(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナーのアスピリン感受性状態およびコンプライアンスを特定する方法であって、
ａ）第一の処理サンプルを形成するために、少なくとも２４時間にわたってアスピリンを経口摂取していない前記ドナーから採取された第一の多血小板サンプルを、２００ｎｇ／ｍＬ未満の量の合成コラーゲンと混合する工程；
ｂ）第一の読み取りを取得するために、前記第一の処理サンプルの凝集を測定する工程であって、前記第一の読み取りは、アスピリンの経口摂取なしでの前記ドナーのベースラインレベルを特定するものである工程；
ｃ）第二の処理サンプルを形成するために、前記ドナーがアスピリンを経口摂取した後に前記ドナーから採取された第二の多血小板サンプルを、２００ｎｇ／ｍＬ未満の量の合成コラーゲンと混合する工程；
ｄ）第二の読み取りを取得するために、前記第二の処理サンプルの血小板凝集を測定する工程、
ｅ）アスピリンの経口摂取なしでの前記ベースラインレベルと前記第二の処理サンプルの読み取りとを比較する工程であって、前記比較は、前記ドナーのアスピリン感受性状態を特定するものである工程、
によって血小板凝集アッセイを実施することを含み、
前記合成コラーゲンが、式（Ｉ）で表されるペプチド断片を有するポリペプチドを含み、
前記読み取りが、一次凝集、一次傾き、曲線下面積、またはこれらの組み合わせであり、
合成コラーゲンの濃度の低下と相関する血小板凝集、傾き、または曲線下面積の値の直線的な減少を示す代わりに、血小板凝集、傾き、または曲線下面積の値が対応して減少するべきところで、血小板凝集、傾き、または曲線下面積の値が少なくとも１つの合成コラーゲン濃度において増加している場合に、前記ドナーがアスピリン耐性である又はアスピリン非コンプライアンスであるとして特定される、方法。
【化１】
0006319308.tif 000003
（式中、ＸはＨｙｐを表し、ｎは２０から２５０の整数を表す。）
【請求項２】
前記ドナーに前記アスピリンを経口摂取させる代わりに、前記第二の多血小板サンプルにアスピリンが添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記合成コラーゲンの量が、５０．０ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記合成コラーゲンの量が、２５．０ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記合成コラーゲンの量が、１０．０ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記ドナーのアスピリン反応性状態をさらに分析するために希釈プロファイル分析を実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法であって、
ｆ）複数の異なる処理ベースラインサンプルを得て、異なる濃度範囲にわたるベースライン希釈プロファイルを取得するために、アスピリンの経口摂取前に前記ドナーから採取された複数の異なる多血小板サンプルを、前記濃度範囲にわたる異なる合成コラーゲン希釈量とそれぞれ独立に混合する工程；
ｇ）ベースライン希釈プロファイル読み取りを取得するために、前記複数の異なる処理ベースラインサンプル全体を通して血小板凝集を測定する工程；
ｈ）複数の異なる処理アスピリン後サンプルを得て、異なる濃度範囲にわたるアスピリン後希釈プロファイルを取得するために、アスピリンの経口摂取後に前記ドナーから採取された複数の異なる多血小板サンプルを、前記濃度範囲にわたる異なる合成コラーゲン希釈量とそれぞれ独立に混合する工程であって、
工程ｆ）の前記ベースライン希釈プロファイルと工程ｈ）の前記アスピリン後希釈プロファイルにおいて同じ希釈量が用いられる、工程；
ｉ）アスピリン後希釈プロファイル読み取りを取得するために、前記複数の異なる処理アスピリン後サンプル全体を通して血小板凝集を測定する工程；
ｊ）前記ドナーのアスピリン感受性のレベルを特定するために、前記アスピリン後希釈プロファイル読み取りを前記ベースライン希釈プロファイル読み取りに対して分析する工程、
を含む、方法。
【請求項７】
前記ドナーに前記アスピリンを経口摂取させる代わりに、前記多血小板サンプルにアスピリンが添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記血小板凝集アッセイが、光透過型アッセイを用いる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記血小板凝集アッセイが、フローサイトメーターを用いる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の異なる合成コラーゲン希釈量が、感受性領域（ＳＲ）内の３、４、または５つの異なる合成コラーゲン量を含む請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法であって、
前記感受性領域（ＳＲ）は、平均アスピリン感受性を有する平均ドナーにおいて測定された血小板活性／凝集が、コラーゲン濃度の低下と共に減少される合成コラーゲン濃度の範囲である、方法。
【請求項１１】
前記異なる合成コラーゲン希釈量が、５０．０ｎｇ／ｍＬから２．５０ｎｇ／ｍＬの濃
度範囲内から選択される５つの異なる合成コラーゲン量を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記５つの異なる合成コラーゲン量が：５０．０ｎｇ／ｍＬ；２５．０ｎｇ／ｍＬ；１０．０ｎｇ／ｍＬ；５．０ｎｇ／ｍＬ；および２．５０ｎｇ／ｍＬを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ドナーの血小板アスピリン感受性状態が、アスピリン高感受性、平均アスピリン感受性、およびアスピリン非応答性から成る群より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全内容が本明細書に組み込まれる２０１２年７月６日出願の米国特許仮出願第６１／６６８，８２０号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
心臓病学の分野では、血小板応答および反応性の効果的な評価法が従来から第一に求められている。心臓発作、脳卒中、ならびに関連する心血管および血栓性疾患の公衆衛生上の広がりおよび負荷についてはよく知られている。医学界は、心血管リスクを低減するためのプライマリケアとしてアスピリンの使用をかなり以前から推奨してきた。アスピリン（サリチレート系化合物）を経口摂取すると、ＣＯＸ１経路が阻害され、およびＣＯＸ２酵素プロセスが修飾され、そしてこれによって、血小板凝集に必要であるこれに続くすべてのイベントが排除される。アスピリンの経口摂取は、血小板凝集を阻害することができることから、多くの心臓発作、脳卒中、またはその他の血栓性イベントの原因であり得る望ましくない血小板凝集を予防するための治療法とされてきた。
【０００３】
心臓病学に加えて、麻酔学；糖尿病学；腎臓学；神経学；腫瘍学；整形外科学；およびリウマチ学を含むその他の医学的専門分野から、その分野の患者に対するアスピリンの有益性が報告されている。
【０００４】
多くの個人においてアスピリン療法が有益であるにも関わらず、一部の個人には、アスピリン療法は、それが血小板凝集の所望される阻害を引き起こさないことから、またはその効果が投与間隔よりも短いことから（患者によっては、２４時間ではなく僅かに６から１２時間の場合があり、投与間の時間において、患者に上記のベースラインリスクをもたらす）、効果的ではない。また、アスピリンが血小板の活性をすべて遮断し、それによって生理学的に必要である場合にも血液が凝血しなくなると思われることから、アスピリン療法は、望ましくない出血性合併症リスクを高めるため、それが有害となり得る個人もいる。
【０００５】
従って、血小板凝集へのアスピリンの応答および反応性を評価、ならびに管理し、さらには患者コンプライアンスを評価するための信頼のおけるツールが求められている。従来から、アスピリンに対する患者の応答は、血小板凝集試験により、アスピリンの存在下での血小板活性を調べることによって試験される。凝集に対する血小板の応答または阻害の度合いまたは程度の尺度として、血小板凝集試験の「至適標準」は、光透過型凝集測定法（ＬＴＡ）であり、これは、血小板凝集をもたらすためのアゴニストとして生物源からのコラーゲンを用いている。しかし、生物学的物質を用いる場合、複数の分析上、性能上、および解釈上の課題、ならびに感染性疾患の伝染のリスクが存在する。「天然」であれ、加工品であれ、発酵、細胞培養、もしくは類似のプロセスによる製造品であれ、または組換え品であれ、生物由来品はすべて、以下の欠点を共通して有する：感染性疾患の伝染リスクを有すること；ロット間の変動（活性物質の比率、性能、化学的特性、溶解性、安定性、水分含有量、およびプロセス汚染物に関して）；製品が作られた場所に依存する生物学的プロファイルの相違；加工に起因する相違；および採取源である動物または培養物に影響を及ぼす環境上、地理上、および食餌上の相違。加えて、生物由来コラーゲンは、化学分析に典型的である化学量論的な挙動を示さない。例えば、希釈されない、検体に対して定量的関係性を有さない、および（アスピリン）検体に対して非感受性である、などである。
【０００６】
光透過型凝集測定アッセイ（ＬＴＡ）によって測定される場合の血小板機能に対するアスピリンの効果を検出するために一般的に用いられるアゴニスト（通常は血小板の凝集を引き起こす化合物）は２種類あり：アラキドン酸（アスピリンの阻害効果を評価するために用いられる）およびコラーゲン（血小板活性化、遺伝的血小板機能障害、およびアスピリン阻害効果を評価するために用いられる）である。
【０００７】
ＬＴＡに加えて、他にも多くの血小板凝集試験が市販されている。しかし、それらはすべて、多くの欠点を有しており、現在利用可能であるアッセイを繋ぐ共通の特徴は、患者のアウトカムを変化させる情報を医師に提供しないことである。これらの試験の多くについて以下に記載する。
【０００８】
血小板機能に対するアスピリンの効果のための市販の試験
【０００９】
１つの市販試験は、Ａｃｃｕｍｅｔｒｉｃｓ（登録商標）によって販売されており、ＶｅｒｉｆｙＮｏｗ（登録商標）アスピリン試験と称される。この試験は、血小板機能を試験するために全血系を用いる。これは、ポイントオブケアまたは研究室の状況において、クエン酸全血中にてアスピリン経口摂取に起因する血小板機能障害の検出を補助するための定量的試験とすることを目的としている。この試験の報告されている制限としては、以下の観察結果が挙げられる。この試験は、アスピリンの非存在下で血小板阻害を示す。ＧＲＡＶＩＴＡＳ治験の結果から、抗血小板療法に対する予測値を持たないことが示された。この試験は、遺伝的血小板欠損の患者には用いることができない。米国特許第７，５９５，１６９号；同第７，２０５，１１５号；同第６，０１６，７１２号；同第５，９２２，５５１；およびＤ４０９，７５８は、この試験に関連すると報告されている。
【００１０】
やはりＡｃｃｕｍｅｔｒｉｃｓ（登録商標）によって販売されている別の市販試験は、ＶｅｒｉｆｙＮｏｗ（登録商標）Ｐ２Ｙ１２試験である。この試験は、活性化血小板がフィブリノーゲンと結合する能力に基づいて血小板機能を評価するように設計されたアッセイである。これは、研究室またはポイントオブケアの状況において、血小板Ｐ２Ｙ１２受容体遮断のレベルを測定するために用いられる全血試験とすることを目的としている。報告されているこの試験の制限としては、以下の観察結果が挙げられる。この試験は、アスピリンの非存在下にて、患者の３０％で血小板阻害を示し、遺伝的血小板欠損の患者には用いることができない。試験の結果は、ＩＩｂ／ＩＩＩａおよびホスホジエステラーゼ阻害剤の影響を受ける。Ｐ２Ｙ１２試験の任意単位と血小板阻害のパーセントとは対応しない。米国特許第７，７９０，３６２号は、この試験に関連すると報告されている。
【００１１】
別の入手可能な製品は、Ｓｐｅｃｔｒａｃｅｌｌ／Ｃｏｒｇｅｎｉｘ（登録商標）によるＡｓｐｉｒｉｎＷｏｒｋｓ（登録商標）である。これは、希釈尿サンプルで行われる競合ＥＬＩＳＡアッセイである。これは、ヒトの尿中の１１‐デヒドロトロンボキサンＢ２（１１ｄｈＴｘＢ２）のレベルを特定するための定性的試験とすることを目的としており、アスピリンに対する血小板応答（血小板の反応性ではなく、阻害）を特定する補助となる。報告されているこの試験の制限としては、以下の観察結果が挙げられる。この試験は、血小板に対して特異的ではなく、単球およびマクロファージが試験結果に影響を与える。この試験は、非自動ＥＬＩＳＡを用いることが必要であり、そのためにこの試験は時間が掛かり、煩雑なものとなってしまう。加えて、この試験は、試験結果の解釈を可能とするために、クレアチニン（血液化学）試験の結果も必要である。米国特許および特許出願である第８，１６８，４００号；第８，１０５，７９０号；第７，７２７，７３０号；第２００３／０１３３８７３号；および第２００３／０１２４６１５号は、この試験に関連すると報告されている。
【００１２】
