(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体であって、
（ａ）Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６に特異的に結合する抗体の抗原結合断片、
（ｂ）膜貫通領域、及び
（ｃ）細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記膜貫通領域及び細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζ由来である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
共刺激タンパク質受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む、請求項１又は２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体であって、Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６に特異的に結合する抗体の抗原結合断片が、
（ａ）次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む重鎖可変領域、
（ｉ）配列番号５のＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号６のＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号７のＣＤＲ３、並びに
（ｂ）次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む軽鎖可変領域、
（ｉ）配列番号８のＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号９のＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号１０のＣＤＲ３、
を含む、前記キメラ抗原受容体。
【請求項５】
共刺激タンパク質受容体がＣＤ２８、４１ＢＢ、及びＩＣＯＳからなる群から選択される、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６に特異的に結合する抗体の抗原結合断片が、
（ａ）配列番号３の重鎖可変領域；及び
（ｂ）配列番号４の軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６に特異的に結合する抗体の抗原結合断片が、配列番号３及び４を含む単鎖可変断片（ＳｃＦＶ）を含む、請求項６に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６に特異的に結合する抗体の抗原結合断片が、配列番号３及び４の間のペプチドリンカーを更に含む、請求項７に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
ペプチドリンカーが配列番号１４を含む、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
キメラ抗原受容体が、配列番号１２のヒトＣＤ２８ヒンジ−膜貫通−細胞質ドメインを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
キメラ抗原受容体が、配列番号１１のヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体であって、
（ａ）配列番号３及び４を含む単鎖可変断片（ＳｃＦＶ）；
（ｂ）配列番号１２のヒトＣＤ２８ヒンジ−膜貫通−細胞質ドメイン；及び
（ｃ）配列番号１１のヒトＣＤ３ζ細胞質ドメイン
を含む、前記キメラ抗原受容体。
【請求項１３】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体であって、配列番号１３の短縮型ヒトＣＤ１９断片を更に含む、前記キメラ抗原受容体。
【請求項１４】
請求項１２に記載のキメラ抗原受容体であって、配列番号１３の短縮型ヒトＣＤ１９断片を更に含む、前記キメラ抗原受容体。
【請求項１５】
ヒンジ領域又はスペーサー領域を更に含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体を含む、組換えＴ細胞。
【請求項１７】
初代ヒトＴ細胞である、請求項１６に記載の組換えＴ細胞。
【請求項１８】
二重特異性Ｔ細胞結合抗体であって、
（ａ）Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６に特異的に結合する抗体の抗原結合断片、並びに
（ｂ）Ｔ細胞抗原に結合する抗原結合ドメイン、を含む、二重特異性Ｔ細胞結合抗体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の二重特異性Ｔ細胞結合抗体であって、Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６に特異的に結合する抗体の抗原結合断片が、
（ａ）次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む重鎖可変領域、
（ｉ）配列番号５のＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号６のＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号７のＣＤＲ３、並びに
（ｂ）次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む軽鎖可変領域、
（ｉ）配列番号８のＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号９のＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号１０のＣＤＲ３、
を含む、前記二重特異性Ｔ細胞結合抗体。
【請求項２０】
前記抗原結合ドメインがＣＤ３に特異的に結合する抗体断片を含む、請求項１８又は１９に記載の二重特異性Ｔ細胞結合抗体。
【請求項２１】
ＣＤ３に特異的に結合する前記抗体断片が、
（ａ）次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む重鎖可変領域、
（ｉ）配列番号１５のＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１６のＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号１７のＣＤＲ３、並びに
（ｂ）次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む軽鎖可変領域、
（ｉ）配列番号１８のＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１９のＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号２０のＣＤＲ３、
を含む、請求項２０に記載の二重特異性Ｔ細胞結合抗体。
【請求項２２】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体；請求項１６又は１７に記載の組み換えＴ細胞；又は請求項１８から２１のいずれか１項に記載の二重特異性Ｔ細胞結合抗体、及び製薬上許容され得る担体を含有する、医薬組成物。
【請求項２３】
患者において、Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６を発現する細胞を殺傷する又はこのような細胞の増殖を阻害するために使用される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
患者におけるＢ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６の高発現と関連付けられる疾患又は状態を治療するために使用される、請求項２２又は２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記疾患又は状態が、骨髄性白血病、急性非リンパ性白血病、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、子宮頸癌、胃肉腫、乳癌、膵臓癌、黒色腫、又は前立腺癌である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
