(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトJagged 1のDelta/Serrate/LAG-2配列(DSL)ドメインを含む配列番号77の一部を含むエピトープを特異的に認識し、ヒトJagged 1とNotch及びCD46からなる群より選択される受容体との相互作用を阻害する抗体であって、前記のヒトJagged 1のDSLドメインの一部が残基E228を含む、抗体。
【請求項２】
前記抗体が、ヒトJagged 1と、ヒトNotch 1、ヒトNotch 2、ヒトNotch 3、ヒトNotch 4、マウスNotch 1、マウスNotch 2、マウスNotch 3、マウスNotch 4、ヒトCD46からなる群より選択される受容体との相互作用を阻害する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、ヒトDelta様リガンド4を特異的に認識しない、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、ヒトDelta様リガンド4とNotchとの相互作用を阻害しない、請求項１〜３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、ヒトDelta様リガンド4と、ヒトNotch 1、ヒトNotch 2、ヒトNotch 3、ヒトNotch 4、マウスNotch 1、マウスNotch 2、マウスNotch 3、マウスNotch 4からなる群より選択される受容体との相互作用を阻害しない、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、ヒトJagged 2を特異的に認識しない、請求項１〜５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、ヒトJagged 2とNotchとの相互作用を特異的に認識しない、請求項１〜６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、ヒトJagged 2と、ヒトNotch 1、ヒトNotch 2、ヒトNotch 3、ヒトNotch 4、マウスNotch 1、マウスNotch 2、マウスNotch 3、マウスNotch 4からなる群より選択される受容体相互作用を阻害しない、請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、マウスJagged 1と、Notch及びCD46からなる群より選択される受容体との相互作用を阻害しない、請求項１〜８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、マウスJagged 1と、ヒトNotch 1、ヒトNotch 2、ヒトNotch 3、ヒトNotch 4、マウスNotch 1、マウスNotch 2、マウスNotch 3、マウスNotch 4、及びヒトCD46からなる群より選択される受容体との相互作用を阻害しない、請求項１〜９の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3が、
それぞれ配列番号１〜６のアミノ酸配列；
それぞれ配列番号７〜１２（ここで任意により、前記抗体のCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3が、それぞれ配列番号７９〜８１のアミノ酸配列を有する）；
それぞれ配列番号１３〜１８のアミノ酸配列；或いは
それぞれ配列番号１９〜２４のアミノ酸配列
を有する、請求項１〜１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3が、
それぞれ配列番号１、２６、及び３；又は
それぞれ配列番号１、２７、及び３
のアミノ酸配列を有し、
CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3が、
それぞれ配列番号４、５、及び６；
それぞれ配列番号４、２９、及び６；又は
それぞれ配列番号４、３０、及び６
のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
軽鎖可変領域（VL）及び重鎖可変領域（VH）が、
それぞれ配列番号６８及び７３；
それぞれ配列番号６８及び７４；
それぞれ配列番号６８及び７５；
それぞれ配列番号６８及び７６；
それぞれ配列番号６９及び７３；
それぞれ配列番号６９及び７４；
それぞれ配列番号６９及び７５；
それぞれ配列番号６９及び７６；
それぞれ配列番号７０及び７３；
それぞれ配列番号７０及び７４；
それぞれ配列番号７０及び７５；又は
それぞれ配列番号７０及び７６
のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3が、
それぞれ配列番号１３、１４、及び１５；
それぞれ配列番号１３、３１、及び１５；
それぞれ配列番号１３、３２、及び１５；又は
それぞれ配列番号１３、３３、及び１５
のアミノ酸配列を有し、
CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3が、
それぞれ配列番号１６、１７、及び１８；又は
それぞれ配列番号１６、３４、及び１８
のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
軽鎖可変領域（VL）及び重鎖可変領域（VH）が、
それぞれ配列番号５８及び６３；
それぞれ配列番号５８及び６４；
それぞれ配列番号５８及び６５；
それぞれ配列番号５８及び６６；
それぞれ配列番号５９及び６３；
それぞれ配列番号５９及び６４；
それぞれ配列番号５９及び６５；
それぞれ配列番号５９及び６６ 
それぞれ配列番号６０及び６３；
それぞれ配列番号６０及び６４；
それぞれ配列番号６０及び６５； 
それぞれ配列番号６０及び６６；
それぞれ配列番号６１及び６３；
それぞれ配列番号６１及び６４；
それぞれ配列番号６１及び６５；又は
それぞれ配列番号６１及び６６
のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか一項に記載の抗体と、医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び／又は、少なくとも１つの更なる治療剤とを含む医薬組成物。
【請求項１７】
治療に使用される、請求項１〜１５の何れか一項に記載の抗体、或いは請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記治療が併用療法である、請求項１７に記載の抗体又は組成物。
【請求項１９】
前記併用療法が、請求項１〜１５の何れか一項に記載の抗体、或いは、請求項１６に記載の医薬組成物の投与と、少なくとも１つの化学療法剤、放射線治療、少なくとも１つの更なる抗体、及び／又は、少なくとも１つのサイトカインの適用とを含む、請求項１８に記載の抗体又は組成物。
【請求項２０】
腫瘍／癌の治療に使用される、請求項１７〜１９の何れか一項に記載の抗体又は組成物。
【請求項２１】
腫瘍／癌が、膵癌、B-細胞慢性リンパ性白血病、舌扁平上皮癌、神経膠腫、腎癌、急性白血病、急性骨髄白血病、子宮内膜癌、結腸直腸癌、膠芽腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、エナメル上皮腫、バレット食道腺癌、肺癌、髄芽腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、頭頸部癌、子宮頸癌、B-細胞慢性リンパ性白血病、びまん性大B-細胞リンパ腫、皮膚原発CD30+リンパ球増殖障害、ホジキンリンパ腫、黒色腫、肝細胞癌、癌幹細胞含有腫瘍／癌からなる群より選択される、請求項２０に記載の抗体又は組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１５の何れか一項に記載の抗体を含有及び／又は分泌するハイブリドーマ。
【請求項２３】
組換型の請求項１〜１５の何れか一項に記載の抗体を発現する細胞又は細胞株。
【請求項２４】
請求項１〜１５の何れか一項に記載の抗体を発現しうる組換発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Jagged 1に結合する治療的抗体、そのような抗体を含有する医薬組成物、及び治療におけるそのような抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、その様々な形において、先進国における主な死因のひとつであり、且つこれらの疾患に罹患した多くの患者を効果的に治療することの失敗は、新たな治療戦略の継続的な研究へと駆り立てている。血管新生は、新規血管が予め存在する血管から成長する生理的過程である。これは、正常な成長及び発達における生命維持プロセスであるが、また酸素及び栄養素を成長している腫瘍に供給するために必要な血管系を提供することにより、癌などの病的状態においても重要な役割を果たす。血管新生は、VEGF及びNotchにより制御される経路などの、多くの経路間の複雑な相互作用により調節される。血管新生の臨床的関連性は、このプロセスを癌治療の論理的根拠のある標的として確実に確立した[1、2]。
【０００３】
抗-VEGF抗体による腫瘍血管新生の標的化は、戦略上成功しつつあり、ベバシズマブは、単剤として又は併用療法のいずれかにおいて、いくつかの腫瘍型について認可され始めている[3]。しかし多くの患者は、反応しないか、又はそれらの反応は一時的である[1]。VEGFR1、VEGFR2、ニューロピリン受容体及びPLGFに対する抗体を含む、VEGF経路の他の成分を標的化する努力もなされている[4]。これらの抗体の毒性は、VEGFRを標的化する小型分子阻害剤の毒性よりも、はるかに低いことは注目され、このことははるかに大きい特異性及び少ない非特異的(off target)作用を暗示している。
【０００４】
Notch経路は、血管ホメオスタシス及びパターン形成において並びに病的血管新生に関与し、このことは治療的恩恵のためにNotch経路を変更する研究を促進している[5]。Notchシグナル伝達は、膜結合型受容体(Notch1-4)及びリガンド(Dll1、3及び4並びにJagged 1及び2)により媒介される。実際、Notch1、Notch3、Notch4、Dll1、Dll4及びJagged1は、血管系の細胞において発現され、且つNotch1[6]、Dll1[7]及びJagged 1[8]ノックアウトマウスは、血管欠損のために胚性致死であるのに対し、Dll4はハプロ不全であり[9]、従ってNotchシグナル伝達は、完全に機能する血管系を作製するために細かく調節されることを必要とすることを示唆している。実際Notch経路変異は、CADASILにおけるNOTCH3変異[10]及びアラジール症候群におけるJAGGED1変異[11]により、血管欠損を示すヒト疾患に関連している。
【０００５】
Notchリガンドの、そのDelta/Serrate/Lag2(DSL)ドメインを介した、Notch受容体のEGF11-12領域への結合は、該受容体のタンパク質分解性の切断及びその細胞内ドメイン(NICD)への放出の引き金をひく。このプロセシングは、2種のプロテアーゼ、すなわち腫瘍壊死因子α-転換酵素(TACE)及びプレセニリン/γ-セクレターゼ(プレセニリン1又は2と、ニカストリン、Pen-2及びAph-1により作製された巨大なプロテアーゼ複合体)の活性を必要とする。引き続きのNICDの核移行は、組換えシグナル配列-結合タンパク質(RBP-Jk)及び転写活性化因子Mastermind-様タンパク質(MAML)としても公知の、転写因子のCSLファミリーメンバー(CBF1、無毛抑制因子、及びLag-1)と、NICDの相互作用を介した、Hes/E(spl)及びHey/Hesrファミリーの遺伝子の転写活性化を生じる。次に、転写抑制因子であるHes及びHeyタンパク質は、細胞分化の運命を選ぶよう駆動する遺伝子の発現を阻害する[12]。
【０００６】
血管新生における重要な役割を果たすことに加え、Notch経路はまた、腫瘍細胞の発癌経路として関与し、ここでこれは、幹細胞集団の維持を補助し、細胞生存を促進し、アポトーシスを阻害し、且つ細胞増殖を駆動することができる([13]において検証)。NOTCH1における変異の活性化は、T細胞性急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)のおよそ56％において同定され[14]；ここで、これらは主に、この受容体のリガンド-依存型活性化又はPESTドメインの変異のいずれかを誘導するように作用し、結果的にNotch1細胞内ドメイン(NICD)の安定性を増大する。NOTCH1変異の活性化はまた、B細胞性慢性リンパ球性白血病(B-CLL)[15、16]、及びマントル細胞リンパ腫[17]において同定され、且つこれらの異常は、予後不良と相関し、このことは、これらは治療的介入のための個別の臨床亜型を規定することを示唆している。NOTCH2変異は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)の8％において検出され、機能獲得型変異であることが機能的に明らかにされた[18]。遺伝病巣の証拠がない異常なNotchシグナル伝達もまた、乳癌、腎癌、膵癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、脳腫瘍、腸癌、肺癌及び皮膚癌を含む固形腫瘍において報告された[19]。Notchの多面的機能は、この経路はまた、いくつかの状況において、腫瘍抑制因子の役割を有し得ることを意味する([20、21]により検証)。しかし、症例の大半において、Notchシグナル伝達は、腫瘍成長を促進する。
【０００７】
従ってNotch阻害は、癌治療への有望な新規アプローチを保持し、且つおそらく放射線治療及び化学療法を含む他の薬剤との併用において、特に有用であるように見える[13]。γ-セクレターゼインヒビターによる汎-Notch阻害の初期の研究は、胃腸毒性を示した一方で；抗-Dll4抗体による長期治療は、血管芽細胞腫に類似した血管/内皮細胞-ベースの腫瘍の発達に繋がった([13]により検証)。より最近になって、個々のNotch受容体を機能的に阻害する抗体は、腸管毒性を伴わずに、抗-腫瘍作用を示した[22、23]。個々のNotchリガンドの役割を研究するために目標となる誘導性腸管特異的遺伝子を使用する更なる分析は、Dll1及びDll4-媒介性Notchシグナル伝達が、小腸幹細胞のホメオスタシスに必要とされるのに対し、Jagged 1の欠失は、腸上皮を無秩序にしなかったことを明らかにした[24]。従って複数のNotch受容体を介して、Jagged 1活性化されたシグナル伝達を標的化することは、胃腸毒性に対する有害作用なしに実現可能であるはずである。
【０００８】
Dll4は、腫瘍血管系において高度に発現され、且つこれは異種移植片モデルにおいて腫瘍血管新生を調節することにより、腫瘍成長に影響を及ぼし[25-28]、より少ないがより機能的な血管を生じる。可溶性Dll4又は抗-Dll4抗体のいずれかの発現によるDll4シグナル伝達の遮断は、VEGF阻害に抵抗性である腫瘍においても、腫瘍成長を減少し[25]、このことはこの経路を治療的標的として確認した。興味深いことに、Dll4シグナル伝達は、Jagged 1の発現を誘導する[29]。このことは、Jagged 1のNotchリガンドは、腫瘍血管新生におけるDll4-Notchシグナル伝達の極めて重要な下流エフェクターであり得ることを示唆している。加えて、Jagged 1受容体及びNotch受容体の高い発現レベルに起因した過剰なNotchシグナル伝達が、いくつかの癌において説明されている。例えば、乳癌におけるJagged 1及びNotch1の過剰発現は、高-レベル共-発現の相乗作用を伴う、全生存の不良に関連している[30]。加えて扁平上皮癌細胞におけるJagged 1の発現は、血管新生を誘導し、Notch1の4種の受容体は、成人血管新生にとって極めて重要であることが知られている[31、32]。興味深いことに、癌細胞から内皮へのJagged 1-引き金を引いたNotchシグナル伝達は、血管新生を誘導し、これはDll4により誘導された血管よりも小さい血管を作製することが示された。
【０００９】
成体におけるほとんどの血管は、少なくとも2種の細胞型、内皮細胞(EC)及び壁細胞(周皮細胞又は血管平滑筋細胞(VSMC))からなる。周皮細胞は、内皮の周りを覆い、生じる血管の安定化機能及び血行動態機能において極めて重要な役割を果たす。近年、EC及び周皮細胞の両方の細胞型が、固形腫瘍の酸素を枯渇することを目的として、効果的に標的化されている。興味深いことに、Notchシグナル伝達は、これらの両細胞型の発達にとって極めて重要であることが示された[5]。
【００１０】
血管を新たに形成するための周皮細胞及び血管平滑筋細胞(VSMC)の動員は、血管成熟及び内皮細胞の静止期への復帰のための極めて重要な段階である。10年程前、周皮細胞は、未熟な血管を安定化し、血管リモデリングの可塑期(plasticity period)を終結することが示された[33]。加えて周皮細胞による高度な血管被覆は、腫瘍血管を安定化するために極めて重要である。未熟又は貧弱に被覆された腫瘍血管は、VEGF-A/VEGFR2シグナル伝達に大きく左右され、結果的にベバシズマブなどの抗-VEGF治療に対し脆弱である。しかし今日まで、抗-VEGF治療後の残存血管の生存の基礎となる機序は、完全にはわかっていない。残存血管は、より大きい周皮細胞被覆を有するように見え、このことはこの細胞型は、これらの抗血管新生治療の有効性を制限し得ることを示唆している[34、35]。興味深いことに、Jagged 1のEC特異的欠失は、胚性致死及び心臓血管系欠損を誘導することが最近示されたが、これは、ECにおける損なわれたNotch1シグナル伝達又は動脈−静脈分化時に起因するものではなかった。代わりにECにおけるJagged 1発現の欠失は、VSMCによる貧弱な血管被覆に関連し、このことは引き続き変異体胚の発達の停止を生じた[36]。従ってJagged 1/Notchシグナル伝達経路は、血管被覆の調節因子としてのその機能を基に、特に抗-VEGF治療と併用する場合、固形腫瘍の治療にとって強力な治療的恩恵を有する魅力的な標的としてそれ自身を提示している。従ってJagged 1-Notchシグナル伝達の遮断を目的とした抗体は、3種の異なるレベル、すなわち内皮細胞、壁細胞及び腫瘍細胞で腫瘍を標的化することにより、臨床上恩恵を有し得る。
【００１１】
制御性T細胞(Treg)は、膨大な腫瘍型において腫瘍を浸潤する。それらの数は、臨床的に関連することが多く、Tregは、抗-腫瘍免疫を抑制し且つ血管新生を促進するそれらの能力を含む、多様な役割を有する(最近[80、81]により検証)。抗原-提示細胞によるJ1の過剰発現は、ヒト抗原-特異性Tregを誘導し、ウイルス抗原に対する免疫応答を修飾することができる[82]。J1などのNotchリガンドもまた、Treg上に発現され、並びにJ1又はN1を標的化する抗体を使用するNotchシグナル伝達の遮断は、Treg抑制因子機能を阻害した[83]。更に、CD4+CD25-エフェクターT細胞のJ1への予備曝露は、Treg-媒介性抑制に対するそれらの感度を有意に上昇した[84]。従って、腫瘍微小環境における免疫調節細胞集団に対するJ1の標的化もまた、腫瘍抗原に対する宿主の免疫応答を改善する機会をもたらす。
【００１２】
Jagged 1はまた、Notchファミリー以外の受容体のリガンドであり得ることを示唆する、新たな証拠が存在する。CD46(MCP)は、当初補体調節タンパク質として、その後ウイルス感染を可能にする細胞内侵入受容体として発見された、遍在的に発現されたヒトI型膜貫通糖タンパク質である。興味深いことに、腫瘍選択性侵入受容体としてそれらの増大されたCD46発現を使用する腫瘍のウイルス標的化は、複数の癌型における治療及び造影を促進する戦略として使用されている[37]。抗癌適用は、乳癌[39]、髄芽腫[40]、神経膠腫[41]及び再発性卵巣癌[42]を含む癌細胞の、ウイルス性誘導された細胞変性効果及びシンシチウム形成による直接標的化[38]；肺腺癌における、遺伝子治療標的化[43]；並びに、前立腺癌の放射線ウイルス療法[44]を含む。より最近には、インターフェロン-γ分泌するエフェクターヒト1型ヘルパーT細胞(TH1)の同時刺激並びにそれらの引き続きのIL-10-産生する制御性T細胞へのスイッチにおける免疫調節の役割が同定された([45]により検証)。
【００１３】
最近検証された補体系及び癌に関する考慮すべき文献が存在する[46、47]。ほとんどの腫瘍は、細胞表面上に可溶性調節因子又は膜結合型補体受容体(CD35、CD46、CD55及びCD59)のいずれかを発現し、結果的に補体系の活性化を抑制し、腫瘍クリアランスにおけるその役割を消失する。腫瘍上のCD46、CD55及びCD59の過剰発現は、直接の補体溶解から腫瘍を保護することは、良く確立されている。更に治療的抗体(リツキシマブなど)は、腫瘍細胞を死滅させるために、補体依存性細胞傷害(CDC)を使用し、この活性は、例えば抗体の遮断を使用する、膜結合型補体受容体の標的化により増大することができる。
【００１４】
腫瘍におけるCD46アップレギュレーションは、広範に報告されており、例としては、膀胱癌の77％においてアップレギュレートされた発現[48]、及び頭頸部扁平上皮癌における高い発現[49]を含む。CD46発現は、初代多発性骨髄腫細胞において、骨髄における様々な系統の正常造血細胞よりも、より豊富であった[50]。CD46のRNAi媒介型ノックダウンは、CD46を過剰発現している膵癌細胞の成長を有意に阻害した[51]。CD46+卵巣癌患者の予後[53]のように、CD46発現を伴う乳癌は、予後が余り好ましくない[52]。miRNAを介したMCF7及びMDA-MB-231乳癌細胞株におけるCD46のダウンレギュレーションは、代替経路により癌細胞のオプソニン化を誘導し、補体活性化を生じる[54]。Du145細胞(前立腺)、BT474細胞(乳房)及びK562細胞(赤白血病)におけるCD46のRNAi標的化も同じく、C3オプソニン化を有意に増大した[55]。子宮頸癌細胞におけるCD46及びDAFのshRNA標的化は、補体媒介性溶解を増強し[56]、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの、補体攻撃に対しCD55及びCD46増感された腫瘍細胞のダウンレギュレートを増強した[57]。
【００１５】
