(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マメ科植物の生育期間の間、マメ科植物または土壌にキトサンを処理することを含む、クメストリン（Ｃｏｕｍｅｓｔｒｉｎ）またはクメストロール（Ｃｏｕｍｅｓｔｒｏｌ）の生産方法であって、
前記マメ科植物は、白太（Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｍａｘ．）であり、
前記キトサンは、低分子水溶性キトサンであり、
前記キトサン処理を４日〜６日間隔で行う、生産方法。
【請求項２】
前記キトサン処理は、マメ科植物の根に処理する、請求項１に記載のクメストリンまたはクメストロールの生産方法。
【請求項３】
前記キトサンを、マメ科植物の生育期間中、ＶＥ時期からＶ４時期までのうちいずれか一つの時期以上の期間中に処理する、請求項１に記載のクメストリンまたはクメストロールの生産方法。
【請求項４】
前記方法は、前記栽培されたマメ科植物の抽出物を製造することをさらに含む、請求項１に記載のクメストリンまたはクメストロールの生産方法。
【請求項５】
前記マメ科植物の抽出物は、根部分の抽出物である、請求項４に記載のクメストリンまたはクメストロールの生産方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項によりクメストリンを生産すること；および
前記クメストリンに、酸、塩基、酵素および微生物からなる群より選択された一つ以上を処理して、クメストリンから糖を除去することをさらに含む、クメストロールの生産方法。
【請求項７】
前記酸、塩基、酵素および微生物からなる群より選択された一つ以上の処理は、クメストリンを含むマメ科植物の抽出物に対して処理する、請求項６に記載のクメストロールの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クメストロールまたはクメストリンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
更年期の女性のためのエストロゲン療法において強力なエストロゲン効果を持っているジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ；ＤＥＳ）等の低廉な合成エストロゲンの使用が米国ＦＤＡによって全面禁止されて以降、女性ホルモンを代替し得る天然の植物性エストロゲン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）に関心が集まっている。しかし、このような物質は、天然にごく微量にしか存在しないため、大量確保が非常に難しいというのが実情である。また、過去半世紀にわたり、こうした物質の大量合成技術の開発が消極的であったため、目立った成果はなかった。間欠的ながらも合成法の開発についての報告がありはしたものの、これもやはり実験室レベルに留まっていたため、現在までこれといった簡単な大量製造方法が皆無の状態である。
【０００３】
クメストロール（ｃｏｕｍｅｓｔｒｏｌ）は、植物性エストロゲンの中で現在までにおいてもっとも強力なものと知られている物質で、主にマメ科（ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）、キク科（ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）植物の種子、根、ならびに葉から発見される物質であり、イソフラボノイド（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ）の一種として、一般的にはクメスタン（ｃｏｕｍｅｓｔａｎ）系化合物に分類されている。クメストロールは、植物が外傷を負った際、損傷部位に高濃度で分泌され、抗酸化、抗炎および抗毒素作用を通じて、抗菌、抗真菌および抗ウイルス作用を果たして感染を防止する役割をすることが知られつつ、注目を受けていた物質である（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
このような現象は、多様なバクテリアおよびカビ類、ウイルス等の感染がクメストロールを含む多様な芳香族化合物（ａｒｏｍａｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）の合成を誘導するためである。こうしたクメストロールの抗生作用の根源は、抗酸化剤としての化学的基本骨格であるフェノール性構造を保有しているため、フリーラジカル性（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ）酸化剤の流入を抑制して、生体内における過酸化化合物の生成を阻止するからであるものと知られている。また、多様な天然クメスタン系の誘導体の中で、唯一クメストロールのみがエストロゲン効果を持っているものと知られている。エストロゲン効果についての実験は、未熟なラットへの経口投与後における、子宮の重量変化に基づいて評価された。こうした実験結果において、特筆すべき事項として、クメストロールは幼いメスのラットにおいては効果的にエストロゲン効果が現れたが成熟したオスの動物には活性を示さず、また、毒性がまったくないものと示された（非特許文献１）。
【０００５】
