(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルの光吸収を記録する方法であって、前記方法は、
１つ以上の光ビームを使用して、光の第１および第２のパルス状ビームを、交互に、前記サンプル上に集束させるステップであって、前記第１および第２のパルス状ビームは、一方の光ビームが、他方の光ビームが呈さない波節を呈するように、異なるビーム形状を有する、ステップと、
サンプルを通して透過された、および／または前記サンプルによって反射された前記第１および第２のパルス状ビームの強度差を測定するステップと、
前記測定された強度差から前記サンプルの画像を生成するステップと
を含み、
前記第１の光ビームは、ゼロ次ガウスを備え、
前記第１および第２のビームは、共整合されるように適合され、
前記第１および第２の光パルス状ビームは、飽和レベルがサブ回折分解能を提供するように、飽和を達成するための強度で選択される、方法。
【請求項２】
同期検出によって、前記サンプルを通して透過された、および／または前記サンプルによって反射された強度変動を記録するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同期検出は、ロックイン増幅器を備える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記同期検出アプローチは、交互する前記第１および第２のパルス状ビームの測定を行うことを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルの吸収は、赤外線波長範囲内で測定される、請求項１から４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルの吸収は、ＵＶ、可視、または近赤外線波長範囲内で測定される、請求項１から５に記載の方法。
【請求項７】
第１および第２のパルス状ビームを提供するように適合された１つの光ビームを備える、請求項１から６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の光ビームは、前記サンプル上に集束させられる前記第１の光ビームより高次のガウスビームを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
点拡がり関数を点状形状に成形して前記画像を生成するステップを含む、請求項１から８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルの化学または構造特性は、前記測定のために修正されない、請求項１から９に記載の方法。
【請求項１１】
サンプルの光吸収を記録するシステムであって、前記システムは、
１つ以上の光ビームを使用して、光の第１および第２のパルス状ビームを、交互に、前記サンプル上に集束させるための手段であって、前記第１および第２の光パルス状ビームは、飽和レベルがサブ回折分解能を提供するように、飽和を達成するための強度を有するように選択され、前記ビームは、共整合されるように適合され、前記第１および第２のパルス状ビームは、一方の光ビームが、他方の光ビームが呈さない波節を呈するように、異なるビーム形状を有し、前記第１の光ビームは、前記サンプル上に集束させられるゼロ次ガウスを備える、手段と、
サンプルを通して透過された、および／または前記サンプルによって反射された前記第１および第２のパルス状ビームの強度差を測定するための手段と、
前記測定された強度差から前記サンプルの画像を生成するための手段と
を備える、システム。
【請求項１２】
前記差を測定するための同期検出モジュールを備え、前記同期検出は、ロックイン増幅器を備える、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記サンプルの吸収は、赤外線波長範囲内で測定されることになる、請求項１１または１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記サンプルの吸収は、ＵＶ、可視、または近赤外線波長範囲内で測定される、請求項１１から１３に記載のシステム。
【請求項１５】
第１および第２のパルス状ビームを提供するように適合された１つの光ビームを備える、請求項１１から１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記第２の光ビームは、前記サンプル上に集束させられる前記第１の光ビームより高次のガウスビームを備える、請求項１１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本発明は、遠視野サブ回折撮像システムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
