(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号９によって表され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号１０によって表される、ヒトタウに結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号１によって表され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号２によって表される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子および配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、
前記細胞が、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含むモノクローナル抗体を発現する能力を有する、哺乳動物細胞。
【請求項５】
請求項３に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含むモノクローナル抗体を発現する能力を有する、哺乳動物細胞。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含むモノクローナル抗体を産生するためのプロセスであって、前記プロセスが、前記モノクローナル抗体が発現されるような条件下で請求項４および５のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞を培養するステップと、発現されたモノクローナル抗体を回収するステップとを含む、プロセス。
【請求項７】
請求項６に記載のプロセスによって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項１〜２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体および１種または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
療法における使用のための、請求項１〜２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
アルツハイマー病、進行性核上性麻痺およびピック病からなる群から選択される疾患の治療における使用のための、請求項１〜２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
アルツハイマー病、進行性核上性麻痺またはピック病の治療のための薬物の製造における使用のための、請求項１〜２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の分野に属する。具体的には、本発明は、タウに対する抗体、こうしたタウ抗体を含む組成物、ならびにアルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、およびピック病（ＰＤ）を含めた神経変性疾患の治療のためにこうしたタウ抗体を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タウは、微小管重合および安定性を促進する軸索微小管結合タンパク質である。ＡＤおよびＰＳＰは、異常性のタウ凝集によって病理学的に特徴づけられる神経変性疾患である。より具体的には、ＡＤおよびＰＳＰにおいて、過リン酸化タウは、微小管不安定化、および神経毒性に繋がる不溶性のタウ線維凝集を促進すると考えられている。細胞培養およびマウスモデル調査は、タウ凝集体形成を含め、タウ凝集体が神経細胞のシナプス接合部全体に広がりかつ単量体の（未変性または非凝集性の）タウを隔離することを示している。タウ凝集の神経解剖学的進行およびＡＤおよびＰＳＰなどの神経変性疾患における蓄積は、タウ線維凝集が神経回路網に沿って伝播し、最終的に微小管の不安定化および最終的に局在化した障害のある神経機能をもたらすことを示唆する。
【０００３】
タウ凝集の密度および神経解剖学的局在化は、ＡＤおよびＰＳＰ神経症状ならびに疾患進行と相互に強く関連がある。例えば、ＡＤにおいて、タウは、トランス嗅内（ｔｒａｎｓｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ）から、辺縁系、新皮質領域の順に発症する傾向があり、かつ認知症の重症度および神経細胞脱落の程度と相互に関連する、神経細胞内神経原線維変化（ＮＦＴ）を形成する。ＰＳＰにおいて、タウ凝集は、皮質下および皮質領域内の神経細胞、星状膠細胞、および乏突起膠細胞において見られ、かつ凝集性タウの密度は、神経細胞脱落の重症度と相互に関連することが示されている。
【０００４】
タウに対する抗体は公知である。例えば、特許文献１、ならびに特許文献２、特許文献３、および特許文献４は、タウに対する抗体およびＡＤなどの神経変性疾患の治療のためのタウ抗体の使用を開示している。しかしながら、これまで治療用途のために承認されているタウを標的とする抗体は無くかつＡＤまたはＰＳＰのための承認された疾患修飾療法は現在無い。したがって、代替のタウ抗体の必要性は依然として存在する。具体的には、タウ凝集体に特異的に結合しかつタウ凝集体形成、ＮＦＴ形成および神経細胞脱落の伝播を減少する代替のタウ抗体の必要性は依然として存在する。こうしたタウ抗体は、好ましくは開発、製造、および／または製剤を容易にするために良好な物理化学的特性も有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８，９２６，９７４号
【特許文献２】国際公開第２０１１／０２６０３１号
【特許文献３】国際公開第２０１２／０４９５７０号
【特許文献４】国際公開第２０１３／０５０５６７号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒトタウに結合しかつ軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）が相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含みかつ重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）がＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含むモノクローナル抗体を提供する。本発明の特定の実施形態によればＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号３によって与えられ、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４によって与えられ、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号５によって与えられ、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６によって与えられ、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７によって与えられ、かつＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８によって与えられる。一実施形態において、本発明は、ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号９によって与えられかつＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号１０によって与えられる、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、ヒトタウに結合するモノクローナル抗体を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列が、配列番号１によって与えられかつ重鎖（ＨＣ）のアミノ酸配列が、配列番号２によって与えられる、ＬＣおよびＨＣを含む、ヒトタウに結合するモノクローナル抗体を提供する。
【０００７】
本発明は、ヒトタウに結合するモノクローナル抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、ヒトタウの立体構造エピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。特定の実施形態において、ヒトタウの立体構造エピトープには、ヒトタウのアミノ酸配列が配列番号１３によって与えられる、ヒトタウのアミノ酸残基７〜９および３１２〜３２２が含まれる。
【０００８】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体および１種または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。さらに、本発明は、本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含むＡＤ、ＰＳＰ、またはＰＤを治療する方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、神経変性疾患を治療する方法を提供する。より詳細には、本発明は、有効量の本発明のモノクローナル抗体をそれを必要とする患者に投与することを含むＡＤ、ＰＳＰ、またはＰＤを治療する方法を提供する。
【００１０】
本発明は、療法における使用のための本発明のモノクローナル抗体も提供する。より詳細には、本発明は、ＡＤ、ＰＳＰ、またはＰＤの治療における使用のための本発明のモノクローナル抗体も提供する。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、ＡＤ、ＰＳＰ、またはＰＤの治療のための薬物の製造における本発明のモノクローナル抗体の使用を提供する。
【００１２】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸分子および発現ベクターにも関する。一実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。特定の実施形態において配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１によって与えられかつ配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２によって与えられる。
