(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ポットでの反応にて酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの少なくとも一方を酵素的に再生するためのプロセスであって、
同一の反応バッチ内で進行する、さらに少なくとも２つの、酵素学的に触媒された酸化還元反応（生成物形成反応）の結果として、この酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨが還元型（ＮＡＤＨ）にて堆積し、この酸化還元補因子ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨが酸化型（ＮＡＤＰ＋）にて堆積し、
ａ）ＮＡＤＨをその元々の酸化型へ変換する再生反応において、酸素またはピルビン酸がそれぞれＮＡＤＨオキシダーゼまたは乳酸脱水素酵素によって還元され、
ｂ）ＮＡＤＰ＋をその元々の還元型へ変換する再生反応において、２−プロパノールまたはリンゴ酸がそれぞれアルコールデヒドロゲナーゼまたはリンゴ酸デヒドロゲナーゼによって酸化される、プロセス。
【請求項２】
酸化反応および還元反応が同一の分子骨格に対して行われる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記酸化反応および前記還元反応が時間的に並行して進行する、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記ＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨへ変換する前記再生反応において、２−プロパノールが、アルコールデヒドロゲナーゼによってアセトンへ酸化される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記ＮＡＤＨをＮＡＤ＋へ変換する前記再生反応において、ピルビン酸が、乳酸デヒドロゲナーゼによって乳酸へ還元される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記ＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨへ変換する前記再生反応において、リンゴ酸が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼによってピルビン酸およびＣＯ２へ酸化される、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
一般式ＩＩＩ
【化１】
0006329086.tif 000019
の化合物に対して、前記同一の反応バッチ内において、少なくとも１つの酸化反応および少なくとも１つの還元反応をそれぞれ行うために使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセスであって、
ここで、Ｒ４は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
Ｒ５は、水素、ヒドロキシ基、オキソ基またはメチル基を示し、
Ｒ６は、水素またはヒドロキシ基を示し、
Ｒ７は、水素、−ＣＯＲ１３（ここで、Ｒ１３は、非置換であるかまたはヒドロキシ基で置換されているＣ１−Ｃ４アルキル基、あるいは、非置換であるかまたは置換されているＣ１−Ｃ４カルボキシアルキル基である。）を示し、
または、Ｒ６およびＲ７は一緒になってオキソ基を示し、
Ｒ８は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
Ｒ９は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
Ｒ１０は、水素、メチル基、またはハロゲンを示し、
Ｒ１１は、水素、メチル基、ヒドロキシ基、オキソ基またはハロゲンを示し、そして
Ｒ１２は、水素、ヒドロキシ基、オキソ基またはメチル基を示し、
ここで、下記構造要素
【化２】
0006329086.tif 000020
は、ベンゼン環、あるいは６個の炭素原子および０〜２個のＣ−Ｃ二重結合を含んでいる環を示す、プロセス。
【請求項８】
Ｒ７は−ＣＯＲ１３を示し、ここで、Ｒ１３はヒドロキシ基で置換されているＣ１−Ｃ４カルボキシアルキル基である、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
一般式ＶＩＩ
【化３】
0006329086.tif 000021
のデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を一般式ＶＩＩＩ
【化４】
0006329086.tif 000022
のテストステロンへ変換するために使用される、請求項７または８に記載のプロセス。
【請求項１０】
請求項７に記載のプロセスであって、
一般式ＩＶ
【化５】
0006329086.tif 000023
の３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（チエノデオキシコール酸）の、
一般式Ｖ
【化６】
0006329086.tif 000024
のケトリトコール酸への酸化、および
引き続く、一般式ＶＩ
【化７】
0006329086.tif 000025
の３α，７β−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（ウルソデオキシコール酸）への還元
による酵素的なエピマー化に使用され、
対称性の２つの立体特異性のヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いる、プロセス。
【請求項１１】
前記酸化反応が、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによって触媒されるか、および／または、前記還元反応が、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ由来の７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによって触媒される、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
３つの立体特異性のヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用い、該３つのうちの２つが対称性の立体特異体である、請求項７に記載のプロセスであって、
一般式ＩＸ
【化８】
0006329086.tif 000026
の３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸（コラン酸）の、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの反応を介する酵素的なエピマー化に使用される、プロセス：
（Ａ）酸化によって、一般式Ｘ
【化９】
0006329086.tif 000027
の３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸（１２−オキソ−ＣＤＣ）を得、上記１２−オキソ−ＣＤＣが、さらに反応されて一般式ＸＩ
【化１０】
0006329086.tif 000028
の３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸（１２−オキソ−ＫＬＣ）を得、そして、引き続く還元によって一般式ＸＩＩ
【化１１】
0006329086.tif 000029
の立体異性体ヒドロキシ化合物３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸（１２−ケト−ウルソデオキシコラン酸）を得る、反応；
（Ｂ）酸化によって、一般式ＸＩＩＩ
【化１２】
0006329086.tif 000030
の３α，１２α−ジヒドロキシ−７−オキソ−５β−コラン酸を得、引き続く酵素的な酸化によって、一般式ＸＩ
【化１３】
0006329086.tif 000031
の３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸（１２−オキソ−ＫＬＣ）を得、そして、引き続く還元によって一般式ＸＩＩの立体異性体ヒドロキシ化合物３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸（１２−ケト−ウルソデオキシコラン酸）を得る、反応；
（Ｃ）酸化によって、一般式ＸＩＩＩの３α，１２α−ジヒドロキシ−７−オキソ−５β−コラン酸を得、引き続く酵素的な還元によって、一般式ＸＩＶ
【化１４】
0006329086.tif 000032
の３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸を得、そして、引き続く酸化によって一般式ＸＩＩの立体異性体ヒドロキシ化合物３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸（１２−ケト−ウルソデオキシコラン酸）を得る、反応。
【請求項１３】
Ｃ５糖またはＣ６糖の異性化に使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
ソルビトールへの還元、引き続くフルクトースへの酸化を介したグルコースの異性化に使用される、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
生成物の形成に関与する前記酸化反応の基質が、前記反応バッチにおいて、少なくとも５％（ｗ／ｖ）またはそれよりも多い濃度で提供される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１６】
生成物の形成に関与する前記酸化反応の基質が、前記反応バッチにおいて、少なくとも７％（ｗ／ｖ）またはそれよりも多い濃度で提供される、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
生成物の形成に関与する前記酸化反応の基質が、前記反応バッチにおいて、少なくとも９％（ｗ／ｖ）またはそれよりも多い濃度で提供される、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記生成物形成反応において、７０％以上のターンオーバーが達成される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記生成物形成反応において、９０％以上のターンオーバーが達成される、請求項１８に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、酸化還元補因子であるNAD+/NADHおよびNADP+/NADPHを１ポットでの反応において酵素的に再生するためのプロセスに関する。ここで、同一の反応バッチ内で進行する、少なくとも２つのさらなる酵素学的に触媒された酸化還元反応（生成物形成反応）の結果として、この２つの酸化還元補因子はそれぞれその一方がその還元型形態で蓄積し、他方がその酸化型形態で蓄積する。