今日、化学分析のための赤外線（ＩＲ）（または、可視および紫外線（ＵＶ））吸光度の重要性にもかかわらず、高空間分解能において、サンプルの吸光度を測定することは、困難なままである。
【０００３】
遠視野では、概して、可視または近ＩＲスペクトル内のより短い波長、典型的には、最大１μｍの波長を使用することによって、高分解能化学撮像を達成することを選定する。実際、Ａｂｂｅ基準によると、波長が短いほど、分解能が良好である。また、ＣＡＲＳ（コヒーレント反ストークス分光法）またはＳＲＳ（誘導ラマン分光法）等のいくつかのアプローチを使用して、化学撮像を得ることができる。これらは、サンプルの特性ラマンシグネチャを調べる。サブ回折ＣＡＲＳ顕微鏡法のための方式は、異なる空間プロファイルの２つの干渉する「ストークス」ビームを伴う、時間および空間的に重複する単一ポンプビームをサンプル中に使用する、第ＵＳ２０１０／０２３８４３８Ａ１号に説明されている。
【０００４】
ＩＲ吸収は、ラマン分光法に対する補完情報を提供し、典型的には、ラマン法と対合される。ＩＲ吸収の明白な利点は、ＩＲ吸収の断面が、ラマン散乱のものより大きく、原理上、より高い感度をもたらすことである。最良ＩＲ吸収撮像（または、ＩＲ顕微分光法）は、現在、シンクロトロンＩＲ源を使用して実施され、回折限界分解能（少なくとも数μｍ）のみをもたらす。
【０００５】
現在、ＣＡＲＳまたはＳＲＳのレベルまでの（または、それを上回る）ＩＲ吸収撮像の分解能を改善するための遠視野法は、実証されていない。現在、ＩＲ吸光度を測定するときの高空間分解能を達成するために、近視野プローブ法を模索する必要がある。これらは、サンプルの近傍において、ナノスケールのプローブを走査することによって実現される。数１０ｎｍ（しかし、典型的には、１００〜１５０ｎｍ）までの分解能が、実証されている。性質上、これらの技法は、サンプルの表面を調べるのに適しており、用途の分野を限定する。本分野における他の刊行物として、特許公報第ＧＢ２４７７８１７号が挙げられる。さらに効果的に機能するプローブを得る際に固有の難点もある。
【０００６】
現在の遠視野サブ回折顕微鏡法は、ＲＥＳＯＬＦＴ（可逆的飽和性光学蛍光遷移）および局在化法（例えば、ＳＴＯＲＭ、ＰＡＬＭ等）を使用することができる。これらの方法は、（非常にわずかな具体的例を除く全てにおいて）サンプルに添加される、蛍光分子の蛍光度を測定する。これらの蛍光分子は、発色団、またはより一般的には、「標識」として知られる。第ＤＥ４４１６５５８号および第ＵＳ２０１１／０２１５２５８Ａ１号は、ＲＥＳＯＬＦＴアプローチの実装を説明している。それらは、したがって、無標識化学撮像には好適ではない。
【０００７】
飽和構造化照射顕微鏡法（ＳＳＩＭ）が、Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ（Ｍ．  Ｇ．  Ｌ．  Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ２００５，  Ｖｏｌ．  １０２，  １３０８１−１３０８６）によって提案されている。しかしながら、ＳＳＩＭもまた、蛍光分子の場合に実現され、ＩＲ吸光度（または、可視／ＵＶ吸光度）を記録するために設計されていない。ＳＳＩＭは、複合画像処理を使用し、広視野アプローチである。選択的指向集束照明ビームおよび広視野アレイ検出器を使用する類似方式が、ＰＣＴ特許公報第ＷＯ２０１０／１０１８９４Ａ２号に提案されている。
【０００８】
さらに、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｔ．  Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｋ．  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｏｐｔｉｃａ  Ａｃｔａ  １９８４，  Ｖｏｌ．  ３１，  ４５３−４６５）によって発表された論文は、その原生状態における、すなわち、いかなる修正も伴わない、単一点光源が、撮像のために走査されているサンプルに進む方式を説明している。サンプルから得られたビームは、次いで、２つのビームに分割され、差動信号が、２つの異なる検出器、すなわち、共焦点検出器および大面積検出器によって測定された強度差として確立される。
【０００９】
第ＵＳ２０１２／００９７８６５号は、発光（蛍光および類似効果）に基づいて、可視撮像の分解能を改善する差動方式を説明しており、「標識」の添加を要求する。本技法では、サンプル中の標識から放出された発光は、完全ではないが、部分的に、サンプル上に重複し、発光を励起させる、２つのビームを使用することによって、サブ回折分解能で測定される。本分野における他の刊行物として、特許公報第ＷＯ２００７１０６０６９号および第ＵＳ２００６１１９９３４号が挙げられる。
【００１０】
