(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＳＭ２３０９０株、ＤＳＭ２３０９１株、ＤＳＭ２３２００株、ＤＳＭ２３０９２株、ＤＳＭ２３０９３株、ＤＳＭ２３２０１株、ＤＳＭ２３１７４株、ＤＳＭ２３１２１株およびＤＳＭ２６０２４株のいずれか１つから選択される、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株。
【請求項２】
請求項１に記載の少なくとも１つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株および担体を含む、
組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物であって、
前記担体が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の培養に適切な培養培地である、
組成物。
【請求項４】
請求項２または３に記載の組成物であって、
少なくとも１つのさらなる微生物を含む、
組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物であって、
前記の少なくとも１つのさらなる微生物は、細菌および／または酵母である、
組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物であって、
前記の少なくとも１つのさらなる微生物は、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖａｒｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｈｕｍｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｉｌｌｅｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｒｎｅｔｔｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｎｏｒから選択される、細菌および／または酵母である
組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の少なくとも１つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株または請求項２から６のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、
ヒト用食品製品および補助食品製品または動物用飼料製品の製造のための、
使用。
【請求項８】
請求項７に記載の使用であって、
前記の食品製品、補助食品製品または飼料製品が、発酵製品である、
使用。
【請求項９】
請求項７または８に記載の使用であって、
前記食品製品が、サワードウまたは飲料である、
使用。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の使用であって、
前記食品製品がサワードウブレッドである、
使用。
【請求項１１】
請求項１に記載のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株または請求項２から６のいずれか一項に記載の組成物であって、
ヒトまたは動物用医薬での、または化粧品での、使用のための、
株または組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株または請求項２から６のいずれか一項に記載の組成物であって、
免疫応答の調節に使用するための、またはスキンケアに使用するための、
株または組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の使用であって、
それからさらにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を培養するための、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サワードウから分離された新規のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株に関する。また、場合によりさらなる他の微生物、例えば細菌および／または酵母を含む、少なくとも１つの前記のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を含む組成物も包含される。本発明はさらに、ヒト用食品製品および補助食品製品または動物用飼料製品を製造するための、前記のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株または組成物の使用に関する。本発明の別態様は、ヒトまたは動物用医薬での、または化粧品での、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の組成物の使用である。
【背景技術】
【０００２】
「乳酸菌」または「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ」という表現は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、非運動性、微好気性または嫌気性の細菌であって、糖を発酵することにより、主な生産物として乳酸、ならびに、酢酸、ギ酸および／またはプロピオン酸を含む酸を産生する細菌のグループの微生物を指す。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトバチルス種、ラクトコッカス種、オエノコッカス種、ストレプトコッカス種、ワイセラ種、エンテロコッカス種、ロイコノストック種およびペディオコッカス種のなかに見られる。
【０００３】
乳酸菌は、乳酸発酵により、病原菌および有害細菌の増殖を阻害する乳酸を産生する微生物である。それらはまた、乳酸および特定の抗生物質の生産により、腸内細菌叢の制御にも関与する。さらにそれらは、神経疾患などの年齢と関係する疾患、例えばパーキンソン、アルツハイマーまたは加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、および、血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症または脳卒中などと関連する、炎症性側面に関する免疫調節プロセスに関与する。
【０００４】
乳酸菌は、食品、飼料および医薬製品の製造の両方において、チーズ、ヨーグルト、およびバターなどの乳製品の製造を含む産業における、産業用発酵プロセスに広く用いられる。それらはまた、特定の食品製品の生産にも、例えば、発酵した野菜、穀類、パンおよび肉の生産においても、必須である。加えて、それらは次第に、ヒトおよび動物のためのプロバイオティクスとして用いられ、それは、純粋培養として得ることができ、または、食品または飼料に添加または取り込むことができ、または菓子に添加することさえできる。
【０００５】
乳酸菌の培養は、例えばサワードウ−ブレッドの製造で用いられ、その工程は、小麦粉と水との混合物の植菌ステップ、その後の発酵ステップ（数日間のこともある）、小麦粉と水を新しくするステップ（ｆｒｅｓｈｉｎｇ）、そして最後に、練って焼く前にゆっくり膨張させるパン生地に混合するステップを含む。培養酵母を用いて製造されるパンのタイプと比較して、それはたいてい、乳酸菌により生産される乳酸が原因で弱い酸味を有する。生地のｐＨ値は、酸性化により４．０〜４．３に段階的に低下する。それによる潜在的なプロセスは、パンの特徴である臭気物質および香味物質の形成の原因となる。
【０００６】
特に、マルチステップのサワードウ発酵工程では、乳酸菌および酵母種が含まれており、サワードウブレッドの特徴的な味および香りの原因となる。サワードウ発酵工程の別の顕著な利点は、長期保存、抗カビおよび抗菌効果、ならびに、サワードウでないパンと比較してサワードウのパンは感覚刺激特性が増大することである。
【０００７】
