(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１３０９
であるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１。
【請求項２】
前記ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１の染色体数が５４〜６３であり、前記ヒト肝臓が
ん細胞系ＨＬＣＺ０１に対し染色体Ｇバンド核型分析を行ったところ、それに染色体異数
化現象が存在することが明らかになり、且つ細胞核型に一つのマーカー染色体が現れたこ
とを特徴とする、請求項１に記載のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１。
【請求項３】
前記ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は肝炎ウイルスに感染され得るヒト肝臓がん細胞
系であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ
０１。
【請求項４】
前記肝炎ウイルスはＢ型肝炎ウイルスや２ａ型のＣ型肝炎ウイルスを含むことを特徴と
する、請求項３に記載のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１のＢ型肝炎ウ
イルスや２ａ型のＣ型肝炎ウイルスを含む肝炎ウイルス感染を維持する細胞モデルとして
の応用。
【請求項６】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１の肝炎ウイル
ス感染を維持する動物モデルの確立における応用。
【請求項７】
前記肝炎ウイルスはＢ型肝炎ウイルスやＣ型肝炎ウイルスを含むことを特徴とする、請
求項６に記載の応用。
【請求項８】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１のＢ型肝炎ウ
イルスやＣ型肝炎ウイルスを含む肝炎ウイルスに抗する薬物の選別又は評価における応用
。
【請求項９】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１の抗腫瘍薬の
選別又は評価における応用。
【請求項１０】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１の人工肝臓の
製造における応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物・動物細胞の分野に関し、特にヒト肝臓がん細胞系及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は種々の重要な生理機能を備え、主として、大量の血清タンパク質例えばアルブミンやリポタンパク質の合成と分泌、タンパク質と結合する脂質の合成と輸送、解毒機能、胆汁の合成と分泌、血糖の調節のための糖の合成、アミノ酸の分解による尿素の合成、ビタミンの活性化、グリコーゲンの合成と分解、及び、グルタチオンやメタロチオネインの合成等を含む。
【０００３】
バイオテクノロジーの進歩に従って、遺伝子組み換えと細胞融合の方法によれば、多数の有用な生物学的製品を生産できるが、比較してみると、動物細胞培養技術は従来よりもさらに重要となる。肝臓は、細胞質タンパク質を合成し分泌する顕著な機能など、他の器官より多い生理機能を備え、且つより高いアルブミンやリポタンパク質を合成する能力、脂質、尿素、グリコーゲン、グルタチオンを輸送する能力、及びより高い代謝能力を備えると考えると、肝臓細胞で上記製品を培養し生産することについて研究者の関心を一層集めている。これにより、肝臓機能を研究し関連する生物学的製品を生産するためには、肝細胞を培養する必要がある。しかしながら、現在の細胞培養技術によれば、肝細胞の培養期間において血漿タンパク質等の生物学的製品を生産できず、正常肝細胞は生体から離れた後に活力が急速に低下することで、関連製品の取得は非常に困難である。
【０００４】
肝臓は成人体内における数少ない再生可能な臓器の一つでもあるが、培養皿にて培養する肝細胞は継代回数の限界があって、繰り返して培養することができない。
【０００５】
既存の一部の肝細胞系は非ヒト由来のものであり、又はヒト肝細胞との差異が大きいため、広く応用することができない。現在、実験動物例えばラット（Ｔｓａｏ ｅｔ． ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， １９８４， １５４：３８−５２；Ｅｎａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９８４， ８７： １４１１−１４１５）に由来する若干の肝細胞系が存在しており、無血清培地により成年ラットの肝臓に由来するラット上皮細胞を確立した（Ｃｈｅｓｓｅｂｅｕｆ ａｎｄ Ｐａｄｉｅｕ， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ， １９８４， ２０：７８０−７９５； Ｅｎａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９８４， ８１：１４１１−１４１５）。ラット肝細胞にはさらにＳＶ４０ ＤＮＡを導入することもできるが（Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９８７， ４６： ４０１８−４０２６； Ｌｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８７， ８４： ５３３５−５３３９）、ヒトの肝細胞の代謝と異なっているため、このような細胞は人体内での薬物の代謝及び肝臓がんの生成についての研究に用いることができない。
【０００６】
また、ヒト肝細胞の無性繁殖に関連する報告も存在しており（Ｋａｉｇｈｎ ａｎｄ Ｐｒｉｎｃｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９７１， ６８：２３９６−２４００）、長期間に培養できるヒト胎児肝臓も確立されたが（Ｓａｌａｓ−Ｐｒａｔｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， １９８８， ２４：２３０−２３８； Ｓｅｌｌｓ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， １９８５， ２１：２１６−２２０）、胎児肝臓と成人肝臓との代謝上の差異により、胎児肝臓の腫瘍生成及び毒性学の研究における応用は制限される一方、成人肝臓は腫瘍生成及び毒性学の研究により適している。
【０００７】