別の入手可能な試験は、Ｐｌａｃｏｒ（登録商標）によるＰｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｅａｃ
ｔｉｖｉｔｙ  Ｔｅｓｔ（登録商標）である。この試験は、血小板反応性のための包括的試験として市販されている。これは、アスピリンおよび抗血小板薬の血小板反応性を測定するためのポイントオブケアデバイスとすることを目的としている。米国特許第７，５３４，６２０号；および第７，３０９，６０７号は、この試験に関連すると報告されている。ＰｌａＣｏｒ  ＰＲＴは、出血時間などの血小板機能の包括的試験であり；同等の試験との若干の一致を示し（ｒ値０．６０）、結果は、血小板数に大きく依存する。Wurtz et
al., Thromb Res. 2012 Nov;130(5):753-8
【００１３】
別の試験は、Ｒｏｃｈｅ（登録商標）によるＡＳＰＩＴｅｓｔ（登録商標）（Ｖｅｒｕｍ  Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標））である。この試験は、アラキドン酸を用いた全血中における血小板機能のインピーダンスに基づく分析である。これは、正常な血小板機能の評価のための日常的な血小板凝集試験とすることを目的としている。報告されているこの試験の制限としては、以下の観察結果が挙げられる。この試験は、アスピリンの非存在下にて血小板阻害を示すと報告されている。大きいサンプルサイズが必要であり、この試験は、血小板機能試験では推奨されていない抗凝血剤を用いる。１５μＭの濃度は、典型的な最大アラキドン酸濃度よりも５０％高い。その添付文書によると、ＡＳＰＩＴｅｓｔ（登録商標）は、シクロオキシゲナーゼ阻害、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト、およびＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の欠乏に対して感受性を有し、アスピリンに特異的ではない。
【００１４】
別の試験は、Ｓｉｅｍｅｎｓ（登録商標）ＰＦＡ１００Ｃｏｌ／ＡＤＰ  ｔｅｓｔ（登録商標）である。この試験は、試験の開始から血小板プラグが開口部を塞ぐまでの時間を特定することによって一次止血を測定するものであり、その時間間隔を、閉塞時間（Closure Time）（ＣＴ）として報告する。ＰＦＡコラーゲン／ＡＤＰ  Ｔｅｓｔカートリッジが、アスピリンの血小板への効果を他の血小板機能障害に対して区別するために用いられる。これは、アスピリンには非感受性であるが、フォン・ヴィルブランド病（ＶＷＤ）、低血小板数、およびその他の血小板機能障害に対しては感受性である。米国特許出願第２００７／０２５４３２５号および同第２００７／０２５４３２４号は、この試験に関連すると報告されている。
【００１５】
別の試験は、Ｓｉｅｍｅｎｓ（登録商標）ＰＦＡ２００Ｐ２Ｙ（登録商標）試験である。この試験は、血小板機能の自動バイオメトリックインピーダンス評価を提供する。これは、Ｐ２Ｙ１２受容体遮断アンタゴニストによる治療法を受けている患者におけるＰ２Ｙ１２受容体遮断を検出することを目的としている。報告されているこの試験の制限としては、以下の観察結果が挙げられる。特異性は、４２％未満であると報告されており、結果は、検体採取に用いられる抗凝血剤によって変動する。この試験はまた、フォン・ヴィルブランド因子およびヘマトクリットにも依存する。米国特許出願第２００７／０２５４３２５号および同第２００７／０２５４３２４号は、この試験に関連すると報告されている。
【００１６】
さらなる試験が、米国特許出願第２０１０／０１７３３９号；同第２０１１／００４５４８１号；同第２００８／０２０７６８１号；および同第２０１０／０１３７１６１号で考察されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、動物由来コラーゲンをアゴニストとして用いず、利用可能である残留血小板反応性の結果を医師に提供する信頼性のより高い血小板活性試験が依然として求められている。また、アスピリン療法に対する患者コンプライアンスを試験／モニタリングするために日常的に用いることが可能である試験も依然として求められている。本発明はこのよう
な必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、合成コラーゲンを用いて、ドナーのアスピリン感受性状態を特定するアッセイを提供する。代表的なアッセイとしては、光透過型凝集アッセイ（ＬＴＡＡ）およびフローサイトメトリーを用いた血小板凝集の評価が挙げられる。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、ドナーの血小板アスピリン感受性状態（アスピリン高感受性、平均的アスピリン感受性、およびアスピリン非応答性であり得る）を特定するための、および／またはアスピリン感受性の度合い、アスピリン高感受性の度合い、もしくはアスピリン非応答性の度合いを特定するための方法を提供する。本発明のアッセイはまた、投与間隔および処方された量において、アスピリン用量が適切であるかどうかを判断するためにも用いることができる。
【００２０】
本発明の特定の実施形態は、生物学的コラーゲンを用いる類似のアッセイと比較して、少なくとも１０００倍少ない量の合成コラーゲンを用いる。
【００２１】
本発明の特定の実施形態は、ドナーがアスピリンを経口摂取する前に、血小板凝集アッセイを行い、光透過型凝集アッセイ（ＬＴＡＡ）およびフローサイトメトリーなどであるがこれらに限定されない方法を用いて血小板凝集の評価を行い、およびドナーがアスピリンを経口摂取した後に、凝集アッセイをもう１度行い、ドナーの血小板アスピリン応答を特定することを含む。特定の実施形態は、ドナーにアスピリンを経口摂取させる代わりに、アスピリン添加（aspirinated）血漿を用いる。
【００２２】
特定の実施形態は、合成コラーゲンの種々の希釈物に対して複数の血小板凝集アッセイを実施して、希釈プロファイルを得ることを含む。希釈プロファイルに対する血小板凝集アッセイの結果解析を用いることで、ドナーの血小板感受性状態、さらには残留もしくは残存血小板機能または反応性が特定される。次に医師は、この結果を、適切な治療法に関する意思決定の補助として用いることができる。
【００２３】
特定の実施形態では、合成コラーゲンは、三重らせんに自己組織化してフィブリルを形成する能力を有し、ヒトＩ型コラーゲンを模倣する合成コラーゲンである。特定の実施形態では、合成コラーゲンは、式（Ｉ）で表されるペプチド断片を有するポリペプチドを含み：
−（Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ）n                （Ｉ）
式中、Ｘは、Ｈｙｐを表し；ｎは、２０から５０００の整数を表し；およびここで、ポリペプチドは、１００００から５０００００の範囲の分子量を有する。特定の実施形態では、ｎ＝２０〜２５０である。
【００２４】
本発明はまた、血小板凝集を試験するためのキットも提供し、該キットは約０．５０ｎｇ／ｍＬから約５００．０ｎｇ／ｍＬの濃度の合成コラーゲンのバイアルを含む。特定の実施形態では、バイアルは、約２．０ｎｇから約６４０ｎｇの濃度の合成コラーゲンを収容してよい。キットは、アッセイにおける合成コラーゲンの使用説明を含有してよい。ある実施形態では、キットは、約５０ｎｇ／ｍＬの濃度の合成コラーゲンのバイアルを含み、ならびに所望に応じて、希釈剤、およびポジティブおよび／またはネガティブコントロールも含有してよい。
【００２５】
本発明はまた、約０．５０ｎｇ／ｍＬから約５００．０ｎｇ／ｍＬ、または約２．０ｎｇ／ｍＬから約６４０ｎｇ／ｍＬの範囲の種々の濃度の合成コラーゲンの複数のさらなるバイアルを含み、ならびに所望に応じて、希釈剤、およびポジティブおよび／またはネガ
ティブコントロールを含んでよいキットも提供する。本発明はまた、約２．５ｎｇ／ｍＬから約５００．０ｎｇ／ｍＬの範囲の種々の濃度の合成コラーゲンの複数のさらなるバイアルを含み、ならびに所望に応じて、希釈剤、およびポジティブおよび／またはネガティブコントロールを含んでよいキットも提供する。
【００２６】
特定の実施形態では（本明細書で述べる方法およびキットを含む）、合成コラーゲンは、ポリプロピレンホモマー容器中にて提供および／または保存される。特定の実施形態では、キャップは、バイアル／チューブと同じ材料である。特定の実施形態では、容器は、追加の内部シール、またはその中に成型された二次シールを持つキャップを有する。特定の実施形態では、容器は、上述のすべての特徴を含有する。
【００２７】
本発明はまた、満たされていない重要な医学的必要性として最近認識され、本発明で満たされるものであるアスピリン療法に対する患者コンプライアンスを、合成コラーゲンを用いる、血小板凝集アッセイで試験する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１Ａは、合成コラーゲンによるＬＴＡＡの実施を示す。種々の量の合成コラーゲンを用いた（量は「詳細」という表題のカラム下に記載）。合成コラーゲンの「試験内」濃度（各ＬＴＡＡで用いたコラーゲンの量）は、２．５ｎｇ／ｍＬから２５ｎｇ／ｍＬの範囲とした。図１Ａは、ＰＡ、ＰＳ、ＳＡ、ＳＳ、ＬＰ、ＤＡ、ＭＡ、およびＦＡと表示したデータのカラムが、測定されたパラメーターであることを示すために提供される。残りのパラメーターＡＵＣは、算出され、これらの中でも、ＰＡが主要な測定であると見なされる。図１Ａは、アスピリン添加血漿による広範囲の希釈物に対して合成コラーゲンが実際に機能することを示しており、このことは、コントロールおよび較正用の血漿を作り出すために既知であることが有用であり、それらを用いて、種々のアッセイ測定におけるパラメーターを設定し、およびアッセイシステム全体を確実に適切に機能させることができる。図１Ａはまた、この濃度範囲全体にわたって、アスピリンの存在にも関わらず、すべての結果が正常なコラーゲン応答として解釈されることも示しており、これは、主治医への報告にアスピリンの存在が記載されなかった場合に臨床的に危険な解釈となる可能性がある。これらの結果には、アスピリンの存在についての明らかな徴候は存在しない。この図から、チャネル３および４の結果が、アスピリンに対する最も低い感受性であることは明らかである。チャネル／サンプル１〜４の血漿サンプルは、２５μＬのアスピリン溶液を血小板に添加することでアスピリン添加されており、サンプル５〜８は、５μＬのアスピリンが血小板に添加されたものである。アスピリン溶液の調製では、５００ｍｇのアスピリン錠剤を粉砕し、希釈剤に懸濁し、得られた溶液は、約１５０ｍｇ／ｍＬのアスピリンを含有していた。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＬＴＡＡからの生データの読み取りにおいて、傾きを算出する基本的方法を示す。この図は、本出願の他の図において、０％ベースラインの逆側が１００％凝集であることを示している。
【図２】図２は、生物学的コラーゲンを用いた場合のＬＴＡＡにおける正常または平均ドナー応答を示す。
【図３】図３は、アスピリンを経口摂取した正常／平均アスピリンレスポンダーからの生物学的コラーゲンに対する典型的な応答を示す。
【図４】図４は、アスピリンを経口摂取した正常／平均アスピリンレスポンダーからの、合成コラーゲンの種々の希釈に対する応答を示す。
【図５】図５は、アスピリン経口摂取なしにて生物学的コラーゲンを用いたＬＴＡＡの結果を示し、ここで、応答は、「正常」に見えるが、実際には、ドナーは、アスピリン抵抗性（アスピリン非応答性）である。
【図６】図６は、アスピリン経口摂取後のＬＴＡＡの結果を示し、ここで、ＬＴＡＡは、生物学的コラーゲンを用いて実施した。ドナーは、生物学的コラーゲンを用いた場合、正常／平均アスピリン応答を有すると思われる。
【図７】図７は、合成コラーゲンの希釈プロファイルに対して行ったＬＴＡＡを示し、ドナーがアスピリン抵抗性（アスピリン非応答性）であることを示している。
【図８】図８は、別の生物学的コラーゲンの複数の希釈に対して行ったＬＴＡＡを示す。
【図９】図９は、別の生物学的コラーゲンの複数の希釈に対して行ったＬＴＡＡを示す。
【図１０】図１０は、合成コラーゲンを用い、３つの異なるドナー多血小板血漿サンプル（ＰＲＰ）を用いて行った希釈プロファイルＬＴＡＡからの傾きを示す。４つの異なる「試験内」濃度、２５．０ｎｇ／ｍＬ、１０．０ｎｇ／ｍＬ、５．０ｎｇ／ｍＬ、および２．５ｎｇ／ｍＬを用いた。合成コラーゲンに対する応答に精通していれば、正常応答（平均アスピリン感受性を有する個人）は、直線的希釈プロファイル（ドナー７２０６で見られるように）を有すると推察され、すなわち、濃度が低下するにつれて、傾きも減少する。ドナー７００３の応答は、明確に非直線的であり、従って、ドナー７００３は、正常応答を持たず、従って平均または正常アスピリン感受性を持たないことを示している。生物学的コラーゲンでは、この異常を検出することができなかった。
【図１１】図１１は、３人の異なるドナーに対する合成コラーゲンを用いたＬＴＡＡの結果を提供する。３人のドナーのアスピリン応答状態は、以下の通りである：ドナー７００３は、アスピリンに対して非感受性の可能性があり；ドナー７２２５は、アスピリンに対して僅かに感受性である可能性があり、ドナー７２０６は、期待されるアスピリンに対する正常な応答を示す可能性がある。
