(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主に下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記（Ｂ）のタンパク質が、下記（Ｃ）のタンパク質である、請求項１記載の製造方法。
（Ｃ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１の１６９位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
前記宿主が微生物である、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が微細藻類である、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記微生物が大腸菌である、請求項３記載の製造方法。
【請求項７】
下記（Ｃ）のタンパク質。
（Ｃ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１の１６９位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項８】
請求項７記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法に関する。また、本発明は、当該方法に用いるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを導入した形質転換体、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、及びこれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合をしてトリアシルグリセロール等の脂質を構成し、多くの動植物においてエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として、また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤として、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。さらに、炭素数１８前後の高級アルコールは植物の成長促進剤としても有用である。
【０００３】
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みがおこなわれている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素数に依存するため、脂肪酸の炭素数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。例えば、ゲッケイジュ（Umbellularia californica（California  bay））由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入により炭素数１２の脂肪酸を蓄積させる方法（特許文献１、非特許文献１）等が提案されている。
【０００４】
近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。
藻類の脂質合成メカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。例えば、上述のアシル−ＡＣＰ型チオエステラーゼについても、現在のところ、藻類由来のものはほとんど報告されておらず、珪藻網等でわずかに報告例があるのみである（例えば、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平７−５０１９２４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Voelker  TA,  Worrell  AC,  Anderson  L,  Bleibaum  J,  Fan  C,  Hawkins  DJ,  Radke  SE,  Davies  HM.,  “Fatty  acid  biosynthesis  redirected  to  medium  chains  in  transgenic  oilseed  plants”,  Science.  1992  Jul  3;257(5066),  p.72-74.
【非特許文献２】Yangmin  Gong,  Xiaojing  Guo,  Xia  Wan,  Zhuo  Liang,  Mulan  Jiang,  “Characterization  of  a  novel  thioesterase  (PtTE)  from  Phaeodactylum  tricornutum”,  Journal  of  Basic  Microbiology,  2011  December,  Volume  51,  p.666-672.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、藻類由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法の提供に関する。また、本発明は、当該方法に用いる形質転換体、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、及びこれをコードする遺伝子の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、藻類由来の新たなアシル−ＡＣＰチオエステラーゼについて鋭意検討を行い、シオミドロ（Ectocarpus）属に属する藻類から、新規のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを見出した。さらに、当該アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを導入した形質転換体で、脂質、特に炭素数８〜１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステルの生産性が有意に向上することを見出した。この本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、宿主に下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）に関する。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
また、本発明は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を、宿主に導入してなる形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう。）に関する。
【００１１】
また、本発明は、下記（Ｃ）のタンパク質に関する。
（Ｃ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１の１６９位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【００１２】
また、本発明は、前記（Ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法を提供することができる。また、本発明によれば、当該方法に用いる形質転換体、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、及びこれをコードする遺伝子を提供することができる。本発明の形質転換体及び製造方法は、脂質生産性に優れ、脂質又は脂肪酸の工業的生産に好適に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、脂質には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれ、具体的には、脂肪酸、脂肪族アルコール類、炭化水素類（アルカン等）、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等が含まれる。
また本発明において、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記でＣｘ：ｙとあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表し、Ｃｘ脂肪酸は炭素原子数ｘの脂肪酸を表す。
以下、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びその改変体、これを用いた形質転換体及び脂質の製造方法について順に説明する。
【００１５】
１．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質である。具体的に、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼには、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質が包含される。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【００１６】
