(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１型（ＩＤＨ１）のアミノ酸１２２〜１３６に相当するアミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号３）に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを含む、前記ペプチドを含むヒトイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１型（ＩＤＨ１）ポリペプチドを発現するがん細胞を含むがんの予防および／または治療に使用するための薬剤。
【請求項２】
前記がんが、神経膠腫、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群または胚芽異形成性神経上皮腫瘍である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
請求項の１または２に記載の薬剤と薬学的に許容できる担体とを含んでなる薬剤。
【請求項４】
ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを持つがんに罹患していることが疑われる対象の血液サンプルと、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを、免疫系構成要素とペプチドの特異的結合を可能にする時間の条件下で接触させるステップと；
ｂ）前記免疫系構成要素と配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとの結合が起きたかどうかを判定するステップと
を含んでなり、該結合の出現が、がんの指標となる、Ｒ１３２Ｈ変異を有する変異ＩＤＨ１の発現をもたらす変異を、少なくともいくつかの腫瘍細胞中のゲノムに有することで特徴付けられるがんの診断を補助するデータを提供する方法。
【請求項５】
前記免疫系構成要素が、血液サンプルに含まれる抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記がんが、神経膠腫であり、または、ＷＨＯ  ＩＩまたはＷＨＯ  ＩＩＩ星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫、膠芽細胞腫または神経膠肉腫であり、または急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群または胚芽異形成性神経上皮腫瘍である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法を実施するための請求項１に記載の薬剤を含む、キットのがんの診断を補助するデータを提供するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍治療学および診断学の分野に関する。具体的には、それは、がんの予防および／または治療で使用するための、ヒトイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１型（ＩＤＨ１）中で連続アミノ酸配列として存在する少なくとも８アミノ酸長を含んでなり、位置１３２に相当する位置でＲからＨへの少なくとも１つのアミノ酸交換を有するペプチドに関する。前記ペプチドを含んでなる薬剤も、さらに検討される。さらに本発明は、Ｒ１３２Ｈ変異を有する変異ＩＤＨ１の発現をもたらす変異を、少なくともいくつかのがん細胞のゲノム中に有することで特徴付けられるがんを診断する方法に関し、方法は、このような腫瘍に罹患していることが疑われる対象の血液サンプルと、ＩＤＨ１中で連続アミノ酸配列として存在する少なくとも１０アミノ酸長を含んでなり、位置１３２に相当する位置でＲからＨへの少なくとも１つのアミノ酸交換を有するペプチドとを、免疫系構成要素のペプチドへの特異的結合を可能にする時間と条件下で接触させるステップと、前記免疫系構成要素のペプチドへの結合が起きたかどうかを判定するステップとを含んでなり、結合の出現が判定されれば、がんが診断される。本発明はまた、前記方法を実施するためのキットおよび装置も提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞質ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１）をコードする遺伝子中の変異は、膠芽細胞腫（ＧＢＭ）の配列分析における思いも寄らない知見として出現した（Ｐａｒｓｏｎｓ  ２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１（５８９７）：１８０７−１２）。最近の研究は、未分化神経膠腫の約７０％と、膠芽細胞腫の１２％で、位置１３２のアミノ酸交換をもたらすＩＤＨ１遺伝子中の変異を報告した（Ｂａｌｌｓ  ２００８，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１１６（６）：５９７−６０２，Ｙａｎ  ２００９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６０（８）：７６５−７３，Ｗａｔａｎａｂｅ  ２００９，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１７４（４）：１１４９−５３，Ｄｅ  Ｃａｒｌｉ  ２００９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６０（２１）：２２４８，Ｄｕｃｒａｙ  ２００９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６０（２１）：２２４８，Ｈａｒｔｍａｎｎ  ２００９，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１１８（４）：４６９−７４，Ｉｃｈｉｍｕｒａ  ２００９，Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ．１１（４）：３４１−７，Ｓａｎｓｏｎ  ２００９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２７（２５）：４１５０−４）。
【０００３】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨへの還元を使用して、イソクエン酸からαケトグルタル酸への酸化脱炭酸を触媒する。変異は、イソクエン酸結合部位に位置する進化上保存領域に属する、アミノ酸配列の位置１３２のアミノ酸アルギニンに影響を及ぼす。報告された変異は、常に異型接合であり、スプライス部位またはナンセンス変異などのタンパク質の不活性化を示唆する変化は検出されず、したがって変異の活性化効果に対する推測が促された。しかし酵素活性の測定は、変異の不活性化効果を示した（Ｙａｎ  ２００９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６０（８）：７６５−７３）。しかしがんの発生および／または進行におけるＩＤＨ１の役割は、依然として捕らえにくい。
【０００４】
ＩＤＨ１変異は、ＷＨＯ等級ＩＩおよびＩＩＩびまん性神経膠腫において、高頻度で発生する。全てのＩＤＨ１変異の９３％は、アミノ酸交換Ｒ１３２Ｈによって特徴付けられる（Ｈａｒｔｍａｎｎ  ２００９，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１１８（４）：４６９−７４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈを伴う前述のがん型などは、ほとんどの場合、予後が芳しくない高悪性度がんであるため、これらのがんに対する効果的な治療法は、非常に望ましい。
【０００６】
前述のがん型に対する現行の診断手段、特に、がんがＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈ変異を伴うかどうかを判定する診断手段は、ゲノムＤＮＡ配列決定アプローチまたは免疫組織学的染色法のいずれかに中心的に基づく（例えば、欧州特許出願公開第２２５６２１４Ａ２号明細書を参照されたい）。しかしどちらの技術にも、面倒で潜在的に危険な生検のみによって得られる、がん組織からの適切な組織サンプルが必要である。したがってこれらのがん型に対する信頼できる効率的な診断手段もまた、望ましい。
【０００７】
本発明の基礎となる技術的問題は、前述の要求に叶う、治療および診断の手段および方法の提供と見なし得る。技術的問題は、特許請求の範囲および下文中で特徴を描写する、実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって本発明は、がんの予防および／または治療で使用するための、ヒトイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１型（ＩＤＨ１）中で連続アミノ酸配列として存在する少なくとも８アミノ酸長を含んでなり、位置１３２に相当する位置でＲからＨへの少なくとも１つのアミノ酸交換を有するペプチドに関る。
【０００９】
「ペプチド」という用語は、本明細書の用法では、その中でアミノ酸がペプチド結合によって共有結合する、小型有機分子を指す。ポリペプチド（タンパク質）とは対照的に、ペプチドは単に２〜約１００アミノ酸からなる。ペプチドは、それらの小さなサイズのために、通常は生物が利用可能な分子であり、すなわちそれらは、生物のほとんどの組織に侵入し得て、さらに細胞に侵入することすらある。本発明によるペプチドは、少なくとも８アミノ酸長を含んでなる。したがってペプチドは、本質的に、少なくとも８〜約１００アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜約５０アミノ酸、少なくとも８〜約４０アミノ酸、少なくとも８〜約３５アミノ酸、少なくとも８〜約３０アミノ酸、少なくとも８〜約２５アミノ酸、少なくとも８〜約２０アミノ酸、少なくとも８〜約１５アミノ酸または少なくとも８〜約１０アミノ酸長からなってもよい。「約」という用語は、この文脈の用法では、正確な数から＋／−１逸脱するアミノ酸の数、すなわちアミノ酸が１つ多い、またはアミノ酸が１つ少ないことを指す。好ましくは、正確な数が意図される。
