(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ実験における温度較正方法であって、下記工程を含む前記方法：
ａ）マルチウェルプレートの各ウェルに、非共有結合で二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光性結合色素を含む試料中の特定の標的核酸を増幅するための反応混合物を供給する工程、
ｂ）ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを各ウェルに供給する工程、
ｃ）特定の標的核酸を各ウェルで増幅させる工程、
ｄ）増幅された特定の標的核酸を各ウェルで融解し、非共有結合で二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光性結合色素からの光の放出を減少させ、二本鎖オリゴヌクレオチドを各ウェルで融解し、ドナー発色団とアクセプター発色団とを空間的に分離することによって、ドナー発色団からの光の放出を増加させ、又はアクセプター発色団からの光の放出を減少させる工程、
ｅ）非共有結合で二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光性結合色素からの光の放出の減少を検出することによって増幅された特定の標的核酸の融解温度値を各ウェルで監視し、ドナー発色団からの光の放出の増加又はアクセプター発色団からの光の放出の減少を検出することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値を各ウェルで別々に監視する工程、及び、
ｆ）二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値のウェル間差に基づいて、増幅された特定の標的核酸に対する融解温度値を各ウェルで補正する工程。
【請求項２】
特定の標的核酸が一塩基多型を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内のヌクレオチドに共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内のヌクレオチドに共有結合し、第１鎖内のヌクレオチド及び第２鎖内のヌクレオチドが相補的な塩基対を形成する、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖の５’末端に共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖の３’末端に共有結合しているか、又はドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖の３’末端に共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖の５’末端に共有結合している、請求項３の方法。
【請求項５】
非共有結合で二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光性結合色素の光の波長及びドナー発色団の光の波長が互いに分離されている、請求項１〜４の方法。
【請求項６】
非共有結合で二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光性結合色素が、LightCycler（登録商標）480 Resolight Dyeである、請求項１〜５の方法。
【請求項７】
ドナー発色団がCy5である、請求項１〜６の方法。
【請求項８】
アクセプター発色団が消光剤分子である、請求項１〜７の方法。
【請求項９】
消光剤分子は、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、及びBHQ-4からなる群から選択される暗消光剤である、請求項８の方法。
【請求項１０】
二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度と増幅された特定の標的核酸の融解温度との差が５℃以下であるように設計される、請求項１〜９の方法。
【請求項１１】
二本鎖オリゴヌクレオチドが、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度と増幅された特定の標的核酸の融解温度が同一であるように設計される、請求項１〜９の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のＰＣＲ実験における温度較正を行うためのキットであって、下記を含む前記キット：
ａ）試料中の特定の標的核酸を増幅するために必要な全ての試薬、
ｂ）非共有結合で二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光性結合色素、及び、
ｃ）ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合する二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１〜１１のＰＣＲ実験における温度較正を行うための反応混合物であって、下記を含む前記反応混合物：
ａ）標的核酸、
ｂ）特定の標的核酸を増幅するために必要な全ての試薬、
ｃ）非共有結合で二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光性結合色素、及び、
ｄ）ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合する二本鎖オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、高解像能融解ＰＣＲ実験における温度較正を行うための方法及びキットに関する。本明細書は、更に、標的及び較正物質に対して同一又は同様の融解温度の読み出しを可能にする最適な較正方法に関する。本明細書は、更に、前記方法を行う装置及び前記方法を実行するコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
高解像能融解（high resolution melting：ＨＲＭ）は、ＰＣＲ増幅後の標的配列中の未知の核酸変異を検出する方法である。変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis：ＤＧＧＥ）等の従来の方法に比べ、ＨＲＭは、変異走査においていくつかの利点を有する。これらの利点としては、試薬及び試料消費量の削減、最適化工程の削減、並びに単一のリアルタイムＰＣＲ装置において閉鎖試験形式が実行可能であることが挙げられる。
【０００３】
二本鎖核酸に非共有結合することができる特別な蛍光性ＤＮＡ結合色素（例えば、LightCycler（登録商標）480 Resolight Dye、Roche Applied Science、カタログ番号04909640001）の存在下で、標的配列を約２５０塩基対の長さまでＰＣＲ増幅した後に、生成したアンプリコンのＨＲＭ工程が追加される。蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素はＰＣＲを阻害しないので、飽和濃度で増幅反応に添加できる。ＨＲＭ工程の間に、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素が放出され、野生型、ホモ接合変異体、及びヘテロ接合変異体間のアンプリコンの融解プロファイルに関する差異を検出することができる（Reed GH, Kent JO, Wittwer CT (2007), Pharmacogenomics 8(6): 597-608; Wittwer CT (2009), Hum. Mutat. 30(6): 857-859; Wittwer et al, 米国特許第７，５８２，４２９号）。
【０００４】