【図１２】図１２は、合成コラーゲンを用いたＬＴＡＡの結果を提供する。この図は、ドナーがアスピリンを経口摂取した後の応答傾きを示し、それが、ドナーがアスピリンを経口摂取していない場合の傾きパターンに対応していることを示している（図１１のように）。従って、この図は、アスピリンの経口摂取前に図１１で予測されたドナーの応答の確認を提供する。
【図１３】図１３は、合成コラーゲンを用いたＬＴＡＡの結果を提供する。図１３は、ドナー７２２５および７２０６で見られるより直線的な傾きに対して、ドナー７００３での「跳ね返り（bounce back）」を示す。
【図１４】図１４は、２つの異なる生物学的コラーゲンを用いて行った試験を示す。上のパネルは、一方の採取源からのコラーゲン「ＢＤＣ」（仔ウシ皮由来、酸抽出、Ｉ型コラーゲン）を用いたものであり、下のパネルは、他方の採取源からの生物学的コラーゲンを用いている（「Ｃｈｒｏｎｏ  Ｌｏｇ」）（ウマ腱由来Ｉ型コラーゲン、測定可能量のＩＩＩ型コラーゲンが存在）。図１４は、生物学的コラーゲンで実施したＬＴＡＡからの傾きの比較を示す。両パネル共に、正常または平均アスピリン感受性を有すると見なされる血小板ドナーを用いた。両パネル共に、アスピリンの経口摂取前（左側、ひし形）および後（右側、正方形）に実施したＬＴＡで、生物学的コラーゲンを用いた。これらの結果は、「Ｃｈｒｏｎｏ  Ｌｏｇ」生物学的コラーゲンが、アスピリンの存在に対して完全に非感受性であることを示している。これらのチャートは、２つの両極端の生物学的コラーゲンを示す。ＢＤＣコラーゲンは、アスピリンを検出するが、応答性または抵抗性の度合いは示さない。Ｃｈｒｏｎｏ‐Ｌｏｇは、アスピリンを検出することができない。Ｃｈｒｏｎｏ‐Ｌｏｇコラーゲンは、使用前に希釈する必要のある液体ではあるが、さらに希釈しても、アスピリンの存在に対して感受性を持つようにはならない。
【図１５Ａ】図１５は、合成コラーゲンおよび生物学的コラーゲンから、非常に類似した形の曲線が作成されることを示しているが、用いられた合成コラーゲンは、生物学的コラーゲンの濃度の数分の１である。合成コラーゲンのＡＵＣ値（約４００）は、生物学的コラーゲンの場合（約３００）よりも非常に高く、このことは、合成コラーゲンが、より感度の高い読み取りを提供すること、およびさらには、合成コラーゲンが、このアッセイにおいて、実際には生物学的コラーゲンとは異なって作用していることを示している。
【図１５Ｂ】図１５は、合成コラーゲンおよび生物学的コラーゲンから、非常に類似した形の曲線が作成されることを示しているが、用いられた合成コラーゲンは、生物学的コラーゲンの濃度の数分の１である。合成コラーゲンのＡＵＣ値（約４００）は、生物学的コラーゲンの場合（約３００）よりも非常に高く、このことは、合成コラーゲンが、より感度の高い読み取りを提供すること、およびさらには、合成コラーゲンが、このアッセイにおいて、実際には生物学的コラーゲンとは異なって作用していることを示している。
【図１６】図１６は、コラーゲン誘導血小板凝集実験（実施例１参照）の結果を示す。
【図１７】図１７は、フローサイトメトリーで評価した、合成コラーゲンを含む種々のコラーゲン試薬によるクエン酸全血中における血小板活性化（実施例１参照）を示す。
【図１８】図１８は、フローサイトメトリーで評価した、種々のコラーゲン試薬によるクエン酸全血中における血小板活性化（実施例１参照）を示す。
【図１９】図１９は、フローサイトメトリーで評価した凝集実験の結果を示し、ここで、活性化の前に、Ａｓｐｉｓｏｌ（登録商標）（生体内使用向けに製剤されたアスピリン溶液）を、１、５、および１０μｇ／ｍＬの濃度で全血に添加した（実施例１参照）。
【図２０】図２０は、フローサイトメトリーで評価した、コラーゲン誘導血小板活性化（実施例１参照）に対するアスピリンの影響を示す。Ａｓｐｉｓｏｌを、１、５、および１０μｇ／ｍＬの濃度で活性化の前に全血に添加した（実施例１参照）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、合成コラーゲンを用いてドナーのアスピリン感受性状態を特定するアッセイを提供する。代表的なアッセイとしては、これらに限定されないが、光透過型凝集アッセイ（ＬＴＡＡ）および全血フローサイトメトリーを用いた血小板凝集の評価が挙げられる。本発明は、ドナーのアスピリンに対する感受性の度合いを予測またはユーザーに通知する、ドナーの血小板アスピリン応答状態を特定するための方法、ならびにドナーのアスピリンに対する感受性を予測するための方法を提供し、ドナーがアスピリンを経口摂取する前後（または、血漿サンプルがアスピリン化された後）で、ドナーの血小板が凝集する能力を試験することによる。
【００３０】
本発明はまた、患者の血小板応答を経時でモニタリングすることにより、アスピリン療法の患者コンプライアンスを試験するための方法も提供する。治療法は、アスピリンを服用すること、およびその抗血小板効果を維持するために適切な時間にアスピリンを服用することの両方を意味する。
【００３１】
アスピリンは、その活性成分がアセチルサリチル酸（ＡＳＡまたはＡＳＳ）である一般的な薬物である。これは弱酸であり、胃および小腸の粘膜内層を通して吸収される。吸収後、ＡＳＡは、酢酸およびサリチル酸に（代謝）加水分解される。
【００３２】
ほとんどの個人では、アスピリンは、血小板凝集の阻害を引き起こし、従って、アスピリンは、血小板凝集を最小限に抑えることが望まれる多くの治療法で用いられる。このような個人は、正常または平均アスピリン感受性と称される場合がある。
【００３３】
しかし、アスピリン服用後であっても血小板が依然として凝集を起こし、従って、アスピリン療法が有益でないか、または少なくとも単独では有益でない個人も存在する。このような個人は、多くの場合、アスピリン耐性もしくはアスピリン非応答性、または治療時血小板高反応性（患者が治療中であっても、血小板が依然として高い反応性を有する）と称される。この状況では、患者がアスピリンに非応答性であるのではなく、その治療法レジメンを順守しているか順守していないかを知ることが、医師にとって重要である。
【００３４】
さらに、非常に少ない用量のアスピリンであっても、重篤な出血病変に繋がる可能性のある血小板凝集の強い阻害が引き起こされる個人も存在する。このような個人は、アスピ
リン高感受性と称され得る。このような個人にとって、アスピリン療法は、出血のリスクが高まるため、得られる有益性よりも害の方が多い場合がある。アスピリン投与が、命に関わるアナフィラキシー反応を引き起こす個人もいる。このような個人は、アスピリン不耐性と称される。従って、患者／ドナーをアスピリンに対するその応答について試験して、患者の血小板凝集に対するアスピリンの持つ効果を見極め、アスピリン療法が望ましくない血小板凝集の予防に有用であるかどうか、またはアスピリン療法をまったく避けるべきか、もしくは場合によってはその代わりにアスピリン効果を高める別の薬物と共に用いられるべきかを判定することができることが非常に望ましい。
【００３５】
本発明の実施形態は、フローサイトメトリーおよび光透過型凝集測定法（ＬＴＡ）が挙げられるがこれらに限定されない本技術分野で公知の方法を用いて血小板凝集の試験を行うことができる。
【００３６】
フローサイトメトリーは、全血を用い、血小板凝集の検出に用いることができる。実施例１を参照されたい。
【００３７】
光透過型凝集測定法（ＬＴＡ）は、アゴニスト（これらに限定されないが、コラーゲン、ＡＤＰ、エピネフリン、リストセチン、アラキドン酸、トロンビン、およびＴＲＡＰなど）の添加後の多血小板血漿（ＰＲＰ）を通る光透過率の変化から（例：血小板凝集のないサンプルと比較して、血小板凝集が発生したサンプルでは、より多くの光が透過する）、複数の光学パラメーターを測定し、それを血小板が存在しないドナーの血漿であるブランク（ＰＰＰ、または少血小板血漿）と比較する生体外診断アッセイである。アゴニストは、多血小板血漿に添加された場合に血小板の凝集を引き起こす物質である。ＬＴＡにおいて、ＰＲＰは、通常、キュベット中３７℃で撹拌され、キュベットは、光源と光電セルとの間に配置される。アゴニストが多血小板血漿（ＰＲＰ）に添加されると、血小板が凝集し、光の吸収が減少し、従って、光透過率が増加し、それが光電セルによって検出される。
【００３８】
光透過型凝集測定アッセイ（ＬＴＡＡ）は、凝集パターンの形態のデータを作成する。ＬＴＡＡは、ｘ／ｙグリッド上にプロットされるパラメーターを作成する。ｘ軸は、通常、直線時間軸である（通常は、分の単位）。ｙ軸は、光透過率に基づく対数スケールである。この光透過率は、凝集パーセント（％）に対応する。
【００３９】
ＬＴＡＡパターンまたは曲線が作成されると、傾き（Ｓａ）；最大凝集；最終凝集；曲線下面積（ＡＵＣ）、傾き下面積（Area Under the Slope）（ＡＵＳ）などを含む種々の誘導される尺度が算出される。
【００４０】
凝集の傾き（Ｓａ）は、反応が進行する速度の尺度である。
【００４１】
希釈プロファイル（ＤＵＰ）は、試験混合物中の反応体濃度の増分変化である。コラーゲン試験において、ＤＵＰは、用いたコラーゲン試薬の濃度に対する変化から成る。分析において、その他の希釈プロファイルが定められ、用いられてよい。
【００４２】
希釈プロファイルの傾き（Ｓｄ）は、一般的に、濃度変化の回帰分析である。
【００４３】
反応プロファイルの傾き（Ｓｒ）は、一般的に、希釈の変化に対する反応の変化の回帰分析である。
【００４４】
回帰分析は、一次、多項式であるか、またはその他のモデルに従ってよい。
【００４５】
曲線下面積（ＡＵＣ）は、反応の開始から反応の終了までの算出されたグラフ上の量である受信者操作曲線（receiver operating curve）であり、凝集および凝集の傾き（Ｓａ）によって定められる。これは、反応によって作り出される「パワー」と見なされ得る。
【００４６】
これまでは、アスピリンに対する応答は、全か無かである、すなわち、患者は、アスピリン服用後に非常に多量の血小板の凝集が阻害される「正常」（すなわち、平均アスピリン感受性）であるか、または患者は、アスピリンの服用用量を増加させた後でも、アスピリンが血小板凝集阻害にほとんど、もしくはまったく効果を及ぼさない（患者の血小板のすべて、または実質的にすべてが依然として凝集した）アスピリン耐性（アスピリン非応答性）であるかのいずれかであると考えられていた。しかし、本発明の方法を用いることで、具体的には、生物源コラーゲンではなく合成コラーゲンを用いることで、実際には、患者間で発生する凝集には幅があり、正常アスピリン感受性とアスピリン非応答性との間の明確な線引きと考えられていたものは、実は、スライディングスケール（sliding scale）であることが特定された。本発明は、合成コラーゲンを用いるものであり、それは、
生物学的コラーゲンよりも非常に感受性、予測性、および正確性が高いことが分かり、従って極めて少ない量の合成コラーゲンの使用が可能であることから、発明者らは、実際には、患者集団全体の応答が全か無かというものではないことを理解することができた。そうではなく、凝集／血小板凝集には範囲があり、このような範囲を用いて、個人を、アスピリン高感受性、平均アスピリン感受性、およびアスピリン非応答性として特徴付けるか、または個人を、自身のアスピリン療法に対する非コンプライアンスとして識別することができる。
【００４７】
本発明の方法を用いることで、発明者らは、過去に平均アスピリン感受性として特徴付けられた患者が、実際には僅かにアスピリン非応答性であったことを見出すことができた。さらに、発明者らは、一部の患者は、アスピリンに対する応答が非常に強いため、アスピリン服用時にほとんど完全な血小板凝集の阻害を起こすということも特定することができ、これは、アスピリン療法を受けている著しい人数の患者が示してきた出血の問題に繋がり得るものである。さらに、発明者らは、アスピリン非応答性と考えられていた個人が、平均／正常アスピリン感受性個人のレベルではないものの、実際はアスピリン服用後にある程度の血小板凝集阻害を起こすことを観察することができた。生物学的コラーゲンによるこれまでの凝集試験法を用いることでは、イエス‐ノーの応答しか得られなかった（すなわち、血小板が凝集したか、または凝集しなかったか）。しかし、合成コラーゲンの使用（生物学的コラーゲンよりも非常に低い濃度で）を含む本発明の方法を用いることにより、発明者らは、驚くべきことに、生物学的コラーゲンを用いるこれまでの試験は、場合によっては、間違った診断を引き起こし（その結果として、重大な有害心血管イベントが起こる可能性がある）、少なくとも、アスピリン感受性およびコンプライアンスの度合いに関する正しくまたは正確な情報を提供することができないことを見出した。従って、本発明者らは、ここで、生物学的コラーゲンの使用が、アスピリンの有効性に関する種々の研究および臨床治験の結果に一貫性がなかった理由であると理解することができると考える。
【００４８】
