(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−末端位置にＮ−末端ドメインとして融合パートナー及びＣ−末端位置にＣ−末端ドメインとしてＲＥＴ蛋白質（ｒｅ−ａｒｒａｎｇｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｉｎ）を必須的に含む、融合蛋白質であって、前記ＲＥＴ蛋白質は、チロシンキナーゼドメインを含み、前記融合パートナーは、ＫＩＦ５Ｂ蛋白質であり、前記ＫＩＦ５Ｂ蛋白質は、二重螺旋ドメインを含む、融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子
を、対象から得られた試験試料で探知する段階；
前記探知する段階において得られた結果を、前記融合遺伝子が試験試料から検出される場合には前記対象が癌患者であるという基準と比較することによって、前記対象が癌患者であるかどうかを試験する段階；
を含む、
肺ガン診断の情報を提供する方法であって、
前記融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子は、５’−ＧＴＧＡＡＡＣＧＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’（配列番号２０）と５’−ＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣ−３’（配列番号２１）のプライマー対、または５’−ＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号２２）と５’−ＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣ−３’（配列番号２１）のプライマー対を用いて探知される、
方法。
【請求項２】
前記融合蛋白質は、配列番号３、７、１１または１５のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記融合遺伝子は、配列番号１、５、９または１３のヌクレオチド配列を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１、５、９または１３でそれぞれ配列番号２、６、１０または１４の融合領域を含む連続的な１００乃至２００個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を生成できるプライマー対、及び
１０番染色体上逆位領域を含む連続的な１００乃至２００個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を生成できるプライマー対
からなる群より選択された少なくとも１種以上を含む、
肺ガン診断用組成物であって、
前記プライマー対は、
５’−ＧＴＧＡＡＡＣＧＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’（配列番号２０）と５’−ＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣ−３’（配列番号２１）のプライマー対、または５’−ＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号２２）と５’−ＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣ−３’（配列番号２１）のプライマー対、または
５’−ＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１８）と５’−ＣＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１９）のプライマー対であり、
前記１０番染色体上逆位は、ＲＥＴ遺伝子の特定の部位と、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子の特定の部位とで起きるものである、
肺ガン診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＮ−末端位置にＮ−末端ドメインとして融合パートナー（ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ）とＣ−末端位置にＣ−末端ドメインとしてＲＥＴ蛋白質（ｒｅ−ａｒｒａｎｇｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｉｎ）を含む融合蛋白質、前記融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子、及び前記融合蛋白質または融合遺伝子の癌診断マーカーとしての用途を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肺ガンは癌による死亡において最も多い死亡者を発生させている。世界的に毎年１．３８万人の死亡者を発生させている。従来の化学治療療法を使用しても、進行期の肺ガン患者の中間生存期間は診断当時から１年にもなっていない。喫煙は西方国家で肺ガンの主な危険要素としてよく知られており、全ての肺ガンの８５％乃至９０％は喫煙によって発生する。しかし、世界肺ガン患者の約２５％は非喫煙者である。特に、アジア国家のデータを見てみると、全体肺ガンの７０〜８０％は非小細胞癌（Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ、ＮＳＣＬＣ）が占めており、このような非小細胞癌の３０〜４０％は非喫煙者が占めている。このような非小細胞癌で最も多く発見される組織学的形態は腺癌種（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）である（〜７０％）。
【０００３】
非喫煙者の肺ガン発病は遺伝的及び厚生的変化に起因するよりは、一つの体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）が起こることによって発生するようになる場合が多い。去る数年間の非小細胞癌でＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、及びＡＬＫ遺伝子（一般に‘トリプルマーカー（三重標識者）（ｔｈｅ  ｔｒｉｐｌｅ−ｍａｒｋｅｒｓ）’と呼ばれる）の体細胞突然変異が報告された。まず非喫煙者及びアジア人の非小細胞癌と連関があるＥＧＦＲのチロシンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）ドメインの突然変異はゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）のようなＥＧＦＲ標的治療に敏感である。ＫＲＡＳに存在するミスセンス突然変異（ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）は肺線癌腫（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）にかかった喫煙者からよく発見され、ＥＧＦＲ抑制剤に対する抵抗性を有する。
【０００４】
たとえいくつかの遺伝子突然変異が報告されているが、大部分の肺ガン患者の癌遺伝体（ｇｅｎｏｍｅ）では何も発見されなかった。非小細胞癌の４０％以上は知らされていない遺伝的事件によって発病するところ、肺ガンを診断するさらに効果的な遺伝子マーカーの発見が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００８−０３１５５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は融合パートナーのＮ−末端ドメイン及びＲＥＴ蛋白質のＣ−末端ドメインを必須的に含む融合蛋白質を提供する。また、ＫＩＦ５Ｂ蛋白質のＮ−末端ドメインとＲＥＴ蛋白質Ｃ−末端ドメインを必須的に含むＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質を提供する。
【０００７】
本発明の他の一実施形態は、前記融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子を提供する。
【０００８】
本発明の他の一実施形態は、前記融合遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。
【０００９】
本発明の他の一実施形態は、下記のような方法の肺ガン診断方法を提供する：
１０番染色体上逆位または転座を含むＲＥＴ−関連再配列、他の蛋白質と融合されたＲＥＴ蛋白質が含まれている融合蛋白質、融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子、及び癌にかからない個別対象から得られた標準試料に比べてＲＥＴ過発現からなる群より選択された１種以上のものを対象から得られた試験試料で探知する方法、または前記群より選択された１種以上が試料で探知される時に前記対象を肺ガン患者と決定する方法。
【００１０】
他の一実施形態は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質を肺ガン診断マーカーとして用いる用途を提供する。
【００１１】
他の一実施形態は、融合蛋白質または融合遺伝子を検出する化合物を含む、肺ガン診断用組成物を提供する。
【００１２】
他の一実施形態は、１種以上の融合蛋白質の抑制剤、１種以上の融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子の抑制剤、１種以上のＲＥＴ暗号化遺伝子の抑制剤、またはこれらの結合を治療的に効果的な量だけ患者に投与する段階を含む、肺ガンを予防または治療する方法を提供する。
【００１３】
他の一実施形態は、１種以上の融合蛋白質の抑制剤、１種以上の融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子の抑制剤、１種以上のＲＥＴ蛋白質を暗号化する遺伝子の抑制剤、またはこれらの組み合わせを含む、肺ガン予防または治療用組成物を活性成分として提供する。
【００１４】
他の一実施形態は、１種以上の融合蛋白質の抑制剤、１種以上の融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子の抑制剤、１種以上のＲＥＴ蛋白質を暗号化する遺伝子の抑制剤、またはこれらの組み合わせを含む組成物の、肺ガン予防または治療用途を提供する。
【００１５】
また他の一実施形態は、下記の肺ガンに対する抗ガン剤をスクリーニングする方法を提供する：融合蛋白質を発現する細胞に試料化合物を処理し；融合蛋白質の細胞内発現水準を測定して、試料化合物を処理した細胞で融合蛋白質の発現水準が、試料化合物を処理する前の細胞、または処理しない細胞に比べて低くなった場合、当該試料化合物を肺ガンに対する抗ガン剤候補物質と決定する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは肺線癌腫患者の染色体逆位によって発生した融合遺伝子を同定して、本発明を完成した。融合遺伝子は子供と非喫煙者肺線癌腫患者でも発見され、これらの癌は従来知られたトリプルマーカー（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、及びＡＬＫ遺伝子）に対しては陰性反応を示す。したがって、本発明の融合遺伝子は肺ガンの効果的なマーカーとして期待され、前記融合遺伝子は従来に知られたトリプルマーカーが機能を果たさない場合にもマーカーの機能を遂行することができる。
【００１７】
一実施形態は癌細胞で特徴的に発見される融合遺伝子及び前記融合遺伝子によって暗号化される融合蛋白質を提供する。
【００１８】
特に、融合パートナーのＮ−末端ドメイン及びＲＥＴ蛋白質のＣ−末端ドメインを含む融合蛋白質を提供する。融合パートナーのＮ−末端ドメインは融合蛋白質のＮ−末端に位置し、ＲＥＴ蛋白質のＣ−末端ドメインは融合蛋白質のＣ−末端に位置し得る。本発明はＲＥＴ蛋白質を含む融合蛋白質の存在は肺ガンを含む癌の進行と関係があるのを発見した。
【００１９】
