(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I：
0006316209.tif 000151
の化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくはエステル：
式中、nは1〜24であり、かつ
R1は、
(1) 式：
0006316209.tif 000152
の化合物であって、式中、mは0または1である、化合物；および
(2 ) 式：
0006316209.tif 000153
の化合物
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
0006316209.tif 000154
の化合物；
(2) 式：
0006316209.tif 000155
の化合物；
(3) 式：
0006316209.tif 000156
の化合物；および
(4) 式：
0006316209.tif 000157
の化合物であって、式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
0006316209.tif 000158
の化合物のいずれかを表す、化合物
からなる群より選択される。
【請求項２】
R1が式：
0006316209.tif 000159
の化合物であって、式中、mは0または1である、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
R1が式：
0006316209.tif 000160
の化合物である、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
R2が式：
0006316209.tif 000161
の化合物である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
R2が式：
0006316209.tif 000162
の化合物である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
R2が式：
0006316209.tif 000163
の化合物である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
R2が式：
0006316209.tif 000164
の化合物であって、式中、R3は一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、Xは硫黄または式：
0006316209.tif 000165
の化合物のいずれかを表す、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
R3がsiRNA分子である、請求項7に記載の化合物。
【請求項９】
R3がフルオレセインイソチオシアネートである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
以下からなる群より選択される、請求項1〜6 のいずれか一項に記載の化合物：
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
3-(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸トリフルオロ酢酸塩；
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；および
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-アセチルスルファニル-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合体化される部分と標的化実体との間に共有結合が形成されるような、チオールなどの反応性求核剤を含有する他の分子との化学反応に適したリンカーおよび官能基を含有する、強力かつ選択的な小分子インテグリンアンタゴニストの合成および反応に関する。アルファVベータ3（αVβ3）型のインテグリン受容体アンタゴニストがαVβ3二量体に結合するように、当該小分子標的化アンタゴニストは同族受容体系に結合する。共有結合により連結された部分としては、小分子治療薬、ポリマー、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが挙げられる。5'-チオ-siRNAの標的化送達を可能にする手段としての5'-チオ-siRNA誘導体を形成するための5'-チオ含有オリゴヌクレオチドが含まれる。そのような誘導体化siRNAと適切なトランスフェクション剤との組み合わせは、そのようなインテグリン受容体を発現する細胞へのsiRNAの選択的送達を促進することで、RNA干渉(RNAi)を通じて標的遺伝子の発現を防止する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンαVβ3型はビトロネクチンの受容体である[Hermann, P. et al. "The vitronectin receptor and its associated CD47 molecule mediates proinflammatory cytokine synthesis in human monocytes by interaction with soluble CD23&quot；[The Journal of cell biology 144 (1999): 767-75]。それはインテグリンαVおよびインテグリンβ3(CD61)という2つの成分からなり、血小板および他の細胞型によって発現される。エタラシズマブのようなαVβ3阻害剤は抗血管新生剤として使用可能であると示されている。
【０００３】
RNA干渉は周知のプロセスであり、このプロセスでは、メッセンジャーRNA(mRNA)のタンパク質への翻訳が、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの相補的もしくは部分相補的オリゴヌクレオチドとの会合または結合によって干渉される。siRNAは、通常は長さが19〜25ヌクレオチドの範囲である二本鎖RNA分子であり、RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)として知られる細胞質中の一組のタンパク質と会合する。RISCが最終的に二本鎖siRNAを分離することで、1本の鎖がmRNA分子の相補的もしくは部分相補的部分と結合または会合し、その後mRNAはRISCによって破壊されるかまたは翻訳を妨げられ、結果的に、コードされたタンパク質または遺伝子産物の発現が抑制される。
【０００４】
治療用途で(特にヒトにおける全身投与に)siRNAなどの核酸を使用する上での問題の1つは、(1) 特定の標的細胞または標的細胞型、および(2) それらの細胞の細胞質(すなわち、mRNAが存在しかつタンパク質に翻訳される場所)に核酸を送達することにあった。送達上の問題の一部は、核酸が負に帯電しており、容易に分解され(特に無修飾の場合)、腎臓によって効率的に濾過され、それ自体では細胞の細胞質に容易に輸送することができないという事実に基づく。したがって、著しい量の研究が、リポソーム、ミセル、ペプチド、ポリマー、結合体およびアプタマーを含む様々な担体および製剤に関する送達上の問題を解決することに重点を置いた。Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009)（非特許文献1）を参照。一部の比較的有望な送達媒体は、脂質ナノ粒子を含む脂質系の使用を包含している。Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009)（非特許文献2）；Hopeらによる国際特許出願公開第WO 2010/042877号（特許文献1）(「Improved Amino Lipids And Methods For the Delivery of Nucleic Acids」)を参照。しかし、特定の標的細胞およびそのような細胞の細胞質へのsiRNA、ならびに小分子、ペプチド、他の核酸、蛍光部分およびポリマーなどの物質の標的化について、さらなる改善が依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許出願公開第WO 2010/042877号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009)
【非特許文献２】Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009)
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、式I：
0006316209.tif 000002
の化合物であって、式中、R1、R2およびnは詳細な説明および特許請求の範囲に定義されている、化合物に関する。特に、本発明は、様々な治療用途および他の用途のための、小分子、ペプチド、核酸、蛍光部分およびポリマーなどの結合体化された部分の、αVβ3二量体を発現する標的細胞への改善された送達のための、式Iの化合物に関する。本発明はまた、そのような化合物を製造および使用する方法に関する。
[本発明1001]
式I：
0006316209.tif 000003
の化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくはエステル：
式中、nは1〜24であり、かつ
R1は、
(1) 式：
0006316209.tif 000004
の化合物であって、式中、mは0または1である、化合物；
(2) 式：
0006316209.tif 000005
の化合物であって、式中、XはNまたはCHである、化合物；
(3) 式：
0006316209.tif 000006
の化合物；
(4) 式：
0006316209.tif 000007
の化合物；および
(5) 式：
0006316209.tif 000008
の化合物
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
0006316209.tif 000009
の化合物；
(2) 式：
0006316209.tif 000010
の化合物；
(3) 式：
0006316209.tif 000011
の化合物；および
(4) 式：
0006316209.tif 000012
の化合物であって、式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
0006316209.tif 000013
の化合物のいずれかを表す、化合物
からなる群より選択される。
[本発明1002]
R1が式：
0006316209.tif 000014
の化合物であって、式中、mは0または1である、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
R1が式：
0006316209.tif 000015
の化合物であって、式中、XはNまたはCHである、本発明1001の化合物。
[本発明1004]
R1が式：
0006316209.tif 000016
の化合物である、本発明1001の化合物。
[本発明1005]
R1が式：
0006316209.tif 000017
の化合物である、本発明1001の化合物。
[本発明1006]
R1が式：
0006316209.tif 000018
の化合物である、本発明1001の化合物。
[本発明1007]
R2が式：
0006316209.tif 000019
の化合物である、本発明1001〜1006のいずれかの化合物。
[本発明1008]
R2が式：
0006316209.tif 000020
の化合物である、本発明1001〜1006のいずれかの化合物。
[本発明1009]
R2が式：
0006316209.tif 000021
の化合物である、本発明1001〜1006のいずれかの化合物。
[本発明1010]
R2が式：
0006316209.tif 000022
の化合物であって、式中、R3は一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、Xは硫黄または式：
0006316209.tif 000023
の化合物のいずれかを表す、本発明1001〜1006のいずれかの化合物。
[本発明1011]
R3がsiRNA分子である、本発明1010の化合物。
[本発明1012]
R3がフルオレセインイソチオシアネートである、本発明1010の化合物。
[本発明1013]
以下からなる群より選択される、本発明1001〜1012のいずれかの化合物：
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
3-(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸トリフルオロ酢酸塩；
(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(テトラヒドロピリミジン-2-イリデンアミノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
(S)-N-[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]メチル]フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジルウレイド)チアゾール-4-カルボニル]アミノ]アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；および
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-アセチルスルファニル-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸。
[本発明1014]
(R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンジル}-ウレイド]-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ}-アセチルアミノ]-フェニル-3-イル-プロピオン酸である、本発明1001の化合物。
[本発明1015]
3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンジル}-ウレイド]-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ}-アセチルアミノ]-フェニル-3-イル-プロピオン酸である、本発明1001の化合物。
[本発明1016]
(R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンジル}-ウレイド]-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ}-アセチルアミノ]-3-ピリジン-3-イル-プロピオン酸である、本発明1001の化合物。
[本発明1017]
(R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンジル}-ウレイド]-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ}-アセチルアミノ]-3-ピリジン-3-イル-プロピオン酸である、本発明1001の化合物。
[本発明1018]
本発明1001〜1017のいずれかの化合物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1019]
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療のための方法であって、それを必要とする患者に治療有効量の本発明1001〜1017のいずれかの化合物を投与する段階を含む方法。
[本発明1020]
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防のための、本発明1001〜1017のいずれかの化合物の使用。
[本発明1021]
