(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態。
【請求項２】
２シータ度＋／−０．２度において得られる下記のピーク：９．１、１０．２、１１．９、１３．０、１７．１、１７．７、１８．７、２０．３、２０．８、２６．０、２６．７、２３．２、２４．１、２４．８、２９．３、２７．４、および２１．４を含むＸ線粉末回折パターンを特徴とする、請求項１に記載の無水結晶形態。
【請求項３】
図１：
0006310474.tif 000008
に示すＸ線粉末回折スペクトルと同じであるＸ線回折スペクトルを有する、請求項１に記載の無水結晶形態。
【請求項４】
図２：
0006310474.tif 000009
に示すものと同じである示差走査熱量測定グラフを有する、請求項１に記載の無水結晶形態。
【請求項５】
医薬品として使用するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の形態。
【請求項６】
治療有効量の請求項１から４のいずれか一項に記載の形態、および１種または複数の治療活性剤を含む組合せ剤。
【請求項７】
関節リウマチ（ＲＡ）；尋常性天疱瘡（ＰＶ）；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）；自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）；後天性血友病Ａ型（ＡＨＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；多発性硬化症（ＭＳ）；重症筋無力症（ＭＧ）；シェーグレン症候群（ＳＳ）；ＡＮＣＡが関連する血管炎；寒冷グロブリン血症；慢性自己免疫性じんま疹（ＣＡＵ）；アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎およびアレルギー性鼻炎からなる群から選択されるアレルギー；グッドパスチャー症候群；移植片拒絶；造血起源の癌；ならびに、重症および脳マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トキソプラズマ症および神経嚢虫症からなる群から選択される疾患または感染症が関連する免疫病理からなる群から選択される、ＰＩ３Ｋ酵素の活性が媒介する疾患または障害の治療用の医薬の製造のための、請求項１から４のいずれか一項に記載の形態の使用。
【請求項８】
ＰＩ３Ｋ酵素の活性が、ＰＩ３Ｋδイソ型の活性である、請求項７に記載の形態の使用。
【請求項９】
治療有効量の請求項１から４のいずれか一項に記載の形態、および１種または複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジヒドロ−ピリド−オキサジン誘導体の新規な固体形態、その調製のための方法および医薬組成物におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＯ２０１３／０９３８４９として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０５７５５４号は、ＰＩ３Ｋ酵素の活性が媒介する障害または疾患の治療に適したジヒドロ−ベンゾ−オキサジンおよびジヒドロ−ピリド−オキサジン誘導体を開示している。ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０５７５５４は、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノン、およびこの化合物を作製する方法を開示している。
【０００３】
これらの化合物は、単独で、または１種もしくは複数の他の薬理学的活性化合物と組み合わせて、限定はされないが、自己免疫障害、炎症性疾患、アレルギー性疾患、気道疾患、例えば、喘息およびＣＯＰＤ、移植片拒絶、例えば、造血起源の癌または固形腫瘍を含む、ＰＩ３Ｋが関連する疾患の治療のために有用である。
【０００４】
これらの化合物はまた、単独で、または１種もしくは複数の他の薬理学的活性化合物と組み合わせて、状態、疾患または障害、例えば、自己免疫障害、炎症性疾患、アレルギー性疾患、気道疾患、例えば、喘息およびＣＯＰＤ、移植片拒絶；関節リウマチ、尋常性天疱瘡、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、シェーグレン症候群、自己免疫性溶血性貧血、ＡＮＣＡが関連する血管炎、寒冷グロブリン血症、血栓性血小板減少性紫斑病、慢性自己免疫性じんま疹、アレルギー（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎）、グッドパスチャー症候群、ＡＭＲ（抗体が媒介する移植片拒絶）、Ｂ細胞が媒介する超急性、急性および慢性の移植片拒絶、ならびに限定はされないが、多発性骨髄腫；白血病；急性骨髄性白血病；慢性骨髄性白血病；リンパ球性白血病；骨髄性白血病；非ホジキンリンパ腫；リンパ腫；真性赤血球増加症；本態性血小板血症；骨髄様化生を伴う骨髄線維症；およびワルデンシュトレーム病を含む造血起源の癌を含み、抗体産生、抗原提示、サイトカイン産生またはリンパ組織形成が異常であるか、または望ましくないもの；より適切には、関節リウマチ（ＲＡ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、後天性血友病Ａ型（ＡＨＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、ＡＮＣＡが関連する血管炎、寒冷グロブリン血症、慢性自己免疫性じんま疹（ＣＡＵ）、アレルギー（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎）、グッドパスチャー症候群、移植片拒絶および造血起源の癌、ならびに疾患または感染症が関連する免疫病理、例えば、重症および脳マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トキソプラズマ症および神経嚢虫症の治療のために有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態；この形態を含む医薬組成物および組合せに関する。本発明はさらに、ＰＩ３Ｋ酵素の活性、好ましくは、ＰＩ３Ｋδイソ型の活性が媒介する疾患の治療のための、その医薬組成物および組合せを含む、この形態を使用する方法に関する。
【０００６】
特定の薬物の活性医薬成分（ＡＰＩ）の結晶形態は、薬物の調製の容易さ、吸湿性、安定性、溶解性、保存安定性、製剤の容易さ、胃腸液における溶解の速度、およびインビボでのバイオアベイラビリティーの重要な決定要因であることが多いことは周知である。結晶形態が起こり、ここでは同じ物質組成が異なる格子配列で結晶化し、特定の結晶形態に特異的な異なる熱力学的特性および安定性をもたらす。結晶形態はまた、同じ化合物の異なる水和物または溶媒和物を含み得る。どの形態が好ましいかを決定することにおいて、形態の多数の特性を比較し、多くの物理的特性の可変部分に基づいて好ましい形態を選択する。特定の態様、例えば、調製の容易さ、安定性などが決定的であると認められるある環境において、１つの形態が好ましくあり得ることが全体的に可能である。他の状況において、より速い溶解速度および／またはより優れたバイオアベイラビリティーのために、異なる形態が好ましくてもよい。特定の化合物が多形を形成するかどうか、任意のこのような多形が治療組成物で商業的使用に適しているかどうか、またはどのような多形がこのような望ましい特性を示すかを予想することはまだ可能ではない。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例Ｆ１、結晶性無水形態のＸ線粉末回折パターンである。
【図２】実施例Ｆ１、結晶性無水形態の示差走査熱量測定グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
一実施形態において、本発明は、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態に関する。
【０００９】
別の実施形態において、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態は、２シータ度＋／−０．２度において得られる下記のピーク：９．１、１０．２、１１．９、１３．０、１７．１、１７．７、１８．７、２０．３、２０．８、２６．０、２６．７、２３．２、２４．１、２４．８、２９．３、２７．４、および２１．４を含むＸ線粉末回折パターンを特徴とする。
【００１０】
別の実施形態において、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態は、図１に示すＸ線粉末回折スペクトルと実質的に同じＸ線回折スペクトルを有する。
【００１１】
別の実施形態において、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態は、図２に示す示差走査熱量測定グラフと実質的に同じ示差走査熱量測定グラフを有する。
【００１２】
他に特定しない限り、用語「本発明の形態」は、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態を指す。
【００１３】
本明細書の上および下で使用される一般用語は好ましくは、他に示さない限り、この開示の文脈内で下記の意味を有する。
【００１４】
本発明は、以下の用語集および結びの実施例を含む以下の説明を参照してより完全に理解することができる。本明細書で使用される場合、用語「含むこと（including）」、「含有すること（containing）」および「含むこと（comprising）」は、オープンな、限定されない意味で、本明細書で使用される。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」には、当業者に知られている、任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料などおよびこれらの組合せが含まれる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版 Mack Printing Company, 1990, 1289-1329ページを参照されたい）。任意の通常の担体が、活性成分と相溶性がない場合を除いて、治療または医薬組成物におけるその使用が考えられる。本発明の化合物の用語「治療有効量」は、対象の生物学的または医学的反応、例えば、酵素もしくはタンパク質活性の低減もしくは阻害を誘発し、または症状を寛解し、状態を軽減し、疾患の進行を遅くしもしくは遅延させ、または疾患などを予防する本発明の化合物の量を指す。１つの非限定的な実施形態において、用語「治療有効量」は、対象に投与したとき、（１）（ｉ）ＰＩ３Ｋが媒介し、または（ｉｉ）ＰＩ３Ｋ活性と関連し、または（ｉｉｉ）ＰＩ３Ｋの活性（正常もしくは異常）によって特徴付けられる、状態、または障害または疾患を少なくとも部分的に軽減し、阻害し、予防しかつ／または寛解させ、あるいは（２）ＰＩ３Ｋの活性を低減または阻害し、あるいは（３）ＰＩ３Ｋの発現を低減または阻害するのに有効な本発明の化合物の量を指す。別の非限定的な実施形態において、用語「治療有効量」は、細胞、または組織、または細胞ではない生物学的材料、または培地に投与されたとき、ＰＩ３Ｋの活性を少なくとも部分的に低減もしくは阻害する；またはＰＩ３Ｋの発現を少なくとも部分的に低減もしくは阻害するのに有効な本発明の化合物の量を指す。ＰＩ３Ｋについての上記の実施形態において例示したような用語「治療有効量」の意味はまた、任意の他の関連性のあるタンパク質／ペプチド／酵素に同じ意味で適用される。
【００１６】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、動物を指す。典型的には、動物は哺乳動物である。対象は、例えば、霊長類（例えば、ヒト、男性または女性）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚、鳥なども指す。特定の実施形態において、対象は霊長類である。さらに別の実施形態において、対象はヒトである。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「阻害する」、「阻害」または「阻害すること」は、
所与の状態、症状、もしくは障害、もしくは疾患の低減もしくは抑制、または生物学的活動もしくは過程の基本的活動における著しい減少を指す。
【００１８】
本明細書で使用される場合、任意の疾患または障害の用語「治療する」、「治療すること」または「治療」は、一実施形態において、疾患または障害を改善すること（即ち、疾患の進行またはその臨床症状の少なくとも一つを遅らせることまたは阻むことまたは減少させること）を指す。別の実施形態において、「治療する」、「治療すること」または「治療」は、患者によって認識され得ない場合もあるものを含む、少なくとも一つの身体的パラメーターを軽減することまたは改善することを指す。さらに別の実施形態において、「治療する」、「治療すること」または「治療」は、身体的（例えば、認識できる症状の安定化）、生理的（例えば、身体的パラメーターの安定化）のいずれかで、または両方で、疾患または障害を調節することを指す。さらに別の実施形態において、「治療する」、「治療すること」または「治療」は、疾患または障害の発症または発現または進行を防止することまたは遅らせることを指す。
【００１９】
本明細書で使用される場合、対象が、生物学的、医学的または生活の質において、治療から利益を得る場合、このような対象は、このような治療を「必要とする」。
【００２０】
本明細書で使用される場合、本発明の文脈で、特に特許請求の範囲の文脈で使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および類似の用語は、本明細書で他に指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むものと解釈されるべきである。
【００２１】
本明細書に記載された全ての方法は、本明細書で他に指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に提供される任意の全ての例、または例示的な言葉、例えば「〜などの」の使用は、単に本発明をより明らかにするよう意図されており、別に特許請求の範囲に記載された本発明の範囲に制限を課すものではない。
【００２２】
別の態様において、本発明は、本発明の形態および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、経口投与、非経口投与、および直腸投与などの特定の投与経路のために製剤化することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、固体形態（無制限に、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤もしくは坐剤を含む）に、または液体形態（無制限に、溶液剤、懸濁液剤もしくは乳濁液剤を含む）に作ることができる。医薬組成物は、滅菌などの通常の製薬工程にかけることができ、かつ／または通常の不活性希釈剤、滑沢剤、または緩衝剤、ならびにアジュバント、例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤および緩衝液などを含有することができる。
【００２３】
典型的に、医薬組成物は、
ａ）希釈剤、例えば、乳糖、デキストロース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／もしくはグリシン；
ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、タルカム、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩および／もしくはポリエチレングリコール；錠剤についてはさらに
ｃ）結合剤、例えば、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／もしくはポリビニルピロリドン；必要に応じて
ｄ）崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡混合物；ならびに／または
ｅ）吸収剤、着色剤、香味剤および甘味剤
と一緒に活性成分を含む錠剤またはゼラチンカプセル剤である。
【００２４】
錠剤は、当技術分野で知られている方法に従って、フィルムコーティングまたは腸溶コーティングすることができる。
【００２５】
経口投与に好適な組成物は、錠剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液剤、分散性散剤、もしくは顆粒剤、乳濁液剤、硬質もしくは軟質カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤の形態で、有効量の本発明の形態を含む。経口使用を目的とした組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野で知られている任意の方法に従って調製し、このような組成物は、薬学的に上質で味のよい製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される１種または複数の薬剤を含有することができる。錠剤は、錠剤の製造に適する、非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物として活性成分を含有することができる。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；造粒剤および崩壊剤、例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア；および滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。錠剤は、コーティングされていないか、または崩壊および消化管中での吸収を遅らせ、それにより長期にわたって持続作用を提供するために、既知の技術によってコーティングされている。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料が使用され得る。経口使用のための製剤は、活性成分が、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合された硬質ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が、水もしくは油性媒体、例えば、ラッカセイ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油と混合された軟質ゼラチンカプセル剤として提供することができる。
【００２６】
特定の注射用組成物は、水性等張液または懸濁液であり、坐剤は、脂肪乳濁液または懸濁液から有利に調製される。前記組成物は、滅菌することができ、かつ／またはアジュバント、例えば保存剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤（solution promoter）、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝液を含有することができる。加えて、それらは、他の治療上有益な物質を含有することもできる。前記組成物は、それぞれ、通常の混合、造粒またはコーティング法に従って調製され、約０．１〜７５％、または約１〜５０％の活性成分を含有する。
【００２７】
経皮投与に適する組成物は、好適な担体と共に、有効量の本発明の形態を含む。経皮送達に適する担体は、宿主の皮膚を通した通過を助けるための吸収性の薬理学的に許容される溶媒を含む。例えば、経皮デバイスは、基材、場合によって担体と共に、場合によって、長期間にわたって制御された所定の速度で、宿主の皮膚の化合物を送達するための速度調節バリアと共に、化合物を含有する貯留層、および皮膚にデバイスを固定するための手段を含む包帯の形態をしている。
【００２８】
局所適用、例えば、皮膚および眼に適した組成物には、水溶液剤、懸濁液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤または、例えばエアゾールによる送達用のスプレー可能な製剤などが含まれる。このような局所送達系は、例えば、皮膚癌の治療のための、例えば、日焼け止めクリーム剤、ローション剤、スプレー剤などにおける予防的使用のための皮膚適用に特に適する。したがって、それらは、当技術分野で周知の、化粧品を含む局所製剤における使用に特に適している。このような組成物は、可溶化剤、安定剤、張性増強剤、緩衝剤および保存剤を含有することができる。
【００２９】
本明細書で使用される局所適用は、吸入または鼻腔内適用に属してもよい。それらは、好適な噴射剤の使用を用いるまたは用いない、乾燥粉末吸入器または加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザーもしくはネブライザーからのエアゾールスプレー提示からの、乾燥粉末（混合物、例えば乳糖とのドライブレンドとして単独で、または、例えばリン脂質との混合成分粒子）の形態で好都合に送達することができる。
【００３０】
水が、特定の化合物の分解を促進することがあるので、本発明は、活性成分として本発明の形態を含む無水医薬組成物および剤形をさらに提供する。
【００３１】
本発明の無水医薬組成物および剤形は、無水または低水分含有成分および低水分または低湿度条件を使用して調製することができる。無水医薬組成物は、その無水性が保たれるように調製し貯蔵することができる。したがって、無水組成物は、それらが、好適な処方キットに含まれ得るように、水への曝露を防ぐことが知られている材料を使用して包装される。好適な包装の例には、限定はされないが、密閉されたホイル、プラスチック、単位用量容器（例えば、バイアル）、ブリスターパック、およびストリップパックが含まれる。
【００３２】
本発明は、活性成分としての本発明の形態が分解する速度を減少させる１種または複数の薬剤を含む医薬組成物および剤形をさらに提供する。「安定剤」と本明細書で呼ばれるこのような薬剤には、限定はされないが、アスコルビン酸などの抗酸化剤、ｐＨ緩衝剤、または塩緩衝液などが含まれる。
【００３３】
本発明の形態は、関節リウマチ、尋常性天疱瘡および関連する疾患、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、シェーグレン症候群、自己免疫性溶血性貧血、ＡＮＣＡが関連する血管炎、寒冷グロブリン血症、血栓性血小板減少性紫斑病、慢性自己免疫性じんま疹、アレルギー（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎）、グッドパスチャー症候群、ＡＭＲ（抗体が媒介する移植片拒絶）、Ｂ細胞が媒介する超急性、急性および慢性の移植片拒絶、ならびに限定はされないが、多発性骨髄腫；急性骨髄性白血病；慢性骨髄性白血病；リンパ球性白血病；骨髄性白血病；非ホジキンリンパ腫；リンパ腫；真性赤血球増加症；本態性血小板血症；骨髄様化生を伴う骨髄線維症；およびワルデンシュトレーム病を含む造血起源の癌を含む、Ｂ細胞の機能の１つまたは複数、例えば、抗体産生、抗原提示、サイトカイン産生またはリンパ組織形成が異常であるか、または望ましくない疾患または感染症が関連する免疫病理を含む状態、疾患または障害の治療において有用であり得る。
【００３４】
本発明は、関節リウマチ、敗血症、肺または呼吸器障害、例えば、喘息、炎症性皮膚病、例えば、乾癬を含む、好中球の機能の１つまたは複数、例えば、スーパーオキシド放出、刺激された開口分泌、または走化性移動が異常であるか、または望ましくない状態、疾患または障害、ならびに疾患または感染症が関連する免疫病理などを治療する方法を含む。
【００３５】
本発明は、アレルギー性疾患（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎）を含む、好塩基球および肥満細胞の機能の１つまたは複数、例えば、走化性移動またはアレルゲン−ＩｇＥ−媒介脱顆粒が異常であるか、または望ましくない状態、疾患または障害、ならびに他の障害、例えば、ＣＯＰＤ、喘息または気腫を治療する方法を含む。
【００３６】
本発明は、関節リウマチ、多発性硬化症、細胞組織もしくは臓器移植の急性もしくは慢性拒絶、または造血起源の癌を含む、Ｔ細胞の機能の１つまたは複数、例えば、サイトカイン産生または細胞が媒介する細胞毒性が異常であるか、または望ましくない状態、疾患または障害、ならびに疾患または感染症が関連する免疫病理を治療する方法含む。
【００３７】
さらに、本発明は、神経変性疾患、心血管疾患および血小板凝集を治療する方法を含む。さらに、本発明は、皮膚疾患、例えば、晩発性皮膚ポルフィリン症、多形日光疹、皮膚筋炎、日光じんま疹、口腔扁平苔癬、脂肪織炎、強皮症、じんま疹様血管炎を治療する方法を含む。
【００３８】
さらに、本発明は、慢性炎症性疾患、例えば、サルコイドーシス、環状肉芽腫を治療する方法を含む。
【００３９】
