(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ配列ライブラリーサンプルから標的ｃＤＮＡｓを選択的に減損させる方法であって：
その両者がＲＮＡから転写される標的ｃＤＮＡｓ及び非標的ｃＤＮＡｓを含むＲＮＡ配列ライブラリーサンプルを取得し、ここで標的ｃＤＮＡｓは、リボソームＲＮＡから転写されるｃＤＮＡｓを含み；
該サンプルから標的ｃＤＮＡｓを減損させるのに十分な様式下で、サンプルを標的ｃＤＮＡｓに特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼと接触させ、ここで、当該核酸誘導型ヌクレアーゼがＲＮＡガイド要素及びＣａｓヌクレアーゼ要素を含み、そして
サンプルから標的ｃＤＮＡを除去し、そしてそれにより前記標的ｃＤＮＡｓを減損させたＲＮＡ配列ライブラリーを生成すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記標的ｃＤＮＡｓが二本鎖核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ｃＤＮＡｓが一本鎖核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃａｓヌクレアーゼ要素が、切断活性を示し、そして前記方法が標的ｃＤＮＡの切断をもたらして、サンプルからの標的ｃＤＮＡを減損させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃａｓヌクレアーゼ要素が、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓ−タグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆタグ、ＧＳＴタグ、ＧＦＰタグ、ビオチン、ストレプトアビジン、及び６−Ｈｉｓタグからなる群から選ばれるタグをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、前記サンプルからから前記標的核酸を回収することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、前記サンプルを複数の２以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼと接触させることを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルをシーケンシングする工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡガイド要素が、ヒト５Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ、及び／又は２８ＳＲＮＡｓに標的化されたｓｇＲＮＡｓを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法（35 U.S.C.）第１１９条（ｅ）に準拠し、本出願は、２０１４年２月１３日に出願された米国仮特許第６１／９３９，６５８号の出願日及び２０１４年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／０４０，８０４号の出願日に対する優先権を主張するものであり；その開示を参照により本明細書中に援用する。
【背景技術】
【０００２】
序論
生物学的医学研究における適用‐例えば、アレイハイブリダイゼーション、ｑＰＣＲ又は大規模な並列配列決定による遺伝子発現解析、では、他の配列との複雑な混合物の状態で存在する核酸の特定のサブセットの分析を伴うことが多い。着目の核酸配列が既知である場合には、特異的プライマー配列を用いたＰＣＲが混合物から所望の配列を増幅するのに使用できる。しかしながら、場合によっては、恐らく配列情報が完全に分かっていない複数の異なった配列を分析することが望まれることもある。例えば、真核細胞系のメッセンジャーＲＮＡは、ポリＡテールに対するプライミングにより最初のｃＤＮＡ鎖合成を開始するためのオリゴｄＴプライマーを使用することで一括して増幅及び分析され、その結果、好ましくない核酸‐例えばリボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ及びゲノムＤＮＡによる夾雑を低減又は回避し得る。しかしながら、このアプローチのための要件はＲＮＡが完全であって、且つ、分解されていないこと、例えば、ポリＡテールがＲＮＡメッセージの本体から失われておらず、切断もされていないことである。残念ながら、多くのその他の有効且つ興味深い生物学的材料‐例えばホルマリン固定及びパラフィン包埋組織サンプル（ＦＦＰＥサンプル）として維持された生検材料などは、こういったサンプルとって実用的ではないオリゴｄＴプライミングをもたらすような分解に晒されることが多い。さらに、多くの興味深いＲＮＡ配列‐例えば、非コーディングＲＮＡや非真核生物のＲＮＡにはポリＡテールがない。こうした場合には、サンプル中のすべてのヌクレオチド種を全体的に増幅するのにランダムプライミングが使用できる。しかしながら、ランダムプライミングはまた、潜在的な好ましくない配列‐例えばゲノムＤＮＡ又はリボソームＲＮＡなどの増幅ももたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
