(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性β−キシロシダーゼ。
【請求項２】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性及びα−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性からなる群より選択される１種以上を有する、請求項１に記載の耐熱性β−キシロシダーゼ。
【請求項３】
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性及びα−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性からなる群より選択される１種以上も有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項７】
真核微生物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の形質転換体内で、耐熱性β−キシロシダーゼを生産することを含む、耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１若しくは２に記載の耐熱性β−キシロシダーゼ、又は請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
【請求項１０】
セルロースを含む材料を、請求項１若しくは２に記載の耐熱性β−キシロシダーゼ、請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼ、請求項６若しくは７に記載の形質転換体、又は請求項９に記載のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性β−キシロシダーゼ、当該耐熱性β−キシロシダーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性β−キシロシダーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性β−キシロシダーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
輸送用エネルギー供給に関わる懸念に加え、地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマスは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。植物バイオマスの主要構成要素であるリグノセルロースは、セルロースやヘミセルロース（キシラン、アラビナン及びマンナンを含む）等の多糖類とリグニンである。これら多糖類は多様なグリコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロース等の単糖に加水分解され、バイオ燃料や化成品原料として利用される。
【０００３】
リグノセルロースは複雑な構造を持ち、難分解性であり、単一の酵素では分解、糖化が難しい。このため、多糖類の中、セルロースの加水分解には、一般的に、グリコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１、ＥＣ３．２．１．１７６）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされる。一方、ヘミセルロースの構造は植物の種類によって異なるが、例えば、広葉樹や草本等はキシランが主要な構成成分となっている。キシランの加水分解には、キシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．８）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）が必要とされる。β−キシロシダーゼは、キシラナーゼによるヘミセルロースの加水分解により生じたオリゴ糖を加水分解し、単糖を生成するプロセスに関わる加水分解酵素の一つである。
【０００４】
従来のリグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として、高固体負荷（３０〜６０％  ｓｏｌｉｄ  ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷によるリグノセルロースの酵素糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、リグノセルロースの加水分解反応が進み難い。そこで、耐熱性酵素を用いて、例えば８０℃以上の高温で酵素糖化処理を行うことにより、加水分解反応速度が上昇することに加えて、バイオマス糖化液の粘性が低下することから、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が達成できると期待される。このため、各種グリコシド加水分解酵素について、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。
【０００５】
多くの耐熱性グリコシド加水分解酵素は、高温環境に生息する好熱性微生物を分離、同定し、これら培養分離された微生物から遺伝子をクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した後、大腸菌や糸状菌などにより発現させることにより得られてきた。例えば、特許文献１には、糸状菌由来のβ−キシロシダーゼが、特許文献２には、糸状菌アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)由来のβ−キシロシダーゼであって、３０℃で酵素活性を示すものが、特許文献３には、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）由来のβ−キシロシダーゼであり、ｐＨ５．５以下、５０℃以上で酵素活性を示すものが、特許文献４には、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）由来のβ−キシロシダーゼであり、４５℃で酵素活性を示すものが、それぞれ開示されている。また、非特許文献１〜６には、特定の細菌や糸状菌から単離されたβ−キシロシダーゼであって、至適温度が６０℃付近のものが開示されている。その他、非特許文献７には、高耐熱性β−キシロシダーゼとして至適温度が９５℃のものが報告されている。ただし、当該酵素のｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ＰＮＰＸ）を基質とした時の触媒効率Ｋｃａｔ／Ｋｍは１１７３．４ｍＭ−１ｓ−１と極めて高いが、ＰＮＰＸ分解活性の半減期は９０℃で約３０分であり、熱安定性は不充分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５０７８３７号公報
【特許文献２】特開平１１−３１３６８３号公報
【特許文献３】特表２０１１−５２３３４６号公報
【特許文献４】特開２０１３−５９２７２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kormelink et al.，Journal of Biotechnology，1993，vol.27，p.249-265.
【非特許文献２】Herrmann et al.，Biochemical Journal，1997，vol.321，p.375-381.
【非特許文献３】kitamoto et al.，Applied and Environmental Microbiology，1999，vol.65，p.20-24.
【非特許文献４】La Grange et al.，Applied and Environmental Microbiology，2001，vol.67，p.5512-5519.
【非特許文献５】Shao et al.，Applied and Environmental Microbiology，2011，vol.77，p.719-726.
【非特許文献６】Morais et al.，Journal of Biological Chemistry，2012，vol.287，p.9213-9221.
