(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
星状ヒト脳腫瘍を非星状ヒト脳腫瘍と区別するための方法であって、
星状ヒト脳腫瘍をＳＲ１０１で標識するためにＳＲ１０１で脳腫瘍を有する疑いのある対象由来の腫瘍組織を染色する工程、及び
星状腫瘍型か非星状腫瘍型かを確認するために蛍光画像装置を用いてＳＲ１０１で染色された該組織を可視化する工程
を含み、
対象由来の該腫瘍組織を生体外で染色する、前記方法。
【請求項２】
該非星状ヒト脳腫瘍は乏突起膠腫である、請求項１記載の前記方法。
【請求項３】
該非星状ヒト脳腫瘍はＣＮＳリンパ腫である、請求項１記載の前記方法。
【請求項４】
該染色する工程及び該可視化する工程を術中に行う、請求項１記載の前記方法。
【請求項５】
齧歯類の異種移植片におけるヒト神経膠腫細胞を迅速に生体内で標識化するための方法であって、
神経膠腫細胞を有する腫瘍組織を染色するために固定可能なＳＲ１０１を該齧歯類に投与する工程、及び
蛍光画像装置を用いて固定可能なＳＲ１０１で染色された該組織を可視化する工程
を含む、前記方法。
【請求項６】
該投与する工程は動脈内注入を含む、請求項５記載の前記方法。
【請求項７】
該可視化する工程は腫瘍境界の描写を含む、請求項５記載の前記方法。
【請求項８】
該可視化する工程は浸潤性腫瘍細胞の描写を含む、請求項５記載の前記方法。
【請求項９】
星状細胞腫の腫瘍境界を決定するための方法であって、
ＳＲ１０１を用いて対象由来の星状細胞腫の腫瘍組織を染色する工程、及び
該星状細胞腫と非星状細胞腫組織の間の境界を決定するために蛍光画像装置を用いて該組織を可視化する工程
を含み、
対象由来の該腫瘍組織を生体外で染色する、前記方法。
【請求項１０】
該染色する工程及び該可視化する工程は術中で行う、請求項９記載の前記方法。
【請求項１１】
星状腫瘍型か非星状腫瘍型かを確認して腫瘍境界を定義するために使用されるＳＲ１０１。
【請求項１２】
星状ヒト脳腫瘍を非星状ヒト脳腫瘍と区別するためのキットを製造するためのＳＲ１０１の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
外科的腫瘍切除は内因性脳腫瘍を含む、多数の癌の最先端治療である。術中の病理的組織診断は外科的切除戦略の指針となる。１００年にもわたって凍結切片がこの病理的診断を得るための選択法であり続けている。有用ではあるが、この技術はアーチファクトを生じその形態及び細胞構造に基づいた組織についての限定的で非特異的な情報しかもたらさない。凍結切片では迅速かつ特異的な情報が得られないので、最も信頼のおける術中の手術計画を策定することが制限されてしまう可能性がある。
【０００２】
一方、医療チームは特異的分子マーカーを同定するために生検した組織の術後の抗体染色に、実際にはしばしば２４〜７２時間かかる過程を待たされることとなる。時々、誤った術中診断により手術が不完全に終わり、結果的に切除が不完全となってしまうことがある。このことにより予後に悪影響をもたらし追加の外科的介入を要することがありうる。他の腫瘍型に関しては、非外科的治療アプローチが最も有効であり、誤診により患者において不必要な切除からくる合併症や副作用の危険性を大いに高めてしまう可能性がある。加えて、診断の不正確さと遅れが患者への不安を高め医療費負担を増大することがありうる。
【０００３】
分子及び細胞イメージングの進歩により研究者にとって組織の特徴付けがますます有効になってきている。しかしながら、これらの進歩した画像化技術の多くの臨床病理学への応用は未発達であるか未だ有用性が知られていないままである。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書の開示は星状ヒト脳腫瘍を非星状ヒト脳腫瘍と区別するための方法及びシステムに関する。１つの実施形態において、方法は脳腫瘍を有する疑いのある対象由来の腫瘍組織をＳＲ１０１で染色する工程及び星状腫瘍型か非星状腫瘍型かを確認するために蛍光画像装置を用いてＳＲ１０１で染色された前記組織を可視化する工程を含む。
【０００５】
有利には、対象由来の腫瘍組織を生体外で染色し、かつ術者を誘導することによってその後の手術の必要性を最小限にするか排除するために前記の染色工程及び可視化工程を術中で行う。
【０００６】