【０００２】
［背景技術］
酵素学的に触媒された酸化還元反応は、工業的な操作において使用されており、例えば、キラルアルコール、α−アミノ酸およびα−ヒドロキシ酸の生産に使用されている。工業的な酸化還元反応に使用される酵素の大部分が、補因子（例えばＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）を使用する。酵素的な酸化還元反応の中で、酸化還元補因子がインサイチュでの補因子再生系によって復元されていることは、特に興味深い。その理由は、高価な補因子（NAD(P)+/NAD(P)H）を触媒量にのみ使用することが可能であるからである。好適なデヒドロゲナーゼおよび他の酵素の利用可能性は、種々の補因子再生系の発達を生み出している。
【０００３】
現在までに記載されている再生系は、以下のように分類され得る：酵素連結型、基質連結型、インビボ（生物における天然の補因子再生系）、光化学、化学または電気酵素。本明細書中に記載されているプロセスは、酵素連結型の再生系に関する。酵素連結型の系の利点は、高度な選択性、種々の生成物の生成への応用性、補因子の再利用率の高さ（総ターンオーバー数；ＴＴＮ）である。
【０００４】
１９９０年代の半ばにおいて、酵素連結型の補因子再生系を用いる第１の工業的プロセスがトンの規模で利用された。このプロセスにおいて、Candida boidiniiに由来するギ酸デキドロゲナーゼが使用された。公知の工業的なプロセスはまだ、精製物の合成のための酸化還元酵素および補因子再生のためのさらなる酵素を使用する。
【０００５】
精製物の形成に関与する２つ以上の酵素的な酸化還元反応および補因子再生のための２つの酵素系が、（並行してまたは連続的に）中間体が単離されることなく１つの反応バッチ内で進行するプロセスは、それらから区別されなければならない。近年、このような酵素カスケード反応（本明細書中で１ポットでの反応といわれる。）は、顕著な注意が払われてきた。なぜなら、これらは、操作費用、操作時間および環境への影響を効果的に低減させるからである。さらに、酸化還元反応の酵素カスケードは、慣用的な化学法によって実行するのが容易でないトランスフォーメーションを容易にする。
【０００６】
しかし、これは、１ポットでの反応におけるいくつかの反応（酸化および還元）を補因子再生と並行して行うチャレンジである。なぜなら、高度に多様化した反応条件がいくつかのトランスフォーメーションにしばしば要求されるからである。今までに、関連する補因子再生系を用いる酸化反応および還元反応を含む１ポットでの試みがなされたのは非常に少数である。
【０００７】
文献（Advanced Synth. Catal., 2008, Volume 351, Issue 9, p. 1303-1311）には、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）、７β−ＨＳＤＨおよび１２α−ＨＳＤＨを用いる１ポットでの反応の実験が記載されている。このプロセスにおいて、位置選択的および立体選択的に、コール酸の７位および１２位で酸化が行われ、引き続いて、位置選択的および立体選択的に、７位で還元が生じた。このプロセスにおいて、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋依存性）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）の両方が、補因子再生系として使用された。ピルビン酸およびグルコースが、補基質として使用された。このプロセスは元々本当の１ポットプロセスを目的としていたが、最終的に、酸化反応および還元反応が別々に行われた。そのように行う際に、酸化工程および還元工程の区切りが、いわゆる「ティーバッグ」リアクターまたは膜リアクターのいずれかで起こった。このような区切りは、ＮＡＤＰＨ−グルコースデヒドロゲナーゼの補因子選択性が低いことに起因する二重生成物（byproduct）の生成を避けるために必要である。しかし、１ポットでの反応において、グルコースデヒドロゲナーゼもまたＮＡＤＰ＋を、酸化を妨げるＮＡＤ＋へ部分的に変換した。記載されたプロセスにおいて、わずか１２．５ｍＭ（約０．５％）の基質コール酸が使用されており、このことは、経済性の観点から興味深くないプロセスにしてしまう。
【０００８】
さらに、中間体としてのプロキラルなケトンを介して二級アルコールのラセミ化合物の脱ラセミ化を１ポット系を用いて行う試みが記載されている（J. Am. Chem. Soc., 2008, Volume 130, p. 13969-13972）。二級アルコールの脱ラセミ化は、異なる補因子特異性を有する２つ（Ｓ特異的およびＲ特異的）のアルコールデヒドロゲナーゼを介して実現された。この系において、ＮＡＤＰは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（過酸化水素産生）によって再生され、ＮＡＤＨは、ギ酸デヒドロゲナーゼによって再生された。ギ酸および酸素は、補基質として使用された。この系において、４つの酵素が、酸化工程および還元工程の区切りを用いることなく使用された。このプロセスの難点は、用いた基質の濃度（０．２〜０．５％）が非常に低いことであり、これは工業目的に不適切である。
【０００９】
さらなる１ポット系が、ＷＯ２００９／１２１７８５Ａ２に記載されている。このプロセスにおいて、光学的に活性な二級アルコールの立体異性体が酸化されてケトンになり、次いで、還元されて対応する光学的対称物になる。反対の光学的立体選択性および異なる補因子特異性を有する２つのアルコールデヒドロゲンーゼが使用された。これらの補因子は、たった一つのさらなる酵素を用いて、いわゆる水素移動系（hydride-transfer system）によって再生された。これらの補因子を再生するために、種々の酵素（例えば、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ）が使用された。このプロセスの難点は、用いた基質の濃度が低いことである。
【００１０】
公知の補因子再生系を含むこの酵素的な１ポット法の難点は、用いた基質の濃度が非常に低いことであり、これは工業目的に不適切である。
【００１１】
対照的に、多くの工業的な酵素的酸化還元反応がすでに知られており、これは、補因子再生系が使用されている。微生物全体、細胞溶解物または単離された酵素を用いる、ＮＡＤ（Ｐ）ＨまたはＮＡＤ（Ｐ）＋の再生が同時に起こる実験が記載されている。工業的な酸化還元反応のための公知の酵素的な補因子再生系としては、例えば以下が挙げられる：ＮＡＤＨについてのギ酸デヒドロゲナーゼ（補基質としてのギ酸）、ＮＡＤＨについてのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．由来）（補基質としての２−プロパノール）、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨについてのヒドロゲナーゼ（補基質としてのＨ２）、ＮＡＤＰＨについてのグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来）（補基質としてのグルコース−６−ホスフェート）、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨについてのグルコースデヒドロゲナーゼ（補基質としてのグルコース）、ＮＡＤＨについてのＮＡＤＨオキシダーゼ（補基質としてのＯ２）、および、ＮＡＤＨについてのホスフィートデヒドロゲナーゼ（補基質としてのホスフィート）。
【００１２】
このような工業的酸化還元反応の使用例は、キラルなヒドロキシ化合物の生産であり、好適なプロキラルなケト化合物から開始される。このプロセスにおいて、補因子は、さらなる酵素によって再生される。これらの方法は、分離された還元反応を構成しかつNAD(P)Hを再生する点で共通している。（例えば、ＥＰ  １  １５２  ０５４参照）。
【００１３】
より高い基質濃度（約１％以上）で進行する補因子再生系と一体となった、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを使用する酵素的なプロセスが、記載されている（ＥＰ  １  ７３１  ６１８；ＷＯ２００７/１１８６４４；Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011 Volume 90 p. 127-135）。これらのプロセスにおいて、補因子ＮＡＤ（Ｐ）ＨまたはＮＡＤ（Ｐ）は、異なる酵素（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（補基質としてのピルビン酸）、Ｔ．ｂｒｏｃｋｉｉ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（補基質としてのイソプロパノール）、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｍｉｎｏｒ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃａｒｎｏｓｕｍ、Ｔ．ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉに由来するアルコールデヒドロゲナーゼによって再生された。しかし、これらの公知のプロセスは、単に、ヒドロキシ化合物の酸化またはオキソ化合物の還元のための分離された単一の反応に関連するのみである。
【００１４】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（リンゴ酸酵素）を用いる、ＮＡＤＨについての補因子再生系がすでに記載されている（Can. J. Chem. Eng. 1992, Volume 70, p. 306-312）。これは、この刊行物において、アラニンデヒドロゲナーゼによるピルビン酸の還元アミン化のために使用された。補因子再生の間のピルビン酸新生は、引き続いて生成物形成反応に使用された。
【００１５】
ＷＯ２００４/０２２７６４において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨの再生が同様に記載されている。以前に記載された刊行物と異なって、リンゴ酸の酸化的な脱カルボキシル化の間に新生するピルビン酸はさらに使用されていない。
【００１６】