【００１０】
「イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１型」または「ＩＤＨ１」という用語は、本明細書の用法では、クエン酸回路に生理学的に関与する酵素を指し、該酵素はクエン酸回路中でイソクエン酸の酸化脱炭酸を触媒し、それによってαケトグルタル酸およびＣＯ２が生じる。反応には、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換が必要である。本発明による好ましい酵素の別のイソ型は、補助因子としてＮＡＤ＋でなくＮＡＤＰ＋を利用して、細胞質ゾル中でもミトコンドリアまたは／およびペルオキシソーム中と同様に、同一反応を触媒する。本明細書で言及されるＩＤＨ１は、好ましくは、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋｉｍ  １９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０８（Ｐｔ１）：６３−６８）で開示されたような、またはＮＣＢＩ／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＧ４６４９６．１、ＧＩ：４９４５６３５１；ＣＡＧ３８７３８．１、ＧＩ：４９１６８４８６；ＣＡＧ３８５５３．１、ＧＩ：４９０６５４７０；またはＡＡＨ１２８４６．１、ＧＩ：１５２７７４８８の下に入手できる、アミノ酸配列を有するヒトＩＤＨ１である。しかし用語はまた、前述の特異的アミノ酸配列で特徴付けられる、前記ヒトＩＤＨ１の変異体も包含する。このような変異体は、一般にオルソログ、パラログまたはホモログであってもよい。本明細書で言及される変異体は、好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加および／または欠失によって、上で言及される特定アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。好ましくは、このような変異アミノ酸配列は、その全長にわたり、前述の特定アミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。好ましくは、同一性の程度は、比較ウィンドウにわたり、２つの最適に整列させた配列を比較することで判定され得て、比較ウィンドウ中のアミノ酸配列断片は、最適アラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列との比較で、付加または欠失（例えばギャップまたはオーバーハング）を含んでなってもよい。百分率は、双方の配列中で同一アミノ酸残基が存在する位置数を判定して整合位置数を得て、整合位置数を比較ウインドウ中の総位置数で除算し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることで、計算される。比較のための最適な配列アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＰＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または外観検査によって��施してもよい。比較のために２つの配列が同定されていることを考えると、それらの最適アラインメント、ひいては同一性の程度を判定するために、ＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴが好ましくは用いられる。好ましくは、５．００のｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ、および０．３０のｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ  ｌｅｎｇｔｈのデフォルト値が用いられる。好ましくは、変異体は、上で言及される酵素機能を有して、上で言及されるヒトＩＤＨ１と本質的に同じ免疫学的特性を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のペプチドは、位置１３２に相当する位置で、ＲからＨへの少なくとも１つのアミノ酸交換を含んでなるべきである。好ましくは、ペプチドは、本明細書の他の箇所で規定されるように、ヒトＩＤＨ１の位置１３２に相当する位置のＲからＨへの交換を唯一のアミノ酸交換として、ヒトＩＤＨ１中で連続アミノ酸配列として存在する少なくとも８個のアミノ酸を含んでなってもよい。しかしペプチドは、好ましくは１つまたは２つの追加的な交換、またはそれ以上にさえ至る、さらなる交換を含んでなってもよい。
【００１２】
好ましくは、本発明のペプチドのアミノ酸の少なくとも８個は、ヒトＩＤＨ１中で連続アミノ酸配列として存在する。したがって本発明のペプチドは、ヒトＩＤＨ１から誘導されるアミノ酸配列から本質的になり得て、またはそれは、ヒトＩＤＨ１から誘導される８個以上のアミノ酸と、ヒトＩＤＨ１中に存在しないその他の一続きのアミノ酸とを含んでなるアミノ酸配列からなってもよい。
【００１３】
好ましくは、本発明のペプチドは、８〜４０アミノ酸長からなり、ペプチドは、ヒトＩＤＨ１中で連続アミノ酸配列として存在する、８〜３５アミノ酸、８〜３０アミノ酸、８〜２５アミノ酸、８〜２０アミノ酸、８〜１５アミノ酸または８〜約１０アミノ酸長からなる。
【００１４】
一般にペプチドのアミノ酸の正確な数、ならびにヒトＩＤＨ１アミノ酸配列から誘導されるアミノ酸の数は、想定される用途次第で、当業者によって判定され得る。この文脈で、当業者は、ＩＤＨ１標的からのペプチド全長または一続きの連続アミノ酸長のいずれかを変動させることで、免疫応答を最適化させてもよいという事実を良く承知している。
【００１５】
好ましくは、本発明のペプチドは、
ａ）アミノ酸１１８〜１３２に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１）；
ｂ）アミノ酸１２０〜１３４に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号２）；
ｃ）アミノ酸１２２〜１３６に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号３）；
ｄ）アミノ酸１２４〜１３８に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号４）；
ｅ）アミノ酸１２６〜１４０に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号５）；
ｆ）アミノ酸１２８〜１４２に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号６）；
ｇ）アミノ酸１３０〜１４４に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号７）；
ｈ）アミノ酸１３２〜１４６に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号８）；
ｉ）アミノ酸１２３〜１４２に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号９）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、またはそれから本質的になる。
【００１６】
「がん」という用語は、本明細書の用法では、生物中における、望まれない増殖、浸潤、および特定条件下での障害細胞の転移から生じるあらゆる悪性新生物を指す。がんを引き起こす細胞は、遺伝的に損なわれており、通常は、細胞分裂、細胞遊走挙動、分化状態および／または細胞死機構を調節する能力が欠失している。ほとんどのがんは腫瘍を形成するが、白血病などのいくつかの造血性がんは腫瘍を形成しない。好ましくは、前記がんは、Ｒ１３２Ｈ変異を有する変異ＩＤＨ１の発現をもたらす変異を、少なくともいくつかのがん細胞のゲノム中に有することで、特徴付けられるがんである。がんが、少なくともいくつかのがん細胞中に、上で規定される変異を有するかどうかは、ＰＣＲベースおよび／または配列決定ベースの検出技術によって、当業者によって判定され得る。さらに本明細書の他の箇所で言及される本発明の方法もまた、適用してもよい。
【００１７】
より好ましくは、前記がんは腫瘍であり、好ましくは神経膠腫である。神経膠腫は、前述のＩＤＨ１変異を含んでなる細胞を頻繁に含んでなり、または細胞からなることさえ報告されている。最も好ましくは、前記神経膠腫は、ＷＨＯ  ＩＩまたはＷＨＯ  ＩＩＩ星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫、膠芽細胞腫、または神経膠肉腫である。
【００１８】
さらに、好ましくは、本明細書で言及されるがんはまた、好ましくは、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、または胚芽異形成性神経上皮腫瘍である。前述のがん型に付随する症状は、当該技術分野で周知であり、さらなる骨折りなしに当業者によって判定され得る。がん型の詳細は、例えば、ＰｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌやＳｔｅｄｍａｎなどの医学の標準的な教科書に見ることができる。
【００１９】
