(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されていない微生物のタンパク質の活性と比較して、配列番号２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が強化されるように改変された、プトレシン生産能を有する微生物。
【請求項２】
前記微生物がさらに、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性が改変されていない微生物のタンパク質の活性より低下するように改変され、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性が改変されていない微生物のタンパク質の活性と比較して強化された、請求項１に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
【請求項３】
前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）が配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含み、グルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）が配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含み、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）が配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
【請求項４】
前記微生物がさらに、アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性が内在的活性より強化されるように改変された、請求項１に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
【請求項５】
前記アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）がそれぞれ配列番号２５、２６、２７及び２８で表されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
【請求項６】
前記微生物がさらに、アセチルトランスフェラーゼ（ＮＣｇｌ１４６９）の活性が改変されていない微生物のタンパク質の活性と比較して低下したものである、請求項１に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
【請求項７】
前記アセチルトランスフェラーゼ（ＮＣｇｌ１４６９）が配列番号３１又は３２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
【請求項８】
前記微生物がエシェリキア属微生物又はコリネ型微生物である、請求項１に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
【請求項９】
前記微生物が大腸菌又はコリネバクテリウムグルタミカムである、請求項８に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１〜９のいずれかに記載のプトレシン生産能を有する微生物を培養して培養物を得るステップと、
（ｉｉ）前記培養された微生物又は培養物からプトレシンを回収するステップとを含む、プトレシンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プトレシン生産性が向上した組換え微生物及びそれを用いて高収率でプトレシンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スペルミジン（spermidine）、スペルミン（spermine）などのポリアミン（polyamine）はほとんどの生きている細胞内に存在する物質であり、プトレシン（putrescine又は1,4-butanediamine）はこのようなスペルミジン及びスペルミン代謝における前駆物質として用いられる。プトレシンは、グラム陰性バクテリアやカビから発見され、様々な種に高濃度で存在するので、微生物の代謝に重要な役割を果たすものと考えられる。
【０００３】
一般に、プトレシンは、アジピン酸（adipic acid）と反応してポリアミンナイロン４，６を合成する重要な原料物質であり、主にプロピレン（propylene）からアクリロニトリル（acrylonitrile）及びスクシノニトリル（succinonitrile）を経由する化学合成法で生産される。この化学合成法は、触媒的酸化反応段階、シアン化物（cyanide）を用いる段階、高圧水素を用いる水素化反応段階などを含む３段階の工程であり、エネルギー消費が多く、環境にやさしくなく、石油資源の枯渇問題を抱えている。よって、プトレシンの生産のために、より環境にやさしく、エネルギー消費を削減できるバイオマスを活用した方法が求められている現状である。
【０００４】
微生物におけるプトレシン生合成経路は、グルタメート（glutamate）からオルニチン（ornithine）の合成まではアルギニン生合成経路と同一である。中間物質として生成されたオルニチンの脱炭酸（decarboxylation）によりプトレシンを合成する経路と、アルギニン（L-arginine）からアグマチン（agmatine）を経由してプトレシンを合成する２つの経路が知られている（非特許文献１）。これらの２つの経路は、代謝に必要なエネルギーを生成したり、酸性に対するストレス耐性を付与する。
【０００５】
微生物を用いたプトレシンの生産方法としては、大腸菌とコリネバクテリウムを形質転換してプトレシンを高濃度で生産する方法が公開されている（特許文献１，２，非特許文献２，３，４）。例えば、特許文献２には、大腸菌に存在するプトレシンの分解及び利用に関与する経路を不活性化し、プトレシンの前駆体であるオルニチンがアルギニンに変換される経路を不活性化する代わりに、オルニチン生合成経路を強化することにより、プトレシンを高収率で製造する方法が開示されている。また、非特許文献３には、プトレシン生産能のないコリネバクテリウム属菌株に、オルニチンをプトレシンに変換するタンパク質を導入し、活性を向上させることにより、プトレシンを高濃度で生産する方法が開示されている。
【０００６】
さらに、プトレシントランスポーター（transporter）に関する研究が大腸菌、酵母、植物及び動物細胞を対象に盛んに行われている（非特許文献５）。大腸菌のプトレシン流入には全部で４つの経路があるが、ＡＴＰ加水分解を用いたｐｏｔＡＢＣＤ又はｐｏｔＦＧＨＩと、Ｈ＋シンポーター（symporter）であるｐｏｔＥと、ｐｕｕ経路のｐｕｕＰとにより細胞内に流入する。プトレシン流入に関与する複合体のＫｍ値について検討すると、ＰｏｔＦＧＨＩは０．５ｍＭ、ｐｏｔＡＢＣＤは１．５ｍＭ、ｐｏｔＥは１．８ｍＭ、ｐｕｕＰは３．７ｍＭを示すので、４つのプトレシン流入経路のうちｐｏｔＦＧＨＩ複合体が最も適するものと考えられる。また、ｐｏｔＥトランスポーターはプトレシン流入及び排出の両方の機能を有するが、中性ｐＨにおいてはプトレシンが陽子と共に細胞内に流入する。しかし、ｐＨが酸性条件に変わると、プトレシン合成酵素であるｓｐｅＦのように発現し、細胞外のオルニチンが細胞内に流入すると共に、細胞内で合成されたプトレシンが細胞外に排出される（非特許文献６）。
【０００７】
酵母のプトレシン排出タンパク質としては、バチルスの多剤トランスポーター（multidrug transporter）であるＢｌｔのアミノ酸配列と類似性が高いＴＰＯ１とＴＰＯ４が知られている。前述した２つの排出タンパク質は、大腸菌のｐｏｔＥのような特性を有するが、塩基性条件ではプトレシン、スペルミジン、スペルミンを細胞内に流入させるのに対して、酸性条件ではこれらを細胞外に排出する機能を有する。また、ゴルジ又はポストゴルジ分泌小胞（ｇｏｌｇｉ ｏｒ ｐｏｓｔ−ｇｏｌｇｉ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）に位置するＴＰＯ５の場合、発現を強化すると１２０ｍＭプトレシンに対する耐性を示すのに対して、欠損させると９０ｍＭプトレシンに対する敏感性を示す（非特許文献７）。
【０００８】
動物細胞において、プトレシンの合成と分解、流入と排出は様々に調節される。ポリアミン排出に関しては大腸菌や酵母ほど多くの研究が行われていないが、結腸上皮細胞（colon epithelial cell）においてアルギニン／ジアミンエクスポーター（exporter）であるＳＬＣ３Ａ２が、細胞外のアルギニンを細胞内に取り込み、プトレシン、アセチルスペルミジン、アセチルスペルミンを細胞外に排出するように作用することが報告されている。しかし、植物細胞においては、いまだプトレシン流入及び排出について報告されていない（非特許文献５）。
【０００９】
なお、コリネバクテリウム属微生物は、プトレシン生合成経路がないのでプトレシン排出に関する研究が全く行われていない。しかし、最近の報告によれば、ポリアミンの一種であるカダベリン（cadaverine）生産菌株においてｃｇ２９８３膜タンパク質の発現を強化すると細胞成長が回復してカダベリンの生産性が向上した（非特許文献８）。
【００１０】
しかし、いまだプトレシン排出タンパク質に関連してプトレシン生産能やプトレシン生産能を有する微生物の生長性については報告されておらず、前記文献においてもｃｇ２９８３膜タンパク質とプトレシン排出機能の連関性は全く言及されていない。
【００１１】
こうした背景の下、本発明者らは、プトレシンをより高収率で生産できる菌株を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、プトレシン生産菌株であるコリネバクテリウム属微生物においてＮＣｇｌ２５２２がプトレシン排出タンパク質として機能することを明らかにし、ＮＣｇｌ２５２２の活性を内在的活性より強化するとプトレシンを高収率で生産できることを確認した。また、プトレシン生産経路を有する大腸菌にＮＣｇｌ２５２２を発現させると培養液中のプトレシン量が増加することを確認することにより、ＮＣｇｌ２５２２が大腸菌においてもプトレシン排出タンパク質として作用することを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０６／００５６０３号
【特許文献２】国際公開第０９／１２５９２４号
【特許文献３】国際公開第２００９／０９６６８９号
【特許文献４】韓国登録特許第１０−０６２００９２号公報
【特許文献５】国際公開第２００６／０６５０９５号
【特許文献６】韓国公開特許第２０１２−００６４０４６号公報
【特許文献７】韓国特許出願第２０１２−０００３６３４号
【特許文献８】韓国公開特許第１９９２−００００９３３号公報
【特許文献９】韓国公開特許第２００８−００３３０５４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Morris et al., J Biol. Chem. 241: 13, 3129-3135, 1996
【非特許文献２】Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104: 4, 651-662, 2009
【非特許文献３】Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88: 4, 859-868, 2010
【非特許文献４】Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 91: 17-30, 2011
【非特許文献５】K Igarashi, Plant Physiol. Biochem. 48: 506-512, 2010
【非特許文献６】Kurihara et.al., J. Bacteriology 191: 8, 2776-2782, 2009
【非特許文献７】Tachihara et. al,, J. Biological Chemistry, 280(13): 12637-12642, 2005
【非特許文献８】Kind et. al., Metabolic Engineering 13: 617-627, 2011
【非特許文献９】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献１０】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【非特許文献１１】Nakamura J et al., Appl. Environ. Microbiol. 73(14): 4491-4498, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＮＣｇｌ２５２２活性が強化されるように変異してプトレシンを高収率で生産できる組換え微生物を提供することを目的とする。