融合パートナーは融合蛋白質のＮ−末端に位置しているＫＩＦ５Ｂ蛋白質のＮ−末端ドメインであり得、このような場合、融合蛋白質はＮ−末端位置にＮ−末端ドメインとしてＫＩＦ５Ｂ蛋白質と、Ｃ−末端位置にＣ−末端ドメインとしてＲＥＴ蛋白質を含む、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ蛋白質を代表することができる。
【００２０】
他の一実施形態は融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子を提供し、前記融合遺伝子は５’末端に位置した融合パートナーのＮ−末端ドメインを暗号化する遺伝子、及び３’末端に位置したＲＥＴ蛋白質のＣ−末端ドメインを暗号化する遺伝子を含むことができる。具体的な実施例で、融合蛋白質がＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ蛋白質である場合、融合遺伝子はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ遺伝子によって代表され、前記ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ遺伝子は５’末端に位置したＫＩＦ５ＢのＮ−末端ドメインを暗号化する遺伝子及び３’末端に位置したＲＥＴ蛋白質のＣ−末端ドメインを暗号化する遺伝子を含むことができる。
【００２１】
他の一実施形態は融合遺伝子及び選択的に融合遺伝子に作動可能に連結された転写要素（例：プロモーターのような）を含む発現ベクターを提供する。また他の実験例は発現ベクターによって形質転換された細胞を提供する。
【００２２】
ＲＥＴ蛋白質は膜貫通受容体チロシンキナーゼ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）である。ＲＥＴは、細胞外領域（カドヘリン（Ｃａｄｈｅｒｉｎ）類似ドメインを含む）、膜貫通ドメイン、及びチロシンキナーゼドメインを含む細胞内領域から構成されている。ＲＥＴ蛋白質がグリア細胞由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ、ＧＤＮＦ）のような共同受容体とリガンドに結合することによって二量化（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）される時、前記ＲＥＴ蛋白質は自己リン酸化（ａｕｔｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）によって活性化され、下流シグナル（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）伝達を刺激する。ＲＥＴの下流シグナルカスケード（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅ）は細胞の生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）／細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、及び転移（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を調節するＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）経路である。ＲＥＴの正常発現は神経発達に重要であるが、組織の分化では活性化されないのが知られている。
【００２３】
ＲＥＴ蛋白質はヒトを含む哺乳類に由来し得る。ヒトＲＥＴ蛋白質を暗号化するヒトＲＥＴ遺伝子は１０番染色体上に位置しており（１０ｑ１１．２）、種類によって１９乃至２１個のエクソンを含んでいる。ヒトＲＥＴ蛋白質はＮＣＢＩ（寄託番号ＮＭ＿０２０６３０またはＮＭ＿０２０９７５）によって代表されるヒトＲＥＴ遺伝子から暗号化できる。
【００２４】
ＲＥＴ蛋白質のＣ−末端ドメインはＲＥＴ遺伝子の、例えばＮＭ＿０２０６３０またはＮＭ＿０２０９７５の、１２番目エクソンから最後のエクソンの、例えば２０番目エクソン、ポリヌクレオチドから暗号化されるアミノ酸配列を含むことができる。ＲＥＴ蛋白質のＣ−末端ドメインは、１２番目エクソンの開始位置から（例えば、ＮＭ＿０２０９７５によって暗号化されるＲＥＴ蛋白質の７１３番目位置）、ＮＭ＿０２０６３０またはＮＭ＿０２０９７５によって暗号化されるＲＥＴ蛋白質のＣ−末端に向かって、少なくとも約３００個の連続的なアミノ酸を含むことができる。例えば、ＲＥＴ蛋白質のＣ−末端ドメインは、１２番目エクソンの開始位置から（例えば、７１３番目位置）、ＮＭ＿０２０６３０（１９個のエクソン）またはＮＭ＿０２０９７５（２０個のエクソン）によって暗号化されるＲＥＴ蛋白質のＣ−末端に向かって、連続的な約３００乃至４５０個のアミノ酸、連続的な約３００乃至４２０個のアミノ酸、または連続的な約３００乃至４０２個のアミノ酸を含むことができる。
【００２５】
キネシン（Ｋｉｎｅｓｉｎ）−１重鎖とも呼ばれるＫＩＦ５Ｂ蛋白質はＫＩＦ５Ｂ遺伝子によって暗号化される。ＫＩＦ５Ｂ蛋白質はヒトを含む哺乳類に由来し得る。ヒトＫＩＦ５Ｂ蛋白質を暗号化するヒトのＫＩＦ５Ｂ遺伝子は１０番染色体（１０ｑ１１．２２）上に位置しており、２６個のエクソンを含んでいる。ヒトＫＩＦ５Ｂ蛋白質はヒトＮＣＢＩ、寄託番号ＮＭ＿００４５２１によって代表されるＫＩＦ５Ｂ遺伝子によって暗号化される。
【００２６】
ＫＩＦ５Ｂ蛋白質のＮ−末端ドメインはＫＩＦ５Ｂ遺伝子（例えば、ＮＭ＿００４５２１）のポリヌクレオチドの１番目エクソンから１６番目エクソン、１番目エクソンから１５番目エクソン、または１番目エクソンから２３番目エクソンから暗号化されたアミノ酸配列を含んでいる。ＫＩＦ５Ｂ蛋白質のＮ−末端ドメインはＮＭ＿００４５２１によって暗号化されるＫＩＦ５Ｂ蛋白質の１番目位置から少なくとも約３２９個の連続的なアミノ酸を含んでいる。ＫＩＦ５Ｂ蛋白質のＮ−末端ドメインはＮＭ＿００４５２１によって暗号化されるＫＩＦ５Ｂ蛋白質の３２９番目位置のアミノ酸から始まる２以上の二重螺旋ドメインをさらに含むことができる。例えば、２つの二重螺旋ドメインはＮＭ＿００４５２１（配列番号２１）によって暗号化されるＫＩＦ５Ｂ蛋白質の３２９番目乃至６３８番目位置のアミノ酸配列をさらに有し得る。ＫＩＦ５Ｂ蛋白質のＮ−末端ドメインはＮＭ＿００４５２１によって暗号化されるＫＩＦ５Ｂ蛋白質の１番目位置から、連続的な約３２９乃至９００個のアミノ酸、連続的な約３２９乃至７００個のアミノ酸、連続的な約３２９乃至６５０個のアミノ酸、または連続的な約３２９乃至６３８個のアミノ酸を含むことができる。
【００２７】
融合蛋白質で、融合は融合点（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）または切断点（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）と呼ばれる、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子の１６番目エクソンとＲＥＴ遺伝子の１２番目エクソンの間で起こる。“融合領域（ｆｕｓｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）”という用語は融合点周辺のポリヌクレオチド断片（約〜３０個のヌクレオチドからなる）またはポリペプチド断片（約〜３０個のアミノ酸からなる）を意味する。
【００２８】
本発明で使用されるエクソンの番号は、ＮＣＢＩに位置したエクソンの番号によって番号を付けた。
【００２９】
一例で、融合蛋白質ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴは配列番号３、７、１１または１５のアミノ酸配列を有し得、配列番号３の６２９番目から６４８番目までの位置、配列番号７の６２９番目から６４８番目までの位置、配列番号１１の５６６番目から５８５番目までの位置、及び配列番号１５の８３９番目から８５８番目までの位置のポリペプチド断片は融合蛋白質ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴの融合領域であり得る。前記融合蛋白質ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴの融合領域は配列番号４、８、１２または１６のアミノ酸配列を有し得る。前記ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質を暗号化するＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子は配列番号１、５、９または１３のヌクレオチド配列を有し得、配列番号１の１８８５番目から１９４４番目までの位置、配列番号５の１８８５番目から１９４４番目までの位置、配列番号９の１６９６番目から１７５５番目までの位置、及び配列番号１３の２５１５番目から２５７４番目までの位置のポリヌクレオチドは、融合遺伝子ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴの融合領域であり得る。融合遺伝子ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴの融合領域は配列番号２、６、１０または１４のヌクレオチド配列を有し得る。前記融合遺伝子、融合蛋白質、及び融合領域は図２７乃至３４に示した。
【００３０】
ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、及びＤＮＡ分子によって暗号化されるアミノ酸配列は、自動化ＤＮＡ配列分析機または自動化ペプチド配列分析機によって決定できる。自動配列分析方法によって決定されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、実際配列と比較した時、部分的な間違いを有し得る。一般に、自動配列分析によって決定された配列は実際配列と比較して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％の同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有している。したがって、融合蛋白質、融合遺伝子、または融合領域は配列番号１乃至１７の配列と比較して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有し得る。
【００３１】
融合蛋白質と融合遺伝子は癌領域で特異的に存在し、癌領域周辺の他の領域では存在しないのが確認されたところ、これは融合蛋白質及び／または融合遺伝子は固形癌、特に肺ガンのような癌のバイオマーカーとしての用途に使用できるのを示唆する。さらに、１０番染色体上で逆位や転座を含むＲＥＴ−関連染色体の再配列またはＲＥＴの過発現は癌細胞、特に肺ガン細胞でも発見される。
【００３２】
また、また他の実験例は対象から得られた試験試料で、下記の群から少なくとも１種以上を探知することを含む、癌を診断する方法または癌診断用情報を提供する方法を提供する：
逆位または転座を含む、１０番染色体でＲＥＴ−関連染色体の再配列；
融合パートナーのＮ−末端ドメイン及びＲＥＴ蛋白質Ｃ−末端ドメインを含む融合蛋白質；
融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子；及び
肺ガンがかからない個人から得られた標準時料と比較してＲＥＴの過発現、
前記群より少なくとも１種以上が試験試料で探知された時、対象を癌患者と決定する。
【００３３】
ＲＥＴ−関連染色体の再配列は融合蛋白質または融合遺伝子の形成による結果であり得る。例えば、ＲＥＴ−関連染色体の再配列は、１０番染色体上の逆位であり得る。前記１０番染色体上の逆位は、１０番染色体上の逆位領域と混成化（相補的結合）可能なポリヌクレオチド（プローブ）及び／または１０番染色体上の逆位を探知可能なプライマー対、例えば、１０番染色体上の逆位領域を含む連続的な１００乃至２００個のヌクレオチドを有しているポリヌクレオチド断片生成が可能なポリヌクレオチド断片を用いて探知することができる。例えば、１０番染色体上の逆位は５’−ＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１８）及び５’−ＣＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１９）から構成されたプライマー対を用いて探知することができる。
