(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質中のセカンドメッセンジャーの濃度の上昇の際に、細胞内で細胞質膜から保持小胞へと蛍光融合ポリペプチドの局在を変化させることができる蛍光融合ポリペプチドであって、該蛍光融合ポリペプチドは、膜局在ペプチド、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチド、小胞体保持シグナル及び蛍光ペプチドを含み、ここで、
ａ．  前記膜局在ペプチドは、前記蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置し、任意にリンカーを介して、前記蛍光ペプチドに物理的に結合しており、該蛍光ペプチドは次いで、任意にリンカーを介して、前記セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合しており、かつ、
ｂ．  前記セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、任意にリンカーを介して、前記小胞体保持シグナルに物理的に結合しており、該小胞体保持シグナルは次いで、前記蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置しており、
「膜局在ペプチド」という用語は、その天然の細胞内局在が細胞膜におけるものであるペプチドを意味する意図であり：
前記セカンドメッセンジャーが、細胞内カルシウムであり、前記セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択される、カルモジュリン結合配列を含み；
前記セカンドメッセンジャーが、細胞内ｃＡＭＰであり、前記セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択される、ＰＫＡのＲＩ及びＲＩＩ制御ドメインとの結合配列を含み；又は
前記セカンドメッセンジャーが、細胞内ジアシルグリセロールであり、前記セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドが、配列番号１９又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択される、ＰＫＣδとの結合配列を含む、蛍光融合ポリペプチド。
【請求項２】
ａ．  前記膜局在ペプチドが、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体であり、かつ、
ｂ．  前記小胞体保持シグナルが、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよい、
請求項１に記載の蛍光融合ポリペプチド。
【請求項３】
ａ．  前記膜局在ペプチドが配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメインであり、かつ、
ｂ．  前記小胞体保持シグナルがペプチドＫＤＥＬである、
請求項１に記載の蛍光融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記小胞体保持シグナルがＫＤＥＬである、請求項１に記載の蛍光融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記膜局在ペプチドが配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメインである、請求項１又は２に記載の蛍光融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記蛍光ペプチドが、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｔＲＦＰ及びｔＲＦＰ６０２からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光融合ポリペプチド。
【請求項７】
ａ．  前記カルモジュリン結合配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択され、
ｂ．  前記膜局在ペプチドが配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメインであり、かつ、
ｃ．  前記小胞体保持シグナルがＫＤＥＬである、
請求項１に記載の蛍光融合ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１５、１６又は１８を含む、請求項１に記載の蛍光融合ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含むバイオセンサー。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の蛍光ポリペプチド又は請求項１０に記載のバイオセンサーを含む細胞。
【請求項１２】
細胞株Ｕ２Ｏ２である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
請求項１０に記載のバイオセンサー又は請求項１〜８のいずれか一項に記載の蛍光ポリペプチドの、セカンドメッセンジャーの検出及び／又は定量のための使用。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野、特に、蛍光融合ポリペプチド、該ポリペプチドを含むバイオセンサー及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景技術の以下の議論は、単に読者が本発明を理解するのを助けるために提供されるものであり、本発明に対する先行技術を記載又は構成するものと認めるものではない。
【０００３】
細胞系におけるハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）は、正常細胞及び異常細胞の働きの解明のために生物学の研究におけるツールとして生細胞を使用する。ＨＣＳはまた、新薬候補の発見及び最適化にも用いられる。
【０００４】
ハイコンテントスクリーニングは、現代の細胞生物学と、すべてのその分子的ツール、自動高分解能顕微鏡法及びロボット操作との組合せである。細胞は化学物質又はＲＮＡｉ試薬にまず曝される。細胞形態の変化が次いで画像解析を用いて検出される。細胞により合成されたタンパク質の量の変化が、内在性タンパク質に融合させた緑色蛍光タンパク質等の種々の技法を用いて又は蛍光抗体によって測定される。
【０００５】
細胞レベルでは、異なる細胞特性、例えば、シグナル伝達カスケードの活性及び細胞骨格完全性についてのデータの同時取得が、より高速であるが詳細ではないハイスループットスクリーニングと比較してのこの方法の主な利点である。ＨＣＳはより遅いものではあるが、取得されるデータが豊富であることにより、薬効のより深い理解を可能とする。この意味で、シグナル伝達カスケードの活性に関連するデータの取得におけるＨＣＳの目的の１つは、細胞内セカンドメッセンジャーレベルの測定を介してシグナル伝達プロセスにおける異なる薬物の効果を決定することである。
【０００６】
セカンドメッセンジャーは、細胞表面上の受容体から細胞質又は核の中の細胞内部の標的分子へとシグナルを中継する分子である。セカンドメッセンジャーは、エピネフリン（アドレナリン）、増殖因子等のようなホルモンのシグナルを中継し、細胞の活性における或る種の変化をもたらす。セカンドメッセンジャーは、シグナル強度を大幅に増幅する。二次メッセンジャーはシグナル伝達カスケードの構成成分である。これらのセカンドメッセンジャーのなかでも、ｃＡＭＰ及びカルシウムは、セカンドメッセンジャーの概念のパラダイムを提供し、細胞内の多くの重要なプロセスを調節する普遍的かつ重要な細胞内分子として認識されている。
【０００７】
理想的には、上記の測定には、ハイコンテントスクリーニング法を用いることによりｉｎ  ｖｉｖｏでセカンドメッセンジャーのレベルをモニターすることを可能とする、正確な局在、高ダイナミックレンジ及び可能な限り小さい細胞生理の妨害のツールが必要である。
【０００８】
このために、蛍光特性を動的に変化させることに基づく多様な蛍光バイオセンサーが作製されている。この意味で、これらのタイプのバイオセンサーの多くが蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の変化に基づくものである。ＦＲＥＴは、励起されたドナーフルオロフォアからのエネルギーが、無放射性双極子−双極子カップリング（dipole-dipole coupling）を介してアクセプターフルオロフォアへと移動するプロセスである。このエネルギー移動の効率は、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの距離（例えば、ＣＦＰ／ＹＦＰについては１０ｎｍ未満）及び相対配向に高度に依存する。しかしながら、ハイコンテントスクリーニング法との関連でのＦＲＥＴ型バイオセンサーは、少なくとも４つのフィルターの検出装置を必要とし、フィルターの２つは励起用であり、フィルターの２つは発光用である。さらに、検出シグナルの強度が低いために、検出シグナル範囲及びスクリーニング感度は低い。最後に、２以上の蛍光発光シグナルの使用には、最終シグナルを正確に分析するためにより多くのアルゴリズムの使用が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、生細胞の動的環境内でのセカンドメッセンジャー濃度のリアルタイム測定のために用いられる改善された方法又は製品を開発する必要が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様は、細胞質中のセカンドメッセンジャーの濃度の上昇の際に、細胞内で細胞質膜（cell cytoplasmic membrane）から保持小胞（retention vesicles）へとその局在を変化させることができる蛍光融合ポリペプチドであって、該蛍光融合ポリペプチドは、膜局在ペプチド、セカンドメッセンジャー変換タンパク質（transduction protein）結合ペプチド、小胞体（reticulum）保持シグナル及び蛍光ペプチドを含み、ここで、