核酸の初期収集物から標的核酸を減損させる（depleting）方法を提供する。該方法の態様には、初期収集物から標的核酸を減損させるのに十分な様式下で標的核酸に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼと初期収集物とを接触させることが含まれる。所定の適用によって、標的核酸の減損は、例えば減損させることが初期収集物中の標的核酸を切断すること、又は初期収集物から標的核酸を選択的に分離することを含み得る場合、核酸の初期収集物を変化させ得る。該方法の実施形態を実施するための組成物及びキットもまた提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、本開示の特定の実施形態における用途が見出された核酸誘導型ヌクレアーゼを図式的に例示する。
【図２】図２は、本開示の一実施形態により核酸ガイド要素の製造方法を図式的に例示する。
【図３】図３は、図２で図式的に例示した方法における用途が見出されたオリゴヌクレオチドの３つの例を示す。
【図４】図４は、ゲル電気泳動によって可視化された鋳型核酸の画像を示す。鋳型核酸は、本開示の一実施形態よるインビトロ転写による核酸ガイド要素の製造における用途が見出された。
【図５】図５は、ゲル電気泳動によって可視化された核酸の画像を示す。画像では、本開示の一実施形態による核酸誘導型ヌクレアーゼを使用した標的核酸の切断が実証されている。
【図６】図６は、ゲル電気泳動によって可視化された核酸の画像を示す。画像では、本開示の一実施形態による核酸誘導型ヌクレアーゼを使用した２つの異なった標的核酸の同時切断が実証されている。
【図７Ａ】図７は、本開示の一実施形態による核酸誘導型ヌクレアーゼを使用した次世代配列決定のための核酸ライブラリにおける標的核酸（この実施例では１８Ｓ ｒＲＮＡ）の減損を実証するデータを提供する。パネルＡは、核酸誘導型ヌクレアーゼの１又は２つの実施例を使用した標的核酸の減損量を示す棒グラフを示す。パネルＢは、本開示の一実施形態によるヌクレアーゼを増量して使用した際の標的核酸の減損量を示す。この実施例では、核酸誘導型ヌクレアーゼのプールが用いられ、そしてそこでは、該プールが単一型のヌクレアーゼ要素と異なったヌクレオチド配列を有する多様な種類の核酸ガイド要素を含んでいる。
【図７Ｂ】図７は、本開示の一実施形態による核酸誘導型ヌクレアーゼを使用した次世代配列決定のための核酸ライブラリにおける標的核酸（この実施例では１８Ｓ ｒＲＮＡ）の減損を実証するデータを提供する。パネルＡは、核酸誘導型ヌクレアーゼの１又は２つの実施例を使用した標的核酸の減損量を示す棒グラフを示す。パネルＢは、本開示の一実施形態によるヌクレアーゼを増量して使用した際の標的核酸の減損量を示す。この実施例では、核酸誘導型ヌクレアーゼのプールが用いられ、そしてそこでは、該プールが単一型のヌクレアーゼ要素と異なったヌクレオチド配列を有する多様な種類の核酸ガイド要素を含んでいる。
【図８】図８は、本開示の一実施形態による核酸誘導型ヌクレアーゼを使用した標的核酸の減損を実証するデータを提供する。この実施例では、核酸誘導型ヌクレアーゼのプールを用いられ、そしてそこでは、該プールが単一型のヌクレアーゼ要素と異なったヌクレオチド配列を有する多様な種類の核酸ガイド要素を含んでいる。
【図９】図９は、配列決定の結果を示し、且つ、本開示の一実施形態による方法を使用した配列ライブラリからの標的核酸を減損させる効果を実証する棒グラフである。
【図１０Ａ】図１０は、本開示の一実施形態による核酸誘導型ヌクレアーゼを使用した標的核酸の切断を実証するデータを提供する。パネルＡは、本開示の一実施形態による実施例のヌクレアーゼ要素の精製を実証するゲル画像を示す。パネルＢは、パネルＡに示したヌクレアーゼ要素を含んでいる核酸誘導型ヌクレアーゼを使用した標的核酸の切断を実証するゲル画像を示す。
【図１０Ｂ】図１０は、本開示の一実施形態による核酸誘導型ヌクレアーゼを使用した標的核酸の切断を実証するデータを提供する。パネルＡは、本開示の一実施形態による実施例のヌクレアーゼ要素の精製を実証するゲル画像を示す。パネルＢは、パネルＡに示したヌクレアーゼ要素を含んでいる核酸誘導型ヌクレアーゼを使用した標的核酸の切断を実証するゲル画像を示す。
【図１１】図１１は、本開示の一実施形態による核酸誘導型ヌクレアーゼを様々な量で使用した標的核酸の切断を実証するゲル画像を示す。
【図１２Ａ】図１２は、Ｃａｓ９の６ｘＨＮタグ付与Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ突然変異体の発現及び精製を実証するデータ（パネルＡ）、並びに核酸の初期収集物から標的核酸を取り出し、標的核酸が濃縮された核酸サンプルを製造するために核酸ガイド要素のプールと組み合わせた該突然変異体の使用の原理証明（パネルＢ）を提供する。
【図１２Ｂ】図１２は、Ｃａｓ９の６ｘＨＮタグ付与Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ突然変異体の発現及び精製を実証するデータ（パネルＡ）、並びに核酸の初期収集物から標的核酸を取り出し、標的核酸が濃縮された核酸サンプルを製造するために核酸ガイド要素のプールと組み合わせた該突然変異体の使用の原理証明（パネルＢ）を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
詳細な説明
核酸の初期収集物から標的核酸を減損させる（depleting）方法を提供する。該方法の態様には、初期収集物から標的核酸を減損させるのに十分な様式下で標的核酸に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼと初期収集物とを接触させることが含まれる。所定の適用によって、標的核酸の減損は、例えば減損させることが初期収集物中の標的核酸を切断すること、又は初期収集物から標的核酸を選択的に分離することを含み得る場合、核酸の初期収集物を変化させ得る。該方法の実施形態を実施するための組成物及びキットもまた提供する。
