(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３ＡまたはＶ１５８  ＦＣＧＲ３Ａバリアントの細胞外リガンド結合ドメイン；(ｂ)ＣＤ８αのヒンジドメインおよび膜貫通型ドメイン；および(ｃ)４−１ＢＢシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含む、キメラ受容体。
【請求項２】
さらにＣＤ８αのシグナルペプチドを含む、請求項１に記載のキメラ受容体。
【請求項３】
Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３ＡおよびＶ１５８  ＦＣＧＲ３Ａバリアントの細胞外リガンド結合ドメインがそれぞれ配列番号１６および配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１または請求項２に記載のキメラ受容体。
【請求項４】
ＣＤ８αのヒンジドメインおよび膜貫通型ドメインが配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項５】
４−１ＢＢシグナル伝達ドメインが配列番号４のアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項６】
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが配列番号５のアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項７】
ＣＤ８αのシグナルペプチドが配列番号６のアミノ酸配列からなる、請求項２〜６のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項８】
配列番号１または配列番号１５の残基２２〜４３６のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１または配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ受容体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のキメラ受容体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号９または配列番号１７をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１２】
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれかに記載のキメラ受容体を含む、単離宿主細胞。
【請求項１４】
Ｔリンパ球またはＮＫ細胞である、請求項１３に記載の単離宿主細胞。
【請求項１５】
該Ｔリンパ球またはＮＫ細胞がエクスビボで活性化および／または増殖される、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
該Ｔリンパ球が抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−２およびフィトヘマグルチニンからなる群から選択される１個以上の薬剤の存在下で活性化されるか、または該ＮＫ細胞がＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２タンパク質、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−２１タンパク質およびＫ５６２細胞株からなる群から選択される１個以上の薬剤の存在下で活性化される、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
癌を有する患者から単離された自己Ｔリンパ球または自己ＮＫ細胞であるか、または同種異系Ｔリンパ球または同種異系ＮＫ細胞である、請求項１４〜１６のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１８】
同種異系Ｔリンパ球における内在性Ｔ細胞受容体が阻止されているかまたは排除されている、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１１または１２に記載のベクターまたは請求項１３〜１８のいずれかに記載の宿主細胞および薬学的に許容される担体または添加物を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
癌の抗体利用免疫療法の効果を、それを必要とする対象において増強することにおける使用のための、または対象における抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を増強することにおける使用のための、請求項１４〜１８のいずれかに記載のＴリンパ球またはＮＫ細胞であって、該対象が癌細胞に結合する抗体で処置されており、該対象が癌を有するヒト患者である、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞。
【請求項２１】
癌が癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、白血病、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎臓細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病およびホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項２０に記載のＴリンパ球またはＮＫ細胞。
【請求項２２】
抗体がリツキシマブ、トラスツズマブ、ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ、エピラツズマブ、セツキシマブおよびラベツズマブからなる群から選択される、請求項２０または２１に記載のＴリンパ球またはＮＫ細胞。
【請求項２３】
キメラ受容体がレトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、ＤＮＡエレクトロポレーションおよびＲＮＡエレクトロポレーションからなる群から選択される方法により、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞に導入される、請求項１〜８のいずれかに記載のキメラ受容体を含むＴリンパ球またはＮＫ細胞を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１９の規定により、２０１３年１０月１７日出願の米国仮特許出願６１／８９２,２１８号、２０１４年７月１８日出願の米国仮特許出願６２／０２６,２４３号および２０１４年９月９日出願の米国仮特許出願６２／０４７,９１６号の利益を主張する。これらの先行出願の全内容を、引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒト免疫グロブリンのＦｃ部分と結合し、活性化シグナルを送達するキメラ受容体に関する。本発明のキメラ受容体は、高親和性Ｖ１５８  ＦＣＧＲ３Ａバリアント、ＣＤ８αのヒンジドメインおよび膜貫通型ドメインならびにＣＤ３ζおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。本発明のキメラ受容体は、リツキシマブ、トラスツズマブ、ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａおよび他の治療用抗体に高親和性を有し、種々の癌に対する抗体治療の有効性の増大に役立つものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫療法は、薬剤耐性の遺伝機構および細胞機構を避け、正常組織を温存しながら腫瘍細胞を標的とするその可能性のゆえに、癌処置の有望な選択肢となっている。Ｔリンパ球は、血液系腫瘍に対する同種異系造血幹細胞移植(ＨＳＣＴ)の結果により示されるとおり、大きな抗腫瘍効果を発揮でき、ここで、Ｔ細胞介在移植片対宿主病(ＧｖＨＤ)が疾患再発と逆比例的に相関し、免疫抑制剤使用中止またはドナーリンパ球注入が再発を含み得る(Weiden et al., N. Engl. J. Med. 1979; 300(19):1068-1073; Porter et al., N. Engl. J. Med. 1994; 330(2):100-106; Kolb et al., Blood 1995; 86(5):2041-2050; Slavin et al., Blood 1996; 87(6):2195-2204; Appelbaum, Nature 2001; 411(6835):385-389)。Ｔリンパ球の反応性は、抗体認識特性を有するキメラシグナル伝達受容体の発現により癌細胞に向けて方向修正することができる。同族標的のライゲーションはＴ細胞活性化を起こし、細胞毒性を誘発する(Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90(2):720-724; Geiger et al., J. Immunol. 1999; 162(10):5931-5939; Brentjens et al., Nat. Med. 2003; 9(3):279-286; Cooper et al., Blood 2003; 101(4):1637-1644; Imai et al., Leukemia 2004; 18:676-684)。キメラ受容体発現自己Ｔリンパ球の注入を用いた臨床試験の最近の結果は、それらの臨床的潜在力の有力な証拠を提供した(Pule et al., Nat. Med. 2008; 14(11):1264-1270; Porter et al., OncLive 2011; 25;365(8):725-733; Brenjens et al., Blood 2011; 118(18):4817-4828; Till et al., Blood 2012; 119(17):3940-3950; Kochenderfer et al., Blood 2012; 119(12):2709-2720; Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 2013; 5(177):177ra138)。
【０００４】
癌免疫療法の他の試みは、アポトーシス促進性シグナルの誘発、補体結合および抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を含む多様な機構により細胞毒性を発揮できるモノクローナル抗体の投与である(Yu et al., N. Engl. J. Med. 2010; 363(14):1324-1334; Ferris et al., J. Clin. Oncol. 2010; 28(28):4390-4399; Maloney, N. Engl. J. Med. 2012; 366(21):2008-2016; Scott et al., Nat. Rev. Cancer 2012; 12(4):278-287; Weiner et al., Cell 2012; 148(6):1081-1084; Galluzzi et al., Oncoimmunology 2012; 1(1):28-37)。抗体のＦｃ部分による、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞ならびに好中球およびマクロファージのような他の細胞の表面上に発現されるＦｃ受容体(ＦｃγＲ)の結合に由来する、ＡＤＣＣの機構が大きな役割を演ずる(Nimmerjahn et al., Nat. Rev. Immunol. 2008; 8(1):34-47)。ＦｃγＲ遺伝子の多型は、著しい機能的意義を有し得て、これが、次に、抗体処置に対する応答に影響する。この目的のために、ＮＫ細胞により発現されるＦｃγＲIIIａ(ＦＣＲＧ３ＡまたはＣＤ１６)をコードする遺伝子のアロタイプは、１５８位にフェニルアラニン(Ｆ)残基またはバリン(Ｖ)残基のいずれかを有する受容体をもたらし得て、少数の個体で生じるＣＤ１６  １５８Ｖ／Ｖは、Ｆｃ結合が高く、腫瘍細胞死滅が増加し、患者において優れた応答を示す(Ferris et al., J. Clin. Oncol. 2010; 28(28):4390-4399; Koene et al., Blood 1997; 90(3):1109-1114; Cartron et al., Blood 2002; 99(3):754-758; Weng et al., J. Clin. Oncol. 2003; 21(21):3940-3947; Dall'Ozzo et al., Cancer Res. 2004; 64(13):4664-4669; Hatjiharissi et al., Blood 2007; 110(7):2561-2564; Musolino et al., J. Clin. Oncol. 2008; 26(11):1789-1796; Bibeau et al., J. Clin. Oncol. 2009; 27(7):1122-1129; Ahlgrimm et al., Blood 2011; 118(17):4657-4662; Veeramani et al., Blood 2011; 118(12):3347-3349)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Weiden et al., N. Engl. J. Med. 1979; 300(19):1068-1073
【非特許文献２】Porter et al., N. Engl. J. Med. 1994; 330(2):100-106
【非特許文献３】Kolb et al., Blood 1995; 86(5):2041-2050
【非特許文献４】Slavin et al., Blood 1996; 87(6):2195-2204
【非特許文献５】Appelbaum, Nature 2001; 411(6835):385-389
【非特許文献６】Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90(2):720-724
【非特許文献７】Geiger et al., J. Immunol. 1999; 162(10):5931-5939
【非特許文献８】Brentjens et al., Nat. Med. 2003; 9(3):279-286
【非特許文献９】Cooper et al., Blood 2003; 101(4):1637-1644
【非特許文献１０】Imai et al., Leukemia 2004; 18:676-684
【非特許文献１１】Pule et al., Nat. Med. 2008; 14(11):1264-1270
【非特許文献１２】Porter et al., OncLive 2011; 25;365(8):725-733
【非特許文献１３】Brenjens et al., Blood 2011; 118(18):4817-4828
【非特許文献１４】Till et al., Blood 2012; 119(17):3940-3950
【非特許文献１５】Kochenderfer et al., Blood 2012; 119(12):2709-2720
【非特許文献１６】Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 2013; 5(177):177ra138
【非特許文献１７】Yu et al., N. Engl. J. Med. 2010; 363(14):1324-1334
【非特許文献１８】Ferris et al., J. Clin. Oncol. 2010; 28(28):4390-4399
【非特許文献１９】Maloney, N. Engl. J. Med. 2012; 366(21):2008-2016
【非特許文献２０】Scott et al., Nat. Rev. Cancer 2012; 12(4):278-287
【非特許文献２１】Weiner et al., Cell 2012; 148(6):1081-1084
【非特許文献２２】Galluzzi et al., Oncoimmunology 2012; 1(1):28-37
【非特許文献２３】Nimmerjahn et al., Nat. Rev. Immunol. 2008; 8(1):34-47
【非特許文献２４】Ferris et al., J. Clin. Oncol. 2010; 28(28):4390-4399
【非特許文献２５】Koene et al., Blood 1997; 90(3):1109-1114
【非特許文献２６】Cartron et al., Blood 2002; 99(3):754-758