さらに、本発明は、合成コラーゲンの感度を充分に利用する実施形態を提供し、従って、合成コラーゲンの複数の希釈全体にわたって（本明細書にて、「希釈プロファイル」と称される）非常に低い用量が使用され、医師によるドナーがアスピリン感受性であるかどうかの判断だけでなく、ドナーのアスピリン感受性状態（例：ドナーがアスピリン感受性、または非応答性である度合い）、さらにはアスピリン療法でのコンプライアンスのさらなる理解に関する補助となる。
【００４９】
この情報は、医師が、アスピリンの適切な用量、および処方された治療レジメンを効果的とするための効果的な投与スケジュールを決定するのに、または、場合によっては、第
二もしくは第三の治療薬が必要であるかどうか、または別の選択肢としての治療法のためにアスピリンの使用を完全に中止することを考慮すべきかどうかを判断するのに有用であり得る。例えば、個人がアスピリン高感受性、または平均アスピリン感受性の上限であることが分かった場合、医師は、平均的な「低用量アスピリン」療法レジメンよりもアスピリンの用量を減らしてよい。低用量アスピリン（８１ｍｇ）は、心臓発作または脳卒中の予防に用いられる最も一般的な用量である。しかし、アスピリンの一日量は、８１ｍｇから３２５ｍｇの範囲であってよい。「低用量アスピリン」として市販されている錠剤は、８１ｍｇのアスピリンを含有している。１つの成人用濃度錠剤は、約３２５ｍｇのアスピリンを含有している。次に、医師は、アスピリン療法の過程で患者のアスピリン感受性状態を継続してモニタリングして、アスピリン用量に追加の変更が必要かどうかを判断し、さらには患者コンプライアンスのモニタリングも行うことが可能である。アスピリンの薬力学から、８１ｍｇの低用量は、患者が投与スケジュールを守る限りにおいて、完全で効果的な保護を提供することが確認されている。このことはまた、より高い用量が投与された場合により多くみられる胃炎および出血エピソードを含む副作用のリスクも低減する。医師は、本発明の方法を用いて患者のアスピリン感受性状態を再確認し、新しい用量が所望される効果を有しているかどうかを判断することが可能であり、続いて状況に応じてアスピリン用量を微調整するか、または場合によっては、アスピリンが所望される結果を達成していない場合に、アスピリンを中止して別の抗血小板薬を試すことさえも可能である。
【００５０】
文献には、アスピリンに対する患者の応答が、特定の状況下では、他の病状のために処方された医薬によって、またはさらにはイブプロフェンなどの大衆薬の自己投与によって変化し、または変化を受ける場合があることを示す報告がある。本発明は、アスピリン応答性の変化を特定するために適している。しかし、アスピリン非感受性（非レスポンダー）の個人の状態は、アスピリンの用量を増やすことで変化させることはできない。従って、このような状況では、別の選択肢としての抗血小板療法が選択されてよい。
【００５１】
合成コラーゲンの感度をさらに充分に利用し、希釈プロファイルの概念をさらに用いることにより、本発明はまた、ドナーのアスピリン感受性を、ドナーがアスピリンを経口摂取する前であっても予測することができる実施形態も提供する。本発明により、研究者らは、アスピリン非レスポンダー（抵抗性）ドナーが、合成コラーゲンの種々の低濃度にわたって実施されたＬＴＡＡに対して独特の応答を有することを見出すことができ、このことを用いて、ドナーのアスピリンに対する応答を診断することが可能である。この、およびその他の実施形態について、本明細書において、以下でより詳細に考察する。
【００５２】
上述のように、ＬＴＡＡは、多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いており、これは、抗凝固処理された全血から調製される。ドナーの血液が採取され、遠心沈殿されてＰＲＰが得られる。血小板は、非常に感受性が高く、ＰＲＰの調製の過程で容易に活性化され得ることから、ドナーの血液は、通常、特定の凝固剤を含有するチューブ中に回収される。例えば、静脈血液は、３．２％／（０．１０９Ｍ）クエン酸ナトリウム中に、１：９の比率（９部の血液に対して１部の抗凝固剤）で採取、回収される。全血サンプルは、採取から４時間以内に処理されるべきであり、血小板を冷却すると、活性化して、誤った試験結果に繋がりかねないことから、血小板凝集試験用の血液サンプルは、室温で保存される必要がある。ＰＲＰは、通常、２０℃、１５０〜２００ｇにて１０〜１５分間の遠心分離によって調製される。ＰＲＰは、注意深く取り出され、ストッパー付きプラスチックチューブに投入される。ＰＲＰは、室温で保存されなければならない。
【００５３】
次に、少血小板血漿（ＰＰＰ）を、残りの血漿を２７００ｇで１５分間さらに遠心分離することによって調製することができる。少血小板血漿（ＰＰＰ）は、血小板やその他の細胞物質を含有しておらず、ＬＴＡサンプル分析においてブランクとして用いられること
が多い。特定の実施形態では、典型的な４５〜６０分間ではなく、約５分間でＰＲＰおよびＰＰＰを作製することができる特殊な遠心分離が用いられる。これによって、緊急の状況または高処理量の臨床状況において、ＬＴＡＡがさらにより実用的となる。
【００５４】
ＰＲＰに血小板アゴニストを添加することは、通常は、血小板の活性化に繋がり、円盤形状からトゲのある球形状へのその形状の変化が引き起こされ、それは、一過性の光学密度の上昇を伴う。その例外は、形状変化を起こさないエピネフリン、および凝集ではなく血小板膠着（platelet agglutination）を引き起こす、すなわち、フィブリノーゲンの結合が存在しないリストセチンである。
【００５５】
アゴニストは、通常、強アゴニストまたは弱アゴニストに分類される。強アゴニスト（例：コラーゲン、トロンビン、ＴＲＡＰ、高濃度ＡＤＰ、およびＵ４６６１９（ＴｘＡ２の類似体））は、血小板凝集、ＴｘＡ２合成、および血小板顆粒分泌を直接誘発する。弱アゴニスト（例：低濃度ＡＤＰおおびエピネフリン）は、分泌を誘発することなく、血小板凝集を誘発する。
【００５６】
一般的に、ＬＴＡＡは、３７℃で実施される。凝集測定装置の較正は：１）光透過率０％に対応するＰＲＰ含有キュベット；および２）光透過率１００％に対応するＰＰＰ含有の第二のキュベットによって行われる。血小板は、通常、活性化され（アゴニストによって）、互いに接触する場合にのみ凝集することから、試験の実施中は、撹拌する必要がある。撹拌を行わない場合、凝集が起こらないか、または少なくとも大きく減少し、その結果として誤った試験結果が得られ、それは続いて、不適切なケアまたは治療を引き起こし得る。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明のＬＴＡＡに用いられるＬＴＡとして、Ｂｉｏ／ＤａｔａのＰＡＰ  ８Ｅ  ＬＴＡが使用される（米国特許第７，４５３，５５５号参照）。
【００５８】
通常、血小板自然凝集（spontaneous platelet aggregation）（「ＳＰＡ」）についての試験が、試験計画の一部として実施される。ＳＰＡは、健康な個人では稀であるが、機能亢進性血小板を持つ人で発生し、一部の血栓形成促進性状態、フォン・ヴィルブランド病（ｖＷＤ）の一部のケース、一部の糖尿病患者、一部の脂質障害、および様々なその他の障害のマーカーとしても認識されている。ＳＰＡの存在は、未希釈のＰＲＰを凝集測定装置中に配置し、１５分間撹拌することによって試験される。ＳＰＡの場合、ＰＲＰを希釈することでこれが破壊され得るものであり、血小板数が＞２００×１０9／Ｌに維持さ
れている場合は、凝集試験を進めてよい。
【００５９】
一般的に、約２２５μＬのＰＲＰが、凝集測定用キュベットに添加され、３７℃に加温される。次に、２５μＬのアゴニストが添加され、応答が記録される。記録される典型的な読み取りまたは応答としては、一次凝集（「ＰＡ」）（通常は凝集量を示す値を提供する）、一次傾き（「ＰＳ」）（通常は凝集速度に関連する値を提供する）、および曲線下面積（「ＡＵＣ」）（一般的にはＰＡとＰＳとの組み合わせに関連する値を提供する）が挙げられる。本技術分野で用いられる凝集測定用機器は、通常、これらの読み取りを、凝集のグラフ画像と共に提供する。各凝集測定装置またはシステムは、これらの値を少し異なった形で算出し、システムソフトウェアに埋め込まれた固有の式を用いる場合がある。
【００６０】
例えば、最大凝集％は、ベースライン［凝集０％‐多血小板血漿］と少血小板血漿［凝集１００％］との間の長さ［Ｙ］を測定し、この数値を最大凝集［Ｘ］で除することによって算出され得る。従って、Ｙ＝１００ｍｍおよびＸ＝８９ｍｍの場合は、最大凝集パーセント＝Ｘ／Ｙ＝８９％である。
【００６１】
傾きを算出する１つの方法について、図１ｂを参照して以下で述べる。傾きの算出には：１）凝集曲線に対する接線を描く。２）チャートレコーダーが１分間に記録する長さをミリメートル［ｍｍ］で特定する。３）接線がベースラインと交差する点から１分間に等しい長さまでをｍｍで測定する。４）「１分間」の点から接線との交差点まで、ベースラインに対して直角の線を描く。５）ベースラインから交差点まで達する長さ［単位ｍｍ］を測定する［Ｘ］。６）ｙ軸［Ｙ］から、凝集の最大高さを誘導する［１００％凝集または最大凝集］。Ｘ／Ｙの割り算を行って、傾きまたは凝集速度を算出する。上記の例では、Ｘ＝２３ｍｍおよびＹ＝９７ｍｍの場合、傾きは、Ｘ／Ｙ＝０．２４である。
【００６２】
本発明は、フローサイトメトリーおよび光透過型凝集測定アッセイ（「ＬＴＡＡ」）を含むアッセイにおいて、アゴニストとして、生物源から得られるコラーゲンの代わりに、合成コラーゲンを用いる。合成コラーゲンの使用は、生物学的コラーゲンの使用と比較して、予想外な有益性を提供するものであり、それを本明細書にて記載する。
【００６３】
本発明の１つの方法は、光透過型アッセイなどの１つ以上の凝集アッセイを実施することを含み、そこでは、第一の多血小板サンプルがドナーから採取され、これが合成コラーゲンと組み合わされて、第一の処理サンプルが形成される。この第一の処理サンプルでは、ドナーは、約２４時間、好ましくは７２〜９６時間、場合によっては好ましくは１６８時間にわたって、アスピリンを経口摂取していない。この趣旨は、ドナーが、血小板凝集試験に影響を与えるアスピリンを自身の系内にまったく有していないことを確実にすることである。次に、サンプルは、ＬＴＡ凝集測定装置またはフローサイトメトリー装置）などの装置を用いて、血小板凝集について試験され、経口摂取アスピリンの非存在下におけるドナーのベースラインレベルを特定するための第一の読み取りが得られる。特定の実施形態では、最初のアッセイは、自然凝集（ＳＰＡ）についての確認を行うために実施されてよい。合成コラーゲンの代わりに生理食塩水が添加され、何らかの凝集が発生するかどうかを見る。これは、血小板が、固有の機能亢進を有するかどうかについての試験である。
【００６４】
続いて、ドナーにアスピリンが投与され、アスピリンを代謝させるのに充分な時間（例：少なくとも約２時間から約１６時間）が経過した後、第二の多血小板血漿サンプルがドナーから採取される。用量が少ない場合（約２５０ｍｇ未満、約４時間の半減期が消去され、一次速度式によって全経路が進行する。より高い用量のサリチレートが経口摂取される場合（例：４．０ｇ超）、半減期は非常に長くなる（１５〜３０時間）。これと同じ半減期の延長は、高齢者、および腎機能不全の患者などで発生する。第二のアッセイが、第二の多血小板血漿サンプルに対して、それを合成コラーゲンで処理して第二の処理サンプルを形成することで行われる。第二の処理サンプルの凝集が測定され、第二の読み取りが得られる。特定の実施形態では、ドナーにアスピリンを経口摂取させる代わりに、血漿がアスピリンで処理される。
【００６５】
経口摂取アスピリンなしでのベースラインレベルの読み取りが、第二の処理サンプルの読み取り（アスピリン経口摂取後／またはサンプルへのアスピリン添加後に得られる）と比較され、この比較の結果から、ドナーの血小板アスピリン応答状態が特定される。例えば、ドナーが、ベースラインサンプルと比較して、アスピリン経口摂取後に（第二のサンプルにおいて）血小板凝集の著しい低下を示す場合、ドナーは、正常または平均アスピリン感受性として特徴付けられ得る。ドナーが、アスピリン服用後において血小板凝集にほとんど違いを示さない場合（すなわち、ドナーがアスピリンを経口摂取した後も、血小板は依然として凝集を起こした）、ドナーは、アスピリン非応答性として特徴付けられ得る。ドナーが、アスピリンの経口摂取後に、血小板凝集のほとんど完全な欠如を示した場合、ドナーは、アスピリン高感受性として特徴付けられ得る。
【００６６】
本発明の方法／アッセイにおいて、患者にアスピリンを経口摂取させ、その後に血液サンプルを採取する代わりに、まったくアスピリンを経口摂取する前に血液のサンプルを採取してよく、そのサンプルを、「アスピリン添加」（または「アスピリン化」）してもよい（すなわち、アスピリン溶液（アスピリンのリジン塩またはＡｓｐｉｓｏｌ（登録商標）であってもよい）がＰＲＰに添加され、続いて試験される）。本発明の方法／アッセイのすべてにおいて、患者がアスピリンを経口摂取してもよく、またはサンプルがアスピリン添加されてもよいと判断された。このことにより、患者がアスピリンを経口摂取して、アスピリンが患者の系内に入るまでの経過時間を持つ必要がないことから、試験を迅速に行うことができる。その代わりに、血液が採取されてＰＲＰサンプルが得られ、一方がアスピリン添加され、他方がアスピリン添加されず、このようにして、２つのサンプルを並行して試験することも可能である。