【００１５】
また、本発明は、前記微生物を用いてプトレシンを高収率で生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は以下を提供する。
［１］配列番号２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が強化されるように改変された、プトレシン生産能を有する微生物。
［２］上記微生物がさらに、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性が内在的活性より低下するように改変され、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性が強化された、上記［１］に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
［３］上記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）が配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含み、グルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）が配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含み、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）が配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む、上記［２］に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
［４］上記微生物がさらに、アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性が内在的活性より強化されるように改変された、上記［１］に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
［５］上記アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）がそれぞれ配列番号２５、２６、２７及び２８で表されるアミノ酸配列を含む、上記［４］に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
［６］上記微生物がさらに、アセチルトランスフェラーゼ（ＮＣｇｌ１４６９）の活性が低下したものである、上記［１］に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
［７］上記アセチルトランスフェラーゼ（ＮＣｇｌ１４６９）が配列番号３１又は３２で表されるアミノ酸配列を含む、上記［６］に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
［８］上記微生物がエシェリキア属微生物又はコリネ型微生物である、上記［１］に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
［９］上記微生物が大腸菌又はコリネバクテリウムグルタミカムである、上記［８］に記載のプトレシン生産能を有する微生物。
［１０］（ｉ）上記［１］〜［９］のいずれかによるプトレシン生産能を有する微生物を培養して培養物を得るステップと、
（ｉｉ）上記培養された微生物又は培養物からプトレシンを回収するステップとを含む、プトレシンの生産方法。
上記目的を達成するために、本発明の一態様は、配列番号２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が強化されるように改変された、プトレシン生産能を有する微生物を提供する。
【００１７】
一具体例として、本発明は、前記微生物がさらに、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性が内在的活性より低下するように改変され、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性が導入された、プトレシン生産能を有する微生物を提供する。
【００１８】
他の具体例として、本発明は、前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）が配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含み、グルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）が配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含み、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）が配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む、プトレシン生産能を有する微生物を提供する。
【００１９】
さらに他の具体例として、本発明は、前記微生物がさらに、アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性が内在的活性より強化されるように改変された、プトレシン生産能を有する微生物を提供する。
【００２０】
さらに他の具体例として、本発明は、前記アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）がそれぞれ配列番号２５、２６、２７及び２８で表されるアミノ酸配列を含む、プトレシン生産能を有する微生物を提供する。
【００２１】
さらに他の具体例として、本発明は、前記微生物がさらに、アセチルトランスフェラーゼの活性が低下したものである、プトレシン生産能を有する微生物を提供する。
【００２２】
さらに他の具体例として、本発明は、前記アセチルトランスフェラーゼが配列番号３１又は３２で表されるアミノ酸配列を含む、プトレシン生産能を有する微生物を提供する。
【００２３】
さらに他の具体例として、本発明は、前記微生物がエシェリキア属微生物又はコリネ型微生物である、プトレシン生産能を有する微生物を提供する。
【００２４】
さらに他の具体例として、本発明は、前記微生物が大腸菌又はコリネバクテリウムグルタミカムである、プトレシン生産能を有する微生物を提供する。
【００２５】
本発明の他の態様は、前記プトレシン生産能を有する微生物を培養して培養物を得るステップと、前記培養した微生物又は培養物からプトレシンを回収するステップとを含むプトレシンの生産方法を提供する。
【００２６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２７】
本発明は、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物において、ＮＣｇｌ２５２２活性が内在的活性より強化されるように改変されてプトレシン生産性が向上した組換えコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００２８】
本発明における「ＮＣｇｌ２５２２」とは、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２において同定された膜タンパク質であり、ＭＦＳ（major facilitator superfamily）に属するパーミアーゼ（permease）を意味する。前記ＮＣｇｌ２５２２は、コリネバクテリウムグルタミカムにおいてジアミノペンタン（diaminopentane）を細胞外に排出させることが知られている。本発明においては、ＮＣｇｌ２５２２が細胞内で生成されたプトレシンを細胞外に排出する役割を果たすトランスポーターとして作用することを確認した。これに基づいて、ＮＣｇｌ２５２２活性が内在的活性より強化されるように改変し、細胞内で生成されたプトレシンの排出を増加させることにより、高収率のプトレシン生産性を示す組換え微生物を提供する。
【００２９】
本発明における「内在的活性」とは、本来微生物が改変されていない状態で有する酵素の活性状態を意味し、「内在的活性より強化されるように改変」されるとは、改変前の状態の酵素活性と比較して当該活性が新たに導入されるか、より向上することを意味する。
【００３０】
本発明における「酵素活性の強化」とは、酵素自体の活性が新たに導入されるか、増大して本来の機能以上の効果を発揮することを意味するだけでなく、内在性遺伝子の活性の増加、内部又は外部要因による内在性遺伝子の増幅、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、遺伝子コピー数の増加、外部からの遺伝子導入、発現調節配列の改変、特にプロモーターの置換又は改変、遺伝子内の突然変異による酵素活性の向上などによるその活性の向上をも意味する。
【００３１】
本発明における「内在的活性より強化されるように改変」されたとは、活性を示す遺伝子が導入されるか、又は当該遺伝子のコピー数の増加、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、又は発現調節配列の改変、例えば改良されたプロモーターの使用などの操作が行われる前の微生物が有する活性に比べて、操作された後の微生物が有する活性が増加した状態を意味する。
【００３２】
本発明により活性が増加するＮＣｇｌ２５２２は、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号２１もしくは２３のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらになお好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列のタンパク質である。また、微生物の種又は菌株によって前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列が異なることがあるので、これらに限定されるものではない。すなわち、活性を強化することによりプトレシン生産性の向上を助けるタンパク質であれば、配列番号２１又は２３のアミノ酸配列の１つ以上の位置における１個又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加などを含むアミノ酸配列を有するタンパク質突然変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「複数」とは、タンパク質のアミノ酸残基の立体構造における位置や種類によって異なるが、具体的には２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、逆位などには、前記ポリペプチドの活性を有する微生物の個体又は種の違いに基づいて天然に生じる突然変異又は人為的な変異（variant）により発生するものも含まれる。
【００３３】
コリネバクテリウム属微生物にはプトレシン生合成経路がないが、外部からオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase, ODC）を導入すると、プトレシンが合成されて細胞外にプトレシンが排出される。これは、コリネバクテリウム属微生物の数多くの膜タンパク質の中にプトレシン通路として作用する排出タンパク質、すなわちトランスポーターが存在することを示すものである。よって、本発明者らは、コリネバクテリウム属微生物においてプトレシン排出タンパク質を同定するために、野生型コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ライブラリーを作製し、それをプトレシン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１１３８Ｐに形質転換し、その後プトレシンを含む最小培地で成長する菌株を選択した。３回のコロニー選択によりプトレシン耐性を有するクローン（Ｂ１９）を最終選択し、塩基配列分析によりＮＣｇｌ２５２２を含有していることを確認した（図１参照）。このようにプトレシン排出タンパク質としてのコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のＮＣｇｌ２５２２は、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列と９８％の相同性を有するコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ２５２２は、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明のＮＣｇｌ２５２２をコードするポリヌクレオチドは、前記ＮＣｇｌ２５２２タンパク質に類似した活性を有するものであれば、配列番号２１もしくは２３のアミノ酸配列、又は前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらになお好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよく、配列番号２０又は２２の塩基配列を含むものが最も好ましい。
