(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を含む医薬であって、ＣＤ４０アゴニストとの組み合わせで、ａ）がんを治療する又はがんの進行を遅らせるための、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長するための、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激するための、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にするための医薬であり、
抗ＡＮＧ−２抗体及びＣＤ４０アゴニストが、同時に、別々に又は連続的に投与される、医薬。
【請求項２】
ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体及びＣＤ４０アゴニストを含む、ａ）がんを治療する又はがんの進行を遅らせるための、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長するための、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激するための、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にするための医薬であって、
抗ＡＮＧ−２抗体及びＣＤ４０アゴニストが、同時に、別々に又は連続的に投与される医薬。
【請求項３】
ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせるための、ｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長するための請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
抗ＡＮＧ−２抗体がヒト抗体であるか又はヒト化抗体である、請求項１〜３の何れか一項に記載の医薬。
【請求項５】
抗ＡＮＧ−２抗体が、表面プラズモン共鳴によって決定される場合、１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ未満のＫＤ値でヒトＡＮＧ２に特異的に結合する、請求項１から４の何れか一項に記載の医薬。
【請求項６】
抗ＡＮＧ−２抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１から５の何れか一項に記載の医薬。
【請求項７】
抗ＡＮＧ−２抗体が、ＴＩＥ２受容体とのヒトＡＮＧ−２の相互作用を１５ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、請求項１から６の何れか一項に記載の医薬。
【請求項８】
ＣＤ４０アゴニストが、アゴニスト性ＣＤ４０抗体又はアゴニスト性ＣＤ４０Ｌポリペプチドである、請求項１から７の何れか一項に記載の医薬。
【請求項９】
ＣＤ４０アゴニストが、アゴニスト性ＣＤ４０抗体である、請求項１から８の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１０】
ｉ）抗ＡＮＧ−２抗体が
（ａ）配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号３の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
を含み、及び
ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体が
（ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号７の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号８の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
を含む、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
ｉ）抗ＡＮＧ−２抗体が
配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；及び
ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体は
（ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の医薬。
【請求項１２】
抗ＡＮＧ−２抗体が、ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体である、請求項９から１１の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１３】
ｉ）ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体が
配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；及び
配列番号９の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；
及び
ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む
請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
ｉ）ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体が
配列番号１１の、配列番号１２の、配列番号１３の、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含み；及び
ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む
請求項１２に記載の医薬。
【請求項１５】
がんが、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫又はリンパ性白血病である、請求項１から１４の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１６】
がんが固形腫瘍を含む、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
ＣＤ４０アゴニストとの組み合わせで、ａ）がんを治療する又はがんの進行を遅らせるための、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長するための、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激するための、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にするための医薬の製造における、ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体の使用であって、
抗体及びＣＤ４０アゴニストが、同時に、別々に又は連続的に投与される使用。
【請求項１８】
ａ）がんを治療する又はがんの進行を遅らせるための、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長するための、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激するための、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にするための医薬の製造における、ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体及びＣＤ４０アゴニストの使用であって、
抗体及びＣＤ４０アゴニストが、同時に、別々に又は連続的に投与される使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体のＣＤ４０アゴニストとの併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生及び血管リモデリングに重要な役割を果たすアンジオポエチンは、増殖する腫瘍の血管新生促進装備一式の一部である。重要なことに、それらは抗ＶＥＧＦ療法の間の二次耐性を導く大きな要因の一つである（Saharinen, P., et al., Trends Mol Med 17 (2011) 347-362）。アンジオポエチン−１（Ａｎｇ１）及びアンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）は、Ｔｉｅ２受容体リガンドである。Ａｎｇ１は血管を安定化し成熟させる傾向があるが（Yancopoulos, G. D., et al., Nature 407 (2000) 242-248）、Ａｎｇ２は血管を不安定化することによって、腫瘍の血管形成及び増殖を促進する。従って、Ａｎｇ２はその機能においてＡｎｇ１と対向する（Cascone, T. et al, J Clin Oncol 30 (2012) 441-444）。この考え方に従うと、Ａｎｇ１でなくＡｎｇ２を遮断すると腫瘍血管を正常化し（Falcon, B. L., H. Hashizume, et al., Am J Pathol 175 (2009) 2159-2170）、抗ＶＥＧＦ療法に対する獲得耐性を克服するのに役立つことが観察されている（Chae, S. S., W. S. Kamoun, et al., Clin Cancer Res 16 (2010) 3618-3627; Thomas, M., et al. PLoS One 8 (2013) e54923）。
【０００３】
免疫調節抗体は、治療アプローチを提供し、抗腫瘍免疫応答を直接増強するために、又は抗がんワクチンのためのアジュバントとして使用されるかも知れない（Melero, I., et al. Nat Rev Cancer 7 (2007) 95-106）。アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、これらの試薬の中で最も効果的なクラスの一つを構成する。ＣＤ４０は、樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現する腫瘍壊死因子の細胞表面メンバーである。抗ＣＤ４０アゴニストを使用した前臨床研究は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の抗体を架橋したＣＤ４０を動作させると、通常はＣＤ４０リガンドを介して提供されるＣＤ４ Ｔ細胞の助けの代わりとなり、ＣＤ８エフェクターＴ細胞の活性化並びに増殖を促進することができることを示唆している（Li, F. et al, Science 333 (2011) 1030-1034）。更に、ＣＤ４０活性化マクロファージはまた、直接的な殺腫瘍機能を発揮することができる（Beatty, G. L., et al. Science 331 (2011) 1612-1616); Vonderheide, R. H., et al. Oncoimmunology 2 (2013) e23033）。
【０００４】
免疫抑制性腫瘍微小環境は、抗腫瘍免疫及び免疫療法アプローチのための主な障害をもたらす（Beatty, G. L., et al. Science 331 (2011) 1612-1616）。
【０００５】
発明の要旨
本発明者は、抗ＡＮＧ２抗体がＣＤ４０アゴニストの有効性を増強させ又は腫瘍の進行を遅延させ、又はがん、例えば固形腫瘍に罹患した患者の生存期間を延ばすことを見いだしてきた。進行の遅延、生存期間の延長並びに投与量の減少による副作用のリスクの低下は患者にとって大きなメリットを表している。
【０００６】
驚くべきことに、ＣＤ４０アゴニストと組み合わせた抗ＡＮＧ２抗体による腫瘍の治療は、腫瘍の進行までの時間及び生存の時間に対して強い相乗効果を示した（一方、ＣＤ４０アゴニストと組み合わせた抗ＶＥＧＦ抗体の組み合わせはわずかな効果を示すのみであった）。
【０００７】
本発明の一態様は、ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体であり、抗体は、ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のため、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激することに使用のため、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にすることに使用のため、ＣＤ４０アゴニストと組み合わせて投与される。
【０００８】
本発明の一態様は、ＣＤ４０アゴニストであり、ＣＤ４０アゴニストは、ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のため、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激することに使用のため、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にすることに使用のため、ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体と組み合わせて投与される。
【０００９】
一態様において、本発明は、ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせるため、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長するため、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激するため、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にするための方法を提供し、該方法は、抗ＡＮＧ２抗体の有効量、及び及びＣＤ４０アゴニストの有効量をそれを必要とする患者へ投与する工程を含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、がんの治療のための医薬の製造における抗ＡＮＧ２抗体の使用を提供し、ここで該抗体はＣＤ４０アゴニストとの投与のためのものである。
【００１１】
本発明の別の態様は、
ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、又は
ｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のため、又は
ｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激することに使用のため、又は
ｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にすることに使用のための、
医薬の製造におけるヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体であり；
ここで抗体はＣＤ４０アゴニストと組み合わせて投与される。
【００１２】
本発明の別の態様は、
ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、又は
ｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のため、又は
ｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激することに使用のため、又は
ｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にすることに使用のための、
医薬の製造におけるＣＤ４０アゴニストであり；
ここでＣＤ４０アゴニストは、ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体とともに投与される。
【００１３】
本発明の別の態様は、ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のため、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激することに使用のため、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にすることに使用のため、ＣＤ４０アゴニストと組み合わせて投与される、ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体である。
