(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．０３〜１．０９ｇ／ｃｍ３の密度を有する、単数または複数のポリカプロラクトン（ＰＣＬ）マイクロキャリアー。
【請求項２】
１．０４〜１．０７ｇ／ｃｍ３の密度を有する、請求項１に記載の単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアー。
【請求項３】
１．０３〜１．０７ｇ／ｃｍ３の密度を有する、請求項１に記載の単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアー。
【請求項４】
約５０〜約４００μｍの平均直径、および１０％未満の直径の変動係数（ＣＶ）を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアー。
【請求項５】
約１５０〜２００μｍの平均直径、および５％未満の直径のＣＶを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアー。
【請求項６】
ＰＣＬマイクロキャリアーが多孔性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアー。
【請求項７】
ＰＣＬマイクロキャリアーが球状の形状である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアー。
【請求項８】
単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアーが乾燥型で提供される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアー。
【請求項９】
接着促進性のポリペプチド、糖ポリペプチド、陽イオン性多価電解質、または多糖を含むコーティングをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアー。
【請求項１０】
（ｉ）マトリックス構成要素を含む第一の層；および
（ｉｉ）マトリックス構成要素を含む別の層；
を含む多層コーティングをさらに含み、
ここでマトリックス構成要素は、ポリ−Ｌ−リジン）、ラミニン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、または、ラミニン、コラーゲンＩ、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびエンタクチン１の混合物、である、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアー。
【請求項１１】
さらに細胞コーティングを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアー。
【請求項１２】
細胞が幹細胞である、請求項１１に記載の単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアー。
【請求項１３】
細胞、場合によって幹細胞を培養する方法であって：
（ｉ）細胞を、請求項１〜１０のいずれか一項記載の単数のＰＣＬマイクロキャリアー、または複数のＰＣＬマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−細胞複合体を形成し；そして
（ｉｉ）マイクロキャリアー−細胞複合体を培養する；
工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
工程（ｉｉ）の後、細胞数が拡大される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
マイクロキャリアー−細胞複合体を培養する工程が、静置状態下での懸濁培養および／もしくは攪拌を伴う懸濁培養を含み、ならびに／または、マイクロキャリアー−細胞複合体の培養が、血清不含培地中の培養を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
幹細胞を分化させる方法であって：
（ｉ）幹細胞を、請求項１〜１０のいずれか一項記載の単数のＰＣＬマイクロキャリアー、または複数のＰＣＬマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−幹細胞複合体を形成し；そして
（ｉｉ）幹細胞の分化を誘導する；
工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学、分子生物学およびバイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、粒子状キャリアー上の幹細胞培養に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、分化した細胞とは異なり、分裂し、そして自己再生するかまたは表現型的にそして機能的に異なる娘細胞に分化するかいずれかの能力を有する（Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００５；１９：１１２９−１１５５；  ＷｏｂｕｓおよびＢｏｈｅｌｅｒ，  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００５；８５：６３５−６７８；  Ｗｉｌｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  １９９３；２２５：９００−９１８；  Ｃｈｏｉら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２００５；１０５：３５９−３６８）。
【０００３】
平面表面上での幹細胞培養は、比較的よく確立されている一方、細胞を培養するために利用可能な表面積が限定され、大きな技術的および操作上の難点になる。療法用量のためには、名目上、１０億（１ｘ１０９）細胞が必要であり、１０００用量に対応する、１兆（１ｘ１０１２）細胞のルーチンのバッチ製造のため、拡大可能な技術が期待される。
【０００４】
三次元バイオリアクターは、細胞培養環境に対する必要な度合いの管理を取り込む、非常に拡大可能な技術を提供する。攪拌下で、その体積はミリリットルから数十リットル、またはそれより多くの範囲になりうる。
【０００５】
微小球体は、マイクロキャリアーとして使用可能であり、三次元環境において、幹細胞の拡大、および潜在的に続く分化を支持することが可能な支持体を提供する。これらは、定義され、そして拡大可能な環境において、攪拌下で、単一細胞植え付けから始まるヒト胚性幹細胞の培養に成功することが立証されている。
【０００６】
本発明は、１９７０年代以降、ＦＤＡに認可されている移植用の生物分解性および生物吸収性ポリマーから作製される、均一なサイズのマイクロキャリアーの製造および適用を記載する。
【０００７】
ＵＳ８１３７９７２Ｂ２は、水より軽いかまたは水と同じ密度（約４℃で〜１ｇ／ｃｍ３）の組織工学作用の足場の製造を記載する。多くのバイオリアクターは、わずかに負に浮揚性であるマイクロキャリアーと使用するために設計されている。したがって、こうしたマイクロキャリアーは、こうしたバイオリアクター中で使用するには適していない。
【０００８】
ＵＳ２０１００３２２９０８Ａ１は、一桁以上の範囲の（すなわち所定のサイズの１〜１０倍）大きなサイズ分布を持つ、生物分解性微小球体を記載する。ＷＯ２００９０１４４４１Ａ２は、流体力学によるポリカプロラクトン（ＰＣＬ）微小球体の製造を記載する；が、彼らの方法のサイズ管理は洗練されておらず、そして本開示に記載するような低い変動係数（ＣＶ）値を可能にしない。均一な密度で植え付けられた培養細胞は、こうしたマイクロキャリアー上で、異なる時点で集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達する。
【０００９】
Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ：  Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｄ（２００８）１９：１７０３−１７１１；  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１０８５６−００７−３２５３−９，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  第２２巻，  第２０号，  ２００１年１０月１５日，  ｐｐ．  ２７８５−２７９４（１０）、およびＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６１（２０１２）９２７−９３２；  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２０１２．０５．００３は、生物活性分子を被包し、そして放出するためのＰＣＬ微小球体の製造を記載する。ＵＳ２００８００２００４９Ａ１は、高多孔性で相互連結され、そして足場内に配置されている微小球体を記載する。これらの文書は微小球体のサイズ均一性を提供しない。
【００１０】
同様に、ＵＳ２０１１０２４５４５６Ａ１は、製造された生物分解性微小球体の、低いＣＶを持つ均一なサイズ分布の達成を提供しない。記載されるスプレー法は、製造された微小球体の高い度合いの均一性を可能にしない。
【００１１】
ＵＳ２００８００９５８２２Ａ１は、架橋されていてもよいヒドロゲル内への微小球体の包埋を記載する。該文書は、ヒドロゲル内の微小球体の均一な分散を開示するが、均一なサイズの微小球体の製造を提供しないしまた記載しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＵＳ８１３７９７２Ｂ２
【特許文献２】ＵＳ２０１００３２２９０８Ａ１
【特許文献３】ＷＯ２００９０１４４４１Ａ２
【特許文献４】ＵＳ２００８００２００４９Ａ１
【特許文献５】ＵＳ２０１１０２４５４５６Ａ１
【特許文献６】ＵＳ２００８００９５８２２Ａ１
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００５；１９：１１２９−１１５５
【非特許文献２】ＷｏｂｕｓおよびＢｏｈｅｌｅｒ，  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００５；８５：６３５−６７８
【非特許文献３】Ｗｉｌｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  １９９３；２２５：９００−９１８
【非特許文献４】Ｃｈｏｉら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２００５；１０５：３５９−３６８
【非特許文献５】Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ：  Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｄ（２００８）１９：１７０３−１７１１  ；  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１０８５６−００７−３２５３−９，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  第２２巻，  第２０号，  ２００１年１０月１５日，  ｐｐ．  ２７８５−２７９４（１０）
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６１（２０１２）９２７−９３２；  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２０１２．０５．００３
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、生物吸収性、生物分解性ポリマーを含む、マイクロキャリアーおよび複数のマイクロキャリアーを提供する。移植に関してＦＤＡ認可された生物分解性、生物吸収性ポリマーを使用すると、組織工学プロセスの不可欠な部分として、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで移植されるべきマイクロキャリアー上で培養することが可能になる。これを骨、軟骨、またはさらに神経再生の背景で用いることも可能である。
【００１５】
いくつかの態様において、生物吸収性、生物分解性ポリマーは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）である。
【００１６】
いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、ＰＣＬ内にブレンドされた第二の生物分解性ポリマーを含む。いくつかの態様において、第二の生物分解性ポリマーは、ＰＣＬ内での二相性エマルジョンとして含まれる。いくつかの態様において、第二の生物分解性ポリマーは、ＰＣＬよりもより迅速に生物分解されるか、またはポロゲンとしてＰＣＬとは異なる溶媒（例えば水性またはエタノール媒体)中に溶解可能であり、ＰＣＬ内に多孔性構造を形成することが可能である。いくつかの態様において、孔は分離された孔であるかまたは相互連結された孔である。いくつかの態様において、孔は巨大孔である。
【００１７】
いくつかの態様において、マイクロキャリアーは親水性表面を有する。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは水中で湿潤性である。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、重量０．０１％未満の界面活性剤を有する。
【００１８】
いくつかの態様において、多価電解質がＰＣＬ内に含まれる。これをＰＣＬ内にブレンド可能であるし、またはジブロックコポリマーの形であることも可能であり、１つのセグメントがＰＣＬと適合性であり、そして第二のセグメントが多価電解質である。この一例が、ポリスチレン−ポリアクリル酸（ＰＳ−ＰＡＡｃ）ジブロックコポリマーであり、該コポリマーは、ジクロロメタン（ＤＣＭ）から形成されるポリスチレン微小球体に、負荷電を与えるために成功裡に使用されてきている。
【００１９】
ＰＣＬによって提供される別の利点は、生物活性分子を含めて分子を放出可能であることである。培養細胞と直接接触しているこれらの分子の放出は、多能性を維持するかまたは特定の細胞系譜への分化を誘導するように、その進化を効率的に導くことも可能である。分子量の範囲は、小分子（数１００ダルトン）から、分子量が数１０キロダルトンのタンパク質または多糖にまたがる。
【００２０】
したがって、いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、ＰＣＬ内に、生物活性物質、例えば骨形成用のヒドロキシアパタイト、または他の生物活性分子を含む。これは、ＰＣＬをこれらの材料と直接ブレンドすることによって、またはＰＣＬ内にこれらを取り込む被包によって達成可能である。
【００２１】
いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、１ｇ／ｃｍ３未満の密度で、例えば２５℃で、適合可能なポリマーを含む。好適には、これを用いて、攪拌バイオリアクター内で使用可能なマイクロキャリアーの密度を調節可能である。
【００２２】
本発明は、コーティングを有するマイクロキャリアーを提供する。いくつかの態様において、コーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、接着促進タンパク質またはウシ血清アルブミンを含む。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、１またはそれより多い接着促進分子を含むコーティングで実質的にまたは完全にコーティングされる。接着促進分子には、哺乳動物表面細胞ポリペプチド、糖ポリペプチド、陽イオン性多価電解質または多糖に結合可能なポリペプチド、糖ポリペプチド、多糖および陽イオン性ポリペプチドが含まれる。いくつかの態様において、陽イオン性多価電解質はポリブレンである。いくつかの態様において、コーティングは１またはそれより多いマトリックス構成要素を含む。マトリックス構成要素には生物学的マトリックスの構成要素が含まれる。いくつかの態様において、マトリックス構成要素は細胞外マトリックス構成要素である。
【００２３】
１つの側面において、本発明は、接着促進分子でコーティングされた単数のＰＣＬマイクロキャリアーまたは複数のＰＣＬマイクロキャリアーを提供する。いくつかの態様において、コーティングは多層コーティングであり、そして多層コーティングは（ｉ）接着促進分子を含む第一の層、および；（ｉｉ）接着促進分子を含む別の層を含む。いくつかの態様において、第一の層の接着促進分子は、第二の層の接着促進分子とは異なる。いくつかの態様において、多層コーティングは２より多い層を含む。いくつかの態様において、多層コーティングは、３、４、５、６、７、８、９または１０層を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、接着促進分子はマトリックス構成要素である。いくつかの態様において、マトリックス構成要素は、ポリリジン（またはポリ−Ｌ−リジン）、ラミニン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、またはラミニン、コラーゲンＩ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物より選択される。いくつかの態様において、マトリックス構成要素は細胞外マトリックス構成要素である。いくつかの態様において、コーティングは、ジアルデヒド、例えばグルタルアルデヒドで架橋された１またはそれより多い細胞外マトリックスタンパク質を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、マトリックス構成要素の組み合わせを含む、接着促進分子の組み合わせでコーティングされる。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、フィブロネクチン、および／またはポリ−Ｌ−リジン、および／またはビトロネクチンの組み合わせでコーティングされる。いくつかの態様において、付着タンパク質の組み合わせは、層状で、同じマイクロキャリアー上に提供される。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、フィブロネクチン、次いでポリ−Ｌ−リジン、次いでフィブロネクチンの層でコーティングされる、ＰＣＬマイクロキャリアーであることも可能である。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、フィブロネクチンおよび／またはポリ−Ｌ−リジン、および／またはビトロネクチン、またはフィブロネクチン、次いでポリ−Ｌ−リジン、次いでフィブロネクチンでコーティングされる、ＰＣＬマイクロキャリアーであることも可能である。
【００２６】
都合よくは、付着支持体（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の組み合わせは、マイクロキャリアーへの細胞のよりよい接着および／またはマイクロキャリアー上での細胞のよりよい増殖を生じることが可能である。例えば、フィブロネクチン、および／またはポリ−Ｌ−リジン、および／またはビトロネクチンの使用は、静置または攪拌培養中の間葉系幹細胞増殖を可能にすることも可能であり、ここで、こうした付着支持体は、攪拌中の細胞接着および増殖を可能にする。いくつかの態様において、コーティングは、フィブロネクチン−ＰＬＬ−フィブロネクチン（ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮ）コーティング、またはフィブロネクチン−ＰＬＬ−ビトロネクチン（ＦＮ−ＰＬＬ−ＶＮ）コーティングであることも可能である。
【００２７】
いくつかの態様において、ＰＣＬマイクロキャリアーまたは複数のＰＣＬマイクロキャリアーは、さらに細胞でコーティングされ、そして／または付着した細胞を有する。
【００２８】
本発明において、細胞は、任意の種類、例えば体細胞であることも可能である。いくつかの好ましい態様において、細胞は、多能性（例えば胚性幹細胞または人工多能性幹細胞）または多分化能（例えば成体幹細胞）であってもよい幹細胞である。細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）であることも可能である。細胞は、非ヒト、例えばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類（齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）の任意の動物由来の細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類または他の非ヒト脊椎動物生物；および／または非ヒト哺乳動物細胞；および／またはヒト細胞であることも可能である。
【００２９】
ヒト胚性幹細胞は、典型的には凝集体中で増殖するが、間葉系幹細胞は、一般的に、単一、または準単一層で培養される。後者は、非常な困難を提示し、これは、細胞の発展（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）が、集密に到達した後（すなわち細胞が全表面を覆い、そして互いに側方に圧を発し始める際）に改変されるためである。この適用のため、マイクロキャリアーサイズが均一であれば、培養細胞がほぼ同じ時点で集密に到達することが可能になる。マイクロキャリアーの表面積が非常に異なる場合、培養細胞は異なる時点で集密に達し、均質でない細胞集団を生じる。したがって、直径のＣＶ（変動係数、平均直径に対する標準偏差の比を示す）が低ければ好都合であり、１０％未満そして好ましくは５％未満であることが好都合である。
【００３０】
したがって、本発明は、直径の１０％未満の変動係数（ＣＶ）を有するＰＣＬマイクロキャリアーまたは複数のＰＣＬマイクロキャリアーを提供する。いくつかの態様において、直径のＣＶは、９％未満、８％未満、７％未満または６％未満のものである。いくつかの態様において、直径のＣＶは５％未満である。いくつかの態様において、直径のＣＶは、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満のものである。都合よくは、均一な密度でこうしたマイクロキャリアー上に植え付けられた培養細胞は、ほぼ同時に集密に達する。
【００３１】
本発明はまた、約５０〜約４００ミクロンの平均直径を有する単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアーも提供する。いくつかの態様において、平均直径は約７５〜約３００ミクロン、約１００〜２５０ミクロン、約１５０〜２００ミクロンである。
【００３２】
マイクロキャリアー密度は、好ましくは、懸濁細胞培養中、例えば攪拌バイオリアクター中のマイクロキャリアーの懸濁を可能にするために適している。
【００３３】
本発明は、１．０１〜１．０９ｇ／ｃｍ３の密度を有する、単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアーを提供する。これは：
１．０１〜１．０９ｇ／ｃｍ３、１．０１〜１．０８５ｇ／ｃｍ３、１．０１〜１．０８ｇ／ｃｍ３、１．０１〜１．０７ｇ／ｃｍ３、１．０１〜１．０６ｇ／ｃｍ３、１．０１〜１．０５ｇ／ｃｍ３、１．０１〜１．０４ｇ／ｃｍ３、１．０１〜１．０３ｇ／ｃｍ３、１．０１〜１．０２ｇ／ｃｍ３；
１．０２〜１．０９ｇ／ｃｍ３、１．０２〜１．０８５ｇ／ｃｍ３、１．０２〜１．０８ｇ／ｃｍ３、１．０２〜１．０７ｇ／ｃｍ３、１．０２〜１．０６ｇ／ｃｍ３、１．０２〜１．０５ｇ／ｃｍ３、１．０２〜１．０４ｇ／ｃｍ３、１．０２〜１．０３ｇ／ｃｍ３；
１．０３〜１．０９ｇ／ｃｍ３、１．０３〜１．０８５ｇ／ｃｍ３、１．０３〜１．０８ｇ／ｃｍ３、１．０３〜１．０７ｇ／ｃｍ３、１．０３〜１．０６ｇ／ｃｍ３、１．０３〜１．０５ｇ／ｃｍ３、１．０３〜１．０４ｇ／ｃｍ３；
１．０４〜１．０９ｇ／ｃｍ３、１．０４〜１．０８５ｇ／ｃｍ３、１．０４〜１．０８ｇ／ｃｍ３、１．０４〜１．０７ｇ／ｃｍ３、１．０４〜１．０６ｇ／ｃｍ３、１．０４〜１．０５ｇ／ｃｍ３；
１．０５〜１．０９ｇ／ｃｍ３、１．０５〜１．０８５ｇ／ｃｍ３、１．０５〜１．０８ｇ／ｃｍ３、１．０５〜１．０７ｇ／ｃｍ３、１．０５〜１．０６ｇ／ｃｍ３
の１つであることも可能である。
【００３４】
好ましい密度は、約１．０２〜約１．０５ｇ／ｃｍ３である。適切な密度には、約１．０２、１．０２５、１．０３、１．０３５、１．０４、１．０４５、１．０５ｇ／ｃｍ３の１つが含まれる。
【００３５】
いくつかの態様において、密度は約１．０３〜１．１ｇ／ｃｍ３である。
【００３６】
いくつかの態様において、マイクロキャリアーは形状が実質的に球状である。
【００３７】
ＰＣＬマイクロキャリアーは乾燥型で提供されてもよい。これらは実質的に精製され、そして混入物質から単離されていてもよい。これらは、無菌または非無菌型で提供されてもよい。
【００３８】
本発明の別の側面において、本発明記載のＰＣＬマイクロキャリアーの少なくとも０．１グラムを含有する密封パッケージングを提供する。ＰＣＬマイクロキャリアーは乾燥型で提供されてもよい。
【００３９】
パッケージングは、容器、例えばバッグ、箱、バイアル、ボトル、またはジャーを含むことも可能である。パッケージングは、プラスチック素材でできていてもよく、そして内容物の乾燥状態を維持するように、防水性であってもよい。マイクロキャリアーは滅菌されていなくてもまたは滅菌されていてもよい。パッケージングは、少なくとも０．２ｇ、０．３ｇ、０．４ｇ、０．５ｇ、０．６ｇ、０．７ｇ、０．８ｇ、０．９ｇ、１．０ｇ、２．０ｇ、３．０ｇ、４．０ｇ、５．０ｇ、１０ｇ、２０ｇ、３０ｇ、４０ｇ、５０ｇ、１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、６００ｇ、７００ｇ、８００ｇ、９００ｇ、１ｋｇまたはそれより多いＰＣＬを含有することも可能である。重量は好ましくは乾燥重量である。
【００４０】
本発明は、微小球体を作製するためのプロセス、例えば製造法であって、（ｉ）第一の液体を、インジェクター中の出口を通じて第二の液体内に注入し、前記出口は第二の液体中に浸されており、第二の液体は前記注入中に前記出口を通過して流れ、第一の液体はポリマーを含み、そして第一および第二の液体は十分に非混和性であり、第二の液体中で第一の液体の小滴が形成され；そして（ｉｉ）小滴から微小球体を形成する工程を含む、前記プロセスを提供する。いくつかの態様において、微小球体は生物分解性および／または生物吸収性である。いくつかの態様において、ポリマーはカプロラクトンまたはそのコポリマーである。
【００４１】
１つの側面において、本発明は、ＰＣＬマイクロキャリアーを産生するためのプロセスであって、（ｉ）第一の液体を、インジェクター中の出口を通じて第二の液体内に注入し、該出口は第二の液体中に浸されており、第二の液体は該注入中に該出口を通過して流れ、第一の液体はカプロラクトンまたはそのコポリマーを含み、そして第一および第二の液体は十分に非混和性であり、第二の液体中で第一の液体の小滴が形成され；そして（ｉｉ）小滴からマイクロキャリアーを形成する工程を含む、前記プロセスを提供する。
【００４２】
いくつかの態様において、第一の液体の流速は、第二の液体の流速と同じかまたはそれより遅い。いくつかの態様において、第二の液体の流速に対する第一の液体の流速の比は、約１：１〜約１：１０、場合によって約１：２〜約１：５、または約１：２〜約１：３の１つである。これは、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９または１：１０の１つであることも可能である。
【００４３】
いくつかの態様において、出口直径は、約０．０５ｍｍ〜約０．３ｍｍの直径を有し、そして第一の液体の流速および第二の液体の流速の比は約１：１〜約５：１である。
【００４４】
都合よくは、工程（ｉｉ）の後に得られる、生じるマイクロキャリアーは、約５０〜４００ミクロンの平均直径、および／または１０％未満、好ましくは５％未満の直径の変動係数を有することも可能である。
【００４５】
いくつかの態様において、方法は、溶媒不含法であり、これによって、ＰＣＬは加熱され、そして冷水槽内に微少流体技術によって押し出される。
【００４６】
いくつかの態様において、第一の液体は、さらに、ゼラチン、ヘパリン、キトサン、ヒドロキシアパタイト、コンドロイチン硫酸、コラーゲン、ポリペプチド、多糖、あるいは場合によって人工的分子、例えば酸化ポリエチレン、ポリオキサゾリン、またはポリアクリルアミドを含むヒドロゲルなどの水溶液の任意の１つまたはそれより多くを含む。いくつかの態様において、ポリマーは、ＧＰＣによって測定されるような、約２０００〜約１００，０００、または約６０，０００〜１００，０００または約５０，０００〜約１００，０００の平均分子量を有する。いくつかの態様において、第一の液体は、さらに、ポリマー用の溶媒を含み、これによって第一の液体は、溶媒中のポリマーの溶液である。いくつかの態様において、第一の液体は、第二の液体のものよりも大きい比重を有する。
【００４７】
いくつかの態様において、溶媒は、塩素化または臭素化溶媒である。いくつかの態様において、溶媒は塩素化炭化水素、場合によってジクロロメタン（ＤＣＭ）である。
【００４８】
いくつかの態様において、ポリマーは、第一の液体中、約０．１〜約１０％ｗ／ｖの濃度、場合によって約０．１〜約５０％、約０．５〜約１０％、または約０．５〜約４％ｗ／ｖの１つを有する。いくつかの態様において、第一の液体は溶媒不含であり、これによって第一の液体はポリマーの融解物（ｍｅｌｔ）を含む。
【００４９】
いくつかの態様において、第二の液体は水性液体である。いくつかの態様において、第二の液体は溶液中にポリマー性安定剤を含む。
【００５０】
いくつかの態様において、第一のまたは第二の液体はどちらも、ポリマー性安定剤以外の界面活性剤を含有しない。いくつかの態様において、ポリマー性安定剤はポリビニルアルコールまたはそのコポリマーである。いくつかの態様において、ポリビニルアルコールは、少なくとも約７５％の度合いの加水分解を有する。いくつかの態様において、ポリマー性安定剤は、第二の液体中、約０．２〜約５％ｗ／ｖ、場合によって約０．５〜約４％ｗ／ｖの濃度を有する。
【００５１】
本発明のプロセスのいくつかの態様において、ポリマーはイオン性モノマー単位を含み、それによって前記ポリマーは、多価電解質コポリマーである。
