズアミジン、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、アプロチニン、アンチパイン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはその任意の組合せから選択される。別の実施形態では、溶液は、特に限定されないが、トリス緩衝液またはＧｌｙｃｉｎｇ−ＮａＯＨから選択される緩衝液系を含む（タンパク質の安定性および活性のための緩衝液の選択に影響を及ぼす様々な条件については、Ｕｇｕｗ  Ｓ．Ｏ．およびＡｐｔｅ  Ｓ．Ｐ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：２００４；Ｍａｒｃ：８６−１１３に具体例が記載されている）。
【００７３】
別の実施形態では、溶液は細胞の生存、細胞の成長、細胞の増殖またはその任意の組合せを可能にし、かつ／または促進する要素を含む。別の実施形態では、細胞の生存、細胞の成長、細胞の増殖またはその任意の組合せを可能にし、かつ／または促進する要素としては、成長培地、血清または抗菌剤が挙げられる。この実施形態では、溶液によりキットの装置内の細胞の生存能を維持することが可能になる。
【００７４】
別の実施形態では、溶液は幹細胞の増殖を可能にする因子を含む。別の実施形態では、幹細胞の増殖を可能にする因子は、特に限定されないが、増殖因子、ホルモン、酵素または化学物質から選択される。
【００７５】
別の実施形態では、キットは、装置または溶液に添加され溶液を本発明のアポトーシス抵抗性細胞に対して選択性にする追加のアポトーシス誘導リガンドをさらに含む。
【００７６】
別の実施形態では、本発明のキットは、細胞集団に添加されるアポトーシス誘導リガンドの同一性または濃度に柔軟性をもたせる。この実施形態では、キットは、それぞれに異なるアポトーシス誘導リガンドが収納された追加の容器を含む。キットの使用者は、本明細書でのちに例示する通り、所望の用途に応じて好ましいアポトーシス誘導リガンドの組合せを選択し、そのリガンドを装置内に導入し、そのリガンドでインキュベートさせる。
【００７７】
別の実施形態では、本発明のキットはアポトーシス誘導リガンドの添加に一時的な柔軟性をもたせる。本明細書でのちに例示する通り、アポトーシス誘導リガンドの組合せ、連続投与またはインキュベーション時間が異なれば、臨床的に異なる転帰が得られる。キットの使用者は、アポトーシス誘導リガンドの所望の添加順序および装置内での各リガンドとのインキュベーション時間を選択することにより、最も好ましい臨床転帰を達成することができる。
【００７８】
別の実施形態では、本発明はさらに、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）移植の臨床転帰を改善する方法を開示する。別の実施形態では、ＨＳＰＣを含む細胞集団を準備する。別の実施形態では、細胞集団を本発明の装置内でアポトーシス誘導リガンドと接触させ、その装置内でインキュベートする。別の実施形態では、生存細胞を回収する。別の実施形態では、回収した細胞を対象に移植する。
【００７９】
別の実施形態では、同種異系臍帯血を本発明のキットの装置内に導入する。この実施形態では、容器の内表面にＦａｓＬを固定化する。臍帯血を装置内で２４時間未満インキュベートする。インキュベーション終了後、装置内にＴＮＦ−αを導入し、インキュベーションを２４〜４８時間継続する。２回目のインキュベーション後、装置から細胞を取り出し、患者に移植する。別の実施形態では、溶液中の細胞残屑およびタンパク質から生きた細胞を単離するため、インキュベーションの終了と移植との間で単離段階を用いる。
【００８０】
別の実施形態では、この方法の細胞集団は自己移植片に由来するものである。別の実施形態では、この方法の細胞集団は同種異系移植片に由来するものである。
【００８１】
別の実施形態では、本発明はさらに、組成物中の悪性細胞を排除する方法を開示する。この方法では、組成物をアポトーシス誘導リガンドと接触させ、これとともにインキュベートする。別の実施形態では、組成物は前駆細胞移植片を含む。
【００８２】
別の実施形態では、アポトーシス誘導リガンドはＦａｓＬである。別の実施形態では、インキュベーションは約２４時間にわたるものである。本発明者らは予想外にも、悪性細胞を含む移植片にＦａｓＬを約２４時間添加することにより、悪性の夾雑物が排除され生存率が改善することをｉｎ  ｖｉｖｏで示した（図１５Ｅおよび１５Ｆ）。
【００８３】
別の実施形態では、この排除方法には、無症候性の悪性疾患に罹患している外見上健常なドナーの移植片中の悪性細胞が存在しないようにする可能性がある。
【００８４】
別の実施形態では、癌患者の骨髄から移植片を取り出し、本発明の装置内に導入する。この実施形態では、移植片を固定化されたＦａｓＬとともに約２４時間インキュベートする。インキュベーション終了後、選択された細胞を癌患者に移植して戻す。別の実施形態では、選択された細胞が細胞残屑およびタンパク質から単離されるよう移植前に単離段階を実施する。
【００８５】
別の実施形態では、本発明はさらに、移植片対腫瘍（ＧｖＴ）活性を保持しながら移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防する方法を開示する。この方法では、試料を準備する。一実施形態では、試料は細胞集団を含む。別の実施形態では、細胞集団はＨＳＰＣを含む。別の実施形態では、細胞集団は免疫細胞を含む。別の実施形態では、細胞集団はＨＳＰＣ、免疫細胞またはその組合せを含む。一実施形態では、細胞集団とアポトーシス誘導リガンドとを接触させる。別の実施形態では、生存細胞を装置から回収する。別の実施形態では、回収した細胞を対象に移植する。
【００８６】
別の実施形態では、本発明の方法により、ＧｖＨＤを誘発しないＴ細胞サブセットのみが選択される。本発明者らは予想外にも、Ｔ細胞感作を同時に行わずにＦａｓＬとともに２〜１６時間の短時間のインキュベーションを実施することにより、ＧｖＨＤエフェクターが効果的に除去されることを発見した（図９）。この実施形態では、ＦａｓＬによる移植細胞の処理が生着を妨げることがなかったため、造血前駆細胞の生着を補助するＴ細胞サブセットの生存が達成される（図１４）。
【００８７】
別の実施形態では、ドナー接種材料からのアポトーシス感受性Ｔ細胞を選択的に排除しても、強力な移植片対腫瘍（ＧｖＴ）反応の発生を妨げることはない。
【００８８】
別の実施形態では、ＧｖＨＤの発生率が高いことが当該技術分野で知られている同種異系動員末梢血移植片に本発明の方法を用いることができる。この実施形態では、同種異系動員末梢血移植片を本発明の装置内に導入する。次いで、移植片を固定化されたＦａｓＬとともに２〜１６時間にわたって短時間インキュベートする。インキュベーション後、残った細胞を回収し、患者に移植する。別の実施形態では、選択された細胞が細胞残屑およびタンパク質から単離されるよう移植前に単離段階を実施し得る。
【００８９】
別の実施形態では、ドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）前の未刺激Ｔ細胞の選択的除去に本発明の方法を用い得る。
【００９０】
いくつかの実施形態による組換え発現
別の実施形態では、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を宿主細胞内、例えば核酸分子で形質転換した微生物細胞内で発現させることによって、本発明のタンパク質を合成し得る。
【００９１】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、そのタンパク質を産生する任意の細胞から当該技術分野で周知の種々の方法を用いて単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（２００１）を参照されたい）。例えば、既知の配列のヌクレオチド配列に基づいて構築した特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、しかるべき微生物のゲノムＤＮＡ、プラスミドまたはコスミドから野生型タンパク質をコードするＤＮＡを増幅することができる。適切な技術は当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号に記載されている。