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置し、任意にリンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合しており、該蛍光ペプチドは次いで、任意にリンカーを介して、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合しており、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、任意にリンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合しており、該小胞体保持シグナルは次いで、蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置している、
蛍光融合ポリペプチドに関する。
【００１１】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態においては、膜局在ペプチドが、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体であり、かつ、小胞体保持シグナルが、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬである。
【００１２】
本発明の第１の態様のより好ましい実施の形態においては、上記セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、ｃＡＭＰ変換タンパク質結合ペプチド、カルシウム変換タンパク質結合ペプチド、ＩＰ３変換タンパク質結合ペプチド、ｃＧＭＰ変換タンパク質結合ペプチド又はジアシルグリセロール変換タンパク質結合ペプチドである。したがって、本発明の更なる好ましい実施の形態において、本発明の第１の態様の蛍光融合ポリペプチドは、カルシウム、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、ｃＧＭＰ又はジアシルグリセロールからなる群より選択されるセカンドメッセンジャーの濃度の上昇の際に、細胞内で細胞質膜から保持小胞へとその局在を変化させることができる。
【００１３】
本発明の第２の態様は、細胞内カルシウムの濃度の上昇の際に、細胞内で細胞質膜から保持小胞へとその局在を変化させることができる蛍光融合ポリペプチドであって、該蛍光融合ポリペプチドは、膜局在ペプチド、カルモジュリン結合配列を含むセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチド、小胞体保持シグナル及び蛍光ペプチドを含み、ここで、
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置し、任意にリンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合しており、該蛍光ペプチドは次いで、任意にリンカーを介して、カルモジュリン結合配列を含むセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合しており、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、任意にリンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合しており、該小胞体保持シグナルは次いで、蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置している、
蛍光融合ポリペプチドに関する。
【００１４】
本発明の第２の態様の好ましい実施の形態においては、カルモジュリン結合配列は、配列番号１（ＭＥＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）、配列番号２（ＡＳＰＷＫＳＡＲＬＭＶＨＴＶＡＴＦＮＳＩ）、配列番号３（ＡＩＧＦＫＫＬＡＥＡＶＫＦＳＡＫＬＭＧＱ）、配列番号４（ＫＫＴＦＫＥＶＡＮＡＶＫＩＳＡＳＬＭＧＴ）、配列番号５（ＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲ）、配列番号６（ＲＧＧＦＲＲＩＡＲＬＶＧＶＬＲＥＷＡＹＲ）、配列番号７（ＧＧＲＬＡＬＬＲＡＲＬＫＥＬＡＡＬＥＡＡ）及び配列番号８（ＡＥＧＶＲＮＩＫＳＭＷＥＫＧＮＶＦＳＳＰ）又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択される。
【００１５】
本発明の第２の態様の更なる好ましい実施の形態において、小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬであり、及び／又は、膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン若しくはアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体である。
【００１６】
本発明の第２の態様の別の好ましい実施の形態において、蛍光ペプチドが、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｔＲＦＰ及びｔＲＦＰ６０２からなる群より選択される。
【００１７】
本発明の第２の態様の更により好ましい実施の形態において、
ａ．  カルモジュリン結合配列は、配列番号１（ＭＥＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）、配列番号２（ＡＳＰＷＫＳＡＲＬＭＶＨＴＶＡＴＦＮＳＩ）、配列番号３（ＡＩＧＦＫＫＬＡＥＡＶＫＦＳＡＫＬＭＧＱ）、配列番号４（ＫＫＴＦＫＥＶＡＮＡＶＫＩＳＡＳＬＭＧＴ）、配列番号５（ＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲ）、配列番号６（ＲＧＧＦＲＲＩＡＲＬＶＧＶＬＲＥＷＡＹＲ）、配列番号７（ＧＧＲＬＡＬＬＲＡＲＬＫＥＬＡＡＬＥＡＡ）及び配列番号８（ＡＥＧＶＲＮＩＫＳＭＷＥＫＧＮＶＦＳＳＰ）又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択され、
ｂ．  膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体であり、かつ、
ｃ．  小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、ここで好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬである。
【００１８】
本発明の更に別の好ましい実施の形態において、カルシウム蛍光融合ポリペプチドは、配列番号１５を含むか、又は好ましくは配列番号１５からなる。
【００１９】
本発明の第３の態様は、細胞内ｃＡＭＰの濃度の上昇の際に、細胞内で細胞質膜から保持小胞へとその局在を変化させることができる蛍光融合ポリペプチドであって、該蛍光融合ポリペプチドは、膜局在ペプチド、ＰＫＡのＲＩ及びＲＩＩ制御ドメインとの結合配列を含むセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチド、小胞体保持シグナル及び蛍光ペプチドを含み、ここで、
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置し、任意にリンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合しており、該蛍光ペプチドは次いで、任意にリンカーを介して、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合しており、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、任意にリンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合しており、該小胞体保持シグナルは次いで、蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置している、
蛍光融合ポリペプチドに関する。
【００２０】