【非特許文献２７】Weng et al., J. Clin. Oncol. 2003; 21(21):3940-3947
【非特許文献２８】Dall'Ozzo et al., Cancer Res. 2004; 64(13):4664-4669
【非特許文献２９】Hatjiharissi et al., Blood 2007; 110(7):2561-2564
【非特許文献３０】Musolino et al., J. Clin. Oncol. 2008; 26(11):1789-1796
【非特許文献３１】Bibeau et al., J. Clin. Oncol. 2009; 27(7):1122-1129
【非特許文献３２】Ahlgrimm et al., Blood 2011; 118(17):4657-4662
【非特許文献３３】Veeramani et al., Blood 2011; 118(12):3347-3349
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌治療のための新規方法および新規薬剤の開発に対する大きな要望がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要約
本発明は、少なくとも一部、例えば、癌治療に使用するための新規キメラ受容体の開発に基づく。したがって、ここに提供されるのは、キメラ受容体、それをコードする核酸、該コード化核酸を含むベクター、キメラ受容体を発現する宿主細胞および対象、例えば、癌患者における抗体利用癌治療および／またはＡＤＣＣ効果を促進するためのこのような宿主細胞の使用である。
【０００８】
一つの面において、本発明は、(ａ)ＣＤ１６分子の細胞外リガンド結合ドメイン、(ｂ)ＣＤ８αのヒンジドメインならびに膜貫通型ドメインおよび(ｃ)４−１ＢＢシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含むキメラ受容体を提供する。ある態様において、ＣＤ１６分子はＦ１５８  ＦＣＧＲ３Ａであり、その細胞外リガンド結合ドメインは配列番号１６のアミノ酸配列を含んでよい(例えば、これから構成されてよい)。他の態様において、ＣＤ１６分子はＶ１５８  ＦＣＧＲ３Ａバリアントであり、その細胞外リガンド結合ドメインは配列番号２のアミノ酸配列を含んでよい(例えば、これから構成されてよい)。
【０００９】
ここに開示するキメラ受容体のいずれにおいても、ＣＤ８αのヒンジドメインおよび膜貫通型ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含んでよく(例えば、これから構成されてよい)、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含んでよく(例えば、これから構成されてよい)および／またはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含んでよい(例えば、これから構成されてよい)。
【００１０】
ここに開示するキメラ受容体のいずれも、ＣＤ８αのシグナルペプチドをさらに含んでよく、これは、キメラ受容体のＮ末端に位置する。一例において、このようなＣＤ８αのシグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含んでよい(例えば、これから構成されてよい)。
【００１１】
ある例において、キメラ受容体は、配列番号１の残基２２〜４３６または配列番号１５の残基２２〜４３６のアミノ酸配列を含み得る。一例において、キメラ受容体は、配列番号１または配列番号１５のアミノ酸配列を含む(例えば、これから構成される)。
【００１２】
他の面において、本発明は、ここに開示するキメラ受容体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。ある例において、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０または配列番号１８のヌクレオチド配列、配列番号１１のヌクレオチド配列、配列番号１２のヌクレオチド配列、配列番号１４のヌクレオチド配列またはこれらの組み合わせを含み得る。ある特定の態様において、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９または配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
さらなる面において、本発明は、ここに開示するキメラ受容体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供し、ここで、該ポリヌクレオチドは、キメラ受容体の発現のための少なくとも１個の調節エレメントと作動可能なように結合され得る。一例において、ベクターはウイルスベクター(例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター)である。
【００１４】
さらに、本発明は、ここに開示するキメラ受容体のいずれかを含む単離宿主細胞を提供する。ある特定の態様において、宿主細胞はＴリンパ球またはＮＫ細胞である。ある特定の態様において、宿主細胞はＴリンパ球またはＮＫ細胞であり、これは、エクスビボで活性化および／または増殖する(例えば、Ｔリンパ球は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−２およびフィトヘマグルチニンからなる群から選択される１種以上の薬剤の存在下で活性化でき、例えば、ＮＫ細胞は、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２タンパク質、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−２１タンパク質およびＫ５６２細胞株からなる群から選択される１種以上の薬剤の存在下で活性化できる)。ある特定の態様において、宿主細胞は、癌を有する患者から単離された自己Ｔリンパ球または自己ＮＫ細胞である。ある特定の態様において、宿主細胞は同種異系Ｔリンパ球または同種異系ＮＫ細胞である。ある特定の態様において、宿主細胞は、内在性Ｔ細胞受容体の発現が阻止されているまたは排除されている同種異系Ｔリンパ球である。
【００１５】
さらに他の面において、本発明は、(ｉ)ここに開示するキメラ受容体のいずれかをコードするポリヌクレオチドもしくはこのようなポリヌクレオチドを含むベクターまたは該キメラ受容体を発現する宿主細胞；および(ii)薬学的に許容される担体または添加物を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、癌細胞に対して細胞毒性を発揮する抗体(例えば、癌細胞に結合し、ヒトＣＤに結合するヒトまたはヒト化Ｆｃ部分を有する抗体またはリツキシマブまたはトラスツズマブまたはｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａまたはエピラツズマブまたはセツキシマブまたはラベツズマブ)をさらに含み得る。
【００１６】
さらに別の面において、本発明は、癌の抗体利用免疫療法の効果を、それを必要とする対象において増強する方法を提供する。対象を、癌細胞に結合する抗体で処置し得る。このような方法は、該対象に、ここに記載するキメラ受容体のいずれかを発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞の治療有効量を導入することを含み得る。
【００１７】
さらに、本発明は、対象におけるＴリンパ球またはＮＫ細胞抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を増強する方法であって、該対象に、ここに記載するキメラ受容体のいずれかを発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞の治療有効量を導入することを含む、方法を提供する。ある特定の態様において、対象は、癌細胞と結合できる抗体で処置されている。
【００１８】
ここに記載する方法のいずれにおいても、対象は、ヒトＣＤ１６に結合できるヒトまたはヒト化Ｆｃ部分を有する抗体で処置し得る。ある特定の態様において、対象は、リツキシマブ、トラスツズマブ、ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ、エピラツズマブ、セツキシマブおよびラベツズマブからなる群から選択される抗体で処置されている。ある特定の態様において、癌は癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫および白血病からなる群から選択される。ある特定の態様において、癌はＢ細胞起源の癌(例えば、Ｂ細胞系譜急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫)、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎臓細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病およびホジキンリンパ腫からなる群から選択される。ある特定の態様において、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞は、該対象から単離された自己Ｔリンパ球または自己ＮＫ細胞である。一つの特定の態様において、対象への再導入前に、自己Ｔリンパ球または自己ＮＫ細胞をエクスビボで活性化および／または増殖させる。ある特定の態様において、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞は同種異系Ｔリンパ球または同種異系ＮＫ細胞である。ある特定の態様において、同種異系Ｔリンパ球は、内在性Ｔ細胞受容体の発現が阻止されているまたは排除されているＴリンパ球である。一つの特定の態様において、対象への導入前に、同種異系Ｔリンパ球または同種異系ＮＫ細胞をエクスビボで活性化および／または増殖させる。ある特定の態様において、キメラ受容体は、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、ＤＮＡエレクトロポレーションおよびＲＮＡエレクトロポレーションからなる群から選択される方法により、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞に導入される。
【００１９】
Ｔリンパ球活性化を含むここに開示する方法のいずれにおいても、Ｔリンパ球は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−２およびフィトヘマグルチニンからなる群から選択される１種以上の薬剤の存在下で活性化できる。ＮＫ細胞活性化を含むここに開示する方法のいずれにおいても、ＮＫ細胞は、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２タンパク質、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−２１タンパク質およびＫ５６２細胞株からなる群から選択される１種以上の薬剤の存在下で活性化できる。
【００２０】
ここに記載する方法のいずれも、対象にＩＬ−２の治療有効量を投与することをさらに含み得る。
【００２１】
また本発明の範囲内に入るのは、(ｉ)癌患者におけるＡＤＣＣ作用の増強または癌の処置に使用するための医薬組成物であって、ここに開示するキメラ受容体をコードするすべてのポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含むベクターまたはキメラ受容体を発現する宿主細胞および薬学的に許容される担体または添加物を含む医薬組成物；および(ii)癌疾患の処置用医薬の製造のための、このような医薬組成物の使用である。医薬組成物は、さらに当分野で知られるようなまたはここに開示するような抗癌抗体を含む。
【００２２】
本発明の態様の一つ以上の詳細を以下に示す。本発明の他の特性または利点は、添付する図面および下のいくつかの態様の詳細な記載ならびに添付する特許請求の範囲から明らかである。
【００２３】
図面の簡単な説明
本特許出願書類は、カラーで作成された少なくとも一つの図面を含む。カラー図面を含む本特許出願書類の複写は、請求および必要な料金の支払いにより特許庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｔ細胞におけるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現を示す。Ａ. ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体構築物の模式図。Ｂ. 末梢血Ｔリンパ球におけるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現。フローサイトメトリードットプロットは、ＧＦＰ単独(偽)またはＧＦＰとＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを含むベクターを形質導入した活性化Ｔリンパ球におけるＧＦＰまたはＣＤ３ζと組み合わせたＣＤ１６(Ｂ７３.１抗体)の発現を説明する。各１／４区における陽性細胞のパーセンテージを示す。Ｃ. ＧＦＰ単独またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを形質導入したＴリンパ球からの細胞ライセートのウェスタンブロッティング。膜を抗ＣＤ３ζ抗体でプローブした。
【００２５】
【図２】Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現を示す。Ａ. 活性化ＣＤ３＋Ｔリンパ球に、ＧＦＰ単独を含むベクター(モック)およびＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ構築物を含むベクターを形質導入した。ＣＤ１６の発現を、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞においてフローサイトメトリーにより試験した。ドットプロットは、一つの代表的実験の結果を示す。Ｂ. ３ドナー由来のＴリンパ球から得た結果(平均±ＳＤ)の概要(Ｐ＝Ｎ.Ｓ.)。
【００２６】
【図３】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の抗体結合能を示す。Ａ. ＧＦＰを含むベクター(偽)またはＧＦＰとＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを含むベクターを形質導入したＴリンパ球をリツキシマブと３０分インキュベートし、細胞表面に結合した抗体の量をフィコエリトリンに接合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(ＧＡＨ  ＩｇＧ)およびフローサイトメトリーで可視化した。Ｂ. ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ(Ｖ１５８)またはＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ(Ｆ１５８)を形質導入したジャーカット細胞をリツキシマブと３０分インキュベートした。プロットは、この２種の受容体を発現する細胞で得られたＧＦＰの平均蛍光強度(ＭＦＩ)とＧＡＨ  ＩｇＧのＭＦＩの関係を比較する。Ｃ. モック形質導入またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入されたジャーカット細胞を、リツキシマブの存在下、カルセインＡＭ橙色−赤色で標識されたダウディ細胞と共培養した。細胞凝集塊を各ドットプロットの上部右１／４区において定量する。Ｄ. Ｃに説明する凝集アッセイの概要。バーは３実験の平均±ＳＤを示す。リツキシマブ(“Ａｂ”)の存在下、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを形質導入したジャーカット細胞で測定した凝集は、３つの他の培養条件で測定したものより有意に高かった(ｔ検定でＰ＜０.００１)。
【００２７】
【図４】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体およびＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体がトラスツズマブおよびヒトＩｇＧと結合する相対的な能力を示す。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ(Ｖ１５８；黒色記号)またはＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ(Ｆ１５８；白色記号)を形質導入したジャーカット細胞をトラスツズマブまたはヒトＩｇＧと３０分インキュベートした。プロットは、いずれかの受容体を発現する細胞で得られたＧＦＰの平均蛍光強度(ＭＦＩ)とＰＥに接合したヤギ抗ヒト(ＧＡＨ)ＩｇＧのＭＦＩの間の関係を比較する(トラスツズマブおよびＩｇＧの両者についてＰ＜０.０００１)。
