(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを、膜貫通ポアならびにヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物と、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップであって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着されており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有するステップ；ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含み、
（ｉ）ポリヌクレオチド結合成分は１つまたは複数のヘリカーゼを含み、
（ａ）構築物中の２つ以上のヘリカーゼが互いに異なっている、および／または
（ｂ）２つ以上のヘリカーゼが同じであるもしくは類似している、もしくは２つ以上のヘリカーゼが同じであるもしくは類似しており各ヘリカーゼ中の同じアミノ酸残基を使用して付着されている、あるいは、
（ｉｉ）ポリヌクレオチド結合成分は
（ａ）ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメイン、真核生物１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、細菌性ＳＳＢ、古細菌ＳＳＢ、ウイルス性ＳＳＢ、２本鎖結合タンパク質、スライディングクランプ、前進性因子、ＤＮＡ結合ループ、複製開始タンパク質、テロメア結合タンパク質、リプレッサー、亜鉛フィンガーおよび増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）から独立に選択される１つまたは複数のドメインを含む、および／または、
（ｂ）アミノ酸配列が配列番号１１６〜１６６のいずれか１つに示されるもの、および、その変種であって、アミノ酸配列が配列番号１１６〜１６６のいずれか１つと、その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて少なくとも９０％相同性を有するものから選択される、および／または、
（ｃ）（１）エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼもしくはトポイソメラーゼに由来する、または（２）Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ（配列番号６２）もしくはその変種であって、その配列全体にわたって配列番号６２とアミノ酸同一性に基づいて少なくとも９０％相同性を有するものに由来する、方法。
【請求項２】
（ａ）ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合成分とが、共有結合的に付着されている、化学的に付着されている、もしくは遺伝子的に融合されている、および／または
（ｂ）ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合成分とが、１つもしくは複数のリンカーによって付着されている、もしくはアミノ酸配列である１つもしくは複数のリンカーによって付着されている、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）１つもしくは複数のヘリカーゼがスーパーファミリー１〜６から独立に選択される、ならびに／または
（ｂ）１つもしくは複数のヘリカーゼが単量体である、ならびに／または
（ｃ）１つもしくは複数のヘリカーゼが、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼ、ＴｒａＩサブグループヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼおよびその変種から独立に選択される、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼがアミノ酸モチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ（配列番号８）（式中、Ｘ１はＣ、ＭもしくはＬであり、Ｘ２は任意のアミノ酸残基である）を含み；
（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼが、
−  アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号２０）（式中、Ｘ１はＧ、ＳもしくはＡであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＰ、Ａ、ＳもしくはＧであり、Ｘ４はＴ、Ａ、Ｖ、ＳもしくはＣであり、Ｘ５はＧもしくはＡであり、Ｘ６はＫもしくはＲであり、Ｘ７はＴもしくはＳである）；および／または
−  アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）３−Ｑ−Ｘ７（配列番号２９）（式中、Ｘ１はＹ、ＷもしくはＦであり、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、ＣもしくはＶであり、Ｘ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ４はＴ、ＮもしくはＳであり、Ｘ５はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、ＶもしくはＩであり、Ｘ６は任意のアミノ酸であり、Ｘ７はＧもしくはＳである）
を含み；
（ｃ）ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼが、
−  アミノ酸モチーフＨ−（Ｘ１）２−Ｘ２−Ｒ−（Ｘ３）５〜１２−Ｈ−Ｘ４−Ｈ（配列番号３１〜３８）（式中、Ｘ１およびＸ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ４はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される）；または
−  アミノ酸モチーフＧ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｈ−（Ｘ８）６〜１２−Ｈ−Ｘ９（配列番号３９〜４５）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ４はＤまたはＥであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である）
を含み；または
（ｄ）ＸＰＤヘリカーゼが、
−  アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｅ−Ｇ（配列番号５０）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ３およびＸ４は任意のアミノ酸残基であってよい）；および／または
−  アミノ酸モチーフＱ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｇ−Ｒ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｒ−（Ｘｅ）３−Ｘｆ−（Ｘｇ）７−Ｄ−Ｘｈ−Ｒ（配列番号５１）（式中、Ｘａ、ＸｅおよびＸｇは任意のアミノ酸残基であってよく、式中、Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄはＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される）
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ中のＸ２がＡ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＴもしくはＰである、ならびに／または
（ｂ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが、（ｉ）配列番号１０、１３、１６もしくは１９のいずれか１つに示す配列、もしくは（ｉｉ）その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号１０、１３、１６もしくは１９と少なくとも９０％相同性を有し、かつヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、または
（ｃ）ＴｒａＩヘリカーゼが、（ｉ）配列番号４６、８７、９８もしくは１０２に示す配列、もしくは（ｉｉ）その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号４６、８７、９８もしくは１０２と少なくとも９０％相同性を有し、かつヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、または
（ｄ）ＸＰＤヘリカーゼ中のＸ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６ならびに／もしくはＸｂ、ＸｃおよびＸｄがＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される、もしくはＸＰＤヘリカーゼが、（ｉ）配列番号５２に示す配列、もしくは（ｉｉ）その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号５２と少なくとも９０％相同性を有し、かつヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つもしくは複数のヘリカーゼが付着を促進するために修飾されている、または
１つもしくは複数のヘリカーゼが、１つもしくは複数の非天然システイン残基および／もしくは１つもしくは複数の４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）残基の導入によって付着を促進するために修飾されている、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
標的ポリヌクレオチドの１つもしくは複数の特性が、
（ａ）電気的測定および／もしくは光学的測定、または
（ｂ）電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定もしくは電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である電気的測定、
によって測定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
２つ以上のヘリカーゼを含む構築物であって、（ａ）構築物中の２つ以上のヘリカーゼが互いに異なっており、および／または（ｂ）２つ以上のヘリカーゼが同じであるもしくは類似している、もしくは２つ以上のヘリカーゼが同じであるもしくは類似しており各ヘリカーゼ中の同じアミノ酸残基を使用して付着されており、および
ヘリカーゼが互いに付着しており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
【請求項９】
構築物が請求項１に定義されたとおりであり、および／または２つ以上のヘリカーゼが請求項３から６のいずれか一項に定義されたとおりである、請求項８に記載の構築物。
【請求項１０】
（ａ）ヘリカーゼと、配列番号９４もしくは配列番号９４の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９４と少なくとも９０％相同性を有するその変種を含むアミノ酸配列とを含む構築物であってヘリカーゼがヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメインに付着されている構築物、または
（ｂ）配列番号９０もしくは配列番号９０の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９０と少なくとも９０％相同性を有するその変種を含み、ヘリカーゼがヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメインに付着されている構築物
であって、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを、請求項８から１０のいずれか一項に記載の構築物に接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む方法。
【請求項１２】
膜貫通ポアと、請求項１から６のいずれか一項に定義されている構築物または請求項８から１０のいずれか一項に記載の構築物との間の複合体を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー。
【請求項１３】
膜貫通ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、請求項１から６のいずれか一項に定義されている構築物または請求項８から１０のいずれか一項に記載の構築物の使用。
【請求項１４】
（ａ）膜貫通ポアおよび（ｂ）請求項１から６のいずれか一項に定義されている構築物または請求項８から１０のいずれか一項に記載の構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット。
【請求項１５】
複数の膜貫通ポア、および請求項１から６のいずれか一項に定義されている複数の構築物または請求項８から１０のいずれか一項に記載の複数の構築物を含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物を使用する方法に関する。ヘリカーゼは、ポリヌクレオチド結合成分に付着されており、構築物はポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制御するために使用でき、ポリヌクレオチドを配列決定するために特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
迅速で安価なポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定および同定技術が、幅広い応用にわたって現在必要である。既存の技術は、主にそれらが、大量のポリヌクレオチドを生成するための増幅技術に依存し、シグナル検出のために多量の専門的な蛍光化学物質を必要とするために、遅く高価である。
【０００３】
膜貫通ポア（ナノポア）は、ポリマーおよび種々の小分子のための直接的、電気的バイオセンサーとして大きな将来性を有する。特に、将来性のあるＤＮＡ配列決定技術としてナノポアが近年注目されている。
【０００４】
電位がナノポア全体に印加される場合、ヌクレオチドなどの分析物が一定時間バレルに一過的に存在する場合に電流が変化する。ヌクレオチドのナノポア検出は、既知のサインおよび持続時間での電流変化をもたらす。「鎖配列決定」法では、１本のポリヌクレオチド鎖がポアを通り、ヌクレオチドのアイデンティティが得られる。鎖配列決定は、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためのヌクレオチドハンドリングタンパク質の使用を含み得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、２つ以上のヘリカーゼを互いに付着させるなどヘリカーゼに追加的ポリヌクレオチド結合成分を付着することが、ポリヌクレオチドの移動を制御する改善された能力を有する構築物を生じることを驚くべきことに実証した。具体的には本発明者らは、そのような構築物が４００ヌクレオチド以上を含むポリヌクレオチドなどの長いポリヌクレオチドに強く結合し、全てではないが大部分のポリヌクレオチドの移動を離れることなく制御することを驚くべきことに実証した。これは、ポリヌクレオチドの移動の有効な制御を、特に鎖配列決定法の際に可能にする。
【０００６】
したがって、本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアならびにヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物と、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップであって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着されており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有するステップ、ならびに（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップを含む方法
を提供する。
【０００７】
本発明は、
−  ２つ以上のヘリカーゼを含む構築物であって、ヘリカーゼが互いに付着しており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物；
−  本発明の構築物をコードしているポリヌクレオチド配列であって、２つ以上のヘリカーゼが遺伝子的に融合されているポリヌクレオチド配列；
−  ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを本発明の構築物に接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む方法；
−  標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成する方法であって、ポアと、上で定義した構築物との間で複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む方法；
−  ポアと、上で定義した構築物との間の複合体を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー；
−  ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、上で定義した構築物の使用；
−  （ａ）ポア、および（ｂ）上で定義した構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット；
−  複数のポア、および上で定義した複数の構築物を含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置；ならびに
−  本発明の構築物を産生する方法であって、２つ以上のヘリカーゼを一緒に付着させ、それにより構築物を産生するステップを含む方法
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】いくつかのＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ構築物の単量体および二量体のゲルを示す図である。レーン１および６は適切なタンパク質ラダーを示す。レーン２はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）単量体（変異Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０）に対応し、レーン３はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）単量体（変異Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０）に対応し、レーン４はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）に対応し、レーン５はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）に対応する。Ａと標識したバンドは単量体に対応し、Ｂと標識したバンドは二量体に対応する。
【図２】Ｈｅｌ３０８  Ｍｈｕ多量体のゲルを示す図である。レーン１は適切なタンパク質ラダーを示し、レーン２はＨｅｌ３０８  Ｍｈｕ多量体（配列番号１９の複数単位）に対応する。
【図３】形成および精製の際の種々の段階でのＨｅｌ３０８  Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体および単量体のゲルを示す図である（レーン１＝タンパク質ラダー、レーン２＝Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体、９０℃、１０分間での加熱後、レーン３＝Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置６７４を介して他に連結されている）、レーン４＝Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製からの溶出ピーク、レーン５＝初期反応混合物およびレーン６＝Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）単量体（変異Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６））。Ａと標識したバンドは単量体に対応し、Ｂと標識したバンドは二量体に対応する。
【図４】ヘリカーゼ／ＤＮＡ結合を検査するための蛍光アッセイを示す図である。通例の蛍光基質が、１本鎖ＤＮＡに結合する種々のヘリカーゼの能力をアッセイするために使用された。８８ｎｔ１本鎖ＤＮＡ基質（最終１ｎＭ、配列番号６９、Ａと標識）は、その５’末端にカルボキシフルオレセイン（carboxyfluorescein）（ＦＡＭ）塩基を有する（円、Ｂと標識）。ヘリカーゼ（Ｃと標識）が緩衝溶液（４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中のオリゴヌクレオチドに結合することから、蛍光偏光（溶液中のオリゴヌクレオチドの自由回転の速度に関連する特性）は増大する。偏光を増大させるために必要なヘリカーゼの量が少ないほど、ＤＮＡとヘリカーゼとの間の結合親和性は強い。酵素が結合していない状態１がより早い回転および低い偏光を有する一方で、酵素が結合している状態２はより遅い回転および高い偏光を有する。Ｘと標識の黒いバーは、ヘリカーゼ濃度の増加に対応する（バーが厚いほどヘリカーゼ濃度は高い）。
【図５】種々のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ構築物の量を増加させてＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６９、その５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有する）の偏光における変化を示す図である（ｙ軸標識＝偏光（ブランク減算）、ｘ軸標識＝タンパク質濃度（ｎＭ））。黒四角点でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）に対応する。空丸でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）に対応する。偏光を増大させるためにより低い濃度のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ二量体が必要であることから、二量体は単量体よりもＤＮＡに対する高い結合親和性を有する。
【図６】種々のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物の量を増加させてＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６９、その５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有する）の偏光における変化を示す図である（ｙ軸標識＝偏光（ブランク減算）、ｘ軸標識＝タンパク質濃度（ｎＭ））。黒四角点でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）に対応する。空丸でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＨｈＨ２ドメイン（配列番号７５）に付着されている）に対応し、空三角でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメイン（配列番号７６）に付着されている）に対応する。付着している追加的ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス結合ドメインを有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼは、単量体よりも低い濃度で偏光における増大を示す。これは、追加的結合ドメインを有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ構築物が単量体よりも強い結合親和性をＤＮＡに対して有することを示唆している。４個のＨｈＨドメインを有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２が、２個のＨｈＨドメインだけを有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２よりもさらに強くＤＮＡに結合することが観察された。
【図７】種々のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物の量を増加させてＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６９、その５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有する）の偏光における変化を示す図である（ｙ軸標識＝偏光（ブランク減算）、ｘ軸標識＝タンパク質濃度（ｎＭ））。黒四角点のデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）に対応する。空丸でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ＵＬ４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＵＬ４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ（配列番号６３）に付着されている）に対応し、上向き空三角でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ（配列番号６４）に付着されている）に対応し、下向き空三角でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）がリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ（配列番号６５）に付着されている）に対応する。付着している追加的結合ドメインを有する全てのＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ＵＬ４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤおよびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ）は、単量体よりも低い濃度で偏光における増大を示す。これは、追加的結合ドメインを有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ構築物が単量体よりもＤＮＡに対して強い結合親和性を有することを示す。
【図８】種々のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物の量を増加させてＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６９、その５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有する）の偏光における変化を示す図である（ｙ軸標識＝偏光（ブランク減算）、ｘ軸標識＝タンパク質濃度（ｎＭ））。黒四角点のデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体に対応する。空丸でのデータは（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）−Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ（配列番号６４）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＴによってヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）に付着されている）に対応する。（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）−Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ構築物は、単量体よりも低い濃度で偏光における増大を示し、ＤＮＡに対するより強い結合が単量体と比較して観察されたことを示している。
【図９】Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して図５〜８に示すデータを二相解離結合曲線にフィットすることを通じて得られた種々のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物についての相対平衡解離定数（Ｋｄ）（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体に関する）を示すグラフである（ｙ軸標識＝相対Ｋｄ、ｘ軸標識＝参照番号）。参照番号は次のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物に対応する、３６１４＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）、３６９４＝（ｇｐ３２−ＲＢ６９ＣＤ）−Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ、３７３３＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ  ＰＥＧ二量体、４４０１＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２、４４０２＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２、４３９４＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ、４３９５＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ１１２Ｄｅｌおよび４３９６＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−ＧＴＧＳＧＡ−ＵＬ４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ。付着している追加的結合ドメインを有する全てのヘリカーゼ構築物はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単独よりも低い平衡解離定数を示す。
【図１０】膜中のナノポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼ単量体の模式図である。Ａ）印加された場の下で（印加された場の方向は破線黒矢印によって示されている）ｃｉｓコンパートメント中のＤＮＡはナノポアによって捕捉され、第１のヘリカーゼ（灰色半円）がナノポアの最上部に接触するまでナノポアを通って運ばれる。この時点後、ヘリカーゼはＤＮＡに沿って移動し（ｄＮＴＰおよび好適な金属イオンの存在下で）ナノポアを通るＤＮＡの移動を制御する（酵素移動の方向は空矢印によって示されている）。示されている実施ではＤＮＡ鎖は、ポアによって５’末端で捕捉され、酵素は場とは反対にＤＮＡを引いて３’から５’へ移動する。酵素が解離しない限り、鎖は同様に全て５’末端で終わり、最終的にｃｉｓ側に押し戻される。代替的にナノポアによって３’末端で捕捉された鎖は、ＤＮＡに沿って３’から５’へ移動する酵素によってポアに供給され、最終的にはｔｒａｎｓ側に出される。５’から３’への極性を示す酵素では、これらのモードは逆になる。Ｂ）酵素単量体について、酵素の１つが解離する場合（矢印１によって示される）ＤＮＡは印加された場によって反対方向にポアを通って移行し始め、ＤＮＡをｃｉｓコンパートメントに引く。Ｃ）ＤＮＡは、第２のヘリカーゼ（黒輪郭半円）がナノポアの最上部に接触するまで印加された場に沿って移動し続ける。
【図１１】膜中のナノポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼ−ヘリカーゼ二量体の模式図である。Ａ）印加された場の下で（印加された場の方向は破線黒矢印によって示されている）ｃｉｓコンパートメント中のＤＮＡはナノポアによって捕捉され、ヘリカーゼがナノポアの最上部に接触するまでナノポアを通って運ばれる。この時点後、ヘリカーゼはＤＮＡに沿って移動し（ｄＮＴＰおよび好適な金属イオンの存在下で）ナノポアを通るＤＮＡの移動を制御する。示される実施ではＤＮＡ鎖は、ポアによって５’末端で捕捉され、酵素は場とは反対にＤＮＡを引いて３’から５’へ移動する。酵素が解離しない限り、鎖は同様に全て５’末端で終わり、最終的にｃｉｓ側に押し戻される。代替的にナノポアによって３’末端で捕捉された鎖は、ＤＮＡに沿って３’から５’へ移動する酵素によってポアに供給され、最終的にはｔｒａｎｓ側に出される。５’から３’での酵素では、これらのモードは逆になる。Ｂ）酵素二量体について、酵素の１つが解離する場合（矢印１によって示される）それは他の酵素に付着したままであり、それによりＤＮＡにあるままである。Ｃ）これは、解離した酵素のＤＮＡへの再結合を増強し、それはＤＮＡに沿って移動し続けられる。この増強された再結合は、二量体構築物がＤＮＡ上のままであり、最終的にＤＮＡの末端まで移動する可能性を改善し、全体的な前進性を改善する。酵素再結合は、矢印２によって示される。ポアの最上部上の酵素がＤＮＡから解離する場合、Ｃ）からＡ）に戻る遷移が観察される可能性がある。ＤＮＡは、付着したトレイル（trailing）酵素に達するまで印加された場によってポアを通って引き戻される。次いで解離した酵素はそれ自体に再付着できる。この工程は、Ｃ）からＡ）へ戻る薄灰色矢印によって強調される。
【図１２】実施例５、６および７において使用したＤＮＡ基質設計を示す図である。鎖Ａは、配列番号７０（４００塩基長）に対応し、鎖Ｂは配列番号７１（３’末端にコレステロールタグを有するプライマー（黒丸２個によって示される））に対応する。
【図１３】ヘリカーゼ単量体が制御された様式でナノポアを通ってＤＮＡを移動させることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせることを示す図である。単量体ヘリカーゼがＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡナノポア（配列番号２に示す８単量体単位、変異Ｌ８８Ｎを有する）を通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（（１２０ｍＶ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ  ４００塩基長ＤＮＡ、１００ｎＭ  Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（トレースＡおよびＢについて、ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））。Ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約２６０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約２０〜６０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｂ）特徴的なポリＴレベルで終わるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の拡大図。
【図１４】ヘリカーゼ−ヘリカーゼ二量体が制御された様式でナノポアを通ってＤＮＡを移動させることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせることを示す図である。二量体ヘリカーゼがＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡナノポア（配列番号２、変異Ｌ８８Ｎを有する）を通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（（１２０ｍＶ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ  ４００塩基長ＤＮＡ、１０ｎＭ  Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ  二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（トレースＡおよびＢについて、ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））。Ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ二量体制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約２６０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約２０〜６０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｂ）特徴的なポリＴレベルで終わるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の拡大図。
【図１５】ナノポアを通るＤＮＡの移動を制御するために単量体Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）を使用する実験についての鎖移動の全長（状態の数、移動した塩基の数に対応する）を示す図である（＋１２０ｍＶ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ  ４００塩基長ＤＮＡ、１００ｎＭ  Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ、ｙ軸標識＝状態の数、ｘ軸標識＝鎖）。点線は、５００に対応する状態の数を強調する。単量体実行について測定されたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の３７％がＤＮＡ鎖の末端のポリＴに達した。
【図１６】ナノポアを通るＤＮＡの移動を制御するためにＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）を使用する実験についての鎖移動の全長（状態の数、移動した塩基の数に対応する）を示す図である（＋１２０ｍＶ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ  ４００塩基長ＤＮＡ、１０ｎＭ  Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ二量体、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ、ｙ軸標識＝状態の数、ｘ軸標識＝鎖）。二量体によって制御されるＤＮＡ移動は、単量体ヘリカーゼによって制御されるものよりも典型的には長い（点線は、５００に対応する状態の数を強調する）。これは、酵素再結合およびしたがって酵素解離の低減を示している。二量体実行について測定されたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の４７％がＤＮＡ鎖の末端のポリＴに達し、二量体の解離の低減および前進性の改善を示している。
【図１７】状態指数の関数としてのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体制御鎖移動に関する状態フィットデータの公知のＤＮＡ配列における位置（ｙ軸標識＝配列における位置）の６例を示す図である（ｘ軸標識＝状態指数）。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）データは、酵素解離およびトレイル酵素に出会うまで印加された場の下でＤＮＡが逆戻りした結果である配列の先行部分への周期的な後退転位を含む、配列を通じた前進性直線移動を示す。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の多数は、酵素解離のために配列の末端までたどり着けない。
【図１８】状態指数の関数としてのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａホモ二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）制御鎖移動に関する状態フィットデータの公知のＤＮＡ配列における位置（ｙ軸標識＝位置配列）の６例を示す図である（ｘ軸標識＝状態指数）。二量体データは、酵素解離の結果である配列の先行部分への周期的な後退転位を含む、配列を通じた前進性直線移動を示す。しかし単量体データとは異なり、酵素はより長くＤＮＡの移動を制御し続け、解離後に酵素はＤＮＡに再結合する。
【図１９】ヘリカーゼ−ヘリカーゼ二量体が制御された様式でナノポアを通ってＤＮＡを移動させることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせることを示す図である。二量体ヘリカーゼがＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡナノポアを通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（１８０ｍＶ、４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ  ４００塩基長ＤＮＡ、およそ１ｎＭ  Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ｑ４４２Ｃ  ２ｋＤａリンカーホモ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置４４２を介して他に連結されている）または１ｎＭ  Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ｑ４４２Ｃ  ３．４ｋＤａリンカーホモ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置４４２を介して他に連結されている）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（トレースＡおよびＢについて、ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））。Ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ｑ４４２Ｃ  ２ｋＤａリンカーホモ二量体制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１７０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約４０〜８０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ｑ４４２Ｃ  ３．４ｋＤａリンカーホモ二量体制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１７０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約４０〜８０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。
