(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）をコードする真核生物発現カセットを含む少なくとも１コピーの組換えDNA分子を含むサルモネラ・チフィTy21aの弱毒化変異株。
【請求項２】
前記WT1は、ヒトWT1および該ヒトWT1と少なくとも90%の配列同一性を有するタンパク質から成る群より選択される、請求項１に記載のサルモネラ・チフィTy21aの弱毒化変異株。
【請求項３】
前記WT1は短縮WT1であり、ここで、前記WT1のジンクフィンガードメインは欠失している、請求項１又は２に記載のサルモネラ・チフィTy21aの弱毒化変異株。
【請求項４】
前記短縮WT1は、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のサルモネラ・チフィTy21aの弱毒化変異株。
【請求項５】
前記組換えDNA分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、pMB1 ori、および、ヒトWT1または該ヒトWT1と少なくとも90%の配列同一性を有するタンパク質をコードする真核生物発現カセットを、CMVプロモーターの制御下で含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のサルモネラ・チフィTy21aの弱毒化変異株。
【請求項６】
癌免疫療法において使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のサルモネラ・チフィTy21aの弱毒化変異株を含む、医薬組成物。
【請求項７】
前記癌免疫療法は、腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含む少なくとも１コピーの組換えDNA分子を含む１つまたは複数の更なるサルモネラ・チフィTy21aの弱毒化変異株を投与することを更に含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記サルモネラ・チフィTy21aの弱毒化変異株は、前記１つまたは複数の更なるサルモネラ・チフィTy21aの弱毒化変異株と共に同時投与される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記癌免疫療法は、化学療法、放射線療法、または生物学的癌療法を伴う、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記サルモネラ・チフィTy21aの弱毒化変異株は、経口的に投与される、請求項６〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記癌は、白血病及び固形腫瘍から選択される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記白血病は、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記固形腫瘍は、肺癌、乳癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、胆管癌、膵臓癌、グリア芽腫、頭頸部癌、滑膜肉腫、血管肉腫、骨肉腫、甲状腺癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、および前立腺癌、から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
１回分の用量に、約１０５〜約１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
患者の腫瘍抗原発現パターンおよび／または間質抗原発現パターンを評価する工程を含み、個別化した（individualized）癌免疫療法のための、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルムス腫瘍タンパク質１をコードする組換えDNA分子を含むサルモネラの弱毒化変異株に関する。本発明は、特に癌免疫療法における前記サルモネラの弱毒化変異株の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルムス腫瘍遺伝子１（WT1）は、細胞の増殖および分化に関与するジンクフィンガー転写因子をコードする。WT1は、いくつかの種類の血液悪性腫瘍および種々の固形腫瘍を含む多種多様の悪性腫瘍において高度に発現される。対照的に、成人でのWT1の正常な組織における発現は、生殖腺、子宮、腎臓、中皮、および各種組織におけるＣＤ３４＋前駆細胞に限られる。WT1は、もともと腫瘍抑制遺伝子として提唱された。しかし、より最近の証拠によると、この転写因子の発癌性機能、つまり、WT1が分化に負に影響し、前駆細胞の増殖を促進することが指摘されている。さらに、過剰発現したWT1は、免疫原性である、つまりWT1特異的Ｔ細胞ならびにＩｇＧ型抗WT1抗体が癌患者において観察される。したがって、WT1は、癌ワクチンの開発に有望な候補である。
【０００３】
HLA（ヒト白血球抗原）制限WT1ペプチド断片ベースのWT1ワクチンを用いたヒト臨床試験について報告されている。Osada et al., Clin Cancer Res 2009;15:2789-2796では、WT1をコードするアデノウイルスワクチンが開示されている。
【０００４】
本発明者が知る限り、WT1を標的とする生細菌性癌ワクチンについての報告はない。また、WT1を標的とする経口癌ワクチンの記載もされていない。
【０００５】
サルモネラ・エンテリカの弱毒化誘導体は、哺乳動物の免疫系へ異種抗原を送達するための魅力的な媒体となる。というのは、S.エンテリカ株は、免疫の粘膜経路を介して、つまり経口または経鼻的に、送達され得るからである。これにより、非経口投与に比べ簡便かつ安全という利点がもたらされる。さらに、サルモネラ株は、全身および粘膜の両方のレベルで強い体液性および細胞性の免疫応答を誘発する。バッチ製造コストは比較的低く、そして生細菌性ワクチンの製剤は非常に安定している。弱毒化は、病原性遺伝子、調節遺伝子、および代謝遺伝子を含む種々の遺伝子の欠失により達成できる。
【０００６】
アロ変異によって弱毒化したいくつかのサルモネラ・チフィリウム株は、動物モデルにおける異種抗原の安全かつ効果的な送達媒体であることが示されている。
【０００７】
生弱毒化サルモネラ・チフィリウム株を介して、抗原、特にVEGF受容体タンパク質、をコードするDNA構築物をマウス標的細胞へ送達するアプローチについては、国際出願WO 03/073995号に記載されている。Niethammer et al., (Nature Medicine 2002, 8(12), 1369）は、腫瘍血管新生のために不可欠であるマウス血管内皮成長因子受容体２（VEGFR-2またはFLK-1）をコードする発現ベクターを保有する弱毒化S.チフィリウムのaroA SL7207株は、癌ワクチンとして機能することを実証した。
【０００８】
しかし、ヒトでの使用が許可されている弱毒化サルモネラ・エンテリカ血清型株はたったの１つしかない、すなわち、サルモネラ・エンテリカ血清型チフス菌Ty21a（S.チフィTy21aと省略）でありVivotif（登録商標）の商品名で流通しているものである（Berna Biotech Ltd., a Crucell Company、スイス国；販売許可番号PL 15747/0001、1996年12月16日付）。
【０００９】
この良好な忍容性を有する、腸チフスに対する経口生ワクチンは、野生型病原性細菌分離株S.チフィTy2の化学的突然変異誘発により得られ、galE遺伝子における機能喪失型変異、並びに他のあまり定義されていない変異を保有する。これは、フィールド試験で有効かつ安全であることが示された後、多くの国で腸チフスワクチンとして認可されている。