【００１４】
本発明の別の態様は、
ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、又は
ｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のため、又は
ｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激することに使用のため、又は
ｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にすることに使用のための、
医薬の製造においてＣＤ４０アゴニストと組み合わせたヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体である。
【００１５】
一態様において、本発明は、ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせるため、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長するため、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激するため、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にするための方法を提供し、該方法は、抗ＡＮＧ２抗体の有効量、及び及びＣＤ４０アゴニストの有効量をそれを必要とする患者へ投与する工程を含む。
【００１６】
本発明の別の態様は、ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせるため、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長するため、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激するため、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にするための、ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体及び組み合わせて使用のためのＣＤ４０アゴニストである。
【００１７】
本発明の別の態様は、
ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせため、又は
ｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長するため、又は
ｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激するため、又は
ｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にするための、
医薬の製造において使用のためのヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体及びＣＤ４０アゴニストである。
【００１８】
本発明の別の態様は、
ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせため、又は
ｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長するため、又は
ｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激するため、又は
ｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にするための、
医薬の製造において組み合わせたヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体及びＣＤ４０アゴニストの使用である。
【００１９】
一実施態様において、抗ＡＮＧ２抗体はヒト又はヒト化抗体である。
【００２０】
好ましくは、抗ＡＮＧ２抗体は、表面プラズモン共鳴（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ）によって決定される場合、１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ未満のＫＤ値でヒトＡＮＧ２に特異的に結合する。
【００２１】
抗ＡＮＧ２抗体は、好ましくはＩｇＧ抗体であり、より好ましくは、抗ＡＮＧ２抗体は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスである。
【００２２】
好ましい一実施態様において、抗ＡＮＧ２抗体は、ＴＩＥ２受容体とのヒトＡＮＧ−２の相互作用を１５ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。
【００２３】
一実施態様において、ＣＤ４０アゴニストは、アゴニスト性ＣＤ４０抗体又はアゴニスト性ＣＤ４０Ｌポリペプチドである。
【００２４】
好ましい一実施態様において、ＣＤ４０アゴニストは、アゴニスト性ＣＤ４０抗体である。
【００２５】
一実施態様において、
ｉ）抗ＡＮＧ２抗体は
（ａ）配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号３の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
を含み、及び
（ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体は
（ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号７の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号８の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
を含む。
【００２６】
好ましい一実施態様において、
ｉ）抗ＡＮＧ２抗体は
配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；又は
及び
（ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体は
配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００２７】
好ましい一実施態様において、抗ＡＮＧ２抗体は、ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体である。
【００２８】
好ましい一実施態様において、
ｉ）ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体は
配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；及び
配列番号９の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；
及び
（ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体は
配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００２９】
好ましい一実施態様において、
ｉ）ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体は
配列番号１１の、配列番号１２の、配列番号１３の、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含み；及び
（ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体は
配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００３０】
好ましい一実施態様において、がんは固形腫瘍を含む。
【００３１】
好ましい一実施態様において、がんは、結腸直腸がん、卵巣がん、神経膠芽腫、胃がん、膵臓がん、乳がん、肺がん、肝細胞がんである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】アゴニスト性ＣＤ４０抗体と組み合わせた抗ＡＮＧ２抗体（及び抗ＡＮＧ２＋抗ＶＥＧＦ抗体（＝抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２））のインビボ抗腫瘍効果（がんの進行（腫瘍増殖）の遅延及び治療された患者の生存期間の延長）−グラフは、３つの独立した実験からプールされたデータを表す。マウスは、図に示される抗体の組み合わせを用いて治療された。
【図２】皮下同系ＭＣ３８結腸癌モデルにおけるアゴニスト性ＣＤ４０抗体と組み合わせた抗ＡＮＧ２抗体（二重特異性）のインビボ抗腫瘍効果。２Ａ：対照（黒四角）と比較したアゴニスト性ＣＤ４０抗体単剤療法（白丸）の腫瘍増殖阻害。２Ｂ：対照（黒四角）と比較した二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体単剤療法（白丸）の腫瘍増殖阻害。２Ｃ：対照（黒四角）と比較したアゴニスト性ＣＤ４０抗体及び二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体の組み合わせ（白丸）の腫瘍増殖阻害。
【図３】雌のＢａｌｂ／ｃマウスにおける同系ＣＴ２６ＷＴモデルにおけるアゴニスト性ＣＤ４０抗体と組み合わせた抗ＡＮＧ２抗体（二重特異性）のインビボ抗腫瘍効果。
【００３３】
発明の詳細な記述
本発明は、患者におけるがんの治療方法で使用するための抗ＡＮＧ２抗体に関し、該方法は、被験体へ抗ＡＮＧ２抗体及びＣＤ４０アゴニストを投与することを含み、本発明者らは、薬剤のこの組み合わせは、治療された患者の癌の進行（腫瘍増殖）の遅延及び生存期間の延長をもたらすことを本明細書において実証する。
【００３４】
ヒトアンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）（あるいはＡＮＧＰＴ２又はＡＮＧ２と略す）（配列番号１５）は、Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60及びCheung, A.H., et al, Genomics 48 (1998) 389-91に記載されている。アンジオポエチン−１及び−２（ＡＮＧ−１（配列番号１０８）及びＡＮＧ−２（配列番号１０７）は、血管内皮細胞内で選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリーであるＴｉｅのリガンドとして発見された。Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48。いまやアンジオポエチンファミリーの４つの確定したメンバーがある。アンジオポエチン−３及び−４（Ａｎｇ−３及びＡｎｇ−４）は、マウス及びヒトにおける同じ遺伝子座の広く分岐したカウンターパートを表すことができる。Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999)26523-28。ＡＮＧ−１及びＡＮＧ−２はそれぞれアゴニスト及びアンタゴニストとして組織培養実験において元々同定された（ＡＮＧ−１について： Davies, S., et al., Cell, 87 (1996) 1161-1169；及びＡＮＧ−２について： Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60を参照）。既知の全てのアンジオポエチンは主にＴｉｅ２に結合し、Ａｎｇ−１及び−２の両方とも３ｎＭの親和性（Ｋｄ）でＴｉｅ２に結合する。Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60。Ａｎｇ−１はＥＣの生存を支持し、内皮の完全性を促進することが示され、Davis, S., et al., Cell, 87 (1996) 1161-1169;Kwak, H.J., et al., FEBS Lett 448 (1999) 249-53; Suri, C., et al., Science 282 (1998) 468-71; Thurston, G., et al., Science 286 (1999) 2511-14; Thurston, G., et al., Nat. Med. 6 (2000) 460-63、ＡＮＧ−２は逆の効果を有しており、生存因子ＶＥＧＦ又は塩基性線維芽細胞増殖因子の非存在下で血管の不安定化及び体縮を促進した。Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60。しかしながら、ＡＮＧ−２機能の多くの研究は、より複雑な状況を示唆している。ＡＮＧ−２は、血管出芽及び血管退行の両方において役割を果たしている血管リモデリングの複雑な調節因子である可能性がある。ＡＮＧ−２のそのような役割を支持し、発現解析では、血管新生発芽の成人の設定において、ＶＥＧＦと共に、ＡＮＧ−２が急速に誘導されるが、一方ＡＮＧ−２は、血管退行の設定においてＶＥＧＦの非存在下で誘導されることを明らかにしている。Holash, J., et al., Science 284 (1999) 1994-98; Holash, J., et al., Oncogene 18 (1999) 5356-62。文脈依存の役割と一致し、ＡＮＧ−２は、同じ内皮特異的受容体であって、Ａｎｇ−１によって活性化されるが、その活性化に対する文脈依存効果を有するＴｉｅ−２に特異的に結合する。Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60。
【００３５】
用語「ヒトＡＮＧ２」は、ヒトタンパク質アンジオポエチン２（配列番号１５）を指す。本明細書で使用されるように、「ヒトＡＮＧ２への結合」若しくは「ヒトＡＮＧ２への特異的結合」又は「ヒトＡＮＧ２に結合する」若しくは「抗ＡＮＧ２抗体」とは、ヒトＡＮＧ２抗原に対して、ＫＤ値が１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、一実施態様においてＫＤ値が１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性で特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの標準的な結合アッセイを用いて決定される。本明細書で使用される「ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体」は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ抗原に対して、ＫＤ １．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下（一実施態様において１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ − １．０ｘ１０−１３ｍｏｌ／ｌ））の結合親和性で、一実施態様においてＫＤ １．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下（好ましくは、１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ − １．０ｘ１０−１３ｍｏｌ／ｌ）の結合親和性で、特異的に結合する抗体を指す。
【００３６】
典型的には、本明細書中に記載される治療のために有用であるヒトＡＮＧ２に結合する抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０６９５３２（例えば、好ましくは抗ＡＮＧ２抗体＜ＡＮＧ−２＞Ａｎｇ２ｉ＿ＬＣ０６、＜ＡＮＧ−２＞Ａｎｇ２ｉ＿ＬＣ０７、又は＜ＡＮＧ−２＞Ａｎｇ２ｉ＿ＬＣ１０）；ＷＯ２０１１／０１４４６９（例えば、好ましくは抗ＡＮＧ２抗体Ｈ１Ｈ６８５Ｐ）；ＵＳ２０１１／１５０８９５（例えば、抗ＡＮＧ２抗体ＳＡＩＴ−Ａｎｇ−２−５、ＳＡＩＴ−Ａｎｇ−２−６又はそのヒト化バージョン）；ＷＯ２００９／０９７３２５（例えば、ＭＥＤＩ１（ＷＯ２００９／０９７３２５の配列番号３）のＶＬ及び（ＭＥＤＩ５）（ＷＯ２００９／０９７３２５の配列番号７）のＶＨにより特徴づけられる抗体ＭＥＤＩ１／５）；ＷＯ２００９／１０５２６９；ＷＯ２００６／０６８９５３又はＷＯ０３／０３０８３３に開示され及び詳細に記載される。
