(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式１の構造を持つ二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式１）
（前記構造式１で、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、ＸおよびＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカー媒介された共有結合を意味して、Ｒは、配列番号７１番の配列を持つセンス鎖と前記センス鎖の配列と相補的な配列を持つアンチセンス鎖を含むデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを意味し、
前記親水性物質は、下記の構造式５または構造式６の構造を持ち、
（Ａ’ｍ−Ｊ）ｎ    （構造式５）
（Ｊ−Ａ’ｍ）ｎ    （構造式６）
前記構造式５および構造式６で、Ａ’は、親水性物質単量体を意味し、Ｊは、ｍ個の親水性物質単量体の間を連結するリンカーを意味するか、又はｍ個の親水性物質単量体とｓｉＲＮＡを互いに連結するリンカーを意味し、ｍは１〜１５の整数を意味し、ｎは１〜１０の整数を意味し、そして親水性物質単量体Ａ’は下記の化合物（１）〜（３）から選択されたいずれか一つの化合物であり、前記リンカー（Ｊ）は、ＰＯ３−、ＳＯ３およびＣＯ２で構成された群から選択される
0006368363.tif 000017
）。
【請求項２】
下記の構造式２の構造を持つことを特徴とする請求項１に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
【化１】
0006368363.tif 000018
（前記構造式２で、Ｓは、請求項１に記載のｓｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳは、請求項１に記載のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を意味して、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは、請求項１に記載の構造式１での定義と同様である）。
【請求項３】
下記の構造式３または構造式４の構造を持つことを特徴とする請求項２に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
【化２】
0006368363.tif 000019
（前記構造式３および構造式４で、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｙ、ＳおよびＡＳは、請求項２に記載の構造式２での定義と同様であり、５’および３’は、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端および３’末端を意味する）。
【請求項４】
前記親水性物質の分子量は、２００〜１０，０００であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項５】
前記親水性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンで構成された群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項４に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項６】
前記疎水性物質の分子量は、２５０〜１，０００であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項７】
前記疎水性物質は、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質、及びリポポリアミンで構成された群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項８】
前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマートおよびコレステリルアミンで構成された群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項９】
前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする請求項７に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１０】
前記ＸおよびＹで表される共有結合は、非分解性結合または分解性結合であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１１】
前記非分解性結合は、アミド結合またはリン酸化結合であることを特徴とする請求項１０に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１２】
前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする請求項１０に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１３】
前記親水性物質に受容体媒介内包作用（ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンドが追加的に結合されたことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１４】
前記リガンドは、ターゲット受容体特異的抗体、アプタマー、ペプチド、葉酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＮＡＧ）、ブドウ糖及びマンノースで構成された群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１５】
前記親水性物質のｓｉＲＮＡと結合された反対側末端部位にアミン基またはポリヒスチジン基が追加的に導入されたことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１６】
前記アミン基またはポリヒスチジン基は、一つ以上のリンカーを介して親水性物質または親水性ブロックと連結されたことを特徴とする請求項１５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１７】
前記アミン基は、第一級〜第三級アミン基中から選択されたことを特徴とする請求項１５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１８】
前記ポリヒスチジン基は、３〜１０個のヒスチジンを含むことを特徴とする請求項１５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子。
【請求項２０】
デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号８２の配列に置き換えられ、そしてアンチセンス鎖が、このセンス鎖の配列と相補的な配列に置き換えられている請求項１〜１８のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体をさらに含む、請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、または請求項１９又は２０に記載のナノ粒子を有効成分として含む薬剤学的組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体と
センス鎖が、配列番号８２の配列に置き換えられ、そしてアンチセンス鎖が、このセンス鎖と相補的な配列に置き換えられている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体と
を含む複数の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を有効成分として含む薬剤学的組成物。
【請求項２３】
請求項２１又は２２に記載の組成物を含む凍結乾燥された形態の製剤。
【請求項２４】
デングウィルス感染の予防または治療用医薬の製造における、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、ナノ粒子、組成物または製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡ、そのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびこれを含むデングウィルス増殖抑制用組成物に関し、前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、細胞内に効率的に伝達されるようにするため、二重らせんＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の両末端に親水性物質および疎水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合を利用して接合された形態の構造を持ち、水溶液で前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の疎水性相互作用によってナノ粒子形態に転換されることができる。前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に含まれたｓｉＲＮＡは、デングウィルスに特異的なｓｉＲＮＡであることが好ましい。
【０００２】
また、本発明は、前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造方法および前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むデングウィルス増殖抑制およびデングウィルス感染を予防および治療するための薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
デングウィルス（Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）は、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）ＲＮＡと径３０ｎｍ大きさの単一外皮を持ち、正極性を示すフラビウィルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）に属するウィルスで、世界中最も多い感染者が発生する疾病の一つである。デング熱は、媒介蚊または感染者によって伝染され、筋肉痛、関節痛を伴った高熱と発疹が起きる症状があり、場合により出血が起きたりもするが、デング出血熱（ｄｅｎｇｕｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ）を伴う場合、命を失う危険が非常に高くなる。また、感染したデングウィルス型に対しては一生免疫ができるが、他のウィルス型に対しては防御できないため、流行る地域に住む人々の場合、一生４種類の形態のデングウィルス感染が全て起きる可能性がある。
【０００４】
世界保健機関は、世界で毎年５千万人以上の感染者と百万人以上の患者が発生すると推算していて、核心の公衆保健問題中の一つと考えられているが、まだ予防ワクチンはない実情である。東南アジアは、地域的にデング熱の最大流行地域であり、様々な血清型のデングウィルスによる再感染が簡単に起きて、二次感染時にはデング出血熱（Ｄｅｎｇｕｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ，ＤＨＦ）とデングショック症候群（Ｄｅｎｇｕｅ  ｓｈｏｃｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＤＳＳ）等が主な死亡原因となっている（Ｑｉｕ  ＦＸ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ，７１：３４９−３５９，１９９３；Ｔａｓｓｎｉｙｏｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，９２：１１１−１１５，１９９３）。国内の場合、現在までデング熱が直接発生した事例はないが、流行る地域との交易の拡大および海外旅行、海外居住などによって今後韓国人のデングウィルス感染者は増加すると予想される。また、奥地旅行のような旅行形態の変化、流行地域に対する繰り返し訪問など個人の感染機会増加は、デングウィルス再感染の可能性を増加させて、二次感染によるＤＨＦやＤＳＳの発生危険も増加させられる。実際に国立保健研究員では２００１〜２００３年６月まで海外旅行から帰国してデング熱疑い症状を見せる９９人に対する血清学的試験を実施して３３人のデングウィルス抗体陽性者を確認した。
【０００５】
デングウィルスは、四つの血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）を示し、約１１ｋｂほどのゲノムの大きさ（ｇｅｎｏｍｅ  ｓｉｚｅ）を持つ。デングウィルスゲノムは、一つのポリプロテイン（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）に翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）され、以後宿主あるいはウィルス内在プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）により切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）されると共に機能性タンパク質（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に分かれる。
【０００６】
既存のワクチン戦略では、類似の四つの血清型に対して汎用的な多価ワクチンでは効果的な保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を誘導せず、デングウィルスの増殖抑制に大きな困難があった。しかし、ウィルスゲノム（ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ）に対する遺伝工学的な接近で四つの血清型全てに効果的なワクチンに対する研究が進行中であり、現在、特定多国籍製薬会社によって最終臨床が進行中である。しかし、一般に一次感染（ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の場合は致命的ではないが、それぞれ異なる血清型による二次感染が起きるようになると、既に形成された抗体によっては効果的に保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）されずかえってＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｐｅｎｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によるウィルス感染を増加させて、命に大きい威嚇を加えられ、現在まではこのような患者に対してサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を処方するレベルの一次的な接近しか出来ずにいる。一方、遺伝子の発現を抑制する技術は、疾病治療のための治療剤開発および標的検証において重要なツールである。この技術で、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」という）は、その役割が発見された以後、多様な種類の哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ）で配列特異的にｍＲＮＡに作用することが明らかになった（Ｓｉｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２００５，８３：７６４−７７３）。長い鎖のＲＮＡ二本鎖が細胞に伝達されると、伝達されたＲＮＡ二本鎖はＤｉｃｅｒというエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によって２１〜２３塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ，ｂｐ）でプロセッシングされた短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、以下「ｓｉＲＮＡ」という）に変換されて、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合してガイド（アンチセンス）鎖が、ターゲットｍＲＮＡを認識して分解する過程を介してターゲット遺伝子の発現を配列特異的に阻害する（ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＢＡＳＩＣ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＣＥＮＴ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２００２．１，５０３−５１４）。
【０００７】