【非特許文献７】Shi et al.，Biotechnology for Biofuels，2013，vol.6, No.27.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を示す新規な耐熱性β−キシロシダーゼ、当該耐熱性β−キシロシダーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性β−キシロシダーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体、及び当該耐熱性β−キシロシダーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ耐熱性β−キシロシダーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法、グリコシド加水分解酵素混合物及びリグノセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［１０］である。
［１］  （Ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性β−キシロシダーゼ。
［２］  α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性及びα−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性からなる群より選択される１種以上を有する、前記［１］の耐熱性β−キシロシダーゼ。
［３］  （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［４］  前記ポリペプチドが、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性及びα−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性からなる群より選択される１種以上も有する、前記［３］のポリヌクレオチド。
［５］  前記［３］又は［４］のポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［６］  前記［５］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［７］  真核微生物である、前記［６］の形質転換体。
［８］  前記［６］又は［７］の形質転換体内で、耐熱性β−キシロシダーゼを生産することを含む、耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法。
［９］  前記［１］若しくは［２］の耐熱性β−キシロシダーゼ、又は前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［１０］  セルロースを含む材料を、前記［１］若しくは［２］の耐熱性β−キシロシダーゼ、前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼ、前記［６］若しくは前記［７］に記載の形質転換体、又は前記［９］のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有する。このため、当該耐熱性β−キシロシダーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】オープンリーディングフレームＯＪ１Ｍ−２７３の塩基配列（配列番号３）とβ−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１の塩基配列（配列番号４）のアライメント図（前半）である。
【図１Ｂ】オープンリーディングフレームＯＪ１Ｍ−２７３の塩基配列（配列番号３）とβ−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１の塩基配列（配列番号４）のアライメント図（後半、図１Ａの続き）である。
【図２】オープンリーディングフレームＯＪ１Ｍ−２７３のアミノ酸配列（配列番号１）とβ−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１のアミノ酸配列（配列番号２）のアライメント図である。
【図３】β−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１のアミノ酸配列（配列番号２）とカンディダトゥス・カルダトリバクテリウム・カリフォルニエンスのβ−キシロシダーゼ（配列番号９）のアライメント図である。
【図４】実施例１において、ＯＪ１Ｍ−２７３−１遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＯＪ１Ｍ−２７３−１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図５】実施例１において、大腸菌発現させたＯＪ１Ｍ−２７３−１タンパク質の各基質に対する加水分解活性（ＰＮＰＸに対する分解活性を１００％とした相対値）の測定結果を示した図である。
【図６】実施例１において、大腸菌発現させたＯＪ１Ｍ−２７３−１タンパク質の各温度におけるＰＮＰＸ加水分解活性（ｐＨ５．０）（１０５℃における加水分解活性を１００％とした相対値）を計測した結果を示した図である。
【図７】実施例１において、大腸菌発現させたＯＪ１Ｍ−２７３−１タンパク質の各ｐＨにおけるＰＮＰＸ加水分解活性（１０５℃）（ｐＨ５．０における加水分解活性を１００％とした相対値）を計測した結果を示した図である。
【図８】実施例１において、大腸菌発現させたＯＪ１Ｍ−２７３−１タンパク質のＰＮＰＸ加水分解活性の熱安定性（ｐＨ５．０）（無処理区（保温時間０分）の活性を１００％とした相対値）を計測した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［耐熱性β−キシロシダーゼ］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の０．１％以下を単離・培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性酵素の開発が進まない一因である。
【００１４】
近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。
【００１５】
本発明者らは、後記実施例１に示すように、採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知のβ−グルコシダーゼ酵素又はβ−キシロシダーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得た。得られたＯＲＦのうち、β−グルコシダーゼ触媒領域（触媒ドメイン）又はβ−キシロシダーゼ触媒領域が確認できた完全長ＯＲＦについて、ＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、ＰＮＰＸ分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、これらのＯＲＦの中からＰＮＰＸ分解活性を持つ耐熱性β−キシロシダーゼ（以下、「ＯＪ１Ｍ−２７３−１」）を得た。ＯＪ１Ｍ−２７３−１のアミノ酸配列を配列番号２に、塩基配列を配列番号４に、それぞれ表す。
【００１６】
後記実施例１に示すように、ＯＪ１Ｍ−２７３−１は、ＰＮＰＸ、ｐ−ニトロフェニル− α −Ｌ−アラビノフラノシド（ＰＮＰＡＦ）、及びｐ−ニトロフェニル− α −Ｌ−アラビノピラノシド（ＰＮＰＡＰ）に対し高い加水分解活性を示し、さらにアラビナン（Ａｒａｂｉｎａｎ）とアラビノガラクタン（Ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ）にも高い分解活性を示す。また、ＯＪ１Ｍ−２７３−１は、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）及びキシラン（Ｘｙｌａｎ）に対しても若干の分解活性を示す。この基質特異性から、ＯＪ１Ｍ−２７３−１は少なくともβ−キシロシダーゼ活性を有するグリコシド加水分解酵素であって、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ及びα−Ｌ−アラビノピラノシダーゼとしての利用も可能であり、多機能酵素として極めて有用であることが示唆される。
【００１７】
さらに、ＯＪ１Ｍ−２７３−１のＰＮＰＸ分解活性の半減期Ｔｈａｌｆは、９０℃と９５℃で約１８０分であり、１００℃で約１３０分である。このように、ＯＪ１Ｍ−２７３−１をはじめとする本発明に係るβ−キシロシダーゼは熱安定性に優れるため、高温条件下におけるヘミセルロースの糖化処理に好適である。
【００１８】
なお、本発明及び本願明細書において、β−キシロシダーゼ活性とは、ＰＮＰＸを基質とする加水分解活性を意味する。
また、本発明及び本願明細書において、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性とは、ＰＮＰＡＦを基質とする加水分解活性を意味する。
また、本発明及び本願明細書において、α−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性とは、ＰＮＰＡＰを基質とする加水分解活性を意味する。
【００１９】
