(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
同時複数試料光散乱（ＳＭＳＬＳ）検出装置であって、
光散乱セルの各々が溶液を含むように構成された複数の光散乱セルと；
前記複数の光散乱セルのうちの少なくとも１つの光散乱セルと各々それぞれに結合された複数のストレッサーモジュールであって、少なくとも１つの前記複数の光散乱セルに含まれる前記溶液にストレッサーを導入するように各々それぞれに構成され、さらにストレッサー情報出力データを生成するように構成される複数のストレッサーモジュールと；
前記複数の光散乱セルのうちの前記少なくとも１つの光散乱セルに結合し散乱光を検出しかつ光散乱データを生成するように構成された光検出器と；
前記複数のストレッサーモジュールおよび前記光検出器と結合されたコンピュータ装置であって、前記光検出器からの光散乱データおよび前記複数のストレッサーモジュールからのストレッサー情報出力データを受けるように構成され、さらに前記光散乱データおよび前記ストレッサー情報出力データからストレッサーの導入により開始される溶液の時間依存応答を決定するように構成されるコンピュータ装置と、を備えた、ＳＭＳＬＳ検出装置。
【請求項２】
前記複数の光散乱セルの各々はその中に含まれる溶液の機械攪拌を生じることができる攪拌装置を含み、各攪拌装置は前記複数のストレッサーモジュールの少なくとも１つに結合され、前記複数のストレッサーモジュールの少なくとも１つは前記攪拌装置に溶液の機械攪拌を生じさせるように構成される、請求項１に記載のＳＭＳＬＳ検出装置。
【請求項３】
さらに、前記複数の光散乱セルに入射光を供給するように構成された入射光源と、
前記複数の光散乱セルのうちの前記少なくとも１つの光散乱セルに結合され、前記入射光を通って制御されたパターンで前記少なくとも１つの光散乱セルを動かすように構成されているラスタリング装置と、を備え、
前記光検出器は、ラスターされた前記光散乱セルを通って放出された前記散乱光を検出するようにさらに構成されている請求項１に記載のＳＭＳＬＳ検出装置。
【請求項４】
1つ以上のストレッサーに対する生物学的溶液の時間依存凝集応答または時間依存分解応答を決定するための方法であって、
複数の光散乱セルの各々に生物学的溶液を導入することと、
ストレッサーモジュールを用いて、前記複数の光散乱セルに含まれる少なくとも１つの生物学的溶液に１つ以上のストレッサーを導入することと、
前記ストレッサーモジュールで、前記１つ以上のストレッサーに対応するストレッサー情報出力データを生成することと、
前記複数の光散乱セルに入射光源を導入することと、
光検出器で、前記少なくとも１つの生物学的溶液における時間依存応答に対応する散乱光を検出することと、
前記光検出器で、前記時間依存応答に対応する光散乱データを生成することと、
コンピュータ装置で、前記光散乱データおよび前記ストレッサー情報出力データを使用して、前記１つ以上のストレッサーに対する前記少なくとも１つの生物学的溶液の時間依存凝集応答または時間依存分解応答を決定することを含む、方法。
【請求項５】
前記ストレッサーは機械的攪拌、超音波、凍結融解サイクル、空気/液体界面への曝露の増加、および表面またはガスへの曝露からなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記方法はさらにストレッサーモジュールを使用して、第１のストレッサーおよび第２のストレッサーを同一の生物学的溶液に導入することを含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記第１のストレッサーは機械的な剪断であり、前記第２のストレッサーは前記空気/液体界面への曝露の増加である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記方法はさらに、ストレッサーモジュールを使用して、第１のストレッサーを前記複数の光散乱セルに含まれる第１の生物学的溶液に導入し、第２のストレッサーを前記複数の光散乱セルに含まれる第２の生物学的溶液に導入することを含む、請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記第２のストレッサーは前記第１のストレッサーとは異なり、前記第１および第２のストレッサーは同時に導入される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
生物学的溶液を導入することには、個別セル制御モジュールを使用して生物学的溶液を導入することが含まれる、請求項４記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的溶液はタンパク質溶液である、請求項４記載の方法。
【請求項１２】
同時複数試料光散乱（ＳＭＳＬＳ）検出装置であって、
光散乱セルの各々が溶液を含むように構成された複数の光散乱セルと；
前記複数の光散乱セルの少なくとも１つとそれぞれに結合され、前記複数の光散乱セルのそれぞれ１つに溶液を導入するように構成された１つ以上の個別セル制御モジュールと；
前記複数の光散乱セルのうちの少なくとも１つの光散乱セルと各々それぞれに結合された複数のストレッサーモジュールであって、少なくとも１つの前記複数の光散乱セルに含まれる前記溶液にストレッサーを導入するように各々それぞれに構成され、さらにストレッサー情報出力データを生成するように構成される複数のストレッサーモジュールと；
前記複数の光散乱セルのうちの前記少なくとも１つの光散乱セルに結合し散乱光を検出しかつ光散乱データを生成するように構成された光検出器と；
前記複数のストレッサーモジュールおよび前記光検出器と結合されたコンピュータ装置であって、前記光検出器からの光散乱データおよび前記複数のストレッサーモジュールからのストレッサー情報出力データを受けるように構成され、さらに前記光散乱データおよび前記ストレッサー情報出力データからストレッサーの導入により開始される溶液の時間依存応答を決定するように構成されるコンピュータ装置と、を備えた、ＳＭＳＬＳ検出装置。
【請求項１３】
前記複数のストレッサーモジュールは、前記複数の光散乱セルのうちの少なくとも１つに第１のストレッサーを導入し、かつ前記複数の光散乱セルのうちの少なくとも１つの他の光散乱セルに第２のストレッサーを導入するように構成される、請求項１に記載のＳＭＳＬＳ検出装置。
【請求項１４】
前記第２のストレッサーは前記第１のストレッサーとは異なり、前記複数のストレッサーモジュールは前記第１および第２のストレッサーを同時に導入するように構成される、請求項１３に記載のＳＭＳＬＳ検出装置。
【請求項１５】
前記複数のストレッサーモジュールの各々は、前記光散乱セルのそれぞれ１つへのストレッサーの導入を独立して制御するように構成される、請求項１に記載のＳＭＳＬＳ検出装置。
【請求項１６】
前記時間依存応答はタンパク質の凝集またはタンパク質の分解である、請求項１に記載のＳＭＳＬＳ検出装置。
【請求項１７】
前記光散乱データは光散乱スパイク（ＬＳＳ）である、請求項１に記載のＳＭＳＬＳ検出装置。
【請求項１８】
前記溶液はタンパク質を含み、前記複数のストレッサーモジュールはタンパク質の凝集応答またはタンパク質の分解応答を開始させるために前記複数の光散乱セルに含まれる前記溶液にストレッサーを導入するように構成される、請求項１に記載のＳＭＳＬＳ検出装置。
【請求項１９】
前記光散乱データは時間依存光散乱シグネチャーを含み、前記コンピュータ装置はタンパク質の凝集またはタンパク質の分解に関連した機構的または動力学的パラメータを決定するように構成される、請求項１に記載のＳＭＳＬＳ検出装置。
【請求項２０】
前記ＳＭＳＬＳ検出装置はさらに前記複数の光散乱セルの少なくとも１つにそれぞれ結合され、かつ前記複数の光散乱セルのそれぞれ１つに溶液を導入するように構成される１つ以上の個別セル制御モジュールを含む、請求項１に記載のＳＭＳＬＳ検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ともに参照によって本明細書に取り込まれる２０１３年８月２０日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６１／８６８，０５０および２０１４年５月２２日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６２／００２，１１１に対して優先権を主張する。
【０００２】
本明細書は、ポリマーおよびコロイド系の特性評価のための改善されたシステムおよび方法に関する。具体的には、複数の独立した試料によって散乱される光をモニタリングするなかで、本明細書は、その安定性および様々な用途に対する適合性を試験するためにポリマーおよびコロイド溶液に適用されうる様々なストレッサーについて記述している。
【背景技術】
【０００３】
光散乱法は、ポリマーおよびコロイド溶液を特性評価するために有用である。モル質量、空間寸法、形状および相互作用パラメタといった量は、散乱光の強度によって測定され得る。これらの測定は、しばしば静的光散乱（ＳＬＳ）測定と呼ばれる。その他の光散乱、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）は、散乱光を自己相関して粒子拡散係数およびその他のパラメタを生じる。溶液中の粒子の性質がどのように経時変化するかをモニターするためにＳＬＳおよび／またはＤＬＳを使用することも可能である。厳密に言えば、コロイドが関与している場合、通常液体中に「懸濁」していると呼ばれることに留意されたい。というのもコロイドは通常の意味で溶解せず、したがって「コロイド溶液」というものはないからである。この文献における利便性のために、「コロイド溶液」は、懸濁しているかそれ以外かに関わらず、コロイドを含む液体を指すものとして使用される。
【発明の概要】
【０００４】
ポリマーおよびコロイド溶液の特性評価のために改良されたシステムおよび方法が本明細書に開示される。
【０００５】
本明細書は、ポリマーおよびコロイド系の特性評価のための改良されたシステムおよび方法に関する。
【０００６】
本明細書の開示の上述のおよびその他の目的、特徴ならびに利点は、本明細書に開示されているところの例示的態様についての以下の詳細な記述から容易に明白になることだろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】いくつかの実施態様に係る例示的なＳＭＳＬＳ脱偏光光散乱システムのフローセル図である。
【図２Ａ】ＳＭＳＬＳ装置２００の一例である。
【図２Ｂ】高性能ＳＭＳＬＳの一例である。
【図２Ｃ】ＳＭＳＬＳセルの例示的構成である。
【図３】１００ＲＰＭ〜１０００ＲＰＭでの攪拌に対してタンパク質の攪拌によって引き起こされる凝集の時間依存性を示すデータ（本体）および初期凝集速度の回転速度依存性を示すデータ（差し込み）である。
【図４】図３と同じタンパク質について、気液界面あり（上）、気液界面なし（中）の状態の試料を３５℃、５００ＲＰＭで攪拌した際、および非攪拌試料（下）の凝集データである。
【図５】ｐＨおよびイオン強度を変えた様々な製剤に対して濃度０．００１ｇ／ｃｍ３で攪拌しない場合のＴ＝６０ＣでのｍＡｂＣの凝集挙動である。
【図６】フィルタフライホイールの一例である。
【図７】飽和中央ピクセルからサイドピクセル上への「ロールオフ」によりＳＭＳＬＳダイナミックレンジを拡張する方法の模式図である。
【図８】拡散制御下（すなわち、０ＲＰＭ）の水中および８０ＲＰＭで撹拌された水中の２ミクロン（μｍ）のラテックス球の希薄溶液について、３０秒のスワス（ｓｗａｔｈ）のデータである。
【図９】タンパク質が凝集するにつれて散乱の幅がどのように増大しうるかを示す光散乱データの一例である。
【図１０】図９の最も強い散乱試料からの２つの５００秒のスワスのデータである。
【図１１】タンパク質試料を撹拌しなかったとき（下）、気液界面がない状態（中）および気液界面がある状態（上）でそれぞれ１００ＲＰＭで撹拌したときの２．５日後の光散乱生データである。
【図１２】１０Ｈｚでサンプリングした際の単一のスパイクの拡大図である。
【図１３】２５０Ｈｚでサンプリングした際のＬＳＳの一例である。
【図１４】辺長１ｃｍのＳＭＳＬＳ正方形バッチセル中で、８０ＲＰＭで撹拌した２ミクロンの球から採用した例示的なヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
説明を簡潔かつ明確にするために適切とみなされる場合、参照番号は、対応するまたは類似する要素を指し示すために図面間で繰り返されることも繰り返されないこともあることが理解されよう。加えて、本明細書に記載された例示態様の完全な理解を提供するために詳細を説明する。本明細書に記載の例示態様は、追加の詳細および要素を用いて、または、本明細書に記載されたその他の要素と組み合わせることで、所定の詳細および要素なしに実施することができる。
【０００９】
Ｒｅｅｄによる「ポリマーおよび／またはコロイドを含む溶液の平衡および非平衡特性のオンライン特性評価のための自動混合および希釈方法」と題された米国特許第６，６５３，１５０号は、希釈されたポリマー流が適切な検出器を通過したとき、重合、分解および凝集といった非平衡プロセスがモニターされうるようなポリマーおよび／またはコロイド溶液の自動オンライン希釈に関する。米国特許第６，６５３，１５０号は、本明細書に記載のあらゆる目的のために参照によって組み込まれる。重合反応の自動連続オンラインモニタリング（ＡＣＯＭＰ）は、高密度の大きな散乱粒子を含む溶液を光散乱スパイク（ＬＳＳ）の分析を可能にするのに十分なほど希釈することができる今回開示した技術によって促進される。ＬＳＳは、大きな個別粒子が散乱体積Ｖｓを通過する際、はるかに小さい粒子の集団に起因して存在する均一な背景散乱に比べてはるかに大きな光のスパイクまたは「フラッシュ」を生じることで発生する。例えば、単一細菌は、単一タンパク分子の何兆倍も光を散乱することができる。ある態様において、１以上の光散乱フローセルには、ＬＳＳ分析を可能にするためのＡＣＯＭＰシステムのフロントエンドによって自動的かつ連続的に調製された希釈調整済みの液体試料が供給される。
【００１０】