【００３４】
融合蛋白質及び融合遺伝子は前述の通りである。
【００３５】
具体的な実施例で、融合蛋白質は、融合蛋白質、融合遺伝子、または融合遺伝子に該当するｍＲＮＡの存在の検出から探知できる。
【００３６】
融合蛋白質の存在は、融合蛋白質と融合蛋白質に特異的に結合する物質（例えば、抗体またはアプタマー）の間の相互作用を測定する一般的分析方法によって探知できる。このような一般的分析方法としては免疫クロマトグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学的染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、酵素免疫抗体法（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、酵素免疫分析法（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＦＩＡ）、閃光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＬＩＡ）、ウエスタンブロット法（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、及び蛍光活性化細胞選択装置（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）などのような方法がある。
【００３７】
また、融合遺伝子またはｍＲＮＡの存在は、融合遺伝子またはｍＲＮＡと混成化（相補的結合）可能なポリヌクレオチドを用いた、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）などのような一般的な分析方法によって検出できる。融合遺伝子は大規模並列配列分析法（ｍａｓｓｉｖｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技術を通じた、全長−転写体（ＲＮＡ）及び／または全長−遺伝体（ＤＮＡ）配列分析併合技術を用いて探知及び／または検証できる。融合遺伝子またはｍＲＮＡと混成化可能なポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプローブ、またはＤＮＡプライマーであり得、前記ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプローブ、またはＤＮＡプライマーは試験試料で、融合されたまたは切断された、遺伝子または転写体との混成化を通じて融合遺伝子またはｍＲＮＡを検出することができる。
【００３８】
融合遺伝子が、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴである時、融合遺伝子ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴは、配列番号２、６、１０または１４の融合領域と混成化（相補的結合）可能なポリヌクレオチド（プローブ）及び／または、配列番号１、５、９または１３でそれぞれ配列番号２、６、１０または１４の融合領域を含む、連続的な１００乃至２００個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を生成できるプライマー対を用いて探知することができる。例えば、融合遺伝子ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴは５’−ＧＴＧＡＡＡＣＧＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’（ＫＩＦ５Ｂ；配列番号２０）と５’−ＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣ−３’（ＲＥＴ；配列番号２１）からなるプライマー対、または５’−ＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧ−３’（ＫＩＦ５Ｂ；配列番号２２）と５’−ＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣ−３’（ＲＥＴ；配列番号２１）からなるプライマー対を用いて探知することができる。また、融合蛋白質ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴは融合蛋白質のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴの融合領域に特異的に結合する抗体またはアプタマーを用いて探知することができる。例えば、融合蛋白質の融合領域は配列番号４、８、１２または１６のアミノ酸配列を有し得る。
【００３９】
前記“融合領域（または逆位領域）と混成化可能な”という用語は、相補的配列または相補的配列の融合領域（または逆位領域）と９０％以上の同一性を有する配列を意味することができる。
【００４０】
また他の実験例は、配列番号２、６、１０または１４の融合領域と混成化可能なポリヌクレオチド、配列番号１、５、９または１３の配列にそれぞれ配列番号２、６、１０または１４の融合領域を含む連続的な１００乃至２００個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を生成できるプライマー対、１０番染色体上の逆位領域と混成化可能なポリヌクレオチド、１０番染色体上の逆位領域を含む１００乃至２００個の連続的なヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片を生成できるプライマー対、及び配列番号４、８、１２または１６の融合領域に結合する抗体またはアプタマーからなる群より選択された１以上を含む癌診断用組成物を提供する。
例えば、プライマー対は融合蛋白質を暗号化するＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子を探知するための５’−ＧＴＧＡＡＡＣＧＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’（ＫＩＦ５Ｂ；配列番号２０）と５’−ＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣ−３’（ＲＥＴ；配列番号２１）からなるプライマー対、または１０番染色体上の逆位を探知するための５’−ＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧ−３’（ＫＩＦ５Ｂ；配列番号２２）と５’−ＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣ−３’（ＲＥＴ；配列番号２１）からなるプライマー対、または５’−ＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１８）と５’−ＣＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１９）からなるプライマー対からなる群より選択された少なくて図１種以上のプライマー対である。
【００４１】
また他の実験例は融合蛋白質及び／または融合遺伝子の癌診断用途を提供する。
【００４２】
患者は任意の哺乳類、例えば、ヒトまたは猿のような霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）またはラット（ｒａｔ）のようなげっ歯類であり得、特にヒトであり得る。
【００４３】
試験試料は患者（例えばヒト）から分離された細胞（例えば肺細胞）、組織（例えば肺組織）、または体液（例えば血液）であり得る。患者はキナーゼ抑制剤を処方を受けるか、処方を受ける予定である。試験試料はヒトの癌細胞、またはヒトの癌細胞抽出物に由来した細胞を含むことができる。
【００４４】
融合蛋白質及び／または融合遺伝子はガン治療のための標的として作用できる。
【００４５】
したがって、また他の実験例は、少なくとも１種以上の融合蛋白質の抑制剤、少なくとも１種以上の融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子の抑制剤、少なくとも１種以上のＲＥＴ暗号化遺伝子の抑制剤、またはこれらの結合を患者に薬学的に（治療的に）効果的な量の投与段階を含む、癌予防及び／または治療のための方法を提供する。前記方法は投与段階以前に予防及び／または治療が必要な患者を同定する段階をさらに含むことができる。
【００４６】
また他の実験例は癌の予防及び／または治療のために、少なくとも１種以上の融合蛋白質の抑制剤、少なくとも１種以上の融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子の阻害体、少なくとも１種以上のＲＥＴ暗号化遺伝子の抑制剤、またはこれらの結合を含む組成物を提供する。
【００４７】
また他の実験例は融合蛋白質の抑制剤、融合蛋白質を暗号化する融合遺伝子の阻害体、ＲＥＴ暗号化遺伝子の抑制剤、またはこれらの結合を癌予防及び／または治療のための用途を提供する。
【００４８】
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質抑制剤は融合蛋白質に特異的に結合するアプタマー；融合蛋白質に特異的に結合する抗体；及びキナーゼ抑制剤（例えば、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）（４−［４−［［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］−Ｎ−メチル−ピリジン−２−カルボキサミド）、カボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）（Ｎ−４−（６，７−ジメトキシキノリン−４−イル）オキシ）フェニル）−Ｎ−４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド）など）からなる群より選択された１種以上であり得る。融合遺伝子またはＲＥＴ暗号化遺伝子抑制剤は、融合遺伝子またはＲＥＴ暗号化遺伝子に特異的に結合可能なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアプタマーからなる群より選択された１種以上であり得る。
【００４９】
本発明で、癌はいかなる固形癌、例えば、肺ガン、肝癌、大腸癌、すい臓癌、胃ガン、乳癌、卵巣ガン、腎臓癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、または脳腫瘍であり得る。具体的な実施例で癌は肺ガン、特に小細胞肺ガン（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）または肺線癌腫、扁平上皮肺ガン（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、または大細胞肺ガン（ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）のような非小細胞肺ガンであり得る。
【００５０】
さらに、また他の実験例は次を含む抗ガン剤スクリーニング方法を提供する：
融合蛋白質を発現する細胞に試料化合物を接触させ；及び細胞内融合蛋白質の発現水準を測定する段階を含み、
前記試料化合物を処理した細胞内融合蛋白質の発現水準が、試料化合物を処理する前の細胞または試料化合物を処理しない細胞の融合蛋白質の発現水準に比べて減少した場合、前記試料化合物を抗ガン剤候補物質と決定する。
【００５１】
前記抗ガン剤スクリーニング方法は、試料化合物を接触させる段階以前に、細胞内融合蛋白質の発現水準測定段階をさらに含むことができる。この場合、試料化合物を処理した後の融合蛋白質の発現水準が、試料化合物を処理する前の細胞の融合蛋白質の発現水準に比べて減少した場合、試料化合物を抗ガン剤候補物質と決定することができる。また他の抗ガン剤スクリーニング方法は、融合蛋白質を発現する細胞を提供する段階、及び試料化合物を提供された細胞の一部に接触させる段階を含むことができる。試料化合物を処理した細胞の融合蛋白質の発現水準が、試料化合物を処理しない細胞に比べて減少した場合、試料化合物を抗ガン剤の候補物質と決定することができる。