【００６７】
凝集アッセイがＬＴＡＡである場合、読み取りは、傾き、一次凝集、範囲下面積（ＡＵＣ）、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００６８】
例えば、Ｂｉｏ／ＤａｔａのＰＡＰ  ８Ｅ凝集測定装置を用いる場合、およびアスピリン高感受性ドナーに対して、３０ｎｇ／ｍＬの合成コラーゲン「試験内」濃度を用いる場合、ＰＡに対するベースラインは、６０％から９５％の範囲である。ＰＳに対するベースラインは、３０から７０の範囲である。ＡＵＣに対するベースラインは、３００から６００の範囲である。アスピリン後、ＡＵＣは、２００から４５０の範囲となる。ＰＳおよびＰＡは、それぞれのベースラインと異なる。アスピリン感受性およびアスピリン非レスポンダーは、ベースラインとの相違を示し；感受性ドナーは、より少ない凝集を示す。アスピリン後、ＰＳは、２５から６０の範囲である。
【００６９】
本アッセイにおいて、合成コラーゲンの量を変化させることも用いてよい。用いられる合成コラーゲンの量は、生物源コラーゲンを用いてＬＴＡＡを実施する場合に一般的に用いられる量よりも約１０００倍少ない。例えば、通常、仔ウシ皮由来生物学的コラーゲンを用いるＬＴＡＡは、一般的に０．１９ｍｇ／ｍＬ（ミリグラム／ｍＬ）のコラーゲンを用い（「試験内濃度として」）；ウマ腱由来コラーゲンを用いるＬＴＡＡは、一般的に、ＬＴＡＡ試験において２．０μｇ／ｍＬ（マイクログラム／ｍＬ）のコラーゲンを用い（「試験内濃度として」）、一方、一般的に、本発明の方法は、各ＬＴＡＡ試験において、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬ（ナノグラム／ｍＬ）の合成コラーゲンを用いる（「試験内濃度として」）。特定の実施形態では、用いられる合成コラーゲンの量は、約５００．０ｎｇから下は約０．５０ｎｇ／ｍＬまでの範囲で各ＬＴＡＡ試験中に（すなわち、各キュベット中に）存在する（「試験内濃度として」）。他の実施形態では、本発明は、各ＬＴＡＡにおいて、約５００．０ｎｇ／ｍＬから約５．００ｎｇ／ｍＬを用いる（「試験内濃度として」）。他の実施形態では、本発明は、各ＬＴＡＡにおいて、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約０．５０ｎｇ／ｍＬを用いる（「試験内濃度として」）。他の実施形態では、各ＬＴＡＡ試験のための合成コラーゲンの量は、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの範囲である（「試験内濃度として」）。
【００７０】
フローサイトメトリーを用いて血小板凝集を試験する場合、生物学的コラーゲンの通常の濃度は、０．０１〜１００μｇ／ｍＬの範囲であり、２０μｇ／ｍＬが最も一般的であると思われる。しかし、合成コラーゲンを用いると、用いられる量は、非常に低くなり、約２．０ｎｇ／ｍＬから約６４０ｎｇ／ｍＬの範囲である。
【００７１】
特定の実施形態では、凝集アッセイを用いる場合、試験内コラーゲンとして用いられる合成コラーゲンの量は、２ｎｇ／ｍＬから６４ｎｇ／ｍＬの範囲である。特定の実施形態では、試験内合成コラーゲンの量は、４ｎｇ／ｍＬから６４ｎｇ／ｍＬ；６から６４ｎｇ／ｍＬ；８ｎｇ／ｍＬから６４ｎｇ／ｍＬ；２ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬ；４ｎｇ
／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬ；６から１００ｎｇ／ｍＬ；８から１００ｎｇ／ｍＬの範囲、および２ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬまでの範囲のいずれかのサブセットまたは個々の数値である。特定の実施形態では、試験内合成コラーゲンの量は、２ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、３２ｎｇ／ｍＬ、および／または６４ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、試験内合成コラーゲンの量は、２ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬの範囲内のいかなる数値であってもよく、これらに限定されないが、２ｎｇ／ｍＬ、３、４、５、６、７、８．．．９５、９６、９７、９８、９９、または１００ｎｇ／ｍＬなどである。
【００７２】
上記に含まれる範囲が存在するが、本発明は、最初と最後の終点の列挙によって、その最初と最後だけを意味することには限定されず、最初と最後の終点、ならびにその終点間の濃度のすべてを明白に含む。本明細書にて、列挙した範囲内に含まれるすべての濃度をリストにすることが煩雑過ぎるというだけのことである。本発明者らは、２つ以上の濃度、および２つ以上の範囲、さらには列挙した範囲内の２つ以上の濃度を用いることを考慮してきた。ある場合では、アッセイは、列挙した範囲内の８個もの異なる濃度を用いた。例えば、本明細書にて以下でより詳細に考察するように、ＬＴＡＡは、多くの異なる希釈で行われ、これらの希釈をプロファイルとして試験した。例えば、これらに限定されないが、希釈プロファイルは、以下の異なる「試験内」希釈で行われた：５００ｎｇ／ｍＬ；５０．０ｎｇ／ｍＬ；２５．０ｎｇ／ｍＬ；１０．０ｎｇ／ｍＬ；５．０ｎｇ／ｍＬ；２．５０ｎｇ／ｍＬ；１．０ｎｇ／ｍＬ；０．５０ｎｇ／ｍＬ、および０．２５ｎｇ／ｍＬ。
【００７３】
そのような低濃度のコラーゲンを用いることができることは、合成コラーゲンを用いることによってのみ可能である。科学者によって生物学的コラーゲンを同様の低濃度まで希釈することが試みられたが、合成コラーゲンによる本発明のＬＴＡＡで用いられる濃度に匹敵するレベルまで生物学的コラーゲンを希釈することは物理的に不可能であった。生物学的コラーゲンは、不溶性、粘稠、不均質な物質であり、三重らせんに巻かれた長い繊維状構造タンパク質を有する。このような物理的特性が、生物学的コラーゲンを、合成コラーゲンの場合の１００倍に近付く濃度であっても、それに匹敵する低濃度まで希釈する可能性を排除するものであった。さらに、２．０μｇ／ｍＬ（マイクログラム／ｍＬ）よりも少し低い濃度にて仔ウシ皮由来コラーゲンを用いた場合、ウマ腱由来コラーゲンを用いた場合、ＬＴＡＡは機能しなかった（凝集が発生しなかった）。
【００７４】
このような極めて少量の合成コラーゲンを用いることにより、生物学的コラーゲンを用いた場合に達成可能なものよりも感度の高いアッセイが得られる。例えば、１人の特定のドナーは、生物学的コラーゲンを用いて実施されたＬＴＡＡの結果に基づいて、正常／平均アスピリン感受性を有する（すなわち、アスピリンが血小板凝集を阻害する）とこれまで考えられていた。しかし、このドナーの血小板を本発明の方法を用いて試験すると、実際には、このドナーはアスピリン非応答性であることが見出された。これらの試験については、以下でより詳細に考察する。
【００７５】
図２は、正常／平均アスピリン応答を有する正常／平均アスピリン感受性（ドナー７２０６）から得られた血小板を用い、および生物学的コラーゲン（０．０１９ｍｇ／ｍＬ  ＢＤＣ（仔ウシ皮由来コラーゲン）および０．２μｇ／ｍＬ  Ｃｈｒｏｎｏ‐Ｌｏｇコラーゲン）を用いた試験の結果を示す。２つの別々のサンプルを試験し、それらは各々、高いパーセントの血小板凝集を示している。一次凝集（「ＰＡ」）は、９１および８４であり；一次傾き（「ＰＳ」）（これは凝集速度である）は、５６および５３であった。曲線下面積（「ＡＵＣ」）は、３１９および３１１であった。２５．０ｎｇ／ｍＬから２．５ｎｇ／ｍＬの濃度の合成コラーゲンを用いて行った同じドナーの血小板の試験も、高いパーセントの血小板凝集を示した（結果示さず）。次に、同じドナー（ドナー７２０６）に
５００ｍｇのアスピリンを投与し、その後、血小板を採取し、０．０１９ｍｇ／ｍＬ、０．０８５ｍｇ／ｍＬ、および０．２μｇ／ｍＬの生物学的コラーゲンを用いたＬＴＡＡで試験した。予想された通り、血小板凝集の著しい低下が示された。図３を参照されたい。ＰＡＰ  ８Ｅ凝集測定装置を用いて、ＰＡは６であり、ＰＳは０であり、ＡＵＣは２６および２４であった。
【００７６】
次に、合成コラーゲンを、正常／平均ドナーの血小板（ドナー７２０６）により、ドナーが５００ｍｇのアスピリンを経口摂取した後に試験した。この試験では、種々の量の合成コラーゲンを試験した（０．００００１ｍｇから０．０００００１ｍｇの範囲）（すなわち、１０．０ｎｇから１．０ｎｇ）。このような非常に低い量の合成コラーゲンを用いた場合であっても、ドナーがアスピリンを経口摂取した後も、ある程度のレベルの血小板凝集が視認可能であったことが分かる。図４を参照されたい。合成コラーゲンにより、および生物学的コラーゲンで用いられるよりも遥かに少ない量を用いることで、血小板凝集を観察することができる。正常／平均ドナーにおいてアスピリン経口摂取後に発生する血小板凝集の量は、アスピリン経口摂取前に見られたものよりも少ない（予想された通り）。図４は、観察された凝集量の変動が、用いた合成コラーゲンの濃度に依存するものであったことを示している。合成コラーゲンの希釈と血小板凝集応答との間に、ほぼ化学量論的な関係が存在することが分かる。
【００７７】
次に、別のドナー（ドナー７００３）の試験を行った。このドナーは、（生物学的コラーゲンを用いて実施されたＬＴＡ試験に基づいて）正常／平均アスピリン感受性を有しているとこれまで考えられていた（アスピリンの経口摂取後、生物学的コラーゲンを用いて正常量の血小板凝集が測定された）。図５は、０．０１９ｍｇ／ｍＬ、０．０８５ｍｇ／ｍＬ、および０．２μｇ／ｍＬの生物学的コラーゲンを用い、アスピリン経口摂取前のドナー７００３の血小板に対して実施されたＬＴＡＡの結果を示す。予想された通り、血小板凝集が見られた。同様に、０．２５から２５ｎｇ／ｍＬの合成コラーゲンを用い、アスピリン経口摂取前のドナー７００３の血小板に対して実施されたＬＴＡＡも、血小板凝集を示している。ドナー７００３にアスピリンを投与し、生物学的コラーゲンを用いたＬＴＡＡで血小板を再度試験すると、凝集が大きく低下しており（凝集はほとんど、またはまったく観察されなかった）、従って、診断医は、ドナー７００３が正常／平均アスピリン感受性を有すると考えることになる。図６を参照されたい。しかし、種々の低量の合成コラーゲン（すなわち、２５．０ｎｇ／ｍＬから２．５０ｎｇ／ｍＬ）を用いて、アスピリン経口摂取後のドナー７００３血小板にＬＴＡＡを実施すると、凝集が観察されている。図７を参照されたい。従って、ドナー７００３は、正常／平均アスピリン感受性を持つのではなく、むしろある程度のアスピリン非応答性を示す。図７は、ドナー７００３が、「高いアスピリン血小板反応性」を有することを示している（このことは、アスピリンを用いても、ドナーの血小板は依然として粘着性であり、ある程度の凝集を起こすことを意味している）。従って、この試験は、生物学的コラーゲンアッセイで用いられるよりも非常に低い濃度の合成コラーゲンを用いた場合であっても、アスピリン非応答性の検出において、合成コラーゲンが生物学的コラーゲンよりも非常に高感度であり、特異的であることを示している。
【００７８】
複数の濃度の生物学的コラーゲンを用いた他のＬＴＡＡ試験では、得られた結果は、生物学的コラーゲンでは、正常／平均感受性ドナーの血小板（７２０６）とアスピリン非応答性ドナーの血小板（７００３）とを区別することができないことを示した。図８は、ドナーがアスピリンを経口摂取した後に、生物学的コラーゲンの複数の希釈を用いて、正常／平均アスピリン感受性ドナー７２０６に対して実施されたＬＴＡＡを示す。すべての希釈において、血小板凝集が見られる。図９は、ドナーがアスピリンを経口摂取した後に、生物学的コラーゲンの複数の希釈を用いて、アスピリン非応答性ドナー７００３に対して実施されたＬＴＡＡを示す。すべての希釈において、血小板凝集が見られる。従って、こ
れらの図から、低量の生物学的コラーゲンを用いたＬＴＡＡは、正常／平均アスピリン感受性血小板ドナーとアスピリン非応答性血小板ドナーとを区別することができないという点で、機能しないことが分かる。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、３つ以上の反応（ベースラインだけでなく（アスピリン経口摂取前）、アスピリン後の試験も）が実施される。一連のアッセイは、複数の異なる低量の合成コラーゲンを用いて実施される。これは、本明細書にて、希釈プロファイルアッセイ、希釈プロファイルＬＴＡＡ、または希釈プロファイルと称される。本実施形態では、複数の異なるＰＲＰサンプルが、アスピリン経口摂取前（ベースライン希釈プロファイルを得るために）、およびアスピリン経口摂取後またはサンプルのアスピリン添加後（アスピリン後希釈プロファイルを得るために）に、ドナーから採取される。各アスピリン前ドナー血小板サンプルは、異なる量の合成コラーゲンと混合され、各サンプルに対して凝集アッセイ（ＬＴＡＡなど）が実施されて、濃度範囲全体にわたるベースライン希釈プロファイルが得られる。次に、ドナーにアスピリンが投与され、確実にアスピリンが代謝されるように充分な時間を経過させる（またはサンプルがアスピリン添加される）。複数のＰＲＰサンプルがドナーから採取され、異なる量の合成コラーゲンと混合される。各サンプルに対して凝集アッセイ（例：ＬＴＡＡまたはフローサイトメトリー）が実施されて、アスピリン後希釈プロファイルが得られる。アスピリン前ベースライン凝集アッセイで用いられたものと同じ合成コラーゲン濃度が、アスピリン後凝集アッセイで用いられることが好ましい。結果が分析され（ＰＡ、ＰＳ、もしくはＡＵＣ、またはこれらの組み合わせの、アスピリン前およびアスピリン後ＬＴＡＡの間での変化、さらにはＰＡ、ＰＳ、もしくはＡＵＣ、またはこれらの組み合わせの、合成コラーゲンの異なる量の間での変化など）、精査されて、ドナーのアスピリン感受性応答（アスピリン高感受性、アスピリン感受性、もしくはアスピリン非応答性であるかどうか、およびその中での感受性の度合い、または非コンプライアンスであるかどうか）が特定される。特定の実施形態では、凝集アッセイがＬＴＡＡである場合、結果は、システムソフトウェア中に埋め込まれた凝集測定装置所有のアルゴリズムを用いて分析され、これにより、分析およびそれに続く報告の診断医による解釈がより容易となる。