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防用の医薬の調製のための、本発明1001〜1017のいずれかの化合物の使用。
[本発明1022]
以上に記載の発明。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１ａ】表1は、特定の5'-誘導体化siRNA一本鎖および二本鎖の組成を示す。
【図１ｂ】表2は、小分子siRNA結合体の分析データを示す。
【図１ｃ】表3は、インテグリンアンタゴニストアッセイにおける小分子-siRNA結合体の効力、およびsiRNAのKDデータを示す。
【図１ｄ】表4は、FITC異性体標識試薬の同一性、特徴づけおよび結合能を示す。
【図１ｅ】ヒストグラフを示す(赤色: 二本鎖-27 500nMおよび例140 10μM；緑色: 二本鎖-27)。
【図２】代表的siRNA取り込み画像(二本鎖-27(500nM))を示す。
【図３】例FITC-5(LFA-1アンタゴニスト標識FITC)を10μMで有する、FITCが結合体化されたJurkat細胞の画像を示す。
【図４】例FITC-14(VLA-4アンタゴニスト標識FITC)を10μMで有する、FITCが結合体化されたJurkat細胞の画像を示す。ヒストグラフは、VLA-4標的化要素を伴うsiRNA二本鎖の存在の変化を示す。VLA-4アンタゴニスト例140の存在下では、この変化は扁平状である。
【図５】5'-センス鎖においてインテグリン標的化小分子によって誘導体化されたsiRNA二本鎖で処理された際のH1299細胞におけるAHA1発現の減少を示す。y軸はAHA1の実測発現レベルを示す。比較的低い棒は比較的高度のノックダウン(比較的高度のsiRNAトランスフェクション)を示し、高い棒は比較的低度のノックダウン(すなわち比較的低度のsiRNAトランスフェクション)を示す。青色の二本鎖はセンス鎖の5'-末端における標的化修飾を有し、桃色の二本鎖はセンス鎖の5'-末端における標的化修飾、およびアンチセンス鎖の5'-末端に結合したNu547フルオロフォアを有する。
【図６】細胞の健康状態のマーカーであるGAPDH mRNA発現のレベルを示す。誘導体化siRNAで処理された細胞とモック細胞および未処理細胞とで発現レベルが類似していることは、当該処理の濃度および期間で細胞毒性が存在しないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
別途指定がない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される以下の特定の用語および語句は以下のように定義される。
【００１０】
「部分」という用語は、1つもしくは複数の化学結合によって別の原子または分子に結合することで分子の一部を形成する、原子または化学結合した原子の群を意味する。例えば、式Iの可変要素R1およびR2は、式Iに示す構造に対して、示された位置で共有結合によって結合している、部分を意味する。
【００１１】
「結合体化された部分」という用語は、治療用のまたは有用な化合物、ペプチド、ポリマー、小分子、蛍光部分、オリゴヌクレオチドまたは核酸である、部分を意味する。例としては、薬物、治療用ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAおよびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)が挙げられる。
【００１２】
別途指定がない限り、「水素」または「ヒドロ」という用語は水素原子部分(-H)を意味し、H2を意味しない。
【００１３】
「ハロゲン」という用語はフッ素部分、塩素部分、臭素部分またはヨウ素部分を意味する。
【００１４】
「アルキル」という用語は、1〜12個の炭素原子の一価の直鎖状または分岐状の飽和炭化水素基を示す。アルキルは、特定の態様では1〜7個の炭素原子、より特定の態様では1〜4個の炭素原子を有する。アルキルの例としてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチルまたはtert-ブチルが挙げられる。
【００１５】
「TFA」という用語はトリフルオロ酢酸を意味する。
【００１６】
別途指定がない限り、「下記式の化合物(a compound of the formula)」または「下記式の化合物(a compound of formula)」または「下記式の化合物(compounds of the formula)」または「下記式の化合物(compounds of formula)」という用語は、その式によって定義される化合物の部類より選択される任意の化合物(別途記載がなければそのような任意の化合物の薬学的に許容される任意の塩またはエステルを含む)を意味する。
【００１７】
「薬学的に許容される塩」という用語は、遊離塩基または遊離酸の生物学的な有効性および特性を保持し、生物学的にまたは他の理由で望ましくないということがない塩を意味する。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、好ましくは塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、サリチル酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、N-アセチルシステインなどの有機酸によって形成することができる。さらに、塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に加えることで調製することができる。無機塩基から誘導される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などが挙げられるが、それらに限定されない。有機塩基から誘導される塩としては、一級、二級および三級アミン、天然置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、N-エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂など）の塩が挙げられるが、それらに限定されない。置換パターンに応じて、本発明の化合物は双性イオンとして存在してもよい。
【００１８】
本発明の化合物は薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。本発明の化合物は薬学的に許容されるエステル(すなわち、プロドラッグとして使用される式Iの酸のメチルおよびエチルエステル)の形態で存在してもよい。本発明の化合物は溶媒和、すなわち水和していてもよい。溶媒和は製造プロセスの途中で行われてもよく、例えば当初は無水である式Iの化合物の吸湿性の結果(水和)として行われてもよい。
【００１９】
同一の分子式を有するが原子の性質もしくは結合順序または原子の空間配置が異なる化合物を「異性体」と呼ぶ。原子の空間配置が異なる異性体を「立体異性体」と呼ぶ。ジアステレオマーとは、鏡像異性体ではない、1つまたは複数のキラル中心において相対する立体配置を有する立体異性体のことである。重ね合わせられない互いの鏡像である、1つまたは複数の不斉中心を有する立体異性体を「鏡像異性体」と呼ぶ。ある化合物が不斉中心を1つ有する場合、例えば炭素原子が4つの異なる基に結合している場合、一対の鏡像異性体が可能である。鏡像異性体は、不斉中心の絶対配置によって特徴づけることができ、Cahn、IngoldおよびPrelogのR-およびS-順位則によって、または分子が偏光面を回転させる様式によって記述され、右旋性または左旋性(すなわちそれぞれ(+)または(-)-異性体)と命名される。キラル化合物は個々の鏡像異性体またはその混合物として存在し得る。等しい割合の鏡像異性体を含有する混合物を「ラセミ混合物」と呼ぶ。
【００２０】
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を予防し、緩和しもしくは寛解させるか、または治療される対象の生存を延長するために有効な化合物の量を意味する。治療有効量の決定は当技術分野における技能の範囲内である。本発明の化合物の治療上有効な量または投薬量は、広い範囲内で変動し得るし、当技術分野において公知の様式で決定することができる。そのような投薬量は、投与される特定の化合物、投与経路、治療される状態および治療される患者を含む、特定の各症例における個々の要件に対して調整される。1日の投薬量は、単一用量または分割用量で投与してもよく、非経口投与では持続注入として投与してもよい。
【００２１】
「薬学的に許容される担体」という用語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに薬学的投与に適合性のある他の材料および化合物を含む、薬学的投与に適合性のあるあらゆる材料を含むように意図される。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性化合物も本組成物に組み入れることができる。
【００２２】
詳しくは、本発明は、式I：
0006316209.tif 000024
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、かつ
R1は、
(1) 式：
0006316209.tif 000025
の化合物（式中、mは0または1である）；
(2) 式：
0006316209.tif 000026
の化合物（式中、XはNまたはCHである）； 
(3) 式：
0006316209.tif 000027
の化合物；
(4) 式：
0006316209.tif 000028
の化合物；ならびに
(5) 式：
0006316209.tif 000029
の化合物
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
0006316209.tif 000030
の化合物；
(2) 式：
0006316209.tif 000031
の化合物；
(3) 式：
0006316209.tif 000032
の化合物；および
(4) 式：
0006316209.tif 000033
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
0006316209.tif 000034
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される、
前記式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルに関する。
【００２３】
上記構造中で使用されている
0006316209.tif 000035
という記号は、構造または部分が共有結合によってベース分子（base molecule）に結合する場所を示すために使用される。さらに、上記の記号との組み合わせで使用される「PEGへ」もしくは「Sへ」という語句または同様の文言は、複数の結合点が存在する場合に構造または部分がベース分子に結合する場所または方法を示す。例えば、R2が式：
0006316209.tif 000036
（式中、Xは式：
0006316209.tif 000037
の化合物である）の化合物である場合、
式Iに基づく構造は、式：
0006316209.tif 000038
（式中、R1、R3およびnは式Iに定義の通りである）である。
【００２４】
本発明はまた、式Iの化合物、およびそのような化合物を含有する薬学的組成物を製造および使用する方法に関する。式Iの化合物は、αVβ3受容体を発現する標的細胞への小分子、タンパク質、核酸、ポリマー、蛍光マーカーおよび他の物質の送達を改善する上で有用である。特定の態様では、本発明は、RNA干渉を通じて特定の標的タンパク質の発現を阻害するために、αVβ3受容体を発現する標的細胞の細胞質にsiRNAを送達する上で有用である、式Iの化合物を含有する組成物および製剤に関する。
【００２５】
より特定の態様では、本発明は、αVβ3受容体を発現する腫瘍細胞および他の細胞型へのsiRNAなどの核酸の送達を促進する製剤のための、式Iの化合物の使用に関する。さらに、炎症、およびがんのような増殖性障害を治療する送達用製剤を合成するための式Iの化合物の使用が、本発明の一部である。
【００２６】
R1は、式Iの化合物をインテグリン受容体複合体に標的化することで、そのような受容体を発現する細胞への該化合物の送達を促進する、小分子インテグリンアンタゴニストを表す。
【００２７】
特定の態様では、R1の小分子インテグリンアンタゴニスト標的化部分は、インテグリン受容体に対する小分子の結合親和性が遊離小分子インテグリンアンタゴニストに比べて実質的に減少しない位置で結合する。式IのR1部分はαVβ3インテグリン二量体を標的化する。
【００２８】
特定の態様では、R1は、式：
0006316209.tif 000039
（式中、mは0または1である）のαVβ3標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００２９】
他の態様では、R1は、式：
0006316209.tif 000040
（式中、XはNまたはCHである）のαVβ3インテグリン標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３０】
他の態様では、R1は、式：
0006316209.tif 000041
のαVβ3インテグリン標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３１】
他の態様では、R1は、式：
0006316209.tif 000042
のαVβ3インテグリン標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３２】
他の態様では、R1は、式：
0006316209.tif 000043
のαVβ3インテグリン標的化部分、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである。
【００３３】
R2は、チオール含有分子などの強力な求核剤を有する、治療用のまたは他の有用な化合物または結合体化される部分との共有結合を形成可能な、反応性部分を表し得る。そのような反応性部分の例としては、
0006316209.tif 000044
からなる群より選択される部分が挙げられる。
【００３４】
あるいは、R2は、治療用のまたは他の有用な化合物、タンパク質またはオリゴヌクレオチドなどの結合体化された部分(R3)に既に結合した部分を表し得る。より具体的には、R2は、式：
0006316209.tif 000045
部分を表し得、
式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
0006316209.tif 000046
の化合物のいずれかを表す。
【００３５】
特定の態様では、R3はオリゴヌクレオチドを表す。より特定の態様では、R3は、一本鎖または二本鎖で存在し得るRNA分子、例えばsiRNA分子のセンス鎖の5'-末端を表す。RNAi剤としても知られるそのようなsiRNA分子は、細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する。特定の態様では、R3は、長さが15〜30ヌクレオチドのオリゴリボヌクレオチド鎖から本質的になるsiRNA分子であり、センスオリゴリボヌクレオチド鎖の5'-末端は、上記構造に示すようにR2に結合しており、標的遺伝子に対応するmRNAの少なくとも一部に相補的である。他の態様では、R3は、5'-末端において結合したDNAのオリゴヌクレオチドである。そのような誘導体化DNAは、一本鎖として、または別のオリゴヌクレオチドの相補鎖とハイブリダイズした1本の鎖として存在し得る。オリゴヌクレオチド鎖は無修飾でもよく、代謝安定性のために修飾されていてもよい。そのような修飾としては、ホスフェート上の特定位置における置換(例えばホスホロチオエート)ならびに2'-ヒドロキシ上の特定位置における置換(例えば2'-O-メチルおよび2'-フルオロ)が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３６】
特定の態様では、式IのR2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、（式Iをベースとする）式5：