しかし、クメストロールはマメ科植物にごく微量にしか存在しないため、現在商用されている天然クメストロールは、高価で販売されている。こうした理由から、合成を通じてクメストロールを得ようとする研究が間欠的に試みられてきた。しかし、複数個の芳香環が融合している多少複雑な化学構造のため、簡単な合成法の開発のためのアプローチ方法が紹介されておらず、いくつかの合成法が報告されているものの、各合成法は、以下に説明する様々な問題を内包しているため、商用化には多くの困難が付随している。また、最近では、化学合成法によって生産した成分よりは天然において生産した成分の方が、安全性の側面において良いイメージが持たれているので、天然において大量に生産することのできる方法についても進行中である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国特許公開第１０−１９９９−００８４０９２号公報
【特許文献２】韓国特許公開第１０−２００８−０１０４８２９号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１２／０３２２６５９号明細書
【特許文献４】韓国特許公開第１０−２０１３−００７９２２０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Darbarwar, M., et al., J. Sci. Ind. Res., 35, 297, 1982
【非特許文献２】Jeffrey, BH, et al., Phytochemical Dictionary, Taylor & Francis, London, pp418, 1933
【非特許文献３】Bourgaud, F. et al., “Production of flavonoids by Psoralea hairy root cultures”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1999, Vol.56, No.2, pp.97-104
【非特許文献４】Korsangruang, Sirintra et al., “Effects of abiotic and biotic elicitors on growth and isoflavonoid accumulation in pueraria candollei var, candollei and P. candollei var, mirifica cell suspension cultures”, Plant cell Tissue and Oragan Culture, 2010.12, Vol.103, No.3, pp.333-342
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一側面において、本発明は、マメ科植物からクメストロールまたはクメストリン（ｃｏｕｍｅｓｔｒｉｎ）を生産する方法を提供する。他の側面において、本発明は、クメストリンの糖除去を通じた多量のクメストロールの生産方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一側面は、マメ科植物の生育期間中、マメ科植物または土壌にキトサンを処理することを含むクメストリン（Ｃｏｕｍｅｓｔｒｉｎ）の生産方法を提供する。
【００１０】
本発明の他の一側面は、キトサン処理をマメ科植物の根に処理するクメストリンの生産方法を提供する。
【００１１】
本発明のまた他の一側面は、前記キトサンを、マメ科植物の生育期間中、ＶＥ時期からＶ４時期までのうちいずれか一つの時期以上の期間中処理するクメストリンの生産方法を提供する。
【００１２】
本発明のまた他の一側面は、低分子水溶性キトサンを使用するクメストリンの生産方法を提供する。
【００１３】
本発明のまた他の一側面は、キトサン処理を４日〜６日間隔で行うクメストリンの生産方法を提供する。
【００１４】
本発明のまた他の一側面は、栽培されたマメ科植物の抽出物を製造することをさらに含むクメストリンの生産方法を提供する。
【００１５】
本発明のまた他の一側面は、マメ科植物の根部分の抽出物を使用するクメストリンの生産方法を提供する。
【００１６】
本発明の一側面は、マメ科植物の生育期間中、マメ科植物または土壌にキトサンを処理することを含むクメストロール（Ｃｏｕｍｅｓｔｒｉｎ）の生産方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の一側面は、キトサン処理をマメ科植物の根に処理するクメストロールの生産方法を提供する。
【００１８】
本発明のまた他の一側面は、前記キトサンを、マメ科植物の生育期間中、ＶＥ時期からＶ４時期までのうちいずれか一つの時期以上の期間中処理するクメストロールの生産方法を提供する。
【００１９】
本発明のまた他の一側面は、低分子水溶性キトサンを使用するクメストロールの生産方法を提供する。
【００２０】
本発明のまた他の一側面は、キトサン処理を４日〜６日の間隔で行うクメストロールの生産方法を提供する。
【００２１】
本発明のまた他の一側面は、栽培されたマメ科植物の抽出物を製造することをさらに含むクメストロールの生産方法を提供する。
【００２２】
本発明のまた他の一側面は、マメ科植物の根部分の抽出物を使用するクメストロールの生産方法を提供する。
【００２３】
本発明のまた他の一側面は、前記方法によりクメストリンおよびクメストロールを生産すること；および、前記クメストリンに、酸、塩基、酵素および微生物からなる群より選択された一つ以上を処理して、クメストリン（Ｃｏｕｍｅｓｔｒｉｎ）から糖を除去することを含むクメストロールの生産方法を提供する。