【００８０】
他の実施形態では、アスピリン前ベースラインは、アスピリン前ドナー血小板サンプルに対する凝集アッセイにおいて、合成コラーゲンの１つの濃度を用いて実施される１つの凝集アッセイで確立され、一方合成コラーゲンの複数の異なる濃度が、複数の凝集アッセイで用いられて、アスピリン後希釈プロファイルアッセイが作られる。この場合、結果が分析され（アッセイがＬＴＡＡである場合、合成コラーゲンの異なる量からの、ＰＡ、ＰＳ、もしくはＡＵＣ、またはこれらの組み合わせの変化など）、精査され、さらにはベースライン（アスピリン前）凝集アッセイに対して比較されて、ドナーのアスピリン感受性応答（アスピリン高感受性、アスピリン感受性、もしくはアスピリン非応答性であるかどうか、およびその中での感受性の度合い）が特定される。
【００８１】
他の実施形態では、アスピリン前ベースライン、またはアスピリン前希釈プロファイルは、取得されない。これは、アスピリン前ベースラインを取得することが実行可能ではない場合、またはアスピリン療法を受けてきたかどうかを患者から判断することができないような、救急の臨床状況において有用であり得る。本実施形態では、複数の異なる多血小板血漿サンプルがドナーから採取され、各々が独立して、異なる濃度の合成コラーゲンと混合されて、希釈プロファイル凝集アッセイのための複数の異なる処理サンプルが得られる。凝集アッセイが、これらのサンプルの各々について実施され、異なる濃度の範囲全体にわたる凝集アッセイ希釈プロファイルが得られる。データが取得され、測定される。ＬＴＡＡの場合、合成コラーゲンの異なる範囲全体にわたって、ＰＡ、ＰＳ、もしくはＡＵＣ、またはこれらの組み合わせが取得され、分析される。特定の実施形態では、システムソフトウェア中に埋め込まれた凝集測定装置所有のアルゴリズムを用いて分析される。
【００８２】
発明者らは、本実施形態ならびにその他の希釈プロファイルの実施形態を用いて、ドナーの血小板アスピリン応答を予測することができることを明らかにした。平均または「正常」アスピリン感受性を有する個人の場合、例えば、傾き、凝集パーセント、またはＡＵＣを希釈プロファイル全体にわたって調べると、傾き、凝集パーセント、またはＡＵＣは、用いられた合成コラーゲンの量の減少に対応しての減少を示している。従って、例えば、合成コラーゲンの種々の希釈の任意の範囲内では、濃度が低下するに従って、傾き、凝集パーセント、およびＡＵＣも減少する。合成コラーゲンの濃度とほぼ平行して進行するか、またはほぼ直接の相関を有して、傾き、凝集パーセント、およびＡＵＣがほぼ直線的に減少していると思われる。他方、アスピリン非レスポンダーである個人の場合、合成コラーゲンの減少に対応して直線的に減少する傾き、凝集パーセント、およびＡＵＣを有する代わりに、希釈プロファイルに沿って、傾きの増加、予想外の一時的な凝集パーセントの増加、および／またはＡＵＣの一時的な増加が見られる時点が、減少するべきところ（合成コラーゲンの濃度が減少することから）で存在する。そして、希釈プロファイルが継続して減少するに従って、傾きおよびＡＵＣは、それがあるべきところへ（合成コラーゲンの希釈に基づいて）、および一時的な増加を見せる前にあったところへ、「跳ね返って戻り」、そして減少を続ける。
【００８３】
アスピリン高感受性の個人は、期待される／正常な結果と比較して、ＰＡ、ＰＳ、およびＡＵＣの増加を示す。
【００８４】
以下で考察する特定の図のレビューから、上記実施形態のさらなる実証が提供され、また希釈プロファイルＬＴＡＡを用いたアスピリン経口摂取前のＬＴＡＡで予測されたものが、後に、ドナーがアスピリンを経口摂取し、ＬＴＡＡが実施された時点で確認されたことも示される。
【００８５】
図１０は、３つの異なるドナー血小板を用い、合成コラーゲンを用いて実施された希釈プロファイルＬＴＡＡからの傾きを示す。２．５ｎｇ／ｍＬ、５．０ｎｇ／ｍＬ、１０．０ｎｇ／ｍＬ、および２５ｎｇ／ｍＬの４つの異なる濃度を用いた。合成コラーゲンに対する応答に精通していれば、正常応答（平均アスピリン感受性を有する個人）は、直線的希釈プロファイル（ドナー７２０６で見られるように）を有すると推察され、すなわち、濃度が低下するにつれて、傾きも減少する。ドナー７００３の応答は、明確に非直線的であり、従って、ドナー７００３は、正常応答を持たず、従って平均アスピリン感受性を持たないことを示している。
【００８６】
図１１は、合成コラーゲンを用いたＬＴＡＡの結果を提供する。３人のドナーのアスピリン応答状態は、以下の通りである：ドナー７００３は、アスピリンに対して非感受性の可能性があり；ドナー７２２５は、アスピリンに対して僅かに感受性である可能性があり、ドナー７２０６は、期待されるアスピリンに対する正常な応答を示す可能性がある。これらの記述は、アスピリン前およびアスピリン後ＬＴＡＡの両方を用いた、合成コラーゲンによるこれまでの研究から得られた結論である。しかし、興味深いことには、この図で報告される試験は、アスピリンなしの血小板に対して実施されてはいるが、これらの傾きから、アスピリン後のＬＴＡＡ試験が行われる前であっても、ドナーの状態に関する見通しが提供される。このことは、合成コラーゲンを低濃度の量で用いる場合にのみ達成することができる、合成コラーゲンの希釈プロファイル全体に対して行われるこれらのＬＴＡＡ（種々の異なる低濃度量の合成コラーゲンを用いて各ドナーの血小板に対して実施された複数の異なるＬＴＡＡ）における傾きの形状によって、この重要な見通しが提供される。合成コラーゲンの濃度の低下に伴って、傾きも減少するものと予想された。これは、ドナー７２０６で見られ、正常応答（平均／正常アスピリン感受性）であると特定された。しかし、ドナー７００３血小板に対して実施されたＬＴＡＡから得られた傾きは、合成コ
ラーゲンの希釈に対応する一定の減少を示していない。実際には、短い時間にわたって傾きが増加し、続いて減少に戻り、そして減少を続けるという時点が１つ存在する。傾き中のこの「こぶ状」の部分は、１００ｎｇ／ｍＬから１０ｎｇ／ｍＬの間の辺りの濃度（おおよそ５０ｎｇ／ｍＬ）において、図１１で見られる。この現象は、多くの場合、本明細書にて「跳ね返り」と称される。この跳ね返りは、５０ｎｇ／ｍＬから２．５ｎｇ／ｍＬの範囲、ならびに１ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬの範囲の合成コラーゲンの他の希釈プロファイル濃度で他のＬＴＡＡを実施した場合にも見られた。アスピリンを経口摂取させることなくドナーの応答をこのように予測する能力は、合成コラーゲンを用いることの非常に大きな利点である（そして、生物学的コラーゲンを用いては達成することができない）。しかも、この結果は、完全に予想外であった。
【００８７】
図１２は、合成コラーゲンを用いたＬＴＡＡの結果を提供する。ドナー７００３が、コラーゲンの濃度を１００ｎｇ／ｍＬから１０ｎｇ／ｍＬに低下させた場合であっても、傾きにこの一時的な上昇および続いての低下を有しているという事実から、ドナー７００３が恐らくはアスピリン非応答性であるという予測が立てられる。これが、「跳ね返り」現象である。この図は、ドナーがアスピリンを経口摂取した後の応答傾きを示しており、それは、ドナーがアスピリンを経口摂取していない場合の傾きパターンに対応していることを示している（図１１のように）。従って、この図は、アスピリンの経口摂取前に図１１で示したように予測されたドナーの応答の確認を提供する。
【００８８】
図１３は、合成コラーゲンを用いたＬＴＡＡの結果を提供する。図１３は、ドナー７２２５および７２０６で見られるより直線性の傾きに対して、ドナー７００３での「跳ね返り」を示す。
【００８９】
図１５は、特定の濃度の合成コラーゲンおよび生物学的コラーゲンから、非常に類似した形の曲線が作成されることを示しているが、合成コラーゲンは、生物学的コラーゲンの量の数分の１で用いられている。この図では、ドナー７０９１血小板を、０．０００２ｍｇ／ｍＬ（すなわち、２００ｎｇ／ｍＬ）および０．００００５ｍｇ／ｍＬ（すなわち、５０ｎｇ／ｍＬ）（最終濃度）の合成コラーゲン（すなわち、「試験内」濃度）で試験し、一方同じドナーの血小板を、０．１９ｍｇ／ｍＬの生物学的コラーゲンでも試験した。類似の低濃度の生物学的コラーゲンを用いることでは、結果を得ることができなかった。図１５は、合成コラーゲンおよび生物学的コラーゲンから非常に類似した形の曲線が作成されることを示してはいるが、合成コラーゲンの場合に報告されるパラメーターから、ＡＵＣが著しく高くなっていることが明らかに示されており、非常により高い感度であることが示唆される。
【００９０】
希釈プロファイル凝集アッセイの概念を用いる本発明の特定の実施形態では、一連の７、６、または５つの異なる濃度が希釈プロファイルに用いられ、他の実施形態では、４つの異なる濃度が用いられ、なお他の実施形態では、３または２つの異なる濃度が用いられる。用いられる異なる濃度の数が多過ぎると、試験が煩雑で時間の掛かるものとなり、一方用いられる濃度の数が少な過ぎると、得られるデータの量が少なくなり、感受性分析が制限されてしまう。
【００９１】
用いられる合成コラーゲンの範囲は、好ましくは、「感受性範囲」であり、これは本明細書にて、平均アスピリン感受性ドナーにおいて測定される血小板活性／凝集が、合成コラーゲン濃度の量の減少に対応して低下する（例：ＡＵＣおよび／または傾きが、コラーゲン濃度と共に減少する）濃度範囲として定義される。特定の実施形態では、感受性範囲は、約２．０ｎｇ／ｍＬから約６４０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、感受性範囲は、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、感受性範囲は、約２．０ｎｇ／ｍＬから約２５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、感
受性範囲は、約１．０ｎｇ／ｍＬから約２５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、感受性範囲は、約２．０ｎｇ／ｍＬから約２５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、感受性範囲は、約５．０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、感受性範囲は、約５．０ｎｇ／ｍＬから約２５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、感受性範囲は、約５．０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、感受性範囲は、約２．０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００９２】
特定の実施形態では、異なる合成コラーゲン希釈量は、約０．０５０ｎｇ／ｍＬから約５０．０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内から選択される複数の異なる合成コラーゲン量を含む。
【００９３】
例えば、特定の実施形態では、以下の通りの７つの異なる合成コラーゲン量が存在する：
ｉ）約５０．０ｎｇ／ｍＬ；
ｉｉ）約２５．０ｎｇ／ｍＬ；
ｉｉｉ）約１０．０ｎｇ／ｍＬ；
ｉｖ）約５．０ｎｇ／ｍＬ；
ｖ）約２．５０ｎｇ／ｍＬ；
ｖｉ）約１．０ｎｇ／ｍＬ；および
ｖｉｉ）約０．５０ｎｇ／ｍＬ；
【００９４】
他の実施形態では、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約０．０５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内から選択される５つの異なる合成コラーゲン量が存在する。例えば、特定の実施形態では、以下の５つの異なる合成コラーゲン量が存在する：（すべてｎｇ／ｍＬ単位、最終「試験内」濃度として）：約５０．０；約２５．０；約１０．０；約５．０；および約２．５。他の実施形態では、以下の５つの異なる合成コラーゲン量が存在する（すべてｎｇ／ｍＬ単位、最終「試験内」濃度として）：約２５．０；約１０．０；約５．０；約２．５０；および約１．０。