特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ、および、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株が、Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ−Ｐａｒｎａｓ（ＥＭＰ）経路を介してヘキソース糖類を代謝して、乳酸、酢酸およびＣＯ２を産生することが知られている。ペントース糖類は、ホスホグルコン酸経路を介して、乳酸および酢酸に代謝される。
【０００８】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓは、サンフランシスコのサワードウのスターターでそれが発見されたことにちなんで名付けられたものであるが、サンフランシスコに固有のものではない。サンフランシスコのサワードウはＩ型サワードウであり、そのようなＩ型サワードウは、３．８〜４．８のｐＨ範囲を有し、２０〜３０℃の範囲の室温で発酵する（Ｇｏｌｄｅｎ，Ｄ．ら、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ｐ．１７９）。それらはさらに、スターター培養の小麦粉を連続的に毎日新しくして微生物を活性状態で維持することにより特徴付けられる。いわゆるＩＩ型サワードウは、生地を発酵させるためのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅをさらに含む。これらのサワードウは、３．５未満のｐＨを有し、３０〜５０℃の温度範囲内で数日間、材料供給せずに発酵され、微生物叢の活性が低下する（Ｓａｄｅｇｈｉ，Ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，７，４１３、および、Ｅｒｃｏｌｉｎｉ，Ｄ．ａｎｄ  Ｃｏｃｏｌｉｎ，Ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  Ｆｏｏｄｓ，２００８，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ｐ．１１９）。ＩＩ型サワードウは、生地を酸性化するために用いられることが多く、半流動性のサイロ調製物である。ＩＩＩ型サワードウは、乾燥調製物であり、凍結乾燥に対して耐性の乳酸菌を含む。それらは、ＩＩ型サワードウ同様に、発酵剤としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａの添加を必要とする。発酵において、グルコース、フルクトース、およびスクロースなどの糖類が嫌気的条件下で細胞エネルギーおよび代謝ラクテートに変換される生物学的プロセスにより、乳酸が産生される（Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  Ｆｒｕｉｔｓ  ａｎｄ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ−Ａ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，１９９８，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ）。
【０００９】
様々なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、それらの特性、例えば発酵速度または代謝物生産の観点から、互いに異なり得る。
【００１０】
特に産業用途のためには、発酵製品を生産する様々なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の能力は、より良い発酵結果および／または、香味および臭気物質のブーケ（ｂｏｕｑｕｅｔ）の改善を得るために最適化されなければならない重大な特性である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の根本的な問題は、ヒト用食品、動物用飼料の製造、および、ヒトおよび動物用医薬での治療目的、ならびに化粧品での用途に、特に適切な新規の乳酸菌を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ  ＤＳＭ  ２６０２４（ＬＲ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９０株（９０  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９１株（９１  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９２株（９２  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９３株（９３  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３１７４株（１７４  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３２００株（２００  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３２０１株（２０１  ＬＳ）、および、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株ＤＳＭ  ２０４５１（ＬＳＴ）を用いた植菌の２４時間後の、ＭＲＳ培養液中の相対的な代謝物濃度のヒートマップ。
【図２】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ  ＤＳＭ  ２６０２４（ＬＲ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９０株（９０  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９１株（９１  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９２株（９２  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９３株（９３  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３１７４株（１７４  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３２００株（２００  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３２０１株（２０１  ＬＳ）、および、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株ＤＳＭ  ２０４５１（ＬＳＴ）の、０．２５×１０７の乳酸菌／ｍＬを用いた植菌の２４時間における、ＭＲＳ培地中のアミノ酸濃度。Ａ：アルギニン濃度。Ｂ：フェニルアラニン濃度。Ｃ：バリン濃度。Ｄ：ロイシン濃度。Ｅ：イソロイシン濃度。Ｆ：ヒスチジン濃度。
【図３】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ  ＤＳＭ  ２６０２４（ＬＲ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９０株（９０  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９１株（９１  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９２株（９２  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９３株（９３  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３１７４株（１７４  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３２００株（２００  ＬＳ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３２０１株（２０１  ＬＳ）、および、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株ＤＳＭ  ２０４５１（ＬＳＴ）の、０．２５×１０７の乳酸菌／ｍＬを用いた植菌の２４時間における、ＭＲＳ培地中のアセチルコリン濃度。