【０００６】
本開示の方法及びキットを更に詳細に説明する前に、本方法及びキットは、言うまでも無くそれ自体が変わり得るように、説明された特定の実施形態に限定されないことを理解すべきである。更に、本方法及びキットの範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用されている用語は単に特定の実施形態を説明するために用いられており、限定することを意図していないことを理解すべきである。
【０００７】
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限及び下限の間の、文脈が別段に明示しない限りは下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値が本方法及びキットの範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限度を条件として本方法及びキットの範囲内に更に包含される。記載された範囲が限度のうちの一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限度の一方又は両方を除外した範囲も本方法及びキットに更に包含される。
【０００８】
ある範囲は、本明細書では用語「約」から始まる数値と共に示されている。用語「約」は、本明細書では「約」から始まる正確な数、及び「約」から始まる数に近い数又は「約」から始まる数に近似した数のための文字通りのサポートを提供するために用いられている。数が具体的に述べられた数に近いか否か又は近似しているか否かを判断する際に、述べられていない近い数又は近似した数は、その数が示されている文脈では、具体的に述べられた数に略相当する数であってもよい。
【０００９】
特に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、本方法が属する技術分野の当業者によって共通して理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等である全ての方法及びキットを、本方法及びキットの実施又は試験に更に使用することができるが、代表的な実例となる方法及び材料を本明細書に記載している。
【００１０】
本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が、具体的に且つ個別に参照によって組み込まれると示されているかのように参照によって本明細書に組み込まれ、刊行物の引用に関連する方法、キット及び／又は材料を開示して記載すべく、参照によって本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであって、先行発明を理由として、本方法及びキットがそのような刊行物に先行する権限がないことを認めるものであるとみなされるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認する必要があるかもしれない。
【００１１】
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」が、本明細書及び添付の特許請求の範囲に用いられている場合、文脈が別段に明示しない限り、複数の指示対象を含むことを留意すべきである。更に、特許請求の範囲がいかなる選択的な要素も排除して記載されていることを留意すべきである。従って、この記述は、請求項の要素の記載に関する「唯一の（solely）」、「のみの（only）」等の排他的用語の使用、又は「否定的な（negative）」限定の使用のための先行記載として機能すべく意図される。
【００１２】
明瞭化のために別々の実施形態の内容に述べられている本方法及びキットの特徴が、１つの実施形態に組み合わせて提供されてもよいことが認識される。逆に、簡潔さのために１つの実施形態の内容に述べられている本方法及びキットの様々な特徴が、別々に又はあらゆる適切な下位の組み合わせで更に提供されてもよい。本実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含されており、各々の及びあらゆる組み合わせが個別に且つ明示的に開示されているかのように、このような組み合わせが操作可能な工程及び／又はデバイス／システム／キットを包含する範囲まで本明細書に開示されている。更に、このような可変性について述べている実施形態に記載されている全ての下位の組み合わせも、本方法及びキットによって具体的に包含されており、各々の及びあらゆるこのような下位の組み合わせが個別に且つ明示的に本明細書に開示されているかのように、本明細書に開示されている。
【００１３】
当業者が本開示を読むと明らかであるように、本明細書に説明され例示された個々の実施形態はそれぞれ、別々の構成要素及び特徴を有しており、別々の構成要素及び特徴は、本方法及びキットの範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の複数の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されてもよく、又はいずれかの特徴と容易に組み合わされてもよい。全ての記載された方法は、記載された事象の順序でも、又は論理的に可能な任意の他の順序でも実行され得る。
【００１４】
本発明の実施形態をさらに説明する際に、まず、対象方法の実施形態の態様がより詳細に説明される。その後、対象方法を実施するためのキットの実施形態の態様がより詳細に説明される。
【００１５】
方法
