(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化するための医薬を製造するためのイソキノリンアルカロイド誘導体の使用であって、前記イソキノリンアルカロイド誘導体は、サルソリノールまたはレチクリンである、使用。
【請求項２】
前記イソキノリンアルカロイド誘導体はサルソリノールである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記イソキノリンアルカロイド誘導体はレチクリンである、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化するための医薬を製造するためのイソキノリンアルカロイド誘導体の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
イソキノリンアルカロイド誘導体は天然の植物および動物に存在する窒素含有有機化合物の群である。それらのほとんどは、環内にそれらの窒素原子が組み込まれている複合環構造を有する。サルソリノールおよびレチクリンを含む、そのようなイソキノリンアルカロイド誘導体は有意な生物活性を有する。サルソリノールは主に血圧の調節のために使用されることが知られており、一方、レチクリンは主にマラリアを治療するための活性成分として、また、鎮痛剤における成分として使用される。
【０００３】
ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）は細胞の代謝またはエネルギーセンサーであり、それはＡＭＰと結合でき、ＡＭＰを介してＡＴＰの生成と消費の間のバランスを維持でき、それによってエネルギー代謝のバランスを維持することを特徴とする。その一方でＡＭＰＫはまた、細胞成長および増殖も調節でき、細胞極性を確立し、安定化させ、動物の寿命を調節し、生理的リズムを調節する。最近、ＡＭＰＫ活性化を標的とすることが医薬開発の重要な点の１つになっている。したがって、医薬品業界は新規ＡＭＰＫ活性化因子の開発を積極的に追い求めている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
予想外に、サルソリノールおよびレチクリンなどの特定のイソキノリンアルカロイド誘導体がＡＭＰＫの活性化における新規用途を有することが本発明において見出された。
【０００５】
一態様において、本発明は、ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化するための医薬を製造するためのイソキノリンアルカロイド誘導体の使用であって、イソキノリンアルカロイド誘導体は、一般式Ｉ：
【化１】
0006386590.tif 000002
（式中、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は各々独立して、Ｈ、アルキルまたはアシル（ＲａＣＯ）基であり、Ｒ３はアルキルまたは置換ベンジル基であり、ＲａはＨまたはアルキル基である）
を有する、使用を提供する。
【０００６】
本発明の一実施形態において、前記置換ベンジル基は以下の式ＩＩ：
【化２】
0006386590.tif 000003
（式中、ＸおよびＹは各々独立して、Ｈ、ＯＨ、メトキシ（ＯＭｅ）またはアシルオキシ（ＲａＣＯ−Ｏ−）基であり、ここでＲａはＨまたはアルキル基である）
を有する。
【０００７】
本発明の一例において、式Ｉを有する前記イソキノリンアルカロイド誘導体はサルソリノールである。
【０００８】
本発明の別の例において、式Ｉを有する前記イソキノリンアルカロイド誘導体はレチクリンである。
【０００９】
別の態様において、本発明は、血糖を減少させるための医薬を製造するための本発明による式Ｉを有するイソキノリンアルカロイド誘導体の使用を提供する。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、糖尿病を治療するための医薬を製造するための本発明による式Ｉを有するイソキノリンアルカロイド誘導体の使用を提供する。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、ＡＭＰＫ関連疾患を治療するための医薬を製造するための本発明による式Ｉを有するイソキノリンアルカロイド誘導体の使用であって、その治療は、その医薬によるＡＭＰＫの活性化により達成され、前記ＡＭＰＫ関連疾患は、がん、心血管疾患、および代謝性疾患からなる群から選択される、使用を提供する。本発明の式Ｉを有する化合物はまた、抗炎症効果を有するか、または創傷治癒を促進する。