一部のCD46の生物学的活性化は、既知のリガンド、例えばC3bとのその相互作用により説明することができず、従ってこの受容体に関して別のリガンドが存在するという推論が存在する。最近の研究において、CD4+ T細胞上のCD46の活性化は、Notch及びそのリガンドの発現を調節することが示され、更にJagged 1が、CD46の追加の生理的リガンドとして同定された[45]。更にこの相互作用が重要であることの証拠は、CD46又はJagged 1をコードしている遺伝子に変異を持つ患者は、再発性感染症を含む重要な生物学的特徴を共有することであった。これらの患者において、TH2細胞のT細胞増殖及びエフェクター機能は影響を受けないが、TH1細胞のインビトロ誘導(又は調節)は重度に損なわれるか又は存在せず、且つIL-2ファミリーのサイトカインに対する変更された反応性に関与するように見えた。最も重要な細胞表面受容体表現型は、T細胞ホメオスタシス並びにTH1及びTH17反応の増強に必要な、IL-7受容体の成分CD127及びCD132のダウンレギュレーションであった。CD127はまた、主要組織適合性複合体とは無関係の、多発性硬化症の強力なリスクのある遺伝子座であることがわかっている。
【００１６】
Jagged 1結合部位は、CD46のCCP1及びCCP2ドメインに局在化され、これらは、アデノウイルスknobタンパク質又は麻疹ウイルス赤血球凝集素などのウイルス性リガンドにより一般に結合されたドメインである。このJagged 1結合は、DSLドメイン及び最初の3つのEGF-様ドメインを含む組換えJagged 1 DSL-EGF3断片により媒介され、これはJagged 1中のCD46-及びNotch 1結合部位は、該タンパク質の同じ領域に位置することを表している。Jagged 1相互作用の結合親和性を測定するための表面プラズモン共鳴実験は、CD46は、可溶性Notch 1(EGF11-13)融合タンパク質よりもJagged 1とより緊密な相互作用を示したことを示唆した。これは、T細胞表面上のCD46の存在は、Notch 1とJagged 1の相互作用を制限することを示唆するデータと一致した。従って補体と、エフェクターT細胞機能を必要とし且つ他の生物学的プロセス、特に癌において重要な役割を果たし得るNotchシステムの間には、重要なクロストークが存在する。
【００１７】
従ってDSLドメイン及び／又は最初の3つのEGFリピートを標的化する抗-Jagged 1抗体はまた、CD46とJagged 1の間の相互作用も遮断する。一部の治療効果は、Notchシステムにより媒介されるが、これらの被験物質(reagent)はまた、CD46が関与する追加の経路も標的化し得る。
【００１８】
Jagged 1の細胞外ドメインは、全てのNotchリガンドと共有された構造上の特徴を有し、これらは、Delta/Serrate/Lag-2 (DSL)ドメイン及び変動数の上皮細胞増殖因子-様(EGF)ドメインの存在である。構造が伝える変異誘発と組合せたヒトJagged 1機能断片(DSL-EGF1-3)の結晶学的研究は、DSLドメインの残基199-207は、Notch結合において重要な役割を有することを明らかにした(Cordleら、2008 [65]、この論文は引用により本明細書中に組み込まれている)。同じ研究は、EGF12ドメインに対しNotch 1上の支配的相互作用部位をマッピングした。
【００１９】
US 2008/0317760は、マウスにおいてヒトJagged 1の残基24-1060に対して生じた一連のモノクローナル抗体を、EGF1ドメインに対するエピトープマッピングと共に、開示している。一つの抗体は、Jagged 1-Notch1会合を阻害することが可能であり、且つマウスの異種移植片モデルにおける腫瘍成長を減少するものとして同定された。従って抗体-ベースの治療の状況において、ヒトJagged 1のDSLドメインの標的化は、Notchなどの内在性受容体への結合の阻害に必須ではなく、結果的にJagged 1-媒介性シグナル伝達をダウンレギュレートしたことは、明らかである。
【００２０】
WO 2011/063237は、抗-Jagged 1モノクローナル抗体を更に開示しており、この場合これは、マウスJagged 1の残基1-1060によるマウスの免疫化により産生され、ファージディスプレーを使用する合成ライブラリーからヒトJagged 1細胞外ドメイン-認識するFab断片を同定した。これらは、ヒト及びマウスの両方のJagged 1に同様の親和性で結合し、一つを除き全て、ヒトJagged 2を認識することがわかった。更にいくつかの抗体は、ヒトNotch 2へのヒトJagged 1の結合を妨害し、Jagged-媒介性シグナル伝達を阻害し且つマウスの異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を減少した。しかし、WO 2011/063237に開示された抗体により認識されたエピトープは、Jagged 1タンパク質内の個別の領域又はドメインに対しマッピングすることはできなかった。
【００２１】
先行技術を考慮し、ヒトJagged 1上の規定されたエピトープを認識する治療的抗-Jagged 1モノクローナル抗体、更にEGFドメインとは異なる抗体、並びに治療における使用について好適な有効性を伴うJagged 1-媒介性シグナル伝達及び腫瘍成長を阻害する抗体の提供について、論理的根拠が存在する。例えばイマチニブ-耐性慢性骨髄性白血病の症例のように、単独の残基の変異に起因した、癌治療薬に対する獲得耐性の出現はよく文書化されている[85]ので、同じ標的に対し予め存在する抗体により認識されるエピトープとは異なることがわかっている規定されたエピトープを伴う治療的抗体の提供は、併用療法の状況において治療的価値がある。更に、異なるタンパク質のEGFドメイン間のモノクローナル抗体の交差反応性は、例えばCD97とEMR2の場合において、先に報告されている[86]。
【００２２】
従って、好ましくはEGFドメインとは異なる、Jagged 1上の規定されたエピトープへの結合により、ヒトJagged 1とNotch/CD46の間の相互作用を阻害することが可能である追加の抗体が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、新規エピトープを介して、ヒトJagged 1(Jag1又はJ1とも称される)のDelta/Serrate/LAG-2(DSL)ドメインへ結合する抗体の同定及び分子特徴づけを基にしている。該抗体は、ヒトJagged 1-受容体相互作用を効果的に遮断し、且つインビトロにおいて、腫瘍細胞株におけるJagged 1-媒介性シグナル伝達を阻害し、結果的に癌治療における使用に関するそれらの好適性を指摘する。
【００２４】
Cordleら(2008)は、ヒトJagged 1 DSLドメインの残基199-207が、Notch受容体結合における重要な役割を有することを確定した[65]。従って本発明者らは、前述の望ましい特性を伴う数多くの抗体を作出し、これらは全て、DSLドメイン残基E228を含むとのみ一般に規定され得るエピトープを認識することに、驚いた。
【００２５】
本発明の第一の態様によると、本発明は、ヒトJagged 1のDelta/Serrate/LAG-2コンセンサス配列(DSL)ドメインの一部を含むエピトープを特異的に認識し、ヒトJagged 1とNotchファミリー及びCD46からなる群より選択される受容体との相互作用を遮断する抗体であって；ここで該ヒトJagged 1のDSLドメインの一部が残基E228を含む、抗体を提供する。
【００２６】
本発明の第二の態様によると、本発明は、先に規定した抗体を、医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤、アジュバント及び／又は少なくとも1種の追加治療剤と共に含有する、医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明の第三の態様によると、本発明は、治療における先に規定した抗体又は医薬組成物の使用を提供する。
【００２８】
本発明の第四の態様によると、本発明は、先に規定した抗体を含有及び／又は分泌するハイブリドーマを提供する。
本発明の第五の態様によると、本発明は、組換型の先に規定した抗体を発現する細胞又は細胞株を提供する。
【００２９】
本発明の第六の態様によると、本発明の抗体を発現することが可能な発現ベクターが存在する。
【００３０】
本発明は、添付する図面を参照し、説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図1は、J1モノクローナル抗体(mAb)による、Jagged 1発現細胞(J1)への、Notch 1(N1)の結合の遮断(A)、及びJ1組換えタンパク質へのCD46結合の遮断(B)を示す。(A)細胞表面J1を認識した21種のハイブリドーマ上清を、細胞発現された完全長ヒトJ1(hJ1；HEK293トランスフェクタント)又はマウスJ1(mJ1；B16F10トランスフェクタント)と、アビジン-コートされたビーズへ結合されたビオチン化されたN1-EGF11-13可溶性組換えタンパク質の間の相互作用を遮断するそれらの能力について、フローサイトメーターによりスクリーニングした(細線は結合を示している)。ヒトフィブリリン1由来の対照タンパク質cbEGF12-14では、結合は認められなかった(灰色影)。完全抗体(J1-65D、J1-156A、J1-183D)又は部分抗体(J1-187B)の4種はいずれも、ヒトN1のヒトJ1への結合を遮断し、これは太線が灰色影と完全に重複するか、又は細線から灰色影に移動した場合に認められた。J1-142Bと称される抗体は、本発明の抗体ではないが、陽性対照としてmJ1-N1結合の部分的遮断を明らかにしている。(B)ビオチン化されたJ1 DSL-EGF3により固定されたCD46(CCP1-CCP3)との相互作用(黒色実線)及びFACS陽性ハイブリドーマ上清の存在下での相互作用(灰色実線)のELISAアッセイ。斜線付き影で表された対照アッセイ(左端及び右端)は、CD46又はビオチン化されたJ1 DSL-EGF3のみを含んだ。Notch 1/Jagged 1遮断するmAbであるJ1-65D、J1-156A、J1-183D及びJ1-187Bは、アスタリスクにより示した。このELISAアッセイにおいて、これらの遮断性抗体の可変性の阻害作用が認められた。しかし天然に発現された完全長Jagged 1による細胞-ベースのアッセイが、J1/CD46相互作用に対するそれらの作用を証明するために必要とされた。
【００３２】
【図２】図2は、J1及びJ2トランスフェクタントのJ1 mAbによる免疫細胞化学染色を示している。空ベクター(293)又は完全長ヒトJ1若しくはJagged 2(J2)をコードしているプラスミドによりトランスフェクションしたHEK293細胞のサイトスピン調製品を、J1 mAbを含むハイブリドーマ上清により免疫標識した。J2に対する市販の抗体を陽性対照(下側右)として使用し、組換えJ2のトランスフェクション及び発現を確認した。J1 mAbは、免疫ペルオキシダーゼ標識により、J2との交差反応性を示さなかった。
【００３３】
【図３】図3は、J1 mAbのNotchリガンド特異性のFACS分析を示す。ヒトJ1又はJ2によりトランスフェクトされたHEK293細胞及びヒトDLL4(hDLL4)又はmJ1によりトランスフェクトされたB16F10細胞を、J1 mAb(10μg/ml)によりFACS染色し、引き続き抗-マウス-APC二次抗体により染色した。全ての抗体は、ヒトJ1を染色したが、mJ1に対する弱い種交差反応性が、J1-65D及びJ1-183Dのみで観察された。J1-156A及びJ1-187Bにより有意でない結合が、hDLL4に対し認められたが、弱い結合が、J2に対し認められた。細胞表面上のJ2発現は、市販の抗体を用いて確認され；hDLL4及びmJ1の発現は、GFP同時-発現の検出により確認された。J1-142Bと称される抗体は、本発明の抗体ではないが、B16F10トランスフェクタント上の細胞表面mJ1の存在を明らかにする陽性対照として働く。
【００３４】
【図４】図4は、J1 mAbのオルソログ種結合特異性を示す。(A)ヒト(hJ1)、マウス(mJ1)、ウサギ、モルモット及びラット(rJ1)のJ1タンパク質に対応する配列を伴うDSLドメイン及び隣接3つのEGFリピート(DSL-EGF3)は、CD1b分子の一部との融合により、細胞表面上に発現された。N-末端FLAGタグ及びC-末端GFPタグを追加した。(B)HEK293T細胞を、前記ハイブリッド構築体により、トランスフェクションし、且つ細胞を48時間後に染色した。mAb結合強度(MFI)を、同じ試料への抗-FLAG mAb染色の強度と比較した(n=2)。(D)次にパネルBに例示した実験を繰り返し、ヒト、マウス又はラットのJ1タンパク質への抗体結合を比較した。(C)種を超えたDSL-EGF3配列のアラインメント。(E)ラット脾臓由来の初代接着細胞を、APC-複合型mAb J1-65D又はJ1-183Dにより免疫標識し、Jagged 1発現を、FACSにより検出した。J1-142Bと称される抗体は、本発明の抗体ではないが、mJ1の特異的認識を例示する陽性対照として働く。
【００３５】
【図５】図5は、内在性J1及びshRNAによるJ1タンパク質発現のノックダウンの染色を示す。MDA-MB-231細胞を、Mission J1 shRNAをコードしているレンチウイルスにより形質導入し、並びにJ1発現レベルを、形質導入後7日目にFACSにより検出した。J1 shRNAは、J1 mAb染色により可視化されるように、Jagged-1発現を、うまくノックダウンした。
【００３６】
【図６】図6は、J1 mAbに関するエピトープマッピングを示す。(A)J1 DSLドメインへのmAb結合に関するELISAスクリーニング。ハイブリドーマ上清を、DSLドメイン単独(DSL)及び／又はDSLドメインと最初の3つのEGFリピート(DSL-EGF3)を含む可溶性で細菌性に発現され且つインビトロにおいてリフォールディングされたJ1組換えタンパク質への結合について、ELISAによりスクリーニングした。21種のFACS陽性抗体のうち、13種は、DSLドメイン単独に結合することができ、そのうちの4種のみが、遮断活性を示した。(B)J1 mAbエピトープのドットブロットマッピング。DSLドメイン内の重要なアミノ酸は、変異され、且つ可溶性DSL-EGF3組換えタンパク質を、ドットブロットにおいて使用し、mAb結合に関与したアミノ酸を同定した。遮断性mAb(左側パネルに示した)は、ハイブリドーマ上清の1:500希釈で使用し、10ng変異体タンパク質を使用した。
【００３７】
【図７】図7は、優先的ヒトJ1結合に関する分子基礎を同定するエピトープマッピングを示す。(A)マウスJ1において置換されているヒトJ1 DSLドメイン中の残基及びEGF1ドメインの最初の残基。これらの残基(DSLドメインからのY190、E228及びEGF1ドメインからのR231)は、Notchへの結合に関して重要であることが示された残基(F199、R201、R203、R207)に対し近傍であることに注意。(B)ドットブロットマッピングJ1 mAbエピトープ。アミノ酸190及び228は、ヒト及びマウスのJ1 DSLドメイン内で異なるアミノ酸同定を有する。位置190、228及び231でのヒトアミノ酸は、各々マウス配列へ変異された。これらの可溶性DSL-EGF3組換えタンパク質を、ドットブロットにおいて使用し、ヒトタンパク質への優先的mAb結合に関与したアミノ酸を同定した。精製されたmAb J1-65D、J1-156A、J1-183D及びJ1-187Bを、濃度0.02μg/mlで使用し、10ng変異体タンパク質を検出した。J1-142Bのハイブリドーマ上清(1:250)を使用し、0.2μgタンパク質を検出した。抗-His(1:10,000でのQiagen社RGS-His複合体)によるブロティングを使用し、等量のタンパク質が負荷されたことを確認した。本発明の4種のJ1 DSLドメイン標的化抗体は全て、アミノ酸228でのヒトグルタミン酸残基がマウスのアスパラギン酸残基へ変換された場合には、J1結合を欠いていた。J1-142Bと称される抗体は、本発明の抗体ではないが、これは、マウスJ1を特異的に認識する抗体によるこの変異型構築体の認識を明らかにした。(c)抗体を、第一級アミンカップリングを使用し、CM5 Biacoreチップのデキストランマトリックスにカップリングさせ、Jagged 1 DSL-EGF3タンパク質100nMをその上に流した。全ての結合は、WT Jagged 1 DSL-EGF3構築体がその抗体へ結合している画分として報告された。報告された値は、5回の独立した注入から算出された平均+/-標準偏差である。WT＝野生型非変異Jagged1。
【００３８】
【図８】図8は、密接に関連したエピトープを認識するJ1遮断性mAbを示す。HEK293-J1安定した細胞は、指定された濃度で、遮断性mAbの存在下、ビオチン化されたJ1 mAbにより染色した。これらの結果は、これらのmAエピトープは、異なるが、複数のmAbの結合を妨害するのに十分に物理的に近接していることを示唆している。
【００３９】
【図９】図9は、内在性Notchシグナル伝達を表す、J1遮断性mAbを示す。(A)Notch補因子RBPJの制御下で、ルシフェラーゼを発現している結腸直腸癌細胞株LS174Tを、J1 mAb(10μg/ml)の存在下で、哺乳動物細胞-発現された可溶性J1タンパク質(NE3-Fc及びNE12-Fc)又は対照タンパク質により刺激し、且つルシフェラーゼ活性を測定した。(B) (A)と同じ細胞株を、異なる組換えヒトNotchリガンド：J1(NE12-Fc)、J2、DLL4又は対照タンパク質(mIgG2b)により、J1 mAb(J1-65D及びJ1-183D)の存在下で刺激し、ルシフェラーゼ活性を測定し、mAbリガンド特異性は、J2及びDLL4刺激に関して阻害が認められないことを証明した。(C)乳癌MDA-MB-231細胞を、J1 mAbと共に培養した。Notch標的遺伝子HES1の発現レベルを、対照遺伝子としてβ2mを用い、qPCRにより測定した。全ての実験において、γ-セクレターゼインヒビターDBZを、汎Notch阻害に関する陽性対照として使用し、且つ対照mAb(IgG2b又はIgG1)又は非処置(NT)を陰性対照とした。
【００４０】
【図１０】図10は、内在性マウス及び組換えラットJagged1リガンドで刺激されたNotchシグナル伝達に対する、J1 mAb処置の作用を示す。(A)マウスJ1を安定して発現するマウス黒色腫B16F10細胞を、各J1 mAbの10μg/ml又はIgG1対照抗体と共に、7日間培養し、2日毎に、新鮮なmAbを補充した。γ-セクレターゼインヒビターDBZ(100nM)を、Notch阻害の対照として使用した。細胞を収集し、総RNAを抽出し、cDNAを合成した。マウスHes1発現レベルを、リアルタイムPCRにより検出し、GAPDHに対して規準化した。J1-142Bと称される抗体は、本発明の抗体ではないが、マウスHes1発現について、mJ1を特異的に認識し且つmJ1-mN1会合を部分的に遮断する抗体の作用を明らかにする陽性対照として働いた。(B)ヒト乳癌細胞(MDA-MB-231)及び初代内皮細胞(HUVEC)を、組換えラットJagged1(rrJag1-Fc)又は対照タンパク質(mIgG1)でコートされたプレート上で、10μg/mlのJ1 mAb又はアイソタイプ対照Abの存在下で、培養した。24時間後、細胞を収集し、総RNAを抽出し、且つcDNAを合成した。ヒトNotch-標的遺伝子HES1及びHEY2の発現を、リアルタイムPCRにより分析し、β2-ミクログロブリンを、対照遺伝子として使用した。1つの代表的実験の結果を示している。
【００４１】
【図１１】図11は、MDA-MB-231 3-D成長に対する抗体力価の作用を示す。MDA-MB-231乳癌細胞を、異なる濃度のJ1-65D(抗-Jagged 1 mAb)又はmIgG1:対照mAbの存在又は非存在下で、スフェロイドとして成長させた。(A)処置された腫瘍細胞スフェロイドの成長曲線。サイズの定量は、画像分析により行った。(B)HES1 Notch-標的遺伝子発現を、経路阻害の測定値としてqPCRにより分析した。(C)は、プロ-腫瘍形成性サイトカインIL6の発現に対する処置作用を説明する、qPCR分析。
【００４２】
【図１２】図12は、乳癌細胞株におけるJ1発現、及び3-Dスフェロイド成長に対するJ1抗体処置の作用を示す。(A)乳癌細胞株のパネルにおけるJ1細胞表面タンパク質発現。FACS分析は、2種のJ1特異的mAbを使用し、6種の異なる細胞株において行い、真に高い(MDA-MB-231)から陰性(T47D)までのJ1発現レベルの大きい変動性を明らかにした。二次抗体のみの染色を、陰性対照として使用した。その後異なるJ1レベルの細胞株の代表を、3-D培養においてスフェロイドとして成長させ、抗-J1 mAbにより処置した(J1-65D及びJ1-183D；DBZ：γ-セクレターゼインヒビター、Notch阻害の陽性対照；mIgG2b：対照mAb；NT：未処置)。少なくとも2つの独立した実験の1つを示した。(B) MCF7細胞の処置(J1についてほぼ陰性)は、抗-J1mAbによる処置に対し、いかなる有意な作用も示さなかった。(C)MDA-MB-468細胞の処置(低J1レベル)は、抗-J1 mAbの1種(J1-183D)による処置に対し、DBZ処置よりもはるかに緩徐ではあるが、有意な成長減少を示した。(D)高度にJ1発現する細胞株MDA-MB-231の処置は、両方のmAb(J1-65D及びJ1-183D)により、DBZ処置と同じくらい強力な有意な成長の減少を示した。
【００４３】
【図１３】図13は、J1 mAb処置に反応する、MDA-MB-231 3-D成長阻害の分析を示す。MDA-MB-231乳癌細胞は、処置の存在下(10mg/ml J1-65D又はJ1-183D：抗-Jagged1 mAb；DBZ：γ-セクレターゼインヒビター；mIgG2b又はmIgG1：対照mAb)、又は処置の非存在下(NT：未処置)で、スフェロイドとして成長させた。(A)9日間処置時のスフェロイドの代表的画像。(B)HES1 Notch-標的遺伝子発現は、経路阻害の測定値として、qPCRにより分析した。(C)Ki67+細胞の増殖率(％)を、単独の実験からの3-5スフェロイド/処置において、IHCにより評価した。定量は、画像解析により行った。バーは、単独の実験における複数のスフェロイドからの陽性細胞数(％)の平均±SDを表す。(D)処置されたスフェロイドにおける癌幹細胞(CSC)の濃厚化された亜集団CD44+/CD24-のFACS分析(％)。バーは、3回以上の独立した実験の平均±SDを表す。(E)アルデヒドデヒドロゲナーゼを発現している乳癌幹細胞の集団を定量するための処置したスフェロイドのALDEFLUOR(商標)染色(1つの代表的実験)。(F)プロ-腫瘍形成性サイトカインIL6及びEMT関連遺伝子E-カドヘリン及びPRRX1の遺伝子発現に対する処置作用を説明するqPCR分析。バーは、2回以上の独立した実験の平均±SDを表す。
【００４４】
【図１４】図14は、インビトロにおけるMDA-MB-231スフェロイドの3-D成長に対する、J1 mAb-化学療法処置の作用を示す。MDA-MB-231乳癌スフェロイドを、亜致死量の乳癌の標準治療用薬物(A)パクリタキセル(Paclit.)及び(B)ドキソルビシン(Dox.)と組み合わせた、mAb(10μg/ml J1-65D又はmIgG1対照 mAb)により処置した。両方の併用療法は、いずれかの単独治療のみよりも、スフェロイド成長の減少で、より有効であることが証明された。
