(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において２型糖尿病を処置するための医薬組成物であって、２型糖尿病が該対象において処置されるように、有効成分として、有効量の非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、または該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的に活性な類似体もしくは該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的に活性な断片、のみを含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
それを必要とする対象において血糖値を低下させるための医薬組成物であって、該対象の血糖値が低下するように、有効成分として、有効量の非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、または該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的に活性な類似体もしくは該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的に活性な断片、のみを含む、前記医薬組成物。
【請求項３】
それを必要とする対象において耐糖能を正常なレベルまで実質的に回復させるための医薬組成物であって、該対象の耐糖能が回復するように、有効成分として、有効量の非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、または該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的に活性な類似体もしくは該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的に活性な断片、のみを含む、前記医薬組成物。
【請求項４】
該非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質の類似体もしくは断片が、該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、該非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列が
ａ）次の配列：
【化１】
0006310398.tif 000015
式中、Ｘ１はＧ、Ａ、Ｖであり、または存在せず；
Ｘ２はＥまたはＫであり；
Ｘ３はＴまたはＳであり；そして
Ｘ４はＱまたはＨである；
またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片である；
ｂ）完全長ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質である；あるいは、
ｃ）次の配列：
【化２】
0006310398.tif 000016
またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片である、
前記医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、該非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列が
ｄ）次の配列：
【化３】
0006310398.tif 000017
またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片である、
前記医薬組成物。
【請求項７】
該非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
該非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
該対象がヒトである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
全身投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片が、１〜１０μｇ／ｇの用量で投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片が１日１回投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片が１日２回投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
さらに医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
該医薬組成物が液体配合物、水性配合物、および凍結乾燥された配合物からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本開示は、非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（ａｐｏＡ−ＩＶ）を用いて糖尿病を処置する方法に関する。より詳細には、本開示は、タンパク質発現系により生成された有効量の非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶを投与することにより２型糖尿病を処置する方法に関する。
【０００２】
関連出願
[0002]  この出願は、２０１２年１月１９日に出願されたＰＣＴ出願第PCT/US2012/021802号に対する優先権を主張する。この出願は、２０１２年７月２５日に出願された米国仮特許出願第61/675692号に対する優先権も主張する。優先権出願の全内容を参照により本明細書にそのまま援用する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  糖尿病の発生は広範囲に及び、米国における人口のおおよそ８％が糖尿病を患っている。糖尿病は、体がインスリンを有効に産生および／または使用できないことによる高血糖を特徴とする慢性疾患である。糖尿病は、腎不全、失明、神経損傷、心疾患、睡眠無呼吸、およびセリアック病が含まれるがそれらに限定されない様々な身体的合併症をもたらし得る。例えば、米国において、糖尿病は腎不全、失明、切断、卒中、および心臓発作の主因である。また、米国において、糖尿病は死亡の６番目の主因であり、中年成人の平均余命を約５〜１０年低減することが示されている。
【０００４】
[0004]  糖尿病の最も一般的な形態は２型糖尿病（ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）（“Ｔ２ＤＭ”または“２型糖尿病（ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ）”とも呼ばれる）である。２型糖尿病は、高血糖症、インスリン耐性、β細胞機能不全、および肝臓糖新生調節不全を特徴とする。２型糖尿病を患っている人は、インスリン分泌の第１相におけるβ細胞からの貯蔵されたインスリン顆粒の放出障害に関連する、グルコースに刺激されるインスリン分泌の喪失を経験する。インスリン分泌の第２相において、２型糖尿病を患っている人はグルコース刺激に応答して活発にインスリンを合成する能力の徐々の喪失を経験する。
【０００５】
[0005]  ２型糖尿病の有病率は増大しており、２００２年において２型糖尿病は結果として１３００億＄より多い健康管理の費用をもたらした。従って、２型糖尿病を有効に処置するための新規の療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
[0006]  本発明は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（ａｐｏＡ−ＩＶ）タンパク質はヒトにおいてグリコシル化されていないという驚くべき発見に基づいている。本開示より前には、当技術分野においてａｐｏＡ−ＩＶタンパク質はグリコシル化されていることが知られていた。ＷｅｉｎｂｅｒｇおよびＳｃａｎｕ((1983) J of Lipid Res vol. 24:52)は、ａｐｏＡ−ＩＶは６重量％の炭水化物（マンノース１．８％、ガラクトース１．５５％、Ｎ−アセチルグルコサミン１．５５％、シアル酸１．１％）を含有する糖タンパク質であると報告した。従って、ａｐｏＡ−ＩＶは一般に糖タンパク質として記述されている（例えば、Gomaraschi et al. (2010) Biochem Biophys Res Commun. 393(1):126-30を参照）。対照的に、下記の実施例１３において記述されるように、ａｐｏＡ−ＩＶは非グリコシル化タンパク質である。
【０００７】
[0007]  従って、１態様において、本発明は、非グリコシル化（ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）（非グリコシル化（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）とも呼ばれる）ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質を用いて２型糖尿病を処置する方法を提供する。その方法は、その対象に有効量の非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質、またはａｐｏＡ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するその生物学的に活性な類似体もしくは断片を投与することを含む。
【０００８】
[0008]  １態様において、非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶはグリコシル化する能力を欠いた発現系を用いて生成される。例えば、細菌発現系、例えば大腸菌を用いて非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶを作ることができる。
【０００９】
[0009]  別の態様において、非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶを作るために用いることができる細胞発現系には、哺乳類細胞発現系、酵母発現系およびバキュロウイルス発現系が含まれるが、それらに限定されない。別の態様において、無細胞発現系を用いて非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質を作ることができる。
【００１０】
[0010]  別の態様において、非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質を含む医薬組成物を開示する。その医薬組成物は、ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％の同一性を有する非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な断片を含む。その医薬組成物は、２型糖尿病の処置のための対象への投与のために配合することができる。
【００１１】
[0011]  １態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つにおいて示されるようなアミノ酸配列（またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４に対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一である配列）を含む非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な断片を含む医薬組成物を提供する。１態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つにおいて示されるようなアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な断片を含む医薬組成物を提供する。別の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な断片を有する医薬組成物を提供する。別の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な断片を有する医薬組成物を提供する。別の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な断片を有する医薬組成物を提供する。別の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な断片を有する医薬組成物を提供する。
【００１２】
[0012]  １態様において、その医薬組成物は医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤を含む。
[0013]  別の態様において、その医薬組成物は、液体配合物、水性配合物、および凍結乾燥された配合物からなる群から選択される。
【００１３】
[0014]  １態様において、本発明は、２型糖尿病を有する対象に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つにおいて示されるようなアミノ酸配列（またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４に対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一である配列）を含むアミノ酸配列を有する非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片を投与することを含む、２型糖尿病を処置する方法を提供する。さらなる態様において、そのａｐｏＡ−ＩＶタンパク質は、原核生物発現系、例えば細菌発現系、例えば大腸菌を用いて生成される。
【００１４】
