(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）を検出するための方法であって、次のステップ、
ａ）周期的に変調される照明光（ＦＥＸ）で、前記又は少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種を含むサンプルを照明するステップと、
ｂ）前記適切に照明されたサンプルによって発光された蛍光発光（ＦＬＵ）を検出するステップと、
を含み、
前記方法がまた、次のステップ、
ｃ）前記周期的に変調される照明光と同じ周期性を示す、且つ前記周期的に変調される照明光に関連する直角位相における前記蛍光発光の強度成分の振幅（ＩＦｏｕｔ）を抽出するステップを含むことと、
前記照明光の平均強度及びその変調周波数が、前記蛍光発光の前記強度成分の前記振幅を最大化するように選択されることと、を特徴とする方法。
【請求項２】
少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）が、第１の化学的状態及び第２の化学的状態を示し、前記状態の少なくとも１つが蛍光性であり、前記又は各前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）が、第１の光誘導反応によって、前記第１の状態から前記第２の状態に切り替えられ得、次に、熱誘導反応及び第２の光誘導反応の両方によって前記第１の状態に戻ることができ、前記照明光が、
【数１】
0006417422.tif 000090
を用いて平均強度Ｉ０を示し、且つ周波数ｆで変調され、これらの式で、
−  σ１２Ｉ０及びσ２１Ｉ０が、それぞれ、前記蛍光種の前記第１の光誘導反応及び前記蛍光種の前記第２の光誘導反応の運動定数であり、
−
【数２】
0006417422.tif 000091
が、前記蛍光種の前記熱誘導反応の運動定数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップａ）において、前記サンプルが、ほぼ単色の照明光によって照明される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記照明光（ＦＥＸ）が、波長λ１の第１のほぼ単色の照明光（ＦＥＸ１）及びλ１と異なる波長λ２の第２のほぼ単色の照明光（ＦＥＸ２）を含み、第１及び第２の前記照明光が、少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）の前記状態の光切り替えを誘導するように適合され、そのうちの少なくとも第１の前記照明光が、周期的に変調される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）が、第１の化学的状態及び第２の化学的状態を示し、前記状態の少なくとも１つが蛍光性であり、前記又は各前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）が、第１の光誘導反応によって、前記第１の状態から前記第２の状態に切り替えられ得、次に、第２の光誘導反応によって前記第１の状態に戻ることができ、前記第１の照明光が、平均強度
【数３】
0006417422.tif 000092
を示し、且つ周波数ｆ’で変調され、前記第２の照明光が、
【数４】
0006417422.tif 000093
を用いて、ほぼ一定の強度
【数５】
0006417422.tif 000094
を示し、これらの式で、
−
【数６】
0006417422.tif 000095
が、それぞれ、前記第１の照明光によって光誘導される前記第１及び前記第２の反応の運動定数であり、
−
【数７】
0006417422.tif 000096
が、それぞれ、前記第２の照明光によって光誘導される前記第１及び前記第２の反応の運動定数である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、異なる動的特性を示す複数の前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種を含み、前記ステップａ）−ｃ）が、少なくとも２つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種の検出用に連続的に実行される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップｂ）及びｃ）が、前記蛍光発光のロックイン検出によって実行される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが、少なくとも１つの他の蛍光種を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
次のステップ、
ｄ）前記ステップｃ）で抽出された前記蛍光発光の前記強度成分から、前記又は少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種の濃度を決定するステップもまた含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記又は少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種が、
−  フォトクロミック蛍光蛋白質と、
−  蛍光発生プローブと生体分子の複合体と、
から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが、生物学的材料を含むことができる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の検出方法を実行する蛍光顕微鏡法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の検出方法を実行する光学遠隔検出方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、生体を含むことができ、１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）の存在及び濃度から選択される少なくとも１つの要素が、前記生体に対してどんなサンプリングも実行せずに、前記ステップｃ）において抽出された前記蛍光発光の前記強度成分から測定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記照明光（ＦＥＸ）が、ある方向に放射され、前記照明光（ＦＥＸ）の前記周期的な変調が、前記照明光（ＦＥＸ）の前記放射方向の変調によって実行される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記照明光（ＦＥＸ）が、日光の一部を含み、日光の前記一部が、前記強度Ｉ０以下にとどまることによって、前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）により受信される光強度に加わる、請求項２又は請求項６〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可逆的に光切り替え可能な蛍光種を検出するための方法に関する。かかる方法は、特に化学、生物学、及び環境測定分野における多数の用途を提供する。
【背景技術】
【０００２】
「種」は、分子若しくは複合体などの化学種、又はナノ粒子などの物理的対象であると理解されたい。「可逆的に光切り替え可能な種」は、異なる蛍光特性を有する、且つ光の影響によって１つの状態からもう一方の状態に可逆的に切り替わることができる少なくとも２つの異なる状態を示す種を意味すると理解されたい。可逆的に光切り替え可能な蛍光種の例は、蛋白質「Ｄｒｏｎｐａ」及び複合体「Ｓｐｉｎａｃｈ−ＤＦＨＢＩ」である（「Ｓｐｉｎａｃｈ」は、ＲＮＡのアプタマーであり、ＤＦＨＢＩは、蛍光発生プローブである）。これらの種は、特に、プローブ又はマーカとして用いることができる。