ＯＪ１Ｍ−２７３−１のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、カンディダトゥス・カルダトリバクテリウム・カリフォルニエンス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｃａｌｄａｔｒｉｂａｃｔｅｉｒｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｅｎｓｅ）のＧＨ３ファミリーに属するβ−キシロシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  登録ＩＤ：ＷＰ＿０２６１４０７７５．１）（配列番号９）であり、その配列同一性（相同性）は、全長において６２％、ＧＨ３触媒領域において６５％であった。基質特異性及び既知のタンパク質とのアミノ酸配列の配列同一性から、ＯＪ１Ｍ−２７３−１は、ＧＨ３ファミリーに属する新規なβ−キシロシダーゼであることが明らかとなった。
【００２０】
ＯＪ１Ｍ−２７３−１は、少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性（β−キシロシダーゼ活性）を有する。実際に、後記実施例１に示すように、ＯＪ１Ｍ−２７３−１は、７０〜１１０℃の広い温度範囲内、かつｐＨ４．５〜７の広いｐＨ範囲内でβ−キシロシダーゼ活性を示す。より詳細には、ＯＪ１Ｍ−２７３−１のβ−キシロシダーゼ活性は、７０〜１０５℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、１０５℃超では急激に低下する傾向にあった。
【００２１】
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＯＪ１Ｍ−２７３−１に対しても、β−キシロシダーゼ活性をはじめとするグリコシド加水分解活性を失わせることなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
【００２２】
すなわち、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるβ−キシロシダーゼ触媒領域を有する、耐熱性グリコシド加水分解酵素である。
（Ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、オープンリーディングフレームＯＪ１Ｍ−２７３、又は遺伝子クローンＯＪ１Ｍ−２７３−１）、
（Ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。
【００２３】
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が欠失する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。
【００２４】
前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００２５】
前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、７５％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８０％以上１００％未満であることが好ましく、８５％以上１００％未満であることがより好ましく、９０％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９５％以上１００％未満であることがよりさらに好ましく、９８％以上１００％未満であることが特に好ましい。
【００２６】
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００２７】
前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＯＪ１Ｍ−２７３−１等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
【００２８】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
【００２９】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性（β−キシロシダーゼ活性）を有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをβ−キシロシダーゼ触媒領域として有することにより、耐熱性β−キシロシダーゼが得られる。
【００３０】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、ＰＮＰＸを基質とする。当該耐熱性β−キシロシダーゼは、ＰＮＰＸ以外のその他のβグルカン等を基質としてもよい。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼが基質とし得るものとしては、例えば、ＰＮＰＡＦ、ＰＮＰＡＰ、ＰＮＰＧ、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−フコピラノシド（ＰＮＰｂｄＦＰ）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノシド（ＰＮＰＭＰ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧＡ）、ｐ−ニトロフェニル− α−Ｌ−フコピラノシド（ＰＮＰＦＰ）、ｐ−ニトロフェニル− α−Ｌ−ラムノピラノシド（ＰＮＰＲＰ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−キシロピラノシド（ＰＮＰａｄＸ）；アラビナン、アラビノガラクタン等のアラビノースを構成糖とするグルカン；キシラン；リケナン等のβ−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン；アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、非結晶性セルロースのリン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）、ＣＭＣ、セロビオース等のβ−１，４結合からなるグルカン；ラミナリン等のβ−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン；β−１，３結合からなるグルカン；ゲンチオビオース等のβ−１，６結合からなるグルカン等が挙げられる。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼとしては、ＰＮＰＸに加えて、ＰＮＰＡＦ、ＰＮＰＡＰ、ＰＮＰＧ、ＰＮＰｂｄＦＰ、アラビナン、アラビノガラクタン、及びキシランからなる群より選択される１種以上を基質とするものが好ましく、ＰＮＰＸ、ＰＮＰＡＦ、ＰＮＰＡＰ、アラビナン、アラビノガラクタン、ＰＮＰＧ、及びキシランを基質とするものがより好ましく、ＰＮＰＸ、ＰＮＰＡＦ、ＰＮＰＡＰ、アラビナン、及びアラビノガラクタンを基質とするものがさらに好ましい。
【００３１】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、少なくともｐＨ５．０の条件下で、ＰＮＰＸを基質とする加水分解活性（β−キシロシダーゼ活性）を、９０〜１１０℃の温度範囲内で示すことが好ましく、８０〜１１０℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、７０〜１１０℃の温度範囲内で示すことがさらに好ましい。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの至適温度は、９０〜１１０℃の範囲内にあることが好ましく、１００〜１１０℃の範囲内にあることがより好ましい。
【００３２】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの至適ｐＨは、ｐＨ４．５〜６．０の範囲内にある。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼとしては、少なくともｐＨ４．５〜７．０の範囲内においてβ−キシロシダーゼ活性を示すものが好ましい。
【００３３】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、β−キシロシダーゼ活性以外のグリコシド加水分解活性を有していてもよい。その他のグリコシド加水分解活性としては、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性、α−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、又はセロビオハイドロラーゼ活性等が挙げられる。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼとしては、β−キシロシダーゼ活性に加えて、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性及びα−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性からなる群より選択される１種以上を有するものが好ましく、β−キシロシダーゼ活性、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性、及びα−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性を全て備えるものがより好ましい。