[0015]  さらに別の態様において、それを必要とする対象において耐糖能を正常なレベルまで実質的に回復させるための方法が開示される。その方法は、その対象に、ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する有効量の非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体もしくは断片を、例えばその非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体もしくは断片の全身投与により投与することを含む。１態様において、本発明は、それを必要とする対象において耐糖能を正常なレベルまで実質的に回復させるための方法を提供し、前記の方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つにおいて示されるようなアミノ酸配列（またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４に対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一であるアミノ酸配列）を有する非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質（またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片）を投与することを含む。
【００１５】
[0016]  さらになお別の態様において、それを必要とする対象において血糖値を低下させるための方法が開示される。その方法は、その対象にその非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶに対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する有効量の非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体もしくは断片を、例えば全身投与により、必要とする対象に投与することを含む。１態様において、本発明は、それを必要とする対象において血糖値を低下させるための方法を提供し、その方法は、その対象にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、または２０〜６４において示されるアミノ酸配列（またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４に対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一である配列）を含む有効量の非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶ（またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片）を投与することを含む。
【００１６】
[0017]  “有効量”は下記で記述される通りであり、約０．２５〜２μｇ／ｇのａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体が含まれてよい。１態様において、その有効量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、その有効量は約１〜１０００ｍｇの一定用量である。さらなる態様において、その有効量は約１〜１０ｍｇの一定用量である。
【００１７】
[0018]  本開示に従うこれらおよび他の様々な態様のこれらおよび他の特徴および利点は、本明細書で提供される図面、詳細な記述、および特許請求の範囲を考慮してより明らかになるであろう。
本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
［態様１］  それを必要とする対象において２型糖尿病を処置する方法であって、該方法が該対象に有効量の非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、または該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的に活性な類似体もしくは断片を２型糖尿病が該対象において処置されるように投与することを含み、該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片がタンパク質発現系を用いて生成される、前記方法。
［態様２］  それを必要とする対象において血糖値を低下させる方法であって、該方法が該対象に有効量の非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、または該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的に活性な類似体もしくは断片を該対象の血糖値が低下するように投与することを含み、該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片がタンパク質発現系を用いて生成される、前記方法。
［態様３］  それを必要とする対象において耐糖能を正常なレベルまで実質的に回復させるための方法であって、該方法が該対象に有効量の非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、または該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的に活性な類似体もしくは断片を該対象の耐糖能が回復するように投与することを含み、該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片がタンパク質発現系を用いて生成される、前記方法。
［態様４］  該非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９５％の同一性を有する、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］  該非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９９％の同一性を有する、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［態様６］  該対象がヒトである、態様１〜５のいずれか１項に記載の方法。
［態様７］  態様１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列が次の配列：
【化１】
0006310398.tif 000002
式中、Ｘ１はＧ、Ａ、Ｖであり、または存在せず；
Ｘ２はＥまたはＫであり；
Ｘ３はＴまたはＳであり；そして
Ｘ４はＱまたはＨである；
またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片である、前記方法。
［態様８］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が完全長ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質である、態様１〜６のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］  態様１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸が次の配列：
【化２】
0006310398.tif 000003
またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片である、前記方法。
［態様１０］  態様１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列が次の配列：
【化３】
0006310398.tif 000004
またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片である、前記方法。
［態様１１］  タンパク質発現系の使用が細菌発現系である、態様１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］  細菌発現系が大腸菌である、態様１１に記載の方法。
［態様１３］  タンパク質発現系が哺乳類発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、および無細胞発現系からなる群から選択される、態様１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１４］  ２型糖尿病を有する対象において２型糖尿病を処置する方法であって、該対象に組み替え非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質を投与することを含み、該ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、前記方法。
［態様１５］  ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、態様１４に記載の方法。
［態様１６］  ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、態様１４に記載の方法。
［態様１７］  ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、態様１４に記載の方法。
［態様１８］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が全身投与される、態様１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
［態様１９］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片の全身投与が経口、皮下、静脈内、筋内、および腹腔内投与からなる群から選択される、態様１８に記載の方法。
［態様２０］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片が約１〜約１０μｇ／ｇの用量で投与される、態様１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
［態様２１］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片が約０．２５〜約２μｇ／ｇの用量で投与される、態様１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
［態様２２］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片が約１μｇ／ｇの用量で投与される、態様１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
［態様２３］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片が１日１回投与される、態様１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
［態様２４］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片が１日約２回投与される、態様１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
［態様２５］  非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、または該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に対して少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的に活性な類似体もしくは断片を含む医薬組成物であって、該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片がタンパク質発現系を用いて生成される、前記医薬組成物。
［態様２６］  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な断片を含む医薬組成物。
［態様２７］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、態様２６に記載の医薬組成物。
［態様２８］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、態様２６に記載の医薬組成物。
［態様２９］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、態様２６に記載の医薬組成物。
［態様３０］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つに対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、態様２６に記載の医薬組成物。
［態様３１］  さらに医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤を含む、態様２５〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［態様３２］  態様２５〜３１のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、該医薬組成物が液体配合物、水性配合物、および凍結乾燥された配合物からなる群から選択される、前記医薬組成物。
［態様３３］  態様２５〜３１のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列が次の配列：
【化４】
0006310398.tif 000005
式中、Ｘ１はＧ、Ａ、Ｖであり、または存在せず；
Ｘ２はＥまたはＫであり；
Ｘ３はＴまたはＳであり；そして
Ｘ４はＱまたはＨである；
またはその生物学的に活性な断片である、前記医薬組成物。
［態様３４］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が完全長ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質である、態様２５〜３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［態様３５］  態様２５〜３１のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸が次の配列：
【化５】
0006310398.tif 000006
またはその生物学的に活性な断片である、前記医薬組成物。
［態様３６］  態様２５〜３１のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列が次の配列：
【化６】
0006310398.tif 000007
またはその生物学的に活性な断片である、前記医薬組成物。
［態様３７］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶが細菌発現系であるタンパク質発現系を用いて生成される、態様２５〜３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［態様３８］  細菌発現系が大腸菌である、態様３７に記載の医薬組成物。