【００３７】
好ましい一実施態様において、本明細書に記載される治療のために有用であるヒトＡＮＧ２に結合する抗体は、
（ａ）配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号３の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
を含むことを特徴とする。
【００３８】
好ましい一実施態様において、抗ＡＮＧ２抗体は、ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体である。
【００３９】
典型的には、本明細書に記載される治療のために有用である、ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０４０５０８、ＷＯ２０１１／１１７３２９又はＷＯ２０１２／１３１０７８に開示され及び詳細に記載される。また、ＷＯ２０１０／０６９５３２；ＷＯ２０１１／０１４４６９；ＵＳ２０１１／１５０８９５；ＷＯ２００９／０９７３２５；ＷＯ２００９／１０５２６９；ＷＯ２００６／０６８９５３又はＷＯ０３／０３０８３３に記載されるＡＮＧ２抗体のＶＨ及びＶＬは、ＷＯ２０１０／０４０５０８、ＷＯ２０１１／１１７３２９又はＷＯ２０１２／１３１０７８に記載される抗ＶＥＧＦ結合アーム及び構造を使用する二重特異性抗体内部で使用することができる。
【００４０】
好ましい一実施態様において、
ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体は
配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；及び
配列番号９の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００４１】
好ましい一実施態様において、
ｉ）ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体は
配列番号１１の、配列番号１２の、配列番号１３の、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
ＣＤ４０抗原は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）ファミリーに属する５０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質である。（Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403-10 (1989)）。ＣＤ４０は、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、胸腺上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、及び平滑筋細胞を含む多くの正常及び腫瘍細胞型において発現される。（Paulie S. et al., Cancer Immunol. Immunother. 20:23-8 (1985); Banchereau J. et al., Adv. Exp. Med. & Biol. 378:79-83 (1995); Alderson M. R. et al., J. of Exp. Med. 178:669-74 (1993); Ruggiero G. et al., J. of Immunol. 156:3737-46 (1996); Hollenbaugh D. et al., J. of Exp. Med. 182:33-40 (1995); Yellin M. J. et al., J. of Leukocyte Biol. 58:209-16 (1995)；及びLazaar A. L. et al., J. of Immunol. 161:3120-7 (1998)）。ＣＤ４０は、全てのＢリンパ腫及び全ての固形腫瘍の７０％において発現される。恒常的に発現するが、ＣＤ４０は、ＬＰＳ、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦなどの成熟シグナルによって抗原提示細胞において上方制御される。
【００４３】
ＣＤ４０活性化は、体液性及び細胞性免疫応答の調節に重要な役割を果たしている。ＣＤ４０の活性化を伴わない抗原提示は、耐性につながる可能性があるが、一方、ＣＤ４０シグナル伝達は、かかる耐性を元に戻し、全ての抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原提示を増強し、ヘルパーサイトカイン及びケモカインの分泌を引き起こし、共刺激分子の発現及びシグナル伝達を増加させ、免疫細胞の細胞溶解活性を刺激することができる。ＣＤ４０は、Ｂ細胞増殖、成熟及びクラスイッチングに重要な役割を果たしている。（Foy T. M. et al., Ann. Rev. of Immunol. 14:591-617 (1996)）。ＣＤ４０シグナル伝達経路の破壊は、異常な血清免疫グロブリンアイソタイプ分布、ＣＤ４＋ Ｔ細胞プライミングの欠如、二次体液性応答の欠損をもたらす。例えば、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群は、ヒトＣＤ４０Ｌ遺伝子の突然変異に関連する疾患であり、患者がＩｇＭアイソタイプのもの以外の抗体を産生することのできないことを特徴とし、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの間の生産的な相互作用が効果的な免疫応答のために必要であることを示唆している。
【００４４】
ＣＤ４０ＬによるＣＤ４０の係合は、ＴＲＡＦ（ＴＮＦ−Ｒ関連因子）とのＣＤ４０細胞質ドメインの会合をもたらす。（Lee H. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1421-6 (1999); Pullen S. S. et al., Biochemistry 37:11836-45 (1998); Grammar A. C. et al., J. of Immunol. 161:1183-93 (1998); Ishida T. K. et al., Proc. Acad Acad. Sci. USA 93:9437-42 (1996); Pullen S. S. et al., J. of Biol. Chem. 274:14246-54 (1999)）。ＴＲＡＰとの相互作用は、ＮＦカッパＢ及びＪｕｎ／ＡＰ１経路の両方の活性化に至ることができる。（Tsukamoto N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1234-9 (1999); Sutherland C. L. et al., J. of Immunol. 162:4720-30 (1999)）。細胞型に応じて、このシグナル伝達は、ＩＬ−６（Jeppson J. D. et al., J. of Immunol. 161:1738-42 (1998); Uejima Y. et al., Int. Arch. of Allergy & Immunol. 110:225-32, (1996), IL-8 (Gruss H. J. et al., Blood 84:2305-14 (1994); von Leoprechting A. et al., Cancer Res. 59:1287-94 (1999); Denfeld R. W. et al., Europ. J. of Immunol. 26:2329-34 (1996)), IL-12 (Cella M. et al., J. of Exp. Med. 184:747-52 (1996); Ferlin W. G. et al., Europ. J. of Immunol. 28:525-31 (1998); Armant M. et al., Europ. J. of Immunol. 26:1430-4 (1996); Koch F. et al., J. of Exp. Med. 184:741-6 (1996); Seguin R. and L. H. Kasper, J. of Infect. Diseases 179:467-74 (1999); Chaussabel D. et al., Infection & Immunity 67:1929-34 (1999)), IL-15 (Kuniyoshi J. S. et al., Cellular Immunol. 193:48-58 (1999)) などのサイトカイン及びケモカイン（ＭＩＰ１ａｌｐｈａ、ＭＩＰ１ｂｅｔａ、ＲＡＮＴＥＳ、その他）（McDyer J. F. et al., J. of Immunol. 162:3711-7 (1999); Schaniel C. et al., J. of Exp. Med. 188:451-63 (1998); Altenburg A. et al., J. of Immunol. 162:4140-7 (1999); Deckers J. G. et al., J. of the Am. Society of Nephrology 9:1187-93 (1998)）の分泌の増強、ＭＨＣ クラスＩ及びＩＩ（Santos-Argumedo L. et al., Cellular Immunol. 156:272-85 (1994)）の発現の増加、及び接着分子（例えば、ＩＣＡＭ）（Lee H. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:1421-6 (1999); Grousson J. et al., Archives of Dermatol. Res. 290:325-30 (1998); Katada Y. et al., Europ. J. of Immunol. 26:192-200 (1996); Mayumi M. et al., J. of Allergy & Clin. Immunol. 96:1136-44 (1995); Flores-Romo L. et al., Immunol. 79:445-51 (1993)) 及び共刺激分子（例えば、Ｂ７）（Roy M. et al., Europ. J. of Immunol. 25:596-603 (1995); Jones K. W. and C. J. Hackett, Cellular Immunol. 174:42-53 (1996); Caux C. et al., Journal of Exp. Med. 180:1263-72 (1994); Kiener P. A. et al., J. of Immunol. 155:4917-25 (1995)）の発現の増加をもたらす。ＣＤ４０の係合により誘発されるサイトカインは、Ｔ細胞の生存及び活性化を増強する。
【００４５】
細胞及び免疫機能の強化に加えて、ＣＤ４０活性化の効果は、ケモカイン及びサイトカインによる細胞の動員及び分化；単球の活性化；細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞溶解活性の増加；ＣＤ４０陽性腫瘍におけるアポトーシスの誘導；ＣＤ４０陽性腫瘍の免疫原性の増強；及び腫瘍特異的抗体の産生を含む。細胞媒介性免疫応答におけるＣＤ４０活性化の役割もまた良く確立されており、それは、 Grewal et al., Ann. Rev. of Immunol. 16:111-35 (1998); Mackey et al., J. of Leukocyte Biol. 63:418-28 (1998);及びNoelle R. J., Agents & Actions -- Suppl. 49:17-22 (1998)において概説される。
【００４６】
交差提示モデル系を用いた研究は、ＡＰＣのＣＤ４０活性化は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成のためのヘルパーＴ細胞の必要性に取って代わることができることを示した。（Bennett et al., Nature 393:478-480 (1998)）。ＣＤ４０Ｌ欠損マウスからの証拠は、ヘルパーＴ細胞プライミングにおけるＣＤ４０シグナル伝達のための明確な必要性を示している。（Grewal I. S. et al., Science 273:1864-7 (1996); Grewal I. S. et al., Nature 378:617-20 (1995)）。ＣＤ４０の活性化は、他の免疫寛容原性、抗原を有するＢ細胞をコンピテントなＡＰＣに変換する。（Buhlmann J. E. et al., Immunity 2:645-53 (1995)）。ＣＤ４０の活性化は、臍帯血前駆細胞の樹状細胞への成熟及び分化を誘導する。（Flores-Romo L. et al., J. of Exp. Med. 185:341-9 (1997); Mackey M. F. et al., J. of Immunol. 161:2094-8 (1998)）。ＣＤ４０の活性化はまた、機能的樹状細胞への単球の分化を誘導する。（Brossart P. et al., Blood 92:4238-47 (1998)）。更に、ＣＤ４０の活性化は、ＡＰＣ−ＣＤ４０誘導性サイトカインを介してＮＫ細胞の細胞溶解活性を増強する（Carbone E. et al., J. of Exp. Med. 185:2053-60 (1997); Martin-Fontecha A. et al., J. of Immunol. 162:5910-6 (1999)）。これらの観察は、ＣＤ４０は、ＡＰＣの成熟、ヘルパーサイトカインの分泌、共刺激分子の上方制御、及びエフェクター機能の増強を誘導することによって、免疫応答の開始及び増強に必須の役割を果たしていることを示している。
【００４７】
体液性及び細胞傷害性免疫応答の開始及び成熟におけるＣＤ４０シグナル伝達の重要な役割は、このシステムを免疫促進のための理想的な標的としている。かかる増強は、一般的に、活性化ＡＰＣの交差提示を介して免疫系に提示される腫瘍抗原に対する有効な免疫応答を備え付けるために特に重要であり得る。（Huang A. Y. et al., Ciba Foundation Symp. 187:229-44 (1994); Toes R. E. M. et al., Seminars in Immunol. 10:443-8 (1998); Albert M. L. et al., Nature 392:86-9 (1998); Bennett S. R. et al., J. of Exp. Med. 186:65-70 (1997)）。
【００４８】
幾つかのグループは、インビトロ及びインビボでの抗腫瘍応答に対するＣＤ４０活性化の有効性を実証している。（Toes R. E. M. et al., Seminars in Immunol. 10:443-8 (1998)）。２つのグループが、ウイルスにより形質転換された細胞による腎細胞癌及び皮下腫瘍の肺転移モデルを使用して、腫瘍特異的抗原に対する耐性を元にもどすことができ、ＣＤ４０の活性化がＴ細胞の効率的な抗腫瘍プライミングをもたらすことを独立に実証した。（Sotomayor E. M. et al., Nature Medicine 5:780-787 (1999); Diehl L. et al., Nature Medicine 5:774-9 (1999)）。免疫細胞の非存在下での抗腫瘍活性は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト乳がん系統モデルにおけるＣＤ４０Ｌ及び抗ＣＤ４０抗体治療によって報告された。（Hirano A. et al., Blood 93:2999-3007 (1999)）。抗ＣＤ４０抗体によるＣＤ４０の活性化は、最近、マウスモデルにおいて、ＣＤ４０＋及びＣＤ４０−リンパ腫を根絶することが示された。（French R. R. et al., Nature Medicine 5:548-53 (1999)）。更に、Ｇｌｅｎｎｉｅ及び共同研究者による以前の研究は、抗ＣＤ４０抗体によるシグナル伝達活性がエフェクターを漸加することが可能な他の抗表面マーカー抗体よりもインビボ腫瘍クリアランスを誘導するためにより効果的であると結論している。（Tutt A. L. et al., J. of Immunol. 161:3176-85 (1998)）。これらの観察と一致して、抗ＣＤ４０抗体は、インビボでＣＤ４０＋腫瘍細胞に対する活性について試験されたときに、全てではないが大部分の殺腫瘍活性はＡＤＣＣよりもむしろＣＤ４０のシグナル伝達と関連していた。（Funakoshi S. et al., J. of Immunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol. 19:93-101 (1996)）。別の研究では、骨髄樹状細胞は、様々な薬剤を用いてエクスビボで処置され、インビボでの抗腫瘍活性について試験された。これらの研究は、ＣＤ４０Ｌで刺激されたＤＣは、抗腫瘍応答を備え付ける最も成熟し、最も有効な細胞であることを実証した。