【００２８】
【図５】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体に結合する免疫グロブリンがＴ細胞活性化、溶解性顆粒のエキソサイトーシスおよび細胞増殖を誘発することを示す。Ａ. ＧＦＰを含むベクター(モック)またはＧＦＰとＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを含むベクターで形質導入したＴリンパ球を、ＩＬ−２非存在下、リツキシマブでコートしたマイクロタイタープレート中４８時間培養し、ＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した。Ｂ. Ａに説明した試験の結果の概要：バーは、ＧＦＰ＋細胞におけるＣＤ２５発現を示し(３ドナーからのＴ細胞を用いた実験の平均±ＳＤ)、ＣＤ２５発現は、リツキシマブ(“Ａｂ”)の存在下、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを形質導入したＴリンパ球が、他の実験条件より有意に高かった(Ｐ≦０.００３)。Ｃ. ４ドナーからのＴリンパ球にＧＦＰを含むベクター(モック)またはＧＦＰとＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを含むベクターを形質導入し、Ａのように培養するか(ｎ＝３)またはダウディ細胞と(ｎ＝３)４時間培養し、ＣＤ１０７ａ染色をフローサイトメトリーで測定した。バーは６実験の平均±ＳＤを示し、ＣＤ１０７ａ発現は、リツキシマブ(“Ａｂ”)の存在下、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを導入したＴリンパ球が、他の実験条件より有意に高かった(Ｐ＜０.０００１)。Ｄ. モックまたはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球を、単独でまたはリツキシマブと、ダウディ細胞存在下または非存在下、最大４週間培養した。記号は、投入細胞数と比較した細胞回収のパーセンテージを示す(３ドナーからのＴ細胞を用いた実験の平均±ＳＤ)。
【００２９】
【図６】インビトロでのＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球が介在する抗体依存性細胞毒性を示す。Ａ. 対応する抗体の存在下、偽またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球が介在する癌細胞株に対する細胞毒性の代表例。各記号は、３培養の平均を示す(全３比較について対応のあるｔ検定によりＰ＜０.０１)。データ一式を図７に示す。Ｂ. 慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)患者からの初代細胞に対する、リツキシマブ(“Ａｂ”)存在下または非存在下の偽またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球の細胞毒性。各バー(各患者について模様が異なる)は、２：１  Ｅ：Ｔ比でのトリプリケート４時間アッセイで測定した、平均(±ＳＤ)細胞毒性に対応する。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔ細胞および抗体での細胞毒性は、他の３条件のいずれで測定したよりも有意に高く(ｔ検定でＰ＜０.０００１)、偽形質導入Ｔ細胞への抗体の添加が細胞毒性を増加させた(Ｐ＝０.０１６)。全ての他の比較：Ｐ＞０.０５。Ｃ. 間葉性間質細胞(ＭＳＣ)存在下、１：２  Ｅ：Ｔで２４時間後のＢで試験したのと同じＣＬＬサンプルに対する細胞毒性。各バーは、２試験の平均に対応する。抗体を伴うＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔ細胞での細胞毒性は、抗体単独(Ｐ＝０.０００２)または細胞単独(Ｐ＜０.０００１)より有意に高く、抗体単独での細胞毒性は細胞単独より有意に高かった(Ｐ＝０.００４５)。
【００３０】
【図７】４時間インビトロ細胞毒性アッセイの集計結果を示す。偽またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球を、記載する細胞株および非反応性ヒト免疫グロブリン(“Ａｂなし”)または対応する抗体(“Ａｂ”)と共に培養した。これは、ダウディおよびラモスについてリツキシマブ、ＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ−３およびＭＫＮ−７についてトラスツズマブならびにＣＨＬＡ−２５５、ＮＢ１６９１、ＳＫ−Ｎ−ＳＨおよびＵ−２  ＯＳに対してｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａであった。Ｔ細胞および／または抗体非存在下で培養した腫瘍細胞と比較した、２：１比(ＣＨＬＡ−２５５については４：１)での細胞毒性を示す。結果は、ＮＢ１６９１およびＳＫ−ＢＲ−３については３ドナー、残りの細胞株については１ドナーのＴリンパ球で実施した３実験の平均(±ＳＤ)細胞毒性に対応し、ダウディの結果は、２ドナーからの３測定およびさらに４ドナーからのＴリンパ球の１測定の平均(±ＳＤ)細胞毒性である。Ｔ細胞非存在下、培養に添加したときのリツキシマブ、トラスツズマブまたはｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａの平均細胞毒性は＜１０％であった。
【００３１】
【図８】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球の細胞毒性が強力で特異的であり、非結合ＩｇＧに影響されないことを示す。Ａ. ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球を、神経芽腫細胞株ＮＢ１６９１と、非反応性ヒト免疫グロブリン(“Ａｂなし”)またはｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ抗体(“Ａｂ”)いずれかの存在下、２４時間共培養した。結果は３実験の平均(±ＳＤ)細胞毒性に対応する。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ細胞とｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ抗体を用いて、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔ細胞単独と比較して、１：８  Ｅ：Ｔであっても、細胞毒性は有意に高く残存した(Ｐ＝０.０００２)。Ｂ. 偽またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球を、Ｂ細胞リンパ腫細胞株ダウディと４時間、２：１  Ｅ：Ｔでリツキシマブまたは非反応性抗体トラスツズマブまたはｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａの存在下、共培養した。結果は３実験の平均(±ＳＤ)細胞毒性に対応する(“偽”結果は、各抗体を用いた３実験の総計)。リツキシマブによる細胞毒性は、全ての他の実験条件のものより有意に高かった(全比較についてＰ＜０.０００１)。Ｃ. 種々の濃度の免疫療法抗体および競合非結合ＩｇＧ(抗体に同時に添加)の存在下、８：１  Ｅ：Ｔでの腫瘍細胞株に対するＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ発現Ｔリンパ球の細胞毒性。記号は、各抗体濃度の少なくとも３測定の平均(±ＳＤ)に対応する。各細胞株について、細胞毒性は、存在する非結合ＩｇＧの量と無関係に、統計的な差はなかった。
【００３２】
【図９】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体を発現するＴリンパ球が、インビボで抗腫瘍活性を発揮することを示す。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ−２ＲＧヌルマウスに、ルシフェラーゼで標識したダウディ細胞３×１０５をｉ.ｐ.注射した。リツキシマブ(１５０μg)を、４日目から開始して、４週間、週に１回ｉ.ｐ.注射した。４匹のマウスには他の処置を施さず、別の５匹のマウスは、最初のリツキシマブ注射の後、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体を発現するＴリンパ球(１×１０７ｉ.ｐ.；ｎ＝５)を５日目および６日目に投与し、各４匹のマウスの他の２群は、リツキシマブの代わりにＲＰＭＩ−１６４０のｉ.ｐ.注射の後ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球を投与するかまたはＲＰＭＩ−１６４０媒体のみのｉ.ｐ.注射をした(“対照”)。Ａ. 腫瘍増殖のインビボ造影の結果。各記号は、一つのバイオルミネセンス測定値に対応するし、線は一匹のマウスにおける全測定値を結ぶ。Ｂ. 各実験条件について代表的マウス(２匹／群)。３日目の腹側画像を高感度で処理して、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ＋リツキシマブ群のマウスにおける腫瘍の存在を示した。バイオルミネセンスが５×１０１０光子／秒に達したら、マウスを屠殺した。Ｃ. 種々の処置群におけるマウスの全生存の比較。
【００３３】
【図１０】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体を発現するＴリンパ球がインビボで抗腫瘍活性を発揮することを確認する。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ−２ＲＧヌルマウスに、ルシフェラーゼで標識したＮＢ１６９１細胞３×１０５をｉ.ｐ.注射した。ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ抗体(２５μg)を、５日目から開始して、４週間、週に１回ｉ.ｐ.注射した。４匹のマウスには他の処置を施さず、別の４匹のマウスは、最初の抗体注射の後、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体を発現するＴリンパ球(１×１０７ｉ.ｐ.；ｎ＝４)を６日目および７日目に投与し、各４匹のマウスの他の２群は、抗体の代わりにＲＰＭＩ−１６４０のｉ.ｐ.注射の後ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球を投与するかまたはＲＰＭＩ−１６４０媒体のみのｉ.ｐ.注射をした(“対照”)。Ａ. 腫瘍増殖のインビボ造影の結果。各記号は、一つのバイオルミネセンス測定値に対応し、線は一匹のマウスにおける全測定値を結ぶ。Ｂ. 各実験条件について全マウスの画像。バイオルミネセンスが１×１０１０光子／秒に達したときマウスを屠殺した。Ｃ. 種々の処置群におけるマウスの全生存の比較。
【００３４】
【図１１】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体とＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体を発現するＴリンパ球の間の機能差を示す。Ａ. フローサイトメトリードットプロットは、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζまたはＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζを形質導入したＴリンパ球におけるＣＤ１６(Ｂ７３.１抗体を用いて検出)および緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)の発現を示す。各１／４区における陽性細胞のパーセンテージを示す。Ｂ. ＣＤ１６Ｖ受容体またはＣＤ１６Ｆ受容体のいずれかを形質導入したＴリンパ球をダウディ細胞、ＳＫ−ＢＲ−３細胞またはＮＢ１６９１細胞と、それぞれリツキシマブ、トラスツズマブおよびｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａの存在下で培養した。全抗体を０.１μg／mLで使用した。記号は、投入細胞数と比較した細胞回収のパーセンテージを示し(３実験の平均±ＳＤ)、培養１〜３週目の細胞数は、全３培養で、対応のあるｔ検定で有意に異なった(ダウディ、Ｐ＝０.０００７；ＳＫ−ＢＲ−３、Ｐ＝０.０１６４；ＮＢ１６９１、Ｐ＝０.０２２)。Ｃ. 種々の濃度のリツキシマブ存在下の、ダウディ細胞に対するＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体またはＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体のいずれかを発現するＴリンパ球が介在する抗体依存性細胞毒性。各記号は、８：１(左)または２：１(右)Ｅ：Ｔでの３培養の平均±ＳＤを示す。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ含有Ｔ細胞の細胞毒性は、ＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ含有Ｔ細胞より有意に高かった(いずれのＥ：ＴでもＰ＜０.００１)。
【００３５】
【図１２】本試験に使用したＣＤ１６キメラ受容体の模式図を示す。
【００３６】
【図１３】異なるシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１６Ｖ受容体の発現を示す。フローサイトメトリードットプロットは、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)単独(偽)または種々のＣＤ１６Ｖ構築物を含むベクターを形質導入した活性化Ｔリンパ球におけるＧＦＰと組み合わせたＣＤ１６の発現(３Ｇ８抗体で検出)を示す。各１／４区における陽性細胞のパーセンテージを示す。
【００３７】
【図１４】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζが、異なるシグナル伝達特性を有するＣＤ１６Ｖ受容体よりも高いＴ細胞活性化、増殖および細胞毒性を誘発することを示す。Ａ. ダウディ細胞およびリツキシマブ(０.１μg／mL)と４８時間共培養後の、種々のキメラ受容体を発現するＴリンパ球における、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)平均蛍光強度(ＭＦＩ)に対してプロットした、フローサイトメトリーにおけるＣＤ２５のＭＦＩ。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζのＣＤ２５発現は、ＣＤ１６Ｖ−ζ、ＣＤ１６Ｖ−ＦｃεＲＩγまたはシグナル伝達能がないＣＤ１６Ｖ(“ＣＤ１６Ｖ切断”)で誘発されるより有意に高かった(直線回帰分析によりＰ＜０.０００１)。Ｂ. 種々のＣＤ１６Ｖ受容体を形質導入されたＴリンパ球をダウディ細胞、ＳＫ−ＢＲ−３細胞またはＮＢ１６９１細胞と、それぞれリツキシマブ、トラスツズマブおよびｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ存在下で培養した。全抗体を０.１μg／mLで使用した。記号は、投入細胞数と比較した回収細胞パーセンテージを示し(３実験の平均±ＳＤ)、培養１〜３週間目の細胞数は、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体が、対応のあるｔ検定で全３培養について全ての他の受容体より有意に高かった(Ｐ＜０.０００１)。Ｃ. ダウディ、ＳＫ−ＢＲ−３およびＮＢ１６９１に対する、それぞれ、リツキシマブ、トラスツズマブおよびｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ存在下の、種々のＣＤ１６Ｖ受容体を発現するＴリンパ球または偽形質導入Ｔ細胞のＡＤＣＣ。記号は、記載したＥ：Ｔでの３培養の平均±ＳＤである。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体での細胞毒性は、他の全ての受容体より有意に高く(全比較においてｔ検定でＰ＜０.０００１)、一方、偽形質導入またはＣＤ１６Ｖ切断受容体形質導入したリンパ球の細胞毒性は、互いに有意差はなく(Ｐ＞０.０５)、ＣＤ１６Ｖ−ＦｃεＲＩγでの細胞毒性は、ダウディ(Ｐ＝０.００６)およびＳＫ−ＢＲ−３(Ｐ＝０.０１９)に対してＣＤ３−ζより高く、いずれかの受容体を発現するリンパ球は、偽形質導入またはＣＤ１６Ｖ切断形質導入したものより細胞毒性が高かった(全比較についてＰ＜０.０１)。