【００３５】
前記「相同性」とは、２つのアミノ酸配列間の同一性を示すものであり、スコア（score）、同一性（identity）、類似度（similarity）などのパラメーター（parameter）を計算するＢＬＡＳＴ ２．０を用いる、当業者に周知の方法で決定される。
【００３６】
また、本発明のＮＣｇｌ２５２２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０もしくは２２の塩基配列又は前記塩基配列由来のプローブ（probe）とストリンジェントな条件（stringent conditions）でハイブリダイズすることができ、正常に機能するＮＣｇｌ２５２２をコードする変異型であってもよい。前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。例えば、このようなストリンジェントな条件は非特許文献９、１０に具体的に記載されている。
【００３７】
本発明における「ＮＣｇｌ２５２２の活性が内在的活性より強化されるように改変」されることは、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の改変、前記酵素の活性が強化されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の改変、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、又はそれらの組み合わせから選択される方法により行われる。
【００３８】
前記ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行われる。具体的には、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターが宿主細胞に導入されることにより行われるか、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターが宿主細胞に導入されることにより前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行われる。
【００３９】
本発明における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列は、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレータ配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【００４０】
本発明において用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどが用いられ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などが用いられる。本発明において使用可能なベクターが特に限定されるわけではなく、公知の発現ベクターが用いられる。ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることが好ましく、ｐＤＺベクターを用いることがより好ましい。
【００４１】
また、細菌内染色体挿入用ベクターにより、染色体内に標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異したポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができる。本発明のベクターは、相同組換えを起こして染色体内に挿入されるので、前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的ポリヌクレオチドが挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、又は表面タンパク質の発現などの選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【００４２】
本発明における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それらを全てを含むものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入される。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。
【００４３】
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本発明の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
【００４４】
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より強い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。
【００４５】
前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されるが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡ又はａｃｅＢプロモーターなどが挙げられ、コリネバクテリウム由来のプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーター又はＣＪ７プロモーターが作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることがより好ましい。ここで、ｌｙｓＣＰ１プロモーターはアスパラギン酸キナーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドのプロモーター部位の塩基配列の置換により改良されたプロモーターであり、アスパラギン酸キナーゼ遺伝子の発現量増大により糖酵素の活性を野生型に比べて約５倍に向上させることのできる強力なプロモーターである（特許文献３）。また、ＣＪ７プロモーターは、コリネバクテリウムアンモニアゲネスから強力なプロモーター配列を有する領域を探索する際にコリネバクテリウムアンモニアゲネス及びエシェリキアから発現可能なプロモーターであり、かつ強力なプロモーター活性を有することが確認されているプロモーターであり、コリネバクテリウムグルタミカムにおいても高い強度で発現可能なプロモーターである（特許文献４及び５）。
【００４６】
また、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
【００４７】
本発明の好ましい一実施形態においては、プトレシン生産性が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供するために、プトレシン排出に関与するＮＣｇｌ２５２２をコードする配列番号２０又は２２の塩基配列を有するポリヌクレオチドを染色体内に導入して遺伝子コピー数を増加させるか、ＮＣｇｌ２５２２の自己プロモーターを改良された活性を示すプロモーター、好ましくは配列番号２４の塩基配列を有するＣＪ７プロモーターに置換する。
【００４８】
本発明における「プトレシン生産能を有する微生物」又は「プトレシンを生産する微生物」とは、プトレシンの生産能のない母菌株にプトレシンの生産能が付与された微生物を意味する。前記プトレシン生産能が付与されるか、又はプトレシンを生産する微生物は、特にこれらに限定されるものではないが、グルタメートからオルニチンまでの生合成経路を強化するために、グルタメートをアセチルグルタメート（N-acetylglutamate）に変換するアセチルグルタメートシンターゼ又はアセチルオルニチンをオルニチンに変換するオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートをアセチルグルタミルホスフェート（N-acetylglutamyl phosphate）に変換するアセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタメートセミアルデヒド（N-acetylglutamate semialdehyde）に変換するアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートセミアルデヒドをアセチルオルニチン（N-acetylornithine）に変換するアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性が内在的活性より増加するように改変されてプトレシンの生合成原料として用いられるオルニチンの生産性が向上したものであってもよい。また、前記微生物は、オルニチンにおいて、アルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransferase, ArgF）、グルタメートの排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）、及び／又はプトレシンをアセチル化するタンパク質（ＮＣｇｌ４６９）の活性を内在的活性より低下するように変異させ、かつ／又はオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase, ODC）の活性を導入するように改変されたものであってもよい。
【００４９】
ここで、前記アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）、グルタメートの排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）、及びオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）は、特にこれらに限定されるものではないが、それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０及び３３で表されるアミノ酸配列、又はそれらと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。また、プトレシンをアセチル化するタンパク質（ＮＣｇｌ４６９）は、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号３１又は３２で表されるアミノ酸配列、又はそれと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００５０】
前記タンパク質のうち、アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）、及びオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性増加は、ＮＣｇｌ２５２２の活性増加に関して前述した方法、例えば、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数増加、前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の改変、前記酵素の活性が強化されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の改変、前記酵素のポリヌクレオチドの発現を抑制する調節因子の欠失、及びそれらの組み合わせから選択される方法により達成することができる。
【００５１】