【０００３】
撮像及び特に蛍光顕微鏡法は、生物学において、しかしまた材料科学などの他の研究分野において必須のツールになった。しかしながら、その用途は、蛍光又はノイズを背景に、興味のあるシグナルを観察する能力によって制限される。この問題は、生体内撮像用途において特に深刻であり、生体内撮像用途では、検出されるべき蛍光マーカは、複合体自己蛍光及び／又は光散乱媒体において散乱される。そのとき、有用なシグナルは、強い暗騒音に埋め込まれる。
【０００４】
従来の蛍光検出及び撮像技術の別の限界は、多数の蛍光体が、広い発光帯を示すという事実にある。その結果、それらの発光スペクトルが重ね合わされる傾向があるので、全く同一のサンプルにおいて多くの蛍光マーカを選択的に検出することは困難である。
【０００５】
これらの制限を克服するために、可逆的に光切り替え可能な蛍光プローブ、変調される照明（所定の方法で時間的に可変である）、及び検出された蛍光シグナルの復調を用いることが提案された。それは、暗騒音から有用なシグナルを抽出するために、可逆的に光切り替え可能なプローブの時間的な力学（それは、可逆的に光切り替え可能なプローブに特有であり、干渉蛍光体の時間的な力学とは異なる）を利用することを可能にする。そのとき、これは、「ダイナミックコントラスト」と呼ばれる。
【０００６】
この原理を利用する先行技術から周知の一技術が、光学ロックイン検出の頭字語であるＯＬＩＤの名前で知られている。それは、ａｒｔｉｃｌｅ  ｂｙ  Ｇ．  Ｍａｒｒｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｏｃｋ−ｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ”，  ＰＮＡＳ，  ｖｏｌ．  １０５，  ｎｏ．  ４６，  ｐａｇｅｓ  １７７８９−１７７９４  （１８  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８）に説明されている。この技術に関する１つの欠点は、それが、可逆的に光切り替え可能な蛍光体の濃度に関する定量的情報を提供しないということである。また、それは、２つの色を備えた光励起シーケンス及び少なくとも１つの基準画素を必要とする。
【０００７】
光切り替え可能な蛍光プローブ及び変調励起を用いる先行技術から周知の別の技術が、「同期増幅蛍光画像回復」の頭字語であるＳＡＦＩＲｅの名前によって知られている。それは、ａｒｔｉｃｌｅ  ｂｙ  Ｃｈ．  Ｉ．  Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｌｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  （ＳＡＦＩＲｅ）”，  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  ２０１０，  １１４，  ６６０−６６５で説明されている。この技術もまた、２色励起を用いる。ダイナミックコントラストの最適化は、経験的に行われるという欠点を有し、それは、追加的な実装形態の複雑さを導入する。
【０００８】
Ｔｈｅ  ａｒｔｉｃｌｅ  ｂｙ  Ｑ．  Ｗｅｉ  ａｎｄ  Ａ．  Ｗｅｉ  “Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ”，  Ｃｈｅｍ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．，  １７，  １０８０−１０９１は、多数の周知のダイナミックコントラスト技術に関して報告する。蛍光の光変調に基づく上記のＯＬＩＤ及びＳＡＦＩＲｅ技術に加えて、この記事は、磁気又は光熱変調を利用する技術を説明する。これらの技術は、それらが、蛍光の励起及び検出用の光学システム及び非光学（磁気又は熱）変調システムの両方を必要とするので、正確に実行するには複雑である。
【０００９】
従って、ダイナミックコントラストを利用する先行技術から周知の全ての蛍光検出技術は、比較的複雑な実装形態という欠点を有する。更に、それらのどれも、全く同一のサンプルにおけるかなりの数（１０程度以上）の蛍光種の連続検出を可能にする十分な選択性を提供しない。更に、これらの技術は、もっぱら顕微鏡用途用に開発されており、環境における蛍光種の遠隔検出に容易に転換することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ａｒｔｉｃｌｅ  ｂｙ  Ｇ．  Ｍａｒｒｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｏｃｋ−ｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ”，  ＰＮＡＳ，  ｖｏｌ．  １０５，  ｎｏ．  ４６，  ｐａｇｅｓ  １７７８９−１７７９４  （１８  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８）
【非特許文献２】ａｒｔｉｃｌｅ  ｂｙ  Ｃｈ．  Ｉ．  Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｌｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  （ＳＡＦＩＲｅ）”，  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  ２０１０，  １１４，  ６６０−６６５
【非特許文献３】ａｒｔｉｃｌｅ  ｂｙ  Ｑ．  Ｗｅｉ  ａｎｄ  Ａ．  Ｗｅｉ  “Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ”，  Ｃｈｅｍ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．，  １７，  １０８０−１０９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、先行技術の上記の欠点の少なくとも１つを克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的を達成できるようにする本発明の一主題は、少なくとも１つの可逆的に光切り替え可能な蛍光種を検出するための方法であって、次のステップ、
ａ）周期的に変調される照明光で、前記又は少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種を含むサンプルを照明するステップと、
ｂ）前記適切に照明されたサンプルによって発光された蛍光発光を検出するステップと、
を含み、
前記方法がまた、次のステップ、
ｃ）前記周期的に変調される照明光と同じ周期性を示す、且つ前記周期的に変調される照明光に関連する直角位相における前記蛍光発光の強度成分の振幅を抽出するステップを含むことと、
前記照明光の平均強度及びその変調周波数が、前記蛍光発光の前記強度成分の前記振幅を最大化するように選択されることと、
を特徴とする方法である。
【００１３】
本発明の異なる実施形態に従って、
−  少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）は、第１の化学的状態及び第２の化学的状態を示し、前記状態の少なくとも１つは蛍光性であり、前記又は各前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）は、第１の光誘導反応によって、前記第１の状態から前記第２の状態に切り替えられ得、次に、熱誘導反応及び第２の光誘導反応の両方によって前記第１の状態に戻ることができ、前記照明光は、
