(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において治療遺伝子を発現させるためのキットであって、該哺乳動物の脳脊髄液内及び血液内への投与のための、該遺伝子を含む伝達性ウイルスベクターの組み合わせを含み、該伝達性ウイルスベクターが、ＡＡＶ９ベクター又はＡＡＶ１０ベクタ―からなる群より選択される、キット。
【請求項２】
多全身性疾患の処置に有効な治療遺伝子の投与による哺乳動物における多全身性疾患を処置するためのキットであって、該治療遺伝子が、伝達性ウイルスベクターに含まれ、該キットが、該哺乳動物の脳脊髄液及び血液内への投与のためのベクターの組み合わせを含み、該伝達性ウイルスベクターが、ＡＡＶ９ベクター又はＡＡＶ１０ベクタ―からなる群より選択される、キット。
【請求項３】
該ベクターのゲノムが、一本鎖又は二本鎖である、請求項１又は２記載のキット。
【請求項４】
該ベクターが、機能的Ｒｅｐ及びＣａｐをコードするウイルス配列を欠く複製欠損ＡＡＶゲノムを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のキット。
【請求項５】
該ベクターが、ｓｓＡＡＶ９ベクター、ｓｃＡＡＶ９ベクター、又はＡＡＶ１０ベクターである、請求項１〜４のいずれか１項記載のキット。
【請求項６】
伝達性ウイルスベクターの哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）への投与が、脳室内（ＩＣＶ）注射、くも膜下腔内注射、又は大槽内注射である、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項７】
少なくとも一つの側脳室内への投与のためのベクターを含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
伝達性ウイルスベクターの哺乳動物の血液内への投与が、静脈内注射（ＩＶ）、筋肉内注射、動脈内注射、腹腔内注射、又は皮下注射である、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項９】
静脈内注射のためのベクターを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
該ベクターの組み合わせのＩＣＶ及びＩＶ注射を含む、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１１】
組み合わせの投与が、互いに７２時間未満内の、好ましくは、４８時間未満内の、より好ましくは、２４時間未満内の、さらにより好ましくは、１時間未満内の該哺乳動物のＣＳＦ及び血液内の投与のための、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１２】
組み合わせの投与が、実質的に同時の投与である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
比率：ＣＳＦ中に投与された用量／血液中に投与された用量が、０．２と５の間、好ましくは、０．２と１．５の間に含まれる、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１４】
該比率が、０．４、０．６、０．８、１．０、又は１．２５である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
治療遺伝子が、成長因子、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質、酵素、抗アポトーシス因子、血管新生因子、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）のような病理障害において突然変異していることが知られている任意のタンパク質から選択される治療ＲＮＡ又はタンパク質をコードする、請求項１〜１４のいずれか１項記載のキット。
【請求項１６】
多全身性疾患が、神経変性疾患、神経筋疾患、疼痛、リソソーム病、トラウマ、骨髄疾患、神経系の癌、脱髄性疾患、神経系の自己免疫疾患、神経毒性症候群、睡眠障害から選択される、請求項２〜１５のいずれか１項記載のキット。
【請求項１７】
単回の組み合わせのＣＳＦ−血液投与のための、請求項１〜１６のいずれか１項記載のキット。
【請求項１８】
それを必要とする哺乳動物においてＳＭＡを処置するためのキットであって、該哺乳動物の脳脊髄液及び血液内への投与のためのＳＭＮ遺伝子を含むＡＡＶ９ベクター及びＡＡＶ１０ベクターから選択されるｔＡＡＶベクターの組み合わせを含み、該組み合わせの投与が、神経系及び末梢組織及び器官におけるＳＭＮタンパク質の発現を導き、ＳＭＡの処置を可能にする、キット。
【請求項１９】
二つのユニタリー用量の、治療遺伝子を含むＡＡＶ９ベクター及びＡＡＶ１０ベクターから選択されるｔＡＡＶベクターを含むキットであって、一つのユニタリー用量は、全身注射のために適応し、一つのユニタリー用量は、ＣＳＦ内への注射に適応する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における治療遺伝子を送達し、発現するための改善された組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、治療遺伝子を哺乳動物のＣＳＦ及び血液の両者内への投与したとき、大量かつ広範な遺伝子送達及び発現が、哺乳動物において得られたという予想外の発見に由来する。脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のモデルにおいて示されるとおり、この組み合わせの投与は、哺乳動物において単回の単一部位における投与と比べて驚くべきかつ相当の治療的有用性を導き、さらにウイルスの低減用量の使用を可能にする。驚くべきことに、ＣＳＦ及び血液内への組み合わせの送達は、ＣＳＦ又は静脈内のいずれかみに適用した同一の総用量に比べてより高い有効性を示し、それによって相乗効果を示す。この相乗効果は、次に、ＣＳＦ内に投与したベクターも全身に分布されるという事実及び全身に送達されたベクターも中枢神経系に送達されるという事実にもかかわらず、ＣＳＦ送達のみ又は全身性送達のみのいずれかと比べて必要な総容量を低減することを可能にする。本発明は、ヒト対象を含む、任意の哺乳動物において用いることができ、治療遺伝子の広範な発現が所望される、運動神経（ＭＮ）疾患又はリソソーム病のような多全身性疾患（multi-systemic disease）の治療に適している。
【０００２】
諸言
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Kennedy病のような、運動神経（ＭＮ）疾患は、脊髄、脳幹及び/又は運動皮質におけるＭＮの選択的変性を特徴とする神経変性疾患である (Monani 2005; Pasinelli and Brown 2006); (MacLean, Warne et al. 1996)。主に全身性注射によるＭＮへの薬物送達は、「脳血液関門」（ＢＢＢ）の存在によって妨げられることから、これらの疾患には治療法がない。この解剖学的かつ生理的バリアーは、中枢神経系（ＣＮＳ）キャピラリーの内皮細胞間のタイトジャンクションによって形成され、血行とＣＮＳの間の分子の容易な通過を防いでいる(Scherrmann 2002)。ＣＮＳ実質内に直接注射した組換えタンパク質でのＭＮの代替サプライも、神経実質内へのタンパク質の拡散が低いために困難であり、反復注射の必要性（又は浸透圧ポンプの留置やが、外科的処置の侵襲性が臨床適用の可能性を妨げている。
【０００３】
従来の薬理学の失敗は、科学界を、特にウイルスベクターを用いる遺伝子導入に技術に基づく新しい治療法の開発に導いた。
【０００４】
この点について、ＭＮ疾患の最初に提案された遺伝子導入方法は、脊髄実質内へのベクターのくも膜下腔内送達又は直接注射に基づいた (Davidson, PNAS 2000) (Azzouz, Hottinger et al. 2000)。しかし、これらのアプローチは、有効な広範なＣＮＳ形質導入を生じることができなかった。
【０００５】
脳室内へのウイルスベクターの注射も脳脊髄液（ＣＳＦ）中の治療タンパク質の分泌を生じるための脈絡叢及び上衣の内皮細胞を形質導入する目的において用いられた(Passini and Wolfe 2001)。しかし、神経組織への組換えタンパク質の拡散は、十分ではなく、ウイルスの拡散を認めることはできなかった。
【０００６】