【００５２】
前記スクリーニング方法で使用される細胞は、融合遺伝子または融合蛋白質が発現及び／または活性化された、癌細胞、細胞抽出物、または細胞培養に由来したものであり得る。前述のように、前記癌細胞は固形癌細胞、特に肺ガン、例えば肺線癌腫のような非小細胞肺ガン細胞であり得る。
【００５３】
融合蛋白質の発現水準は免疫クロマトグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学的染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、酵素免疫抗体法（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、酵素免疫分析法（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＦＩＡ）、閃光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＬＩＡ）、ウエスタンブロット法（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、及び蛍光活性化細胞選択装置（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）のような一般的な分析方法を通じて探知することができる。
【００５４】
試料化合物はいかなる天然化合物または合成化合物でもよい。例えば、一般的な化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、及びこのような化合物からなる群より１種以上選択されたものであり得る。
【発明の効果】
【００５５】
本発明は肺線癌腫患者の染色体逆位によって発生した融合遺伝子を同定し、融合遺伝子は子供と非喫煙者肺線癌腫患者からも発見され、これらの癌は従来に知られたトリプルマーカー（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、及びＡＬＫ遺伝子）に対しては陰性反応を示す。したがって、本発明の融合遺伝子は肺ガンの効果的なマーカーとして期待され、前記融合遺伝子は従来に知られたトリプルマーカーが機能を果たさない場合にもマーカーの機能を遂行することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】患者（ＡＫ５５）のＣＴ−誘導生体検査（ＣＴ−ｇｕｉｄｅｄ  ｂｉｏｐｓｙ）を通じて得られた原発性肺ガン組織のパラフィン切片の１００倍率顕微鏡写真である。
【図２】患者（ＡＫ５５）のＣＴ−誘導生体検査（ＣＴ−ｇｕｉｄｅｄ  ｂｉｏｐｓｙ）を通じて得られた原発性肺ガン組織のパラフィン切片の４００倍率顕微鏡写真である。
【図３】原発性肺ガン組織のＣＫ７に対する免疫組織化学的分析結果を示す顕微鏡写真である。
【図４】原発性肺ガン組織のＴＴＦ１に対する免疫組織化学的分析結果を示す顕微鏡写真である。
【図５】原発性肺ガン組織のＣＫ２０に対する免疫組織化学的分析結果を示す顕微鏡写真である。
【図６】肺ガン転写体配列分析を通じて同定された融合遺伝子のグラフィック表現を示す。
【図７】ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子を概略的に示す。
【図８】各ＲＥＴエクソンの、ＲＮＡ発現水準を示すグラフである。
【図９】癌遺伝体の大規模並列配列分析法（ｍａｓｓｉｖｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じた１０番染色体上で１０．６Ｍｂの長さの逆位を概略的に示す。
【図１０】ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子の確認のためのＡＫ５５のＲＮＡのＰＣＲ増幅結果を示す。
【図１１】ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子確認のためのＡＫ５５のＤＮＡのＰＣＲ増幅結果を示す。
【図１２】ＲＮＡ確認のためのサンガー配列分析法（Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じた逆位切断点探知結果を示す。
【図１３】ＤＮＡ確認のためのサンガー配列分析法（Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じた逆位切断点探知結果を示す。
【図１４】ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質の機能的ドメインを概略的に示す。
【図１５】ＰＨＹＲＥ２アルゴリズムを通じて予測したＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質の３次元構造を示す。
【図１６】患者（ＡＫ５５）から得られた肺ガン（骨転移）でのＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ発現の免疫組織化学的分析結果の顕微鏡写真を示す（ｘ４００）。
【図１７】他の肺線癌腫（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）でのＲＥＴ発現分析結果を示すグラフである。
【図１８】肝転移での遺伝子発現ネットワーク分析結果を示す。
【図１９】正常細胞（Ａ）と肺ガン細胞（Ｂ）のＦＩＳＨ分析結果を示す。
【図２０】ＮＩＨ３Ｔ３細胞株でのＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質の発現を示すウエスタンブロッティング結果である。
【図２１】ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子に形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞株のコロニー形成能力を示す。
【図２２】キナーゼ抑制剤、カボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）を処理した状態でのＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子に形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞株での蛋白質発現水準を示す。
【図２３】キナーゼ抑制剤、カボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）を処理した状態でのＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質発現細胞の細胞成長率を示すグラフである。
【図２４】肝転移性肺ガン（ＡＫ５５）及びトリプルマーカー陰性の肺線癌腫（ＬＣ＿Ｓ２）のゲル電気泳動イメージである。
【図２５Ａ】二重陰性肺線癌腫（ＬＣ＿Ｓ６）のゲル電気泳動イメージである。
【図２５Ｂ】ＬＣ＿Ｓ６のサンガー配列分析法を用いたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子の切断点同定結果である。
【図２６】ＡＫ５５、ＬＣ＿Ｓ２及びＬＣ＿Ｓ６のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写体を概略的に示す。
【図２７】ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子及びＮＭ＿０２０９７５に由来したＫＩＦ５Ｂドメインを含む融合領域のヌクレオチド配列を示す。
【図２８】ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質及びＮＭ＿０２０９７５に由来したＫＩＦ５Ｂドメインを含む融合領域のアミノ酸配列を示す。
【図２９】ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子及びＮＭ＿０２０６３０に由来したＫＩＦ５Ｂドメインを含む融合領域のヌクレオチド配列を示す。
【図３０】ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質及びＮＭ＿０２０６３０に由来したＫＩＦ５Ｂドメインを含む融合領域のアミノ酸配列を示す。
【図３１】ＬＣ＿Ｓ２から得られたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ変種融合遺伝子の、ヌクレオチド配列及び融合領域を示す。
【図３２】ＬＣ＿Ｓ２から得られたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ変種融合蛋白質の、アミノ酸配列及び融合領域を示す。
【図３３】ＬＣ＿Ｓ６から得られたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ変種融合遺伝子の、ヌクレオチド配列及び融合領域を示す。
【図３４】ＬＣ＿Ｓ６から得られたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ変種融合蛋白質の、アミノ酸配列及び融合領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明が下記の実施例によって限定されるのではない。
【実施例】
【００５８】
実施例１：試料準備段階
実施例で使用された全てのプロトコルはソウル聖母病院（承認番号ＫＣ１１ＯＩＳＩ０６０３）の臨床試験審査委員会によって承認されたものである。パラフィン包埋組織（Ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ）はＡＫ５５患者の原発性肺がん及び骨転移癌から得られた。また、ＡＫ５５の肝転移性癌の生検（ｂｉｏｐｓｙ）を通じて得られた冷凍組織も用いることができた。また、ＡＫ５５の静脈血を採取した。ＡＫ５５患者の肺ガン、骨転移癌、肝転移癌、及び血液から遺伝体ＤＮＡを抽出した。さらに、ＡＫ５５患者の冷凍された肝転移癌からＲＮＡを抽出した。そして、本願発明に参考として引用された“Ｊｕ  ＹＳ、Ｋｉｍ  ＪＩ、Ｋｉｍ  Ｓ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１１，”のように全体ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
【００５９】
ＡＫ５５患者（肺線癌腫及び多発性転移を有する３３歳の男患者）は３３歳までは元気であったが、図１と図２に示すように肺の右上葉に低分化腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）が発達していた。図１と図２はＣＴ−誘導生体検査（ヘマトキシリン及びエオシン染色）を通じて得られた原発性肺ガン組織のパラフィン切片顕微鏡写真である（図１：ｘ１００；図２：ｘ４００）。ガン組織で、低分化腫瘍細胞巣が結合組織形成基質（ｄｅｓｍｏｐｌａｓｔｉｃ  ｓｔｒｏｍａ）に存在した。さらに、癌細胞は膨らんだ細胞質と大きい多形性核を有していた。
【００６０】
ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）を通じて、肝と多数の骨でも転移が発見された。病理学的診断のために、彼は原発性肺がんのＣＴ誘導生体検査（ＣＴ−ｇｕｉｄｅｄ  ｂｉｏｐｓｙ）だけでなく肝転移性癌の超音波誘導生体検査（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｇｕｉｄｅｄ  ｂｉｏｐｓｙ）もした。ＡＫ５５患者は祖父母世帯から癌家族歴はなく、彼は喫煙したことがなかった。診断１週後、彼は頸椎（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｂｏｎｅ）への転移によって首骨折され、そのためにＣ７頸椎体除去術（ｃｏｒｐｅｃｔｏｍｙ）を受けた。病理学研究で、彼の肺線癌腫は、知られたＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、及びＡＬＫ突然変異に対して陰性反応を示した。ＣＫ７、ＣＫ２０、及びＴＴＦ１に対する免疫組織化学的分析結果は肺線癌腫と一致した（図３乃至図５；ＣＫ７陽性（図３）、ＴＴＦ１陽性（図４）、ＣＫ２０陰性（図５））。
