(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール１０（ＦＮＩＩＩ  １０）を含む修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、前記ＦＮＩＩＩ  １０が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフ及びジスルフィド結合を形成するための２個のＣｙｓ置換を含み、前記Ｃｙｓ置換の一方が前記ＲＧＤモチーフのＮ末端側にあり、前記Ｃｙｓ置換のもう一方が前記ＲＧＤモチーフのＣ末端側にあり、前記ＦＮＩＩＩ  １０が、配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記２個のＣｙｓ置換が６〜９個のアミノ酸残基によって隔てられている、ポリペプチドであり、
前記ポリペプチドが、インテグリンα５β１又はインテグリンαｖβ３活性を阻害し、インテグリンαＩＩｂβ３活性を阻害しないポリペプチド。
【請求項２】
前記２個のＣｙｓ置換が７又は８個のアミノ酸残基によって隔てられている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＦＮＩＩＩ  １０が、アミノ酸１４９１、１４９２、１４９６、１４９７、又は１４９８位に少なくとも１個のアミノ酸置換を更に含み、前記１４９１位におけるアミノ酸置換がＡｒｇ又はＩｌｅであり、前記１４９２位におけるアミノ酸置換がＡｌａ又はＰｒｏであり、前記１４９６位におけるアミノ酸置換がＭｅｔ、Ａｓｎ、又はＴｒｐであり前記１４９７位におけるアミノ酸置換がＡｓｎであり、前記１４９８位におけるアミノ酸置換がＡｓｐ又はＧｌｕである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記２個のＣｙｓ置換が、アミノ酸１４９１位におけるＴｈｒからＣｙｓへの置換及びアミノ酸１４９９位におけるＳｅｒからＣｙｓへの置換であり、前記ＦＮＩＩＩ  １０が、式Ｃｙｓ1491−Ｘ1−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｃｙｓ1499
（式中、
Ｘ1は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、又はＰｒｏであり；
Ｘ2は、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、又はＴｒｐであり；
Ｘ3は、Ｐｒｏ又はＡｓｎであり；
Ｘ4は、Ａｌａ、Ａｓｐ、又はＧｌｕである）
を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｘ1がＰｒｏであり、Ｘ2がＭｅｔであり、Ｘ3がＰｒｏであり、Ｘ4がＡｓｐである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントが、アミノ酸１４０８位におけるＬｅｕからＰｒｏへの置換を含んでもよいヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール９（ＦＮＩＩＩ  ９）を更に含み、前記ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０（ＦＮＩＩＩ  ９−１０）が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、又は配列番号２６のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが配列番号２０のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがインテグリンαｖβ３活性を阻害する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントが、アミノ酸１４０８位におけるＬｅｕからＰｒｏへの置換を含んでいてもよいヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール９（ＦＮＩＩＩ  ９）を更に含み、前記ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０（ＦＮＩＩＩ  ９−１０）が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記２個のＣｙｓ置換が、アミノ酸１４９０位におけるＶａｌからＣｙｓへの置換及びアミノ酸１４９９位におけるＳｅｒからＣｙｓへの置換であり、前記ＦＮＩＩＩ  １０が、式Ｃｙｓ1490−Ｘ1−Ｘ2−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｘ3−Ｐｒｏ−Ｘ4−Ｃｙｓ1499（式中、
Ｘ1は、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、又はＩｌｅであり；
Ｘ2は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、又はＰｒｏであり；
Ｘ3は、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、又はＡｓｎであり；
Ｘ4は、Ａｌａ又はＡｓｐである）を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号１０８、配列番号１０９、又は配列番号１１０のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
Ｘ1がＡｒｇであり、Ｘ2がＡｌａであり、Ｘ3がＡｓｎであり、Ｘ4がＡｓｐである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが配列番号３２のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドがインテグリンα５β１活性を阻害する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール９（ＦＮＩＩＩ  ９）が、アミノ酸１３４１位におけるＡｓｎからＡｌａへの置換、アミノ酸１３７７位におけるＨｉｓからＰｒｏへの置換、アミノ酸１３７６位におけるＰｒｏからＬｙｓへの置換、又はアミノ酸１３７６位におけるＰｒｏからＡｓｐへの置換を含んでもよい、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、又は配列番号１１４のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドがインテグリンα５β１活性を阻害する、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
治療有効量の請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチドと薬学的に許容される補形剤、希釈剤、又はキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項２２】
哺乳動物において腫瘍の進行を阻害するための、請求項２１に記載の医薬組成物であって、前記腫瘍細胞がαｖβ３又はα５β１を発現するものである、医薬組成物。
【請求項２３】
前記腫瘍が、肺癌、乳房腫瘍、結腸腫瘍、骨肉腫、膵腫瘍、卵巣腫瘍、頸部腫瘍、膠芽腫、前立腺腫瘍、肝腫瘍、又は黒色腫である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
哺乳動物の血管新生関連疾患を阻害するための、請求項２１に記載の医薬組成物であって、前記血管新生関連疾患が、癌、黄斑変性、浮腫、又は関節炎である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は広義には細胞生物学、具体的には、細胞外マトリックスタンパク質とインテグリンの機能及び相互作用に関する。より具体的には、本発明は、インテグリンの特異的アンタゴニストとしての、特にインテグリンα５β１及びインテグリンαｖβ３の特異的アンタゴニストとしてのヒトフィブロネクチンのフラグメント及び／又はそのバリアントに関する。本明細書と一緒に提出された配列テキストファイルの全体を参照により援用する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、細胞−マトリックス間及び細胞間の相互作用を仲介する糖タンパク質膜受容体のファミリーである。インテグリンはα及びβサブユニットからなるヘテロ二量体である。今日まで、１８個のαサブユニット及び８個のβサブユニットを含む少なくとも２４個の別個のインテグリンヘテロ二量体が報告されている。インテグリンは、種々の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質との特異的相互作用を介して細胞の固定（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）及び遊走を仲介する。更に、細胞の生存、分裂、及び分化も、細胞とＥＣＭとの有効な会合に依存している（Morgan et al. 2009, IUBMB Life, 61:731-38）。
【０００３】
インテグリンα５β１及びαｖβ３は培養細胞の接着接触部に局在する。インテグリン−ＥＣＭ複合体は、固定及び遊走に必要な細胞間相互作用及び細胞−マトリックス相互作用を持続させる役割を果たすだけでなく、細胞−ＥＣＭ複合体の形成は更に、細胞内部の動的複合体中に酵素及びアダプターをリクルートすることによりインテグリン仲介細胞内シグナル伝達の引き金を引く。インテグリンの下流の細胞内シグナルは、遺伝子発現、細胞生存、分化、及び増殖に影響を与え得る。インテグリンは、血管新生及び腫瘍進行等の多くの病態に関連付けられている。
【０００４】
複数のインテグリンが、フィブロネクチン中に存在するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフを介してフィブロネクチンと相互作用することが知られている。これらのインテグリンには、５個のαｖインテグリン（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、及びαｖβ８）及び２個のβ１インテグリン（α５β１及びα８β１）が含まれる（Smith, W., 2008, J. Allergy Clin. Immunol. 121 :S375-S379）。フィブロネクチンは、インテグリン及び他の細胞外マトリックスタンパク質に結合する、細胞外マトリックスの高分子量（約４４０ｋＤａ）糖タンパク質である。フィブロネクチンは、Ｃ末端のジスルフィド結合によって連結された２個の単量体の二量体として存在する。各フィブロネクチン単量体の分子量は、Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ型の３つのドメインを含む２３０〜２５０ｋＤａである。Ｉ及びＩＩ型ドメインは、鎖内ジスルフィド結合によって安定化されており、一方、ＩＩＩ型ドメインはジスルフィド結合を含まない。ジスルフィド結合がないため、ＦＮのＩＩＩ型ドメインの構造中に柔軟性が生じ得る。
【０００５】
各ドメインは、フィブロネクチン単量体の全長に沿って機能的なタンパク質結合性領域を形成するように組織された複数のモジュールを含む。例えば、Ｉ型ドメイン中のモジュールは、フィブロネクチンマトリックスの組み立ての開始に必要であり、Ｉ型及びＩＩＩ型の両方のドメイン中のモジュールは、他のフィブロネクチン分子との会合に重要である。ＲＧＤモチーフはＩＩＩ型ドメインのモジュール１０（ＦＮＩＩＩ  １０）中に位置し、インテグリンα５β１及びαｖβ３へのフィブロネクチンの結合部位を構成する。ＩＩＩ型ドメインモジュール９（ＦＮＩＩＩ  ９）中の配列、特にＰＨＳＲＮシナジーループは、インテグリンα５β１へのフィブロネクチンの結合を容易化する。フィブロネクチンのインテグリンαｖβ３への結合はモジュール９の相乗効果を必要としない。
【０００６】
インテグリンは種々の細胞機能の制御において役割を果たすので、疾患の処置にインテグリンアンタゴニストが用いられる可能性が研究されてきた。例えば、血小板凝集を活性化するインテグリンであるインテグリンαＩＩｂβ３のアンタゴニストが、血栓症関連虚血血管性疾患を処置するための抗凝固薬として実験された（Coller et al., 2008, Blood, 112:3011-25）。ディスインテグリン、例えばロドストミン（Ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）は、インテグリンによって仲介される血小板凝集及び細胞接着を阻害するヘビ毒中に天然に見出される小タンパク質インテグリンアンタゴニストのファミリーである。しかし、ディスインテグリンは、非特異的であり、免疫原性が高い。これは、細胞表面でβ１及びβ３含有インテグリンへの結合についてフィブロネクチンと競合し、インテグリンα５β１、αｖβ３、及びインテグリンαＩＩｂβ３に対する活性を区別せずに阻害する。したがって、インテグリンα５β１及びαｖβ３のアンタゴニストとしてのディスインテグリンの使用は、血小板凝集及び血液凝固を防ぐαＩＩｂβ３のアンタゴニスト活性のため、出血のリスクが高い。
【０００７】
同様に、エルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）タンパク質インベイシンはインテグリン結合タンパク質である。細菌インベイシンタンパク質は、インテグリンに結合することにより細胞への細菌の移入を容易化する。細菌タンパク質は免疫原性が高い可能性があり、インベイシンタンパク質の特異性は決定されていないので、インテグリンアンタゴニストとしてのインベイシンの使用には問題がある。
【０００８】
高濃度で、ＦＮＩＩＩ  ９−１０は全長フィブロネクチン分子の生物学的活性をある程度模倣する（van der Walle et al., 2002, Protein Engineering 15: 1021-24）。ＦＮＩＩＩ９−１０は、インテグリンとの結合について、他のＥＣＭタンパク質と競合する。インテグリンとの結合ドメインを含むこのような切断型フィブロネクチン分子又はフラグメント（例えばＦＮＩＩＩ  １０又はＦＮＩＩＩ  ９−１０）は、ディスティンテグリンと比べてヒト中で免疫原性がより低く、特異性がより高いので、出血を生じさせない。しかし、インテグリンアンタゴニストとして切断型フィブロネクチンを用いる場合には問題がある。問題の１つは、安定性及び溶解性である。ヒトＦＮＩＩＩ  ９又はＦＮＩＩＩ  ９−１０は単独では構造的に不安定である（上記のvan der Walle参照）。更に、高濃度のＦＮＩＩＩ  ９−１０は不溶性であり、これは大規模での調製及び製造にとって大きな問題となる。したがって、免疫原性が低く、特異性が高く、安定性及び溶解性が増強された、より良くデザインされたインテグリンアンタゴニストが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、とりわけ、先行技術中に見られる制限事項によって妨げられない、インテグリンアンタゴニスト及びその使用を提供する。
【００１０】
予想されていなかったことに、本発明者らは、本明細書に開示されている変異体又は修飾ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）フラグメントがインテグリンアンタゴニスト活性を示すことを見出した。更に、本明細書に開示のＦＮＩＩＩ  １０又はＦＮＩＩＩ  ９−１０変異体又はバリアントは、野生型配列を有するＦＮフラグメントと比べて溶解度及び安定性の増大を示した。
【００１１】
ヒトＦＮでは、大きく秩序が乱れた可動性（ｍｏｂｉｌｅ）のＩＩＩ型ドメイン１０のループ中にＲＧＤモチーフが位置し、おそらく柔軟性がその機能に重要である。本発明者らは、予期されなかったことに、設計された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ジスルフィド結合をＦＮＩＩＩ  １０内に導入することによるドメイン内の堅さ（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）が、
増大された溶解性及び安定性を付与し且つ／又はインテグリンα５β１及び／若しくはインテグリンαｖβ３に対するアンタゴニスト活性を維持若しくは向上させることを見出した。特定の具体的な実施形態では、本発明のＦＮＩＩＩフラグメントは、ｐＨ７．０の溶液中で少なくとも約２０〜約２４ｍｇ／ｍｌの溶解度を示す。他の特定の具体的な実施形態では、本発明のＦＮＩＩＩフラグメントは少なくとも約７〜約２７ｍｇ／ｍｌの溶解度を示す。特定の具体的な実施形態では、この溶解度は遊離アミノ酸Ａｒｇ及びＧｌｕの非存在下で達成される。別の特定の実施形態では、本発明のＦＮＩＩＩフラグメントは、野生型ヒト配列を有するＦＮＩＩＩフラグメントと比べて、約１０〜約３００％、特に約２０〜約２８０％、２５〜約２５０％、３０〜約２００％、２０〜約１５０％の溶解度の増大を示す。
【００１２】
モジュール９は、インテグリンαｖβ３への結合には必要でないが、インテグリンα５β１への結合を相乗的に増強すると考えられている。本発明者らは、驚くべきことに、ＦＮＩＩＩ  ９の存在下で、ＲＧＤモチーフに隣接する２個のＣｙｓ置換（例えば式Ｃｙｓ−Ｘ8−Ｃｙｓを含み、更なる例としては式Ｃｙｓ1490Ｘ2ＲＧＤＸ3Ｃｙｓ1499を含む）によってモジュール１０中に導入されたジスルフィド結合により、ＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの溶解度及び安定性を向上させることができ、それらのインテグリンα５β１アンタゴニスト活性を増大させることができることを発見した。更に、本発明者らは、予想されていなかったことに、ＲＧＤモチーフに隣接するＦＮＩＩＩモジュール１０中の設計されたジスルフィド結合（例えば、式Ｃｙｓ−Ｘ7−Ｃｙｓを含み、更なる例では式Ｃｙｓ1491ＸＲＧＤＸ3Ｃｙｓ1499を含む）により、ＦＮＩＩＩ  １０バリアントの溶解度及び安定性並びにインテグリンαｖβ３に対するそれらのアンタゴニスト活性を向上させることができることを発見した。更に、本発明者らは、驚くべきことに、ＦＮＩＩＩ  ９−１０との関連で、例えば式Ｃｙｓ−Ｘ7−Ｃｙｓを含む、更なる例としてはＣｙｓ1491ＸＲＧＤＸ3Ｃｙｓ1499を含む、Ｃｙｓ置換を有するバリアントが、インテグリンα５β１ではなくインテグリンαｖβ３に対する結合特異性を示すことを見出した。
【００１３】
したがって、一態様では、本発明は、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール１０（ＦＮＩＩＩ  １０）を含む修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、ＦＮＩＩＩ  １０が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフと、ジスルフィド結合を形成するための２個のＣｙｓ置換とを含み、一方のＣｙｓ置換が、ＲＧＤモチーフのＮ末端側であり、他方のＣｙｓ置換がＲＧＤモチーフのＣ末端側であり、ＦＮＩＩＩ  １０が、配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、インテグリンα５β１又はインテグリンαｖβ３の活性を阻害するか阻害可能であり、インテグリンαＩＩｂβ３活性は阻害しない。本願中、修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントは、ヒトフィブロネクチンのその他のモジュール及び／又はドメインを更に含んでもよい。特定の実施形態では、修飾ヒトフィブロネクチンは、ＩＩＩ型ドメインモジュール９を更に含み、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール９及び１０（ＦＮＩＩＩ  ９−１０）は、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、ＦＮＩＩＩ  ９−１０は、モジュール９中のアミノ酸１４０８位にＬｅｕからＰｒｏへの置換を更に含んでよい。