0006316209.tif 000047
（式中、R1、nおよびXは式Iに定義の通りである）中に示すRNAのセンス鎖を含む。
【００３７】
他の特定の態様では、センス鎖はアンチセンス鎖に結合し得る。
【００３８】
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3（式中、R3は小分子またはタンパク質を表す）を表し、それによって、共有結合により連結された、式Iの特異的標的化実体が形成される。
【００３９】
より特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は治療用の小分子またはタンパク質を表す。
【００４０】
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、細胞顕微鏡観察技術を使用するこれらのインテグリン受容体結合の可視化に有用な蛍光部分を表す。
【００４１】
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、一級反応性スルフィドを有するポリマーを表す。より具体的には、R3は、細胞表面および細胞の細胞質ドメインに対するsiRNAの複合体形成および送達に有用なカチオン性ポリマーを表し得る。
【００４２】
より特定の態様では、本発明は、R3が、
0006316209.tif 000048
に示すフルオレセインイソチオシアネート(FITC)の構造異性体の1つである、式Iの化合物に関する。
【００４３】
より特定の他の態様では、本発明は、R3が、
0006316209.tif 000049
に示すFITC-14の構造異性体の1つである、式Iの化合物に関する。
【００４４】
他の態様では、本発明は、nが9〜13、好ましくは12である、式Iの化合物に関する。
【００４５】
より特定の態様では、本発明は、以下の化合物（またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル）のうちの1つからなる群より選択される式Iの化合物に関する：
αVβ3リガンド試薬1: (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
αVβ3リガンド試薬2: (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
αVβ3リガンド試薬3: 3:(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸トリフルオロ酢酸塩；
αVβ3リガンド試薬4: (S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(テトラヒドロピリミジン-2-イリデンアミノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
αVβ3リガンド試薬5: (S)-N-[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]メチル]フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジルウレイド)チアゾール-4-カルボニル]アミノ]アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
αVβ3リガンド試薬6: (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
αVβ3リガンド試薬7: (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
αVβ3リガンド試薬8: (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-アセチルスルファニル-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；
αVβ3リガンド試薬9: (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンジル}-ウレイド]-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ}-アセチルアミノ]-フェニル-3-イル-プロピオン酸；
αVβ3リガンド試薬10: 3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンジル}-ウレイド]-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ}-アセチルアミノ]-フェニル-3-イル-プロピオン酸；
αVβ3リガンド試薬11: (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンジル}-ウレイド]-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ}-アセチルアミノ]-3-ピリジン-3-イル-プロピオン酸；
αVβ3リガンド試薬12: (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンジル}-ウレイド]-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ}-アセチルアミノ]-3-ピリジン-3-イル-プロピオン酸。
【００４６】
さらに、本発明は、αVβ3二量体を発現する標的細胞の細胞質へのsiRNAなどの核酸の改善された送達をもたらす、siRNAと組み合わせた際にナノ粒子を創製するための、式Iの化合物を含有する新規組成物および製剤に関する。特定の態様では、本発明は、(1) R2が5'-siRNAオリゴヌクレオチドを含む、式Iの化合物と、(2) ポリカチオン性トランスフェクション剤とを含む、siRNA製剤に関する。
【００４７】
本発明はまた、そのような化合物および組成物を製造および使用する方法に関する。式Iの化合物は、αVβ3二量体を発現する組織または細胞への薬物、核酸または他の治療用化合物の送達を改善する組成物または製剤の成分として有用である。特定の態様では、本発明は、RNA干渉を通じて特定のタンパク質の発現を阻害するために、αVβ3二量体を発現する標的細胞の細胞質にsiRNAを送達する上で有用である、式Iの化合物を含有する製剤に関する。より特定の態様では、本発明は、がんまたは炎症性疾患の治療のための、αVβ3二量体を発現する腫瘍細胞および他の細胞型にsiRNAを有効に送達可能な、式Iの化合物およびそのような化合物を含有する組成物に関する。そのような化合物および組成物は、式Iの化合物を欠く同様の製剤に比べて、より有効であるし、改善されたノックダウン能力を示す。
【００４８】
本発明の化合物の一般的合成
式Iの化合物を合成するための好適な方法を実施例に示す。一般に、式Iの化合物は、以下に示すスキームに従って調製することができる。別途指定がない限り、以下のスキーム中の変数nならびにR1およびR2は、式Iの部類に関する以前の定義と同様に定義される。
【００４９】
マレイミド-(PEG)n-インテグリンアンタゴニスト結合剤の一般的合成
様々な長さのPEGのスキーム1の26などの化合物は市販されている(例えばPierce BioScienceから)。そのような化合物は、PEGアミノ酸のアミノ末端をアミド結合形成条件下で3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオン酸によってアシル化した後、エステル形成条件下でのN-ヒドロキシコハク酸との反応によって反応性N-ヒドロキシコハク酸エステルを形成することで作製することもできる。スキーム1に示すように、化合物26と27などの一級または二級アミンを含有する化合物との反応を、非プロトン性またはプロトン性溶媒中、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)などの塩基性アミンの存在下、室温で行うことで、PEG化中間体28を生成させる。
0006316209.tif 000050
【００５０】
R4がチオアセチルまたは2-ジチオピリジルであって、様々な長さのPEG部分を有する、スキーム2の29などの化合物も市販されている(例えばPierce BioScienceから)。構造29を有する化合物と27などの一級または二級アミンを含有する化合物との反応を、非プロトン性またはプロトン性溶媒中、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)などの塩基性アミンの存在下、室温で行うことで、PEG化中間体30を生成させる。
0006316209.tif 000051
【００５１】
本発明の特定の非限定的な例として、スキーム3に示すように、中間体26と31とを反応させることでマレイミド中間体32を生成する。
0006316209.tif 000052
【００５２】
同様に、スキーム4に示すように、中間体26と33とを反応させることでマレイミド中間体34を生成することができる。
0006316209.tif 000053
【００５３】
同様に、スキーム5に示すように、中間体29と35とを反応させることで中間体36を生成することができ、R4はチオアセチルまたは2-ジチオピリジルを表す。
0006316209.tif 000054
【００５４】
同様に、スキーム6に示すように、中間体29と37とを反応させることで中間体38を生成することができ、R4はチオアセチルまたは2-ジチオピリジルを表す。
0006316209.tif 000055
【００５５】
一般構造26または29の化合物では、異なるPEGの長さが利用であるかまたは当業者によって容易に作製され、好ましくはn = 8〜24である。このトピックは徹底的に報告および考察されてきた(例えばChemistry for peptide and protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews Volume 54, Issue 4, 17 June 2002, Pages 459-476)。
【００５６】
スキーム7に示すように、中間体31は既報(例えばSidduri, A. et al. Bioorganic &amp；Medicinal Chemistry Letters, 2002, 12, 2475-2478)と同様に合成することができる。
0006316209.tif 000056
【００５７】
具体的には、スキーム7に示すように、中間体41を市販の(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸40から作り出した。メタノール溶液中の市販の出発原料40のニトロ基を塩化アンモニウムの存在下、亜鉛末によって室温で数時間かけて還元してアニリン41を得た。ニトロ還元の他の方法は当業者に公知である。アニリン41をジクロロメタンなどの非プロトン性溶媒中、ジ-イソプロピル-エチルアミンなどの塩基の存在下、室温で、塩化2,6-ジクロロベンゾイル42などのハロゲン化ベンゾイル誘導体によってアシル化した。こうしてアミド43を形成した。t-ブチルカルボニル(Boc)アミン保護基を、当業者に公知の標準的方法に従って、例えば室温でのジオキサン中HCl溶液による処理によって除去し、これにより塩酸塩44を得た。塩酸塩44を公知の1-(2-アジド-エチル)-シクロペンタンカルボン酸45の存在下、アミド結合形成条件(やはり当業者に周知)で処理することで、ジ-アミド46を生成した。中間体46のアジド基をテトラヒドロフランなどの非プロトン性溶媒中、室温でのトリ-アルキルホスフィンによる処理によって還元した。さらに、メチルエステルをエタノールおよびテトラヒドロフランなどの溶媒混合物中、50℃などの高温で15時間の水酸化ナトリウムによる処理によって鹸化した。この方法によって、双性イオンとして提示されることもある中間体31を形成した。
【００５８】
PEG部分の結合は、スキーム8に示すように合成される中間体39によっても可能である。具体的には、3,5-ジクロロフェノール47をDMFなどの極性非プロトン性溶媒中、イミダゾールなどの塩基の存在下で塩化トリ-イソプロピルシリルによって保護した後、無水テトラヒドロフラン中、-78℃などの低温でブチルリチウムなどの強塩基と反応させる。得られたリチウム錯体を、ドライアイスの形態で加えられる二酸化炭素で反応停止させることで、安息香酸誘導体である中間体48を得る。次に中間体48をトルエンなどの非プロトン性溶媒中での塩化スルホニル(SOCl2)による処理によって塩素化することで塩化アシルを形成する。この時点で、塩化アシルとアミン塩酸塩49とをジクロロメタン(DCM)などの非プロトン性溶媒中、ジ-イソプロピルエチルアミン(DIPEA)などの塩基の存在下で反応させることで中間体50を形成する。中間体50のシリル保護基をテトラヒドロフランなどのプロトン性溶媒中、室温でのフッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF)による処理によって除去する。このフェノール中間体と3-N-t-ブチル-カーボネート-1-ブロモプロパンとをジメチルホルムアミド(DMF)などの非プロトン性溶媒中、炭酸カリウム(K2CO3)などの塩基の存在下で反応させる。こうして中間体52を形成し、これをトリフルオロ酢酸(TFA)で脱保護し、続いてエタノールなどのプロトン性溶媒中で水酸化ナトリウムなどの塩基によって加水分解することで中間体39を形成する。
0006316209.tif 000057
【００５９】
αVβ3アンタゴニスト誘導体化剤の合成
αVβ3標的化モジュールである中間体117は、以下のスキーム15に示すように合成することができる。簡潔に言えば、m-アミノ安息香酸110とN,N-ジ-Boc-メチルチオ尿素111とをDMF、ジクロロメタンおよびピリジン中、酢酸第二水銀の存在下で反応させる。この時点で、ベンジルエステル保護グリシンと上記反応の生成物のカルボン酸とを標準的ペプチド形成条件下でカップリングする。ベンジルエステルを水素化分解条件によって除去することで遊離酸112を得る。別の反応系列において、p-ニトロフェノール113と(2-ヒドロキシ-エチル)カルバミン酸tert-ブチルエステルとをテトラヒドロフランなどの非プロトン性溶媒中、トリフェニルホスフィンおよびジイソプロピルアゾジカルボキシレートの存在下でカップリングする。この生成物のニトロ基を対応するアニリン114に還元し、これをアミド結合形成条件下でN-α-Fmoc-L-アスパラギン酸β-tert-ブチルエステルとカップリングする。ピペリジンでの処理によるアミノ保護基Fmocの除去後、アミノ末端と中間体115とをやはり標準的アミド結合形成条件下でカップリングすることで中間体116を形成する。中間体117をトリフルオロ酢酸などの強酸での処理によって形成し、当業者に周知の精製方法(例えば分取HPLC)によって単離する。
0006316209.tif 000058
【００６０】
(2-ヒドロキシエチル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの代わりに(3-ブロモプロピル)カルバミン酸tert-ブチルエステルを使用し、スキーム15に示すのと同様にして、3-炭素鎖アミン類似体117を調製することができる。
【００６１】