【００６１】
図３乃至図５は原発性肺ガン組織（図３；ＣＫ７；図４：ＴＴＦ１；図５：ＣＫ２０）の免疫組織化学的結果を示す顕微鏡写真である。このような分析は頸椎に転移された腫瘍で行われた。ＣＫ７とＴＴＦ１は陽性であったが、ＣＫ２０は陰性であった。結果は原発性肺線癌腫がこの癌の起源である可能性を高く示す。
【００６２】
実施例２：全長遺伝体分析
前記実施例１の方法のように、ＡＫ５５患者から得られたそれぞれ試料の遺伝体変種（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）は単一塩基変異（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ、ＳＮＶ）、短い挿入（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）と欠失（挿入欠失、ｉｎｄｅｌ）、及び大量欠失（ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）に、本願発明に参考として引用された“Ｊｕ  ＹＳ，  Ｋｉｍ  ＪＩ，  Ｋｉｍ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１１”と“Ｋｉｍ  ＪＩ，  Ｊｕ  ＹＳ，  Ｐａｒｋ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２００９；４６０：１０１１−５”で叙述されたように、全長−遺伝体配列分析法（ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の修正された基準を用いて分類された。その後、ガン組織での前記遺伝体変種を癌−関連体細胞突然変異を同定するために血液内の遺伝体と比較した。ＤＮＡ及びＲＮＡ配列データも本願発明に参考として引用された“Ｊｕ  ＹＳ，  Ｋｉｍ  ＪＩ，  Ｋｉｍ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１１，”で叙述した方法で分析した。
【００６３】
原発性肺がんのＤＮＡはパラフィン包埋組織にある少量のＤＮＡから抽出されるため、分析のための短い−リード重複（ｓｈｏｒｔ−ｒｅａｄ  ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が高すぎた。したがって、主要比較は肝転移と血液の配列の間で行われた。配列分析実験は、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の標準方法、及び本願発明に参考として引用された“Ｊｕ  ＹＳ，  Ｋｉｍ  ＪＩ，  Ｋｉｍ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１１”と“Ｋｉｍ  ＪＩ，  Ｊｕ  ＹＳ，  Ｐａｒｋ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２００９；４６０：１０１１−５”で叙述された方法を用いて行った。
【００６４】
配列ライブラリ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｙ）はイルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．）の標準プロトコルによって作った。配列分析の高い処理量のために、パラフィン包埋骨転移からの遺伝体ＤＮＡ（ＤＮＡ濃度が低すぎ、発明者の基準に満たされず配列ライブラリ構築をするには不適合）を除いた試料はイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のＨｉＳｅｑ２０００とＧｅｎｏｍｅ  ＡｎａｌｙｚｅｒＩＩｘを用いて配列分析した。ＡＫ５５患者の癌（肝転移）及び正常組織（血液）の全長−遺伝体ディープシーケンシング（ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）から、発明者らはそれぞれ４７．７７ｘと２８．２７ｘの平均リード−深さ（ｒｅａｄ−ｄｅｐｔｈ）を得た。表１は得られた結果を示す。肺ガン患者ＡＫ５５の配列分析統計要約を表１に示した。
【００６５】
【表１】
0006389124.tif 000002
【００６６】
全長−遺伝体範囲は均一に分散されていた（中心小体（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）または末端小粒（ｔｅｌｏｍｅｒｅｃ）領域での正常‘スパイク（ｓｐｉｋｅｓ）’除外）。これはガン組織で異数性の証拠がないのを示す（図６）。図６は肺ガンの転写体配列分析で同定された融合遺伝子の視覚的表現を示す。染色体内部、及び染色体間の融合遺伝子は中間層で観察される。線の厚さは証拠の量（スパニングリード（ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｒｅａｄｓ）の数）を示す。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子は赤色で表示された。染色体イデオグラム（ｉｄｅｏｇｒａｍｓ）は外層で観察される。癌全長遺伝体配列分析の範囲は１番目中間層で観察される。このような結果は、癌遺伝体は広範囲な染色体の異数性を有していないのを示唆する。ヒットマップ（Ｈｅａｔｍａｐ）を用いた遺伝子の発現水準は２番目中間層で観察される。
【００６７】
癌全長−遺伝体配列で、私たちはＯＭＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ）及びＳＮＰｅｄｉａに保管されて知られたいかなる癌関連体細胞点突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）も見つけられなかった。癌と血液間のＳＮＶｓ、挿入欠失、及びＣＮＶｓ（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｎｔｓ）の比較では発癌可能性がある癌関連遺伝子でのどんな眼に触れる突然変異も見つけられなかった。
【００６８】
実施例３：融合遺伝子分析
融合遺伝子を検出するために、転写体配列分析（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、他の遺伝子と並んでいるリード（ｒｅａｄ）の端に存在するディスコーダントリード（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｒｅａｄ）、及びキメリック転写体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）の融合切断点を横切っているエクソン−スパニングリード（ｅｘｏｎ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｒｅａｄ）を使用した。最終融合遺伝子候補のために、相応する遺伝体の再配列、即ち、逆位、転座及び大量欠失、を全長遺伝体配列分析データを通じて調査した。
【００６９】
転写体データが分析され、多くの癌は病原性染色体の転座または逆位による融合遺伝子によって由来すると知られているため、発明者らは融合遺伝子を見つけることに焦点を合わせた。
【００７０】
融合遺伝子を見つけるために、それぞれ約３００ｂｐの長さのｃＤＮＡ断片の端を１０１ｂｐまで次世代塩基配列分析（ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて配列分析した（Ｊｕ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２０１２  ２２：４３６−４４５）。配列データから、私たちは他の染色体に整列されている配列の両端にあるディスコーダントリードの存在を調査した。さらに、各最終の配列の一つは融合遺伝子の切断点から作られ、エクソン−スパニングリードの存在も調査した。ディスコーダントリード及びエクソン−スパニングリードは融合遺伝子の存在を示す。ディスコーダントリードとエクソン−スパニングリードを全て有する遺伝子を肺ガン融合遺伝子と決めた。
【００７１】
ＡＫ５５で同定された融合遺伝子の中で選択されたもの（５２個のうちの２０個）に対して融合遺伝子の確認方法を表２及び図６に示した。
【００７２】
【表２】
0006389124.tif 000003
【００７３】
これらの中、９４．２％（ｎ＝４９）は隣接した遺伝子（＜１３５Ｋｂ）の間の染色体間融合であり、これは発癌でいかなる機能的役割も有していないだろう（表２）。また、１．９％（ｎ＝１）は染色体内融合であったが、これは肝で高く発現される遺伝子であるハプトグロビン（ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ、ＨＰ）によって発生したものである。たとえ前記融合遺伝子の存在は生物学的に遺伝子の分子的機能と関連して興味深いが、これが腫瘍形成をするとは考えられない。残った３．８％（ｎ＝２）はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴとＫＩＡＡ１４６２−ＫＩＦ５Ｂ融合遺伝子であり、これらの染色体内融合は離れている遺伝子（＞〜２Ｍｂ）の間で発生した。この結果によってＫＩＡＡ１４６２−ＫＩＦ５Ｂは除外された。なぜならＫＩＡＡ１４６２−ＫＩＦ５Ｂの発現水準が低く、ＫＩＡＡ１４６２は分子機能が知られない仮想の蛋白質であるためである。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を除いては、私たちは融合遺伝子候補内で染色体の再配列（例えば、大量欠失、逆位、または転座）に該当するものが見つけられなかった。
【００７４】
ＲＥＴはチロシンキナーゼガン原遺伝子（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）とよく知られているため、最終融合遺伝子であるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴは特に興味がある。また、前記融合遺伝子はヒトの癌では報告されたことがない。さらに、それは新規なものと見なされる。この遺伝子融合事件の特性はＲＮＡ配列分析データを用いてさらに確認された。融合遺伝子は高く発現され、３４個のディスコーダントペアード−エンドリードと６０個のフュージョン−ジャンクション（ｆｕｓｉｏｎ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を横切るスパニングリードによって立証された（表２及び図７）。図７はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子を概略的に示す。転写体配列分析で、３４個のディスコーダントペアード−エンド（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ）リードと６０個のエクソン−ジャンクション（ｅｘｏｎ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を横切るスパニングリードが同定された。このようなリードの存在は融合遺伝子の強力な証拠である。ディスコーダントペアード−エンドリードは末端配列が異なる遺伝子と整列されたリードと定義した。スパニングリードは予測された融合転写体のジャンクションを横切って整列された末端配列を有するリードをいう。前記分析で、融合はＫＩＦ５Ｂの１６番目エクソンとＲＥＴの１２番目エクソンの間で起こった。
【００７５】
このようなデータはＫＩＦ５Ｂの１６番目エクソンの端とＲＥＴガン原遺伝子の１２番目エクソンの開始が合わせられるのを示す。発現プロファイルはガン組織でＲＥＴの１番目乃至１２番目エクソンは発現されないのを示し（図８）、これは癌での大部分のＲＥＴ発現はそのままのＲＥＴ遺伝子より融合遺伝子で起こるのを示す。図８はそれぞれのＲＥＴエクソンのＲＮＡ発現水準を示すグラフである。ＲＥＴ発現は１２番目エクソン、即ち、融合遺伝子のジャンクションの下側で観察された。これは全てのＲＥＴ発現は正常ＲＥＴ遺伝子よりＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子に由来したのを提示する。