肝細胞を代替する研究モデルを見出すために、研究者は肝臓がんに由来し、正常肝細胞と同じ機能（例えばアルブミンを分泌する機能）を備える細胞系を確立した。現在、種々の肝臓がん細胞系、例えば肝臓がん細胞系ＨｅｐＧ２（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４３９３１３３）が確立されている（ｅ．ｇ．， Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，３９３，１３３， ｉｓｓｕｅｄ Ｊｕｌ． １２， １９８３； Ｋｎｏｗｌｅｓ Ｂ． Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８０， ２０９：４９７−４９９； Ｍｏｎｊａｒｄｉｎｏ Ｊ． ａｎｄ Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｅ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９７９， ９６：６５２−６５５； Ｐａｒｋ Ｊ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， １９９５， ６２：２７６−２８２； Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ２００５， １０２（２６）：９２９４−９２９９； Ｆｕａｎｄ Ｃｈｅｎｇ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ２０００， ４４（１２）：３４０２−３４０７）。ＨｅｐＧ２のさらなる利用についての研究に関連する報告も存在している（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ． ａｎｄ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， １９８９， ２５：２１７−２２２； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，２９０，６８４；ａｎｄ Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ． ａｎｄ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， １９８７， ２−３：３４９−３５４）。また、Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉは肝臓がん細胞系Ｈｕｈ７を確立している（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８２， ４２：３８５８−３８６３）。これまでに出版された文献をまとめて見ると、既存の肝臓がん細胞系としては、ＨＬＦ （Ｏｋａｙａｍａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｈｏｏｌ： １９７５）， ＨＬＥ， ｃ−１ （Ｏｋａｙａｍａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｈｏｏｌ： １９７５）， ＨｕＨ−６ ｃｌｏｎｅ ５ （Ｏｋａｙａｍａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｈｏｏｌ： １９７６）， ＨｕＨ−７（Ｏｋａｙａｍａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｈｏｏｌ： １９７９）， Ｃ−ＨＣ−４ （Ｈｏｋｋａｉｄｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９７９）， ＨＣＣ−Ｍ （Ｋｅｉｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８０）， ＪＨＨ−１ （Ｔｈｅ Ｔｏｋｙｏ Ｊｉｋｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８０）， ＪＨＨ−２ （Ｔｈｅ Ｔｏｋｙｏ Ｊｉｋｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８２）， ＪＨＨ−４ （Ｔｈｅ Ｔｏｋｙｏ Ｊｉｋｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８３）， ＫＩＭ−１ （Ｋｕｒｕｍｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８３）， ＪＨＨ−５ （Ｔｈｅ Ｔｏｋｙｏ Ｊｉｋｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８４）， ＪＨＨ−６ （Ｔｈｅ Ｔｏｋｙｏ Ｊｉｋｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：１９８４）， ＯＨＲ （Ｓｈｏｗａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ�� ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８５）， ＫＭＣＨ−１ （Ｋｕｒｕｍｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８５）， ＫＭＧ−Ａ （Ｋｕｒｕｍｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８５）， ＪＨＨ−７ （Ｔｈｅ Ｔｏｋｙｏ Ｊｉｋｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８６）， ＪＨＣ−１ （Ｔｈｅ Ｔｏｋｙｏ ＪｉｋｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８６）， ＫＹＮ−１ （Ｋｕｒｕｍｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８６）， ＫＹＮ−２ （Ｋｕｒｕｍｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８７）， ＨＣＣ−Ｔ （Ｋｅｉｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８６）， ＨＰＴ−ＮＴ／Ｄ３ （Ｋｙｕｓｈｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８６）， Ｈｅｐ−ｔａｂａｔａ （Ｍｉｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８６）， ＨｕＣＣ−Ｔ１ （Ｔｏｙａｍａ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １９８７），及びＨｕＨ−２８ （Ｏｋａｙａｍａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｈｏｏｌ： １９８７）などがある。上記関連データについては、ヒト細胞Ｖｏｌ． １， Ｎｏ． １， ｐ． １０６−１２６， １９８８を参照することができる。
【０００８】
生物反応器で肝細胞を培養して人工肝臓を製造する研究は多く存在している。人工技術は腎臓、心臓及び肺の移植で進展を見ている。人工肝臓及び他の技術により長期間に肝機能を保つことについての報告はすでに存在している（例えば、Ａｎａｎｄ Ａ． Ｃ．， Ｉｎｄｉａｎ Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， ２００３， ２２ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ６９−７４； Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．， ＡＳＡＩＯ Ｊ， ２００３， ４９（４）：４０１−６； Ｔｉｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ． Ｓｕｒｇ．， ２００２， ９（６）：６８６−９６； Ｍｅｔａｂ． Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ．， ２００５， ２０（４）：３２７−３５； ａｎｄ Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．， ２００５， ９９（４）：３１１−９）。肝臓補助装置に関連する報告も存在している（例えば、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．