(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）微細藻類に光を照射して走光性を誘発する工程と、
（ｂ）前記微細藻類の光反応性または光敏感性の走光性指標及び光合成指標を算出する工程と、
（ｃ）対照群と比較して、前記微細藻類の走光性指標が増加した場合、光合成効率または、光転換効率が改善された突然変異が誘発された微細藻類として選別する工程と、を含む走光性を利用した光合成効率または、光転換効率が改善された突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項２】
前記方法は、前記（ａ）工程の前に微細藻類を持続的光条件で培養した後、前記微細藻類を暗条件で培養する前処理工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項３】
前記持続的光条件は、５４０〜６００ｎｍまたは４３０〜５００ｎｍの波長を持つ２０〜５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２ｓ−１強度の光を、１２〜２４時間照射することを特徴とする請求項２に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項４】
前記前処理工程の培養は、対数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）まで培養することを特徴とする請求項２に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項５】
前記微細藻類は、単一コロニー由来または多数コロニー由来であることを特徴とする請求項１に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項６】
前記走光性は、陽性または陰性走光性であることを特徴とする請求項１に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項７】
前記走光性は、陰性走光性であり、５４０〜６００ｎｍまたは４３０〜５００ｎｍの波長の光を、２０〜５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２ｓ−１強度の光によって誘発されることを特徴とする請求項６に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項８】
前記走光性指標は、（ｉ）用いられた総微細藻類数に対する走光性に反応して単位時間当り移動した微細藻類数の比；（ｉｉ）単位時間当たり移動した微細藻類数の分布を基にしたヒストグラム頂点分析；または（ｉｉｉ）前記方法に用いられた微細藻類の単位距離当たり移動に所要された平均時間、または速度またはその偏差を含むことを特徴とする請求項１に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項９】
前記走光性指標は、光合成効率、または光転換効率を含むことを特徴とする請求項１に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項１０】
前記微細藻類は、緑藻類、ケイ藻類、紅藻類、淡緑藻類、茶色鞭毛藻類、黄緑色藻類、渦鞭毛藻類、または、藍藻類であることを特徴とする請求項１に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項１１】
前記茶色鞭毛藻類は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、及びＣｈｒｏｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．の中の一つ以上であることを特徴とする請求項１０に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項１２】
前記Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉであることを特徴とする請求項１１に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項１３】
前記走光性を利用した光合成効率または、光転換効率が改善された突然変異微細藻類の選別は微細流体光反応装置を利用して行われて、前記微細流体光反応装置は光透過性個体流入部と、前記個体流入部とは別に形成される個体到達部と、前記個体流入部及び前記個体到達部に流体疎通可能に連結されたチャネル部と、前記チャネル部の両末端の間に形成された計測部と、を含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項１４】
前記計測部は、前記チャネル部の径と同等または小さく形成されることを特徴とする請求項１３に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項１５】
前記計測部の径は、前記個体流入部に導入された個体の運動の個別的観察が可能な大きさで形成されることを特徴とする請求項１４に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項１６】
前記計測部の径は、１０〜１００μｍであることを特徴とする請求項１４に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項１７】
前記微細流体光反応装置は、光源を追加で含むことを特徴とする請求項１３に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【請求項１８】
前記光源は、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）またはレーザーダイオードであることを特徴とする請求項１７に記載の突然変異微細藻類の選別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、突然変異が誘発された単細胞生物体の選別方法及びこれに用いられる微細流体装置に関し、より詳しくは走光性を利用した突然変異単細胞生物体の選別方法で、前記方法は、単細胞生物体に光を照射して走光性を誘発する工程と、前記単細胞生物体の走光性指標を算出する工程と、対照群と比較して、前記単細胞生物体の走光性指標が変化した場合、これを目的する突然変異が誘発された単細胞生物体として選別する工程と、を含む。
【背景技術】
【０００２】
バクテリア、酵母、及び微細藻類を含む様々な単細胞生物体は、農業、畜産、水産、医薬及び資源分野で多様な目的に利用される。例えば、バクテリア及び酵母は、医薬用タンパク質発現に広く用いられ、特に微細藻類は、光エネルギーと二酸化炭素及び無機物質からバイオディーゼルに転換が可能な中性脂質を多量生産できる能力があって、近年化石燃料使用量の急増によるエネルギー資源枯渇問題及び温室ガス排出による地球温暖化問題を解決できる代案の一つとして注目されている。
【０００３】