【００１２】
本発明のこれらおよび他の態様は、好ましい実施形態の以下の説明および図面によってさらに分類することができる。本明細書において変更または修飾が存在してもよいが、それらは本発明に開示される新規概念の精神および範囲に背かないだろう。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態を示す図面は本発明を例示することを目的とする。本発明は示される好ましい実施形態に限定されないことは理解されるべきである。図面および実施例におけるデータは、対応のあるｔ検定（ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）によって決定される、平均±標準偏差（ＳＤ）として示される。有意差は以下のように示される：＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＃：Ｐ＝０．０６７。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＡＭＰＫリン酸化に対するサルソリノールの影響を示し、様々な濃度（１、３および１０μＭ）のサルソリノールを用いてＡＭＰＫ活性試験をＣ２Ｃ１２細胞で行った。
【図２】ＡＭＰＫリン酸化に対するレチクリンの影響を示し、様々な濃度（１、３および１０μＭ）のレチクリンを用いてＡＭＰＫ活性試験をＣ２Ｃ１２細胞で行った。
【図３】血糖の急速な減少に対するサルソリノールの影響を示す。ＩＣＲマウスの各々に２週間、高脂質食餌および高フルクトースシロップを与えた。次いで、サルソリノール（１０ｍｇ／Ｋｇ／日）およびグリベンクラミド（１０ｍｇ／Ｋｇ）を１日目に投与した。３０分後、グルコース（１ｇ／Ｋｇ）を経口投与し、その後すぐに血液をマウスから採取した（この時点を０分と指定した）。血液をまた、３０、６０、９０、１２０および１５０分後に採取し、血清中の血糖値を測定した。
【図４】血糖の長期の減少に対するサルソリノールの影響を示す。ＩＣＲマウスの各々に２週間、高脂質食餌および高フルクトースシロップを与え、次いでサルソリノール（１０ｍｇ／Ｋｇ／日）およびグリベンクラミド（１０ｍｇ／Ｋｇ）を１４日連続で投与した。その後、サルソリノール（１０ｍｇ／Ｋｇ／日）およびグリベンクラミド（１０ｍｇ／Ｋｇ）を再び投与し、グルコース（１ｇ／Ｋｇ）を３０分後に経口投与し、その後すぐに血液をマウスから採取した（この時点を０分と指定した）。血液をまた、３０、６０、９０、１２０および１５０分後に採取し、血清中の血糖値を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
他に定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００１６】
本明細書に明確に指定されない限り、冠詞「１つの（ａ、ａｎ）」および「前記」の全ての意味は、「１つより多い」複数形を含む。したがって、例えば、「成分」という用語が使用される場合、それは複数の前記成分および前記分野の当業者に知られている等価物を含む。
【００１７】
本明細書に使用される場合、「活性化すること」または「活性化」という用語は、分子を活性にするか、または分子を機能もしくは作用させる働きを指す。本発明において、活性化は、化合物が対象においてＡＭＰＫを機能させることを意味する。
【００１８】
本明細書に使用される場合、「置換された」または「置換」という用語は、化合物における官能基が別の基と置き換えられることを指す。
【００１９】
本明細書に使用される場合、「対象」という用語は、患者、ペット（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）または実験動物（例えば、ラット、マウス、ウサギなど）などのヒトまたは哺乳動物を指す。
【００２０】
本明細書に使用される場合、「ＡＭＰＫ」という用語は、ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの略語であり、多くの生物学的プロセスにおいて主要な調節因子である、細胞内のエネルギー代謝を調節するプロテインキナーゼの種類を指す。ＡＭＰＫのシグナル伝達経路はグルコースおよび脂質の代謝を含み、関連遺伝子およびタンパク質の発現に影響を及ぼす。ＡＭＰＫがリン酸化される場合、その活性は増加し、ＡＭＰＫシグナル伝達経路における下流のタンパク質がさらに調節され、それによって肝臓、骨格筋、心臓、脂質組織および膵臓における代謝が調節される。したがって、ＡＭＰＫ活性化における医薬の効果は、代謝性疾患（糖尿病など）、がん、および心血管疾患（アテローム性動脈硬化症および虚血性心疾患など）などの多くの疾患の治療において潜在的に有効であり得る。それらはまた、抗炎症または創傷治癒を促進するために使用できる。血管内皮細胞における抗炎症活性を含むＡＭＰＫ活性化因子の作用様式はいくつかの前臨床および臨床所見において確立されており、したがってＡＭＰＫはまた、心血管および代謝性疾患の治療における薬物標的とみなされる。
