(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低いフェニルアラニン（Ｐｈｅ）含有量を有するカゼイノマクロペプチド含有組成物を製造する方法であって、前記組成物が当該組成物のタンパク質総量に対して最大０．５％（ｗ／ｗ）のＰｈｅを含み、前記方法が、
ａ）カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）と少なくとも１種の追加的なタンパク質とを含んでなり、最大で４のｐＨを有する、ホエー由来供給物を提供するステップと、
ｂ）単量体ＣＭＰを通過させる限外濾過フィルターを使用して、前記ホエー由来供給物を限外濾過し、それによってＣＭＰに関して富化されたＵＦ透過液と、ＵＦ残余分とを提供するステップと、
ｃ）前記ＵＦ透過液に由来する第１の組成物をカチオン交換材に接触させるステップと、
ｄ）前記カチオン交換材と結合しない前記第１の組成物の画分を収集し、それによって前記ＣＭＰ含有組成物を得るステップと
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記乳清由来供給物が、チーズホエーまたはその濃縮物に由来することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、前記乳清由来供給物が、レンネット凝固カゼインまたはカゼイネートから得られるホエーまたはその濃縮物に由来することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか一項に記載の方法において、前記乳清由来供給物が、タンパク質総量と比較して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ総量を含有することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか一項に記載の方法において、前記乳清由来供給物が、タンパク質総量と比較して、１％〜６０（ｗ／ｗ）の範囲のＣＭＰ総量を含有することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか一項に記載の方法において、前記少なくとも１種の付加タンパク質が、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、βカゼイン、カゼイン由来ペプチド、乳脂肪球皮膜（ＭＦＧＭ）タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか一項に記載の方法において、前記少なくとも１種の付加タンパク質が、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、βカゼイン、カゼイン由来ペプチド、乳脂肪球皮膜（ＭＦＧＭ）タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも２種のタンパク質を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか一項に記載の方法において、前記乳清由来供給物が、タンパク質総量と比較して、最大で３％（ｗ／ｗ）のカゼインの総量を含有することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか一項に記載の方法において、前記乳清由来供給物が、前記乳清由来供給物重量と比較して、少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）のタンパク質総量を含有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか一項に記載の方法において、前記乳清由来供給物が、前記乳清由来供給物重量と比較して、０．２〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲のタンパク質総量を含有することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか一項に記載の方法において、前記乳清由来供給物が、ｐＨ１〜４の範囲のｐＨを有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１の何れか一項に記載の方法において、前記限外濾過フィルターが、５〜３００ｋＤａの範囲の名目上の分画分子量を有することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２の何れか一項に記載の方法において、前記ＵＦ透過液が、タンパク質総量と比較して、少なくとも５５％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ総量を含有することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３の何れか一項に記載の方法において、前記ＵＦ透過液が、５００ｎｍで最大０．１ＡＵの吸光度を有することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか一項に記載の方法において、前記第１の組成物が、タンパク質総量と比較して、少なくとも５５％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ総量を含有することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１乃至１５の何れか一項に記載の方法において、前記第１の組成物が、タンパク質総量と比較して、５５％〜９５（ｗ／ｗ）の範囲のＣＭＰ総量を含有することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１乃至１６の何れか一項に記載の方法において、前記第１の組成物が、前記第１の組成物重量と比較して、最大で０．５％（ｗ／ｗ）のカゼイン総量を含有することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１乃至１７の何れか一項に記載の方法において、前記第１の組成物が、少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）のタンパク質総量を含有することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１８の何れか一項に記載の方法において、前記第１の組成物が、０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲のタンパク質総量を含有することを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９の何れか一項に記載の方法において、前記第１の組成物が、ｐＨ２〜５の範囲のｐＨを有することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１乃至２０の何れか一項に記載の方法において、前記第１の組成物が、１〜８ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有することを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１乃至２１の何れか一項に記載の方法において、前記第１の組成物との接触時に、前記カチオン交換材がカラムに充填されていることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１乃至２２の何れか一項に記載の方法において、前記第１の組成物との接触時に、前記カチオン交換材が易流動性粒子として、前記第１の組成物に懸濁されていることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１乃至２３の何れか一項に記載の方法において、前記収集された画分を濃縮するステップをさらに含んでなることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１乃至２４の何れか一項に記載の方法において、前記収集された画分を噴霧乾燥するステップをさらに含んでなることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非常に低いフェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルを有するカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）を含有する組成物を、高収率で製造する方法に関する。より正確には、方法は、ホエー由来供給物を、限外濾過と引き続くカチオン交換クロマトグラフィーの組み合わせの対象とすることを伴う。
【背景技術】
【０００２】
ＣＭＰは、ガラクトサミン、ガラクトース、およびｏ−シアル酸による多様なグリコシル化パターンと、異なる程度のグリコシル化のために、非常に不均一なペプチドである。この理由からＣＭＰは、単一電荷を有しないが、事実上、荷電分布が存在する。
【０００３】
ＣＭＰは、Ｐｈｅを含有しない、ユニークな天然起源ペプチドである。ＣＭＰは、例えばチーズの製造中に、キモシンがκ−カゼインを１０５から１０６アミノ酸残基の間で特異的に切断する際に、形成される。パラκカゼイン（残基１〜１０５）が凝析して、チーズカードを形成する一方で、ＣＭＰ（残基１０６〜１６９）はホエー中に残留する。ＣＭＰは、甘性ホエー中で、β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）およびα−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）に次ぐ、３番目に最も豊富なタンパク質である。
【０００４】