［態様３９］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶが哺乳類発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、および無細胞発現系からなる群から選択されるタンパク質発現系を用いて生成される、態様２２〜３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［態様４０］  それを必要とする対象において２型糖尿病を処置する方法であって、前記の方法が以下の工程：
タンパク質発現系においてアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片を生成し、そして
該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片を２型糖尿病を有する対象に２型糖尿病が処置されるように投与する；
を含み、ここで該アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片はグリコシル化されていない、前記方法。
［態様４１］  タンパク質発現系が細菌発現系である、態様４０に記載の方法。
［態様４２］  タンパク質発現系が酵母または哺乳類細胞発現系である、態様４０に記載の方法。
［態様４３］  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４において示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、態様４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
［態様４４]  アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４のいずれか１つにおいて示される配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、態様４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【００１８】
[0019]  本開示の態様の以下の詳細な記述は、以下の図面と合わせて読まれた場合、よりよく理解することができ、ここで同じ構造は同じ参照数字で示されており、ここで：
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】[0020]  図１は、本開示の１態様に従う医薬組成物のリザーバーおよび注射器を有する装置の側面斜視図である。
【図２】[0021]  図２は、腹腔内グルコース負荷試験（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ）に関する時間（分）に関するオスのａｐｏＡ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおける血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図３】[0022]  図３は、１６ヶ月齢のａｐｏＡ−ＩＶ野生型およびノックアウト動物における腹腔内グルコース負荷試験に関する時間（分）に関する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図４】[0023]  図４は、腹腔内グルコース負荷試験に関する、組み換えａｐｏＡ−ＩＶ（μｇ／ｇ）または生理食塩水溶液の腹腔内投与後のオスのａｐｏＡ−ＩＶノックアウトマウスにおける時間（分）に関する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図５】[0024]  図５は、腹腔内グルコース負荷試験に関する、組み換えａｐｏＡ−Ｉまたは生理食塩水溶液の腹腔内投与後のａｐｏＡ−ＩＶノックアウトマウスにおける時間（分）に関する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図６】[0025]  図６は、組み換えａｐｏＡ−Ｉまたは生理食塩水溶液の腹腔内投与後のａｐｏＡ−ＩＶノックアウトマウスにおける時間（分）に関するインスリン分泌（ｎｇ／ｍＬ）のグラフである。
【図７】[0026]  図７は、腹腔内グルコース負荷試験に関する、慢性的に高脂肪の飼料を与えたａｐｏＡ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおける時間（分）に関する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図８】[0027]  図８は、腹腔内グルコース負荷試験に関する、組み換えマウスａｐｏＡ−ＩＶ（１μｇ／ｇ）または生理食塩水溶液の腹腔内投与後の、慢性的に高脂肪の飼料を与えたａｐｏＡ−ＩＶノックアウトマウスにおける時間（分）に関する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図９】[0028]  図９は、腹腔内グルコース負荷試験に関する、組み換えマウスａｐｏＡ−ＩＶ（１μｇ／ｇ）または生理食塩水溶液の腹腔内投与後の糖尿病マウスにおける時間（ｈ）に関する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１０】[0029]  図１０は、ａｐｏＡ−ＩＶノックアウトマウス、野生型マウス、およびａｐｏＡ−Ｉノックアウトマウスにおける血清アミロイドＡタンパク質構成要素のレベルのウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図１１】[0030]  図１１は、腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）の間の時間（分）に関するメスのａｐｏＡ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおける血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１２】[0031]  図１２は、腹腔内グルコース負荷試験の間の１．０μｇ／ｇヒトａｐｏＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の腹腔内投与後の野生型マウスにおける時間（分）に関する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１３】[0032]  図１３は、腹腔内グルコース負荷試験の間の１．０μｇ／ｇ組み換えマウスａｐｏＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の腹腔内投与後のメスの野生型マウスにおける時間（分）に関する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１４】[0033]  図１４は、３ｍＭまたは２０ｍＭグルコースの存在下で３０ｍＭ  ＫＣｌおよび２５０μＭジアゾキシドにより脱分極させたヒトの島（ｉｓｌｅｔｓ）への１０μｇ／ｇヒトａｐｏＡ−ＩＶの作用を示す棒グラフである。
【図１５】[0034]  図１５は、完全長野生型ヒトａｐｏＡ−ＩＶのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）を有するタンパク質である。
【図１６】[0035]  図１６は、完全長野生型マウスａｐｏＡ−ＩＶのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）を有するタンパク質である。
【図１７】[0036]  図１７は、Ｎ末端にグリシンが付加された完全長野生型ヒトａｐｏＡ−ＩＶのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）を有するタンパク質である。
【図１８】[0037]  図１８は、多型性置換Ｔ３４７Ｓ、Ｑ３６０Ｈ、および／またはＥ１６５Ｋを示し、場合によりグリシン、アラニンまたはバリンがＮ末端に付加されているヒトａｐｏＡ−ＩＶのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）を有するタンパク質である。
【図１９】[0038]  図１９は、完全長野生型ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶをコードするポリヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）である。
【図２０−１】[0039]  図２０には、大腸菌におけるペリプラズム発現のためのＯｍｐ−Ａｐｏ  Ａ−ＩＶコンストラクトのアミノ酸配列および最適化されたヌクレオチドコード配列が含まれる。
【図２０−２】[0039]  図２０には、大腸菌におけるペリプラズム発現のためのＯｍｐ−Ａｐｏ  Ａ−ＩＶコンストラクトのアミノ酸配列および最適化されたヌクレオチドコード配列が含まれる。
【図２１−１】[0040]  図２１には、大腸菌におけるペリプラズム発現のためのＰｅｌＢ−Ａｐｏ  Ａ−ＩＶコンストラクトのアミノ酸配列および最適化されたヌクレオチドコード配列が含まれる。
【図２１−２】[0040]  図２１には、大腸菌におけるペリプラズム発現のためのＰｅｌＢ−Ａｐｏ  Ａ−ＩＶコンストラクトのアミノ酸配列および最適化されたヌクレオチドコード配列が含まれる。
【図２２−１】[0041]  図２２には、大腸菌におけるペリプラズム発現のためのＥＮＸ−Ａｐｏ  Ａ−ＩＶコンストラクトのアミノ酸配列および最適化されたヌクレオチドコード配列が含まれる。
【図２２−２】[0041]  図２２には、大腸菌におけるペリプラズム発現のためのＥＮＸ−Ａｐｏ  Ａ−ＩＶコンストラクトのアミノ酸配列および最適化されたヌクレオチドコード配列が含まれる。
【図２３−１】[0042]  図２３には、大腸菌における細胞質発現のためのＡｐｏ  Ａ−ＩＶコンストラクトのアミノ酸配列および最適化されたヌクレオチドコード配列が含まれる。
【図２３−２】[0042]  図２３には、大腸菌における細胞質発現のためのＡｐｏ  Ａ−ＩＶコンストラクトのアミノ酸配列および最適化されたヌクレオチドコード配列が含まれる。
【図２４−Ａ】[0043]  図２４ＡおよびＢは、ヒト野生型ａｐｏＡ−ＩＶ（図２４Ａ）および変異体Ｐ３９３Ｈ（図２４Ｂ）に関するＮ−グリコシル化の予測結果を示す。
【図２４−Ｂ】図２４ＡおよびＢは、ヒト野生型ａｐｏＡ−ＩＶ（図２４Ａ）および変異体Ｐ３９３Ｈ（図２４Ｂ）に関するＮ−グリコシル化の予測結果を示す。
【図２５−Ａ】[0044]  図２５ＡおよびＢは、ヒト野生型ａｐｏＡ−ＩＶ（図２５Ａ）および変異体Ｐ３９３Ｈ（図２５Ｂ）に関するＯ−グリコシル化の予測結果を示す。
【図２５−Ｂ】図２５ＡおよびＢは、ヒト野生型ａｐｏＡ−ＩＶ（図２５Ａ）および変異体Ｐ３９３Ｈ（図２５Ｂ）に関するＯ−グリコシル化の予測結果を示す。
【００２０】
[0045]  当業者は、図中の要素は単純性および明確性のために図説されており、必ずしも一定の縮尺で描かれていないことを理解しているであろう。例えば、本開示の様々な態様の理解を向上させるのを助けるため、その図中の要素の一部の寸法が他の要素と比較して誇張されている、ならびに従来の部品が取り除かれている可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[0046]  以下の用語を本出願において用いる：
[0047]  本明細書で用いられる際、用語“非グリコシル化（ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）”または“非グリコシル化（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）”は、例えば等電点分画法、ＰＮＧアーゼＦ消化および／またはＭＡＬＤＩ分析による検出限界の範囲内で観察可能なＮ結合型グリコシル化および／またはＯ結合型グリコシル化を有しないタンパク質を意味する。１態様において、用語“非グリコシル化（ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）”または“非グリコシル化（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）”は、観察可能なＮ結合型グリコシル化を有さず、かつ観察可能なＯ結合型グリコシル化を有しないことを意味する。別の態様において、用語“非グリコシル化（ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）”または“非グリコシル化（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）”は、観察可能なＮ結合型グリコシル化を有しないことを意味する。別の態様において、用語“非グリコシル化（ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）”または“非グリコシル化（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）”は、観察可能なＯ結合型グリコシル化を有しないことを意味する。
【００２２】
[0048]  本明細書で用いられる際、用語“タンパク質発現系”は、対象のタンパク質、例えばａｐｏＡ−ＩＶを生成するために用いられる細胞に基づく、または非細胞に基づく発現系を指す。驚くべきことにａｐｏＡ−ＩＶがグリコシル化を欠いていることが分かったとすれば、グリコシル化機構を欠く発現系を用いて２型糖尿病の処置における使用のためのタンパク質を生成することができる。１態様において、哺乳類細胞のようなグリコシル化を行う細胞に基づく発現系を用いて非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶを生成することができる。１態様において、ａｐｏＡ−ＩＶを作るために用いられるタンパク質発現系には、細菌発現系、哺乳類細胞発現系、バキュロウイルス（昆虫）細胞発現系、または酵母発現系のいずれかが含まれる。
【００２３】