【００１４】
特定の実施形態では、２個のＣｙｓ置換は、ＲＧＤモチーフに隣接する約６〜約９アミノ酸残基によって隔てられている。別の特定の実施形態では、２個のＣｙｓ置換は７又は８アミノ酸残基で隔てられている。特定の実施形態では、２個のＣｙｓ置換は、アミノ酸１４８７〜１５０１位の中に位置する。別の特定の実施形態では、ＦＮＩＩＩ  １０は、アミノ酸１４９１、１４９２、１４９６、１４９７、又は１４９８位に少なくとも１個のアミノ酸置換を更に含み、１４９１位におけるアミノ酸置換はＡｒｇ又はＩｌｅであり、
１４９２位におけるアミノ酸置換はＡｌａ又はＰｒｏであり、１４９６位におけるアミノ酸置換はＭｅｔ、Ａｓｎ、又はＴｒｐであり、１４９７位におけるアミノ酸置換はＡｓｎであり、１４９８位におけるアミノ酸置換はＡｓｐ又はＧｌｕである。本願中で用いられるアミノ酸のナンバリングは、全長ヒトフィブロネクチンタンパク質（配列番号７４）のアミノ酸ナンバリングに基づく。例えば、配列番号７４の配列に基づくアミノ酸１４９１位のＴｈｒ残基は、配列番号２に示されるＦＮＩＩＩ  １０のアミノ酸７６位のＴｈｒ残基を指す。
【００１５】
特定の具体的な実施形態では、Ｃｙｓ置換は、アミノ酸１４９１位におけるＴｈｒからＣｙｓへの置換（Ｔ１４９１Ｃ）及びアミノ酸１４９９位におけるＳｅｒからＣｙｓへの置換（Ｓ１４９９Ｃ）である。特定の実施形態では、ＦＮＩＩＩ  １０は、式Ｃ1491Ｘ1(n)ＲＧＤＸ2(n)Ｃ1499を含み、前記ｎは、１、２、又は３であり、Ｘ1及びＸ2は、同じ又は異なるアミノ酸残基を表し得る。特定の具体的な実施形態では、ＦＮＩＩＩ  １０は、式Ｃ1491Ｘ1(1)ＲＧＤＸ2(3)Ｃ1499を含む。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドはインテグリンαｖβ３活性を阻害する。
【００１６】
更に別の実施形態では、ＦＮＩＩＩ  １０は、式Ｃｙｓ1491−Ｘ1−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｃｙｓ1499を含み、式中、Ｘ1は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、又はＰｒｏであり；Ｘ2は、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、又はＴｒｐであり；Ｘ3は、Ｐｒｏ又はＡｓｎであり；Ｘ4は、Ａｌａ、Ａｓｐ、又はＧｌｕである。特定の具体的な実施形態では、Ｘ1はＰｒｏであり、Ｘ2はＭｅｔであり、Ｘ3はＰｒｏであり、Ｘ4はＡｓｐである。別の特定の具体的な実施形態では、Ｘ1はＰｒｏであり、Ｘ2はＴｒｐであり、Ｘ3はＡｓｎであり、Ｘ4はＧｌｕである。更に別の具体的な実施形態では、Ｘ1はＡｌａであり、Ｘ2はＡｓｎであり、Ｘ3はＰｒｏであり、Ｘ4はＡｓｐである。特定の具体的な実施形態では、Ｘ1はＧｌｙであり、Ｘ2はＳｅｒであり、Ｘ3はＰｒｏであり、Ｘ4はＡｌａである。別の特定の実施形態では、ポリペプチドは配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２のアミノ酸配列を有する。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列を有する。別の特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドは、インテグリンαｖβ３活性を選択的に阻害するか選択的に阻害可能である。
【００１７】
別の特定の実施形態では、修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントは、アミノ酸１４０８位にＬｅｕからＰｒｏへの置換を含んでもよいヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール９（ＦＮＩＩＩ  ９）を更に含み、ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０（ＦＮＩＩＩ  ９−１０）は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、又は配列番号２６のアミノ酸配列を有する。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドは配列番号２０のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
別の特定の実施形態では、Ｃｙｓ置換は、アミノ酸１４９０位におけるＶａｌからＣｙｓへの置換（Ｖ１４９０Ｃ）及びアミノ酸１４９９位におけるＳｅｒからＣｙｓへの置換（Ｓ１４９９Ｃ）であり、修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントは、アミノ酸１４０８位におけるＬｅｕからＰｒｏへの置換を更に含んでもよいヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール９を更に含んでもよい。特定の実施形態では、ＦＮＩＩＩ  １０は、式Ｃｙｓ1490−Ｘ1−Ｘ2−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｘ3−Ｐｒｏ−Ｘ4−Ｃｙｓ1499を含み、式中、Ｘ1は、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、又はＩｌｅであり；Ｘ2は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、又はＰｒｏであり；Ｘ3は、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、又はＡｓｎであり；Ｘ4は、Ａｌａ又はＡｓｐである。特定の具体的な実施形態では、Ｘ1はＡｒｇであり、Ｘ2はＡｌａであり、Ｘ3はＡｓｎであり、Ｘ4はＡｓｐである。別の特定の実施形態では、ポリペプチドは配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号１０８
、配列番号１０９、又は配列番号１１０のアミノ酸配列を有する。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドは配列番号３２、配列番号１０８、配列番号１０９、又は配列番号１１０のアミノ酸配列を有する。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドはインテグリンα５β１活性を選択的に阻害するか選択的に阻害可能である。特定の実施形態では、Ｃｙｓ置換は、アミノ酸１４９０位におけるＶａｌからＣｙｓへの置換（Ｖ１４９０Ｃ）及びアミノ酸１４９９位におけるＳｅｒからＣｙｓへの置換（Ｓ１４９９Ｃ）であり、修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントは、アミノ酸１４０８位におけるＬｅｕからＰｒｏへの置換及び場合により含まれてもよいアミノ酸１３４１位におけるＡｓｎからＡｌａへの置換、アミノ酸１３７７位におけるＨｉｓからＰｒｏへの置換、アミノ酸１３７６位におけるＰｒｏからＬｙｓへの置換、又はアミノ酸１３７６位におけるＰｒｏからＡｓｐへの置換を更に含んでもよいヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール９を更に含んでもよい。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、又は配列番号１１４のアミノ酸配列を有する。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドはインテグリンα５β１活性を選択的に阻害するか選択的に阻害可能である。
【００１９】
ＦＮＩＩＩ  ９−１０ドメイン間結合の柔軟性は、ヒトＦＮタンパク質の大規模なコンホメーション変化を可能にすると考えられてきた。ＦＮＩＩＩ  ９−１０接点のリンカーの延長によるＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０の部分的な構造的アンカップリングはモジュール９の相乗的結合を失わせた（Altroff et al., 2004, J Biological Chemistry, 279:55995-56003）。過去の結果は、モジュール９と１０の移行部にわたるジスルフィド結合によって導入されたドメイン間の堅さ（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）が、インテグリンα５β１への結合を介したＦＮＩＩＩ  ９−１０の相乗的細胞接着活性を消失させ、ＦＮＩＩＩ  ９非依存性のインテグリンαｖβ３結合への親和性を低減させることを示している（上記のAltroff et al．）。
【００２０】
しかし、本発明者らは、驚くべきことに、非共有結合によって作られたモジュール９と１０との間のドメイン間結合がインテグリンα５β１への結合親和性を維持していることを発見した。この非共有結合は、ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ１０に適切な配向を提供してインテグリンα５β１への結合を容易化することができる。
【００２１】
したがって、別の態様では、本発明は、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール９及びヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール１０（ＦＮＩＩＩ  ９−１０）を含む修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、ＦＮＩＩＩ  ９が、アミノ酸１４０８位におけるＬｅｕからＰｒｏへの置換を含んでもよく、ＦＮＩＩＩ  ９及び／又はＦＮＩＩＩ  １０が少なくとも１個のアミノ酸置換を含み、ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０中のアミノ酸残基が非共有結合を形成し、ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同であり且つ配列番号６４ではないアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドはインテグリンα５β１活性を阻害するか阻害可能である。
【００２２】
本発明のこの態様によれば、特定の実施形態で、ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０中のアミノ酸置換は、ドメイン間ジスルフィド結合を形成する。別の特定の実施形態では、ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０中のアミノ酸置換はドメイン間水素結合を形成する。特定の具体的な実施形態では、ＦＮＩＩＩ  ９中のアミノ酸置換は、アミノ酸１３４０位におけるＡｌａからＡｓｐへの置換（Ａ１３４０Ｄ）であり、ＦＮＩＩＩ  １０中のアミノ酸置換は、アミノ酸１４４２位におけるＶａｌからＬｙｓへの置換（Ｖ１４４２Ｋ）である（図４）。更なる特定の実施形態では、ポリペプチドは配列番号４０のアミノ酸配列を有する。別の特定の実施形態では、ＦＮＩＩＩ  １０中のアミノ酸置換は、アミノ
酸１４９１位におけるＴｈｒからＡｒｇへの置換（Ｔ１４９１Ｒ）である。特定の具体的な実施形態では、非共有結合ドメイン間結合は、アミノ酸１３４１位のＡｓｎと１４９１位のアミノ酸残基との間で形成される。更なる特定の実施形態では、ポリペプチドは配列番号７２のアミノ酸配列を有する。
【００２３】
更なる態様では、本発明は、式Ｖａｌ1490−Ｘ1−Ｘ2−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｓｅｒ1500（式中、Ｘ1は、Ｔｈｒ又はＡｒｇであり；Ｘ2は、Ａｌａ又はＰｒｏであり；Ｘ3は、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、又はＡｓｎであり；Ｘ4は、Ｐｒｏ又はＡｓｎであり；Ｘ5は、Ａｓｐ又はＧｌｕであり；Ｘ6は、Ｓｅｒ又はＧｌｙである）を含むヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール１０（ＦＮＩＩＩ  １０）を含む修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、修飾フィブロネクチンフラグメントが、配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同であり且つ配列番号５０ではないアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。特定の具体的な実施形態では、Ｘ1はＴｈｒであり；Ｘ2はＰｒｏであり；Ｘ3はＭｅｔであり；Ｘ4はＰｒｏであり；Ｘ5はＡｓｐであり；Ｘ6はＳｅｒである。別の特定の具体的な実施形態では、Ｘ1はＴｈｒであり；Ｘ2はＡｌａであり；Ｘ3はＡｓｎであり；Ｘ4はＰｒｏであり；Ｘ5はＡｓｐであり；Ｘ6はＳｅｒである。更なる実施形態では、Ｘ1はＡｒｇであり；Ｘ2はＡｌａであり；Ｘ3はＡｓｎであり；Ｘ4はＰｒｏであり；Ｘ5はＡｓｐであり；Ｘ6はＳｅｒである。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドはインテグリンα５β１活性及び／又はインテグリンαｖβ３活性を阻害するか阻害可能である。別の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４８、配列番号５２、又は配列番号５４のアミノ酸配列を有する。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドは配列番号４８のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
本発明のこの態様によれば、特定の実施形態で、修飾フィブロネクチンフラグメントは、アミノ酸１４０８位におけるＬｅｕからＰｒｏへの置換を含んでもよいヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール９（ＦＮＩＩＩ  ９）を更に含み、ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０（ＦＮＩＩＩ  ９−１０）は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を含む。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドは配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、又は配列番号６２のアミノ酸配列を有する。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドは配列番号６０又は配列番号６２のアミノ酸配列を有する。
【００２５】
本明細書に記載の全ての実施形態は、文脈から組み合せることができないことが明確でない限り、別の実施形態と組み合せることができる。例えば、ドメイン間ジスルフィド結合を含むＦＮＩＩＩ  ９−１０を含む修飾フィブロネクチンフラグメントは、ＦＮＩＩＩ
９とＦＮＩＩＩ  １０との間に設計されたドメイン間結合を更に含んでもよい。その他の組合せも本発明に包含されると理解される。
【００２６】
更なる態様では、本明細書に記載のポリペプチドを含む組成物が提供される。更に別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドと薬学的に許容される補形剤、希釈剤、又はキャリアとを含む医薬組成物を提供する。特定の具体的な実施形態では、医薬組成物は、前述の種々の態様に記載されたポリペプチドを治療有効量含む。
【００２７】
更なる態様では、本発明は、インテグリンが仲介する細胞の接着、成長、遊走、又は分化を阻害する方法であって、細胞を有効量の本発明のポリペプチドと接触させるステップを含み、インテグリンがαｖβ３及び／又はα５β１インテグリンを含む、方法を提供する。本発明のこれらの態様によれば、特定の実施形態で、インテグリンはインテグリンαｖβ３である。特定の更なる実施形態では、ポリペプチドは配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２０、配列番号４４、又は配列番号５６のアミノ酸配列を有する。
特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列を有する。別の更なる特定の実施形態では、インテグリンはインテグリンα５β１であり、ポリペプチドは配列番号２８、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、又は配列番号５８のアミノ酸配列を有する。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドは配列番号３２のアミノ酸配列を有する。
【００２８】
更に別の態様では、本発明は、哺乳動物においてインテグリンによって仲介される細胞の接着、成長、遊走、又は分化を阻害する方法であって、それを必要とする哺乳動物に本明細書に記載の発明的ポリペプチドを含む医薬組成物を投与するステップを含み、インテグリンがαｖβ３又はα５β１である、方法を提供する。更なる態様では、本発明は、哺乳動物の腫瘍成長、腫瘍進行、又は腫瘍転移を阻害又は処置する方法であって、本明細書に記載の発明的ポリペプチドを含む医薬組成物を哺乳動物に投与するステップを含み、腫瘍がαｖβ３又はα５β１を発現するものである、方法を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の本明細書に記載の発明的ポリペプチドを含む。これらの態様によれば、特定の実施形態で、インテグリンはインテグリンαｖβ３であり、ポリペプチドは配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２０、配列番号４８、又は配列番号５６のアミノ酸配列を有する。別の特定の実施形態では、インテグリンはインテグリンα５β１であり、ポリペプチドは配列番号２８、配列番号３２、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、又は配列番号７２のアミノ酸配列を有する。特定の具体的な実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００２９】
更なる別の態様では、本発明は、哺乳動物において血管新生関連疾患を阻害する方法であって、それを必要とする哺乳動物に本明細書に記載の発明的ポリペプチドを含む医薬組成物を投与することを含み、血管新生関連疾患が、癌、黄斑変性、浮腫、又は関節炎である方法を提供する。この態様によれば、特定の具体的な実施形態で、血管新生関連疾患は、インテグリンαｖβ３及び／又はα５β１に仲介される疾患を含み、別の特定の実施形態では、医薬組成物は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４８、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、又は配列番号７２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００３０】