補因子再生系を含む、Ｄ−キシロースのキシリトールへの酵素的還元の例が記載されている（FEBS J., 2005, Volume 272, p. 3816- 3827）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ.由来のホスフィートデヒドロゲナーゼのＮＡＤＰＨ依存性変異体が、補因子再生酵素として使用された。これもまた、生成物の生産のための単一の反応である。
【００１７】
キラルな鏡像異性的に富化された有機化合物（例えば、アルコールまたはアミノ酸）の酵素的生産のさらなる例が記載されている（Organic Letters, 2003, Volume 5, p. 3649-3650;ＵＳ  ７，１６３，８１５；Biochem. Eng. J., 2008, Volume 39(2) p. 319-327；ＥＰ  １  ２８５  ９６２）。これらの系において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓに由来するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性オキシダーゼが、補因子再生酵素として使用された。この試みも同様に、生成物の形成のための単一の反応を構成する。
【００１８】
ＷＯ２０１１/０００６９３に、４−アンドロステン−３，１７−ジオンの１７位での酸化還元反応の実行を可能にする１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびプロセスが記載されている。これもまた、分離された還元反応である。上述した工業的に進行する酸化反応または還元反応は、１ポットでの反応の利点（例えば、時間及び材料の節約の結果としての費用対効果、および酵素カスケード反応に起因する良好なターンオーバー）を欠いている。
【００１９】
［詳細な説明］
本発明の目的は、１つの反応バッチにおいて経済的な様式にて酵素学的に触媒された２つ以上の酸化還元反応を行うために、酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの少なくとも一方（例えばＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ）を再生するためのプロセスを提供することにある。
【００２０】
本発明に従えば、上記目的は、最初に述べた種類のプロセスにて達成され、１ポットでの反応にて酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの少なくとも一方（特にＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ）を酵素的に再生するためのプロセスが提供される。本プロセスにおいて、同一の反応バッチ内で進行する、さらに少なくとも２つの、酵素学的に触媒された酸化還元反応（生成物形成反応）の結果として、この２つの酸化還元補因子の一方が還元型にて堆積し、もう一方が酸化型にて堆積し、本プロセスは、
ａ）還元された上記補因子をその元々の酸化型へ変換する再生反応において、酸素または一般式Ｉの化合物
【００２１】
【化１】
0006329086.tif 000002
【００２２】
（ここで、Ｒ１は直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または（Ｃ１−Ｃ４）カルボキシアルキル基を示す。）
が還元され、
ｂ）酸化された上記補因子をその元々の還元型へ変換する再生反応において、（Ｃ４−Ｃ８）シクロアルカノールまたは一般式ＩＩの化合物
【００２３】
【化２】
0006329086.tif 000003
【００２４】
（ここで、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（ここで、アルキルは直鎖または分枝鎖である。）、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル（ここで、アルケニルは直鎖または分枝鎖でありかつ１〜３個の二重結合を含んでいる。）、アリール（特に、Ｃ６−Ｃ１２アリール）、カルボキシル、および（Ｃ１−Ｃ４）カルボキシアルキル（特にシクロアルキル（例えば、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル）からなる群より選択される。）
が酸化されることによって特徴付けられる。
【００２５】
本発明に従って提供されるプロセスは、本明細書中において、本発明に従うプロセス（本発明のプロセス）ともいう。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、１ポットでの反応にて酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの少なくとも一方（例えばＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ）を酵素的に再生するための本発明に従うプロセスを提供する。本プロセスにおいて、
同一の反応バッチ内で進行する、さらに少なくとも２つの、酵素学的に触媒された酸化還元反応（生成物形成反応）の結果として、この２つの酸化還元補因子の一方がその還元型にて堆積し、もう一方がその酸化型にて堆積し、
ａ）上記酸化された補因子の再生の間に、一般式Ｉの化合物
【００２７】
【化３】
0006329086.tif 000004
【００２８】
（ここで、Ｒ１は置換または非置換の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基を示す。）
が還元され、
ｂ）上記還元された補因子の再生の間に、一般式ＩＩの化合物
【００２９】
【化４】
0006329086.tif 000005
【００３０】
（ここで、Ｒ２およびＲ３は互いに独立して、
１）Ｈ、
２）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（ここで、アルキルは直鎖または分枝鎖である。）、
３）（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル（ここで、アルケニルは直鎖または分枝鎖であり、必要に応じて二重結合を３個まで含んでいる。）、
４）シクロアルキル（特に、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル）、
５）アリール（特に、Ｃ６−Ｃ１２アリール）、
６）（Ｃ１−Ｃ４）カルボキシアルキル（特に、一般式Ｉの化合物がピルビン酸である場合）、および、必要に応じて、カルボキシル
からなる群より選択される。）
が酸化される。
【００３１】
さらなる局面では、本発明に従うプロセスにおいて、Ｒ２およびＲ３は互いに独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（ここで、アルキルは直鎖または分枝鎖である。）、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル（ここで、アルケニルは直鎖または分枝鎖でありかつ１〜３個の二重結合を含んでいる。）、アリール（特に、Ｃ６−Ｃ１２アリール）、カルボキシル、および（Ｃ１−Ｃ４）カルボキシアルキルからなる群より選択される。
【００３２】
従来技術と比較すると、本発明に従うプロセスは、プロセスの顕著な改善を構成する。
ここで、化合物がどちらも酵素学的に触媒されそして還元される。なぜなら、必要とされる酸化反応および還元反応、ならびに１つの反応バッチ内での補因子再生に関連する反応を実行することが可能となり、同時に、従来技術に従うものよりも顕著に高い基質濃度を使用することが可能となるからである。
【００３３】
本発明に従うプロセスにおいて、補因子ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨが使用される。ここで、ＮＡＤ＋は、ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチドの酸化型を示し、ＮＡＤＨは、ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチドの酸化型を示す。ＮＡＤＰ＋は、ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスフェートの酸化型を示し、ＮＡＤＨは、ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスフェートの還元型を示す。
【００３４】
酵素学的に触媒された酸化還元反応は、補因子再生の一部でなく、本発明に従うプロセスにおいて、生成物の形成に関与し、本明細書中にて「酸化反応」および「還元反応」といわれる。「酸化反応」および「還元反応」は、「生成物形成反応」と要約される。本発明に従うプロセスにおいて、生成物形成反応は、どちらの場合にも、少なくとも１つの酸化反応および少なくとも１つの還元反応を含んでいる。
【００３５】
ＮＡＤ＋が酸化反応の補因子として使用される場合、ＮＡＤＰＨが還元反応の補因子である。ＮＡＤＰ＋が酸化反応の補因子として使用される場合、ＮＡＤＨが還元反応の補因子である。
【００３６】
本発明に従うプロセスにおいて、酸化反応および還元反応が時間的に並行して、または、時間的に連続して実施され得、好ましくは同一の反応バッチ内で時間的に並行して実施される。
【００３７】
生成物を形成する目的で使用される化合物は、本明細書中にて補基質といわれる。補因子再生の間に反応される化合物は、本明細書中で補基質といわれる。
【００３８】
本発明に従うプロセスにおいて、１つの基質およびいくつかの基質が使用され得る。そのように行う際に、還元および／または酸化の反応が、同一の基質(分子骨格）に対して行われ得、異なる基質に対しても行われ得、好ましくは同一の基質である。さらに、本発明に従うプロセスにおいて、還元および／または酸化の反応が、同一または異なる官能基に対して行われ得る。
【００３９】
本発明に従うプロセスは、複数の反応に、例えば、立体特異性のヒドロキシ化合物の、対応するケトンへの酸化、引き続く、対称性の立体特異性のヒドロキシ化合物への還元を介した構造の変換に好適である。
【００４０】
生成物の形成に関与する２つ以上の酵素的な酸化還元反応、および中間体を単離することなく進行する補因子再生のための酵素的な２つの系の、１つの反応バッチ内でのプロセスは、本明細書中で「１ポットでの反応」といわれる。
【００４１】