代替的非侵襲的方法が、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によってＭＮにウイルスベクターの逆行性軸索輸送を用いてさらに開発された。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又は狂犬病Ｇ糖タンパク質で偽型にしたウマ貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来するいくつかのウイルスベクターは、ｉ．ｍ．注射の後にＭＮ軸索に沿って逆行性輸送を受ける。これらのウイルスのいくつかは、実験動物において首尾よく用いられ、より低いＭＮを形質導入した(Finiels et al., 1995; Kaspar et al., 2003; Azzouz et al., 2004)。しかし、この方法の臨床価値は、特に、患者の運動単位のほとんどに影響する病理におけるＭＮを標的する必要がある、大量の注射部位及びウイルス粒子のために、疑問のままだった。
【０００７】
WO2009/043936及びDuque et al (Mol Ther 2009)において、発明者は、驚くべきことにＡＡＶ９のような所定のウイルスの末梢注射が、単回の末梢（たとえば、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、又は筋肉内（ｉ．ｍ．））注射後に目的の遺伝子を新生児及び成体哺乳動物のＭＮ内に導入することができることを初めて示す、インビボでＣＮＳ細胞の相当の形質導入を生じることを見出した。
【０００８】
研究を続けることによって、発明者は、今や、インビボでの遺伝子導入及び発現の有効性を、遺伝子を特定のクラスのウイルスベクターにクローニングし、ベクターを組み合わせのＣＳＦ／血液投与プロトコールによって投与したとき、大幅に改善することができることを驚くべきことに見出した。この方法は、一つの単一部位への投与に比べてインビボでの驚くべきかつ相当の治療有効性（生存、体重増加）に実際に導く。この組み合わせの投与は、相乗的であると思われる：組み合わせは、ＣＳＦ内又は全身性のいずれかで送達された同一の用量と比べてより有効である。この相乗効果は、所望の効果を達成するためのウイルスの低減用量の使用を可能にする。本発明は、したがって、インビボで治療用遺伝子を発現するための、ヒト対象を含む、任意の哺乳動物において使用することができる改善された方法を提供する。ＭＮ又はリソソーム病のような多全身性疾患を処置することに特に適している。
【０００９】
発明の要約
本発明は、伝達性ウイルスベクターを用いるインビボでの治療産物の送達のための新規方法に関する。より具体的には、本発明は、対象のＣＳＦ及び血液内への伝達性ウイルスベクターの組み合わせの投与による哺乳動物対象の神経系及び末梢組織内への治療遺伝子の送達及び発現のための組成物及び方法に関する。
【００１０】
本発明の目的は、より具体的には、治療用遺伝子を含む、伝達性ウイルスベクター、好ましくは伝達性ＡＡＶベクター（ｔＡＡＶ）の該哺乳動物のＣＳＦ及び血液内の組み合わせの投与を含む、哺乳動物における治療用遺伝子を発現させるための方法に関する。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、多全身性疾患に有効な治療用遺伝子の投与による哺乳動物における多全身性疾患を処置するための方法であって、該治療遺伝子が、伝達性ウイルスベクター、好ましくはｔＡＡＶベクターに含まれ、該方法が、該哺乳動物のＣＳＦ及び血液内へのベクターの組み合わせの投与を含む、方法に関する。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、治療用遺伝子を該対象に投与することを含むその必要がある対象におけるＭＮ疾患のようなＣＮＳ障害を処置する方法であって、該治療用遺伝子が、伝達性ウイルスベクター、好ましくはｔＡＡＶベクターを含み、該方法が、該哺乳動物のＣＳＦ及び血液内へのベクターの組み合わせの投与を含み、対象の処置を導く方法にある。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、対象に治療用遺伝子を投与することによるＭＮ疾患を有する対象における生存又は体重を増加させる方法であって、治療用遺伝子が、伝達性ウイルスベクター、好ましくはｔＡＡＶベクターに含まれ、該方法が、該哺乳動物のＣＳＦ及び血液内へのベクターの組み合わせの投与を含み、対象の生存又は体重の増加を導く方法にある。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、対象のＣＳＦ及び血液内へのベクターの組み合わせの投与による哺乳動物対象における多全身性疾患の処置において用いるための治療用遺伝子を含む伝達性ウイルスベクターである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、それが必要な対象のＣＳＦ及び血液内へのベクターの組み合わせの投与による哺乳動物対象におけるＣＮＳ障害の処置において用いるための治療用遺伝子を含む伝達性ウイルスベクターである。
【００１６】
好ましい実施態様によれば、伝達性ウイルスベクターは、ＡＡＶ９ベクター又はＡＡＶ１０ベクターｔＡＡＶのようなｔＡＡＶである。
【００１７】
哺乳動物のＣＳＦ内へのウイルスベクターの投与は、好ましくは、脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．又はＩＣＶ）注射、くも膜下腔内注射、又は大槽内注射によって行われ、血液内への投与が、好ましくは、静脈内注射（i.v.又はＩＶ）、筋肉内注射、動脈内注射、腹腔内注射、又は皮下注射、皮内注射、経鼻送達、経皮送達（たとえばパッチ）のような非経口送達によってか、又は経腸送達（経口又は直腸）によって行われる。
【００１８】
本願において説明したとおり、組み合わせの投与は、より好ましくは、逐次投与ではなく、同時投与を行うことができる。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、伝達性ウイルスベクターの二つのユニタリー用量、全身注射のために適応する一つのユニタリー用量、及びＣＳＦ内への注射に適応する一つのユニタリー用量を含む、組成物又はキットである。
【００２０】
本発明のさらなる特定の目的は、治療用遺伝子を含む、伝達性ウイルスベクター、好ましくは、ｔＡＡＶベクターの該哺乳動物のＣＳＦ及び血液内への組み合わせの投与を含む、それが必要な哺乳動物におけるＳＭＡを処置する方法であって、該組み合わせの投与は、神経系及び末梢組織又は器官における治療用遺伝子の発現を導き、ＳＭＡの処置を可能する方法にある。
【００２１】
より具体的には、ＳＭＡを処置留守ための治療用遺伝子は、ＳＭＮ遺伝子（たとえば、ＳＭＮタンパク質をコードする任意のＤＮＡ又はＲＮＡ）又は選択的スプライシングをモジュレートできるか、プロモーターを活性化することができるか、又はＳＭＮタンパク質の安定性を増加することができ、ＳＭＮレベルの増加を生じる任意の配列（たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列）である。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、臨床有用性を低減することなく、遺伝子治療処置が必要な対象に投与された治療用遺伝子の用量を低減する方法であって、対象のＣＳＦ及び血液内に伝達性ウイルスベクターを用いて該遺伝子を投与することを含む方法にある。
【００２３】
本発明は、任意の哺乳動物、好ましくはヒト対象において用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１．ICV及びIV scAAV9-PGK-SMNopti注射SMNdelta7マウスのKaplan-Meier生存曲線。ICV (n=10)及びIV (n=10)注射マウスの両者(P0)が、非注射マウスの最大寿命を超えて生存した(18 days, n=14)。ICV注射マウスは、６０日齢前には全く死亡しなかったが、IV注射マウスではたった５４％しかこの日齢まで生存しなかった。ICV注射マウスの生存中央値は、IV注射マウスのそれに比べて有意に高かった(163日対73日)。