【００５２】
いくつかの態様において、第一の液体は、さらに、第二のポリマーを含む。いくつかの態様において、第二のポリマーは多価電解質である。
【００５３】
いくつかの態様において、第一の液体はポロゲン、場合によってポリマー性ポロゲンを含む。
【００５４】
本発明のプロセスのいくつかの態様において、注入工程は、第一の液体および第二の液体が同じ方向に流動するものである。いくつかの態様において、第一の液体の流速および第二の液体の流速の間の比は、約１：１〜約５：１、場合によって約２：１〜約３：１、場合によって約２：１である。
【００５５】
本発明のプロセスのいくつかの態様において、出口は、約０．０５〜約０．３ｍｍの内径、場合によって約０．０５〜約０．２ｍｍ、０．０５〜約０．１ｍｍ、０．１〜約０．３ｍｍ、０．１〜約０．２ｍｍ、０．１〜約０．３ｍｍ、または０．２〜約０．３ｍｍの１つを有する。他のインジェクター／針サイズおよび管直径もまた使用可能である。異なるインジェクター／針直径、管直径、ならびに連続および分散相の流速は、微小球体の直径範囲を制御する。
【００５６】
いくつかの態様において、インジェクターは、内側の管の形であり、そして第二の液体は内側の管を取り巻く外側の管内を流動する。いくつかの態様において、第一の液体は、第二の液体内に第一の液体の小滴が形成されるような速度で流動する。いくつかの態様において、第二の液体の流速は、第二の液体が層流体制にあるようなものである。いくつかの態様において、第一の液体の流速および第二の液体の流速は、独立に、１分あたり約１〜約１０，０００マイクロリットルの間である。いくつかの態様において、第一の液体の流速は、１分あたり、約１０〜約５００マイクロリットルの間、場合によって、１分あたり、約１０〜４００マイクロリットルの間である。いくつかの態様において、第二の液体の流速は、１分あたり、約１０〜約５００マイクロリットルの間、場合によって、１分あたり、約１０〜４００マイクロリットルの間である。
【００５７】
本発明のプロセスのいくつかの態様において、インジェクターはシリンジ針を含み、そして第二の液体は管を通じて流れ、それによってシリンジ針の注入部分は、実質的に管と同心円状である。
【００５８】
本発明のプロセスのいくつかの態様において、工程（ｉ）は、ゲルマイクロキャリアーの形成を生じ、そして工程（ｉｉ）は、ゲルマイクロキャリアーが部分的に第二の液体から分離することを可能にし、第二の液体の大部分をゲルマイクロキャリアーから取り除き、そしてゲルマイクロキャリアーが固形ポリマーマイクロキャリアーを形成することを可能にする工程を含む。
【００５９】
好ましい態様において、マイクロキャリアー小滴は、液体相から分離される。いくつかの態様において、マイクロキャリアー小滴は乾燥される。
【００６０】
本発明のプロセスのいくつかの態様において、第一の液体は生物活性物質、例えばヒドロキシアパタイトを含み、そしてマイクロキャリアーは生物活性物質を含む。
【００６１】
いくつかの態様において、本発明のプロセスは、水性水酸化物溶液でマイクロキャリアーを処理する工程をさらに含む。いくつかの態様において、処理は、約１〜約６時間であり、そしてマイクロキャリアーの湿潤性を増加させる。いくつかの態様において、処理は、マイクロキャリアーに負の表面荷電を与える。いくつかの態様において、処理は、約１〜約１０日間であり、そして多孔性マイクロキャリアーを生じる。いくつかの態様において、水酸化物は水酸化ナトリウムである。
【００６２】
いくつかの態様において、本発明のプロセスは、マイクロキャリアー中でポリマーを架橋する工程をさらに含む。いくつかの態様において、架橋は過酸化物、例えば過酸化ベンゾイルの存在下で、マイクロキャリアーを加熱する工程を含む。
【００６３】
いくつかの態様において、プロセスは、１またはそれより多い接着促進分子を含むコーティングで、マイクロキャリアーをコーティングする工程をさらに含む。接着促進分子には、哺乳動物表面細胞ポリペプチド、糖ポリペプチド、陽イオン性多価電解質または多糖に結合可能なポリペプチド、糖ポリペプチド、多糖および陽イオン性ポリペプチドが含まれる。いくつかの態様において、陽イオン性多価電解質はポリブレンである。いくつかの態様において、コーティングはポリ−Ｌ−リジン、接着促進タンパク質またはウシ血清アルブミンを含む。いくつかの態様において、コーティングは１またはそれより多いマトリックス構成要素を含む。マトリックス構成要素には生物学的マトリックスの構成要素が含まれる。いくつかの態様において、マトリックス構成要素は細胞外マトリックス構成要素である。
【００６４】
いくつかの態様において、プロセスは多層コーティングでのマイクロキャリアーのコーティングを含み、ここで多層コーティングは（ｉ）接着促進分子を含む第一の層、および；（ｉｉ）接着促進分子を含む別の層を含む。いくつかの態様において、第一の層の接着促進分子は、第二の層の接着促進分子とは異なる。
【００６５】
いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、接着促進分子の層で、連続してコーティングされる。いくつかの態様において、プロセスは、接着促進分子を含む層でマイクロキャリアーをまずコーティングし、そして続いて、接着促進分子を含む別の層でマイクロキャリアーをコーティングする工程を含む。いくつかの態様において、第一の層の接着促進分子は、第二の層の接着促進分子とは異なる。いくつかの態様において、多層コーティングは２より多い層を含む。いくつかの態様において、プロセスは、マイクロキャリアーを連続してコーティングして、３、４、５、６、７、８、９または１０層を含む多層コーティングを有するマイクロキャリアーを生じる工程を含む。
【００６６】
いくつかの態様において、接着促進分子はマトリックス構成要素である。いくつかの態様において、マトリックス構成要素は、ポリリジン（またはポリ−Ｌ−リジン）、ラミニン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、またはラミニン、コラーゲンＩ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物より選択される。いくつかの態様において、マトリックス構成要素は細胞外マトリックス構成要素である。いくつかの態様において、プロセスは、ジアルデヒド、例えばグルタルアルデヒドでマイクロキャリアーを処理する工程をさらに含む。
【００６７】
いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、哺乳動物細胞表面タンパク質に結合可能なポリペプチドでコーティングされる。いくつかの態様において、ポリペプチドは、リジンまたはリジン誘導体を含むポリアミノ酸である。いくつかの態様において、ポリペプチドは細胞外マトリックスタンパク質である。いくつかの態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、オステオポンチンまたはコラーゲン、あるいはその誘導体である。
【００６８】
いくつかの態様において、プロセスは、フィブロネクチン、および／またはポリ−Ｌ−リジン、および／またはビトロネクチンの組み合わせでマイクロキャリアーをコーティングする工程を含む。いくつかの態様において、プロセスは、同じマイクロキャリアー上で、コーティングの層でマイクロキャリアーを連続してコーティングする工程を含む。こうしたものとして、マイクロキャリアーは、任意の順で、ポリリジンおよび／またはフィブロネクチンおよび／またはビトロネクチンの層でコーティングされることも可能である。いくつかの態様において、プロセスは、フィブロネクチンを含む層でマイクロキャリアーをまずコーティングし、次いでポリ−Ｌ−リジンを含む層、次いでフィブロネクチンを含む別の層でコーティングする工程を含む。いくつかの態様において、プロセスは、フィブロネクチンを含む層でマイクロキャリアーをまずコーティングし、次いでポリ−Ｌ−リジンを含む層、次いでビトロネクチンを含む別の層でコーティングする工程を含む。
【００６９】
いくつかの態様において、ＰＣＬマイクロキャリアーまたは複数のＰＣＬマイクロキャリアーは、細胞でさらにコーティングされ、そして／またはそこに付着した幹細胞を有する。いくつかの態様において、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。いくつかの態様において、ＭＳＣまたはＨＳＣは、それぞれ、ヒトＭＳＣまたはヒトＨＳＣである。
【００７０】
したがって、いくつかの態様において、プロセスは、マイクロキャリアーを胚性幹細胞または間葉系幹細胞に曝露し、幹細胞をマイクロキャリアーに付着させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、本発明のプロセスは、（ｉ）マイクロキャリアーを、哺乳動物細胞表面タンパク質に結合可能な１またはそれより多いポリペプチドに曝露し、そして（ｉｉ）胚性幹細胞または間葉系幹細胞がマイクロキャリアーに付着するように、前記幹細胞にマイクロキャリアーを曝露する工程を含む。
【００７１】
１つの側面において、本発明は、本発明のプロセスを用いることによって得られるかまたは得られうる単数または複数のＰＣＬマイクロキャリアーを提供する。
【００７２】
１つの側面において、本発明は、本発明記載の単数または複数のマイクロキャリアーを含むか、含有するかまたは支持する足場を提供する。
【００７３】
１つの側面において、本発明は（ｉ）複数の鎖を含む足場；および（ｉｉ）足場中および／または足場上に配置された本発明の複数のＰＣＬマイクロキャリアーを含む、移植可能デバイスを提供する。
【００７４】
いくつかの態様において、移植可能デバイスは放射線不透過性マーカーを含む。いくつかの態様において、放射線不透過性マーカーは、硫酸バリウムまたは金ナノ粒子である。
【００７５】
いくつかの態様において、移植可能デバイスの鎖は、約２００〜約３５０ミクロン、場合によって約２３０〜約２５０ミクロンの直径を有する。いくつかの態様において、鎖は格子状に重層される。いくつかの態様において、格子は隣接する層間で６０°の角度変化を有する。いくつかの態様において、隣接する鎖間の間隔は約４００ミクロンである。
【００７６】
移植可能デバイスのいくつかの態様において、足場は生物分解性または生物吸収性材料で作製される。
【００７７】
本発明のマイクロキャリアーまたは複数のマイクロキャリアーを、（ｉ）細胞の静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養において；（ｉｉ）組織工学において；（ｉｉｉ）炎症性／異所性効果の生成において；（ｉｖ）ヒト間葉系幹細胞および／または胚性幹細胞を拡大するため；（ｖ）ヒト間葉系幹細胞の分化において；（ｖｉ）患者の治療または患者内への移植であって、前記マイクロキャリアー上で培養された分化または未分化間葉系幹細胞を前記患者内に移植する、前記治療または移植において；（ｖｉｉ）患者の治療または患者内への移植であって、前記治療または前記患者内への前記移植前に、前記マイクロキャリアー上で分化または未分化間葉系幹細胞を培養し、次いで足場中におよび／または足場上に配置する、前記治療または移植において；そして（ｖｉｉｉ）放射線不透過性色素のためのビヒクルとして、使用することも可能である。
【００７８】
１つの側面において、本発明は、幹細胞を培養する方法であって、（ｉ）細胞、場合によって幹細胞を、本発明のＰＣＬマイクロキャリアー、または複数のＰＣＬマイクロキャリアーに付着させ、そして（ｉｉ）マイクロキャリアー−細胞複合体を培養する工程を含む、前記方法を提供する。
【００７９】
場合によって、マイクロキャリアーの表面は、マトリックス、あるいはマトリックスの２またはそれより多い層でコーティングされる。
【００８０】
いくつかの態様において、培養は、静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養である。いくつかの態様において、方法は、本発明のマイクロキャリアーまたは複数のマイクロキャリアーを、前記マイクロキャリアーまたは複数のマイクロキャリアーと適合する液体内に導入する工程を含む。
【００８１】
いくつかの態様において、工程（ｉｉ）の後、幹細胞数を拡大する。いくつかの態様において、マイクロキャリアー−細胞複合体を培養する工程は、静置条件下での懸濁培養および／または攪拌を伴う懸濁培養を含む。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養において、多様な間葉系幹細胞（骨髄、胎児、脂肪等）の拡大を支持する。
【００８２】
いくつかの態様において、マイクロキャリアー−幹細胞複合体を培養する工程は、血清不含培地中の培養を含む。
【００８３】
いくつかの態様において、細胞は幹細胞であり、そして方法は（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の培養細胞を継代培養し；そして工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を少なくとも３継代反復し、ここで細胞は好ましくは、継代後に、その多能性または多分化能状態を保持する工程を含むことも可能である。いくつかの態様において、方法は、得た幹細胞の分化を誘導する工程をさらに含むことも可能である。
【００８４】
いくつかの態様において、方法は、マイクロキャリアー−幹細胞複合体を幹細胞の分化を誘導する条件下に置く工程を含む。こうした方法は、工程（ｉｖ）の後に、得た幹細胞を、複数の第二のマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−幹細胞複合体を形成し、ここで第二のマイクロキャリアーの表面がマトリックスでコーティングされているかまたはコーティングされておらず；そして幹細胞の分化を誘導する条件下で、マイクロキャリアー−幹細胞複合体を懸濁培養中で培養する工程を含むことも可能である。
【００８５】
いくつかの態様において、方法は、幹細胞をマイクロキャリアーから分離し、そして分離した幹細胞を非マイクロキャリアー培養中、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含むことも可能である。
【００８６】
１つの側面において、本発明は、幹細胞を分化させる方法であって、（ｉ）本発明のＰＣＬマイクロキャリアーまたは複数のＰＣＬマイクロキャリアーに幹細胞を付着させ、そして（ｉｉ）幹細胞の分化を誘導する工程を含む。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養において、多様なＭＳＣ（骨髄、胎児、脂肪等）の骨または軟骨へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化を支持する。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養において、多様な多能性細胞（例えばヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞等）の三胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）由来の分化した細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化を支持する。
【００８７】
１つの側面において、本発明は、組織工学の方法において使用するための、本発明のＰＣＬマイクロキャリアーまたは複数のＰＣＬマイクロキャリアーを提供する。本発明の関連する側面において、薬物または薬学的組成物の製造における本発明のＰＣＬマイクロキャリアーまたは複数のＰＣＬマイクロキャリアーの使用が、組織工学の方法における使用のために提供される。いくつかの態様において、方法は、生存生物内に、場合によって注射によって、本発明のマイクロキャリアーを導入する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、組織工学または抗炎症／異所性効果の生成のため、体内に、ＭＳＣ（骨髄、胎児、脂肪等に由来する）で覆われたＰＣＬマイクロキャリアーをｉｎ  ｖｉｖｏ移植する工程を含む。細胞は、非分化型で用いてもよいし、あるいは骨または軟骨に分化していてもよい。いくつかの態様において、方法は、組織工学目的のため、体内に、三胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）由来の細胞に分化した多様な多能性細胞（例えばヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞等）で覆われたＰＣＬマイクロキャリアーをｉｎ  ｖｉｖｏ移植する工程を含む。
【００８８】
培養した支持体から細胞を解離させないことの利点は、生存性が改善され、そして潜在的に、組織工学適用において、その役割により迅速に適応することである。
【００８９】
都合よくは、いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、生物に対して毒性であるか、またはそうでなければ有害である産物を製造せずに、生物内で少なくとも部分的に吸収されるかまたは分解する。
【００９０】
１つの側面において、本発明は、医学的治療の方法において使用するための、本発明のＰＣＬマイクロキャリアーまたは複数のＰＣＬマイクロキャリアーを提供する。本発明の関連する側面において、薬物または薬学的組成物の製造における本発明のＰＣＬマイクロキャリアーまたは複数のＰＣＬマイクロキャリアーの使用が、医学的治療の方法における使用のために提供される。
【００９１】
本発明の１つの側面において、ヒトまたは動物の体内にＰＣＬマイクロキャリアーを移植する工程を含む方法を提供し、ＰＣＬマイクロキャリアーは、好ましくは、移植部位でまたはその近傍で、療法効果を提供するように意図された細胞に付着している。
【００９２】
以下の番号付けされた段落は、本明細書に開示する本発明の技術的特徴の広い組み合わせの言及を含有する：
１．  生物吸収性、生物分解性ポリマーで作製された、均一なサイズ（１０％未満、そして好ましくは５％未満のＣＶ）の微小球体の製造。
【００９３】
２．  移植のためにＦＤＡ認可されているポリカプロラクトンで作製されたこれらの微小球体。
【００９４】
３．  ＰＣＬを加熱し、そして微少流体技術を通じて冷水槽に押し出すことに頼る、溶媒不含法を用いた、ＰＣＬ微小球体の製造。
【００９５】
４．  湿潤性を増加させ、そして負の表面荷電を与えるための、続く水酸化ナトリウム処理（実施例を参照されたい）を伴うこれらのマイクロキャリアー。
【００９６】
５．  ポリ−Ｌ−リジンまたは他の陽イオン性多価電解質、例えばポリブレンでコーティングされているこれらのマイクロキャリアー。
【００９７】
６．  ＮａＯＨを伴いまたは伴わず、そしてＰＬＬ（または類似のもの）を伴いまたは伴わず、その例にラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、ケラチン、ゼラチン等が含まれる接着促進タンパク質でコーティングされている、これらのマイクロキャリアー。
【００９８】
７．  ＮａＯＨを伴いまたは伴わず、そしてＰＬＬ（または類似のもの）を伴いまたは伴わず、ＢＳＡまたは他のタンパク質あるいは多糖、例えばヘパリンまたはヘパラン硫酸でコーティングされている、これらのマイクロキャリアー。
【００９９】
８．  ＰＣＬにブレンドされる第二の生物分解性ポリマーの包含。
【０１００】
９．  ＰＣＬ内の、二相性エマルジョンとしての第二の生物分解性ポリマーの包含。
【０１０１】
１０．  より迅速に生物分解性であるポリマー、あるいはポロゲンとしてＰＣＬとは異なる溶媒（例えば水性またはエタノール媒体）中に溶解可能であり、ＰＣＬ内で多孔性構造を形成可能であり、大部分、単離された多孔性または相互連結された孔で構成する、ポリマーの使用。
【０１０２】
１１．  ＰＣＬ内の多価電解質の包含。これはＰＣＬ内にブレンドされてもよいし、またはジブロックコポリマーの形であってもよく、１つのセグメントがＰＣＬと適合し、そして第二のセグメントが多価電解質である。この１つの例は、ポリスチレン−ポリアクリル酸（ＰＳ−ＰＡＡｃ）ジブロックコポリマーであり、該コポリマーは、ＤＣＭから形成されたポリスチレン微小球体に負の電荷を与えるために成功裡に用いられてきている（実施例、上記に記載される通り）。
【０１０３】
１２．  ＰＣＬ内の、骨形成用のヒドロキシアパタイト、または他の生物活性分子などの生物活性物質の包含。これは、ＰＣＬとこれらの物質の直接ブレンドによって、またはＰＣＬ内にこれらを取り込む被包によって達成可能である。
【０１０４】
１３．  攪拌バイオリアクター内で用いられるであろうマイクロキャリアーの密度を調整するために使用可能である、１ｇ／ｃｍ３未満の密度の適合性ポリマーの包含。
【０１０５】
１４．  静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養における、多様なＭＳＣ（骨髄、胎児、脂肪等）の拡大を支持するＰＣＬマイクロキャリアー。
【０１０６】
１５．  静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養における、多様な多能性細胞（ｈＥＳＣ、ｉＰＳＣ等）の拡大を支持するＰＣＬマイクロキャリアー。
【０１０７】
１６．  静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養における、骨または軟骨への多様なＭＳＣ（骨髄、胎児、脂肪等）のｅｘ  ｖｉｖｏ分化を支持するＰＣＬマイクロキャリアー。
【０１０８】
１７．  静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養における、多様な多能性細胞（ｈＥＳＣ、ｉＰＳＣ等）の三胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）由来の分化した細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化を支持するＰＣＬマイクロキャリアー。
【０１０９】
１８．  組織工学または抗炎症／異所性効果の生成のための、体内への、ＭＳＣ（骨髄、胎児、脂肪等に由来する）で覆われたＰＣＬマイクロキャリアーのｉｎ  ｖｉｖｏ移植。細胞を未分化型で、あるいは骨または軟骨に分化させて用いてもよい。
【０１１０】
１９．  組織工学目的のための、体内への、三胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）由来の細胞に分化させた多様な多能性細胞（ｈＥＳＣ、ｉＰＳＣ）で覆われたＰＣＬマイクロキャリアーのｉｎ  ｖｉｖｏ移植。
【０１１１】
２０．  ＭＳＣ（骨髄、胎児、脂肪等に由来する）で覆われたＰＣＬ  ＭＣを充填した足場（多様な生物分解性物質で作製され、そして異なるコンホメーションを有する）の骨または軟骨へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化。分化は、静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養中で実行可能である。
【０１１２】
２１．  三胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）由来の細胞に分化させる多様な多能性細胞（ｈＥＳＣ、ｉＰＳＣ等）で覆われたＰＣＬ  ＭＣを充填した足場（多様な生物分解性物質で作製され、そして異なるコンホメーションを有する）のｅｘ  ｖｉｖｏ分化。分化は、静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養中で実行可能である。
【０１１３】
２２．  組織工学または抗炎症／異所性効果の生成のための、体内への、ＭＳＣ（骨髄、胎児、脂肪等に由来する）で覆われた、ＰＣＬ  ＭＣを含む足場（多様な生物分解性物質で作製され、そして異なるコンホメーションを有する）のｉｎ  ｖｉｖｏ移植。細胞を未分化型で、あるいは骨または軟骨に分化させて用いてもよい。
【０１１４】
２３．  三胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）由来の細胞に分化させた多能性細胞（ｈＥＳＣ、ｉＰＳＣ等）で覆われた、ＰＣＬ  ＭＣを含む足場（多様な生物分解性物質で作製され、そして異なるコンホメーションを有する）のｉｎ  ｖｉｖｏ移植。
【０１１５】
２４．  微小球体を作製するためのプロセスであって：
ａ）第一の液体を、インジェクター中の出口を通じて第二の液体内に注入し、前記出口は第二の液体中に浸されており、第二の液体は前記注入中に前記出口を通過して流れ、第一の液体はポリマーを含み、そして第一および第二の液体は十分に非混和性であり、第二の液体中で第一の液体の小滴が形成され；そして
ｂ）小滴から微小球体を形成する
工程を含む、前記プロセス。
【０１１６】
２５．  ポリマーが生物分解性ポリマーであって、それによって微小球体が生物分解性および／または生物吸収性である、段落２４のプロセス。
【０１１７】
２６．  ポリマーがカプロラクトンまたはそのコポリマーである、段落２５のプロセス。
【０１１８】
２７．  第一の液体が、ゼラチン、ヘパリン、キトサン、ヒドロキシアパタイト、コンドロイチン硫酸、コラーゲン、ポリペプチド、多糖、あるいは場合によって人工的な分子、例えば酸化ポリエチレン、ポリオキサゾリン、またはポリアクリルアミドを含むヒドロゲルなどの水溶液の１またはそれより多くをさらに含む、段落２６のプロセス。
【０１１９】
２８．  ポリマーが、ＧＰＣによって測定されるような、約２０００〜約１００，０００、または約６０，０００〜１００，０００または約５０，０００〜約１００，０００の重量平均分子量を有する、段落２４〜２７のいずれか一項のプロセス。
【０１２０】
２９．  第一の液体が、さらに、ポリマー用の溶媒を含み、これによって第一の液体は、溶媒中のポリマーの溶液である、段落２４〜２８のいずれか一項のプロセス。
【０１２１】
３０．  第一の液体が第二の液体のものよりも大きい比重を有する、段落２９のプロセス。
【０１２２】
３１．  溶媒が、塩素化または臭素化溶媒である、段落２９または段落３０のプロセス。
【０１２３】
３２．  溶媒が塩素化炭化水素、場合によってジクロロメタンである、段落３１のプロセス。
【０１２４】
３３．  ポリマーが、第一の液体中、約０．１〜約１０％ｗ／ｖ、場合によって０．５〜４％ｗ／ｖの濃度を有する、段落２９〜３２のいずれか一項のプロセス。
【０１２５】
３４．  第一の液体が溶媒不含であり、これによって第一の液体がポリマーの融解物を含む、段落２４〜２８のいずれか一項のプロセス。
【０１２６】
３５．  第二の液体が水性液体である，段落２４〜３４のいずれか一項のプロセス。
【０１２７】
３６．  第二の液体が溶液中にポリマー性安定剤を含む、段落２４〜３５のいずれか一項のプロセス。
【０１２８】
３７．  第一のまたは第二の液体はどちらも、ポリマー性安定剤以外の界面活性剤を含有しない、段落３６のプロセス。
【０１２９】
３８．  ポリマー性安定剤がポリビニルアルコールまたはそのコポリマーである、段落３６または段落３７のプロセス。
【０１３０】
３９．  ポリビニルアルコールが、少なくとも約７５％の度合いの加水分解を有する、段落３８のプロセス。
【０１３１】
４０．  ポリマー性安定剤が、第二の液体中、約０．２〜約５％ｗ／ｖ、場合によって約０．５〜約４％ｗ／ｖの濃度を有する、段落３６〜３９のいずれか一項のプロセス。
【０１３２】
４１．  ポリマーがイオン性モノマー単位を含み、それによって前記ポリマーが、多価電解質コポリマーである、段落２４〜４０のいずれか一項のプロセス。
【０１３３】
４２．  第一の液体が、さらに、第二のポリマーを含む、段落２４〜４１のいずれか一項のプロセス。
【０１３４】
４３．  第二のポリマーが多価電解質である、段落４２のプロセス。
【０１３５】
４４．  第一の液体がポロゲン、場合によってポリマー性ポロゲンを含み、それによって微小球体が多孔性である、段落２４〜４３のいずれか一項のプロセス。
【０１３６】
４５．  注入工程が、第一の液体および第二の液体が同じ方向に流動するものである、段落２４〜４４のいずれか一項のプロセス。
【０１３７】
４６．  第一の液体の流速および第二の液体の流速の間の比が、約１：１〜約５：１、場合によって約２：１〜約３：１、場合によって約２：１である、段落４５のプロセス。
【０１３８】
４７．  出口が、約０．０５〜約０．３ｍｍ、場合によって約０．１〜０．２ｍｍの内径を有する、段落２４〜４６のいずれか一項のプロセス。
【０１３９】
４８．  インジェクターが、内側の管の形であり、そして第二の液体が内側の管を取り巻く外側の管内を流動する、段落２４〜４７のいずれか一項のプロセス。
【０１４０】
４９．  第一の液体が、第二の液体内に第一の液体の小滴が形成されるような速度で流動する、段落２４〜４８のいずれか一項のプロセス。
【０１４１】
５０．  第二の液体の流速が、第二の液体が層流体制にあるようなものである、段落２４〜４９のいずれか一項のプロセス。
【０１４２】
５１．  第一の液体の流速および第二の液体の流速が、独立に、１分あたり約１〜約１０，０００マイクロリットルの間である、段落２４〜５０のいずれか一項のプロセス。
【０１４３】
５２．  第一の液体の流速が、１分あたり、約１０〜約５００マイクロリットルの間、場合によって、１分あたり、約１０〜４００マイクロリットルの間である、段落５１のプロセス。
【０１４４】
５３．  第二の液体の流速が、１分あたり、約１０〜約５００マイクロリットルの間、場合によって、１分あたり、約１０〜４００マイクロリットルの間である、段落５１または段落２５のプロセス。
【０１４５】
５４．  インジェクターがシリンジ針を含み、そして第二の液体が管を通じて流れ、それによってシリンジ針の注入部分が、実質的に管と同心円状である、段落２４〜５３のいずれか一項のプロセス。
【０１４６】
５５．  工程ａ）が、ゲル微小粒子の形成を生じ、そして工程ｂ）が、ゲル微小粒子が部分的に第二の液体から分離することを可能にし、第二の液体の大部分をゲル微小粒子から取り除き、そしてゲル微小粒子が固形ポリマー微小粒子を形成することを可能にする工程を含む、段落２４〜５４のいずれか一項のプロセス。
【０１４７】
５６．  第一の液体が生物活性物質、例えばヒドロキシアパタイトを含み、それによってマイクロキャリアーが生物活性物質を含む、段落２４〜５５のいずれか一項のプロセス。
【０１４８】
５７．  水性水酸化物溶液で微小粒子を処理する工程をさらに含む、段落２４〜５６のいずれか一項のプロセス。
【０１４９】
５８．  処理が、微小粒子の湿潤性を増加させるように、約１〜約６時間である、段落５７のプロセス。