点変異の種類によっては観察される融解温度の差が非常に小さい場合がある。一塩基多型（ＳＮＰ）では、典型的には、ＳＮＰのクラス１（Ｃ／Ｔ及びＧ／Ａ塩基変化）及びＳＮＰのクラス２（Ｃ／Ａ及びＧ／Ｔ塩基変化）に対して約１．０℃、ＳＮＰのクラス３（Ｃ／Ｇ塩基変化）に対して約０．５℃、ＳＮＰのクラス４（Ａ／Ｔ塩基変化）に対して約０．２℃程度の融解温度シフトとなる。ヘテロ接合変異は、典型的には、野生型とは異なる蛍光融解プロファイル（融解曲線形状）を示すが、ホモ接合変異は、多くの場合、野生型と非常に類似した融解プロファイルとなり、小さな温度シフトによってのみ識別される。
【０００５】
ＨＲＭに関する最新技術は、本明細書で以下に記載するようないくつかの欠点を有する。融解温度のわずかな差異を検出するためには、測定システムの非常に高い温度精度が要求される。リアルタイムＰＣＲ機器は、典型的には、正確な温度制御のためにペルチェ素子を使用したブロックに基づくシステムとして設計される。しかしながら、温度制御は、温度センサの較正、ペルチェ素子の制御、及び個々のマイクロウェルプレートの熱ブロックの取り付け部への形状的な適合性等に起因する物理的な制約を受ける。これらの制約により、典型的には、熱ブロック内の最も熱い位置と最も冷たい位置間の観察温度の差は０．５〜１．０℃の範囲となる。従って、反応体積内の温度制御ではホモ接合変異体の融点プロファイル特性が野生型に非常に類似しているＨＲＭ実験におけるわずかな温度シフトを識別することは不可能である。
【０００６】
ブロックに基づくサーモサイクラーの全ての位置での不均一な温度分布を補正するために、２つの異なる方法が現在確立されている。
ＨＲＭ実験を特定の機器で実行する前に別個の温度較正を特別な較正板によって実行する。全ての位置でのブロックに特有の温度データを機器のソフトウェアに保存し、その後、全ての位置の温度差を補正するためにＨＲＭ実験に使用する。この方法は、例えば、Applied Biosystems 7500及び7900HTリアルタイムＰＣＲシステム（例えば、MeltDoctor（登録商標）ＨＲＭ較正板、カタログ番号PN4425618）、及びBiorad CFXリアルタイムＰＣＲシステム（例えば、融解較正キット、カタログ番号184-5020）に対して確立されている。
【０００７】
前記較正方法の欠点は、別々に温度較正が実行される場合、温度不均一性に対する実験特有の原因を補正することができないことである。これらの原因には、個々のマイクロウェルプレートの熱ブロック取り付け部への嵌合の変動及びそれと関連する取り付け部からプレート及び反応体積への温度伝達の差異が含まれる。更には、例えば、イオン強度の変動（精製法或いは試料物質に起因）等に伴う反応条件の変動は観察融解温度に確実に影響を及ぼす。その上、ペルチェブロックの熱劣化をこの方法で補償することはできない。
【０００８】
ＨＲＭ実験の間に内部温度較正物質を各々の反応に追加する。温度較正物質は、標的配列の予測融解温度の下及び上の融解温度を採用し、反応中に存在する蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素によって検出される非標識二本鎖オリゴヌクレオチドから成る。較正物質のウェル間の温度差の測定値に基づいて検出された標的温度を補正する。この方法は、例えば、Idaho Technology社製のLightScanner（登録商標）装置（高感度Master Mix、カタログ番号HRLS-ASY-0008）に対して確立されている。
【０００９】
温度較正物質法の欠点：非標識内部温度較正物質の検出は、標的変異検出に使用するのと同じ蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素の放出に基づいている。従って、標的融解温度は較正物質の融解温度と重なり合ってはならない。このために、アンプリコンのサイズは約４０〜１２０塩基対の範囲に制限される。更に、標的のＧ／Ｃ含有量に応じて、アンプリコンの長さを許容融解温度範囲に適合するように最適化することが必要である。しかもアンプリコン融解の蛍光輝度が内部較正物質の信号を上回り、結果的に内部較正物質の信号を隠してはならない。蛍光輝度は生成されたＰＣＲ産物の量に強く依存する。そのため、出発核酸物質の量及びプライマーの濃度は、ＨＲＭ実験を実行する前に各標的に対して最適化しなければならない。
【００１０】
本明細書の目的は、上記の欠点を示さないＨＲＭ法を提供することである。
【発明の概要】
【００１１】
本明細書の第１の側面は、ＰＣＲ実験における温度較正の方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：ａ）マルチウェルプレートの各ウェルに、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素を含む試料中の特定の標的核酸を増幅するための反応混合物を供給する工程、ｂ）ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを各ウェルに供給する工程、ｃ）特定の標的核酸を各ウェルで増幅させる工程、ｄ）増幅された特定の標的核酸を各ウェルで融解し、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素からの光の放出を減少させ、二本鎖オリゴヌクレオチドを融解し、ドナー発色団とアクセプター発色団とを空間的に分離することによって、ドナー発色団からの光の放出を増加させる、又はアクセプター発色団からの光の放出を減少させる工程、ｅ）蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素からの光の放出の減少を検出することによって増幅された特定の標的核酸の融解温度値を各ウェルで監視し、ドナー発色団からの光の放出の増加又はアクセプター発色団からの光の放出の減少を検出することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度の値を各ウェルで別々に監視する工程、及びｆ）二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値のウェル間差に基づいて、増幅された特定の標的核酸に対する融解温度値を各ウェルで補正する工程。
【００１２】
本明細書の第２の側面は、上述したようにＰＣＲ実験における温度較正を行うためのキットに関し、前記キットは、ａ）試料中の特定の標的核酸配列を増幅するために必要な全ての試薬、ｂ）蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素、ｃ）二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、ドナー発色団が前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、アクセプター発色団が前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合する。
【００１３】
本明細書の第３の側面は、上述したようにＰＣＲ実験における温度較正を行うための反応混合物に関し、前記反応混合物は、ａ）標的核酸配列、ｂ）特定の標的核酸配列を増幅するために必要な全ての試薬、ｃ）蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素、及びｄ）二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、ドナー発色団は前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、アクセプター発色団は前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合する。
【００１４】
本明細書の第４の側面は、上述したようにＰＣＲ実験における温度較正を行うための装置に関する。