【００２４】
本発明のまた他の一側面は、前記酸、塩基、酵素および微生物からなる群より選択された一つ以上の処理は、クメストリンを含むマメ科植物の抽出物に対して処理する、クメストロールの生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
一側面において、本発明に係るクメストロールまたはクメストリンの生産方法は、マメ科植物を使用したものであって、生成されるクメストロールまたはクメストリンの含量を高めるため、それから多量のクメストロールを高い収率で得ることを可能にする。このように生産されたクメストロールまたはクメストリンは、薬学、食品または化粧品を例として挙げられる多様な分野に活用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】誘導因子処理と生長時期に応じたマメ科植物の根部分の抽出物内におけるクメストロールの含有量を示す。
【図２】マメ科植物の根部分の抽出物を水に溶かした後、β‐グルコシダーゼを利用して酵素反応を進めた後、酵素反応によって生成された沈殿物を、ＨＰＬＣを利用して分析したものを示す。
【図３】酵素反応前後の、マメ科植物の根部分の抽出物内におけるクメストロールの含量比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
クメストロール（ＣＭＳ、３，９‐ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ‐６Ｈ‐ｂｅｎｚｏｆｕｒｏ（３，２‐ｃ）（１）ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ‐６‐ｏｎｅ  Ｃ１５Ｈ８Ｏ５、ＭＷ：２６８．２）は、天然エストロゲンであるエストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）またはスチルベストロール（ｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）と構造的に類似したクマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）類似化合物であって、下記化学式１のような構造を有する。
【００２８】
【化１】
0006332873.tif 000002
【００２９】
本発明のクメストリンは、下記化学式２で表わされてよい。
【００３０】
【化２】
0006332873.tif 000003
【００３１】
本発明は、マメ科植物の播種後、一定の栽培時期までマメ科植物または周辺土壌にキトサンを処理して、クメストリンを生産する方法を提供する。また、本発明は、マメ科植物の播種後、一定の栽培時期までマメ科植物または周辺土壌にキトサンを処理してクメストロールを生産する方法を提供する。マメ科植物の全体、または種子、葉、茎、実など、一部分にキトサンを処理してよく、特に、マメの根部分にキトサンを処理することが好ましい。
【００３２】
本発明の一側面において、前記マメ科植物は、クメストリンおよび／またはクメストロールを合成するマメ科植物であれば、特に制限なしに使用可能である。たとえば、本発明において使用されてよいマメ科植物の種類は、醤類および豆腐用、惣菜用、かて飯用または枝豆用の品種であってよい。ジャン類および豆腐用の品種としては、大豊（大韓民国品種名称登録（以下、省略）出願公告番号第２００３‐９４０号）、湖醤（出願公告番号第２００３‐９５０号）、壯元（出願公告番号第２００２‐７６号）、デーファン（出願公告番号第２０００‐３７９号）、ソダム（出願公告番号第１９９９‐９３３号）、松鶴（出願公告番号第１９９９‐９３６号）、大元（大韓民国国家品種目録（以下、省略）登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐３８号）、眞品（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐２６号）、蛋白（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐１８号）、豆油（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐２２号）、新八達（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐１５号）、太光（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐１２号）、萬里（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐１１号）、長壽（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐９号）、無限（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐７号）、白雲（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐２号）、セアル（登載番号第１０‐０００３‐１９９７‐３号）、黄金（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐１号）および長葉（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐４１号）等がある。