他のαVβ3標的化モジュールは、以下のスキーム16に示すように合成することができる。[(2-アミノ-チアゾール-4-カルボン酸メチルエステル120が報告された(Amide derivatives and their preparation and use as pesticides, By Kobayashi, Yumi；Daido, Hidenori；Katsuta, Hiroyuki；Nomura, Michikazu；Tsukada, Hidetaka；Hirabayashi, Atsushi；Takahashi, Yusuke；Aoki, Yoji；Kawahara, Atsuko；Fukazawa, Yasuaki；et al 米国特許出願公開(2011) US 20110201687 A1 20110818)。中間体120とアラニンメチルエステル塩酸塩121とを標準的アミド結合形成条件下で反応させることでエステル中間体122を作り出す。これとは別に、N-(2-ヒドロキシベンジル)アセトアミド127とtert-ブチル 3-ブロモプロピルカルバメート124とをDMFなどの非プロトン性溶媒中、炭酸カリウムなどの塩基の存在下で反応させることでtert-ブチル 3-(2-(アミノメチル)フェノキシ)プロピルカルバメート129を生成する。中間体129のアミノ基をヒドラジン水和物での処理によって露わにする。得られた遊離アミン130をトリホスゲンで処理してイソシアネート131を作り出し、これをDMFなどの非プロトン性溶媒中で[(2-アミノ-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-酢酸メチルエステル132と組み合わせて中間体133を生成する。中間体133のメチルエステルの変換を標準的鹸化条件下で実現した後、標準的アミド結合形成反応条件下で市販のメチル 3-アミノ-3-フェニルプロパノエート塩酸塩146、またはメチル 3-アミノ-3-(3-ピリジル)プロパノエート塩酸塩147および148の鏡像異性的に純粋な異性体とカップリングすることで中間体135を形成する。Boc保護基を標準的条件下で除去してαVβ3標的化小分子136を形成する。
【００６２】
以下の例の反応スキーム16: αVβ3リガンド試薬9、αVβ3リガンド試薬10、αVβ3リガンド試薬11およびαVβ3リガンド試薬12：
0006316209.tif 000059
【００６３】
有用性
式Iの化合物は、様々な治療用途および他の用途で、αVβ3インテグリン受容体複合体を発現する標的細胞に治療薬、小分子、ペプチド、核酸、蛍光部分およびポリマーなどの結合体化された部分を送達する上で有用である。したがって、式Iの化合物は、αVβ3の発現または過剰発現に関連する様々な疾患および状態を治療するために使用することができる。そのような疾患および状態としては炎症、がん、および代謝関連疾患を挙げることができる。
【００６４】
特定の態様では、本発明は、がんの治療または予防を、そのような治療を必要とする哺乳動物(好ましくはヒト)において行う方法であって、治療有効量の式Iの化合物を投与する段階を含む方法を含む。そのような組成物は良質の医療のための原則(good medical practice)に一致する様式で投与することができる。この文脈で考慮される要素としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および開業医に公知の他の要因が挙げられる。投与すべき化合物の「有効量」は、疾患または状態を治療もしくは予防し(例えば標的タンパク質の発現を阻害し)かつ許容されない毒性を回避するために必要な最小量などの考慮事項によって左右される。例えば、そのような量は正常細胞、または哺乳動物全体に毒性のある量を下回ることができる。本発明の式Iの化合物を含有する組成物は非経口投与、腹腔内投与および肺内投与によって投与することができる。非経口注入としては筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与が挙げられる。
【実施例】
【００６５】
本発明は、以下の実施例を参照することでさらに完全に理解されよう。しかし、それらを本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００６６】
試薬をAldrich、SigmaおよびPierce BioScience、または以下に示す他の供給業者から購入し、さらに精製せずに使用した。マルチミリグラム〜マルチグラムのスケールの精製を当業者に公知の方法、例えばシリカゲルフラッシュカラムの溶離により行った。また、いくつかの場合では、分取フラッシュカラム精製を、CombiFlashシステムで溶離される使い捨て予備充填マルチグラムシリカゲルカラム(RediSep)の使用により行った。また、Biotage(商標)およびISCO(商標)は、中間体の精製に本発明で使用可能なフラッシュカラム機器である。
【００６７】
化合物の同一性および純度を判定する目的で、以下のシステムを使用してLC/MS(液体クロマトグラフィー/質量分析)スペクトルを記録した。質量スペクトルの測定では、システムはMicromass Platform II分光計: ポジティブモードのESイオン化(質量範囲: 150〜1200amu)からなる。同時クロマトグラフィー分離を以下のHPLCシステムで実現した: ES Industries Chromegabond WR C-18 3u 120Å(3.2x30mm)カラムカートリッジ；移動相A: 水(0.02% TFA)および相B: アセトニトリル(0.02% TFA)；勾配10% B〜90% B、3分；平衡化時間1分；流量2mL/分。いくつかの場合では、分取HPLC中に20ミリモル濃度の酢酸アンモニウムを有効イオン化用調節剤として使用した。そのような場合ではアンモニウム塩を単離した。
【００６８】
いくつかの分離では、超臨界流体クロマトグラフィーの使用も有用であり得る。超臨界流体クロマトグラフィー分離は以下の典型的条件でMettler-Toledo Minigramシステムを使用して行った: 12mm ADカラムを超臨界流体CO2中40% MeOHによって100bar、30℃、2.0mL/分で溶離。塩基性アミノ基を有する分析物の場合、0.2%イソプロピルアミンをメタノール調節剤に加えた。
【００６９】
化合物を、Varian Inova 400 MHz NMR分光計またはVarian Mercury 300 MHz NMR分光計を使用する1H-NMR、およびBruker Apex-II高分解能4.7T FT-質量分析計を使用する高分解能質量分析によって特徴づけた。また、最終化合物を、Thermo Electronが販売するLTQ CL Orbitrapを使用する高分解能質量分析によって特徴づけた。
【００７０】
本明細書において使用される略語は以下の通りである。
AIBN         2,2'-アゾビスイソブチロニトリル
Bu           ブチル
DCE          1,2-ジクロロエタン
DCM          ジクロロメタン
DBU          1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン
DIAD         ジイソプロピルアゾジカルボキシレート
DIEA         ジエチルアミン
DIPEA        ジイソプロピルエチルアミン
DMF          N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO         ジメチルスルホキシド
EDC-HCl      1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
EtOAc        酢酸エチル
EtOH         エチルアルコール
FCC          フラッシュカラムクロマトグラフィー
h            時間
HBTU         O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム
ヘキサフルオロホスフェート
HOBt         ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC         高圧液体クロマトグラフィー
HRMS         高分解能質量スペクトル
LRMS         低分解能質量スペクトル
LC           液体クロマトグラフィー
L-Pro        L-プロリン
MCPBA        メタ-クロロ過安息香酸
MeOH         メチルアルコール
MW           マイクロ波
NIS          N-ヨードスクシンイミド
NBS          N-ブロモスクシンイミド
NMP          1-メチル-2-ピロリジノン
PdCl2(dppf)  [1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)
PEGn         ポリエチレングリコールのn回繰り返し(例えばPEG2 = -OCH2CH2OCH2CH2-)
PG           保護基
PyBroP       ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
rt           室温
TBAF         フッ化テトラブチルアンモニウム
TBDMS        tert-ブチル-ジメチルシリル
TBTU         2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム
テトラフルオロボレート
TMS          トリメチルシリル
TEA          トリエチルアミン
TFA          トリフルオロ酢酸
THF          テトラヒドロフラン
TLC          薄層クロマトグラフィー
TPP          トリフェニルホスフィン
【００７１】
αVβ3を標的化する化合物の合成
実施例1
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；αVβ3リガンド試薬1
0006316209.tif 000060
【００７２】
工程1：3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)-安息香酸の調製
0006316209.tif 000061
3-アミノ安息香酸(82.3g、0.60モル)、N,N'-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-S-メチルイソチオ尿素(1,3-ジ-boc-2-メチルイソチオ尿素、CAS # 107819-90-9)(174.2g、0.6モル)およびピリジン(94.92g、97mL、1.20モル、2.0当量)の無水ジメチルホルムアミド(600mL)と無水1,2-ジクロロエタン(600mL)との混合物中溶液を酢酸第二水銀(95.6g、0.30モル、0.5当量)で処理し、オーバーヘッドメカニカルスターラーによって室温で5時間攪拌した。次に固体を濾去し、ジクロロメタンで洗浄し、一緒にした濾液および洗浄液を蒸発させて粗生成物(約307g)を得た。この粗材料にメタノール(240mL)を加え、混合物を2時間激しく攪拌した。次に、激しく攪拌しながら水2400mLをゆっくりと加えた。濾過し、固体を水で徹底的に洗浄し、終夜吸引乾燥させて3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)-安息香酸を理論値を超えた収率で得た。高真空ポンプ乾燥させた。
【００７３】
得られた重量は理論値を超えていた(理論値 = 227.6g、実測値 = 251.2g、1H NMRは約10%のDMFの存在を示唆)。
【００７４】
工程2：2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸ベンジルエステルの調製
0006316209.tif 000062
3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)安息香酸(171.56g、0.4073モル)、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-トリアジン(71.52g、0.4073モル)およびN-メチルモルホリン(41.2g、44.78mL、0.4073モル)の無水テトラヒドロフラン(1600mL)中明褐色溶液を室温で2時間攪拌(オーバーヘッドメカニカルスターラー)した後、グリシンベンジルエステルp-TsOH塩(137.44g、0.4073モル)および第2の等量のN-メチルモルホリン(41.2g、44.78mL、0.4073モル)を加えた。得られた混合物を室温で36時間攪拌した。次にテトラヒドロフランをロータリーエバポレーター上で除去した後、酢酸エチル(2000mL)を加えた。得られた混合物を氷冷0.5N HCl(3x1000mL)、水(1x1000mL)、5%炭酸ナトリウム水溶液(1x1000mL)、水(1x1000mL)、飽和塩化ナトリウム水溶液(1x1000mL)で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾去し、溶媒を蒸発させて粗生成物(228.5g)を油状物として得た。粗材料を、40:45:15の比のジクロロメタン:ヘキサン:酢酸エチルを溶離液として使用するWaters Prep500(運転10回)上でのクロマトグラフィーで精製して2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸ベンジルエステル(収率79.3%)を得た。(注: 1回目の運転では清浄な材料152gおよびわずかに不純な材料33gが得られ、後者は2回の運転で再度クロマトグラフィーにかけた)。
0006316209.tif 000063
【００７５】
工程3：2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸の調製
0006316209.tif 000064
2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸ベンジルエステル(170.0g、0.323モル)の無水エタノール(2000mL)溶液を高圧設備中、60psiにて、室温で終夜(18時間)、10% Pd炭素(湿式触媒20g、水を約50%含有)上で水素化した。触媒を濾去し、溶媒を蒸発させて生成物を得た。生成物をトルエン(3回)と共沸させてすべてのエタノールを除去することで、2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸(収率97.88%)を白色固体として得た。
0006316209.tif 000065
【００７６】
工程4：[3-(4-ニトロ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルの調製
0006316209.tif 000066
(3-ヒドロキシ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステル(7.03g、40.1mmol)の無水THF(40mL)溶液に4-ニトロフェノール(5.07g、36.5mmol)、トリフェニルホスフィン(10.5g、40.1mmol)を窒素雰囲気下、室温で加えた。得られた溶液を氷水浴で約0℃に冷却した後、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(DIAD、8.1g、40.1mmol)を15〜20分間滴下した。添加後、溶液を室温に昇温させ、15時間攪拌し、その時点でLCMS分析は16%の出発原料の存在を示した。次にすべての上記試薬をさらに0.1当量加え、反応混合物をさらに15時間攪拌した。固体を濾去し、酢酸エチルで洗浄した後、濾液を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過および濃縮によって粗残渣を得て、これをISCO(340g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して[3-(4-ニトロ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(収率64%)を白色固体として得た。
0006316209.tif 000067
【００７７】
工程5：[3-(4-アミノ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルの調製
0006316209.tif 000068