本発明の更なる特徴及び利点は添付の図面と合わせて読むと特定の好ましい実施形態の以下の詳細な記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１に非固定性ＳＲ１０１が培養下のヒト星状細胞腫細胞を標識し齧歯類の異種移植片において腫瘍核及び腫瘍境界を同定することを示す結果を描写する。Ｕ２５１星状細胞腫の細胞培養物（Ａ−Ｂ）。（Ａ）ＳＲ１０１と共にインキュベーションしたヒトＵ２５１星状細胞腫細胞の蛍光オーバーレイを伴うＤＩＣ画像。（Ｂ）挿入図は細胞の細胞質充填及び細胞核の描写（矢じり）を示す。Ｕ２５１細胞と共に頭蓋内に移植した齧歯類由来の急性スライス（Ｃ−Ｈ）。（Ｃ）Ｕ２５１由来腫瘍を含む急性スライス。代表的な核及び境界領域はそれぞれ白い円及び灰色の円で特定される。（Ｄ）ＳＲ１０１で標識した腫瘍核の共焦点蛍光画像。（Ｅ）Ｕ２５１細胞の典型的な形態を示す高倍率の挿入図。（Ｆ）腫瘍核と背景の間のＥにおけるＳＲ１０１蛍光分布の柱状グラフ（ｘ軸は画素数であり、ｙ軸は蛍光強度である）。腫瘍（１０２．８４）と背景（８．７４）とでは平均蛍光強度（ＭＦＩ）において明確に異なることに注目されたい。（Ｇ）ＳＲ１０１で標識した細胞を用いた腫瘍境界の画像。（Ｈ）腫瘍境界付近の神経膠腫細胞（矢じり）に囲まれた形態学的に同定された反応性星状細胞（矢印）の挿入図。（Ｉ）背景に対して正規化されたＵ２５１細胞及び反応性星状細胞の平均蛍光強度（ｙ軸）（３つの急性スライス由来のｎ＝９の光学切片）。２つの細胞型の間でＭＦＩにおける統計学的に顕著な違いはなかったことに注意されたい。スケールバー＝２０ｕｍ。
【０００８】
【図２】図２に固定可能なＳＲ１０１が星状細胞のマーカーＧＦＡＰと共に着色することを示す結果を描写する。固定可能な型のＳＲ１０１中でインキュベーションした齧歯類の異種移植片の急性スライスの共焦点画像。インキュベーション後スライスを固定しＧＦＡＰ及びＤａｐｉで染色した。星状細胞腫の核を撮影した画像（Ａ−Ｄ）。固定可能なＳＲ１０１は細胞核におけるＧＦＡＰ陽性細胞の細胞体を満たすが、星状細胞の突起（矢）はわずかに満たすだけである。境界画像においてＧＦＡＰ、ＤＡＰＩ及びＳＲ１０１は顕著に重複することに注意されたい。前記星状細胞腫の境界を撮影した画像（Ｅ−Ｈ）。固定可能なＳＲ１０１は腫瘍境界でＧＦＡＰ陽性細胞の細胞体を満たす。実線の矢印はＳＲ１０１及びＧＦＡＰ陽性細胞を特定する。前記星状細胞腫の境界で選択的に認められるＳＲ１０１又はＧＦＡＰで標識されないＤＡＰＩ陽性細胞（矢じり）の外観に注意されたい。スケールバー＝２０ｕｍ。
【０００９】
【図３】図３にＳＲ１０１は齧歯類の異種移植片においてＣＮＳリンパ腫とヒト星状細胞腫を迅速に区別することを示す結果を描写する。星状細胞腫細胞（Ｕ２５１）（上部）又はリンパ腫細胞（ＭＣ１１６）（中間部）と共に移植した異種移植動物からとった急性スライスの共焦点画像。スライスは固定可能なＳＲ１０１及び星状細胞腫（ＧＦＡＰ）又はリンパ腫（ＣＤ２０）に特異的なマーカーを用いて染色した。核はＤＡＰＩで対比染色した。上部：固定可能なＳＲ１０１と共にインキュベーションしＧＦＡＰ及びＤＡＰＩで対比染色したＵ２５１星状細胞腫の急性スライスの領域（Ａ−Ｄ）。中間部：（Ｅ）ＳＲ１０１はＭＣ１１６異種移植片のリンパ腫領域において単一細胞を標識する（破線矢印）。（Ｆ）ＣＤ２０免疫染色によりリンパ腫細胞が標識されるがＳＲ１０１陽性細胞を含む領域は標識されない（実線矢印）。（Ｇ）視野内の細胞核のＤＡＰＩ対比染色。（Ｈ）ＳＲ１０１とＣＤ２０の共局在化が乏しいことを示す統合リンパ腫画像。スケールバー＝２０ｕｍ。下部：急性スライスの共焦点立体学（方法参照）。（I）Ｕ２５１異種移植片星状細胞腫領域に存在するＳＲ１０１及びＧＦＡＰ陽性細胞の数は統計学的な違いはない（ｐ＜０．０１＊）。（Ｊ）ＭＣ１１６異種移植片リンパ腫領域に存在するＳＲ１０１及びＣＤ２０陽性細胞の数は統計学的に大いに異なる（ｐ＜０．０１＊）。（Ｋ）ＳＲ１０１はＣＤ２０リンパ腫細胞（１．９７％）と比べＧＦＡＰ陽性星状細胞腫細胞（７９．６％）と顕著に重複する（ｐ＜０．０１）。
【００１０】
【図４】図４にＳＲ１０１はヒト星状細胞及び星状脳腫瘍を選択的に標識することを示す結果を描写する。ヒト脳腫瘍生検はＳＲ１０１で迅速に染色され共焦点顕微鏡で画像化される。（Ａ）ＳＲ１０１で標識されたヒト脳腫瘍由来の星状細胞。（Ｂ）形態的に異なる腫瘍細胞及び反応性星状細胞を有する低悪性度の星状細胞腫。（Ｃ）グレードＩＶの星状細胞腫。（Ｄ）Ｃ由来の挿入図；富核及び核がはっきりと示される（矢じり）。（Ｅ−Ｇ）ＳＲ１０１で細胞質が満たされた細胞のない非星状腫瘍。組織における暗い領域は細胞体の位置を示す。（Ｈ）乏突起膠腫はＳＲ１０１では染色されない。（Ｉ）リンパ腫はＳＲ１０１染色に陰性である。スケールバー＝２０ｕｍ。