【００９２】
当該技術分野で公知の種々の方法を用いて増幅する前に、細胞からＤＮＡを抽出することができる（例えば、Ｍａｒｅｋ  Ｐ．Ｍら，”Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ９，Ｉｓｓｕｅ  ８，Ａｕｇｕｓｔ  １９８７，Ｐａｇｅｓ  ４７４−４７８を参照されたい）。
【００９３】
タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドはｐＥＴ２８ａプラスミドなどのベクターにクローン化することができる。
【００９４】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離しクローン化する際に、当該技術分野で公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８５，８２：４８８−４９２；Ｗｅｉｎｅｒら，Ｇｅｎｅ  １９９４，１５１：１１９−１２３；Ｉｓｈｉｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９８，２９３：５３−７１を参照されたい）、カセット変異誘発法（例えば、Ｋｅｇｌｅｒ−Ｅｂｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４  Ｍａｙ  １１；２２（９）：１５９３−１５９９を参照されたい）、再帰的アンサンブル変異誘発法（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（例えば、Ｄｅｌａｇｒａｖｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １９９３，６（３）：３２７−３３１を参照されたい）および遺伝子部位飽和変異誘発法（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１３０７１８号を参照されたい）などを用いて１つ以上の塩基対を改変することにより、変異（１つまたは複数）を導入することができる。
【００９５】
このほか、ポリヌクレオチド内に多重変異を導入する方法がよく知られている（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌｉａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２，２０：３７６；Ｄｗｉｖｅｄｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，２２１：４２５−４２８；Ｂｈａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６，５７：２６９−２７７；Ｍｅｅｔｅｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，２６４：２８８−２９１；Ｋｉｍら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０００，２８：１９６−１９８；ならびに国際公開第０３／００２７６１Ａ１号および同第９９／２５８７１号を参照されたい）。
【００９６】
所望の配列を有するポリヌクレオチドを作製するまた別の方法が合成遺伝子の使用である。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを合成により、例えばホスホロアミダイト法を用いて調製してもよい（Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｃｕｎ−Ｐｒｏｔｏｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｍａｙ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｕｎｉｔ  ３．３；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７，１５４：２８７−３１３を参照されたい）。
【００９７】
合成遺伝子を使用することにより、所望の種（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））で発現させるのに最適化されたヌクレオチド配列を含む人工遺伝子の作製が可能である。多くの場合、遺伝子の再設計が遺伝子発現を向上させる１つの手段となる。遺伝暗号には冗長性があるため、オープンリーディングフレームを書き換えることが可能である。したがって、オープンリーディングフレームのヌクレオチドの約３分の１まで変化させても依然として同じタンパク質を産生することが可能である。例えば、３００個のアミノ酸からなる典型的なタンパク質配列には同一のタンパク質をコードするコドンの組合せが１０１５０以上ある。ほとんど使用されないコドンを比較的よく使用されるコドンに置き換えるなど最適化法を用いることにより、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルに劇的な効果をもたらすことができる。ＲＮＡ二次構造の除去などのまた別の最適化も含まれ得る。ここに挙げたものをはじめとする同時最適化を実施するのにコンピュータプログラムを利用することができる。元のＤＮＡ配列にヌクレオチド改変が多数施されることから、新たに設計された遺伝子を作出する唯一の実用的な方法は遺伝子合成を用いることである。
【００９８】
次いで、このようにして作製したポリヌクレオチドに精製、アニーリング、ライゲーション、増幅、制限酵素による消化およびしかるべきベクターへのクローン化のうちの１つ以上を含めたさらなる操作を行うことができる。ポリヌクレオチドを最初にクローニングベクターに連結しても、特定の宿主細胞型での発現に適した発現ベクターに直接連結してもよい。
【００９９】
当業者には容易にわかることであるが、野生型酵素をコードする配列中に本来存在するアミノ酸を置換するための特定のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドに使用するコドンは、ポリヌクレオチドの発現用に選択する宿主細胞の好ましい既知のコドン使用頻度に従って選択するべきである。
【０１００】
当業者であれば核酸配列とタンパク質配列との間の関係、特に遺伝暗号および遺伝暗号の縮重について理解しており、本発明のタンパク質をコードする核酸を容易に構築することができるであろう。例えば、当業者であれば、タンパク質配列のアミノ酸置換にはそれぞれ、その置換アミノ酸をコードするコドンが１つ以上存在し得ることがわかるであろう。したがって、その特定のアミノ酸残基に対する遺伝暗号の縮重に応じて、１つの変異体タンパク質配列に対応する核酸配列を１つ以上作製し得ることが明らかであろう。
【０１０１】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば非コード５’および３’配列を含めた非コード配列、例えば転写される非翻訳配列、終止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配列、イントロンおよびポリアデニル化シグナルなどを含み得る。さらに、変異体タンパク質に対して異種性の追加のアミノ酸のコード配列、特に、融合タンパク質形態のタンパク質の精製を容易にするポリＨｉｓタグなどのマーカー配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【０１０２】
本発明のタンパク質を例えば抽出および精製に役立つ、タグ化タンパク質として作製することができる。タグ構築物の非限定的な例にはＨｉｓタグ（６個の連続したヒスチジン残基）があり、これは従来の方法によって単離および精製することができるものである。このほか、タグを除去するためにタグ部分と目的タンパク質配列との間にトロンビン切断部位などのタンパク質分解切断部位を含ませると便利であろう。