本発明の目的は、遠視野内のそのサブ回折撮像のために、サンプルによる光（ＩＲ、可視、またはＵＶ）の吸収の測定に基づく方法およびシステムを提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０２３８４３８号明細書
【特許文献２】英国特許第２４７７８１７号明細書
【特許文献３】欧州特許第４４１６５５８号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１０／１０１８９４号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１２／００９７８６５号明細書
【特許文献６】国際公開２００７／１０６０６９号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６／１１９９３４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要約）
本発明によると、添付の請求項に記載のように、サンプルの光吸収を記録する方法が提供され、該方法は、
１つ以上の光ビームを使用して、第１および第２の光のパルス状ビームを該サンプル上に提供するステップであって、該第１および第２のパルス状ビームは、異なる空間定義を有する、ステップと、
サンプルを通して透過された、および／またはそれによって反射された該第１および第２のパルス状ビームの強度差を測定するステップと、
該測定された強度差からサンプルの画像を生成するステップと
を含む。
【００１３】
本発明のシステムおよび方法は、数１００ｎｍの分解能を達成することができる、したがって、今日存在する最も匹敵する技法である、シンクロトロンＩＲ吸収撮像と比較して、著しい改良をもたらす。走査プローブアプローチに優る本発明の利点は、物理的プローブの不在であり、したがって、閉じ込めを表面情報に抑制し、プローブの機能挙動に関する不確実性を除去する。ＳＲＳおよび他のラマンベースのアプローチと比較して、本発明は、補完的ＩＲシグネチャをもたらすだけではなく、また、より微細な量を測定し、したがって、より感度を有する。本発明のシステムおよび方法は、サンプルのタイムリーな制御ポンピングの必要性を除去し、任意のＲＥＳＯＬＦＴベースのアプローチより実現をはるかに単純にする。
【００１４】
一実施形態では、同期検出によって、サンプルを通して透過された、および／またはそれによって反射されたパルス状ビームの強度変動を記録するステップが、提供される。
【００１５】
一実施形態では、測定ステップは、サンプルの振動情報を測定する。
【００１６】
一実施形態では、１つの光ビームが、第１および第２のパルス状光ビームを提供するように適合され、ビームは、異なる空間定義を備える。
【００１７】
一実施形態では、第１および第２のパルス状光ビームは、飽和レベルがサブ回折分解能を提供するように、サンプルの吸収を飽和させる強度で選択される。
【００１８】
一実施形態では、透過および／または反射された第１および第２の光のビームの強度を比較するステップが、提供され、該ビームは、共整合されるように適合され、異なる空間定義を備える。
【００１９】
一実施形態では、点拡がり関数を点状形状に成形または変調させ、該画像を生成するステップが、提供される。
【００２０】
一実施形態では、サンプルの化学または構造特性は、測定ステップのために修正されない。
【００２１】
別の実施形態では、サンプルの吸収を記録する方法が提供され、該方法は、
−１つ以上の光ビームを使用して、第１および第２の光のパルス状ビームを該サンプル上に提供するステップであって、該第１および第２のパルス状ビームは、異なる空間定義を有する、ステップと、
−サンプルを通して透過された、および／またはそれによって反射された第１および第２のパルス状ビームの両方に関する強度差を測定するステップと、
−そのような測定を行いながら、サンプルを走査することによって、画像を生成するステップと
を含む。
【００２２】
本発明のさらなる実施形態では、サンプルの吸収を記録するシステムが提供され、該システムは、
−１つ以上の光ビームを使用して、第１および第２の光のパルス状ビームを該サンプル上に提供するための手段であって、該第１および第２のパルス状ビームは、異なる空間定義を有する、手段と、
−サンプルを通して透過された、および／またはそれによって反射された第１および第２のパルス状ビームの両方に関する強度差を測定するための手段と、
−そのような測定を行いながら、サンプルを走査することによって、画像を生成するための手段と
を備える。
【００２３】
別の実施形態では、サンプルの光吸収を記録するシステムが提供され、該システムは、
１つ以上の光ビームを使用して、第１および第２の光のパルス状ビームを該サンプル上に提供するための手段であって、該第１および第２のパルス状ビームは、異なる空間定義を有する、手段と、