酸または酸塩の言及は、本明細書中にてそれぞれ言及されていない用語を含む。同様に、酸、特に胆汁酸は、それに由来するエステルの全てを含む。さらに、保護基とともに提供される化合物(部分的）は、潜在的な物質の言及に含まれる。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、酸化反応および還元反応が時間的に並行して進行することによって特徴付けられる。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、酸化反応および還元反応の両方が同一の分子骨格に対して生じることによって特徴付けられる。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、式Ｉの化合物（２−オキソ酸）として、ピルビン酸（補基質）が使用されることによって特徴付けられる。ピルビン酸は、乳酸デヒドロゲナーゼによって還元されて乳酸になる。このことは、還元された補因子がその元々の酸化型へ変換される再生反応において、ピルビン酸が乳酸デヒドロゲナーゼによって乳酸へ還元されることを意味する。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、式ＩＩの化合物（第二級アルコール）として、２−プロパノール（イソプロピルアルコール，ＩＰＡ）（補基質）が使用されることによって特徴付けられる。２−プロパノールは、アルコールデヒドロゲナーゼによって還元されてアセトンになる。このことは、酸化された補因子がその元々の還元型へ変換される再生反応において、２−プロパノールがアルコールデヒドロゲナーゼによってアセトンへ酸化されることを意味する。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、ＮＡＤＨオキシダーゼによって還元される酸素が使用されることによって特徴付けられる。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、第二級アルコールとして、リンゴ酸（補基質）が使用されることによって特徴付けられる。リンゴ酸は、オキサロ酢酸を脱炭酸するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（「リンゴ酸酵素」）によって酸化されてピルビン酸およびＣＯ２になる。例えば、酸化された補因子をその元々の還元型へ変換する再生反応において、リンゴ酸は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼによってピルビン酸およびＣＯ２へ酸化される。
【００４８】
この実施形態において、新生のピルビン酸は、さらなる酸化還元反応において反応される。この反応は、生成物の形成に働かないが第二の補因子再生反応を構成する。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、一般式ＩＩＩ
【００５０】
【化５】
0006329086.tif 000006
【００５１】
の化合物に対して、前記同一の反応バッチ内において、少なくとも１つの酸化反応および少なくとも１つの還元反応をそれぞれ行うために使用されることによって特徴付けられ、
ここで、Ｒ４は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
Ｒ５は、水素、ヒドロキシ基、オキソ基またはメチル基を示し、
Ｒ６は、水素またはヒドロキシ基を示し、
Ｒ７は、水素、−ＣＯＲ１３（ここで、Ｒ１３は、非置換であるかまたはヒドロキシ基で置換されているＣ１−Ｃ４アルキル基、あるいは、非置換であるかまたは(特にヒドロキシ基で）置換されているＣ１−Ｃ４カルボキシアルキル基である。）を示し、
または、Ｒ６およびＲ７は一緒になってオキソ基を示し、
Ｒ８は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
Ｒ９は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
Ｒ１０は、水素、メチル基、またはハロゲンを示し、
Ｒ１１は、水素、メチル基、ヒドロキシ基、オキソ基またはハロゲンを示し、そして
Ｒ１２は、水素、ヒドロキシ基、オキソ基またはメチル基を示し、
ここで、下記構造要素
【００５２】
【化６】
0006329086.tif 000007
【００５３】
は、ベンゼン環、あるいは６個の炭素原子および０〜２個のＣ−Ｃ二重結合を含んでいる環を示し、ここで、好ましくは、生成物の形成に関連する還元反応のための反応バッチにおいて５％（ｗ／ｖ）未満の濃度で基質が提供される。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、一般式ＶＩＩ
【００５５】
【化７】
0006329086.tif 000008
【００５６】
のデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を一般式ＶＩＩＩ
【００５７】
【化８】
0006329086.tif 000009
【００５８】
のテストステロンへの酵素的な変換によって特徴付けられる。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、例えば、対称性の２つの立体特異性のヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いて、一般式ＩＶ
【００６０】
【化９】
0006329086.tif 000010
【００６１】
のヒドロキシステロイド化合物３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（チエノデオキシコール酸，ＣＤＣ）の酵素的なエピマー化が、一般式Ｖ
【００６２】
【化１０】
0006329086.tif 000011
【００６３】
のケトリトコール酸への酸化、および一般式ＶＩ
【００６４】
【化１１】
0006329086.tif 000012
【００６５】
の３α，７β−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（ウルソデオキシコール酸，ＵＤＣ）への還元を介して生じることによって特徴付けられる。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、一般式ＩＸ
【００６７】
【化１２】
0006329086.tif 000013
【００６８】
の３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸（コラン酸）の酵素的なエピマー化に使用されることによって特徴付けられ、上記エピマー化は、例えば、３つの立体特異性のヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いる（該３つのうちの２つが対称性の立体特異体である。）、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの反応あるいは（Ａ）〜（Ｃ）の反応の任意の組合せの反応を介する：
（Ａ）酸化によって、一般式Ｘ
【００６９】
【化１３】
0006329086.tif 000014
【００７０】
の３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸（１２−オキソ−ＣＤＣ）を得、上記１２−オキソ−ＣＤＣが、さらに反応されて一般式ＸＩ
【００７１】
【化１４】
0006329086.tif 000015
【００７２】
の３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸（１２−オキソ−ＫＬＣ）を得、そして、引き続く還元によって一般式ＸＩＩ
【００７３】
【化１５】
0006329086.tif 000016
【００７４】
の立体異性体ヒドロキシ化合物３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸（１２−ケト−ウルソデオキシコラン酸）を得る、反応；
（Ｂ）酸化によって、一般式ＸＩＩＩ
【００７５】
【化１６】
0006329086.tif 000017
【００７６】
の３α，１２α−ジヒドロキシ−７−オキソ−５β−コラン酸を得、引き続く酵素的な酸化によって、一般式ＸＩの３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸（１２−オキソ−ＫＬＣ）を得、そして、引き続く還元によって一般式ＸＩＩの立体異性体ヒドロキシ化合物３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸（１２−ケト−ウルソデオキシコラン酸）を得る、反応；
（Ｃ）酸化によって、一般式ＸＩＩＩの３α，１２α−ジヒドロキシ−７−オキソ−５β−コラン酸を得、引き続く酵素的な還元によって、一般式ＸＩＶ
【００７７】
【化１７】
0006329086.tif 000018
【００７８】
の３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸を得、そして、引き続く酸化によって一般式ＸＩＩの立体異性体ヒドロキシ化合物３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸（１２−ケト−ウルソデオキシコラン酸）を得る、反応。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、Ｃ５糖またはＣ６糖が基質として使用されることを特徴としており、例えば、Ｃ５糖またはＣ６糖の異性化に使用される。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従うプロセスは、グルコースの異性化がソルビトールへの還元およびフルクトースへの酸化を介して生じることを特徴としており、例えば、本プロセスは、ソルビトールへの還元、引き続くフルクトースへの酸化を介したグルコースの異性化に使用される。
【００８１】
本発明に従うプロセスは、好ましくは、水系にて行われ、ここで、酸化反応または還元反応の基質が、懸濁液の形態にて溶解していない状態で、および／または第二の液相として、部分的に提供される。
【００８２】
特定の実施形態において、本発明に従うプロセスは、生成物の形成に関与する酸化反応の基質が、上記反応バッチにおいて、少なくとも５％（ｗ／ｖ）またはそれよりも多い濃度、特に、７％（ｗ／ｖ）またはそれよりも多い濃度、特に、９％（ｗ／ｖ）またはそれよりも多い濃度で提供されることを特徴としており、例えば、５％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）、例えば、５％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）例えば、５％（ｗ／ｖ）〜１２％（ｗ／ｖ）例えば、５％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。
【００８３】
特定の実施形態において、本発明に従うプロセスは、生成物形成反応において、その全体に対して７０％以上、特に９０％以上のターンオーバーが達成されることによって特徴付けられる。
【００８４】