， ２００５， １１ （１１−１２）：１６６７−７７； Ｐｌｅｓｓ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．， ２００５， ３７（９）：３８９３−５； Ｍｉｌｌｉｓ ａｎｄ Ｌｏｓａｎｏｆｆ， Ｎａｔ． Ｃｌｉｎ． Ｐｒａｃｔ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．， ２００５， ２（９）：３９８−４０５； ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｅ Ｊ．， Ｊ． Ａｓｓｏｃ． Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｉｎｄｉａ， ２００４， ５２：７１９−２２）。これらの肝臓補助装置は移植手術においてよく用いられている。例えば、人工肝臓と肝臓補助装置により、劇症肝不全患者に手術の前に意識を保持させ落ち着かせることができ、移植手術の後、特に再灌流に応答しない場合に患者を安定させることができ、そして場合によっては肝移植を代替することもできる。バイオ人工肝臓及び肝臓補助装置をより有効に利用するために、軽便でコンパクトなバイオリアクターを発明する必要がある。従って、培養される細胞は反応器にて緊急に必要な且つ十分な肝特異タンパク質を産生することが求められている。正常ヒト肝細胞の欠乏により、肝臓がん細胞はこの応用で高い潜在力がある。研究者はＨｅｐＧ２細胞によりこれらの装置にて抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２を生産することに成功した（Ｔｅｒａｄａ Ｓ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ２００３， ９５（２）：１４６−５１）。
【０００９】
肝臓がんは一般的な腫瘍であり、多くの肝臓がんは肝炎ウイルス例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）や、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に起因したものであり、今はまだ有効な療法がない。ＨＣＶ感染は主なヒト感染症の一つであり、予防・治療に有効なワクチンはまだない。一部の証拠から、細胞性免疫の肝炎ウイルスを取り除くことの重要性が証明されたが、患者体内の抗体に仲介される抗ウイルス反応のメカニズムはまだ明確ではない。多くの患者体内の抗体はウイルス抗原を中和できるが、血清における中和抗体の含有量と強度は未知のものであり、ウイルス感染をサポートする細胞モデル又は動物モデルが乏しいため、中和抗体に関する研究は制限されている。
【００１０】
ヒト肝臓がんに由来する若干の細胞系は存在しているが、これらの既存の細胞系の多くは低分化で肝細胞機能不全のものである。発明者らが調べたところ、現在、ＨＢＶとＨＣＶ感染をサポートする細胞系は一つもなく、それにより、抗ウイルス薬の開発と応用も制限されている。一部の研究チームは初代ヒト肝細胞により少量のＨＣＶコピーを検出したことがあるが、野生型ＨＣＶの大量コピーをサポートする細胞系はまだない（Ｔａｇａｗａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ， １９９５， １０：５２３−５２７； Ｉｔｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， １９９６， ７７ （Ｐｔ． ５）：１０４３−１０５４； Ｉｔｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２００１， ３４：５６６−５７２）。２００５年、いくつかの研究チームは細胞系において２ａ型ＨＣＶ ＪＦＨ１の生理的リズムを現すことに成功した（Ｈｅｌｌｅｒ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ２００５， １０２：２５７９−２５８３； Ｗａｋｉｔａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ２００５， １１（７）：７９１−７９６； Ｚｈｏｎｇ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡｓ， ２００５， １０２（２６）：９２９４−９； Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ Ｂ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５， ３０９（５７３４）：６２３−６）。
【００１１】
現在、ＨＣＶ感染をサポートする唯一の動物モデルはチンパンジーである（Ｌａｎｆｏｒｄ Ｒ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２００２， ２９３：１−９）。このような動物モデルの利点は、ウイルスの実際の生理的リズムを現していることであり、ヒトを感染させた病理学的表現と異なっていても（Ａｌｔｅｒ Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ．， １９９９， ３４１：５５６−５６２； Ｂａｓｓｅｔｔ Ｓ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １９９８， ７２：２５８９−２５９９）、このようなモデルはウイルス感染後の宿主の免疫反応に対して多くの解釈を提供した。このようなモデルの利用における最大の制限はチンパンジーの供給源が少なく、費用が非常に高いことである。コモンツパイは霊長類に近い小動物で、実験室環境に非常に適応しやすい。ある研究から、コモンツパイも肝炎ウイルスを含む複数種のヒトウイルスに感染できることが明らかになった（ｄｉｅ Ｚ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９９８， ２４４：５１３−５２０）。
【００１２】
ＨＣＶコアタンパク質を発現する遺伝子改変マウスは肝臓病理及び腫瘍生成の研究に用いられている（Ｌｅｍｏｎ Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓ． Ａｍ． Ｃｌｉｎ． Ｃｌｉｍａｔｏｌ． Ａｓｓｏｃ．， ２０００， １１１：１４６−１５６）。多くの遺伝子改変動物は肝細胞に対する毒性を示しておらず、あるモデルはリンパ細胞炎症及び肝細胞壊死を示しており（Ｚｈａｏ Ｘ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ， ２００２， １０９：２２１−２３２）、他の二種のモデルは脂肪変性及び肝臓がんを示している（Ｍｏｒｉｙａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ， １９９７， ７８ （Ｐｔ． ７）：１５２７−１５３１； Ｍｏｒｉｙａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， １９９８， ４：１０６５−１０６７）。ＨＢＶ遺伝子改変マウスを利用したモデルは、ＨＢＶに起因した免疫病の発生メカニズムについての研究を非常に大きく広めた（Ｃｈｉｓａｒｉ Ｆ． Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８５， ２３０：１１５７−１１６０； Ｃｈｉｓａｒｉ Ｆ． Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １９９５， ２２：１３１６−１３２５）。遺伝子改変マウスはＨＣＶ免疫学ではまだ幅広く応用されておらず、ウイルスタンパク質に対する免疫寛容はマウスモデルを利用する研究での問題となる。