本発明の態様は、核酸の初期収集物から標的核酸を選択的に減損させる方法を含んでいる。標的核酸を「減損させる」こととは、核酸の初期収集物中の標的核酸の量を低減することを意味する。例えば、（単数若しくは複数の）ヌクレアーゼ要素がヌクレアーゼ活性を有する１若しくは複数の核酸誘導型ヌクレアーゼによる標的核酸内の１若しくは複数の位置での標的核酸の切断によって、標的核酸が減損され得る。そして、初期収集物中に存在する非減損核酸が、核酸増幅、核酸配列決定、遺伝子発現分析（例えば、アレイハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ‐ＰＣＲ、大規模並列配列決定などによる）、又は着目のその他の下流適用などの着目の下流適用に使用され得る。
或いは、標的核酸は、標的核酸の除去（及び適宜、回収）によって核酸の初期収集物から減損され得る。以下でより詳細に説明されるとおり、特定の態様において、初期収集物からの標的核酸の除去は、切断欠損性ヌクレアーゼを含めた核酸誘導型ヌクレアーゼを使用して作用され、そしてそのヌクレアーゼは、核酸の初期収集物からのヌクレアーゼ（従って、該ヌクレアーゼに結合する標的核酸）の除去を容易にする異種要素（例えば、タグ）を含んでいてもよい。初期収集物から標的核酸を取り出すか又は回収することによって、標的配列が濃縮された次の核酸収集物を得ることができる。そして、この濃縮サンプル（例えば、エキソーム濃縮サンプル、着目の遺伝子パネルを濃縮したサンプルなど）は、例えば核酸増幅、核酸配列決定、遺伝子発現分析（例えば、アレイハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ‐ＰＣＲ、大規模並列配列決定などによる）又は着目のその他の下流適用などの着目の下流適用に使用されてもよい。
【００１６】
特定の実施形態によると、初期収集物中に存在する標的核酸の減損は、斯かる標的核酸の切断によって特定の種類の標的核酸を減損させること、並びに核酸の初期収集物からの斯かる標的核酸の除去（及び適宜、回収）によって特定の他の種類の標的核酸を減損させることを含んでいる。
標的核酸は異なっていてもよい。「核酸」とは、あらゆる長さ、例えば１０塩基以上、２０塩基以上、５０塩基以上、１００塩基以上、５００塩基以上、１０００塩基以上、２０００塩基以上、３０００塩基以上、４０００塩基以上、５０００塩基以上、１０，０００塩基以上、５０，０００塩基以上のヌクレオチド、例えばリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドで構成された高分子を意味している。場合によっては、核酸の長さは、１００，０００塩基以下、例えば７５，０００塩基以下、５０，０００塩基以下、例えば２５，０００塩基以下、例えば１０，０００塩基以下、５，０００塩基以下、２，０００塩基以下、１，０００塩基以下又は５００塩基以下などを含めた長さである。
【００１７】
初期収集物からの標的核酸の減損は、完全な排除でない場合には、収集物中の標的核酸の存在を部分的に低減する。場合によっては、核酸の初期収集物中の所定の標的核酸のコピー数は、５％以上、例えば１０％以上など、例えば２５％以上、５０％、７５％、９０％以上を含めた、標的核酸の存在が完全に排除される実施形態を含めたコピー数である。標的核酸の減損は、サンプル中の総核酸に関してサンプル中の標的核酸のパーセンテージを低減する。特定の態様において、標的核酸の減損後、サンプル中の標的核酸の初期量と比較した場合に標的核酸の残存パーセントは、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ以下、つまり０．５％、０．１％、０．０１％以下を含めた残存パーセントである。初期収集物中の標的核酸を減損させることによって、ある型の核酸（例えば、望ましい核酸）が収集物中で濃縮され得る。特定の実施形態によると、標的核酸が減損されたサンプル中では、ある型の核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／又は同様のもの）が、合計に対してサンプル中に残存する斯かる型の核酸のパーセンテージが５％以上、例えば１０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、つまり８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び９９．５％以上を含めたパーセンテージになるように、サンプル中で濃縮される。
【００１８】
核酸の初期収集物は核酸誘導型ヌクレアーゼと接触させられる。本明細書中に使用されるとき、「核酸誘導型ヌクレアーゼ」は、ヌクレアーゼ要素と核酸ガイド要素とを含んでいる集合体（例えば、複合体）である。核酸誘導型ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ／切断活性を有することができ、例えば標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡなど）の２つ以上の生成物への加水分解を触媒し、その結果、標的核酸を減損させる。所望であれば、（例えば残存する核酸収集物を精製するために）切断産物をサンプルから取り除いてもよい。特定の態様において、切断によって特定の標的核酸を減損することが望ましいとき、使用される異なった核酸誘導型ヌクレアーゼの数、及び／又は（単数若しくは複数の）核酸誘導型ヌクレアーゼによって切断される標的核酸の（単数若しくは複数の）位置は、標的核酸断片のすべて又はほとんどすべてが、例えばエタノール又はイソプロパノール沈殿、スピンカラム精製（例えば、Clontech Laboratories, Inc.（Mountain View, CA）製のNucleoSpin（登録商標）Clean Upカラムを使用）、Solid Phase Reversible Immobilization（ＳＰＲＩ）ビーズ、又は同様のものなどの核酸精製によって取り除かれるのに十分な小ささになるように選択され得る。ヌクレアーゼ要素がヌクレアーゼ活性を有するとき、該ヌクレアーゼは、標的核酸において二本鎖の破断を生じ得るか、又は該ヌクレアーゼは、二本鎖標的核酸の一本鎖に破断を導入するヌクレアーゼであり得る（例えば、該ヌクレアーゼ要素はニッカーゼであってもよい）。