他の実施形態において、（例えば、ＰＩ３Ｋが媒介する）状態または障害は、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、骨髄様化生を伴う骨髄線維症、喘息、ＣＯＰＤ、ＡＲＤＳ、レフラー症候群、好酸球性肺炎、寄生虫（特に、後生動物）の寄生（熱帯性好酸球増加症を含む）、気管支肺アスペルギルス症、結節性多発性動脈炎（チャーグ−ストラウス症候群を含む）、好酸球性肉芽腫、薬物反応によって引き起こされる気道に影響を与える好酸球が関連する障害、乾癬、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、円形脱毛症、多形性紅斑、疱疹状皮膚炎、強皮症、白斑、過敏性脈管炎、じんま疹、水疱性類天疱瘡、エリテマトーデス、天疱瘡、後天性表皮水疱症、自己免疫性血液障害（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血および特発性血小板減少症）、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティーブンスジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、肺胞炎、慢性過敏性肺臓炎、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎（前部および後部）、間質性肺線維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、深部静脈血栓症、脳卒中、心筋梗塞、不安定狭心症、血栓塞栓症、肺塞栓症、血栓溶解症、急性動脈虚血、末梢の血栓性閉塞、および冠動脈疾患、再灌流傷害、網膜症、例えば、糖尿病性網膜症または高圧酸素によって誘発される網膜症、ならびに上昇した眼内圧または眼房水の分泌によって特徴付けられる状態、例えば、緑内障からなる群から選択される。
【００４０】
別の実施形態において、本発明の形態は、自己免疫疾患、および炎症状態、特に、自己免疫性成分を含む病因を伴う炎症状態、例えば、関節炎（例えば、関節リウマチ、慢性進行性関節炎および変形性関節炎）、ならびに炎症状態を含むリウマチ性疾患、および骨喪失が関与するリウマチ性疾患、炎症性疼痛、強直性脊椎炎を含む脊椎関節症、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、および腸炎性関節炎、過敏症（気道過敏症および皮膚過敏症の両方を含む）、ならびにアレルギーの治療、予防、または寛解において有用である。それに対して本発明の形態を用い得る特定の自己免疫疾患には、自己免疫性血液障害（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血および特発性血小板減少症を含む）、後天性血友病Ａ、寒冷凝集素症、寒冷グロブリン血症、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、炎症性筋障害、多発性軟骨炎、強皮症、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、ＩｇＭ媒介ニューロパシー、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブンスジョンソン症候群、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病および過敏性腸症候群を含む）、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、視神経脊髄炎、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（真性糖尿病Ｉ型）、ブドウ膜炎（前部、中間部および後部、ならびに汎ぶどう膜炎）、乾性角結膜炎および春季角結膜炎、間質性肺線維症、乾癬性関節炎および糸球体腎炎（例えば、特発性ネフローゼ症候群または微小変化型ネフロパシーを含むネフローゼ症候群を伴う、および伴わない）、腫瘍、皮膚および角膜の炎症性疾患、筋炎、骨移植片のゆるみ、代謝性障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、ならびに異脂肪血症が含まれる。
【００４１】
別の実施形態において、本発明の形態は、原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫、自己免疫性水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ブラジルの天疱瘡の固有の形態（ブラジル天疱瘡）、腫瘍随伴性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、慢性移植片対宿主病、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス、血管炎、小血管炎、低補体血症性じんま疹様血管炎、抗好中球細胞質抗体−血管炎、寒冷グロブリン血症、シュニッツラー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、血管性浮腫、白斑、全身性エリテマトーデス、特発性血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、寒冷凝集素症、自己免疫性溶血性貧血、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、移植片対宿主病、寒冷グロブリン血症および血栓性血小板減少性からなる群から選択される状態または障害の治療において有用である。
【００４２】
このように、さらなる実施形態として、本発明は、治療における（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態の使用を提供する。さらなる実施形態において、治療は、ＰＩ３Ｋの阻害によって治療し得る疾患から選択される。別の実施形態において、疾患は、上述の一覧、適切には、自己免疫障害、炎症性疾患、アレルギー性疾患、気道疾患、例えば、喘息およびＣＯＰＤ、移植片拒絶；関節リウマチ、尋常性天疱瘡、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、シェーグレン症候群、自己免疫性溶血性貧血、ＡＮＣＡが関連する血管炎、寒冷グロブリン血症、血栓性血小板減少性紫斑病、慢性自己免疫性じんま疹、アレルギー（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎）、グッドパスチャー症候群、ＡＭＲ（抗体が媒介する移植片拒絶）、Ｂ細胞が媒介する超急性、急性および慢性の移植片拒絶、ならびに限定はされないが、多発性骨髄腫；白血病；急性骨髄性白血病；慢性骨髄性白血病；リンパ球性白血病；骨髄性白血病；非ホジキンリンパ腫；リンパ腫；真性赤血球増加症；本態性血小板血症；骨髄様化生を伴う骨髄線維症；およびワルデンシュトレーム病を含む造血起源の癌を含む、抗体産生、抗原提示、サイトカイン産生またはリンパ組織形成が異常であるか、または望ましくないものから；より適切には、関節リウマチ（ＲＡ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、後天性血友病Ａ型（ＡＨＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、ＡＮＣＡが関連する血管炎、寒冷グロブリン血症、慢性自己免疫性じんま疹（ＣＡＵ）、アレルギー（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎）、グッドパスチャー症候群、移植片拒絶および造血起源の癌、ならびに疾患または感染症が関連する免疫病理、例えば、重症および脳マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トキソプラズマ症および神経嚢虫症から選択される。
【００４３】
別の実施形態において、本発明は、治療的に許容される量の（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態を投与することを含む、ＰＩ３Ｋの阻害によって治療される疾患を治療する方法を提供する。さらなる実施形態において、疾患は、上述の一覧から、適切には、自己免疫障害、炎症性疾患、アレルギー性疾患、気道疾患、例えば、喘息およびＣＯＰＤ、移植片拒絶；関節リウマチ、尋常性天疱瘡、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、シェーグレン症候群、自己免疫性溶血性貧血、ＡＮＣＡが関連する血管炎、寒冷グロブリン血症、血栓性血小板減少性紫斑病、慢性自己免疫性じんま疹、アレルギー（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎）、グッドパスチャー症候群、ＡＭＲ（抗体が媒介する移植片拒絶）、Ｂ細胞が媒介する超急性、急性および慢性の移植片拒絶、ならびに限定はされないが、多発性骨髄腫；白血病；急性骨髄性白血病；慢性骨髄性白血病；リンパ球性白血病；骨髄性白血病；非ホジキンリンパ腫；リンパ腫；真性赤血球増加症；本態性血小板血症；骨髄様化生を伴う骨髄線維症；およびワルデンシュトレーム病を含む造血起源の癌を含む、抗体産生、抗原提示、サイトカイン産生またはリンパ組織形成が異常であるか、または望ましくないものから；より適切には、関節リウマチ（ＲＡ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、後天性血友病Ａ型（ＡＨＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、ＡＮＣＡが関連する血管炎、寒冷グロブリン血症、慢性自己免疫性じんま疹（ＣＡＵ）、アレルギー（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎）、グッドパスチャー症候群、移植片拒絶および造血起源の癌、ならびに疾患または感染症が関連する免疫病理、例えば、重症および脳マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トキソプラズマ症および神経嚢虫症から選択される。
【００４４】
このように、さらなる実施形態として、本発明は、医薬の製造のための（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態の使用を提供する。さらなる実施形態において、医薬は、ＰＩ３Ｋの阻害によって治療し得る疾患の治療のためである。別の実施形態において、疾患は、上述の一覧から、適切には、自己免疫障害、炎症性疾患、アレルギー性疾患、気道疾患、例えば、喘息およびＣＯＰＤ、移植片拒絶；関節リウマチ、尋常性天疱瘡、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、シェーグレン症候群、自己免疫性溶血性貧血、ＡＮＣＡが関連する血管炎、寒冷グロブリン血症、血栓性血小板減少性紫斑病、慢性自己免疫性じんま疹、アレルギー（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎）、グッドパスチャー症候群、ＡＭＲ（抗体が媒介する移植片拒絶）、Ｂ細胞が媒介する超急性、急性および慢性の移植片拒絶、ならびに限定はされないが、多発性骨髄腫；白血病；急性骨髄性白血病；慢性骨髄性白血病；リンパ球性白血病；骨髄性白血病；非ホジキンリンパ腫；リンパ腫；真性赤血球増加症；本態性血小板血症；骨髄様化生を伴う骨髄線維症；およびワルデンシュトレーム病を含む造血起源の癌を含む、抗体産生、抗原提示、サイトカイン産生またはリンパ組織形成が異常であるか、または望ましくないものから；より適切には、関節リウマチ（ＲＡ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、後天性血友病Ａ型（ＡＨＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、ＡＮＣＡが関連する血管炎、寒冷グロブリン血症、慢性自己免疫性じんま疹（ＣＡＵ）、アレルギー（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎）、グッドパスチャー症候群、移植片拒絶および造血起源の癌、ならびに疾患または感染症が関連する免疫病理、例えば、重症および脳マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トキソプラズマ症および神経嚢虫症から選択される。
【００４５】
本発明の医薬組成物または組合せは、約５０〜７０ｋｇの対象に、約１〜１０００ｍｇの活性成分、または約１〜５００ｍｇまたは約１〜２５０ｍｇまたは約１〜１５０ｍｇまたは約０．５〜１００ｍｇ、または約１〜５０ｍｇの活性成分の単位用量であり得る。化合物、その医薬組成物、またはこれらの組合せの治療有効投与量は、対象の種、体重、年齢および個別状態、障害または疾患または治療する障害または疾患の重症度に依存する。通常の技術の医師、臨床医または獣医師は、障害または疾患を予防する、治療するまたは進行を阻害するために必要な活性成分のそれぞれの有効量を容易に決定できる。
【００４６】
上記の投与特性は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サルまたは単離臓器、組織およびその調製物などの有利な哺乳動物を使用したインビトロおよびインビボ試験で証明できる。本発明の形態は、溶液、例えば、水溶液の形態で、インビトロにて、および例えば、懸濁液として、または水溶液において、インビボにて経腸的に、非経口的に、有利には静脈内で適用することができる。インビトロでの用量は、約１０−３モル濃度と１０−９モル濃度との間の範囲で変わり得る。インビボでの治療有効量は、投与経路に依存し、約０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ、または約１〜１００ｍｇ／ｋｇの間の範囲であり得る。
【００４７】
本発明の形態は、１種または複数の他の治療剤と同時に、または１種もしくは複数の他の治療剤の前もしくは後に投与し得る。本発明の形態は、別々に、同じもしくは異なる投与経路によって、または他の薬剤として同じ医薬組成物において一緒に投与し得る。
【００４８】
一実施形態において、本発明は、治療における同時の、別々のまたは逐次の使用のための合わせた調製物として、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態および少なくとも１種の他の治療剤を含む生成物を提供する。一実施形態において、治療は、ＰＩ３Ｋ酵素の活性が媒介する疾患または状態の治療である。合わせた調製物として提供される生成物は、同じ医薬組成物中で一緒に、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態および他の治療剤（複数可）を含む組成物、または別々の形態で、例えば、キットの形態で、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態および他の治療剤（複数可）を含む。
【００４９】
一実施形態において、本発明は、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態および別の治療剤（複数可）を含む医薬組成物を提供する。任意選択で、医薬組成物は、上記のような薬学的に許容される担体を含み得る。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、２種以上の別々の医薬組成物を含むキットを提供し、これらの少なくとも１つは、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態を含有する。一実施形態において、キットは、前記組成物を別々に保持するための手段、例えば、容器、分割されたボトル、または分割されたホイルパケットを含む。このようなキットの一例は、典型的には錠剤、カプセル剤などのパッケージングのために使用されるようなブリスターパックである。
【００５１】
本発明のキットは、異なる剤形、例えば、経口および非経口を投与するために、異なる投与間隔での別々の組成物を投与するために、または別々の組成物を互いに滴定するために使用し得る。服薬遵守を支援するために、本発明のキットは典型的には、投与のための指示を含む。
【００５２】
本発明の併用療法において、本発明の形態および他の治療剤は、同じまたは異なる製造者が製造および／または製剤し得る。さらに、本発明の形態および他の治療剤は、（ｉ）医師への組合せ生成物のリリースの前に（例えば、本発明の形態および他の治療剤を含むキットの場合）；（ｉｉ）投与の直前に、医師自身によって（または医師の指導の下に）；（ｉｉｉ）例えば、本発明の形態および他の治療剤の逐次投与の間に、患者自身において、併用療法にまとめ得る。
【００５３】
本発明はまた、医薬品としての使用のための（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態の使用を提供する。
【００５４】
したがって、本発明は、疾患を治療するための、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態の使用を提供する。本発明はまた、ＰＩ３Ｋ酵素の活性が媒介する疾患または状態を治療するための、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態の使用を提供し、医薬は、別の治療剤との投与のために調製される。本発明はまた、ＰＩ３Ｋ酵素の活性が媒介する疾患または状態の治療のための別の治療剤の使用を提供し、医薬は、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態と共に投与される。
【００５５】
本発明はまた、治療法において使用するための、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態を提供する。本発明はまた、ＰＩ３Ｋ酵素の活性が媒介する疾患または状態を治療する方法において使用するための、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態を提供し、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態は、別の治療剤との投与のために調製される。本発明はまた、ＰＩ３Ｋ酵素の活性が媒介する疾患または状態を治療する方法において使用するための別の治療剤を提供し、他の治療剤は、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態との投与のために調製される。本発明はまた、ＰＩ３Ｋ酵素の活性が媒介する疾患または状態を治療する方法において使用するための、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態を提供し、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態は、別の治療剤と共に投与される。本発明はまた、ＰＩ３Ｋ酵素の活性が媒介する疾患または状態を治療する方法において使用するための別の治療剤を提供し、他の治療剤は、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態と共に投与される。
【００５６】
本発明はまた、疾患を治療するための、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態の使用を提供する。本発明はまた、ＰＩ３Ｋ酵素の活性が媒介する疾患または状態を治療するための、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態の使用を提供し、患者は、従前（例えば、２４時間以内）に別の治療剤で治療をされてきている。本発明はまた、ＰＩ３Ｋ酵素の活性が媒介する疾患または状態を治療するための別の治療剤の使用を提供し、患者は、従前（例えば、２４時間以内）に（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態で治療をされてきている。
【００５７】
（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態は、唯一の活性成分として、あるいは例えば、アジュバントとして、例えば、同種異系移植片もしくは異種移植片の急性もしくは慢性拒絶、または炎症性もしくは自己免疫障害の治療もしくは予防のための、他の薬物、例えば、免疫抑制剤または免疫調節剤または他の抗炎症剤、あるいは化学療法剤、例えば、悪性細胞抗増殖剤と併せて投与し得る。例えば、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態は、カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３、ＴＡＦＡ−９３、バイオリムス−７またはバイオリムス−９；免疫抑制特性を有するアスコマイシン、例えばＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１など；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン；メトトレキセート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸または塩；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリンまたは免疫抑制同族体、類似体もしくはその誘導体；例えばＷＯ０２／３８５６１またはＷＯ０３／８２８５９に開示されたＰＫＣ阻害剤、例えば実施例５６または７０の化合物；ＪＡＫ３キナーゼ阻害剤、例えば、Ｎ−ベンジル−３，４−ジヒドロキシ−ベンジリデン−シアノアセトアミドα−シアノ−（３，４−ジヒドロキシ）−］Ｎ−ベンジルシンナムアミド（Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  ＡＧ  ４９０）、プロジギオシン２５−Ｃ（ＰＮＵ１５６８０４）、［４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン］（ＷＨＩ−Ｐ１３１）、［４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン］（ＷＨＩ−Ｐ１５４）、［４−（３’，５’−ジブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン］ＷＨＩ−Ｐ９７、ＫＲＸ−２１１、遊離形態または薬学的に許容される塩形態、例えばモノクエン酸塩の３−｛（３Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−３−［メチル−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−アミノ］−ピペリジン−１−イル｝−３−オキソ−プロピオニトリル（ＣＰ−６９０，５５０とも呼ばれる）、またはＷＯ０４／０５２３５９もしくはＷＯ０５／０６６１５６に開示されている化合物；免疫抑制モノクローナル抗体、例えば、白血球受容体に対するモノクローナル抗体、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはそれらのリガンド；他の免疫調節化合物、例えば、ＣＴＬＡ４の��胞外ドメインの少なくとも一部分を有する組換え結合分子または変異体、例えば、非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合したＣＴＬＡ４の少なくとも一つの細胞外部分またはその変異体、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えば、ＡＴＣＣ  ６８６２９と命名）またはその変異体、例えば、ＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１または−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニストまたはＶＬＡ−４アンタゴニスト；または抗ヒスタミン剤；または鎮咳薬、もしくは気管支拡張剤；またはアンジオテンシン受容体遮断薬；または抗感染性因子（anti-infectious agent）と共に使用することができる。
【００５８】
（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態が、他の免疫抑制性／免疫調節性、抗炎症性、化学療法的または抗感染性治療と併せて投与される場合、同時投与される免疫抑制剤、免疫調節性、抗炎症性、化学療法的または抗感染性化合物の用量は、用いられる共薬物のタイプ、例えば、これがステロイドまたはカルシニューリン阻害剤であるかどうかによって、用いられる特定の薬物によって、治療される状態などによって当然ながら変化する。
【００５９】