【００３８】
【図１５】ｍＲＮＡエレクトロポレーションによるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現を示す。Ａ. 活性化Ｔリンパ球をＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  ｍＲＮＡと共にまたはｍＲＮＡ非存在下(偽)に電気穿孔し、ＣＤ１６の発現を、２４時間後にフローサイトメトリーにより試験した。Ｂ. 偽またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ電気穿孔Ｔ細胞の細胞毒性を、リツキシマブの存在下、ラモス細胞株に対して試験した。記号は、細胞毒性パーセントの平均±ＳＤを示す(ｎ＝３；全Ｅ：Ｔ比での比較についてＰ＜０.０１)。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な記載
本発明は、癌処置における抗癌抗体の有効性を増強する新規キメラ受容体の構築に基づく。αβ  Ｔ細胞受容体を発現するＴリンパ球(Ｔ細胞の大部分)は活性化ＦｃγＲを欠き、抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を仲介しない。Nimmerjahn et al., Nat Rev Immunol. 2008;8(1):34-47。本発明は、ＦｃγＲおよびＴ細胞シグナル伝達分子からなるキメラ受容体の発現がこれらの細胞にＡＤＣＣ能を与え、それゆえに、標的腫瘍抗原と関係なく、モノクローナル抗体(ならびに、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分またはＦｃ含有ＤＮＡもしくはＲＮＡと組み合わさった腫瘍表面受容体に結合するリガンド(例えば、サイトカイン、免疫細胞受容体)からなる混成分子のようなＦｃ部分を含む他の抗腫瘍分子)の抗腫瘍潜在能を有意に増強することを示す。このようなキメラ受容体を発現するＴリンパ球の抗体誘導抗腫瘍活性をここに記載する。
【００４０】
本発明は、(ｉ)Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３Ａまたは高親和性Ｖ１５８  ＦＣＧＲ３Ａバリアントであり得るＣＤ１６分子の細胞外リガンド結合ドメイン、(ii)ＣＤ８αのヒンジドメインおよび膜貫通型ドメインならびに(ii)ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を提供する。本発明のキメラ受容体は、多様な腫瘍に対する抗体治療の有効性を有意に増強する可能性を有する、普遍的キメラ受容体である。下の実施例の章に記載するとおり、レトロウイルス形質導入によりヒトＴ細胞で発現したとき、本発明の受容体は、共通Ｆ１５８バリアントを含む他方の受容体と比較して、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブのようなヒト化抗体を含むヒトＩｇＧに有意に高い親和性を有する。キメラ受容体の結合はＴ細胞活性化、溶解性顆粒のエキソサイトーシスおよび増殖を誘発する。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ発現Ｔ細胞は、低エフェクター：標的比で、リツキシマブの存在下、リンパ腫細胞株および初代慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)細胞を、ＣＬＬ培養を骨髄由来間葉性細胞上で行ったときでさえ、特異的に殺す。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブは、乳癌および胃癌細胞に対する、そして抗ＧＤ２抗体ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａは神経芽腫および骨肉腫細胞に対するキメラ受容体介在抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を誘発する。実施例の章にさらに記載するとおり、キメラ受容体とリツキシマブを組み合わせて発現するＴ細胞は、免疫欠損マウスにおいてヒトリンパ腫細胞を根絶させ、Ｔ細胞または抗体単独ではさせなかった。この技術の臨床応用を促進するために、ウイルスベクターを使用することなく、効率的かつ一過性の受容体発現に至る、キメラ受容体ｍＲＮＡのエレクトロポレーションに基づく方法がここに開示するとおりに開発された。
【００４１】
定義
ここで使用する用語“キメラ受容体”は、単一のタンパク質上で一緒には天然で見られない組み合わせで、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインを含む細胞表面受容体として定義される。本発明のキメラ受容体は主としてＴ細胞と共に使用することが意図されるが、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞との使用も可能である。
【００４２】
用語“約”または“凡そ”は、当業者により決定される特定の値の許容される誤差範囲内を意味し、これは、一部、そのようにその値を測定したかまたは決定したか、すなわち、測定系の限界による。例えば、“約”は、当分野の実務による、許容される標準偏差を意味し得る。あるいは、“約”は、ある値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、さらに好ましくは最大±１％を意味し得る。あるいは、特に生物学的系または過程において、本用語は、ある値から１桁以内、好ましくは２倍以内であることを意味し得る。特定の値が本明細書および特許請求の範囲に記載されているとき、特に断らない限り、用語“約”が含意され、この文脈で、特定の値に対する許容される誤差範囲内を意味する。
【００４３】
本発明の状況において、ここに列記する疾患状態のいずれかに関する限り、用語“処置”、“処置する”などは、このような状態に付随する少なくとも一つの症状の緩和もしくは軽減またはこのような状態の進行の遅延もしくは逆転を意味する。本発明のこの意味の範囲内で、用語“処置”はまた停止、発症(すなわち、疾患の臨床的顕在化までの期間)遅延および／または疾患発症もしくは悪化のリスクの低減も意味する。例えば、癌と関連して、用語“処置”は、患者の腫瘍負荷の排除もしくは軽減または転移の予防、遅延または阻止などを意味し得る。
【００４４】
ここで使用する、用量または量に適用される“治療上有効”なる用語は、処置を必要とする対象に投与したときに、所望の活性を生じるのに十分な化合物または医薬組成物(例えば、本発明のキメラ受容体を含み、所望により腫瘍特異的細胞毒性モノクローナル抗体またはＦｃ部分を含む他の抗腫瘍分子(例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分またはＦｃ含有ＤＮＡもしくはＲＮＡと組み合わさった腫瘍表面受容体と結合したリガンド(例えば、サイトカイン、免疫細胞受容体)からなる混成分子)をさらに含む、Ｔリンパ球(および／またはＮＫ細胞)を含む組成物)の量をいう。本発明の状況内で、用語“治療上有効”は、本発明の方法により処置される障害の少なくとも一つの症状の顕在化遅延、進行停止、緩和または軽減に有効である化合物または医薬組成物の量をいう。活性成分の組み合わせが投与されるとき、該組み合わせの有効量は、個々に投与されたときに有効であろう各成分の量を含む場合もあれば含まない場合もあることに注意すべきである。
【００４５】
本発明の組成物に関連してここで使用する用語“薬学的に許容される”は、哺乳動物(例えば、ヒト)に投与したときに、生理学的に耐容性であり、典型的に望ましくない反応を生じない、このような組成物の分子実体および他の成分をいう。好ましくは、ここで使用する用語“薬学的に許容される”は、哺乳動物、より具体的にヒトにおける使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局に承認されたまたは米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。
【００４６】
ここで使用する用語“対象”はあらゆる哺乳動物をいう。好ましい態様において、対象はヒトである。
【００４７】
本明細書および添付する特許請求の範囲で使用する単数表現は、文脈から他のことが明確に示されない限り、複数表現を含む。
【００４８】
本発明によって、当業者が備えている技能の範囲内で従来の分子生物学、微生物学および組み換えＤＮＡ技術を使用し得る。このような技術は文献に十分説明されている。例えば、とりわけSambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (herein “Sambrook et al., 1989”); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986); B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照のこと。
【００４９】
本発明のキメラ受容体
本発明は、(ａ)Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３ＡまたはＶ１５８  ＦＣＧＲ３Ａバリアントの細胞外リガンド結合ドメイン(例えば、それぞれ配列番号１６または配列番号２)；(ｂ)ＣＤ８αのヒンジドメインおよび膜貫通型ドメイン(例えば、配列番号３)；および(ｃ)４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン(例えば、配列番号４)およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン(例えば、配列番号５)を含む細胞質ドメインを含む、キメラ受容体を提供する。キメラ受容体は、さらに、ＣＤ８αのシグナルペプチド、例えば、配列番号６を含み得る。ある特定の態様において、キメラ受容体は、配列番号１または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。一例において、キメラ受容体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζである。他の例において、キメラ受容体は、配列番号１５のアミノ酸配列からなるＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζである。
【００５０】
一つの態様において、本発明のキメラ受容体は、ここに記載する２個のシグナル伝達ドメイン、すなわち、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ１３７に加えて１個以上のシグナル伝達ドメインを含む。一つの特定の態様において、数個のシグナル伝達ドメインが、相加的または相乗的作用のために互いに融合している。有用な付加的シグナル伝達ドメインの非限定的例は、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩｙ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２およびＣＤ４０の１個以上の一部または全てを含む。
【００５１】
本発明はまた、上記キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドを提供する。ある特定の態様において、Ｖ１５８  ＦＣＧＲ３Ａバリアントの細胞外リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。あるいは、Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３Ａ細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様において、ＣＤ８αのヒンジドメインおよび膜貫通型ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様において、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様において、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様において、ＣＤ８αのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
一例において、キメラ受容体はＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζのポリヌクレオチドをコードし、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。他の例において、キメラ受容体はＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζのポリヌクレオチドをコードし、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。
【００５３】
ポリヌクレオチドと併せて、本発明はまたこのようなポリヌクレオチドを含むベクター(このようなポリヌクレオチドがキメラ受容体の発現のための少なくとも１個の調節エレメントと作動可能なように結合しているベクターを含む)も提供する。本発明の有用なベクターの非限定的例は、例えば、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。
【００５４】
一つの特定の態様において、このようなベクターはまた自殺遺伝子を含む。ここで使用する用語“自殺遺伝子”は、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子をいう。自殺遺伝子は、該遺伝子が発現された細胞に薬剤、例えば、医薬に対する感受性を付与し、該細胞が該薬剤と接触したときまたは該薬剤に暴露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は当分野で知られ(例えば、Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004参照)、例えば、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)チミジンキナーゼ(ＴＫ)遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼおよびカスパーゼ８のようなカスパーゼを含む。
【００５５】
本発明はまた上記キメラ受容体を含む宿主細胞を提供する。有用な宿主細胞の非限定的例は、Ｔリンパ球およびＮＫ細胞を含み、これは自己でも同種異系でもよい(内在性Ｔ細胞受容体は除去されているかまたは保持されている)。ある特定の態様において、宿主細胞は、癌を有する患者から単離された自己Ｔリンパ球である。一つの特定の態様において、このような自己Ｔリンパ球をエクスビボで活性化および増殖する。
【００５６】
本発明のキメラ受容体は、当分野で知られる任意の方法により宿主細胞に導入できる。特に有用な方法の非限定的例は、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入およびＤＮＡおよびｍＲＮＡエレクトロポレーションを含む。下記実施例に示すとおり、ｍＲＮＡエレクトロポレーションは、Ｔリンパ球における本発明のキメラ受容体の有効な発現を生じる。レトロウイルス形質導入を記載する参考文献の例は、Anderson et al.、米国特許５,３９９,３４６号; Mann et al., Cell 33:153 (1983); Temin et al., U.S. Pat. No. 4,650,764; Temin et al.、米国特許５,１２４,２６３号；Dougherty et al.の国際特許公開ＷＯ９５／０７３５８号(１９９５年３月１６日公開)；およびKuo et al., Blood 82:845 (1993)を含む。国際特許公開ＷＯ９５／０７３５８号は、初代Ｂリンパ球の高効率形質導入を記載する。例えば、使用できるレトロウイルス形質導入およびｍＲＮＡエレクトロポレーションの具体的技術についてまた下の実施例の章も参照のこと。
【００５７】
宿主細胞活性化および増殖を使用して、通常ウイルスベクターのゲノムへの組込みおよび本発明のキメラ受容体をコードする遺伝子の発現を可能とする。しかしながら、ｍＲＮＡエレクトロポレーションを使用するならば、活性化および増殖は必要ない(エレクトロポレーションは、活性化細胞上で実施するときにより有効ではあるが)。ウイルス形質導入の結果として、宿主細胞(Ｔリンパ球またはＮＫＴ細胞)は、該受容体が一過性に(典型的に３〜５日)発現されたときのｍＲＮＡエレクトロポレーションよりも強い効果を生じる可能性を有して、長期間本発明のキメラ受容体を発現する。しかしながら、ウイルス形質導入は複雑であり、高価であり、実行が困難であるが、一方ｍＲＮＡエレクトロポレーションははるかに単純であり、実行がはるかに容易である。さらに、一過性発現は、毒性の可能性があるならば有用であり、副作用の可能性のために臨床試験の初期相で役立つはずである。