【図２】図２．ICV及びIV注射scAAV9-PGK-SMNopti SMNdelta7マウスの体重曲線。ICVのSMNdelta7注射マウス(n=10)の体重減少表現型は、IV注射のSMNdelta7マウス(n=13)のそれと比べて改善した。IV及びICV注射マウス両者の体重減少表現型は、非注射SMNdelta7マウスのそれと比べて改善した；。ICV注射マウスについて改善は、IV注射マウスのそれより優れていた(30日齢で、ヘテロマウスについて≒33g及び非処理マウスについて≒3gに対して、注射マウスのi.v.及びi.c.v.について、それぞれ、≒17g、≒25gg)。Ht: コントロールヘテロマウス; NI: 非注射SMNdelta7マウス。
【図３】図３．P0でのICV scAAV9-PGK-SMN注射後のSMNdelta7マウスの中枢神経系におけるSMNの発現。脳及び脊髄におけるSMN発現の(A) Western-blot及び(B) 免疫蛍光分析は、非注射SMNdelta7(n=2)及び野生型(n=2)マウスよりもICV注射SMNdelta7マウス(n=3)において高いSMNレベルを示した。
【図４】図４．P0でのICV scAAV9-PGK-SMN注射後のSMNdelta7マウスの末梢器官におけるSMNの発現。SMNの発現をICV注射新生児SMNdelta7マウス(n=3)の心臓、腎臓及び肝臓において検出する。
【図５】図５．ICV、IV、及びCo-ICV/IV scAAV9-PGK-SMNopti注射SMNdelta7マウスのKaplan Meier生存曲線。IV(n=10)又はICV(n=14)のみを注射したマウスと比べてCo-ICV/IV注射マウス(n=14)において遅発型疾患の傾向がある。co-ICV/IVマウスの100%が50日齢でまだ生存している。
【図６】図６．体重減少表現型は、IV(n=10)又はICV(n=14)のみで注射したマウスと比べてCo-ICV/IVで注射したマウス(n=14)において改善する。15週で、平均体重は、Co-ICV/IV、ICV、及びIVについて、それぞれ、24g、21g、及び16gに達した（ヘテロマウスの体重は、26.5gであった。）。15週で、ANOVA解析は、ヘテロとCo-IV/ICV注射マウス間の体重にいかなる統計学的差も示さなかった（ICV又はIV注射マウスとは対照的に）。
【図７】図７．ICV、IV、及びCo-ICV/IV scAAV9-PGK-SMNopti注射hSMN2マウスのKaplan Meier生存曲線。Co-ICV/IV注射マウス(≒ 27 days)の平均生存は、Co-ICV/IV注射マウスの一匹が１７０日まで生存しIV(≒9日)又は(ICV≒8日)のそれよりも優れている。200日齢のマウスの一匹がこの提出時にまだ生存し、同様の差が、scAAV10-SMNopti注射マウスで見られた。
【図８】図８．scAAV9-PGK-SMNoptiを用いてP0でICV、IV又はCo-ICV/IVのいずれかで注射した重度のhSMN2マウスの体重表現型の比較。ICV/IV co-injected KOマウスの体重減少表現型がIV又はICV注射SMNdelta7マウスと比べて改善した(Hz:コントロールヘテロマウス; KO:非注射重度SMAマウス; WT:野生型マウス)。重要なことには、一匹のICV/IV注射マウスは１７０日齢まで生存した。
【図９】図９．ICV、IV、又はCo-IV/ICV scAAV9-PGK-SMN注射SMNdelta7マウスのCNSにおけるSMN発現の比較。(A)異なる送達経路によってscAAV9-PGK-SMNを用いてP0で注射１５日後のマウスの脳及び脊髄、非注射SMNdelta7及び野生型コントロールのWestern blot分析。SMNレベルは、ICVのみで注射したマウスと比べてCo-ICV/IV注射マウスにおいて減少した。ICV注射SMNdelta7マウスにおけるSMNの脳及び脊髄発現。(B)異なる送達経路によるscAAV9-PGK-SMNでのP0で注射し、注射１５日後にSMN免疫蛍光で処理したマウスからの脊髄横断切片の代表的切片。この場合もやはり、SMN陽性細胞の数及び染色の強度は、ICVのみで注射したマウスと比べてCo-ICV/IV注射マウスにおいて減少した。
【図１０】図１０．処置SMAマウスにおける生殖能力の回復。明らかな利点が、IV注射マウスに比べて生殖能力の回復についてICV又はICV/IV注射後のSMNdelta7雌マウスにおいて観察された。生殖することができないIV処置マウスとは対照的に雌の100%がICV/IV及びICV処理群において生殖性であった。
【図１１】図１１．野生型マウスとCo-ICV/IV AAV10-hSMNopti注射hSMN2マウスの生存及び体重表現型の比較。Co-ICV/IV AAV10注射マウスの体重減少表現型及び生存が、非処理マウス、特に、209及び36日齢の２匹のマウスに比べて、かなり改善された。非処理マウスは、6日齢を経過することはなかった（生存中央値≒3日）。
【００２５】
発明の詳細な説明
神経系及び末梢組織の両者への広範な遺伝子送達は、ＭＮ疾患（たとえば、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ））又はリソソーム病のような多全身性疾患の処置について重要なチャレンジである。ここに、哺乳動物の血液及びＣＳＦ内へのウイルスベクターの単回の組み合わせ注射後に神経系（中枢及び末梢の両者）及び末梢器官の効率的な形質導入を可能にする新たな遺伝子導入方法を記載する。より具体的には、ｔＡＡＶベクターをマウスに静脈内(“i.v.”又は“IV”)及び脳室内(“i.c.v.”又は“ICV”)で注射し、ＳＭＡの重度(hSMN2)及び軽症(SMNdelta7)マウスモデルの両者において単回のICV注射後に比べてより高く、大幅な臨床有用性が得られた。SMNdelta7マウスについて体重増加、そしてhSMN2において生存及び体重増加が認められた。さらなる有用性が、軽症SMNdelta7マウスにおいてIV注射マウスに比べて回復した生殖能について観察された。治療用遺伝子発現を脊髄のＭＮ及びグリア細胞において、背面知覚線維（dorsal sensory fibers）において、背根神経節（dorsal root ganglions）及び心臓又は肝臓において見出すことができた。
【００２６】
本発明は、したがって、ウイルス介在遺伝子治療による多全身性疾患を処置するために有用な新たな改善された方法を提供する。
【００２７】
伝達性ウイルスベクター
本発明において、用語「ウイルスベクター」は、ウイルスを含むか又はウイルスの成分に由来し、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞を感染することに適した任意のベクターを意味する。典型的には、ウイルスベクターは、ウイルスカプシド又はエンベロープにパッケージされた組換えウイルスゲノムを含む。
【００２８】
「伝達性」ウイルスベクターは、ＣＳＦ注射後の器官のＣＮＳ及び非ＣＮＳ領域において拡散することができるウイルスベクターを意味する。具体的には、伝達性ウイルスベクターは、ＣＳＦ内への注射に応じて拡散することができ、典型的にはＢＢＢを横断又は通過することによって末梢器官の細胞に導入される。本発明は、ウイルスベクターがＣＮＳ注射に応じて、高効率で心臓、肝臓又は肺のような末梢器官への導入能力及び導入することができることを実際に立証した。
【００２９】
本発明の伝達性ウイルスベクターは、種々のタイプのウイルスに由来することができる。以下に開示するとおり、最も好ましい実施態様において、本発明のウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。
【００３０】
用語ＡＡＶベクターは、典型的には、治療産物（たとえば、タンパク質、ペプチド、又はアンチセンスのようなＲＮＡ配列）をコードする少なくとも核酸分子（ゲノム）を含むＡＡＶウイルス粒子（又はビリオン）をいう。以下で議論するが、ＡＡＶは、セロタイプの組み合わせ（たとえば、「偽型」（pseudotyped）ＡＡＶ）を含む、種々のセロタイプ、又は種々のゲノム（たとえば、一本鎖又は自己相補的）に由来することができる。さらに、ＡＡＶベクターは、複製欠損及び/又は標的化であることができる。
【００３１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、約２０ナノメートルのサイズの、依存性パルボウイルスである。他のパルボウイルスのように、ＡＡＶは、二つのオープン・リーディング・フレームを含む、約５０００ヌクレオチドの長さのゲノムを有する、一本鎖の、エンベロープを持たないＤＮＡウイルスである。左側オープン・リーディング・フレームは、複製に関与するタンパク質（Ｒｅｐ）をコードし、右側オープン・リーディング・フレームは、カプシドの構造タンパク質（Ｃａｐ）をコードする。オープン・リーディング・フレームは、ウイルスゲノムの複製の原点として働く二つのＩＴＲ配列によって隣接している。さらに、ゲノムは、ＡＡＶカプシド内へのウイルスゲノムのパッケージングを可能にするパッケージ配列も含む。