アシル−ＡＣＰ（アシルキャリヤープロテイン）チオエステラーゼは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌・真菌や動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼには、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが存在していることが知られており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
本発明において、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性を有することをいう。
【００１７】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、シオミドロ（Ectocarpus）属に属する藻類であるシオミドロ（Ectocarpus siliculosus）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである。シオミドロのゲノム配列情報は２０１０年に公開されているが、配列番号１に示すアミノ酸配列の機能はこれまでわかっていなかった。本発明者は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼであることを同定した。さらに、本発明者が、配列番号１のアミノ酸配列と他の公知のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ配列を比較したところ、配列同一性（相同性）が非常に低かった。
【００１８】
（Ｂ）のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
（Ｂ）のタンパク質において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、配列番号１のアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。より好ましくは９７％以上であり、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。
【００１９】
本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法（Science，227，1435，（1985））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（homology  search）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２０】
また、（Ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列として、配列番号１のアミノ酸配列に変異を導入したアミノ酸配列、すなわち、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列も好ましい。変異アミノ酸配列の例としては、配列番号１のアミノ酸配列において特定のアミノ酸が置換された配列、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端にシグナルペプチド等の他のアミノ酸配列が付加したアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端の一部が欠失した配列、等が挙げられる。
（Ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において変異アミノ酸の数は、１〜２０個であることが好ましく、１〜１５個であることがより好ましく、１〜１０個であることがよりさらに好ましい。より好ましくは１〜５個であり、１〜３個がさらに好ましく、１〜２個がよりさらに好ましい。
アミノ酸配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法については、後述する。
なお、本明細書においては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、配列番号１で表されるアミノ酸配列が一部変異したアミノ酸配列からなるタンパク質をアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体ともいう。
【００２１】
（Ｂ）のタンパク質としては、下記（Ｃ）のタンパク質が好ましい。
（Ｃ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１の１６９位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【００２２】
配列番号１のアミノ酸配列では、１６９位のアミノ酸はメチオニンである。（Ｃ）のタンパク質は、配列番号１の１６９位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに置換されている。後述の実施例に示すように、配列番号１の１６９位のアミノ酸をトリプトファンに置換したアミノ酸配列からなるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体も、優れた脂質生産性を示す。
本明細書においては、アミノ酸置換を以下のように略記することがある。
Ｍ１６９Ｗ：アミノ酸配列の１６９位のメチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）がトリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）に置換
【００２３】
アミノ酸配列または塩基配列における「相当する位置」または「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，ｐ．４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ，[ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ，[ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ]）のウェブサイト上で利用することができる。
【００２４】
（Ｃ）のタンパク質のアミノ酸配列として好ましくは、下記（Ｃ１）のタンパク質である。
（Ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１６９位のメチオニンがトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ１）のタンパク質では、Ｃ８アシル−ＡＣＰ及びＣ１０アシル−ＡＣＰに対する特異性が向上する。すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と比べて、基質としてＣ８アシル−ＡＣＰ及びＣ１０アシル−ＡＣＰを選択的に利用し、これを加水分解する活性が向上する。
【００２５】
本発明のタンパク質がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan  L,  Voelker  TA,  Hawkins  DJ.  “Modification  of  the  substrate  specificity  of  an  acyl-acyl  carrier  protein  thioesterase  by  protein  engineering”  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  1995  Nov  7;92(23),  p.10639-10643）によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を測定することができる。
【００２６】
本発明のタンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、シオミドロから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子及びその変異体を用いることができる。
【００２７】
２．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の例として、配列番号２や配列番号３に示す塩基配列が挙げられる。配列番号３に示す塩基配列は、シオミドロ由来の野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例である。配列番号２に示す塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列情報に基づいて、大腸菌のコドン使用頻度に合わせてコドン最適化を施した塩基配列である。
【００２８】
前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子の具体例として、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子が例示できるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（ａ）  配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２９】
（ｂ）において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、配列番号２又は配列番号３の塩基配列との同一性は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがよりさらに好ましい。より好ましくは９７％以上であり、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。