（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態はまた、他の治療剤、特に、他の抗増殖剤と組み合わせて有利に使用し得る。このような抗増殖剤には、限定はされないが、アロマターゼ阻害剤；抗エストロゲン剤；トポイソメラーゼＩ阻害剤；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；微小管活性剤；アルキル化剤；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；細胞分化過程を誘発する化合物；シクロオキシゲナーゼ阻害剤；ＭＭＰ阻害剤；ｍＴＯＲ阻害剤；抗新生物性代謝拮抗剤；プラチン化合物；タンパク質または脂質キナーゼ活性を標的とする／減少させる化合物、およびさらなる抗血管新生化合物；タンパク質または脂質ホスファターゼの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物；ゴナドレリンアゴニスト；抗アンドロゲン剤；メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤；ビスホスホネート；生物学的応答調節剤；抗増殖性抗体；ヘパラナーゼ阻害剤；Ｒａｓ発癌性イソ型の阻害剤；テロメラーゼ阻害剤；プロテアソーム阻害剤；血液悪性腫瘍の治療において使用される薬剤；Ｆｌｔ−３の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物；Ｈｓｐ９０阻害剤；テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標））；ならびにロイコボリンが含まれる。用語「アロマターゼ阻害剤」は、本明細書で使用される場合、エストロゲン産生、すなわち、それぞれ、エストロンおよびエストラジオールへの基質アンドロステンジオンおよびテストステロンの変換を阻害する化合物に関する。この用語には、限定はされないが、ステロイド、特に、アタメスタン、エキセメスタンおよびフォルメスタン；ならびに特に、非ステロイド、特に、アミノグルテチミド、ログレチミド、ピリドグルテチミド、トリロスタン、テストラクトン、ケトコナゾール、ボロゾール、ファドロゾール、アナストロゾールおよびレトロゾールが含まれる。エキセメスタンは、例えば、商標ＡＲＯＭＡＳＩＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。フォルメスタンは、例えば、商標ＬＥＮＴＡＲＯＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。ファドロゾールは、例えば、商標ＡＦＥＭＡで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。アナストロゾールは、例えば、商標ＡＲＩＭＩＤＥＸで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。レトロゾールは、例えば、商標ＦＥＭＡＲＡまたはＦＥＭＡＲで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。アミノグルテチミドは、例えば、商標ＯＲＩＭＥＴＥＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。アロマターゼ阻害剤である化学療法剤を含む本発明の組合せは、ホルモン受容体陽性腫瘍、例えば、乳房腫瘍の治療のために特に有用である。
【００６０】
用語「抗エストロゲン剤」は、本明細書で使用される場合、エストロゲン受容体レベルでのエストロゲンの効果をアンタゴナイズする化合物に関する。この用語には、限定はされないが、タモキシフェン、フルベストラント、ラロキシフェンおよびラロキシフェン塩酸塩が含まれる。タモキシフェンは、例えば、商標ＮＯＬＶＡＤＥＸで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。ラロキシフェン塩酸塩は、例えば、商標ＥＶＩＳＴＡで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。フルベストラントは、米国特許第４，６５９，５１６号に開示されているように製剤することができ、またはこれは、例えば、商標ＦＡＳＬＯＤＥＸで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。抗エストロゲン剤である化学療法剤を含む本発明の組合せは、エストロゲン受容体陽性腫瘍、例えば、乳房腫瘍の治療のために特に有用である。
【００６１】
用語「抗アンドロゲン剤」は、本明細書で使用される場合、男性ホルモンの生物学的効果を阻害することができる任意の物質に関し、限定はされないが、ビカルタミド（ＣＡＳＯＤＥＸ）が含まれ、これは、例えば、米国特許第４，６３６，５０５号に開示されているように製剤することができる。
【００６２】
用語「ゴナドレリンアゴニスト」は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、アバレリックス、ゴセレリンおよびゴセレリン酢酸塩が含まれる。ゴセレリンは、米国特許第４，１００，２７４号に開示されており、例えば、商標ＺＯＬＡＤＥＸで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。アバレリックスは、例えば、米国特許第５，８４３，９０１号に開示されているように製剤することができる。
【００６３】
用語「トポイソメラーゼＩ阻害剤」には、本明細書で使用される場合、限定はされないが、トポテカン、ギマテカン、イリノテカン、カンプトテシンおよびその類似体、９−ニトロカンプトテシンならびに高分子カンプトテシンコンジュゲートＰＮＵ−１６６１４８（ＷＯ９９／１７８０４における化合物Ａ１）が含まれる。イリノテカンは、例えば、商標ＣＡＭＰＴＯＳＡＲで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。トポテカンは、例えば、商標ＨＹＣＡＭＴＩＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。
【００６４】
用語「トポイソメラーゼＩＩ阻害剤」には、本明細書で使用される場合、限定はされないが、アントラサイクリン、例えば、リポソーム製剤、例えば、ＣＡＥＬＹＸを含むドキソルビシン；ダウノルビシン；エピルビシン；イダルビシン；ネモルビシン；アントラキノンであるミトキサントロンおよびロソキサントロン；ならびにポドフィロトキシンであるエトポシドおよびテニポシドが含まれる。エトポシドは、例えば、商標ＥＴＯＰＯＰＨＯＳで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。テニポシドは、例えば、商標ＶＭ２６−ＢＲＩＳＴＯＬで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。ドキソルビシンは、例えば、商標ＡＤＲＩＢＬＡＳＴＩＮまたはＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。エピルビシンは、例えば、商標ＦＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。イダルビシンは、例えば、商標ＺＡＶＥＤＯＳで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。ミトキサントロンは、例えば、商標ＮＯＶＡＮＴＲＯＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。
【００６５】
用語「微小管活性剤」は、限定はされないが、タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル；ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、特に、ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン、特に、硫酸ビンクリスチンおよびビノレルビン；ディスコデルモリド；コルヒチン；ならびにエポチロンおよびその誘導体、例えば、エポチロンＢもしくはＤまたはその誘導体を含む、微小管安定化剤、微小管不安定化剤および微小管重合阻害剤に関する。パクリタキセルは、例えば、市販されているような形態、例えば、ＴＡＸＯＬで投与し得る。ドセタキセルは、例えば、商標ＴＡＸＯＴＥＲＥで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。ビンブラスチン硫酸塩は、例えば、商標ＶＩＮＢＬＡＳＴＩＮ  Ｒ．Ｐで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。硫酸ビンクリスチンは、例えば、商標ＦＡＲＭＩＳＴＩＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。ディスコデルモリドは、例えば、米国特許第５，０１０，０９９号に開示されているように得ることができる。また含まれるのは、ＷＯ９８／１０１２１、米国特許第６，１９４，１８１号、ＷＯ９８／２５９２９、ＷＯ９８／０８８４９、ＷＯ９９／４３６５３、ＷＯ９８／２２４６１およびＷＯ００／３１２４７に開示されているエポチロン誘導体である。特に好ましいのは、エポチロンＡおよび／またはＢである。
【００６６】
用語「アルキル化剤」には、本明細書で使用される場合、限定はされないが、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファランまたはニトロソ尿素（ＢＣＮＵもしくはＧｌｉａｄｅｌ）が含まれる。シクロホスファミドは、例えば、商標ＣＹＣＬＯＳＴＩＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。イホスファミドは、例えば、商標ＨＯＬＯＸＡＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。
【００６７】
用語「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」または「ＨＤＡＣ阻害剤」は、ヒストンデアセチラーゼを阻害し、かつ増殖抑制作用を有する化合物に関する。これは、ＷＯ０２／２２５７７に開示されている化合物、特に、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミドおよび薬学的に許容されるその塩を含む。これはさらに、特に、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）を含む。
【００６８】
用語「抗新生物性代謝拮抗剤」には、限定はされないが、５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵ；カペシタビン；ゲムシタビン；ＤＮＡ脱メチル化剤、例えば、５−アザシチジンおよびデシタビン；メソトレキセートおよびエダトレキサート；ならびに葉酸アンタゴニスト、例えば、ペメトレキセドが含まれる。カペシタビンは、例えば、商標ＸＥＬＯＤＡで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。ゲムシタビンは、例えば、商標ＧＥＭＺＡＲで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。また含まれるのは、例えば、商標ＨＥＲＣＥＰＴＩＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができるモノクローナル抗体トラスツズマブである。
【００６９】
用語「プラチン化合物」には、本明細書で使用される場合、限定はされないが、カルボプラチン、シスプラチン、シスプラチナムおよびオキサリプラチンが含まれる。カルボプラチンは、例えば、商標ＣＡＲＢＯＰＬＡＴで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。オキサリプラチンは、例えば、商標ＥＬＯＸＡＴＩＮで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。
【００７０】
用語「タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性；またはタンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／減少させる化合物；あるいはさらなる抗血管新生化合物」には、本明細書で使用される場合、限定はされないが、タンパク質チロシンキナーゼならびに／またはセリンおよび／もしくはトレオニンキナーゼ阻害剤あるいは脂質キナーゼ阻害剤、例えば、
ａ）血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、例えば、ＰＤＧＦＲの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、特に、ＰＤＧＦ受容体を阻害する化合物、例えば、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、例えば、イマチニブ、ＳＵ１０１、ＳＵ６６６８およびＧＦＢ−１１１；
ｂ）線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物；
ｃ）インスリン様増殖因子受容体Ｉ（ＩＧＦ−ＩＲ）の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、例えば、ＩＧＦ−ＩＲの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、特に、ＩＧＦ−ＩＲ受容体を阻害する化合物、例えば、ＷＯ０２／０９２５９９において開示されているこれらの化合物；
ｄ）Ｔｒｋ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物；
ｅ）Ａｘｌ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物；
ｆ）ｃ−Ｍｅｔ受容体の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物；
ｇ）Ｋｉｔ／ＳＣＦＲ受容体チロシンキナーゼの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物；
ｈ）Ｃ−ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼ（ＰＤＧＦＲファミリーの部分）の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、例えば、ｃ−Ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、特に、ｃ−Ｋｉｔ受容体を阻害する化合物、例えば、イマチニブ；
ｉ）ｃ−Ａｂｌファミリーのメンバーおよびこれらの遺伝子融合産物、例えば、ＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、例えば、ｃ−Ａｂｌファミリーメンバーおよびこれらの遺伝子融合産物の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、例えば、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、例えば、イマチニブ、ＰＤ１８０９７０、ＡＧ９５７、ＮＳＣ６８０４１０またはＰａｒｋｅＤａｖｉからのＰＤ１７３９５５；
ｊ）タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）およびセリン／トレオニンキナーゼのＲａｆファミリーのメンバー、ＭＥＫ、ＳＲＣ、ＪＡＫ、ＦＡＫ、ＰＤＫのメンバーおよびＲａｓ／ＭＡＰＫファミリーメンバー、またはＰＩ（３）キナーゼファミリー、またはＰＩ（３）−キナーゼ−関連キナーゼファミリー、および／またはサイクリン依存性キナーゼファミリー（ＣＤＫ）のメンバーの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、ならびに特に、米国特許第５，０９３，３３０号に開示されているこれらのスタウロスポリン誘導体、例えば、ミドスタウリン；さらなる化合物の例は、例えば、ＵＣＮ−０１；サフィンゴール；ＢＡＹ４３−９００６；ブリオスタチン１；ペリホシン；イルモホシン；ＲＯ３１８２２０およびＲＯ３２０４３２；ＧＯ６９７６；Ｉｓｉｓ３５２１；ＬＹ３３３５３１／ＬＹ３７９１９６；イソキノリン化合物、例えば、ＷＯ００／０９４９５において開示されているもの；ＦＴＩ；ＰＤ１８４３５２；またはＱＡＮ６９７（Ｐ１３Ｋ阻害剤）を含む；
ｋ）タンパク質−チロシンキナーゼ阻害剤の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、例えば、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ）またはチルホスチンを含む、タンパク質−チロシンキナーゼ阻害剤の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物。チルホスチンは、好ましくは低分子量（Ｍｒ＜１５００）化合物、または薬学的に許容されるその塩、特に、化合物のベンジリデンマロニトリルクラスまたはＳ−アリールベンゼンマロニトリルもしくは二基質キノリンクラスから選択される化合物、より特に、チルホスチンＡ２３／ＲＧ−５０８１０、ＡＧ９９、チルホスチンＡＧ２１３、チルホスチンＡＧ１７４８、チルホスチンＡＧ４９０、チルホスチンＢ４４、チルホスチンＢ４４（＋）エナンチオマー、チルホスチンＡＧ５５５、ＡＧ４９４、チルホスチンＡＧ５５６、ＡＧ９５７およびアダフォスチン（４−｛［（２，５−ジヒドロキシフェニル）メチル］アミノ｝−安息香酸アダマンチルエステル、ＮＳＣ６８０４１０、アダフォスチンからなる群から選択される任意の化合物である；ならびに
ｌ）受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子ファミリー（ホモ二量体またはヘテロ二量体としてＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４）の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、例えば、上皮増殖因子受容体ファミリーの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物は、特に、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４を阻害し、またはＥＧＦもしくはＥＧＦ関連リガンドに結合する化合物、タンパク質または抗体であり、特に、ＷＯ９７／０２２６６において一般的におよび特に開示されているそれらの化合物、タンパク質またはモノクローナル抗体、例えば、実施例３９の、またはＥＰ０５６４４０９；ＷＯ９９／０３８５４；ＥＰ０５２０７２２；ＥＰ０５６６２２６；ＥＰ０７８７７２２；ＥＰ０８３７０６３；米国特許第５，７４７，４９８号；ＷＯ９８／１０７６７；ＷＯ９７／３００３４；ＷＯ９７／４９６８８；ＷＯ９７／３８９８３、および特に、ＷＯ９６／３０３４７における化合物、例えば、ＣＰ３５８７７４として公知の化合物；ＷＯ９６／３３９８０、例えば、化合物ＺＤ１８３９；およびＷＯ９５／０３２８３、例えば、化合物ＺＭ１０５１８０、例えば、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、セツキシマブ、Ｉｒｅｓｓａ、Ｔａｒｃｅｖａ、ＯＳＩ−７７４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＧＷ−２０１６、Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３またはＥ７．６．３；ならびにＷＯ０３／０１３５４１に開示されている７Ｈ−ピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体
が含まれる。
【００７１】
さらなる抗血管新生化合物は、例えば、タンパク質または脂質キナーゼ阻害と無関係のこれらの活性のための別の機序を有する化合物、例えば、サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ）およびＴＮＰ−４７０を含む。
【００７２】
タンパク質または脂質ホスファターゼの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物は、例えば、ホスファターゼ１、ホスファターゼ２Ａ、ＰＴＥＮまたはＣＤＣ２５の阻害剤、例えば、オカダ酸またはその誘導体である。
【００７３】
細胞分化過程を誘発する化合物は、例えば、レチノイン酸、α−、γ−もしくはδ−トコフェロールまたはα−、γ−もしくはδ−トコトリエノールである。
【００７４】
用語シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、例えば、Ｃｏｘ−２阻害剤、５−アルキル置換２−アリールアミノフェニル酢酸および誘導体、例えば、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ）、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ）、エトリコキシブ、バルデコキシブまたは５−アルキル−２−アリールアミノフェニル酢酸、例えば、５−メチル−２−（２’−クロロ−６’−フルオロアニリノ）フェニル酢酸またはルミラコキシブを含む。
【００７５】
用語「ビスホスホネート」は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、エチドロン酸、クロドロン酸、チルドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、イバンドロン酸、リセドロン酸およびゾレドロン酸を含む。「エチドロン酸」は、例えば、商標ＤＩＤＲＯＮＥＬで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。「クロドロン酸」は、例えば、商標ＢＯＮＥＦＯＳで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。「チルドロン酸」は、例えば、商標ＳＫＥＬＩＤで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。「パミドロン酸」は、例えば、商標ＡＲＥＤＩＡ（商標）で、例えば、市販されているような形態で投与することができる。「アレンドロン酸」は、例えば、商標ＦＯＳＡＭＡＸで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。「イバンドロン酸」は、例えば、商標ＢＯＮＤＲＡＮＡＴで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。「リセドロン酸」は、例えば、商標ＡＣＴＯＮＥＬで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。「ゾレドロン酸」は、例えば、商標ＺＯＭＥＴＡで、例えば、市販されているような形態で投与することができる。
【００７６】
用語「ｍＴＯＲ阻害剤」は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）を阻害し、かつ増殖抑制作用を有する化合物、例えば、シロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標））、エベロリムス（Ｃｅｒｔｉｃａｎ（商標））、ＣＣＩ−７７９およびＡＢＴ５７８に関する。
【００７７】
用語「ヘパラナーゼ阻害剤」は、本明細書で使用される場合、ヘパラン硫酸の分解を標的とし、減少させまたは阻害する化合物を指す。この用語には、限定はされないが、ＰＩ−８８が含まれる。
【００７８】
用語「生物学的応答調節剤」は、本明細書で使用される場合、リンフォカインまたはインターフェロン、例えば、インターフェロンγを指す。
【００７９】
用語「Ｒａｓ発癌性イソ型の阻害剤」、例えば、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−ＲａｓまたはＮ−Ｒａｓは、本明細書で使用される場合、Ｒａｓの発癌性活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物、例えば、「ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤」、例えば、Ｌ−７４４８３２、ＤＫ８Ｇ５５７またはＲ１１５７７７（Ｚａｒｎｅｓｔｒａ）を指す。
【００８０】
用語「テロメラーゼ阻害剤」は、本明細書で使用される場合、テロメラーゼの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物を指す。テロメラーゼの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物は、特に、テロメラーゼ受容体を阻害する化合物、例えば、テロメスタチンである。
【００８１】
用語「メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤」は、本明細書で使用される場合、メチオニンアミノペプチダーゼの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物を指す。メチオニンアミノペプチダーゼの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物は、例えば、ベンガミドまたはその誘導体である。
【００８２】
用語「プロテアソーム阻害剤」は、本明細書で使用される場合、プロテアソームの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物を指す。プロテアソームの活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物は、例えば、ＰＳ−３４１およびＭＬＮ３４１を含む。
【００８３】
用語「マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤」または「ＭＭＰ阻害剤」には、本明細書で使用される場合、限定はされないが、コラーゲンペプチド模倣および非ペプチド模倣阻害剤、テトラサイクリン誘導体、例えば、ヒドロキサメートペプチド模倣物阻害剤であるバチマスタットおよびその経口的に生物が利用可能な類似体マリマスタット（ＢＢ−２５１６）、プリノマスタット（ＡＧ３３４０）、メタスタット（ＮＳＣ６８３５５１）ＢＭＳ−２７９２５１、ＢＡＹ１２−９５６６、ＴＡＡ２１１、ＭＭＩ２７０ＢまたはＡＡＪ９９６が含まれる。
【００８４】
用語「血液悪性腫瘍の治療において使用される薬剤」は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−３Ｒ）の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物；インターフェロン、１−ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａ−ｃ）およびビスルファン；ならびにＡＬＫ阻害剤、例えば、未分化リンパ腫キナーゼを標的とし、減少させ、または阻害する化合物が含まれる。