【００１３】
さらに、本発明は、プロセスに従って調製されたモノクローナル抗体であって、前記プロセスが、モノクローナル抗体が発現されるような条件下で、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養するステップ、ならびにＬＣのアミノ酸配列が、配列番号１によって与えられかつＨＣのアミノ酸配列が、配列番号２によって与えられる、ＬＣおよびＨＣを含むモノクローナル抗体を前記宿主細胞から回収するステップを含む、モノクローナル抗体を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書で使用する場合、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続した２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む免疫グロブリン分子である。それぞれのＬＣおよびＨＣのアミノ末端部分には、その中に含まれるＣＤＲによって抗原認識の主な責任を負う約１００〜１２０のアミノ酸の可変領域が含まれる。ＣＤＲには、より保存された、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる領域が点在する。それぞれのＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序で配列された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＬＣの３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と呼ばれかつＨＣの３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原との特異的な相互作用を形成する残基の大部分を含有する。特定の抗原に結合する抗体の機能的能力は、６つのＣＤＲによって大きく影響される。本発明の抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割当ては、周知のＫａｂａｔ番号付け規約（Ｋａｂａｔら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２〜９３（１９７１年）、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１年））、およびＮｏｒｔｈ番号付け規約（Ｎｏｒｔｈら、Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＤＲ  Ｌｏｏｐ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４０６：２２８〜２５６（２０１１年））に基づく。
【００１５】
ＬＣは、それぞれ当技術分野において知られているように特定の定常領域によって特徴付けられる、カッパまたはラムダに分類される。本発明のモノクローナル抗体には、カッパＬＣが含まれる。ＨＣは、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類されかつ抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとして定義する。本発明のモノクローナル抗体には、ＩｇＧ  ＨＣが含まれる。ＩｇＧ抗体は、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４にさらに分割され得る。特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ４である。それぞれのＨＣのカルボキシ末端部は、エフェクター機能の主な責任を負う定常領域を画定する。特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、エフェクター機能を減少するそれぞれのＨＣの定常領域における１つまたは複数の修飾を有する。より特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ４でありかつ残基２３０および２３１（例示した配列番号２のＨＣに基づく残基番号付け）の両方におけるアミノ酸アラニンを含めたエフェクター機能を減少する両方のＨＣの定常領域における修飾を有する。さらにより特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ４でありかつ残基２３０および２３１の両方におけるアミノ酸アラニンを含めたエフェクター機能を減少する両方のＨＣの定常領域における修飾を有しかつ残基２２４におけるアミノ酸プロリンおよび残基４４３（例示した配列番号２のＨＣに基づく残基番号付け）におけるアミノ酸リジンの欠失を含めた安定性を促進する両方のＨＣの定常領域におけるさらなる修飾を有する。
【００１６】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）である。本発明のためのｍＡｂは、２つのＨＣおよび２つのＬＣを含有する完全なｍＡｂである。本明細書でいう、ｍＡｂは、例えば、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含めた単一コピーまたはクローンから導かれる抗体であり、かつそれが産生される方法ではない。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ技術、組み換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、例えば、ＣＤＲグラフティング、あるいはこうした技術または当技術分野において公知の他の技術の組み合わせによって産生され得る。
【００１７】
抗体を産生および精製する方法は、当技術分野において周知でありかつ、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、５〜８章および１５章、ＩＳＢＮ０−８７９６９−３１４−２において見つかる。例えば、マウスは、ＡＤを有すると特徴付けられる患者の脳組織からのヒトタウ対らせん状細線維（「ＰＨＦ」）で免疫化することができ（Ｊｉｃｈａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、１５：４８（２）、１２８〜１３２（１９９７年４月））、かつ得られる抗体は、回収、精製され、および当技術分野において周知の従来の方法を用いてアミノ酸配列が決定され得る。本発明のモノクローナル抗体は、非ヒト抗体由来のＣＤＲを囲繞する１つまたは複数のヒトフレームワーク領域を含有するために改変される。ヒトフレームワーク生殖系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＮＧＴ）からそのウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒを通して、またはＭａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  ＬｅｆｒａｎｃおよびＧｅｒａｒｄ  ＬｅｆｒａｎｃによるＴｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年、ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から取得してよい。本発明の特定の実施形態によれば、本発明のモノクローナル抗体において使用するための特定の生殖系列ＨＣフレームワークおよびＬＣフレームワーク領域には、それぞれ５−５１およびＡ２７が含まれる。
【００１８】
本発明の特定の実施形態において、抗体、またはそれをコードする核酸は、単離された形態で提供される。本明細書で使用する場合、「単離された」と言う語は、細胞環境において見つかる他の高分子種を含まないまたは実質的に含まないタンパク質、ペプチド、または核酸を指す。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、公知の方法を用いて調製および精製してよい。例えば、ＨＣ（例えば配列番号２によって与えられるアミノ酸配列）およびＬＣ（例えば、配列番号１によって与えられるアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡ配列は、ＧＳ（グルタミンシンセターゼ）発現ベクター内にクローン化および改変してよい。改変された免疫グロブリン発現ベクターは、次いでＣＨＯ細胞内に安定にトランスフェクトしてよい。当業者なら理解するであろうように、哺乳動物の抗体の発現は、典型的にはＦｃ領域内の高度に保存されたＮ−グリコシル化部位における、グリコシル化を生じるであろう。安定クローンは、タウ凝集体に特異的に結合する抗体の発現について検証してよい。陽性クローンは、バイオリアクターにおける抗体産生のための無血清培養培地内に拡大してよい。その中に抗体が分泌されている、培地は、従来技術によって精製してよい。例えば、培地は、リン酸緩衝食塩水などの、適合した緩衝液で平衡化されているプロテインＡまたはＧセファロースＦＦカラムに好都合に適用してよい。カラムは、非特異的な結合成分を除去するために洗われる。結合した抗体は、例えば、ｐＨグラジエントによって溶離されかつ抗体画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって、検出され、かつ次いでプールされる。抗体は、一般的な技術を用いて濃縮および／または除菌ろ過してよい。可溶性凝集体およびマルチマーは、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含めた、一般的な技術によって有効に除去してよい。産生物は、例えば−７０℃で、直ちに凍結するか、または凍結乾燥してよい。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体は、患者の治療において用いてよい。より詳細には本発明の抗体は、ＡＤ、ＰＳＰ、およびＰＤを含む、タウオパチーと呼ばれる、神経変性障害の類を治療することが予期される。本発明のモノクローナル抗体は、ＡＤ、ＰＳＰ、およびＰＤの治療において有用と期待されているが、こうした抗体は、慢性外傷性脳症を含めた、他のタウオパチーの治療においても有用で有り得る。本明細書において区別なく用いられる場合、「治療」および／または「治療すること」および／または「治療する」は、本明細書に記載される障害の進行を遅らせる、中断する、抑える、制御する、停止する、または逆転することが有り得る全てのプロセスを指すことが意図されるが、全ての障害症状の全体的な解消は必ずしも示さない。治療には、タウ凝集体形成、ＮＦＴ形成および神経細胞脱落の少なくとも１つの伝播の減少から恩恵を受けるであろうヒトにおける疾患または状態の治療のための本発明の抗体の投与が含まれ、かつ（ａ）疾患のさらなる進行を阻害すること、すなわちその発病を抑えること、ならびに（ｂ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患または障害の退行を生じさせることあるいはその症状または合併症を緩和することが含まれる。