「ポリマーおよび／またはコロイドを含む複数の液体試料からの光散乱を同時に測定する装置および方法」と題されたＲｅｅｄに対する米国特許第６，６１８，１４４号は、同時複数試料光散乱（ＳＭＳＬＳ）装置に関するものであり、これにより、独立した光散乱測定が複数の試料で独立してかつ同時になされ得る。米国特許第６，６１８，１４４号は、本明細書に記載のあらゆる目的のために参照によって組み込まれる。ＳＭＬＳアプローチにより、単一試料装置と比較してスループットが劇的に増加し、測定される試料あたりの経済性もより向上する。
【００１１】
ＳＭＳＬＳは、レーザー、光ファイバー、光検出技術ならびに複数の光散乱実験およびモニタリングを連続的かつ同時に互いに独立して行うことを可能にする「一棟」計装のためのパワフルなマイクロコンピューティングおよびプログラムの分野における性能およびコスト低減に関しての過去数十年のめざましい進歩を利用している。光源には、レーザーに限定されないが、低コストで高い安定性があることからとりわけダイオードレーザーが含まれ得る。様々な光検出法が利用可能であり、特に限定されないが例えばフォトマルチプライヤ、フォトダイオードおよび電荷結合素子（ＣＣＤ）が含まれる。ＣＣＤ検出は、低コスト、高感度および高い信号雑音比（Ｓ／Ｎ比）の観点で際だった優位性がある。
【００１２】
試料セルは、試料溶液がセルに導入された「バッチ」タイプを含み、これは、入射光ビーム路にあるか、またはビーム路に挿入することそしてビーム路から除去することができる。斯かるセルは丸、四角、六角、八角またはその他の形状であり得る。セルは、自動または手動で充填され得る。測定する間、フローセルには試料溶液が流れている。液体試料は、いくつかのポンプ機構を用いて系内を再循環され得るか、またはその他の検出器に流れ込むか、または循環されずに廃棄される。ＳＭＳＬＳは、様々な分野において重要な高スループット用途を有する。ＳＭＳＬＳは、様々なポリマーおよびコロイド溶液の特性を評価するように適合された特定のＳＭＳＬＳシステムおよび方法を用いて修正され実施され得る。ポリマーおよびコロイド溶液としては特に限定されないが、例えば本明細書に記載されたＳＭＳＬＳ技術を用いて特性評価されたポリマーおよびコロイド溶液が含まれる。
【００１３】
例えば、本明細書に記載されたバイオテクノロジーおよび薬学ＳＭＳＬＳシステムおよび方法は、様々な製剤における治療タンパク質安定性の高スループット、定量的、連続モニタリングを用いて、様々な変異および合成タンパク質型由来の変異および合成タンパク質型ポリマーおよびコロイド溶液を特性評価することができる。タンパク薬物製剤における不安定性（例えば、タンパク凝集）は、全てのバイオテクノロジーおよび製薬企業における主要な問題である。バイオテクノロジーおよび薬学ＳＭＳＬＳシステムおよび方法は、タンパク質薬物製剤の製造において生じる不安定性（例えば、タンパク質凝集）をモニタリングし、理解し、軽減するための非常に感度の高いツールを提供する。
【００１４】
なお、本明細書に記載されたポリマーおよびコロイドの溶解のためのＳＭＳＬＳシステムおよび方法は、相図の迅速なレンダリングおよび判断を可能にする。２成分以上の系（例えば、水、塩および界面活性剤）の相図は、確立するために多くの時間と退屈を要する。本明細書に記載されたポリマーおよびコロイドの溶解のためのＳＭＳＬＳシステムおよび方法は、相図構築の手段を提供する。相図構築には、異なる溶媒中における難溶性物質に関する「微小溶解性」の領域を判定することが含まれる。
【００１５】
本明細書に記載されたポリマー安定性テストのためのＳＭＳＬＳシステムおよび方法は、ポリマーまたはコロイド溶液に対してストレッサーを適用することができる。ストレッサーには、とりわけ熱ストレス、超音波、凍結融解サイクル、剪断応力ならびに異なる物質および表面への曝露が含まれ、これらは、ポリマー溶液および安定性を評価するために用いられるポリマーストレス応答を生成する。ポリマーが曝されうる物質には、様々な種類の金属、セラミック、プラスチック、コーティング、オイル、様々なイオン、ならびにＯ２、Ｎ２およびより複雑なガスといったガスが含まれる。その他のストレッサーには光やその他の照射形態が含まれる。タンパク質の凍結／融解サイクルには、例えばバイオテクノロジーで幅広く遭遇し、今回開示した技術によって試料セル内で試料を凍結および融解すること、ならびに、凍結／融解プロセスの前、最中および後の試料挙動を直ちにモニタリングすることが可能になる。さらにその他のストレッサーには、ポリマーまたはコロイド溶液を分解しもしくは損傷しうるような強い光を含む光が含まれる。「光」にはγ線からラジオ波にいたるまで様々なタイプの電磁放射が含まれる。イオン化電磁放射に加えて電子、プロトン、およびイオンビームといったイオン化放射もまたストレッサーとして用いられる。ストレッサーは、ポリマーおよびコロイド溶液内への適用に代えて、または加えて該溶液の表面にも適用され得る。１つの例は、気相界面がある場合と気相に代えて固相界面がある場合とで、攪拌されたタンパク質の挙動の相違をモニタリングすることである。追加的なストレッサーには、滴定剤およびその他の材料を含む、モニタリングプロセスにおける材料の追加が含まれる。例えば、モニタリングプロセスの間、イオン強度、ｐＨ、金属イオン含有量および抗原を変えうる追加の材料を非個別量でまたは連続的に添加することができ、これによりポリマーまたはコロイド溶液において相転移、凝集、解離、ナノ−もしくはマクロ構造化、結晶化等の応答を引き起こし得る。斯かる添加または滴定は、即時にもしくは時間をかけて測定可能な応答をもたらしうる。とりわけ異なるストレッサーは、ポリマーおよびコロイド溶液中で不安定性の異なる動的経路または別の時間依存プロセスをもたらしうる。
【００１６】
本明細書に記載のサブコンポーネントの特性評価のためのＳＭＳＬＳシステムおよび方法はまた、重合反応の自動連続オンラインモニタリング（「ＡＣＯＭＰ」）を用いてサブコンポーネントの生成をモニタリングするために使用し得る。様々な刺激条件のもとでの流れる反応種および内容物は、ＡＣＯＭＰを用いて応答挙動を探査される。
【００１７】
本明細書に記載の取り込みおよび動力学的特性評価のためのＳＭＳＬＳシステムおよび方法は、標的剤のカプセル化剤による取り込みおよび動力学を測定するために使用し得る。１つの例は、原油流出の際に使用し得るカプセル化または分散剤によるオイルの取り込みである。
【００１８】
本明細書に開示されている技術は、上述したそしてその他の改良されたＳＭＳＬＳシステムおよび方法に関するが、本明細書に列挙された用途の分野または利点に限定されない。
【００１９】
本明細書に記載のＳＭＳＬＳ脱偏光化した光散乱技術は、１以上の散乱面で散乱光を検出するための光源として直線偏光入射レーザー光を使用し得る。１以上の検出器は、等方的散乱粒子からの散乱が最大である場合、直線偏光に対して垂直な平面に配置されている。典型的には、入射光についての偏光の平面は、「垂直」であり、非脱偏光散乱体についての散乱が最大となる平面は、水平面である。この水平面は、垂直偏光した入射光が使用される場合、しばしば「散乱面」と呼ばれる。合成および生物学的ポリマーならびにコロイドに対する用途のような本願技術の多くの用途においては、散乱機構は、電気双極子散乱を経由するものであろう。多くの対象の散乱粒子は、（入射光によって粒子に励起される電気双極子のサイズおよび方向を決定する）スカラーの電気的分極率を有し、これは散乱光が入射光と同じ方向に偏光していることを意味する。例えば、散乱光は、垂直方向に偏光された入射光に対して垂直方向に偏光している。
【００２０】
空間的に異方性の粒子は、テンソルの電気的分極率を有しており、このことは、散乱光が必ずしも入射光の偏光状態にはないことを意味する。斯かる散乱光には、脱偏光された散乱光が含まれる。テンソルの分極率は、粒子が棒状、楕円状、円盤状等といった異方形状またはモルフォロジーを有しているとき、頻繁に生じる。それは、トルエン、二硫化炭素、メタノールおよびその他の小分子液体といった多くの小分子においても生じる。当該分野の用途の大部分において言及されている散乱分析は、入射光フォトンが１度のみ散乱することを想定している。混濁媒体においてみられるような複数散乱もまた、散乱体それ自体が等方性であって、脱偏光散乱光を生じないときでさえ脱偏光散乱成分を生じさせ得る。大きな、つまり光の波長よりもはるかに大きい等方性粒子に対して、複数の内部散乱が脱偏光散乱を同様にもたらしうる。
【００２１】
本明細書に記載のＳＭＳＬＳ脱偏光光散乱技術は、ある粒子がテンソルの分極率および形状異方性を有するかどうかを決定する手段として脱偏光散乱を測定する。脱偏光散乱の変化を経時モニタリングすることで、散乱粒子が形態的に変化しているかどうかを明らかにすることができる。上記変化には例えば、アルツハイマー病に関係づけられているアミロイドタンパクのフィブリル状凝集がある。アミロイドタンパクのフィブリル状凝集は、脱偏光信号の増加によってモニタリングしうる一方、通常の散乱面にある検出は、モル質量における正味の変化を追跡し得る。脱偏光散乱の検出は、溶液中の混濁のレベルを評価するために使用し得る。というのも、脱偏光散乱は、濁度が増加するにつれて増加するからである。脱偏光散乱の検出はまた、粒子の寸法の増加をモニタリングすることもできる。というのも、光の波長よりも大きな粒子は、形態学的に等方性のものであっても、脱偏光散乱をもたらしうるからである。
【００２２】
脱偏光散乱検出に関する様々なＳＭＳＬＳ実施態様は、バッチセルおよびフローセルに使用しうる。本明細書に開示されているＳＭＳＬＳ技術における脱偏光検出を実施するいくつかの手段がある。偏光相互関係によって、垂直散乱成分を水平偏光入射光から検出することは、垂直入射偏光の水平散乱成分を検出することと等価である。レーザーの前に半波長板を置くことは、入射偏光を垂直から水平に切り替え、散乱面において「通常散乱」の検出に使用される光検出器は、脱偏光散乱を測定しうる。半波長板アプローチは、バッチセルにもフローセルにも使用しうる。それは様々な手法で自動的に挿入し、そして除去することができ、その手法には、ステッパーモータまたはその他の装置が含まれるが、これらには限定されない。偏光面の回転を達成しうるその他の装置には、光弾性変調器、カーセルおよびポッケルスセルが含まれる。用語「通常」検出とは、散乱光と検出手段との間に検光子が挿入されていない場合に水平散乱面に通常検出される散乱光のことを言っている。（この限定された使用における「通常」とは、別の文脈でしばしば意図されるところの「垂直」も「直交」も意味しない。）脱偏光散乱がない場合には、「通常散乱」は、垂直偏光であろう。脱偏光であるならば、「通常散乱」には偏光および脱偏光成分が共に含まれることだろう。一方で脱偏光検出を行う光検出器は、脱偏光散乱のみを測定している。本願技術のいくつかの実施態様では、水平散乱面に散乱された光と検出手段との間に検光子を置くことが望ましく、その結果、「通常散乱」の垂直散乱成分のみがこの場合検出されるだろう。
【００２３】
大抵の場合、フォトダイオード、ＣＣＤ（電荷結合素子）またはフォトダイオードもしくは光増倍管といったその他の光検出器は、検出のための散乱光に極めて近接して直接配置され得る。斯かる検出器は、試料セル内で入射ビームの所望の部分のみから光を検出するために必要などんな開口部、レンズまたはその他の光学部品でも通常有しているだろう。検出されるセル内のビームの照射部分は、通例「散乱体積」と呼ばれる。多くの場合、所望の散乱体積から光を集めて、フォトダイオードまたはＣＣＤといった光検出器に導くために光学ファイバーを使用することが便利である。「光ファイバー」について言及される全てのケースおよび図面において、直接の光検出も使用することができ、そして光ファイバーが要件ではないことが理解されるべきである。ＳＭＳＬＳ装置における光ファイバーの１つの利点は、複数の光学セルからの複数の光ファイバーが単一のＣＣＤか複数のＣＣＤに導かれ、複数の場合その総数はファイバーの数よりはるかに少ないことである。しかしながら、フォトダイオードおよびその他の光検出器の低コストおよび小型化によって、各セルが光ファイバーの代わりにそれ自体に光検出器を備えた便利なＳＭＳＬＳ装置があってもよい。
【００２４】
バッチセルに関するＳＭＳＬＳ脱偏光光散乱システムおよび方法のもう１つの実施態様では、第２の検出ファイバーがセルの下部または上部に配置され、同じ相互関係が作用するようになっており、セルの下部または上部にあるファイバーは、通常の水平散乱面に対して９０°の角度をなしている。検出ファイバーの位置は、脱偏光散乱の測定を可能としている一方、同時に通常散乱が水平散乱面にある別の光検出器によって測定され得る。
【００２５】
散乱光の垂直成分は、迷光最小化ステップを用いて検出される。迷光は、望ましい散乱粒子以外の光源から散乱光検出器に入る光であり、例えば、界面（例えば、空気／ガラス、液体／空気、液体／ガラス）から引き起こされる光がある。光ファイバー検出を用いた散乱セルに対して、ファイバーは、円筒チューブに引き込まれ、ファイバーの受入れ角は、光ファイバーの窪みがない場合にとりこまれる光を支配するファイバーの開口数によってというよりむしろチューブ内でのその深さによって決定される（例えば、液体中に浸漬された、散乱セルの内腔へのファイバー搭載フラッシュ（ｆｉｂｅｒ  ｍｏｕｎｔｅｄ  ｆｌｕｓｈ））。バッチセルには、メニスカスでの反射による迷光が生じ得る。この迷光は、液体界面に反射を低減する黒色または暗色材料を接触させることによって低減され得る。黒色または暗色材料には、セルの内径に適合する平坦で黒いプラスチック板が含まれる。
【００２６】
フローセルの場合、通常の水平散乱面に対して９０°の角度をなす検出器も使用され得る。流路は、光ファイバーまたは光検出のその他の手段がフローセルの上部または下部に挿入しうるようになっているべきである。
【００２７】
図１は、いくつかの実施態様に係る例示的なＳＭＳＬＳ脱偏光光散乱システムのフローセル図を示している。
【００２８】
上述したいずれのＳＭＳＬＳ脱偏光光散乱システムおよび方法でも、脱偏光検出システムのパフォーマンスは、周知の有機溶媒（例えば、トルエン、二硫化炭素等）の偏光比率を用いて評価し得る。脱偏光成分と比べた偏光成分の消失は、パフォーマンスを決定するために使用しうる。１０ｎｍ未満の径のラテックス球のような等方性の散乱体が使用される場合、偏光信号に対する脱偏光の比率（例えば本ケースでは漏れ）が１０−４程度の低さの非常に高性能のシステムが達成される。小さいラテックス球は、基本的に散乱の際入射光を脱偏光しない。