【０１０３】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを多種多様な発現ベクターに組み込み、これを多種多様な宿主細胞内で形質転換させることができる。宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【０１０４】
宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入は、よく知られた方法、例えば化学変換（例えば、塩化カルシウム処理）、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、形質導入、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質によるトランスフェクション、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、衝撃導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染などによって達成することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、細胞は原核細胞である。適切な原核宿主の非限定的な代表例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｔａｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の細胞などの細菌細胞が挙げられる。他の実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの例示的な実施形態では、細胞は酵母などの真菌細胞である。適切な酵母細胞の非限定的な代表例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。ほかの例示的な実施形態では、細胞は植物細胞である。
【０１０６】
タンパク質は発現に適した任意のベクターで発現させることができる。選択する宿主細胞に応じて、しかるべきベクターを決定する。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でタンパク質を発現させるためのベクターとしては、特に限定されないが、ＥＴ、ｐＫ２３３、ｐＴ７およびラムダｐＳＫＦが挙げられる。その他の発現ベクター系にはβ‐ガラクトシダーゼ（ｐＥＸ）、マルトース結合タンパク質（ｐＭＡＬ）およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｐＧＳＴ）に基づくベクターがある。
【０１０７】
所望のベクターで形質転換された宿主細胞の選択は、非形質転換細胞に対して毒性のある選択培地で増殖させることを含む標準的な選択プロトコルを用いて達成することができる。例えば、抗生物質の選択薬剤を含有する培地で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を増殖させてもよく、抗生物質耐性遺伝子をさらにもたらす発現ベクターで形質転換された細胞は、この選択培地で増殖する。
【０１０８】
適切な宿主細胞を形質転換し、タンパク質発現に適した条件下で増殖させた後、形質転換細胞の細胞抽出物中に所望のタンパク質を同定することができる。宿主によって発現されるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、そのゲルを、同じベクターで形質転換されたが目的タンパク質をコードする核酸配列を含まない宿主から得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと比較することにより、目的タンパク質を発現する形質転換宿主を特定することができる。
【０１０９】
このほか、適切な抗体を用いる免疫ブロット解析、全細胞抽出物のドットブロット、限定的タンパク質分解、質量分析およびその組合せなどの他の既知の方法によって目的タンパク質を同定することができる。
【０１１０】
硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびその組合せを含めた従来の方法によって目的タンパク質を単離および精製することができる。
【０１１１】
単離された目的タンパク質は、当該技術分野で公知の方法を用いてその種々の特性、例えば比活性および熱安定性について分析することができ、このような方法の一部を本明細書でのちに記載する。
【０１１２】
上に挙げた方法およびその他の有用な方法を実施するための条件は、当業者によって容易に決定される（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓを参照されたい）。
【０１１３】
特定の実施形態では、開始コドン（メチオニンまたはバリン）を含まない状態ならびに／または組換えタンパク質の産生および精製に有利なリーダー（シグナル）ペプチドを含まない状態で本発明のタンパク質を作製ならびに／使用することができる。リーダーペプチドをコードする配列を含まない遺伝子をクローン化すると、タンパク質が宿主細胞の細胞質に限定され、その回収が容易になることが知られている（例えば、Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．およびＰａｓｔｅｒｎａｋ，Ｊ．Ｊ．（１９９８）Ｉｎ  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ”，第２版，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐ．１０９−１４３）。
【０１１４】
いくつかの実施形態による合成による作製
本発明のタンパク質をタンパク質合成分野の当業者に公知の任意の技術によって合成してもよい。固相タンパク質合成については、多数の技術の概要が、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．（１９６３），”Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；ならびにＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ（１９７３）．”Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，”  ｖｏｌ．２，ｐ．４６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）にみられる。古典的な液相合成法の概説については、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｇ．およびＬｕｐｋｅ，Ｋ．（１９６５）．Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【０１１５】
ペプチド合成法では一般に、伸長するペプチド鎖に１個以上のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸を連続的に付加していく。通常、最初のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを適切な保護基で保護する。次いで、保護アミノ酸または誘導アミノ酸をアミド結合形成に適した条件下で、不活性な固体担体に付着させるか、適切に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列内の次のアミノ酸を付加することによって溶液中で用い得る。次いで、この新たに付加されたアミノ酸残基から保護基を除去した後、次のアミノ酸（適切に保護されたもの）を付加することなどを行うが、従来通りの方法ではこの工程に洗浄段階を伴う。所望のアミノ酸をすべて適切な配列で連結した後、残った保護基（および固体担体）をすべて順次または同時に除去し、最終ペプチド化合物を得る。この一般的な方法に簡単な修正を加えることによって、例えば、保護されたトリペプチドと適切に保護されたジペプチドとをカップリングし（キラル中心をラセミ化しない条件下）、脱保護の後にペンタペプチドを形成させることなどにより、伸長する鎖にアミノ酸を同時に２個以上付加することが可能である。