医薬組成物が更に第２の治療薬を含有する、請求項２２から２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第６１／６４３，４５６号（２０１２年５月７日出願）、及び米国特許出願第６１／７０５，２２７号（２０１２年９月２５日出願）の利益を主張し、これらの特許文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により、契約番号ＣＡ１３０９１１の下、政府による援助を得てなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍細胞の排除に関与する自然免疫系のリンパ球である。ヒトにおいて、細胞障害性受容体（natural cytotoxicity receptors）（ＮＣＲ）ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６の活性化は、ＮＫ細胞により介在される腫瘍細胞の可溶化において重要な役割を果たす。ＮＫｐ３０は、Ｂ７ファミリーのメンバーであるＢ７−Ｈ６を認識する。既知のすべてのＢ７ファミリーメンバーと同様、Ｂ７−Ｈ６は、細胞外領域においてフェーズ１のイントロンと隣接する２つのＩｇドメインを含む。重要なことに、Ｂ７−Ｈ６は正常なヒト組織では検出されず、Ｔ及びＢリンパ腫、黒色腫、並びに細胞腫を含む各種ヒト腫瘍細胞株でのみ選択的に発現される（Ｂｒａｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０６：１４９５〜１５０３）。更に、腫瘍細胞におけるＢ７−Ｈ６発現により、ＮＫｐ３０特異的なＮＫ細胞による細胞傷害並びにサイトカイン分泌が誘導される。したがって、Ｂ７−Ｈ６は、腫瘍により誘導される、自然免疫を惹起する自己分子として機能し、活性化受容体ＮＫｐ３０との相互作用により細胞を形質転換させる（上掲Ｂｒａｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００９））。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６（Ｂ７−Ｈ６）に特異的に結合する単離抗体、又は抗体の抗原結合断片であり、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、それぞれ配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に示され、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、それぞれ配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０に示される。一実施形態では、抗体は、配列番号３の重鎖可変ドメインを有する。別の実施形態では、抗体は、配列番号４の軽鎖可変ドメインを有する。他の実施形態では、抗体はヒト化されている。更に他の実施形態では、抗体は、標識、細胞傷害性薬物又は治療用放射性同位体などの合成分子と結合されている。尚更に他の実施形態では、抗体はキメラ抗原受容体であり、合成分子は、膜貫通領域、細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ζから得られるもの、並びに共刺激タンパク質受容体の任意選択的な細胞内ドメインを含む。他の実施形態では、抗体は二重特異性Ｔ細胞結合抗体であり、合成分子は、Ｔ細胞抗原に結合する抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ３）を含む。本発明の抗体又は抗原結合断片、並びに製薬上許容され得る担体を含む医薬組成物が提供され、例えば、標識と結合させた抗体又は抗原結合断片を含有するキットとして提供される。
【０００５】
本発明は、Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６、膜貫通領域、及び細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインに特異的に結合する抗体の抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体でもある。一部の実施態様では、膜貫通領域及び細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζから得られる。他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、共刺激タンパク質受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。
【０００６】
本発明は、Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６に特異的に結合する抗体の抗原結合断片、並びにＴ細胞抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、二重特異性Ｔ細胞結合抗体を更に提供し、一部の実施形態では、Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
【０００７】
Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６を発現する細胞を殺傷するあるいはこのような細胞の増殖を阻害する、並びにＢ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６の異常発現と関連付けられる疾患又は状態を治療する方法も、本明細書に記載の抗体を使用して提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】抗Ｂ７Ｈ６  ＣＡＲ構造を示す。
【図２】ＮＫｐ３０キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び抗Ｂ７Ｈ６  ＣＡＲ修飾されたＴ細胞が、ＩＦＮ−γを産生することによりＮＫｐ３０リガンド陽性細胞に応答することを示すグラフである。野生型Ｂ７−Ｈ６（ＷＴ）、抗Ｂ７−Ｈ６  ＣＡＲ（ａＢ７Ｈ６−２８−ｚ）、又はＮＫｐ３０−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ融合タンパク質（３０−２８−ｚ）を発現するＴ細胞を、２４時間にわたって培地、ＲＭＡ細胞、Ｂ７−Ｈ６を発現するＲＭＡ細胞、又はＫ５６２細胞（１０5個）（図２Ａ）と接触させるか、あるいは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、１０5個）又は未熟なＤＣ（ｉＤＣｓ、２×１０4個）（図２Ｂ）と接触させ、ＩＦＮγの産生量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は中央値＋ＳＤで示す。
【図３】未熟樹状細胞（ｉＤＣ）及び成熟樹状細胞（ｍＤＣ）のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＮＫｐ３０リガンド、及びＢ７−Ｈ６の発現を示す。
【図４】各種ヒト細胞株並びにマウスＲＭＡ及びＲＭＡ−Ｂ７Ｈ６細胞（抗Ｂ７Ｈ６モノクローナル抗体を使用）及びＮＫｐ３０リガンド（可溶性ＮＫｐ３０−Ｉｇを使用）の発現を、アイソタイプ対照の染色と比較して示す。
【図５】抗Ｂ７Ｈ６  ＣＡＲにより修飾したＴ細胞が、ＲＭＡ／Ｂ７Ｈ６リンパ腫を保有するマウスのインビボ処置後の生存率を向上させることを示す。Ｂ６マウスにはＲＭＡ／Ｂ７Ｈ６（１０5個、経静脈投与、第０日目）を接種した。Ｍｏｃｋ形質導入又は抗Ｂ７Ｈ６  ＣＡＲ修飾Ｔ細胞を投与した（５×１０6、経静脈投与、第５、７、９日（図５Ａ））。データはカプラン・マイヤー生存曲線で示した。データは、２つの独立した試行を合わせて示した（図５Ｂ）。未処置及び生存マウス（図５Ｂ）の皮下に１０4ＲＭＡ（Ｂ７Ｈ６非発現）により再負荷を行い、腫瘍面積は１日おきに測定した（図５Ｃ）。これらのデータは、ＣＡＲ治療後の生存マウスが同様の腫瘍に対して抵抗性であったことを示す。ＲＭＡ細胞はＢ７Ｈ６を発現していないことから、これにより、その他の腫瘍抗原に対する免疫反応の誘導が示される。
【図６】抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥの構造及び活性を示す。図６Ａは、抗Ｂ７Ｈ６抗体のｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）のｓｃＦｖの融合体を示す。ＶＨ、可変領域重鎖；ＶＬ、可変領域軽鎖；並びにＬ、リンカー。図６Ｂは、このＢｉＴＥを含有する条件培地は、腫瘍細胞抵抗性でありＢ７Ｈ６を発現するヒトＴ細胞（ＲＭＡ−Ｂ７Ｈ６、Ｋ５６２）によるＢ７Ｈ６＋腫瘍細胞のロバストな殺傷を誘導するのに対し、Ｂ７Ｈ６を発現しない腫瘍細胞（ＲＭＡ）の殺傷は誘導しないことを示す。ＯＫＴ３活性化ＰＢＭＣは、抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥを含有している条件培地又は対照培地に１：４希釈し、Ｅ：Ｔ比（標的細胞に対するエフェクター細胞の割合）５：１で腫瘍細胞株と共培養した。共培養から５時間後、細胞上清を回収し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出活性をもとに細胞傷害性を評価した。