サンプルを通して透過された、および／またはそれによって反射された該第１および第２のパルス状ビームの強度差を測定するための手段と、
該測定された強度差からサンプルの画像を生成するための手段と
を備える。
【００２４】
一実施形態では、同期検出によって、サンプルを通して透過および／または反射されたパルス状ビームの強度変動を記録するための手段が、提供される。
【００２５】
一実施形態では、同期検出は、ロックイン増幅器を備える。
【００２６】
一実施形態では、同期検出アプローチは、異なる空間定義を有する、交互する第１および第２のパルス状ビームの強度の測定を行うことを含む。
【００２７】
一実施形態では、測定手段は、サンプルのＩＲ吸光度を測定する。
【００２８】
一実施形態では、サンプルの吸収は、ＵＶ−可視波長範囲内で測定される（サンプルのＵＶ−可視吸収を測定する）。
【００２９】
一実施形態では、１つの光ビームが、第１および第２のパルス状ビームを提供するように適合され、パルス状ビームは、異なる空間定義を備える。
【００３０】
一実施形態では、透過または反射された第１および第２の光のビームの強度を比較するための手段が、提供され、該ビームは、共整合されるように適合され、異なる空間定義を備える。
【００３１】
一実施形態では、第１のパルス状光ビームは、ゼロ次ガウスビームを備える。
【００３２】
一実施形態では、第２のパルス状光ビームは、第１の光ビームより高次のガウスビーム（中心波節を呈する、渦ビームとも呼ばれる）を備える。
【００３３】
一実施形態では、点拡がり関数を点状形状に成形し、該画像を生成するための手段が、提供される。
【００３４】
一実施形態では、サンプルの化学または構造特性は、測定手段のために修正されない。
【００３５】
また、記録媒体、搬送波信号、または読取専用メモリ上に具現化され得る、コンピュータプログラムに前述の方法を実施させるためのプログラム命令を備える、コンピュータプログラムが、提供される。
本明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
サンプルの光吸収を記録する方法であって、前記方法は、
１つ以上の光ビームを使用して、第１および第２の光のパルス状ビームを前記サンプル上に提供するステップであって、前記第１および第２のパルス状ビームは、異なる空間定義を有する、ステップと、
サンプルを通して透過された、および／またはそれによって反射された前記第１および第２のパルス状ビームの強度差を測定するステップと、
前記測定された強度差から前記サンプルの画像を生成するステップと
を含む、方法。
（項目２）
同期検出によって、前記サンプルを通して透過された、および／またはそれによって反射された強度変動を記録するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記同期検出は、ロックイン増幅器を備える、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記同期検出アプローチは、異なる空間定義を有する交互する前記第１および第２のパルス状ビームの測定を行うことを含む、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記第１および第２の光パルス状ビームは、飽和レベルがサブ回折分解能を提供するように、飽和を達成するための強度で選択される、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記サンプルの吸収は、赤外線波長範囲内で測定される、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記サンプルの吸収は、ＵＶ、可視、または近赤外線波長範囲内で測定される、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
第１および第２のパルス状ビームを提供するように適合された１つの光ビームを備え、前記パルス状ビームは、異なる空間定義を備える、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
第１および第２の光のビームを比較するステップを含み、前記ビームは、共整合されるように適合され、異なる空間定義を備える、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記第１の光ビームは、前記サンプル上に集束されるゼロ次ガウスビームを備える、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記第２の光ビームは、前記サンプル上に集束される前記第１の光ビームより高次のガウスビームを備える、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