本発明に従うプロセスにおいて、緩衝液が水系に添加され得る。好適な緩衝液は、例えばリン酸カリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびグリシンであり、ｐＨは５〜１０、好ましくは６〜９の範囲を有している。さらに、あるいは代替的に、酵素を安定化させるイオン（例えば、Ｍｇ２＋）または他の添加剤（例えばグリセロール）がこの系に添加され得る。本発明に従うプロセスにおいて、添加される補因子ＮＡＤ（Ｐ）＋およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度は、通常０．００１ｍＭと１０ｍＭとの間であり、好ましくは０．０１ｍＭと１ｍＭとの間である。
【００８５】
使用される酵素に依存して、本発明に従うプロセスは、１０℃〜７０℃の範囲の温度で行われ得、好ましくは２０℃〜４５℃である。
【００８６】
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）は、ヒドロキシ基の、対応するケト基への酸化（逆にいうと、ステロイド骨格でのケト基の、対応するヒドロキシ基への還元）を触媒する酵素であると理解されている。
【００８７】
ヒドロキシステロイドに対する酸化還元反応に使用され得る好適なヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼは、例えば３α−ＨＳＤＨ、３β−ＨＳＤＨ、７α−ＨＳＤＨ、７β−ＨＳＤＨまたは１７β−ＨＳＤＨである。
【００８８】
７α−ＨＳＤＨ活性を有する好適な酵素は、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｂｓｏｎｕｍ，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｉｉ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓから取得され得る。
【００８９】
７β−ＨＳＤＨ活性を有する好適な酵素は、例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｂｓｏｎｕｍから取得され得る。
【００９０】
好適な乳酸デヒドロゲナーゼは、例えば、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓから取得され得る。
【００９１】
好適なアルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒから取得され得る。
【００９２】
好適なキシロースレダクターゼは、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓから取得され得る。
【００９３】
好適なソルビトールデヒドロゲナーゼは、例えば、ヒツジ肝、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＭａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａから取得され得る。
【００９４】
好適なＮＡＤＨオキシダーゼは、例えば、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍから取得され得る。
【００９５】
本発明に従うプロセスにおいて、酵素は、好ましくはＥ．ｃｏｌｉにて組換え的に過剰発現されたタンパク質として使用され、対応する細胞溶解物は、好ましくは任意のさらなる精製を行うことなく使用されるよう続けられる。これにより、酵素単位１Ｕは、毎分１μモルの基質が反応する際に必要とされる酵素量に対応する。
【００９６】
［図面の簡単な説明］
［図１］チエノデオキシコール酸の、中間体３α−ヒドロキシ−７オキソ−５β−コラン酸を介した、ウルソデオキシコール酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
［図２］チエノデオキシコール酸の、中間体３α−ヒドロキシ−７オキソ−５β−コラン酸を介した、ウルソデオキシコール酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、リンゴ酸およびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
［図３］チエノデオキシコール酸の、中間体３α−ヒドロキシ−７オキソ−５β−コラン酸を介した、ウルソデオキシコール酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよび酸素を用いた補因子再生を伴う。
［図４］グルコースのフルクトースへの異性化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
［図５］グルコースのフルクトースへの異性化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよび酸素を用いた補因子再生を伴う。
［図６］コラン酸の、中間体３α，７α−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸および３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸を介した、３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
［図７］コラン酸の、中間体３α，７α−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸および３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸を介した、３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよび酸素を用いた補因子再生を伴う。
［図８］コラン酸の、中間体３α，７α−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸および３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸を介した、３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノール、ピルビン酸および酸素を用いた補因子再生を伴う。
［図９］コラン酸の、中間体３α，７α−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸および３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸を介した、３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノール、ピルビン酸および酸素を用いた補因子再生を伴う。
［図１０］コラン酸の、種々の中間体および補因子再生系を介した、３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へのエピマー化の推定の反応スキームを示す。ＮＡＤ＋の再生には、代替的に乳酸デヒドロゲナーゼ（基質としてピルビン酸）およびＮＡＤＨオキシダーゼ（基質として酸素）が使用された。ＮＡＤＰＨの再生にはアルコールデヒドロゲナーゼ（基質としてイソプロパノール）が使用された。
［図１１］チエノデオキシコラン酸の、中間体  ３α−ヒドロキシ−７オキソ−５β−コラン酸  （７−ケトリトコラン酸＝７Ｋ−ＬＣＡ＝ＫＬＣ）を介した、ウルソデオキシコラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよび２−ペンタノール（いずれの場合も、アルコールデヒドロゲナーゼ）、ならびにピルビン酸（乳酸デヒドロゲナーゼ）および酸素（ＮＡＤＨオキシダーゼ）を用いた補因子再生を伴う。
【００９７】
図中において、以下の略語を使用する：
ＢｓＳＤＨ            Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の
ソルビトールデヒドロゲナーゼ
ＣＡ                  ３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸
７β−ＣＡ            ３α，７β，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸
Ｃａｏｘｏ            Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ由来の
ＮＡＤＨ  オキシダーゼ
ＣＤＣ，  ＣＤＣＡ    ３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸
ＣｔＸＲ              Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来の
キシロースレダクターゼ
７α−ＨＳＤＨ        ７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
７β−ＨＳＤＨ        ７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
１２α−ＨＳＤＨ      １２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
ＫＬＣ                ３α−ヒドロキシ−７−オキソ−５β−コラン酸
７Ｋ−ＬＣＡ          ３α−ヒドロキシ−７−オキソ−５β−コラン酸
ＬａｃＤＨ            乳酸デヒドロゲナーゼ：ＮＡＤ（Ｈ）−依存性
ＬｋＡＤＨ            Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ由来の
アルコールデヒドロゲナーゼ：ＮＡＤＰ（Ｈ）−依存性
Ｌｍｏｘｉｄ          Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来の
ＮＡＤＨオキシダーゼ
ＭａｌＤＨ            Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ
：ＮＡＤＰ（Ｈ）−依存性
７ｏｘｏ−ＣＡ        ３α，１２α−ジヒドロキシ−７−オキソ−５β−コラン酸
１２ｏｘｏ−ＣＤＣ    ３α，７α−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸
１２ｏｘｏ−ＫＬＣ    ３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸
１２ｏｘｏ−ＵＤＣ    ３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸
ＳＩＳＤＨ            ヒツジ肝ソルビトールデヒドロゲナーゼ