惣菜用の品種としては、シンファコン（出願公告番号第２００９‐９８２号）、ソウォンコン（出願公告番号第２０００‐３７６号）、安平（出願公告番号第２００３‐９３９号）、西南（出願公告番号第２００３‐９４８号）、多彩（出願公告番号第２００３‐９３０号）、小緑、小湖（出願公告番号第２００２‐７８号）、疏明（出願公告番号第１９９９‐９３２号）、多元（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐４０号）、豊産（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐３４号）惣菜、益山（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐２９号）惣菜、小白（登載番号第０１‐２００３‐１９９７‐３１号）惣菜、光安（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐１９号）、短葉および銀河（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐６号）等がある。かて飯用品種では、青磁（出願公告番号第２００２‐８０号）、黒青（出願公告番号第２０００‐３８１号）、褐味（出願公告番号第２０００‐３８０号）、鮮黒（出願公告番号第１９９９‐９３４号）、コムジョンコン（登載番号第０１‐２００３‐１９９７‐１７号）および一品コムジョンコン（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐４２号）等がある。また、枝豆用品種では、ダオル（出願公告番号第２００３‐９３１号）、新緑（出願公告番号第２００２‐７７号）、セオル（出願公告番号第１９９９‐９３８号）、コムジョンオル（登載番号第０１‐２００３‐１９９７‐３７号）、夕凉プッコン（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐２５号）、華嚴プッコン（登載番号第０１‐０００３‐１９９７‐２１号）およびクンオル（登載番号第０１‐２００３‐１９９７‐１４号）等がある。
【００３３】
本発明の一側面において、キトサン処理は、マメ科植物の生育期間のうち、ＶＥ、ＶＣ、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、またはＶ４のうちいずれか一つの時期以上の期間中、処理してよい。好ましくは、ＶＥ時期からＶ３時期まで、より好ましくはＶＥ時期からＶ４時期まで処理してよい。ＶＥ時期は、生育段階のうち発芽段階であって子葉が地上に現れる時を意味し、ＶＣ時期は、子葉段階であって初生葉が展開中の時を意味する。Ｖ１時期は、初生葉段階であって初生葉が完全に展開した時を意味し、Ｖ２時期は、第１複葉期であって第１複葉が完全に展開した時を意味し、Ｖ３時期は、第２複葉期であって第２の複葉が完全に展開した時を意味する。Ｖ４時期は、第３複葉期であって第３複葉が完全に展開した時を通常意味する。
【００３４】
さらに、キトサン処理は、マメ科植物および／または周辺土壌に４日〜６日間隔で散布してよい。
【００３５】
本発明の一側面において、クメストロールまたはクメストリンの生産方法に使用するキトサンは、低分子水溶性キトサンが好ましく、分子量が、好ましくは２０，０００以下、１５，０００以下、１０，０００以下、または５，０００以下である低分子水溶性キトサンであってよい。低分子水溶性キトサンの分子量は、好ましくは５００以上、１，０００以上、２，０００以上、または５，０００以上であってよい。キトサンのもっとも重要な特性は、低分子量を有しつつ中性の水に可溶性を有することである。キトサンは、部分的に脱アセチル化されたキチンであって、非毒性である。使用するキトサンの濃度には制限がないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．３％以上が適当である。キトサンとともに使用する溶媒は、キトサンがよく溶け、安全な溶媒であれば制限されず、好ましくは水（Ｈ２Ｏ）が適当である。
【００３６】
本発明の一側面において、クメストリンの生産方法は、前記方法により製造されたマメ科植物の抽出物を製造するステップをさらに含んでよく、好ましくは、豆の根部分の抽出物を製造するステップをさらに含んでよい。本発明の他の一側面において、クメストロールの生産方法は、前記方法により製造されたマメ科植物の抽出物を製造するステップをさらに含んでよく、好ましくは、豆の根部分の抽出物を製造するステップをさらに含んでよい。
【００３７】
本発明の他の一側面において、クメストロールの生産方法は、マメ科植物の一定の生育期間中、マメ科植物または土壌にキトサンを処理して、クメストリンおよびクメストロールを生産するステップ、ならびに、前記生成されたクメストリンに、酸、塩基、酵素、および微生物からなる群より選択された一つ以上を処理して、クメストリンから糖を除去するステップを含んでよい。マメ科植物または土壌に対してキトサン処理をすることにより、クメストリンおよびクメストロールを同時に生成することができ、生成されたクメストリンから糖を除去するステップを追加することにより、クメストリンがクロメストロールに転換され得るため、生成されるクメストロールの収率が著しく向上し得る。すなわち、本発明の一側面によれば、マメ科植物または土壌に対してキトサン処理のみをしてクメストロールを生産する場合に比べて、クメストリンに対する糖除去ステップを追加することにより、大量のクメストロールの生産が可能である。