本発明の第３の態様の好ましい実施の形態において、ＰＫＡのＲＩ及びＲＩＩ制御ドメインとの結合配列は、配列番号９（ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ）、配列番号１０（ＶＱＧＮＴＤＥＡＱＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ）、配列番号１１（ＶＱＧＮＴＤＥＡＱＥＥＬＬＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ）、配列番号１２（ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱ）、配列番号１３（ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＫ）、及び配列番号１４（ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ）又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択される。
【００２１】
本発明の第３の態様の更なる好ましい実施の形態において、小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬであり、及び／又は、膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン若しくはアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体である。
【００２２】
本発明の第３の態様の別の好ましい実施の形態において、蛍光ペプチドが、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｔＲＦＰ及びｔＲＦＰ６０２からなる群より選択される。
【００２３】
本発明の第３の態様の更により好ましい実施の形態において、
ａ．  ＰＫＡのＲＩ及びＲＩＩ制御ドメインとの結合配列は、配列番号９（ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ）、配列番号１０（ＶＱＧＮＴＤＥＡＱＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ）、配列番号１１（ＶＱＧＮＴＤＥＡＱＥＥＬＬＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ）、配列番号１２（ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱ）、配列番号１３（ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＫ）、及び配列番号１４（ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ）又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択され、
ｂ．  膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体であり、かつ、
ｃ．  小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬである。
【００２４】
本発明の第３の態様の更に別の好ましい実施の形態において、蛍光融合ポリペプチドは、配列番号１６を含むか、又は好ましくは配列番号１６からなる。
【００２５】
本発明の第４の態様は、細胞内ジアシルグリセロールの濃度の上昇の際に、細胞内で細胞質膜から保持小胞へとその局在を変化させることができる蛍光融合ポリペプチドであって、該蛍光融合ポリペプチドは、膜局在ペプチド、ＰＫＣδとの結合配列を含むセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチド、小胞体保持シグナル及び蛍光ペプチドを含み、ここで、
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置し、任意にリンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合しており、該蛍光ペプチドは次いで、任意にリンカーを介して、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合しており、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、任意にリンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合しており、該小胞体保持シグナルは次いで、蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置している、
蛍光融合ポリペプチドに関する。
【００２６】
本発明の第４の態様の好ましい実施の形態において、ＰＫＣδとの結合配列は、配列番号１９（ＡＡＲＫＲＫＧＳＦＦＹＧＧ）又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体である。
【００２７】
本発明の第４の態様の更なる好ましい実施の形態において、小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬであり、及び／又は、膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン若しくはアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体である。
【００２８】
本発明の第４の態様の別の好ましい実施の形態において、蛍光ペプチドが、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｔＲＦＰ及びｔＲＦＰ６０２からなる群より選択される。
【００２９】
本発明の第４の態様の更により好ましい実施の形態において、
ａ．  ＰＫＣδとの結合配列は、配列番号１９（ＡＡＲＫＲＫＧＳＦＦＹＧＧ）又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体であり、
ｂ．  膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体であり、かつ、
ｃ．  小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬである。
【００３０】
本発明の第４の態様の更に別の好ましい実施の形態において、蛍光融合ポリペプチドは、配列番号１８を含む。
【００３１】
本発明の第５の態様は、本発明の先の態様のいずれかにおいて規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【００３２】
本発明の第６の態様は、本発明の第１、第２、第３及び第４の態様において規定される融合ポリペプチドを含むバイオセンサーに関する。
【００３３】
本発明の第７の態様は、本発明の第１、第２、第３若しくは第４の態様のいずれかにおいて規定される蛍光融合ポリペプチド又は本発明の第６の態様において規定されるバイオセンサーを含む細胞に関し、好ましくは、該細胞は細胞株Ｕ２Ｏ２である。
【００３４】
更なる態様において、本発明は、本発明の第１、第２、第３若しくは第４の態様のいずれかにおいて規定される蛍光融合ポリペプチド又は本発明の第６の態様において規定されるバイオセンサーのいくつかの使用に関する。
【００３５】
本明細書に引用され、本明細書の一部をなす添付の図面は、いくつかの実施形態を例示し、本明細書の記載とともに開示される組成物及び方法を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】蛍光バイオセンサー細胞局在モデルの模式図である。蛍光バイオセンサーは、細胞質内のセカンドメッセンジャーの濃度の上昇の際に、細胞内でのその局在を細胞質膜から小胞（vesicles）へと変化させる。
【図２】蛍光バイオセンサーを用いるセカンドメッセンジャー定量（determination）である。セカンドメッセンジャー濃度の上昇は蛍光バイオセンサーの再分布を促進する。細胞蛍光の変化を、これら細胞の粒度（granularity）の増大として計算した。これらの同じ結果がこの図に示されるように上記細胞株の３つの異なるクローンについて得られ、この図は、カルシウムバイオセンサーを含有する３つのクローン（左図）又はｃＡＭＰバイオセンサーを含有する３つのクローン（右図）に対応するこれらの結果の再現性の証拠を提供する。
【図３】カルシウムバイオセンサー刺激細胞の細胞分布である。ヒトニューロキニン受容体１及び蛍光カルシウムバイオセンサーを安定に発現するＵ２ＯＳを、１０μＭのサブスタンスＰアゴニストで６時間刺激した。処理の後、蛍光バイオセンサーは細胞質ゾル中の小胞内にインターナライズされた（internalized：取り込まれた）。ヒトニューロキニン受容体１活性を、画像解析アルゴリズムを用いて小胞の生成を測定して決定した。