【００３２】
ＡＡＶは、培養細胞における増殖感染を起こすために（たとえば、アデノウイルスによってか又は適切なパッケージング細胞又はヘルパープラスミドによって提供されることができる）コヘルパー（co-helper）機能を必要とする。上記ヘルパー機能の不在下で、ＡＡＶビリオンは、実質的に細胞に入り、一本鎖ＤＮＡ分子として核に移動し、細胞のゲノム内に組み込まれる。ＡＡＶは、ヒト細胞を含む、広い範囲の宿主感染性を有しており、ヒトにおいて広範に分布しており、完全に非病原性である。
【００３３】
ＡＡＶベクターは、治療目的を含み、ヒト対象における遺伝子送達を介在するために設計され、製造され、そして用いられてきた。臨床試験が、ＡＡＶベクターを用いて種々の国において現在進行中である。典型的には、遺伝子導入において用いるためのＡＡＶベクターは、ウイルス配列をコードする機能的Ｒｅｐ及びＣａｐを欠く複製欠損ＡＡＶゲノムを含む。この複製欠損ＡＡＶベクターは、より好ましくは、Ｒｅｐ及びＣａｐコード配列のほとんど又は全てを欠き、一つ又は二つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列とパッケージング配列を実質的に残す。欠損ゲノムを、ウイルス粒子中にパッケージし、欠損、組換えＡＡＶウイルス、「ＡＡＶベクター」ともいう、を形成する。
【００３４】
パッケージング細胞、補助のウイルス又はプラスミド、及び/又はバキュロウイルスシステムを用いることを含む、このＡＡＶベクターを製造する方法は、文献に開示されている(Samulski et al., (1989) J. Virology 63, 3822; Xiao et al., (1998) J. Virology 72, 2224; Inoue et al., (1998) J. Virol. 72, 7024; WO98/22607; WO2005/072364) 。偽型ＡＡＶベクターを製造する方法(たとえばWO00/28004)、及びインビボ投与において免疫原性を低減するためのＡＡＶベクターの種々の改変又は製剤も、報告されている(たとえばWO01/23001; WO00/73316; WO04/112727; WO05/005610; WO99/06562を参照)。
【００３５】
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶの種々のセロタイプから調製するか又は由来することができ、互いに混合することができ、又は他のタイプのウイルスとキメラ（たとえば偽型の）のＡＡＶウイルスを製造することもできる。
【００３６】
ｔＡＡＶの好適例は、ヒトＡＡＶ４ベクター、ヒトＡＡＶ７ベクター、ヒトＡＡＶ９ベクター、ヒトＡＡＶ１０ベクター、又はウシＡＡＶベクターである。
【００３７】
ＡＡＶベクターは、単一のＡＡＶセロタイプに由来するか又は少なくとも二つの異なるＡＡＶセロタイプ（偽型ＡＡＶベクター）、たとえば、一つのＡＡＶセロタイプ（たとえばＡＡＶ９）に由来するＡＡＶゲノムを含むＡＡＶベクターに起源する配列又は成分、及び少なくとも異なるＡＡＶセロタイプからの一部に由来するカプシドを含むことができる。
【００３８】
ＡＡＶベクターの具体例は：
−  ＡＡＶ９由来カプシド中にＡＡＶ９由来ゲノム（治療タンパク質、好ましくは二つのＡＡＶ９由来ＩＴＲフランキングＡＡＶ９由来ＩＴＲ及びＡＡＶ９由来パッケージング配列及び治療タンパク質をコードする核酸に動作可能にリンクした、ＡＡＶ９由来ＩＴＲ及びＡＡＶ９由来パッケージング配列を含む核酸分子）を含むベクター；
−  ＡＡＶ１０由来カプシド中にＡＡＶ１０由来ゲノムを含むベクター；
−  ＡＡＶ１０由来カプシド中にＡＡＶ９由来ゲノムを含むベクター；
−  ＡＡＶ９由来カプシド中にＡＡＶ１０由来ゲノムを含むベクター；
−  ＡＡＶ１０由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；
−  ＡＡＶ９由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；
−  ウシＡＡＶ由来カプシド中にウシＡＡＶ由来ゲノムを含むベクター
である。
【００３９】
ＡＡＶベクターは、ベクターのトロピズムを改変するために、非ウイルス起源又は構造的に改変したタンパク質又はペプチドを含む、改変カプシドを含むことができる。具体例として、カプシドは、それぞれ、レセプター又はリガンドを発現する細胞種に向けてベクターを標的するために、特定のレセプターのリガンド、又は特定のリガンドのレセプターを含むことができる。
【００４０】
本発明において用いられるＡＡＶベクターにおいて、ＡＡＶゲノムは、一本鎖核酸又は二本鎖核酸、自己相補的核酸(McCarty et al., Gene Therapy, 2001)のいずれかであることができ、より好ましくは、自己相補的核酸である。
【００４１】
本発明において用いられる最適のウイルスベクターは、ｓｃＡＡＶ９ベクター、ｓｓＡＡＶ９ベクター、ｓｃＡＡＶ１０ベクター又はｓｓＡＡＶ１０ベクターである。
【００４２】
上で議論したとおり、ＡＡＶ由来ゲノムは、治療産物をコードする核酸（たとえば、タンパク質又はＲＮＡ）を含む。典型的には、核酸は、発現を可能にする制御配列、好ましくは、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、のようなコードしたタンパク質の分泌、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする配列等も含む。これに関して、最適の核酸は、感染した細胞において治療タンパク質の発現を生じるか又は改善するための、コード配列に動作可能にリンクした、プロモーター領域を含む。このプロモーターは、ユビキタス、組織特異的、強い、弱い、制御された、キメラ等であることができ、感染した組織において治療産物の有効かつ適切な産生を可能にする。プロモーターは、細胞性、ウイルス、真菌、植物又は合成プロモーターを含む、コードタンパク質とホモ又はヘテロであることができる。本発明において用いるために最適のプロモーターは、具体的にはヒト細胞の、神経細胞、より好ましくはＭＮにおいて機能的であるべきである。この制御されたプロモーターの例は、限定することなく、Ｔｅｔ  ｏｎ／ｏｆｆエレメント含有プロモーター、ラママイシン誘導性プロモーター及びメタロチオネインプロモーターを含む。ＭＮに特異的なプロモーターの例は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、公知のＭＮ由来因子又はＨＢ９プロモーターを含む。ＭＮにおいて機能的な他のプロモーターは、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、シナプシン、又はニューロン特異的サイレンサーエレメント（ＮＲＳＥ）を含むユビキタスプロモーターを含む。ユビキタスプロモーターの例は、ウイルスプロモーター、具体的には、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等及び細胞性プロモーター、たとえば、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターを含む。
【００４３】
特定の実施態様において、核酸は、コードしたタンパク質の分泌を可能にするリーダー配列を含むことができる。対象の導入遺伝子と分泌シグナルペプチドをコードする配列（通常は、分泌ポリペプチドのＮ末端に位置する）の融合は、導入細胞から分泌されることができる形態における治療タンパク質の産生を可能にする。このシグナルペプチドの例は、アルブミン、β−グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼ又はフィブロネクチン分泌シグナルペプチドを含む。
【００４４】
別の特定の実施態様によれば、導入細胞からの治療タンパク質の分泌及び近隣細胞による再摂取を生じるか又は改善するために、導入遺伝子をＴａｔ又はＶＰ２２配列のようなＰＴＤ配列と融合する。
【００４５】
特定の実施態様において、核酸は、コードしたタンパク質の発現及び分泌を可能にするために、動作可能にリンクした、プロモーター及びリーダー配列を含む。
【００４６】
さらに特定の実施態様において、核酸は、コードしたタンパク質の発現及び分泌を可能にするために、動作可能にリンクした、プロモーター、リーダー配列及びＰＴＤ配列を含む。