【００１１】
【図５】図５にＳＲ１０１で染色されたヒト生検の分布及び最終診断を示す。ＳＲ１０１は１５の星状細胞腫の症例の内の１４例及び多形性黄色星状細胞腫を選択的に染色した。ＳＲ１０１は追加的に試料化したＣＮＳ新生物由来の腫瘍細胞を染色しなかった。
【００１２】
【図６】図６に固定可能なＳＲ１０１の動脈内注射後の齧歯類異種移植片におけるヒト神経膠腫細胞の特異的な生体内標識化を示す。（Ａ）低拡大画像は腫瘍細胞及び腫瘍境界のＳＲ１０１標識化を示す（矢印）。（Ｂ）腫瘍境界の高拡大画像は浸潤性腫瘍細胞の標識化を示す（破線矢印）。
【図７】図７に星状ヒト脳腫瘍を非星状ヒト脳腫瘍から迅速に手術中に確定するのを促進するシステム又はキットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載する実施形態の様相には生理学的蛍光色素分子を用いる生細胞画像技術の使用が含まれ、前記蛍光色素分子はより迅速で特異的な最終病理学的診断をもたらすことによって現在の標準的な医療を激変しうる。
【００１４】
膠芽腫（ＧＢＭ）、グレードＩＶの星状細胞腫は、平均生存期間が１１〜１５ヶ月しかない、星状細胞腫の最も一般的な亜型である。患者の生存期間は腫瘍境界を手術中に同定することによって導かれるＧＢＭ腫瘍切除の範囲に直接関係する。一方、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫等の、他のＣＮＳ腫瘍に関しては、根治的切除は禁忌であり、最も一般的な外科的手法は診断的生検のみである。従って、腫瘍のこれら２つの型を区別することは治療行動の方向性を決定する上で重要である。現在、形態的手法単独ではしばしば不充分であり切除した脳組織の抗体染色を必要とする。ＧＢＭ及びリンパ腫は患者の生検標本を免疫染色することによって区別される。グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）はＧＢＭの診断を積極的に支持するのに対して、ＣＤ２０はＣＮＳ・Ｂ細胞リンパ腫を積極的に同定する。有効ではあるが、この方法はこれまで手術の間に完了させるには時間がかかり過ぎていた。
【００１５】
スルホローダミン１０１は生きている組織中の星状細胞を同定するために神経科学研究において幅広く使用されている。この染色の機構は完全には理解されていないが、大多数の報告により染色が迅速に生細胞に作用し星状細胞を特異的に標識することが立証されている。ＳＲ１０１の標識化はＧＦＡＰに類似しており、培養下の齧歯類の星状細胞腫細胞を標識することが示されている。
【００１６】
特定の実施形態を更に説明すると、以下の実施例において、星状腫瘍亜型を識別するため、腫瘍境界を定義するために、原発性脳腫瘍の最も一般的な組織型である、星状細胞腫のマーカーとして蛍光色素分子、スルホローダミン１０１（ＳＲ１０１）を使用することが記載される。
【実施例】
【００１７】
細胞培養：本発明者らはヒト神経膠腫細胞系Ｕ２５１及びヒトＣＮＳリンパ腫細胞系ＭＣ１１６をＡＴＣＣから入手した。細胞はそれぞれ１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地、及び２０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地を用いて培養下で維持した（ニューヨーク州、グランドアイランドのInvitrogenから全て入手）。細胞は３７℃で加湿インキュベーター中５％ＣＯ２下で成長させた。
【００１８】
インビトロのＳＲ１０１標識化：本発明者らはＵ２５１神経膠腫細胞をコラーゲンで被覆したガラス底培養皿（MatTek）に１００，０００細胞を播種することによって標識化した。２４時間後、培地を５ｕＭのＳＲ１０１（Sigma）含有ａＣＳＦに２０分間置換した後、標準ａＣＳＦで５分間２回洗浄した。
【００１９】
動物：１５匹の雄性Crl:NIH-Foxnlmuラット（５週齢）をThe Charles River Laboratories International, Inc.（マサチューセッツ州、ウイルミントン）からえた。実験はthe National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに記載された指針及び規制に従って行い、the Institutional Animal Care and Use Committee of the Barrow Neurological Institute and St. Joseph's Hospital and Medical Centerによって承認された。