更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載の発明的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、又は配列番号６１のヌクレオチド配列を含む。特定の具体的な実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４７、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、又は配列番号６１のヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載の発明的ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。更なる態様では、本発明は、（ａ）コードされたポリペプチドを発現ベクターから発現させるのに有効な条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養するステップ；及び（ｂ）培養物からポリペプチドを回収するステップを含む、ポリペプチドの製造方法を提供する。特定の具体的な実施形態では、単離されたポリペプチドはＡｒｇ及び／又はＧｌｕを含まないバッファー中に回収される。
【００３２】
以下の特定の好ましい実施形態のより具体的な説明及び請求項から本発明の具体的な実施形態が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】Ｔ１４９１Ｃ置換とＳ１４９９Ｃ置換との間のＲＧＤループ領域中に形成された設計されたドメイン内ジスルフィド結合を有する修飾ヒトＦＮＩＩＩ  １０の例を示す図である。
【図２】野生型ヒトＦＮＩＩＩ  ９−１０（配列番号４）と種々の哺乳動物種に由来するオルソログ：チンパンジー（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿００３３０９５０６）（配列番号６６）；雌ウシ（ＤＡＡ３２４５６）（配列番号６７）；イノシシ（Ｂｏａｒ）（ＸＰ＿００３１３３６９１）（配列番号６８）；マウス（ＢＡＥ２８０４０）（配列番号６９）；及びラット（ＥＤＬ７５２６２）（配列番号７０）とのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。「*」、同一；「：」、保存的置換；「．」、半保存的置換。
【図３Ａ】ＮＭＲ（図３Ａ）、示差走査熱量測定及び硫安沈殿（図３Ｂ、３Ｃ）により示される、野生型及び変異体ＦＮフラグメントの熱安定性及び溶解度を示す図である。
【図３Ｂ】ＮＭＲ（図３Ａ）、示差走査熱量測定及び硫安沈殿（図３Ｂ、３Ｃ）により示される、野生型及び変異体ＦＮフラグメントの熱安定性及び溶解度を示す図である。図３Ｂ中、ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ−中央のピーク、四角；ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＲＡＲＧＤＮＰＤ）−左ピーク、三角；ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）−右ピーク、円。
【図３Ｃ】ＮＭＲ（図３Ａ）、示差走査熱量測定及び硫安沈殿（図３Ｂ、３Ｃ）により示される、野生型及び変異体ＦＮフラグメントの熱安定性及び溶解度を示す図である。図３Ｃ中、ＦＮＩＩＩ  １０−中央のピーク、円；ＦＮＩＩＩ  １０（ＰＲＧＤＭＰＤ）タンパク質（配列番号４８）−左ピーク、四角；ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）タンパク質（配列番号６）−右ピーク、三角。
【図４】モジュール９中のＡ１３４０Ｄ置換とモジュール１０中のＶ１４２２Ｋ置換との間に形成される設計されたドメイン間水素結合を有する修飾ＦＮＩＩＩ  ９−１０の例を図解したである。
【図５Ａ】ＦＮＩＩＩ  ９とインテグリンα５サブユニットとの間の相互作用面を示すコンピューターに基づくモデルを示す図である（右パネル）。相互作用する可能性のある点が示されている。
【図５Ｂ】ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ−ＣＲＡ（配列番号３２）−インテグリン結合性複合体のコンピューターによるドッキングモデル及び計算されたドッキングエネルギーに基づくインテグリン結合選択性を示す図である。
【図６Ａ】Ｎｉ2+−キレートクロマトグラフィーによる種々のＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの精製結果を示す図である。溶出プロファイルを、Ａ２８０（吸光度）測定により（左）及び還元剤２−メルカプトエタノールの存在下又は非存在下で分子間Ｓ−Ｓ結合によって形成された単量体又は二量体の形態のＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントのＳＤＳゲル電気泳動のクーマシーブルー染色の画像により（右）分析した。
【図６Ｂ】Ｎｉ2+−キレートクロマトグラフィーによる種々のＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの精製結果を示す図である。溶出プロファイルを、Ａ２８０（吸光度）測定により（左）及び還元剤２−メルカプトエタノールの存在下又は非存在下で分子間Ｓ−Ｓ結合によって形成された単量体又は二量体の形態のＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントのＳＤＳゲル電気泳動のクーマシーブルー染色の画像により（右）分析した。
【図６Ｃ】Ｎｉ2+−キレートクロマトグラフィーによる種々のＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの精製結果を示す図である。溶出プロファイルを、Ａ２８０（吸光度）測定により（左）及び還元剤２−メルカプトエタノールの存在下又は非存在下で分子間Ｓ−Ｓ結合によって形成された単量体又は二量体の形態のＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントのＳＤＳゲル電気泳動のクーマシーブルー染色の画像により（右）分析した。
【図７Ａ】細胞遊走、細胞生存、及び細胞成長に対する種々のＦＮＩＩＩフラグメントの作用の結果を示す図である。図７Ａの左パネルは、Ａ５４９細胞遊走に対するＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）（配列番号３２）の阻害効果を要約した棒グラフを示しており、右パネルは、Ａ３７５細胞に対するＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）タンパク質（配列番号６）の阻害効果を要約した棒グラフを示している。図７Ｂは、Ａ３７５メラノーマ細胞において種々のＦＮＩＩＩバリアントによって誘導されるＧ１停止を示す棒グラフである。図７Ｃ及び７Ｄは、それぞれＡ３７５細胞及びＡ５４９細胞において種々のＦＮＩＩＩフラグメントによって誘導されるアポトーシスを示す棒グラフである。
【図７Ｂ】細胞遊走、細胞生存、及び細胞成長に対する種々のＦＮＩＩＩフラグメントの作用の結果を示す図である。図７Ａの左パネルは、Ａ５４９細胞遊走に対するＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）（配列番号３２）の阻害効果を要約した棒グラフを示しており、右パネルは、Ａ３７５細胞に対するＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）タンパク質（配列番号６）の阻害効果を要約した棒グラフを示している。図７Ｂは、Ａ３７５メラノーマ細胞において種々のＦＮＩＩＩバリアントによって誘導されるＧ１停止を示す棒グラフである。図７Ｃ及び７Ｄは、それぞれＡ３７５細胞及びＡ５４９細胞において種々のＦＮＩＩＩフラグメントによって誘導されるアポトーシスを示す棒グラフである。
【図７Ｃ】細胞遊走、細胞生存、及び細胞成長に対する種々のＦＮＩＩＩフラグメントの作用の結果を示す図である。図７Ａの左パネルは、Ａ５４９細胞遊走に対するＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）（配列番号３２）の阻害効果を要約した棒グラフを示しており、右パネルは、Ａ３７５細胞に対するＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）タンパク質（配列番号６）の阻害効果を要約した棒グラフを示している。図７Ｂは、Ａ３７５メラノーマ細胞において種々のＦＮＩＩＩバリアントによって誘導されるＧ１停止を示す棒グラフである。図７Ｃ及び７Ｄは、それぞれＡ３７５細胞及びＡ５４９細胞において種々のＦＮＩＩＩフラグメントによって誘導されるアポトーシスを示す棒グラフである。
【図７Ｄ】細胞遊走、細胞生存、及び細胞成長に対する種々のＦＮＩＩＩフラグメントの作用の結果を示す図である。図７Ａの左パネルは、Ａ５４９細胞遊走に対するＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）（配列番号３２）の阻害効果を要約した棒グラフを示しており、右パネルは、Ａ３７５細胞に対するＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）タンパク質（配列番号６）の阻害効果を要約した棒グラフを示している。図７Ｂは、Ａ３７５メラノーマ細胞において種々のＦＮＩＩＩバリアントによって誘導されるＧ１停止を示す棒グラフである。図７Ｃ及び７Ｄは、それぞれＡ３７５細胞及びＡ５４９細胞において種々のＦＮＩＩＩフラグメントによって誘導されるアポトーシスを示す棒グラフである。
【図８Ａ】9ＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの熱安定性（Ａ）及び溶解度（Ｂ）を示す図である。
【図８Ｂ】9ＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの熱安定性（Ａ）及び溶解度（Ｂ）を示す図である。
【図９Ａ】ＦＮＩＩＩ  １０バリアントの熱安定性（Ａ）及び溶解度（Ｂ）を示す図である。
【図９Ｂ】ＦＮＩＩＩ  １０バリアントの熱安定性（Ａ）及び溶解度（Ｂ）を示す図である。
【図１０Ａ】インテグリンα５β１特異的アンタゴニストであるＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントによりＶＥＧＦ誘導管形成が阻害されること（A）及び9,10Ｆｎ３バリアントによりｂＦＧＦ誘導管形成が阻害されないこと（Ｂ）を示す図である。
【図１０Ｂ】インテグリンα５β１特異的アンタゴニストであるＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントによりＶＥＧＦ誘導管形成が阻害されること（A）及び9,10Ｆｎ３バリアントによりｂＦＧＦ誘導管形成が阻害されないこと（Ｂ）を示す図である。
【図１１】インテグリンα５β１特異的アンタゴニストＦＮＩＩＩ  ９−１０（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）によるＶＥＧＦ誘導血管新生の阻害を示す図である。
【図１２】インテグリンαｖβ３特異的アンタゴニストＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）によるｂＦＧＦ誘導血管新生の阻害を示す図である。
【図１３】ＦＮＩＩＩ  ９−１０（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）によるＡ３７５を有するＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長の用量依存的阻害を示す図である。
【図１４Ａ】ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）によるＡ５４９を有するＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長の用量依存的阻害を示す図である。
【図１４Ｂ】ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）によるＡ５４９を有するＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長の用量依存的阻害を示す図である。
【図１４Ｃ】ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）によるＡ５４９を有するＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長の用量依存的阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書に引用する全ての刊行物、特許、及び特許出願をあらゆる目的のために参照により明示的に援用する。
【００３５】
本願中、特に断りのない限り、利用される技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA)等の複数の周知の参考文献のいずれかの中に見出すことができる。具体的な定義がなされていない限り、本明細書に記載される分子生物学、遺伝子操作、分析化学、合成有機化学、及び医薬品・製薬化学に関連して使用される命名法並びにその実験手法及び技術は、当該技術分野で周知且つ一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬品の製造、製剤化、及び送達、並びに患者の処置に標準的な技術を用いることができる。
【００３６】
文脈によって要求されない限り、単数形は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形の用語を含むものとする。例えば、「ポリペプチド」への言及は、１又は複数のポリペプチドを意味する。
【００３７】
以下に説明されるように、本発明は、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール１０（ＦＮＩＩＩ  １０）を含む修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、ＦＮＩＩＩ  １０がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフを含み、修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントが少なくとも１個のアミノ酸置換を含み、修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントが、配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントは、ＦＮＩＩＩ  ９を更に含み、アミノ酸１４０８位におけるＬｅｕからＰｒｏへの置換を更に含んでもよく、修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントは、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を含む。本願全体を通して使用されるアミノ酸のナンバリングは、全長成熟ヒトフィブロネクチン（配列番号７４）のアミノ酸ナンバリングに従う。全長ヒトフィブロネクチン
のｃＤＮＡ及びタンパク質の配列はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿２１２４７６（配列番号７３）及びＮＰ＿９９７６４１（配列番号７４）に基づく。
【００３８】
発明的修飾ＦＮＩＩＩ  １０又は修飾ＦＮＩＩＩ  ９−１０に加えてフィブロネクチンの更なるモジュール及びドメイン（例えば、限定されるものではないが、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインのモジュール６、モジュール７、及び／又はモジュール８）を含む修飾フィブロネクチンフラグメントを含む単離されたポリペプチドも本発明に包含される。本明細書に記載の１又は複数の発明的変異を有する全長ＦＮポリペプチドも本発明の範囲に包含される。
【００３９】
ヒトフィブロネクチンは、ＦＮＩＩＩ  １０中にあるＲＧＤモチーフを介してインテグリンα５β１及びインテグリンαｖβ３に結合する。図１参照。しかし、ＦＮＩＩＩ  １０だけではインテグリンαｖβ３に対して低い親和性しか示さない。本発明者らは、予期されなかったことに、ＦＮＩＩＩ  １０内の２個のＣｙｓ置換間に形成される鎖内ジスルフィド結合をＲＧＤループ中に導入することでＦＮＩＩＩ  １０のインテグリン結合及び／又はアンタゴニスト活性が向上することを見出した。更に、予期されなかったことに、式Ｃｙｓ1491−Ｘ1−ＲＧＤ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｃｙｓ1499を含むＣｙｓ置換により、ＦＮＩＩＩ  １０又はＦＮＩＩＩ  ９−１０のいずれかと関連してインテグリンαｖβ３アンタゴニスト活性が向上することが見出された。一方、式Ｃｙｓ1490−Ｘ1−Ｘ2−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｘ3−Ｐｒｏ−Ｘ4−Ｃｙｓ1499を含む修飾ＦＮＩＩＩ  ９−１０は、野生型配列を有するＦＮＩＩＩ  ９−１０と等しい又はそれより優れたインテグリンα５β１アンタゴニスト活性を示した。別の特定の実施形態では、本明細書に記載の修飾された発明的フィブロネクチンフラグメント中に、修飾フィブロネクチンフラグメントの望ましい活性に影響を与えずに保存的アミノ酸置換を含む更なる変異が導入され得る。
【００４０】
高濃度で、ＦＮＩＩＩ  ９−１０は全長ＦＮの生物学的活性をある程度模倣すると考えられてきた。ＦＮＩＩＩ  ９−１０又はＦＮＩＩＩ  １０は溶液中で構造的に不安定であることが知られていた。アミノ酸１４０８位におけるＬｅｕからＰｒｏへの置換（Ｌ１４０８Ｐ）がＦＮＩＩＩ  ９の安定性を向上させることが以前に報告されている。前述のvan der Walle et al.参照。ＦＮＩＩＩ  １０内のアミノ酸１４２２位におけるＡｓｐからＡｓｎへの置換（Ｄ１４２２Ｎ）によりＦＮＩＩＩ  １０の安定性が向上することも以前に報告されている（Koide A., et al. Biochemistry 2001, 40: 10326-10333）。しかし、本発明者らは、予想されなかったことに、ＲＧＤループ内に形成される設計されたジスルフィド結合（例えば、式Ｃｙｓ1491ＸＲＧＤＸ3Ｃｙｓ1499を含む）が、Ｌ１４０８Ｐ及び／又はＤ１４２２Ｎ置換の存在に関係なくＦＮフラグメントＦＮＩＩＩ  ９−１０及びＦＮＩＩＩ  １０の安定性及び溶解度を増大させることを見出した。また、本発明者らは、式Ｃｙｓ1490Ｘ2ＲＧＤＸ3Ｃｙｓ1499を含むＲＧＤループ内に形成される設計されたジスルフィド結合がＦＮフラグメントＦＮＩＩＩ  ９−１０の安定性及び溶解度を増大させることを見出した。
【００４１】