[0049]  用語“組み換え宿主細胞”（または単に“宿主細胞）は、本明細書で用いられる際、核酸配列により形質転換されており、または形質転換されることができ、それにより対象の遺伝子、例えばａｐｏＡ−ＩＶを発現する細胞を指す。そのような用語は特定の対象細胞を指すだけでなくそのような細胞の子孫も指すことが意図されていることは理解されるべきである。変異または環境的影響のどちらかにより後に続く世代において特定の修飾が起こる可能性があるため、そのような子孫は実際にはその親細胞と同一ではない可能性があるが、なお本明細書で用いられるような用語“宿主細胞”の範囲内に含まれる。宿主細胞は、外来性の核酸配列を発現することができる原核または真核細胞であってよい。宿主細胞の例には、細菌、例えば大腸菌、酵母、植物細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）−２９３細胞および昆虫細胞が含まれる。
【００２４】
[0050]  用語“単離された”は、それがタンパク質に関して用いられる場合、その由来の起源または源により、（１）その未変性状態においてそれを伴う、天然において会合している構成要素と会合していない；（２）同じ種からの他のタンパク質を有しない；（３）異なる種からの細胞により発現されている；または（４）天然に存在しない、タンパク質、ポリペプチドまたは抗体である。従って、例えば化学的に合成された、またはそれが天然において源を発する細胞と異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然において会合している構成要素から“単離されている”であろう。タンパク質は、あらゆる適切なタンパク質精製技法を用いる単離により天然において会合している構成要素を実質的に含まないようにすることもできる。１態様において、本発明の組成物および方法において用いられるａｐｏＡ  ＩＶタンパク質は、組み換え宿主細胞、例えば細菌細胞から得られた単離されたタンパク質である。
【００２５】
[0051]  句“パーセント同一の”または“パーセント同一性”は、少なくとも２つの異なる配列間の類似性（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）を指す。このパーセント同一性は、標準的なアラインメントアルゴリズム、例えばＡｌｔｓｈｕｌらにより記述された基本的局所的アラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（ＢＬＡＳＴ）((1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズム((1970) J. Mol. Biol. 48:444-53)；またはＭｅｙｅｒｓらのアルゴリズム((1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)により決定することができる。パラメーターのセットは、例えば１２のギャップペナルティー、４のギャップ伸長ペナルティー、および５のフレームシフトギャップペナルティーを用いたＢｌｏｓｕｍ  ６２スコア行列であることができる。２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム((1989) CABIOS 4:11-17)を用いて決定することもでき、それはＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ伸長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを用いるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれている。
【００２６】
[0052]  用語“組み換えタンパク質”は、組み換えＤＮＡから発現されるタンパク質分子を指す。例えば、組み換えＡｐｏＡ−ＩＶタンパク質は、組み換え宿主細胞中で発現されるタンパク質である。好ましくは、本発明の方法および組成物において用いられるＡｐｏＡ−ＩＶタンパク質は組み換えＡｐｏＡ−ＩＶタンパク質である。
【００２７】
[0053]  本明細書で用いられる際、用語“有効量”は、所望の生物学的作用を実現するのに必要または十分な量を記述する。あらゆる特定の適用に関する有効量は、投与される個々の組成物、その対象の大きさ、および／または処置されている疾患および／または病期の重症度が含まれるがそれらに限定されない様々な要因に依存して異なり得る。１態様において、“有効量”は約０．２５〜１０μｇ／ｇの非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体の用量である。あるいは、非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体の“有効量”は、約１〜１０μｇ／ｇ、約０．２５〜２μｇ／ｇ、約１μｇ／ｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、その有効量は約１〜１０００ｍｇの一定用量である。さらなる態様において、その有効量は約１〜１０ｍｇの一定用量である。
【００２８】
[0054]  非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたは生物学的に活性な類似体は１日１回投与される。あるいは、非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体は１日約２回投与される。さらに別の代替案において、非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体は１日２回より多く、例えば１日３回投与される。さらに別の代替案において、非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶは２日、３日、４日、５日もしくは６日ごとに１回、または週１回投与される。
【００２９】
[0055]  本明細書で用いられる際、用語“所望の生物学的作用”は、疾患または病気の作用を低減する、疾患または病気を中和する、および／または排除することを記述している。例えば、２型糖尿病の文脈において、所望の生物学的作用には、血糖の低下、耐糖能の向上、耐糖能の正常なレベルへの実質的な回復、インスリン分泌の向上、および／またはインスリン分泌の正常なレベルへの実質的な回復が含まれるが、それらに限定されない。
【００３０】
[0056]  本明細書で用いられる際、用語“正常なレベル”は、処置の必要のない対象におけるレベルと実質的に同じであるレベルを記述する。例えば、２型糖尿病の処置の文脈において、正常な血糖値は、食前に約７０ｍｇ／ｄＬから約１３０ｍｇ／ｄＬまで、および食事の約１〜２時間後に約１８０ｍｇ／ｄＬ未満、または食前に約７０ｍｇ／ｄＬから約１００ｍｇ／ｄＬまで、および食事の約１〜２時間後に約１４０ｍｇ／ｄＬ未満である。２型糖尿病の処置の文脈における別の例において、耐糖能の正常なレベルは、血糖値が食前に約７０ｍｇ／ｄＬから約１３０ｍｇ／ｄＬまでおよび食事の約１〜２時間後に約１８０ｍｇ／ｄＬ未満、または食前に約７０ｍｇ／ｄＬから約１００ｍｇ／ｄＬまでおよび食事の約１〜２時間後に約１４０ｍｇ／ｄＬ未満であるように炭水化物を代謝する対象の能力を記述する。２型糖尿病の処置の文脈におけるさらに別の例において、インスリン分泌の正常なレベルは正常なレベルの耐糖能を維持するために必要な量であり、ここでインスリン分泌のレベルは食事の約１５時間後に約１ｎｇ／ｍＬより大きい。さらなる態様において、正常な血糖値は早朝空腹時血糖試験に関して約７０ｍｇ／ｄｌから１００ｍｇ／ｄｌまでである。
【００３１】
[0057]  血糖値の文脈において、用語“回復させる”は、対象の血糖値を正常なレベルまで変化させることを記述する。同様に、耐糖能の文脈において、用語“回復させる”は、対象の耐糖能を正常なレベルまで変化させることを記述する。また、インスリン分泌の文脈において、“回復させる”は、対象のインスリン分泌を正常なレベルまで変化させることを記述する。
【００３２】
[0058]  非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶの文脈において、用語“生物学的に活性な断片”は、２型糖尿病を有する対象において所望の生物学的作用を実現することができる非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶの断片を記述する。用語“生物学的に活性な類似体”は、２型糖尿病を有する対象において所望の生物学的作用を実現することができる非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶの類似体を記述する。１つの例において、所望の生物学的作用は、実施例２において記述されるようにａｐｏＡ−ＩＶノックアウトマウスにおいて耐糖能を回復させることである。所望の生物学的作用の別の例は、２型糖尿病の動物モデル、例えば実施例７において記述されるマウスモデルにおいて異常なグルコースレベルの統計学的に有意な低下を引き起こすことである。
【００３３】
[0059]  本明細書で用いられる際、用語“肥満の”は、対象が正常な体重をかなり上回っている状態を記述する。１つの特定の例において、肥満のという用語は、対象がそれらの理想的な体重を約２０％より大きく超える、および／または約３０もしくは約３０より大きい肥満指数を有する状態を記述する。１態様において、処置されている対象は肥満であり；別の態様において、処置されている対象は肥満ではなく；そしてさらに別の態様において、処置されている対象は正常な体重を有する。
【００３４】
[0060]  本開示の態様は、それを必要とする対象において２型糖尿病を処置するための方法および２型糖尿病の処置のための医薬組成物に関する。１態様において、糖尿病を処置する方法が開示される。１つの特定の態様において、それを必要とする対象において２型糖尿病を処置する方法が開示され、ここでその方法は有効量の非グリコシル化アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（以下“ａｐｏＡ−ＩＶ”）またはその生物学的に活性な類似体もしくは断片をその対象に投与することを含む。
【００３５】
[0061]  １態様において、その２型糖尿病を処置する方法は対象の血糖値を低下させるために有効である。１つの特定の態様において、その方法は対象の血糖値を約２０〜５０％低下させるために有効である。さらなる態様において、その方法は対象の血糖値を約４０％低下させるために有効である。さらなる態様において、その方法は対象の血糖値を約７０％低下させるために有効である。さらに別の態様において、その方法は血糖値を正常なレベルまで実質的に回復させるために有効である。
【００３６】
[0062]  １態様において、２型糖尿病を処置する方法は結果として対象の血糖値を低下させる。１つの特定の態様において、その方法は対象の血糖値を投与間隔の過程にわたってベースラインレベルから約１ｍｇ／ｄｌ、２ｍｇ／ｄｌ、３ｍｇ／ｄｌ、４ｍｇ／ｄｌ、５ｍｇ／ｄｌ、６ｍｇ／ｄｌ、７ｍｇ／ｄｌ、８ｍｇ／ｄｌ、９ｍｇ／ｄｌ、１０ｍｇ／ｄｌ、１１ｍｇ／ｄｌ、１２ｍｇ／ｄｌ、１３ｍｇ／ｄｌ、１４ｍｇ／ｄｌ、１５ｍｇ／ｄｌ、１６ｍｇ／ｄｌ、１７ｍｇ／ｄｌ、１８ｍｇ／ｄｌ、１９ｍｇ／ｄｌ、２０ｍｇ／ｄｌ、４０ｍｇ／ｄｌ、６０ｍｇ／ｄｌ、８０ｍｇ／ｄｌ、１００ｍｇ／ｄｌ、１２０ｍｇ／ｄｌ、１４０ｍｇ／ｄｌ、１６０ｍｇ／ｄｌ、１８０ｍｇ／ｄｌ、２００ｍｇ／ｄｌ、２２０ｍｇ／ｄｌ、または２４０ｍｇ／ｄｌ低下させるために有効である。
【００３７】
[0063]  別の態様において、２型糖尿病を処置する方法は、対象の耐糖能を正常なレベルまで実質的に回復させるために有効である。１つの特定の態様において、その方法は対象の耐糖能を１用量の非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体の投与後約２時間以内に正常なレベルまで実質的に回復させるために有効である。別の態様において、その方法は対象の耐糖能を１用量のａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体の投与後約３時間以内または約４時間以内に正常なレベルまで実質的に回復させるために有効である。別の態様において、対象の耐糖能は約８〜１２時間正常なレベルまで実質的に回復している。
【００３８】
[0064]  さらに別の態様において、その処置はインスリン分泌を正常なレベルまで実質的に回復させるために有効である。１つの特定の態様において、その処置はインスリン分泌を１用量の非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体もしくは断片の投与後約２時間以内に正常なレベルまで実質的に回復させるために有効である。別の態様において、インスリン分泌は約８〜１２時間正常なレベルまで実質的に回復している。さらに別の態様において、その処置はＣ反応性タンパク質のレベルを低下させるために有効である。
【００３９】
[0065]  １態様において、非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体は全身投与される。非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその類似体の全身投与は、経口、皮下、静脈内、筋内、および腹腔内投与からなる群から選択される。
【００４０】
[0066]  別の態様において、医薬組成物が開示される。１つの特定の態様において、その医薬組成物は非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体もしくは断片を含む。別の態様において、その非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその類似体は２型糖尿病の処置のための対象への投与のために配合される。この特定の態様において、それを必要とする対象において２型糖尿病を処置するための方法も提供され、ここでその方法は有効量のその医薬組成物をその対象に投与することを含む。
【００４１】