また、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）及びグルタメートの排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）、並びにプトレシンをアセチル化するタンパク質（ＮＣｇｌ４６９）の活性低下は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部又は全部の欠失、前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の改変、前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の改変、及びそれらの組み合わせから選択される方法により達成することができる。
【００５２】
具体的には、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部又は全部を欠失させる方法は、細菌内染色体挿入用ベクターにより染色体内に内在的な標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には１〜３００個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個である。
【００５３】
また、発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がより低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれる。
【００５４】
さらに、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、前記酵素の活性がより低下するように、ポリヌクレオチド配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
【００５５】
さらに、前記酵素のポリヌクレオチドの発現を抑制する調節因子を欠失させる方法は、発現抑制因子のポリヌクレオチドを一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には１〜３００個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個である。
【００５６】
なお、本発明の微生物は、プトレシン生産能を有する微生物であり、前記配列番号２１又は２３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質が発現する原核微生物を含み、その例としては、エシェリキア属（Escherichia sp.）、シゲラ属（Shigella sp.）、シトロバクター属（Citrobacter sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）、エルシニア属（Yersinia sp.）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、エルウィニア属（Erwinia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、セレノモナス属（Selenomanas sp.）、ビブリオ属（Vibrio sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）、アルカノバクテリウム属（Arcanobacterium sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes sp.）などに属する微生物が挙げられる。本発明の微生物は、エシェリキア属に属する微生物又はコリネバクテリウム属に属する微生物であることが好ましく、大腸菌又はコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であることがより好ましい。
【００５７】
本発明の具体的な一実施形態においては、グルタメートからプトレシンを生成する経路が強化されて高濃度プトレシン生産能を有する菌株として、寄託番号ＫＣＣＭ１１１３８Ｐのコリネバクテリウム属微生物（特許文献６）と寄託番号ＫＣＣＭ１１２４０Ｐのコリネバクテリウム属微生物（特許文献７）を用いた。
【００５８】
本発明の他の実施形態においては、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３８Ｐ及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐとそれぞれ同じ遺伝子型（genotype）を有するコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａ及びＤＡＢ１２−ｂを用いた。ＡＴＣＣ１３８６９菌株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection; ATCC）から入手することができる。すなわち、各菌株にはＡＴＣＣのカタログに列挙された固有の登録番号が付与されており、その登録番号を用いて注文することができる。具体的には、プトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａは、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９からオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）をコードする遺伝子及びグルタメート排出タンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）をコードする遺伝子が欠損し、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子が導入され、オルニチン生合成遺伝子オペロン（ａｒｇＣＪＢＤ）のプロモーターが改良されたプロモーターに置換されたことを特徴とする。また、プトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ｂは、前記ＤＡＢ１２−ａ菌株においてプトレシンをアセチル化するタンパク質ＮＣｇｌ１４６９の活性が内在的活性より低下するように改変されたことを特徴とする。
【００５９】
本発明の好ましい一実施例においては、まず野生型コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２において、染色体内のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）をコードする遺伝子及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）をコードする遺伝子が欠損し、グルタメートからのオルニチン合成に関与する酵素をコードするＡｒｇＣＪＢＤ遺伝子群の自己プロモーターが改良されたプロモーターに置換され、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子が染色体内に導入されたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１１３８Ｐと、前記微生物において、さらにアセチルトランスフェラーゼであるＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子を欠失させたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１２４０Ｐをプトレシン生産菌株として準備した。
【００６０】
なお、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のＮＣｇｌ２５２２欠損菌株を作製するために、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のＮＣｇｌ２５２２の塩基配列に基づいてプラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２５２２（Ｋ／Ｏ）を作製した。
【００６１】
前記プラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２５２２（Ｋ／Ｏ）を準備したプトレシン生産菌株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐにそれぞれ形質導入し、その後ＮＣｇｌ２５２２欠損菌株として選択し、それらの菌株をそれぞれＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２と命名した。前述した方法と同様の方法により、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ２５２２欠損菌株を作製してＤＡＢ１２−ａ△ＮＣｇｌ２５２２及びＤＡＢ１２−ｂ△ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【００６２】
このように作製した４種のＮＣｇｌ２５２２欠損菌株と母菌株のプトレシン生産能を比較した結果、ＮＣｇｌ２５２２が欠損したＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２、ＤＡＢ１２−ａ△ＮＣｇｌ２５２２及びＤＡＢ１２−ｂ△ＮＣｇｌ２５２２の全てにおいて、母菌株に比べてプトレシン生産量が減少することが確認された（表３参照）。上記結果から、本発明者らは、プトレシン生産菌株においてＮＣｇｌ２５２２の活性がプトレシン生産性と密接な関連があることを確認し、その活性強化によりプトレシン生産性を向上させるためにＮＣｇｌ２５２２強化菌株を作製した。
【００６３】
そのために、本発明の好ましい一実施例においては、コリネバクテリウムグルタミカム菌株のトランスポゾン内にＮＣｇｌ２５２２をさらに導入するか、又は染色体内のＮＣｇｌ２５２２の自己プロモーターを本出願人が新規に開発したＣＪ７プロモーター（ＫＣＣＭ１０６１７，特許文献４）に置換した。
【００６４】
このように作製された６種のＮＣｇｌ２５２２強化菌株と母菌株のプトレシン生産能を比較した結果、トランスポゾンにＮＣｇｌ２５２２をさらに導入した菌株の全てにおいて、母菌株に比べてプトレシン生産量が増加することが確認された（表６参照）。向上したプトレシン生産能を示すＮＣｇｌ２５２２強化菌株を対象に細胞内のプトレシン濃度を測定した結果、母菌株に比べて細胞内のプトレシン濃度が低下することが確認された（表９参照）。上記結果から、本発明者らは、プトレシン生産菌株においてＮＣｇｌ２５２２の活性が強化されることにより、細胞内で生成されたプトレシンの細胞外への排出が増加し、最終的にプトレシン生産性が向上することを確認した。
【００６５】
よって、本発明者らは、プトレシン生産菌株コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１１３８ＰにおいてＮＣｇｌ２５２２の活性が内在的活性より強化されるように改変され、向上したプトレシン排出能を示すことによりプトレシン生産性が向上したコリネバクテリウム属微生物をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＣ０１−０５１０と命名し、ブダペスト条約に基づいて２０１３年３月８日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に寄託番号ＫＣＣＭ１１４０１Ｐとして寄託した。
【００６６】
本発明のさらに他の態様は、（ｉ）前記プトレシン生産性が向上した微生物を培養して培養物を得るステップと、（ｉｉ）前記培養された微生物又は培養物からプトレシンを回収するステップとを含む、プトレシンの生産方法を提供する。
【００６７】
上記方法において、前記微生物を培養するステップは、特にこれらに限定されるものではないが、公知のバッチ培養方法、連続培養方法、流加培養方法などにより行われることが好ましい。ここで、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、最も好ましくはｐＨ６．８）に調節し、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持し、培養温度を２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃に維持し、約１０〜１６０時間培養することが好ましい。前記培養により生産されたプトレシンは、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留する。
【００６８】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができ、窒素供給源として窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及びウレア）、又は無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができ、リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それらに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができ、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。