エルシニア・シュードツベルクローシスのインベイシン等のその他の特定の天然インテグリンβ１結合タンパク質とは異なり、ＦＮＩＩＩ  ９−１０のα５β１インテグリン相互作用面は、２個のモジュール間の相互作用が最小限であるため、柔軟性がより小さい。Hamburger et al., Science, 1999, 286:291参照。ＦＮのモジュール９とモジュール１０との間の構造的柔軟性がＦＮの生物学的機能の維持に重要であることが示唆されてきた。前述のAltroff et al.；Van Nhieu et al. 1996, J. Biol. Chem. 271:7665-72；及びBiochemistry 37: 10945 (1998)参照。しかし、驚くべきことに、本発明者らは、ＦＮＩＩＩ
９とＦＮＩＩＩ  １０との間の制限されたドメイン間の動きがＦＮＩＩＩ  ９−１０のインテグリンα５β１アンタゴニスト活性に影響しないことを発見した。
【００４２】
本発明のこの態様によれば、特定の実施形態で、本発明は、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール９及びヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール１０（ＦＮＩＩＩ  ９−１０）を含む修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、ＦＮＩＩＩ  ９がアミノ酸１４０８位におけるＬｅｕからＰｒｏへの置換を含んでもよく、ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０のそれぞれが少なくとも１個のアミノ酸置換を含み、ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０中のアミノ酸置換が非共有結合を形成し、ＦＮＩＩＩ  ９及びＦＮＩＩＩ  １０が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同であり且つ配列番号６４ではないアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドはインテグリンα５β１活性を阻害する。
【００４３】
コンピューター支援３次元ドッキングモデルを用いることにより、本発明者らは、インテグリンα５サブユニットとの相互作用に関わるＦＮＩＩＩ  ９のアミノ酸残基を同定した（図５Ａ、右パネル）。ドッキングモデルは更に、ＦＮＩＩＩ  ９がαＩＩｂ又はαＶサブユニットと相互作用しないことを示している。コンピューターにより作製されたＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ（配列番号３２）のドッキングモデルは、好ましいドッキングエネルギーから明らかなように、このＦＮＩＩＩバリアントがインテグリンα５β１結合への選択性を示すことを示している（図５Ｂ、下パネル）。
【００４４】
本明細書に記載の種々の実施形態に加え、望ましいアンタゴニスト活性に影響しない更なるアミノ酸置換を含む修飾ＦＮフラグメントを含み、修飾ＦＮフラグメントが対応する野生型ＦＮ配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同であるポリペプチドも本発明に包含される。ＦＮのアミノ酸配列は種々の哺乳動物種間で高度に保存されている。例として、図２に、ヒトのＦＮＩＩＩ  ９−１０と他の記載されている哺乳動物種のＦＮＩＩＩ  ９−１０とのアミノ酸配列アラインメントを示す。これらの配列はＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）データベースから入手可能である。全長ＦＮの配列も公開されている。したがって、配列番号２（又は配列番号４）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同であり且つＦＮフラグメントの望まれる活性を維持しているであろう、更なる変異（限定されるものではないが例えば挿入、欠失、及び置換）を有する本発明のＦＮバリアントを種々の哺乳動物種間の配列保存に基づいて決定することは当業者の能力内である。
【００４５】
本発明において、「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」という用語は核酸、とりわけゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ、組換えＲＮＡ、又は合成起源の核酸、又はこれらの何らかの組合せによってコードされたタンパク質であって、（１）通常それと一緒に見られる少なくともいくつかのタンパク質を含まないか、（２）同じソースに由来する（例えば同じ細胞又は種に由来する）他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異なる種に由来する細胞によって発現されるか、（４）ソース細胞から単離される時に通常それと一緒に見られるポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、又は他の材料の少なくとも約５０パーセントから分離されているか、（５）「単離されたタンパク質」が自然の状態で連結しているポリペプチドの全て又は一部に（共有結合性又は非共有結合性の相互作用によって）連結されていないか、（６）自然の状態でそれが連結していないポリペプチドに（共有結合性又は非共有結合性の相互作用により）作動可能に連結しているか、あるいは（７）自然界で生じないタンパク質を指す。好ましくは、単離されたタンパク質は、その治療、診断、予防、又は研究における使用を妨げる、その天然環境で見られるその他の混入タンパク質若しくはポリペプチド又はその他の混入物を実質的に含まない。
【００４６】
本発明において、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その誘導体、又はその組合せを含む核酸を指して交換可能に使用され得る。
【００４７】
本発明において、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、交換可能に使用することができ、組み換えられていない天然細胞によって、遺伝子操作された若しくは組み換えられた細胞によって、又は化学合成によって産生されるタンパク質を指し、天然タンパク質のアミノ酸配列又は天然配列の１若しくは複数のアミノ酸の欠失、付加、及び／若しくは置換を有する配列を有する分子を含む。本発明によれば、ポリペプチド又はタンパク質は特に、修飾ヒトフィブロネクチン又はそのフラグメント若しくはそのバリアントを包含する。特定の具体的な実施形態では、ポリペプチド又はタンパク質は、インテグリン活性を阻害するヒトフィブロネクチンフラグメント又はそのバリアントを包含する。特定の具体的な実施形態では、インテグリンはインテグリンα５β１又はαｖβ３である。別の特定の具体的な実施形態では、インテグリンはαＩＩｂβ３ではない。
【００４８】
本発明において、「インテグリンアンタゴニスト」又は「インテグリンに対するアンタゴニスト」という用語はインテグリン活性の阻害、ブロック、中和、低減、抑止、又は干渉が可能な分子を指す。特定の実施形態では、アンタゴニストは、インテグリンに結合し、他の分子、例えば他のＥＣＭタンパク質へのインテグリンの結合を封鎖することによって、インテグリン活性を阻害する。別の特定の実施形態では、アンタゴニストは、インテグリンに結合して、インテグリンが細胞中における下流のシグナル伝達イベントの引き金を引くことを妨げることにより、インテグリン活性を阻害する。
【００４９】
本発明において、インテグリン活性との関連における「阻害」又は「阻害する」という用語は、種々の機能性アッセイによる分析で、インテグリンの活性を低減するインテグリンアンタゴニストの性質を指す。そのような機能性アッセイとしては結合アッセイ、遊走アッセイ、アポトーシスアッセイ、及び細胞接着アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の特定の実施形態で、修飾フィブロネクチンフラグメントを含むポリペプチドはインテグリン活性を阻害し、特定の具体的な実施形態では、インテグリンはインテグリンα５β１である。別の特定の具体的な実施形態では、インテグリンはインテグリンαｖβ３である。更なる特定の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドアンタゴニスト非存在下の対照と比べて、インテグリン活性を約０〜約１００％阻害する。
【００５０】
本発明において、「選択的に阻害する」、「選択的阻害」、「異なって阻害する（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔ）」、又は「異なる阻害（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」という用語は、特定の標的分子への異なる特異性を示すアンタゴニストの性質を指す。例えば、インテグリンαｖβ３活性は阻害するがインテグリンα５β１活性は阻害しない修飾ＦＮフラグメントを含むポリペプチドは、インテグリンαｖβ３を選択的に阻害する。特定の実施形態では、ＦＮＩＩＩ  １０を含む、最適にはＦＮＩＩＩ  ９を更に含む、修飾フィブロネクチンフラグメントを含むポリペプチドは、インテグリンαｖβ３活性を選択的に阻害し、別の特定の実施形態では、ＦＮＩＩＩ  ９−１０を含む修飾フィブロネクチンフラグメントを含むポリペプチドはインテグリンα５β１を選択的に阻害する。別の特定の実施形態では、ＦＮＩＩＩ  ９−１０を含む修飾フィブロネクチンフラグメントを含むポリペプチドは、インテグリンαｖβ３及びインテグリンα５β１の両方の活性を特異的に阻害する。
【００５１】
本発明において「天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」という用語は、自然界に見出すことができる物体、例えば、自然界のソースから単離でき且つ人によって意図的に修飾されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド又はポリヌ
クレオチド配列を指す。「天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」又は「天然（ｎａｔｉｖｅ）」という用語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等の生物学的材料に関連して使用される場合、自然界に見出される、人によって操作されていない材料を指す。同様に、本発明において、「組換え体」、「非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」又は「非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）」とは、自然界には見出されない又は人によって構造的に修飾された若しくは合成された材料を指す。
【００５２】
本発明において、核酸配列又はポリペプチド配列との関連における「野生型」という用語は、人によって意図的に修飾されていない天然（ｎａｔｉｖｅ）又は天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）配列を指す。野生型ヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列は配列番号７４に示されている。野生型配列からのアミノ酸配列の変化を有する天然アレルバリアントが存在し得ると理解される。野生型ヒトＦＮアミノ酸配列を、本願中で使用されるアミノ酸残基のナンバリングの基準として配列番号７４に示す。
【００５３】
本発明において、「タンパク質フラグメント」又は「ポリペプチドフラグメント」という用語は、対応する野生型タンパク質の全長アミノ酸配列より少ないアミノ酸配列を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。タンパク質のフラグメントは、Ｎ末端及び／又はＣ末端に由来する全長タンパク質の切断物又は全長タンパク質の内部に由来する切断物を含み得る。特定の実施形態では、ポリペプチドのフラグメントは全長ポリペプチドの望ましい活性を保持している。別の特定の実施形態では、ポリペプチドのフラグメントは、全長タンパク質と比べて、望ましい付加的な又は変更された活性を獲得している。特定の具体的な実施形態では、タンパク質フラグメントは、本明細書に記載されている発明的な修飾の１又は複数を含む修飾されたヒトフィブロネクチンドメインＩＩＩモジュール１０（ＦＮＩＩＩ  １０）又はモジュール９及び１０（ＦＮＩＩＩ  ９−１０）を含むヒトフィブロネクチンフラグメントである。別の特定の実施形態では、更なる挿入、欠失、又は置換を更に含み、望ましい活性を保持している、修飾ヒトフィブロネクチンを含むポリペプチドも本発明に包含される。
【００５４】
本発明において、「バリアント」、「変異体」、「修飾（された）（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」という用語は、野生型配列とは異なる数なくとも１つの置換又は変化を含む配列、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列のいずれかを指す。特定の実施形態では、バリアントは、少なくとも１個のアミノ酸置換を含むヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインモジュール１０（ＦＮＩＩＩ  １０）を含む修飾ヒトフィブロネクチンフラグメントを含む。翻訳後修飾を更に含む修飾ＦＮバリアントも考えられ、本発明の範囲に包含される。本明細書に記載の対応する発明的アミノ酸置換を含む全長ヒトＦＮも考えられ、本発明に包含される。
【００５５】
本発明において、「相同性」又は「相同な」という用語は、対応するフィブロネクチンフラグメント間の全体的な配列の類似性及び／又は同一性のレベルを指す。高い配列相同性は、タンパク質活性の保存を示唆する。複数の公に利用可能なアルゴリズム又はソフトウェアプログラムを配列相同性の決定に用いることができる。当業者であれば、更なる保存的又は非保存的アミノ酸置換の好適性及び配列相同性レベルを決定することができる。
【００５６】
「のＮ末端側」又は「のＣ末端側」という語句は、タンパク質又はそのフラグメント中における２個以上のアミノ酸残基の相対的位置を指すと当業者に理解される。例えば、参照アミノ酸残基のＮ末端側のペプチド配列中のアミノ酸残基とは、参照アミノ酸残基よりペプチド配列のＮ末端に近いペプチド配列の位置にあると理解される。同様に、参照アミノ酸残基のＣ末端側のアミノ酸残基とは、参照アミノ酸残基よりもペプチド配列のＣ末端に近いペプチド配列の位置にあると理解される。
【００５７】
ヒトＦＮＩＩＩ  １０及びＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントを以下の表１に要約する。
【００５８】
【表１−１】
0006297543.tif 000002
【００５９】
【表１−２】
0006297543.tif 000003
【００６０】
【表１−３】
0006297543.tif 000004
【００６１】
【表１−４】
0006297543.tif 000005
【００６２】
【表１−５】
0006297543.tif 000006
【００６３】
【表１−６】
0006297543.tif 000007
【００６４】
【表１−７】
0006297543.tif 000008
【００６５】
【表１−８】
0006297543.tif 000009
【００６６】
【表１−９】
0006297543.tif 000010
【００６７】
本発明において、２０個の通常のアミノ酸及びその略語は従来の用法に従う。あらゆる目的で参照により本明細書に援用するIMMUNOLOGY--A SYNTHESIS, 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Gren, Eds.), 1991, Sinauer Associates, Sunderland, Mass.参照。特定の実施形態では、１又は複数のアミノ酸置換（特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換）が天然配列中（特定の実施形態では、分子間接触を形成する又は機能的ドメインを含むドメインの外側のポリペプチド部分中）になされ得る。特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させない（例えば、置換アミノ酸は、へリックス等の親又は天然タンパク質を特徴付ける２次構造を乱さないべきである）。当該技術分野で認識されているポリペプチドの２次及び３次構造の例は、それぞれ参照により本明細書に援用されるPROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company；INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing；及びThornton et at., 1991, Nature 354: 105に記載されている。
【００６８】
天然残基は共通する側鎖の性質に基づいてクラスに分類され得る：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６９】
保存的アミノ酸置換は、生体系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって通常取り込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらには、ペプチド模倣物及び他の逆形態（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｆｏｒｍ）又は反転形態（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｆｏｒｍ）のアミノ酸部分が含まれる。
【００７０】
対照的に、非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を含み得る。このような置換残基は、分子の相同領域、非相同領域、又は非保存領域中に導入され得る。
【００７１】
このような変化の作製において、特定の実施形態では、アミノ酸のハイドロパシー・インデックスが考慮され得る。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性に基づいてハイドロパシー・インデックスが割り当てられている。それらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３
．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）（Kyte et al, 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131）。
【００７２】
タンパク質への相互作用的な生物学的機能の付与において、アミノ酸のハイドロパシー・インデックスが重要であることが当該技術分野で理解されている（例えば、Kyte et al, 1982（同書）参照）。特定のアミノ酸を、同様なハイドロパシー・インデックス又はスコアを有する別のアミノ酸で置換することができ且つ依然として同様な生物学的活性が保持されることが知られている。ハイドロパシー・インデックスに基づく変化の導入には、特定の実施形態では、ハイドロパシー・インデックスが±２以内のアミノ酸の置換が含まれる。特定の実施形態では、±１以内のものが含まれ、特定の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。
【００７３】