【００４９】
抗腫瘍免疫はまた、腫瘍ワクチンに対する野生型及びＣＤ４０−／−マウスの応答を比較することによって実証されている。これらの研究は、ＣＤ４０−／−マウスは、正常マウスにおいて観察された腫瘍免疫を達成することができないことを示している。（Mackey M. F. et al., Cancer Research 57:2569-74 (1997)）。別の研究では、腫瘍を有するマウスからの脾細胞は、腫瘍細胞により刺激され、エクスビボで抗ＣＤ４０抗体を活性化して処置され、増強された腫瘍特異的ＣＴＬ活性を有することが示された。（Donepudi M. et al., Cancer Immunol. Immunother. 48:153-164 (1999)）。これらの研究は、ＣＤ４０が、ＣＤ４０陽性及び陰性腫瘍の両方において、抗腫瘍免疫において重要な位置を占めることを示している。ＣＤ４０は、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、鼻咽頭、膀胱、卵巣、及び肝臓の癌の大部分、及び一部の乳癌及び結腸直腸癌で発現されるため、ＣＤ４０の活性化は、広範囲の臨床適用を有することができる。
【００５０】
本明細書で使用される「ＣＤ４０アゴニスト」は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を刺激する任意の部分を含む。この文脈において使用されるＣＤ４０は、好ましくはヒトＣＤ４０を指し、従って、ＣＤ４０アゴニストは、好ましくは、ヒトＣＤ４０のアゴニストである。典型的には、これらの部分は、アゴニスト性ＣＤ４０抗体又はアゴニストＣＤ４０Ｌポリペプチドとなるであろう。これらの抗体は、一例として、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ結合相互作用を特異的に刺激する、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体のｓｃＦｖ、及び抗体断片を含む。好ましい一実施態様において、アゴニスト性ＣＤ４０抗体は、キメラ、完全ヒト又はヒト化ＣＤ４０抗体を含むであろう。好ましい別の実施態様において、アゴニスト性ＣＤ４０抗体は、キメラ、完全ヒト又はヒト化ＣＤ４０抗体を含む。
【００５１】
「アゴニスト」は、細胞上の受容体と結合し、受容体の天然リガンドによって開始されたものと類似であるか又は同じである反応又は活性を開始する。「ＣＤ４０アゴニスト」は、限定されないが、以下の応答の何れか又は全てを誘導する：Ｂ細胞の増殖及び／又は分化；ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＶＣ ＡＭなどの分子を介した細胞間接着の上方制御；ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦなどの炎症促進性サイトカインの分泌；ＴＲＡＦ（例えば、ＴＲＡＦ２及び／又はＴＲＡＦ３）、ＮＩＫ（ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ）、ＩカッパＢキナーゼ（ＩＫＫ／．ｂｅｔａ．）などのＭＡＰキナーゼ、転写因子ＮＦ−κＢ、Ｒａｓなどの経路及びＭＥＫ／ＥＲＫ経路、ＰＩ３Ｋ ＡＫＴ経路、Ｐ３８のＭＡＰＫ経路等によるＣＤ４０受容体を介したシグナル伝達；ＸＩＡＰ、ｍｃｌ−１、ｂｃｌ−ｘなどの分子による抗アポトーシスシグナルの伝達；Ｂ及び／又はＴ細胞記憶生成；Ｂ細胞の抗体産生；Ｂ細胞アイソタイプスイッチイング、ＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ８０／８６などの細胞表面発現の上方制御。
【００５２】
アゴニスト活性は、Ｂ細胞応答のアッセイにおいて測定される場合、陰性対照によって誘導されるアゴニスト活性よりも少なくとも３０％、１０ ３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％，又は１００％大きいアゴニスト活性を意図している。
【００５３】
好ましい一実施態様において、ＣＤ４０アゴニストは、Ｂ細胞応答のアッセイにおいて測定される場合、陰性対照によって誘導されるアゴニスト活性よりも少なくとも２倍大きい又は少なくとも３倍大きいアゴニスト活性を有する。
【００５４】
従って、目的のＢ細胞応答がＢ細胞増殖である場合、アゴニスト活性は陰性対照によって誘導されるＢ細胞増殖のレベルよりも少なくとも２倍大きい又は少なくとも３倍大きいＢ細胞増殖のレベルの誘導であろう。
【００５５】
一実施態様において、ＣＤ４０に結合しない抗体は、陰性対照としての役割を果たす。「有意なアゴニスト活性を有しない」物質は、Ｂ細胞応答のアッセイにおいて測定される場合、陰性対照によって誘導されるアゴニスト活性よりも最大で約２５％大きい、好ましくは最大で約２０％大きい、１５％大きい、１０％大きい、５％大きい、１％大きい、０．５％大きい、又は実に約０．１％大きいアゴニスト活性を示すであろう。
【００５６】
「アゴニスト性ＣＤ４０抗体」又は「活性化ＣＤ４０抗体」又は「アゴニスト性若しくは活性化抗ＣＤ４０抗体」は、本明細書において使用される場合、ヒトＣＤ４０に結合し、かつ、ＣＤ４０を発現する細胞、組織又は生物に添加されると、一以上のＣＤ４０活性を少なくとも約２０％増加させる抗体を意味する。幾つかの実施態様において、抗体は、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、ＣＤ４０活性を活性化する。
【００５７】
幾つかの実施態様において、活性化抗体は、ＣＤ４０Ｌの存在下で添加される。
【００５８】
好ましい別の実施態様において、アゴニスト性ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性は以下のように測定される。
【００５９】
抗ＣＤ４０抗体による細胞株Ｊｙの免疫原性の増加
ＣＤ４０陽性のＪＩＹＯＹＥ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８７）（「Ｊｙ細胞」）が培養され、ＲＰＭＩ培地中で維持された。ＪＩＹＯＹＥ細胞は、完全ＲＰＭＩ培地中で本発明の抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）又はアイソタイプ対応抗体（抗ＫＬＨ）とともに２４時間インキュベートされた。次いで、細胞を洗浄し、２５ミリグラムのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）／７ｍＬの培地で６０分間処理された。次いでこれらの細胞は３７℃で６日間単離されたヒトＴ細胞と共に１：１００の比でインキュベートされた。（５％のＣＯ２）。Ｔ細胞を、その後、回収し、洗浄し、ＣＴＬ活性のレベルが、新鮮なクロム５１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）標識したＪＩＹＯＹＥ細胞に対して決定された。特異的ＣＴＬ活性は、特異的細胞溶解の％＝（細胞溶解Ｊｙ（ｃｐｍ）−自発的細胞溶解（ｃｐｍ））／（総細胞溶解（ｃｐｍ）−自発的細胞溶解（ｃｐｍ））として計算された。
【００６０】
好ましい一実施態様において、本明細書中で使用されるアゴニスト性ＣＤ４０抗体は、（上記の）インビトロのＪＩＹＯＹＥ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８７）アッセイにおいて測定される場合、少なくとも５０％、ＣＤ４０陽性ＪＩＹＯＹＥ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８７）において免疫原性を増加させた。
【００６１】
アゴニスト性ＣＤ４０抗体はまた、本明細書において抗ＣＤ４０活性化抗体と命名され、幾つかの重要な機構を介して腫瘍根絶に寄与することができる。これらの中で最も重要なのは、増強された腫瘍抗原のプロセシング及び提示、並びに腫瘍特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球の活性化をもたらす、ＣＤ４０陽性腫瘍細胞それら自身の増強された抗原提示又は免疫原性のための宿主樹状細胞の活性化である。更なる抗腫瘍活性は、ＣＤ４０シグナル伝達の他の免疫増強効果（ケモカイン及びサイトカインの生産、単球の動員及び活性化、及び増強されたＣＴＬ及びＮＫ細胞溶解活性）、並びにアポトーシスの誘導による又はＡＤＣＣをもたらす体液性応答を刺激することによるＣＤ４０＋腫瘍の直接的な死滅によって媒介され得る。アポトーシス細胞及び瀕死の腫瘍細胞は、プロセスされ、ＣＤ４０で活性化したＡＰＣによって提示される腫瘍特異的抗原の重要な源になることができる。
【００６２】
本発明は、ヒトＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のアゴニストとして作用する単離された抗体又はその抗原結合部分を記載する。
【００６３】
アゴニスト性ＣＤ４０抗体は、例えば、Beatty et al., Science 331 (2011) 1612-1616, R. H. Vonderheide et al., J Clin Oncol 25, 876 (2007); Khalil, M, et al., Update Cancer Ther. 2007 June 1; 2(2): 61-65に記載され、モデル抗体としてのアゴニストＣＤ４０ラット抗マウスＩｇＧ２ａ ｍＡｂ ＦＧＫ４５は、S. P. Schoenberger, et al, Nature 393, 480 (1998)に記載され；マウス交差反応性アゴニスト性ＣＤ４０抗体クローン１Ｃ１０は、Santos-Argumedo L. et al., Cell Immunol. 156 (1994) 272-285及びHeath AW et al. Eur J Immunol 24 (1994) 1828-34に記載される。臨床試験での例としては、例えば、ＣＰ−８７０，８９３及びダセツズマブ（アゴニストＣＤ４０抗体、ＣＡＳ番号８８０４８６−５９−９，ＳＧＮ−４０；ヒト化Ｓ２Ｃ６抗体）（Khalil, M, et al, Update Cancer Ther. 2007 June 1; 2(2): 61-65）である。
【００６４】
好ましい一実施態様において、アゴニスト性ＣＤ４０抗体は、Ｐｆｉｚｅｒが開発した完全ヒトＩｇＧ２アゴニスト性ＣＤ４０抗体であるＣＰ−８７０，８９３である。それはヒトＣＤ４０に３．４８×１０−１０ＭのＫＤで結合するが、ＣＤ４０Ｌの結合をブロックしない（例えば、Ｕ．Ｓ．７，３３８，６６０又はＥＰ１４７６１８５を参照（ここではＣＰ−８７０，８９３は抗体２１．４．１として記載される）。ＣＰ−８７０，８９３（ＵＳ７，３３８，６６０の抗体２１．４．１）は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＤＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＱＰＬＧＹＣＴＮＧＶＣＳＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）（ＵＳ７，３３８，６６０の配列番号４２に対応する）の重鎖可変領域のアミノ酸配列、（ｂ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＹＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＴＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＩＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６）（ＵＳ７，３３８，６６０の配列番号４４に対応する）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むこと；及び／又は；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）アクセッション番号ＰＴＡ−３６０５を有するハイブリドーマ２１．４．１により産生される抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を有することを特徴とする。ダセツズマブ及び他のヒト化Ｓ２Ｃ６抗体は、ＵＳ６，９４６，１２９及びＵＳ８，３０３，９５５に記載される。
【００６５】
従って、好ましい一実施態様において、ＡＮＧ−２又はＡＮＧ−２／ＶＥＧＦ抗体との併用療法において使用されるアゴニスト性ＣＤ４０抗体は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＤＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＱＰＬＧＹＣＴＮＧＶＣＳＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）（ＵＳ７，３３８，６６０の配列番号４２に対応する）の重鎖可変領域のアミノ酸配列、（ｂ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＹＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＴＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＩＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６）（ＵＳ７，３３８，６６０の配列番号４４に対応する）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むこと；及び／又は；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）アクセッション番号ＰＴＡ−３６０５を有するハイブリドーマ２１．４．１により産生される抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を有することを特徴とする。ダセツズマブ及び他のヒト化Ｓ２Ｃ６抗体は、ＵＳ６，９４６，１２９及びＵＳ８，３０３，９５５に記載される。
【００６６】
好ましい一実施態様において、ＡＮＧ−２又はＡＮＧ−２／ＶＥＧＦ抗体との併用療法において使用されるアゴニスト性ＣＤ４０抗体は、ヒト化Ｓ２Ｃ６抗体である。ヒト化Ｓ２Ｃ６抗体は、例えば、ｍＡＢ Ｓ２Ｃ６（ＡＴＣＣにＰＴＡ−１１０として寄託）の重鎖及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、２及び３に基づいている。マウスｍＡＢ Ｓ２Ｃ６の重鎖及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、２及び３は、ＵＳ６，９４６，１２９に記載され、開示される。一実施態様において、アゴニスト性ＣＤ４０抗体は、ダセツズマブである。一実施態様において、アゴニスト性ＣＤ４０抗体は、（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＶＩＰＮＡＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＩＹＷＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ（配列番号７）の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び（ｂ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＳＱＴＴＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号８）の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００６７】
