(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２ＣＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＸ１２（配列番号４８）
（配列中、
Ｘ１は、Ｌ、Ｍ、Ａ、Ｓ及びＶから選択され；
Ｘ２は、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘ３は、Ｆ、Ｉ及びＹから選択され；
Ｘ４は、Ｆ、Ｉ及びＹから選択され；
Ｘ５は、Ｄ及びＥから選択され；
Ｘ６は、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＰから選択され；
Ｘ７は、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ａ及びＴから選択され；
Ｘ８は、Ｙ、Ｄ、Ｆ、Ｎ及びＷから選択され；
Ｘ９は、Ｇ、Ｄ及びＥから選択され；
Ｘ１０は、Ｙ及びＦから選択され；
Ｘ１１は、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｑ及びＷから選択され；並びに
Ｘ１２は、Ｆ、Ｌ、Ｃ、Ｖ及びＹから選択される）を含むペプチドであって、１０μM未満のＩＣ５０でＵＳＰ３０を阻害する、ペプチド。
【請求項２】
ＵＳＰ７、ＵＳＰ５、ＵＣＨＬ３及びＵＳＰ２から選択される少なくとも１個、少なくとも２個又は少なくとも３個のペプチダーゼに対するペプチドのＩＣ５０が、２０μM超、３０μM超、４０μM超又は５０μM超である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号１〜２２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
細胞を請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドと接触させることを含む、細胞におけるマイトファジーを増加させるex vivo又はin vitro方法。
【請求項５】
細胞を請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドと接触させることを含む、細胞におけるミトコンドリアのユビキチン化を増加させるex vivo又はin vitro方法。
【請求項６】
細胞を請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドと接触させることを含む、細胞におけるＴｏｍ２０、ＭＩＲＯ、ＭＵＬ１、ＡＳＮＳ、ＦＫＢＰ８、ＴＯＭ７０、ＭＡＴ２Ｂ、ＰＲＤＸ３、ＩＤＥ、ＶＤＡＣ１、ＶＤＡＣ２、ＶＤＡＣ３、ＩＰＯ５、ＰＳＤ１３、ＵＢＰ１３及びＰＴＨ２から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個又は１４個のタンパク質のユビキチン化を増加させるex vivo又はin vitro方法。
【請求項７】
Ｔｏｍ２０のＫ５６、Ｋ６１及びＫ６８から選択される少なくとも１個、少なくとも２個又は３個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＭＩＲＯのＫ１５３、Ｋ１８７、Ｋ３３０、Ｋ４２７、Ｋ５１２、Ｋ５３５、Ｋ５６７及びＫ５７２から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個又は８個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＭＵＬ１のＫ２７３、Ｋ２９９及びＫ５２から選択される少なくとも１個、少なくとも２個又は３個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＳＮＳのＫ１４７、Ｋ１６８、Ｋ１７６、Ｋ２２１、Ｋ２４４、Ｋ２７５、Ｋ４７８、Ｋ５０４及びＫ５５６から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個又は９個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＦＫＢＰ８のＫ２４９、Ｋ２７１、Ｋ２７３、Ｋ２８４、Ｋ３０７、Ｋ３１７、Ｋ３３４及びＫ３４０から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個又は８個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＯＭ７０のＫ７８、Ｋ１２０、Ｋ１２３、Ｋ１２６、Ｋ１２９、Ｋ１４８、Ｋ１６８、Ｋ１７０、Ｋ１７８、Ｋ１８５、Ｋ２０４、Ｋ２３０、Ｋ２３３、Ｋ２４５、Ｋ２７５、Ｋ２７８、Ｋ３１２、Ｋ３２６、Ｋ３４９、Ｋ３５９、Ｋ４４１、Ｋ４６３、Ｋ４７０、Ｋ４７１、Ｋ４９４、Ｋ５０１、Ｋ５２４、Ｋ５３６、Ｋ５６３、Ｋ５７０、Ｋ５９９、Ｋ６００及びＫ６０４から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＡＴ２ＢのＫ２０９、Ｋ２４５、Ｋ３１６及びＫ３２６から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個又は４個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＲＤＸ３のＫ８３、Ｋ９１、Ｋ１６６、Ｋ２４１及びＫ２５３から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個又は５個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＩＤＥのＫ５５８、Ｋ６５７、Ｋ８５４、Ｋ８８４、Ｋ９２９及びＫ９３３から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又は６個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＶＤＡＣ１のＫ２０、Ｋ５３、Ｋ６１、Ｋ１０９、Ｋ１１０、Ｋ２６６及びＫ２７４から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個又は７個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＶＤＡＣ２のＫ３１、Ｋ６４、Ｋ１２０、Ｋ１２１、Ｋ２７７及びＫ２８５から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又は６個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＶＤＡＣ３のＫ２０、Ｋ５３、Ｋ６１、Ｋ１０９、Ｋ１１０、Ｋ１６３、Ｋ２６６及びＫ２７４から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個又は８個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＰＯ５のＫ２３８、Ｋ３５３、Ｋ４３６、Ｋ４３７、Ｋ５４８、Ｋ５５６、Ｋ６１３、Ｋ６７８、Ｋ６９０、Ｋ７０５、Ｋ７７５及びＫ８０６から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＳＤ１３のＫ２、Ｋ３２、Ｋ９９、Ｋ１１５、Ｋ１２２、Ｋ１３２、Ｋ１６１、Ｋ１８６、Ｋ３１３、Ｋ３２１、Ｋ３４７、Ｋ３５０及びＫ３６１から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＵＢＰ１３のＫ１８、Ｋ１９０、Ｋ２５９、Ｋ３２６、Ｋ３２８、Ｋ４０１、Ｋ４０５、Ｋ４１４、Ｋ４１８、Ｋ４３５、Ｋ５８６、Ｋ５８７及びＫ６４０から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＴＨ２の４７位、７６位、８１位、９５位、１０６位、１１９位、１３４位、１７１位、１７７位から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個又は９個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞が酸化ストレス下にある、請求項４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞を請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドと接触させることを含む、細胞における酸化ストレスを減少させるex vivo又はin vitro方法。
【請求項２５】
細胞が、Ｐａｒｋｉｎの病因性突然変異、ＰＩＮＫ１の病因性突然変異、又はＰａｒｋｉｎの病因性突然変異及びＰＩＮＫ１の病因性突然変異を含む、請求項４〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が、表１の突然変異から選択されるＰａｒｋｉｎの病因性突然変異を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞が、表２の突然変異から選択されるＰＩＮＫ１の病因性突然変異を含む、請求項２５又は請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞が、ニューロン、心臓細胞及び筋細胞から選択される、請求項４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
細胞が被験体内に含まれる、請求項４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
被験体におけるミトコンドリア障害が関与する症状を処置するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項３１】
ミトコンドリア障害が関与する症状が、マイトファジーの障害が関与する症状、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異が関与する症状、ミトコンドリアの酸化ストレスが関与する症状、ミトコンドリアの形状又は形態の障害が関与する症状、ミトコンドリア膜電位の障害が関与する症状、及びリソソーム蓄積障害が関与する症状から選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ミトコンドリア障害が関与する症状が、神経変性疾患；ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）症候群；レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；神経障害性−運動失調症−網膜色素変性症−母性遺伝リー症候群（ＮＡＲＰ−ＭＩＬＳ）；ダノン病；心筋梗塞につながる虚血性心疾患；多種スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）；ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ  ＩＩ）；ムコリピドーシスＩＩＩ（ＭＬ  ＩＩＩ）；ムコリピドーシスＩＶ（ＭＬ  ＩＶ）；ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）；神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ１）；アルパーズ病；バース症候群；β−酸化欠損；カルニチンアシルカルニチン欠損症；カルニチン欠損症；クレアチン欠損症候群；補酵素Ｑ１０欠損症；複合体Ｉ欠損症；複合体ＩＩ欠損症；複合体ＩＩＩ欠損症；複合体ＩＶ欠損症；複合体Ｖ欠損症；ＣＯＸ欠損症；慢性進行性外眼筋麻痺症候群（ＣＰＥＯ）；ＣＰＴ  Ｉ欠損症；ＣＰＴ  ＩＩ欠損症；グルタル酸尿症ＩＩ型；カーンズ・セイヤー症候群；乳酸アシドーシス；長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＣＨＡＤ）；リー病又は症候群；致死乳児心筋症（ＬＩＣ）；ルフト病；グルタル酸尿症ＩＩ型；中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤ）；赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）症候群；ミトコンドリア劣性運動失調症候群；ミトコンドリア細胞症；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群；筋神経胃腸障害及び脳症；ピアソン症候群；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症；ＰＯＬＧ突然変異；中鎖／短鎖３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｍ／ＳＣＨＡＤ）欠損症；並びに超長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＶＬＣＡＤ）欠損症から選択される、請求項３０又は請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、虚血、脳卒中、レビー小体型認知症及び前頭側頭型認知症から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
被験体における神経変性疾患を処置するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項３５】
神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、虚血、脳卒中、レビー小体型認知症及び前頭側頭型認知症から選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
被験体におけるパーキンソン病を処置するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項３７】
被験体が、前記被験体の細胞の少なくとも一部にＰａｒｋｉｎの病因性突然変異、ＰＩＮＫ１の病因性突然変異、又はＰａｒｋｉｎの病因性突然変異及びＰＩＮＫ１の病因性突然変異を含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
Ｐａｒｋｉｎの病因性突然変異が表１の突然変異から選択される、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ＰＩＮＫ１の病因性突然変異が表２の突然変異から選択される、請求項３７又は請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
被験体において酸化ストレスを受けている細胞が関与する症状を処置するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項４１】
経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与される、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
少なくとも１つのさらなる治療剤と組み合わせた、請求項３０〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
少なくとも１つのさらなる治療剤が、レボドパ、ドーパミンアゴニスト、モノアミノオキシゲナーゼ（ＭＡＯ）Ｂインヒビター、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）インヒビター、抗コリン薬、アマンタジン、リルゾール、コリンエステラーゼインヒビター、メマンチン、テトラベナジン、抗精神病薬、クロナゼパム、ジアゼパム、抗鬱薬及び抗痙攣薬から選択される、請求項４２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
ＵＳＰ３０インヒビター及びＵＳＰ３０インヒビターの使用方法が提供される。いくつかの実施態様では、ミトコンドリア障害が関与する症状を処置する方法が提供される。
【０００２】
背景
マイトファジーは、リソソームによる分解を介してミトコンドリアを排除する特殊なオートファジー経路である。このように、それは、オルガネラの正常な細胞ターンオーバー中に、赤血球の成熟中に、及び受精後にミトコンドリアを除去して、精子由来のミトコンドリアを排除する。マイトファジーはまた、損傷ミトコンドリアのクリアランス（これは、ミトコンドリア品質コントロールの重要な一面である）を媒介する。障害のある又は過剰なミトコンドリアは、クリアランスされずに放置されると異常な酸化ストレス源になり、ミトコンドリア融合を介して健全なミトコンドリアを損ない得る。酵母では、マイトファジーの選択的遮断は、過剰なミトコンドリア及びミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔ−ＤＮＡ）の喪失によって活性酸素種（ＲＯＳ）の産生増加を引き起こす。ミトコンドリア品質コントロールの障害も、重要な生合成経路（ＡＴＰ産生及びＣａ２＋バッファリング）に影響を与え、全体的な細胞ホメオスタシスを障害し得る。
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）（これは、アルツハイマー病（ＡＤ）後に２番目に多い神経変性障害である）は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失を最も顕著な特徴とする。ＰＤの発症機構は不明であるが、いくつかの証拠は、ミトコンドリア機能障害がＰＤの中心であることを示唆している。ヒトでは、ミトコンドリア毒素のＭＰＴＰはドーパミンニューロンを損傷して、臨床パーキンソン症候群をもたらす。疫学的証拠によれば、ＰＤと、ロテノン（複合体Ｉインヒビター）及びパラコート（酸化ストレス剤）などの殺虫剤への曝露には関連がある。ミトコンドリア障害と一致して、ＰＤ患者由来の黒質では、複合体Ｉ活性の低下及び高レベルのｍｔ−ＤＮＡ突然変異が見出された。同様に、ＰＤの遺伝モデルでは、ミトコンドリアの機能的及び形態学的な変化が存在する。おそらく最も有力なのは、早期発症家族性ＰＤは、Ｐａｒｋｉｎユビキチンリガーゼ及びＰＩＮＫ１セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（これらは両方とも、ミトコンドリアのダイナミクス及び品質コントロールをレギュレーションすることによって健全なミトコンドリアを維持するように機能する）の突然変異によって引き起こされ得る。
【０００４】
ハエにおける遺伝子研究により、ＰＩＮＫ１はＰａｒｋｉｎの上流に作用して、適切なミトコンドリアの形態及び機能を維持することが立証された。ＰＩＮＫ１が、損傷ミトコンドリアの細胞質から表面にＰａｒｋｉｎをリクルートすると、ミトコンドリア外膜タンパク質がＰａｒｋｉｎによってユビキチン化されて、マイトファジーによって損傷ミトコンドリアが除去される。ＰＩＮＫ１又はＰａｒｋｉｎのいずれかのＰＤ関連突然変異は、Ｐａｒｋｉｎのリクルート、ミトコンドリアのユビキチン化及びマイトファジーを障害する。Ｐａｒｋｉｎは、ミトコンドリアのダイナミクス及び輸送などのミトコンドリア機能の複数の側面をレギュレーションし、さらにはミトコンドリア生合成に影響を与え得る。損傷ミトコンドリア上における広範囲のミトコンドリア外膜タンパク質の分解は、Ｐａｒｋｉｎによって影響されると思われる。これらのミトコンドリア関連タンパク質の中では、ＭＩＲＯ（これは、ミトコンドリア−キネシンモーターアダプター複合体の成分である）は、Ｐａｒｋｉｎ及びＰＩＮＫ−１の両方の共通基質であり得る。
【０００５】
Ｐａｒｋｉｎの発現及び／又は活性は、家族性ＰＤにおける遺伝子突然変異又は散発性ＰＤにおけるリン酸化によって障害され得る。黒質ドーパミンニューロンにおける本質的に高いミトコンドリアの酸化ストレスとの関連では、Ｐａｒｋｉｎ媒介性ミトコンドリア品質コントロールの喪失により、神経変性に対する黒質ニューロンの感受性がより大きいことが説明され得る。損傷ミトコンドリアのクリアランスを促進し、ミトコンドリア品質コントロールを増強することは、ＰＤにおいて有益であり得る。
【０００６】
概要
いくつかの実施態様では、細胞におけるマイトファジーを増加させる方法が提供される。いくつかの実施態様では、前記方法は、前記細胞をＵＳＰ３０インヒビターと接触させることを含む。
【０００７】
いくつかの実施態様では、細胞におけるミトコンドリアのユビキチン化を増加させる方法が提供される。いくつかの実施態様では、細胞におけるＴｏｍ２０、ＭＩＲＯ、ＭＵＬ１、ＡＳＮＳ、ＦＫＢＰ８、ＴＯＭ７０、ＭＡＴ２Ｂ、ＰＲＤＸ３、ＩＤＥ、ＶＤＡＣ１、ＶＤＡＣ２、ＶＤＡＣ３、ＩＰＯ５、ＰＳＤ１３、ＵＢＰ１３及びＰＴＨ２から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個又は１４個のタンパク質のユビキチン化を増加させる方法が提供される。いくつかの実施態様では、前記方法は、前記細胞をＵＳＰ３０インヒビターと接触させることを含む。
【０００８】
いくつかの実施態様では、前記方法は、Ｔｏｍ２０のＫ５６、Ｋ６１及びＫ６８から選択される少なくとも１個、少なくとも２個又は３個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＭＩＲＯのＫ１５３、Ｋ１８７、Ｋ３３０、Ｋ４２７、Ｋ５１２、Ｋ５３５、Ｋ５６７及びＫ５７２から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個又は８個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＭＵＬ１のＫ２７３、Ｋ２９９及びＫ５２から選択される少なくとも１個、少なくとも２個又は３個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＡＳＮＳのＫ１４７、Ｋ１６８、Ｋ１７６、Ｋ２２１、Ｋ２４４、Ｋ２７５、Ｋ４７８、Ｋ５０４及びＫ５５６から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個又は９個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＦＫＢＰ８のＫ２４９、Ｋ２７１、Ｋ２７３、Ｋ２８４、Ｋ３０７、Ｋ３１７、Ｋ３３４及びＫ３４０から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個又は８個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＴＯＭ７０のＫ７８、Ｋ１２０、Ｋ１２３、Ｋ１２６、Ｋ１２９、Ｋ１４８、Ｋ１６８、Ｋ１７０、Ｋ１７８、Ｋ１８５、Ｋ２０４、Ｋ２３０、Ｋ２３３、Ｋ２４５、Ｋ２７５、Ｋ２７８、Ｋ３１２、Ｋ３２６、Ｋ３４９、Ｋ３５９、Ｋ４４１、Ｋ４６３、Ｋ４７０、Ｋ４７１、Ｋ４９４、Ｋ５０１、Ｋ５２４、Ｋ５３６、Ｋ５６３、Ｋ５７０、Ｋ５９９、Ｋ６００及びＫ６０４から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＭＡＴ２ＢのＫ２０９、Ｋ２４５、Ｋ３１６及びＫ３２６から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個又は４個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＰＲＤＸ３のＫ８３、Ｋ９１、Ｋ１６６、Ｋ２４１及びＫ２５３から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個又は５個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＩＤＥのＫ５５８、Ｋ６５７、Ｋ８５４、Ｋ８８４、Ｋ９２９及びＫ９３３から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又は６個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＶＤＡＣ１のＫ２０、Ｋ５３、Ｋ６１、Ｋ１０９、Ｋ１１０、Ｋ２６６及びＫ２７４から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個又は７個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＶＤＡＣ２のＫ３１、Ｋ６４、Ｋ１２０、Ｋ１２１、Ｋ２７７及びＫ２８５から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又は６個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＶＤＡＣ３のＫ２０、Ｋ５３、Ｋ６１、Ｋ１０９、Ｋ１１０、Ｋ１６３、Ｋ２６６及びＫ２７４から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個又は８個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＩＰＯ５のＫ２３８、Ｋ３５３、Ｋ４３６、Ｋ４３７、Ｋ５４８、Ｋ５５６、Ｋ６１３、Ｋ６７８、Ｋ６９０、Ｋ７０５、Ｋ７７５及びＫ８０６から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＰＳＤ１３のＫ２、Ｋ３２、Ｋ９９、Ｋ１１５、Ｋ１２２、Ｋ１３２、Ｋ１６１、Ｋ１８６、Ｋ３１３、Ｋ３２１、Ｋ３４７、Ｋ３５０及びＫ３６１から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＵＢＰ１３のＫ１８、Ｋ１９０、Ｋ２５９、Ｋ３２６、Ｋ３２８、Ｋ４０１、Ｋ４０５、Ｋ４１４、Ｋ４１８、Ｋ４３５、Ｋ５８６、Ｋ５８７及びＫ６４０から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＰＴＨ２の４７位、７６位、８１位、９５位、１０６位、１１９位、１３４位、１７１位、１７７位から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個又は９個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む。
【０００９】
いくつかの実施態様では、前記細胞は、酸化ストレス下にある。いくつかの実施態様では、細胞における酸化ストレスを減少させる方法が提供される。いくつかの実施態様では、前記方法は、前記細胞をＵＳＰ３０インヒビターと接触させることを含む。
【００１０】
いくつかの実施態様では、前記細胞は、Ｐａｒｋｉｎの病因性突然変異、ＰＩＮＫ１の病因性突然変異、又はＰａｒｋｉｎの病因性突然変異及びＰＩＮＫ１の病因性突然変異を含む。Ｐａｒｋｉｎの非限定的で例示的な病因性突然変異は、表１に示されている。従って、いくつかの実施態様では、Ｐａｒｋｉｎの病因性突然変異は、表１の突然変異から選択される。ＰＩＮＫ１の非限定的で例示的な病因性突然変異は、表２に示されている。いくつかの実施態様では、ＰＩＮＫ１の病因性突然変異は、表２の突然変異から選択される。
【００１１】
様々な実施態様では、前記細胞は、ニューロン、心臓細胞及び筋細胞から選択される。いくつかのこのような実施態様では、前記細胞は、ex vivo又はin vitroにある。あるいは、いくつかのこのような実施態様では、前記細胞は、被験体内に含まれる。
【００１２】
いくつかの実施態様では、被験体におけるミトコンドリア障害が関与する症状を処置する方法が提供される。いくつかの実施態様では、前記方法は、有効量のＵＳＰ３０インヒビターを前記被験体に投与することを含む。いくつかの実施態様では、ミトコンドリア障害が関与する症状は、マイトファジーの障害が関与する症状、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異が関与する症状、ミトコンドリアの酸化ストレスが関与する症状、ミトコンドリアの形状又は形態の障害が関与する症状、ミトコンドリア膜電位の障害が関与する症状、及びリソソーム蓄積障害が関与する症状から選択される。
【００１３】
いくつかの実施態様では、ミトコンドリア障害が関与する症状は、神経変性疾患；ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）症候群；レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；神経障害性−運動失調症−網膜色素変性症−母性遺伝リー症候群（ＮＡＲＰ−ＭＩＬＳ）；ダノン病；心筋梗塞につながる虚血性心疾患；多種スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）；ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ  ＩＩ）；ムコリピドーシスＩＩＩ（ＭＬ  ＩＩＩ）；ムコリピドーシスＩＶ（ＭＬ  ＩＶ）；ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）；神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ１）；アルパーズ病；バース症候群；β−酸化欠損；カルニチンアシルカルニチン欠損症；カルニチン欠損症；クレアチン欠損症候群；補酵素Ｑ１０欠損症；複合体Ｉ欠損症；複合体ＩＩ欠損症；複合体ＩＩＩ欠損症；複合体ＩＶ欠損症；複合体Ｖ欠損症；ＣＯＸ欠損症；慢性進行性外眼筋麻痺症候群（ＣＰＥＯ）；ＣＰＴ  Ｉ欠損症；ＣＰＴ  ＩＩ欠損症；グルタル酸尿症ＩＩ型；カーンズ・セイヤー症候群；乳酸アシドーシス；長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＣＨＡＤ）；リー病又は症候群；致死乳児心筋症（ＬＩＣ）；ルフト病；グルタル酸尿症ＩＩ型；中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤ）；赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）症候群；ミトコンドリア劣性運動失調症候群；ミトコンドリア細胞症；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群；筋神経胃腸障害及び脳症；ピアソン症候群；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症；ＰＯＬＧ突然変異；中鎖／短鎖３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｍ／ＳＣＨＡＤ）欠損症；並びに超長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＶＬＣＡＤ）欠損症から選択される。
【００１４】
いくつかの実施態様では、神経変性疾患を処置する方法が提供される。いくつかの実施態様では、前記方法は、有効量のＵＳＰ３０インヒビターを被験体に投与することを含む。
【００１５】
いくつかの実施態様では、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、虚血、脳卒中、レビー小体型認知症及び前頭側頭型認知症から選択される。
【００１６】
いくつかの実施態様では、パーキンソン病を処置する方法が提供される。いくつかの実施態様では、前記方法は、有効量のＵＳＰ３０インヒビターを被験体に投与することを含む。
【００１７】
いくつかの実施態様では、酸化ストレスを受けている細胞が関与する症状を処置する方法が提供される。いくつかの実施態様では、前記方法は、有効量のＵＳＰ３０インヒビターを被験体に投与することを含む。
【００１８】
被験体の処置を含むいくつかの実施態様では、前記被験体は、前記被験体の細胞の少なくとも一部にＰａｒｋｉｎの病因性突然変異、ＰＩＮＫ１の病因性突然変異、又はＰａｒｋｉｎの病因性突然変異及びＰＩＮＫ１の病因性突然変異を含む。いくつかの実施態様では、Ｐａｒｋｉｎの病因性突然変異は、表１の突然変異から選択される。いくつかの実施態様では、ＰＩＮＫ１の病因性突然変異は、表２の突然変異から選択される。
【００１９】
いくつかの実施態様では、前記ＵＳＰ３０インヒビターは、経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与される。いくつかの実施態様では、前記方法は、少なくとも１つのさらなる治療剤を投与することを含む。いくつかの実施態様では、前記少なくとも１つのさらなる治療剤は、レボドパ、ドーパミンアゴニスト、モノアミノオキシゲナーゼ（ＭＡＯ）Ｂインヒビター、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）インヒビター、抗コリン薬、アマンタジン、リルゾール、コリンエステラーゼインヒビター、メマンチン、テトラベナジン、抗精神病薬、クロナゼパム、ジアゼパム、抗鬱薬及び抗痙攣薬から選択される。
【００２０】
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、前記ＵＳＰ３０インヒビターは、ＵＳＰ３０発現インヒビターであり得る。非限定的で例示的なＵＳＰ３０発現インヒビターとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が挙げられる。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、前記ＵＳＰ３０インヒビターは、ＵＳＰ３０活性インヒビターであり得る。非限定的で例示的なＵＳＰ３０活性インヒビターとしては、抗体、ペプチド、ペプチボディ、アプタマー及び低分子が挙げられる。
【００２１】
いくつかの実施態様では、ペプチドＵＳＰ３０インヒビターは、アミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２ＣＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＸ１２（配列番号４８）
（配列中、
Ｘ１は、Ｌ、Ｍ、Ａ、Ｓ及びＶから選択され；
Ｘ２は、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘ３は、Ｆ、Ｉ及びＹから選択され；
Ｘ４は、Ｆ、Ｉ及びＹから選択され；
Ｘ５は、Ｄ及びＥから選択され；
Ｘ６は、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＰから選択され；
Ｘ７は、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ａ及びＴから選択され；
Ｘ８は、Ｙ、Ｄ、Ｆ、Ｎ及びＷから選択され；
Ｘ９は、Ｇ、Ｄ及びＥから選択され；
Ｘ１０は、Ｙ及びＦから選択され；
Ｘ１１は、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｑ及びＷから選択され；並びに
Ｘ１２は、Ｆ、Ｌ、Ｃ、Ｖ及びＹから選択される）を含む。
いくつかの実施態様では、ペプチドＵＳＰ３０インヒビターのペプチドは、配列番号１〜２２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、前記ペプチドは、１０μM未満のＩＣ５０でＵＳＰ３０を阻害する。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ７、ＵＳＰ５、ＵＣＨＬ３及びＵＳＰ２から選択される少なくとも１個、少なくとも２個又は少なくとも３個のペプチダーゼに対するペプチドＵＳＰ３０インヒビターのＩＣ５０は、２０μM超、３０μM超、４０μM超又は５０μM超である。
【００２２】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡの領域及び／又はＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ前駆体の領域と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡの領域又はＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ前駆体の領域は、少なくとも少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施態様では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０〜５００ヌクレオチド長、又は１０〜４００ヌクレオチド長、又は１０〜３００ヌクレオチド長、又は１０〜２００ヌクレオチド長、又は１０〜１００ヌクレオチド長、又は１５〜１００ヌクレオチド長、又は１０〜５０ヌクレオチド長、又は１５〜５０ヌクレオチド長である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の非ヌクレオチド成分を含み得る。
【００２３】
いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡの領域及び／又はＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ前駆体の領域と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡの領域又はＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ前駆体の領域は、少なくとも少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０又は少なくとも２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施態様では、前記ｓｉＲＮＡは、１０〜２００ヌクレオチド長、又は１０〜１００ヌクレオチド長、又は１５〜１００ヌクレオチド長、又は１０〜６０ヌクレオチド長、又は１５〜６０ヌクレオチド長、又は１０〜５０ヌクレオチド長、又は１５〜５０ヌクレオチド長、又は１０〜３０ヌクレオチド長、又は１５〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ｓｈＲＮＡである。
【００２４】
本発明のある実施態様は、被験体におけるミトコンドリア障害が関与する症状を処置するためのＵＳＰ３０インヒビターである。特定の実施態様では、ミトコンドリア障害が関与する症状は、マイトファジーの障害が関与する症状、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異が関与する症状、ミトコンドリアの酸化ストレスが関与する症状、ミトコンドリアの形状又は形態の障害が関与する症状、ミトコンドリア膜電位の障害が関与する症状、及びリソソーム蓄積障害が関与する症状から選択される。別の特定の実施態様では、ミトコンドリア障害が関与する症状は、神経変性疾患；ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）症候群；レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；神経障害性−運動失調症−網膜色素変性症−母性遺伝リー症候群（ＮＡＲＰ−ＭＩＬＳ）；ダノン病；心筋梗塞につながる虚血性心疾患；多種スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）；ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ  ＩＩ）；ムコリピドーシスＩＩＩ（ＭＬ  ＩＩＩ）；ムコリピドーシスＩＶ（ＭＬ  ＩＶ）；ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）；神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ１）；アルパーズ病；バース症候群；β−酸化欠損；カルニチンアシルカルニチン欠損症；カルニチン欠損症；クレアチン欠損症候群；補酵素Ｑ１０欠損症；複合体Ｉ欠損症；複合体ＩＩ欠損症；複合体ＩＩＩ欠損症；複合体ＩＶ欠損症；複合体Ｖ欠損症；ＣＯＸ欠損症；慢性進行性外眼筋麻痺症候群（ＣＰＥＯ）；ＣＰＴ  Ｉ欠損症；ＣＰＴ  ＩＩ欠損症；グルタル酸尿症ＩＩ型；カーンズ・セイヤー症候群；乳酸アシドーシス；長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＣＨＡＤ）；リー病又は症候群；致死乳児心筋症（ＬＩＣ）；ルフト病；グルタル酸尿症ＩＩ型；中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤ）；赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）症候群；ミトコンドリア劣性運動失調症候群；ミトコンドリア細胞症；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群；筋神経胃腸障害及び脳症；ピアソン症候群；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症；ＰＯＬＧ突然変異；中鎖／短鎖３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｍ／ＳＣＨＡＤ）欠損症；並びに超長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＶＬＣＡＤ）欠損症から選択される。より特定の施態様では、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、虚血、脳卒中、レビー小体型認知症及び前頭側頭型認知症から選択される。
【００２５】
本発明の別の実施態様は、被験体における神経変性疾患を処置するためのＵＳＰ３０インヒビターであって、前記被験体に投与することを含むＵＳＰ３０インヒビターである。特定の（raticular）実施態様では、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、虚血、脳卒中、レビー小体型認知症及び前頭側頭型認知症から選択される。
【００２６】
また、本発明のある実施態様は、被験体におけるパーキンソン病を処置するためのＵＳＰ３０インヒビターである。
【００２７】
本発明の別の実施態様では、前記ＵＳＰ３０インヒビターは、経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与される。
【００２８】
本発明の特定の実施態様では、本明細書に記載される処置で使用するためのＵＳＰ３０インヒビターは、少なくとも１つのさらなる治療剤と組み合わせられる。さらなる特定の実施態様では、前記少なくとも１つのさらなる治療剤は、レボドパ、ドーパミンアゴニスト、モノアミノオキシゲナーゼ（ＭＡＯ）Ｂインヒビター、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）インヒビター、抗コリン薬、アマンタジン、リルゾール、コリンエステラーゼインヒビター、メマンチン、テトラベナジン、抗精神病薬、クロナゼパム、ジアゼパム、抗鬱薬及び抗痙攣薬から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本特許又は本出願の書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を含む本特許又は本特許出願公報のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供されるであろう。
【００３０】
【図１】図１Ａは、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ及び個々のＦＬＡＧタグ付ＤＵＢでコトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の免疫染色を示す。発現の２４時間後、ＣＣＰ（２０μM、２４時間）で細胞を処理し、ＧＦＰ、ＦＬＡＧ及び内因性Ｔｏｍ２０について免疫染色した。ＦＬＡＧタグ付ＵＳＰ３０、ＤＵＢＡ２、ＵＣＨ−Ｌ１、ＵＳＰ１５及びＡＴＸＮ３について、代表的な画像を示す；他のＤＵＢは示さず。スケールバー、１０μm。図１Ｂは、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ並びに示されているコントロール（β−Ｇａｌ）及びＵＳＰ３０構築物でコトランスフェクションしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の免疫染色を示す。発現の２４時間後、ＣＣＣＰ（２０μM、２４時間）で細胞を処理し、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ並びに内因性Ｔｏｍ２０及びＨＳＰ６０について免疫染色した（スケールバー、５μm）。図１Ｃは、図１ＢのＴｏｍ２０又はＨＳＰ６０染色細胞の割合の定量を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。Ｎ＝３回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。図１Ｄは、図１Ｂの全Ｔｏｍ２０及びＨＳＰ６０蛍光強度／細胞の定量を示す（＊＊ｐ＜０．０１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。それぞれコントロール（β−Ｇａｌ）群、ＵＳＰ３０−ＦＬＡＧ群及びＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓ−ＦＬＡＧ群について、ｎ＝細胞６３個、６７個及び５４個。Ｎ＝３回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。図１Ｅは、図１ＢのＰａｒｋｉｎクラスタを含有する細胞の割合の定量を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。Ｎ＝３回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。
【図２】図２Ａは、培養ラット海馬ニューロンにおけるトランスフェクションＵＳＰ３０−ＦＬＡＧ（赤色）及びミトコンドリアターゲティングＧＦＰ（緑色）の免疫染色を示す。重ね合わせはカラーで示されている；個々のチャネルはグレースケールで示されている。スケールバー、５μm。図２Ｂは、コントロール又はＵＳＰ３０  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＳＨ−Ｓｙ５Ｙ細胞の免疫染色を示す。ノックダウンの３日後、細胞を固定し、内因性ＵＳＰ３０及びＨＳＰ６０について免疫染色した。ＵＳＰ３０  ｓｉＲＮＡは、主にミトコンドリアのＵＳＰ３０抗体染色を減少させた（スケールバー、５μm）。枠で囲まれた領域の高倍率画像を右のパネルに示す（スケールバー、２μm）。図２Ｃは、ＵＳＰ３０、ＨＳＰ６０及びＧＡＰＤＨ抗体による、ラット脳由来の細胞質画分及びミトコンドリアが豊富な画分の免疫ブロットを示す。図２Ｄは、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ並びに示されているコントロール（β−Ｇａｌ）及びＵＳＰ３０構築物でコトランスフェクションしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の免疫染色を示す。発現の２４時間後、ＣＣＣＰ（２０μM、４時間）で細胞を処理し、ＧＦＰ、ＦＬＡＧ並びに内因性Ｔｏｍ２０及びポリユビキチン鎖について免疫染色した（ＦＫ２抗体で検出）（スケールバー、５μm）。図２Ｅは、図２Ｄのミトコンドリア面積によって標準化したミトコンドリア関連ポリユビキチン染色強度の定量を示すプロットである（ミトコンドリアＦＫ２染色の蛍光強度／Ｔｏｍ２０染色の面積を統合）。（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。それぞれβ−Ｇａｌ群、ＵＳＰ３０−ＦＬＡＧ群及びＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓ−ＦＬＡＧ群について、ｎ＝細胞６１個、４５個及び５９個。エラーバーはＳＥＭを表す）。図２Ｆは、示されているコントロール（β−Ｇａｌ）及びＵＳＰ３０構築物でトランスフェクションしたＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ発現安定ＨＥＫ−２９３細胞由来の細胞溶解物の免疫ブロットを示す。発現の２４時間後、ＣＣＣＰ（５μM、２時間）で細胞を処理し、溶解した。図２Ｇは、アクチンに対して標準化した図２ＦのＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎの免疫ブロットシグナルの定量を示すプロットである（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。Ｎ＝６回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。
【図３】図３Ａは、ｍｔ−Ｋｅｉｍａが細胞質（緑色）及びリソソーム（赤色）ミトコンドリアをディファレンシャルに強調していることを示す。ｍｔ−Ｋｅｉｍａ及びＧＦＰで培養海馬ニューロンをトランスフェクションした。発現の２日後、４５８nm（緑色で示す）又は５４３nm（赤色で示す）の光励起で細胞をイメージングした。ＧＦＰシグナルを使用して、細胞の輪郭を示した（白色で示す）。スケールバー、５μm。図３Ｂは、Ｐａｒｋｉｎ  ｓｈＲＮＡノックダウン構築物でトランスフェクションしたニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａのイメージングを示す。スケールバー、５μm。図３Ｃは、図３Ｂのマイトファジー指数の定量を示すプロットである（＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。ｎ＝細胞５２〜１０９個／群。Ｎ＝３〜６回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。図３Ｄは、ＰＩＮＫ１  ｓｈＲＮＡノックダウン構築物でトランスフェクションしたニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａのイメージングを示す。スケールバー、５μm。図３Ｅは、図３Ｄのマイトファジー指数の定量を示すプロットである（＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。ｎ＝細胞５２〜１０９個／群。Ｎ＝３〜６回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。図３Ｆは、ＰＩＮＫ１−ＧＦＰ及びＰａｒｋｉｎ−ｓｈＲＮＡ＃１（コントロールとしてルシフェラーゼｓｈＲＮＡ及びβ−Ｇａｌ）でトランスフェクションしたニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａのイメージングを示す。スケールバー、５μm。図３Ｇは、図３Ｆのマイトファジー指数の定量を示すプロットである（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。ｎ＝細胞５５〜７７個。Ｎ＝３回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。
【図４】図４Ａは、ＮＨ４Ｃｌ処理（５０mM、２分間）の前後の培養海馬ニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａのイメージングを示す。５４３nm又は４５８nmのレーザー励起源を用いて収集したｍｔ−Ｋｅｉｍａシグナルをそれぞれ赤色及び緑色で示す。スケールバー、５μm。図４Ｂは、海馬ニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａ及びLysotracker（グレースケールで示されている）のイメージングを示す。スケールバー、５μm。図４Ｃは、ｍｔ−Ｋｅｉｍａシグナルについてイメージングしたニューロンにおける内因性ＬＡＭＰ−１の事後免疫染色を示す。ｍｔ−Ｋｅｉｍａをイメージングした直後に、細胞を固定し、抗ＬＡＭＰ１抗体で染色した（グレースケールで示されている）。スケールバー、５μm。図４Ｄは、培養海馬ニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａ発現の１日、３日及び６〜７日後のマイトファジー指数の定量を示すプロットである（＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Bonferroni多重比較検定を使用。ｎ＝細胞５６〜１４６個。Ｎ＝６回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。図４Ｅは、ＦＬＡＧ−Ｐａｒｋｉｎ  ｃＤＮＡ及びＰａｒｋｉｎ  ｓｈＲＮＡ発現構築物でトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞溶解物の免疫ブロットである。ＰＳＤ−９５−ＦＬＡＧをコントロールとしてコトランスフェクションした。図４Ｆは、ＰＩＮＫ１−ＧＦＰ  ｃＤＮＡ及びＰＩＮＫ  ｓｈＲＮＡ構築物でトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞溶解物の免疫ブロットである。ＰＳＤ−９５−ＦＬＡＧをコントロールとしてコトランスフェクションした。図４Ｇは、示されているｓｈＲＮＡを発現するアデノ随伴ウイルスを感染させた培養海馬ニューロンにおける内因性Ｐａｒｋｉｎの免疫ブロットを示す。図４Ｈは、示されているｓｈＲＮＡを発現するアデノ随伴ウイルスを感染させた培養海馬ニューロンにおける内因性ＰＩＮＫ１の免疫ブロットを示す。図４Ｉは、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ（又はコントロールとしてＧＦＰ）でトランスフェクションしたニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａのイメージングを示す。スケールバー、５μm。図４Ｊは、図４Ｉのマイトファジー指数の定量を示すプロットである（ｐ＝０．５２、Student ｔ検定による。ｎ＝細胞６１〜６７個。Ｎ＝３回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。
【図５】図５Ａは、ＵＳＰ３０−ＦＬＡＧ又はＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓ−ＦＬＡＧでトランスフェクションしたニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａのイメージングを示す。スケールバー、５μm。図５Ｂは、示されているｃＤＮＡ及びｓｈＲＮＡ構築物でトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞溶解物の免疫ブロットを示す。ＰＳＤ−９５−ＦＬＡＧをコントロールとしてコトランスフェクションした。図５Ｃは、ＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡを発現するアデノ随伴ウイルス粒子を感染させた培養海馬ニューロンにおける内因性ＵＳＰ３０の免疫ブロットを示す。図５Ｄは、ラットＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡ及びヒトＵＳＰ３０  ｃＤＮＡ発現構築物（コントロールとしてルシフェラーゼｓｈＲＮＡ及びβ−Ｇａｌ）でトランスフェクションしたニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａのイメージングを示す。スケールバー、５μm。図５Ｅは、図５Ａのマイトファジー指数の定量を示すプロットである（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Bonferroni多重比較検定による。ｎ＝細胞４３〜１２２個。Ｎ＝６回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。図５Ｆは、図５Ｂのマイトファジー指数の定量を示すプロットである（＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。ｎ＝細胞９６〜１０１個。Ｎ＝４回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。
【図６】図６Ａは、ＨＡ−ユビキチン及び示されている構築物でトランスフェクションした（ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎを欠く）親ＨＥＫ−２９３細胞株における内因性ＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０の抗ＨＡ−免疫沈降物の免疫ブロットを示す。発現の２４時間後、ＣＣＣＰ（５μM、２時間）で細胞を処理し、抗ＨＡビーズでユビキチン化タンパク質を免疫沈降した。示されている抗体で免疫沈降物及びインプットをブロットした。図６Ｂは、ＵＳＰ３０ノックダウンした場合の内因性ＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０の抗ＨＡ−免疫沈降物の免疫ブロットを示す。ＨＡ−ユビキチン並びに示されているｓｈＲＮＡ及びｃＤＮＡ発現構築物で、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ発現安定ＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクションした。発現の６日後、図６Ａのように細胞を処理した。図６Ｃ及びＥは、示されているＨＡタグ付ユビキチン突然変異体でトランスフェクションし、ＣＣＣＰ（２０μM、２時間）で処理した細胞由来の内因性Ｍｉｒｏ及びＴｏｍ２０の抗ＨＡ免疫沈降物の免疫ブロットを示す。図６Ｄ及びＦは、（Ｃ）及び（Ｅ）の免疫ブロットシグナルの定量を示す。ユビキチン突然変異体によってもたらさたユビキチン化の量を、野生型ユビキチンと比べて報告する（＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１、「野生型ＨＡ−ユビキチン＋ＣＣＣＰ」群との比較、Dunnett多重比較検定による一元ＡＮＯＶＡを使用。δは＊＊＊ｐ＜０．００１を示す）。図６Ｇは、示されているＦＬＡＧタグ付ＵＳＰ３０構築物でトランスフェクションし、ＣＣＣＰ（５μM、１〜６時間）で処理したＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ  ＨＥＫ−２９３安定細胞溶解物の免疫ブロットを示す。図６Ｈは、図６Ｇに示されているアクチンに対して標準化した免疫ブロットシグナルの定量を示すプロットである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、β−Ｇａｌコントロールとの比較、Bonferroni多重比較検定による二元ＡＮＯＶＡを使用。全ての他のタンパク質（ＶＤＡＣ、Ｍｆｎ−１、Ｔｏｍ７０、Ｈｓｐ６０）の免疫ブロットシグナルが有意に達しなかった。Ｎ＝３〜５回の実験）。
【図７】図７Ａは、ＵＳＰ３０を過剰発現させた場合の内因性ＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０の抗ＨＡ−免疫沈降物の免疫ブロットを示す。ＨＡ−ユビキチン及び示されている構築物で、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ安定発現ＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクションした。発現の２４時間後、ＣＣＣＰ（５μM、２時間）で細胞を処理し、抗ＨＡビーズでユビキチン化タンパク質を免疫沈降した。示されている抗体で免疫沈降物及びインプットをブロットした。図７Ｂは、図７Ａの共免疫沈降ＭＩＲＯの免疫ブロットシグナルの定量を示すプロットである。図７Ｃは、図７Ａの共免疫沈降Ｔｏｍ２０の免疫ブロットシグナルの定量を示すプロットである。抗ＨＡビーズで共沈降したタンパク質レベルを「β−Ｇａｌ＋ＣＣＣＰ」群に対して標準化している（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による、β−Ｇａｌ＋ＣＣＣＰとの比較。Ｎ＝３〜５回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。図７Ｄは、ＵＳＰ３０ノックダウンした場合の内因性ＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０の抗ＨＡ免疫沈降物の免疫ブロットを示す。ＨＡ−ユビキチン及び示されているｓｈＲＮＡプラスミドで、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ発現安定ＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクションした。発現の６日後、図７Ａのように細胞を処理した。図７Ｅは、図７Ｄの共免疫沈降ＭＩＲＯの免疫ブロットシグナルの定量を示すプロットである。図７Ｆは、図７Ｄの共免疫沈降Ｔｏｍ２０の免疫ブロットシグナルの定量を示すプロットである。抗ＨＡビーズで共沈降したタンパク質レベルを「ルシフェラーゼｓｈＲＮＡ＋ＣＣＣＰ」群に対して標準化している（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による、「ルシフェラーゼｓｈＲＮＡ＋ＣＣＣＰ」との比較。Ｎ＝４〜６回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。
【図８】図８Ａは、示されている構築物でトランスフェクションしたＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ  ＨＥＫ−２９３細胞由来のＨＡ−ユビキチン沈降物の免疫ブロットを示す。トランスフェクション及びＣＣＣＰ処理（５μM、２時間）後、抗ＨＡビーズでユビキチン化タンパク質を免疫沈降し、示されている抗体で沈降物及びインプットを免疫ブロットした。図８Ｂは、Ｔｏｍ２０−ｍｙｃ及びＵＳＰ３０構築物（コントロールとしてβ−Ｇａｌ）でトランスフェクションしたニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａのイメージングを示す。スケールバー、５μm。図８Ｃは、ＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡ及びＭＩＲＯ  ｃＤＮＡ構築物（コントロールとしてルシフェラーゼＲＮＡｉ及びβ−Ｇａｌ）でトランスフェクションしたニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａのイメージングを示す。スケールバー、５μm。図８Ｄは、図８Ｂのマイトファジー指数の定量を示すプロットである（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。全ての群について、ｎ＝細胞６７〜８０個。Ｎ＝３回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。図８Ｅは、図８Ｃのマイトファジー指数の定量を示すプロットである（＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Bonferroni多重比較検定による。全ての群について、ｎ＝細胞７２〜７５個。Ｎ＝３回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。
【図９】図９Ａは、ＵＳＰ３０ノックダウン実験におけるＴｏｍ２０から同定されたＫ−ＧＧペプチドに対応する抽出イオンクロマトグラムを示す。各ユビキチン化ペプチドの相対存在量を、最も豊富な分析（前駆イオンが示したｍ／ｚが各ピークを上回っている）と比べてｙ軸上に示す。各Ｋ−ＧＧペプチドの配列は、下方に緑色で示されている。アスタリスクは、改変リシン残基を示す。図９Ｂは、Ｐａｒｋｉｎ過剰発現実験におけるＵＳＰ３０から同定されたＫ−ＧＧペプチドに対応する抽出イオンクロマトグラムを示す。データを（Ａ）と同様に示す。図９Ｃは、野生型、Ｋ１６１Ｎ及びＧ４３０Ｄ  ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ構築物でトランスフェクションした細胞由来の内因性ＵＳＰ３０の抗ＨＡ−免疫沈降物の免疫ブロットを示す。発現の２４時間後、ＣＣＣＰ（２０μM、２時間）で細胞を処理し、抗ＨＡビーズでユビキチン化タンパク質を免疫沈降した。示されている抗体で免疫沈降物及びインプットをブロットした。図９Ｄは、（Ｃ）の共免疫沈降ＵＳＰ３０の免疫ブロットシグナルの定量を示す。抗ＨＡビーズで共沈降したタンパク質レベルを「野生型ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ＋ＣＣＣＰ」群に対して標準化している（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による、「野生型ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ＋ＣＣＣＰ」との比較。Ｎ＝４回の実験。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す）。図９Ｅは、示されているＧＦＰ及びＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ構築物でトランスフェクションし、ＣＣＣＰ（２０μM）で処理したＨＥＫ−２９３細胞から調製した溶解物の免疫ブロットを示す。図９Ｆは、アクチンに対して標準化した（Ｅ）のＵＳＰ３０の免疫ブロットシグナルの定量を示す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、野生型ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎとの比較、Bonferroni多重比較検定による二元ＡＮＯＶＡを使用。Ｎ＝４回の実験。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す）。
【図１０】図１０Ａは、示されているｓｉＲＮＡ及びｃＤＮＡ発現構築物でトランスフェクションしたＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ−Ｇ４３０Ｄ発現安定ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における免疫染色を示す。発現の３日後、ＣＣＣＰ（２０μM、２４時間）で細胞を処理し、固定し、ＧＦＰ、ＦＬＡＧ及び内因性Ｔｏｍ２０について染色した。スケールバー、５μm。図１０Ｂは、図１０ＡのＴｏｍ２０蛍光強度の定量を示すプロットである（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。エラーバーはＳＥＭを表す）。図１０Ｃは、図１０ＡのＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ−Ｇ４３０Ｄ斑点面積の定量を示すプロットである（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による、エラーバーはＳＥＭを表す）。図１０Ｄは、Ｐａｒｋｉｎ  ｓｈＲＮＡ及びＵＳＰ３０−Ｃ７７Ａ−ＦＬＡＧでトランスフェクションしたニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａのイメージングを示す。スケールバー、５μm。図１０Ｅは、図１０Ｄのマイトファジー指数の定量を示すプロットである（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。ｎ＝細胞７１〜７７個。Ｎ＝３回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。
【図１１】図１１Ａは、ＵＳＰ３０  ｓｉＲＮＡで３日間トランスフェクションしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における内因性ＵＳＰ３０の免疫ブロットを示す。図１１Ｂ及び１１Ｃは、示されているｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ−Ｇ４３０Ｄ発現安定ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における免疫染色を示す。ノックダウンの３日後、ＣＣＣＰ（２０μM、２４時間）で細胞を処理し、固定し、ＧＦＰ及び内因性Ｔｏｍ２０について染色した。スケールバー、５μm。図１１Ｄは、コントロールｓｉＲＮＡに対して標準化した図１１Ｂ及び１１ＣのＴｏｍ２０染色強度の倍率変化の定量を示すプロットである（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。エラーバーはＳＥＭを表す）。図１１Ｅ及び１１Ｆは、ＵＳＰ３０  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ−Ｇ４３０Ｄ（Ｅ）及びＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ−Ｋ１６１Ｎ（Ｆ）発現ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における免疫染色を示す。ノックダウンの３日後、ＣＣＣＰ（２０μM、２４時間）で細胞を処理し、固定し、ＧＦＰ並びに内因性Ｔｏｍ２０及びＨＳＰ６０について染色した。スケールバー、５μm。図１１Ｇ及び１１Ｈは、コントロールｓｉＲＮＡに対して標準化した図１１Ｅ及び１１ＦのＴｏｍ２０（Ｇ）及びＨＳＰ６０（Ｈ）染色強度の倍率変化の定量を示すプロットである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊＜０．００１、Student ｔ検定による。Ｎ＝２〜３回の実験。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す）。
【図１２】図１２Ａは、野生型、ｐａｒｋｉｎ突然変異体（ｐａｒｋ２５）及び「ｐａｒｋｉｎ突然変異体；ｄＵＳＰ３０ノックダウン」（ｐａｒｋ２５；アクチン−ＧＡＬ４＞ＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉ）ハエ由来の間接飛翔筋（ＩＦＭ）の横断面を示す。電子密度の高いミトコンドリアは、矢印でマーキングされている。減少及び崩壊したクリステを有するミトコンドリア（従って、外見は淡色）の輪郭は、破線で示されている（上のパネル−スケールバー、１μm）。高倍率画像を下のパネルに示す（スケールバー、０．２μm）。図１２Ｂ及びＣは、（Ａ）のミトコンドリア完全性の定量を示す。全ミトコンドリア面積に対する、崩壊したクリステを含有するミトコンドリア面積の割合（Ｂ）、及び崩壊したミトコンドリアを含有する筋面積の割合（Ｃ）を盲検的に定量する（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ−Bonferroni多重比較検定による野生型との比較。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｐａｒｋ２５対ｐａｒｋ２５；アクチン−ＧＡＬ４＞ＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉ。ハエ１匹当たりのイメージング領域３４〜５５個、Ｎ＝ハエ３〜４匹。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す）。図１２Ｄ及びＥは、Drosophilaにおけるクライミングアッセイに対するｄＵＳＰ３０ノックダウン及びパラコートの効果を示す。示されている遺伝子型について、ビヒクル（５％スクロース）又はパラコート（１０mM、４８時間）で処理したもののうち、３０秒間で１５cm超登るハエの割合（＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１、Bonferroni多重比較検定による一元ＡＮＯＶＡによる。Ｎ＝４〜１０回の実験。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す）。図１２Ｆは、示されている遺伝子型について、ＥＬＩＳＡによって決定した場合の、Drosophilaの頭部１個当たりのドーパミン神経伝達物質レベルを示す（＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Bonferroni多重比較検定による。ｎ＝頭部２８個／遺伝子型。Ｎ＝４回の実験。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す）。図１２Ｇ及びＨは、Drosophilaの生存に対するｄＵＳＰ３０ノックダウン及びパラコートの効果を示す。示されている遺伝子型について、ビヒクル又はパラコート（１０mM、最大９６時間）で処理したもののうち、依然として生きているハエの割合（＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１、Bonferroni多重比較検定による二元ＡＮＯＶＡを使用。Ｎ＝３回（Ｇ）及び４回（Ｈ）の実験。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す）。
