(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５，７−ジメトキシフラボン、５，７，４’−トリメトキシフラボン、３，５，７−トリメトキシフラボン、及び３，５，７，４’−テトラメトキシフラボンからなる群より選択される１種以上のメトキシフラボノイドを有効成分として含有するＴａｕタンパク質凝集阻害剤。
【請求項２】
Ａβタンパク質の凝集抑制作用を有する請求項１に記載のＴａｕタンパク質凝集阻害剤。
【請求項３】
神経原線維化阻害剤として用いられる、請求項１又は２に記載のＴａｕタンパク質凝集阻害剤。
【請求項４】
医薬品又は医薬部外品である請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴａｕタンパク質凝集阻害剤。
【請求項５】
食品又は食品添加物である請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴａｕタンパク質凝集阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー型認知症の原因の一つと考えられているＴａｕタンパク質の凝集を阻害するＴａｕタンパク質凝集阻害剤及び、当該Ｔａｕタンパク質凝集阻害剤を含有する医薬品などに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー型認知症は、脳が委縮し、記憶、思考、運動障害などをもたらす認知症の一種である。高齢者ほど発症率が高く、高齢化社会へ進行する日本において社会的な課題である。
【０００３】
アルツハイマー型認知症の患者の脳における特徴的な病理変化として、Ａβタンパク質タンパク質（以下、Ａβタンパク質）というペプチドの凝集体である老人斑や、異常にリン酸化されたＴａｕタンパク質の凝集体である神経原線維化が認められる。
【０００４】
かつてアルツハイマー型認知症は対する有効な薬剤は存在しなかったが、近年の研究によりドネペジルやリバスチグミンなどの薬剤が開発され実用されるようになってきた。しかしながら、これらの薬剤は神経賦活作用が主たるものであり、根本から治すというものではない。
【０００５】
このような現状を鑑みると、Ａβタンパク質やリン酸化されたＴａｕタンパク質の凝集を阻害することが予防の観点から有効である。Ａβタンパク質の凝集阻害作用を示す天然素材として、例えば、牡丹皮エキスや桂皮エキスが示されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２０６５８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、リン酸化されたＴａｕタンパク質の凝集を阻害する物質を見出し、その物質を有効成分とするＴａｕタンパク質凝集阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための手段として、以下の発明などを提供する。すなわち、メトキシフラボノイドを有効成分として含有するＴａｕタンパク質凝集阻害剤を提供する。
【０００９】
また、さらにＡβタンパク質の凝集抑制作用を有する上記のＴａｕタンパク質凝集阻害剤を提供する。
【００１０】
また、上記のＴａｕタンパク質凝集阻害剤を含有する食品、食品添加物、医薬品及び医薬部外品を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、アルツハイマー型認知症の原因の一つと考えられるリン酸化したＴａｕタンパク質の凝集を阻害するＴａｕタンパク質凝集阻害剤などを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】メトキシフラボノイドの基本骨格を示す図
【図２】各試料の構造式を示す図
【図３】実施形態１の試験における各試料のＴａｕタンパク質凝集阻害率を示す表
【図４】実施形態１の試験における各試料のＴａｕタンパク質凝集阻害率を示すグラフ
【図５】実施形態２の試験における各試料のＡβタンパク質凝集阻害率を示す表
【図６】実施形態２の試験における各試料のＡβタンパク質凝集阻害率を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、本発明は、これらの実施形態に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
＜実施形態１＞
＜概要＞
【００１４】
本実施形態のＴａｕタンパク質凝集阻害剤は、メトキシフラボノイドを有効成分として含有するものである。
＜構成＞
【００１５】
本実施形態において、「Ｔａｕタンパク質凝集阻害剤」とは、リン酸化されたＴａｕタンパク質の凝集を阻害することができる剤を意味する。
【００１６】
「メトキシフラボノイド」とは、メトキシ基（構造式がCH3O-と表わされる１価の官能基）を有するフラボノイドである。図１は、フラボノイドの基本骨格を示す図である。フラボノイドとは、ベンゼン環２個（図１におけるＡ環とＢ環）を３個の炭素原子でつないだジフェニルプロパン構造を有するフェニル化合物群の総称である。