【図４】ニューロキニン１受容体−カルシウムバイオセンサー細胞株におけるサブスタンスＰについての濃度応答曲線である。細胞を１０ｌｏｇ希釈系列で処理した（ｎ＝４）。サブスタンスＰについてのＥｃ５０はアゴニストによる６時間の処理後に約９．５×１０−１２Ｍであった。細胞を固定し、核をＤＡＰＩで染色した。％活性を、陽性（１０μＭ）に対して計算した。インターナリゼーションアッセイをハイコンテントスクリーニングについて平均Ｚ’＝０．８５±０．０１を用いて確証した。
【図５】ｃＡＭＰバイオセンサー刺激細胞の細胞分布である。ヒトアドレナリンベータ２受容体及び蛍光ｃＡＭＰバイオセンサーを安定に発現するＵ２ＯＳを、１０μＭのイソプロテレノールアゴニストで３６時間刺激した。処理の後、蛍光バイオセンサーは細胞質ゾル中の小胞内にインターナライズされた。ヒトアドレナリンベータ２受容体活性を、画像解析アルゴリズムを用いて小胞の生成を測定して決定した。
【図６】アドレナリンベータ２−ｃＡＭＰバイオセンサー細胞株におけるイソプロテレノールについての濃度応答曲線である。細胞を６ｌｏｇ希釈系列で処理した（ｎ＝４）。イソプロテレノールについてのＥｃ５０はアゴニストによる３６時間の処理後に２．３×１０−７Ｍであった。細胞を固定し、核をＤＡＰＩで染色した。％活性を、陽性（１０μＭ）に対して計算した。インターナリゼーションアッセイをハイコンテントスクリーニングについて平均Ｚ’＝０．７±０．０１を用いて確証した。
【図７】ＤＡＧバイオセンサー刺激細胞の細胞分布である。蛍光ＤＡＧバイオセンサーを安定に発現するＵ２ＯＳを、２５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで４時間刺激した。処理の後、蛍光バイオセンサーは細胞質ゾル中の小胞内にインターナライズされた。ＤＡＧバイオセンサー活性を、画像解析アルゴリズムを用いて小胞の生成を測定して決定した。
【図８】ＤＡＧバイオセンサー細胞株についての濃度応答曲線である。細胞を９ｌｏｇ希釈系列で処理した（ｎ＝４）。イソプロテレノールについてのＥｃ５０はＤＡＧによる４時間の処理後に２．８９×１０−４ｎｇ／ｍｌであった。細胞を固定し、核をＤＡＰＩで染色した。％活性を、陽性（５０ｎｇ／ｍｌ）に対して計算した。インターナリゼーションアッセイをハイコンテントスクリーニングについて平均Ｚ’＝０．７６±０．０１を用いて確証した。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
特に断りのない限り、「含む（comprising）」という用語は、本明細書の文脈において、「含む」により導入されるリストの構成要素に加えて更なる構成要素が任意に存在していてもよいことを示すのに用いられる。しかしながら、本発明の特定の実施形態として、「含む」という用語が更なる構成要素が存在しない可能性を包含すること、即ち、この実施形態の目的に合わせて「含む」が「のみからなる（consisting of）」の意味を有すると理解されるべきであるということが考えられる。
【００３８】
定義
本発明の文脈において、「融合ポリペプチド」という用語は、組み合わされて同一のポリペプチド構造となる、異なるタンパク質からの少なくとも４つのペプチドの組合せを含むハイブリッドポリペプチドのことをいう。
【００３９】
本発明の文脈において、「膜局在ペプチド」という用語は、その天然の細胞内局在が細胞膜におけるものであるペプチドを意味する意図である。
【００４０】
本明細書において用いる場合、「変換タンパク質結合ペプチド」という用語は、特定のコンフォメーション（conformation：構造）における変換タンパク質に結合することができるペプチドを意味する意図である。それゆえ、このペプチドは、変換タンパク質に、この変換タンパク質がセカンドメッセンジャー（ｃＡＭＰ、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、ジアシルグリセロール等）と相互作用している場合にのみ結合することができる。
【００４１】
本明細書において用いる場合、「小胞体保持シグナル」という用語は、ポリペプチドの輸送を小胞体へと向け、それによって分泌経路を介して多小胞（multivesicular）局在を与える短いペプチド鎖を意味する意図である。
【００４２】
本明細書において用いる場合、「蛍光ペプチド」という用語は、蛍光能力を有する蛍光ペプチドを意味する意図である。蛍光ペプチドドメインは、特定の励起スペクトルと発光スペクトルとを有することを特徴とする。
【００４３】
本発明の文脈において、リンカーは少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくは少なくとも２つの連続アミノ酸残基を有する。
【００４４】
本明細書において用いる場合、「バイオセンサー」という用語は、物理的若しくは化学的刺激に対して感受性があり、かかる刺激に対して応答することができ、細胞状態についての情報を伝達することができる、分子的ツール又は実体を意味する意図である。
【００４５】
本明細書において用いる場合、「薬物」という用語は、シグナル伝達経路のアゴニスト又はアンタゴニスト又はモジュレーターとして潜在的に作用する分子を意味する意図である。
【００４６】
本明細書において用いる場合、「安定発現細胞株（stable cell line）」は、それ自体を細胞のゲノムに組み入れたＤＮＡの外来性断片をトランスフェクト又は感染させた細胞株を意味する意図である。
【００４７】
本明細書において用いる場合、「カルモジュリン結合配列」は、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼのカルモジュリン結合ドメインに対応するアミノ酸配列を意味する意図である。この配列は、１−１４カルモジュリン結合モチーフの塩基性１−８−１４サブクラスに含まれる。塩基性１−８−１４のコンセンサス配列は、（ＲＫ）（ＲＫ）（ＲＫ）（ＦＩＬＶＷ）ｘｘｘｘｘｘ（ＦＡＩＬＶＷ）ｘｘｘｘｘ（ＦＩＬＶＷ）である。これらのタイプの配列はカルモジュリン結合データベース（http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/ctdb/home.html）において容易に見出すことができる。
【００４８】
本明細書において用いる場合、「ＰＫＡのＲＩ及びＲＩＩ制御ドメインとの結合配列」は、Ａ−キナーゼアンカータンパク質ファミリー（ＡＫＡＰ）に存在し、その主要な機能がタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御ドメイン（ＲＩ又はＲＩＩ）への結合である、保存アミノ酸配列を意味する意図である。
【００４９】
本明細書において用いる場合、「ＨＴ３１」は、ＡＫＡＰと競合することによりＡ−キナーゼの係留（anchorage）を（ｃＡＭＰシグナルによる活性化の後に）破壊することができるヒト甲状腺Ａ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）由来のペプチドである。ＨＴ３１はタンパク質キナーゼＡの２つの制御ドメイン（ＲＩ及びＲＩＩ）に結合するが、これらのドメインに対するその親和性は異なっており、ＲＩドメインについては、親和性は低く、ＲＩＩドメインについては、親和性は高い。
【００５０】
本明細書において用いる場合、「ＰＫＣデルタとの結合配列」は、ＰＫＣデルタに特異的に結合し、その他のＰＫＣには結合しない、合成可溶性ペプチドに対応するアミノ酸配列を意味する意図である。これらのタイプの配列は、ＰＫＣＬａｂデータベース（http://www.pkclab.org/PKC/link/substrate_specificity.htm）において容易に見出すことができる。
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞系においてハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）を用いることによりｉｎ  ｖｉｖｏでセカンドメッセンジャーの細胞内濃度レベルの変動をモニターすることができる、正確な局在、高ダイナミックレンジ及び可能な限り小さい細胞生理の妨害のツールを提供するという課題に取り組むものであり、ここでこれらツールはＦＲＥＴ型バイオセンサーの不都合を有さないものである。
【００５２】
上記課題を解決するために、本発明者らは、膜局在ペプチド、蛍光ペプチド、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチド及び小胞体保持シグナルを含む新しい蛍光融合ポリペプチドを設計した。このバイオセンサーは、２つの異なる細胞コンパートメントを標的とする２つのペプチドにより形成され、細胞質内の蛍光ポリペプチドの分布をモニターすることによってセカンドメッセンジャー濃度の測定を可能とする。この意味で、細胞内でのバイオセンサー転位は、変換タンパク質のセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドへの結合によって引き起こされる、ポリペプチドの両方の末端における位置シグナルを隠蔽又は露出させる、その３Ｄコンフォメーションにおける変化に起因するものであるとされる。基底状態において、バイオセンサーはコンパートメントの一方に位置し、これは他方の細胞コンパートメントへの位置ペプチドが３Ｄコンフォメーションによって隠蔽されていることを意味する。細胞刺激によりセカンドメッセンジャーの濃度が上昇すると、これらセカンドメッセンジャーが変換タンパク質に結合し、変換タンパク質は活性となる。活性の変換タンパク質はバイオセンサーにおける変換タンパク質結合ペプチドに結合することができ、コンフォメーション変化をもたらす。ここでバイオセンサーにおける異なる構造要素の空間分布が改変され、他方の細胞コンパートメントへの位置ペプチドが新たな３Ｄコンフォメーションによって露出されて、そのためバイオセンサー全体が新しい細胞コンパートメントでのその新しい位置へと輸送される。このプロセスはすべてバイオセンサー中の蛍光タンパク質の存在によって生細胞中で追跡することができる。このプロセスの模式表示は、図１に示す模式図において視覚化することができる。