【００３４】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるβ−キシロシダーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のβ−キシロシダーゼが有する、酵素触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼには、公知のβ−キシロシダーゼに対し、酵素触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
【００３５】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼがβ−キシロシダーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ様ドメインを含むことも好ましい。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ様ドメインは、β−キシロシダーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ様ドメインとβ−キシロシダーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼとしては、β−キシロシダーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ様ドメインが存在しているものが好ましく、β−キシロシダーゼ触媒領域の下流にリンカー領域を介してＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ様ドメインが存在しているものがより好ましい。
【００３６】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、その他にも、そのＮ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、又は分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼが、そのＮ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを有している場合には、形質転換体中で発現させた耐熱性β−キシロシダーゼを、細胞外へ分泌させたり、細胞中の小胞体等に局在させることができる。
【００３７】
また、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えば当該耐熱性β−キシロシダーゼのＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現又は精製において汎用されているタグを用いることができる。
【００３８】
［耐熱性β−キシロシダーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼをコードする。当該耐熱性β−キシロシダーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
【００３９】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｅ)のいずれかの塩基配列からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
【００４０】
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００４１】
なお、本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
【００４２】
本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００４３】
前記（ａ）〜（ｅ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号３で表される塩基配列であってもよく、配列番号４で表される塩基配列であってもよく、配列番号３又は４で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。
【００４４】
配列番号３又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＯＪ１Ｍ−２７３−１をコードする遺伝子（「ＯＪ１Ｍ−２７３−１遺伝子」ということがある。）の全長若しくはβ−キシロシダーゼ触媒領域を含む部分領域を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＯＪ１Ｍ−２７３−１遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３又は４で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。
【００４５】
前記（ｄ）の塩基配列において、配列番号３又は４で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましい。
【００４６】
なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００４７】
例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号３又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２以上の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列としては、ＯＪ１Ｍ−２７３−１遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＯＪ１Ｍ−２７３−１遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。
【００４８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、β−キシロシダーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
【００４９】
［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、及びターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットが、発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことができる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００５０】
本発明及び本願明細書において、発現ベクターとは、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、外来ＤＮＡを組込むための配列を有するＤＮＡ、及びターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターである。
【００５１】
当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
【００５２】
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された細胞と形質転換されていない細胞の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びビアラホス耐性遺伝子等がある。
【００５３】
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを発現させ得る。発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性β−キシロシダーゼを生産し得る。
【００５４】
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、ヒートショック法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【００５５】
宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
【００５６】
［耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法］
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性β−キシロシダーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性β−キシロシダーゼを発現させる。
【００５７】
形質転換体によって生産された耐熱性β−キシロシダーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。
【００５８】
形質転換体から耐熱性β−キシロシダーゼを抽出又は精製する方法は、耐熱性β−キシロシダーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性β−キシロシダーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の耐熱性β−キシロシダーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