微細藻類は、クロロフィル、カロチノイド、フィコビリンスなどといった色素を含有していて、光合成を介して細胞成長及びこれに必要な有機物質を合成できる単細胞性藻類を微細藻類（microalgae）といい、多くの植物性プランクトンがこれに属する。現在まで数十万種を越える微細藻類が淡水及び海洋生態系に存在すると報告されていて、様々な目的のために研究開発が試みられているが、遺伝子操作の限界等によって生産性向上のための菌株改良などに多くの困難に直面している。
【０００４】
このような微細藻類の効率的利用のために、目的に合う最適な菌株開発、培地最適化、最適反応器設計、代謝工程と生産物精製などのための研究が必要である。
【０００５】
この中最適な菌株を開発する方法中一つが、微細藻類のゲノムに特定または無作為突然変異を誘発した後、目的する性質、例えば光合成効率増大、高い脂質生産量または迅速な生長速度のような特徴を示す菌株を発掘することである。
【０００６】
米国公開特許公報第２００８−００２５４４９３号は、タンパク質分解酵素を発現しない突然変異微生物菌株の選別方法に関し、突然変異が発生した菌株をタンパク質分解酵素の気質が含まれたゲル上で培養して、気質の分解の可否を介した突然変異菌株を選別することに対して開示している。
【０００７】
大韓民国公開特許公報第２０１１−００１８７９８号は、微細流体細胞チップ、これを利用した細胞死滅定量分析法及び細胞映像分析装置に関し、微細流体システムを利用して細胞死滅をリアルタイムで分析及び映像化できる装置及び方法を開示している。
【０００８】
しかし、これは多くの場合、複雑な生化学的及び分子生物学的分析が伴う数万個の菌株に対するスクリーニングが求められる。従って、スクリーニング初期段階で菌株を高速選別できる方法の開発が求められる。
そこで、本発明者等は、前記問題を解決して効率的に単細胞生物体を選別するための方法を開発するために鋭意努力した結果、微細流体光反応装置を利用して、走光性をベースに改良された単細胞生物体を効果的に選別できることを確認して、本発明を完成することになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／００２５４４９３号明細書
【特許文献２】韓国特許第２０１１−００１８７９８号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、改良された光反応性等の特徴を有する遺伝子変異が誘発された最適な単細胞生物体を迅速かつ効率的に選別できる方法及び装置を提供するところにある。
【００１１】
前記目的を達成するために本発明は、（ａ）単細胞生物体に光を照射して走光性を誘発する工程と、（ｂ）前記単細胞生物体の走光性指標を算出する工程と、（ｃ）対照群と比較して、前記単細胞生物体の走光性指標が変化した場合、これを目的する突然変異が誘発された単細胞生物体として選別する工程と、を含む走光性を利用した突然変異単細胞生物体の選別方法及び前記方法によって選別された突然変異単細胞生物体を提供する。
【００１２】
本発明はまた、光透過性個体流入部と、前記個体流入部とは別に形成される個体到達部と、前記個体流入部及び前記個体到達部に流体疎通可能に連結されたチャネル部と、前記チャネル部の両末端の間に形成された計測部と、を含む微細流体光反応装置を提供する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）単細胞生物体に光を照射して走光性を誘発する工程と、
（ｂ）前記単細胞生物体の走光性指標を算出する工程と、
（ｃ）対照群と比較して、前記単細胞生物体の走光性指標が変化した場合、これを目的する突然変異が誘発された単細胞生物体として選別する工程と、を含む走光性を利用した突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目２）
前記方法は、前記（a）工程の前に単細胞生物体を持続的光条件で培養した後、前記単細
胞生物体を暗条件で培養する前処理工程をさらに含むことを特徴とする項目１に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目３）
前記持続的光条件は、５４０〜６００ｎｍまたは４３０〜５００ｎｍの波長を持つ２０〜５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２ｓ−１強度の光を、１２〜２４時間照射することを特徴とする項目２に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目４）
前記前処理工程の培養は、対数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）まで培養することを特徴とする項目２に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目５）
前記単細胞生物体は、単一コロニー由来または多数コロニー由来であることを特徴とする項目１に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目６）
前記走光性は、陽性及び陰性走光性であることを特徴とする項目１に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目７）
前記走光性は、陰性走光性であり、５４０〜６００ｎｍまたは４３０〜５００ｎｍの波長の光を、２０〜５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２ｓ−１ｃｍ−１強度の光によって誘発されることを特徴とする項目６に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目８）
前記走光性指標は、光反応性または光敏感性の中の一つ以上の測定を解して算出されることを特徴とする項目１に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目９）
前記目的する突然変異が誘発された単細胞生物体は、対照群と比較して、光合成色素を含む光合成機構の変化、光合成効率、または光転換効率を含む光合成指標、及び成長速度の中の一つ以上のが改善されたことを特徴とする項目１に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目１０）
前記走光性指標は、（i）用いられた総単細胞生物体数に対する走光性に反応して単位時
間当り移動した単細胞生物体数の比；（ii）単位時間当たり移動した単細胞生物体数の分布を基にしたヒストグラム頂点分析；または（iii）前記方法に用いられた単細胞生物体
の単位距離当たり移動に所要された平均時間、または速度またはその偏差を含むことを特徴とする項目１に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目１１）
前記選別された突然変異単細胞生物体に対して光合成指標を追加で分析する工程を含むことを特徴とする項目１に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目１２）