【数１】
0006417422.tif 000002
を用いて平均強度Ｉ０を示すことができ、且つ周波数ｆで変調され得る。これらの式で、
−  σ１２Ｉ０及びσ２１Ｉ０は、それぞれ、前記蛍光種の前記第１の光誘導反応及び前記蛍光種の前記第２の光誘導反応の運動定数である。
−
【数２】
0006417422.tif 000003
は、前記蛍光種の前記熱誘導反応の運動定数である。
−  前記ステップａ）において、前記サンプルは、ほぼ単色の照明光によって照明することができる。
−  前記照明光（ＦＥＸ）は、波長λ１の第１のほぼ単色の照明光（ＦＥＸ１）、及びλ１と異なる波長λ２の第２のほぼ単色の照明光（ＦＥＸ２）を含み、第１及び第２の前記照明光は、少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）の前記状態の光切り替えを誘導するように適合され、そのうちの少なくとも第１の前記照明光は、周期的に変調される。
−  少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）は、第１の化学的状態及び第２の化学的状態を示し、前記状態の少なくとも１つは蛍光性であり、前記又は各前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）は、第１の光誘導反応によって、前記第１の状態から前記第２の状態に切り替えられ得、次に、第２の光誘導反応によって前記第１の状態に戻ることができ、前記第１の照明光は、平均強度
【数３】
0006417422.tif 000004
を示し、且つ周波数ｆ’で変調され、前記第２の照明光は、
【数４】
0006417422.tif 000005
を用いて、ほぼ一定の強度
【数５】
0006417422.tif 000006
を示す。
これらの式で、
−
【数６】
0006417422.tif 000007
は、それぞれ、前記第１の照明光によって光誘導される前記第１及び前記第２の反応の運動定数であり、
−
【数７】
0006417422.tif 000008
は、それぞれ、前記第２の照明光によって光誘導される前記第１及び前記第２の反応の運動定数である。
−  前記サンプルは、異なる動的特性を示す複数の前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種を含むことができ、前記ステップａ）−ｃ）は、少なくとも２つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種の検出用に連続的に実行される。
−  前記ステップｂ）及びｃ）は、前記蛍光発光のロックイン検出によって実行することができる。
−  前記サンプルは、少なくとも１つの他の蛍光種を含むことができる。
−  方法はまた、次のステップ、
ｄ）前記ステップｃ）において抽出された前記蛍光発光の強度成分から、前記又は少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種の濃度を決定するステップを含むことができる。
−  前記又は少なくとも１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種は、フォトクロミック蛍光蛋白質、及び例えば、アプタマー又は蛋白質などの生体分子と蛍光発生プローブとの複合体から選択することができる。
−  前記サンプルは、生物学的材料を含むことができる。
【００１４】
本発明の別の主題は、かかる検出方法を実行する蛍光顕微鏡法である。
【００１５】
本発明の別の主題は、かかる検出方法を実行する光学遠隔検出方法である。
【００１６】
本発明の実施形態によれば、
−  前記サンプルは、生体を含むことができ、１つの前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）の存在及び濃度から選択される少なくとも１つの要素は、前記生体に対してどんなサンプリングも実行せずに、前記ステップｃ）において抽出された前記蛍光発光の強度成分から測定することができる。
−  前記照明光（ＦＥＸ）は、ある方向に放射され、前記照明光（ＦＥＸ）の前記周期的な変調は、前記照明光（ＦＥＸ）の前記放射方向の変調によって実行される。
【００１７】
別の実施形態によれば、本発明は、前記照明光（ＦＥＸ）が、日光の一部を含む、且つ日光の前記一部が、前記強度Ｉ０以下にとどまることによって、前記可逆的に光切り替え可能な蛍光種（Ｐ）により受信される光強度に加わる方法である。
【００１８】
本発明の他の特徴、詳細及び利点は、例として提示された添付の図に関連して提供される説明を読むことで明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態による方法の一般原理を示す。
【図２Ａ】蛍光強度の位相及び直角位相が、可逆的に光切り替え可能な蛍光種の動的パラメータにどのように依存するかを示すグラフである。
【図２Ｂ】蛍光強度の位相及び直角位相が、可逆的に光切り替え可能な蛍光種の動的パラメータにどのように依存するかを示すグラフである。
【図３Ａ−３Ｆ】直角位相において正規化された振幅の計算の結果を、異なる制御パラメータの関数として示すグラフである。
【図４】可逆的に光切り替え可能な蛍光種の濃度の決定への、本発明の実施形態による方法の適用を示すグラフである。
【図５Ａ】２つの別個の光ビームを備えた励起の場合に、直角位相における検出を最適化するために実行される計算を示すグラフである。
【図５Ｂ】２つの別個の光ビームを備えた励起の場合に、直角位相における検出を最適化するために実行される計算を示すグラフである。
【図６】可逆的に光切り替え可能な蛍光複合体「Ｓｐｉｎａｃｈ」の検出への、本発明の実施形態による方法の適用を示す。
【図７】可逆的に光切り替え可能な蛍光複合体「Ｓｐｉｎａｃｈ」及びマイクロ流体装置における干渉蛍光体を含む混合物の選択的な撮像への、本発明の実施形態による方法の適用を示す。
【図８】可逆的に光切り替え可能な蛍光蛋白質「Ｄｒｏｎｐａ−２」及びマイクロ流体装置における干渉蛍光体を含む混合物の選択的な撮像への、本発明の実施形態による方法の適用を示す。
【図９】可逆的に切り替え可能な蛍光蛋白質「Ｄｒｏｎｐａ−３」を表現する生物学的材料の選択的な撮像への、本発明の実施形態による方法の適用を示す。
【図１０】可逆的に光切り替え可能な蛍光蛋白質「Ｄｒｏｎｐａ−２」及びマイクロ流体装置における干渉蛍光体を含む混合物の選択的な撮像への、２つの励起ビームを用いる本発明の実施形態による方法の適用を示す。
【図１１】図７を取得するために用いられる実験装置を概略的に示す。
【図１２】本発明の実施形態による遠隔検出用途において使用できる装置を概略的に示す。
【図１３】図１０を取得するために用いられる実験装置を概略的に示す。
【図１４】図８を取得するために用いられる実験装置を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１に示されているように、本発明による検出方法は、周期的に変調される励起光ビームＦＥＸによる、可逆的に光切り替え可能な蛍光種Ｐを含むサンプルＥの照明を含む。図１の非限定的な例は、角周波数ωで正弦波的に変調された励起ビームの場合を検討する。その強度は、
Ｉ（ｔ）＝Ｉ０［１＋ε  ｓｉｎ（ωｔ）］
によって与えられ、この式で、Ｉ０は、平均強度であり、ε≦１は、変調振幅である。より一般的には、任意の周期関数で励起ビームの強度を変調することが可能であり、その周波数は、ｆ＝１／Ｔ（Ｔは、期間である。正弦波変調の場合に、ｆ＝ω／２πである）によって示される。ストローブ関数（任意の負荷サイクルの矩形波）による変調の利用は、実装形態におけるその単純性故に特に有利である。変調はまた、例えば走査顕微鏡観察の文脈において、照明ビームを周期的に転置することによって得ることができる。実際において、サンプルの局所的な領域（例えばマイクロ流体装置のチャンバ又はダクト）が検討される場合に、照明ビームの周期的な転置は、前記ビームの強度の周期的な変調と類似の方法で照明を修正する。