【図７】抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥタンパク質がＩＦＮ−γ分泌を誘導することを示すデータを提供する。図７Ａ、ＯＫＴ３活性化ヒトＴ細胞は、各種濃度のｈｕＢｉＴＥ１下でＥ：Ｔ比１：１（１０5：１０5）で腫瘍細胞と共培養した。２４時間後に上清を回収し、ＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡにより求めた。図７Ｂ、ＯＫＴ３活性化Ｔ細胞は、Ｅ：Ｔ比４：１、１：１、又は０．２５：１で腫瘍細胞と培養した。ＨｕＢｉＴＥ１を、２５０ｎｇ／ｍＬの濃度で共培養に加えた。２４時間後に培養上清を回収した。ＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。図７Ｃは、マウスＴ細胞を活性化する抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥを含有する条件培地が、Ｂ７Ｈ６を発現するマウス腫瘍細胞と共培養した場合にマウスＴ細胞からロバストなＩＦＮ−γを誘導することを示す。ＣｏｎＡ活性化マウス脾細胞を、マウスＢｉｔｅ１プラスミドにより形質移入した２９３Ｆ細胞由来の条件培地又は対照培地により１：４希釈して、Ｅ：Ｔ比５：１（Ｂ１６Ｆ１０及びＢ１６Ｆ１０／Ｂ７Ｈ６、１０5：２×１０4）又は１：１（Ｋ５６２、１０5：１０5）で腫瘍細胞株と共培養した。共培養後（２４時間）、上清を回収し、ＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図８】マウスＢｉＴＥ１（抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥ）がマウスＴ細胞を特異的に活性化し、Ｂ７Ｈ６＋腫瘍細胞を殺傷することを示す。ＣｏｎＡ活性化マウス脾細胞を、Ｅ：Ｔ比１：１、５：１、及び１０：１で、ＲＭＡ（０．１μＭ  ＣＳＦＥにより予め標識）及びＲＭＡ−Ｂ７Ｈ６（１μＭ  ＣＳＦＥにより予め標識）混合物（５０％ＲＭＡ＋５０％ＲＭＡ−Ｂ７Ｈ６；図８Ａ）、又はＢ１６Ｆ１０及びＢ１６Ｆ１０−Ｂ７Ｈ６混合物（５０％Ｂ１６Ｆ１０＋５０％Ｂ１６Ｆ１０−Ｂ７Ｈ６；図８Ｂ）と共培養した。８時間後及び２４時間後、生細胞を回収し、生細胞の同一性をフローサイトメトリーにより評価した。対照群により正規化した各実験群ＲＭＡ：ＲＭＡ−Ｂ７Ｈ６の割合又はＢ１６Ｆ１０：Ｂ１６Ｆ１０−Ｂ７Ｈ６の割合に基づき、Ｂ７Ｈ６＋細胞の特異的溶解を算出した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
がん治療においてＢ７−Ｈ６を標的とするため、Ｂ７−Ｈ６を特異的に認識する、マウス由来の２種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製した。いずれのクローンもマウスＩｇＧ２ａのサブクラスであった。ｍＡｂクローン４７．３９の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子を単離した。ヌクレオチド及び推定されるアミノ酸を決定した。これらの配列を使用して、ｍＡｂ  ４７．３９の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変部位を含有させたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製した。具体的には、抗Ｂ７−Ｈ６  ＣＡＲには、Ｂ７−Ｈ６を認識した単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、続いてＣＤ２８分子の一部（ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む）及びＣＤ３ζの細胞質領域を含有させた（図１）。フローサイトメトリーを使用して、このＣＡＲがＢ７−Ｈ６分子を認識し得ることを確認した。更に、抗Ｂ７−Ｈ６  ＣＡＲを発現するＴ細胞が、Ｂ７−Ｈ６陽性細胞、すなわち、Ｂ７−Ｈ６を発現するＫ５６２骨髄性白血病細胞、及びＲＭＡ細胞（図２Ａ）による刺激に応答して高濃度のＩＦＮγを産生した一方で、自己ＰＢＭＣ及びｉＤＣは抗Ｂ７−Ｈ６  ＣＡＲには応答しなかったことが判明した（図２Ｂ）。フローサイトメトリーデータは、樹状細胞（ＤＣ）が細胞表面にＢ７−Ｈ６を発現していない一方で（図３）、Ｋ５６２、Ｕ９３７、Ａ３７５、Ｈｅｌａ、Ｔ４７Ｄ、及びＰａｎｃ−１などの癌細胞株はＢ７−Ｈ６を発現しており（図４）、この発現はＮＫｐ３０発現と関連付けられることを示した。この観点において、ＮＫｐ３０系ＣＡＲとは異なり、抗Ｂ７Ｈ６  ＣＡＲは、自己樹状細胞に対しては何ら応答をしなかった。更に、抗Ｂ７Ｈ６  ＣＡＲは、Ｔ細胞にＢ７Ｈ６陽性腫瘍細胞の特異的な可溶化を再誘導したものの、Ｂ７Ｈ６陰性腫瘍細胞の特異的な可溶化は再誘導しなかったことが示された。Ｂ７Ｈ６特異的ＣＡＲを発現するマウスＴ細胞の養子移植により、結果として、５日早くＢ７Ｈ６+リンパ腫細胞を注入されたＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率は上昇した（図５Ａ及び５Ｂ）。更に、Ｂ７Ｈ６+リンパ腫による初回負荷に生存したマウスは、Ｂ７Ｈ６+リンパ腫細胞による再負荷に応じ免疫を示した（図５Ｃ）。したがって、これにより、Ｂ７Ｈ６+腫瘍に対する養子Ｔ細胞免疫療法のための、Ｂ７Ｈ６特異的なＣＡＲの使用を実証する。
【００１０】
抗Ｂ７Ｈ６  ＣＡＲに加えて、抗Ｂ７Ｈ６／抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞結合抗体）を作製した（図６Ａ）。ヒト及びマウス版の抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥ（すなわち、それぞれｈｕＢｉＴＥ１及びｍｕＢｉＴＥ１）を産生した所、両方共がＢ７Ｈ６+腫瘍を特異的に可溶化することができた（図６Ｂ、８Ａ、及び８Ｂ）。更に、抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥのヒト版及びマウス版の両方が、Ｔ細胞及び腫瘍細胞共培養下でＩＦＮ−γ分泌を誘導した（図７Ａ〜７Ｃ）。
【００１１】
したがって、本発明は、Ｂ７−Ｈ６特異性を有する抗体を提供し、抗体は、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされる重鎖、及び配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖を有する。更に、本発明は、Ｂ７−Ｈ６特異性を有する抗体を提供し、抗体は、配列番号３の重鎖アミノ酸配列、及び配列番号４の軽鎖アミノ酸配列を有する。より具体的には、本発明は、Ｂ７−Ｈ６に特異的に結合する抗体を提供し、ここで、抗体の重鎖可変領域はＧｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ（配列番号５）のＣＤＲ１配列、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ（配列番号６）のＣＤＲ２配列、及びＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号７）のＣＤＲ３配列を有し、かつ抗体の軽鎖可変領域は、Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（配列番号８）のＣＤＲ１配列、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ（配列番号９）のＣＤＲ２配列、及びＬｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ（配列番号１０）のＣＤＲ３配列を有する。一部の実施態様では、抗体は、配列番号３の重鎖を、米国特許出願第２００４／０１５２１０５号、国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０３００３９号、並びに国際公開第ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００３４１１号に記載のものなどの任意の好適な軽鎖と組み合わせて含有し得る。同様に、抗体は、配列番号４の軽鎖を、米国特許出願第２００４／０１５２１０５号、国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０３００３９号、並びに国際公開第ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００３４１１号に記載のものなどの任意の好適な重鎖と組み合わせて含有し得る。