【００１７】
フラボノイドは、Ｃ環の構造の差異により、フラボン類、フラボノール類、イソフラボン類などに分類される。本明細書におけるメトキシフラボノイドは、メトキシ基を有するフラボノイドであればよくフラボノイドの分類まで限定するものではない。メトキシフラボノイドには、例えば、フラボン類のトリシンやノビレチンなどがある。
【００１８】
本実施形態のＴａｕタンパク質凝集阻害剤は、さらに既知の方法を用いることにより、当該Ｔａｕタンパク質凝集阻害剤を含有する食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして提供することが可能である。
【００１９】
例えば、医薬品とする場合には、本実施形態のＴａｕタンパク質凝集阻害剤を粉体や粒体としカプセルに充填したり、あるいは、賦形剤、結合剤、崩壊剤などを添加して打錠機等を用いて錠剤とすることができる。また、食品とする場合には、黒ガリンガルを適宜乾燥や破砕等を施してから湯で煮出すことで提供できる。また、医薬品のようにカプセルや錠剤のような形態で提供してもよいし、他の飲料、調味料、菓子等の各種の食品にＴａｕタンパク質凝集阻害剤を添加した態様で提供することもできる。
＜試験＞
【００２０】
≪１．試料≫
本試験に試料として用いたメトキシフラボノイドは、以下の通りである。図２は、各試料の構造式を示す図である。
（No.１）5,7-dimethoxy flavone（5,7-ジメトキシフラボン）
（No.２）5,7,4'-trimethoxy flavone（5,7,4'-トリメトキシフラボン）
（No.３）3,5,7-trimethoxy flavone（3,5,7-トリメトキシフラボン）
（No.４）3,5,7,4'-tetramethoxy flavone（3,5,7,4'-テトラメトキシフラボン）
（No.５）3,5,7,3',4'-pentamethoxy flavone（3,5,7,3',4'-ペンタメトキシフラボン）
【００２１】
≪２．試験系≫
Ｔａｕタンパク質は、His-tag融合タンパク質として発現するプラスミドベクター(3R MBD: 3repeat-microtubule binding domain)を用いて培養、精製したものを用いる。チオフラビンT(ThT)蛍光強度を測定することにより、Ｔａｕタンパク質凝集を評価する。
【００２２】
≪３．試験系選択の理由≫
Ｔａｕタンパク質は凝集するとβ-sheet構造を形成するとされている。チオフラビンT(ThT)はタンパク質のβ-sheet構造を認識して蛍光を発するため、この特徴を利用してＴａｕタンパク質の凝集が確認できる。さらに蛍光強度を比較することにより、凝集の程度を比較することができる。（参考文献１「Okuyama K, Nishiura C, Mizushima F, Minoura K, Sumida M, Taniguchi T, et al (2008).Linkage-dependent contribution of repeat peptides to self-aggregation of three- or four-repeat microtubule-binding domains in tau protein. FEBS J. 275(7): 1529-39」、参考文献２「Sugino E, Nishiura C, Minoura K, In Y, Sumida M, Taniguchi T, et al (2009).Three-/four-repeat-dependent aggregation profile of tau microtubule-binding domain clarified by dynamic light scattering analysis. Biochem Biophys Res Commun. 385(2): 236-40」）
【００２３】
≪４．手順≫
≪４．−１リコンビナントＴａｕタンパク質(3R-MBD)の準備≫
≪４．−１−１  Ｔａｕ(3R MBD)の培養≫
【表１】
0006416828.tif 000002
【００２４】
表１の条件の下、培地を調製した後、オートクレーブで滅菌する。冷却後、Ampicillin sodium salt (RO水で100 mg/mLに調製した液)を終濃度50 μg/mLとなるよう加える。
【００２５】
≪方法≫
プラスミドベクターをタンパク質大量発現用大腸菌BL21(DE3)に形質転換し、作成したグリセロールストックを用いる。（参考文献３「Yao TM, Tomoo K, Ishida T, Hasegawa H, Sasaki M, Taniguchi T (2003).Aggregation analysis of the microtubule binding domain in tau protein by spectroscopic methods. J Biochem. 134(1): 91-9」）