【図２０】追加的結合ドメインに付着しているヘリカーゼが制御された様式でナノポアを通ってＤＮＡを移動させることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせることを示す図である。ヘリカーゼがＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡナノポアを通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（１４０ｍＶ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、０．６ｎＭ  ４００塩基長ＤＮＡ、１００ｎＭ  Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８  Ｈｌａ第５ドメイン（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８  Ｈｌａ（配列番号６６））の第５ドメインに付着されている、または１００ｎＭ  Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８  Ｈｖｏ第５ドメイン（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８Ｈｖｏ（配列番号６７）の第５ドメインに付着されている）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（トレースＡおよびＢについて、ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））。Ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８Ｈｌａ第５ドメイン制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１００ｐＡ）からＤＮＡレベル（約１０〜４０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８Ｈｖｏ第５ドメイン制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１００ｐＡ）からＤＮＡレベル（約１０〜４０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。
【図２１】実施例８において使用されたＤＮＡ基質設計を示す図である。鎖Ａは配列番号７２（９００塩基長）に対応し、鎖Ｂは配列番号７３（アンチセンス配列より４塩基対少ないリーダー）に対応する。鎖Ｃは配列番号７４（コレステロールタグを３’末端に有するプライマー（黒丸２個によって示される））に対応する。
【図２２】追加的ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス結合ドメインに付着しているヘリカーゼが制御された様式でナノポアを通してＤＮＡを移動でき、ＤＮＡがポアを通って移動するときに電流における段階的変化を生じることを示す図である。ヘリカーゼがＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡナノポア（配列番号２に示され、変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する８単量体単位））を通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（１４０ｍＶ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、０．１ｎＭ  ９００塩基長ＤＮＡ、１００ｎＭ  Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＨｈＨ２ドメイン（配列番号７５）に付着されている）または１００ｎＭ  Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメイン（配列番号７６）に付着されている）、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（トレースＡおよびＢについて、ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））。Ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２制御９００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１１０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約１０〜４０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２制御９００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１１０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約１０〜４０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。
【図２３】酵素活性を検査するための蛍光アッセイを示す図である。通例の蛍光基質が、ハイブリダイズしたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼ／ヘリカーゼ二量体（ａ）の能力をアッセイするために使用された。１）蛍光基質鎖（５０ｎＭ最終、配列番号９１および９２）は、３’および５’の両方のｓｓＤＮＡオーバーハングおよびハイブリダイズしたｄｓＤＮＡの４４塩基セクションを有する。上部鎖（ｂ）はカルボキシフルオレセイン塩基（ｃ）を５’末端（配列番号９１中、５と標識）に有し、ハイブリダイズされた相補物（ｄ）はブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基（ｅ）を３’末端（配列番号９２中、６と標識）に有する。ハイブリダイズされた場合、フルオレセインからの蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は実質的に非蛍光性である。蛍光基質鎖の下部に部分的に相補的である捕捉鎖（ｆ、配列番号９３）１μＭがアッセイに含まれる。２）ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１ｍＭ）の存在下で、基質に添加されたヘリカーゼ（１００ｎＭ）は、蛍光基質の３’尾部に結合し、上部鎖に沿って移動し、示されるとおり相補鎖（ｄ）を置換する。３）ＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると主要な鎖上のフルオレセインは蛍光を発する。４）置換された下部鎖（ｄ）は過剰量の捕捉鎖（ｆ）に優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ。
【図２４】ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  単量体（Ａと標識、配列番号８７）およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ−ＴｏｐｏＶ  Ｍｋａ（Ｂと標識、ＴｒｗＣ  ＣｂａはリンカーＡＹＤＶＧＡによって、配列番号９０に示すトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ全長配列のドメインＨ−Ｌに付着されている）についての４００ｍＭ  ＮａＣｌでの緩衝液溶液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号９１および９２）、１μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号９３））中の活性の初期速度のグラフ（ｙ軸＝１０００ｘｄｓＤＮＡ代謝回転（分子／分／酵素）、ｘ軸＝酵素）である。
【図２５】ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ単量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）の形成および精製中の種々の段階でのゲルを示す図である。レーンＭ＝タンパク質ラダー、レーン１＝Ｅ３−Ｑ２７６Ｃ単量体出発材料、レーン２および３＝反応混合物。ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）に対応するバンドは灰色矢印によって示されている。
【図２６】ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ単量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）の形成および精製中の種々の段階でのゲルを示す図である。レーンＭ＝タンパク質ラダー、レーンＸ＝ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体についての参照レーン、レーン４〜１４はＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている））の溶出物からの精製画分を含有する。ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）に対応するバンドは灰色矢印によって示されている。
【図２７】Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ−ＰＥＧ４リンカー−ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ二量体（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単位（２と標識）は、位置５７７のアミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）に変異されている配列番号１０を含み、ＰＥＧ４リンカー（黒点線）によってＴｒｗＣ  Ｃｂａ単量体単位（１と標識）変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７に付着されており、リンカーはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体上の位置５７７およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ上の位置２７６で各単量体に付着されている）を形成するために必要である化学反応ステップの模式図である。ステップ１は、ＴｒｗＣ  Ｃｂａの表面上の位置２７６のシステインとＰＥＧ４リンカーの一方の端のマレイミド官能基（Ｘと標識）とが反応する。ステップ２は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕの表面上の位置５７７の４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）アミノ酸とＰＥＧ４リンカーの他方の端のＤＢＣＯ官能基（Ｙと標識）とがクリック化学を使用して反応する。
【図２８】実施例１２由来の試料の４〜１２％ゲルを示す図である。各レーンの試料は次のとおり−レーンａ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）、レーンｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ（ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）、レーンｃ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ（ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）、レーンｄ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋５ｋＤａ  ＰＥＧ、レーンｅ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋アジドが付着している５ｋＤａ  ＰＥＧ、レーンｆ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ａｚｉｄｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フルオロフォアとＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体との非特異的相互作用を確認するために使用）、レーンｇ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ、レーンｈ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリンカーに付着されている変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）、レーンｉ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ−ＰＥＧ４リンカー−ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ二量体（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単位は、位置５７７のアミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）に変異されている配列番号１０を含み、ＰＥＧ４リンカーによってＴｒｗＣ  Ｃｂａ単量体単位、変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７に付着されており、リンカーはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体上の位置５７７およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ上の位置２７６で各単量体に付着されている）に加えて未反応ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ単量体（ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）、レーンｊ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ＋アジドが付着している５ｋＤａ  ＰＥＧ、レーンｋ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ＋Ａｚｉｄｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フルオロフォアとＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体との非特異的相互作用を確認するために使用）。所望の二量体産生物（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ−ＰＥＧ４リンカー−ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ二量体（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単位は、位置５７７のアミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）に変異されている配列番号１０を含み、ＰＥＧ４リンカーによってＴｒｗＣ  Ｃｂａ単量体単位、変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７に付着されており、リンカーはＨｅｌ３０８Ｍｂ���単量体上の位置５７７およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ上の位置２７６で各単量体に付着されている））に対応するバンドは灰色矢印によって示されている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
配列表の記載
配列番号１は、ＭＳ−Ｂ１変異ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレチド配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
【００１０】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、以下の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
【００１１】
配列番号３は、α−ヘモリジン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddartら、PNAS、2009;106(19):7702-7707）の１つの単量体をコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１２】
配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つの単量体のアミノ酸配列を示す。
【００１３】
配列番号５から７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。
【００１４】
配列番号８は、Ｈｅｌ３０８モチーフのアミノ酸配列を示す。
【００１５】
配列番号９は、拡張Ｈｅｌ３０８モチーフのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
配列番号１０はＨｅｌ３０８Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００１７】
配列番号１１はＨｅｌ３０８ＭｂｕおよびＨｅｌ３０８ＭｈｕのＨｅｌ３０８モチーフを示す。
【００１８】
配列番号１２はＨｅｌ３０８ＭｂｕおよびＨｅｌ３０８Ｍｈｕの伸長されたＨｅｌ３０８モチーフを示す。
【００１９】
配列番号１３はＨｅｌ３０８  Ｃｓｙのアミノ酸配列を示す。
【００２０】
配列番号１４はＨｅｌ３０８  ＣｓｙのＨｅｌ３０８モチーフを示す。
【００２１】
配列番号１５はＨｅｌ３０８  Ｃｓｙの伸長されたＨｅｌ３０８モチーフを示す。
【００２２】
配列番号１６はＨｅｌ３０８  Ｔｇａのアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号１７はＨｅｌ３０８  ＴｇａのＨｅｌ３０８モチーフを示す。
【００２４】
配列番号１８はＨｅｌ３０８  Ｔｇａの伸長されたＨｅｌ３０８モチーフを示す。
【００２５】
配列番号１９はＨｅｌ３０８  Ｍｈｕのアミノ酸配列を示す。
【００２６】
配列番号２０はＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。
【００２７】
配列番号２１、２２および２３は伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。
【００２８】
配列番号２４はＲｅｃＤモチーフＩを示す。
【００２９】
配列番号２５は好ましいＲｅｃＤモチーフＩ、すなわちＧ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｋ−Ｔを示す。
【００３０】
配列番号２６、２７および２８は伸長されたＲｅｃＤモチーフＩを示す。
【００３１】
配列番号２９はＲｅｃＤ様モチーフＶを示す。
【００３２】
配列番号３０はＲｅｃＤモチーフＶを示す。
【００３３】
配列番号３１から３８はＭｏｂＦモチーフＩＩＩを示す。
【００３４】
配列番号３９から４５はＭｏｂＱモチーフＩＩＩを示す。
【００３５】
配列番号４６はＴｒａＩ  Ｅｃｏのアミノ酸配列を示す。
【００３６】
配列番号４７はＴｒａＩ  ＥｃｏのＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。
【００３７】
配列番号４８はＴｒａＩ  ＥｃｏのＲｅｃＤ様モチーフＶを示す。
【００３８】
配列番号４９はＴｒａＩ  ＥｃｏのＭｏｂＦモチーフＩＩＩを示す。
【００３９】
配列番号５０はＸＰＤモチーフＶを示す。
【００４０】
配列番号５１はＸＰＤモチーフＶＩを示す。
【００４１】
配列番号５２はＸＰＤ  Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００４２】
配列番号５３はＸＰＤ  ＭｂｕのＸＰＤモチーフＶを示す。
【００４３】
配列番号５４はＸＰＤ  ＭｂｕのＸＰＤモチーフＶＩを示す。
【００４４】
配列番号５５は好ましいＨｈＨドメインのアミノ酸配列を示す。
【００４５】
配列番号５６はｇｐ３２遺伝子によってコードされる、バクテリオファージＲＢ６９由来ＳＳＢのアミノ酸配列を示す。
【００４６】
配列番号５７はｇｐ２．５遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ７由来ＳＳＢのアミノ酸配列を示す。
【００４７】
配列番号５８はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列を示す。
【００４８】
配列番号５９はＰＣＮＡのサブユニット１のアミノ酸配列を示す。
【００４９】
配列番号６０はＰＣＮＡのサブユニット２のアミノ酸配列を示す。
【００５０】
配列番号６１はＰＣＮＡのサブユニット３のアミノ酸配列を示す。
【００５１】
配列番号６２はＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００５２】
配列番号６３はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列（１から３１９）を示す。
【００５３】
配列番号６４はバクテリオファージＲＢ６９由来ＳＳＢのアミノ酸配列、すなわちＣ末端が欠失している（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）配列番号５６を示す。
【００５４】
配列番号６５はバクテリオファージＴ７（ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ）由来のＳＳＢのアミノ酸配列（１から２１０）を示す。全長タンパク質は配列番号５７において示されている。
【００５５】
配列番号６６はＨｅｌ３０８Ｈｌａの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００５６】
配列番号６７はＨｅｌ３０８Ｈｖｏの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００５７】
配列番号６８はヘリカーゼ二量体産生において使用されるＤＮＡ鎖のポリヌクレオチド配列を示す。
【００５８】
配列番号６９はヘリカーゼ蛍光アッセイにおいて使用されるＤＮＡ鎖のポリヌクレオチド配列を示す。
【００５９】
配列番号７０は実施例５、６および７において使用されるｓｓＤＮＡ鎖のポリヌクレオチド配列を示す。配列番号７０の５’末端に、ナノポアによる捕捉を補助するために５０Ｔリーダー配列に付着している４個の２’−Ｏ−メチルウラシル塩基がある。
【００６０】
配列番号７１は実施例５、６および７において使用されるｓｓＤＮＡ鎖のポリヌクレオチド配列を示す。
【００６１】
配列番号７２および７３は実施例８において使用されるｓｓＤＮＡ鎖のポリヌクレオチド配列を示す。
【００６２】
配列番号７４は実施例８において使用されるｓｓＤＮＡ鎖のポリヌクレオチド配列を示す。
【００６３】
配列番号７５は（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００６４】
配列番号７６は（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００６５】
配列番号７７はヒトミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ）のアミノ酸配列を示す。
【００６６】
配列番号７８はＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ由来ｐ５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００６７】
配列番号７９は大腸菌（E. coli）由来野生型ＳＳＢのアミノ酸配列を示す。
【００６８】
配列番号８０は、ｇｐ３２遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ４由来ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。
【００６９】
配列番号８１はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＡｌａのアミノ酸配列を示す。
【００７０】
配列番号８２はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＮＧＧＮのアミノ酸配列を示す。
【００７１】
配列番号８３はＥｃｏＳＳＢ−Ｑ１５２ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。
【００７２】
配列番号８４はＥｃｏＳＳＢ−Ｇ１１７ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。
【００７３】
配列番号８５はＧＴＧＳＧＡリンカーを示す。
【００７４】
配列番号８６はＧＴＧＳＧＴリンカーを示す。
【００７５】
配列番号８７はアミノ酸配列ＴｒｗＣ  Ｃｂａを示す。
【００７６】
配列番号８８は実施例９において使用されるポリヌクレオチド配列の一部を示す。この配列の５’末端に付着しているのは２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー群の５’末端に付着している追加的な２個のＴを有する。この配列の３’末端に付着しているのは４つのｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、配列番号１０４の５’末端に付着している。
【００７７】
配列番号８９はトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus Kandleri））のアミノ酸配列を示す。
【００７８】
配列番号９０はＴｒｗＣ  Ｃｂａ−ＴｏｐｏＶ  Ｍｋａのアミノ酸配列を示し、ＴｒｗＣ  ＣｂａはリンカーＡＹＤＶＧＡによってトポイソメラーゼＶ  ＭｋａのドメインＨ−Ｌに付着されている。
【００７９】
配列番号９１〜９３は実施例１０において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００８０】
配列番号９４はトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus Kandleri））のドメインＨ−Ｌのアミノ酸配列を示す。
【００８１】
配列番号９５から１０３は表２に示すＴｒａＩ配列のいくつかを示す。
【００８２】
配列番号１０４は実施例９において使用されるポリヌクレオチド配列の部分を示す。この配列の５’末端に付着しているのは４個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後は配列番号８８に付着されている。配列番号８８の５’末端に付着しているのは２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー群の５’末端に付着している追加的な２個のＴを有する。
【００８３】
配列番号１０５は変異体Ｓ（大腸菌（Escherichia coli））のアミノ酸配列を示す。  
【００８４】
配列番号１０６はＳｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sufolobus solfataricus））のアミノ酸配列を示す。
【００８５】
配列番号１０７はＳｓｏ１０ｂ１（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。
【００８６】
配列番号１０８はＳｓｏ１０ｂ２（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。
【００８７】
配列番号１０９はトリプトファンリプレッサー（大腸菌（Escherichia coli））のアミノ酸配列を示す。
【００８８】
配列番号１１０はラムダリプレッサー（腸内細菌（Enterobacteria）ファージラムダ）のアミノ酸配列を示す。
【００８９】
配列番号１１１はＣｒｅｎ７（ヒストン・クレンアーキア（Histone crenarchaea）Ｃｒｅｎ７  Ｓｓｏ）のアミノ酸配列を示す。
【００９０】
配列番号１１２はヒトヒストン（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。
【００９１】
配列番号１１３はｄｓｂＡ（腸内細菌ファージＴ４）のアミノ酸配列を示す。
【００９２】
配列番号１１４はＲａｄ５１（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。
【００９３】
配列番号１１５はＰＣＮＡスライディングクランプ（sliding clamp）（シトロミクロビウム・バチオマリヌム（Citromicrobium bathyomarinum）ＪＬ３５４）のアミノ酸配列を示す。
【００９４】
発明の詳細な記載
本開示の生成物および方法のさまざまな応用が当技術分野における具体的な必要性に適合され得ることは理解される。本明細書で用いられる用語は本発明の詳細な実施形態を記載する目的のためのみであり、限定されることを意図しないことも理解される。
【００９５】
付加的に、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他を明確に記す場合を除いて複数の参照物を含む。したがって例えば、「構築物（a construct）」を参照することは「構築物（constructs）」を含み、「ヘリカーゼ（a helicase）」を参照することは２つ以上のそのようなヘリカーゼを含み、「膜貫通タンパク質ポア（a transmembrane protein pore）」を参照することは２つ以上のそのようなポアを含む、など。
【００９６】
本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は（上記または下記に関わらず）それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
本発明における使用のための構築物
本発明は、ポリヌクレオチドの移動を制御するために役立つ構築物を使用する方法を提供する。構築物は、ヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む。ヘリカーゼは、ポリヌクレオチド結合成分に付着されている。構築物はポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。構築物は、人工または非天然である。
【００９８】
下により詳細に考察されるとおり構築物は、２つ以上のヘリカーゼを含む場合がある（すなわち追加的ポリヌクレオチド結合成分は１つまたは複数の追加的ヘリカーゼである）。そのような実施形態では構築物中の各ヘリカーゼは、そのままでヘリカーゼとして機能できる。構築物それ自体は、二量体ヘリカーゼなどの多量体またはオリゴマーヘリカーゼではない。換言すると、構築物それ自体は、二量体などの多量体またはオリゴマーとして天然に存在するヘリカーゼではない。構築物は二量体などの多量体ヘリカーゼを含んでよいが、それは別のヘリカーゼなどの追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着されていなければならない。ヘリカーゼは、好ましくは単量体である。ヘリカーゼは好ましくはヘリカーゼ酵素由来のヘリカーゼドメインではない。これは下でより詳細に考察される。
【００９９】
本明細書に記載の構築物は、鎖配列決定法の際にポリヌクレオチドの移動を制御するための有用な手段である。ポリヌクレオチド、特に、５００ヌクレオチド以上のものを配列決定することにおいて生じる問題は、ポリヌクレオチドの移行を制御する分子モーターがポリヌクレオチドから離される場合があることである。これは、ポリヌクレオチドが印加された場の方向に急速かつ制御されない様式でポアを通って引かれるようにする。本明細書に記載の構築物は、配列決定されているポリヌクレオチドから離されにくい。構築物は、ナノポアを通るポリヌクレオチドの移行を制御することからポリヌクレオチドの読み取り長さの増大を提供できる。本明細書に記載の構築物の制御下でポリヌクレオチド全体をナノポアを通して移行させる能力は、その配列などのポリヌクレオチドの特性を改善された確度でおよび公知の方法を超える速度で推定できるようにする。鎖長が長くなるにつれてこれはより重要になり、分子モーターは前進性の改善を必要とする。本明細書に記載の構築物は、５００ヌクレオチド以上、例えば１０００ヌクレオチド、５０００、１００００、２００００、５００００、１０００００またはそれ以上の標的ポリヌクレオチドの移行を制御することにおいて特に有効である。
【０１００】
特異的ポリヌクレオチド配列に結合する標的化構築物も設計できる。下により詳細に考察されるとおりポリヌクレオチド結合成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合でき、それにより構築物のヘリカーゼ部分を特異的配列に標的化できる。
【０１０１】
本明細書に記載の構築物は、等温ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための有用な手段でもある。そのような方法においては、２本鎖ＤＮＡの鎖は典型的には最初に本明細書に記載の構築物によって分離され、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）−結合タンパク質によってコートされる。第二ステップでは、２個の配列特異的プライマーが、典型的にはＤＮＡ鋳型の各辺縁にハイブリダイズする。次いでＤＮＡポリメラーゼは鋳型にアニールしたプライマーを、２本鎖ＤＮＡを産生するように伸長するために使用でき、２個の新たに合成されたＤＮＡ産生物は、次いで本明細書に記載の構築物によって基質として使用され、次の回の反応に入ることができる。したがって鎖反応が同時に進行し、選択された標的配列の指数関数的増幅が生じる。
【０１０２】
構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。ポリヌクレオチドの移動を制御する構築物の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を使用してアッセイできる。例えば構築物は、ポリヌクレオチドに接触されてよく、ポリヌクレオチドの位置は、標準的方法を使用して決定され得る。ポリヌクレオチドの移動を制御する構築物の能力は、実施例において記載のとおり典型的にはアッセイされる。
【０１０３】
構築物は、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製されていてよい。構築物は、それが脂質、ポリヌクレオチド、またはポア単量体などの任意の他の構成成分を完全に含まない場合に単離または精製されている。構築物は、その目的の使用を妨害しない担体または希釈剤と混合されている場合に実質的に単離されている。例えば構築物は、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満の脂質、ポリヌクレオチド、またはポア単量体などの他の構成成分を含む形態で存在する場合に実質的に単離または実質的に精製されている。
【０１０４】
付着
ヘリカーゼは、追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着されている。ヘリカーゼは、好ましくは共有結合的に追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着している。ヘリカーゼは、２個または３個などの１個以上の点で成分に付着していてよい。
【０１０５】
ヘリカーゼは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して成分に共有結合的に付着できる。ヘリカーゼおよび成分は、別々に産生され、次いで一緒に付着されてよい。２つの構成成分は、任意の立体配置で付着されてよい。例えばそれらは、それらの末端（すなわちアミノまたはカルボキシ末端）アミノ酸を介して付着してよい。好適な立体配置は、これだけに限らないが、成分のアミノ末端がヘリカーゼのカルボキシ末端に付着しているおよびその逆を含む。代替的に２つの構成成分は、それらの配列内のアミノ酸を介して付着され得る。例えば成分は、ヘリカーゼのループ領域中の１つまたは複数のアミノ酸に付着する場合がある。好ましい実施形態では成分の末端アミノ酸は、ヘリカーゼのループ領域中の１つまたは複数のアミノ酸に付着する。末端アミノ酸およびループ領域は、当技術分野において公知の方法（Edman P., Acta Chemica Scandinavia, (1950), 283-293）を使用して同定できる。例えば、ループ領域はタンパク質モデリングを使用して同定できる。これは、相同体においてタンパク質構造がタンパク質配列よりも保存されているという事実を活用する。それにより、タンパク質の原子分解モデルを作成することは、クエリー配列の構造に類似していると考えられる１つまたは複数のタンパク質構造の同定に依存する。タンパク質モデルを構築するための「鋳型」として使用するための好適なタンパク質構造が存在するかどうかを評価するために、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）データベースの検索を実施する。タンパク質構造は、クエリー配列と合理的なレベルの配列同一性を共有している場合に好適な鋳型であると考えられる。そのような鋳型が存在する場合、次いで鋳型配列はクエリー配列と「配列比較」される、すなわちクエリー配列中の残基が鋳型残基に位置付けられる。配列の配列比較および鋳型構造は、次いでクエリー配列の構造モデルを作成するために使用される。そのためタンパク質モデルの品質は、配列の配列比較および鋳型構造の品質に依存する。
【０１０６】
２つの構成成分は、システイン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸およびグルタミンなどのそれらの天然に存在するアミノ酸を介して付着してよい。天然に存在するアミノ酸は、付着を促進するために修飾されてよい。例えば天然に存在するアミノ酸は、アシル化、リン酸化、グリコシル化またはファルネシル化によって修飾されてよい。他の好適な修飾は、当技術分野において公知である。天然に存在するアミノ酸への修飾は、翻訳後修飾であってよい。２つ以上の部分は、それらの配列に導入されるアミノ酸を介して付着してよい。そのようなアミノ酸は、好ましくは置換によって導入される。導入されるアミノ酸は、システインまたは付着を促進する非天然アミノ酸であってよい。好適な非天然アミノ酸は、これだけに限らないが、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、およびLiu C. C. and Schultz P. G.、Annu. Rev. Biochem.、2010、79、413-444の図１に含まれている１〜７１と番号付けられたアミノ酸のいずれか１つを含む。導入されるアミノ酸は、上に考察したとおり修飾されてよい。
【０１０７】
好ましい実施形態ではヘリカーゼは、成分に、例えばリンカー分子を介して化学的に付着されている。リンカー分子は、下により詳細に考察される。化学的な付着の１つの好適な方法は、システイン連結である。これは下でより詳細に考察される。
【０１０８】
ヘリカーゼは、ヘキサｈｉｓタグまたはＮｉ−ＮＴＡによって成分に一過的に繋がれてよい。ヘリカーゼおよび成分は、それらが相互に一過的に付着されるようにも修飾されてよい。
【０１０９】
別の好ましい実施形態ではヘリカーゼは、成分に遺伝子的に融合される。構築物全体が１本のポリヌクレオチド配列から発現される場合にヘリカーゼは、遺伝子的に成分に融合されている。ヘリカーゼおよび成分のコード配列は、構築物をコードしている１本のポリヌクレオチド配列を形成するために任意の方法で組み合わされてよい。核酸結合タンパク質へのポアの遺伝子的融合は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）において考察されている。
【０１１０】
ヘリカーゼおよび成分は、任意の立体配置で遺伝的に融合され得る。ヘリカーゼおよび成分は、それらの末端アミノ酸を介して融合され得る。例えば成分のアミノ末端はヘリカーゼのカルボキシ末端に融合でき、逆も同様である。成分のアミノ酸配列は、ヘリカーゼのアミノ酸配列にインフレームで好ましくは付加される。換言すると成分は、ヘリカーゼの配列内に好ましくは挿入される。そのような実施形態ではヘリカーゼおよび成分は、２つの点で、すなわち成分のアミノおよびカルボキシ末端アミノ酸を介して典型的には付着される。成分がヘリカーゼの配列内に挿入される場合、成分のアミノおよびカルボキシ末端アミノ酸が近接近にあり、ヘリカーゼまたはその変種の配列内の隣接アミノ酸にそれぞれ付着していることは好ましい。好ましい実施形態では成分は、ヘリカーゼのループ領域に挿入される。
【０１１１】
構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力を保持している。ヘリカーゼのこの能力は、そのβ鎖およびαヘリックスによって典型的には提供されるその三次元構造により典型的には提供される。αヘリックスおよびβ鎖は、ループ領域により典型的には繋がれている。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力に影響を与えることを回避するために、成分は好ましくはヘリカーゼのいずれかの末端に遺伝子的に融合される、またはヘリカーゼの表面露出ループに挿入される。特異的ヘリカーゼのループ領域は、当技術分野において公知の方法を使用して同定できる。例えば、ループ領域は、タンパク質モデリング、結晶状態におけるタンパク質のＸ線回折測定（Rupp B (2009). Biomolecular Crystallography: Principles、Practice and Application to Structural Biology. New York: Garland Science.）、溶液におけるタンパク質の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（Mark Rance; Cavanagh、John; Wayne J. Fairbrother; Arthur W. Hunt III; Skelton、Nicholas J. (2007). Protein NMR spectroscopy: principles and practice (2nd ed.). Boston: Academic Press.）または凍結水和状態におけるタンパク質のクリオ電子顕微鏡（van Heel M、Gowen B、Matadeen R、Orlova EV、Finn R、Pape T、Cohen D、Stark H、Schmidt R、Schatz M、Patwardhan A (2000). ”Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.”. Q Rev Biophys. 33: 307-69を使用して同定できる。上に述べた方法によって決定されたタンパク質の構造情報は、タンパク質バンク（ＰＤＢ）データベースから公開で入手可能である。
【０１１２】
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ（配列番号１０、１３、１６および１９）に関して、β鎖は２個のＲｅｃＡ様エンジン（RecA-like engine）ドメイン（ドメイン１および２）においてだけ見出すことができる。これらのドメインは、燃料ヌクレオチド（通常はＡＴＰ）の加水分解と移動との連関に関与する。ポリヌクレオチドに沿って徐々に動かすための重要なドメインは、ドメイン３および４であるが、中でもドメイン４である。興味深いことにドメイン３および４の両方はαヘリックスだけを含む。ドメイン４中にラチェットヘリックスと称される重要なαヘリックスがある。結果として本発明のＨｅｌ３０８実施形態では、成分は好ましくはα−ヘリックスのいずれにも遺伝子的に融合されていない。