【００２０】
頭蓋内移植：動物を１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン及び８０ｍｇ／ｋｇのケタミンの混合物(ニュージャージー州、マディソンのWyeth)を筋注することにより麻酔し、小動物用定位頭部枠内に配置した（カリフォルニア州、タハンガのDavid Kopf Instruments、モデル９００）。動物の眼の間から開始して１０ｍｍ切開し、前項を露出させた。前項から側方に３．５ｍｍの穿頭孔をあけた。シリンジ（Hamilton）を５．０ｍｍ進めて０．５ｍｍのポケットを生じた後脳の表面から下方に４．５ｍｍの深さにＵ２５１又はＭＣ１１６細胞を注入した。細胞懸濁液は３．００μＬ／分の注入速度で１０μＬの量にセットしたＵＭＰ３−１・UltraMicroPump微量注入器（フロリダ州、サラソータのWPI）を用いて注入した。前記細胞懸濁液の逆流を最小限にするために注入から２分後に針を抜いた。前記穿頭孔を骨ろうで覆い皮膚切開を縫合した。
【００２１】
急性スライス：移植から２０日後、前述のキシラジン／ケタミン混合物を用いてラットに深く麻酔をかけた。動物は頭部を迅速に切除し、脳を取り出し、前頭皮質スライス（３５０ｕｍ厚）をvibratome上で切り取った（TrentのaCSFプロトコル）。スライスを次いで室温で５ｕＭのＳＲ１０１含有ａＣＳＦ中２０分間インキュベーションした後ａＣＳＦで１０分間洗浄した。
共標識化：異種移植片の急性スライスは固定可能な型のＳＲ１０１（Texas Redヒドラジド; Sigma）と共にインキュベーションし、室温で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて１２時間４℃で固定した。次いで、スライスをリン酸緩衝生理食塩水中ですすぎ、０．３％トリトンで透過処理し、ＣＡＳブロック（Invitrogen）でブロックした（Pierreの論文参照）。ＧＢＭ異種移植片スライスを抗ＧＦＡＰ一次抗体中で１２時間インキュベーションし（Millipore； 1:500）、リンパ腫切片は抗ＣＤ２０一次抗体中で１２時間インキュベーションした（Millipore； 1:250）。切片は次にすすいでAlexaFluor488二次抗体（Invitrogen）と共にインキュベーションし、次いでＤａｐｉ（Invitrogen）を用いて核対比染色を行った。蛍光標識された切片はvectashield（Vector labs）及びNo1.5カバースリップ（VWR）を伴うスライド上にのせた。
【００２２】
立体学：本発明者らは固定可能なＳＲ１０１と共にインキュベーションした腫瘍を含む各脳由来の１つの吻側、正中、及び尾側の急性スライスを無作為に選択した。神経膠腫のスライスをＧＦＡＰに関して免疫蛍光を利用して染色し、リンパ腫含有スライスをＣＤ２０に関して染色した。各スライスにおける１０の無作為に選択した１５０ｕｍ２の腫瘍領域をZeiss 710LSMを用いて５０ｕｍに光学的に分割した。各画像スタックの最初の５ｕｍを破棄し分割の間に損傷した細胞由来のカウントを最小限に抑えた。最大強度の突出画像は残りの４５ｕｍから生じ、立体学解像装置を前記画像に重ね合わした。前記解像装置内の細胞及びその左縁と底縁に接触する細胞をＧＦＡＰ又はＣＤ２０陽性のいずれか、及びＳＲ１０１陽性についてカウントした。免疫染色及びＳＲ１０１陽性の間で重複するパーセントを算出した。０．０５以下に設定した有意性を有するｔ−検定を用いて神経膠腫及びリンパ腫モデルにおいて抗体とＳＲ１０１で標識された細胞の間で違いがあるかどうかを決定した。
【００２３】
生体内での標識化：移植後２０日後、前述のケタミン／キシラジン混合物を用いてラットに深く麻酔をかけた。次いで前記ラットの動脈内にTexas redヒドラジドを注射した。注射から２時間後、脳を環流し、固定し低温保持装置上で切片とした。切片をスライドに載せZeiss LSM 710共焦点顕微鏡を用いて撮像した。
【００２４】
ヒト試料：この研究はSt. Joseph's Hospital and Medical Centerの施設内倫理委員会の承認をえており、全ての手術はthe Barrow Neurological Instituteで行った。全ての対象は参加に関して術前に同意した。試料は術者が安全と決定した位置で腫瘍塊内から開頭術時に取得した。平均の大きさが４ｘ２ｘ２ｍｍの試料を５ｕＭのＳＲ１０１を含有する氷冷した人工髄液（aCSF）内に移した。試料は次いで手術室から研究室に移送し、aCSFですすぎ（１０分間）、直ちに画像化した。