【００８５】
ＦＭＳ様チロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−３Ｒ）の活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物は、特に、Ｆｌｔ−３Ｒ受容体キナーゼファミリーのメンバーを阻害する化合物、タンパク質または抗体、例えば、ＰＫＣ４１２、ミドスタウリン、スタウロスポリン誘導体、ＳＵ１１２４８およびＭＬＮ５１８である。
【００８６】
用語「ＨＳＰ９０阻害剤」には、本明細書で使用される場合、限定はされないが、ＨＳＰ９０の内因性ＡＴＰアーゼ活性を標的とし、減少させまたは阻害し、ユビキチンプロテアソーム経路を介してＨＳＰ９０クライアントタンパク質を分解し、標的とし、減少させまたは阻害する化合物が含まれる。ＨＳＰ９０の内因性ＡＴＰアーゼ活性を標的とし、減少させまたは阻害する化合物は、特に、ＨＳＰ９０のＡＴＰアーゼ活性を阻害する化合物、タンパク質または抗体、例えば、１７−アリルアミノ、１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）、ゲルダナマイシン誘導体、他のゲルダナマイシンが関連する化合物、ラディシコールおよびＨＤＡＣ阻害剤である。
【００８７】
用語「抗増殖性抗体」には、本明細書で使用される場合、限定はされないが、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））、トラスツズマブ−ＤＭ１、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、ＰＲＯ６４５５３（抗ＣＤ４０）および２Ｃ４抗体が含まれる。抗体とは、例えば、損なわれていないモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種の損なわれていない抗体から形成される多特異的抗体、および所望の生物活性を示す限りにおいて抗体フラグメントを意味する。
【００８８】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療のために、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態は、標準的な白血病の治療と組み合わせて、特に、ＡＭＬの治療のために使用される治療と組み合わせて使用することができる。特に、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態は、例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ならびに／またはＡＭＬの治療に有用な他の薬物、例えば、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ａｒａ−Ｃ、ＶＰ−１６、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、カルボプラチナムおよびＰＫＣ４１２と組み合わせて投与することができる。
【００８９】
（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態はまた、他の治療剤、特に、他の抗マラリア剤と組み合わせて有利に使用し得る。このような抗マラリア剤には、限定はされないが、プログアニル、クロルプログアニル、トリメトプリム、クロロキン、メフロキン、ルメファントリン、アトバコン、ピリメタミン−スルファドキシン、ピリメタミン−ダプソン、ハロファントリン、キニーネ、キニジン、アモジアキン、アモピロキン、スルホンアミド、アルテミシニン、アルテフレン、アルテメテル、アルテスナート、プリマキン、吸入ＮＯ、Ｌ−アルギニン、ジプロピレントリ−アミンＮＯＮＯエート（ＮＯドナー）、ロシグリタゾン（ＰＰＡＲγアゴニスト）、活性炭、エリスロポエチン、レバミソール、およびピロナリジンが含まれる。
【００９０】
（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態はまた、例えば、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症および神経嚢虫症の治療のために使用される他の治療剤と組み合わせて有利に使用し得る。このような薬剤には、限定はされないが、硫酸クロロキン、アトバコン−プログアニル、アルテメテル−ルメファントリン、硫酸キニン、アルテスネート、キニン、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、メグルミンアンチモニエート、ナトリウムスチボグルコネート、ミルテフォシン、ケトコナゾール、ペンタミジン、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、リポソーマル−ＡｍＢ、パロモマイシン、エフロルニチン、ニフルチモックス、スラミン、メラルソプロール、プレドニゾロン、ベンズニダゾール、スルファジアジン、ピリメタミン、クリンダマイシン、トリメトロピン、スルファメトキサゾール、アジトロマイシン、アトバコン、デキサメタゾン、プラジクアンテル、アルベンダゾール、ベータ−ラクタム、フルオロキノロン、マクロライド、アミノグリコシド、スルファジアジンおよびピリメタミンが含まれる。
【００９１】
コード番号、一般名または商品名によって同定された活性剤の構造は、標準の概論「The Merck Index」の現行版またはデータベース、例えば、Patents International、例えば、IMS World Publicationsから得ることができる。
【００９２】
（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態と組み合わせて使用することができる上記の化合物は、例えば、上記で引用した文献において当技術分野で記載されているように調製および投与することができる。
【００９３】
（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態はまた、公知の治療方法、例えば、ホルモン、または特に、放射線の投与と組み合わせて有利に使用し得る。
【００９４】
（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態は特に、放射線療法に対して乏しい感受性を示す腫瘍の治療のために、特に、放射線増感剤として使用し得る。
【００９５】
「組合せ」とは、１つの用量単位形態における固定された組合せ、または合わせた投与のためのパーツのキットを意味し、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態および組合せパートナーは、組合せパートナーが協同効果、例えば、相乗効果、または任意のこれらの組合せの効果を示すことを特に可能とする時間間隔内で、独立して同時にまたは別々に投与し得る。用語「同時の投与」または「合わせた投与」などは、本明細書において利用されるように、それを必要としている単一の対象（例えば、患者）への選択した組合せパートナーの投与を包含することを意味し、薬剤が同じ投与経路によって、または同時に、必ずしも投与されない治療レジメンを含むことを意図する。用語「医薬品の組合せ」は、本明細書で使用される場合、複数種の活性成分を混合し、または合わせることからもたらされ、かつ活性成分の固定された組合せおよび固定されていない組合せの両方を含む生成物を意味する。用語「固定された組合せ」は、活性成分、例えば、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態および組合せパートナーが、単一の実体または用量の形態で、患者に両方とも同時に投与されることを意味する。用語「固定されていない組合せ」は、活性成分、例えば、（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノン）の無水結晶形態および組合せパートナーが、特定の期限を伴わずに同時に、併行的にまたは逐次的に、患者に別々の実体として両方とも投与されることを意味し、このような投与は、患者の体内で２種の化合物の治療有効レベルを実現する。後者はまた、カクテル療法、例えば、３種以上の活性成分の投与に適用される。
【実施例】
【００９６】
実験の詳細：
下記の実施例は本発明を例示することを意図し、それに対する限定として解釈されない。温度は、摂氏温度で示す。他に記述しない限り、全ての蒸発は、減圧下、典型的には、約１５ｍｍＨｇ〜１００ｍｍＨｇ（＝２０〜１３３ミリバール）で行う。最終生成物、中間体および出発材料の構造は、標準的な分析方法、例えば、微量分析および分光学的特徴、例えば、ＭＳ、ＩＲ、ＮＭＲによって確認する。使用する略語は、当技術分野で通常のものである。
【００９７】
本発明の形態を合成するために利用する全ての出発材料、構造ブロック、試薬、酸、塩基、脱水剤、溶媒、および触媒は、市販であるか、または当業者に公知の有機合成法によって生成することができる（Houben-Weyl 第4版1952, Methods of Organic Synthesis, Thieme, 21巻）。さらに、本発明の形態は、下記の実施例において示すように、当業者に公知の有機合成法によって生成することができる。
【００９８】
略語
ＡＣＮ  アセトニトリル
ＡｃＯＨ  酢酸
ａｑ．  水溶液
Ｂｏｃ  ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
Ｂｏｃ２Ｏ  ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート
ｔＢｕ  ｔｅｒｔ−ブチル
ｔＢｕＯＨ  ｔｅｒｔ−ブタノール
ＢｒｅｔｔＰｈｏｓ  ２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）−３，６−ジメトキシ−２’−４’−６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル
ｂｒ  ｓ  ブロードな一重項
ＣＯＭＵ  （１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスフェート
ｃｏｎｃ．  濃縮した
ｄ  日
ｄ  二重項
ｄｄ  二重項の二重項
ｄｂａ  ジベンジリデンアセトン
ＤＣＭ  ジクロロメタン
ＤＥＡ  ジエチルアミン
ＤＥＡＤ  アゾジカルボン酸ジエチル
ＤＥＡＰ  ジエチルアミノピリジン
ＤＩＰＥＡ  ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＤＭＭＥ  ジメトキシメタン
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＡ  ジフェニルホスホリルアジド
ＤＰＰＦ  １，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン
ＥＤＣ  １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
ｅｑ．  当量
ＥＳＩ  エレクトロスプレーイオン化
Ｅｔ３Ｎ  トリエチルアミン
Ｅｔ２Ｏ  ジエチルエーテル
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル
ＥｔＯＨ  エタノール
ｈ  時間
ＨＡＴＵ  Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ  Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＭＤＳ  ヘキサメチルジシラザン
ＨＯＢＴ  １−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
ＩＰＡ  イソプロパノール
ＬＣＭＳ  液体クロマトグラフィー質量分析法
ｍＣＰＢＡ  メタ−クロロ過安息香酸
ＭｅＯＨ  メタノール
ｍ  多重項
ｍｉｎ  分
ＭＳ  質量分析法
ｍｗ  マイクロ波
ＮＭＲ  核磁気共鳴分析法
ＮａＯｔＢｕ  ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド
ＮＰ  順相
ＯＢＤ  最適床密度
Ｐｄ２（ｄｂａ）３  トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム
ＰＬ−ＨＣＯ３  ＭＰ  ＳＰＥ  酸除去のためのポリマー担持バイカーボネートカートリッジ
ｐｒｅｐ．  分取
ＰＰｈ３  トリフェニルホスフィン
ｑ  四重項
Ｒａｃ−ＢＩＮＡＰ  ラセミの２，２’−ビス（ジ−ｐ−トリルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル
ＲＰ  逆相
Ｒｔ  保持時間
ｒｔ  室温
ＲｕＰｈｏｓ  ２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジ−イソプロポキシ−１，１’−ビフェニル
ｓａｔ．  飽和
ＳＣＸ−２  ポリマー担持スルホン酸マクロ多孔性ポリスチレン
ｓｏｌｎ．  溶液
ｔ  三重項
ＴＢＭＥ  ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
ＴＢＡＦ  フッ化テトラブチルアンモニウム
ＴＢＤＭＳＣｌ  ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド
テトラメチル−ｔ−ブチル−ＸＰｈｏｓ  ２−ジ−ｔ−ブチルホスフィノ−３，４，５，６−テトラメチル−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
ＴＬＣ  薄層クロマトグラフィー
ＵＰＬＣ  超高速液体クロマトグラフィー
ＸＰｈｏｓ  ２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル
Ｐｄ［ＲｕＰｈｏｓ］  （２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’６’−ジイソプロピル−１１’−ビフェニル）（２−（２−アミノエチル）フェニル）パラジウム（ＩＩ）
使用するマイクロ波装置は、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ（登録商標）である。
全ての化合物は、ＡｕｔｏＮｏｍを使用して命名する。
【００９９】
一般的クロマトグラフィー情報
ＬＣＭＳ方法Ｍ１（ＲｔＭ１）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×５０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３、１．８μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．０５容量％ギ酸＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム、Ｂ）ＡＣＮ＋０．０４容量％ギ酸
ＨＰＬＣ−勾配：１．４分で２〜９８％Ｂ、９８％Ｂ、０．４５分、流量＝１．２ｍｌ／分
ＨＰＬＣ−カラム温度：５０℃
ＬＣＭＳ方法Ｍ２（ＲｔＭ２）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×３０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．０５容量％ギ酸＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム、Ｂ）ＡＣＮ＋０．０４容量％ギ酸
ＨＰＬＣ−勾配：１．４分で２〜９８％Ｂ、９８％Ｂ、０．７５分、流量＝１．２ｍｌ／分
ＨＰＬＣ−カラム温度：５０℃
ＬＣＭＳ方法Ｍ３（ＲｔＭ３）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×３０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．０５容量％ギ酸＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム、Ｂ）ＡＣＮ＋０．０４容量％ギ酸
ＨＰＬＣ−勾配：８．５分で２〜９８％Ｂ、９８％Ｂ、１分、流量＝１．２ｍｌ／分
ＨＰＬＣ−カラム温度：５０℃
ＬＣＭＳ方法Ｍ４（ＲｔＭ４）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：４．６×５０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８、５μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．１容量％ＴＦＡ、Ｂ）ＡＣＮ＋０．１容量％ＴＦＡ
ＨＰＬＣ−勾配：８．０分で５〜１００％Ｂ      Ｂ、流量＝２ｍｌ／分
ＨＰＬＣ−カラム温度：４０℃
ＬＣＭＳ方法Ｍ５（ＲｔＭ５）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：０．４６×２５ｃｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ−Ｈ（１１８９）
ＨＰＬＣ−溶離液：ＥｔＯＨ／ＭｅＯＨ、６０：４０
ＨＰＬＣ−勾配：均一濃度、流量＝０．５ｍｌ／分
検出器：ＵＶ２２０ｎｍ
ＬＣＭＳ方法Ｍ６（ＲｔＭ６）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×３０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．０５％ＴＦＡ、Ｂ）ＡＣＮ＋０．０４％ＴＦＡ
ＨＰＬＣ−勾配：１．４分で２〜９８％Ｂ、９８％Ｂ、０．７５分、流量＝１．２ｍｌ／分
ＨＰＬＣ−カラム温度：５０℃
ＬＣＭＳ方法Ｍ７（ＲｔＭ７）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×３０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．０５％ＴＦＡ、Ｂ）ＡＣＮ＋０．０４％ＴＦＡ
ＨＰＬＣ−勾配：３．０分で１０〜９５％Ｂ、９５％Ｂ、１分、流量＝１．２ｍｌ／分
ＨＰＬＣ−カラム温度：５０℃
ＬＣＭＳ方法Ｍ８（ＲｔＭ８）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×３０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム、Ｂ）アセトニトリル＋０．０４％ギ酸
ＨＰＬＣ−勾配：３．０分で１０〜９５％Ｂ、流量＝１．２ｍｌ／分
ＬＣＭＳ方法Ｍ９（ＲｔＭ９）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×３０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム、Ｂ）アセトニトリル＋０．０４％ギ酸
ＨＰＬＣ−勾配：１０％Ｂ、０．０〜０．５分、次いで、勾配１０〜９５％Ｂ、０．５分〜３．０分、流量＝１．２ｍｌ／分
ＬＣＭＳ方法Ｍ１０（ＲｔＭ１０）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×５０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．１容量％ギ酸、Ｂ）アセトニトリル
ＨＰＬＣ−勾配：１．００分で２０〜２５％Ｂ、次いで、３．２０分で２５〜９５％Ｂ、次いで、０．１０分で９５〜１００％Ｂ、次いで、１００％０．２０分間、流量＝０．７ｍｌ／分
ＬＣＭＳ方法Ｍ１１（ＲｔＭ１１）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×５０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．１容量％ギ酸、Ｂ）アセトニトリル
ＨＰＬＣ−勾配：１．００分で５〜１０％Ｂ、次いで、３．００分で１０〜９０％Ｂ、次いで、０．１０分で９０〜１００％Ｂ、次いで、１００％０．４０分間、流量＝０．７ｍｌ／分
ＬＣＭＳ方法Ｍ１２（ＲｔＭ１２）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×３０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．１容量％ＴＦＡ、Ｂ）アセトニトリル
ＨＰＬＣ−勾配：１．７分にわたり１０〜９５％Ｂ、および溶媒流量として１．２ｍＬ／分、次いで、０．７分にわたり９５５Ｂ、流量＝１．４ｍＬ／分。
ＬＣＭＳ方法Ｍ１３（ＲｔＭ１３）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×３０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム、Ｂ）アセトニトリル＋０．０４％ギ酸
ＨＰＬＣ−勾配：３．７分で１０〜９５％Ｂ、流量＝１．２ｍｌ／分
ＬＣＭＳ方法Ｍ１４（ＲｔＭ１４）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×３０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム、Ｂ）アセトニトリル＋０．０４％ギ酸
ＨＰＬＣ−勾配：１．５分で１０〜９５％Ｂ、９５％Ｂ、１分、流量＝１．２ｍｌ／分
ＬＣＭＳ方法Ｍ１５（ＲｔＭ１５）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：０．４６×２５ｃｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈ（１１９４）
ＨＰＬＣ−溶離液：Ｈｅｘａｎ／ＥｔＯＨ５０：５０＋０．０５％ＤＥＡ
ＨＰＬＣ−勾配：均一濃度、流量＝０．５ｍｌ／分
検出器：ＵＶ２２０ｎｍ
ＬＣＭＳ方法Ｍ１６（ＲｔＭ１６）
ＨＰＬＣ−カラムの寸法：２．１×５０ｍｍ
ＨＰＬＣ−カラムタイプ：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３、１．８μｍ
ＨＰＬＣ−溶離液：Ａ）水＋０．０５容量％ギ酸＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム、Ｂ）ＡＣＮ＋０．０４容量％ギ酸
ＨＰＬＣ−勾配：１．４分で５〜９８％Ｂ、０．４分、９８％Ｂ、流量＝１．０ｍｌ／分
ＨＰＬＣ−カラム温度：６０℃
【０１００】
Ｘ線粉末回折
計器類：
方法Ｘ１
機器  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ８  ＧＡＤＤＳ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ
照射  ＣｕＫα（４０ｋＶ、４０ｍＡ）
検出器  ＨＩ−ＳＴＡＲ  Ａｒｅａ検出器
走査範囲、６°〜３９°（２シータ値）
【０１０１】
融点の決定：
融点は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定した。ＤＳＣは、１０℃／分の加熱速度を使用してＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＤＳＣ  Ｑ２０００で記録した。０．６ｍｇの試料を、標準的なアルミニウムパン（パン＋蓋、ＴＡ９００７８６．９０１、９００７７９．９０１）中に秤量した。機器は、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｑ−シリーズソフトウェアＶ．２．６．０．３６７およびＴｈｅｒｍａｌ  ＡｄｖａｎｔａｇｅソフトウェアＶ４．６．９を使用して操作した。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｖ４．３Ａ  Ｂｕｉｌｄ４．３．０．６を使用して、熱事象を特性決定した。ピンホールを有さない試料パンに対して試料を測定した。試料を下記のプロトコルによって処置した。
ステップ１：０℃で平衡化
ステップ２：３００℃まで１０℃／分の勾配
【０１０２】
実施例Ｆ１：（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノン
【０１０３】
【化１】
0006310474.tif 000002
ａ）７−クロロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン
７−クロロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−２−オン（ＣＡＳ登録９２８１１８−４３−８）（３．７０ｇ、２０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６３ｍｌ）溶液を、ＢＨ３＊ＴＨＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、４７ｍｌ、４７ｍｍｏｌ）で処置した。反応混合物を７５℃で１時間撹拌し、次いで、室温に冷却し、メタノール（２４ｍｌ、６００ｍｍｏｌ）でクエンチした。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃで溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、表題生成物を淡黄色の固体として得た（３．３ｇ、９６％収率）。
ＵＰＬＣ  ＲｔＭ１＝０．４７分；ＥＳＩＭＳ：１７１［（Ｍ＋Ｈ）＋］。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.53 (s, 1H), 7.11 (br s, 1H), 6.47 (s, 1H), 4.09 (t, 2H), 3.17-3.38 (m, 2H).