ベルトラン（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）研究グループの研究によると、同じターゲット遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）に比べてｓｉＲＮＡが生体内／外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ）でｍＲＮＡ発現の阻害効果が優れて、該当効果が長く持続される効果を持つと明らかになった（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２．２９６：１０００−１００４）。
【０００８】
また、ｓｉＲＮＡの作用機序は、ターゲットｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的に標的遺伝子の発現を調節するので、既存の抗体ベース医薬品や化学物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｒｕｇ）に比べて適用できる対象が画期的に拡大する可能性がある長所を持つ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ．２００６  １３（４）：６６４−６７０）。
【０００９】
ｓｉＲＮＡなどの優れた効果および多様な使用範囲にもかかわらず、ｓｉＲＮＡが治療剤として開発されるためには、ｓｉＲＮＡの安定性改善と細胞伝達効率改善によって、ｓｉＲＮＡがターゲット細胞に効果的に伝達されなければならない（Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．２００６  Ｊａｎ；１１（１−２）：６７−７３）。
【００１０】
前記問題を解決するために、体内安定性改善のためにｓｉＲＮＡの一部ヌクレオチドまたは骨格（ｂｏａｃｋｂｏｎｅ）を核酸分解酵素抵抗性を持つように修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するかウィルス性ベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）、リポソームまたはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）等の伝達体の利用などに対する研究が活発に試みられている。
【００１１】
アデノウィルスやレトロウィルスなどのウィルス性ベクターを利用した伝達システムは、形質注入効率（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）が高いが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）および発ガン性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が高い。一方、ナノ粒子を含む非ウィルス性（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ）伝達システムは、ウィルス性伝達システムに比べて細胞伝達効率は低い方であるが、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が高く、ターゲット特異的に伝達が可能で、内包されているＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞または組織に吸収（ｕｐｔａｋｅ）および内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）等の改善された伝達効果が高いだけでなく、細胞毒性および免疫誘発（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）が殆どなく、安全性が高い長所を有していて、現在はウィルス性伝達システムに比べて有力な伝達方法と評価されている（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡ  ｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００７  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ３；１１７（１２）：３６２３−３６３２）。
【００１２】
前記非ウィルス性伝達システムのうちナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）を利用する方法は、リポソーム、陽イオン高分子複合体などの様々な高分子を使用ことによってナノ粒子を形成して、ｓｉＲＮＡをこのようなナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、すなわちナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）に担持して細胞に伝達する形態を持つ。ナノ伝達体を利用する方法のうち主に活用される方法は、高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、高分子ミセル（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｅｌｌｅ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）等があるが、この中でリポプレックスを利用した方法は、カチオン性脂質で構成されて細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）のアニオン性脂質と相互作用してエンドソームの脱安定化効果を誘発して、細胞内で（に）伝達する役割をする（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１５；９３（２１）：１１４９３−８，１９９６）。
【００１３】
また、ｓｉＲＮＡパッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ；センス（ｓｅｎｓｅ））鎖の末端部位に化学物質などを連結して増進された薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）的特徴を持つようにして、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で高い効率を誘導できることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ  １１；４３２（７０１４）：１７３−８，２００４）。この時ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ；パッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ））またはアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ；ガイド（ｇｕｉｄｅ））鎖の末端に結合された化学物質の性質によりｓｉＲＮＡの安定性が変わる。例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）のような高分子化合物が接合された形態のｓｉＲＮＡはカチオン性物質が存在する条件でｓｉＲＮＡのアニオン性リン酸基と相互作用して複合体を形成することによって、改善されたｓｉＲＮＡ安定性を持つ伝達体となる（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２９（２）：１０７−１６，２００８）。特に高分子複合体で構成されたミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）は薬品伝達運搬体として使われる他のシステムである、小球体（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）等に比べてその大きさが小さく分布が非常に一定で、自発的に形成される構造であるため、製剤の品質管理および再現性確保が容易である長所がある。
【００１４】
また、ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ））を単純共有結合またはリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合で接合させたｓｉＲＮＡ接合体を介して、ｓｉＲＮＡの安定性確保および効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（大韓民国登録特許公報第８８３４７１号参照）。しかし、ｓｉＲＮＡの化学的修飾およびポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）を接合させること（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）だけでは生体内での低い安定性とターゲット組織への伝達がスムーズでない短所は依然として残る。このような短所を解決するために、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡのような二重らせんオリゴＲＮＡに親水性および疎水性物質が結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が開発されたが、前記構造体は、疎水性物質の疎水性相互作用によってＳＡＭｉＲＮＡＴＭ（ｓｅｌｆ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）と命名された自己組み立てナノ粒子を形成することになるが、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術は、既存の伝達技術に比べて非常にサイズが小さいながらも均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ナノ粒子を収得できる長所を持つ。
【００１５】
ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術の具体的な例として、親水性物質としてＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）が使用されるが、ＰＥＧは合成ポリマー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）で、よく医薬品特にタンパク質の水溶性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）増加および薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の調節のために使用された。ＰＥＧはすべての合成ポリマーがそうであるように、多分散系（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ）物質で、一つのバッチ（ｂａｔｃｈ）のポリマーは、他の個数の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の総計からなり分子量がガウス曲線形態を示し、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｖａｌｕｅ，Ｍｗ／Ｍｎ）で物質の同質性程度を表現する。すなわち、ＰＥＧが低い分子量（３〜５ｋＤａ）である時、約１．０１の多分散指数を示して高い分子量（２０ｋＤａ）である時、約１．２との高い多分散指数を示して、高い分子量であるほど物質の同質性が相対的に低い特徴を見せる（Ｆ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  （２００１）  ２２：４０５−４１７）。したがって、ＰＥＧを医薬品に結合させた場合、接合体にＰＥＧの多分散的特徴が反映されて単一物質の検証が容易ではない短所があって、ＰＥＧの合成および精製過程の改善を通じて低い多分散地数を持つ物質を生産する傾向にあるが、特に分子量が小さい物質にＰＥＧを結合させた場合、結合が容易できたかに対する確認が容易でない不便な点があるなど物質の多分散性特徴による問題点が存在する（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ａｎｄ  Ｇｉａｎｆｒａｎｃｏ  Ｐａｓｕｔ．ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＤＲＵＧ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＴＯＤＡＹ（２００５）  １０（２１）：１４５１−１４５８）。
【００１６】
これにより、最近では既存自己組み立てナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術の改良された形態で、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭを構成する二重らせんＲＮＡ構造体の親水性物質を一定の分子量を持つ均一な１〜１５の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）と必要に応じてリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む基本単位をブロック（ｂｌｏｃｋ）化して、これを必要に応じて適切な個数を使用することによって、既存のＳＡＭｉＲＮＡＴＭに比べてより小さい大きさを持ちまた多分散性が画期的に改善された新しい形態の伝達体技術が開発された。
【００１７】
以上考察したとおり、デングウィルスの大部分の血清型に対する優秀な治療効果を持つ治療剤は現在存在せず、既存のワクチン治療法は限界を有していて新しい形態の治療剤の開発が切実な状況である。ＲＮＡｉ技術に基づいたデングウィルス感染治療剤がその代案になる可能性はあるが、まだＲＮＡｉ技術に基づいた効果的な治療剤、特に全てのデングウィルス血清型に対する治療効果を持つ治療剤に対する開発は行われていない状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
前記のような問題点を解決しようと鋭意努力した結果、本発明者等はデングウィルスの保存配列から導き出されたｓｉＲＮＡ候補群が全てのデングウィルス血清型の増殖を優れた効率で抑制することを確認して、本発明を完成することになった。
【００１９】
そこで、本発明の目的は、血清型１、２、３および４のデングウィルスに特異的でありかつ非常に高い効率でその発現を阻害できる新規ｓｉＲＮＡおよびこれを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、そしてそのような二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造方法を提供するところにある。
また、本発明の他の目的は、前記デングウィルス特異的なｓｉＲＮＡまたはそのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を有効成分として含むデングウィルス増殖抑制および／または、窮極的にデングウィルス感染を予防および治療するための薬学的組成物を提供することである。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、前記デングウィルス特異的なｓｉＲＮＡまたはそのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を利用してデングウィルスの増殖方法および／または、窮極的にデングウィルス感染を予防および治療する方法を提供することである。
【課題を解決する手段】
【００２１】
本発明では配列番号１〜配列番号８８番から選択されたいずれか一つの配列を持つセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）の第１のオリゴヌクレオチドとそれに相補的な配列を持つアンチセンス鎖である第２のオリゴヌクレオチドを含むデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを提供する。
【００２２】
本発明でのｓｉＲＮＡは、一般的なＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）作用を持つ全ての物質を含む概念で、前記デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡにはデングウィルス特異的ｓｈＲＮＡなども含まれることは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者には自明である。
前記配列番号１〜配列番号８８番は、デングウィルスに特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖配列で、全てのデングウィルス血清型に存在する保存的領域をターゲットとしており、血清型と関係なく全てのデングウィルスの増殖を抑制して窮極的にデングウィルス感染の予防および／または、治療効果を示す特性を持つ。
【００２３】
本発明に係るｓｉＲＮＡは、好ましくは配列番号４〜８、１３、１６、２０、２２、２３、２９、３２、３４、３９〜４２、４４〜４７、５１、５２、７０〜７２、７６、７７および８０〜８２番中いずれか一つによるデングウィルス特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む。
【００２４】
さらに好ましくは、配列番号４、１６、２２、５１、５２、７１および８２番中いずれか一つによるデングウィルス特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む。