【００３８】
前記抽出物の抽出方法は、当該技術分野において通常的に使用される熱水抽出方法、高圧抽出方法、還流抽出方法、超音波抽出方法等を使用してよい。
【００３９】
具体的に、まず、マメ科植物から水または有機溶媒を利用してクメストリンを含有する植物抽出物の製造するために、マメ科植物、例えばマメ科植物の根に約１〜６倍、好ましくは約３倍の水またはエタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテートおよびクロロホルムを含む群から選択された一つ以上の有機溶媒またはこれら有機溶媒と水との混合溶媒を入れ、常温で１〜５回撹拌しながら抽出して脱脂させてから、脱脂された植物に約１〜８倍、好ましくは約４倍の水または前記有機溶媒を入れ、１〜５回還流抽出した後、１０〜２０℃で１〜３日間浸漬させた後、濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離された濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エーテル等を利用して色素を除去してから、前記有機溶媒を使用して水層を１〜５回抽出した後、収得した有機溶媒層を減圧濃縮して前記有機溶媒抽出物を得た後、これを少量のメタノール等に溶かした後、大量のエチルアセテート等を追加して生成された沈殿物を乾燥させることにより、本発明の前記クメストリンを含有するマメ科植物抽出物を収得してよい。
【００４０】
その次に、前記配糖体を含有する抽出物を、酸、塩基、酵素または前記酵素を生産する微生物を利用して、加水分解してクメストロールを製造する。
【００４１】
このとき、酸を利用する際には、前記抽出物に０．１Ｎ〜２Ｎ濃度、好ましくは１Ｎ濃度の酸または酸およびアルコールの混合溶媒（好ましくは４０〜６０％エタノール混合溶媒）を加えた後、５０〜１００℃、好ましくは８０℃の水浴槽で０．５〜２時間の間加熱還流させて、加水分解して反応液を収得してよい。
【００４２】
前記酸は、塩酸、硫酸および硝酸からなる群より選択された一つ以上の酸、またはこれら酸とエタノール、メタノールおよびブタノールからなる群より選択された一つ以上のアルコールとの混合溶媒を使用してよい。
【００４３】
このとき、塩基を利用する際には、前記抽出物を溶かした後、０．１Ｎ〜２Ｎ濃度、好ましくは１Ｎ濃度の塩基または塩基およびアルコールの混合溶媒（好ましくは４０〜６０％ブタノール混合溶媒）を加えて、５０〜１００℃、好ましくは１００℃の水浴槽で１〜１２時間の間加熱還流させて、加水分解して反応液を収得してよい。
【００４４】
前記塩基は、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムからなる群より選択された一つ以上の塩基、またはこれら塩基とエタノール、メタノール、ブタノールからなる群より選択された一つ以上のアルコールとの混合溶媒を使用してよい。
【００４５】
このとき、酵素を利用する際には、前記抽出物を５〜２０倍、好ましくは約１０倍の酸性緩衝溶液に溶解させてから、酵素を添加して約３５〜４０℃の水槽上で約１〜６０時間の間撹拌しながら、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して、基質が完全に消失したら熱水（８０〜１００℃）中で５〜１５分間加熱して加水分解反応を終了させ、反応液を収得してよい。
【００４６】
前記酵素を生産する微生物を活用する際には、前記抽出物を５〜１０倍、好ましくは約１０倍のイオン水に溶解させた後、１１０〜１３０℃で３０分間滅菌して２５〜３５℃に冷却した後、あらかじめ培養された微生物を液体量に対し５〜１０％で接種して、２５〜３５℃で２〜５日培養させた後、５，０００〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で数回洗浄した後、遠心分離して沈殿物として反応液を収得してよい。
【００４７】
前記酵素または前記酵素を生産する微生物は、エキソ（ｅｘｏ）糖結合分解酵素または前記エキソ糖結合分解酵素を生産する微生物を使用してよく、また、前記酵素は、配糖体から糖部分を除去してクメストロールを分離してよい。
【００４８】
前記のように酸、塩基、酵素または前記酵素を生産する微生物を利用して加水分解した後、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にアルコールを加えて１〜５回攪拌させた後、沈殿した塩等を濾過を通じて除去し、濾過された濾液を減圧濃縮してクメストロール粗生成物を収得し、前記収得した粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（たとえば、クロロホルム：メタノール＝８：１）を収得してよい。
【００４９】
たとえば、糖の除去は、下記表１のように行われてよい。
【００５０】
【表１】
0006332873.tif 000004
【００５１】
前記クメストリンを含む物質に、酸、塩基、酵素、または微生物からなる群より選択された一つ以上を処理することは、マメ科植物の抽出物に対して処理してよく、また、マメ科植物の抽出物を濾過または精製した後に処理してクメストロールを生産してもよい。