ｂ）２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−オール
ジオキサン（３２．５ｍｌ）中の７−クロロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン（１．０８ｇ、６．３３ｍｍｏｌ）、ＫＯＨ水溶液（５．４ｍｌの水中１．０７ｇ、１９ｍｍｏｌのＫＯＨ）、２−ジ−ｔ−ブチルホスフィノ−３，４，５，６−テトラメチル−２’，４’，６−トリ−ｉ−プロピルビフェニル９８％（０．３０ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）およびＰｄ２（ｄｂａ）３（０．２９ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の混合物を窒素で３回脱気し、チューブを密封し、反応混合物を１００℃で５時間撹拌した。室温に冷却した後、ｈｙｆｌｏを通して反応混合物を濾過し、ＥｔＯＡｃおよびメタノールですすいだ。濾液を濃縮し、表題化合物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９８：２から７５：２５）の後にオレンジ色の残渣として得た（６６０ｍｇ、６９％収率）
ＵＰＬＣ  ＲｔＭ１＝０．３４分；ＥＳＩＭＳ：１５３［（Ｍ＋Ｈ）＋］。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.33 (br s, 1H), 7.03 (br s, 1H), 6.71 (s, 1H), 5.15 (s, 1H), 3.95 (t, 2H), 3.25 (m, 2H).
ｃ）（Ｓ）−３−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ）−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
乾燥した２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−オール（０．６６ｇ、４．３４ｍｍｏｌ）および（Ｒ）−３−メタンスルホニルオキシ−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＣＡＳ登録１２７４２３−６１−４）（１．７３ｇ、６．５１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４０ｍｌ）溶液を、水素化ナトリウム（鉱油中６０％、０．２１ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）で処置し、反応混合物を８０℃で１８時間撹拌した。室温に冷却した後、反応混合物をＴＢＭＥで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、表題化合物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ、９５：５〜３０：７０）後に黄色の油として得た（１．０３５ｇ、７５％純度、５６％収率）
ＵＰＬＣ  ＲｔＭ１＝０．６５分；ＥＳＩＭＳ：３２２［（Ｍ＋Ｈ）＋］。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.54 (s, 1H), 5.86 (s, 1H), 5.42 (br s, 1H), 4.25-4.41 (m, 1H), 4.19 (t, 2H), 3.38-3.66 (m, 6H), 2.00-2.18 (m, 2H), 1.46 (d, 9H).
ｄ）（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
ジオキサン（６ｍｌ）中の（Ｓ）−３−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ）−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２５４ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、５−ブロモ−２−メトキシ−３−メチルピリジン（ＣＡＳ登録７６０２０７−８７−２）（２０８ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）、ＸＰｈｏｓ（３０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、およびＮａＯｔＢｕ（１６７ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）の混合物をアルゴンで５分間脱気し、次いで、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（２９ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を加えた。チューブをアルゴンで充填し、密封し、反応混合物を１００℃で２時間撹拌した。室温に冷却した後、ｈｙｆｌｏを通して反応混合物を濾過し、ＥｔＯＡｃですすぎ、濾液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。水層を、ＥｔＯＡｃで２回再抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で脱水させ、濾過し、濃縮し、表題化合物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、１００：０〜５０：５０）の後に透明なガムとして得た（２７４ｍｇ、７８％収率）。ＵＰＬＣ  ＲｔＭ１＝１．２０分；ＥＳＩＭＳ：４４３［（Ｍ＋Ｈ）＋］。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.93 (d, 1H), 7.61 (br s, 1H), 7.30-7.35 (m, 1H), 5.71 (s, 1H), 5.34-5.46 (m, 1H), 4.31 (br s, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.68 (t, 2H), 3.34-3.62 (m, 4H), 2.23 (s, 3H), 2.01-2.09 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).
ｅ）１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−７−（（Ｓ）−ピロリジン−３−イルオキシ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン
（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３６４ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（６ｍｌ）溶液を、ＴＦＡ（０．６３ｍｌ、８．２３ｍｍｏｌ）で処置し、反応混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、表題生成物を赤色の油として得て、これをそれ以上精製することなく次のステップで使用した（３１３ｍｇ、９０％純度、定量的収率）。
ＵＰＬＣ  ＲｔＭ１＝０．６５分；ＥＳＩＭＳ：３４３［（Ｍ＋Ｈ）＋］。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.93 (d, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.32 (d, 1H), 5.70 (s, 1H), 5.26-5.36 (m, 1H), 4.31 (t, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.67 (t, 2H), 2.95-3.15 (m, 3H), 2.81-2.92 (m, 1H), 2.22 (s, 3H), 1.98-2.10 (m, 1H), 1.79-1.90 (m, 1H).
ｆ）（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノン
１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−カルボン酸（ＣＡＳ登録６４０９６−８７−３）（１０６ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍｌ）溶液を、ＨＢＴＵ（２２５ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．２４ｍｌ、１．３７ｍｍｏｌ）で処置した。このように得られたオレンジ色の溶液を、室温で５分間撹拌し、次いで、１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−７−（（Ｓ）−ピロリジン−３−イルオキシ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン（１５６ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮し、残渣をＤＣＭで溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。相分離カートリッジを通過させることによって有機層を乾燥させ、濃縮し、ＳＦＣクロマトグラフィー（カラムＤＥＡＰ（２５０ｍｍ×３０ｍｍ、６０Ａ、５μｍ）Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、６分で超臨界ＣＯ２中メタノールの勾配１１〜１６％）後に僅かに着色した固体として表題化合物を得た（１１２ｍｇ、４９％収率）。
ＵＰＬＣ  ＲｔＭ１＝０．８１分；ＥＳＩＭＳ：５０３［（Ｍ＋Ｈ）＋］。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.01 (s, 1H), 7.61 (m, 1H), 7.52 (d, 1H), 5.52 (d, 1H), 5.24-5.43 (m, 1H), 4.26 (br s, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.59-3.79 (m, 3H), 3.41-3.56 (m, 2H), 3.21-3.39 (m, 1H), 2.98-3.21 (m, 4H), 2.67-2.83 (m, 1H), 1.84-2.20 (m, 9H).
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6): δ 8.01 (s, 1H), 7.63-7.59 (m, 1H), 7.55-7.51 (m, 1H), 5.55-5.51 (m, 1H), 5.43-5.24 (m, 1H), 4.29-4.22 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.80-3.60 (m, 2H), 3.56-3.37 (m, 3H), 3.28-2.99 (m, 5H), 2.89-2.66 (m, 1H), 2.19-2.09 (m, 4H), 2.08-1.98 (m, 2H), 1.98-1.86 (m, 3H).
【０１０４】
イソプロパノール／ジエチルエーテル中での加熱および冷却による実施例Ｆ１の結晶化
４７４ｍｇのアモルファスの実施例Ｆ１を、１．４ｍＬのイソプロパノールに懸濁した。混合物を７０℃に加熱し、７０℃で撹拌し、実施例Ｆ１の完全な溶解を可能とした。溶液を室温に冷却し、接着剤残渣が形成された。２ｍＬのジエチルエーテルを加え、スラリーを４８時間撹拌した。白色の懸濁液が形成された。懸濁液を濾過し、固体を４０℃、１５ミリバールで乾燥させた。微細な白色の粉末が得られた。材料は、僅かのみの残留溶媒（＜０．５％）を含有する。１４８．７７℃の融解開始を伴う実施例Ｆ１の結晶性無水形態を得た。
【０１０５】
実施例Ｆ１の無水形態（方法Ｍ１）の許容差±０．５を伴うＸ線粉末回折パターンからの最も有意な２シータピークの一覧（情報のために低い／弱いピークを含む）。注記：ピークのこの一覧は網羅的ではないが、単に「とりわけ」である。
【０１０６】
【表１】
0006310474.tif 000003
【０１０７】
生物学的評価
化合物の活性は、次のインビトロおよびインビボ法によって評価することができる。
【０１０８】
生物学的アッセイ
１  酵素的ＰＩ３ＫアルファおよびＰＩ３Ｋデルタイソ型阻害の測定
１．１  脂質キナーゼ活性の試験
ＰＩ３キナーゼ阻害剤としての化合物の効能は、以下のとおり実証することができる。
キナーゼ反応を、ハーフエリアＣＯＳＴＡＲ、９６ウェルプレートのウェル当たり５０μｌの最終体積で実施する。アッセイにおけるＡＴＰおよびホスファチジルイノシトールの最終濃度は、それぞれ、５μＭおよび６μｇ／ｍＬである。ＰＩ３キナーゼ、例えばＰＩ３キナーゼδの添加によって、反応を開始する。
ｐ１１０δ。アッセイの成分を、次のとおりウェル当たり添加する。
−  カラム２−１におけるウェル当たり５％  ＤＭＳＯ中１０μｌ試験化合物。
−  カラム１の最初の４ウェルおよびカラム１２の最後の４ウェルにおける１０μｌの５％体積／体積ＤＭＳＯの添加によって、合計活性を測定する。
−  カラム１の最後の４ウェルおよびカラム１２の最初の４ウェルへの１０μＭ対照化合物の添加によって、バックグラウンドを測定する。
−  ２ｍＬ「アッセイミックス」をプレート当たり調製する。
１．９１２ｍＬのＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液
ウェル当たり５μＭの最終濃度をもたらすＡＴＰの３ｍＭストックの８．３３μｌ
ウェル当たり０．０５μＣｉをもたらす活性日における１μｌの［３３Ｐ］ＡＴＰ
ウェル当たり６μｇ／ｍＬの最終濃度をもたらす１ｍｇ／ｍＬ  ＰＩストックの３０μｌ
ウェル当たり１ｍＭの最終濃度をもたらす１ＭストックＭｇＣｌ２の５μｌ
−  ２０μｌのアッセイミックスをウェル当たり添加する。
−  ２ｍＬ「酵素ミックス」をプレート当たり調製する（２ｍＬのキナーゼ緩衝液中ｘ＊μｌのＰＩ３キナーゼｐ１１０β）。アッセイプレートへの添加の間、「酵素ミックス」を、氷上に維持する。
−  ２０μｌ「酵素ミックス」を、ウェル当たり添加して反応を開始する。
−  次いで、プレートを、室温で９０分間インキュベートする。
−  ウェル当たり５０μｌのＷＧＡ−ＳＰＡビーズ（コムギ胚芽凝集素をコーティングしたシンチレーション近接アッセイビーズ）懸濁液の添加によって、反応を停止する。
−  ＴｏｐＳｅａｌ−Ｓ（ポリスチレンマイクロプレート用ヒートシール、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ［Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ］ＧｍｂＨ、Ｒｏｄｇａｕ、ドイツ）を使用して、アッセイプレートを密閉し、室温で少なくとも６０分間インキュベートする。
−  次いで、Ｊｏｕａｎ卓上遠心分離機（Ｊｏｕａｎ  Ｉｎｃ．、Ｎａｎｔｅｓ、フランス）を使用して、１５００ｒｐｍで２分間、アッセイプレートを遠心分離する。
−  Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔを使用して、アッセイプレートをカウントし、各ウェルを２０秒間カウントする。
＊酵素の量は、使用するバッチの酵素活性によって決まる。
【０１０９】
一つのより好ましいアッセイにおいて、少量ノンバインディングＣＯＲＮＩＮＧ、３８４ウェルブラックプレート（カタログ番号３６７６）のウェル当たり１０μｌの最終体積で、キナーゼ反応を実施する。アッセイにおけるＡＴＰおよびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の最終濃度は、それぞれ１μＭおよび１０μｇ／ｍＬである。ＡＴＰの添加によって、反応を開始する。
【０１１０】
アッセイの成分を次のとおりウェル当たり添加する。
一つずつ８種の濃度（１／３および１／３．３３連続希釈ステップ）でのカラム１〜２０における、ウェル当たり９０％  ＤＭＳＯ中の５０ｎｌ試験化合物。
−  低対照：カラム２３〜２４の半分のウェルに５０ｎｌの９０％  ＤＭＳＯ（最終０．４５％）。
−  高対照：カラム２３〜２４の別の半分に参照化合物（例えば、ＷＯ２００６／１２２８０６における実施例７の化合物）の５０ｎｌ（最終２．５μＭ）。
−  標準：カラム２１〜２２における試験化合物として希釈した、ちょうど言及した５０ｎｌの参照化合物。
−  ２０ｍＬ「緩衝液」をアッセイ当たり調製する。
２００μｌの１Ｍ  ＴＲＩＳ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５（最終１０ｍＭ）
６０μｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ２（最終３ｍＭ）
５００μｌの２Ｍ  ＮａＣｌ（最終５０ｍＭ）
１００μｌの１０％  ＣＨＡＰＳ（最終０．０５％）
２００μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ（最終１ｍＭ）
１８．９４ｍＬのナノ純水
−  １０ｍＬ「ＰＩ」をアッセイ当たり調製する。
３％オクチルグルコシド中に調製された２００μｌの１ｍｇ／ｍＬの１−アルファ−ホスファチジルイノシトール（Ｌｉｖｅｒ  Ｂｏｖｉｎｅ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  カタログ番号８４００４２Ｃ  ＭＷ＝９０９．１２）（最終１０μｇ／ｍＬ）
９．８ｍＬの「緩衝液」
−  アッセイ当たり１０ｍＬ「ＡＴＰ」を調製する。
ウェル当たり１μＭの最終濃度をもたらす６．７μｌのＡＴＰの３ｍＭストック
１０ｍＬの「緩衝液」
−  次の最終濃度で「ＰＩ」中にアッセイ当たり２．５ｍＬの各ＰＩ３Ｋ構築物を調製する。
１０ｎＭ  ＰＩ３ＫアルファＥＭＶ  Ｂ１０７５
２５ｎＭ  ベータＥＭＶ  ＢＶ９４９
１０ｎＭ  デルタＥＭＶ  ＢＶ１０６０
１５０ｎＭ  ガンマＥＭＶ  ＢＶ９５０
−  ウェル当たり５μｌの「ＰＩ／ＰＩ３Ｋ」を添加する。
−  ウェル当たり５μｌの「ＡＴＰ」を添加して反応を開始する。
−  次いで、室温で６０分間（アルファ、ベータ、デルタ）または１２０分間（ガンマ）、プレートをインキュベートする。
−  １０μｌキナーゼ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号６７１４）の添加によって、反応を停止する。
−  １００ミリ秒の積分時間および１９１に設定された感度で、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２  ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ、Ｖｅｒｍｏｎｔ  米国）で、１０分後に、アッセイプレートを読む。
−  アウトプット：高対照は、約６０’０００カウントであり、低対照は、３０’０００以下である。
−  このルミネセンスアッセイは、０．４から０．７の間の有用なＺ’比を与える
Ｚ’値は、アッセイのロバストネスの万能尺度である。０．５から１．０の間のＺ’は、優れたアッセイと認められる。
【０１１１】
このアッセイのために、記載されたＰＩ３Ｋ構築物を以下のとおり調製する。
【０１１２】
１．２  遺伝子構築物の生成
二つの異なる構築物、ＢＶ  １０５２およびＢＶ  １０７５を使用して、化合物スクリーニングのためのＰＩ３キナーゼαタンパク質を生成する。
【０１１３】
ＰＩ３Ｋα  ＢＶ−１０５２  ｐ８５（ｉＳＨ２）−Ｇｌｙリンカー−ｐ１１０ａ（Ｄ２０ａａ）−Ｃ−末端Ｈｉｓタグ
ｐ８５サブユニットのインターＳＨ２ドメイン（ｉＳＨ２）およびｐ１１０−ａサブユニット（最初の２０個のアミノ酸の欠失を有する）のためのＰＣＲ生成物を生成し、オーバーラップＰＣＲによって融合する。ｉＳＨ２  ＰＣＲ生成物を、最初にプライマー
ｇｗＧ１３０−ｐ０１（５’−ＣＧＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＴ−３’）（配列番号１）およびｇｗＧ１３０−ｐ０２（５’−ＴＧＧＴＴＴ−ＡＡＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＴＧＴＣＡＡＴ−３’）（配列番号２）
を使用して一本鎖ｃＤＮＡから生成する。続いて、二次ＰＣＲ反応において、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、スイス）組換えＡｔｔＢ１サイトおよびリンカー配列を、プライマー
ｇｗＧ１３０−ｐ０３（５’−ＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴ−ＧＣＧＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＴ−３’）（配列番号３）および
ｇｗＧ１５２−ｐ０４（５’−ＴＡＣＣＡＴＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＡＡＡＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＴＴ−ＡＡＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＴＧＴＣＡＡＴ−３’）（配列番号４）