【０１１６】
ペプチド合成のさらに詳細な説明が米国特許第６，４７２，５０５号に開示されている。
【０１１７】
本発明のほかの目的、利点および新規な特徴については、限定することを目的としない以下の実施例の実験を検討すれば当業者に明らかになるであろう。さらに、本明細書でこれまでに詳述し、のちの「特許請求の範囲」の節で特許請求する本発明の種々の実施形態および態様はそれぞれ、以下の実施例で実験的に裏付けられる。
【０１１８】
配列
【表１】
0006429191.tif 000002
実施例
【０１１９】
実施例１
臍帯血細胞のデスリガンドへのｅｘ  ｖｉｖｏ曝露
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞死受容体活性化のアポトーシス作用
ＴＮＦスーパーファミリーの主な作用はアポトーシスシグナルの伝達である。インフォームドコンセントに基づいて正期産で得られた新鮮な臍帯血（ＵＣＢ）を、増殖因子を添加しない液体培養で様々時間にわたってＦａｓＬおよびＴＮＦ−αに曝露した。ゲートをかけたバルクＵＣＢ培養物中のＣＤ３４＋前駆細胞ではアポトーシスの割合の減少がみられ、時間の関数として感受性が増大した（図１Ａ）が、ＴＮＦファミリーのデスリガンドへの曝露によってアポトーシス細胞死は増強されなかった。造血前駆細胞における受容体の低レベルの発現によってアポトーシスシグナル伝達に対する非感受性が生じることが、これまでに示唆されている。解析により、ゲートをかけたＣＤ３４＋および単離ｌｉｎ−前駆細胞の方がバルクＵＣＢ集団よりもＦａｓおよびＴＮＦ受容体の発現が低いことが明らかになった（図１Ｂ）。この受容体を発現する細胞のサブセットをさらに焦点を絞って評価したところ、ＣＤ３４＋前駆細胞に過剰なアポトーシス感受性があることがわかったが、同族受容体によるアポトーシスの誘導は、１例を除いてみられなかった（図１Ｃ）。ＴＮＦ−αに短時間（２４時間未満）曝露したものが、ＴＮＦ−Ｒ１およびＴＮＦ−Ｒ２をともに発現するＣＤ３４＋細胞の受容体仲介性アポトーシスが検出された唯一の例であった。以上のデータは、細胞死受容体の発現が、液体培養において特に自発的アポトーシスに感受性である細胞の特徴であることを示唆するものである。アポトーシスの変動が増殖速度の差から生じた可能性も否定できないが、受容体陽性ＣＤ３４＋前駆細胞のアポトーシスに対する感受性の増大と、同じく同族リガンドの存在による影響を受けない増殖速度の低下との間には相関がみられた（図１Ｄ）。
【０１２０】
ＵＣＢ細胞のどのサブセットがアポトーシス感受性であるかを明らかにするため、骨髄系およびリンパ系の細胞をさらに詳細に評価した。ＣＤ３＋Ｔ細胞が高レベルのＦａｓを発現するのに対して、ＣＤ３３＋骨髄細胞ではＴＮＦ受容体が優勢であった（図１Ｅ）。いずれの系列陽性サブセットでも、全般的にＴＮＦ−Ｒ１の方がＴＮＦ−Ｒ２よりも高レベルで発現した。デスリガンドによるアポトーシス刺激に４８時間曝露したところ、いずれの系列陽性サブセットもｌｉｎ−前駆細胞に比べて自発性アポトーシスの割合が過剰になることが明らかになり、これはリガンドの存在による影響をほとんど受けなかった（図１Ｆ）。２つの顕著な例外、すなわちａ）ＵＣＢ好中球に対応し、高レベルのＴＮＦ受容体を発現するＣＤ１４−ＣＤ３３＋骨髄細胞におけるＦａｓ仲介性アポトーシス；およびｂ）ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＴＮＦ誘導性アポトーシスが観察された。液体培養におけるＵＣＢ由来Ｔ細胞のアポトーシスに対する抵抗性は、この抗原未経験のサブセットをＡＩＣＤ型のネガティブ調節に感作するには刺激を必要とするという、このナイーブ性によって説明される。したがって、培養中での未刺激ＵＣＢ細胞のアポトーシスは、様々なサブセットにＴＮＦファミリー受容体の選択的アポトーシス機能を有するＣＤ１９＋Ｂリンパ球および骨髄細胞（ＣＤ１４＋、ＣＤ３３＋）の死によって支配される。
【０１２１】
ＳＣＩＤ−再増殖細胞および長期培養開始細胞は受容体仲介性アポトーシスに抵抗性である
ＳＣＥＤ再増殖細胞（ＳＲＣ）アッセイ、長期開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイおよび短期コロニー形成アッセイを含めた数種類の代替アッセイを用いて、漸進的に抗原感作される前駆細胞の機能を評価した。ＳＲＣ活性にはヒト再構成細胞と一部互換性があり、試料中で最も初期の前駆細胞の代替的な機能アッセイとしての役割を果たす。異種キメリズムのレベルの差が大きいと生着の増強を厳密に評価できないため、移植法を用いる前にＦａｓＬおよびＴＮＦ−αを加えた状態およびこれを加えない状態でインキュベートした同数の開始細胞を使用した（図２Ａ）。移植前にＦａｓＬおよびＴＮＦ−αに２４〜４８時間曝露してもＳＲＣ機能が維持され（図２Ｂ〜２Ｄ）、このことは、最も初期の造血前駆細胞が液体培養において自発性および受容体仲介性アポトーシスに非感受性であることを示している。ｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーション時間を延長すると、ＦａｓＬおよびＴＮＦ−αの有無に関係なくヒト造血前駆細胞の生着能が失われる（図２Ｅ）。ケモカインおよび増殖因子を添加した液体培地でＵＣＢ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーション時間を延長すると表現型が著しく変化し、免疫抑制マウスでは細胞のホーミングおよび生着が低下することが知られている。しかし、ＳＲＣ生着不全をデスリガンドによる受容体仲介性アポトーシスに帰するこれまでの研究とは異なり、培養時間の延長による悪影響は膜細胞死受容体の活性化とほとんど関係がない。
【０１２２】
ｅｘ  ｖｉｖｏ培養時間延長後のヒト細胞生着不全は、増殖およびＧ０／Ｇ１細胞周期段階からの脱出によるものである。インキュベーションの４８時間後、ＵＣＢ細胞、ＣＤ３４＋前駆細胞およびｌｉｎ−前駆細胞の増殖速度（図２Ｅ）および細胞周期段階（図２Ｆ）ともに、ＦａｓＬおよびＴＮＦ−αの有無による影響はみられなかった。デスリガンドの存在下でも有糸分裂が静止した前駆細胞が高率で維持されることにより、ＳＲＣ生着のレベルが等しいことが説明されるが、これはＧ０／Ｇ１にある細胞に限られる。
【０１２３】
造血前駆細胞活性の代替ｅｘ  ｖｉｖｏアッセイには、半固形メチルセルロース培養で抗原感作前駆細胞によって形成されるコロニーよりも初期のサブセットである間葉系間質細胞の長期培養（ＬＴＣ−ＩＣ）が含まれる。長期培養の全５週間にわたって体細胞に毒性のある濃度のＦａｓＬおよびＴＮＦ−αに曝露してもＬＴＣ−ＩＣ活性に対する影響はみられず（図２Ｇ）、ＣＤ３４＋およびｌｉｎ−前駆細胞のＦａｓおよびＴＮＦ受容体仲介性アポトーシスシグナル伝達に対する全体的な抵抗性と一致する結果となった。したがって、種々のＵＣＢサブセットに本来備わっているアポトーシスに対する感受性の差により、デスリガンド曝露時の生存サブセットの組成が著明に変化するにもかかわらず、最も初期の前駆細胞のＳＲＣおよびＬＴＣ−ＩＣ活性は維持され、このことは受容体仲介性アポトーシスに対する抵抗性を反映している。
【０１２４】
死細胞排除による骨髄前駆細胞の純化
ＵＣＢ細胞の種々のサブセットには自発性アポトーシスおよび受容体が誘導するアポトーシスに対する感受性が本来備わっているため、ｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーション後の生存細胞の組成が著明に変動する。例えば、毒性量のＦａｓＬとともに４８時間インキュベートすると生存系列陰性細胞が著明に純化されるのに対して、ＴＮＦ−αとともにインキュベートすると生存骨髄細胞が相対的に純化される（図３Ａ）。曝露後の前駆細胞の純化がコロニー形成活性を増大させると考えるのが妥当であると思われた。フィコールで沈降させて死細胞を除去し、半固形メチルセルロース培養で同数の生存ＵＣＢ細胞を平板培養して（図３Ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で刺激した後にコロニー形成単位（ＣＦＵ）の頻度の変動を評価することができる。成熟ＵＣＢ細胞でアポトーシスが優勢であるのと同様に、ＦａｓＬおよびＴＮＦ−α曝露の４８時間後、ＣＦＵ−ＧＭ頻度が対照培養の１：１４３からそれぞれ１：３７および１：３１に増加した（図３Ｃ）。インキュベーションの４８時間後に最大の純化が観察されたが、この時間よりもｅｘ  ｖｉｖｏ培養を延長すると、抗原感作された骨髄前駆細胞の機能に有害な結果がもたらされた。このアッセイではＵＣＢ試料中の非前駆細胞が選択的受容体を介して排除されることが明らかになったが、この排除によって、全体的なアポトーシスの割合がほぼ同じでありながら、ＣＦＵ−ＧＭ頻度が４〜５倍増加した。