【００５９】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に耐熱性β−キシロシダーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の耐熱性β−キシロシダーゼを簡便に精製することができる。
【００６０】
すなわち、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性β−キシロシダーゼを生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記耐熱性β−キシロシダーゼを抽出し精製することを含む。
【００６１】
［グリコシド加水分解酵素混合物］
前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼ、又は前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物として多糖類の加水分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
【００６２】
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記耐熱性β−キシロシダーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、リグノセルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記β−キシロシダーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ等のヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又はエンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のグリコシド加水分解酵素を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼを全て含むものがより好ましい。
【００６３】
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれるその他のグリコシド加水分解酵素は、少なくとも８５℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましく、７０〜９０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがより好ましい。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該グリコシド加水分解酵素混合物によるリグノセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該グリコシド加水分解酵素混合物が耐熱性グリコシド加水分解酵素のみを含む場合、当該グリコシド加水分解酵素混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。
【００６４】
［リグノセルロース分解物の製造方法］
本発明に係るリグノセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼにより、キシラナーゼによりへミセルロースが加水分解して生じたオリゴ糖、若しくはセロビオハイドロラーゼによりセルロースが加水分解して生じたオリゴ糖を単糖に加水分解する、リグノセルロース分解物を得る方法である。具体的には、ヘミセルロース若しくはセルロースを含む材料を、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼ、本発明に係る形質転換体、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼ、又は本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、ヘミセルロース若しくはセルロース分解物を生産する。
【００６５】
ヘミセルロース、若しくはセルロースを含む材料としては、ヘミセルロース、若しくはセルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼと接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等による化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。
【００６６】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼによるヘミセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該耐熱性β−キシロシダーゼがセロオリゴ糖加水分解活性を示す条件であればよい。例えば、７０〜１１０℃、ｐＨ４．５〜７．０で反応を行うことが好ましく、９０〜１１０℃、ｐＨ４．５〜６．５で反応を行うことがより好ましく、９５〜１１０℃、ｐＨ４．５〜６．０で反応を行うことがさらに好ましい。前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で前記加水分解反応を行うことができる。
【００６７】
リグノセルロースの加水分解反応には、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼに加えて、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を用いることも好ましい。当該その他のグリコシド加水分解酵素としては、前記グリコシド加水分解酵素混合物に含められるグリコシド加水分解酵素と同様のものを用いることができ、少なくとも８５℃で、好ましくは少なくとも７０〜９０℃で、より好ましくは７０〜１０５℃で、さらに好ましくは７０〜１１０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましい。また、当該リグノセルロース分解物の製造方法には、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼに代えて、前記グリコシド加水分解酵素混合物を用いてもよい。
【実施例】
【００６８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６９】
［実施例１］温泉土壌からの新規耐熱性β−キシロシダーゼのクローニング
＜１＞  温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
７０〜１１０℃で活性を示す新規耐熱性β−キシロシダーゼの遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。
【００７０】
採取した温泉土壌サンプル１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ  Ｌａｒｇｅ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のシーケンサーＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ４５４及びイルミナ社製のシーケンサーＧＡ２ｘを用いて、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンスを行った。４５４シーケンサーには抽出されたＤＮＡ５μｇを用い、ＧＡ２ｘシーケンサーには、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて増幅した産物を用いて、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行った。ＧＡ２ｘによるシーケンスでは、イルミナ社製のｃＢｏｔを用いてＤＮＡライブラリー及び試薬をフローセルに流し込み、ＤＮＡ１分子から、自動的に同一配列をもつクラスターをフローセル内に形成させた。ＧＡ２ｘを用いて１０１ｂｐのペアエンドシーケンスを行い、メタゲノムシーケンスデータを得た。
温泉土壌サンプルＯＪ１について、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、４５４シーケンサーにおいては平均リード長３９０ｂｐ、総リード数６，３０１，４５０個、総ゲノム解読量２，４５６，２０６，４３４ｂｐを得、ＧＡ２ｘシーケンサーにおいては平均リード長１１４ｂｐのペアエンドで、総リード数５４５，１８５，０１６個、総ゲノム解読量６２，１５１，０９１，８２４ｂｐを得、合計して６４．６Ｇｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。
【００７１】
＜２＞  温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