一実施態様において、アゴニスト性ＣＤ４０抗体は、ヒト抗体である。本明細書に使用される、用語「ヒト抗体」は、可変及び定常ドメイン配列がヒト配列に由来する抗体を意味する。ヒトアゴニスト性抗ＣＤ４０抗体は、開示内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ０３／０４０１７０に詳細に記載される。ヒト抗体は、ヒト患者における非ヒト抗体の使用に関連している免疫原性及びアレルギー性応答を最小化することが期待されるため、本発明の治療方法において実質的な利点を提供する。
【００６８】
本発明に有用な他の例示的なヒト抗ＣＤ４０抗体は、ＷＯ０３／０４０１７０に記載される３．１．１、３．１．１  Ｈ−Ａ７８Ｔ、３．１．１  Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、２１．４．１、２１．２．１、２２．１．１、２２．１．１  Ｈ−Ｃ１０９Ａ、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２８．１Ｈ−Ｄ１６Ｅ、２３．２９．１、２４．２．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ及び２３．２８．１Ｌ−Ｃ９２Ａと指定された抗体のアミノ酸配列を有する抗体、並びにその典型的な抗体の何れかのＣＤＲ又は可変領域を含む抗体を含む。
【００６９】
ある実施態様において、がん又は腫瘍の治療は、がん細胞の増殖を阻害し、腫瘍の重量又は体積の増加を阻害し又は防止し、及び／又は腫瘍の重量又は体積の減少を引き起こす。幾つかの実施態様において、がん治療は患者の生存期間を延長する。ある実施態様において、腫瘍増殖は、治療されていないものと比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害される。幾つかの実施態様において、がん又は腫瘍は、ＣＤ４０陽性である。
【００７０】
本発明においては、代替的に、当該技術分野で知られているように、用語「ＣＤ４０Ｌ」又は「ＣＤ１５４」は、全哺乳動物、例えば、ヒト、ラット、非ヒト霊長類、マウスのＣＤ４０Ｌ、並びにその断片、変異体、オリゴマー、及びそのコンジュゲートを含み、少なくともその対応する哺乳動物のＣＤ４０ポリペプチド、例えば、ヒトＣＤ４０に結合する。本発明において、投与されるＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０Ｌポリペプチド又は前記ＣＤ４０ＬポリペプチドをコードするＤＮＡを含み得る。このようなＣＤ４０Ｌポリペプチド及びＤＮＡは、特に、Ｉｍｍｕｎｅｘ米国特許第６，４１０，７１１号；米国特許第６，３９１，６３７号；米国特許第５，９８１，７２４号；米国特許第５，９６１，９７４号及び米国特許出願公開第２００４０００６００６号に開示される天然型ＣＤ４０Ｌ配列及びその断片、変異体、及びオリゴマーを含み、その特許及び出願並びにそこに開示されたＣＤ４０Ｌ配列は、本明細書にその全体が参考として援用される。
【００７１】
ＣＤ４０Ｌポリペプチドは、本発明によるＣＤ４０アゴニストとして使用することができ、特に、Ｉｍｍｕｎｅｘ米国特許第６，４１０，７１１号；米国特許第６，３９１，６３７号；米国特許第５，９８１，７２４号；米国特許第５，９６１，９７４号及び米国特許出願公開第２００４０００６００６号に開示される天然型ＣＤ４０Ｌ配列及びその断片、変異体、及びオリゴマーを含み、その特許及び出願並びにそこに開示されたＣＤ４０Ｌ配列は、本明細書にその全体が参考として援用される。
【００７２】
「エピトープ」なる用語は、抗体に特異的に結合することが可能な抗原の決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面のグルーピングからなり、通常エピトープは特異的な３次元構造の特徴並びに特異的な電荷特性を有する。コンホメーション及び非コンホメーションエピトープは、変性溶媒の存在において、後者ではなく、前者への結合が失われることにおいて区別される。
【００７３】
本明細書で使用される「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメインＶＬ、重鎖の可変ドメインＶＨ）は、抗体を抗原に結合させることに直接関与する軽鎖及び重鎖の対のそれぞれを示す。軽鎖及び重鎖ドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは、その配列が広範囲に保存され、３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）により結合されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβシート立体構造を採り、ＣＤＲはβシート構造を連結するループを形成しうる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によりその３次元構造で保持され、他の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、よって本発明の更なる目的を提供する。
【００７４】
「抗体の抗原結合部位」は、本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部位は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、ここで定義する超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、ＮからＣ末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域であり、抗体の特性を定める。ＣＤＲ及びＦＲは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) の標準的定義に従って決定され、及び／又は「超可変ループ」からの残基である。
【００７５】
本発明で使用される「核酸」又は「核酸分子」なる用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図している。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００７６】
この出願中において使用される「アミノ酸」なる用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に生じるカルボキシα−アミノ酸の群を示す。
【００７７】
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗体の抗原への結合に直接的にかかわらないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は当業者に良く知られており、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分けられ、これらの幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。重鎖の定常領域に従って、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化は、Ｃ１ｑの結合及びＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与している。補体活性（ＣＤＣ）は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスの定常領域に対する補体因子Ｃ１ｑの結合により開始される。補体系に対する抗体の影響は、特定の状態に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分に定められた結合部位により引き起こされる。そのような結合部位は、先端技術において知られており、例えば、Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; ＥＰ０３０７４３４により記載される。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９である（Ｋａｂａｔ，Ｅ．ＡのＥＵ指標に従い番号付け、下記参照）。通常、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、補体活性化及びＣ１ｑ及びＣ３結合を示すが、ＩｇＧ４は補体系を活性化させず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。
【００７８】
一実施態様において、本明細書に記載される抗体は、ヒトＩｇＧクラスのもの（即ち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブクラスのもの）である。
【００７９】
好ましい実施態様において、抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスのもの又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一実施態様において、本明細書に記載されるのは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。一実施態様において、本明細書に記載される抗体は、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。
【００８０】
一実施態様では、本発明による抗体はヒト起源由来のＦｃ部分、及び好ましくはヒト定常領域の他の部分全てを含む。本明細書で使用される場合、用語「ヒト起源由来のＦｃ部分」とは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分の何れか、好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラスからのＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラスからの変異Ｆｃ部分（一実施態様において、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａにおける変異を含む）、ヒトＩｇＧ４サブクラスからのＦｃ部分又はヒトＩｇＧ４サブクラスからの変異Ｆｃ部分（一実施態様において、Ｓ２２８Ｐにおける変異を含む）であるＦｃ部分を意味する。
【００８１】
一実施態様において、本明細書に記載される抗体は、定常鎖がヒト起源のものであることを特徴とする。このような定常鎖は、先端技術において知られており、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．により記載される（例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照）。
【００８２】
本発明は、患者にＣＤ４０アゴニスト（例えばアゴニスト性ＣＤ４０抗体）の治療的有効量とともに本明細書に記載の抗ＡＮＧ２抗体の治療的有効量を投与することを特徴とする、治療を必要とする患者の治療のための方法を含む。本発明は、記載された治療のために、ＣＤ４０アゴニスト（例えばアゴニスト性ＣＤ４０抗体）とともに本明細書に記載の抗ＡＮＧ２抗体の使用を含む。
【００８３】
本明細書に記載された抗体は、好ましくは組み換え手段によって産生される。そのような方法は先端技術において広く知られており、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現を含み、その後の抗体ポリペプチドの単離、及び通常は薬学的に許容される純度までの精製を伴う。タンパク質発現のために、軽鎖及び重鎖又はその断片をコードする核酸は標準的な方法によって発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞などの適当な原核生物又は真核生物宿主細胞中で行われ、抗体は細胞（上清から又は細胞溶解後）回収される。
【００８４】
組み換えによる抗体の産生は、最新技術分野において周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse,S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol.Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説に記載されている。
【００８５】
抗体は、細胞全体に、細胞溶解物中に、又は部分精製形態あるいは実質的に純粋な形態で存在してもよい。細胞成分又は他の汚染物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野で周知の他のものを含む標準的な技術によって、精製が行われる。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照。
【００８６】
ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270により説明される。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9に記述される。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記述される。好適な一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、 Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83及びSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199により記述される。
【００８７】
発明による重及び軽鎖可変ドメインは、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列と組み合わせられ、発現ベクターコンストラクトが形成される。重及び軽鎖発現コンストラクトは単一ベクターに組み入れられ、宿主細胞に同時に、連続的に、又は別々にトランスフェクトされ、次いでそれは融合され両鎖を発現する単一宿主細胞が形成される。
【００８８】
原核生物に適している制御配列は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００８９】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作動可能に連結」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されている場合、そのポリペプチドのＤＮＡに操作可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に操作可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にある場合、コード配列と操作可能に結合している。一般に、「作動可能に連結した」とは、連結しているＤＮＡ配列は連続しており、分泌リーダーの場合には、リーディング・フレームにあり連続している。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位での連結反応によって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、従来の慣例に従って使用される。
【００９０】
モノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどによって培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは容易に単離され、従来の手順を用いて配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、ＤＮＡとＲＮＡの供給源として機能することができる。一度単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに挿入することができ、これらは次いで、本来ならば免疫グロブリンタンパク質を生成しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又はミエローマ細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトされ、宿主細胞中で組換えモノクローナル抗体の合成を得る。
【００９１】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」なる表現は相互に交換可能に用いられ、かかる標記は子孫を含む。よって、「形質転換体」や「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細胞と何世代移行したかを問わずそれから由来した培養物とを含む。また、全ての子孫は、意図的な又は不慮の突然変異により、ＤＮＡ量において、厳密には同一でない可能性もあると理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされた場合、同じ機能又は生物活性を有する変異子孫も含まれる。
【００９２】
別の態様では、本発明は、本発明の、モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分の一又は複数の組み合わせを含有し、薬学的に許容可能な担体と共に製剤化された、組成物、例えば薬学的組成物を提供する。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的適合性の、ありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収／再吸収遅延剤、及び同様なものを含む。好ましくは、担体は注射又は注入に適している。
【００９４】
本発明の組成物は、当該技術で知られている種々の方法で投与することができる。当業者に理解されているように、投与の経路及び／又は方式は、所望する結果に応じて変えられるであろう。
【００９５】
薬学的に許容可能な担体は、無菌の水溶液又は分散系及び無菌の注射可能溶液又は分散系の調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は当分野で知られている。水に加えて、担体は、例えば、等張緩衝生理食塩水でありうる。
【００９６】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形態、及び／又は本発明の薬学的組成物で使用される本発明の化合物は、当業者に知られている一般的な方法により、薬学的に許容可能な剤形に処方される。
【００９７】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性であること無く、特定の患者、組成物、及び投与の形式について所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るために、変更されてもよい（有効量）。選択された投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、又はそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定の化合物、使用される特定の組成物と併用して使用される他の薬物、化合物及び／又は材料の排出速度、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康状態及び事前治療歴、ならびに、医療技術分野において周知である同様の因子を含む様々な薬物動態因子に依存するであろう。
【００９８】
用語「治療の方法」又はその等価物は、例えば、がんに適用される場合、患者においてがん細胞の数を減少又は除外するように又はがんの症状を緩和する設計されている手順若しくは採るべき道を指す。がん又は別の増殖性疾患を「治療する方法」は、がん細胞もしくは他の疾患が実際に排除されること、細胞の数もしくは疾患が実際に減ること、又はがんもしくは他の疾患の症状が実際に緩和されることを必ずしも意味しない。しばしば、がんを治療する方法は、成功の可能性が低いが、それにも関わらず、患者の病歴及び推定生存年数を所与として、全体的に有益な採るべき道を誘導するとみなされて実施されることとなる。
【００９９】
用語「組み合わせて投与される（administered in combination with）」又は「共投与（co-administration）」、「共投与する（co-administering）」又は「併用療法（combination therapy）」、「ともに投与される（administered with）」又は「併用療法（combination treatment）」は、本明細書に記載される抗ＡＮＧ２抗体、及び本明細書に記載されるアゴニスト性ＣＤ４０抗体の、例えば別々の処方／適用（又は単一の処方／適用）としての投与を言う。同時投与は、同時もしくは何れかの順序で連続的であることができ、好ましくは両方（又は全て）の活性薬剤がその生物学的活性を同時に発揮する期間がある。前記抗体及び前記更なる薬剤は、連続的注入を介して（例えば、静脈内に（ｉｖ））同時に又は連続的に共投与される。両方の治療薬が連続的に共投与される場合、投与量は同日に別々の投与で投与され、又は薬剤の一つが第１日に、２番目のが第２日から第７日に、好ましくは第２日から第４日に共投与される。従って、一実施態様において、用語「連続的に（逐次的に）」は、第一成分の投与後７日以内に、好ましくは第一成分の投与後４日以内を意味し；用語「同時に」は同時刻でを意味する。抗ＡＮＧ２抗体及び／又はアゴニスト性ＣＤ４０抗体の維持（投与）量に関する用語「共投与」は、維持投与量は、治療サイクルが両方の薬剤で適切である場合、例えば毎週、両方を共投与することができることを意味する。又は、更なる薬剤が、例えば初日から第３日おきに、投与され、前記抗体は毎週投与される。又は維持投与量は、１日以内又は数日以内の何れかで連続的に共投与される。
【０１００】
抗体は、患者に対して、研究者、獣医、医師又は他の臨床医によって求められている、組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を惹起するであろうそれぞれの化合物もしくはそれらの組み合わせの量である「治療的有効量」（又は単に「有効量」）で投与されるのは自明である。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、用語「患者」又は「被験体」は、好ましくは、がん、又は前がん状態若しくは病変の治療を必要とするヒトを指す。しかし、用語「患者」は、ヒト以外の動物、例えば、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及び非ヒト霊長類など、とりわけ、治療を必要としている哺乳動物を指すことができる。
【０１０２】
共投与の量及び共投与のタイミングは、タイプ（種、性別、年齢、体重など）、及び治療される患者の状態、及び治療される疾患又は状態の重症度に依存するであろう。前記抗ＡＮＧ２抗体と更なる薬剤は、患者に対して、一時に又は一連の治療にわたって、例えば同じ日に、又は翌日に適切に共投与される。
【０１０３】
疾患のタイプ及び重症度に依存して、前記抗ＡＮＧ２抗体及び／又はアゴニスト性ＣＤ４０抗体の約０．１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）が、患者への両方の薬剤の共投与のための初期候補投与量である。本発明は、がん、とりわけ結腸がん、卵巣がん、膠芽細胞腫、胃がん、膵臓がん、乳がん、肺がん、肝細胞がんに罹患した患者の治療のための本発明による抗体の使用を含む。
【０１０４】
アゴニスト性ＣＤ４０抗体組み合わせた抗ＡＮＧ２抗体に加えて、化学療法剤も投与することができる。
【０１０５】
一実施態様において、本明細書に記載される抗ＡＮＧ２抗体及び本明細書に記載されるアゴニスト性ＣＤ４０抗体とともに投与されうる係る付加的化学療法剤は、限定されないが、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）などのニトロソ尿素；テモダール（ＴＭ）（テモゾロミド）；トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）などのエチレンイミン／メチルメラミン；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル；ダカルバジンなどのトリアジン（ＤＴＩＣ）を含むアルキル化剤；メトトレキサート及びトリメトレキサートなどの葉酸類似体、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジンなどのピリミジン類似体；６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコフォルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）などのプリン類似体を代謝拮抗剤；パクリタキセル、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビンなどのビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチンなどの抗有糸分裂薬；エトポシド及びテニポシドなどのポドフィロトキシン（ｐｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ）；ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ及びアクチノマイシンなどの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；インターフェロン−α、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦなどの生物学的応答調節剤を含む天然物；オキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体、ミトキサントロンなどのアントラセンジオン、ヒドロキシ尿素などの置換尿素、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（Ｏ、Ｐ−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤を含むその他の薬剤；プレドニゾン及び等価物などの副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、デキサメタゾン及びアミノグルテチミド；ジェムザール（ＴＭ）（ゲムシタビン）、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物などのエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲンを含むホルモン及びアンタゴニスト；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体及びロイプロリドなどの抗アンドロゲン；及びフルタミドなどの非ステロイド性抗アンドロゲン、を含む抗腫瘍剤が含まれる。エピジェネティックな機構を標���とする治療薬（Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）は、限定されないが、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤（例えば、Ｖｉｄａｚａ）を含み、そして転写抑制（ＡＴＲＡ）治療薬の放出は、抗原結合タンパク質と組み合わせることができる。一実施態様において、化学療法剤は、タキサン（例えば、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール））、修飾パクリタキセル（例えば、アブラキサン及びオパキシオ）、ドキソルビシン、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、及びその他のマルチキナーゼ阻害剤、オキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、及びビンブラスチンからなる群から選択される。一実施態様において、化学療法剤は、タキサン（例えばタキソール（パクリタキセル）、ドセタキセル（タキソテール）、修飾パクリタキセル（例えばアブラキサン及びオパキシオ）からなる群から選択される。一実施態様において、付加的化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン、又はオキサリプラチンから選択される。一実施態様において、化学療法剤は、５−フルオロウラシル、ロイコボリン及びイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）である。一実施態様において、化学療法剤は、５−フルオロウラシル、ロイコボリン及びオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）である。
【０１０６】
付加的化学療法剤との併用療法の具体的な例は、例えば、乳がんの治療用に、タキサン（例えば、ドセタキセル又はパクリタキセル）又は修飾パクリタキセル（例えば、アブラキサン又はオパキシオ）、ドキソルビシン）、カペシタビン及び／又はベバシズマブ（アバスチン）による治療；卵巣がんには、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシン（又は修飾ドキソルビシン（Ｃａｅｌｙｘ又はＤｏｘｉｌ））、又はトポテカン（ハイカムチン）による治療；腎臓がんの治療用に、マルチキナーゼ阻害剤、ＭＫＩ、（スーテント、ネクサバール、又は７０６）及び／又はドキソルビシンによる治療；扁平上皮癌の治療用にオキサリプラチン、シスプラチン及び／又は放射線とヒトＣＳＦ−１Ｒ抗体による治療；肺がんの治療用に、タキソール及び／又はカルボプラチンによる治療が含まれる。
【０１０７】
従って、一実施態様において、付加的化学療法剤は、乳がんの治療用に、タキサン（ドセタキセル又はパクリタキセル又は修飾パクリタキセル（アブラキサン又はオパキシオ）、ドキソルビシン、カペシタビン及び／又はベバシズマブの群から選択される。
【０１０８】
抗ＡＮＧ２抗体／アゴニスト性ＣＤ４０抗体の併用療法の一実施態様においては、付加的化学療法剤は投与されない。
【０１０９】
本発明はまた、そのような疾患に罹患した患者の治療のための方法を含む。
【０１１０】
本発明は、本発明による抗体の有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む薬学的組成物の製造法、及びその方法のための本発明による抗体の使用を提供する。
【０１１１】
本発明は、がんに罹患した患者の治療のために、好ましくは薬学的に許容される担体と一緒に、医薬品の製造のための本発明による抗体の有効量での使用を更に提供する。
【０１１２】
本発明はまた、がんに罹患した患者の治療のために、好ましくは薬学的に許容される担体と一緒に、医薬品の製造のための本発明による抗体の有効量での使用を提供する。
【０１１３】
以下に、本発明の幾つか特定の実施態様が記載される。
１：
ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体であって、抗体は、ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のため、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激することに使用のため、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にすることに使用のため、ＣＤ４０アゴニストと組み合わせて投与される。
２：
抗体が、ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、ｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のため、ＣＤ４０アゴニストと組み合わせて投与される、ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体。