【００６９】
本発明の前記培養ステップで生産されたプトレシンを回収する方法は、培養方法、例えばバッチ培養方法、連続培養方法、流加培養方法などにより、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から標的とするアミノ酸を回収することができる。
【発明の効果】
【００７０】
本発明のプトレシン生産性が向上したコリネバクテリウム属微生物は、細胞内でプトレシンを排出するＮＣｇｌ２５２２の活性が内在的活性より強化されるように改変されるので、細胞外へのプトレシンの排出が増加し、プトレシンに対する耐性度も増加することが確認された。
【００７１】
また、本発明のプトレシン生産経路を含む大腸菌においてＮＣｇｌ２５２２を発現させると、細胞外でプトレシンの量が増加することが確認された。よって、プトレシン生産能を有する微生物にコリネバクテリウムグルタミカム由来のＮＣｇｌ２５２２を適用することにより、効果的なプトレシン生産に広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明によりコリネバクテリウム染色体ライブラリーが導入された形質転換コロニーから最終選択したクローン（Ｂ１９）にＮＣｇｌ２５２２が含まれることを示す模式図である。
【図２】本発明によりＮＣｇｌ２５２２が欠失又は強化された組換え菌株のプトレシンに対する耐性度を評価した結果である。  １：ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ  ２：ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２  ３：ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７４】
参照例１：プトレシン生成能を有するコリネバクテリウム属微生物の作製
プトレシン生成能を有するコリネバクテリウム属微生物を作製するために、特許文献６に記載のとおり、オルニチンからアルギニンへの生合成経路を遮断し、グルタメートからオルニチンを生産する生合成経路の活性を強化し、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を外来から導入することにより、プトレシン生産能が付与された微生物を作製した。
【００７５】
具体的には、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をベースとして前記菌株の染色体内のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）をコードする遺伝子、及びグルタメート（glutamate）排出に関与するタンパク質であるＮＣｇｌ１２２１をコードする遺伝子を相同組換えにより欠損させることにより、オルニチン前駆体であるグルタメートの細胞内の含有量を増加させた。また、前記菌株にオルニチンからのプトレシンの合成に関与する、野生型大腸菌Ｗ３１１０由来のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子を染色体に導入した。さらに、グルタメートからのオルニチン合成に関与する酵素をコードする、ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群の自己プロモーターを改良型プロモーターであるＣＪ７プロモーターに置換することにより、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウムグルタミカム菌株を作製した。ここで、前記ａｒｇＣＪＢＤは、グルタメートからのオルニチン生合成経路に関与する、アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）をコードする。このように作製されたプトレシン生成能を有するコリネバクテリウムグルタミカム菌株は、ブダペスト条約に基づいて韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１０年１１月２４日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１１１３８Ｐとして寄託された。プトレシン生成能を有するコリネバクテリウム属微生物の作製に関する詳細な過程は、その全体が参照として本願に含まれる特許文献６に記載されている。
【００７６】
参照例２：プトレシン生成能を有するコリネバクテリウム属微生物の作製
プトレシン生成能を有する他のコリネバクテリウム属微生物として、参照例１で作製されたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１１３８Ｐにおいて、アセチルトランスフェラーゼ（acetyltransferase）であるＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子を欠失させてＮ−アセチルプトレシンを生成させないことにより、プトレシン生産量が増加したコリネバクテリウムグルタミカム菌株を作製した。
【００７７】
具体的には、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、ＮＣｇｌ１４６９のＮ末端部位の相同組換え断片を得るための配列番号１及び２のプライマー対と、ＮＣｇｌ１４６９のＣ末端部位の相同組換え断片を得るための配列番号３及び４のプライマー対を下記表１のように作製した。
【００７８】
【表１】
0006297134.tif 000002
【００７９】
前記コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、２対の各プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｎ末端部位とＣ末端部位のＰＣＲ断片をそれぞれ得て、その後それを電気泳動することにより目的とする断片を得た。ここで、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長の過程を３０回繰り返した。こうして得られたＮ末端部位の断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理し、Ｃ末端部位の断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａIで処理し、処理した断片を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｂａIで処理したｐＤＺベクターにクローニングすることにより、プラスミドｐＤＺ−ＮＣｇｌ１４６９（Ｋ／Ｏ）を作製した。
【００８０】
前記プラスミドｐＤＺ−ＮＣｇｌ１４６９（Ｋ／Ｏ）を電気穿孔法によりコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１１３８Ｐに導入して形質転換体を得て、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）と（5-bromo-4-chloro-3-indolin--D-galactoside）とを含むＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ／ｌ，ソルビトール９１ｇ／ｌ，寒天２％）に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。こうして形成されたコロニーから青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺ−ＮＣｇｌ１４６９（Ｋ／Ｏ）が導入された菌株を選択した。
【００８１】
前記選択した菌株をＣＭ培地（グルコース １０g／ｌ，ポリペプトン １０ｇ／ｌ，酵母抽出液 ５ｇ／ｌ，牛肉抽出液 ５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ２．５ｇ／ｌ，ウレア ２ｇ／ｌ，ｐＨ６．８）に接種して３０℃で８時間振盪培養し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈し、その後Ｘ−ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。形成されたコロニーから比較的低い割合で出現する白色のコロニーを選択し、ＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子が欠失することによりプトレシン生産性が向上したコリネバクテリウムグルタミカム菌株を作製した。このように作製されたプトレシン生成能が向上したコリネバクテリウムグルタミカム菌株をＫＣＣＭ１１１３８Ｐ ＮＣｇｌ１４６９と命名し、ブダペスト条約に基づいて韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１１年１２月２６日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１１２４０Ｐとして寄託した。プトレシン生成能を有するコリネバクテリウム属微生物の作製に関する詳細な過程は、その全体が参照として本願に含まれる特許文献７に記載されている。
【実施例】
【００８２】
実施例１：プトレシン排出タンパク質の探索及びプトレシンに対する耐性を付与するライブラリークローンの選択
コリネバクテリウムグルタミカムにはプトレシン生合成経路がないが、外部からオルニチンデカルボキシラーゼを導入してプトレシン合成能を有するようになると、プトレシンが生成されて細胞外にプトレシンが排出される。これは、コリネバクテリウム属微生物の数多くの膜タンパク質の中にプトレシン排出通路として作用するトランスポータータンパク質が存在することを示すものである。
【００８３】
コリネバクテリウム属微生物においてプトレシン排出タンパク質を分離、同定するために、野生型コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ライブラリーを作製した。具体的には、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで処理して不完全切断を行い、３〜５ｋｂのサイズの遺伝子断片を分離してＢａｍＨＩで処理したｐＥＣＣＧ１２２ベクター（大腸菌とコリネバクテリウムのシャトルベクター，特許文献８）にクローニングした。
【００８４】
こうして得られたコリネバクテリウム染色体ライブラリーを参照例１によるプトレシン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１１３８Ｐに形質転換し、その後０．３５Ｍのプトレシン含有最小培地（蒸留水１リットル中に、ブドウ糖１０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ、ＮＨ４Ｃｌ ４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ、尿素２ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １ｍｇ、ニコチンアミド５ｍｇ、チアミン塩酸塩５ｍｇ、ビオチン０．１ｍｇ、１ｍＭアルギニン、カナマイシン２５ｍｇ、０．３５Ｍプトレシン含有、ｐＨ７．０）で成長する菌株を選択した。コリネバクテリウム染色体ライブラリーが導入された約５．５×１０５個の形質転換コロニーから４１３個のコロニーを選択し、次いでプトレシン耐性度２次確認により得られた各ライブラリークローンをプトレシン生産菌株に再導入し、その後プトレシン耐性度３次確認により最終的に１個のクローンＢ１９を選択した。前記クローンを対象に塩基配列分析を行った結果、ＮＣｇｌ２５２２が含まれることが確認された（図１）。
【００８５】
プトレシン排出タンパク質としてコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から分離、同定されたＮＣｇｌ２５２２は配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号２０で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８６】
実施例２：ＮＣｇｌ２５２２欠損菌株の作製及びそのプトレシン生産能の確認