【００５８】
本発明の医薬組成物
本発明のさらなる面は医薬組成物を提供する。一つの態様において、本発明は、(ｉ)本発明のキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび(ii)薬学的に許容される担体または添加物を含む医薬組成物を提供する。
【００５９】
他の態様において、本発明は、(ｉ)本発明のキメラ受容体を含む宿主細胞および(ii)薬学的に許容される担体または添加物を含む医薬組成物を提供する。一つの特定の態様において、このような医薬組成物は、さらに、癌細胞に対する細胞毒性を発揮できるモノクローナル抗体(例えば、リツキシマブ、トラスツズマブ、ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａなど)またはＦｃ部分を含む他の抗腫瘍分子(例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分またはＦｃ含有ＤＮＡもしくはＲＮＡと組み合わせて腫瘍表面受容体に結合したリガンド(例えば、サイトカイン、免疫細胞受容体)からなる混成分子)をさらに含む。
【００６０】
本発明の医薬組成物で使用するための適当な添加物は当業者に周知であり、例えば、組織培養培地(例えば、細胞をエクスビボで生存させるため)または食塩水溶液(例えば、細胞を患者に注射するとき)を含み得る。薬学的に許容される添加物の詳細な記載は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)から入手可能である。
【００６１】
本発明の医薬組成物はまた、処置する特定の適応症にとって必要であるならば、１個以上の付加的活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない、補完的活性を有するものも含み得る。可能な付加的活性化合物の非限定的例は、例えば、ＩＬ−２ならびに下記の組み合わせ処置の記載において挙げた種々の薬剤を含む。
【００６２】
本発明の治療法
本発明のキメラ受容体は、Ｔリンパ球に抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)能を与え、ＮＫ細胞におけるＡＤＣＣを増強する。受容体が腫瘍細胞に結合する抗体(またはＦｃ部分を含む他の抗腫瘍分子)により結合されたら、Ｔ細胞活性化、持続増殖および該抗体(またはＦｃ部分を含むこのような他の抗腫瘍分子)が標的とする癌細胞に対する特異的細胞毒性が誘発される。下の実施例の章に記載するとおり、本発明の受容体を含むＴリンパ球は、Ｂ細胞リンパ腫、乳癌および胃癌、神経芽腫および骨肉腫を含む広範な腫瘍細胞型ならびに初代慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)に対して高度に細胞毒性であった。細胞毒性は、標的細胞に結合した特異的抗体の存在に完全に依存し、可溶性抗体は、細胞溶解性顆粒のエキソサイトーシスを誘発せず、非特異的細胞毒性を誘発しなかった。ＩｇのＦｃ部分に対するＣＤ１６の親和性の程度がＡＤＣＣ、ゆえに、抗体免疫療法に対する臨床応答の重要な決定因子である。１５８Ｖ多型性を有するＣＤ１６を例として選択し、このバリアントはＩｇに高結合親和性を有し、優れたＡＤＣＣを仲介した。
【００６３】
本発明のキメラ受容体は、多様な癌細胞型に対してある１個の受容体を使用することを可能にするＴ細胞治療を促進する。腫瘍が利用する免疫逃避機構を考えると、最終的に有利であり得る戦略である、同時に多様な抗原のターゲティングも可能とする(Grupp et al., N. Engl. J. Med. 2013; 368(16):1509-1518)。抗体介在性細胞毒性は、抗体投与の単純な中止により、いつでも何時用であれば停止できる。本発明のキメラ受容体を発現するＴ細胞が、標的細胞に結合した抗体によってのみ活性化されるため、未結合免疫グロブリンは、注入されたＴ細胞内に何ら刺激を発揮しない。何らかの可能性のある自己免疫性反応性を制限するために、キメラ受容体を一過性に発現するためのｍＲＮＡエレクトロポレーションの使用によりさらに臨床的安全性を高め得る。
【００６４】
下の実施例の章に記載する結果は、自己Ｔ細胞の注入、エクスビボでの活性化および増殖および本発明のキメラ受容体で遺伝子修飾後の再注入が、ＡＤＣＣを著しく押し上げることを示す。組み合わせたＣＤ３ζ／４−１ＢＢシグナル伝達もＴ細胞増殖を起こすため、腫瘍部位へ活性化Ｔ細胞が蓄積され、これがその活性をさらに増強し得る。
【００６５】
それゆえに、一つの態様において、本発明は、癌の抗体利用免疫療法の効果を、それを必要とする対象(該対象は、癌細胞と結合でき、ヒトＣＤ１６と結合できるヒト化Ｆｃ部分を有する抗体で処置されている)において増強する方法であって、該対象にＴリンパ球またはＮＫ細胞(該Ｔリンパ球またはＮＫ細胞は本発明のキメラ受容体を含む)の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００６６】
他の態様において、本発明は、対象にＴリンパ球またはＮＫ細胞(該Ｔリンパ球またはＮＫ細胞は本発明のキメラ受容体を含む)を投与することを含む、対象におけるＴリンパ球またはＮＫ細胞ＡＤＣＣ活性を増強する方法を提供する。一つの態様において、対象は癌を有する。一つの特定の態様において、このような対象は、癌細胞と結合できる抗体で処置されている。
【００６７】
上記方法の一つの態様において、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞は、該対象から単離された自己Ｔリンパ球またはＮＫ細胞である。一つの特定の態様において、対象への再導入前に、自己Ｔリンパ球またはＮＫ細胞をエクスビボで活性化および／または増殖する。他の態様において、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞は同種異系Ｔリンパ球またはＮＫ細胞である。ある特定の態様において、Ｔリンパ球は内在性Ｔ細胞受容体の発現が阻止されているまたは排除されている同種異系Ｔリンパ球である。一つの特定の態様において、対象への導入前に、同種異系Ｔリンパ球をエクスビボで活性化および／または増殖する。Ｔリンパ球は、例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−２および／またはフィトヘマグルチニンの存在下、当分野で知られる任意の方法により活性化できる。ＮＫ細胞は、例えば、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２タンパク質、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−２１タンパク質およびＫ５６２細胞株からなる群から選択される１個以上の薬剤の存在下、当分野で知られる任意の方法により活性化できる。例えば、ＮＫ細胞を増殖するための有用な方法の記載について米国特許７,４３５,５９６号および８,０２６,０９７号を参照のこと。
【００６８】
上記方法の一つの態様において、キメラ受容体を、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入またはＤＮＡまたはＲＮＡエレクトロポレーションによりＴリンパ球またはＮＫ細胞(例えば、エクスビボ活性化および／または増殖後)に導入する。
【００６９】
上記方法の一つの態様において、対象へのＴリンパ球またはＮＫ細胞の導入(または再導入)に続いて、ＩＬ−２の治療有効量を対象に投与する。
【００７０】
本発明のキメラ受容体は、ＣＤ１６に結合するＦｃ部分を伴う特異的抗体が存在するかまたは産生できる、癌、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫および白血病を含むが、これらに限定されないあらゆる癌の処置に使用し得る。本発明のキメラ受容体により処置できる癌の具体的非限定的例は、例えば、Ｂ細胞起源の癌(例えば、Ｂ細胞系譜急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫)、乳癌、胃癌、神経芽腫および骨肉腫を含む。
【００７１】
本発明の方法により有効性が増強できる、ヒトＣＤ１６と結合できるＦｃ部分を含む抗癌抗体の非限定的例は、例えば、リツキシマブ、トラスツズマブ、ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ、エピラツズマブ、セツキシマブおよびラベツズマブを含む。
【００７２】
使用する抗体の適切な投与量は、処置する癌のタイプ、疾患の重篤度および経過、先の治療、患者の臨床歴および抗体に対する応答および処置医の裁量による。抗体を、患者に一度にまたは一連の複数処置で投与できる。本発明の治療の進行は従来の技術およびアッセイにより容易にモニターできる。
【００７３】
抗体の投与は、全身投与ならびに疾患の部位への(例えば、初代腫瘍への)直接投与を含む、任意の適当な経路により実施できる。
【００７４】
本発明の方法において使用するＴリンパ球は、最も好ましくは、先に血液サンプルから単離され、好ましくは例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、ＩＬ−２またはフィトヘマグルチニンのような標準法を用いてエクスビボで活性化および増殖(例えば、３〜５日)されている、患者の自身の細胞(すなわち、自己細胞)である。あるいは、同種異系Ｔリンパ球を使用できる(好ましくは内在性Ｔ細胞受容体の発現が阻止されているまたは排除されている同種異系Ｔリンパ球)。Torikai et al., Blood, 2012 119: 5697-5705参照。単離(および所望により活性化および／または増殖)後、患者からのＴリンパ球およびＮＫ細胞に、本発明のキメラ受容体をコードするポリヌクレオチド(またはそのようなポリヌクレオチドを含むベクター)を形質導入(または電気穿孔)し、そうして、キメラ受容体がＴ細胞またはＮＫ細胞の細胞表面に発現されるようにする。修飾細胞をその後患者に投与できる(例えば、治療用抗体点滴１日後)。
【００７５】
本発明によって、患者は、約１０５〜１０１０以上の細胞／体重キログラム(細胞／Kg)の範囲の治療上有効投与量の本発明のキメラ受容体を含むＴリンパ球またはＮＫ細胞の注入により処置され得る。注入は、所望の応答が達成されるまで、患者が耐容性を示し得る限り、できるだけ頻繁にかつ多くの回数、反復し得る。適切な注入用量およびスケジュールは患者毎に異なるであろうが、特定の患者について処置医が決定できる。典型的に、約１０６細胞／Kgの初回投与量を注入し、１０８以上の細胞／Kgまで増加させる。ＩＬ−２を、注入細胞を注入後増殖させるために併用できる。ＩＬ−２の量は、約１〜５×１０６国際単位／体表面平方メートルであり得る。
【００７６】
本発明の方法において使用するＮＫ細胞は、主要組織適合抗原Ｉおよび／またはII分子を欠くかほとんど発現せず、膜結合ＩＬ−１５および４−１ＢＢリガンド(ＣＤＩ３７Ｌ)を発現するように遺伝子修飾されている細胞に暴露することにより優先的に増殖され得る。このような細胞株は、Ｋ５６２[ＡＴＣＣ、ＣＣＬ  ２４３; Lozzio et al., Blood 45(3): 321-334 (1975); Klein et al., Int. J. Cancer 18: 421-431 (1976)]およびウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ[Fehniger T A, Caligiuri M A. Int Rev Immunol 20(3-4):503-534 (2001); Harada H, et al., Exp Hematol 32(7):614-621 (2004)]、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−II、肝芽腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞癌細胞株Ｌｕ−１３０およびＬｕ−１３４−Ａ、神経芽腫細胞株ＮＢ  １９およびＮ１３６９、精巣ＮＥＣ  １４由来の胚性癌細胞株、頸癌細胞株ＴＣＯ−２および骨髄転移神経芽腫細胞株ＴＮＢ  １[Harada H., et al., Jpn. J. Cancer Res 93: 313-319 (2002)]を含むが、必ずしもこれらに限定されない。好ましくは使用する細胞株は、Ｋ５６２およびＨＦＷＴ細胞株のように、ＭＨＣ  ＩおよびII分子の両者を欠くかほとんど発現しない。固体支持体を細胞株の代わりに使用し得る。このような支持体は、好ましくはＮＫ細胞と結合し、初期活性化事象および／または増殖性応答を誘発するかまたはこのような作用を有する分子の結合が可能であり、それにより足場として作用する少なくとも１個の分子がその表面に結合している。支持体は、その表面にＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５受容体抗体が結合していてよい。好ましくは、支持体は、その表面に結合したＩＬ−１５受容体抗体およびＣＤ１３７抗体を有する。
【００７７】
本発明の組み合わせ処置
本明細書に記載する組成物および方法は、化学療法、手術、放射線、遺伝子治療などのような癌のための他のタイプの治療と組み合わせて利用し得る。このような治療は、本発明に従う免疫療法と同時にまたは逐次的に(任意の順序で)適用し得る。
【００７８】
さらなる治療剤と併用するとき、各薬剤の適当な治療上有効な投与量は、相加的または相乗的作用により減少させ得る。
【００７９】
本発明の処置を、例えば、治療用ワクチン(ＧＶＡＸ、ＤＣワクチンなどを含むが、これらに限定されない)、チェックポイント阻害剤(ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３などを遮断する薬剤を含むが、これらに限定されない)またはアクティベーター(４１ＢＢ、ＯＸ４０などを増強する薬剤を含むが、これらに限定されない)のような、他の免疫調節処置と組み合わせ得る。
【００８０】
本発明の免疫療法との組み合わせに有用な他の治療剤の非限定的例は次のものを含む。
(ｉ) 抗血管形成剤(例えば、ＴＮＰ−４７０、血小板因子４、トロンボスポンジン−１、組織メタロプロテアーゼ阻害物質(ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２)、プロラクチン(１６Kdフラグメント)、アンジオスタチン(プラスミノーゲンの３８Kdフラグメント)、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターフェロンアルファ、可溶性ＫＤＲおよびＦＬＴ−１受容体、胎盤のプロリフェリン関連タンパク質ならびにCarmelietおよびJain(2000)に記載のもの；
【００８１】
(ii) 抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体フラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲが遮断できるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤およびこれらの任意の組み合わせのようなＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト；
【００８２】