前記走光性指標は、光合成色素を含む光合成機構の変化、光合成効率、または光転換効率を含むことを特徴とする項目１１に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目１３）
前記単細胞生物体は、微細藻類であることを特徴とする項目１に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目１４）
前記微細藻類は、緑藻類、硅藻類、紅藻類、鞭毛類、淡緑藻類、茶色鞭毛藻類、黄緑色藻類、渦鞭毛藻類、または、藍藻類であることを特徴とする項目１３に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目１５）
前記茶色鞭毛藻類は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ.,Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ.,及びＣｈｒｏｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ.の中の一つ以上であることを特徴とする請求
項１４に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目１６）
前記Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ.は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎ
ｈａｒｄｔｉｉであることを特徴とする項目１５に記載の突然変異単細胞生物体の選別方法。
（項目１７）
項目１〜１６の中一項に記載の方法によって選別された突然異単細胞生物体。
（項目１８）
光透過性個体流入部と、前記個体流入部とは別に形成される個体到達部と、前記個体流入部及び前記個体到達部に流体疎通可能に連結されたチャネル部と、前記チャネル部の両末端の間に形成された計測部と、を含む微細流体光反応装置。
（項目１９）
前記計測部は、前記チャネル部の径と同等または小さく形成されることを特徴とする項目１８に記載の微細流体光反応装置。
（項目２０）
前記計測部の径は、前記個体流入部に導入された個体の運動の個別的観察が可能な大きさで形成されることを特徴とする項目１９に記載の微細流体光反応装置。
（項目２１）
前記計測部の径は、１０〜１００μｍであることを特徴とする項目１９に記載の微細流体光反応装置。
（項目２２）
前記微細流体光反応装置は、光源を追加で含むことを特徴とする項目１８に記載の微細流体光反応装置。
（項目２３）
前記光源は、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）またはレーザーダイオードであることを特徴とする項目２２に記載の微細流体光反応装置。
（項目２４）
前記装置は、項目１〜１７の中いずれか一項に記載の方法に用いられることを特徴とする項目１８に記載の微細流体光反応装置。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】光合成微細藻類菌株を本発明の一実現例に係る微細流体システム内で走光性を利用して光反応が特異的な菌株を選別する全体的な過程を図式化した概略図である。
【図２Ａ】本発明に用いられる様々な例示的微細流体光反応装置の平面図である。
【図２Ｂ】本発明の一実現例で用いられた微細流体光反応装置の平面図（上段）、斜視図（下段）である。
【図３Ａ】走光性を介した微細藻類選別に効果的な光の波長を決めるために、本発明一実現例により様々な波長のＬＥＤを用いて微細藻類の光反応を測定したグラフである。
【図３Ｂ】図２Ａに図示されたそれぞれの微細流体光反応装置を利用して、走光性による微細藻類の光反応を測定したグラフで、グラフ上の１、２、３、４は、図２Ａの各装置に記載された番号に相応するものである。
【図４】本発明の一実現例で用いたれた微細藻類菌株内クロロフィルaとクロロフィルbの比（ａ/ｂ  ratio）を示したグラフである。
【図５】本発明の一実現例に係る微細流体光反応装置を利用して、光反応を示す微細藻類菌株の時間に伴う分布を細胞数でしめしたヒストグラムで、対照群として用いた野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）と突然変異菌株群集（ｃｏｌｏｎｙ）の光反応程度を示す。
【図６Ａ】対照群及び突然変異菌株それぞれにおいて全細胞数に対する光反応を見せた細胞数の比率を介して光反応性を分析したグラフである。
【図６Ｂ】対照群と突然変異菌株が走光性によって一定距離（３ｃｍ）を移動するのに必要とされた平均所要時間の偏差を示したグラフで、突然変異菌株の間の光敏感度を示す。
【図７Ａ】クロロフィルａ/ｂ比率とＮＰＱとの相関を示したたグラフで、クロロフィルａ/ｂ比率が高いほどＮＰＱ（ｎｏｎ−ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）値が低い逆比例相関を示して光合成効率が高いとことを示す。
【図７Ｂ】クロロフィルａ/ｂ比率とｑＰ（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕｅｎｃｈｉｎ）の相関を示すグラフで、クロロフィルａ/ｂ比率が高いほどｑＰ値が高い相関を示した光合成効率が高いことを示す。
【図８Ａ】本発明の一実施例に係る走光性指標で平均到達時間と光合成効率測定指標であるＮＰＱとの相関グラフで、走光性を介して平均到達時間が速くなった突然変異菌株は、光合成効率測定指標であるＮＰＱ値が低い相関を示して光敏感性が増加した金株は光合成効率が高いことを示す。
【図８Ｂ】本発明の一実施例に係る走光性指標で平均到達時間と光合成効率測定指標であるｑＰとの相関グラフで、走光性を介して平均到達時間が速くなった突然変異菌株は光合成効率測定指標であるｑＰと高い相関を示してＮＰＱと同様に光敏感性が増加した菌株が光合成効率が高いことを示す。
【図９】走光性を介して一定時間（５分）の間一定距離（３ｃｍ）を移動する細胞数を対照群の細胞数で分けた値を示した移動細胞個体数比率とＮＰＱとの相関を比較したグラフである。これは、値が１以上である突然変異菌株は、一定時間の間対照群菌株に対比してより多くの細胞数が移動したことで、光敏感性及び光反応性が優れた突然変異が誘発された菌株を示して、このような菌株は、ＮＰＱ値が低い相関を示すので、光合成効率が増加した菌株であることを示す。
【図１０】本発明の一実現例に係る微細流体光反応装置を利用して走光性による微細藻類の実際の動きを見せる光学顕微鏡（×４０）イメージである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１５】
本発明は、運動性を有する光合成単細胞生物体から改良された光反応性を有する突然変異体を走光性の差を通じて効果的に選別することができるとの発見に基づいたもので、具体的に単細胞生物体が有する光敏感性及び/または、光反応性の差を利用して微細流体システム内で突然変異が誘発された細胞の個体別運動の統計的分析を介して光に対する光反応が特異的に変化した特徴を持つ突然変異が誘発された菌株を迅速かつ効率的に選別する可能性があることを発見した。