【００２５】
最も好ましくは、配列番号５１、５２、７１および８２番中いずれか一つによるデングウィルス特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む。
【００２６】
本発明に係るｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドからなることが好ましく、前記配列番号１〜配列番号８８番から選択されたいずれか一つのｓｉＲＮＡのセンス鎖およびこれに相補的なアンチセンス鎖を含む。
【００２７】
本発明に係るｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、血清型１、２、３および４デングウィルスの配列に結合できるのを特徴とするデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡであることを特徴とする。
【００２８】
本発明で提供されるデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡは、該当遺伝子を暗号化するｍＲＮＡと相補的に結合することができるように設計された塩基配列を持つので、該当遺伝子の発現を効果的に抑制できることを特徴とする。また、前記ｓｉＲＮＡの３’末端に一つまたは二つ以上の非結合（ｕｎｐａｉｒｅｄ）されたヌクレオチドを持つ構造であるオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含んでもよい。
【００２９】
また、前記ｓｉＲＮＡの生体内安定性向上のために、核酸分解酵素抵抗性付与および非特異的免疫反応減少のための様々な修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含んでもよい。前記ｓｉＲＮＡを構成する第１または第２オリゴヌクレオチドの修飾は一つ以上のヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ３（メチル）、−ＯＣＨ３（メトキシ）、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル（ｐｒｏｐｙｌ）、−Ｏ−２−メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換による修飾；ヌクレオチド内糖（ｓｕｇａｒ）構造内の酸素が硫黄に置き換えられた修飾；及びヌクレオチド結合のホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合への修飾で選択された一つ以上の修飾が組み合わせて使用でき、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄａｃｉｄ）またはＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）形態への修飾も使用可能である（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．５５：ｐｐ６１−６５  ２００４、ＵＳ５，６６０，９８５、ＵＳ５，９５８，６９１、ＵＳ６，５３１，５８４、ＵＳ５，８０８，０２３、ＵＳ６，３２６，３５８、ＵＳ６，１７５，００１；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３９−１１４３，２００３；ＲＮＡ，９：１０３４−１０４８，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３１：５８９−５９５，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（１７）５７６１−５７７３，２０１０；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（５）１８２３−１８３２，２０１１）。
【００３０】
本発明で提供されるデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡは、該当遺伝子の発現を低下させるだけでなく、該当タンパク質の発現を顕著に阻害して、結局細胞培養液に子孫ウィルス（ｐｒｏｇｅｎｙ）が排出されるのを抑制する。
【００３１】
本発明の他の様態として、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡの生体内への効率的な伝達および安定性向上のために、ｓｉＲＮＡの両末端に親水性物質および疎水性物質が接合された形態の接合体を提供する。
【００３２】
前記のとおりｓｉＲＮＡに親水性物質および疎水性物質が結合されたｓｉＲＮＡ接合体の場合、疎水性物質の疎水性相互作用によって自己組み立てナノ粒子を形成するようになるが（大韓民国特許登録番号第１２２４８２８号参照）、このような接合体は、体内への伝達効率および体内での安定性がきわめて優秀なだけでなく、粒子の大きさが均一性が優秀でＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）が容易であるため、薬物としての製造工程が簡単である長所がある。
【００３３】
一つの好ましい具体例として、本発明に係るデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記の構造式１のような構造を持つことが好ましい：
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式１）
前記構造式１で、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、ＸおよびＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味して、Ｒはデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを意味する。
【００３４】
より好ましくは、本発明に係るデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記の構造式２の構造を持つ：
【化１】
0006368363.tif 000002
前記構造式２で、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは、前記構造式１での定義と同様であり、Ｓは、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳは、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を意味する。
【００３５】
より好ましくは、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記の構造式３または４の構造を持つ：
【化２】
0006368363.tif 000003
前記構造式３および構造式４で、Ａ、Ｂ、Ｓ、ＡＳ、ＸおよびＹは、前記構造式１での定義と同様であり、５’および３’は、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端および３’末端を意味する。
【００３６】
前記構造式１〜構造式４でのデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のアンチセンス鎖の５’末端にリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）が一つ〜三つ結合されてもよく、ｓｉＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡが使用されてもよいことは本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者には自明である。
【００３７】
前記構造式１〜構造式４での親水性物質は分子量が２００〜１０，０００であるカチオン性または非イオン性高分子物質であることが好ましく、さらに好ましくは１，０００〜２，０００である非イオン性高分子物質である。例えば、親水性高分子化合物としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性高分子化合物を使用することが好ましいが、必ずしもこれに限定されるのではない。
【００３８】
特に、構造式１〜構造式４での親水性物質（Ａ）は、下記の構造式５または構造式６のような形態の親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）形態で利用されるが、このような親水性物質ブロックを必要に応じて適切な個数（構造式５または構造式６でのｎ）を使用することによって、一般合成高分子物質などを使用する場合に発生し得る多分散性による問題点を大きく改善することができる：
（Ａ’ｍ−Ｊ）ｎ    （構造式５）
（Ｊ−Ａ’ｍ）ｎ    （構造式６）
前記構造式５および構造式６で、Ａ’は、親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）を、Ｊはｍ個の親水性物質単量体の間またはｍ個の親水性物質単量体とｓｉＲＮＡを互いに連結するリンカー、ｍは１〜１５の整数、ｎは１〜１０の整数を意味して、（Ａ’ｍ−Ｊ）または（Ｊ−Ａ’ｍ）で表される繰り返し単位が親水性物質ブロックの基本単位に該当する。
【００３９】
前記構造式５または構造式６のような親水性物質ブロックを持つ場合、本発明に係るデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記の構造式７または構造式８のような構造を持つことができる：
（Ａ’ｍ−Ｊ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式７）
（Ｊ−Ａ’ｍ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式８）
前記構造式７および構造式８で、Ｘ、Ｒ、ＹおよびＢは、構造式１での定義と同様であり、Ａ’、Ｊ、ｍおよびｎは、構造式５および構造式６での定義と同様である。
【００４０】
前記構造式５〜構造式８で、親水性物質単量体（Ａ’）は、非イオン性親水性高分子の単量体中本発明の目的に合致するものなら制限なしに使用が可能で、好ましくは表１に記載された化合物（１）〜化合物（３）から選択された単量体、さらに好ましくは化合物（１）の単量体が使用され、化合物（１）でＧは好ましくはＣＨ２、Ｏ、ＳおよびＮＨから選択される。
【００４１】
特に、親水性物質単量体の中でも化合物（１）で表される単量体には様々な官能基を導入することができ、生体内親和性が良く免疫反応を少なく誘導するなど生体適合性（ｂｉｏ−ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）が優れるとともに、構造式７または構造式８に係る構造体内に含まれたｓｉＲＮＡの生体内安定性を増加させて、伝達効率を増加させることができる長所を有していて、本発明に係る構造体の製造に非常に適している。
【表１】
0006368363.tif 000004
【００４２】
構造式５〜構造式８での親水性物質（親水性物質ブロック）は総分子量が１，０００〜２，０００の範囲内であることが好ましい。したがって、例えば、構造式７および構造式８で化合物（１）に係るヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、すなわちＧがＯで、ｍが６である物質が使用される場合ヘキサエチレングリコールスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）の分子量が３４４であるため、繰り返し回数（ｎ）は３〜５が好ましい。
【００４３】
特に、本発明は必要に応じて前記構造式５および構造式６で（Ａ’ｍ−Ｊ）または（Ｊ−Ａ’ｍ）ｎで表される親水性基の繰り返し単位、すなわち親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）がｎと表される適切な個数で使用され得ることを特徴とする。前記各親水性物質ブロック内に含まれる親水性物質単量体であるＡ’とリンカーであるＪは、独立して各親水性物質ブロックの間に同じであってもよく、異なってもよい。すなわち、親水性物質ブロックが三つ使用される場合（ｎ＝３）、最初のブロックには化合物（１）に係る親水性物質単量体が、二番目のブロックには化合物（２）に係る親水性物質単量体が、三番目のブロックには化合物（３）に係る親水性物質単量体が使用されるなど、すべての親水性物質ブロック別に他の親水性物質単量体が使用されてもよく、すべての親水性物質ブロックに化合物（１）〜化合物（３）に係る親水性物質単量体で選択されたいずれか一つの親水性物質単量体が同様に使用されてもよい。同様に、親水性物質単量体の結合を媒介するリンカーも、各親水性物質ブロック別に全て同じリンカーが使用されてもよく、各親水性物質ブロック別に異なるリンカーが使用されてもよい。また、親水性物質単量体の個数であるｍも各親水性物質ブロックの間に同じであってもよく、異なってもよい。すなわち、最初の親水性物質ブロックでは、親水性物質単量体が三つ連結（ｍ＝３）され、二番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が五つ（ｍ＝５）、三番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が四つ連結（ｍ＝４）されるなど、それぞれ異なる個数の親水性物質単量体が使用されてもよく、すべての親水性物質ブロックで同じ個数の親水性物質単量体が使用されてもよい。
【００４４】
また、本発明で前記リンカー（Ｊ）は、ＰＯ３−、ＳＯ３およびＣＯ２で構成された群から選択されることが好ましいが、これに制限されず、使用される親水性物質の単量体などに応じて本発明の目的に合致する限りいかなるリンカーでも使用できることは当業者には自明である。
【００４５】
前記構造式１〜構造式４，構造式７および構造式８での疎水性物質（Ｂ）は、疎水性相互作用を介して構造式１〜構造式４，構造式７および構造式８に係るオリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子を形成する役割をする。前記疎水性物質は、分子量が２５０〜１，０００であることが好ましく、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）等が使用されるが、これに制限されず、本発明の目的に合致するものであればいかなる疎水性物質も使用可能である点は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者には自明である。
【００４６】
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマートおよびコレステリルアミンからなる群で選択されてもよく、前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどから選択されるが、この時、グリセリドの脂肪酸としては、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和脂肪酸が好ましい。
【００４７】
特に、前記疎水性物質の中でも飽和または不飽和炭化水素やコレステロールが、本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体の合成段階で容易に結合させることができる長所を有している点から好ましく、Ｃ２４炭化水素、特にジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を含むテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）が最も好ましい。
【００４８】
前記疎水性物質は、親水性物質の反対側末端（ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｄ）に結合され、二本鎖オリゴのセンス鎖またはアンチセンス鎖のどの位置に結合されても構わない。
【００４９】
本発明に係る構造式１〜構造式４，構造式７および構造式８で親水性物質ブロックまたは疎水性物質とデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡは単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合（ＸまたはＹ）によって結合される。前記共有結合を媒介するリンカーは、親水性物質、または疎水性物質とデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡの末端で共有結合して、必要に応じて特定環境で分解が可能な結合を提供する限り特に限定されるのではない。したがって、前記リンカーは、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造過程中デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡおよび／または親水性物質（または、疎水性物質）を活性化するために結合させるいかなる化合物も使用されることができる。前記共有結合は、非分解性結合または分解性結合のうちいずれでもよい。この時、非分解性結合としては、アミド結合またはリン酸化結合があり、分解性結合としては、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合または酵素分解性結合などがあるが、これに限定されない。