[0067]  “アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ”は哺乳類のａｐｏＡ−ＩＶを指し、それには完全長ａｐｏＡ−ＩＶおよびａｐｏＡ−ＩＶの生物学的に活性な断片が含まれる。完全長ヒトａｐｏＡ−ＩＶタンパク質は３７６アミノ酸のタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であり、そのアミノ酸配列は図１５において示されており、その分子量は４３．４ｋＤａである。完全長マウスａｐｏＡ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）は図１６において示されている。完全長ヒト配列のａｐｏＡ−ＩＶのＮ末端にグリシンが追加された既知の類似体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、図１７において示されている）およびそのＮ末端グリシンに関する保存的置換（例えばアラニンおよびバリン）を有するその類似体も、用語“アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ”に含まれる。“アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ”には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１により表されるヒトの配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３の対応する位置に対するＴ３４７Ｓ、Ｑ３６０Ｈ、またはＥ１６５Ｋ置換が含まれるその多型形態も含まれる。従って、“アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ”には、図１８において示されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のタンパク質が含まれる。加えて、ヒトの“アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ”には、下記の表１において示されるように、それぞれ以下のミスセンス変異を有する変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０〜６４）が含まれる：Ｐ３９３Ｈ、Ｑ３８５Ｋ、Ｑ３８１Ｋ、Ｑ３８０Ｈ、Ｑ３７７Ｐ、Ｔ３６７Ｓ、Ｓ３５３Ａ、Ｎ３５２Ｙ、Ｖ３３６Ｍ、Ｄ３３５Ｈ、Ｇ３１１Ｒ、Ｖ３０７Ｌ、Ｒ３０５Ｃ、Ｒ３０４Ｑ、Ｅ２９１Ｇ、Ｖ２７４Ｍ、Ｖ２７４Ａ、Ｒ２６４Ｑ、Ａ２６０Ｔ、Ｅ２５０Ｋ、Ｎ２３５Ｓ、Ｑ２３１Ｋ、Ｒ２２０Ｃ、Ｑ２１４Ｈ、Ｅ２０７Ｋ、Ｔ２０２Ｍ、Ｒ２００Ｃ、Ｄ１９１Ｎ、Ｄ１８４Ｎ、Ｐ１８１Ｌ、Ａ１７２Ｔ、Ｒ１６９Ｗ、Ａ１６１Ｓ、Ｒ１５４Ｗ、Ｔ１４８Ｍ、Ｓ１４７Ｎ、Ａ１３９Ｅ、Ｎ１２７Ｋ、Ｓ９５Ｌ、Ｒ９０Ｃ、Ｔ８５Ａ、Ｑ７７Ｈ、Ｇ７４Ｓ、Ｖ１３Ｍ、またはＶ６Ｍ。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０〜６５にはシグナル配列が含まれる。１態様において、本明細書で記述される方法および組成物には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０〜６５において記述されるタンパク質の成熟形態が含まれる。
【００４２】
[0068]  １態様において、本明細書で記述される方法および組成物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な断片を用いる。あるいは、本明細書で記述される方法および組成物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、もしくは２０〜６４からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む非グリコシル化ＡｐｏＡ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的に活性な断片を用いる。
【００４３】
[0069]  ａｐｏＡ−ＩＶの生物学的に活性な類似体は、ａｐｏＡ−ＩＶに対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する。前の段落において記述したように、ａｐｏＡ−ＩＶには完全長の哺乳類のａｐｏＡ−ＩＶ（例えばヒトまたは哺乳類）（ヒトはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において記述されている）、その多型形態、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３および４のタンパク質、ならびに前記のもののいずれかの生物学的に活性な断片が含まれる。生物学的に活性な類似体におけるアミノ酸変異は、好ましくはその野生型配列と比較して保存的置換を有する。“保存的置換”は、同じ正味の電子電荷ならびにおおよそ同じ大きさおよび形状を有する、アミノ酸の別のアミノ酸による置き換えである。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基は、それらの側鎖中の炭素および複素原子の総数が約４より多くなく異なる場合、おおよそ同じ大きさを有する。それらは、それらの側鎖中の分枝の数が１より多くなく異なる場合、おおよそ同じ形状を有する。それらの側鎖中にフェニルまたは置換フェニル基を有するアミノ酸残基は、およそ同じ大きさおよび形状を有すると考えられる。下記に５つのアミノ酸の群を列挙する。あるアミノ酸残基の同じ群からの別のアミノ酸残基による置き換えは、結果として保存的置換をもたらす：
第Ｉ群：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イロソイシン、セリン、スレオニン、システイン、およびＣ１〜Ｃ４脂肪族またはＣ１〜Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖またはモノ分枝状）を有する非天然存在アミノ酸。
【００４４】
第ＩＩ群：グルタミン酸、アスパラギン酸およびカルボン酸置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（未分枝または１分枝点）を有する非天然存在アミノ酸。
第ＩＩＩ群：リシン、オルニチン、アルギニンおよびアミンまたはグアニジン置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（未分枝または１分枝点）を有する非天然存在アミノ酸。
【００４５】
第ＩＶ群：グルタミン、アスパラギンおよびアミド置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（未分枝または１分枝点）を有する非天然存在アミノ酸。
第Ｖ群：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプトファン。
【００４６】
[0070]  ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体は、好ましくはグリコシル化されていない。組み換え非グリコシル化ヒトおよびマウスａｐｏＡ−ＩＶの調製が図１２において記述されている。完全長野生型ヒトアポリポタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）のポリヌクレオチド配列が図１９においてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５として示されている。
【００４７】
[0071]  実施例１〜１０において用いられるａｐｏＡ−ＩＶはグリコシル化されていない。非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶは、分子生物学の分野において既知の標準的な方法に従って調製することができる。例えば、非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶは伝統的な分子クローニング技法により調製することができる。
【００４８】
[0072]  １態様において、ａｐｏＡ−ＩＶはTubb et al. (2009) J of Lipid Res 50:1497において記述されている方法に従って調製され、ここで著者は親和性タグ（ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ）を有する組み替えａｐｏＡ−ＩＶを細菌発現系、すなわち大腸菌において発現させた。Ｔｕｂｂらは、そのａｐｏＡ−ＩＶタンパク質からのＨｉｓタグの切断のための手段としてのタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼの使用を記述している。従って、そのａｐｏＡ−ＩＶタンパク質を組み替え宿主細胞、例えば大腸菌中でＨｉｓタグを用いて発現させることができ、それはＴＥＶプロテアーゼにより切断される。あるいは、そのａｐｏＡ−ＩＶタンパク質を組み替え宿主細胞、例えば大腸菌中でグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを用いて発現させることができ、それはＴＥＶプロテアーゼにより切断される。１態様において、ＴＥＶプロテアーゼはそのａｐｏＡ−ＩＶタンパク質から親和性タグを切断するために用いられる。
【００４９】
[0073]  １態様において、細菌宿主を用いて非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶを生成することができる。細菌宿主の例には、大腸菌ＢＬ−２１、ＢＬ−２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＡＩ（商標）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）、およびＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるが、それらに限定されない。コリネバクテリウムもａｐｏＡ−ＩＶを発現させるための宿主として用いることができる。その細菌宿主中への形質転換の前に、ＡｐｏＡ−ＩＶまたはその類似体をコードするＤＮＡ断片をその細菌宿主中への形質転換のための適切な発現ベクターのいずれかの中に組み込むことができる。適切な発現ベクターには、例えばSambrook, et al., Molecular Cloning Manual, 第２版, 1989において記述されているような、当業者に様々な形で知られているプラスミドベクター、コスミドベクター、およびファージベクターが含まれる。発現ベクターの例には、ｐＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＪｅｘｐｒｅｓｓベクター（ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．）が含まれる。１態様において、大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）をＡｐｏＡ−ＩＶをコードする遺伝子を含有するｐＥＴ３０発現ベクターを用いて形質転換する。
【００５０】
[0074]  原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌または酵母はａｐｏＡ−ＩＶをコードするベクターに関する適切なクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母、または一般的なパン酵母は、低級真核性宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。しかし、分裂酵母；例えばＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウイッケルハミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マーキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）のようなクリベロマイセス属の宿主；ヤロウイア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ  １８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４，２３４）；アカパンカビ；シュワンニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワンニオマイセス・オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに糸状菌、例えばニューロスポーラ属、ペニシリウム属、トリポクラディウム属、ならびにアスペルギルス属の宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のような多くの他の属、種、および株が一般的に入手可能であり、本明細書において有用である。
【００５１】
[0075]  ａｐｏＡ−ＩＶの発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来することもできる。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。数多くのバキュロウイルス株および変異体ならびにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、およびカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のような宿主からの対応する許容的昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入のための様々なウイルス株、例えばキンウワバ科（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコガＮＰＶのＢｍ−５株が公的に利用可能であり、そのようなウイルスを本発明に従う本明細書におけるウイルスとして、特にヨトウガ細胞の形質移入のために用いることができる。
【００５２】
[0076]  ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。
[0077]  ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質の生成のための別の適切な宿主細胞は、脊椎動物細胞である。有用な哺乳類宿主細胞株の例には、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児性腎臓株（例えば、２９３または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、例えばＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；ＣＨＯ  Ｋ１、ＣＨＯ  ｐｒｏ３．ｓｕｐ．−、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＵＸＢ１１、Ｌｅｃ１３、Ｂ−Ｌｙ１、およびＣＨＯ  ＤＰ１２細胞が含まれるがそれらに限定されないチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）、好ましくはＣＨＯ  ＤＵＸ（ＤＨＦＲ−）またはその下位クローン（本明細書において“ＣＨＯ  ＤＵＸ”と呼ばれる）；Ｃ１２７細胞、マウスＬ細胞：Ｌｔｋ．ｓｕｐ．−細胞；マウスセルトリ細胞（(ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス骨髄腫細胞；ＮＳ０；ハイブリドーマ細胞、例えばマウスハイブリドーマ細胞；ＣＯＳ細胞；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が含まれるが、それらに限定されない。
