(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクダ種から得られる抗体ライブラリであって、少なくとも7種の異なるヒト抗体鎖ファミリーに属する抗体鎖を含有する前記ライブラリ。
【請求項２】
少なくとも2つの異なる遺伝子によって発現される1つのヒト抗体鎖ファミリー内の抗体鎖を含む、請求項1記載の抗体ライブラリ。
【請求項３】
ラマから得られる、請求項1記載の抗体ライブラリ。
【請求項４】
少なくとも10種の異なるヒト抗体鎖ファミリーに属する抗体鎖を含有する、請求項1記載の抗体ライブラリ。
【請求項５】
少なくとも12種の異なるヒト抗体鎖ファミリーに属する抗体鎖を含有する、請求項1記載の抗体ライブラリ。
【請求項６】
少なくとも15種の異なるヒト抗体鎖ファミリーに属する抗体鎖を含有する、請求項1記載の抗体ライブラリ。
【請求項７】
以下のヒト抗体鎖ファミリーのうちの少なくとも1つの抗体鎖を含有する、請求項1記載の抗体ライブラリ:VH6;Vκ3;及びVλ6。
【請求項８】
ヒト抗体鎖ファミリーVH3、Vκ1、及びVλ6のメンバーを含む、請求項1記載の抗体ライブラリ。
【請求項９】
ヒト抗体鎖ファミリーVH1、VH3、Vκ1、及びVλ6のメンバーを含む、請求項8記載の抗体ライブラリ。
【請求項１０】
ヒト抗体鎖ファミリーVH1、VH3、Vκ1、Vλ1、及びVλ6のメンバーを含む、請求項9記載の抗体ライブラリ。
【請求項１１】
ヒト抗体鎖ファミリーVH1、VH3、Vκ1、Vλ1、Vλ2、及びVλ6のメンバーを含む、請求項11記載の抗体ライブラリ。
【請求項１２】
ヒト抗体鎖ファミリーVH1、VH3、Vκ1、Vλ1、Vλ2、及びVλ6のメンバーを含む、請求項11記載の抗体ライブラリ。
【請求項１３】
ヒト抗体鎖ファミリーVH1、VH3、Vκ1、Vκ2、Vλ1、Vλ2、及びVλ6のメンバーを含む、請求項12記載の抗体ライブラリ。
【請求項１４】
ラクダ種から免疫ライブラリを構築するための方法であって、配列
【化１】
0006283030.tif 000008
を有するプライマーを使用するPCRにおいてFabフラグメントを増幅するステップを含む前記方法。
【請求項１５】
ラクダ種から免疫ライブラリを構築するための方法であって、配列
【化２】
0006283030.tif 000009
を有するプライマーを使用するPCRにおいてFabフラグメントを増幅するステップを含む前記方法。
【請求項１６】
ラクダ種から免疫ライブラリを構築する方法であって、配列
【化３】
0006283030.tif 000010
を有するプライマーを使用するPCRにおいてFabフラグメントを増幅するステップを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の背景)
(1.発明の分野)
本発明は、概して、ラクダ種から得られる抗体ライブラリに、より詳細には、野生型ヒト抗体において使用されるものに相当する鎖のファミリーを含有するラクダ抗体ライブラリに関する。
【背景技術】
【０００２】
(2.関連技術の説明)
リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、及び細胞表面ディスプレイなどのディスプレイ法の出現によって、抗体ライブラリは、抗体の研究及び開発のための、ますます重要な手立てとなりつつある。抗体ライブラリは、設計、及び構築の手段の点で違いがある。最も重要なライブラリは、治療用抗体の特定及び単離のために開発されたものである。概要は、Ponselらの文献「高親和性、発展性、及び機能的規模:コンビナトリアル抗体ライブラリ産生の聖杯(High Affinity, Developability and Functional Size: The Holy Grail of Combinatorial Antibody Library Generation)」, Molecules 2011, 16, 3675-3700によって提供されている。
【０００３】