【００５０】
また、前記構造式１〜構造式４、構造式７および構造式８でのＲ（または、ＳおよびＡＳ）で表されるｓｉＲＮＡは、デングウィルス特異的に結合できる特性を持つｓｉＲＮＡならばいずれも制限なしに使用可能で、好ましくは本発明では配列番号１〜配列番号８８から選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を持つアンチセンス鎖で構成される。
【００５１】
本発明に係るｓｉＲＮＡは、好ましくは、配列番号４〜８、１３、１６、２０、２２、２３、２９、３２、３４、３９〜４２、４４〜４７、５１、５２、７０〜７２、７６、７７および８０〜８２番中いずれか一つによるデングウィルス特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み、
さらに好ましくは、配列番号配列番号４、１６、２２、５１、５２、７１、および８２番中いずれか一つによるデングウィルス特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み、
最も好ましくは、配列番号５１、５２、７１および８２番中いずれか一つによるデングウィルス特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む。
【００５２】
本発明はまた、本発明に係るデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体において、前記構造体内の親水性物質のｓｉＲＮＡと結合された反対側末端部位にアミン基またはポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が追加的に導入されてもよい。
【００５３】
これは、本発明に係るデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含む伝達体の細胞内導入とエンドソーム脱出を容易にするためのものであって、すでに量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）、デンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの伝達体の細胞内導入とエンドソーム脱出を容易にするためにアミン基の導入とポリヒスチジン基が利用できる点およびその効果が報告されている。
【００５４】
具体的に、伝達体の末端あるいは外側に修飾された１次アミン基は、生体内ｐＨでプロトン化されながら負電荷を帯びる遺伝子と静電気的相互作用によって結合体を形成して、細胞内流入後でエンドソームの低いｐＨで緩衝効果を持つ内部３次アミンによりエンドソームの脱出が容易になるにつれ、リソソームの分解から伝達体を保護することができると知られている（高分子ベースハイブリッド物質を利用した遺伝子伝達および発現抑制、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３，ｐｐ２５４−２５９）。
非必須アミノ酸の一つであるヒスチジンは、残基（−Ｒ）にイミダゾリン（ｐｋａ３  ６．０４）を持つので、エンドソームとリソソームで緩衝能力（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）を増加させる効果があって、リポソームをはじめとする非ウィルス性遺伝子伝達体（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）でエンドソーム脱出効率を上げるために、ヒスチジン修飾を利用することができる点が知られている（Ｎｏｖｅｌ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｓｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１８，ｐｐ２６２−２７０）。
【００５５】
前記アミン基またはポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基は、一つ以上のリンカーを介して親水性物質または親水性ブロックと連結されることができる。
【００５６】
本発明の構造式１に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の親水性物質にアミン基またはポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入される場合には、構造式９のような構造を持つことができる：
Ｐ−Ｊ１−Ｊ２−Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式９）
前記構造式９で、Ａ、Ｂ、Ｒ、ＸおよびＹは、構造式１での定義と同様であり、Ｐは、アミン基またはポリヒスチジン基を意味して、Ｊ１とＪ２は、リンカーとして、独立して単純共有結合、ＰＯ３−、ＳＯ３、ＣＯ２、Ｃ２−１２のアルキル、アルケニル、アルキニルから選択されるが、これに限定されず、使用される親水性物質により本発明の目的に合致するＪ１とＪ２はいかなるリンカーでも使用できることは当業者には自明である。
【００５７】
好ましくは、アミン基が導入された場合には、Ｊ２は単純共有結合またはＰＯ３−、Ｊ１はＣ６アルキルであることが好ましいが、これに限定されない。
【００５８】
また、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入された場合には構造式９では、Ｊ２は単純共有結合またはＰＯ３−、Ｊ１は化合物（４）が好ましいが、これに限定されない。
【化３】
0006368363.tif 000005
【００５９】
また、構造式９に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の親水性物質が構造式５または構造式６に係る親水性物質ブロックで、これにアミン基またはポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入される場合には、構造式１０または構造式１１と同じ構造を持つことができる：
Ｐ−Ｊ１−Ｊ２−（Ａ’ｍ−Ｊ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式１０）
Ｐ−Ｊ１−Ｊ２−（Ｊ−Ａ’ｍ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式１１）
前記構造式１０および構造式１１で、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ’、Ｊ、ｍおよびｎは、構造式５または構造式６での定義と同様であり、Ｐ、Ｊ１およびＪ２は、構造式９での定義と同様である。
【００６０】
特に、前記構造式１０および構造式１１において、親水性物質はデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合された形態であることが好ましく、この場合前記構造式９〜構造式１１は次の構造式１２〜構造式１４の形態を持つことができる：
【化４】
0006368363.tif 000006
前記構造式１２〜構造式１４で、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ、Ａ’、Ｊ、ｍ、ｎ、Ｐ、Ｊ１およびＪ２は、前記構造式９〜構造式１１での定義と同様であり、５’および３’は、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端および３’末端を意味する。
【００６１】
本発明で導入されることができるアミン基では、第一級〜第三級アミン基が使用され、一次アミン基が使用されることが特に好ましい。前記導入されたアミン基は、アミン塩で存在することもできるが、例えば一次アミン基の塩はＮＨ３＋の形態で存在することができる。
【００６２】
また、本発明で導入されることができるポリヒスチジン基は、３〜１０個のヒスチジンを含むことが好ましく、特に好ましくは５〜８個、最も好ましくは６個のヒスチジンを含む。追加的にヒスチジン以外に一つ以上のシステインが含まれてもよい。
【００６３】
ナノ粒子を用いた能動的ターゲッティング（ａｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）は、標的物質（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）をナノ粒子に結合させる技術として、ナノ粒子をターゲット組織での蓄積を増進（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）させるか、ターゲット細胞中にナノ粒子が伝達されると内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を改善することが報告された（Ｄｏｅｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｕｍｏｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｕｐｔａｋｅ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  Ｏｃｔ；２６（１０）：５５２−８．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ａｕｇ  ２１）。能動的ターゲッティングは、ターゲット細胞表面特異的または過発現されている炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）と結合できる能力を持つ物質（ターゲッティングモイエティ、ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）を利用する（Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００６；５（８）：１９０９−１９１７）。
【００６４】
したがって、本発明に係るデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびこれから形成されたナノ粒子にターゲッティングモイアティが備わると、効率的にターゲット細胞への伝達を促進して、比較的低い濃度の投与量でもターゲット細胞に伝達されて高いターゲット遺伝子発現調節機能を示し、他臓器および細胞への非特異的なデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡの伝達を防止することができる。
【００６５】
これにより、本発明は、前記構造式１〜構造式４、構造式７および構造式８に係る構造体にリガンド（Ｌ）、特に受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド（ｌｉｇａｎｄ）が追加的に結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を提供して、例えば構造式１に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体にリガンドが結合された形態は、下記の構造式１５のような構造を持つ：
（Ｌｉ−Ｚ）−Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式１５）
前記構造式１５で、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは、前記構造式１での定義と同様であり、Ｌは受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド、Ｚは、単純共有結合または親水性物質ブロック内の親水性物質単量体とリガンドの結合を媒介するリンカーを意味して、ｉは、１〜５の整数、好ましくは１〜３の整数である。
【００６６】
前記構造式１５でのリガンドは、好ましくはターゲット細胞特異的に細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させるＲＭＥ特性を持つターゲット受容体特異的抗体やアプタマー、ペプチド；または、葉酸（Ｆｏｌａｔｅ、一般にｆｏｌａｔｅとｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄは互いに交差使用されており、本発明での葉酸は、自然状態または人体で活性化状態であるｆｏｌａｔｅを意味する）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＮＡＧ）等のヘキソアミン（ｈｅｘｏａｍｉｎｅ）、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）をはじめとする糖や炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）等の化学物質などで選択されるが、これに限定されるのではない。
【００６７】
また、前記構造式１５での親水性物質Ａは、構造式５および構造式６に係る親水性物質ブロックの形態で使用されることができる。
【００６８】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、前記デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する方法を提供する。
【００６９】
本発明に係るデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する過程は、例えば、
（１）固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）をベースに親水性物質を結合させる段階；
（２）前記親水性物質が結合された固形支持体をベースにＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（３）前記ＲＮＡ一本鎖５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；
（４）前記ＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すれば固形支持体からＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖を分離精製する段階；及び
（６）製造されたＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖のアニーリングにより二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する段階；
を含む。
【００７０】
本発明での固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）は、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）が好ましいが、これに限定されず、ポリスチレン、シリカゲル、セルロースペーパーなどが使用されてもよい。ＣＰＧである場合、径は４０〜１８０μｍであることが好ましく、５００〜３０００Åの孔隙の大きさを持つことが好ましい。前記段階（５）以後、製造が完了されると、精製されたＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分子量を測定して、目的するＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖が製造されたか否かを確認することができる。前記製造方法において（２）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階（４）は、（１）段階以前または（１）段階〜（５）段階のうちいずれか一つの過程中に実行されても構わない。
【００７１】
また、（２）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖と相補的配列を含むＲＮＡ一本鎖は、５’末端にリン酸基が結合された形態で利用されたことを特徴とする製造方法であってもよい。
【００７２】
一方、本発明は、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に追加的にリガンドが結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造方法を提供する。
【００７３】
リガンドが結合されたデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含むオリゴＲＮＡ構造体を製造する方法は、例えば、
（１）官能基が結合されている固形支持体に親水性物質を結合させる段階；
（２）官能基−親水性物質が結合されている固形支持体をベースにＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（３）前記ＲＮＡ一本鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合させる過程で合成する段階；
（４）前記ＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すると、固形支持体から官能基−ＲＮＡ−高分子構造体および相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を分離する段階；
（６）前記官能基を利用して親水性物質末端にリガンドを結合してリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体一本鎖を製造する段階；及び