点拡がり関数を点状形状に成形し、前記画像を生成するステップを含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記サンプルの化学または構造特性は、前記測定のために修正されない、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
サンプルの光吸収を記録するシステムであって、前記システムは、
１つ以上の光ビームを使用して、第１および第２の光のパルス状ビームを前記サンプル上に提供するための手段であって、前記第１および第２のパルス状ビームは、異なる空間定義を有する、手段と、
サンプルを通して透過された、および／またはそれによって反射された前記第１および第２のパルス状ビームの強度差を測定するための手段と、
前記測定された強度差から前記サンプルの画像を生成するための手段と
を備える、システム。
（項目１５）
同期検出によって、前記サンプルを通して透過された強度変動を記録するための手段を備える、項目１４に記載のシステム。
（項目１６）
前記同期検出は、ロックイン増幅器を備える、項目１５に記載のシステム。
（項目１７）
前記同期検出アプローチは、異なる空間定義を有する交互する前記第１および第２のパルスビームの測定を行うことを含む、項目１５または１６に記載のシステム。
（項目１８）
前記サンプルの吸収は、赤外線波長範囲内で測定されることになる、項目１４から１７に記載のシステム。
（項目１９）
前記サンプルの吸収は、ＵＶ、可視、または近赤外線波長範囲内で測定される、項目１４から１８に記載のシステム。
（項目２０）
第１および第２のパルス状ビームを提供するように適合された１つの光ビームを備え、前記パルス状ビームは、異なる空間定義を備える、項目１４から１９に記載のシステム。
（項目２１）
前記第１および第２の光のビームの透過／反射された強度を比較するための手段を備え、前記ビームは、共整合されるように適合され、異なる空間定義を備える、項目１４から２０に記載のシステム。
（項目２２）
前記第１の光ビームは、前記サンプル上に集束されるゼロ次ガウスビームを備える、項目２１に記載のシステム。
（項目２３）
前記第２の光ビームは、前記サンプル上に集束される前記第１の光ビームより高次のガウスビームを備える、項目２２に記載のシステム。
（項目２４）
点拡がり関数を点状形状に成形し、前記画像を生成するための手段を備える、項目１４から２３のいずれかに記載のシステム。
（項目２５）
前記サンプルの化学または構造特性は、前記測定のために修正されない、項目１４から２４のいずれかに記載のシステム。
（項目２６）
項目１４から２５のいずれかに記載のシステムを備える、顕微鏡。
（項目２７）
項目１４から２５のいずれかに記載のシステムを備える、撮像システム。
【００３６】
本発明は、付随の図面を参照して、単なる一例として与えられる、その実施形態の以下の説明からより明白に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１（ａ）および（ｂ）は、本発明の第１および第２の実施形態による、システムの２つの基礎構成を図示する。
【図２】図２（ａ）は、サンプルを通して通過する光子のビームが、いくつかの振動体を励起し、（ｂ）サブ回折分解能が、ビームの形状を時間的に周期的に修正することによって達成され得ることを図示する。
【図３】図３は、一実施形態において使用されるような２つのビームの半径方向プロファイルを図示する。
【図４】図４（ａ）は、比較のために、一実施形態に従って算出されたＤＩＲＮ  ＰＳＦと、（ｂ）算出された従来のＩＲ吸収ＰＳＦを示す。
【図５】図５は、異なるパルスエネルギーに関して算出されたＤＩＲＮ  ＰＳＦを図示する。
【図６】図６は、異なるパルスエネルギーに関するＤＩＲＮ  ＰＳＦ中心ピークのＦＷＨＭ（半値全幅）を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、回折限界を下回る空間分解能を用いて、サンプルの赤外線吸収を記録するための方法およびシステムを提供する。本方法は、赤外線（中および近赤外線）、可視、およびＵＶ吸収に対して、同一の方法で機能するであろう。本明細書に説明される手順は、透過幾何学形状のためのものであるが、反射幾何学形状もまた、可能性として考えられる。手順は、２Ｄ撮像の場合において説明されるが、手順は、３Ｄ撮像にも拡張可能である。赤外線吸収スペクトルは、材料中に存在する振動モードを識別および特定することを可能にする。これらのモードは、サンプルの特性である、ＩＲ周波数で生じ、したがって、ＩＲ吸収の記録は、サンプルからの化学情報を測定するための方法である。吸収の画像が産生されると、それらは、化学画像と称される。
【００３９】