【００１９】
特定の態様において、ヌクレアーゼは、修飾の結果としてヌクレアーゼ活性を有していない（例えば、切断欠損性である）改変ヌクレアーゼである。斯かるヌクレアーゼは、核酸誘導型ヌクレアーゼと標的核酸との間で形成された複合体で存在する標的核酸の除去の時点で、核酸の初期収集物から標的核酸を減損させるために用いられ得、そして該減損は、特定の態様において、ヌクレアーゼ上に提供されたタグ（例えば、エピトープタグ）によって容易になる。
【００２０】
任意の好適なヌクレアーゼ要素が、対象方法の実施者によって利用され得る。ヌクレアーゼ要素は、ヌクレアーゼ活性を呈する野生型酵素であっても、又はそのヌクレアーゼ活性を維持している改変バリアントであってもよい。他の態様において、ヌクレアーゼ要素は、異種ヌクレアーゼ（又は「切断」）ドメインに作動可能に連結された非ヌクレアーゼタンパク質であってもよく、ヌクレアーゼドメインに連結することによって、該タンパク質が標的核酸を切断することができるようなものである。好適な切断ドメインは公知であり、例えばＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインが含まれる。例えば、特定の態様において、核酸誘導型ヌクレアーゼのヌクレアーゼ要素は、Ｃａｓ９（例えば、野生型Ｃａｓ９又は切断欠損性Ｃａｓ９）又は例えばＦｏｋＩ切断ドメインなどの切断ドメインに作動可能に連結された他のヌクレアーゼであってもよい。特定の実施形態によると、ヌクレアーゼは切断欠損性である突然変異体‐例えばＳｐ，Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａ突然変異体、Ｃａｓ９ Ｈ８４０Ａ突然変異体、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ突然変異体（例えば、Sander & Joung (2014) Nature Biotechnology 32:347-355 doi:10.1038/nbt.2842を参照のこと）又はその他の好適な切断欠乏性突然変異体である。斯かるストラテジーは、遺伝子工学的目的のために、それぞれジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮｓを作り出すためのジンクフィンガー及び転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質によるヌクレアーゼ活性を付与するために首尾よく利用された（例えば、Kim et al. (1996) PNAS 93(3):1156-1160、並びに米国特許出願公開番号ＵＳ２００３／０２３２４１０、ＵＳ２００５／０２０８４８９、ＵＳ２００６／０１８８９８７、ＵＳ２００６／００６３２３１、及びＵＳ２０１１／０３０１０７３を参照のこと）。
【００２１】
特定の実施形態によると、ヌクレアーゼドメインはエンドヌクレアーゼに由来し得る。ヌクレアーゼ／切断ドメインがそれから誘導され得るエンドヌクレアーゼとしては、これだけに限定されるものではないが：Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）、アルゴノートヌクレアーゼ（例えば、Ｔｔｈ Ａｇｏ、哺乳類のＡｇｏ２など）、Ｓ１ヌクレアーゼ；インゲンマメヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ；ホーミングエンドヌクレアーゼ；などが挙げられる；例えばMishra（Nucleases: Molecular Biology and Applications (2002) ISBN-10: 0471394610）もまた参照のこと。特定の態様において、核酸誘導型ヌクレアーゼのヌクレアーゼ要素は、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）（又は任意の好適なそのバリアント）のＣａｓ９ヌクレアーゼであり、そしてそれは、分解のために標的ＲＮＡに対してｓｃａＲＮＡを使用する（Sampson et al. (2013) Nature 497:254-257を参照のこと）。
【００２２】
先に記載したように、特定の実施形態によると、核酸誘導型ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ関連（又は「Ｃａｓ」）ヌクレアーゼを含んでいる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは真核生物のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に類似した古細菌及び多くの細菌のＲＮＡ媒介ゲノム防御経路である。該経路は、２つの進化的に（そして多くの場合、物理的に）連結された座位：ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）座位（システムのＲＮＡ要素をコードする）とＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）座位（タンパク質をコードする）から作り出される。
【００２３】
全てがＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を包含している３つのタイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが存在する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、４つの逐次ステップで標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断をおこなう。第１ステップで、２つの非コーディングＲＮＡ（プレｃｒＲＮＡアレイ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）がＣＲＩＳＰＲ座位から転写される。第２ステップで、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、個々のスペーサ配列を含む成熟ｃｒＲＮＡへのプレｃｒＲＮＡのプロセッシングを媒介する。第３ステップで、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡ上のスペーサと、標的認識のための追加要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソンークリック塩基対合を介してＣａｓ９を標的ＤＮＡに向かわせる。最終ステップで、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内での二本鎖破断を作成する。
【００２４】
Ｉ及びＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムはともに、ｃｒＲＮＡへと完全にプロセッシングされると、ｃｒＲＮＡに相補的な核酸を切断できるマルチＣａｓタンパク質複合体を構築するプレｃｒＲＮＡがプロセッシングされたＣａｓエンドヌクレアーゼを有している。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、プレｃｒＲＮＡ内の繰返し配列に相補的な転写活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）がＣａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖特異的ＲＮアーゼＩＩＩによる処理を引き起こす機構によって、ｃｒＲＮＡが作り出される。そして、Ｃａｓ９が、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合、及びＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列とも呼ばれるｃｒＲＮＡ内の短いモチーフの存在に依存した様式により、成熟ｃｒＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡを切断することができる。
ｃｒＲＮＡ‐ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の要件は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって通常形成されたヘアピンを含む「単独ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）を形成するためにｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの遺伝子操作された融合の使用によって回避できる。例えば、Jinek et al. (2012) Science 337:816-821；Mali et al. (2013) Science 339:823-826；及びJiang et al. (2013) Nature Biotechnology 31:233-239を参照のこと。
【００２５】
ｓｇＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓ結合ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間で形成されるとき、標的ＤＮＡを切断するようにＣａｓ９を誘導する。Ｃａｓ９タンパク質とＰＡＭ配列を含んでいる遺伝子操作ｓｇＲＮＡを含むこのシステムは、ＺＦＮｓやＴＡＬＥＮｓと同様の編集効率を有するＲＮＡ誘導ゲノム編集のために使用された。例えば、Hwang et al. (2013) Nature Biotechnology 31 (3):227を参照のこと。
特定の実施形態によると、核酸誘導型ヌクレアーゼのヌクレアーゼ要素は、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。Ｃａｓタンパク質の制限されることのない例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、その相同体、又はその改変バージョンが挙げられる。特定の態様において、核酸誘導型ヌクレアーゼのヌクレアーゼ要素はＣａｓ９である。