【００１０】
WT1は、癌ワクチンの開発のために有望な腫瘍抗原である。従前から利用可能なWT1ペプチドワクチンの大きな制限事項は、HLA制限および非経口投与である。WT1を標的とすることに基づく癌治療アプローチの改善に対する大きな必要性が、未だ満たされていない。
【００１１】
本発明の目的は、従来技術に対し新規な、WT1を標的とする経口癌ワクチンを提供することである。このようなWT1を標的とする癌ワクチンは、癌患者にとって治療の選択肢を向上するのに大きな利点をもたらすであろう。
【発明の概要】
【００１２】
一態様では、本発明は、ウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）をコードする発現カセットを含む少なくとも１コピーの組換えDNA分子を含むサルモネラの弱毒化変異株に関する。
【００１３】
本発明の弱毒化サルモネラ株は、マウス白血病細胞でチャレンジしたマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を示すことが示された。本発明者の知る限り、この新規な弱毒化サルモネラ株は、WT1を標的とする初の生細菌性癌ワクチンである。また、本発明の弱毒化サルモネラ株は、WT1を標的とする初の経口癌ワクチンである。WT1は、多種多様な血液悪性腫瘍および固形腫瘍で過剰発現されているので、本発明の弱毒化サルモネラ株は、汎用性のある癌ワクチンとして大きな可能性を有する。
【００１４】
初回の試験で、本発明に係るワクチン（VXM06）は、腹腔内に移植した白血病細胞を有するマウスの生存を効率的に延長することが実証された。これらの結果により、VXM06のワクチン投与は、WT1を過剰発現する腫瘍細胞に対する免疫応答および免疫記憶の発達につながる可能性があることが示される。新規ワクチンVXM06は、比較的低用量で効果的であることは注目に値しかつ驚くべきことである。本発明の弱毒化サルモネラ変異株は、単剤療法または第二の腫瘍抗原をコードするDNA分子を含む第二のサルモネラの弱毒化変異株と組み合わせて適用できる。また、本発明の弱毒化変異株は、化学療法、放射線療法、または生物学的癌療法と組み合わせて投与してもよい。患者が化学療法に対する耐性を獲得している場合（化学療法不応性の患者）も、VXM06を用いる治療が効果的であり得る。本発明の新規弱毒化サルモネラ株は、したがって、新規かつ大幅に改善した癌治療アプローチに有用であり得る。
【００１５】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、サルモネラ・エンテリカ種である。特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、サルモネラ・チフィTy21aである。
【００１６】
特定の実施形態では、発現カセットは、真核生物発現カセットである。
【００１７】
特定の実施形態では、WT1は、ヒトWT1および該ヒトWT1と少なくとも約80%の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。
【００１８】
特定の実施形態では、WT1は短縮されている（truncated）。特定の実施形態では、WT1のジンクフィンガードメインが欠失している。特定の実施形態では、短縮WT1は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００１９】
特定の実施形態では、組換えDNA分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、pMB1 ori、および、ヒトWT1または該ヒトWT1と少なくとも約80%の配列同一性を有するタンパク質、特に短縮ヒトWT1、をコードする真核生物発現カセットを、CMVプロモーターの制御下で含む。特定の実施形態では、組換えDNA分子は、pVAX10.hWT1と命名されるプラスミドであり、配列番号２の核酸酸配列を有する。
【００２０】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、医薬として使用するためのものである。
【００２１】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、ワクチンとして使用するためのものである。
【００２２】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、癌免疫療法において使用するためのものである。
【００２３】
特定の実施形態では、癌免疫療法は、腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含む少なくとも１コピーの組換えDNA分子を含む１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒化変異株を投与することを更に含む。特定の実施形態では、前記１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒化変異株は、真核生物発現カセットを含むサルモネラ・チフィTy21aである。特定の実施形態では、前記１つまたは複数の更なるサルモネラの株は、ヒトVEGFR-2をコードするサルモネラの弱毒化変異株を含む。
【００２４】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、前記１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒化変異株と共に同時投与される。
【００２５】
特定の実施形態では、癌免疫療法は、化学療法、放射線療法、または生物学的癌療法を伴う。
【００２６】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、化学療法または放射線療法の治療サイクルの間(during)、または生物学的癌療法の間(during)に投与される。
【００２７】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、化学療法または放射線療法の治療サイクルの前、または生物学的癌療法の前に投与される。
【００２８】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、化学療法または放射線療法の治療サイクルの後、または生物学的癌療法の後に投与される。
【００２９】
更なる実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、化学療法、放射線療法の治療サイクル、および生物学的癌療法のうち少なくとも１つの前およびその間（before and during）に投与される。化学療法、放射線療法、および生物学的癌療法のうち複数の療法を行う場合、サルモネラの弱毒化変異株は、これら複数の療法のうち少なくとも１つの療法の前または該療法の間、特にこれら複数の療法のうち少なくとも２つの療法の間に投与されてもよい。
【００３０】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、経口的に投与される。
【００３１】
特定の実施形態では、癌は、白血病、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、並びに固形腫瘍、特に、肺癌、乳癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、胆管癌、膵臓癌、グリア芽腫、頭頸部癌、滑膜肉腫、血管肉腫、骨肉腫、甲状腺癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、前立腺癌から、選択される。
【００３２】