【図４】様々なパンおよび生地サンプルの、ＨＯＣｌ解毒に対する効果。
【図５】様々なパンおよび生地サンプルの、全血系における効果（ザイモサン使用）。
【図６】様々なパンおよび生地のサンプルの、全血系における効果（ザイモサン不使用）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
異なるサワードウサンプルの分析において、９つの新規のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株が同定されている。これらの株は、ブダペスト条約により、Ｌｅｉｂｎｉｔｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託されている。新規のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、以下のアクセッション番号および寄託日を有する：ＤＳＭ  ２３０９０（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ  ２３０９１（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ  ２３２００（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ  ２３０９２（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ  ２３０９３（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ  ２３２０１（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ  ２６０２４（２０１２−０６−０４）、ＤＳＭ  ２３１７４（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ  ２３１２１（２０１２−０６−２１）。新規の細菌株は、それぞれ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅとして同定されている。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓのプロトタイプ株と比較して、９７．５〜９９．２％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する（表３）。寄託された株は、ヒトまたは動物用途の発酵製品の生産に非常に良く適合する。寄託された株は、サワードウの製造での使用に特に適切であり、特にマルチステップのサワードウ発酵工程での使用により適切である。有利なことに、寄託された株は、ヒトおよび動物の健康に有益なバランスの良い比率の代謝物と組み合わせて、優れた香りを与えるのに寄与する（表４および図１〜３）。
【００１４】
本発明は、ＤＳＭ  ２３０９０株、ＤＳＭ  ２３０９１株、ＤＳＭ  ２３２００株、ＤＳＭ  ２３０９２株、ＤＳＭ  ２３０９３株、ＤＳＭ  ２３２０１株、ＤＳＭ  ２６０２４株、ＤＳＭ  ２３１７４株  および  ＤＳＭ  ２３１２１株、またはそれらから培養される株の、いずれか１つから選択されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を提供する。好ましくは、ＤＳＭ  ２３０９０株、ＤＳＭ  ２３０９１株、ＤＳＭ  ２３２００株、ＤＳＭ  ２３０９２株、ＤＳＭ  ２３０９３株、ＤＳＭ  ２３２０１株、ＤＳＭ  ２６０２４株、ＤＳＭ  ２３１７４株およびＤＳＭ  ２３１２１株の、いずれか１つから選択されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株が提供される。
【００１５】
本明細書において用いられる用語「それらから培養される株」は、原株の培養により得られる子孫株を意味する。
【００１６】
一部の実施態様では，本発明は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９株の組み合わせに関する。
【００１７】
株は、液体または固体の調製物として、例えば液体の細胞懸濁液として、または、凍結、噴霧乾燥または凍結乾燥の調製物として、提供され得る。
【００１８】
本発明の株は、マンニット、ラクテート、アセテート、およびそれらの組み合わせから選択される代謝物を産生することができる。代謝物は、約５〜７０ｍｍｏｌのマンニット／ｋｇ培養培地、約１０〜１１０ｍｍｏｌのラクテート／ｋｇ培養培地、および約５〜５０ｍｍｏｌのアセテート／ｋｇ培養培地の濃度で産生され得る。
【００１９】
好ましい実施態様では、いくつかの本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株またはそれらから培養される株の組み合わせは、代謝物のマンニット、ラクテートおよびアセテートを、特に、約５〜７０ｍｍｏｌのマンニット／ｋｇ培養培地、約１０〜１１０ｍｍｏｌのラクテート／ｋｇ培養培地、および約５〜５０ｍｍｏｌのアセテート／ｋｇ培養培地の濃度で産生することで特徴付けられる。より好ましい実施態様では、細菌により産生される代謝物は、約４０〜６０ｍｍｏｌのマンニット／ｋｇ培養培地、約５０〜１００ｍｍｏｌのラクテート／ｋｇ培養培地、および約２０〜４２ｍｍｏｌのアセテート／ｋｇ培養培地の濃度であり得る。培養培地は、任意の適切な培養培地、具体的には生地、より具体的にはサワードウであってよい。
【００２０】
本発明の株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株（ＤＳＭ  ２０４５１）と比較して、有意に異なる代謝プロファイルを、特に産生されるアミノ酸濃度に関して示す。アミノ酸、具体的にはロイシン、イソロイシンおよびバリンの量が少ないことは、製パンにとって、ベーキング工程中に産生される苦味化合物の量を減らすのに好ましい。このことは、苦味を減らすために生地に添加しなければならない塩（ＮａＣｌ）の量を減少させる。
【００２１】
本発明の株は、アルギニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、およびそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸を産生することが可能である。このアミノ酸は、少なくとも２．０ｍＭのアルギニン、好ましくは約２．０〜３．０ｍＭのアルギニン、少なくとも２．０ｍＭのフェニルアラニン、好ましくは約２．０〜２．６ｍＭのフェニルアラニン、少なくとも５ｍＭのバリン、好ましくは約５〜１２ｍＭのバリン、少なくとも１０ｍＭのロイシン、好ましくは約１０〜２４ｍＭのロイシン、少なくとも３ｍＭのイソロイシン、好ましくは約３〜７ｍＭのイソロイシン、および、少なくとも１ｍＭのヒスチジン、好ましくは約１〜１．５ｍＭのヒスチジンの濃度で産生され得る。
【００２２】
好ましい実施態様では、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、少なくとも５ｍＭのバリン、好ましくは約５〜１２ｍＭのバリン、少なくとも１０ｍＭのロイシン、好ましくは約１０〜２４ｍＭのロイシン、および、少なくとも３ｍＭのイソロイシン、好ましくは約３〜７ｍＭのイソロイシンを産生することで特徴付けられる。
【００２３】
また、本発明の株は、アセチルコリン（ＡＣＨ）を、少なくとも０．０２ｍＭのＡＣＨ、好ましくは約０．０２〜０．２５ｍＭのＡＣＨの濃度で、産生することも可能である。
【００２４】
アセチルコリンの存在は、薬学的特性の改善をもたらし（同時係属出願ＥＰ  １３  １５３  ９９６．７を参照）、胃と腸の運動および腸分泌を刺激することにより食物消化を助ける。
【００２５】