【００５３】
[0078]  宿主細胞にａｐｏＡ−ＩＶタンパク質の生成のための発現またはクローニングベクターを用いて形質移入し、誘導性プロモーターのために適宜改変された一般に用いられる栄養培地中で培養し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅する。
【００５４】
[0079]  本実施例において用いられるａｐｏＡ−ＩＶノックアウトマウスはJ Lipid Res. 1997 Sep;38(9):1782-94において開示されている手順に従って生成され、その全教示を参照により本明細書に援用する。
【００５５】
[0080]  ２型糖尿病を処置するための併用療法も本発明の方法に含まれる。アポリポタンパク質Ａ−ＩＶとの組み合わせで用いることができる追加の療法剤の例には、スルホニル尿素類、メグリチニド類、ビグアニド類、チアゾリジンジオン類、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、ＤＰＰ−４阻害剤、インクレチン模倣物、およびインスリンが含まれるが、それらに限定されない。追加の療法剤は、ａｐｏＡ−ＩＶの投与の前に、ａｐｏＡ−ＩＶの投与と同時に、またはａｐｏＡ−ＩＶの投与後にそれを必要とする対象に投与することができる。
【００５６】
[0081]  ２型糖尿病の処置のために対象に投与されるａｐｏＡ−ＩＶの有効量は、例えば体重に基づく用量（例えばｍｇ／ｋｇ）であってよく、または別の態様において一定用量（体重に依存しない）であってよい。１態様において、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇのａｐｏＡ−ＩＶがそれを必要とする対象に投与される。別の態様において、それを必要とする対象に投与されるａｐｏＡ−ＩＶの有効量は、約１〜１０００ｍｇの一定用量である。さらなる態様において、その有効量はそれを必要とする対象に投与されるａｐｏＡ−ＩＶの一定用量であり、約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１、ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇ、１４０ｍｇ、１６０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、９５０ｍｇ、または１０００ｍｇである。
【００５７】
[0082]  １つの特定の態様において、その医薬組成物はさらに医薬的に許容できるキャリヤーを含むことができる。医薬的に許容できるキャリヤーには、この分野で一般的に用いられる広い範囲の既知の希釈剤（すなわち溶媒）、充填剤、増量剤、結合剤、懸濁化剤、崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ）、界面活性剤、潤滑剤、賦形剤、湿潤剤等が含まれる。その医薬組成物は好ましくは水性であり、すなわちそれは液体配合物であり、好ましくは発熱物質を含まない水を含む。これらのキャリヤーは、その医薬製剤の形態に応じて、単独で、または組み合わせで用いることができる。結果として得られた製剤は、必要であれば、医薬製剤の分野で広く用いられる１種類以上の可溶化剤、緩衝剤、保存剤、着色剤、香料、香味料等を組み込むことができる。
【００５８】
[0083]  その非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体は、錠剤、カプセル、顆粒、丸剤、注射剤、液剤、エマルジョン、懸濁液、およびシロップ剤からなる群から選択される剤形中に配合することができる。その医薬組成物に関する形態および投与経路は限定されず、適切に選択することができる。例えば、錠剤、カプセル、顆粒、丸剤、シロップ剤、液剤、エマルジョン、および懸濁液は経口投与することができる。加えて、注射剤（例えば皮下、静脈内、筋内、および腹腔内）は、単独で、もしくはグルコース、アミノ酸および／または同様のものを含有する一般的に用いられる補液（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）との組み合わせで静脈内投与することができ、または単独で筋内、皮内、皮下および／または腹腔内投与することができる。
【００５９】
[0084]  ２型糖尿病を処置するための本発明の医薬組成物は、この種類の医薬分野で既知の方法に従って、医薬的に許容できるキャリヤーを用いて調製することができる。例えば、経口形態、例えば錠剤、カプセル、顆粒、丸剤等は、賦形剤、例えばサッカロース、ラクトース、グルコース、デンプン、マンニトール等；結合剤、例えばシロップ、アラビアガム、ソルビトール、トラガカント、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等；崩壊剤、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロースまたはそのカルシウム塩、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール等；潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、シリカ等；および湿潤剤、例えばラウリン酸ナトリウム、グリセロール等を用いて既知の方法に従って調製される。
【００６０】
[0085]  注射剤、液剤、エマルジョン、懸濁液、シロップ剤等は、既知の方法に従って、その有効成分を溶解させるための溶媒、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油等；界面活性剤、例えばソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン、レシチン等；懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース等が含まれるセルロース誘導体、トラガカント、アラビアガム等が含まれる天然ガム；および保存剤、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル類、塩化ベンザルコニウム、ソルビン酸塩類等を適切に用いて調製することができる。
【００６１】
[0086]  ２型糖尿病を処置するための本発明の医薬組成物中に含有されるべき有効成分の割合は、広い範囲から適切に選択することができる。
[0087]  １つの特定の態様において、２型糖尿病の処置を必要とする対象は哺乳類である。その哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、およびウサギからなる群から選択することができる。１つの特定の態様において、その哺乳類はヒトである。別の態様において、非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶまたはその生物学的に活性な類似体を２型糖尿病の処置のために対象に投与することができ、ここでその対象は肥満である。あるいは、非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶを２型糖尿病の処置のために対象に投与することができ、ここでその対象は肥満ではない。
【００６２】
[0088]  さらに別の態様において、図１を参照すると装置１が開示されている。１態様において、その装置１は前に上記で論じられた医薬組成物のリザーバー１０を含む。さらなる態様において、そのリザーバー１０はバイアル１２を含む。そのバイアル１２はその医薬組成物の機能を阻害しないあらゆる材料で形成されていてよい。例えば、そのバイアル１２はガラスおよび／またはプラスチックを含んでいてよい。加えて、そのバイアル１２は、それを通してその医薬組成物を取り出すことができる突き通すことができる隔壁１４を含んでいてよい。使用において、そのバイアルの隔壁１４を注射器２０の針２２により突き通し、その医薬組成物をバイアル１２から注射器２０により取り出し、そしてその医薬組成物を必要とする対象に注射により投与する。
【実施例】
【００６３】
[0089]  以下の限定的でない実施例は、本開示の方法を説明する。
実施例１：ａｐｏＡ−ＩＶノックアウトマウスのグルコース不耐性
[0090]  実験プロトコル。オスのａｐｏＡ−ＩＶノックアウト（“以下“ＫＯ”）マウスを得た。野生型（以下“ＷＴ”）マウスは対照の役目を果たした。ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスはシンシナティ大学（オハイオ州シンシナティ）において維持されているコロニーから得られた。ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスは固形飼料を与えられた。グルコース負荷試験を実施する前に、ＡｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスを５時間絶食させた。そのグルコース負荷試験において、そのａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスに約２ｍｇ／ｇ体重の用量のグルコースを腹腔内注射し、血漿グルコースをグルコースの注射後約０、１５、３０、６０、および１２０分の時点で測定した。そのグルコース負荷試験を２回（３ヶ月齢において１回、１６ヶ月齢においてもう１回）実施した。
【００６４】
[0091]  実験結果。図２において示されるように、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスはＷＴマウスと比較してグルコース不耐性であった。具体的には、図２は、ＷＴマウスにおける血漿グルコースレベルはａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルよりもグルコースの腹腔内注射後２時間の間低かったことを示している。理論により束縛されるわけではないが、これらの研究の意味することは、ａｐｏＡ−ＩＶは（少なくともオスにおいて）正常なグルコースの恒常性に必要であることであった。さらに、図３において示されるように、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスは１６ヶ月齢において試験した際に増大したグルコース不耐性を示した。具体的には、図３は、１６ヶ月齢において試験したａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルは３ヶ月齢において試験したａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯにおける血漿グルコースレベルよりも高かったことを示している。理論により束縛されるわけではないが、これらの研究の意味することは、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスの耐糖能は年齢と共に悪化することであった。
【００６５】
メスの野生型およびａｐｏＡ−ＩＶノックアウトマウスを用いた実験
[0092]  メスのＡｐｏＡ−ＩＶ野生型およびノックアウトマウスに対して、この実施例１中でより早く記述されたようなオスのａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスに関して用いられた試験と同じ腹腔内グルコース負荷試験を実施した。その結果が図１１において示されている。メスのａｐｏＡ−ＩＶ−／−マウスは、腹腔内にグルコースで負荷をかけた際、メスのＷＴ動物と比較して増大した血漿グルコースレベルを有するが、統計学的に有意な差は存在しない。一方で、オスはＷＴおよびＫＯ動物の間で有意差を有する。
【００６６】
実施例２：ａｐｏＡ−ＩＶノックアウトマウスにおける耐糖能の回復
[0093]  実験プロトコル。ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスがグルコース不耐性であることを実証する際、ａｐｏＡ−ＩＶのａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスへの投与が耐糖能を正常なレベルまで回復させるであろうかどうかを決定するため、一連の広範な試験を実施した。具体的には、投与すべきａｐｏＡ−ＩＶの量だけでなくａｐｏＡ−ＩＶをグルコース負荷試験を実施する前に投与すべき最適な時点も決定するため、一連の試験を実施した。
【００６７】
[0094]  オスのａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに重量により約０．２５、０．５、１、および２μｇ／ｇの用量のａｐｏＡ−ＩＶを腹腔内注射した。また、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに対照としての役目を果たさせるために生理食塩水溶液を腹腔内注射した。マウスａｐｏＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射後、３ヶ月齢において前に論じたようにグルコース負荷試験を実施した。具体的には、ａｐｏＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射の約２時間後にグルコース負荷試験を実施した。実験結果は、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて耐糖能を回復させるための最適な時点はグルコース負荷試験を実施する約２時間前にａｐｏＡ−ＩＶを投与することであることを示した。
【００６８】
[0095]  実験結果。図４において示されるように、ａｐｏＡ−ＩＶのａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスへの投与は耐糖能を正常なレベルまで回復させた。具体的には、図４はａｐｏＡ−ＩＶを注射したａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルは生理食塩水溶液を注射したａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルよりも低かったことを示している。さらに、図４において示されるように、ａｐｏＡ−ＩＶを注射したａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルは最高投与量のａｐｏＡ−ＩＶを注射したａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて最低であり；同様に、ａｐｏＡ−ＩＶを注射したａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルは最低投与量のａｐｏＡ−ＩＶを注射したａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて最高であった。従って、耐糖能の向上の程度は投与されるａｐｏＡ−ＩＶの用量に依存しており、より高い用量は結果として向上した耐糖能をもたらすことが発見された。