特定の実施形態では、１回分の用量は、約１０５〜約１０１１、具体的には約１０６〜約１０１０、より具体的には約１０６〜約１０９、更に具体的には約１０６〜約１０８、最も具体的には、約１０６〜約１０７コロニー形成単位（ＣＦＵ）である。
【００３３】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、患者の腫瘍抗原発現パターンおよび／または間質抗原発現パターンを評価する工程を含み、個人用の（personalized）癌免疫療法に使用するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、プラスミドpVAX10.hWT1に含まれるWT1 cDNAによりコードされる短縮ヒトWT1のアミノ酸配列である。
【００３５】
【図２】図２は、pVAX10.hWT1の核酸配列である。
【００３６】
【図３】図３は、pVAX10.hWT1のプラスミドマップである。
【００３７】
【図４】図４は、VXM0m_empty、VXM06m、VXM06で処理したFBL-3白血病を有するマウスのKaplan-Meier生存曲線である。
【００３８】
【図５】図５は、VXM0m_empty、VXM06m、VXM06で処理したFBL-3白血病を有するマウスの平均生存日数である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、以下の発明の詳細な説明およびそこに含まれる実施例を参照することによってより容易に理解し得る。
【００４０】
一態様では、本発明は、ウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）をコードする発現カセットを含む少なくとも１コピーの組換えDNA分子を含むサルモネラの弱毒化変異株に関する。
【００４１】
本発明によれば、弱毒化サルモネラ株は、ウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）をコードする発現カセットを含む組換えDNA分の細菌キャリアとして、該組換えDNA分子を標的細胞内へ送達するように機能する。
【００４２】
本発明の文脈において、用語「弱毒化」は、弱毒化変異を有することなく（not harboring the attenuating mutation）、親菌株と比較して病原性が減少した細菌株を指す。弱毒化細菌性株は、好ましくは、元の病原性を失ったが、防御免疫を誘発する能力は保持している。弱毒化は、病原性遺伝子、調節遺伝子、および代謝遺伝子を含む種々の遺伝子の欠失により達成できる。弱毒化細菌は、天然に見出され得る、あるいは例えば新しい培地又は細胞培養物に適用することによって実験室で人為的に作製され得る、あるいは組換えDNA技術によって作製され得る。
【００４３】
本発明の文脈において、用語「変異株」とは、自身のゲノムに変異を有する細菌株を指す。この文脈において、用語「変異」は、点突然変異、挿入、欠失、転座、および逆位を含む核酸配列の変化を指す。
【００４４】
本発明の文脈において、用語「含む（comprises）」または「含む（comprising）」とは、「包含するがこれに限定されない（including, but not limited to）」という意味である。この用語は、言及する任意の特徴、要素、数、工程、または構成要素の存在を特定するのに、オープンエンドであることを意図するが、１つ以上の他の特徴、要素、数、工程、構成要素、またはそれらの存在または追加を排除しない。従って、用語「含む（comprising）」は、より制限的な用語「から成る（consisting of）」および「から本質的になる（essentially consisting of）」をも包含する。一実施形態では、本願、特に特許請求の範囲において使用される用語「含む（comprising）」は、用語「から成る（consisting of）」に置き換えられ得る。
【００４５】
本発明の文脈において、用語「組換えDNA分子」は、改変したDNA構築物を指し、好ましくは、異なる起源のDNA断片から成る。組換えDNA分子は、直鎖状核酸、または好ましくは、発現ベクタープラスミドにWT1をコードするオープンリーディングフレームを導入することによって生成された環状組換えDNAプラスミドであり得る。
【００４６】
本発明の文脈において、用語「発現カセット」は、少なくともWT1遺伝子をその発現を制御する調節配列の制御下で含む核酸単位を指す。サルモネラの弱毒化変異体株に含まれる発現カセットは、好ましくは、標的細胞においてWT1をコードするオープンリーディングフレームの転写を媒介し得る。発現カセットは、典型的には、プロモーター、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム、および転写終結シグナルを含む。
【００４７】
ジンクフィンガー転写因子ウィルムス腫瘍タンパク質１は、WT1遺伝子によってコードされる。このタンパク質は、Ｃ末端に４つのジンクフィンガーモチーフ、そしてＮ末端にプロリン／グルタミンリッチDNA結合ドメインを含む。２つのコーディングエクソンにおいて選択的スプライシングから生じる複数の転写変異体（transcript variants）の特徴づけはよくされている。WT1は、泌尿生殖器系の発達において重要な役割を果たし、細胞の増殖および分化に関与する。WT1遺伝子は、小児腎腫瘍であるウィルムス腫瘍の原因となる遺伝子として単離された。WT1は、いくつかの種類の血液悪性腫瘍および種々の固形腫瘍を含む多種多様の悪性腫瘍において高度に発現される。対照的に、成人でのWT1の正常な組織における発現は、生殖腺、子宮、腎臓、中皮、および各種組織における前駆細胞に限定される。その発現プロファイル、発癌性機能、および免疫原性のため、腫瘍抗原WT1は、癌ワクチンの開発に有望な候補である。
【００４８】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、サルモネラ・エンテリカ種である。特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、サルモネラ・チフィTy21aである。弱毒化S.チフィTy21a株は、Typhoral L（登録商標）（Vivotif（登録商標）としても知られるBerna Biotech Ltd., Crucell Company、スイス国によって販売）の有効成分である。これは、腸チフスに対し現在認可されている唯一の経口生ワクチンである。このワクチンは広範に検査済みであり、患者に対する毒性並びに第三者への感染について安全であることが証明されている（Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295）。このワクチンは、４０カ国超で承認されている。Typhoral L（登録商標）の販売許可番号は、PL 15747/0001である（1996年12月16日付）。ワクチンの１回分の用量に、少なくとも２ｘ１０９コロニー形成単位の生（viable）S.チフィTy21a、および少なくとも５ｘ１０９個の非生（non-viable）S.チフィTy21a細胞が含まれる。
【００４９】
サルモネラ・チフィTy21a細菌株の生化学的特性の一つは、ガラクトースを代謝できないことである。また、この弱毒細菌株は、サルフェート（sulfate）からスルフィド（sulfide）に還元できず、これにより野生型サルモネラ・チフィTy2株と区別される。その血清学的特性に関しては、サルモネラ・チフィTy21a株は、細菌の外膜の多糖類であるＯ９抗原を含み、一方サルモネラ・チフィリウムの特徴的な成分であるＯ５抗原を欠く。この血清学的特性は、バッチリリース用の同一性試験のパネルにおける各検査を含む理論的根拠の裏づけとなる。
【００５０】