【００２１】
本明細書において区別なく用いられる場合、「患者」、「対象」、および「個人」と言う語は、ヒトを指す。特定の実施形態において、患者は、タウ凝集体形成、ＮＦＴ形成、および神経細胞脱落の少なくとも１つの伝播の減少から恩恵を受けるであろう疾患、障害、または状態（例えば、神経変性障害）でさらに特徴付けられる。別の実施形態において、患者は、タウ凝集体形成、ＮＦＴ形成、および神経細胞脱落の少なくとも１つの伝播の減少から恩恵を受けるであろう神経変性の障害、疾患、または状態を発症するリスクがあるとさらに特徴付けられる。
【００２２】
本明細書で使用する場合、タウに「結合する」と言う語は、ヒトタウ凝集体のエピトープとの抗体の相互作用を指す。より好ましくは、エピトープは、ヒトタウの立体構造エピトープである。特定の実施形態において、タウに「結合する」と言う語は、ヒトタウ凝集体のアミノ酸残基７〜９および３１２〜３２２（例示した配列番号１３のヒトタウに基づく残基番号付け）を含めた立体構造エピトープとの相互作用を指す。例えばスプライス変異型から生じる、ヒトタウタンパク質の既知の変異型があることを理解すべきである。こうした既知の変異型は、しかしながら、配列番号１３のアミノ酸残基７〜９および３１２〜３２２を含めた立体構造エピトープを有する。既知の変異型は、しかしながら、配列番号１３のアミノ酸残基７〜９および３１２〜３２２について変更された残基番号付けをもたらし得る。残基番号付けは、一部の変異型において変更され得るが、エピトープを含むアミノ酸は、同じままである。「エピトープ」と言う語は、本明細書で使用する場合本発明のモノクローナル抗体によって認識される抗原の分離した、３次元の部位を指す。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法によって調製してよくかつ本発明のモノクローナル抗体ならびに１種または複数の薬学的に許容可能な担体（１種または複数）および／または希釈剤（１種または複数）を含む医薬組成物に組み込んでよい（例えば、医師に一般に公知の製剤技術の概論を提供する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版、Ｌｏｙｄ  Ｖ．編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、２０１２年）。医薬組成物のために適した担体には、本発明のモノクローナル抗体と組み合わせられた場合に、分子の活性を維持しかつ患者の免疫システムと非反応性である、任意の材料が含まれる。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体を含む医薬組成物は、非経口経路（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｒｏｕｔｅｓ）（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または経皮的）によって本明細書に述べるような疾患または障害の、リスクがある、または示している患者に投与してよい。本発明の医薬組成物は、本明細書において区別なく用いられるような、本発明のモノクローナル抗体の「有効」または「治療的有効」量を含有する。有効量は、所望の治療結果を達成するために（用量でおよび投与の期間のためおよび手段のために）必要な量を指す。モノクローナル抗体の有効量は、個人の疾患の状態、年齢、性別、および体重、ならびに個人において所望の反応を引き出すモノクローナル抗体の能力などの因子に従って変わり得る。有効量は、治療的に有益な効果が、本発明のモノクローナル抗体のいかなる毒性または有害作用にも上回る量でもある。
【００２５】
改変されたタウ抗体
本発明のモノクローナルタウ抗体を構築するときに化学的および物理的安定性と関連する重大な問題に直面した。直面した問題には、低い結合親和性、免疫原性、凝集、ＨＣ二量化、ならびに可変領域脱アミド、酸化、異性化およびミスフォールディングが含まれた。
【００２６】
例えば、アミノ酸残基７〜９および３１２〜３２２（例示した配列番号１３のアミノ酸配列を有するヒトタウタンパク質に基づく残基番号付け）におけるタウタンパク質の立体構造エピトープを認識する、マウスＩｇＧ１抗体ＭＣ−１（「ＭＣ−１」）（アルベルトアインシュタイン医学校、Ｊｉｃｈａら、１９９７年）は、当初３つのＭＣ−１マウスＨＣ  ＣＤＲを複数のヒトＨＣフレームワーク生殖系列遺伝子におよび３つのＭＣ−１マウスＬＣ  ＣＤＲを複数のヒトＬＣフレームワーク生殖系列遺伝子に改変することによってヒト化された。ＭＣ−１のヒト化構築物は、１２個のＨＣフレームワーク生殖系列ファミリーのそれぞれ（特異的なヒトＨＣフレームワーク：１−２４、１−４６、１−６９、２−０５、３−１５、３−２３、３−５３、３−７２、４−０４、４−３９、５−５１、および６−０１）および８個のＬＣ生殖系列ファミリーのそれぞれ（特異的なヒトＬＣフレームワーク：Ａ−２６、Ａ−２７、Ｂ−２、Ｂ−３、Ｌ−２、Ｌ−１２、Ｏ１１、およびＯ−２）に相当する、重鎖および軽鎖フレームワークの９６個の異なる組み合わせを利用した。それぞれのフレームワーク生殖系列遺伝子は、重鎖および軽鎖ヒトＩｇＧ４発現ベクター内にクローン化されかつ発現およびＥＬＩＳＡによる結合の解析のためにＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトされた。複数のフレームワーク対は、ＥＬＩＳＡにおいてヒトタウへの結合のいくらかのレベルを実証したが、得られる抗体構築物は、乏しい結合親和性、凝集、ＨＣ二量化、ならびに可変領域における脱アミド、酸化、および異性化などの化学安定性の問題を含めた無数の問題を示した。
【００２７】
修飾は、したがって改善された結合親和性、解消されたまたは低減されたＨＣ二量化、低減された免疫原性、および改善された化学的および物理的安定性を有するタウ抗体を開発するために改変された。アミノ酸修飾（ＭＣ−１に対して、Ｊｉｃｈａら、１９９７年）は、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３において改変された。修飾されたマウス抗体は、３つのＨＣ  ＣＤＲを複数のヒトＨＣフレームワーク生殖系列遺伝子内におよび３つのＬＣ  ＣＤＲを複数のヒトＬＣフレームワーク生殖系列遺伝子に本質的に上述した通りに改変することによってヒト化された。さらに、広範なタンパク質安定性調査が実行されかつ改変されたモノクローナル抗体は、発現および熱安定特性ならびに結合親和特性についてスクリーニングされた。７個のＣＤＲ突然変異体（アミノ酸部分は、表１に示された例示した本発明の抗体の直鎖のアミノ酸残基番号付けに基づく：Ｎ６１ＥおよびＥ６２ＫにおけるＨＣＤＲ２；Ｐ１０３ＶおよびＹ１０５ＤにおけるＨＣＤＲ３；Ｇ３４ＱにおけるＬＣＤＲ１；Ｓ５７ＤにおけるＬＣＤＲ２；およびＨ９８ＬにおけるＬＣＤＲ３）を含有するモノクローナル抗体は、結合親和性、化学的および物理的安定性、ならびに本発明のモノクローナル抗体についての免疫原性（ＭＣ−１に対して、Ｊｉｃｈａら、１９９７年）を改善すると確認された。上記の修飾はいずれもＭＣ−１またはヒト化ＭＣ−１抗体構築物の特性決定においては確認されなかった。
【００２８】
例示した本発明の改変されたタウモノクローナル抗体は、表１に示される。例示した改変されたタウモノクローナル抗体には、ヒトＨＣフレームワーク５−５１およびヒトＬＣフレームワークＡ２７が含まれる。例示した改変されたタウモノクローナル抗体の種々の領域の関係は、次の通りである（アミノ酸の番号付けは、直線的番号付けを適用する；可変ドメインへのアミノ酸の割り当ては、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能なＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）に基づく；ＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知のＫａｂａｔ番号付け規約に基づくＨＣＤＲ２を除いて、周知のＮｏｒｔｈ番号付け規約に基づく）。
【表１】
0006431615.tif 000002
【００２９】
次の実施例およびアッセイは、本発明のモノクローナル抗体が、ＡＤ、ＰＳＰ、またはＰＤなどのタウ凝集体の伝播と関連する神経変性障害の治療のために有用であることを実証する。しかしながら、次の実施例は、限定ではなく例証の目的で記載され、かつ種々の変更が当業者によってなされ得ることが理解されるべきである。
【実施例】
【００３０】
改変されたタウ抗体の発現