【００６９】
実施例３：ａｐｏＡ−ＩＶ  ノックアウトマウスにおける耐糖能の回復におけるａｐｏＡ−ＩＶの特異性
[0096]  実験プロトコル。ａｐｏＡ−ＩＶの特異性を評価するため、我々はアポリポタンパク質ＡＩ（以下“ａｐｏＡ−Ｉ”）をａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに投与した。ａｐｏＡ−Ｉは、ａｐｏＡ−ＩＶも産生する小腸上皮細胞により作られるタンパク質である。ａｐｏＡ−ＩはａｐｏＡ−ＩＶの機能の多くを共有している。ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに重量により１μｇ／ｇの用量のａｐｏＡ−Ｉを腹腔内注射した。また、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに対照としての役目を果たさせるために生理食塩水溶液を腹腔内注射した。ａｐｏＡ−Ｉまたは生理食塩水溶液の注射後、３ヶ月齢において前に論じたようにグルコース負荷試験を実施した。具体的には、ａｐｏＡ−Ｉまたは生理食塩水溶液の注射の約２時間後にグルコース負荷試験を実施した。
【００７０】
[0097]  実験結果。図５において示されるように、ａｐｏＡ−ＩのａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスへの投与は耐糖能を回復または向上させなかった。
実施例４：ａｐｏＡ−ＩＶ  ノックアウトマウスにおける耐糖能の回復の機序
[0098]  実験プロトコル。ＡｐｏＡ−ＩＶがａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて耐糖能を向上させる機序を評価するため、我々はａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいてグルコースに誘導されるインスリン分泌を測定した。より具体的には、我々は前に論じたような３ヶ月齢におけるグルコース負荷試験の間にグルコースに誘導されるインスリン分泌を測定した。この研究において、グルコース負荷試験を実施する２時間前に、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに重量により約１μｇ／ｇの用量のマウスａｐｏＡ−ＩＶを腹腔内注射した。ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに、グルコース負荷試験を実施する約２時間前に、対照としての役目を果たさせるために生理食塩水溶液を注射した。
【００７１】
[0099]  実験結果。図６において示されるように、第Ｉ相インスリン分泌は生理食塩水溶液を注射したａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスには存在しなかった。しかし、図６において示されるように、ａｐｏＡ−ＩＶをグルコース負荷試験を実施する２時間前に腹腔内注射した場合、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて第Ｉ相インスリン分泌が回復した。
【００７２】
実施例５：高脂肪飼料を与えたａｐｏＡ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおけるａｐｏＡ−ＩＶの有効性
[00100]  実験プロトコル。ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスに、Ｄｙｅｔｓ（ペンシルバニア州ベスレヘム）から購入した高脂肪の半精製の栄養的に完全な実験飼料（ＡＩＮ−９３Ｍ）を１０週間慢性的に与えた。その高脂肪飼料は、１００ｇの飼料あたり約２０ｇの脂肪（すなわち約１９ｇのバター脂および必須脂肪酸を提供するための１ｇの大豆油）を含有する。そのａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスは、温度（約２２±１℃）および光（約１２時間明／１２時間暗）制御された動物施設中に置かれたコーンコブ（ｃｏｒｎｃｏｂ）を有する個々のタブケージ（ｔｕｂ  ｃａｇｅｓ）中に収容された。３ヶ月齢において前に論じたようにグルコース負荷試験を実施した。そのグルコース負荷試験を実施する前に、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスを５時間飢えさせた。そのグルコース負荷試験において、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスに約２ｍｇ／ｇ体重の用量のグルコースを腹腔内注射した。
【００７３】
[00101]  実験結果。図７において示されるように、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスはＷＴマウスと比較してより大きいグルコース不耐性を示した。具体的には、図７はグルコースの腹腔内注射後２時間の間ＷＴマウスにおける血漿グルコースレベルがａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルよりも低かったことを示している。
【００７４】
実施例６：高脂肪飼料を与えたａｐｏＡ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおける耐糖能の回復。
[00102]  実験プロトコル。３ヶ月齢において高脂肪飼料（２０重量％の脂肪、１９％のバター脂および１％のサフラワー油）を１４週間与えたａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスへのａｐｏＡ−ＩＶの投与に関連して一連の試験を実施した。具体的には、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスに約１μｇ／ｇ体重の用量のマウスａｐｏＡ−ＩＶを腹腔内注射した。また、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスに対照としての役目を果たさせるために生理食塩水溶液を腹腔内注射した。ａｐｏＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射後、グルコース負荷試験を実施した。具体的には、ａｐｏＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射の２時間後にグルコース負荷試験を実施した。
【００７５】
[00103]  実験結果。図８において示されるように、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおけるａｐｏＡ−ＩＶの投与は耐糖能を有意に向上させた。具体的には、図８はａｐｏＡ−ＩＶを注射したａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルが生理食塩水溶液を注射したａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルよりも低かったことを示している。［前の文は、次の文が同じことを記述しているため、余分である。データは本明細書に含まれていないが、慢性的に高脂肪飼料を与えたＷＴマウスにおけるａｐｏＡ−ＩＶの投与も耐糖能を有意に向上させることも発見された。
【００７６】
実施例７：２型糖尿病を有するマウスにおける耐糖能の回復
[00104]  実験プロトコル。ａｐｏＡ−ＩＶが２型糖尿病を有する動物における耐糖能の促進において有効であることを確証するため、ヘテロ接合性のＫＫ  Ｃｇ−Ａ／Ｊ（以下“Ｃｇ−Ａ／Ｊ”）マウスをジャクソン研究所（メイン州バーハーバー）から得た。Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスは８週齢までに高血糖症、高インスリン血症、肥満、およびグルコース不耐性を発現する。これらのマウスにおける糖尿病の主因は、Ａｙ変異との多遺伝子相互作用によりもたらされたインスリン耐性であり、それはａｇｏｕｔｉ関連タンパク質およびメラノコルチン−ＩＶ受容体の拮抗物質をコードしている。Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスに固形飼料を与えた。加えて、その固形飼料を与えた１０から１４週間まで血糖における顕著な上昇が存在した。
【００７７】
[00105]  １４週齢において、Ｃｇ−Ａ／ＪマウスにマウスａｐｏＡ−ＩＶ（約１μｇ／ｇ体重）または生理食塩水溶液（対照の役目を果たす）のどちらかを腹腔内注射により投与した。次いで血漿グルコースを約０、０．５、１、２、３、４、５、７、１１、および２４時間の時点で決定した。
【００７８】
[00106]  実験結果。図９において示されるように、ａｐｏＡ−ＩＶは生理食塩水対照と比較してＣｇ−Ａ／Ｊマウスの血糖値の低下において顕著な作用を有する。生理食塩水溶液を注射したＣｇ−Ａ／Ｊマウスは２４時間の試験期間全体を通して不変の（ｓｔｅａｄｙ）血漿グルコースレベルを維持していたが、ａｐｏＡ−ＩＶを注射したＣｇ−Ａ／Ｊマウスは１０時間より長い間血漿グルコースにおける低下を経験し、そしてこの期間のほとんどの間、その血漿グルコースレベルは我々が研究していたＣ５７ＢＬ／６Ｊ動物と比較可能であった。この試験から、我々はａｐｏＡ−ＩＶの投与はＣｇ−Ａ／Ｊマウスにおける血漿グルコースの低下において有効であると結論付ける。
【００７９】
実施例８：ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯ、ａｐｏＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおける血清アミロイドＰ構成要素のレベル
[00107]  実験プロトコル。アテローム生成性飼料を与えたａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯ、ａｐｏＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおける血清アミロイドＡタンパク質構成要素（以下“ＳＡＰ”）のレベルの決定に関連して一連の試験を実施した。ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯ、ａｐｏＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスはシンシナティ大学から得た。ＳＡＰはアミロイドＰ構成要素（以下“ＡＰ”）の血清形態であり、アミロイドと呼ばれる生体内の病的沈着物の５角形の構成要素として最初に同定された２５ｋＤａの５量体タンパク質である。ＳＡＰはヒトにおいてＣ反応性タンパク質のように振る舞う。具体的には、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯ、ａｐｏＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおける血漿ＳＡＰのレベルをａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯ、ａｐｏＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおいてアテローム生成性飼料を１２週間与えた後に決定した。血漿ＳＡＰのレベルはウェスタンブロット分析により決定された。
【００８０】
[00108]  実験結果。図１０において示されるように、ａｐｏＡ−ＩＶ  ＫＯマウス（マウス番号１、８、および１０に対応する）におけるＳＡＰのレベルはａｐｏＡ−Ｉ  ＫＯマウス（マウス番号２８、２９、および３０に対応する）およびＷＴマウス（マウス番号１９、２０、および２５に対応する）と比較して増大した。
【００８１】
[00109]  本開示を記述および定義する目的のため、用語“約”および“実質的に”は本明細書においてあらゆる定量的比較、値、測定、または他の表現に帰することができる本来備わっている不確定性の程度を表すために利用されていることを特筆する。用語“約”および“実質的に”は、本明細書において定量的表現が結果的に問題の主題の基本的な機能における変化をもたらすことなく記載された参照から変動してよい程度を表すためにも利用されている。
【００８２】
[00110]  上記の記述および図は典型的な態様を説明するものとだけ考えられるべきであり、それは本開示の特徴および利点を達成する。記述された特徴および工程の修正および置換は、本開示の意図および範囲から逸脱することなく行うことができる。従って、本開示は前記の記述および図により限定されるものとして考えられるべきではなく、それは添付された特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００８３】
実施例９：ヒトａｐｏＡ−ＩＶは腹腔内グルコース負荷試験を受けている野生型マウスにおいて血糖値を低下させる。
[00111]  実験プロトコル。ヒトａｐｏＡ−ＩＶの野生型マウスへの投与がグルコース負荷試験を受けているマウスにおける血糖値に影響を及ぼすであろうかどうかを決定するための試験を実施した。
【００８４】
[00112]  ３ヶ月齢の野生型マウスに重量により約１μｇ／ｇの用量のヒトａｐｏＡ−ＩＶを腹腔内注射した。対照として、別の群の野生型マウスに生理食塩水溶液を腹腔内注射した。ヒトａｐｏＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射後、グルコース負荷試験を実施した。具体的には、ａｐｏＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射の約２時間後および絶食の約５時間後にグルコース負荷試験を実施した。尾の血液を採取し、グルコメーター（ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ）により測定した。
【００８５】
[00113]  実験結果。図１２において示されるように、ヒトａｐｏＡ−ＩＶはグルコース負荷試験を受けている野生型マウスにおける血糖の低下において有効であった。
実施例１０．腹腔内グルコース負荷試験を受けている野生型のメスのマウスにおけるマウスａｐｏＡ−ＩＶの作用