特定の実施形態では、発現カセットは、真核生物発現カセットである。本発明の文脈において、用語「真核生物発現カセット」とは、真核細胞におけるオープンリーディングフレームの発現を可能にする発現カセットを指す。異種抗原の量が十分な免疫応答を誘発するのに必要な量だと、細菌に対して毒性であり得るので、細胞死、異種抗原の過剰な弱毒化や発現の喪失を生じ得ることが示されている。細菌ベクター中では発現されず、標的細胞内でのみ発現される真核生物発現カセットを使用すると、この毒性についての問題を克服することができ、発現されたタンパク質は、真核生物のグリコシル化パターンを示し得る。
【００５１】
真核生物発現カセットは、真核細胞内のオープンリーディングフレームの発現を制御可能な調節配列、好ましくはプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む。本発明のサルモネラの弱毒化変異株に含まれる組換えDNA分子に包含されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、好ましくは、免疫化されるべき対象の細胞内で機能的であるように選択される。特にヒト用のDNAワクチンの製造に適切なプロモーターとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：サイトメガロウイルス（CMV）由来のプロモーター、例えば、強力なCMV即時初期プロモーター；サルウイルス４０（SV40）、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、例えば、HIVの長い末端反復（LTR）プロモーター、モロニーウイルス、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）由来のプロモーター；並びに、ヒト遺伝子、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、及びヒトメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター。特定の実施形態において、真核生物発現カセットは、CMVプロモーターを含む。本発明の文脈において、用語「CMVプロモーター」は、強力な即時初期サイトメガロウイルスプロモーターを指す。
【００５２】
特にヒト用のDNAワクチンの製造に適切なポリアデニル化シグナルとしては、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化部位、SV40ポリアデニル化シグナル、およびLTRポリアデニル化シグナルが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、本発明のサルモネラの弱毒化変異体株に含まれる組換えDNA分子に包含される真核生物発現カセットは、BGHポリアデニル化部位を含む。
【００５３】
プロモーターおよびポリアデニル化シグナルのような異種WT1遺伝子の発現に必要な調節因子に加えて、他の因子も組換えDNA分子に含めることができる。このような追加的な因子としてはエンハンサーが挙げられる。エンハンサーとしては、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンのエンハンサー、およびCMV、RSV、およびEBV由来のウイルスエンハンサー等が挙げられる。
【００５４】
調節配列及びコドンは、一般的に種に依存するので、タンパク質の産生を最大にするように、調節配列及びコドンは、好ましくは、免疫対象の種において有効であるように選択される。当業者は、所与の対象種において機能的な組換えDNA分子を作成できる。
【００５５】
特定の実施形態では、WT1は、ヒトWT1および該ヒトWT1と少なくとも約80%の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。
【００５６】
この文脈において、「約（about）」または「約（approximately）」という用語は、特定の値または範囲の80%〜120%以内、あるいは、90%〜110%以内（95%〜105%以内を含む）にあることを意味する。
【００５７】
本発明の文脈において、用語「ヒトWT1と少なくとも約80%の配列同一性を有するタンパク質」は、ヒトWT1のアミノ酸配列および／または該アミノ酸をコードする核酸配列が異なるタンパク質を指す。このタンパク質は、天然由来、例えば、異種のWT1のホモログであってもよく、あるいは改変タンパク質、例えば、改変WT1誘導体であってもよい。コドンの使用頻度は、種間で異なることが知られている。したがって、標的細胞において異種タンパク質を発現させる際に、核酸配列をその標的細胞のコドン使用頻度に適合させることが必要または少なくとも役立つことがあり得る。所与のタンパク質の誘導体を設計および構築する方法は当業者によく知られている。
【００５８】
ヒトWT1と少なくとも約80%の配列同一性を有するタンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む１つまたは複数の変異を含み得る。本発明の教示によれば、上述の欠失、付加、および／または置換アミノ酸は、連続したアミノ酸であってもよく、あるいは、ヒトWT1と少なくとも約80%の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列の全長にわたり散在していてもよい。本発明の教示によれば、ヒトWT1との配列同一性が少なくとも約80%である限り、任意の数のアミノ酸が、付加、欠失、および／または置換され得る。特定の実施形態では、ヒトWT1との配列同一性は、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、あるいは更に具体的には、少なくとも約95%である。親タンパク質と、親配列に対し欠失、付加、および／または置換を有するその誘導体との比較を含む配列同一性を決定するための方法およびアルゴリズムは、当技術分野の通常の技術の知識を有する者によく知られている。DNAレベルでは、ヒトWT1と少なくとも約80%の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子コードの縮重により、より大きな程度で異なっていてもよい。
【００５９】
特定の実施形態では、WT1は短縮されている。特定の実施形態では、WT1のジンクフィンガードメインが欠失している。特定の実施形態では、短縮WT1は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００６０】
WT1のＣ末端のジンクフィンガードメインは、４つのジンクフィンガーモチーフを含む。配列番号１に記載のアミノ酸配列の短縮WT1は、UniProt ref P19544-7のアミノ酸番号1〜371を表す。ジンクフィンガードメインを欠失させると、転写因子を含む他のジンクフィンガーとの免疫学的交差反応のリスクが低減される。さらに、ジンクフィンガードメインを欠く短縮WT1は、全長WT1より大きな免疫原性を有する。加えて、DNA結合に必須なジンクフィンガーモチーフを欠失させると、WT1による腫瘍形成の危険性を低減するので、発癌性を抑えることになる。
【００６１】
特定の実施形態では、組換えDNA分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、pMB1 ori、および、ヒトWT1または該ヒトWT1と少なくとも約80%の配列同一性を有するタンパク質、特に短縮ヒトWT1、をコードする真核生物発現カセットを、CMVプロモーターの制御下で含む。特定の実施形態では、組換えDNA分子は、pVAX10.hWT1と命名されるプラスミドであり、配列番号２の核酸酸配列を有する。
【００６２】