【０１２５】
ＴＮＦファミリー受容体間のクロストークはアポトーシスに対して感作させない
ＴＮＦファミリー受容体／リガンド相互作用は、受容体活性化が部分的に相同であるが、特異性が異なることを特徴とする。ほとんどのリガンドが複数の同族受容体と結合するが、複数のリガンドによる受容体のクロス活性化は知られていない。したがって、このファミリーのクロストークは、別のＴＮＦファミリー受容体の活性化に応答して誘導された受容体のアップレギュレーションによって仲介される。最もよく知られたクロストークの例は、ＣＤ３４＋前駆細胞のＴＮＦ受容体が活性化されて誘導されるＦａｓ発現である。ＴＮＦ誘導によるＦａｓ発現がＵＣＢ細胞をアポトーシスに感作させるかどうかを明らかにするため、細胞を最初にＴＮＦ−αに曝露した後、ＦａｓＬに曝露したところ（図４Ａ）、Ｆａｓ受容体が著明にアップレギュレートされた（図４Ｂ）。培養２日目にＦａｓＬに曝露することによりＦａｓ＋細胞がアポトーシスに誘導されたのに対して、ＵＣＢ細胞、ゲートをかけたＣＤ３４＋および単離ｌｉｎ−前駆細胞はＴＮＦ−αの存在によって比較的保護されており（図４Ｃ）、このことはＦａｓ発現のアップレギュレーションとアポトーシスに対する感受性とは関係がないことを示している。リガンドを介したアポトーシス感受性細胞の排除による前駆細胞純化の機能アッセイでは、ＵＣＢ細胞をＦａｓＬとＴＮＦ−αに同時に曝露するとＣＦＵ−ＧＭ頻度が増加し（図４Ｄ）、ＵＣＢ細胞を両リガンドに同時に曝露しても依然としてｉｎ  ｖｉｖｏのＳＲＣ活性は低下しない（不掲載）ことがわかった。以上のデータは、造血前駆細胞のアポトーシスシグナル伝達に対する抵抗性が２つの独立した経路、すなわち前駆細胞の同時活性化およびＴＮＦファミリー受容体間のクロストークによるものであることを裏付けるものである。
【０１２６】
ＵＣＢ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増幅における分化細胞の除去
臍帯血は、侵襲性の放射線化学療法後に免疫−造血系を再構築するための造血前駆細胞の優れた入手源であるが、細胞数が少ない、生着に時間がかかるという２つの大きな欠点がある。この制約を克服するため、移植前にＵＣＢ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ増幅する方法が多数開発されてきた。細胞は数が増幅され、前駆細胞が活性化し、これにより造血系再構築の質が改善する。細胞培養物をＴＮＦファミリーリガンドに曝露すれば、分化細胞のクローン増殖が制限されることによってこれより初期の前駆細胞が相対的に優勢になり、生着の効率にあまり影響を及ぼさないと考えるのが妥当であると思われた。ＣＤ３４＋前駆細胞の割合（図５Ａ）および絶対数（図５Ｂ）を増加させる標準的な増幅プロトコルを用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養第３週および最終週にＦａｓＬを添加したところ、ＣＤ３４＋サブセットがさらに大幅に増幅された。最も基本的なヒト造血前駆細胞のアッセイであるＳＲＣの頻度および機能を明らかにするため、ブスルファンで免疫抑制状態にしたＮＯＤ．ＳＣＢＤマウスに同じＵＣＢ単位に由来する同数のＵＣＢ細胞を移植した（図５Ｃ）。培養第３週にＦａｓＬに曝露したところ、同レベルおよび／またはこれより高レベルのヒト造血異種キメリズムが生じ（図５Ｄ）、このことは前駆細胞の機能が改善したことを強調するものである。個々のマウスの生着に大きなばらつきがみられるため、増幅ＣＤ３４＋前駆細胞数の増加の優れた機能をこれ以上正確に判定することは不可能である。したがって、アポトーシス感受性細胞の選択的排除は、移植用にｅｘ  ｖｉｖｏ増幅したＵＣＢ前駆細胞の割合および数を増加させるのに効果的な１つの方法である。
【０１２７】
実施例２
動員末梢血細胞のデスリガンドへのｅｘ  ｖｉｖｏ曝露
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞死受容体活性化のアポトーシス作用
移植のための造血前駆細胞の一般的な入手源は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）またはｃ−ｋｉｔおよびＣＸＣＲ４のアンタゴニストにより動員した末梢血である。次いで、相当数のＣＤ３４＋前駆細胞が含まれる動員単核細胞をアフェレーシスにより末梢血から収集する。末梢血から回収した細胞は一般に活性化されているため、選択的除去のためにデスリガンドに曝露する時間はかなり短い。ＵＣＢ細胞について示したデータと異なるまた別の点は、凍結保存したｍＰＢ試料を使用することであり、この試料を解凍すると細胞の１５〜２５％がアポトーシス死する。ＣＤ３４＋前駆細胞の約２５％（図６Ａ）およびかなりの割合のＢリンパ球および骨髄細胞（５０〜６５％、図６Ｂ）にＦａｓが発現する。ＴＮＦ受容体は主として系列陽性ｍＰＢ細胞に発現し、ＴＮＦ−Ｒ１の発現が優勢である。短時間の培養後にＦａｓ発現が減少している（図６Ｃ）、いずれのサブセットもＴＮＦ−Ｒ２の著明なアップレギュレーションを示している（図６Ｄ）。以上のデータは、解凍ｍＰＢ細胞の細胞死受容体発現には大きな変動がみられ、一方ではＦａｓ＋細胞の死による影響を、他方ではＴＮＦ−Ｒ２のアップレギュレーションの影響を受けることを明らかにするものである。
【０１２８】
４時間のｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーションの間に系列陽性細胞の２５〜４５％がアポトーシスを起こし、１６時間のインキュベーションの間に系列陽性細胞の６０〜９０％がアポトーシスに誘導された（図６Ｅ）。ＦａｓＬおよびＴＮＦ−αが存在しても、培地で観察される系列陽性細胞の高いアポトーシス率は有意に低下しない。ＵＣＢ細胞からの変動が最も顕著なのは動員末梢血（ｍＰＢ）の活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞サブセットであり、このサブセットは短時間でリガンドによってアポトーシスに誘導される。この受容体仲介性アポトーシスに対する相対的な感受性により生存細胞の組成が大幅に変化し、４時間のインキュベーション後にＴ細胞の著明な減少がみられ、１６時間のインキュベーション後にＢリンパ球および骨髄細胞の著明な減少がみられる。いずれの時点でもＣＤ３＋Ｔ細胞が選択的に除去され、ＣＤ３４＋前駆細胞の生存画分が純化されている（図６Ｆ）。したがって、凍結保存ｍＰＢ試料では、動員末梢血をデスリガンドとともに短時間インキュベートすると成熟細胞のサブセットが除去され、前駆細胞が純化される。
【０１２９】
Ｆａｓ架橋に感受性のｍＰＢ由来Ｔ細胞を除去すると移植片対宿主病が軽減される
ｍＰＢ細胞移植における罹患の最も大きな原因はＧｖＨＤであり、これは末梢血中のＴ細胞の内因的な活性化状態によるものである。ＦａｓＬの異種ＧｖＨＤに対する影響を評価するため、リガンドに曝露した同じ単位およびリガンドに曝露していない同じ単位の生存ｍＰＢ１．５×１０７個をＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに移植した。ＦａｓＬとともに４時間プレインキュベートしたものでは全マウスが生存したが、培地でインキュベートしたものではレシピエントの３分の１が死亡した（図７Ａ）。生存個体にほぼ同じレベルのヒト造血キメリズムがみられ（図７Ｂ）、これはｍＰＢ中のＳＲＣがＦａｓ仲介性アポトーシスに抵抗性であることを改めて示すものである。重度の体重減少（図７Ｃ）、臨床スコア（図７Ｄ）および肝組織像（図７Ｅ）による判定では、重度のＧｖＨＤが、培地でインキュベートしたｍＰＢを接種したマウスの死因であった。ｍＰＢ細胞をＦａｓＬに短時間曝露することによって、生存率および異種ＧｖＨＤのこれらすべての特徴が改善された。さらに機能アッセイから、見かけ上全体的なアポトーシス率がほぼ同じであるにもかかわらず、リガンドの有無が系列陽性ｍＰＢ細胞の異なるサブセットに影響を及ぼすことが明らかである。