３：
抗ＡＮＧ２抗体がモノクローナル抗体である、実施態様１又は２に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体。
４：
抗ＡＮＧ２抗体がヒトであるか又はヒト化されている、実施態様１から３の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体。
５：
抗ＡＮＧ２抗体が、表面プラズモン共鳴（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ）によって決定される場合、１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ未満のＫＤ値でヒトＡＮＧ２に特異的に結合する、実施態様１から４の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体。
６：
抗ＡＮＧ２抗体がＩｇＧ抗体である、実施態様１から５の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体。
７：
抗ＡＮＧ２抗体が、ＴＩＥ２受容体とのヒトＡＮＧ−２の相互作用を１５ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、実施態様１から６の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体。８：
ＣＤ４０アゴニストが、アゴニスト性ＣＤ４０抗体又はアゴニスト性ＣＤ４０Ｌポリペプチドである、実施態様１から７の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体。
９：
ＣＤ４０アゴニストが、アゴニスト性ＣＤ４０抗体である、実施態様１から７の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体。
１０：
ｉ）抗ＡＮＧ２抗体が
（ａ）配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号３の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
を含み、及び
（ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体が
（ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号７の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号８の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
を含む、実施態様９に記載のヒトＡＮＧ−２に結合する抗体。
１１：
ｉ）抗ＡＮＧ２抗体が
配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；又は
及び
（ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体は
（ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、実施態様９に記載のヒトＡＮＧ−２に結合する抗体。
１２：
抗ＡＮＧ２抗体が、ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体である、実施態様９に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体。
１３：
ｉ）ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体が
配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；及び
配列番号９の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；
及び
ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、実施態様１０に記載のヒトＡＮＧ−２に結合する抗体。
１４：
ｉ）ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体が
配列番号１１の、配列番号１２の、配列番号１３の、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含み；及び
ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、実施態様１０に記載のヒトＡＮＧ−２に結合する抗体。
１５：
がんが、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫又はリンパ性白血病である、実施態様１から１４の何れか一項に記載の使用のためのヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体。
１６：
がんが固形腫瘍を含む、実施態様１５に記載の使用のためのヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体。
１７：
がんが、結腸がん、卵巣がん、膠芽細胞腫、胃がん、膵臓がん、乳がん、肺がん、肝細胞がんである、実施態様１５に記載の使用のためのヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体。
１８：
治療の方法において、抗ＡＮＧ２抗体及びＣＤ４０アゴニストが、同時に、別々に又は連続的に被験体に投与される、実施態様１から１７の何れか一項に記載の使用のためのヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体。
【０１１４】
アミノ酸配列の説明
配列番号１  ＜ＡＮＧ−２＞Ｅ６Ｑの可変重鎖ドメインＶＨ
配列番号２  ＜ＡＮＧ−２＞Ｅ６Ｑの可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号３  ＜ＡＮＧ−２＞Ａｎｇ２ｉ＿ＬＣ０６の可変重鎖ドメインＶＨ
配列番号４  ＜ＡＮＧ−２＞Ａｎｇ２ｉ＿ＬＣ０６の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号５  ＣＰ−８７０，８９３（Ｕ．Ｓ．７，３３８，６６０の抗体２１．４．１）の可変重鎖ドメインＶＨ
配列番号６  ＣＰ−８７０，８９３（Ｕ．Ｓ．７，３３８，６６０の抗体２１．４．１）の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号７  ヒト化Ｓ２Ｃ６重鎖可変ドメインＶＨ変異体
配列番号８  ヒト化Ｓ２Ｃ６軽鎖可変ドメインＶＬ変異体
配列番号９  ＜ＶＥＧＦ＞  ベバシズマブの可変重鎖ドメインＶＨ
配列番号１０  ＜ＶＥＧＦ＞ベバシズマブの可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号１１  二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体ＸＭａｂ１＜ＶＥＧＦ＞軽鎖
配列番号１２  二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体ＸＭａｂ１＜ＡＮＧ２＞軽鎖
配列番号１３  二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体ＸＭａｂ１＜ＶＥＧＦ＞重鎖
配列番号１４  二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体ＸＭａｂ１＜ＡＮＧ２＞重鎖
配列番号１５  ヒトアンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）
配列番号１６  ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）
配列番号１７  ＜ＶＥＧＦ＞Ｂ２０−４．１の可変重鎖ドメインＶＨ
配列番号１８  ＜ＶＥＧＦ＞Ｂ２０−４．１の可変軽鎖ドメインＶＬ
【０１１５】
以下に、本発明の実施態様が記載される。
１：
ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体であって、抗体は、ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のため、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激することに使用のため、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にすることに使用のため、ＣＤ４０アゴニストと組み合わせて投与される。
２：
抗体が、ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、ｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のため、ＣＤ４０アゴニストと組み合わせて投与される、ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体。
３：
ｉ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体、及び
ｉｉ）ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のため、又はｃ）Ｔ細胞活性（一実施態様においてＣＤ８エフェクターＴ細胞活性）又はマクロファージ活性（一実施態様においてＣＤ４０活性化マクロファージ活性）などの免疫応答又は機能を刺激することに使用のため、又はｄ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体を用いた治療に対してがんを感受性にすることに使用のための医薬の製造のためのＣＤ４０アゴニスト
の組み合わせの使用。
４：
ｉ）ヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体、及び
ｉｉ）ａ）がんを治療すること又はがんの進行を遅らせることに使用のため、又はｂ）がんに罹患した患者の生存期間を延長することに使用のための医薬の製造のためのＣＤ４０アゴニスト
の組み合わせの使用。
５：
抗ＡＮＧ２抗体がヒトであるか又はヒト化されている、実施態様１から４の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体又はその使用。
６：
抗ＡＮＧ２抗体が、表面プラズモン共鳴（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ）によって決定される場合、１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ未満のＫＤ値でヒトＡＮＧ２に特異的に結合する、実施態様１から５の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体又はその使用。
７：
抗ＡＮＧ２抗体がＩｇＧ抗体である、実施態様１から６の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体又はその使用。
８：
抗ＡＮＧ２抗体が、ＴＩＥ２受容体とのヒトＡＮＧ−２の相互作用を１５ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、実施態様１から７の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体又はその使用。
９：
ＣＤ４０アゴニストが、アゴニスト性ＣＤ４０抗体又はアゴニスト性ＣＤ４０Ｌポリペプチドである、実施態様１から８の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体又はその使用。
１０：
ＣＤ４０アゴニストが、アゴニスト性ＣＤ４０抗体である、実施態様１から９の何れか一項に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体又はその使用。
１１：
ｉ）抗ＡＮＧ２抗体が
（ａ）配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号３の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
を含み、及び
（ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体が
（ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号７の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号８の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
を含む、実施態様１０に記載のヒトＡＮＧ−２に結合する抗体又はその使用。
１２：
ｉ）抗ＡＮＧ２抗体が
配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；又は
及び
（ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体は
（ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、実施態様１０に記載のヒトＡＮＧ−２に結合する抗体又はその使用。１３：
抗ＡＮＧ２抗体が、ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体である、実施態様１０に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体又はその使用。
１４：
更に、ヒトＶＥＧＦに結合する抗体が、ＣＤ４０アゴニストと組み合わせて投与される又は組み合わせて使用される、実施態様１０に記載の使用のための抗ＡＮＧ２抗体又はその使用。
１５：
ｉ）ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体が
配列番号１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；及び
配列番号９の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；
及び
（ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、実施態様１３に記載のヒトＡＮＧ−２に結合する抗体又はその使用。
１６：
ｉ）ヒトＡＮＧ−２に結合し及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体が
配列番号１１の、配列番号１２の、配列番号１３の、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含み；及び
ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、実施態様１３に記載のヒトＡＮＧ−２に結合する抗体又はその使用。
１７：
ｉ）ヒトＶＥＧＦに結合する抗体が、
配列番号９の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み；及び
ｉｉ）アゴニスト性ＣＤ４０抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、実施態様１４に記載のヒトＡＮＧ−２に結合する抗体又はその使用。
１８：
がんが、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫又はリンパ性白血病である、使用のための、又は実施態様１から１７の何れか一項に記載の使用のためのヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体又はその使用。
１９：
がんが固形腫瘍を含む、実施態様１８に記載の使用のためのヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体又はその使用。
２０：
がんが、ＡＮＧ−２の発現又は過剰発現により更に特徴づけられる、実施態様１８又は１９に記載の抗体又は使用。