「予防する」という用語は、本明細書の用法では、本明細書で言及されるような疾患発生の予防を指す。このような予防は、好ましくは、本発明のペプチド投与に際して、一定の時間ウィンドウにわたり得られる。好ましくは、前記時間ウィンドウは、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも５年間、少なくとも１０年間であり、または前述の予防的治療を受けた被験者の残り寿命全体に及ぶ。本明細書で言及される予防的治療は、ほぼ確実に、治療を受けた全被験者で成功することはないものと理解される。しかし予防的治療は、治療された対象の少なくとも統計学的に有意な部分において、有効であることが想定される。例えば対象コホートの統計的に有意な部分が、成功裏に予防され得るかどうかは、好ましくは、本明細書の他の箇所でより詳細に考察される、統計的検定によって判定されてもよい。
【００２０】
「治療する」という用語は、本明細書の用法では、本明細書で言及される疾患を改善および／または治癒して、疾患進行を妨げ、または少なくとも前記疾患に付随する少なくとも１つの症状を改善することを指す。本明細書で言及される治療は、ほぼ確実に、治療を受けた全被験者で成功することはないものと理解される。しかし治療は、治療された対象の少なくとも統計学的に有意な部分において、有効であることが想定される。例えば対象コホートの統計的に有意な部分が、成功裏に治療され得るかどうかは、好ましくは、本明細書の他の箇所でより詳細に考察される、統計的検定によって判定されてもよい。
【００２１】
本発明によるペプチドは、がんを治療および／または予防するのに使用するために提供され、すなわちそれは薬剤として製造され、例えば医薬組成物に含まれる。このような薬剤または医薬組成物の詳細は、本明細書の他の箇所にある。本発明によって使用されるペプチドは、がんを治療および／または予防する方法に応用し得る。したがって本発明はまた、本明細書で定義されるペプチドの治療有効量をがんに罹患している対象に投与するステップを含んでなる、対象においてがんを治療および／または予防する方法を想定する。
【００２２】
有利なことに、本発明の基礎となる研究において、本発明のペプチドを使用して、ＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈ変異に対する免疫応答を特異的に引き起こし得ることが分かった。したがって変異ＩＤＨ１を発現するがん細胞は、免疫系の細胞および体液性応答によって攻撃され、前述のＩＤＨ１変異に付随することが知られている、本明細書で言及されるがん型を、特異的に治療および／または予防する効果的な方法がもたらされる。本発明の基礎となる知見のおかげで、がん型の治療のための効果的な薬剤、ならびにがんワクチンが提供される。
【００２３】
上記の説明およびコメントは、変更すべきところは変更して、以下に記載される本発明の実施形態に適用される。
【００２４】
本発明は、本発明のペプチドと、好ましくは、薬学的に許容できる担体とを含んでなる薬剤に関する。
【００２５】
本明細書の用法では「薬剤」という用語は、一態様では、上で言及されるペプチドを薬剤活性化合物として含有する医薬組成物を指し、医薬組成物は、治療有効用量で、ヒトまたは非ヒトの種々の疾患または障害治療のために使用してもよい。ペプチドは、好ましくは、液体または凍結乾燥形態で存在し得る。薬剤は、好ましくは、局所または全身投与用である。慣例的に、薬剤は、筋肉内または皮下投与される。しかし化合物の性質と作用機序次第で、薬剤はその他の経路でも投与されてもよい。ペプチドは組成物の活性成分であり、好ましくは、従来の手順に従って薬物と標準薬学的担体とを組み合わせて調製される、従来型剤形で投与される。これらの手順は、所望の製剤に応じて、成分の混合、顆粒化、および圧搾、または溶解を伴ってもよい。薬学的に許容可能な担体または希釈剤の形態および特徴は、それが組み合わせられる活性成分の量、投与経路、およびその他の周知の変数によって決まることが理解されるであろう。
【００２６】
担体は、調合物のその他の成分に適合し、その受容者にとって無害であると言う意味で、許容可能でなくてはならない。用いられる薬学的担体としては、固体、ゲル、または液体が挙げられる。固体担体の例は、乳糖、白土、スクロース、滑石、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。例示的な液体担体は、リン酸緩衝食塩水溶液、シロップ、油、水、エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤などである。同様に、担体または希釈剤としては、単独で、またはワックスを添加した、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの技術分野で周知の時間遅延材料が挙げられる。前記適切な担体は上述のもの、および当該技術分野で周知の他のものを含んでなり、例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａを参照されたい。
【００２７】
希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。これに加えて、医薬組成物または調合物は、その他の担体、アジュバント、または無毒で非治療的な非免疫原性安定剤なども含んでもよい。
【００２８】
治療有効用量とは、本明細書で言及される疾患または病状に付随する症状を予防し、改善し、治療する、本発明の薬剤で使用されるペプチドの量を指す。例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％で致死性の用量）などの化合物の治療効果および毒性は、細胞培養物または実験動物中で、標準薬学的手順によって判定し得る。治療効果と毒性効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表し得る。投薬計画は、主治医およびその他の臨床学的要素によって判定される。医療技術分野で周知のように、あらゆる患者のための投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定化合物、性別、投与時間と経路、総体的な健康、および併行投与されるその他の薬物をはじめとする、多数の要素に左右される。経過は、周期的評価によってモニターし得る。本明細書で言及される薬剤は、本明細書で列挙される疾患または病状を治療または改善または予防するために、少なくとも１回投与される。しかし前記薬剤は、２回以上投与されてもよい。特定の薬剤は、製薬技術分野で周知の様式で調製されて、上で言及される少なくとも１つの活性化合物を混和材料中に含んでなり、あるいは薬学的に許容できる担体または希釈剤と別の方法で関連する。これらの特定の医薬組成物を製造するために、通常は、活性化合物を担体または希釈剤と混合する。結果として生じる製剤は、投与様式に適応される。考慮される受容者に応じた用量調節を見込むために、処方者または使用者用の使用説明に、推奨用量が指示される。
【００２９】
本発明による薬剤はまた、本発明の拮抗薬に加えて薬物を含んでなってもよく、それは調合中に薬剤に添加される。
【００３０】
最後に、薬剤の調合は、薬剤の質、製剤安全性、および有効性を確実にするために、ＧＭＰ標準条件下などで行われるものと理解される。
【００３１】
本発明はまた、
ａ）Ｒ１３２Ｈ変異を有する変異ＩＤＨ１の発現をもたらす変異を、少なくともいくつかのがん細胞のゲノム中に有することで特徴付けられるがんに罹患していることが疑われる対象の血液サンプルと、ＩＤＨ１中で連続アミノ酸配列として存在する少なくとも１０アミノ酸長を含んでなり、位置１３２に相当する位置でＲからＨへの少なくとも１つのアミノ酸交換を有するペプチドとを、免疫系構成要素のペプチドへの特異的結合を可能にする時間と条件下で接触させるステップと；
ｂ）前記免疫系構成要素のペプチドへの結合が起きたかどうかを判定するステップと
を含んでなり、結合の出現が判定されれば、がんが診断される、
Ｒ１３２Ｈ変異を有する変異ＩＤＨ１の発現をもたらす変異を、少なくともいくつかのがん細胞のゲノム中に有することで特徴付けられるがんを、診断する方法にも関する。
【００３２】
本発明の方法は、対象の単離サンプル上で、すなわち生体外法で実施される。さらに方法は、完全にまたは少なくとも一部を自動化することで、補助されてもよい。例えば、手順ａ）およびｂ）は、本明細書の他の箇所で規定されるような装置によって行われてもよい。さらに実際の診断手順は、適切なコンピュータプログラムによって確立され得て、それは結合発生に基づいて、適切な出力形式でがん診断を示す。
【００３３】
「診断する」という用語は、本明細書の用法では、対象ががんに罹患しているかどうかを評価することを意味する。当業者によって理解されるであろうように、このような評価は、通常は、同定される対象の全て（すなわち１００％）において、正確であることは意図されない。しかし用語は、対象の統計学的に有意な部分が、同定され得ることを要求する（例えばコホート研究中のコホート）。部分が統計的に有意かどうかは、例えば、信頼区間の判定、ｐ値判定、スチューデントｔ検定、マンホイットニー検定などの様々な周知の統計学評価ツールを利用して、さらなる骨折りなしに当業者によって判定され得る。詳細は、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３にある。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。ｐ値は、好ましくは、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、または０．０００１である。より好ましくは、集団の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の対象が、本発明の方法によって適切に同定され得る。本発明による診断は、モニタリング、確認、および該当するがんの下位分類における、方法の適用を含む。