ＳｍＯｘｏ            Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来の
ＮＡＤＨオキシダーゼ
ＵＤＣ，  ＵＤＣＡ    ３α，７β−ジヒドロキシ−５β−コラン酸。
【００９８】
以下の実施例において、温度データの全てが摂氏（℃）で与えられ、以下の略語が使用される：
ＥｔＯＡｃ            酢酸エチル
ｈ                    時間（ｓ）
ＩＰＡ                イソプロピルアルコール（２−プロパノール）
ＭｅＯＨ              メタノール
Ｒｔ                  室温。
【００９９】
［実施例］
［実施例１］
乳酸デヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化
０．５ｍＬのチャージは、５０ｍｇ  チエノデオキシコール酸、１２Ｕ  リコンビナント７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、６Ｕ  リコンビナント７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ由来）、ならびに０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋および０．３ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む。ＮＡＤ＋の再生のために、６Ｕ  リコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼおよび３５０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを用いる。ＮＡＤＰＨの再生のために、６Ｕ  リコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ由来）および最初に２．４％（ｗ／ｖ）のＩＰＡを用いる。この反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．８）を２５℃で連続的に振盪（８５０ｒｐｍ）しながら用いる。アセトンの蒸発を容易にするために、そしてウルソデオキシコール酸へ向かう反応のシフトを容易にするために、開放系を使用し続ける。６時間後に１．６％（ｗ／ｖ）  ＩＰＡを、１６時間後に２．４％（ｗ／ｖ）  ＩＰＡを、２４時間後に３．９％（ｗ／ｖ）  ＩＰＡを、４０時間後に０．８％（ｗ／ｖ）  ＩＰＡを、さらに加える。さらに、２４時間後に２０μＬの４−メチル−２−ペンタノールを加える。４６時間後に２００μＬの２−ペンタノールおよび１．６％（Ｗ／ｖ）  ＩＰＡを添加する。４８時間後、反応混合物中の全ての胆汁酸におけるウルソデオキシコール酸の割合は、９７％以上である。
【０１００】
［実施例２］
乳酸デヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化
０．５ｍＬのチャージは、５０ｍｇ  チエノデオキシコール酸、２０Ｕ  リコンビナント７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、２０Ｕ  リコンビナント７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ由来）、ならびに１ｍＭ  ＮＡＤ＋および１ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む。ＮＡＤ＋の再生のために、１０Ｕ  乳酸デヒドロゲナーゼ（Sigma-Aldrich）を用い、反応開始のために、１６．５ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを用いる。ＮＡＤＰＨの再生のために、２０Ｕ  リコンビナントリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）および３２０ｍＭ  リンゴ酸ナトリウムを用いる。反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．８）を２５℃で連続的に振盪（８５０ｒｐｍ）しながら用いる。初期のＣＯ２からの回避を可能にするために、開放系を使用し続ける。２０Ｕの７α−ＨＳＤＨおよび１０Ｕの７β−ＨＳＤＨを、２０時間後、２４時間後、４４時間後および４８時間後に添加する。さらに、１０Ｕのリンゴ酸デヒドロゲナーゼを４０時間後に添加する。７２時間後、反応混合物中の全ての胆汁酸におけるウルソデオキシコール酸の割合は、約９０％である。
【０１０１】
［実施例３］
ＮＡＤＨオキシダーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化
０．５ｍＬのチャージは、５０ｍｇ  チエノデオキシコール酸、１２Ｕ  リコンビナント７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、７．５Ｕ  リコンビナント７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ由来）、ならびに１ｍＭ  ＮＡＤ＋および１ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む。ＮＡＤ＋の再生のために、２０Ｕ  リコンビナントのＮＡＤＨオキシダーゼ（Clostridium aminovalericum由来）を用いる。ＮＡＤＰＨの再生のために、５Ｕ  リコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ由来）および最初に２．４％（ｗ／ｖ）のＩＰＡを用いる。反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．８）を２５℃で連続的に振盪（８５０ｒｐｍ）しながら用いる。アセトンの蒸発を容易にするために、そしてウルソデオキシコール酸へ向かう反応のシフトを容易にするために、開放系を使用し続ける。２％  ＩＰＡを、１８時間後、２２時間後、２６時間後および４１時間後に、そして５％  ＩＰＡを４１時間後および４８時間後に添加する。２０ＵのＮＡＤＨオキシダーゼを、２４時間後に添加し、７．５Ｕの７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび５Ｕのアルコールデヒドロゲナーゼを４１時間後に添加する。４８時間後、反応混合物中の全ての胆汁酸におけるウルソデオキシコール酸の割合は、約９５〜９８％である。
【０１０２】
［実施例４］
胆汁酸の再処理および分析
実施例１〜３に記載された反応が完了すると、反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出する。続いて、蒸発によって溶媒を除去する。蒸発の残余を、ＭｅＯＨ：アセトニトリル：リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝３）が４０：３０：３７の混合物（０．７８ｇ／Ｌ）に溶解し、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸への返還をＨＰＬＣによってモニタリングする。逆相分離カラム（ZORBAX（登録商標）Eclipse（登録商標） XDB C18，流速０．８ｍＬ／分）および光屈折検出器（RID）、Agilent 1260 Infinity（登録商標）（いずれもAgilent Technologies Inc.,）を使用する。
【０１０３】
［実施例５］
ＮＡＤＰＨの再利用のためのアルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤ＋の再利用のための乳酸デヒドロゲナーゼを用いる、キシロースレダクターゼおよびソルビトールデヒドロゲナーゼを介するグルコースのフルクトースへの変換
０．５ｍＬのチャージは、５０ｍｇ／ｍＬ  グルコース、６Ｕ／ｍＬのリコンビナントキシロースレダクターゼ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来；Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）にて過剰発現させる）および０．１ｍＭ  ＮＡＤＰ＋を含む。補因子の再生のために、７％  ＩＰＡおよびリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ由来；Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）にて過剰発現させる）を用いる。これらの酵素を、細胞溶解物の形態にて使用する。反応を、開放系にて、ｐＨ９（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液）、４０℃で連続的に振盪（９００ｒｐｍ）しながら２４時間行う。開放系は、アセトンの蒸発を導き、これは、ソルビトールの形成へ向けて反応を駆動する。この開放系において、水およびＩＰＡもまた蒸発する。その結果、これらは６時間後及び２１時間後に添加される。各時点で、総量０．５ｍＬおよびＩＰＡ濃度（７％（ｖ／ｖ））を調整する。２４時間後、反応容器を、酵素を不活性化しかつ有機溶媒を蒸発させるために、減圧下にて６０℃でインキュベートする。室温への冷却後に、リコンビナントソルビトールデヒドロゲナーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来；Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）にて過剰発現させる）を、最終濃度５Ｕ／ｍＬで添加し、ＺｎＣｌ２を最終濃度１ｍＭで、ＮＡＤ＋を最終濃度０．１ｍＭで添加する。補因子再生系のために、５Ｕ／ｍＬ（最終濃度）の乳酸デヒドロゲナーゼ（ウサギ筋肉由来（Sigma Aldrich））および３００ｍＭピルビン酸を使用する。このチャージを水で０．５ｍＬにする。この反応を、閉鎖系にて４０℃で連続的に振盪（９００ｒｐｍ）しながら２４時間さらに行う。Ｄ−グルコースのＤ−フルクトースへの変換は９０％以上に達する。
【０１０４】
［実施例６］
ＮＡＤＰＨを再利用するためのアルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤ＋を再利用するためのＮＡＤＨオキシダーゼを用いる、キシロースレダクターゼおよびソルビトールデヒドロゲナーゼを介するグルコースのフルクトースへの変換