[3-(4-ニトロ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(7.7g、26mmol)のメタノール(200mL、出発原料を溶解させるように加熱)溶液に水(10mL)、塩化アンモニウム(20.9g、390mmol、15当量)および亜鉛末(16.4g、260mmol、10当量、3回に分けて)を室温で加えた。亜鉛末の添加後、反応混合物は発熱性になり、反応混合物を1〜2時間攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示した。次に固体を濾去し、水および酢酸エチルで洗浄し、濾液からの有機化合物を酢酸エチル(3x100mL)で抽出した。一緒にした抽出物をブライン溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過および濃縮によって粗残渣を得て、これをISCO(330g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して[3-(4-アミノ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(収率79%)を白色固体として単離した。
0006316209.tif 000069
【００７８】
工程6：(S)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルの調製
0006316209.tif 000070
[3-(4-アミノ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(5.41g、20.2mmol)および(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-コハク酸tert-ブチルエステルのDMF(40mL)溶液にHOBT(3g、22.2mmol)およびDIPEA(8.52g、66.6mmol)を室温で加えた。得られた溶液を氷浴で0℃に冷却し、固体HBTU(8.43g、22.2mmol)を5〜10分間で3回に分けて加えた。添加後、冷却浴を取り外し、反応混合物を室温に昇温させ、2.5時間攪拌し、その時点でLCMS分析は出発原料の非存在を示した。次に反応混合物を酢酸エチル(400mL)で希釈し、水(400ml)、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(400mL)およびブライン溶液(400mL)で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾液を濃縮し、粗残渣をISCO(330g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して(S)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(収率95%)を白色固体として単離した。
0006316209.tif 000071
【００７９】
工程7：(S)-3-アミノ-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルの調製
0006316209.tif 000072
(S)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(11g、16.67mmol)のTHF(95mL)溶液にピペリジン(4.26g、50mmol)を室温で加えた。得られた溶液を4時間攪拌し、その時点でLCMS分析は出発原料の非存在を示した。次に溶媒を減圧除去し、残渣をトルエンと共沸させて白色固体を得て、これを最小限の酢酸エチル(25〜30mL)に高温条件で溶解させた後、析出するまでヘキサン(250〜300mL)で希釈した。得られた固体を濾取し、ヘキサンで洗浄し、風乾後に(S)-3-アミノ-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(収率81%)を白色固体として得た。
0006316209.tif 000073
【００８０】
工程8：(S)-3-(2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルの調製
0006316209.tif 000074
(S)-3-アミノ-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(2.0g、4.58mmol)、2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸(2.0g、4.58mmol)、HBTU(1.91g、5.04mmol)およびHOBT(681mg、5.04mmol)の混合物にDMF(15mL)、続いてDIPEA(1.95g、15.12mmol)を窒素雰囲気下、室温で加えた。得られた明褐色溶液を2日間攪拌し、その時点で多くのゲル様固体が形成された。次に水(約50mL)を加え、得られた明褐色ペースト状物を酢酸エチル(約200mL)に高温条件で溶解させた。次に2つの層を分離し、水層を酢酸エチル(100mL)でもう1回抽出した。一緒にした酢酸エチル抽出物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、水およびブライン溶液で洗浄した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過および濃縮によって粗明褐色固体を得て、これをISCO(120g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して(S)-3-(2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(収率94%)を白色固体として単離した。
0006316209.tif 000075
【００８１】
工程9：(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-(3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸トリフルオロ酢酸塩αVβ3リガンド-1の調製
0006316209.tif 000076
(S)-3-(2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(3.7g、4.32mmol)のジクロロメタン(80mL)溶液に過剰のトリフルオロ酢酸(40mL)を窒素雰囲気下、0℃(氷浴)で加えた。得られた無色溶液をこの温度で1〜2時間攪拌した後、冷却浴を取り外すことで室温に昇温させた。15時間攪拌後、溶媒を減圧除去し、残渣をトルエンと共沸した。得られた濃青色ペースト状物をtert-ブチルメチルエーテルでトリチュレートしたが、良好な固体は得られなかった。そこで溶媒を減圧除去し、残渣をジクロロメタンおよびジエチルエーテルでトリチュレートした。得られた明褐色固体を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄した。風乾後、(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-(3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸2.7gをトリフルオロ酢酸塩(収率85%)として単離した。
0006316209.tif 000077
【００８２】
工程10：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；αVβ3リガンド試薬1の調製
0006316209.tif 000078
(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-(3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸(245mg、0.289mmol)および3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(200mg、0.289mmol)のDMSO(5mL)溶液に過剰のDIPEA(186mg、252uL、1.44mmol)を窒素雰囲気下、室温で加えた。得られた明黄色溶液を2時間攪拌し、その時点でLCMS分析は出発原料の非存在を示した。次に、過剰のDIPEAを減圧除去し、所望の生成物をHPLCを使用する精製によって単離して(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸212mg(収率68%)を明黄色固体として得た。
0006316209.tif 000079
【００８３】
実施例2
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；αVβ3リガンド試薬2の調製
0006316209.tif 000080
(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-(3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸(245mg、0.289mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(250mg、0.289mmol)およびDIPEA(373mg、503uL、2.89mmol)から出発して実施例1、工程10に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に明褐色油状物(312mg、86%)を得た。
0006316209.tif 000081
【００８４】
実施例3
(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸トリフルオロ酢酸塩；αVβ3リガンド試薬3の調製
0006316209.tif 000082
(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-(3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸(245mg、0.289mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(172mg、0.289mmol)およびDIPEA(503uL、2.89mmol)から出発して実施例1、工程10に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に明黄色粘稠油状物(172mg、73%)を得た。
0006316209.tif 000083
【００８５】
実施例4
(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(テトラヒドロピリミジン-2-イリデンアミノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；αVβ3リガンド試薬4
0006316209.tif 000084
【００８６】
工程1：2-[3-(ベンジルオキシカルボニルメチルカルバモイル)フェニルイミノ]-ジヒドロピリミジン-1,3-ジカルボン酸ジtert-ブチルエステルの調製
0006316209.tif 000085
無水テトラヒドロフラン(90mL)中の2-[3-カルボキシフェニルイミノ]-ジヒドロピリミジン-1,3-ジカルボン酸ジtert-ブチルエステル(4.85g、11.56mmol)、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-トリアジン(2.03g、11.56mmol)、N-メチルモルホリン(1.17g、1.27mL、11.56mmol)、グリシンベンジルエステルp-TsOH塩(3.9g、11.56mmol)および第2の等量のN-メチルモルホリン(1.17g、1.27mL、11.56mmol)から出発して実施例1、工程2に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、ISCOカラムクロマトグラフィー精製後に無色粘稠油状物(3.19g、49%)を得た。
0006316209.tif 000086
【００８７】
工程2：2-[3-(カルボキシメチル-カルバモイル)フェニルイミノ]-ジヒドロ-ピリミジン-1,3-ジカルボン酸ジtert-ブチルエステルの調製
0006316209.tif 000087
無水エタノール(20mL)中の2-[3-(ベンジルオキシカルボニルメチルカルバモイル)フェニルイミノ]-ジヒドロピリミジン-1,3-ジカルボン酸ジtert-ブチルエステル(475mg、0.84mmol)および10% Pd/炭素(250mg)から出発して実施例1、工程3に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製して非晶質白色固体(355mg、89%)を得た。
0006316209.tif 000088
【００８８】
工程3：2-[3-[[[(S)-2-tert-ブトキシカルボニル-1-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)フェニルカルバモイル]エチルカルバモイル]メチル]カルバモイル]フェニルイミノ]ジヒドロピリミジン-1,3-ジカルボン酸ジtert-ブチルエステルの調製
0006316209.tif 000089
DMF(5mL)中の2-[3-(カルボキシメチル-カルバモイル)フェニルイミノ]-ジヒドロピリミジン-1,3-ジカルボン酸ジtert-ブチルエステル(332mg、0.69mmol)、(S)-3-アミノ-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(305mg、0.69mmol)、HBTU(290mg、0.76mmol)、HOBT(104mg、0.76mmol)およびDIPEA(297mg、400uL、2.3mmol)から出発して実施例1、工程8に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、ISCOカラムクロマトグラフィー精製後に非晶質白色固体(602mg、97%)を得た。
0006316209.tif 000090
【００８９】
工程4：(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)フェニル]-3-[2-[3-(テトラヒドロピリミジン-2-イリデンアミノ)ベンゾイルアミノ]アセチルアミノ]スクシンアミド酸；αVβ3リガンド-2の調製
0006316209.tif 000091
ジクロロメタン(20mL)中の2-[3-[[[(S)-2-tert-ブトキシカルボニル-1-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)フェニルカルバモイル]エチルカルバモイル]メチル]カルバモイル]フェニルイミノ]ジヒドロピリミジン-1,3-ジカルボン酸ジtert-ブチルエステル(595mg、0.66mmol)およびトリフルオロ酢酸(10mL)から出発して実施例1、工程9に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製して明褐色固体をトリフルオロ酢酸塩(555mg、96%)として得た。
0006316209.tif 000092
【００９０】
工程5：(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(テトラヒドロピリミジン-2-イリデンアミノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸(αVβ3リガンド試薬4)の調製
0006316209.tif 000093
(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)フェニル]-3-[2-[3-(テトラヒドロピリミジン-2-イリデンアミノ)ベンゾイルアミノ]アセチルアミノ]-スクシンアミド酸(265mg、0.3mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(179mg、0.3mmol)およびDIPEA(387mg、526uL、3.0mmol)から出発して実施例1、工程10に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に明黄色粘稠油状物(208mg、68%)を得た。
0006316209.tif 000094