本発明の改変されたタウモノクローナル抗体は、本質的に以下の通りに発現させ精製してよい。配列番号１１のＤＮＡ配列（配列番号１のＬＣアミノ酸配列をコードする）および配列番号１２のＤＮＡ配列（配列番号２のＨＣアミノ酸配列をコードする）を含有するグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）発現ベクターを、電気穿孔法によってチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）をトランスフェクトするために用いる。発現ベクターは、ＳＶ早期（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳのための遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯ細胞によって必要とされるアミノ酸、グルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクト後、細胞は、５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を用いるバルク選択（ｂｕｌｋ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を受ける。ＭＳＸによるＧＳの阻害を、選択の厳重さを増加するために利用する。宿主細胞ゲノムの転写活性領域への発現ベクターｃＤＮＡの組み込みを有する細胞は、内因性レベルのＧＳを発現する、ＣＨＯ野生型細胞に対抗して選択され得る。トランスフェクトしたプールを、低密度で平板培養して安定発現細胞のクローン性に近い増殖（ｃｌｏｓｅ−ｔｏ−ｃｌｏｎａｌ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を可能にさせる。マスターウェルを、抗体発現についてスクリーニングし次いで産生に用いるために血清を含まない、懸濁培養液中で拡大する。抗体がその中へ分泌されている、浄化した培地を、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）などの適合した緩衝液で平衡化したプロテインＡ親和性カラムに適用する。カラムを、非特異的な結合成分を除去するために１Ｍ  ＮａＣｌで洗う。結合したタウモノクローナル抗体を、例えば、クエン酸ナトリウムでｐＨ（約）３．５で溶離して画分を１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液で中和する。タウモノクローナル抗体画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析用サイズ排除などによって、検出し次いでプールする。可溶性凝集体およびマルチマーは、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含めた、一般的な技術によって有効に除去してよい。本発明のタウモノクローナル抗体を、一般的な技術を用いて濃縮および／または除菌ろ過する。これらのクロマトグラフィーステップ後のタウモノクローナル抗体の純度は、９５％より大きい。本発明のタウモノクローナル抗体は、−７０℃で直ちに凍結または数か月間４℃で貯蔵してよい。
【００３１】
結合キネティクスおよび親和性
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００計器（ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニング緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋３ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０５％界面活性剤Ｐ２０）で２５℃で準備）で測定する、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを、実施例１の例示したタウモノクローナル抗体のヒト単量体（例えば、未変性または非凝集性）タウおよびヒトタウ凝集体（共に配列番号１３に記述されているようなアミノ酸配列を有する）の両方への結合を測定するために用いる。ヒト化ＭＣ−１抗体構築物（フレームワークの組み合わせ：５−５１重鎖、Ａ２７軽鎖を有する）のヒト単量体タウおよびヒトタウ凝集体への結合を、同一の手法で測定する。
【００３２】
記述がない限り、全ての試薬および材料は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＡＢ（ウプサラ、スウェーデン）からである。捕捉方法論を採用するために全４つのフローセル（ＦＣ）上の（標準のＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを用いて生成した）固定化したプロテインＡを含有するＣＭ５チップを用いる。抗体試料を、ランニング緩衝液への希釈によって０．５μｇ／ｍＬで調製する。単量体タウおよび線維タウを、ランニング緩衝液への希釈によって２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３、７．８２、３．９１、１．９５、および０（ブランク）ｎＭの濃度に調製する。それぞれの解析サイクルは、（１）別個のフローセル（ＦＣ２、ＦＣ３、およびＦＣ４）上への抗体試料の捕捉、（２）５０μＬ／分の速度でそれぞれのＦＣ上の２５０μＬ（３００秒）の単量体タウまたは線維タウ凝集体の注入、（３）解離相を観測するために２０分間の緩衝液流への戻し、（４）グリシン、ｐＨ１．５の２５μＬ（３０秒）注入でのチップ表面の再生、（５）ＨＢＳ−ＥＰ＋の５０μＬ（６０秒）注入でのチップ表面の平衡からなる。
【００３３】
タウ凝集体への結合のデータは、標準的な二重参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）を用いて処理してＢｉａｃｏｒｅ  ２０００評価ソフトウェア、バージョン４．１を用いて１：１結合モデルに適合させ、会合速度（ｋｏｎ、Ｍ−１ｓ−１単位）、解離速度（ｋｏｆｆ、ｓ−１単位）およびＲｍａｘ（ＲＵ単位）を決定してよい。平衡解離定数（ＫＤ）は、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎの関係から計算し、モル単位である。単量体タウへの結合のデータは、急速な会合および解離速度が原因で上述のようにＳＰＲによって正確決定できない。したがって、単量体タウへの結合についてのＫＤは、抗原の濃度対反応単位をプロットすることから定常状態結合フィットモデル（ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｉｔ  ｍｏｄｅｌ）を用いて得られる。得られる結合データを表２に示す。
【表２】
0006431615.tif 000003
【００３４】
表２に示した結果は、実施例１のタウモノクローナル抗体が、（急速な会合および解離速度が原因で）親和性値がＢｉａｃｏｒｅ解析によって正確に決定できないような単量体タウへの測定可能な結合を有さないことを実証する。逆に、表２に示した結果は、実施例１のタウモノクローナル抗体が、ヒト化ＭＣ−１抗体構築物と比較してタウ凝集体への改善された親和性を有することを実証する。
【００３５】
酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ  Ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）を、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のＡＤ脳ホモジネートからの凝集体タウ線維への相対的な結合親和性を決定するために用いる。ＡＤ脳ホモジネートは、ＡＤ患者の脳からの約８０ｇの皮質から調製する。簡単に言うと、緩衝液（ＴＢＳ／１ｍＭ  ＰＭＳＦ／１Ｘ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、製品番号（ｐ／ｎ．）１１  ６９７  ４９８  ００１）およびホスファターゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、製品番号７８４２８））を、約１０ｍｌ／１ｇ（組織）でＡＤ脳組織に加える。組織を、手持ち式Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎを用いてスピード６〜７で均質化する。組織を、次いでＰａｒｒ  Ｂｏｍｂ（Ｐａｒｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、製品番号４６５３）を用いて１５００ｐｓｉの窒素において３０分間さらに均質化する。ホモジネートを、２８，０００ｇで（Ｊ１４  Ｂｅｃｋｍａｎローター）４℃で３０分間回転する。上清を収集し、プールしてより大きいデブリを除去するためにＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４００  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗの４ｃｍ高さのガードカラム上を流し、次いでＭＣ１に結合しているタウ線維を精製するために、１時間当たり５０〜６０ｍｌの流速で２５ｍｌのＭＣ１−Ａｆｆｉｇｅｌ  １０カラム上を流す。精製の回収を最大化するために、上清を、ＭＣ−１カラムを通して４℃で１８〜２０時間掛けて再循環する。ガードカラムを除去してＭＣ１カラムをＴＢＳで少なくとも４０カラム体積で洗う。結合したタウ凝集体を、次いで２カラム体積の３Ｍ  ＫＳＣＮで溶離して、約１ｍｌ画分内で収集する。それぞれの溶離した画分におけるタンパク質濃度を、マイクロタイタープレートＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって確認する。陽性タンパク質レベルを含有する画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋ）を用いて４℃で約２ｍｌに濃縮し、１リットルのＴＢＳに対してＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（１０Ｋ  ＭＷＣＯ３〜１２ｍｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて一晩透析する。ＡＤ脳ホモジネートから精製したタウ線維内のタウの濃度を、ＤＡ−９捕捉抗体およびＣＰ２７検出抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。
【００３６】
ＰＢＳ中の精製したタウ線維（５０μｌ）を、９６ウェルプレート（Ｃｏａｓｔａｒ、製品番号３６９０）のウェル上に０．７μｇ／ｍｌの総タウに相当する濃度でコートする。プレートを、４℃で一晩インキュベートし、次いで１５０μｌのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗い、１００μｌのＢＢ３（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、製品番号６４３）内に室温で少なくとも１時間（通常２時間）ブロッキングする。ブロッキング後、ブロッキング緩衝液をウェルから除去する。例示した実施例１のタウモノクローナル抗体およびヒト化ＭＣ−１抗体構築物（フレームワーク組み合わせ：５−５１重鎖、Ａ２７軽鎖を有する）を、１０００ｎＭストックまで０．２５％カゼイン緩衝剤に希釈し、次いで２倍希釈で連続的に２３倍希釈する。５０μｌのストックおよび連続的に希釈した抗体（例示した実施例１のタウモノクローナルまたはヒト化ＭＣ−１抗体構築物）を、別個のウェルに加えて２時間室温でインキュベートし、その後プレートを１ウェル当り２００μｌのＰＢＳＴで４回洗う。５０μｌの抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（１：４０００で０．２５％カゼイン緩衝剤に希釈）を加えて室温で１時間インキュベートし、その後プレートを１ウェル当り２００μｌのＰＢＳＴで４回洗う。５０μｌのＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２を加えて室温で約１０分インキュベートする。反応を、５０μｌの停止液（２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を加えることによって停止して比色分析シグナルを４５０ｎｍで測定する。データを、Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ）プログラムに入力してＥＣ５０値を、非線形回帰曲線適合およびシグモイド型用量反応を用いて生成する。結果を表３に示す。