【００２１】
励起ビームＦＥＸは、ほぼ単色であることが、即ち、そのスペクトルが、単一の強度最大値及び／又は５０ｎｍ以下のスペクトル幅を示すことが好ましい。
【００２２】
可逆的に光切り替え可能な蛍光種は、光の作用下で交換できる２つの異なる状態を示す。それは、フォトクロミック蛍光種、又は自らの動的挙動が、光の作用下で２つの状態間の交換に変えられ得る任意の他の系とすることができる。これらの状態は、分子における異なる立体化学的配置、複合体の結合／非結合状態等に対応することができる。図１において、第１の状態（熱力学的に一層安定している）は、１によって示され、中身の詰まった正方形によって表されている。第２の状態（熱力学的にそれほど安定していない）は、２によって示され、中空の正方形によって表されている。これらの２つの状態は、異なる輝度を有する。単純にするために、且つ非限定的な例として、状態１だけが著しく蛍光性であると見なすことができる。
【００２３】
励起ビームの波長λは、状態１及び２の蛍光発光の励起及びまた状態１から状態２への切り替え（逆も同様である）の両方を可能にする。従って、一定の強度Ｉを備えた照明の場合に、
−  状態１は、運動定数σ１２Ｉで状態２に切り替えられ、σ１２は、状態１から状態２への光切り替えの有効断面である。
−  状態２は、運動定数σ２１Ｉ＋ｋΔ２１で状態１に切り替えられ、σ２１は、状態２から状態１への光切り替えの有効断面であり、ｋΔ２１は、状態２から状態１への熱緩和の運動定数である。
【００２４】
変調励起ビームＦＥＸによって照明されたサンプル（特に、サンプルが含む種Ｐ）は、蛍光発光ＦＬＵを発光し、その強度は、再び変調され、且つ
−  図においてＩＦｉｎによって示されている、励起ビームと同位相の成分及び
−  図においてＩＦｏｕｔによって示されている、励起ビームと直角位相の成分に分割することができる。
【００２５】
本発明者らは、蛍光発光の直角位相成分の振幅を最大化するために、照明ビームの平均強度Ｉ０及びその変調周波数ｆを選択することが可能であると分かった。この振幅を最大化するパラメータＩ０及びｆの最適値は、パラメータσ１２、σ２１、ｋΔ２１に、且つ検討される可逆的に光切り替え可能な蛍光種に依存する。従って、標的の可逆的に光切り替え可能な蛍光種の発光の直角位相成分の振幅を最適化する励起ビームは、サンプルに存在し得る他の蛍光種（可逆的に光切り替え可能かどうかにかかわらず）を最適化しない。従って、選択的検出が、ダイナミックコントラストによって得られる。
【００２６】
本発明の１つの有利な特徴は、パラメータＩ０及びｆの最適値が、検出される種の動的特性及び特にσ１２、σ２１及びｋΔ２１から計算され得るということである。従って、或る先行技術の技法におけるように、試験による反復最適化を用いる必要はない。更に、Ｉ０及びｆの最適値は、解析的に決定することができる。
【００２７】
本発明の別の利点は、選択的検出が量的であり得るということである。換言すれば、較正は、蛍光強度の直角位相成分の振幅から、標的の可逆的に光切り替え可能な蛍光種の濃度を決定できるようにする。
【００２８】
蛍光発光の直角位相成分における振幅の抽出は、どんな特別の困難も提示しない。それは、例えば、ロックイン検出によって、又は蛍光強度のフーリエ変換の解析によって行うことができる。同様に、励起ビームの変調は、周知の方法、例えば照明源の直接変調、又は電気光学的若しくは機械的な光変調器の使用によって達成することができる。
【００２９】
先行技術から周知の技術と反対に、複数の励起ビームを供給する必要はない。単一の照明ビーム（又は拡散単色照明であっても、同じ波長及び同じ変調の複数のビーム）を用いることができる。
【００３０】
ここで、本発明が依拠する理論が、図２Ａ及び２Ｂを用いて、より詳細に説明される。
【００３１】
照明がない状態で、光切り替え可能な蛍光種Ｐは、ほとんど、その最も安定した状態１にのみ存在する。系が、強度Ｉ０で照明されると、速度定数
【数８】
0006417422.tif 000009
によって特徴付けられる状態１から状態２への光切り替え、及び速度定数
【数９】
0006417422.tif 000010
によって特徴付けられる状態２から状態１への切り替え（熱及び光誘導の両方）が観察される。
【００３２】
緩和時間
【数１０】
0006417422.tif 000011
によって期間が定義される過渡期間後に、系は、明白な光異性化定数
【数１１】
0006417422.tif 000012
によって特徴付けられる光定常領域に達する。
【００３３】
この領域において、１０及び２０でそれぞれ示された状態１及び２の濃度は、
【数１２】
0006417422.tif 000013
によって与えられ、この式で、Ｐｔｏｔは、種Ｐの合計濃度である。蛍光発光の強度ＩＦ（ｔ）は、
【数１３】
0006417422.tif 000014
によって与えられ、この式で、Ｑ１及びＱ２は、それぞれ、状態１及び２の分子輝度であり、Ｑ１≠Ｑ２である。
【００３４】
ここで、角周波数ω及び変調振幅εで正弦波的に変調された照明の場合が検討される。
Ｉ（ｔ）＝Ｉ０［１＋ε  ｓｉｎ（ωｔ）］            （６）
ε＜＜１の場合には、一次に対して、
【数１４】
0006417422.tif 000015
である。
【００３５】
この仮説ε＜＜１が、本発明の実装形態にとって決して必須ではなく、解析的展開を単純化することが注目されるべきである。
【００３６】
換言すれば、本発明は、供給されるパラメータＩ０及びωの値を保持することによって、「強い」振幅変調（１に近いε）で実施することができ、そのとき、それ未満では、１及び２における濃度の変調の直角位相における一次項の振幅を最適化することができる。
【００３７】
緩和時間
【数１５】
0006417422.tif 000016
を超えると、系は、定常状態強制領域に入り、そこにおいて、２つの状態ｉ（ｉ＝１又は２）の濃度は、
ｉ（ｔ）＝ｉ０＋ε［ｉ１ｓｉｎｓｉｎ（ωｔ）＋ｉ１ｃｏｓｃｏｓ（ωｔ）］      （８）
の値を有する。この式で、ｉ０は、光子束Ｉ０に関連する定常状態におけるｉの濃度であるのに対して、εｉ１ｓｉｎｓｉｎ（ωｔ）およびεｉ１ｃｏｓｃｏｓ（ωｔ）
は、角周波数ωで振動する同位相及び直角位相の項である。
【数１６】
0006417422.tif 000017
と示すことができる。そこでは、
【数１７】
0006417422.tif 000018
である。
【００３８】
次に、蛍光発光の強度ＩＦ（ｔ）は、
【数１８】
0006417422.tif 000019
になり、それと共に
【数１９】
0006417422.tif 000020
である。
【００３９】
平均値ＩＦ０で除算することによって、正規化された蛍光発光が得られる。
【数２０】
0006417422.tif 000021
この式で、αｉｎ及びαｏｕｔは、αｉｎ＝（Ｑ１−Ｑ２）１１ｓｉｎ／Ａ０およびαｏｕｔ＝（Ｑ１−Ｑ２）１１ｃｏｓ／Ａ０と共にＡ０＝Ｑ１１０＋Ｑ２２０によってそれぞれ定義された同位相及び直角位相成分の振幅である。
【００４０】
固定平均照度強度Ｉ０に関して、可逆的に光切り替え可能な蛍光体Ｐを特徴付ける３つ組のパラメータ
【数２１】
0006417422.tif 000022
は、２つの同等の動的パラメータセット
【数２２】
0006417422.tif 000023
を与える。この第２のセットは、系の力学を特徴付けるように選択される。次に、蛍光強度の同位相及び直角位相成分が依存する項１１ｓｉｎ及び１１ｃｏｓは、
【数２３】
0006417422.tif 000024
によって表すことができる。
【００４１】
図２Ａ及び２Ｂは、同位相における正規化された振幅｜１１ｓｉｎ／Ｐｔｏｔ｜