【図１３】図１３は、ＵＳＰ３０ノックダウン（左側）及びＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ過剰発現（右側）実験の両方における「組み合わせ」処理対ＣＣＣＰ処理のみについて、そのユビキチン化が有意に増加した（ｐ＜０．０５）４１個のタンパク質のサブセットを実証する非対称「火山型プロット」を示す。「組み合わせ」は、それぞれ２つの実験において、ＣＣＣＰで処理したＵＳＰ３０−ｓｈＲＮＡ発現細胞、又はＣＣＣＰで処理したＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ発現細胞を指す。このタンパク質サブセットについて、ユビキチン化（ｘ軸）及びｐ値（ｙ軸）の倍率増加を報告する。（Human MitoCartaデータベースに基づいて同定された）ミトコンドリアタンパク質は、赤色で示されている。
【図１４】図１４は、実施例１０に記載されているように、阻害ペプチドＵＳＰ３０＿３（「ｐｅｐ３」；配列番号１）及びＵＳＰ３０＿８（「ｐｅｐ８」；配列番号２）による様々なペプチダーゼ（ＵＳＰ３０を含む）の阻害を示す。
【図１５】図１５は、実施例１０に記載されているように、ＵＳＰ３０＿３及び特定の親和性成熟ペプチドのペプチド位置による残基確率のグラフを、信号対雑音比（「Ｓ／Ｎ」）、ＥＬＩＳＡシグナル（「シグナル」）、各配列のクローン数（「ｎ」）、クローンの総数（「合計」）及びユニークな配列の数（「Ｕｎｉｑ」）と共に示す。
【図１６】図１６は、実施例１０に記載されているように、ＵＳＰ３０＿３及び３個の親和性成熟ペプチドの信号対雑音比のグラフを示す。各ペプチドについて、試験したターゲットは、左から右にＵＳＰ２、ＵＳＰ７、ＵＳＰ１４、ＵＳＰ３０、ＵＣＨＬ１、ＵＣＨＬ３及びＵＣＨＬ５であった。各ペプチドの配列を以下に示す。
【図１７】図１７Ａは、ＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡでトランスフェクションした海馬ニューロンにおけるｍｉｔｏ−ｒｏＧＦＰのレシオメトリックイメージングを示す。０（ＤＴＴ処理（１mM）後のｍｉｔｏ−ｒｏＧＦＰ比、黒色で示されている）〜１（アルドリチオール処理（１００μM）後のｍｉｔｏ−ｒｏＧＦＰ比、赤色で示されている）の「カラースケール」で「相対的酸化指数」を示した。図１７Ｂは、図１７Ａの相対的酸化の定量を示すプロットである（＊＊＊ｐ＜０．００１、Student ｔ検定による。ｎ＝細胞２４個（ルシフェラーゼｓｈＲＮＡ）及び細胞３６個（ＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡ）、Ｎ＝３回の実験。エラーバーはＳＥＭを表す）。図１７Ｃは、ｄＵＳＰ３０  ｍＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲを示す。アクチン−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉ及びアクチン−ＧＡＬ４＞ＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉハエのｑＲＴ−ＰＣＲをアクチン−ＧＡＬ４と比べて表した。各群において、ｄＵＳＰ３０  ｍＲＮＡレベルをDrosophila ＲｐＩＩ１４０  ｍＲＮＡレベルに対して標準化した。Ｎ＝７回の実験。＊＊＊ｐ＜０．００１、Bonferroni多重比較検定による一元ＡＮＯＶＡによる。図１７Ｄは、コントロールハエ（アクチンＧＡＬ４）におけるクライミングアッセイを示す。ビヒクルコントロール（５％スクロース）又はパラコート（１０mM、４８時間）でハエを処理した。示されているように、パラコートと同時にＬ−ＤＯＰＡ（１mM、４８時間）を投与した。（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定による。Ｎ＝６回の実験。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す）。図１７Ｅは、ＥＬＩＳＡによって評価した場合の、ハエの頭部１個当たりのセロトニンレベルを示す。パラコート（１０mM、４８時間）又はビヒクルコントロール（５％スクロース）でハエを処理した。（一元ＡＮＯＶＡ−Bonferroni多重比較検定によって、ｐ値を計算した。ｎ＝頭部８個、Ｎ＝２回の実験。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す）。図１７Ｆ及びＧは、示されている遺伝子型のハエにおける（Ｆ）ｄＵＳＰ４７及び（Ｇ）ｄＹＯＤ１  ｍＲＮＡレベルの定量ＲＴ−ＰＣＲ測定結果を、アクチン−ＧＡＬ４遺伝子型と比べて表したものを示す。ＴａｑＭａｎアッセイＤｍ０１７９５２６９＿ｇ１（Drosophila  ＣＧ５４８６（ＵＳＰ４７））及びＤｍ０１８４０１１５＿ｓ１（Drosophila  ＣＧ４６０３（ＹＯＤ１））を使用した。Ｄｍ０２１３４５９３＿ｇ１（ＲｐＩＩ１４０）を標準化に使用した。（ｐ＊＊＜０．０１及びｐ＊＊＊＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ−Dunnett多重比較検定を使用。Ｎ＝３回の反復。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す）。図１７Ｈ及びＩは、ビヒクル又はパラコート（１０mM）で処理した、示されている遺伝子型のハエの生存曲線を示す。グラフは、パラコート給餌後の示されている時点で生きているハエの割合を示す。（＊ｐ＜０．０５、ｐ＊＊＜０．０１及びｐ＊＊＊＜０．００１、Bonferroni多重比較検定による二元ＡＮＯＶＡを使用。Ｎ＝５回（Ｈ）及び４回（Ｉ）の実験。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す）。
【００３１】
詳細な説明
本発明者らは、ＵＳＰ３０（これは、ミトコンドリアに局在するデユビキチナーゼ（ＤＵＢ）である）をＰａｒｋｉｎ媒介性マイトファジーのアンタゴニスト（atagonist）として同定した。ＵＳＰ３０は、そのデユビキチナーゼ活性を介して、損傷ミトコンドリアのユビキチン化及び分解に対して反作用するので、ＵＳＰ３０の阻害は、突然変異体Ｐａｒｋｉｎによって引き起こされるマイトファジーの障害をレスキューする。さらに、ＵＳＰ３０のＵＳＰ３０阻害は酸化ストレスを減少させ、ミトコンドリア毒素のロテノンに対する保護を提供する。損傷ミトコンドリアはＰａｒｋｉｎを蓄積する可能性が高いので、ＵＳＰ３０の阻害は、不健全なミトコンドリアを選択的にクリアランスするはずである。ニューロン（例えば、パーキンソン病におけるミトコンドリア機能障害に対して特に脆弱な黒質ニューロン）に加えて、心筋細胞などの長命の代謝活性細胞も、効率的なミトコンドリア品質コントロールシステムに依拠している。これに関連して、Ｐａｒｋｉｎは、虚血性ストレスに応じてマイトファジーを活性化し、損傷ミトコンドリアをクリアランスすることによって、虚血／再灌流傷害から心筋細胞を保護することが示されている。従って、ＵＳＰ３０インヒビターにより、神経学的症状、心臓症状及び全身症状を含むミトコンドリア障害が関与する症状の処置が提供される。
【００３２】
Ｉ．定義
「インヒビター」は、ターゲットの活性の１つ以上を遮断し、中和し、阻害し、無効化し、減少させ及び／若しくは干渉することができ、並びに／又はターゲットタンパク質の発現（又は、ターゲットタンパク質をコードする核酸の発現）を減少させることができる薬剤を指す。インヒビターとしては、限定されないが、抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び他の阻害ＲＮＡ、低分子（例えば、無機低分子）、多糖、ポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー及びペプチボディが挙げられる。インヒビターは、ターゲットタンパク質の活性及び／又は発現を、そのインヒビターで処理されていないターゲットタンパク質の発現及び／又は活性と比較して少なくとも１０％減少（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又はさらには１００％減少）させ得る。
【００３３】
「ＵＳＰ３０インヒビター」は、ＵＳＰ３０の活性の１つ以上を遮断し、中和し、阻害し、無効化し、減少させ及び／若しくは干渉することができ、並びに／又はＵＳＰ３０の発現（又は、ＵＳＰ３０をコードする核酸の発現）を減少させることができる薬剤を指す。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターは、ＵＳＰ３０のデユビキチナーゼ活性を減少させる。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターは、デユビキチナーゼ活性を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は１００％減少させる。デユビキチナーゼ活性は、限定されないが、ＵＳＰ３０の活性部位に干渉すること、ターゲット認識に干渉すること、ＵＳＰ３０のコンフォメーションを変化させること、ＵＳＰ３０の適切な細胞内局在性に干渉することなどを含む任意の機構によってインヒビターによって減少され得る。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターは、ｍＲＮＡ（例えば、それは、ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡを生成するためのＵＳＰ３０遺伝子の転写を阻害する）及び／又はタンパク質レベル（例えば、それは、ＵＳＰ３０タンパク質を生成するためのＵＳＰ３０  ｍＲＮＡの翻訳を阻害する）としての発現であり得るＵＳＰ３０発現を阻害する。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０発現インヒビターは、ＵＳＰ３０タンパク質レベルを少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は１００％減少させる。
【００３４】
「マイトファジー」及び「ミトコンドリア分解」という用語は、細胞のリソソーム機構を介してレギュレーションされたミトコンドリア分解を指すために互換的に使用される。
【００３５】
「ミトコンドリア障害が関与する症状」は、細胞集団におけるミトコンドリアの機能、ミトコンドリアの形状／形態、ミトコンドリア膜電位、及び／又はマイトファジーの１つ以上の障害が関与する症状を指す。ミトコンドリア障害が関与する障害としては、限定されないが、細胞集団におけるマイトファジーが正常な細胞集団よりも遅い速度で又は少ない程度に起こるようなマイトファジーの障害が関与する症状が挙げられる。いくつかの実施態様では、マイトファジーの障害は、マイトファジーの減少により障害のあるミトコンドリアの存在が増加するような他のミトコンドリア障害を伴う。ミトコンドリア障害が関与する症状としてはまた、限定されないが、ミトコンドリア機能の変化をもたらすミトコンドリアＤＮＡの突然変異が関与する症状が挙げられる。ミトコンドリア障害が関与する障害としてはまた、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は活性窒素種（ＲＮＳ）レベルの増加がタンパク質凝集及び／又はミトコンドリア機能障害に関連する、ミトコンドリアの酸化ストレスが関与する症状が挙げられる。ミトコンドリアの酸化ストレスはミトコンドリア機能障害をもたらし得るか、又はミトコンドリア機能障害は酸化ストレスをもたらし得る。ミトコンドリア障害が関与する障害としてはまた、限定されないが、ミトコンドリアの形状／形態の障害が関与する症状、及びミトコンドリア膜電位の障害が関与する症状が挙げられる。ミトコンドリア障害が関与する例示的な症状としては、限定されないが、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、虚血、脳卒中、レビー小体型認知症及び前頭側頭型認知症）；ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）症候群；レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；神経障害性−運動失調症−網膜色素変性症−母性遺伝リー症候群（ＮＡＲＰ−ＭＩＬＳ）；ダノン病；赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）症候群；心筋梗塞につながる虚血性心疾患；多種スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）；ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ  ＩＩ）；ムコリピドーシスＩＩＩ（ＭＬ  ＩＩＩ）；ムコリピドーシスＩＶ（ＭＬ  ＩＶ）；ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）；神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ１）；アルパーズ病；バース症候群；β−酸化欠損；カルニチンアシルカルニチン欠損症；カルニチン欠損症；クレアチン欠損症候群；補酵素Ｑ１０欠損症；複合体Ｉ欠損症；複合体ＩＩ欠損症；複合体ＩＩＩ欠損症；複合体ＩＶ欠損症；複合体Ｖ欠損症；ＣＯＸ欠損症；慢性進行性外眼筋麻痺症候群（ＣＰＥＯ）；ＣＰＴ  Ｉ欠損症；ＣＰＴ  ＩＩ欠損症；グルタル酸尿症ＩＩ型；カーンズ・セイヤー症候群；乳酸アシドーシス；長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＣＨＡＤ）；リー病又は症候群；致死乳児心筋症（ＬＩＣ）；ルフト病；グルタル酸尿症ＩＩ型；中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤ）；赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）症候群；ミトコンドリア劣性運動失調症候群；ミトコンドリア細胞症；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群；筋神経胃腸障害及び脳症；ピアソン症候群；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症；ＰＯＬＧ突然変異；中鎖／短鎖３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｍ／ＳＣＨＡＤ）欠損症；並びに超長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＶＬＣＡＤ）欠損症が挙げられる。
【００３６】
Ｐａｒｋｉｎ又はＰＩＮＫ１の「病因性突然変異」は、細胞内の活性の減少をもたらし、機能喪失及び／又は機能獲得が関与し得る各タンパク質又は遺伝子の１つ以上の突然変異（例えば、ドミナントネガティブ突然変異、例えばＰａｒｋｉｎ  Ｑ３１１ｓｔｏｐ）を指す。細胞内のこのような活性の減少としては、限定されないが、酵素活性の減少（例えば、ユビキチン化又はキナーゼ活性の減少）、ドミナントネガティブ突然変異体タンパク質の存在による活性の減少、別の細胞因子に対する結合の減少、細胞内局在の変化による活性の減少、及び／又は細胞若しくは細胞区画内のタンパク質レベルの減少による活性の減少が挙げられ得る。いくつかの実施態様では、Ｐａｒｋｉｎ及び／又はＰＩＮＫ１の病因性突然変異は、マイトファジーの減少をもたらし得るミトコンドリアのユビキチン化の減少をもたらす。病因性突然変異はまた、タンパク質コード領域の外側、例えばイントロン（例えば、スプライシングに影響を与える）、プロモーター、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域などで起こり得る。さらに、Ｐａｒｋｉｎ突然変異は、置換、欠失、挿入、重複など又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。Ｐａｒｋｉｎの非限定的で例示的な病因性突然変異を表１に示す。ＰＩＮＫ１タンパク質の非限定的で例示的な病因性突然変異を表２に示す。Parkinson Disease Mutation Database, http://www.molgen.ua.ac.be/PDmutDB/などのパーキンソン病突然変異のデータベースが公的に利用可能である。
【００３７】
【表１】
0006310919.tif 000002
【００３８】
【表２】
0006310919.tif 000003
【００３９】
「酸化ストレス」という用語は、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は活性窒素種（ＲＮＳ）の増加を指す。いくつかの実施態様では、酸化ストレスは、タンパク質凝集及び／又はミトコンドリア機能障害につながる。いくつかの実施態様では、ミトコンドリア機能障害は、酸化ストレスにつながる。
【００４０】
本明細書で使用される「ＵＳＰ３０」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＵＳＰ３０（「ユビキチン特異的ペプチダーゼ３０」又は「ユビキチン特異的プロテアーゼ３０」）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＵＳＰ３０、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＵＳＰ３０を包含する。この用語はまた、天然に存在するＵＳＰ３０変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＵＳＰ３０のアミノ酸配列を配列番号２６に示す（表４）。
【００４１】
本明細書で使用される「Ｐａｒｋｉｎ」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＰａｒｋｉｎを指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」Ｐａｒｋｉｎ、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＰａｒｋｉｎを包含する。この用語はまた、天然に存在するＰａｒｋｉｎ変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＰａｒｋｉｎのアミノ酸配列を配列番号２９に示す（表４）。
【００４２】
本明細書で使用される「ＰＩＮＫ１」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＰＩＮＫ１（ＰＴＥＮ誘導性推定キナーゼタンパク質１）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＰＩＮＫ１、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＰＩＮＫ１を包含する。この用語はまた、天然に存在するＰＩＮＫ１変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＰＩＮＫ１のアミノ酸配列を配列番号３０に示す（表４）。
【００４３】
本明細書で使用される「Ｔｏｍ２０」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＴｏｍ２０を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」Ｔｏｍ２０、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＴｏｍ２０を包含する。この用語はまた、天然に存在するＴｏｍ２０変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＴｏｍ２０のアミノ酸配列を配列番号２７に示す（表４）。
【００４４】
本明細書で使用される「ＭＩＲＯ１」及び「ＭＩＲＯ」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＭＩＲＯ１（ミトコンドリアＲｈｏＧＴＰａｓｅ１）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＭＩＲＯ１、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＭＩＲＯ１を包含する。この用語はまた、天然に存在するＭＩＲＯ１変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＭＩＲＯ１のアミノ酸配列を配列番号２８に示す（表４）。
【００４５】
本明細書で使用される「ＭＵＬ１」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＭＵＬ１（ＮＦκＢのミトコンドリアユビキチンリガーゼ活性化因子）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＭＵＬ１、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＭＵＬ１を包含する。この用語はまた、天然に存在するＭＵＬ１変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＭＵＬ１のアミノ酸配列を配列番号３２に示す（表４）。
【００４６】
本明細書で使用される「ＡＳＮＳ」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＡＳＮＳ（アスパラギン合成酵素［グルタミン加水分解］）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＡＳＮＳ、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＡＳＮＳを包含する。この用語はまた、天然に存在するＡＳＮＳ変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＡＳＮＳのアミノ酸配列を配列番号３３に示す（表４）。
【００４７】
本明細書で使用される「ＦＫＢＰ８」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＦＫＢＰ８（ＦＫ５０６結合タンパク質８）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＡＳＮＳ、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＦＫＢＰ８を包含する。この用語はまた、天然に存在するＦＫＢＰ８変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＦＫＢＰ８のアミノ酸配列を配列番号３４に示す（表４）。
【００４８】
本明細書で使用される「ＴＯＭ７０」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＴＯＭ７０（外膜７０kDaサブユニットのトランスロカーゼ）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＴＯＭ７０、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＴＯＭ７０を包含する。この用語はまた、天然に存在するＴＯＭ７０変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＴＯＭ７０のアミノ酸配列を配列番号３５に示す（表４）。
【００４９】
本明細書で使用される「ＭＡＴ２Ｂ」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＭＡＴ２Ｂ（メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ２サブユニットベータ）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＭＡＴ２Ｂ、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＭＡＴ２Ｂを包含する。この用語はまた、天然に存在するＭＡＴ２Ｂ変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＭＡＴ２Ｂのアミノ酸配列を配列番号３６に示す（表４）。
【００５０】
本明細書で使用される「ＰＲＤＸ３」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＰＲＤＸ３（ペルオキシレドキシンＩＩＩ）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＰＲＤＸ３、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＰＲＤＸ３を包含する。この用語はまた、天然に存在するＰＲＤＸ３変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＰＲＤＸ３のアミノ酸配列を配列番号３７に示す（表４）。
【００５１】
本明細書で使用される「ＩＤＥ」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＩＤＥ（インスリン分解酵素）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＩＤＥ、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＩＤＥを包含する。この用語はまた、天然に存在するＩＤＥ変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＩＤＥのアミノ酸配列を配列番号３８に示す（表４）。
【００５２】
本明細書で使用される「ＶＤＡＣ１」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＶＤＡＣ１（電位依存性陰イオン選択チャネルタンパク質１）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＶＤＡＣ１、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＶＤＡＣ１を包含する。この用語はまた、天然に存在するＶＤＡＣ１変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＶＤＡＣ１のアミノ酸配列を配列番号３９に示す（表４）。
【００５３】
本明細書で使用される「ＶＤＡＣ２」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＶＤＡＣ２（電位依存性陰イオン選択チャネルタンパク質２）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＶＤＡＣ２、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＶＤＡＣ２を包含する。この用語はまた、天然に存在するＶＤＡＣ２変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＶＤＡＣ２のアミノ酸配列を配列番号４４に示す（表４）。
【００５４】
本明細書で使用される「ＶＤＡＣ３」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＶＤＡＣ３（電位依存性陰イオン選択チャネルタンパク質３）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＶＤＡＣ３、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＶＤＡＣ３を包含する。この用語はまた、天然に存在するＶＤＡＣ３変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＶＤＡＣ３のアミノ酸配列を配列番号４５に示す（表４）。
【００５５】
本明細書で使用される「ＩＰＯ５」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＩＰＯ５（インポーチン５）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＩＰＯ５、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＩＰＯ５を包含する。この用語はまた、天然に存在するＩＰＯ５変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＩＰＯ５のアミノ酸配列を配列番号４０に示す（表４）。
【００５６】
本明細書で使用される「ＰＴＨ２」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＰＴＨ２（ミトコンドリアのペプチジルｔＲＮＡヒドロラーゼ２）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＰＴＨ２、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＰＴＨ２を包含する。この用語はまた、天然に存在するＰＴＨ２変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＰＴＨ２のアミノ酸配列を配列番号４１に示す（表４）。
【００５７】
本明細書で使用される「ＰＳＤ１３」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＰＳＤ１３（２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰａｓｅレギュレーションサブユニット１３）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＰＳＤ１３、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＰＳＤ１３を包含する。この用語はまた、天然に存在するＰＳＤ１３変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＰＳＤ１３のアミノ酸配列を配列番号４２に示す（表４）。
【００５８】
本明細書で使用される「ＵＢＰ１３」という用語は、特に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなＵＢＰ１３（ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼ１３）を指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＵＢＰ１３、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＵＢＰ１３を包含する。この用語はまた、天然に存在するＵＢＰ１３変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。例示的なヒトＵＢＰ１３のアミノ酸配列を配列番号４３に示す（表４）。
【００５９】
「添付文書」という用語は、適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又は治療製品の使用に関する警告についての情報を含有する市販の治療製品パッケージに通常含まれる説明書を指すのに使用される。
【００６０】
「個体」又は「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特定の実施態様では、個体又は被験者はヒトである。
【００６１】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性のパーセント（％）」は、配列をアライメントし、必要な場合にはギャップを導入して配列同一性の最大パーセントを求め、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しないとした後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性のパーセントを決定する目的のアラインメントは、当技術分野の技能の範囲内の様々な方法で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign (DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することによって達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定し得る。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性の％値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech, Inc.によって作製されたものであり、ソースコードは、U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559において使用者用書類と共にファイリングされており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に入手可能であり、又はソースコードからコンパイルし得る。デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムで使用するためには、ALIGN-2プログラムをコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータをALIGN-2プログラムによって設定し、変更しない。
【００６２】
ALIGN-2をアミノ酸配列比較に用いる状況では、所定のアミノ酸配列Ｂに対する所定のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性の％（あるいは、所定のアミノ酸配列Ｂに対して特定のアミノ酸配列同一性の％を有するか又はこれを含む所定のアミノ酸配列Ａと表現され得る）を以下のように計算する：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
（式中、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメント中の、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって同一マッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと同等ではない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性の％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性の％と同等ではないと認識されよう。特に明記しない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性の％値は、直前の段落に記載されているようにALIGN-2コンピュータプログラムを使用して得られる。
【００６３】
「医薬製剤」という用語は、そこに含まれる有効成分の生物学的活性が有効であることを許容にする形態の調製物であって、その製剤を投与する被験体にとって許容不可能なほど毒性のさらなる成分を含有しない調製物を指す。
【００６４】
「薬学的に許容しうる担体」は、医薬製剤中の有効成分以外の成分であって、被験体に対して非毒性の成分を指す。薬学的に許容しうる担体としては、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は保存剤が挙げられる。
【００６５】
本明細書で使用される「処置（treatment）」（及び「処置する（treat）」又は「処置する（treating）」などのその文法変化形）は、処置されている個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理学の過程のいずれかで実施され得る。望ましい処置効果としては、限定されないが、疾患の発症又は再発の予防、症候の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的病理学的結果の縮小、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後改善が挙げられる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるため、又は疾患進行を遅らせるために使用される。
【００６６】
１つ以上のさらなる治療剤と「組み合わせた」投与は、同時（併用）及び任意の順序の連続投与を含む。