【００３４】
さらに診断は、対象の予後の確立もまた含む。本発明の方法によって、がんに罹患していると診断された対象は、ＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈポリペプチドを発現するがん細胞を有する。前記変異ＩＤＨ１の存在は、対象におけるおそらくは予後不良の前兆となる指標である。したがって、本発明の方法はまた、リスク層別化アプローチのために適用し得て、したがってがんに罹患している個々の対象に必要とされる、集中治療や入院の量を判定するために、適用し得る。
【００３５】
「血液サンプル」という用語は、本明細書の用法では、全血またはその任意の画分のサンプルを指す。全血の画分は、白血球などの細胞を含んでなる画分であっても、または血漿または血清などの本質的に無細胞の画分であってもよい。
【００３６】
「免疫系構成要素」という用語は、本明細書の用法では、免疫系の細胞および非細胞構成要素を指す。
【００３７】
本発明による非細胞構成要素は、抗原ペプチドと特異的に結合できるものを包含する。したがって好ましくは、前記免疫系構成要素は、血液サンプルに含まれる抗体である。この文脈で言及される抗体は、好ましくは、対象の血中で生じて、本発明の方法に従って、本明細書で言及されるＩＤＨ１のペプチドに特異的に結合する抗体である。対象の血中で生じてもよい抗体は、好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプの抗体である。
【００３８】
免疫系の非細胞構成要素が、本発明の方法に従って判定される場合、方法で適用される前記ペプチドは、好ましくは、ヒトＩＤＨ１中で連続アミノ酸配列として存在して、
ａ）アミノ酸１１８〜１３２に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１）；
ｂ）アミノ酸１２０〜１３４に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号２）；
ｃ）アミノ酸１２２〜１３６に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号３）；
ｄ）アミノ酸１２４〜１３８に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号４）；
ｅ）アミノ酸１２６〜１４０に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号５）；
ｆ）アミノ酸１２８〜１４２に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号６）；
ｇ）アミノ酸１３０〜１４４に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号７）；および
ｈ）アミノ酸１３２〜１４６に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号８）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、１０〜２０アミノ酸長からなる。
【００３９】
本発明によって免疫系構成要素と称される細胞構成要素は、ペプチド抗原と特異的に結合できる免疫系細胞である。ペプチド抗原と特異的に結合できる免疫系細胞は、好ましくは、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、または樹状細胞である。より好ましくは、免疫系構成要素はリンパ球であり、最も好ましくは、血液サンプルに含まれる、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球、またはＢリンパ球である。
【００４０】
免疫系の細胞構成要素が、本発明の方法に従って判定される場合、方法で適用される前記ペプチドは、好ましくは、ヒトＩＤＨ１中で連続アミノ酸配列として存在して、
ａ）アミノ酸１１８〜１３２に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１）；
ｂ）アミノ酸１２０〜１３４に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号２）；
ｃ）アミノ酸１２２〜１３６に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号３）；
ｄ）アミノ酸１２４〜１３８に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号４）；
ｅ）アミノ酸１２６〜１４０に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号５）；
ｆ）アミノ酸１２８〜１４２に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号６）；
ｇ）アミノ酸１３０〜１４４に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号７）；
ｈ）アミノ酸１３２〜１４６に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号８）；
ｉ）アミノ酸１２３〜１３２に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１０）；
ｊ）アミノ酸１２４〜１３３に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１１）；
ｋ）アミノ酸１２５〜１３４に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１２）；
ｌ）アミノ酸１２６〜１３５に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１３）；
ｍ）アミノ酸１２７〜１３６に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１４）；
ｎ）アミノ酸１２８〜１３７に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１５）；
ｏ）アミノ酸１２９〜１３８に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１６）；
ｐ）アミノ酸１３０〜１３９に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１７）；
ｑ）アミノ酸１３１〜１４０に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１８）；および
ｒ）アミノ酸１３２〜１４１に相当するアミノ酸からなる、アミノ酸配列（配列番号１９）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、１０〜２０アミノ酸長からなる。
【００４１】
「対象」という用語は、本明細書の用法では動物、好ましくは哺乳類、そしてより好ましくはヒトに関する。好ましくは、本発明の方法は、臨床的に明らかな症状の観点から前述のいずれかのがん型に罹患していることが疑われる対象、あるいは潜在的な高い素因のために前記がんに罹患していることが疑われる対象に、適用される。
【００４２】
ＩＤＨ１中で連続アミノ酸配列として存在する少なくとも１０アミノ酸長を含んでなり、位置１３２に相当する位置でＲからＨへの少なくとも１つのアミノ酸交換を有する、適切なペプチドは、本明細書の他の箇所で規定される。特に好ましいペプチドは、上に詳述される。
【００４３】
本明細書で言及されるサンプルを接触させるとは、ペプチドとサンプルとを物理的に接触させ、それによってサンプルに含まれる、または含まれない免疫系構成要素のペプチドへの特異的結合を可能にすることを指す。本明細書で意図される接触は、構成要素がペプチドと特異的に結合できるようにするのに十分な時間と条件下で実施されるものと理解される。サンプルの性質次第では、構成要素がペプチドにアクセスして特異的に結合し得るように、前処理段階が必要かもしれない。さらに、サンプルの種類によっては、取り扱いが異なるかもしれない。例えば、免疫系構成要素が、本明細書の他の箇所で規定されるような非細胞構成要素であれば、最初に全血サンプルから血清または血漿を得てもよい。構成要素が細胞構成要素であれば、適切な細胞の濃縮および／または分離が必要なこともある。好ましくは、血液サンプルに接触させるペプチドは、固体支持体上に固定化される。好ましくは、この固定化は、検出の感度および／または特異性を改善するために、そしてバックグラウンドノイズを除去するために、接触後に、血液サンプルを除去する洗浄段階を行えるようにする。さらに、このような接触段階は、自動化様式で、好ましくは、本明細書の他の箇所で規定される、本発明の装置の分析ユニット内で、行ってもよい。しかしこれもまた好ましくは、血液サンプル中に存在する免疫系構成要素を固定化して、例えばペプチドを含んでなる溶液と接触させてもよい。
【００４４】
接触に際して、前記免疫系構成要素とペプチドの結合が起きたかどうか、判定されるべきものと理解される。本明細書の用法では、構成要素とペプチドの結合を判定することは、構成要素とペプチドの複合体が形成されたかどうか、あるいは構成要素が、例えば洗浄後、ペプチドと結合しているために、固体支持体上に固定化形態で存在するかどうかを検出できるようにする、適切な検出方法によって達成され得る。第１の状況では、免疫系構成要素とペプチドの複合体のための検出剤を使用し得る。第２の状況では、免疫系構成要素のためのあらゆる検出剤を使用してもよい。免疫系構成要素を最初に固定化させ、その後ペプチドと接触させる場合、構成要素とペプチドの複合体が形成されたかどうかを検出できるようにする検出方法を使用し得て、あるいは検出可能な標識とペプチドそれ自体をカップリングさせてもよい。