【００４７】
最適の実施態様において、プロモーターは、ユビキタスである。
【００４８】
また、一を超える治療産物をコードするウイルスベクターも用いることができる。このビ又はポリシストロンウイルスベクターは、たとえばＳＭＮ（又はＳＭＮレベルの増加を促進する任意の配列）処置する疾患のための治療目的の別の機能、たとえば細胞生存（たとえば抗アポトーシス又は神経栄養因子）、軸索成長又は維持（たとえば、ニュートロフィン、トランスフォーミング成長因子又は細胞外マトリックス成分）を促進する因子をコードする配列、又は骨格筋又は心筋への有利な効果を与える任意の配列（たとえば、筋肉栄養因子、筋形成のアクティベーター）をコードすることができる。
【００４９】
上で議論したとおり、ＡＡＶベクターは、実施例でさらに説明するように、技術的にそれ自体が公知である技術によって製造することができる。
【００５０】
組み合わせの脳脊髄液及び血液投与
本発明は、とりわけ、伝達性ウイルスベクターを用い、対象の血液及び脳脊髄液（ＣＳＦ）の両者に送達したとき、改善されたウイルス介在遺伝子発現及び疾患是正を得ることができるという予想外の発見に基づく。驚くべきことに、この結果は、この組み合わせの投与が一つの単一投与部位におけるウイルスの同一用量と比べて大幅に増加した治療用遺伝子発現を導くことを示す。本発明は、さらに、組み合わせの投与が処置した対象における治療有用性を改善すること、たとえば、生存及び体重増加の大幅な改善及び生殖能力の回復を示す。
【００５１】
本発明において、血液投与は、血流又は周辺組織への直接のベクターの末梢投与を意味する。この投与は、限定なしに、全身投与、たとえば、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）、腹腔内（i.p.）、動脈内、皮下又は経皮注射を含む。最適の血液投与は、i.v.、i.a.又はs.c.注射を含む。
【００５２】
さらなる血液送達の経路は（好ましくはないが）、皮内注射、経鼻送達、経皮送達（たとえばパッチ）、又は腸内送達（経口又は直腸）を含む。
【００５３】
血液投与は、従来の機器及びプロトコールを用いて行うことができる。たとえば、注射は、任意の利用可能なシリンジ、針、ポンプ、手術等を用いて行うことができる。
【００５４】
本発明において、ＣＳＦ内への投与は、ＣＳＦ又は周辺組織内への直接のベクターの投与を意味し、ＣＳＦ内へのウイルスベクターの放出を可能にする。脳脊髄液は、脳室を満たし、脳及び脊髄を囲んでいる。ＣＳＦは、脈絡叢によって本質的に製造される。研究は、ＣＳＦは、継続的に作られ、循環し、吸収されるという事実と調和して、成体ヒトにおけるＣＳＦの容量は、約１５０ｍｌであり、ＣＳＦの約５００ｍｌは、毎日作られることを示唆する。ＣＳＦは、最終的にクモ膜柔毛及び頭蓋内脈管副鼻洞（intracranial vascular sinuses）を介して血液内に流入する。
【００５５】
ＣＳＦ内に本発明のｔＡＡＶベクターを注射することによって、発明者は、驚くべきことに、ｔＡＡＶベクターが（脳、網膜及び脊髄を含む）ＣＮＳ及び末梢系（たとえば、末梢神経系、及び骨格筋及び心臓を含む末梢器官）に細胞を導入することができることを見出した。ＣＳＦ内へのｔＡＡＶ注射は、末梢投与単独に比べてより強い遺伝子発現及び臨床有用性さえ導くことができる。
【００５６】
本発明によるＣＳＦ投与は、具体的にはi.c.v.注射、くも膜下腔内（i.t.）注射、又は大槽内（i.c）注射を含む。好ましいＣＳＦ投与は、ＩＣＶ又はＩＴ注射を含む。最も好ましい投与は、少なくとも一つの側脳室（cerebral lateral ventricle）における注射を含む。
【００５７】
これに関して、本発明のウイルスベクターは、針、シリンジ、カニューレ、又はカテーテルのような適切な装置を用いて脳室領域（たとえば、ＣＳＦで満たされている側脳室の一方又は両方内への）内への注射によってＣＳＦに直接送達することができる。この投与は、技術的にそれ自体公知の脳神経外科技術を用いて行うことができる(Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000)。i.c.v.注射について、注射するウイルスベクター溶液の総容量は、典型的には、０．１〜５ｍｌである。
【００５８】
くも膜下腔内注射は、技術的にそれ自体公知の技術を用いて行うことができる。患者におけるi.t.注射において、ＡＡＶベクターを、臨床で日常的に行われる安全な手順である腰椎穿刺によってくも膜下腔内に投与することができ、ＣＳＦ周囲内へのウイルス粒子の放出を可能にする(Beutler AS, Curr Opin Mol Ther. 2005 Oct;7(5):431-9)。
【００５９】
ＣＮＳの特定領域に特異的なウイルスベクターの投与は、定位的マイクロインジェンクションによって行うことができる。この目的のために、脳の一つ以上のイメージを、たとえば、高解像度ＭＲＩを用いて作成することができ、得られたイメージを定位的マイクロインジェンクションを管理するコンピューターに移すことができる。必要であれば、ヒト脳内の特定構造を一般常識用いて同定することができる(たとえばThe Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply, 2nd ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela, 1999を参照)。
【００６０】
上に示したとおり、本発明は、ＣＳＦ及び血液内への組み合わせの投与に基づくウイルス介在遺伝子治療の方法にある。
【００６１】
本発明において、用語「組み合わせの」投与は、実質的な免疫干渉なしにインビボで組み合わせの効果を生じるための、十分に短いタイムフレーム内で二つのコンパートメントにおけるベクターの投与を意味する。より好ましくは、「組み合わせの」投与は、互いに７２時間未満内、好ましくは４８時間未満内、より好ましくは２４時間未満内、さらにより好ましくは互いに１時間未満内の哺乳動物のＣＳＦ及び血液内への投与を含む。組み合わせの投与は、最初にＣＳＦにおいて行い、次に血液において、又は逆に行うことができる。
【００６２】
好適実施態様において、組み合わせの投与は、実質的に同時注射、すなわち、両注射が実質的に同時か又は一方のすぐ後に行われる。
【００６３】
ウイルスベクターの用量及びＣＳＦ／血液比率は、当業者が疾患状態、対象、及び処置スケジュールに応じて、適合させることができる。ウイルスベクターは、典型的には、「治療有効」量、すなわち、疾患状態と関連する症状の少なくとも一つを緩和（たとえば、減少、縮小、ブロック、又はコレクト）するためにか又は対象の状態の改善を提供するために十分である量で投与する。有効用量は、生存を増加させるために十分な用量であることができる。典型的には、109〜1016の、好ましくは1010〜1015のウイルスベクターの総用量（すなわち、粒子又はウイルスゲノム）で用い、これは、それぞれ、ＣＳＦ／血液投与のために二つのユニタリー用量に、分けられている。実例の用量は、５×1010〜５×1010／ｋｇである。
【００６４】
これに関して、ＣＳＦ及び血液内に投与するウイルスベクターの相対量は、最適の臨床有用性を提供するために調整することができる。これに関して、発明者は、比率：ＣＳＦ内に投与する用量／血液内に投与する用量は、好ましくは０．２〜５、なおさらに好ましくは０．２〜３であるものとすることを示す。好ましい比率の具体例は、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０又は１．２５である。
【００６５】
処置は、単一の組み合わせの投与からなることができるか、又は反復することができる。投与を反復するとき、後続の投与は、単一（すなわち、ＣＳＦ又は血液から選択された一つの部位のみで）か又は組み合わせのいずれかであることができる。また、反復投与を行った場合、交互に、異なるウイルスセロタイプを好ましくは用いる。例として、最初の組み合わせの投与は、ＡＡＶ９ベクターを用いて行い、第二の投与をＡＡＶ１０ベクターを用いてか、又はその逆を行うことができる。
【００６６】
ウイルスベクターを、任意の適切な形態、溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射前に溶液又は液中の懸濁に適した固体形態として、ゲル又はエマルション、又はスプレーとして、投与することができる。ウイルスベクターを、典型的には、任意の適切かつ薬学的に許容可能な付形剤、担体、アジュバント、希釈剤等で製剤する。注射のためには、付形剤は液体、等張液、バッファー、たとえば、滅菌・パイロジェンフリー水又は滅菌・パイロジェンフリーリン酸緩衝生理食塩液であることができる。