０．５ｍＬのチャージは、５０ｍｇ／ｍＬ  グルコース、６Ｕ／ｍＬのリコンビナントキシロースレダクターゼ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来；Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）にて過剰発現させる）および０．１ｍＭ  ＮＡＤＰ＋を含む。補因子の再生のために、７％（ｖ／ｖ）  ＩＰＡおよびリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ由来；Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）にて過剰発現させる）を用いる。これらの酵素を、細胞溶解物の形態にて使用する。反応を、開放系にて、ｐＨ８（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液）、４０℃で連続的に振盪（９００ｒｐｍ）しながら２４時間行う。開放系は、アセトンの蒸発を導き、これは、ソルビトールの形成へ向けて反応を駆動する。この開放系において、水およびＩＰＡもまた蒸発する。その結果、これらは６時間後及び２１時間後に添加される。各時点で、総量０．５ｍＬおよびＩＰＡ濃度（７％（ｖ／ｖ））を調整する。２４時間後、反応容器を、酵素を不活性化しかつＩＰＡおよび形成された任意のアセトンを蒸発させるために、減圧下にて６０℃でインキュベートする。室温への冷却後に、リコンビナントＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来；Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）にて過剰発現させる）を、最終濃度５Ｕ／ｍＬで添加し、ＣａＣｌ２を最終濃度１ｍＭで、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨを最終濃度０．１ｍＭで添加する。補因子再生系のために、１０Ｕ／ｍＬ（最終濃度）のＮＡＤＨ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ由来；Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）にて過剰発現させる）を使用する。これらの酵素を、細胞溶解物の形態にて使用する。このチャージを水で０．５ｍＬにする。この反応を、ＮＡＤＨオキシダーゼのために空気中から十分な酸素の供給を保証するために、開放系にて４０℃で連続的に振盪（９００ｒｐｍ）しながら２４時間行う。６時間後および２１時間後にこのチャージを水で容積０．５ｍＬにする。Ｄ−グルコースのＤ−フルクトースへの変換は９８％に達する。
【０１０５】
［実施例７］
糖の再処理および分析
酵素を不活性化するためにチャージを６５℃で１０分間インキュベートし、続いて遠心分離する。次いで、上清を、０．２μＭ  ＰＶＤＦ膜で濾過し、リガンド交換ＨＰＬＣ（Agilent Technologies Inc.）によって分析する。この際に、水（VWR International GmbH, HPLC Grade）を流速０．５ｍＬ／分、８０℃で用いるリードカラム（Showa Denko K.K. (Shodex（登録商標） Sugar SP0810)）を介して、糖とポリオールとを分離する。Agilent Technologies Inc.のインラインフィルター、プレカラムとしての陰イオン交換カラム（Shodex（登録商標） Axpak-WAG）、逆相カラム（Shodex（登録商標） Asahipak（登録商標） ODP-50 6E）およびShowa Denko K.K.の糖プレカラム（SUGAR SP-G）を用いる。
【０１０６】
［実施例８］
乳酸デヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、コラン酸の３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸への変換
０．５ｍＬのチャージは、２５ｍｇのコラン酸、１２．５Ｕのリコンビナント１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅｇｇｅｒｔｅｌｌａ  ｌｅｎｔａまたはＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓに由来）、１６Ｕのリコンビナント７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、６Ｕのリコンビナント７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ由来）、ならびに１ｍＭ  ＮＡＤ＋および１ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む。ＮＡＤ＋の再生のために、１２．５Ｕのリコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ由来；筋肉アイソフォーム）および２００ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを使用する。ＮＡＤＰＨの再生のために、５Ｕのリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ由来）および最初は２％のＩＰＡ（ｗ／ｖ）を使用する。反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）中にて２５℃で連続的に振盪しながら行う（８５０ｒｐｍ）。アセトンの蒸発を可能にし、反応を３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へシフトさせるために、開放系をさらに使用する。１８時間後及び２４時間後に、２％  ＩＰＡ（ｗ／ｖ）をさらに添加する。４８時間後に、使用したコラン酸（６１％）が、３α，７α−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸と反応する。
【０１０７】
［実施例９］
乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、コラン酸の３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸への変換
０．５ｍＬのチャージは、２５ｍｇのコラン酸、１２．５Ｕのリコンビナント１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅｇｇｅｒｔｅｌｌａ  ｌｅｎｔａまたはＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓに由来）、１６Ｕのリコンビナント７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、６Ｕのリコンビナント７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ由来）、ならびに１ｍＭ  ＮＡＤ＋および１ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む。ＮＡＤ＋の再生のために、５ＵのリコンビナントＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来）、１２．５Ｕのリコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ由来；筋肉アイソフォーム）および２００ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを使用する。ＮＡＤＰＨの再生のために、５Ｕのリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ由来）および最初は２％のＩＰＡ（ｗ／ｖ）を使用する。反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）中にて２５℃で連続的に振盪しながら行う（８５０ｒｐｍ）。アセトンの蒸発を可能にし、反応を３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へシフトさせるために、開放系をさらに使用する。１８時間後及び２４時間後に、２％  ＩＰＡ（ｗ／ｖ）をさらに添加する。４８時間後に、使用したコラン酸（７０％）が、３α，７α−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸と反応する。
【０１０８】
［実施例１０］
乳酸デヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化．マンガンコロイド（ＭｎＣｌ２）を添加する利点
０．５ｍＬのチャージは、５０ｍｇチエノデオキシコラン酸、１２Ｕのリコンビナント７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、６Ｕのリコンビナント７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ由来）、ならびに０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋および０．３ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む。ＮＡＤ＋の再生のために、６Ｕのリコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼおよび３５０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを使用する。ＮＡＤＰＨの再生のために、６Ｕのリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ由来）および最初は２．４％のＩＰＡ（ｗ／ｖ）を使用する。反応を、５ｍＭのＭｎＣｌ２を含む水性のリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）中にて２５℃で連続的に振盪しながら行う（８５０ｒｐｍ）。アセトンの蒸発を可能にし、反応をウルソデオキシコラン酸へシフトさせるために、開放系をさらに使用する。１．６％  ＩＰＡ（ｗ／ｖ）を６時間後に、２．４％  ＩＰＡ（ｗ／ｖ）を１６時間後に、３．９％  ＩＰＡ（ｗ／ｖ）を２４時間後にさらに添加する。３６時間後に、２００μＬの２−ペンタノールおよび３％（ｗ／ｖ）のＩＰＡを添加し、４８時間後に、１００μＬの２−ペンタノールおよび４％（ｗ／ｖ）のＩＰＡをさらに添加する。６４時間後に、反応混合物中において胆汁酸の全てのウルソデオキシコラン酸の割合は９９％以上である。特に、チエノデオキシコラン酸の割合は０．３％である。ＭｎＣｌ２を添加しないコントロールチャージにおいて、チエノデオキシコラン酸の割合は２％であり、ウルソデオキシコラン酸の割合は９７．５％である（５回の実験からの平均値）。
【０１０９】
［実施例１１］
アルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を乳酸デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨオキシダーゼに依存性の補因子再生系と組み合わせて用いる、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化
０．５ｍＬのチャージは、５０ｍｇチエノデオキシコラン酸、１２Ｕのリコンビナント７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、６Ｕのリコンビナント７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ由来）、ならびに０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋および０．３ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む。ＮＡＤ＋の再生のために、６Ｕのリコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼおよび３５０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを使用する。ＮＡＤ＋の再生のために、９ＵのリコンビナントＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来）および６ＵのリコンビナントＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ由来）をさらに使用する。ＮＡＤＰＨの再生のために、６Ｕのリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ由来）および最初は２．４％のＩＰＡ（ｗ／ｖ）を使用する。反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）中にて２５℃で連続的に振盪しながら行う（８５０ｒｐｍ）。アセトンの蒸発を可能にし、反応をウルソデオキシコラン酸へシフトさせるために、開放系をさらに使用する。１．６％  ＩＰＡ（ｗ／ｖ）を６時間後に、２．４％  ＩＰＡ（ｗ／ｖ）を１６時間後に、３．９％  ＩＰＡ（ｗ／ｖ）を２４時間後にさらに添加する。３６時間後に、２００μＬの２−ペンタノールおよび３％（ｗ／ｖ）のＩＰＡを添加し、４８時間後に、１００μＬの２−ペンタノールおよび４％（ｗ／ｖ）のＩＰＡをさらに添加する。６４時間後に、反応混合物中において胆汁酸の全てのウルソデオキシコラン酸の割合は９９％以上である。特に、チエノデオキシコラン酸の割合は０．２％である。ＮＡＤＨオキシダーゼを添加しないコントロールチャージにおいて、チエノデオキシコラン酸の割合は２％であり、ウルソデオキシコラン酸の割合は９７．５％である（実施例１１におけるコントロールチャージと同じ；５回の実験からの平均値）。
【０１１０】
［実施例１２］
アルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を乳酸デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨオキシダーゼに依存性の補因子再生系と組み合わせて用いる、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化．２−ペンタノールおよび２−プロパノールのさらなる利点
５０ｍＬのチャージは、５ｇチエノデオキシコラン酸、２４Ｕのリコンビナント７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、１２Ｕのリコンビナント７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ由来）、ならびに０．５５ｍＭ  ＮＡＤ＋および０．３ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む。ＮＡＤ＋の再生のために、１２Ｕのリコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼおよび３５０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを使用する。ＮＡＤ＋の再生のために、１８ＵのリコンビナントＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来）および１２ＵのリコンビナントＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ由来）をさらに使用する。ＮＡＤＰＨの再生のために、１２Ｕのリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ由来）および最初は１．５％のＩＰＡ（ｗ／ｖ）を使用する。反応を、５ｍＭのＭｎＣｌ２を含む水性のリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）中にて２５℃で連続的に振盪しながら行う（８５０ｒｐｍ）。三方活栓中で、ＫＰＧスターラを用いて１００ｒｐｍで攪拌する。反応から産生するアセトンの除去は、反応容器を通すエアスチーム（４００〜６００ｍＬ／分）によってもたらされる。同時に２−プロパノールが同様に蒸発されるので、さらなる添加（例えば、０．７５ｍＬ（１、５ｈ）、０．７５ｍＬ（３ｈ）、０．５ｍＬ（４ｈ）、０．７５ｍＬ（６ｈ）、０．７５ｍＬ（８ｈ）、０．５ｍＬ（１１ｈ）、０．５ｍＬ（１４ｈ）、０．５ｍＬ（１７ｈ）、０．５ｍＬ（２１ｈ）、１ｍＬ（２３ｈ）、２．５ｍＬ（２５ｈ）、４ｍＬ（２９ｈ））が必要である。３０ｈ後に、２０ｍＬの２−ペンタノールおよび２ｍＬの２−プロパノールを添加する。総反応時間の４６時間後に、７−ケトリトコラン酸の割合は、（チエノデオキシコラン酸、ウルソデオキシコラン酸および７−ケトリトコラン酸の合計に対して）約１％である。さらに、２−プロパノールを添加し（３ｍＬ（４６ｈ）、４ｍＬ（５２ｈ）、４ｍＬ（５４ｈ））、１０ｍＬの２−ペンタノールを添加する。総反応時間の７２時間後に、７−ケトリトコラン酸の割合は、０．２％を下回り得る。ウルソデオキシコラン酸の割合は９９％以上である。
【０１１１】
［実施例１３］
胆汁酸の検査および分析
実施例８〜１２に記載した反応の完了後に、試験に存在した胆汁酸を、実施例４に記載の方法によって分析し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】チエノデオキシコール酸の、中間体３α−ヒドロキシ−７オキソ−５β−コラン酸を介した、ウルソデオキシコール酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
【図２】チエノデオキシコール酸の、中間体３α−ヒドロキシ−７オキソ−５β−コラン酸を介した、ウルソデオキシコール酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、リンゴ酸およびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
【図３】チエノデオキシコール酸の、中間体３α−ヒドロキシ−７オキソ−５β−コラン酸を介した、ウルソデオキシコール酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよび酸素を用いた補因子再生を伴う。
【図４】グルコースのフルクトースへの異性化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
【図５】グルコースのフルクトースへの異性化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよび酸素を用いた補因子再生を伴う。
【図６】コラン酸の、中間体３α，７α−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸および３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸を介した、３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
【図７】コラン酸の、中間体３α，７α−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸および３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸を介した、３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよび酸素を用いた補因子再生を伴う。
【図８】コラン酸の、中間体３α，７α−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸および３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸を介した、３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノール、ピルビン酸および酸素を用いた補因子再生を伴う。
【図９】コラン酸の、中間体３α，７α−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸および３α−ヒドロキシ−７，１２−ジオキソ−５β−コラン酸を介した、３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノール、ピルビン酸および酸素を用いた補因子再生を伴う。
【図１０】コラン酸の、種々の中間体および補因子再生系を介した、３α，７β−ジヒドロキシ−１２−オキソ−５β−コラン酸へのエピマー化の推定の反応スキームを示す。ＮＡＤ＋の再生には、代替的に乳酸デヒドロゲナーゼ（基質としてピルビン酸）およびＮＡＤＨオキシダーゼ（基質として酸素）が使用された。ＮＡＤＰＨの再生にはアルコールデヒドロゲナーゼ（基質としてイソプロパノール）が使用された。
【図１１】チエノデオキシコラン酸の、中間体  ３α−ヒドロキシ−７オキソ−５β−コラン酸  （７−ケトリトコラン酸＝７Ｋ−ＬＣＡ＝ＫＬＣ）を介した、ウルソデオキシコラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、２−プロパノールおよび２−ペンタノール（いずれの場合も、アルコールデヒドロゲナーゼ）、ならびにピルビン酸（乳酸デヒドロゲナーゼ）および酸素（ＮＡＤＨオキシダーゼ）を用いた補因子再生を伴う。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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