【００４５】
構成要素とペプチドの複合体の検出、または構成要素の検出のために、本発明の方法で使用してもよい検出剤としては、抗体、アプタマー、または特異的結合を可能にするあらゆるその他の分子が挙げられる。検出剤は、好ましくは、放射性同位体（例えばヨウ化テクネチウムの放射性同位体）、蛍光性または化学発光剤（例えばＦＩＴＣ、ローダミン）、基質を変換することで検出可能なシグナルを発生できる酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、またはβガラクトシダーゼ）、蛍光タンパク質（例えば緑色、青色または赤色蛍光タンパク質）などの検出可能なマーカーとカップリングされる。適切な検出可能なマーカーについては、当該技術分野で周知である。さらに、検出剤は複合剤であってもよく、その中では、第１の薬剤が構成要素に特異的に結合するものであり、または複合体が検出可能な標識とカップリングされた１つまたは複数のさらなる薬剤を誘引できる。このような薬剤は、ビオチンであってもよい。このような場合、アビジンまたはストレプトアビジンとカップリングされた薬剤を使用し得て、それらは構成要素または複合体に結合したビオチンの結合に際して、検出可能なマーカーとしての役割を果たす。このような場合の適切な検出可能なマーカーは、上で言及されるものであり、より好ましくは、このような場合、検出可能なマーカーとして酵素が使用される。さらに検出抗体を使用して、複合体または構成要素を検出してもよい。このような検出抗体は、上述のような検出可能なマーカーとカップリングされる。したがって後者の場合、検出抗体は、構成要素または複合体との結合に際して、検出可能なシグナルを発生する。抗体による検出の原理は、当該技術分野で周知であり、慣例的に適用される。変更すべきところは変更して、前述の検出剤をペプチドの検出に適用してもよく、ペプチドは固定化された免疫系構成要素に適用されて、それと特異的に結合する。
【００４６】
検出可能なマーカーのタイプ次第で、検出可能なマーカーによって発生するシグナルの読み取りシステムを使用して、異なる検出方法を適用し得る。このようなシステムとしては、検出可能なシグナルの手動または自動検出のための、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ読み取り装置などの自動シグナル読み取り装置が挙げられる。さらに、読み取りシステムは、サンプルの追加的な情報を測定してもよく、例えば自動シグナル読み取り装置は、サンプルが包含するさらなる生物マーカーをさらに測定してもよい。
【００４７】
ペプチドと免疫系構成要素の特異的結合が判定された場合、診断が確立され、または少なくとも、本発明の方法から診断の助けが収集され得る。
【００４８】
有利なことに、本発明の基礎となる研究において、がん細胞中に存在する場合、ＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈ変異は、体液性免疫応答ならびに細胞性免疫応答をもたらす免疫応答を引き起こすことが示されている。したがって特異的にＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈ変異に対する、特に前記変異を含んでなるペプチドエピトープに対する、抗体、ならびに免疫系の細胞成分が、神経膠腫などのＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈ陽性がんに罹患している患者の血中に認められた。これらの知見に基づいて、本発明の方法は、神経膠腫などの特定タイプの悪性がん、好ましくは、ＷＨＯ  ＩＩまたはＷＨＯ  ＩＩＩ星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫、膠芽細胞腫、神経膠肉腫、または急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、または胚芽異形成性神経上皮腫瘍の血液ベースの診断を可能にする。さらに本発明の方法は、がんをＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈ陽性がんとして、したがって不良な予後を有するがんの特定の悪性段階またはクラスとして、分類できるようにする。方法は、サンプル材料として血液を使用するので、例えば上で言及される神経膠腫などの診断のために、目下使用されている面倒でおよび高価な生検を回避し得る。方法はまた、臨床ルーチンスクリーニングアプローチに含めることを可能にする。
【００４９】
本発明の方法の好ましい実施形態では、前記方法は、ステップｂ）で得られた診断に基づいて、抗がん療法を推奨するステップをさらに含んでなる。
【００５０】
「推奨する」という用語は、本明細書の用法では、対象のために、抗がん療法を奨めること、あるいは特定の抗がん療法を除外する（すなわち推奨しない）ことを指す。このような推奨は、任意選択的に、例えば病理組織学的試験からの情報などのその他の情報と合わせて、臨床医が、個々の対象に特定の抗がん療法を適用し、または適用しないことの基礎となる。本発明の方法のステップｂ）で確立された診断、すなわち「がん」または「がんでない」という診断に基づいて、抗がん療法が推奨される。本発明の方法によって「がん」の診断が確立された場合のみ、抗がん療法が推奨されるものと理解される。本発明の方法に基づいて、「がんでない」ことが診断として確立された場合、抗癌治療を控えることが推奨される。上述のように、サンプルが由来する対象からのさらなる情報もまた利用して、推奨を改善し得る。一態様では、本発明の方法によってがん細胞が同定されるが、例えば病理組織学分析などによって、検査されたがんの中に、本発明の方法では同定されないさらなるがん細胞が検出された場合は、例えば異なる抗腫瘍薬などによる併用抗がん療法を推奨し得る。
【００５１】
「抗がん療法」という用語は、本明細書の用法では、外科手術ベース療法、照射ベース療法、薬物ベース療法またはそれらの組み合わせである療法を包含する。前記薬物ベースの抗がん療法は、好ましくはテモゾロマイドまたはニトロソウレアベースの治療法である。
【００５２】
本発明は、さらに、
ａ）対象のサンプル中の免疫系構成要素を検出するように準備された、ＩＤＨ１中で連続アミノ酸配列として存在する少なくとも８アミノ酸長を含んでなり、位置１３２に相当する位置でＲからＨへの少なくとも１つのアミノ酸交換を有するペプチドを含んでなる、分析ユニット；および
ｂ）免疫系構成要素と前記ペプチドの特異的結合を検出でき、特異的結合が起きたか否かを示す出力シグナルを発生する検出器を含んでなる、評価ユニット
を含んでなる、Ｒ１３２Ｈ変異を有する変異ＩＤＨ１の発現をもたらす変異を、少なくともいくつかのがん細胞のゲノム中に有することで特徴付けられるがんを、診断する装置にも関する。
【００５３】
「装置」という用語は、本明細書の用法では、少なくとも、互いに作動可能に連結する、前述の分析ユニットと評価ユニットを含んでなる、システムに関する。装置のユニットを稼働様式でどのように接続するかは、装置に含まれるユニットのタイプに左右される。例えばサンプルを自動分析するユニットが施用され、前記自動稼働分析ユニットによって得られたデータは、評価ユニットによって所望の結果を得るために、例えばコンピュータプログラムで処理され得る。好ましくは、このような場合、ユニットは単一装置によって構成される。分析ユニットは、固体支持体上の固定化形態のペプチドを含んでなってもよい。このような分析ユニットは、特に液体サンプルにとって有用である。本発明の装置で検査されるサンプルは、好ましくは、本明細書の他の箇所で規定される血液サンプルである。ペプチドは、好ましくは、血液サンプルなどの溶液を塗布し得るように、分析ユニット中の検出ゾーンに固定化形態で含まれる。さらに分析ユニットは、固定化ペプチドに対する免疫系構成要素の適切な検出を可能にするために、ペプチドをサンプルに接触させた後、検出ゾーンに塗布しなくてはならないこともある洗浄液または検出溶液のための内部または外部バイアルを含んでなってもよい。分析ユニットはまた、免疫系構成要素が、検出ゾーン内の固定化ペプチドに結合したかどうかを測定できる、検出器も含んでなるものとする。当業者は、免疫系成分の固定化ペプチドへの結合を測定するために使用される検出反応の種類次第で、適切な検出器を含めることができる。評価ユニットは、好ましくは、分析ユニットによって測定された結合を評価するための実装規則、すなわちアルゴリズムを含んでなる、コンピュータまたはデータ処理装置であり、それによって、結合は、シグナルのタイプと強度に基づいて、有意なまたは有意でない結合と評価される。有意でない結合を示すと評価されたサンプルでは、「がんでない」という診断が確立され、好ましくは適切な出力形式で示される。評価の結果として有意な結合が得られた場合、がんの診断が確立され、好ましくは適切な出力形式で示される。
【００５４】
最後に、本発明は、Ｒ１３２Ｈ変異を有する変異ＩＤＨ１の発現をもたらす変異を、少なくともいくつかのがん細胞中のゲノムに有することで特徴付けられるがんを診断するためのキットに関し、前記キットは、前記方法を実施するための使用説明と、ＩＤＨ１中で連続アミノ酸配列として存在する少なくとも１０アミノ酸長を含んでなるペプチドとを含んでなり、前記ペプチドは、位置１３２に相当する位置にＲからＨへの少なくとも１つのアミノ酸交換を有する。
【００５５】
「キット」という用語は、本明細書の用法では、サンプル中のがんを診断するために、すぐ使用できる様式で提供される、前述の抗体および使用説明の集まりを指す。ペプチドおよび使用説明は、好ましくは単一容器内で提供される。好ましくは、キットは、診断を行うために必要である、さらなる構成要素もまた含んでなる。このような構成要素は、ペプチド結合の検出に必要な助剤、分析サンプルの前処理のための薬剤、または較正基準であってもよい。