【００６７】
薬剤、例えば医薬製剤の「有効量」は、必要な投与量及び期間で、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。
【００６８】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を伝搬することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造物としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それが作動可能に連結された核酸の発現を指令することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
【００６９】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞（このような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞としては、初代トランスフォーメーション細胞及びそれら由来の子孫（継代数にかかわらず）を含む「トランスフォーマント」及び「トランスフォーメーション細胞」が挙げられる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなくてもよく、突然変異を含有し得る。元のトランスフォーメーション細胞でスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体子孫がここに含まれる。
【００７０】
ＩＩ．組成物及び方法
様々な態様では、本発明は部分的には、ＵＳＰ３０インヒビター、並びに疾患及び障害を処置する方法であって、ＵＳＰ３０を阻害することを含む方法に基づくものである。
【００７１】
Ａ．例示的なＵＳＰ３０インヒビター
本発明は部分的には、ＵＳＰ３０活性インヒビター及び／又はＵＳＰ３０発現インヒビターが、ミトコンドリアのユビキチン化及びマイトファジーを増加及び／又は回復させるのに有効であるという発見に基づくものである。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターは、神経変性疾患、例えばパーキンソン病、及びミトコンドリア障害が関与する症状、例えばマイトファジーの障害、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異、ミトコンドリアの酸化ストレス及び／又はリソソーム蓄積障害が関与するものを処置するのに有効である。
【００７２】
ＵＳＰ３０インヒビターとしては、ＵＳＰ３０活性インヒビター及びＵＳＰ３０発現インヒビターが挙げられる。非限定的で例示的なこのようなインヒビターとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗体、ペプチド、ペプチボディ、アプタマー及び低分子が挙げられる。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ＵＳＰ３０発現を阻害するのに使用され得る。いくつかの実施態様では、抗体、ペプチド、ペプチボディ、アプタマー及び低分子は、ＵＳＰ３０活性を阻害するのに使用され得る。ＵＳＰ３０インヒビターのいくつかの非限定的な例は、本明細書に記載されている。本明細書で議論されるものを含む当技術分野における標準的な方法を使用して、さらなるインヒビターを同定し得る。
【００７３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ及び／又はＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ前駆体にハイブリダイゼーションするアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。ＵＳＰ３０をコードする非限定的で例示的なヒトｍＲＮＡ配列を配列番号３０に示す（表４）。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ及び／又はＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ前駆体の領域にハイブリダイゼーションし、二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを切断するＲＮａｓｅ  Ｈによるその分解を指令する。ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ及び／又はＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ前駆体の切断を媒介することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内のＵＳＰ３０タンパク質の量を減少させ得る（すなわち、ＵＳＰ３０発現を阻害し得る）。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ  Ｈによる分解を媒介せず、例えば、翻訳機構の結合若しくはプロセスビリティに干渉することによってｍＲＮＡの翻訳を「遮断」するか、又は例えば、スプライシング機構及び／若しくはスプライス部位のアクセシビリティに干渉することによってｍＲＮＡ前駆体の適切なスプライシングを「遮断」する。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ  Ｈ以外の機構によるｍＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡ前駆体の分解を媒介し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの任意の阻害機構が本明細書で意図される。
【００７４】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０〜５００ヌクレオチド長、又は１０〜４００ヌクレオチド長、又は１０〜３００ヌクレオチド長、又は１０〜２００ヌクレオチド長、又は１０〜１００ヌクレオチド長、又は１５〜１００ヌクレオチド長、又は１０〜５０ヌクレオチド長、又は１５〜５０ヌクレオチド長である。様々な実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個又は少なくとも１００個のヌクレオチドを含むＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡ前駆体の領域にハイブリダイゼーションする。さらに、様々な実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡの領域及び／又はＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ前駆体の領域と１００％相補的である必要はないが、１つ以上のミスマッチを有し得る。従って、いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡの領域及び／又はＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ前駆体の領域と少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的又は１００％相補的である。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡの領域又はＵＳＰ３０  ｍＲＮＡ前駆体の領域は、少なくとも少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００ヌクレオチド長である。
【００７５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合、糖部分及び／又は核酸塩基の１つ以上に対する改変を含み得る。さらに、非ヌクレオチド成分によってヌクレオチドの配列が中断されていてもよいし、及び／又はオリゴヌクレオチドの一端若しくは両端に非ヌクレオチド成分が付加されていてもよい。
【００７６】
非限定的で例示的なヌクレオチド改変としては糖改変が挙げられ、この場合、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかが、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置換されていてもよいし、標準的な保護基によって保護されていてもよいし、若しくはさらなるヌクレオチドに対するさらなる結合を調製するために活性化されていてもよいし、又は固体支持体に結合されていてもよい。５’及び３’末端ＯＨはリン酸化されていてもよいし、又はアミン若しくは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換されていてもよい。他のヒドロキシル基も、標準的な保護基に誘導体化され得る。オリゴヌクレオチドはまた、例えば、２’−Ｏ−メチル−−２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−又は２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドを含む、当技術分野で一般に公知のリボース又はデオキシリボース糖の類似形態を含有し得る。１つ以上のホスホジエステル結合は、改変ヌクレオシド間結合によって置換され得る。これらの改変ヌクレオシド間結合としては、限定されないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各Ｒ又はＲ’は独立して、Ｈ、又は場合によりエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジルを含有する置換若しくは非置換アルキル（１〜２０Ｃである）によって置換されている実施態様が挙げられる。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。前記説明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡを含む本明細書で言及される全てのオリゴヌクレオチドに適用される。
【００７７】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の１つ以上の糖部分は、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−ＯＭｅ）及び２’−フルオロなどの２’改変を含むか、又は二環式糖部分（例えば、ＬＮＡ）である。非限定的で例示的な核酸塩基の改変としては、５−メチルシトシンが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単一のオリゴヌクレオチド内に複数の種類の改変を含み得る。すなわち、非限定的な例として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じオリゴヌクレオチド中に２’−Ｏ−アルキル改変、二環式ヌクレオチド及びホスホロチオエート結合を含み得る。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、「ギャップマー」である。ギャップマーは、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断を媒介するための中央のデオキシリボヌクレオチド領域と、二重鎖の安定性を増加させる改変糖部分を含む５’及び３’「ウィング」とを含む。
【００７８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計及び機構は、例えば、van Roon-Mom et al., Methods Mol. Biol., 867: 79-96 (20120); Prakash, Chem. Biodivers., 8: 1616-1641 (2011); Yamamoto et al., Future Med. Chem., 3: 339-365 (2011); Chan et al., Clin. Exper. Pharmacol. Physiol., 33: 533-540 (2006); Kurreck et al., Nucl. Acids Res., 30: 1911-1918 (2002); Kurreck, Eur. J. Biochem., 270: 1628-1644 (2003); Geary, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 5: 381-391 (2009); "Designing Antisense Oligonucleotides," available online from Integrated DNA Technologies (2011)に記載されている。
【００７９】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０発現は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって阻害される。本明細書で使用されるｓｉＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と同義であり、各末端のヘアピン構造（小ヘアピンＲＮＡ又はｓｈＲＮＡとも称される）の有無にかかわらず、二本鎖ＲＮＡオリゴマーを含む。低分子干渉ＲＮＡは、小分子干渉ＲＮＡ、サイレンシングＲＮＡ、低分子阻害ＲＮＡ及び／又は小分子阻害ＲＮＡとしても公知であり、本明細書では、これらの用語を同等であると考える。
【００８０】
「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」という用語は、遺伝子発現に干渉する小分子二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡが相同遺伝子をサイレンシングする過程であるＲＮＡ干渉のメディエーターである。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、一本鎖オーバーハングを含み得る二重鎖を形成する約１５〜２５ヌクレオチド長の２本の一本鎖ＲＮＡから構成される。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、１５〜２５ヌクレオチド長であり得る二本鎖部分であって、一本鎖オーバーハングを含み得る二本鎖部分を含むヘアピン構造を形成する単一のＲＮＡから構成される。このようなヘアピンｓｉＲＮＡは、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と称され得る。酵素複合体、例えばポリメラーゼによる二本鎖ＲＮＡのプロセシングは、二本鎖ＲＮＡの切断をもたらしてｓｉＲＮＡを生成し得る。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ｍＲＮＡ切断を誘導してｍＲＮＡ分解を促進するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）サイレンシング複合体によって使用される。例えば、哺乳動物細胞において、ｓｉＲＮＡを使用して特定の遺伝子をサイレンシングするために、無関係なｍＲＮＡとの相補性の機会を回避するように塩基対形成領域を選択する。当技術分野では、例えばFire et al., Nature 391:806-811, 1998及びMcManus et al., Nat. Rev. Genet. 3(10):737-747, 2002によって、ＲＮＡｉサイレンシング複合体が同定されている。
【００８１】
いくつかの実施態様では、小分子干渉ＲＮＡは、少なくとも約１０〜約２００個のヌクレオチド、例えば少なくとも約１６個のヌクレオチド、少なくとも約１７個のヌクレオチド、少なくとも約１８個のヌクレオチド、少なくとも約１９個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約２１個のヌクレオチド、少なくとも約２２個のヌクレオチド、少なくとも約２３個のヌクレオチド、少なくとも約２４個のヌクレオチド、少なくとも約２５個のヌクレオチド、少なくとも約２６個のヌクレオチド、少なくとも約２７個のヌクレオチド、少なくとも約２８個のヌクレオチド、少なくとも約２９個のヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも約３５個のヌクレオチド、少なくとも約４０個のヌクレオチド、少なくとも約４５個のヌクレオチド、少なくとも約５０個のヌクレオチド、少なくとも約５５個のヌクレオチド、少なくとも約６０個のヌクレオチド、少なくとも約６５個のヌクレオチド、少なくとも約７０個のヌクレオチド、少なくとも約７５個のヌクレオチド、少なくとも約８０個のヌクレオチド、少なくとも約８５個のヌクレオチド、少なくとも約９０個のヌクレオチド、少なくとも約９５個のヌクレオチド、少なくとも約１００個のヌクレオチド、少なくとも約１１０個のヌクレオチド、少なくとも約１２０個のヌクレオチド、少なくとも約１３０個のヌクレオチド、少なくとも約１４０個のヌクレオチド、少なくとも約１５０個のヌクレオチド又は１５０個超のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、１０〜２００ヌクレオチド長、又は１０〜１００ヌクレオチド長、又は１５〜１００ヌクレオチド長、又は１０〜６０ヌクレオチド長、又は１５〜６０ヌクレオチド長、又は１０〜５０ヌクレオチド長、又は１５〜５０ヌクレオチド長、又は１０〜３０ヌクレオチド長、又は１５〜３０ヌクレオチド長である。特定の実施態様では、ｓｉＲＮＡは、約２１〜約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ及びＤＮＡのヘテロ二重鎖である。
【００８２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に、ｓｉＲＮＡは、糖、ヌクレオシド間結合及び／又は核酸塩基に対する改変を含み得る。ｓｉＲＮＡに使用するのに適切な非限定的で例示的な改変は本明細書に記載されており、例えば、Peacock et al., J. Org. Chem., 76: 7295-7300 (2011); Bramsen et al., Methods Mol. Biol., 721: 77-103 (2011); Pasternak et al., Org. Biomol. Chem., 9: 3591-3597 (2011); Gaglione et al., Mini Rev. Med. Chem., 10: 578-595 (2010); Chernolovskaya et al., Curr. Opin. Mol. Ther., 12: 158-167 (2010)にも記載されている。
【００８３】
細胞におけるＵＳＰ３０発現を阻害するための方法は、部分的又は完全な二本鎖特性を有するｓｉＲＮＡを細胞に導入することを含む。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ＵＳＰ３０遺伝子コード領域又はｍＲＮＡ前駆体に見られるヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡを合成し、被験体に直接導入する。他の実施態様では、ｓｉＲＮＡを特異的に認識してそれを適切な組織又は細胞型に送達するターゲティング送達系（例えば、ターゲット特異的リポソーム）の一部としてｓｉＲＮＡを製剤化し得る。ターゲティングｓｉＲＮＡを被験体に投与すると、ｓｉＲＮＡは適切な細胞型に送達され、それにより、細胞型内のｓｉＲＮＡ濃度が増加する。送達されるｓｉＲＮＡの用量に応じて、この過程は、ＵＳＰ３０タンパク質発現の部分的又は完全な喪失を提供し得る。
【００８５】
他の実施態様では、ＵＳＰ３０遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖をコードする核酸を含む発現構築物を適切な細胞又は組織に提供する。これらの実施態様では、ｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖をコードする核酸を、構成的又は調節的プロモーターのいずれかのコントロール下に配置し得る。いくつかの実施態様では、核酸は、ヘアピン構造を形成するｓｉＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡをコードする。
【００８６】
ｓｉＲＮＡのための様々な担体及び薬物送達系は、例えば、Seth et al., Ther. Deliv., 3: 245-261 (2012); Kanasty et al., Mol. Ther., 20: 513-524 (2012); Methods Enzymol., 502: 91-122 (2012); Vader et al., Curr. Top. Med. Chem., 12: 108-119 (2012); Naeye et al., Curr. Top. Med. Chem., 12: 89-96 (2012); Foged, Curr. Top. Med. Chem., 12: 97-107 (2012); Chaturvedi et al., Expert Opin. Drug Deliv., 8: 1455-1468 (2011); Gao et al., Int. J. Nanomed., 6: 1017-1025 (2011); Shegokar et al., Pharmazie., 66: 313-318 (2011); Kumari et al., Expert Opin. Drug Deliv., 11: 1327-1339 (2011)に記載されている。
【００８７】
抗体
いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターは抗体である。「抗体」という用語は本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体フラグメントを含む様々な抗体構造を包含する。本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、少なくとも軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３とを含む分子であって、抗原に結合することができる分子を指す。抗体という用語は、限定されないが、抗原に結合することができるフラグメント、例えばＦｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及び（Ｆａｂ’）２を含む。抗体という用語はまた、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びマウス、ヒト、カニクイザルなどの様々な種の抗体を含む。
【００８８】
いくつかの実施態様では、抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、これらの一方又は両方が各定常領域を含んでもよいし、又は含まなくてもよい。重鎖可変領域は、重鎖ＣＤＲ１、フレームワーク（ＦＲ）２、ＣＤＲ２、ＦＲ３及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施態様では、重鎖可変領域はまた、ＣＤＲ１のＮ末端にあるＦＲ１の少なくとも一部、及び／又はＣＤＲ３のＣ末端にあるＦＲ４の少なくとも一部を含む。同様に、軽鎖可変領域は、軽鎖ＣＤＲ１、フレームワーク（ＦＲ）２、ＣＤＲ２、ＦＲ３及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施態様では、軽鎖可変領域はまた、ＦＲ１及び／又はＦＲ４を含む。
【００８９】
非限定的で例示的な重鎖定常領域としては、γ、δ及びαが挙げられる。非限定的で例示的な重鎖定常領域としてはまた、ε及びμが挙げられる。各重定常領域は、抗体アイソタイプに対応する。例えば、γ定常領域を含む抗体はＩｇＧ抗体であり、δ定常領域を含む抗体はＩｇＤ抗体であり、α定常領域を含む抗体はＩｇＡ抗体である。特定のアイソタイプをサブクラスにさらに細分化し得る。例えば、ＩｇＧ抗体としては、限定されないが、ＩｇＧ１（γ１定常領域を含む）、ＩｇＧ２（γ２定常領域を含む）、ＩｇＧ３（γ３定常領域を含む）及びＩｇＧ４（γ４定常領域を含む）抗体が挙げられる。非限定的で例示的な軽鎖定常領域としては、λ及びκが挙げられる。
【００９０】
いくつかの実施態様では、抗体は、第１の種（例えば、マウス、ラット、カニクイザルなど）由来の少なくとも１つの可変領域と、第２の種（例えば、ヒト、カニクイザル、ニワトリなど）由来の少なくとも１つの定常領域とを含むキメラ抗体である。キメラ抗体のヒト定常領域は、非ヒト定常領域と同じアイソタイプのものである必要はなく、存在する場合にはそれを交換する。キメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号；及びMorrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-55 (1984)で議論されている。
【００９１】
いくつかの実施態様では、抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、カニクイザル、ニワトリなど）のフレームワーク領域中の少なくとも１個のアミノ酸が、ヒト可変領域由来の対応するアミノ酸で置換されたヒト化抗体である。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つのヒト定常領域又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、（Ｆａｂ’）２などである。例示的なヒト化抗体としては、第１の（非ヒト）種の相補性決定領域（ＣＤＲ）が第２の（ヒト）種のフレームワーク領域（ＦＲ）に移植されたＣＤＲ移植抗体が挙げられる。ヒト化抗体は、非ヒト抗体に対するヒト免疫応答（例えば、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答）（これは、抗体治療薬に対する免疫応答、及び治療薬の有効性の低下をもたらし得る）を軽減又は排除するので、治療分子として有用である。任意の方法によって、抗体をヒト化し得る。非限定的で例示的なヒト化方法としては、例えば、米国特許第5,530,101号；米国特許第5,585,089号；米国特許第5,693,761号；米国特許第5,693,762号；米国特許第6,180,370号; Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-27 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-36 (1988);及び米国特許出願公開第2009/0136500号に記載されている方法が挙げられる。
【００９２】
いくつかの実施態様では、抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒト動物（例えば、XenoMouse（登録商標））において産生される抗体、及びin vitro法（例えば、ファージディスプレイ）を使用して選択される抗体などのヒト抗体であり、抗体レパートリーは、ヒト免疫グロブリン配列に基づくものである。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウス、及びヒト抗体の作製におけるそれらの使用は、例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-55 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-8 (1993); Lonberg et al., Nature 368: 856-9 (1994);並びに米国特許第5,545,807号；米国特許第6,713,610号；米国特許第6,673,986号；米国特許第6,162,963号；米国特許第5,545,807号；米国特許第6,300,129号；米国特許第6,255,458号；米国特許第5,877,397号；米国特許第5,874,299号；及び米国特許第5,545,806号に記載されている。ファージディスプレイライブラリを使用してヒト抗体を作製する方法は、例えば、Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381-8 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-97 (1991);及びWO99/10494に記載されている。
【００９３】
重鎖定常領域の選択は、抗体がin vivoでエフェクター機能を有するか否かを決定し得る。いくつかの実施態様では、このようなエフェクター機能としては、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が挙げられ、抗体が結合した細胞の殺傷をもたらし得る。典型的には、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３重鎖を含む抗体は、エフェクター機能を有する。いくつかの実施態様では、エフェクター機能は望ましくない。いくつかのこのような実施態様では、ヒトＩｇＧ４又はＩｇＧ２重鎖定常領域を選択又は設計し得る。
【００９４】
ペプチド
いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターはペプチドである。ペプチドは、一本鎖のＤ−若しくはＬ−アミノ酸、又はＤ−及びＬ−アミノ酸がペプチド結合によって連結された混合物から構成されるアミノ酸配列である。ペプチドのアミノ酸サブユニットは天然に存在するアミノ酸でもよいし、又は天然に存在しないアミノ酸でもよい。多くの天然に存在しないアミノ酸が当技術分野で公知であり、市販されている。さらに、アミノ酸サブユニットを連結するペプチド結合を改変し得る。例えば、Sigma-Aldrich; Gentilucci et al., Curr. Pharm. Des. 16: 3185-3203 (2010)；US2008/0318838を参照のこと。一般に、ペプチドは少なくとも２個のアミノ酸残基を含有し、約５０アミノ酸長未満である。様々な実施態様では、ペプチドインヒビターは、３〜５０個、５〜５０個、１０〜５０個、１０〜４０個、１０〜３５個、１０〜３０個又は１０〜２５個のアミノ酸を含み得るか、又はこれらからなり得る。様々な実施態様では、ペプチドインヒビターは、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のアミノ酸を含み得る。様々な実施態様では、ペプチドインヒビターは、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のアミノ酸からなり得る。
【００９５】
ターゲット分子に特異的に結合するペプチドを開発する方法が当技術分野で公知であり、ファージディスプレイ法が挙げられる。例えば、米国特許第5,010,175号；WO1996/023899；WO1998/015833；Bratkovic, Cell. Mol. Life Sci., 67: 749-767 (2010); Pande et al., Biotech. Adv. 28: 849-858 (2010)を参照のこと。いくつかの実施態様では、ペプチドの選択後、例えば、非天然アミノ酸及び／又はペプチド結合を組み込むことによって、ペプチドを改変し得る。ペプチドＵＳＰ３０インヒビターを選択する非限定的で例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００９６】
いくつかの実施態様では、アラニンスキャニング突然変異誘発によって、ペプチド阻害に重要なアミノ酸を決定し得る。次に、各残基を単一のアミノ酸、典型的にはアラニンで置換し、ＵＳＰ３０阻害に対する効果を評価する。例えば、米国特許第5,580,723号及び米国特許第5,834,250号を参照のこと。また、トランケーション分析を使用して、阻害活性に対するペプチド末端のアミノ酸の重要性だけではなく、ペプチド長の重要性を決定し得る。いくつかの場合では、トランケーション分析は、親ペプチドよりも強固に結合するより短いペプチドを明らかにし得る。アラニンスキャニング突然変異誘発及びトランケーション分析などの様々な突然変異分析の結果を使用して、インヒビターペプチドのさらなる改変の情報を提供し得る。
【００９７】
非限定的で例示的なペプチドインヒビターは、本明細書に、例えば実施例１０及び図１５に記載されている。当業者であれば、いくつかの実施態様では、所望の特性、例えば改善されたＵＳＰ３０特異性、ＵＳＰ３０に対するより強い結合、改善された溶解性、及び／又は改善された細胞膜透過性を有するさらなるペプチドインヒビターを作製するために、本明細書に記載されるペプチド配列を改変し得ることを認識するであろう。いくつかの実施態様では、ペプチドＵＳＰ３０インヒビターは、配列番号１〜２２から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００９８】
いくつかの実施態様では、ペプチドインヒビターは、アミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２ＣＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＸ１２（配列番号４８）
（配列中、
Ｘ１は、Ｌ、Ｍ、Ａ、Ｓ及びＶから選択され；
Ｘ２は、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘ３は、Ｆ、Ｉ及びＹから選択され；
Ｘ４は、Ｆ、Ｉ及びＹから選択され；
Ｘ５は、Ｄ及びＥから選択され；
Ｘ６は、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＰから選択され；
Ｘ７は、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ａ及びＴから選択され；
Ｘ８は、Ｙ、Ｄ、Ｆ、Ｎ及びＷから選択され；
Ｘ９は、Ｇ、Ｄ及びＥから選択され；
Ｘ１０は、Ｙ及びＦから選択され；
Ｘ１１は、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｑ及びＷから選択され；並びに
Ｘ１２は、Ｆ、Ｌ、Ｃ、Ｖ及びＹから選択される）を含む。いくつかの実施態様では、ペプチドは、１０μM未満のＩＣ５０でＵＳＰ３０を阻害する。いくつかの実施態様では、Ｘ１は、Ｌ及びＭから選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ３は、Ｙ及びＤから選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ３は、Ｆである。いくつかの実施態様では、Ｘ４は、Ｙ及びＦから選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ４は、Ｙである。いくつかの実施態様では、Ｘ５は、Ｄである。いくつかの実施態様では、Ｘ６は、Ｌ及びＭから選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ７は、Ｓ、Ｎ及びＤから選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ８は、Ｙである。いくつかの実施態様では、Ｘ９は、Ｇである。いくつかの実施態様では、Ｘ１０は、Ｙである。いくつかの実施態様では、Ｘ１１は、Ｌである。いくつかの実施態様では、Ｘ１２は、Ｆ及びＬから選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ１２は、Ｆである。
【００９９】
いくつかの実施態様では、ペプチドインヒビターは、アミノ酸配列：
ＸＡＸ１Ｘ２ＣＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＸ１２ＸＢ（配列番号４９）
（配列中、Ｘ１〜Ｘ１２は、上に定義されているとおりであり、ＸＡ及びＸＢはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸である）を含む。いくつかの実施態様では、ＸＡは、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｅ、Ｑ、Ｄ及びＲから選択される。いくつかの実施態様では、ＸＢは、Ｄ、Ｙ、Ｅ、Ｈ、Ｓ及びＩから選択される。
【０１００】
ペプチボディ
いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターはペプチボディである。ペプチボディは、ビヒクルに連結されたペプチド配列である。いくつかの実施態様では、ペプチボディのビヒクル部分は分解を減少させ、及び／又は半減期を増加させ、毒性を減少させ、免疫原性を減少させ、及び／又はペプチドの生物学的活性を増加させる。いくつかの実施態様では、ペプチボディのビヒクル部分は、抗体Ｆｃドメインである。他のビヒクルとしては、直鎖状ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリシン、デキストランなど）；分岐鎖状ポリマー（例えば、米国特許第4,289,872号及び米国特許第5,229,490号；WO1993/0021259を参照のこと）；脂質；コレステロール基（例えば、ステロイド）；炭水化物又はオリゴ糖；又は任意の天然若しくは合成タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドビヒクルが挙げられる。ペプチボディのペプチド部分は、典型的には、ターゲット、例えばＵＳＰ３０に結合する。いくつかの実施態様（emodiments）では、ペプチボディのペプチド部分は、本明細書に記載されるペプチドである。
【０１０１】
いくつかの実施態様では、ペプチボディは、抗体の特定の望ましい特徴（例えば、血漿中で長命、及び結合パートナーに対する増加した親和性（例えば、Ｆｃドメインの二量体化による））を保持する。ペプチボディの生産は、例えば、WO2000/0024782及び米国特許第6,660,843号に一般に記載されている。
【０１０２】
アプタマー
いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターはアプタマーである。本明細書で使用される「アプタマー」という用語は、ＵＳＰ３０などのターゲット分子に特異的に結合する核酸分子を指す。高特異的であり、サイズが比較的小さく、及び／又は非免疫原性であるように、アプタマーを選択し得る。例えば、Ni, et al., Curr. Med. Chem. 18: 4206 (2011)を参照のこと。いくつかの実施態様では、アプタマーは、ＵＳＰ３０に特異的に結合して阻害することができる二次及び／又は三次構造を形成する小さなＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合ＲＮＡ／ＤＮＡ分子である。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、アプタマーは、例えば、in vivo安定性を増加させ、ターゲット親和性を増加させ、溶解性を増加させ、血清半減期を増加させ、分解耐性を増加させ、及び／又は膜透過性を増加させるなどする１つ以上の改変ヌクレオシド（例えば、改変糖、改変核酸塩基及び／又は改変ヌクレオシド間結合を有するヌクレオシド）を含む。いくつかの実施態様では、アプタマーは、例えば、エクソヌクレアーゼによる末端の分解を防止するために、その末端に１つ以上の改変又は逆位ヌクレオチドを含む。
【０１０４】
アプタマーの作製及び治療的使用は、当技術分野で十分に確立されている。例えば、米国特許第5,475,096号を参照のこと。いくつかの実施態様では、アプタマーは、例えば、Ellington et al., Nature 346: 818 (1990);及びTuerk et al., Science 249: 505 (1990)に記載されているように、試験管内進化法（systematic evolution of ligands by exponential enrichment：ＳＥＬＥＸ）によって生産される。いくつかの実施態様では、アプタマーは、例えば、Berezovski et al., J. Am. Chem. Soc. 130: 913 (2008)に記載されているように、AptaBid法によって生産される。低オフ速度アプタマー及びこのようなアプタマーの選択方法は、例えば、Brody et al., Expert Rev. Mol. Diagn., 10: 1013-22 (2010);及び米国特許第7,964,356号に記載されている。
【０１０５】
低分子
いくつかの実施態様では、低分子ＵＳＰ３０インヒビターが提供される。いくつかの実施態様では、低分子ＵＳＰ３０インヒビターは、酵素活性又はターゲット結合の効率が減少するように、ＵＳＰ３０に結合してＵＳＰ３０酵素活性（例えば、ペプチダーゼ活性）を阻害し、及び／又はＵＳＰ３０のターゲット結合に干渉し、及び／又はＵＳＰ３０のコンフォメーションを変化させる。
【０１０６】
「低分子」は、本明細書では、約１０００ダルトン未満、例えば約９００ダルトン未満、約８００ダルトン未満、約７００ダルトン未満、約６００ダルトン未満又は約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。低分子は有機的なものでもよいし又は無機的なものでもよく、例えば、化合物ライブラリ若しくは天然の供給源から単離してもよいし、又は公知の化合物の誘導体化によって得てもよい。
【０１０７】
いくつかの実施態様では、低分子ＵＳＰ３０インヒビターは、低分子ライブラリをスクリーニングすることによって同定される。低分子ライブラリの作製及びスクリーニングは、当技術分野で周知である。例えば、Thompson et al., Chem. Rev. 96: 555-600 (1996);及びthe National Institutes of Health Molecular Libraries Programを参照のこと。コンビナトリアル化学ライブラリは、例えば、様々な組み合わせで化学ビルディングブロックのセットを混合することによって形成され得、何百万の化合物をもたらし得る。例えば、１００個の互換性化学ビルディングブロックを系統的に組み合わせて混合することにより、理論的には、１億の四量体化合物又は１００億の五量体化合物が合成される。例えば、Gallop et al. 1994, J. Med. Chem. 37: 1233-1250)を参照のこと。例えば、天然産物ライブラリなどの様々な他の種類の低分子ライブラリも設計及び使用し得る。低分子ライブラリは、様々な商業的供給業者から得られ得る。例えば、ChemBridge、Enzo Life Sciences、Sigma-Aldrich、AMRI Globalなどを参照のこと。
【０１０８】
低分子ＵＳＰ３０インヒビターを同定するために、いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるアッセイを使用して、低分子ライブラリをスクリーニングし得る。いくつかの実施態様では、低分子のさらなる改変の情報を提供するのに使用され得る低分子インヒビターに共通の特徴を同定するために、ＵＳＰ３０を阻害する各低分子の特徴を検討する。
【０１０９】
いくつかの実施態様では、例えば、最初のライブラリスクリーニングで同定された１つ以上の低分子ＵＳＰ３０インヒビターを使用して、最初の低分子インヒビターの改変を含む次のライブラリを作製し得る。この方法を使用し、続いて反復して、（他のＤＵＢと対比して）より高いＵＳＰ３０特異性、及び／又はより高いＵＳＰ３０結合親和性、及び／又は他の所望の特性、例えば低毒性、より高い溶解性、より高い細胞透過性などを有する候補化合物を開発し得る。
【０１１０】
脱ユビキチン化酵素の様々な低分子インヒビターが当技術分野で公知であり、その一部を表３に示す。
【０１１１】
【表３】
0006310919.tif 000004
0006310919.tif 000005
【０１１２】
表３に示されているインヒビター及びそこで引用されている参考文献、並びに当技術分野で公知のさらなるインヒビターは、特異的ＵＳＰ３０インヒビターを含むさらなる脱ユビキチン化酵素インヒビターを開発するための基礎を形成し得る。WO2007/009715も参照のこと。当業者であれば、例えば、上記構造のいずれかに対して改変を行って推定脱ユビキチン化酵素インヒビターのライブラリを形成し、本明細書に記載されるアッセイを使用して、ＵＳＰ３０に対する特異性を有する改変化合物についてスクリーニングし得る。
【０１１３】
Ｂ．アッセイ
様々なアッセイを使用して、ＵＳＰ３０インヒビターを同定及び試験し得る。ＵＳＰ３０タンパク質発現を減少させるインヒビターの場合、タンパク質レベルを検出する任意のアッセイが、阻害を測定するのに適切であり得る。一例として、タンパク質レベルは、ＵＳＰ３０に結合する抗体を使用する様々なイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学などによって検出され得る。インヒビターがＵＳＰ３０の細胞内局在性に影響を与える場合、例えば、免疫組織化学によって、又は細胞成分を分画し、１つ以上の抗体を使用して様々な画分中のＵＳＰ３０レベルを検出することによって、細胞内局在性の変化を検出し得る。ＵＳＰ３０  ｍＲＮＡレベルを減少させるインヒビターの場合、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などの増幅系アッセイを使用して、ｍＲＮＡレベルの変化を検出し得る。
【０１１４】
ＵＳＰ３０酵素活性に影響を与えるインヒビターの場合、非限定的で例示的なアッセイは、以下のとおりである：ＵＳＰ３０基質の存在下で、ＵＳＰ３０をインヒビター又は候補インヒビターと接触させる。非限定的で例示的なＵＳＰ３０基質としては、Ｕｂ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（例えば、Quesada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 314:54-62 (2004)を参照のこと）、Ｕｂ４鎖（例えば、Ｌｙｓ−４８−及びＬｙｓ−６３連結Ｕｂ）、直鎖状のＵＢＩＱ遺伝子翻訳産物；モノユビキチン化又はマルチユビキチン化コンジュゲート中の翻訳後に形成される分岐状ペプチド結合；プロテアソーム媒介性分解から生じるユビキチン化残遺物、及び他の小さなアミド又はエステル付加物が挙げられる。ＵＳＰ３０及びインヒビター又は候補インヒビターの存在下で、ＵＳＰ３０活性（例えば、Ｕｂ基質のプロセシング）を測定する。この活性を、インヒビター又は候補インヒビターなしの場合のＵＳＰ３０存在下におけるＵｂ基質のプロセシングと比較する。インヒビター又は候補インヒビターがＵＳＰ３０活性を阻害する場合、ＵＢ基質のプロセシングの量は、インヒビター又は候補インヒビターなしの場合のＵＳＰ３０存在下におけるＵＢ基質のプロセシングの量と比較して減少するであろう。
【０１１５】
阻害及び／又は特異性を決定するためのさらなる非限定的で例示的なアッセイは、実施例１０に記載されている。簡潔に言えば、ある濃度範囲のインヒビターをユビキチン−ＡＭＣ及びＵＳＰ３０と混合する（インヒビターを基質と混合し、次いで、ＵＳＰ３０を追加して反応を開始し得る）。特異性を決定しようとする場合、ＵＳＰ３０に代えて１つ以上のさらなるＤＵＢ又はユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ）を用いて、同様の反応を設定し得る。酵素の追加直後に、（３４０nmの励起及び４６５nmの発光を用いて）蛍光をモニタリングする。実施例１０に記載されているように、酵素活性の初速度を計算し得る。
【０１１６】
Ｃ．医薬製剤
本明細書に記載されるＵＳＰ３０インヒビターの医薬製剤は、所望の程度の純度を有するこのようなインヒビターを、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態の１つ以上の任意の薬学的に許容しうる担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と混合することによって調製される。薬学的に許容しうる担体は、一般に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、限定されないが：緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；キレート化剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。本明細書における例示的な薬学的に許容しうる担体としてはさらに、間質性薬物分散剤、例えば可溶性中性−活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０(HYLENEX（登録商標）, Baxter International, Inc.）が挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及びその使用方法は、米国特許公開第2005/0260186号及び米国特許公開第2006/0104968号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰをコンドロイチナーゼなどの１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせる。
【０１１７】
本明細書の製剤はまた、処置されている特定の適応症に必要な複数の有効成分、好ましくは、互いに対して悪影響を及ぼさない相補活性を有するものを含有し得る。
【０１１８】
有効成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に封入され得る。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０１１９】
徐放調製物を調製し得る。徐放調製物の適切な例としては、インヒビターを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、成形物形態（例えば、フィルム又はマイクロカプセル）のマトリックスが挙げられる。
【０１２０】
in vivo投与に使用される製剤は、一般に滅菌されている。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成され得る。
【０１２１】
Ｄ．治療方法及び組成物
本明細書で提供されるＵＳＰ３０インヒビターのいずれかは、方法、例えば治療方法で使用され得る。いくつかの実施態様では、細胞におけるマイトファジーを増加させる方法であって、前記細胞におけるＵＳＰ３０阻害を可能にする条件下で、前記細胞をＵＳＰ３０インヒビターと接触させることを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、細胞におけるミトコンドリアのユビキチン化を増加させる方法であって、前記細胞におけるＵＳＰ３０阻害を可能にする条件下で、前記細胞をＵＳＰ３０インヒビターと接触させることを含む方法が提供される。実施例６に記載されているように、例えば、免疫蛍光を使用して、マイトファジーの増加を決定し得る。実施例５に記載されているように、例えば、トリプシン消化後のユビキチン化ペプチドを免疫親和性濃縮し、続いて質量分析によって、ユビキチン化の増加を決定し得る。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターと接触させた細胞又は細胞集団におけるミトコンドリアタンパク質のユビキチン化を、前記インヒビターと接触させていないマッチ細胞又は細胞集団におけるミトコンドリアタンパク質のユビキチン化と比較することによって、ミトコンドリアのユビキチン化の増加を決定し得る。
【０１２２】
いくつかの実施態様では、マイトファジーの増加は、ＵＳＰ３０インヒビターと接触させた細胞集団における細胞１個当たりのミトコンドリアの平均数が、前記インヒビターと接触させていないマッチ細胞集団と比較して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％又は少なくとも７５％減少することを意味する。いくつかの実施態様では、ミトコンドリアのユビキチン化の増加は、ＵＳＰ３０インヒビターと接触させた細胞又は細胞集団におけるミトコンドリアタンパク質の全体的なユビキチン化が、前記インヒビターと接触させていないマッチ細胞又は細胞集団と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％（すなわち、２倍）、少なくとも１５０％又は少なくとも２００％（すなわち、３倍）増加することを意味する。
【０１２３】
いくつかの実施態様では、細胞におけるＴｏｍ２０、ＭＩＲＯ、ＭＵＬ１、ＡＳＮＳ、ＦＫＢＰ８、ＴＯＭ７０、ＭＡＴ２Ｂ、ＰＲＤＸ３、ＩＤＥ、ＶＤＡＣ、ＩＰＯ５、ＰＳＤ１３、ＵＢＰ１３及びＰＴＨ２から選択される少なくとも１個のタンパク質のユビキチン化を増加させる方法であって、前記細胞におけるＵＳＰ３０阻害を可能にする条件下で、前記細胞をＵＳＰ３０インヒビターと接触させることを含む方法が提供される。いくつかのこのような実施態様では、ユビキチン化は、Ｔｏｍ２０のＫ５６、Ｋ６１及びＫ６８から選択される少なくとも１個、少なくとも２個若しくは３個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＭＩＲＯのＫ１５３、Ｋ１８７、Ｋ３３０、Ｋ４２７、Ｋ５１２、Ｋ５３５、Ｋ５６７及びＫ５７２から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個若しくは８個のアミノ酸で増加する。いくつかのこのような実施態様では、ユビキチン化は、Ｔｏｍ２０のＫ５６、Ｋ６１及びＫ６８から選択される少なくとも１個、少なくとも２個若しくは３個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＭＩＲＯのＫ１５３、Ｋ１８７、Ｋ３３０、Ｋ４２７、Ｋ５１２、Ｋ５３５、Ｋ５６７及びＫ５７２から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個若しくは８個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＭＵＬ１のＫ２７３、Ｋ２９９及びＫ５２から選択される少なくとも１個、少なくとも２個若しくは３個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＦＫＢＰ８のＫ２４９、Ｋ２７１、Ｋ２７３、Ｋ２８４、Ｋ３０７、Ｋ３１７、Ｋ３３４及びＫ３４０から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個若しくは８個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＡＳＮＳのＫ１４７、Ｋ１６８、Ｋ１７６、Ｋ２２１、Ｋ２４４、Ｋ２７５、Ｋ４７８、Ｋ５０４及びＫ５５６から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個若しくは９個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＴＯＭ７０のＫ７８、Ｋ１２０、Ｋ１２３、Ｋ１２６、Ｋ１２９、Ｋ１４８、Ｋ１６８、Ｋ１７０、Ｋ１７８、Ｋ１８５、Ｋ２０４、Ｋ２３０、Ｋ２３３、Ｋ２４５、Ｋ２７５、Ｋ２７８、Ｋ３１２、Ｋ３２６、Ｋ３４９、Ｋ３５９、Ｋ４４１、Ｋ４６３、Ｋ４７０、Ｋ４７１、Ｋ４９４、Ｋ５０１、Ｋ５２４、Ｋ５３６、Ｋ５６３、Ｋ５７０、Ｋ５９９、Ｋ６００及びＫ６０４から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個若しくは少なくとも１０個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＭＡＴ２ＢのＫ２０９、Ｋ２４５、Ｋ３１６及びＫ３２６から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個若しくは４個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＰＲＤＸ３のＫ８３、Ｋ９１、Ｋ１６６、Ｋ２４１及びＫ２５３から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個若しくは５個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＩＤＥのＫ５５８、Ｋ６５７、Ｋ８５４、Ｋ８８４、Ｋ９２９及びＫ９３３から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個若しくは６個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＶＤＡＣ１のＫ２０、Ｋ５３、Ｋ６１、Ｋ１０９、Ｋ１１０、Ｋ２６６及びＫ２７４から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個若しくは７個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＶＤＡＣ２のＫ３１、Ｋ６４、Ｋ１２０、Ｋ１２１、Ｋ２７７及びＫ２８５から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個若しくは６個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＶＤＡＣ３のＫ２０、Ｋ５３、Ｋ６１、Ｋ１０９、Ｋ１１０、Ｋ１６３、Ｋ２６６及びＫ２７４から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個若しくは８個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＩＰＯ５のＫ２３８、Ｋ３５３、Ｋ４３６、Ｋ４３７、Ｋ５４８、Ｋ５５６、Ｋ６１３、Ｋ６７８、Ｋ６９０、Ｋ７０５、Ｋ７７５及びＫ８０６から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個若しくは少なくとも１０個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＰＳＤ１３のＫ２、Ｋ３２、Ｋ９９、Ｋ１１５、Ｋ１２２、Ｋ１３２、Ｋ１６１、Ｋ１８６、Ｋ３１３、Ｋ３２１、Ｋ３４７、Ｋ３５０及びＫ３６１から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個若しくは少なくとも１０個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＵＢＰ１３のＫ１８、Ｋ１９０、Ｋ２５９、Ｋ３２６、Ｋ３２８、Ｋ４０１、Ｋ４０５、Ｋ４１４、Ｋ４１８、Ｋ４３５、Ｋ５８６、Ｋ５８７及びＫ６４０から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個若しくは少なくとも１０個のアミノ酸で増加し；並びに／又はユビキチン化は、ＰＴＨ２のＫ４７、Ｋ７６、Ｋ８１、Ｋ９５、Ｋ１０６、Ｋ１１９、Ｋ１３４、Ｋ１７１、Ｋ１７７から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個若しくは９個のアミノ酸で増加する。いくつかの実施態様では、細胞をＵＳＰ３０インヒビターと接触させると、１個以上のさらなるタンパク質のユビキチン化が増加する。そのユビキチン化がＵＳＰ３０インヒビターの存在下で増加し得る非限定的で例示的なタンパク質は、添付書類Ａ（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている。実施例５に記載されているように、例えば、トリプシン消化後のユビキチン化ペプチドを免疫親和性濃縮し、続いて質量分析によって、ターゲットタンパク質のユビキチン化の増加を決定し得る。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターと接触させた細胞又は細胞集団におけるターゲットタンパク質のユビキチン化を、前記インヒビターと接触させていないマッチ細胞又は細胞集団における同じターゲットタンパク質のユビキチン化と比較することによって、ユビキチン化の増加を決定し得る。
【０１２４】
いくつかの実施態様では、タンパク質のユビキチン化の増加は、ＵＳＰ３０インヒビターと接触させた細胞又は細胞集団におけるタンパク質のユビキチン化が、前記インヒビターと接触させていないマッチ細胞又は細胞集団と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％（すなわち、２倍）、少なくとも１５０％又は少なくとも２００％（すなわち、３倍）増加することを意味する。
【０１２５】
いくつかの実施態様では、細胞は酸化ストレス下にある。さらに、いくつかの実施態様では、細胞における酸化ストレスを減少させる方法であって、前記細胞におけるＵＳＰ３０阻害を可能にする条件下で、前記細胞をＵＳＰ３０インヒビターと接触させることを含む方法が提供される。
【０１２６】
上記方法のいずれかにおいて、細胞は、Ｐａｒｋｉｎの病因性突然変異、ＰＩＮＫ１の病因性突然変異、又はＰａｒｋｉｎの病因性突然変異及びＰＩＮＫ１の病因性突然変異を含み得る。Ｐａｒｋｉｎ及びＰＩＮＫ１の非限定的で例示的な病因性突然変異は、例えば、本明細書の表１及び２に示されている。
【０１２７】
いくつかの実施態様では、細胞はニューロンである。いくつかの実施態様では、細胞は黒質ニューロンである。いくつかの実施態様では、細胞は心臓細胞である。いくつかの実施態様では、細胞は心筋細胞である。いくつかの実施態様では、細胞は筋細胞である。
【０１２８】
上記方法のいずれかのいくつかの実施態様では、細胞は被験体内に含まれる。上記方法のいずれかのいくつかの実施態様では、細胞は、in vitro又はex vivoにあり得る。
【０１２９】
別の態様では、医薬として使用するためのＵＳＰ３０インヒビターが提供される。さらなる態様では、処置方法で使用するためのＵＳＰ３０インヒビターが提供される。いくつかの実施態様では、被験体におけるミトコンドリア障害が関与する症状を処置する方法であって、有効量のＵＳＰ３０インヒビターを前記被験体に投与することを含む方法が提供される。ミトコンドリア障害が関与する症状には、マイトファジーの障害、ミトコンドリアＤＮＡの１つ以上の突然変異、ミトコンドリアの酸化ストレス、ミトコンドリアの形状／形態の障害、ミトコンドリア膜電位の障害、及び／又はリソソーム蓄積障害が関与し得る。ミトコンドリア障害が関与する非限定的で例示的な症状としては、神経変性疾患；ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）症候群；レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；神経障害性−運動失調症−網膜色素変性症−母性遺伝リー症候群（ＮＡＲＰ−ＭＩＬＳ）；ダノン病；心筋梗塞につながる虚血性心疾患；多種スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）；ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ  ＩＩ）；ムコリピドーシスＩＩＩ（ＭＬ  ＩＩＩ）；ムコリピドーシスＩＶ（ＭＬ  ＩＶ）；ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）；神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ１）；アルパーズ病；バース症候群；β−酸化欠損；カルニチンアシルカルニチン欠損症；カルニチン欠損症；クレアチン欠損症候群；補酵素Ｑ１０欠損症；複合体Ｉ欠損症；複合体ＩＩ欠損症；複合体ＩＩＩ欠損症；複合体ＩＶ欠損症；複合体Ｖ欠損症；ＣＯＸ欠損症；慢性進行性外眼筋麻痺症候群（ＣＰＥＯ）；ＣＰＴ  Ｉ欠損症；ＣＰＴ  ＩＩ欠損症；グルタル酸尿症ＩＩ型；カーンズ・セイヤー症候群；乳酸アシドーシス；長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＣＨＡＤ）；リー病又は症候群；致死乳児心筋症（ＬＩＣ）；ルフト病；グルタル酸尿症ＩＩ型；中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤ）；赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）症候群；ミトコンドリア劣性運動失調症候群；ミトコンドリア細胞症；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群；筋神経胃腸障害及び脳症；ピアソン症候群；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症；ＰＯＬＧ突然変異；中鎖／短鎖３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｍ／ＳＣＨＡＤ）欠損症；並びに超長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＶＬＣＡＤ）欠損症が挙げられる。ミトコンドリア障害が関与する非限定的で例示的な神経変性疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、虚血、脳卒中、レビー小体型認知症及び前頭側頭型認知症が挙げられる。ミトコンドリア障害が関与し得るさらなる例示的な神経変性疾患としては、限定されないが、頭蓋内出血、脳出血、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄性筋萎縮症、遺伝性筋萎縮症、椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢障害、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害、ポルフィリア（prophyria）、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、脱髄疾患、ギラン−バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー−マリー−トゥース病、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群（ＧＳＳ）及び致死性家族性不眠症が挙げられる。いくつかのこのような実施態様では、前記方法は、例えば下記のような、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤を個体に投与することをさらに含む。
【０１３０】
いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターは、医薬の製造又は調製で使用するために提供される。いくつかのこのような実施態様では、医薬は、ミトコンドリア障害が関与する症状、例えば、マイトファジーの障害が関与する症状、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異が関与する症状、ミトコンドリアの酸化ストレスが関与する症状、ミトコンドリアの形状／形態の障害が関与する症状、ミトコンドリア膜電位の障害が関与する症状、及びリソソーム蓄積障害が関与する症状を処置するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、ミトコンドリア障害が関与する症状を処置する方法であって、有効量の前記医薬を、ミトコンドリア障害が関与する症状を有する個体に投与することを含む方法で使用するためのものである。このような一実施態様では、前記方法は、例えば下記のような、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤を個体に投与することをさらに含む。
【０１３１】
本明細書の実施態様のいずれかの「個体」は、ヒトであり得る。
【０１３２】
さらなる態様では、例えば、上記治療方法のいずれかで使用するための、本明細書で提供されるＵＳＰ３０インヒビターのいずれかを含む医薬製剤が提供される。一実施態様では、医薬製剤は、本明細書で提供されるＵＳＰ３０インヒビターのいずれかと、薬学的に許容しうる担体とを含む。別の実施態様では、医薬製剤は、本明細書で提供されるＵＳＰ３０インヒビターのいずれかと、例えば下記のような、少なくとも１つのさらなる治療剤とを含む。
【０１３３】
治療では、ＵＳＰ３０インヒビターを単独で、又は他の薬剤と組み合わせてのいずれかで使用し得る。例えば、ＵＳＰ３０インヒビターは、少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与され得る。
【０１３４】
例えば、パーキンソン病の処置のためにＵＳＰ３０インヒビターと組み合わせ得る例示的な治療剤としては、レボドパ、ドーパミンアゴニスト（例えば、プラミペキソール、ロピニロール及びアポモルヒネ）、モノアミンオキシゲナーゼ（ＭＡＯ）Ｂインヒビター（例えば、セレギリン及びラサギリン）、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）インヒビター（例えば、エンタカポン及びトルカポン）、抗コリン薬（例えば、ベンゾトロピン及びトリヘキシルフェニジル）及びアマンタジンが挙げられる。例えば、筋萎縮性側索硬化症の処置のためにＵＳＰ３０インヒビターと組み合わせ得るさらなる例示的な治療剤は、リルゾールである。例えば、アルツハイマー病の処置のためにＵＳＰ３０インヒビターと組み合わせ得る例示的な治療剤としては、コリンエステラーゼインヒビター（例えば、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン及びタクリンなど）及びメマンチンが挙げられる。例えば、ハンチントン病の処置のためにＵＳＰ３０インヒビターと組み合わせ得る例示的な治療剤としては、テトラベナジン、抗精神病薬（例えば、ハロペリドール及びクロザピン）、クロナゼパム、ジアゼパム、抗鬱薬（例えば、エスシタロプラム、フルオキセチン及びセルトラリン）及び気分安定薬（例えば、リチウムなど）及び抗痙攣（例えば、バルプロ酸、ジバルプロエクス及びラモトリジン）が挙げられる。
【０１３５】
「組み合わせ」投与は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別個の製剤に含まれる）及び個別投与を包含し、この場合、本発明のインヒビターの投与は、さらなる治療剤及び／又はアジュバントの投与前に、その投与と同時に、及び／又はその投与後に行われ得る。いくつかの実施態様では、ＵＳＰ３０インヒビターの投与及びさらなる治療剤の投与は、互いの約１カ月以内、又は約１週間、２週間若しくは３週間以内、又は約１日、２日、３日、４日、５日若しくは６日以内に行われる。本発明のインヒビターはまた、他の種類の治療と組み合わせて使用され得る。
【０１３６】
本発明のインヒビター（及び任意のさらなる治療剤）は、経口投与、非経口投与、肺内投与、鼻腔内投与及び病巣内投与を含む任意の適切な手段によって投与され得る。非経口投与としては、限定されないが、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、脳内投与、脳室内投与、髄腔内投与、眼内投与、腹腔内投与及び皮下投与が挙げられる。本発明のインヒビター（及び任意のさらなる治療剤）はまた、埋め込み送達デバイス、例えば脳内インプラントを使用して投与され得る。非限定的で例示的な中枢神経系送達方法は、例えば、Pathan et al., Recent Patents on Drug Delivery & Formulation, 2009, 3: 71-89に概説されている。部分的には投与が短期又は長期であるかに応じて、投与は、任意の適切な経路、例えば注射、例えば静脈内注射又は皮下注射によるものであり得る。限定されないが、様々な時点にわたる単回投与又は複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で企図される。
【０１３７】
本発明のインヒビターは、適正な医療行為に準拠して製剤化、用量決定及び投与されるであろう。これに関して考慮される要因としては、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の経過、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に公知の他の要因が挙げられる。インヒビターは、必須ではなく場合により、問題の障害を予防又は処置するのに現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するインヒビターの量、障害又は処置の種類、及び上記他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載される投与経路を用いて同じ投与量で、又は本明細書に記載される投与量の約１〜９９％で、又は適切であると経験的／臨床的に決定された任意の経路によって任意の投与量で使用される。
【０１３８】