【００２９】
図２Ａ−２Ｃは、いくつかの実施態様に係るポリマーおよびコロイド溶液の特性評価のためのＳＭＳＬＳシステムの一例を示している。図２Ａは、ＳＭＳＬＳ装置２００の一例を示している。図２Ａに描かれているように、１６個のＳＭＳＬＳセル２０２がある。いくつかの実施態様において、ＳＭＳＬＳセル２０２の数は、１６個より多くなっても少なくなってもよい。いくつかの実施態様において、ＳＭＳＬＳセルの内部は四角形であり得る。当業者は、ＳＭＳＬＳセルの内部形状の多くのバリエーションが開示された技術の精神から離れることなく使用されうることを理解するだろう。ＳＭＳＬＳセル２０２は、ＳＭＳＬＳセルの制御または非制御加熱が可能な１以上の温度制御装置２１０に結合されうる。いくつかの態様では、ペルチェ素子がＳＭＳＬＳセル２１０の冷却を可能にするための温度制御環境で使用され、高抵抗ワイヤといった抵抗加熱ユニットも使用される。いくつかの態様では、ペルチェ素子に加えて、各ＳＭＳＬＳセルには、ＳＭＳＬＳセルから取り出された熱を排出するためのファンが結合していてもよい。
【００３０】
各ＳＭＳＬＳセルは、レーザー２０４のような光源からの光を受けるように構成されている。レーザー２０４は、レーザー光２０８をセル２０２に放射するように位置づけられている。レーザー光２０８は、セル２０２に入るレーザー光の強度を調節するための減光フィルタ２０６を通過してもよい。いくつかの実施態様において、ＳＭＳＬＳセル中の光ファイバー２１２は、セルに放射されたレーザー光を光検出器（図示せず）に伝搬する。いくつかの実施態様において、光検出器は、電荷結合素子（ＣＣＤ）、光増倍管、フォトダイオード等であってよい。
【００３１】
図２Ｂは、高性能ＳＭＳＬＳに関する一例の図を示している。ＳＭＳＬＳセル２４０は、バッチセルまたはフローセルのいずれかでありうる。フローセルでは、当該セルに放射されたレーザー光が流動流体流の一部を通って流れる間、流体がセル中を流れる。蠕動ポンプ２５２，２５４は、異なる材料を混合連結管２５６に送り、フローセルに材料を流す前に異なる材料同士を混合するために使用しうる。例えば、蠕動ポンプ２５２が、タンパク質を混合連結管に送ることができ、別の蠕動ポンプ２５４は、緩衝液を混合連結管２５６に送り、タンパク質と緩衝液との混合流を生成し、混合連結管２５６を出て、フローセル２４０に入る。当業者は、その他のポンプタイプがフローセルおよび混合連結管と組み合わせて使用され得ることを理解するだろう。例えば、いくつかの実施態様において、材料を混合連結管に送るために容積型ポンプを使用してもよい。バッチセルでは、バッチセル内にある材料の組成物は、独立して調製され、光学ガラスキュベットのような容器またはその他の同様の容器において各バッチセルに個別に導入される。いくつかの実施態様において、ＳＭＳＬＳセルは、バッチセル、フローセル、またはバッチセルおよびフローセルの組み合わせでありうる。
【００３２】
いくつかの実施態様において、ＳＭＳＬＳシステムは、個別のセル内に試料をセットアップするように構成された個別セル制御２４２を含みうる。個別セル制御は、個別セルのうちテストされたセットアップおよび変数についてオペレータからの指示を受けるためのユーザーインターフェイスを含むソフトウェア部品を含み得る。いくつかの実施態様において、個別セル制御２４２は、対象の試料統計値および試料間隔を指定するためのインターフェイスも含み得る。いくつかの実施態様において、個別セル制御はまた、セルに材料を提供するためにセルへの入力を制御しうる。
【００３３】
いくつかの実施態様において、ストレッサーモジュール２４４は、各個別セルと関連づけられたストレッサーを制御する。いくつかの実施態様において、ストレッサーとしては特に限定されないが、凍結および融解を含む温度変化、剪断力の適用、金属、プラスチック、気泡、ガラス、オイル、特定のイオン、キレート剤またはその他の化学試剤、超音波、光およびその他の照射形態といった所定の表面の導入が含まれる。ストレッサーモジュール２４４は、各セルに関連づけられた温度、攪拌、ステッパーモータおよびその他のストレッサーをセルごとに個別に制御することを可能にする。いくつかの実施態様において、ストレッサーモジュールは、ステッパーモータを制御するためのコンピュータコード、コンピュータコードを解釈するためのプロセッサ、セルまわりに磁場を生成するためのステッパーモータハードウェア、およびセル内にある磁場攪拌子といったソフトウェアおよびハードウェアの組み合わせであり、これらすべてを集合的に所定のストレッサーモジュールの一部とみなし得る。その他のストレッサーモジュールには、ソフトウェア、コンピュータ、およびエネルギー、材料または本明細書で特定され当業者に知られているその他のストレッサーの形態のストレッサーを導入するためのその他の装置が含まれる。
【００３４】
ＳＭＳＬＳセルに導入されたストレッサーの効果と関連づけられた光散乱測定は、光検出器２４６によって検出される。いくつかの実施態様において、光検出器２４６は、電荷結合素子（ＣＣＤ）であり得る。いくつかの実施態様において、ＣＣＤは、２０４８ピクセルを有しているが、本願技術は、特定のピクセル数のＣＣＤには限定されない。当業者に理解されるように、試料中の反射光を測定しうるいかなる光検出器も使用することができる。各レーザーから放射された光は、個別試料セルに存在する光ファイバーを通して光検出器２４６に伝搬されるか、または光検出器は、各試料セルに結合され得る。ストレッサー情報出力２４８が表示する試料温度、攪拌モータスピード、試料中への気体流、試料中への液体流といった各セルに関連づけられた追加的な出力が測定されうる。光散乱データ２５０およびストレッサー情報出力データ２４８は、ストレッサーがポリマーおよびコロイド溶液の特性評価にいかに影響するかを判定するために、様々な形態のデータ分析を実施するためのデータベースに保存される。
【００３５】
図２Ｃは、ＳＭＳＬＳセルの例示的構成を示している。レーザー２８０は、光をＳＭＳＬＳセル２８２に放射するように構成されている。いくつかの実施態様において、減光（ＮＤ）フィルタ２８４は、ＳＭＳＬＳセル２８２に放射されたレーザー光の強度を調節するために使用される。レーザー２８０光が通過しうる半波長（λ／２）板２８６は、入射偏光を垂直から水平に切り替えることができ、散乱面における「通常散乱」検出のために使用される光検出器は、脱偏光散乱を測定する。半波長板アプローチは、バッチセルにもフローセルにも使用しうる。ＳＭＳＬＳセルの中にある光ファイバー２８８は、レーザーから放射されたレーザー光を光検出器に伝搬するために使用される。いくつかの実施態様において、光ファイバー２８８は、４５°、９０°または１３５°というように１以上の所望の角度に位置づけられ、各角度に散乱されたレーザー光を捕捉する。当業者は、光ファイバー２８８が散乱レーザー光を捕捉するために別の角度に位置づけてもよいことを理解するだろう。ＳＭＳＬＳセル２９０から出て進むレーザー光は、レーザートラップまで伝播する。ペルチェ素子２９２は、冷却のために使用され、離間した加熱要素は、加熱のために使用される。温度制御装置は、ＳＭＳＬＳ試料セルの温度を調節するために設置されうる。ステッパーモータ２９４は、ＳＭＳＬＳ内に磁場を生成する磁石に結合されている。ステッパーモータ２９４が毎分所定の回転数（ＲＰＭ）で回転するとき、磁場はセル内で変化し、今度は磁気攪拌棒をＳＭＳＬＳセル内で所定のＲＰＭで回転する。
【００３６】
いくつかの実施態様において、その他の装置およびモジュールが上述したＳＭＳＬＳシステムと一緒に使用され、追加の測定または分析を提供しうる。例えば、動的光散乱のための自己相関モジュール、蛍光を測定するための光学バンドパスフィルタ、または高度に減衰したスループットビームが濁度を測定するために使用されうる。
【００３７】
上記図面は、いくらかの上記特異性とともに描かれたが、当業者は、依然本願技術の範囲内にある、実際のシステム部品およびそのレイアウトに対する多くのバリエーションを理解することだろう。本明細書の開示は、添付の特許請求の範囲に特定されなければ限定の意図はない。
【００３８】
ＳＭＳＬＳでの攪拌
本願技術のいくつかの実施態様において、ポリマー、タンパク質またはコロイド溶液は、１以上のストレッサーに曝され、凝集、分解、相変化、溶解性変化といった１以上の時間依存応答またはプロセスを開始しまたは引き金となる。ストレッサーとしては特に限定されないが、凍結および融解を含む温度変化、剪断力の適用、金属、気泡、プラスチック、ガラス、オイル、特定のイオン、キレート剤またはその他の化学試剤といった所定の表面の導入、超音波、光およびその他の照射形態が含まれる。
【００３９】
ストレッサーは、所定のポリマーまたはコロイド溶液全体に均一に影響を与えるが、ストレッサーは、確率論的であり、様々な起源を有し、所定のポリマーまたはコロイド溶液に空間的に不均一に影響を与えることも可能である。例えば、核形成は、溶液の特定の体積要素において核形成粒子のまわりに引き起こされうる。核形成は、溶液のその他の部分にも迅速または緩慢な所定の核形成速度で進行しうる。典型的な光散乱では、「散乱体積」は、散乱検出手段によって検出された被照射試料の一部分のことである。例えば、典型的な散乱体積は、ピンホール、開口、光感受性領域といったある種の視野絞りによって規定される溶液を通過するレーザービームの寸法と関係している。典型的な散乱体積は、１０ナノリッターのオーダーであり得るが、一方全体溶液体積は、１ｍｌのオーダーであり得る。斯かる場合に、散乱体積は、合計試料体積の１０−５に相当するのみである。したがって、もし核形成イベントといった局所的な現象が２，３の場所でのみ起きる場合は、散乱体積では検出され得ない。この時間では、核形成サイトが散乱体積の中にまたは外に拡散し、ＬＳ（光散乱）強度を上昇させ、次いでＬＳ強度を低減させる。
【００４０】
本明細書に開示された例示的なＳＭＳＬＳ技術は、ポリマーまたはコロイド挙動の散発的でかつ再現性がない検出を回避することができる。これを達成する１つの手段は、散乱体積が、ポリマーまたはコロイド溶液で発生する局所的な現象をより正確に検出し特性評価するために増加されうることである。例えば、視野絞りの寸法は、光ファイバーまたはより大きな開口数および／またはコア径を備えた光学装置の使用によって増加されうる。
【００４１】
１以上の散乱体積も、ポリマーまたはコロイド溶液で発生する局所的な現象をより正確に検出し特性評価するために使用し得る。例えば、１より多い散乱体積は、入射ビームを分割し、試料溶液を通過する分割ビームの各部分に対して検出器を提供することにより生成されうる。
【００４２】
ポリマーまたはコロイド溶液で発生する局所的な現象をより正確に検出し、特性評価するために、本明細書に開示のＳＭＳＬＳシステムは、試料セルまたは入射ビームを特定のパターンで移動することにより該セルをラスタリングすることができる。サンプリングセルは、ステッパーモータのような装置によって自動的に上げ、下げまたは左右に移動しうる。サンプリングセルは、レーザーまたはその他の光源からの入射ビームを通ってあらゆるパターンで移動し得るか、または入射ビーム自体が、光源を動かすことによって試料セルを通ってあらゆるパターンで移動し得る。ラスターは、試料セルホルダを移動しなくても起きる。水平ラスターは、所望により、試料セルホルダのサイズを大きくして、ホルダ内での試料セルの自動水平動を可能にすることにより達成される。試料セルホルダ全体が、その中に固定された試料セルとともに移動しうる。
【００４３】
ポリマーまたはコロイド溶液に生じる局所的な現象をより正確に検出し特性評価するために、本明細書に記載のＳＭＳＬＳシステムは、セル中の液体の対流攪拌を最小限にすることができる。その結果、核形成局所凝集といった任意の時間依存プロセスと比較したとき、十分に短い時間スケールで全ての試料セル容積の混合がある。ポリマーまたはコロイド溶液に適用された攪拌は十分にゆっくりであるため、溶液不安定性をもたらしうる顕著な剪断応力は導入されない。十分な剪断力のもとでは、タンパク質は凝集し、ポリマーは開裂し、コロイドは凝集する。したがって、最小限の対流攪拌が導入される。
【００４４】
いくつかの実施態様において、最小限の対流攪拌は、試料セル含量を溶液中で測定される時間依存変化よりも短い時間スケールで混合することができる攪拌の程度であるが、溶液中の検出変化をもたらしうる剪断力の導入を防止するために十分低い。
【００４５】
いくつかの実施態様において、最小限の対流攪拌は、磁石攪拌棒を使用することで提供されるか、または機械的に挿入され、非常に低ｒｐｍの運転が可能なステッパーモータに取り付けられた攪拌ブレードを使用することで提供される。ステッパーモータは、撹拌棒またはブレードを１回転数あたり２００ステップで回転することができる。適切なステッパードライバと組み合わされたこのモータは、１ＲＰＭ以下の非常に低速で滑らかな回転を可能にするが、５０００ＲＰＭ以上のより高速回転へのスピードアップも可能にする。
【００４６】
最小限の対流の特徴は、以下のようにテストされる。単一のラテックス球（例えば、２μｍ径）が散乱体積を通過するとき、散乱スパイクを生じる。超希釈球が最小対流を用いてまたは用いることなく検出のために導入されうる。散乱体積は、合計セル体積の何万分の１という大きさであることから、希釈は、球が散乱体積に入る確率をいつでも低くするようにできる。対流がない場合、球は、一旦拡散して入ると散乱体積中に比較的長時間残存するが、球は当該体積に次に入るまでの間、非常に長時間を費やすだろう。最小限の対流によって、球は、当該体積を迅速に通り過ぎ、鋭い散乱ピークを生じ、そして単なる拡散による場合より頻繁に出現する。長いサンプリング時間の限度において、散乱体積における球の合計滞在時間は、拡散による場合と対流による場合とで同じであるが、拡散による個別の平均滞在時間は、対流によるものよりはるかに長いであろう。散乱体積中に出現する頻度は、対流による方がはるかに高いだろう。最小限の対流攪拌は、最小限の対流系の性能の統計計算および対応する定量評価を可能にする。
【００４７】