【表３】
0006431615.tif 000004
【００３７】
表３に示すように、本発明の例示したタウモノクローナル抗体は、精製されたタウ線維に対してヒト化ＭＣ−１抗体構築物と比較して６０倍改善された（ＥＣ５０によって測定されるような）親和性を実証する。
【００３８】
タウ凝集体対タウ単量体に対する実施例１のタウモノクローナル抗体の選択性を、直接ＥＬＩＳＡによって決定する。実質的に上記で示したようなＥＬＩＳＡ手順に従って、組み換えタウ（ｒタウ（ｒＴａｕ））を、「高」濃度（１μｇ／ｍＬ）または「低」濃度（１５ｎｇ／ｍＬ）のいずれかに相当する濃度で９６ウェルプレート上にコートする。高濃度のｒタウは、マイクロウェルプレート上にコートした場合、凝集し、凝集性のタウへの結合を模擬する。低濃度のｒタウは、マイクロウェルプレート上にコートした場合、タウ単量体への結合を模擬する。高または低濃度のｒタウでコートした、プレートを、それぞれ、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体に暴露して例示したタウモノクローナル抗体のそれぞれの濃度のｒタウへの結合を、実質的に上記のＥＬＩＳＡアッセイに記載のように測定する。結果を表４に示す。
【表４】
0006431615.tif 000005
【００３９】
表４に示すように、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体は、凝集体タウに対して単量体タウと比較して１２０倍改善された（ＥＣ５０によって測定されるような）親和性を実証する。
【００４０】
Ｅｘ  Ｖｉｖｏでの標的結合調査
例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のヒト脳由来の凝集性タウへの結合を、「正常な」個人（最少のタウ凝集を示している）、ＡＤ患者（重篤なタウ凝集およびＮＦＴ形成、ならびにアミロイド斑病変を示している）、ＰＤ患者（重篤なタウ凝集を示している）から得られるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）脳切片の免疫組織化学染色によって決定する。染色は、バックグラウンドの非特異的な染色レベルを決定するためにヒトタウを有さない「対照」野生マウス由来の脳切片でも実行する。
【００４１】
ＦＦＰＥ切片を、脱パラフィン化および再水和する。その後、クエン酸緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号ＴＡ−２５０−ＰＭ１Ｘ）において１００℃で２０分間切片を加熱すること次いで切片をｄＨ２０において冷却することが含まれる、抗原賦活化（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＰＴモジュールシステム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを用いる）を、切片で実行する。切片を、次いで次の７つのインキュベーションステップに（室温で）暴露する：（１）０．０３％Ｈ２Ｏ２において１０分、（２）ＰＢＳＴに希釈した正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ．、製品番号Ｓ−１０００）の１：２０希釈液において３０分、（３）例示した実施例１のタウモノクローナル抗体またはヒト化ＭＣ−１抗体構築物（フレームワーク組み合わせ：５−５１重鎖、Ａ２７軽鎖を有する）において６０分（例示したタウモノクローナル抗体およびヒト化ＭＣ−１抗体構築物のどちらも切片とのインキュベーションの前に１ｍｇ／ｍｌに標準化し、次いでＰＢＳＴにおいて１：４０００の希釈液に希釈する）、（４）（例示した抗体のＦｃ領域に対して生じた）ウサギ抗ヒトＩｇＧ４においてＰＢＳＴ中１．１μｇ／ｍｌの濃度で３０分、（５）ＰＢＳＴに希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ．、製品番号ＢＡ−１０００）の１：２００希釈液において３０分、（６）アビジン−ビオチン複合体溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ．、製品番号ＰＫ−７１００）において３０分、（７）３，３’−ジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ．、製品番号ＳＫ−４１０５）において５分。切片を、上記の７つのステップのそれぞれの間にＰＢＳＴを用いて洗う。上記の７つインキュベーションステップの後、切片を、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水してカバーガラスをセットする。マウス「対照」組織切片については上記プロトコルは、インキュベーションステップ（３）において（１：４０００希釈とは対照的に）例示したタウモノクローナル抗体およびヒト化ＭＣ−１抗体構築物の両方の１：８０００希釈液を用いること、ならびにインキュベーションステップ（４）および（５）を単一の３０分のＰＢＳＴにおけるビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ．製品番号ＢＡ−３０００）の１：２００希釈で置き換えることによって修正する。
【００４２】
実質的に上述の通りの手順に従って、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のヒト脳由来タウへの結合の解析を実行する。結果を表５に示す。
【表５】
0006431615.tif 000006
【００４３】
表５に示す結果は、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体が、ヒト化ＭＣ−１抗体構築物と比較して海馬脳切片において、ＡＤおよびＰＤ患者の両方からの、凝集性タウへの染色の有意に高いレベルを実証することを示す。表５に示す結果は、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体が、ヒト化ＭＣ−１抗体構築物よりも高度に非特異的な結合を実証しないことも実証する（例示したタウモノクローナル抗体は、正常対照ヒト切片における最小量の凝集性タウへの結合を実証する）。さらに、ＡＤおよびＰＤはタウをコードする遺伝子の異なるスプライシング変異体によって特徴付けられるので、これらの結果は、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体が、ＡＤおよびＰＤの両方のタウ凝集体に共通して特異的にヒトタウのアミノ酸残基７〜９および３１２〜３２２（例示した配列番号１３のヒトタウに基づく残基番号付け）を含む立体構造エピトープに結合するという結論を支持する。
【００４４】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏでのタウ凝集伝播の中和
約５か月齢のＰ３０１Ｓマウスからのホモジネート脳調製物は、未変性の、非凝集体タウの存在下で、未変性タウの凝集を誘導するためおよびタウ凝集の伝播様効果を実証するために、知られている。４．５から５か月齢のＰ３０１Ｓマウスからの脳組織のサルコシル不溶性ホモジネート調製物を、超音波処理してＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．によるＧＩＢＣＯ、製品番号３１９８５−０６２）で希釈して０．７７μｇ／ｍｌの最終濃度までの測定されたタウ（１調製物当り）をもたらす。それぞれの調製物を、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体（濃度：２１．００、７．００、２．３３、０．７８、０．２６、０．０９、０．０３、および０．０１μｇ／ｍｌ）またはヒト化ＭＣ−１抗体構築物（濃度：５０．００、１６．６７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１、０．０７、０．０２および０．０１μｇ／ｍｌ）のうちの１つと共に室温で３０分間インキュベートする。
【００４５】
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児由来腎臓細胞株）を、電気穿孔法によってトランスフェクトしてヒトタウの突然変異体形態を誘導的に発現させる（残基３０１（Ｐ３０１Ｓ）（例示した配列番号１３のヒトタウに基づく残基番号付け）におけるプロリンについてセリン置換を有する、１Ｎ４Ｌ）。（Ｆａｌｃｏｎ  Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０：１０４９〜１０６５、２０１５年）。安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、完全培地（Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号１１９６５−０９２）、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号１６０００）、１×ｐｅｎ．ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号１５１４０−１２２）、５μｇ／ｍｌのＢｌａｓｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号Ｒ２１０−０１）、２００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号Ｒ２５０−０１））において９６ウェルプレートのウェル内に１ｘ１０４細胞／ウェルの濃度で平板培養する。プレートを、３７℃で３日間インキュベートする。インキュベーション後、１ウェル当り１：１０００希釈で（１μｇテトラサイクリン／ｍｌ培地の最終濃度まで）１ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加えて突然変異体タウの発現を誘導する。プレートを、次いで３７℃で２４時間インキュベートする。インキュベーション後、培養培地を除去して（上述のように調製した）例示した実施例１のタウモノクローナル抗体またはヒト化ＭＣ−１抗体構築物のうちの１つのそれぞれの濃度のうちの１つを含む５０μｌのホモジネート調製物を加える。プレートを、３時間インキュベートし、その後ホモジネート調製物を除去して１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび同じそれぞれの濃度の例示したタウモノクローナル抗体またはヒト化ＭＣ−１抗体構築物を含む１００μｌの完全培地を、それぞれのウェルに加える。プレートを、３７℃で２４時間インキュベートし、その後培地を除去して１００μｌの完全培地および同じそれぞれの濃度の例示したタウモノクローナル抗体またはヒト化ＭＣ−１抗体構築物を、それぞれのウェルに加える。プレートを、３７℃で４８時間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を、２００μｌのＤＰＢＳで洗い排水する。