【００９１】
実施例5
(S)-N-[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]メチル]フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジルウレイド)チアゾール-4-カルボニル]アミノ]アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；αVβ3リガンド試薬5の調製
0006316209.tif 000095
(S)-N-[4-アミノメチルフェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジルウレイド)チアゾール-4-カルボニル]アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸(166mg、0.3mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(232mg、0.3mmol)およびDIPEA(387mg、522uL、3.0mmol)から出発して実施例1、工程10に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に明褐色油状物(362mg、99%)を得た。
0006316209.tif 000096
【００９２】
実施例6
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；αVβ3リガンド試薬6
0006316209.tif 000097
【００９３】
工程1：2-アミノ-チアゾール-4-カルボン酸エチルエステル臭化水素酸塩の調製
0006316209.tif 000098
冷却器、温度計およびメカニカルスターラーを備え、油浴中に固定した3L三つ口フラスコにチオ尿素(48.2g、634mmol)およびブロモピルビン酸エチル(137g、88.3mL、634mmol)を装入した。透明溶液が形成されるまで反応液をゆっくりと慎重に加熱し(60℃)、その時点で反応液は発熱性になり(反応液の温度が110℃に到達)、反応液が凝固した時点で攪拌した。反応液にEA(500mL)を加え、反応液を熱から取り外し、室温に冷却した。固体を濾過し、EAおよびEt2Oで洗浄して2-アミノ-チアゾール-4-カルボン酸エチルエステル臭化水素酸塩を白色固体(157g、98%)として得た。
【００９４】
工程2：2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボン酸エチルエステルの調製
0006316209.tif 000099
2-アミノ-チアゾール-4-カルボン酸エチルエステル臭化水素酸塩(66.6g、263mmol)、4-エチルモルホリン(60.7g、67.1mL、527mmol)および無水DMF(660ml)を含む反応容器にベンジルイソシアネート(42.1g、316mmol)を加え、反応液をアルゴン下、室温で7時間攪拌し、ベンジルイソシアネート(42.1g、316mmol)をさらに加え、反応液をアルゴン下、室温で終夜攪拌した。翌日、反応液を2/3に濃縮し、水(1.6L)で希釈し、得られた析出物を濾過し、終夜吸引乾燥させて2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボン酸エチルエステルを帯黄白色固体(146g、182%)として得た。NMR分析は材料が依然として水およびDMFで湿潤していることを示唆しており、これをそのまま使用した。
【００９５】
工程3：2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボン酸の調製
0006316209.tif 000100
湿潤2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボン酸エチルエステル(146g、推定理論値263mmol)を含む反応容器にエタノール(1.2L)および1N NaOH(1.31L)を加えた。反応液を昇温させ(60℃)、アルゴン下で4時間攪拌した。反応液を濾過し、固体を廃棄した。濾液を氷浴中で冷却し、1N HCl(1.31L)で酸性化し、得られた析出物を濾過し、水で洗浄し、2日間吸引乾燥させて2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボン酸(72g、99%)を得た。
【００９６】
工程4：{[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ}-酢酸エチルエステルの調製
0006316209.tif 000101
2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボン酸(72g、259mmol)、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-トリアジン(45.5g、259mmol)、N-メチルモルホリン(26.2g、28.5ml、259mmol)、グリシンエチルエステル塩酸塩(36.2g、259mmol)および第2の等量のN-メチルモルホリン(26.2g、259mmol)から出発して実施例1、工程2に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、結晶化およびクロマトグラフィー後に白色結晶を固体(72.6g、76%)として得た。
【００９７】
工程5：{[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ}-酢酸の調製
0006316209.tif 000102
{[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ}-酢酸エチルエステル(72.3g、199mmol)、メタノール(200mL)、THF(1L)、1N NaOH(0.2L)および1N HCl(0.2L)から出発して実施例1、工程3に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、中和、蒸発および結晶化後に白色結晶(73.1g、109%)を得た。NMR分析は生成物が溶媒を含むことを示唆しており、これをそのまま使用した。
【００９８】
工程6：(S)-3-(2-{[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ}-アセチルアミノ)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルの調製
0006316209.tif 000103
{[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ}-酢酸、(S)-3-アミノ-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(1.5g、3.43mmol)、HBTU(1.43g、3.77mmol)、HOBT(0.51g、3.77mmol)およびDIPEA(1.46g、1.97mL、11.3mmol)から出発して実施例1、工程8に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製して白色固体(1.83g、70%)を得た。
0006316209.tif 000104
【００９９】
工程7：(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-{[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ}-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸αVβ3リガンド試薬8、40389-052) αVβ3リガンド-3の調製
0006316209.tif 000105
(S)-3-(2-{[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ}-アセチルアミノ)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(1.83g、2.48mmol)から出発して実施例1、工程9に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製して白色固体(1.29g、88%)を得た。
0006316209.tif 000106
【０１００】
工程8：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸の調製
0006316209.tif 000107
(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-{[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ}-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸αVβ3リガンド試薬8、40389-052)(242mg、0.405mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(280mg、0.405mmol)およびDIPEA(262.2mg、353μL、2.03mmol)から出発して実施例1、工程10に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に明褐色ゴム状物(206mg、43%)を得た。
0006316209.tif 000108
【０１０１】
実施例7
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；αVβ3リガンド試薬7、40389-058)の調製
0006316209.tif 000109
(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-{[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ}-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸αVβ3リガンド試薬8、40389-052)(155mg、0.260mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(225mg、0.260mmol)およびDIPEA(167mg、226μL、1.29mmol)から出発して実施例1、工程10に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に明黄色ゴム状物(149mg、42%)を得た。
0006316209.tif 000110
【０１０２】
実施例8
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-アセチルスルファニル-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸；αVβ3リガンド試薬8の調製
0006316209.tif 000111
(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-{[2-(3-ベンジル-ウレイド)-チアゾール-4-カルボニル]-アミノ}-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸、40389-052)(120mg、0.201mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-アセチルスルファニル-エトキシ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(120mg、0.201mmol)およびDIPEA(129.2mg、174μL、1.01mmol)から出発して実施例1、工程10に記載のものと同様の手順を使用して標記化合物を調製し、HPLC精製後に明褐色ゴム状物(206mg、43%)を得た。
0006316209.tif 000112
【０１０３】
N-(2-メトキシベンジル)アセトアミドの調製
0006316209.tif 000113
未希釈の化合物2-メトキシベンジルアミン(40g、0.29mol)にAc2O(80mL、0.85mol)を氷水浴上で滴下した。次に反応混合物を室温でさらに2時間攪拌した。混合物を水50mLに注ぎ、酢酸エチル(3x300mL)で抽出した。一緒にした有機層を水(3x150mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過および濃縮後、残渣を石油エーテル(200mL)に懸濁させ、10分間攪拌した後、濾過し、乾燥させて標記化合物(36.5g、69.9%)を純粋な白色固体として得た。
0006316209.tif 000114
【０１０４】
N-(2-ヒドロキシベンジル)アセトアミドの調製
0006316209.tif 000115
N-(2-メトキシベンジル)アセトアミド(6.5g、0.036mol)をDCM(100mL)に溶解させ、溶液を窒素下で-10℃に冷却した。この溶液にBBr3(15mL、0.15mol)を滴下した。添加後、氷浴を取り外し、反応混合物を室温で2時間攪拌した。反応混合物を-10℃に再冷却し、水(20mL)で反応停止させた。混合物をDCM(3x100mL)で抽出し、有機層を水(3x100mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させて標記化合物(4.3g、71.7%)を固体として得た。それをさらに精製せずに次の工程に直接使用した。
0006316209.tif 000116
【０１０５】
tert-ブチル 3-ブロモプロピルカルバメートの調製
0006316209.tif 000117
3-ブロモプロピルアミン臭化水素酸塩(50g、0.228mol)のDCM(1000mL)懸濁液に(Boc)2O(52g、0.238mol)およびトリエチルアミン(100mL、0.722mol)を加えた。次に反応液を室温でさらに3時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を石油エーテル(500mL)で洗浄した。混合物を濾過し、濾液を蒸発させて標記化合物(54g、99.2%)を無色油状物として得た。
0006316209.tif 000118
【０１０６】
{3-[2-(アセチルアミノ-メチル)-フェノキシ]-プロピル}-カルバミン酸tert-ブチルエステルの調製
0006316209.tif 000119
N-(2-ヒドロキシベンジル)アセトアミド(18.8g、0.11mol)のDMF(100mL)中攪拌溶液にtert-ブチル 3-ブロモプロピルカルバメート(32g、0.135mol)およびK2CO3(47g、0.34mol)を室温で加えた。次に反応混合物を室温で16時間攪拌した。混合物を濾過し、溶媒を減圧除去して粗生成物を得て、これをシリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル = 1:3〜1:4)で精製して標記化合物(23g、62.8%)を固体として得た。
0006316209.tif 000120
【０１０７】
tert-ブチル 3-(2-(アミノメチル)フェノキシ)プロピルカルバメートの調製
0006316209.tif 000121
{3-[2-(アセチルアミノ-メチル)-フェノキシ]-プロピル}-カルバミン酸tert-ブチルエステル(10.4g、0.032mol)をヒドラジン水和物(150mL、85%)に懸濁させ、反応混合物を還流温度で20時間攪拌した。混合物を室温に冷却し、ジエチルエーテル(3x150mL)で抽出した。一緒にした有機相をブライン(150mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過および濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(DCM/MeOH = 20:1〜1:1)で精製して標記化合物(4g、44.6%)を得た。