また、当該技術分野では、特に本発明の場合のようにそれにより作製された生物学的機能性タンパク質又はペプチドが免疫学的実施形態で使用されることが意図される場合、親水性に基づいて同様なアミノ酸の置換を効果的に行うことができることが知られている。特定の実施形態では、その近接するアミノ酸の親水性によって決定されるタンパク質の最大局所平均親水性（ｇｒｅａｔｅｓｔ  ｌｏｃａｌ  ａｖｅｒａｇｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）が、免疫原性及び抗原結合又は免疫原性と、すなわちタンパク質の生物学的特性と関連する。
【００７４】
米国特許第４，５５４，１０１号に記載されているように、以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）、及びトリプトファン（−３．４）。同様な親水性値に基づく変化の導入には、特定の実施形態では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が含まれ、特定の実施形態では、±１以内のものが含まれ、特定の実施形態では±０．５以内のものが含まれる。アミノ酸置換の例を表２に示す。
【００７５】
【表２】
0006297543.tif 000011
【００７６】
当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に記載されているようにポリペプチドの好適なバリアントを決定することができる。特定の実施形態では、当業者は、活性に重要であると思われない領域を標的にすることにより、活性を破壊することなく変更することができる分子の好適な領域を同定することができる。特定の実施形態では、（例えば、配列アラインメントの分析により）同様なポリペプチド間で保存されている分子の残基及び部分を同定することができる。特定の実施形態では、生物学的活性又は構造に重要な領域でさえ、生物学的活性を破壊せずに又はポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換に供することができる。
【００７７】
更に、当業者は、活性又は構造維持に重要な、同様な又は関連するポリペプチド中のアミノ酸残基を同定することができる。そのような比較を考慮して、同様なタンパク質中の
活性又は構造に重要なアミノ酸残基に相当するタンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予想することができる。当業者は、そのような予想される重要なアミノ酸残基に対して、化学的に同様なアミノ酸置換を選択し得る。種々の哺乳動物種に由来するＦＮＩＩＩ  ９−１０のアミノ酸配列アラインメントを図２に示す。
【００７８】
当業者は、同様なポリペプチド中の３次元構造及びその構造に関連するアミノ酸配列を分析することもできる。そのような情報を考慮して、当業者は、３次元構造に関してポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを予想することができる。特定の実施形態では、タンパク質表面にあることが予想されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関わることがあるので、当業者はそのような残基に根本的な変化を導入しないことを選択し得る。更に、当業者は、望ましいアミノ酸残基それぞれの単一アミノ酸置換を含む試験バリアントを作製してよい。次いで、当業者に公知の活性アッセイを用いてバリアントをスクリーニングすることができる。そのようなバリアントは、好適なバリアントに関する情報を集めるのに用いることができる。例えば、特定のアミノ酸残基への変化により、破壊された、望ましくなく低減された、又は不適切な活性が得られることが見出された場合、そのような変化を有するバリアントを回避することができる。換言すると、そのような日常的な実験から集められた情報に基づき、当業者は、単独又は他の変異との組合せでの更なる置換を避けるべき場所のアミノ酸を容易に決定することができる。
【００７９】
２０個の通常のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−,α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の特殊な（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）アミノ酸も本発明のポリペプチドの好適な構成要素であり得る。特殊なアミノ酸の例としては、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ν，Ν，Ν−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、並びに他の同様なアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書中で使用されるポリペプチド表記中、標準的な慣例及び慣習に従い、左手方向はアミノ末端方向であり右手方向はカルボキシ末端方向である。
【００８０】
別の特定の実施形態では、ヒトフィブロネクチンフラグメントを含むポリペプチドは、融合タンパク質を形成するための異種性実体（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｔｉｔｙ）を更に含む。異種性実体は、組換え合成されたヒトフィブロネクチンフラグメントの検出及び／又は精製を容易にすることができる。好適な異種性実体としては、限定されないが、マルチヒスチジンタグ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）タグ、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）タグ、及びマルトース結合タンパク質タグ、ＦＬＡＧタグ、又はＨＡタグが含まれる。好適なタグの選択及び異種性タグ（又はエピトープタグ）を有する目的のタンパク質を発現する発現ベクターの構築は当業者の能力の範囲内である。望ましいエピトープタグに連結された標的タンパク質は、エピトープタグをコードする配列をプライマー配列に組み込んだＰＣＲにより作製することができる。異種性タグにコンジュゲートした目的のタンパク質を組換え発現するためにデザインされた発現ベクターは市販されており、例えばｐＧＥＸ−２ＫＳ（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）及びｐＥＴ２１ａ（ノバジェン社製）がある。特定の実施形態では、異種性実体又はエピトープタグは、例えば、組換え合成ポリペプチドの精製後に、組み込まれているプロテアーゼ切断部位でのプロテアーゼ切断によって除去される。
【００８１】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞又は標的細胞の形質転換に適しており、挿入された異種性核酸配列の発現を方向付ける且つ／又は調節する核酸配列を含むベクターを指す。発現は、限定されるものではないが、転写、翻訳、及びイントロンが存在する場合ＲＮＡスプライシング等のプロセスを含む。特定の実施形態では、発現ベクターは、ヒト
フィブロネクチンフラグメント又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の具体的な実施形態では、発現ベクターは、ヘキサヒスチジンコンジュゲートヒトフィブロネクチンフラグメント又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
典型的には、宿主細胞又は標的細胞のいずれかで使用される発現ベクターは、ベクター維持のための並びに外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含む。そのような配列は、特定の実施形態において「隣接配列」としてまとめて言及され、通常、以下のヌクレオチド配列の１又は複数を含む：プロモーター、１又は複数のエンハンサー配列、複製開始点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸を挿入するための１又は複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメント。
【００８３】
「形質導入（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語は、通常はファージによる、１つの細菌から別の細菌への遺伝子の移動を指す。「形質導入」は、レトロウイルス等のウイルスによる真核細胞配列の獲得又は移動も指す。
【００８４】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）又は外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ＤＮＡの取込みを指して使用され、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された時、細胞は「トランスフェクトされた」という。複数のトランスフェクション技術が当該技術分野で周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Elsevier)；及びChu et al., 1981, Gene 13: 197参照。このような技術を用いて、１又は複数の外因性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。
【００８５】
本発明において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」という用語は細胞の遺伝的特徴の変化を指し、細胞が新たなＤＮＡを含むように修飾された時、細胞は形質転換されたという。例えば、細胞がその自然な（ｎａｔｉｖｅ）状態から遺伝的に修飾されている場合、細胞は形質転換されている。トランスフェクション又は形質導入後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体中に物理的に組み込まれることにより細胞のＤＮＡと組み換えられてもよく、複製されずにエピソームエレメントとして一時的に維持されてもよく、又はプラスミドとして独立して複製されてもよい。細胞分裂と共にＤＮＡが複製される場合、細胞は安定に形質転換されている。
【００８６】
「宿主細胞」という用語は、核酸配列が導入された細胞、又は核酸配列を導入して、その後、目的の遺伝子を発現することができる細胞を指して用いられる。この用語は親細胞の子孫を含み、子孫は、遺伝子が存在すれば、最初の親と形態又は遺伝子構成が同一であっても同一でなくてもよい。好ましい実施形態では、宿主細胞は真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはげっ歯類又はヒトの細胞である。
【００８７】
別の態様では、本発明は、インテグリンが仲介する細胞の接着、成長、遊走、又は分化を阻害する方法の方法であって、治療有効量の本発明のポリペプチドと細胞を接触させるステップを含み、インテグリンがαｖβ３及び／又はα５β１インテグリンである、方法を提供する。更に別の態様では、本発明は、哺乳動物で腫瘍成長、腫瘍進行、又は腫瘍転移を阻害又は処置する方法であって、本明細書に記載の発明的ポリペプチドを含む医薬組成物を哺乳動物に投与するステップを含み、腫瘍がαｖβ３及び／又はα５β１を発現す
るものである、方法を提供する。好適な腫瘍の非網羅的な例としては、肺癌、乳房腫瘍、結腸腫瘍、骨肉腫、膵腫瘍、卵巣腫瘍、頸部腫瘍、膠芽腫、前立腺腫瘍、肝腫瘍、及び黒色腫が含まれる。特定の実施形態では、腫瘍はインテグリンα５β１を発現するものであり、好適な腫瘍の非網羅的な例としては、肺、乳房、結腸、黒色腫、骨肉腫、及び前立腺の腫瘍が含まれる。別の特定の実施形態では、腫瘍はインテグリンαｖβ３を発現し、好適な腫瘍の非網羅的な例としては、乳房、黒色腫、膵臓、卵巣、頸部膠芽腫、及び前立腺の腫瘍が含まれる。
【００８８】
更なる態様では、本発明は、哺乳動物で血管新生関連疾患を阻害する方法であって、それを必要とする哺乳動物に本明細書に記載の発明的ポリペプチドを含む医薬組成物を投与することを含み、血管新生関連疾患が、癌、黄斑変性、浮腫、関節炎、多発性硬化症、血管奇形、肥満、乾癬、いぼ、アレルギー性皮膚炎、ＡＩＤＳにおけるカポジ肉腫、糖尿病性網膜症、原発性肺高血圧症、喘息、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、歯周病、肝硬変、子宮内膜症、卵巣嚢胞、子宮出血、骨髄炎、又は糖尿病性腎症である、方法を提供する。この態様によれば、特定の実施形態で、血管新生関連疾患は、インテグリンαｖβ３及び／又はα５β１によって仲介される疾患を含む。
【００８９】
本発明において、「有効量」又は「治療有効量」の単離されたポリペプチドという用語は、記載されている望ましい結果、例えばインテグリンによって仲介される細胞の接着、成長、遊走、若しくは分化の阻害又は腫瘍成長、腫瘍進行、若しくは腫瘍転移の阻害若しくは処置を達成するのに充分な量を指す。「有効量」又は「治療有効量」を構成するポリペプチド又は化合物の量は、ポリペプチド又は化合物、障害及びその重症度、並びに処置される対象の年齢によって異なるが、当業者はルーチン的に決定することができる。特定の実施形態では、対象は哺乳動物である。特定の具体的な実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００９０】
本発明において、「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、哺乳動物、例えばヒトにおける本明細書に記載の疾患又は障害の処置を含み、以下を含む：（ｉ）疾患又は障害を阻害すること、すなわち、その発達を停止させること；（ｉｉ）疾患又は障害を軽減すること、すなわち、障害を後退させること；（ｉｉｉ）障害の進行を遅らせること；及び／又は（ｉｖ）疾患又は障害の１又は複数の症状の阻害、軽減、又はその進行の減速。
【００９１】
本発明の医薬組成物の投与経路としては、経口によるもの、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、皮下、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内経路による注射を介したもの；徐放系によるもの、又は移植デバイスによるものが含まれる。医薬組成物は、ボーラス注射により投与されてもよく、注入により連続的に投与されてもよく、移植デバイスによって投与されてもよい。医薬組成物は、その上に所望の分子が吸収又は封入されたメンブレン、スポンジ、又は他の適切な材料の移植を介して局所的に投与するとこもできる。移植デバイスを用いる場合、デバイスは任意の好適な組織又は器官に移植され得、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラス、又は連続投与によるものであり得る。
【００９２】
本発明のポリペプチドは、送達すべきポリペプチドを薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、又は補形剤と組み合せる、医薬組成物を製造するための公知の方法に従って製剤化することができる。好適なキャリア、希釈剤、及び補形剤並びにその調製は例えばGenaro, A. O. "Remington: The Science and Practice of Pharmacy." Lippincott Williams &
Wilkins (2005)に記載されている。
【００９３】
生体内で用いられる水性医薬組成物には発熱性物質除去蒸留水が好ましい。そのような製剤は、哺乳動物、特にヒトへの投与に適した薬学的に許容される組成物を製造するため
の好適な量の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、又は補形剤と共に有効量のポリペプチドを含む。望ましい治療効果を実現するために哺乳動物、好ましくはヒトに投与される組成物の有効量は、当業者又は医師の知識の範囲内であり、本願中に更に教示されている。
【００９４】
特定の実施形態では、本発明の修飾ＦＮフラグメントを含む組成物は、治療効果を提供するための他の抗癌薬、抗血管新生薬、及び化学療法薬を更に含んでよい。
【００９５】
タンパク質分解が防止又は低減されるように本発明の修飾ＦＮフラグメントを化学的に修飾することができる。タンパク質又はそのフラグメントを化学的に修飾又は最適化する方法は当該技術分野で周知であり、例えば、非天然アミノ酸残基による天然アミノ酸残基の置換、アミノ酸結合置換、Ｎ−アシル化、Ｎ−ピログルタミン酸、及び／又はＣ−アミド化によるＮ又はＣ末端のブロッキング、並びにＮ末端のエステル化又はペグ化修飾が含まれるが、これらに限定されない。例えばVlieghe et al., 2010, Drug Discovery Today, 15:40-56参照。
【００９６】
更なる態様では、本明細書に記載の発明的ポリペプチド、組成物、又は医薬組成物を含むキットが提供される。本発明の医薬組成物は、乳剤、ゲル剤、液剤、懸濁剤等の形態であり得る。本発明の組成物は、輸送及び保存し易いように凍結乾燥して乾燥形態の組成物にしてもよい。本発明の組成物は、密封バイアル、容器、アンプル、又は同様のものに保存され得る。組成物が乾燥形態である場合、投与前に組成物を（例えば滅菌蒸留水又はバッファーに）溶解又は再懸濁する。食塩水若しくはリン酸緩衝食塩水等の不活性キャリア又は組成物の溶解度が好適な任意のそのようなキャリアが使用され得る。
【００９７】
以下に実施例を用いて本発明の具体的な実施形態及びその種々の使用を説明する。これらは説明のみを目的として記載されるものであり、発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９８】
実施例１．ＦＮＩＩＩフラグメントの野生型及びバリアントを発現する発現ベクターの構築
野生型ヒトＦＮＩＩＩ  ９−１０をベクターｐＥＴ２１ａ（ノバジェン社製）にクローニングして発現させた。ＦＮＩＩＩバリアントをコードするＤＮＡは、大腸菌中で優先的に使用されるコドンで構成した。ＮｄｅＩ認識部位とアフィニティー精製のための６ヒスチジン残基とを有するフォワードプライマー５’−ＣＡＴＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＧＴＣＴＴＧＡＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴ−３’（配列番号７５）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により野生型ＦＮＩＩＩ  ９−１０コード配列を増幅した。リバースプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位とＴＣＡ（又はＴＴＡ）終止コドンとを有する５’−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＧＧＴＡＡＴＴＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＧ−３’（配列番号７６）である。ＰＣＲ産物を精製した後、大腸菌組換えベクターｐＥＴ２１ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーションした。この組換えプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、ＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、１．０％寒天、ｐＨ７．４）及び１００μｇ／ｍｌの抗生物質アンピシリンを用いた寒天プレート上でコロニーを選択した。