【００７６】
ＫＩＦ５ＢとＲＥＴはそれぞれ１０ｐ１１．２２と１０ｑ１１．２１に１０．６Ｍｂだけ離れて存在する。二つの遺伝子を暗号化するストランドが異なるため、融合遺伝子を作られるためには１０．６Ｍｂの長さの逆位が起こらなければならない（図９）。図９は１０番大規模並列配列分析法（ｍａｓｓｉｖｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じた癌遺伝体の染色体での１０．６Ｍｂの長さの逆位を概略的に示す。このような逆位はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子の原因である。ＫＩＦ５Ｂは一般に自身のユニバーサルプロモーターと共に発現される。逆位が起こった後、前記プロモーターはＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子のグローバル発現を活性化する。
【００７７】
前記遺伝体の逆位は癌で逆位（肝転移に８個のリード；原発性肺がんに１つのリード）を裏付けるリードの検出を通じて確認された。しかし、血液組織の全体遺伝体配列分析では相応する染色体の再配列がなかった。
【００７８】
前記結果は遺伝体のＤＮＡとｃＤＮＡをＰＣＲ増幅とサンガー配列分析法を通じた分析を用いてさらに立証された。ＰＣＲ反応は９５℃で１０分間、９５℃で３０秒間３０サイクル、６２℃で１０秒間、７２℃で１０秒間、最後に７２℃で１０分間行った。遺伝体の逆位のためのＰＣＲ及びサンガー配列分析法プライマーは５’−ＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１８）と５’−ＣＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１９）であった。融合転写体のためのプライマーは５’−ＧＴＧＡＡＡＣＧＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’（配列番号２０）と５’−ＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣ−３’（配列番号２１）である。全てのサンガー配列分析法（Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）実験はマクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｃｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）で実施した。
【００７９】
ＡＫ５５患者（肺ガン、骨と肝に転移）の三つの癌関連組織は正常血液を除いた全てがＰＣＲ生成物は逆位の結果であるのを示す（図１０及び図１１）。図１０及び図１１はＡＫ５５患者から得られたＲＮＡ（図１０）とＤＮＡ（図１１）のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子確認のためのＰＣＲ増幅結果である。ＲＮＡ及びＤＮＡでのＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子の確認は前述の逆位に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ増幅及び及び電気泳動を通じて行われた。融合遺伝子患者の癌組織のＲＮＡとＤＮＡのみから発見された。
【００８０】
これら結果物のサンガー配列分析はヌクレオチド分解を有する逆位の切断点を見つけることによって融合転写体を検証した（ヒト委託遺伝体ビルド３６．３（ｈｕｍａｎ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｕｉｌｄ  ３６．３）のｃｈｒ１０：３２、３５１、３０６−４２、９３１、６０１）。図１２と１３はＲＮＡ（図１２）とＤＮＡ（図１３）の検証のためのサンガー配列分析法を通じた逆位切断点の探知結果を示す。融合遺伝子はサンガー配列分析法を用いて成功的に確認された。遺伝体にある逆位切断点はまたシングル−ヌクレオチドレゾリューション（ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で確認された。遺伝体の切断点はＫＩＦ５ＢとＲＥＴのイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）に位置している。切断点（ヒト委託遺伝体ビルド３６．３のｃｈｒ１０：４２、９３１、６０４）から２つの塩基ダウンストリーム（ｄｏｗｎｄｔｒｅａｍ）に、１−ｂｐ欠失が作られ、これはＮＨＥＪ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）が、二重鎖ＤＮＡの切断以後に発生した前記逆位から起因した可能性があるのを提示する。
【００８１】
興味深いことに、単一塩基対欠失は切断点（ｃｈｒ１０：４２、９３１、６０４）に２ｂｐ隣接したところで同定され、これはエラー−プローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＤＮＡ修復メカニズム、即ち、ＮＨＥＪ、この二重鎖ＤＮＡの切断以後に発生した前記逆位から起因した可能性があるのを提示する。これに加えて、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ（ｎｏｎ−ＢＤＮＡ）構造はＲＥＴに存在する、こわれやすく染色体の転座の根源と知られた切断点の、〜１００ｂｐアップストリーム（ｕｐｓｔｒｅａｍ）にあると予想される。
【００８２】
実施例４：ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合キナーゼの機能性評価
ＲＥＴ腫瘍遺伝子は膜貫通受容体チロシンキナーゼ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）である。ＲＥＴは細胞外領域（Ｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅドメインを含んでいる）、膜貫通ドメイン及びチロシンキナーゼドメインを含む細胞内領域から構成されている（図１４）。図１４はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質の機能的なドメインを概略的に示す。融合蛋白質はＫＩＦ５Ｂの６３８Ｎ−末端残基及びＲＥＴの４０２Ｃ−末端残基から構成されている。融合遺伝子は二重螺旋ドメインを含んで蛋白質チロシンキナーゼドメインを有している。二重螺旋ドメインは自己リン酸化によって発ガン性蛋白質チロシンキナーゼドメイン（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）を活性化させることができる同種二量化（ｈｏｍｏ−ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を誘発する。
【００８３】
ＲＥＴがＧＤＮＦのような共同受容体やリガンドに結合することによって二量化される時、自己リン酸化によって活性化され、下流シグナル伝達を刺激する。ＲＥＴガン原遺伝子の下流シグナルカスケード（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅ）は細胞生存／細胞死滅、増殖、分化、及び転移を調節するＭＡＰＫ経路である。ＲＥＴの正常発現は神経発達に重要であるが、分化した組織では活性化されないのが知られている。
【００８４】
ＫＩＦ５Ｂは微小管依存性モータ（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｔｏｒ）蛋白質であり、普遍的にＫＩＦ５Ｂの活性化プロモーターによって発現され、真核細胞内の細胞小器官の輸送に参加する。ＫＩＦ５Ｂの二重螺旋ドメインは自分の動きに必須の同種二量化を誘導する。
【００８５】
図１５はＰＨＹＲＥ２アルゴリズムを用いて予測したＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質の３次元構造を示す。融合蛋白質のＮ−末端及びＣ−末端は赤色と青色で表示された。それぞれ蛋白質３ＤモデリングはＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子の蛋白質配列を用いたＰＨＹＲＥ２ソフトウェアで遂行された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｐｈｙｒｅ２／）。
【００８６】
これと同様に、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子は高く発現され、その後、ＫＩＦ５Ｂによって翻訳された後に二量化される（図１４及び１５）。その後、二量化されたＲＥＴ蛋白質チロシンキナーゼドメインは非正常的に刺激され、これにより発癌経路の磁極が促進される。免疫組織化学的分析はＲＥＴのチロシンキナーゼドメインは肺ガン組織で高く発現されたのを示す（図１６）。図１６は患者（ＡＫ５５）の肺ガン（骨転移）でのＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ発現を免疫組織化学的分析した結果を示す顕微鏡写真である（ｘ４００）。蛋白質が腫瘍細胞で独占的に観察されたことは、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質は癌で重要な役割を果たすのを意味する。
【００８７】
実施例５：他の肺ガン試料でのＲＥＴ過発現頻度評価
ＲＥＴの発ガン性効果はＰＴＣ／ＲＥＴ融合蛋白質の形成を主導する、多様な種類の染色体の転座と逆位がある、甲状腺乳頭状癌（ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＰＴＣ）で初めて確認された。特定の点突然変異も多発性内分泌腫瘍症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ、ＭＥＮ）２Ａと２Ｂタイプでドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）として報告された。また、活性化されたＲＥＴが前立腺癌、すい臓癌、悪性黒色種で観察された。前記ＲＥＴの腫瘍生成能力もＲＥＴ形質転換されたネズミ研究で多様な種類の悪性腫瘍を作り出すことによって裏付けられる。しかし、前記ＲＥＴ遺伝子は従来の肺ガンでは強調されなかった。
【００８８】
肺線癌腫でのＲＥＴ過発現頻度はデータベースに保管されている従来マイクロアレイデータを用いて評価した。特に、一般的な肺線癌腫（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）でのＲＥＴ過発現を調査するために、私たちはデータベース（遺伝子発現オムニバス（Ｏｍｎｉｂｕｓ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／と癌ゲノムアトラス（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ、ＴＣＧＡ）：ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に保管されている肺線癌腫の発現プロファイルを分析した。
【００８９】