【００４５】
【図１５】図15は、ヒトJ1過剰-発現は、インビトロ及びインビボの両方において、腫瘍成長を促進することを示す。(A)MDA-MB-231細胞及びU87細胞は、グリーン蛍光タンパク質(GFP)を伴うビシストロン性にヒトJ1をコードしているレトロウイルスにより形質導入した。J1又はベクターを形質導入された細胞を、混合し、親細胞と共培養し、GFP+集団を、FACSにより規則的に35日間モニタリングした。両方の細胞株において、J1発現している細胞は、親細胞株と混合された共培養物において、ベクター形質導入された細胞を上回る成長の利点を示した。(B)J1又はベクター単独により形質導入されたU87細胞を、BALB/c nu/nuマウスへ注射し(n＝7)、腫瘍サイズを規則的に測定し、腫瘍成長をモニタリングした。ヒトJ1を発現しているU87細胞は、インビボにおいて有意な成長の利点を示した。
【００４６】
【図１６】図16は、10mg/kg J1 mAbは、J1過剰発現が誘導した腫瘍過剰成長を遅延するが、20mg/kgではそれらは、J1過剰発現が誘導した腫瘍過剰成長を無効にすることを示している。(A, B)J1又はベクター単独で形質導入されたU87細胞を、BALB/c nu/nuマウスへ注射した(実施例A  U87-Vec-PBS及びU87-J1-183D、n＝7；U87-J1-PBS及びU87-J1-65D、n＝6；実施例B  U87-Vec-PBS、n＝7；他の群：n＝10)。動物は、腫瘍接種と同時に開始した、(A)10mg/kg又は(B)20mg/kgでの、J1-65D、又はJ1-183D mAbの、週2回の腹腔内(i.p.)投与により処置した。対照群には、等容積のPBS、又は20mg/kg対照IgG1 mAbを注射した。腫瘍サイズを、規則的に測定し、腫瘍成長をモニタリングした。腫瘍サイズが、幾何学的平均直径(GMD)15mmに到達した時点で、マウスを屠殺したことを基に、生存曲線を作製した。*、(A)U87-J1-PBS群又は(B)U87-J1-IgG1群と比較して、P＜0.05。
【００４７】
【図１７】図17は、J1 mAbは、インビボにおいてMDA-MB-231異種移植片腫瘍増殖の初期段階を遅延することを示す。MDA-MB-231細胞を、BALB/c nu/nuマウスへ接種した(A、B、n＝7；C、n＝10)。動物は、腫瘍接種と同時に開始した、J1-65D、又はJ1-183D mAbの10mg/kg(A、B)又は20mg/kg(C)のいずれかの、週2回の腹腔内(i.p.)投与により処置した。対照群には、等容積のPBSを注射した。腫瘍サイズを、規則的に測定し、腫瘍成長をモニタリングした。*、PBS群と比較してP＜0.05。(B)10mg/kg処置群におけるNotch経路阻害は、腫瘍から抽出されたRNAについてqPCR分析により確認した。ヒト及びマウスの両方のNotch-標的遺伝子の減少が認められた。バーは、群別の全ての腫瘍の平均±SEを表す。
【００４８】
【図１８】図18は、ヒト化され且つ脱免疫化された(de-immunised)組換えJ1 mAb変種は、細胞表面に過剰発現されたヒトJ1へ特異的に結合するが、J2タンパク質には結合しないことを示す。J1-65D(A)及びJ1-183D(B)抗体の各々の16種のヒト化され且つ脱免疫化された変種(V1-16)、並びに各々のキメラ変種(Chi)を使用し、指定された濃度で、293-JAG1安定した細胞を染色し、引き続き抗-ヒト-APC二次抗体で染色した。試料を、FACSにより分析し、平均蛍光強度(MFI)をプロットした。親細胞293及び対照細胞293-JAG2も、対照として含んだ。親マウスmAb(J1- 65D、J-183D)染色を、陽性対照として含み、抗-マウス-APC二次抗体を用いて検出した。J1-65D変種13-16を除いて、残りの全ての抗体は、ヒトJ1タンパク質へ効果的に結合した。
【００４９】
【図１９】図19は、ヒト化され且つ脱免疫化された組換えJ1 mAb変種は、ヒトJ1に対する特異性を保持するが、マウスJ1へは結合しないことを示す。ヒト化J1-65D(A)及びJ1-183D(B)抗体変種、並びに各々のキメラ変種(Chi)を使用し、指定された濃度で、B16F10-mJAG1過剰発現している安定した細胞を染色し、引き続き抗-ヒト-APC二次抗体で染色した。ヒトJ1を発現している親細胞B16F10及び293-JAG1細胞を、対照として使用した。試料を、FACSにより分析し、平均蛍光強度(MFI)をプロットした。当初のマウスmAb(J1-65D、J1-183D)染色は、抗-マウス-APC二次抗体により検出した。
【００５０】
【図２０】図20は、インビトロにおける、ヒト化及び脱免疫化されたJ1-mAbによる、ヒトJagged 1/Notchシグナル伝達の阻害を示す。Notch補因子RBPJの制御下で、ルシフェラーゼを発現している結腸直腸癌細胞株LS174Tを、J1 mAb(10μg/ml)の存在下で、哺乳動物細胞-発現された組換えJ1タンパク質(NE3-Fcタンパク質、各処置に関して右側バー)又は対照タンパク質(左側バー)により刺激し、ルシフェラーゼ活性を測定した。親マウスモノクローナル抗体(Mo)、マウスIgG1、DMSO及びDBZを、対照として使用した。キメラ抗体(Chi)を含む全ての試験したJ1-65D及びJ1-183D抗体変種は、J1誘導したNotchシグナル伝達を効果的に遮断した。
【００５１】
【図２１】図21は、ヒト化及び脱免疫化されたJ1-65D抗体の、MDA-MB-231 3-D成長に対する作用を示す。MDA-MB-231乳癌細胞を、J1-65D(抗-Jagged 1 mAb)又はmIgG1(対照mAb)の存在又は非存在下で、スフェロイドとして成長させた。全ての抗体は、最大成長減少を誘導する最低濃度である(図11参照)5μg/mlで使用した。当初のマウス抗体(murine又はmouse)又はDBZを、陽性対照として含んだのに対し、DMSO及びmIgG1を、陰性対照として使用した。(A)処置した腫瘍細胞スフェロイドの成長曲線。(B)培養9日目のスフェロイドサイズ(1群につき5-6スフェロイド)。(C)抗体の各対を比較する統計解析。
【００５２】
【図２２】図22は、ヒト化及び脱免疫化されたJ1-183D 抗体の、MDA-MB-231 3-D成長に対する作用を示す。MDA-MB-231乳癌細胞を、J1-183D(抗-Jagged 1 mAb)又はmIgG1(対照mAb)の存在又は非存在下で、スフェロイドとして成長させた。全ての抗体は、最大成長減少を誘導する最低濃度である(図11参照)5μg/mlで使用した。当初のマウス抗体(murine又はmouse)又はDBZを、陽性対照として含んだのに対し、DMSO及びmIgG1を、陰性対照として使用した。(A)処置した腫瘍細胞スフェロイドの成長曲線。(B)培養9日目のスフェロイドサイズ(1群につき5-6スフェロイド)。(C)抗体の各対を比較する統計解析。
【００５３】
【図２３】図23は、複数の変種抗体を構築するために使用される、野生型J1-183D抗体のCDRドメインアミノ酸配列を、変種CDR配列と一緒に示す。灰色の強調は、野生型と異なるアミノ酸配列を示す。また、変種抗体の構築に使用された、完全な個別のVL及びVH野生型配列及び変種配列も示す。
【００５４】
【図２４】図24は、複数の変種抗体を構築するために使用される、野生型J1-65D抗体のCDRドメインアミノ酸配列を、変種CDR配列と一緒に示す。灰色の強調は、野生型と異なるアミノ酸配列を示す。また、変種抗体の構築に使用された、完全な個別のVL及びVH野生型配列及び変種配列も示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、新規エピトープを介して、ヒトJagged 1(Jag1又はJ1とも称される)のDelta/Serrate/LAG-2コンセンサス配列(DSL)ドメインに結合する抗体を提供する。該抗体は、ヒトJagged 1-Notch受容体相互作用を効果的に遮断し、インビトロにおいて腫瘍細胞株におけるJagged 1-媒介性シグナル伝達を、及びインビボにおいてヒトJagged 1依存型腫瘍成長を阻害し、その結果癌治療における使用にこれらが適していることが指摘される。
【００５６】
Cordleら(2008)は、ヒトJagged 1 DSLドメインの残基199-207は、Notch受容体結合において重要な役割を有することを確定した[65]。その結果本発明者らは、全て、単にDSLドメイン残基E228を含む一般に定義され得るエピトープを認識する、前述の望ましい特性を伴う数多くの抗体を作製することに驚かされた。
【００５７】
従って、本発明の抗体は全て、定義されたエピトープを認識する。そのような特徴付けは、癌治療、特に併用療法の状況において望ましく、これにより、薬物又は治療的抗体に対する獲得された耐性は、標的タンパク質における1又は2以上の残基の変異の結果として起こり得る。従って、悪性細胞における獲得された耐性を予測するか及び／又はこれに反応するために、1又は2以上の好適な補完療法を選択する場合に、治療的抗体の結合部位を知ることは望ましい。
【００５８】
本発明者らは、ヒトJagged 1の限定された細胞外断片(残基185-335 - DSL+EGF1-3)によるマウスの免疫化により、ヒトJagged 1のDSLドメインを標的化するモノクローナル抗体を作出した。その後免疫化したマウスから摘出した脾細胞を、骨髄腫融合パートナー細胞株と融合させ、その抗原との反応性について試験し、次にモノクローナル抗体の均質な集団を分泌するハイブリドーマ細胞株を作製するために、単独の細胞希釈物によりクローニングした。これらの抗体を含むハイブリドーマ培養物上清を次に、ELISA及びFACSにより、DSLドメインへの結合及びJagged 1-Notch 1相互作用の遮断についてスクリーニングし、望ましい特徴を持つ4種を同定した(J1-65D、J1-156A、J1-183D及びJ1-187Bと称される)。
【００５９】
免疫細胞化学染色及びFACS分析により明らかであるように(図2及び3)、前述の4種の抗体は、標的タンパク質に高い特異性を示し、同じくDSLドメインを含む2種の別のヒトNotchリガンドであるヒトJagged 2及びヒトDelta-様リガンド4(DLL4)(DSLドメイン配列アラインメントは、Cordleらの論文(2008[65])に認めることができる)へは、最低の結合を示すか又は結合しない。従って、1又は2以上の結合アッセイにおける陰性結果を生じることにより(陽性対照と比較した場合、図2のJ2 Ab、及び図3のhDLL4-GFP参照)、本発明の抗体は、2種の別のDSLドメイン含有Notchリガンドのいずも特異的に認識することはできないと考えることができる。結果的に、これらの抗体による阻害活性は、ヒトJagged 2及びDLL4-媒介性シグナル伝達においては認められず(図9B)、これは治療的状況におけるJagged 1-媒介性シグナル伝達の排他的阻害の可能性を指摘している。更にインビトロにおける本抗体による遮断活性は、マウスJagged 1-媒介性シグナル伝達(図10)も、マウスJagged 1トランスフェクタントと組換え発現されたヒトNotch 1の間の相互作用(図1)についても示されない。前記知見の分子基礎は、ヒトとマウスJagged 1の間のE228D置換(図7)として決定され、結果的に本発明の抗体は全て、ヒトJagged 1の残基E228を含むエピトープを特異的に認識することを明らかにしている。抗体J1-65D及びJ1-183Dのヒト化及び脱免疫化された変種は、これらの望ましい特徴を保持した(図18及び19)。
【００６０】
対照的に、ヒトJagged 1-媒介性シグナル伝達に関して、本発明の抗体(ハイブリドーマ培養物上清の形)は、FACSにより分析した場合、Jagged 1-トランスフェクトされた細胞と組換え発現された蛍光標識されたNotch 1の間の相互作用の効果的なインビトロにおける遮断を示す(図1)。更に全ての抗体(選択されたヒト化及び脱免疫化された変種を含む)は、様々な腫瘍細胞株におけるJagged 1-媒介性Notchシグナル伝達の阻害(図9、10B、13、17B及び20)に加え、標準の治癒用化学療法薬との併用療法により増強され得る(図14)腫瘍スフェロイド成長の阻害(図11、12、13、14、21及び22)を明らかにしているが；他方で、腫瘍のJagged 1過剰発現は、インビトロ及びインビボにおける腫瘍成長を増強する重要な因子として暗示されている(図15及び16)。注目すべきことに、本抗体は、インビボにおいてヒトJagged 1過剰発現に依存した腫瘍成長を効果的に防止することができた。Le FriecらによりJagged 1の新規受容体としてCD46が同定されたこと(2012) [45]、及び本発明の抗体のJagged 1-CD46結合に対する阻害作用を示す能力(図1B)を前提として、これも、治療的恩恵の可能性を付与し得る。
【００６１】
本明細書記載の抗体の更なる特性は、非限定的実施例において明らかにされる。
【００６２】
用語「抗体」とは、重鎖及び軽鎖(VH及びVL)の免疫グロブリン可変ドメイン、より詳細には相補性決定領域(CDR)の結合特徴により決定されるような、標的上のエピトープを特異的に認識する免疫グロブリンを指す。用語「モノクローナル抗体」及び「抗体」は、別に指定しない限りは、本明細書において互換的に使用される。多くの可能性のある抗体型が、当該技術分野において公知であり、これは、複数の無傷のモノクローナル抗体、又は無傷のモノクローナル抗体を含むポリクローナル混合物、抗体断片(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片、線状抗体、一本鎖抗体及び抗体断片を含む多重特異性抗体)、一本鎖可変領域断片(scFv)、多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び標的上の所与のエピトープの認識に必要なドメインを含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。抗体はまた、治療効果のために、非限定的に細胞毒性薬及び放射性核種を含む、様々な部分に複合されてよい。抗体は、γ、δ、α、μ及びε型重鎖定常ドメインを含むことができ、ここで該ドメインを含む抗体は、各々、クラスIgG、IgD、IgA、IgM又はIgEと称される。クラスは更に、重鎖定常ドメインの配列の変動によりサブクラスに分割される(例えば、IgG1-4)。軽鎖は、定常領域の同一性に応じ、κ又はλクラスと称される。
【００６３】
用語抗体の「可変領域」とは、単独で又は組合せて、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々、「超可変領域」としても公知である、3つの相補性決定領域(CDR)により連結された4つのフレームワーク領域(FR)からなる。各鎖のCDRは、FRにより密に近接してまとめて保持され、且つ他鎖由来のCDRとの、抗体の抗原-結合部位の形成に寄与する。CDRを決定するための少なくとも2つの技術が存在する：(1)異種間配列変動性を基にしたアプローチ[79]；及び、(2)抗原-抗体複合体の結晶学的試験を基にしたアプローチ[78]。加えて、CDRを決定するために、当該技術分野において、これらの2種のアプローチの組合せを時には使用する。
【００６４】
用語「モノクローナル抗体」とは、標的上の単独のエピトープを認識する、抗体(先に説明された形、例えば抗体断片を含む)の均質な集団を指す。これは、典型的には異なる抗原決定基に向けられた異なる抗体の混合物を含む、ポリクローナル抗体とは対照的である。更に「モノクローナル抗体」とは、非限定的にハイブリドーマ産生、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物を含む、いくつかの技術により作製されたそのような抗体を指す。
【００６５】
用語「ヒト化抗体」とは、最小の非-ヒト(例えばマウスの)配列を含む、特異的免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、又はそれらの断片である、非-ヒト(例えばマウスの)抗体の形を指す。
【００６６】
用語「脱免疫化抗体」とは、可能性のあるT-細胞エピトープをコードしている最小配列を含む、特異的免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、又はそれらの断片である抗体を指す。
【００６７】
用語「キメラ抗体」とは、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が、2種以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、望ましい特異性、親和性、及び／又は能力(capability)を伴う、哺乳動物の1つの種(例えば、マウス、ラット、ウサギなど)に由来する抗体の可変領域に対応するが、その種における免疫反応の誘発を避けるために、定常領域は、別の種(通常ヒト)に由来する抗体の配列と相同である。
【００６８】
用語「エピトープ」とは、所与の抗体により特異的に認識される標的の部分を指す。抗原がタンパク質である場合には、エピトープは、連続又は不連続の多数のアミノ酸のいずれかから形成され得(各々「線状」又は「高次構造的」エピトープ)、これにより後者の場合、エピトープを含む残基は、ポリペプチドの三次元フォールド内でまとまる。エピトープは典型的には、互いに関して特定の位置及び配向で、3〜10個のアミノ酸を含むが、これらに限定されるものではない。抗体により認識されたエピトープ(具体的にエピトープが所与の残基を含むかどうか)を決定する当該技術分野において公知の技術は、下記に例示されるような、特異的認識又はそれらの欠如を決定するための技術と組み合わせた、部位特異的変異誘発又は標的タンパク質に対し好適な相同タンパク質の使用を含むが、これらに限定されるものではない。限定するものではないが一例として、エピトープは、該抗体による、未変性の(非置換の)標的タンパク質の特異的認識を含む対照との比較分析により、所与の残基を含むとして決定され得；ここで、該対照と比較した場合に、該抗体による結合の減少及び／又は特異的認識の欠如は、エピトープの一部を形成するものとして所与の残基を同定する。更に、X線結晶解析及び／又は核磁気共鳴(NMR)分光法、又はそれらの好適な派生法による抗体-標的タンパク質複合体の構造分析はまた、エピトープを構成する残基の決定に使用することができる。
【００６９】
用語「部分」とは、全体よりも少ないいずれかを指す。例として、Jagged 1のDSLドメインは、43残基を含む[65]。抗体のCDRは、各残基と実質的に相互作用しないので、該抗体が、DSLドメイン全体を含むエピトープを特異的に認識することは不可能であろう。従って本発明の抗体は、ヒトJagged 1のDSLドメインの部分を特異的に認識すると説明されてよい。ヒト及びマウスJ1 DSLドメインは、各々、配列番号:77及び78として示されている。
【００７０】
用語「特異的に認識する」とは、抗体-エピトープ相互作用の文脈において、抗体又はエピトープのいずれかが、別の物質、例えば無関係のタンパク質と置換される場合よりも、より頻繁に若しくはより迅速に、又はより長い期間若しくはより大きい親和性で、又は前記のいずれかの組合せで、抗体とエピトープが会合する相互作用を指す。必ずしもではないが概して、結合への言及は、特異的認識を意味する。異なる種におけるオルソログタンパク質間の配列同一性のために、モノクローナル抗体は、2つ以上の種において、Jagged 1タンパク質などの、標的上のエピトープを特異的に認識することができる(例として、本発明の抗体は全て、ヒト、ウサギ、モルモット及びラットJagged 1を特異的に認識する−図4)。同様に、このタンパク質のポリペプチド配列のある領域における異なるJaggedタンパク質の間の相同性のために、モノクローナル抗体による特異的認識は、2種以上のJaggedタンパク質(例えば、ヒトJagged 1及びヒトJagged 2)上のエピトープへの結合を含むことができる。モノクローナル抗体による標的の特異的認識又はその欠如の決定に関する当該技術分野において公知の技術は、FACS分析、免疫細胞化学染色、免疫組織化学、ウェスタンブロット／ドットブロット、ELISA、アフィニティクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されるものではない。限定するものではないが一例として、特異的認識又はその欠如は、該標的を特異的に認識することが当該技術分野において公知の抗体の使用を含む対照及び／又は非存在若しくは最小の該標的の特異的認識を含む対照との比較分析により決定されてよい(例えば、ここで対照は、非特異的抗体の使用を含む)。該比較分析は、定性的又は定量的のいずれかであってよい。
【００７１】
しかし、所与の標的の排他的特異的認識を示す抗体又は結合部分は、例えば標的及び相同タンパク質の両方を特異的に認識する抗体と比べ、該標的についてより高度な特異性を有すると称されることは理解されるべきである。
【００７２】
用語「受容体」及び「リガンド」は、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。
【００７３】
用語「遮断する」は、受容体-リガンド相互作用及びそれらの抗体破壊の文脈において、おそらく、受容体又はリガンドのいずれかの上のエピトープの特異的認識に関与する、受容体とリガンドの間の未変性の相互作用を破壊する、抗体の能力を指す。受容体-リガンド相互作用を遮断する抗体の能力又はそれらの欠如の決定に関する当該技術分野において公知の技術は、FACS分析、リガンド-媒介性シグナル伝達の下流エフェクターの制御下でのレポーター遺伝子(例えばルシフェラーゼ)を含む細胞-ベースのアッセイ、リガンド-媒介性シグナル伝達の標的遺伝子及び／又はタンパク質の転写及び／又は翻訳の分析を含む細胞-ベースのアッセイ、リガンド-媒介性シグナル伝達の少なくとも1種の下流成分のタンパク質分解性プロセシング、そうでなければ修飾の分析を含む細胞-ベースのアッセイを含むが、これらに限定されるものではない。限定するものではないが一例として、遮断の能力又はそれらの欠如は、該受容体-リガンド相互作用の実質的阻害を含む対照及び／又は非存在若しくは最小の該受容体-リガンド相互作用の阻害を含む対照との比較分析により決定されてよい。該比較分析は、定性的又は定量的のいずれかであってよい。非存在若しくは最小の該受容体-リガンド相互作用の阻害を含む対照は、非特異的タンパク質又は抗体による処置を含むことができる。
【００７４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、且つそれらの当該技術分野における通常の意味を有する。
【００７５】
用語「アミノ酸」及び「残基」は、本明細書において互換的に使用され、且つそれらの当該技術分野における通常の意味を有する。具体的アミノ酸は、それらの通常の一文字コード又は三文字コードにより本明細書において言及され；更にヒトJagged 1残基は、Cordleらの論文(2008)[65]及びUniProtエントリーP78504 (http://www.uniprot.org)に従い番号付けされる。