（７）製造されたリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖のアニーリングによりリガンド−二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する段階；
を含む。
【００７４】
前記（６）段階以後、製造が完了すると、リガンド−ＲＮＡ−高分子構造体および相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を分離精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分子量を測定して目的するリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体および相補的なＲＮＡが製造されたかを確認することができる。製造されたリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖のアニーリングによりリガンド−二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造することができる。前記製造方法において（３）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階（４）は、独立的な合成過程として（１）段階以前または（１）段階〜（６）段階のうちいずれか一つの過程中実行されても構わない。
【００７５】
本発明のさらに他の様態として、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子を提供する。
【００７６】
すでに先に説明したとおり、デングウィルス遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、疎水性および親水性物質を共に含んでいる両親媒性であり、親水性の部分は、体内に存在する水分子と水素結合などの相互作用を介して親和力を有していて外側へ向かうようになり、疎水性物質は、それらの間の疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を介して内側へ向かうようになり、熱力学的に安定したナノ粒子を形成するようになる。すなわち、ナノ粒子の中心に疎水性物質が位置するようになり、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡの外側方向に親水性物質が位置して、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを保護する形態のナノ粒子を形成する。このように形成されたナノ粒子は、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡの細胞内伝達向上およびｓｉＲＮＡ効能を向上させる。
【００７７】
本発明に係るナノ粒子は、互いに異なる配列を持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体で構成されることを特徴とするが、本発明での互いにことなる配列を持つｓｉＲＮＡは、デングウィルスの他のターゲット遺伝子特異的なｓｉＲＮＡであってもよく、同じターゲット遺伝子特異性を持ちながらその配列が異なる場合も含まれて解釈される。
【００７８】
また、デングウィルス特異的なｓｉＲＮＡ以外に他の疾患治療のためのターゲット遺伝子特異的なｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が本発明に係るナノ粒子に含まれてもよい。
【００７９】
また、本発明はさらに他の様態として、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡ、これを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体および／または前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を含むデングウィルス増殖抑制用組成物およびデングウィルス感染予防および／または治療のための薬学的組成物を提供する。
【００８０】
特に、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むデングウィルス増殖抑制用組成物には、
配列番号４〜８、１３、１６、２０、２２、２３、２９、３２、３４、３９〜４２、４４〜４７、５１、５２、７０〜７２、７６、７７および８０〜８２番に係る配列から選択されたいずれか一つの配列、より好ましくは配列番号４、１６、２２、５１、５２、７１および８２番から選択されたいずれか一つの配列、最も好ましくは配列番号５１、５２、７１および８２番中いずれか一つの配列を持つセンス鎖およびこれに相補的な配列を持つアンチセンス鎖を含むデングウィルス特異的なｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が含まれれもよく、
前記デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が混合された形態で含まれてもよい。
【００８１】
前記のように互いに異なる配列を持つデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を２種以上含むデングウィルス増殖抑制用組成物を利用する場合、併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）のように相乗効果を上げることができる。
【００８２】
また、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を含む本発明に係る薬学的組成物に含まれるナノ粒子もデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体で選択されたいずれか一つの構造体だけで純粋に構成されてもよく、デングウィルス特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が２種以上混合された形態で構成されてもよい。
【００８３】
本発明の組成物は、投与のために前記記載した有効成分以外に追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造してもよい。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能であるべきで、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち一つの成分または二つ以上の成分を混合して使用でき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形で製剤化することができる。特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）された形態の剤形（請求項３１）で製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥剤形製造のために本発明が属する技術分野で通常知られている方法が使用でき、凍結乾燥のための安定化剤が追加されてもよい。さらには、当分野の適正な方法でまたはレミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を利用して、各疾病に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００８４】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる有効成分などの含有量および投与方法は、通常の患者の症候と疾病の深刻度に基づいて本技術分野の通常の専門家が決めることができる。また、散剤、精製、カプセル剤、液剤、注射剤、軟こう剤、シロップ剤などの様々な形態で製剤化することができて、単位投与量または多投与量容器、例えば密封されたアンプルおよびビンなどで提供されてもよい。
【００８５】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または、非経口投与が可能である。本発明に係る薬剤学的組成物の投与経路は、これらに限定されず、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与が可能である。本発明に係る組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、方法、排泄率および疾病の重症度等によりその範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決めることができる。また、臨床投与のために、公知の技術を利用して本発明の薬剤学的組成物を適した剤形で製剤化することができる。
【００８６】
また、本発明は、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、これを含むナノ粒子および前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体または前記ナノ粒子を予防または治療を要する患者に投与することを含むデングウィルス感染の予防および治療方法を提供する。
【発明の効果】
【００８７】
本発明に係るデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡ、これを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むデングウィルス感染の予防および治療用組成物は、副作用なしに高い効率でデングウィルスの発現を抑制することができるので、現在適切な治療剤がないデングウィルス感染の予防および治療に非常に有用に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】デングウィルスゲノム配列５’−ＵＴＲ部位の多重整列結果を示す図面。Ａ：Ｕ１部位の多重整列結果、Ｂ：Ｕ２部位の多重整列結果。
【図２】デングウィルスゲノム配列３’−ＵＴＲ部位の多重整列結果を示す図面。Ａ：３’−ＵＴＲ上流の部分、Ｂ：Ｕ３〜Ｕ５部分部位の多重整列結果、Ｂ：Ｕ５部分〜Ｕ６部位の多重整列結果。
【図３】汎用（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ｓｉＲＮＡのウィルスゲノム上の相対的な位置を示す図面。
【図４】Ｃ６／３６細胞株での各血清型別デングウィルスの複製特性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示すグラフ。Ａ：デングウィルス血清型２の複製特性を示すグラフ、Ｂ：デングウィルス血清型３の複製特性を示すグラフ、Ｃ：デングウィルス血清型４の複製特性を示すグラフ。
【図５】ＶｅｒｏＥ６細胞株での各血清型別デングウィルスの複製特性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示すグラフ。Ａ：デングウィルス血清型２の複製特性を示すグラフ、Ｂ：デングウィルス血清型３の複製特性を示すグラフ、Ｃ：デングウィルス血清型４の複製特性を示すグラフ。
【図６】一次選別された５６種類のｓｉＲＮＡ候補群のデングウィルス血清型４の増殖抑制効果を示す図面。
【図７】一次選別された５種類のｓｉＲＮＡ候補群のデングウィルス血清型４の増殖抑制効果を示す図面。
【図８】一次選別された５種類のｓｉＲＮＡ候補群の濃度依存的デングウィルス血清型４の増殖抑制効果を示す図面。
【図９】一次選別された５種類のｓｉＲＮＡ候補群のデングウィルス血清型別増殖抑制効果を示す図面。
【図１０】高い相同性を示す部位から選定された既存の汎用ＳｉＲＮＡ＃５１とＳｉＲＮＡ＃５２でｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｌｉｄｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ  ｓｃａｎｎｉｎｇによってデザインされた二次汎用ｓｉＲＮＡ位置の相対的な位置を示す図面。
【図１１】一次選別された汎用的なＳｉＲＮＡ＃５１とＳｉＲＮＡ＃５２に対してｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｌｉｄｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ  ｓｃａｎｎｉｎｇによってデザインされた二次汎用３２個のｓｉＲＮＡ候補群のデングウィルス血清型２および血清型３の増殖抑制効果を示すグラフ。Ａ：ＳｉＲＮＡ＃５１ベースｓｉＲＮＡの増殖抑制効果、Ｂ：ＳｉＲＮＡ＃５２ベースｓｉＲＮＡの増殖抑制効果。
【図１２】最終選別された２種類のｓｉＲＮＡであるＳｉＲＮＡ＃５１−１５およびＳｉＲＮＡ＃５２−１０のデングウィルス血清型２〜血清型４の増殖抑制効果を示すグラフ。Ａ：ＳｉＲＮＡ＃５１−１５の増殖抑制効果。Ａ、Ｂ：ＳｉＲＮＡ＃５２−１０の増殖抑制効果。
【図１３】最終選別された２種類のｓｉＲＮＡであるＳｉＲＮＡ＃５１−１５およびＳｉＲＮＡ＃５２−１０の組み合わせ使用によるデングウィルス血清型２〜血清型４およびデングウィルスＪＢ２の増殖抑制効果を示すグラフ。
【図１４】実際デング患者治療適用の可能性検証のために、Ｐｒｅ−ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎで最終選別された２種類のｓｉＲＮＡであるＳｉＲＮＡ＃５１−１５およびＳｉＲＮＡ＃５２−１０の組み合わせ使用によるデングウィルス血清型２〜血清型４およびデングウィルスＪＢ２の増殖抑制効果を示すグラフ。
【図１５】最終選別された２種類のｓｉＲＮＡであるＳｉＲＮＡ＃５１−１５およびＳｉＲＮＡ＃５２−１０を各々または組み合わせ使用した場合のデングウィルス血清型１〜血清型４およびデングウィルスＪＢ２に対する濃度別増殖抑制効果を示すグラフ。Ａ：デングウィルス血清型１、Ｂ：デングウィルス血清型２、Ｃ：デングウィルス血清型ＪＢ２、Ｄ：デングウィルス血清型３、Ｅ：デングウィルス血清型４。
【図１６】本発明に係る二重らせんオリゴ高分子構造体で構成されたナノ粒子の模式図。
【図１７】本発明に係るＵ１  ｓｉＲＮＡを含むＳＡＭｉＲＮＡを利用したデングウィルス血清型４の増殖抑制効果を示す図面。
【図１８】本発明に係るｃｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡを含むＭｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡの全てのデングウィルス血清型１〜血清型４およびデングウィルスＪＢ２に対する増殖抑制効果を示すグラフ。
【図１９】本発明に係るｃｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡを含むＭｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡの全てのデングウィルス血清型１〜血清型４およびデングウィルスＪＢ２に対する濃度に応じた増殖抑制効果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００８９】
以下、添付された実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、このような実施例は本発明の技術的思想の内容と範囲を簡単に説明するための例示するものであって、これによって本発明の技術的範囲が限定されたり変更されるのではない。また、このような例示に基づいて本発明の技術的思想の範囲の中で様々な変形と変更が可能であることは当業者には当然である。
【００９０】
≪実施例１：デングウィルスの目標塩基配列デザインおよびｓｉＲＮＡの製造≫
病原性ウィルス銀行（Ｋｏｒｅａ  Ｂａｎｋ  ｆｏｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｋｏｒｅａ）から分譲されたデングウィルス血清型（Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ）４（銀行登録番号ＫＢＰＶ−ＶＲ−３１）をベロＥ６細胞（ＶｅｒｏＥ６  ｃｅｌｌ）に感染させて４日後細胞ペレット（ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔ）を回収した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔを利用してＲＮＡをｐｒｅｐして定量後２μｇの合計ｍＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡ）に基づいてＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＲｏｃｋｅｔｓｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）を使用してｃＤＮＡを合成して、獲得したｃＤＮＡの配列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）結果、デングウィルス血清型４菌株（ｓｔｒａｉｎ）Ｈ２４１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ９４７５３９．１）の全塩基配列のうち１１個の塩基（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、６個のアミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）配列を除いては一致することを確認した。