【００５３】
しかしながら、本発明者らは、上記の蛍光融合ポリペプチド内のペプチドの順序はポリペプチド内で任意に配置することはできないということを見出した。多数の実験を通して、要素の１つの組合せのみがバイオセンサーの他方の細胞コンパートメントへの輸送という技術的効果を提供すると本発明者らにより結論付けられたので、これは正しいといえ、かかる組合せとは以下であった。
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置していなければならず、また任意にリンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合していなければならず、該蛍光ペプチドは次いで、任意にリンカーを介して、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合していなければならず、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、任意にリンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合していなければならず、該小胞体保持シグナルは次いで蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置していなければならない。
【００５４】
本発明者らは、かかる上記構造を有するバイオセンサーが、異なるタイプのセカンドメッセンジャーの検出及び定量に用いることができるか否かを試験した。本明細書に開示される実施例１〜３に示すように、本発明者らは、それらすべてが、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメインを膜局在ペプチドとして、ペプチドＫＤＥＬを小胞体保持シグナルとして、及びｔｕｒｂｏＧＦＰを蛍光ペプチドとして含む、３つの異なる蛍光融合ポリペプチドを構築した。したがって、これらの蛍光融合ポリペプチドの間の唯一の相違は、用いるセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドのタイプにあった。この意味で、実施例１のカルシウムバイオセンサーの場合、本発明者らはカルモジュリン結合ドメインを含むセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドを用い、実施例２のｃＡＭＰバイオセンサーの場合、本発明者らはＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）からのタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）結合ドメインを含むセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドを用い、実施例３のジアシルグリセロールバイオセンサーの場合、本発明者らは配列番号１９の結合ドメインを含むセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドを用いた。
【００５５】
驚くべきことに、実施例１〜３の上記融合ポリペプチドを用いることによる実施例及び添付の図面に示される結果は、セカンドメッセンジャーの濃度の上昇はバイオセンサーのコンフォメーション変化を誘導し、かかるコンフォメーション変化は蛍光バイオセンサーの再分布を促進することを示した。３つのすべての場合において、活性を、本発明のバイオセンサーをトランスフェクトした細胞の粒度の増大として計算した。バイオセンサーの蛍光再分布は、画像解析アルゴリズムを用いて蛍光により検出した。したがって、セカンドメッセンジャー濃度の変動は、この位置シグナルの「隠蔽及び露出」プロセス並びにバイオセンサーの最終局在によってモニターすることができる。
【００５６】
したがって、本発明の第１の態様は、細胞質中のセカンドメッセンジャーの濃度の上昇の際に、細胞内で細胞質膜から保持小胞へとその局在を変化させることができる蛍光融合ポリペプチドであって、該蛍光融合ポリペプチドは、膜局在ペプチド、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチド、小胞体保持シグナル及び蛍光ペプチドを含み、ここで、
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置し、任意にリンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合しており、該蛍光ペプチドは次いで、任意にリンカーを介して、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合しており、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、任意にリンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合しており、該小胞体保持シグナルは次いで、蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置している、
蛍光融合ポリペプチドに関する。
【００５７】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態において、膜局在ペプチドが、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン又はアミノ酸同一性に基づいてその全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体であり、かつ、小胞体保持シグナルが、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルがＫＤＥＬである。
【００５８】
本発明の第１の態様のより好ましい実施形態において、上記セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、ｃＡＭＰ変換タンパク質結合ペプチド、カルシウム変換タンパク質結合ペプチド、ＩＰ３変換タンパク質結合ペプチド、ｃＧＭＰ変換タンパク質結合ペプチド又はジアシルグリセロール変換タンパク質結合ペプチドである。したがって、本発明の更なる好ましい実施形態において、本発明の第１の態様の蛍光融合ポリペプチドは、カルシウム、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、ｃＧＭＰ又はジアシルグリセロールからなる群より選択されるセカンドメッセンジャーの濃度の上昇の際に、細胞内で細胞質膜から保持小胞へとその局在を変化させることができる。
【００５９】
本発明の第２の態様は、細胞内カルシウムの濃度の上昇の際に、細胞内で細胞質膜から保持小胞へとその局在を変化させることができる蛍光融合ポリペプチドであって、該蛍光融合ポリペプチドは、膜局在ペプチド、カルモジュリン結合配列を含むセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチド、小胞体保持シグナル及び蛍光ペプチドを含み、ここで、
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置し、任意にリンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合しており、該蛍光ペプチドは次いで、任意にリンカーを介して、カルモジュリン結合配列を含むセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合しており、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、任意にリンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合しており、該小胞体保持シグナルは次いで、蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置している、
蛍光融合ポリペプチドに関する。
【００６０】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態において、カルモジュリン結合配列は、配列番号１（ＭＥＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）、配列番号２（ＡＳＰＷＫＳＡＲＬＭＶＨＴＶＡＴＦＮＳＩ）、配列番号３（ＡＩＧＦＫＫＬＡＥＡＶＫＦＳＡＫＬＭＧＱ）、配列番号４（ＫＫＴＦＫＥＶＡＮＡＶＫＩＳＡＳＬＭＧＴ）、配列番号５（ＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲ）、配列番号６（ＲＧＧＦＲＲＩＡＲＬＶＧＶＬＲＥＷＡＹＲ）、配列番号７（ＧＧＲＬＡＬＬＲＡＲＬＫＥＬＡＡＬＥＡＡ）及び配列番号８（ＡＥＧＶＲＮＩＫＳＭＷＥＫＧＮＶＦＳＳＰ）又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択される。