(iii) 例えば、ピリミジンアナログ(５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン)、プリンアナログ、葉酸アンタゴニストおよび関連阻害剤(メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン(クラドリビン))のような化学療法化合物；ビンカアルカロイド(ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン)のような天然産物、タキサン(パクリタキセル、ドセタキセル)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン類およびナベルビンのような微小管撹乱因子、エピポドフィロトキシン(エトポシド、テニポシド)、ＤＮＡ傷害剤(アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン類、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミン、オキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホロアミドおよびエトポシド(ＶＰ１６))を含む抗増殖性／有糸分裂阻害剤；ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ)、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン、アントラサイクリン類、ミトキサントロン、ブレオマイシン類、プリカマイシン(ミトラマイシン)およびマイトマイシンのような抗生物質；酵素(Ｌ−アスパラギンを全身性に代謝し、自身のアスパラギンを合成する能力を有しない細胞を取り除くＬ−アスパラギナーゼ)；抗血小板剤；窒素マスタード類(メクロレタミン、シクロホスファミドおよびアナログ、メルファラン、クロラムブシル)、エチレンイミン類およびメチルメラミン類(ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ)、アルキルスルホネート類−ブスルファン、ニトロソウレア類(カルムスチン(ＢＣＮＵ)およびアナログ、ストレプトゾシン)、トラゼン類−ダカルバジン(ＤＴＩＣ)のような抗増殖性／抗有糸分裂アルキル化剤；葉酸アナログ(メトトレキサート)のような抗増殖性／抗有糸分裂代謝拮抗剤；白金配位錯体類(シスプラチン、カルボプラチン)、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン類、ホルモンアナログ(エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド)およびアロマターゼ阻害剤(レトロゾール、アナストロゾール)；抗凝血剤(ヘパリン、合成ヘパリン塩類および他のトロンビン阻害剤)；線維素溶解性剤(例えば組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ)、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤(ブレフェルジン)；免疫抑制剤(シクロスポリン、タクロリムス(ＦＫ−５０６)、シロリムス(ラパマイシン)、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル)；抗血管形成化合物(例えば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ)および増殖因子阻害剤(例えば、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)阻害剤)；アンギオテンシン受容体ブロッカー；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体(トラスツズマブ)；細胞周期阻害剤および分化誘導因子(トレチノイン)；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤(ドキソルビシン(アドリアマイシン)、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、テニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン)、コルチコステロイド(コルチゾン、デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾンおよびプレドニゾロン)；増殖因子シグナル形質導入キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導因子およびカスパーゼアクティベーター；および染色質撹乱因子。
【００８３】
さらなる有用な薬剤の例についてはまたPhysician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.Jを参照のこと。
【００８４】
さらに詳述することなく、当業者は、上の記載に基づき、本発明を最大限に利用できると考える。次の具体的態様は、それゆえに、単なる例示と解釈すべきであり、決して本開示の残りを限定するものではない。ここに引用する全ての刊行物は、ここに言及した目的または対象のために、引用により本明細書に包含させる。
【実施例】
【００８５】
本発明を、次の実施例によってまた記載し、示す。しかしながら、本明細書におけるこれらのおよび他の実施例の使用は単なる説明であって、本開示もしくは例示的用語の範囲または意味を決して限定しない。同様に、本発明はここに記載する何らかの特定の好ましい態様に限定されない。実際、本発明の多くの修飾および改変が、本明細書を読んだ当業者には明らかである可能性があり、このような変動は、性質または範囲において本開示から逸脱することなく為し得る。
【００８６】
材料および方法
細胞
ヒトＢ細胞系譜リンパ腫細胞株ダウディおよびラモス、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株ジャーカットおよび神経芽腫細胞株ＣＨＬＡ−２５５、ＮＢ１６９１およびＳＫ−Ｎ−ＳＨは、St. Jude Children's Research Hospitalから入手可能であった。乳癌細胞株ＭＣＦ−７(ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２)およびＳＫ−ＢＲ−３(ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３０)および骨肉腫細胞株Ｕ−２  ＯＳ(ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９６)は、American Type Culture Collection(ＡＴＣＣ; Rockville, MD)から得て、胃癌細胞株ＭＫＮ７は、独立行政法人医薬基盤研究所(大阪、日本)から得た。ダウディ、ＣＨＬＡ−２５５、ＮＢ１６９１、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、Ｕ−２  ＯＳおよびＭＫＮ７も、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むマウス幹細胞ウイルス(ＭＳＣＶ)−配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)−緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)レトロウイルスベクターを形質導入した(Fujisaki et al., Cancer Res. 2009; 69(9):4010-4017)。形質導入細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別機(BD Biosciences, San Jose, CA)を用いてＧＦＰの発現について選択した。インフォームド・コンセントおよびシンガポール国立大学病院を管理する領域特化型倫理委員会の承認の後、Ｂ慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)と新たに診断され、かつ未処置の患者からの末梢血または骨髄サンプルを得た。
【００８７】
末梢血サンプルを、健常成人ドナーからの血小板献血の非特定化副産物から得た。単核細胞を、Accu-Prepヒトリンパ球細胞分離培地(Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, N.Y.)上での遠心により富化し、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)、抗生物質、１００IU  インターロイキン(ＩＬ)−２(Roche, Mannheim, Germany)を添加したＲＰＭＩ−１６４０中、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)と３日培養した。４日目に、Ｔ細胞をＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３およびＣＤ２３５ａ抗体の混合物と磁気ビーズを用いるネガティブセレクションにより精製した(Pan T Cell Isolation Kit II; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)(純度＞９８％)。精製したＴ細胞を、隔日で１００IU  ＩＬ−２を添加しながら、上記培地に維持した。
【００８８】
プラスミド、ウイルス産生および遺伝子形質導入
ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、ｐＥＱ−ＰＡＭ３(−Ｅ)およびｐＲＤＦを、St. Jude Children's Research HospitalのVector Development and Production Shared Resource(Memphis, TN)10から得た。ＦＣＲＧ３Ａ  ｃＤＮＡをOrigene(Rockville, MD)から得て、“Ｆ”プライマーＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＴＴＧＴＴＧＧＧＡＧＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧＴＣ(配列番号７)および“Ｒ”プライマーＧＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧ(配列番号８)を使用するＰＣＲによる部位特異的変異誘発を使用してそのＶ１５８Ｆバリアントを産生した。ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通型ドメイン(配列番号１１)および４−１ＢＢ(配列番号１２)およびＣＤ３ζ(配列番号１３)の細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドを、先に製造された抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ｃＤＮＡからサブクローニングした。Imai et al., Leukemia 2004; 18:676-684を参照のこと。これらの分子を、ＰＣＲでの重複伸長によるスプライシングを使用して組み立てた。構築物(“ＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ”および“ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ”)および発現カセットを、ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩ部位およびＭＬｕ１部位にサブクローニングした。
【００８９】
ＲＤ１１４シュードタイプ化レトロウイルスを産生するために、ｆｕＧＥＮＥ  ６またはＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９(Roche, Indianapolis, IN)を使用して、３.５μgのＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζをコードするｃＤＮＡ、３.５μgのｐＥＱ−ＰＡＭ３(−Ｅ)および３μgのｐＲＤＦで３×１０６  ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした(Imai et al., Leukemia 2004; 18:676-684)。２４時間目に培地を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０に置き換えた後、レトロウイルスを含む培地を４８〜９６時間後に回収し、レトロネクチン(タカラ、大津、日本)被覆ポリプロピレンチューブに入れ、これを１４００ｇで１０分遠心分離し、３７℃で６時間インキュベートした。さらに遠心分離し、上清を除去した後、Ｔ細胞(１×１０５)をチューブに入れ、３７℃で２４時間静置した。その後、細胞を形質導入後７〜２１日に実験するときまで、ＦＢＳ、抗生物質および１００IU／mL  ＩＬ−２添加ＲＰＭＩ−１６４０に維持した。
【００９０】
ＣＤ１６の表面発現を、Ｒ−フィコエリトリン接合抗ヒトＣＤ１６(クローンＢ７３.１、BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)を使用するフローサイトメトリーで分析した。ウェスタンブロッティングのために、２×１０７  Ｔ細胞を、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma, St Louis, MO)および１％ホスファターゼ阻害剤カクテル２(Sigma)を含むCellytic M lysis Buffer(Sigma)に溶解した。遠心分離後、ライセート上清を、等量のＬＤＳ緩衝液(Invitrogen, Carlsbad, CA)と、還元緩衝液(Invitrogen)存在下または比存在下で沸騰させ、次いでNuPAGE Novex 12%Bis-Tris Gel(Invitrogen)により分離した。タンパク質をポリフッ化ビニリデン(ＰＶＤＦ)膜に移し、これをマウス抗ヒトＣＤ３ζ(クローン８Ｄ３; BD eBioscience Pharmingen)、次いでヤギ抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ接合二次抗体(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)とインキュベートした。抗体結合を、Amersham ECL Prime検出試薬(GE Healthcare)を使用して明らかにした。
【００９１】
ｍＲＮＡエレクトロポレーション
ｐＶＡＸ１ベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)をインビトロｍＲＮＡ転写のための鋳型として使用した。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  ｃＤＮＡを、ｐＶＡＸ１のＥｃｏＲＩ部位およびＸｂａＩ部位にサブクローニングした。対応するｍＲＮＡを、インビトロでＴ７  ｍＳｃｒｉｐｔ  ｍＲＮＡ産生系(CellScript, Madison, WI)を用いて転写した。例えば、Shimasaki et al., Cytotherapy. 2012;14(7):830-40を参照のこと。
【００９２】
エレクトロポレーションのために、Amaxa Nucleofector(Lonza, Walkersville, MD)を使用し、１×１０７の精製Ｔ細胞活性化と２００IU／mL  ＩＬ−２を、一夜２００μg／mL  ｍＲＮＡとCell Line Nucleofector Kit V(Lonza)と混合し、処理チャンバーに移し、プログラムＸ−００１を使用してトランスフェクトした。エレクトロポレーション直後、細胞を処理チャンバーから２４ウェルプレートに移し、ＦＢＳ、抗生物質および１００IU／mL  ＩＬ−２(Roche, Mannheim, Germany)添加ＲＰＭＩ−１６４０で培養した。またShimasaki et al., Cytotherapy, 2012, 111も参照のこと。
【００９３】
抗体結合、細胞接合および細胞増殖アッセイ
キメラ受容体の抗体結合能を測定するために、キメラ受容体またはＧＦＰのみを含むベクターを形質導入したＴリンパ球(５×１０５)をリツキシマブ(リツキサン、Roche; ０.１〜１μg／mL)、トラスツズマブ(ハーセプチン; Roche; ０.１〜１μg／mL)および／または精製ヒトＩｇＧ(R&D Systems, Minneapolis, MN ; ０.１〜１μg／mL)と、３０分、４℃でインキュベートした。リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で２回洗浄後、細胞をヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)と１０分、室温でインキュベートし、細胞染色をAccuri C6 flow cytometer(BD Biosciences)を使用して測定した。
【００９４】
受容体への抗体結合が細胞凝集により促進されるか否かを決定するために、ＣＤ２０陽性ダウディ細胞を、CellTraceカルセイン赤色−橙色ＡＭ(Invitrogen)で標識し、リツキシマブ(０.１μg／mL)で３０分、４℃でインキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、該細胞と、キメラ受容体形質導入または偽形質導入ジャーカット細胞と、１：１  Ｅ：Ｔ比で９６丸底プレート(Costar, Corning, NY)で、６０分、３７℃でインキュベートした。異種性細胞凝集塊(カルセインＡＭ−ＧＦＰ二重陽性)を形成する細胞の比を、フローサイトメトリーにより決定した。
【００９５】