【００９１】
このような塩基配列分析結果に基づいて、Ｈ２４１塩基配列を対象にする４ヶ所のバイオ企業のｓｉＲＮＡデザインアルゴリズムを使用して上位ｓｃｏｒｅのｓｉＲＮＡと各機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）タンパク質に均等に分布されるように追加で選定されたｓｉＲＮＡを合わせて計５０種のｓｉＲＮＡを表２に記載されたとおりデザインした。
Ｂｉｏｎｅｅｒ：http://10.10.10.46:8080/siRNA2/menuDesigner.jsf；
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress；
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ：https://www.genscript.com/ssl-bin/gs_login；
ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：http://www.thermoscientificbio.com/design-center/-redirect=true）
【００９２】
以後、４種の血清型に属する約６０種余りのデングウィルス菌株（Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ）のＧｅｎｅｂａｎｋに登載されたゲノム配列（ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の５’−ＵＴＲ部位と３’−ＵＴＲ部位配列の多重整列（ｍｕｌｔｉａｌｉｇｎ）によって相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を比較して相同性が高い保存的配列（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部分を導き出した（図１および図２）。これにより、この部分をターゲットとする新しい汎用（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ｓｉＲＮＡ６個を表３に記載されたとおり追加で作製して、これらｓｉＲＮＡの相対的な位置を図３に示した。
【００９３】
【表２】
0006368363.tif 000007
【００９４】
【表３】
0006368363.tif 000008
【００９５】
また、ある遺伝子の発現を阻害しない配列のｓｉＲＮＡであるｓｉＣＯＮＴ（配列番号８９をセンス鎖として持つ）を製造した（表４）。前記ｓｉＲＮＡは、β−シアノエチルホスホロアミダイト（β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結して製造した（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：４５３９−４５５７，１９８４）。具体的に、ＲＮＡ合成機（３８４  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，ＢＩＯＮＥＥＲ，ＫＯＲＥＡ）を使用して、ヌクレオチドが付着された固形支持体上で、遮断除去（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）およびキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）からなる一連の過程を繰り返して望む長さのＲＮＡを含む反応物を収得した。前記反応物をＤａｉｓｏｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製して、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を利用して目標塩基配列と合致するか否かを確認した。以後、センスとアンチセンスＲＮＡ鎖を結合させて、配列番号１〜５６および配列番号８９から選択された配列をセンス鎖として含む二本鎖ｓｉＲＮＡを製造した。
【００９６】
【表４】
0006368363.tif 000009
【００９７】
≪実施例２：デングウィルス血清型２、３、４の培養および増殖≫
２．１：細胞の感染および培養
１２−ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にＣ６／３６ｃｅｌｌ（２．５×１０５／ｗｅｌｌ）とＶｅｒｏ  Ｅ６  ｃｅｌｌ（１×１０５／ｗｅｌｌ）を接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）して、デングウィルスで感染（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させる直前ＤＰＢＳで洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ  ｏｕｔ）した。
【００９８】
デングウィルス感染後２４時間の間隔でウィルス培養液を回収して遠心分離（６０００ｒｐｍ、５ｍｉｎｓ、４℃）を維持ばって培養液中４００μＬをＥｘｉＰｒｅｐＴＭ１６ＤＸ  ＲＮＡ  ｐｒｅｐ装備でＲＮＡ  ｐｒｅｐをして、計５０μＬと湧出されたＲＮＡ中１９．５μＬをｃＤＮＡ合成に使用して、計２０μＬのｃＤＮＡ中５μＬをｑＰＣＲに使用した。
使用されたデングウィルス血清型中血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）２〜血清型４は、病原性ウィルス銀行（Ｋｏｒｅａ  Ｂａｎｋ  ｆｏｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｋｏｒｅａ）から、血清型１は疾病管理本部神経系ウィルス課から分譲された。
【００９９】
２．２：ウィルスコピー（ｃｏｐｙ）数確認
回収した計４００μＬの培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）からＥｘｉｐｒｅｐ  ＤｘＴＭ装備を活用してＲＮＡを抽出した。この装備を活用して培養液４００μＬ当たり湧出（ｅｌｕｔｉｏｎ）された約５０μＬのＲＮＡを得た。
【０１００】
その後、ウィルスの血清型によるｃＤＮＡの合成のために使用された表５にしめしたプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）のアンチセンスプライマー（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）（１００ｐＭ／μＬ）０．５μＬと準備（ｐｒｅｐ．）されたウィルスＲＮＡ１９．５μＬをＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を使用して５０℃１ｈｒ、９５℃５ｍｉｎの反応時間を与えて計２０μＬのｃＤＮＡサンプルを最終的に確保した。その後、ｑＰＣＲの実行のために血清型１〜３の検出は、ＤＮ１２３４＿Ｓ、ＤＮ１２３＿ＡＳ、ＤＮ１２３＿ｐｒｏｂｅを使用して、血清型４の検出のためにはＤＮ１２３４＿Ｓ、ＤＮ４＿ＡＳ、ＤＮ４＿ｐｒｏｂｅを使用した。
【０１０１】
ｑＰＣＲ反応は、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  ＤｕａｌＳｔａｒＴＭ  ｑＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を使用してトータル  ５０μＬの反応体積に該当プライマーとプローブが０．３μＬずつ（１００ｐＭ／μＬストック（ｓｔｏｃｋ）基準）、ｃＤＮＡ５μＬ、４４．１μＬのｄＨ２Ｏをいれて、約３〜５分間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）して混合してＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ  ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を利用して９５℃１０ｍｉｎ、（９５℃５ｓｅｃ、６０℃５ｓｅｃ）×４５ｃｙｃｌｅで反応をして、各サイクル（ｃｙｃｌｅ）毎に蛍光値が検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）されるプロトコルを使用した。ｑＰＣＲ  ａｒｒａｙ後出後出てきた結果から各サンプルのウィルスコピー数および残余ウィルス（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｖｉｒｕｓ）の相対的な量（％）を計算した。
【０１０２】
【表５】
0006368363.tif 000010
【０１０３】
２．３：ウィルス増殖特性
各日数毎に二つのサンプルをＤｕｐｌｉｃａｔｅで進行して四つの値の平均値でｑＰＣＲ結果をグラフで導き出した。その結果、血清型２、３および４共にＣ６／３６細胞株（Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）で感染後７２時間までコピー（ｃｏｐｙ）数が急激に増加した後、維持されることを確認した（図４）。ＶｅｒｏＥ６細胞株の場合、血清型２および３は、感染後７２時間までコピー数が急激に増加した後、維持されて、血清型４は１４４時間まで徐々にコピー数が増加することを観察した（図５）。したがって、ウィルス増殖のために感染後７日目にウィルスを回収して、ｓｉＲＮＡ効能評価時にはウィルス増殖の多くが最高点に達する最小３日目に培養液を回収して実施例に使用した。血清型１の場合、日数よるコピー数の定量測定実験結果は、本明細書に明示はしなかったが、他の血清型と同じ条件と方法で実施例に使用された。
【０１０４】
≪実施例３：一次選別されたｓｉＲＮＡのデングウィルス増殖阻害能確認≫
３．１：ｓｉＲＮＡの形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）およびウィルス感染（ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例１で作製した５６種類のｓｉＲＮＡを利用して、ＶｅｒｏＥ６細胞を形質転換させて、前記形質転換された細胞株で生産されるウィルスのコピー数を分析してｓｉＲＮＡ性能を確認した。
【０１０５】
ｓｉＲＮＡ形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）２４時間前に、ＶｅｒｏＥ６細胞を１２−ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）（Ｎｕｎｃ，ＵＳＡ）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種する。ＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）完全培地（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ）を細胞の培養液として使用して１ｗｅｌｌ当たり１ｍＬずつ処理して３７℃、５％ＣＯ２の条件で細胞を培養した。完全培地組成は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  ５００ｍＬ（ｐＨ７．４）に４．００ｍＭのＬ−Ｇｕｔａｍｉｎｅおよび４５００ｍｇ／ＬのＧｌｕｃｏｓｅ、ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）を最終１０％の濃度に合わせた。２４時間後ｓｉＲＮＡの形質感染のために、１２−ウェルプレートに培養液を除去して、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）５００μＬに交換した後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）にそのままプレインキュベーション（Ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）したた。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）試薬３．５μＬを２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭに混合したのとｓｉＲＮＡを一定濃度に希釈した２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭをそれぞれ準備した後、５分間ＲＴで別々に置いた後、ｓｉＲＮＡが含まれた希釈したＯＰＴＩ−ＭＥＭをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉｍａｘが添加されたＯＰＴＩ−ＭＥＭに添加して２０分間ＲＴでインキュベーションした後に細胞に処理した。約６時間経過された後、洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ  ｏｕｔ）してＤＭＥＭに１０％ＦＢＳが添加された完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉａ）に交換して、２４時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。２４時間後、培地をｗａｓｈｉｎｇ  ｏｕｔした後準備されたｖｉｒｕｓ  ｓｏｕｐ（約１．０×１０８ｃｏｐｙ／ｍＬ）を二倍に希薄して２００μＬ当たり１×１０７ｃｏｐｉｅｓを越えるように調整した。２００μＬずつ各ウェルに処理後２時間の間３０分毎にｒｏｃｋｉｎｇしてウィルスがよく塗布されるようにして感染させて１ｍＬの２％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地（ｖｉｒｕｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉａ）を添加してアッセイ（ａｓｓａｙ）する前までインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を進行した。３日経過後取得した細胞培養液（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）からＲＮＡを抽出してウィルスコピー数を測定した。
【０１０６】
３．２：デングウィルス血清型４に対する５６種類ｓｉＲＮＡの阻害能確認
デザインされた計５６種のｓｉＲＮＡ候補群（表２および表３）でデングウィルス血清型４の増殖に対して阻害能を持つ候補群を選別するために、まず２０ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡを処理してスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）実験を行った。各実験毎にｓｉＲＮＡ  ｓｉＣＯＮＴ対照群の残存ウィルス（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｖｉｒｕｓ）値を１００％に定めて、他のｓｉＲＮＡ候補群の残存ウィルス値をそれに対する相対的な％として示して互いに比較できるように補正した。その結果、図６に図示されたとおり３０種以上のｓｉＲＮＡで１５％未満の残存ウィルスだけが存在することが明らかになり、高いデングウィルス阻害能を有していることを確認した。
【０１０７】
これにより、２０ｎＭの濃度で高いデングウィルス増殖阻害能を示す２３種のｓｉＲＮＡ候補群（ＳｉＲＮＡ＃４，ＳｉＲＮＡ＃５，ＳｉＲＮＡ＃６，ＳｉＲＮＡ＃７，ＳｉＲＮＡ＃８，ＳｉＲＮＡ＃１３，ＳｉＲＮＡ＃１６，ＳｉＲＮＡ＃２０，ＳｉＲＮＡ＃２２，ＳｉＲＮＡ＃２３，ＳｉＲＮＡ＃２９，ＳｉＲＮＡ＃３２，ＳｉＲＮＡ＃３４，ＳｉＲＮＡ＃３９，ＳｉＲＮＡ＃４０，ＳｉＲＮＡ＃４１，ＳｉＲＮＡ＃４２，ＳｉＲＮＡ＃４４，ＳｉＲＮＡ＃４５，ＳｉＲＮＡ＃４６，ＳｉＲＮＡ＃４７，ＳｉＲＮＡ＃５１，ＳｉＲＮＡ＃５２）を一次的に選別した。
【０１０８】
前記一次的に選別されたｓｉＲＮＡ候補群は、前記記載された順にそれぞれ配列番号４〜８、１３、１６、２０、２２、２３、２９、３２、３４、３９〜４２、４４〜４７、５１および５番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡである（表２および表３）。
本発明において、“ＳｉＲＮＡ＃Ｘ”のｓｉＲＮＡは、表２、表３および表６などでＳｉＲＮＡ♯Ｘと表示される配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを意味する。
【０１０９】
３．３：一次選別された五つのｓｉＲＮＡ候補群のデングウィルス血清型４に対する阻害能分析
前記実施例３．２で選別された２３個のｓｉＲＮＡ候補群を利用して、デングウィルス血清型４の増殖抑制効果を持つか否かを検定するために、５ｎＭの濃度のｓｉＲＮＡ処理を介してスクリーニング実験を行って、これから五つのｓｉＲＮＡ候補群（ＳｉＲＮＡ＃４，ＳｉＲＮＡ＃１６，ＳｉＲＮＡ＃２２，ＳｉＲＮＡ＃５１，ＳｉＲＮＡ＃５２）を選別した。
【０１１０】
以後、前記選別された５種のｓｉＲＮＡが全てのデングウィルス血清型に対する増殖抑制効果を持つか否かを確認するために、１０ｎＭの濃度のｓｉＲＮＡ処理を介したデングウィルス血清型４に対する増殖抑制効果を確認した。この時、Ｋｏｒｒａｐａｔｉ  ＡＢ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ．６（７）：ｅ１７３５，２０１２に記載されたｓｈＲＮＡと同じ配列のｓｉＲＮＡ（ＵｎｉｓｉＲＮＡ−ｓｈ）を陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として共に使用した。