【０１５０】
５９．  処理が、多孔性微小粒子を生じるように、約１〜約１０日間である、段落５７または５８のプロセス。
【０１５１】
６０．  微小粒子中でポリマーを架橋する工程をさらに含む、段落２４〜５９のいずれか一項のプロセス。
【０１５２】
６１．  架橋工程が過酸化物、例えば過酸化ベンゾイルの存在下で、微小粒子を加熱する工程を含む、段落６０のプロセス。
【０１５３】
６２．  微小粒子を、少なくとも１つのポリペプチドまたは糖ポリペプチドまたは陽イオン性多価電解質または多糖中で、微小粒子を実質的にコーティングするように、前記の少なくとも１つのポリペプチドまたは糖ポリペプチドまたは陽イオン性多価電解質または多糖の水溶液に、微小粒子を曝露する工程をさらに含む、段落２４〜６１のいずれか一項のプロセス。
【０１５４】
６３．  少なくとも１つのポリペプチドまたは糖ポリペプチドが、ポリリジンまたはタンパク質、例えばゼラチン、ビトロネクチンまたはラミニンを含むかまたはこれらである、段落６２のプロセス。
【０１５５】
６４．  少なくとも１つのポリペプチドがゼラチンであり、そしてプロセスが、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒドで、生じた微小粒子を処理する工程をさらに含む、段落６３のプロセス。
【０１５６】
６５．  ポリペプチドが哺乳動物細胞表面タンパク質に結合可能である、段落６３のプロセス。
【０１５７】
６６．哺乳動物細胞表面タンパク質に結合可能なポリペプチドが、リジンまたはリジン誘導体を含むポリアミノ酸である、段落６５のプロセス。
【０１５８】
６７．  哺乳動物細胞表面タンパク質に結合可能なポリペプチドが細胞外マトリックスタンパク質である、段落６５または段落６６のプロセス。
【０１５９】
６８．  細胞外マトリックスタンパク質が、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、オステオポンチンまたはコラーゲン、あるいはその誘導体である、段落６７のプロセス。
【０１６０】
６９．  ａ）哺乳動物細胞表面タンパク質に結合可能な１またはそれより多いポリペプチドに微小粒子を曝露し；そしてｂ）胚性幹細胞または間葉系幹細胞が微小粒子に付着するように、前記幹細胞に微小粒子を曝露する工程を含む、段落２４〜６８のいずれか一項のプロセス。
【０１６１】
７０．  微小粒子が約１０％未満、好ましくは約５％未満の直径の変動係数を有する、段落２４〜６９のいずれか一項のプロセス。
【０１６２】
７１．  生物分解性ポリマーを含むポリマー性微小粒子であって、前記粒子が約１０％未満、好ましくは約５％未満の直径の変動係数を有し、前記微小粒子が固体である、前記ポリマー性微小粒子。
【０１６３】
７２．  段落１〜４７のいずれか一項のプロセスによって作製される、段落７１のポリマー性微小粒子。
【０１６４】
７３．  実質的に均一な粒子直径を有する、段落７１または段落７２のポリマー性微小粒子。
【０１６５】
７４．  生物分解性ポリマーがポリカプロラクトンまたはそのコポリマーである、段落７１〜７３のいずれか一項のポリマー性微小粒子。
【０１６６】
７５．  ゼラチン、ヘパリン、キトサン、ヒドロキシアパタイトおよびコンドロイチン硫酸の任意の１つまたはそれより多くをさらに含む、段落７４のポリマー性微小粒子。
【０１６７】
７６．  生物分解性ポリマーがイオン性モノマーのコポリマーであり、それによって前記ポリマーが多価電解質コポリマーである、段落７１〜７５のいずれか一項のポリマー性微小粒子。
【０１６８】
７７．  生物分解性ポリマーとは異なる多価電解質コポリマーをさらに含む、段落７１〜７６のいずれか一項のポリマー性微小粒子。
【０１６９】
７８．  均質ポリマーブレンド、浸透性ポリマーネットワーク、連続ポリマー相中の不連続ポリマー相の分散、およびコアシェル構造からなる群より選択される形態を有する、段落７７のポリマー性微小粒子。
【０１７０】
７９．  前記微小粒子が実質的に球状であるかまたは実質的に筒状である、段落７１〜７８のいずれか一項のポリマー性微小粒子。
【０１７１】
８０．  約５０〜約４００ミクロン、場合によって約１５０〜約２５０ミクロン、好ましくは約１６０〜約２００ミクロンの平均直径を有する、段落７１〜７９のいずれか一項のポリマー性微小粒子。
【０１７２】
８１．  １．０３〜１．１、場合によって１．０３〜１．０５または１．０８〜１：１の密度を有する、段落７１〜８０のいずれか一項のポリマー性微小粒子。
【０１７３】
８２．  親水性表面を有する、段落７１〜８１のいずれか一項の微小粒子。
【０１７４】
８３．  前記微小粒子が水中で湿潤性である、段落８２の微小粒子。
【０１７５】
８４．  重量にして０．０１％未満の界面活性剤を有する、段落７１〜８３のいずれか一項の微小粒子。
【０１７６】
８５．  多孔性、場合によってマクロ多孔性である、段落７１〜８４のいずれか一項の微小粒子。
【０１７７】
８６．  生物活性物質、例えばヒドロキシアパタイトを含む、段落７１〜８５のいずれか一項の微小粒子。
【０１７８】
８７．  哺乳動物表面細胞タンパク質または陽イオン性多価電解質または多糖に結合可能な、１またはそれより多いポリペプチドまたは糖ポリペプチドを含むコーティングで実質的に完全にコーティングされている、段落７１〜８６のいずれか一項の微小粒子。
【０１７９】
８８．  コーティングがポリ−Ｌ−リジン、接着促進タンパク質またはウシ血清アルブミンを含む、段落８７の微小粒子。
【０１８０】
８９．  コーティングが、ジアルデヒド、例えばグルタルアルデヒドで架橋された１またはそれより多い細胞外マトリックスタンパク質を含む、段落８８の微小粒子。
【０１８１】
９０．  コーティングがそれに付着した胚性幹細胞または間葉系幹細胞を有する、段落８７〜８９のいずれか一項記載の微小粒子。
【０１８２】
９１．  以下の適用：
ｉ）静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養；
ｉｉ）組織工学；
ｉｉｉ）炎症／異所性効果の生成；
ｉｖ）ヒト間葉系幹細胞および／または胚性幹細胞の拡大；
ｖ）ヒト間葉系幹細胞の分化；
ｖｉ）前記微小粒子上で培養される分化または未分化間葉系幹細胞が前記患者内に移植される、患者の治療または患者への移植；
ｖｉｉ）患者の治療または患者内への移植前に、分化または未分化間葉系幹細胞を前記微小粒子上で培養し、次いで、足場中および／または足場上に配置する、患者の治療または患者内への移植；
ｖｉｉｉ）放射線不透過性色素のためのビヒクルとして
のいずれか１つにおける段落７１〜９０のいずれか一項記載の微小粒子の使用。
【０１８３】
９２．  段落７１〜９０のいずれか一項記載の微小粒子を、前記微小粒子と適合する液体内に導入する工程を含む、静置または攪拌スピナーまたはバイオリアクター培養を調製するための方法。
【０１８４】
９３．  段落７１〜９０のいずれか一項記載の微小粒子を生存生物内に導入する工程を含む、組織工学または炎症／異所性効果の生成のための方法。
【０１８５】
９４．  導入工程が前記微小粒子を前記生物に注入する工程を含む、段落９３の方法。
【０１８６】
９５．  微小球体が、生物に対して毒性であるかまたはそうでなければ有害である産物の産生を伴わずに、生物内で、少なくとも部分的に吸収されるかまたは分解される、段落９３または段落９４の方法。
【０１８７】
９６．  生物が非ヒト生物である、段落９２〜９５のいずれか一項の方法。
【０１８８】
９７．  ｉ）複数の鎖を含む足場；および
ｉｉ）前記足場中および／または足場上に配置された段落９０記載の複数の微小粒子
を含む、移植可能デバイス。
【０１８９】
９８．  足場または微小粒子のいずれかあるいは両方が、放射線不透過性マーカーを含む、段落９７の移植可能デバイス。
【０１９０】
９９．  放射線不透過性マーカーが、硫酸バリウムまたは金ナノ粒子である、段落９８の移植可能デバイス。
【０１９１】
１００．  鎖が、約２００〜約３５０ミクロン、場合によって約２３０〜約２５０ミクロンの直径を有する、段落９７〜９９のいずれか一項の移植可能デバイス。
【０１９２】
１０１．  鎖が格子状に重層される、段落９７〜１００のいずれか一項の移植可能デバイス。
【０１９３】
１０２．  格子が隣接する層間で６０°の角度変化を有する、段落１０１の移植可能デバイス。
【０１９４】
１０３．  約４００ミクロンである隣接する鎖間の間隔を有する、段落９７〜１０２のいずれか一項の移植可能デバイス。
【０１９５】
１０４．  足場が生物分解性または生物吸収性材料で作製される、段落９７〜１０３のいずれか一項の移植可能デバイス。
【０１９６】
１０５．  生物分解性または生物吸収性材料が、ポリカプロラクトンまたはカプロラクトンのコポリマーである、段落１０４の移植可能デバイス。
【０１９７】
１０６．  間葉系幹細胞が、血清含有または血清不含培地中、これらのマイクロキャリアー上に付着し、そして増殖することが可能であるような、生物分解性マイクロキャリアーをコーティングするための付着支持体の使用。
【０１９８】
ａ．  こうした生物分解性マイクロキャリアーには、フィブロネクチン、および／またはポリ−Ｌ−リジン、および／またはビトロネクチンの組み合わせでコーティングされた、ポリカプロラクトン・マイクロキャリアーが含まれる。
【０１９９】
ｂ．  組み合わせて、マイクロキャリアー上の間葉系幹細胞のよりよい接着および／または増殖を提供可能である、同じマイクロキャリアー上でのこうした付着支持体の多数の層の使用。
【０２００】
ｃ．  こうした組み合わせの例には、限定されるわけではないが、フィブロネクチン、次いでポリ−Ｌ−リジン、次いでフィブロネクチンの層でコーティングされたＰＣＬが含まれる。
【０２０１】
ｄ．  血清不含培地中のＰＣＬマイクロキャリアー上での間葉系幹細胞接着および／または増殖を可能にする付着支持体としてのビトロネクチンの包含。この技術の１つの明示が、フィブロネクチン、および／またはポリ−Ｌ−リジン、および／またはビトロネクチンでコーティングされたＰＣＬである。
【０２０２】
ｅ．  静置または攪拌培養における間葉系幹細胞増殖を可能にするための、フィブロネクチン、および／またはポリ−Ｌ−リジン、および／またはビトロネクチンの使用であって、こうした付着支持体が、攪拌中の細胞接着および増殖を可能にする、前記使用。例には、血清含有培地中での間葉系幹細胞接着および増殖を可能にするフィブロネクチン−ＰＬＬ−フィブロネクチン・コーティングの使用、および血清不含培地中での間葉系幹細胞接着および増殖を可能にするフィブロネクチン−ＰＬＬ−ビトロネクチンの使用が含まれる。
【０２０３】
１０７．  この適用における血清不含培地には、ヒトまたはウシ、あるいは他の動物の血清の非存在を含有する任意の培地が含まれる。これには、商業的に入手可能な血清不含培地、例えばＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ＭＳＣ  Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ  ＳＦＭ  ＸＦ、およびＧｉｂｃｏ  ＳｔｅｍＰｒｏ  ＭＳＣ  ＳＦＭ  ＸＦが含まれる。血清不含培地の他の例には、本出願に含まれる、ＫＡ３血清不含培地が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】ＰＣＬ微小球体に関する、連続および分散相流速の関数としての、（Ａ）平均直径（μｍ）、および（Ｂ）変動係数（ＣＶ）を示すグラフ。
【図２】ＮａＯＨ処理の（上部パネル）３０時間後および（下部パネル）７日後のＰＣＬマイクロキャリアーを示す顕微鏡写真。
【図３】未処理およびＮａＯＨ処理マイクロキャリアー上のコーティング溶液濃度の関数としての、ＰＣＬ微小球体上の（Ａ）ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、および（Ｂ）ラミニン（ＬＮ）表面密度を示すグラフ。
【図４】ＰＣＬマイクロキャリアー上のコラーゲンおよびゼラチンのコーティングを示すグラフ。
【図５】ｈＥＳＣに関して用いたマイクロキャリアーおよびコーティングを要約する表１。
【図６】１週間後、異なるＥＣＭコーティングのＰＳまたはＰＣＬマイクロキャリアー上で培養したｈＥＳＣで達成された細胞密度を示す棒グラフ。
【図７】異なるコーティング、ＮａＯＨ、ＰＬＬ、ＬＮおよびＶＮを伴うＰＣＬマイクロキャリアー上でのｈＥＳＣの増殖を示す写真。高密度の細胞は、いくつかのコーティング条件に関して、細胞−マイクロキャリアー凝集物の大きなクラスターを形成する。
【図８】ＭＳＣに関して用いるマイクロキャリアーおよびコーティングを要約する表２。
【図９】第４日での細胞密度および拡大倍数を示す棒グラフ。棒の上の数字は、２つ組での細胞拡大倍数を示す。点線は、５ｘ１０４細胞／ウェルでの最初の植え付け密度を示す。
【図１０】市販のＣｙｔｏｄｅｘ３に比較した、４日後の、異なるコーティング（ポリリジン、ＰＬＬ、ＮａＯＨ、ゼラチン、ＧＬまたはコラーゲンＣＬ）を伴うＰＣＬマイクロキャリアー上のＭＳＣの増殖を示す顕微鏡写真。
【図１１】６ウェルＵＬＡプレート中で培養した、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮでコーティングしたＰＣＬマイクロキャリアー上のｈｆＭＳＣの増殖を示す棒グラフ。データを、３つ組結果の平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。スチューデントのｔ検定分散分析を群間の比較として適用し、＊は６ｄ静置および１ｄ静置４ｄ振盪培養に比較した有意な相違（ｐ≦０．０５）を示す。
【図１２】培養６日後の、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮでコーティングし、そして幹細胞を植え付けたＰＣＬマイクロキャリアーを示す顕微鏡写真。代表的な画像を示す。
【図１３】培養６日後の、６ウェルＵＬＡプレート上のｈｆＭＳＣ上の幹細胞表面マーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１４６の発現を示す棒グラフ。静置または混合静置／振盪条件下で６日間培養した後、細胞をマイクロキャリアーから採取し、ＭＳＣ幹細胞表面マーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１４６に対する抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。左から右に、バーは、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１４６である。
【図１４】Ｔ２５  ＵＬＡフラスコ中で培養したＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮでコーティングしたＰＣＬマイクロキャリアー上のｈｆＭＳＣの増殖を示す棒グラフ。データを、３つ組結果の平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。スチューデントのｔ検定分散分析を群間の比較として適用し、７ｄ静置培養（＊はｐ≦０．０５を示す）ならびに１ｄ静置および６ｄ振盪培養（＊＊はｐ≦０．０１を示す）に比較して、より多い細胞数を生じた。
【図１５】培養７日後の、超低接着Ｔ２５フラスコ中のＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮでコーティングし、そして幹細胞を植え付けたＰＣＬマイクロキャリアーを示す顕微鏡写真。
【図１６】培養７日後の、Ｔ２５  ＵＬＡフラスコ中のｈｆＭＳＣ上の幹細胞表面マーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１４６の発現を示す棒グラフ。静置または混合静置／振盪条件下で７日間培養した後、細胞をマイクロキャリアーから採取し、ＭＳＣ幹細胞表面マーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１４６に対する抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。左から右に、バーは、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１４６である。
【図１７】静置条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮコーティングしたＰＣＬマイクロキャリアー上のｈｆＭＳＣの接着および増殖を示す、（Ａ）および（Ｂ）顕微鏡写真、ならびに（Ｃ）写真。３つの異なる条件に関して、ｈｆＭＳＣの接着および増殖を評価した：（１）ＰＣＬマイクロキャリアー直接分化（ＤＤ）、（２）ＰＣＬマイクロキャリアー拡大／分化（ＥＤ）、および（３）ＴＣＰマイクロキャリアー拡大／分化（ＥＤ）。骨形成誘導培地中での培養による分化（Ａ）１日後および（Ｂ）７日後のｈｆＭＳＣの顕微鏡写真。（Ｃ）写真は骨形成分化２１日後のマイクロキャリアー凝集物サイズを示す。
【図１８】骨形成誘導培地中、１、７、１４、２１および２８日後の培養で測定した、組織培養プラスチックまたはＰＣＬマイクロキャリアーのいずれかの上で培養したｈｆＭＳＣによって沈着される総カルシウムを示すグラフ。ｈｆＭＳＣミネラル化を３つの異なる条件：（１）ＰＣＬマイクロキャリアー直接分化、（２）ＰＣＬマイクロキャリアー拡大／分化、および（３）ＴＣＰ拡大／分化で試験し、（３）は陽性対照として働いた。各条件を３つ組で分析し、バーは標準誤差を示す。事後チューキーを伴う一方向ＡＮＯＶＡによるＧｒａｐｈｐａｄにおいて、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１９】上部パネル−ＭＣ−ｈｆＭＳＣ未採取培養の２１日目の位相差顕微鏡法は、足場に捕捉されたマイクロキャリアー上の集密細胞増殖および単細胞ｈｆＭＳＣ培養の分散した増殖を示す。下部パネル−総カルシウム沈着（足場あたりのｍｇ）の動力学を示すグラフは、単細胞ＭＳＣに勝る、ＭＣ−ｈｆＭＳＣ未採取足場培養における、より迅速な沈着動力学およびより高い沈着レベル（２倍より多いカルシウム沈着）を示すグラフ。
【図２０】一定攪拌培養における血清含有培地中のＰＣＬマイクロキャリアー上でのｈＭＳＣの細胞密度および拡大を示す棒グラフ。ｈＭＳＣをＰＣＬマイクロキャリアー４０ｍｇ（または対照として、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアー４ｍｇ）あたり６．５ｘ１０４細胞でＰＣＬマイクロキャリアー上に植え付け、そして振盪プラットフォーム上の一定攪拌（２８振動／分）で、Ｔ２５超低接着フラスコ中で増殖させた。点線は、６．５ｘ１０４細胞／ウェルの最初の植え付け密度を示す。ＰＬＬ：ポリ−Ｌ−リジン；ＦＮ：フィブロネクチン；ＰＢ：ポリブレン。多層のコーティングに関しては：ＦＮ＋ＰＬＬ＋ＦＮはフィブロネクチン、ポリ−Ｌ−リジン、およびフィブロネクチンの三重層を指す。
【図２１】一定攪拌培養における血清含有培地中のＰＣＬマイクロキャリアー上でのｈＭＳＣの増殖を示す棒グラフ。ｈＭＳＣをＰＣＬマイクロキャリアー４０ｍｇ（または対照として、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアー４ｍｇ）あたり６．５ｘ１０４細胞でＰＣＬマイクロキャリアー上に植え付け、そして振盪プラットフォーム上の一定攪拌（２８振動／分）で、Ｔ２５超低接着フラスコ中で増殖させた。ＦＮ＋ＰＬＬ＋ＦＮはフィブロネクチン、ポリ−Ｌ−リジン、およびフィブロネクチンの三重層を指す。左のバー＝ＰＣＬ＋ＦＮ＋ＰＬＬ＋ＦＮ、右のバー＝Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３。
【図２２】（Ａ）血清含有培地中の一定攪拌培養で４日間培養した後のＰＣＬ−ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮマイクロキャリアー上のＭＳＣの写真。（Ｂ）採取した細胞がＭＳＣに特徴的な細胞表面マーカーを発現することを示す、フローサイトメトリーデータのヒストグラム。ｈＭＳＣを、振盪プラットフォーム上の一定攪拌（２８振動／分）で、フィブロネクチン−ポリ−Ｌ−リジン−フィブロネクチンの三重層でコーティングしたＰＣＬマイクロキャリアー（ＰＣＬ−ＦＮ＋ＰＬＬ＋ＦＮ）上で増殖させた。
【図２３】静置培養における血清含有培地中のＰＣＬマイクロキャリアー上でのｈＭＳＣ増殖を示す棒グラフ。ｈＭＳＣをＰＣＬマイクロキャリアー４０ｍｇ（または対照として、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアー４ｍｇ）あたり６．５ｘ１０４細胞でＰＣＬマイクロキャリアー上に植え付け、そして静置培養中、Ｔ２５超低接着フラスコ中で増殖させた。
【図２４】一定攪拌培養における血清含有培地中のＰＣＬマイクロキャリアー上でのｈＭＳＣの増殖を示す棒グラフ。ｈＭＳＣをＰＣＬマイクロキャリアー４０ｍｇ（または対照として、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアー４ｍｇ）あたり６．５ｘ１０４細胞でＰＣＬマイクロキャリアー上に植え付け、そして振盪プラットフォーム上の一定攪拌（２８振動／分）で、１０％ＦＢＳを補充したアルファＭＥＭ培地中、Ｔ２５超低接着フラスコ中で増殖させた。
【図２５】ＰＣＬマイクロキャリアー産生法の模式図。
【発明を実施するための形態】
【０２０５】
本発明において、マイクロキャリアーは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）からなるか、またはこれを含む。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは、純粋であるかほぼ純粋なポリカプロラクトンである。他の態様において、ポリカプロラクトンを１またはそれより多い他のポリマー、活性物質または選択した剤とブレンドしてもよい。
【０２０６】
マイクロキャリアーは、少なくとも３０％のＰＣＬ、または少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％のＰＣＬの１つを含むか、あるいはこれを有する材料から製造されることも可能である。
【０２０７】
潜在的に、異なる分子量分布で構成される、医薬等級のＰＣＬを含めた、多様な等級のＰＣＬを同様に用いて、以下に記載するように微小球体を製造することも可能である。
【０２０８】
ＰＣＬは、好ましくは、分子式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ２）ｎを有する。ＰＣＬは、触媒を用いたε−カプロラクトンの開環重合によって調製可能である。ＰＣＬは、ヒトまたは動物体内の生理学的条件下を含めて、エステル結合の加水分解によって生物分解可能であり、そしてしたがって、移植における使用に適している。
【０２０９】
本発明のマイクロキャリアーは、約３００〜約７００ｃｍ２／ｇ（乾燥重量）の範囲の表面積を有する。これは、約３００〜約６００、約３００〜約５００、約３００〜約４００、約４００〜約７００、約４００〜約６００、約４００〜約５００、約５００〜約７００、約５００〜約６００の１つ、あるいは約３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０または７００ｃｍ２／ｇ（乾燥重量）の１つであることも可能である。
【０２１０】
グラム（乾燥重量）あたりのマイクロキャリアーの数は、約０．２５ｘ１０８〜約３．２ｘ１０８の範囲であることも可能である。これは、約０．２５ｘ１０８〜３ｘ１０８、約０．２５ｘ１０８〜２．５ｘ１０８、約０．２５ｘ１０８〜２ｘ１０８、約０．２５ｘ１０８〜１．５ｘ１０８、約０．２５ｘ１０８〜１ｘ１０８、約０．２５ｘ１０８〜０．５ｘ１０８、約０．３ｘ１０８〜３ｘ１０８、約０．３ｘ１０８〜２．５ｘ１０８、約０．３ｘ１０８〜２ｘ１０８、約０．３ｘ１０８〜１．５ｘ１０８、約０．３ｘ１０８〜１ｘ１０８、約０．３ｘ１０８〜０．５ｘ１０８、約０．４ｘ１０８〜３ｘ１０８、約０．４ｘ１０８〜２．５ｘ１０８、約０．４ｘ１０８〜２ｘ１０８、約０．４ｘ１０８〜１．５ｘ１０８、約０．４ｘ１０８〜１ｘ１０８、約０．４ｘ１０８〜０．５ｘ１０８、約０．５ｘ１０８〜３ｘ１０８、約０．５ｘ１０８〜２．５ｘ１０８、約０．５ｘ１０８〜２ｘ１０８、約０．５ｘ１０８〜１．５ｘ１０８、約０．５ｘ１０８〜１ｘ１０８、約０．７５ｘ１０８〜３ｘ１０８、約０．７５ｘ１０８〜２．５ｘ１０８、約０．７５ｘ１０８〜２ｘ１０８、約０．７５ｘ１０８〜１．５ｘ１０８、約０．７５ｘ１０８〜１ｘ１０８、約１ｘ１０８〜３ｘ１０８、約１ｘ１０８〜２．５ｘ１０８、約１ｘ１０８〜２ｘ１０８、約１ｘ１０ｓ〜１．５ｘ１０８、約１．５ｘ１０８〜３ｘ１０８、約１．５ｘ１０８〜２．５ｘ１０８、約１．５ｘ１０８〜２ｘ１０８、約２ｘ１０８〜３ｘ１０８、約２ｘ１０８〜２．５ｘ１０８、約２．５ｘ１０８〜３ｘ１０８の１つであることも可能である。グラム（乾燥重量）あたりのマイクロキャリアーの数は、約０．２５ｘ１０８、０．５ｘ１０８、０．７５ｘ１０８、１．０ｘ１０８、１．２５ｘ１０８、１．５ｘ１０８、１．７５ｘ１０８、２．０ｘ１０８、２．２５ｘ１０８、２．５ｘ１０８、２．７５ｘ１０８、または３．０ｘ１０８であることも可能である。
【０２１１】
マイクロキャリアーは、定義されるサイズ分布パラメータを有することも可能である。例えば、質量中央径（ＭＭＤまたはｄ５０）は、約７５μｍ〜約１９０μｍ、例えば７５μｍ〜約１８０μｍ、約７５μｍ〜約１７０μｍ、約７５μｍ〜約１６０μｍ、約７５μｍ〜約１５０μｍ、約７５μｍ〜約１４０μｍ、約７５μｍ〜約１３０μｍ、約８０μｍ〜約１８０μｍ、約８０μｍ〜約１７０μｍ、約８０μｍ〜約１６０μｍ、約８０μｍ〜約１５０μｍ、約８０μｍ〜約１４０μｍ、約８０μｍ〜約１３０μｍ、約９０μｍ〜約１８０μｍ、約９０μｍ〜約１７０μｍ、約９０μｍ〜約１６０μｍ、約９０μｍ〜約１５０μｍ、約９０μｍ〜約１４０μｍ、約９０μｍ〜約１３０μｍ、約１００μｍ〜約１８０μｍ、約１００μｍ〜約１７０μｍ、約１００μｍ〜約１６０μｍ、約１００μｍ〜約１５０μｍ、約１００μｍ〜約１４０μｍ、約１００μｍ〜約１３０μｍ、約１１０μｍ〜約１８０μｍ、約１１０μｍ〜約１７０μｍ、約１１０μｍ〜約１６０μｍ、約１１０μｍ〜約１５０μｍ、約１１０μｍ〜約１４０μｍ、約１１０μｍ〜約１３０μｍ、約１２０μｍ〜約１８０μｍ、約１２０μｍ〜約１７０μｍ、約１２０μｍ〜約１６０μｍ、約１２０μｍ〜約１５０μｍ、約１２０μｍ〜約１４０μｍ、約１２０μｍ〜約１３０μｍの１つの範囲であることも可能である。
【０２１２】
マイクロキャリアーは、約７５〜８０μｍ、８０〜８５μｍ、８５〜９０μｍ、９０〜９５μｍ、９５〜１００μｍ、１００〜１０５μｍ、１０５〜１１０μｍ、１１０〜１１５μｍ、１１５〜１２０μｍ、１２０〜１２５μｍ、１２５〜１３０μｍ、１３０〜１３５μｍ、１３５〜１４０μｍ、１４０〜１４５μｍ、１４５〜１５０μｍ、１５０〜１５５μｍ、１５５〜１６０μｍ、１６０〜１６５μｍ、１６５〜１７０μｍ、１７０〜１７５μｍ、１７５〜１８０μｍ、１８０〜１８５μｍ、または１８５〜１９０μｍの１つのｄ５０を有することも可能である。
【０２１３】
マイクロキャリアーは、約７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５または１９０μｍの１つのｄ５０を有することも可能である。
【０２１４】
２５℃ｓｔｐで約１．１４５ｇ／ｃｍ３の密度を有する多孔性純粋ＰＣＬはない。マイクロキャリアー中の表面孔は、ＰＣＬマイクロキャリアーの全体の密度を減少させる。マイクロキャリアーは、０．１〜１．５μｍの範囲の孔サイズを有することも可能である。
【０２１５】
懸濁培養および幹細胞の継代
本発明者らは、マトリックスコーティングを有する粒子上で、霊長類およびヒト幹細胞および人工多能性幹細胞を含む幹細胞を培養し、増殖させ、そして継代することが可能であることを先に立証してきている（例えば、ＷＯ２００９／１１６９５１およびＷＯ２０１０／１０７３９２を参照されたい）。特に、本発明者らは、懸濁培養中、マトリックスコーティングしたマイクロキャリアー上で、幹細胞を連続して増殖させ、そして継代することも可能であることを示してきている。
【０２１６】
方法は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、幹細胞を成長させるか、増やすか、増殖させるか、培養するか、または拡大するか、あるいは幹細胞数を増加させることを含んでもよい。幹細胞を、以下に記載するように、１またはそれより多い継代に渡って継代することも可能である。
【０２１７】
方法は、粒子を提供する工程を含んでもよい。粒子はコーティングされていなくてもよいし、または上にコーティングされたマトリックスを含んでもよい。これらは正電荷を有してもよいし、または正に荷電した表面を提供するコーティングを有してもよい。粒子は付着した幹細胞の凝集を可能にするサイズを有してもよい。幹細胞が粒子に付着することを可能にすることも可能である。異なる粒子上で増殖する細胞が互いに接触し、そして凝集体を形成することを可能にすることも可能である。培養を少なくとも１回の継代に関して継代することも可能である。キャリアーに付着した、あるいはキャリアーから引き離されたまたは分離された幹細胞を用いてもよい。これらを未分化もしくは多能性／多分化能状態または両方で用いてもよく、あるいは望ましい細胞タイプに分化させてもよい。これらを用いて胚様体を形成してもよい。
【０２１８】
粒子が連続増殖を支持するためには、これらは、幹細胞、例えば霊長類またはヒト幹細胞の寸法に適合するサイズ、例えば約１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍ、２３０μｍ、２４０μｍ、２５０μｍ、２６０μｍ、２７０μｍ、２８０μｍ、２９０μｍ、３００μｍ、３１０μｍ、３２０μｍ、３３０μｍ、３４０μｍ、３５０μｍ、３６０μｍ、３７０μｍ、３８０μｍ、３９０μｍ、または４００μｍ程度の１つを有するべきである。この桁のサイズを有するこうした粒子上の幹細胞の培養は、その上で増殖する細胞が互いに凝集することを可能にし、そして連続増殖を支持するであろう。粒子の適切な組成、形状およびサイズを、以下にさらに詳細に記載する。
【０２１９】
実施例は、幹細胞培養をマイクロキャリアー粒子上に接種し、そして１またはそれより多い継代を伴って、数世代に渡り、懸濁培養で増殖させうることを示す。機械的または酵素的解離、あるいは両方の方法の組み合わせなどの任意の手段により、表面から除去することによって、幹細胞を継代してもよい。
【０２２０】