１０個の腺癌種細胞株（ＧｅｍｍＡ，  Ｌｉ  Ｃ，  ＳｕｇｉｙａｍＹ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６；６：１７４）の発現プロファイルは二つの試料でＲＥＴが高く発現されたのを示す。反面、ＲＥＴは本データセットの１０個の小細胞癌細胞株と９個の扁平細胞癌腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株で活性化されなかった。私たちは原発性肺がんでのＲＥＴガン原遺伝子発現をプロファイルした３つの研究をさらに発見した。第一の研究のデータセットで（Ｄｉｎｇ  Ｌ，  Ｇｅｔｚ  Ｇ，  Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＤＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２００８；４５５：１０６９−７５）、７５個のうちの６個の腫瘍（８％）でＲＥＴが過発現した。また他のデータセット（Ｋｕｎｅｒ  Ｒ，  Ｍｕｌｅｙ  Ｔ，  Ｍｅｉｓｔｅｒ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９；６３：３２−８）は４０個のうちの５個の試料（１２．５％）でＲＥＴ活性を示した。最後に、癌ゲノムアトラス（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ、ＴＣＧＡ）データセットは３２個のうちの３つの試料（９．４％；図１７）でＲＥＴ過発現を示した。図１７は他の肺線癌腫でＲＥＴ発現分析結果を示すグラフである。ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）に寄託されている３２個の発現マイクロアレイデータを分析した。これらのうちの３つの試料は明白なＲＥＴ過発現を示し、これは肺線癌腫での過発現頻度は約１０％であるのを提示する。
【００９０】
これと共に、前記結果は肺線癌腫でＲＥＴ過発現頻度は〜１０％であるのを提示する。
【００９１】
図１８は肝転移での遺伝子発現ネットワーク分析結果を示す。ネットワーク分析はＭｉＭＩ  ｐｌｕｇｉｎ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｍｉｐｌｕｇｉｎ．ｎｃｉｂｉ．ｏｒｇ／）と共にＣｙｔｏｓｃａｐｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｙｔｏｓｃａｐｅ．ｏｒｇ／）を用いて行われた。癌で遺伝子が過発現されることはネットワークでマッピングされ、ノードの大きさは相対的な発現に比例する。主な官能基は標識され、機能的に重要な遺伝子は赤色で標識された。
【００９２】
実施例６：ＦＩＳＨ分析を通じたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子の同定
ＲＥＴ再配列を同定するために、ＦＩＳＨをＡＫ５５細胞株と対照群として正常細胞に、ＲＥＴのためにブレイク−アパートプローブ（ｂｒｅａｋ−ａｐａｒｔｐｒｏｂｅ）を用いて行った。スライドはＣｉｔｒｉｓｏｌｖｅ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に１５分間浸漬させ、ジェット空気で乾燥させた後、再びルゴール溶液（Ｌｕｇｏｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に５分間浸漬させた。その後、２．５％チオシアン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）に３０秒間浸漬させた。その後、スライドをクエン酸塩／クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ／ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）溶液（ｐＨ６．０）１０ｍｍｏｌ／Ｌに位置させ、５分間高い設定でマイクロウエーブ（ｍｉｃｒｏｗａｖｅ）し、次いで３７℃で１５乃至４５分間０．４％ペプシン溶液（ｐｅｐｓｉｎ  Ａ／０．９％  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ａｔ  ｐＨ  １．５）でマイクロウエーブする。１０マイクロリットルのＦＩＳＨ試薬（７ｕｌ  ＬＳＩ  ｂｕｆ−ｆｅｒ［Ｖｙｓｉｓ，  Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，  ＩＬ］、３ｕｌプローブ）をそれぞれのスライドに入れた後、スライドにカバースライドをかぶせる。Ｈｙｂｒｉｔｅ（Ｖｙｓｉｓ）で融点８０℃で５分間変成させ、湿度室（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ｃｈａｍｂｅｒ）内で３７℃で１２時間インキュベーティングした。スライドを２ＸＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）／０．１％ＮＰ４０（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，  Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，  ＭＡ）で７０℃で２分間洗浄した後、ＤＡＰＩ（４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌ  ｉｎｄｏｌｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）と対照した。細胞はマイクロスコーピスト（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｓｔ）によって適切なフィルターセットが装着された蛍光顕微鏡を用いて分析された。染色体逆位、即ち、推論された染色体の再配列はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合に責任がある。得られたＦＩＳＨ結果は図１９で示され、赤色と緑色プローブの、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性腫瘍に側面（ｆｌａｎｋ）ＲＥＴ転座サイト分裂を示す（矢印）。
【００９３】
実施例７：ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子に形質転換された哺乳類細胞の細胞成長率及び生存力実験
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質を暗号化しＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質を発現させるｃＤＮＡが含まれたコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）に形質転換させることによって、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質の発現が正常細胞を腫瘍細胞に変換させるのに寄与するか否かは確実になった。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ／ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１６５８）は１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ペニシリン、及びストレプトマイシンが含まれているＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で保管された。レトロウイルスの上清液準備と形質転換はＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＡＢｓから購入したＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍが提供するプロトコルにより行われた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞はｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ／Ｆｕｓｉｏｎ蛋白質発現ベクターを含むレトロウイルスの上清液を通じて形質導入し、その後に形質導入された細胞をピューロマイシン（２ｕｇ／ｍｌ）を用いて選別した。細胞株からの全ての細胞溶解物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ遂行後、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）メンブレインの上にブロッティングをした。ブロッティングは０．１％ツイン２０と５％ＢＳＡが含まれているＴＢＳで遮断され、ａｎｔｉ−ＲＥＴ（＃３２２３、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＵＳＡ）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＥＴ（Ｔｙｒ９０５）（＃３２２１、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＵＳＡ）、及びａｎｔｉ−ａｃｔｉｎ（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で探索した。０．１％ツイン２０が含まれているＴＢＳで洗浄後、メンブレインはワサビダイコン過酸化酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ））結合された抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）または抗ウサギ（ａｎｉｔ−ｒａｂｂｉｔ）２次抗体と共にインキュベートし、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔ；Ｐｉｅｒｃｅ、＃３４０８０）を処理した。得られた結果は図２０に示し、選別されたＮＩＨ３Ｔ３細胞が安定的にＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子に形質転換されたのをウエスタンブロット法を通じて示す。
【００９４】
ＦＢＳが含まれるかまたはＦＢＳが含まれない培地で、ＮＩＨ３Ｔ３両親世帯細胞とＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴａを発現するＮＩＨ３Ｔ３安定した細胞株、またはＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｃ融合遺伝子（ＮＩＨ３Ｔ３／ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴａ、ＮＩＨ３Ｔ３／ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｃ）細胞の成長率を測定し、それぞれを比較した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＮＩＨ３Ｔ３／ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ細胞はＦＢＳが含まれている培地とＦＢＳが含まれない培地でそれぞれ２４時間培養した。その後に得られたイメージを図２１に示した。図２１で示されているように、形質転換されないＮＩＨ３Ｔ３細胞の成長率はＦＢＳが含まれない培地で抑制されたが、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子に形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞はＦＢＳが含まれない培地でも成長し、コロニーをよく形成した。前記結果はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質の発現はＮＩＨ３Ｔ３細胞の特性を変化させ、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子に形質転換された細胞はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質のためにＦＢＳが不足した培地のような非正常条件でも生存と成長可能であるのを示す。
【００９５】
実施例８：融合蛋白質抑制剤（カボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ））による哺乳類固形癌細胞成長阻害試験。
融合蛋白質が融合蛋白質を発現する細胞株（または腫瘍細胞）の成長及び生存を刺激するかに対する効果を確認するために、細胞株にキナーゼに対する阻害剤または融合蛋白質に含まれている他のドメインに対する阻害剤を処理した。