攪拌によって生じうる剪断応力の効果は、ポリマーまたはコロイド溶液の安定性を評価する際、定量化する重要なパラメタである。いくつかの実施態様において、制御可能な攪拌応力を有していることが望ましいが、制御可能な攪拌応力を有している場合に限定されない。ポリマーまたはコロイド溶液内に攪拌応力を生成することができる攪拌装置は、溶液をゆっくり攪拌するために使用される。
【００４８】
いくつかの実施態様において、攪拌装置に結合したステッパーモータは、当該装置の回転頻度に関連した溶液の攪拌応力を生じるために使用される。ステッパーモータは、攪拌速度の制御を可能とする。
【００４９】
当該溶液に適用された攪拌応力の正確な知識が利用できないときでさえ、ポリマーまたはコロイド溶液への剪断応力の効果は、定量する重要なパラメタである。いくつかの実施態様において、磁気攪拌または直接機械攪拌手段と結合した直流モータは、ポリマーまたはコロイド溶液を攪拌するために使用され、当該溶液の安定性を判定する。
【００５０】
例示的なＳＭＳＬＳシステム
例示的なＳＭＳＬＳシステムは、８つの独立したバッチセルを備えるように製造され、各々は、３５ｍＷの垂直偏光赤色ダイオードレーザー、ＣＣＤ検出器に結合され９０°で光散乱を検出するための光ファイバーを備えている。試料セルホルダの光ファイバーから集められた全てのセルからの光散乱信号は、ＣＣＤに導かれ、そして捕捉され、保存および分析のための単一のコンピュータに伝送される。各試料セルは、独立した温度制御を有し、これは温度を一定に保ち、連続的に変化させまたは段階的に変化させることができる。攪拌は、各セルで直流モータ駆動の磁気攪拌棒によって提供される。データサンプリングは、概して１Ｈｚで実施されたが、長時間続く実験では、より緩慢なサンプリング、例えば０．０１６Ｈｚが使用された。当該システムは、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｆ．  Ｄｒｅｎｓｋｉ，  Ｍａｒｋ  Ｌ．  Ｂｒａｄｅｒ，  Ｒｏｙ  Ｗ．  Ａｌｓｔｏｎ，  Ｗａｙｎｅ  Ｆ．  Ｒｅｅｄによる、「同時複数試料光散乱（ＳＭＳＬＳ）を備えたタンパク質凝集速度のモニタリング：高濃度製剤への応用」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４３７，  １８５−１９７，  ２０１３に記述されており、これは本明細書に記載のあらゆる目的のために参照によって組み込まれる。
【００５１】
機械的な攪拌応力の効果は、ポリマーまたはコロイド溶液の安定性を評価する際、定量化すべき重要なパラメタである。いくつかの実施態様において、制御可能な機械攪拌応力を有することが望ましい。ポリマーまたはコロイド溶液内に攪拌応力を生成することができる攪拌装置は、溶液をゆっくり攪拌し、局所および平均剪断速度を測定するために使用される。
【００５２】
いくつかの実施態様において、試料液体内に回転攪拌をもたらす攪拌装置に結合したステッパーモータは、装置の回転頻度に基づいて溶液の局所的かつ平均的剪断速度を測定し見積もるために使用される。ステッパーモータは攪拌の速度または強さの正確な制御を可能にすることができる。機械攪拌のその他の形態には、震盪すること、溶液に気体をバブリングすること、そして落下または短期間の高加速または減速によってもたらされるような非周期的な攪拌を加えることを含み；非周期的な攪拌としては、例えば、治療用タンパク溶液といったコロイドまたはポリマーの容器が落下した際に商業的な状況で発生し得るようなことがある。
【００５３】
当該溶液に適用された攪拌応力の正確な見積が利用できないときでさえ、測定できないレベルの攪拌応力がポリマーまたはコロイド溶液の安定性に与える効果は、定量すべき重要なパラメタである。いくつかの実施態様において、磁気攪拌または直接機械攪拌手段と結合した直流モータは、ポリマーまたはコロイド溶液を攪拌するために使用され、当該溶液の安定性を判定する。
【００５４】
いくつかのタンパク質について攪拌したＳＭＳＬＳの実験的結果
図３は、１００ＲＰＭ〜１０００ＲＰＭでの攪拌に対してタンパク質の攪拌によって引き起こされる凝集の時間依存データを示している。差し込み図は、初期線形凝集速度ｄ（Ｍｗ／Ｍ０）／ｄｔ対ＲＰＭを示している。凝集速度は、攪拌速度ＲＰＭｓが増加するにつれて増加する。図３への差し込み図は、ＲＰＭについての凝集速度のシグモイド依存性を示している。凝集速度を決定する手段は、Ｄｒｅｎｓｋｉ，  Ａｌｓｔｏｎ，  Ｂｒａｄｅｒ，  ａｎｄ  Ｒｅｅｄのそれである。Ｍｗ／Ｍ０は、各瞬間の散乱強度から溶液散乱ベースラインを差し引いたものを、タンパク質溶液に対するｔ＝０での初期散乱強度から溶液散乱ベースラインを差し引いたもので割った比率を形成することによってＳＭＳＬＳを用いて測定する。Ｍｗ／Ｍ０は、溶液中の全ての非凝集および凝集タンパクの重量平均質量のｔ＝０での重量平均質量に対する分数変化率を表す。凝集に関して、Ｍｗ／Ｍ０は時間につれて増加し、ＳＭＳＬＳ散乱データの初期の直線部分の傾きは、ｄ（Ｍｗ／Ｍ０）／ｄｔであり、１秒あたりの凝集重量平均重量の部分的な増加を単位として凝集速度を表す。図３への差し込み図は、図３の主要部分に示されているようなデータの初期の直線傾きから得られる速度を示している。
【００５５】
Ｂｅｅらおよびその他の者は、攪拌に起因するタンパク質凝集が、攪拌の機械的な剪断応力よりむしろ、タンパク質の空気界面への曝露が増加することに時々端を発しうることを見いだした。ＳＭＳＬＳは、気液界面がないキャップまでバイアルを満たすことで、これをテストすることを許容している。図４は、３５℃で５００ＲＰＭで攪拌した際の図３と同じタンパク質に関する凝集データを示している。図４に示されているのは、気液界面が有る試料に対するデータ（「キャップされていない」）および気液界面が無い試料に対するデータ（「キャップされている」）である。キャップされた場合の凝集速度は、キャップされていない場合よりも２．５倍遅い。したがって、気液界面は、より迅速な凝集動力学を引き起こし、界面をなくすことは、凝集プロセスを緩慢にするが止めることはなく、攪拌由来の機械的剪断および気液界面への曝露の増加は、ともにストレッサーであることを示唆している。攪拌されなかった対照試料も示されている；その場合実験のタイムスケールでは凝集は生じなかった。タンパク質の違いによって、熱によって引き起こされる凝集にケタの相違があることがわかったが、同じタンパク質は攪拌下では非常に似通った凝集速度を有しており、攪拌下では熱によって引き起こされる変性とは異なる損傷機構が起きていることを示唆している。異なる界面応力同士を区別する能力は、加工ストレスへの相対的な感受性のための開発の初期においてタンパク質候補分子および試験製剤を評価することに適用可能な便利なアプローチを表している。
【００５６】
製剤条件を変えることおよびストレッサーとしての製剤条件
ＳＭＳＬＳの重要な用途は、製剤を開発する際である。目的は賦形剤、ｐＨ、イオン強度、濃度といったファクターを最適化することにある。これらの製剤条件自体は、いずれもストレッサーであり、当該製剤が温度および攪拌といったその他のストレッサーにどのように反応するかに影響する。これらは大抵最善の選択を見いだすために経験的に取り組まれなければならない。複数の試料を同時にモニタリングするＳＭＳＬＳの能力や、リアルタイムでモニタリングする際、試料を様々な試薬で滴定する能力は、製剤スクリーニングスループットを膨大に増加させる。
【００５７】
図５は、ｐＨおよびイオン強度を変えた４つの様々な製剤に対して濃度０．００１ｇ／ｃｍ３で攪拌しない場合のＴ＝６０ＣでのｍＡｂＣの凝集挙動を示している。このように、製剤条件に起因する安定性の相違は劇的であるので、様々な凝集速度を評価するために対数時間スケールが必要とされる。図５への差し込み図は、凝集速度ｄ（Ｍｗ／Ｍ０）／ｄｔ対製剤＃を示している。最も安定な製剤と最も不安定な製剤との間には速度に６００倍を超える相違がある。
【００５８】
入射光に関する選択可能な減衰装置
いくつかの実施態様において、ＳＭＳＬＳ装置にはさらに、本明細書に記載のＳＭＳＬＳシステムおよび方法において入射光ビームまたはその他の光ビームの強度を自動的にモニタリング、減衰および制御する自動光変調システムが含まれる。自動光変調システムには、コントローラまたはプロセッサ；可動部材に配置された複数の減光フィルタ；可動部材と結合したドライブトレイン、モータまたはその他の機械および／または電子装置といった、フィルタを構成するための手段；たとえば、入射光を検出するためにコントローラまたはプロセッサに結合したＣＣＤまたはフォトダイオード等の光検出器が含まれる。コントローラまたはプロセッサは、入射光の検出強度に応答して、フィルタを構成するための手段に信号を送ることができる。コンピュータシステムで作動するコントローラまたはプロセッサは、連続的かつ自動的に入射光強度をモニタリングするために分析およびコントロールソフトウェアを実行し、必要に応じて光を調節または減衰するように、入射光の光路に適切なフィルタ構成でフィルタを位置づけるための構成手段に制御信号を提供することができる。減光フィルタ（即ち、入射波長の伝搬する光を独立して減衰する光学要素）は、安価で扱いやすく、ガラスプレート（例えば、マイクロスコープスライドまたはスライドカバー）といったその他のアイテムは、ビームスプリッタと同様に光を減衰するために使用され、特定の波長または波長範囲にチューニングされた光学フィルタが使用される。
【００５９】
上述した自動光減衰要素は、インプットレーザービームが変調されうる範囲を増加させる。いくつかの実施態様において、自動光減衰要素は、自動的に制御され、異なるフィルタは、サーボモータを用いて設置される。図６に例示されているフィルタフライホイールは、本明細書に記載されている自動フィルタ要素の１つの例示的な実施態様であるがこれに限定されない。光減衰素子は、直線的に配置することもでき、直動ステージで自動的に位置を移動するように作動され得る。円形または線状に伸びる単一の連続的な減光フィルタを使用することも可能である。減衰素子をぐるぐる（円形素子）または一定方向に沿って（線状素子）連続的に動かすことにより、達成されるべき０付近から１００％付近までの一連の減衰を与える。
【００６０】
拡張されたダイナミックレンジ（ＥＤＲ）
安定かつ安価であることから、現在のＳＭＳＬＳプロトタイプは、３５ｍＷダイオードレーザーを用いる。このパワーは、弱く散乱する溶液からでさえ、よい信号を与える。上で述べたように、減光フィルタは、タンパク質凝集体といった非常に散乱しているシステムが測定される場合、入射光出力を低減するためにしばしばビーム路に挿入されなければならない。このような状況で入射光出力が低減されない場合、ＣＣＤの中央ピクセルは、飽和する（またはフォトダイオードまたはその他の検出器も飽和しえた）。
【００６１】
ピクセル飽和を低減する別のやり方は、ＣＣＤ上の積算時間を低減することであり、これは感度コントロールと等価である。しかしながら、中央ピクセルが飽和未満である場合でさえ、その低い信号雑音レベル（ＳＮレベル）から最大値のレベルまで所定のピクセルと関係づけられた一定のダイナミックレンジがある。
【００６２】
ＳＭＳＬＳダイナミックレンジを拡張する方法の一例では、散乱光をＣＣＤに伝搬する光ファイバーの２つの特徴が使用される：それはすなわち、ｉ）商業上利用可能なＣＣＤ  （Ｍｉｇｈｔｅｘ  ＴＣＥ−１３０４−Ｕ，  Ａｌｐｈａｌａｓ  ＣＣＤ−Ｓ３６００−Ｄ）が、動作レンジで高度に線形応答を示すこと、ｉｉ）散乱光をＣＣＤに伝搬する光ファイバーから出る光が、各々別のファイバーに対するピクセルレンジにわたって概ねガウシアン強度プロファイルを生成すること、である。このことは、飽和中央ピクセルからサイドピクセル上への「ロールオフ」を与え、より広範囲の強度にわたり線形および非飽和検出を継続している。単一ピクセルをモニタリングするかまたは図７の差し込み図に見られる全ガウシアン強度プロファイルを統合することにより可能になる。図７の主要部位は、側波帯ピクセルの使用が約１５０％レンジを拡張することを示している。さらなるロールオフピクセルを用いてより高いゲインが得られた。
【００６３】
データは、現行のプロトタイプから取得された。所定のファイバーに関して一群のピクセルに入射した強度は、広範なレンジで変わり、中央で最も強度が高い。図７は、ピクセル３９６をピークピクセル４１９に拡大することによってレンジが２．５倍増加することを示している。４１９がＬＳ＝１０で飽和する時間までに、拡大されたピクセル３９６は、試料に関する散乱最大値に到達する前に２５まで継続し；ＥＤＲの２．５倍増加が達成される。実験は、５．２日間にわたりタンパク質凝集を引き起こした。現行のＰＴ２は、隣接するファイバーでのピクセルクロストーク；すなわち、１つのファイバーからの光が隣の外側ピクセルと重なり合うことが原因で、通常ＥＤＲを使用することができない。データは、隣接する試料セルにある（タンパク質バッファー安定性の長期間モニタリングのために使用された）非常に低い散乱バッファーを用いることによって得られた。
【００６４】
いくつかの実施態様において、複数の光ファイバーが提供される。光ファイバーは、カップリング素子を用いてＣＣＤと光学的に結合された試料含有試料セルからの散乱光を伝搬する。カップリング素子は、ＣＣＤにあるピクセルアレイに対して固定された位置にファイバーを保持する機械素子であり得る。複数のピクセルは、所定のファイバーに割り当てられ、ファイバーを伝搬する光はピクセルに到達する。プロセッサおよびソフトウェアを含むコンピュータは、ＣＣＤ上のいくつかのまたは全てのピクセルを読むために使用され、ピクセルの一群は、上述のように各ファイバーに割り当てられる。実験では、目的記述ソフトウェアプログラムが、実験の最初に最高の非飽和信号、または非飽和ピクセルのサブグループを採りこむ。例えば、ポリマーまたはコロイドの凝集に起因して、実験の際、散乱信号が増加する場合は、選択したピクセルまたはピクセル範囲が飽和する場合、プログラムは自動的に次に利用可能な非飽和ピクセルの一つに測定を切り替える。初期の最高またはほぼ最高のピクセルまたはピクセル群は、発生時から知られている。なぜならば：（１）ＣＣＤは線形であり、（２）各ファイバーに割り当てられたピクセル群における各ピクセルの強度比率は、既知である−即ち各ピクセルの相対感度は既知であり、測定は次の非飽和ピクセルまたはピクセル群にスムースに切り替わるからである。もし強度が増加し続けるならば、ロールオーバーを補正するための強度の線形比を用いて現在の飽和ピクセルから非飽和ピクセルにロールオフするこのプロセスは、所定のファイバーに関連づけられた最新のピクセルが到達するまで必要に応じて何度も続けることができる。この結果は、単一のピクセルまたはピクセルのサブグループのみが使用され当該ピクセル（グループ）が測定時に飽和した場合に利用可能であっただろう強度レンジと比べてはるかに大きな強度レンジにわたる所定のセルに対する散乱強度の連続的な記録である。