【００２５】
画像化：ＳＲ１０１で標識された試料を非被覆No.1.5ガラス底培養皿に配置し、40x/l.2NA水浸対物レンズを備えたZeiss 710レーザー走査共焦点顕微鏡のステージ上に設置した。本発明者らは５６１ｎｍダイオードレーザーで蛍光色素分子を励起し５９５ｎｍ〜６２５ｎｍの発光を集めることによりＳＲ１０１を画像化した。共焦点開口は全ての画像化に関してエアリーユニット（Airy unit）に設定した。レーザー及びゲイン値は光電子増倍管のダイナミック・レンジを満たすように設定し、フレームの大きさはナイキストで試料をとるように設定した。画像は非線形処理をせず８及び１２bit形式で収集した。染色していない隣接組織試料を各試料について画像化した。場合によって、広い視野でタイトルを付し光学的に分割した画像をZeiss線掃引共焦点顕微鏡を用いて迅速に取得した。このシステムに関するフレームの大きさはリニア電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイにより５１２ｘ５１２に固定した。
【００２６】
スルホローダミン１０１はヒト星状細胞腫細胞及び反応性星状細胞を標識する
ＳＲ１０１は赤色蛍光染料であり、迅速かつ特異的に星状細胞を標識するために神経科学の研究において繰り返し使用されている。ヒト星状細胞腫細胞を同様に同定するためのこの蛍光色素分子の可能性を調べるために、本発明者らは先ずＳＲ１０１を培養下のヒト星状細胞腫の細胞系Ｕ２５１に適用した。短インキュベーション及び蛍光オーバーレイを用いる微分干渉イメージングの後、前記蛍光色素分子は前記培養細胞の細胞質を満たし細胞核の輪郭を明確に線引きした（図１Ａ，１Ｂ）。このことがきっかけとなり動物モデルにおける星状細胞腫細胞を標識するＳＲ１０１の能力を研究することとなった。
【００２７】
本発明者らはヒト星状細胞腫細胞を頭蓋内から充分に特徴付けられた腫瘍を一貫して生じることが知られているモデルを用いてヌードラットの尾状核被殻内に移植した（tomoko, sontheimer）。腫瘍を４週間成長させた後、本発明者らは前記動物から急性スライスを調製した（図１Ｃ）。次いで２０分間浴に適用することによりスライスをＳＲ１０１で迅速に処置し生細胞の共焦点画像を撮影した。薄いレベルの背景染色とは明確に区別される腫瘍核を撮った画像により細胞がＳＲ１０１で著しく標識されることが示された（図１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ）。
【００２８】
腫瘍核を迅速に同定することは診断を補助するのに重要である。しかしながら、それは星状細胞腫の切除を誘導するのに最終的に重要となる腫瘍境界の同定である。この点について、本発明者らはＳＲ１０１で処理した前記急性スライス内の腫瘍境界を画像化するために共焦点顕微鏡を再度用いた。ＳＲ１０１染色によりＳＲ１０１陽性星状細胞腫細胞及び反応性星状細胞を含んだ明確に異なる腫瘍境界が明らかとなった（図１Ｇ，１Ｈ）。星状細胞腫細胞及び反応性星状細胞からの蛍光強度を定量した後、本発明者らはこれら２つの細胞型の間で平均蛍光強度に違いがないことを見出した（図１Ｉ）。しかしながら、反応性星状細胞はこれらの明確に異なる形態に基づいて容易に区別できるであろう（図１Ｈ）。これらの結果からヒトＳＲ１０１染色は細胞培養下及び動物モデルにおいて星状細胞だけでなく、星状細胞腫の腫瘍細胞も迅速に同定するのに極めて有用であり、前記腫瘍境界を定義するのに有効なツールであることが示される。
【００２９】
固定可能なＳＲ１０１はＧＦＡＰ陽性ヒト星状細胞腫細胞及び反応性星状細胞を標識する。
次に本発明者らは星状細胞腫の同定に関して臨床基準である、ＧＦＡＰ抗体染色とＳＲ１０１の染色局在性を比較した。ＳＲ１０１は固定には適していないので、本発明者らはこれらの実験にＳＲ１０１の固定可能な型を用いた（Texas Redヒドラジド）。この蛍光色素分子の染色パターンはＳＲ１０１の染色パターンに類似することは充分に確認されている。本発明者らは星状細胞腫の異種移植片由来の急性スライスを固定可能なＳＲ１０１と共にインキュベーションし、前記スライスを固定し、ＧＦＡＰ及びＤＡＰＩを用いて対比染色を行った。
【００３０】
腫瘍核領域を撮った共焦点画像にはＧＦＡＰ陽性である固定可能なＳＲ１０１で満たされた多数の細胞が示されていた（図２Ａ−２Ｄ）。いくつかの細胞突起はＧＦＡＰよりも固定可能なＳＲ１０１に関して染色強度が低かった（矢印２Ａ，２Ｂ，２Ｄ）。腫瘍核由来の統合画像によれば大部分の細胞が固定可能なＳＲ１０１及びＧＦＡＰの両方に陽性であることが明らかに示された。