Ｐｈｅの欠如は、ＣＭＰを、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患している人々のための興味深いタンパク質源にする。
【０００５】
ホエーからＣＭＰを単離するいくつかの試みが、先行技術に記載されている。
【０００６】
米国特許第５，２７８，２８８号明細書は、チーズホエーをカチオン交換し、引き続いて非結合画分を低ｐＨで限外濾過し、それによって単量体ＣＭＰおよびその他の不純物を限外濾過透過液中に単離する、ＣＭＰを製造する方法を開示する。得られた透過液のｐＨを最終的にｐＨ７に調節して、ＣＭＰオリゴマーの形成をもたらし、ＣＭＰオリゴマーは限外濾過によって濃縮される。得られた組成物のＰｈｅ含有量は、米国特許第５，２７８，２８８号明細書では言及されない。
【０００７】
国際公開第９９／１８８０８号パンフレットは、ＣＭＰを回収する別の方法を開示する。より具体的には、国際公開第９９／１８８０８号パンフレットは、チーズホエーを、順次実施される逆極性の二段階イオン交換の対象とする方法を記載する。上述の米国特許第５，２７８，２８８号明細書は、国際公開第９９／１８８０８号パンフレットの背景技術セクションで考察され、米国特許第５，２７８，２８８号明細書の方法のＣＭＰ回収は、不経済に低いと言及されている。
【０００８】
国際公開第９８／１４０７１号パンフレットは、ＣＭＰ組成物を製造する方法を開示する。この方法は、チーズホエーをアニオン交換処理し、引き続いてカチオンまたはアニオン交換処理であってもよい第２のイオン交換処理を実施することを伴う。得られたＣＭＰ組成物は、塩酸によるタンパク質加水分解後に測定されたアミノ酸総量と比較して、最大で０．５％（ｗ／ｗ）のＰｈｅ含有量を有するとされている。
【発明の概要】
【０００９】
当該技術分野の一般的理解（例えば国際公開第９９／１８８０８号パンフレットの２頁を参照されたい）に反して、本発明者らは、限外濾過とカチオン交換の組み合わせが、ホエー由来供給物からＣＭＰを分離する経済的方法をもたらし得ることを発見した。しかしこれは、カチオン交換ステップと、それに続く限外濾過ステップを開示する米国特許第５，２７８，２８８号明細書とは異なり、カチオン交換ステップの前に限外濾過ステップを実施することを要する。
【００１０】
本発明を使用することで、非常に高い収率と非常に低いＰｈｅ含有量の双方で、ＣＭＰを経済的に単離してもよい。
【００１１】
したがって本発明の態様は、低いフェニルアラニン含有量を有するカゼイノマクロペプチド含有組成物を製造する方法に関し、方法は、
ａ）カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰと少なくとも１種の追加的なタンパク質とを含んでなり、最大で４のｐＨを有する、ホエー由来供給物を提供するステップと、
ｂ）単量体ＣＭＰを通過させる限外濾過（ＵＦ）フィルターを使用して前記ホエー由来供給物を限外濾過し、それによってＣＭＰに関して富化されたＵＦ透過液と、ＵＦ残余分とを提供するステップと、
ｃ）前記ＵＦ透過液に由来する第１の組成物をカチオン交換材に接触させるステップと、
ｄ）カチオン交換材と結合しない第１の組成物の画分を収集し、それによってＣＭＰ含有組成物を得るステップと
を含んでなる。
【００１２】
本発明の文脈で、「カゼイノマクロペプチド」または「ＣＭＰ」という用語は、例えばチーズ製造中に、例えばキモシンへの曝露時に、κ−カゼインから遊離してもよいペプチドに関する。ＣＭＰという用語は、ＣＭＰのグリコシル化および非グリコシル化形態の双方を包含する。学術文献では、ＣＭＰは、時にカゼイノグリコマクロペプチド（ｃＧＭＰ）またはグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）とも称される。
【００１３】
低いｐＨでは、ＣＭＰは、「単量体ＣＭＰ」とも称される単一ＣＭＰ分子として存在する。より高いｐＨでは、単一ＣＭＰ分子は凝集し始め、したがってＣＭＰ二量体（２つの単一ＣＭＰ分子の複合体）またはＣＭＰオリゴマー（２つを超える単一ＣＭＰ分子の複合体）を形成する。
【００１４】
本発明の文脈で、低いフェニルアラニン（Ｐｈｅ）含有量を有する組成物は、組成物のタンパク質総量に対して最大で０．５％（ｗ／ｗ）のＰｈｅを含有する。本明細書に記載されるように、さらにより低いＰｈｅ含有量が好ましいこともある。組成物のＰｈｅ含有量は、ＩＳＯ  １３９０３：２００５（動物飼料−アミノ酸含有量判定）に従って判定される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＵＦ透過液（３）が第１の組成物として使用される、本発明の実施形態の概略図である。
【図２】図２は、ＵＦ透過液（３）が第１の組成物として使用され、ＵＦ残余分（２）が水（５）で希釈されて、限外濾過システムへの供給物（５）として再循環される、本発明の実施形態の概略図である。
【図３】図３は、本発明の実施形態の概略図であり、３つのＵＦユニットが順に配列されて、最初にホエー由来供給物が濾過され（１）、次に第１のＵＦユニットからのＵＦ残余分（２）が水（５）で希釈され、最後に第２のＵＦユニットからのＵＦ残余分（２’）もまた水（５）で希釈される。３つのＵＦユニット（３、３’、および３’’）のＵＦ透過液は、合わされて第１の組成物として使用される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の態様は、低いフェニルアラニン含有量を有する、カゼイノマクロペプチド含有組成物を製造する方法に関し、方法は、
ａ）カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰと少なくとも１種の追加的なタンパク質とを含んでなり、最大で４のｐＨを有する、ホエー由来供給物を提供するステップと、
ｂ）単量体ＣＭＰを通過させる限外濾過フィルターを使用して、前記ホエー由来供給物を限外濾過し、それによってＵＦ透過液と、ＣＭＰに関して富化されたＵＦ残余分とを提供するステップと、
ｃ）前記ＵＦ透過液に由来する第１の組成物をカチオン交換材に接触させるステップと、
ｄ）カチオン交換材と結合しない第１の組成物の画分を収集し、それによってＣＭＰ含有組成物を得るステップと
を含んでなる。
【００１７】
ホエー由来供給物は、限外濾過の対象となる液体供給物である。ホエー由来供給物は、例えばホエーの処理中に典型的に得られる、プロセスストリームの１つであってもよい。
【００１８】
本発明の文脈で、「ホエー」という用語は、例えばレンネットベースのチーズ製造中に生じる、特にκ−カゼインであるカゼインの酵素的切断によって、カゼインが凝固する際に得られる液体画分に関する。
【００１９】
ホエー由来供給物中では、総タンパク質の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）がホエーに由来する。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ホエー由来供給物の総タンパク質の少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、好ましくは実質的に全てが、ホエーに由来する。
【００２０】
ホエーは、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、ラクダ、ラマ、ウマおよび／またはシカからのミルクなどの好ましくは哺乳類ミルクのホエーである。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ホエー由来供給物は牛乳に由来する。
【００２１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ホエー由来供給物は、チーズホエーまたはその濃縮物に由来する。ホエー由来供給物は、例えばチーズホエーまたはそのタンパク質濃縮物からなってもよい。
【００２２】
本発明の文脈で、液体の「タンパク質濃縮物」という用語は、元の液体のタンパク質の実質的に全部を含有するが、より少量の水および任意選択的により少量の塩、炭水化物、およびその他の小型分子を含有する、液体組成物または粉末組成物に関する。タンパク質濃縮物は、例えば蒸発によって、または低分子カットオフ膜を使用する限外濾過によって調製してもよい。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態では、ホエー由来供給物は、β−ラクトグロブリン低下供給物、またはそのタンパク質濃縮物に由来する。
【００２４】
本発明のその他の好ましい実施形態では、ホエー由来供給物は、レンネット凝固カゼインまたはカゼイネートから得られるホエー、またはその濃縮物に由来する。ホエー由来供給物は、例えばレンネット凝固カゼインまたはカゼイネートからのホエー、またはその濃縮物からなってもよい。このようなホエーは、例えばミルクの代わりにカゼインミセル単離物をベースとするチーズ製造中に得られる。
【００２５】
ホエー由来供給物のＣＭＰ含有量は変動してもよく、どの特定ホエー由来供給物が使用されるかに左右される。
【００２６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ホエー由来供給物は、タンパク質総量と比較して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のＣＭＰを含有する。例えばホエー由来供給物は、タンパク質総量と比較して、少なくとも５％（ｗ／ｗ）のＣＭＰを含有してもよい。好ましくはホエー由来供給物は、タンパク質総量と比較して、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）の量のＣＭＰを含有する。ホエー由来供給物は、例えばタンパク質総量と比較して、少なくとも１５％（ｗ／ｗ）の量のＣＭＰを含有してもよい。
【００２７】