４５４シーケンサー及びＧＡ２ｘシーケンサーで読みとられた塩基配列に対して、ＣＬＣｂｉｏ社製のＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖｅｒ５．４．８）を用いてクオリティーフィルタリング及びｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリングを行った。クオリティーフィルタリング後には、４５４シーケンサーで得られたリードの総リード長は２，４４６，２８０，４５２ｂｐとなり、ＧＡ２ｘシーケンサーで得られた塩基配列データの総リード長は５４，０６６，１９１，００５ｂｐとなった。アセンブリング後には、５００ｂｐ以上の長さを持つコンティグの数は２，０８０，５５５個、総全長は１，０８３，５２０，８５８ｂｐとなり、このうち最大コンティグ長は１，０６３，８６９ｂｐであった。
【００７２】
＜３＞  β−キシロシダーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース  １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２０１１／１２／９）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＭｅｔａｇｅｎｅ（Noguchi et al., DNA Research，2008,15(6)）を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した（Ｍｅｔａｇｅｎｅ  ｏｐｔｉｏｎ：−ｍ）。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ  ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ  ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ＝−１、Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットしたＯＲＦ配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。収集された塩基配列は、セルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含んでいた。
【００７３】
＜４＞  遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類
前記＜３＞で収集された塩基配列について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ  ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２３．０  ａｎｄ  ＨＭＭＥＲ  ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｆｉｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性から、前記＜３＞で収集された各塩基配列についてグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。なお、ＧＨ触媒ドメインの配列を７０％以上カバーしているものを、各ファミリーに属する酵素遺伝子としてカウントした。
【００７４】
メタゲノムＯＪ１シーケンスデータを用いたＢＬＡＳＴＰによる相同性検索及びＨＭＭＥＲによるドメイン検索により、４７８個のＯＲＦ（完全長ＯＲＦが３３１個、不完全長ＯＲＦが１４７個）がβ−グルコシダーゼ又はβ−キシロシダーゼ遺伝子と予測された。これらのＯＲＦのＧＨファミリー分類を表１に示す。ＧＨ触媒ドメインのカバー率が７０％以上のものを各ＧＨファミリーに分類した。表１に示すように、ＯＪ１メタゲノムからは、ＧＨファミリー１に属する完全長ＯＲＦが４６個、ＧＨファミリー３に属する完全長ＯＲＦが１９７個、ＧＨファミリー１６に属する完全長ＯＲＦが１個、ＧＨファミリー２６に属する完全長ＯＲＦが１個、ＧＨファミリー３１に属する完全長ＯＲＦが３７個、ＧＨファミリー３９に属する完全長ＯＲＦが１個、ＧＨファミリー４３に属する完全長ＯＲＦが４７個、ＧＨファミリー５２に属する完全長ＯＲＦが１個、それぞれ得られた。
【００７５】
【表１】
0006319907.tif 000002
【００７６】
＜５＞  オープンリーディングフレームＯＪ１Ｍ−２７３からの遺伝子クローニング
β−グルコシダーゼ遺伝子又はβ−キシロシダーゼ遺伝子と推定された全てのＯＲＦについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子を増幅した。増幅したＰＣＲ産物はＣｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを用いて配列確認を行った。
【００７７】
ＰＣＲクローニングにより、オープンリーディングフレームＯＪ１Ｍ−２７３から４個の遺伝子クローンＯＪ１Ｍ−２７３−１、ＯＪ１Ｍ−２７３−３、ＯＪ１Ｍ−２７３−１２、及びＯＪ１Ｍ−２７３−１８を得た。オープンリーディングフレームＯＪ１Ｍ−２７３の塩基配列（配列番号３）は２，１７８ｂｐであったが、ＧＡ２ｘシーケンサーのペアエンド配列を使用したため、間に不明配列（配列番号３中の「ｎ」、配列番号１中の「Ｘａａ」）が含まれており、実際に得られた β−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１の塩基配列（配列番号４）は、２，２４７ｂｐであった。
【００７８】
図１Ａ及び図１Ｂに、オープンリーディングフレームＯＪ１Ｍ−２７３とβ−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１の塩基配列のアライメントを、図２に、オープンリーディングフレームＯＪ１Ｍ−２７３とβ−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１のアミノ酸配列のアライメントを示す。 それぞれの図中、黒白反転文字は、塩基若しくはアミノ酸が異なっている配列部分、又はオープンリーディングフレームで不明であった配列部分を示す。
【００７９】
β−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１は、７４８アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号２）をコードし、１位のアミノ酸残基がメチオニンから開始し、３’末端が終始コドンで終わる完全長配列（配列番号４）であった。モチーフの配列相同性から、β−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１は、１２位のメチオニン（Ｍ）から４１７位のロイシン（Ｌ）までの４０６アミノ酸がＧｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ３の触媒ドメインをコードしていると推測された。シグナル配列予測ソフトウェアＳｉｇｎａｌＰ  ４．１を使った解析によれば、β−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１は、シグナルペプチドは予想されなかった。当該遺伝子クローンは、カンディダトゥス・カルダトリバクテリウム・カリフォルニエンスのβ−キシロシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  登録ＩＤ：ＷＰ＿０２６１４０７７５．１）（配列番号９）とＧＨ３触媒領域について６５％、全長について６２％のアミノ酸配列同一性を示す、新規な配列であった。配列相同性は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより算出した。
【００８０】
図３に、β−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１のアミノ酸配列（配列番号２）とカンディダトゥス・カルダトリバクテリウム・カリフォルニエンスのβ−キシロシダーゼ（配列番号９）のアライメントを示す。図３中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、網掛けのアミノ酸は、これらのアミノ酸配列において類似アミノ酸残基(similar)を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。
【００８１】
＜６＞  β−キシロシダーゼ酵素タンパク質の発現及び精製
シーケンス確認後、目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Ｃｈａｍｐｉｏｎ（登録商標）  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）に付属するＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５〜２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。当該操作により、 β−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１がコードする酵素タンパク質の弱い発現が得られた。
【００８２】