疾患の予防又は処置のために、（単独で、又は１つ以上の他のさらなる治療剤と組み合わせて使用する場合の）ＵＳＰ３０インヒビターの適切な投与量は、処置すべき疾患の種類、インヒビターの種類、疾患の重症度及び経過、インヒビターを予防目的で投与するか又は治療目的で投与するか、以前の治療、患者の病歴及びインヒビターに対する応答、並びに主治医の判断に依存するであろう。インヒビターは、１回で又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。例えば、１回以上の個別投与によるか又は持続注入によるかにかかわらず、疾患の種類及び重症度に応じて、約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば、０．１mg/kg〜１０mg/kg）のインヒビターが患者への投与の初回候補投与量であり得る。１つの典型的な１日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μg/kg〜１００mg/kg又はそれ以上の範囲であり得る。数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、症状に応じて、処置は、一般に、疾患症候の所望の抑制が生じるまで持続されるだろう。インヒビターの１つの例示的な投与量は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲であろう。従って、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kgの１つ以上の用量（又はそれらの任意の組み合わせ）が、患者に投与され得る。このような用量は、（例えば、患者が約２回〜約２０回又は例えば約６回のインヒビター投与を受けるように）間欠的に、例えば毎週又は３週間毎に投与され得る。初回の高ローディング用量と、その後の１回以上の低用量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンが有用な場合がある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０１３９】
上記製剤又は治療方法のいずれかは複数のＵＳＰ３０インヒビターを使用して行われ得ると理解される。
【０１４０】
Ｅ．製造品
本発明の他の態様では、本明細書に記載される疾患の処置、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は、容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ液バッグなどが含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成され得る。容器は、組成物単独又は障害を処置、予防及び／又は診断するために有効な他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有する静脈内投与溶液バッグ又はバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明のインヒビターである。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状の処置に使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明のインヒビターを含む組成物を中に収容する第１の容器と、（ｂ）さらなる細胞傷害剤又はそれ以外の治療剤を含む組成物を中に収容する第２の容器とを含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の症状の処置に使用され得ることを示している添付文書をさらに含み得る。あるいは又は加えて、製造品は、薬学的に許容し得る緩衝液、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液又はデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含み得る。さらに、それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含み得る。
【０１４１】
ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記一般的な説明を考慮して、様々な他の実施態様を実施し得ると理解される。
【０１４２】
実施例１：材料及び方法
ＤＵＢ  ｃＤＮＡの過剰発現スクリーニング：
マイトファジーのレギュレーターを同定するために、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)（ＤＵＢ−ＦＬＡＧ：ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ  ｃＤＮＡの比１：３）を使用して、ＦＬＡＧタグ付ＤＵＢライブラリ由来の個々のｃＤＮＡをＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎと共にＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションした。発現の２４時間後、１０μM  ＣＣＣＰで細胞を２４時間処理し、固定し、抗Ｔｏｍ２０（Santa Cruz Biotechnology）、抗ＧＦＰ（Aves Labs）及び抗ＦＬＡＧ（Sigma）一次抗体を使用して染色した。二次抗体で染色した後、４０×／１．２５オイル対物レンズ（０．３４μm／ピクセル解像度、１μm共焦点ｚステップサイズ）を使用してLeica SP5 Laser Scanning Confocal Microscopeを用いて、ランダムフィールドの画像を取得した。Ｔｏｍ２０染色を含有するＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ及びＦＬＡＧ−ＤＵＢコトランスフェクション細胞の割合を盲検的にスコア化した。
【０１４３】
海馬の培養、トランスフェクション及びｍｔ−Ｋｅｉｍａのイメージング：
記載されているように（Seeburg et al., Neuron 58: 571-583 (2008)）、解離海馬ニューロン培養物を調製し、ＤＩＶ８〜１０でLipofectamine LTX PLUSを使用してトランスフェクションした。過剰発現実験の場合は１〜３日間及びノックダウン実験の場合は３〜４日間にわたって、構築物を発現させた。４０×／１．２５オイル対物レンズ（０．０７μm／ピクセル解像度、１μm共焦点ｚステップサイズ）を備えるLeica TCS SP5 Laser Scanning Confocal microscopeを用いて、ｍｔ−Ｋｅｉｍａトランスフェクションニューロンをイメージングした。イメージング中、３７℃／５％ＣＯ２に維持した加湿チャンバー中で細胞を維持した。４５８nm（中性ｐＨシグナル）及び５４３nm（酸性ｐＨシグナル）レーザー励起を用いてシーケンシャルモードのハイブリッド検出器を使用し、６３０〜７１０nmで発光蛍光を収集して、２つの画像を取得した。ImageJにおいて特注のマクロによって、全ての画像の定量を実施した。ｍｔ−Ｋｅｉｍａの定量のために、細胞体の輪郭を手動で示し、高比率（５４３nm／４５８nm）リソソームシグナルの総面積を、体細胞ミトコンドリアシグナルの総面積で割った（マイトファジー指数）。
【０１４４】
質量分析
Ｐａｒｋｉｎ基質を決定するために、ドキシサイクリンでＨＥＫ−２９３  ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ誘導細胞を２４時間処理し、次いで、５μM  ＣＣＣＰ又はＤＭＳＯビヒクルコントロールで２時間処理した。ＵＳＰ３０基質を決定するために、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を使用して、ヒトＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡでＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を６日間トランスフェクションし、次いで、先のように処理した。両方の実験において、細胞を溶解し（２０mM  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、８Ｍ尿素、１mMオルトバナジン酸ナトリウム、２．５mMピロリン酸ナトリウム、１mMβ−グリセロホスフェート）、超音波処理し、遠心分離によって清澄化してから、ユビキチン残遺物を有するペプチドをタンパク質分解消化及び免疫親和性濃縮し、質量分析を行った。
【０１４５】
細胞溶解物の調製及び免疫沈降
全ての溶解物実験について、トランスフェクションの２４時間後において、サンプル還元剤（Invitrogen）を含有するＳＤＳサンプル緩衝液（Invitrogen）に、トランスフェクションＨＥＫ−２９３細胞を溶解した。免疫沈降実験については、トランスフェクションの２４時間後（過剰発現実験）又は６日後（ノックダウン実験）において、０．５％ＳＤＳを含有するＴＢＳ緩衝液に細胞を溶解し、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及びプロテアーゼ及びホスファターゼインヒビターを含有する緩衝液で溶解物を希釈した。抗ＨＡアフィニティマトリックスビーズ（Roche Applied Science）を用いて、ＨＡ−ユビキチントランスフェクション細胞の溶解物からユビキチン化タンパク質を免疫沈降した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってインプット及び沈降物を分離し、免疫ブロッティングによって分析した。
【０１４６】
統計分析
エラーバーは、平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す。ｐ値を計算するために、図の凡例に示されているように、対応のないStudent ｔ検定、Dunnett多重比較検定（単一条件との比較の場合）又はBonferroni多重比較検定（複数条件間の比較の場合）による一元ＡＮＯＶＡ、及び二元ＡＮＯＶＡを使用した。全ての統計分析をGraphPad Prism v.5ソフトウェアで実施した。
【０１４７】
ＤＮＡの構築
ＤＵＢ過剰発現スクリーニングのために、１００個のｃＤＮＡからなるＦＬＡＧタグ付ＤＵＢライブラリを使用した。トランスフェクションのために、以下の構築物をβ−アクチンプロモーターベースのｐＣＡＧＧＳプラスミドにサブクローニングした：ＵＳＰ３０−ＦＬＡＧ（ラット）、ＵＳＰ３０−ＦＬＡＧ（ヒト）、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ（ヒト）、ＦＬＡＧ−Ｐａｒｋｉｎ（ヒト）、ＰＩＮＫ１−ＧＦＰ（ヒト）、ｍｙｃ−Ｐａｒｋｉｎ（ヒト）、ＲＨＯＴ１（ＭＩＲＯ）−ｍｙｃ−ＦＬＡＧ（ヒト）、ＴＯＭ２０−ｍｙｃ（ヒト）、ＨＡ−ユビキチン、ＰＳＤ−９５−ＦＬＡＧ及びｍｔ−ｍＫｅｉｍａ（Katayama et al., Chemistry & Biology 18: 1042-1094 (2011)）。以下の構築物については、QuikChange II XL (Agilent Technologies)を使用して、点突然変異を生成した：ＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓ−ＦＬＡＧ（ラット）、ＵＳＰ３０−Ｃ７７Ａ−ＦＬＡＧ（ラット）、ＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓ−ＦＬＡＧ（ヒト）、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ  Ｋ１６１Ｎ（ヒト）及びＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ  Ｇ４３０Ｄ（ヒト）。Ｍｉｔｏ−ｔａｇＧＦＰ２（Evrogen）、Ｔｏｍ２０−３ＫＲ−ｍｙｃ及びＨＡ−ユビキチン突然変異体（Blue Heron）は購入した。β−Ｇａｌ（Seeburg and Sheng, J. Neurosci. 28: 6583-6591 (2008)）及びｍｉｔｏ−ｒｏ−ＧＦＰ（Dooley et al., J. Biol. Chem. 279: 22284-22293 (2004)）発現プラスミドは、以前に記載されているものであった。以下の領域をターゲティングするショートヘアピン配列をｐＳｕｐｅｒ又はｐＳｕｐｅｒ−ＧＦＰ−ｎｅｏプラスミドにクローニングした：ラットＰＩＮＫ１＃１（ＴＣＡＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＣＡＡＴＴ）、ラットＰＩＮＫ１＃２（ＣＣＡＧＴＡＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡ）、ラットＰａｒｋｉｎ＃１（ＧＧＡＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＡＡＧＣＧＡ）、ラットＰａｒｋｉｎ＃２（ＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＣＡＣＧＡＡＡＣＡ）、ラットＵＳＰ３０（ＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＴＴＴ）、ヒトＵＳＰ３０（ＣＣＡＧＡＧＴＣＣＴＧＴＴＣＧＡＴＴＴ）及びホタルルシフェラーゼ（ＣＧＴＡＣＧＣＧＧＡＡＴＡＣＴＴＣＧＡ）。
【０１４８】
抗体及び試薬：
以下の抗体を免疫細胞化学に使用した：ウサギ抗ＴＯＭ２０、マウス抗ＴＯＭ２０、ヤギ抗ＨＳＰ６０（Santa Cruz Biotechnology）；マウス抗ＦＬＡＧ、ウサギ抗ＦＬＡＧ、マウス抗ｍｙｃ（Sigma-Aldrich）；及びニワトリ抗ＧＦＰ（Aves Labs）。
【０１４９】
以下の抗体を免疫ブロッティングに使用した：ウサギ抗ＴＯＭ２０、ヤギ抗ＨＳＰ６０（Santa Cruz Biotechnology）；マウス抗ＭＦＮ１、ＨＲＰコンジュゲート抗ＦＬＡＧ、マウス抗ｍｙｃ、ウサギ抗ＵＳＰ３０、ウサギ抗ＲＨＯＴ１（ＭＩＲＯ）、ウサギ抗ＴＩＭＭ８Ａ（Sigma-Aldrich）；ウサギ抗ＧＦＰ、ニワトリ抗ＧＦＰ（Invitrogen）；ＨＲＰコンジュゲート抗ＧＡＰＤＨ、ＨＲＰコンジュゲート抗α−アクチン、ＨＲＰコンジュゲート抗β−チューブリン、ウサギ抗ＶＤＡＣ（Cell Signaling Technology）；ウサギ抗ＴＯＭ７０（Proteintech Group）；抗ユビキチン（ＦＫ２）（Enzo Life Sciences）；マウス抗ＬＡＭＰ１（StressGen）；ＨＲＰコンジュゲート抗ＨＡ（Roche）；及び抗ＵＳＰ３０ウサギ（精製ヒトＵＳＰ３０アミノ酸６５〜５１７でウサギを免疫することによって作製）。
【０１５０】
免疫沈降実験のために、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティゲルビーズ（Sigma）及び抗ＨＡアフィニティマトリックスビーズ（Roche Applied Science）を使用した。
【０１５１】
Ｐａｒｋｉｎ、ＰＩＮＫ１及びＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡを発現するアデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ２）粒子は、ｐＳｕｐｅｒベクターのＨ１プロモーター及びｓｈＲＮＡ発現カセットを含有するｐＡＡＶ−ＢＡＳＩＣ−ＣＡＧｅＧＦＰ−ＷＰＲＥベクターからVector Biolabs, Inc.が生産したものであった。
【０１５２】
示されているように、以下の試薬を購入した：ブラストサイジンＳ、ゼオシン、Lipofectamine 2000、Lipofectamine LTX PLUS、LysoTracker Green DND-626 (Invitrogen);ＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害錠剤、cOmplete  ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害錠剤、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Roche Applied Science）；カルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、ドキシサイクリン、ジメチルスルホキシド、塩化アンモニウム、ロテノン、ＤＴＴ、アルドリチオール、パラコートジクロリド（Sigma-Aldrich)；Ｎ−エチルマレイミド（Thermo Scientific）；及びハイグロマイシン（Clontech Laboratories）。
【０１５３】
トランスフェクション及び免疫細胞化学：
製造業者の説明書（Invitrogen）に従って、ｃＤＮＡ発現の場合にはLipofectamine 2000で、及びｓｉＲＮＡノックダウン実験の場合にはLipofectamine RNAiMAXで全ての異種細胞をトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡは、DharmaconからsiGenomeプール（非サイレンシングプール＃２をコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクションとして使用した）として購入した。以前に記載されているように（Seeburg et al., Neuron 58: 571-583 (2008)）、海馬培養物を調製し、１．８μgのＤＮＡ、１．８μlのＰＬＵＳ試薬及び６．３μlのＬＴＸ試薬と共にLipofectamine LTX PLUS (Invitrogen)でトランスフェクションした。薬物処理後、４％パラホルムアルデヒド／４％スクロースのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）（Electron Microscopy Sciences）で細胞を固定した。透過処理し（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−ＸのＰＢＳ溶液）、ブロッキングし（２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液）、一次抗体とインキュベーションした後、Alexa色素コンジュゲート二次抗体（Invitrogen）を使用して、抗体を可視化した。４０×／１．２５オイル対物レンズ（０．３４μm／ピクセル解像度、１μm共焦点ｚステップサイズ）を備えるLeica SP5 laser scanning microscopeを用いて、全ての免疫細胞化学画像を取得した。
【０１５４】
ＨＥＫ２９３及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ安定細胞株の作製
ｐＯＧ４４Ｆｌｐ−リコンビナーゼ発現ベクター（Invitrogen）、及びＣＭＶプロモーターの下で対応する構築物を発現するｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴベクター（Invitrogen）でＦＬＰ−Ｉｎ  ２９３細胞をコトランスフェクションすることによって、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ（ヒト）野生型、Ｋ１６１Ｎ及びＧ４３０Ｄを発現する安定トランスフェクションＨＥＫ細胞株を作製した。５０μg/mLハイグロマイシン選択を使用して、細胞株を選択及び維持した。ｐＯＧ４４、及びＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ（ヒト）を発現するｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯベクター（Invitrogen）でＦＬＰ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ  ２９３細胞をコトランスフェクションすることによって、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ（ヒト）を発現する誘導ＨＥＫ安定細胞株を作製した。５０μg/mLハイグロマイシン及び１５μg/mLブラストサイジンを使用して、株を選択及び維持した。ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯを使用してＦｌｐ−Ｉｎ誘導親細胞株と同様にＳＨ−ＳＹ５Ｙ安定細胞を作製し、７５μg/mlハイグロマイシン及び３μg/mlブラストサイジンの下で維持した。
【０１５５】
質量分析によるユビキチン改変の単離及び同定
Ｐａｒｋｉｎ基質を同定するために、ドキシサイクリン（１μg/mL）を使用して、誘導ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ（ヒト）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４時間誘導し、次いで、５μM  ＣＣＣＰ又はＤＭＳＯビヒクルコントロールで２時間処理した。ＵＳＰ３０基質を決定するために、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を使用して、ヒトＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡでＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を６日間トランスフェクションし、次いで、上記のように処理した。
【０１５６】
以前に記載されているように（Xu et al., Nat. Biotech., 28: 868-873 (2010); Kim et al., Mol. Cell, 44: 325-340 (2011)）、免疫親和性単離及び質量分析法を使用して、消化タンパク質溶解物からＫ−ＧＧペプチドを濃縮及び同定した。氷上で短時間超音波処理することによって、溶解緩衝液（８Ｍ尿素、１mMオルトバナジン酸ナトリウム、２．５mMピロリン酸ナトリウム、１mMβ−グリセロホスフェートを含む２０mM  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０））中で細胞溶解物を調製した。４．１mM  ＤＴＴ中で、タンパク質サンプル（６０mg）を６０℃で２０分間還元し、氷上で１０分間冷却し、室温の暗所において９．１mMヨードアセトアミドで１５分間アルキル化した。２０mM  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）を使用してサンプルを４倍希釈し、１０μg/mlトリプシン中、室温で一晩消化した。消化後、ＴＦＡを追加して最終濃度１％にし、ペプチドを酸性にしてから、Sep-Pak C18カートリッジ（Waters）で脱塩した。４０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡでペプチドをカートリッジから溶出し、急速凍結し、４８時間凍結乾燥した。乾燥ペプチドを１．４mlの１×ＩＡＰ緩衝液（Cell Signaling Technology）に穏やかに再懸濁し、１８００×ｇで５分間遠心分離することによって清澄化した。予めカップリングした抗ＫＧＧビーズ（Cell Signaling Technology）を１×ＩＡＰ緩衝液で洗浄してから、消化ペプチドを接触させた。
【０１５７】
免疫親和性濃縮を４℃で２時間実施した。ビーズをＩＡＰ緩衝液で２回洗浄し、水で４回洗浄してから、０．１５％ＴＦＡ中、室温で各１０分間にわたってペプチドを２回溶出した。以前に記載されているように（Rappsilber et al., Anal. Chem., 75: 663-670 (2003)）、STAGE-Tipsを使用して、免疫親和性濃縮ペプチドを脱塩した。
【０１５８】
データ依存トップ１５モードで作動するLTQ-Orbitrap Velos質量分析計で、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析を実施した。NanoAcquity UPLCを使用して、ペプチドを0.1 x 100-mm Waters 1.7-um BEH-130 C18カラムに注入し、二段階直線勾配（最初に８５分間かけて溶媒Ｂを２％から２５％に上昇させ、次いで５分間かけて２５％から４０％に上昇させる）を使用して１ul／分で分離した。カラムから溶出するペプチドをイオン化し、ADVANCEソース（Michrom-Bruker）を使用して質量分析計に入れた。各デューティサイクルでは、Orbitrapにおいて１個のフルＭＳスキャンを解像度６０，０００で収集し、続いて、荷電状態が定義されたモノアイソトピック前駆体（ｚ＞１）のイオントラップで最大１５個のＭＳ／ＭＳスキャンを収集した。ＭＳ／ＭＳ（±２０ppm）のために選択したイオンを３０秒間にわたって動的排除に供した。
【０１５９】
リレーショナルデータベースにロードするために、質量スペクトルデータをｍｚｘｍｌに変換した。ヒトタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ）由来のトリプシンペプチド及び一般的な汚染物質の連結ターゲットデコイデータベースに対してマスコットを使用して、ＭＳ／ＭＳスペクトルを検索した。前駆イオンの質量許容範囲を±５０ppmに設定した。カルバミドメチルシステイン（＋５７．０２１４）の固定改変並びに酸化メチオニン（＋１５．９９４９）及びＫ−ＧＧ（＋１１４．０４２９）の変動改変を考慮した。線形判別分析（ＬＤＡ）を使用して、各ランからのペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）を５％のペプチドレベル偽発見率（ＦＤＲ）に対してフィルタリングし、続いて、全ランの集合（０．５％未満のペプチドレベルＦＤＲ）として２％のタンパク質レベルＦＤＲに対してフィルタリングした。改変バージョンのAScoreアルゴリズム、及びAScoreシーケンスに従ってローカライゼーションした改変の位置を使用して、各Ｋ−ＧＧ  ＰＳＭについてローカライゼーションスコアを作成した。（Beausoleil et al., Nat. Biotech. 24(10): 1285-1292 (2006)）。トリプシンは、ユビキチン改変リシンＰＳＭ付近を切断することができないことを示す研究がある（この場合、AScoreシーケンスは、Ｃ末端リシンに対する−ＧＧ改変が疑わしいと報告する）（Bustos et al., Mol. Cell. Proteomics, published online June 23, 2012, doi: 10.1074/mcp.R112.019117; Seyfried et al., Anal. Chem., 80: 4161-4169 (2008)）。これの考えられる例外は、タンパク質（又はin vivoトランケーション産物）のＣ末端のリシン、真のＫ−ＧＧペプチドのソースフラグメンテーションから生じるＰＳＭであろう。下流分析のための最も信頼性の高いデータセットを確立するために、AScoreシーケンスがＣ末端リシンを報告するＰＳＭを２群に分割した：−ＧＧを代替的にローカライゼーションし得る利用可能な内部リシン残基を有するもの、及び利用可能なリシンを欠いたもの。下流分析では、Ｃ末端Ｋ−ＧＧを有するが利用可能なリシンを欠くＰＳＭを検討から除外した。残りのＰＳＭについては、Ｃ末端に最も近い利用可能なリシンに対して−ＧＧ改変を再ローカライゼーションした。
【０１６０】
ローカライゼーションが曖昧な明確に同定されたペプチド（AScore＜１３）であって、単一の内部リシン残基のみを有するペプチドは、その内部リシンに対してローカライゼーションした改変と共に報告した。トリプシンはユビキチン改変リシン残基で切断することができないことを示唆する証拠に基づいて、改変をＣ末端リシンに割り当てたペプチド（AScore＞１３）を廃棄した。
【０１６１】
XQuantと称される改変バージョンのVistaGrandeアルゴリズムを用いて、個々のＫ−ＧＧペプチドのラベルされていないピーク面積（直接ＰＳＭ又は正確な前駆イオンによって左右される）及び保持時間マッチング（交差定量）を調べた。直接ＰＳＭについては、以前に記載されているように固定質量及び保持許容範囲を使用して（Bakalarski et al., J. Proteome Res., 7: 4756-4765 (2008)）、ラベルされていないピーク面積の定量を実施した。XQuant内での交差定量を可能にするために、実験内の全分析を通じて１〜４のＰＳＭによって同定された高スコアペプチド配列に基づいて、ペアワイズ機器分析全体の保持時間相関を決定した。保持時間相関式を求めるための線形最小二乗回帰モデルを使用して、マッチ保持時間ペアリングをモデリングした。別個のＭＳ／ＭＳによってペプチドが同定されなかった機器分析では、回帰モデルから求めた前駆イオンの計算質量及びその予測保持時間でXQuantアルゴリズムをシードすることによって、交差定量を行った。各ペアワイズ機器のランについて、ｍ／ｚ許容範囲は固定したが、保持時間許容範囲はダイナミックに調整した。ペプチドが所定機器のラン内では明確に同定されなかったが、複数の他のランでは同定された場合、データの質を保証するために複数の交差定量イベントを実施した。以前に記載されているように（Bakalarski et al., J. Proteome Res., 7: 4756-4765 (2008)）、８３以上のヒューリスティック信頼スコアに対してXQuant結果をフィルタリングした。単一ラン内の同じｍ／ｚの多重定量イベントから生じるフルスキャンピーク面積の測定結果を、それらの保持時間のピーク境界がオーバーラップする場合には一緒にグルーピングした。このようなグループから、最大総ピーク面積を有するピークをその単一の代表として選択した。
【０１６２】
Ｐａｒｋｉｎ及びＵＳＰ３０の候補基質を同定するために、グラフ分析及び混合効果モデリングをXQuantデータに適用した。各タンパク質のＡＵＣデータに対して混合効果モデルをフィッティングした。「処置」（例えば、コントロール、Ｐａｒｋｉｎ過剰発現／ＵＳＰ３０ノックダウン、ＣＣＣＰ、組み合わせ）はカテゴリー固定効果であり、「ペプチド」はランダム効果としてフィッティングした。各処理対コントロールのＰ値に基づいて、偽発見率（ＦＤＲ）を計算する。プロットの作成では、組み合わせ対コントロール及び組み合わせ対ＣＣＣＰからの平均ＡＵＣの倍率変化及びＰ値を利用した。Ｒで「ｎｌｍｅ」によって、混合効果モデルをフィッティングした（Pinheiro et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. R package version 3, 1-101 (2011)）。
【０１６３】
細胞溶解物の調製及び免疫沈降
全ての溶解物実験について、２４時間後において、サンプル還元剤（Invitrogen）を含有するＳＤＳサンプル緩衝液（invitrogen）に細胞を溶解し、９５℃で１０分間煮沸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって全溶解物を分離し、免疫ブロッティングによって分析した。免疫沈降実験については、２４時間（過剰発現実験）又は６日間（ノックダウン実験）の時点において、０．５％ＳＤＳのトリス緩衝生理食塩水（１０mM  ＴＲＩＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中で、５μM  ＭＧ１３２並びに示されている濃度及び期間のＣＣＣＰで細胞を処理し、７０℃で１０分間煮沸した。免疫沈降緩衝液（５０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、プロテアーゼインヒビター（Roche Applied Science）、ホスファターゼインヒビター（Roche Applied Science）、ＤＮＡｓｅ  Ｉ（Roche Applied Science）、２mM  Ｎ−エチルマレイミド（Thermo Scientific）、ｐＨ７．４）で溶解物を希釈し、３１，０００ｇで１０分間遠心分離することによって清澄化し、抗ＨＡアフィニティマトリックスビーズ（Roche Applied Science）と共に一晩インキュベーションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってインプット及び抗ＨＡ免疫沈降物を分離し、免疫ブロッティングによって分析した。
【０１６４】
ミトコンドリアの分画
FOCUS SubCell Kit (G Biosciences)を使用して、約Ｐ６０の成体雄性ラットの前脳から細胞内分画を実施した。
【０１６５】
Drosophilaのストック
以下のDrosophila系統を分析のために入手した：ｙ、ｗ；アクチン５Ｃ−ＧＡＬ４／ＣｙＯ、ｙ＋（Bloomington Drosophila Stock Center, 4414）、ＵＡＳ−ＣＧ３０１６ＲＮＡｉ（本明細書ではＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉと称される；NIG-Fly Stock Center, 3016R-2）。ＵＳＰ３０ノックダウン実験のために、標準的な遺伝子技術を使用して、アクチン５Ｃ−ＧＡＬ４及びＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉを同じ染色体上に組換え導入した。
【０１６６】
製造業者の説明書に従って調製したNutri-Fly "German Food" Formulation (Genesee, 66-115)でハエを飼育した。全てのハエを２５℃で飼育し、標準的な遺伝子技術を使用して交配した。年齢マッチ雄性ハエを使用して、全ての実験を実施した。
【０１６７】
定量ＲＴ−ＰＣＲ
製造業者の説明書（Qiagen RNeasy Plus kit, Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription kit）に従って、単一のハエからＲＮＡ及び続いてｃＤＮＡを得た。ＴａｑＭａｎアッセイＤｍ０１７９６１１５＿ｇ１及びＤｍ０１７９６１１６＿ｇ１（Drosophila  ＣＧ３０１６（ＵＳＰ３０））、Ｄｍ０１７９５２６９＿ｇ１（Drosophila  ＣＧ５４８６（ＵＳＰ４７））及びＤｍ０１８４０１１５＿ｓ１（Drosophila  ＣＧ４６０３（ＹＯＤ１））を使用するApplied Biosystems ViiA7 Real-Time PCRシステムを使用して、定量ＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｄｍ０２１３４５９３＿ｇ１（ＲｐＩＩ１４０）をコントロールとして使用した。
【０１６８】
摂取パラコート濃度の決定
５％スクロースのみ（水中）又は５％スクロース＋１０mMパラコート（水中）を含有する溶液をワットマン紙に染み込ませて、１日齢の成体雄に与えた。処理の４８時間後、１条件当たり１５匹のハエを回収し、１００μLの水中でホモジナイズした。適切な量のパラコートを未処理ハエ由来のホモジネートにスパイクすることによって、標準曲線サンプルを作製した。次いで、サンプルをボルテックスで混合し、内部標準（プロプラノロール）を含有する２００μLのアセトニトリルを追加した。サンプルを再度ボルテックスし、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。２００μLの水を含有する新たなプレートに上清を移し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析してパラコート濃度を定量した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、Applied Biosystems (Foster City, CA)製の4000 Q TRAP（登録商標）MS及びTurboIonSpray（登録商標）イオン源が接続されたAgilent 1100シリーズＨＰＬＣシステム（Santa Clara, CA）及びCTC Analytics (Carrboro, NC)製のHTS PALオートサンプラーから構成されていた。Phenomenex製のKrud Katcherガードカラムを備えるWaters Atlantis dC18カラム（３μm  １００×２．１mm）で、ＨＰＬＣ分離を実施した。トランジション１８５．１→１６５．１（パラコート）及び２６０．２→１８３．１（プロプラノロール）の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用して、定量を行った。アッセイの下限及び上限は、それぞれ１０μM及び１０００μMである。アッセイの定量（quatitation）では、重み付け１／ｘ２線形回帰を用いて、分析物／ＩＳピーク面積比対名目パラコート濃度をプロットすることによって作図した検量線を用いた。