Ｃａｓ９は、これだけに限定されるものではないが、ＮＧＧのＰＡＭ配列を有するストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（「ｓｐＣａｓ９」、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９９ＺＷ２）、ＮＮＮＮＧＡＴＴのＰＡＭ配列を有するネイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）（「ｎｍＣａｓ９」、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｃ６Ｓ５９３）、ＮＮＡＧＡＡのＰＡＭ配列を有するストレプトコッカス・サーモフィルス（streptococcus thermophilus）（「ｓｔＣａｓ９」、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５Ｍ５４２）、及びＮＡＡＡＡＣのＰＡＭ配列を有するトレポネーマ・デンティコルス（Treponema denticols）（「ｔｄＣａｓ９」、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｍ２Ｂ９Ｕ０）を含めた着目の任意の生物体由来であってよい。ｓｇＲＮＡガイド要素が汎用の標的核酸の相補的領域と整列されている、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡガイド要素を含んでいる核酸誘導型ヌクレアーゼの例が図１で図式的に例示されている。
【００２６】
特定の態様において、核酸誘導型ヌクレアーゼのヌクレアーゼ要素はアルゴノート（Ａｇｏ）ヌクレアーゼである。Ａｇｏタンパク質はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）プラットフォーム及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）機能及びビオゲネシスに主要な進化的に保存されたタンパク質のファミリーである。それらは低分子ＲＮＡ介在性遺伝子調節機序に必要とされるＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の中心的な要素として最もよく知られている。転写後遺伝子サイレンシングでは、低分子ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡなど）によって誘導されたＡｇｏが、塩基対合を介して相補的な転写産物に結合し、そして、タンパク質を動員して遺伝子サイレンシングを容易にするためのプラットフォームとしての役割を果たす。
哺乳動物は８つのアルゴノートタンパク質を有し、そしてそれは、２つのサブファミリー：Ｐｉｗｉクレード及びＡｇｏクレードに分類される。野生型Ａｇｏタンパク質（Ａｇｏ１‐４、又はＥＩＦ２Ｃ１‐４）では、Ａｇｏ２だけがエンドヌクレアーゼ活性を持っている。完全長ヒトＡｇｏ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＫＶ８）の結晶構造が解明された。例えば、Elkayam et al. (2012) Cell 150(1):100-110を参照のこと。細菌の対応物と同様に、ヒトＡｇｏ２は、Ｎ末端（Ｎ）、ＰＡＺ、ＭＩＤ、及びＰＩＷＩドメインを含む二小葉性構造物である。ＰＡＺドメインは、低分子ＲＮＡの３’末端を固定し、Ａｇｏ２の触媒能のために不必要である。しかしながら、ＰＡＺ領域欠失は、非接触Ａｇｏｓが低分子ＲＮＡ二本鎖をほどき、機能性ＲＩＳＣを形成する能力を妨害する。
【００２７】
核酸誘導型ヌクレアーゼのヌクレアーゼ要素がＡｇｏヌクレアーゼであるときに、該ヌクレアーゼは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、又はＤＮＡ‐ＲＮＡ二本鎖を切断するＡｇｏヌクレアーゼであり得る。Ａｇｏヌクレアーゼは、原核生物又は真核生物などの任意の好適な生物体由来であり得る。特定の態様において、Ａｇｏは原核生物のＡｇｏである。着目のＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ａｇｏとしては、これだけに限定されるものではないが、Wang et al. (2008) Nature 456(7224):921-926；及びWang et al. (2009) Nature 461(7265):754-761に記載のＴｔｈ Ａｇｏヌクレアーゼなどのサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophiles）Ａｇｏ（「Ｔｔｈ Ａｇｏ」）が挙げられる。Ｔｔｈ Ａｇｏ及び長さが１３〜２５ヌクレオチドのリン酸化ＤＮＡガイドを使用したインビボにおけるＤＮＡ誘導性ＤＮＡ干渉は、Swarts et al. (2014) Nature 507:258-261によって最近記載された。
【００２８】
核酸誘導型ヌクレアーゼは、（例えば、標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡなど）の加水分解に触媒する）ヌクレアーゼ活性を有するヌクレアーゼを含んでも、又は修飾の結果としてヌクレアーゼ活性を有しない（例えば、切断欠損性である）改変ヌクレアーゼであってもよい。場合によっては、ヌクレアーゼ要素（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ要素）は切断欠損性突然変異体であり、そして、方法は標的核酸／核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体を含む生成物組成物の製造をもたらす。得られた複合体の一部であるときに、標的核酸は核酸の収集物中に含まれておらず、そのため核酸の初期収集物から減損された。他の態様において、複合体のヌクレアーゼ要素は切断適格性ヌクレアーゼであるが、核酸誘導型ヌクレアーゼは、標的核酸の切断に続く標的核酸の断片への結合を維持する。