本明細書の第５の側面は、上述したようにＰＣＲ実験における温度較正を行うための方法を実行するためのコンピュータプログラムに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１に記載したように、較正物質を“使用しない”、３２個の野生型、３２個のヘテロ接合変異体、及び３２個のホモ接合変異体の正規化融解曲線を示す。実験は、“熱較正していない”ＰＣＲブロックを有する機器で行った。
【図２】図２は、実施例１に記載したように、較正物質を“使用している”、３２個の野生型、３２個のヘテロ接合変異体、及び３２個のホモ接合変異体の正規化融解曲線を示す。実験は、“熱較正していない”ＰＣＲブロックを有する機器で行った。
【図３】図３は、実施例１に記載したように、較正物質を“使用しない”、６個の遺伝子型変異体の正規化融解曲線を示す。実験は、“事前に熱較正した”ＰＣＲブロックを有する機器で行った。
【図４】図４は、実施例１に記載したように、較正物質を“使用している”、６個の遺伝子型変異体の正規化融解曲線を示す。実験は、“事前に熱較正した”ＰＣＲブロックを有する機器で行った。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の定義は、本明細書に使用される種々の用語の意味及び範囲を例示し、定義するために記載される。
用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、一般に、文脈上明確に指示する場合を除き、複数形を含む。
【００１７】
用語「アンプリコン」は、一般に、例えば当技術分野で公知の増幅技術で生成されたもの等のフォワードプライマー及びリバースプライマーの特定の一対によって増幅される選択された増幅産物を指す。
【００１８】
用語「増幅」は、一般に、標的核酸からの複数の核酸分子の産生を指し、プライマーは、ポリメラーゼによる伸長のための開始部位を提供する目的で標的核酸分子の特定の部位にハイブリッド形成する。増幅は、一般的に、当技術分野で公知の任意の方法により行い、例えば、これらに限定されないが、標準ＰＣＲ、ロングＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及び等温増幅等が挙げられる。
【００１９】
用語「較正物質」又は「温度較正物質」は、本明細書で使用され、ＦＲＥＴ対を担持する二本鎖オリゴヌクレオチドを指し、その対の一方の発光波長を、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解時に検出することができる。較正物質は、マルチウェルプレートのウェル間の温度差（例えば、マルチウェルプレートを担持した熱ブロックのばらつき、或いは個々のマイクロウェルプレートの熱ブロックの取り付け部への形状的な適合性等に起因）を測定する目的で高解像能融解実験に使用される。温度差は、放出された光の変化に基づいて較正物質の融解温度を正確に測定することによって決定することができる。前記変化は強度の変化（増加又は減少）である。
【００２０】
用語「相補的」は、一般に、適切な温度及びイオン緩衝液条件で、２個のヌクレオチドの塩基間で有利な熱力学的安定性及び特定の対を形成する能力を指す。この対形成は、各ヌクレオチドの水素結合特性に依存する。これの最も基本的な例としては、チミン／アデニン及びシトシン／グアニンの塩基間の水素結合対が挙げられる。本明細書において、標的核酸の増幅のためのプライマーは、標的核酸分子と全長にわたって完全に相補的であっても、「半相補的」（プライマーが標的核酸に最小限のハイブリッド形成をすることができる又はハイブリッド形成ができない追加の非相補的な配列を含む）であってもよい。
【００２１】
用語「色素」は、全ての種類の光吸収分子を集約するために使用され、従って、蛍光色素、非蛍光色素、及び消光剤分子が含まれる。消光剤分子は、蛍光により励起可能であり、熱等によってエネルギーを分配するので、蛍光色素の蛍光を消光することができる。非蛍光色素は、従来の蛍光色素とは対照的に実質的に蛍光発光のない色素である。
【００２２】
用語「蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素」は、二本鎖ＤＮＡに結合でき、定量ＰＣＲ実験におけるＤＮＡ形成の測定及び融解分析における解離を可能にする発色団を指す。蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素は、二本鎖ＤＮＡに結合する際に、特定の波長の光の形態で光を放出する。二本鎖ＤＮＡの２つの相補鎖が、例えば融解実験中に、解離する場合は光の放出は減少する。
【００２３】
用語「ＦＲＥＴ」又は「蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescent resonance energy transfer）」又は「フェルスター共鳴エネルギー移動」は、互換的に使用することができ、少なくとも２つの発色団、即ちドナー発色団及びアクセプター発色団、の間のエネルギー移動を指す。ドナーが適切な波長の光線によって励起された場合、典型的には、ドナーはアクセプターにエネルギーを移動する。アクセプターは、典型的には、移動したエネルギーを異なる波長の光線の形態で再放出する。アクセプターが「暗」消光剤である場合は、移動したエネルギーを光以外の形態、例えば、熱の形態で消散させる。一般的に使用される暗消光剤としては、BlackHole Quenchers（登録商標）（BHQ）（Biosearch Technologies社、カリフォルニア州ノバト）、Iowa Black（登録商標）（Integrated DNA Tech社、アイオワ州コーラルビル）、及びBlackBerry（登録商標）Quencher 650（BBQ-650）（Berry & Assoc.社、ミシガン州デクスター）が挙げられる。
【００２４】
用語「ハイブリッド形成する」は、一般に、それらのヌクレオチド配列と一致する別の核酸分子間の塩基対形成を指す。用語「ハイブリッド形成する」と用語「アニールする」は互換的に使用することができる。
【００２５】
用語「マルチウェルプレート」は本明細書で使用され、当業者の専門家に知られているように、１つ以上の試料を並行して行う物理的、化学的、又は生物学的特徴の分析に使用されるプレートを指す。マルチウェルプレートは、９６、３８４、１５３６、又は３４５６個の個別のウェルが含まれる。この用語は、また８−ウェル列等の他の種類の反応装置も含む。
【００２６】
本明細書の文脈において、用語「変異体」は、対応する天然に存在する又は非修飾の核酸に対して１つ以上の塩基置換を含むポリヌクレオチドを意味する。
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用でき、リボース核酸（ribose nucleic acid：ＲＮＡ）又はデオキシリボース核酸（deoxyribose nucleic acid：ＤＮＡ）重合体、又はそれらの類似体に相当する重合体を指す。これは、ＲＮＡ及びＤＮＡ等のヌクレオチド、合成形態、及びそれらの修飾（例えば、化学的又は生化学的修飾）形態の重合体、並びに混合重合体（例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡサブユニットを含む）を含む。修飾の例としては、メチル化、類似体による天然に存在する１個以上のヌクレオチドの置換、非荷電結合（メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、アミドリン酸エステル、カルバミン酸エステル等）等のヌクレオチド間修飾、懸垂部分（ポリペプチド等）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート剤、アルキル化剤、並びに修飾結合（例えば、α―アノマー核酸等）を含む。また、水素結合及び他の化学的相互作用によって指定された配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣した合成分子も含まれる。典型的には、ヌクレオチド単量体はリン酸ジエステル結合を介して連結できるが、核酸の合成形態は他の結合を含むこともできる（例えば、ニールセン等、Science 254:1497-1500, 1991に記載のペプチド核酸）。核酸は、例えば、染色体若しくは染色体部分、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ重合体、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーであるか、これらを含んでもよい。核酸は、例えば、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であってよく、特定の長さには限定されない。特に断らない限り、特定の核酸配列は明示された全ての配列に加えて相補配列を含む、又はそれらをコードする。