【００４６】
細胞を、１ウェル当り５０μｌのＨ緩衝液（２ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号７８４４２０）を含有するＴＢＳ  ｐＨ７．４）に再懸濁させて１０分間浴超音波処理する（ｂａｔｈ−ｓｏｎｉｃａｔｅｄ）。総タンパク質濃度を、ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号ＰＩ−２３２２７）によって測定する。タウ凝集レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定する。９６ウェルプレートを、５０μｌの２μｇ／ｍｌ  ＡＴ８抗体で４℃で一晩コートする。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗い、次いで１００μｌのＢＢ３で室温で１時間ブロッキングする。標準曲線を、ＡＤ脳全抽出物を用いて４０μｇ／ｍｌの開始濃度から０．３１２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで２倍希釈を用いて０．２５％カゼイン緩衝剤における連続的希釈によって用意する。細胞溶解物を、約０．１ｍｇ／ｍｌの総タンパク質濃度まで０．２５％カゼイン緩衝剤内に希釈する。５０ｕｌのそれぞれの標準試料希釈液または希釈した細胞試料を、次いでブロッキングしたプレートの別個のウェルに加えて４℃で一晩インキュベートし、その後プレートをＰＢＳＴで４回洗う。ビオチン化ＣＰ２７抗体を、０．２５％カゼイン緩衝剤に１：２０００希釈して次いで５０μｌを試料を含有するウェルに加える。プレートを、室温で２時間インキュベートし、その後プレートを、ＰＢＳＴで４回洗う。Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号ＳＮＮ２００４）を、０．２５％カゼイン緩衝剤に１：５０００希釈して次いで５０μｌを、それぞれのウェルに加えプレートを室温で１時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで４回洗い５０μｌのＨ２Ｏ２およびＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号３４０２１）の１：１混合物を加える。プレートを、室温で１０分間インキュベートして５０μｌのＨ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止する。比色分析シグナルを、４５０ｎｍまたは６５０ｎｍで測定する。ＡＴ８陽性タウレベルを、それぞれの試料における総タンパク質レベルに対して正規化する。それぞれの試料について正規化された値を、対照試料（抗体で処理されていない）におけるＡＴ８陽性タウレベルに対してさらに正規化する。それぞれの試料におけるタウ凝集伝播の阻害率を、さらに正規化された値を１００から引くことによって決定してそれぞれの試料の阻害値の割合を、ＥＣ５０値の生成のために非線形回帰曲線適合およびシグモイド型用量反応を適用するＰｒｉｓｍ  ６  Ｓｏｆｔｗａｒｅプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ）に入力する。結果を表６に示す。
【表６】
0006431615.tif 000007
【００４７】
表６に示す結果は、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体が、誘導されたタウ凝集伝播の阻害において約３０倍の改善を実証することを示す。
【００４８】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏでのタウ凝集伝播の中和
約５か月齢のＰ３０１Ｓマウスからのホモジネート脳幹調製物は、正常な１０週齢の雌Ｐ３０１Ｓマウスの海馬内への注入で、タウ凝集の伝播様効果を実証する、未変性、非凝集体タウの凝集を誘導することが知られている。４．５から５か月齢のＰ３０１Ｓマウスからの脳幹組織のホモジネート調製物を、実質的に上述と同様に調製する。
【００４９】
正常な１０週齢の雌Ｐ３０１Ｓマウスに、海馬の左半球に５μｌのホモジネート脳調製物および７．５μｇの例示した実施例１のタウモノクローナル抗体（Ｎ＝１２）、または７．５μｇの対照ヒトＩｇＧ４抗体（Ｎ＝１１）のいずれかを注入する。注入の４週後、マウスを屠殺して左および右半球を収集し、パラフィン包埋して、６μｍの連続切片をスライドガラスに載せる。前頂（Ａ−Ｐ＝−２．３０）を含有するスライドを脱パラフィン化し、包埋された組織を再水和し、クエン酸緩衝液中でスライドを１００℃に２０分間加熱することによって抗原賦活化を実行する。スライドを、ｄＨ２Ｏ中で冷却して以下のステップに従って室温でインキュベートする：（ａ）（０．０３％）Ｈ２Ｏ２中で１０分、（ｂ）正常ヤギ血清の１：２０希釈液中で３０分、（ｃ）ＰＧ−５抗体の１：８０００希釈液（ＰＢＳＴに希釈）中で６０分（イェシーバー大学のアルベルトアインシュタイン医学校、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｄａｖｉｅｓの研究室から得たＰＧ−５抗体、リン酸化された場合に例示した配列番号１３のヒトタウに基づく残基番号付けの、タウの残基４０９におけるセリンに特異的に結合するＰＧ−５抗体）、（ｄ）ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の１：２００希釈液（ＰＢＳＴに希釈）中で３０分、（ｅ）アビジン−ビオチン複合体溶液中で３０分、および（ｆ）３，３’−ジアミノベンジジン中で５分。ＰＢＳＴを、それぞれのステップの間の洗浄のために用いる。３，３’−ジアミノベンジジンにおける５分間のインキュベーション後、切片を、ヘマトキシリンで対比染色し、再水和してカバーガラスをセットする。染色シグナルを、Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ  ＡＴ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｐｅｒｉｏ）によって２０ｘ倍率で測定する。ＰＧ−５免疫反応性を定量化してＩｍａｇｅｓｃｏｐｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．１１．１．２．７８０、Ａｐｅｒｉｏ）の正画素アルゴリズム（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｉｘｅｌ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて割合として表わす。結果を表７に示す。
【表７】
0006431615.tif 000008
【００５０】
表７に示す結果は、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体が、対照ＩｇＧ４抗体と比較して左および右海馬の両方におけるタウ凝集のレベルを減少することを実証する。示したように、例示したタウモノクローナル抗体は、対照ＩｇＧ４抗体と比較して、それぞれ、左海馬におけるタウ凝集の６０．５％大きい減少、および右海馬におけるタウ凝集の６６．５％大きい減少を生じる。これらの結果は、例示したタウモノクローナル抗体が、タウ凝集の伝播に対する中和活性を有することを実証する。
【００５１】
Ｉｎ  ＶｉｖｏでのＴｇ４５１０マウスモデルにおける有効性解析
遺伝子導入Ｔｇ４５１０マウスは、ヒトタウの突然変異形態を発現する（残基３０１（Ｐ３０１Ｌ）におけるプロリンについてロイシン置換を有する、４Ｒ０Ｎ、Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．、２５：１０６３７〜１０６４７（２００５年）およびＳａｎｔａｃｒｕｚ  Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５年）、例示した配列番号１３のヒトタウに基づく残基番号付け）。Ｔｇ４５１０マウスは、海馬および新皮質領域においてＰ３０１Ｌ突然変異体ヒトタウの高レベルの発現を示し、これは、年齢依存性のタウ凝集進行を実証する。
【００５２】
本発明のタウ抗体は、Ｔｇ４５１０マウスにおける免疫原性反応を誘導し得る。したがって、齧歯類モデルにおける慢性投与について本発明のタウモノクローナル抗体の治療的可能性を試験するために、同一立体構造エピトープを標的としかつ例示した実施例１のタウモノクローナル抗体と比較して同様のレベルの改善された親和性を示す代理マウスタウ抗体を構築する。代理タウ抗体は、（例示した実施例１のタウモノクローナル抗体について）上述した通りにＥＬＩＳＡによって測定される、１３．１ｐＭとなる、精製されたＡＤタウ線維に対する親和性（ＥＣ５０）を有する。
【００５３】