【００５６】
本明細書で言及される全ての参考文献は、それらの開示内容全体、および本明細書で具体的に言及される開示内容に関して、本明細書に参照によって援用する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ変異神経膠腫がある患者における、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈに対する天然ＭＨＣクラスＩＩ制限免疫応答。野生型（ｗｔ）または変異ＩＤＨ１ペプチドがある、末梢血刺激からのエリスポットアッセイ（左）。ペプチド混合物およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）が、対照の役割を果たした。ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈペプチドによる刺激後に増殖したＴ細胞上における、ＣＤ４およびＣＤ８の細胞表面発現を分析するフローサイトメトリー（右）。
【図２Ａ】ＭＨＣクラスＩＩヒト化マウスにおける、ＭＨＣクラスＩＩ制限免疫原性ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈエピトープ。ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈペプチド１２３〜１４２（パネル１）、１２４〜１３８（パネル２）、１２２〜１３６（パネル３）または擬免疫化（パネル４）による免疫化と、示されるＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈペプチド配列による生体外再刺激後における、マウスＭＨＣクラスＩおよびＩＩを欠いているが、ヒトＡ２およびＤＲ１で遺伝子組換えされている、遺伝子組換えマウス中の末梢免疫応答。野生型ＩＤＨ１ペプチド１２３〜１４２、ＤＭＳＯ、およびＭＨＣクラスＩＩ制限免疫原性ミエリンペプチド（ＭＯＧ）が、対照の役割を果たした。
【図２Ｂ】同上
【図３】ＭＨＣクラスＩＩヒト化マウスにおける、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ特異的抗体応答。ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈペプチド１２３〜１４２（暗青色）、１２４〜１３８（緑色）、１２２〜１３６（淡青色）または擬免疫化（赤色）による免疫化、および示されるＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈペプチド配列への結合後における、マウスＭＨＣクラスＩおよびＩＩを欠いているが、ヒトＡ２およびＤＲ１で遺伝子組換えされている、遺伝子組換えマウス血清中のＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ特異的ＩｇＧ抗体応答。野生型ＩＤＨ１ペプチド１２２〜１３６および１２６〜１４０、ＤＭＳＯ、およびＭＨＣクラスＩＩ制限免疫原性ミエリンペプチド（ＭＯＧ）が、対照の役割を果たした。
【図４】ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ変異神経膠腫がある患者における、天然ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ特異的抗体応答。ＩＤＨ１変異神経膠腫、ＩＤＨ１野生型神経膠腫（ｗｔ）、ＩＤＨ１状態未知の神経膠腫がある患者、または健常対照の血清中のＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２６〜１４０ペプチドに対する、天然ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ特異的ＩｇＧ抗体応答。入手できる場合、ＭＨＣクラスＩＩハプロタイプおよび腫瘍型の情報が示される。
【図５】ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ変異神経膠腫がある患者における、天然ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ特異的抗体応答のエピトープ特異性。ＩＤＨ１変異神経膠腫がある５人のＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ患者（色分けされている）の血清中における、示される野生型（ｗｔ）またはＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ（ＲＨ）ペプチドに対する、天然ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ特異的ＩｇＧ抗体応答。
【図６Ａ】ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈペプチドワクチン接種はＴｈ１およびＣＴＬ応答を誘導するＡ２．ＤＲ１マウスをＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１中の１００μｇのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２ペプチド、３００ｎｇのＧＭ−ＣＳＦ、および５０μｌのＡｌｄａｒａクリーム（５％イミキモド）で免疫化して、１４日後にＧＭ−ＣＳＦなしで追加免疫した。対照マウスは、ペプチドなしで同一様式で処置した。さらに１４日後、脾臓およびリンパ節を分析のために摘出した。Ａ）リンパ節細胞を、１０μｇ／ｍｌのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ１ｗｔペプチド、陰性対照ペプチド（ＭＯＧ）で、ビヒクル単独で、または２００μｇ／ｍｌのＩＦＮｇ処置されたＩＤＨ１ｗまたはＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ過剰発現ＧＬ２６１細胞のタンパク質溶解産物で、３８時間刺激した。ＩＦＮγ産生は、エリスポットによって測定した。左、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈワクチン接種；右、ビヒクル対照ワクチン接種。
【図６Ｂ】Ｂ）（Ａ）と同様に、および２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで、および陽性対照としての１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで、７２時間刺激された脾細胞中において、全身性のＩＦＮγＴ細胞応答を確認した。上清を収集し、ビオチン化抗ＩＦＮγによる標準曲線、ストレプトアビジン−ＨＲＰ、およびＴＭＢを使用して、抗ＩＦＮγ被覆ＥＬＩＳＡ中で、ＩＦＮγを三重反復試験で比色分析により定量化した。
【図６Ｃ−１】Ｃ）ＩＦＮγ産生脾細胞は、サイトカインフローサイトメトリーによって分析した。脾細胞をＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２またはビヒクル対照によって生体外で刺激し、分泌阻害のためのＧｏｌｇｉ輸送阻害剤である５μｇ／ｍｌのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａを含む、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで５時間再刺激した。表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８を染色して、細胞内染色のために細胞を透過処理して固定し、ＩＦＮγを染色した。細胞は、フローサイトメーターで分析した。上パネル、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈワクチン接種マウス；下パネル、ビヒクル対照ワクチン接種マウス。１匹のマウスの代表的な結果を示す。
【図６Ｃ−２】同上
【図７Ａ】ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈペプチドワクチン接種は、Ｔｈ２またはＴｈ１７サイトカインを誘発しないＡ２．ＤＲ１マウスをＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１中の１００μｇのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２ペプチド、３００ｎｇのＧＭ−ＣＳＦ、および５０μｌのＡｌｄａｒａクリーム（５％イミキモド）で免疫化して、１４日後にＧＭ−ＣＳＦなしで追加免疫した。対照マウスは、ペプチドなしで同一様式で処置した。さらに１４日後、脾臓およびリンパ節を分析のために摘出した。Ａ）脾細胞を、１０μｇ／ｍｌのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ１ｗｔペプチド、陰性対照ペプチド（ＭＯＧ）で、ビヒクルのみで、または陽性対照として２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで、７２時間刺激した。上清を収集し、ビオチン化抗サイトカイン抗体による標準曲線、ストレプトアビジン−ＨＲＰ、およびＴＭＢを使用して、抗サイトカイン被覆ＥＬＩＳＡ中で、サイトカインを三重反復試験で比色分析により定量化した。