自然界では、体細胞超変異(SHM)を使用して、高親和性の抗体が作製される。SHMを模倣するための、いくつかの親和性成熟技術が開発されている。成熟技術は一般に、選択された中程度の親和性候補に、ある程度の多様性を導入し、それに続いて、段階的に増大させる選択圧下での繰り返しの選択を行うことを意図している。高い成熟前親和性を有する抗体を与えるライブラリを提供することが望ましい。Perelsonらによれば、コンビナトリアル抗体ライブラリから直接的に(すなわち、親和性成熟なしに)得ることができる親和性は、一般に、ライブラリのサイズと相関関係がある(Perelson,A.S.; Oster,G.F.の文献「クローン選択の理論研究:最小抗体レパートリーサイズ及び自己-非自己識別の信頼性(Theoretical studies of clonal selection: Minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination)」J. Theor. Biol. 1979, 81, 645-670)。
【０００４】
親和性/ライブラリのサイズ相関は、確率の見地から、容易に理解することができる:ライブラリが大きいほど、その利用可能な構成単位から高親和性の抗体を産生することができる確率が高くなる。しかし、Ponselらの文献「機能的ライブラリサイズ…絶対的ライブラリサイズよりも大きな問題(Functional library size…matters more than absolute library size)」(Ponselら、上記、3676ページ)によって記述されている通り、サイズだけが答えではなく、ライブラリの質も、少なくとも同じ程度に重要である。
【０００５】
自然界は、抗体構成単位、特に重鎖(VH)と軽鎖(VL)の、ランダムな組み合わせに依存している。ヒト抗体産生は、例えば、ヒト抗体の多様性に大いに貢献する7種のVHファミリーと16種のVLファミリー(10種のλファミリー及び6種のκファミリー)を使用する。自然界で遭遇する多様性に近づけるために、抗体ライブラリが、かなりの数の抗体ファミリーを含有することが望ましい。
【０００６】
健康なヒトドナーから得られた抗体から構築された未処置の抗体ライブラリは、原理的には、十分な集団のヒト抗体鎖を含有している。免疫ライブラリと比較すると、未処置のライブラリは、高親和性の治療用抗体の開発には、あまり適していない。さらに、未処置のライブラリの鎖多様性の重要な部分が、標準のスクリーニング及び濃縮プロトコルの選択圧下で失われていることが判明している。
【０００７】
感染させたヒトから得られた抗体から構築された免疫ライブラリは、高親和性の治療用抗体を産生する潜在的可能性を有する。こうしたライブラリは、十分な集団のヒト抗体鎖を含有することが期待されるかもしれない。しかし、感染させたヒトドナーの免疫系は、しばしば、激しく損なわれており、質の低い免疫ライブラリがもたらされる。実際、対象となる治療用抗体は、ほぼ当然のことながら、患者における免疫系の低下を特徴とする疾患に対処する。
【０００８】
多くの場合、健康なヒトドナーの免疫化を介して抗原特異的な抗体を得ることは可能ではない。生命を脅かす又は毒性がある抗原での免疫化は、倫理的に可能ではない。他の抗原は、ヒトにおける強力な免疫応答を誘発しない、又は免疫応答をまったく誘発しない。
【０００９】
マウス又はラットなどの実験動物の免疫化によって、抗原特異的な抗体を得ることができる。しかし、こうした動物は、非常に近交系である傾向であり、免疫応答の多様性が低下する。さらに、ネズミ抗体は、ヒト生殖細胞系列とは、限られた数の抗体鎖ファミリーしか共通ではない。
【００１０】
Dreierらの米国特許出願公開第2011/0300140号(2011年12月8日)は、ラクダ種、ラマ(Lama glama)の免疫化によって高親和性の抗体を産生するための方法を開示している。この文献は、ファミリーλ3、5、及び8におけるVλ鎖の単離を報告している。Vκ鎖は報告されていない。
【００１１】
Dreierらの米国特許出願公開第2011/0165621号(2011年7月7日)は、ラクダ種の免疫化によって得られた抗体のヒト化のための方法を開示している。この文献は、以下のファミリーの鎖のためのヒト化プロトコルを提案している:重鎖:VH1、VH3、及びVH4; Vλ鎖:Vλ1、Vλ2、Vλ3、Vλ5、及びVλ8;並びにVκ鎖Vκ1、Vκ2、及びVκ4。
【００１２】