＜２−１＞ＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株からＮＣｇｌ２５２２欠損菌株の作製
コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のＮＣｇｌ２５２２がプトレシン排出に関与しているか否かを確認するために、ＮＣｇｌ２５２２をコードする遺伝子を欠損させるベクターを作製した。
【００８７】
具体的には、前記ＮＣｇｌ２５２２をコードする遺伝子の配列番号２０で表される塩基配列に基づいて、ＮＣｇｌ２５２２のＮ末端部位の相同組換え断片を得るための配列番号５及び６のプライマー対と、ＮＣｇｌ２５２２のＣ末端部位の相同組換え断片を得るための配列番号７及び８のプライマー対を下記表２のように作製した。
【００８８】
【表２】
0006297134.tif 000003
【００８９】
前記コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、２対の各プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＮＣｇｌ２５２２遺伝子のＮ末端部位とＣ末端部位のＰＣＲ断片をそれぞれ増幅し、その後それを電気泳動することにより目的とする断片を得た。ここで、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長の過程を３０回繰り返した。こうして得られたＮ末端部位の断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理し、Ｃ末端部位の断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａIで処理し、処理した断片を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｂａIで処理したｐＤＺベクターにクローニングすることにより、プラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２５２２（Ｋ／Ｏ）を作製した。
【００９０】
前記プラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２５２２（Ｋ／Ｏ）を電気穿孔法（electroporation）により参照例１及び２によるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１１３８Ｐ及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐにそれぞれ導入して形質転換体を得て、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とＸ−ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolin--D-galactoside）とを含むＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ／ｌ，ソルビトール９１ｇ／ｌ，寒天２％）に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。こうして形成されたコロニーから青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２５２２（Ｋ／Ｏ）が導入された菌株を選択した。
【００９１】
前記選択した菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ／ｌ，ポリペプトン １０ｇ／ｌ，酵母抽出液 ５ｇ／ｌ，牛肉抽出物 ５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ２．５ｇ／ｌ，ウレア ２ｇ／ｌ，ｐＨ６．８）で振盪培養（３０℃，８時間）し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈し、その後Ｘ−ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。形成されたコロニーから比較的低い割合で出現する白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によりＮＣｇｌ２５２２をコードする遺伝子が欠失した菌株を最終選択した。最終選択した菌株を対象に配列番号５及び８のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、ＮＣｇｌ２５２２をコードする遺伝子が欠失したことを確認し、前記コリネバクテリウムグルタミカム変異株をそれぞれＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【００９２】
＜２−２＞ＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株からＮＣｇｌ２５２２欠損菌株の作製
コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３８Ｐ及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐと同じ遺伝子型（genotype）を有するコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａ（ＡｒｇＦ欠損，ＮＣｇｌ１２２１欠損，大腸菌ｓｐｅＣ導入，ａｒｇオペロンプロモーター置換，参照例１参照）及びＤＡＢ１２−ｂ（ＡｒｇＦ欠損，ＮＣｇｌ１２２１欠損，大腸菌ｓｐｅＣ導入，ａｒｇオペロンプロモーター置換，ＮＣｇｌ１４６９欠損，参照例２参照）を対象にＮＣｇｌ２５２２欠損菌株を作製した。
【００９３】
具体的には、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ２５２２をコードする遺伝子及びそれから発現するタンパク質配列を確認するために、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び８のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ここで、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で２分の伸長の過程を３０回繰り返した。こうして得られたＰＣＲ産物を電気泳動で分離し、その後配列分析を行った結果、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ２５２２をコードする遺伝子は配列番号２２で表される塩基配列を含み、それによりコードされるタンパク質は配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む。コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のＮＣｇｌ２５２２とコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ２５２２のアミノ酸配列を比較した結果、これらは９８％の配列相同性を有することが確認された。
【００９４】
コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ２５２２をコードする遺伝子を欠損させるために、実施例＜２−１＞と同様に、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示す２対の各プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＮＣｇｌ２５２２遺伝子のＮ末端部位とＣ末端部位のＰＣＲ断片をそれぞれ増幅し、その後それらを電気泳動することにより目的とする断片を得た。ここで、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長の過程を３０回繰り返した。こうして得られたＮ末端部位の断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理し、得られたＣ末端部位の断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａIで処理し、処理した断片を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｂａIで処理したｐＤＺベクターにクローニングすることにより、プラスミドｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ２５２２（Ｋ／Ｏ）を作製した。
【００９５】
前記プラスミドｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ２５２２（Ｋ／Ｏ）を、実施例＜２−１＞と同様に、コリネバクテリウムグルタミカムＤＡＢ１２−ａ及びＤＡＢ１２−ｂにそれぞれ形質転換することにより、ＮＣｇｌ２５２２をコードする遺伝子が欠失した菌株を選択した。こうして選択されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株をそれぞれＤＡＢ１２−ａ△ＮＣｇｌ２５２２及びＤＡＢ１２−ｂ△ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【００９６】
＜２−３＞ＮＣｇｌ２５２２欠損菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株においてＮＣｇｌ２５２２欠損がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、実施例＜２−１＞及び＜２−２＞で作製されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【００９７】
具体的には、４種のコリネバクテリウムグルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２、ＤＡＢ１２−ａ△ＮＣｇｌ２５２２、及びＤＡＢ１２−ｂ△ＮＣｇｌ２５２２）と４種の母菌株（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ、ＤＡＢ１２−ａ、及びＤＡＢ１２−ｂ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有ＣＭ平板培地（１リットル中に、グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母抽出液 ０．５％、牛肉抽出物 ０．５％、ＮａＣｌ ０．２５％、ウレア ０．２％、５０％ＮａＯＨ １００μｌ、寒天 ２％、ｐＨ６．８）に塗抹して３０℃で２４時間培養した。こうして培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（１リットル中に、グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５％、トウモロコシ固形物０．５０％、(ＮＨ４)２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ウレア ０．１５％、ビオチン１００ｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３ ５％）に１白金耳ほど接種し、その後それを３０℃にて２００ｒｐｍで９８時間振盪培養した。全ての菌株の培養の際に、培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたプトレシンの濃度を測定し、その結果を下記表３に示す。
【００９８】
【表３】
0006297134.tif 000004
【００９９】
表３に示すように、ＮＣｇｌ２５２２が欠損した４種のコリネバクテリウムグルタミカム変異株の全てにおいてプトレシン生産量が大幅に減少することが確認された。
【０１００】
実施例３：ＮＣｇｌ２５２２強化菌株の作製及びそのプトレシン生産能の確認
＜３−１＞ＡＴＣＣ１３０３２の染色体におけるトランスポゾン遺伝子内へのＮＣｇｌ２５２２の導入
プトレシン生成能を有するコリネバクテリウム属微生物ＫＣＣＭ１１１３８ＰにおいてＮＣｇｌ２５２２遺伝子（自己プロモーター部位を含む）の染色体内への追加挿入によるプトレシン高生産効果を確認するために、ＮＣｇｌ２５２２をトランスポゾン遺伝子内に導入した。コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて染色体内への遺伝子導入を可能にする形質転換用ベクターｐＤＺＴｎ（特許文献９）を用いた。
【０１０１】