【０１３０】
デスリガンドへの曝露により骨髄前駆細胞の頻度が増大する
短時間のインキュベーション後のｍＰＢ培養物中の生存サブセットの組成は、Ｆａｓ受容体およびＴＮＦ受容体が仲介するアポトーシスに対するｍＰＢ由来免疫細胞の感受性の差を反映するものである。相対的な細胞の分布は、４時間のインキュベーションではＣＤ３＋Ｔ細胞のアポトーシス感受性が高く、インキュベーション時間が長くなると、続いてＣＤ１９＋Ｂリンパ球およびＣＤ３３＋骨髄細胞が死ぬという事実と一致している（図８Ａ）。このような差は、デスリガンドとともに短時間インキュベートし死細胞を排除することにより、ｍＰＢ試料中の前駆細胞の頻度を増大させ得ることを示唆するものである（図８Ｂ）。ＦａｓＬおよびＴＮＦ−αに曝露すると骨髄前駆細胞の純化が４倍になり、培地でのインキュベーション後に観察される純化の２倍になる（図８Ｃ）。ＵＣＢ細胞と同様に、デスリガンドに曝露するとＣＦＵ頻度が増大するが、ＵＣＢ細胞とは異なり、ｍＰＢのデスリガンド曝露時間の方がはるかに短い。以上のデータは、提案されるＧｖＨＤエフェクターの機能的排除の効率および安全性を補完するものであり、アポトーシス非感受性前駆細胞が著明に純化されることを示している。
【０１３１】
移植前のＦａｓＬへの曝露は免疫および移植片対腫瘍反応性を低下させない
ＧｖＨＤの予防およびその重症度の軽減に選択的Ｔ細胞除去を用いる実験で極めて重要な問題は、移植片が強力な移植片対腫瘍反応を誘発する能力を保持するかどうかである。培地でインキュベートしたｍＰＢおよびＦａｓＬとともにインキュベートしたｍＰＢでは、その組成が変化するにもかかわらず、放射線照射した同種異系ヒトｍＰＢ刺激細胞に対する反応性が維持される（図８Ｄ）。この結果の通り、皮下ＨＴ２９ヒト結腸癌腫瘍のある免疫抑制状態のマウスでは、ＦａｓＬに曝露したｍＰＢを接種しても、ＦａｓＬに曝露していないｍＰＢを接種しても、腫瘍成長抑制に同等の効果が得られる（図８Ｅ）。したがって、ＦａｓＬに曝露した未刺激の凍結保存ｍＰＢ細胞は致命的ＧｖＨＤを抑制し、生着を促進し、ＧｖＴ反応性を保持する。
【０１３２】
実施例３
移植前のＴ細胞除去が致命的ＧｖＨＤを予防する
宿主感作Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ選択的除去による致命的ＧｖＨＤの予防
ドナー接種材料からのＴ細胞の物理的除去およびＦａｓＬによる宿主反応性Ｔ細胞の除去はともに、ＧＶＨＤを確実に予防する。ハプロタイプが一致するマウス間（親から子）の移植はＧｖＨＤのリスクが極めて高く、高レベルの死亡率を特徴とする。第一段階では、宿主抗原に感作させた後のアポトーシスシグナルによるＴ細胞除去を用いて実験を繰り返した。２〜３日間にわたるｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗原特異的感作により、Ｆａｓとその同族リガンドを同時にアップレギュレートする反応性Ｔ細胞がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して刺激され、防御的抗アポトーシス機序のダウンレギュレーションと並行してアポトーシスカスケードが遂行される。この方法と、インキュベーションを延長しない短時間のｅｘ  ｖｉｖｏアポトーシスリガンド曝露を用いる被験方法とを比較するため、ドナーを宿主抗原に対してｉｎ  ｖｉｖｏで予め免疫化した（図９Ａ）。予想された通り、感作した脾細胞をＦａｓＬに曝露すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方にアポトーシスが有意に誘導された（図９Ｂ）。感作の効果は、刺激性Ｈ２Ｋｄ同種異系抗原に対してＢＡＬＢ／ｃリンパ球（Ｈ２Ｋｄ）で免疫化したＢ６マウスから回収されたリンパ球（Ｈ２Ｋｂ）の方がサードパーティー（Ｈ２Ｋｋ）抗原よりも増殖応答が強いことから明らかであった（図９Ｃ）。この応答は応答細胞を対照培地で短時間（２４時間）インキュベートした後も維持されたが、ＦａｓＬを添加すると、前感作した脾細胞のＨ２Ｋｄ刺激細胞に対する応答性が低下した。サードパーティーＨ２Ｋｋ抗原に対する応答は維持された。
【０１３３】
感作リンパ球がＧｖＨＤを引き起こす能力に対するＦａｓＬ曝露の効果を評価するため、致死線量未満で放射線照射したハプロタイプが一致するＦ１レシピエントにＨ２Ｋｄ免疫化Ｈ２Ｋｂ親ドナーの生存細胞を養子移入した（Ｈ２Ｋｂ→Ｈ２Ｋｂ／ｄ）。前感作した脾細胞を対照培地でインキュベートして注入したところ、重度のＧｖＨＤが発生し、リポ多糖（ＬＰＳ）抗原投与後にはこれが一様に致死性となり、全マウスが死亡した（図９Ｄ）。ＬＰＳ抗原投与は強力な免疫活性化および炎症性サイトカインの放出を引き起こし、これが進行中のＧｖＨＤ反応を最大限に悪化させて死に至らしめる。これに対して、前感作したドナーの脾細胞を注入前にｅｘ  ｖｉｖｏでＦａｓＬとともにインキュベートしたところ、ＬＰＳ投与後でもマウスの５０％が生存していた。このｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、同種異系抗原によるリンパ球刺激により、アポトーシス促進剤を用いて特異的に排除することが可能なＧＶＨＤを引き起こすエフェクター細胞集団を詳細に調べられることを示すこれまでの研究を裏付けるものである。
【０１３４】
未刺激Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ選択的除去による致命的ＧｖＨＤの予防
本発明者らには、移植前にドナーリンパ球を宿主抗原に曝露することがＴ細胞刺激を増強し、培養で生じた一部のエフェクター／記憶リンパ球サブセットのＦａｓ仲介性アポトーシスに対する感受性が低いことにより、あるいはＦａｓ架橋では同種異系反応性Ｔ細胞を完全には排除できないことにより、この同種異系反応が継続すると考えるのが妥当であると思われた。さらに、この前感作させる方法をヒトのドナー／宿主ペアに臨床適応することが極めて困難であることも否定できない。より容易で確実な同種異系反応性Ｔ細胞のＦａｓＬ選択モデルを探求するため、インキュベーション法を修正し、レシピエント同種異系抗原に予め曝露されていないナイーブドナー細胞に用いた（図９Ｅ）。この新たな方法では、予めあるいは同時に宿主抗原に曝露せず、また増殖性刺激も行わずにＦａｓＬ含有培地に曝露することにより、ナイーブ脾細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ除去した。ＦａｓＬによりナイーブＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のアポトーシスが増大したが（図９Ｆ）、のちにｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した生存細胞では同種異系反応が維持された（図９Ｇ）。したがって、未刺激脾細胞をＦａｓＬに曝露することにより、アポトーシス非感受性細胞が同種異系抗原に応答する能力が維持される。
【０１３５】
未刺激リンパ球のｅｘ  ｖｉｖｏ排除の効果を評価するため、致死線量未満で放射線照射したハプロタイプが一致するＦ１レシピエントに生存脾細胞を注入した（Ｈ２Ｋｂ−ＧＦＰ→Ｈ２Ｋｂ／ｄ）。培地でインキュベートした未感作リンパ球は比較的弱い致死的ＧｖＨＤのメディエーターであったため、ＬＰＳを用いてサイトカインストームを誘発し、ドナーリンパ球の活性を極性化した。ＦａｓＬで前処理した未刺激脾細胞のレシピエントのＬＰＳ抗原投与後の生存率７０％という値は、ｅｘ  ｖｉｖｏ除去した宿主刺激脾細胞のレシピエントの生存率を上回るものであったが、対照培地でインキュベートした脾細胞の全レシピエントに致死的ＧｖＨＤが発生した（図９Ｈ）。したがって、リスクの高い親からＦ１ハイブリッドへの急性ＧＶＨＤモデルにおいて、ドナーリンパ球をＦａｓＬで処置すると、予め宿主抗原に曝露することなく致命的ＧｖＨＤ（ＬＰＳ抗原投与）が予防された。