好ましい実施態様では、いくつかの本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の組み合わせは、アミノ酸のアルギニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびヒスチジンを、具体的には、約２．０〜３．０ｍＭのアルギニン、約２．０〜２．６ｍＭのフェニルアラニン、約５〜１２ｍＭのバリン、約１０〜２４ｍＭのロイシン、約３〜７ｍＭのイソロイシン、および約０．１〜１．５ｍＭのヒスチジンの濃度で産生することで特徴付けられる。より好ましくは、その組み合わせは、少なくとも５ｍＭのバリン、好ましくは約５〜１２ｍＭのバリン、少なくとも１０ｍＭのロイシン、好ましくは約１０〜２４ｍＭのロイシン、および、少なくとも３ｍＭのイソロイシン、好ましくは約３〜７ｍＭのイソロイシンを産生することで特徴付けられる。その組み合わせは、アセチルコリンを、具体的には、約０．１〜０．２５ｍＭのアセチルコリンの濃度で産生することでさらに特徴付けられる。培養培地は、任意の適切な培養培地、具体的には生地、さらに具体的にはサワードウであってよい。
【００２６】
本発明の別の実施態様は、ＤＳＭ  ２３０９０、ＤＳＭ  ２３０９１、ＤＳＭ  ２３２００、ＤＳＭ  ２３０９２、ＤＳＭ  ２３０９３、ＤＳＭ  ２３２０１、ＤＳＭ  ２６０２４、ＤＳＭ  ２３１７４、およびＤＳＭ  ２３１２１、またはそれらから培養される株の群から選択される少なくとも１つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株、および、栄養学的または薬学的に許容できる担体を含む、組成物である。好ましい実施態様では、組成物は、本発明の乳酸菌を２、３、４、５、６、７、８、および／または９株含むことができる。最も好ましい実施態様では、組成物は、本発明の少なくとも５株を含む。
【００２７】
本発明の組成物は、少なくとも１つのさらなる微生物をさらに含んでよい。さらなる微生物は、細菌および／または酵母であり得る。前記の細菌または酵母は、好ましくは、ヒトまたは動物に有害であることが知られている病理学的特性を有さない、栄養学的または薬学的に適合する株である。好ましい実施態様では、さらなる細菌および／または酵母は、動物用および／またはヒト用の食品および／または飲料の生産に適切である。別の好ましい実施態様では、さらなる細菌および／または酵母は、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を発酵するのに適切であり、それにより、ヒトまたは動物の健康に有益な代謝物を提供する。さらなる細菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｏｌｙｔｉｃｕｓ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖａｒｕｓ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｎｔｉｓ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ株および／またはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ株からなる群より選択してよい。さらなる酵母株は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｈｕｍｉｌｉｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｉｌｌｅｒｉ株、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ株、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｉｇｕｕｓ株、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｒｎｅｔｔｉ株、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株および／またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｎｏｒ株からなる群より選択される。より好ましい実施態様では、酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｒｎｅｔｔｉ株である。
【００２８】
組成物は、本発明の微生物を、組成物の総重量に基づいて約０．１〜約９９％重量、好ましくは約２〜約２０％重量、さらにより好ましくは、約４〜約１０％重量の量で含んでよい。さらに、組成物は、本発明の微生物を、組成物の総重量に基づいて約１０３〜１０１２ｃｆｕ／ｇ（コロニー形成単位／ｇ）、好ましくは約１０４〜０．５×１０１２ｃｆｕ／ｇ、より好ましくは約１０７〜１０１１ｃｆｕ／ｇの量で含んでよい。
【００２９】
組成物は、液体または固体の組成物（例えば、凍結乾燥、粉砕または粉末）であってよい。
【００３０】
組成物は、細菌および／または酵母の培養に適切な培養培地、具体的には、培養液、培養液の濃縮物および／または培養液の乾物をさらに含んでよい。培養培地は、微生物、具体的には乳酸菌の培養に関して当技術分野で知られている任意の培地であってよい。培養培地は、寒天系の増殖培地のような固体の培養培地、生地、特にサワードウ、または、微生物、特に乳酸菌の培養に適切な任意の他の固体の培地であってよい。また、培養培地は液体の培養培地であってもよく、細菌は培養液または液体栄養培地中に懸濁されている。
【００３１】
培養培地は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の培養に適切な成分、例えばグルコースまたはマルトースなどの炭素源、ペプトンまたは肉エキスなどの窒素源、リン酸二水素カリウムなどのリン源、細菌の増殖に必須な金属塩、および場合により、アミノ酸および／またはビタミンのような成長促進物質を含んでよい。培養培地は、好ましくは酸性領域、具体的にはｐＨ６未満のｐＨを有する。一部の実施態様では、乳酸菌の抗炎症能は、それらの細胞壁のテイコ酸におけるＤ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）の割合に依存した高いＩＬ−１０／ＩＬ１２比の誘導により増加し得るので、培養培地はアミノ酸Ｄ−アラニンを含む。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ突然変異体における１％のＤ−Ａｌａ含有量は、野生型における４１％と比較して、曝された単球において、誘導されるＩＬ−１２／ＩＬ−１０比のインターロイキン−誘導を、１２２から３まで減少させた（Ｇｒａｇｎｅｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２（２００５），１０３２１；Ｆｏｌｉｇｎｅら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３（２００７），２３６）。
【００３２】
好ましい実施態様では、培養培地は、少なくとも、水、酵母および小麦粉、および／または、穀類および／または疑似穀類、例えば、小麦、ライコ麦、ライ麦、大麦、スペルト小麦、ヒトツブ小麦、オート麦、ソバ、カムート、エンマー、キビ、米、トウモロコシ、モロコシ、アマランス、キノア、大麻、ルピナス、またはそれらの組み合わせの麦芽を含む。場合により、塩またはスパイスまたはスパイス混合物を、培地の発酵前または発酵後に培養培地に添加することができる。
【００３３】
医薬または栄養の用途のための組成物は、例えば、錠剤、コーティング錠、カプセル、溶液、懸濁液、エマルション、ペレット、シロップなどのような、固体または液体の剤形であってよく、有効成分を賦形剤および／または、例えば天然鉱物粉末（カオリン、タルク）または合成鉱物粉末（例えばシリケート）のような担体と混合して、場合によりアジュバント（例えばグリコール）および／または分散剤（例えばメチルセルロース）を添加することにより、通常の様式で調製される。
【００３４】