自己プロモーターを含むＮＣｇｌ２５２２遺伝子は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号９及び１０のプライマー対を用いて約１．８８ｋｂの遺伝子断片を増幅した（表４参照）。ここで、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒又は２分の伸長の過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、その後所望のサイズのバンドを溶離して精製した。ｐＤＺＴｎベクターはＸｈｏＩで処理し、ＡＴＣＣ１３０３２菌株のＮＣｇｌ２５２２ ＰＣＲ産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングには、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ−１’ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【０１０２】
【表４】
0006297134.tif 000005
【０１０３】
前記プラスミドｐＤＺＴｎ−１’ＮＣｇｌ２５２２を参照例１に示すコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１１３８Ｐに電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を得て、前記形質転換体から実施例２の方法によりトランスポゾンにＮＣｇｌ２５２２が導入された菌株を選択した。
【０１０４】
選択した菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号９及び１０のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、プラスミドｐＤＺＴｎ−１’ＮＣｇｌ２５２２の導入によってトランスポゾン内にＮＣｇｌ２５２２が導入されたことが確認された。ここで、ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長の過程を３０回繰り返した。
【０１０５】
こうして選択されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１１３８Ｐ Ｔｎ：１’ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【０１０６】
＜３−２＞ＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株からＮＣｇｌ２５２２プロモーター置換菌株の作製
プトレシン生産菌株においてＮＣｇｌ２５２２活性を強化するために、染色体内のＮＣｇｌ２５２２の開始コドンの前にＣＪ７プロモーター（特許文献５）を導入した。
【０１０７】
まず、配列番号２４で表される塩基配列を有するＣＪ７プロモーターを含み、前記プロモーターの両末端部位が染色体上のＮＣｇｌ２５２２本来の配列を有する相同組換え断片を得た。具体的には、ＣＪ７プロモーターの５’末端部位は、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１及び１２のプライマー対を用いたＰＣＲにより得た。ここで、ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長の過程を３０回繰り返した。また、ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号１３及び１４のプライマー対を用いて同一条件でＰＣＲにより得て、ＣＪ７プロモーターの３’末端部位は、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び１６のプライマー対を用いて同一条件でＰＣＲにより得た。プロモーター置換に用いられたプライマーを下記表５に示す。
【０１０８】
【表５】
0006297134.tif 000006
【０１０９】
前述したように得られた各ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＸｂａIで処理したｐＤＺベクターにフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングには、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ−Ｐ（ＣＪ７）−１’ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【０１１０】
前述したように作製したプラスミドｐＤＺ−Ｐ（ＣＪ７）−１’ＮＣｇｌ２５２２をそれぞれ参照例１及び２によるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１１３８Ｐ及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐに電気穿孔法で導入して形質転換体を作製した。作製した形質転換体をＣＭ培地に接種して３０℃で８時間振盪培養し、こうして得られた培養物を１０−４〜１０−１０に希釈し、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンとＸ−ｇａｌを含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。
【０１１１】
ほとんどのコロニーが青色を示すに対して、 、２次交差により最終的にＮＣｇｌ２５２２プロモーターがＣＪ７プロモーターに置換された菌株を選択した。選択した菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び１６のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、プラスミドｐＤＺ−１’ＣＪ７ＮＣｇｌ２５２２の導入によって染色体内のＮＣｇｌ２５２２の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入されたことが確認された。ここで、ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分の伸長の過程を３０回繰り返した。
【０１１２】
こうして選択されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株をそれぞれＫＣＣＭ１１１３８Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【０１１３】
＜３−３＞ＡＴＣＣ１３８６９の染色体におけるトランスポゾン遺伝子内への遺伝子ＮＣｇｌ２５２２の導入
コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のプトレシン菌株からＮＣｇｌ２５２２遺伝子の染色体内への追加挿入によるプトレシン高生産効果を確認するために、ＮＣｇｌ２５２２（プロモーター部位を含む）をトランスポゾン遺伝子内に導入することにした。ＮＣｇｌ２５２２遺伝子は、ＡＴＣＣ１３８６９菌株の染色体を鋳型とし、配列番号１７及び１０のプライマー対を用いて約１．９７ｋｂの遺伝子断片を増幅した（表６参照）。ここで、ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間又は２分間の伸長の過程を３０回繰り返した。こうして得られたＮＣｇｌ２５２２のＰＣＲ断片をＸｈｏＩで処理したｐＤＺＴｎベクターにフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングには、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ−２’ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【０１１４】
【表６】
0006297134.tif 000007
【０１１５】
前記プラスミドｐＤＺＴｎ−２’ＮＣｇｌ２５２２を、実施例＜３−１＞と同様に、コリネバクテリウムグルタミカムＤＡＢ１２−ａに形質転換することにより、トランスポゾン内にＮＣｇｌ２５２２が導入されたことが確認された。
【０１１６】
こうして選択されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ａ Ｔｎ：２’ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【０１１７】
＜３−４＞ＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株からＮＣｇｌ２５２２プロモーター置換菌株の作製
コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ２５２２の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターを導入するために、実施例＜３−２＞と同様に、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記表７に示す３対の各プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＣＪ７プロモーター部位、そのＮ末端部位及びＣ末端部位のＰＣＲ断片をそれぞれ増幅し、その後それを電気泳動することにより目的とする断片を得た。ここで、ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長の過程を３０回繰り返した。こうして得られたＣＪ７プロモーター部位、そのＮ末端部位及びＣ末端部位のＰＣＲ断片をＢａｍＨＩとＸｂａIで処理したｐＤＺベクターにフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングには、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ−Ｐ（ＣＪ７）−２’ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【０１１８】
【表７】
0006297134.tif 000008
【０１１９】
前記プラスミドｐＤＺ−'Ｐ（ＣＪ７）−２’ＮＣｇｌ２５２２を、実施例＜３−２＞と同様に、コリネバクテリウムグルタミカムＤＡＢ１２−ａ及びＤＡＢ１２−ｂにそれぞれ形質転換することにより、ＮＣｇｌ２５２２の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入された菌株を選択した。こうして選択されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株をそれぞれＤＡＢ１２−ａ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２及びＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【０１２０】
＜３−５＞ＮＣｇｌ２５２２強化菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株においてプロモーター置換によるＮＣｇｌ２５２２活性の強化がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、実施例＜３−１＞〜＜３−４＞で作製した６種のコリネバクテリウムグルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ Ｔｎ：１’ＮＣｇｌ２５２２、ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、ＤＡＢ１２−ａ Ｔｎ：２’ＮＣｇｌ２５２２、ＤＡＢ１２−ａ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、及びＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２）と４種の母菌株（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ、ＤＡＢ１２−ａ、及びＤＡＢ１２−ｂ）のプトレシン生産能を比較した。各菌株を実施例２−３と同様に培養し、その後各培養物から生産されたプトレシンの濃度を測定した。その結果を下記表８に示す。
【０１２１】
【表８】
0006297134.tif 000009
【０１２２】
表８に示すように、トランスポゾンにＮＣｇｌ２５２２をさらに導入するか、プロモーターを置換することによりＮＣｇｌ２５２２活性が強化された６種のコリネバクテリウムグルタミカム変異株の全てにおいてプトレシン生産量が増加することが確認された。