細胞増殖を測定するために、キメラ受容体形質導入または偽形質導入した１×１０６のＴ細胞を、ＦＢＳ、抗生物質および５０IU／mL  ＩＬ−２添加ＲＰＭＩ−１６４０中、２４ウェルプレート(Costar, Corning, NY)のプレートに入れた。ダウディ細胞をStreck細胞防腐剤(Streck Laboratories, Omaha, NE)で処理して増殖を停止させ、リツキシマブ(０.１μg／mL)で、３０分、４℃で標識した。それらをウェルに添加し、０日目、７日目、１４日目および２１日目にＴ細胞を１：１比で添加した。培養後の生存可能Ｔ細胞数をフローサイトメトリーで測定した。
【００９６】
ＣＤ１０７脱顆粒および細胞毒性アッセイ
ＣＤ１６架橋が溶解性顆粒のエキソサイトーシスを引き起こすか否かを決定するために、キメラ受容体形質導入および偽形質導入Ｔ細胞(１×１０５)を、リツキシマブ被覆９６ウェル平底プレートの欠くウェルに入れ、４時間、３７℃で培養した。他の実験で、Ｔ細胞を、リツキシマブとプレインキュベートしたダウディ細胞と共培養した。フィコエリトリン(BD Biosciences)と接合した抗ヒトＣＤ１０７ａ抗体を培養開始時に添加し、１時間後、GolgiStop(０.１５μl; BD Biosciences)を添加した。ＣＤ１０７ａ陽性Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【００９７】
細胞毒性を試験するために、標的細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０に懸濁し、カルセインＡＭ(Invitrogen)で標識し、９６ウェル丸底プレート(Costar)に播種した。Ｔ細胞を、結果の欄に記載する種々のＥ：Ｔ比で添加し、標的細胞と、４時間、抗体リツキシマブ(リツキサン、Roche)、トラスツズマブ(ハーセプチン、Roche)またはｈｕ１４.１８Ｋ３２２ＡSt Jude Children's GMP, Memphis, TNのDr. James Allayから恵与；１μg／mL)存在下または非存在下に共培養した。培養の最後に、細胞を回収し、同体積のＰＢＳに再懸濁し、ヨウ化プロピジウムを添加した。生存可能標的細胞(カルセインＡＭ陽性、ヨウ化プロピジウム陰性)数を、Accuri C6 flow cytometerを使用して計数した(Fujisaki et al., Cancer Res. 2009; 69(9):4010-4017)。接着性細胞株について、細胞毒性を、ルシフェラーゼ標識標的細胞を使用して試験した。接着性細胞株ＮＢ１６９１、ＣＨＬＡ−２５５、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、Ｕ−２  ＯＳおよびＭＫＮ７に対する細胞毒性を測定するために、そのルシフェラーゼ標識派生物を使用した。少なくとも４時間プレーティング後、Ｔ細胞を上記のとおり添加した。４時間共培養後、Promega Bright-Gloルシフェラーゼ試薬(Promega, Madison, WI)を各ウェルに添加し、５分後、発光をプレートリーダーBiotek FLx800(BioTek, Tucson, AZ)を使用して測定し、Gen5 2.0 Data Analysis Softwareを使用して解析した。
【００９８】
異種移植実験
ルシフェラーゼを発現するダウディ細胞を、ＮＯＤ.Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ−２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ(ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ−２ＲＧｎｕｌｌ)マウス(Jackson Laboratory, Bar Harbor)に腹腔内注射した(ｉ.ｐ.；０.３×１０６細胞／マウス)。数匹のマウスは、ダウディ接種４日後、５日目および６日目のヒト初代Ｔ細胞のｉ.ｐ.注射を伴いまたは伴わずに、リツキシマブ(１００μg)をｉ.ｐ.投与された。Ｔ細胞は、３日間抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化されており、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体を形質導入され、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁され、１×１０７細胞／マウスで注射された。リツキシマブ注射を４週間、毎週続け、さらなるＴリンパ球注射は行わなかった。全てのマウスが、１０００−２０００IUのＩＬ−２のｉ.ｐ.注射を、４週間、週に２回受けた。マウスの１群は、リツキシマブまたはＴ細胞の代わりに組織培養培地を投与された。
【００９９】
腫瘍生着および増殖をXenogen IVIS-200 system(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)を使用して測定した。Ｄ−ルシフェリンカリウム塩水溶液(３mg／マウス)のｉ.ｐ.注射５分後に造影を介しし、ルシフェラーゼ発現細胞から放出される光子を、Living Image 3.0 softwareを使用して定量した。
【０１００】
結果
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現
約１／４の個体で発現されるＦＣＲＧ３Ａ(ＣＤ１６)のＶ１５８多型性は高親和性免疫グロブリンＦｃ受容体を発現し、抗体治療に対する好都合な応答と関係する(２５、２６、２９〜３１)。ＦＣＧＲ３遺伝子のＶ１５８バリアントを産生した。それをＣＤ８αのヒンジドメインおよび膜貫通型ドメイン、Ｔ細胞刺激分子ＣＤ３ζおよび同時刺激分子４−１ＢＢと合わせた(図１Ａ)。Imai et al., Leukemia 2004; 18:676-684。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ構築物およびＧＦＰを含むＭＣＳＶレトロウイルスベクターを使用して、１２ドナーからの末梢血Ｔリンパ球に形質導入し、ＣＤ３＋細胞の中央ＧＦＰ発現は８９.９％(範囲７５.３％〜９７.１％)であり、同細胞において、抗ＣＤ１６染色で評価した中央キメラ受容体表面発現は８３.０％(６７.５％〜９１.８％)であった(図１Ｂ)。ＧＦＰのみを含むベクターで形質導入した同じドナーからのＴリンパ球の、中央ＧＦＰ発現は９０.３％(６７.８％〜９８.７％)であったが、１.０％(０.１％〜２.７％)しかＣＤ１６を発現しなかった(図１Ｂ)。受容体の発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞で有意に異ならなかった。６９.８％±１０.８％ＣＤ４＋細胞が、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζで形質導入後ＣＤ１６＋であり、それに対し、ＣＤ８＋細胞は７７.６％±９.２％であった(図２)。
【０１０１】
キメラ受容体の他の要素が発現されていることを確認するために、ＣＤ３ζの発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した。図１Ｂに示すとおり、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球は、偽形質導入細胞が発現するよりはるかに高いレベルでＣＤ３ζを発現した。平均蛍光強度の平均(±ＳＤ)は前者で４５,９８５±１６,３６５であり、それに対し後者で１２,５４７±４,２９６であった(ｔ検定でＰ＝０.０２７；ｎ＝３；図１Ｂ)。キメラタンパク質の存在も、抗ＣＤ３ζ抗体でプローブするウェスタンブロッティングにより決定した。図１Ｃに示すとおり、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球は、還元条件下、１６kDaの内在性ＣＤ３ζに加えて、約２５kDaのキメラタンパク質を発現した。非還元条件下、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζタンパク質は、単量体または５０kDaの二量体のいずれかとして発現されることが示された。
【０１０２】
Ｖ１５８対Ｆ１５８  ＣＤ１６受容体の抗体結合能
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζキメラ受容体が免疫グロブリン(Ｉｇ)に結合する能力を測定するために、３ドナーからの末梢血Ｔリンパ球に形質導入した。図３Ａに示すように、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ発現Ｔリンパ球を、リツキシマブとインキュベーション後抗体で被覆した。トラスツズマブおよびヒトＩｇＧで類似する結果が得られた。
【０１０３】
続いて、ＦＣＲＧ３Ａ(ＣＤ１６)の高親和性Ｖ１５８多型性を含むＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体のＩｇ結合能を、代わりにＦ１５８バリアントを含む同一受容体(“ＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ”)と比較した。ジャーカット細胞にいずれかの受容体を形質導入後、リツキシマブおよび抗ヒトＩｇ  ＰＥ抗体(結合リツキシマブ)とインキュベートし、ＰＥ蛍光強度をＧＦＰと相関させた。図３Ｂに示すとおり、ＧＦＰのいずれのレベルでも、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体を形質導入した細胞が、ＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体を形質導入した細胞よりＰＥ蛍光強度が高く、前者が有意に高い抗体結合親和性を有することを示した。トラスツズマブおよびヒトＩｇＧも高い親和性でＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体と結合した(図４)。
【０１０４】
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体への抗体結合がエフェクター細胞と標的細胞の凝集を促進するか否かを決定するために、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ(およびＧＦＰ)を発現するジャーカット細胞を、１：１比でＣＤ２０＋ダウディ細胞株(カルセインＡＭ赤色−橙色で標識)と６０分混合し、ＧＦＰ−カルセインダブレットの形成をリツキシマブを添加してまたは添加せずに測定した。３実験において、培養中の３９.０％±１.９％の事象が、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体発現ジャーカット細胞とリツキシマブが存在するならば、ダブレットであった(図３ＣおよびＤ)。対照的に、リツキシマブの代わりにヒトＩｇＧを用いたとき、または偽形質導入ジャーカット細胞を用いたとき、リツキシマブの存在に関わらず、ダブレットは＜５％であった。
【０１０５】
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζへのＩｇの結合はＴ細胞活性化、脱顆粒および細胞増殖を誘発する
固定化抗体によるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体架橋がＴリンパ球における活性化シグナルを誘発できるか否かを決定した。実際、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを形質導入したＴリンパ球は、リツキシマブを被覆したプレートで培養したときＩＬ−２受容体発現(ＣＤ２５)が著しく増加したが、抗体非存在下で、または偽形質導入細胞では抗体の存在に関わらず、変化は観察されなかった(図５ＡおよびＢ)。
【０１０６】
ＩＬ−２受容体の発現に加えて、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体架橋は、ＣＤ１０７ａ染色で検出して、Ｔリンパ球における溶解性顆粒のエキソサイトーシスを誘発した。それゆえに、４ドナーからのＴリンパ球をリツキシマブで被覆したマイクロタイタープレートに播種するか(ｎ＝３)またはリツキシマブの存在下ダウディ細胞と共培養した６(ｎ＝３)実験において、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球はＣＤ１０７ａ陽性となった(図５Ｃ)。
【０１０７】
最後に、受容体架橋が細胞増殖を誘発できたか否かを決定した。図５Ｄに示すとおり、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球を、リツキシマブおよびダウディ細胞(Ｔリンパ球と１：１比)の存在下増殖させた。３実験で、培養７日後の平均Ｔ細胞回収率は、投入細胞の６３２％(±９７％)であり、培養４週間後、６８７７％(±１３９９％)であった。注目すべきことに、未結合リツキシマブは、極めて高濃度(１〜１０μg／mL)であっても、標的細胞の非存在下で細胞増殖に顕著な影響を与えず、リツキシマブ非存在下では、または偽形質導入Ｔ細胞では抗体および／または標的細胞の存在に関わらず、細胞増殖が生じなかった(図５Ｄ)。それゆえに、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体架橋は、持続性増殖をもたらすシグナルを誘発する。
【０１０８】
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球は、インビトロおよびインビボでＡＤＣＣを仲介する
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ架橋が溶解性顆粒のエキソサイトーシスを惹起したとの観察は、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球が、特異的抗体存在下に標的細胞を死滅させることができることを暗示する。実際、４時間のインビトロ細胞毒性アッセイにおいて、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球はリツキシマブ存在下、Ｂ細胞リンパ腫細胞株ダウディおよびラモスに対して高度に細胞毒性であった。典型的に、２：１  Ｅ：Ｔ比での４時間の共培養後、５０％を超える標的細胞が溶解した(図６および図７)。対照的に、標的細胞死滅は抗体非存在下または偽形質導入Ｔ細胞で低かった(図６および図７)。顕著なことに、これらの実験で使用したエフェクター細胞はＣＤ３＋Ｔリンパ球(＞９８％)に非常に富み、ＣＤ３−  ＣＤ５６＋  ＮＫ細胞を含まなかった。リツキシマブが介在するＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球の細胞毒性もＣＤ２０＋初代ＣＬＬ細胞で確認され(ｎ＝５)、図６Ｂに示すとおり、典型的に２：１  Ｅ：Ｔ比で４時間共培養後、細胞毒性は７０％を超えた。骨髄間葉性間質細胞は免疫抑制性効果を有することが示されている(Jefferis, Nat. Rev. Drug Discov. 2009; 8(3):226-234; Clemenceau et al., Blood 2006; 107(12):4669-4677)。これがＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球の細胞傷害能に影響するか否かを試験するために、骨髄由来間葉性間質細胞の存在下、１：２  Ｅ：Ｔで２４時間、ＣＬＬ細胞と共培養した。図６Ｃに示すように、間葉性細胞はＡＤＣＣ介在リンパ球の致死能を低下させなかった。
【０１０９】
次に、異なる免疫治療抗体が、対応する抗原を発現する腫瘍細胞に対して類似の細胞毒性を誘発できるか否かを決定した。それゆえに、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球の細胞毒性を、ＨＥＲ２(乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＳＫ−ＢＲ−３および胃癌細胞株ＭＫＮ７)またはＧＤ２(神経芽腫細胞株ＣＨＬＡ−２５５、ＮＢ１６９１およびＳＫ−Ｎ−ＳＨおよび骨肉腫細胞株Ｕ２−ＯＳ)を発現する固形腫瘍細胞に対して試験した。抗体トラスツズマブをＨＥＲ２の標的に使用し、ｈｕ１４.１８Ｋ３２２ＡをＧＤ２の標的に使用した。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球は対応する抗体の存在下、これらの細胞に対して高度に細胞毒性であった(図６および図７)。ＮＢ１６９１を用いる実験で、細胞毒性が、培養を２４時間に延長することにより低Ｅ：Ｔ比で達成できるか否かも試験した。図８に示すとおり、ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａの存在下、１：８比で細胞毒性は５０％を超えた。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ介在細胞死滅の特異性をさらに試験するために、ＣＤ２０＋ダウディ細胞をＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球および種々の特異性の抗体と培養した。リツキシマブだけでも細胞毒性を仲介したが、トラスツズマブまたはｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａの存在下、細胞毒性は増加しなかった(図８)。最後に、免疫治療抗体存在下のＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ介在細胞死滅が、未結合単量体ＩｇＧにより阻害されるか否かを決定した。図８に示すとおり、ＩｇＧが細胞結合免疫治療抗体より最大１０００倍高濃度で存在しても、Ｔ細胞毒性は影響を受けなかった。