【００６７】
特定の実施態様において、本発明は、疾患を処置するために有効な治療用遺伝子の投与による哺乳動物における多全身性疾患を処置するための方法であって、治療用遺伝子が、ＡＡＶ９又はＡＡＶ１０ベクターに含まれ、i.c.v./i.v.の用量比率が０．３〜３でのベクターの組み合わせのi.c.v.及びi.v.投与を含む、方法にある。
【００６８】
上に示したとおり、本発明は、神経系疾患、好ましくはＣＮＳ又は多全身性疾患を処置するために用いることができる。処置は、病態を緩和するため、具体的には生存、体重、生殖能力、運動機能、ＭＮの数又は筋肉サイズを改善するために用いることができる。
【００６９】
キット
本発明は、また、組成物及びキットにも関する。これに関して、本発明のさらなる目的は、治療用遺伝子を含む伝達性ウイルスベクターの二つのユニタリー用量、全身注射に適合させた一つのユニタリー用量、ＣＳＦ内への注射に適切な一つのユニタリー用量を含む組成物又はキットである。i.c.v.／全身用量比率は、好ましくは、０．３〜３であり、なおより好ましくは、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０又は１．２５から選択される。
【００７０】
本発明のキットは、各ユニタリーＣＳＦ及び血液用量を含む一つ以上の別々のコンテナーを一般的に含む。キットは、また、ここに記載された任意の方法のためのベクターの使用に関する、指示のセット、一般的には指示書も含む。キットは、また、アンプル、シリンジ、針等のような、ユニタリー用量の投与に適切な装置又はコンポーネントも含む。
【００７１】
運動神経障害
本発明は、治療産物の大量及び広範な送達によって種々の障害を処置するために用いることができる。治療産物は、疾患の原因又は症状を緩和又は減少させるか又は対象に利益を与えることができる、任意のタンパク質、ペプチド又はＲＮＡであることができる。治療タンパク質の例は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質、酵素、抗アポトーシス因子、血管新生因子、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）のような病理障害において突然変異していることが知られている任意のタンパク質を含む。治療ＲＮＡの例は、以下に記載の任意の疾患において治療目的を有するタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを標的にするアンチセンスＲＮＡ又はＲＮＡｉを含む。たとえば、スーパーオキシドジスムターゼ酵素を標的にするＲＮＡｉは、ＡＬＳの処置を考慮して、上で定義したとおりのＡＡＶベクターがコードすることができる。
【００７２】
治療産物の好ましい候補のリストを以下に示す：
SMN (SMA)
IGHMBP2 (SMA-RD)
VAPB (SMA or ALS)
SMN2 (SMA)のpre-mRNAスプライシング部位を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
SOD1(ALS)又はATX (Spinocerebellar ataxia)又はUBQLN2 (ALS)又はATAXIN2 (ALS)又はC9又はf72 (ALS)又はTARDBP (ALS)又はTDP-43、FUS、(ALS and FTD)のpre-mRNAスプライシング部位を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
SOD1 (ALS)又はATX (Spinocerebellar ataxia)又はUBQLN2 (ALS)又はATAXIN2 (ALS)又はC9orf72 (ALS又はfrontotemporal lobar degeneration [FTD])又はTARDBP (ALS)又はTDP-43 (ALS及びFTD)又はFUS、(ALS及びFTD)又はCHMP2B (ALS)のmRNAを標的にするshRNA(microRNA又はsiRNA)
ATX (Spinocerebellar ataxia)又はUBQLN2 (ALS)又はATAXIN2 (ALS)又はC9orf72 (ALS又はfrontotemporal lobar degeneration [FTD]) 又はTARDBP (ALS) 又はTDP-43又はFUS, (ALS及びFTD) 又はCHMP2B (ALS)
MECP2又はMECP2 (Rett syndrome)を標的にするshRNA
HEXB (Sandhoff disease)
【００７３】
治療産物に応じて、本発明を神経組織内に治療タンパク質を発現させること又は神経組織から毒タンパク質を抑制することによって処置又は阻止することができる任意の疾患を含む、種々の疾患を処置するために用いることができる。この疾患は、中枢又は末梢神経障害、好ましくは神経変性疾患、神経筋疾患、トラウマ、骨髄傷害、（神経障害性疼痛を含む）疼痛、神経系の癌、脱髄性疾患、神経系の自己免疫疾患、神経毒性症候群、又はリソソーム病又はペルオキシソーム病のような多全身性疾患から含まれる障害を含む。
【００７４】
疾患の具体例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、トゥーレット症候群、統合失調症、スライ症候群、ハンター病、痴呆、パラノイア、強迫性障害、精神遅滞、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、シャルコー・マリー・トゥース病、脊髄小脳失調、痙性対麻痺、ケネディー病、神経膠芽細胞腫、ニューロブラストーマ、自閉症、ゴーシェ病、ハーラー病、クラッベ病及び変化した挙動（たとえば、睡眠、知覚又は認知における障害）を含む。
【００７５】
本発明は、予防又は治療処置のために、成体を含む、任意の哺乳動物、特にヒト対象において用いることができる。
【００７６】
本発明のさらなる面及び利点は、本願の範囲を限定することなく、単に説明と見なされる、以下の実施例において開示される。
【００７７】
実施例
材料及び方法
動物
SMNdelta7マウスを(SMA type Iのモデルと考えられる) をJackson Laboratoryから購入した(SMN2+/+, SMNdelta7+/+, Smn-/-, JACKSON no. SN 5025)。これらのマウスはExon 2の標的突然変異によって外来性マウスＳｍｎ遺伝子を無効にされたトリプル突然変異体であり、二つのトランスジェニックアレル(ヒトSMN2 cDNA [exon 7を欠く]及び全ヒトSMN2遺伝子)を有する(Le T.T. Hum Mol Genet 2005)。野生型マウスは、[SMN2+/+, SMNdelta7+/+, Smn+/+]同腹子及び[SMN2+/+, SMNdelta7+/+, Smn+/-]同腹子にヘテロ接合性（Ht）に相当する。マウスを飼育し、自立コロニーを作り、そしてコントロールされた条件下で維持した(22±1℃, 60±10% 相対湿度、 12 h/12 h 明／暗サイクル、飼料及び水を自由に)。全ての動物実験を実験動物の世話と使用のための欧州ガイドラインにしたがって行った。
【００７８】
ｓｃＡＡＶベクターの製造
CMVプロモーターのコントロール下のGFP導入遺伝子又はホスホグリセラートキナーゼ(PGK)プロモーターのコントロール下のhSMN1 (SMNopti)のコドン最適化配列のいずれかを発現するAAV2プラスミドを用いて、若干改変して、以前に記載のとおり対応する偽型ＡＡＶ９ベクターを作った(Duque et al., Mol Ther 2009; Dominguez et al., Hum Mol Genet 2011)。簡略には、(i)アデノウイルスヘルパープラスミド、(ii) rep2及びcap9遺伝子をコードするＡＡＶパッケージングプラスミド(p5E18-VD2/9)及びGFP又はSMNoptiを発現するＡＡＶ２プラスミドを用いる、AAV9-SMNをHEK293細胞中のヘルパーウイルスフリー３プラスミドトランスフェクションによって作った。この組換えベクターをイオジキサノール密度勾配での超遠心によって精製した。ウイルス調製品を脱塩し、Amicon Ultra-Ultra cell 100 K フィルターユニット(Millipore)を用いて濃縮した。アリコートを使用まで−８０℃で保存した。ベクター力価をリアルタイムＰＣＲによって決定し、ミリリットル当たりのウイルスゲノムとして表した(vg/ml)。