【００３０】
また、（ｂ）の塩基配列として、配列番号２又は配列番号３の塩基配列に変異を導入した塩基配列、すなわち、配列番号２又は配列番号３の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列も好ましい。変異塩基配列の例としては、配列番号２又は配列番号３の塩基配列において特定の塩基が置換された配列、配列番号２又は配列番号３の塩基配列の５’末端又は３’末端にシグナルペプチド等をコードする他の塩基配列が付加した塩基配列、配列番号２又は配列番号３の塩基配列の５’末端又は３’末端の一部が欠失した配列、等が挙げられる。
（ｂ）のＤＮＡの塩基配列において変異塩基の数は、１〜３０個であることが好ましく、１〜２５個であることがより好ましく、１〜２０個であることがさらに好ましく、１〜１５個であることがよりさらに好ましい。より好ましくは１〜１０個であり、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個がよりさらに好ましい。
【００３１】
塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR反応（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００３２】
（ｂ）のＤＮＡとしては、下記（ｃ）のＤＮＡが好ましい。
（ｃ）  配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列であって、配列番号２又は配列番号３の５０５位〜５０７位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンをコードする塩基である塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）の塩基配列は、前記（Ｃ）のアミノ酸配列が有するアミノ酸置換に相当する塩基置換を有する。配列番号２又は配列番号３の塩基配列では、５０５位〜５０７位の塩基はメチオニンをコードする。（ｃ）のＤＮＡでは、これに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換されている。
（ｃ）のＤＮＡの塩基配列として好ましくは、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列において、５０５位〜５０７位の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列、である。
【００３３】
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号２や配列番号３に示す塩基配列に基づいて、人工合成により遺伝子を取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、シオミドロからクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
【００３４】
また、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子に変異を導入する方法の一例としては、まず、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする塩基配列（例えば配列番号２又は配列番号３）を、In-Fusion（登録商標）  HD  Cloning  Kit（Clonthech,  Mountain  View,  California）を用いてベクターに組み込む。次いで、得られたベクターＤＮＡを鋳型にして、所望の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡを、メチル化ＤＮＡを特異的に切断するDpnＩ酵素で処理し、これを用いて大腸菌を形質転換し、抗生物質含有プレート培地で選択する。形質転換された大腸菌よりプラスミド抽出することで、目的のアミノ酸変異が導入されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を取得することができる。
【００３５】
３．形質転換体（組換え体）
本発明の形質転換体は、宿主に前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、脂質の生産能、特にＣ８〜Ｃ１６脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産能が有意に向上する。また、当該形質転換体では、宿主と比べ、脂質中の脂肪酸組成が変化する。なお、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００３６】
本発明の形質転換体は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００３７】
形質転換体の宿主としては特に限定されず、微生物、植物体、又は動物体を用いることができる。なお、本発明において微生物には藻類や微細藻類が含まれる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物やバシラス（Bacillus）属に属する微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、エシェリキア属に属する微生物である大腸菌（Escherichia coli）、バシラス属に属する微生物である枯草菌（Bacillus subtilis）、酵母に属する微生物である赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又は糸状菌に属する微生物であるモルチエレラ  エスピー（Mortierella  sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
また、前記微生物としては、微細藻類も好ましい。前記微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、又はナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、Nannochloropsis oculata、Nannochloropsis gaditana、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis oceanica、Nannochloropsis atomus、Nannochloropsis maculata、Nannochloropsis granulata、又はNannochloropsis  sp．、等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、Nannochloropsis oculata、又はNannochloropsis gaditanaが好ましく、Nannochloropsis oculataがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００３８】
発現ベクターの母体となるベクターとしては、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現可能なベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）  II  SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.  et  al.,（1986）,Plasmid  15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript  II  SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas  Center）、P-322（Chlamydomonas  Center）、pPha-T1（非特許文献２参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver  Kilian,  et  al.,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America,  Dec  27;108(52),  2011、の文献記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片や制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
【００３９】
発現ベクターや遺伝子発現カセットに用いるプロモーターやターミネーター等の発現調節領域や選択マーカーの種類も特に限定されず、通常使用されるプロモーターやマーカー等を導入する宿主の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
具体的なプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。
また、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子）等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
【００４０】