【００１２】
抗体は、ヒトＢ７−Ｈ６に対する特異性を有する単離抗体であってよく、並びに完全長の抗体又は抗体断片であってよい。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体であってよい。更に、抗体は、限定するものではないがＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭを含む任意のアイソタイプであってよい。したがって、例えば、抗体は、任意のＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２など）、又は任意のＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は合成ＩｇＧなど）であってよい。抗体は、Ｂ７−Ｈ６に対する特異性を有する、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）、ＶＬ、ＶＨ、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ，（ｓｃＦｖ）2、二重特異性抗体、及び二価抗体などの任意の抗体断片であってもよい。抗体は、非枯渇性（non-depleting）ＩｇＧ抗体、改変Ｔ細胞、又は抗体のその他のＦｃ若しくはＦａｂ変異体が挙げられるがこれらに限定されない任意の改変又は合成抗体であってよい。
【００１３】
配列番号３の重鎖に加えて、本発明の抗体は、ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｎａｉｖｅ  ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ法を用いＦａｂライブラリから選択される軽鎖を更に含有し得る。同様にして、配列番号４の軽鎖に加えて、本発明の抗体は、ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｎａｉｖｅ  ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ法を用いＦａｂライブラリから選択される重鎖を更に含有し得る。
【００１４】
一部の実施態様では、本発明は、Ｂ７−Ｈ６に対し、約１０μＭ以下、５μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、又は２００ｎＭ以下の結合活性を備える抗体を提供する。本発明は、Ｂ７−Ｈ６に対し、約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、又は約５ｎＭ以下の結合活性を備える抗体も提供する。結合活性は、ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡＣＯＲＥなどの、当該技術分野で既知の技術を使用して測定することができる。
【００１５】
本発明の抗体は、例えば、任意の好適な真核生物発現系又は非真核生物発現系を使用して、任意の好適な技術により産生することができる。特定の実施形態では、抗体は、哺乳類発現系を使用して産生される。一部の実施態様では、重鎖は配列番号１などのＤＮＡ配列によりコードされ、かつ軽鎖は配列番号２などのＤＮＡ配列によりコードされ得る。
【００１６】
本発明の抗体は、細菌発現系などの好適な非真核生物発現系を使用して産生され得る。Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）、ＶＬ、ＶＨ、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ，（ｓｃＦｖ）2、及び二重特異性抗体などの断片を産生するために、細菌発現系を使用することができる。ＤＮＡコード配列を変更してこのような断片を産生するための手法は当該技術分野において既知である。
【００１７】
本発明の抗体は、任意の好適な種類の結合法を使用し、合成分子と結合させることができる。遺伝子操作されかつセレノシステインが組み込まれた組換体（例えば、国際公開第２００８／１２２０３９号に記載のものなど）を使用して、合成分子を結合させることができる。他の方法には、天然又は遺伝子操作されたリシン側鎖のアミン又はシステイン側鎖のチオールに共有結合させるものが含まれ得る。例えば、Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１３７〜１１４６を参照されたい。合成分子は、腫瘍を標的にするものなどの任意の分子であってよい。言うまでもなく、合成分子はタンパク質又は抗体であってもよく、得られる融合タンパク質は、一般的な組み換えタンパク質発現系及び方法により産生され得ることは理解されたい。
【００１８】
この観点において、特定の実施形態は、キメラ抗原受容体を包含する（ＣＡＲ）。人工的なＴ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、又はキメラ免疫受容体としても知られるＣＡＲは、遺伝子操作された受容体であり、任意の特異性を免疫細胞に付与する。通常、これらの受容体は、例えば、レトロウイルスベクター発現法によりモノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与するために使用される。これらの分子に最も一般的な形態は、モノクローナル抗体由来のｓｃＦｖを、ＣＤ３−ζの膜貫通及び膜内ドメイン、すなわち、細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインに融合させた融合体である。このような分子は、標的となるｓｃＦｖによる認識に応答したζシグナルの伝達を生じさせる。「第一世代」のＣＡＲは、通常、ＣＤ３ζ鎖由来の細胞内ドメインを有し、内因性ＴＣＲ由来のシグナルの主要な伝達分子である。「第２世代」のＣＡＲは、各種共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）由来の細胞内シグナル伝達ドメインを、ＣＡＲの細胞質側末端に付加し、Ｔ細胞に更なるシグナルをもたらす（図１ａを参照されたい）。前臨床試験では、第２世代のＣＡＲのデザインにより、Ｔ細胞の抗腫瘍活性が向上することが示されている（Ｍａｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：７０〜７５；Ｋｏｗｏｌｉｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１０９９５〜１１００４）。より近年では、「第３世代」のＣＡＲは、複数のシグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−４１ＢＢ又はＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−ＯＸ４０との組み合わせにより更に力価が増大している（Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：５５６３〜５５７４；Ｐｕｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：９３３〜９４１；Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：４１３〜４２０）。適宜に、本発明の一実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ６  ｓｃＦｖ断片はＣＡＲ内に含有される。
【００１９】
本発明のＣＡＲは、ＣＤ３−ζ並びに当該技術分野において既知のその他の共刺激分子の配列を使用し、標準的な組換えタンパク質法を使用して作製され得る。例えば、ヒトＣＤ３−ζ配列はＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＰ＿９３２１７０で利用可能であり、ヒトＣＤ２８配列はＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＰ＿００６１３０で利用可能であり、ヒトＯＸ４０配列はＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＰ＿００３３１８で利用可能であり、並びにヒトＣＤ１９配列はＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＡＡＡ６９９６６で利用可能である。特定の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ヒトＣＤ３ζ細胞質ドメイン（アミノ酸５２〜１６４；配列番号１１）、ヒトＣＤ２８ヒンジドメイン−膜貫通ドメイン−細胞質ドメイン（アミノ酸１３５〜２２０；配列番号１２）、並びに任意にＣＤ１９の一部分（アミノ酸１〜３２７；配列番号１３）を含む。
【００２０】