２１：
がんが、結腸がん、卵巣がん、膠芽細胞腫、胃がん、膵臓がん、乳がん、肺がん、肝細胞がんである、実施態様１８から２０の何れか一項に記載の使用のためのヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体。
２２：
治療の方法において、抗ＡＮＧ２抗体及びＣＤ４０アゴニストが、同時に、別々に又は連続的に被験体に投与される、実施態様１から２１の何れか一項に記載の使用のためのヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に結合する抗体。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
ヒトＡＮＧ−２のＴＩＥ２受容体との相互作用の阻害（実験Ａ）
ヒトＡＮＧ−２／ヒトＴｉｅ２の相互作用の遮断は、受容体相互作用をＥＬＩＳＡによって示された。３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を室温で２時間０．５μｇ／ｍｌのヒトＴｉｅ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ，カタログ番号３１３−ＴＩ又は社内で製造された材料）でコーティングし、振盪下、室温で１時間、０．２％のＴｗｅｅｎ−２０及び２％のＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ）を補充したＰＢＳでブロックした。一方で、ＰＢＳ中の精製抗体の希釈物を０．２／ｍｌのｈｕＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１／２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃９２３−ＡＮ／ＣＦ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ，カタログ番号６２３−ＡＮ又は社内製造された材料）とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、０．５μｇ／ｍｌのビオチン化抗アンジオポエチン１／２クローン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＢＡＦ９２３，ＢＡＭ０９８１ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）及び１：３０００希釈ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ，カタログ番号１１０８９１５３００１）の混合物を１時間添加した。その後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。プレートを室温で３０分間、新たに調製したＡＢＴＳ試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ、緩衝液＃２０４ ５３０ ００１、タブレット＃１１ １１２ ４２２ ００１）で顕色させた。吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【０１１７】
得られた阻害濃度は以下の表に要約される。
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【０１１８】
ヒトＡＮＧ−２のＴＩＥ２受容体との相互作用の阻害（実験Ｂ）
相互作用ＥＬＩＳＡを室温で３８４ウェルマイクロタイタープレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、ＤＥ、カタログ番号４６４７１８）上で行った。各インキュベーション工程の後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＥＬＩＳＡプレートを、１時間（ｈ）、５μｇ／ｍｌのＴｉｅ−２タンパク質でコーティングした。その後、ウェルを室温で１時間、０．２％のＴｗｅｅｎ−２０及び２％のＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ）を補充したＰＢＳでブロックした。ＰＢＳ中の精製二重特異性Ｘｍａｂ抗体の希釈物を０．２μｇのｈｕＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ、カタログ番号６２３−ＡＮ）と一緒に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、０．５μｇ／ｍｌのビオチン化抗アンジオポエチン−２クローンＢＡＭ０９８１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）及び１：３０００希釈ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ，カタログ番号１１０８９１５３００１）の混合物を１時間添加した。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを室温で３０分間、新たに調製したＡＢＴＳ試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ、緩衝液＃２０４ ５３０ ００１、タブレット＃１１ １１２ ４２２ ００１）で顕色させる。吸光度を４０５ｎｍで測定し、ＩＣ５０を決定した。
【０１１９】
ＸＭａｂ１、ヒトＡＮＧ２に及びヒトＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体（ＷＯ２０１１／１１７３２９及び配列番号１１−１４の配列を参照）は、１２ｎＭのＩＣ５０でＴｉｅ−２へのＡＮＧ−２の結合の阻害（ＡＮＧ２／Ｔｉｅ２の受容体相互作用の阻害）を示した。
【０１２０】
実施例２
アゴニスト性ＣＤ４０抗体と組み合わせた抗ＡＮＧ２抗体のインビボ抗腫瘍効果（がんの進行（腫瘍増殖）の遅延及び治療された患者の生存期間の延長）
方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５００．０００の同系ＭＣ３８腫瘍細胞が皮下注射され、腫瘍が４０−６０ｍｍ３の大きさに達した１６日目から開始して治療された。
【０１２１】
腫瘍が１５００ｍｍ３（エンドポイント）のサイズに達したとき、マウスを獣医の規制に従って安楽死させた。抗ＡＮＧ２抗体として、＜ＡＮＧ−２＞Ａｎｇ２ｉ＿ＬＣ０６のＶＨ及びＶＬ（配列番号３−４）に基づいた単一特異性ＩｇＧ１抗体が使用された。ベバシズマブがマウス交差反応性でないため、マウス交差反応性の代替として、＜ＶＥＧＦ＞Ｂ２０−４．１のＶＨ及びＶＬ（配列番号１７−１８）に基づいたＶＥＧＦ抗体が、＜ＶＥＧＦ＞ベバシズマブのＶＨ及びＶＬ（配列番号９−１０）の代わりに使用された。これらの抗体は、単独で、又は組み合わせて使用された。同様の理由で、アゴニスト性ＣＤ４０抗体ＣＰ−８７０８９３（Ｕ．Ｓ．７，３３８，６６０の抗体２１．４．１）（配列番号５−６のＶＨ及びＶＬを参照）の代わりに、マウス交差反応性アゴニスト性ＣＤ４０抗体クローン１Ｃ１０（Santos-Argumedo L. et al., Cell Immunol. 156 (1994) 272-285, Heath AW et al. Eur J Immunol 24 (1994) 1828-34を参照；例えば、Ａｂｎｏｖａカタログ＃ＭＡＢ５６０７から入手可能）が、具体的にはマウスＩｇＧ１のフォーマット（マウスＩｇＧ１定常領域と組み合わせて、クローン１Ｃ１０の可変領域ＶＨ及びＶＬから生成可能であり又はロックフェラー大学から入手可能である）で使用された。比較のためにまた、単一特異性の抗ＶＥＧＦ抗体＜ＶＥＧＦ＞Ｂ２０−４．１（配列番号１７−１８）との組み合わせも検討された。しかし、トランスジェニックヒト化マウスを用いた同様の実験又は臨床試験を、作用機序に基づいて同様の結果を期待して、アゴニスト性ＣＤ４０抗体ＣＰ−８７０８９３（Ｕ．Ｓ．７，３３８，６６０の抗体２１．４．１）及び二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体ＸＭａｂ１（配列番号１１−１４）を使用して行うことができる。
【０１２２】
治療は、示された用量で、以下の以下のスケジュールに従って適用された。
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【０１２３】
結果
結果を図１に示す。グラフは３つの独立した実験からプールされたデータを表す。マウスは、図に示される抗体の組み合わせを用いて治療された。
【０１２４】
要約
我々のデータは、使用された全試薬は、独力でいくばくかの抗腫瘍活性を示すことを実証する。抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせた場合に、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体の組み合わせは僅かな効果を示すだけであったが、抗ＡＮＧ２抗体（単一特異性ＡＮＧ２抗体又は抗ＡＮＧ２／抗ＶＥＧＦ抗体の組み合わせの何れか）とアゴニスト性ＣＤ４０抗体との組み合わせは、腫瘍細胞の増殖、進行の遅延及び生存期間の延長に強い相乗効果を示した。最も強い効果は、アゴニスト性ＣＤ４０抗体と抗ＡＮＧ２／抗ＶＥＧＦ抗体の組み合わせとの組み合わせについて観察することができた。腫瘍を有するマウスの大部分は、抗Ａｎｇ−２及び抗ＣＤ４０の何れかと組み合わせた治療又は抗ＡＮＧ２／抗ＶＥＧＦ抗体（抗ＶＥＧＦ／Ａｎｇ−２）と抗ＣＤ４０との組み合わせにより治癒された。従って、これらの組み合わせは、癌患者のための実質的な治療的有用性を提供することができる。
【０１２５】
実施例３
皮下同系ＭＣ３８結腸癌モデルにおけるアゴニスト性ＣＤ４０抗体と組み合わせた抗ＡＮＧ２抗体（二重特異性）のインビボ抗腫瘍効果
マウス結腸直腸腺癌細胞株ＭＣ−３８の細胞（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手）は、５％ＣＯ２で水飽和大気中、３７℃で、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で培養された。接種の日に、ＭＣ３８腫瘍細胞を培養フラスコからＰＢＳで回収し、培養培地に移し、遠心分離し、一回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。細胞の注入のために、最終力価を１×１０７細胞／ｍｌに調整した。その後この懸濁液１００μｌ（１×１０６細胞）を６−１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスに皮下接種した。動物の群は、対照抗体（ＭＯＰＣ−２１（１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に週１回）及び／又は２Ａ３（１００μｇを腹腔内に１回）；Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ）により、及び抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＦＧＫ４５（アゴニストＣＤ４０ラット抗マウスＩｇＧ２ａ ｍＡｂ ＦＧＫ４５（S. P. Schoenberger, et al, Nature, 393, 480 (1998)、ＢｉｏＸｃｅｌｌから入手可能）ＣＤ４０クローンＦＧＫ．４５、１００μｇ、腹腔内、二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体の第一用量と同時に１回）と組み合わせた二重特異性抗ＡＮＧ２抗体により治療された。二重特異性は、ＡＮＧ２結合アームのための＜ＡＮＧ−２＞Ｅ６ＱのＶＨ及びＶＬ（配列番号１−２）に基づいた二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体であった。マウス交差反応性の代替ＶＥＧＦ結合アームとして、＜ＶＥＧＦ＞Ｂ２０−４．１のＶＨ及びＶＬ（配列番号１７−１８）が、＜ＶＥＧＦ＞ベバシズマブのＶＨ及びＶＬ（配列番号９−１０）の代わりに使用された。構造は、しかしながら、ＸＢ１と同じであった（ＶＨ／ＶＬｓ＜ＶＥＧＦ＞のみがＢ２０−４．１のマウス交差反応性のものと交換された）。
【０１２６】
腫瘍が確立され、単独療法については５０から８０ｍｍ３又は併用療法については２００ｍｍ３の平均サイズに達した後に、治療が開始された。腫瘍体積を週に２回測定し、動物の体重を並行してモニターした。結果を図７に示す。アゴニスト性ＣＤ４０ ｍＡｂとの二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体の組み合わせは、腫瘍は２１日目に退縮へと進み（ＴＧＩ＞１００％）、同系ＭＣ３８マウス腺癌モデルにおける単剤療法よりも改善された抗腫瘍効果を示した。３２日目では、１０匹の動物のうち５匹は無腫瘍であった。
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【０１２７】
実施例４
雌のＢａｌｂ／ｃマウスにおける同系ＣＴ２６ＷＴモデルにおけるＡｎｇ２／ＶＥＧＦ抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ；ＬＣ０６／Ｂ２０．４．１）及びＣＤ４０抗体（ＦＧＫ４．５；ｉＴＭＥ−０００４−０００５）単独又は組み合わせの抗腫瘍効果
【０１２８】
実験手順
試験薬剤
ＡＮＧ２結合アームのための＜ＡＮＧ−２＞Ｅ６ＱのＶＨ及びＶＬ（配列番号１−２）に基づいた二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体。マウス交差反応性の代替ＶＥＧＦ結合アームとして、＜ＶＥＧＦ＞Ｂ２０−４．１のＶＨ及びＶＬ（配列番号１７−１８）が、＜ＶＥＧＦ＞ベバシズマブのＶＨ及びＶＬ（配列番号９−１０）の代わりに使用された。構造は、しかしながら、ＸＢ１と同じであった（ＶＨ／ＶＬｓ＜ＶＥＧＦ＞のみがＢ２０−４．１のマウス交差反応性のものと交換された）。二重特異性ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙで生成された。ＣＤ４０抗体（ＦＧＫ４．５；ｉＴＭＥ−０００４−０００５）はＡｄｉｐｏｇｅｎ／Ｂｉｏｍｏｌから入手した。
【０１２９】
抗体緩衝液は、２０ｍＭのヒスチジン及び１４０ｍＭの塩化ナトリウム液（ｐＨ６．０）を含んでいた。抗体溶液は、投与前にストックから上記の緩衝液中に適切に希釈された。
【０１３０】
細胞株及び培養条件
マウスＣＴ２６ＷＴ細胞株を、５％ＣＯ２で水飽和大気中３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｕｓｔｒｉａ）及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０中でルーチン的に培養した。
【０１３１】
動物
到着時に６〜７週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入）は、コミットガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明／１２時間暗黒の日々のサイクルによる特定病原体を含まない条件下で維持された。実験研究プロトコールは見直され、地方政府によって承認された（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｏｂｅｒｂａｙｅｒｎ；登録番号５５．２−１−５４−２５３１．２−３２−１０）。到着後、新しい環境に慣れるため及び観察のために、動物を１週間動物施設で維持した。継続的な健康管理が定期的に実施された。ダイエット食品（Ａｌｔｒｏｍｉｎ）及び水（フィルター処理）は自由に与えられた。
【０１３２】
モニタリング
動物は、臨床症状や副作用の検出のために毎日管理された。モニタリングのため、実験を通して、動物の体重を毎週２回記録し、無作為化後に腫瘍体積をキャリパーで測定した。  
【０１３３】
動物の治療
動物の治療は、腫瘍細胞接種後１２日目に、約１３０ｍｍ３の腫瘍体積で無作為化の日に開始された。投薬後、投与の経路及び治療スケジュールが適用されている：
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【配列表】
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