特定の実施形態では、組換えDNA分子は、市販のpVAX1（商標）発現プラスミド（Invitrogen社、サンディエゴ、カリフォルニア州）から由来である。この発現ベクターは、複製の高コピーpUC複製起点（high copy pUC origin）をpBR322の複製の低コピーpMB1複製起点（low copy pMB1 origin）に置き換えることによって改変された。代謝負担を軽減し、構築物をより安定にするために低コピー改変を行った。生成された発現ベクターの骨格をpVAX10と命名した。NheI/XhoIによりヒトの短縮WT1をこの発現ベクター骨格に挿入すると発現プラスミドpVAX10.hWT1となる。これは、配列番号２の核酸酸配列を有する。発現プラスミドpVAX10.hWT1を、図３に模式的に示す。
【００６３】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、医薬として使用するためのものである。
【００６４】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、ワクチンとして使用するためのものである。
【００６５】
本発明の文脈において、用語「ワクチン」は、投与により対象における免疫応答を誘発可能な薬剤を指す。ワクチンは、好ましくは、疾患を予防、軽減、または治療できる。本発明に係るワクチンは、サルモネラの弱毒化変異株、好ましくはS.チフィTy21aを含む。本発明に係るワクチンは、WT1、好ましくは、ヒトWT1および該ヒトWT1と少なくとも約80%の配列同一性を有するタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする発現カセット、好ましくは真核生物発現カセットを含む少なくとも１コピーの組換えDNA分子を更に含む。好ましくは、前記WT1は短縮されており、特にジンクフィンガードメインが欠失している。
【００６６】
WT1をコードする組換えDNA分子を含む本発明に係る生弱毒化サルモネラ変異株は、この組換えDNA分子の経口送達のためのビヒクルとして使用できる。WT1のような異種抗原をコードするDNA分子を含むかかる送達ベクターを、DNAワクチンと称する。
【００６７】
遺伝子免疫は、従来のワクチン投与よりも有益であり得る。標的DNAは、かなりの期間にわたり検出可能なので、抗原のデポーとして作用する。いくつかのプラスミド中の配列モチーフは、GpC島のように、免疫刺激性であり、LPSおよび他の細菌成分による免疫刺激によってさらに強化されたアジュバントとして機能できる。
【００６８】
WT1タンパク質の小断片に対する免疫を媒介できる唯一のペプチドワクチンとは対照的に、遺伝子ワクチン投与は、コードされたWT1タンパク質の全長にわたって存在する多種多様なエピトープに対する免疫になり得る。
【００６９】
それとは別に、臨床試験で多く用いられるWT1ペプチドワクチンの用途は、ペプチドのHLAが制限されている、すなわち、抗原提示細胞（APC）のHLA分子への結合能のため限定されている。対照的に、本発明のDNAワクチンは、HLAが制限されていない。
【００７０】
生細菌ベクターは、リポ多糖（LPS）といった、独自の免疫調節因子をin situで産生するため、マイクロカプセル化などの他の形態での投与を上回る利点となり得る。また、サルモネラのような多くの細菌は、腸管内腔から、パイエル板のＭ細胞を経由し、最終的にリンパ節および脾臓に移行するので、免疫系の誘発部位にワクチンを標的化することが可能になるため、自然経路を入口として利用するのが有益だと証明されている。サルモネラ・チフィTy21aのワクチン株は、優れた安全性プロファイルを有することが最近実証された。腸管内腔からＭ細胞を経由する際に、細菌は、マクロファージや樹状細胞などの食細胞によって取り込まれる。これらの細胞は、病原体によって活性化され、分化し始め、そしておそらくリンパ節および脾臓に移行する。S.チフィTy21株の細菌は、弱毒化突然変異のため、これらの食細胞内で存続できず、この時点で死滅する。組換えDNA分子は、特定の輸送システムを介して、またはエンドソームの漏れのいずれかによって、放出され、続いて貪食免疫細胞のサイトゾルへ移動する。最終的に、組換えDNA分子は核に入り込む。核内で、それらの組換えDNA分子が転写され、食細胞のサイトゾル内でWT1が発現することになる。WT1に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞が、活性化した抗原提示細胞によって誘発される。
【００７１】
S.チフィTy21aが全身の血流に侵入し得ることを示す今日利用可能なデータはない。よって、生弱毒化サルモネラ・チフィTy21aワクチン株は、優れた安全性プロファイルを示しながら、免疫系の特異的な標的化を可能にする。
【００７２】
サルモネラ・エンテリカの弱毒化誘導体は、免疫の粘膜経路を介して、つまり経口または経鼻的に、送達できるため、哺乳動物の免疫系へ異種抗原を送達するための魅力的な媒体となる。これにより、非経口投与に比べ簡便かつ安全であるという利点がもたらされる。さらに、サルモネラ株は、全身および粘膜の両方のレベルで強い体液性および細胞性の免疫応答を誘発する。
【００７３】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、癌免疫療法において使用するためのものである。
【００７４】
特定の実施形態では、癌免疫療法は、腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含む少なくとも１コピーの組換えDNA分子を含む１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒化変異株を投与することを更に含む。特定の実施形態では、前記１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒化変異株は、真核生物発現カセットを含むサルモネラ・チフィTy21aである。特定の実施形態では、前記１つまたは複数の更なるサルモネラの株は、ヒトVEGFR-2をコードするサルモネラの弱毒化変異株を含む。
【００７５】
本発明のサルモネラの弱毒化変異株と、第二の腫瘍抗原をコードするDNA分子を含む第二の弱毒化変異株とを組み合わせると、相乗的な抗腫瘍効果を奏し得る。特に、異なる腫瘍抗原を同時に標的化すると、腫瘍が逃げるリスクを最小にし得る。WT1ベースの癌免疫療法とVEGFR-2ベースの免疫療法を組み合わせると、WT1を過剰発現する腫瘍細胞および腫瘍血管系が同時に攻撃されるので、特に有効であると証明し得る。
【００７６】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、前記１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒化変異株と共に同時投与される。
【００７７】
本発明の文脈において、用語「同時投与（co-administration）」または「同時投与（co-administer）」は、連続した３日間以内、より具体的には連続した２日間日以内に、より具体的には同日に、より具体的には１２時間以内に、２つの異なるサルモネラの弱毒化変異体株を投与することを意味する。本発明の文脈において、特定の場合、用語「同時投与」は、２つの異なるサルモネラの弱毒化変異体株を同時に投与すること（simultaneous administration）を意味する。
【００７８】
特定の実施形態では、癌免疫療法は、化学療法、放射線療法、または生物学的癌療法を伴う。癌の治療にとっては、癌幹細胞の完全な根絶が重要である。効力を最大にするために、異なる治療アプローチを組み合わせることが有益であり得る。
【００７９】
本発明の文脈において、用語「生物学的癌療法」又は「癌免疫療法」は、悪性腫瘍細胞又は腫瘍間質を攻撃するよう患者の免疫系を刺激することを指す。生物学的癌治療のアプローチとしては、腫瘍抗原を送達すること、薬剤として治療抗体を送達すること、免疫刺激性サイトカインを投与すること、および免疫細胞を投与することが挙げられる。
【００８０】