【００２７】
用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２個の核酸単量体単位（例えば、ヌクレオチド）を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には、約６〜約１７５個の核酸単量体単位を含み、より典型的には、約８〜約１００個の核酸単量体単位、更により典型的には、約１０〜約５０個の核酸単量体単位（例えば、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５個以上の核酸単量体単位）を含む。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途を含む多くの因子に依存する。オリゴヌクレオチドは、所望により任意の適切な方法で調製され、その方法としては、限定されないが、既存の、或いは天然の配列の単離、ＤＮＡ複製又は増幅、逆転写、適切な配列のクローニング及び制限消化、又はNarangらのリン酸トリエステル法（Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979）；Brownらのリン酸ジエステル法（Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979）；Beaucageらのジエチルホスホラミダイト法（Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981）；Matteucciらのトリエステル法（J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981）；自動化合成法；或いは米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法による直接的化学合成、又は当業者に公知のその他の方法等が挙げられる。
【００２８】
用語「プライマー」は、一般に、核酸配列にアニーリング、即ちハイブリッド形成をして、十分な条件（緩衝液、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、一価又は二価の塩、温度等）で、プライマーが相補的である核酸の伸長を可能にするオリゴヌクレオチドを指す。
【００２９】
用語「定量ＰＣＲ」は、一般に、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応、定量ポリメラーゼ連鎖反応、又はキネティックポリメラーゼ連鎖反応として知られているＰＣＲ技術を指す。この技術はＰＣＲを用い、標的核酸の増幅と定量を同時に行い、この際、定量は標的核酸にハイブリッド形成した場合のみ検出可能となる蛍光レポーター分子を含む挿入蛍光色素又は配列特異的プローブによって行う。
【００３０】
用語「反応混合物」は、当技術分野の専門家に周知のように本明細書で使用され、１つ以上の標的核酸の増幅に使用される、酵素、緩衝水溶液、塩、プライマー、標的核酸及びヌクレオシド三リン酸等の種々の試薬を含む水溶液を指す。反応混合物は、完全又は不完全な増幅反応混合物のいずれであってもよい。
【００３１】
ＰＣＲ実験における既知の温度較正法の限界を克服する温度較正の方法が本明細書に記載されている。本明細書に従う方法を用いるＨＲＭ実験においては、温度較正物質として二本鎖オリゴヌクレオチドが使用され、マルチウェルプレートの各反応に添加される。二本鎖オリゴヌクレオチド（本明細書では、「温度較正物質」又は「較正物質」とも呼ばれる）はＦＲＥＴ対を担持し、その一方の発光波長を、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解時に検出することができる。次いで、二本鎖オリゴヌクレオチドの検出された融解温度値は、マルチウェルプレートの各ウェルに対して、二本鎖オリゴヌクレオチドのウェル間の融解温度値の差異に基づいて、増幅された特定の標的核酸の融解温度値を補正するために使用される。
【００３２】
本明細書は、ＰＣＲ実験における温度較正の方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：ａ）マルチウェルプレートの各ウェルに、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素を含む試料中の特定の標的核酸を増幅するための反応混合物を供給する工程、ｂ）ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを各ウェルに供給する工程、ｃ）特定の標的核酸を各ウェルで増幅させる工程、ｄ）増幅された特定の標的核酸を各ウェルで融解し、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素からの光の放出を減少させ、二本鎖オリゴヌクレオチドを融解し、ドナー発色団とアクセプター発色団とを空間的に分離することによって、ドナー発色団からの光の放出を増加させる、又はアクセプター発色団からの光の放出を減少させる工程、ｅ）蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素からの光の放出の減少を検出することによって増幅された特定の標的核酸の融解温度値を各ウェルで監視し、ドナー発色団からの光の放出の増加又はアクセプター発色団からの光の放出の減少を検出することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度の値を各ウェルで別々に監視する工程、及びｆ）二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値のウェル間差に基づいて、増幅された特定の標的核酸に対する融解温度値を各ウェルで補正する工程。
【００３３】
一態様では、特定の標的核酸は一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。別の態様では、特定の標的核酸は２つ以上のＳＮＰを含む。ＳＮＰは、異なる試料中の対応する核酸断片間の点変異である。このようなＳＮＰは、同じＳＮＰを示さない別の試料（例えば、参照試料）の対応する断片と比較して、試料に含まれる規定値によって核酸断片の融解温度を変化させる。ＳＮＰの有無で、対応する断片間の融解温度の差は一般に非常に小さく、点変異の種類に依存する。ＳＮＰにより、典型的には、対応する断片間で０．２℃〜１．０℃の融解温度のシフトが起こる。融解温度のシフトは、ｉ）ＳＮＰのクラス１（Ｃ／Ｔ及びＧ／Ａ塩基変化）及びＳＮＰのクラス２（Ｃ／Ａ及びＧ／Ｔ塩基変化）に対して約１．０℃、ｉｉ）ＳＮＰのクラス３（Ｃ／Ｇ塩基変化）に対して約０．５℃、及びｉｉｉ）ＳＮＰのクラス４（Ａ／Ｔ塩基変化）に対して約０．２℃程度である。温度のシフトは、本明細書では、別の試料（例えば、参照試料）中の対応する標的核酸と比較して特定の標的核酸中のＳＮＰの存在を決定するために使用される。
【００３４】
ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内の位置で共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内の位置で共有結合して、第１鎖内の位置と第２鎖内の位置が互いに近接している。ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内の位置で共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内の位置で共有結合して、第１鎖内の位置と第２鎖内の位置が互いに反対の位置にある。ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖の３’末端に共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖の５’末端に共有結合して、第１鎖内の位置と第２鎖内の位置が互いに反対の配置にある。ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖の５’末端に共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖の３’末端に共有結合して、第１鎖内の位置と第２鎖内の位置が互いに反対の配置にある。
【００３５】
一態様では、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内のヌクレオチドに共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内のヌクレオチドに共有結合し、第１鎖内のヌクレオチド及び第２鎖内のヌクレオチドは２つ以下の塩基対によって互いに分離されている。
【００３６】
一態様では、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内のヌクレオチドに共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内のヌクレオチドに共有結合し、第１鎖内のヌクレオチド及び第２鎖内のヌクレオチドは相補的な塩基対を形成する。
【００３７】
特定の態様では、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖の５’末端に共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖の３’末端に共有結合しているか、又はドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖の３’末端に共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖の５’末端に共有結合している。
【００３８】
蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素は当技術分野において周知である。このような蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素としては、例えば、LC Green（登録商標）（Idaho Technology）、EvaGreen（登録商標）（BioRad）がある。特定の態様では、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素は、LightCycler（登録商標）480 Resolight Dyeである。
【００３９】
一態様では、ドナー発色団は、VIC、Hex、Yellow555、Red610、Red640、Texas Red、Rox、Cy5、又はCy5.5等の蛍光色素である。特定の態様では、ドナー発色団はCy5である。
特定の態様では、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素の光の波長及びドナー発色団又はアクセプター発色団の光の波長は互いに分離され、それらの融解温度とは無関係に両方の融解事象の検出が可能となる。このことによる利点は、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素の発光波長及びドナー発色団又はアクセプター発色団の発光波長を、標的核酸及び二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度が同一又は少なくとも非常に近い場合でも識別できるということである。
【００４０】
一態様では、アクセプター発色団は消光剤分子であり、例えば、BlackHole Quenchers（登録商標）（BHQ）（Biosearch Technologies社、カリフォルニア州ノバト）、Iowa Black（登録商標）（Integrated DNA Tech社、アイオワ州コーラルビル）、及びBlackBerry（登録商標）Quencher 650（BBQ-650）（Berry & Assoc.社、ミシガン州デクスター）等が挙げられる。特定の態様では、消光剤分子は、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、及びBHQ-4からなる群から選択される暗消光剤である。より特定の態様では、消光剤分子はBHQ-3である。
【００４１】
一態様では、ドナー発色団は共有結合した蛍光色素であり、アクセプター発色団は共有結合した消光剤分子である。二本鎖オリゴヌクレオチドの２つの相補鎖が互いにハイブリッド形成し、蛍光色素及び消光剤は互いに近接している場合には、蛍光色素に特定の波長を照射すると、蛍光色素から放出されたエネルギー（光）は消光剤分子に移動し、消光剤分子はエネルギーを熱に変換し、蛍光色素から放出される光は全く又はほとんど測定されない。二本鎖オリゴヌクレオチドの２つの相補鎖が融解時に互いに分離されている場合、蛍光色素及び消光剤は互いに空間的に分離されている。この場合、蛍光色素に特定の波長を照射しても、蛍光色素から放出された光は消光剤分子に移動できず、蛍光色素から放出される光の増加を測定することができる。従って、二本鎖オリゴヌクレオチドの２つの相補鎖の融解温度は、蛍光色素から放出された光の増加を測定することによって正確に決定できる。
【００４２】
別の態様では、ドナー発色団は第１の共有結合した蛍光色素及びアクセプター発色団は第２の共有結合した蛍光色素である。二本鎖オリゴヌクレオチドの２つの相補鎖が互いにハイブリッド形成し、第１の共有結合した蛍光色素及び第２の共有結合した蛍光色素が近接している場合には、第１の共有結合した蛍光色素に特定の波長を照射すると、第１の共有結合した蛍光色素から放出されたエネルギー（光）は第２の共有結合した蛍光色素に移動し、蛍光色素はエネルギーを変換し、特定の波長の光が第２の共有結合した蛍光色素から放出される。二本鎖オリゴヌクレオチドの２つの相補鎖が融解する場合は、第１の共有結合した蛍光色素及び第２の共有結合した蛍光色素は互いに空間的に分離されている。この場合には、第１の共有結合した蛍光色素に特定の波長を照射しても、第１の共有結合した蛍光色素から放出される光は第２の共有結合した蛍光色素にもはや移動することはできず、第１の共有結合した蛍光色素から放出される光の増加量及び第２の共有結合した蛍光色素から放出される光の減少量を測定することができる。このように、第１の共有結合した蛍光色素から放出される光の増加量及び／又は第２の共有結合した蛍光色素から放出される光の減少量を測定することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドの２つの相補鎖の融解温度を正確に決定することができる。
【００４３】