【図７Ｂ−１】Ｂ）ＩＦＮγ産生細脾胞は、サイトカインフローサイトメトリーによって分析した。脾細胞をＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２またはビヒクル対照によって生体外で刺激し、分泌阻害のためのＧｏｌｇｉ輸送阻害剤である５μｇ／ｍｌのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａを含む、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで５時間再刺激した。表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ２５を染色して、細胞内染色のために細胞を透過処理して固定し、ＩＬ４、ＩＬ１７、およびＦｏｘＰ３を染色した。細胞は、フローサイトメーターで分析した。上パネル、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈワクチン接種マウス；下パネル、ビヒクル対照ワクチン接種マウス。左；Ｔｈ２およびＴｈ１７；右、Ｔｒｅｇ。１匹のマウスの代表的な結果を示す。
【図７Ｂ−２】同上
【図８Ａ】ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈペプチドワクチン接種はＩｇＧ産生を誘導するＡ２．ＤＲ１マウスをＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１中の１００μｇのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２ペプチド、３００ｎｇのＧＭ−ＣＳＦ、および５０μｌのＡｌｄａｒａクリーム（５％イミキモド）で免疫化して、１４日後にＧＭ−ＣＳＦなしで追加免疫した。対照マウス（ＤＭＳＯ）は、ペプチドなしで同一様式で処置した。さらに１４日間後、顎下静脈から採血して血清を得た。ＨＲＰ共役抗ＩｇＧ抗体およびＴＭＢを使用して、ＩＤＨ１Ｒ１３２ＨまたはＩＤＨ１ｗｔペプチド被覆ＥＬＩＳＡ中で、ＩＤＨ１結合総ＩｇＧ（Ａ）、およびＩｇＧサブタイプ（Ｂ）について、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈワクチン接種およびビヒクル対照ワクチン接種マウスからの血清を検査した。
【図８Ｂ−１】同上
【図８Ｂ−２】同上
【図８Ｂ−３】同上
【図９Ａ】ＣＤ４Ｔ細胞系は、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲ依存性および変異特異的であるＡ２．ＤＲ１マウスをＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１中の１００μｇのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２ペプチド、３００ｎｇのＧＭ−ＣＳＦ、および５０μｌのＡｌｄａｒａクリーム（５％イミキモド）で免疫化して、１４日後にＧＭ−ＣＳＦなしで追加免疫した。対照マウスは、ペプチドなしで同一様式で処置した。さらに１４日間後、脾臓を摘出して、１０μｇ／ｍｌのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２で刺激した。ＣＤ４＋  ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２特異的Ｔ細胞系を作成するために、２μｇ／ｍｌのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２およびＣｏｎＡを負荷した同質遺伝子型照射脾細胞で、細胞を４週間毎に再刺激して、３回の再刺激後に分析した。Ａ）２μｇ／ｍｌのＬＰＳおよび７μｇ／ｍｌのデキストラン硫酸によって、同質遺伝子型脾細胞から、１０５個のＢ細胞芽球を３日間かけて作成し、０．１または１．０μｇ／ｍｌの（Ａ）ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２、ＩＤＨ１ｗｔ１２３〜１４２陰性対照ペプチド（ＭＯＧ）またはビヒクルを負荷して、ＣＤ４＋Ｔ細胞系の２５０個の細胞を刺激するために使用した。
【図９Ｂ】Ｂ）０．１μｇ／ｍｌの（Ａ）ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２負荷によるＢ細胞芽球の刺激は、０．２μｇ／ｍｌのＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体で阻害された。３８時間後に、エリスポットによってＩＦＮγ産生を測定した。＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図９Ｃ】Ｃ）ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２特異的Ｔ細胞によるＣＤ４発現は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８の染色と、フローサイトメトリーによって確認された。
【図９Ｄ】Ｄ）分泌阻害のためのＧｏｌｇｉ輸送阻害剤である５μｇ／ｍｌのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａを含む、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２特異的Ｔ細胞を５時間刺激した。表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ２５を染色して、細胞内染色のために細胞を透過処理して固定し、ＩＦＮγ、ＩＬ４、ＩＬ１７、およびＦｏｘＰ３を染色した。細胞は、フローサイトメーターで分析された。
【図９Ｅ】Ｅ）４μｇ／ｍｌのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２を負荷して、２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦによって、骨髄から産生された同質遺伝子型ＤＣ（Ｔ細胞：ＤＣ１：５）で、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２特異的Ｔ細胞を５日間刺激した。細胞内サイトカイン染色のために、（Ｄ）と同様に、細胞を分泌阻害のための５μｇ／ｍｌのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａで処理して、フローサイトメトリーのために染色した。
【図１０Ａ】ＣＤ４Ｔ細胞クローンは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲ依存性および変異特異的であるＣＤ４＋ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２特異的Ｔ細胞系から、単細胞クローンを作成して、２μｇ／ｍｌのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２およびＣｏｎＡを負荷した同質遺伝子型照射脾細胞で、４週間毎に再刺激した。Ａ）２μｇ／ｍｌのＬＰＳおよび７μｇ／ｍｌのデキストラン硫酸によって、同質遺伝子型脾細胞から、１０５個のＢ細胞芽球を３日間かけて作成し、０．１または１．０μｇ／ｍｌの（Ａ）ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２、ＩＤＨ１ｗｔ１２３〜１４２陰性対照ペプチド（ＭＯＧ）またはビヒクルを負荷して、ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの２５００個の細胞を刺激するために使用した。
【図１０Ｂ】Ｂ）０．１μｇ／ｍｌの（Ａ）ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２負荷によるＢ細胞芽球の刺激は、０．２μｇ／ｍｌのＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体で阻害された。３８時間後に、エリスポットによってＩＦＮγ産生を測定した。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図１１Ａ】ＧＢＭ患者におけるＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ特異的ＩＦＮγ応答はＴｈ１媒介性であるＡ）１０７個のＰＢＭＣをＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ＋ＧＢＭ患者の末梢血から単離して、４０μｇ／ｍｌのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２、陰性対照ペプチドＭＯＧまたは陽性対照としての１μｇ／ｍｌスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で６時間刺激して、ＩＦＮγ産生細胞を捕捉アッセイによって単離した。４５分間の分泌期間にわたって、細胞表面の分泌ＩＦＮγを捕捉するために、細胞を捕捉試薬としての抗ＩＦＮγ抗体で標識した。細胞をＰＥ共役ＩＦＮγ特異的抗体および抗ＰＥミクロビーズで標識して、磁力的にソートした。フローサイトメトリーのために、ＩＦＮγ産生を表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８で染色して、ＩＦＮγ陰性細胞（ＡＰＣ）を対照として使用した。
【図１１Ｂ】Ｂ）同一患者の５＊１０５個のＰＢＭＣを２０μｇ／ｍｌＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２、ＩＤＨ１ｗｔ１２３〜１４２または陰性対照ペプチド（ＭＯＧ）で３８時間刺激して、ＩＦＮγ産生をエリスポットによって測定した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１１Ｃ】Ｃ）同一患者（左）および未分化神経膠腫患者（Ａ°ＩＩＩ）の腫瘍組織中で、ＣＤ３＋腫瘍浸潤性Ｔ細胞を染色した。