【００９５】
他の実施形態では、以下の範囲の各々から１つの量を含む５つの異なる「試験内」合成コラーゲン量が存在する：約５０．０から約２５．０ｎｇ／ｍＬ；約２５．０から約１０．０ｎｇ／ｍＬ；約１０．０から約５．００ｎｇ／ｍＬ；約５．００から約２．５０ｎｇ／ｍＬ；および約２．５０から約１．００ｎｇ／ｍＬ）。
【００９６】
他の実施形態では、以下の範囲の各々から１つの量を含む５つの異なる「試験内」合成コラーゲン量が存在する：約６．０から約４．０ｎｇ／ｍＬ；約２．７から約２．３ｎｇ／ｍＬ；約１．５から約０．９０ｎｇ／ｍＬ；約０．６０から約０．４０ｎｇ／ｍＬ；および約０．３０から約０．２０ｎｇ／ｍＬ。
【００９７】
他の実施形態では、合成コラーゲンの最大濃度に対しては約５０．０から約２５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内から、最小濃度に対しては約２．５０から約０．５０ｎｇ／ｍＬより選択される３つの異なる「試験内」合成コラーゲン量が存在する。
【００９８】
他の実施形態では、最大濃度に対しては約６．０から約４．０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内から、最小濃度に対しては約０．３から約０．１ｎｇ／ｍＬより選択される３つの異なる「試験内」合成コラーゲン量が存在する。
【００９９】
本発明の別の実施形態では、合成コラーゲンによる上記で考察したアッセイを用いて、処方されたアスピリン用量服用における患者コンプライアンス、および残留血小板活性を試験／モニタリングする方法が提供される。非コンプライアンスとは、アスピリンを服用しないこと、適切な用量を服用しないこと、または有効な投与（時間）スケジュールに従
わないことが挙げられる。生物由来コラーゲンの一部はアスピリンに対して非感受性であり、従ってこのようなコラーゲンをアゴニストとして用いる試験では、信頼のおける試験結果が得られないことが見出された。さらに、最近の研究から、患者の非コンプライアンスが医療における大きな問題であることが示された。以前はアスピリン耐性と見なされていたものが、そうではなく、アスピリンに対する血小板阻害応答を評価するために複数の非標準化実験室試験を用いることによって複雑化された非コンプライアンスの顕在化であり得ると現在では考えられている。
【０１００】
従って、コンプライアンスを測定するために、患者は、週１回、月２回、月１回、３か月に１回など定期的に検査を受け、その結果が互いに対して比較されてよい。凝集の結果が検査ごとに大きく変動する場合、患者はさらに検査を受けて、アスピリン耐性が発達したかどうか特定されてよく、または患者は、アスピリンの処方された用量の服用における自身のコンプライアンスについて質問されてもよい。患者がアスピリンを服用していなかったことが疑われる場合、患者の血漿がアスピリンで処理され、次に検査されてよい。凝集がアスピリン添加サンプルにおいて見られる場合は、患者が指示通りにアスピリンを服用していなかったと結論付けられ得る。場合によっては、患者は、アスピリンを時々服用し、毎日の同じ時間には服用していないということもあり得る。凝集検査は、試験ごとの変動性を示す場合があり、この変動性は、患者が処方された定期的な投与レジメンに従っていなかったことの指標として用いることが可能である（用量を毎日は服用していないか、または一日の異なる時間に用量を服用している）。アスピリン療法を受けている患者で、治療法に従わないが、毎日はアスピリンを服用していない、または一日の異なる時間に服用している場合、その患者は、実際のところ、血栓性イベントのリスクがベースラインレベルよりも高くなることが見出された。アスピリン添加サンプル中に凝集が見られない場合、患者がアスピリン耐性を発達させた可能性がある。患者が、アスピリンおよび異なる抗血小板薬の二重療法、または場合によっては、まったくアスピリンを用いない異なる抗血小板薬によるレジメンを受けるべきであるかどうかを判断するために、さらなる検査が実施されてよい。
【０１０１】
合成コラーゲン
特定の実施形態では、合成コラーゲンは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／５２０，５０８号に記載されている。特定の実施形態では、合成コラーゲンは、三重らせんに自己組織化してフィブリルを形成する能力を有する合成コラーゲンであり、それによって、合成コラーゲンはＩ型コラーゲンを模倣することが可能となる。特定の実施形態では、合成コラーゲンは、式（Ｉ）で表されるペプチド断片を有するポリペプチドを含み：
−（Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ）n                （Ｉ）
式中、Ｘは、Ｈｙｐを表し；ｎは、２０から５０００の整数を表し；およびここで、ポリペプチドは、１００００から５００００００００の範囲の分子量を有する。特定の実施形態では、式（Ｉ）の構造を有する合成コラーゲンは、三重らせんに自己組織化してフィブリルを形成する能力を有し、それによって、合成コラーゲンはＩ型コラーゲンを模倣することが可能となる。本発明のすべてのアッセイで用いられる合成コラーゲンは、三重らせんに自己組織化してフィブリルを形成する能力を有し、それによって、合成コラーゲンはヒトＩ型コラーゲンを模倣することが可能となる。
【０１０２】
特定の実施形態では、用いられる合成コラーゲンは、米国特許第７，２６２，２７５号に記載されている。合成コラーゲン分子は、米国特許第７，２６２，２７５号に記載されている方法によって作製された（例えば、実施例６および実施例７を参照）。この分子の分子量は、同特許の実施例セクションに記載の方法により、１００００００超であると測定された。
【０１０３】
特定の実施形態では、合成コラーゲンは、ＧＰＣ‐ＭＡＬＳ（ゲル浸透クロマトグラフィー‐多角度レーザー光散乱）に基づく以下の値を有する；平均分子量（Ｍn）１．３×
１０4；Ｍw（重量平均分子量）＝１．６×１０4；サイズ平均分子量（Ｍz）２．０×１０4。他の実施形態では、合成コラーゲンは、ＧＰＣ‐ＭＡＬＳ（ゲル浸透クロマトグラフ
ィー‐多角度レーザー光散乱）に基づく以下の値を有する；平均分子量（Ｍn）２．８×
１０4；Ｍw（重量平均分子量）＝４．１×１０4；サイズ平均分子量（Ｍz）６．１×１０4。
【０１０４】
合成コラーゲンは、ＧＰＣ‐ＭＡＬＳによって測定することができる。本発明で試験される合成コラーゲン分子は、東ソー製のＨＬＣ‐８１２０ＧＰＣデバイスを用い、以下の条件で測定した。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  α‐Ｍ（内径７．８ｍｍ×３０ｃｍ）×２（東ソー製）
密度検出器：示差屈折率計（ＲＩ検出器）、極性＝（＋）
ＭＡＬＳ：ＤＡＷＮ  ＨＥＬＥＯＳ（ウィアットテクノロジー（Wyatt Technology）製）
ＭＡＬＳレーザー波：６５８ｎｍ
溶出液：ＨＦＩＰ（１，１，１，３，３，３‐ヘキサフルオロ‐２‐プロパノール）セントラル硝子製  ＋  ５ｍＭ  ＣＦ3ＣＯＯＮａ（１級、和光純薬製）
流速：０．６ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＲＩ検出器温度：４０℃
ＭＡＬＳ温度：室温
サンプル密度：２ｍｇ／ｍＬ
サンプル量：１００μＬ
サンプルの前処理：サンプルの秤量後、任意の量の溶出液を添加することでこれを溶解し、室温で一晩静置した。サンプルを緩やかに混合し、次に０．５μｍのＰＴＦＥカートリッジフィルターでろ過した。
【０１０５】
特定の実施形態では、ｎは、２０から２５０の整数である。特定の実施形態では、ｎは、２０から２００の整数である。特定の実施形態では、ｎは、２０から１５０の整数である。特定の実施形態では、ｎは、３０から１００の整数である。特定の実施形態では、ｎは、２０から２５００；２０から２０００；２０から１５００；２０から１０００；２０から５００；２０から２５０；３０から２５００；３０から２０００；３０から１５００；３０から１０００；３０から５００；または３０から２５０の整数である。上記で考察した合成コラーゲン分子は、三重らせんに自己組織化してフィブリルを形成する能力を有することが好ましく、それによって、合成コラーゲンはＩ型コラーゲンを模倣することが可能となる。
【０１０６】
合成コラーゲン選択の際に考慮される２つの因子は、溶解性および取扱いの容易さである。分子量が小さすぎると、合成コラーゲンは、低い溶解度特性を有し得る。分子量が大きすぎると、合成コラーゲンは、良好な取扱い特性を持たない可能性がある（粘稠過ぎる、および分散性が悪い可能性がある）。従って、式（Ｉ）［−（Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ）n
］の好ましい合成コラーゲンは、良好な溶解性および良好な取扱い特性の両方を有する。
【０１０７】
以下の合成コラーゲン分子について試験を行った：ｎ＝２４（Ｍｎ＝６３００）；ｎ＝２８（Ｍｗ＝７５００）；ｎ＝４９（Ｍｎ＝１３０００）；ｎ＝６０（Ｍｗ＝１６０００）；ｎ＝７５（Ｍｚ＝２００００）；ｎ＝１０５（Ｍｎ＝２８０００）；ｎ＝１５３（Ｍｗ＝４１０００）；ｎ＝２２９（Ｍｚ＝６１０００）。種々の合成分子を試験すると、４９〜７５のｎ値を有する分子が、望ましい溶解性と取扱い特性との最良の組み合わせを示した。
【０１０８】
本発明の特定の実施形態では、合成コラーゲンは、すべて１つの長さであってよく（例えば、すべての合成分子においてｎ＝４９、特定の実施形態では、合成コラーゲンは、多くの異なる長さの混合物であってよい（例えば、これに限定されないが、合成コラーゲンは、４９〜７５のｎを有する分子の混合物）。
【０１０９】
キット
本発明は、血小板凝集を試験するのに有用である、合成コラーゲンを含むキットも提供する。合成コラーゲンは、上述の通りであり、多くの異なる濃度であってよい。合成コラーゲンは、「試験内」濃度として用いられるよりも高い濃度でバイアル中に供給されてよい。特定の実施形態では、バイアル中の合成コラーゲンは、好ましくは、所望される最終「試験内」濃度の量の１０倍超である。例えば、以下の表は、代表的なバイアルを提供する。
【０１１０】
【表１】
0006319308.tif 000002
【０１１１】
特定の実施形態では、合成コラーゲンは、合成コラーゲンの希釈を作り出す必要性を回避するために、本発明の方法で用いられることが考慮される濃度でキット中に供給される。言い換えると、合成コラーゲンは、それが本発明の方法で直接用いられることになる濃度であるように提供される。従って、例えば、１ｍＬの合成コラーゲンの使用が必要であり、アッセイでの最終濃度が２５ｎｇ／ｍＬであることが必要である方法の場合、キット中のバイアルは、２５ｎｇ／ｍＬの濃度で合成コラーゲンを提供することになる。従って、バイアルからの１ｍＬを用いることで、ユーザーは、２５ｎｇ／ｍＬの最終作業濃度を得ることになる。別の例としては、０．５ｍＬの使用、および最終濃度２５ｎｇ／ｍＬが必要である方法の場合、キット中のバイアルは、好ましくは、５０ｎｇ／ｍＬを収容することになる。従って、この５０ｎｇ／ｍＬ溶液の０．５ｍＬを用いることで、ユーザーは、２５ｎｇ／ｍＬの最終濃度を得ることになる。
【０１１２】
特定の実施形態では、合成コラーゲンは、血小板凝集アッセイでの最終「試験内」コラーゲン量が２５ｎｇ／ｍＬ以下となるように、２５ｎｇ／ｍＬの濃度で提供され、コラーゲンの直接の使用が可能となる。他の実施形態では、合成コラーゲンは、（例えば）約２５．０ｎｇ／ｍＬ、約１０．０ｎｇ／ｍＬ、約５．０ｎｇ／ｍＬ、または約２．５ｎｇ／ｍＬのいずれかの「試験内」濃度で提供される。
【０１１３】
他の実施形態では、バイアルは、より高い濃度の量を収容してよく、キットに含まれる説明書きが、合成コラーゲンの所望される最終濃度を達成するようにアッセイで用いられる所望される濃度に関する使用説明を提供する。
【０１１４】
他の実施形態では、キットは、合成コラーゲンの少なくとも１つの単回使用バイアルおよび／または少なくとも１つの多数回使用バイアルを含む。単回使用バイアルの場合バイアルは、１回の凝集アッセイに必要とされる合成コラーゲンの量のみを収容する。多数回使用バイアルの場合、合成コラーゲンは、所望される試験内濃度で供給されてよいが、バイアルは、２回以上の凝集アッセイに必要とされる体積を超える量を収容する。例えば、凝集アッセイが合成コラーゲンの最終試験内濃度２５ｎｇ／ｍＬの溶液１ｍＬを必要とする場合、バイアルは、濃度２５ｎｇ／ｍＬを２５０ｍＬ収容してよい。この場合、ユーザーは、１ｍＬの合成コラーゲンを取り出してそれを各凝集アッセイに用いることになり、このバイアルは、２５０回の凝集アッセイに充分な量を収容することになる。バイアルは、僅かに１回の凝集アッセイ、または限定されない例として５００回などのより多い回数の凝集アッセイを実施するのに所望されるいかなる量を収容してもよい。
【０１１５】
限定されない例として、特定の実施形態では、合成コラーゲンは、凝集アッセイの最終濃度が５００ｎｇ／ｍＬ以下となるようにコラーゲンの直接の使用を可能とするために、５００ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される。他の実施形態では、合成コラーゲンは、約０．５００ｎｇ／ｍＬから約０．０５０ｎｇ／ｍＬの範囲内から選択される濃度で提供される。