Schofieldらの文献「ハイスループット抗体産生及び特徴付けへのファージディスプレイの適用(Application of Phage Display to High Throughput Antibody Generation and Characterization)」Genome Biol. (2007)は、1010を超えるヒト抗体を含有する高品質のファージディスプレイライブラリを報告している。この刊行物は、様々な抗体鎖の使用頻度の全体像を提供する。Vκ1及びVλ6は、最も頻繁に使用される軽鎖である。
【００１３】
したがって、多数のヒト抗体鎖ファミリーに相当する、ヒト以外の動物由来の抗体ライブラリが必要である。
【００１４】
ヒト抗体鎖Vλ6に相当する、ヒト以外の動物由来の抗体ライブラリが、特に必要である。
【発明の概要】
【００１５】
(発明の概要)
本発明は、ラクダ種に由来する抗体ライブラリであって、以下のヒト抗体鎖ファミリーのうちの少なくとも1つに属する抗体鎖を含有する前記ライブラリに関する:VH6;Vκ3;及びVλ6。好ましいのは、ヒトVλ6ファミリーに属する抗体鎖を含有する抗体ライブラリである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
(図面の簡単な説明)
【００１７】
【図１】図1は、Schofieldらの上記のライブラリに存在するヒト鎖ファミリーの使用頻度のグラフ表示である。出典:http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=2258204_gb-2007-8-11-r254-3&query=the&fields=all&favor=none&it=none&sub=none&uniq=0&sp=none&req=4&simCollection=2583049_pone.0003793.g005&npos=35&prt=3
【００１８】
【図２】図2は、ヒト抗体における重鎖ファミリーの使用頻度(各対の右側バー)と比較した、本発明のラクダ抗体ライブラリにおけるヒト重鎖ファミリーの使用頻度(各対の左側バー)のグラフ表示である。
【００１９】
【図３】図3は、ヒト抗体におけるκ鎖ファミリーの使用頻度(各対の右側バー)と比較した、本発明のラクダ抗体ライブラリにおけるヒトκ鎖ファミリーの使用頻度(各対の左側バー)のグラフ表示である。
【００２０】
【図４】図4は、ヒト抗体におけるλ鎖ファミリーの使用頻度(各対の右側バー)と比較した、本発明のラクダ抗体ライブラリにおけるヒトVH1鎖ファミリーの使用頻度(各対の左側バー)のグラフ表示である。
【００２１】
【図５】図5は、ヒト抗体におけるλ鎖ファミリーの使用頻度(各対の右側バー)と比較した、本発明のラクダ抗体ライブラリにおけるヒトVH3鎖ファミリーの使用頻度(各対の左側バー)のグラフ表示である。
【００２２】
【図６】図6は、ヒト抗体におけるλ鎖ファミリーの使用頻度(各対の右側バー)と比較した、本発明のラクダ抗体ライブラリにおけるヒトVκ1鎖ファミリーの使用頻度(各対の左側バー)のグラフ表示である。
【００２３】
【図７】図7は、ヒト抗体におけるλ鎖ファミリーの使用頻度(各対の右側バー)と比較した、本発明のラクダ抗体ライブラリにおけるヒトVλ1鎖ファミリーの使用頻度(各対の左側バー)のグラフ表示である。
【００２４】
【図８】図8は、Vλ生殖細胞系列6の表示である。
【００２５】
【図９】図9は、ヒトVHファミリーと呼ばれるVHファミリー(VH1、VH3、VH4、VH5、及びVH7)及び生殖細胞系列遺伝子対応物ごとの、ラクダVH生殖細胞系列遺伝子のアラインメントである。同一性(%)は、基準のFRアミノ酸配列(ref)(ここではヒトVH生殖細胞系列対応物)と共通のVH生殖細胞系列のラクダ(フタコブラクダ(Camel ferus))及びラマ(アルパカ(Lama pacos)又はピクーニャ(lama vicugna))フレームワーク(FR1+FR2+FR3)のそれぞれの同一のアミノ酸(点)の割合を示す。
【００２６】
【図１０】図10は、ヒトVλファミリーと呼ばれるVλファミリー(Vλ1、Vλ2、Vλ3、Vλ4、Vλ5、Vλ6、Vλ7、Vλ8、Vλ9、及びVλ10)及び生殖細胞系列遺伝子対応物ごとの、ラクダVλ生殖細胞系列遺伝子のアラインメントである。同一性(%)は、基準のFRアミノ酸配列(ref)(ここではヒトVλ生殖細胞系列対応物)と共通のVλ生殖細胞系列のラクダ(フタコブラクダ(Camel ferus))及びラマ(アルパカ又はピクーニャ)フレームワーク(FR1+FR2+FR3)のそれぞれの同一のアミノ酸(点)の割合を示す。