【００７６】
「保存的アミノ酸置換」は、1個のアミノ酸残基が、類似した側鎖を有する別のアミノ酸残基により置き換えられるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非帯電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ-分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。例えば、フェニルアラニンのチロシンとの置換は、保存的置換である。好ましくは、本発明のポリペプチド及び抗体の配列における保存的置換は、抗原(複数可)への、すなわちそれにポリペプチド又は抗体が結合する1又は2以上のJaggedタンパク質への、アミノ酸配列を含むポリペプチド又は抗体の結合を無効にしない。抗原結合を排除しないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該技術分野において周知である。
【００７７】
2又は3以上の核酸又はポリペプチドの文脈における用語「同一性」又はパーセント「同一性」とは、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換とは考えられない、最大対応部分(maximum correspondence)と比較及び並置した場合(必要ならギャップを導入する)に、同じであるか又は特定の割合の同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する、2又は3以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用し、又は目視検査により、測定されてよい。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが、当該技術分野において公知である。これらは、BLAST及びALIGNを含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様において、本発明の2種の核酸又はポリペプチドは、実質的に同一であり、このことはこれらが、最大対応配列と比較し且つ並置し、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視検査により測定した場合に、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％のヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性を有することを意味する。一部の実施態様において、同一性は、長さが少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約40〜60残基の配列の領域にわたり存在する。一部の実施態様において、同一性は、少なくとも約90〜100残基など、60〜80残基よりもより長い領域にわたり存在する。一部の実施態様において、配列は、ヌクレオチド配列のコード領域など、比較される配列の完全長にわたり実質的に同一である。
【００７８】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」とは、本明細書において互換的に使用され、且つそれらの当該技術分野における通常の意味を有する。
【００７９】
用語「癌」及び「癌性」とは、細胞の集団が、不規則な細胞成長、増殖及び／又は生存により特徴づけられる、哺乳動物における生理的状態を指すか又は説明する。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、骨髄腫及び白血病を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
用語「腫瘍」及び「新生物」とは、前癌性病変を含む、良性(非癌性)又は悪性(癌性)のいずれかの、過剰な細胞成長、増殖及び／又は生存から生じる組織の塊を指す。
【００８１】
用語「癌細胞」及び「腫瘍細胞」は、腫瘍細胞集団の集塊(bulk)を含む非腫瘍形成性細胞、及び腫瘍形成性幹細胞(CSCとも称される癌幹細胞)の両方を含む、腫瘍又は前癌性病変に由来する細胞の集団全体をいい、文法的に同等である。本明細書に使用される用語「腫瘍細胞」は、癌幹細胞からそれらの腫瘍細胞を識別するために再生能及び分化能を欠くそれらの腫瘍細胞のみを指す場合、用語「非腫瘍形成性」により修飾されるであろう。
【００８２】
用語「腫瘍形成性」とは、自己再生の特性(追加の腫瘍形成性癌幹細胞を生じる)、並びに固形腫瘍幹細胞が腫瘍を形成することを可能にする、全ての他の腫瘍細胞を生じる増殖の特性(分化した、従って非腫瘍形成性の腫瘍細胞を生じる)を含む、固形腫瘍幹細胞の機能的特徴を指す。これらの自己再生及び全て他の腫瘍細胞を生じる増殖の特性は、連続移植時に腫瘍を形成することはできない非腫瘍形成性腫瘍細胞と比べ、癌幹細胞に、免疫不全宿主(例えばマウス)への連続移植時に触手可能な腫瘍を形成する能力をもたらす。非腫瘍形成性腫瘍細胞は、固形腫瘍から腫瘍細胞を入手した後、免疫不全宿主への初回移植時に、腫瘍を形成することができるが、これらの非腫瘍形成性腫瘍細胞は、連続移植時には腫瘍を生じないことが認められている。
【００８３】
用語「対象」とは、特定の治療のレシピエントであるべき、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類、及び同類のものを含むが、これらに限定されるものではない、任意の動物(例えば哺乳動物)を指す。典型的には、用語「対象」と「患者」は、ヒト対象に関して、本明細書において互換的に使用される。
【００８４】
語句「医薬的に許容可能な賦形剤、担体又はアジュバント」とは、本開示の少なくとも1種の抗体と一緒に、対象へ投与され、且つそれらの医薬活性及び／又は生物活性を破壊せず、治療的量の抗体を送達するのに十分な投与量で投与された場合に無毒である賦形剤、担体又はアジュバントを指す。
【００８５】
語句「治療的有効量」とは、対象における疾患又は障害を「治療する」か、又はインビトロにおいて1又は2以上の細胞に対し作用を発揮するのに有効な、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小型有機分子、又は他の薬物の量を指す。癌の症例において、薬物(例えば抗体)の治療的有効量は、癌細胞の数を減少すること；腫瘍サイズを縮小すること；末梢器官への癌細胞の浸潤、例えば軟組織及び骨への癌の拡散を阻害及び／又は停止すること；腫瘍転移を阻害及び／又は停止すること；腫瘍成長を阻害及び／又は停止すること； 1又は2以上の癌に関連した症状をある程度緩和すること；罹患率及び死亡率を低下すること；生活の質を向上すること；腫瘍の腫瘍形成性、腫瘍形成頻度、又は腫瘍形成能を低下すること；腫瘍における癌幹細胞の数又は頻度を低下すること；非腫瘍形成性状態へ腫瘍形成性細胞を分化すること；或いは、そのような作用を組合せることができる。薬物が存在する癌細胞の成長を妨害し及び／又は死滅させる程度まで、これは細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性と称され得る。インビトロにおける1又は2以上の細胞に対する作用の場合に、細胞表面上にJagged 1を発現している不死化された細胞株若しくは癌細胞株、又は例えば組織生検、胸膜滲出液、骨髄穿刺液若しくは血液試料などの患者試料から分離された腫瘍細胞が、該抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小型有機分子、又は他の薬物を含有する培地において培養される場合、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小型有機分子、又は他の薬物の治療的有効量は、腫瘍細胞の成長を阻害することができる。
【００８６】
用語「治療する」及び「治療」及び「治療するため」並びに「緩和する」及び「緩和するため」とは、1)診断された病的状態又は障害を治癒し、遅延し、症状を軽減し及び／又は進行を停止する治療的手段、並びに2)標的化された病的状態又は障害の発症を予防し及び／又は遅延する、予防的又は防御的手段の両方を指す。従って、治療を必要とするものは、既に障害を伴うもの；障害を有する傾向があるもの；及び、障害が予防されるべきものを含む。いくつかの実施態様において、患者が、以下の1又は2以上を示す場合に、対象は、本発明の方法に従い癌がうまく「治療される」：癌細胞の数の減少、又は癌細胞の完全な非存在；腫瘍サイズの縮小；末梢器官への癌細胞の浸潤、例えば軟組織及び骨への癌の拡散の阻害及び／又は不在；腫瘍転移の阻害及び／又は不在；腫瘍成長の阻害及び／又は不在；特定の癌に関連した1又は2以上の症状の緩和；罹患率及び死亡率の低下；生活の質の向上；腫瘍の腫瘍形成性、腫瘍形成頻度、又は腫瘍形成能の低下；腫瘍における癌幹細胞の数又は頻度の低下；非腫瘍形成性状態への腫瘍形成性細胞の分化；或いは、いくつかの作用の組合せ。
【００８７】
本明細書において「A及び／又はB」などの語句で使用される用語「及び／又は」は、以下の具象の各々を含むことが意図される：A及びB；A又はB；A(のみ)及びB(のみ)。同様に「A、B、及び／又はC」などの語句で使用される用語「及び／又は」は、以下の具象の各々を含むことが意図される：A、B、及びC；A、B、又はC；A又はC；A又はB；B又はC；A及びC；A及びB；B及びC；A(のみ)；B(のみ)；並びに、C(のみ)。
【００８８】
いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体は、J1-65Dと称され、これは配列番号:1のアミノ酸配列を有するCDR-L1、配列番号:2のアミノ酸配列を有するCDR-L2、配列番号:3のアミノ酸配列を有するCDR-L3、配列番号:4のアミノ酸配列を有するCDR-H1、配列番号:5のアミノ酸配列を有するCDR-H2、及び配列番号:6のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含む。
【００８９】
いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体は、J1-156Aと称され、これは配列番号:7のアミノ酸配列を有するCDR-L1、配列番号:8のアミノ酸配列を有するCDR-L2、配列番号:9のアミノ酸配列を有するCDR-L3、配列番号:10のアミノ酸配列を有するCDR-H1、配列番号:11のアミノ酸配列を有するCDR-H2、及び配列番号:12のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含む。この抗体は、いつもではないが、以下のCDRアミノ酸配列を含む、第二軽鎖(VL2)も含む；CDR-L1 配列番号:79、CDR-L2 配列番号:80及びCDR-L3 配列番号:81。一本の重鎖を有するが2本の軽鎖を有する抗体は、文献[87]に説明されている。
【００９０】
いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体は、J1-183Dと称され、これは配列番号:13のアミノ酸配列を有するCDR-L1、配列番号:14のアミノ酸配列を有するCDR-L2、配列番号:15のアミノ酸配列を有するCDR-L3、配列番号:16のアミノ酸配列を有するCDR-H1、配列番号:17のアミノ酸配列を有するCDR-H2、及び配列番号:18のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含む。
【００９１】
いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体は、J1-187Bと称され、これは配列番号:19のアミノ酸配列を有するCDR-L1、配列番号:20のアミノ酸配列を有するCDR-L2、配列番号:21のアミノ酸配列を有するCDR-L3、配列番号:22のアミノ酸配列を有するCDR-H1、配列番号:23のアミノ酸配列を有するCDR-H2、及び配列番号:24のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含む。
【００９２】
本発明の抗体はまた、アミノ酸置換、欠失又は挿入により、本明細書に開示のものとは異なるCDR配列を有することもできる。得られる抗体は、残基E228を含み、且つヒトJagged 1とその関連受容体の間の相互作用を遮断するヒトJagged 1のDSLドメインを含むエピトープの特異的認識の特性を保持するであろう。いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体のCDRのアミノ酸配列は、配列番号:1-6のいずれか一つと比べ、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含み、好ましくはアミノ酸配列は、1、2、3又は4個以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む。
【００９３】
いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体のCDRのアミノ酸配列は、配列番号:7-12のいずれか一つと比べ、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含み、任意に配列番号:79-81のものを含み、好ましくはアミノ酸配列は、1、2、3又は4個以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む。
【００９４】
いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体のCDRのアミノ酸配列は、配列番号:13-18のいずれか一つと比べ、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含み、好ましくはアミノ酸配列は、1、2、3又は4個以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む。
【００９５】
いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体のCDRのアミノ酸配列は、配列番号:19-24のいずれか一つと比べ、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含み、好ましくはアミノ酸配列は、1、2、3又は4個以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む。
【００９６】
いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体のCDRのアミノ酸配列は、配列番号:1-6と比べた場合、実質的に同一である。
【００９７】
いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体のCDRのアミノ酸配列は、任意に配列番号:79-81を含む、配列番号:7-12と比べた場合、実質的に同一である。
【００９８】
いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体のCDRのアミノ酸配列は、配列番号:13-18と比べた場合、実質的に同一である。
【００９９】
いくつかの実施態様において、本発明のヒトJagged 1-結合抗体のCDRのアミノ酸配列は、配列番号:19-24と比べた場合、実質的に同一である。
【０１００】
具体的変種CDR配列は、表5に示し、且つ1又は2以上のこれらの配列を伴い構築された抗体は、J1-65D-VL-4を含む変種を除いて、本発明の範囲内である。変種CDR配列の組合せにより構築された抗体は、表6に示し、これらは、再度J1-65D-VL-4を除いて、本発明の範囲内である。完全長VL及びVH配列は、図23及び24(配列番号:57-76)に示しているが、これはヒト化及び／又は脱免疫化が実行されたCDR配列の外側の変動を示す。
【０１０１】
全てのCDR配列は、Kabat番号付けシステム[79]を用いて規定される。
【０１０２】
CDR残基の挿入、置換及び／又は欠失は、所与の標的に対する抗体の増大した又は減少した親和性及び／又は特異性を生じることができることは、当該技術分野において公知である。該挿入、置換及び／又は欠失の作用は、抗体により認識されたエピトープの性質、変更前のCDRの配列及び長さ、並びに置換の場合の、先に同じ位置を占拠しているアミノ酸と比べた新規アミノ酸の特性によって決まる。該変更は、当該技術分野において公知の方法を使用し、親和性及び／又は特異性などの結合特性を改善するために、当業者により行われ得る。
【０１０３】
当業者は、残基E228を含み、且つ本発明の抗体により保持されるヒトJagged 1とその関連した受容体の間の相互作用を遮断する、ヒトJagged 1のDSLドメインを含むエピトープの特異的認識の特性は、可変ドメインにおける3又はそれ未満、2又はそれ未満のCDR中の残基の置換により実質的に維持されるか又は改善され得；ここで、全ての残基、CDRの1つを除く全ての残基は、置換され；ここで、全ての置換、1を除く全ての置換、2を除く全ての置換は、非保存的であることを理解するであろう。
【０１０４】
本発明の抗体のものに対し長さが変動するCDRはまた、残基E228を含み、且つヒトJagged 1とその関連した受容体の間の相互作用を遮断する、ヒトJagged 1のDSLドメインを含むエピトープの特異的認識の特性を付与することができる。CDRを含む残基の挿入、置換及び／又は欠失はまた、本発明の抗体のヒト化及び／又は脱免疫化を目的として、当業者により実行されることができる。
【０１０５】
本発明は更に、本明細書記載のヒトJagged 1-結合抗体の1又は2以上を含有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、その例が当該技術分野において公知である、医薬的に許容可能なビヒクル又は希釈剤を更に含む。これらの医薬組成物は、腫瘍成長の阻害及び対象(例えばヒト患者)での癌治療における使用を認める。
【０１０６】
いくつかの実施態様において、組成物は、本発明の精製された抗体を、医薬的に許容可能なビヒクル(例えば、担体又は賦形剤)と組合せることにより、貯蔵及び使用のために調製される。好適な医薬的に許容可能なビヒクルは、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの、無毒の緩衝液；塩化ナトリウムなどの、塩；アスコルビン酸及びメチオニンを含む、抗酸化剤；オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、及びm-クレゾールなどの、保存剤；低分子量ポリペプチド(例えば、約10個未満のアミノ酸残基)；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどの、タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの、親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどの、アミノ酸；単糖、二糖、グルコース、マンノース、又はデキストリンなどの、炭水化物；EDTAなどの、キレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの、糖類；ナトリウムなどの、塩形成対イオン；Zn-タンパク質錯体などの、金属錯体；並びに、TWEEN又はポリエチレングリコール(PEG)などの、非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０７】
本発明の医薬組成物は、任意の通常の方式で投与することができる。投与は、非経口的投与により、より特定すると静脈内投与によることができる。しかし投与の他の経路も、想起される。
【０１０８】
いくつかの実施態様において、ヒトJagged 1-結合抗体を含むことに加え、本発明の医薬組成物は更に、少なくとも1種の追加の治療剤を含む。いくつかの実施態様において、少なくとも1種の追加の治療剤は、1、2、3種又はそれよりも多い追加の治療剤を含む。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、追加の治療剤は、治療(併用療法)時に、ヒトJagged 1-結合抗体の投与の前に、並行して及び／又は引き続き投与されることができる。一部の実施態様において、少なくとも1種の追加の治療剤は、1、2、3種又はそれ以上の追加の治療剤を含む。少なくとも2種の治療剤による併用療法は、異なる作用機序により働く薬剤に関与することが多いが、これは必ずしもではない。異なる作用機序の薬剤を使用する併用療法は、付加作用又は相乗作用を生じ得る。併用療法は、各薬剤の単剤治療において使用されるものよりもより少ない投与量を可能にし、これにより毒性副作用を軽減する。併用療法は、抵抗性癌細胞が発生する尤度を低下することができる。併用療法は、1種の治療剤が、腫瘍形成性癌幹細胞へと標的化されることを可能にすることができる一方で、第二の治療剤は、非腫瘍形成性癌細胞を標的化することができる。
【０１１０】
ヒトJagged 1-結合抗体と追加の治療剤の組合せは、任意の順番で又は並行して投与されてよいことは理解されるであろう。一部の実施態様において、ヒトJagged 1-結合抗体は、第二の治療剤による治療を予め受けた患者へ投与されるであろう。いくつかの他の実施態様において、ヒトJagged 1-結合抗体及び第二の治療剤は、実質的に同時に又は並行して投与されるであろう。例えば対象は、第二治療剤(例えば化学療法)による治療過程を受けている間に、ヒトJagged 1-結合抗体(例えば抗体)が与えられることができる。いくつかの実施態様において、ヒトJagged 1-結合抗体は、第二治療剤による治療の1年以内に投与されるであろう。いくつかの代わりの実施態様において、ヒトJagged 1-結合抗体は、第二治療剤による任意の治療の10、8、6、4、又は2ヶ月以内に投与されるであろう。いくつかの他の実施態様において、ヒトJagged 1-結合抗体は、第二治療剤による任意の治療の4、3、2、又は1週間以内に投与されるであろう。一部の実施態様において、ヒトJagged 1-結合抗体は、第二治療剤による任意の治療の5、4、3、2、又は1日以内に投与されるであろう。2種(又はそれよりも多い)薬剤又は治療は、数時間又は数分以内に(within a matter of hours or minutes)(すなわち、実質的に同時に)、対象へ投与されることができることは、更に理解されるであろう。
【０１１１】