及び直角位相における正規化された振幅｜１１ｃｏｓ／Ｐｔｏｔ｜の依存性を、（対数単位で表現された）
【数２４】
0006417422.tif 000025
の関数としてそれぞれ示す。１１ｃｏｓ（及び従って蛍光発光強度の直角位相成分
【数２５】
0006417422.tif 000026
）が、十分に定義された最大値を示すことに注目することができる。それは、１１ｓｉｎの場合には当てはまらない。この最大値は、ポイント
【数２６】
0006417422.tif 000027
を中心とする。
【００４２】
これらの条件を満たすために、制御パラメータ（Ｉ０、ω）を選択することが可能である。従って、１１ｃｏｓ−の（及びＩＦｏｕｔ−の）値は、
【数２７】
0006417422.tif 000028
換言すれば、
【数２８】
0006417422.tif 000029
の場合に最大である。
【００４３】
物理的に、Ｉ０に関する条件（１９）は、熱及び光誘導反応の運動定数を等しくすることになり、ω又はｆに関する条件（２０−２１）は、共振条件（１８）を満たすために、緩和時間
【数２９】
0006417422.tif 000030
における変調周波数をチューニングすることになる。
【００４４】
低振幅の変調シグナルの使用は、単純な解析式の導出に資する。他方において、それは、弱い変調故に、種Ｐからのシグナルの小さな変化だけを生成できるようにし、それは、直角位相における一次応答の信頼できる抽出にとって欠点を表す。光切り替え可能な種Ｐの応答は、この欠点を緩和するために、広い振幅変調αの場合に解析することができる。前の場合の拡張として、広い振幅αの正弦波変調が、
Ｉ（ｔ）＝Ｉ０［１＋αｓｉｎ（ωｔ）］      （２２）
のように、まず第一に検討され得る。
【００４５】
可逆的に光切り替え可能な蛍光種における濃度の時間依存性を計算するために、より一般的な場合に、光強度が、
Ｉ（ｔ）＝Ｉ０［１＋αｈ（ωｔ）］      （２４）
の形式で書くことが可能であることを第一に検討することができる。この式で、ｈ（ωｔ）は、基本ラジアル周波数ωの周期関数を表す。式２４は、式１及び２の速度定数を展開するために用いることができる。濃度の式を次のように書くことによって、
２＝２０＋αｆ（ωｔ）      （２５）
１＝１０−αｆ（ωｔ）      （２６）
濃度１及び２の時間的展開を管理する微分方程式系は、
【数３０】
0006417422.tif 000031
となり、この式では、
【数３１】
0006417422.tif 000032
である。
【００４６】
緩和時間
【数３２】
0006417422.tif 000033
後に、ｆ（θｘ）が周期的な連続関数である定常領域が確立される。低振幅の正弦波変調の場合と異なり、ｆ（θｘ）の解析を一次に制限することは可能ではない。関数ｆ（θｘ）は、フーリエ級数で展開されなければならない。
【数３３】
0006417422.tif 000034
この式で、ａｎ及びｂｎは、フーリエ級数のｎ番目の成分の振幅を表す。項ａｎ及びｂｎは、同じ次数の振幅の識別によって、式２７から抽出することができる。従って、濃度１及び２の式を得ることが可能である。
【数３４】
0006417422.tif 000035
【００４７】
従って、定常領域において、照明の広い振幅の変調は、ラジアル周波数の無限大にわたる濃度１及び２の変調につながる。式３３及び３４は、ラジアル周波数ｎωで振動する同位相又は直角位相における項の振幅ｉｎ，ｉｎ及びｉｎ，ｏｕｔを明らかにするために変形することができる。ｉの濃度は、次のように書くことができる。
【数３５】
0006417422.tif 000036
【００４８】
項ｉｏ、ｉｎ，ｉｎ及びｉｎ，ｏｕｔは、Ｐｔｏｔに比例する。実際には、式２７は、
【数３６】
0006417422.tif 000037
に変形することができる。
【００４９】
ｂもｈ（θｘ）も、Ｐｔｏｔに依存しない（式２２、２３、２８−３１を参照）。他方において、αは、Ｐｔｏｔに比例する（式４及び２９を参照）。導出が線形であるので、式３６は、ｆ（θｘ）がＰｔｏｔに比例することを意味する。ａｎ及びｂｎに接近できる方程式系は線形である。従って、全ての振幅ａｎ及びｂｎがＰｔｏｔに個々に比例すると推定することができる。最後に、式３３−３５は、ｉｏ、ｉｎ，ｉｎ及びｉｎ，ｏｕｔがＰｔｏｔに比例することを推定するために用いることができる。小さな振幅の光の正弦波変調の場合に、２１，ｏｕｔが、式１９及び２１の共振条件が満たされる場合に、最適であることが前に証明された。２１，ｏｕｔ用の解析式がない状態で、かかる結論は、強い振幅の周期的な光変調の場合には導き出すことができない。それらの関連は、数値計算によって推定された。
【００５０】
本発明の実施形態の例として、広い振幅の正弦波変調の場合が解析された。特に、依存性ｉｎ，ｏｕｔ＝−２１，ｏｕｔ＝−α１が、制御パラメータω及びＩ０に基づいて解析された。この目的のために、２ｎ＋１の未知のパラメータａ０、．．．、ａｎ、ｂｎ）が、ｎの増加する次数用に、フーリエ級数（式３２）における展開の切り捨てによって見つけられる。
【００５１】
図３は、α＝１の場合に、（ｅｉｎ．ｓ−１．ｍ−２における）光束Ｉ０及び無次元ラジアル周波数
【数３７】
0006417422.tif 000038
に対する正規化された振幅の依存性
【数３８】
0006417422.tif 000039
を表す。数値計算は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ用に、それぞれ一次、二次、三次、四次及び五次においてフーリエ級数ｆ（θｘ）を切り捨てることで実行される。パネルＦは、低振幅変調領域で観察される、同じ変数に対する正規化された振幅の依存性を表示する。マーカは、等濃度曲線（ダッシュ記号用の０．０１、点用の０．０３、及びダッシュ記号用の０．０５）に対応する。５次（ｎ＝５）への関数ｆ（θｘ）のフーリエ級数の切り捨ては、収束を観察するのに十分である。Ｉ０及びωに対する
【数３９】
0006417422.tif 000040
の依存性は、ｎ＝５を超えてはそれほど変化しない。
【数４０】
0006417422.tif 000041
は、スペースにおける最適値（Ｉ０、ω）を示し、そのための位置及び振幅は、低振幅の正弦波変調の場合に観察されるものに非常に近い。用いられるαの振幅が何であっても、低振幅の変調にのみ有効な解析式を取ることによってなされる誤差は、２０％未満である。かかる誤差は、平均光強度及びラジアル周波数をそれらの共振値ＩＯ，Ｒ及びωＲに設定することによる実験誤差程度である。
【００５２】
単一の可逆的に光切り替え可能な蛍光種を検討する代わりに、異なる動的パラメータを示すが、しかし重なり合うか又は近い吸収／発光帯（照明光のスペクトル幅に含まれる）複数のかかる種を含むサンプルに興味が集中される場合に、直角位相における強度は、複数の極大値（各前記種用に１つ）を示す。
【００５３】
図４は、本発明による検出の選択性と同様に、その定量的性質を強調する。
【００５４】
この図において、同じ濃度、同一の吸収及び発光波長、並びに同じ輝度の状態１（状態２は、一般性を失うことなく、非蛍光と見なされる）を有する９つの可逆的に光切り替え可能な蛍光種を含むサンプルの場合が検討される。即ち、１つの標的種及び８つの干渉種である。スペース
【数４１】
0006417422.tif 000042
（「Ｘ」は干渉種を識別し、このインデックスのないパラメータは標的種を指す）において、干渉種は、エッジキューブ「ｎ」を形成し、標的種は、中心にある。次の値、即ち「ｎ」：１、１．５、２、２．５、３、３．５、４に対応する異なる７つの場合が検討される。
【００５５】
一定の強度の照明を用いることにより、蛍光検出によって標的種を滴定する試みがなされる場合に、測定は、干渉種によって強く影響される。より正確に且つ「ｎ」の値と無関係に、
【数４２】