本発明のサルモネラの弱毒化変異株と組み合わせて使用できる化学療法剤としては、例えば、以下が挙げられる：ゲムシタビン、アミフォスチン（エチオール）、カバジタキセル、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、フォリン酸、ゲムシタビン（ジェムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノキソーム）、プロカルバジン、ケトコナゾール、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、オキサリプラチン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、およびそれらの組み合わせ。
【００８１】
本発明においてVXM06と組み合わせるのに最も好ましい化学療法剤は、カバジタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、パクリタキセル（タキソール）、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、フォリン酸、５−フルオロウラシル、およびブレオマイシン、特にゲムシタビンである。
【００８２】
起こる可能性のある副作用の発生により抗生物質や抗炎症薬を用いる治療を含むのが有利なことがある。
【００８３】
ヒスタミン、ロイコトリエン、またはサイトカインが媒介する過敏反応に似た有害事象が発生した場合、発熱、アナフィラキシー、血圧不安定、気管支痙攣、および呼吸困難に対する治療という選択肢がある。不要なＴ細胞による自動攻撃の場合、治療の選択肢は、幹細胞の移植後に起こる急性および慢性の移植片対宿主病における標準的な治療スキームに基づく。シクロスポリンやグルココルチコイドが、治療の選択肢として提案されている。
【００８４】
サルモネラ・チフィTy21a型の感染の可能性が低い場合、適切な抗生物質、例えば、シプロフロキサシンまたはオフロキサシンを含むフルオロキノロンを用いた治療が推奨される。胃腸管の細菌感染は、リファキシミンのような各種薬剤を用いて治療することになる。
【００８５】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、化学療法または放射線療法の治療サイクルの間、または生物学的癌療法の間に投与される。
【００８６】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、化学療法または放射線療法の治療サイクルの前、または生物学的癌療法の前に投与される。このアプローチは、化学療法又は放射線療法を、癌免疫を強めた条件下で行うことができるという利点を有し得る。
【００８７】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、化学療法または放射線療法の治療サイクルの後、または生物学的癌療法の後に投与される。
【００８８】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、経口的に投与される。経口投与は、非経口投与よりも簡単、安全、そして安楽である。多くの臨床試験において使用されているWT1ペプチドワクチンは、通常、皮下または皮内に投与されるが、それらの多くの場合、皮膚の紅斑や局所的な炎症反応をもたらす。これらの副作用は、本発明のDNAワクチンの経口投与によって克服できる。本発明のサルモネラの弱毒化変異体株は、他の任意の適切な経路によっても投与し得る。好ましくは、治療的有効量を対象に投与する。この量は、特定の用途、悪性腫瘍の種類、対象の体重、年齢、性別、健康状態、投与の方法、および処方等に依存する。投与は、必要に応じて、単回または複数回行ってもよい。
【００８９】
本発明のサルモネラの弱毒化変異体株は、溶液、懸濁液、凍結乾燥物、または他の適切な任意の形態で提供できる。これは、医薬的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤と組み合わせて設けてもよい。ｐＨ調整剤、緩衝剤、毒性調整剤などを含めてもよい。本発明の文脈において、用語「医薬的に許容される」とは、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与したとき、生理学的に許容可能で、典型的には予期しない有害反応を生じない医薬組成物の分子的な実体物および他の成分を指す。また、用語「医薬的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトにおける使用に関し、連邦政府の規制当局または州政府によって承認されること、あるいは米国薬局方その他の一般に認められた薬局方のリストに載っていることを意味することもある。
【００９０】
特定の実施形態では、癌は、白血病、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、並びに固形腫瘍、特に、肺癌、乳癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、胆管癌、膵臓癌、グリア芽腫、頭頸部癌、滑膜肉腫、血管肉腫、骨肉腫、甲状腺癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、前立腺癌から、選択される。
【００９１】
本発明のワクチンは、比較的低用量でも驚くほど効果的である。特定の実施形態では、１回分の用量は、約１０５〜約１０１１、具体的には約１０６〜約１０１０、より具体的には約１０６〜約１０９、更に具体的には約１０６〜約１０８、最も具体的には、約１０６〜約１０７コロニー形成単位（ＣＦＵ）である。この細菌性生ワクチンは低用量で投与するので、排出のリスクが低減し、第三者への感染も最小限に抑える。
【００９２】
この文脈において、「約（about）」または「約（approximately）」という用語は、特定の値または範囲の３倍以内、あるいは、２倍以内（１．５倍以内を含む）を意味する。
【００９３】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化変異株は、患者の腫瘍抗原発現パターンおよび／または間質抗原発現パターンを評価する工程を含む個別の（individualized）癌免疫療法に使用するためのものである。
【００９４】
VXM06は、単独で、あるいは、様々な種類の癌の治療用の真核生物発現系を含む他のサルモネラ・チフィTy21aベースの癌ワクチンと組み合わせて使用できる。特定の実施形態では、VXM06は、個別の患者に特定した癌治療用に使用し得る。この目的のために、第１の工程で、例えば、患者の特定の腫瘍及び／又は間質抗原パターンを標的とするコンパニオン診断によって、患者の腫瘍及び／又は間質抗原発現パターンを評価してもよい。患者の腫瘍及び／又は間質抗原発現パターンに依存して、VXM06は、単独で、または真核生物発現系を含む１つまたは複数の適切な更なるサルモネラ・チフィTy21aベースの癌ワクチンと組み合わせて投与できる。しかしながら、VXM06と１つまたは複数の更なるサルモネラ・チフィTy21aベースの癌ワクチンとの組み合わせは、固定した組み合わせとして投与してもよい。二つ以上のサルモネラ・チフィTy21aベースの癌ワクチンを組み合わせたこれらのカクテルは、別個の市販品から構成できる。固定または個別いずれかの組合せに、VXM01を抗血管新生ベースの療法として含んでいてもよい。
【実施例】
【００９５】
実施例１：組換えプラスミドpVAX10.mWT1およびpVAX10.hWT1の調製
ヒト短縮WT1（1116bp、UniProtによる参照配列番号P19544-7のWT1配列、ジンクフィンガードメインによる短縮）およびマウス短縮WT1（1101bp、UniProtによる参照配列番号P22561-5のWT1配列、ジンクフィンガードメインによる短縮）を、pVAX10.VR2-1由来のpVAX10骨格にクローニングした。WT1のDNA断片を二本鎖遺伝子合成により作成し、これにオリゴヌクレオチドを、熱安定性リガーゼを用いて一緒に連結した。