【００６５】
ロールオーバーは様々な手法で容易にされ得、上述した手順は、本明細書の開示範囲および飽和ピクセルのロールオフの方法を限定するものとは意図されない。例えば、利用可能な隣接する非飽和ピクセルまたは非飽和ピクセル群へのロールオーバーは必要ではない。既に飽和したピクセルに近接していることに起因して迅速に飽和することがないように、現在の飽和ピクセルまたはピクセル群から遠く離れたピクセルへのロールオーバーが望ましい。
【００６６】
このような付加的な特徴を有する方法のＳＭＳＬＳシステムは、隣接するファイバー由来のピクセル間のクロストークなしに、ＥＤＲを５０倍、ともすればそれ以上に増加させることができる。このことは、ＳＭＳＬＳ検出ダイナミックレンジの大幅な増加を意味している。ＣＣＤに結合しているうまく設計されていない光ファイバーでは、１つのファイバーのガウシアン強度分布からの強度が、隣接するファイバーに属するピクセル上に「流れ出る」ことがある。
【００６７】
ＥＤＲが有用になりうる多くのコンテキストがある。時間につれて散乱が増加するポリマーおよびコロイドを含有する溶液では、決定的な価値を有しうる。いくつかの実施例は、次のものを含むがこれらに限定されない：
【００６８】
ｉ）ポリ−ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）およびそのコポリマーといった刺激応答ポリマーは、より低い臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有しており、この温度では、ポリマー鎖がランダムコイルから小球につぶれて、可逆的に凝集が始まる。ＬＣＳＴでこの相転移が起きると、光散乱強度が劇的に、しばしば桁違いに増加する。ＥＤＲは、ＬＣＳＴの前後で光散乱測定をスケール上に保つであろう。
【００６９】
ｉｉ）多くの治療タンパク質は凝集する傾向を有し、このことは、当該タンパク質で構成される薬剤に対する否定的な結果をもつ。というのも、凝集タンパクは、治療上の生物利用可能性を失い、抗原性でありさえするからである。米国食品医薬品局、米国標準技術局のほか、多数の製薬／バイオテクノロジー企業もまた、タンパク質凝集プロセスおよび凝集をいかにして最小化しまたは除外しうるかについての研究に活発に従事している。光散乱強度は、凝集が進行するにつれて劇的に増加し、ＥＤＲにより、広範なタンパク質凝集由来の光散乱をスケールを保ちつつ測定できる。
【００７０】
ｉｉｉ）市町村の水処理、冶金、製紙、石油回収のための多くのタイプの凝集剤がある。凝集剤は、光散乱の大幅な増加をもたらし、ＥＤＲにより、このようなプロセスを広いレンジにわたりスケールを保って測定することができる。
【００７１】
ｉｖ）非常に広範なポリマーおよびコロイドは、溶液中で元来不安定であり、やがて凝集する。ＥＤＲにより、ＥＤＲがない場合よりはるかに広範囲にわたりこのようなプロセスがモニタリングされる。
【００７２】
ｖ）多くのポリマーおよびコロイドは、ｐＨ、イオン強度、特定イオン、キレート剤、界面活性剤等の溶液条件が変化するまで安定である。ＥＤＲにより、このような溶液に対する不安定化剤の探査が可能になる。
【００７３】
全散乱強度に加えてその他の性質を測定するためのＳＭＳＬＳプラットフォームの適応
本明細書に開示したＳＭＳＬＳシステムは、例えば、シングルモードファイバーの付加および強度信号のための自己相関器の使用ならびにホモダインまたはヘテロダイン動作モードの選択によって、動的光散乱を測定するように適応させることができる。
【００７４】
例えば、９０°検出においてフィルタの複数の垂直レベルが蛍光検出範囲の拡張をもたらしうる場合、本明細書に開示したＳＭＳＬＳシステムは、ファイバーの前または後にノッチまたはナローバンドパスフィルタを置くことによって蛍光を測定するように適応させることができる。一般により低い波長のレーザーまたは非常によく操作されたブロードバンド源が使用される。
【００７５】
本明細書に開示したＳＭＳＬＳシステムは、例えば、高度に減衰されたレーザービームおよび可能な対数増幅）を用いた前方検出によって、濁度を測定するように適応させることができる。
【００７６】
本明細書に開示したＳＭＳＬＳシステムは、例えば、実質的にすべて光学的に活性である天然の多糖性およびタンパク質性天然産物を使用した偏光状態の回転によって、光学活性を測定するように適応させることができる。偏光子および機械的またはカー効果検出を使用して、光学活性が測定される。
【００７７】
本明細書に開示したＳＭＳＬＳシステムは、ＵＶ検出器を利用して光学活性ＵＶ吸光度を測定するように適応させることができる。
【００７８】
本明細書に開示したＳＭＳＬＳシステムは、自動連続混合をもたらすように適応させることができる。
【００７９】
本明細書に開示したＳＭＳＬＳシステムおよび方法は、ナノおよびマイクロキャリア（例えば、デンドリマー、キャビタンドなど）による薬物の封入および放出の高スループットモニタリングに使用することができる。さらに、本明細書に開示したＳＭＳＬＳシステムおよび方法は、タンパク質およびコロイド溶液の高スループット溶解、相図、およびマイクロ溶解度（ｍｉｃｒｏｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）をリアルタイムで判定するのに使用することができる。
【００８０】
酵素反応を含めたポリマー反応における凝集または分解の動力学を解釈するための特定の時間依存光散乱シグネチャーの使用
本明細書に開示したＳＭＳＬＳシステムおよび方法は、溶液の特定の時間依存光散乱特性を測定するのに使用することができる。ポリマーまたはコロイドが凝集または分解するとき、プロセスの機構的および動力学的側面を明らかにする、プロセスに関連した数学的に予測可能な時間依存光散乱シグネチャーが存在しうる。このようなプロセスとしては、凝集、酵素加水分解、酵素重合、合成重合、相分離、相変態などがあるが、これらに限定されない。
【００８１】
サンプリングセルのグループへのユーザー保護された遠隔アクセス
本明細書に開示したＳＭＳＬＳシステムおよび方法は、サンプリングセルのアレイ中の１つまたは複数のサンプリングセルから生成されるデータへのリアルタイムアクセスを提供することができる。ポリマーもしくはコロイド特性データまたは光パラメタデータを、対象の当該システムのユーザーにセル単位で流して、複数のユーザーに同時にリアルタイムのポリマーおよびコロイドデータを提供することができる。各試料セルまたは試料セルのグループを、ユーザー名およびパスワードで保護して、１つまたは複数のサンプリングセルから生成されるデータへの安全な遠隔アクセスを提供することができる。
【００８２】
ＳＭＳＬＳユーザーが検索可能なデータベースを作成して、１人または複数のユーザーが割り当てられたサンプリングセルから生成されるデータへの遠隔オフラインおよびオンラインユーザーアクセスを提供することもできる。１つまたは複数のサンプリングセルから生成されるデータを、測定し、収集し、本明細書に開示したＳＭＳＬＳシステムおよび方法から生成されるポリマーまたはコロイド溶液データへの安全な遠隔アクセスを提供するデータベース中に記憶することができる。
【００８３】
タンパク質凝集中に形成する微粒子
治療タンパク質製剤中の粒子は、いくつかの源から生じうる；シリンジ、「粉塵」、および加工装置からの高度に凝集したタンパク質、シリコーン油、および外来粒子。タンパク質凝集体は、薬物利用可能性を低減し、アレルギー反応および免疫応答を悪化させ、誘発しうる一方、金属および油粒子は、さらにより大きい免疫原性を持つ不均一粒子および他の有害な生理的結果をもたらしうる。［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｓ．、ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００６、８、Ｅ５０１〜Ｅ５０７；Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，Ｈ．、Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ、２０１０、９、５６０〜５６４］。
【００８４】
米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、これらを規制することに興味を持っており、米国標準技術局（ＮＩＳＴ）は、これらの特性評価を標準化する手段を追究している。タンパク質溶液中の微粒子をより良好に特性評価する主な取り組みが進行中である［Ｍａｌｌｏｙ，Ａ．、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｏｄａｙ、２０１１、１４、１７０〜１７３；Ｆｉｌｉｐｅ，Ｖ．；Ｈａｗｅ，Ａ．；Ｊｉｓｋｏｏｔ，Ｗ．、Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓ、２０１０、２７、７９６〜８１０；Ｂａｒｎａｒｄ，Ｊ．Ｇ．；Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．；Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｔ．Ｗ．；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、２０１１、１００、４９２〜５０３；Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｔ．；Ｓｈａｒｍａ，Ｄ．；Ｏｍａ，Ｐ．；Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，Ｒ．、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、２００９、９８、３０５８〜３０７１］。「肉眼では見ることができない」粒子の問題、ならびにより厳密な定量化、モニタリング、および制御の必要性は、近年、多くの注目が集められている［Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．；Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｔ．Ｗ．；Ｊｉｓｋｏｏｔ，Ｗ．；Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｄ．Ｊ．Ａ．；Ｍｉｄｄａｕｇｈ，Ｃ．Ｒ．；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．；Ｆａｎ，Ｙ．−Ｘ．；Ｋｉｒｓｈｎｅｒ，Ｓ．；Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，Ｄ．；Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ，Ｓ．；Ｃｌｏｕｓｅ，Ｋ．Ａ．；Ｓｗａｎｎ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．；Ｃｈｅｒｎｅｙ，Ｂ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、２００９、９８、１２０１〜１２０５］。
【００８５】
歴史的に、バイオテクノロジー産物中の凝集体および粒子の制御は、可溶性凝集体定量化についてＳＥＣを、粒子計数について光掩蔽法をほとんどもっぱら利用してきた。しかし、０．１μｍ〜１０μｍのサイズ範囲内の粒子は、この範囲内の粒子が免疫原性を誘発することができるという認識にもかかわらず、大部分は見過ごされてきた。バイオテクノロジー産業は、この範囲内の粒子を検出することができる新しい改善された方法、ならびにこれらの起源ならびにバイオプロセシング方法およびストレスがどのようにこれに影響するかをより有効に探査するための方法論を特定することに懸命に努力している。肉眼では見ることができない粒子とサブミクロン粒子との間の潜在的な関係性も指摘されており、最近の研究では、産物のロバスト性をより良好に理解し、安定性を予測する目的でこれらの相互関係を探索し始めた［Ｂａｉ，Ｓ．；Ｍｕｒｕｇｅｓａｎ，Ｙ．；Ｖｌａｓｉｃ，Ｍ．；Ｋａｒｐｅｓ，Ｌ．Ｂ．；Ｂｒａｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、２０１３、１０２、３４７〜３５１］。新たに出現したＬＳベース法は、タンパク質凝集の最も早い段階、ならびに、サブミクロン粒子から、肉眼では見ることができない粒子、そして目に見える粒子の形成への進行がどのように起こるかを探査するためのより感度の良好なアプローチを提供することにおいて重要な役割を果たす可能性が高い。ＳＭＳＬＳは、光散乱スパイク、ＬＳＳを引き起こす個々の大粒子を見分けるその能力を介して、微粒子の特性評価に役立つことになる。
【００８６】
用語の不均一時間依存静的光散乱（ＨＴＤＳＬＳ）は、Ｓｃｈｉｍａｎｏｗｓｋｉらによって、個々の大粒子からのＬＳＳを分解および計数すると同時に、均一な散乱体の集団から背景散乱を測定することができる彼らの計測器に関連して導入された［Ｓｃｈｉｍａｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．；Ｓｔｒｅｌｉｔｚｋｉ，Ｒ．；Ｍｕｌｌｉｎ，Ｄ．Ａ．；Ｒｅｅｄ，Ｗ．Ｆ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９９、３２、７０５５〜７０６３］。頭字語中の「不均一」は、溶液が微粒子およびはるかに弱い散乱体の背景集団の両方を含むという事実を指す。その研究の著者は、背景散乱を埋め合わせながら溶液中の粒子数密度を判定することができた。実証は、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）が溶解されたブロス中で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を増殖させることによって行われた。ＨＴＤＳＬは、細菌個体数の経時的な増加ならびにＰＶＰのＭｗおよびＲｇの特性評価を与えた。