【００２１】
本明細書に使用される「アルキル基」という用語は、１〜１０個の炭素を有するアルキル基、好ましくは１〜６個の炭素を有するアルキル基、より好ましくは１〜３個の炭素を有するアルキル基などの、１〜２０個の炭素原子を含有する直鎖または分枝一価炭化水素を指す。アルキル基の例としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔ−ブチルが挙げられる。
【００２２】
本発明は、ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化するための医薬を製造するためのイソキノリンアルカロイド誘導体の使用であって、イソキノリンアルカロイド誘導体は、一般式Ｉ：
【化３】
0006386590.tif 000004
（式中、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は各々独立して、Ｈ、アルキルまたはアシル（ＲａＣＯ）基であり、Ｒ３はアルキルまたは置換ベンジル基であり、ここでＲａはＨまたはアルキル基である）
を有する、使用を提供する。
【００２３】
本発明の特定の例において、前記置換ベンジル基は、以下の式ＩＩ：
【化４】
0006386590.tif 000005
（式中、ＸおよびＹは各々独立して、Ｈ、ＯＨ、メトキシ（ＯＭｅ）またはアシルオキシ（ＲａＣＯ−Ｏ−）基であり、ここでＲａはＨまたはアルキル基である）
を有する。
【００２４】
本発明の実施形態において、イソキノリンアルカロイド誘導体はサルソリノールであり、それは一般式Ｉ（式中、Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝ＨおよびＲ３＝Ｍｅ（メチル）である）を有する。サルソリノールは以下の式：
【化５】
0006386590.tif 000006
を有する。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、イソキノリンアルカロイド誘導体はレチクリンであり、それは一般式Ｉ（式中、Ｒ＝Ｒ２＝Ｍｅ（メチル）、Ｒ１＝Ｈである）を有し、Ｒ３は式ＩＩ（式中、Ｘ＝ＯＨであり、Ｙ＝ＯＭｅである）の置換ベンジル基である。レチクリンは以下の式：
【化６】
0006386590.tif 000007
を有する。
【００２６】
本発明の実施例に示されるように、サルソリノールおよびレチクリンなどの本発明の式Ｉを有するイソキノリンアルカロイド誘導体はＡＭＰＫを活性化する効果を有し、さらに血糖を減少させる効果を有することが実証されているので、糖尿病を治療するために使用できる。
【００２７】
したがって、本発明はまた、血糖を減少させるための医薬を製造するための本発明の式Ｉを有するイソキノリンアルカロイド誘導体の使用を提供する。一実施形態において、式Ｉを有するイソキノリンアルカロイド誘導体はサルソリノールまたはレチクリンである。
【００２８】
さらに、本発明の式Ｉを有するイソキノリンアルカロイド誘導体は治療の効果を達成するようにＡＭＰＫ活性化に効果的であるので、例えば、がん、心血管疾患、および代謝性疾患を含む、ＡＭＰＫ関連疾患の治療に有用である。さらに、抗炎症効果を有するか、または創傷治癒を促進することも考慮される。
【００２９】
本発明によれば、式Ｉを有する前記イソキノリンアルカロイド誘導体は、周知であるか、または製薬分野において一般に使用される任意の形態の医薬に製剤化され得、製薬分野において周知の任意に技術に従って、一般に使用される担体または薬学的に許容可能な担体と共に治療有効量の前記化合物を含む、組成物に調製され得る。
【００３０】
本明細書に使用される「担体」または「薬学的に許容可能な担体」という用語は、限定されないが、製薬分野において当業者に周知のものを含む、薬学的に許容可能な賦形剤、充填剤、希釈剤などを含む。
【００３１】
本発明を本発明の上記の説明および以下の実施例において例示しており、それらは本発明の範囲を限定するために使用されるべきではない。
【実施例】
【００３２】
実施例１：本発明の式Ｉを有するイソキノリンアルカロイド誘導体の調製