酵素タンパク質の発現量改善のため、 β−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１をＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ ｐＬＥＡＤ（ニッポン・ジーン社製）に組み込み、ＪＭ１０９株で形質転換を行った。発現ベクターｐＬＥＡＤは、従来の大腸菌発現ベクターでは発現し難いＧＣ含有量の高い遺伝子の発現に有効なことが示されている（Suzuki et al.，J. Biochem.，1997，vol.121，p.1031−1034.; Ishida and Oshima， J. Biochem.，2002，vol.132．，p.63−70）。この結果、 β−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１がコードする酵素タンパク質の強い発現が確認された。
【００８３】
具体的には、β−キシロシダーゼ候補遺伝子ＯＪ１Ｍ−２７３−１をもつｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターを鋳型にして、配列番号７で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＧＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡ−３’：配列番号５で表される塩基配列の５’末端側に３塩基（ＧＴＧ）付加し、５’末端をリン酸化したもの。）と配列番号８で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＴＧＣＧＧＧＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣ−３’ ：配列番号６で表される塩基配列の５’末端側に制限酵素Ｓａｃ Ｉ認識配列を付加したもの。Ｓａｃ Ｉはベクターへの挿入に利用する配列である。）を用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製)で増幅したＰＣＲ産物をｐＬＥＡＤ５ベクターへ挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを用いて配列確認を行った。
【００８４】
シーケンス確認されたＯＪ１Ｍ−２７３−１／ｐＬＥＡＤ５プラスミドを持つ形質転換大腸菌クローンを、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＴｕｒｂｏ  Ｂｒｏｔｈ培地（アテナ  エンバイロメンタル  サイエンス社製）に植菌し、 約２０時間培養することによって目的タンパク質を発現させた。培養後、遠心分離処理を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８サイクル繰返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。
【００８５】
当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ  ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。β−キシロシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のβ−キシロシダーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｎｅｎｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。β−キシロシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。β−キシロシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０によって１ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）への溶液交換と濃縮を行い、同バッファーにより平衡化したヒドロキシアパタイトカラムＣＨＴ５−１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に充填し、４００ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ６．８）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。β−キシロシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。
【００８６】
遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素（精製したβ−キシロシダーゼ酵素タンパク質）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素のＳＤＳ電気泳動は、ミニプロティアンＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行った。前記上清又は精製酵素を、それぞれＴｒｉｓ−ＳＤＳ βＭＥ処理液（コスモバイオ社製）と１：１で混合した泳動用サンプルを、１００℃で１０分間処理した後、１サンプルあたり、遺伝子組換え大腸菌破砕上清は１０μＬ、精製酵素は２μｇをそれぞれ泳動させた。泳動終了後、ＣＢＢ染色によって、タンパク質のバンドを検出した。
【００８７】
図４に、ＯＪ１Ｍ−２７３−１遺伝子を導入した形質転換大腸菌から調製された遺伝子組換え大腸菌破砕上清及び当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清から精製された精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１はタンパク質質量指標、レーン２は遺伝子組換え大腸菌破砕上清、レーン３は精製酵素の電気泳動パターンである。この結果、前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清（レーン２）において、アミノ酸配列（配列番号２）から予想される分子量７８．９ｋＤａ近傍に強いバンドが認められ、精製酵素（レーン３）では、当該バンドに対応する単一バンドが認められた（図中、矢印）。
【００８８】
＜７＞  ＰＮＰＸを基質としたβ−キシロシダーゼ活性測定（ＰＮＰＸ加水分解活性）
β−キシロシダーゼ活性測定には、ＰＮＰＸを基質として用いた。ＰＮＰＸ（Ｓｉｇｍａ社製）を水で溶かし、所定の終濃度となるように調整したものを、基質溶液として用いた。なお、以降の実験に用いたＰＮＰＸ基質溶液は、全て当該方法により調製したＰＮＰＸ水溶液を用いた。計測には、前記＜６＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．１〜０．０１ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。
【００８９】
反応液の組成は、６μＬの希釈した精製酵素、２９４μＬの精製水、 １５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５）、１５０μＬの２０ｍＭ  ＰＮＰＸ水溶液とした。反応には、リアクティサーモ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、６０℃〜１１５℃で１０分間反応させた。なお、反応容器には、１．５ｍＬ容のガラスバイアルを使用し、酵素タンパク質吸着抑制のため、あらかじめ１．５質量％ＢＳＡ溶液で内部をコーティングした。全ての計測において、遺伝子組換え大腸菌破砕上清又は精製酵素の代わりに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と酵素（遺伝子組換え大腸菌破砕上清又は精製酵素）は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温（プリインキュベーション）した後に混合し、反応開始とした。１０分間の反応終了後は、各反応液に対して等量の０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３溶液を加えて撹拌することにより反応を停止させた後、それを５分間遠心分離処理し、上清を得た。上清中のｐ−ニトロフェノール量は、分光光度計を用いて４２０ｎｍの吸光度を計測し、予め作成していたｐ−ニトロフェノール量と４２０ｎｍの吸光度の検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素による加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。また各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。
【００９０】
この結果、遺伝子組換え大腸菌破砕上清を用いた場合と精製酵素を用いた場合の両方とも、β−キシロシダーゼ活性（ＰＮＰＸ加水分解活性）があることが確認された。
【００９１】
＜８＞  ＯＪ１Ｍ−２７３−１の基質特異性