【０１１６】
本発明のキットは、本明細書で述べる方法を用いる光透過型アッセイで合成コラーゲンを用いるための使用説明を含有することが好ましい。
【０１１７】
他の実施形態では、本発明のキットは、同じ濃度の合成コラーゲンのバイアルを２つ以上含み、または他の実施形態では、キットは、異なる濃度のバイアルを２つ以上含む。異なる濃度のバイアルを２つ以上有するキットは、本発明の希釈プロファイル凝集アッセイで有用である。例えば、本発明の１つのキットは、約０．５００ｎｇ／ｍＬから約．０５０ｎｇ／ｍＬの範囲の異なる濃度の合成コラーゲンを収容する８、７、６、５、４、３、または２つのバイアルを含んでもよい。本発明の１つのキットは、約２５．０ｎｇ／ｍＬ、約１０．０ｎｇ／ｍＬ、約５．０ｎｇ／ｍＬ、または約２．５ｎｇ／ｍＬの異なる「試験内」濃度の合成コラーゲンを収容する７、６、５、４、または３つのバイアルを含有してよい。各バイアルは、特定の実施形態では、合成コラーゲンおよび所望される最終「試験内」濃度を提供し、単回使用または多数回使用バイアルとして供給されてよい。
【０１１８】
別の実施形態では、キットは、各々が以下の通りの合成コラーゲンの異なる濃度（ｎｇ／ｍＬ単位）を有する少なくとも５つのバイアルを含んでもよい：約５０．０；約２５．０；約１０．０；約５．０；約２．５０。
【０１１９】
別の実施形態では、キットは、各々が合成コラーゲンの異なる濃度を有する５つのバイアルを含有してよく、ここで、各バイアルは、以下の範囲内からの濃度（ｎｇ／ｍＬ単位）を収容する：約５０．０から約２５．０；約２５．０から約１０．０；約１０．０から約５．００；約５．００から約２．５０；および約２．５０から約１．００ｎｇ／ｍＬ）。
【０１２０】
別の実施形態では、キットは、各々が合成コラーゲンの異なる濃度を有する５つのバイアルを含んでもよく、ここで、各バイアルは、以下の範囲内からの濃度を収容する：合成コラーゲンの最大濃度については約６．０から約４．０ｎｇ／ｍＬおよび最小濃度については約０．３から約０．１ｎｇ／ｍＬ。
【０１２１】
バイアル中に存在する異なる濃度の選択は、ドナーの血小板アスピリン応答状態を異なる量の合成コラーゲンに対して測定することができるように、本発明の希釈プロファイルアッセイを実施可能となるように行われる。上述のように、このことから、希釈に応答する直線的な傾きを探すことで、またはアスピリン非応答性のドナーの場合は、希釈プロフ
ァイル全体で「跳ね返り」（すなわち、傾きが合成コラーゲンの希釈に対応する代わりに、合成コラーゲンの濃度が低下しているために減少すべきところで、傾きが明らかに急に増加している点が少なくとも１つ存在する）を探すことで、ドナーの血小板アスピリン応答を予測することが可能となる。上記で考察したように、このキットは、アスピリン経口摂取前および／またはアスピリン経口摂取後のドナーに用いることが可能である。
【０１２２】
生物学的または合成コラーゲンの保存に用いられるバイアルの性質は、コラーゲンをある程度活性化することによってコラーゲンに影響を与え得ることが見出された。合成コラーゲンを保存するために用いられる容器は、コラーゲンを活性化せず、合成コラーゲンがバイアルから取り出されて試験系中に導入された際に、合成コラーゲンの活性化および接着の度合いが試験系だけに起因することを確保することが好ましい。言い換えると、コラーゲンと容器との相互作用による意図しない活性化によって引き起こされるアーチファクトは、凝集アッセイ中に導入されない。合成コラーゲンを含むコラーゲンは、汎用ポリプロピレンバイアルまたは容器中に保存されると、その後容器に接着し、従って試験系に加えることができない。容器および／またはキャップに接着したために試験系に用いることができないコラーゲンの量は未知であり、安定性データに基づいて、不定である。発明者らは、ホモポリマー容器中で作製され、保存された合成コラーゲンを用いることで、試験結果の高い度合いの変動性が排除されることを見出した。従って、合成コラーゲンは、ホモポリマー容器中で作製され、保存されることが好ましい。
【０１２３】
ポリプロピレンとして示されるほとんどの容器は、単一のプラスチックではなく、製造プロセスの過程で種々の添加剤を含めることによってその性能が修飾され得るプラスチックのファミリーである。従って、製造プロセス自体によって、異なる様々なポリプロピレンが作製され得る。さらに、添加剤の性質の大部分は、購入者／一般には未知であるか、または開示されておらず、それは、この情報が、製造業者にとって所有財産であると見なされているからである。加えて、離型剤により、評価することのできない別の変動要素が追加される。
【０１２４】
最も長期的な安定性を有し、合成コラーゲンとの相互作用を起こさない容器は、以下の特性を有することが見出された：ａ）化学構造は、繰り返される特定の同一のモノマーに基づいている（ホモポリマー  −  同一のモノマーユニットから成るポリプロピレンポリマー）；ｂ）キャップは、チューブと同じ材料から作製される；およびｃ）キャップは、シリコーンＯリングまたはワッシャーなどの追加の内部シールを有するか、またはキャップの中に成型された二次シールを有する。代表的なバイアルとしては、シムポート（Ｔ３１０シリーズ）；レークチャールズマニュファクチャリング（５４Ａシリーズ）；およびＢＤ  Ｆａｌｃｏｎチューブ  ３５２０９６シリーズ）から入手されるクライオバイアルおよびキャプが挙げられる。
【０１２５】
加えて、本発明者らは、合成コラーゲンが、精製水の代わりに生理食塩水（保存剤としてのチメロサールあり、または、なし）で希釈された場合に、より良好な安定性が達成されることを見出した。従って、本発明のキットは、合成コラーゲン希釈用の生理食塩水のバイアルを含んでもよい。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：血小板凝集測定法およびフローサイトメトリーを用いた合成コラーゲンの評価物質：
１．  コラーゲン  可溶性  仔ウシ皮由来；ＢｉｏＤａｔａ
２．  合成コラーゲン（図１６〜２０にて、コラーゲンＳと称する）
３．  コラーゲン  −  Ｉ型  ウマ由来；Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ
４．  ＲｅｏＰｒｏ  −  ２．５、５、１０μｇ／ｍＬ  最終濃度
５．  インテグリン  −  １、２、５μｇ／ｍＬ  最終濃度
６．  Ａｇｇｒａｓｔａｔ  −  １、２、５μｇ／ｍＬ  最終濃度
７．  Ａｓｐｉｓｏｌ  −  １、５、１０μｇ／ｍＬ  最終濃度
【０１２７】
方法：
血小板測定法：
ＢｉｏＤａｔａ仔ウシ皮由来コラーゲンのバイアルを、０．５ｍＬの水で再構成して、１．９ｍｇ／ｍＬの溶液を作製した。合成コラーゲンのバイアルを、１ｍＬの合成コラーゲン用希釈液で再構成して、０．００００５ｍｇ／ｍＬの溶液を作製した。Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇコラーゲンを生理食塩水で希釈して、１００μｇ／ｍＬの溶液を作製した。Ｂｉｏ／Ｄａｔａアラキドン酸のバイアルを、０．５ｍＬの水で再構成して、５ｍｇ／ｍＬの溶液を作製した。
【０１２８】
３２５ｍｇのアスピリン錠剤を経口摂取する前後に、健康な個人から全血をクエン酸ナトリウム（３．２％）中へ採取し、遠心分離して、ＰＲＰおよびＰＰＰを作製した。ＰＡＰ‐８Ｅ  凝集測定装置を、２５０μＬのＰＰＰでブランク調整した（blanked）。２０
０μＬのＰＲＰを、撹拌棒を入れた４つのキュベットの各々にピペットで移した。２５μＬの抗血小板剤をＰＲＰに添加した。３分間のインキュベーション時間の後、２５μＬの生理食塩水またはアゴニストをキュベットに添加した。凝集応答を、最大凝集が達成されるまでモニタリングした。
【０１２９】
フローサイトメトリー：
ＢｉｏＤａｔａ仔ウシ皮由来コラーゲンのバイアルを、０．５ｍＬの水で再構成して、１．９ｍｇ／ｍＬの溶液を作製した。合成コラーゲンのバイアルを、１ｍＬの合成コラーゲン用希釈液で再構成して、０．００００５ｍｇ／ｍＬの溶液を作製した。Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇコラーゲンを生理食塩水で希釈して、１００μｇ／ｍＬの溶液を作製した。２％のパラホルムアルデヒドストック溶液を、カルシウム非含有タイロード緩衝液で希釈して、１％のパラホルムアルデヒド溶液を作製した。１ｍＬの１％パラホルムアルデヒドを入れたチューブ一式を作製した。３０μＬのコラーゲン試薬および３０μＬの抗血小板薬を入れた第二のチューブ一式を作製し、３７℃の加熱ブロックに設置した。健康な個人から全血をクエン酸ナトリウム中へ採取した。２４０μＬのクエン酸血を、１５〜２０秒の間隔でチューブに添加し、緩やかに混合した。３分間のインキュベーション時間の後、５０μＬの活性化血を、対応するパラホルムアルデヒド含有チューブへ移した。４℃で３０分間インキュベートした後、サンプルを、１６００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを、７５０μＬのタイロード緩衝液中に再懸濁した。ＣＤ６１ＦＩＴＣおよびＣＤ６２ＰＥ（ＢＤバイオサイエンス）の各１０μＬを、一式の清浄なチューブに添加した。１００μＬの再懸濁した細胞を、これらの抗体チューブに添加した。室温、暗所での３０分間のインキュベーション時間の後、７００μＬのタイロード緩衝液を各チューブに添加し、サンプルをフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ‐ＸＬ、ベックマン‐コールター）で分析した。血小板活性化を、Ｐ‐セレクチンを発現する血小板のパーセントおよび凝集した血小板のパーセントについて評価した。
【０１３０】
結果：
合成コラーゲンの複数の濃度ロットを、光透過型凝集測定法を用いて試験した。合成コラーゲンに対する凝集応答を、Ｂｉｏ／ＤａｔａおよびＣｈｒｏｎｏｌｏｇ製コラーゲン試薬の応答と比較した（図１６参照）。０．００００５ｍｇ／ｍＬの合成コラーゲンが、最小の凝集を起こした一方で、より高い濃度（０．０００２および０．０００５ｍｇ／ｍＬ）では、その他のコラーゲン試薬に匹敵するレベルの凝集を起こした。
【０１３１】
種々のコラーゲン試薬に対するアスピリン化血小板の応答は、非アスピリン化血小板の
応答と比較して、僅かに減弱されていた。凝集の度合いは、非アスピリン化血小板と比較して、アスピリン化血小板では、９％（Ｂｉｏ／Ｄａｔａ）から２０％（合成コラーゲン）低かった。
【０１３２】
血小板活性化を誘導する種々のコラーゲン試薬の能力を、全血フローサイトメトリーを用いて評価した。血小板活性化は、２つのパラメーター：Ｐ‐セレクチンの発現および血小板凝集物の形成について評価した。本アッセイにおいて、血小板凝集物は、非凝集血小板集団よりもサイズが大きい（前方角度光散乱（forward angle light scatter））ＣＤ
６１（＋）イベントとして定義される。すべてのコラーゲン試薬は、血小板表面上でＰ‐セレクチンの発現を誘導することができたが（図１７）、ＢｉｏＤａｔａコラーゲンは、その他の試薬と比較して効果は非常に低かった。類似の傾向が、全血中の血小板凝集物の形成でも観察された（図１８）。
【０１３３】
フローサイトメトリー試験では、活性化の前に、アスピリンの可溶性の形態、Ａｓｐｉｓｏｌ（登録商標）を、クエン酸全血に添加した。Ａｓｐｉｓｏｌは、コラーゲン誘導Ｐ‐セレクチン発現にほとんど効果がなかったが、血小板凝集物の形成に対しては、濃度依存性の効果を有していた。この効果は、合成コラーゲン試薬で最も容易に見られた（図１９および２０参照）。
【図１Ａ】
0006319308.tif 000004
【図１Ｂ】
0006319308.tif 000005
【図２】
0006319308.tif 000006
【図３】
0006319308.tif 000007
【図４】
0006319308.tif 000008
【図５】
0006319308.tif 000009
【図６】
0006319308.tif 000010
【図７】
0006319308.tif 000011
【図８】
0006319308.tif 000012
【図９】
0006319308.tif 000013
【図１０】
0006319308.tif 000014
【図１１】
0006319308.tif 000015
【図１２】
0006319308.tif 000016
【図１３】
0006319308.tif 000017
【図１４】
0006319308.tif 000018
【図１５Ａ】
0006319308.tif 000019
【図１５Ｂ】
0006319308.tif 000020
【図１６】
0006319308.tif 000021
【図１７】
0006319308.tif 000022
【図１８】
0006319308.tif 000023
【図１９】
0006319308.tif 000024
【図２０】
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