【０１１０】
インビボのＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球の抗腫瘍能を測定するために、ルシフェラーゼ標識ダウディ細胞移植ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ−２ＲＧヌルマウスでの実験を実施した。腫瘍増殖をＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球とリツキシマブを受けたマウスにおけるライブイメージングにより測定し、その結果を、リツキシマブまたはＴリンパ球のいずれか単独を投与されたまたは処置を受けていないマウスと比較した。図９に示すとおり、リツキシマブ、続いてＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球を投与された以外の全マウスで腫瘍細胞は増殖した。この組み合わせ処置した全５匹のマウスは、腫瘍注射＞１２０日後でもなお寛解しており、対照的に未処置のまたは抗体もしくは細胞単独を投与された１２匹のマウス中０匹が寛解であった。強い抗腫瘍活性がまた神経芽腫細胞株ＮＢ１６９１を移植し、ｈｕ１４.１８Ｋ３２２ＡおよびＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球で処置したマウスでも観察された(図１０)。
【０１１１】
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζと他の受容体の比較
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体またはＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体のいずれかを有するＴ細胞の機能を比較した。Ｉｇに対する高い親和性と一致して、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体は、低親和性ＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体により誘発されるより有意に高いＴ細胞増殖およびＡＤＣＣを誘発した(図１１)。
【０１１２】
次に、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを有するＴ細胞の機能を、種々のシグナル伝達特性を有する他の受容体を発現するＴ細胞と比較した。これらは、シグナル伝達能を有しない受容体(“ＣＤ１６Ｖ切断”)、ＣＤ３ζを有するが４−１ＢＢを有しない受容体(“ＣＤ１６Ｖ−ζ”)およびＣＤ１６ＶとＦｃεＲＩγの膜貫通型ドメインおよび細胞質ドメインを合わせる、先に記載された受容体を(”ＣＤ１６Ｖ−ＦｃεＲＩγ”)含む(Jefferis, Nat. Rev. Drug Discov. 2009; 8(3):226-234; Clemenceau et al., Blood 2006; 107(12):4669-4677)(図１２)。活性化Ｔ細胞へのレトロウイルス形質導入後、全ての受容体は高度に発現された(図１３)。図１４に示すとおり、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζは、全ての他の構築物よりも油井に高い活性化、増殖および特異的細胞毒性を誘発した。
【０１１３】
ｍＲＮＡエレクトロポレーションによるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現
上の実験の全てにおいて、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ発現はレトロウイルス形質導入により強化された。別の方法であるｍＲＮＡのエレクトロポレーションもまたＴリンパ球にＡＤＣＣ能を付与できるか否かを試験した。２ドナーからの活性化Ｔリンパ球を電気穿孔し、高発現効率を得た。エレクトロポレーション２４時間後、５５％および８２％のＴリンパ球がＣＤ１６＋となった(図１５Ａ)。第二のドナーにおいて、受容体発現も４３％であった３日目に試験し、発現が７２〜９６時間持続する他の受容体での先の実験と同様の結果を得た(Fujisaki et al., Cancer Res. 2009; 69(9):4010-4017)。ＡＤＣＣは、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  ｍＲＮＡを電気穿孔したＴリンパ球で活性化された。リツキシマブ存在下、８０％ラモス細胞が２：１  Ｅ：Ｔ比で４時間後に死滅したが、ｍＲＮＡを用いず電気穿孔した細胞は効果がなかった(図１５Ｂ)。
【０１１４】
考察
ここに記載されるのは、Ｔリンパ球にＡＤＣＣを発揮する能力を付与する、キメラ受容体の開発である。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体が腫瘍細胞と結合する抗体と結合したとき、該抗体が標的とする癌細胞に対するＴ細胞活性化、持続性増殖および特異的細胞毒性が誘発される。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球は、Ｂ細胞リンパ腫、乳癌および胃癌、神経芽腫および骨肉腫ならびに初代ＣＬＬ細胞を含む広範な腫瘍細胞型に対して高度に細胞毒性であった。細胞毒性は、標的細胞に結合する特異的抗体の存在に完全に依存し、未結合抗体は非特異的細胞毒性を惹起することも、細胞結合抗体の細胞毒性に影響することもなかった。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔ細胞はまた間葉性細胞層上でＣＬＬ細胞を培養したとき、この微小環境の既知免疫抑制性効果に関わらず、これらの細胞を死滅させた(Jefferis, Nat. Rev. Drug Discov. 2009; 8(3):226-234; Clemenceau et al., Blood 2006; 107(12):4669-4677)。さらに、リツキシマブ後に注入したＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球は、免疫欠損マウスに移植されたＢ細胞リンパ腫細胞を根絶させ、抗ＧＤ２抗体の存在下、神経芽腫細胞を移植したマウスにおいて相当な抗腫瘍活性を有した。纏めると、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴ細胞は、インビトロおよびインビボで強いＡＤＣＣに影響した。
【０１１５】
ＩｇのＦｃ部分に対するＣＤ１６の親和性はＡＤＣＣの重要な決定因子であり、それゆえに、抗体免疫療法に対する臨床応答に影響する。それゆえに、例えば糖鎖工学により、ＦｃγＲに対するＦｃフラグメントの親和性をさらに増強するために、相当な労力が払われているNimmerjahn et al., Nat. Rev. Immunol. 2008; 8(1):34-47, Kohrt et al., Immunotherapy 2012; 4(5):511-527)。本発明のキメラ受容体を構築するために、１５８Ｖ多型性を有するＦＣＲＧ３Ａ(ＣＤ１６)遺伝子(配列番号１０)を一例として使用した。このバリアントは、Ｉｇに対して高い結合親和性を有し、優れたＡＤＣＣを仲介することが知られる受容体である(Ferris et al., J. Clin. Oncol. 2010; 28(28):4390-4399; Koene et al., Blood 1997; 90(3):1109-1114; Cartron et al., Blood 2002; 99(3):754-758; Weng et al., J. Clin. Oncol. 2003; 21(21):3940-3947; Dall'Ozzo et al., Cancer Res. 2004; 64(13):4664-4669; Hatjiharissi et al., Blood 2007; 110(7):2561-2564; Musolino et al., J. Clin. Oncol. 2008; 26(11):1789-1796; Bibeau et al., J. Clin. Oncol. 2009; 27(7):1122-1129; Ahlgrimm et al., Blood 2011; 118(17):4657-4662; Veeramani et al., Blood 2011; 118(12):3347-3349)。実際、より一般的なＦ１５８バリアントを含むキメラ受容体との並置比較(side-to-side comparisons)において、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζは有意に高いヒトＩｇ  Ｆｃへの結合能を有し、より強壮な増殖および細胞毒性を誘発し、キメラ抗原受容体機能における親和性の役割を扱う最近の試験の結果を想起させる(Kono et al., Cancer Res. 2002; 62(20):5813-5817; Delgado et al., Cancer Res. 2010; 70(23):9554-956)。現在の“第二世代”キメラ受容体は、刺激分子と同時刺激分子を組み合わせてシグナル伝達を増強し、活性化誘発アポトーシスを阻止する。それゆえに、ＣＤ１６  Ｖ１５８を、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)により構成される刺激分子とタンデムで組み合わせた。実際、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体は、ＣＤ３ζ単独を介する受容体またはＦｃεＲＩγより著しく優れたＴ細胞活性化、増殖および細胞毒性を誘発した。
【０１１６】
腫瘍細胞の表面上の抗原を認識し、刺激シグナルを伝達できる受容体を発現する遺伝子修飾Ｔ細胞の臨床的潜在力を証明する臨床試験結果が増えている(Pule et al., Nat. Med. 2008; 14(11):1264-1270; Porter et al., OncLive 2011; 25;365(8):725-733; Brenjens et al., Blood 2011; 118(18):4817-4828; Till et al., Blood 2012; 119(17):3940-3950; Kochenderfer et al., Blood 2012; 119(12):2709-2720; Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 2013; 5(177):177ra138)。最も顕著なことに、顕著な腫瘍減少および／または完全寛解が、ウイルス形質導入によりＣＤ１９またはＣＤ２０に対するキメラ抗原受容体を発現する自己Ｔリンパ球を投与されたＢ細胞悪性腫瘍患者で報告されている(Porter et al., OncLive 2011; 25;365(8):725-733; Brenjens et al., Blood 2011; 118(18):4817-4828; Till et al., Blood 2012; 119(17):3940-3950; Kochenderfer et al., Blood 2012; 119(12):2709-2720; Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 2013; 5(177):177ra138)。この戦略を他の腫瘍に拡大するために、法的な要求事項に準ずる他のキメラ抗原受容体構築物の開発および大規模形質導入条件の最適化を含む、多大な労力が伴う。これに関し、ここに記載するＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体は、ある一つの受容体を多様な癌細胞型に対して使用可能にすることにより、Ｔ細胞治療の実行を促進するはずである。単一特異性を有するキメラ受容体により標的とされるマーカーを欠くサブクローンにより駆動される白血病再発についての最近の報告により説明されるような、腫瘍が利用する免疫逃避機構を考えると、最終的に有利であり得る戦略である、同時に多様な抗原のターゲティングも可能とする。抗体介在性細胞毒性は、抗体投与の単純な中止により、いつでも何時用であれば停止できる。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴ細胞が、標的細胞に結合した抗体によってのみ活性化されるため、可溶性免疫グロブリンは、注入されたＴ細胞内に何ら刺激を発揮しない。それにも関わらず、そうして、何らかの自己免疫性反応性の可能性を制限するために、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体を一過性に発現するためのｍＲＮＡエレクトロポレーションの使用によりこの戦略の臨床的安全性を試験することが重要である。ここに示されるとおり、ｍＲＮＡエレクトロポレーションは、受容体を極めて効率的に発現できる。
【０１１７】
抗体治療は、多くの癌サブタイプの標準治療となってきており、その臨床的有効性は、Ｆｃ受容体の結合によりＡＤＣＣを誘発するその能力により大部分決定される(Ferris et al., J. Clin. Oncol. 2010; 28(28):4390-4399)。ＡＤＣＣの主エフェクターはＮＫ細胞であるが、癌を有する患者ではその機能が障害され得る。例えば、ＨＥＲ２を過発現する胃癌細胞のトラスツズマブ介在ＡＤＣＣが、胃癌患者および進行性疾患からの末梢血単核細胞で、初期疾患または健常ドナーから得られたものと比較して有意に低いことが報告された。さらに、応答は、ＮＫ細胞阻害受容体およびそのリガンドの遺伝子型を含む他の因子に影響を受ける。ここに示す結果は、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体で遺伝子操作した自己Ｔ細胞の注入が、ＡＤＣＣを著しく押し上げることを示すことを示す。組み合わせたＣＤ３ζ／４−１ＢＢシグナル伝達もＴ細胞増殖を起こすため、腫瘍部位へ活性化Ｔ細胞が蓄積され、これがその活性をさらに増強し得る。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体は、採血からＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ発現細胞注入までわずか数時間しかかからず、それゆえに臨床適用に十分に適する方法である、活性化Ｔリンパ球だけでなく、残りの末梢血単核細胞へのｍＲＮＡエレクトロポレーションにより発現できる。
【０１１８】
本発明はここに記載する具体的態様の範囲に制限されない。実際、ここに記載するものに加えて本発明の種々の修飾が、上記から当業者には明らかとなる。このような修飾は添付する特許請求の範囲の範囲内に入ることは明らかである。
【０１１９】
ここに引用する全ての特許、出願、刊行物、試験法、文献および他の材料は、本明細書に物理的に存在するかのように、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【０１２０】
【表１】
0006417413.tif 000002
【表２】
0006417413.tif 000003
【図１】
0006417413.tif 000004
【図２】
0006417413.tif 000005
【図３】
0006417413.tif 000006
【図４】
0006417413.tif 000007
【図５】
0006417413.tif 000008
【図６】
0006417413.tif 000009
【図７】
0006417413.tif 000010
【図８】
0006417413.tif 000011
【図９】
0006417413.tif 000012
【図１０】
0006417413.tif 000013
【図１１】
0006417413.tif 000014
【図１２】
0006417413.tif 000015
【図１３】
0006417413.tif 000016
【図１４】
0006417413.tif 000017
【図１５】
0006417413.tif 000018
【配列表】
0006417413000001.app