【００２６】
前培養として本培養の1/10のスケールの2×YT培地にグリセロールストックを添加し、37℃、130 rpm、15時間培養する。この培養液を本培養の2×YT培地に加えてスケールアップし、OD600＝0.5に達するまで37℃、160 rpmで培養する。OD600＝0.5に達したところでIPTG（終濃度1 mM）を添加して発現誘導を行い、さらに37℃、160 rpm、4時間培養する。その後培養液を遠心分離して菌体を回収し、-30℃で保存する。
【００２７】
≪４．−１−２．Ｔａｕ(3R MBD)の精製≫
≪方法≫
培養・回収した菌体を、菌体量1Lあたり10 mLのBuffer（50 mM Tris-HCl、50 mM NaCl pH7.6）で懸濁し、超音波破砕を行う（超音波破砕：1秒＋氷冷：2秒  を40回）。この懸濁液を遠心分離した後、上清を回収し、アフィニティークロマトグラフィー（Ni Chelating）を用いて単離精製を行う。
・結合Buffer：50 mM Tris-HCl/500 mM NaCl/10 mM Imidazole、pH7.6
・溶出Buffer：50 mM Tris-HCl/500 mM NaCl/100 mM Imidazole、pH7.6
【００２８】
オープンカラムに樹脂を2 mL充填し、Ni（0.1M硫酸ニッケル溶液）を添加する。ここに遠心分離後の上清を添加し、ステップワイズ法により、溶出Bufferで目的Ｔａｕタンパク質を溶出させる。
【００２９】
アフィニティークロマトグラフィーで得られた溶出画分はBuffer（100 mM酢酸アンモニウム）で透析する（4℃、一晩）。透析後のサンプルを-30℃で予備凍結させた後、凍結乾燥器で乾燥させる。
【００３０】
≪４．−２  ThT蛍光測定≫
凝集反応：
1.5 mlマイクロチューブ（BIO-BIK）に、以下の順に試料及びＴａｕ溶液を添加する。
（１）50 mM Tris-HCl (pH7.6)                                           150 μL
（２）試料溶液、陽性対照(Methylene Blue)、陰性対照(Water又は50%EtOH)  10 μL
（３）100 μM Tau (3R-MBD)                                              20 μL
（４）100 μM Heparin                                                    20 μL
Total 200 μL
上記を添加後、ボルテックスミキサーで撹拌し、アルミホイルで覆って遮光後37℃、16時間インキュベートする。
【００３１】
測定：
インキュベート終了後、各反応液を96 well plateへ135 μLずつ添加し(n=3)、Perkin Elmer ARVO Wallac1420にて自家蛍光を測定する。（励起波長：440nm、測定波長：486 nm）さらにこの反応液に100 μM ThT溶液を15 μLずつ添加し、プレートミキサーにかけた後、同波長で測定する。
【００３２】
≪５．データ解析≫
陰性対照の測定値を100%として各被験物質の測定値を%換算し、さらに100%からこの％換算値を引いて凝集阻害率とする。
【００３３】
≪６．結果≫
図３は、No.１からNo.５までの各試料について、3μM，10μM，30μMの各濃度における凝集阻害率を示す表である。併せて陽性対照としてメチレンブルーの凝集阻害率を示したものである。なお、メチレンブルーについては、0.3μM，1μM，3μMの各濃度における凝集阻害率を示した。
【００３４】
また、図４は、上記各試料の凝集阻害率を示したグラフである。No.１とNo.４については濃度30μMにおいてＴａｕタンパク質凝集阻害作用が認められた。また、No.２についてはいずれの濃度においてもＴａｕタンパク質凝集阻害作用を確認することができた。
＜効果＞
【００３５】
上述した試験結果より、メトキシフラボノイドにＴａｕタンパク質の凝集を阻害する作用があり、とくに3,5,7-トリメトキシフラボンに凝集阻害作用があることが分かった。このようなメトキシフラボノイドによりＴａｕタンパク質凝集阻害剤などを提供することができる。
＜実施形態２＞
＜概要＞
【００３６】
Ａβタンパク質の凝集は、上述したようにアルツハイマー型認知症の原因の一つと考えられている。また、Ａβタンパク質とＴａｕタンパク質との関連についても研究が進められている。Ａβタンパク質の凝集体とＴａｕタンパク質の凝集体がいずれもアルツハイマー型認知症の原因物質であるならば、両者の凝集を阻害する物質は極めて有用である。そこで、メトキシフラボノイドのＡβタンパク質凝集阻害能を試験により明らかにする。
＜試験＞
【００３７】
≪１．試験系≫
チオフラビンT(ThT)蛍光強度を測定することにより、Ａβタンパク質凝集を評価する。
【００３８】
≪２．試験系選択の理由≫