【０１１３】
別の実施形態ではヘリカーゼは、インテインタグ配列を使用して成分に付着される。２つのタンパク質は、各タンパク質の末端に適合性の分割インテイン（split intein）タグ配列を遺伝的にコードすることによって連結され得る。インテインは、触媒または酵素を必要とせず、２つのタンパク質を連結する際に自己遊離（self release）する。連結は、痕跡がなく、１本鎖ペプチドを残す。この方法は、一般的にはタンパク質の末端を連結するためである。
【０１１４】
ヘリカーゼは、成分に直接付着されていてよい。ヘリカーゼは、２つまたは３つなどの１つまたは複数のリンカーを使用して成分に好ましくは付着されている。１つまたは複数のリンカーは、成分の可動性を制限するように設計される場合がある。リンカーは、ヘリカーゼおよび／または成分における１つまたは複数の反応性システイン残基、反応性リシン残基または非天然アミノ酸に付着してよい。非天然アミノ酸は、上に考察した任意のものであってよい。非天然アミノ酸は、好ましくは４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）である。好適なリンカーは、当技術分野において十分公知である。
【０１１５】
ヘリカーゼは、１つもしくは複数の化学的架橋剤または１つもしくは複数のペプチドリンカーを使用して好ましくは成分に付着される。好適な化学的架橋剤は、当技術分野において十分公知である。好適な化学的架橋剤は、これだけに限らないが、次の官能基：マレイミド、活性エステル、サクシニミド、アジド、アルキン（ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯまたはＤＢＣＯ）、ジフルオロシクロアルカンおよび直鎖アルカンなど）、ホスフィン（無痕跡および無痕跡でないシュタウディンガーライゲーションにおいて使用されるものなど）、ハロアセチル（ヨードアセトアミドなど）、ホスゲン型試薬、スルホニルクロリド試薬、イソチオシアン酸、ハロゲン化アシル、ヒドラジン、ジスルフィド、ビニルスルホン、アジリジンおよび光反応性試薬（アリールアジド、ジアジリジンなど）を含むものを含む。架橋剤は、好ましくはビス（スルホサクシニミジル）スベレート（ＢＳ３）ではない。ヘリカーゼおよび成分は、好ましくはホルムアルデヒドを使用して架橋結合されない。
【０１１６】
システイン／マレイミドなど、アミノ酸と官能基との間の反応は自発的であってよく、またはアジドと直鎖状アルキンを連結するためのＣｕ（Ｉ）など、他の試薬を必要としてよい。
【０１１７】
リンカーは、必要な距離にわたって伸びる任意の分子を含んでよい。リンカーは、炭素１個（ホスゲン型リンカー）から多数のオングストロームに長さが変化できる。直鎖状分子の例に含まれるのは、これだけに限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリペプチド、多糖、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、飽和および不飽和炭化水素、ポリアミドである。これらのリンカーは不活性または反応性であってよく、具体的にはそれらは、規定の位置で化学的に切断可能であってよい、またはフルオロフォアもしくはリガンドでそれ自体が修飾されてよい。リンカーは、好ましくはジチオスレイトール（dithiothreitol）（ＤＴＴ）に抵抗性である。
【０１１８】
切断可能なリンカーは、非付着構成成分からの構築物の分離への補助として使用でき、合成反応をさらに制御するために使用できる。例えばヘテロ二機能性リンカーは、ヘリカーゼと反応できるが、成分とはできない。ヘリカーゼタンパク質を表面に結合するためにリンカーの遊離末端が使用できる場合、最初の反応由来の未反応ヘリカーゼは混合物から除去され得る。続いてリンカーは、成分と反応する基を露出させるために切断され得る。付加的に、一連の連結反応に続いて、条件は最初にヘリカーゼへの反応のために、次いでリンカーの切断後の成分への反応のために最適化され得る。第二の反応は、リンカーが既に付着している領域に限定されることから、成分との正確な反応部位に向けてさらに方向付けられる。
【０１１９】
好ましい架橋剤は、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタノエート、ジ−マレイミドＰＥＧ  １ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  ３．４ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  ５ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  １０ｋ、ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビス−マレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ＢＭ［ＰＥＯ］２（１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール）、ＢＭ［ＰＥＯ］３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール）、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）、ＤＴＭＥジチオビスマレイミドエタン、ビスマレイミドＰＥＧ３、ビスマレイミドＰＥＧ１１、ＤＢＣＯ−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ  ２．８ｋＤａ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ  ４．０ｋＤａ、ＤＢＣＯ−１５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−２６原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−３５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ１１−ビオチンを含む。最も好ましい架橋剤は、サクシニジミル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）およびマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）−マレイミド（アルファ，オメガ−ビス−マレイミドポリ（エチレングリコール））である。
【０１２０】
ヘリカーゼは、ヘリカーゼ／架橋剤複合体が成分に共有結合的に付着する前に、二機能性架橋剤に共有結合的に付着されてよい。代替的に成分は、二機能性架橋剤／成分複合体がヘリカーゼに付着する前に、二機能性架橋剤に共有結合的に付着してよい。ヘリカーゼおよび成分は、化学的架橋剤に同時に共有結合的に付着してよい。
【０１２１】
ヘリカーゼは、相互に特異的である２つの異なるリンカーを使用して成分に付着される場合がある。リンカーの一方は、ヘリカーゼに付着しており、他方は成分に付着している。一度一緒に混合されると、リンカーは、本明細書に記載の構築物を形成するように反応しなければならない。ヘリカーゼは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載のハイブリダイゼーションリンカーを使用して成分に付着されてよい。具体的にはヘリカーゼは、ハイブリダイズ可能な領域および共有結合を形成できる基をそれぞれ含む２つ以上のリンカーを使用して成分に付着されてよい。リンカーにおけるハイブリダイズ可能な領域は、成分にハイブリダイズし、連結する。連結された成分は、次いで基の間の共有結合の形成を介してカップリングされる。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に開示の任意の特異的リンカーは、本発明により使用できる。
【０１２２】
ヘリカーゼおよび成分は、修飾される場合があり、次いで２つの修飾に特異的である化学的架橋剤を使用して付着されてよい。上に考察した任意の架橋剤は、使用できる。
【０１２３】
代替的にリンカーは、アミノ酸配列を好ましくは含む。そのようなリンカーは、ペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの長さ、可動性および親水性は、ヘリカーゼおよび成分の機能を妨害しないように典型的には設計される。好ましい可動性ペプチドリンカーは４、６、８、１０または１６などの２から２０のセリンおよび／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい可動性リンカーは（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５、（ＳＧ）８、（ＳＧ）１０、（ＳＧ）１５または（ＳＧ）２０を含み、式中Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい硬いリンカーは、４、６、８、１６または２４などの２から３０のプロリンアミノ酸のストレッチである。より好ましい硬いリンカーは（Ｐ）１２を含み、式中Ｐはプロリンである。
【０１２４】
リンカーは、標識されてよい。好適な標識は、これだけに限らないが、蛍光分子（Ｃｙ３またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５など）、放射性同位元素、例えば  １２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよび、ビオチンなどのリガンドを含む。そのような標識は、リンカーの量を定量できるようにする。標識は、ビオチンなどの切断可能な精製タグ、またはタンパク質自体には存在しないがトリプシン消化によって遊離されるペプチドなどの同定方法において明らかになる特異的配列であってもよい。
【０１２５】
ヘリカーゼを成分に付着させる好ましい方法は、システイン連結を介する。これは、二機能性化学的リンカーにより、または末端に存在するシステイン残基を有するポリペプチドリンカーにより調節できる。連結は、ヘリカーゼおよび／または成分中の天然システインを介して生じてよい。代替的にシステインは、ヘリカーゼおよび／または成分に導入される場合がある。ヘリカーゼがシステイン連結を介して成分に付着される場合、１つまたは複数のシステインは、置換によってヘリカーゼおよび／または成分に好ましくは導入される。
【０１２６】
任意の二機能性リンカーの長さ、反応性、特異性、硬さおよび溶解度は、成分がヘリカーゼとの関連で正確に位置付けられ、ヘリカーゼおよび成分の両方の機能が保持されることを確実にするように設計され得る。好適なリンカーは、１，４−ビス（マレイミド）ブタン（ＢＭＢ）またはビス（マレイミド）ヘキサンなどのビスマレイミド架橋剤を含む。特異的部位での付着が好ましい場合に、表面の利用可能なシステイン残基への二機能性リンカーの結合は制御することが困難である場合があり、基質結合または活性に影響を与える場合があることから、二機能性リンカーを引き戻すものは、さらなる表面の利用可能なシステイン残基を含まないヘリカーゼおよび成分の必要性である。ヘリカーゼおよび／または成分がいくつかの利用可能なシステイン残基を含有する場合は、修飾がヘリカーゼおよび成分のフォールディングまたは活性に影響を与えないことを確実にしながら、それらを除去するためにヘリカーゼおよび／または成分の修飾が必要である場合がある。これは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）において考察されている。好ましい実施形態では反応性システインは、成分に遺伝子的に付着されているペプチドリンカー上に存在する。これは、成分から他の利用可能なシステイン残基を除去するために追加的修飾が必ずしも必要ではないことを意味する。システイン残基の反応性は隣接残基の、例えばペプチドリンカー上の修飾によって増強できる。例えば近接するアルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをさらに反応性のＳ−基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ｄＴＮＢ）などのチオール保護基によって保護できる。これらは、リンカーが付着される前に成分またはヘリカーゼの１つまたは複数のシステイン残基と、単量体またはオリゴマーの部分としてのいずれかで反応され得る。表面の利用可能なシステインの選択的脱保護は、ビーズに固定した還元試薬（例えば固定化トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ＴＣＥＰ）を使用して可能である。２つ以上のヘリカーゼのシステイン連結は、下により詳細に考察される。
【０１２７】
ヘリカーゼを成分に付着させる別の好ましい方法は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）連結を介する。これは、二機能性化学的リンカーによってまたは末端に存在するＦａｚ残基を有するポリペプチドリンカーによって調節できる。１つまたは複数のＦａｚ残基は、置換によってヘリカーゼおよび／または成分に好ましくは導入される。２つ以上のヘリカーゼのＦａｚ連結は、下により詳細に考察される。
【０１２８】
ヘリカーゼまたは成分のそれ自体への交差結合は、リンカーの濃度をヘリカーゼおよび／または成分の大過剰に維持することによって妨げることができる。代替的に「鍵と鍵穴」配置は、２つのリンカーが使用される場合に使用できる。各リンカーの一方の末端だけが長いリンカーを形成するために併せて反応でき、リンカーの他方の末端は構築物の異なる部分（すなわちヘリカーゼまたは成分）とそれぞれ反応する。これは下でより詳細に考察される。
【０１２９】
付着の部位は、構築物がポリヌクレオチドと接触する場合に、ヘリカーゼおよび成分の両方がポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できるように選択される。
【０１３０】
付着は、ヘリカーゼおよび成分のポリヌクレオチド結合活性を使用して促進され得る。例えば相補的ポリヌクレオチドは、ヘリカーゼおよび成分を、それらがハイブリダイズすることから、併せて運ぶために使用できる。ヘリカーゼは一方のポリヌクレオチドに結合でき、成分は相補的ポリヌクレオチドに結合できる。次いで２つのポリヌクレオチドは、相互にハイブリダイズできるようになる。これは、ヘリカーゼを成分と密接に接触するようにして、連結反応をさらに効率的にする。これは、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための正確な方向で２つ以上のヘリカーゼを付着させるために特に有益である。使用できる相補的ポリヌクレオチドの一例は、下に示されている。
【０１３１】
【化１】
0006429773.tif 000002
【０１３２】
ヘリカーゼ−Ｐｈｉ２９構築物に関して、下のＤＮＡは使用され得る。
【０１３３】
【化２】
0006429773.tif 000003
【０１３４】
構築物の精製を容易にするためにタグが構築物に付加され得る。これらのタグは、次いでそれらの除去が必要である場合に、化学的にまたは酵素的に切断除去され得る。フルオロフォアまたはクロモフォアも含まれる場合があり、これらも切断可能であってよい。
【０１３５】
構築物を精製するための簡単な方法は、各タンパク質（すなわちヘリカーゼおよび成分）上に、ヘキサ−Ｈｉｓ−タグおよびＳｔｒｅｐ−タグ（登録商標）などの異なる精製タグを含むことである。２つのタンパク質が互いに異なる場合、この方法は特に有用である。２つのタグの使用は、両方のタグを含む分子種だけが容易に精製されるようにする。
【０１３６】
２つのタンパク質が２つの異なるタグを有さない場合、他の方法が使用できる。例えば遊離表面システインを有するタンパク質または構築物を形成するために反応していない付着リンカーを有するタンパク質は、例えばマレイミドリンカーに対するヨードアセトアミドレジンを使用して除去され得る。
【０１３７】
構築物は、未反応タンパク質から異なるＤＮＡ前進性特徴に基づいても精製され得る。具体的には構築物は、未反応タンパク質からポリヌクレオチドに対する親和性の増大、既に結合したポリヌクレオチドから離れる可能性の低減および／またはナノポアを通るポリヌクレオチドの移行を制御するときのポリヌクレオチドの読み取り長さの増大に基づいて精製され得る。
【０１３８】
ヘリカーゼ
任意のヘリカーゼは、本明細書に記載の構築物に使用してよい。ヘリカーゼは、しばしばトランスロカーゼとして公知であり、２つの用語は互換的に使用できる。好適なヘリカーゼは、当技術分野において十分公知である（M. E. Fairman-Williamsら、Curr. Opin. Struct Biol.、2010、20 (3)、313-324、T. M. Lohmanら、Nature Reviews Molecular Cell Biology、2008、9、391-401）。ヘリカーゼは典型的にはスーパーファミリー１から６の内の１つのメンバーである。ヘリカーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群３．６．１．−および２．７．７．−．のいずれかのメンバーである。ヘリカーゼは、好ましくはＡＴＰ−依存性ＤＮＡヘリカーゼ（ＥＣ群３．６．４．１２）、ＡＴＰ−依存性ＲＮＡヘリカーゼ（ＥＣ群３．６．４．１３）またはＡＴＰ非依存性ＲＮＡヘリカーゼである。
【０１３９】
ヘリカーゼは、多量体またはオリゴマーヘリカーゼであってよい。換言するとヘリカーゼは、機能するために二量体などの多量体またはオリゴマーを形成する必要がある場合がある。しかし上に考察したとおり構築物それ自体は、多量体またはオリゴマーヘリカーゼであることはできない。多量体またはオリゴマーヘリカーゼは追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着されていなければならない。ヘリカーゼは、好ましくは単量体である。換言するとヘリカーゼは、好ましくは機能するために二量体などの多量体またはオリゴマーを形成する必要はない。Ｈｅｌ３０８、ＲｅｃＤ、ＴｒａＩおよびＸＰＤヘリカーゼは、全て単量体ヘリカーゼである。これらは下により詳細に考察される。ヘリカーゼは、好ましくはＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ヘリカーゼ（ＮＳ３ｈとしても公知）ではない。ＮＳ３ヘリカーゼは、オリゴマーとして作用し、単量体ではない。
【０１４０】
単量体ヘリカーゼは、一緒に付着しているいくつかのドメインを含んでよい。例えばＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩサブグループヘリカーゼは２つのＲｅｃＤヘリカーゼドメイン、レラクサーゼ（relaxase）ドメインおよびＣ末端ドメインを含有する場合がある。ドメインは、オリゴマーを形成することなく機能できる単量体ヘリカーゼを典型的には形成する。
【０１４１】
ヘリカーゼは、典型的には完全なＨｅｌ３０８、ＲｅｃＤ、ＴｒａＩまたはＸＰＤヘリカーゼなどの完全なヘリカーゼである。ヘリカーゼは、好ましくはヘリカーゼ酵素由来のヘリカーゼドメインではない。例えばヘリカーゼは、好ましくはブロムモザイクウイルス（Brome mosaic virus）（ＢＭＶ）ウイルス複製タンパク質１ａ由来のＲｅｃＤドメインまたはヘリカーゼドメインではない。構築物は、それ自体が、互いに付着している２つのＲｅｃＤドメインを含むＴｒａＩヘリカーゼなどの、互いに付着している２つ以上のヘリカーゼドメインを含むヘリカーゼであることはできない。構築物は、ＴｒａＩヘリカーゼなどの２つ以上のヘリカーゼドメインを含むヘリカーゼを含む場合があるが、追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着されていなければならない。ヘリカーゼは、内部ヌクレオチドで標的ポリヌクレオチドに好ましくは結合できる。内部ヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド中の末端ヌクレオチドではないヌクレオチドである。例えばそれは３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドではない。環状ポリヌクレオチド中の全てのヌクレオチドは内部ヌクレオチドである。
【０１４２】
一般に内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼは、末端ヌクレオチドでも結合できるが、いくつかのヘリカーゼについて内部ヌクレオチドで結合する傾向は、他よりも大きい。本発明において使用に好適なヘリカーゼは、ポリヌクレオチドへのその結合の典型的には少なくとも１０％が内部ヌクレオチドにである。典型的には、その結合の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％が内部ヌクレオチドにである。末端ヌクレオチドでの結合は、末端ヌクレオチドおよび隣接内部ヌクレオチドの両方へ結合を同時に含み得る。本発明の目的のためにこれは、内部ヌクレオチドでの標的ポリヌクレオチドへの結合ではない。換言すると本発明において使用されるヘリカーゼは、１つまたは複数の隣接内部ヌクレオチドとの組合せで末端ヌクレオチドに結合できるだけではない。ヘリカーゼは、末端ヌクレオチドに同時に結合することなく内部ヌクレオチドに結合できる。
【０１４３】
内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼは、１個より多い内部ヌクレオチドに結合できる。典型的にはヘリカーゼは、少なくとも２個の内部ヌクレオチド、例えば少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個または少なくとも１５個の内部ヌクレオチドに結合する。典型的にはヘリカーゼは、少なくとも２個の隣接する内部ヌクレオチド、例えば少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個または少なくとも１５個の隣接する内部ヌクレオチドに結合する。少なくとも２個の内部ヌクレオチドは、隣接または非隣接であってよい。
【０１４４】
内部ヌクレオチドでポリヌクレオチドに結合するヘリカーゼの能力は、競合アッセイを実行することによって決定できる。対照ポリヌクレオチドＡに結合するモーターの能力は、同じだが末端ヌクレオチドに付着しているブロッキング基を含むポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＢ）に結合する能力と比較される。ブロッキング基は、鎖Ｂの末端ヌクレオチドでのいかなる結合も妨げ、それによりヘリカーゼの内部結合だけを可能にする。
【０１４５】
内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼの例は、これだけに限らないが、Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ、Ｈｅｌ３０８ＭｈｕおよびＨｅｌ３０８Ｃｓｙを含む。したがって分子モーターは、好ましくは（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ（すなわち配列番号１６）の配列もしくはその変種または（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ（すなわち配列番号１３）の配列もしくはその変種または（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ（すなわち配列番号１９）の配列もしくはその変種を含む。これらの配列の変種は、下により詳細に考察される。変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
【０１４６】
ヘリカーゼは、好ましくはＨｅｌ３０８ヘリカーゼである。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、それらがオリゴマーを形成することなく機能することから単量体である。本発明に従って、任意のＨｅｌ３０８ヘリカーゼを使用し得る。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼはｓｋｉ２様ヘリカーゼとしても公知であり、２つの用語は互換的に用いられ得る。好適なＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、米国特許出願第６１，５４９，９９８号の表４および第６１／５９９，２４４ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号（ＷＯ２０１３／０５７４９５として公開）に開示されている。
【０１４７】
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ（本明細書以下でＨｅｌ３０８モチーフと称する；配列番号８）を典型的には含む。Ｈｅｌ３０８モチーフは、典型的にはヘリカーゼモチーフＶＩの部分である（Tuteja and Tuteja、Eur.J.Biochem.271 1849-1863(2004)）。Ｘ１は、Ｃ、ＭまたはＬであってよい。Ｘ１は、好ましくはＣである。Ｘ２は、任意のアミノ酸残基であってよい。Ｘ２は、典型的には疎水性または中性残基である。Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＰまたはＲであってよい。Ｘ２は、好ましくはＡ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＴまたはＰである。Ｘ２は、より好ましくはＡ、ＭまたはＬである。Ｘ２は、最も好ましくはＡまたはＭである。
【０１４８】
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、好ましくはモチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ−Ｐ（本明細書以下で伸張されたＨｅｌ３０８モチーフと称される；配列番号９）を含み、式中Ｘ１およびＸ２は上に記載のとおり。
【０１４９】
最も好ましいＨｅｌ３０８モチーフおよび伸張されたＨｅｌ３０８モチーフは、下の表１に示される。
【０１５０】
【表１】
0006429773.tif 000004
【０１５１】
最も好ましいＨｅｌ３０８モチーフは、配列番号１７に示されている。最も好ましい伸長されたＨｅｌ３０８モチーフは、配列番号１８に示されている。他の好ましいＨｅｌ３０８モチーフおよび伸長されたＨｅｌ３０８モチーフは、米国特許出願第６１，５４９，９９８号の表５および第６１／５９９，２４４号ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号（ＷＯ  ２０１３／０５７４９５として公開）に見出すことができる。
【０１５２】
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（すなわち配列番号１０）の配列またはその変種を好ましくは含む。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、より好ましくは（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｔｇａの配列（すなわち、配列番号１６）もしくはその変種、（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙの配列（すなわち、配列番号１３）もしくはその変種、または（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕの配列（すなわち配列番号１９）もしくはその変種を含む。最も好ましくはＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、配列番号１６またはその変種に示されている配列を含む。
【０１５３】
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼの配列から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。特に、配列番号１０、１３、１６または１９の変種は、配列番号１０、１３、１６または１９の配列から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。ポリヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。好適な方法は、これだけに限らないが、蛍光偏光測定、トリプトファン蛍光および電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を含む。例えば１本鎖ポリヌクレオチドに結合する変種の能力は、実施例に記載のとおり決定できる。
【０１５４】
変種はヘリカーゼ活性を保持している。これは、種々の方法において測定できる、例えばポリヌクレオチドに沿って移行させる変種の能力は電気生理化学、蛍光アッセイまたはＡＴＰ加水分解を使用して測定され得る。
【０１５５】
変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、上で考察したＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフの外の領域において野生型ヘリカーゼとは典型的には異なる。しかし変種は、これらのモチーフ（複数可）内に修飾を含む場合がある。
【０１５６】
配列番号１０、１３、１６または１９のアミノ酸配列全長にわたって、変種は好ましくは、アミノ酸同一性に基づいてその配列に対して少なくとも３０％相同である。より好ましくは、変種ポリペプチドは、配列番号１０、１３、１６または１９のアミノ酸配列に対して、配列全長にわたるアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であってよい。少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
【０１５７】
配列番号１０、１３、１６または１９の変種は、上で表１に示されたとおり、野生型配列のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフを好ましくは含む。しかし変種は、異なる野生型配列由来のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸長されたＨｅｌ３０８モチーフを含む場合がある。例えば配列番号１２の変種は、Ｈｅｌ３０８モチーフまたは配列番号１３から伸張されたＨｅｌ３０８モチーフ（すなわち配列番号１４または１５）を含んでもよい。配列番号１０、１３、１６または１９の変種は、関連する野生型配列のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸長されたＨｅｌ３０８モチーフ内に修飾を含む場合もある。Ｘ１およびＸ２での好適な修飾は、２つのモチーフを定義する際に上に考察されている。配列番号１０、１３、１６または１９の変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
【０１５８】
配列番号１０の変種は、配列番号１０の最初の１９アミノ酸を欠失しているおよび／または配列番号１０の最後の３３アミノ酸を欠失している場合がある。配列番号１０の変種は、配列番号１０のアミノ酸２０から２１１または２０から７２７にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはより好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％相同である配列を好ましくは含む。
【０１５９】
配列番号１０（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ）は５個の天然システイン残基を含有する。しかし、これらの残基の全ては酵素のＤＮＡ結合グローブ（grove）内または周辺に位置付けられている。ＤＮＡ鎖が酵素内に結合されると、これらの天然システイン残基は、外からの修飾に関して利用しにくくなる。これは、上に考察したとおり配列番号１０の特異的システイン変異体の設計を可能にし、システイン連結を使用して成分に付着できるようにする。配列番号１０の好ましい変種は、次の置換：Ａ２９Ｃ、Ｑ２２１Ｃ、Ｑ４４２Ｃ、Ｔ５６９Ｃ、Ａ５７７Ｃ、Ａ７００ＣおよびＳ７０８Ｃの１つまたは複数を有する。これらの位置の１つまたは複数でのシステイン残基の導入は、上に考察したとおりシステイン連結を促進する。配列番号１０の他の好ましい変種は次の置換：Ｍ２Ｆａｚ、Ｒ１０Ｆａｚ、Ｆ１５Ｆａｚ、Ａ２９Ｆａｚ、Ｒ１８５Ｆａｚ、Ａ２６８Ｆａｚ、Ｅ２８４Ｆａｚ、Ｙ３８７Ｆａｚ、Ｆ４００Ｆａｚ、Ｙ４５５Ｆａｚ、Ｅ４６４Ｆａｚ、Ｅ５７３Ｆａｚ、Ａ５７７Ｆａｚ、Ｅ６４９Ｆａｚ、Ａ７００Ｆａｚ、Ｙ７２０Ｆａｚ、Ｑ４４２ＦａｚおよびＳ７０８Ｆａｚの１つまたは複数を有する。これらの位置の１つまたは複数でのＦａｚ残基の導入は、上に考察したとおりＦａｚ連結を促進する。
【０１６０】
ヘリカーゼは、好ましくはＲｅｃＤヘリカーゼである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、それらがオリゴマーを形成することなく機能することから単量体である。任意のＲｅｃＤヘリカーゼが本発明により使用できる。ＲｅｃＤヘリカーゼの構造は、当技術分野において公知である（FEBS J. 2008 Apr;275(8):1835-51. Epub 2008 Mar 9. ATPase activity of RecD is essential for growth of the Antarctic Pseudomonas syringae Lz4W at low temperature. Satapathy AK、Pavankumar TL、Bhattacharjya S、Sankaranarayanan R、Ray MK; EMS Microbiol Rev. 2009 May;33(3):657-87. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. Garcillan-Barcia MP、Francia MV、de la Cruz F; J Biol Chem. 2011 Apr 8;286(14):12670-82. Epub 2011 Feb 2. Functional characterization of the multidomain F plasmid TraI relaxase-helicase. Cheng Y、McNamara DE、Miley MJ、Nash RP、Redinbo MR）。
【０１６１】
ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（本明細書以下でＲｅｃＤ様モチーフＩと称する；配列番号２０）を典型的には含み、式中Ｘ１はＧ、ＳまたはＡであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＰ、Ａ、ＳまたはＧであり、Ｘ４はＴ、Ａ、Ｖ、ＳまたはＣであり、Ｘ５はＧまたはＡであり、Ｘ６はＫまたはＲおよびＸ７はＴまたはＳである。Ｘ１は好ましくはＧである。Ｘ２は好ましくはＧ、Ｉ、ＹまたはＡである。Ｘ２はより好ましくはＧである。Ｘ３は好ましくはＰまたはＡである。Ｘ４は好ましくはＴ、Ａ、ＶまたはＣである。Ｘ４は好ましくはＴ、ＶまたはＣである。Ｘ５は好ましくはＧである。Ｘ６は好ましくはＫである。Ｘ７は好ましくはＴまたはＳである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、Ｑ−（Ｘ８）１６〜１８−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（本明細書以下で伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＩと称する；配列番号２１、２２および２３）を好ましくは含み、式中Ｘ１からＸ７は上に定義のとおりであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である。好ましくは伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＩ中に１６個のＸ８残基がある（すなわち（Ｘ８）１６）。（Ｘ８）１６についての好適な配列は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の配列番号１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７および５０ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）の配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２および４４で同定できる。
【０１６２】
ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＧ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｘａ−Ｇ−Ｋ−Ｘｂ（本明細書以下でＲｅｃＤモチーフＩと称する；配列番号２４）を好ましくは含み、式中ＸａはＴ、ＶまたはＣであり、ＸｂはＴまたはＳである。Ｘａは好ましくはＴである。Ｘｂは好ましくはＴである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、配列Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｋ−Ｔ（配列番号２５）を好ましくは含む。ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−（Ｘ８）１６〜１８−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｘａ−Ｇ−Ｋ−Ｘｂ（本明細書以下で伸長されたＲｅｃＤモチーフＩと称する；配列番号２６、２７および２８）をより好ましくは含み、式中ＸａおよびＸｂは上に定義のとおりであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である。伸長されたＲｅｃＤモチーフＩ中に好ましくは１６個のＸ８残基がある（すなわち（Ｘ８）１６）。（Ｘ８）１６についての好適な配列は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の配列番号１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７および５０ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）の配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２および４４で同定できる。
【０１６３】
ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）３−Ｑ−Ｘ７（本明細書以下でＲｅｃＤ様モチーフＶと称する；配列番号２９）を典型的には含み、式中Ｘ１はＹ、ＷまたはＦであり、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、ＣまたはＶであり、Ｘ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ４はＴ、ＮまたはＳであり、Ｘ５はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、ＶまたはＩであり、Ｘ６は任意のアミノ酸であり、Ｘ７はＧまたはＳである。Ｘ１は好ましくはＹである。Ｘ２は好ましくはＡ、Ｍ、ＣまたはＶである。Ｘ２はより好ましくはＡである。Ｘ３は好ましくはＩ、ＭまたはＬである。Ｘ３はより好ましくはＩまたはＬである。Ｘ４は好ましくはＴまたはＳである。Ｘ４はより好ましくはＴである。Ｘ５は好ましくはＡ、ＶまたはＩである。Ｘ５はより好ましくはＶまたはＩである。Ｘ５は最も好ましくはＶである。（Ｘ６）３は好ましくはＨ−Ｋ−Ｓ、Ｈ−Ｍ−Ａ、Ｈ−Ｇ−ＡまたはＨ−Ｒ−Ｓである。（Ｘ６）３はより好ましくはＨ−Ｋ−Ｓである。Ｘ７は好ましくはＧである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｘｅ−Ｈ−Ｋ−Ｓ−Ｑ−Ｇ（本明細書以下でＲｅｃＤモチーフＶと称する；配列番号３０）を好ましくは含み、式中ＸａはＹ、ＷまたはＦであり、ＸｂはＡ、Ｍ、ＣまたはＶであり、ＸｃはＩ、ＭまたはＬであり、ＸｄはＴまたはＳであり、ＸｅはＶまたはＩである。Ｘａは好ましくはＹである。Ｘｂは好ましくはＡである。Ｘｄは好ましくはＴである。Ｘｄは好ましくはＶである。好ましいＲｅｃＤモチーフＩは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されている。好ましいＲｅｃＤ様モチーフＩは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されている。好ましいＲｅｃＤ様モチーフＶは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表５および７ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されている。
【０１６４】
ＲｅｃＤヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表４もしくは５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されているヘリカーゼの１つまたはその変種である。変種は米国特許出願第６１／５８１，３３２号および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に記載されている。
【０１６５】
ＲｅｃＤヘリカーゼは、好ましくはＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼである。ＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、オリゴマーを形成することなく機能することから単量体である。ＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、２つのＲｅｃＤヘリカーゼドメイン、レラクサーゼドメインおよびＣ末端ドメインを含有する場合がある。ＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、好ましくはＴｒｗＣヘリカーゼである。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表６および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示すヘリカーゼの１つまたはその変種である。変種は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に記載されている。
【０１６６】
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、上に定義のＲｅｃＤ様モチーフＩ（配列番号２０）および／または上に定義のＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号２９）を典型的には含む。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、ＲｅｃＤ様モチーフＩ（配列番号２０）およびＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号２９）の両方を好ましくは含む。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、次の２つのモチーフの１つを典型的にはさらに含む：