ホエー由来供給物は、例えばタンパク質総量と比較して、１〜６０％（ｗ／ｗ）の範囲の量のＣＭＰを含有してもよい。例えばホエー由来供給物は、タンパク質総量と比較して、５〜５０％（ｗ／ｗ）の範囲の量のＣＭＰを含有してもよい。好ましくはホエー由来供給物は、タンパク質総量と比較して、１０〜４０％（ｗ／ｗ）の範囲の量のＣＭＰを含有する。ホエー由来供給物は、例えばタンパク質総量と比較して、１５〜３０％（ｗ／ｗ）の範囲の量のＣＭＰを含有してもよい。
【００２８】
例えばホエー由来供給物または関連製品などの組成物のＣＭＰの量および総タンパク質の量は、好ましくはＴｈｏｍａｅ  ｅｔ  ａｌ（Ｔｈｏｍａｅ，Ｃ．，Ｋｒａｕｓｅ，Ｉ．ａｎｄ  Ｋｕｌｏｚｉｋ，Ｕ．（２００６）．Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｏｆ  ｃａｓｅｉｎｏｍａｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ＲＰ−ＨＰＬＣ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１６，２８５−２９３）に記載されるようにして判定される。
【００２９】
既述したように、ホエー由来供給物は、少なくとも１種の追加的なタンパク質、典型的には少なくとも数種の追加的なタンパク質を含有する。追加的なタンパク質は、常態でホエー中に固有に存在するタンパク質を含んでなる。
【００３０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、少なくとも１種の追加的なタンパク質は、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、βカゼイン、カゼイン由来ペプチド、乳脂肪球皮膜（ＭＦＧＭ）タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質を含んでなる。
【００３１】
ＣＭＰもまたカゼインに由来するにもかかわらず、本発明の文脈では、「カゼイン由来ペプチド」という用語は、ＣＭＰを包含しないことに留意すべきである。
【００３２】
例えば少なくとも１種の追加的なタンパク質は、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、βカゼイン、カゼイン由来ペプチド、乳脂肪球皮膜（ＭＦＧＭ）タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも２種のタンパク質を含んでなってもよい。
【００３３】
ホエー由来供給物は、塩、脂肪、乳糖およびその他の炭水化物などの、常態でホエーに見られるその他の成分をさらに含有してもよい。
【００３４】
一般に、ホエー由来供給物は、少量のカゼインのみを含有することが好ましく、好ましくは実質的にカゼインを全く含まない。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態では、ホエー由来供給物は、タンパク質総量と比較して、最大で３％（ｗ／ｗ）のカゼイン総量を含有する。
【００３６】
例えばホエー由来供給物は、タンパク質総量と比較して、最大で１％（ｗ／ｗ）の量のカゼインを含有してもよい。好ましくはホエー由来供給物は、タンパク質総量と比較して、最大で０．１％（ｗ／ｗ）の量のカゼインを含有する。ホエー由来供給物は、例えばタンパク質総量と比較して、最大で０．０１％（ｗ／ｗ）の量のカゼインを含有してもよい。
【００３７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ホエー由来供給物は、ホエー由来供給物の重量と比較して、少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）のタンパク質総量を含有する。例えばホエー由来供給物は、ホエー由来供給物の重量と比較して、少なくとも０．８％（ｗ／ｗ）のタンパク質総量を含有してもよい。好ましくはホエー由来供給物は、ホエー由来供給物の重量と比較して、少なくとも２％（ｗ／ｗ）のタンパク質総量を含有する。ホエー由来供給物は、例えばホエー由来供給物の重量と比較して、少なくとも５％（ｗ／ｗ）のタンパク質総量を含有してもよい。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態ではホエー由来供給物は、ホエー由来供給物の重量と比較して、０．２〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲のタンパク質総量を含有する。例えばホエー由来供給物は、ホエー由来供給物の重量と比較して、０．８〜１５％（ｗ／ｗ）の範囲のタンパク質総量を含有してもよい。好ましくはホエー由来供給物は、ホエー由来供給物の重量と比較して、２〜１４％（ｗ／ｗ）の範囲のタンパク質総量を含有する。ホエー由来供給物は、例えばホエー由来供給物の重量と比較して、例えば４〜８％（ｗ／ｗ）の範囲などの、４〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲のタンパク質総量を含有してもよい。
【００３９】
ホエー由来供給物は、オリゴマーＣＭＰ複合体の単量体ＣＭＰへの分離に有利に働くｐＨを有することが好ましい。ホエー由来供給物は、例えばｐＨ１〜４の範囲のｐＨを有してもよい。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態では、ホエー由来供給物は、１．５〜３．８の範囲のｐＨを有する。例えばホエー由来供給物は、２．０〜３．６の範囲のｐＨを有してもよい。ホエー由来供給物は、例えば２．８〜３．２の範囲などの、例えば２．５〜３．５の範囲のｐＨを有してもよい。
【００４１】
それが特に明記されない限り、本明細書で言及されるｐＨ価は、１２℃で測定される。
【００４２】
既述したように、ステップｂ）は、単量体ＣＭＰを通過させる限外濾過フィルター使用して、ホエー由来供給物を限外濾過し、それによってＣＭＰに関して富化されたＵＦ透過液と、ＵＦ残余分とを提供することを伴う。
【００４３】
ＵＦ透過液は、ＵＦ透過液中のタンパク質総量と比較したＣＭＰの重量百分率が、ホエー由来供給物よりも高いという意味で、ＣＭＰに関して富化される。ＵＦ透過液中のＣＭＰの絶対濃度が、ホエー由来供給物中のＣＭＰの絶対濃度よりも低いこともあり得るが、限外濾過フィルターが、ＣＭＰでない別のタンパク質のより大きな百分率を保持しさえすれば、これは問題ではない。
【００４４】
例えば限外濾過工程の実装例は、あらゆる目的のために参照によって本明細書に援用する、欧州特許第１０３７５３７Ｂ１号明細書に見られる。
【００４５】
ステップｂ）は、最初のＵＦ残余分のいわゆる透析濾過をさらに伴って、残余分中に残留するＣＭＰのより多くを洗い出してもよい。透析濾過は、タンパク質を実質的に含有しない液体で、最初のＵＦ残余分を希釈することを伴う。このような液体の有用な例は、例えば水、ホエーまたはミルクのナノ濾過透過液、ホエーまたはミルクのＣＭＰ非含有ＵＦ透過液などの液体である。代案としては、希釈のために使用される液体は、逆浸透透過液であってもよい。逆浸透透過液は、例えばミルク、ホエー、ミルクＵＦ透過液、またはホエーＵＦ透過液の逆浸透から得られてもよく、主に水および小型の一価のイオンを含んでなる。
【００４６】
次に、最初のＵＦステップで必要とされるのと同一または類似条件下で、同一または類似ＵＦフィルターを使用して、希釈液体を限外濾過する。必要ならば、希釈残余分のｐＨを最大でｐＨ４のｐＨに調節すべきである。最初のＵＦ透析濾過ステップは、第１のＵＦ透析濾過透過液および第１のＵＦ透析濾過残余分の形成をもたらす。
【００４７】
この工程は、前回の残余分を毎回希釈し、必要ならばｐＨを調節して、次に新規供給物を限外濾過して、１回または複数回繰り返してもよく、それはさらなるＣＭＰ富化ＵＦ透析濾過透過液と、さらなるＣＭＰ低下ＵＦ透析濾過残余分の形成をもたらす。
【００４８】
第１のおよびさらなるＵＦ透析濾過透過液は、好ましくは最初のＵＦ透過液と合わせて、第１の組成物の一部を形成する。
【００４９】
限外濾過フィルターは、フィルターの供給物側により大型の分子を保持して、より小型の分子を通過させる構成要素である。限外濾過フィルターは、例えば特定孔径分布を有する孔を含有する薄膜であってもよい。
【００５０】
限外濾過フィルターは、好ましくは、操作中に、フィルターに単量体ＣＭＰを通過させるように、そしてβ−ラクトグロブリン好ましくは類似ホエータンパク質もまた保持できるように、選択される。当業者には理解されるように、限外濾過フィルターの分離特性は、その物理および化学構造の双方、供給材料の特性、および限外濾過が実施される工程パラメータに左右される。
【００５１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、限外濾過フィルターは、５〜３００ｋＤａの範囲の名目上の分画分子量を有する。例えば限外濾過フィルターは、１０〜１５０ｋＤａの範囲の名目上の分画分子量を有してもよい。好ましくは、限外濾過フィルターは、２０〜１００ｋＤａの範囲の名目上の分画分子量を有してもよい。限外濾過フィルターは、例えば３５〜６０ｋＤａの範囲などの、例えば３０〜８０ｋＤａの範囲の名目上の分画分子量を有してもよい。
【００５２】
例えば限外濾過フィルターは、５〜１００ｋＤａの範囲の名目上の分画分子量を有してもよい。好ましくは、限外濾過フィルターは、１０〜７０ｋＤａの範囲の名目上の分画分子量を有してもよい。限外濾過フィルターは、例えば２０〜４０ｋＤａの範囲などの、例えば１５〜５０ｋＤａの範囲の名目上の分画分子量を有してもよい。代案としては、限外濾過フィルターは、１０〜５０ｋＤａの範囲の名目上の分画分子量を有してもよい。
【００５３】
限外濾過フィルターの名目上の分画分子量は、典型的に、フィルター製造会社によって提供される。「名目上の分画分子量」は、９０％の溶質がフィルターによって保持される、最低分子量溶質（ダルトン単位）と定義される。「名目上の分画分子量」は、ＡＳＴＭ規格Ｅ  １３４３−９０に従って判定される。