場合により、組成物は、プレバイオティクスを含むこともできる。本明細書において用いられる「プレバイオティクス組成物」は、大腸に既に生息している制限された数の種の微生物のうちの１つの増殖、活性または両方を選択的に刺激することにより、宿主に有利に影響する、少なくとも非消化性の食品成分である。プレバイオティクスは、好ましくは、非消化性オリゴ糖、例えばフラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ラクツロース（ｌａｃｔｏｌｏｓｅ）、キシロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖（ｉｓｍａｌｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、大豆オリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、グルコオリゴ糖、フルクタン、ラクトスクロース、単鎖フラクトオリゴ糖、およびそれらの混合物である。
【００３５】
本発明の別の好ましい実施態様は組成物であり、ここで組成物は、飲料、チーズ、ヨーグルトまたはパンなどの発酵製品の製造のための、スターター培養および／または発酵スターターである。
【００３６】
別の好ましい実施態様では、微生物は、食用材料、好ましくは食品または飼料製品、具体的にはオート麦フレークまたはヨーグルトに適用することができる。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、ヒト用食品製品および補助食品製品または動物用飼料製品の製造のための、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株またはそれらから培養される株の使用、または、上述の組成物の使用に関する。
【００３８】
本明細書において用いられる用語「発酵性（ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ）」は、少なくとも１つの微生物、例えば乳酸菌または酵母を添加して、その微生物によって発酵を行なうことにより作られる生産品を指す。具体的には、その用語は、発酵スターターを食品または飼料のベースに添加して、それからそれをインキュベートすることにより作られる食品および飼料を指す。発酵スターターは、活性成分として、ＤＳＭ  ２３０９０、ＤＳＭ  ２３０９１、ＤＳＭ  ２３２００、ＤＳＭ  ２３０９２、ＤＳＭ  ２３０９３、ＤＳＭ  ２３２０１、ＤＳＭ  ２６０２４、ＤＳＭ  ２３１７４およびＤＳＭ  ２３１２１、またはそれらから培養される株、株の培養液、および／または、培養液の濃縮物、および／または、培養液の乾物の群より選択される少なくとも１つの株を含む。別の実施態様では，発酵スターターは、二酸化ケイ素または珪藻土などの食品技術または薬科学において許容できる担体に適用した、本発明の微生物株を含む。
【００３９】
本明細書において用いられる用語「食品製品」は、必要な栄養分を生物に提供する植物または動物起源の食品を意味する。食品製品は、乳系製品、野菜製品，肉製品、果汁、ワインおよびベーカリー製品、または他の低温殺菌されていない開放発酵性の食品、好ましくは、例えばアルコール飲料およびノンアルコール飲料、パン，キムチ、塩漬け発酵性の魚介類、味噌、チーズ、ヨーグルト、麦汁などであってよい。より好ましくは，食品製品は、サワードウまたは飲料、特にサワードウブレッドである。
【００４０】
本明細書において用いられる補助食品製品は、食事の補助、および、不足し得る、またはヒトの食事では十分な量を摂取され得ない、ビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、アミノ酸および／または酵素のような栄養分の提供を目的とする調製物である。他の補助は、ヒトの健康のための重要な制御成分、例えば、酵母由来のβ−グルカン、または、例えば緑茶、発酵茶、赤ワイン抽出物、ブドウ種子抽出物、クランベリーまたはアロニア抽出物または汁などを由来とする、多様なポリフェノールを含んでよい。さらに典型的な補助食品製品は、発酵性濃縮物である。
【００４１】
本明細書において用いられる用語「飼料製品」は、物質または食品製品、および添加剤を意味し、それらは、それらの加工レベルに応じて、動物、例えばウシ、ブタまたはシカの経口摂食向けである。
【００４２】
便利な飼料製品の出発原料は、乳酸菌発酵のステップに慣習的に供せられる任意の材料、例えば、草、穀類材料、エンドウマメ、アルファルファ−またはシュガー−ビート（ｓｕｇａｒ−ｂｅａｔ）の葉などのサイレージを含み、そこでは、これの保存を達成するために、サイロに入れて貯蔵されるべき飼料作物に細菌培養物が植え付けられ、または、タンパク質が豊富な動物廃棄物の生成物、例えば屠殺臓物および魚臓物に細菌の培養物が植え付けられる（動物飼育目的のためにこの臓物を保存する目的もある）。
【００４３】
しかしながら本発明は、ヒトまたは動物用医薬での、または化粧品での、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株または上述の組成物の使用にも関する。
【００４４】
好ましい医薬用途は、この点において、免疫応答を調節することが可能であり、それ故に炎症性症候群を制御することが可能な、乳酸菌株を提供することである。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、本明細書中に開示の乳酸菌株は、制御性Ｔ細胞（ＴＨ１７）の介入に対し、ＴＨ１および／またはＴＨ２の免疫応答のバランスを取って、不快かつ有害な症状を最小限化する中和平衡（ｎｅｕｔａｒｌｉｚｉｎｇ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）を獲得することが可能であり、それによって、ＩＬ−１０の放出を強調することによりアレルギー性（ＴＨ２）または炎症性反応（ＴＨ１）が抑制されるようにヘルパーＴ細胞の活性が調節されると推測する。
【００４５】
本発明の乳酸菌株の免疫調節特性は、実施例５にも示されている。特許請求の範囲に記載の細菌株を含むサワードウは、特定の細菌代謝物が活性酸素種（ＲＯＳ）を中和する特性により生じる抗酸化作用に起因して、防御細胞の活性を低下させる。特定の条件下では、サワードウは、防御細胞の活性を高めることにより、免疫系を刺激することも可能である。
【００４６】
本発明に係る細菌株を含むサワードウから作られるサワードウブレッドは、免疫調節特性を示す。パンの中身の免疫調節活性は、ベーキング工程中に失われず、免疫系を刺激する細菌の細胞壁に起因する。抗酸化活性は、主にパンの皮に存在する。
【００４７】
この点における好ましい化粧品用途は、皮膚の老化プロセスを調節して老化の結果を緩和することができる乳酸菌を提供することである。理論に束縛されるものではないが、本発明に係る乳酸菌株により生産される代謝物は、サーチュインタンパク質を活性化し、それにより、酸化ストレスに起因する皮膚の劣化を緩和する。特に、アミノ酸、抗酸化ポリフェノール類、および、本発明に係る細菌株により提供される乳酸環境の組み合わせは、結合組織の支持体の酸化劣化、例えばヒアルロン酸の脱重合を防ぐ。特に、アミノ酸は、対応するクロラミン類の形成下において、次亜塩素酸などの活性酸素種（ＲＯＳ）のスカベンジャーとして作用し、ＲＯＳの解毒をもたらす。さらに、前記の組み合わせは、皮膚の静水張力の改善およびアレルギー気質の免疫調節的な減少をもたらす。これらの効果の結果として、皮膚のスムージングを達成されることができる。
【００４８】
さらに好ましい実施態様では、組成物は、スキンケアまたは化粧品製品に取り込まれる。
【００４９】
本発明の別態様は、ＤＳＭ  ２３０９０、ＤＳＭ  ２３０９１、ＤＳＭ  ２３２００、ＤＳＭ  ２３０９２、ＤＳＭ  ２３０９３、ＤＳＭ  ２３２０１、ＤＳＭ  ２６０２４、ＤＳＭ  ２３１７４およびＤＳＭ  ２３１２１の群から選択されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の、それらに由来するさらなるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の培養のための使用である。
【実施例】
【００５０】
さらに本発明は、以下の実施例によって、より詳細に説明される。
（実施例１）
１．サワードウのサンプルの分析
サワードウの４サンプルを分析して、それぞれ個々に冷凍および冷蔵した（表１）。
【表１】