他の合成分子には、細胞傷害性薬物、細胞分裂阻害剤、又は抗血管新生剤及び放射性同位体などの治療剤が含まれる。細胞傷害性薬物は、植物、真菌、又は細菌由来の分子であり得る（例えば、タンパク質毒素）。治療薬は、マイタンシノイド（例えば、マイタンシノール又はＤＭ１マイタンシノイド）、タキサン、又はカリチアマイシンであってよい。治療薬は、ビンクリスチン及びプレドニゾンを含む。治療薬は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサートなどの葉酸代謝拮抗剤、５−フルオロウラシルなどのフルオロピリミジン、シトシンアラビノシド、又はプリン又はアデノシンの類似体）、挿入剤（例えば、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、又はミトラサイクリンなどのアントラサイクリン）、白金誘導体（例えば、シスプラチン又はカルボプラチン）、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミドニトロソ尿素又はチオテパ）、有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセル又はドセタキセルなどのビンカアルカロイド様ビンクリスチン又はタキソイド）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド及びテニポシド、アムサクリン、トポテカン）、細胞周期阻害剤（例えば、フラボピリドール（flavopyridol））、又は微小管安定化剤（例えば、エポチロン、ディスコデルモリド類似体、又はエリュテロビン類似体）であってよい。治療薬は、ボルテゾミブ、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェート、テニポシド、又はリン酸エトポシドなどのプロテオソーム阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤であってよい。治療用放射性同位体には、イットリウム（90Ｙ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、アクチニウム（225Ａｃ）、プラセオジム、アスタチン（211Ａｔ）レニウム（186Ｒｅ）、ビスマス（212Ｂｉ又は213Ｂｉ）、及びロジウム（188Ｒｈ）が含まれる。抗血管新生薬は、ロキニメックス（linomide）、ベバシズマブ（bevacuzimab）、アンジオスタチン、及びラゾキサンを含む。合成分子は、リツキシマブ又はベバシズマブ（bevacuzimab）などの別の抗体であってもよい。
【００２１】
合成分子は標識であってもよい。標識は診断用途に有用であってよく、例えば、造影剤を含み得る。造影剤は、ヨード（131Ｉ又は125Ｉ）インジウム（111Ｉｎ）、テクネチウム（99Ｔｃ）、リン（32Ｐ）、炭素（14Ｃ）、トリチウム（3Ｈ）、他の放射性同位体（例えば、放射活性イオン）、又は上掲の治療用放射性同位体などの、放射性標識であってよい。加えて、造影剤は、放射線不透過性物質、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）剤、超音波造影剤、及び動物の体を撮像する装置による検出に適切な任意の他の造影剤を含み得る。合成分子は、蛍光標識、生物学的に活性な酵素標識、発光標識、又は発色団による標識であってもよい。
【００２２】
更に、合成分子は、磁気ナノ粒子、制御放出ポリマーナノ粒子又は脂質組成物であってもよい。磁気ナノ粒子としては、鉄（例えば、Ｆｅ3Ｏ4又はＦｅ2Ｏ4）、コバルト、亜鉛、カドミウム、ニッケル、ガドリニウム、クロム、銅、マンガン、テルビウム、ユーロピウム、金、銀、白金、又はこれらの合金が挙げられるがこれに限定されない。制御放出ポリマーナノ粒子は、一般的な方法を使用して、生分解性又は非生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリ乳酸誘導体、ＰＥＧ化ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸−グリコール酸共重合体誘導体、ＰＥＧ化乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリオルトエステル誘導体、ＰＥＧ化ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリカプロラクトン誘導体、ＰＥＧ化ポリカプロラクトン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸誘導体、ポリウレタン、ポリウレタン誘導体、又はこれらの組み合わせ）から製造することができる。同様にして、脂質組成物（例えば、リポソーム、及び固体脂質ナノ粒子など）は、一般的な方法を使用して産生し、本発明の抗体と結合させることができる。
【００２３】
一部の実施態様では、抗体は、Ｂ７−Ｈ６の他に１種以上の抗原に対する特異性も有し得る。例えば、本発明の抗体は、Ｂ７−Ｈ６及び別の腫瘍抗原、例えば、本明細書で開示されるリンパ腫、白血病、黒色腫、又は肉腫と関連する抗原に対する特異性を有するよう、遺伝子操作することもできる（例えば、二価二重特異性抗体又は標識化Ｆａｂ二量体又は三量体として）。あるいは、Ｂ７−Ｈ６特異性を有するよう、並びに他の細胞、例えば、細胞傷害性エフェクター細胞又はＴ細胞の活性化を促進する又は標的とする抗原特異性を有するよう、抗体を遺伝子操作することができる。したがって、本発明は、ＢｉＴＥＳ（二重特異性Ｔ細胞結合抗体）及びＤＡＲＴＳ（二重特異性再標的化試薬（dual affinity retargeting reagents））も含む。
【００２４】
当該技術分野において既知であるように、ＢｉＴＥは、２つの抗原結合ドメインを有する単一のポリペプチド鎖分子を指し、２つのドメインのうち１つはＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）に結合し、２つのドメインのうち他方は標的細胞の表面上に存在する抗原に結合する（国際公開第０５／０６１５４７号；Ｂａｅｕｅｒｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ３３：１３７〜１４７；Ｂａｒｇｏｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９７４〜９７７）。これまでに、ＢｉＴＥ抗体は、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＣＤ６６ｅ（又はＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＤ３３、ＥｐｈＡ２、及びＭＣＳＰ（又はＨＭＷ−ＭＡＡ）を含む各種標的抗原に対し構築されている（Ｂａｅｕｅｒｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２２〜３０）。それらの組み合わせにおいて、その他の二重特異性抗体コンストラクトと区別されるＢｉＴＥ抗体の重要な特質としては、０．１〜５０ｐｍｏｌ／Ｌ（２〜１，０００ｐｇ／ｍＬ）の範囲のＥＣ50値を有する再誘導される可溶化が高力価であること（Ｂａｅｕｅｒｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）上掲）、Ｔ細胞の厳密な標的細胞依存性活性（Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０：７９８〜８０７）、並びに活性化されたＴ細胞による一連の溶解の補助、すなわち、低Ｅ：Ｔ比での活性、が挙げられる。ＢｉＴＥ抗体は、通常、高等真核細胞株により分泌される組換え型のグリコシル化タンパク質として産生される。適宜に、本発明の他の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ６抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＢｉＴＥの構成成分である。特定の実施形態では、本発明のＢｉＴＥは、リンカー、例えば、（Ｇ4Ｓ）3リンカーにより共に融合された抗Ｂ７−Ｈ６抗体断片及び抗ＣＤ３抗体断片から構成される。特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体断片は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−ＨｉｓのＣＤＲ１配列（配列番号１５）、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＡｓｐのＣＤＲ２配列（配列番号１６）、及びＴｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号１７）のＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域、並びにＳｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−ＡｓｎのＣＤＲ１配列（配列番号１８）、Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＳｅｒのＣＤＲ２配列（配列番号１９）、及びＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＰｈｅのＣＤＲ３配列（配列番号２０）を有する軽鎖可変領域を含有する。米国特許第５，９２９，２１２号を参照されたい。