【０１３６】
ＧｖＨＤ予防の定量的側面および定性的側面
対照培地でインキュベートした後に生存脾細胞の養子移植したところ、致死線量未満で放射線照射したハプロタイプが一致するＦ１レシピエントに著しいＧｖＨＤが認められ、ドナー細胞をＦａｓＬとともにプレインキュベートすることにより抑制された（図１０Ａ）。体重の用量依存性の減少が、培地でインキュベートしたハプロタイプが一致する脾細胞のレシピエントにおける進行性ＧＶＨＤの重症度の証拠である（図１０Ｂ）。これに対して、ＦａｓＬとともにプレインキュベートしたナイーブ親脾細胞を注入したＦ１ハイブリッドマウスでは体重減少が有意に低い値を示し、ＧｖＨＤ重症度の軽減と一致するものであった。ハプロタイプ一致移植（Ｈ２Ｋｂ→Ｈ２Ｋｂ／ｄ）における臨床ＧｖＨＤスコア（図１０Ｃ）および体重減少（図１０Ｄ）は同種異系マウスの組合せ（Ｈ２Ｋｂ→Ｈ２Ｋｄ）で観察されたものよりも良好であり、同種異系移植では一貫して、ＧｖＨＤ予防にＦａｓＬとのプレインキュベーションの保護効果がより効果的であった。特に、マウスでのＴ細胞１．５〜５×１０６個の養子移植はヒトではＴ細胞６０〜２００×１０６個／ｋｇの投与量に相当するが、表現型Ｔ細胞除去によるＧｖＨＤ予防の安全閾値は、ハプロタイプ一致移植でＴ細胞０．０２×１０６個／ｋｇである。
【０１３７】
異なる実験群における生存個体の免疫プロファイルの差を評価するため、ＬＰＳ抗原投与前および抗原投与２日後に脾臓の組成物を評価した（図１０Ｅ）。致死線量未満の放射線照射後１週間は、脾細胞の養子移植とは関係なくＴ細胞およびＢ細胞サブセットはいずれも減少した。対照培地でインキュベートしたリンパ球のレシピエントは、脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにＢリンパ球のサージによりＬＰＳに応答し（ｐ＜０．００１）、ＦａｓＬで前処理した脾細胞のレシピエントではこれが有意に低下した（ｐ＜０．００１）。未分画脾細胞ではなく精製Ｔ細胞を用いて上記実験を再び実施したところ、ほぼ同じ結果を示した（データ不掲載）。
【０１３８】
ｅｘ  ｖｉｖｏでのデスリガンド曝露時間を決定するためのＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおけるＧｖＨＤの刺激
未刺激ドナーＴ細胞の選択的除去によるＧｖＨＤ予防では、考えられる２つの機序の関与について疑問が浮上する。第一に、致死線量未満の放射線照射によって生じる部分的な免疫枯渇および骨髄枯渇は、残存する宿主免疫要素がＦａｓＬ除去したドナーＴ細胞に対して良好に作動することによりＧｖＨＤが抑制されることを示唆している。第二に、全身放射線照射による前処置は、ＧｖＨＤの求心路（ａｆｆｅｒｅｎｔ  ａｒｍ）に何らかの重要な役割を果たす組織損傷を引き起こす。この２つの機序を評価するため、移植前処置を行わないリンパ球欠損ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに疾患を誘発した。未刺激脾細胞をＦａｓＬに２４時間および４８時間曝露したところ、有意なアポトーシスが誘発され（図１１Ａ）、これに対応してＣＤ４＋およびＣＤ８＋生存Ｔ細胞の割合が減少した（図１１Ｂ）。
【０１３９】
一連のキャリブレーション実験の後、ＦａｓＬ含有培地での２４時間または４８時間のｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーションの後、ナイーブ同種異系脾細胞をそれぞれ３×１０６個または３×１０７個をＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに注入した（Ｈ２Ｋｂ→Ｈ２Ｋｇ７）（図１１Ｃ）。培地でインキュベートした脾細胞を注入したところ、投与量の多いグループで約２０％が死亡し、ＬＰＳ抗原投与後には著しく高い死亡率が記録された（図１１Ｄ）。ＬＰＳ注射後のマウスの良好な生存率により、ドナーリンパ球が仲介する致死的ＧｖＨＤに対するＦａｓＬインキュベーションの保護効果がここでも明らかになった（図１１Ｄ）。この保護効果は臨床スコア（図１１Ｅ）および体重減少（図１１Ｆ）の著明な改善を伴うものであった。ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいて、能力のある免疫が宿主に残存しておらず、宿主に前処置による組織損傷などの素因がみられない状態でＧｖＨＤが予防されたことは、ＧｖＨＤが主として、未刺激リンパ球をＦａｓＬに曝露することによってドナーＴ細胞接種物を調節した結果であることを強調するものである。
【０１４０】
実施例４
造血細胞生着に対する未刺激リンパ球のｅｘ  ｖｉｖｏ選択的除去の影響
Ｆａｓ感受性ナイーブ脾細胞の除去が骨髄移植におけるＧＶＨＤを軽減する
ＧｖＨ様モデルでの発見を移植現場に拡大するため、Ｆａｓによる宿主ナイーブ細胞の除去の効果をドナーリンパ球注入とともにハプロタイプ一致ＢＭＴを受けているマウスで評価した（図１２Ａ）。対照培地でプレインキュベートした脾細胞１５０万個、３００万個および４５０万個とともにハプロタイプが一致するＢＭＣ  ５×１０６個を投与した放射線照射Ｆ１レシピエント（Ｈ２Ｋｂ→Ｈ２Ｋｂ／ｄ）に重度のＧｖＨＤが発症し（図１２Ｂ）、１０〜１５％の有意な体重減少がみられた（図１２Ｃ）。耳皮膚および肝臓標本の組織学的解析によりＧｖＨＤの臨床スコアを裏付けた（図１２Ｄ）。注入ナイーブ脾細胞をＦａｓＬとともに２４時間プレインキュベートすることによりＧｖＨＤ臨床スコアが減少し（ｐ＜０．００５）、体重減少が抑制され（ｐ＜０．００５）、罹患標的器官におけるリンパ球浸潤が減少した（ｐ＜０．００５）。しかし、残存する軽度のＧｖＨＤ活性が、ＦａｓＬで前処理したハプロタイプが一致する脾細胞３〜４．５×１０６個を注入した後にも持続した。このＴ細胞投与量がＴ細胞４〜６×１０個／Ｋｇの投与量に相当するものであり、これは適合非血縁ドナーからの無操作の同種異系全骨髄移植でよく投与されるＴ細胞数であることは注目すべきことである。
【０１４１】
ハプロタイプ一致ＢＭＴおよびアポトーシス感受性細胞の選択的除去後の免疫−造血系再構築
ＧｖＨＤは移植片の機能を抑制し、レシピエントの免疫応答を著しく打ち消す。Ｆａｓ感受性ドナー脾細胞の除去が移植後の免疫−造血系再構築にいかなる影響を及ぼすかを明らかにするため、移植ドナーリンパ球の生存率、キメリズムおよび無関係な抗原に対する免疫応答について宿主を評価した。ＦａｓＬで前処理した脾細胞のレシピエントよりも対照培地でプレインキュベートした無操作ドナー脾細胞の投与量が最も多い（４．５×１０６個）レシピエントの方が、移植後３週間および６週間におけるキメリズムのレベルが減少しており（図１３Ａ）、これはドナーリンパ球の前処理により未処理細胞の移植片抑制効果が打ち消されることを示している。
【０１４２】
移植時に注入した成熟リンパ球が骨髄移植片によって生じたリンパ球と末梢での恒常性増殖で競合し、正味のリンパ球数をもたらすため、ＦａｓＬ処理したリンパ球の注入がリンパ系再構築に及ぼす影響を検討した。移植後数週間にわたって、マイナーＣＤ４５抗原の相違（ＣＤ４５．１とＣＤ４５．２）を用いてレシピエントの注入脾細胞とＢＭＣ移植片由来Ｔ細胞を鑑別した。Ｆ１レシピエントが親免疫細胞を拒絶しないという事実があるにもかかわらず、移植の３週間後、ＦａｓＬとともにインキュベートしたか対照培地でインキュベートしたかに関係なく、レシピエントの末梢リンパ器官に注入脾細胞（Ｈ２Ｋｂ、ＣＤ４５．２＋ＧＦＰ＋）はほとんど検出されなかった（図１３Ｂ）。定性的には、対照およびＦａｓＬで前処理した脾細胞のレシピエントは、キメラマウスに予想される通りにドナー抗原にも宿主抗原にも無応答性を示し、サードパーティー（Ｈ２Ｋｋ）抗原に同程度に応答した（図１３Ｃ）。したがって、ＦａｓＬによるリンパ球のｅｘ  ｖｉｖｏ処理は、移植後に定量的にも機能的にも免疫再構築をもたらさないと思われるが、ＧｖＨＤ予防によりドナー細胞生着が改善する。
【０１４３】