【００２７】
【図１１】図11は、ラクダVκファミリーと、対応するヒト生殖細胞系列とのアラインメントである。同一性(%)は、基準のFRアミノ酸配列(ref)(ここではヒトVκ生殖細胞系列対応物)と共通のラクダ(フタコブラクダ)及びラマ(アルパカ又はピクーニャ)フレームワーク(FR1+FR2+FR3)Vκ生殖細胞系列のそれぞれの同一のアミノ酸(点)の割合を示す。
【００２８】
【図１２】図12は、ラクダ(アルパカ及びフタコブラクダ)VH遺伝子及び対応するプライマーを示す。
【００２９】
【図１３】図13は、ラクダ(アルパカ、フタコブラクダ、及びラマ)Vλ遺伝子及び対応するプライマーを示す。
【００３０】
【図１４】図14は、ラクダ(アルパカ、フタコブラクダ、及びラマ)Vκ遺伝子及び対応するプライマーを示す。
【００３１】
【図１５】図15は、VH1 FR1の最初の23bpを有するVH1-プライマー1のアラインメントの例を示す。このアラインメントの例は、Vファミリー増幅のための特異的なプライマーをどのようにして設計するかということを例示する。Vファミリー特異的なプライマーは、同じファミリーに属するV生殖細胞系列遺伝子の、すべてのフレームワーク1、すなわちFR1を整列させることによって産生される(ここではVH1ファミリーについての例)。すべてのFR1ファミリーV特異性は、発見されたすべてのV生殖細胞系列配列から抽出され、収集され、アルパカWGS及びHTG、フタコブラクダWGS、及びあらゆる利用可能な配列データベース又は非公開の若しくは公開された文献から注釈付けされる。WGSは、全ゲノムショットガン配列決定計画を表し、HTG又はHTGSは、ハイスループットゲノム配列を表す。点は、基準配列(この例においては、VH1-プライマー1によって表される)と比較した場合に同一のヌクレオチドを表す。ここでは、VH1-プライマー1は、第13位置のG又はCとアニーリングすることが可能な縮重プライマーであり;Sは、プライマー合成のためのG/Cを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
(発明の詳細な説明)
以下は、発明の詳細な説明である。
【００３３】
(定義)
「抗体」(Ab)及び「免疫グロブリン」(Ig)は、(標的)抗原に対する結合特異性を発揮する糖タンパク質である。ラクダ種は、2つの異なる型の抗体;旧来又は「従来の」抗体と重鎖抗体を有することが公知である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「ラクダ抗体」とは、IgA、IgG、IgD、IgE、又はIgMを含めた、あらゆるアイソタイプの従来のラクダ抗体をいう。天然の又は自然に発生する「従来の」ラクダ抗体は、通常、2本の同一の軽(L)鎖と2本の同一の重(H)鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパク質である。
【００３５】
用語「抗体鎖」は、用語「抗体ドメイン」と互換的に使用され、抗体の重鎖又は軽鎖を指す。
【００３６】
用語「抗体ライブラリ」とは、スクリーニングのために及び/又は組み合わせて完全な抗体にするためにディスプレイされた抗体及び/又は抗体フラグメントの集合をいう。抗体及び/又は抗体フラグメントは、リボソーム上で;ファージ上で;又は細胞表面、特に酵母細胞表面上でディスプレイすることができる。
【００３７】
ヒト抗体鎖は、あるファミリーの他のメンバーとの配列相同性が少なくとも80%である場合、その特定の「抗体鎖ファミリー」に属すると考えられる。この定義に基づいて、23のヒト抗体鎖ファミリーは、7の重鎖(VH)ファミリー;6のVκ軽鎖ファミリー;及び10のVλ軽鎖ファミリーと特定されている。したがって、ヒト抗体鎖は、Vλ6ファミリーの他のメンバーとの配列相同性が少なくとも80%である場合、ヒトファミリーVλ6に属すると考えられる。一般に、抗体鎖は、他のファミリーのメンバーとの配列相同性が70%未満であることが判明している。
【００３８】
ラクダ抗体鎖は、あるファミリーのヒト生殖細胞系列配列との配列相同性が少なくとも80%である場合、その特定のヒト抗体鎖ファミリーに属すると考えられる。好ましくは、配列相同性は、少なくとも85%、より好ましくは90%、さらに好ましくは少なくとも95%である。