−  アミノ酸モチーフＨ−（Ｘ１）２−Ｘ２−Ｒ−（Ｘ３）５〜１２−Ｈ−Ｘ４−Ｈ（本明細書以下でＭｏｂＦモチーフＩＩＩと称する；配列番号３１から３８）、式中Ｘ１およびＸ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ４はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される。（Ｘ１）２は当然ながらＸ１ａ−Ｘ１ｂである。Ｘ１ａおよびＸ１ｂは、同じまたは異なるアミノ酸であってよい。Ｘ１ａは、好ましくはＤまたはＥである。Ｘ１ｂは、好ましくはＴまたはＤである。（Ｘ１）２は、好ましくはＤＴまたはＥＤである。（Ｘ１）２は、最も好ましくはＤＴである。（Ｘ３）５〜１２中の５から１２個のアミノ酸は同じまたは異なっていてよい。Ｘ２およびＸ４はＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ２およびＸ４は、好ましくは荷電していない。Ｘ２およびＸ４は、好ましくはＨではない。Ｘ２は、より好ましくはＮ、ＳまたはＡである。Ｘ２は、最も好ましくはＮである。Ｘ４は、最も好ましくはＦまたはＴである。（Ｘ３）５〜１２は、好ましくは長さ６または１０残基である。（Ｘ３）５〜１２の好適な実施形態は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表７に示す配列番号５８、６２、６６および７０、ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）の配列番号６１、６５、６９、７３、７４、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４および１６８由来であってよい。
−  アミノ酸モチーフＧ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｈ−（Ｘ８）６〜１２−Ｈ−Ｘ９（本明細書以下でＭｏｂＱモチーフＩＩＩと称する；配列番号３９から４５）、式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ４はＤまたはＥであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９はＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９は、好ましくは荷電していない。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９は、好ましくはＨではない。（Ｘ８）６〜１２中の６から１２個のアミノ酸は、同じまたは異なっていてよい。好ましいＭｏｂＦモチーフＩＩＩは、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されている。
【０１６７】
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、より好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表６または７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示すヘリカーゼの１つまたはその変種である。ＴｒａＩヘリカーゼは、配列番号４６に示す配列またはその変種を最も好ましくは含む。配列番号４６はＴｒａＩ  Ｅｃｏ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６１４８３．１；Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＱ９８６１９．１；配列番号４６）である。ＴｒａＩ  Ｅｃｏは、次のモチーフ：ＲｅｃＤ様モチーフＩ（ＧＹＡＧＶＧＫＴ；配列番号４７）、ＲｅｃＤ様モチーフＶ（ＹＡＩＴＡＨＧＡＱＧ；配列番号４８）およびＭｏｂ  ＦモチーフＩＩＩ（ＨＤＴＳＲＤＱＥＰＱＬＨＴＨ；配列番号４９）を含む。
【０１６８】
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、下の表２に示すヘリカーゼの１つの配列、すなわち配列番号４６、８７、９８および１０２の１つまたはその変種をより好ましくは含む。
【０１６９】
【表２】
0006429773.tif 000005
【０１７０】
ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼのものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。これは、上に記載のとおり測定され得る。具体的には配列番号４６、８７、９８または１０２の変種は、配列番号４６、８７、９８または１０２のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。変種は、ヘリカーゼ活性を保持している。変種は、下に考察する２つのモードの少なくとも１つで作動しなければならない。好ましくは、変種は両方のモードで作動する。変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、上で考察したモチーフの外の領域において野生型ヘリカーゼとは典型的には異なる。しかし変種は、これらのモチーフ（複数可）内に修飾を含む場合がある。
【０１７１】
配列番号４６、８７、９８および１０２の任意の１つのアミノ酸配列の全長にわたって、変種はアミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも１０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全長にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４６、８７、９８および１０２の任意の１つのアミノ酸配列に少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して上に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
【０１７２】
配列番号４６、８７、９８および１０２の任意の１つの変種は、野生型配列のＲｅｃＤ様モチーフＩおよび／またはＲｅｃＤ様モチーフＶを好ましくは含む。しかし配列番号４６、８７、９８または１０２の変種は、野生型配列とは異なるＲｅｃＤ様モチーフＩおよび／または伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＶを含んでよい。例えば変種は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表５および７ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示す好ましいモチーフの任意の１つを含んでよい。配列番号４６、８７、９８および１０２の変種は、野生型配列のＲｅｃＤ様モチーフＩおよびＶ内に修飾を含んでよい。配列番号４６、８７、９８または１０２の変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
【０１７３】
ヘリカーゼは好ましくはＸＰＤヘリカーゼである。ＸＰＤヘリカーゼは、オリゴマーを形成することなく機能することから単量体である。任意のＸＰＤヘリカーゼが本発明により使用できる。ＸＰＤヘリカーゼはＲａｄ３ヘリカーゼとしても公知であり、２つの用語は互換的に使用できる。
【０１７４】
ＸＰＤヘリカーゼの構造は、当技術分野において公知である（Cell. 2008 May 30;133(5):801-12. Structure of the DNA repair helicase XPD. Liu H、Rudolf J、Johnson KA、McMahon SA、Oke M、Carter L、McRobbie AM、Brown SE、Naismith JH、White MF）。ＸＰＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｅ−Ｇ（本明細書以下でＸＰＤモチーフＶと称する；配列番号５０）を典型的には含む。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、好ましくは荷電していない。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、好ましくはＨではない。Ｘ１は、より好ましくはＶ、Ｌ、Ｉ、ＳまたはＹである。Ｘ５は、より好ましくはＶ、Ｌ、Ｉ、ＮまたはＦである。Ｘ６は、より好ましくはＳまたはＡである。Ｘ３およびＸ４は、任意のアミノ酸残基であってよい。Ｘ４は、好ましくはＫ、ＲまたはＴである。
【０１７５】
ＸＰＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｇ−Ｒ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｒ−（Ｘｅ）３−Ｘｆ−（Ｘｇ）７−Ｄ−Ｘｈ−Ｒ（本明細書以下でＸＰＤモチーフＶＩと称する；配列番号５１）を典型的には含む。Ｘａ、ＸｅおよびＸｇは任意のアミノ酸残基であってよい。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄはＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、典型的にはＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、好ましくは荷電していない。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、好ましくはＨではない。Ｘｂは、より好ましくはＶ、Ａ、Ｌ、ＩまたはＭである。Ｘｃは、より好ましくはＶ、Ａ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＣである。Ｘｄは、より好ましくはＩ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、ＭまたはＶである。Ｘｆは、ＤまたはＥであってよい。（Ｘｇ）７はＸｇ１、Ｘｇ２、Ｘｇ３、Ｘｇ４、Ｘｇ５、Ｘｇ６およびＸｇ７である。Ｘｇ２は、好ましくはＧ、Ａ、ＳまたはＣである。Ｘｇ５は、好ましくはＦ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ａ、ＷまたはＹである。Ｘｇ６は、好ましくはＬ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、ＩまたはＶである。Ｘｇ７は、好ましくはＡ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＳである。
【０１７６】
ＸＰＤヘリカーゼは、ＸＰＤモチーフＶおよびＶＩを好ましくは含む。最も好ましいＸＰＤモチーフＶおよびＶＩは、米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６１として公開）に示されている。
【０１７７】
ＸＰＤヘリカーゼは、硫化鉄（ＦｅＳ）コアを２つのウォーカーＡおよびＢモチーフ（モチーフＩおよびＩＩ）の間に好ましくはさらに含む。ＦｅＳコアは、システイン残基のスルフィド基の間に配位した鉄原子を典型的には含む。ＦｅＳコアは、典型的には四面体である。
【０１７８】
ＸＰＤヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表４または５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６１として公開）に示されているヘリカーゼの１つまたはその変種である。ＸＰＤヘリカーゼは、配列番号５２に示されている配列またはその変種を最も好ましくは含む。配列番号５２は、ＸＰＤ  Ｍｂｕ（メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）；ＹＰ＿５６６２２１．１；ＧＩ：９１７７３５２９）である。ＸＰＤ  Ｍｂｕは、ＹＬＷＧＴＬＳＥＧ（モチーフＶ；配列番号５３）およびＱＡＭＧＲＶＶＲＳＰＴＤＹＧＡＲＩＬＬＤＧＲ（モチーフＶＩ；配列番号５４）を含む。
【０１７９】
ＸＰＤヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼのものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。これは、上に記載のとおり測定され得る。具体的には配列番号５２の変種は、配列番号５２のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。変種は、ヘリカーゼ活性を保持している。変種は、下に考察する２つのモードの少なくとも１つで作動しなければならない。好ましくは、変種は両方のモードで作動する。変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、上で考察したＸＰＤモチーフＶおよびＶＩの外の領域において野生型ヘリカーゼとは典型的には異なる。しかし変種は、これらのモチーフの１つまたは両方の内に修飾を含む場合がある。
【０１８０】
配列番号５２のアミノ酸配列の全長にわたって、配列番号１０などの変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも１０％、好ましくは３０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸配列に配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して上に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
【０１８１】
配列番号５２の変種は、野生型配列のＸＰＤモチーフＶおよび／またはＸＰＤモチーフＶＩを好ましくは含む。配列番号５２の変種は、配列番号５２のＸＰＤモチーフＶおよびＶＩの両方をより好ましくは含む。しかし、配列番号５２の変種は、野生型配列とは異なるＸＰＤモチーフＶおよび／またはＶＩを含む場合がある。例えば、配列番号５２の変種は、米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６１として公開）に示されている好ましいモチーフの任意の１つを含む場合がある。配列番号５２の変種は、野生型配列のＸＰＤモチーフＶおよび／またはＸＰＤモチーフＶＩ内に修飾も含む場合がある。これらのモチーフへの好適な修飾は、２つのモチーフを定義する際に上に考察されている。配列番号５２の変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
【０１８２】
ヘリカーゼは、米国仮特許出願第６１／６７３，４５２号（２０１２年７月１９日出願）、米国仮特許出願第６１／７７４，８６２号（２０１３年３月８日出願）および本出願と同時に出願された国際出願に記載および特許請求されているいずれの修飾ヘリカーゼであってもよい（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｒｅｆ：ＯＮＴ  ＩＰ  ０３３）。
【０１８３】
ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する１つまたは複数の位置への１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸が、より好ましくは導入されるＨｅｌ３０８ヘリカーゼであり、ここでヘリカーゼはポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している。
【０１８４】
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む、配列番号１０、１３、１６または１９の１つの変種を好ましくは含む。
【０１８５】
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む、配列番号１０、１３、１６または１９の１つの変種を好ましくは含む。
【０１８６】
下の表３ａおよび３ｂは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する、他のＨｅｌ３０８ヘリカーゼにおける位置を示す。別のＨｅｌ３０８ヘリカーゼにおける対応する位置の欠如は「−」と印を付ける。
【０１８７】
【表３ａ】
0006429773.tif 000006
【０１８８】
【表３ｂ】
0006429773.tif 000007
【０１８９】
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む、配列番号１０、１３、１６または１９の１つの変種を好ましくは含む。ヘリカーゼは、表３ａの各列にＡからＧと標識の位置の次の任意の組合せに１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含んでよい：｛Ａ｝、｛Ｂ｝、｛Ｃ｝、｛Ｄ｝、｛Ｇ｝、｛Ｅ｝、｛Ｆ｝、｛ＡおよびＢ｝、｛ＡおよびＣ｝、｛ＡおよびＤ｝、｛ＡおよびＧ｝、｛ＡおよびＥ｝、｛ＡおよびＦ｝、｛ＢおよびＣ｝、｛ＢおよびＤ｝、｛ＢおよびＧ｝、｛ＢおよびＥ｝、｛ＢおよびＦ｝、｛ＣおよびＤ｝、｛ＣおよびＧ｝、｛ＣおよびＥ｝、｛ＣおよびＦ｝、｛ＤおよびＧ｝、｛ＤおよびＥ｝、｛ＤおよびＦ｝、｛ＧおよびＥ｝、｛ＧおよびＦ｝、｛ＥおよびＦ｝、｛Ａ、ＢおよびＣ｝、｛Ａ、ＢおよびＤ｝、｛Ａ、ＢおよびＧ｝、｛Ａ、ＢおよびＥ｝、｛Ａ、ＢおよびＦ｝、｛Ａ、ＣおよびＤ｝、｛Ａ、ＣおよびＧ｝、｛Ａ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ、ＣおよびＦ｝、｛Ａ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、ＣおよびＤ｝、｛Ｂ、ＣおよびＧ｝、｛Ｂ、ＣおよびＥ｝、｛Ｂ、ＣおよびＦ｝、｛Ｂ、ＤおよびＧ｝、｛Ｂ、ＤおよびＥ｝、｛Ｂ、ＤおよびＦ｝、｛Ｂ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、ＧおよびＦ｝、｛Ｂ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、または｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝。
【０１９０】
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１０、１３、１６または１９の１つの変種をより好ましくは含む。
【０１９１】
ポリヌクレオチド結合成分
本明細書に記載の構築物は、追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む。ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチドに結合できるポリペプチドである。成分は、規定のポリヌクレオチド配列に好ましくは特異的結合できる。換言すると成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に好ましくは結合するが、少なくとも１０分の１の結合を異なる配列に、またはより好ましくは少なくとも１００分の１の結合を異なる配列に、または最も好ましくは少なくとも１０００分の１の結合を異なる配列に示す。異なる配列は無作為配列であってよい。いくつかの実施形態では成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合するが、異なる配列への結合は測定できない。特異的配列に結合する成分は、そのような配列に標的化される構築物を設計するために使用され得る。
【０１９２】
成分は、典型的にはポリヌクレオチドの少なくとも１つの特徴と相互作用および改変する。成分は、個々のヌクレオチドまたは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。成分は、ポリヌクレオチドを特異的位置に方向付けるまたは移動させること、すなわちその移動を制御することによってそれを修飾できる。
【０１９３】
核酸などのポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含み得る。ヌクレオチドは、天然に存在するものまたは人工的であってよい。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷をうけ得る。例えばポリヌクレオチドは、ピリミジン二量体を含む場合がある。そのような二量体は、紫外光による障害に典型的には関連し、皮膚メラノーマの主原因である。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば標識またはタグで、修飾され得る。好適な標識は、上に記載されている。標的ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含み得る。
【０１９４】
ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は典型的には複素環である。核酸塩基は、これだけに限らないがプリンおよびピリミジンならびにより具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンを含む。糖は典型的には五炭糖である。ヌクレオチド糖は、これだけに限らないがリボースおよびデオキシリボースを含む。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは典型的には一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着できる。
【０１９５】
ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）およびデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を含む。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。
【０１９６】
ヌクレオチドは、塩基を持たない場合がある（すなわち核酸塩基を欠失している）。ヌクレオチドは、核酸塩基および糖も欠失している場合がある（すなわちＣ３スペーサーである）。
【０１９７】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で相互に付着されてよい。ヌクレオチドは、核酸においてと同様にそれらの糖およびリン酸基により典型的には付着されている。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体においてと同様にそれらの核酸塩基を介して繋がれてよい。
【０１９８】
ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であってよい。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、好ましくは２本鎖である。
【０１９９】
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であってよい。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本鎖にハイブリダイズしたＲＮＡの１本鎖を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当技術分野において公知の任意の合成核酸であってよい。
【０２００】
成分の三次構造が公知であることは好ましい。成分の三次元構造の知識は、構築物におけるその機能を促進するために成分に修飾を作製できるようにする。
【０２０１】
成分は、任意のサイズであってよく、任意の構造を有してよい。例えば成分は、二量体または三量体などのオリゴマーである場合がある。成分は、好ましくは１つの単量体から形成された小さな球状ポリペプチドである。そのような成分は操作が容易であり、ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力を、特にヘリカーゼの配列に融合または挿入された場合に、干渉しにくい。
【０２０２】
成分のアミノおよびカルボキシ末端は、好ましくは近接近にある。成分のアミノおよびカルボキシ末端は、成分の同じ面により好ましくは存在する。そのような実施形態は、ヘリカーゼの配列中への成分の挿入を促進する。例えば成分のアミノおよびカルボキシ末端が近接近にある場合、それぞれはヘリカーゼの配列中の隣接アミノ酸への遺伝子的融合によって付着され得る。
【０２０３】
成分の活性部位の位置および機能が公知であることも好ましい。これは、成分の活性を消滅させる活性部位に修飾が作製されることを防ぐ。これは成分がヘリカーゼに付着できるようにし、成分はポリヌクレオチドに結合し、その移動を制御する。成分がポリヌクレオチドに結合および方向付けられる方法の知識は、有効な構築物を設計できるようにする。
【０２０４】
本明細書に記載の構築物は鎖配列決定法において有用である。成分は、鎖配列決定法およびヌクレオチドの識別に適合性である緩衝液バックグラウンドにおいてポリヌクレオチドに好ましくは結合する。成分は、１００ｍＭから２Ｍなどの通常の生理学的レベルを大幅に上回る塩濃度において少なくとも残存活性を好ましくは有する。成分は、高塩濃度でのその活性を増大させるためにより好ましくは修飾される。成分は、その前進性、安定性および有効期間を改善するために修飾されてもよい。
【０２０５】
好適な修飾は、好塩性、中度好塩性細菌、好熱性および中等度好熱性生物などの好極限性細菌（extremphile）、ならびに中温性または好熱性エキソヌクレアーゼの耐塩性、安定性および温度依存性を変更するための定向進化手法由来のポリヌクレオチド結合成分の特性決定から決定され得る。
【０２０６】
ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（helix-hairpin-helix）（ＨｈＨ）ドメイン、真核生物１本鎖結合タンパク質（single-stranded binding protein）（ＳＳＢ）、細菌性ＳＳＢ、古細菌ＳＳＢ、ウイルス性ＳＳＢ、２本鎖結合タンパク質、スライディングクランプ、前進性因子（processivity factor）、ＤＮＡ結合ループ、複製開始タンパク質、テロメア結合タンパク質、リプレッサー、亜鉛フィンガーおよび増殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen）（ＰＣＮＡ）から独立に選択される１つまたは複数のドメインを好ましくは含む。
【０２０７】
ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメインは、ＤＮＡに配列非特異的様式で結合するポリペプチドモチーフである。それらは、ポリメラーゼに融合された場合に塩安定性および前進性を付与し、それらの熱安定性を増大させることが示されている。好適なドメインは、メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソメラーゼＶ（配列番号８９）由来のドメインＨ（残基６９６〜７５１）およびドメインＨＩ（残基６９６〜８０２）を含む。下の考察のとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、配列番号９４に示す配列番号８９のドメインＨ〜Ｌであってよい。メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソメラーゼＶは、下に考察の２本鎖結合タンパク質の一例である。
【０２０８】
ＨｈＨドメインは、配列番号５５もしくは７５もしくは７６に示す配列またはその変種を好ましくは含む。このドメインは、本明細書に記載の構築物において使用された場合にヘリカーゼの前進性および耐塩性を増大させる。配列番号５５もしくは７５もしくは７６の変種は、配列番号５５または７５または７６のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号５５または７５または７６に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号５５または７５または７６と異なっていてよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
【０２０９】
ＳＳＢは、高親和性で配列非特異的様式で１本鎖ＤＮＡに結合する。それらは、全ての生き物に種々の形態で存在し、単量体または多量体としてＤＮＡに結合する。アミノ酸配列の配列比較およびアルゴリズム（Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルなど）を使用して、ＳＳＢはそれらの配列相同に従って分類され得る。Ｐｆａｍファミリー、ＰＦ００４３６は、全てが公知のＳＳＢに配列類似性を示すタンパク質を含む。ＳＳＢのこの群は、次いでタンパク質の構造分類（Structural Classification of Proteins）（ＳＣＯＰ）に従ってさらに分類され得る。ＳＳＢは、次の系列に分けられる：クラス；全てのベータタンパク質、フォールド；ＯＢ−フォールド、スーパーファミリー：核酸結合タンパク質、ファミリー；１本鎖ＤＮＡ結合ドメイン、ＳＳＢ。このファミリー内でＳＳＢは、各サブファミリー内でしばしば特性決定されるいくつかの型の分子種を含むサブファミリーに分類され得る。
【０２１０】
ＳＳＢは、ヒト、マウス、ラット、真菌、原虫または植物など由来の真核生物由来、細菌および古細菌などの原核生物由来またはウイルス由来であってよい。
【０２１１】
真核性ＳＳＢは、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）として公知である。多くの場合それらは、さまざまなサイズの単位から形成されたヘテ三量体である。大きな単位（例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲＰＡ７０）のいくつかは安定であり、単量体形態でｓｓＤＮＡに結合する。
【０２１２】
細菌性ＳＳＢは安定なホモ四量体（例えば大腸菌（E.coli）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））またはホモ二量体（例えばディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima））としてＤＮＡに結合する。古細菌ゲノム由来のＳＳＢは、真核ＲＰＡと関連すると考えられている。クレン古細菌門スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）によってコードされるＳＳＢなどのそのいくつかは、ホモ四量体である。他の大部分の種由来のＳＳＢは、真核生物由来の複製タンパク質に密接に関連しており、ＲＰＡと称される。これらの種のいくつかにおいて、それらは単量体であることが示されている（メタノコッカス・ジャンナスキイ（Methanococcus jannaschii）およびメタノサーモバクター・サーモオートトロフィクカム（Methanothermobacter thermoautotrophicum）。さらに、アーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）およびメタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）を含む古細菌の他の種は、ＲＰＡに配列類似性を有する２つのオープンリーディングフレームをそれぞれ含有すると考えられている。タンパク質レベルでの証拠はなく、それらのＤＮＡ結合能力またはオリゴマー状態に関する公表されたデータもない。しかし、これらの各遺伝子中の２つのオリゴヌクレオチド／オリゴ糖（oligonucleotide/oligosaccharide）（ＯＢ）フォールドの存在（Ｍ．ブルトニイ（M.burtonii）ＯＲＦの１つの場合にはＯＢフォールド３個）はそれらも１本鎖ＤＮＡに結合することを示唆している。
【０２１３】
ウイルス性ＳＳＢは、単量体としてＤＮＡに結合する。このことおよびそれらの比較的小さなサイズは、それらを、例えば可動性ペプチドリンカーを介して他のタンパク質に遺伝子的に融合しやすくする。代替的にＳＳＢは、別々に発現され、化学的方法（例えばシステイン、非天然アミノ酸）によって他のタンパク質に付着される場合がある。これは下でより詳細に考察される。
【０２１４】
ＳＳＢは、好ましくは（ｉ）正味の負電荷を有さないカルボキシ末端（Ｃ末端）領域を含むＳＳＢ（ｉｉ）Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそのＣ末端領域に含む修飾ＳＳＢのいずれかである。そのようなＳＳＢは、膜貫通ポアを遮断せず、したがって標的ポリヌクレオチドの特性決定を可能にする。
【０２１５】
正味の負電荷を有さないＣ末端領域を含むＳＳＢの例は、これだけに限らないが、ヒトミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ；配列番号７７、ヒト複製タンパク質Ａ  ７０ｋＤａサブユニット、ヒト複製タンパク質Ａ  １４ｋＤａサブユニット、オキシトリカ・ノバ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質アルファサブユニット、オキシトリカ・ノバ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質ベータサブユニットのコアドメイン、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のテロメアタンパク質１（Ｐｏｔ１）の保護、ヒトＰｏｔ１、マウスまたはラット由来ＢＲＣＡ２のＯＢ−フォールドドメイン、ｐｈｉ２９由来のｐ５タンパク質（配列番号７８）またはこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。変種は、野生型タンパク質から変化したアミノ酸配列を有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。ポリヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる（上に記載のとおり）。例えば、１本鎖ポリヌクレオチドに結合する変種の能力は、実施例に記載のとおり決定され得る。
【０２１６】
配列番号７７または７８の変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号７７または７８に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号７７または７８と異なっていてよい。具体的には変種は、表８および９に示す１つまたは複数の保存的置換を有する場合がある。
【０２１７】
正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそれらのＣ末端領域に必要とするＳＳＢの例は、これだけに限らないが、大腸菌（E. coli）のＳＳＢ（ＥｃｏＳＳＢ；配列番号７９、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）のＳＳＢ、ディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）のＳＳＢ、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophiles）のＳＳＢ、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来ＳＳＢ、ヒト複製タンパク質Ａ  ３２ｋＤａサブユニット（ＲＰＡ３２）断片、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＣＤＣ１３  ＳＳＢ、大腸菌（E. coli）由来プライモソーム複製タンパク質Ｎ（Primosomal replication protein N）（ＰｒｉＢ）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来ＰｒｉＢ、仮説タンパク質Ａｔ４ｇ２８４４０、Ｔ４由来ＳＳＢ（ｇｐ３２；配列番号８０）、ＲＢ６９由来ＳＳＢ（ｇｐ３２；配列番号５６）、Ｔ７由来ＳＳＢ（ｇｐ２．５；配列番号５７）またはこれらの任意のタンパク質の変種を含む。したがって本発明の方法において使用されるＳＳＢは、これらのタンパク質のいずれかに由来してよい。
【０２１８】
Ｃ末端領域中の１つまたは複数の修飾に加えて、方法において使用されるＳＳＢはＣ末端領域の外側にあるまたはＣ末端領域の正味の負電荷を減少させない追加的修飾を含んでよい。換言すると本発明の方法において使用されるＳＳＢは、野生型タンパク質の変種に由来する。変種は、野生型タンパク質のものから変化しているアミノ酸配列を有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。ポリヌクレオチド結合活性は、上に考察したとおり決定され得る。
【０２１９】
本発明において使用されるＳＳＢは、配列番号５６、５７、７９または８０の変種に由来してよい。換言すると配列番号５６、５７、７９または８０の変種は、本発明において使用されるＳＳＢのための出発点として使用できるが、実際に使用されるＳＳＢは、Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそのＣ末端領域にさらに含む。配列番号５６、５７、７９または８０の変種は、配列番号５６、５７、７９または８０にアミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号５６、５７、７９または８０と異なっていてよい。具体的には変種は、表８および９に示す１つまたは複数の保存的置換を有してよい。
【０２２０】
通常のタンパク質ＮからＣへの命名法に従ってＳＳＢのＣ末端領域を同定することは容易である。ＳＳＢのＣ末端領域は、ＳＳＢのＣ末端の最後の３分の１などの好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約３分の１である。ＳＳＢのＣ末端領域は、より好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の４分の１、５分の１または８分の１などのＳＳＢのＣ末端の最後の約４分の１、５分の１または８分の１である。ＳＳＢの最後の３分の１、４分の１、５分の１または８分の１は、アミノ酸の数を単位としてまたはＳＳＢタンパク質の一次構造の実際の長さを単位として測定されてよい。ＮからＣ方向での種々のアミノ酸の長さは、当技術分野において公知である。
【０２２１】
Ｃ末端領域は、好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１０から最後の約６０アミノ酸である。Ｃ末端領域は、より好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１５、最後の約２０、最後の約２５、最後の約３０、最後の約３５、最後の約４０、最後の約４５、最後の約５０または最後の約５５アミノ酸である。
【０２２２】
Ｃ末端領域は、グリシンおよび／またはプロリンのリッチ領域を典型的には含む。このプロリン／グリシンリッチ領域は、Ｃ末端領域に可動性を与え、Ｃ末端領域を同定するために使用され得る。
【０２２３】
正味の負電荷を減少させるための好適な修飾は、米国仮特許出願第６１／６７３，４５７号（２０１２年７月１９日出願）、米国仮特許出願第６１／７７４，６８８号（２０１３年３月８日出願）および本出願と同時に出願された国際出願に開示されている（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｒｅｆ：ＯＮＴ  ＩＰ  ０３５）。ＳＳＢは、米国仮特許出願および国際出願に開示されているいずれのＳＳＢであってもよい。
【０２２４】
修飾ＳＳＢは、配列番号６４、６５および８１から８４に示されるものから選択される配列を最も好ましくは含む。
【０２２５】
２本鎖結合タンパク質は高親和性で２本鎖ＤＮＡに結合する。好適な２本鎖結合タンパク質は、これだけに限らないがミューテーターＳ（ＭｕｔＳ；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿４１７２１３．１；配列番号１０５）、Ｓｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sufolobus solfataricus）Ｐ２；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４３８８９．１；配列番号１０６；Nucleic Acids Research、2004、Vol 32、No. 3、1197-1207）、Ｓｓｏ１０ｂ１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４６．１；配列番号１０７）、Ｓｓｏ１０ｂ２（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４８．１；配列番号１０８）トリプトファンリプレッサー（Ｔｒｐリプレッサー；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿２９１００６．１；配列番号１０９）、ラムダリプレッサー（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４０６２８．１；配列番号１１０）、Ｃｒｅｎ７（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４５９．１；配列番号１１１）、主なヒストンクラスＨ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６６４０３．２；配列番号１１２）、ｄｓｂＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４９８５８．１；配列番号１１３）、Ｒａｄ５１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２８６６．２；配列番号１１４）、スライディングクランプおよびトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ（配列番号８９）またはこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。配列番号８９、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３または１１４の変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号８９、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３または１１４に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種は、ヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号８９、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３または１１４と異なっていてよい。具体的には変種は、表８および９に示す１つまたは複数の保存的置換を有する場合がある。大部分のポリメラーゼは、スライディングクランプと相互作用することにより前進性を達成している。一般にこれらは、ｄｓＤＮＡの周囲を囲む多量体タンパク質（ホモ二量体またはホモ三量体）である。これらのスライディングクランプは、ＡＴＰ依存性プロセスでそれらをＤＮＡヘリックスの周囲に会合させるためにアクセサリータンパク質（クランプローダー）を必要とする。それらもＤＮＡと直接接触せず、形態的テザーとして作用する。スライディングクランプがポリメラーゼドメインを介する特異的様式で同族ポリメラーゼと相互作用することから、この断片はヘリカーゼのスライディングクランプへの動員刺激のためにヘリカーゼに融合され得る。この相互作用は共有結合の作製によってさらに安定化され得る（システインまたは非天然アミノ酸の導入）。
【０２２６】