【００１３】
以上の従来の研究結果から、肝臓がんに類似する機能を備える肝臓がん細胞系及び動物モデルを得ることは非常に有利であることが明らかになっている。これらの細胞系の潜在的な応用としては、抗腫瘍薬物を選別し評価すること、細胞系においてＨＢＶやＨＣＶを培養してウイルスの自然的な感染形態をシミュレート・再現すること、抗ウイルス薬物を選別し評価すること、及び、肝細胞の代謝エネルギーを研究することを含むがこれらに限定されるものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明が解決しようとする技術問題は従来技術の問題点を克服して、高分化で、体外で培養でき、肝臓の機能特性を有し、肝炎ウイルスに感染され得るヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１を提供し、それに応じて当該ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１の細胞モデル、動物モデル、及び抗ウイルスと抗腫瘍薬の調製と選別等における応用をも提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明は、中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣと略称する）に寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１３０９であるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１を提供することを特徴とする。当該ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１の寄託部門は中国武漢大学に位置する中国典型培養物保蔵センターＣＣＴＣＣであり、寄託日は２０１３年１月１７日。当該ヒト肝臓がん細胞系はヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１と命名した。
【００１６】
上記のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１において、その染色体数は５４〜６３であることが好ましい。
【００１７】
上記のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１において、前記のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１に染色体Ｇバンド核型分析を行ったところ、それに染色体異数化現象が存在することが明らかになり、且つ細胞核型に一つのマーカー染色体が現れた。
【００１８】
上記のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は肝細胞特異遺伝子ＡＬＢとＡＡＴを含むだけでなく、肝細胞特異タンパク質ＡＬＢとＡＡＴを発現することもできる。上記のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は高分化のヒト肝臓がん細胞系である一方、肝炎ウイルスに感染させることができ、前記肝炎ウイルスは特にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）やＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を言い、２ａ型のＣ型肝炎ウイルス及び各型のＢ型肝炎ウイルスを含むもののいずれにも感染され得る。ＨＢＶとＨＣＶは本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１において大量にコピーすることができる。
【００１９】
全体的な技術思想としては、本発明はさらに上記のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１のＢ型肝炎ウイルスやＣ型肝炎ウイルスを含む肝炎ウイルス感染をサポートする（特に２ａ型のＣ型肝炎ウイルス及び各型のＢ型肝炎ウイルスを含むもののいずれにも感染され得る）細胞モデルとしての応用を提供する。本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１はＨＢＶとＨＣＶの完全な生活環を維持し、細胞モデルにおいてＨＢＶとＨＣＶを培養することにより、ウイルスの自然な感染形態を再現することができる。
【００２０】
全体的な技術思想としては、本発明はさらに上記のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１のウイルス感染をサポートする動物モデルの確立における応用を提供する。前記ウイルスはＢ型肝炎ウイルスやＣ型肝炎ウイルスを含むことが好ましい。具体的には、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は非ヒト動物モデルに用いることができ、ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１を動物体内（例えばマウス体内）に植え込む又は導入すれば、ウイルス感染をサポートする動物（例えばマウス）モデルの確立に用いることが可能になる。本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１により確立された動物モデルは肝臓病理学と肝炎ウイルス学の研究に役立つ。前記のように、ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１はＨＢＶとＨＣＶの完全な生活環を維持するため、ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１においてＨＢＶとＨＣＶの肝心な病理過程を再現でき、該ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１を含む動物モデルはＨＢＶとＨＣＶに対する人体の抗ウイルス反応の研究に用いることが可能になる。
【００２１】
全体的な技術思想としては、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は肝炎ウイルス感染をサポートする細胞モデルとしての応用、又はウイルス感染をサポートする動物モデルの確立における応用が可能であることで、臨床でＨＢＶとＨＣＶを抑制し又はそれらに介入する薬物（ウイルスワクチン及びその他の補助試薬）を選別することに役立つため、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１はＢ型肝炎ウイルスやＣ型肝炎ウイルスを含む肝炎ウイルスに抗する薬物の調製、選別又は評価に応用することも可能になる。
【００２２】
全体的な技術思想としては、本発明にかかる上記のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は培地にて体外培養を行うことができ、さらに細胞に対する化合物の発がん性と催奇性を予測する研究に用いることもでき、化学発がん研究により、さらに抗腫瘍薬の調製、選別又は評価に用いることが可能になる。
【００２３】