【００７９】
インビボでのＡＡＶ注射
新生仔：
i.v.注射を眼の近くの側頭部静脈の血流中に33G針のハミルトンシリンジを用いて行った。i.c.v.注射を前1mm、ラムダまで横1mmそして深さ2mm、33G針のハミルトンシリンジを用いて行った。IV及びICV注射の両者を青色染料溶液を用いて確認した。
【００８０】
新生仔SMNdelta7マウス又はコントロールの野生型同腹子を誕生の日（P0）にウイルス溶液で注射した。単回のi.c.v注射について、AAV9-GFP (マウス当たり1.7 × 10e10 vg、7μl)又はAAV9-SMNopti (マウス当たり4.5 × 10e10 vg、7μl)を右側脳室内に片側性に注射した。単回のi.v.注射について、同じ濃度のベクターを70μl(PBS中)の容量で側頭静脈内に注射した。組み合わせのi.v.及びi.c.v.注射について、2.5x10e10vg (30μl)のAAV9-SMNoptiを側頭静脈内に注射し、そして2x10e10vg (3 μl)のAAV9-SMNoptiを右側脳室内に片側性に注射した。
【００８１】
新生Smn-/-SMN2+/+マウス及び野生型コントロール同腹子を同様の方法を用いて誕生時に注射した。AAV9-GFP及びAAV9-SMNoptiの単回のi.c.v.注射について、ベクター用量及び容量は、新生SMNdelta7マウスと同様であった。i.v.注射について、AAV9-GFP (マウス当たり1.2 × 10e11 vg)又はAAV9-SMNopti (マウス当たり3.4 × 10e11 vg)を50μl (PBS中)の容量で側頭静脈内に注射した。組み合わせのi.v.及びi.c.v.注射について、4.5x10e10vg (50μl)のAAV9-SMNoptiを側頭静脈内に注射し、そして4.5x10e10vg (7 μl)のAAV9-SMNoptiを右側脳室内に片側性に注射した。
【００８２】
成体
１月齢野生型マウス(n=4)を右側脳室内にscAAV9-GFP (4.8 × 10e10 vg, 20 μl)を注射した。注射を腹膜内麻酔下でおこなった(ケタミン(100mg/Kg)、キシラジン(10mg/kg))。
定位的注射を左側脳室内に直接行った(後ろ0.34 mm、十字縫合まで横1.0 mm及び脳の頂点から深さ1.8 mm)。
【００８３】
組織学
マウスを、それぞれ、ＳＭＮ及びＧＦＰ発現分析のために注射１５日及び１月後に安楽死させた。マウスを安楽死させ(10 mg/kgキシラジン、100 mg/kgケタミン)、0.1 mol/l PBS、次いで、PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)で心臓内で還流した。筋をPBS還流のみの後に凍結した（P15新生仔を除く）。組織を除去し、同じPBS-4% PFA溶液中で24時間インキュベーションすることによってポストフィックスした。次いで、これを、冷イソペンタン（-50℃）中で凍結する前に、脳及び非神経器官についてPBS-15%ショ糖溶液中、脊髄についてPBS-30%ショ糖溶液中４℃で少なくとも24時間インキュベーションした。連続切片をクリオスタットで切り出し、さらなる分析のために-80℃で保存した(脳について16μm切片; 脊髄及び心臓について14μm; 脾臓及び腎臓について12μm; 肝臓について10μm; 筋肉について8μm)。
【００８４】
免疫染色分析
AAV9-GFP注射マウスからの組織におけるGFPの免疫組織化学検出のために、切片を最初にPBS Triton X-100 0.1%中で洗浄し、次いで、過酸化水素1%、メタノール20%及びTriton X-100 0.1%と一緒にPBSバッファー溶液(又は過酸化水素溶液[Peroxidase Blocking Solution; Dako, Trappes, France])で20分間インキュベーションし、内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片を4%ヒツジ血清(Dako)、4%ウシ血清アルブミン(Sigma)及び0.1%Triton X-100でPBSバッファー中室温で1時間ブロックした。次いで、切片をウサギポリクローナル抗GFP(1/5000; Abcam)で一晩インキュベーションした。リンスの後、切片を西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）ビオチン化抗ウサギ抗体(1/250; Vectastain, Vector Laboratories)で２時間、次いで、アビジン−ビオチン複合体(Vectastain Elite ABC kit, Vector Laboratories)で30分間インキュベーションした。0.1% PBS Triton X-100でのリンスの後、ジアミノベンジジン（DAB）染色をVector Laboratoriesからのペルオキダーゼ3.3'-DAB基質キットで明らかにした。反応を水で止め、切片をオイキットでマウントする前にアルコールとキシレンで脱水した。
【００８５】
ダブルNeuN/GFP免疫蛍光分析のために、凍結切片をPBS中の5%のウシ血清アルブミン(Sigma)、3%のロバ血清(Millipore)及び0.4% Triton X-100での1時間、次いでウサギポリクローナル抗GF抗体(1:2000; Abcam)で一晩のインキュベーションによってブロックした。切片をPBSで洗浄し、次いでAlexa 488コンジュゲートロバ抗ウサギIgG (1:500; Invitrogen)で室温で1時間インキュベーションした。切片をPBS中で洗浄し、キットMOMプロトコールにしたがってブロックした。次に、切片をマウス抗NeuN抗体(1/300; MAB377, Chemicon International)で一晩ブロックした。切片をPBS中で洗浄し、次いで、Alexa 594コンジュゲートロバ抗マウスIgG (1:500; Invitrogen)で室温で1時間インキュベーションした。切片をPBS中で洗浄し、fluoromount-G (Calbiochem)でマウントし、共焦点顕微鏡(Axio Imager Z1, Zeiss)及びAxioVision 4.7ソフトウェア(Zeiss)による観察の前に4℃で保存した。
【００８６】
ウェスタンブロット分析
タンパク質抽出液を14日齢の未処置SMNdelta7マウス(n=3)、AAV9-SMNopti処置SMNdelta7マウス(n=3)及びWTマウス(n=3)から、そして1及び2月齢のAAV9-GFP注射又は非注射WTマウスからの脳、脊髄、心臓、肝臓、腎臓及び脾臓から調製した。組織抽出物を製造者のプロトコール(Qiagen)にしたがってQproteome FFPE 組織キットを用いて調製した。筋肉を、プロテアーゼインヒビターカクテル(Complete Mini, Roche Diagnostics)を添加したRIPAEバッファー(150 mm NaCl、50 mm Tris-HCl、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1% NP40、1% SDS)中で溶解した。85又は（肝臓について）70μgの全タンパク質をSDS10%ポリアクリルアミドゲルに流し、Immobilon-pメンブラン(Millipore)に移した。このメンブランをTBSTブロッキングバッファー(5%脱脂粉乳を添加した0.2% Tween 20を含むTris-buffered saline)で希釈した、ウサギ抗GFP抗体(1:2000; AbCam)又はマウス抗SMN抗体(1:1000; BD transduction)及びマウス抗αチューブリン(1:10000; Sigma)で連続的にインキュベーションした。TBSTバッファー中での４回の洗浄後に、メンブランをブロッキングバッファーで希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウス又は抗ウサギ抗体(GE Healthcare, 1:10 000)でインキュベーションした。メンブランを化学蛍光Super Signal Ultra試薬(Pierce)を用いてさらに処理した。
【００８７】
SMAマウスSMNdelta7への組み合わせのＡＡＶ投与のプロトコール
ベクター: AAV9-PGK-SMN (CsCl勾配精製)
力価: 6,7x10e12vg/ml
SMAマウス: SMNdelta7 (軽症SMA, SMA type 2モデル)
生存中央値  13.6日(最大平均余命18日)
用量
ICV (n=10): マウス当たり4.5x10e10vg