８週齢の雌Ｔｇ４５１０マウスを、３つの別個の群にグループ分けする。第１の群（Ｎ＝１５）は、対照マウスＩｇＧ１抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）を９週間週に２回注入する。第２の群（Ｎ＝１５）は、ＭＣ−１ハイブリドーマを注入したマウス腹水から産生した組み換えＭＣ−１抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）を９週間週に２回注入する。第３の群（Ｎ＝１５）は、代理マウスタウ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）を９週間週に２回注入する。最終投与後、マウスを屠殺してそれらの脳を収集する。皮質の部分および海馬切片を収集し、パラフィン包埋して、６μｍの連続切片を免疫組織化学法用途のためにスライドガラスに載せる。
【００５４】
収集した脳の皮質領域の残りを、皮質体積より１０倍大きい体積のＨ緩衝液においてパルス音波処理によって均質化し、２１，０００ｇで４℃で２０分間回転しそれぞれの皮質からの上清のアリコートを収集してＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号ＰＩ−２３２２７）によって製造者のプロトコルに従って総タンパク質レベルを決定する。上清の残りを、１００，０００ｇで４℃で１時間回転し、上清を破棄して、得られる不溶性のペレットを、（破棄した上清の体積の１／２の体積の）Ｈ緩衝液に再懸濁させる。再懸濁したペレットを、超音波処理してそれぞれのペレットにおけるＡＴ８陽性タウ凝集レベルを、実質的に上述の通りにＡＴ８捕捉抗体およびＣＰ２７検出抗体を用いてＥＬＩＳＡによって決定する。ＡＴ８陽性タウ凝集レベルを、総タンパク質レベルに対して正規化する。
【００５５】
同様に、収集した脳からの海馬の残りを、海馬体積より１０倍大きい体積のＨ緩衝液においてパルス音波処理によって均質化し、２１，０００ｇで４℃で２０分間回転し、それぞれの海馬からの上清を収集して総タンパク質レベルを決定する。上清におけるＡＴ８陽性タウ凝集レベルを、実質的に上述の通りにＡＴ８捕捉抗体およびＣＰ２７検出抗体を用いてＥＬＩＳＡによって決定する。ＡＴ８陽性タウ凝集レベルを、総タンパク質レベルに対して正規化する。結果を表８に示す。
【表８】
0006431615.tif 000009
【００５６】
表８に示す結果は、代理マウスタウ抗体が、皮質および海馬の両方におけるタウ凝集体のレベルを、対照ｍＩｇＧ１処置マウスに対して、それぞれ２４％および３５％減少したことを実証する。結果はさらに、組み換えマウスＭＣ−１抗体で処置したマウスが、対照ｍＩｇＧ１処置マウスと比較してタウ凝集体のレベルにおける改善された減少を示さなかったことを示す。
【００５７】
収集した脳から調製したパラフィン包埋した切片の皮質および海馬におけるタウ凝集のレベルを、実質的に上述の通りにＰＧ−５を用いる免疫組織化学法によっても測定する。データを、ｌｏｇ１０値に変換することによって正規化して結果を表９に概説する。
【表９】
0006431615.tif 000010
【００５８】
表９に示す結果は、代理マウスタウ抗体が、対照ｍＩｇＧ１抗体と比較して皮質（１８％減少）および海馬（４３％減少）の両方においてタウ凝集体のレベルを減少することを実証するのに対して組み換えマウスＭＣ−１抗体は、対照ｍＩｇＧ１抗体と比較して皮質または海馬のどちらにおいてもタウ凝集体のレベルの注目すべき減少を実証しなかった。
【００５９】
改変されたタウモノクローナル抗体の物理化学特性
例示した実施例１のタウモノクローナル抗体は、良好な溶解度、化学安定性、および物理的安定性を実証する。
【００６０】
溶解度：
十分に高い溶解度は、好都合な投薬を可能にするために望ましい。例えば、１００ｋｇの患者への１．０ｍＬの注入によって投与される１ｍｇ／ｋｇの投与量には、１００ｍｇ／ｍｌの溶解度が必要となる。さらに、高濃度において高分子量（ＨＭＷ）の凝集を伴わず抗体を単量体状態に維持することも、望ましい。例示した実施例１のタウモノクローナル抗体の溶解度を、１５ｍｇの例示した抗体を１０Ｋ分子量カットオフフィルタ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕ．Ｃ．ｆｉｌｔｅｒｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９０３０２４）で１００μｌ未満の体積に濃縮することによって解析する。試料の最終濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＡ２８０におけるＵＶ吸光度によって測定した。
【００６１】
実質的に上述の通りの手順に従って、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体は、１４０ｍｇ／ｍｌ（１０ｍＭクエン酸緩衝液中ｐＨ６で）、１７７ｍｇ／ｍｌ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸中ｐＨ６で）、および１７０ｍｇ／ｍｌ（ＰＢＳ緩衝液中ｐＨ７．４で）より大きい溶解度を示す。さらに、低レベルのＨＭＷ（約３から約５．４％）のみが高濃度において存在し相分離は観察されない。
【００６２】
化学的および物理的安定性：
化学安定性は、十分な貯蔵寿命を有する薬剤製剤の開発を容易にする。例示した実施例１のタウモノクローナル抗体の化学安定性を、例示したタウ抗体を１０ｍＭクエン酸中に１ｍｇ／ｍｌの濃度に製剤することによって評価してｐＨ４、５、６、または７に緩衝化する。製剤した試料を、加速分解調査において４℃、２５℃、または４０℃で４週間インキュベートする。化学変化を示す、抗体の電荷プロファイルにおける変化を、毛管等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を用いて標準的な手順に従って評価する。
【００６３】
実質的に上述の通りの手順に従って、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体は、表１０に表わされる化学安定性結果を実証する。
【表１０】
0006431615.tif 000011
【００６４】
表１０に示す結果は、４０℃での４週間の貯蔵後、例示した実施例１のタウ抗体が、ｐＨ５で製剤した場合にわずか１．１パーセント点の主ピーク減少、およびｐＨ６（抗体製剤において用いられる一般的なｐＨ）で製剤した場合にわずか０．３パーセント点の主ピーク減少の割合しか有さないことを実証する。さらに、質量分析法解析は、４０℃での４週間の貯蔵後に最低限の分解しか観察されず（全てのＣＤＲ配列において５％未満の分解を伴う約１．５％のＬＣＤＲ１脱アミド）、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体が、適切な貯蔵寿命を有する溶液製剤の開発を容易にするために十分な化学安定性を有することを示していることを実証する。
【００６５】
比較の目的のために、（フレームワーク組み合わせ：５−５１重鎖、Ａ２７軽鎖を有する）ヒト化ＭＣ−１抗体構築物の化学的および物理的安定性を、抗体をｐＨ８で４０℃で２週間インキュベートすることによって実行する。ヒト化ＭＣ−１抗体構築物は、ＬＣＤＲ１の１２％の脱アミド、ＨＣＤＲ３における５％の脱アミドおよび１０％の異性化ならびにＨＣフレームワークにおける３％の酸化を含めた有意の化学分解を示した。
【００６６】
例示した実施例１のタウモノクローナル抗体の４週加速分解調査後の、結合親和性を、例示したモノクローナル抗体を１０ｍＭクエン酸中に１ｍｇ／ｍｌの濃度に製剤することによって評価してｐＨ４または６に緩衝化する。製剤した試料を、加速分解調査において４℃または４０℃で４週間インキュベートする。インキュベーション後、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体の９６ウェルプレート上にコートしたｒタウ（１５ｎｇ／ｍｌ）への結合親和性を、実質的に上述の通りのＥＬＩＳＡ手順に従って直接ＥＬＩＳＡによって決定する。重複して実行した、上記の結合親和性調査の結果を、表１１に示す。
【表１１】
0006431615.tif 000012
【００６７】
表１１は、例示した実施例１のタウモノクローナル抗体の低濃度のｒタウへの結合親和性が、４℃でインキュベートした対照試料と比較して、４週加速分解後の試料と同様のままであったことを実証する。
【００６８】
配列
配列番号１−例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のＬＣ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＶＤＮＲＦＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＳＱＳＴＬＶＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【００６９】
配列番号２−例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のＨＣ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＲＧＮＹＶＤＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
【００７０】
配列番号３−例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のＬＣＤＲ１
ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨ
【００７１】
配列番号４−例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のＬＣＤＲ２
ＹＫＶＤＮＲＦＳ
【００７２】
配列番号５−例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のＬＣＤＲ３
ＳＱＳＴＬＶＰＬＴ
【００７３】
配列番号６−例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のＨＣＤＲ１
ＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥ
【００７４】
配列番号７−例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のＨＣＤＲ２
ＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧ
【００７５】
配列番号８−例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のＨＣＤＲ３
ＡＲＲＧＮＹＶＤＤ
【００７６】