0006431845.tif 000002
【００５１】
ｐＨ値および細菌および酵母の数の決定。
生地のｐＨ値は、ガラス電極を用いて決定した。細胞数を決定するために、冷蔵および冷凍の生地を、緩衝ペプトン水中に段階希釈し、変性ＭＲＳ寒天上に播いた。細菌数を決定するための変性ＭＲＳ寒天は、酵母の生育を阻害するために、１００ｍｇ／ｌのシクロヘキシミドを含有した。これらのプレートを、好気的に３０℃で４８時間インキュベートした。酵母数を決定するための変性ＭＲＳ寒天は、１００ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有した。これらのプレートを、好気的に３０℃で４８時間インキュベートした。
【００５２】
細菌の同定および特性化。
サンプル中に存在する細菌株を同定するために、形態学的に異なる分離株を、最も高い希釈段階のプレート（１５〜１５０の細菌数）から拾って広げた。シングルコロニーを３０℃で２４時間、変性ＭＲＳ緩衝液中でインキュベートした。冷蔵および冷凍の生地から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ&Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、合計７７コロニーからＤＮＡを分離した。
【００５３】
２つのプライマーペア（Ｂｏｘ２ＡＲ  および  ＧＴＧ５）を用いたＲｅｐＰＣＲにより、クローナルな分離株（ｃｌｏｎａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ）を除去した。分離株の分類学的同定のために、２５分離株から１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をシーケンスした。ＰＣＲにより１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した（プライマー６１６Ｖ、６３０Ｒ）。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いてＰＣＲ産物（約１５００塩基対）を洗浄し、Ｍａｃｒｏｇｅｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）によりシーケンスした。配列を、データベースＰｒｏｊｅｃｔ  ９（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）での株と比較した。
【００５４】
代謝物濃度の分析。
マルトース、マンニット、ラクテート、グリセロール、アセテートおよびエタノールの濃度を、ＨＰＬＣにより決定した。サンプル調製のために、生地を７％の過塩素酸で１：１希釈し、４℃で一晩インキュベートした。上清を直接分析した。Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰ８７Ｘカラム（Ｂｉｏｒａｄ）上で分離を行ない、０．４ｍＬ分−１にて７０℃で、５ｍＭのＨ２ＳＯ４を用いて溶出を行なった。定量化は、屈折率（ＲＩ）検出および外部標準物質に基づいた。
【００５５】
結果
細菌数およびｐＨ値。
冷蔵生地中の細菌および酵母のｐＨ値がより低くてより数が多いことは、デリバリー中の後発酵を示す。冷凍生地中の酵母数がより少ないことは、冷凍中に酵母が部分的に壊死することが原因であった。冷蔵生地中の細菌数は同様に、ｌｏｇ８．３〜８．９の細菌形成単位（ＧＦＵ）／ｇであった（表２）。冷凍全粒粉スターターはこの例外であり、冷蔵生地中よりも冷凍生地中の細菌数の方が多かった。
【００５６】
【表２】
0006431845.tif 000003
【００５７】
分離された株の同定。
ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）タイピングにより区別可能な１０株の２５分離株を、シーケンスのために選択した。２０分離株がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓとして同定され、ＲＡＰＤパターンｄ８に基づき異なる株に割り当てられた（表３）。いくつかの株は、同じ生地の冷蔵および冷凍サンプルにおいて分離された。いくつかの株は、全粒粉生地およびサワードウから分離することができた（株番号３、４、５、および６）。
【００５８】
冷凍生地由来の５分離株は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．であると同定された。
【００５９】
分離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託された。ＤＳＭ番号を表３に示す。
【００６０】
【表３】
0006431845.tif 000004
【００６１】
代謝物の組成物の定量分析。
サワードウ微生物叢の分類学的特徴付けは、代謝物の分析により裏付けられた。サワードウ中にマンニットおよびアセテートが存在することは、ヘテロ発酵性を導く細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓが細菌叢で優勢であることを確証した（表４）。グリセロールおよびエタノールは、酵母の代謝に起因すると考えることができた。デリバリー中に起きた後発酵は、代謝物の分析においても確認することができた。ラクテート、グリセロールおよびエタノールは、冷蔵生地中に、さらにより高い濃度で存在した。したがって、マルトースおよび高いグルコース濃度は、冷凍生地においてのみ検出することができた。おそらく小麦粉と比較して全粒粉の緩衝能がより高いことにより、冷凍生地では、発酵性全粒粉スターターが最も多量のラクテートおよびアセテートを示した。
【００６２】
【表４】
0006431845.tif 000005
【００６３】
３．要約
２つの試験された生地（全粒粉生地サンプル１と２、および生地サンプル３と４）は、細菌叢の組成物に関して有意差を示した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓのいくつかの異なる株が同定された。
【００６４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓのヘテロ発酵性代謝は、ラクテート、マンニット、およびアセテートの形成を説明付けた。サワードウ酵母の代謝は、グリセロールおよびエタノールの形成をもたらした。
【００６５】
（実施例２）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ  ＤＳＭ２６０２４株の分離
実施例１で記載したのと同様の条件下で，サワードウからＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ  ＤＳＭ２６０２４株をＭＲＳプレート（１．５％寒天、０．１５％Ｌ−システイン、ｐＨ５．４）上で分離し、コロニー形態および１６Ｓ  ＤＮＡシーケンシングによって同定した。
【００６６】
（実施例３）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の培養
本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を、ＤＳＭ培地２２５（サワードウ培地）またはｍＭＲＳ５（Ｍｅｒｏｔｈら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．６９：４７５）からなる培地中で培養した。組成物は、リットルあたり、１０ｇのトリプトン、５ｇの肉エキス、５ｇの酵母、１０ｇのマルトース、５ｇのフルクトース、５ｇのグルコース、５ｇのＮａ−アセテート×３Ｈ２Ｏ、３ｇのＮＨ４Ｃｌ、２．６ｇのＫ２ＨＰＯ４×３Ｈ２Ｏ、４ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．１ｇのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＭｎＳＯ４×４Ｈ２Ｏ、０．５ｇのシステイン−ＨＣｌ、１ｍｌのＴｗｅｅｎ  ８０、１ｍｌのビタミン混合物（コバラミン、葉酸、ニコチン酸アミド、ピリドキサールホスフェートおよびチアミンを、各０．２ｇ／Ｌ）を含んだ。糖類は別々にオートクレーブした；ビタミン混合物を濾過滅菌し、オートクレーブ後に添加した。培地を１２０℃で２０分間滅菌した。滅菌後のｐＨは好ましくは５．８であった。ガス雰囲気は、４％のＯ２、約５％のＣＯ２、およびバランス窒素（ｂａｌａｎｃｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ）を含んだ。ブレッディング温度は３０℃であり、ブレッディング持続時間は２４〜７２時間であった。純粋培養を植菌に用いた。