【００３１】
反応性星状細胞は脳腫瘍の外側領域に密集して存在し、ＳＲ１０１及びＧＦＡＰに対して陽性である。これらの細胞はＳＲ１０１陽性であるので、これらをＳＲ１０１陽性腫瘍細胞と区別することが重要である。従って、本発明者らはこれらの細胞において固定可能なＳＲ１０１の染色パターンをＧＦＡＰと比較した。本発明者らは星状細胞腫に隣接する脳領域を撮像し固定可能なＳＲ１０１及びＧＦＡＰに関して類似の染色パターンを見出した（図２Ｅ，２Ｆ）。しかしながら、膜突起のより完全な標識化はＧＦＡＰ標識で明らかとなった。周辺領域における細胞は広範囲の膜突起物を含み、これら突起物はこの特徴を欠いた腫瘍核内の細胞とは差別化しうるであろう。本発明者らはこれらの領域のさらなる細胞をＤＡＰＩを用いて染色することによって同定し（図２Ｇ）、固定可能なＳＲ１０１及びＧＦＡＰの両方に陰性な細胞の群を観察した（図２Ｇ，２Ｈ矢印）。このことにより腫瘍核の外側領域に典型的な混合細胞集団が存在することが示された。まとめると、これらのデータにより固定可能なＳＲ１０１と共にインキュベーションした組織はＧＦＡＰと共に共局在化するように染まることが示され、ＳＲ１０１陽性細胞はＧＦＡＰ陽性星状細胞腫の細胞集団であることが確認され、固定可能なＳＲ１０１により星状細胞腫細胞を反応性星状細胞と区別するのに充分な形態学上の情報がもたらされる。
【００３２】
ＳＲ１０１は星状細胞腫をリンパ腫と区別する。
星状細胞腫のリンパ腫との確定的な術中区別は現在の臨床業務では不可能である。リンパ腫患者は切除することなく最善の治療がなされるが、星状細胞腫患者は最大の腫瘍切除で恩恵を受けるので、この差異は極めて重要である。現在、これらの腫瘍はＧＦＡＰ及びＣＤ２０を用いる２段階抗体染色で臨床的に識別されている。ＧＦＡＰ陽性は星状細胞腫の診断を支持し、一方、ＣＤ２０陽性であればリンパ腫との診断を支持する。この方法は実際に診断が出るまで典型的に最短でも２４時間を要するので、手術中に情報をもたらすには遅過ぎる。
【００３３】
本発明者らはこれらの腫瘍を区別するための迅速な診断情報をもたらすのにＳＲ１０１を実際に用いうるか実行可能性を研究した。ＳＲ１０１が齧歯類の異種移植片において星状細胞腫細胞を特異的に標識することを本発明者らは見出したので、ヒトＣＮＳリンパ腫動物モデルに対するその作用を試験した。本発明者らはヒトＣＮＳリンパ腫細胞と共に頭蓋内に移植したヌードラットから急性スライスを作製し、前記スライスをＳＲ１０１と共にインキュベーションした。前記スライスの共焦点画像化によりリンパ腫領域からＳＲ１０１の信号は最少であることが示された。
【００３４】
次に、本発明者らは星状細胞腫及びＣＮＳリンパ腫動物モデル由来の急性スライスを固定可能なＳＲ１０１と共にインキュベーションし、星状細胞腫スライスに関してＧＦＡＰ及びリンパ腫スライスに関してＣＤ２０への染色局在化を定量した。本発明者らは固定可能なＳＲ１０１及びＧＦＡＰ又はＣＤ２０抗体で標識した腫瘍細胞を定量するために標準的な立体学的手法を採用した。固定可能なＳＲ１０１は星状細胞腫の腫瘍領域における大部分の細胞を標識した（図３Ａ−３Ｄ，３Ｉ）。ＣＮＳリンパ腫において、ＳＲ１０１は腫瘍領域の少数の細胞しか標識しなかった（図３Ｅ）。リンパ腫領域における固定可能なＳＲ１０１によって標識されたいくつかの細胞はＣＤ２０陽性ではなく、形態に基づいて反応性星状細胞であることが明らかであった（図３Ｅ，３Ｆ，３Ｈ矢印）。
【００３５】
統計学的に、星状細胞腫領域におけるＳＲ１０１陽性細胞の数はＧＦＡＰ陽性細胞の数と違いはなかった（図３Ｉ）。しかしながら、リンパ腫スライスにおいて、固定可能なＳＲ１０１陽性細胞よりもＣＤ２０陽性細胞の方が著しく多かった（図３Ｊ）。本発明者らは抗体局在化を比較し、ＳＲ１０１が星状細胞腫領域において７９．６％のＧＦＡＰ陽性細胞と共に局在化し、リンパ腫腫瘍領域において１．９７％のＣＤ２０陽性細胞と共に局在化していたことがわかった（ｐ＜０．００１）（図３Ｋ）。このことにより星状細胞腫におけるＳＲ１０１のＧＦＡＰ陽性細胞への共局在化が立証され、この星状細胞腫瘍をＣＮＳリンパ腫等の非星状腫瘍と迅速に識別できる能力が立証される。
【００３６】
ＳＲ１０１はヒト星状細胞腫を他のヒトＣＮＳリンパ腫新生物と術中に区別する