Ａβタンパク質は凝集するとβ-sheet構造を形成するとされている。チオフラビンT(ThT)はタンパク質のβ-sheet構造を認識して蛍光を発するため、この特徴を利用してＡβタンパク質の凝集が確認できる。さらに蛍光強度を比較することにより、凝集の程度を比較することができる。（参考文献４「Hudson SA, Ecroyd H, Kee TW, Carver JA. (2009) The thioflavin T fluorescence assay for amyloid fibril detection can be biased by the presence of exogenous compounds FEBS J.; 276 (20): 5960-72.」、参考文献５「HARRY LEVINE. (1992) Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease β-amyloid peptides:Detection of amyloid aggregation in solution. Department of Neuroscience Pharmacology, Parke-Davis Pharmaceutical Research Division, Warner-Lambert Company, Ann Arbor, Michigan 48106-1047」）
【００３９】
≪３．手順≫
≪３．１  Ａβタンパク質の準備≫
Ａβタンパク質1-42：
インキュベート直前にＡβタンパク質1-42(ペプチド研 大阪 4349-v Lot:611204)に0.1% NH3水を240 μL加え溶解後(500 μM)、PBSを960μL加える。この溶液をPBSにて20 μMに希釈する。
【００４０】
≪３．２  ThT蛍光測定≫
凝集反応：
反応系終濃度の100倍の被験物質溶液を蒸留水または50%EtOHで希釈し作成し、これをPBSにて50倍希釈する。384well plateに調製した各被験物質溶液を25μL添加し、さらに希釈したＡβタンパク質1-42を25uLずつ添加する(n=3)。撹拌後アルミホイルで遮光し、37 ℃で24 時間インキュベートする。
【００４１】
測定：
インキュベート終了後、Perkin Elmer ARVO Wallac1420にて自家蛍光を測定する（励起389 nm、測定488 nm）。さらに反応液に6 μM ThT溶液を50 μLずつ添加し、プレートミキサーに30秒かけた後、同波長で測定する。
【００４２】
≪４．データ解析≫
陰性対照の測定値を100％として各被験物質の測定値を％換算し、さらに100％からこの％換算値を引いて凝集阻害率とする。
【００４３】
≪５．結果≫
図５は、No.１からNo.５までの各試料について、3μM，10μM，30μMの各濃度におけるＡβタンパク質の凝集阻害率を示している。併せて陽性対照としてメチレンブルーの凝集阻害率を示したものである。なお、メチレンブルーについては、0.3μM，1μM，3μMの各濃度における凝集阻害率を示した。
【００４４】
また、図６は、上記各試料の凝集阻害率を示したグラフである。各試料とも濃度30μMにおいてＡβタンパク質の凝集阻害作用が認められた。No.３とNo.５についてはいずれの濃度においてもＡβタンパク質の凝集阻害作用が認められた。
【００４５】
上述した実施形態１及び２において試料とした種類のメトキシフラボノイドを有する植物として、黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）が報告されている。これらの化合物はフラボノイド骨格のメトキシ基の数と結合部位に違いがある。そこで、これらメトキシフラボンの疎水性の違いを利用した逆相HPLCにより分離分析し、各化合物の存在を確認した。
【００４６】
その方法として、黒ガリンガルの乾燥粉末を熱水抽出し、得られた抽出液をエタノールで２倍希釈し、下記HPLC条件で５種類のメトキシフラボノイドを分離分析した。なお、各化合物の標本は、株式会社常盤植物化学研究所により製造されている各化合物を用いた。
（HPLC条件）
カラム：InertsilODS-4, 3μm
カラムサイズ（長さx内径）：100×4.6（mm）
溶離液：0.1%ギ酸/ 0.1%ギ酸-ACN= 70/ 30
流速：1.0mL/min
検出波長：UV 260nm
カラム温度：25℃
注入量：10μL（抽出液をエタノールで２倍希釈）
【００４７】
上記測定の結果、５種類すべてのメトキシフラボノイドが含まれていることが確認できた。
＜効果＞
【００４８】
上述した試験結果より、ある種のメトキシフラボノイドには、Ｔａｕタンパク質の凝集を阻害する作用だけでなく、Ａβタンパク質の凝集を阻害する作用もあることが分かった。
【図１】
0006416828.tif 000003
【図２】
0006416828.tif 000004
【図３】
0006416828.tif 000005
【図４】
0006416828.tif 000006
【図５】
0006416828.tif 000007
【図６】
0006416828.tif 000008