本発明者らは、未刺激リンパ球のＦａｓＬとのプレインキュベーションによるＧｖＨＤの予防が細胞のナビゲーション能力の低下を原因とするものであるのかどうかという疑問を抱いた。致死線量未満で放射線照射したＦ１レシピエントに生存脾細胞を注入し（Ｈ２Ｋｂ−ＧＦＰ→Ｈ２Ｋｂ／ｄ）、細胞をＦａｓＬに前曝露するか、対照培地に前曝露するかに関係なく、注入２４時間後にリンパ球がレシピエントの脾臓および腸間膜リンパ節にホーミングしていることを示すことによって、この可能性を検討した（図１３Ｄ）。以上のデータは、リンパ球の前曝露により、ナビゲーション能力を低下させずに潜在的なＧｖＨＤエフェクターが除去されることを示すものである。
【０１４４】
造血細胞のデスリガンド曝露が生着を改善する
造血移植片からＴ細胞をすべて除去することにより、生着を促進する細胞が除去され、それを補うために幹細胞を大量に投与する必要がある。移植片をＦａｓＬとともに２４時間プレインキュベートしても（図１４Ａ）、放射線照射宿主への同種異系全ＢＭＣ２×１０６個の移植（Ｈ２Ｋｄ→Ｈ２Ｋｂ）によって引き起こされるドナーキメリズムのレベルに影響はみられなかった（図１４Ｂ）。したがって、移植前に異種全ＢＭＣ集団をデスリガンに曝露しても生着が失われることはない。
【０１４５】
Ｔ細胞は以下に挙げる２つの機序を介して造血前駆細胞の生着を補助する：ａ）残存するドナーの免疫による移植片拒絶反応にドナーＴ細胞が対抗し得ること、およびｂ）骨髄の播種部位にＴ細胞と前駆細胞とが共存し、未だ明らかにされていない非免疫原性の機序を介して生着を補助すること。拒絶反応を予防するためのアポトーシス感受性Ｔ細胞の除去が、生着を促進する細胞も排除するかどうかを明らかにするため、放射線照射したＨ２Ｋｂマウスに操作していない生存Ｈ２Ｋｄｌｉｎ−前駆細胞１０６個を移植した。このモデルでは、ＧｖＨＤ活性のないＦ１ドナー（Ｈ２Ｋｂ／ｄ）由来の脾細胞を用いた。対照培地でのインキュベーションまたはＦａｓＬとのインキュベーション後に生存Ｆ１脾細胞１０６個を注入したところ、ドナーキメリズムのレベルが増大し（図１４Ｃ）、これはＦａｓ感受性脾細胞を除去しても、ＨＳＰＣ生着を促進する細胞が排除されないことを示している。
【０１４６】
ドナーリンパ球をデスリガンドに前曝露すれば遅延させたドナーリンパ球注入の生着補助活性が保持される
移植後のドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）はドナーのキメリズムを改善し、感染に対する応答性を増強し、移植片対腫瘍反応を促進するのに効果的な方法である。遅延させたＤＬＩの方が造血移植時に前処置レシピエントにリンパ球を注入するよりも耐容性に優れ、ＧｖＨＤを引き起こしにくいが、リンパ球がＧｖＨＤの重症度を増大させる能力を有する。混合キメリズムのモデルに遅延させたドナーリンパ球注入を実施したところ（図１４Ｅ）、移植前にリンパ球をＦａｓＬに曝露するかどうかにに関係なくドナーキメリズムのレベルを増大させる効果がみられた（図１４Ｆ）。したがって、Ｆａｓ感受性未刺激リンパ球の除去によって移植後ＤＬＬの効果が低下することはない。
【０１４７】
ＦａｓＬはＧＶＴを低下させずにＧＶＨＤを軽減する
悪性疾患の治療に実施された幹細胞移植が全体的に成功したのは、移植片対腫瘍（ＧｖＴ）効果によるものであると考えられる。様々な臨床状況では、Ｔ細胞のバルク除去（ｅｉｔｈｅｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏで、または強力なｉｎ  ｖｉｖｏ免疫抑制の実施によって）によりＧｖＴ効果が抑制され、移植後の再発率が増大することがある。２つの実験モデルを用いて、ＦａｓＬインキュベーションがＧｖＴ効果を打ち消すかどうかをそのＧｖＨＤに対する有益な効果と平行して検討した。第一のモデルでは、宿主適合リンパ球の同種異系腫瘍に対するＧｖＴ反応性がＦａｓＬによる除去後に保持されるかどうかを評価した。ＮＯＤ（免疫能のある）ドナーの脾細胞１．５×１０７個を養子移入したＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（Ｈ２Ｋｇ７）にＣＴ２６結腸癌細胞（Ｈ２Ｋｄ）を移植した（Ｈ２Ｋｇ７、図１５Ａ）。ＦａｓＬとともに２４時間プレインキュベートした脾細胞では対照培地でインキュベートした脾細胞と同程度に腫瘍移植物の成長が抑制され（図１５Ｂ）、これはＦａｓＬとのインキュベーションにより、リンパ球が仲介するＧｖＴ反応性が保持されることを裏付けるものである。第二のモデルでは、ＭＨＣ適合神経芽腫（Ｎｅｕｒｏ−２ａ、Ｈ２Ｋａ）腫瘍を有するＨ２Ｋａマウスに致死線量未満の放射線を照射し、同種異系ドナーのｌｉｎ−前駆細胞２×１０６個を移植した（Ｈ２Ｋｂ、図１５Ｃ）。腫瘍を自己として認識するＦ１ドナーのリンパ球（Ｈ２Ｋｂ／ｄ）を注入しても、腫瘍成長に対して何ら有意な影響はみられなかった（図１５Ｄ）。これに対して、同種異系脾細胞（Ｈ２Ｋｂ）を注入すると腫瘍成長速度が低下したが、マウスの８０％が重度のＧｖＨＤのため３週間以内に死亡した。Ｆａｓによる未刺激ドナー脾細胞（Ｈ２Ｋｂ）のｅｘ  ｖｉｖｏ除去では、同等の腫瘍抑制効果がみられると同時に致命的ＧｖＨＤが軽減され、全マウスが実験終了時まで生存した。以上のデータは、ＧＶＨＤがＧｖＴ効果の必要条件ではなく、したがって、ＧｖＨＤの予防が選択的除去を受けたリンパ球の抗腫瘍活性を低下させることはないことを裏付けるものである。
【０１４８】
ＦａｓＬによる悪性細胞のパージング
侵襲性の放射線化学療法の自己移植片には大きな利点および安全性が認められるが、移植片に残存悪性細胞が混入すれば疾患再発の危険因子となる。この可能性を検討するため、同系のＢＡＬＢ／ｃマウスでは致死量となる量の骨髄細胞とＡ２０Ｂ細胞リンパ腫との混合物をマウスに注入した（図１５Ｅ）。培地でインキュベートした細胞混合物を注入したところ、４週間以内にレシピエントの８０％が死亡したのに対して、ＦａｓＬに曝露した移植片を注入したマウスでは全個体がこの期間生存していた（図１５Ｆ）。以上のデータは、造血移植片からアポトーシス感受性の悪性細胞を除去するためにデスリガンドとともに短時間インキュベーションすることが有効であることを裏付けるものである。
【０１４９】
Ｆａｓ感受性細胞の除去が自己移植片における自己免疫の養子移植を防ぐ
１型糖尿病は膵臓ランゲルハンス島のインスリン産生β細胞を破壊する自己免疫反応である。この障害は一般に非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ）でモデル化されており、疾患発症率は３０週齢雌で８０％である。自己免疫糖尿病はＴ細胞によって養子移入されるが、全骨髄細胞の移植ではあまり効率が高くない。予備実験では、骨髄細胞５×１０７個により、致死線量未満の放射線を照射したＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスの約５０％に疾患が移入され（図１５Ｇ）、両系統ともハプロタイプ（Ｈ２Ｋｇ７）を有することが明らかになった。さらに、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスは免疫能のあるＴリンパ球およびＢリンパ球を欠くため、ドナー細胞を拒絶しない。培地で４８時間インキュベートしたＢＭＣの養子移植では疾患が効率的に移入されたのに対して、ＦａｓＬに曝露したＢＭＣのレシピエントには高血糖症がみられなかった（図１５Ｈ）。したがって、造血細胞をｅｘ  ｖｉｖｏでデスリガンドに曝露することにより、自己免疫反応性を有する細胞が排除される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
0006429191.tif 000009
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
0006429191.tif 000013
【図２Ｆ】
0006429191.tif 000014
【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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