ＤＮＡスライディングクランプに関して前進性因子は、それらの同族ポリメラーゼをＤＮＡに固着させるウイルス性タンパク質であり、作製される断片の長さの劇的な増大を導く。それらは、単量体（単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）１由来ＵＬ４２についての場合）または多量体（サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）由来ＵＬ４４は二量体である）であってよく、それらはＤＮＡ鎖周囲に閉じた環を形成せず、それらはＤＮＡに直接接触する。ＵＬ４２は、その対応するポリメラーゼの速度を低減することなく前進性を増大させることが示されており、それがＳＳＢとは異なるモードでＤＮＡと相互作用することを示唆している。ＵＬ４２は、配列番号５８もしくは配列番号６３に示す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号５８または６３の変種は、配列番号５８または６３のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号５８または６３に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号５８または配列番号６３と異なっていてよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
【０２２７】
ＵＬ４２をヘリカーゼに付着させることは、遺伝子的融合または化学的付着（システイン、非天然アミノ酸）を介して行われ得る。ＵＬ４２に結合しているポリメラーゼポリペプチドが結晶構造において観察できることから、これらの３５アミノ酸（残基１２００〜１２３５）はヘリカーゼのＣ末端に融合でき、このポリペプチドと前進性因子との間の天然の親和性は複合体を形成するために使用される。相互作用は、共有結合相互作用（システインまたは非天然アミノ酸）を導入することによって安定化され得る。選択肢の１つは、ポリペプチド相互作用部位近くに位置付けられている天然ＵＬ４２システイン（Ｃ３００）を利用し、ポリメラーゼポリペプチドに点変異（例えばＬ１２３４Ｃ）を導入することである。
【０２２８】
ポリメラーゼ前進性を増大する報告された方法は、大腸菌（E.coli）チオレドキシン（Ｔｒｘ）とバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼのチオレドキシン結合ドメイン（ＴＢＤ）（残基２５８〜３３３）との間の相互作用を活用することである。ＴｒｘからＴＢＤへの結合は、ＤＮＡに結合するものへのコンホメーション変化をポリペプチドに生じさせる。ＴＢＤは、ＤＮＡ鎖上に固定され、ポリメラーゼオフ速度を限定し、それにより前進性を増大させると考えられている。キメラポリメラーゼは、ＴＢＤを非前進性ポリメラーゼに転移することによって作製され、重合された断片長の１０００倍増加を生じる。ＴＢＤを任意の他のクラスのタンパク質に付着させる試みはなかったが、ＴＢＤとＴｒｘとの間の共有結合は操作され、相互作用を安定化するために使用できる。
【０２２９】
いくつかのヘリカーゼは、前進性を達成するためにアクセサリータンパク質をｉｎ−ｖｉｖｏで使用する（例えば大腸菌（E.coli）Ｒｅｐヘリカーゼに関して、ファージΦｘ１７４由来ｃｉｓＡおよびファージＭ１３由来ｇｅｎｅ  ＩＩタンパク質）。これらのタンパク質のいくつかは、１つより多いヘリカーゼと相互作用することが示されている（例えばＭｕｔＬは同程度ではないがＵｖｒＤおよびＲｅｐの両方に作用する）。これらのタンパク質は内在性ＤＮＡ結合能力を有し、それらのいくつかは特異的ＤＮＡ配列を認識する。いくつかのこれらのアクセサリータンパク質のそれら自体を特異的ＤＮＡ配列に共有結合的に付着させる能力は、ヘリカーゼ活性についての一連の開始点を作出するためにも使用できる。
【０２３０】
染色体の末端を保護するタンパク質は、テロメアｓｓＤＮＡ配列に高特異性の様式で結合する。この能力は、そのまままたは配列特異性を消滅させる点変異を使用することによってのいずれかで活用され得る。
【０２３１】
小さなＤＮＡ結合モチーフ（ヘリックス−ターン−ヘリックスなど）は、特異的ＤＮＡ配列を認識する。バクテリオファージ４３４リプレッサーの場合、６２残基断片が操作され、ＤＮＡ結合能力および特異性を保持していることが示されている。
【０２３２】
真核生物タンパク質における豊富なモチーフ、亜鉛フィンガーは特異的様式でＤＮＡに結合するおよそ３０アミノ酸からなる。典型的には各亜鉛フィンガーは３個のＤＮＡ塩基だけを認識するが、マルチプルフィンガーはより長い配列を認識するために連結されてよい。
【０２３３】
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡを引き上げるおよび下げる非常に堅固なクランプ（ドーナツ）を形成する。クレン古細菌門（crenarchaeota）由来ＰＣＮＡは、ヘテロ三量体になることが特有であり、それにより１つのサブユニットを機能化し、活性を保持することが可能である。そのサブユニットは、配列番号５９、６０および６１に示されている。ＰＣＮＡは、好ましくは配列番号５９、６０および６１に示す配列またはその変種を含む三量体である。ｐＣＮＡスライディングクランプ（ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ＿０６８６３０５０．１；配列番号１１５）は二量体を形成する。ｐＣＮＡは、好ましくは配列番号１１５またはその変種を含む二量体である。変種は、配列番号５９、６０、６１または１１５から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって配列番号５９、６０、６１および１１５のそれぞれに少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を有する配列を含む典型的には三量体であり、ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号５９、６０、６１または１１５と異なっている配列を含んでよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。好ましい実施形態では、サブユニット１および２（すなわち配列番号５９および６０またはその変種）は、遺伝子的に融合されるなど付着し、得られたタンパク質は構築物を形成するようにヘリカーゼに付着される。構築物の使用の際にサブユニット３（すなわち配列番号６１またはその変種）は、構築物がポリヌクレオチドに結合すると、ＰＣＮＡクランプ（またはドーナツ）を完了するために付加される場合がある。好ましい実施形態では、１つの単量体（すなわち配列番号１１１またはその変種）は、遺伝子的に融合されているなど、付着されていて、得られるタンパク質は本発明の構築物を形成するようにヘリカーゼに付着されている。構築物の使用の際に第二の単量体（すなわち配列番号１１１またはその変種）は、構築物がポリヌクレオチドに結合すると、ＰＣＮＡクランプ（またはドーナツ）を完了するために付加される場合がある。
【０２３４】
ポリヌクレオチド結合モチーフは、下の表４に示すもののいずれかから選択されてよい。
【０２３５】
【表４】
0006429773.tif 000008
0006429773.tif 000009
0006429773.tif 000010
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【０２３６】
ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチド結合酵素に好ましくは由来する。ポリヌクレオチド結合酵素は、ポリヌクレオチドに結合でき、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特徴と相互作用し、修飾するポリペプチドである。酵素は、個々のヌクレオチドまたは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。酵素は、ポリヌクレオチドを特異的位置に方向付けるまたは移動させることによってそれを修飾できる。ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できる限り酵素活性を示す必要はない。例えば成分は、その酵素活性を除去するように修飾されている酵素由来であってよく、またはそれが酵素として作用することを妨げる条件下で使用されてよい。
【０２３７】
ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくは核酸分解酵素由来である。酵素は、より好ましくは酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバー由来である。酵素は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のもののいずれかであってよい。
【０２３８】
好ましい酵素は、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヘリカーゼおよび、ジャイレースなどのトポイソメラーゼである。好適なエキソヌクレアーゼは、これだけに限らないが、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素、高度好熱菌（T. thermophilus）由来ＲｅｃＪならびにバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼおよびその変種を含む。
【０２３９】
ポリメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群２．７．７．６、２．７．７．７、２．７．７．１９、２．７．７．４８および２．７．７．４９のいずれかのメンバーである。ポリメラーゼは、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６２）由来である。成分は、配列番号６２に示す配列またはその変種を含む場合がある。配列番号６２の変種は、配列番号６２のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含む場合がある。
【０２４０】
配列番号６２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて配列の全長にわたって配列番号６２のアミノ酸配列に少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上のストレッチ、例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
【０２４１】
ヘリカーゼは、上に考察したもののいずれであってもよい。ヘリカーゼ二量体および多量体は下に詳細に考察される。ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼ由来のポリヌクレオチド結合ドメインであってよい。例えばポリヌクレオチド結合成分は、配列番号６６または６７に示す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号６６または６７の変種は、配列番号６６または６７のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含む場合がある。
【０２４２】
配列番号６６または６７のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて配列番号６６または６７のアミノ酸配列の配列の全長にわたって少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が４０以上のストレッチ、例えば５０、６０、７０または８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
【０２４３】
トポイソメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のいずれかのメンバーである。
【０２４４】
ポリヌクレオチド結合成分は、上に考察したいずれの酵素であってもよい。構築物は、ポリメラーゼ、トポイソメラーゼまたはプライマーゼに付着しているヘリカーゼを好ましくは含まない。構築物は、互いに付着している２つ以上のＮＳ３ヘリカーゼを好ましくは含まない。構築物は、ビス（スルホサクシニミジル）スベレート（ＢＳ３）を使用して互いに付着している２つ以上のＮＳ３ヘリカーゼをより好ましくは含まない。
【０２４５】
成分は、明示用標識（revealing label）で標識されてよい。標識は、上に記載のもののいずれであってもよい。
【０２４６】
成分は、大腸菌（E. coli）、Ｔ．サーモフィルス（T. thermophilus）またはバクテリオファージ、などの任意の成分産生生物から単離され得る、または合成的もしくは組換え的手段によって作製できる。例えば成分は、下に記載のとおりｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写によって合成できる。成分は、下に記載のとおり大規模に産生されてよく、精製が続く。
【０２４７】
好ましい構築物
上の考察から明らかであるとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼに好ましくは由来する。例えばそれは、ヘリカーゼ由来ポリヌクレオチドドメインであってよい。成分は、１つまたは複数のヘリカーゼをより好ましくは含む。ヘリカーゼは、上に考察したもののいずれであってもよい。そのような実施形態では構築物は、互いに付着している２個以上のヘリカーゼを当然ながら含む。本発明は、互いに付着している２つ以上のヘリカーゼを含む構築物を提供する。上に考察したとおり各ヘリカーゼは、そのままでヘリカーゼとして機能できなければならない。本発明の方法において使用できる構築物、具体的には使用できるヘリカーゼの型および付着方法を参照して上に考察の任意の実施形態は、本発明の構築物に等しく適用可能である。２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは単量体ヘリカーゼである。２つ以上のヘリカーゼは、好ましくはヘリカーゼ酵素由来の２つ以上のヘリカーゼドメインではない。
【０２４８】
本発明の構築物は、互いに付着している２つ以上のＮＳ３ヘリカーゼを好ましくは含まない。本発明の構築物は、ビス（スルホサクシニミジル）スベレート（ＢＳ３）を使用して互いに付着している２つ以上のＮＳ３ヘリカーゼをより好ましくは含まない。
【０２４９】
構築物は、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のヘリカーゼを含んで良い。換言すると本発明の構築物は、ヘリカーゼ二量体、ヘリカーゼ三量体、ヘリカーゼ四量体、ヘリカーゼ五量体などを含んでよい。
【０２５０】
２つ以上のヘリカーゼは、任意の方向で互いに付着していてよい。同一または類似のヘリカーゼは、各ヘリカーゼ中の同一のアミノ酸残基（すなわち同じ位置）または空間的に近接しているアミノ酸残基（すなわち空間的に近接している位置）を介して付着してよい。これは、「ヘッドトゥーヘッド」編成と呼ばれる。代替的に同一または類似のヘリカーゼは、各ヘリカーゼの反対または異なる側のアミノ酸残基（または位置）を介して付着してよい。これは、「ヘッドトゥーテール」編成と呼ばれる。３つの同一のまたは類似のヘリカーゼを含むヘリカーゼ三量体は、ヘッドトゥーヘッドおよびヘッドトゥーテール編成の両方を含む場合がある。
【０２５１】
２つ以上のヘリカーゼは、互いに異なっていてよい（すなわち構築物はヘテロ二量体、三量体、四量体または五量体などである）。例えば本発明の構築物は：（ａ）１つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼ；（ｂ）１つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼ；（ｃ）１つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＴｒａＩヘリカーゼ；（ｄ）１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼ；（ｅ）１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＴｒａＩヘリカーゼ；または（ｆ）１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＴｒａＩヘリカーゼを含む場合がある。構築物は、同じヘリカーゼの２つの異なる変種を含む場合がある。例えば構築物は、各変種において異なる位置に導入された１つまたは複数のシステイン残基またはＦａｚ残基を有する、上に考察したヘリカーゼの内の１つの２つの変種を含む場合がある。この場合ヘリカーゼは、ヘッドトゥーテール編成であってよい。好ましい実施形態では、Ｑ４４２Ｃを含む配列番号１０の変種はシステイン連結を介してＱ５５７Ｃを含む配列番号１０の変種に付着されてよい。Ｈｅｌ３０８ＭｂｕのＣｙｓ変異体は、必要に応じてヘテロ二量体に作製されてもよい。この手法ではＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｑ４４２ＣおよびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｑ５７７Ｃなどの２つの異なるＣｙｓ変異体対は、ヘッドトゥーテール様式で連結されてよい。ヘテロ二量体は、２つの可能な方法で形成されてもよい。第一は、上に考察したホモ二機能性リンカーの使用を含む。ヘリカーゼ変種の１つは、１つのリンカーがタンパク質の１分子に付着されるように大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾変種は、次いで未修飾タンパク質、潜在的ホモ二量体、および他のヘリカーゼ変種と反応する未反応リンカーから精製されてよい。得られた二量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。
【０２５２】
第二は、ヘテロ二機能性リンカーの使用を含む。例えばヘリカーゼ変種の１つは、一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基および他方の末端にシクロオクチン官能基（ＤＩＢＯ）を含有する第一のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。この一例は下に示される：
【０２５３】
【化３】
0006429773.tif 000013
【０２５４】
第二のヘリカーゼ変種は、一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基および他方の末端にアジド官能基を含有する第二のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。一例を下に示す：
【０２５５】
【化４】
0006429773.tif 000014
【０２５６】
２つの異なるリンカーを有する２つのヘリカーゼ変種は、次いで精製され、二量体を作製するために合わせてクリック（Ｃｕ２＋フリークリックケミストリーを使用する）されてよい。銅フリークリックケミストリーは、その望ましい特徴によりこれらの応用において使用されている。例えばそれは、迅速、清潔およびタンパク質に無毒である。しかし他の好適な生体直交型化学は、これだけに限らないが、シュタウディンガー化学、ヒドラジンまたはヒドラジド／アルデヒドまたはケトン試薬（ＨｙＮｉｃ＋４ＦＢ化学、全てのＳｏｌｕｌｉｎｋ（商標）試薬を含む）、ディール・アルダー試薬対およびボロン酸／サリチルヒドロキサム酸試薬を含む。
【０２５７】
同じヘリカーゼの２つの異なる変種を連結するこれらの２つの方法は、２つの異なるヘリカーゼの二量体およびヘリカーゼポリメラーゼ二量体などのヘリカーゼと成分とが互いに異なっている上に考察した構築物のいずれについても有効である。
【０２５８】
類似の方法がさまざまなＦａｚ変種を連結するために使用され得る。１つのＦａｚ変種（Ｑ４４２Ｃを含む配列番号１０など）は、１つのリンカーがタンパク質の１つの分子に付着されるように大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾Ｆａｚ変種は、次いで未修飾タンパク質、潜在的ホモ二量体、および第二のＦａｚ変種（Ｑ５７７Ｆａｚを含む配列番号１０など）と反応する未反応リンカーから精製されてよい。得られた二量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。
【０２５９】
ヘテロ二量体は、同じヘリカーゼまたは異なるヘリカーゼのシステイン変種とＦａｚ変種とを連結することによっても作製できる。例えば任意の上のシステイン変種（Ｑ４４２Ｃを含む配列番号１０など）は、任意の上のＦａｚ変種（Ｑ５７７Ｆａｚを含む配列番号１０など）と二量体を作製するために使用できる。一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能性および他方の末端にＤＢＣＯ官能性を有するヘテロ二機能性ＰＥＧリンカーは、この変異体の組合せにおいて使用できる。そのようなリンカーの一例は、下に示されている（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）：
【０２６０】
【化５】
0006429773.tif 000015
【０２６１】
リンカーの長さは、２つの官能基間のＰＥＧ単位の数を変えることによって変更できる。
【０２６２】
ヘリカーゼヘテロ三量体は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼおよびこれらの変種から選択される３種の異なる型のヘリカーゼを含んでよい。３個より多いヘリカーゼを含むオリゴマーについても同様である。構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、配列番号１０、１３、１６または１９の異なる変種などの同じヘリカーゼの異なる変種であってよい。異なる変種は、異なる位置を介する付着を促進するために異なる位置で修飾されてよい。ヘテロ三量体は、したがってヘッドトゥーテールおよびヘッドトゥーヘッド編成である場合がある。
【０２６３】
本発明の構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、互いに同じであってよい（すなわち構築物はホモ二量体、三量体、四量体または五量体などである）。ホモオリゴマーは、２つ以上のＨｅｌ３０８ヘリカーゼ、２つ以上のＸＰＤヘリカーゼ、２つ以上のＲｅｃＤヘリカーゼ、２つ以上のＴｒａＩヘリカーゼまたは２つ以上の上に考察した任意の変種を含んでよい。そのような実施形態ではヘリカーゼは、各ヘリカーゼ中の同じアミノ酸残基（すなわち同じ位置）を使用して好ましくは付着している。ヘリカーゼは、したがってヘッドトゥーヘッドで付着している。ヘリカーゼは、同じ位置でヘリカーゼに置換されているシステイン残基またはＦａｚ残基を使用して連結されてよい。同一のヘリカーゼ変種中のシステイン残基は、マレイミドまたはヨードアセトアミドなどのチオール反応性基を含有するホモ二機能性リンカーを使用して連結されてよい。これらの官能基は、次の例のとおりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の末端にあってよい：
【０２６４】
【化６】
0006429773.tif 000016
【０２６５】
リンカーの長さは、必要とされる応用に合わせて変更できる。例えばｎは、２、３、４、８、１１、１２、１６またはそれ以上であってよい。ＰＥＧリンカーは、水溶性などの好都合な特徴を有することから好適である。他の非ＰＥＧリンカーもシステイン連結において使用できる。
【０２６６】
同様の手法を使用することによって同一のＦａｚ変種は、ホモ二量体に作製され得る。ＤＩＢＯ官能基を有するホモ二機能性リンカーは、Ｃｕ２＋フリークリック化学を使用してホモ二量体を作製するために、同じＦａｚ変種の２分子を連結するために使用できる。リンカーの一例は下に示されている：
【０２６７】
【化７】
0006429773.tif 000017
【０２６８】
ＰＥＧリンカーの長さは、２、４、８、１２、１６またはそれ以上のＰＥＧ単位を含んで変化してよい。そのようなリンカーは、定量を容易にするために蛍光タグを組み込んで作製されてもよい。そのような蛍光タグは、マレイミドリンカーにも組み込まれ得る。
【０２６９】
本発明の好ましい構築物は下の表５に示されている。
【０２７０】
【表５】
0006429773.tif 000018
【０２７１】
本発明の好ましい構築物は、下の表６に示されている。各列は、左側のカラムのヘリカーゼが右側のカラムの追加的ポリヌクレオチド結合成分に本発明により付着している好ましい構築物を示す。
【０２７２】
【表６】
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【０２７３】
本発明は、ヘリカーゼおよび配列番号９４（メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来トポイソメラーゼＶ由来Ｈ−Ｌドメイン；配列番号８９）または配列番号９４の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９４に少なくとも８０％相同性を有するその変種を含むアミノ酸配列を含む構築物であって、ヘリカーゼがアミノ酸配列に付着されており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物も提供する。ヘリカーゼは、上に考察したいずれの方法でアミノ酸配列に付着されていてもよい。
【０２７４】
構築物は、配列番号９０または配列番号９０の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９０に少なくとも８０％相同性を有するその変種を好ましくは含む。
【０２７５】
配列番号９４または９０のアミノ酸配列の全長にわたって、変種はアミノ酸同一性に基づいて配列に好ましくは少なくとも８０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９４または９０のアミノ酸配列に少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であり得る。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上のストレッチ、例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
【０２７６】
ポリヌクレオチド配列
本発明は、２つ以上のヘリカーゼが遺伝子的に融合されている構築物をコードしているポリヌクレオチド配列も提供する。標準的技術を使用してそのようなポリヌクレオチド配列を作製することは容易である。ヘリカーゼをコードしているポリヌクレオチド配列は、別のヘリカーゼをコードしているポリヌクレオチド配列に融合または挿入されてもよい。融合または挿入は、典型的にはインフレームである。ヘリカーゼをコードしているポリヌクレオチド配列が別のヘリカーゼをコードしているポリヌクレオチド配列に挿入される場合、成分をコードしている配列はＢｓｐＥ１によって認識されるものなどの制限エンドヌクレアーゼ部位によって典型的には両端で隣接されている。それは、セリンまたはグリシンをそれぞれコードしている５から１０コドンなどのリンカーをコードしているポリヌクレオチド配列によって両端で隣接されている場合もある。
【０２７７】
ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して単離および複製され得る。染色体ＤＮＡは、メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）などのヘリカーゼ産生生物からおよび／または大腸菌（E. coli）、サーマスサーモフィルス（T. thermophilus）またはバクテリオファージ（bacteriophage）などの成分産生生物から抽出され得る。ヘリカーゼおよび成分をコードしている遺伝子は、特異的プライマーを伴うＰＣＲを使用して増幅され得る。増幅された配列は、次いでクローニングベクターなどの組換え複製可能ベクターに組み込まれてよい。ベクターは、適合性の宿主細胞においてポリヌクレオチドを複製するために使用され得る。したがってヘリカーゼおよび／または成分をコードしているポリヌクレオチド配列は、ヘリカーゼおよび／または成分をコードしているポリヌクレオチドを複製可能ベクターに導入し、ベクターを適合性の宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製され得る。ベクターは宿主細胞から回収され得る。ポリヌクレオチドのクローニングのために好適な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、下により詳細に記載される。
【０２７８】
ポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターにクローニングされてよい。発現ベクターでは構築物をコードしているポリヌクレオチド配列は、典型的には、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に作動可能に連結される。そのような発現ベクターは構築物を発現するために使用され得る。
【０２７９】
用語「作動可能に連結する」は、記載される構成成分がそれらが意図する様式で機能する関係の近位にあることを指す。コード配列に「作動可能に連結される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合性である条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。同じまたは異なるポリヌクレオチドの複数のコピーは、ベクターに導入されてよい。
【０２８０】
発現ベクターは、次いで好適な宿主細胞に導入されてよい。それにより構築物は、構築物をコードしているポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、ベクターを適合性の細菌宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって産生され得る。
【０２８１】
ベクターは、複製開始点、場合により前記ポリヌクレオチド配列の発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターと共に提供される例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってよい。ベクターは、１つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子、例えばアンピリシン耐性遺伝子を含有してよい。プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計された宿主細胞に適合性であるように選択されてよい。Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλＬプロモーターは典型的には使用される。
【０２８２】
宿主細胞は、典型的には高いレベルで構築物を発現する。構築物をコードしているポリヌクレオチド配列で形質転換される宿主細胞は、細胞を形質転換するために使用される発現ベクターに適合性であるように選ばれる。宿主細胞は、典型的には細菌性、好ましくは大腸菌（E. coli）である。λＤＥ３溶原菌を有する任意の細胞、例えばＣ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、ＯｒｉｇａｍｉおよびＯｒｉｇａｍｉ  Ｂは、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現できる。
【０２８３】
本発明の方法
本発明は、本発明の構築物、すなわち互いに付着している２つ以上のヘリカーゼを含む構築物を使用して標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを本発明の構築物と接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む。方法は、好ましくはポアに電位が印加されて実行される。下により詳細に考察されるとおり、印加された電位は、ポアと構築物との複合体の形成を典型的には生じる。印加された電位は、電圧電位であってよい。代替的に印加された電位は、化学電位であってよい。この一例は、両親媒性層全体に塩勾配を用いている。塩勾配は、Holdenら、J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5に開示されている。
【０２８４】
本発明は標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法も提供する。方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本明細書に記載の構築物に接触させて、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む。方法は、（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性の指標であり、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップも含む。
【０２８５】
ステップ（ａ）および（ｂ）は、上に考察したとおり好ましくはポアに電位が印加されて実行される。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流が標的ポリヌクレオチドの配列を決定するために使用される。これは、鎖配列決定法である。
【０２８６】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためである。ポリヌクレオチドは上に定義されている。
【０２８７】
標的ポリヌクレオチドの全体または部分だけは、本方法を用いて特性付けられ得る。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。例えばポリヌクレオチドは、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチド対であってよい。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド対以上、長さ５０００ヌクレオチド対以上または長さ１０００００ヌクレオチド対以上であってよい。
【０２８８】
標的ポリヌクレオチドは、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、標的ポリヌクレオチドを含有することが公知であるまたは含有すると考えられる試料について典型的には実行される。代替的に本発明は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの同一性を確認するために試料中でのその存在が公知であるまたは期待される試料について実行され得る。
【０２８９】
試料は生物学的試料であってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたまたは抽出された試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。生物または微生物は典型的には古細菌のもの、原核性または真核性であり、典型的には五界：植物界、動物界、菌界、モネラ界および原生生物界の１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られたまたは抽出された試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。試料は、好ましくは液体試料である。試料は典型的には、患者の体液を含む。試料は尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。典型的には試料は、ヒト由来であるが、代替的に、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育される動物由来などの別の哺乳動物由来であってもよく、代替的にネコまたはイヌなどの愛玩動物であってもよい。代替的に植物由来の試料は、穀類、マメ、果実または野菜などの商品作物（例えばコムギ、オオムギ、カラスムギ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマメ、サトウキビ、ココア、ワタ）から典型的には得られる。
【０２９０】
試料は、非生物学的試料であってよい。非生物学的試料は、好ましくは液体試料である。非生物学的試料の例は、手術用液（surgical fluids）、水（飲料水、海水または河川水など）および検査室検査のための試薬を含む。
【０２９１】
試料は、典型的にはアッセイされる前に例えば遠心分離によってまたは、不要の分子または細胞（赤血球細胞など）をろ過して除く膜を通すことによって処理される。試料は採取されてから直ちに測定されてよい。試料は、典型的にはアッセイの前に好ましくは−７０℃より低くで、保存されてもよい。
【０２９２】
膜貫通ポアは、ある程度膜を超える構造である。それは印加された電位によって駆動された水和イオンが膜を超えてまたは膜内に流れるようにする。膜貫通ポアは、典型的には膜全体を超え、それにより水和イオンは膜の一方の側から膜の他方の側へ流れられる。しかし膜貫通ポアは、膜を超えている必要はない。それは、一方の端で閉じていてもよい。例えばポアは、水和イオンが膜に沿ってまたは膜内に流れ得る穴であってもよい。
【０２９３】
任意の膜貫通ポアが本発明において使用され得る。ポアは、生物学的または人工であってよい。好適なポアは、これだけに限らないが、タンパク質ポア、ポリヌクレオチドポアおよびソリッドステートポアを含む。
【０２９４】
任意の膜が本発明により用いられ得る。好適な膜は、当技術分野において周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、少なくとも１つの親水性の部分および少なくとも１つの親油性または疎水性の部分の両方を有するリン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性層は単層または二重層であってよい。両親媒性分子は合成または天然に存在するものでよい。天然に存在しない両親媒性物質、および単層を形成する両親媒性物質は当技術分野において公知であり、例えばブロック共重合体（Gonzalez-Perezら、Langmuir、2009、25、10447-10450）を含む。ブロック共重合体は、２つ以上の単量体サブユニットが１本のポリマー鎖を作るように併せて重合されている重合体材料である。ブロック共重合体は、典型的には各単量体サブユニットによって寄与される特徴を有する。しかし、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成されたポリマーが有さない特有の特徴を有する場合がある。ブロック共重合は、単量体サブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）である一方で他のサブユニット（複数可）が水性媒体中では親水性であるように操作されてよい。この場合ブロック共重合体は、両親媒性特徴を有する場合があり、生物学的膜を模倣する構造を形成できる。ブロック共重合体は、ジブロック（２個の単量体サブユニットからなる）であってよいが、両親媒性物質として振る舞うさらに複雑な配置を形成するために２個より多い単量体サブユニットから構築されてもよい。共重合体はトリブロック、テトラブトックまたはペンタブロック共重合体であってもよい。
【０２９５】
両親媒性層は、典型的には平面状脂質二重層または支持された二重層である。
【０２９６】
両親媒性層は典型的には、脂質二重層である。脂質二重層は細胞膜のモデルであり、さまざまな実験研究のための優れたプラットフォームとして役立つ。例えば、脂質二重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査のために用いられ得る。代替的に脂質二重層は、さまざまな物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして用いられ得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。好適な脂質二重層は、これだけに限らないが平面状脂質二重層、支持された二重層またはリポソームを含む。脂質二重層は好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に開示されている。
【０２９７】
脂質二重層を形成するための方法は、当技術分野において公知である。好適な方法は実施例に開示する。脂質二重層は、脂質単層が水溶液／空気界面にその界面に垂直である開口部のいずれかの端を通って運ばれる、モンタルおよびミューラーの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1972;69:3561-3566）によって一般的には形成される。
【０２９８】
モンタルおよびミューラーの方法は、タンパク質ポア挿入のために好適である良質な脂質二重層を形成する対費用効果が高くて比較的簡単な方法であることから一般的である。二重層形成の他の一般的方法は、チップディッピング、ペインティング二重層およびリポソーム二重層のパッチクランピングを含む。
【０２９９】
好ましい実施形態では、脂質二重層は国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載のとおり形成される。別の好ましい実施形態では、膜は、ソリッドステート層である。ソリッドステート層は生物由来ではない。換言すると、ソリッドステート層は、生物または細胞などの生物学的環境由来でなく、またはそれから単離されず、生物学的に入手可能な構造の合成的に製造されたバージョンでもない。ソリッドステート層は、これだけに限らないがミクロ電子材料、Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２０３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチックまたは２要素添加硬化シリコンゴム（two-component addition-cure silicone rubber）などのエラストマーならびにガラスを含む有機材料ならびに無機材料の両方から形成され得る。ソリッドステート層は、グラフェン（graphene）などの一原子層からまたは数原子厚だけである層から形成され得る。好適なグラフェン（graphene）層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。
【０３００】
方法は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）挿入されたポアを有する細胞を用いて典型的には実行される。方法は、人工脂質二重層などの人工両親媒性層を用いて典型的には実行される。両親媒性層は、ポアに加えて他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質ならびに他の分子を含んでもよい。好適な装置および条件は、下に考察される。本発明の方法は、典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される。ポリヌクレオチドは、膜にカップリングされ得る。これは、任意の公知の方法を用いてされ得る。膜が脂質二重層などの両親媒性層である場合は（下に詳細に考察されるとおり）、ポリヌクレオチドは、膜に存在するポリペプチドまたは膜に存在する疎水性アンカーを介して膜に好ましくはカップリングされる。疎水性アンカーは、好ましくは脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブまたはアミノ酸である。
【０３０１】
ポリヌクレオチドは膜に直接カップリングされ得る。ポリヌクレオチドは好ましくは膜にリンカーを介してカップリングされる。好ましいリンカーは、これだけに限らないがポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどのポリマーを含む。ポリヌクレオチドが膜に直接カップリングされる場合、膜とヘリカーゼとの間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。リンカーが用いられる場合、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。リンカーが用いられる場合、リンカーはポリヌクレオチドの任意の位置に付着され得る。リンカーは、テールポリマーでポリヌクレオチドに好ましくは付着される。
【０３０２】