【０１６９】
Drosophila間接飛翔筋の透過型電子顕微鏡検査
以前に記載されているように（Greene et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 4078-4083 (2003)）、残りの胴体から成体雄の胸部を分離し、次いで、縦方向に片側切断し、直ぐに固定し、処理した。
【０１７０】
クライミングアッセイ
以下のDrosophila系統を使用して、クライミングアッセイを実施した：ｙ、ｗ；アクチン５Ｃ−ＧＡＬ４／ＣｙＯ、ｙ＋（アクチンのみ）；ｙ、ｗ；ＵＡＳ−ＣＧ３０１６−ＲＮＡｉ／ＣｙＯ、ｙ＋（ＲＮＡｉのみ）；ｙ、ｗ；ＵＡＳ−ＣＧ３０１６ＲＮＡｉ、アクチン５Ｃ−ＧＡＬ４／ＣｙＯ、ｙ＋（ＵＳＰ３０ノックダウン）。
【０１７１】
５％スクロースのみ（水中）又は５％スクロース＋１０mMパラコート（水中）を含有する溶液をワットマン紙に染み込ませて、１日齢の成体雄に与えた。処理の４８時間後、二酸化炭素を使用してハエを麻酔し、１％アガロースのみを含有するバイアルに１０匹一組で移して、二酸化炭素の影響から１時間の回復期間を設けた。次いで、ハエを新たなガラス管に移し、穏やかにタップして底部に落とし、クライミング能力についてスコア化した。３０秒間で垂直に１５cm超登るハエの数を記録した。
【０１７２】
生存アッセイ
５％スクロースのみ（水中）又は５％スクロース＋１０mMパラコート（水中）を含有する溶液をワットマン紙に染み込ませて、バイアル１個当たり１０匹の成体１日齢雄に与えた。記載されている間隔で、生きているハエの数を計数した。
【０１７３】
ＭｕｌｔｉＴｏｘ細胞死アッセイ
１％ウシ胎児血清を含有する通常の成長培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び1X GlutaMax）中で、コントロール又はＵＳＰ３０  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をロテノンで処理する。２４時間のインキュベーション後、製造業者の説明書に従ってMulti-Tox Fluorアッセイ（Promega）を使用して、細胞生存率を測定する。各条件について、ＧＦ−ＡＦＣ蛍光をビスＡＡＦ−Ｒ１１０蛍光に対して標準化し、コントロール（コントロールＲＮＡｉ＋ＤＭＳＯ）に対する割合として示す。
【０１７４】
実施例２：ＵＳＰ３０は、損傷ミトコンドリアのＰａｒｋｉｎ媒介性クリアランスをアンタゴナイズする
ミトコンドリアクリアランスをレギュレーションするＤＵＢを同定するために、確立されたミトコンドリア分解アッセイ（Narendra et al., J. Cell Biol., 183: 795-803 (2008)）において、ＦＬＡＧタグ付ヒトＤＵＢ  ｃＤＮＡライブラリ（９７個のＤＵＢ）をスクリーニングした。このアッセイでは、プロトノフォアカルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ、２０μM、２４時間）によって誘導されるミトコンドリアの脱分極が、Ｐａｒｋｉｎを過剰発現する培養細胞における顕著なミトコンドリアの喪失をもたらす（ミトコンドリア外膜タンパク質マーカーＴｏｍ２０の染色による測定）。ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎでトランスフェクションした細胞の大多数では、ＣＣＣＰ処理は、Ｔｏｍ２０染色のロバストな消失をもたらした（Ｐａｒｋｉｎトランスフェクション細胞の８０％超では、ＣＣＣＰ後にＴｏｍ２０染色が欠如していた−図１Ａ）。ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎと共に個々のＦＬＡＧタグ付ＤＵＢ  ｃＤＮＡをコトランスフェクションし、ＣＣＣＰ誘導性ミトコンドリア（Ｔｏｍ２０）クリアランスに対する効果を測定した。ＣＣＣＰ処理ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎトランスフェクション細胞では、約１００個の異なるＤＵＢのライブラリのうち、２個のＤＵＢ（ＵＳＰ３０及びＤＵＢＡ２）がＴｏｍ２０染色の喪失をロバストに阻止したのに対して、他のものはほとんど効果がなかった（図１Ａ−Ｔｏｍ２０染色細胞に対する％：コントロール（β−Ｇａｌ）：１５．３％、ＵＳＰ３０：９７．４％、ＤＵＢＡ２：９４．７％、ＵＣＨ−Ｌ１：３６％、ＵＳＰ１５：２３．３％、ＡＴＸＮ３：８．３％；他のネガティブなＤＵＢは示さず）。ＵＳＰ３０は、ミトコンドリア外膜に局在し、その酵素ドメインが推定では細胞質に面していると報告されており（Nakamura and Hirose, Mol. Biol. Cell, 19: 1903-1914 (2008)）、従って、ミトコンドリアに対するＰａｒｋｉｎの作用への反作用はまさに細胞内コンパートメントに存在するであろうから、ＤＵＢＡ２ではなくＵＳＰ３０をさらなる研究に選択した。ニューロンでは、トランスフェクションＵＳＰ３０−ＦＬＡＧ及び内因性ＵＳＰ３０がミトコンドリアマーカーと免疫共局在していることによって（図２Ａ、Ｂ）、並びにラット脳からＵＳＰ３０が精製ミトコンドリアと共分画されたことによって（図２Ｃ）、ＵＳＰ３０の特異的ミトコンドリア結合を確認した。
【０１７５】
ｍｙｃ−Ｐａｒｋｉｎでトランスフェクションした様々な細胞株（ドーパミン作動性ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）では、ＵＳＰ３０過剰発現がＣＣＣＰ誘導性マイトファジーを防止する能力も示された（図１Ｂ）。ＵＳＰ３０の効果がＴｏｍ２０特異的ではないことを確認するために、ＵＳＰ３０過剰発現が、ミトコンドリアマトリックスタンパク質ＨＳＰ６０のＣＣＣＰ誘導性減少も防止するかを試験した。実際、ＵＳＰ３０過剰発現はＨＳＰ６０のＣＣＣＰ誘導性減少も防止したが、これは、ＵＳＰ３０がオルガネラの一斉分解を阻止することを示唆している（図１Ｂ〜Ｄ）。対照的に、触媒的に不活性なＵＳＰ３０  Ｃ７７Ｓ突然変異体（Nakamura and Hirose, Mol. Biol. Cell, 19: 1903-1914 (2008)）の発現はＰａｒｋｉｎ媒介性ミトコンドリア分解を防止するのに有効ではなく、これは、ＵＳＰ３０がミトコンドリア基質の脱ユビキチン化を介してマイトファジーに反作用するという考えを裏付けている（図１Ｂ〜Ｄ）。
【０１７６】
ＵＳＰ３０酵素活性はマイトファジーの遮断に必要であったので、ＵＳＰ３０及びＰａｒｋｉｎがミトコンドリアのユビキチン化に対して逆効果を及ぼすかを調べた。以前に報告されているように、短期的なＣＣＣＰ処理（２０μM、４時間）は、ミトコンドリアへのＰａｒｋｉｎの再分配を引き起こし（Ｔｏｍ２０によってマーキング）、ミトコンドリアにおけるユビキチン化シグナルの蓄積をもたらした（ポリユビキチン抗体ＦＫ２による染色によって測定、図２Ｄ；（Lee et al., J. Cell Biol., 189: 671-680 (2010)）。ＵＳＰ３０をＰａｒｋｉｎと共発現させると、ミトコンドリアに蓄積したユビキチンシグナルの量は約７５％減少し、この効果にはＵＳＰ３０酵素活性も必要であった（図２Ｄ、Ｅ）。これらのデータは、ＵＳＰ３０が、ミトコンドリアタンパク質に対するＰａｒｋｉｎのユビキチンリガーゼ作用に対抗するＤＵＢとして機能し、それにより、マイトファジーを阻害するという考えを裏付けている。
【０１７７】
以前の研究により、リガーゼ活性が欠損したＰａｒｋｉｎ病因性突然変異体は、ＣＣＣＰ応答性のミトコンドリア分解を支援することができず、これが、Ｐａｒｋｉｎの移行に関連する核周囲領域におけるクリアランスされないミトコンドリアのクラスタリングにつながることが示された(Geisler et al., Nat. Cell Biol., 12: 119-131 (2010); Lee et al., J. Cell Biol., 189: 671-680 (2010)）。注目すべきことに、ＵＳＰ３０＋ＰａｒｋｉｎでコトランスフェクションしてＣＣＣＰで処理した細胞では、野生型ｍｙｃ−Ｐａｒｋｉｎは、非分解ミトコンドリアの核周囲クラスタに依然として結合していたという点で、突然変異体Ｐａｒｋｉｎと類似の挙動を示した（図１Ｂ（白色矢印）、Ｅ）。ＵＳＰ３０の共発現は、Ｐａｒｋｉｎ発現レベルを変化させなかった（図２Ｆ、Ｇ）。これらのデータは、Ｐａｒｋｉｎのミトコンドリアへの移行を阻害することによるのではなく、損傷ミトコンドリアにおけるユビキチンシグナルの酵素的除去によって、ＵＳＰ３０がマイトファジーを遮断することを示している。
【０１７８】
実施例３：ＰＩＮＫ１、Ｐａｒｋｉｎは、ニューロンにおけるマイトファジーに必要である
ニューロンにおけるマイトファジーを測定するために、ｍｔ−Ｋｅｉｍａ（これは、ミトコンドリアマトリックスにターゲティングされるレシオメトリックｐＨ感受性蛍光タンパク質である）をモニタリングした。低比率のｍｔ−Ｋｅｉｍａ由来の蛍光（５４３nm／４５８nm）は中性環境を知らせるのに対して、高比率の蛍光は酸性ｐＨを知らせる（Katayama et al., Chemistry & Biology 18: 1042-1094 (2011)）。従って、ｍｔ−Ｋｅｉｍａは、細胞質のミトコンドリア及び酸性リソソームのミトコンドリアのディファレンシャルなイメージングを可能にする。ｍｔ−Ｋｅｉｍａはリソソームプロテアーゼに耐性であるので、ミトコンドリアの累積的なリソソーム送達を経時的に測定することを可能にする。
【０１７９】
ラット解離海馬培養物におけるトランスフェクション後、ｍｔ−Ｋｅｉｍａシグナルは、ミトコンドリアに特徴的な細長い構造に最初に蓄積し、５４３／４５８比の値は低かった（緑色で示されている−図３Ａ）。発現の２〜３日後、高比率（酸性）シグナルを有する複数の円形ｍｔ−Ｋｅｉｍａ構造も細胞体全体に現れた（赤色で示されている−図３Ａ）。（１）ＮＨ４Ｃｌで細胞を中性にすることにより、特にこれらの円形構造では管状細網ミトコンドリアシグナルに影響を与えずに、高比率（５４３／４５８）ピクセルが低比率シグナルに完全に逆転したこと（図４Ａ）；（２）無関係なリソソームマーカー色素（lysotracker green DND-26）は高比率ｍｔ−Ｋｅｉｍａ構造を染色したが、ｍｔ−Ｋｅｉｍａを伴わないLysotrackerポジティブな構造も多かったこと（図４Ｂ）；（３）事後免疫染色実験では、高比率ピクセルが、内因性リソソームタンパク質ＬＡＭＰ−１と共局在したこと（図４Ｃ）から、これらのｍｔ−Ｋｅｉｍａポジティブな円形構造はリソソームに相当する可能性が高い。「酸性」ｍｔ−Ｋｅｉｍａシグナルのほぼ全てが神経細胞体で見られたので（細胞体は、全高比率（５４３／４５８）シグナルの９５．６±２．２％を含有していた）、細胞体内のリソソーム（赤色）シグナル／ミトコンドリア（緑色）シグナルの面積比を、ニューロンにおけるミトコンドリアのリソソーム送達の尺度（「マイトファジー指数」）として使用した（Katayama et al., Chemistry & Biology 18: 1042-1094 (2011)）。このマイトファジー指数によって定量したところ、リソソームにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａの存在度は日数の経過と共に増加したが（図４Ｄ）、これは、基本条件下の培養ニューロンではマイトファジーが活性であることを示唆している。
【０１８０】
異種細胞では、Ｐａｒｋｉｎ過剰発現は、ミトコンドリアの脱分極時にミトコンドリア分解を駆動し得る；しかしながら、内因性Ｐａｒｋｉｎ及びＰＩＮＫ１が非神経細胞又は神経細胞におけるマイトファジーに必要であるかについては、未だに立証されていない（Youle and Narendra, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12: 9-14 (2011)）。ニューロンのマイトファジーにおけるＰＩＮＫ１／Ｐａｒｋｉｎ経路の役割を調べるために、ｐＳｕｐｅｒベースのベクターから発現させた小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、Ｐａｒｋｉｎ又はＰＩＮＫ１をノックダウンした。これらのＰａｒｋｉｎ及びＰＩＮＫ１  ｓｈＲＮＡは、異種細胞におけるそれらの各ターゲットのｃＤＮＡ駆動性発現を効率的にノックダウンし（図４Ｅ、Ｆ）、ニューロン培養物における内因性Ｐａｒｋｉｎ又はＰＩＮＫ１のタンパク質レベルをそれぞれ約８０％及び約９０％抑制した（図４Ｇ、Ｈ）。コントロールルシフェラーゼｓｈＲＮＡと比較して、Ｐａｒｋｉｎ  ｓｈＲＮＡ（２つの独立した配列）でトランスフェクションしたニューロンはマイトファジー指数の約５０％の減少を示したが、これは、リソソームへのミトコンドリア送達の減少を示している（図３Ｂ、Ｃ）。ＰＩＮＫ１  ｓｈＲＮＡは、酸性ｍｔ−Ｋｅｉｍａシグナルを減少させるのにさらにより有効であった（マイトファジー指数の約８０〜９０％の減少（図３Ｄ、Ｅ））。以前の遺伝学的研究では、健全なミトコンドリアを維持する際に、Ｐａｒｋｉｎの上流にＰＩＮＫ１が配置された（Clark et al., Nature, 441: 1162-1166 (2006); Park et al. Nature, 441: 1157-1161 (2006)）。遺伝的エピスタシスと一致して、本発明者らのｍｔ−Ｋｅｉｍａ実験により、ＰＩＮＫ１過剰発現はニューロンにおけるマイトファジーを強く増強し、この効果はＰａｒｋｉｎノックダウンによって完全に失われたことが示された（図３Ｆ、Ｇ）。一方、ｍｔ−Ｋｅｉｍａアッセイによって測定したところ、Ｐａｒｋｉｎの単独の過剰発現は、基本マイトファジーに対して明らかな効果がなかった（図４Ｉ、Ｊ）。従って、ニューロンのマイトファジーはＰＩＮＫ１及びＰａｒｋｉｎの両方を必要とし、ＰＩＮＫ１は−明らかに限定的に−Ｐａｒｋｉｎの上流に作用する。
【０１８１】
実施例４：ＵＳＰ３０は、ニューロンにおけるマイトファジーをアンタゴナイズする
次に、ＵＳＰ３０が、ニューロンにおけるマイトファジーを異種細胞でのように抑制するかを調査した。β−Ｇａｌ及びｍｔ−Ｋｅｉｍａでトランスフェクションしたコントロールニューロンと比較して、野生型ＵＳＰ３０の共発現は、３日目にマイトファジー指数の約６０％の減少を引き起こしたが、これは、ＵＳＰ３０がニューロンにおけるミトコンドリアのリソソーム送達を阻害することを示している（図５Ａ、Ｅ）。対照的に、酵素的に不活性なＵＳＰ３０（Ｃ７７Ｓ又はＣ７７Ａ）の過剰発現は、マイトファジーシグナルのロバストな増加を誘導した（図５Ａ、Ｅ）。リソソームへのミトコンドリア送達の増強は、おそらくは基質又はマイトファジー促進性ユビキチン鎖と相互作用し、内因性ＵＳＰ３０からそれらを隔離することによって、触媒的に不活性なＵＳＰ３０のドミナントネガティブ作用を反映する可能性がある（Berlin et al., J. Biol. Chem., 285: 34909-34921 (2010); Bomberger et al., J. Biol. Chem., 284: 18778-18789 (2009); Ogawa et al., J. Biol. Chem., 286: 41455-41465 (2011)）。
【０１８２】
内因性ＵＳＰ３０の機能を試験するために、ｓｈＲＮＡを使用してＵＳＰ３０をノックダウンした。異種細胞では、ラットＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡプラスミドは、トランスフェクションラットのＵＳＰ３０  ｃＤＮＡ発現を特異的に排除した（図５Ｂ）。ニューロン培養物では、同じラットＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡは、内因性ＵＳＰ３０の約８５％の減少をもたらした（図５Ｃ）。ニューロンでは、ＵＳＰ３０ノックダウンは、ネガティブコントロールルシフェラーゼｓｈＲＮＡと比べて、ｍｔ−Ｋｅｉｍａのリソソーム送達を増加させた（マイトファジー指数の約６０％の増加）（図５Ｄ、Ｆ）。ｓｈＲＮＡ耐性ヒトＵＳＰ３０  ｃＤＮＡのコトランスフェクションは、この効果を「レスキュー」した（すなわち、それは、ミトコンドリア分解に対するブレーキを回復させた）が、これは、ＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡが非特異的効果を発揮しなかったことを示している（図５Ｂ、Ｄ、Ｆ）。実際、ヒトＵＳＰ３０  ｃＤＮＡ＋ラットＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡでコトランスフェクションしたニューロンでは、単独で野生型ＵＳＰ３０を過剰発現するニューロンと同様に、ｍｔ−Ｋｅｉｍａのリソソーム蓄積がコントロールよりも低レベルであることが示された（図５Ｄ、Ｆ）。また、酵素的に不活性なヒトＵＳＰ３０（Ｃ７７Ｓ）は、ＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡによって誘導されるマイトファジーの増強を低減することができず、実際にはＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡよりもさらにマイトファジー活性を増強したが（図５Ｄ、Ｆ）、後者の結果は、ＵＳＰ３０ノックダウンが不完全であることを示唆している。これらの結果は、内因性ＵＳＰ３０がそのＤＵＢ活性を介してニューロンにおけるマイトファジーを抑制するという強力な証拠を提供する。
【０１８３】
実施例５：ＵＳＰ３０は、複数のミトコンドリアタンパク質を脱ユビキチン化する
Ｐａｒｋｉｎ及びＵＳＰ３０は、ミトコンドリア分解をアンタゴニスティックにレギュレーションするので、このＥ３リガーゼ及びＤＵＢはいくつかの共通基質に対して作用すると仮説した。Ｐａｒｋｉｎ及びＵＳＰ３０基質を同定するために、トリプシン消化抽出物由来のユビキチン化ペプチドを、ユビキチン分岐鎖特異的（Ｋ−ＧＧ）抗体を使用して免疫親和性濃縮した後、質量分析（ＭＳ）することによって、細胞における全体的なユビキチン化を分析した。２つの異なる条件セットのＨＥＫ−２９３細胞において、ＭＳによって全体的なユビキチン化を分析及び定量した：１）誘導性Ｐａｒｋｉｎ過剰発現、又は２）ＵＳＰ３０ノックダウン（ＵＳＰ３０ノックダウン効率は８５±５％であった（図７Ｃを参照のこと））。各セットでは、ＣＣＣＰ（５μM、２時間）又はビヒクルコントロール（ＤＭＳＯ）で細胞を処理した。全体では、ＭＳ分析により、１５，０００個超のユニークなユビキチン化部位が約３２００個のタンパク質上にあることが明らかになり、その一部は、ＣＣＣＰのみ（内因性Ｐａｒｋｉｎ及びＵＳＰ３０レベル）又はＰａｒｋｉｎ過剰発現／ＵＳＰ３０ノックダウンのいずれかに対して応答した（約３２００個のタンパク質のリストについては、添付書類Ａを参照のこと）。ＭＳにより、ｐａｒｋｉｎ過剰発現又はＵＳＰ３０ノックダウンによってそのユビキチン化が増加した２３３個及び３３５個のタンパク質がそれぞれ同定された（すなわち、「ｐａｒｋｉｎ過剰発現＋ＣＣＣＰ」又は「ＵＳＰ３０ノックダウン＋ＣＣＣＰ」では、ＣＣＣＰのみと対比して有意に多くのユビキチン化が示された）。これらのタンパク質のうちの４１個は、Ｐａｒｋｉｎ過剰発現及びＵＳＰ３０ノックダウンの両方によってレギュレーションされた（図１３）。これら４１個のタンパク質のうちの１２個は、ミトコンドリア又はミトコンドリア関連のものである（Ｔｏｍ２０、ＭＩＲＯ１、ＦＫＢＰ８、ＰＴＨ２、ＭＵＬ１、ＭＡＴ２Ｂ、ＴＯＭ７０、ＰＲＤＸ３、ＩＤＥ及び３個のＶＤＡＣアイソフォーム全て−Human MitoCartaデータベースに基づく）。他には、核内輸送タンパク質（例えば、ＩＰＯ５）、デメチラーゼ（例えば、ＫＤＭ３Ｂ）及びユビキチン／プロテアソーム系の構成要素（例えば、ＰＳＤ１３、ＵＢＰ１３）が含まれていた（図１３）。
【０１８４】
本発明者らは、ＵＳＰ３０ノックダウンによるユビキチン化の大幅な増加を示した２個のミトコンドリアタンパク質（Ｔｏｍ２０及びＭＩＲＯ）にさらなる研究の焦点を当てた（ＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡ＋ＣＣＣＰ／ＣＣＣＰユビキチン化比＝３．５２、ｐ＝０．００５（Ｔｏｍ２０の場合）；＝２．９５、ｐ＝０．０１９（ＭＩＲＯの場合）；図１３、左を参照のこと）。Ｔｏｍ２０及びＭＩＲＯはまた、Ｐａｒｋｉｎ過剰発現によるユビキチン化の大規模で非常に有意な増加を示した（図１３、右）。ＵＳＰ３０がこれらのタンパク質を脱ユビキチン化し得ることを確認するために、ＨＡ−ユビキチンで、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎを安定的に過剰発現する細胞株をトランスフェクションし、抗ＨＡ抗体を使用してユビキチン化タンパク質を免疫沈降（ＩＰ）した。ミトコンドリアの脱分極（ＣＣＣＰ、５μM、２時間）後、抗ＨＡ−免疫沈降物中のＭＩＲＯについて免疫ブロッティングによって測定したところ、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ安定細胞は、内因性ＭＩＲＯのユビキチン化のロバストな増強を示した（図７Ａ）。ＨＡ−ユビキチンを用いないコントロールトランスフェクションでは、抗ＨＡ−ビーズはＭＩＲＯを免疫沈降しなかったが、これは、ＭＩＲＯユビキチン化シグナルの特異性を示している（図７Ａ、左のレーン）。β−Ｇａｌコントロールと比較して、ＤＵＢ−失活  ＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓではなく野生型ＵＳＰ３０のコトランスフェクションが、ユビキチン化ＭＩＲＯの量を約８５％減少させた（図７Ａ、Ｂ）。同様に、野生型ＵＳＰ３０過剰発現は、Ｔｏｍ２０のユビキチン化を減少させたのに対して（図７Ａ）、ＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓは、ドミナントネガティブ機構と一致して、基本Ｔｏｍ２０ユビキチン化（ＣＣＣＰなし）を実際には約２倍増加させ、ＣＣＣＰ誘導性ユビキチン化を約８倍増加させた（図７Ａ、Ｃ）。（ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎを欠く）親ＨＥＫ−２９３細胞株では、ＣＣＣＰは、検出可能なＴｏｍ２０又はＭＩＲＯユビキチン化を誘導しなかった（図６Ａ）。しかしながら、この細胞株では、ＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓ過剰発現は依然として基本Ｔｏｍ２０ユビキチン化及びＵＳＰ３０を増強して、それを抑制することができた（図６Ａ）。統合すると、本発明者らのデータは、ＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０がＵＳＰ３０基質であること、並びにミトコンドリア損傷後において、ＵＳＰ３０がＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０の両方のＰａｒｋｉｎ媒介性ユビキチン化に反作用し得ることを示している。
【０１８５】
基本条件下であっても、共通基質の一部は、ＵＳＰ３０によってレギュレーションされたことが見出された（上述のＴｏｍ２０による例証）。ＭＩＲＯではなくＭＵＬ１、ＡＳＮＳ及びＦＫＢＰ８は、Ｔｏｍ２０と類似の挙動を示した基質であった；すなわち、それらも、ＣＣＣＰの非存在下でＵＳＰ３０ノックダウンによるユビキチン化の基本的な増加を示した。従って、ＵＳＰ３０は、基本的には、おそらくはミトコンドリアＥ３リガーゼ（これは、ＣＣＣＰの非存在下で活性であり、ＭＩＲＯではなくＴｏｍ２０に対して作用する）に対して拮抗作用することによって、このタンパク質セットを脱ユビキチン化する。一方、ＴＯＭ７０、ＭＡＴ２Ｂ及びＰＴＨ２などのタンパク質は、ＣＣＣＰ後においてのみ、ＵＳＰ３０ノックダウンによるユビキチン化の増強を示したという点でＭＩＲＯと類似の挙動を示したが、これは、Ｐａｒｋｉｎがミトコンドリアにリクルートされた後においてのみ、ＵＳＰ３０がこれらのタンパク質の脱ユビキチン化に関与することを示唆している。損傷ミトコンドリアにリクルートされた後、Ｐａｒｋｉｎは、Ｔｏｍ２０及びＭＩＲＯ型の両方のＵＳＰ３０基質をターゲティングして、それらのポリユビキチン化のバランスを変化させ得る。
【０１８６】
同じ実験系（ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ及びＨＡ−ユビキチンを過剰発現する細胞）を使用して、内因性ＵＳＰ３０の機能をｓｈＲＮＡ抑制によって試験した。ＵＳＰ３０ノックダウンは、ＭＩＲＯの基本ユビキチン化（ＣＣＣＰ誘導性ミトコンドリア損傷がない場合）に影響を与えなかった。しかしながら、ミトコンドリアの脱分極（ＣＣＣＰ  ５μM、２時間）後においては、ＭＳ実験と一致して、ＵＳＰ３０ノックダウンは、ＨＡ−ユビキチン免疫沈降で測定した場合にユビキチン化ＭＩＲＯのレベルを約２．５倍増加させた（図７Ｄ、Ｅ）。注目すべきことに、ＵＳＰ３０ノックダウンは、酵素的に不活性なＵＳＰ３０と同様に、基本Ｔｏｍ２０ユビキチン化及びＣＣＣＰ誘導性Ｔｏｍ２０ユビキチン化の両方を増加させた（図７Ｄ、Ｆ）。ＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡによって引き起こされたＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０ユビキチン化の増加は、ヒトＵＳＰ３０  ｓｈＲＮＡに対して非感受性のラットＵＳＰ３０  ｃＤＮＡの発現によって妨げられたが、これは、このＲＮＡｉ効果の特異性を示している（図６Ｂ）。従って、これらの生化学的データは、内因性ＵＳＰ３０がＴｏｍ２０及びＭＩＲＯの両方のユビキチン化のブレーキとして作用するというＭＳ調査結果を裏付けている。
【０１８７】
Ｐａｒｋｉｎは、様々なミトコンドリア基質上のＫ２７−、Ｋ４８−及びＫ６３型ポリユビキチン鎖をアセンブルすることが以前に示されている（Geisler et al., Nat. Cell Biol., 12: 119-131 (2010)。Ｔｏｍ２０及びＭｉｒｏに対するポリユビキチン鎖トポロジーを調べるために、本発明者らは、７個のリシン残基全てをアルギニンで個別に置換したＨＡ−ユビキチン突然変異体（単一Ｋ−Ｒ突然変異体）を用いて、又は単一のリシンをインタクトにしておき、他の６個のリシン全てをアルギニンで置換した突然変異体を用いて、ユビキチン化アッセイを繰り返した。本発明者らは、これらのユビキチン突然変異体によって得られたＣＣＣＰ誘導性Ｔｏｍ２０及びＭｉｒｏユビキチン化の量を野生型ユビキチンと比較した。全ての「単一Ｋ−Ｒ突然変異体」の中で、Ｋ２７Ｒ突然変異のみがＣＣＣＰ誘導性Ｔｏｍ２０ユビキチン化を阻止したのに対して、他のＫ−Ｒ突然変異体（Ｋ６Ｒ、Ｋ１１Ｒ、Ｋ２９Ｒ、Ｋ３３Ｒ、Ｋ４８Ｒ、Ｋ６３Ｒ）は正常なＴｏｍ２０ユビキチン化を支援した（図６Ｃ、Ｄ）。逆に、正常なＴｏｍ２０ユビキチン化は、Ｋ２７がインタクトなユビキチン（他のリシンは全て突然変異されている）によってのみ支援されたのに対して、他の単一リシン突然変異体（Ｋ６、Ｋ１１、Ｋ２９、Ｋ３３、Ｋ４８、Ｋ６３）は全て、Ｔｏｍ２０ユビキチン化を障害した（図６Ｅ、Ｆ）。従って、ユビキチンのＫ２７は、Ｔｏｍ２０におけるポリユビキチン鎖の構築に必要かつ十分なものであり、これは、Ｔｏｍ２０に対する主なポリユビキチントポロジーがＫ２７型鎖であることを示唆している。Ｔｏｍ２０と同様に、Ｍｉｒｏもその正常なユビキチン化にＫ２７を必要とした（そして、ユビキチンの他のリシンを必要としなかった）（図６Ｃ、Ｄ）。Ｋ２７のみを含有するユビキチン突然変異体がＭｉｒｏユビキチン化を最も良く支援したが、Ｍｉｒｏに付着したユビキチンは、野生型ユビキチンと比較して有意に少なく（野生型ユビキチンの約６５％）、これは、ＭｉｒｏがＫ２７以外の他の鎖型を蓄積することを示唆している（図６Ｅ、Ｆ）。本発明者らのデータは、他の基質上でＫ２７連結鎖をアセンブルするＰａｒｋｉｎの能力と一致している（Geisler et al., Nat. Cell Biol., 12: 119-131 (2010)）。
【０１８８】
ユビキチン化の他に、ＵＳＰ３０は、ユビキチン化に加えてタンパク質のターンオーバーをレギュレーションするか？公開された証拠は、Ｐａｒｋｉｎが複数のミトコンドリア外膜タンパク質の分解を媒介することを示唆している（Chan et al., Human Mol. Genet., 20: 1726-1737 (2011)）。これと一致して、調べたいくつかの外膜タンパク質（ＭＩＲＯ、ＭＦＮ−１、ＴＯＭ７０、ＶＤＡＣ、Ｔｏｍ２０）の全てが、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ安定細胞株を６時間にわたってＣＣＣＰ処理（５μM）する間に、タンパク質レベルの有意な低下を示した（図６Ｇ、Ｈ）。Ｔｏｍ２０レベルも減少したが、ＭＩＲＯ及び他の外膜タンパク質よりも少ない程度であった（ＣＣＣＰによる１０＋／−１％の減少、ｔ＝６時間、ｐ＜０．０１）（図６Ｇ、Ｈ）。外膜タンパク質とは対照的に、ミトコンドリアマトリックスタンパク質ＨＳＰ６０及び内膜タンパク質ＴＩＭＭ８Ａは、この時間枠内ではＣＣＣＰによって変化しなかった。ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ安定細胞におけるＵＳＰ３０過剰発現は、ＣＣＣＰ誘導性のＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０枯渇を大きく減弱させるか又は無効化した（図６Ｇ、Ｈ）。他のミトコンドリア膜タンパク質（ＭＦＮ−１、ＴＯＭ７０、ＶＤＡＣ）のＣＣＣＰ誘導性分解には影響がなかったので、ＵＳＰ３０過剰発現による安定化はＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０に対して比較的特異的であるように思われた（図６Ｇ、Ｈ）。野生型ＵＳＰ３０とは異なり、不活性Ｃ７７Ａ−又はＣ７７Ｓ−ＵＳＰ３０突然変異体は、ＣＣＣＰによって誘導されるＭＩＲＯ又はＴｏｍ２０分解を阻害しなかったが、これは、ＤＵＢ活性の必要性を示唆している（図６Ｇ、Ｈ）。これらのデータは、ＵＳＰ３０が、他のミトコンドリアタンパク質のターンオーバーに影響を与えずに、ＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０の分解に対して特異的に反作用し得ることを示している。
【０１８９】
ＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０分解はマイトファジーを伴い（図６Ｇ、Ｈ及び（Chan et al., Human Mol. Genet., 20: 1726-1737 (2011)）、ＵＳＰ３０ノックダウンはマイトファジー（図５Ｃ、Ｅ）並びにＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０のユビキチン化（図７）を増強するので、これらのタンパク質の枯渇はマイトファジーをトリガーし得ると推測した。このモデルでは、これらのタンパク質の過剰発現は、ＵＳＰ３０ノックダウンによって誘導されるマイトファジーを遮断するであろう。代わりに、ニューロンにおけるＭＩＲＯ又はＴｏｍ２０の過剰発現は−それら自体によってさえ−ｍｔ−Ｋｅｉｍａアッセイにおいてマイトファジーのロバストな増加をもたらし（図８Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）、これはＵＳＰ３０ノックダウンと類似の効果であることが見出された。従って、ＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０のユビキチン化は（ユビキチン化に続発するそれらの分解ではなく）マイトファジーのシグナルとして働き、ＭＩＲＯ及びＴｏｍ２０の過剰発現は、ユビキチン化に利用可能なこれらの基質のプールを増加させることによってマイトファジーを促進するという仮説を立てた。
【０１９０】
そのユビキチン化がＣＣＣＰ又はＵＳＰ３０ノックダウンにより増加し、ＣＣＣＰ処理＋ＵＳＰ３０ノックダウンの組み合わせに応じてさらに増加した３個のリシン残基（Ｋ５６、Ｋ６１及びＫ６８）が、Ｔｏｍ２０由来のユビキチン化ペプチドのＭＳ分析によって同定された（図９）。これらの特定部位におけるユビキチン化を確認するために、Ｔｏｍ２０における３個のリシン残基をアルギニンに突然変異させた（「３ＫＲ−Ｔｏｍ２０」（Ｋ５６Ｒ、Ｋ６１Ｒ、Ｋ６８Ｒ突然変異体））。ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎを過剰発現する細胞では、ｍｙｃタグ付野生型Ｔｏｍ２０は、内因性Ｔｏｍ２０と同様に、酵素的に不活性なＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓ（図８Ａ）の共発現によるユビキチン化の増加を示した（図７Ａ、Ｃ）。対照的に、３ＫＲ−Ｔｏｍ２０は、野生型Ｔｏｍ２０よりも少ない基本ユビキチン化を示したのに加えて、ドミナントネガティブＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓによって影響されなかったが（図８Ａ）、これは、これらの３個のリシン残基がＴｏｍ２０上の主なＵＳＰ３０ターゲット残基であることを示している。
【０１９１】
ニューロンにおけるｍｔ−Ｋｅｉｍａアッセイでは、野生型Ｔｏｍ２０の過剰発現はマイトファジーを増強したのに対して、３ＫＲ−Ｔｏｍ２０突然変異体はそうすることができなかった（図８Ｂ、Ｄ）；従って、Ｔｏｍ２０はマイトファジーを駆動するのに十分であるが、この能力はそのユビキチン化に依存する。また、３ＫＲ−Ｔｏｍ２０は、ＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓによって誘導されるマイトファジーの増加を阻止したが（図８Ｂ、Ｄ）、これは、ドミナントネガティブＵＳＰ３０によって引き起こされるマイトファジーフラックスの増加がＴｏｍ２０ユビキチン化を必要とすることを示唆している。あるいは、過剰発現された３ＫＲ−Ｔｏｍ２０は、非触媒的にＵＳＰ３０と物理的に結合することによってＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓ誘導性マイトファジーに対抗し得る。
【０１９２】
質量分析により、ＵＳＰ３０及びＰａｒｋｉｎによってレギュレーションされるＭＩＲＯ上の９個のリシンユビキチン化部位が同定されたが、これらのいくつかは、正常なＭＩＲＯ機能に必要であることが公知である（例えば、Ｋ４２７はＧＴＰａｓｅ活性に必要）（Fransson et al., Bioch. Biophys. Res. Comm., 344: 500-510 (2006)）。従って、ＵＳＰ３０ノックダウンはＭＩＲＯユビキチン化を増加させるので（図７Ｄ、Ｅ）、コンビナトリアル突然変異誘発を追求するのではなく、ＭＩＲＯのマイトファジー誘導能に対するＵＳＰ３０の効果を研究した。ＭＩＲＯユビキチン化はマイトファジーを駆動するという考えと一致して、ＵＳＰ３０ノックダウンは、ＭＩＲＯのみを過剰発現させた後に観察されたものよりもマイトファジーをさらに増強した（図８Ｃ、Ｅ）。統合すると、これらのデータは、ＭＩＲＯ又はＴｏｍ２０のユビキチン化がニューロンにおけるマイトファジーを駆動し得ること、及び少なくとも部分的にはこれらのタンパク質の脱ユビキチン化によって、ＵＳＰ３０によるマイトファジーの阻害を説明し得ることを示している。
【０１９３】
実施例６：ＵＳＰ３０ノックダウンは、ＰＤ突然変異に関連するマイトファジーの障害をレスキューする
ＰａｒｋｉｎのＰＤ関連突然変異に関連するミトコンドリア分解障害が、損傷ミトコンドリアのユビキチン化の障害に起因するものであり、ＵＳＰ３０が、Ｐａｒｋｉｎの生化学的及び機能的なアンタゴニストとして実際に機能する場合、ＵＳＰ３０の阻害は、ミトコンドリアのユビキチン化及び分解を回復させるはずである。この仮説を試験するために、本発明者らは、マイトファジーの障害を伴って（Geisler et al., Nat. Cell Biol., 12: 119-131 (2010); Lee et al., J. Cell Biol., 189: 671-680 (2010)）減弱したリガーゼ活性を示す（Sriram et al., Human Mol. Genet., 14: 2571-2586 (2005)）ＰＤ関連Ｐａｒｋｉｎ病因性突然変異体、例えばＧ４３０Ｄ及びＫ１６１Ｎに焦点を当てて研究した（例えば、Ｇ４３０Ｄ及びＫ１６１Ｎ）。
【０１９４】