【０１１１】
その結果、選別された５種のｓｉＲＮＡ候補群（ＳｉＲＮＡ＃４，ＳｉＲＮＡ＃１６，ＳｉＲＮＡ＃２２，ＳｉＲＮＡ＃５１，ＳｉＲＮＡ＃５２）が、ＵｎｉｓｉＲＮＡ−ｓｈに比べて優れたデングウィルス増殖阻害能を有していることが確認された（図７）。
【０１１２】
また、最終選別された五つのｓｉＲＮＡ候補群（ＳｉＲＮＡ＃４，ＳｉＲＮＡ＃１６，ＳｉＲＮＡ＃２２，ＳｉＲＮＡ＃５１，ＳｉＲＮＡ＃５２）の濃度依存的（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）なデングウィルス血清型４に対する増殖抑制効果があるか否かを調べるために、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭの四つの濃度でスクリーニング実験を行った。
【０１１３】
その結果、五つのｓｉＲＮＡ候補群いずれにおいて既存の５ｎＭ以上の濃度で、特に１０ｎＭ以上では多くのｓｉＲＮＡが１０％内外の残存ウィルスを現す阻害能を示す。一方、１ｎＭに濃度を低くした時には、その阻害能が維持されず減少することを確認することができた。この実験により５種類のｓｉＲＮＡ共に１０ｎＭ以上程度の濃度で処理をした時、高い阻害能を示すことを確認することができた（図８）。
【０１１４】
３．４：一次選別された５種類のｓｉＲＮＡの血清型別デングウィルス増殖抑制効能分析
一次選別された五つのｓｉＲＮＡ候補群が、各デングウィルス血清型別に阻害能を示すのか否かを調べるために、４種類血清型のデングウィルスを使用してそれぞれスクリーニング実験を行った。
【０１１５】
その結果、１０ｎＭのｓｉＲＮＡを処理してテストした結果、ＳｉＲＮＡ＃５１とＳｉＲＮＡ＃５２が多くの血清型で阻害能が高く示されることが確認され、残りの３種類のｓｉＲＮＡは、血清型４を除いては血清型により全般的に阻害能効能が大きくないことが確認された（図９）。
【０１１６】
≪実施例４：Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｌｉｄｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ  ｓｃａｎｎｉｎｇによる二次汎用ｓｉＲＮＡの製造≫
４．１：二次ｓｉＲＮＡデザインおよび製造
二次的にデングウィルスゲノムの５’−ＵＴＲ部位とＣｐ部位の相同性が高い保存的配列（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部分をターゲットとして作製されたそれぞれのＳｉＲＮＡ＃５１とＳｉＲＮＡ＃５２のｓｅｑｕｅｎｃｅを基にｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｌｉｄｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ  ｓｃａｎｎｉｎｇデザイン方法により、それぞれ１６個の新しい汎用（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ｓｉＲＮＡを（合計３２種類）表６に記載されたとおり追加的に作製し、これらのｓｉＲＮＡの相対的な位置を図１０に示した。
【０１１７】
【表６】
0006368363.tif 000011
【０１１８】
４．２：デングウィルス血清型２および血清型３に対する二次選別された３２種類ｓｉＲＮＡの阻害能確認
一次選別されたＳｉＲＮＡ＃５１とＳｉＲＮＡ＃５２の阻害能が、多くの血清型で１０ｎＭの濃度で処理した時高く出るので、さらに効率の良い汎用ｓｉＲＮＡ候補群の探すため、ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｌｉｄｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ  ｓｃａｎｎｉｎｇ方法によってＳｉＲＮＡ＃５１とＳｉＲＮＡ＃５２の配列を基に二次的に新しくデザインされた３２種類のｓｉＲＮＡ候補群を利用して１０ｎＭの濃度で既存の一次ｓｉＲＮＡ候補群と血清型２、３ウィルスに対する阻害能を比較するスクリーニング実験を行った。
【０１１９】
その結果、ＳｉＲＮＡ＃５１−１４（配列番号７０），ＳｉＲＮＡ＃５１−１５（配列番号７１），ＳｉＲＮＡ＃５１−１６（配列番号７２），ＳｉＲＮＡ＃５２−４（配列番号７６），ＳｉＲＮＡ＃５２−５（配列番号７７），ＳｉＲＮＡ＃５２−８（配列番号８０），ＳｉＲＮＡ＃５２−９（配列番号８１）およびＳｉＲＮＡ＃５２−１０（配列番号８２）のｓｉＲＮＡを処理した実験群で１％未満のウィルスだけが残存して、非常に強い阻害能を示すことを確認した。これは、既存のＳｉＲＮＡ＃５１とＳｉＲＮＡ＃５２の効能よりはるかに良い阻害能数値である（図１１）。
【０１２０】
４．３：デングウィルス血清型２〜血清型４の増殖に対する最終選別された２種類のｓｉＲＮＡの阻害能確認
次に、強い阻害能を示すｓｉＲＮＡ候補群中ＳｉＲＮＡ＃５１とＳｉＲＮＡ＃５２配列を基に作製されたｓｉＲＮＡの中再現性が優秀なＳｉＲＮＡ＃５１−１５（配列番号７１）とＳｉＲＮＡ＃５２−１０（配列番号８２）を最終的に選定し、これらのデングウィルス血清型２〜血清型４の増殖に対する阻害能効果を１０ｎＭの濃度で再検定した。
【０１２１】
その結果、ＳｉＲＮＡ＃５１−１５とＳｉＲＮＡ＃５２−１０は、既存のＳｉＲＮＡ＃５１とＳｉＲＮＡ♯５２に比べてさらに高い阻害能効果を示すことを再確認することができた（図１２）。
【０１２２】
４．４：デングウィルス血清型２〜血清型４の増殖に対するＳｉＲＮＡ＃５１−１５とＳｉＲＮＡ＃５２−１０の組み合わせ使用（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）による阻害能効果検定
先述したｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｌｉｄｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗｓ  ｓｃａｎｎｉｎｇ実験を通じてデングウィルス血清型２、３、４の増殖に対してより良い阻害能を持つ二つのｓｉＲＮＡであるＳｉＲＮＡ＃５１−１５とＳｉＲＮＡ＃５２−１０を選別したが、一つのｓｉＲＮＡだけで全ての血清型のデングウィルスの増殖を抑制する汎用的な治療剤として適用するには充分でないこともあるとの点に着目した（ＳｉＲＮＡ＃５１−１５の場合、デングウィルス血清型４に対して強い阻害能を示さない）。
【０１２３】
ＳｉＲＮＡ＃５１−１５とＳｉＲＮＡ＃５２−１０を１：１のモル比（ｍｏｌａｒ  ｒａｔｉｏ）で混合されたｓｉＲＮＡ混合物（以下‘Ｃｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡ’という）を製造して、全ての血清型のデングウィルスの増殖に対してｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ（補強効果）による汎用的に強い阻害能効果を示すことができるか否かを１０ｎＭの濃度でスクリーニング実験を進行した。
【０１２４】
その結果、Ｃｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡで全ての血清型のデングウィルスの増殖に対して強い阻害能効果を示すことを確認することができた（図１３）。
【０１２５】
４．５：自然界での感染による治療剤適用環境を作るために、まずウィルスを感染させた状態（ｐｒｅ−ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）でのデングウィルス血清型２〜血清型４増殖に対するＳｉＲＮＡ＃５１−１５とＳｉＲＮＡ＃５２−１０の組み合わせ使用による阻害能効果検定
次に実際蚊によるウィルス感染状態を考慮して培養された細胞にウィルスｉｎｆｅｃｔｉｏｎを先にさせた後に、ｓｉＲＮＡを処理した時、ｓｉＲＮＡが治療剤としての効能を示すことができるか否かを調べた。
【０１２６】
最終選別されたＳｉＲＮＡ＃５１−１５とＳｉＲＮＡ＃５２−１０の２種類のｓｉＲＮＡをそれぞれ５ｎＭずつ追加して、ここにそれぞれｓｉＣＯＮＴ  ５ｎＭを追加して、最終ｓｉＲＮＡ濃度を１０ｎＭに調整して処理した。また、ＳｉＲＮＡ＃５１−１５とＳｉＲＮＡ＃５２−１０の２種類ｓｉＲＮＡをそれぞれ５ｎＭずつ含むＣｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡを処理して阻害能を確認してみた結果、Ｃｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡ処理が全ての血清型のデングウィルス増殖に対して強い増殖阻害能を示すことを確認した（図１４）。
【０１２７】
これにより、Ｃｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡが全ての血清型のウィルスに対して汎用的な治療剤としての機能することができることが分かった。
【０１２８】
４．６：全ての血清型のデングウィルス増殖に対するＣｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡの阻害能効果およびＩＣ５０値の決定
最終選別されたＳｉＲＮＡ＃５１−１５とＳｉＲＮＡ＃５２−１０の２種類ｓｉＲＮＡとＣｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡが濃度依存的に全ての血清型のデングウィルスＪＢ（血清型２、全北（チョンブク）大学分離株）およびデングウィルス血清型１〜血清型４）に対して増殖抑制効果を検証するために、１０ｎＭ、１ｎＭ、２００ｐＭ、５０ｐＭの４種類の濃度でスクリーニング実験を行った。
【０１２９】
その結果、それぞれのｓｉＲＮＡ候補群別に全ての血清型デングウィルスに対して互いに異なる濃度依存的な効果を示し（図１５）、
デングウィルス血清型４を除いて多くのウィルスに対して５０〜２００ｐＭの間の低い濃度でＩＣ５０値を示す。Ｃｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡの場合、他のｓｉＲＮＡよりも良いＩＣ５０値を示す（表７）。
【０１３０】
【表７】
0006368363.tif 000012
【０１３１】
≪実施例５：ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子のデングウィルス増殖抑制陵確認≫
５．１：二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ）の製造
本発明で製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ）は、下記の構造式１６のような構造を持つ：
【化５】
0006368363.tif 000013
前記構造式１６で、ＳはｓｉＲＮＡのセンス鎖；ＡＳはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖；ＰＥＧは親水性物質でポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）；Ｃ２４は疎水性物質でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）が含まれたテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）；５’および３’は二重らせんオリゴＲＮＡ末端の方向性を意味する。
【０１３２】
前記構造式１６でのｓｉＲＮＡのセンス鎖は、大韓民国公開特許公報第２０１２−０１１９２１２号の実施例１に記載された方法により製造された３’ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ、Ｍｎ＝２，０００）−ＣＰＧを支持体として先述した方式のとおりβ−シアノエチルホスホロアミダイトを利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結していく方法により３’末端部位にポリエチレングリコールが結合されたセンス鎖の二重らせんオリゴＲＮＡ−親水性物質構造体を合成した後、ジスルフィド結合が含まれているテトラドコサンを５’末端に結合して望むＲＮＡ−高分子構造体のセンス鎖を製造した。前記鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、先述した反応を介してセンス鎖と相補的な配列のアンチセンス鎖を製造した。
【０１３３】
合成が完了すると、６０℃の温湯器（ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ）で２８％（ｖ／ｖ）アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ）を処理して合成されたＲＮＡ一本鎖とＲＮＡ高分子構造体をＣＰＧから引き離した後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応を介して保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ−高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）およびトリエチルアミントリハイドロフルオリド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を体積比１０：３：４の割合で処理して２’ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）を除去した。
【０１３４】
前記反応物をＤａｉｓｏｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製して、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を利用して目標塩基配列と合致するか否かを確認した。以後、それぞれの二重らせんオリゴＲＮＡ高分子構造体を製造するために、センス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭカリウムアセテート（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭマグネシウムアセテート（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０〜７．５）に入れて、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、再び３７℃で反応させて、最終選別された五つのｓｉＲＮＡ候補群（ＳｉＲＮＡ＃４、ＳｉＲＮＡ＃１６、ＳｉＲＮＡ＃２２、ＳｉＲＮＡ＃５１、ＳｉＲＮＡ＃５２）を含む二重らせんオリゴＲＮＡ高分子構造体をそれぞれ製造した。製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動を介してアニーリングされたことを確認した。
【０１３５】
製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ）は、二重らせんオリゴＲＮＡの末端に結合された疎水性物質の間の疎水性相互作用によってナノ粒子、すなわちミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）を形成するようになる（図１６）。製造されたＳＡＭｉＲＮＡを１．５ｍＬ  ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）に５０μｇ／ｍＬの濃度で溶解した後、−７５℃、５ｍＴｏｒｒ条件で４８時間凍結乾燥を介してナノ粒子パウダーを製造した後、溶媒であるＤＰＢＳに溶解して均質化されたナノ粒子を製造して本発明の実施例で使用した。
【０１３６】
５．２：ＳＡＭｉＲＮＡ形態で選出された一次選別された５種のｓｉＲＮＡ候補群の汎用性阻害能分析
実施例５．１の方法によって一次選別された五つのｓｉＲＮＡ候補群（ＳｉＲＮＡ＃４，ＳｉＲＮＡ＃１６，ＳｉＲＮＡ＃２２，ＳｉＲＮＡ＃５１，ＳｉＲＮＡ＃５２）を含むように製造されたＳＡＭｉＲＮＡを利用して、デングウィルス血清型３と血清型４に対する増殖抑制効能を確認した。
【０１３７】
前記実施例で使用した全てのデングウィルス血清型に対して全般的に阻害能が高いＳｉＲＮＡ＃５１とＳｉＲＮＡ＃５２を含むＳＡＭｉＲＮＡを利用する場合、約２００ｎＭ以上で細胞内に伝達されて高い阻害能（７０〜７５％）が示されることを確認した（図１７）。
【０１３８】
５．３：Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ形態で最終的に選出されたＣｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡ候補群の汎用的阻害能に対する再現性分析
前記実施例５．２で使用されたＳＡＭｉＲＮＡ形態とは異なり、親水性物質をＰＥＧの代わりに親水性物質ブロックである［ＰＯ３−−ヘキサエチレングリコール］４（以下、‘Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ  ＳＡＭｉＲＮＡ’という、構造式１７参照）を使用して、安定性を向上した形態のＳＡＭｉＲＮＡにＳｉＲＮＡ＃５１−１５とＳｉＲＮＡ＃５２−１０が共に含まれるようにした：
【化６】
0006368363.tif 000014
【０１３９】