カップリングは、安定または一過的であってよい。ある種の応用に関してカップリングの一過的な性質は好ましい。安定カップリング分子がポリヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかに直接付着された場合、二重層とヘリカーゼ活性部位との間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。カップリングが一過的である場合、カップリングされた端は無作為に二重層から遊離し、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。安定なまたは一過的連結を膜と形成する化学基は、下により詳細に考察される。ポリヌクレオチドは、コレステロール（cholesterol）または脂肪酸アシル鎖を用いて脂質二重層などの両親媒性層に一過的にカップリングされ得る。ヘキサデカン酸などの長さ６から３０までの炭素原子を有する任意の脂肪酸アシル鎖は用いられ得る。
【０３０３】
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、両親媒性層にカップリングされる。合成脂質二重層へのポリヌクレオチドのカップリングは、種々の異なるテザーリング戦略で既に実行されている。これらを下の表７に要約する。
【０３０４】
【表７】
0006429773.tif 000020
【０３０５】
ポリヌクレオチドは、合成反応において修飾ホスホラミダイトを用いて官能基化されることができ、チオール、コレステロール（cholesterol）、脂質およびビオチン基などの反応基の付加に容易に適合される。これらのさまざまな付着化学物質は、ポリヌクレオチドに一連の付着選択肢をもたらす。さまざまな各修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌクレオチドを繋ぎ止め、カップリングは常に永久的ではなく、二重層へのさまざまな残存時間をポリヌクレオチドにもたらす。一過的カップリングの有利点は、上に考察される。
【０３０６】
ポリヌクレオチドのカップリングは、反応基がポリヌクレオチドに付加され得る限り多数の他の手段によっても達成され得る。ＤＮＡのいずれかの端への反応基の付加は既に報告されている。チオール基はポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いてｓｓＤＮＡの５’に付加され得る（Grant,G.P.およびP.Z.Qin (2007) "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10):e77）。ビオチン、チオールおよびフルオロフォア（fluorophore）などの化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むためにターミナルトランスフェラーゼを用いて付加され得る（Kumar,A.,P.Tchenら、(1988)."Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2):376-82）。
【０３０７】
代替的に反応基は、二重層に既にカップリングされたものに相補的なＤＮＡの短片の付加のために考慮される場合があり、付着はハイブリダイゼーションを介して達成され得る。ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている（Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williamsら、(1992)."Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20):9823-5）。代替的にｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかは、天然ｄｓＤＮＡにライゲーションされることができ、次いで２本鎖は熱的または化学的変性によって分離された。天然ｄｓＤＮＡについて、ｓｓＤＮＡの１片を二重鎖の１つもしくは両方の端に、またはｄｓＤＮＡを１つまたは両方の端へのいずれかで付加できる。次いで、二重鎖が融解される際に、ｓｓＤＮＡが５’末端、３’末端もしくは両端でのライゲーションもしくは修飾のために用いられ、ｄｓＤＮＡがライゲーションのために用いられた場合、各一重鎖は５’または３’修飾のいずれかを有する。ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、カップリング化学はポリペプチドの化学合成の際に組み込まれ得る。ここ例えばポリヌクレオチドは、付着された反応基を有するプライマーを用いて合成され得る。
【０３０８】
ゲノムＤＮＡのセクションの増幅のための一般的技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いている。本明細書では、２個の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡの同じセクションの多数の複製物が作製される場合があり、各複製物について二重鎖中の各鎖の５’は合成ポリヌクレオチドである。コレステロール（cholesterol）、チオール（thiol）、ビオチン（biotin）または脂質などの反応基を有するアンチセンスプライマーを用いるステップによって、増幅された標的ＤＮＡの各複製物は、カップリングのための反応基を含有する。
【０３０９】
膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、分析物などの水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側へ流れるようにするポリペプチドまたはポリペプチドの集積物である。本発明では膜貫通タンパク質ポアは、水和イオンが印加された電位によって膜の一方の側から他方へ流れるように駆動されるようにするポアを形成できる。膜貫通タンパク質ポアは、ヌクレオチドなどの分析物が膜（脂質二重層など）の一方の側から他方へ流れるように好ましくはする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドがポアを通って移動されることを可能にする。
【０３１０】
膜貫通タンパク質ポアは、単量体またはオリゴマーであってよい。ポアは、いくつかの反復サブユニット（６、７、８または９サブユニット）から好ましくは作られる。ポアは好ましくは六量体、七量体、八量体または九量体ポアである。
【０３１１】
膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレルまたはチャネルを典型的には含む。ポアのサブユニットは、典型的には中央軸を取り囲み、膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束もしくはチャネルに鎖を供する。
【０３１２】
膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に好ましくは位置する。膜貫通タンパク質ポアは、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との間の相互作用を典型的には促進する。
【０３１３】
本発明による使用のための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポアまたはα−ヘリックス束ポアから生じ得る。β−バレルポアは、β−鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なβ−バレルポアは、これだけに限らないが、α−ヘモリジン（hemolysin）、炭疽毒素およびロイコシジン（leukocidin）などのβ−毒素、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリン（porin）を含む。α−ヘリックス束ポアは、α−ヘリックスから形成されたバレルまたはチャネルを含む。好適なα−ヘリックス束ポアは、これだけに限らないが内膜タンパク質ならびに、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通ポアは、Ｍｓｐ由来またはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来である場合がある。
【０３１４】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに由来し、好ましくはＭｓｐＡに由来する。そのようなポアはオリゴマーであり、典型的にはＭｓｐ由来の７、８、９または１０個の単量体を含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐ由来のホモオリゴマーポアであってよい。代替的にポアは、少なくとも１個の他とは異なる単量体を含むＭｓｐ由来のヘテロオリゴマーポアであってもよい。好ましくはポアは、ＭｓｐＡまたはその相同体もしくはパラログ由来である。
【０３１５】
Ｍｓｐ由来の単量体は典型的には、配列番号２に示す配列またはその変種を含む。配列番号２はＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。それは次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変種は、配列番号２のものから変化し、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は測定され得る。サブユニットを両親媒性層などの膜に挿入するための方法は、当技術分野において公知である。例えばサブユニットは、脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合するステップおよび機能的状態に会合するステップによって挿入されるように脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁され得る。代替的にサブユニットは、M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005、127、6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックアンドプレース」法を用いて膜に直接挿入され得る。
【０３１６】
配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種は、配列全体にわたって配列番号２のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が１００以上（例えば１２５、１５０、１７５もしくは２００またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。
【０３１７】
相同性を決定するために当技術分野における標準的方法が用いられ得る。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えばその初期設定で用いられる）を提供する（Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Research 12、387-395頁）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を算出するためまたは配列を列挙するために（等価残基または対応する配列を同定するステップなど（典型的にはその初期設定で））用いられ得る、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S.Fら、(1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開で入手可能である。
【０３１８】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。変種は、ＭｓｐＡと比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体中の任意の変異を含み得る。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態は配列番号５から７に示される。詳細には変種は、ＭｓｐＢに存在する次の置換：Ａ１３８Ｐを含む場合がある。変種は、ＭｓｐＣに存在する次の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐの１つまたは複数を含む場合がある。変種はＭｓｐＤに存在する次の置換：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの１つまたは複数を含む場合がある。変種は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤ由来の１つまたは複数の変異および置換の組合せを含み得る。変種は、好ましくは変異Ｌ８８Ｎを含む。配列番号２の変種は、ＭＳ−Ｂ１の全変異に加えて変異Ｌ８８Ｎを有し、ＭＳ−（Ｂ２）８と称される。本発明において用いられるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８である。配列番号２の変種は変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６ＲをＭＳ−Ｂ１の全ての変異に加えて含み、ＭＳ−Ｂ２Ｃと称される。本発明において使用されるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８またはＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８である。
【０３１９】
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号２のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、アミノ酸を同様の化学構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積を有する他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有してよい。代替的に保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入する場合がある。保存的アミノ酸変更は、当技術分野において周知であり、下の表８に定義のとおり２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が同様の極性を有する場合、これは表９におけるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参照することによっても決定され得る。
【０３２０】
【表８】
0006429773.tif 000021
【０３２１】
【表９】
0006429773.tif 000022
【０３２２】
配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
【０３２３】
変種は、配列番号２の断片を含み得る。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。そのような断片は、ポアを生成するために用いられ得る。断片は、配列番号２のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の１つを含まなければならない。典型的には断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の全てを含む。
【０３２４】
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的または追加的に付加され得る。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長はより長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）よい。担体タンパク質は、本発明によるアミノ酸配列に融合され得る。他の融合タンパク質は、下により詳細に考察される。
【０３２５】
上に考察したとおり変種は、配列番号２から変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与する配列番号２の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するＭｓｐのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号２の変種は、β−シートを形成する配列番号２中の領域を典型的には含む。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に作出され得る。配列番号２の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。
【０３２６】
Ｍｓｐ由来の単量体は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓｔタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラッグタグの付加によって、または（細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によってポリペプチドが天然でそのような配列を含有しない場合に）修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポア上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側に操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている（Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505）。
【０３２７】
Ｍｓｐ由来の単量体は、明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、上に記載されている。
【０３２８】
Ｍｓｐ由来の単量体は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成され得る。例えばＭｓｐ由来の単量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
【０３２９】
Ｍｓｐ由来の単量体は、ヌクレオチド識別を促進するために１つまたは複数の特異的修飾を含有する。Ｍｓｐ由来の単量体は、他の非特異的な修飾をそれらがポア形成を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、Ｍｓｐ由来の単量体の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
【０３３０】
Ｍｓｐ由来の単量体は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。Ｍｓｐ由来の単量体は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばポアはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアを生成するための好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に考察されている。ポアを膜に挿入するための方法は考察されている。
【０３３１】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来でもある。野生型α−ＨＬポアは、７個の同一単量体またはサブユニットから形成される（すなわち七量体である）。α−ヘモリジン−ＮＮの１個の単量体またはサブユニットの配列は配列番号４に示されている。膜貫通タンパク質ポアは、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個の単量体を好ましくは含む。配列番号４のアミノ酸１、７から２１、３１から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７２から２７４、２８７から２９０および２９４はループ領域を形成する。配列番号４の残基１１３および１４７はα−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄の一部を形成する。
【０３３２】
そのような実施形態では、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個のタンパク質または単量体を含むポアは、本発明の方法において好ましくは用いられる。７個のタンパク質は、同じ（ホモ七量体）または異なっていて（ヘテロ七量体）よい。
【０３３３】
配列番号４の変種は、配列番号４のものから変化したアミノ酸配列を有し、ポア形成能力を保持しているタンパク質である。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に脂質二重層などの両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は決定され得る。サブユニットを脂質二重層などの両親媒性層に挿入するための方法は当技術分野において公知である。好適な方法は上に考察されている。
【０３３４】
変種は、構築物への共有結合付着または相互作用を促進する修飾を含み得る。変種は、構築物への付着を促進する１つまたは複数の反応性システイン残基を好ましくは含む。例えば変種は、配列番号４の位置８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の１つまたは複数にシステインを含み得る。好ましい変種は、配列番号４の位置８、９、１７、２３７、２３９および２８７の残基のシステインでの置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。変種は、好ましくは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載の変種のいずれか１つである。
【０３３５】
変種は、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促進する修飾も含み得る。
【０３３６】
変種は、生物（例えば細菌ブドウ球菌（Staphylococcus））によって天然で発現される天然に存在する変種であってよい。代替的に変種は、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは組換え的に発現されてもよい。変種は、組換え技術によって生成される天然に存在しない変種も含む。配列番号４のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号４のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上（例えば２３０、２５０、２７０もしくは２８０またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。相同性は上に考察のとおり決定され得る。
【０３３７】
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号４のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、上に考察の通り作出され得る。
【０３３８】
配列番号４のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
【０３３９】
変種は、配列番号４の断片であり得る。そのような断片はポア形成能力を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。断片は、配列番号４のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は典型的には配列番号４の残基１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を含む。
【０３４０】
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的にまたは追加的に付加され得る。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはその変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長は、より長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）良い。担体タンパク質は、ポアまたは変種に融合されてもよい。
【０３４１】
上に考察したとおり、配列番号４の変種は、配列番号４のものから変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するサブユニットである。変種は、ポア形成に関与する配列番号４の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するα−ＨＬのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号４の変種は、β鎖を形成する配列番号４の領域を典型的には含む。β鎖を形成する配列番号４のアミノ酸は上に考察されている。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限りβ−鎖を形成する配列番号４の領域に作出され得る。配列番号４のβ鎖領域に作られ得る具体的な修飾は、上に考察されている。
【０３４２】
配列番号４の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。α−ヘリックスおよびループを形成するアミノ酸は、上に考察されている。
【０３４３】
変種は、上に考察のとおり、その同定または精製を支援するために修飾され得る。
【０３４４】
α−ＨＬ由来のポアは、Ｍｓｐ由来のポアに関連して上に考察のとおり作出され得る。
【０３４５】
いくつかの実施形態では膜貫通タンパク質ポアは、化学的に修飾される。ポアは、任意の方法および任意の部位で化学的に修飾され得る。膜貫通タンパク質ポアは、１つもしくは複数のシステインへの分子の付着（システイン連結）、１つもしくは複数のリシンへの分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって好ましくは化学的に修飾される。そのような修飾を実行するための好適な方法は、当技術分野において周知である。膜貫通タンパク質ポアは、任意の分子の付着によって化学的に修飾され得る。例えばポアは、色素またはフルオロフォアの付着によって化学的に修飾され得る。
【０３４６】
ポア中の任意の数の単量体は、化学的に修飾され得る。１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）の単量体は、上に考察のとおり好ましくは化学的に修飾される。
【０３４７】
システイン残基の反応性は、隣接残基の修飾によって増強され得る。例えば近接アルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより反応性のＳ−基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが付着する前にポアの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。
【０３４８】
（ポアが化学的に修飾される）分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のとおりポアに直接付着され得るか、またはリンカーを介して付着され得る。
【０３４９】
構築物は、ポアに共有結合的に付着されていてもよい。構築物は、好ましくはポアに共有結合的に付着されていない。ポアおよび構築物への電圧の印加は、典型的には標的ポリヌクレオチドを配列決定できるセンサーの形成を生じる。これは、下により詳細に考察される。
【０３５０】
本明細書に記載の任意のタンパク質、すなわち膜貫通タンパク質ポアまたは構築物は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラッグタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または、それらの細胞からの分泌を促進するために（ポリペプチドが天然でそのような配列を含有していない場合に）シグナル配列の付加によって修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポアまたは構築物上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側の操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている（Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505）。
【０３５１】
ポアおよび／または構築物は明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、これだけに限らないが蛍光分子、放射性同位元素（例えば１２５Ｉ、３５Ｓ）、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド（ビオチンなど）を含む。
【０３５２】
タンパク質は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばポアおよび／または構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアおよび／または構築物のアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むようにまたはタンパク質の安定性を増大させるように修飾され得る。タンパク質が合成的手段によって生成される場合、そのようなアミノ酸は、生成の際に導入され得る。ポアおよび／または構築物は、合成的にまたは組換え生成のいずれかに続いて変更され得る。
【０３５３】
ポアおよび／または構築物は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成し得る。例えばポアまたは構築物は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
【０３５４】
ポアおよび／または構築物は、他の非特異的修飾もそれらがポア形成または構築物機能を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、タンパク質（複数可）の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
【０３５５】
ポアおよび構築物は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を用いて得られ、複製され得る。ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的技術を用いて細菌宿主細胞において発現され得る。ポアおよび／または構築物は、組換え発現ベクターからのポリペプチドの原位置での発現によって細胞において生成され得る。場合により発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを保持する。これらの方法は、Sambrook,J.and Russell,D.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual、3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYに記載されている。
【０３５６】
ポアおよび／または構築物は、大規模に生成されることができ、タンパク質生成生物または組換え発現からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィー系による精製が続く。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィー系は、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏ−Ｃａｄ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ｓｙｓｔｅｍおよびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを含む。
【０３５７】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定するステップを含む。方法は、標的ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つまたは５つ以上の特性を測定するステップを含み得る。１つまたは複数の特性は、好ましくは（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される。（ｉ）から（ｖ）の任意の組合せは本発明により測定され得る。
【０３５８】
（ｉ）に関して、ポリヌクレオチドの長さは、例えば標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の数または標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の持続時間を測定することによって測定され得る。
【０３５９】
（ｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの同一性は、多数の方法において測定され得る。ポリヌクレオチドの同一性は、標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴ってまたは標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は、簡単であり、ポリヌクレオチドは配列決定され、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行われ得る。例えばポリヌクレオチド中の具体的なモチーフの存在は（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定するステップを伴わずに）測定され得る。代替的に、方法における具体的な電気的および／または光学的シグナルの測定は、標的ポリヌクレオチドを具体的な供給源由来であるとして同定できる。
【０３６０】
（ｉｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの配列は、以前記載されたとおり決定され得る。好適な配列決定方法、詳細には電気的測定を用いるものは、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。
【０３６１】
（ｉｖ）に関して、二次構造は、種々の方法において測定され得る。例えば方法が電気的測定を含む場合、二次構造は残存時間における変化またはポアを通って流れる電流における変化を用いて測定され得る。これは、１本鎖と２本鎖のポリヌクレオチドの領域を区別できるようにする。
【０３６２】
（ｖ）に関して、任意の修飾の存在または非存在は、測定され得る。方法は、好ましくは標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているかどうかを決定するステップを含む。具体的な修飾は、下に記載の方法を用いて測定され得るポアとの特異的な相互作用を生じる。例えばメチルシトシンは、各ヌクレオチドとのその相互作用の際にポアを通って流れる電流に基づいてシトシンから区別され得る。
【０３６３】
種々の異なる種類の測定が作出されてよい。これは、非限定的に：電気的測定および光学的測定を含む。可能性のある電気的測定は、電流測定：インピーダンス測定、トンネル測定（Ivanov APら、Nano Lett.2011 Jan 12;11(1):279-85）およびＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）を含む。光学的測定は、電気的測定（Soni GVら、Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301）と組み合わされ得る。測定は、ポアを通って流れるイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってよい。
【０３６４】
電気的測定は、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ−２０００／２８３１２号に記載の標準的単一チャネル記録機器を用いて作出され得る。代替的に電気的測定は、例えば国際出願第ＷＯ−２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ−２０１１／０６７５５９号に記載のマルチチャネル系を用いても作出され得る。
【０３６５】
好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本明細書に記載の構築物と、標的ポリヌクレオチドがポアを通って移動し、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ、ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するステップであって、電流が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む。
【０３６６】
方法は、ポアが膜内に存在している膜／ポア系を調べるのに好適である任意の装置を用いて実行され得る。方法は、膜貫通ポアセンシングに好適である任意の装置を用いて実行され得る。例えば装置は、水性溶液および、チャンバーを２つのセクションに分離する障壁を含むチャンバーを含む。障壁は典型的にはポアを含有する膜が形成される開口部を有する。代替的に障壁は、ポアが存在する膜を形成する。
【０３６７】
方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ２００８／１０２１２０）に記載の装置を用いて実行され得る。
【０３６８】
方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するステップを含んでよい。したがって装置は、電位を印加でき、膜およびポアを通る電気シグナルを測定できる電気回路も含む。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いても実行され得る。方法は、電圧クランプの使用を好ましくは含む。
【０３６９】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通過する電流の測定を含み得る。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するための好適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例で開示される。方法は、膜およびポア全体に印加される電圧と共に典型的には実行される。用いられる電圧は典型的には、＋２Ｖから−２Ｖまで、典型的には−４００ｍＶから＋４００ｍＶまでである。好ましくは用いられる電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値および＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限値を含む範囲内である。用いられる電圧は、より好ましくは１００ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍＶまでの範囲内である。印加される電位を増加させることによってポアによるさまざまなヌクレオチド間の識別を向上させることは可能である。
【０３７０】
方法は、金属塩（例えばアルカリ金属塩）、ハロゲン化塩（例えばアルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩）などの任意の電荷担体の存在下で典型的には実行される。電荷担体は、イオン液体または有機塩、例えばテトラメチル塩化アンモニウム、トリメチルフェニル塩化アンモニウム、フェニルトリメチル塩化アンモニウムもしくは１−エチル−３メチルイミダゾリウムクロリド（1-ethyl-3-methyl imidazolium chloride）を含み得る。上に考察した例示的装置では、塩はチャンバー中の水性溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が典型的には使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌおよびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物は好ましい。塩濃度は飽和であってよい。塩濃度は、３Ｍ以下があり得、典型的には０．１から２．５Ｍまで、０．３から１．９Ｍまで、０．５から１．８Ｍまで、０．７から１．７Ｍまで、０．９から１．６Ｍまでまたは１Ｍから１．４Ｍまでである。塩濃度は、好ましくは１５０ｍＭから１Ｍまでである。Ｈｅｌ３０８、ＸＰＤ、ＲｅｃＤおよびＴｒａＩヘリカーゼは、高塩濃度下で驚くべきことに作用する。方法は、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍなどの少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて好ましくは実行される。高塩濃度は、高い信号対雑音比を提供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流が同定されることを可能にする。
【０３７１】
方法は、緩衝剤の存在下で典型的には実行される。上に考察した例示的装置では、緩衝剤はチャンバー中の水性溶液に存在する。任意の緩衝剤が本発明の方法において用いられ得る。典型的には、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。別の好適な緩衝剤はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤である。方法は、４．０から１２．０まで、４．５から１０．０まで、５．０から９．０まで、５．５から８．８まで、６．０から８．７までまたは７．０から８．８までまたは７．５から８．５までのｐＨで典型的には実行される。用いられるｐＨは好ましくは約７．５である。
【０３７２】
方法は、０ｏＣから１００ｏＣまで、１５ｏＣから９５ｏＣまで、１６ｏＣから９０ｏＣまで、１７ｏＣから８５ｏＣまで、１８ｏＣから８０ｏＣまで、１９ｏＣから７０ｏＣまでまたは２０ｏＣから６０ｏＣまでで実行され得る。方法は典型的には室温で実行される。方法は、約３７℃などの酵素機能を支持する温度で場合により実行される。
【０３７３】
方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物および／または構築物の作用を促進する酵素補因子の存在下で実行されてもよい。方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物の非存在下でおよび酵素補因子の非存在下で実行されてもよい。遊離ヌクレオチドは、上に考察した個々のヌクレオチドの任意の１つまたは複数であってよい。遊離ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含む。遊離ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、構築物を機能させる因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオンは好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくはＭｇ２＋である。
【０３７４】
標的ポリヌクレオチドは、構築物およびポアと任意の順序で接触され得る。標的ポリヌクレオチドが構築物およびポアと接触される場合、標的ポリヌクレオチドは最初に構築物と複合体を形成することは好ましい。ポアに電圧が印加される場合、標的ポリヌクレオチド／構築物複合体は次いでポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０３７５】