一態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度の値の少なくとも一部が、増幅された特定の標的核酸の融解温度の値の少なくとも一部と同一であるように設計される。別の態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度が増幅された特定の標的核酸の融解温度と同一であるように設計される。別の態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度と増幅された特定の標的核酸の融解温度との差が１０℃以下であるように設計される。特定の態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度と増幅された特定の標的核酸の融解温度との差が５℃以下であるように設計される。別の特定の態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度と増幅された特定の標的核酸の融解温度との差が２℃以下であるように設計される。蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素及びドナー発色団を、それらが異なる波長の光を放出するように選択することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドを、標的核酸及び二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度が同一又は少なくとも非常に近くなるように設計することができる。従って、一態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度と増幅された特定の標的核酸の融解温度が同一であるように設計される。
【００４４】
二本鎖オリゴヌクレオチドのドナー発色団（Cy5等）の励起波長及び発光波長は、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素（LightCycler（登録商標）480 Resolight Dye等）の励起波長及び発光波長とは異なる。二本鎖オリゴヌクレオチドの融解は、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素の検出波長とは別の波長範囲で検出することができる。従って、較正物質の融解温度は、標的の融解温度と重なっていてもよい。これにより、両者の融解温度を互いに近接して設計が可能となり、正確に適切な温度に較正することができる。マルチウェルプレートの位置間の温度差はＨＲＭに用いる温度範囲の全域で一定ではないので、二本鎖オリゴヌクレオチド及び標的核酸の同一融解温度の測定値を可能にする較正方法を提供することは特別な利点である。その上、標的核酸の融解温度及び蛍光強度は二本鎖オリゴヌクレオチドから検出される信号に影響しないので、二本鎖オリゴヌクレオチドの信号を隠さない限定された量を生成するために標的核酸の量又はプライマー濃度を最適化する必要がない。
【００４５】
二本鎖オリゴヌクレオチドは、２つの相補鎖、二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖及び二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖から成る。一態様では、第１鎖及び第２鎖の各々が１０〜４０個のヌクレオチドを含む。特定の態様では、第１鎖及び第２鎖の各々が２０〜３０個のヌクレオチドを含む。更に特定の態様では、第１鎖及び第２鎖の各々が２５個のヌクレオチドを含む。
【００４６】
一態様では、第１鎖の５’末端はドナー発色団（Cy5等）に共有結合し、第１鎖の３’末端はリン酸化されている。第２鎖の３’末端は暗消光剤（BHQ-3等）に共有結合している。別の態様では、第２鎖の５’末端はドナー発色団（Cy5等）に共有結合し、第２鎖の３’末端はリン酸化されている。第１鎖の３’末端は暗消光剤（BHQ-3等）に共有結合している。
【００４７】
特定の一態様では、第１鎖（配列番号０１）及び相補的な第２鎖（配列番号０２）は、以下の配列と標識を含む：
配列番号０１     5’-Cy5-TGG GGG TGG GGG TGG GGG TGG GGG T-P-3’
配列番号０２     5’-ACC ACC CCC CCC ACC ACC CCC CCC A-BHQ-3-3’
既に述べたように、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度の値の少なくとも一部が、増幅された特定の標的核酸の融解温度値の少なくとも一部と同じになるように、二本鎖オリゴヌクレオチド（較正物質）を設計するのが有利である。従って、較正物質は、増幅されて分析される標的核酸に依存する任意の配列を含むことができる。配列番号０１及び配列番号０２は、本実施例１〜３の較正物質として適しているとわかっている１つの可能性と考えなければならない。
【００４８】
特定の態様では、ＰＣＲ実験における温度較正方法は、ａ）マルチウェルプレートの各ウェルに、試料中の特定の標的核酸を増幅するための反応混合物を供給する工程であって、前記特定の標的核酸は一塩基多型及びLightCycler（登録商標）480 Resolight Dyeを含む工程、ｂ）二本鎖オリゴヌクレオチドを各ウェルに供給する工程であって、前記蛍光色素Cy5は前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、暗消光剤BHQ-3鎖は前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合し、前記蛍光色素Cy5は前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内のヌクレオチドに共有結合し、暗消光剤BHQ-3鎖が前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内のヌクレオチドに共有結合し、第１鎖内のヌクレオチド及び第２鎖内のヌクレオチドは相補的塩基対を形成する工程、ｃ）特定の標的核酸を各ウェルで増幅させる工程、ｄ）増幅された特定の標的核酸を各ウェルで融解し、LightCycler（登録商標）480 Resolight Dyeからの光の放出を減少させ、二本鎖オリゴヌクレオチドを融解し、蛍光色素Cy5と暗消光剤BHQ-3とを空間的に分離することによって、Cy5からの光の放出を増加させる工程、ｅ）LightCycler（登録商標）480 Resolight Dyeからの光の放出の減少を検出することによって増幅された特定の標的核酸の融解温度値を各ウェルで監視し、前記蛍光色素Cy5からの光の放出の増加を検出することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値を各ウェルで別々に監視する工程、及びｆ）二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値のウェル間差に基づいて、増幅された特定の標的核酸に対する融解温度値を各ウェルで補正する工程を含む。
【００４９】
本明細書は更に、上述のＰＣＲ実験における温度較正を行うためのキットに関し、前記キットは、ａ）試料中の特定の標的核酸配列を増幅するために必要な全ての試薬、ｂ）蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素、ｃ）二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、ドナー発色団が前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、アクセプター発色団が前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合する。一態様では、前記特定の標的核酸は一塩基多型を含む。
【００５０】