【００１６】
従って、一観点において、本発明は、（ａ）単細胞生物体に光を照射して走光性を誘発する工程と、（ｂ）前記単細胞生物体の走光性指標を算出する工程と、（ｃ）対照群と比較して、前記単細胞生物体の走光性指標が変化した場合、これを目的する突然変異が誘発された単細胞生物体として選別する工程と、を含む走光性を利用した突然変異単細胞生物体の選別方法に関する。
【００１７】
本発明で用いられた用語「単細胞生物体」、「細胞」または「菌株」は、相互交換的に用いられて、これは運動性があって光に対して反応、走光性を示す多様な単細胞生物を称するもので、例えば光合成細菌またはバクテリア、光合成ができるユーグレナのような原生動物または微細藻類を含む。一実現例では、特に代表的に微細藻類であるコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）が用いられる。
【００１８】
本発明で用いられた用語「走光性」とは、光に反応した単細胞生物体の運動で光に沿って移動する陽性走光性または、光を避けて移動する陰性走光性を全部含むものであり、特定光量では陽性走光性を示す場合でも、光の光度が一定強度を越える場合、陰性走光性を示す場合もある。
【００１９】
本発明で用いられた用語「突然変異」とは、変異が誘発されなかった対照群と比較して、遺伝子水準で変異が発生して、このような変異によって表現型、特に走光性、光反応性及び/または、光敏感度等の特徴に差が誘発されたもので、自然界で発見される突然変異はもちろん人為的に導入された突然変異を全部含むものである。突然変異は、無作為または特定位置で発生した突然変異、遺伝子を成すヌクレオチドの付加、欠如、及び/または、置換などによる突然変異を全部含むものである。
【００２０】
本発明で用いられた用語「目的する突然変異」または「目的する特性を持つ」、「目的する特徴が誘発された突然変異」とは、前記のような遺伝的変化によって単細胞生物体で改良しようとする一つ以上の特性が変化、例えば改善、向上したもので、単細胞生物体の最終用途に応じて多様な特性が含まれる。例えば、単細胞生物体として微細藻類が用いられる場合、光合成に関連した特性または指標、例えば、光合成色素を含む光合成機構の変化、光合成効率、光転換効率を含み、、その他成長速度の変化、脂質含有量及び/または脂質成分の変化等を含むが、これに制限するものではない。改善された程度を把握するために、突然変異が誘発された単細胞生物体で相応する特性と比較することができ、当業者ならば、改善された特徴を考慮して適切な基準を選択できて、例えば、対照群と対比して、例えば、約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上改善されるのを目的する突然変異が誘発された単細胞生物体として選別することができるはずである。
【００２１】
改善された特徴を示す突然変異が誘発された個体を選別する本発明の方法に用いられる単細胞生物体は、自然的または人為的突然変異が誘発されて、ゲノムに一つ以上の突然変異を持つと予測される多様な単細胞生物体を含む突然変異ライブラリ由来であってもよい。また、本発明の方法には、一種類の突然変異を含むと予測される、一つの細胞から由来した単一コロニーまたはそれぞれ同じまたは異なる一つ以上の突然変異を含む多数の細胞から由来した多数コロニー由来であってもよい。例えば、単一コロニー由来の場合、特性確認、または単一コロニーの個別的特性確認を介した最適な特性を示す突然変異単細胞生物体の選別、または多数のコロニー混合物が用いられる場合、突然変異ライブラリから所望の特性を持つ遺伝子変異が誘発された目的する突然変異を効率的選別に用いられることができる。
【００２２】
本発明方法は、走光性を利用した迅速かつ簡単な分析で、自然界で発見される変異体、または人為的に突然変異が誘発された突然変異ライブラリに含まれた数個〜数万個の突然変異中、所望の突然変異が誘発された個体の選別に効果的に用いられることができる。特に、後者の場合、本発明の方法を繰り返し行って、多量の突然変異が誘発された単細胞生物体を迅速かつ効率的に選別することができる。
【００２３】
本発明で用いられた用語「光反応性」とは、単細胞生物体に光が照射される場合、走光性によって光の反対側に移動する特性を示すもので、これは一定時間、例えば30分間、一定の光度、例えば３０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２ｓ−１が照射された場合、導入した総細胞、例えば約３，０００個の細胞のうちに走光性によって反対側に到達した細胞数の水で測定されることができる。
【００２４】
本発明で用いられた用語「光敏感性」とは、単細胞生物体に光が照射される場合、走光性によって光の反対側もどれだけ迅速に移動するのかを示したもので、一定の光度、例えば３０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２ｓ−１の光が照射された場合、一定距離、例えば3cmを走光性によって到達するのにかかる時間で測定されることができる。
【００２５】
本発明に係る方法は、光に対する単細胞生物体の反応を基本とするもので、本発明で用いられた走光性反応指標または走光性指標は、光に反応した単一細胞生物体の特徴変化を示すことができる指標で、多様な数値を含むことができ、光反応性または光敏感性の中の一つ以上の測定を解して算出されることができる。このような走光性指標は、対照群と比較して、光に対する反応に関連した変化を測定できることならいずれも含むことができ、（i）本発明の方法に用いられた総単細胞生物体数に対する走光性に反応して単位時間当り移動した単細胞生物体数の比；（ii）単位時間当たり移動した単細胞生物体数の分布を基にしたヒストグラム頂点分析；または（iii）前記方法に用いられた単細胞生物体の単位距離当たり移動に所要された平均時間、または速度またはその偏差を含む。例えば、本発明の実施例及び図３乃至９に記載された多様な方式で算出されることができる。例えば、図５の頂点分析を介して野生型菌株と突然変異菌株の反応到達時間の頂点移動を観察することができて、頂点分析を介して細胞の最大反応時間と反応した細胞の比率分析などが可能である。
【００２６】
本発明に係る一実現例で、本方法が後述する本発明に係る装置に用いられる場合は、例えば、前記方法に（i）用いられた総細胞数対比前記チャネルを介して一定時間前記到達部に移動した総細胞数の比；（ii）一定数の細胞が前記到達部に移動するのに所要された平均時間またはその偏差；（iii）前記方法に用いられた細胞の前記到達部までの移動速度；及び（iv）前記方法に用いられた細胞が前記到達部まで移動するのにかかる時間による細胞数分布を含むが、これに制限するものではない。
【００２７】