[00114]  実験プロトコル。マウスａｐｏＡ−ＩＶのメスの野生型マウスへの投与がグルコース負荷試験を受けているマウスにおける血糖値に影響を及ぼすであろうかどうかを決定するための試験を実施した。
【００８６】
[00115]  ３ヶ月齢のメスの野生型マウスに重量により約１μｇ／ｇの用量のマウスａｐｏＡ−ＩＶを腹腔内注射した。対照として、別の群のメスの野生型マウスに生理食塩水溶液を腹腔内注射した。ヒトａｐｏＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射後、グルコース負荷試験を実施した。具体的には、ａｐｏＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射の約２時間後および絶食の約５時間後にグルコース負荷試験を実施した。尾の血液を採取し、グルコメーターにより測定した。
【００８７】
実験結果。図１３において示されるように、マウスａｐｏＡ−ＩＶはグルコース負荷試験を受けている野生型のメスのマウスにおける血糖の低下において有効であった。
実施例１１  ヒトａｐｏＡ−ＩＶはヒトの島においてインスリンの放出を刺激する
[00116]  高純度のヒトの島はバージニア大学、Ａｘｏｎ  Ｃｅｌｌｓにより提供された。島を１０％  ＦＢＳおよび１１ｍＭグルコースを含有するＲＰＭＩ  １６４０中で９５％空気および５％ＣＯ２の加湿した雰囲気中で３７℃において４８時間培養した。次いで４つの群の５０個のＩＥＱ島を３．０ｍＭグルコースを含有する通常のＫＲＢ（１２９ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．２％  ＢＳＡ）中で３７℃において１時間前保温した。次いで最初の２つの群中の島を３．０ｍＭグルコースを含有する通常のＫＲＢ中で１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で１時間保温し、さらに１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で２０ｍＭグルコースと共に追加で１時間保温した。最後の２つの群中の島を３．０ｍＭグルコースを含有する３０ｍＭ  ＫＣｌ  ＫＲＢ（１０３．８ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．２％  ＢＳＡ）＋２５０μｍｏｌ／ｌジアゾキシド中で１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で１時間保温し、さらに１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で２０ｍＭグルコースと共に追加で１時間保温した。それぞれの１時間保温の終了時に培地を収集した。インスリンレベルをＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により測定した。
【００８８】
[00117]  図１４から理解できるように、ヒトの島を３０ｍＭ  ＫＣｌ＋２５０μＭジアゾキシドにより最大限に脱分極させた場合、１０μｇ／ｍｌのｈＡ−ＩＶはインスリン分泌への有意な刺激作用を示した。
【００８９】
実施例１２  非グリコシル化ａｐｏＡ−ＩＶの調製
[00118]  ヒトおよびマウスのａｐｏＡ−ＩＶのｃＤＮＡはｐＳＰ６５維持ベクター中に含有されており、ＡｆｌＩＩＩ制限部位が成熟ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質に関するコード配列のすぐ５’側に設計されていた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。その遺伝子をその維持ベクターから切り出し、ｐＥＴ３０発現ベクター中にライゲーションした。そのコンストラクトを大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞中に形質移入し、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を補ったルリア−ベルターニ培地中で３７℃において増殖させた。その細胞におけるａｐｏＡ−ＩＶタンパク質合成の誘導後、その細胞を回収し、超音波処理した。その溶解物からのａｐｏＡ−ＩＶタンパク質をＨｉｓ結合親和性カラムクロマトグラフィーおよび透析により精製した。結果として得られたａｐｏＡ−ＩＶタンパク質を、生理食塩水中で１．０ｍｇ／ｍｌの終濃度に希釈した。
【００９０】
実施例１３  ヒトａｐｏＡ−ＩＶにおけるＮ−およびＯ−グリコシル化の非存在
[00119]  www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/webface?jobid=netNglyc, 4F9C6AD203AFBD5CにおけるNetNGlyc 1.0サーバーを用いて、ヒトａｐｏＡ−ＩＶおよび４５種類のミスセンス変異体をインシリコで分析した。そのミスセンス変異体に関する詳細が表１において提供されている。そのＯ−およびＮ−結合型グリコシル化分析は、図２４および２５において天然のａｐｏＡ−ＩＶおよび典型的な変異体、すなわちＰ３９３Ｈにより例示されている。その結果は、ヒトａｐｏＡ−ＩＶおよびミスセンス変異体はＮ結合型またはＮ結合型グリコシル化部位を一切有しないことを示している。特に、表１において記述されている変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０〜６４において記述されているアミノ酸配列より表される；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ６５はシグナル配列を有するＡｐｏＡＩＶを表す）は、図２４および２５において示されるグリコシル化プロフィールと同一のグリコシル化プロフィールを有していた。これらの結果は、ａｐｏＡ−ＩＶはマンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびシアル酸によりグリコシル化されているという当技術分野における常識（例えばWeinberg, et al., J Lipid Res. 1983, 24(1):52-9）を考慮すると予想外である。
【００９１】
【表１−１】
0006310398.tif 000008
【００９２】
【表１−２】
0006310398.tif 000009
【００９３】
【表１−３】
0006310398.tif 000010
【００９４】
【表１−４】
0006310398.tif 000011
【００９５】
実施例１４  ａｐｏＡ−ＩＶの細菌発現に関する最適化
[00120]  ａｐｏＡ−ＩＶの大腸菌におけるペリプラズム発現を促進するため、様々なシグナルペプチドを用いてコンストラクトを調製した（ｐｒｅｓｐａｒｅｄ）。これらのシグナルペプチド（すなわちＯｍｐＡ、ＰｅｌＢ、およびＥＮＸ）をそれぞれａｐｏＡ−ＩＶのＮ末端に融合させた。それぞれのこれらのシグナル配列のアミノ酸および核酸配列は以下のように提供される：
[00121]  ＯｍｐＡシグナルペプチド
【００９６】
【化１】
0006310398.tif 000012
【００９７】
ＰｅｌＢシグナルペプチド
【００９８】
【化２】
0006310398.tif 000013
【００９９】
ＥＮＸシグナルペプチド
【０１００】
【化３】
0006310398.tif 000014
【０１０１】
[00122]  大腸菌におけるタンパク質収率を向上させるため、ａｐｏＡ−ＩＶに関するコドン使用頻度を最適化した。最適化はＤＮＡ２．０のアルゴリズム（ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．）または実験データおよびｔＲＮＡ装填能力（ｃｈａｒｇｅａｂｉｌｉｔｙ）（アミノアセチル化）に基づく他のアルゴリズムを用いて実施された。次いで、最適化されたコドンを有するａｐｏＡ−ＩＶのコード配列を５’末端においてシグナルペプチドのヌクレオチド配列の３’末端に融合させた。加えて、そのコドン最適化された配列をその３’末端において二重停止コドンに連結することができる。最適化されたコドンおよびクローニング部位を有するコンストラクトが図２０〜２３において例示されている。その最適化されたＤＮＡ配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、１５、１７、および１９において記述されており、結果として生じるアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１４、１６、および１８において示されている。特に、その最適化された配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２〜１９）も本発明の方法および組成物において用いることができる。
【０１０２】
[00123]  次いでそのａｐｏＡ−ＩＶコンストラクトをＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．により合成し、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓベクター（例えばｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１）中にＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位を用いてサブクローニングすることができる。これらのコンストラクトをＢＬ２１大腸菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ）（Ｆ−  ＯｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ）中に形質転換することができ、これらのコンストラクトを含有するクローンをカナマイシンを用いて選択することができる。１２５ｍｌのカナマイシン含有（例えば５０μｇ／ｍｌ）ＹＥＳ培地中での前培養物を、１つの単離されたコロニーから出発して植え付け、２７０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で約１６時間培養することができる。５００ｍｌのカナマイシン含有ＹＥＳ培地中での新しい培養物に１０ｍＬのその前培養物を植え付け、２７０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃でＯＤ６００が０．５〜１．０（最適＝０．６）に達するまで培養することができる。次いで結果として得られた培養物をＩＰＴＧ（例えば１ｍＭの終濃度で）を用いて誘導し、３７℃で１時間、２時間、４時間、または２２時間保温するであろう。
【０１０３】
[00124]  ａｐｏＡ−ＩＶタンパク質を上記で調製された培養物のペリプラズムおよび細胞質画分から単離することができる。より具体的には、その培養物をペレットにすることができる。結果として得られた培養物のペレットを、高張性ＴＥＳ緩衝液（スクロース２０％）／ＯＤ６００／ｍＬ中で懸濁し、室温で５分間保温した後、４℃において４体積の精製水中で希釈することができる。その希釈された懸濁液を氷上でさらに１０分間保温し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することができる。結果として得られた上清はペリプラズム画分（Ｐ）であり、そのペレットは細胞質画分である。ａｐｏＡ−ＩＶの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタン分析により分析することができる。次いでこれらの画分中のａｐｏＡ−ＩＶを、一般に用いられる、および／または親和性クロマトグラフィーにより精製し、ＩＩ型糖尿病の処置のためのヒトへの送達のために配合することができる。
【０１０４】
参照による援用
本明細書で引用された全ての参考文献および特許の内容を、参照により本明細書にそのまま援用する。
【０１０５】
均等物
当業者は、本明細書で記述された本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識しており、またはルーチン的な実験法のみを用いて確かめることができるであろう。そのような均等物は以下の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。
【符号の説明】
【０１０６】
１  装置
１０  リザーバー
１２  バイアル
１４  隔壁
２０  注射器
２２  針
【図１】
0006310398.tif 000018
【図２】
0006310398.tif 000019
【図３】
0006310398.tif 000020
【図４】
0006310398.tif 000021
【図５】
0006310398.tif 000022
【図６】
0006310398.tif 000023
【図７】
0006310398.tif 000024
【図８】
0006310398.tif 000025
【図９】
0006310398.tif 000026
【図１０】
0006310398.tif 000027
【図１１】
0006310398.tif 000028
【図１２】
0006310398.tif 000029
【図１３】
0006310398.tif 000030
【図１４】
0006310398.tif 000031
【図１５】
0006310398.tif 000032
【図１６】
0006310398.tif 000033
【図１７】
0006310398.tif 000034
【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
0006310398.tif 000037
【図２０−２】
0006310398.tif 000038
【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
0006310398.tif 000043
【図２３−２】
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【図２４−Ａ】
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【図２４−Ｂ】
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【図２５−Ａ】
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【図２５−Ｂ】
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【配列表】
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