上記ベクターにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS  Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives  of  Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and  Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Randor  Radakovits,  et  al.,  Nature  Communications,  DOI:10.1038/ncomms1688,  2012、に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
【００４１】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００４２】
４．脂質の製造方法
次いで、上記で得られた形質転換体を用いて脂質を生産する。
本発明の製造方法は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体から脂質を採取する工程を含む。当該工程は、脂質の生産性向上の観点から、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養して培養物を得る工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。なお、本発明において形質転換体を培養するとは、微生物、藻類、植物体、動物体、及びそれらの細胞や組織を培養、生育することをいい、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。また、培養物には、培養液はもちろん、培養等した後の形質転換体そのものも含まれる。
【００４３】
培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。
また、脂質の生産効率の点から、培地中に、例えばアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
【００４４】
一例として、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地又はOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養を行うことが挙げられる。また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培を行うことが挙げられる。
【００４５】
形質転換の宿主が藻類の場合、以下の培地及び培養条件を用いることができる。
培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
【００４６】
形質転換体において産生された脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、培養物や形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物や形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００４７】
本発明の製造方法は、脂質の製造に好適に用いることができる。とりわけ、本発明の製造方法は、Ｃ８〜Ｃ１６脂肪酸（好ましくはＣ８〜Ｃ１４脂肪酸、及びＣ１６：１脂肪酸）及びその誘導体の製造に好適に用いることができる。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質であることが好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましい。脂質中に含まれる脂肪酸又はそのエステルは、界面活性剤等への利用性からＣ８〜Ｃ１６の脂肪酸又はそのエステルが好ましく、Ｃ８〜Ｃ１４の脂肪酸又はそのエステルがより好ましい。
【００４８】
本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００４９】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体、タンパク質、遺伝子を開示する。
【００５０】
＜１＞  宿主に下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【００５１】
＜２＞  前記（Ｂ）のタンパク質が、下記（Ｃ）のタンパク質である、＜１＞項記載の製造方法。
（Ｃ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１の１６９位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
＜３＞  前記（Ｂ）又は（Ｃ）において、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である、＜１＞又は＜２＞項記載の製造方法。
＜４＞  前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の製造方法。
（ａ）  配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜５＞  前記（ｂ）のＤＮＡが、下記（ｃ）のＤＮＡである、＜４＞項記載の製造方法。
（ｃ）  配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列であって、配列番号２又は配列番号３の５０５位〜５０７位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンをコードする塩基である塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜６＞  前記（ｂ）又は（ｃ）において、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である、＜４＞又は＜５＞項記載の製造方法。
【００５２】
＜７＞  前記宿主が微生物である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜８＞  前記微生物が微細藻類である、＜７＞項記載の製造方法。
＜９＞  前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、＜８＞項記載の製造方法。
＜１０＞  前記微生物が大腸菌である、＜７＞項記載の製造方法。
＜１１＞  前記脂質が炭素数８〜１４の脂肪酸又はそのエステルを含む、＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の製造方法。
【００５３】
＜１２＞  前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を、宿主に導入してなる形質転換体。
＜１３＞  前記宿主が微生物である、＜１２＞項記載の形質転換体。
＜１４＞  前記微生物が微細藻類である、＜１３＞項記載の形質転換体。
＜１５＞  前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、＜１４＞項記載の形質転換体。
＜１６＞  前記微生物が大腸菌である、＜１３＞項記載の形質転換体。
【００５４】
＜１７＞  前記（Ｃ）のタンパク質。
【００５５】
＜１８＞  ＜１７＞項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜１９＞  前記（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
【００５６】
＜２０＞  ＜１８＞又は＜１９＞項記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【００５７】
＜２１＞  脂質を製造するための、＜１２＞〜＜１６＞のいずれか１項記載の形質転換体の使用。
＜２２＞  前記脂質が炭素数８〜１４の脂肪酸又はそのエステルを含む、＜２１＞項記載の形質転換体の使用。
【００５８】
＜２３＞  宿主に前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
【００５９】
＜２４＞  宿主に前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
＜２５＞  前記脂質が炭素数８〜１４の脂肪酸又はそのエステルを含む、＜２４＞項記載の方法。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６１】
実施例１  CBJ26101遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
１．CBJ26101遺伝子の取得
National  Center  for  Biotechnology  Information(NCBI)のタンパクデータベースから、Accession  No.  CBJ26101として登録されているEctocarpus siliculosus由来の機能未知タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を取得した。以下、このアミノ酸配列をコードする遺伝子をCBJ26101遺伝子ともいう。オペロンバイオテクノロジー株式会社の提供する人工遺伝子受託合成サービスを利用して、配列番号２に示すCBJ26101遺伝子配列を合成した。なお、配列番号２の遺伝子は、大腸菌のコドン使用頻度に合わせてコドン最適化を施した塩基配列である。