【００３９】
ラクダ抗体は、ラクダ科の中の種の、末梢血又は特定の組織、例えば脾臓から得ることができる。抗体は、正常な健康な動物から、又は病気の動物から得ることができる。しかし、標的抗原に対する免疫応答(ここでは、動物が、標的抗原と免疫反応性であるラクダの従来の抗体を産生する)を誘発するために、好ましくは、ラクダ抗体は、標的抗原での能動免疫化後の動物から得られる。ラクダの免疫化のためのプロトコルは、その開示が参照により本明細書に組み込まれるUS 2011/0300140に記載されている。
【００４０】
このプロセスは、一般的に、ラクダ科の種(限定はされないが、ラマ及びアルカパ(alcapa)を含めて)の動物の免疫化を含むこととなる。好ましくは、この動物は、非近交系集団（非近交系集団は、免疫応答の強度及び多様性に寄与する）に属する。能動免疫化の後、免疫化した動物から、末梢血リンパ球又は生体組織、例えばリンパ節又は脾臓組織を単離することができる。採取したリンパ球は、標的抗原に対する従来のラクダ抗体の産生についてスクリーニングすることができる。未処置の抗体ライブラリの構築については、こうしたスクリーニングは実施されない。
【００４１】
ラクダVH及びVLドメインをコードする核酸(能動免疫化によって得られるか他の手段によって得られるかを問わない)を使用して、US 2011/0300140に記載されている通りに、ラクダライブラリ、例えばFabライブラリを調製することができる。
【００４２】
従来のラクダ抗体のVH及び/又はVLドメインをコードする発現ベクターのライブラリを構築して、増幅された遺伝子断片(各遺伝子断片は、従来のラクダ抗体のVH及び/又はVLドメインをコードするヌクレオチドの配列を含有する)を得ることも可能である。発現ベクターライブラリを構築することは、以下のステップを含む:
a)従来のラクダ抗体のVH及び/又はVLドメインをコードする核酸分子の領域を増幅して、増幅された遺伝子断片(各遺伝子断片は、従来のラクダ抗体のVHドメインをコードするヌクレオチドの配列又はVLドメインをコードするヌクレオチドの配列を含有する)を得ること;及び
b)a)で得られた遺伝子断片を、各発現ベクターが、VHドメインをコードする遺伝子断片及び/又はVLドメインをコードする遺伝子断片を少なくとも含有するように、発現ベクターにクローン化し、それによって発現ベクターのライブラリを得ること。
【００４３】
ステップa)は、任意の適切な増幅技術、例えばPCRによって実施することができる。PCRが使用される場合、適切なプライマーの選択が重要である。最適以下のプライマーの使用は、価値ある多様性の喪失をもたらす。何故なら、重要なヒトファミリーに属する抗体鎖が、単離及び検出から漏れる可能性があるからである。例えば、ヒトVH6に属するこれまでの鎖では、Vκ3又はVλ6ファミリーが、これらのファミリーに属する配列に適切でないプライマーの使用という理由で、単離及び/又は検出から漏れている。
【００４４】
第1の実施態様では、本発明の抗体ライブラリは、少なくとも7、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも12、さらに好ましくは少なくとも15のヒト抗体鎖ファミリーに属する抗体鎖を含む。この実施態様は、抗体ライブラリの機能的サイズが、絶対的サイズよりも重要であるという発見を利用する。等しい絶対的サイズ(例えば1010抗体)の2つの抗体ライブラリAとBを考える。ライブラリAは、わずか5の異なるファミリーの抗体鎖を含むのに対して、ライブラリBは、10の異なるファミリーの抗体鎖を含む。ライブラリBが、鎖シャッフリングなどの親和性成熟プロトコルにおける、より可能性の高い置換を提供することが容易にわかる。したがって、どちらのライブラリも、絶対的サイズが等しいけれども、ライブラリBは、ライブラリAよりも、高親和性の抗体を産生する確率が高い。
【００４５】
ライブラリ多様性はまた、重要な、より優れたエピトープ範囲でもあり、多様性が、より大きいと、機能的及び/又は治療的に妥当な抗原上のエピトープを標的にできる可能性が増大する。ライブラリ多様性はまた、結合特異性;標的抗原のオルソログに対する交差反応性;安定性;製造のしやすさ;などの望ましい二次的な特性を有する抗体分子を特定する確率を増大させるためにも重要である。