【００５４】
限外濾過は、例えば十字流濾過のために配置されたフィルターを含む限外濾過システムを使用して、実施してもよい。有用なフィルター配置の非限定的例は、渦巻形限外濾過システム、中空糸膜システム、および管状膜システムである。
【００５５】
いくつかの好ましい実施形態では、限外濾過フィルターは限外濾過膜であり、好ましくは高分子膜である。代案としては、膜は、金属膜またはセラミック膜であってもよい。
【００５６】
有用な限外濾過フィルターのより多くの例は、”Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ”，ＡＰＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｗ．Ｋ．（Ｅｄ．），Ｓｉｌｋｅｂｏｒｇ  Ｂｏｇｔｒｙｋｋｅｒｉ  Ａ／Ｓ（２００３），ＩＳＢＮ  ８７８８０１６７５７−９７８８７８８０１６７５８に見られる。
【００５７】
限外濾過中のホエー由来供給物の温度は、広範囲で変動してもよいが、典型的に温度は、５〜６０℃の範囲内であることが好ましい。例えば限外濾過中のホエー由来供給物の温度は、６〜４０℃の範囲、好ましくは７〜３０℃の範囲、なおもより好ましくは８〜２０℃の範囲であってもよい。
【００５８】
現在のところ、ホエー由来供給物の温度を上述の間隔の下端に保つことが好ましい。したがって本発明のいくつかの好ましい実施形態では、限外濾過中のホエー由来供給物の温度は、５〜２０℃の範囲、好ましくは７〜１６℃の範囲、なおもより好ましくは８〜１２の範囲である。
【００５９】
限外濾過中に使用される圧力は、使用されるＵＦフィルターの特定タイプおよびデザインに応じて変動してもよい。典型的に、０．２〜１０バールのフィルター差圧が使用される。フィルター差圧は、例えば１〜８バールの範囲であってもよい。代案としては、フィルター差圧は、例えば２〜６バールの範囲であってもよい。例えばフィルター差圧圧力は、例えば約４バールなどの３〜５バールの範囲であってもよい。
【００６０】
限外濾過の実用的な実装および操作に関する詳細は、書籍、”Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ”，ＡＰＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｗ．Ｋ．（Ｅｄ．），Ｓｉｌｋｅｂｏｒｇ  Ｂｏｇｔｒｙｋｋｅｒｉ  Ａ／Ｓ（２００３），ＩＳＢＮ  ８７８８０１６７５７−９７８８７８８０１６７５８に見られる。
【００６１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ＵＦ透過液は、タンパク質総量と比較して、少なくとも５５％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ総量を含有する。例えばＵＦ透過液は、タンパク質総量と比較して、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ総量を含有してもよい。ＵＦ透過液は、例えばタンパク質総量と比較して、少なくとも６５％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ総量を含有してもよい。
【００６２】
ＵＦ透過液は、好ましくは低いタンパク質凝集体含有量を有する。タンパク質凝集体はより高い分子量を有し、したがって単一タンパク質分子よりも低い拡散係数を有し、したがって非ＣＭＰタンパク質を結合させるために使用される、引き続くカチオン交換ステップ中で除去するのは、困難である。
【００６３】
本発明の文脈で、「タンパク質凝集体」という用語は、凝集タンパク質分子の粒子に関し、その粒子は少なくとも１０ｎｍの典型的な平均流体力学直径を有する。
【００６４】
ＵＦ透過液中のタンパク質凝集体含有量は、５００ｎｍの波長を有する光を生じる、タンパク質凝集体の散乱レベルの測定によって定量化してもよい。散乱レベルは、標準的１ｃｍキュベットをはじめとする、標準的吸光度測定設定を使用して判定される。
【００６５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ＵＦ透過液は、５００ｎｍにおいて、最大で０．１ＡＵの吸光度を有する（１ｃｍの光路長）。例えばＵＦ透過液は、５００ｎにおいて、最大で０．０５ＡＵの吸光度を有してもよい。好ましくはＵＦ透過液は、５００ｎｍにおいて、最大で０．０１ＡＵの吸光度を有する。なおもより好ましくは、ＵＦ透過液は、５００ｎｍにおいて、最大で０．００１ＡＵの吸光度を有する。
【００６６】
理想的には、ＵＦ透過液は、５００ｎｍにおいて、検出可能な吸光度を全く有しない。
【００６７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ＵＦ透過液は、ＵＦ透過液中のタンパク質総量と比較して、最大で１％（ｗ／ｗ）のタンパク質凝集体を含有する。例えばＵＦ透過液は、タンパク質総量と比較して、最大で０．１％（ｗ／ｗ）のタンパク質凝集体を含有してもよい。好ましくは、ＵＦ透過液は、タンパク質総量と比較して、最大で０．０１％（ｗ／ｗ）のタンパク質凝集体を含有する。なおもより好ましくは、ＵＦ透過液は、ＵＦ透過液のタンパク質総量と比較して、最大で０．００１％（ｗ／ｗ）のタンパク質凝集体を含有する。
【００６８】
既述したように、ステップｃ）は、前記ＵＦ透過液に由来する第１の組成物をカチオン交換材に接触させることを伴う。
【００６９】
本発明の文脈で「第１の組成物」という用語は、ステップｃ）でカチオン交換される、ＣＭＰ含有供給物に関する。第１の組成物は、好ましくは液体水性組成物である。第１の組成物は、第１の組成物のＣＭＰの少なくとも５０％（ｗ／ｗ）が、ＵＦ透過液に由来するという意味で、ＵＦ透過液に由来する。ステップｂ）が最初のＵＦ残余分のＵＦ透析濾過をさらに伴う場合、第１の組成物は、第１の組成物のＣＭＰの少なくとも５０％（ｗ／ｗ）が、最初のＵＦ透過液と、１つまたは複数の引き続くＵＦ透析濾過透過液とに由来するという意味で、ＵＦ透過液に由来する。
【００７０】
例えば第１の組成物のＣＭＰの少なくとも７５％（ｗ／ｗ）が、ＵＦ透過液と、あらゆる追加的なＵＦ透析濾過透過液とに由来してもよい。好ましくは第１の組成物のＣＭＰの少なくとも９０％（ｗ／ｗ）が、ＵＦ透過液と、あらゆる追加的なＵＦ透析濾過透過液とに由来する。なおもより好ましくは、例えば全てのＣＭＰなどの、第１の組成物のＣＭＰの少なくとも９０％（ｗ／ｗ）が、ＵＦ透過液と、あらゆる追加的なＵＦ透析濾過透過液とに由来する。
【００７１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物はＵＦ透過液である。
【００７２】
しかし本発明の別の実施形態では、ＵＦ透過液は、第１の組成物の形成をもたらす、追加的な工程段階の対象になってもよい。このような追加的な工程段階は、例えば温度調節、濃縮、ｐＨ調節、および／またはさらなる分画を伴ってもよい。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態では、第１の組成物の準備は、ＵＦ透過液と、あらゆる追加的なＵＦ透析濾過透過液のｐＨ調節および濃縮を伴う。
【００７４】
本発明の別の実施形態では、第１の組成物の準備は、例えばあらゆる追加的なＵＦ透析濾過透過液と混合されたＵＦ透過液の濃縮、および合わせた透過液のｐＨおよび導電率に関する調節を伴う。
【００７５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物は、タンパク質総量と比較して、少なくとも５５％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ総量を含有する。例えば第１の組成物は、タンパク質総量と比較して、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ総量を含有してもよい。第１の組成物は、例えばタンパク質総量と比較して、少なくとも６５％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ総量を含有してもよい。
【００７６】
第１の組成物は、例えばタンパク質総量と比較して、５５〜９５％（ｗ／ｗ）の範囲のＣＭＰ総量を含有してもよい。例えば第１の組成物は、タンパク質総量と比較して、６０〜９０％（ｗ／ｗ）範囲のＣＭＰ総量を含有してもよい。第１の組成物は、例えばタンパク質総量と比較して、６５〜８０％（ｗ／ｗ）の範囲のＣＭＰ総量を含有してもよい。
【００７７】
既述したように、第１の組成物は、少なくとも１種の追加的なタンパク質、典型的には少なくとも数種の追加的なタンパク質を含有する。追加的なタンパク質は、常態でホエー中に本質的に存在するタンパク質を含んでなる。
【００７８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、少なくとも１種の付加タンパク質は、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、βカゼイン、カゼイン由来ペプチド、乳脂肪球皮膜（ＭＦＧＭ）タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質を含んでなる。
【００７９】