全体的な技術思想としては、本発明にかかる上記のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は肝臓の重要な機能と特性を有し、アンモニアを尿素に変換できるが、アンモニアを代謝して尿素とする機能により、それは人工肝臓又は肝臓補助設備を製造する有利なツールとなるため、臨床又は科学研究に用いることができる。このため、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は人工肝臓の製造に応用することもできる。
【００２４】
上記の基本的な応用形態に加え、本発明にかかる上記のヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１はさらに、肝細胞代謝の研究（例えば、化合物の肝臓での代謝活性化作用を評価する）及びその他の代謝機能の研究、肝炎ウイルスの肝細胞での生存とコピーの研究、並びに人体寄生虫の研究等に応用することもでき、細胞に外来遺伝子を導入してその機能を研究するのに応用することもできるが、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１はチトクロームＰ４５０と、ＣｙＰ１Ａ１、ＣｙＰ１Ｂ１及びＣｙＰ２Ｃ９タンパク質とを発現できるため、大量の同原細胞実験の必要な場合、例えば薬物代謝研究に応用することもできる。
【発明の効果】
【００２５】
従来技術に比べて、本発明は以下の利点を有する：本発明は画期的なヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１を選別して得られたものであり、当該ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は高分化のヒト肝臓がん細胞系に属するだけでなく、培地にて体外培養を行うこともでき、それは肝臓の重要な機能と特性を有し、アミンを尿素に変換でき、チトクロームＰ４５０と、ＣｙＰ１Ａ１、ＣｙＰ１Ｂ１及びＣｙＰ２Ｃ９タンパク質とを発現できる。より重要なのは、肝炎ウイルスに感染させることができ、ＨＢＶとＨＣＶがその中に大量にコピーできることであり、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１が有する特殊な性能により、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は抗ウイルスと抗腫瘍薬の調製、開発、選別及び評価に幅広く応用することができ、生物人工肝臓等の各種の臨床治療用生物学的製品の製造に用いることができる。本発明において選別して培養したヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は他の動物肝細胞よりもヒト肝臓の代謝機能と病気の進展過程についての研究に役立つ。
【００２６】
ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１の寄託機関は中国武漢大学に位置する中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣと略称する）であり、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１３０９、寄託日は２０１３年１月１７日である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の実施例において、ＲＴ−ＰＣＲにより三種類の細胞における遺伝子ＡＬＢとＡＡＴを検出した対照的な検出結果であるゲル撮影装置による電気泳動図である。
【図２】本発明の実施例において、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにより三種類の細胞におけるＡＬＢとＡＡＴタンパク質発現を検出した対照的な検出結果である。
【図３】本発明の応用実施例１において、ヒト肝臓がん細胞系がＨＣＶに感染した後にウイルスのコピー量が培養時間に従って変化する曲線である。
【図４】本発明の応用実施例１において、ヒト肝臓がん細胞系がＨＣＶに感染した後の免疫蛍光による検出結果であり、そのうち、左の図はＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ａに抗する抗体によりウイルス感染細胞内のウイルスを検出することを示し、中間の図はＤＡＰＩにより細胞核を対比染色することを示し、右の図は左の図と中間の図を結合した図を示す。
【図５】本発明の応用実施例２において、ＨＬＣＺ０１細胞がＨｅｐａＧ２．２．１５細胞内に由来するＨＢＶに感染した後にＰＣＲにより定量的に検出した結果である。
【図６】本発明の応用実施例３において、二種のヒト肝臓がん細胞系がＨＣＶに感染した後にウイルスのコピー量が培養時間に従って変化する曲線である。
【図７】本発明の応用実施例３において、ヒト肝臓がん細胞系がＨＢＶとＨＣＶに感染した後の免疫蛍光による検出結果であり、そのうち、四つの図は左から右まで順に以下のとおりである：Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａ抗体により細胞内のＣ型肝炎ウイルスを検出したもの、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質抗体により細胞内のＢ型肝炎ウイルスを検出したもの、ＤＡＰＩにより細胞核を対比染色したもの、及び、ごくわずかの細胞が二種のウイルスに同時に感染され得る左側の三つの図を結合した図である。
【図８】本発明の応用実施例１において、ＨＬＣＺ０１細胞によるヒト化マウスがＣ型肝炎ウイルスに感染した後、マウス血清におけるウイルスの含有量が感染時間に従って変化する曲線である。
【図９】本発明の応用実施例２において、ＨＬＣＺ０１細胞内のＢ型肝炎ウイルスの含有量がインターフェロンの使用量及び処理時間に従って変化する関係図である。
【図１０】本発明の応用実施例１において、ＨＬＣＺ０１細胞内のＣ型肝炎ウイルスの含有量がインターフェロンの使用量及び処理時間に従って変化する関係図である。
【図１１】本発明の応用実施例４において、フローサイトメトリーによりＴＲＡＩＬに対するＨＬＣＺ０１細胞の感受性を検出した結果である。
【図１２】本発明の実施形態において、ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１について染色体核型分析を行った染色体分布頻度図である。
【図１３】本発明の実施形態において、ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１（２ｎ＝５４）について染色体核型分析を行った結果図である。
【図１４】本発明の実施形態において、ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１（２ｎ＝５９）について染色体核型分析を行った結果図である。
【図１５】本発明の実施形態において、ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１（２ｎ＝６３）について染色体核型分析を行った結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に、明細書の添付図面及び具体的な好ましい実施例と結びつけて本発明をさらに説明するが、これにより本発明の保護範囲を制限するものではない。
【００２９】
下記実施例において、特に説明していない限り、いずれも一般的な方法とする。下記実施例に用いる実験材料又は生物製剤については、特に説明していない限り、いずれも市場から購入できる一般的な試薬である。以下の実施例における定量実験は、いずれについても三回の繰り返し実験を設定して、平均値を結果とする。
【００３０】
実施例に用いる主な実験材料及び試薬：
【００３１】