マイクロキャリアー粒子培養を粒子上で世代から世代に増殖させてもよい。あるいは、またはさらに、間に１またはそれより多い世代に渡って、慣用的な２Ｄ培養上で培養を増殖させてもよい。マイクロキャリアー上で増殖している幹細胞を２Ｄコロニー培養に戻してもよいし、そして逆を行ってもよい。
【０２２１】
本明細書記載の方法は、未分化型の幹細胞を効率的に増殖させるための方法を利用可能にする。１対２および１対１０の間のスプリット比で、機械的にまたは酵素的に解離させることによって、マイクロキャリアー培養をマイクロキャリアー上に継代することも可能であり、この比は、慣用的な２Ｄ培養に関して典型的に可能であるよりも高い。これによって、より迅速に培養をスケールアップしつつ、バイオマテリアルのより効率的な利用が可能になる。
【０２２２】
マイクロキャリアー培養中の細胞の体積収量は、ルーチンに、２Ｄコロニー対照の２〜４倍である。本明細書に記載する方法によって増殖するヒト幹細胞の体積収量は、最大２００万細胞／ｍｌまたはそれより多い可能性もある。
【０２２３】
本明細書記載の方法は、以下にさらに詳細に記載するように、９回またはそれより多い継代に関して、粒子から粒子に幹細胞を継代することを可能にする。
【０２２４】
本明細書記載の方法は、その多能性または多分化能特性を保持する幹細胞の増殖を可能にする。したがって、増殖幹細胞は、２Ｄコロニー培養として増殖する幹細胞と同等の多能性マーカー、Ｏｃｔ−４、Ｔｒａ−１−６０およびｍＡｂ８４の発現を、５またはそれより多い継代に渡って示し、正常核型を保持することも可能である。
【０２２５】
重要なことに、マイクロキャリアー上に幹細胞を係留することによって、より大規模なスピナーフラスコ中で細胞を連続継代することが可能である。
【０２２６】
本明細書記載の方法を用いて、任意の幹細胞を増殖させてもよい。これらは、霊長類幹細胞、例えば、サル、類人猿またはヒト幹細胞を含んでもよい。幹細胞は胚性幹細胞または成体幹細胞を含んでもよい。幹細胞は、人工多能性幹細胞を含んでもよい。例えば、幹細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含んでもよい。本明細書記載の方法および組成物で使用するのに適したこれらのおよび他の幹細胞を、以下にさらに詳細に記載する。
【０２２７】
本明細書記載の方法および組成物は、既知の「２Ｄ」培養法に勝る多様な利点を有する。粒子は、２Ｄコロニー培養支持体よりも、幹細胞を付着させるのにより効率的である。このためそして他の理由のため、懸濁培養細胞は、より効果的に継代可能である。本明細書記載の方法は、数サイクルに渡って、幹細胞を凍結しそして融解することを可能にする。該細胞をマイクロキャリアー上で直接凍結し、そして増殖培地上で融解してもよい（伝統的なプレート培養または微粒子マイクロキャリアー上のいずれであっても）。マイクロキャリアー上で増殖させた幹細胞を、ＧＭＰ準拠の血清不含培地中で増殖させてもよい。
【０２２８】
本明細書に記載する方法は、本質的に、未分化状態で、胚性幹細胞などの幹細胞を培養し、そして維持することを可能にする。増殖幹細胞は、培養中（例えばマイクロキャリアー上）で、またはそこから引き離されて、部分的に、または完全に分化させることも可能である。
【０２２９】
増殖幹細胞を用いて、さらなる使用のため、胚様体を形成してもよい。胚様体形成前に、２Ｄ増殖表面から細胞を除去するさらなる工程を必要とする以前の方法とは対照的に、マイクロキャリアー上で増殖する幹細胞を、単に、分化培地にトランスファーして、直接、胚様体を形成することも可能である。
【０２３０】
したがって、本明細書記載の方法および組成物は、増殖表面または支持体から除去することなく、それらの上で幹細胞の分化を導くことを可能にする。
【０２３１】
本明細書記載の方法および組成物は、より多量に、培養幹細胞の拡大およびスケールアップを可能にする。バイオリアクターまたは産業スケールへのスケールアップによって、幹細胞のより生産的な培養が可能になる。攪拌培養中、マイクロキャリアー上で幹細胞を増殖させることが可能であれば、つまり、培養を懸濁状態でスケールアップすることも可能である。Ｗａｖｅバイオリアクターなどの制御バイオリアクターまたは攪拌培養を用いてもよい。これによって、係留依存性の２次元コロニー培養の現在の制限に比較して、細胞をより多量に拡大することが可能になる。最大数百リットルのバイオリアクター中での大規模懸濁培養が可能である。
【０２３２】
正電荷
粒子またはマイクロキャリアーは、例えば中性ｐＨまたは生理学的に適切なｐＨ、例えばｐＨ７．４またはｐＨ７．２で、正電荷を含んでもよい。
【０２３３】
正電荷の量は多様であることも可能であるが、いくつかの態様において、細胞が粒子に付着するのを可能にするために十分に高いことが意図される。例えば、粒子がアミン、例えば三級または四級アミンとカップリングすることによって荷電される場合、粒子上の電荷は、グラム乾燥物質（粒子の）あたり、約０．５〜４ミリ当量、例えばグラム乾燥物質（粒子の）あたり、約１〜３．５ミリ当量の間、またはグラム乾燥物質（粒子の）あたり、約１〜２ミリ当量の間の小イオン交換容量に対応しうる。
【０２３４】
正電荷は、粒子のｐＫａが７より大きく（例えば７．４より大きく、例えば７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５またはそれより大きく）なるようなものであってもよい。
【０２３５】
最大２０ｍｇ／ｍｌ粒子の濃度で、例えば硫酸プロタミンまたは臭化水素酸ポリ−Ｌ−リジンにカップリングすることによって、粒子を誘導体化してもよい。
【０２３６】
理論によって束縛されることは望ましくないが、本発明者らは、粒子上の正電荷の存在が、粒子への細胞の付着を補助すると考えている。
【０２３７】
粒子は、当該技術分野に知られる任意の手段を通じて正電荷を所持してもよい。粒子は、正荷電基を含んでもよいし、またはこれらを所持するように誘導体化されてもよい。
【０２３８】
粒子が正電荷を所持するように粒子を誘導体化してもよい。例えば、粒子はそれに付着したアミン基を含んでもよい。アミン基は、一級アミン基、二級アミン基、三級アミン基または四級アミン基であってもよい。粒子をアミン含有化合物にカップリングすることによって、アミン基を粒子に付着させてもよい。カップリング法は当該技術分野に周知である。例えば、臭化シアンを使用することによって、アミンを粒子にカップリングしてもよい。
【０２３９】
架橋剤もまた使用可能である。これらは、２つの同一反応基を含有するホモ二官能性架橋剤、または２つの異なる反応基を伴うヘテロ二官能性架橋剤に分けられる。ヘテロ二官能性架橋剤は、連続コンジュゲート化を可能にし、重合を最小限にする。カップリングおよび架橋試薬は、いくつかの製造者から、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍまたはＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから得られうる。
【０２４０】
カップリング前に粒子を活性化して、その反応性を増加させてもよい。クロロ酢酸を用いてコンパクトな粒子を活性化した後、ＥＤＡＣ／ＮＨＳ−ＯＨを用いてカップリングしてもよい。また、ジイソシアン酸ヘキサンを用いて粒子を活性化して、一級アミノ基を得てもよい。こうして活性化された粒子を、任意のヘテロ二官能性架橋剤と組み合わせて用いてもよい。特定の態様において、ジビニルスルホンを用いて、コンパクトな粒子を活性化する。こうして活性化されたコンパクトな粒子は、例えば、ペプチド上のアミノ基またはチオール基と反応可能な部分を含む。
【０２４１】
また、塩化トレシルを用いて粒子を活性化して、アミノ基またはチオール基と反応可能な部分を得てもよい。また、塩化シアンを用いて粒子を活性化して、アミノ基またはチオール基と反応可能な部分を得てもよい。
【０２４２】
マトリックスコーティング
多くの態様において、マイクロキャリアーをマトリックスでコーティングする。マトリックスコーティングの１またはいくつかの層をマイクロキャリアーに適用させてもよい。
【０２４３】
したがって、粒子をマトリックスでコーティングしてもよく、本文書の背景では、マトリックスは、表面上などで、粒子に付着する物質の層（例えば薄層またはフィルム）を指す。マトリックスは、細胞の増殖を補助することが可能な生物学的に適合したまたは生理学的に適切なマトリックスを含んでもよい。マトリックスは、細胞増殖のための支持体を含んでもよい。
【０２４４】
マトリックスは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成要素を含んでもよい。幹細胞増殖を支持可能であるものなどのＥＣＭの任意の既知の構成要素を用いてもよい。細胞外マトリックスの構成要素が当該技術分野に知られ、そして例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら（２００２），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  第ＩＶ章、および該文献に引用される参考文献に記載される。
【０２４５】
マトリックス材料には、ポリ−Ｌ−リジン、ラミニン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、またはラミニン、コラーゲンＩ、ヘパラン硫酸プロゲオグリカンおよびエンタクチン１の混合物、あるいはその誘導体または断片が含まれてもよい。
【０２４６】
慣用的な手段を通じて、ＥＣＭ構成要素を粒子に付着させるかまたはカップリングするかまたはコーティングしてもよい。例えば、上述の任意のカップリング試薬および架橋剤を用いて、粒子にＥＣＭ構成要素をカップリングしてもよい。
【０２４７】
ＥＣＭ構成要素は、巨大分子、例えば多糖、タンパク質、プロテオグリカン、糖タンパク質、通常はプロテオグリカンの形でタンパク質に共有結合して見出されるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、エラスチン、フィブロネクチン、およびラミニンを含む線維状タンパク質、コラーゲン（例えばコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ）などを含んでもよい。
【０２４８】
マトリックスコーティングは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含んでもよい。グリコサミノグリカンは、反復二糖単位で構成される、非分枝多糖鎖を含む。この反復二糖中の２つの糖の一方は、常に、アミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）であり、大部分の場合、硫酸化されている。第二の糖は通常、ウロン酸（グルクロン酸またはイズロン酸）である。
【０２４９】
マトリックスコーティングは、ヒアルロナン（ヒアルロン酸またはヒアルロネートとも呼ばれる）またはその誘導体を含んでもよい。ウシ硝子体液などの、いくつかの供給源のいずれからヒアルロン酸を得てもよい。ヒアルロン酸ナトリウムなどのヒアルロン酸の塩または塩基を使用してもよい。これは連鎖球菌由来であってもよい。
【０２５０】
マトリックスコーティングは、ラミニンおよび／またはフィブロネクチンおよび／またはビトロネクチンおよび／またはコラーゲンおよび／またはケラチンおよび／またはゼラチンを含んでもよい。
【０２５１】
マトリックスコーティングは、例えば、プロテオグリカンとしてタンパク質に連結されるような、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸などのＧＡＧを含んでもよい。マトリックスコーティングは、アグリカン、デコリン等を含んでもよい。
【０２５２】
マトリックスコーティングは、ヘパランあるいは塩基または塩などのその誘導体を含んでもよい。マトリックスコーティングは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含んでもよい。ウシ腎臓などのいくつかの供給源のいずれからヘパラン硫酸プロテオグリカンを得てもよい。
【０２５３】
マトリックスコーティングは、デキストラン、例えばデキストラン硫酸またはデキストラン硫酸ナトリウムを含んでもよい。マトリックスコーティングは、フィブロネクチン、ラミニン、ナイドジェンまたはタイプＩＶコラーゲンを含んでもよい。マトリックスコーティングは、コンドロイチン硫酸を含んでもよい。
【０２５４】
マトリックスは、ゼラチン、ポリオルニチン、またはフィブロネクチンのＲＧＤ結合ドメインの結合モチーフを含んでもよい。
【０２５５】
ＥＣＭマトリックス材料には：ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、アグリカン、デコリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロナンが含まれる。
【０２５６】
マトリックスコーティングは、多様な比率で、上述の構成要素の任意の２またはそれより多い混合物を含んでもよい。マトリックスコーティングは、例えばＥＣＭの、精製されたかまたは実質的に精製された構成要素を含んでもよい。マトリックス構成要素は、ＥＣＭの部分的に精製された構成要素を含んでもよい。マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌＴＭなどのＥＣＭ抽出物を含んでもよい。
【０２５７】
細胞培養は、異なるマトリックスコーティングを有する粒子を含んでもよい。例えば、第一の粒子集団は、上述のものより選択される第一のマトリックスコーティングを有し、そして第二の粒子集団は、上述のものより選択される第二のマトリックスコーティングを有する。
【０２５８】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ
ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを含むマトリックスコーティングで粒子をコーティングしてもよい。
【０２５９】
Ｍａｔｒｉｇｅｌは、マウス腫瘍細胞によって分泌され、そしてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国マサチューセッツ州ベッドフォード）によって販売される、ゼラチン状タンパク質混合物の商品名である。この混合物は、多くの組織で見られる複雑な細胞外環境に似ており、そして細胞生物学者によって、細胞培養支持体として用いられている。
【０２６０】
ＢＤ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭマトリックスは、ＥＣＭタンパク質が豊富な腫瘍であるＥＨＳマウス肉腫から抽出された可溶化基底膜調製物である。主な構成要素は、ラミニン（約５６％）、続いてコラーゲンＩＶ（約３１％）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１（約８％）である。室温では、ＢＤ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭマトリックスは重合して、哺乳動物細胞性基底膜に似た、生物学的に活性であるマトリックス材料を産生する。
【０２６１】
こうしたものとして、マトリックスコーティングは、ラミニン、コラーゲンＩ、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびエンタクチン１の混合物を含んでもよい。
【０２６２】
一般的な実験室法は、少量の冷却（４℃）Ｍａｔｒｉｇｅｌをプラスチック組織培養実験機器などの表面上に分配するものである。３７℃（体温）でインキュベーションした際、Ｍａｔｒｉｇｅｌタンパク質は自己アセンブリして、表面を覆う薄いフィルムを生じる。
【０２６３】
Ｍａｔｒｉｇｅｌは、細胞形態、生化学的機能、遊走または浸潤、および遺伝子発現に関して生理学的に適切な環境を提供する。
【０２６４】
Ｍａｔｒｉｇｅｌが細胞の複雑な振る舞いを刺激しうるのは、不均一な組成を有するためである。Ｍａｔｒｉｇｅｌの主な構成要素は、ラミニンおよびコラーゲンなどの構造タンパク質であり、これらは、培養細胞が天然環境で出会う接着性のペプチド配列を、培養細胞に提示する。多くの細胞タイプの分化および増殖を促進する増殖因子もまた存在する。Ｍａｔｒｉｇｅｌは、以下の増殖因子を含む（濃度範囲、平均濃度）：  ＥＧＦ（０．５〜１．３ｎｇ／ｍｌ、０．７ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（＜０．１〜０．２ｐｇ／ｍｌ、未知）、ＮＧＦ（＜０．２ｎｇ／ｍｌ、未知）、ＰＤＧＦ（５〜４８ｐｇ／ｍｌ、１２ｐｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１（１１〜２４ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−β（１．７〜４．７ｎｇ／ｍｌ、２．３ｎｇ／ｍｌ）。Ｍａｔｒｉｇｅｌは、少量の中に多数の他のタンパク質を含有する。
【０２６５】
交代性マトリックスコーティング
いくつかの態様において、細胞を１回またはそれより多い継代（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０回またはそれより多い継代）に関して、第一のマトリックスコーティングを有する粒子上で培養し、その後、１回またはそれより多い継代（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０回またはそれより多い継代）に関して、異なる（第二の）マトリックスコーティングを有する粒子にトランスファーしてもよい。場合によって、次いで、細胞を、第二のコーティングとは異なるマトリックスコーティングを有する粒子に、例えば第一のマトリックスコーティングに戻して、または別のマトリックスコーティングに、あるいはコーティングされていない粒子にトランスファーしてもよい。
【０２６６】
粒子組成
本明細書に記載する方法および組成物において、幹細胞を粒子またはマイクロキャリアー上で増殖させる。粒子は、ＩＵＰＡＣ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ（第２版，  １９９２，  Ｖｏｌ．６４，  ｐ．１６０）に記載されるようなマイクロキャリアーを含んでもよい。
【０２６７】
粒子は、ポリカプロラクトンで作製される。粒子を固形物質または半固形、ゲル等として配合することも可能である。粒子を多孔性または非孔性であるように調製することも可能である。
【０２６８】
粒子は、正電荷および／またはマトリックスコーティングの付着を可能にするために、少なくとも反応性であるか、あるいはアクチベーターによって反応性にされることが可能であるが、別の方式で、一般的に不活性の物質を含んでもよい。
【０２６９】
粒子上で細胞が増殖することを可能にする前に、粒子を処理してもよい。本文書の別の箇所に記載するように、より強い接着、電荷の利用可能性、生物学的適合性などを達成するため、こうした処理を試みてもよい。
【０２７０】
細胞培養は、１より多いタイプの粒子の混合物を含んでもよい。例えば、第一の粒子集団（例えばコンパクトな形状の粒子）および第二の粒子集団（例えば伸長した形状の粒子）。いくつかの態様において、第一の細胞タイプ、例えばフィーダー細胞を第一の粒子に付着させてもよく、そして第二の細胞タイプ、例えばｈＥＳＣを第二の粒子に付着させてもよい。各粒子タイプは、同じまたは異なるマトリックスコーティングを有してもよい。場合によって一方または両方の粒子タイプがマトリックスコーティングを持たなくてもよい。
【０２７１】
粒子は、ビーズまたはマイクロビーズであってもよい。適切なマイクロビーズサイズには、４０〜１２０μｍ、２０〜５０μｍ、２０〜８０μｍ、５０〜１５０μｍ、１００〜３００μｍのビーズサイズ（平均直径）が含まれる。
【０２７２】
粒子は細胞増殖に適した任意の形状、例えばコンパクトな形状または伸長した形状を含んでもよい。
【０２７３】
コンパクトな形状
コンパクトな形状の例は、一般的に球状粒子、楕円形粒子、または顆粒形粒子である。
【０２７４】
「コンパクトな」によって、本発明者らは、一般的に伸長していない形状を意味する。言い換えると、「コンパクトな」形状は、一般的に、伸長していないかまたは伸展しておらず、あるいはいかなる１つの方向にも伸展していない。コンパクトな形状は、一般的に広がっていないか、あるいは長くもまたは細長くもないものであってもよい。したがって、こうした「コンパクトな形状」は、一般的に類似であってもよいか、または大きくは異ならない線寸法（ｌｉｎｅａｒ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）を一般的に所持する。
【０２７５】
したがって、コンパクトな形状の任意の２つの寸法の比は、５：１またはそれ未満、例えば４：１またはそれ未満、例えば３：１、２．５：１、２．４：１、２．３：１、２．２：１、２．１：１、２：１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１またはそれ未満であってもよい。例えば、いかなる２対の寸法も、５：１またはそれより高い比を持ちえない。
【０２７６】
いくつかの態様において、コンパクトな形状の最長の寸法は、コンパクトな形状の最短の寸法の５倍未満である。他の態様において、コンパクトな形状の最長の寸法は、最短の寸法より有意に長くなく、すなわち形状は比較的均一である。
【０２７７】
「最長の寸法」は、本文書で用いた際、主軸、すなわち粒子を通じて引くことが可能な最長の線を含有する軸の長さを意味するよう解釈されるべきである。同様に、「最短の寸法」は、本文書で用いた際、短軸、すなわち粒子を通じて引くことが可能な最短の線を含有する軸の長さである。
【０２７８】
線寸法がほぼ同じであるかまたは匹敵するか、あるいは最長の寸法対最短の寸法の比が５：１未満である、均一な形状が、本明細書に記載するコンパクトな粒子に含まれる。上記の比は、したがって、最長の寸法対最短の寸法の比に関する。いくつかの態様において、２寸法の比（例えば最長の寸法対最短の寸法）は、１．１：１未満、例えば１：１（すなわち均一なまたは一律な形状）である。
【０２７９】
したがって、適用可能な場合、粒子の長さは、その幅または直径の５ｘ未満、例えばその幅または直径の４ｘ未満、例えば３ｘ未満、例えば２ｘ未満、またはそれより小さくてもよい。
【０２８０】
コンパクトな形状は、均一な固体、球体、スフェロイド、偏球、扁平スフェロイド、楕円体、立方体、円錐体、円筒、または多面体であってもよい。多面体には、単純多面体または均一多面体が含まれる。多面体には、例えば六面体、ホリヘドロン（ｈｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）、キュボイド、デルタ多面体、五面体、十四面体、多面体、テトラフレクサゴン（ｔｅｔｒａｆｌｅｘａｇｏｎ）、ねじれ双角錐、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）多面体、ジオデシックドーム、七面体および六十面体が含まれる。上に提供する定義にしたがって、「コンパクト」であるような、上記形状のいずれを用いてもよい。例えば、形状が偏球を含む場合、これは、スフェロイドがコンパクトであり、そして伸長していないように、適切な扁平さを有する。
【０２８１】
いくつかの態様において、コンパクトな形状は、寸法が上に提供するとおりである限り、バルーン形、葉巻形、ソーセージ形、ディスク形、涙形、ボール形または楕円形を含んでもよい。コンパクトな形状はまた、球形、立方体形、キュボイド形、タイル形、卵形、楕円形、ディスク形、セル形、ピル形、カプセル形、平たい円筒形、豆形、ドロップ形、球状形、エンドウ豆形、ペレット形等も含んでもよい。
【０２８２】
伸長した形状
粒子は、一般的に伸長した形状を有してもよい。伸長した形状の例には、一般的に、棒の形状の粒子、円筒の形状の粒子、またはスティックの形状の粒子がある。伸長した粒子は、ホロー・ファイバーを含んでもよい。
【０２８３】
「伸長した」によって、本発明者らは、一般的にコンパクトでない形状を意味する。言い換えると、「伸長した」形状は、一般的に、別のものに比較して、１つの寸法が伸展しているものである。伸長した形状は、広がっているか、長いかまたは細長いものであってもよい。したがって、こうした「伸長した形状」は、一般的に、多かれ少なかれ、互いに異なる線寸法を所持する。
【０２８４】
したがって、伸長した形状の任意の２つの寸法の比は、５：１またはそれより大きく、４：１以下、例えば、１．１：１またはそれより大きく、１．２：１またはそれより大きく、１．３：１またはそれより大きく、１．４：１またはそれより大きく、１．５：１またはそれより大きく、１．６：１またはそれより大きく、１．７：１またはそれより大きく、１．８：１またはそれより大きく、１．９：１またはそれより大きく、２：１またはそれより大きく、２．１：１またはそれより大きく、２．２：１またはそれより大きく、２．３：１またはそれより大きく、２．４：１またはそれより大きく、２．５：１またはそれより大きく、３：１またはそれより大きく、４：１またはそれより大きく、または５：１またはそれより大きくてもよい。
【０２８５】
例えば、任意の２対の寸法が５：１またはそれより大きい比を有してもよい。したがって、いくつかの態様において、伸長した形状の最長の寸法は、伸長した形状の最短の寸法の５倍より大きい。
【０２８６】
したがって、適用可能な場合、粒子の長さは、その幅または直径の２ｘより大きく、例えばその幅または直径の３ｘより大きく、例えば４ｘより大きく、例えば５ｘより大きく、または１０ｘより大きくてもよい。
【０２８７】
粒子サイズ
粒子が連続増殖を支持するために、これらは細胞が粒子上で増殖することを可能にするサイズを有してもよい。粒子サイズはまた、他の粒子上で増殖している他の細胞と、細胞が凝集することも可能にする。例えば、粒子サイズが、少なくとも１つの寸法が霊長類またはヒト幹細胞の寸法と適合するものである必要がある可能性がある。
【０２８８】
例として、粒子は、一般的に球状または顆粒状の形状を有するコンパクトなマイクロキャリアーを含んでもよい。これが当てはまる場合、コンパクトなマイクロキャリアーは、約５０μｍ〜約４００μｍの間の範囲の寸法を有してもよい。いくつかの好ましい態様において、寸法は１００μｍ〜２００μｍの間である。
【０２８９】
コンパクトなマイクロキャリアーに関する寸法（例えば平均直径）範囲の上限は、約４００μｍ、約３９０μｍ、約３８０μｍ、約３７０μｍ、約３６０μｍ、約３５０μｍ、約３４０μｍ、約３３３μｍ、約３２０μｍ、約３１０μｍ、約２９０μｍ、約２８０μｍ、約２７０μｍ、約２６０μｍ、約２５０μｍ、約２４０μｍ、約２３０μｍ、約２２０μｍ、約２１０μｍ、約２００μｍ、約１９０μｍ、約１８０μｍ、約１７０μｍ、約１６０μｍ、約１５０μｍ、約１４０μｍ、約１３０μｍ、約１２０μｍ、約１１０μｍ、約１００μｍ、約９０μｍ、約８０μｍ、約７０μｍ、約６０μｍ、または約５０μｍの１つであってもよい。
【０２９０】
コンパクトなマイクロキャリアーの寸法（例えば平均直径）範囲の下限は、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２０μｍ、約１３０μｍ、約１４０μｍ、約１５０μｍ、約１６０μｍ、約１７０μｍ、約１８０μｍ、約１９０μｍ、約２００μｍ、約２１０μｍ、約２２０μｍ、約２３０μｍ、約２４０μｍ、約２５０μｍ、約２６０μｍ、約２７０μｍ、約２８０μｍ、約２９０μｍ、約３００μｍ、約３１０μｍ、約３２０μｍ、約３３０μｍ、約３４０μｍ、約３５０μｍ、約３６０μｍ、約３７０μｍ、約３８０μｍ、約３９０μｍ、または約４００μｍの１つであってもよい。
【０２９１】
コンパクトなマイクロキャリアーは、５０μｍ〜４００μｍ、５０μｍ〜３５０μｍ、５０μｍ〜３００μｍ、５０μｍ〜３５０μｍ、５０μｍ〜２００μｍ、５０μｍ〜１５０μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜９０μｍ、５０μｍ〜８０μｍ、５０μｍ〜７０μｍ、または５０μｍ〜６０μｍの間の寸法（例えば平均直径）を有してもよい。
【０２９２】
コンパクトなマイクロキャリアーは、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２０μｍ、約１３０μｍ、約１４０μｍ、約１５０μｍ、約１６０μｍ、約１７０μｍ、約１８０μｍ、約１９０μｍ、約２００μｍ、約２７０μｍ、約２８０μｍ、約２９０μｍ、約３００μｍ、約３１０μｍ、約３２０μｍ、約３３０μｍ、約３４０μｍ、約３５０μｍ、約３６０μｍ、約３７０μｍ、約３８０μｍ、約３９０μｍ、または約４００μｍの１つの寸法（例えば平均直径）を有してもよい。
【０２９３】
寸法は好ましくは、マイクロキャリアーの、例えば組成物、調製物、細胞培養、パッケージ、容器またはバイアル中のマイクロキャリアーの平均直径であってもよい。これは、球状マイクロキャリアーの好ましい寸法であってもよい。
【０２９４】
伸張したマイクロキャリアーに関して、寸法は、マイクロキャリアーの最長の寸法（例えば桿体または円筒の長さ）またはその最短の寸法（例えば桿体または円筒の直径）であってもよい。
【０２９５】
粒子は、多孔性または非多孔性であってもよい。多孔性粒子は、培地が増殖領域内をそして該領域全体を循環することを可能にし、そしてこれが細胞成長を補助しうる。
【０２９６】
粒子密度
別に言及しない限り、例えばマイクロキャリアーまたはポリマー物質の密度に対する言及は、２５℃ｓｔｐで測定した相対密度である。
【０２９７】
幹細胞培養
例えば実施例に示すように、幹細胞を培養する任意の適切な方法を、本明細書に記載する方法および組成物において用いてもよい。
【０２９８】
任意の適切な容器を用いて、本明細書に記載する方法および組成物にしたがって、幹細胞を増殖させてもよい。適切な容器には、米国特許公報ＵＳ２００７／０２６４７１３（Ｔｅｒｓｔｅｇｇｅ）に記載されるものが含まれる。
【０２９９】
容器には、例えば、バイオリアクターおよびスピナーが含まれてもよい。本文書で用いる際、用語「バイオリアクター」は、真核細胞、例えば動物細胞または哺乳動物細胞を、例えば大規模に培養するのに適した容器である。制御バイオリアクターの典型的な培養体積は、２０ｍｌ〜５００ｍｌの間である。
【０３００】