例えば少なくとも１種の付加タンパク質は、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、βカゼイン、カゼイン由来ペプチド、乳脂肪球皮膜（ＭＦＧＭ）タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも２種のタンパク質を含んでなってもよい。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態では、第１の組成物の追加的なタンパク質の総量の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）が、ＵＦ透過液と、あらゆる追加的なＵＦ透析濾過透過液とに由来する。例えば第１の組成物の少なくとも７５％（ｗ／ｗ）が、ＵＦ透過液と、あらゆる追加的なＵＦ透析濾過透過液とに由来してもよい。好ましくは第１の組成物の少なくとも９０％（ｗ／ｗ）が、ＵＦ透過液と、あらゆる追加的なＵＦ透析濾過透過液とに由来する。なおもより好ましくは、例えば第１の組成物の全ての追加的なタンパク質などの、追加的なタンパク質の少なくとも９０％（ｗ／ｗ）が、ＵＦ透過液と、あらゆる追加的なＵＦ透析濾過透過液とに由来する。
【００８１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物は、タンパク質総量と比較して、最大で４５％（ｗ／ｗ）の追加的なタンパク質総量を含有する。例えば第１の組成物は、タンパク質総量と比較して、最大で４０％（ｗ／ｗ）の追加的なタンパク質総量を含有してもよい。第１の組成物は、例えばタンパク質総量と比較して、最大で３５％（ｗ／ｗ）の追加的なタンパク質総量を含有してもよい。
【００８２】
第１の組成物は、例えばタンパク質総量と比較して、５〜４５％（ｗ／ｗ）の範囲の追加的なタンパク質総量を含有してもよい。例えば第１の組成物は、タンパク質総量と比較して、１０〜４０％（ｗ／ｗ）の範囲の追加的なタンパク質総量を含有してもよい。第１の組成物は、例えばタンパク質総量と比較して、２０〜３５％（ｗ／ｗ）の範囲の追加的なタンパク質総量を含有してもよい。
【００８３】
第１の組成物は、塩、脂肪、乳糖およびその他の炭水化物などの常態でホエーに見られるその他の成分をさらに含有してもよい。
【００８４】
一般に、第１の組成物は、少量のカゼインのみを含有することが好ましく、好ましくは実質的にカゼインを全く含まない。
【００８５】
本発明のいくつかの実施形態では、第１の組成物は、タンパク質総量と比較して、最大で０．５％（ｗ／ｗ）のカゼイン総量を含有する。
【００８６】
例えば第１の組成物は、タンパク質総量と比較して、最大で０．１％（ｗ／ｗ）の量のカゼインを含有してもよい。好ましくは第１の組成物は、タンパク質総量と比較して、最大で０．０１％（ｗ／ｗ）の量のカゼインを含有する。第１の組成物は、例えばタンパク質総量と比較して、最大で０．００１％（ｗ／ｗ）の量のカゼインを含有してもよい。
【００８７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物は、第１の組成物重量と比較して、少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）のタンパク質総量を含有する。例えば第１の組成物は、第１の組成物重量と比較して、少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）のタンパク質総量を含有してもよい。好ましくは第１の組成物は、第１の組成物重量と比較して、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）タンパク質総量を含有する。例えば第１の組成物は、第１の組成物重量と比較して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）のタンパク質総量を含有してもよい。
【００８８】
本発明のいくつかの実施形態では第１の組成物は、第１の組成物重量と比較して、０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲のタンパク質総量を含有する。例えば第１の組成物は、第１の組成物重量と比較して、０．２〜１５％（ｗ／ｗ）の範囲のタンパク質総量を含有してもよい。好ましくは第１の組成物は、第１の組成物重量と比較して、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲のタンパク質総量を含有する。第１の組成物は、第１の組成物重量と比較して、例えば１〜２％（ｗ／ｗ）の範囲などの、例えば１〜５％（ｗ／ｗ）の範囲のタンパク質総量を含有してもよい。
【００８９】
ＵＦ透過液と同様に、第１の組成物は、好ましくは低いタンパク質凝集体含有量を有する。
【００９０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物は、５００ｎｍにおいて、最大で０．１ＡＵの吸光度を有する（１ｃｍの光路長）。例えば第１の組成物は、５００ｎにおいて、最大で０．０５ＡＵの吸光度を有してもよい。好ましくは第１の組成物は、５００ｎｍにおいて、最大で０．０１ＡＵの吸光度を有する。なおもより好ましくは、第１の組成物は、５００ｎｍにおいて、最大で０．００１ＡＵの吸光度を有する。
【００９１】
理想的には、第１の組成物は、５００ｎｍにおいて、検出可能な吸光度を全く有しない。
【００９２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物は、第１の組成物中のタンパク質総量と比較して、最大で１％（ｗ／ｗ）のタンパク質凝集体を含有する。例えば第１の組成物は、タンパク質総量と比較して、最大で０．１％（ｗ／ｗ）のタンパク質凝集体を含有してもよい。好ましくは第１の組成物は、タンパク質総量と比較して、最大で０．０１％（ｗ／ｗ）のタンパク質凝集体を含有する。なおもより好ましくは、第１の組成物は、第１の組成物のタンパク質総量と比較して、最大で０．００１％（ｗ／ｗ）タンパク質凝集体を含有する。
【００９３】
第１の組成物は、典型的に、ｐＨ２〜５の範囲のｐＨを有する。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態では、第１の組成物は、ｐＨ２．３〜４．６の範囲のｐＨを有する。例えば第１の組成物は、２．６〜４．２の範囲のｐＨを有してもよい。第１の組成物は、例えば３．０〜３．７の範囲などの、例えば２．８〜４．０の範囲のｐＨを有してもよい。
【００９５】
第１の組成物は、例えば２．５〜４．８の範囲のｐＨを有してもよい。例えば第１の組成物は、３．０〜４．６の範囲のｐＨを有してもよい。第１の組成物は、例えば３．６〜４．２の範囲などの、例えば３．４〜４．４の範囲のｐＨを有してもよい。
【００９６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物は、１２℃で１〜８ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有する。
【００９７】
水溶液の「導電率」（時に「比導電率」と称される）は、溶液が電気を伝導する能力の尺度である。導電率は、例えば２枚の電極間の溶液のＡＣ抵抗の測定によって判定されてもよく、結果は、典型的に１ｃｍあたりのミリジーメンス（ｍＳ／ｃｍ）単位で示される。導電率は、例えばＥＰＡ（米国環境保護庁）法第１２０．１号に従って評価されてもよい。
【００９８】
例えば第１の組成物の導電率は、１２℃で１．５〜７ｍＳ／ｃｍの範囲であってもよい。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物の導電率が、１２℃で２〜５ｍＳ／ｃｍの範囲であることがさらにより好ましくあってもよい。
【００９９】
第１の組成物は、例えば１２℃で０．５〜５ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有してもよい。例えば第１の組成物は、例えば１２℃で０．６〜４ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有してもよい。代案としては、第１の組成物は、例えば１２℃で０．８〜２ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有してもよい。
【０１００】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物は、１２℃で１〜８ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率と、１２℃でｐＨ２〜５の範囲のｐＨを有する。
【０１０１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物は、１２℃で１．５〜６ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率と、１２℃でｐＨ２．５〜３．９の範囲のｐＨを有する。
【０１０２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物は、１２℃で２〜５ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率と、１２℃でｐＨ３．０〜３．８の範囲のｐＨを有する。
【０１０３】
例えば、第１の組成物は、１２℃で０．５〜５ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率と、１２℃でｐＨ３．０〜４．８の範囲のｐＨを有してもよい。
【０１０４】
代案としては、第１の組成物は、１２℃で０．７〜３ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率と、１２℃でｐＨ３．５〜４．５の範囲のｐＨを有してもよい。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態では、第１の組成物との接触時に、カチオン交換材がカラムに充填される。
【０１０６】
カチオン交換材は、第１の組成物との接触時に、例えば易流動性粒子として第１の組成物に懸濁されてもよい。
【０１０７】
本発明のいくつかの実施形態では、カチオン交換材は、固相と、カチオンに結合できる１つまたは複数のアニオン性基とを含んでなる。