【０１２３】
実施例４：ＮＣｇｌ２５２２強化菌株の細胞内のプトレシン濃度の測定
ＮＣｇｌ２５２２活性が強化されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株においてプトレシン排出能が向上することにより細胞内のプトレシン濃度が低下したか否かを確認するために、コリネバクテリウムグルタミカム変異株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ Ｔｎ：１’ＮＣｇｌ２５２２及び母菌株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐを対象に有機溶媒を用いた抽出方法で細胞内のプトレシン濃度を測定した。細胞内の代謝物質（intracellular metabolite）の分析は、非特許文献１１に記載の方法により行った。
【０１２４】
まず、コリネバクテリウムグルタミカム変異株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ Ｔｎ：１’ＮＣｇｌ２５２２及び母菌株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐをそれぞれ１ｍＭアルギニン含有ＣＭ液体培地（１リットル中に、グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母抽出液 ０．５％、牛肉抽出液０．５％、ＮａＣｌ ０．２５％、ウレア ０．２％、５０％ＮａＯＨ １００ｌ、ｐＨ６．８）２５ｍｌに接種し、その後３０℃にて２００ｒｐｍで振盪培養した。培養中に細胞成長が指数増殖期（exponential phase）に達すると、急速真空濾過（rapid vacuum filtration, Durapore HV, 0.45 m; Millipore, Billerica, MA）により培養液から細胞を分離した。細胞が吸着したフィルタを１０ｍｌの冷却水で２回洗浄し、その後５Ｍモルホリノエタンスルホン酸（morpholine ethanesulfonic acid）及び５Ｍメチオニンスルホン（methionine sulfone）を含有するメタノールに１０分間浸漬した。こうして得られた抽出液に同量のクロロホルムと０．４倍の体積の水を混ぜ合わせ、その後水相（aqueous phase）のみスピンカラム（spin column）にかけてタンパク質汚染物を除去した。濾過した抽出液をキャピラリー電気泳動質量分析計（capillary electrophoresis mass spectrometry）で分析した。その結果を下記表９に示す。
【０１２５】
【表９】
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【０１２６】
表９に示すように、母菌株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐに比べてＮＣｇｌ２５２２活性が強化されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ Ｔｎ：１’ＮＣｇｌ２５２２の細胞内のプトレシン濃度が低下することが確認された。よって、前記コリネバクテリウムグルタミカム変異株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ Ｔｎ：１’ＮＣｇｌ２５２２においてＮＣｇｌ２５２２活性の強化によりプトレシン排出能が向上するので、細胞内で生成されたプトレシンが細胞外に円滑に排出されるものと予測される。
【０１２７】
実施例５：ＮＣｇｌ２５２２が欠失又は強化された菌株のプトレシン耐性度の評価
ＮＣｇｌ２５２２のプトレシン耐性に対する影響を確認するために、前述したように作製したＫＣＣＭ１１２４０Ｐ、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２菌株を対象にプトレシン耐性度を評価した。
【０１２８】
各菌株を２ｍｌのＣＭＡ液体培地に接種して３０℃で約１０時間培養し、その後１０５、１０４、１０３、１０２及び１０１に順次希釈した。準備した各希釈液を、０Ｍ又は０．８Ｍのプトレシンを含むＣＭＡ平板培地（１リットル中に、グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母抽出液 ０．５％、牛肉抽出物 ０．５％、ＮａＣｌ ０．２５％、ウレア ０．２％、寒天 １．８％、１ｍＭ アルギニン、ｐＨ６．８）にスポッティング（spotting）し、その後３０℃で４８時間培養して各菌株の成長を比較した。
【０１２９】
その結果、前記菌株は２つの異なる成長様相を示した。図２に示すように、ＮＣｇｌ２５２２遺伝子が欠損した菌株においてはプトレシンが高濃度で含まれる条件で成長できないのに対して、ＮＣｇｌ２５２２遺伝子の発現が強化された菌株においては同一条件で細胞の成長が促進された。これは、ＮＣｇｌ２５２２遺伝子の強化によるプトレシン排出能の向上が高濃度のプトレシンが含まれる条件で母菌株に比べて高い細胞成長性を示すものであり、高濃度プトレシン発酵のためにＮＣｇｌ２５２２の導入及び強化が必須であることを示すものである。
【０１３０】
実施例６：大腸菌へのＮＣｇｌ２５２２導入によるプトレシン発酵
プトレシン生合成経路を有する大腸菌野生型菌株Ｗ３１１０においてコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のＮＣｇｌ２５２２発現時のプトレシン生産増加効果を確認するために、Ｗ３１１０にプトレシン合成酵素であるｓｐｅＣ発現ベクターとＮＣｇｌ２５２２発現ベクターをそれぞれ導入した。
【０１３１】
ｓｐｅＣ発現ベクターを生産するために、Ｗ３１１０の染色体を鋳型とし、配列番号３４及び３５のプライマー対を用いて約２．１ｋｂのｓｐｅＣ遺伝子断片を増幅した（表１０参照）。このＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、その後所望のサイズのバンドを溶離して精製した。Ｔｒｃプロモーターを含むｐＳＥ２８０ベクター（Invitrogen）をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで処理し、その後ｓｐｅＣ ＰＣＲ産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングには、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ(R) ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＳＥ２８０−ｓｐｅＣと命名した。
【０１３２】
ＮＣｇｌ２５２２発現ベクターを生産するために、ｐＳＥ２８０を鋳型とし、配列番号３６及び３７のプライマー対を用いてＴｒｃプロモーター断片を得て、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号３８及び３９のプライマー対を用いてＮＣｇｌ２５２２断片を得た。このＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、その後所望のサイズのバンドを溶離して精製した。ＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐｃｃ１ＢＡＣにｔｒｃプロモーター断片とＮＣｇｌ２５２２断片をフュージョンクローニングした。結果として得られたプラスミドをｐｃｃ１ＢＡＣ−Ｐ（ｔｒｃ）−ＮＣｇｌ２５２２と命名した。
【０１３３】
【表１０】
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【０１３４】
前記プラスミドｐＳＥ２８０−ｓｐｅＣとｐｃｃ１ＢＡＣ−Ｐ（ｔｒｃ）−ＮＣｇｌ２５２２をＷ３１１０に形質転換した。大腸菌内での形質転換は２×ＴＳＳ溶液（Epicentre）を用いて行い、ｐＳＥ２８０−ｓｐｅＣが導入された大腸菌はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）が含まれるＬＢ平板培地（１リットル中に、トリプトン １０ｇ、酵母抽出液 ５ｇ、Ｎａｃｌ １０ｇ、寒天 ２％）に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。ｐｃｃ１ＢＡＣ−Ｐ（ｔｒｃ）−ＮＣｇｌ２５２２が導入された大腸菌は、クロラムフェニコール（３５μｇ／ｍｌ）が含まれるＬＢ平板培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。前述したように得られた菌株を対象にプトレシン生産能を確認した。
【０１３５】
具体的には、Ｗ３１１０、Ｗ３１１０ ｐＳＥ２８０−ｓｐｅＣ及びＷ３１１０ ｐｃｃ１ＢＡＣ−Ｐ（ｔｒｃ）−ＮＣｇｌ２５２２をそれぞれＬＢ、ＬＡ及びＬＣ固体培地に接種して３７℃で２４時間培養し、それらをそれぞれ２５ｍｌの力価培地（１リットル中に、(ＮＨ４）２ＰＯ４ ２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４６．７５ｇ、クエン酸 ０．８５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．７ｇ、微量元素 ０．５％（ｖ／ｖ）、グルコース １０ｇ、ＡＭＳ ３ｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ）に接種して３７℃で２４時間培養した。微量金属溶液（Trace metal solution）は、１リットル中に５Ｍ ＨＣｌ：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １ｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ ０．２３ｇ、 ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ２ｇ、及び（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ ０．１ｇを含む。
【０１３６】
各培養物から生産されたプトレシンの濃度を測定した。その結果を下記表１１に示す。
【０１３７】
【表１１】
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【０１３８】
表１１に示すように、プトレシン生合成酵素ｓｐｅＣが導入されたＷ３１１０ ｐｃｃ１ＢＡＣ−ｐＳＥ２８０−ｓｐｅＣ菌株に比べて、ＮＣｇｌ２５２２が導入されたＷ３１１０ ｐｃｃ１ＢＡＣ−Ｐ（ｔｒｃ）−ＮＣｇｌ２５２２においてプトレシン生産量がさらに増加することが確認された。
【０１３９】
これは、前記ＮＣｇｌ２５２２遺伝子が大腸菌においてもプトレシン排出タンパク質として活性を有することを立証するものである。
【０１４０】
本発明者は、プトレシン生成能を有するコリネバクテリウム属微生物ＫＣＣＭ１１１３８Ｐにおいてトランスポゾン内にＮＣｇｌ２５２２をさらに導入してＮＣｇｌ２５２２活性を強化したコリネバクテリウムグルタミカム菌株が向上したプトレシン排出能により高収率でプトレシンを生産できることを確認し、前記菌株をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＣ０１−０５１０と命名し、ブダペスト条約に基づいて２０１３年３月８日付けで韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１１４０１Ｐとして寄託した。
【０１４１】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例は全ての面において、あくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明のプトレシン生産性が向上したコリネバクテリウム属微生物は、細胞内でプトレシンを排出するＮＣｇｌ２５２２の活性が内在的活性より強化されるように改変されるので、細胞外へのプトレシンの排出が増加し、プトレシンに対する耐性度も増加することが確認された。また、本発明のプトレシン生産経路を含む大腸菌においてＮＣｇｌ２５２２を発現させると、細胞外でプトレシン量が増加することが確認された。よって、プトレシン生産能を有する微生物にコリネバクテリウムグルタミカム由来のＮＣｇｌ２５２２を適用することにより、効果的なプトレシン生産に広く活用することができる。
【０１４３】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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