0006417422.tif 000043
であることが分かる。この式で、それぞれ、
【数４３】
0006417422.tif 000044
は、平均蛍光強度の定量化から抽出された、標的の測定濃度であり、Ｐｔｏｔは、その実際の濃度であり、Ｘｔｏｔは、干渉種Ｘの合計濃度であり、１０及び１０ｘは、標的及び干渉種Ｘの、一定の強度Ｉ０における照明下の定常濃度である。図４のグラフが示すように、濃度は、８倍を超えて過大評価される。
【００５６】
しかしながら、変調された照明が、蛍光の直角位相における検出と一緒に用いられる場合に、次の式が得られる。
【数４４】
0006417422.tif 000045
この式で、
【数４５】
0006417422.tif 000046
は、直角位相における応答の解析から抽出された標的の測定濃度であり、１１ｃｏｓ及び
【数４６】
0006417422.tif 000047
は、標的及び干渉種Ｘの状態１における濃度の直角位相成分の振幅である。
【００５７】
照明の変調周波数及び強度が、標的種の検出用に最適化される場合に、１１ｃｏｓ／Ｐｔｏｔは、
【数４７】
0006417422.tif 000048
よりはるかに大きい。図４のグラフは、パラメータ「ｎ」が高い場合に、
【数４８】
0006417422.tif 000049
が、Ｐｔｏｔにより近いことを示す。干渉種の動的特性が、標的種の動的特性から十分に離れている場合に（ここで検討される例ではｎ≧２）、それらが引き起こす過大評価は無視できる。従って、本発明の方法によって得られる選択性は、干渉種が、標的種における動的パラメータとは十分に異なる動的パラメータを示すならば（これは一般に事実であり、特に生物学サンプルにおいて当然に存在する干渉蛍光体は、可逆的に光切り替え可能ではないので、一層事実である）、干渉種が存在する状態でさえ、定量的検出（滴定）を可能にする。
【００５８】
図４に表示されている結果は、次のパラメータ、即ち、
【数４９】
0006417422.tif 000050
を検討することにより、数値シミュレーションによって得られた。
【００５９】
変形として、異なる波長を備えた２つの別個の励起ビームを用いることが可能である。異なる電磁スペクトル及び光強度の２つのビームのそれぞれは、種ｐの２つの状態を連結する反応における異なる速度定数を課することができる。２つのビームを使用する際の不都合の１つが、検出方法の実装形態を複雑にすることである。他方において、それは、有利なことに、単一の光ビームを使用する場合に、状態２から状態１への熱緩和に連結される取得速度に対する制限を克服できるようにする。
【００６０】
本発明のこの特定の実施形態において、種Ｐは、それぞれ波長λ１及びλ２の成分Ｉ１（ｔ）及びＩ２（ｔ）を含む、強度Ｉ（ｔ）の光によって照明される。次に、前に説明した２つの状態を備えた系は、次の速度定数を有する。
【数５０】
0006417422.tif 000051
この式で、
σ１２，１Ｉ１（ｔ），σ１２，２Ｉ２（ｔ），σ２１，１Ｉ１（ｔ）、σ２１，２Ｉ２（ｔ）及び
【数５１】
0006417422.tif 000052
は、それぞれ、速度定数の光化学及び熱寄与である。この場合に、光異性化用の有効な分子セクションσ１２，１及びσ２１，１（λ１に対して）、σ１２，２及びσ２１，２（λ２に対して）、並びに熱緩和定数
【数５２】
0006417422.tif 000053
は、光切り替え可能な種Ｐの挙動を完全に定義する。
【００６１】
本発明の特定の実施形態において、この系は、ラジアル周波数ω１で、平均値
【数５３】
0006417422.tif 000054
を中心に振動する正弦波周期強度の波長λ１を備え、且つ小さな振動振幅
【数５４】
0006417422.tif 000055
を備えた照明と共に用いられ、
その照明には、一定の強度
【数５５】
0006417422.tif 000056
で、波長λ２（λ１≠λ２）の照明が重ね合わされる。次に、以下の式
【数５６】
0006417422.tif 000057
が当てはまる。
【００６２】
【数５７】
0006417422.tif 000058
を導入することによって、次の式を書くことができる。
【数５８】
0006417422.tif 000059
濃度１及び２の時間的展開を管理する微分方程式系は、この一次光摂動において解かれる。緩和時間
【数５９】
0006417422.tif 000060
後に、強制及び定常領域が確立され、そこにおいて濃度は、
Ｉ＝ｉ０＋εｉ１ｓｉｎ（ωｔ−φ１２）      （４８）
である。各種において、ｉ（ｉ＝１又は２）は、ラジアル周波数ωだが、しかし
【数６０】
0006417422.tif 000061
の位相遅延を伴い、平均値ｉ０（それは、光子束Ｉ０に関連する定常領域におけるｉの濃度に対応する。式４を参照）を中心に振動する。濃度変調の振幅は、
【数６１】
0006417422.tif 000062
によって与えられる。この式で、
【数６２】
0006417422.tif 000063
は、Ｉ０で照明することによって、それぞれ１から２への且つ２から１への遷移に対して、定常領域における反応速度及び変調光による光化学処理を示す。
【００６３】
濃度ｉはまた、
Ｉ（ｔ）＝ｉ０＋ε［ｉ１，ｉｎｓｉｎ（ωｔ）＋ｉ１，ｏｕｔｃｏｓ（ωｔ）］      （５２）
と書くことができ、この式で、εｉ１，ｉｎｓｉｎ（ωｔ）及びεｉ１，ｏｕｔｃｏｓ（ωｔ）は、ラジアル周波数ωで同位相及び直角位相において振動する項である。同位相及び直角位相における項の振幅ｉ１，ｉｎ、ｉ１，ｏｕｔは、
【数６３】
0006417422.tif 000064
であり、この式で、
【数６４】
0006417422.tif 000065
である。
【００６４】
蛍光発光が、種１及び２の寄与から生じるので、振動濃度における位相遅延は、振動蛍光発光における位相遅延を引き起こす。次に、振動蛍光発光は、
【数６５】
0006417422.tif 000066
である。この式で、
同位相及び直角位相における項の振幅
【数６６】
0006417422.tif 000067
は、
【数６７】
0006417422.tif 000068
であり、
【数６８】
0006417422.tif 000069
である。
【００６５】
２つの別個の励起ビームを用いる本発明の実施形態は、状態１及び２間の交換が、２つのビームを用いる場合に本質的に光化学の寄与によるという制限において、単一の励起ビームを用いる本発明の実施形態と異なる。
【００６６】
２つの励起ビームを用いて本発明を実施する場合に、直角位相における応答を最適化する制御パラメータを計算することが可能である。解析は、
【数６９】
0006417422.tif 000070
であるように、強度範囲
【数７０】
0006417422.tif 000071
に制限される。図５のパネルＡ及びＢは、これらの計算を示す。図５において、用いられる蛍光種Ｐは、Ｄｒｏｎｐａ−２である。それは、σ１２，１＞＞σ１２，２及びσ２１，２＞＞σ２１，１であるように、５個一組のパラメータ
【数７１】
0006417422.tif 000072
によって特徴付けられる。直角位相におけるその正規化された振幅
【数７２】
0006417422.tif 000073
が、制御パラメータ
【数７３】
0006417422.tif 000074
の関数として図５に表示されている。
【００６７】
【数７４】
0006417422.tif 000075
は、次の２つの共振条件
【数７５】
0006417422.tif 000076
が満たされる場合に、単一の最適値を示す。
【００６８】
１１，ｏｕｔの最適化は、式５４における項
【数７６】
0006417422.tif 000077
の独立した最適化から生じる。
【数７７】
0006417422.tif 000078
は、振幅の光強度ジャンプ
【数７８】
0006417422.tif 000079