【００４６】
この実施態様のライブラリの別の重要な態様は、該ライブラリが、かなりの数の「ヒト」鎖ファミリーに相当することである。ネズミ抗体ライブラリは、ネズミ生殖細胞系列における多数のVκファミリーのおかげで、高度に多様であり得る。このようにして、ネズミ抗体ライブラリは、こうしたライブラリへの期待に基づく機能的サイズの基準を満たし、特定の標的に対してスクリーニングした場合にかなりの数の高親和性の抗体を産生する。しかし、これらの「ヒット」の多くは、ヒト抗体に対する非類似性が原因で、使用不可能である。他のヒットは、その親和性のかなりの部分を失うような大規模なヒト化操作を必要とする可能性がある。しかし、本発明のライブラリは、ヒト化操作をほとんど必要としない抗体を産生する。
【００４７】
ほとんど又はすべての抗体鎖ファミリーは、複数の特有の遺伝子によって発現されることが判明している。例えば、Vλ1鎖ファミリーについては、少なくとも5つの異なる遺伝子が存在する。この発見は、さらに大きなライブラリ多様性への扉を開く。本発明の重要な態様は、抗体プールからの、所与の抗体鎖ファミリーに対する2種以上の遺伝子の抽出を可能にするプライマーの開発である。
【００４８】
第2の実施態様では、本発明の抗体ライブラリは、以下のヒト鎖ファミリーのうちの少なくとも1種の抗体鎖を含む:VH6、Vκ3;及びVλ6。この実施態様は、これらのファミリーのそれぞれが、これらのファミリーの採取可能な量の鎖を含有するのに十分に大きいラクダ抗体ライブラリを構築する努力、並びにこれらを増幅及び単離するのに必要な適切なプライマーを開発する努力を保証するために、ヒト生殖細胞系列抗体の多様性にとって十分に重要であるという洞察に基づいている。
【００４９】
第3の実施態様では、本発明の抗体ライブラリは、3種のヒトファミリーVH3、Vκ1、及びVλ6のメンバー;好ましくは4種のヒトファミリーVH1、VH3、Vκ1、及びVλ6のメンバー;さらに好ましくは5種のヒトファミリーVH1、VH3、Vκ1、Vλ1、及びVλ6のメンバー;さらに好ましくは6種のヒトファミリーVH1、VH3、Vκ1、Vλ1、Vλ2、及びVλ6のメンバー;最も好ましくは7種のヒトファミリーVH1、VH3、Vκ1、Vκ2、Vλ1、Vλ2、及びVλ6のメンバーを少なくとも含む。この実施態様は、自然界では、抗体鎖のこれらの組み合わせが、それぞれ1.5%、3.1%、4.7%、6.3%、及び7.8%の置換可能性を示すとしても、ヒト抗体の約50%から80%超に相当するという認識を反映している。このライブラリは、こうしたライブラリの絶対的サイズが比較的小さかったとしても、有用な治療用抗体を産生する確率が高い鎖のこれらの組み合わせを含むということになる。
【００５０】
上の3つの実施態様で述べた基準は、互いに排他的ではないこと、また、特定のライブラリが、これらの実施態様の2つの、場合により3つすべての基準を満たす可能性があることを理解されたい。例えば、すべての23種のヒトファミリーの鎖を含むライブラリは、3つすべての実施態様の基準を確実に満たすこととなる。
【実施例】
【００５１】
(例示的な実施態様/実施例の説明)
【００５２】
以下は、例示目的のみで与えられる、本発明のある種の実施態様の説明である。
【００５３】
(実施例1)
(プライマー配列を含む増幅プロトコルの説明)
免疫化、PBL単離、RNA抽出、及びcDNA調製を、Dreierらの米国特許出願公開第2011/0300140号に開示されている通りに行った。
【００５４】
Fabフラグメントを、de Haardらの文献(JBC 1999)に記載されている通りに、鋳型としてcDNAを用い、可変領域のフレームワーク1(FR1)と特異的にアニーリングするプライマー(BACKプライマー)及び定常領域(FORプライマー)の末端と特異的にアニーリングするプライマーを使用するPCRによって増幅した。プライマーの配列は、全ゲノムショットガン(Whole Genome Shotgun)(WGS)データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ABRR00000000)、ハイスループット(High-throughput genome)(HTG)データベース、及び配列決定されたアンプリコンから得られたラクダ(アルパカ、フタコブラクダ、及びラマ)由来の生殖細胞系列配列に基づいて設計した。図9〜11は、ラクダVH、Vλ、及びVκファミリーと、対応するヒト生殖細胞系列とのアラインメントを示す。これらの配列を、表1〜3に記載したFR1プライマーの設計のための鋳型として使用した。ラクダ生殖細胞系列配列と、対応するFR1プライマーとの概要を、図12〜14に示す。