を使用して、それぞれｐ８５  ｉＳＨ２フラグメントの５’末端および３’末端に添加する。
【０１１４】
ｐ１１０−ａフラグメントを同様に、最初にプライマー
ｇｗＧ１５２−ｐ０１（５’−ＣＴＡＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＣＡＡＡＴＧＧ−３’）（配列番号５）および
ｇｗＧ１５２−ｐ０２（５’−ＧＴＴＣＡＡＴＧ−ＣＡＴＧＣＴＧＴＴＴＡＡＴＴＧＴＧＴ−３’）（配列番号６）
を使用して、一本鎖ｃＤＮＡから生成する。
【０１１５】
続いてのＰＣＲ反応において、リンカー配列およびヒスチジンタグを、プライマー
ｇｗ１５２−ｐ０３（５’−ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＴＡＴＧＧＴＡＣ−ＴＡＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＣ−ＡＡＡＴＧＧＡ−３’）（配列番号７）および
ｇｗＧ１５２−ｐ０６（５’−ＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＧＴＴＣＡＡＴＧ−ＣＡＴＧＣＴＧＴＴＴＡＡＴＴＧＴＧＴ−３’）（配列番号８）
を使用して、それぞれｐ１１０−ａフラグメントの５’末端および３’末端に添加する。
【０１１６】
ｐ８５−ｉＳＨ２／ｐ１１０−ａ融合タンパク質を、ｉＳＨ２フラグメントの３’末端およびｐ１１０−ａフラグメントの５’末端においてオーバーラップするリンカーによって、上述されたｇｗＧ１３０−ｐ０３プライマーおよびオーバーラップするヒスチジンタグおよびＡｔｔＢ２組換え配列
（５’−ＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＡＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴ−ＧＴＧＣＴＣＣ−３’）（配列番号９）
を含有するプライマーを使用して、第３のＰＣＲ反応において組み立てる。
【０１１７】
この最終生成物を、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＯＲ反応においてドナーベクターｐＤＯＮＲ２０１に組み込んでＯＲＦ３１８エントリークローンを生成する。このクローンをシークエンシングによって検証し、バキュロウイルス発現ベクターＬＲ４１０の生成のためのＧａｔｅｗａｙ採用ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入物を移すために、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ反応において使用する。
【０１１８】
ＰＩ３Ｋα  ＢＶ−１０７５  ｐ８５（ｉＳＨ２）−１２  ＸＧｌｙリンカー−ｐ１１０ａ（Ｄ２０ａａ）−Ｃ−末端Ｈｉｓタグ
バキュロウイルスＢＶ−１０７５のための構築物を、ｐ８５フラグメントおよびベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５にクローニングしたｐ１１０−ａフラグメントから構成された３部のライゲーションによって生成する。ｐ８５フラグメントは、Ｎｈｅ／Ｓｐｅで消化したプラスミドｐ１６６１−２由来である。ｐ１１０−ａフラグメントは、ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてＬＲ４１０（上記を参照されたい）由来である。クローニングベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｎｈｅ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化する。これは、構築物ＰＥＤ  １５３．８をもたらす。
【０１１９】
ｐ８５成分（ｉＳＨ２）は、テンプレートとしてのＯＲＦ  ３１８（上記に記載された）および一つのフォワードプライマー
ＫＡＣ１０２８（５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＧＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＡＣＣ）（配列番号１０）および二つのリバースプライマー
ＫＡＣ１０２９（５’−ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＴＧＴＣ）
（配列番号１１）および
ＫＡＣ１０３９（５’−ＴＡＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣ）
（配列番号１２）
を使用して、ＰＣＲによって生成する。
【０１２０】
二つのリバースプライマーは、オーバーラップし、１２ｘ  Ｇｌｙリンカーおよびｐ１１０ａ遺伝子のＮ−末端配列をＳｐｅＩ部位に組み込む。１２ｘ  Ｇｌｙリンカーは、ＢＶ１０５２構築物においてリンカーを置き換える。ＰＣＲフラグメントをｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。得られたクローニング物において、ｐ１６６１−２が正しいことが決定される。このプラスミドをＮｈｅおよびＳｐｅＩで消化し、得られるフラグメントをゲル単離し、サブクローニングのために精製する。ｐ１１０−ａクローニングフラグメントを、Ｓｐｅ  ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、クローンＬＲ４１０（上記を参照されたい）の酵素消化によって生成する。ＳｐｅＩ部位は、ｐ１１０ａ遺伝子のコーディング領域にある。得られるフラグメントを、ゲル単離しサブクローニングのために精製する。
【０１２１】
クローニングベクター、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＮｈｅおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて酵素消化によって調製する。切断したベクターを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｎ．Ｖ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）カラムを用いて精製し、次いで、子牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて脱リン酸化する。ＣＩＰ反応の完了後、切断したベクターを、再びカラム精製して最終ベクターを生成する。３部のライゲーションを、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄリガーゼおよびベンダー仕様書を使用して実施する。
【０１２２】
ＰＩ３Ｋβ  ＢＶ−９４９  ｐ８５（ｉＳＨ２）−Ｇｌｙリンカー−ｐ１１０ｂ（完全長）−Ｃ−末端Ｈｉｓタグ
ｐ８５サブユニットのインターＳＨ２ドメイン（ｉＳＨ２）および完全長ｐ１１０−ｂサブユニットのためのＰＣＲ生成物を生成し、ＰＣＲをオーバーラップすることによって融合する。
【０１２３】
ｉＳＨ２  ＰＣＲ生成物を、最初にプライマー
ｇｗＧ１３０−ｐ０１（５’−ＣＧＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＴ−３’）（配列番号１）およびｇｗＧ１３０−ｐ０２（５’−ＴＧＧＴＴＴ−ＡＡＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＴＧＴＣＡＡＴ−３’）（配列番号２）
を使用して、一本鎖ｃＤＮＡから生成する。続いて、二次ＰＣＲ反応において、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）組換えＡｔｔＢ１部位およびリンカー配列を、プライマー
ｇｗＧ１３０−ｐ０３（５’−ＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡ−ＴＡＣＡＴＡＴＧＣＧＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＴ−３’）（配列番号３）および
ｇｗＧ１３０−ｐ０５（５’−ＡＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＴＴＡＡＴ−ＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＴＧＴＣ−３’）（配列番号１３）
を使用して、それぞれｐ８５  ｉＳＨ２フラグメントの５’末端および３’末端に添加する。
【０１２４】
ｐ１１０−ｂフラグメントを同様に、リンカー配列およびｐ１１０−ｂの５’末端を含有するプライマー
ｇｗＧ１３０−ｐ０４（５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＣ−ＴＣＣＴＧＣＴ−３’）（配列番号４）
および、ヒスチジンタグに融合したｐ１１０−ｂの３’末端の配列を含有するプライマー
ｇｗＧ１３０−ｐ０６（５’−ＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡＧＴＣＴＴＴ−ＣＣＧＡＡＣＴＧＴＧＴＧ−３’）（配列番号１４）
を最初に使用して、一本鎖ｃＤＮＡから生成する。
【０１２５】
ｐ８５−ｉＳＨ２／ｐ１１０−ｂ融合タンパク質を、上述されたｇｗＧ１３０−ｐ０３プライマーおよびオーバーラップするヒスチジンタグおよびＡｔｔＢ２組換え配列（５’−ＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴ−ＡＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣ−３’）（配列番号１５）を含有するプライマーを使用して、ｉＳＨ２フラグメントの３’末端およびｐ１１０−ｂフラグメントの５’末端におけるリンカーの反応であるＰＣＲをオーバーラップすることによって組み立てる。
【０１２６】
最終生成物を、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＯＲ反応においてドナーベクターｐＤＯＮＲ２０１に組み込んでＯＲＦ２５３エントリークローンを生成する。このクローンをシークエンシングによって検証し、バキュロウイルス発現ベクターＬＲ２８０の生成のためのＧａｔｅｗａｙ採用ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入物を移すために、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ反応において使用する。
【０１２７】
ＰＩ３Ｋδ  ＢＶ−１０６０  ｐ８５（ｉＳＨ２）−Ｇｌｙリンカー−ｐ１１０ｄ（完全長）−Ｃ−末端Ｈｉｓタグ
ｐ８５サブユニットのインターＳＨ２ドメイン（ｉＳＨ２）および完全長ｐ１１０−ｄサブユニットのためのＰＣＲ生成物を生成し、ＰＣＲをオーバーラップすることによって融合する。
【０１２８】
ｉＳＨ２  ＰＣＲ生成物を、最初にプライマー
ｇｗＧ１３０−ｐ０１（５’−ＣＧＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＴ−３’）（配列番号１）およびｇｗＧ１３０−ｐ０２（５’−ＴＧＧＴＴＴ−ＡＡＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＴＧＴＣＡＡＴ−３’）（配列番号２）
を使用して、一本鎖ｃＤＮＡから生成する。続いて、二次ＰＣＲ反応において、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）組換えＡｔｔＢ１部位およびリンカー配列を、プライマー
ｇｗＧ１３０−ｐ０３（５’−ＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ−ＡＴＧＣＧＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＴ−３’）（配列番号３）および
ｇｗＧ１５４−ｐ０４（５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＴＧＴＣ−３’）（配列番号１６）
を使用して、それぞれｐ８５  ｉＳＨ２フラグメントの５’末端および３’末端に添加する。
【０１２９】
ｐ１１０−ａフラグメントは、同様に、最初にプライマー
ｇｗＧ１５４−ｐ０１（５’−ＡＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＴＧＣＣＣＣＡＴ−３’）（配列番号１７）およびｇｗＧ１５４−ｐ０２（５’−ＣＴＡＣＴＧ−ＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＣＧＴ−３’）（配列番号１８）
を使用して、一本鎖ｃＤＮＡから生成する。
【０１３０】
続いてのＰＣＲ反応において、リンカー配列およびヒスチジンタグを、プライマー
ｇｗ１５４−ｐ０３（５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣ−ＴＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡ−３’）（配列番号１９）およびｇｗＧ１５４−ｐ０６（５’−ＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴ−ＧＧＴＧＡＴＧＴＧＣＴ−ＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＣＧＴＴＧＴ−３’）（配列番号２０）
を使用して、それぞれｐ１１０−ｄフラグメントの５’末端および３’末端に添加する。
【０１３１】
ｐ８５−ｉＳＨ２／ｐ１１０−ｄ融合タンパク質を、第３のＰＣＲ反応において、上述されたｇｗＧ１３０−ｐ０３プライマーおよびオーバーラップするヒスチジンタグおよびＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＡｔｔＢ２組換え配列（５’−ＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡ−ＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴ−ＡＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣ−３’）（配列番号２１）を含有するプライマーを使用して、ｉＳＨ２フラグメントの３’末端およびｐ１１０−ｄフラグメントの５’末端でリンカーをオーバーラップすることによって組み立てる。
【０１３２】
この最終生成物を、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＯＲ反応において、ドナーベクターｐＤＯＮＲ２０１に組み込んでＯＲＦ３１９エントリークローンを生成する。このクローンをシークエンシングによって検証し、バキュロウイルス発現ベクターＬＲ４１５の生成のためのＧａｔｅｗａｙ採用ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入物を移すために、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ反応において使用する。
【０１３３】
ＰＩ３Ｋγ  ＢＶ−９５０      ｐ１１０ｇ（Ｄ１４４ａａ）−Ｃ−末端Ｈｉｓタグ
この構築物を、Ｒｏｇｅｒ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｌａｂ、ＭＲＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、イギリス（２００３年１１月）より得る。構築物の説明：Pacold M. E.ら、(2000) Cell 103巻、931〜943ページ。
【０１３４】
１．３  タンパク質の発現および精製
ＰＩ３Ｋイソ型のための組換えバキュロウイルスおよびタンパク質を生成する方法：
異なるＰＩ３キナーゼ遺伝子を含有するｐＢｌｕｅ−Ｂａｃ４．５（ａ、ｂ、およびｄイソ型用）またはｐＶＬ１３９３（ｇ用）プラスミドを、ベンダーに推奨される方法を使用して、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ  ＷＴゲノムＤＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、米国）と共に同時形質移入する。続いて、形質移入から得られる組換えバキュロウイルスを、Ｓｆ９昆虫細胞上でプラーク精製して、組換えタンパク質を発現しているいくつかの単離株を得る。陽性クローンは、抗ＨＩＳまたは抗イソ型抗体ウェスタンによって選択される。ＰＩ３Ｋアルファおよびデルタイソ型について、二次プラーク精製を、ＰＩ３Ｋの第１のクローンウイルスストック上で実施する。全てのバキュロウイルス単離株の増幅を、低い感染多重度（ｍｏｉ）において実施して、タンパク質生成用の高力価低継代ストックを生成する。バキュロウイルスを、ＢＶ１０５２（α）およびＢＶ１０７５（α）、ＢＶ９４９（β）、ＢＶ１０６０（δ）およびＢＶ９５０（γ）と称する。
【０１３５】
タンパク質産生は、２ｌのガラスＥｒｌｅｎｍｙｅｒフラスコ（１１０ｒｐｍ）またはウェーブ−バイオリアクター（２２〜２５ｒｐｍ）における３９〜４８時間の、２〜１０のｍｏｉにおける、タンパク質を含まない培地における懸濁されたＴｎ５（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）またはＴｉｎｉＰｒｏ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＬＬＣ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ、ＣＡ、米国）細胞の感染（３代以下の継代）を含む。最初、１０ｌの作業体積のウェーブ−バイオリアクターに、半分の許容量（５Ｌ）で、３ｅ５細胞／ｍＬの密度で播種する。反応器を、７２時間、細胞増殖期中１５ｒｐｍで揺り動かし、空気と混合した５％酸素を補う（毎分０．２ｌ）。感染の直前に、ウェーブ−リアクター培養物を、密度、生存度について分析し、約１．５ｅ６細胞／ｍＬに希釈する。１００〜５００ｍＬの高力価、低継代ウイルスを、追加の培養の２〜４時間後に添加する。３９〜４８時間の感染期間、酸素を３５％に増加し、振動台のｒｐｍを２５に増加する。感染の間、Ｖｉｃｅｌｌ生存度分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、米国）によって、生存度、直径および密度のバイオプロセスについて細胞をモニターする。種々のパラメーターおよび代謝産物（ｐＨ、Ｏ２飽和、ブドウ糖など）のＮｏｖａ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＮＯＶＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）による読み取りを、回収まで１２〜１８時間毎に行う。ウェーブ−バイオリアクター細胞を、感染後４０時間以内に集める。遠心分離（１５００ｒｐｍで４度Ｃ）によって細胞を集め、続いて、溶解および精製のためにペレットのプーリング中、氷上に維持する。少量の冷たい、補充されていないＧｒａｃｅ培地（プロテアーゼ阻害剤を含まない）を用いて、ペレットプールを作る。
【０１３６】
ＨＴＳ（ＢＶ１０５２）のためのＰＩ３Ｋアルファ精製プロトコル
ＰＩ３Ｋアルファを三つのクロマトグラフィーステップ：Ｎｉセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ所属、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＣＴ、米国）上の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するゲル濾過、最後にＳＰ−ＸＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の陽イオン交換ステップで精製する。全ての緩衝液を４℃に冷却し、氷上で冷却したまま溶解を行う。カラム分画を、室温で迅速に行う。
【０１３７】
典型的に、凍結昆虫細胞を、高張溶解緩衝液に溶解し、分取ＩＭＡＣカラムに適用する。樹脂を３〜５カラム体積の溶解緩衝液で洗浄し、次いで、４５ｍＭイミダゾールを含有する３〜５カラム体積の洗浄緩衝液で洗浄し、次いで、目的のタンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で溶離する。画分を、クーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールし、分取ＧＦＣカラムに適用する。ＧＦＣカラムからの画分を、クーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールする。ＧＦＣカラムからのプールを、低塩濃度緩衝液に希釈し、分取ＳＰ−ＸＬカラムに適用する。安定なＡ２８０ベースライン吸光度が達成されるまで、カラムを低塩濃度緩衝液で洗浄し、０ｍＭ  ＮａＣｌから５００ｍＭ  ＮａＣｌまでの２０カラム体積勾配を使用して溶離する。再び、ＳＰ−ＸＬカラムからの画分を、クーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールする。最終的なプールを、５０％グリセロールを含有する保存用緩衝液中に透析し、−２０℃で貯蔵する。最終的なプールを、ホスホイノシトールキナーゼアッセイで活性について評価する。