【００９９】
ＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントを合成し、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含むプライマーを用いた重複オリゴヌクレオチド戦略を用いたＰＣＲにより増幅した。バリアントの合成又は確認に用いた種々のプライマーのヌクレオチド配列を表３に示す。
【０１００】
全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００８／０１８８４１３号に記載されている手順に従ってポリメラーゼ連鎖反応を行った。簡潔に述べると、反応は、９５℃１分、５５℃１分、及び７２℃１分を２５サイクル行った。複数の変異部位を生じさせるためにプライマー混合物も用いた。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。所望のＰＣＲ産物を精製した後、酵母転移ベクターｐＰＩＣＺαＡのＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩ部位にライゲーションした。組換えプラスミドを用いて大腸菌ＸＬＩ−ｂｌｕｅ株を形質転換し、抗生物質Ｚｅｏｃｉｎを含む寒天プレート上でコロニーを選択した。Ｚｅｏｃｉｎ陽性コロニーから得られたプラスミドＤＮＡを増幅及び単離し、プラスミドに含まれるＦＮＩＩＩ配列をＤＮＡシークエンシングで確認した。
【０１０１】
【表３−１】
0006297543.tif 000012
【０１０２】
【表３−２】
0006297543.tif 000013
【０１０３】
実施例２．ＦＮＩＩＩ  ９−１０及びＦＮＩＩＩ  １０バリアントの発現及び精製
Ｐｉｃｈｉａ  ＥＡＳＹＣＯＭＰ（商標）  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）をメーカーの推奨にわずかな変更を加えて用いて野生型ＦＮＩＩＩ  ９−１０、ＦＮＩＩＩ  １０、又はそのバリアントのタンパク質発現を行った。簡潔に述べると、ＦＮＩＩＩ  ９−１０、ＦＮＩＩＩ  １０、又はそのバリアントをコードするＤＮＡを含む合計１０μｇのプラスミドをＳａｃＩで消化してプラスミドを線状化した。Ｐｉｃｈｉａ  ＥＡＳＹＣＯＭＰ（商標）  Ｋｉｔを用いて、ヒートショック法により線状化したコンストラクトでピキア株Ｘ３３を形質転換した。シングルクロスオーバーにより５’ＡＯＸ１座に線状化コンストラクトをで組み込んだ。Ｌｙｔｉｃａｓｅ（シグマ社製）でピキア細胞を溶解し、ＰＣＲで分析してピキアゲノム中へのＦＮＩＩＩ配列の組込みを確認した。ＹＰＤ（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース、及び２％寒天）及び１００μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎを含む寒天プレート上でコロニーを選択した。最も高いＦＮＩＩＩ  ９−１０又はＦＮＩＩＩ  １０タンパク質発現にマルチコピーのＦＮＩＩＩ挿入を有する複数のコロニーが選択された。
【０１０４】
組換えＦＮＩＩＩ  ９−１０、ＦＮＩＩＩ  １０、及びバリアントを以下の通り作製した：選択されたコロニーを、１００μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎを含むＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び２％デキストロース）中で３０℃にて成長させた。４８時間後、細胞を遠心により回収し、１リットルの最小メタノール培地（１．３４％酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム含有、アミノ酸不含、及び４×１０-5％ビオチンを含む）中で成長させた。２４時間に１回、合計１％のメタノールを添加してＦＮＩＩＩ又はそのバリ
アントの発現を２日間誘導した。上清を遠心により回収し、５リットルのバッファーＡ（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、８Ｍ尿素、及び１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．７）に対して２回透析した。最終溶液をニッケルキレートカラムに充填し、２００ｍＭイミダゾールのグラジエントで溶出した。組換えＦＮＩＩＩ  ９−１０、ＦＮＩＩＩ  １０、及びそのバリアントをＨＰＬＣ（逆相Ｃ１８  ＨＰＬＣ）により更に精製した。精製した組換えＦＮＩＩＩの純度は、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる判定で９５％を超えていた。複数のＦＮＩＩＩバリアントの発現及び純度を図６に示す。ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ（配列番号２０、Ｌ１４０８Ｐ（ＣＡＲＧＤＮＰＤＣ）タンパク質（配列番号２２及びＬ１４０８Ｐ、Ｖ１４４２Ｋ置換（配列番号２８）の配列を有するＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの代表的なＨＰＬＣプロファイル及び純度をそれぞれ図６Ａ〜Ｃに示す。
【０１０５】
実施例３．ＦＮＩＩＩ  １０ドメイン内ジスルフィド結合はＦＮＩＩＩ  ９−１０及びＦＮＩＩＩ  １０の安定性及び溶解度を向上させた
アミノ酸１４０８位のＬｅｕからＰｒｏへの置換がＦＮＩＩＩ  ９−１０の安定性を改善することが以前に示されている（van der Walle et al, 2002, Protein Engineering 15: 1021-24）。モジュール１０中のドメイン内ジスルフィド結合変異の安定性を種々のｐＨ値のバッファー中での１次元ＮＭＲスペクトル分析により調べた。Ｌ１４０８Ｐ変異の存在は、５０ｍＭの遊離アルギニン及びグルタミンを含む溶液中の野生型ＦＮＩＩＩ  ９−１０と比べて、ｐＨ５．０でＦＮＩＩＩ  ９−１０の安定性を向上させた。遊離アルギニン及びグルタミンは、到達可能な最大タンパク質濃度を上げるため並びに沈殿及び分解に対する長期間のサンプル安定性を向上させるために加えられた（Golovanov A.P., et al. J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 8933-8939参照）。しかし、Ｌ１４０８Ｐ変異体の安定性は、遊離アルギニン及びグルタミンの非存在下で、より高いｐＨ、例えばｐＨ６．０（図３Ａ、右下パネル）又はより低いｐＨ、例えばｐＨ３．５では低下した。一方、ドメイン内ジスルフィド結合は、Ｌ１４０８Ｐ変異を必要とせず且つ遊離アルギニン及びグルタミンを必要とせずに、ｐＨ７．５でもリン酸バッファー中でＦＮＩＩＩ  ９−１０を安定化した。図３Ａの右上のパネルに示されているように、ドメイン内ジスルフィド結合を有し且つＬ１４０８Ｐ変異を有さないＦＮＩＩＩ  ９−１０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ、配列番号２０）は、アルギニン及びグルタミンを含まない溶液中、ｐＨ７．５で安定なままであった。ドメイン内ジスルフィド結合は更に、ＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの安定性及び溶解度を増大させた（図３Ｂ）。
【０１０６】
また、モジュール１０の１４２２位のＡｓｐからＡｓｎへの置換（配列番号６５）が、ｐＨ５、５０ｍＭ遊離アルギニン及びグルタミン存在下でＦＮＩＩＩ  １０の安定性を向上させることも示されている。しかし、Ｄ１４２２Ｎ変異体の安定性は、ｐＨが５．４及び６に上がった時に低減した。図３Ａ、左下パネル参照。図３Ｃに示されているように、ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）タンパク質（配列番号６）中に存在するドメイン内ジスルフィド結合は、Ｄ１４２２Ｎ変異を必要とせずにＦＮＩＩＩ  １０の安定性及び溶解度を向上させた（図３Ｃ）。
【０１０７】
実施例４．ＦＮＩＩＩ  ９−１０又はＦＮＩＩＩ  １０バリアントはインテグリンα５β１又はαｖβ３仲介細胞付着を阻害した
以前に報告されているように細胞接着阻害アッセイによりＦＮＩＩＩバリアントのインテグリンアンタゴニスト活性を評価した（Zhang, et al., 1998 J Biol Chem 273:7345-7350）。簡潔に述べると、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ−２マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ）製、ニューヨーク州）を、濃度５０〜５００ｎＭの基質を含む１００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：１０ｍＭリン酸バッファー、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。コーティングの基質には以下が含まれた：α５β１にはフィブリノーゲン（ＦＧ）５０μｇ／ｍｌ、αｖβ３にはビトロネクチン（ＶＮ）１０μｇ／ｍｌ、αＩＩｂβ３には
フィブロネクチン（ＦＮ）２５μｇ／ｍｌ。各ウェルを２００μｌの熱変性１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、カルビオケム社製）と室温（２５℃）で１．５時間インキュベートすることにより、非特異的タンパク質結合部位をブロックした。その後、ブロッキング熱変性ＢＳＡを捨て、各ウェルを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。
【０１０８】
インテグリンαｖβ３及びα５β１を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（それぞれ、ＣＨＯ−αｖβ３及びＣΗΟ−α５β１）を１００μｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地中で維持した。ＣＨＯ−αｖβ３及びＣＨＯ−α５β１はどちらもＤｒ．  Ｙ．  Ｔａｋａｄａ（スクリプス研究所（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））の厚意により寄贈されたものであり、ネオマイシン耐性遺伝子による安定なトランスフェクションにより確立されたものである。対数増殖中のＣＨＯ細胞をトリプシン処理してはがし、３×１０5細胞／ｍｌでアッセイに用いた。ＦＮＩＩＩ  ９−１０、ＦＮＩＩＩ  １０、及びそのバリアントを濃度０．００１〜５００μＭで培養細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ2で１５分間インキュベートした。次いで、処理した細胞をコーティングされたプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。次いで、インキュベーション溶液を捨て、２００μｌのＰＢＳで２回洗浄することにより非接着細胞を除去した。
【０１０９】
クリスタルバイオレット染色により結合細胞を定量化した。簡潔に述べると、ウェルを１００μｌの１０％ホルマリンで１０分間固定し、乾燥した。次いで、５０マイクロリットルの０．０５％クリスタルバイオレットをウェルに室温で２０分間加えた。各ウェルを２００μｌの蒸留水で４回洗浄し、乾燥した。１５０μｌの着色溶液（５０％アルコール及び０．１％酢酸）を加えることにより着色を行った。生じた吸光度を６００ｎｍで読み取り、読取値を接着細胞数と関連付けた。阻害は、阻害（％）＝１００−［ＯＤ600（ＦＮＩＩＩ野生型又はバリアント−処理サンプル／ＯＤ600（非処理サンプル）］×１００として定義した。ＩＣ50を、細胞接着を５０％阻害するのに必要な濃度（ｎＭ）として定義した。したがって、ＩＣ50が低いほど、それぞれのインテグリンの細胞接着活性の阻害におけるバリアントの特異性又は効力が大きいことを示している。結果を以下の表４及び５に要約する。
【０１１０】
野生型ＦＮＩＩＩ  １０は、インテグリンαｖβ３への結合についてＦＮと効果的に競合せず、したがって、細胞接着アッセイにおいてインテグリンαｖβ３アンタゴニスト活性を示さなかった。アミノ酸１４９２〜１４５１位に配列ＰＲＧＤＷＮＥＧＳＫを有するＦＮＩＩＩ  １０（配列番号５０）は、インテグリンαｖβ３結合活性を示し、インテグリンαｖβ３への結合について全長ＦＮと競合した。表４及びRichards et al., J Mol Biol. 2003, 326(5): 1475-88参照。
【０１１１】
予想されていなかったことに、ＲＧＤループ中に、式Ｃｙｓ−Ｘ７−Ｃｙｓを含む配列中のＲＧＤモチーフに隣接する２個のＣｙｓ置換の間、例えばＴ１４９１Ｃ置換とＳ１４９９Ｃ置換との間にジスルフィド結合を導入することにより、インテグリンαｖβ３アンタゴニスト活性が大幅に上昇することが発見された（例えば、表４、配列番号２と比べた配列番号６、８、及び１０参照）。更に、設計されたジスルフィド結合は、既にインテグリンαｖβ３アンタゴニスト活性を示していたＦＮＩＩＩ  １０バリアントのインテグリンαｖβ３アンタゴニスト活性を更に上昇させた。例えば、ＦＮＩＩＩ  １０  ＰＲＧＤＭＰＤを背景としたＲＧＤモチーフに隣接する２個のシステイン置換（すなわち、ＣＰＲＧＤＭＰＤＣを有する配列番号６）は、Ｃｙｓ置換を有さないバリアント（配列番号４８）と比べてインテグリンαｖβ３結合親和性を７倍上昇させ、したがって細胞接着を５０％阻害するのに必要な濃度を低減した（配列番号６と配列番号４８の結果を比較されたい）。
【０１１２】
要約すると、緩い構造のＲＧＤループ内にジスルフィド結合を導入すると、インテグリンαｖβ３へのＦＮＩＩＩバリアントの結合親和性がかなり上昇し、したがって、細胞接着アッセイによって測定されるインテグリンαｖβ３アンタゴニスト活性が上昇した。
【０１１３】
【表４−１】
0006297543.tif 000014
【表４−２】
0006297543.tif 000015
【０１１４】
野生型ＦＮＩＩＩ  ９−１０はインテグリンα５β１には結合するがインテグリンαｖβ３には結合しない。表５の野生型ＦＮＩＩＩ  ９−１０（配列番号４）の結果を参照されたい。興味深いことに、式Ｃ−Ｘ7−Ｃ中でＲＧＤモチーフに隣接する設計されたジスルフィド結合を有するＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントは結合特異性の変化を示した。例えば、アミノ酸１４９０〜１５０１位にアミノ酸配列ＶＣＰＲＧＤＭＰＤＣＳＫを有するＦＮＩＩＩ  ９−１０（配列番号２０）は、ＦＮＩＩＩ  ９−１０がインテグリンα５β１バインダーであると見なされているにも関わらず、インテグリンα５β１ではなくインテグリンαｖβ３アンタゴニスト活性を示した。表４参照。配列番号６及び２０の結果と表５の配列番号４の結果を比較されたい。
【０１１５】
一方、式Ｃ−Ｘ8−Ｃを含む配列中にＣｙｓ置換によって形成されたドメイン内ジスルフィド結合はＦＮＩＩＩ  ９−１０の結合特異性を変化させず、場合によっては、インテグリンα５β１への結合親和性を向上させた（例えば、表５配列番号４又は配列番号６３の結果と比較した配列番号３２の結果参照）。
【０１１６】
モジュール９と１０との間のドメイン間ジスルフィド結合（Ｌ１４０８Ｐ置換を背景とする）は、ＦＮＩＩＩ  ９−１０フラグメントを安定化するが、インテグリンα５β１に結合するモジュール９の相乗効果を低下させることが以前に示されている（前述のAltroff et al.）。しかし、本発明者らは、予想されなかったことに、１３４０位及び１４４２位の設計されたＡｓｐとＬｙｓ（Ａ１３４０Ｄ及びＶ１４４２Ｋ置換）との間で形成されたドメイン間結合を有するＦＮＩＩＩ  ９−１０（Ｌ１４０８Ｐ置換を背景とする）が、インテグリンα５β１と比べて結合親和性を維持していることを発見した（表５、配列番号４又は配列番号６３の結果と比較した配列番号４０の結果参照）。
【０１１７】
更に、ＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの一部はインテグリンαｖβ３への結合親和性も獲得した（表４、配列番号４又は配列番号６３の結果と比較した配列番号６０の結果参照）
【０１１８】
【表５−１】
0006297543.tif 000016
【０１１９】
【表５−２】
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【表５−３】
0006297543.tif 000018
【０１２０】
要約すると、式Ｃ−Ｘ8−Ｃを含む配列でジスルフィド結合をＦＮＩＩＩ  ９−１０のＲＧＤループ中に導入することで、インテグリンα５β１アンタゴニスト活性を向上させることができる（表５、配列番号３２の結果を配列番号４、配列番号６３、及び配列番号６２と比較されたい）。
【０１２１】
実施例５．ＦＮＩＩＩ  １０及びＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントはインテグリンαＩＩｂβ３に結合せず、血小板凝集を誘導しなかった。
少なくとも２週間如何なる投薬も受けていない健常ドナー由来の静脈血（９部）サンプルを３．８％クエン酸ナトリウム（１部）中に採取した。血液サンプルを１５０×ｇで１０分間遠心して多血小板血漿（ＰＲＰ）を得、５分間静置し、ＰＲＰを回収した。残りの血液から、２０００×ｇで２５分間遠心することにより乏血小板血漿（ＰＰＰ）を調製した。ＰＰＰ血小板数を血液分析装置で測定し、２５０，０００血小板／μｌに希釈した。１９０μｌのＰＲＰと１０μｌの種々の濃度のＦＮＩＩＩ  １０又はＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアント又はＰＢＳバッファーとの溶液をＨｅｍａ  Ｔｒａｃｅｒ  ６０１血小板凝集計中で３７℃にて５分間インキュベートした。１０マイクロリットルの２００μＭアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を更に加えて、光透過により血小板凝集反応をモニタリングした。表４及び５に示されているように、試験した野生型又はバリアントはいずれもインテグリンαＩＩｂβ３に結合しなかったか、血小板凝集を促進しなかった。
【０１２２】
実施例６．インテグリンが仲介する細胞遊走、細胞生存、及び細胞成長に対するＦＮＩＩＩ  １０又はＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの影響
インテグリンが仲介する生物学的プロセスへのＦＮＩＩＩ  １０又はＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの影響を分析した。フローサイトメトリーによる確認でαｖβ３又はα５β１を安定に発現しているヒトメラノーマ細胞Ａ３７５又はＡ５４９をＦＮＩＩＩ  １０
ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ（配列番号６及びＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）又はＦＮＩＩＩ  ９−１０
Ｌ１４０８Ｐ  ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣＳＫ（配列番号３２）とインキュベートし、トランスウェルアッセイで細胞遊走への影響を調べた。細胞遊走（Ｈａｐｔｏｔａｘｉｓ）アッセイを以前に報告されているように行った（Bisanz et al., 2005, Model. Mol. Ther.