本発明者らは動物モデルにおいて星状細胞腫細胞及び反応性星状細胞を迅速に標識化し区別するためのＳＲ１０１の能力を同定した後、手術中の診断薬としてのその有用性を試験した。本発明者らはＳＲ１０１で標識した新鮮なヒト脳腫瘍生検を共焦点蛍光イメージングすることによって星状脳腫瘍を手術中に同定する実行可能性を決定した。本発明者らは全部で１０の一般的なヒト脳腫瘍型の患者６０人＊からの試料をスクリーニングした。伝統的な免疫組織化学並びにパラフィン包埋ヘマトキシリン及びエオシン組織病理学により決定した診断を比較する目的で最終的な診断とした。
【００３７】
組織試料を人工髄液に移し切除から３０〜４０分以内に画像化した。本発明者らは最初にＳＲ１０１が腫瘍のない脳における星状細胞の細胞質を満たすことを見出した（図４Ａ）。次に、本発明者らは腫瘍境界からサンプリングした組織を調べたところ、ＳＲ１０１がこれら領域における反応性星状細胞及び腫瘍細胞の細胞質を満たすことを見出した（図４Ｂ）。本発明者らはまた星状細胞腫の腫瘍核由来の細胞の細胞質が濃く染色されることも見出した（図４Ｃ）。より高い倍率で、本発明者らはＳＲ１０１がいくつかの細胞核の輪郭を描きいくつかの神経膠腫の共通特性である核異型を同定することを観察した（図４Ｃ）。非星状腫瘍試料において、ＳＲ１０１は非特異的な背景染色を生じた。これらの腫瘍生検において、ＳＲ１０１は細胞体の位置のあらましを示すが細胞質への充填は生じなかった（図Ｅ−Ｉ）。
【００３８】
興味深いことに、ＳＲ１０１はしばしばＧＦＡＰ陽性のある種の低悪性度のヒト乏突起膠腫試料を標識しなかった（図４Ｈ）。前記動物モデルのデータを裏付けとするように、ＳＲ１０１はヒトリンパ腫を染色しなかった（図４Ｉ）。これらのデータによりＳＲ１０１のヒト星状細胞、星状細胞腫及び反応性星状細胞に対する特異性が示される。共焦点顕微鏡と組み合わされたＳＲ１０１染色によりヒト星状腫瘍及び反応性星状細胞を術中の手術方針決定を支援する時間枠内で迅速に同定できるようになる。
【００３９】
本発明者らは蛍光染料スルホローダミン１０１に生体外で暴露することによって最も一般的な主要脳腫瘍を同定する技術を実証した。この技術は手術がまだ進行しているうちに診断を下すのに充分な速さで完了することができる。本発明者らの研究において、本発明者らはＳＲ１０１の特異性に関してヒト細胞培養、同所齧歯類異種移植片、及びヒト腫瘍試料において試験を行った。免疫細胞化学及び最終的な病理学的なパラフィン包埋診断と比較して、ＳＲ１０１は全てのモデル系で星状腫瘍のより迅速で同様に正確な同定をもたらした。ヒト試料において、ＳＲ１０１は星状腫瘍及びそれらの境界の効果的な視覚化と区別をもたらした。
【００４０】
タイムリーでかつ正確な術中診断における改良は臨床神経外科において強く求められている。現在の診断技術は標準的な光学顕微鏡及び通常の造影剤を用いる組織の可視化に依存しており、技術はここ１００年に渡ってほとんど進歩していない。本明細書において、本発明者らは共焦点イメージングと組み合わせた生体外での組織の蛍光標識が現在の診断技術と比較して明確な恩恵をもたらしうることを示している。本発明者らの技術により凍結、固定、又は切片化を行うことなく病理組織を可視化できる。組織から収集した画像により手術がまだ進行している間に患者の治療指針をもたらすために時間枠内に診断を下すことが可能となる。
【００４１】
本発明者らは近代化した病理学部門では生体外での組織の蛍光イメージングは一般的な技術となるであろうと予想する。本発明者らはこの診断様式が解剖病理学、高いグレードの星状細胞腫をＣＮＳリンパ腫と差別化することができる即座に利益をもたらす実施例を確認した。これらの腫瘍は切除する間に類似の肉眼的外観で存在しているが、それらの治療計画は著しく異なる。星状細胞腫では患者に延命効果をもたらすには最大限の安全な切除が必要とされるが、リンパ腫では生検を行いアジュバント療法で治療することが最善である。これらの腫瘍を区別するには診断処理に最短でも２４時間かかる外科生検が必要となる。本発明者らはこれらの腫瘍をＳＲ１０１染色及び共焦点顕微鏡により生検の３０分以内で区別できることを見出した。この情報により手術計画に迅速な変更が可能となりその結果改良がもたらされるであろう。従って、星状ヒト脳腫瘍を非星状ヒト脳腫瘍から迅速に手術中に確定するのを促進するシステム又はキットを提供する（図７）。前記キットはＳＲ１０１を含有する氷冷人工髄液を有する容器、ＳＲ１０１を含まない氷冷人工髄液を有する容器、及び染色／画像化の間に組織を配置するための基材を含む。前記システムには蛍光画像装置が加えられる。
【００４２】