【００２５】
ＤＡＲＴは、会合（特に、共有結合による相互作用による）して、同一又は異なるエピトープを認識し得る少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成する、少なくとも２種のポリペプチド鎖を含む、免疫グロブリン分子を指す。ＤＡＲＴの各ポリペプチド鎖は、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含むものの、これらの領域が相互作用してエピトープ結合部位を形成することはない。むしろ、ある１つ（例えば第１）のＤＡＲＴポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域は、異なる（例えば、第２の）ＤＡＲＴポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域と相互作用してエピトープ結合部位を形成する。同様にして、ある１つ（例えば第１）のＤＡＲＴポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域は、異なる（例えば、第２の）ＤＡＲＴポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域と相互作用してエピトープ結合部位を形成する。ＤＡＲＴは、単一特異性、二重特異性、三重特異性などであってよく、したがって、同時に１、２、３、又はそれ以上の種類の異なるエピトープ（同一又は異なる抗原のエピトープであってよい）と結合し得る。ＤＡＲＴは、更に、一価、二価、三価、四価、五価、六価などであってもよく、したがって、同時に１、２、３、４、５、６又はそれ以上の分子と結合し得る。ＤＡＲＴのこれらの２つの特性（すなわち、特異性の度合い及び価数）を組み合わせることで、例えば、四価（すなわち、４組のエピトープに結合することができる）の二重特異性（すなわち２つのエピトープに結合する能力がある）抗体などを産生することもできる。ＤＡＲＴ分子の構築は、国際公開第２００６／１１３６６５号、国際公開第２００８／１５７３７９号、及び国際公開第２０１０／０８０５３８号に開示されている。適宜に、本発明の他の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ６抗体断片はＤＡＲに含有される。
【００２６】
本発明は、本発明の抗体を産生するよう遺伝子組換えされた真核細胞又は非真核細胞を更に提供する。真核細胞又は非真核細胞は、発現系として使用して、本発明の抗体を産生させることができる。別の実施形態では、本発明は、遺伝子組換えにより本発明のＢ７−Ｈ６特異抗体を発現するよう遺伝子操作されており、Ｂ７−Ｈ６を標的とする、免疫細胞を提供する。例えば、本発明は、本発明の抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｓｃＦｖ）2）を発現するよう遺伝子操作されているＴ細胞を提供し、本発明の抗体は、次のドメイン、すなわちスペーサー又はヒンジ領域（例えば、ＣＤ２８又はＩｇＧヒンジ）、膜貫通ドメイン領域（例えば、標準的な膜貫通ドメイン）、並びに細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインを備える合成分子と連結されており、これによりＣＡＲを形成する。ＣＡＲに含有され得る細胞内ＴＣＲシグナル伝達ドメインには、シグナル伝達ドメインのＣＤ３ζ、ＦｃＲ−γ及びＳｙｋ−ＰＴＫ、並びに共シグナル伝達ドメイン（co-signaling domains）のＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ１３４が含まれるがこれに限定されない。ＣＡＲを発現するＴ細胞の構築方法は当該技術分野において既知である。例えば、Ｍａｒｃｕ−Ｍａｌｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：５７９〜９１を参照されたい。
【００２７】
本発明は、Ｂ７−Ｈ６を発現する細胞（Ｂ７−Ｈ６細胞）を、本発明の抗体、抗体断片、又は融合タンパク質（例えば、ＢｉＴＥ）と接触させることにより、細胞を阻害する方法を提供する。抗体は、そのままの（結合していない）抗体であっても、又は合成分子（例えば、細胞傷害性薬物、細胞分裂阻害剤、又は抗血管新生剤、又は放射性同位体）に結合されている抗体であってもよい。方法を使用して、インビトロ又は患者において（すなわち、インビボ）、Ｂ７−Ｈ６を阻害することができる。接触させるＢ７−Ｈ６細胞は、例えば、Ｂ７−Ｈ６の異常発現又は異常濃度と関連付けられる疾患の細胞培養モデル又は動物モデルにおけるものであってよい。この方法は、例えば、抗体の、Ｂ７−Ｈ６細胞型特異的な阻害活性を測定及び／又は等級付けする（別の抗体と比較して）のに有用である。Ｂ７−Ｈ６細胞の阻害には、Ｂ７−Ｈ６陽性細胞（すなわち、Ｂ７−Ｈ６を発現する細胞）の活性又は増殖を阻害又は減少させることを包含し得る。阻害することには、Ｂ７−Ｈ６陽性細胞を殺傷することも包含することができる。本発明の抗体、抗体断片、又は融合タンパク質（例えば、ＢｉＴＥ）の細胞傷害性は、例えば、ＰＲＯＭＥＧＡから市販のＣＹＴＯＴＯＸ  ９６非放射活性細胞傷害性アッセイなどの、乳酸デヒドロゲナーゼ細胞傷害性アッセイを含む任意の一般的なアッセイ法により、評価することができる。
【００２８】
本発明は、異常濃度のＢ７−Ｈ６と関連付けられる疾患を有する、このような疾患を有すると疑われる、又はこのような疾患のリスク下にある患者を治療する方法も提供する。本発明の文脈に関して使用するとき、用語「異常」は、正常又は健常細胞におけるＢ７−Ｈ６の発現と比較して、Ｂ７−Ｈ６発現が増加又は減少していることを包含することを意図する。この観点において、正常細胞はＢ７−Ｈ６を発現せず、疾患細胞のＢ７−Ｈ６については、疾患細胞はＢ７−Ｈ６の異常発現を示す。一般的に、治療方法は、治療に有効な量の本発明の単離抗体、抗体断片又は融合タンパク質を、患者に投与する工程、を包含する。抗体は、本明細書に記載の任意の抗Ｂ７−Ｈ６抗体であってよい。したがって、抗体は、キメラ、ヒト化、合成、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）、ＶＬ、ＶＨ、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、又は（ｓｃＦｖ）2抗体であり得る。一部の実施態様では、方法は、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）2、二重特異性抗体、二価抗体、ＣＡＲ、ＢＩＴＥ、又はＤＡＲＴを投与する工程を包含する。他の実施形態では、投与する抗体は、上記の合成分子、例えば、細胞傷害性薬物、細胞分裂阻害剤、又は抗血管新生剤、又は治療用放射性同位体と結合させることができる。代表的な細胞傷害性薬物は、シュードモナス（Pseudomonas）外毒素Ａ（ＰＥ３８）である。治療され得る疾患としては、例えば、リンパ腫、白血病、黒色腫、及び肉腫が挙げられる。高濃度Ｂ７−Ｈ６と関連付けられ、治療され得る特定の疾患には、骨髄性白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、急性非リンパ性白血病、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病、Ｔ又はＢ細胞性リンパ腫、子宮頸癌、胃肉腫、乳癌、膵癌、黒色腫、又は前立腺癌が含まれる。
【００２９】
本発明は、高濃度のＢ７−Ｈ６と関連付けられる疾患を有する、このような疾患を有すると疑われる、又はこのような疾患のリスク下にある患者を、本明細書に記載の組換え宿主細胞、例えば、Ｂ７−Ｈ６に選択的に結合するＣＡＲ又はＢｉＴＥなどの本発明の抗体を発現するＴ細胞を養子移植することにより治療する方法も提供する。組換え法を使用して、ＣＡＲ又はＢｉＴＥをコードする遺伝子材料を任意の好適なＴ細胞、例えば、治療される患者由来のエフェクター記憶Ｔ細胞に導入することができる。遺伝子材料を保有するＴ細胞を増殖させることもできる（例えば、サイトカインの存在下で）。組換えＴ細胞は、通常、注入により患者に移植される。移植される本発明のＴ細胞は、その後、患者内のＢ７−Ｈ６発現細胞に対し免疫反応を開始することができる。例えば、骨髄性白血病、急性非リンパ性白血病、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病Ｔ又はＢ細胞性リンパ腫、子宮頸癌、胃肉腫（例えば、結腸がん）、乳癌、膵癌、黒色腫、又は前立腺癌を有する、又はこのような疾患を有すると疑われる患者を治療するために、養子移植法を使用することができる。