【００５２】
以下、実験例を挙げつつ、本発明の構成と効果についてより具体的に説明する。しかし、以下の実験例は、本発明の理解を助けるために例示の目的としてのみ提供されているだけにすぎず、本発明のカテゴリおよび範囲がそれによって制限されるものではない。
【００５３】
［実験例１］マメ科植物の生育期間中における誘導因子処理
マメ科植物（大豆（白太、Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｍａｘ．））の生育期間中、初期（ＶＥ）時期からＶ４時期まで、低分子水溶性キトサンまたは麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）を土壌およびマメ科植物に処理して栽培した。低分子水溶性キトサンは、水に容易に溶解するため土壌に処理することが容易であり、他の誘導因子と比較して食用が可能な成分であって、人体に無害な成分である。低分子水溶性キトサンは、（株）ＹｏｕｎｇＣｈｉ  Ｐｈａｒｍで生産する水溶性キトサン（ＹＷＣＴＳ‐１００）を購入した。キトサン処理は、水に０．３％の濃度で溶かした後、じょうろを利用して根にも接触し得るように、マメの茎や土壌を中心に、５日間隔で散布した。
【００５４】
麹菌は、多くの研究を通じて誘導効能に優れるものと知られている菌類であって、食品発酵菌として使用されている人体に無害な成分である。麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の乾燥菌体は、（株）ＭＥＤＩＯＧＥＮで購入した。麹菌処理は、マメに処理する１日前に、砂糖１０ｇを１Ｌの水に溶かした後、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）乾燥菌体１０ｇをよく混ぜた。その後、振盪式恒温器で３０℃の温度で１２時間培養した。培養後、じょうろを利用して、マメの茎およびマメの茎周辺の土壌によくしみ込むように散布した。麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の処理は、５日の間隔とした。このとき、対照群は、同量の精製水を散布した。
【００５５】
［実験例２］マメの根抽出物の製造
キトサンと麹菌をそれぞれ処理した実験群と何も処理せずに栽培したマメの根を生長時期別（ＶＥ〜Ｖ４時期、計６時期）に採取した後、精製水で洗浄し、乾燥させてから細粉化した。前記マメの根の粉１００ｇを７０％エタノール水溶液１リットル（Ｌ）に入れ、室温で２４時間抽出した後、３００メッシュ（ｍｅｓｈ）の濾布で濾過した。濾液を、冷却コンデンサの付いた蒸留装置を利用して５０℃で減圧濃縮し、乾燥してマメの根抽出物を作製した。
【００５６】
［実験例３］マメの根抽出物内におけるクメストロールの含量分析
前記実験例２で得られた各生長時期別マメの根抽出物におけるクメストロール（ｃｏｕｍｅｓｔｒｏｌ）含量の定量分析のために、ＨＰＬＣを利用した。マメの根抽出物のクメストロールの含量を比較するために、基準物質としてＩｎｄｏｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入したクメストロールを使用した。
【００５７】
誘導因子処理および生長時期別のマメの根抽出物内におけるクメストロールの含量は、図１のとおりである。誘導因子処理によりマメの根抽出物内のクメストロールの含量は、誘導因子処理をしなかった対照群のクメストロールの含量に比べて大きく増加した。特に、生育期間のうちＶ３およびＶ４時期に、クメストロールの含量が急激に増加した。Ｖ４時期までに生成されたクメストロールの含量は、無処理対照群のクメストロールの含量が抽出物ｇ当たり１．６ｍｇ／ｇであるのに対し、麹菌処理時は２．６ｍｇ／ｇで含量が約１．６倍増加し、キトサン処理時は約３．２ｍｇ／ｇで含量が２倍程度増加した。
【００５８】
［実験例４］クメストリンの糖除去を通じたクメストロールの含量増進
前記実験例１で行われたキトサン処理されたマメの根に、クメストロールの配糖体形態であるクメストリンが生成されたということを確認した。キトサン処理されたマメの根抽出物からクメストリンの糖を除去することにより、抽出物内におけるクメストロールの含量をさらに増加させることができる。
【００５９】
糖を除去することのできる方法のうち、β‐グルコシダーゼを利用して酵素反応を進行した後、酵素反応によって生成された沈殿物を、ＨＰＬＣを利用して分析してみた。分析の結果、抽出物内のクメストリンの糖が除去されるとともに、図２のように、クメストリンがクメストロールに転換されつつ、クメストロールの含量が既存のマメの根抽出物に比べてはるかに増加したことを確認することができた。すなわち、クメストリンを示す数値４４．００付近のピークが、＜マメの根抽出物＞のＨＰＬＣに比べて＜マメの根抽出物酵素反応沈殿物＞のＨＰＬＣにおいて少し減少したのに対し、クメストロールを示す数値５７．００付近のピークは、約１５倍程度増加した。
【００６０】
酵素反応前後のマメの根抽出物内におけるクメストロールの含量比較は、図３のとおりである。酵素反応を通じて、キトサン処理後のマメの根抽出物内におけるクメストロールの含量が約３．５倍増加した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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