【０１０８】
好ましくは、アニオン性基の少なくとも一部は、固相に付着する。
【０１０９】
本発明のいくつかの実施形態では、カチオン交換材の固相は、複数粒子、フィルター、およびメンブランからなる群から選択される、１つまたは複数の構成要素を含んでなる。
【０１１０】
固相は、例えば多糖類を含んでなってもよく、またはそれから本質的になってさえよい。架橋多糖類が、特に好ましい。有用な多糖類の例は、セルロース、アガロース、および／またはデキストランである。
【０１１１】
代案としては、固相は、非炭水化物ポリマーを含んでなってもよく、またはそれから本質的になってさえよい。有用な非炭水化物ポリマーの例は、メタクリレート、ポリスチレン、および／またはスチレン−ジビニルベンゼンである。
【０１１２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、アニオン性基は、例えばスルホン酸基などの、例えば強力なカチオン交換基を含んでなってもよく、またはそれから本質的になってさえよい。代案としては、またはそれに加えて、アニオン性基は、例えばカルボン酸基などの、例えば弱いカチオン交換基を含んでなってもよく、またはそれからなってさえよい。
【０１１３】
サイクルあたりの最適タンパク質装填量は、カチオン交換クロマトグラフィー工程のデザイン、およびカチオン交換材の特性に左右される。
【０１１４】
圧力などをはじめとする、カチオン交換クロマトグラフィー中の工程条件は、実際の工程実装、使用機器、および使用カチオン交換材に左右される。
【０１１５】
ステップｃ）における第１の組成物の温度は、典型的に、微生物成長を最小化して、タンパク質およびカチオン交換材の熱損傷を回避するのに十分低いが、第１の組成物の許容できる粘度を提供するのに十分高い。
【０１１６】
本発明のいくつかの実施形態では、ステップｃ）における第１の組成物の温度は、２〜４０℃の範囲である。好ましくは、ステップｂ）における第１の組成物の温度は、４〜２０℃の範囲、なおもより好ましくは６〜１５℃の範囲である。
【０１１７】
カチオン交換クロマトグラフィーと、その工業的実施に関する詳細は、あらゆる目的のために、参照によって本明細書に援用するＳｃｏｐｅｓにある。
【０１１８】
ステップｄ）は、カチオン交換材と結合しない第１の組成物の画分を収集し、それによってＣＭＰ含有組成物を得ることを伴う。
【０１１９】
収集された画分は、そのままＣＭＰ含有組成物として使用してもよく、または代案としては、それを例えば組成物の脱塩および濃縮などの追加的工程段階の対象とし、引き続いて粉末に転換してもよい。
【０１２０】
したがって本発明のいくつかの好ましい実施形態では、収集された画分は、加熱処理、濃縮、脱ミネラル化、溶媒蒸発、噴霧乾燥、およびタンパク質結合カチオン置換からなる群から選択される、１つまたは複数の工程段階をさらに受ける。
【０１２１】
例えば、収集された画分を濃縮してもよい。
【０１２２】
代案としては、またはそれに加えて、収集された画分を、例えば単量体ＣＭＰを保持する限外濾過フィルターを使用する透析濾過によって、脱ミネラル化してもよい。
【０１２３】
濃縮または透析濾過前に、収集された画分のｐＨを、例えば少なくともｐＨ５を超えるｐＨなどの、ｐＨ４を超えるｐＨに調節してもよい。ｐＨ上昇は、単量体ＣＭＰのオリゴマーへの結合をもたらし、それより大型の孔径を有する膜を使用した濃縮および／または透析濾過を可能にする。
【０１２４】
代案としては、またはそれに加えて、収集された画分を蒸発ステップの対象としてもよい。
【０１２５】
代案としては、またはそれに加えて、収集された画分を噴霧乾燥ステップの対象としてもよい。
【０１２６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、収集された画分を以下のステップの対象とした：
ｉ）例えば限外濾過、ナノ濾過、または逆浸透による濃縮、
ｉｉ）例えば水中での透析濾過、
ｉｉｉ）任意選択的に、例えば蒸発による、別の濃縮ステップ、
ｉｖ）低温殺菌、および
ｖ）低温殺菌組成物を粉末に転換するための噴霧乾燥。
【０１２７】
本方法は、バッチプロセスまたは半バッチプロセスとして実施してもよい。
【０１２８】
本発明のＣＭＰ含有組成物は、非常に高いＣＭＰ純度と、非常に低いＰｈｅ含有量の双方を有する。
【０１２９】
本発明の好ましい実施形態では、方法は、組成物のタンパク質総量と比較して、少なくとも９２％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ純度を有するＣＭＰ含有組成物を製造するための方法である。例えば方法は、組成物のタンパク質総量と比較して、少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ純度を有するＣＭＰ含有組成物を製造するための方法であってもよい。好ましくは、方法は、組成物のタンパク質総量と比較して、例えば少なくとも９８％（ｗ／ｗ）などの少なくとも９７％（ｗ／ｗ）の、または約１００％（ｗ／ｗ）にさえ至る、ＣＭＰ純度を有するＣＭＰ含有組成物を製造するための方法である。
【０１３０】
本発明の方法の例示的実施形態は、図１に概略的に図示される。ホエー由来供給物（１）をＵＦユニットに誘導し、限外濾過する。ＵＦステップは、ＵＦ残余分（２）、すなわちＵＦフィルターによって保持される画分と、ＵＦフィルターを透過した画分であるＵＦ透過液との形成をもたらす。この実施形態では、ＵＦ透過液（３）が第１の組成物として使用され、カチオン交換クロマトグラフィーの対象となる。第１の組成物の非ＣＭＰタンパク質不純物は、カチオン交換材（図示せず）と結合して、精製ＣＭＰ含有組成物（４）が収集される。
【０１３１】
方法の別の例示的実施形態は、図２に概略的に描写される。図１の工程と同様に、ホエー由来供給物を限外濾過した。得られたＣＭＰ濃縮ＵＦ透過液（３）は、第１の組成物として使用され、カチオン交換クロマトグラフィーの対象となる。カチオン交換材と結合しないタンパク質画は、ＣＭＰ含有組成物として収集される。しかし図２の方法では、ＵＦ残余分は水（５）でさらに希釈されて、ＵＦ工程への供給物として再循環され、それによって元のホエー由来供給物のＣＭＰのより多くの部分が洗い流されて、ＵＦ透過液中で回収される。
【０１３２】
本発明のさらに別の例示的な実施形態は、図３で概略的に例証される。ここでは、一連の３つの限外濾過ユニットが、ステップｂ）で使用される。ホエー由来供給物（１）は、第１のＵＦユニットに供給されて、第１のＵＦ残余分（２）と第１のＵＦ透過液（３）が得られる。最初のＵＦ残余分（２）は、水（５）と混合されて第２のＵＦユニットに供給され、第２のＵＦ残余分（２’）および第２のＵＦ透過液（３’）が得られる。第２のＵＦ残余分（２’）は、水（５）と混合されて第３のＵＦユニットに供給され、第３のＵＦ残余分（２’’）および第３のＵＦ透過液（３’’）が得られる。第１、第２、および第３の透過液（３、３’、および３’’）は、合わされて第１の組成物として使用され、カチオン交換クロマトグラフィーの対象となる。
【０１３３】
本発明の別の態様は、説明される方法によって得られるＣＭＰ含有組成物に関するその中で。
【０１３４】
ＣＭＰ含有組成物は、好ましくはタンパク質総量と比較して、最大で０．５％（ｗ／ｗ）のフェニルアラニンを含有する。例えばＣＭＰ含有組成物は、タンパク質総量と比較して、最大で０．４％（ｗ／ｗ）のフェニルアラニンを含有してもよい。好ましくは、ＣＭＰ含有組成物は、好ましくはタンパク質総量と比較して、最大で０．３％（ｗ／ｗ）のフェニルアラニンを含有する。なおもより好ましくは、ＣＭＰ含有組成物は、タンパク質総量と比較して、最大で０．１％（ｗ／ｗ）フェニルアラニンなどの、好ましくはタンパク質総量と比較して、最大で０．２％（ｗ／ｗ）のフェニルアラニンを含有する。
【０１３５】
本発明の好ましい実施形態では、ＣＭＰ含有組成物は、組成物のタンパク質総量と比較して、少なくとも９２％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ純度を有する。例えばＣＭＰ含有組成物は、組成物のタンパク質総量と比較して、少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のＣＭＰ純度を有してもよい。好ましくは、ＣＭＰ含有組成物は、組成物のタンパク質総量と比較して、例えば少なくとも９８％（ｗ／ｗ）などの少なくとも９７％（ｗ／ｗ）の、または約１００％（ｗ／ｗ）にさえ至る、ＣＭＰ純度を有する。
【０１３６】
本発明について、特定の実施形態を参照して上で説明した。しかし上述した以外のその他の実施形態も本発明の範囲内で等しく可能である。それが特に明記されない限り、本発明の異なる特徴および様々な実施形態および態様のステップは、本明細書に記載されるもの以外の方法で組み合わされてもよい。
【実施例】
【０１３７】
実施例１：発明のプロセス変形型
限外濾過Ｉ−分離：
３０％の乾燥物質および２４％のタンパク質を含有する１２０００リットルのホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）をミネラル除去冷水で希釈して、乾物含量１０％およびタンパク質含有量８％にした。ｐＨが２．８になるまで、１２Ｍの塩酸を添加した。３１ミルのスペーサーがあり名目上のカットオフ値が５０，０００ダルトンである、Ｓｙｎｄｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，Ｖａｃａｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳからのタイプＢＮ６３３８の６”渦巻形膜を使用して、溶液を濾過した。総膜面積は、３０７２ｍ２であった。濾過は、以下の条件で実施した：温度を１０℃に維持し、３．５バールの送り圧力で、平均圧を４．５バールに維持した。１２Ｍ塩酸を使用してｐＨを２．８に維持し、透過液が除去されるのと同じ流れで、限外濾過ＩＩ（下記参照）からの透過液を添加した。ループ内の再循環流は１８０ｍ３／ｈであり、供給タンク上の再循環はおよそ１０ｍ３／ｈであった。１０時間の濾過後に、限外濾過ＩＩからの透過液の添加を停止した。平均流束は、８Ｌ／ｍ２ｈと測定された。