バイオリアクターは、１またはそれより多い条件、例えば酸素分圧を調節または監視可能な、制御バイオリアクターを含んでもよい。これらの条件を測定しそして制御するためのデバイスが当該技術分野に知られる。例えば、酸素分圧に関して、酸素電極を用いてもよい。選択するガス混合物（例えば空気、あるいは空気および／または酸素および／または窒素および／または二酸化炭素の混合物）の量および組成を通じて、酸素分圧を制御してもよい。酸素分圧を測定しそして制御するのに適したデバイスは、Ｂａｉｌｅｙ，  Ｊ  Ｅ．（Ｂａｉｌｅｙ，  Ｊ  Ｅ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，  第２版，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮ  ０−０７−００３２１２−２  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ（１９８６））またはＪａｃｋｓｏｎ  Ａ  Ｔ．  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ａ  Ｔ．，  Ｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ  ｉｎ  ｄｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ＩＳＢＮ  ３５４０５６１９００（１９９３））に記載される。
【０３０１】
他の適切な容器にはスピナーが含まれる。スピナーは、ガラスボール攪拌装置、羽根車攪拌装置、および他の適切な攪拌装置などの多様な攪拌機構を用いて攪拌可能な、制御または非制御バイオリアクターである。スピナーの培養体積は、典型的には２０ｍｌ〜５００ｍｌの間である。ローラーボトルは、４００〜２０００ｃｍ２の間の培養面積を有するプラスチックまたはガラス製の丸い細胞培養フラスコである。これらのフラスコの全内表面に沿って、細胞を培養する；細胞は培地でコーティングされ、これは「回転」運動によって達成され、すなわちボトルをそれ自体の個々の軸の周りに回転させる。
【０３０２】
あるいは、培養は静的であってもよく、すなわち培養／培地の能動的な攪拌を使用しなくてもよい。培養の攪拌を減少させることによって、細胞／マイクロキャリアーの凝集塊の形成が可能になりうる。何らかの攪拌を使用して、培養細胞上への培地の分布および流動を促してもよいが、凝集塊形成を実質的に妨害しないようにこの攪拌を適用してもよい。例えば、低いｒｐｍ、例えば３０ｒｐｍ未満または２０ｒｐｍ未満の攪拌を使用してもよい。
【０３０３】
継代を伴う増殖
本明細書に記載する方法および組成物は、培養中の継代またはスプリットを含んでもよい。該方法は、連続的なまたは継続的な継代を伴ってもよい。
【０３０４】
「継続的な」または「連続的な」によって、本発明者らは、幹細胞が継代される、例えば増殖中のマイクロキャリアーから剥がされ、そして他のマイクロキャリアーまたは粒子にトランスファーされるのを可能にする方式で幹細胞のマイクロキャリアー上での増殖を、本発明者らの方法が可能にすることを意味し、そしてこのプロセスを少なくとも１回、例えば２回、３回、４回、５回等、反復してもよいことを意味する（以下に示すとおり）。いくつかの場合、これを任意の回数、例えば不確定にまたは無限に反復してもよい。最も好ましくは、プロセスを５回またはそれより多く、例えば６回またはそれより多く、７回またはそれより多く、８回またはそれより多く、９回またはそれより多く、１０回またはそれより多く、１１回またはそれより多く、１２回またはそれより多く、１３回またはそれより多く、１４回またはそれより多く、１５回またはそれより多く、１６回またはそれより多く、１７回またはそれより多く、１８回またはそれより多く、１９回またはそれより多く、２０回またはそれより多く、２１回またはそれより多く、２２回またはそれより多く、２３回またはそれより多く、２４回またはそれより多く、２５回またはそれより多く、反復する。また、用語「継続的な」または「連続的な」を用いて、事象、例えば細胞増殖の実質的に中断されない延長を意味してもよい。例えば、本発明者らの方法は、増殖または培養を終結させる必要を伴わずに、幹細胞を任意の望ましい世代数まで拡大することを可能にする。
【０３０５】
培養中の細胞を、支持体またはフラスコから解離させ、そして組織培地内に希釈しそして再プレーティングすることによって、「スプリットする」か、継代培養するか、または継代してもよい。
【０３０６】
粒子上で増殖している細胞を、粒子培養に継代し直してもよい。あるいは、これらを慣用的な（２Ｄ）培養に継代し直してもよい。プレート上で増殖している組織培養細胞を粒子培養に継代してもよい。これらの方法を各々、以下により詳細に記載する。
【０３０７】
用語「継代」は、一般的に、細胞培養のアリコットを取り、細胞を完全にまたは部分的に解離させ、希釈し、そして培地に接種するプロセスを指してもよい。継代を１回またはそれより多く反復してもよい。アリコットは、細胞培養のすべてまたは一部を含んでもよい。アリコットの細胞は、完全に集密、部分的に集密、または集密でなくてもよい。継代は、工程の以下の順列の少なくともいくつかを含んでもよい：吸引、リンス、トリプシン処理、インキュベーション、除去、急冷（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）、再植え付けおよびアリコット。ＵＣサンディエゴ校のＨｅｄｒｉｃｋ研究室によって公表されたプロトコルを用いてもよい（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｄｒｉｃｋｌａｂ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ＣＯＳＣｅｌｌ．ｈｔｍｌ）。
【０３０８】
当該技術分野に知られる機械的または酵素的手段などの任意の適切な手段によって、細胞を解離させてもよい。機械的解離によって、例えば細胞スクレーパーまたはピペットを用いて、細胞を破壊してもよい。１００ミクロンまたは５００ミクロン篩を通じるなど、適切な篩サイズを通じて篩にかけることによって、細胞を解離させてもよい。酵素的解離によって、例えばコラゲナーゼまたはｔｒｙｐＬＥでの処理によって採取し、スプリットしてもよい。解離は完全であってもまたは部分的であってもよい。
【０３０９】
希釈は任意の適切な希釈であってもよい。細胞培養中の細胞を任意の適切な比でスプリットしてもよい。例えば、細胞を１：２またはそれより高い、１：３またはそれより高い、１：４またはそれより高いまたは１：５またはそれより高い比でスプリットしてもよい。細胞を１：６またはそれより高い、１：７またはそれより高い、１：８またはそれより高い、１：９またはそれより高いまたは１：１０またはそれより高い比でスプリットしてもよい。スプリット比は１：１０またはそれより高くてもよい。これは、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９または１：２０またはそれより高くてもよい。スプリット比は１：２１、１：２２、１：２３、１；２４、１：２５または１：２６またはそれより高くてもよい。
【０３１０】
したがって、幹細胞を１回またはそれより多く、継代してもよい。例えば、幹細胞を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５回またはそれより多く、継代してもよい。幹細胞を２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５回またはそれより多く、継代してもよい。幹細胞を無期限に培養中で継代してもよい。
【０３１１】
継代を細胞増殖の世代として表してもよい。本発明者らの方法および組成物は、幹細胞が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５世代またはそれより多く、増殖することを可能にする。幹細胞を２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５世代またはそれより多く、増殖させてもよい。
【０３１２】
また、継代を細胞倍加の回数として表してもよい。本発明者らの方法および組成物は、幹細胞が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５細胞倍加またはそれより多く、増殖することを可能にする。幹細胞を２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５細胞倍加またはそれより多く、増殖させてもよい。
【０３１３】
幹細胞を５より多い、１０より多い、１５より多い、２０より多い、２５より多い、３０より多い、４０より多い、４５より多い、５０より多い、１００より多い、２００より多い、５００より多い、または８００より多い継代、世代または細胞倍加に渡って、培養してもよい。幹細胞を１００、２００、５００またはそれより多い継代、世代または細胞倍加に渡って維持してもよい。
【０３１４】
幹細胞特性の維持
増殖した幹細胞は、哺乳動物、霊長類またはヒト幹細胞の少なくとも１つの特性を維持しうる。幹細胞は、１回またはそれより多い継代後、該特性を維持しうる。幹細胞は、複数回の継代後、その特性を維持しうる。幹細胞は、上述のような言及する回数の継代後、特性を維持しうる。
【０３１５】
特性は、形態学的特性、免疫組織化学的特性、分子生物学的特性等を含んでもよい。特性は、生物学的活性を含んでもよい。
【０３１６】
幹細胞特性
本発明者らの方法によって増殖する幹細胞は、以下の幹細胞特性のいずれを示してもよい。
【０３１７】
幹細胞は、Ｏｃｔ４および／またはＳＳＥＡ−１および／またはＴＲＡ−１−６０および／またはＭａｂ８４の発現増加を示しうる。自己再生性である幹細胞は、自己再生性でない幹細胞に比較して短くなった細胞周期を示しうる。
【０３１８】
幹細胞は定義される形態を示しうる。例えば、標準的顕微鏡画像の二次元において、ヒト胚性幹細胞は、画像平面における高い核／細胞質比、顕著な仁、および細胞接合がほとんど認識不能なコンパクトなコロニー形成を示す。
【０３１９】
幹細胞はまた、以下にさらに詳細に記載するような、発現細胞マーカーによっても特徴付け可能である。
【０３２０】
多能性マーカーの発現
維持される生物学的活性は、１またはそれより多い多能性マーカーの発現を含んでもよい。
【０３２１】
ステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）は、特定の胚性細胞タイプに特徴的である。ＳＳＥＡマーカーに対する抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（メリーランド州ベセスダ）より入手可能である。他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と称される抗体を用いて検出可能である（Ａｎｄｒｅｗｓら，  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒｓ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  １９８７，  上記中）。ヒト胚性幹細胞は、典型的には、ＳＳＥＡ−１陰性およびＳＳＥＡ−４陽性である。ｈＥＧ細胞は、典型的には、ＳＳＥＡ−１陽性である。霊長類多能性幹細胞（ｐＰＳ）細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１発現の喪失、ならびにＳＳＥＡ−１発現増加を生じる。ｐＰＳ細胞はまた、アルカリホスファターゼ活性の存在によっても特徴付け可能であり、これは、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、そして次いで、製造者によって記載されるように、基質としてＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄを用いて現像することによって検出可能である（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）。
【０３２２】
胚性幹細胞はまた、典型的には、テロメラーゼ陽性およびＯＣＴ−４陽性である。テロメラーゼ活性は、商業的に入手可能なキット（ＴＲＡＰｅｚｅ．ＲＴＭ．ＸＫテロメラーゼ検出キット、カタログ番号ｓ７７０７；  Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．、ニューヨーク州パーチェス；またはＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．テロメラーゼＰＣＲ  ＥＬＩＳＡプラス、カタログ番号２，０１３，８９；  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  インディアナポリス）を用い、ＴＲＡＰ活性アッセイ（Ｋｉｍら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１，  １９９７）を用いて決定可能である。また、ＲＴ−ＰＣＲによって、ｍＲＮＡレベルでｈＴＥＲＴ発現を評価してもよい。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．  ｈＴＥＲＴ定量化キット（カタログ番号３，０１２，３４４；  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）が、研究目的のため、商業的に入手可能である。
【０３２３】
ＦＯＸＤ３、ＰＯＤＸＬ、アルカリホスファターゼ、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４等を含む、これらの多能性マーカーの任意の１またはそれより多くが、増殖幹細胞によって保持されうる。
【０３２４】
マーカーの検出は、当該技術分野に知られる任意の手段を通じて、例えば免疫学的に達成可能である。組織化学染色、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）等が使用可能である。
【０３２５】
フロー免疫細胞化学を用いて、細胞表面マーカーを検出してもよい。細胞内または細胞表面マーカーに関して、免疫組織化学（例えば固定細胞または組織切片の）を用いてもよい。細胞抽出物に対してウェスタンブロット分析を行ってもよい。細胞抽出物または培地内に分泌される産物に関して、酵素連結イムノアッセイを用いてもよい。
【０３２６】
この目的のため、商業的供給源から入手可能であるような、多能性マーカーに対する抗体を用いてもよい。
【０３２７】
ステージ特異的胎児抗原１および４（ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４）ならびに腫瘍拒絶抗原１−６０および１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を含む幹細胞マーカーの同定のための抗体は、例えばＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ（米国カリフォルニア州テメキュラ）より得られうる。モノクローナル抗体を用いたこれらの抗原の免疫学的検出は、多能性幹細胞を特徴付けるために広く用いられてきている（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  Ｍ．Ｊ．ら（１９９８）  ＰＮＡＳ  ９５：１３７２６−１３７３１；  Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ．ら（２０００）．  ＰＮＡＳ  ９７：１１３０７−１１３１２；  Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．Ａ．ら（１９９８）．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７；  Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  Ｂ．Ｅ．ら（２０００）．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９−４０４；  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｊ．Ｋ．ら（２００２）．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：３２９−３３７；  Ｐｅｒａ  Ｍ．ら（２０００）．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１３：５−１０．）。
【０３２８】
組織特異的遺伝子産物の発現はまた、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析によって、あるいは標準的増幅法において配列特異的プライマーを用いた逆転写酵素開始ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ｍＲＮＡレベルで検出可能である。本開示に列挙する特定のマーカーに関する配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ）などの公的データベースから得られうる。さらなる詳細に関しては、米国特許第５，８４３，７８０号を参照されたい。
【０３２９】
実質的にすべての増殖細胞、またはそのかなりの部分が、マーカー（単数または複数）を発現しうる。例えば、単数または複数のマーカーを発現する細胞の割合は、５０％またはそれより高いか、６０％またはそれより高いか、７０％またはそれより高いか、８０％またはそれより高いか、９０％またはそれより高いか、９３％またはそれより高いか、９５％またはそれより高いか、９７％またはそれより高いか、９８％またはそれより高いか、９９％またはそれより高いか、あるいは実質的に１００％でありうる。
【０３３０】
細胞生存度
生物学的活性は、言及する回数の継代後の細胞生存度を含んでもよい。細胞生存度は、例えばトリパンブルー排除によるなど、多様な方式でアッセイされうる。
【０３３１】
生存染色のプロトコルは以下のとおりである。適切な試験管に、適切な体積の細胞懸濁物（２０〜２００μＬ）を入れ、等体積の０．４％トリパンブルーを添加し、そして穏やかに混合し、室温で５分間放置する。１０μｌの染色細胞を血球計数板に入れ、そして生存（未染色）および死亡（染色）細胞の数を計数する。各象限の未染色細胞の平均数を計算し、そして２ｘ１０４を乗じて、細胞／ｍｌを見出す。生存細胞の割合は、生存細胞数を死亡細胞および生存細胞の数で割ったものである。
【０３３２】
細胞生存度は、５０％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９３％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９７％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、９９％またはそれより多く、あるいは実質的に１００％でありうる。
【０３３３】
核型
増殖幹細胞は、増殖中または増殖後、正常な核型を保持しうる。「正常な」核型は、幹細胞が由来する親幹細胞の核型と同一であるか、類似であるかまたは実質的に類似である核型、あるいは親幹細胞と異なるが、いかなる実質的な意味でも異ならないものである。例えば、転座、染色体の喪失、欠失等のいかなる全体的な異常もあってはならない。
【０３３４】
核型は、いくつかの方法によって、例えば光学顕微鏡法のもとで視覚的に評価可能である。核型は、ＭｃＷｈｉｒら（２００６）、Ｈｅｗｉｔｔら（２００７）、ならびにＧａｌｌｉｍｏｒｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９７３）に記載されるように、調製および分析可能である。また、標準的なＧバンド形成技術（カリフォルニア州オークランドのＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂなどの、ルーチンの核型決定サービスを提供する多くの臨床診断実験室で利用可能）を用いて細胞の核型を決定し、そして公表される幹細胞核型と比較してもよい。
【０３３５】
増殖細胞のすべてまたはかなりの部分が正常な核型を保持しうる。この比率は、５０％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９３％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９７％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、９９％またはそれより多く、あるいは実質的に１００％でありうる。
【０３３６】
多能性
増殖幹細胞は、３つの細胞系譜すべて、すなわち内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力を保持しうる。幹細胞を誘導して、これらの細胞系譜の各々に分化させる方法が当該技術分野に知られ、そしてこれを用いて、増殖幹細胞の能力をアッセイしてもよい。
【０３３７】
増殖細胞のすべてのまたはかなりの部分がこの能力を保持しうる。これは、増殖幹細胞の５０％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９３％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９７％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、９９％またはそれより多く、あるいは実質的に１００％でありうる。
【０３３８】
共培養およびフィーダー
方法は、共培養の存在下または非存在下で、幹細胞を培養する工程を含んでもよい。用語「共培養」は、一緒に増殖する２またはそれより多くの異なる種類の細胞混合物、例えば間質フィーダー細胞の混合物を指す。２またはそれより多くの異なる種類の細胞を、同じ表面上で、例えば粒子または細胞容器表面上で、あるいは異なる表面上で、増殖させてもよい。異なる種類の細胞を異なる粒子上で増殖させてもよい。
【０３３９】
本文書で用いる場合、用語、フィーダー細胞は、異なるタイプの細胞の培養のために用いられるかまたは必要とされる細胞を意味しうる。幹細胞培養の状況において、フィーダー細胞は、生存、増殖、およびＥＳ細胞多能性の維持を確実にする機能を有する。ＥＳ細胞多能性は、フィーダー細胞を直接共培養することによって達成されうる。あるいは、またはさらに、フィーダー細胞を培地中で培養して、培地を馴化させてもよい。馴化培地を用いて、幹細胞を培養してもよい。
【０３４０】
培養ディッシュなどの容器の内表面を、分裂しないように処理してあるマウス胚性皮膚細胞のフィーダー層でコーティングしてもよい。フィーダー細胞は、ＥＳ細胞増殖に必要な栄養分を培地内に放出する。したがって、粒子上で増殖する幹細胞は、こうしたコーティングされた容器中で増殖可能である。
【０３４１】
フィーダー細胞自体が粒子上で増殖可能である。幹細胞に関して記載するのと類似の方式で、これらを粒子上に植え付けてもよい。増殖させようとする幹細胞を、こうしたフィーダー粒子と一緒にまたは別個に増殖させてもよい。したがって、幹細胞はこうしたフィーダー細胞コーティング粒子上の層上で増殖可能である。一方、幹細胞を別個の粒子上で増殖させてもよい。これらの任意の設定の任意の組み合わせもまた可能であり、例えば粒子上で増殖するフィーダー細胞、フィーダー細胞および幹細胞を含む粒子、ならびに増殖する幹細胞を含む粒子を含む培養も可能である。これらの組み合わせを、フィーダー層を含むまたは含まない容器中で増殖させてもよい。
【０３４２】
フィーダー細胞をその上に増殖させる粒子は、マトリックスコーティングでコーティングされてもまたはコーティングされなくてもいずれでもよい。
【０３４３】
フィーダー細胞が存在しないか、または必要とされない設定もまた可能である。例えば、フィーダー細胞または幹細胞によって馴化された培地（馴化培地）中で細胞を増殖させてもよい。
【０３４４】
培地およびフィーダー細胞
多能性幹細胞を単離しそして増殖させるための培地は、得られる細胞が望ましい特性を有し、そしてさらに増殖可能である限り、いくつかの異なる配合のいずれを有してもよい。
【０３４５】
適切な供給源は以下のとおりである：ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；ノックアウト・ダルベッコの修飾イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８；  ２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０；ベータ−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。例示的な血清含有胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％  ＤＭＥＭ（典型的にはＫＯ  ＤＭＥＭ）、熱不活化されていない２０％定義ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノールで作製される。培地をろ過し、そして４℃で２週間まで保存する。血清不含胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％  ＫＯ  ＤＭＥＭ、２０％血清代用品（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノールで作製される。有効な血清代用品は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８である。培地をろ過し、そして４℃で２週間まで保存する。使用直前、ヒトｂＦＧＦを最終濃度４ｎｇ／ｍＬまで添加する（Ｂｏｄｎａｒら、Ｇｅｒｏｎ社、国際特許公報ＷＯ  ９９／２０７４１）。
【０３４６】
培地は、１０％血清置換培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）、５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）および５ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ  ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）を補充したノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）を含んでもよい。
【０３４７】
フィーダー細胞（用いる場合）は、９０％  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２）、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃３００７１−０３）、および２ｍＭグルタミンを含有するｍＥＦ培地中で増殖可能である。ｍＥＦをＴ１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４３０８２５）中で増殖させ、トリプシンを用いて、１日おきに１：２で細胞をスプリットし、細胞を集密以下に維持する。フィーダー細胞層を調製するため、増殖を阻害するが、ヒト胚性幹細胞を補助する、重要な因子の合成を可能にする線量（約４０００ｒａｄガンマ照射）で、細胞を照射する。６ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３０４など）を、ウェルあたり１ｍＬの０．５％ゼラチンと、３７℃で一晩インキュベーションすることによってコーティングし、そしてウェルあたり３７５，０００の照射ｍＥＦをプレーティングする。フィーダー細胞層は、典型的には、プレーティング５時間後〜４日後に用いられる。ｐＰＳ細胞を植え付ける直前に、培地を新鮮なヒト胚性幹（ｈＥＳ）培地に交換する。
【０３４８】
他の幹細胞を培養するための条件が知られ、そして細胞タイプに応じて、適切に最適化可能である。先のセクションに言及される特定の細胞タイプのための培地および培養技術は、引用する参考文献中に提供される。
【０３４９】
血清不含培地
本明細書に記載する方法および組成物には、血清不含培地中の幹細胞の培養が含まれてもよい。
【０３５０】
用語「血清不含培地」は、血清タンパク質、例えばウシ胎児血清を含まない細胞培地を含んでもよい。血清不含培地は、当該技術分野に知られ、そして例えば、米国特許５，６３１，１５９および５，６６１，０３４、ＵＳ５９０８７８２、ＵＳ７１０９０３２、ＵＳ２００５／０２６５９８０、ＷＯ２０１２／０３１２６３、およびＣｈａｓｅら（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｌｉａｎｔ  Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｉｎ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２０１２）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ２０１２；  １：７５０−７５８）、Ｓａｎｔｏｓら（Ｔｏｗａｒｄ  ａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ−Ｇｒａｄｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｕｒｃｅｓ：  Ａ  Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｎｄｅｒ  Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（２０１１）  Ｓａｎｔｏｓら，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １７（１２）：１２０１−１０）に記載される。血清不含培地は、例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＭＳＣ  ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔＴＭ  ＳＦ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から商業的に入手可能である。
【０３５１】
血清不含培地は、タンパク質、加水分解物、および未知の組成の構成要素を欠いていてもよいという点で、タンパク質不含であってもよい。血清不含培地は、すべての構成要素が既知の化学構造を有する、化学的に定義された培地を含んでもよい。化学的に定義される血清不含培地は、変動を排除し、改善された再現性およびより一貫した性能を可能にし、そして偶発的な剤による混入の可能性を減少させる、完全に定義された系を提供するため、好適である。これはまた、動物由来構成要素を含まない可能性もある。
【０３５２】