0006316209.tif 000122
【０１０８】
化合物2-アミノチアゾール-4-カルボン酸120の合成
0006316209.tif 000123
化合物150(125g、0.525mol)のTHF(2500mL)懸濁液にNaOH溶液(水790mL中63g)を1時間かけて滴下した。得られた混合物を室温で2時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を2N HCl(770mL)で処理し、濾過し、乾燥させて化合物120(75g、99.1%)を黄色固体として得た。
0006316209.tif 000124
【０１０９】
化合物[(2-アミノ-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-酢酸メチルエステル8の合成
0006316209.tif 000125
化合物120(1g、6.93mmol)のDMF(50mL)溶液に化合物121(0.97g、7.73mmol)、DIPEA(3.5mL、21.1mmol)およびHATU(2.93g、7.7mmol)を加えた。得られた溶液を室温で終夜攪拌した。反応溶液を85℃で減圧蒸発乾固し、THF 30mLで処理し、室温で約0.5時間攪拌した後、濾過し、少しのエタノールで洗浄し、乾燥させて化合物122(0.7g、46.9%)を黄色固体として得た。
0006316209.tif 000126
【０１１０】
[(2-{3-[2-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-ベンジル]-ウレイド}-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-酢酸メチルエステルの調製
0006316209.tif 000127
tert-ブチル 3-(2-(アミノメチル)フェノキシ)プロピルカルバメート(489mg、1.74mmol)のDCM(50mL)中攪拌溶液にDIPEA(449mg、3.48mmol)のDCM(5.0mL)溶液を加えた。この溶液を別のトリホスゲン(180mg、0.61mmol)のDCM(5mL)溶液に窒素下、0℃で滴下した。添加後、混合物を0℃でさらに15分間攪拌した。溶液を蒸発させて[3-(2-イソシアナトメチル-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルを白色固体として得た。それをDMF 2.5mLに溶解させて次の工程に直接使用した。
【０１１１】
[(2-アミノ-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-酢酸メチルエステル(374mg、1.74mmol)およびDIPEA(449mg、3.48mmol)のDMF(2.5mL)溶液に[3-(2-イソシアナトメチル-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルのDMF溶液(2.5mL、上記で作製)を室温で加えた。反応混合物を80℃で2時間攪拌した。次に混合物を冷却し、水50mLに注ぎ、酢酸エチル(3x100mL)で抽出した。有機相をブライン(20mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過および濃縮後、残渣をクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル = 1:2〜1:1)で精製して標記化合物(165mg、2工程で18.2%)を黄色固体として得た。
0006316209.tif 000128
【０１１２】
[(2-{3-[2-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-ベンジル]-ウレイド}-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-酢酸の調製
0006316209.tif 000129
[(2-{3-[2-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-ベンジル]-ウレイド}-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-酢酸メチルエステル(0.165g、0.31mmol)のTHF(5mL)溶液にLiOH.H2O(0.132g、3.1mmol)の水(1mL)溶液を室温で滴下した。次に溶液をこの温度で16時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を水5mLで希釈した。水溶液を酢酸エチル(10mL)で抽出し、水相をpH約5まで1Nクエン酸溶液によって酸性化した。水溶液を酢酸エチル(3x15mL)で抽出し、一緒にした有機層をブライン(10mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。濾過および濃縮後、標記化合物(0.080g、50.9%)を固体として得た。
0006316209.tif 000130
【０１１３】
メチル 3-(2-(2-(3-(2-(3-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)プロポキシ)ベンジル)ウレイド)チアゾール-4-カルボキサミド)アセトアミド)-3-フェニルプロパノエートの調製
0006316209.tif 000131
[(2-{3-[2-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-ベンジル]-ウレイド}-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-酢酸(0.7g、1.38mmol)のTHF(25mL)溶液にDIPEA(1.4g、10.8mmol)およびHATU(0.525g、1.38mmol)を室温で加えた。次に反応液を20分間攪拌した。メチル 3-アミノ-3-フェニルプロパノエート塩酸塩(0.29g、1.34mmol)を1回で加え、反応混合物を16時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を酢酸エチル50mLに溶解させ、1N NaOH溶液(3x15mL)、続いて1N HCl(3x15mL)および水(3x15mL)、次にブライン(15mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過および濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル/石油エーテル/メタノール = 25:25:2で溶離)で精製して標記化合物(0.54g、58.6%)を固体として得た。
0006316209.tif 000132
【０１１４】
メチル 3-(2-(2-(3-(2-(3-アミノプロポキシ)ベンジル)ウレイド)チアゾール-4-カルボキサミド)アセトアミド)-3-フェニルプロパノエート塩酸塩の調製
0006316209.tif 000133
HClの酢酸エチル(250mL)中攪拌飽和溶液にメチル 3-(2-(2-(3-(2-(3-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)プロポキシ)ベンジル)ウレイド)チアゾール-4-カルボキサミド)アセトアミド)-3-フェニルプロパノエート(5.5g、8.23mmol)の酢酸エチル(30mL)溶液を室温で滴下した後、混合物を室温で16時間攪拌した。有機溶媒を減圧除去し、固体をジエチルエーテル(50mL)で処理した後、濾過して標記化合物(4.7g、94.5%)を白色固体として得た。
0006316209.tif 000134
【０１１５】
3-{2-[(2-{3-[2-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンジル]-ウレイド}-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-アセチルアミノ}-3-フェニル-プロピオン酸αVβ3リガンド-4の調製
0006316209.tif 000135
3-{2-[(2-{3-[2-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンジル]-ウレイド}-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-アセチルアミノ}-3-フェニル-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(2.0g、3.31mmol、当量: 1.00)のメタノール(10ml)溶液に2M水酸化ナトリウム(33.1mmol、当量: 10.00)を加えた。反応混合物を55℃で終夜攪拌した。1N HClでの中和の間に粗生成物が析出し、これを濾取した(2.19g)。粗生成物を逆相HPLCで精製して標記化合物1041mgをTFA塩として得た。
HRMS m/e 555.2006 (M+H)+
【０１１６】
(R)-エチル 3-(2-(2-(3-(2-(3-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)プロポキシ)ベンジル)ウレイド)チアゾール-4-カルボキサミド)アセトアミド)-3-(ピリジン-3-イル)プロパノエートの調製
0006316209.tif 000136
[(2-{3-[2-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-ベンジル]-ウレイド}-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-酢酸(7.08g、13.9mmol)およびHATU(5.8g、15.2mmol)のTHF(150mL)溶液にDIPEA(13.9g、107.7mmol)を窒素下、室温で加えた。次に反応混合物を室温でさらに20分間攪拌した。化合物(R)-エチル 3-アミノ-3-(ピリジン-3-イル)プロパノエート塩酸塩(4.45g、16.8mmol)を1回で加え、反応液をこの温度で16時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチル500mLに溶解させ、0.3N HCl(2x100mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させて粗生成物を得て、これをシリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル中10%メタノールで溶離)で精製して標記化合物(7.2g、77.3%)を固体として得た。LC-MS: 684.2 [M+H]+、tR = 2.60分。
【０１１７】
(R)-エチル 3-(2-(2-(3-(2-(3-アミノプロポキシ)ベンジル)ウレイド)チアゾール-4カルボキサミド)アセトアミド)-3-(ピリジン-3-イル)プロパノエート塩酸塩の調製
0006316209.tif 000137
(R)-エチル 3-(2-(2-(3-(2-(3-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)プロポキシ)ベンジル)ウレイド)チアゾール-4-カルボキサミド)アセトアミド)-3-(ピリジン-3-イル)プロパノエート(2.3g、3.36mmol)のエタノール(50mL)中攪拌溶液に塩化アセチル(5mL)を0℃で加えた。次に溶液を室温で1時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を酢酸エチル(100mL)で洗浄して標記化合物(1.1g、52.6%)を白色固体として得た。
0006316209.tif 000138
【０１１８】
(R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-アミノプロポキシ)ベンジル)ウレイド)チアゾール-4-カルボキサミド)アセトアミド)-3-(ピリジン-3-イル)-プロピオン酸αVβ3リガンド-5の調製
0006316209.tif 000139
(R)-エチル 3-(2-(2-(3-(2-(3-アミノプロポキシ)ベンジル)ウレイド)チアゾール-4-カルボキサミド)アセトアミド)-3-(ピリジン-3-イル)プロパノエート二塩酸塩(1.99g、3.1mmol)のMeOH(10mL)溶液に2N水酸化ナトリウム(15.5mL、31.0mmol)を加え、得られた反応混合物を55℃で終夜攪拌した。次にそれを1N塩酸で中和し、逆相HPLCで精製して標記化合物1.10gを得た。
【０１１９】
実施例11
αVβ3リガンド試薬9の調製
0006316209.tif 000140
3-{2-[(2-{3-[2-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンジル]-ウレイド}-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-アセチルアミノ}-3-フェニル-プロピオン酸および3-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオン酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステルを用いて、実施例7に示すのと同様にして標記化合物を調製した。HRMS m/e 883.2978 (M+Na)+
【０１２０】
実施例12
αVβ3リガンド試薬10の調製
0006316209.tif 000141
3-{2-[(2-{3-[2-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンジル]-ウレイド}-チアゾール-4-カルボニル)-アミノ]-アセチルアミノ}-3-フェニル-プロピオン酸および1-(S-アセチル)-メルカプト-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-ドデカオキサノナトリアコンタン-39-酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルを用いて、実施例7に示すのと同様にして標記化合物を調製した。HRMS m/e 1213.5248 (M+H)+
【０１２１】
実施例13
αVβ3リガンド試薬11の調製
0006316209.tif 000142
(R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-アミノプロポキシ)ベンジル)ウレイド)チアゾール-4-カルボキサミド)アセトアミド)-3-(ピリジン-3-イル)-プロピオン酸TFAおよび3-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオン酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステルを用いて、実施例7に示すのと同様にして標記化合物を調製した。HRMS m/e 884.2924 (M+H)+
【０１２２】
実施例14
αVβ3リガンド試薬12の調製
0006316209.tif 000143
(R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-アミノプロポキシ)ベンジル)ウレイド)チアゾール-4-カルボキサミド)アセトアミド)-3-(ピリジン-3-イル)-プロピオン酸TFAおよび1-(S-アセチル)-メルカプト-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-ドデカオキサノナトリアコンタン-39-酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルを用いて、実施例7に示すのと同様にして標記化合物を調製した。HRMS m/e 1214.5205 (M+H)+。
【０１２３】
フルオレセイン(FITC)標識標的化試薬の調製