本発明の方法に用いられることができる単細胞生物体は、前述した通りであり、例えば走光性及び運動性を示す光合成単細胞生物体、好ましくは微細藻類が用いられる。一実現例で、微細藻類は、緑藻類、硅藻類、紅藻類、鞭毛類、淡緑藻類、茶色鞭毛藻類、黄緑色藻類、渦鞭毛藻類、または、藍藻類である、例えば緑藻類（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓなど）、硅藻類（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏsなど）、紅藻類（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ、Ｇａｌｄｉｅｒｉａなど）、鞭毛類（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｐａｖｌｏｖａなど）、淡録藻類（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、茶色鞭毛藻類（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓなど）、黄緑色藻類（Ｏｌｉｓｔｏｄｉｓｃｕｓなど）、渦鞭毛藻類（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ、Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ、Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ、Ｃｈａｔｔｏｎｅｌｌａ、Ｋａｒｅｎｉａなど）、藍藻類（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍなど）が挙げられるが、これらに制限するのではない。一実現例では、茶色鞭毛藻類、好ましくはＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ.,Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ.,Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ.，さらに好ましくはコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）が用いられるか、これに制限されない。
【００２８】
本発明の方法で、前記（a）工程の前に単細胞生物体を持続的光条件で培養した後、前記単細胞生物体を暗条件で培養する前処理工程を追加で含んでもよい。前処理工程は、持続的な光条件で培養することによって細胞の活性が最も優れた対数期状態で維持するためのものであって、走光性測定直前に暗条件で培養するのは、光に対する敏感性を増加させて、走光性による細胞の光反応性を増加させるためである。
【００２９】
すなわち、前処理工程は、持続的光条件は、光合成を介して成長する微細藻類が活動性が最も優れた対数期状態になれる光量なら十分であり、特に限定されるのではない。また、対数期により迅速な到達のために、光が持続的に照射されうる。このような条件を満たす限り、光量及び照射時間は限定されないが、例えば持続的光条件は、例えば約２０〜５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２ｓ−１強度の光を、好ましくは約４０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２ｓ−１強度の光を約１２〜２４時間照射するが、これに制限されない。
【００３０】
前記目的を達成する限り様々な範囲の光度及び時間が用いられてもよい。用いられる波長は、実験対象単細胞生物体の具体的種類によって異なってもよい。光合成が可能な単細胞生物体別に、効率的に認知する光の波長があって、当業者ならばこのような事項を考慮して適切な波長を選択できるはずである。例えば、微細藻類クラミドモナスの場合、眼点（ｅｙｅｓｐｏｔ）という光を感知する部分があるが、この部分が認知する光波長が一般的に５４０〜６００ｎｍまたは約４３０〜５００ｎｍの波長を持つ光を認知するので、この波長領域帯の光を用いることが好ましい。
【００３１】
また、前処理工程の培養は、細胞生長周期の最適な状態である対数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）まで培養した後、次の工程で用いられる。単細胞生物体の生長は、大きく誘導期（ｌａｇ  ｐｈａｓｅ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）；対数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ，ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ，ｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ）；停止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ）；及び死滅期（ｄｅａｔｈ  ｐｈａｓｅ）で構成され、当業者ならば対数増殖期を判別できるはずである。
【００３２】
本発明の方法による走光性は、陽性及び陰性走光性を全部含む。走光性に関しては、先に説明した通りであり、本発明に係る実現例では、陰性走光性が誘発される。通常の光の強度では、陽性走光性を誘発する単細胞生物体で陰性走光性を誘発するために、強い強度の光が照射されなければならない。すなわち、陰性走光性を誘発できる光の強度は、目的する対象生物体に応じて異なり、このような効果を達成できる多様な光度の光が用いられ、当業者ならば走光性程度を基準に適切な範囲の強度を選択できるはずである。本発明に係る実現例では、微細藻類、特にコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）が用いられて、この場合、光の強度は約３０μｍｏｌｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２ｓ−１ｃｍ−１であってもよいが、これに制限されない。光の波長に関しては、前述したとおりである。
【００３３】
本発明の方法により選別された単細胞生物体は、対照群、すなわち突然変異が誘発されなかった菌株、または、参照として使う比較対象菌株と比較して、光反応性及び光敏感性が増加しており、このような特徴の変化は、前述した走光性指標で測定でき、走光性指標が改善されることを目的する突然変異が誘発された菌株として選別することができる。走光性指標の改善程度は、分析対象または指標の種類によって異なるが、例えば対照群と比較して約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０%以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上改善されたことを目的する突然変異が誘発された単細胞生物体として選別することができるはずである。
【００３４】