IV (n=10): マウス当たり4.5x10e10vg
ICV+IV (n=9): 2.5x10e10vg IV + 2x10e10vg ICV
【００８８】
SMAマウスsmn-/-への組み合わせのＡＡＶ投与のプロトコール
ベクター: AAV9-PGK-SMN (CsCl勾配精製)
力価: 6.7x10e12vg/ml
SMAマウスモデル: [Smn-/- ; hSmn1 +/+] (≪ KO ≫) (重度SMA, SMA type 1モデル)
生存中央値3.6日(最大平均余命6日)
用量
KO ICV (n=7): マウス当たり4,7.1010 vg (7μl)
KO IV (n=4): マウス当たり3,35.1011vg (50μl)
KO ICV+IV (n=4): (4,7.1010 vg ICV + 4,7.1010 vg IV) , マウス当たり全9,4.1010 vg
【００８９】
結果
・  i.c.v.対i.v.AAV9-SMNopti注射SMNΔ7マウスの生存及び表現型
我々は、翻訳効率及び導入遺伝子(AAV9-SMN)発現を改善するために、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターのコントロール下でヒトコドン最適化されたヒトSMN1遺伝子を発現し、PBKプロモーターのとSMN1 cDNAの間にキメライントロンを含む最適化scAAV9ベクターを用いた(Dominguez, Hum. Mol. Genet. 2011)。
【００９０】
２５匹のSMNΔ7マウスに、側頭静脈(70μl, n=13)、側脳室(7μl, n=13)のいずれか又は両部位 (2.5x1010vg i.v. in 30μl; 2.5x1010vg i.c.v. in 3μl, n=9)に、AAV9-SMNoptiベクター(マウス当たり4.5x1010vg、3x1013vg vg/kg)をP0で注射した。コントロールは、非注射SMNΔ7(n=14)又はヘテロ(n=14)同腹子マウスである。
【００９１】
動物の表現型の特徴は、生存、体重、末梢壊死、全体の一般的外観の毎日分析、及び70日齢での運動活性のモニタリングを含む。全てのAAV9-SMN注射SMNΔ7マウスは、非注射マウスの最大寿命(18日)を超えて生存した。しかし、i.c.v. AAV9-SMNoptiによって得られた治療の利点は、i.v.処置のそれをしのいだ（図１）。実際に、脳室内に投与した同一用量のAAV9-SMNoptiは、i.v.に比べて35日まで運動性の発症を遅延させた（60対25日）。マウスをAAV9-SMNoptiでi.c.v.注射したとき、i.v.注射マウスと比べて、生存中央値は、有意に増加した(i.c.v.及びi.v.について、それぞれ、非注射マウスの11.5から、163日及び73日)。我々のi.v.注射群における最長生存マウスは、今まで327日齢であり、我々の最後のi.c.v.注射マウスは286日例で死亡した。
【００９２】
・  i.c.v.対i.v. AAV9-SMNopti注射SMNΔ7マウスの体重減少表現型の改善
i.v.及びi.c.v. AAV9-SMN注射マウスの両者は、試験期間を通じて体重を増加させ、それらの体重は、14日(疾患の末期)での非注射SMNΔ7マウスのそれに比べて有意に高かった(i.v.及びi.c.v.について、それぞれ、非注射マウスの3.1gに対して4.7g及び5.5gの平均体重)(図2)。注射の６週間後に、i.c.v.注射マウスの平均体重は、ヘテロマウスのそれに近かったが、対照的に、i.v.注射マウスは有意に小さかった(i.v.及びi.c.v.注射マウスの体重が、ヘテロマウスの18.3±0.6に対して、それぞれ、11.0±1.3及び16.3±1.2であった。)。
【００９３】
・  P0でのICV scAAV9-PGK-SMN注射後のSMNdelta7マウスの中枢神経系におけるSMNの発現
ウェスタンブロット分析は、ICV注射SMNdelta7マウス(n=3)におけるSMNの脳及び脊髄発現が、非注射SMNdelta7 (n=2)、及びさらに野生型動物(n=2)に比べて有意に高かったことを立証した（図3A）。i.c.v.注射マウスのCNSにおけるSMN発現レベルの増加は、同濃度のベクターのi.v.注射後(P0での, 側頭静脈における)に以前に報告されたそれよりも優れていた(Duque et al., Mol. Ther. 2009)。i.c.v.注射によって誘発される高CNS発現を、GFPコードscAAV9ベクターでi.c.v.注射したマウスの脳及び脊髄におけるGFP陽性アストログリア及び神経細胞の数の存在によって確認した(図3B)。これは、CNSにおけるSMN発現が、SMA病理からSMNdelta7マウスを救うために十分であることができることを示唆する。
【００９４】
・  P0でのICV scAAV9-PGK-SMN注射後のSMNdelta7マウスの末梢器官におけるSMNの発現
予想外にも、SMNの発現が、P0でのscAAV9-PGK-SMNのi.c.v.送達後に末梢器官において検出された。
具体的には、SMNタンパク質がICV注射SMNdelta7マウス(n=3)の心臓、腎臓及び肝臓において見出された(図4A)。これらの結果は、GFPコードscAAV9ベクターで同一条件において注射されたマウスにおけるGFP免疫蛍光分析によって確認された(図4B)。
【００９５】
・  P0 SMNdelta7マウスにおけるscAAV9-PGK-SMNoptiのICV/IV同時注射後の生存率
ICV/IV注射マウスの100%が、注射50日後でもまだ生存した(IV後40%(図5)。しかし、ICVとIV/ICV群間の生存における差を検出するにはまだ早すぎる。
【００９６】
・  P0 SMNdelta7マウスにおけるscAAV9-PGK-SMNoptiのICV/IV同時注射後のSMNdelta7マウスの体重
ICV/IV同時注射SMNdelta7マウスの体重減少表現型は、IV又はICV注射SMNdelta7マウスのそれに比べて改善された(Ht:コントロールヘテロマウス; NI:非注射SMNdelta7マウス(図6)。
【００９７】
・  P0重度SMAマウスにおけるscAAV9-PGK-SMNoptiのICV/IV同時注射後の生存率
AAV9-SMN注射マウス平均生存は、ICV (8.1 ± 2, n=7)又はIV (9 ± 2.7, n=4)注射のいずれかの後で、非注射マウスのそれに比べて増加した(3.7 ± 0.4, n=14) (図7)。しかし、IV/ICVマウスの寿命中央値(17日)は、IV(12日)注射又はICV(9日)のみ注射マウスのそれに比べて優れていた。組み合わせのIV/ICV注射の治療効果は、重度SMAマウスの個体間変動性(ICVの平均生存27 ± 13日)のために、変動した(7〜60日を超えて)。４匹中の１匹は、組み合わせのIV/ICV群においてまだ生きている(注射後60を超えて)。
【００９８】
さらに、ICV/IV同時注射KOマウスの体重減少表現型は、IV又はICV注射SMNdelta7マウスのそれに比べて改善される(Hz: コントロールヘテロマウス; KO: 非注射重度SMAマウス; WT: 野生型マウス) (図8)。
【００９９】
ICV、IV、又はCo-IV/ICV scAAV9-PGK-SMN注射SMNdelta7マウスにおけるSMN発現の比較
図９は、SMNレベルがICV単独注射マウスと比べてCo-ICV/IV注射マウスにおいて減少していることを示す。SMN陽性細胞の数及び染色強度もICV単独注射マウスと比べてCo-ICV/IV注射マウスにおいて減少した。
【０１００】
処置したSMAマウスにおける生殖能力の回復
明らかな利点がIV注射マウスに比べて回復された生殖能力がICV又はICV/IV注射後のSMNdelta7雌マウスにおいて観察された(図10)。100%の雌がICV/IV及びICV処理群において繁殖性であったが、対照的に、IV処理マウスでは、生殖することはできなかった。
【０１０１】
野生型マウス及びCo-ICV/IV AAV10-hSMNopti注射hSMN2マウスの生存及び体重表現型の比較
Co-ICV/IV AAV10 注射マウスの体重減少表現型と生存が、特に209及び36日齢の２匹のマウスにおいて、非処理マウスに比べて相当に改善した(図11)。非処理マウスは、決して６日齢を超えなかった(生存中央≒3日)。
【０１０２】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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