有用な治療剤のクラスは、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、アルキル化剤(例えば、シスプラチン、モノ(白金)、ビス(白金)及び三核白金錯体及びカルボプラチンなどの白金錯体)、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸エステル、代謝拮抗薬、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、プリン代謝拮抗薬、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカ・アルカロイドなどを含む。いくつかの実施態様において、第二治療剤は、代謝拮抗薬、抗有糸分裂薬、トポイソメラーゼ阻害剤又は血管新生阻害剤である。
【０１１２】
ヒトJagged 1-結合抗体と組合せて投与することができる治療剤は、化学療法薬を含む。従って一部の実施態様において、本方法又は治療は、ヒトJagged 1-結合抗体又は本発明の抗体と化学療法薬又は複数の異なる化学療法薬のカクテルの併用投与に関与している。抗体による治療は、化学療法薬の投与の前に、並行して又は引き続き起こり得る。併用投与は、単独の医薬製剤中で又は個別の製剤を使用してのいずれかでの、同時投与、或いは全ての活性物質がそれらの生物学的活性を同時に発揮することができるようないずれかの順番であるが一般にある期間内の連続投与を含むことができる。
【０１１３】
本発明において有用な化学療法薬は、チオテパ及びシクロホスファミド(サイトキサン)などの、アルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン、などのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ（uredopa）などの、アジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミンを含む、エチレンイミン及びメチルメラミン(methylamelamin)；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの、ナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどの、ニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの、抗生物質；メトトレキセート及び5-フルオロウラシル(5-FU)などの、代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの、葉酸アナログ；フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどの、プリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シトシンアラビノシド、ジデオキシウリジン、ドキシフルウリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、5-FUなどの、ピリミジンアナログ；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどの、アンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの、抗副腎薬；フォリン酸などの、葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクォン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクォン；2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシ卜シン(gacytosin)；アラビノシド("Ara-C")；タキソイド、例えばパクリタキセル(���キソール)及びドセタキセル(タキソテレ)；クロラムブシル；ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン及びカルボプラチンなどの、白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド(VP-16)；イホスファミド；マイトマイシンC；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン(Novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；CPT11；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン(DMFO)；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；並びに、前記のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体を含むが、これらに限定されるものではない。化学療法薬はまた、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗-ホルモン剤、例として、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害薬4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY1170 18、オナプリストン、及びトレミフェン(フェアストン)を含む抗エストロゲン薬；並びに、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの、抗アンドロゲン薬；並びに、前記のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体も含む。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、化学療法薬は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素(例えば、トポイソメラーゼI又はII)の作用を妨害する化学療法薬である。トポイソメラーゼ阻害剤は、ドキソルビシンHCl、ダウノルビシンクエン酸塩、ミトキサントロンHCl、アクチノマイシンD、エトポシド、トポテカンHCl、テニポシド(VM-26)、及びイリノテカン、更にはこれらのいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施態様において、第二治療剤は、イリノテカンである。
【０１１５】
いくつかの実施態様において、化学療法薬は、代謝拮抗薬である。代謝拮抗薬は、正常な生化学反応に必要とされる代謝産物に類似した構造を有するが、細胞分裂などの1又は2以上の細胞の正常な機能を妨害するのに十分に異なる化学物質である。代謝拮抗薬は、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキセートナトリウム、ラルチトレキセド、ペメトレキセド、テガファー、シトシンアラビノシド、チオグアニン、5-アザシチジン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、及びクラドリビン、更にはこれらのいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施態様において、第二治療剤は、ゲムシタビンである。
【０１１６】
いくつかの実施態様において、化学療法薬は、チューブリンに結合する薬剤を含むが、これらに限定されるものではない、抗有糸分裂薬である。一部の実施態様において、この薬剤は、タキサンである。いくつかの実施態様において、この薬剤は、パクリタキセル若しくはドセタキセル、又はパクリタキセル若しくはドセタキセルの医薬的に許容可能な塩、酸、若しくは誘導体である。いくつかの実施態様において、この薬剤は、パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル(タキソテレ)、アルブミン-結合型パクリタキセル(アブラキサン)、DHA-パクリタキセル、又はPG-パクリタキセルである。いくつかの別の実施態様において、抗有糸分裂薬は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、若しくはビンデシンなどの、ビンカ・アルカロイド、又はそれらの医薬的に許容可能な塩、酸、若しくは誘導体を含む。一部の実施態様において、抗有糸分裂薬は、キネシンEg5の阻害剤、又はAurora A若しくはPlklなどの有糸分裂キナーゼの阻害剤である。いくつかの実施態様において、ヒトJagged 1-結合抗体と組合せて投与される化学療法薬が抗有糸分裂薬である場合、治療される癌又は腫瘍は、乳癌又は乳房腫瘍である。
【０１１７】
いくつかの実施態様において、併用療法は、本発明のヒトJagged 1-結合抗体と放射線治療の併用投与に関与している。ヒトJagged 1-結合抗体による治療は、熟練した医療従事者による、放射線治療の投与の前、並行して、又は引き続き起こることができる。
【０１１８】
一部の実施態様において、第二治療剤は、抗体を含む。従って、治療は、本発明のヒトJagged 1-結合抗体の、追加の腫瘍-関連抗原に対する他の抗体、非限定的に、EGFR、ErbB2、HER2、DLL4、Notch及び／又はVEGFに結合する抗体を含むものとの併用投与に関与することができる。いくつかの実施態様において、第二治療剤は、血管新生阻害剤である抗体(例えば、抗-VEGF抗体)である。いくつかの実施態様において、第二治療剤は、ベバシズマブ(アバスチン)、トラスツズマブ(ハーセプチン)、パニツムマブ(ベクチビックス)、又はセツキシマブ(エルビタックス)である。併用投与は、単独の医薬製剤中で又は個別の製剤を使用してのいずれかでの、同時投与、或いは全ての活性物質がそれらの生物学的活性を同時に発揮することができるようないずれかの順番であるが一般にある期間内の連続投与を含むことができる。
【０１１９】
更に、本明細書記載のヒトJagged 1-結合抗体との併用療法は、1又は2以上のサイトカイン(例えば、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、及び／又は増殖因子)による治療を含むことができる。
【０１２０】
更に、本明細書記載のヒトJagged-結合抗体による治療は、腫瘍、癌細胞の手術による除去、又は治療担当医により必要と判断されるいずれか他の治療を随伴することができる。
【０１２１】
本発明の抗体は、腫瘍／癌の治療において使用することができる。該腫瘍／癌は、腫瘍性Jagged 1発現及び／又はJagged 1-媒介性シグナル伝達を含むものを含むが、これらに限定されるものではなく、好ましくはここで該発現及び／又はシグナル伝達は、病理学的作用と関連される。腫瘍性Jagged 1発現及び／又はJagged 1-媒介性シグナル伝達を含む腫瘍／癌は、膵癌、B-細胞慢性リンパ性白血病、舌扁平上皮癌、神経膠腫、腎癌、急性白血病、急性骨髄白血病、子宮内膜癌、結腸直腸癌、膠芽腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、エナメル上皮腫、バレット食道腺癌、肺癌、髄芽腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、頭頸部癌、子宮頸癌、B-細胞慢性リンパ性白血病、びまん性大B-細胞リンパ腫、皮膚原発CD30+リンパ球増殖障害、ホジキンリンパ腫、黒色腫、肝細胞癌、癌幹細胞含有腫瘍／癌を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
本発明の抗体により治療される腫瘍／癌は、Jagged 1及び／又はNotch-媒介性シグナル伝達が関与させられている1又は2以上の腫瘍微小環境プロセスを含むものを含むが、これらに限定されるものではなく、ここで好ましくは該プロセスは、病理学的作用に関連している。Jagged 1及び／又はNotch-媒介性シグナル伝達が関与している腫瘍微小環境プロセスは、複数の癌型に関連し、且つ血管成熟、血管新生、T細胞-媒介性免疫抑制、濾胞樹状細胞、制御性T細胞による免疫調節、上皮間葉転換、CD46シグナル伝達を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
本発明の抗体により治療される腫瘍／癌はまた、腫瘍／癌の細胞と、腫瘍微小環境を含む細胞の間にJagged 1-媒介性シグナル伝達を含むものを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
本発明の抗体は、組換え形において発現されてよい。組換えヒトJagged 1-結合抗体の発現に適した宿主細胞は、好適なプロモーターの制御下で、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は比較的高等な真核細胞を含む。原核細胞は、例えば、大腸菌又は枯草菌などの、グラム陰性又はグラム陽性の生物を含む。比較的高等な真核細胞は、以下に説明されたような哺乳動物起源の樹立された細胞株を含む。無細胞翻訳システムも利用することができる。
【０１２５】
様々な哺乳動物細胞又は昆虫細胞の培養システムが、組換えタンパク質を発現するために、使用される。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、そのようなタンパク質は一般に正確にフォールドされ、適切に修飾され且つ完全に機能があるので、好ましいとされ得る。好適な哺乳動物の宿主細胞株の例は、COS-7(サル腎臓-由来)、L-929(マウス線維芽細胞-由来)、C127(マウス乳腺癌-由来)、3T3(マウス線維芽細胞-由来)、CHO(チャイニーズハムスター卵巣由来)、HeLa(ヒト子宮頸癌-由来)及びBHK(ハムスター腎線維芽細胞-由来)の細胞株を含む。哺乳動物の発現ベクターは、複製起点、発現されるべき遺伝子に連結された好適なプロモーター及びエンハンサー、並びに他の5'又は3'側に隣接する非転写配列、並びに必須のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位及び受容部位などの5'又は3'側非翻訳配列、並びに転写終結配列などの、非転写エレメントを含むことができる。
【０１２６】
昆虫細胞における異種タンパク質生成のためのバキュロウイルスシステムは、当業者に公知である。
【０１２７】
本発明の抗体はまた、遺伝子治療技術により患者へ投与されることができ、これは患者に、本抗体をコードしているポリヌクレオチドが投与される。例えば、本抗体をコードしているポリヌクレオチドを含む、遺伝子治療ベクターが投与され、その結果この抗体はインビボにおいて発現され得る。そのような好適な技術による抗体の送達は、当業者には明らかであろう[88]、[89]。
【０１２８】
本発明の抗体はまた、癌の治療において、腫瘍崩壊性のウイルスと組合せて送達されてよい。これは、そのような治療のバイスタンダー殺傷作用を向上することができる。
【０１２９】
本発明の抗体は、マウスJagged 1へは適切に結合しないが、ラットJagged 1へは結合する。従って、本発明の抗体を使用し、内在性ラット細胞-由来Jagged 1と異種移植片内のヒト細胞株の間のパラクリンシグナル伝達を遮断することができる。これは、本抗体が毒性であるか及び／又は増大した有効性を有するかどうかを試験するために有用である。従って、本発明は、被験抗体をヒト癌細胞株を伴う異種移植片を含むラットへ投与すること、及び毒性作用を決定すること、又はNotchシグナル伝達の阻害レベルを決定することを含み、ここで本抗体は請求項1において規定されたものである、内在性に、抗-Jagged 1抗体の毒性及び／又は有効性を試験するアッセイを提供する。
【実施例】
【０１３０】
本発明はここで、下記の非限定的実施例において更に説明する。
【０１３１】
実施例1−抗-J1モノクローナル抗体の作製
J1のNotch受容体への結合を遮断する能力のあるヒトJ1-特異的mAbを作製するために、長さの異なる3種のヒトJ1抗原を作製した。これらは、細菌により発現され且つリフォールドされたDSL-EGF3(DSL＋EGF1-3)及びDSLドメイン組換えタンパク質、並びにNotchタンパク質との直接接触を媒介することが報告された領域[65]に対応するDSLドメイン-由来18merペプチドで構成される。これらを免疫原として使用し、MF1マウスを免疫化した。免疫化された動物由来の脾細胞及びマウス骨髄腫融合パートナー細胞株NS0を使用する標準の融合技術により、ハイブリドーマ細胞株を作製した。これらの免疫原に対するELISAによるスクリーニングは、99種の反応性抗体を同定した。J1トランスフェクションされた細胞に対する免疫染色及びFACSは、細胞表面J1を認識することができるわずか21種のハイブリドーマを同定した(表1)。
【０１３２】
【表１】
0006416117.tif 000002
【０１３３】
実施例2−J1 mAbの遮断及び結合特異性
J1-N1タンパク質：タンパク質相互作用を破壊する能力を伴うmAbを機能的に同定するために、ハイブリドーマ培養上清を、FACS-ベースの結合アッセイにおいて試験した。ビオチン化された可溶性ヒトN1 EGF11-13組換えタンパク質を、アビジン-コートされたビーズへ結合させ、且つFACSによる、細胞表面hJ1を認識する各mAbの存在又は非存在下での、J1-発現細胞の染色に使用した。21種のmAbのうちの5種(J1-65D、-156A、-183D、-187B及び-142B、最後のJ1-142Bは本発明の抗体ではない)は、J1へのN1結合を、異なる有効性で、遮断することができ：J1-65D、-183D及び-156Aは、この結合を完全に遮断したのに対し、J1-187B及び-142Bは、結合を部分的に遮断した(図1A)。4種の本発明の遮断性抗体はまた、ELISAアッセイにおいて、組換えCD46のビオチン-タグ付きJ1 DSL-EGF3組換えタンパク質への結合を遮断することもできた(図1B)。こうして、複数の受容体へのJ1結合を遮断するそれらの能力を明らかにする。4種の本発明の遮断性mAbを、無血清-培養上清から精製し、且つ等濃度の精製した抗体を使用し、それらの活性を引き続きのアッセイにおいて比較した(ハイブリドーマ上清が特定されなかった場合を除いて)。DSLドメインを超える配列保存は、J1 mAbが、Jagged 2(J2)タンパク質へも結合することができる可能性を生じた。抗体結合特異性は、最初に、hJ1及びhJ2トランスフェクタントのサイトスピン試料の免疫細胞化学標識により試験した(図2)。全ての抗体は、J1トランスフェクタントを染色したが、いずれもJ2でトランスフェクトされた細胞を染色せず、且つ同一実験においてJ2発現を、市販の抗-J2抗体を用いて確認した。精製されたmAbの特異性を、hJ2、ヒトDelta-様リガンド4(hDLL4)、又はmJ1によりトランスフェクトされた哺乳動物細胞において更に調べた(図3)。トランスフェクタントは、4種の遮断性mAbの各々10μg/mlにより、FACS染色した。先に認められたように、これら全てのmAbは、hJ1トランスフェクタントを染色した。J1-65D及びJ1-183D mAbのmJ1への弱い結合のみが認められ、このことはこれらの被験物質は、mJ1のN1への結合を機能的に遮断することができないこと(図1)と一致した。これらのmAbのいずれも、hDLL4への有意な結合は示さなかったが、J2への非常に弱い結合が、J1-156A及びJ1-187Bについて認められた(図3)。
【０１３４】
J1 mAbの遮断効率を試験するために、精製したmAbを力価決定し、細胞表面に発現されたhJ1への組換えN1結合の遮断に必要な濃度を決定した。細菌性に-発現されたN1 EGF11-13タンパク質によりコートされたビーズを使用し、様々な濃度のmAbの存在下で、hJ1-発現している細胞を染色した。表2に示したように、試験した全てのmAbは、治療に関連した濃度10μg/mlよりも低い濃度で、J1へのN1結合を遮断することができた。J1-65D及びJ1-183Dは、最強の阻害作用を示し、1μg/mlでN1結合を完全に阻害することができた。
【０１３５】
【表２】
0006416117.tif 000003
【０１３６】
これらのmAbのJ1タンパク質への結合親和性を定量するために、表面プラズモン共鳴(SPR)を行い、J1 mAbの、以下のJ1可溶性タンパク質の3種の異なる形との結合を調べた：細菌性-発現された免疫原DSL-EGF3(J1-DE3)、及び第三のEGFドメインまでの全てのN-末端側(J1-NE3)又はEGF12までの全てのN-末端側(J1-NE12)を含む2種の真核性に発現されたより長い形。各結合のKDを、表3に示したように測定した。前述の結合及び遮断実験のデータと一致するように、J1-183D及びJ1-65Dは、J1タンパク質の3種の形全てに対し、最高の結合親和性を示した。
【０１３７】
【表３】
0006416117.tif 000004
【０１３８】
マウスJ1に対する遮断活性の欠如(図1)は、ヒトとマウスのJ1タンパク質の間のDSLドメイン配列の差異により潜在的に説明される。様々な範囲の種に由来するDSLドメイン及びEGFリピートに対応するJ1タンパク質配列の配列アラインメントは、霊長類における完全な保存を示したのに対し、DSLドメイン配列は、ウサギ及びモルモットなどの齧歯類を含むいくつかの種においてヒトと同一であった。異種間の反応性を更に調べるために、ヒト、マウス、ウサギ、モルモット及びラットJ1に関して、DSLドメインと3つのEGFドメインを、エピトープタグ付けし、細胞表面上で発現させ、次にJ1 mAbへのそれらの結合能を試験した(図4)。4種の抗体は全て、ウサギ、モルモット及びラットJ1に効果的に結合した。これら4種の抗体は、ヒトタンパク質よりも低い効率でmJ1へ結合し、及びJ1-156Aについては結合は認められなかった。ラット脾臓から分離された初代接着細胞への抗体結合は、J1-65D及びJ1-183Dについて確認され、このことは、この種における未変性のJ1タンパク質の結合を示唆している(図4)。
【０１３９】
実施例3−ヒト癌細胞株により発現されたJ1の認識
先の実験のほとんどは、組換発現されたJ1を用いて行った。J1 mAbの内在性発現されたJ1へ結合する能力を、乳癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、及び結腸直腸癌を含む異なる組織型由来の癌細胞株の、FACS染色により試験した(表4及び図12A)。4種のJ1 mAbは一般に、同様に挙動したが、J1-65D及びJ1-183Dは、わずかに幅広に細胞株パネルを染色した。これは、J1に関するそれらのより高い親和性と一致している。細胞表面J1発現を明らかにしている染色プロファイルは、RT-PCR及びウェスタンブロットなどの他の技術によりJ1発現を検出した先行する刊行物の結果[58, 59]と、大部分一致した。
【０１４０】