【０１３８】
ＨＴＳ（ＢＶ９４９）のためのＰＩ３Ｋベータ精製プロトコル
ＰＩ３Ｋベータを、二つのクロマトグラフィーステップ：Ｎｉセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するゲル濾過（ＧＦＣ）で精製する。全ての緩衝液を４℃に冷却し、氷上で冷却したまま溶解を行う。カラム分画を、室温で迅速に行う。
【０１３９】
典型的に、凍結昆虫細胞を、高張溶解緩衝液に溶解し、分取ＩＭＡＣカラムに適用する。樹脂を３〜５カラム体積の溶解緩衝液で洗浄し、次いで、４５ｍＭイミダゾールを含有する３〜５カラム体積の洗浄緩衝液で洗浄し、次いで、目的のタンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で溶離する。画分を、クーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールし、分取ＧＦＣカラムに適用する。ＧＦＣカラムからの画分を、クーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールする。最終的なプールを、５０％グリセロールを含有する保存用緩衝液中に透析し、−２０℃で貯蔵する。最終的なプールを、ホスホイノシトールキナーゼアッセイで活性について評価する。
【０１４０】
ＨＴＳ（ＢＶ９５０）のためのＰＩ３Ｋガンマ精製プロトコル
ＰＩ３Ｋガンマを、二つのクロマトグラフィーステップ：Ｎｉセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するゲル濾過（ＧＦＣ）で精製する。全ての緩衝液を４℃に冷却し、氷上で冷却したまま溶解を行う。カラム分画を、室温で迅速に行う。典型的に、凍結昆虫細胞を、高張溶解緩衝液に溶解し、分取ＩＭＡＣカラムに適用する。樹脂を３〜５カラム体積の溶解緩衝液で洗浄し、次いで、４５ｍＭイミダゾールを含有する３〜５カラム体積の洗浄緩衝液で洗浄し、次いで、目的のタンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で溶離する。画分を、クーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールし、分取ＧＦＣカラムに適用する。ＧＦＣカラムからの画分を、クーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールする。最終的なプールを、５０％グリセロールを含有する保存用緩衝液中に透析し、−２０℃で貯蔵する。最終的なプールを、ホスホイノシトールキナーゼアッセイで活性について評価する。
【０１４１】
ＨＴＳ（ＢＶ１０６０）のためのＰＩ３Ｋデルタ精製プロトコル
ＰＩ３Ｋデルタを、三つのクロマトグラフィーステップ：Ｎｉセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するゲル濾過、最後にＱ−ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の陰イオン交換ステップで精製する。全ての緩衝液を、４℃に冷却し、氷上で冷却したまま、溶解を行う。カラム分画を室温で迅速に行う。典型的に、凍結昆虫細胞を、高張溶解緩衝液に溶解し、分取ＩＭＡＣカラムに適用する。樹脂を３〜５カラム体積の溶解緩衝液で洗浄し、次いで、４５ｍＭイミダゾールを含有する３〜５カラム体積の洗浄緩衝液で洗浄し、次いで、目的のタンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で溶離する。画分を、クーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールし、分取ＧＦＣカラムに適用する。ＧＦＣカラムからの画分を、クーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールする。ＧＦＣカラムからのプールを、低塩濃度緩衝液に希釈し、分取Ｑ−ＨＰカラムに適用する。安定なＡ２８０ベースライン吸光度が達成されるまで、カラムを低塩濃度緩衝液で洗浄し、０ｍＭ  ＮａＣｌから５００ｍＭ  ＮａＣｌまでの２０カラム体積勾配を使用して溶離する。再び、Ｑ−ＨＰカラムからの画分を、クーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールする。最終的なプールを、５０％グリセロールを含有する保存用緩衝液中に透析し、−２０℃で貯蔵する。最終的なプールを、ホスホイノシトールキナーゼアッセイで活性について評価する。
【０１４２】
ＩＣ５０を、「ｅｘｃｅｌ  ｆｉｔ」と組み合わせての４パラメーター曲線適合ルーティンによって求める。４パラメーターロジスティック方程式を、８種の濃度（通常、１０、３．０、１．０、０．３、０．１、０．０３０、０．０１０および０．００３μＭ）における各化合物の阻害百分率のＩＣ５０値（ＩＤＢＳ  ＸＬｆｉｔ）を計算するために使用する。別法として、ＩＣ５０値を、４パラメーターロジスティックモデルであるｉｄｂｓＸＬｆｉｔモデル２０４を使用して計算する。
【０１４３】
さらに、別法として、ＡＴＰ枯渇アッセイについて、試験すべき化合物を、ＤＭＳＯに溶解し、ウェル当たり０．５μｌで白色３８４ウェルプレートに直接分配する。反応を開始するために、１０μｌの１０ｎＭ  ＰＩ３キナーゼおよび５μｇ／ｍＬ  １アルファ−ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を、各ウェルに添加し、次いで１０μｌの２μＭ  ＡＴＰを添加する。ＡＴＰの約５０％が枯渇するまで反応を行い、次いで、２０μｌのキナーゼ−Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）の添加によって停止する。停止した反応物を、５分間インキュベートし、次いで、残ったＡＴＰをルミネセンスによって検出する。次いで、ＩＣ５０を求める。
【０１４４】
本発明の一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であって、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、酵素的ＰＩ３ＫデルタアッセイにおけるＩＣ５０として表された活性の範囲は、１ｎＭから５００ｎＭの間である。
【０１４５】
本発明の別の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であって、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、酵素的ＰＩ３ＫデルタアッセイにおけるＩＣ５０として表された活性の範囲は、１ｎＭから１００ｎＭの間である。
【０１４６】
本発明の別の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であって、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、酵素的ＰＩ３ＫデルタアッセイにおけるＩＣ５０として表された活性の範囲は、０．５ｎＭから１０ｎＭの間である。
【０１４７】
本発明の一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であって、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、細胞のＰＩ３ＫデルタアッセイにおけるＩＣ５０として表された活性の範囲は、１ｎＭから１０００ｎＭの間である。
【０１４８】
本発明の別の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であって、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、細胞のＰＩ３ＫデルタアッセイにおけるＩＣ５０として表された活性の範囲は、１ｎＭから５００ｎＭの間である。
【０１４９】
本発明の別の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であって、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、阻害剤は、他のイソ型の１つまたは複数よりＰＩ３Ｋデルタイソ型への選択性を示し、この選択性は少なくとも１０倍である。
【０１５０】
本発明の別の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であって、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、阻害剤は、他のイソ型の１つまたは複数よりＰＩ３Ｋデルタイソ型への選択性を示し、この選択性は少なくとも２０倍である。
【０１５１】
本発明の別の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であって、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、阻害剤は、異なるパラログＰＩ３ＫαおよびβよりＰＩ３Ｋデルタイソ型への選択性を示し、この選択性は少なくとも１０倍である。
【０１５２】
本発明の別の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であって、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、阻害剤は、異なるパラログＰＩ３ＫαおよびβよりＰＩ３Ｋデルタイソ型への選択性を示し、この選択性は少なくとも２０倍である。
【０１５３】
本発明の別の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であって、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、細胞のＰＩ３ＫデルタアッセイにおけるＩＣ５０として表された活性の範囲は、１ｎＭから５００ｎＭの間であり、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、阻害剤は、異なるパラログＰＩ３ＫαおよびβよりＰＩ３Ｋデルタイソ型への選択性を示し、この選択性は少なくとも１０倍である。
【０１５４】
本発明の別の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であって、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、細胞のＰＩ３ＫデルタアッセイにおけるＩＣ５０として表された活性の範囲は、１ｎＭから５００ｎＭの間であり、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋデルタイソ型への阻害作用を有し、阻害剤は、異なるパラログＰＩ３ＫαおよびβよりＰＩ３Ｋデルタイソ型への選択性を示し、この選択性は少なくとも２０倍である。
【０１５５】
２．細胞アッセイ
２．１  Ｒａｔ−１細胞におけるホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）が媒介するＡｋｔ１／２（Ｓ４７３）リン酸化
ヒトホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の触媒サブユニットであるアルファ、ベータまたはデルタのミリストイル化形態を安定的に過剰発現しているＲａｔ−１細胞を、３０ｕｌの完全増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０μｇ／ｍＬのピューロマイシンおよび１％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ高グルコース））中で、７５００個（ＰＩ３Ｋアルファ）、６２００個（ＰＩ３Ｋベータ）、または４０００個（ＰＩ３Ｋデルタ）の細胞の密度で３８４ウェルプレートに蒔き、３７％Ｃ／５％ＣＯ２／９５％湿度にて２４時間インキュベートした。９０％  ＤＭＳＯ中の４０試験化合物用の８点連続希釈、ならびに４参照化合物プラス１６高対照および１６低（阻害された）対照を得るために、３８４ウェル化合物プレート中で化合物を希釈した。Ｈｕｍｍｉｎｇｗｅｌｌナノリットルディスペンサーを使用して３８４ウェルポリプロピレンプレートに２５０ｎｌの化合物溶液をピペット分注することによって、予備希釈プレートを調製した。４９．７５ｕｌの完全成長培地の添加によって、化合物を予備希釈した。１０ｕｌの予備希釈した化合物溶液を、３８４ウェルピペッターを使用して細胞プレートに移し、０．１１％の最終ＤＭＳＯ濃度をもたらした。
【０１５６】
細胞を３７％Ｃ／５％ＣＯ２／９５％湿度にて１時間インキュベートした。上清を除去し、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）検出のために細胞を２０ｕｌの溶解緩衝液中で溶解した。
【０１５７】
ｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）の検出のために、ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）ｐ−Ａｋｔ  １／２（Ｓｅｒ４７３）アッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国）を使用した。５ｕｌの細胞溶解物を、３８４ウェルピペッターを使用して検出のために３８４ウェル少量Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅに移した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）試薬の添加は、製造者のプロトコルに従って行った。第一に、５ｕｌの反応緩衝液プラスＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）アクセプタービーズを含有する活性化緩衝液ミックスを添加し、プレートを密閉し、室温において２時間プレートシェーカー上でインキュベートした。第二に、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ドナービーズを含有する２ｕｌの希釈緩衝液を添加し、プレートを、さらに２時間、上記のとおりプレートシェーカー上でインキュベートした。プレートを、標準的ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）設定を使用して、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）互換性プレートリーダーで読み取った。
【０１５８】
２．２  マウスのＢ細胞活性化の決定
細胞がＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を介して刺激されるとき、ＰＩ３ＫδはＢ細胞機能をモジュレートすると認識されてきた（Okkenhaug et al. Science 297:1031 (2002)）。Ｂ細胞活性化に対する化合物の阻害特性を評価するために、マウス脾臓抗体に由来するマウスのＢ細胞上の活性化マーカーＣＤ８６およびＣＤ６９のアップレギュレーションを、抗ＩｇＭによる刺激の後に測定する。ＣＤ６９は、Ｂ細胞およびＴ細胞のための周知の活性化マーカーである（Sancho et al. Trends Immunol. 26:136 (2005)）。ＣＤ８６（Ｂ７−２としてもまた公知である）は、Ｂ細胞を含む抗原提示細胞上に主に発現する。休止Ｂ細胞は、ＣＤ８６を低レベルで発現するが、例えば、ＢＣＲまたはＩＬ−４受容体の刺激に続いてＣＤ８６をアップレギュレートする。Ｂ細胞上のＣＤ８６は、Ｔ細胞上のＣＤ２８と相互作用する。この相互作用は、最適なＴ細胞活性化のために、および最適なＩｇＧ１反応を生じさせるために必要とされる（Carreno et al. Annu Rev Immunol. 20:29 (2002)）。
【０１５９】
Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾臓を集め、脾細胞を単離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩで２回洗浄する。このように補充されるＲＰＭＩは、その後培地と称される。細胞を、培地中で２．５×１０６個の細胞／ｍＬに調節し、２００μｌの細胞懸濁液（５×１０６個の細胞）を９６ウェルプレートの適当なウェルに加える。
【０１６０】
次いで、培地中の５０μｌの抗ＩｇＭ  ｍＡｂ（最終濃度：３０μｇ／ｍＬ）を加えることによって細胞を刺激する。３７℃での２４時間のインキュベーション後、細胞を下記の抗体カクテルで染色する。抗マウスＣＤ８６−ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ６９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、Ｂ細胞のアセスメントのための抗マウスＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ、および抗マウスＣＤ３−ＦＩＴＣ、Ｔ細胞のアセスメントのための抗マウスＣＤ６９−ＰＥ（２μｌの各抗体／ウェル）。暗中で室温（ｒｔ）にて１時間後、細胞を９６ディープウェルプレートに移す。２％ＦＢＳを含有する１ｍＬのＰＢＳで細胞を１回洗浄し、２００μｌ中での再懸濁の後、試料をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析する。リンパ球を、サイズおよび粒度によってＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにおいてゲーティングし、ＣＤ１９、ＣＤ３および活性化マーカー（ＣＤ８６、ＣＤ６９）の発現についてさらに分析する。データを、ＢＤ  ＣｅｌｌＱｅｓｔソフトウェアを使用して、ＣＤ１９＋またはＣＤ３＋集団内で活性化マーカーについて陽染された細胞の百分率としてドットブロットから計算する。
【０１６１】
化合物の阻害特性を評価するために、化合物を最初に溶解し、ＤＭＳＯに希釈し、それに続いて培地に１：５０希釈する。Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾細胞を単離し、再懸濁し、上記のような９６ウェルプレートに移す（２００μｌ／ウェル）。希釈した化合物または溶媒をプレート（２５μｌ）に加え、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、培養物を２５μｌの抗ＩｇＭ  ｍＡｂ／ウェル（最終濃度３０μｇ／ｍＬ）で３７℃にて２４時間刺激し、抗マウスＣＤ８６−ＦＩＴＣおよび抗マウスＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ（２μｌの各抗体／ウェル）で染色する。ＣＤ１９陽性Ｂ細胞上のＣＤ８６発現は、上記のようなフローサイトメトリーによって定量化する。
【０１６２】
２．３  ラットＢ細胞活性化の決定
細胞がＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を介して刺激されるとき、ＰＩ３ＫδはＢ細胞機能をモジュレートすることが認識されてきた（Okkenhaug et al. Science 297:1031 (2002)）。Ｂ細胞活性化に対する化合物の阻害特性を評価するために、全血に由来するラットＢ細胞に対する活性化マーカーＣＤ８６のアップレギュレーションを、抗ＩｇＭおよび組換えＩＬ−４による刺激の後で測定する。ＣＤ８６分子（Ｂ７−２としてもまた公知である）は、Ｂ細胞を含む抗原提示細胞上に主に発現している。休止Ｂ細胞は、ＣＤ８６を低レベルで発現するが、例えば、ＢＣＲまたはＩＬ−４受容体の刺激に続いてＣＤ８６をアップレギュレートする。Ｂ細胞上のＣＤ８６は、Ｔ細胞上のＣＤ２８と相互作用する。この相互作用は、最適なＴ細胞活性化のために、および最適なＩｇＧ１反応を生じさせるために必要とされる（Carreno et al. Annu Rev Immunol. 20:29 (2002)）。
【０１６３】
ラット血液の収集
ヘパリンナトリウムで事前コーティングした皮下針を有する１０ｍｌのシリンジを使用して、全血を、成体雄Ｌｅｗｉｓラット（ＬＥＷ／ＨａｎＨｓｄ）ｏｂｙの腹部大動脈から集めた。血液を５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ中に移し、抗凝血剤濃度を１００Ｕ／ｍｌに調節した。
【０１６４】
ラットＢ細胞の刺激、および特定の阻害剤による処置