顕微鏡での視覚化及び深部生体内構造の診断を可能にするプローブ及び装置は現在開発中である。いくつかの生体内蛍光画像化機器は既に臨床で試験されている（Confocal, FLIM, Optiscan）。しかしながら、安全上の懸念から、いくつかの蛍光色素分子及び画像化様式は生体内の臨床使用には決して承認されないであろう。本発明者らは生体内の臨床使用には安全ではないかもしれない技術で処理された組織からの情報をもたらす生体内画像化を迅速な生体外診断器具が将来補完するであろうと確信している。
【００４３】
前記共焦点顕微鏡システムを用いるのに加えて、前記実施例において記載したように、ＳＲ１０１蛍光色素分子は例えば、広視野/落射蛍光又は多光子顕微鏡システム等のいずれの蛍光顕微鏡を用いても撮像できることがわかっている。前記蛍光色素分子は生体外ではもちろん生体内でも（局所及び注射可能）、種々の濃度で使用できる。１つの実験において、０．５ｕＭ〜１ｍＭの濃度で試験は成功し、生体内使用ではより高濃度が有用であった。この蛍光色素分子はヒト乏突起膠腫を星状細胞腫と臨床で区別するのを容易にすると思われる。このような区別は抗体（ＧＦＡＰ）染色を用いる標準的な病理手法では現在不可能である。
【００４４】
スルホローダミン１０１の診断への使用には不利な点がある。この薬剤を用いた染色では前記染料と共にインキュベーションする際に生存し比較的健康な組織を必要とする。損傷した細胞は前記染料を取り込むとの報告がなされている。しかしながら、本発明者らの実験において著しく誤った陽性例はなかった。ＳＲ１０１を広範に使用するための実際の制約には切除組織を即時にインキュベーションするための操作室において利用できる溶液が含まれる。現在、特異的な蛍光プローブを用いる即時生体外イメージングは臨床病理業務に含まれていない。従って、共焦点顕微鏡は大部分の病理学研究室では見当たらない。本発明者らはこれらの制約は病理学部門の近代化により克服されるであろうと確信している。
【００４５】
本発明者らが知る限り、本発明者らの結果は機能的染料を生きたヒト脳腫瘍組織への最初の使用をもたらし臨床的に有意義な生体外での組織病理学的診断をもたらす。添付の特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内で種々の改変が可能である。
以下の項目に、本発明に従った実施形態を示す。
１．  星状ヒト脳腫瘍を非星状ヒト脳腫瘍と区別するための方法であって、
星状ヒト脳腫瘍をＳＲ１０１で標識するためにＳＲ１０１で脳腫瘍を有する疑いのある対象由来の腫瘍組織を染色する工程、及び
星状腫瘍型か非星状腫瘍型かを確認するために蛍光画像装置を用いてＳＲ１０１で染色された該組織を可視化する工程
を含み、
対象由来の該腫瘍組織を生体外で染色する、前記方法。
２．  該非星状ヒト脳腫瘍は乏突起膠腫である、項目１に記載の前記方法。
３．  該非星状ヒト脳腫瘍はＣＮＳリンパ腫である、項目１に記載の前記方法。
４．  該染色する工程及び該可視化する工程を術中に行う、項目１に記載の前記方法。
５．  齧歯類の異種移植片におけるヒト神経膠腫細胞を迅速に生体内で標識化するための方法であって、
神経膠腫細胞を有する腫瘍組織を染色するために固定可能なＳＲ１０１を該齧歯類に投与する工程、及び
蛍光画像装置を用いて固定可能なＳＲ１０１で染色された該組織を可視化する工程
を含む、前記方法。
６．  該投与する工程は動脈内注入を含む、項目５に記載の前記方法。
７．  該可視化する工程は腫瘍境界の描写を含む、項目５に記載の前記方法。
８．  該可視化する工程は浸潤性腫瘍細胞の描写を含む、項目５に記載の前記方法。
９．  星状細胞腫の腫瘍境界を決定するための方法であって、
ＳＲ１０１を用いて対象由来の星状細胞腫の腫瘍組織を染色する工程、及び
該星状細胞腫と非星状細胞腫組織の間の境界を決定するために蛍光画像装置を用いて該組織を可視化する工程
を含み、
対象由来の該腫瘍組織を生体外で染色する、前記方法。
１０．  該染色する工程及び該可視化する工程は術中で行う、項目９に記載の前記方法。
１１．  星状腫瘍型か非星状腫瘍型かを確認して腫瘍境界を定義するために使用されるＳＲ１０１。
１２．  星状ヒト脳腫瘍を非星状ヒト脳腫瘍と区別するためのキットを製造するためのＳＲ１０１の使用。
【図１】
0006316803.tif 000002
【図２】
0006316803.tif 000003
【図３】
0006316803.tif 000004
【図４】
0006316803.tif 000005
【図５】
0006316803.tif 000006
【図６】
0006316803.tif 000007
【図７】
0006316803.tif 000008