12:4 634-643）。８μｍ細孔ポリカーボナートを有するインサート（ファルコン社（Ｆａｌｃｏｎ）製）の多孔性メンブレンの下側を２００μｌのフィブロネクチン（５０μｇ／ｍｌ）を用いて室温で２時間コーティングし、その後、洗浄し、１％（ｗ／ｖ）熱変性ＢＳＡで室温にて２時間ブロッキングし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。チャンバーを無血清ＤＭＥＭと共に組み立てた後、１×１０5細胞を上側のチャンバーに置いた。各実験は、下側をＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでコーティングされたポリカーボナートフィルターからなる対照を伴い、これは一貫して遊走を示さなかった。６時間インキュベート後、細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。上側チャンバーに残った細胞を綿棒で除去し、遊走細胞の写真を撮り、定量化した。プレーティング時に上側チャンバーに種々の量のＦＮ−ＩＩＩバリアントを加えたこと以外は前述したようにＦＮ−ＩＩＩバリアントによる遊走阻害を行った。ＦＮＩＩＩバリアントが細胞遊走を阻害したことを示している図７Ａに結果を要約する。
【０１２３】
更に、細胞周期停止へのＦＮＩＩＩ  １０又はＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントの影響を調べた。細胞周期分析を以前の報告（Brooks et al., 1994, Cell 79: 1157-1164）に幾分の変更を加えて行った。簡潔に述べると、ＦＮ−ＩＩＩバリアントを、接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）の２４時間後、細胞がよく広がった時に加えた。処理の４８時間後、浮遊及び付着している細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に回収した。細胞を１，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、３ｍｌの冷７０％ＰＢＳ中に再懸濁した後、−８０℃で一晩保存した。４℃で４５分間インキュベートした後、細胞を回収し、１，３００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。その後、細胞を１ｍｌのＰＩ染色液（２００μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ヨウ化プロピジウム、２００μｌのＲＮａｓｅ  Ａ、及び２００μｌの５％トリトンＸ１００を含む９．４ｍｌのＰＢＳ）に３７℃で１５分間再懸濁した。前述したようにＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて細胞蛍光を測定した。結果を図７Ｂに要約する。要約すると、ＦＮＩＩＩ野生型フラグメント処理は、対照（ＰＢＳ）と比べてＧ１細胞のパーセンテージを上昇させ、ＦＮＩＩＩバリアント処理は更に細胞周期停止を誘導した。
【０１２４】
更に、ＦＮＩＩＩ又はＦＮＩＩＩ  ９−１０バリアントがアポトーシスを誘導する能力
を分析した。細胞アポトーシス実験を、以前の報告（Maubant et al., 2006, Blood 108:
3035-3044）に幾分の変更を加えて行った。簡潔に述べると、接種の２４時間後、細胞がよく広がった時にＦＮ−ＩＩＩバリアントを加えた。処理の４８時間後、浮遊及び付着細胞を回収し、アネキシンＶ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（モレキュラープローブス社製）及びＰＩ（シグマ社製）を用いた１００μｌのアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色に３７℃で１５分間供した。得られた蛍光をフローサイトメトリーで測定した。アネキシンＶ及びＰＩの組合せで細胞を染色することにより、非アポトーシス細胞（アネキシンＶ-／ＰＩ-）、初期アポトーシス細胞（アネキシンＶ+／ＰＩ-）、後期アポトーシス細胞（アネキシンＶ+／ＰＩ+）、及び壊死細胞（アネキシンＶ-／ＰＩ+）を明らかにした。結果を図７Ｃ〜７Ｄに要約する。要約すると、ＦＮＩＩＩ及びそのバリアントはインテグリン発現細胞でアポトーシスを誘発した。
【０１２５】
発明をその具体的実施形態を参照して詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱せずに改変及び変更が可能であることは明らかであろう。より具体的には、本発明のいくつかの態様が特に有利であるとして本明細書中に特定されているが、本発明は必ずしも発明のこれらの特定の態様に限定されないと考えられる。
【０１２６】
実施例６．本発明のバリアントの熱安定性及び溶解度
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定される熱安定性
製造、保存、及び患者への送達を通して生物学的薬物が安定なままであることが重要である。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、溶液中での生物学的薬物の相対的安定性の良好な指標であることが知られているタンパク質の熱転移点Ｔｍを正確、迅速、且つ容易に測定することができる（Demarest et al., 2004；Sanchez-Ruiz et al., 1988；Vermeer and Norde, 2000）。そこで、ＤＳＣを、（１）製剤化のためのバッファー及び補形剤のスクリーニング；（２）活性に加えて妥当な安定性を有する治療薬候補のスクリーニング；及び（３）タンパク質凝集傾向の予測に用いた。上記の理由から、本発明者らは、デザインしたタンパク質の安定性、9,10Ｆｎ３バリアント及び10Ｆｎ３バリアントのＴｍをＤＳＣにより特徴付けた。
【０１２７】
ＶＰ−ＤＳＣマイクロ熱量計（マイクロカル社（ＭｉｃｒｏＣａｌ）製）を用いてＤＳＣ分析を行った。３ｋＤａ分子量カットオフメンブレンを用いて、調製したバッファー中にサンプルを透析し、サンプルの終濃度を約０．７ｍｇ／ｍｌに調節した。全ての実験はスキャン速度６０℃／ｈｒで２０から１１０℃に加熱した。同じ実験条件下でバッファー−バッファーベースラインを得、サンプルトレースから引いた。ＤＳＣ分析アドオン（マイクロカル社製）を備えたＯｒｉｇｉｎ  ７．０（オリジンラボ社（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ
Ｃｏｒｐ）製、ノーサンプトン、マサチューセッツ州）を用いてデータ分析を行った。一致するバッファースキャンの参照値を引いた後、データの濃度を標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）することにより、各タンパク質過剰熱容量曲線を補正した。標準化されたデータから熱変性曲線の頂点を計算することにより転移点又は融解温度（見かけのＴｍ）を決定した。
【０１２８】
示差散乱熱量測定（ＤＳＣ）実験を用いて、温度の関数として目的分子の溶液の過剰熱用量（Ｃｐ）をモニタリングすることにより、生物学的巨大分子の熱誘導転移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）が研究された（Bruylants et al., 2005; Spink, 2008）。本発明者らは、ＰＢＳバッファー中での熱安定性を比較するために、一連の本発明者らが設計したタンパク質のＤＳＣ実験を行った。本発明者らのタンパク質の熱変性プロセスは不可逆的であるので、転移エンタルピー（ΔＨ°ｍ）の代わりに融解温度（Ｔｍ）を用いて、本発明者らのタンパク質の安定性を反映させた。これらのタンパク質の熱誘導アンフォールディングにより、１つの吸熱転移からなるＤＳＣプロファイルが生成された。非２状態転移モデルを用いたＤＳＣトレースのデコンボリューションにより、１つの吸熱ピーク及びＴｍが
得られた。実験的トレース及び計算されたトレースの比較によりモデルの適合性が確認された。ピークを１つだけを有する変性曲線は通常、２個以上のドメインがタンパク質分子中に存在し、種々のドメインが互いに独立せずに変性していることを示すと解釈される。３つの代表的タンパク質のＤＳＣ実験は、ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）、ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（配列番号６３）、及びＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＲＡＲＧＤＮＰＤ）バリアント（配列番号６２）でそれぞれ６２．４℃、６０．８℃、及び５８．７℃のＴｍ値を示した（表６及び図８Ａ参照）。ＦＮＩＩＩ  １０野生型（配列番号２）、ＦＮＩＩＩ  １０、ＦＮＩＩＩ  １０  ＰＲＧＤＭＰＤバリアント（配列番号４８）、及びＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）バリアントの安定性はそれぞれ８０．７℃、７４．３℃、及び８５．０℃である（表７及び図９Ａ参照）。主な吸熱が１つだけ存在することから、ジスルフィド結合を有する又は有さない生成物による異種性がないことが確認された。本実験中、ＤＳＣ転移のＴｍ値は、再現性があり、したがってＷＴ及びその変異体の相対的熱安定性を反映していると見なすことができる。
【０１２９】
【表６】
0006297543.tif 000019
【０１３０】
【表７】
0006297543.tif 000020
【０１３１】
硫安沈殿によって測定された溶解度
溶解度は、医薬品プレフォーミュレーション中に研究される物理化学的特性の問題である。液体製剤開発のためには、最終製品の堅牢性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）を確実にするために正確な溶解度データが必須である。固形製剤では、適切な量の薬物が生体内での吸収に利用可能であるかどうかの決定に溶解度データが重要である。化合物の水溶性が低い場合、化合物は、胃腸（ＧＩ）残留時間内での吸収が溶解速度又は溶解度によって限定され得る。タンパク質の溶解度を増大させるために用いることができる方法は、高分解能構造研究及び医薬品への応用に有用である。複数の実験が、タンパク質の溶解度を増大させるための表面残基の部位特異的変異誘発の利用に成功している。ここで、本発明者らは、折り畳まれたタンパク質のＲＧＤループ上の変異がこれらの溶解度にどのように影響するかを調べることにより、タンパク質溶解度の内因的決定要因を調べた。
【０１３２】
硫酸アンモニウムを用いたタンパク質沈殿がタンパク質溶解度の測定に成功している（Trevino, S.R., Scholtz, J.M., and Pace, C.N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of pharmaceutical sciences 97, 4155-4166）。硫安沈殿は、同じタンパク質のバリアントの相対的溶解度の値について迅速且つ正確な情報を得ることができるが、凍結乾燥タンパク質の水／バッファー含有量又は実験中に導入され得る付随イオン（ｉｎｃｉｄｅｎｔａｌ  ｉｏｎ）等の調整困難な要因が高濃度の塩によって遮蔽されるので、この方法は実験的に信頼性が高い。それに加え、この方法は、水相及び固相がよく定まった沈殿溶液を生成し、可溶性の高いタンパク質を調べる場合でも、必要なタンパク質が比較的少量である（１０ｍｇ以下）。
【０１３３】
全ての測定は、以前に報告されているように室温（２５℃）で行った（Trevino, S.R.,
Scholtz, J.M., and Pace, C.N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of pharmaceutical sciences 97, 4155-4166）。簡潔に述べると、３つの溶液（５０ｍＭバッファー、３．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭバッファー、及びタンパク質ストック溶液を含む５０ｍＭバッファー）を、０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブ中で一緒に混合して、所望の硫酸アンモニウム及びタンパク質濃度の最終サンプル体積１５μｌにした。アモルファス塩析プロセスのためにサンプルを１分超平衡化した。その後、サンプルを１．５ｍｌのエッペンドルフ社製チューブに移し、１６，０００ｇで１分間遠心して凝集を除去した。分光光度計を１．１Ｍ硫酸アンモニウム溶液４９５μｌでブランク設定した。遠心後、吸光度測定のために５μｌのサンプルを４９５μｌのブランク溶液に加えて混合して１００倍希釈物とした。
【０１３４】
アモルファス沈殿を誘導するために硫酸アンモニウム法によるタンパク質溶解度測定を用いた（Trevino, S.R., Scholtz, J.M., and Pace, C.N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of pharmaceutical sciences 97, 4155-4166）。目的のタンパク質の溶解度を示すために、硫酸アンモニウム濃度の関数としてのタンパク質の溶解度曲線を用いた。ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）、野生型タンパク質、及びＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＲＡＲＧＤＮＰＤ）バリアントの溶解度は２４．４、１９．９、及び４．０ｍｇ／ｍｌである（表６及び図８Ｂ参照）。ＦＮＩＩＩ  １０、ＦＮＩＩＩ  １０野生型（配列番号２）、ＦＮＩＩＩ  １０（ＴＰＲＧＤＭＰＤ）バリアント（配列番号４８）、及びＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）の溶解度は７．３、５．３、及び２７．８ｍｇ／ｍｌである（表７及び図９Ｂ参照）。各溶解度の値は３回繰り返した。したがってＷＴ及びその変異体の相対的溶解度を反映していると考えることができる。総合すると、インテグリンα５β１特異的ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）及びインテグリンαｖβ３特異的ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）へのジスルフィド結合の導入は安定性及び溶解度を増大させた（図８Ｂ及び９Ｂ参照）。
【０１３５】
実施例７．インビトロでの成長因子誘導血管形成への影響
血管新生の再組織化段階をモデル化するために一般的に用いられるインビトロアッセイの１つは、管形成アッセイ（ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）である（Arnaoutova, I., and Kleinman, H.K. (2010). In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols 5, 628-635）。アッセイは、適切な細胞外マトリックス支持体を用いてサブコンフルエントな密度でプレーティングされた内皮細胞がキャピラリー様構造を形成する能力を測定する。典型的には、能力は、培養皿の顕微鏡画像中のこれらのキャピラリー様構造の数、長さ、又は面積を測定することにより定量化することができる。化合物が管形成を阻害できる場合、それらは、腫瘍が新血管形成を刺激して比較的小サイズを超えて成長するための酸素及び栄養素を得る癌等の種々の疾患に有用なはずである。ここで、本発明者らは、本発明者らがデザインした変異体が管形成を促進又は阻害する能力を調べた。