興味深いことに、びまん性大B細胞リンパ腫(DLBCL)由来の複数の細胞株であるDB、Karpas 422、OCI-Ly3、RIVA、SUDHL-10及びU-2932を含むものを、J1 mAbを用いて標識した。DLBCLは、西欧諸国における成人非ホジキンリンパ腫の30〜40％を構成し、且つ形態学的及び臨床的の両面で均一ではない。患者は一般に、CHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソン)化学療法並びに抗-CD20モノクローナル抗体リツキシマブ(R-CHOP)により治療される。この患者群におけるリスク階層化に関して多くの異なる戦略が存在し；例として、国際予後判定指標である、起始細胞[予後不良の活性化B細胞-様(ABC)DLBCL又は濾胞中心B細胞-様(GCB)DLBCL]、及び微小環境におけるストロマ特徴(stromal signatures)([60]において検証)がある。興味深いことに、予後不良のストロマ-2特徴は、有害な臨床転帰の予測因子として、血管新生及び血管密度に関与した[61]。微細血管密度(MVD)も、DLBCLの有害な予後因子として報告されている[62]。
【０１４１】
R-CHOPをベバシズマブ(抗-VEGF)と併用する臨床試験が、血管新生を標的とする戦略として、DLBCL患者において試験されているが、改善された転帰に関して見込みがなく、且つ重篤な毒性の増加が生じた[63]；しかし、ベバシズマブは、単剤としていくらか有望な活性を有する[64]。残念ながら、リスク−ベネフィット評価は、Roche社が、2010年6月3日に、DLBCLにおけるベバシズマブ＋R-CHOPのそれらのMAIN治験への登録の停止という、独立したデータ安全性モニタリング委員会(DSMB)の勧告を受け容れることに繋がった。Notch2のコピー数の増加及び機能変異の増加が、DLBCLにおいて報告された[18]が、この悪性腫瘍の発病におけるJ1の関与を報告するようには見えなかった。従って、DLBCLは、血管新生を標的とする追加薬物の満たされていない臨床上の必要性が存在する、Jagged 1発現している悪性腫瘍である。
【０１４２】
【表４】
0006416117.tif 000005
【０１４３】
内在性J1を検出するためJ1 mAb特異性を更に検証するために、遺伝子ノックダウンを、レンチウイルスJ1 shRNAを用い、乳癌細胞株MDA-MB-231について行った(図5)。FACS染色により示されたように、J1サイレンシングは、試験した2種のmAbとの結合を完全に無効化し、結果的にそれらのJ1への特異性を確認した。
【０１４４】
実施例4−エピトープマッピング
DSLドメインの保存面は、Notch受容体結合に重要であるとして確定された[65]。FACSにより細胞表面上のJ1を認識した21種の抗-J1 mAbのうち、13種の認識したエピトープは、ELISAによりDSLドメインに含まれた(図6A)。残りの抗体はおそらく、EGFドメイン内のエピトープ、DSL-EGFドメイン境界に広がるエピトープ、又はコンホメーション感受性があり且つ隣接ドメインを必要とするエピトープを有するであろう。
【０１４５】
前述の13種の抗-DSLドメイン標的化抗体のうち4種のみが遮断活性を示したので、本発明者らのデータは、J1のDSLドメインへの結合が可能な作出抗体は、受容体-リガンド結合を破壊するそれらの能力を付与するにはそれ自身十分ではないことを明確に示している。
【０１４６】
J1における重要なアミノ酸(F199、R201、R203、D205、F207)は、DSLドメインの一つの面上に曝され、推定されるNotch結合部位を形成している[65]。次に推定される重要な残基のアラニン置換を伴う変異体J1タンパク質を、ドットブロティングにより、J1 mAb結合を妨害するそれらの能力について試験した。これらの変異体のいずれも、J1-183D mAb結合を妨害しなかったが、F199、R201、R203、及びF207の置換は、他の3種のmAbの結合を阻害した(図6B、左側パネル)。これらの結果は、全てのmAbは受容体-リガンド結合を遮断することができるが、これらは各々異なるアミノ酸残基でJ1タンパク質に接触していることを示唆している。
【０１４７】
いくつかの非-遮断性mAbも、これらの重要な残基へのそれらの結合について試験した(図6B、右側パネル)。それら(J1-49B、J1-62C、J1-116B、J1-180B、及びJ1-121D)のタンパク質への結合は、DSLドメイン置換により影響されなかったので、これらのmAbのほとんどは、重要なアミノ酸と相互作用しない。このことは、これらの非-遮断性mAbは、推定Notch結合部位の外側でJ1に結合することを示唆している。しかし他の4種のmAbであるJ1-191H、J1-187C、J1-77B及びJ1-13Cの結合は、これらの重要な残基置換により明確に影響され、このことは、これらの残基への結合のみでは、Notch相互作用の遮断には十分でないことを示唆している。一部の抗体(J1-62C、J1-191H、J1-187C、J1-121D、J1-77B及びJ1-13C)は、ドットブロット検出を可能にするためには、組換えJ1タンパク質のかなり高い濃度を必要とし、従って起こり得る可能性としては、J1タンパク質に関するこれらのmAbの親和性は、そのN1への結合の機能的遮断を可能にするには低すぎる。
【０１４８】
DSLドメイン内にエピトープを伴う4種のJ1遮断性mAbは、N1へ結合するヒトJ1を遮断することができるが、マウスのJ1はできないことにより、機能性種特異性を示す。配列アラインメントは、それらのDSLドメイン中でヒトとマウスのJ1の間には、位置190及び228に、わずかの2個のアミノ酸差異が存在することを示す(図7A)。第一のEGFリピートの隣接アミノ酸(位置231)も異なる。これらの更なる点変異を使用し、これらのmAbのヒト-特異性遮断作用は、これらの重要な残基に結合する抗体により媒介されるかどうかを決定した。J1抗体を標的化する4種のDSLドメイン全ての結合は、アミノ酸228のヒトグルタミン酸残基が、マウスアスパラギン酸残基(E228D)へ変異された場合に、妨害された。DSLドメイン中のY190又はEGF1中のR231の変異は、結合を遮断せず、このことは、ヒトJ1特異性は、E228結合により主に付与されることを指摘している(図7B)。従ってここで説明された4種のJ1 DSLドメイン標的化抗体は、マウスのJ1タンパク質においては保存されず、且つ同じくヒトJ2タンパク質においても存在しない、ヒトJ1 DSLタンパク質(アミノ酸E228を含む)上の新規エピトープ／界面に結合する。E228D置換は、ヒト及びマウスのJ1タンパク質を認識するJ1-142B mAb(本発明の抗体ではない)の結合は妨害しなかった。
【０１４９】
これらのmAbの各々を、他のmAbのJ1への結合を遮断するそれらの能力について試験した場合、それらの全ては、それら自身及び他のmAbの両方の結合を遮断するいくらかの能力を示した(図8)。DSLドメインエピトープは全て、同時にJ1への効果的な2種の異なるmAb結合を妨害するのに十分に物理的に近接しているように見えた。従って、これらは異なる個別のアミノ酸と接触するにもかかわらず、これらは全て、J1 DSLドメイン上の類似した界面内で結合する。これらの結果は、併用療法においてこれらの抗体を一緒に使用すると最初に何も獲得されないことを示唆している。しかしJ1-65D及びJ1-183Dの両方は、良好な機能活性を示し且つDSLドメイン内の個別のアミノ酸を認識するので、第二の抗体の結合活性が有効で有り続けるならば、第一の被験物質に対し耐性を獲得した状況において、第二の抗体を使用することはある程度価値があるであろう。
【０１５０】
実施例5−内在性Notchシグナル伝達のmAb遮断の機能試験
J1 mAbは、J1リガンドのその受容体N1への結合を遮断することができることを確立したので、Notchシグナル伝達経路の活性に対するそれらの作用を調べた。Notch補因子RBPJの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現しているヒト結腸直腸癌細胞株LS174Tを、固定されたJ1タンパク質の2つの形で刺激した：EGF3までのN-末端及びEGF12までのN-末端。両方のタンパク質は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を効果的に活性化し、且つこの誘導は、基本的なNotchシグナル伝達も阻害する汎Notchインヒビターであるγ-セクレターゼインヒビターDBZにより遮断されることがわかった(図9A)。J1 mAbがこの培養システムへ添加された場合、ルシフェラーゼ活性は有意に阻害され、J1-65D及びJ1-183Dは最強の阻害を示した。重要なことに、最良の2種のJ1 mAb(J1-65D及びJ1-183D)はまた、リガンド特異性を検証するために、他のNotchリガンドに対して試験した。図9Bに示したように、これらのmAbのいずれも、他の被験リガンド(J2及びDLL4)により誘導されたNotch活性化を防止することができなかった。
【０１５１】
内在性標的遺伝子HES1のNotch活性化を遮断するJ1 mAbの能力も、調べた(図9C)。N1及びJ1を有意なレベルで発現するMDA-MB-231細胞を、J1 mAbで処置し、Notch標的遺伝子活性のレベルを調べた。ルシフェラーゼアッセイ同様、全てのJ1 mAbは、Notch制御された標的遺伝子の発現を減少する有意な能力を示した。J1-65D及びJ1-183Dは、HES1転写を抑制する点で最も有効であった。いずれかのJ1 mAbが、マウス細胞におけるNotch標的Hes1の発現を調節することができるかどうかを試験するために、mJ1を過剰発現しているマウス黒色腫B16F10細胞を、J1 mAb、J1-142B mAb(mJ1タンパク質に結合する陽性対照として)、陰性対照IgG1 mAb又は汎NotchインヒビターDBZの各々の存在下で培養した(図10A)。Hes1発現の抑制は、DBZの使用で認められ、並びにJ1-142B抗体でより少ない程度認められた。他の抗-J1抗体又は対照IgG1抗体については、抑制は認められなかった。抗体J1-65D、J1-156A、J1-183D及びJ1-187Bには、完全なマウスシステムにおいてmJ1を介して媒介されたN1シグナル伝達を遮断する能力がないことは、マウスJ1対ヒトJ1へのそれらの低下した結合と一致し(図3及び4)、これはエピトープへ寄与するE228、及びN1へのmJ1の結合を効果的に遮断することのそれらの機能滴不能の結果である(図1)。これらのデータは、4種のDSLドメイン標的化抗体は、それらのマウスJ1への弱い結合にもかかわらず、マウスJ1よりもヒトJ1により媒介されるN1結合及びシグナル伝達の遮断に関して機能的に特異的であることを示唆している。これらの抗体のラットJ1へ結合する能力(図4D)は、これらは、ラットJ1により誘導されたNotchシグナル伝達の阻害が可能であることを示唆した。実際J1-65D及びJ1-183Dの両方の抗体は、組換えラットJagged 1-Fc融合タンパク質により刺激されたMDA-MB-231細胞及びHUVEC細胞の両方において、Notchシグナル伝達を効果的に阻害した(図10B)。これらのデータは、これらの抗体のラットJ1リガンドへ結合する能力は、そのNotchシグナル伝達活性を遮断するのに十分であることを明らかにしている。
【０１５２】
実施例6−3-Dスフェロイド-ベースのアッセイを使用するインビトロにおける腫瘍成長の阻害
標準2-D成長条件下で、J1 mAbは、MDA-MB-231乳癌細胞の成長を阻害しなかった(データは示さず)。同様の知見が、LS-1034細胞株上で試験した場合に、Merck 抗-N1 mAbについても報告されている[66]。細胞-細胞接触は、Notchシグナル伝達の活性化に必要であるので、スフェロイド-ベースの3-D成長モデルを使用し、J1 mAbの腫瘍成長を遮断する能力を試験した。更に、この3-Dモデルは、低酸素症及びアシドーシスを含むインビボ条件を比較的良く模倣しており、より現実的な状況におけるこれらのmAb作用を評価することを可能にする。スフェロイドは、MDA-MB-231乳癌細胞から作製し、且つ異なる濃度のJ1-65D mAbのそれらの成長を阻害する能力を、評価した。最大成長阻害は、最小抗体濃度5μg/mlで認められた(図11A)。10μg/mlは、Notch標的遺伝子HES1及びプロ-腫瘍形成性サイトカインIL6のわずかにより良い転写抑制を生じた(各々、図11B及び11C)ので、この濃度を、その後の実験のために選択した。
【０１５３】
スフェロイドは、異なるレベルのJ1を発現している乳癌細胞株で作製し(図12A)、それらの成長をJ1 mAb処置下でモニタリングした。J1 mAbによる成長阻害のレベルは、J1発現レベルと厳密に相関したことがわかった。実際、MCF7細胞に関して有意な作用は、認められなかったが(ほぼ検出不能なJ1レベル)(図12B)、他方MDA-MB-468(中間J1)及びMDA-MB-231(高J1)細胞株に関して、次第に増大する成長阻害作用が認められた(図12C、D)。MDA-MB-231において、J1-65D及びJ1-183D mAbの両方は、スフェロイド成長を、汎NotchインヒビターDBZと同等の有効性で遮断した(図12D及び図13A)。Notchシグナル伝達の阻害は、Notch-標的遺伝子HES1の発現の抑制について、qPCRにより確認した(図13B)。
【０１５４】
J1抗体が腫瘍成長を阻害した機序は、本実験の最後に収集されたスフェロイドの、免疫標識、フローサイトメトリー及びqPCR分析により、調べた。Ki67+細胞の割合により測定した免疫組織化学的試験は、増殖に対する最小作用を確定した(図13C)。癌幹細胞において濃厚な集団であるCD44+/CD24-細胞(図13D)、並びにアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現している幹細胞及び前駆細胞(図13E)の頻度の低下が、認められた。これらのデータは、Jagged 1遮断性抗体は、処置したMDA-MB-231スフェロイド中で乳癌幹細胞を枯渇することを示唆している。qPCRによる乳癌生物学において先に関連付けられた他の遺伝子の発現の分析は、成長及び生存に関与した遺伝子IL6(図13F)[67、68]及びCA9(データは示さず)[69、70]の低下した発現を確定した。上皮マーカーE-カドヘリン及びPRRX1(図13F)の増大した発現は、上皮間葉転換の逆行の可能性を示し[71-73]、これはIL6減少それ自身によっても示唆された。
【０１５５】
実施例7−3-Dスフェロイド-ベースのアッセイを使用するインビトロにおける腫瘍成長阻害に対する化学療法との併用の相加作用
MDA-MD-231乳癌3-Dスフェロイドを、乳癌の標準治療用薬物であるパクリタキセル(図14A)又はドキソルビシン(図14B)の亜致死量と組み合わせた、J1-65D又はJ1-183D抗体により処置した。両方の併用療法は、いずれかの単独治療のみよりも、スフェロイド成長の減少においてより効果があることを証明した。
【０１５６】
実施例8−インビトロ及びインビボにおけるヒトJ1過剰発現により媒介された腫瘍成長促進の阻害
MDA-MB-231乳癌細胞及びU87神経膠腫細胞を、ヒトJ1タンパク質をコードしているレトロウイルスにより、安定して形質導入した。インビトロにおけるそれらの成長を、親細胞のJ1-過剰発現細胞との共培養により、調べた。ベクター-形質導入された細胞を、対照として使用した(図15A)。両方の細胞株において、J1過剰発現は、細胞成長を有意に促進し、その理由はベクター-形質導入された細胞ではなく、J1-形質導入された細胞は、時間をかけてそれらの親細胞を過剰成長するからである。BALB/cヌードマウスをU87安定細胞により異種移植したインビボモデルにおいて、ヒトJ1タンパク質は、U87異種移植片の成長に対し、有意なインビボにおける成長の利点を付与した(図15B)。
【０１５７】
J1遮断性mAb(J1-65D及びJ1-183D)のヒトJagged 1過剰発現に応じて増強された腫瘍成長を阻害する能力を、調べた(図16)。投与量10mg/kgで、これらの遮断性mAbは、J1-誘導した腫瘍成長を有意に遅延した(図16A)。20mg/kgでJ1-65Dは、ヒトJagged 1過剰発現により促進された増強された腫瘍成長を完全に無効にしたが、J1-183D抗体は、より低い投与量で投与された場合よりも、かなりより有効であった(図16B)。
【０１５８】
実施例9−インビボにおける腫瘍異種移植片成長阻害
ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231細胞がBALB/cヌードマウスへ注射された異種移植片モデルを使用し、J1遮断性mAb(J1-65D及びJ1-183D)の、インビボにおける腫瘍成長に対する作用を調べた。これらのmAbを、腫瘍移植と同時に注射し、引き続き投与量10mg/kgで、3又は4日毎に注射した場合、遮断性mAbは、対照群と比べ、腫瘍成長を遅らせることができた(図17A)。遮断性mAb J1-183Dは、最も強力な阻害を示し(30日間にわたり有意な成長低下を伴う)、J1-187B及びJ1-65Dは、軽度の阻害を示した。20mg/kgで、両方の遮断性mAb(J1-65D及びJ1-183D)は、最初の36日間、腫瘍成長を有意に阻害した(図17C)。
【０１５９】
種-特異性PCRプライマーを開発し、且つ図17Aに例示した実験の終了時に収集したMDA-MD-231異種移植片におけるヒト又はマウスのNotch標的遺伝子の発現を個別に分析するよう、試験した(図17B)。腫瘍微小環境及び血管系において、ヒトNotch標的遺伝子は、異種移植された腫瘍細胞において発現されたが、マウスNotch標的遺伝子は、マウス細胞において発現されなかった。これらの抗体は、ヒトJ1タンパク質のみを機能的に阻害するかどうか、或いはこれらはまた、マウスJ1タンパク質にも作用するかどうかに関わりなく、マウスとヒトの受容体/リガンドと腫瘍血管分布(vascularity)に対する作用の間のクロストークは、例えヒトJ1特異性抗体であっても、マウスNotch標的遺伝子発現を変更する機会をもたらす。
【０１６０】
初期の分析は、ヒトHES-1転写発現は、両方のJ1-65D抗体により有意に抑制されたが、J1-183Dを使用し、有意でない抑制が認められたことを指摘している。マウスHey2抑制に対する有意でない傾向は、各J1 mAbで処置した異種移植片において認められ、これはマウスJ1により媒介されたストロマNotchシグナル伝達は、効果的に標的化されないことを示唆している。これらのデータは、J1 mAbで処置した乳癌異種移植片におけるNotch経路のインビボ抑制を確認しているが、HES1の抑制の程度は、どのmAbが、腫瘍成長に対し最も作用があるかを指摘しないことを示唆している。
【０１６１】
実施例10−インビトロにおいて特異性及び機能性を保持するヒト化及び脱免疫化された抗体
ヒト化及び脱免疫化を、Lonza Biologics社に外部委託した。更なるタンパク質操作は、可能性のある翻訳後修飾を回避／除去すること、及び等電点の変化の最小化を含んだ。4種の軽鎖及び4種の重鎖の変種を、インシリコでデザインし、一緒にして、J1-65D及びJ1-183Dの両方について、16種の抗体変種を作製した(表5)。未変更のCDRsを含むキメラ抗体も構築した。
【０１６２】
【表５】
0006416117.tif 000006
【０１６３】
これらの抗体のタンパク質収量、それらの可溶性凝集物のレベル及びそれらの免疫原(J1-DE3)に対する結合親和性を、(表6)に示している。VL4軽鎖を含むJ1-65D変種(J1抗原に対する好適な親和性を欠く)を除き、全ての抗体は、許容し得る収量、凝集物レベル及び親和性を明らかにした。
【０１６４】
【表６】
0006416117.tif 000007
【０１６５】
ヒト化抗体変種J1-65DV1-16(図18A)及びJ1-183DV1-16(図18B)の、細胞表面ヒトJ1へ結合する能力を、親CDR配列を保持するキメラ抗体の能力と比較した。J1-65DV13-16(共通VL4軽鎖)を除き、全ての変種が、キメラ抗体と同等のJ1結合活性及び特異性を保持した。いずれの変種も、J2結合活性を示さなかった。ヒト化抗体変種J1-65DV1-16(図19A)及びJ1-183DV1-16(図19B)はまた、ヒトJ1へのそれらの特異性を保持し、マウスJ1タンパク質へは結合しなかった。
【０１６６】
J1-発現している細胞を染色するための、アビジン-コートされた蛍光ビーズに結合されたビオチン化された可溶性ヒトN1 EGF11-13組換えタンパク質を使用するFACS-ベースの結合アッセイを、各変種mAbの連続希釈物を用い、FACSによるN1へのJ1結合を遮断するそれらの能力を試験するために、行った(表7)。J1-65DV13-16(共通VL4軽鎖)を除き、全ての変種が、それらの親及びキメラ抗体と同等のインビトロにおける遮断活性を保持した。従って、16種のJ1-65D1変種のうちの12種V1-12及び全てのJ1-183D変種は、所望の結合活性及び遮断活性を有する。
【０１６７】
【表７】
0006416117.tif 000008
【０１６８】
ヒト化及び脱免疫化されたJ1 mAbは、J1リガンドのその受容体N1への結合を遮断することができることが確立されたので、Notchシグナル伝達経路の活性に対するそれらの作用を調べた。Notch補因子RBPJの制御下で、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現しているヒト結腸直腸癌細胞株LS174Tを、固定されたJ1タンパク質(EGF3までのN-末端)により刺激し、このことはルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を効率的に活性化し、且つこの誘導は、汎Notchインヒビターであるγ-セクレターゼインヒビターDBZにより遮断された(図20)。選択されたヒト化J1 mAb(J1-65DV4、V5、V8、V9、V12又はJ1-183DV1、V8、V9)又はキメラ抗体が、培養システムへ添加された場合、ルシフェラーゼ活性は、親マウスmAbによるものと同じくらい効果的に阻害された。
【０１６９】
ヒト化及び脱免疫化された抗体の、MDA-MB-231乳癌スフェロイドの3-D成長を阻害する能力も、調べた。この実験のために、抗体濃度5μg/mlを選択し、mAb濃度の低下は、ヒト化された変種間の機能の差異を同定することを補助するかどうかを決定した。J1-65D変種に関して(図21)、試験したそれらは全て、スフェロイド成長を、mIgG1対照と比べ、有意に低下した。J1-65DV5及びJ1-65DV9のスフェロイド成長を阻害する能力は、親mAbとほとんど同等であったが(図21)、変種J1-65DV4、8及び12は、スフェロイド成長を阻害する能力のわずかな低下を示した。J1-183D変種(これは一般にJ1-65D変種よりも、J1についてより低い親和性を示す)に関して、試験したそれらは全て、スフェロイド成長を、mIgG1対照と比べ、有意に低下したが、全般的にスフェロイド成長を阻害するそれらの能力において、より注目される差異が存在した(図22)。J1-183DV1は、当初のマウス抗体とほとんど同等の有効性を示したのに対し、変種9、8、12及び15は、次第に少ない作用を示した。これは、このアッセイにおけるその機能的重要性を強調し、Jagged 1に関するそれらの親和性と密接に対応していた。全般的にこれらのデータは、親マウスmAbのインビトロにおけるNotchシグナル伝達及び腫瘍成長を阻害する機能的能力を保持している、J1結合性及び遮断性ヒト化抗体のパネルを確定する。