【００６７】
（実施例４）
１．細菌培養
本発明に係るＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ（ＤＳＭ  ２３０９０株、ＤＳＭ  ２３０９１株、ＤＳＭ  ２３０９２株、ＤＳＭ  ２３０９３株、ＤＳＭ  ２３１７４株、ＤＳＭ  ２３２００株、およびＤＳＭ  ２３２０１株）、本発明に係るＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ  ＤＳＭ  ２６０２４株、および、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株ＤＳＭ  ２０４５１（ＤＳＭ  ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、０．２５×１０７の細菌／ｍＬで植菌後、Ａｎａｅｒｏｇｅｎパッケージ（Ａｎａｅｒｏｇｅｎ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｏｘｏｉｄ，ＵＫ）を用いて、嫌気的条件下で２４時間、新しく添加された０．１５％のＬ−システインを含むＭＲＳ培養液（ｐＨ５．４）中で、３０℃で増殖させた。
【００６８】
２．代謝物の分析
代謝物の定量化のために、乳酸菌のＭＲＳ増殖培地をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。分析の前に、１０  ｋＤａ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＭＲＳ培地を濾過した。
【００６９】
サンプルは以下を用いて測定した：
Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｉｄｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
−ポンプ−ＨＰＧ−３４００ＳＤ
−デガッサー−ＳＲＤ−３４００
−オートサンプラー−ＷＰＳ−３０００ＴＳＬ
−カラムオーブン−ＴＣＣ−３０００ＳＤ
ＡＰＩ  ４０００  ＱＴＲＡＰ，リニアイオントラップ四重極質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）：
−イオン化型−エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）
−測定器制御−アナリストソフトウェア（ＡｂＳｃｉｅｘ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
−固定相：ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０  ３μｍ（１５０×２ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
−固定相温度：４０℃
−移動相：
溶離液Ａ：アセトニトリル／５ｍＭ／Ｌのアンモニウムアセテート  水中（９５＋５）
溶離液Ｂ：５ｍＭ／Ｌのアンモニウムアセテート  水中（９５＋５）
【表５】
0006431845.tif 000006
【００７０】
Ｍｕｌｔｉｑｕａｎｔ  ２．０（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてクロマトグラムを分析し、サンプル中の濃度を標準スペクトルに従って計算した。
【００７１】
３．統計分析
データを平均値±標準偏差（ＳＤ）として表す。全ての統計的計算は、処置群と対応するコントロール群とを比較する統計プログラミングプラットフォームＲ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｒ）を用いて行ない、独立ｔ検定を用いて分析した。様々な処置群と対応するコントロール群とを比較するデータは、１元配置分散分析（Ｏｎｅ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）の後に適切な多重比較手段を用いて分析した。データが正規分布でないか、または、不連続なデータを含む場合は、ノンパラメトリック検定（マンフォイトニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）／順位和検定、順位に関する分散分析（ＡＮＯＶＡ  ｏｎ  ｒａｎｋｓ））を用いた。ｐ値が<０．０５（＊）または<０．０１（＊＊）である場合に有意差と見なした。主成分分析（ＰＣＡ）は、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｋ．；Ｏｎ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｅｓｔ  Ｆｉｔ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  Ｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  Ｓｐａｃｅ，Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ  Ｍａｇａｚｉｎｅ  （１９０１），２  （１１），５５９−５７２、および、Ｔｈｅｏｄｏｒｉｄｉｓ，Ｇ．，Ｇｉｋａ，Ｈ．Ｇ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ｄ．；ＬＣ−ＭＳ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｇｌｏｂａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ／ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ，ＴｒＡＣ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２００８），２７（３），２５１−２６０に記載されている。
【００７２】
４．結果
４．１  サワードウ乳酸菌の増殖培地中の代謝物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
本発明に係るＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ株（ＤＳＭ  ２６０２４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株（ＤＳＭ  ２３０９０、ＤＳＭ  ２３０９１、ＤＳＭ  ２３０９２、ＤＳＭ  ２３０９３、ＤＳＭ  ２３１７４、ＤＳＭ  ２３２００およびＤＳＭ  ２３２１０）、および、比較株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株（ＤＳＭ  ２０４５１）を、ＭＲＳ培地で２４時間培養した。増殖培地を回収して濾過し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。