【００８７】
ＨＴＤＳＬＳを実施するための条件の１つは、入射ビームと粒子との間に相対運動が存在することである。これにより、粒子が散乱体積を速やかに通過し、明確なＬＳＳが生じることが保証される。Ｓｃｈｉｍａｎｏｗｓｋｉらは、光散乱フローセルを使用することによってこれを提供した。
【００８８】
溶液が、任意の所与の時間および散乱角で均一に光を散乱させる散乱体の背景集団、ならびに各大粒子が個々の背景散乱粒子より何桁も多く光を散乱させる大散乱体の集団を含む多くの場合が存在する。このような系としては、ｉ）大凝集体の形態でないタンパク質の均一な背景を含む溶液中の大タンパク質凝集体、ｉｉ）凝集形態でないタンパク質の均一な背景を含み、そのなかに大きい非タンパク質散乱体、例えば、生体細胞、細菌、ウイルス、細胞片、または油ナノ液滴もしくは油微小液滴、金属、プラスチック、またはガラス粒子などが存在する溶液、ｉｉｉ）天然または合成ポリマーの均一な背景およびコロイド粒子の集団、例えば、多糖系発酵液中の細菌、アクリルアミド系コポリマーの溶液中のミクロゲルなどを含む溶液があるが、これらに限定されない。
【００８９】
大粒子は、検出可能な光散乱スパイクを生じるのに十分な光を散乱させる任意の粒子を意味する。したがって、光散乱システムの感度は、大粒子と見なされるものの下限を設定する。ある態様において、大粒子は、０．１ミクロン、またはさらにより小さい場合がある。他の態様において、大粒子は、十分希薄であり、十分に高感度な検出手段が利用可能である場合に光散乱スパイクとして検出されうる単一気体原子でありうる。さらに別の態様では、大粒子は、背景散乱粒子と対比される個々の粒子でありうる。用語「大粒子」は、以下では、均一な背景に対して検出可能な散乱スパイクを生じさせるのに十分大きい粒子を示すのに慣習として使用される。一般に、個々に測定可能なＬＳＳを生じさせることができる大粒子は、約０．１ミクロンから数百ミクロンまで、すなわち最大で、肉眼で見えるほど大きい粒子までの範囲となる。サイズは光散乱強度を制御する唯一の決定的性質でないことも留意されたい。半径０．０５ミクロンの固体粒子は、根平均二乗回転半径が０．０５ミクロン、モル質量が２．４×１０６ｇ／モル、そして固体粒子と同じ屈折率のランダムコイル分子よりおよそ１，０００倍散乱することを予期することができる。
【００９０】
今回開示した技術が使用される試料タイプの重要な側面とは、試料の安定性に関することである。すなわち、平衡状態でなく、したがってやがて漸進的に変化する合成もしくは生体巨大分子、および／またはコロイドを含む多くの溶液が存在する。漸進的変化は、多くの方法でそれ自体を顕在化させることができる。例えば、粒子は、凝集する場合があり、凝集および沈殿する場合があり、ミクロゲルまたは微結晶を形成する場合があり、次いでこれらは、長時間にわたって安定となり得、または最終的に沈殿する場合があり、粒子は、巨大分子の化学または酵素分解など、分解してより小さい断片または分子になる場合があり、相分離する場合があり、意図的な作因（例えば、重合反応）または周囲の作因（酸素、温度、湿度）によって推進される化学反応を起こす場合があり、溶解する場合があるなど。これらの不安定性が妥当な時間スケールで起こる場合、このようなプロセスの動力学、そして溶液の巨大分子、コロイド、および粒子の外観がどのように変化するかを測定することができるのは有利であることが多い。
【００９１】
妥当な時間にわたって変化しない溶液は、「安定」または「準安定」と見なされる。「妥当な時間」は、溶液の特性が変化しないことが重要である期間を意味する。妥当な時間は、薬物の保存可能期間が２年でありうることである場合がある。棚上の薬物が２年にわたって安定または実質的に安定である限り、これは妥当な時間である。妥当な時間のもう１つの例として、測定が不純物を含むミセル系で行われる場合を説明する。系は、数日間のみ安定であり、実験は、１時間未満を要する。この例では、系は、実験の妥当な時間にわたって安定である。妥当な時間のもう１つの例が、強磁性材料（例えば、鉄）の永久磁化の概念を使用して説明される。磁化は最終的に、熱的効果（ネール緩和）に起因して失われることになる。しかし、強磁性材料が磁化を失うのに数百万年を要しうる。磁石を使用する人間は、この磁化を永続的であると宣言する。理由は、これが人間の寿命にわたって磁化されたままであるためであり、この寿命は、この場合妥当な時間である。
【００９２】
不均一時間依存静的光散乱（ＨＴＤＳＬＳ）は、背景散乱体および大粒子を同時に検出する手段である。この方法は、散乱セルを通じて流れる液体試料を利用し、大粒子が試料セルの散乱体積を通過するたびに測定可能な光散乱スパイク（ＬＳＳ）を生じさせる。散乱体積は、システムの検出光学系によって検出される入射光ビームによって照射される試料の部分を指す。ある態様において、散乱体積は、典型的な光散乱についてナノリットルの数分の１から数百ナノリットルの程度である。
【００９３】
ある態様において、撹拌能力を伴ったバッチモードＳＭＳＬＳは、散乱実験で使用される試料溶液と入射光ビームとの間の相対運動、したがってＨＴＤＳＬＳ性能を実現することができる。ある態様において、ＳＭＳＬＳシステムは、制御された撹拌ＲＰＭを利用することができる。撹拌は、ＲＰＭが制御されているか否かにかかわらず、大粒子が明確に決められた時間内にレーザービームを強制的に通過させられ、光散乱ピークを生じさせることを保証する。撹拌されないままの場合、粒子は、ランダムな様式で光散乱体積を通って拡散することになり、粒子が散乱体積の内外を蛇行する際に定義できない幅の拡がったピークを生じうる。
【００９４】
図８は、この点を説明するものであり、ここでは、拡散制御下（すなわち、０ＲＰＭ）の水中および８０ＲＰＭで撹拌された水中の２ミクロン（μｍ）のラテックス球の希薄溶液について、３０秒のスワス（ｓｗａｔｈ）のデータが示されている。図８に表したように、拡散制御された散乱スパイクは、広くランダムな幅のものであり、不規則な間隔で起こる。８０ＲＰＭのスパイクは、より狭く、より均一な幅を有し、より頻繁に起こる。様々なピークの高さの差異は、粒子が横断する散乱体積中のレーザービームの強度プロファイルのどの部分であるかに関係する。
【００９５】
ＳＭＳＬＳシステムでは、撹拌の特徴を使用して相対運動をもたらすことができる。図８は、ｉ）相対運動がなく、ＬＳＳが拡散制御されている場合、およびｉｉ）８０ＲＰＭの撹拌が使用された場合についてＳＭＳＬＳシステムから収集された、水中の２μｍのラテックス球からの光散乱ピークを示す。サンプリングは、１０Ｈｚで行った。拡散制御ピークは不規則な形状および継続時間のものである一方、８０ＲＰＭでのＬＳＳは明確であり、より狭くよりしっかりと制御された幅を有し、より頻繁に起こる。散乱体積にわたるビーム強度は均一でないので、これらのような単分散粒子でさえ、ＬＳＳピーク高さの分布を生じる。十分長いサンプリング期間をとると、時間に対するＬＳ強度の積分は、予期されるように、場合ｉ）およびｉｉ）の両方で同じである。
【００９６】
重要なことに、拡散制御ＬＳＳスパイク下面積を長い時間にわたって積分すると、面積は、８０ＲＰＭのスパイクが同じ期間にわたって積分されるときと同じである。平均すると、拡散制御粒子は、撹拌されるものと同じ量の時間をビーム中で費やす。これは、予期される統計的な結果である。その実用的な価値は、制御撹拌を使用して個々のスパイクの平均幅および平均頻度を制御することができ、撹拌能力をタンパク質溶液中の微粒子をモニタリングするための強力なツールにすることができることである。というのも、散乱体積を通過する際に粒子を１つずつ文字通り観察することができ、何千という粒子を実験の過程で検出することができ、分析のための大きな統計的データベースを生じさせることができるためである。例えば、決して限定的ではなく、粒子を１秒ごとに計数することができ、その結果、１時間の実験の過程で、３０００を超えるスパイクが分析に利用可能である。タンパク質溶液中の微粒子の特性評価は、バイオテクノロジーおよび医薬品部門にわたる主要な問題である。Ｕ．Ｓ．ＮＩＳＴ（米国標準技術局）は、粒子測定を標準化するように試みており、治療タンパク質製剤中の微粒子含量に対する規制を設定する試みは、ＦＤＡ（食品医薬品局）が懸命に努力している目標である。今回開示した技術は、粒径が品質の指標または他の所望のパラメタでありうる合成または天然源に由来する微粒子の特性評価を含めて、この分野および他の分野において新しいツールを提供する。いくつかの例としては、ナノ粒子、合成ポリマー、バイオポリマー、カーボンナノチューブ、および他の天然または合成材料がある。
【００９７】
潜在的に重要なもう１つの用途は、入射ビームｐ→によって励起される電気双極子が入射ビームの電場Ｅ０→と整列しないようなテンソルの分極率α＝を有する粒子に関係する。入射ビームは、
【数１】
0006416908.tif 000002
によって表現される。
【００９８】
この場合、散乱光は、スカラー分極率αの粒子が有さない検出可能な脱偏光成分を有することになる。このような粒子は通常、異方性のモルフォロジー、例えば、ロッド、楕円体などを有する。したがって、異方性粒子単独、または等方性粒子と共存するものからのＬＳＳを測定することが可能である。この後者の場合では、スカラー分極率の粒子から異方性粒子の数密度およびＭＷＤを分離することが可能となる。サブミクロン範囲内のほとんどのポリマーおよびコロイドは、スカラー分極率を有し、したがって脱偏光信号を生じない。最良の検出を実現するために、散乱試料への入射光は、直線偏光される。これは、楕円偏光される場合もある（このうち、円偏光および直線偏光が特別な場合である）。非偏光入射光は、脱偏光を測定するのに最も好ましくない手段である。
【００９９】
例えば、異方性の生物学的な粒子、例えば、棒状の細菌またはウイルスなどは、他の粒子、例えば、等方性細胞、細胞片、血漿などの混合物中に存在しうる。脱偏光ＬＳＳを使用して、これらの数密度および特性を、本明細書に概説した様々なＬＳＳ  ＭＷＤ分析法を使用して判定することができる。このような集団が、栄養分または薬物に応答する場合を含めてどのように経時変化し、増加または減少しうるかも、モニターすることができる。
【０１００】
他の場合では、アルツハイマーおよび関連疾患において見つかる小繊維アミロイド凝集型などの異方性タンパク質を、他の粒子に囲まれた中で検出することができ、これらの数密度およびＭＷＤ特性が得られる。天然のまたは人間が加えた原因に起因するこれらの増大または減少をモニターすることも可能である。例えば、アミロイドタンパク質凝集体を解離させる薬物は、凝集体の数密度を減少させ、ＭＷＤおよびその平均を減少させるはずである。
【０１０１】
カーボンナノチューブは、一般に異方性であり、脱偏光散乱を生じさせることができる。例えば、複合体およびこれから作製される溶液中で異方性でない他の粒子と共存する場合、ナノチューブ集団を特性評価するために脱偏光ＬＳＳを使用することが可能である。ナノチューブも、凝集する強い傾向を有する。凝集体は通常、様々な脱偏光特性を有しており、その結果、脱偏光ＬＳＳ法を、溶液中のナノチューブの分散性および安定性を特性評価するためのツールとして使用することができる。例えば、ナノチューブ凝集体は、これらのテンソルの分極率を失い、または大いに低減し、異方性（非凝集ナノチューブ）および等方性または疑似等方性粒子の混合物をもたらしうる。
【０１０２】
入射光の波長よりはるかに大きい粒子は、そのモルフォロジーにかかわらず光を脱偏光しうる。この一例は、サイズが数ミクロンまたはそれ超である粒子である。したがって、脱偏光ＬＳＳスパイクを使用して、ＬＳＳを生じさせるが、有意な脱偏光ＬＳＳを生じるほど大きくはない他のより小さい粒子から、非常に大きい粒子に由来する散乱を分離することができる。このような粒子は、多くのタイプのプロセス、例えば、均一相および不均一相中の合成ポリマー、合成ゴム、ならびに水浄化化学物質の生産、多糖などの天然産物の加工、治療タンパク質のＲ＆Ｄおよび生産、ならびにはるかに多くの場合などで形成しうる。
【０１０３】
図９中の光散乱データの幅の漸増は、０．０１０ｇ／ｃｍ３で、１００ＲＰＭで空気／液体界面を伴わずに撹拌されるときのタンパク質の微粒子が形成されていることを示す。図９は、タンパク質が凝集するにつれて散乱の幅がどのように増大しうるかを示す。広幅化は、よりノイズの多い信号として現れる。実際には、幅および見かけ上のノイズの増大は、タンパク質溶液中の微粒子集団の発生および漸進的発達に起因する。図９中の光散乱データの幅の漸増は、０．０１０ｇ／ｃｍ３で、１００ＲＰＭで空気／液体界面を伴わずに撹拌されるときのタンパク質の微粒子が形成されていることを示す。
【０１０４】
これを説明するために、図１０は、図９の最も強い散乱試料からの２つの５００秒のスワスのデータを示す。図１０の下側のｘ軸によって表されているように、凝集プロセスの早期において、非常にわずかなスパイクが存在することが分かる。早期のスワスでは、微粒子が少数しか存在せず、ＬＳＳの低い振幅によって分かるように、これらは小さい。２５，５００秒から開始する５００秒のスワスについての凝集プロセスの後期では、微粒子集団は、より高い数密度を有し、粒子は、はるかにより大きい。これは、この段階でのタンパク質凝集体が依然として可溶性であり、サイズがサブミクロンであるという事実に帰される。図１０の上のｘ軸によって表したように、様々な幅および高さの多数のスパイクが２５，０００秒後に見られ、これは、巨大な１ミクロン超のサイズの粒子の存在を明らかに示している。
【０１０５】
研究は、ＬＳＳスペクトルを使用して、粒子密度、およびそれがどのように経時変化するか、ならびに粒子のモル重量分布の尺度を得るために、現在進行中である。
【０１０６】