血清不含培地は、ノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）を含んでもよい。
【０３５３】
血清不含培地に、例えば５％、１０％、１５％等の濃度で、血清置換培地などの１またはそれより多くの構成要素を補充してもよい。血清不含培地に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ（ニューヨーク州グランドアイランド）の血清置換培地を１０％補充してもよい。
【０３５４】
解離または脱凝集された胚性幹細胞を培養する血清不含培地は、１またはそれより多い増殖因子を含んでもよい。ＦＧＦ２、ＩＧＦ−２、ノギン、アクチビンＡ、ＴＧＦベータ１、ＨＲＧ１ベータ、ＬＩＦ、Ｓ１Ｐ、ＰＤＧＦ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、Ｗｎｔ３Ａおよびその他を含む、いくつかの増殖因子が当該技術分野に知られる。増殖因子（単数または複数）を、１ｐｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌの間などの任意の適切な濃度で用いてもよい。
【０３５５】
培地補充物
培地に１またはそれより多く添加物を補充してもよい。例えばこれらは：脂質混合物、ウシ血清アルブミン（例えば０．１％  ＢＳＡ）、大豆タンパク質の加水分解物の１またはそれより多くから選択可能である。
【０３５６】
幹細胞
本文書で用いる際、用語「幹細胞」は、分裂に際して、２つの発生オプションに直面する細胞を指す：娘細胞は、元来の細胞に同一であってもよく（自己再生）、またはこれらはより特殊化された細胞タイプの前駆体であってもよい（分化）。したがって、幹細胞は一方または他方の経路を採用可能である（各細胞タイプの１つを形成可能であるさらなる経路が存在する）。したがって、幹細胞は、最終分化しておらず、そして他のタイプの細胞を産生可能である細胞である。
【０３５７】
一般的に、本明細書における（複数の）細胞への言及には、単数の幹細胞が含まれうるし、そして逆も当てはまる。特に、幹細胞を培養し、そして分化させる方法には、単細胞および凝集体培養技術が含まれてもよい。本発明において、幹細胞培養は、凝集体または単細胞のものであってもよい。
【０３５８】
以下に論じるように、分化することが可能な細胞タイプ範囲に関して、幹細胞を記載することも可能である。
【０３５９】
「全能性」幹細胞は、成体の任意の細胞タイプ、または胚体外膜（例えば胎盤）の任意の細胞になる潜在能力を有する細胞を指す。したがって、全能性細胞は受精卵およびその分裂によって産生される最初の４つ程度の細胞のみである。
【０３６０】
「多能性」幹細胞は真の幹細胞であり、体の中で任意の分化した細胞を作製する潜在能力を持つ。しかし、これらは胚体外膜を作製するのに寄与できず、該膜は栄養膜に由来する。胚性幹（ＥＳ）細胞は、多能性幹細胞の例であり、そして胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から単離可能であり、胚盤胞は着床が起こる胚発生段階である。
【０３６１】
「多分化能」幹細胞は、真の幹細胞であるが、限定された数の細胞タイプにのみ分化可能である。例えば、骨髄は、血液の細胞すべてを生じさせるが、他のタイプの細胞を生じない、多分化能幹細胞を含有する。多分化能幹細胞は、成体動物に見られ、そしてときに成体幹細胞と呼ばれる。死んだまたは損傷を受けた細胞を置換可能な体のすべての臓器（脳、肝臓）は、該細胞を含有すると考えられる。
【０３６２】
幹細胞を特徴付ける方法が当該技術分野に知られ、そしてこれには、クローンアッセイ、フローサイトメトリー、長期培養、ならびに分子生物学技術、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロッティングなどの標準的アッセイ法の使用が含まれる。
【０３６３】
形態学的相違に加えて、ヒトおよびネズミ多能性幹細胞は、いくつかの細胞表面抗原（幹細胞マーカー）の発現が異なる。幹細胞マーカーおよびその検出法は、本文書の別の箇所に記載される（「幹細胞特性の維持」以下）。
【０３６４】
幹細胞の供給源
米国特許第５，８５１，８３２号は、脳組織から得られる多分化能神経幹細胞を報告する。米国特許第５，７６６，９４８号は、新生大脳半球からの神経芽細胞産生を報告する。米国特許第５，６５４，１８３号および第５，８４９，５５３号は、哺乳動物神経冠幹細胞の使用を報告する。
【０３６５】
米国特許第６，０４０，１８０号は、哺乳動物多分化能ＣＮＳ幹細胞培養からの、分化したニューロンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成を報告する。ＷＯ  ９８／５０５２６およびＷＯ  ９９／０１１５９は、神経上皮幹細胞、オリゴデンドロサイト−アストロサイト前駆体、および細胞系譜制限神経前駆体の生成および単離を報告する。
【０３６６】
米国特許第５，９６８，８２９号は、胚性前脳から得られ、そしてグルコース、トランスフェリン、インスリン、セレン、プロゲステロン、およびいくつかの他の増殖因子を含む培地で培養される、神経幹細胞を報告する。
【０３６７】
初代肝細胞培養は、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼの適切な組み合わせを用いた灌流によって、ヒト生検または外科的に切除された組織から得られうる。あるいは、ＥＰ  ０  ９５３  ６３３  Ａ１は、刻んだヒト肝臓組織を用意し、増殖培地中に濃縮組織細胞を再懸濁し、そして培養中で細胞を拡大することによって、肝細胞を単離する工程を報告する。増殖培地は、グルコース、インスリン、トランスフェリン、Ｔ３、ＦＣＳ、および悪性形質転換を伴わずに、肝細胞が増殖するのを可能にする、多様な組織抽出物を含む。
【０３６８】
肝臓中の細胞は、肝臓実質細胞、クッパー細胞、類洞内皮、および胆管上皮を含む特殊化細胞、ならびにまた成熟肝細胞または胆管上皮細胞の両方に分化する能力を有する前駆細胞（「肝芽細胞」または「卵円形細胞」と称される）を含有すると考えられる（Ｌ．  Ｅ．  Ｒｏｇｌｅｒ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５０：５９１  ，  １９９７；  Ｍ．  Ａｌｉｓｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０：７１０，  １９９８；  Ｌａｚａｒｏら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８：５１４，  １９９８）。
【０３６９】
米国特許第５，１９２，５５３号は、ヒト新生または胎児造血幹細胞または前駆細胞を単離するための方法を報告する。米国特許第５，７１６，８２７号は、Ｔｈｙ−１陽性前駆体であるヒト造血細胞、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれらを再生するために適した増殖培地を報告する。米国特許第５，６３５，３８７号は、ヒト造血細胞およびその前駆体を培養するための方法およびデバイスを報告する。米国特許第６，０１５，５５４号は、ヒトリンパ系細胞および樹状細胞を再構成する方法を記載する。
【０３７０】
米国特許第５，４８６，３５９号は、１より多い結合組織タイプ、例えば骨、軟骨、腱、靱帯、および真皮の細胞に分化可能な、ヒト間葉系幹細胞の均一な集団を報告する。これらは骨髄または骨膜より得られる。やはり報告されるのは、間葉系幹細胞を拡大するために用いられる培養条件である。ＷＯ  ９９／０１１４５は、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどの増殖因子で処置された個体の末梢血から単離される、ヒト間葉系幹細胞を報告する。ＷＯ  ００／５３７９５は、実質的に脂肪細胞および赤血球を含まない、脂肪由来幹細胞および格子を報告する。報告によれば、これらの細胞を拡大し、そして培養して、ホルモンおよび馴化培地を産生することも可能である。
【０３７１】
任意の脊椎動物種の幹細胞を用いてもよい。含まれるのは、ヒト；ならびに非ヒト霊長類、飼育動物、家畜、および他の非ヒト哺乳動物、例えば齧歯類、マウス、ラット等由来の幹細胞である。幹細胞は、非ヒト、例えばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類（齧歯目の任意の動物由来の細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類または他の非ヒト脊椎動物生物；および／または非ヒト哺乳動物細胞；および／またはヒト細胞であることも可能である。
【０３７２】
本明細書に記載する方法および組成物で使用するために適した幹細胞の中には、妊娠後に形成される組織に由来する霊長類またはヒト多能性幹細胞、例えば胚盤胞、あるいは妊娠中の任意の時点に採取される胎児または胚性組織がある。限定されない例は、胚性幹細胞の初代培養または樹立された株である。
【０３７３】
間葉系幹細胞
いくつかの好ましい態様において、幹細胞は、例えば結合組織および／または骨細胞、例えば軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞および脂肪細胞に分化可能な、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。
【０３７４】
間葉系幹細胞は、軟骨、骨、筋肉、腱、靱帯、脂肪および他の結合組織を生成する能力を有する多分化能前駆細胞である。これらは、骨細胞（骨芽細胞）、軟骨細胞（軟骨細胞）、筋肉細胞（筋細胞）および脂肪細胞（脂肪細胞）を含む非常に多様な細胞タイプに分化することが可能である（例えばＲａｓｔｅｇａｒら  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２０１０年８月２６日；  ２（４）：  ６７−８０を参照されたい）。
【０３７５】
これらの原始的な前駆体は、出生後に存在し、そして幹細胞特性、すなわち低い発生率および広範な再生潜在能力を示す。これらの特性は、その発生可塑性と組み合わせて、損傷を受けた組織を置換する間葉系幹細胞の潜在的な使用に非常な関心を生じてきた。
【０３７６】
間葉系幹細胞は、骨髄、筋肉、脂肪、歯髄、成体組織、胎児組織、新生児組織、および臍帯を含む、ある範囲の組織タイプから単離可能である。間葉系幹細胞は、非ヒト哺乳動物から、またはヒトから得られうる。
【０３７７】
間葉系幹細胞は、最小限に侵襲性の技術によって骨髄から容易に得られることも可能であり、そして培養中で拡大して、そして望ましい系譜に分化させることを可能にしうる。分化は、特定の増殖因子によって誘導可能である。トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーメンバータンパク質、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、間葉系幹細胞の軟骨形成性および骨形成性分化の重要な因子である。
【０３７８】
骨髄再増殖の潜在能力を示す、ＣＤ３４＋分画から、選択的マーカー、例えばＳＴＲＯ−Ｉを用いて、ヒト骨髄間葉系幹細胞を単離し、そして検出することも可能である。これらの細胞表面マーカーは間葉系幹細胞の細胞表面のみに見られ、そして細胞の多分化能の指標である。
【０３７９】
培養間葉系幹細胞は、通常、ＣＤ１４６とともに、表面上にＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５を発現する一方、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７９ａの発現を欠く。
【０３８０】
骨髄の吸引物（例えばＷｅｘｌｅｒら  Ａｄｕｌｔ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｉｓ  ａ  ｒｉｃｈ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ’ｓｔｅｍ’  ｃｅｌｌｓ  ｂｕｔ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ａｎｄ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｂｌｏｏｄ  ａｒｅ  ｎｏｔ．  ＨＡＥＭＯＰＯＩＥＳＩＳ  ＡＮＤ  ＬＥＵＣＯＣＹＴＥＳ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １２１（２）：３６８−３７４，  ２００３年４月）または臍帯のワルトン膠様質（例えばＴａら  Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｍａｒｋｅｒ  Ａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  Ｊｅｌｌｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．  ２００９年７月２０日（Ｅｐｕｂ））から収集した骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）から、適切な間葉系幹細胞を得るか、導き出すことも可能である。
【０３８１】
当該技術分野に周知であるように、適切な分化因子を適用することによって、多能性幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞の分化によって、間葉系幹細胞を得ることも可能である。
【０３８２】
間葉系幹細胞は、軟骨、骨、筋肉、腱、靱帯、脂肪および血液の構成要素を生成することが可能な多分化能前駆細胞である。これらの原始的な前駆体は、出生後に存在し、そして幹細胞特性、すなわち低い発生率および広範な再生潜在能力を示す。これらの特性は、その発生可塑性と組み合わせて、損傷を受けた組織を置換する間葉系幹細胞の潜在的な使用に非常な関心を生じてきた。本質的に、これらの幹細胞を培養して、数を拡大し、次いで、損傷を受けた部位に、あるいは適切な組織構築物を生成するために足場中／足場上に植え付けた後に移植することも可能である。
【０３８３】
したがって、骨格、筋肉、腱、靱帯および血液修復／再生のための代替アプローチは、間葉系幹細胞（またはそこから得られる軟骨細胞、骨芽細胞、筋芽細胞の前駆体）などの適切な前駆細胞の選択、拡大および調節である。
【０３８４】
本発明の側面において、細胞凝集物またはマイクロキャリアーとしてを含めて、マイクロキャリアーに付着した間葉系幹細胞、あるいは細胞凝集物またはマイクロキャリアーとしてを含めて、マイクロキャリアーに付着した間葉系幹細胞から分化した細胞を、被験体において組織を修復するかまたは再生するために、被験体に移植することも可能である。
【０３８５】
胚性幹細胞
胚性幹細胞は、霊長類種のメンバーの胚盤胞から単離可能である（Ｔｈｏｍｓｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：７８４４，  １９９５）。Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号；  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，  １９９８；  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ３８：１３３  ｆｆ．，  １９９８）およびＲｅｕｂｉｎｏｆｆら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １８：３９９，  ２０００によって記載される技術を用いて、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞をヒト胚盤胞細胞から調製することも可能である。
【０３８６】
簡潔には、ヒト胚盤胞は、ヒトｉｎ  ｖｉｖｏ着床前胚から得られうる。あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）胚を用いてもよいし、または一細胞ヒト胚を胚盤胞段階まで拡大してもよい（Ｂｏｎｇｓｏら，  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ４：  ７０６，  １９８９）。ヒト胚をＧ１．２およびＧ２．２培地中で胚盤胞段階まで培養する（Ｇａｒｄｎｅｒら，  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．  ６９：８４，  １９９８）。胚性幹細胞単離のため、発生する胚盤胞を選択する。プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）に短時間曝露することによって、胚盤胞から透明帯を除去する。１：５０希釈のウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に胚盤胞を３０分間曝露して、次いで、ＤＭＥＭで５分間３回洗浄し、そして１：５希釈のモルモット補体（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝露する、免疫手術によって、内部細胞塊を単離する（Ｓｏｌｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７２：５０９９，  １９７５を参照されたい）。ＤＭＥＭでさらに２回洗浄した後、穏やかにピペッティングすることによって、溶解した栄養外胚葉細胞を損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）内部細胞塊（ＩＣＭ）から除去し、そしてＩＣＭをｍＥＦフィーダー層上にプレーティングする。
【０３８７】
９〜１５日後、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むカルシウムおよびマグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に曝露するか、ディスパーゼまたはトリプシンに曝露するか、あるいはマイクロピペットで機械的に解離させるか、いずれかによって、内部細胞塊由来外植を凝集塊に解離させ；そして次いで、新鮮な培地中、ｍＥＦ上に再プレーティングする。解離細胞を、新鮮な胚性幹（ＥＳ）培地中、ｍＥＦフィーダー層上に再プレーティングし、そしてコロニー形成に関して観察する。未分化形態を示すコロニーをマイクロピペットによって個々に選択し、機械的に凝集塊に解離させ、そして再プレーティングする。胚性幹細胞様形態は、見かけ上の高い核対細胞質比および顕著な仁を持つコンパクトなコロニーとして特徴付けられる。次いで、短時間のトリプシン処理、ダルベッコのＰＢＳ（カルシウムまたはマグネシウムを含まず、そして２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）への曝露、タイプＩＶコラゲナーゼ（約．２００Ｕ／ｍＬ；  Ｇｉｂｃｏ）への曝露によって、あるいはマイクロピペットによる個々のコロニーの選択によって、１〜２週間ごとに、生じる胚性幹細胞をルーチンにスプリットする。約５０〜１００細胞の凝集塊のサイズが最適である。
【０３８８】
胚性生殖細胞
ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞は、最後の月経期間の約８〜１１週後に採取されるヒト胎児材料中に存在する始原生殖細胞より調製可能である。適切な調製法は、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１３７２６，  １９９８および米国特許第６，０９０，６２２号に記載される。
【０３８９】
人工多能性幹細胞
本明細書記載の方法および組成物を人工多能性幹細胞の増殖に用いてもよい。
【０３９０】
一般的にはｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞は、特定の遺伝子を挿入することによって、非多能性細胞、典型的には成体体細胞、例えば線維芽細胞、肺またはＢ細胞から人工的に得られる多能性幹細胞の一種である。
【０３９１】
ｉＰＳ細胞は、すべて本明細書に援用される、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．  ＆  Ｙａｍａｎａｋａ（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｃｅｌｌ  ２００６；１２６：６６３−６７６）、Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓら（Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓら  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００７．１１．０１９、およびＹａｍａｎａｋａ  Ｓら  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；４４８：３１３−７）、Ｗｅｒｎｉｇ  Ｍら（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ＥＳ−ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ  ｓｔａｔｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；４４８：３１８−２４）、Ｍａｈｅｒａｌｉ  Ｎら（Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｓｈｏｗ  ｇｌｏｂａｌ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００７；１：５５−７０）およびＴｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，  Ｙｕ  Ｊら（Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＯＩ：  １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１５１５２６）およびＴａｋａｈａｓｈｉら（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｃｅｌｌ．（２００７）１３１（５）：８６１−７２．）に概説され、そして論じられる。
【０３９２】
ｉＰＳ細胞は、典型的には、非多能性細胞、例えば成体線維芽細胞内に特定の幹細胞関連遺伝子をトランスフェクションすることによって得られる。トランスフェクションは、典型的には、レトロウイルスなどのウイルスベクターを通じて達成される。トランスフェクション遺伝子には、マスター転写制御因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２が含まれるが、他の遺伝子が誘導効率を増進させると示唆される。３〜４週間後、少数のトランスフェクション細胞が、形態学的におよび生化学的に多能性幹細胞と類似となり始め、そして典型的には、形態学的選択、倍加時間を通じて、またはレポーター遺伝子および抗生物質感染を通じて単離される。
【０３９３】
多能性幹細胞の供給源
現在、胚の破壊につながらない、例えば成体体細胞または生殖細胞の形質転換（誘導）による、多能性幹細胞の単離のためのいくつかの方法が提供されてきている。これらの方法には、以下が含まれる：
１．核トランスファーによる再プログラミング。この技術は、体細胞から卵母細胞または接合子内への核のトランスファーを伴う。
【０３９４】
２．胚性幹細胞との融合による再プログラミング。この技術は、体細胞と胚性幹細胞の融合を伴う。
【０３９５】
３．培養による自発的再プログラミング。この技術は、長期培養後の非多能性細胞からの多能性細胞の生成を伴う。例えば、始原生殖細胞（ＰＧＣ）の長期培養によって、多能性胚性生殖（ＥＧ）細胞が生成されてきている（本明細書に援用される、Ｍａｔｓｕｉら，  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｃｅｌｌ  ７０，  ８４１−８４７，  １９９２）。
【０３９６】
４．定義される因子による再プログラミング。例えば、レトロウイルスが仲介する、例えば上述のような、マウス胚性または成体線維芽細胞内への転写因子（例えばＯｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４）の導入による、ｉＰＳ細胞の生成。Ｋａｊｉら（Ｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００９；４５８（７２３９）：７７１−７７５）はまた、２Ａペプチドと連結されたｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のコード配列を含む、単一の多タンパク質発現ベクターの非ウイルストランスフェクションを記載し、これは、マウスおよびヒト線維芽細胞をどちらも再プログラミング可能であった。この非ウイルスベクターで産生されたｉＰＳ細胞は、多能性マーカーのロバストな発現を示し、再プログラミング状態が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化アッセイおよび成体キメラマウスの形成によって、機能的に確認されることを示した。Ｋａｊｉらは、胚性線維芽細胞から、多能性マーカーをロバストに発現する、再プログラミングされたヒト細胞株を確立するのに成功した。
【０３９７】
方法１〜４は、本明細書に援用される、山中伸弥による、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １，  Ｊｕｌｙ  ２００７ａ２００７  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｉｎｃ）に記載され、そして論じられる。
【０３９８】
５．単一卵割球または生検卵割球由来のｈＥＳＣ株の誘導。すべて本明細書に援用される、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓ，  Ｌｕ  ＳＪ，  Ｌａｎｚａ  Ｒ．  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；  ４４４：５１２、Ｌｅｉら  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ，  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：６８２−６８８、Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００６；４３９：２１６−２１９．  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００６；４４４：４８１−４８５．  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｍｂｒｙｏ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２００８；２：１１３−１１７およびＤｕｓｋｏ  Ｉｌｉｃら（Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｐｓｉｅｄ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｅｄｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｘｅｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  ２００９；１８（９）：１３４３−１３５０）を参照されたい。
【０３９９】
６．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、卵割を停止し、そして桑実胚および胚盤胞まで発生するのに失敗した停止胚から得られるｈＥＳＣ株。どちらも本明細書に援用される、Ｚｈａｎｇ  Ｘ，  Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ  Ｐ，  Ｐｒｚｙｂｏｒｓｋｉ  Ｓら  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｒｒｅｓｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００６；２４：２６６９−２６７６およびＬｅｉら  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ，  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：６８２−６８８を参照されたい。
【０４００】
７．単為生殖。この技術は、未受精卵を化学的または電気的に刺激して、胚性幹細胞を得られうる割球に発生させる工程を伴う。例えば、幹細胞を産生するために未受精中期ＩＩ卵母細胞の化学的活性化を使用した、Ｌｉｎら  Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｏｏｃｙｔｅｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００３；２１（２）：１５２−６１を参照されたい。
【０４０１】