ＯＪ１Ｍ−２７３−１遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＯＪ１Ｍ−２７３−１）に対して、様々なセルロース基質とヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。基質として、ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製)、キシラン（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）、アラビナン（シュガービート由来、Ｓｉｇｍａ社製）、アラビノガラクタン（カラマツ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＸ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製） 、ＰＮＰＡＦ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＡＰ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＧＡ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＦＰ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＲＰ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＭＰ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰａｄＸ（Ｓｉｇｍａ社製）、及びＰＮＰｂｄＦＰ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
【００９２】
具体的には、ＣＭＣ、キシラン、アラビナン、アラビノガラクタン以外（ＰＮＰ基質）を基質とする場合には、０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素と２０ｍＭの各基質水溶液を用いて１０５℃で反応させた以外は前記＜７＞と同様にして、酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
ＣＭＣ、キシラン、アラビナン、又はアラビノガラクタンを基質とする場合には、０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素と１質量％の各基質水溶液を用いて１０５℃で反応させた以外は前記＜７＞と同様にして反応させ、反応終了後に等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心分離処理し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線（キシランを基質とした場合は、キシロースで作成した検量線、アラビナン、又はアラビノガラクタンを基質とした場合はアラビノースで作成した検量線）を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。
【００９３】
測定結果を図５に示す。酵素活性は、ＰＮＰＸに対する分解活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。この結果、ＯＪ１Ｍ−２７３−１はＰＮＰＸ、ＰＮＰＡＦ、ＰＮＰＡＰ、アラビナン、及びアラビノガラクタンに対し高い加水分解活性を示し、ＰＮＰＧとキシランに対しても弱い加水分解活性を示したが、その他の基質に対しては、ほとんど分解活性を示さなかった。
【００９４】
＜９＞  ＯＪ１Ｍ−２７３−１のβ−キシロシダーゼのカイネティクス
ＯＪ１Ｍ−２７３−１によるＰＮＰ基質加水分解の最大初速度（Ｖｍａx）、ミカエリス定数（Ｋｍ）及び触媒効率（Ｋｃａt／Ｋｍ）を調べた。カイネティクスの測定は、ＰＮＰＸ水溶液の濃度を、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、又は２０ｍＭとし、ＰＮＰＡＦ水溶液及びＰＮＰＡＰ水溶液の濃度を、１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、又は６０ｍＭとし、０．０１ｍｇ／ｍＬに希釈した酵素を用い、１０５℃で反応させた以外は前記＜７＞と同様に行い、ＰＮＰ基質加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。最大初速度（Ｖｍａｘ）とミカエリス定数（Ｋｍ）は、データ分析ソフトＯｒｉｇｉｎ（ライトストーン社製）を用いたミカエリス−メンテンモデルのフィッティングによって求め、得られた数値から触媒効率（Ｋｃａt／Ｋｍ）を算出した。
【００９５】
結果を表２に示す。最大初速度はＰＮＰＡＦの時が最も大きかったが、触媒効率はＰＮＰＸの時が最も大きかった。これは、ＰＮＰＸがＯＪ１Ｍ−２７３−１に最も適した基質であることを示している。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
＜１０＞  ＰＮＰＸを基質としたβ−キシロシダーゼ活性のｐＨ及び温度依存性
ＯＪ１Ｍ−２７３−１遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＯＪ１Ｍ−２７３−１）のＰＮＰＸ加水分解活性の温度依存性及びｐＨ依存性を調べた。計測には、前記＜６＞で得られた精製酵素を０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。
【００９８】
精製したＯＪ１Ｍ−２７３−１のＰＮＰＸ加水分解活性の温度依存性の測定は、反応温度を６０、７０、８０、９０、９５、１００、１０５、１１０又は１１５℃で行った以外は、前記＜７＞と同様に行い、酵素による加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、ＰＮＰＸ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
結果を図６に示す。酵素活性は、最も高い分解活性を示した１０５℃の値を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。ＯＪ１Ｍ−２７３−１は、温度範囲６０〜１１０℃においてＰＮＰＸ加水分解活性を示した（図６）。６０〜１０５℃の範囲では、酵素反応温度の上昇と共にＰＮＰＸ加水分解活性も上昇し、最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、１０５℃であった。酵素反応温度を１０５℃以上にした場合には、ＰＮＰＸ加水分解活性は急激に減少した。
【００９９】
精製したＯＪ１Ｍ−２７３−１のＰＮＰＸ加水分解活性のｐＨ依存性の測定は、０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液と１５０μＬのマッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）を用い、１０５℃で反応させた以外は、前記＜７＞と同様に行い、酵素による加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、ＰＮＰＸ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
結果を図７に示す。最も高い分解活性を示したｐＨ５．０の値を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。ＯＪ１Ｍ−２７３−１は、ｐＨ４．５〜７の範囲において、ＰＮＰＸ加水分解活性を示した。至適ｐＨは５．１４（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値）であった。
【０１００】
＜１１＞  β−キシロシダーゼの熱安定性測定
ＯＪ１Ｍ−２７３−１によるＰＮＰＸ加水分解活性の熱安定性を調べた。計測には、前記＜６＞で得られた精製酵素を０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。
具体的には、６μＬの精製酵素溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）、２９４μＬの精製水、１５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．０）からなる混合液を、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、又は１０５℃の各温度で、０、３０、６０、１２０、又は２４０分間保温（プリインキュベーション）した後、前記＜７＞と同様にして、ＰＮＰＸ加水分解活性を９５℃で測定し、酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【０１０１】
計測結果を図８に示す。酵素活性は、無処理区（保温時間０分）の活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。酵素活性が無処理区の５０％に低下する保温時間を半減期Ｔｈａｌｆとした。ＯＪ１Ｍ−２７３−１のＴｈａｌｆは、保温温度８５℃の場合は約２４０分、 ９０℃及び９５℃の場合は約１８０分、１００℃の場合は約１３０分であった。一方、保温温度を１０５℃にした場合、ＰＮＰＸ加水分解活性は急速に減少し、３０分で約３０％になった。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、少なくとも１０５℃、ｐＨ５．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有しており、高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該耐熱性β−キシロシダーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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