【００６２】
２．CBJ26101遺伝子発現プラスミドの構築
CBJ26101遺伝子を鋳型として、表１に示す配列番号４及び配列番号５のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号２に示す塩基配列からなるCBJ26101遺伝子断片を増幅した。また、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)（Stratagene社製）を鋳型として、表１に示す配列番号６及び配列番号７のプライマー対を用いたＰＣＲ反応によりpBluescriptII  SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これら２つの断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、CBJ26101遺伝子発現プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、配列番号１のアミノ酸配列の１位のアミノ酸の上流に、プラスミド由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位〜２９位のアミノ酸配列と融合させた形で構築した。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
３．発現プラスミドの大腸菌への導入
前記２．で構築したCBJ26101遺伝子発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株（fadD88）（Overath  et  al，  Eur．J．Biochem．7，559-574，1969）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を３０℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBAmp液体培地（Bacto  Trypton  1%，Yeast  Extract  0.5%，NaCl  1%，アンピシリンナトリウム50μg/mL）１ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。この培養液２μＬを、２ｍＬのOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）に接種し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記４．の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
【００６５】
４．大腸菌培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養液１ｍＬに、内部標準として１ｍｇ/ｍＬの７−ペンタデカノンを５０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルム、１ｍＬのメタノール及び１０μＬの２Ｎ塩酸を培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置した。その後さらに、０．５ｍＬのクロロホルム及び０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍにて１５分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分間恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）を添加し、８０℃にて１０分間恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
【００６６】
得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。測定条件を以下に示す。
キャピラリーカラム：ＤＢ−１  ＭＳ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（J＆W  Scientific）、
移動相：高純度ヘリウム、
カラム内流量：１．０ｍＬ／分、
昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／分→３００℃（５分間）、
平衡化時間：１分間、
注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１），
圧力１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／分，
注入量１μＬ、
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム、
検出器温度：３００℃
【００６７】
また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である７−ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。結果を表２に示す。表２には各プラスミド導入株について、独立した３回の実験の平均値および標準偏差を示している。
なお、以下の表において、「ＴＦＡ」は総脂肪酸量を、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸の重量を示す。また、Ｃｘ：ｙとあるのは、炭素原子数ｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表し、Ｃ１７：０ΔおよびＣ１９：０Δはそれぞれcis-9,10-Methylen-hexadecanoic  acidおよびcis-11,12-Methylen-octadecanoic  acidを表す。
【００６８】
【表２】
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【００６９】
表２から明らかなように、CBJ26101遺伝子を導入した形質転換体では、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)を導入した形質転換体（表２のpBS）と比べ、総脂肪酸量が増加していた。また、CBJ26101遺伝子を導入した形質転換体では、pBluescriptII  SK(-)を導入した形質転換体と比べ、脂肪酸組成が変化していた。特に、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：１、Ｃ１２：０、Ｃ１４：１、Ｃ１４：０、Ｃ１６：１脂肪酸の割合が増加した。これらの結果から、CBJ26101遺伝子によりコードされるタンパク質は、アシル−ＡＣＰから特定の脂肪酸を切り出すアシル−ＡＣＰチオエステラーゼであると考えられる。
また、シオミドロ（Ectocarpus siliculosus）自身の脂肪酸組成について、Ｃ８〜Ｃ１２脂肪酸は検出されず、Ｃ１４：０及びＣ１６：１脂肪酸も微量であると報告されている（Simon  M.  et  al.,  The  Plant  Journal,  Volume  71,  Issue  3,  pages  366‐377,  August  2012）。これに対し、CBJ26101遺伝子を導入した形質転換体は、Ｃ８〜Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４：０及びＣ１６：１脂肪酸を豊富に含むものであった。
【００７０】
実施例２  CBJ26101遺伝子改変体を導入した大腸菌による脂質の製造
１．CBJ26101遺伝子改変体の作製
実施例１の２．で作製したCBJ26101遺伝子発現プラスミドを鋳型とし、表１に示す配列番号８及び配列番号９のプライマー対を用いたＰＣＲ反応を行い、配列番号２の塩基配列において５０５位〜５０７位の塩基が変異した遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片を用いて、実施例１の２．と同様の手法により、発現プラスミドCBJ26101(M169W)を構築した。なお、プラスミドCBJ26101(M169W)が有するCBJ26101遺伝子改変体は、配列番号２に示す塩基配列において５０５位〜５０７位の塩基がトリプトファンをコードする塩基ＴＧＧに置換された塩基配列からなる。
【００７１】
２．発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
実施例１の３．と同様の方法で、発現プラスミドCBJ26101(M169W)を大腸菌へ導入し、実施例１の４．と同様の方法で脂質の解析を行った。結果を表３に示す。
【００７２】
【表３】
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【００７３】
表３から明らかなように、配列番号１の１６９位のアミノ酸がトリプトファンに置換されたCBJ26101(M169W)導入株でも、総脂肪酸量がCBJ26101遺伝子導入株と同程度に増加した。また、CBJ26101遺伝子導入株と同様に、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：１、Ｃ１２：０、Ｃ１４：１、Ｃ１４：０、Ｃ１６：１脂肪酸の割合が増加した。特に、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：１脂肪酸の含有率は、CBJ26101遺伝子導入株よりもさらに向上した。
【配列表】
0006332855000001.app