配列番号９−例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のＬＣＶＲ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＶＤＮＲＦＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＳＱＳＴＬＶＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【００７７】
配列番号１０−例示した実施例１のタウモノクローナル抗体のＨＣＶＲ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＲＧＮＹＶＤＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【００７８】
配列番号１１−例示したＬＣ（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列
ｇａａａｔｔｇｔｇｔｔｇａｃｇｃａｇｔｃｔｃｃａｇｇｃａｃｃｃｔｇｔｃｔｔｔｇｔｃｔｃｃａｇｇｇｇａａａｇａｇｃｃａｃｃｃｔｃｔｃｃｔｇｃａｇａｔｃｔａｇｔｃａｇａｇｃｃｔｔｇｔａｃａｃａｇｔａａｔｃａｇａａｃａｃｃｔａｔｔｔａｃａｔｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａａｃｃｔｇｇｃｃａｇｇｃｔｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｔｃａｔｃｔａｔａａａｇｔｔｇａｃａａｃｃｇａｔｔｔｔｃｔｇｇｃａｔｃｃｃａｇａｃａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｃｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇａｃｔｇｇａｇｃｃｔｇａａｇａｔｔｔｔｇｃａｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｔｃｔｃａａａｇｔａｃａｃｔｇｇｔｔｃｃｇｃｔｃａｃｇｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａａｃｇｇａｃｃｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｃ
【００７９】
配列番号１２−例示したＨＣ（配列番号２）をコードするヌクレオチド配列
ｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｔｃｔｇｇａｇｃａｇａｇｇｔｇａａａａａｇｃｃｃｇｇｇｇａｇｔｃｔｃｔｇａａｇａｔｃｔｃｃｔｇｔａａｇｇｇｔｔｃｔｇｇｃｔａｃａｃａｔｔｃａｇｔａａｃｔａｃｔｇｇａｔａｇａｇｔｇｇｇｔｇｃｇｃｃａｇａｔｇｃｃｃｇｇｇａａａｇｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｇｇｇｇｇａｇａｔｔｔｔａｃｃｔｇｇａａｇｔｇａｔａｇｔａｔｔａａｇｔａｃｇａａａａｇａａｔｔｔｃａａｇｇｇｃｃａｇｇｔｃａｃｃａｔｃｔｃａｇｃｃｇａｃａａｇｔｃｃａｔｃａｇｃａｃｃｇｃｃｔａｃｃｔｇｃａｇｔｇｇａｇｃａｇｃｃｔｇａａｇｇｃｃｔｃｇｇａｃａｃｃｇｃｃａｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃｇａｇａａｇｇｇｇｇａａｃｔａｃｇｔｇｇａｃｇａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｃｔｔｃｔａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃｇｃｔａｇｃｇｃｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｇａｇｃａｃｃｔｃｃｇａｇａｇｃａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｇａａｇａｃｃｔａｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔａｇａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａｇａｇｔｔｇａｇｔｃｃａａａｔａｔｇｇｔｃｃｃｃｃａｔｇｃｃｃａｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇｇｇａｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃｇｔｃｃｔｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃａｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａａａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａｇｇｃｔａａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｇａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇｔ
【００８０】
配列番号１３−ヒト、全長タウのアミノ酸配列
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶＤＥＧＡＰＧＫＱＡＡＡＱＰＨＴＥＩＰＥＧＴＴＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ
本願は以下の発明に関するものである。
（１）  軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含むヒトタウに結合するモノクローナル抗体であって、前記ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、かつ前記ＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のＣＤＲを含み、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号３によって表され、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４によって表され、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号５によって表され、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６によって表され、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７によって表され、かつ前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号８によって表される、モノクローナル抗体。
（２）  軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号９によって表され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号１０によって表される、上記（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）  軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号１によって表され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号２によって表される、上記（１）〜（２）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（４）  配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
（５）  配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
（６）  配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
（７）  上記（４）に記載のＤＮＡ分子および（５に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含むモノクローナル抗体を発現する能力を有する、哺乳動物細胞。
（８）  上記（６）に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含むモノクローナル抗体を発現する能力を有する、哺乳動物細胞。
（９）  配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含むモノクローナル抗体を産生するためのプロセスであって、前記プロセスが、前記モノクローナル抗体が発現されるような条件下で上記（７）および（８）のいずれかに記載の哺乳動物細胞を培養するステップと、発現されたモノクローナル抗体を回収するステップとを含む、プロセス。
（１０）  上記（９）に記載のプロセスによって産生されるモノクローナル抗体。
（１１）  上記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体および１種または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
（１２）  有効量の上記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺またはピック病を治療する方法。
（１３）  上記（１１）に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺またはピック病を治療する方法。
（１４）  療法における使用のための、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（１５）  アルツハイマー病、進行性核上性麻痺およびピック病からなる群から選択される疾患の治療における使用のための、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（１６）  アルツハイマー病、進行性核上性麻痺またはピック病の治療のための薬物の製造における使用のための、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【配列表】
0006431615000001.app