【０１３８】
限外濾過ＩＩ−残余分の透析濾過および透過液濃度：
限外濾過Ｉからの透過液を限外濾過ＩＩへの供給タンク内に収集し、６％水酸化ナトリウムを使用してｐＨを継続的に６．０に調節した。限外濾過Ｉと同時に、３１ミルのスペーサーがあり名目上のカットオフ値が５０，０００ダルトンである、Ｋｏｃｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳからのタイプＨＦＫ−３２８  ６３３８の６”渦巻形膜を使用して限外濾過ＩＩを実施した。総膜面積は、２３０４ｍ２であった。濾過は、以下の条件で実施した：温度を１０℃に維持し、透過液が限外濾過Ｉから除去されるのと同じ流れで、透過液を限外濾過Ｉに供給するために、平均圧を１．０〜５．０バールに維持した。１０時間の濾過後に、すなわち限外濾過Ｉの停止後に、残余分を収集した。引き続いて残余分を透析濾過し、濾液が除去されるのと同じ流れで、７０，０００リットルの水道水を添加した。透析濾後過、残余分中のタンパク質含有量が１２％になるまで、残余分を濃縮した。残余分の最終容積は、３４５０リットルであった。濾過条件は、上と同じであった。残余分中のＣＭＰの純度は、ＨＰＬＣ分析に基づいて７９％（１００ｇのタンパク質あたり７９ｇのＣＭＰ）と判定された。
【０１３９】
カチオン交換クロマトグラフィー：
１日間の製造で、６５０リットルの限外濾過ＩＩからの最終残余分を、脱ミネラル冷水で１．２４％のタンパク質含有量（１００ｇ溶液あたり１．２４ｇのタンパク質）に希釈した。４２％ｗ／ｗのクエン酸を使用して、溶液のｐＨを３．５０に調節し、２ＭのＮａＣｌと２ＭのＫＣｌ溶液とを使用して、導電率を２．０ｍＳ／ｃｍに調節した。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎからの１１６リットルの食品等級Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓで充填されたカラムを使用して、７２５リットルの調節されたタンパク質溶液をカチオン交換クロマトグラフィーの対象とした。
【０１４０】
カチオン交換クロマトグラフィーの各サイクルにおいて、以下の条件が使用された：カラムを流速１３００Ｌ／ｈで、２９０リットルの脱ミネラル冷水でフラッシュした。上記の７２５リットルの供給液（調節されたタンパク質溶液）を流速１０５０Ｌ／ｈで、カラムにポンプで送り込み、通過画分（非結合物質）を製品タンク内に収集し、これはＣＭＰ溶液とも表記される。カラムをそれぞれ流速１０５０Ｌ／ｈおよび１３００Ｌ／ｈで、それぞれ２３２リットルおよび５８リットルの脱ミネラル水でフラッシュした。同時の溶出および定置洗浄ステップは、流速９４３Ｌ／ｈで５８０リットルの０．５Ｍ水酸化ナトリウムをカラムにポンプで送り込むことで実施した。カラムをそれぞれ流速９４３Ｌ／ｈおよび１３００Ｌ／ｈで、それぞれ２９０リットルおよび５８０リットルの脱ミネラル水でフラッシュした。カチオン交換クロマトグラフィーの１サイクルの時間は、２．６時間であった。カチオン交換クロマトグラフィーステップのＣＭＰの相対収率は、９２％（供給物中の１００ｇのＣＭＰあたり通過画分中の９２ｇのＣＭＰ）であった。
【０１４１】
毎日８サイクルのカチオン交換クロマトグラフィーを実施して、製品タンク内のＣＭＰ溶液を濃縮するための、標準的限外濾過（Ｋｏｃｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳからのＨＦＫ−３２８メンブレン）がそれに続いた。限外濾過前に、水酸化カリウムと水酸化ナトリウムの混合溶液によって、製品タンクのｐＨを６．５に調節した。合計３２サイクルのカチオン交換クロマトグラフィーを実施して、その後、標準的限外濾過（Ｋｏｃｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳからのＨＦＫ−３２８メンブレン）によって、ＣＭＰ溶液をさらに濃縮した。標準的噴霧乾燥機を使用して濃縮ＣＭＰ溶液を噴霧乾燥し、１９６ｋｇの粉末を得た。粉末の組成は、選択されたパラメータと共に表１に記載される。
【０１４２】
実施例２−発明のプロセス変形型
限外濾過ＩおよびＩＩは、実施例１に記載されるのと同様の方法で実施した。最終限外濾過ＩＩ残余分中のＣＭＰ純度は、ＨＰＬＣ分析に基づいて８０％（１００ｇタンパク質あたり８０ｇのＣＭＰ）と判定された。
【０１４３】
カチオン交換クロマトグラフィーは、以下を除いて、実施例１に記載されるのと同様の方法で実施された：希釈溶液のｐＨを３．３７に調節して、合計４７サイクルのカチオン交換クロマトグラフィーを実施した。カチオン交換クロマトグラフィーステップのＣＭＰの相対収率は、９０％（供給物中の１００ｇのＣＭＰあたり通過画分中の９０ｇのＣＭＰ）であった。標準的噴霧乾燥機を使用して濃縮ＣＭＰ溶液を噴霧乾燥し、３５７ｋｇの粉末を得た。粉末の組成は、選択されたパラメータと共に表１に記載される。
【０１４４】
実施例３−発明のプロセス変形型
限外濾過ＩおよびＩＩは、実施例１に記載されるのと同様の方法で実施した。最終限外濾過ＩＩ残余分中のＣＭＰ純度は、ＨＰＬＣ分析に基づいて８３％（１００ｇタンパク質あたり８３ｇのＣＭＰ）と判定された。
【０１４５】
カチオン交換クロマトグラフィー：
１日間の製造で、４５０リットルの限外濾過ＩＩからの最終残余分を、脱ミネラル冷水で０．６６％のタンパク質含有量（１００ｇ溶液あたり０．６６ｇのタンパク質）に希釈した。３０％ｗ／ｗの塩酸を使用して、溶液のｐＨを３．２５に調節し、２ＭのＮａＣｌと２ＭのＫＣｌ溶液とを使用して、導電率を２．０ｍＳ／ｃｍに調節した。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎからの８０リットルの食品等級Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓで充填されたカラムを使用して、１０００リットルの調節されたタンパク質溶液をカチオン交換クロマトグラフィーの対象とした。
【０１４６】
カチオン交換クロマトグラフィーの１サイクルにおいて、以下の条件が使用された：
カラムを流速１３００Ｌ／ｈで、３００リットルの脱ミネラル冷水、３００リットルの０．５０％ｗ／ｗ酢酸、および２００リットルの脱ミネラル冷水でフラッシュした。上記の１０００リットルの供給液（調節されたタンパク質溶液）を流速１３００Ｌ／ｈで、カラムにポンプで送り込み、通過画分（非結合物質）を製品タンク内に収集し、これはＣＭＰ溶液とも表記される。
【０１４７】
カラムを流速１３００Ｌ／ｈで、２００リットルの脱ミネラル冷水でフラッシュした。同時の溶出および定置洗浄ステップは、流速７００Ｌ／ｈで４００リットルの１．０Ｍ水酸化ナトリウムをカラムにポンプで送り込むことで実施した。カラムをそれぞれ流速７００Ｌ／ｈおよび１３００Ｌ／ｈで、それぞれ２００リットルおよび４００リットルの脱ミネラル冷水でフラッシュした。カチオン交換クロマトグラフィーの１サイクルの時間は、２．７時間であった。カチオン交換クロマトグラフィーステップのＣＭＰの相対収率は、７７％（供給物中の１００ｇのＣＭＰあたり通過画分中の７７ｇのＣＭＰ）であった。毎日８サイクルのカチオン交換クロマトグラフィーを実施して、製品タンク内のＣＭＰ溶液を濃縮するための、標準的限外濾過（Ｋｏｃｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳからのＨＦＫ−３２８メンブレン）がそれに続いた。限外濾過前に、水酸化カリウムと水酸化ナトリウムの混合溶液を使用して、製品タンクのｐＨを６．５に調節した。合計２０サイクルのカチオン交換クロマトグラフィーを実施して、その後、標準的限外濾過（Ｋｏｃｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳからのＨＦＫ−３２８メンブレン）によって、ＣＭＰ溶液をさらに濃縮した。標準的噴霧乾燥機を使用して濃縮ＣＭＰ溶液を噴霧乾燥し、７８ｋｇの粉末を得た。粉末の組成は、選択されたパラメータと共に表１に記載される。
【０１４８】
実施例４−発明のプロセス変形型
限外濾過ＩおよびＩＩは、実施例１に記載されるのと同様の方法で実施した。最終限外濾過ＩＩ残余分中のＣＭＰ純度は、ＨＰＬＣ分析に基づいて７９％（１００ｇタンパク質あたり７９ｇのＣＭＰ）と判定された。
【０１４９】
カチオン交換クロマトグラフィー：
１日間の製造で、２７８リットルの限外濾過ＩＩからの最終残余分を、脱ミネラル冷水で０．６８％のタンパク質含有量（１００ｇ溶液あたり０．６８ｇのタンパク質）に希釈した。３０％ｗ／ｗの塩酸を使用して、溶液のｐＨを３．７５に調節し、５ＭのＮａＣｌ溶液を使用して、導電率を４．０ｍＳ／ｃｍに調節した。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎからの８０リットルの食品等級Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓで充填されたカラムを使用して、１０００リットルの調節されたタンパク質溶液をカチオン交換クロマトグラフィーの対象とした。
【０１５０】
カチオン交換クロマトグラフィーの１サイクルにおいて、以下の条件が使用された：