【００３０】
一部の実施態様では、前述の治療法は、高濃度Ｂ７−Ｈ６に関連付けられる疾患のための第２の治療薬を同時投与する工程を更に含み得る。例えば、治療される疾患がＢ７−Ｈ６を発現する癌を包含する場合、この方法は、がんの治療に好適な細胞傷害性薬物、細胞分裂阻害剤、又は抗血管新生剤の同時投与を更に包含し得る。癌がＢ細胞リンパ腫である場合、方法は、例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、又はＣＨＯＰ化学療法レジメンの同時投与を更に含み得る。
【００３１】
本明細書で使用するとき、用語「治療（treat）」、「治療すること（treating）」、「治療（treatment）」及び「治療上有効な（therapeutically effective）」は、必ずしも１００％又は完全な治療を意味するものではない。むしろ、有益である又は治療効果を有する可能性があるものとして当業者が認識する様々な度合いの治療が存在する。この観点において、本方法は、任意の強度の治療薬を任意の量で提供することができる。更に、本方法により提供される治療は、治療される疾患の１つ以上の状態又は症状の治療を含み得る。
【００３２】
治療における使用に関し、本発明は、本明細書に記載される通りの抗体及び製薬上許容され得る担体を含有する医薬組成物も提供する。製薬組成物は、本明細書に記載の任意の抗体から調製され得る。例示組成物には、配列番号３（重鎖）及び／又は配列番号４（軽鎖）を有するキメラ抗体が含まれる。別の例示的な組成物は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０の群から選択される１、２、３、４、５、又は６つのＣＤＲを有するヒト化抗体を含む。更に別の例示の医薬組成物は、可動性リンカーにより抗ＣＤ３ｅ  ｓｃＦｖと融合されている抗Ｂ７−ｈ６  ｓｃＦｖを含む（すなわち、ＢｉＴＥ）。更に別の例示の医薬組成物は、ＣＤ２８のヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン、並びにＣＤ３ζの細胞内ドメインに融合されている抗Ｂ７−ｈ６  ｓｃＦｖを含む（すなわち、ＣＡＲ）。
【００３３】
本発明の組成物は、抗体のための担体、望ましくは製薬上許容され得る担体を含み得る。製薬上許容され得る担体は、任意の好適な製薬上許容され得る担体であってよい。本明細書で使用するとき、用語「製薬上許容され得る担体」は、ヒト又は獣医学的な患者に投与する際に好適である１種以上の相溶性固体又は液体充填剤、希釈剤、他の賦形剤、又は封入材料を意味する（例えば、生理学的に許容され得る担体又は薬理学的に許容され得る担体）。用語「担体」は、活性成分と組み合わせることで、活性成分の投与を容易にする、天然又は合成有機又は無機成分を意味する。製薬上許容され得る担体が組成物中に１種以上存在する場合、製薬上許容され得る担体は、所望される薬剤の有効性を実質的に損なわないような方法で、１種以上の活性成分、例えばハイブリッド分子、及び互いと組み合わせて混合することができる。「製薬上許容され得る」物質は、通常、悪心、めまい、発疹、又は急性胃蠕動などの望ましくない生理学的作用を有意にもたらすことなく患者に投与することができる。これは、例えば、治療目的でヒト患者に投与される際に免疫原性にならない製薬上許容され得る担体を含む組成物に望ましい。
【００３４】
医薬組成物は、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、及びリン酸塩を含む、好適な緩衝剤を含有し得る。医薬組成物には、場合により好適な保存料、例えば、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、及びチメロサールを含有させることもできる。
【００３５】
医薬組成物は、投与単位剤形で存在させることができ、並びに任意の好適な方法により調製することができ、このような方法の多くは製薬業界で既知である。このような方法は、本発明の抗体を、１種以上の副成分を構成する担体と会合させる工程を包含する。広くは、組成物は、活性物質を液体担体、超微粒子状固体担体、又はいずれもと均一及び十分に会合させ、次に必要に応じて剤を成形することにより調製される。
【００３６】
非経口投与に好適な組成物には、便宜上、本発明の組成物の滅菌水性製剤を含み、これは好ましくは被投与者の血液と等張であるこの水性製剤は、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、既知の方法に従って配合することができる。滅菌注射製剤は、非毒性、非経口的接種可能な希釈剤又は溶媒による、滅菌注射液又は懸濁液であってよく、例えば、１，３−ブタンジオール溶液であってよい。とりわけ採用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンガー液、及び等張の塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌、不揮発性油は、一般的に溶媒又は懸濁媒質として採用される。この用途に際し、任意の、合成モノ又はジグリセリドなどの無菌性の固定油を採用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を、注射剤の調製に使用することができる。経口、皮下、静脈内、筋肉内投与等に好適な担体製剤は、「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に見出すことができる。
【００３７】
本発明の文脈で有用な送達システムには、徐放性、遅延放出性、持続放出性送達システムが含まれ、本発明の組成物の送達は、治療する部位の感作を引き起こす前に、あるいは感作を引き起こすのに十分な時間生じる。本発明の組成物は、他の治療薬又は治療法と組み合わせて使用することができる。このような系は、患者及び医師にとっての利便性を向上させることにより、本発明の組成物の反復投与を回避することができ、本発明の特定の組成に特に好適であり得る。
【００３８】
多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に既知である。好適な放出送達システムには、ポリ（ラクチドグリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物などのポリマー系システムが含まれる。薬剤を含有する、前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達システムには、コレステロール、コレステロールエステル、及びモノ、ジ、及びトリグリセリドなどの脂肪酸又は中性脂肪などのステロールを含む脂質である非ポリマーシステム、ヒドロゲル放出システム、ｓｙｌａｓｔｉｃシステム、ペプチド系システム、ワックスコーティング、一般的な結合剤及び賦形剤を使用する圧縮錠、並びに部分的に融合させた埋め込み錠なども含まれる。具体的な例としては、活性組成物が、米国特許第４，４５２，７７５号、米国特許第４，６６７，０１４号、米国特許第４，７４８，０３４号、及び米国特許第５，２３９，６６０号に記載されるものなどのマトリックス内に含有される浸食性システム、並びに活性成分が、米国特許第３，８３２，２５３号及び米国特許第３，８５４，４８０号に記載されたものなどのポリマーから制御された速度で広がる拡散システムが挙げられるがこれに限定されない。加えて、ポンプ系ハードウェアによる送達システムを使用することができ、このシステムの一部は埋め込みに適している。
【００３９】
用語「患者」は、本明細書において、例えば、治療及び診断法との関連において使用され、ヒト又は動物患者を指す。動物患者には、骨髄性白血病、急性非リンパ性白血病、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病、Ｔ又はＢ細胞性リンパ腫、子宮頸癌、胃肉腫（例えば、大腸癌）、乳癌、膵臓癌、黒色腫、又は前立腺癌などの、Ｂ７−Ｈ６高発現と関連付けられる状態又は疾患の哺乳類モデルなどの動物モデルが含まれるがこれに限定されない。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、例えば対照と比較して、Ｂ７−Ｈ６（例えば、細胞表面Ｂ７−Ｈ６）の量の変動を試験サンプルにおいて検出するための、本発明の抗体の使用を提供する。試験サンプルは、細胞培養物由来又は試験患者由来であってよく、例えば、患者におけるＢ７−Ｈ６の異常発現と関連付けられる疾患又は状態を有する、このような疾患又は状態を有すると疑われる、又はこのような疾患又は状態のリスク下にある患者由来の血漿又は組織サンプルであってよい。調節量は、１つ以上の対照培養物又は患者に由来する対応するサンプルにおいて、同一の抗体を使用して検出されるＢ７−Ｈ６量に望ましくは一致する。本発明の抗体を使用して、Ｂ７−Ｈ６量を測定する方法は、イムノ（ウェスタン）ブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、及びフローサイトメトリー、例えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）解析などの任意のイムノアッセイを含み得る。