【０１３６】
インビトロでｂＦＧＦ又はＶＥＧＦが仲介する内皮管形成へのＦｎ３変異体の影響を評価するために、１５ウェルμスライド（ｉｂｉｄｉ社（ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨ）製）を１０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社製）でコーティングした。Ｆｎ３変異体と１５分間プレインキュベートしたＨＵＶＥＣを、ウェル中の２％ＦＢＳ及び内皮細胞成長サプリメントを含むＭ１９９に加え、最後に、５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ又は２０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦを加えた。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて管の長さの合計を測定し、示されている時点の対照と比較した。ＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ  ｆｘ；フォトメトリクス社（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）製）及びＮ  ＰＬＡＮ  １０×／０．２５対物レンズを備えた倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＥ２）で管形成の顕微鏡写真を撮り、加工した。
【０１３７】
ＦＮＩＩＩ  ９−１０（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）によるＶＥＧＦ誘導管形成の阻害
インテグリンα５β１はＶＥＧＦ誘導血管新生に関わることが知られており、インテグリンα５β１の遮断はＶＥＧＦ誘導血管新生をインビトロ及びインビボで阻害し得る。本発明者らのインテグリンα５β１特異的アンタゴニストが毛細管形成及びマトリゲルプラグアッセイを抑制し得るかどうかを評価するために。フローサイトメトリー分析により、インテグリンα５β１がＨＵＶＥＣ上で過剰発現していることが示された。本発明者らは、ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）を、最も強い結合及び強固な生物物理学的特性を有していたので、本実験に選択した。ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）は、細胞外基底膜マトリックス（Kleinman et al., 1986）であるマトリゲル上で成長したＨＵＶＥＣによるＶＥＧＦ誘導毛細管形成を約１．６μＭのＩＣ50値で阻害した（図１０Ａ）。しかし、ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）は、マトリゲル上で成長したＨＵＶＥＣによるｂＦＧＦ誘導毛細管形成を阻害しなかった（図１０Ｂ）。この結果は、本発明者らのインテグリンα５β１特異的アンタゴニストが、ＨＵＶＥＣ細胞上のインテグリンα５β１を特異的に標的化でき、ＶＥＧＦ誘導管形成へのその関与を妨げることができることを示唆している。
【０１３８】
ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）はｂＦＧＦ誘導管形成を阻害しなかった
10Ｆｎ３（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）は、マトリゲル上で成長したＨＵＶＥＣによるそれぞれＶＥＧＦ誘導及びｂＦＧＦ誘導毛細管形成を阻害しなかった。しかし、ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）はインビボでｂＦＧＦ誘導血管新生を阻害した。管形成に加えて、ＨＵＶＥＣ遊走も血管新生プロセスに関与する。したがって、本発明者らは、本発明者らのインテグリンαｖβ３特異的アンタゴニストが、ｂＦＧＦ誘導条件下で遊走を妨げるが管形成は妨げないと推測した。
これを、ｂＦＧＦ誘導トランスウェル遊走アッセイで更に確認する。
【０１３９】
実施例８．インビボマトリゲルプラグ血管新生アッセイ
マトリゲルプラグ血管新生アッセイは、ヌードマウス中の移植ゲルプラグ中で新たに形成された血管を検出するための簡便なインビボ技術である）。マトリゲルマトリックス組成物が基底膜タンパク質に相当する。これは、内皮細胞等の種々の細胞型の分化を誘導することができる。対照と比べたプラグの色の差により、血管新生性又は抗血管新生性化合物の活性レベルを視覚的に評価することができる。ヘモグロビン検出のような種々の方法を用いて更なる定量化を行うことができる。本発明者らの場合、タンパク質あり又はなしで成長因子（ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ）をマトリゲルと混合した後、マウスに注射して、タンパク質の抗血管新生活性を決定した。
【０１４０】
インビボでの血管新生作用を評価するために、ヘパリン（５００Ｕ／ｍＬ）を含む成長因子低減液体マトリゲル（０．２５ｍＬ）及び１２５ｎｇ  ｂＦＧＦ／ＶＥＧＦとＦｎ３変異体との組合せをＣ５７ＢＬ／６マウスの腹部正中線近くに皮下注射した。移植の４日後、マウスを安楽死させ、マトリゲルプラグを外科的に取り出し、ＣＭＯＳカメラ（６００Ｄ、キヤノン社製）で撮影し、ヘモグロビン比色測定キット（ケイマン社製）を用いて各マトリゲルプラグのヘモグロビン含有量を測定した。
【０１４１】
ＦＮＩＩＩ  ９−１０  バリアント（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）（配列番号３２）によるＶＥＧＦ誘導血管新生の阻害
本発明者らは次に、マトリゲルプラグアッセイを用いてインビボでＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）が血管新生をブロックする能力を測定した。（Passaniti, R.M. Taylor, R. Pili, Y. Guo, P.V. Long, J.A. Haney, R.R. Pauly, D.S. Grant, G.R. Martin., A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor., Lab. Invest., 67 (1992), pp.
519-528)）。ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）は、陰性対照に近いレベルにまで血管新生を著しく阻害した（図１１参照）。これは、インテグリンα５β１がＶＥＧＦ誘導血管新生において役割を果たすことを示しており、この生物学的プロセスは、本発明者らがデザインしたα５β１特異的アンタゴニストでブロックすることができる。
【０１４２】
ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）によるｂＦＧＦ誘導血管新生の阻害
本発明者らは更に、マトリゲルプラグアッセイを用いてインビボでＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）が血管新生をブロックする能力を測定した。ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）は、陰性対照に近いレベルにまで血管新生を著しく阻害した（図１２参照）。これは、インテグリンαｖβ３がｂＦＧＦ誘導血管新生において役割を果たすことを示しており、この生物学的プロセスは、本発明者らがデザインしたαｖβ３特異的アンタゴニストでブロックすることができる。
【０１４３】
実施例９．ＳＣＩＤマウス中のヒト腫瘍異種移植片の成長への影響
新規がん治療薬の開発のための主な前臨床スクリーニングは、免疫不全げっ歯類へのヒト癌細胞の異種移植によって達成される（異種移植片モデル）（Christopher L Morton &
Peter J Houghton, NATURE PROTOCOLS. 2007 247-250）。これらのモデルは、臨床的に有効な薬剤を同定してきており、未だに医薬品業界の「主力（ｗｏｒｋｈｏｒｓｅ）」である。治療アプローチの提唱されるメカニズムを明らかにするために、腫瘍生検の免疫組織化学染色により腫瘍の分子的特徴が同定され得る。この実験において、本発明者らは、
２つのインテグリンアンタゴニストの抗腫瘍活性を試験するためにそれぞれ２つの異種移植モデルを確立する。
【０１４４】
腫瘍血管新生へのＦＮＩＩＩ変異体の影響を評価するために、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの背側に１×１０6メラノーマ／肺癌細胞を皮下注射した。このマウスに、様々な量の大腸菌発現ＦＮＩＩＩ変異体（５又は１０ｍｇ／ｋｇ体重）を１日１回皮下注射した。腫瘍を回収し、カメラ（Ｔ３０、ソニー社製）で写真を撮り、薄片を作製した。ＣＤ３１に対する抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）及びＫｉ−６７（ライカ社製）を用いたＩＨＣ染色によりそれぞれ腫瘍内微小血管及び細胞を検出した。ＢＸ５１顕微鏡（オリンパス社製、東京、日本）を用いて画像をキャプチャーした。腫瘍内微小血管密度及び細胞を定量化した。簡潔に述べると、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアを用いて、拡大率１０倍で各腫瘍切片中の微小血管及び細胞の積算光学濃度（ＩＯＤ）を計算した。
【０１４５】
免疫組織化学
全ての組織切片を脱パラフィンし、再水和し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ９．０）中で６分間オートクレーブすることによる熱誘導抗原賦活化に供した。３％Ｈ2Ｏ2のメタノール溶液と５分間インキュベートした後、ＴＢＳ中で２回洗浄し、組織切片をタンパク質ブロック（ＮｏｖｏＬｉｎｋ（商標））と５分間インキュベートした。その後、サンプルを、抗体希釈物中の一次抗体と混合し、室温で３０分間インキュベートした。ＴＢＳで３回洗浄した後、切片を二次抗体と室温で１０分間インキュベートした。ＴＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＢ試薬（ＮｏｖｏＬｉｎｋ（商標））を用いてサンプルを３分間発色させ、０．０２％ヘマトキシリンで５分間対比染色し、キシレンを用いてマウントした。最後に、倒立顕微鏡（ＩＸ７１；オリンパス社製、東京、日本）を用いて切片を可視化した。
【０１４６】
統計解析．データは平均値±ＳＤで表される。Ｐ＜０．０５の値を統計的に有意と見なした。
【０１４７】
ＦＮＩＩＩ  ９−１０（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）によるＡ３７５腫瘍成長の阻害
ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）が抗血管新生活性を有していたことから、これが病的血管新生を抑制できるかどうかを調べることにした。腫瘍成長は血管新生依存的であり、血管新生の抑制は腫瘍成長を阻害することが示されている。ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）の抗腫瘍活性の可能性を調べるために、本発明者らはヒトＡ３７５メラノーマ異種移植片を用いた。フローサイトメトリー分析により、Ａ３７５腫瘍細胞上でインテグリンα５β１が過剰発現していることが示された。ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）のインビボ皮下投与は腫瘍成長を用量依存的に抑制した。３週間処理した後、腫瘍の体積及び重量の減少が観察された（図１３参照）。全身腫瘍組織量（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）において観察された異常の細胞的根拠を解明するために、本発明者らは、適切なマーカーを用いてパラフィン包埋腫瘍切片の免疫組織化学的検査を行うことにより、Ａ３７５誘導腫瘍の増殖及び血管新生へのＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）の影響を評価した。細胞のＫｉ６７発現レベルの量に反映されるように、腫瘍は非常にわずかな増殖状態の欠損を示した。これは、ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）が腫瘍細胞増殖に対するわずかな阻害を示した本発明者らのインビトロの結果と一致する。観察された成長欠損の別の説明可能性として、以前にβ１インテグリンが腫瘍血管新生の促進に関係付けられていることから、腫瘍脈管構造を効率的にリクルートできないことによるものである可能性がある。この可能性を調べるために、本発明者らは、抗ＣＤ３１抗体を用いて
腫瘍の免疫組織化学分析を行った。興味深いことに、タンパク質で処理した腫瘍は、能力のあるその対応物と比べて、異なるＣＤ３１染色パターンを示した。タンパク質処理腫瘍内の総血管で観察されたＣＤ３１陽性ピクセルの数は、平均でほぼ１倍減少していた。ＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）処理腫瘍の新血管形成は対照腫瘍と比べて有意に減少した（図１３参照）。これらの結果は、Ａ３７５誘導腫瘍で観察された腫瘍浸潤管の平均直径の減少を反映しており、これらの腫瘍への血液供給の全体的低下を示唆した。これはＦＮＩＩＩ  ９−１０  Ｌ１４０８Ｐ（ＣＲＡＲＧＤＮＰＤＣ）バリアント（配列番号３２）が管形成及びマトリゲルプラグアッセイで有意な抑制を示した本発明者らのインビトロでの結果と一致する。総合すると、これらの観察結果は、インテグリンα５β１アンタゴニスト処理による、Ａ３７５で誘導される腫瘍の成長及び進行の欠損が、血管新生の減少と相関するが腫瘍細胞生存とは相関しないことを示している。
【０１４８】
ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）によるＡ５４９腫瘍成長の阻害
ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）が抗血管新生活性を有していたことから、本発明者らは、これが病的血管新生を抑制できるかどうかを決定することにした。10Ｆｎ３（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）の抗腫瘍活性の可能性を調べるために、本発明者らはヒトＡ５４９メラノーマ異種移植片を用いた。フローサイトメトリー分析により、Ａ５４９腫瘍細胞上でインテグリンαｖβ３が過剰発現していないことが示された。驚くべきことに、ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）の生体内皮下投与は腫瘍成長を用量依存的に抑制した。３週間の処理後、腫瘍の体積及び重量の減少が観察された（図１４参照）。観察された全身腫瘍組織量の欠損の細胞的根拠を解明するために、本発明者らは、適切なマーカーを用いてパラフィン包埋腫瘍切片に免疫組織学的検査を行うことにより、ＦＮＩＩＩ  １０（ＣＰＲＧＤＭＰＤＣ）バリアント（配列番号６）のＡ３７５誘導腫瘍の増殖及び血管新生への影響を評価した。細胞Ｋｉ６７発現レベルの量に反映されるように、腫瘍は増殖状態の劇的な欠損を示した（図１４参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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