【図１２】ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ＋神経膠腫患者における体液性および細胞ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ応答Ａ）ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ＋およびＩＤＨ１ｗｔ神経膠腫患者からの血清を、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２２〜１３６ペプチドＥＬＩＳＡ中で、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ特異的ＩｇＧについて検査した。ウェルあたり１０μｇのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２２〜１３６ペプチドで、プレートを被覆し、３％ＦＢＳでブロックして、ＩｇＧのペプチドへの結合のために血清をインキュベートした。ＩｇＧは、ＨＲＰ共役抗ヒトＩｇＧ抗体およびＴＭＢによって、比色分析で検出した。陰性対照として、ＭＯＧペプチドで被覆した。示されるのは、ＭＯＧペプチドに対する相対値である。データは、全部で５０人の患者から得られ、その内１５人にはＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ、２３人にはＩＤＨ１ｗｔがあり、１２人のＩＤＨ１状態は未知であった。Ｂ）ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ＋神経膠腫患者の末梢血から、５＊１０５個のＰＢＭＣを単離して、２０μｇ／ｍｌのＩＤＨ１ｗｔ１２３〜１４２またはＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２で３８時間刺激して、ＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体で処理した。ＩＦＮγ産生は、エリスポットで定量化した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１３−１】ＩＤＨ１Ｒ１３２ＨＩＦＮγ捕捉アッセイ染色およびゲーティングストラテジーの確立Ａ）１０７個のＰＢＭＣをＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ＋神経膠腫患者の末梢血から単離して、４０μｇ／ｍｌのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２、陰性対照ペプチドＭＯＧまたは陽性対照としての１μｇ／ｍｌスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で６時間刺激して、ＩＦＮγ産生細胞を捕捉アッセイによって単離した。４５分間の分泌期間にわたって、細胞表面の分泌ＩＦＮγを捕捉するために、細胞を捕捉試薬としての抗ＩＦＮγ抗体で標識した。細胞をＰＥ共役ＩＦＮγ特異的抗体および抗ＰＥミクロビーズで標識して、磁力的にソートした。フローサイトメトリーのために、ＩＦＮγ産生性およびＩＦＮγ陰性細胞（ＡＰＣ）を表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８で染色し、死細胞はＰＩで標識した。
【図１３−２】同上
【図１４Ａ】神経膠腫患者におけるＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ特異的ＩＦＮγ応答性Ｔ細胞の不在１０７個のＰＢＭＣをＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ＋神経膠腫患者の末梢血から単離して、４０μｇ／ｍｌのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２、陰性対照ペプチドＭＯＧまたは陽性対照としての１μｇ／ｍｌスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で６時間刺激して、ＩＦＮγ産生細胞を捕捉アッセイによって単離した。４５分間の分泌期間にわたって、細胞表面の分泌ＩＦＮγを捕捉するために、細胞を捕捉試薬としての抗ＩＦＮγ抗体で標識した。細胞をＰＥ共役ＩＦＮγ特異的抗体および抗ＰＥミクロビーズで標識して、磁力的にソートした。フローサイトメトリーのために、ＩＦＮγ産生性およびＩＦＮγ陰性細胞（ＡＰＣ）を表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８で染色し、死細胞はＰＩで標識した。Ａ）患者０１０２７５、Ｂ）患者２７０２８４、Ｃ）患者０８０５７２。
【図１４Ｂ】同上
【図１４Ｃ】同上
【図１５Ａ】神経膠腫患者におけるＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ特異的ＩＦＮγ応答性Ｔ細胞の存在１０７個のＰＢＭＣをＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ＋神経膠腫患者の末梢血から単離して、４０μｇ／ｍｌのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ１２３〜１４２、陰性対照ペプチドＭＯＧまたは陽性対照としての１μｇ／ｍｌスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で６時間刺激して、ＩＦＮγ産生細胞を捕捉アッセイによって単離した。４５分間の分泌期間にわたって、細胞表面の分泌ＩＦＮγを捕捉するために、細胞を捕捉試薬としての抗ＩＦＮγ抗体で標識した。細胞をＰＥ共役ＩＦＮγ特異的抗体および抗ＰＥミクロビーズで標識して、磁力的にソートした。フローサイトメトリーのために、ＩＦＮγ産生性およびＩＦＮγ陰性細胞（ＡＰＣ）を表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８で染色し、死細胞はＰＩで標識した。Ａ）患者１７０１８５、Ｂ）患者１５０１６１。
【図１５Ｂ】同上
【実施例】
【００５８】
以下の実施例は、本発明を単に例証するものである。それらは、本発明の範囲をどのようにも限定するものではないと、解釈されるべきである。
【００５９】
実施例１：ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈワクチン接種ＭＨＣＩＩヒト化マウスにおけるＭＨＣＩＩ制限抗ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ  ＣＤ４＋Ｔ細胞応答と抗体生成の同定。
マウスＭＨＣクラスＩおよびＩＩを欠いているが、ヒトＡ２およびＤＲ１で遺伝子組換えされて、ヒトクラスＩおよびクラスＩＩのコンテクストで抗原提示を模倣する、遺伝子組換えマウスにおいて、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈに対する末梢免疫応答を検査した。これらの実験（図２）は、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈペプチド１２３〜１４２、１２４〜１３８、または１２２〜１３６による免疫化と、様々な変異特異的ペプチドによる生体外再刺激後に、変異１２３〜１４２および１２２〜１３６ペプチドは免疫原性であるが、変異１２４〜１３８は免疫原性でないことを明らかにした。１２３〜１４２の特異的免疫原性は、ワクチン接種ヒト化マウスにおいて抗体応答を分析した際に、再現された。これらの実験は、免疫化後に、ＩＤＨ１変異特異的抗体が産生されたことを示した（図３）。
【００６０】
実施例２：ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ変異神経膠腫のある患者におけるＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ  １２３〜１４２の免疫原性。
ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ  １２３〜１４２の免疫原性はまた、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ変異神経膠腫患者においても示され、天然ＣＤ４Ｔ細胞応答が検出され（図１）、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ変異神経膠腫患者では天然ＩＤＨＲ１３２Ｈ特異的抗体が明白であったが、ＩＤＨ１野生型神経膠腫の健常対照ではそうでなかった（図４）。これらの抗体は、エピトープ特異性がほとんど同じであり、１２２〜１３６および１２６〜１４０が好まれるようであった（図５）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ−１】
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【図６Ｃ−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ−１】
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【図７Ｂ−２】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−１】
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【図８Ｂ−２】
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【図８Ｂ−３】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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