標的化試薬は、標的化小分子に対する受容体を発現する細胞へのそれらの結合の追跡を試験するために有用であり得るフルオロフォアで誘導体化することができる。そのような分子は2つの方法の一方または両方で作製することができる。第一に、標的化マレイミドと2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタンとの反応を行うことが可能である。あるいは、インテグリンアンタゴニスト小分子標的化リガンドのワンポット反応を行うことが可能であり、2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタン、ならびにスキーム17および18に示す二官能性PEG試薬を用いる。
【０１２４】
方法a)の例
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸-FITCの調製
0006316209.tif 000144
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸(37.5mg、0.03mmol)および2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタン(FITC試薬)(15.6mg、0.036mml)のメタノール(5mL)中黄色懸濁液に過剰のDIPEA(38.7mg、52uL、0.3mmol)を窒素雰囲気下、室温で加えた。得られた明黄色懸濁液を2時間攪拌し、その時点でLCMS分析は出発原料の非存在を示した。次に、過剰のDIPEAを減圧除去し、所望の生成物をHPLCを使用する精製によって単離して(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸-FITC誘導体25mg(収率50%)を褐色固体として得た。
0006316209.tif 000145
【０１２５】
方法b)の例
0006316209.tif 000146
【０１２６】
工程1. シスタミン二塩酸塩(68mg、0.301mmol)およびDIEA(110μL、2.1当量)をDMF(10mL)に溶解させた後、5-および6-カルボキシフルオレセインの混合物であるNHS-フルオレセイン(300mg、0.634mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で終夜攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水で3回、ブラインで1回洗浄した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮し、少量のメタノールおよび酢酸エチルに再溶解させた後、ジエチルエーテルでトリチュレートしてフルオレセイン-シスタミン付加体140mgを明橙色固体として得た。
【０１２７】
工程2. フルオレセイン-シスタミン付加体(80mg、0.092mmol)をメタノールおよび水の3:1混合物(4mL)に溶解させ、TCEP塩酸塩(80mg、3当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で2時間攪拌した。生成物をHPLCで精製して生成物78mgを得た。LRMS (ESI) 435.0
【０１２８】
フルオレセイン標識小分子-PEG結合体の調製
0006316209.tif 000147
【０１２９】
一般的手順
リガンド(1当量)のDMSO溶液にDIEA(2当量)およびSM(PEG)4n(1当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で1時間攪拌した。次に、チオールハンドルを有するフルオレセイン(1当量)を加え、反応混合物をさらに10分間攪拌した。生成物をHPLCで精製した。
【０１３０】
5'-チオール-siRNAオリゴヌクレオチドへの小分子インテグリン標的化リガンドの共有結合の手順
siRNAの調製
オリゴリボヌクレオチド合成
ABI 394合成機(Applied Biosystems)を10μmolスケールで使用する固相上でのホスホラミダイト技術に従ってオリゴリボヌクレオチドを合成した。RNA配列の情報は表1および2を参照のこと。対応するsiRNAはハウスキーピング遺伝子AHA1に対するものである。細孔制御ガラスでできた固体支持体(CPG、520Å、負荷75μmol/g、米国ペンシルベニア州アストンのPrime Synthesisから得た)上で合成を行った。定型的RNAホスホラミダイトである2'-O-メチルホスホラミダイト、および補助試薬をProligo(ドイツ・ハンブルク)から購入した。具体的には、以下のアミダイトを使用した: (5'-O-ジメトキシトリチル-N6-(ベンゾイル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、5'-O-ジメトキシトリチル-N4-(アセチル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、(5'-O-ジメトキシトリチル-N2-(イソブチリル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイトおよび5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト。2'-O-メチルホスホラミダイトは定型的RNAアミダイトと同一の保護基を有していた。すべてのアミダイトを無水アセトニトリル(100mM)に溶解させ、モレキュラーシーブ(3Å)を加えた。オリゴマーの5'-末端においてスルフヒドリルリンカーを生成させるために、Glen Research(米国バージニア州スターリング)からの1'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイトリンカーである1-O-ジメトキシトリチル-ヘキシル-ジスルフィドを使用した。小分子の結合体化の前に、トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP、以下参照)を使用してジスルフィドリンカーを還元した。Nu547フルオロフォアによる5'-末端標識のために、Thermo Fisher(ウィスコンシン州ミルウォーキー)から得た対応するホスホラミダイトを使用した。5-エチルチオテトラゾール(ETT、アセトニトリル中500mM)をアクチベーター溶液として使用した。カップリング時間は6分とした。ホスホロチオエート結合を導入するために、3-エトキシ-1,2,4-ジチアゾリン-5-オン(EDITH、スコットランド・ラナークシャーのLink Technologiesから得た)の無水アセトニトリル中100mM溶液を使用した。
【０１３１】
支持体結合オリゴマーの開裂および脱保護
固相合成の完了後、乾燥固体支持体を15mL管に移し、メタノール中メチルアミン(2M、Aldrich)によって45℃で180分間処理した。遠心分離後、上澄み液を新たな15mL管に移し、CPGをN-メチルピロリジン-2-オン(NMP、スイス・ブックス、Fluka)1200μLで洗浄した。洗浄液をメチルアミンのメタノール溶液と一緒にし、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(TEA・3HF、ドイツ・カールスルーエ、Alfa Aesar)450μLを加えた。この混合物を65℃に150分間到達させた。室温に冷却後、NMP 0.75mLおよびエトキシトリメチルシラン(スイス・ブックス、Fluka)1.5mLを加えた。10分後、析出したオリゴリボヌクレオチドを遠心分離により収集し、上澄み液を廃棄し、固体を緩衝液A(以下参照)1mL中で再構成した。
【０１３２】
オリゴリボヌクレオチドの精製
粗オリゴリボヌクレオチドを、AKTA Explorerシステム(GE Healthcare)上で分取22x250mm DNA Pac 100カラム(ドイツ・イトシュタイン、Dionex)を使用する強アニオン交換(SAX)HPLCにより精製した。緩衝液Aは10mM NaClO4、1mM EDTA、10mMトリス(pH 7.4)、6M尿素および20%アセトニトリルからなっていた。緩衝液Bは緩衝液A中に500mM NaClO4を有していた。流量4.5mL/分を使用した。260および280nmでのUVトレースを記録した。55分以内の20%B〜45%Bの勾配を使用した。適切な画分をプールし、3M NaOAc(pH=5.2)および70%エタノールで析出させた。
【０１３３】
粗Nu547標識オリゴマーを、AKTA Explorerシステム(GE Healthcare)上でXTerra Prep MS C8 10x50mmカラム(ドイツ・エシュボルン、Waters)を使用するRP HPLCにより精製した。緩衝液Aは100mM酢酸トリエチルアンモニウム(オランダ・ファルケンスワールト、Biosolve)であり、緩衝液Bは緩衝液A中に50%アセトニトリルを含有していた。流量5mL/分を使用した。260、280および547nm(Nu547標識オリゴリボヌクレオチドの場合)でのUVトレースを記録した。58個のカラム体積(CV)以内の5%B〜60%Bの勾配を使用した。適切な画分をプールし、3M NaOAc(pH=5.2)および70%エタノールで析出させた。
【０１３４】
最後に、精製オリゴマーを、Sephadex G-25(GE Healthcare)を含むカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。溶液の濃度を、UV光度計(ドイツ・クレーフェルト、Beckman Coulter)中、260nmでの吸光度測定により決定した。アニーリングまで、個々の鎖を-20℃で凍結溶液として貯蔵した。
【０１３５】
小分子RNA結合体の調製
マレイミド官能基を備えた小分子を、チオエーテル結合を通じた共有結合により、RNAと結合体化させた。この化学反応を可能にするために、5'-ジスルフィドリンカーを含有するRNA約60mgを、TCEP(水中0.5M、Sigma Aldrichから得た)1mLを使用して水(5mL)中で対応するチオールに還元した。分析用アニオン交換HPLCが反応の完了を示した時点で(室温で約2時間)、RNAをエタノール/3M NaOAc(pH 5.4)32:1(v/v)30mLによって-20℃で終夜析出させた。ペレットを遠心分離により収集し、引き続く小分子の結合体化に使用した。
【０１３６】
典型的な結合体化反応において、RNA 10mgをリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH 7.0)2mLに溶解させた。この溶液にACN/NMP 1:1(v/v)中小分子(0.12mM)を5分かけて加えた。RP LC-ESI MSが入力RNAの消費を示した時点で、混合物を水(約10mL)で希釈し、エタノール/3M NaOAc(pH 5.4)32:1(v/v)約40mLを-20℃で終夜加えて、結合体化されたRNAを析出させた。ペレットを遠心分離により収集し、水に溶解させ、必要であれば上記に示す手順に従ってアニオン交換HPLCで精製した。結合体が十分に純粋である場合、反応混合物をサイズ排除カラム(Sephadex G-25、GE Healthcare)を通じて濾過した。
【０１３７】
siRNAを生成させるためのオリゴリボヌクレオチドのアニーリング
等モルのRNA溶液を組み合わせることで相補鎖をアニールした。混合物を凍結乾燥させ、適切な量のアニーリング緩衝液(100mM NaCl、20mMリン酸ナトリウム、pH 6.8)で再構成することで所望の濃度を実現した。この溶液を95℃の水浴に入れ、3時間以内に室温に冷却した。
【０１３８】
本発明のαVβ3標的化化合物のαVβ3に対する結合親和性を評価するために、以下のアッセイを行った。
【０１３９】
ヒトαVβ3固相アッセイ
αVβ3 100uL(1x)を各ウェルに加え、プレートを4℃で終夜インキュベートすることで、イムノ96ウェルプレート(NUNC、Part# 439454)をαVβ3(R &amp；D、Cat# 3050-AV)でコーティングした。緩衝液A（20mMトリス、150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、pH 7.4）を使用した。コーティング試薬の除去後、緩衝液A中3.5% BSA 150uLを各ウェルに加えてプレートを37℃で105分間ブロッキングした。ブロッキング後、プレートを緩衝液B（緩衝液A + 1mM MnCl2）200uLで5回洗浄した。次に5% DMSO中試験化合物溶液50uL(2x)およびフィブリノーゲン50uL(2x)(Innovative Research、Cat# IFIB)を各ウェルに加えた。プレートを2分間振盪した後、37℃で2時間インキュベートした。プレートを緩衝液B 200uLで5回洗浄した後、100uL/ウェルの量の一次抗体であるウサギ抗ヒトフィブリノーゲン(Innovative Research、Cat IASHFBGN-GF)および50uL/ウェルの量の二次抗体であるヤギ抗ウサギIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体(Invitrogen、Cat#G21234)をそれぞれプレートに加えた。一次抗体の添加後および二次抗体の添加後、プレートを2分間振盪し、37℃で60分間インキュベートした後、同様に緩衝液B 200uLで5回洗浄した。固相アッセイの最終条件は[avβ3] = 1.25ug、[フィブリノーゲン] = 0.75ug/mL、[抗FG] = 1/2400(希釈)、[HPR-抗ウサギ] = 1/1000(希釈)とした。結合アッセイが完了した時点で検出試薬ABTS(試薬Aと試薬Bとの混合物)(KPL、Cat#50-62-00)100uL/ウェルをプレートに加えた。プレートを室温で5〜8分間振盪したところ、緑色の発色が徐々に現れた。停止緩衝液(1.0Mリン酸(HPO4))100uL/ウェルを加えた後、プレートをEnvision上にて吸光度モード450nmで読み取った。
【０１４０】
対照化合物(141)のIC50は約2nMであると決定された(すなわち、細胞のαVβ3受容体がおそらく対照化合物に結合または会合したことから、細胞の50%はウェルの表面上のαVβ3に結合しなかった)。これらの結果を以下の表3および表4に示す。
0006316209.tif 000148
【０１４１】
標的化送達のための、FITCフルオロフォアおよびsiRNAに共有結合により連結されたインテグリンアンタゴニストの小分子誘導体の細胞透過性および局在の証拠
手順
成長培地(10% FBSを有するRPMI 1640)中で、AML MV4-11細胞を二本鎖-27(500nM)と共に37℃で1時間インキュベートした。VLA-4非依存性結合を決定するために、VLA-4依存性結合をブロッキングする1つの条件に140(10μM)を含めた。インキュベーション後、細胞をD-PBSで2回洗浄し、1%パラホルムアルデヒド中で10分間固定した。ImageStreamx(シアトル、Aminis Corporation)を使用するイメージングフローサイトメトリーによってsiRNAの取り込みを分析した。結果を表Aおよび図1〜4に示す。
【０１４２】
（表Ａ）
0006316209.tif 000149
【０１４３】
細胞系におけるAHA1 mRNAをノックダウンするための、5'-センス鎖を修飾したsiRNAのアッセイ
材料および方法
0006316209.tif 000150
【０１４４】
リバーストランスフェクション: DharmaFect-1トランスフェクション試薬を0.15μl/ウェルで使用して、明記されたsiRNAを最終濃度50nMでH1299細胞にトランスフェクションした。次に、細胞を96ウェルプレートに5000細胞/ウェルでプレーティングし、37℃で48時間インキュベートした。
【０１４５】
siRNAによるノックダウンの有効性を、ベンダーが報告した通りに分岐DNAアッセイによって測定した。そのようなノックダウンの結果を図5に示す。相対的な細胞生存率を、同一ウェルにおけるGAPDHの絶対発現量によって評価した(図6)。
【０１４６】
反対の記述がない限り、実施例中のすべての化合物は上記のように調製し、特徴づけた。本明細書において引用されるすべての特許および刊行物は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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