【００６１】
本発明の第２の態様の更なる好ましい実施形態において、小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬであり、及び／又は、膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン若しくはアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体である。
【００６２】
本発明の第２の態様の別の好ましい実施形態において、蛍光ペプチドが、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｔＲＦＰ及びｔＲＦＰ６０２からなる群より選択される。
【００６３】
本発明の第２の態様の更により好ましい実施形態において、
ａ．  カルモジュリン結合配列は、配列番号１（ＭＥＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）、配列番号２（ＡＳＰＷＫＳＡＲＬＭＶＨＴＶＡＴＦＮＳＩ）、配列番号３（ＡＩＧＦＫＫＬＡＥＡＶＫＦＳＡＫＬＭＧＱ）、配列番号４（ＫＫＴＦＫＥＶＡＮＡＶＫＩＳＡＳＬＭＧＴ）、配列番号５（ＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲ）、配列番号６（ＲＧＧＦＲＲＩＡＲＬＶＧＶＬＲＥＷＡＹＲ）、配列番号７（ＧＧＲＬＡＬＬＲＡＲＬＫＥＬＡＡＬＥＡＡ）及び配列番号８（ＡＥＧＶＲＮＩＫＳＭＷＥＫＧＮＶＦＳＳＰ）又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択され、
ｂ．  膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体であり、かつ、
ｃ．  小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬである。
【００６４】
本発明の更に別の好ましい実施形態において、蛍光融合ポリペプチドは、配列番号１５を含むか、又は好ましくは配列番号１５からなる。
【００６５】
本発明の第３の態様は、細胞内ｃＡＭＰの濃度の上昇の際に、細胞内で細胞質膜から保持小胞へとその局在を変化させることができる蛍光融合ポリペプチドであって、該蛍光融合ポリペプチドは、膜局在ペプチド、ＰＫＡのＲＩ及びＲＩＩ制御ドメインを含むセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチド、小胞体保持シグナル及び蛍光ペプチドを含み、ここで、
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置し、任意にリンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合しており、該蛍光ペプチドは次いで、任意にリンカーを介して、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合しており、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、任意にリンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合しており、該小胞体保持シグナルは次いで、蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置している、
蛍光融合ポリペプチドに関する。
【００６６】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態において、ＰＫＡのＲＩ及びＲＩＩ制御ドメインとの結合配列は、配列番号９（ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ）、配列番号１０（ＶＱＧＮＴＤＥＡＱＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ）、配列番号１１（ＶＱＧＮＴＤＥＡＱＥＥＬＬＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ）、配列番号１２（ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱ）、配列番号１３（ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＫ）、及び配列番号１４（ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ）又はアミノ酸同一性に基づいてこれらの配列のいずれかと全領域にわたって少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択される。
【００６７】
本発明の第３の態様の更なる好ましい実施形態において、小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬであり、及び／又は、膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン若しくはアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体である。
【００６８】
本発明の第３の態様の別の好ましい実施形態において、蛍光ペプチドが、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｔＲＦＰ及びｔＲＦＰ６０２からなる群より選択される。
【００６９】
本発明の第３の態様の更により好ましい実施形態において、
ａ．  ＰＫＡのＲＩ及びＲＩＩ制御ドメインとの結合配列は、配列番号９（ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ）、配列番号１０（ＶＱＧＮＴＤＥＡＱＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ）、配列番号１１（ＶＱＧＮＴＤＥＡＱＥＥＬＬＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ）、配列番号１２（ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱ）、配列番号１３（ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＫ）、及び配列番号１４（ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ）又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択され、
ｂ．  膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体であり、かつ、
ｃ．  小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬである。
【００７０】
本発明の第３の態様の更に別の好ましい実施形態において、蛍光融合ポリペプチドは、配列番号１６を含むか、又は好ましくは配列番号１６からなる。
【００７１】
本発明の第４の態様は、細胞内ジアシルグリセロールの濃度の上昇の際に、細胞内で細胞質膜から保持小胞へとその局在を変化させることができる蛍光融合ポリペプチドであって、該蛍光融合ポリペプチドは、膜局在ペプチド、ＰＫＣδとの結合配列を含むセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチド、小胞体保持シグナル及び蛍光ペプチドを含み、ここで、
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置し、任意にリンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合しており、該蛍光ペプチドは次いで、任意にリンカーを介して、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合しており、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、任意にリンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合しており、該小胞体保持シグナルは次いで、蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置している、
蛍光融合ポリペプチドに関する。
【００７２】
本発明の第４の態様の好ましい実施形態において、ＰＫＣδとの結合配列は、配列番号１９（ＡＡＲＫＲＫＧＳＦＦＹＧＧ）又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体からなる群より選択される。