本発明の方法は、突然変異菌株を製作する目的に応じて追加の工程を含んでもよい。例えば、突然変異の選別が、光合成特徴の改質、脂質生産の改質、成長速度改善のためのものならば、それぞれの特徴分析のための追加の工程を含む。例えば、光合成指標、好ましくは光合成色素を含む光合成機構の変化、光合成効率、光転換効率を追加で分析する工程を含んでもよいが、これに制限されない。このような分析方法は、当業界に公示されていて、当業者ならば適切なものを選択でき、例えば本発明の実施例及び図３乃至９に記載された多様な指標、例えばＮＰＱ（ｎｏｎ−ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）、またはｑＰ（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕｅｎｃｈｉｎ）及び/またはクロロフィルａ/ｂ比等を含むか、これに制限されない。
【００３５】
他の観点において、本発明は、前記走光性を利用した突然変異単細胞生物体の選別方法によって選別された突然変異単細胞生物体に関する。
【００３６】
前記菌株は、突然変異の様態に合わせて様々な分野で有用物質の生産などのために応用されることができる。例えば、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）は、現在まで微細藻類のうち最も多くの研究が進行された種であり、他の菌株に比べて形質転換等の遺伝子操作が容易で関連道具が開発されていると共に、ゲノム配列も明らかになっていて、微細藻類のモデル生物体と思われている。従って、光合成機序が改善された突然変異菌株を選別して、これをバイオディーゼル生産のための脂質関連研究、水素生産研究などに活用することができる。
【００３７】
本発明方法により選別された菌株は、実施例及び図７乃至９に記載された通り、クロロフィルａ/ｂ比率と光合成効率測定指標であるＮＰＱとｑＰが、相関の分析を介して、目的する突然変異が誘発されて、これは本方法の優秀性を示している。
【００３８】
また他の観点において、本発明は、光透過性個体流入部と、前記個体流入部とは別に形成される個体到達部と、前記個体流入部及び前記個体到達部に流体疎通可能に連結されたチャネル部と、前記チャネル部の両末端の間に形成された計測部と、を含む微細流体光反応装置に関する。
【００３９】
本発明の方法は、本発明の方法を達成する限り様々な装置に用いられるのは、当業者に明らかである。すなわち、本発明の装置はもちろん、本発明の装置の各構成と相応する部位を持つこのような目的を達成できる他の装置が用いられてもよい。以下、本発明の装置に含まれた構成及びそれによる名称を例に挙げて説明するか、これに限定されるのではなく、発明を理解して解釈するに当たり相応する構成と解釈されなければならない。
【００４０】
図２Ａ及び２Ｂを参照すると、本発明の装置は、一定間隔を置いて形成された個体流入部１１０及び個体到達部１２０を含み、その間に様々な形のチャネル１３０が位置する。前記個体流入部１１０及び個体到達部１２０は、分析対象である単細胞生物体を入ることができる空間、形及び大きさで形成され、対象個体、例えば単細胞生物体の大きさ、特性及び用いられる個体数に応じて多様な形、大きさ及び/または材質で形成されることができる。走光性に関する反応を見るために、一実現例では、光透過性物質で製作される。形、大きさは、特定形状に制限されるのではなく、同じまたは異なるように形成されてもよい。
【００４１】
前記チャネルは、個体流入部及び個体到達部と流体が疎通できるように形成される。前記チャネルを介して、個体流入部に単細胞生物体と共に導入された培養液及び単細胞生物体が移動する。従って、前記チャネルは、単細胞生物体の移動が邪魔にならないように抵抗性が最小化できる構造及び大きさで製作される。一実現例では、前記チャネルは、前記個体流入部または到達部の径と同等または小さく形成される。他の実現例では、図２Ｂに記載されのと同じ大きさを持つことができるが、これは例示的であり、これに限定されるのではない。
【００４２】
前記チャネルの両末端の間の一部に計測部１４０が形成される。図１０を参照すると、前記計測部は、移動する単細胞生物体を単一細胞レベルで顕微鏡的方法を利用して観察する部位で、単細胞生物体の運動の個別的観察が可能な構造及び大きさで形成される。例えば、本装置に使用しようとする細胞の径を基準に、例えば１個乃至約５個の細胞が通過できる程度の大きさで製作され、用いられる対象単細胞生物体の具体的大きさに応じて変わる。例えば、約１０ｕｍ乃至２００ｕｍ、例えば特に微細藻類クラミドモナスが用いられる場合、径は約５０ｕｍ乃至１００ｕｍであってもよいが、これに制限されない。
【００４３】
本発明の微細流体光反応装置に含まれる各構成は、光透過性がある透明な材質で用いられる単細胞生物体に対する毒性がなく、多孔性で生物活性に必要な物質伝達が容易で、単細胞生物体の移動を邪魔しない材質、または前記特徴を有するように前処理された材質で製作されることが好ましい。このような物質としては、例えばＰＭＭＡ（Ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ＰＳ（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）、またはＰＤＭＳ（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）等が挙げられるが、これに制限されない。
【００４４】
図１を参照すると、本発明の微細流体光反応装置は、光源を追加で含んでもよい。本発明の装置に用いられる単細胞生物体に目的する最適な走光性を誘発できる光源及び波長が選択されて、このような効果を示す限り、分析する対象及び目的に合わせて多様な光源及び波長の光が用いられる。
【００４５】
光源の種類では、一定波長を放出できるものなら可能で、例えばレーザーダイオード、またはＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）が用いられる。本発明の一実現例では、分析対象に微細藻類が用いられて、特にコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の場合、緑色と青色波長を出すＬＥＤ光源が利用される。
【００４６】
図１は、本発明の装置及びこれを利用した突然変異単細胞生物体、すなわち菌株選別方法を例示的に示した模式図である。本発明に係る微細流体光反応装置は、走光性を示す運動性のある単細胞生物体の走光性を利用して、光に反応する特徴が変異された生物体の選別に用いられる。例えば、本発明に係る装置の細胞流入部に一定量の走光性及び運動性を持つ単一または多数コロニー由来の単一細胞生物体、例えば微細藻類を導入した後、特定強度の強い光を照射すると、これに反応して、細胞が光源が照射される方向から遠ざかる方向にチャネルを介して移動する。チャネルを介して移動する細胞は、計測部を通過する際に、顕微鏡的観察を介して、走光性指標算定のための各種データ、例えば一定距離移動時間、移動細胞数等、様々なデータが収集されて、これに関しては、前述した記載を参照することができる。本発明に係る実現例で、走光性を利用した突然変異が誘発された単細胞生物体として、微細藻類が用いられる場合、次の工程を含んでもよい。
【００４７】