病因性突然変異体ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ−Ｇ４３０ＤでトランスフェクションしてＣＣＣＰで処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では、ミトコンドリアはクリアランスされることができず、欠陥Ｐａｒｋｉｎタンパク質に関連する核周囲クラスタを形成する（図１０Ａ、最初のカラム）。Ｐａｒｋｉｎ−Ｇ４３０Ｄ及びＵＳＰ３０  ｓｉＲＮＡでダブルトランスフェクション（これは、ＵＳＰ３０タンパク質の約６０％ノックダウンをもたらした（図１１Ａ））した同じ細胞は、Ｐａｒｋｉｎ−Ｇ４３０Ｄ及びコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞と比較して、ミトコンドリアの６０％の減少を示した（全Ｔｏｍ２０蛍光による測定）（図１０Ａ、定量はＢ）。この結果は、欠陥Ｐａｒｋｉｎにもかかわらず、ＵＳＰ３０タンパク質レベルのｓｉＲＮＡノックダウンがマイトファジーを大幅にレスキューし得ることを示している。ミトコンドリア分解は、他のＤＵＢ（ＵＳＰ６、ＵＳＰ１４）のノックダウンによってレスキューされなかった（図１１Ｂ〜Ｄ）。不活性ラットＵＳＰ３０−Ｃ７７Ｓ突然変異体ではなくＲＮＡｉ耐性野生型ＵＳＰ３０（ラットＵＳＰ３０  ｃＤＮＡ）を再導入することにより、ＵＳＰ３０  ｓｉＲＮＡによるミトコンドリア分解のレスキューが妨げられた（図１０Ａ、Ｂ）。ミトコンドリア分解のレスキューは、（通常はミトコンドリアに結合している）突然変異体Ｇ４３０Ｄ  Ｐａｒｋｉｎの核周囲クラスタの喪失、及び細胞質全体にわたって小さく散在したＰａｒｋｉｎ含有斑点の出現と相関していた（図１０Ａ、Ｃ；図１１Ｂ、Ｃも参照のこと）。ＣＣＣＰ処理ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ−Ｇ４３０Ｄ発現細胞では、ＵＳＰ３０ノックダウンはＴｏｍ２０免疫反応性の喪失をもたらしただけではなく、マトリックスタンパク質ＨＳＰ６０の染色も減少させたが、これは、ＵＳＰ３０抑制がミトコンドリア全体の分解を回復させたことを示唆している（図１１Ｅ、Ｇ）。別のＰＤ関連Ｐａｒｋｉｎ突然変異体（Ｋ１６１Ｎ）に関連するミトコンドリア分解障害も同様に、ＵＳＰ３０  ｓｉＲＮＡノックダウンによってレスキューされた（図１１Ｆ、Ｈ）。ニューロンでは、Ｐａｒｋｉｎノックダウンに関連するマイトファジーの減少（ｍｔ−Ｋｅｉｍａアッセイによる測定）も、ドミナントネガティブＵＳＰ３０−Ｃ７７Ａによってレスキューされた（図１０Ｄ、Ｅ）。従って、ＵＳＰ３０の発現又は活性を抑制することにより、細胞は、欠陥Ｐａｒｋｉｎ又はＰａｒｋｉｎノックダウンを克服し、損傷ミトコンドリアのクリアランスを回復させることができる。
【０１９５】
いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、Ｐａｒｋｉｎリガーゼ活性はユビキチン化を介してミトコンドリアをマーキングするので、Ｐａｒｋｉｎ突然変異体中に存在するいくらかの残存リガーゼ活性は、ＵＳＰ３０ノックダウンがマイトファジーをレスキューするのに必要であり得る。ＵＳＰ３０ノックダウンがＰａｒｋｉｎ活性の完全な喪失に有効であるかについては、現在のところ不明である。しかしながら、重複する基質を有するか、又はＰａｒｋｉｎの欠如を補い得る他のＥ３が存在する可能性がある。
【０１９６】
実施例７：ＵＳＰ３０はＰａｒｋｉｎ基質である
Ｐａｒｋｉｎはミトコンドリア外膜タンパク質に対して広い活性を有するので、本発明者らは、ＰａｒｋｉｎがＵＳＰ３０（これもこのミトコンドリア区画に存在する）をユビキチン化するかを知ろうとした。この可能性を裏付けることにより、本発明者らは、ＣＣＣＰで処理したＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ発現細胞のプロテオミクス実験において、ＵＳＰ３０駆動性ユビキチン化ペプチドを同定した（「ＤＭＳＯ」に対する「ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ＋ＣＣＣＰ」におけるＵＳＰ３０ユビキチン化の倍率変化＝２７．２３、ｐ＜０．００１）。ＰａｒｋｉｎによるＵＳＰ３０ユビキチン化を確認するために、本発明者らは、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ及びＨＡ−ユビキチンを過剰発現する細胞においてユビキチン化アッセイを繰り返したところ、ＣＣＣＰ処理（２０μM、２時間、図９Ｃ、Ｄ）後に内因性ＵＳＰ３０のＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ誘導性ユビキチン化を見出した。質量分析によって同定されたＵＳＰ３０のユビキチン化部位（Ｋ２３５及びＫ２８９）はそのユビキチン化に必要ではなかったが、これは、ＵＳＰ３０における他のリシン残基がユビキチンを受容し得ることを示唆している（データは示さず）。ＣＣＣＰ処理（２０μM）も、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ発現細胞におけるＵＳＰ３０レベルの有意な低下を誘導した（図９Ｅ、Ｆ）。重要なことに、病因性突然変異Ｇ４３０Ｄ又はＫ１６１Ｎを有するＰａｒｋｉｎは、ＵＳＰ３０をユビキチン化（図９Ｃ、Ｄ）及び分解（図９Ｅ〜Ｆ）することができなかった。これらのデータは、ＰａｒｋｉｎがＵＳＰ３０をユビキチン化及び分解して、マイトファジーのブレーキを除去することを示している。
【０１９７】
実施例８：ＵＳＰ３０ノックダウンは、in vivoで酸化ストレスを減少させて保護を提供する
次に、ＵＳＰ３０ノックダウンが機能的利益をミトコンドリア及び細胞に提供するかを調べた。ＲＯＳ（これは、大部分がミトコンドリアに由来する）は神経変性障害に関連し、ミトコンドリア機能障害は、ＰＤにおける酸化ストレスの増加に寄与し得る（Lee et al., Biochem. J., 441: 523-540 (2012)）。ミトコンドリアにおける酸化ストレスを測定するために、ミトコンドリアマトリックスターゲティングｒｏ−ＧＦＰ（ｍｉｔｏ−ｒｏＧＦＰ）（これは、ミトコンドリアの酸化還元電位の定量的なレシオメトリックイメージングを可能にするレドックス感受性蛍光タンパク質である）を使用した（Dooley et al., J. Biol. Chem. 279: 22284-22293 (2004)）。個々の細胞におけるレシオメトリックｍｉｔｏ−ｒｏＧＦＰシグナルを測定した後、培養物を逐次にＤＴＴ（１mM）で処理してプローブを完全に還元し、アルドリチオール（１００μM）で処理してプローブを完全に酸化することによって、プローブのダイナミックレンジを較正した（Guzman et al., Nature, 468: 696-700 (2010）。ＤＴＴ及びアルドリチオールの後に測定したｍｉｔｏ−ｒｏＧＦＰ比をそれぞれ０及び１に設定して、相対的酸化指数を較正した。コントロールルシフェラーゼｓｈＲＮＡでトランスフェクションしたコントロール細胞では、ニューロンは、約０．６の平均相対的酸化指数を有していた（図１７Ａ、Ｂ）。ＵＳＰ３０ノックダウンは相対的酸化指数を約０．４に低下させたが、これは、ＵＳＰ３０タンパク質の抑制がミトコンドリアの酸化ストレスの減少をもたらしたことを示唆している。
【０１９８】
in vivoストレス条件下で、ＵＳＰ３０ノックダウンにより保護が得られるかを試験するために、本発明者らは、ＰＤ分子病態の研究に有効なモデル系として現れたDrosophilaを使用した（Guo, Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2(11) pii: a009944 (2012)）。ハエＵＳＰ３０（ＣＧ３０１６。以下、ｄＵＳＰ３０と称する）をノックダウンするために、本発明者らはＧＡＬ４／ＵＡＳ系を用いた（Brand et al., Development, 118: 401-415 (1993)）。本発明者らは、アクチン−ＧＡＬ４駆動系統をＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉトランスジェニック系統と交配し、これにより、アクチンプロモーターのコントロール下でｄＵＳＰ３０  ＲＮＡｉを発現させることが可能になる（このアクチン−ＧＡＬ４＞ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉ系統は、「ｄＵＳＰ３０ノックダウン」系統と称される）。定量ＲＴ−ＰＣＲによれば、アクチン−ＧＡＬ４によるＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉの活性化は、アクチン−ＧＡＬ４のみ又はＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉのみを含有するコントロール親系統と比較して、ｄＵＳＰ３０  ｍＲＮＡの約９０％の減少をもたらした（図１７Ｃ）。ｄＵＳＰ３０ノックダウンの保護効果を試験するために、本発明者らは、「ｄＵＳＰ３０ノックダウン」系統をｐａｒｋｉｎ突然変異体ハエ（ｐａｒｋ２５）と交配した（Greene et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 4078-4083 (2003)）。ｐａｒｋｉｎを欠くハエは、その間接飛翔筋（ＩＦＭ）における重度のミトコンドリア形態障害（これは、崩壊した薄いクリステを伴う奇形であり、ＥＭ下におけるミトコンドリアの外見が「淡色」になる）を示す（図１２Ａ及びGreene et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 4078-4083 (2003)）。対照的に、野生型ハエは、クリステで均一にパックされた多くの暗染色ミトコンドリアを有する（図１２Ａ）。Ｐａｒｋｉｎ欠損ミトコンドリアに対するＵＳＰ３０阻害の効果を決定するために、本発明者らは、ｐａｒｋｉｎ突然変異体をｄＵＳＰ３０ノックダウンハエと交配した。「ｐａｒｋｉｎ突然変異体；ｄＵＳＰ３０ノックダウン」ハエでは、ＩＦＭミトコンドリアのほとんどは電子密度が高く、多数のクリステを含有していたが、フラグメンテーションされたクリステを有する「淡色」ミトコンドリアも時々見られた（図１２Ａ）。崩壊したクリステを含有するミトコンドリア面積の総ミトコンドリア面積に対する割合を定量することにより、ミトコンドリア完全性がｄＵＳＰ３０ノックダウンによって強く改善されることが明らかになった（図１２Ｂ−ｐａｒｋｉｎ突然変異体の約９０％対「ｐａｒｋｉｎ突然変異体；ｄＵＳＰ３０ノックダウン」の約２５％）。また、「Ｐａｒｋｉｎ突然変異体；ｄＵＳＰ３０ノックダウン」ハエでは、筋肉面積当たりの損傷ミトコンドリアが少なかった（図１２Ｃ）。従って、ｄＵＳＰ３０発現を抑制することにより、ｐａｒｋｉｎ欠損Drosophilaのin vivoにおけるミトコンドリアの形態的完全性を大きく回復させることができる。
【０１９９】
ＰＤに関連するニューロンにおけるＵＳＰ３０抑制効果を調べるために、本発明者らは、ドーパミンデカルボキシラーゼ（Ｄｄｃ）−ＧＡＬ４３９を使用して、ハエ神経系のアミン作動性ニューロンにおいて特異的にｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉを駆動した。ミトコンドリア損傷及びＰＤのモデルとして、本発明者らは、ＰＤに関連するミトコンドリア毒素のパラコートでハエを処理した（Castello et al., J. Biol. Chem., 282: 14186-14193 (2007); Cocheme et al., J. Biol. Chem., 283: 1786-1798 (2008); Tanner et al., Environmental Health Perspect., 119: 866-872 (2011)）。パラコート（１０mM、４８時間）で処理した後、Ｄｄｃ−ＧＡＬ４及びＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉコントロールハエ系統の両方が、１５cm超登る能力の低下を示した（図１２Ｄ）。このクライミング障害は、さらなるＬ−ＤＯＰＡ処理によって十分にレスキューされたが（図１７Ｄ）、これは、この行動障害がドーパミン枯渇に起因する可能性があることを示している。一貫して、コントロールハエ系統（Ｄｄｃ−ＧＡＬ４又はＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉトランスジェニックのみ）では、パラコート処理（１０mM、４８時間）は、セロトニン神経伝達物質レベルを変化させずに、ハエ頭部におけるドーパミンレベルの３０〜６０％の減少を引き起こした（これは、このモデルのドーパミン作動系に対するパラコートの毒性が特異的であることを示している−図１２Ｆ及び図１７Ｅ）。Ｌ−ＤＯＰＡと同様に、Ｄｄｃ−ＧＡＬ４＞ＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉハエにおけるｄＵＳＰ３０ノックダウンも、パラコート誘導性クライミング障害を完全にレスキューしたが（図１２Ｄ）、これは、この行動試験におけるパラコート毒性に対する完全保護が、アミン作動性ニューロンにおける特異的なＵＳＰ３０抑制によってもたらされ得ることを示している。アクチン−ＧＡＬ４＞ＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉハエにおける全身ＵＳＰ３０ノックダウンによっても、同様の完全保護が観察された（図１２Ｅ）。驚くべきことに、Ｄｄｃニューロン（Ｄｄｃ−ＧＡＬ４＞ＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉハエ）におけるＵＳＰ３０ノックダウンも、パラコート誘導性ドーパミン枯渇を防止した（図１２Ｆ）。ＵＳＰ３０ノックダウンは、ドーパミン枯渇及び運動障害の両方をレスキューしたので、これらの結果は、神経化学的及び機能的な観点の両方において、ＵＳＰ３０抑制がドーパミン作動性ニューロン及び生物に利益をもたらし得ることを示している。
【０２００】
ＵＳＰ３０ノックダウンが生物の生存に影響を及ぼすかを試験するために、本発明者らは、長期のパラコート処理（１０mM、９６時間）にわたって生きているハエの割合をモニタリングした。ｄＵＳＰ３０  ＲＮＡｉを発現するハエは、コントロールよりも有意に長く生存した（図１２Ｇ）。アクチン−ＧＡＬ４及びＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉコントロール群では、９６時間の時点において、パラコートで処理したハエのわずか１５％未満が生きていたのに対して、アクチン−ＧＡＬ４＞ＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉ（「全身ｄＵＳＰ３０ノックダウン」）群では、ハエの約４５％が生きていた（図１２Ｇ）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定したところ、３つのハエ系統全てがほぼ同量のパラコートを摂取していたことから（ハエ１匹当たりの平均パラコート量：ＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉ：３．２μg、アクチン−ＧＡＬ４：２．７μg、アクチン−ＧＡＬ４＞ＵＡＳ−ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉ：２．７μg）、本発明者らは、ＵＳＰ３０ノックダウンの利益がパラコートに対する曝露の差異に起因するものではなかったことを確認した。ハエにおける他のＤＵＢ（ｄＵＳＰ４７（ＣＧ５４８６）又はｄＹＯＤ１（ＣＧ４６０３））のノックダウンは、生存アッセイにおいて利益を提供しなかった；むしろ、それらは、パラコートに応じて死亡率を悪化させた（図１７Ｆ〜Ｈ）。さらに、ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉを発現するハエにヒトＵＳＰ３０  ｃＤＮＡを導入することにより、ｄＵＳＰ３０ＲＮＡｉによって提供される生存利益が減弱したが（図１７Ｉ）、これは、このＲＮＡｉ効果の特異性を実証している。注目すべきことに、Ｄｄｃニューロンにおいて特異的なＵＳＰ３０ノックダウンは、全身ＵＳＰ３０ノックダウンには劣るものの、有意な生存利益を提供するのに十分であった（図１２Ｈ）。この結果は、ＵＳＰ３０抑制の生物利益の大部分がドーパミン作動性ニューロンで媒介されることを示唆しており、ドーパミン作動性ニューロンの機能障害において、ＵＳＰ３０が重要な役割を果たすという考えをさらに補強している。
【０２０１】
実施例９：考察
ＰＤの病原性機構をより良く理解することは、この神経変性疾患の疾患改変療法を合理的に設計するのに役立つであろう。ＰＤにおける酸化的リン酸化酵素の活性障害（Schapira et al., Lancet, 1: 1269 (1989)）、酸化ストレスマーカーレベルの上昇（Lee et al., Biochem. J., 441: 523-540 (2012)）及びｍｔＤＮＡ突然変異（Bender et al., Nature Genet., 38: 515-517 (2006); Kraytsberg et al., Nature Genet., 38: 518-520 (2006)）は、欠陥ミトコンドリアの蓄積を示唆している（Zheng et al., Science Transl. Med., 2: 52ra73 (2010)）。ＰＩＮＫ１／Ｐａｒｋｉｎの遺伝学は異常ミトコンドリアの生物学にさらに関係し、ミトコンドリア品質コントロール障害をＰＤの病因の原因因子として指摘している（Youle et al., J. Biol. Chem., 12: 9-23 (2011)）。クリアランスされない損傷ミトコンドリアは毒性源になり、健全なミトコンドリアとの融合を介してミトコンドリアネットワークを「汚染」し得る（Tanaka et al., J. Cell. Biol., 191: 1367-1380 (2010)）。
【０２０２】
本発明者らは、マイトファジーのネガティブレギュレーターとしてＵＳＰ３０（ミトコンドリアに局在するＤＵＢ）を同定した。ＵＳＰ３０は、そのデユビキチナーゼ活性を介して、ミトコンドリアタンパク質のＰａｒｋｉｎ媒介性ユビキチン化及び分解に対して対抗し、マイトファジーのための損傷ミトコンドリアのマーキングを減弱させる。ＵＳＰ３０のノックダウン阻害はマイトファジーを加速し、ＰＤ関連Ｐａｒｋｉｎ突然変異体を発現する細胞におけるＣＣＣＰ誘導性ミトコンドリア分解を回復させた。ＵＳＰ３０ノックダウンは、ｐａｒｋｉｎ突然変異体ハエにおいてミトコンドリア完全性を改善するが、これは、Ｐａｒｋｉｎ及びＵＳＰ３０がin vivoでミトコンドリア品質に対して反作用することを裏付けている。ＵＳＰ３０ノックダウンはまた、パラコートで処理した野生型ハエにおいて運動行動及び生存の利益をもたらしたが、これは、ＵＳＰ３０阻害がミトコンドリア損傷の効果を改善し得るという考えをさらに裏付けている。
【０２０３】
Ｐａｒｋｉｎ、ＵＳＰ３０及びミトコンドリア品質コントロール
Ｐａｒｋｉｎ及びＰＩＮＫ１はマイトファジーのキープレーヤーとして同定されているが、特に哺乳動物細胞におけるマイトファジー経路に関する詳細な機構的理解は不足している。ニューロンにおける基本マイトファジーがＰａｒｋｉｎ及びＰＩＮＫ１に依存するという事実（図３）は、これらのタンパク質が、通常起こるミトコンドリア損傷を活発にモニタリングしていることを示唆している。ミトコンドリア分裂（これは、Ｐａｒｋｉｎ媒介性マイトファジーに必要であると思われる（Tanaka et al., J. Cell. Biol., 191: 1367-1380 (2010)）は、２個の娘ミトコンドリアの一方における膜電位の一時的低下を誘発することによって、基本ミトコンドリアターンオーバーに寄与し得る（Twig et al., EMBO J., 27: 433-446 (2008)）。膜電位が速やかに再確立されない場合、膜電位のこの一時的低下は、ＰＩＮＫ１の蓄積及びＰａｒｋｉｎのリクルートに関する機会を作り出して、最終的なマイトファジーにつながる。従って、基本条件下では、ＵＳＰ３０ノックダウンは、分裂に伴うミトコンドリア膜電位の低下中にＰａｒｋｉｎ媒介性ユビキチン化を有利にすることによって、マイトファジーを加速し得る。損傷ミトコンドリアはＰａｒｋｉｎを蓄積する可能性が高いので、ＵＳＰ３０機能の抑制は不健全なミトコンドリアを選択的にクリアランスすると予想される。
【０２０４】
Ｐａｒｋｉｎリガーゼ活性はユビキチン化を介してミトコンドリアをマーキングするので、Ｐａｒｋｉｎ突然変異体中に存在するいくらかの残存リガーゼ活性は、ＵＳＰ３０ノックダウンがマイトファジーをレスキューするのにおそらく必要である。Ｐａｒｋｉｎ活性が完全に喪失した場合、他のＥ３リガーゼが重複する基質を有し、Ｐａｒｋｉｎの欠如を補償することができない限り、ＵＳＰ３０ノックダウンはクリアランスのレスキューに有効ではないと予想される。ｐａｒｋｉｎ突然変異体ハエにおいてｐａｒｋｉｎ遺伝子の大部分がないとしても、ＵＳＰ３０ノックダウンによってミトコンドリア完全性がレスキューされることは、後者の可能性を裏付けている。
【０２０５】
正常なターンオーバーの一環として、クリアランスされるアミトコンドリアは、おそらくはミトコンドリア生合成を介して交換される必要がある。培養細胞株では、ミトコンドリア損傷は全体的なミトコンドリア質量を増加させる（Narendra et al., PLoS Biology, 8: e1000298 (2010)）。これに関連して、Ｐａｒｋｉｎも、ネガティブ転写レギュレーターを分解することによってミトコンドリア生合成を増強し得ることは注目に値する（Shin et al., Cell 144: 689-702 (2011)）。ＵＳＰ３０も生合成経路をレギュレーションするか、及びＵＳＰ３０阻害によって誘導されるマイトファジーが新たなミトコンドリア産生を伴うかを決定するためには、さらなる研究が必要とされる。
【０２０６】
共通基質上のＵＳＰ３０対Ｐａｒｋｉｎ
全体的ユビキチン化部位のマッピング実験により、そのユビキチン化がＰａｒｋｉｎ過剰発現及びＵＳＰ３０ノックダウンの両方によって影響される複数の基質が同定された。これらの共通推定基質の中で、本発明者らは、Ｍｉｒｏ及びＴｏｍ２０が、Ｐａｒｋｉｎ及びＵＳＰ３０によってアンタゴニスティックにレギュレーションされるユビキチン化レベルを有することを確認した（すなわち、ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ過剰発現又はＵＳＰ３０ノックダウンは、ＣＣＣＰ処理によって誘導されるユビキチン化を増加させた）。興味深いことに、Ｔｏｍ２０によって例証されたこれらの共通基質の一部は、基本条件下でさえＵＳＰ３０によってレギュレーションされた。ＭｉｒｏではなくＭｕｌ１、Ａｓｎｓ及びＦｋｂｐ８が、Ｔｏｍ２０と類似の挙動を示したミトコンドリア基質であり、ＣＣＣＰの非存在下でＵＳＰ３０ノックダウンによるユビキチン化の基本的増加を示した。従って、おそらくはミトコンドリアＥ３リガーゼ（これは、ＣＣＣＰの非存在下で活性であり、ＭｉｒｏではなくＴｏｍ２０に対して作用する）に対して拮抗作用することによって、ＵＳＰ３０は、基本的にはこのタンパク質セットを脱ユビキチン化する。ＣＣＣＰ後においても、ＵＳＰ３０は、この基質セットのＰａｒｋｉｎ依存性ユビキチン化に反作用する。一方、Ｔｏｍ７０、Ｍａｔ２ｂ及びＰｔｈ２などのタンパク質は、ＣＣＣＰ後においてのみ、ＵＳＰ３０ノックダウンによるユビキチン化の増強を示したという点でＭｉｒｏと類似の挙動を示した。この観察結果は、リクルートされるＰａｒｋｉｎの非存在下でこれらのタンパク質セットが低レベルの基本ユビキチン化を受ける（すなわち、Ｐａｒｋｉｎはそれらの主なＥ３リガーゼである）こと、又は基本条件下ではＵＳＰ３０がこれらのタンパク質に対して不活性であることを示唆している。ミトコンドリア脱分極は、おそらくはＰＩＮＫ１媒介性リン酸化を介して（Kondapalli et al., Open Biology, 2: 120080 (2012); しかしVives-Bauza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 378-383 (2010)を参照のこと）、ＰａｒｋｉｎのＥ３リガーゼ活性をレギュレーションする（Matsuda et al., J. Cell Biol., 189: 211-221 (2010)）；ＵＳＰ３０（これは、ミトコンドリアに構成的に局在する）の活性もミトコンドリア損傷によってレギュレーションされるかについては、まだ研究されていない。
【０２０７】
全体的ユビキチン化分析により、そのユビキチン化がＰａｒｋｉｎ及びＵＳＰ３０によって逆にレギュレーションされた一連の非ミトコンドリアタンパク質（核タンパク質、代謝酵素及びユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）の構成要素を含む）も明らかになった。これは、Ｐａｒｋｉｎ及びＵＳＰ３０間のアンタゴニスティックな機能的関係がミトコンドリア以外に及び得ることを示唆している。これらの非ミトコンドリア「基質」は、Ｐａｒｋｉｎ及びＵＳＰ３０によって間接的にレギュレーションされ得るか、又はミトコンドリア上に亜集団を有し得るが、計算ツールが用いるフィルタリング基準が厳格であるので、正式にはミトコンドリア局在性を有するとされていない（Pagliarini et al., Cell, 134: 112-123 (2008)）。また、ＭＳにより、（内因性Ｐａｒｋｉｎ及びＵＳＰ３０レベルの下で）ＣＣＣＰによるユビキチン化の増強を示したタンパク質であって、Ｐａｒｋｉｎ過剰発現又はＵＳＰ３０ノックダウンによりユビキチン化がさらに増加しないタンパク質がいくつか同定されたが（例えば、Ｓｓｂｐ、ＺＯ１、Ｒａｂ１０、Ｖａｍｐ１）、これは、ミトコンドリア脱分極後の別のＵＰＳ経路の関与を示唆している。いくつかの場合では、ユビキチン化種のレベルの上昇は、全タンパク質基質それ自体のレベルの増加に由来し得ることに留意することが適切である。
【０２０８】
興味深いことに、ＰａｒｋｉｎもＵＳＰ３０をユビキチン化及び分解し、病因性Ｐａｒｋｉｎ突然変異は、ＵＳＰ３０をダウンレギュレーションするこの能力を遮断した。マイトファジーのネガティブレギュレーターを除去することができないと、これらのＰａｒｋｉｎ突然変異体に関連する非効率的なユビキチン化が悪化する可能性があり、これにより部分的には、ＵＳＰ３０ノックダウンによるマイトファジーのレスキューを説明することができる。
【０２０９】
Ｐａｒｋｉｎ、ＵＳＰ３０及び神経変性
ＰＤ関連Ｐａｒｋｉｎ突然変異は、触媒活性の減少、凝集の増強及び／又は発現の減少につながり得る（Hampe et al., Human Mol. Genet., 15: 2059-2075 (2006); Matsuda et al., J. Biol. Chem., 281: 3204-3209 (2006); Wang et al., J. Neurochem., 93: 422-431 (2005); Winklhofer et al., J. Biol. Chem. 278: 47199-47208 (2003)）。散発性ＰＤでは、Ｐａｒｋｉｎ活性は、細胞ストレスによっても阻害され得る（Corti et al., Physiol. Rev., 91: 1161-1218 (2011)）。ＰＤ関連ＰＩＮＫ１突然変異は、Ｐａｒｋｉｎの損傷ミトコンドリアへの移行を障害する（Matsuda et al., J. Cell Biol., 189: 211-221 (2010); Narendra et al., PLoS Biology, 8: e1000298 (2010); Vives-Bauza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 378-383 (2010)）。従って、ミトコンドリア品質コントロールにおけるＰａｒｋｉｎの機能低下は、珍しいＰａｒｋｉｎ突然変異によって表されるよりもＰＤで見られやすく、特発性ＰＤにおけるＵＳＰ３０阻害が有用である可能性をさらに裏付けている。ＵＳＰ３０阻害の利益と一致して、ＵＳＰ３０ノックダウンは、ＰＤ関連突然変異体Ｐａｒｋｉｎを発現する細胞におけるマイトファジーを回復させ、ニューロンにおける酸化ストレスを減少させる。Drosophilaのｐａｒｋｉｎ突然変異体では、ＵＳＰ３０ノックダウンは、ミトコンドリア完全性を改善する。さらに、ＵＳＰ３０ノックダウンは、ミトコンドリアに関連する酸化ストレッサーであるパラコートに対する行動及び生存アッセイにおいて利益を提供する（Castello et al., J. Biol. Chem., 282: 14186-14193 (2007); Cocheme et al., J. Biol. Chem., 283: 1786-1798 (2008)）。パラコートは、ＰＤに疫学的に関連するミトコンドリア毒であるので（Tanner et al., Environmental Health Perspect., 119: 866-872 (2011)）、本発明者らの知見は、ＵＳＰ３０阻害が、ミトコンドリアの損傷及び機能障害によって引き起こされる疾患に有用であり得るというin vivo証拠を提供する。
【０２１０】
ＰＤでは、ミトコンドリア機能障害は黒質ニューロン特異的なものではなく、全身に存在している（Schapira et al, Parkinson’s Dis., 2011: 159160 (2011)）。ＵＳＰ３０発現は広範囲に及ぶと思われるので（Nakamura and Hirose, Mol. Biol. Cell, 19: 1903-1914 (2008)）、ＵＳＰ３０阻害は、損傷ミトコンドリアのクリアランスを促進することによって幅広い利益を提供する可能性がある。ニューロンに加えて、心筋細胞などの長命な代謝活性細胞も、効率的なミトコンドリア品質コントロールシステムに依拠している（Gottlieb et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol., 299: C203-210 (2010)）。これに関連して、Ｐａｒｋｉｎは、虚血性ストレスに応じてマイトファジーを活性化し、損傷ミトコンドリアをクリアランスすることによって、虚血／再灌流傷害から心筋細胞を保護することが示されている（Huang et al., PLoS One, 6: e20975 (2011)）。遺伝性ミトコンドリア病では、ｍｔＤＮＡ突然変異が野生型ｍｔＤＮＡと同じ細胞内に共存しており、ミトコンドリア機能障害及びミトコンドリア病は、突然変異ｍｔＤＮＡの割合が高い場合にのみ起こる（Bayona-Bafaluy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 14392-14397 (2005)）。興味深いことに、Ｐａｒｋｉｎ過剰発現は、おそらくは突然変異体ｍｔＤＮＡを含有するミトコンドリアを分解することによって、有害なｍｔＤＮＡ突然変異を有するミトコンドリアを排除し、ミトコンドリア機能を回復させる（Suen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 11835-11840 (2010)）。従って、ＵＳＰ３０阻害は、ミトコンドリアの品質を増強することによって、ＰＤ以外の疾患に利益をもたらす可能性がある。
【０２１１】
実施例１０：ペプチドＵＳＰ３０インヒビター
以前に記載されているように（Stanger, et al., 2012, Nat. Chem. Bio., 7: 655-660）、ビオチン化ＵＳＰ３０＿ｃｄ（Ｃ７７Ａ突然変異を有するＵＳＰ３０触媒ドメイン）溶液(Stanger, et al., 2012, Nat. Chem. Bio., 7: 655-660）を用いる結合選択ラウンドによって、２種類のファージディスプレイナイーブペプチドライブラリ（Linear-lib及びCyclic-lib)をサイクルした。この選択により、適度なスポットＥＬＩＳＡシグナル（約５の信号対雑音比）を有していたペプチドＵＳＰ３０＿３及びＵＳＰ３０＿８を同定した。ＵＳＰ＿３０及びＵＳＰ＿８は、配列：
ＵＳＰ３０＿３：ＰＬＹＣＦＹＤＬＴＹＧＹＬＣＦＹ（配列番号１）；
ＵＳＰ３０＿８：ＶＳＲＣＹＩＦＷＮＥＭＦＣＤＶＥ（配列番号２）
を有する。
【０２１２】
次いで、ＵＳＰ３０の阻害並びにさらにはＵＳＰ７、ＵＳＰ５、ＵＣＨＬ３及びＵＳＰ２の阻害について、ＵＳＰ３０＿３及びＵＳＰ３０＿８をアッセイして、各ペプチドのＵＳＰ３０特異性を以下のように決定した。濃度範囲０〜１００μM（ＵＳＰ３０＿３の場合）及び０〜５００μM（ＵＳＰ３０＿８の場合）のＵＳＰ３０ペプチドリガンドを２５０nMユビキチン−ＡＭＣ（Boston Biochem., Boston, MA; Cat. No. U-550）と混合した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＢＳＡ及び１mM  ＤＴＴを含有するＰＢＳ緩衝液中の５．６、２、２、５及び０．０５nMのＤＵＢ（それぞれＵＳＰ３０、ＵＳＰ７、ＵＳＰ２、ＵＳＰ５及びＵＣＨＬ３）のパネルを、ユビキチン−ＡＭＣ／ＵＳＰ３０ペプチドリガンド混合物に３０分間追加し、SpectraMax（登録商標）M5e (Molecular Device, Sunnyvale, CA)を使用して蛍光（励起３４０nm及び発光４６５nm）をモニタリングすることによって、初期速度を直ぐに測定した。蛍光シグナルの増加の傾きに基づいて、初期速度を計算した。ペプチドリガンド濃度がゼロである場合の速度の割合に対して速度を標準化し、KaleidaGraphを使用して以下の式：
【数１】
0006310919.tif 000006
（式中、ｖは、最大速度の割合であり；Ｉは、インヒビター（ＵＳＰ３０ペプチドリガンド）の濃度であり；ｖ０及びｖｍａｘは、それぞれ速度の最小割合及び最大割合である）に対してフィッティングすることによって、データを処理した。
【０２１３】
実験結果を図１４に示す。ペプチドＵＳＰ３０＿３は、ＩＣ５０が８．０μMである優れたＵＳＰ３０特異性を示した。ＵＳＰ５に対するペプチドＵＳＰ３０＿３のＩＣ５０は６倍超高く（４９．４μM）、ＵＳＰ２に対するペプチドＵＳＰ３０＿３のＩＣ５０は１０倍超高かった（約１００μM）。ＵＣＨＬ３及びＵＳＰ２に対するペプチドＵＳＰ３０＿３のＩＣ５０は、２００μM超であった。
【０２１４】
ペプチドＵＳＰ３０＿３を親和性成熟のために選択した。親和性を改善するために、以前に記載されているように（Stanger, et al., 2012, Nat. Chem. Bio., 7: 655-660）、ターゲティングする親としてＵＳＰ３０＿３配列を使用してソフトランダム化ライブラリを構築し、溶液中でＵＳＰ３０＿ｃｄに対してパニングした。４ラウンドの溶液パニング後、親ＵＳＰ３０＿３よりも強いスポットファージＥＬＩＳＡシグナルを有するＵＳＰ３０触媒ドメインに結合した２０個のペプチドを同定し、信号対雑音比の約３〜６倍の改善が認められた。
【０２１５】
図１５は、ＵＳＰ３０＿３及び親和性成熟ペプチドの位置による残基確率のグラフを示す。特定の親和性成熟ペプチドの配列を信号対雑音比（「Ｓ／Ｎ」）（これは、NeutrAvidinコーティングプレートのみに対するＥＬＩＳＡシグナルに対する、NeutrAvidinコーティング３８４ウェルMaxisorbプレート上に捕捉されたビオチン化ＵＳＰ３０  ｃｄに対して検出されたスポットファージＥＬＩＳＡシグナル（「シグナル」）の比である）と共にグラフの下方に示す。図１５はまた、選択における各配列の出現回数（「ｎ」）、クローンの総数（「合計」；６６）及びユニークな配列の数（「Ｕｎｉｑ」；２０）を示す。親和性成熟ペプチドは全て、ＵＳＰ３０＿３．２７及びＵＳＰ３０＿３．６２を除いて１０超の信号対雑音比を示した。
【０２１６】
次いで、ＵＳＰ３０対他の脱ユビキチン化酵素に対する特異性について、特定のペプチドを試験した。ＥＬＩＳＡによって結合を試験した。図１６は、ＵＳＰ２、ＵＳＰ７、ＵＳＰ１４及びＵＳＰ３０の触媒ドメイン（それぞれ、活性部位のシステインがアラニンに突然変異されている）並びにＵＣＨＬ１、ＵＣＨＬ３及びＵＣＨＬ５の触媒ドメインに対する親ＵＳＰ３０＿３ペプチド並びに親和性成熟ペプチドＵＳＰ３０＿３．２、ＵＳＰ３０＿３．２３、ＵＳＰ３０＿３．６５及びＵＳＰ３０＿３．８８の結合の信号対雑音比（「ｓ／ｎ比」）を示す。各ペプチドの棒グラフセットについて、試験したターゲットは、左から右にＵＳＰ２、ＵＳＰ７、ＵＳＰ１４、ＵＳＰ３０、ＵＣＨＬ１、ＵＣＨＬ３及びＵＣＨＬ５であった。
【０２１７】
理解を明確にする目的で、図解及び実施例によって上記本発明をいくらか詳細に説明したが、これらの説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。
【０２１８】
【表４】
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【０２１９】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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