【００９６】
特に、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴに形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３／ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ）（実施例７）に、図２２で示されるように、カボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）（４Ｃｈｅｍ、韓国）を多様な濃度で２日間処理した。そして、ＲＥＴ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＥＴ、及びアクチン（ａｃｔｉｎ）の発現水準（対照群）を相応する抗体を用いた免疫ブロッティングを通じて測定した。抗ＲＥＴ（ａｎｔｉ−ＲＥＴ）及び抗ホスホＲＥＴ（ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＥＴ）（Ｔｙｒ９０５）抗体はそれぞれセルシグナリングテクノロジー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（＃３２２３、＃３２２１）から入手した。抗アクチン（ａｎｔｉ−ａｃｔｉｎ）抗体はシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（＃Ａ５４４１）から入手した。
【００９７】
得られた結果は図２２に示し、ＲＥＴの活性化された形態であるｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＥＴの発現がカボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）の濃度によって減少することを示す。前記結果はＲＥＴ蛋白質が融合蛋白質形質転換された細胞で非正常的に活性化されたのを示し、融合蛋白質形質転換された細胞の成長はキナーゼ抑制剤を処理することによって阻害できるのを示す。
【００９８】
細胞成長阻害に対する定量的分析のために、融合蛋白質を発現する細胞の数を数えてみて、細胞成長阻害は製造者が提供したプロトコルによってＷＳＴ−１  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて分析した。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴに形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を約１０００乃至５０００個を９６−ｗｅｌｌプレートにシード（ｓｅｅｄ）し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが供給された完全培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で培養した。２４時間が経過した後、図２３で示されるように培地を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳと１００ｎＭ濃度のカボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）が含まれている完全成長培地１００μｌに交替した後、細胞を７２時間さらに培養した。細胞培養最後に、それぞれのｗｅｌｌにＷＳＴ−１溶液を１０μｌ添加し、１乃至３時間さらに培養を実施した。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いて測定した。成長阻害はカボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）を処理した細胞と処理しない細胞で測定された吸光率の平均±ＳＤ値を比較して評価した。分析は３回実施し、得られた結果は図２３に示した。図２３で示されるように、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質は細胞成長率増加とヒト腫瘍細胞（ＮＳＣＬＣなど）の細胞生存に寄与し、融合蛋白質阻害剤は細胞生存減少及び細胞死滅増加につながる可能性がある。
【００９９】
実施例９：他の患者らでＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子の検出
他の原発性肺線癌腫でもＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子がまた存在するのを示すために、追加的に３重陰性（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、及びＥＭＬ４−ＡＬＫに陰性）原発性肺線癌腫の転写体を大規模並列配列分析法を用いて分析した。追加された試料はＬＣ＿Ｓ２（肺線癌腫３Ａ期診断を受けた６２歳男患者）と命名した。ＬＣ＿Ｓ２試料を実施例１での方法で準備した。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写体がＬＣ＿Ｓ２で発見された。表３で示すようにＬＣ＿Ｓ２にある１２番目エクソンで、ＲＥＴがＡＫ５５と同様に高く発現された。ｅｘｏｎ−ｂｙ−ｅｘｏｎ  ＲＥＴ発現を表３に示した。
【０１００】
【表３】
0006389124.tif 000004
【０１０１】
ＫＩＦ５Ｂは通常分化された組織で発現されるため、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子はこのような肺ガン組織（ＡＫ５５とＬＣ＿Ｓ２）に存在するＫＩＦ５Ｂ活性プロモーターによって発現できる。前記ＬＣ＿Ｓ２に存在する融合転写体はｃＤＮＡ  ＰＣＲを用いて検証した。
【０１０２】
ＡＫ５５とＬＣ＿Ｓ２から得られた検証データを図２４に示した。図２４はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写体を対象にしたｃＤＮＡ  ＰＣＲ及びＡＫ５５の肝転移性肺ガンと追加的に３重陰性肺線癌腫（ＬＣ＿Ｓ２）でのゲル電気泳動の分析結果を示す。ＡＫ５５（配列番号１）及びＬＣ＿Ｓ２（配列番号９）から来たｃＤＮＡは融合転写体の明白な証拠を示す。ＡＫ５５の融合転写体はＬＣ＿Ｓ２（エクソン１５）のエクソンと比較してＫＩＦ５Ｂ（エクソン１６）のエクソンを１つ以上さらに含んでいるため、ＡＫ５５のＰＣＲ生成物の長さはＬＣ＿Ｓ２のＰＣＲ生成物の長さより長かった。
【０１０３】
また、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子は二重陰性（病理学研究でＥＧＦＲとＥＭＬ４−ＡＬＫは陰性；ＫＲＡＳ突然変異状態は分からない）原発性肺線癌腫（ＬＣ＿Ｓ６（肺線癌腫１Ａ期診断を受けた５８歳男患者）のｃＤＮＡ  ＰＣＲを用いてさらに評価した。ＬＣ＿Ｓ２の試料は前記実施例１の方法で準備した。ＬＣ＿Ｓ２の融合転写体はｃＤＮＡ  ＰＣＲを用いて検証して、ＬＣ＿Ｓ６はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子（配列番号１３）を示すのを確認した（図２５）。図２５はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写体を目標にしたｃＤＮＡ  ＰＣＲと二重陰性肺線癌腫（ＬＣ＿Ｓ６）のゲル電気泳動を用いた確認結果を示す。ＬＣ＿Ｓ６融合転写体の明白な証拠を示す。ＬＣ＿Ｓ６での融合転写体はＡＫ５５と比較して７つ以上のＫＩＦ５Ｂ（エクソン１７乃至２３）エクソンを含んでいるのを示す。
【０１０４】
ＬＣ＿Ｓ６の融合遺伝子切断点をサンガー配列分析法を用いて同定し、得られた結果は図２５ｂに示した。
【０１０５】
図２４、２５ａ、及び２５ｂに関連する検証はＰＣＲ増幅及び遺伝体ＤＮＡとｃＤＮＡサンガー配列分析法を用いて行った。ＰＣＲは９５℃で１０分間；９５℃で３０秒間３０サイクル、６２℃で１０秒間、そして７２℃で１０秒間；最後に、７２℃で１０分間実施した。ＡＫ５５遺伝体の逆位のためのＰＣＲとサンガー配列分析法のプライマーは５’−ＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧ−３’（ＫＩＦ５Ｂ；配列番号１８）と５’−ＣＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＡＧＴＧＧＡ−３’（ＲＥＴ；配列番号１９）であった。融合転写体のためのプライマーは５’−ＧＴＧＡＡＡＣＧＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’（ＫＩＦ５Ｂ；配列番号２０；ＡＫ５５及びＬＣ＿Ｓ６のための）と５’−ＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣ−３’（ＲＥＴ；配列番号２１；またはＡＫ５５、ＬＣ＿Ｓ２、及びＬＣ＿Ｓ６）を使用した。複製研究でｃＤＮＡ  ＰＣＲのために、他のＫＩＦ５Ｂプライマー（５’−ＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号２２）がＬＣ＿Ｓ２のために使用された。なぜなら、ＬＣ＿Ｓ２でのＫＩＦ５Ｂ融合切断点はＡＫ５５の切断点と異なるためである。全てのサンガー配列分析実験はマクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ。ｍａｃｒｏｇｅｎ。ｃｏｍ）で行われた。
【０１０６】
総合的に、複製研究で私たちは２つの原発性肺線癌腫でのＫＩＦ５ＢＲＥＴ融合遺伝子（ＬＣ＿Ｓ２及びＬＣ＿Ｓ６）事例をさらに分析した。このような結果はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合がめずらしいものでなく、融合転写体が一般に原発性肺線癌腫に存在するのを明白に示す。また、他のガン組織で同一な非機能的融合遺伝子を見つけるのは非常に難しいため、このような結果はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子の発現は肺ガンで重要な機能的影響を有するという間接的な証拠を提供する。
【０１０７】
興味深いことに、ＬＣ＿Ｓ２とＬＣ＿Ｓ６でＲＥＴのエクソン１２はＡＫ５５のようにＫＩＦ５Ｂのエクソン１６の代わりにエクソン１５（ＬＣ＿Ｓ２）及びエクソン２３（ＬＣ＿Ｓ６）と結合した。図２６はＡＫ５５（配列番号１）、ＬＣ＿Ｓ２（配列番号９）、及びＬＣ＿Ｓ６（配列番号１３）のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写体を概略的に示す。それぞれの長方形はＫＩＦ５Ｂ遺伝子（青）及びＲＥＴ遺伝子（赤）のエクソンを示す。
【０１０８】
前記結果はＫＩＦ５ＢにＤＮＡ二重鎖の壊れ（ｂｒｅａｋ）は原発性肺ガンの中で一致しないことがあるのを提示する。しかし、その両試料（融合遺伝子の中の二重螺旋ドメインの長さはＬＣ＿Ｓ２の場合に２４７個のアミノ酸であり、ＬＣ＿Ｓ６の場合に５２０個のアミノ酸であった）で二重螺旋ドメインはＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴキメリック腫瘍遺伝子でよく保存されているため、二量化活性度はＡＫ５５（３１０アミノ酸）と比較して大きく異ならないだろう。
【０１０９】
肺線癌腫試料（ＡＫ５５、ＬＣ＿Ｓ２、及びＬＣ＿Ｓ６）で得られたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子とＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合蛋白質は表４に要約した：
【０１１０】
【表４】
0006389124.tif 000005
【図１】
0006389124.tif 000006
【図２】
0006389124.tif 000007
【図３】
0006389124.tif 000008
【図４】
0006389124.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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