【００７３】
本発明の第４の態様の更なる好ましい実施形態において、小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでｘはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬであり、及び／又は、膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン若しくはアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の相同性のある変異体である。
【００７４】
本発明の第４の態様の別の好ましい実施形態において、蛍光ペプチドが、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｔＲＦＰ及びｔＲＦＰ６０２からなる群より選択される。
【００７５】
本発明の第４の態様の更により好ましい実施形態において、
ａ．  ＰＫＣδとの結合配列は、配列番号１９（ＡＡＲＫＲＫＧＳＦＦＹＧＧ）又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体であり、
ｂ．  膜局在ペプチドは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメイン又はアミノ酸同一性に基づいて全領域にわたってこの配列と少なくとも９０％の相同性のある変異体であり、かつ、
ｃ．  小胞体保持シグナルは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＸＫＸＸ及びＲＸＲからなる群より選択されるペプチドであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、該小胞体保持シグナルはＫＤＥＬである。
【００７６】
本発明の第４の態様の更に別の好ましい実施形態において、蛍光融合ポリペプチドは、配列番号１８を含む。
【００７７】
本発明の第５の態様は、本発明の先の態様のいずれかにおいて規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【００７８】
本発明の第６の態様は、本発明の第１、第２、第３及び第４の態様において規定される融合ポリペプチドを含むバイオセンサーに関する。
【００７９】
本発明の第７の態様は、本発明の第１、第２、第３若しくは第４の態様のいずれかにおいて規定される蛍光融合ポリペプチド又は本発明の第６の態様において規定されるバイオセンサーを含む細胞に関し、好ましくは、該細胞は細胞株Ｕ２Ｏ２である。
【００８０】
更なる態様において、本発明は、本発明の第１、第２、第３若しくは第４の態様のいずれかに規定される蛍光融合ポリペプチド又は本発明の第６の態様に規定されるバイオセンサーについてのいくつかの使用に関する。本発明によるバイオセンサーの第１の使用は、ｃＡＭＰ、カルシウム、ジアシルグリセロール、ＩＰ３及びｃＧＭＰを含むがこれらに限定されないセカンドメッセンジャーの検出及び定量のためのものである。既に述べたように、セカンドメッセンジャーの、本発明のこれらの態様のいずれかの蛍光融合ポリペプチドへの結合は、細胞内蛍光局在の変化を導く、空間的コンフォメーションのかなりの変化をもたらす。この蛍光転位は、蛍光顕微鏡法によるセカンドメッセンジャー定量に利用することができる。さらに、この全プロセスは、バイオセンサーにおける蛍光タンパク質の存在によって生細胞中で追跡することができる。
【００８１】
本発明の第１、第２、第３若しくは第４の態様のいずれかに規定される蛍光融合ポリペプチド又は本発明の第６の態様に規定されるバイオセンサーの使用は、薬物スクリーニング用のツールとしてのその使用も更に含む。
【００８２】
さらに、本発明の第１、第２、第３若しくは第４の態様のいずれかに規定される蛍光融合ポリペプチド又は本発明の第６の態様に規定されるバイオセンサーは、セカンドメッセンジャー伝達（transduction）の読み取りが得られる本質的にあらゆる適用の実施に有用である。かかる適用は当該技術分野において既知である。しかしながら、本発明の単に例示的な適用としては限定されないが以下が挙げられる。
ａ．  蛍光顕微鏡法装置を用いてセカンドメッセンジャー移動を研究することによる、増殖因子、サイトカイン、Ｇタンパク質共役型受容体、インテグリン及びカルシウムイオンチャンネルから選択される細胞表面受容体の、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト又は天然リガンドとして作用する試験化合物の同定。好ましい実施形態において、上記細胞表面受容体はＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。
ｂ．  受容体のペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及びインバースアゴニストの発現クローニング。
ｃ．  セカンドメッセンジャーの細胞内存在を変化させるモジュレーターの発現クローニング。
ｄ．  膜分子モジュレーターの用量応答曲線の確立。
ｅ．  シグナル伝達カスケードがこれらセカンドメッセンジャーに依存し、それによってバイオセンサーを診断ツールとして用いることができる、疾患又は障害に関与する膜分子及びモジュレーターの変化の決定。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の第１、第２、第３若しくは第４の態様のいずれかに規定される蛍光融合ポリペプチド又は本発明の第６の態様に規定されるバイオセンサーは、生細胞におけるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャンネル、及びその他のタンパク質の活性の研究を可能とする安定発現細胞株の作製に用いることができる。本発明のバイオセンサーの迅速な転位は、ＧＰＣＲ及びイオンチャンネル刺激の定量を可能とする。
【００８４】
本発明の蛍光融合ポリペプチド及び対応するバイオセンサーは当業者に既知の技法によって作ることができるが、例として、それらは以下のようにして構築することができる。膜局在ペプチド、蛍光ペプチド、タンパク質変換相互作用ペプチド及び小胞体局在シグナルに対応するコード配列はＰＣＲによって容易に増幅し、シャトルプラスミドにクローニングすることができる。これらのコード配列は次いで、各配列に隣接する制限酵素部位を用いて本明細書において示される特定の順序で最終融合プラスミドに容易にクローニングすることができる。
【００８５】
以下の実施例は単に本発明を例示するものである。
【実施例】
【００８６】
実施例１．  セカンドメッセンジャーであるカルシウムの広いダイナミックレンジの生理的濃度内における生細胞中のカルシウムの測定のためのカルシウムバイオセンサーの構築（Construction）及び使用
本発明者らは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメインを膜局在ペプチドとして、配列番号１の筋ミオシン軽鎖キナーゼからのカルモジュリン結合ドメインをセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドとして、ペプチドＫＤＥＬを小胞体保持シグナルとして、及びｔｕｒｂｏＧＦＰを蛍光ペプチドとして含む蛍光融合ポリペプチドを構築し、ここで、
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置させ、リンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合させ、該蛍光ペプチドは次いで、リンカーを介して、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合させ、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、リンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合させ、該小胞体保持シグナルは次いで蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置させた。
【００８７】
完全な蛍光融合ポリペプチドを配列番号１５に示す。
【００８８】
このポリペプチドが生細胞内での細胞内蛍光再分布を誘導するか否かを評価するために、ｔｕｒｂｏＧＦＰポリペプチドを蛍光ペプチドとしてクローニングし、バイオセンサーの細胞局在をカルシウム誘導性活性化の際に分析した。この意味で、細胞株ＨＥＫ２９３及びＵ２Ｏ２に上記バイオセンサーのｃＤＮＡ（配列番号１５を参照されたい）を含有するプラスミド構築物（construction）を安定にトランスフェクトした。トランスフェクションの後に、両方の細胞株は蛍光の膜分布を示した。しかしながら、バイオセンサーの膜分布のかなりの低下が、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ及び１μＭのイオノマイシンによりカルシウムの細胞内レベルを上昇させた後に観察された。この結果は、細胞内カルシウム濃度の上昇は、蛍光バイオセンサーの再分布を促進するバイオセンサーのコンフォメーション変化を誘導することを示す。活性をこれらの細胞の粒度の増大として計算した。これらの同じ結果が図２（左図）に示すように上記細胞株の３つの異なるクローンを用いて得られ、これはこれらの結果の再現性の証拠を提供する。