例えば、一実現例で、本発明の装置を利用した方法は、例えば（ａ）単細胞生物体を持続的光条件で培養した後、前記単細胞生物体を暗条件で培養する前処理工程；（ｂ）前記前処理された単細胞生物体を前記光反応装置の細胞流入部に導入する工程；（ｃ）細胞流入部に導入された前記単細胞生物体の走光性を誘発できるよう、前記細胞流入部に光源を照射する工程；（ｄ）前記走光性によって前記チャネルを介して前記到達部に移動する前記単細胞生物体を前記計測部で観察して、走光性反応指標を収集する工程；及び（ｅ）対照群と比較して、前記走光性指標が変化した場合、これを突然変異が誘発された細胞と選別する工程を含むが、これに制限されない。前記前処理工程は、選択的に含んでもよい。本方法に用いられる各用語及び説明は先に説明した本発明方法に関連して言及したのを参照することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４９】
実施例１:突然変異が誘発された菌株の製造
本実施例に用いられた菌株は、漢陽（ハンヤン）大学のチンオンソン教授研究室で入手したもので、種はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｎｉｈａｒｄｔｉｉである。
前記菌株は、野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）菌株ＪＬ４２８で、野生型菌株に挿入突然変異誘発法（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）で無作為突然変異を誘発した後、通常知られているクロロフィルａ/ｂ比率が高い菌株が光合成効率が高い可能性が大きい点（Ａｎａｓｔａｓｉｏｎｓ  Ｍｅｌｉｓ  （２０１２）  Ｖｏｌ.１５８  ９３０−９４５）を利用して、一次的にクロロフィルａ/ｂ比率が野生型菌株より高い菌株を選別して、本発明方法の効能検証のために用いた。
微細藻類培養に用いられた培地は、TAP培地で、これらの構成成分は［表１］に示した。
【００５０】
実施例２:微細藻類培養及び微細流体装置製作
微細流体装置は、シリコン基板に陰性感光剤SU-8  50を回転塗布した後、デザインされたマスクを覆って紫外線露機を利用して紫外線に露出させてフォトリソグラフィ（ｐｈｏｔｏ−ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）を介して製作され、高分子ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）と硬化剤を１０：１の割合で混合して、フォトリソグラフィで製作されたSU-8モールドの上に製作した。完成されたPDMS微細流体装置はプラズマ処理を介してスライドグラスと結合させた。製作された装置は図２Ｂのとおりである。
【００５１】
前記装置は、図２Ａで見られるように、最適なチャネル構造を選別するために、チャネルの幅及び形態に応じた細胞の運動性を下記の実施例３のように分析した。要約すると、緑色ＬＥＤ光源（５４０ｎｍ）を細胞をいれた入口細胞流入部の部分に照らしながら一定距離に位置する反対側部位、すなわち細胞到達部に到達する細胞数をそれぞれの装置で測定して、その結果を比較した結果、図３Ｂで見られるように、微細流体装置内細胞流入部と近接したチャネルの幅によって細胞の走光性による運動が影響を受ける現象を確認した。従って、細胞の運動に対する抵抗性を最小化しながら、計測部での個別細胞の観察及び統計的分析を容易にするために、図２Ｂのようにチャネル入口の幅が４ｍｍから出口の幅が１００ｕｍに一定に減る形態のチャネルが含まれた装置デザインを選定して、上述した通り製作した。
【００５２】
実施例３:光の波長に応じた微細藻類の光反応分析
光に対する細胞の光反応性及び光敏感性を効率的に一定に調節するための適応するための前処理過程で、人為的突然変異が誘発されなかったＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ野生型菌株（ＪＬ４２８）及び実施例１の突然変異菌株をＴＡＰ  ａｇａｒ培地で種培養（ｓｅｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）した。具体的に、ＴＡＰ液体培地に４０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２ｓ−１強度の２４時間持続的な光条件及び２３℃  温度条件で２日間培養した。２日間培養した後、対数成長段階に入ると、７．５×１０３ｃｅｌｌｓ  ｍｌ−１に希釈して暗室条件で1時間保管した。
【００５３】
以後、暗室条件で１時間保管した細胞を下記の図２Ｂの細胞流入口の部分に４０ｕｌ入れて、細胞到達部には４０ｕｌ  ＴＡＰ培地を入れた後、計測部で倒立光学顕微鏡で走光性による微細藻類細胞の動きを観察した。
【００５４】
光の波長別微細藻類の光反応を分析するために、細胞濃度と条件を前記条件のように一定に維持した後、用いるＬＥＤ光源の波長を異なるように調節した。緑色（５４０ｎｍ）、赤色（６５０ｎｍ）、青色（４７０ｎｍ）、白色（全波長）、そして暗室条件の計五つの条件で微細藻類の走光性を介した光反応分析を実施した。
【００５５】
その結果、図３Ａで見られるように、微細藻類は、特定波長で敏感な反応を示したが、緑色（５４０ｎｍ）と青色（４７０ｎｍ）で反応性が大きく示され、赤色（６５０ｎｍ）では光に対する反応を示さなかった。これらの結果から、本発明で基本的に用いられる光の波長は５４０ｎｍの緑色ＬＥＤ光源を用いた。
【００５６】
実施例４:野生型及び突然変異菌株の走光性による光反応パターン分析及び選別
緑色ＬＥＤ光源（５４０ｎｍ）を３０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２ｓ−１の強度で細胞流入部に光を照らして、計測部に到達する細胞数を30分間分単位で測定した。結果は、図５で見られるように、光反応による各菌株別時間に応じた移動個体数を分析した結果、一定の形態のヒストグラムを得た。突然変異菌株のヒストグラムを対照群のヒストグラムと比較した結果、突然変異１、２、３の場合、対照群に比べて光反応ヒストグラムの頂点が左に移動したのを確認した。それに対して、突然変異４、５の場合、対照群と大きな差を見せなかった。この結果は、光合成効率と間接的に関連するクロロフィルａ/ｂ比率と関連して、一般的にクロロフィルａ/ｂ比率が高い菌株が光合成効率が高い菌株である確率が高いが、走光性によって得たヒストグラムを分析してみると、対照群に比べてクロロフィルａ/ｂ比率が増加した菌株が、光によって移動する細胞数が増加して、対照群とクロロフィルａ/ｂ比率が大きい差を見せない突然変異菌株は、走光性による移動細胞数が差が殆どないことから、図５のヒストグラムのパターン分析だけでも、光合成効率が増加した突然変異が誘発された菌株を走光性反応で容易で効率的な観測が可能であることが分かる。
【００５７】