図１１は、撹拌ストレスのない、空気／液体界面を伴って１００ＲＰＭで撹拌した、および空気／液体界面を伴わないで１００ＲＰＭで撹拌したタンパク質試料を示す。図１１は、２．５日後の５００秒のデータのスワスから採用したこれらの３つの試料の微粒子含量の差異を示す。空気／液体界面を伴った試料は、空気／水界面を伴わない試料と比較してより大きい粒子およびより高い濃度の粒子を有する。撹拌していない対照試料は、一番下にある。凝集も粒子化も、３５℃での３日の実験にわたって撹拌していない試料中では起こらなかった。
【０１０７】
多くのタイプの分析を、ＳＭＳＬＳスパイクスペクトルおよび均一な背景散乱データに対して実施することができる。これらの分析には、
ａ）大きい微粒子の数密度、および仮にあったとしてもこれらがどのように経時変化するかを得ること。数密度は、相対数であっても絶対数であってもよい。
ｂ）ＬＳＳを生じさせる大粒子の定義を得ること
ｃ）大粒子のモル質量（Ｍ）を算出すること
ｄ）較正された標準物質を使用することによってＭをクロスチェックすること。例えば、ＮＩＳＴラテックス球。
ｅ）ある特定の単純な仮定の下で角度効果について補正すること
ｆ）大粒子の半径（Ｒ）などのサイズを算出すること
ｇ）大粒子が多分散であるとき、Ｍの平均を見つけること
ｈ）大粒子が多分散であるとき、Ｒの平均を見つけること
ｉ）多分散大粒子のモル重量分布（ＭＷＤ）を計算すること
ｊ）多分散大粒子の粒径分布（ＰＳＤ）を計算すること
ｋ）均一な背景散乱ネイティブタンパク質および凝集体から大粒子への、そして大粒子が分解して均一な背景散乱体になる場合には逆の場合も同様に、物質移動、または等価的には濃度を計算すること
ｌ）沈殿の開始および沈殿速度を判定すること
ｍ）散乱体積Ｖｓにおける入射レーザー強度分布を判定すること
ｎ）ＬＳＳの計数および分析を使用してＶｓを判定すること
が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
数密度は、粒子／体積、例えば、粒子／ｃｍ３を単位としている。粒子数密度の判定は、当業者によって理解されるはずであり、開示した技術によって集められるデータに適用可能である。粒子数密度を判定するのに使用される分析は、散乱体積中に粒子がない平均時間であるクリアウインドウ時間（ｃｌｅａｒ  ｗｉｎｄｏｗ  ｔｉｍｅ）に依存し、これは散乱体積中のＬＳＳ間の平均時間を規定する。さらに、この分析は、任意の瞬間において１つまたは複数の粒子が散乱体積を占有する確率を計算して、ｅｘｐ（−ｎＶｓ）（式中、ｎは、粒子数密度であり、Ｖｓは、散乱体積である）で変化する単一粒子検出の確率を判定するのに二項分布を使用することを含み得る。
【０１０９】
Ｖｓが非常に小さく、Ｖｓ中に同時に複数の大粒子が存在する場合では、この産物を、ｎもしくはＶｓまたは両方を低減することによって低減することができる。第１の場合では、試料を単に希釈することができる。第２では、ＳＭＳＬＳシステムの改変が行われる。ｉ）より狭い直径および／またはより小さい開口数の光学的検出ファイバーを使用し、ｉｉ）タイトなビームウエストを有するようにビームを集束させ、ｉｉｉ）ファイバーがピンホールモードで動作していることを保証することが可能である。Ｖｓ中に平均で１つを超える粒子が存在する場合、粒子はもはや個々に検出されないので、この方法は破綻し始める。
【０１１０】
今回開示した技術は、以前に開示されていない、公開されていない、当業者によって公知でないタイプのデータ分析を含む。すなわち、大粒子のモル重量分布（ＭＷＤ）の尺度は、この開示した技術の方法から計算することができる。第１に、このような測定は、所与のＳＭＳＬＳユニットの最も検出し難い角度、好ましくは３０°未満、より好ましくは１０°未満で、さらにより好ましくは０°に外挿することによって行われるべきであるが、９０°でさえ、ＭＷＤへの有用な近似を測定することができる。
【０１１１】
問題は、それが思われうるほど簡単明瞭ではない。その理由は、通常Ｖｓ全体にわたるレーザー入射強度は均一でなく、これは、分析が二重に統計的となることを意味するためである。例えば、単分散粒子からでさえ主要因とされなければならないＬＳＳ振幅スペクトルが存在することになる。第２に、ＭＷＤは、統計の第２の層を加える。最も理想的な場合では、Ｖｓにわたるビームは、ビームの中心からの距離のガウス関数として消滅するＴＥＭ００モードでの強度を有する短円筒として処理される。実際には、レーザー、特にダイオードレーザーからの軸方向の非対称性、ビーム路中の光学系の効果、より高次の通常モードの混合などは、ガウスビームプロファイル以外および非円筒形体積形状をもたらし得る。さらに、攪拌棒に起因する角運動中の粒子は、必ずしも直角でレーザービームに交差するとは限らない。
【０１１２】
ＬＳＳを分解するための要件を定義することが重要である。図１２は、上記データからの単一のスパイクに対する拡大を示す。サンプリングレートは、およそ１０Ｈｚである。主要なスパイクがはっきり見えるが、サンプリングレートは、スパイクの完全な形状を見るのに十分な時間分解能をもたらすほど十分に高くない。図１２では、３つのサンプリングポイント（立ち上がりに１つ、最大で１つ、および立ち下りに第３）を有するＬＳＳは、測定され、または検出されていると宣言することができるが、「時間分解されている」と宣言することはできない。スパイクの測定は、それが粒子数濃度の知識を与え、ピークを真のピーク高さの推定として使用することができるのでそれ自体で有用である。ところが実際は、真の高さは、スパイクの最高ポイントよりある程度高く、測定された最大の少し前または後に起こる場合がある。完全に時間分解されたスパイクは、スパイクの幅および高さの両方を許容できるレベルの精度まで判定することができる十分な数のデータサンプリングポイントを有するはずである。サンプリングポイントの最小数は、５つ、すなわち、スパイクの開始をマークするのに２つ、スパイクの昇降にそれぞれ１つ、および最大で１つのポイントでありうる。これを用いると、ピーク高さをより良好に推定するための内挿を行うことができる。もちろん、ＬＳＳ中のサンプリングが速いほど、かつサンプリングポイントの数が高いほど、最大および形状を判定するための精度は高くなる。時間分解された形状は、ＬＳＳの幅を計算することを可能にする。形状は、散乱体積中の光ビーム強度分布およびＬＳＳを引き起こす粒子の散乱体積を通る軌跡のさらなる詳細をもたらす場合もある。遅すぎるサンプリングは、ＬＳＳを時間分解することができないだけでなく、ＬＳＳの見落としにつながり、それによって粒子数密度の誤った特性評価に至る場合があることに留意されるべきである。このようなアンダーサンプリングはまた、ＭＷＤおよびサイズ分布分析において誤差につながる。
【０１１３】
ＬＳＳの時間分解された捕捉に必要なサンプリングレートは、散乱体積中で粒子が費やす時間の量に依存する。これは、ひいては、撹拌速度、散乱体積の幾何形状および寸法、撹拌機構、ならびに撹拌機構およびＲＰＭによって任意の所与のセル内で生じる軌跡に依存する。図１２の特定の例に関して、５ポイントの捕捉についての最小サンプリングレートは、使用した１０Ｈｚではなく、およそ２０Ｈｚであるはずであり、これは、ＬＳＳのサンプリングポイントの数を約６に増加させるはずである。
【０１１４】
図１３は、２５０ＨｚでサンプリングしたＬＳＳの一例を示す。このように、ＬＳＳを構成する３００を超える個々のサンプリングポイントが存在し、ＬＳＳの十分過ぎる分解能を生じている。
【０１１５】
一般に、サンプリングレートは、１ヘルツの程度〜数千ヘルツまで及ぶことが予期され、１０から１，０００の間のサンプリングレートが最も一般的である。他の範囲が使用されうる特定の態様を想定することは容易である。非常に低い撹拌速度については、１０Ｈｚ未満のサンプリングが十分でありうる。対照的に、非常に高い撹拌速度については、１，０００Ｈｚを超えるサンプリングレートが要求されうる。
【０１１６】
この開示した技術についての通常の運転条件下で、液体試料と散乱体積との間の相対運動によって生じる流れは、非乱流であるはずである。
【０１１７】
ビームの空間的強度の詳細およびビームを通過する粒子の軌跡とは無関係にビーム強度プロファイルを判定する手段は、以下の通りである：２μｍの球などの均一な散乱体が非常に希薄なレベルで使用される。撹拌は、非乱流、回転流を生じさせるようなものでなければならない。粒子は撹拌され、平均するとすべての希薄粒子溶液について同じとなる軌跡で散乱体積を通過する。次いで検出器からのＬＳＳ高さのヒストグラムが、Ｗ（ＩＲ，Ｍ）の単位でビームの強度分布をもたらす。Ｗ（ＩＲ，Ｍ）ｄＩＲは、モル質量Ｍの同一粒子の集団の粒子が規模ＩＲ〜ＩＲ＋ｄＩＲのスパイクを生じさせる確率である。分布は、以下のように正規化される：
【数２】
0006416908.tif 000003
【０１１８】
この分布の形状は、散乱体積内の入射ビーム強度分布Ｗ（Ｉ０）のみに依存するシステムの普遍的曲線である。ここで、Ｗ（Ｉ０）ｄＩ０は、散乱体積中のランダムポイント内の入射強度がＩ０からＩ０＋ｄＩ０の間にある確率である。任意のサイズの単分散粒子は、Ｗ（Ｉ０）に関連したＷ（ＩＲ（Ｍ））の同じ形状を与える。
【数３】
0006416908.tif 000004
【０１１９】
数濃度Ｎの希薄な散乱粒子のレイリー散乱比ＩＲ（１／ｃｍ）は、以下の通りある：
【数４】
0006416908.tif 000005
【０１２０】
式中、φは、入射光中の垂直偏光電場の方向から測定した高度角である。最大の散乱を与え、散乱面と呼ばれるφ＝９０°は、大抵の光散乱計測器によって通常使用される面である。αは、単一粒子の分極率である。
【０１２１】
分極率αのレイリー散乱体から距離ｒにおける単一粒子からの散乱光強度Ｉは、そのポイントにおけるレーザー場の入射強度Ｉ０に比例し、レイリー散乱体について、以下によって与えられる：
【数５】
0006416908.tif 000006
【０１２２】
一般に、αは、粒子のモル質量に比例する。
【０１２３】
すべてのサイズの大粒子が同じ様式でビームを通って掃引されるという仮定、および非常に低い散乱角の仮定の下で、Ｗ（ＩＲ（Ｍ））の形状は、任意の質量の単分散大粒子について同じとなる。
【０１２４】
所与の質量Ｍの任意の粒子について、強度で重み付けされたＬＳＳピーク高さは、以下の通り、Ｍ２に比例することになる：
【数６】
0006416908.tif 000007
【０１２５】
Ｗ（ＩＲ）が決定された後、これは、所与のセル幾何形状における所与のＲＰＭについて同じであるはずである。非相互作用大散乱体の多分散集団は、質量の分布、Ｎ（Ｍ）を有し、この場合、Ｎ（Ｍ）ｄＭは、ＭからＭ＋ｄＭの間のモル質量を有する粒子の数密度である。本発明者らは、ｓ（ＩＲ）ｄＩＲを、ＩＲからＩＲ＋ｄＩＲの間のＬＳＳスペクトル中のスパイクの数であると定義する。ＬＳＳスペクトル中のスパイクの総数Ｓｔは、以下に従って、モル質量分布Ｎ（Ｍ）の各部分から生じるＷ（ＩＲ（Ｍ））の重ね合わせとなる：
【数７】
0006416908.tif 000008
【０１２６】
式中、βは、以下の通り、Ｓｔおよび粒子の総数Ｎｔｏｔａｌによって与えられる比例因子である：
【数８】
0006416908.tif 000009
【０１２７】
これは、求められているＮ（Ｍ）は、Ｓ（Ｍ）＝βＮ（Ｍ）によって間隔Ｍ〜Ｍ＋ｄＭ中の粒子に起因するＬＳＳの数、Ｓ（Ｍ）ｄＭに直接関係することを意味する。βは単なる比例因子であるので、Ｎ（Ｍ）は、以下と等価である上記積分から見出すことができる：
【数９】
0006416908.tif 000010
【０１２８】
大粒子集団についての情報を獲得するために、Ｎ（Ｍ）が積分から抽出される。開示した技術は、この抽出が行われるための任意の数の方法を可能にし、この方法には、ｉ）フーリエ変換または他の変換方法による積分の反転、ｉｉ）積分がモル重量間隔ΔＭにわたる和として行われるようなヒストグラム法、ｉｉｉ）分布のモーメントが計算される平均法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
例えば、Ｗ（ＩＲ，Ｍ）および実験的なＬＳＳ振幅スペクトルを以下の通り使用して、重量平均質量および数平均質量、それぞれＭｗおよびＭｎの積を判定することができる：
【数１０】
0006416908.tif 000011
【０１３０】
このような分析に伴われる統計的負担は、散乱体積中の入射光強度をより均一にすることによって低減することができる。均一またはほぼ均一な強度を実現することができる場合、以下の式が適用される：
【数１１】
0006416908.tif 000012
【０１３１】
デルタ関数は、Ｖｓ中の入射光強度の均一性を表現するのに理想的な形式である。実際には、Ｗ（Ｉ０）の幅は、大いに減少させることができ、その結果これは、Ｖｓ全体にわたって本質的に均一である。
【０１３２】
Ｖｓ中の均一またはほぼ均一な入射強度が実現される場合、上記二重積分は、粒子特性評価にとって妥当な積分であるＭの単一積分に崩れる。二重積分中のＩＲの積分は、ビームの不均一性によって引き起こされる「統計的アノイアンス（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎｎｏｙａｎｃｅ）」である。
【０１３３】
レーザービーム中の強度プロファイルの成形を取り扱う全体的な科学的および技術的分野が存在する。生成するのによく知られている形状は、フラットトップ分布、すなわち、ビーム直径にわたる均一な強度である。例えば、最初のガウスビームから均一なレーザービームを生成するためにプロダクトラインは、当業者によって理解されるはずである。アナモルフィック光学系、段階的な屈折率を有する材料、その他を伴う、ビームを均一にするいくつかの方法が存在する。レーザービーム中の均一化された「トップハット」強度プロファイルを生成する特によく知られている手段は、マイクロレンズアレイの使用であり、これは、マイクロレンズアレイに入射するビームの様々な断面強度を一緒にして強度を混合することができる。多くの場合、このようなマイクロレンズの混合された強度の出力は、第２のマイクロレンズアレイによって再編成され、次いで追加の個々のレンズまたは他の光学部品によって集束させ、またはコリメートすることができる。
【０１３４】