一態様では、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内の位置で共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内の位置で共有結合して、第１鎖内の位置と第２鎖内の位置が互いに近接している。特定の態様では、第１鎖内の位置と第２鎖内の位置は、二本鎖オリゴヌクレオチドの互いに反対の位置にある。
【００５１】
特定の態様では、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内のヌクレオチドに共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内のヌクレオチドに共有結合し、第１鎖内のヌクレオチド及び第２鎖内のヌクレオチドは２つ以下の塩基対によって互いに分離されている。
【００５２】
一態様では、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内のヌクレオチドに共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内のヌクレオチドに共有結合し、第１鎖内のヌクレオチド及び第２鎖内のヌクレオチドは相補的な塩基対を形成する。
【００５３】
一態様では、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素の発光波長及びドナー発色団の発光波長は互いに分離される。
特定の態様では、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素は、LightCycler（登録商標）480 Resolight Dyeである。一態様では、ドナー発色団はCy5である。一態様では、アクセプター色素は消光剤分子である。特定の態様では、消光剤分子は、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、及びBHQ-4からなる群から選択される暗消光剤である。より特定の態様では、消光剤分子はBHQ-3である。
【００５４】
本明細書は、上述したようにＰＣＲ実験における温度較正を行うための反応混合物に関し、前記反応混合物は、ａ）標的核酸配列、ｂ）特定の標的核酸配列を増幅するために必要な全ての試薬、ｃ）蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素、及びｄ）二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、ドナー発色団は前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、アクセプター発色団は前記二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合する。一態様では、標的核酸は一塩基多型を含む。
【００５５】
一態様では、標的核酸配列を増殖するために必要な試薬は、緩衝液、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、一価及び二価の塩、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。
一態様で、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内の位置で共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内の位置で共有結合して、第１鎖内の位置と第２鎖内の位置が互いに近接している。特定の態様では、第１鎖内の位置と第２鎖内の位置は、二本鎖オリゴヌクレオチドの互いに反対の位置にある。
【００５６】
一態様では、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内のヌクレオチドに共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内のヌクレオチドに共有結合し、第１鎖内のヌクレオチド及び第２鎖内のヌクレオチドは２つ以下の塩基対によって互いに分離されている。
【００５７】
一態様では、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内のヌクレオチドに共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内のヌクレオチドに共有結合し、第１鎖内のヌクレオチド及び第２鎖内のヌクレオチドは相補的な塩基対を形成する。
【００５８】
一態様では、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素の発光波長及びドナー発色団の発光波長は互いに分離される。
特定の態様では、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素は、LightCycler（登録商標）480 Resolight Dyeである。一態様では、ドナー発色団はCy5である。一態様では、アクセプター色素は消光剤分子である。特定の態様では、消光剤分子は、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、及びBHQ-4からなる群から選択される暗消光剤である。より特定の態様では、消光剤分子はBHQ-3である。
【００５９】
本明細書は更に、上述のようにＰＣＲ実験で温度較正を行う装置について述べる。従って、本明細書は、ＰＣＲ実験における温度較正の方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：ａ）マルチウェルプレートの各ウェルに、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素を含む試料中の特定の標的核酸を増幅するための反応混合物を供給する工程、ｂ）ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを各ウェルに供給する工程、ｃ）特定の標的核酸を各ウェルで増幅させる工程、ｄ）増幅された特定の標的核酸を各ウェルで融解し、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素からの光の放出を減少させ、二本鎖オリゴヌクレオチドを融解し、ドナー発色団とアクセプター発色団とを空間的に分離することによって、ドナー発色団からの光の放出を増加させる、又はアクセプター発色団からの光の放出を減少させる工程、ｅ）蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素からの光の放出の減少を検出することによって増幅された特定の標的核酸の融解温度値を各ウェルで監視し、ドナー発色団からの光の放出の増加又はアクセプター発色団からの光の放出の減少を検出することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値を各ウェルで別々に監視する工程、及びｆ）二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値のウェル間差に基づいて、増幅された特定の標的核酸に対する融解温度値を各ウェルで補正する工程。一態様では、標的核酸は、一塩基多型を含む。
【００６０】
一態様では、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内の位置で共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内の位置で共有結合して、第１鎖内の位置と第２鎖内の位置が互いに近接している。特定の態様では、第１鎖内の位置と第２鎖内の位置は、二本鎖オリゴヌクレオチドの互いに反対の位置にある。
【００６１】
特定の態様では、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内のヌクレオチドに共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内のヌクレオチドに共有結合し、第１鎖内のヌクレオチド及び第２鎖内のヌクレオチドは２つ以下の塩基対によって互いに分離されている。