また、図６Ａで見られるように、全細胞数対比光反応に移動した個体数の比率から、対照群菌株と突然変異菌株の光反応性を比較した結果、対照群菌株の場合、全体細胞の６５％が光反応を見せたことに比べて、突然変異１は８５％が光反応を見せて移動して、突然変異２、３も８０％ほどの細胞が光反応を見せた。それに対して、突然変異４、５は、光反応比率においても対照群と類似する比率を見せた。この結果は、クロロフィルａ/ｂ比率の増加による光合成効率が増加した突然変異菌株は、同じ光の強度に対して反応する程度が、対照群に比べてより大きいことを意味して、対照群に比べてクロロフィルａ/ｂ比率の増加が大きくない突然変異菌株は、光合成効率の程度が対照群と似ていることを意味して、このような菌株は同じ光の強度に対する光反応性も対照群と似ていることを意味する。
【００５８】
対照群と突然変異菌株の光に対する走光性によって、一定時間内に細胞個体の移動にかかる平均時間の偏差を分析することによって、光に対する敏感性を比較分析でき、これを介して簡単に光反応が特異的な菌株を選別することが可能である。突然変異１、２、３の場合、図６Ｂで見られるように対照群に比べて平均時間が減少したのを確認できて、突然変異４、５は、対照群に比べて大きく減少しない結果を見せた。この結果は、クロロフィルａ/ｂ比率が増加することによって光合成効率が増加した突然変異菌株は、一定の光の強度に対して対照群菌株より敏感であることを意味して、これは細胞の移動速度と関連して示される。同じ光の強度に対して光に対する敏感性が増加した菌株は、さらにはやい反応に移動して一定距離（３ｃｍ）を行くのにかかる所用時間が減ることを示す。相対的に対照群菌株とクロロフィルａ/ｂ比率が差が殆どない菌株の場合には、一定の光の強度に対する敏感性が似ていて、一定の距離を行くのにかかる時間が対照群菌株と比較して殆ど差がないことを示す。
【００５９】
一方、図５、６Ａ、６Ｂで見られるように、微細藻類対照群及び突然変異菌株の走光性による光反応性は、図４に示されたクロロフィルａ/ｂの比率と非常に類似するパターンを見せて、これは、本発明で適用した菌株の個体別光反応性に対する統計的分析法によって得た各種指標（ヒストグラムの頂点、移動平均時間、光反応細胞の比率等）が、走光性による光反応性、光敏感性だけでなく突然変異によって発生するクロロフィル等光合成機構の変化とも関連性を持つ可能性があることを示す。
【００６０】
従って、本発明で用いられた微細流体システム内微細藻類の走光性に対する分析方法を利用して一次選別された菌株を対象に光合成効率が向上した菌株をより効率的に探索することができる。
【００６１】
実施例５:選別された突然変異菌株の光合成指標分析
本実施例では、前記の通りに走光性によって選別された突然変異菌株の光合成効率を測定した。指標として、ＮＰＱとｑＰを用いた。ＮＰＱは、光合成のために受けた光エネルギー中光合成に使用できず消滅するエネルギーで、ＮＰＱ値が低いほど光合成効率が高いことを意味して、ｑＰは光合成に用いられるエネルギーを意味して、ｑＰ値が高いほど光合成効率が高いことを意味する。
【００６２】
５−１選別された菌株のクロロフィルａ/ｂ比率とＮＰＱ、ｑＰと相関分析
選別された菌株のクロロフィルａ/ｂ比率とＮＰＱ、ｑＰと相関を次の通り分析した。クロロフィル測定法は、吸光度測定を基本とする公示された方法（Ｈａｒｔｕｍｕｔ  Ｋ.ＬｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒとＣｌａｕｓ  Ｂｕｓｃｈｍａｎｎ  （２００１）  Ｆ４．３．１−Ｆ４.３．８）で測定した。
【００６３】
要約すると、フラスコで光度40μmol  photon  m-2s-1で３日間培養した後、対数成長期に入った時、クロロフィル測定を実施した。フラスコをよく振って1mlを1.5mlチューブに移して、１５，０００ｒｐｍで1分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を除去して、メタノール1mlを入れた後、ボルテックスを行って、クロロフィルを抽出した。引き続き１５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、上澄み液に対してＡ６６３．２、Ａ６４６．８波長で吸光度を測定した。その後、下記の式に代入して、クロロフィルaとbを測定してクロロフィルａ/ｂ比率を測定した。
Ｃｈｌ  ａ（ｇ/ｍｌ）＝１６．７２×Ａ６６５．２―９．１６×Ａ６５２．４
Ｃｈｌ  ｂ（ｇ/ｍｌ）＝３４．０９×Ａ６５２．４―１５．２８×Ａ６６５．２
Ｃｈｌ  ａ/ｂ＝Ｃｈｌ  ａ÷  Ｃｈｌ  ｂ
【００６４】
ＮＰＱ及びｑＰは、TAP培地に寒天をを含む寒天培地で２３で菌株を培養した後、Imaging-PAMクロロフィル蛍光分析装備（Ｈｅｉｎｚ  Ｗａｌｚ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して測定した。
【００６５】
以後、実施例３乃至５と同様の分析を介して収得したデータ、すなわち平均移動時間、単位時間到達した細胞群集の細胞比率などと、クロロフィルａ/ｂ比率、ＮＰＱそしてｑＰとの分析を実施した。
【００６６】
結果は、図７Ａ及び７Ｂに記載されている。これに示された通り、クロロフィルａ/ｂ比率が高いほどＮＰＱ値が低い相関を示して、ｑＰ値は高い相関を示して、光合成効率が高いことを示した。
【００６７】
５−２選別された菌株の平均到達時間とＮＰＱとの相関分析
実施例４に記載された通り、各菌株に対してて得た走光性指標のうち平均到達時間と実施例５に記載された光合成効率測定指標との分析を実施した。
【００６８】
結果は、図８Ａ及び８Ｂに記載されている。これに示された通り、二つの指標間の相関性を示すr2値が１に近いほど相関性が高く、従来に用いられたクロロフィルａ/ｂ比率よりは、本発明の方法による走光性を介して得た指標が、光合成効率が増加した突然変異菌株を選別するのに有用であることを示している。
【００６９】
５−３選別された菌株の対照群対比移動細胞数の比とＮＰＱとの相関分析
実施例４に記載された通り、各菌株に対して得た走光性指標のうち、対照群対比移動細胞数の比と実施例５に記載された光合成効率測定指標との分析を実施した。
【００７０】
結果は、図９に記載されている。これに示された通り、その比率が１以上である突然変異菌株は、一定時間対照群菌株に対比してより多くの細胞数が移動したことで、これは、光敏感性及び光反応性が優れた突然変異菌株を意味して、このような菌株が、ＮＰＱ値が低い相関を示すので、これは、光合成効率が増加した菌株であることを示す。従って、このような結果は、走光性を利用した本発明方法を利用する場合、光合成効率が高い菌株の選別が可能であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、走光性を利用して改良された単細胞生物体を微細流体システムを利用して効果的に選別できるもので、細胞単位で容易なモニタリングが可能で、収集した結果の統計的分析を含んだ様々な分析を介して、変化した光反応性及び/または光敏感性を持つ突然変異菌株を容易にまたは高速で選別できて、走光性及び光転換効率の相関解明、光転換効率が向上した改良された単細胞生物体選別に有用に活用できる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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