【００５５】
ラマ可変領域の増幅は、ワンステップPCR又はツーステップPCRで行うことができる。ワンステップPCRについては、増幅に使用されるBACK及びFORプライマーは、PCRフラグメントのpCB3ファージミドベクターへのクローニングを可能にする制限部位を含有する。ツーステップPCRについては、タグ付けしていないプライマー(制限部位を含まない)を用いて第1のPCRを行った。アンプリコンを単離及び精製し、その後、制限部位を含有するプライマーを用いて第2のPCRを行った。制限部位は、BACKプライマーに対してはApaLI、FORプライマーに対してはAscIである。制限部位は、VH-CH1のBACK及びFORプライマーに対しては、それぞれSfiI及びNotIである。或いは、DNA断片を、制限部位で(FORプライマーをAscI部位で、FR4ベースのBACKプライマーをBsteII部位で)タグ付けしたプライマーを用いて再増幅し、VLフラグメントとしてクローン化し、このようにして、ヒトC領域と合わせたラマ由来のV領域を含有するキメラFabを作製することができる。アンチセンスプライマーを、表4に示す。
【００５６】
Phusionポリメラーゼ(ThermoFischer社)及び500pMの各プライマーを使用して、50μl反応の体積で、28サイクル(96℃で1分、60℃で1分、72℃で1分)でPCRを実施した。
【００５７】
Dreierらの米国特許出願公開第2011/0300140号に記載されている通りに、Fabライブラリの構築を行った。
表1.ラクダVH遺伝子の増幅のためのFR1プライマー
【表１】
0006283030.tif 000002
表2.ラクダVλ遺伝子の増幅のためのFR1プライマー
【表２】
0006283030.tif 000003
0006283030.tif 000004
0006283030.tif 000005
表3.ラクダVκ遺伝子の増幅のためのFR1プライマー
【表３】
0006283030.tif 000006
【００５８】
表4.VH、Vλ、及びVκ遺伝子の増幅のために使用されるアンチセンスプライマー(5’-3’)。
【表４】
0006283030.tif 000007
【００５９】
表中及び本明細書で提供されるプライマー配列では、以下の表記を使用している:
S-G又はC
M-A又はC
Y-T又はC
K-G又はT
W-A又はT
R-G又はA
N-A、C、T、G、不明、その他
【００６０】
このようにして、本発明を、上に論じたある種の実施態様を参照することによって説明してきた。これらの実施態様は、当分野の技術者に周知の様々な改変及び代替形態の余地があることが理解されよう。例えば、抗体ライブラリは、PCRプライマーを改変及び/又は微調整することによって改変することができる。
【００６１】
本明細書に記載した構造及び技術に対して、本発明の趣旨及び範囲を逸脱せずに、上に記載したもの以外の多くの改変を施すことができる。したがって、具体的実施態様を記載してきたが、これらは、例に過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【図１】
0006283030.tif 000011
【図２】
0006283030.tif 000012
【図３】
0006283030.tif 000013
【図４】
0006283030.tif 000014
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１０−１０】
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【図１０−１１】
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【図１０−１２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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