ドーパミン（１．６ｇ）、１０ｍＬのメタノール、１ｍＬの１Ｎ塩酸、および２ｍＬの９９％アセトアルデヒドを５０ｍＬの丸底フラスコに連続して加え、室温下で６時間撹拌した。減圧濃縮によって得た濃縮物をＬｏｂａｒ  ＲＰ−１８カラム（サイズＢ、Ｍｅｒｃｋ）に充填し、０．０５％ギ酸水溶液によって溶出して、１Ｈ  ＮＭＲにより本質的に純粋なサルソリノール（１．０ｇ）を得た。
【００３３】
分光分析に基づいて、サルソリノールの１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ分光データならびにＥＳＩＭＳデータは以下の通りである：
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ６．６３（１Ｈ，ｓ），６．５７（１Ｈ，ｓ），４．３０（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−１），３．４０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１２．６，５．６Ｈｚ，Ｈａ−３），３．２０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．６，８．２，５．６Ｈｚ，Ｈｂ−３），２．９２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１６．８，８．２，５．８Ｈｚ，Ｈａ−４），２．８０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１６．８，５．６Ｈｚ，Ｈｂ−４），１．５５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｍｅ−１）；ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ１８０（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００３４】
レチクリンは、公知の方法（Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔａｉｐ．１９９２、３９、１８９−１９４）に従って、コニシダモ（Ｋｏｎｉｓｈｉ’ｓ  Ｎｅｗｌｉｔｓｅ）（Ｎｅｏｌｉｔｓｅａ  ｋｏｎｉｓｈｉｉ（Ｈ．）Ｋ．＆Ｓ．）の木の部分、クスノキ（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）科の植物から単離できる。
【００３５】
実施例２：ＡＭＰＫ活性化におけるサルソリノールおよびレチクリンの効果の評価
Ｃ２Ｃ１２骨格筋芽細胞株は、Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｓｉｎｃｈｕ、台湾）から購入した。Ｃ２Ｃ１２細胞株は、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２、および３７℃下で細胞インキュベーター内で成体のＣ３Ｈマウスの肢骨格筋を培養することによって得た細胞株であった。細胞は、４．５ｍｇ／ｍＬのグルコース、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、および抗生物質溶液（ペニシリン＝１００ＩＵ／ｍＬおよびストレプトマイシン＝１００μｇ／ｍＬの最終濃度を有する）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養した。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を増殖させてペトリ皿の１０分の７の面積を覆うと、ウシ胎仔血清を２％のウマ血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と置き換えて、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を誘導させて多核筋細胞にした。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は４日で筋細胞に分化し、実験の２４時間前に細胞の培養培地を無血清ＤＭＥＭと置き換えて細胞の代謝を減少させた。
【００３６】
Ｃ２Ｃ１２筋細胞を５および１５分間、１μＭ、３μＭおよび１０μＭのサルソリノールおよびレチクリンのそれぞれで処理した。次いでＣ２Ｃ１２筋細胞をＰＢＳ緩衝溶液でリンスし、プロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝溶液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のＮＰ−４０、および１００Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル）を細胞に加えた。細胞を回収し、氷上で遠心分離した。次いで、上清試料の濃縮物を同様に調製した。