【００９６】
オリゴの設計と合成
第１の工程において、短縮ヒトおよび短縮マウスWT1（ジンクフィンガードメインによる短縮）の遺伝子配列は、ソフトウェア「SeqEditor」（Entelechon）を使用して、４０〜５０塩基の個々のオリゴヌクレオチドに細分した。定義したオリゴヌクレオチドをオーバーラップさせ両方のDNA鎖に対応させた。両方のDNA鎖のオリゴヌクレオチド合成後、これらのオリゴヌクレオチドを、最終濃度が50pmol/μlになるように10mM Tris（pH8.5）で希釈した。
【００９７】
キナーゼ反応
その後、インビトロで合成したオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとのインキュベーションによりリン酸化し、その後オリゴヌクレオチドのライゲーションが可能になるようにした。フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドをリン酸化した。
【００９８】
反応の設定を、以下の表１にまとめる。
【００９９】
【表１】
0006416877.tif 000002
【０１００】
この反応混合物を水浴中37℃で１時間インキュベートした。その後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを95℃で5分間の加熱工程により不活化し、その後すぐに氷上で冷却し更なる処理をするまでおいた。
【０１０１】
12.5μLのキナーゼ混合物をライゲーションに直接使用した（20U Taq DNA リガーゼ、反応容量35μl）（New England Biolabs, M0208S）。
【０１０２】
95℃での変性工程に続き、徐々に冷却（1℃／分）した。この工程の間に、相補的なオリゴヌクレオチドが二本鎖DNAへと結合する。この工程は、サーモサイクラー（Personal Cycler, Biometra）で行った。熱安定性Taq DNAリガーゼを添加することにより、オリゴヌクレオチドの５’−ＰＯ４末端を、次のオリゴヌクレオチドの遊離３’−ＯＨ末端に結合させた。変性及び再結合工程を繰り返すことにより、ミスマッチのオリゴヌクレオチドが遊離した。このプログラムの終了時に、混合物を4℃に冷却した。
【０１０３】
ＰＣＲによるライゲーション産物の増幅
得られたライゲーション産物（約1.1kb）5μlを、以下の表２に記載のフランキングプライマーを有する50μl容量のＰＣＲにより増幅した。
【０１０４】
【表２】
0006416877.tif 000003
【０１０５】
ＰＣＲミックスに含有される成分は以下の通りである：0.2〜0.5μMの各プライマー、20 mM Tris-Cl、pH 8.8、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、2 mM MgSO4、0.1% Triton X-100、25 mM dNTP(各)、2U VentRポリメラーゼ。
【０１０６】
インビトロで合成したDNA断片（短縮ヒトおよびマウスWT1；それぞれ約1.1kb）をNheI/XhoIを用いてpVAX10骨格にクローニングした（組換えプラスミドpVAX10.VR2-1のVEGFR-2コード領域を、短縮ヒトまたはマウスWT1に置換した）。品質管理のために、全プラスミドをシーケンシングし、大腸菌に形質転換した後、各参照配列にアラインした。両配列は、エラーがないことが判明した。得られたプラスミドをpVAX10.mWT1およびpVAX10.hWT1と命名した。
【０１０７】
実施例２：組換えプラスミドを有する弱毒化サルモネラ株の形質転換
S.チフィTy21aは、プラスミドpVAX10.hWT1で形質転換した。S.チフィリウムSL7207（aroA-）は、プラスミドpVAX10.mWT1で形質転換した。形質転換は、エレクトロポレーションにより行った。
【０１０８】
コンピテントサルモネラ細胞の調製
S.チフィTy21aおよびS.チフィリウムSL7207のグリセロール培養物をＬＢプレート（動物成分を含有しない（animal component free、ＡＣＦ）大豆ペプトン）に接種した。プレートを37℃で一晩インキュベートした。それぞれ１個のコロニーを一晩液体前培養した。それぞれ１個のコロニーを接種した3mlのＬＢ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）を、37℃、180rpmで一晩インキュベートした。コンピテント細胞を調製するために、2×300mlのＬＢ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）に、一晩培養した培養物を3ml接種し、37℃、180rpmで約0.5のOD600に達するまでインキュベートした。培養物を10分間氷上に置いた。続いて、細菌を4℃、3000×gで10分間遠心分離し、各ペレットを500mLの氷冷H2Odest内に再懸濁した。新たな遠心分離工程の後、細菌ペレットを10%の氷冷グリセロール内で２回洗浄した。両方のペレットを一緒に2mlの10%グリセロールに投入し、50μLのアリコートに分けて最終的にドライアイス上で凍結した。使用したグリセロールには、いかなる動物成分も含まれていなかった（Sigma Aldrich, G5150）。
【０１０９】
コンピテントサルモネラ細胞の形質転換
各形質転換反応用に、コンピテント細胞の50μlのアリコートを氷上で10分間解凍した。3〜5μLのプラスミドDNA（コンピテントS.チフィTy21a細胞にはpVAX10.hWT1、コンピテントS.チフィリウムSL7207細胞にはpVAX10.mWT1）を添加した後、混合物を5分間氷上でインキュベートした。続いて、混合物を予め冷却したキュベット（厚さ1mm）に移した。電気パルスを12.5kV/cmで行った。その直後に、1mlのＬＢ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）を細胞に添加し、細胞を2mlのエッペンドルフチューブに移し、37℃で１時間振とうした。ベンチ遠心機による短い遠心分離工程（16600rcf、20s）の後、細菌ペレットを、抗生物質を含まない200μlのＬＢ（ＡＣＦ大豆ペプトン）培地に再懸濁した。混合物を、カナマイシン（濃度＝25μg/mlまたは50μg/ml）を含むＬＢプレート（ＡＣＦ大豆ペプトン）上に、ドリガルスキスパチュラを用いて塗布した。プレートを37℃で一晩インキュベートした。
【０１１０】
組換えサルモネラクローンのプラスミド調製
各組換えサルモネラ株の３つのクローンを、カナマイシン（50μg/ml）を含む3mlのＬＢ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）内で、37℃で一晩インキュベートした。その後、細菌培養物を遠心分離（16600rcf、30秒）によりペレット化した。プラスミドをMacherey-Nagel社のNucleoSpinプラスミドキットを用いて単離した。プラスミドDNAは、50μlの水でシリカゲルカラムから溶出させた。5μlの溶出液を、アガロースゲル電気泳動に流し対照として用いた。
【０１１１】
長期保存のために、陽性クローンのグリセロール培養物を1ml用意した。この目的のために、172μlのグリセロール（動物成分無）を1 low mlねじマイクロチューブ内で、対数成長中の3mlの培養物の培地828μlに添加した。試料は、さらに使用するまで−70℃で保存した。
【０１１２】
サルモネラから単離された組換えプラスミドDNAの完全シーケンシング