（１）細胞培養：ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１（寄託されているもの）、Ｈｕｈ７．５細胞（アメリカロックフェラー大学のＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｃｅ教授の実験室から贈られたもの）、ＨＣＶｃｃ（ＪＦＨ１ウイルス上澄みであり、ＨＣＶ材料は日本国立感染症研究所のＴａｋａｊｉ Ｗａｋｉｔａ教授の実験室から贈られたもの）、１００ｍｍの細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ社）、６０ｍｍの細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ社）、６ウェル型細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ社）、ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ペニシリンとストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、羊血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１×ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）；
【００３２】
（２）細胞の総ＲＮＡ抽出：ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、イソプロパノール（上海生工）、無水エタノール（上海生工）、ＤＥＰＣ（上海生工）；
【００３３】
（３）ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ及びＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ：ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（Ｔａｒａｋａ社）、２００μＬ型８連ＰＣＲチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）；
【００３４】
（４）細胞の総タンパク質抽出：ＲＩＰＡ溶解液（Ｔｈｅｒｍｏ社）、プロテアーゼ阻害剤（Ｍｅｒｃｋ社）、タンパク質濃度測定用試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）；
【００３５】
（５）Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ：ＰＶＤＦフィルム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、抗ＡＬＢ抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ）、抗ＡＡＴ抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ）、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体（アメリカフロリダ大学から贈られたもの）、二次抗体ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ＨＲＰ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ社）、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ露光機（Ｋｅｄａ社）；
【００３６】
（６）免疫蛍光：スライドガラスとカバーガラス（ＳＰＩＳｕｐｐｌｉｅｓ社）、免疫組織化学染色ペン（ＺＬＩ−９３０５、ＰＡＰＰｅｎ）、１×ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、羊血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、抗ＨＣＶＮＳ５Ａ抗体（自製）、二次抗体ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ（ＦＩＴＣ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。
【００３７】
実施例：
【００３８】
本実施例では本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１が得られる。当該ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は中国典型培養物保蔵センターに寄託されており、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１３０９、寄託機関は中国武漢大学に位置し、寄託日は２０１３年１月１７日である。当該ヒト肝臓がん細胞系はヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１と命名した。
【００３９】
ＨＬＣＺ０１細胞系の確立及び培養方法
【００４０】
１．男性肝臓がん患者の手術において切除された新鮮な手術標本を採取し、ＰＢＳで一度洗浄し、組織ブロックをメスで１ｍｍ３の小さなブロックに切ってコラーゲンで処理した培養皿（１００ミリメートル）に敷き、８ｍｌの新鮮な培地を加え、かつ表皮成長因子を加え、最終濃度を１０ｎｇ／ｍｌとする。
【００４１】
２．２日培養した後に新鮮な培地に取り替えてから、３日毎に新鮮な培地に取り替える。
【００４２】
３．培養皿においてクローン細胞が生じたことを観察した後、ＰＢＳで細胞を一度洗浄し、０．２５％のパンクレアチンをクローン細胞に滴下し、インキュベータに１ｍｉｎ放置してから取り出し、ピペットで新鮮な培地を吸い上げて消化されたクローン細胞を洗い流して吸い出し、１２ウェルプレートに転移して培養し続ける。
【００４３】
４．１２ウェルプレートにおいて細胞が一面に生じてから、６ウェルプレートに移し替え、一面に成長してから１０ｃｍの培養皿に広げる。
【００４４】
５．１×１０７個の細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの皮下に接種し、約４５日後に著しい瘤腫が生じてから、瘤腫を取り出しヒト肝臓がん組織の培養方法に従って培養し続けてＨＬＣＺ０１細胞を得る。
【００４５】
ＲＴ−ＰＣＲにより、本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１には肝細胞特異遺伝子ＡＬＢとＡＡＴが含まれていることが検出された。具体的な過程は以下のとおりである。
【００４６】
ヒト肝臓がん細胞系Ｈｕｈ７、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１及びチャイニーズハムスター卵巣細胞系ＣＨＯ（アメリカＡＴＣＣから購入されたもの）を、各種の細胞がそれぞれ二つのウェルを占めるように６ウェル型細胞培養プレートに敷き（３０万／ウェル）、２４ｈ培養した後、三種類の細胞をそれぞれ一つのウェルから採取し、ＴＲＩＺＯＬで細胞の総ＲＮＡを抽出し、そして１μｇの総ＲＮＡを採集してｃＤＮＡに逆転写し、１μＬのｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行ってＡＬＢとＡＡＴ遺伝子を増幅した。増幅した結果は図１に示すとおりである。図１から分かるように、ヒト肝臓がん細胞系Ｈｕｈ７とヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１のいずれにも肝細胞特異遺伝子ＡＬＢとＡＡＴが増幅される一方、非肝臓がん細胞系ＣＨＯではこの二種の遺伝子は増幅されない。