８．胎児起源の幹細胞。これらの細胞は、可能性の観点からは胚性および成体幹細胞の間に位置し、そして該細胞を用いて、多能性または多分化能細胞を得ることも可能である。多能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｒｅｘ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１、β−ガラクトシダーゼ染色によって示されるような老化の証拠が最小限であること、およびテロメラーゼ活性の一貫した発現を含む）を発現するヒト臍帯由来胎児間葉系幹細胞（ＵＣ  ｆＭＳＣ）が、Ｃｈｒｉｓ  Ｈ．  Ｊｏら（本明細書に援用される、Ｆｅｔａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｓｕｓｔａｉｎ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ（２００８）３３４：４２３−４３３）によって成功裡に得られている。Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｃｏｓｔａ  Ｐｅｒｅｉｒａら（本明細書に援用される、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ２００８；２：３９４−３９９）は、ヒト臍帯のワルトン膠様質から、間葉系幹細胞の純粋な集団を単離した。ワルトン膠様質由来の間葉系幹細胞はまた、Ｔｒｏｙｅｒ  ＆  Ｗｅｉｓｓ（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｒｅｖｉｅｗ：  Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  Ｊｅｌｌｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｒｅ  ａ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８：２６：５９１−５９９）にも概説されている。Ｋｉｍら（本明細書に援用される、Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００７  Ｗｉｎｔｅｒ；９（４）：５８１−９４）は、ヒト羊膜からヒト羊膜由来間葉系細胞を単離することに成功した。臍帯は、通常廃棄される組織であり、そしてこの組織由来の幹細胞は、道徳的または倫理的な反対を招かない傾向がある。
【０４０２】
９．  Ｃｈｕｎｇら［（２００８）Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２（２）１１３−１１７．Ｅｐｕｂ  ２００８年１月１０日］は、胚破壊を伴うヒト胚性幹細胞株の生成を記載する。
【０４０３】
人工多能性幹細胞は、胚の破壊を引き起こさない方法によって、より具体的には、ヒトまたは哺乳動物胚の破壊を引き起こさない方法によって得られうるという利点を有する。
【０４０４】
Ｃｈｕｎｇらによって記載される方法（上記項目９）もまた、ヒト胚の破壊を引き起こさない方法によって、ヒト胚性幹細胞を得ることを可能にする。
【０４０５】
こうしたものとして、こうした細胞が得られうるヒトまたは動物胚の破壊を必然的に伴う方法のみによって調製されたのではない細胞を用いることによって、本発明の側面を実行または実現可能である。この場合による限定は、欧州特許庁拡大審判部の２００８年１１月２５日の決定Ｇ０００２／０６を考慮に入れることが特に意図される。
【０４０６】
分化／胚様体
当業者に知られる分化技術を用いることによって、多能性細胞を含む培養した幹細胞を、任意の適切な細胞タイプに分化させることも可能である。
【０４０７】
本発明者らは、分化した細胞を産生するためのプロセスであって、本明細書に記載するような方法によって幹細胞を増殖させ、そして次いで、既知の技術にしたがって幹細胞を分化させる工程を含む、前記方法を記載する。例えば、本発明者らは、外胚葉、中胚葉および内胚葉、ならびに心筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞等に分化させる方法を提供する。本発明者らはさらに、こうした方法によって得られうる胚様体および分化した細胞を提供する。こうした幹細胞および分化した細胞から作製される細胞株もまた提供する。
【０４０８】
幹細胞を分化させる方法は当該技術分野に知られ、そして例えば、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ（Ｊ  Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ，  Ｍ  Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ，  Ｄ  Ｋａｒｓｅｎｔｉ，  Ａ  Ｅｄｅｎ，  Ｏ  Ｙａｎｕｋａ，  Ｍ  Ａｍｉｔ，  Ｈ  Ｓｏｒｅｑ，  Ｎ  Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒｓ．  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２０００  Ｆｅｂ  ；６  （２）：８８−９５）およびＧｒａｉｃｈｅｎら（Ｒａｌｐｈ  Ｇｒａｉｃｈｅｎ，  Ｘｉｕｑｉｎ  Ｘｕ，  Ｓｔｅｆａｎ  Ｒ  Ｂｒａａｍ，  Ｔｈａｖａｍａｌａｒ  Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｓｉｔｉ  Ｎｏｒｆｉｚａ，  Ｓｈｉｒｉｙ  Ｓｉｅｈ，  Ｓｅｔ  Ｙｅｎ  Ｓｏｏ，  Ｓｕ  Ｃｈｉｎ  Ｔｈａｍ，  Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｍｕｍｍｅｒｙ，  Ａｌａｎ  Ｃｏｌｍａｎ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｚｗｅｉｇｅｒｄｔ，  Ｂｒｕｃｅ  Ｐ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐ３８  ＭＡＰＫ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２００７  （Ｎｏｖ  １５））、Ｋｒｏｏｎら（Ｋｒｏｏｎら（２００８）  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｒ；２６（４）：４４３−５２．）およびＨａｙら（Ｈａｙら（２００８）．  Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈＥＳＣｓ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ＡｃｔｉｖｉｎＡ  ａｎｄ  Ｗｎｔ３ａ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．  ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ．  １０５．  Ｎｏ．３４  １２３１０−１２３０６）、ＷＯ  ２００７／０３０８７０、ＷＯ  ２００７／０７０９６４、Ｎｉｅｂｒｕｇｇｅら（Ｎｉｅｂｒｕｇｇｅら（２００９），  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｅｓｏｄｅｒｍ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｉｚｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｉｎ  ａｎ  Ｏｘｙｇｅｎ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｖｏｌ．１０２，  ｎｏ．２，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １，  ２００９）、Ｒ  Ｐａｓｓｉｅｒら（Ｒ．  Ｐａｓｓｉｅｒら  ２００５．  Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ  ｉｎ  ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＦＢＳ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００５  Ｏｃｔ；１６（５）：４９８−５０２．  Ｒｅｖｉｅｗ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００５  Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；２３（６）：���７２−８０）、Ｐ  Ｗ  Ｂｕｒｒｉｄｇｅら（Ｐ  Ｗ  Ｂｕｒｒｉｄｇｅら  ２００６．  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ（ＰＶＡ），  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｂＦＧＦ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００７  Ａｐｒ；２５（４）：９２９−３８．  Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｄｅｃ  ２１）、Ｍ  Ａ  Ｌａｆｌａｍｍｅら（Ｍ  Ａ  Ｌａｆｌａｍｍｅら  ２００７．  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｆｏｒ  ２４  ｈ，  ａｎｄ  ＢＭＰ  ４  ｆｏｒ  ４  ｄａｙｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００７  Ｓｅｐ；２５（９）：１０１５−２４．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ａｕｇ  ２６．）、Ｌ  Ｙａｎｇら（Ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＢＭＰ４（１  ｄａｙ），  ＢＭＰ４，  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｂＦＧＦ（ｄａｙｓ  １−４），  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｂＦＧＦ（ｄａｙｓ  ４−８），  ａｎｄ  ＤＫＫ１  ａｎｄ  ＶＥＧＦ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００８  Ｍａｙ  ２２；４５３（７１９４）：５２４−８．  Ｅｐｕｂ  ２００８  Ａｐｒ  ２３）、ならびにＸ  Ｑ  Ｘｕら（Ｘ  Ｑ  Ｘｕら  ２００８．  ＳＢ２０３５８０（ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）  ＰＧＩ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  ｍｅｍｂｅｒ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ＥＮＤ２−ＣＭ）．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  ２００８  Ｎｏｖ；７６（９）：９５８−７０．  Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｊｕｎ  １３）に記載される。
【０４０９】
適切な分化因子を含有する培地中での培養によって、幹細胞を、神経系譜に分化するように誘導することも可能である。こうした因子には、アクチビンＡ、レチノイン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニスト、例えばノギン（Ｎｉｋｎｅｊａｄら  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｖｏｌ．１９  ２０１０  ２２〜２９ページ）の１またはそれより多くが含まれうる。神経系譜に向かって分化する細胞を、神経マーカー、例えばＰａｘ６、ネスチン、Ｍａｐ２、β−チューブリンＩＩＩおよびＧＦＡＰの発現によって同定することも可能である。神経系譜の細胞は、クラスターを形成して、ニューロスフェア（ネスチン陽性細胞凝集体であることも可能である）を形成することも可能であり、そしてＥＧＦおよび／またはＦＧＦ１および／またはＦＧＦ２などの選択される増殖因子の適用によって、これらを拡大することも可能である。
【０４１０】
分化は、腺細胞、ホルモン分泌細胞、神経細胞、代謝細胞、血液細胞、生殖細胞、免疫細胞、収縮細胞、または分泌細胞の１つから選択される特定の細胞タイプへのものであることも可能である。
【０４１１】
また、胚様体を形成するために培養幹細胞を用いてもよい。胚様体、および胚様体を作製するための方法が、当該技術分野に知られる。用語「胚様体」は、懸濁中で胚性幹細胞を増殖させることによって産生される、培養中に見られる球状コロニーを指す。胚様体は、細胞タイプが混合されたものであり、そして特定の細胞タイプの分布および出現タイミングは、胚内で観察されるものに対応する。半固形培地などの培地上に胚性幹細胞をプレーティングすることによって、胚様体を生成することも可能である。Ｌｉｍら，  Ｂｌｏｏｄ．  １９９７；９０：１２９１−１２９９に記載されるように、メチルセルロース培地を用いてもよい。
【０４１２】
例えばＩｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ（２０００、上記）に記載される方法を用いて、胚性幹細胞を誘導して胚様体を形成してもよい。胚様体は、３つの胚性胚葉すべての細胞を含有する。
【０４１３】
例えば適切な誘導因子または環境変化への曝露によって、胚様体をさらに誘導して、異なる細胞系譜に分化させることも可能である。Ｇｒａｉｃｈｅｎら（２００７、上記）は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路の操作によって、ヒト胚性幹細胞からの心筋細胞の形成を記載する。Ｇｒａｉｃｈｅｎは、１０マイクロモル未満のＳＢ２０３５８０などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼの特異的阻害剤に曝露することによって、幹細胞から心筋細胞形成が誘導されることを示す。
【０４１４】
当該技術分野に知られるような、再生療法などの、任意の適切な目的のために、分化した細胞を使用してもよい。
【０４１５】
本発明記載の培養法および技術を通じて得られる幹細胞を用いて、医学的治療法で用いるための別の細胞タイプに分化させてもよい。したがって、分化した細胞タイプは、本明細書記載の培養法および技術によって得られ、続いて分化を許されている幹細胞に由来しうる。分化した細胞タイプは、本明細書記載の培養法および技術によって得られ、続いて分化を許された幹細胞の産物と見なされうる。場合によって薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と一緒に、こうした分化した細胞を含む薬学的組成物を提供してもよい。こうした薬学的組成物は、医学的治療法において有用でありうる。
【０４１６】
マイクロキャリアー上での分化
マイクロキャリアー上での懸濁培養中、幹細胞、特に胚性幹細胞およびｉＰＳを誘導して、分化させてもよい。
【０４１７】
胚性幹細胞を誘導して、３つの一次胚葉：外胚葉、内胚葉および中胚葉、ならびにその誘導体に分化させてもよい。胚性幹細胞を誘導して胚様体を形成してもよい。したがって、ある範囲の細胞タイプまたは組織、例えば心筋細胞、心臓中胚葉、肝細胞、肝臓内胚葉、膵島細胞、膵臓内胚葉、インスリン産生細胞、神経組織、神経外胚葉、上皮組織、表面外胚葉、骨、軟骨、筋肉、靱帯、腱または他の結合組織が得られうる。
【０４１８】
幹細胞の分化および胚様体の形成のための方法は上記のとおりであり、そしてこれはマイクロキャリアー培養中の幹細胞の分化に適用可能である。
【０４１９】
マイクロキャリアー培養中で幹細胞を分化させる方法は、上述のように、マイクロキャリアーをコーティングしないか、またはマトリックスコーティングでコーティングする必要がありうる。例えば、適切なコーティングには：  Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸の１またはそれより多くが含まれてもよい。
【０４２０】
マイクロキャリアー培養中で幹細胞を分化させる方法には、培地への補助剤の添加が含まれてもよい。例えば、補助剤には、ウシ血清アルブミン、脂質またはＨｙ−Ｓｏｙ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−これは大豆タンパク質の酵素的加水分解物である）が含まれてもよい。
【０４２１】
マイクロキャリアー培養中で幹細胞を分化させる方法は、２Ｄ培養中または３Ｄ懸濁マイクロキャリアー培養中のいずれかでの幹細胞の初期培養および増殖、その後、マイクロキャリアー培養中の分化誘導を伴ってもよい。
【０４２２】
バイオマテリアル、足場および移植物
本発明の薬学的組成物および薬剤は、ＰＣＬマイクロキャリアーでコーティングされそして／または含浸されたバイオマテリアルの形を取ることも可能である。移植物または装具（ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）をバイオマテリアルから形成してもよい。こうした移植物または装具を外科的に移植して、組織（例えば骨または結合組織）増殖、修復、再生、再構築および／またはリモデリングを補助してもよい。
【０４２３】
ＰＣＬマイクロキャリアーを移植物、装具に適用して、望ましい位置での新規組織形成を加速することも可能である。
【０４２４】
バイオマテリアルを、ＰＣＬマイクロキャリアーでコーティングするかまたはこれに含浸することも可能である。含浸は、ＰＣＬマイクロキャリアーを、例えば重合中に、バイオマテリアルの構成要素と混合するか、またはＰＣＬマイクロキャリアーをバイオマテリアル内に吸収させることによって、バイオマテリアルを形成する工程を含むことも可能である。コーティングは、ＰＣＬマイクロキャリアーをバイオマテリアル表面上に吸着させる工程を含むことも可能である。
【０４２５】
バイオマテリアルは、被験体に投与するかまたは移植した際、コーティングまたは含浸ＰＣＬマイクロキャリアーが、バイオマテリアルから放出されることを可能にしなければならない。バイオマテリアル放出動力学は、バイオマテリアルの構造、例えば多孔性を改変することによって改変可能であるはずである。
【０４２６】
バイオマテリアルをＰＣＬマイクロキャリアーでコーティングするかまたはこれに含浸することに加えて、１またはそれより多い生物学的活性分子を、バイオマテリアル上に含浸させるかまたはコーティングすることも可能である。例えば：ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＯＰ−１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３；ＶＥＧＦ；コラーゲン；ラミニン；フィブロネクチン；ビトロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つ。上記生物活性分子に加えて、またはそれとは別に、１またはそれより多いビスホスホネートを、ＰＣＬマイクロキャリアーとともに、バイオマテリアル上に含浸させるかまたはコーティングすることも可能である。有用なビスホスホネートの例には：エチンドロネート；クロドロネート；アレンドロネート；パミドロネート；リセドロネート；ゾレドロネートからなる群より選択される少なくとも１つが含まれることも可能である。
【０４２７】
ＰＣＬマイクロキャリアーでコーティングまたは含浸されたバイオマテリアルは、医学的および獣医学的目的の両方において有用でありうる。本発明は、患者の生活の質を改善するか、または例えば交配に使用するための価値ある競走馬の生命を潜在的に延長させることも可能であることが認識されるであろう。
【０４２８】
バイオマテリアルは、足場またはマトリックス支持体を提供する。バイオマテリアルは、組織における移植に適している可能性もあり、または投与に適している可能性もある（例えば溶液中のマイクロカプセルとして）。
【０４２９】
移植物または装具は、生体適合性、すなわち非毒性および低免疫原性（最も好ましくは非免疫原性）でなければならない。バイオマテリアルは、創傷治癒が起こるにつれてバイオマテリアルが分解されるように生物分解性であり、最終的に、被験体において、ｉｎ  ｓｉｔｕで、再生した骨のみを残すことも可能である。あるいは、非生物分解性バイオマテリアルを用いて、例えば広範囲の断裂（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｉｔｙ）に渡って、骨再生を導いてもよく、バイオマテリアルの外科的除去が、創傷治癒成功後に場合によって必要とされてもよい。
【０４３０】
バイオマテリアルは、柔らかくそして／または柔軟であることも可能であり、例えばヒドロゲル、フィブリンウェブまたはメッシュ、あるいはコラーゲンスポンジであることも可能である。「ヒドロゲル」は、天然または合成であってもよい有機ポリマーが固化または固形化して、三次元開放格子構造を生成し、この構造が水または他の溶液の分子を捕捉してゲルを形成する際に形成される物質である。固形化は、凝集、凝固、疎水性相互作用または架橋によって起こることも可能である。
【０４３１】
あるいは、バイオマテリアルは、例えばプラスチックまたは生物学的不活性金属、例えばチタンなどの固形材料から形成される、比較的堅い構造であることも可能である。
【０４３２】
バイオマテリアルは、架橋ポリマーによって提供可能な多孔性マトリックス構造を有することも可能である。マトリックスは、好ましくは、骨増殖に必要な栄養分および増殖因子に対して浸透性である。
【０４３３】
マトリックス構造を、繊維、例えばフィブリンまたはコラーゲンを架橋することによって、あるいは適切な架橋剤、例えばカルシウム塩、ポリアクリル酸、ヘパリンを用いたアルギン酸ナトリウム、キトサン、または他の多糖の液体フィルムで形成可能である。あるいは、当業者に知られるよく確立された方法を用いて架橋される、コラーゲンまたはアルギン酸によって製造されるゲルとして、足場を形成することも可能である。
【０４３４】
マトリックス形成に適したポリマー材料には：コラーゲン、フィブリン、キトサン、ポリカプロラクトン、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリヒドロキシアルカノエート、そのコポリマーからなる群より選択可能な生物分解性／生物吸収性ポリマー、あるいは：酢酸セルロース；酪酸セルロース、アルギネート、アガロース、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、スルホン化ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、そのコポリマーからなる群より選択可能な非生物分解性ポリマーが含まれる。
【０４３５】
コラーゲンは、生体適合性、ならびに細胞付着および機能を補助する好ましい特性のため、マトリックス構築のための有望な材料である（米国特許第５，０１９，０８７号；  Ｔａｎａｋａ，  Ｓ．；  Ｔａｋｉｇａｗａ，  Ｔ．；  Ｉｃｈｉｈａｒａ，  Ｓ．  ＆  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｔ．  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｎｅｒｖｅ  ｇｕｉｄｅ  ｔｕｂｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００６，  ４６，  １４６１−１４６７）。コラーゲンスポンジは当該技術分野に周知である（例えばＩｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのもの）。
【０４３６】
フィブリン足場（本明細書に記載する）は、代替マトリックス材料を提供する。
【０４３７】
バイオマテリアルのさらなる例は、ヒドロキシアパタイトまたはヒアルロン酸を取り込むポリマーである。
【０４３８】
バイオマテリアルにさらなる細胞を補充してもよい。例えば、未分化骨前駆細胞、例えば幹細胞、例えば間葉系幹細胞、より好ましくはヒト間葉系幹細胞をバイオマテリアルに「植え付ける」（またはそれと同時合成する）ことも可能である。
【０４３９】
本発明記載の方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実行することも可能である。用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、材料、生物学的物質、細胞および／または組織を用いた実験室条件における、または培養における実験を含むよう意図され、一方、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、損なわれていない多細胞生物を用いた実験および処置を含むよう意図される。
【０４４０】
本発明には、記載する側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれるが、こうした組み合わせが明らかに許容しえないかまたは明確に回避される場合を除く。
【０４４１】
本明細書で用いるセクション見出しは、構成目的のみのためであり、そして記載する主題を限定すると見なされないものとする。
【０４４２】
本発明の側面および態様を、例として、付随する図に言及しながら例示する。さらなる側面および態様は、当業者には明らかであろう。本テキストに言及されるすべての文書は、本明細書に援用される。
【実施例】
【０４４３】
実施例１−ポリマー微小球体の製造
本実施例は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）由来の均一なサイズを持つ球状微小球体の製造を記載する。
【０４４４】
ガス浸透クロマトグラフィ（ｇａｓ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒｐｈｙ）（ＧＰＣ）によって測定した際、およその範囲７０，０００〜９０，０００のＭＷで、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（参照番号４４０７４４）からＰＣＬを得た。
【０４４５】
微少流体デバイスを用いた、ポリマー微小球体の製造
７．５ｇのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および２５０ｍｌの脱イオン水（ｄｉ−ｗａｔｅｒ）を２５０ｍｌガラス瓶に添加し、次いで８０℃で溶解し、そして振盪して、３重量％水性ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液を得た（連続相と称されるであろう）。
【０４４６】
１００ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ；ＣＨ２ＣＬ２）中の１％（ｗ／ｖ）ＰＣＬ溶液を調製した（分散相と称されるであろう）。
【０４４７】
２つの２０ｍｌシリンジを、個々に調節可能な流速を持つ、それぞれのシリンジポンプ上に搭載した。１つのシリンジは連続相をＰＴＦＥチューブ（Ｉ．Ｄ．＝０．５ｍｍ）に供給し、そしてもう一方のシリンジは、針（２７Ｇ、Ｉ．Ｄ．＝０．１９１ｍｍ）内に分散相を供給した。針直径はＰＴＦＥチューブよりも小さく、そして針はチューブの軸中、同心円状に配置されているため、針を通じて流れる分散相は、チューブを通じて流れる連続相内に注入される。
【０４４８】
連続および分散相のシリンジポンプ流速を調整して、ポリマー微小球体を調製するために適した値にした。本実施例で用いる流速を図１に示す。
【０４４９】
シリンジポンプを作動させて、ＰＣＬ／ＤＣＭ微小滴を形成し、これを、５０ｍｌの３％水性ＰＶＡ溶液を含む、２５０ｍｌビーカー中に室温で収集した。およそ４０ｍｌのＰＣＬ／ＤＣＭ微小滴を１つのビーカーに収集可能である。
【０４５０】
次いで、ＤＣＭを蒸発させることによって、ポリマー／ＤＣＭ微小滴を室温で乾燥させ、こうしてポリマー微小球体を得る。微小滴上のＰＶＡ溶液を取り除いて、数ミリメートルの深さを残す。ＤＣＭは水性相を通じて拡散し、そして３〜７日間の期間に渡って、ドラフト下で蒸発させた。流動性が欠如しており、そして容器表面にある程度の接着があることによって立証されるように、微小滴が微小球体に固形化しているようである場合、容器を室温の真空オーブンに一晩入れて、乾燥プロセスを完了する。
【０４５１】
純水中で分散させ、そして５回連続リンスして、いかなるＰＶＡ残渣も取り除いた後、光学顕微鏡で、球体直径を測定した。図１は、連続および分散相流速の関数としての平均直径および変動係数（ＣＶ、標準偏差を平均直径によって割ったものとして計算）を示す。製造したＰＣＬマイクロキャリアーは、１８４±１１μｍの直径を有し、１．０８５ｇ／ｃｍ３の密度を有した。
【０４５２】
この一般的な方法の後、ＤＣＭ溶液中のＰＶＡの量（グラム）および／または％（ｗ／ｖ）ＰＣＬを変化させることによって、すなわちＰＶＡおよびＰＣＬ溶液濃度を変化させることによって、多様な孔サイズおよび全体密度を有するマイクロキャリアーを生成した。乾燥させた後、走査型電子顕微鏡によって決定されるように、すべての孔には空気が充填されていることが見出された。
【０４５３】
実施例２−ＰＣＬマイクロキャリアーのＮａＯＨ処理
純水中で５回リンスした後、ＰＣＬ微小球体を、５Ｍ水性水酸化ナトリウム中、室温で３時間インキュベーションして、ＰＣＬ湿潤性を増加させ、そして負の表面荷電を生成した。微小球体を、続いて５回、純水中でリンスし、そして次いで、衛生化のため、７０％水性エタノールに１時間曝露した。無菌純水でさらに５回リンスした後、微小球体を１ｘ無菌ＰＢＳで２回リンスし、そして次いで、タンパク質コーティングのため、無菌１ｘＰＢＳ懸濁物中に残した。
【０４５４】
微小球体を、長時間のＮａＯＨ処理により、典型的には１〜７日続けて処理して、多孔性にすることも可能である。孔はまた、マイクロキャリアー形成前に、潜在的に表面活性剤、例えば界面活性剤または親水性／疎水性ジブロックコポリマーの使用を伴って、ＰＣＬ内にブレンドされるであろう、ポロゲン、例えば生物分解性または水溶性ヒドロゲル相によって生成されてもよい。図２は、延長ＮａＯＨ処理によって生成された多孔性マイクロキャリアーを示す。
【０４５５】
実施例３−ポリ−ｌ−リジン（ＰＬＬ）およびタンパク質でのＰＣＬ微小球体コーティング
分子量７０ｋＤａ〜１５０ｋＤａのポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ．より購入した。＞９０％純度のヒト血漿ビトロネクチン（ＶＮ）を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅより購入し、そしてＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｍ肉腫由来の＞９５％純度の天然マウスラミニン（ＬＮ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。
【０４５６】