上に考察したとおり、ヘリカーゼは、ポアに関して２つのモードで作動できる。そのようなヘリカーゼを含む本明細書に記載の構築物は、２つのモードでも作動できる。第一に、方法は、印加された電圧から生じる場に沿ってポアを通って標的配列を移動させるように構築物を用いて好ましくは実行される。このモードでは、ＤＮＡの５’末端が最初にポアに捕捉され、標的配列が最終的に二重層のｔｒａｎｓ側に移行されるまで場に沿ってポアを通るように構築物は、ＤＮＡをポア中に移動させる。代替的に、方法は、印加された電圧から生じる場とは反対に構築物が標的配列をポアを通して移動させるように好ましくは実行される。このモードでは、ＤＮＡの３’末端が最初にポアに捕捉され、構築物は、標的配列が最終的に二重層のｃｉｓ側に戻って放されるまで印加された場とは反対にポアの外側へ引かれるようにＤＮＡをポアを通して移動させる。
【０３７６】
他の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法も提供する。方法は、ポアと本明細書に記載の構築物との複合体を形成するステップを含む。複合体は、ポアと構築物とを標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させ、次いで、ポアに電位を印加するステップによって形成され得る。印加される電位は、上に記載のとおり化学電位または電圧電位であってよい。代替的に複合体は、ポアを構築物に共有結合的に付着するステップによっても形成され得る。共有結合付着のための方法は、当技術分野において公知であり、例えば国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）および第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）において開示されている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーである。方法は、Ｍｓｐ由来のポアと本明細書に記載の構築物との複合体を形成するステップを好ましくは含む。本発明の方法を参照して上に考察した任意の実施形態は、この方法に等しく適用される。本発明は、本発明の方法を使用して産生されるセンサーも提供する。
【０３７７】
キット
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットも提供する。キットは、（ａ）ポアおよび（ｂ）本明細書に記載の構築物を含む。本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、キットに等しく適用する。
【０３７８】
キットは、脂質二重層などの両親媒性層を形成するために必要なリン脂質などの膜の構成成分をさらに含んでよい。
【０３７９】
本発明のキットは、上に述べた任意の実施形態が実行されるようにする１つまたは複数の他の試薬または器具を追加的に含んでよい。そのような試薬または器具は、次の：好適な緩衝剤（複数可）（水性溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは、針を含む器具など）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現するための手段、上に定義の膜または電圧もしくはパッチクランプ装置、の１つまたは複数を含む。試薬は、液体試料が試薬を再懸濁するように乾燥状態でキット中に存在する場合がある。キットは、キットが本発明の方法において用いられ得るようにする説明書、またはいずれの患者に方法が用いられ得るかに関する詳細も場合により含む場合がある。キットは、場合によりヌクレオチドを含み得る。
【０３８０】
装置
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置も提供する。装置は、複数のポアおよび複数の本明細書に記載の構築物を含む。装置は、本発明の方法を実行するための説明書を好ましくはさらに含む。装置は、アレイまたはチップなどのポリヌクレオチド分析のための任意の従来装置であってよい。本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、本発明の装置に等しく適用可能である。
【０３８１】
装置は、本発明の方法を実行するために好ましくはセットアップされている。
【０３８２】
装置は、好ましくは：
複数のポアを支持でき、ポアおよび構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
を含む。
【０３８３】
装置は、好ましくは：
膜および複数のポアを支持でき、ポアおよび構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための１つまたは複数の容器を含み、
流体系は、１つまたは複数の容器からセンサーデバイスに試料を選択的に供給するように構成されている。装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１２２２９３として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（未公開）または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ００／２８３１２として公開）において記載の任意のものであってよい。
【０３８４】
本発明の構築物を産生する方法
本発明は、本発明の構築物を産生する方法も提供する。一実施形態では方法は、２つ以上のヘリカーゼを付着するステップ、好ましくは共有結合で付着するステップを含む。別の実施形態では方法は、ヘリカーゼを、配列番号９４または配列番号９４の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９４に少なくとも８０％相同性を有するその変種を含むアミノ酸配列に付着させる、好ましくは共有結合で付着させ、それにより構築物を産生するステップを含む。上に考察した任意のヘリカーゼが方法において使用できる。付着の部位および方法は上に考察したとおり選択される。
【０３８５】
方法は、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップをさらに含んでもよい。これを行うためのアッセイは、上に記載されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得る場合、ヘリカーゼは正しく付着され、本発明の構築物が産生されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得ない場合、本発明の構築物は産生されていない。
【０３８６】
次の実施例は本発明を例示する。
実施例
【実施例１】
【０３８７】
本実施例および続く全ての実施例では、ビスマレイミド官能性ＰＥＧリンカーはそれらの分子量を参照して同定される。例えば「２ｋＤａ」、「２ｋＤＡリンカー」または「２ｋＤＡ  ＰＥＧリンカー」は２ｋＤａの分子量を有するビスマレイミド官能性ＰＥＧリンカーを指す。
【０３８８】
本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）の合成する方法を記載する。これらの二量体の場合にはＡ７００Ｃは、二量体タンパク質（Ｍｂｕ／Ｒ６８７Ａ  Ａ７００Ｃ−２ｋＤａ  ＰＥＧリンカー−Ａ７００Ｃ  Ｍｂｕ／Ｒ６８７ＡおよびＭｂｕ／Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ  Ａ７００Ｃ−２ｋＤａ  ＰＥＧリンカー−Ａ７００Ｃ  Ｍｂｕ／Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ）においてリンカーへの接続として役立つ追加変異である。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中には天然でシステイン５個が存在するが、これらはあまり反応性ではなく、したがって反応はほとんどＡ７００Ｃ上が中心である。
【０３８９】
ＤＴＴをＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ（２ｍｇ／ｍＬ）（変異Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０）に５ｍＭで添加し、３０分間ローテータに置いた。還元したタンパク質を１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２に緩衝液交換した。３０塩基長ｓｓＤＮＡ（配列番号６８）をヘリカーゼ（１０倍過剰）に内部システインを保護するために添加し、タンパク質が安定のままである可能性を増大させる。タンパク質／ＤＮＡ溶液を緩衝液で１．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、窒素雰囲気下に置き、室温、３０分間インキュベートした。０．０１６ｍＭビスマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）を添加し、反応を室温、窒素雰囲気下で２時間進行させた。１０ｍＭ  ＤＴＴを反応をクエンチするために添加し、いかなるジスルフィド架橋分子種も壊した。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ変異体二量体をＤＮＡおよび試薬を除去するために初回Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎステップ、続いて溶液中に存在する全ての他の分子種から二量体を分離するためにアニオン交換クロマトグラフィーステップを使用して直ちに精製した。
【０３９０】
ＡＫＴＡ精製装置を精製のために使用した。ストレップ（Ｓｔｒｅｐ）精製を１ｍＬ  ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムで実施した。タンパク質溶液をカラムに添加する前に結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。全ての未結合材料を除去するための初回洗浄ステップ後、緩衝液中の１０ｍＭデスチオビオチンで溶出する前にタンパク質からＤＮＡを解離するためにタンパク質を２Ｍ塩を含有する同じ緩衝液で洗浄した。二量体と溶液中に存在する全ての他の分子種との分離用に調製するために、溶出されたタンパク質をＬＯＷ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。イオン交換ステップをＧＥ  Ｍｉｎｉ  Ｑ  ＰＣ  ３．２／３カラム、流速０．４ｍＬ／分、ＬＯＷからＨＩＧＨ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）でのグラジエントで実施した。溶出された二量体ピークの開始時、中央および終了時を別々にプールし、別々のＩＤ番号を付けた。中央ピークを電気生理学での検査に使用する前に３つ全てを活性アッセイした。図１は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）単量体（変異Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０、レーン２）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ二量体（レーン４）のゲルを示す。上記手順はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）単量体（変異Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０、図１、レーン３）からＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ二量体（図１、レーン５）を形成するために使用できる。
【実施例２】
【０３９１】
本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ多量体（配列番号１９複数単位）を合成する方法を記載する。Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ（配列番号１９）に追加的変異は無く、そのためＷＴに含有されるシステインは、連結のための部位として使用される。
【０３９２】
ＤＴＴをＨｅｌ３０８  Ｍｈｕ（１．８３ｍｇ／ｍＬ）（配列番号１９）に１０ｍＭで添加し、３０分間ローテータに置いた。還元したタンパク質を１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２に緩衝液交換した。３０塩基長ｓｓＤＮＡ（配列番号６８）をヘリカーゼ（６倍過剰）に内部システインを保護するために添加し、タンパク質が安定のままである可能性を増大させる。タンパク質／ＤＮＡ溶液を緩衝液で１．６ｍｇ／ｍＬに希釈し、窒素雰囲気下に置き、室温、３０分間インキュベートした。０．００９５ｍＭビスマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）を添加し、反応を室温、窒素雰囲気下で２時間進行させた。１０ｍＭ  ＤＴＴを反応をクエンチするために添加し、いかなるジスルフィド架橋分子種も壊した。Ｈｅｌ３０８  Ｍｈｕ多量体をＤＮＡおよび試薬を除去するために初回Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎステップ、続いて溶液中に存在する全ての他の分子種から単量体を除去するためにアニオン交換およびゲルろ過クロマトグラフィーステップを使用して直ちに精製した。
【０３９３】
ＡＫＴＡ精製装置を精製のために使用した。ストレップ精製を５ｍＬ  ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムで実施した。タンパク質溶液をカラムに添加する前に結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。全ての未結合材料を除去するための初回洗浄ステップ後、緩衝液中の１０ｍＭデスチオビオチンで溶出する前にタンパク質からＤＮＡを解離するためにタンパク質を２Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ緩衝液で洗浄した。二量体と溶液中に存在する全ての他の分子種との分離用に調製するために、溶出されたタンパク質をＬＯＷ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。イオン交換ステップをＧＥ  Ｍｏｎｏ  Ｑ  ５／５０ＧＬカラム、流速１ｍＬ／分、ＬＯＷからＨＩＧＨ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）でのグラジエントで実施した。溶出されたピークをアニオン交換によって同じカラムで３回さらに精製した。最後の精製ステップから回収した溶出ピークを回収し、０．２５ｍＬに濃縮し、緩衝液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０に交換し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）１０／３００  ＧＬカラムでのゲルろ過によって精製した。最終タンパク質は、単量体：二量体：三量体：多量体（ＯＮＴ  Ｒｅｆ−ＯＮＬＰ４４５４）の比がおよそ１：１：１：１であった。図２は、Ｈｅｌ３０８  Ｍｈｕ多量体試料（レーン２）のゲルを示す。
【実施例３】
【０３９４】
本実施例は、Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置６７４を介して連結されている）を合成する方法を記載する。この二量体の場合Ｎ６７４Ｃは、二量体タンパク質（Ｔｇａ  Ｎ６７４Ｃ−２ｋＤａ  ＰＥＧリンカー−Ｎ６７４Ｃ  Ｔｇａ）においてリンカーへの接続として役立つ追加変異である。
【０３９５】
ＤＴＴをＨｅｌ３０８  Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）（２ｍｇ／ｍＬ）（ここで各単量体単位は変異Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置６７４を介して他に連結されている）に１０ｍＭで添加し、３０分間ローテータに置いた。還元したタンパク質を１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２に緩衝液交換した。３０塩基長ｓｓＤＮＡ（配列番号６８）をヘリカーゼに添加し、タンパク質が安定のままである可能性を増大させる。タンパク質／ＤＮＡ溶液を緩衝液で１．６ｍｇ／ｍＬに希釈し、窒素雰囲気下に置き、室温、３０分間インキュベートした。０．０３８ｍＭビスマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）を添加し、反応を２３℃、窒素雰囲気下で２．５時間進行させた。１０ｍＭ  ＤＴＴを反応をクエンチするために添加し、いかなるジスルフィド架橋分子種も壊した。Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）変異体二量体をＤＮＡおよび試薬を除去するために初回Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎステップ、続いて溶液中に存在する全ての他の分子種から二量体を分離するためにアニオン交換クロマトグラフィーステップを使用して直ちに精製した。
【０３９６】
ＡＫＴＡ精製装置を精製のために使用した。ストレップ精製を５ｍＬ  ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムで実施した。タンパク質溶液をカラムに添加する前に結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。全ての未結合材料を除去するための初回洗浄ステップ後、緩衝液中の１０ｍＭデスチオビオチンで溶出する前にタンパク質からＤＮＡを解離するためにタンパク質を４ｍＭ  ＡＴＰを含有する同じ緩衝液で洗浄した。溶出されたタンパク質を０．２５ｍｌに濃縮し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０に緩衝液交換し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）１０／３００  ＧＬカラムでのゲルろ過により精製した。図３は、Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体および単量体の形成および精製の際の種々の段階でのゲルを示す（レーン１＝タンパク質ラダー、レーン２＝Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体加熱処置後、レーン３＝Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置６７４を介して他に連結されている）、レーン４＝ｓｔｒｅｐ溶出、レーン５＝初期反応混合物およびレーン６＝Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）単量体（変異Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６））。
【実施例４】
【０３９７】
本実施例は、蛍光に基づくアッセイを使用して種々のＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ構築物のＤＮＡ結合能力をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）のものと比較する。
【０３９８】
通例の蛍光基質を１本鎖ＤＮＡに結合する種々のヘリカーゼの能力をアッセイするために使用した。８８ｎｔ１本鎖ＤＮＡ基質（最終１ｎＭ、配列番号６９）は、その５’末端にカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）塩基を有する。ヘリカーゼが緩衝溶液（４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中のオリゴヌクレオチドに結合することから、蛍光偏光（溶液中のオリゴヌクレオチドの自由回転の速度に関連する特性）は増大する。偏光を増大させるために必要なヘリカーゼの量が少ないほど、ＤＮＡとヘリカーゼとの間の結合親和性は強い（図４）。図５〜８は、種々のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物の量を増加させてＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６９、その５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有する）の偏光における変化を示す。検査した全ての構築物は、単量体よりも低い濃度で偏光における増大を示す。検査した構築物は：
１．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ二量体（各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されているヘリカーゼ二量体）、
２．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ２）ドメイン（配列番号７５）に付着されている）、
３．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメイン（配列番号７６）に付着されており、ＨｈＨはヘリックス−ヘアピン−ヘリックスドメインである）、
４．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ＵＬ４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって前進性因子ＵＬ４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ（配列番号６３）に付着されている）、
５．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＳＳＢ  ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ（配列番号６４）に付着されている）、
６．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＳＳＢ  ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ（配列番号６５）に付着されている）および
７．（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）−Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ）（ここでＳＳＢ  ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ（配列番号６４）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＴによってヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）に付着されている）。
である。
【０３９９】
図９は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して図５〜８に示すデータを二相解離結合曲線にフィットすることを通じて得られた種々のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物についての相対平衡解離定数（Ｋｄ）（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）に対して）を示す。付着した追加的結合ドメインを有するヘリカーゼ構築物の全ては、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）単独よりも低い平衡解離定数を示す。したがって追加的結合構築物を有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼは、全てＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体よりもＤＮＡにより強い結合を示す。
【実施例５】
【０４００】
本実施例は、ナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖（４００塩基長）の移動を制御するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）の能力をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）のものと比較する。単量体による制御されたＤＮＡ移行のための一般的方法を図１０に、二量体によるものを図１１に示す。
【０４０１】
材料および方法
４００塩基長ＤＮＡ配列：
プライマーをＰｈｉＸ１７４の約４００ｂｐ断片を増幅するために設計した。これらのプライマーの各５’末端は５０ヌクレオチド非相補性領域、同種重合体ストレッチまたは１０ヌクレオチド同種重合体セクションの反復単位のいずれかを含んだ。これらは、ナノポアを通る鎖の制御された移行についての識別子として役立ち、移行の方向を決定する。付加的にフォワードプライマーの５’末端は４個の２’−Ｏ−メチル−ウラシル（ｍＵ）ヌクレオチドを含んで「キャップ」され、リバースプライマーの５’末端は化学的にホスホリル化された。次いでこれらのプライマー修飾は、ラムダエキソヌクレアーゼを使用するアンチセンス鎖だけの優先的な制御された消化を可能にする。ｍＵキャッピングはセンス鎖をヌクレアーゼ消化から保護する一方で、アンチセンス鎖の５’のＰＯ４はそれを促進する。したがってラムダエキソヌクレアーゼとのインキュベーション後に２本鎖のセンス鎖だけが、ここでは１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）としてインタクトのまま残る。作製したｓｓＤＮＡを次いで既に記載のとおりＰＡＧＥ精製した。
【０４０２】
本明細書に記載の全ての実験において使用されるＤＮＡ基質設計を図１２に示す。ＤＮＡ基質は、ナノポアによる捕捉を助けるために５０Ｔ  ５’−リーダーに付着している４個の２’−Ｏ−メチルウラシル塩基を配列の５’末端に含むＰｈｉＸ由来ｓｓＤＮＡの４００塩基セクションからなる（配列番号７０、配列番号７０の５’末端にナノポアによる捕捉を助けるために５０Ｔリーダー配列に付着している４個の２’−Ｏ−メチルウラシル塩基がある）。５０Ｔリーダーの直後でこの鎖にアニールするのは、二重層の表面上のＤＮＡを増やし、それにより捕捉効率を改善するための３’コレステロールＴＥＧ（配列番号７１）を含有するプライマーである。
【０４０３】
緩衝溶液：１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ
ナノポア：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ（配列番号２、変異Ｌ８８Ｎを有する）
単量体酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）最終１００ｎＭで添加
二量体酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａホモ二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）最終１０ｎＭで添加
【０４０４】
１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）二重層に挿入された単一のＭｓｐＡナノポアから電気計測値を得た。二重層は、モンタル−ミューラー技術によって開口部直径約１００ｕｍ、厚さ２０ｕｍのＰＴＦＥフィルム（Ｄｅｌｒｉｎ  ｃｈａｍｂｅｒｓ注文生産）で形成され、２個の１ｍＬ緩衝溶液に分けた。全ての実験は、上記の緩衝溶液中で実行した。単一チャネル電流を１４４０Ａデジタイザーを備えたＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を緩衝溶液に繋ぎ、ｃｉｓコンパートメント（ナノポアおよび酵素／ＤＮＡの両方が添加されている）をＡｘｏｐａｔｃｈ  ｈｅａｄｓｔａｇｅのアースに繋ぎ、ｔｒａｎｓコンパートメントをｈｅａｄｓｔａｇｅの探査電極に繋ぐ。
【０４０５】
二重層中に単一ポアを達成後、ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２をｃｉｓチャンバーに添加し、十分に混合した。次いでＤＮＡ構築物およびヘリカーゼを緩衝液１００ｕＬに添加し、５分間予備インキュベートした（ＤＮＡ＝１．５ｎＭ（配列番号７０および７１（３’コレステロールＴＥＧを有する））、単量体酵素＝１ｕＭまたは二量体酵素＝０．１ｕＭ）。この予備インキュベーション混合物をＭｓｐＡナノポア中でのヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始するために電気生理化学チャンバーのｃｉｓコンパートメント中の緩衝液９００ｕＬに添加した（最終濃度、ＤＮＡ＝０．１５ｎＭ、単量体酵素＝０．１ｕＭまたは二量体酵素＝０．０１ｕＭをもたらす）。ヘリカーゼＡＴＰａｓｅ活性を必要に応じてｃｉｓコンパートメントへのｄＮＴＰ（最終ＡＴＰ１ｍＭ）の付加によって開始した。実験は、＋１２０ｍＶの一定電位で実行した。
【０４０６】
結果および考察
図１３に示すとおり、ヘリカーゼ−単量体ＤＮＡ基質のＭｓｐＡナノポア（図１０に示す）への添加は、特徴的電流遮断を生じる。所与の基質について本発明者らは、各ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関してＤＮＡ配列を反映する特徴的な電流遷移のパターンを観察した。ヘリカーゼが結合していないＤＮＡは、ナノポアと一過的に相互作用し、電流において一時的な遮断をもたらす（＜＜１秒間）。結合し、活性な（すなわちＡＴＰａｓｅ作用の下でＤＮＡ鎖に沿って移動する）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）を有するＤＮＡは、図１３に示すとおり電流における段階的変化を伴う長い特徴的な遮断レベルを生じる。ナノポア中の異なるＤＮＡモチーフは、特有の電流遮断レベルを生じる。
【０４０７】
ＭｓｐＡナノポア（図１１に示す）へのヘリカーゼ二量体−ＤＮＡ基質の添加は、図１４に示す特徴的な電流遮断を生じる。結合し、活性な（すなわちＡＴＰａｓｅ作用の下でＤＮＡ鎖に沿って移動する）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）を有するＤＮＡは、図１４に示すとおり電流における段階的変化を伴う長い特徴的な遮断レベルを生じる。二量体の１０分の１濃度を使用することも可能であり、これらの特徴的な電流遮断をまだ観察できる。
【０４０８】
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）がポアを通る４００塩基長ＤＮＡ鎖の移行を制御する場合に産生される電流遮断は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）によって産生されるものに類似している。しかし、２回の実験（同一条件下で単量体Ｈｅｌ３０８ＭｂｕまたはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ二量体のいずれかで実行する）についてヘリカーゼ制御鎖移動の全長を比較する場合、二量体でのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動（図１６）は典型的には単量体（図１５）によって観察されるものよりも長い。これは、酵素再結合を示し、したがって酵素解離を低減する。付加的に単量体実行について測定したヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の３７％がＤＮＡ鎖の末端のポリＴに達した一方で、二量体実行について測定したヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の４７％がポリＴに達し、二量体の解離の低減および前進性の改善を示している。図８および９は、ＤＮＡ運動がＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（図１７）またはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａ二量体（図１８）のいずれかによって制御されている場合の状態指数（横軸）の関数としての鎖移動についての状態フィットデータの公知のＤＮＡ配列における位置（縦軸）の６例をそれぞれ示す。単量体データは、酵素解離およびトレイル酵素に出会うまで印加された場の下でＤＮＡが逆戻りした結果である配列の先行部分への周期的な後退転位（破線円で強調）を含む、配列を通じた前進性直線移動を示す。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の多数は、酵素解離のために配列の末端までたどり着けない。一方二量体データについては、酵素はより長くＤＮＡの移動を制御し続け、解離後に酵素はＤＮＡに再結合する。
【実施例６】
【０４０９】
本実施例は、実施例５において考察のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ａ７００Ｃ  ２ｋＤａホモ二量体と比較して異なるアミノ酸位置を介して繋がれており、異なる長さのリンカー（２ｋｂおよび３．４ｋｂリンカー）を有する２つの異なるＨｅｌ３０８Ｍｂｕホモ二量体が、ナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖（４００塩基長）の移動を制御できたことを示す。二量体による制御されたＤＮＡ移行のための一般的方法を図１１に示す。
【０４１０】
緩衝溶液：４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ
ナノポア：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ（変異Ｌ８８Ｎを有する配列番号２）
二量体酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ｑ４４２Ｃ  ２ｋＤａリンカーホモ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置４４２を介して他に連結されている）はおよそ最終１ｎＭで添加、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ｑ４４２Ｃ  ３．４ｋＤａリンカーホモ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置４４２を介して他に連結されている）は最終およそ１ｎＭで添加。
【０４１１】
電気的実験を脂質二重層中に挿入された単一ポアを達成するために実施例５に記載のとおり設定した。二重層中に単一ポアを達成した後、ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１ｍＭ）をｃｉｓチャンバーに添加し、十分に混合した。次いでＤＮＡポリヌクレオチド配列番号７０および７１（３’コレステロールＴＥＧを有する）（ＤＮＡ＝０．１５ｎＭ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ｑ４４２Ｃ  ２ｋＤａリンカーホモ二量体またはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ｑ４４２Ｃ  ３．４ｋＤａリンカーホモ二量体のいずれかをＭｓｐＡナノポア中でのヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始するために電気生理化学チャンバーのｃｉｓコンパートメントに添加した。実験は、＋１８０ｍＶの一定電位で実行した。
【０４１２】
結果および考察
ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ基質移行を制御するためのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ｑ４４２Ｃ  ２ｋＤａリンカーホモ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置４４２を介して他に連結されている）ヘリカーゼの使用は、図１９Ａに示す特徴的な電流遮断を生じる。所与の基質について本発明者らは、各ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関してＤＮＡ配列を反映する特徴的な電流遷移のパターンを観察する。ヘリカーゼが結合していないＤＮＡは、ナノポアと一過的に相互作用し、電流において一時的な遮断をもたらす（＜＜１秒間）。結合し、活性な（すなわちＡＴＰａｓｅ作用の下でＤＮＡ鎖に沿って移動する）ヘリカーゼ二量体を有するＤＮＡは、図１９Ａに示すとおり電流における段階的変化を伴う長い特徴的な遮断レベルを生じる。ナノポア中の異なるＤＮＡモチーフは、特有の電流遮断レベルを生じる。ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ移動を制御するためのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ  Ｑ４４２Ｃ  ３．４ｋＤａリンカーホモ二量体ヘリカーゼ（ここで各単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置４４２を介して他に連結されている）の使用も、図１９Ｂに示す特徴的な電流遮断を生じる。これは、２つのヘリカーゼを２つの異なるリンカー長を使用して異なる位置で互いに付着させ、酵素活性を保持できることを例示する。
【実施例７】
【０４１３】
本実施例は、Ｃ末端に融合された追加的結合ドメインを有するヘリカーゼを使用する、ナノポアを通るヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す。示す２つの例は、Ｃ末端に遺伝子的に融合されたＨｅｌ３０８  Ｈｌａ（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８  Ｈｌａ（配列番号６６）の第５ドメインに付着されている）またはＨｅｌ３０８Ｈｖｏ（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８  Ｈｖｏ（配列番号６７）の第５ドメインに付着されている）由来の追加的第５ドメインを含むＨｅｌ３０８Ｍｂｕである。
【０４１４】
緩衝溶液：４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ
ナノポア：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ（変異Ｌ８８Ｎを有する配列番号２）
二量体酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８  Ｈｌａ第５ドメイン（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８  Ｈｌａ（配列番号６６）の第５ドメインに付着されている）は最終１００ｎＭで添加され、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８  Ｈｖｏ第５ドメイン（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８  Ｈｖｏ（配列番号６７）の第５ドメインに付着されている）は最終１００ｎＭで添加される。
【０４１５】
電気的実験を脂質二重層中に挿入された単一ポアを達成するために実施例５に記載のとおり設定した。二重層中に単一ポアを達成した後、ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１ｍＭ）をｃｉｓチャンバーに添加し、十分に混合した。＋１４０ｍＶでの対照記録を５分間実行した。次いでＤＮＡポリヌクレオチド配列番号７０および７１（３’コレステロールＴＥＧを有する）（ＤＮＡ＝０．６ｎＭ）および、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８  Ｈｌａ第５ドメイン（１００ｎＭ、ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８  Ｈｌａ（配列番号６６）の第５ドメインに付着されている）またはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８  Ｈｖｏ第５ドメイン（１００ｎＭ、ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８  Ｈｖｏ（配列番号６７）の第５ドメインに付着されている）のいずれかをＭｓｐＡナノポア中でのヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始するために電気生理化学チャンバーのｃｉｓコンパートメントに添加した。＋１４０ｍＶでの第２の対照記録を１０分間実行した。最終的にヘリカーゼＡＴＰａｓｅ活性を必要に応じてｃｉｓコンパートメントへのＡＴＰ（１ｍＭ）の添加によって開始した。実験は、＋１４０ｍＶの一定電位で実行した。
【０４１６】
結果および考察
ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ基質移行を制御するためのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８  Ｈｌａヘリカーゼ第５ドメイン（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８  Ｈｌａ（配列番号６６）の第５ドメインに付着されている）の使用は、図２０Ａに示す特徴的な電流遮断を生じる。所与の基質について本発明者らは、各ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関してＤＮＡ配列を反映する特徴的な電流遷移のパターンを観察した。ヘリカーゼが結合していないＤＮＡは、ナノポアと一過的に相互作用し、電流において一時的な遮断をもたらす（＜＜１秒間）。結合し、活性な（すなわちＡＴＰａｓｅ作用の下でＤＮＡ鎖に沿って移動する）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８Ｈｌａヘリカーゼ第５ドメインを有するＤＮＡは、図２０Ａに示すとおり電流における段階的変化を伴う長い特徴的な遮断レベルを生じる。ナノポア中の異なるＤＮＡモチーフは、特有の電流遮断レベルを生じる。ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ移動を制御するためのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８  Ｈｖｏヘリカーゼ（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）第５ドメインはＨｅｌ３０８  Ｈｖｏ（配列番号６７）の第５ドメインに付着されている）の使用も、図２０Ｂに示す特徴的な電流遮断を生じる。これは、ヘリカーゼの追加的結合ドメインを別のヘリカーゼに付着させ、酵素活性を保持できることを例示する。
【実施例８】
【０４１７】
本実施例は、付着した追加的ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメインを有するヘリカーゼを使用して、ナノポアを通るヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す。示される２例は２個または４個いずれかのヘリックス−ヘアピン−ヘリックスドメインがＣ末端に付着しているＨｅｌ３０８Ｍｂｕである。
【０４１８】
材料および方法
５０−ポリＴ５’リーダーをＰｈｉＸ  ｄｓＤＮＡの約９００塩基断片にライゲーションすることによって、ＤＮＡを形成した。リーダーは、ＤＮＡが二重層に挿入されるようにするために配列番号７４（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する）がハイブリダイズされた相補性セクションも含有する。最終的にＡＣＧＴの４ｎｔ  ３’−オーバーハングを得るためにＰｈｉＸ  ｄｓＤＮＡの３’末端をＡａｔＩＩ消化酵素で消化した（ＤＮＡ基質設計の図に関して図２１を参照されたい）。