3mlの液体LB-Kan培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）に、組換えサルモネラ（pVAX10.hWT1を有するS.チフィTy21a、およびpVAX10.mWT1を有するS.チフィリウムSL7207）の１個のコロニーを接種し、37℃、180rpmで一晩インキュベートした。一晩培養した培養物を、ベンチ遠心機（Biofuge pico, Heraeus）により遠心分離（1300rpm，30秒）してペレット化した。プラスミドをMacherey-Nagel社のNucleoSpinプラスミドキットを用いて単離した。高分子量のゲノムDNA及び細胞成分のアルカリ溶解および沈殿後、プラスミドDNAを、シリカ膜を有するカラムに搭載した。洗浄工程の後、プラスミドを50μlの滅菌水でカラムから溶出し、シーケンシングした。その後、これらの配列を、クローン特異的アラインメントによって各参照配列と比較した、すなわち、各サルモネラクローンのプラスミド配列を一つずつ参照配列とアラインした。全ての配列が各参照配列と一致していた。組換えサルモネラ株を、VXM06（プラスミドpVAX10.hWT1を有するS.チフィTy21a）およびVXM06m（プラスミドpVAX10.mWT1を有するS.チフィリウムSL7207）と命名した。
【０１１３】
実施例３：同系（syngeneic）白血病マウスモデルにおけるVXM06およびVXM06mの抗腫瘍活性の評価
VXM06およびVXM06mの有効性を４３日の期間にわたって同系白血病C57/BL6Jマウスモデルにおいて評価した、（４つの群に分け一日おきに用量を投与し、１７日目に白血病細胞を投与した）。それぞれ、１０匹の雄マウス（ｎ＝１０）から成る二つの群に、VXM06（短縮ヒトWT1をコードするpVAX10.hWT1を含むS.チフィTy21a）またはVXM06m（短縮マウスWT1をコードするpVAX10.mWT1を含むS.チフィリウム）を、各群1010CFUの用量で投与した。同様の構成から成る１つの対照群には、VXM0m_empty（発現プラスミドを有しないS.チフィリウムベクター対照）を処理群と同じ用量で投与した。試験の間、体重、死亡率、および生存率について調査した。この主試験に先立って、ワクチン投与をしないC57B16雄マウスを用いた１４日間にわたるパイロット試験（一群当たりｎ＝５）を５．０×１０６個および３．０×１０７個のFBL-3細胞を使用して実施した。その後、主ワクチン投与試験に最適な初期細胞濃度を決定した。
【０１１４】
DNAワクチン
VXM06、VXM06m、およびS.チフィリウムを有しないベクター（VXM0m_empty）（発現プラスミドなし）は使用するまで−80℃以下で保存した。その後、ワクチン投与の際に使用したバイアルは再び凍結せず廃棄した。検査したDNAワクチンは、以下の表３に記載する特徴を有する。
【０１１５】
【表３】
0006416877.tif 000004
【０１１６】
薬剤の投与経路
100μlのVXM0m_empty、VXM06m、およびVXM06を動物及び用途に合わせて適用した。試験品は解凍後30分以内に適用した。すべての試験品は、マウス１匹当たり100μlの注入量でカニューレを用いて強制的に経口投与（per os, P.O）した。
【０１１７】
動物群によらず、各動物に投与前適用バッファ（pre-dose application buffer）を投与し、投与前における胃内の酸性物を中和した（すべての用量群において、動物一匹当たり適用毎に100μl）。このバッファは、2.6gの炭酸水素ナトリウム、1.7gのＬ−アスコルビン酸、0.2gのラクトース一水和物、及び100mlの飲料水を含有していた。投与前適用は、試験品を適用する30分前までに実施した。
【０１１８】
細胞培養
WT1を過剰発現するマウス白血病細胞FBL-3は、確実に生存させ、必要量の細胞を達成するために継代を必要とした。
【０１１９】
生存数を決定するために、指数関数的に増殖する腫瘍細胞を回収し、トリパンブルーと混合し（推奨希釈率１：１）、光学顕微鏡下で計数チャンバーを用いて手入力で計数した。FBL-3細胞を洗浄し、C57BL/6マウスへ注入するために無血清ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。
【０１２０】
ワクチン投与および腫瘍細胞接種
腹腔内（ＩＰ）注入用の細胞注入条件は、細胞生存数≧97%；５．０×１０６細胞／500μl／マウスである。
【０１２１】
動物（３０匹のC57BL/6マウス、４〜６週間、雄、それぞれ約20g、チャールズ・リバー、フランス）に番号を付し、個別の動物ＩＤを耳ノッチマークで付し、体重を週に２回測定した。
【０１２２】
各群それぞれ１０匹のマウス（ｎ＝１０、雄）に、VXM0m_empty、VXM06m、およびVXM06をワクチン投与した。ワクチン投与は、１、３、５、および７日目に１０１０ＣＦＵ／適用で強制経口投与により行った。１７日目に、FBL-3腫瘍細胞を腹腔内経路によりマウスに投与した。実験計画を以下の表４にまとめる。
【０１２３】
【表４】
0006416877.tif 000005
【０１２４】
結果
３つの処置群についての生存数のデータを、以下の表５に記載する。
【０１２５】
【表５】
0006416877.tif 000006
【０１２６】
すべての動物に対し、行動、苦痛の兆候（悪液質、移動または食事が困難になる）について毎日臨床検査をした。
【０１２７】
腫瘍チャレンジ後に死滅した動物数を、以下の表６に記載する。
【０１２８】
【表６】
0006416877.tif 000007
【０１２９】
図４は、VXM0m_empty、VXM06m、VXM06で処理したFBL-3白血病を有するマウスのKaplan-Meier生存曲線を示す。VXM06m及びVXM06で処理したマウスは、対照マウスよりも長く生存した（最大２６日間）。VXM06m及びVXM06で処理したマウスの約40%は、VXM0m_emptyで処理したマウスよりも長く生存した。３つの試験群の平均及び中間生存日数を以下の表７に示す。
【０１３０】
【表７】
0006416877.tif 000008
【０１３１】
図５は、VXM0m_empty、VXM06m、およびVXM06で処理したFBL-3白血病を有するマウスの平均生存数を示す。VXM06mおよびVXM06で処理したマウスは、対照マウスよりも長く生存した。
【０１３２】
この試験により、マウスモデルにおいてWT1を過剰発現する白血病細胞を標的とするVXM06およびVXM06m構築物の有効性が実証された。空のベクターで処置した対照マウスは、腫瘍細胞チャレンジの後、最大１６日間生存した（図４参照）。対照的に、VXM06mまたはVXM06で処置したマウスは、空の対照ベクターVXM0m_emptyでワクチン投与したマウスに比べて生存期間の延長がみられた（両方の試験対象につき最大２６日間）。VXM06mまたはVXM06を投与したマウスの約40%が、VXM0m_emptyで処置した対照群よりも長く生存した。
【０１３３】
要約すると、VXM06mおよびVXM06は、同系C57B16白血病マウスモデルにおいて試験動物の生存に対し薬力学的効果を示した。空のベクターと比較して、２つの化合物VXM06mおよびVXM06では似たような薬力学的効果が観察された。これらの結果より、これらのワクチンが、免疫コンピテントマウス白血病モデルにおいてWT1に対する応答を誘発でき、これにより空のベクターで処置した動物と比較して、動物の生存がより長くなるという結果となったことが示される。
【図１】
0006416877.tif 000009
【図２−１】
0006416877.tif 000010
【図２−２】
0006416877.tif 000011
【図３】
0006416877.tif 000012
【図４】
0006416877.tif 000013
【図５】
0006416877.tif 000014
【配列表】
0006416877000001.app