２４ウェル組織培養ポリスチレンプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ参照番号３５３０４７）のウェル中、６００μｌの水性ＰＬＬまたはタンパク質懸濁物中で、２５ｍｇのＰＣＬ微小球体を４℃で１５時間インキュベーションすることによって、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、またはラミニン（ＬＮ）およびコラーゲン（ＣＬＧ）を含むタンパク質で微小球体をコーティングした。用いた最初のＰＬＬおよびタンパク質溶液濃度を図３に示す。修飾ブラッドフォードアッセイを用いて、インキュベーションの前および後に濃度を測定し、溶液から吸着されたＰＬＬまたはタンパク質の定量化を可能にした。容器上および微小球体上に吸着したＰＬＬタンパク質の染色を測定することによって、この測定を補完した。Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓは、吸着されたタンパク質の絶対測定値を提供しないが、微小球体上に吸着されたものに対する容器上に吸着されたタンパク質の比の決定を可能にする。１７５μｍ平均直径ＰＣＬ微小球体の２５ｍｇに関して、１５ｃｍ２の表面積と計算されたことから、各溶液濃度に関して吸着されたＰＬＬまたはタンパク質を定量化し、そして表面密度として表した。ＰＣＬ微小球体に対して吸着したＰＬＬ、ラミニン、ゼラチンおよびコラーゲンに関する表面密度データを図３および４に示す。
【０４５７】
ゼラチンでのＰＣＴ微小球体コーティング
２４ウェル組織培養ポリスチレンプレートのウェル中で、４０ｍｇのＰＣＬ微小球体を、１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌゼラチン溶液中、４℃で１５時間インキュベーションすることによって、微小球体をゼラチン（ＧＬ）でコーティングした。ゼラチンでコーティングした後、ゼラチン溶液中のＰＣＬ微小球体を、１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管内にトランスファーし、そしてゼラチン上清を取り除いた。ＰＢＳ中の０．０７％グルタルアルデヒド溶液１ミリリットルを、試験管内に添加して、ＰＣＬ微小球体上にコーティングされたゼラチンを架橋した。グルタルアルデヒド溶液中で一晩インキュベーションした後、ゼラチンでコーティングされたＰＣＬを、純水中で１０回リンスして、いかなる残渣も取り除いた。
【０４５８】
実施例４−フィブロネクチン／ポリ−Ｌ−リジン／フィブロネクチン多層でのＰＣＬ微小球体のコーティング
ＰＣＬマイクロキャリアーを、フィブロネクチン−ポリ−Ｌ−リジン−フィブロネクチン（ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮ）の多層で、振盪プラットフォーム上、室温で行う、３回の一晩（１５〜１８時間）インキュベーション工程を用いて、コーティングした。最初に、１．５ｍｌエッペンドルフ試験管中のマイクロキャリアーをＰＢＳ中の組換えフィブロネクチン（ＦＮ）溶液中でインキュベーションし、そしてＰＣＬ  ＭＣのすべての１センチメートル平方を１μｇのＦＮでコーティングした。次に、マイクロキャリアーをＰＢＳ中のポリ−ｌ−リジン（ＰＬＬ）中でインキュベーションし、そしてＰＣＬ  ＭＣのすべての１センチメートル平方を２μｇのＰＬＬでコーティングした。第三に、マイクロキャリアーを再び、第一のＦＮ溶液と同じ濃度のＰＢＳ中のフィブロネクチン（ＦＮ）溶液中でインキュベーションし、ＰＣＬ  ＭＣのすべての１センチメートル平方を１μｇのＦＮでコーティングした。各インキュベーション工程後、ＰＣＬマイクロキャリアーをＰＢＳで２回リンスした。
【０４５９】
実施例５−ＰＣＬマイクロキャリアー上のｈＥＳＣの増殖
ヒト胚性幹細胞株、ＨＥＳ−３（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）をルーチンに、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０５８５０）を含むＭａｔｒｉｇｅｌコーティング組織培養プレート上で維持した。ポリカプロラクトン（ＰＣＬ；カタログ番号４４０７４４）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。９７±１０μｍの平均直径のポリスチレンビーズ（ＰＳ；カタログ番号７６０２Ｂ）を、陽性対照として、ＴｈｅｒｍｏーＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。７０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量のポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ；カタログ番号Ｐ６２６８）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃから購入した。＞９０％純度のヒト血漿ビトロネクチン（ＶＮ；カタログ番号ＣＣ０８０）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入し、そしてＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｍ肉腫由来の＞９５％純度の天然マウスラミニン（ＬＮ；カタログ番号２３０１７−０１５）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。
【０４６０】
ＰＣＬマイクロキャリアーを表１（図５）に示すような異なる試薬でコーティングした。ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１２６０４−０２１）で単細胞に酵素的に解離させた後、細胞を、２０ｍｇのＥＣＭコーティングＰＳ上に、または３０ｍｇのＥＣＭコーティングＰＣＬ（ＮａＯＨ処理を含むかまたは含まない）上に、ウェルあたり１ｘ１０６細胞（５ｍＬ中）で植え付け、超低接着６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３４７１）の底面に落ち着けた。
【０４６１】
植え付け直後、培養プレートを一時的に、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中、１１０ｒｐｍの軌道振盪装置上に２時間置いて、ｈＥＳＣおよびマイクロキャリアー間の接触を促進した。次いで、これらを、静置条件下で７日間培養し、そして培地を毎日新しくした（８０％）。ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，  Ｉｎｃ）を用いて、第７日に細胞数を計数した。４週間に渡って、培養を７日後に継代した。図６は、１週間後、異なるＥＣＭコーティングＰＳまたはＰＣＬマイクロキャリアー上で培養したｈＥＳＣで達成された細胞密度を示す。図７は、異なるコーティング、ＮａＯＨ、ＰＬＬ、ＬＮおよびＶＮを伴うＰＣＬマイクロキャリアー上でのｈＥＳＣの増殖を示す。高密度の細胞は、いくつかのコーティング条件に関して、細胞−マイクロキャリアー凝集物の大きなクラスターを形成する。
【０４６２】
実施例６−ＰＣＬマイクロキャリアー上でのＭＳＣの増殖
試薬および化学薬品
高グルコース・ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ；カタログ番号１１９６０）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ；カタログ番号１０２７０）、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（カタログ番号２５２００）およびダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；カタログ番号１４１９０）をＧｉｂｃｏ、米国より購入した。Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３型マイクロキャリアー（カタログ番号Ｃ３２７５）およびポリカプロラクトン（ＰＣＬ；カタログ番号４４０７４４）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。超低付着組織培養プレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＬＳ３５１６）およびＴ−１７５フラスコ（Ｎｕｎｃ）以外のすべての消耗品をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ニュージャージー州フランクリンレイクス）より購入した。
【０４６３】
ＭＳＣ培養
臨床的に示された妊娠終結後、妊娠女性の承諾書を得て、妊娠１３週のヒト胎児間葉系幹細胞を得た。胎児組織収集は、研究用胎児組織使用に関する国際的指針（Ｐｏｌｋｉｎｇｈｏｒｎｅ、１９９２）にしたがって、シンガポール国立大学病院領域特化型審査委員会（ＤＳＲＢ−Ｄ−０６−１５４）の認可を得た。２２ゲージ針を、１０％ｖ／ｖ  ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（本明細書においてＤ１０と称される）内に上腕骨および大腿骨の骨髄細胞をフラッシュすることによって、胎児骨髄の単細胞懸濁物を調製した。次いで、Ｄ１０中、Ｔ−１７５フラスコ中に、２９００細胞／ｃｍ２の接種密度で細胞を培養し、そして４日ごとに継代培養した。ほぼ集密に達したら（７０％）、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして各Ｔ−１７５フラスコに関して、３．０ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡを用いて酵素的に採取し、そして新鮮なＤ１０を含有する新規Ｔフラスコ内に接種した。すべての培養を３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で維持した。
【０４６４】
Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアーの調製
４００ｍｌのＣａ２＋、Ｍｇ２＋不含ＰＢＳを用いて、４ｇの乾燥Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアー（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＳ番号：８８８９５−１９−６）マイクロキャリアーをＰｙｒｅｘフラスコ中、室温で３時間水和させた。上清をデカントし、そしてマイクロキャリアーを新鮮なＣａ２＋、Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ（３０〜５０ｍｌ／ｇ  Ｃｙｔｏｄｅｘ）中で数分間洗浄した。ＰＢＳを廃棄し、そして新鮮なＣａ２＋、Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ（３０〜５０ｍｌ／ｇ  Ｃｙｔｏｄｅｘ）で置き換え、そしてオートクレーブ処理（１１５℃、１５分間、１５ｐｓｉ）によって、マイクロキャリアーを滅菌した。水和マイクロキャリアーをオートクレーブし、そして後に使用するため、４℃で保存した。
【０４６５】
ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）マイクロキャリアーの調製
ＰＣＬマイクロキャリアーを表２（図８）に示すように３つの異なる試薬でコーティングした。
【０４６６】
ＭＳＣのマイクロキャリアー培養
Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアー培養に関して、４ｍｇのＣｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアーを、２つ組で、６ウェルプレート中、５ｍｌのＤ１０に添加した。ＰＣＬマイクロキャリアー培養に関しては、４０ｍｇのマイクロキャリアーを用いた。次いで、継代５のＭＳＣを１ｘ１０４細胞／ｍｌの密度でウェルに植え付けた。細胞を植え付ける前に、Ｄ１０中で少なくとも２継代拡大した。次いで、プレートを５分間、穏やかに攪拌し、そして５％加湿ＣＯ２、３７℃で４日間の増殖のためにインキュベーションした。第４日、細胞を２ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理し、そしてＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，  Ｉｎｃ．）を用いて、計数した。第４日の、異なるＰＣＬマイクロキャリアー上でのＭＳＣ増殖結果を図９に示す。図１０は、市販のＣｙｔｏｄｅｘ  ３と比較した、４日後の、異なるコーティング（ポリリジン、ＰＬＬ、ＮａＯＨ、ゼラチン、ＧＬまたはコラーゲンＣＬ）を伴うＰＣＬマイクロキャリアー上でのＭＳＣの増殖を示す。
【０４６７】
実施例７−フィブロネクチン／ポリ−Ｌ−リジン／フィブロネクチンでコーティングしたＰＣＬ微小球体上の幹細胞の培養および計数
６ウェル超低付着プレート
トリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｈｆＭＳＣを単細胞に酵素的に解離させた後、ＦＮ、ＰＬＬ、およびＦＮで連続してコーティングした（ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮ）ＰＣＬマイクロキャリアー４０ｍｇ上に、細胞をウェルあたり５ｘ１０４細胞（５ｍｌ中）で植え付けた。次いで、これらを６ウェル超低付着（ＵＬＡ）プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）底面上に落ち着かせた。異なる振盪措置で、２５ｒｐｍ、３５°の角度で細胞を６日間培養した：３７℃、５％加湿ＣＯ２インキュベーター中、（１）６日間静置条件（６ｄ静置）、（２）１日間静置、その後、振盪条件で５日間（１ｄ静置＋５ｄ振盪）、および（３）静置条件下で２日、その後、振盪条件下で４日間（２ｄ静置＋４ｄ振盪）。
【０４６８】
超低接着６ウェルプレート中、静置および振盪条件下、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮコーティングＰＣＬマイクロキャリアーは幹細胞増殖を支持する
ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，  Ｉｎｃ．）を用いて、細胞を第６日に計数した。図１１は、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮでコーティングしたＰＣＬマイクロキャリアーが幹細胞増殖を支持し、２ｄ静置＋４ｄ振盪条件で、最高の細胞増殖が観察されたことを示す。計数によって、６ｄ静置条件に関して、３．５ｘ１０５細胞／ウェルが明らかになり、これは、７．４倍の細胞拡大に相当した。１日または２日の静置休止後に連続振盪を導入すると、まったく振盪しない場合と比較して、細胞増殖増加を支持するようであり、１ｄ静置＋５ｄ振盪および２ｄ静置＋４ｄ振盪群で、それぞれ、３．９ｘ１０５（７．８倍拡大）および４．５ｘ１０５細胞／ウェル（９倍拡大）が達成された（ｐ≦０．０５）。
【０４６９】
超低接着６ウェルプレート中、幹細胞を植え付けられたＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮコーティングＰＣＬマイクロキャリアーは、小さい凝集物または大きなシート様凝集物を形成する
マイクロキャリアー上の細胞の形状および構造を決定するため、顕微鏡画像を捕捉した。図１２は、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮでコーティングされ、そして幹細胞を植え付けられたＰＣＬマイクロキャリアーが、培養６日後、細胞およびマイクロキャリアーの小さい凝集物または大きなシート様凝集物を形成することを示す（図１２を参照されたい）。１ｄ静置＋５ｄ振盪条件下で、細胞を植え付けられたマイクロキャリアーは、培養６日後に凝集物を形成した。２ｄ静置＋４ｄ振盪措置は、ともに融合して、より大きな細胞シートを形成する、細胞／ＭＣ凝集物の形成を促進する。
【０４７０】
超低接着６ウェルプレート中、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮコーティングＰＣＬマイクロキャリアー上で増殖した幹細胞は、幹細胞マーカーを発現し続ける
静置または混合静置／振盪条件下での培養６日後、細胞をマイクロキャリアーから採取し、ＭＳＣ幹細胞表面マーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１４６に対する抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。図１３は、試験したすべての培養条件に関して、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮでコーティングしたＰＣＬマイクロキャリアー上、６ウェルプレート中で増殖させたｈｆＭＳＣに関して、発現が高いまま（９０％以上）であったことを示し、間葉系幹細胞表現型が不変であったことを示す。
【０４７１】
超低接着Ｔ２５フラスコ
トリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でｈｆＭＳＣを単細胞に酵素的に解離させた後、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮでコーティングしたＰＣＬマイクロキャリアー１００ｍｇ上に、フラスコあたり１．２５ｘ１０５細胞を植え付けた。これらを全部で１０ｍｌの培地中で培養し、そしてＴ−２５超低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の底面上に落ち着かせた。異なる振盪措置で、２５ｒｐｍ、３５°の角度で細胞を７日間培養した：３７℃、５％加湿ＣＯ２インキュベーター中、（１）７日間静置条件（７ｄ静置）、（２）１日間静置、その後、振盪条件で６日間（１ｄ静置＋６ｄ振盪）、および（３）静置条件下で２日、その後、振盪条件下で５日間（２ｄ静置＋５ｄ振盪）。
【０４７２】
超低接着Ｔ２５フラスコ中、静置および振盪条件下、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮコーティングＰＣＬマイクロキャリアーは幹細胞増殖増加を支持する
ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−３０００を用いて、細胞を第７日に計数して、幹細胞増殖を決定した。図１４は、７ｄ静置培養（＊はｐ≦０．０５を示す）、ならびに１ｄ静置および６ｄ振盪培養（＊＊はｐ≦０．０１を示す）に比較して、２ｄ静置および５ｄ振盪培養がより高い細胞数を生じたことを示す。７ｄ静置条件に関して、７日後、細胞数は、１０．７ｘ１０５細胞／ウェル（８．６倍拡大）であった。振盪措置もまた導入されると、細胞数は、７ｄ静置に比較して、１ｄ静置＋６ｄ振盪ではより低かった（６．８ｘ１０５細胞／ウェル、５．４倍拡大）が、２ｄ静置＋５ｄ振盪条件ではより高かった（１４．５ｘ１０５細胞／ウェル、１２倍拡大、ｐ≦０．０５）。
【０４７３】
超低接着Ｔ２５フラスコ中、静置および振盪条件下で、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮコーティングＰＣＬマイクロキャリアー上で増殖させた幹細胞は、マイクロキャリアーまたは小さいマイクロキャリアー凝集物上で単層を形成する
マイクロキャリアー上の細胞の形状および構造を決定するため、顕微鏡画像を捕捉した。図１５は、超低接着Ｔ２５フラスコ中、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮコーティングＰＣＬマイクロキャリアー上で増殖させた幹細胞が、６ｄ静置条件では大きな凝集物を形成したが、１ｄ静置＋５ｄ振盪条件下では単層として増殖し、そして２ｄ静置＋４ｄ振盪条件下では小さい凝集物を形成したことを示す。
【０４７４】
超低接着Ｔ２５フラスコ中、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮコーティングＰＣＬマイクロキャリアー上で増殖した幹細胞は、幹細胞マーカーを発現し続ける
超低接着Ｔ２５フラスコ中、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮでコーティングしたＰＣＬマイクロキャリアー上、プレート上で、培養７日後、細胞をマイクロキャリアーから採取し、ＭＳＣ幹細胞表面マーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１４６に対する抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。図１６は、試験したすべての３つの培養条件に関して、細胞集団の大部分で（細胞の９０％以上）、ｈｆＭＳＣが、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１４６を発現し続けたことを示し、間葉系幹細胞表現型が不変であったことを示す。
【０４７５】
実施例８−フィブロネクチン／ポリ−Ｌ−リジン／フィブロネクチン多層を伴うＰＣＬ微小球体上で増殖される幹細胞の培養および骨形成分化
２ｘ１０４  ｈｆＭＳＣを、組織培養処理プラスチック（ＴＣＰ）６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）上、または超低接着６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中のＰＣＬマイクロキャリアー１５ｍｇ上のいずれかに植え付けた。植え付け後、細胞を増殖培地中で４日間培養し、そして次いで、骨形成誘導培地中で２８日間（拡大／分化）培養するか、または直ちに骨形成誘導培地中で２８日間（直接分化）培養した。細胞植え付けおよび培養はどちらも、静置条件下で行った。試験した３つの条件は：（１）ＴＣＰ拡大／分化、（２）ＰＣＬマイクロキャリアー拡大／分化、および（３）ＰＣＬマイクロキャリアー直接分化であった。培地を２〜３日ごとに補充した。増殖培地は、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したアルファＭＥＭであった。骨形成誘導培地は、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０ｍＭベータ・グリセロリン酸、１０ｎＭデキサメタゾン、および０．２ｍＭアスコルビン酸を補充したＤＭＥＭであった。
【０４７６】
ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮコーティングＰＣＬマイクロキャリアーは、静置条件下で、ｈｆＭＳＣ（幹細胞）接着および増殖を支持する
図１７は、静置条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、骨形成誘導培地中での培養によって、分化１日後（図１７Ａ）および７日後（図１７Ｂ）、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮでコーティングしたＰＣＬマイクロキャリアー上で培養したｈｆＭＳＣの顕微鏡写真を示す。ＰＣＬマイクロキャリアー表面への高レベルの初期細胞接着が観察され（図１７Ａ）、そして次の６日間に渡って、細胞は迅速に増殖し、そして凝集した（図１７Ｂ）。図１７Ｃは、静置条件下、超低接着プレート中、２１日後に、大きな細胞凝集物が形成されたことを示す。組織培養プラスチック拡大および分化（ＴＣＰ  ＥＤ）細胞が対照として含まれた。
【０４７７】
実施例９−フィブロネクチン／ポリ−Ｌ−リジン／フィブロネクチン多層を伴うＰＣＬ微小球体上で増殖させた幹細胞によって沈着するカルシウムの測定
ｈｆＭＳＣミネラル化を３つの異なる条件：（１）ＰＣＬマイクロキャリアー直接分化、（２）ＰＣＬマイクロキャリアー拡大／分化、および（３）ＴＣＰ拡大／分化で試験し、（３）は陽性対照として働いた。分化の１、４、７、２１および２８日後、ＴＣＰまたはマイクロキャリアー上のｈｆＭＳＣを、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳで２回洗浄し、０．５Ｍ酢酸内に移し、そして室温で１時間インキュベーションした。次いで、試料をボルテックスし、そして遠心分離し、そして製造者の支持にしたがって、Ｑｕａｎｔｉｃｈｒｏｍカルシウムアッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、酢酸上清をカルシウム内容物に関して分析した。結果を図１８に示す。
【０４７８】
ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮコーティングＰＣＬマイクロキャリアーは、ｈｆＭＳＣ（幹細胞）骨形成分化およびミネラル化（骨表現型への変換および石灰化マトリックスの沈着）を支持する
図１９は、ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮコーティングＰＣＬマイクロキャリアー（ＭＣ）が、静置条件で培養されるｈｆＭＳＣのロバストなｉｎ  ｖｉｔｒｏ骨形成分化を支持することを示す。すべての群に関して、カルシウム沈着レベルは、第１日では低バックグラウンドレベル（５０μｇ未満）であったが、骨形成誘導培地中での２８日間の培養に渡って増加した。骨形成誘導の２８日後までに、カルシウムレベルは、拡大／分化（ＥＤ）プロトコル下でのＰＣＬマイクロキャリアーまたはＴＣＰ上で培養した細胞に比較した際、直接分化（ＤＤ）下のＰＣＬマイクロキャリアー上で培養したｈｆＭＳＣに関して、より高かった。第２８日、ＰＣＬマイクロキャリアーＤＤ群におけるｈｆＭＳＣは、５０３．１±１７．６μｇカルシウムを含有し、ＴＣＰ  ＥＤ（３７０．３±１４．９μｇカルシウム）、陽性対照群に比較して、カルシウムの３６％の増加が、そしてＰＣＬマイクロキャリアーＥＤ群（２９．７±０．７μｇカルシウム）に比較して、カルシウムの１２３％の増加が示された。
【０４７９】
総合すると、これらの結果は、ＰＣＬマイクロキャリアーが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｈｆＭＳＣ接着、増殖および骨形成分化を支持することを示す。
【０４８０】
実施例１０−ポリ−Ｌ−リジン、ポリブレンおよびＥＣＭタンパク質フィブロネクチンおよびビトロネクチンでのＰＣＬ微小球体のコーティング
ポリブレン（ＰＢ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ．（カタログ番号１０７６８９）から購入し、ビトロネクチン（ＶＮ）をＰｒｉｍｏｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（カタログ番号０７１８０）から購入し、そしてフィブロネクチン（ＦＮ）をＳｉｇｍａ（カタログ番号＃Ｆ０８９５）から得た。微小球体をＰＬＬ、ＰＢ、ＶＮ、またはＦＮの一層またはいくつかの層でコーティングした。１．５ｍｌエッペンドルフ試験管中、ＰＬＬ、ＰＢ、ＶＮまたはＦＮの１ｍｌ  ＰＢＳ溶液中で、ＰＣＬ微小球体４００ｍｇを室温で１５時間インキュベーションすることによって、各コーティング層を適用した。沈着のために用いたＰＬＬ、ＰＢ、ＦＮおよびＶＮ溶液濃度は、それぞれ４８０、４８０、１２０および１２０μｇ／ｍｌであった。それぞれ、ＰＬＬ、ＰＢ、ＦＮまたはＶＮの各層でコーティングした後、コーティングしたＰＣＬ  ＭＣをＰＢＳ中で２回リンスした。このプロセスを各コーティング溶液で反復することによって、以下の多層コーティングをＰＣＬマイクロキャリアー（上述のように製造）上に沈着させた：
【０４８１】
【化１】
0006416206.tif 000002
【０４８２】
実施例１１−一定の攪拌培養において、付着支持体コーティングＰＣＬマイクロキャリアー上の間葉系幹細胞の培養
付着支持体（実施例９）の異なる層でコーティングしたＰＣＬマイクロキャリアーを、振盪プラットフォーム上、攪拌培養中に、１０％ウシ胎児血清含有培地中で、ＭＳＣ増殖を支持する能力に関して試験した。４０ｍｇのＰＣＬマイクロキャリアー（または対照としての４ｍｇのＣｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアー）あたり６．５ｘ１０４細胞でＰＣＬマイクロキャリアー上にｈＭＳＣを植え付け、そして静置培養中、または振盪プラットフォーム上、一定の攪拌のいずれかで、Ｔ２５超低接着フラスコ中で増殖させた（２８振動／分）。
【０４８３】
フィブロネクチン、ポリ−Ｌ−リジン、およびフィブロネクチン（ＦＮ−ＰＬＬ−ＦＮ）の三重層でコーティングしたＰＣＬマイクロキャリアーは、こうした条件下でＭＳＣの増殖を支持し、投入量を超える、細胞数の１４倍の増加を生じた（図２０）。これらの細胞は、ＭＳＣに特徴的な細胞表面マーカーを発現した（図２２Ｂ）。
【０４８４】
ＰＣＬマイクロキャリアーを、静置培養中、血清含有培地中でＭＳＣ増殖を支持する能力に関して試験した。中心層がポリ−Ｌ−リジンで、フィブロネクチンおよび／またはビトロネクチンの三重層からなるコーティングは、すべて、ＭＳＣ増殖を支持した（図２３）。
【０４８５】
図２４は、振盪プラットフォーム上、一定の攪拌で、血清含有培地中のＭＳＣ増殖を示す。
【０４８６】
実施例１２−サイズ分布パラメーター
連続相（Ｖｃ）および分散相（Ｖｄ）の異なる流速で、１％ＰＣＬ／ＤＣＭ溶液で作製されたＰＣＬマイクロキャリアーに関するサイズ分布パラメーター（μｍのｄｘ）、ならびに乾燥ＰＣＬマイクロキャリアー１μｇの面積および数を以下の表に提供する。
【０４８７】
【表１】
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【０４８８】
ＰＣＬマイクロキャリアーは、水溶液中で、認識されうるほど膨張しなかった。ＰＣＬマイクロキャリアーの走査型電子顕微鏡は、マイクロキャリアーの全体の密度の減少に寄与する、表面孔の存在を確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
0006416206.tif 000007
【図５】
0006416206.tif 000008
【図６】
0006416206.tif 000009
【図７−１】
0006416206.tif 000010
【図７−２】
0006416206.tif 000011
【図８】
0006416206.tif 000012
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0006416206.tif 000020
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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