図１（ａ）は、本発明の方法の一実施形態による、サンプルの吸収を記録するための例示的構成を図示する。光源（１）、例えば、レーザ源（図示せず）が、光ビームを提供し、それは、ビームスプリッタ（２）によって、２つに分割され、２つのビームを生成することができ、一方の経路は、位相フィルタを通して進み、螺旋位相プレート（３）（ガウスおよびドーナツ信号と協働するように選定する場合）を使用して、ガウスビームをドーナツ形状に成形するであろう。ビーム経路は、ミラー（４、５）によって制御されることができる。チョッパ（６、７）は、一方または他方のビームの使用を可能にする（すなわち、２つのチョッパは、本実施形態では、位相がずれている）。ビームは、ビームスプリッタ（８）を使用して、共整合される。２つのパルス状ビームは、単一光ビームによって提供されることができ、ビームの空間定義は、繰り返し変動されることを理解されるであろう。サンプル（９）が、２つの対物レンズ（１０、１１）間に位置付けられ、スキャナ（１２）によって走査されるように適合される。コンピュータ（１３）は、スキャナを制御し、チョッパ（６、７）と同調して、基準信号（１６）にロックオンされ、光検出器（１７）によって発せられる信号を測定する、ロックイン増幅器（１５）によって生成される差動信号（１４）を記録する。本システムは、透過された強度差を測定し（但し、反射強度は、ビームスプリッタをサンプルの前に追加し、そのビームスプリッタの出力に検出器を置くことによって可能である）し、そのような測定を行うときに、サンプルを走査することによって、画像を生成する。
【００４０】
図１（ｂ）は、コンピュータ制御式波面変調器（１８）が使用される、実施形態の変形例を図示する。波面変調器は、第１および第２の光のパルス状ビームをサンプル上に提供するための手段を提供する。図１（ｂ）に示される実施形態の動作は、図１（ａ）に関して本明細書に説明されるものに類似し、より容易なビーム整合を提供することができる。
【００４１】
動作時、サンプルは、Ｇｌｏｂａｒ源に基づく、シンクロトロンＩＲ撮像またはＩＲ顕微鏡の場合と同様に調製される。反射幾何学形状または透過幾何学形状内における機能もまた、可能性として考えられる。サンプルは、顕微鏡の２つの対物レンズ間に置かれる（共焦点構成は、最終的には、より優れた分解能をもたらし、したがって、好ましいが、不可欠ではない）。本手順は、交互に、ガウス形状のビームおよびドーナツ形状のビーム（しかしながら、他のビーム形状も、可能性として考えられる）を集束し、サンプルを通して透過された後続強度変動を記録する。これは、単に、ビームの交互周波数と同調して、基準信号を使用して、強度に関する同期検出によって（例えば、ロックイン増幅器を用いて）行われることができる。シャッタが、他方が通過する間、一方のビームを遮断する、およびその逆のために使用され、交互性をもたらすことができる（他のシャッタ構成／技術も、可能性として考えられる）。２つのビームの精密な形状は、一方が、他方が呈さない、ある波節を呈する限り、問題ではないことに留意されたい。ここでは、ロックイン増幅器の出力である、信号が、サブ回折分解能における撮像をもたらすことを可能にすることが示され得る。
【００４２】
図１のシステムは、走査技法を使用して、測定は、ビーム内のサンプルの位置を変動させることによって繰り返される。便宜上、両ビームは、同一の位置に中心付けられ、かつ集束される。しかしながら、構成に関して、いくつかの制約がある（本質的に、ある波節は、波腹に面するべきである）。高空間分解能は、吸光度の非線形性のため達成される。
【００４３】
図２（ａ）では、振動体の緩和サンプルを検討すると、サンプルを通して通過する光子のビームは、いくつかの振動体を励起させるであろうことが説明される。ＩＲ吸収分光法または顕微分光法に基づいて、ある確率で、これが生じる。いくつかの光子は、したがって、損失され、透過サンプルを通した透過前後の強度の比率の測定は、吸光度を与える（厳密には、吸光度の定義上、さらに、本比率の対数を算出するべきである）。左から右に見られるものは、入射光子束（すなわち、ビーム強度）の増加が、最初は、損失光子（すなわち、吸収）の増加につながるが、飽和が達成される後の段階では（すなわち、２つのレベルシステムの場合、これは、基本および励起状態の分布密度が等しいときに生じる）、吸収された光子の数は、同一のままであるということである。飽和は、サブ回折分解能の起源である。
【００４４】
図２（ｂ）では、サブ回折分解能が、ビームの形状を時間的に周期的に修正することによって（例えば、ガウスとドーナツとの間で）、かつ透過されたＩＲ光の差異を記録することによって達成されることができることが図示される。ビーム形状変動と同調した透過および／または反射された光の変動は、ロックイン増幅器が測定するであろうものである。ロックイン増幅は、物理学で頻繁に使用される方法であり、同期検出とも呼ばれる。
【００４５】