【０４１９】
緩衝溶液：４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
ナノポア：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）
二量体酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＨｈＨ２ドメイン（配列番号７５）に付着されている）最終１００ｎＭで添加、およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメイン（配列番号７６）に付着されている）最終１００ｎＭで添加。
【０４２０】
電気的実験を脂質二重層中に挿入された単一ポアを達成するために実施例５に記載のとおりだが、白金電極をＡｇ／ＡｇＣｌ電極の代わりに使用して設定した。二重層中に単一ポアを達成した後、ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）およびＡＴＰ（１ｍＭ）をチャンバーに添加した。＋１４０ｍＶでの対照記録を５分間実行した。次いでＤＮＡポリヌクレオチド配列番号７２、７３および７４（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する）（ＤＮＡ＝０．１ｎＭ）を電気生理化学チャンバーのｃｉｓコンパートメントに添加し、ＤＮＡ移行事象を観察した。最後にＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（１００ｎＭ、ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＨｈＨ２ドメイン（配列番号７５）に付着されている）またはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２（１００ｎＭ、ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメイン（配列番号７６）に付着されている）のいずれかをＭｓｐＡナノポア中でのヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始するために電気生理化学チャンバーのｃｉｓコンパートメントに添加した。実験は、＋１４０ｍＶの一定電位で実行した。
【０４２１】
結果および考察
ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ基質移行を制御するためのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＨｈＨ２ドメイン（配列番号７５）に付着されている）の使用は、図２２Ａに示す特徴的な電流遮断を生じる。所与の基質について本発明者らは、各ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関してＤＮＡ配列を反映する特徴的な電流遷移のパターンを観察した。ヘリカーゼが結合していないＤＮＡは、ナノポアと一過的に相互作用し、電流において一時的な遮断をもたらす（＜＜１秒間）。結合し、活性な（すなわちＡＴＰａｓｅ作用の下でＤＮＡ鎖に沿って移動する）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２を有するＤＮＡは、図２２Ａに示すとおり電流における段階的変化を伴う長い特徴的な遮断レベルを生じる。ナノポア中の異なるＤＮＡモチーフは、特有の電流遮断レベルを生じる。ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ移動を制御するためのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメイン（配列番号７６）に付着されている）の使用も、図２２Ｂに示す特徴的な電流遮断を生じる。これは、ヘリカーゼに追加的ヘリックス−ヘアピン−ヘリックスドメインを付着させ、酵素活性を保持できることを例示する。
【実施例９】
【０４２２】
本実施例は、ナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖（配列番号８８の５’末端に付着しているのは２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー基の５’末端に付着している２つの追加的Ｔ’を有する、配列番号８８の３’末端に付着しているは配列番号１０４の５’末端に付着されているさらに４個のｉＳｐＣ３スペーサーである）の移動を制御するＴｒｗＣ  Ｃｂａ単量体（配列番号８７）の能力を、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）のものと比較する。二量体は、単量体よりも高い百分率のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の長い滞留（移動の長い滞留は、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の主な集団での平均から３標準偏差を超えて離れているヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動である）を生じる。
【０４２３】
材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ（１ｎＭ、配列番号８８の５’末端に付着しているのは２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー基の５’末端に付着している２つの追加的Ｔ’を有する、配列番号８８の３’末端に付着しているは配列番号１０４の５’末端に付着されているさらに４個のｉＳｐＣ３スペーサーである）および酵素（ＴｒｗＣ  Ｃｂａ単量体（１ｎＭ、配列番号８７）またはＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（０．３ｎＭ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）のいずれか）を合わせて＞１６時間予備インキュベートした。
【０４２４】
緩衝液（６２５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）中のブロック共重合体に挿入された単一ＭｓｐＡナノポアＭＳ（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋを有する配列番号２）から電気測定値を得た。ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびｄＴＴＰ（５ｍＭ）を緩衝液（６２５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）と一緒に混合し、次いでＤＮＡ（配列番号８８の５’末端に付着しているのは２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー基の５’末端に付着している２つの追加的Ｔ’を有する、配列番号８８の３’末端に付着しているのは配列番号１０４の５’末端に付着されているさらに４個のｉＳｐＣ３スペーサーである）、酵素予備混合物（ＴｒｗＣ  Ｃｂａ単量体（１ｎＭ、配列番号８７）またはＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（１ｎＭ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）と合わせて混合した。二重層中に単一ポアを達成した後、予備混合物を単一ナノポア実験系に添加した。実験は、＋１２０ｍＶの一定電位で実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０４２５】
結果および考察
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をヘリカーゼＴｒｗＣ  Ｃｂａ単量体（配列番号８７）およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）について観察した。観察したヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動について検出された移動のおよそ９５％を占める主要な集団がある、しかし、滞留時間が顕著に長い（ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の主な集団での平均から３標準偏差を超えて離れている）移動のわずかな百分率がある。これらの長い移動は、データ分析の改善を可能にする。ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（１ｎＭ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）をＤＮＡ移動を制御するために使用した場合、これらのより長い滞留時間移動（ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の主な集団での平均から３標準偏差を超えて離れている）のより高い百分率（ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体と比較して２０％、およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ  単量体に対して５％）が観察された。二量体ヘリカーゼの使用は、ナノポア配列決定系におけるデータ分析の改善を可能にすることから単量体を超える有利点を提供する。
【実施例１０】
【０４２６】
本実施例は、酵素活性を検査するための蛍光アッセイを使用してＴｒｗＣ  Ｃｂａ−ＴｏｐｏＶ  Ｍｋａ（ここでＴｒｗＣ  ＣｂａはリンカーＡＹＤＶＧＡによって配列番号９０に示すトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ全長配列のドメインＨ−Ｌに付着されている）の耐塩性を例示する。
【０４２７】
材料および方法
通例の蛍光基質をＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｔｏｐｏ  Ｖ  Ｍｋａ（ここでＴｒｗＣ  ＣｂａはリンカーＡＹＤＶＧＡによって配列番号９０に示すトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ全長配列のドメインＨ−Ｌに付着されている）のハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換する能力をアッセイするために使用した。図２３の１）に示すとおり、蛍光基質鎖（最終５０ｎＭ）は３’および５’ｓｓＤＮＡオーバーハングの両方、ならびにハイブリダイズされたｄｓＤＮＡの４４塩基セクションを有する。３’ｓｓＤＮＡオーバーハングを含有する上部鎖は、５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基（配列番号９１において５と標識）を有し、ハイブリダイズした相補体は３’末端にブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基（配列番号９２において６と標識）を有する。ハイブリダイズされると、フルオレセインからの蛍光は局在ＢＨＱ−１によってクエンチされ、基質は実質的に非蛍光性である。蛍光基質の下の鎖に部分的に相補的である捕捉鎖（配列番号９３）１μＭはアッセイに含まれる。２）に示すとおりＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１ｍＭ）の存在下で、基質に添加されたヘリカーゼ（１００ｎＭ）は、蛍光基質の３’尾部に結合し、上部鎖に沿って移動し、相補鎖を置換する。３）に示すとおりＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると主要な鎖の上のフルオレセインは蛍光を発する。４）に示すとおり置換された鎖は過剰量の捕捉鎖に優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ。
【０４２８】
結果および考察
図２４のグラフは、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ単量体（図２４においてＡと標識；配列番号８７）およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｔｏｐｏ  Ｖ  Ｍｋａ（図２４においてＢと標識；ここでＴｒｗＣ  ＣｂａはリンカーＡＹＤＶＧＡによって配列番号９０に示すトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ全長配列のドメインＨ−Ｌに付着されている）についての緩衝液溶液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号９１および９２）、１μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号９３））中の４００ｍＭのＮａＣｌでの活性の初期速度を示す。調査した塩濃度では、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｔｏｐｏ  Ｖ  Ｍｋａ（ここでＴｒｗＣ  ＣｂａはリンカーＡＹＤＶＧＡによって配列番号９０に示すトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ全長配列のドメインＨ−Ｌに付着されている）はＴｒｗＣ  Ｃｂａ単量体（配列番号８７）よりも高いｄｓＤＮＡ代謝回転の速度を示した（図２４を参照されたい）。
【実施例１１】
【０４２９】
本実施例は、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）を合成する方法を記載する。
【０４３０】
材料および方法
ＤＴＴをＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ単量体（２ｍｇ／ｍＬ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）に１０ｍＭで添加し、３０分間ローテータに置いた。還元したタンパク質を１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２に緩衝液交換した。ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ  単量体（２ｍｇ／ｍＬ）（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）を２ｍｇ／ｍｌで添加した。ビスマレイミド−ＰＥＧ（３．４ｋＤａ；０．０３８  ｍＭ）を添加し、反応を２３℃、窒素雰囲気下で２．５時間進行させた。ＤＴＴ（１０ｍＭ）を反応をクエンチするために添加し、いかなるジスルフィド架橋分子種も壊した。ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）を試薬を除去するために初回Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎステップ、続いて溶液中に存在する全ての他の分子種から二量体を分離するためにＧＦ−クロマトグラフィーステップを使用して直ちに精製した。
【０４３１】
ＡＫＴＡ精製装置を精製のために使用した。ストレップ精製を５ｍＬ  ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムで実施した。タンパク質溶液をカラムに添加する前に結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。全ての未結合材料を除去するための初回洗浄ステップ後、それを緩衝液中の１０ｍＭデスチオビオチンで溶出した。溶出されたタンパク質を０．２５ｍｌに濃縮し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０に緩衝液交換し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）１０／３００  ＧＬカラムでのゲルろ過により精製した。図２５および２６は、形成および精製の際の種々の段階でのＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ単量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）のゲルを示す（図２５−レーンＭ＝タンパク質ラダー、レーン１＝Ｅ３−Ｑ２７６Ｃ単量体出発材料、レーン２＝反応混合物、レーン３＝反応混合物。図２６−レーンＭ＝タンパク質ラダー、レーンＸ＝ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体についての参照レーン、レーン４〜１４はＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている））の溶出物からの精製画分を含有する。ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）に対応するバンドを図２５および２６の両方において灰色矢印によって示す。
【０４３２】
本実施例に記載のものと類似の手順を使用して、次のＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−１ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は１ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）を作製することができた。
【実施例１２】
【０４３３】
本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ−ＰＥＧ４リンカー−ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ二量体（ここでＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単位は、位置５７７のアミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）に変異されている配列番号１０を含み、ＰＥＧ４リンカーによってＴｒｗＣ  Ｃｂａ単量体単位、変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７に付着されており、リンカーはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体上の位置５７７およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ上の位置２７６で各単量体に付着されている）を合成する方法を記載する。２つの単量体単位に付着する方法の模式図を図２７に示す。
【０４３４】
材料および方法
ＤＴＴ（１０ｍＭ）をＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ単量体（０．９ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）に添加し、試料を室温に１時間置いた。ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ単量体（０．９ｍｇ／ｍＬ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）試料の緩衝液交換を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ４００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．５中の４０Ｋ  Ｚｅｂａカラムを使用して二回実施した。Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ（５００μＭ）を緩衝液交換されたＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ単量体（０．９ｍｇ／ｍＬ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）に添加し、試料を室温に３時間置いた。ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ単量体（０．９ｍｇ／ｍＬ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯを次いで４０Ｋ  Ｚｅｂａカラムを使用して１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ４００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５に２回緩衝液交換した。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ（１．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬ、ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）を４０Ｋ  Ｚｅｂａカラムを使用して１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ４００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５に緩衝液交換した。２つの緩衝液交換タンパク質を合わせて混合し、室温に３時間置いた。最終的に次の試料を４〜１２％ゲル（図２８に示す）で実行した、レーンａ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）、レーンｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ（ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）、レーンｃ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ（ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）、レーンｄ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋５ｋＤａ  ＰＥＧ、レーンｅ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋アジドが付着している５ｋＤａ  ＰＥＧ、レーンｆ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ａｚｉｄｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フルオロフォアとＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体との非特異的相互作用を確認するために使用）、レーンｇ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ、レーンｈ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリンカーに付着されている変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）、レーンｉ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ−ＰＥＧ４リンカー−ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ二量体（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単位は、位置５７７のアミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）に変異されている配列番号１０を含み、ＰＥＧ４リンカーによってＴｒｗＣ  Ｃｂａ単量体単位、変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７に付着されており、リンカー��Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体上の位置５７７およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ上の位置２７６で各単量体に付着されている）に加えて未反応ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ単量体（ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）、レーンｊ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ＋アジドが付着している５ｋＤａ  ＰＥＧ、レーンｋ）ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ＋Ａｚｉｄｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フルオロフォアとＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体との非特異的相互作用を確認するために使用）。
また、本発明は以下を提供する。
［１］  標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアならびにヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物と、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップであって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着されており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有するステップ；および
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む方法。
［２］  ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合成分とが共有結合的に付着されている、［１］に記載の方法。
［３］  ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合成分とが化学的に付着されている、または遺伝子的に融合されている、［１］または［２］に記載の方法。
［４］  ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合成分とが１つまたは複数のリンカーによって付着されている、前記のいずれか一項に記載の方法。
［５］  １つまたは複数のリンカーがアミノ酸配列である、［４］に記載の構築物。
［６］  ポリヌクレオチド結合成分が１つまたは複数のヘリカーゼを含む、前記のいずれか一項に記載の方法。
［７］  構築物中の２つ以上のヘリカーゼが互いに異なっている、［６］に記載の方法。
［８］  ２つ以上のヘリカーゼが同じであるまたは類似している、［６］に記載の方法。
［９］  ２つ以上のヘリカーゼが各ヘリカーゼ中の同じアミノ酸残基を使用して付着されている、［８］に記載の方法。
［１０］  ポリヌクレオチド結合成分が、ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメイン、真核生物１本鎖結合タンパク質（single-stranded binding protein）（ＳＳＢ）、細菌性ＳＳＢ、古細菌ＳＳＢ、ウイルス性ＳＳＢ、２本鎖結合タンパク質、スライディングクランプ、前進性因子、ＤＮＡ結合ループ、複製開始タンパク質、テロメア結合タンパク質、リプレッサー、亜鉛フィンガーおよび増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）から独立に選択される１つまたは複数のドメインを含む、［１］から［５］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］  ポリヌクレオチド結合成分が表４に示されるものおよびその変種から選択される、［１０］に記載の方法。
［１２］  ポリヌクレオチド結合成分がエキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼまたはトポイソメラーゼ由来である、［１］から［５］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］  ポリメラーゼがＰｈｉ２９ポリメラーゼ（配列番号６２）またはその変種である、［１２］に記載の方法。
［１４］  １つまたは複数のヘリカーゼがスーパーファミリー１〜６から独立に選択される、前記のいずれか一項に記載の方法。
［１５］  １つまたは複数のヘリカーゼが単量体である、前記のいずれか一項に記載の方法。
［１６］  １つまたは複数のヘリカーゼが、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、Ｔｒａｌヘリカーゼ、Ｔｒａｌサブグループヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼおよびその変種から独立に選択される、前記のいずれか一項に記載の方法。
［１７］  （ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼがアミノ酸モチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ（配列番号８）（式中、Ｘ１はＣ、ＭもしくはＬであり、Ｘ２は任意のアミノ酸残基である）を含み；
（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼが、
−  アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号８）（式中、Ｘ１はＧ、ＳもしくはＡであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＰ、Ａ、ＳもしくはＧであり、Ｘ４はＴ、Ａ、Ｖ、ＳもしくはＣであり、Ｘ５はＧもしくはＡであり、Ｘ６はＫもしくはＲであり、Ｘ７はＴもしくはＳである）；および／または
−  アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）３−Ｑ−Ｘ７（配列番号１２）（式中、Ｘ１はＹ、ＷもしくはＦであり、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、ＣもしくはＶであり、Ｘ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ４はＴもしくはＮであり、Ｘ５はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、ＶもしくはＩであり、Ｘ６は任意のアミノ酸であり、Ｘ７はＧもしくはＳである）
を含み；
（ｃ）ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼが、
−  アミノ酸モチーフＨ−（Ｘ１）２−Ｘ２−Ｒ−（Ｘ３）５〜１２−Ｈ−Ｘ４−Ｈ（配列番号３１〜３８）（式中、Ｘ１およびＸ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ４はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される）；または
−  アミノ酸モチーフＧ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｈ−（Ｘ８）６〜１２−Ｈ−Ｘ９（配列番号３９〜４５）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ４はＤまたはＥであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である）
を含み；または
（ｄ）ＸＰＤヘリカーゼが、
（ａ）アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｅ−Ｇ（配列番号８）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ３およびＸ４は任意のアミノ酸残基であってよい）；および／または
（ｂ）アミノ酸モチーフＱ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｇ−Ｒ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｒ−（Ｘｅ）３−Ｘｆ−（Ｘｇ）７−Ｄ−Ｘｈ−Ｒ（配列番号９）（式中、Ｘａ、ＸｅおよびＸｇは任意のアミノ酸残基であってよく、式中、Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄはＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される）
を含む、［１６］に記載の方法。
［１８］  Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ中のＸ２がＡ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＴまたはＰである、［１７］に記載の方法。
［１９］  Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが表１に示すヘリカーゼの１つまたはその変種である、［１７］または［１８］に記載の方法。
［２０］  Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが、（ａ）配列番号１０、１３、１６もしくは１９のいずれか１つに示す配列、または（ｂ）その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて関連配列に少なくとも４０％相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、［１９］に記載の方法。
［２１］  ＴｒａＩヘリカーゼが、（ａ）配列番号４６、８７、９８もしくは１０２に示す配列、または（ｂ）その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて関連配列に少なくとも４０％相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、［１７］に記載の方法。
［２２］  ＸＰＤヘリカーゼ中のＸ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６ならびに／またはＸｂ、ＸｃおよびＸｄがＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される、［１７］に記載の方法。
［２３］  ＸＰＤヘリカーゼが、（ａ）配列番号５２のいずれか１つに示す配列、または（ｂ）その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて関連配列に少なくとも４０％相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、［１７］または［２２］に記載の方法。
［２４］  １つまたは複数のヘリカーゼが付着を促進するために修飾されている、前記のいずれか一項に記載の方法。
［２５］  １つまたは複数のヘリカーゼが、１つもしくは複数の非天然システイン残基および／または１つもしくは複数の４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）残基の導入によって修飾されている、［２４］に記載の方法。
［２６］  １つまたは複数の特性が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される、前記のいずれか一項に記載の方法。
［２７］  標的ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されている、［２６］に記載の方法。
［２８］  標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性が電気的測定および／または光学的測定によって測定される、前記のいずれか一項に記載の方法。
［２９］  電気的測定が電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、［２８］に記載の方法。
［３０］  （ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアならびにヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物と、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップであって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着されており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有するステップ；および
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通過する電流を測定するステップであって、電流が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む、前記のいずれか一項に記載の方法。
［３１］  ポアに電圧を印加して、ポアと構築物との複合体を形成するステップをさらに含む、前記のいずれか一項に記載の方法。
［３２］  ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖である、前記のいずれか一項に記載の方法。
［３３］  ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアである、前記のいずれか一項に記載の方法。
［３４］  膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリジン（hemolysin）、ロイコシジン（leukocidin）、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）Ａ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来である、［３３］に記載の方法。
［３５］  ２つ以上のヘリカーゼを含む構築物であって、ヘリカーゼが互いに付着しており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
［３６］  構築物が［７］から［９］のいずれか一項に定義されており、および／または２つ以上のヘリカーゼが［１４］から［２５］のいずれか一項に定義されている、［３５］に記載の構築物。
［３７］  ヘリカーゼと、配列番号９４または配列番号９４の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９４に少なくとも８０％相同性を有するその変種を含むアミノ酸配列とを含む構築物であって、ヘリカーゼがアミノ酸配列に付着されており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
［３８］  配列番号９０、または配列番号９０の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９０に少なくとも８０％相同性を有するその変種を含む、［３７］に記載の構築物。
［３９］  ［３５］から［３８］のいずれか一項に記載の構築物をコードしているポリヌクレオチド配列であって、２つ以上のヘリカーゼが遺伝子的に融合されているポリヌクレオチド配列。
［４０］  ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを［３５］から［３８］のいずれか一項に記載の構築物に接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む方法。
［４１］  標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成する方法であって、ポアと、［１］から［２５］のいずれか一項に記載の構築物または［３５］から［３８］のいずれか一項に記載の構築物との複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む方法。
［４２］  複合体が、（ａ）標的ポリヌクレオチドの存在下で構築物とポアとを接触させるステップおよび（ｂ）ポアに電位を印加するステップによって形成される、［４１］に記載の方法。
［４３］  電位が、電圧電位または化学電位である、［４２］に記載の方法。
［４４］  複合体が、ポアを構築物に共有結合的に付着するステップによって形成される、［４２］に記載の方法。
［４５］  ポアと、［１］から［２５］のいずれか一項に定義されている、構築物または［３５］から［３８］のいずれか一項に記載の構築物との間の複合体を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー。
［４６］  ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための［３５］から［３８］のいずれか一項に記載の構築物または［１］から［２５］のいずれか一項に定義されている、構築物の使用。
［４７］  （ａ）ポアおよび（ｂ）［１］から［２５］のいずれか一項に定義されている、構築物または［３５］から［３８］のいずれか一項に記載の構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット。
［４８］  両親媒性膜を含むチップをさらに含む、［４７］に記載のキット。
［４９］  複数のポア、および［１］から［２５］のいずれか一項に定義されている、複数の構築物または［３５］から［３８］のいずれか一項に記載の複数の構築物を含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置。
［５０］  複数のポアを支持でき、ポアおよび構築物を使用してポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー
を含む、［４９］に記載の装置。
［５１］  複数のポアを支持でき、前記ポアおよび構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための１つまたは複数の容器
を含み、前記流体系が前記１つまたは複数の容器から前記センサーデバイスに前記試料を選択的に供給するように構成されている、［４９］または［５０］に記載の装置。
［５２］  ［３５］および［３６］に記載の構築物を産生する方法であって、２つ以上のヘリカーゼを互いに付着させ、それにより構築物を産生するステップを含む方法。
［５３］  ［３７］または［３８］に記載の構築物を産生する方法であって、ヘリカーゼを、配列番号９４または配列番号９４の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９４に少なくとも８０％相同性を有するその変種を含むアミノ酸配列に付着させ、それにより構築物を産生するステップを含む方法。
［５４］  得られた構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップをさらに含む、［５２］または［５３］に記載の方法。
［５５］  （ａ）［３９］に記載のポリヌクレオチドを提供するステップ；および
（ｂ）ポリヌクレオチド配列を発現するステップ
を含む、［５２］から［５４］のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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