【００８９】
次に、カルシウムが生理的ダイナミックレンジ内で有意なコンフォメーション変化を誘導するか否かを決定するために、Ｕ２Ｏ２バイオセンサー安定発現細胞株に安定にヒトタキキニン受容体１をトランスフェクトした。ニューロキニン１受容体（ＮＫ１Ｒ）又はサブスタンスＰ受容体（ＳＰＲ）としても知られているタキキニン受容体１（ＴＡＣＲ１）は、中枢神経系及び末梢神経系においてみられるＧタンパク質共役型受容体である。この受容体は他のタキキニンについてもいくらかの親和性を有するが、この受容体の内在性リガンドはサブスタンスＰであり、サブスタンスＰは神経細胞によって合成され、シナプス小胞へと輸送され、サブスタンスＰの放出はカルシウム依存的機構の脱分極作用を介して達成される。ＮＫ１受容体を刺激すると、それらは多様なセカンドメッセンジャーを生成することができ、かかるセカンドメッセンジャーは、細胞興奮性及び機能を調節する広範なエフェクター機構を始動することができる。これらの機構の１つは細胞内及び細胞外の両方の源からのカルシウムの動員を導く。
【００９０】
二重安定発現細胞株を９６ｍｍ光学プレート上の１ウェルあたり２００００細胞にて播種し、１０％ウシ胎仔血清を追加した２００ｕｌのＤＭＥＭ  Ｆ１２中で培養した。蛍光バイオセンサー再分布のために、細胞を異なる濃度のアゴニストであるサブスタンスＰで６時間刺激した。処理の後に、核をＤＡＰＩで染色し、バイオセンサー蛍光再分布を、画像解析アルゴリズムを用いて蛍光によって検出した。細胞をアゴニストで処理した場合、バイオセンサーは、原形質膜から高強度で小胞へとインターナライズされた（図３）。活性をこれらの細胞の粒度の増大として計算した。細胞を１１ｌｏｇ希釈系列で処理した（ｎ＝５）。サブスタンスＰについてのＥｃ５０はアゴニストによる６時間の処理後に約９．５×１０−１２Ｍであった。再分布アッセイをハイコンテントスクリーニングについて平均Ｚ’＝０．８５±０．０１を用いて確証した（図４）。
【００９１】
その他の方法と比較したバイオセンサー感度を確認するために、典型的な蛍光カルシウムアッセイをＦｕｒａ−２／ＡＭ放射測定を用いて行った。細胞の内側のカルシウムの上昇は、カルシウムイオンに結合したＦｕｒａ２からの蛍光とカルシウムイオンに結合していないＦｕｒａ２からの蛍光との比を用いて測定した。細胞をＦｕｒａ２−ＡＭとともにインキュベートし、サブスタンスＰ濃度を徐々に上昇させて処理した。細胞を０μＭ〜１０μＭの範囲のサブスタンスＰ濃度で、４連で処理した。サブスタンスＰについてのＥＣ５０は約１．４×１０−８Ｍであった。カルシウムアッセイをハイコンテントスクリーニングについてＺ’＝０．８４を用いて確証した。
【００９２】
両方の定量方法において、画像取得はBD Biosciencesからの「ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  ８５５」Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｂｉｏｉｍａｇｅｒを用いて行った。
【００９３】
実施例２．  セカンドメッセンジャーであるｃＡＭＰの広いダイナミックレンジの生理的濃度内における生細胞中のｃＡＭＰの測定のためのｃＡＭＰバイオセンサーの構築及び使用
本発明者らは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメインを膜局在ペプチドとして、配列番号９のＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）からのタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）結合ドメインをセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドとして、ペプチドＫＤＥＬを小胞体保持シグナルとして、及びｔｕｒｂｏＧＦＰを蛍光ペプチドとして含む蛍光融合ポリペプチドを構築し、ここで、
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置させ、リンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合させ、該蛍光ペプチドは次いで、リンカーを介して、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合させ、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、リンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合させ、該小胞体保持シグナルは次いで蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置させた。
【００９４】
完全な蛍光融合ポリペプチドを配列番号１６に示す。
【００９５】
実施例１のバイオセンサーと同様に、上記ポリペプチドの活性化が生細胞中での細胞内蛍光再分布を誘導するか否かを評価するために、ペプチドｔｕｒｂｏＧＦＰを蛍光ペプチドとしてクローニングし、バイオセンサーの細胞局在をｃＡＭＰ誘導性活性化の際に分析した。この意味で、細胞株ＳＨＳＹ５Ｙ及びＵ２Ｏ２に安定に上記バイオセンサーのコード配列を含有するプラスミド構築物をトランスフェクトした。両方の細胞株が蛍光の膜分布を示した。実施例１と同様に、活性を３つの異なる安定なクローンにおいてこれら細胞を１０μＭのフォルスコリン及び２５μＭのＩＢＭＸで３６時間処理することによる粒度の増大として計算した（図２右図）。
【００９６】
ｃＡＭＰが生理的ダイナミックレンジ内で有意なコンフォメーション変化を誘導するか否かを決定するために、Ｕ２Ｏ２バイオセンサー安定発現細胞株にヒトアドレナリンベータ２受容体を安定にトランスフェクトした。このアドレナリン受容体は、カテコールアミン、特に、ノルアドレナリン（ノルエピネフリン）及びアドレナリン（エピネフリン）の標的であるＧタンパク質共役型受容体の一種である。二重安定発現細胞株を９６ｍｍ光学プレート上の１ウェルあたり２００００細胞にて播種し、１０％ウシ胎仔血清を追加した２００ｕｌのＤＭＥＭ  Ｆ１２中で培養した。蛍光バイオセンサー再分布のために、細胞を異なる濃度のイソプロテレノールアゴニストで３６時間刺激した（図５）。処理の後に、核をＤＡＰＩで染色し、バイオセンサー蛍光再分布を、画像解析アルゴリズムを用いて蛍光によって検出した。細胞をアゴニストで処理した場合、バイオセンサーは、原形質膜から高強度で小胞へとインターナライズされた。活性をこれらの細胞の粒度の増大として計算した。細胞を１１ｌｏｇ希釈系列で処理した（ｎ＝５）。イソプロテレノールについてのＥｃ５０はアゴニストでの２４時間の処理後に約２．３×１０−７Ｍであった。再分布アッセイをハイコンテントスクリーニングについて平均Ｚ’＝０．７±０．０１を用いて確証した。結果を図６に示す。
【００９７】
実施例３．  セカンドメッセンジャーであるジアシルグリセロールの広いダイナミックレンジの生理的濃度内における生細胞中のジアシルグリセロールの測定のためのジアシルグリセロールバイオセンサーの構築及び使用
本発明者らは、配列番号１７のインターロイキン−２受容体の細胞外ドメインを膜局在ペプチドとして、配列番号１９の結合ドメインをセカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドとして、ペプチドＫＤＥＬを小胞体保持シグナルとして、及びｔｕｒｂｏＧＦＰを蛍光ペプチドとして含む蛍光融合ポリペプチドを構築し、ここで、
ａ．  膜局在ペプチドは、蛍光融合ポリペプチドのＮ−末端に位置させ、リンカーを介して、蛍光ペプチドに物理的に結合させ、該蛍光ペプチドは次いで、リンカーを介して、セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドに物理的に結合させ、かつ、
ｂ．  セカンドメッセンジャー変換タンパク質結合ペプチドは、リンカーを介して、小胞体保持シグナルに物理的に結合させ、該小胞体保持シグナルは次いで蛍光融合ポリペプチドのＣ−末端に位置させた。
【００９８】
完全な蛍光融合ポリペプチドを配列番号１８に示す。
【００９９】
先の実施例と同様に、上記ポリペプチドの活性化が生細胞中での細胞内蛍光再分布を誘導するか否かを評価するために、ペプチドｔｕｒｂｏＧＦＰを蛍光ペプチドとしてクローニングし、バイオセンサーの細胞局在をジアシルグリセロール誘導性活性化の際に分析した。この意味で、Ｕ２Ｏ２細胞株に上記バイオセンサーのコード配列を含有するプラスミド構築物を安定にトランスフェクトした。この安定にトランスフェクトされた細胞株は、細胞内ジアシルグリセロールの活性化の誘導の前には蛍光の膜分布を示した。先の実施例と同様に、活性を、徐々に上昇させた用量のＰＭＡによってこれら細胞を処理することによる粒度の増大として計算した。結果を図７及び図８に示す。
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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