【０１７０】
下記の材料及び方法は、本発明者らにより使用されたものを例示している。
【０１７１】
抗-J1モノクローナル抗体の作製
DSLドメイン及び3つの隣接EGFリピート(アミノ酸185-335)を含むヒトJ1細胞外領域の一部は、N-末端His6タグ及びC-末端ビオチン化タグを伴い、大腸菌NM554において、先に説明されたように[65]、発現した。DSLドメイン(アミノ酸185-230)をコードしている類似の構築体は、同様の様式で発現した。これらのタンパク質を、Ni2+-アフィニティクロマトグラフィーにより、細胞溶解液から精製し、インビトロにおいてリフォールディングし、陰イオン交換FPLC及び逆相HPLCにより更に精製した。DSLドメイン由来の還元されたペプチド(アミノ酸197-214 NKFCRPRDDFFGHYACDQ (配列番号.35))を、市販のGenScriptにより合成し、リフォールディングし、キーホールリンペットヘモシアニンと複合させた。
【０１７２】
MF1マウス(6〜8週齢の雌)を、前述の精製されたタンパク質又はペプチドにより、標準プロトコールに従い、すなわち、10日毎に3回、各マウスに1回の免疫につき100μgで、免疫化した。初回免疫後40日目に、追加免疫を施し、融合をその後2日間行った。標準融合プロトコールは、融合パートナーとしてのNS0細胞に従い、且つハイブリドーマは、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン(HAT)選択下で成長させた。
【０１７３】
ハイブリドーマ上清を、ELISAにより、免疫原と反応性である分泌された抗体の存在についてスクリーニングした。その後陽性細胞株を、限定希釈によりクローニングした。ハイブリドーマ由来の上清を、ヒトJ1によりトランスフェクトされたHEK293T細胞への結合に関して、及びヒトN1可溶性タンパク質のJ1トランスフェクトされた細胞への結合の遮断に関して、更にスクリーニングした。精製された抗体を、ハイブリドーマ細胞の無血清培地への適用によるか、又は無血清培地における細胞のバルク培養、それに続くプロテインA若しくはプロテインG精製のいずれかにより作製した。精製された抗体を、ELISA及びFACSアッセイにより、結合及び遮断に関する特異性について再度試験した。
【０１７４】
Jagged 1に結合するmAbの同定のためのELISA
96ウェルMaxiSorpプレートを、PBS中の好適なJ1抗原10μg/mlにより、4℃で一晩コーティングした。その後プレートを、PBS/0.1％Tween-20で洗浄し、PBS中の1％BSAにより室温で2時間ブロックした。プレートを再度洗浄し、その後ハイブリドーマ上清を添加し、1時間インキュベーションした。洗浄後、HRP複合型抗-マウス二次抗体を、各ウェルへ1:1000希釈で添加し、1時間インキュベーションした。基質ABTSを各ウェルに添加し、その後洗浄し、5〜30分以内にOD405nmをプレートリーダーで測定した。
【０１７５】
発現構築体
完全長ヒトJ1に関するIMAGEクローンを、SourceBioscience社から購入し、オープンリーディングフレーム配列を、PCRにより増幅し、pEGFP-N1発現ベクターへ方向性をもってクローニングした。Myc-DDK-タグ付きヒトJ2完全長発現ベクターを、Origene Technologies社から購入した。ヒトDLL4及びmJ1は、先に説明されている[25]。細胞表面上にヒト及びマウスJ1-DSL-EGF3を発現するために、pEGFP-N1をベースにした発現ベクターを構築し、C-末端でEGFPに融合されたN-末端-タグ付きCD1b分子(そのα3ドメイン、膜貫通領域、及び細胞質側末端を含む)を発現した。ヒト及びマウスJ1-DSL-EGF3をコードしているcDNA配列を、PCR増幅し、前記ベクターへ方向性をもってクローニングした。ウサギ及びモルモットのJ1アミノ酸配列を、ヒトの配列と比較し、FLAG-EGFP-タグ付きヒトJ1構築体を、ウサギ(I275T)及びモルモット(R231K、L247I、D250N、I275T、N277I)J1構築体の作製に従い変異した。FLAG-EGFP-タグ付きマウスJ1構築体を、ラット構築体(D228E)を作製するように変異した。
【０１７６】
抗-J1抗体によるFACS分析
ヒトJ1、J2又はFLAG-EGFP-タグ付きDSL-EGF3構築体によりトランスフェクトされたHEK293細胞、ヒトDLL4又はマウスJ1によりトランスフェクトされたB16F10細胞、並びにヒト癌細胞株を、FACS洗浄緩衝液(PBS中2％FBS＋0.1％アジ化ナトリウム)中に10μg/mlに希釈された精製された抗-J1抗体、又は未希釈のハイブリドーマ上清のいずれかにより、染色し、引き続きアロフィコシアニン(APC)-複合型二次抗体の1:200希釈物で染色し：マウス一次抗体については、ヤギ抗-マウス-APC(eBioscience社)を使用し；ヒト化抗体及びキメラ抗体には、ヤギ抗-ヒトIgG(H+L)二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories社)を使用した。洗浄後、試料を、1％パラホルムアルデヒド(PBS中)で固定し、FACSCaliburにより獲得した。FACSデータを、FlowJoソフトウェア(TreeStar社)により解析した。場合によっては、APC-複合型J1-65D及びJ1-183D抗体を使用した(例えば、図4E)。
【０１７７】
抗-J1抗体による免疫染色分析
J1及びJ2 HEK293トランスフェクタントのアセトン固定したサイトスピン細胞調製品を、未希釈のハイブリドーマ上清と共に、室温で30分間インキュベーションした。J2モノクローナル抗体MHJ2-523(Biologend社)を、J2染色のための陽性対照として1:50希釈で使用した。PBS中で2回洗浄後、これらのスライドを、ポリクローナルヤギ抗-マウス免疫グロブリン/HRP抗体(Dako社、P0447)の1:50希釈物と共に、室温で30分間インキュベーションした。ポリクローナルウサギ抗-ヤギ免疫グロブリン/HRP抗体(Dako社、P0449)を、1:25希釈でJ1ヤギポリクローナル抗体染色したスライドのために使用した。PBS中で2回洗浄後、呈色反応を、REAL Envision Detection System、ペルオキシダーゼ/DAB+、ウサギ/マウスキット(Dako社、K5007)を用いて、発色させた。これらのスライドを洗浄し、Harrisヘマトキシリン中で対比染色し、その後Aquatex Mounting Agent (BDH/VWR社、63123S)中に搭載した。
【０１７８】
免疫組織化学
簡単に述べると、パラフィン-包埋したスフェロイド切片を、脱脂し(de-waxed)、加圧下で、マイクロウェーブオーブン内750Wで10分間、熱が誘導した抗原賦活化を施した(クエン酸塩pH6賦活化緩衝液；Dako社)。切片を、Ki67-特異的Ab(M7240；Dako社；1:50)と共に、室温で1時間インキュベーションした。結合したAbを、Envisionシステム(DAKOCytomation社、イーリー、ケンブリッジシャー、英国)を用いて検出し、2,3-ジアミノベンジジン色素原を用いて可視化し、ヘマトキシリンにより対比染色した。
【０１７９】
Notch結合遮断アッセイ
先に説明されたように[74]、ヒトN1 EGF11-13(411-526)を、大腸菌において発現させ、インビトロにおいてリフォールディングさせ、紫色の蛍光アビジン-コートされたビーズ(Spherotech社)により標識した。ヒトJ1によりトランスフェクトされたHEK293細胞又はマウスJ1によりトランスフェクトされたB16F10細胞を、HBBS/10％FCS中に希釈されたJ1抗体上清又は精製された抗体(マウス、キメラ又はヒト化)の存在下、N1蛍光ビーズにより染色した。細胞を洗浄し、染色緩衝液中に再懸濁させ、その後FACSCaliburにより分析し、データをCellQuestにより解析した。ヒトJagged 2によりトランスフェクトされたHEK293細胞並びにヒト及びマウスDLL4によりトランスフェクトされたB16F10細胞を、同様に染色し、特異性の遮断を試験した。
【０１８０】
CD46結合遮断アッセイ
96-ウェルMaxiSorpプレートを、トリス緩衝食塩水中の濃度5μg/mlのCD46(CCP1-CCP3)によりコーティングし、4℃で一晩インキュベーションした。このプレートを、20mM HEPES、pH7.4、1％BSA中で、4℃で一晩ブロックした。その後、ELISA緩衝液(ビオチン化されたJ1 DSL-EGF3(0.5μg/ml)を含有する、20mM HEPES、pH7.4、10mM CaCl2、0.005％Tween 20、0.25％NP40、4％BSA)中、各ハイブリドーマ上清の1:10 希釈物の非存在又は存在下で、室温で2時間インキュベーションした。ELISA緩衝液で5回洗浄した後、プレートを、ニュートラビジンHRP複合体(Invitrogen社)の1:1000希釈物と共にインキュベーションした。プレートを、6回洗浄し、2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩(Sigma-Aldrich社)により呈色させた。
【０１８１】
抗体結合遮断アッセイ
精製したJ1 mAbを、EZ-link Micro Sulfo-NHS-ビオチン化キット(Fisher Scientific社)を製造業者のマニュアルに従い用いて、ビオチン化した。ビオチン化されたmAbを使用し、J1の1.0μg/mlにより安定してトランスフェクトされたHEK293細胞を、様々な濃度の非-ビオチン化J1 mAbの存在下で、4℃で20分間、染色した。洗浄後、ストレプトアビジン-PE(Sigma-Aldrich社、1:200)を使用し、ビオチン化されたJ1 mAb染色を検出し、暗所において4℃で20分間インキュベーションした。その後試料を洗浄し、1％パラホルムアルデヒドにより固定し、その後FACSCaliburにより分析した。FACSデータを、Flowjoソフトウェア(TreeStar社、カリフォルニア州)により解析した。
【０１８２】
表面プラズモン共鳴
マウスJ1 mAbの異なる形のJ1可溶性タンパク質への結合親和性を、BIACore T-3000により試験した。J1 mAbを、チップ表面にカップリングしている第一級アミンを介して固定した。J1可溶性タンパク質を、10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％界面活性剤P20中で、チップ上を通過させた。力価決定を、濃度範囲0.8nMから10nMまで(J1-187Bについて7.8nMから100nMまで)にわたり、流量10μl/分、25℃で、行った。
【０１８３】
J1安定細胞株の作製
J1完全長cDNAを、レトロウイルスベクターLZRSpBMN-リンカー-IRES-EGFPへクローニングした。HEK293T細胞を、このウイルス構築体によりトランスフェクトし、且つパッケージング混合物及びウイルス粒子を、トランスフェクション後24、48及び72時間に収集した。ウイルス含有培養上清を、0.45μmシリンジフィルターユニットにより濾過し、標的細胞MDA-MB-231及びU87に適用した。これらの細胞を、7日間培養し、分割し、必要な場合は培地を交換した。次にGFPを高発現している集団を、FACS検索し、培養において拡大した。J1発現を確認し、FACS染色により、GFP発現と相関させた。空ベクターを形質導入した細胞も、並行して作製した。
【０１８４】
J1ノックダウン
レンチウイルスベクターTRC2中のMission shRNA (配列CCGGGTGCACCTCTGACTCCTATTACT CGAGTAATAGGAGTCAGAGGTGCACTTTTTG (配列番号:36))を購入し(Sigma-Aldrich社)、且つHEK293T細胞を、パッケージングプラスミド(Invitrogen社)及びレンチウイルスプラスミドにより、同時トランスフェクトすることにより、レンチウイルス粒子を作製した。ウイルス粒子を含有する培養上清を、トランスフェクション後24、48及び72時間に収集し、0.45μmシリンジフィルターユニットにより濾過した。次にウイルス粒子を、標的細胞MDA-MB-231に適用し、これらの細胞を、7日間培養し、分割し、必要な場合は培地を交換し、その後それらのJ1発現レベルを、前述のようにFACSにより試験した。
【０１８５】
J1 mAbのドットブロットエピトープマッピング
J1 DSL-EGF3構築体においてY190H、F199A、R201A、R203A、F207A、N215A、E228D及びR231Kを作製するためのミスセンス変異を、Pfu DNAポリメラーゼによるPCR-ベースの部位特異的変異誘発により、野生型構築体のcDNA配列を含むpQE30組換えプラスミドへ導入した。所望の変異の作製は、DNAシークエンシングにより確認した。変異型構築体を、野生型J1 DSL-EGF3 BirAについて説明したように、精製した。質量は、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)により確認した。野生型及び変異型構築体を、検出に適した濃度で調製し、ニトロセルロース上に1μlをスポットした。タンパク質を、希釈したハイブリドーマ上清又は精製したmAbにより、図面の説明文に示された濃度で、引き続き抗-マウスHRP複合体(1:1000)で検出し、化学発光により可視化した(Amersham社、ECL Plusウェスタンブロット検出システム)。
【０１８６】
総RNA抽出、逆転写及び定量的リアルタイムPCR
細胞培養物/スフェロイドからの総RNAを、RNeasyミニキット(Qiagen社、英国)を製造業者の指示に従い用いて分離した。相補的DNA(cDNA)を、総RNAの0.5〜1μgから、Superscript III第一鎖システム(Invitrogen社)を用いて合成した。定量的PCR(qPCR)分析を、SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal(Invitrogen社)及びChromo4蛍光検出装置(MJ Research社、米国)を用い、3つ組みで行った。相対定量を、β2-ミクログロブリン遺伝子又はマウスβ-アクチン発現に対し規準化する、ΔΔCt法を用いて行った。プライマーに関する配列を、下記表に示す。
【０１８７】
【表８】
0006416117.tif 000009
【０１８８】
ルシフェラーゼアッセイ
実験に先立ち、透明な底の96-ウェルプレート(CELLSTAR社)ウェルを、J1-ECD断片(NE3-Fc及びNE12-Fc)、他のNotch-リガンド(J2又はDLL4；両方共R&D社より)又は対照タンパク質(mIgG2b)のいずれかにより、0.1％BSA-PBS中濃度5μg/mlでコーティングした(4℃で一晩インキュベーション)。次にNotch補因子RBPJの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現しているLS174T結腸直腸癌細胞を、異なるmAb(10μg/ml)又はDBZ(100nM)の存在下で、播種した(4×104個細胞/ウェル)。次にルシフェラーゼ活性を、24時間後、Bright-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega社)を使用し、定量した。
【０１８９】
スフェロイドアッセイ
細胞を収集し、2.5％マトリゲル(BD)-完全DMEM培地中に再懸濁した。細胞懸濁液を、低接着96-ウェルプレート(Corning社)上に播種し(200μl/ウェル)、次にほぼ固定された細胞数(MDA-MB-231及びMDA-MB-468細胞株について5×103個細胞；MCF7細胞について2×103個細胞)のスフェロイドを、プレートを1800rpmで10分間回転することにより、作製した。翌日、スフェロイドの写真を撮影し(1日目)、処置を加えた(mAbを、10μg/ml[ヒト化抗体について5μg/ml]、他方DBZを、濃度100nMで使用)。一部の実験において、パクリタキセル(1nM)及びドキソルビシン(20nM)を、J1-65D mAb処置と併用した。2日毎に、写真を撮影し、培地の半分を、mAb/薬物を含有する新鮮な培地と交換した。実験の最後に、スフェロイドを、RNA抽出のために溶解し、免疫組織化学分析のためにプロセシングし且つパラフィン包埋するか、又はFACS分析のために単独細胞懸濁液へピペッティング及びトリプシン処理により、解離させるかのいずれかで処置した。スフェロイドサイズは、ImageJソフトウェアを使用する、画像解析により、評価した。
【０１９０】
癌幹細胞定量
スフェロイド解離後、細胞を、CD44-CD24表面発現(MDA-MB-231細胞株における癌幹細胞-濃厚な集団を同定することができるマーカーの組合せ[75])又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ1活性(幹細胞を同定するより一般的な方法[76])のいずれかにより分析した。CD44-CD24分析に関して、細胞を、フィコエリトリン(PE)-複合型抗-ヒトCD44抗体(クローン2C5；R&D Systems社)により、製造業者の指針に従い染色した。洗浄後、試料を、1％パラホルムアルデヒド(PBS中)で固定し、FACSCaliburにより獲得した。アルデヒドデヒドロゲナーゼ1活性に関して、細胞を調製し、製造業者のプロトコールに従い分析した(ALDEFLUOR(商標)キット；STEMCELL Technologies社)。
【０１９１】
J1安定細胞株共-培養実験
J1-又はベクター-形質導入されたMDA-MB-231細胞及びU87細胞を、それらの親細胞と共に、6ウェルプレートにおいて、5週間、共培養した。細胞を毎週2回分割し、GFP陽性集団(形質導入された細胞を表す)を、各分割後、FACSにより測定した。
【０１９２】
異種移植片実験
マトリゲル100μl中のMDA-MB-231細胞(1×107個)又はU87安定細胞株(1×107個ベクター又はヒトJ1形質導入された)を、BALB/c nu/nuマウスの側腹部へ皮下注射した。指定された濃度のJ1遮断性mAb、対照IgG1 mAb、又は等容積のPBSを、腫瘍移植片として、同時に、及びその後3又は4日毎に、腹腔内注射した。腫瘍寸法を測定し、腫瘍容積を、説明されたように[77]、L×W×H×π/6として算出した。幾何平均直径(GMD)を、(L×W×H)1/3として算出した。
【０１９３】
J1 mAbのヒト化及び脱免疫化
J1 mAb(J1-65D及びJ1-183D)を、Lonza Biologics社により、ヒト化及び脱免疫化した。簡単に述べると、インシリコヒト化及び脱免疫化を、両方のmAb配列について、CDRグラフティング技術及びT-細胞エピトープ減少を使用し、行った。重鎖及び軽鎖可変領域cDNAsを合成し、ヒトIgG1フレームワークをコードしている発現ベクターへとクローニングした。合計で16種の変種を、各mAbについて作製した。一過性トランスフェクションを、CHOK1SV GS-KO細胞において行い、ヒト化抗体を、プロテインAクロマトグラフィーにより、200ml培養上清から精製した。
【０１９４】
配列番号１
RASGNIHNYLA
配列番号２
NAKTLADDI
配列番号３
QHFWSAPWT
配列番号４
DYEMH
配列番号５
QPGGGGTAYNQKFKG
配列番号６
RGYDDYPFAY
配列番号７
KSSQSLLNSSNQKNYLA
配列番号８
FASTRESGV
配列番号９
QQHYSTPYT
配列番号１０
DYAMH
配列番号１１
NTYYGDASYNQKFKG
配列番号１２
LYDYDGGFAY
配列番号１３
RTSENIYSYLT
配列番号１４
NAKILAAGV
配列番号１５
QHHYDIPWT
配列番号１６
DYAIH
配列番号１７
NTYYGDSKYNQKFKD
配列番号１８
GYDGFAY
配列番号１９
RASENIYSYLA
配列番号２０
NAKTLAEVV
配列番号２１
QHHYGTPLT
配列番号２２
DYAMH
配列番号２３
NTYYGDARYNQKFKG
配列番号２４
GLEGFAY
配列番号７９
QQHYSTPYT
配列番号８０
NAKTLAEGV
配列番号８１
QHHYGTPWT
【０１９５】
参考文献
1. Carmeliet P, Jain RK: Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature 2011, 473(7347):298-307.
2. Li JL, Harris AL: Crosstalk of VEGF and Notch pathways in tumour angiogenesis: therapeutic implications. Front Biosci 2009, 14:3094-3110.
3. Jain RK, Duda DG, Clark JW, Loeffler JS: Lessons from phase III clinical trials on anti-VEGF therapy for cancer. Nat Clin Pract Oncol 2006, 3(1):24-40.
4. Kerbel RS: Tumor angiogenesis. N Engl J Med 2008, 358(19):2039-2049.
5. Sainson RC, Harris AL: Regulation of angiogenesis by homotypic and heterotypic notch signalling in endothelial cells and pericytes: from basic research to potential therapies. Angiogenesis 2008, 11(1):41-51.
6. Swiatek PJ, Lindsell CE, del Amo FF, Weinmaster G, Gridley T: Notch1 is essential for postimplantation development in mice. Genes Dev 1994, 8(6):707-719.
7. Hrabe de Angelis M, McIntyre J, 2nd, Gossler A: Maintenance of somite borders in mice requires the Delta homologue DII1. Nature 1997, 386(6626):717-721.
8. Xue Y, Gao X, Lindsell CE, Norton CR, Chang B, Hicks C, Gendron-Maguire M, Rand EB, Weinmaster G, Gridley T: Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Hum Mol Genet 1999, 8(5):723-730.