【００６２】
一態様では、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖内のヌクレオチドに共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖内のヌクレオチドに共有結合し、第１鎖内のヌクレオチド及び第２鎖内のヌクレオチドは相補的な塩基対を形成する。
【００６３】
一態様では、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素の発光波長及びドナー発色団の発光波長は互いに分離される。
特定の態様では、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素は、LightCycler（登録商標）480 Resolight Dyeである。一態様では、ドナー発色団はCy5である。一態様では、アクセプター色素は消光剤分子である。特定の態様では、消光剤分子は、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、及びBHQ-4からなる群から選択される暗消光剤である。より特定の態様では、消光剤分子はBHQ-3である。
【００６４】
本明細書は、更に、上述のような方法を実行するためのコンピュータプログラムに関する。従って、本明細書は、ＰＣＲ実験における温度較正の方法を実行するためのコンピュータプログラムに関し、本方法はａ）マルチウェルプレートの各ウェルに、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素を含む試料中の特定の標的核酸を増幅するための反応混合物を供給する工程、ｂ）ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖に共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第２鎖に共有結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを各ウェルに供給する工程、ｃ）特定の標的核酸を各ウェルで増幅させる工程、ｄ）増幅された特定の標的核酸を各ウェルで融解し、蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素からの光の放出を減少させ、二本鎖オリゴヌクレオチドを融解し、ドナー発色団とアクセプター発色団とを空間的に分離することによって、ドナー発色団からの光の放出を増加させる、又はアクセプター発色団からの光の放出を減少させる工程、ｅ）蛍光性非共有結合二本鎖ＤＮＡ結合色素からの光の放出の減少を検出することによって増幅された特定の標的核酸の融解温度値を各ウェルで監視し、ドナー発色団からの光の放出の増加又はアクセプター発色団からの光の放出の減少を検出することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値を各ウェルで別々に監視する工程、及びｆ）二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値のウェル間差に基づいて、増幅された特定の標的核酸に対する融解温度値を各ウェルで補正する工程を含む。一態様では、特定の標的核酸は、一塩基多型を含む。
【００６５】
二本鎖オリゴヌクレオチド（較正物質）の最適設計、配列及び標識化を決定し、本明細書に記載の本発明の最大限の利点を達成すべきである。特に較正物質の次の特性は従来技術に比べて有利である。
ａ）位置間の温度差は分析する標的の温度に依存するので、較正物質のＴｍは典型的な標的核酸のＴｍと同程度である必要がある。
ｂ）標的の増幅効率を阻害しない。これは較正物質の存在によって全く影響を受けないＰＣＲ解析から客観的な結果を得るために重要である。
ｃ）標的核酸及び較正物質の融解曲線形状の干渉を低減させるために蛍光性非共有結合ＤＮＡ結合色素と較正物質との発光波長の重なりを最小にする。
ｄ）較正物質のＴｍの信頼できる読み出し値を得るのに十分な融解信号強度を発生する。
【００６６】
実施例１〜３は、本明細書の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。改良は本発明の精神から逸脱することなく記載された手順で行うことができる。
【実施例】
【００６７】
実施例１
較正物質の設計
較正物質は、２つの２５量体の相補鎖で構成されている。一方の鎖の５’末端は蛍光色素Cy5で標識され、３’末端はリン酸化されている。他方の鎖の３’末端は暗消光剤BHQ-3（Biosearch Technologies社）で標識されている。
配列番号０１    5’-Cy5-TGG GGG TGG GGG TGG GGG TGG GGG T-P-3’
配列番号０２    5’-ACC ACC CCC CCC ACC ACC CCC CCC A-BHQ-3-3’
以下に示す実験は、各々、本明細書の較正物質を使用する場合と使用しない場合の両方で行われる。
実施例２
熱較正されていないＰＣＲブロックでの較正物質使用による温度分解能の改善
２つの一塩基多型（ＳＮＰ）領域を２ｎｇヒトのゲノムＤＮＡ（異なるヒト血液試料から精製）から増幅した。
ADD1遺伝子領域を、以下のプライマー配列を用いて増幅した。
配列番号０３    5’-GAT GGC TGA ACT CTG GC-3’
配列番号０４    5’-CGA CTT GGG ACT GCT TC-3’
Cyp2C9遺伝子領域を、以下のプライマー配列を用いて増幅した。
配列番号０５    5’-CGT TTC TCC CTC ATG ACG-3’
配列番号０６    5’-TCA GTG ATA TGG AGT AGG GTC-3’
以下のＰＣＲ及び融解の手順をLightCycler（登録商標）９６リアルタイムＰＣＲ機器（Roche Applied Science社の試作装置）を用いて実施した。
【００６８】
【表１】
0006389473.tif 000002
【００６９】
観察された結果：図１から明らかに分かるように、未較正ＰＣＲブロックで本明細書の較正物質を使用しない場合は、６種の異なる遺伝子型を識別することはできない。しかしながら、本明細書の較正物質を実験に導入した場合には、未較正ＰＣＲブロックでも６種の群の明確な識別が可能である（図２）。
実施例３
事前に熱較正したＰＣＲブロックで較正物質の使用により改良された温度分解能
１つの一塩基多型（ＳＮＰ）領域を８８の異なるヒトのゲノムＤＮＡ（異なるヒト血液試料から精製）から増幅した。
TNFα遺伝子領域を、以下のプライマー配列を用いて増幅した。
配列番号０７    5’-GGG CTA TGG AAG TCG AGT A-3’
配列番号０８    5’-CGT CCC CTG TAT CCA TAC C-3’
以下のＰＣＲ及び融解の手順をLightCycler（登録商標）９６リアルタイムＰＣＲ機器（Roche Applied Science社の試作装置）を用いて実施した。
【００７０】
【表２】
0006389473.tif 000003
【００７１】
観察された結果：図３から明らかに分かるように、事前較正済のＰＣＲブロックで本明細書の較正物質を使用しない場合は、６種の異なる遺伝子型を明確には識別することはできない。しかしながら、本明細書の較正物質を実験に導入した場合には、事前較正済のＰＣＲブロックで６種の群の明確な識別が可能である（図４）。事前較正済のＰＣＲブロックを有する機器で実験を行った場合でも、本明細書の較正物質は異なった遺伝子型間の識別を改良することをこの実験は示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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