結果が、点画像を表す、１つの可能性として考えられる点拡がり関数（ＰＳＦ）を図示するために示される（Ｄｉｒａｃ関数の理論では、単一画素のみ（２５×２５ｎｍ２）においてアクティブなサンプルによってここでシミュレートされる）。全ビームは、円形幾何学形状であり、したがって、半径方向座標のみ、表される。ＰＳＦの半値全幅（ｆｗｈｍ）は、通常そうであるように、分解能と見なされる。シミュレーションは、以下の方程式系の解の結果である（両方とも、大学生用の光学教科書から周知である）。
【数１】
0006396324.tif 000002
式中、Γは、自発脱励起率であり、βは、光速に対して正規化された誘導放出／吸収アイシュタイン係数であり、ΔＮは、２つのレベル間の相対的分布密度差であり、Ｎは、励起状態の分布密度であり、Ｉは、局所強度（振動体によって吸収されることができる光子のみを包含する）であり、ｚは、伝搬方向に沿った位置であり、ｔは、時間である。ｈｖは、光子エネルギーであり、ρは、振動体の密度である。
【００４６】
サンプルは、したがって、ρ、β、およびΓによって説明され、その値は、空間の全３次元に依存され得る。Ｍａｔｈｌａｂコードが、後退オイラー法を使用し、かつＮ、ΔＮ、およびＩをｚに対して法線のサンプル平面内の座標にも依存させて展開された方程式系を解法するために記述されることができる。系の解は、事実上、基本状態が室温においてのみ占有されるため、
【化１】
0006396324.tif 000003
であり、
【化２】
0006396324.tif 000004
がサンプルに衝打する強度の時間発展に対応することを認識することによって、反復によって容易に見出される。射出プローブパルスのエネルギーΣは、座標ｚがサンプル深度を超える１つのパルスの持続時間にわたって、かつｚに対して法線のサンプル平面にわたって積分することによって、求められる。ＩＲ吸収画像およびサブ回折画像は、サンプルに対するパルスの相対位置を変動させるプロセスを繰り返すことによって、算出される。差動赤外線ナノ顕微鏡法（ＤＩＲＮ）信号は、以下のように定義される。
【数２】
0006396324.tif 000005
式中、
【化３】
0006396324.tif 000006
は、ｚ０（または、サンプルの不在）下におけるサンプルの入射時に算出されたガウスプローブパルスであり、
【化４】
0006396324.tif 000007
は、ドーナツ形状ビームに対して透過された信号であり、
【化５】
0006396324.tif 000008
は、ガウス形状ビームに対して透過された信号である。ドーナツ（すなわち、１次ガウス）およびガウス（すなわち、ゼロ次ガウス）ビームの使用は、最も明白な実施形態であるが、唯一の解決策ではないことに留意されたい。実験的に測定された信号は、以下となり得る。
【数３】
0006396324.tif 000009
式中、Ａは、較正定数である。前述のような割合の参照は、信号コントラストの推定値を提供し、したがって、信号を実験的に記録する困難度を査定するために使用されることができるため、ここでは有用である。しかし、基準信号が実験的に測定される場合、また、ＤＩＲＮ（％）も同様に記録可能である。
【００４７】
ＤＩＲＮ顕微鏡法の点拡がり関数（ＰＳＦ）をシミュレートするために、サンプルが、以下によって定義されたプローブを使用して、２５×２５ｎｍ２の単一画素内で定義された。
【数４】
0006396324.tif 000010
【００４８】
第１のものは、ガウスプロファイルに対応し、第２のものは、ドーナツプロファイルに対応する。ビームは、１ｎＪ、１０ｎＪ、１００ｎＪ、および１μＪのエネルギーを達成するように正規化される。ウエストｗ０は、ドーナツの場合、１．５９μｍに選択され、ガウスの場合の１．２倍大きい（それらの値は、Ｃ−Ｈ伸縮モードの共鳴波長である、３．５μｍで機能するとき、高ＮＡ光学のために実験的に合理的である）。再び、これは、ここで使用される好適な幾何学形状であるが、概念またはその実践的実現に必須ではない。プローブは、時間ドメインにおける１ｐｓガウスｆｗｈｍのパルスとして設定される。実践的観点から、他の持続時間も、ピーク強度に到達し得る限り、使用されることができる。
【００４９】
図３は、一実施形態において使用される２つのビームの半径方向プロファイルを示す。両方とも、時間ドメインにおける１ｎＪおよび１ｐｓｆｗｈｍのパルスエネルギーのために本明細書で表される。均一オクタデシルシラン単分子膜の場合の０．５％吸収の実験値が、２．０ｎｍの厚さ、分子あたり２７Å２の面積（アルカン自己組織単分子膜）、および分子あたり１７の振動体（ＣＨ２部分）を考慮して、βを１．４ｎｍ２．ｆＪ−１に、振動体の密度ρを３１．５ｎｍ−３に設定することによって再現される。Γは、０．１ｐｓ−１（１０ｐｓの寿命に対応する）の平均実験値に設定される。しかしながら、Γの値は、ＤＩＲＮにとって非常に重要ではない。したがって、ＤＩＲＮ顕微鏡法のＰＳＦをシミュレートするために、透明基板上のオクタデシルシラン２５×２５ｎｍ２の平方ドメインの透過率においてＤＩＲＮ画像を算出することも可能である。