免疫抑制薬のインビトロの効果のアセスメントのために、ヘパリン添加血液を、培地で５０％に事前希釈した。培地として務めたのは１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ｍｇ／ｍｌのデキストラン４０および５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｆｅｔａｃｌｏｎｅ  Ｉ、Ｇｉｂｃｏ＃１０２７０−１０６）を補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ａｎｉｍｅｄカタログ＃１−２６Ｆ０１−Ｉ）。次いで、１９０μｌの事前希釈した血液を、９６ウェルＵ底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）において１０μｌの事前希釈した試験化合物でスパイクし、２０〜０．０００３μＭの濃度範囲を伴う３倍段階希釈をもたらした。対照ウェルをＤＭＳＯで事前処置し、０．５％ＤＭＳＯの最終濃度を得た。培養物を２連で設け、プレート振盪機（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  Ｔｉｔｒａｍａｘ１０１；３０秒、スピード９００）上で撹拌によってよく混合し、ピペットに吸い上げて吐き出し、再びプレート振盪機上で撹拌した。培養物を３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。次いで、２０μｌのポリクローナルヤギ抗ラットＩｇＭ  Ａｂ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、カタログ＃３０２００１）および１０μｌの希釈した組換えｒＩＬ−４（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ＃３４００８５）を加え、それぞれ、３０μｇ／ｍｌおよび５ｎｇ／ｍｌの最終濃度を得た。上記のようにプレート振盪機上での撹拌によってプレートを混合し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１６５】
フローサイトメトリーによるＢ細胞活性化の決定
インキュベーションの後、１５μｌの２５ｍＭのＥＤＴＡ溶液を、ウェル毎に加え、１５分間振盪し、接着細胞を剥離した。次いで、表面活性化マーカーの分析のために、試料をＰＥ−Ｃｙ５−標識した抗ラットＣＤ４５ＲＡ（ＢＤカタログ＃５５７０１５）で染色し、ＦＡＣＳ分析においてＢ細胞上のゲーティングを可能とした。さらに、試料をＰＥ−標識した抗ラットＣＤ８６（ＢＤカタログ＃５５１３９６）で染色した。全ての染色手順は、暗中室温で３０分間行った。インキュベーション後、試料を２ｍｌ／ウェルのＢＤ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ＃３４９２０２）を含有する９６ディープウェルＶ底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３９６０９６）に移した。赤血球の溶解後、試料を２ｍｌのＣｅｌｌＷＡＳＨ（ＢＤ＃３４９５２４）で洗浄した。データは、それぞれ、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  ＰｌｕｓまたはＤＩＶＡ（バージョン６．１．１）ソフトウェアを使用して、ＬＳＲＩＩまたはＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。リンパ球を、サイズおよび粒度によってＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにおいてゲーティングし、ＣＤ４５ＲＡおよび活性化マーカーの発現についてさらに分析した。データは、ＣＤ４５ＲＡ＋集団内で活性化マーカーについて陽染された細胞の百分率としてドットブロットまたはヒストグラムから計算した。
【０１６６】
統計的評価
薬物への曝露の後のＢ細胞活性化の阻害百分率を、下記の式によって計算した。
【０１６７】
【数１】
0006310474.tif 000004
ＯＲＩＧＩＮ７ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を、非線形回帰曲線の当てはめのために使用した。５０％阻害をもたらす薬物濃度（ＩＣ５０）を、阻害データにヒルの式をフィットさせることによって得た。
【０１６８】
２．４  マウス脾細胞におけるＴＬＲ９誘発ＩＬ−６の測定
マウス脾臓からの単一細胞懸濁液の調製
安楽死後即座に、脾臓をＣ５７ＢＬ／６マウスから切り取った。５ｍｌシリンジからのプランジャーを使用して０．４μＭセルストレーナーを通して脾臓をすりつぶす前に、過剰な脂肪を脾臓から切り取った。単一細胞懸濁液を調製し、冷ＰＢＳを使用して５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ管中で、体積を１５ｍｌに調節した。上清の除去および脾臓当たり５ｍｌの赤血球溶解緩衝液中の再懸濁および５分間の室温インキュベーションの前に、４℃において５分間１５００ｒｐｍで細胞を遠心分離した。４℃での５分間１５００ｒｐｍの遠心分離の前に、氷冷したＰＢＳ（３０ｍｌ）を細胞に添加した。上清を除去し、４０ｍｌのマウス脾細胞培養培地（ＭＳＣＭ）で２度、細胞を洗浄した。ＭＳＣＭは、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１×非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、および１０％加熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩからなった。細胞を１０〜２０ｍｌのＭＳＣＭに再懸濁し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓセルカウンターを使用してカウントした。およそ６０×１０６個の脾細胞が、単一のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓から得られた。
【０１６９】
マウス脾細胞の刺激および特定の阻害剤による処理
脾細胞を、９６ウェル平底プレートに１００μｌの量で２×１０５細胞／ウェルの最終密度でプレートし、加湿した３７℃のインキュベーター中で２〜４時間インキュベートした。その後、試験すべき化合物を、先に調製した化合物ストックプレートを使用し、自動液体操作機械を使用して分注した。ストックプレートは、２倍または３倍希釈を使用して８〜１０点に配列した化合物（９０％／１０％  ＤＭＳＯ／ｄｄＨ２Ｏ中）からなった。液体操作機械は、先に調製された化合物ソースプレートからの１μｌの各希釈を、９６ウェルプレート中の適切な目的ウェル中に分注した。細胞培養物中の化合物の最終出発濃度は、１０μＭであった。細胞培養物中のＤＭＳＯの最終濃度は、０．５％であった。細胞を、ＴＬＲリガンドの添加前に、１時間、化合物と共にインキュベートした。次いで、１０×ＥＣ８０濃度のＣｐＧ１８２６を、２０μｌの量で（２００μｌの最終培養物体積のために）添加し、その後、加湿した３７℃のインキュベーター中で終夜、培養物をインキュベートした。
【０１７０】
ＥＬＩＳＡによるインターロイキン６の測定
終夜の培養の後、プレートを室温で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離した。続いて１５０μｌの各培養物を、９６ウェルＶ底プレートに移し、市販のマウスＩＬ−６サンドイッチＥＬＩＳＡキットを使用して、ＩＬ−６レベルを測定した。一時的に、ＰＢＳ／０．１％  ＢＳＡで１時間、遮断する前に、プレートを捕捉抗体で終夜コーティングした。試料および標準を５０μｌの量で添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。標準／試料の除去後、５０μｌのビオチン化検出抗体の添加の前に、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎを使用してプレートを洗浄し、その後、撹拌しながら、プレートを室温で２時間インキュベートした。ウェル当たり５０μｌストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼの添加の前に、プレートを、２０分間、再び洗浄した。追加のプレート洗浄に続いて、５０μｌ  ＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、２５μｌ／ウェルの停止液の添加の前に、プレートを２０分間インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（４５０ｎｍ）を使用して、ＩＬ−６レベルを測定し、ＳｏｆｔＭａｘ  ＰｒｏおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
【０１７１】
２．５  ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＴＬＲ９誘発ＩＦＮアルファの測定
ヒト新鮮血からのＰＢＭＣの調製
ヒト血液（約７５ｍｌ）を、Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｓ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ  ７．５ｍＬ  ＮＨ  Ｈｅｐａｒｉｎ  １６  ＩＵ／ｍＬ血液；Ｓｔａｒｓｔｅｄｔ）を入れた１０Ｓ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ管に集めた。Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（商標）管（３０ｍＬ  ＃２２７２９０；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）を、管当たり１５ｍｌリンパ球分離培地ＬＳＭ１０７７（商標）（＃Ｊ１５−００４；ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の添加および１０００ｇにおける３０秒間の遠心分離によって調製した。等量のＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない；＃１４１９０−０９４）による希釈に続いて、約２５ｍｌの血液をＬｅｕｃｏｓｅｐ（商標）管に移した。ブレーキをかけずにＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ遠心分離機を使用して、２２℃で２０分間、８００ｇで、試料を遠心分離した。ＰＢＭＣ層を、血漿：分離媒体界面から注意深く取り出し、清潔な５０ｍｌ管に移した。細胞を、ＰＢＳ（最大で４５ｍｌまで）の添加によって一度洗浄し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒを使用してブレーキ（速度９に設定）をかけながら遠心分離（２２℃で１４００ｒｐｍ、１０分）した。ペレット細胞を、培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび５％ｖ／ｖ  ＦＣＳ）に注意深く再懸濁化し、試料をプールした。培地成分の２−メルカプトエタノール（＃３１３５０−０１０；５０ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ（＃１５６３０−０５６、１Ｍ）およびＲＰＭＩ  １６４０（１×）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（＃６１８７０−０１０）はＧｉｂｃｏから得た。ＦＣＳ（＃２−０１Ｆ３６−１）は、Ａｍｉｍｅｄから得た。ＰＢＭＣを、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）自動セルカウンターを使用してカウントした（等量（１０μｌ）のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅの添加の前に、試料を培地に１：１０で予備希釈した）。細胞を、４×１０６細胞／ｍｌに希釈し、３８４ウェルプレート（＃３５３９６２；  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ）に播種して２５μｌの最終量を得た（即ち、１×１０５細胞／ウェル）。
【０１７２】
ＰＢＭＣの刺激および特定の阻害剤による処理
化合物を、１００％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ（＃４１６４０−１００ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に予備希釈し、次いで培地に移した（０．２５％の最終ＤＭＳＯ濃度を達成するため）。適切な化合物希釈（５μｌ）またはビヒクル対照（５μｌ）で、細胞を処理し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２を含む空気中で、加湿したインキュベーター中で３０分間、３７℃でインキュベートした。細胞を、ＣｐＧ２２１６（０．３μＭ；＃ｔｌｒｌ−ｈｏｄｎａ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）またはビヒクル対照（１０μｌ／ウェル）で刺激し、２０時間インキュベートした。プレートを、短時間遠心分離（２２℃で２００×ｇ、２分間）し、ＩＦＮαレベルの定量のために、上清試料（３０μｌ）を取り出した。
【０１７３】
ＡｌｐｈａＬｉｓａ技術を使用したＩＦＮαの定量化
ＩＦＮアルファの定量化のために、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製のヒトインターフェロンＡｌｐｈａＬＩＳＡキット（＃ＡＬ２６４Ｆ）を使用した。抗ＩＦＮαアクセプタービーズ（最終５μｇ／ｍｌ）およびビオチン化抗体抗ＩＦＮα（最終０．５ｎＭ）を含有する抗体ミックスを、新しく調製し、３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅ（商標）（＃６００７２９９；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中に分注（５μｌ）する。既知のＩＦＮα標準（ヒトＩＦＮα  Ｂ（２ｂ））の希釈を調製し、細胞上清（５μｌ）と一緒に上記プレートに添加した。プレートを短時間遠心分離（２００ｇにおけるパルス）し、接着性シーリングフィルムで覆い、ボルテックスし、暗所で、室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン-コーティングしたドナービーズ（最終２０μｇ／ｍｌ）を調製し、薄暗い場所（光に敏感なミックス）において各ウェル（５μｌ）に添加した。プレートを室温で３０分インキュベートした（プレートを遠心分離または覆ってはならない）。インキュベーション後、装置自体の「ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ標準設定」（例えば、合計測定時間：５５０ｍｓ、レーザー  ６８０ｎｍ励起時間：１８０ｍｓ、ミラー：Ｄ６４０  ａｓ、発光フィルター：Ｍ５７０ｗ、中心波長５７０ｎｍ、帯域幅１００ｎｍ、透過率７５％）を使用するＡＬＰＨＡオプションを備えたＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）マルチプレートリーダーで、プレートを読んだ。分析およびＩＦＮαレベルの定量化のためにデータを集めた。
【０１７４】
データ評価および分析
ＸＬｆｉｔアドイン（ＩＤＢＳ；バージョン４．３．２）を備えたＥｘｃｅｌ  ＸＬ  ｆｉｔ  ４．０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してデータを分析した。特定のＩＦＮα濃度を、ヒトＩＦＮα  Ｂ（２ｂ）を使用する標準曲線への外挿に従って求めた。化合物の個別のＩＣ５０値は、実験データへの曲線の適合後の非線形回帰によって求めた。
【０１７５】
３  ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対する抗体産生の決定
簡潔に言えば、ＯＦＡラットに、ｄ０にヒツジ赤血球をｉ．ｖ．注射し、研究中の化合物で経口的に連続４日（ｄ０からｄ３）処置した。ｄ４に脾臓細胞懸濁液を調製し、指標細胞（ＳＲＢＣ）および補体の存在下でリンパ球を軟寒天上に蒔いた。ＳＲＢＣ特異抗体（主に、ＩｇＭサブクラス）の分泌による指標細胞の溶解、および補体の存在によって、プラークが生じた。プレート毎のプラークの数を計数し、脾臓毎のプラークの数として表した。
【０１７６】
免疫化：５匹の雌性ＯＦＡラットの群を、ラット毎に０．５ｍｌの容量でｉ．ｖ．注射によって２×１０８個／ｍｌのＳＲＢＣ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＬＡＳ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧから得た）で０日目に免疫化した。
【０１７７】
化合物処置：動物を、０．５％ＣＭＣ、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０に懸濁した化合物で、免疫化の日に開始して連続４日間（０日目、１日目、２日目および３日目）処置した。化合物を、投与の間に１２時間の間隔を伴って、５ｍｌ／ｋｇ体重の適用容量で経口的に１日２回投与した。
【０１７８】
脾臓細胞懸濁液の調製：
４日目に、ＣＯ２で動物を安楽死させた。脾臓を取り出し、秤量し、各ラットの脾臓について１０ｍｌの冷たい（４℃）ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ、ｐＨ７．３、１ｍｇのフェノールレッド／１００ｍｌを含有）を含有するプラスチックチューブ中に入れた。ガラス製ポッターで脾臓をホモジナイズし、氷上で５分間静置し、１ｍｌの上清を、新しいチューブ中に移した。細胞を４ｍｌのＨＢＳＳ中で１回洗浄し、次いで、上清を廃棄し、ペレットを１ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁した。脾臓毎のリンパ球数を自動化細胞計数器によって決定し、脾臓細胞懸濁液を３０×１０６個／ｍｌの細胞濃度に調節した。
【０１７９】
プラーク形成アッセイ：
軟寒天ペトリ皿は、ＨＢＳＳ中の０．７％アガロース（ＳＥＲＶＡ）と共に調製した。
【０１８０】
さらに、１ｍｌの０．７％アガロースを、プラスチックチューブ中で調製し、水浴において４８℃で保持した。５０μｌの３０×１０６個／ｍｌでの脾臓細胞懸濁液および５０μｌの４０×１０８個／ｍｌでのＳＲＢＣを加え、急速に混合し（ボルテックス）、調製したアガロース皿中に注いだ。ペトリ皿を僅かに傾け、アガロース層上の細胞混合物の均一な分布を達成した。皿を室温で１５分間静置し、次いで、３７℃にて６０分間インキュベートした。次いで、１．４ｍｌのモルモット補体（Ｈａｒｌａｎ；１０％）を加え、３７℃にてさらに６０分間インキュベーションを続けた。ＳＲＢＣ特異的抗体は、これらの近傍において抗原（ＳＲＢＣ）に結合したプレートアウトしたＢ細胞によって放出された。これらの抗原−抗体複合体は補体を活性化し、ＳＲＢＣの溶解をもたらし、赤血球層内に明るいスポット（プラーク）を残した。プラークを、顕微鏡で計数した。
【０１８１】
プラーク形成の阻害の決定のための下記の式を使用した。
阻害％＝Ｃ＊１００／Ｖ−１００
式中、Ｖ＝ビヒクル群についてのプラークの平均数／脾臓；Ｃ＝化合物処置群についてのプラークの平均数／脾臓
【０１８２】
参考文献：
0006310474.tif 000005
【０１８３】
生物学的データ
酵素アッセイ
【０１８４】
【表２】
0006310474.tif 000006
【０１８５】
細胞アッセイ
【０１８６】
【表３】
0006310474.tif 000007
なお、本願発明には、以下の実施形態が包含される。
［１］（１，１−ジオキソ−ヘキサヒドロ−１λ６−チオピラン−４−イル）−｛（Ｓ）−３−［１−（６−メトキシ−５−メチル−ピリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イルオキシ］−ピロリジン−１−イル｝−メタノンの無水結晶形態。
［２］２シータ度＋／−０．２度において得られる下記のピーク：９．１、１０．２、１１．９、１３．０、１７．１、１７．７、１８．７、２０．３、２０．８、２６．０、２６．７、２３．２、２４．１、２４．８、２９．３、２７．４、および２１．４を含むＸ線粉末回折パターンを特徴とする、［１］に記載の無水結晶形態。
［３］図１に示すＸ線粉末回折スペクトルと実質的に同じであるＸ線回折スペクトルを有する、［１］に記載の無水結晶形態。
［４］図２に示すものと実質的に同じである示差走査熱量測定グラフを有する、［１］に記載の無水結晶形態。
［５］医薬品として使用するための、［１］から［４］のいずれか一項に記載の形態。
［６］治療有効量の［１］から［４］のいずれか一項に記載の形態、および１種または複数の治療活性剤を含む組合せ。
［７］ＰＩ３Ｋ酵素の活性、好ましくはＰＩ３Ｋδイソ型の活性が媒介する疾患または障害の治療用の医薬の製造のための、［１］から［４］のいずれか一項に記載の形態の使用。
［８］ＰＩ３Ｋ酵素の活性、好ましくはＰＩ３Ｋδイソ型の活性が媒介する疾患または障害の治療における使用のための、［１］から［４］のいずれか一項に記載の形態。
［９］治療有効量の［１］から［４］のいずれか一項に記載の形態、および１種または複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［１０］対象に治療有効量の［１］から［４］のいずれか一項に記載の形態を投与するステップを含む、対象において、ＰＩ３Ｋ酵素、好ましくはＰＩ３Ｋδイソ型の活性をモジュレートする方法。
［１１］対象において、ＰＩ３Ｋ酵素の活性、好ましくはＰＩ３Ｋδイソ型の活性が媒介する障害または疾患の治療のための、［１］から［４］のいずれか一項に記載の形態の使用。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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