【００４１】
加えて、Ｂ７−Ｈ６の検出を使用して、Ｂ７−Ｈ６発現と関連付けられる疾患の進行をモニターすることもできる。Ｂ７−Ｈ６量が、対照と比較して優位に増加又は減少している場合、それぞれ、患者の疾患が悪化又は改善していることを意味する。
【００４２】
前述の選別法を使用して、例えば、骨髄性白血病、急性非リンパ性白血病、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病Ｔ又はＢ細胞性リンパ腫、子宮頸癌、胃肉腫（例えば、大腸癌）、乳癌、膵臓癌、黒色腫、又は前立腺癌などの疾患の有無を特定すること、又は疾患の進行をモニターすることができる。
【００４３】
本発明は、本発明の方法を実施するのに好適なキットも提供する。通常、キットは、本発明の治療又は検出法の実施に必要とされる２つ以上の構成要素を含む。キットの構成要素には、本発明の１種以上の抗体、適切な試薬、及び／又は装置が含まれるがこれに限定されない。
【００４４】
キットは、本発明の抗体及びＢ７−Ｈ６の検出（例えば、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによる）に好適なイムノアッセイ緩衝剤を含み得る。キットは、１つ以上のマイクロリットルプレート、標準物質、アッセイ希釈剤、洗浄緩衝剤、粘着性プレートカバー、及び／又はキットを使用して本発明の方法を実施するための指示書も含み得る。キットは、好適に包装されておりＢ７−Ｈ６の検出に有用である基材（例えば、マルチウェルプレート又はチップ）に固定化させた、本発明の抗体も含み得る。一部の実施態様では、キットは、蛍光標識、生物学的に活性な酵素標識、発光標識、又は発色団による標識などの標識と結合させた本発明の抗体を含む。キットは、結合させた抗体を可視化するための試薬、例えば、酵素基質を更に含む。一部の実施態様では、キットは、造影剤、及び所望により、患者において抗体を画像化するのに有用である１種以上の剤又は装置の一片と結合させた本発明の抗体を含む。
【００４５】
一般的に、キットにおいて、本発明の抗体は適切に包装されており、例えば、バイアル、パウチ、アンプル、及び／又は治療若しくは検出法に適切な任意の容器に包装されている。キットの構成要素は、濃縮物（凍結乾燥組成物を含む）として提供されてもよく、この濃縮物は、使用前に更に希釈されてよく、あるいは使用濃度で提供されてもよい。本発明の抗体がインビボで使用するためのものである場合、所望の量及び濃度の剤を有する単回用量が滅菌容器に充填されてもよい。
【００４６】
本発明は、以降の非限定例により更に詳細に記載される。
【実施例】
【００４７】
実施例１：材料及び方法
抗Ｂ７Ｈ６キメラ抗原受容体の構築抗Ｂ７Ｈ６ハイブリドーマクローン４７．３９の単一変異可変断片（ｓｃＦｖ）を、ヒトＣＤ２８ヒンジ−膜貫通ドメイン−細胞質ドメイン（残基１３５〜２２０）及びＣＤ３ζ細胞質ドメイン（残基５２〜１６４）と融合させることにより、抗Ｂ７Ｈ６  ＣＡＲを構築した。重鎖（ＶH）及び軽鎖（ＶL）可変領域を、１５個のアミノ酸からなるグリシン（Ｇ）−セリン（Ｓ）リンカー（（Ｇ4Ｓ）3リンカー；ＧＧＧＧＳ（配列番号１４）の３回反復配列）と融合させることにより、抗Ｂ７Ｈ６  ｓｃＦｖの構築を行った。次に、抗Ｂ７Ｈ６コンストラクトを、レトロウイルスベクターｐＦＢ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）にクローニングした。抗Ｂ７Ｈ６  ＣＡＲを、Ｔ２Ａ配列と、それに続いてトランケート型ヒトＣＤ１９（残基１〜３２７）と融合させて、抗Ｂ７Ｈ６  ＣＡＲ−Ｔ２Ａ−ｔＣＤ１９コンストラクトを作製した。すべてのＰＣＲは、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して実施した。
【００４８】
レトロウイルスによる形質導入ベクターにより形質導入したＧＰ＋Ｅ８６細胞から回収したエコトロピックウイルスを使用して、マウス初代Ｔ細胞の形質導入を実施し、ベクターにより形質導入したＰＴ６７細胞から作製した二重向性（dualtropic）レトロウイルスを使用して、ヒト初代Ｔ細胞を感染させた。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ，１μｇ／ｍＬ）刺激後１８〜２４時間でＢ６マウス脾臓由来の初代Ｔ細胞に感染させた。感染の２日後、形質導入した初代Ｔ細胞（０．５〜１×１０6／ｍＬ）を、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍＬ）に加え２５Ｕ／ｍＬ  ｒＨｕＩＬ−２を含有させたＲＰＭＩ−１０培地で更に３日間選別した。ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１０８３（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）を使用して生細胞を単離し、何度も洗浄し、Ｇ４１８は使用せず２日間増殖させた後、機能解析又は静脈投与を行った。形質導入前に、抗ＣＤ３  ｍＡｂ  ＯＫＴ３（４０ｎｇ／ｍＬ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に加え、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）で細胞クローン由来の初代ヒトＴ細胞を３日間活性化させた。マウスＴ細胞の培養と同様の手順後に、Ｇ４１８選別及びＴ細胞の増殖を実施した。
【００４９】
抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥの構築可動性リンカーを介し、抗Ｂ７Ｈ６  ｓｃＦｖを抗ＯＫＴ３  ｓｃＦｖに融合させた（すなわち、ａｎｔｉ−ＣＤ３  ｓｃＦｖ；Ａｒａｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：６５７〜６２、米国特許第５，９２９，２１２号、これらの文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）（図６Ａ）。得られるヒトＢｉＴＥタンパク質（ｈｕＢｉＴＥ）を、レトロウイルスベクターで安定的に形質移入させたＰＴ６７パッケージング細胞で発現させた。次に、得られた細胞を無血清培地で培養した。上清を回収し、一般的な乳酸デヒドロゲナーゼアッセイを使用して、抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥの腫瘍細胞傷害性を評価した（図６Ｂ）。この解析により、抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥはＢ７Ｈ６+腫瘍細胞を特異的に可溶化することが示された。
【００５０】
抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥがＴ細胞及び腫瘍細胞の両方に結合し、Ｔ細胞を活性化させるかを決定するため、抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥを使用し、又は使用せずにＯＫＴ３活性化Ｔ細胞を腫瘍細胞（ＲＭＡ、ＲＭＡ−Ｂ７Ｈ６、及びＫ５６２）と２４時間共培養した。上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡにより解析した。この解析により、抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥが、Ｂ７Ｈ６を発現している腫瘍細胞、すなわち、ＲＭＡ−Ｂ７Ｈ６及びＫ５６２と共培養したＴ細胞の培地へのＩＦＮ−γ分泌を誘導したことが示された（図７Ａ及び７Ｂ）。同様にして、ＣｏｎＡ活性化脾細胞及び腫瘍細胞の共培養にマウス抗Ｂ７Ｈ６  ＢｉＴＥ（ＭｕＢｉＴＥ１）を加えたところ、Ｔ細胞及び腫瘍細胞の共培養システムにおいてロバストなＩＦＮ−γ分泌が誘導されることが示された（図７Ｃ）。更に、ｈｕＢｉＴＥ同様、ｍｕＢｉＴＥは、Ｔ細胞を特異的に活性化して、Ｂ７Ｈ６＋腫瘍細胞を殺傷した（図８Ａ及び８Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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