後の定常領域２０の合成偏差Δ２０を測定する。この成分は、２つの光源によって誘導された光化学反応が同じ速度で発生する場合に、最大化される。第２の最適化された項は、
【数７９】
0006417422.tif 000080
【数８０】
0006417422.tif 000081
であるように、交換緩和時間
【数８１】
0006417422.tif 000082
でラジアル周波数ωを調整することによって最大化される。
【数８２】
0006417422.tif 000083
の場合に、交換は、変光と比較して遅く、種｛１、２｝は、応答するための十分な時間がない。次に、項ｉ１，ｉｎ及びｉ１，ｏｕｔは消える。反対に、
【数８３】
0006417422.tif 000084
の場合に、ｉ１，ｏｕｔは相殺され、次に、濃度１及び２は、光変調と同位相で振動する。
【００６９】
図５のパネルＡは、
【数８４】
0006417422.tif 000085
の場合に、直角位相における振動の正規化された振幅
【数８５】
0006417422.tif 000086
を表示する。図５のパネルＢは、
【数８６】
0006417422.tif 000087
の場合に、直角位相における振動の正規化された振幅
【数８７】
0006417422.tif 000088
を表示する。
【００７０】
本発明の特定の実施形態において、２つの別個の光ビームを用いることが可能であり、その場合に、光ビームの１つにおける強度は、単一光源を用いた照明の場合におけるように、その強度の平均値に対して大きな振幅で変調される。
【００７１】
本発明はまた、実験的に検証された。
【００７２】
図７によって示されている第１の検証は、可逆的に光切り替え可能な蛍光種として、図６によって示されている「Ｓｐｉｎａｃｈ−ＤＦＨＢＩ」系を用いる。
【００７３】
「Ｓｐｉｎａｃｈ」は、小さな分子と複合体を形成できるアプタマーである。ＤＦＨＢＩは、「Ｓｐｉｎａｃｈ」によって複合体を形成され得る、且つ２つの異性体シス及びトランスの形で存在できる発蛍光団である。従って、系は、４つの状態で存在する。  
−  １ｆｒｅｅによって示されているフリーシス−ＤＦＨＢＩ。
−  ２ｆｒｅｅによって示されているフリートランス−ＤＦＨＢＩ。
−  １ｂｏｕｎｄによって示されている複合シス−ＤＦＨＢＩ。
−  ２ｂｏｕｎｄによって示されている複合トランス−ＤＦＨＢＩ。
【００７４】
結合（複合体形成）状態は、自由状態と反対に蛍光性であり、特に、状態１ｂｏｕｎｄは、状態２ｂｏｕｎｄより安定し且つ明るい。トランス−シス（２→１）異性化反応は、熱によって（図６におけるシンボル「Δ」）且つ照明の影響下（シンボル「ｈｖ」）の両方で発生するのに対して、シス−トランス（１→２）反応は、もっぱら光誘導性である（シンボル「ｈｖ」）。
【００７５】
低照明領域において、光異性化反応は、複合体形成／脱複合体形成反応と比較して遅い。従って、一組の状態（１ｆｒｅｅ；１ｂｏｕｎｄ）及び（２ｆｒｅｅ；２ｂｏｕｎｄ）は、仮想状態
【数８８】
0006417422.tif 000089
と見なすことができる。従って、「Ｓｐｉｎａｃｈ−ＤＦＨＢＩ」系は、可逆的に光切り替え可能な蛍光種と見なすことができ、上記で説明した理論が当てはまる。
【００７６】
４つのチャネル（深さ２００μｍ、幅５０μｍ）を含むマイクロ流体装置が、サンプルとして用いられた。装置のチャネル１〜４が、次の溶液で満たされた。
１：（Ｓｐｉｎａｃｈ２５０ｎＭ、ＤＦＨＢＩ２．５μＭ）＋７５ｎＭフルオレセイン
２：（Ｓｐｉｎａｃｈ５００ｎＭ、ＤＦＨＢＩ５μＭ）＋５０ｎＭフルオレセイン
３：（Ｓｐｉｎａｃｈ５００ｎＭ、ＤＦＨＢＩ５μＭ）のみ
４：フルオレセイン１００ｎＭのみ
【００７７】
系（Ｓｐｉｎａｃｈ−ＤＦＨＢＩ）は、標的種をモデル化し、フルオレセインは、干渉蛍光体をモデル化する。
【００７８】
図７のパネル「ａ」は、一定の照明が存在する状態で、顕微鏡によって記録されたこのマイクロ流体装置の蛍光画像を示す。パネル「ｂ」は、撮像されるチャネルの長さにわたって統合された、対応する正規化蛍光強度Ｉ０Ｆ，ｎｏｒｍを示す。パネル「ｃ」及び「ｄ」は、標的種の検出用の最適条件において、変調された照明及び直角位相における検出の場合に対応する。
【００７９】
本発明に従って測定された蛍光強度ＩｏｕｔＦ，ｎｏｒｍが、（Ｓｐｉｎａｃｈ−ＤＦＨＢＩ）の濃度にほぼ比例すること、即ち、チャネル１におけるよりもチャネル２及び３において２倍大きく、チャネル４においてゼロであることが、パネル「ｄ」で分かる。対照的に、一定の照明において実行された測定（パネル「ｂ」）は、フルオレセインの存在によってかなり乱される（チャネル４の強度は、チャネル１の強度とほぼ等しく、一方で標的種は存在しない）。
【００８０】
図８によって示されている第２の検証は、可逆的に光切り替え可能な蛍光種として、蛋白質「Ｄｒｏｎｐａ−２」を用いる。
【００８１】
４つの正方形チャンバ（長さ×幅×厚さ＝４００×４００×２０μｍ３）を含むマイクロ流体装置が、サンプルとして用いられた。装置のチャンバ１〜４は、次の溶液で満たされた。
１：（Ｄｒｏｎｐａ−２  ２０μＭ、ＢＳＡ１００μＭ）（左上）
２：  フルオレセイン１μＭのみ（右上）
３：（Ｄｒｏｎｐａ−２  １０μＭ、ＢＳＡ１００μＭ）（左底部）
４：（Ｄｒｏｎｐａ−２  ５μＭ、ＢＳＡ１００μＭ）（右底部）
【００８２】
Ｄｒｏｎｐａ−２系は、標的種をモデル化し、フルオレセインは、干渉蛍光体をモデル化する。
【００８３】
図８のパネル「ａ」は、一定の照明が存在する状態で顕微鏡によって取得されたこのマイクロ流体装置の蛍光画像を示す。パネル「ｂ」は、標的種の検出用の最適条件において、変調された照明及び直角位相における検出の場合に対応する。
【００８４】
本発明に従って測定された蛍光強度ＩｏｕｔＦ，ｎｏｒｍが、Ｄｒｏｎｐａ−２の濃度にほぼ比例すること、即ち、チャンバ４と比較してチャンバ１及び３用の比率が４及び２であることが、パネル「ｂ」で分かる。また、蛍光強度ＩｏｕｔＦ，ｎｏｒｍが、フルオレセインだけを含む正方形においてゼロに近いことが分かる。
【００８５】
明らかに、上記の種以外の可逆的に光切り替え可能な蛍光種が、本発明を実施するために使用可能である。
【００８６】
図９は、可逆的に切り替え可能な蛍光蛋白質「Ｄｒｏｎｐａ−３」を表現する生物学的材料の選択的な撮像への、本発明の実施形態による方法の適用を示す。図９のパネル「ａ」及び「ｂ」は、哺乳動物細胞において表現された「Ｄｒｏｎｐａ−３」の選択的な撮像を示す。各パネルは、２つの画像を表示する。即ち、落射蛍光で撮られた写真に対応する一画像と、核における、可逆的に光切り替え可能な蛍光種である「Ｄｒｏｎｐａ−３」及びＨＥＫ２９３細胞の細胞膜における、可逆的に光切り替え可能な蛍光種でない「ＥＧＦＰ」の両方を表現するＨＥＫ２９３細胞の選択的な撮像で撮られた写真に対応するもう一方の画像と、を表示する。パネル「ａ」が、固定細胞を表示するのに対して、パネル「ｂ」は、生細胞を表示し、その画像は、光信号の変調期間後に撮られる。スケールバーは、５０μｍである。
【００８７】
パネル「ｃ」及び「ｄ」は、受精の２４時間後に撮られた、且つ標的アクチンである「ｌｉｆｅａｃｔ−Ｄｒｏｎｐａ−３」を表現する、ゼブラフィッシュ胚における「Ｄｒｏｎｐａ−３」の選択的な撮像を示す。同様に、各パネルは、２つの画像を示す。即ち、落射蛍光において撮られた写真に対応する一画像と、選択的な撮像において撮られた写真に対応するもう一方の画像と、を示す。パネル「ｃ」は、照明振幅の変調が正弦波で大きな振幅（α＝９０％）である、且つ制御パラメータが「Ｄｒｏｎｐａ−３」の共振に設定される画像を表示する。パネル「ｄ」は、高振幅（α  ＝９０％）の照明の矩形波変調が適用された、且つ制御パラメータが「Ｄｒｏｎｐａ−３」の共振に設定される画像を表示する。パネル「ｃ」が、落射蛍光の画像を表示するのに対して、パネル「ｄ」は、単一平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）において取得された画像を表示する。パネル「ｄ」において、点輪郭の白い長方形は、励起光平面のより薄い部分を示す。ここで選択的な撮像は、落射蛍光においてよりも明確にアクチンネットワークを観察できるようにする。図９のパネル「ａ」、「ｂ」及び「ｃ」の画像は、３７℃で撮られ、パネル「ｄ」の画像は、２０℃で撮られる。スケールバーは、５０μｍである。