前記構造式１７で、Ｓはデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖；ＡＳはデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖；Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌは親水性物質；Ｃ２４は疎水性物質でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）が含まれたテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）；５’および３’は二重らせんオリゴＲＮＡ内のセンス鎖末端の方向性を意味する。
【０１４０】
作製されたＭｏｎｏ−ＨＥＧ  ＳＡＭｉＲＮＡがデングウィルスの各血清型別に再現性があって似たような阻害能を持つのか否かを確認するために、５００ｎＭの濃度でスクリーニングを実施した。その結果、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ  ＳＡＭｉＲＮＡ処理によって各血清型別にいずれも再現性があって似たような阻害能を示すことを確認することができた（図１８）。
【０１４１】
５．４：Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ形態で最終的に選出されたＣｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡ候補群の濃度別汎用的阻害能分析およびＩＣ５０決定
最終的に選出されたＳｉＲＮＡ＃５１−１５とＳｉＲＮＡ＃５２−１０の２種類のｓｉＲＮＡ候補群を１：１のモル比（ｍｏｌａｒ  ｒａｔｉｏ）で混合したＣｏｍｂｉ−ｓｉＲＮＡをＳＡＭｉＲＮＡ形態で合成して、結果的にｉｎ  ｖｉｔｒｏでどの程度低い濃度でも効率的にデングウィルスの増殖を５０％まで抑制するか否かを検証することによって、実際治療剤としての有効性の評価を行った。
【０１４２】
具体的に、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡにＳｉＲＮＡ＃５１−１５とＳｉＲＮＡ＃５２−１０が共に含まれるようにして、５００ｎＭ、２００ｎＭ、５０ｎＭの濃度で全てのデングウィルス血清型での増殖抑制効果を検証するスクリーニング実験を行った。
【０１４３】
その結果、デングウィルス血清型４を除いた残りの血清型ではほとんど５０〜２００ｎＭの間の濃度で再現性のあるＩＣ５０値が示されることを確認することができた（図１９および表８）。
【０１４４】
【表８】
0006368363.tif 000015
【０１４５】
≪実施例６：ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子のアミン基導入によるＳＡＭｉＲＮＡ伝達体の細胞内導入とエンドソーム脱出効率の比較分析≫
前記構造式１７のようなＭｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡの細胞内伝達効率を上げるための方案として、構造式１８のようにセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）の３’末端にアミン基を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）させて新しく修飾させたａｍｉｎｅ−Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡを合成した。
【０１４６】
【化７】
0006368363.tif 000016
【０１４７】
前記構造式１８で、Ｓはデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖；ＡＳはデングウィルス特異的ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖；Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌは親水性物質；Ｃ６は［Ｈｅｘａ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ］４とアミン基を連結するＣ６アルキルであるリンカーで、Ｃ２４は疎水性物質でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）が含まれたテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）；５’および３’は二重らせんオリゴＲＮＡ内のセンス鎖末端の方向性を意味する。
【０１４８】
新しく合成されたａｍｉｎｅ−Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡは、アンチセンス鎖（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）の３’ｅｎｄ部分にＦＩＴＣ蛍光物質を結合させて蛍光顕微鏡で既存のＭｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡと比較してアミン基の導入によるその伝達効率の増加があるか否かを可視的に測定することができるように最終的に作製した。本実験では、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡとａｍｉｎｅ−Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡの時間別伝達効率を共焦点顕微鏡を利用して得たイメージｄａｔａと無作為でイメージをキャプチャーしてｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒで蛍光度を定量的に測定して比較分析することによって、アミン基の導入によるＳＡＭｉＲＮＡの伝達効率の増大効果を確認しようとした。
【０１４９】
６．１：共焦点顕微鏡を利用して蛍光イメージ比較観察を通じてＭｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ＦＩＴＣの時間別処理による伝達効率比較
Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ＦＩＴＣを処理する１５時間前に、ＨｅＬａ細胞を２−ｃｈａｍｂｅｒ（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｖｅｓｓｅｌ（ＢＤ  ＦａｌｃｏｎＴＭ  ｃｕｌｔｕｒｅｓｌｉｄｅｓ）に２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで分株した。ＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）完全培地（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ）を細胞の培養液として使用して１ｃｈａｍｂｅｒ当たり１ｍＬずつ処理して３７℃、５％ＣＯ２の条件で細胞を培養した。
【０１５０】
完全培地組成はＤｕｌｂｅｃｃｏｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  ５００ｍＬ（ｐＨ７．４）に４．００ｍＭのＬ−Ｇｕｔａｍｉｎｅおよび４５００ｍｇ／ＬのＧｌｕｃｏｓｅ、ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）を最終１０％の濃度で合わせたものである。細胞培養１５時間培養後ｃｈａｍｂｅｒ内の培養液を除去して、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）１ｍＬに培地を入れ替えたた後、ＩＦＡ（ＩｍｍｕｎｏＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ；免疫蛍光アッセイ）を一度に同時に行うことができるようにＳＡＭｉＲＮＡ−ＦＩＴＣを１０００ｎＭ濃度でそれぞれの決まった時間に（０ｈｒ、０．５ｈｒ、１ｈｒ、３ｈｒ、１２ｈｒ）合わせて光に露出されない条件下で処理した。
【０１５１】
６．２：共焦点顕微鏡実験のためのＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ（ＩＦＡ）実行
光が最大限遮断された実験空間下でＩＦＡを行った。
【０１５２】
２−ｃｈａｍｂｅｒ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｖｅｓｓｅｌにＳＡＭｉＲＮＡ−ＦＩＴＣを処理した細胞の培養液を１０００ｐ  ｐｉｐｅｔｔｏｒで除去した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  １ｍＬで２回洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ  ｏｕｔ）した。その後、１Ｘ  ＰＢＳ  １ｍＬで３分間一度洗浄した後、２％ＰＦＡ（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を５００μＬずつ処理した後、室温で３０分間細胞を固定（Ｆｉｘａｔｉｏｎ）させた。この時使用された２％ＰＦＡは、ｆｒｅｓｈに製造してｆｉｌｔｅｒｉｎｇした後、冷凍保管して使用した。細胞固定後１Ｘ  ＰＢＳ  １ｍＬでそれぞれ３分ずつ２回洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ  ｏｕｔ）し、１Ｘ  ＰＢＳに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＵＳＢ）と１０％ＢＳＡ（Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｂｏｖｉｎｅ，ｐＨ７．０）が含まれたＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを５００μＬずつ処理して室温で３０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇした後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを除去後、簡単に１Ｘ  ＰＢＳで１回洗浄した。その後、１Ｘ  ＰＢＳに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＵＳＢ）と３％ＢＳＡ（Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｂｏｖｉｎｅ，ｐＨ７．０）が含まれた溶液に細胞内ｅｎｄｏｓｏｍｅを染色する一次抗体（ＥＥＡ１（Ｈ−３００），Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−３３５８５）を５００：１（ｖ／ｖ）の割合で希釈した後、各細胞に５００μＬずつ処理して９０分間Ｆｏｉｌで包んで一次染色を実行した。一次染色後、１Ｘ  ＰＢＳ  １ｍＬでそれぞれ３分ずつ３回洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ  ｏｕｔ）を行い、１Ｘ  ＰＢＳに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＵＳＢ）と３％ＢＳＡ（Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｂｏｖｉｎｅ，ｐＨ７．０）が含まれた溶液にＲｅｄ系列の蛍光を示す二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０００：１（ｖ／ｖ）の割合で希釈した後、各細胞に５００μＬずつ処理して９０分間Ｆｏｉｌで包んで二次染色を実行した。二次染色後、１Ｘ  ＰＢＳ  １ｍＬでそれぞれ３分ずつ３回洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ  ｏｕｔ）を行い、１Ｘ  ＰＢＳにＤＡＰＩ（ＤＡＰＩ，Ｄｉｌａｃｔａｔｅ，Ｓｉｇｍａ，Ｄ−９５６４），１０ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  Ｄ．Ｗ）を１０００：１（ｖ／ｖ）の割合で希釈した溶液を各細胞に５００μＬずつ分株して室温で２０分間核染色を実施した。その後、１Ｘ  ＰＢＳ  １ｍＬでそれぞれ３分ずつ３回洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ  ｏｕｔ）を行い、ｃｈａｍｂｅｒ  ｗａｌｌを引き離した後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＭＵ−ＭＯＵＮＴ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｈａｎｄｏｎ，ｃａｔ．ＮＯ．９９９０４０２）１滴を気泡が最大限入らないように細胞の上に落とした後ｃｏｖｅｒ  ｇｌａｓｓを慎重に覆ってＭｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍが固まる時までホイルを利用して光が遮断された状態で２０分以上室温で乾燥した。その後、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）でＦＩＴＣ  ｓｉｇｎａｌ（Ｇｒｅｅｎ）とＡｌｅｘａ５４６（Ｒｅｄ）ｓｉｇｎａｌをｄｅｔｅｃｔｉｏｎして観察した後イメージｄａｔａ分析を行った。
【０１５３】
６．３：共焦点顕微鏡によるＭｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ＦＩＴＣイメージＤａｔａ分析実行
共焦点顕微鏡を利用して各時間帯のサンプル（０ｈｒ、０．５ｈｒ、１ｈｒ、３ｈｒ、１２ｈｒ）別に４００Ｘの倍率で２Ｄイメージを得て１０００Ｘの倍率でｚ−ｓｔａｃｋｉｎｇによる細胞単位の３Ｄイメージを得た。２Ｄ及び３Ｄイメージ分析によりＦＩＴＣ信号（ｓｉｇｎａｌ）とＡｌｅｘａ５４６の信号（ｓｉｇｎａｌ）の併合（Ｍｅｒｇｅ）が起きる信号があるか否か（ＳＡＭｉＲＮＡ−ＦＩＴＣ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅのｅｎｄｏｓｏｍｅとｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を確認し、またＦＩＴＣ信号（ｓｉｇｎａｌ）が細胞内部細胞質に位置するか否かを確認した。共焦点顕微鏡から得たイメージは、ＺＥＮ  ２００９  ｌｉｇｈｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）ソフトによって分析、編集した。
【０１５４】
その結果、アミン基を含むａｍｉｎｅ−Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡがＭｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡよりも処理後時間が過ぎるほど初期に大きいｓｐｏｔで現れたＦＩＴＣ信号（ｓｉｇｎａｌ）が小さいｓｐｏｔで現れて、細胞質内により多く存在することが確認された（図２０）。
【０１５５】
６．４：Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙソフトを利用した時間別細胞内存在ＦＩＴＣ蛍光値の定量分析
ＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＳＡＭｉＲＮＡ処理後早い時間で（０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ）各時間帯別２００Ｘの倍率で共焦点顕微鏡を利用して６カットずつの２Ｄイメージを得た後、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して各イメージから出るＦＩＴＣ蛍光値だけを定量して各時間代別にアミン基の導入有無によるＳＡＭｉＲＮＡ−ＦＩＴＣ伝達効率を蛍光値測定で比較分析した。その結果、ａｍｉｎｅ−Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡの蛍光値がＭｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡよりも時間に応じて高いことを確認することができた（図２１）前記実験結果からアミン基の導入により既存のＭｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡの細胞質内伝達効率をさらに増加させることができることが分かった。
【０１５６】
６．５：Ａｍｉｎｅ−Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ＤＮ  Ｃｏｍｂｉ修飾体による汎用的デングウィルス増殖阻害能比較実験
Ｃｏｍｂｉ−ＳＡＭｉＲＮＡにアミン基を含んで新しい形態のＭｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ＤＮ  Ｃｏｍｂｉにアミン基を導入して治療剤を合成して、これを既存のＣｏｍｂｉ−ＳＡＭｉＲＮＡと比較して各血清型別デングウィルスの増殖阻害能面で段違いの差があるか否かを確認するために、５００ｎＭの濃度でスクリーニングを実施した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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