【００３７】
上清試料を８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて垂直電気泳動分離に通し、分離したタンパク質をＰＶＤＦブロッティング膜に移した。ブロッティングが完了した後、ＰＶＤＦブロッティング膜を除去し、５％の無脂肪乳を有するＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）のブロッキングバッファーを用いて室温下で１時間ブロックした。次いで、ＰＶＤＦブロッティング膜を、５％のＢＳＡならびに一次モノクローナル抗体ホスホ−ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（１：１０００）およびＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（１：１０００）のそれぞれを含有するＴＢＳＴ溶液中に入れ、一次免疫ブロッティング反応を４℃下で実施した。次いで、ＰＶＤＦブロッティング膜をＴＢＳＴで３回リンスし、二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）（１：１００００）を含有するＴＢＳＴ溶液を加えて室温下で１時間、二次反応を実施した。最後に、膜をＴＢＳＴで３回リンスし、その後、ＥＣＬ（増強した化学発光）を加えると色を示した。
【００３８】
結果
図１に示されるように、Ｃ２Ｃ１２細胞を１０μＭのサルソリノールで５分間処理した後、これらの細胞におけるＡＭＰＫリン酸化は対照細胞のものの１．６６倍に増加した。このことは、サルソリノールがＡＭＰＫ活性化において優れた効果を有することを示す。
【００３９】
さらに、図２に示されるように、Ｃ２Ｃ１２細胞を３μＭおよび１０μＭのレチクリンで５分間処理した後、これらの細胞におけるＡＭＰＫリン酸化はそれぞれ対照細胞のものの１．５２倍および２．０５倍に増加した。Ｃ２Ｃ１２細胞を１５分間処理した後、その細胞におけるＡＭＰＫリン酸化は対照細胞のものの１．０４倍および２．０７倍に増加した。これらのことは、レチクリンがＡＭＰＫ活性化において優れた効果を有することを示す。
【００４０】
実施例３：血糖減少におけるサルソリノールの効果の評価
経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を用いて血糖減少の効果を評価した。ＩＣＲマウスの各々に高脂肪食餌および高フルクトースシロップを２週間与え、次いでサルソリノール（１０ｍｇ／Ｋｇ／日）およびグリベンクラミド（１０ｍｇ／Ｋｇ）を１４日連続して投与した。動物実験のためにマウスを８つの群に分けた。１日目およびその後の１４連続日の投与後、マウスを個々に麻酔し、サルソリノール（１０ｍｇ／Ｋｇ／日）およびグリベンクラミド（１０ｍｇ／Ｋｇ）をそれぞれ与えた。３０分後、グルコース（１ｇ／Ｋｇ）を経口投与し、その後すぐに、血液をマウスから採取した（この時点を０分と指定した）。血液をまた、３０、６０、９０、１２０および１５０分後にも採取し、血清中の血糖値を遠心分離後に測定した。
【００４１】
結果
図３に示されるように、高糖高脂質食餌をマウスに与えることによって誘導されたＩＩ型糖尿病を有するマウスにおいて、サルソリノールは血糖の急速な減少に関してグリベンクラミドと同様の血糖減少効果を有する。図４に示されるように、サルソリノールはまた、長期の血糖の減少に関してグリベンクラミドと同様の血糖減少効果を有することがさらに見出された。
【００４２】
実施例の結果に基づいて、サルソリノールはＡＭＰＫ活性化において優れた効果を有することが理解され得る。さらに、サルソリノールはグリベンクラミドと同様の血糖減少効果を有する。しかしながら、グリベンクラミドはまた、インスリンの分泌にも影響を及ぼすが、グリベンクラミドと対照的に、サルソリノールはインスリン分泌に対してより低い作用を有する。レチクリンもまた、ＡＭＰＫ活性化において優れた効果を有する。１０μＭのレチクリンでさえ、かなり良好な効果を提供する。
【図１】
0006386590.tif 000008
【図２】
0006386590.tif 000009
【図３】
0006386590.tif 000010
【図４】
0006386590.tif 000011