【００８８】
図１０によって示されている別の検証は、４８０ｎｍ及び４０５ｎｍのほぼ単色の波長における２つの別個の光ビームによって励起される蛋白質「Ｄｒｏｎｐａ−２」を、可逆的に光切り替え可能な蛍光種として用いる。ビームの１つ（λ＝４０５ｎｍ）は、一定の強度で照明し、もう一方のビーム（λ＝４８０ｎｍ）は、大振幅強度変調で照明する。
【００８９】
４つの正方形チャンバ（長さ×幅×厚さ＝４００×４００×  ２０μｍ３）を含むマイクロ流体装置が、サンプルとして用いられた。装置のチャンバ１〜４は、次の溶液で満たされた。
１：（Ｄｒｏｎｐａ−２  ２０μＭ、ＢＳＡ１００μＭ）（左上）
２：  フルオレセイン１μＭのみ（右上）
３：（Ｄｒｏｎｐａ−２  １０μＭ、ＢＳＡ１００μＭ）（左底部）
４：（Ｄｒｏｎｐａ−２  ５μＭ、ＢＳＡ１００μＭ）（右底部）
【００９０】
Ｄｒｏｎｐａ−２系は、標的種をモデル化し、フルオレセインは、干渉蛍光体をモデル化する。
【００９１】
図１０パネル「Ａ」は、一定の照明が存在する状態で、顕微鏡によって取得されたこのマイクロ流体装置の蛍光画像を示す。パネル「Ｂ」は、標的種の検出用の最適条件において、直角位相における検出の場合に対応する。
【００９２】
本発明に従って測定された蛍光強度ＩｏｕｔＦ，ｎｏｒｍが、Ｄｒｏｎｐａ−２の濃度にほぼ比例すること、即ち、チャンバ４と比較してチャンバ１及び３用の比率が４及び２であることが、パネル「ｂ」で分かる。また、蛍光強度ＩｏｕｔＦ，ｎｏｒｍが、フルオレセインだけを含む正方形においてゼロに近いことが分かる。
【００９３】
明らかに、上記の種以外の可逆的に光切り替え可能な蛍光種が、本発明を実施するために使用可能である。
【００９４】
図１１は、上記の実験的検証の幾つかを実行するために用いられるタイプの、本発明の実施形態による方法を実行するための装置を示す。非限定的な例として示されているかかる装置は、電源ＡＭによって電力を供給される発光ダイオードストリップからなる光源ＳＬＭを含む。前記光源によって生成された励起光ビームＦＥＸの変調は、電源の変調によって達成される。発光ダイオードの発光が広帯域なので、ビームＦＥＸは、サンプル上に導かれる前に、この場合にマイクロ流体装置ＤＭＦからなる第１の光学フィルタＦ１によってフィルタリングされる。適切に照明されたサンプルは、蛍光発光を収集し且つそれをビームＦＬＵへと集光する対物レンズＯＢＪによって、その裏面で観察される。ビームＦＬＵは、フィルタリングされ（フィルタＦ２、Ｆ３）、且つミラーＭ及びレンズＬＦを介してカメラＣＡＭに導かれる。プロセッサＰＲ（実際には、コンピュータによって適切にプログラムされる）は、上記のように直角位相における検出を実行するために、電源ＡＭ及びカメラＣＡＭを駆動する。撮像なしに単純な検出又は滴定を実行するために、カメラＣＡＭは、スポットライトセンサによって取り替えることができる。
【００９５】
図１２は、環境における可逆的に光切り替え可能な蛍光プローブを遠隔で検出できるようにする、本発明の別の実施形態による方法を実行するための装置を示す。かかる用途において、直角位相における検出によって可能にされる大きな選択性は、周囲光からなる非常に強い背景に対して、有用なシグナルを明白に示すために必要である。
【００９６】
図１２の装置において、光源ＳＬＭ’は、連続領域で動作するレーザ発振器である。励起ビームＦＥＸは、２つのレンズＬ１、Ｌ２によって拡張されコリメートされ、次に電気−光変調器ＭＥＯによって変調される。操縦可能なミラーＭ１及びＭ２が、少なくとも１つの可逆的に光切り替え可能な蛍光種Ｐ（例えばＤｒｏｎｐａ）を含む観察される標的ＣＯ（地表エリア又は水面）を走査するために用いられる。蛍光発光ＦＬＵは、カメラＣＡＭ’の対物レンズによって収集され、カメラＣＡＭ’は、標的の画像を取得する。前の場合におけるように、プロセッサＰＲが、上記のように直角位相における検出を実行するために、変調器ＭＥＯ及びカメラＣＡＭ’を駆動する。
【００９７】
図１３は、上記の実験的検証の幾つかを実行するために用いられるタイプの、本発明の実施形態による方法を実行するための装置を示す。非限定的な例として示されているかかる装置は、発光ダイオードの２つのストリップからなる２つの光源ＳＬＭ１及びＳＬＭ２を含む。光源ＳＬＭ１が、電源ＡＭ１によって電力を供給され、光源ＳＬＭ２が、電源ＡＭ２によって電力を供給される。前記光源によって生成された励起光ビームＦＥＸ１の変調は、電源の変調によって達成される。発光ダイオードの発光が広帯域なので、ビームＦＥＸ１及びＦＥＸ２は、サンプル上に導かれる前に、この場合にマイクロ流体装置ＤＭＦからなる２つの光学フィルタＦ１１及びＦ１２によってフィルタリングされる。適切に照明されたサンプルは、蛍光発光を収集し且つそれをビームＦＬＵへと集光する対物ＯＢＪによって、その裏面で観察される。ビームＦＬＵは、フィルタリングされ（フィルタＦ２）、且つミラーＭ及びレンズＬＦを介してカメラＣＡＭに導かれる。プロセッサＰＲ（実際には、コンピュータによって適切にプログラムされる）は、上記のように直角位相における検出を実行するために、電源ＡＭ１、ＡＭ２及びカメラＣＡＭを駆動する。撮像なしに単純な検出又は滴定を実行するために、カメラＣＡＭは、スポットライトセンサによって取り替えることができる。
【００９８】
図１４は、上記の実験的検証の幾つかを実行するために用いられるタイプの、本発明の実施形態による方法を実行するための装置を示す。非限定的な例として示されているかかる装置は、電源ＡＭによって電力を供給される発光ダイオードストリップからなる光源ＳＬＭを含む。前記光源によって生成された励起光ビームＦＥＸの変調は、電源の変調によって達成される。発光ダイオードの発光が広帯域なので、ビームＦＥＸは、サンプル上に導かれる前に、この場合にマイクロ流体装置ＤＭＦからなる第１の光学フィルタＦ１によってフィルタリングされる。適切に照明されたサンプルは、蛍光発光を収集し且つそれをビームＦＬＵへと集光する対物ＯＢＪによって観察される。ビームＦＬＵは、フィルタリングされ（フィルタＦ２）、且つミラーＭ及びレンズＬＦを介して、カメラＣＡＭに導かれる。プロセッサＰＲ（実際には、コンピュータによって適切にプログラムされる）が、上記のように直角位相における検出を実行するために、電源ＡＭ及びカメラＣＡＭを駆動する。撮像なしに単純な検出又は滴定を実行するために、カメラＣＡＭは、スポットライトセンサによって取り替えることができる。
【００９９】
本発明は、蛍光を発光する可逆的に光切り替え可能な種の事例を検討することによって説明された。しかしながら、たった今説明した直角位相における検出用の方法はまた、可逆的に光切り替え可能な種の２つの状態を区別できるようにする任意の他の分光観察を利用することができる。非限定的な例として、吸収を検討することができる（特に、ベール−ランベルトの法則が線形化され得る低吸収領域において）。この場合に、蛍光発光を検出する代わりに、入射光強度と関係する透過光強度が検出され、次に、直角位相におけるその成分の振幅が決定される。別の例は、反射率である。最適な照明条件を定義する式１９−２１及び５８−５９は、検討される分光観察の何にでも適用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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