【００５０】
図４（ａ）は、一実施形態に従って算出されたＤＩＲＮ  ＰＳＦを示し、図４（ｂ）は、比較のための従来のＩＲ  ＰＳＦである。ＤＩＲＮの場合、ピークｆｗｈｍは、１００ｎＪに対して較正値２７５ｎｍであることが分かる。また、負の信号は、ピークから離れ、これらの構造の精密な形状は、プローブビーム形状の詳細に依存することが分かる。ビーム形状を最適化し、それらの影響を最小限にする、または画像のデコンボリューションを使用して、アーチファクトを抑制することができる。しかしながら、これは、単純デコンボリューションであり、ＳＳＩＭ（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ法）の場合のように、複雑なアルゴリズムを要求しないであろう。
【００５１】
図５は、プローブ１ｎＪ、１０ｎＪ、１００ｎＪ、および１μＪのエネルギーに関して算出されたＰＳＦを示す。分解能は、１μＪの場合、１００ｎｍを下回って改良され（また、差込図参照）、信号コントラストの％が、プローブエネルギーの増加に伴って減少することが分かる。同期検出の品質は、したがって、分解能を限定するであろう。本発明は、それでもなお、演繹的に、１００ｎｍまでのサブ回折撮像に好適である。単分子膜厚２５０×２５０ｎｍ２画素は、２５０ｎｍの分解能のための光検出器における強度より較正値１０−６小さい信号コントラストを与えるであろう（より厚いサンプルは、より大きい信号コントラストを伴うであろう）。したがって、ロックインおよび雑音レベルの品質は、信号／分解能を限定するであろうが、１０−８の比率を伴う近視野測定が実証されたため、ナノスケールの撮像が、可能である。分解能はまた、１ｎＪの場合でも、サブ回折（１．３μｍ）であり、図５および図６に示されるように、飽和閾値を下回ることに留意されたい。
【００５２】
サブ回折分解能は、サンプルを通して透過された強度変動の同期検出によって達成されることを理解されるであろう。本方法は、通常ＩＲ顕微鏡（また、共焦点）に基づく、本明細書に図示されるような透過中のＩＲに対して機能することができる。吸光度は、原理がまた、より短い波長、したがって、可視およびＵＶを含む波長にも当てはまるように測定される。非透明サンプルの撮像も、本手順が等しく可能である、反射幾何学形状において可能である。
【００５３】
図面を参照して説明される本発明における実施形態は、コンピュータ装置および／またはコンピュータ装置内で行われるプロセスを備える。しかしながら、本発明はまた、コンピュータプログラム、特に、本発明を実践するために適合される搬送波上または内に記憶されたコンピュータプログラムにも拡張される。プログラムは、ソースコード、オブジェクトコード、あるいは部分的にコンパイルされた形態または本発明による方法の実装において使用するために好適な任意の他の形態等における、コード中間ソースおよびオブジェクトコードの形態であってもよい。搬送波は、ＲＯＭ、例えば、ＣＤ  ＲＯＭ、または磁気記録媒体、例えば、フロッピー（登録商標）ディスクまたはハードディスク等の記憶媒体を備えてもよい。搬送波は、電気または光学ケーブルを介して、あるいは無線または他の手段によって、伝送され得る、電気または光学信号であってもよい。
【００５４】
明細書では、用語「備える（ｃｏｐｒｉｓｅ、ｃｏｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｐｒｉｓｅｄ、およびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」またはその任意の変形例および用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｅｄ、およびｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」またはその任意の変形例は、完全に交換可能であると見なされ、それらは全て、最も広い可能性として考えられる解釈が与えられ、その逆も同様であるべきである。
【００５５】
本発明は、前述の実施形態に限定されず、構造および詳細の両方において変動され得る。
【図１（ａ）】
0006396324.tif 000011
【図１（ｂ）】
0006396324.tif 000012
【図２（ａ）】
0006396324.tif 000013
【図２（ｂ）】
0006396324.tif 000014
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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