入射強度Ｉ０の均一なビームに対する粒子の質量およびサイズの推定
ＬＳＳスペクトルからのモル質量測定の背後にある原理のいくつかを理解するために、数密度Ｎ（粒子／ｃｍ３）のレイリー散乱体の希薄コレクションからの散乱光の強度Ｉｓが、以下の式によって、上述したＣＧＳ単位で与えられる：
【数１２】
0006416908.tif 000013
【０１３５】
レイリー散乱体は、Ｄ＜＜λ（式中λは、入射光の波長である）であるような特徴的なサイドＤを有する。このような粒子は、垂直偏光入射光について散乱面、φ＝９０°内で等方的に散乱する。
【０１３６】
式中、Ｉｏは、垂直偏光入射光の強度であり、αは、粒子の分極率、または水溶液中のタンパク質など、粒子が溶媒中にある場合、粒子の分極率と溶媒の分極率との差異であり、ｒは、散乱体から検出器までの距離であり、φは、入射光の垂直偏光電場に関して測定した高度角であり、ｋは、波数、ｋ＝２π／λである。
【０１３７】
同じ溶液中の２種の粒子、数密度Ｎ１およびモル質量Ｍ１を有するタイプ１、ならびに数密度Ｎ２およびモル質量Ｍ２を有するタイプ２を考えられたい。粒子はやはり、相互作用が無視できるほど十分希薄であると仮定される。そのとき、散乱光の比は、以下の式で定義される：
【数１３】
0006416908.tif 000014
【０１３８】
この式は、様々なタイプの分析をする手段を提供する。例えば、両方の粒子が同じ材料のものである場合（例えば、ネイティブタンパク質およびタンパク質凝集体）、特定の分極率は、高い近似まで同じとなり、それぞれのモル質量に比例し、その結果、この場合、以下の式が適用される：
【数１４】
0006416908.tif 000015
【０１３９】
タイプ１がネイティブタンパク質であり、タイプ２が凝集体である場合を考えられたい。ν１およびν２が、以下に表現されるように、それぞれ、タイプ１および２の散乱体積Ｖｓ中の粒子の数とする
ν１＝Ｎ１Ｖｓおよびν２＝Ｎ２Ｖｓ
【０１４０】
散乱体積から単一の光散乱スパイクを生じさせるために、ν２＝１をさらに考えられたい。そのときＭ２は、以下の式によって見出すことができる：
【数１５】
0006416908.tif 000016
【０１４１】
ν１は、より好都合なことには、以下の式によって濃度ｃ１（ｇ／ｃｍ３）の観点から表現される：
【数１６】
0006416908.tif 000017
【０１４２】
その結果、Ｍ２は、以下のように表現される：
【数１７】
0006416908.tif 000018
【０１４３】
これは、ＬＳＳを介して検出可能となり、したがって大粒子を宣言することができる最小Ｍ２の計算を可能にする。これは、光散乱系の安定性によって厳密に判定されることになり、その結果、不可避な熱的および量子力学的ノイズを含めた様々なノイズ源によって課される場合を除いて基本的な制限はない。電荷結合素子（ＣＣＤ）などの冷却半導体ベース検出器などのＳ／Ｎ比を改善する手段が存在する。
【０１４４】
説明のために、Ｖｓ＝１０ｎＬ＝１０−５ｃｍ３の散乱体積中Ｍ１＝１０５ｇ／モルのタンパク質の１０−３ｇ／ｃｍ３の溶液中の均一な背景散乱の１％のＬＳＳがある；すなわち、Ｉｓ，２／Ｉｓ，１＝０．０１と仮定すれば、Ｍ２＝２．４５×１０９ｇ／モルが検出可能である。これは、Ｖｓ中の１つの粒子を介してＬＳＳを生じさせることができる「大粒子」と見なされる最小質量粒子である。
【０１４５】
さらに、ＬＳＳの振幅がタイプ１からの均一な背景散乱と等しい場合；すなわち、すべての他のパラメタが同じとしてＩｓ，２／Ｉｓ，１１＝１を考えられたい。そのとき、Ｍ２＝２．４５×１０１０ｇ／モルである。
【０１４６】
質量密度ρ２の球状大粒子の半径Ｒ２の観点から、Ｍ２は、以下のように表現することができる：
【数１８】
0006416908.tif 000019
【０１４７】
またはＲ２は、以下のように表現することができる：
【数１９】
0006416908.tif 000020
【０１４８】
Ｉｓ，２／Ｉｓ，１＝０．０１およびＭ２＝２．４５×１０９ｇ／モルについての上記の例を使用し、ρ２＝１ｇ／ｃｍ３を採用すると、
Ｒ２＝１０−５ｃｍ＝０．１μｍ
が得られる。
【０１４９】
上記の他の例、Ｉｓ，２／Ｉｓ，１＝１およびＭ２＝２．４５×１０１０ｇ／モルについて、やはりρ２＝１ｇ／ｃｍ３を採用すると、以下の式：
Ｒ２＝２．１５×１０−５ｃｍ＝０．２１５μｍ
が得られる。
【０１５０】
重要なことに、これらの例、特に、Ｉｓ，２／Ｉｓ，１＝１が最も控えめなＳＭＳＬＳシステムにおいてでさえ容易に達成可能である後者は、高密度な散乱粒子が１ミクロン未満で検出可能となることを示す。これは、ＬＳＳを生じさせうる「大粒子」の観点から優れたローエンドのブラケット（ｌｏｗ−ｅｎｄ  ｂｒａｃｋｅｔ）を与える。
【０１５１】
レイリー近似に対する粒径の制限
ブラケットのアッパーエンドは、最小の到達できる角度によって主に制限される。大粒子分析にＭｉｅ理論を行使することが要求される前に、最大でどのサイズまでレイリー−デバイ近似が有効であり続けるかを調査する価値がある。レイリー−デバイ基準は、以下に表現するように、屈折率ｎｐの散乱粒子の特徴的な寸法Ｄを通って進む光と、同じ距離を指数ｎｓの溶媒を通って進む光との光路長差が、入射光の真空波長、λよりはるかに小さいはずであることである：
【数２０】
0006416908.tif 000021
【０１５２】
水溶液中の典型的なタンパク質について、ｎｐ−ｎｓ＝０．１９である。λ＝６３５ｎｍ、ｎｓ＝１．３３、および比：
【数２１】
0006416908.tif 000022
について。
【０１５３】
これは、Ｄ＝４．５×１０−５ｃｍ＝０．４５μｍの特徴的な寸法を生じる。０．４もの高い比をとるということは、レイリー−デバイ近似が、最大で約２μｍまでの粒子について有効でありうることを意味する。この後、より低い角度での回折またはＭｉｅ分析が得策であるはずであるが、等価なサイズは、おそらく最大でおよそ１０μｍまで、近似下で依然として有用に得ることができる。これを超えると、レイリー−デバイ近似下で、結果は定性的となる。大粒子がこれらの内部により多くの水を含むほど、近似がより良好となり、より高いサイズまで有効となる。
【０１５４】
レイリー−デバイ近似下でＺｉｍｍの式を使用する粒径の制限、およびマルチアングル測定を用いない補正の手段
大粒子を均一な密度（ガウシアンなどの他の分布も使用されうる）の球とみなすことは、平均二乗回転半径＜Ｓ２＞＝３Ｒ２／５を意味する。これは、以下のように表現される単一の成分についてのレイリー−デバイ近似下でＺｉｍｍの式とともに使用することができる：
【数２２】
0006416908.tif 000023
【０１５５】
式中、Ｐ（ｑ）は、粒子の散乱形状因子である。多分散系を含む
【数２３】
0006416908.tif 000024
【０１５６】
を有する粒子については、これは、
【数２４】
0006416908.tif 000025
となる。
【０１５７】
これは、重量平均モル質量Ｍｗ、二重ｚ平均（ｄｏｕｂｌｅ  ｚ−ａｖｅｒａｇｅｄ）第２ビリアル係数＜Ａ２＞、およびｚ平均の平均二乗回転半径＜Ｓ２＞ｚの判定を直接可能にする。Ｋは、
【数２５】
0006416908.tif 000026
によって表現される、垂直偏光入射光について与えられる光学定数である。
【０１５８】
ここで、ｎは、溶媒の屈折率であり、λは、入射光の真空波長であり、ｄｎ／ｄｃは、選択された溶媒中のポリマーについての示差屈折率であり、ｑは、通常の散乱波ベクトルｑ＝（４πｎｓ／λ）ｓｉｎ（θ／２）（式中、θは、散乱角である）である。微粒子についてのＡ２項は、実質的にすべての場合において無視できる。ｎｓ＝１．３３およびλ＝６．３５×１０−５ｃｍについて
【数２６】
0006416908.tif 000027
である。
【０１５９】
θ＝９０°および
【数２７】
0006416908.tif 000028
で、Ｒ＝５．４×１０−６ｃｍ＝０．０５４μｍは、θ＝９０°に対してこの誤差を生じる。したがって、θ＝９０°未満になることが通常必要である。例えば、同じ２０％の誤差レベルでＤ＝１μｍの粒子を検出することは、θ＝１０°での測定を必要とする。マルチアングルＳＭＳＬＳは、計測器でもたらすことができる特徴の１つである。
【０１６０】
しかし、９０°以外の角度を使用しなくても、対象の補正を行うことができる。有限の角度θで測定される上述したＭ２は、ここではＭ２，θと表され、これは、
【数２８】
0006416908.tif 000029
によって表現されるようにθ＝０、Ｍ２，０に外挿されるとき、粒子の真の値に関係する。
【０１６１】
そのとき、粒子２のモルフォロジーに関して、例えば、スフェロイド、ランダムコイル、ロッドなど任意のモデルを使用することができる。実際には、
【数２９】
0006416908.tif 000030
に対する制限を緩和し、計算においてこの範囲を越える特定のＰ（ｑ）（例えば、球についてのＰ（ｑ））を使用することができる。
【０１６２】
粒子が球状のものであるという以前使用したのと同じ仮定を使用して説明することは、
【数３０】
0006416908.tif 000031
内で機能している。
【数３１】
0006416908.tif 000032
【０１６３】
そのとき、これから数値的に、補正された質量Ｍ２，０を抽出することは容易である。
【０１６４】
均一な散乱体から大粒子への物質移動の判定
この場合において続けると、Ｎ２が平均クリアウインドウ時間ｅｘｐ（−Ｎ２Ｖｓ）を見つけることによって、またはＳｃｈｉｍａｎｏｗｓｋｉらにおいて詳しく説明されたものなどの他の手段によって判定される場合、均一な背景タンパク質および凝集体の、定義が上記に与えられている大粒子の形態への移動を計算することが可能である。
【０１６５】
ｃｏを溶液中の材料の初期濃度とし、便宜上、材料が最初に、以下のように表現される検出可能な大粒子を有さないと仮定する：
Ｃｏ＝ｃ１＋ｃ２、ｔ＝０でＣｏ＝Ｃ１
【０１６６】
大粒子の濃度は、以下の式によって与えられる：
【数３２】
0006416908.tif 000033
【０１６７】
したがって、例えば上記方法によってＭ２が判定されると、Ｎ２が分かっている場合、ｃ２を計算することができる。Ｎ２を計算するための一方法は、ＮＩＳＴトレーサブルラテックス球などの既知の数濃度Ｎ２，ｓｔａｎｄａｒｄの粒子を使用し、ＬＳＳスペクトルのスワス中のＬＳＳ間の平均間隔、または平均頻度を計算することである。次いでＮ２，ｓｔａｎｄａｒｄを使用して、ＬＳＳ間の平均間隔またはＬＳＳの平均頻度を比較することによってＮ２を計算することができる。
【０１６８】
以下の式を使用して、標準物質に頼ることなくクリアウインドウ時間（ＣＷＴ）を使用してＮ２を見つけることも可能である：
【数３３】
0006416908.tif 000034
【０１６９】
ＣＷＴは、以下の通り、平均幅＜τ＞のＬＳＳ間の平均時間＜Δｔ＞から、ＬＳＳスペクトルから計算することができる：
【数３４】
0006416908.tif 000035
【０１７０】
例えば、ＣＷＴが０．１であり、Ｍ２＝１０１０ｇ／モル、およびＶｓ＝１０−５ｃｍ３とすると、ｃ２＝３．８３×１０−９ｇ／ｃｍ３であり、これは、ｃｏ＝１０−３ｇ／ｃｍ３の溶液中の全材料の微小画分であるはずである。Ｃ２は、より大きいＭ２およびより小さいＣＷＴについてより有意となりうる。Ｎ２Ｖｓを減少させることが、この例においてはるかにより高いｃ２を測定するのに必要であるはずである。
【０１７１】
不均一な入射強度および多分散大粒子
確率分布Ｗ（ＩＲ，Ｍ）は、単一タイプの質量Ｍの単分散粒子、例えば、ラテックス球から実験的に判定することができる。図１４は、辺長１ｃｍのＳＭＳＬＳ正方形バッチセル中で、８０ＲＰＭで撹拌した２ミクロンの球から採用した例示的なヒストグラムである。任意の特定の溶液を特性評価するために、ＬＳＳスペクトルが、タンパク質溶液中の大粒子形成について上記に示した例などの時間内に測定される。これらのスペクトルは、大粒子が形成し始めるとき、Ｓｃｈｉｍａｎｏｗｓｋｉらの方法を使用して、粒子の数密度を計算することができ、開示した技術の方法を使用して、ＭＷＤおよび／またはその平均を計算することができることを示す。Ｓ（ＩＲ）をＮ（Ｍ）に関連付ける積分の反転に関するより詳細な説明は、ここに提供されていないが、フーリエまたは他の変換を用いた解析的反転、ヒストグラム、分布平均、および他の方法を含めたいくつかのアプローチを使用することができる。
【０１７２】
ビーム均一化光学系を使用すると、分析手順、特にＭＷＤおよびその平均を判定するためのものの実施に関与する統計的なタスクが大いに低減されるはずであることが気付かれる。ビーム均一化を用いると、以下のヒストグラムは、狭いスパイクとなるはずである。Ｖｓ中の均一な強度を通過するすべての粒子は、同じ散乱ピーク高さ、または少なくともほぼ同じものを生じるはずである。均一なビーム中のＬＳＳの差異は単に、Ｖｓを通る異なる通過経路またはＶｓ中の「滞留時間」を説明する、これらの幅であるはずである。
【０１７３】
ポリマーおよびコロイド系の特性評価のための改良されたシステムおよび方法に関して、例示態様を以上に記述した。開示された例示態様に対する様々な変更や開示された例示態様からの逸脱は、当業者に思いつくだろう。本開示の精神の範囲内にあることが意図される主題は、以下の特許請求の範囲において説明される。
【図１】
0006416908.tif 000036
【図２Ａ】
0006416908.tif 000037
【図２Ｂ】
0006416908.tif 000038
【図２Ｃ】
0006416908.tif 000039
【図３】
0006416908.tif 000040
【図４】
0006416908.tif 000041
【図５】
0006416908.tif 000042
【図６】
0006416908.tif 000043
【図７】
0006416908.tif 000044
【図８】
0006416908.tif 000045
【図９】
0006416908.tif 000046
【図１０】
0006416908.tif 000047
【図１１】
0006416908.tif 000048
【図１２】
0006416908.tif 000049
【図１３】
0006416908.tif 000050
【図１４】
0006416908.tif 000051