9. Gale NW, Dominguez MG, Noguera I, Pan L, Hughes V, Valenzuela DM, Murphy AJ, Adams NC, Lin HC, Holash J et al: Haploinsufficiency of delta-like 4 ligand results in embryonic lethality due to major defects in arterial and vascular development. Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101(45):15949-15954.
10. Joutel A, Corpechot C, Ducros A, Vahedi K, Chabriat H, Mouton P, Alamowitch S, Domenga V, Cecillion M, Marechal E et al: Notch3 mutations in CADASIL, a hereditary adult-onset condition causing stroke and dementia. Nature 1996, 383(6602):707-710.
11. Oda T, Elkahloun AG, Pike BL, Okajima K, Krantz ID, Genin A, Piccoli DA, Meltzer PS, Spinner NB, Collins FS et al: Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nat Genet 1997, 16(3):235-242.
12. Bray SJ: Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nat Rev Mol Cell Biol 2006, 7(9):678-689.
13. Purow B: Notch inhibition as a promising new approach to cancer therapy. Adv Exp Med Biol 2012, 727:305-319.
14. Weng AP, Ferrando AA, Lee W, Morris JPt, Silverman LB, Sanchez-Irizarry C, Blacklow SC, Look AT, Aster JC: Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia. Science 2004, 306(5694):269-271.
15. Fabbri G, Rasi S, Rossi D, Trifonov V, Khiabanian H, Ma J, Grunn A, Fangazio M, Capello D, Monti S et al: Analysis of the chronic lymphocytic leukemia coding genome: role of NOTCH1 mutational activation. J Exp Med 2011, 208(7):1389-1401.
16. Puente XS, Pinyol M, Quesada V, Conde L, Ordonez GR, Villamor N, Escaramis G, Jares P, Bea S, Gonzalez-Diaz M et al: Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in chronic lymphocytic leukaemia. Nature 2011, 475(7354):101-105.
17. Kridel R, Meissner B, Rogic S, Boyle M, Telenius A, Woolcock B, Gunawardana J, Jenkins C, Cochrane C, Ben-Neriah S et al: Whole transcriptome sequencing reveals recurrent NOTCH1 mutations in mantle cell lymphoma. Blood 2012, 119(9):1963-1971.
18. Lee SY, Kumano K, Nakazaki K, Sanada M, Matsumoto A, Yamamoto G, Nannya Y, Suzuki R, Ota S, Ota Y et al: Gain-of-function mutations and copy number increases of Notch2 in diffuse large B-cell lymphoma. Cancer Sci 2009, 100(5):920-926.
19. Shi W, Harris AL: Notch signaling in breast cancer and tumor angiogenesis: cross-talk and therapeutic potentials. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2006, 11(1):41-52.
20. Lobry C, Oh P, Aifantis I: Oncogenic and tumor suppressor functions of Notch in cancer: it's NOTCH what you think. J Exp Med 2011, 208(10):1931-1935.
21. Ranganathan P, Weaver KL, Capobianco AJ: Notch signalling in solid tumours: a little bit of everything but not all the time. Nat Rev Cancer 2011, 11(5):338-351.
22. Li K, Li Y, Wu W, Gordon WR, Chang DW, Lu M, Scoggin S, Fu T, Vien L, Histen G et al: Modulation of Notch signaling by antibodies specific for the extracellular negative regulatory region of NOTCH3. J Biol Chem 2008, 283(12):8046-8054.
23. Wu Y, Cain-Hom C, Choy L, Hagenbeek TJ, de Leon GP, Chen Y, Finkle D, Venook R, Wu X, Ridgway J et al: Therapeutic antibody targeting of individual Notch receptors. Nature 2010, 464(7291):1052-1057.
24. Pellegrinet L, Rodilla V, Liu Z, Chen S, Koch U, Espinosa L, Kaestner KH, Kopan R, Lewis J, Radtke F: Dll1- and dll4-mediated notch signaling are required for homeostasis of intestinal stem cells. Gastroenterology 2011, 140(4):1230-1240 e1231-1237.
25. Li JL, Sainson RC, Shi W, Leek R, Harrington LS, Preusser M, Biswas S, Turley H, Heikamp E, Hainfellner JA et al: Delta-like 4 Notch ligand regulates tumor angiogenesis, improves tumor vascular function, and promotes tumor growth in vivo. Cancer Res 2007, 67(23):11244-11253.
26. Noguera-Troise I, Daly C, Papadopoulos NJ, Coetzee S, Boland P, Gale NW, Lin HC, Yancopoulos GD, Thurston G: Blockade of Dll4 inhibits tumour growth by promoting non-productive angiogenesis. Nature 2006, 444(7122):1032-1037.
27. Ridgway J, Zhang G, Wu Y, Stawicki S, Liang WC, Chanthery Y, Kowalski J, Watts RJ, Callahan C, Kasman I et al: Inhibition of Dll4 signalling inhibits tumour growth by deregulating angiogenesis. Nature 2006, 444(7122):1083-1087.
28. Scehnet JS, Jiang W, Kumar SR, Krasnoperov V, Trindade A, Benedito R, Djokovic D, Borges C, Ley EJ, Duarte A et al: Inhibition of Dll4-mediated signaling induces proliferation of immature vessels and results in poor tissue perfusion. Blood 2007, 109(11):4753-4760.
29. Harrington LS, Sainson RC, Williams CK, Taylor JM, Shi W, Li JL, Harris AL: Regulation of multiple angiogenic pathways by Dll4 and Notch in human umbilical vein endothelial cells. Microvasc Res 2008, 75(2):144-154.
30. Reedijk M, Odorcic S, Chang L, Zhang H, Miller N, McCready DR, Lockwood G, Egan SE: High-level coexpression of JAG1 and NOTCH1 is observed in human breast cancer and is associated with poor overall survival. Cancer Res 2005, 65(18):8530-8537.
31. Hellstrom M, Phng LK, Hofmann JJ, Wallgard E, Coultas L, Lindblom P, Alva J, Nilsson AK, Karlsson L, Gaiano N et al: Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis. Nature 2007, 445(7129):776-780.
32. Limbourg FP, Takeshita K, Radtke F, Bronson RT, Chin MT, Liao JK: Essential role of endothelial Notch1 in angiogenesis. Circulation 2005, 111(14):1826-1832.
33. Benjamin LE, Hemo I, Keshet E: A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development 1998, 125(9):1591-1598.
34. Bergers G, Song S, Meyer-Morse N, Bergsland E, Hanahan D: Benefits of targeting both pericytes and endothelial cells in the tumor vasculature with kinase inhibitors. J Clin Invest 2003, 111(9):1287-1295.
35. Erber R, Thurnher A, Katsen AD, Groth G, Kerger H, Hammes HP, Menger MD, Ullrich A, Vajkoczy P: Combined inhibition of VEGF and PDGF signaling enforces tumor vessel regression by interfering with pericyte-mediated endothelial cell survival mechanisms. FASEB J 2004, 18(2):338-340.
36. High FA, Lu MM, Pear WS, Loomes KM, Kaestner KH, Epstein JA: Endothelial expression of the Notch ligand Jagged1 is required for vascular smooth muscle development. Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105(6):1955-1959.
37. Msaouel P, Dispenzieri A, Galanis E: Clinical testing of engineered oncolytic measles virus strains in the treatment of cancer: an overview. Curr Opin Mol Ther 2009, 11(1):43-53.
38. Anderson BD, Nakamura T, Russell SJ, Peng KW: High CD46 receptor density determines preferential killing of tumor cells by oncolytic measles virus. Cancer Res 2004, 64(14):4919-4926.
39. McDonald CJ, Erlichman C, Ingle JN, Rosales GA, Allen C, Greiner SM, Harvey ME, Zollman PJ, Russell SJ, Galanis E: A measles virus vaccine strain derivative as a novel oncolytic agent against breast cancer. Breast cancer research and treatment 2006, 99(2):177-184.
40. Studebaker AW, Kreofsky CR, Pierson CR, Russell SJ, Galanis E, Raffel C: Treatment of medulloblastoma with a modified measles virus. Neuro Oncol 2010, 12(10):1034-1042.
41. Nandi S, Ulasov IV, Rolle CE, Han Y, Lesniak MS: A chimeric adenovirus with an Ad 3 fiber knob modification augments glioma virotherapy. J Gene Med 2009, 11(11):1005-1011.
42. Galanis E, Hartmann LC, Cliby WA, Long HJ, Peethambaram PP, Barrette BA, Kaur JS, Haluska PJ, Jr., Aderca I, Zollman PJ et al: Phase I trial of intraperitoneal administration of an oncolytic measles virus strain engineered to express carcinoembryonic antigen for recurrent ovarian cancer. Cancer Res 2010, 70(3):875-882.
43. Wang Y, Ma L, Wang S, Bao Y, Ni C, Guan N, Zhao J, Fan X: Assessment of CAR- or CD46-dependent adenoviral vector-mediated TRAIL gene therapy in clinical adenocarcinoma lung cancer cells. Oncology 2009, 77(6):366-377.
44. Msaouel P, Iankov ID, Allen C, Aderca I, Federspiel MJ, Tindall DJ, Morris JC, Koutsilieris M, Russell SJ, Galanis E: Noninvasive imaging and radiovirotherapy of prostate cancer using an oncolytic measles virus expressing the sodium iodide symporter. Mol Ther 2009, 17(12):2041-2048.
45. Le Friec G, Sheppard D, Whiteman P, Karsten CM, Shamoun SA, Laing A, Bugeon L, Dallman MJ, Melchionna T, Chillakuri C et al: The CD46-Jagged1 interaction is critical for human T(H)1 immunity. Nat Immunol 2012.
46. Kolev M, Towner L, Donev R: Complement in cancer and cancer immunotherapy. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 2011, 59(6):407-419.
47. Gancz D, Fishelson Z: Cancer resistance to complement-dependent cytotoxicity (CDC): Problem-oriented research and development. Mol Immunol 2009, 46(14):2794-2800.
48. Varela JC, Atkinson C, Woolson R, Keane TE, Tomlinson S: Upregulated expression of complement inhibitory proteins on bladder cancer cells and anti-MUC1 antibody immune selection. Int J Cancer 2008, 123(6):1357-1363.
49. Ravindranath NM, Shuler C: Expression of complement restriction factors (CD46, CD55 & CD59) in head and neck squamous cell carcinomas. J Oral Pathol Med 2006, 35(9):560-567.
50. Ong HT, Timm MM, Greipp PR, Witzig TE, Dispenzieri A, Russell SJ, Peng KW: Oncolytic measles virus targets high CD46 expression on multiple myeloma cells. Exp Hematol 2006, 34(6):713-720.
51. Lee CN, Heidbrink JL, McKinnon K, Bushman V, Olsen H, FitzHugh W, Li A, Van Orden K, He T, Ruben SM et al: RNA interference characterization of proteins discovered by proteomic analysis of pancreatic cancer reveals function in cell growth and survival. Pancreas 2012, 41(1):84-94.
52. Maciejczyk A, Szelachowska J, Szynglarewicz B, Szulc R, Szulc A, Wysocka T, Jagoda E, Lage H, Surowiak P: CD46 Expression is an unfavorable prognostic factor in breast cancer cases. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2011, 19(6):540-546.
53. Surowiak P, Materna V, Maciejczyk A, Kaplenko I, Spaczynski M, Dietel M, Lage H, Zabel M: CD46 expression is indicative of shorter revival-free survival for ovarian cancer patients. Anticancer Res 2006, 26(6C):4943-4948.
54. Cui W, Zhang Y, Hu N, Shan C, Zhang S, Zhang W, Zhang X, Ye L: miRNA-520b and miR-520e sensitize breast cancer cells to complement attack via directly targeting 3'UTR of CD46. Cancer Biol Ther 2010, 10(3):232-241.
55. Geis N, Zell S, Rutz R, Li W, Giese T, Mamidi S, Schultz S, Kirschfink M: Inhibition of membrane complement inhibitor expression (CD46, CD55, CD59) by siRNA sensitizes tumor cells to complement attack in vitro. Curr Cancer Drug Targets 2010, 10(8):922-931.
56. Gao LJ, Guo SY, Cai YQ, Gu PQ, Su YJ, Gong H, Liu Y, Chen C: Cooperation of decay-accelerating factor and membrane cofactor protein in regulating survival of human cervical cancer cells. BMC Cancer 2009, 9:384.
57. Zell S, Geis N, Rutz R, Schultz S, Giese T, Kirschfink M: Down-regulation of CD55 and CD46 expression by anti-sense phosphorothioate oligonucleotides (S-ODNs) sensitizes tumour cells to complement attack. Clin Exp Immunol 2007, 150(3):576-584.
58. Sethi N, Dai X, Winter CG, Kang Y: Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell 2011, 19(2):192-205.
59. Jundt F, Probsting KS, Anagnostopoulos I, Muehlinghaus G, Chatterjee M, Mathas S, Bargou RC, Manz R, Stein H, Dorken B: Jagged1-induced Notch signaling drives proliferation of multiple myeloma cells. Blood 2004, 103(9):3511-3515.
60. Perry AM, Cardesa-Salzmann TM, Meyer PN, Colomo L, Smith LM, Fu K, Greiner TC, Delabie J, Gascoyne RD, Rimsza L et al: A new biologic prognostic model based on immunohistochemistry predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Blood 2012, 120(11):2290-2296.
61. Lenz G, Wright G, Dave SS, Xiao W, Powell J, Zhao H, Xu W, Tan B, Goldschmidt N, Iqbal J et al: Stromal gene signatures in large-B-cell lymphomas. N Engl J Med 2008, 359(22):2313-2323.
62. Cardesa-Salzmann TM, Colomo L, Gutierrez G, Chan WC, Weisenburger D, Climent F, Gonzalez-Barca E, Mercadal S, Arenillas L, Serrano S et al: High microvessel density determines a poor outcome in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus chemotherapy. Haematologica 2011, 96(7):996-1001.
63. Stopeck AT, Unger JM, Rimsza LM, LeBlanc M, Farnsworth B, Iannone M, Glenn MJ, Fisher RI, Miller TP: A phase 2 trial of standard-dose cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, prednisone (CHOP) and rituximab plus bevacizumab for patients with newly diagnosed diffuse large B-cell non-Hodgkin lymphoma: SWOG 0515. Blood 2012, 120(6):1210-1217.
64. Stopeck AT, Unger JM, Rimsza LM, Bellamy WT, Iannone M, Persky DO, Leblanc M, Fisher RI, Miller TP: A phase II trial of single agent bevacizumab in patients with relapsed, aggressive non-Hodgkin lymphoma: Southwest oncology group study S0108. Leuk Lymphoma 2009, 50(5):728-735.
65. Cordle J, Johnson S, Tay JZ, Roversi P, Wilkin MB, de Madrid BH, Shimizu H, Jensen S, Whiteman P, Jin B et al: A conserved face of the Jagged/Serrate DSL domain is involved in Notch trans-activation and cis-inhibition. Nat Struct Mol Biol 2008, 15(8):849-857.
66. Aste-Amezaga M, Zhang N, Lineberger JE, Arnold BA, Toner TJ, Gu M, Huang L, Vitelli S, Vo KT, Haytko P et al: Characterization of Notch1 antibodies that inhibit signaling of both normal and mutated Notch1 receptors. PLoS One 2010, 5(2):e9094.
67. Knupfer H, Preiss R: Significance of interleukin-6 (IL-6) in breast cancer (review). Breast cancer research and treatment 2007, 102(2):129-135.
68. Korkaya H, Kim GI, Davis A, Malik F, Henry NL, Ithimakin S, Quraishi AA, Tawakkol N, D'Angelo R, Paulson AK et al: Activation of an IL6 Inflammatory Loop Mediates Trastuzumab Resistance in HER2+ Breast Cancer by Expanding the Cancer Stem Cell Population. Molecular cell 2012.
69. Robertson N, Potter C, Harris AL: Role of carbonic anhydrase IX in human tumor cell growth, survival, and invasion. Cancer research 2004, 64(17):6160-6165.
70. Winum JY, Scozzafava A, Montero JL, Supuran CT: Inhibition of carbonic anhydrase IX: a new strategy against cancer. Anti-cancer agents in medicinal chemistry 2009, 9(6):693-702.
71. Kang Y, Massague J: Epithelial-mesenchymal transitions: twist in development and metastasis. Cell 2004, 118(3):277-279.
72. Moreno-Bueno G, Portillo F, Cano A: Transcriptional regulation of cell polarity in EMT and cancer. Oncogene 2008, 27(55):6958-6969.
73. Ocana OH, Corcoles R, Fabra A, Moreno-Bueno G, Acloque H, Vega S, Barrallo-Gimeno A, Cano A, Nieto MA: Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1. Cancer cell 2012, 22(6):709-724.
74. Cordle J, Redfieldz C, Stacey M, van der Merwe PA, Willis AC, Champion BR, Hambleton S, Handford PA: Localization of the delta-like-1-binding site in human Notch-1 and its modulation by calcium affinity. J Biol Chem 2008, 283(17):11785-11793.
75. Marotta LL, Almendro V, Marusyk A, Shipitsin M, Schemme J, Walker SR, Bloushtain-Qimron N, Kim JJ, Choudhury SA, Maruyama R et al: The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. The Journal of clinical investigation 2011, 121(7):2723-2735.
76. Yu F, Li J, Chen H, Fu J, Ray S, Huang S, Zheng H, Ai W: Kruppel-like factor 4 (KLF4) is required for maintenance of breast cancer stem cells and for cell migration and invasion. Oncogene 2011, 30(18):2161-2172.
77. Tomayko MM, Reynolds CP: Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemother Pharmacol 1989, 24(3):148-154.
78. Al-Lazikani B., Lesk A.M., Chothia C. (1997). Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J Mol Biol. 273. 927-948.
79. Kabat et al., J. Immunol., 1991; 147(5): 1709-1719.
80. Facciabene A, Motz GT, Coukos G: T-regulatory cells: key players in tumor immune escape and angiogenesis. Cancer Research 2012 72(9): 2162-2171.
81. Oleinika K, Nibbs RJ, Graham GJ, Fraser AR: Suppression, subversion and escape: the role of regulatory T cells in cancer progression. Clin Exp Immunol 2013 171(1): 36-45. 
82. Vigouroux S, Yvon E, Wagner HJ, Biagi E, Dotti G, Sili U, Lira C, Rooney CM, Brenner MK: Induction of antigen-specific regulatory T cells following overexpression of a Notch ligand by human B lymphocytes. J Virol 2003 77(20): 10872-10880.
83. Asano N, Watanabe T, Kitani A, Fuss IJ, Strober W: Notch1 signaling and regulatory T cell function. J Immunol 2008 180(5): 2796-2804.
84. Hue S, Kared H, Mehwish Y, Mouhamad S, Balbo M, Levy Y: Notch   activation on effector T cells increases their sensitivity to Treg cell-mediated suppression through upregulation of TGF-βRII expression. Eur J Immunol 2012 42(7): 1796-1803. 
85. Branford S, Rudzki Z, Walsh S, Grigg A, Arthur C, Taylor K, Herrmann R, Lynch KP, Hughes TP: High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood 2002 99(9): 3472-3475.
86. Kop EN, Kwakkenbos MJ, Teske GJ, Kraan MC, Smeets TJ, Stacey M, Lin HH, Tak PP, Hamann J: Identification of the epidermal growth factor-TM7 receptor EMR2 and its ligand dermatan sulfate in rheumatoid synovial tissue. Arthritis Rheum 2005 52(2): 442-450.
87. Zack et al., Mol. Immunol., 1995; 32 (17-18): 1345-53.
88. Samaranayake et al., Ann. Med., 2009; 41(5): 322-31.
89. Fang et al., Mol. Ther., 2007; 15(6):1153-9.
【図１】
0006416117.tif 000010
【図２】
0006416117.tif 000011
【図３】
0006416117.tif 000012
【図４】
0006416117.tif 000013
【図５】
0006416117.tif 000014
【図６】
0006416117.tif 000015
【図７】
0006416117.tif 000016
【図８】
0006416117.tif 000017
【図９】
0006416117.tif 000018
【図１０】
0006416117.tif 000019
【図１１】
0006416117.tif 000020
【図１２】
0006416117.tif 000021
【図１３】
0006416117.tif 000022
【図１４】
0006416117.tif 000023
【図１５】
0006416117.tif 000024
【図１６】
0006416117.tif 000025
【図１７】
0006416117.tif 000026
【図１８】
0006416117.tif 000027
【図１９】
0006416117.tif 000028
【図２０】
0006416117.tif 000029
【図２１】
0006416117.tif 000030
【図２２】
0006416117.tif 000031
【図２３】
0006416117.tif 000032
【図２４】
0006416117.tif 000033
【配列表】
0006416117000001.app