カラムを流速１３００Ｌ／ｈで、３００リットルの１Ｍ  ＮａＣｌ、３００リットルの脱ミネラル冷水、３００リットルの０．２５％ｗ／ｗ酢酸、および２００リットルの脱ミネラル冷水でフラッシュした。上記の１０００リットルの供給液（調節されたタンパク質溶液）を流速１３００Ｌ／ｈで、カラムにポンプで送り込み、通過画分（非結合物質）を製品タンク内に収集し、これはＣＭＰ溶液とも表記される。カラムを流速１３００Ｌ／ｈで、２００リットルの脱ミネラル冷水、３００リットルの１ＭのＮａＣｌ（溶出）、および２００リットルの脱ミネラル冷水でフラッシュした。定置洗浄ステップは、流速７００Ｌ／ｈで４００リットルの１．０Ｍ水酸化ナトリウムをカラムにポンプで送り込むことで実施した。カラムをそれぞれ流速７００Ｌ／ｈおよび１３００Ｌ／ｈで、それぞれ２００リットルおよび４００リットルの脱ミネラル水でフラッシュした。カチオン交換クロマトグラフィーの１サイクルの時間は、３．３時間であった。カチオン交換クロマトグラフィーステップのＣＭＰの相対収率は、９０％（供給物中の１００ｇのＣＭＰあたり通過画分中の９０ｇのＣＭＰ）であった。毎日５サイクルのカチオン交換クロマトグラフィーを実施して、製品タンク内のＣＭＰ溶液を濃縮するための、標準的限外濾過（Ｋｏｃｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳからのＨＦＫ−３２８メンブレン）がそれに続いた。限外濾過前に、水酸化カリウムと水酸化ナトリウムの混合溶液によって、製品タンクのｐＨを６．５に調節した。合計１０サイクルのカチオン交換クロマトグラフィーを実施して、その後、標準的限外濾過（Ｋｏｃｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳからのＨＦＫ−３２８メンブレン）によって、ＣＭＰ溶液をさらに濃縮した。標準的噴霧乾燥機を使用して濃縮ＣＭＰ溶液のほぼ半分を噴霧乾燥し、２４ｋｇの粉末を得た。粉末の組成は、選択されたパラメータと共に表１に記載される。
【０１５１】
実施例５−発明のプロセス変形型
限外濾過Ｉ−分離：
２３％の乾燥物質、２０％のタンパク質を含有して、ＣＭＰ純度がおよそ２４％（１００ｇのタンパク質あたり２４ｇのＣＭＰ）である、６００リットルのβ−ラクトグロブリン低下ＷＰＣ濃縮物を脱ミネラル冷水で希釈して、乾物含量１１％およびタンパク質含有量８．９％にした。ｐＨが２．２になるまで、３０％ｗ／ｗ塩酸を添加した。３１ミルのスペーサーがあり名目上のカットオフ値が５０，０００ダルトンである、Ｓｙｎｄｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，Ｖａｃａｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳからのタイプＢＮ６３３８の６”渦巻形膜を使用して、溶液を濾過した。総膜面積は、６４ｍ２であった。濾過は、以下の条件で実施した：温度を１０℃に維持し、送り圧力３．０バールで、平均圧を（２つのフィルター構成要素にわたり）２．０バールに維持した。３０％ｗ／ｗの塩酸を使用してｐＨを２．２に維持し、透過液が除去されるのと同じ流れで、限外濾過ＩＩからの透過液を添加した。ループ内の再循環流は３０ｍ３／ｈであり、供給タンク上の再循環はおよそ５ｍ３／ｈであった。８．５時間の濾過後に、限外濾過ＩＩからの透過液の添加を停止した。平均流束は、２２Ｌ／ｍ２ｈと測定された。
【０１５２】
限外濾過ＩＩ−残余分の透析濾過および透過液濃度：
限外濾過ＩＩのために、限外濾過Ｉからの透過液を供給タンク内に収集した。限外濾過Ｉと同時に、３１ミルのスペーサーがあり名目上のカットオフ値が３，０００ダルトンであるＳｙｎｄｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，Ｖａｃａｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳからのタイプＶＴ６３３８の６”渦巻形膜を使用して限外濾過ＩＩを実施した。総膜面積は、６４ｍ２であった。濾過は、以下の条件で実施した：温度を１０℃に維持し、送り圧力０．５〜１．０バールで、平均圧を（２つのフィルター構成要素にわたり）１．０〜１．５バールに維持した。限外濾過Ｉから透過液が除去されるのと同じ流れで、透過液を生成するために、圧力条件を調節した。８．５時間の濾過後に、すなわち限外濾過Ｉの停止後に、上記と同じ条件を使用して残余分を濃縮し、６００リットルの残余分を得た。引き続いて４％水酸化ナトリウムを使用して残余分をｐＨ６．３に調節し、透析濾過し、濾液が除去されるのと同じ流れで、３，３００リットルの水道水を添加した。濾過条件は、上と同じであった。乾物含量３．４％およびタンパク質含有量２．９％の、８２０リットルの残余分が得られた。残余分中のＣＭＰの純度は、ＨＰＬＣ分析に基づいて７２％（１００ｇのタンパク質あたり７２ｇのＣＭＰ）と判定された。
【０１５３】
カチオン交換クロマトグラフィー：
カチオン交換クロマトグラフィーは、以下を除いて、実施例１で示される説明と同様に実施された：限外濾過ＩＩからの最終残余分を脱ミネラル冷水で希釈して、タンパク質含有量１．１４％（１００ｇの溶液あたり１．１４ｇのタンパク質）にして、希釈溶液中のｐＨを３．４７に調節し、導電率を２．３ｍＳ／ｃｍに調節した。各サイクル中に８０５リットルの供給液をカラムにポンプで送り込み、合計２サイクルのカチオン交換クロマトグラフィーを実施した。カチオン交換クロマトグラフィーステップのＣＭＰの相対収率は、８０％（供給物中の１００ｇのＣＭＰあたり通過画分中の８０ｇのＣＭＰ）であった。噴霧乾燥機を使用して濃縮ＣＭＰ溶液のほぼ半分を標準的噴霧乾燥し、６ｋｇの粉末を得た。粉末の組成は、選択されたパラメータと共に表１に記載される。
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【０１５４】
実施例６−先行技術との比較
米国特許第５，２７８，２８８Ａ号明細書は、ＣＭＰを製造するために、カチオン交換クロマトグラフィーと限外濾過を記述される順序で組み合わせる方法を開示する。例えば第１のカチオン交換ステップでは、チーズホエーをカチオン交換樹脂に接触させ、非吸着物質を収集する。引き続いてカットオフ値が１０，０００〜５０，０００ダルトンである膜を使用して、非吸着物質を４未満のｐＨで限外濾過し、それによって濾液中にＣＭＰを得た。最後に濾液のｐＨを調節して、噴霧乾燥前にＣＭＰ溶液を濃縮するために、標準的限外濾過を実施した。したがって２つの重要な分離ステップは、記述される順序でのカチオン交換クロマトグラフィーと、ｐＨ＜４における限外濾過である。本発明では、２つの分離ステップの順序が逆転される。本発明では、最大で４のｐＨにおける限外濾過を最初に実施して（実施例中の「限外濾過Ｉ」）、非吸着物質（「通過画分」または「非結合物質」としても示される）中にＣＭＰが得られる、カチオン交換クロマトグラフィーがそれに続いた。本発明の分離ステップの順序は、米国特許第５，２７８，２８８Ａ号明細書で示される分離ステップの順序と比較して、いくつかの利点を有する。
【０１５５】
本発明の第１の利点は、本発明の方法を使用した最終生成物中のＣＭＰの純度（総タンパク質の％ＣＭＰ）が、米国特許第５，２７８，２８８Ａ号明細書で得られるＣＭＰ純度と比較して、はるかにより高いことである。米国特許第５，２７８，２８８Ａ号明細書には、８０％〜８８％の純度が示される。本発明の方法によって、およそ９８％以上の純度を達成し得る。本発明によって得られるＣＭＰ製品の非常に高い純度のために、製品は、フェニルケトン尿症に罹患している患者のための栄養成分として適切であり、これは製品中に存在するフェニルアラニンの非常に低いレベルによっても示唆される。米国特許第５，２７８，２８８Ａ号明細書からの方法によって得られる製品中の８０％〜８８％のＣＭＰ純度は、フェニルケトン尿症患者にとって高すぎるフェニルアラニン含有量と相関する。
【０１５６】
本発明の第２の利点は、それが、米国特許第５，２７８，２８８Ａ号明細書の方法、または同等の高純度ＣＭＰを提供する先行技術のあらゆるその他の方法よりも、１ｋｇの単離ＣＭＰあたりより少ないイオン交換材を使用することである。本発明に従って、第１の限外濾過ステップは、非ＣＭＰホエータンパク質の大部分を除去する。したがって、カチオン交換クロマトグラフィーステップへの供給液中の非ＣＭＰホエータンパク質とＣＭＰの重量比は、米国特許第５，２７８，２８８Ａ号明細書よりもはるかに低く、したがって全ての非ＣＭＰホエータンパク質と結合するために、ＣＭＰの質量単位あたり、はるかにより低い容積のカチオン交換樹脂が必要とされる。
【０１５７】
本発明の第３の利点は、本発明の方法を使用したＣＭＰの全収率（出発原料中のＣＭＰ質量と比較した、最終製品中のＣＭＰの％質量）が、米国特許第５，２７８，２８８Ａ号明細書で得られるＣＭＰの全収率と比較して、はるかにより高いことである。米国特許第５，２７８，２８８Ａ号明細書の実施例２を使用して、ゴーダホエー中のタンパク質含有量を６．２ｇ／Ｌ、総タンパク質含量に対するＣＭＰ含量を１８％と仮定すれば、最終生成物中で得られた８１ｍｇのＣＭＰに基づいて、総ＣＭＰ収率は０．７３％と計算され得る。本発明の実施例２を使用して、出発原料中の総タンパク質含量に対するＣＭＰ含量を１８％と仮定すれば、総ＣＭＰ収率は５０％と計算され得て、これは限外濾過ステップからの６３％の収率と、最終粉末製品へのカチオン交換クロマトグラフィーステップを包含する８０％の収率を組み合わせることで得られる。
【０１５８】
本発明の第４の利点は、米国特許第５，２７８，２８８Ａ号明細書と比較して、イオン交換樹脂のバッチが、消耗するまでに耐えられるイオン交換サイクルの回数を増大させることである。イオン交換クロマトグラフィーは比較的高価な単位操作であり、イオン交換樹脂の経費は、全体的な加工経費のかなり大きい部分である。したがってイオン交換材の寿命を延長させることは、高純度ＣＭＰ含有製品製造の全体的な加工経済性を改善するための興味深いアプローチである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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