【００７３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株と比較して、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株の代謝プロファイルにおいて有意差を示す（図１）。アミノ酸バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、本発明の乳酸菌によって、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株よりも有意に低い濃度で生産される（図２ｃ〜図２ｅ）。アルギニンおよびフェニルアラニンの濃度は一般的に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株よりもわずかに低く、ヒスチジン濃度は、株に応じて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株よりも高いか、または低い（図２のａおよびｂならびに図２ｆ）。本発明に係るＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株のアミノ酸の全般的な濃度プロファイルは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株のものと比較して、有意により低い。そのようなアミノ酸プロファイルは、パンの製造に望ましく、かつ有利である。特に、アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの濃度が低いことは、パンのベーキング工程中に形成される苦味化合物の量を減らすために必要である。したがって、生地に添加しなければならない塩（ＮａＣｌ）（それはとりわけ、生地の苦みを低減させる）は、より少ない。
【００７４】
４．２  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、サワードウ乳酸菌の増殖培地中のアセチルコリンの存在を明らかにした。
【００７５】
図３は、様々な乳酸菌により生産されるアセチルコリンの濃度における有意差を示す。２４時間にわたってＡＣＨを最も多く産生するのは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２３０９２株である。本発明の全てのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株と比較して、さらにより多量のアセチルコリンを産生する。
【００７６】
アセチルコリンの存在は、薬学的特性の改善をもたらす（同時係属出願ＥＰ  １３  １５３  ９９６．７参照）。
【００７７】
（実施例５）
１．本発明の細菌株を含む、様々なパンのタイプおよびサワードウの、免疫調節特性の分析
サワードウブレッド（＃１）、比較パンａ（＃２）と比較パンｂ（＃３）、および、サワードウ（Ｔ）を分析した。サワードウブレッド（＃１）は、本発明の乳酸菌を含むサワードウ（Ｔ）から作った。
【００７８】
１．１  サンプル調製
サンプルを分配して急速冷凍し（−２０℃）、それから凍結乾燥した。遊星ミルを用いて、凍結乾燥されたサンプルを細かく粉砕して合わせ、４つの混合サンプルを形成した（１、２、３およびＴ）。
【００７９】
サンプルからの有効成分の抽出
ヒトの胃の中の状態をシミュレートするために、様々なサンプルの１ｇ粉末を採取することにより（数回反復）、有効成分を１０ｍｌのＨＣｌ（１５０ｍＭ；ｐＨ２）中で抽出し、その後、インキュベーター内に置かれたオーバーヘッド回転子を用いて、３７℃で２．５時間を超えてインキュベーションした。
【００８０】
それから、サンプルを以下のように処理した：
【００８１】
ａ）懸濁液
懸濁液（ＨＣｌと紛体）を生産するために、インキュベートしたサンプルを合わせて、８．２５Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ値を７に調節した。サンプルを分配して−７０℃で凍結乾燥した。
【００８２】
ｂ）上清
上清を生産するために、懸濁液を、４，０００ｒ／分の速度で１０分を超えて遠心分離した。残渣（ペレット）上に生じた上清を取り出し、それからサンプルを合わせて、ｐＨ値を、ａ）に記載のとおりに７に調節した。その後、サンプルを分配して凍結乾燥した。
【００８３】
ｃ）ペレット
ペレットを生産するために、（ｂ）からの残渣を、サンプルから抽出試薬を完全に除去するために１０ｍｌの０．９％  ＮａＣｌ溶液を用いて２回洗浄した。それから、ペレットを１０ｍｌの０．９％  ＮａＣｌ溶液で覆って、「濡れた（ｗｅｔ）」状態で冷凍した。
【００８４】
１．２  全血系
免疫調節またはＨＯＣｌ解毒特性の分析を、全血テスト系を用いて行なった。３人の健康なヒトドナー由来の全血を用いた。活性化免疫細胞の反応中、活性酸素種（ＲＯＳ）が放出され、それはとりわけ、ＨＯＣｌ＝次亜塩素酸である。これは、病原体を死に導く。ＨＯＣｌ（次亜塩素酸）の産生の選択的指示薬（ＡＣＣ；１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸）を用いて、この効果を、ガスクロマトグラフィーを用いて測定した。サンプル１、２、３およびＴの、ペレット、懸濁液、および上清を、３人のドナー由来の血液を用いて全血系で分析した。
【００８５】
１．２．１  次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）を用いたＡＣＣ切断の解毒
この方法は、用いられる被検物質が、ＨＯＣｌと反応することが可能かどうか把握することを可能にする。もしそうであれば、全血系で同定された抗酸化作用を、少なくとも部分的に、ＨＯＣｌとの反応に帰することができる。したがってＨＯＣｌは、他の反応に関して無害にされた（「解毒された」）。
【００８６】
図４は、サワードウが、ＡＣＣ切断を、パンのサンプルよりも有意に勝って阻害したことを示す。懸濁液および上清は、ＨＯＣｌとの同様の反応度を示した。活性の水溶性成分が上清中に見られた。全てのパンのタイプは、ＨＯＣｌに関し、制限された解毒作用のみ示した。様々な画分の間に明確な違いは無かった。ベーキング工程は、水溶性成分の活性を失わせることが考えられる。
【００８７】
１．２．２  アクチベーターとしてザイモサンを用いた全血系
この場合では、様々な活性酸素種が産生されるように、全血中の免疫細胞を、ザイモサン（酵母の細胞壁成分）を用いて刺激した。これは、とりわけ、ＨＯＣｌ（ＡＣＣと反応してエチレンを産生する）を放出させた。産生されるエチレンの量は、免疫細胞の活性の基準となった。サンプル中に含まれるエチレンが少なければ少ないほど、免疫細胞の活性は低いことが分かった。
【００８８】
図５は、サワードウが、最良の抗酸化作用および最高の抗酸化能を示し、反応が全てのドナーで阻害されたことを示す。パン＃２は、ドナーＡでのみ免疫細胞活性が減少し、一方で、パン＃２はドナーＢに影響を及ぼさなかった。ドナーＣに関しては、反応は全てのパンのタイプにわたって刺激された。パン＃１およびパン＃３は、ドナーＡの血液において反応に影響を及ぼさず、パン＃３は、初めはドナーＢにおいて刺激を誘導したが、より高濃度では、反応に影響を及ぼさなかった。これは、抗酸化剤として作用する物質が失われたベーキング工程により説明することができる。
【００８９】
１．２．３  アクチベーターとしてザイモサンを用いない全血系
この場合では、反応サンプルにザイモサンを添加しなかった。用いられた被検物質がそれでもなお、その系において作用を示したら、すなわち、エチレンが産生されたら、免疫細胞を、その被検物質により刺激した。このようにして、免疫調節または免疫刺激作用を検出することができた。
【００９０】
図６は、全ドナーの免疫細胞が、様々なサンプルによって刺激され得たことを示す。その効果は、ドナーＣについて、および、ドナーＢでのサワードウサンプルについて、最も強かった。ドナーＢを除き、サワードウとパンとの間に明らかな違いは見られなかった。このことは、免疫刺激特性がベーキング工程中に失われなかったことを意味する。サワードウブレッド＃１の刺激効果は、比較パンの刺激効果よりも高い傾向にあり、その違いはドナーＡにおいて最も強かった。
【００９１】
一般に、懸濁液の効果は常に最も強かったということができ、そして、ペレットおよび上清の効果は同程度であったということができる。したがって、ペレット成分と合わせて、上清中の水溶性成分の相乗効果がある。
【００９２】
ペレットは、より低い濃度において、より刺激性であり、濃度が増加するにつれてその活性化能は低下した。このことは、刺激は受容体に依存すること、および、サンプルの成分がそれぞれシグナル伝達プロセスに介入することを示唆する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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