【００４７】
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにより、本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１に肝細胞特異タンパク質ＡＬＢとＡＡＴを発現できることが実証された。具体的な過程は以下のとおりである。
【００４８】
上記６ウェル型細胞培養プレートにおける余剰の三つのウェル中の三種類の細胞を採取し、ＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒで細胞を溶解し、細胞溶解液を氷の上に１５ｍｉｎ放置してから、１３０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ（４℃）遠心させ、上澄みを採取して新たなＥＰ管に転移し、Ｌｏｗｒｙ法でタンパク質濃度を測定し、それぞれ５０μｇのタンパク質を採取してポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行う。そしてポリアクリルアミドゲル上のタンパク質をＰＶＤＦフィルムに移し替え、最後にＡｎｔｉ−ＡＬＢとＡｎｔｉ−ＡＡＴ一次抗体及びＨＲＰラベル付き二次抗体で各タンパク質サンプルにおけるＡＬＢとＡＡＴの発現を検出した。結果は図２に示すとおりであり、図２から分かるように、ヒト肝臓がん細胞系Ｈｕｈ７とＨＬＣＺ０１の細胞のいずれにもＡＬＢとＡＡＴタンパク質が発現している一方、非肝臓がん細胞系ＣＨＯにはこの二種のタンパク質が発現していない。
【００４９】
以上の実験により、本発明において選別して得たヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は肝細胞特異遺伝子ＡＬＢとＡＡＴを含むだけでなく、肝細胞特異タンパク質ＡＬＢとＡＡＴを発現することもできるのが実証された。
【００５０】
上記本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１について染色体核型分析を行ったが、当該染色体核型分析はアメリカＡＴＣＣによる動物細胞系の染色体核型分析方法を参考とする。検出に送られる細胞について一般方法で継代させ、それぞれＰ２、Ｐ４、Ｐ７世代の細胞（１０００個の中期分裂細胞）について染色体調製を行い、一般的な核型染色体計数を行い、染色体分布頻度を計算し、Ｇバンドに染色して観察し、ＣＣＤで結像しＶｉｄｅｏＴｅｓｔ−Ｋａｒｙｏ ３．１ソフトウェアにより核型分析を行う。
【００５１】
本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１において、染色体核型分析の結果から、染色体数が５４〜６３であることが分かり、その分布頻度は図１２に示すとおりである。
【００５２】
本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１において、ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１について染色体Ｇバンド核型分析を行ったところ、それに染色体異数化現象が存在することが明らかになり、且つ細胞核型に一つのマーカー染色体が現れた。そのうち最も典型的な三組の染色体（２ｎ＝５４、２ｎ＝５９、２ｎ＝６３の三組の染色体）核型分析を例とし、その分析結果は図１３〜図１５に示すとおりであり、図１３〜図１５から分かるように、いずれの細胞核型にも一つのマーカー染色体が現れた。
【００５３】
応用実施例１：ＨＬＣＺ０１が肝炎ウイルスＨＣＶに感染した場合。
【００５４】
１．本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１及び従来のＨｕｈ７．５を６ウェル型細胞培養プレートに敷き（２０万／ウェル）、２４ｈ後に培地を２％のＦＢＳのみを含む培地に取り替え、ＭＯＩ＝０．２のＪＦＨ１ウイルスで細胞を感染させ、２４ｈ後に新鮮な完全培地に取り替えて、細胞をそれぞれ１日、２日、３日及び６日培養し、対応する時点でＴＲＩＺＯＬにより二種の細胞の総ＲＮＡを抽出する。そして１μｇの総ＲＮＡを採集してｃＤＮＡに逆転写し、１μＬのｃＤＮＡをテンプレートとして定量ＰＣＲを行って、二種の細胞におけるＨＣＶのＲＮＡレベルを検出し、結果は図３に示すとおりである。
【００５５】
２．    ３日感染した後の上記ヒト肝臓がん細胞系の一部を別途採集して６０ｍｍの培養皿中のカバーガラスに敷き、３日培養し続ける。１×ＰＢＳにより細胞を二度洗浄した後、アイスアセトンで上記の二種のヒト肝臓がん細胞系を８ｍｉｎ固定した。毎回の５ｍｉｎ間において、１×ＰＢＳで固定した後に前記ヒト肝臓がん細胞系が生じたカバーガラスを３度洗浄し、羊血清を室温で３０ｍｉｎ密閉する。そしてＡｎｔｉ−ＮＳ５Ａ一次抗体を加えて１ｈ培養し、１×ＰＢＳにより３度洗浄してからＦＩＴＣにマーキングされた二次抗体を加えて１ｈ培養し、１×ＰＢＳにより３度洗浄してからＤＡＰＩで封止し、最後に蛍光顕微鏡で観察し、結果は図４に示すとおりであり、図４から、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１の細胞からウイルスタンパク質ＮＳ５Ａを検出できることがさらに証明された。
【００５６】
以上から分かるように、ＨＣＶでＨＬＣＺ０１細胞を感染させてから、蛍光定量ＰＣＲにより細胞におけるＨＣＶのＲＮＡレベルを検出し、及び免疫蛍光により細胞におけるウイルスタンパク質の発現を検出することで、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は肝炎ウイルスＨＣＶ（ＪＦＨ１）に感染し得ることがさらに証明された。これにより、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は肝炎ウイルスＨＣＶ感染を維持する細胞モデルとして応用することができ、ＨＣＶウイルス感染を維持する動物モデルの確立における応用も可能であり、さらにＨＣＶ肝炎ウイルス用の抗ウイルス薬の調製、選別又は評価に用いることもできる。
【００５７】
本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１を、肝炎ウイルス（上記Ｃ型肝炎ウイルス）感染を維持する細胞モデルとして応用する場合は図３及び図４に示すとおりである。
【００５８】
本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１を、上記Ｃ型肝炎ウイルス感染を維持する動物モデルの確立に応用する場合は図８に示すとおりであり、図８は本実施例においてヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１によるヒト化マウスがＣ型肝炎ウイルスに感染した後、マウス血清におけるウイルスの含有量が感染時間に従って変化する曲線である。
【００５９】
本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１はさらにＣ型肝炎ウイルス用の抗ウイルス薬の調製、選別又は評価に用いることもできる。発明者らによる実験から、上記Ｃ型肝炎ウイルスで当該ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１を感染させた後、現在Ｃ型肝炎を治療するための薬物――α−インターフェロンはＣ型肝炎ウイルスに感染した当該ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１内のウイルスの含有量を低減できることが明らかになり（図１０参照）、図１０はＨＬＣＺ０１細胞におけるＣ型肝炎ウイルスの含有量がインターフェロンの使用量及び処理時間に従って変化する関係を示し、このことから分かるように、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１はＣ型肝炎ウイルス用の抗ウイルス薬の調製、選別又は評価に用いることができる。
【００６０】
応用実施例２：ＨＬＣＺ０１が肝炎ウイルスＨＢＶに感染した場合。
【００６１】
本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１を６０ｍｍの培養皿に敷き、２４ｈ後に培地（ＤＭＥＭ培地）をＨｅｐａＧ２．２．１５細胞上澄みに取り替えて完全培地と（１：１の体積比で）混合し、５日培養し続ける。５日後に細胞を継代させ、正常培地に取り替えて培養し、３日毎に継代させる時に一部の細胞を採集して総細胞ＤＮＡを抽出する。テンプレートとして第４６日に抽出したＤＮＡを採集して定量ＰＣＲを行って、ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１細胞におけるＨＢＶの含有量を検出し、結果は図５に示すとおりであり、図５から分かるように、ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１にはＨＢＶが検出され得る。
【００６２】
以上から分かるように、ＨＢＶでＨＬＣＺ０１細胞を感染させてから、蛍光定量ＰＣＲにより細胞におけるＨＢＶの含有量レベルを検出することによって、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は肝炎ウイルスＨＢＶ（ＨｅｐａＧ２．２．１５細胞内に由来するＢ型肝炎ウイルス）に感染し得ることがさらに実証された。これにより、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は肝炎ウイルスＨＢＶ感染を維持する細胞モデルとして応用することができ、ＨＢＶウイルス感染を維持する動物モデルの確立における応用も可能であり、さらにＨＢＶ肝炎ウイルス用の抗ウイルス薬の調製、選別又は評価に用いることもできる。
【００６３】
本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１を肝炎ウイルス（上記Ｂ型肝炎ウイルス）感染を維持する細胞モデルとして応用する場合は図５に示すとおりである。
【００６４】
本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１はさらにＢ型肝炎ウイルス用の抗ウイルス薬の調製、選別又は評価に用いることもできる。発明者らによる実験から、上記Ｂ型肝炎ウイルスで当該ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１を感染させた後、現在Ｂ型肝炎を治療するための薬物――α−インターフェロンはＢ型肝炎ウイルスに感染した当該ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１内のウイルスの含有量を低減できることが明らかになり（図９参照）、図９はＨＬＣＺ０１細胞におけるＢ型肝炎ウイルスの含有量がインターフェロンの使用量及び処理時間に従って変化する関係を示し、このことから分かるように、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１はＢ型肝炎ウイルス用の抗ウイルス薬の調製、選別又は評価に用いることができる。
【００６５】
応用実施例３：ＨＬＣＺ０１が同時に肝炎ウイルスＨＢＶとＨＣＶに感染した場合。
【００６６】
１．ＨＢＶ（応用実施例２におけるＨＢＶ）で５３日感染させた後のＨＬＣＺ０１細胞を採集して６ウェル型細胞培養プレートに敷き（２０万／ウェル）、それと同時にＨＢＶに感染していないＨＬＣＺ０１細胞を採集して６ウェル型細胞培養プレートに敷き（２０万／ウェル）、２４ｈ後に完全培地を２％のＦＢＳのみを含む培地に取り替え、ＭＯＩ＝０．２のＪＦＨ１ウイルスで前記の二種のＨＬＣＺ０１細胞（ＨＢＶに感染され及びＨＢＶに感染されていない二種の細胞）を感染させる。２４ｈ後に新鮮な完全培地に取り替え、細胞をそれぞれ１日、２日、３日及び６日培養し、対応する時点でＴＲＩＺＯＬにより細胞総ＲＮＡを抽出し、そして１ｕｇの総ＲＮＡを採集してｃＤＮＡに逆転写し、１ｕＬのｃＤＮＡをテンプレートとして定量ＰＣＲを行って、細胞におけるＨＣＶのＲＮＡレベルを検出し、結果は図６に示すとおりである。図６から分かるように、二種のＨＬＣＺ０１細胞におけるＨＣＶの含有量はいずれも感染時間に従って増加した一方、ＨＢＶに感染したＨＬＣＺ０１細胞におけるＨＣＶの含有量は感染しなかったＨＬＣＺ０１細胞より低い。
【００６７】
２．ＨＢＶに感染したＨＬＣＺ０１細胞を採取し、上記方法によりＨＣＶで６日感染させ、アセトンで細胞を固定し、それぞれＨＢＶコアタンパク質抗原及びＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質に対する抗体で細胞における肝炎ウイルスを検出し、結果は図７に示すとおりである。図７から分かるように、ＨＬＣＺ０１細胞はＨＢＶとＨＣＶの二種のウイルスタンパク質を検出でき、また同一のＨＬＣＺ０１細胞で二種のウイルスタンパク質を検出できる。
【００６８】
以上から分かるように、ＨＢＶとＨＣＶで同時にＨＬＣＺ０１細胞を感染させてから、蛍光定量ＰＣＲにより細胞におけるＨＢＶとＨＣＶのＲＮＡレベルを検出し、及び免疫蛍光により細胞におけるウイルスタンパク質の発現を検出することによって、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は同時に肝炎ウイルスＨＢＶ（ＨｅｐａＧ２．２．１５細胞内に由来するＢ型肝炎ウイルス）及びＨＣＶ（ＪＦＨ１）に感染し得ることがさらに実証された。これにより、本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１は肝炎ウイルスＨＢＶとＨＣＶによる同時感染を維持する細胞モデルとして応用することができ、ＨＢＶとＨＣＶウイルスによる同時感染を維持する動物モデルの確立における応用も可能であり、さらに同時にＨＢＶとＨＣＶ肝炎ウイルスに抗する薬物の調製、選別又は評価に用いることもできる（図６〜図１０参照）。
【００６９】
応用実施例４：ＨＬＣＺ０１の抗腫瘍薬の調製、選別又は評価における応用。
【００７０】
図１１は、現在ＩＩ段階の臨床試験に用いる薬物ＴＲＡＩＬが当該ＨＬＣＺ０１細胞を誘導して死亡させ得る実験データを提供しており、これから分かるように、本実施例によるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１はさらに抗腫瘍薬の調製、選別又は評価に用いることもできる。
【００７１】
以上の応用実施例の検出結果をまとめて見ると、本発明において確立された細胞系ＨＬＣＺ０１はヒト肝臓がん細胞系であり、当該ヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１はＨＢＶやＨＣＶに（同時に）感染し得ることが有力に証明されたが、ＨＢＶは実施例２におけるＨｅｐａＧ２．２．１５細胞由来のＨＢＶに限らず、ＨＣＶも２ａ型ＨＣＶ由来のＪＦＨ１感染に限らない。本発明にかかるヒト肝臓がん細胞系ＨＬＣＺ０１の確立によれば、ＨＢＶとＨＣＶ等の肝炎ウイルス学、肝臓がん腫瘍学及び他の研究に対して有力なツールを提供し、幅広い応用価値及び応用の将来性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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