場合によっては、該方法はさらに、生成物組成物の他の構成要素と（例えば、Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９突然変異体、Ｈ８４０Ａ Ｃａｓ９突然変異体、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｃａｓ９突然変異体、及び／又は同様のものなどの切断適格性ヌクレアーゼ要素及び／又は切断欠損性ヌクレアーゼ要素を含んでいる）標的核酸／核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体を分離すること（例えば、取り出すこと）を含む。所望である場合、ヌクレアーゼ要素は、初期収集物の他の要素からの（例えば、アフィニティー精製による）複合体の分離を容易にするために、例えばタグ、例えば、エピトープタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓ‐タグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆタグ、ＧＳＴタグ、ＧＦＰタグ、ビオチン、ストレプトアビジン、６‐Ｈｉｓタグなどを含んでもよい。
【００２９】
特定の実施形態によると、該方法が標的核酸／核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体の形成を伴うとき、その方法はさらに、複合体から標的核酸を回収することを含む。標的核酸を回収するためのあらゆる好適なストラテジーが利用できる。斯かるストラテジーは、組成物の他の構成要素から複合体を分離し、次に、核酸誘導性ヌクレアーゼから標的核酸を分離することを含み得る。特定の態様において、核酸誘導型ヌクレアーゼのヌクレアーゼ要素は、タグ（例えば、エピトープタグ）を含み、そして、複合体はアフィニティー精製によって他の構成要素から分離され得る。例えば、複合体は、タグ（例えば、タグに結合する抗体又は他の好適な結合パートナー）の結合パートナーを含んでいる固相（例えば、カラム、プレート、ビーズ（例えば、アガロース又は磁性ビーズ）、及び／又は同様のもの）の表面に固定され、次に、組成物のすべての残留構成要素を取り除くために洗浄され得る。次に、標的核酸は、標的核酸と核酸誘導性ヌクレアーゼとの相互作用を妨害するために、好適な溶出バッファー（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのタンパク質変性剤を含んでいるバッファー）を使用して、ヌクレアーゼ要素を消化する試薬（例えば、プロテイナーゼＫ）を含んでいるバッファーを使用して、熱変質を使用して、及び／又は同様のものを使用して核酸誘導型ヌクレアーゼから回収され得る。タンパク質複合体からの核酸のアフィニティー精製及び回収のためのアプローチは、例えば、Methods for Affinity-Based Separations of Enzymes and Proteins (Munishwar Nath Gupta, ed., Birkhauser Verlag, Basel-Boston-Berlin, 2002)；Chromatin Immunoprecipitation Assays: Methods and Protocols (Collas, ed., 2009)；及びThe Protein Protocols Handbook (Walker, ed., 2002)に記載されている。所望であれば、分離された標的核酸は、アルコール沈殿、カラム精製、又はその他の簡便な核酸精製ストラテジーによってさらに精製されてもよい。
【００３０】
先にまとめられているとおり、特定の態様において、核酸誘導型ヌクレアーゼは核酸ガイド要素を含んでいる。ヌクレアーゼ要素を標的核酸に誘導できる任意の好適な核酸ガイド要素が利用され得る。核酸ガイド要素は、利用される特定のヌクレアーゼ要素にとって適切である場合には一本鎖であっても又は二本鎖であってもよい。
核酸ガイド要素は任意の好適な長さの１若しくは複数の核酸重合体であってもよい。特定の態様において、核酸ガイド要素は、長さが１０〜２００ヌクレオチド、例えば長さが１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、又は１０〜１５ヌクレオチドを含めた長さが１０〜１５０ヌクレオチドなどの核酸高分子（例えば、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ）である。
核酸ガイド要素の少なくとも一部は、着目の標的核酸の少なくとも一部に相補的（例えば１００％相補的又は１００％未満相補的）である。核酸ガイド要素のすべての配列又は一部の配列は、標的核酸にヌクレアーゼ要素を特異的に誘導するために着目の標的核酸に対して十分に相補的であるように、対象方法の実施者によって選択され得る。着目の標的核酸の核酸配列は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）、欧米分子生物学研究所の欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ‐ＥＢＩ）の核酸配列データベースなどのリソースから容易に入手可能である。一例として、着目の標的核酸がヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ（１．９ｋｂ）及び／又はヒト２８Ｓ ｒＲＮＡの一方又は両方であるとき、１８Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド配列は、それぞれＮＣＢＩ参照配列ＮＲ＿００３２８６．２及びＮＲ＿００３２８７．２のものが容易に入手可能である。
【００３１】
標的核酸が選択され、そして、標的核酸の入手可能な配列情報に基づき、該核酸ガイド要素のすべて又は一部が、例えばヌクレアーゼによって標的領域で切断して標的核酸を減損させるために、ハイブリダイゼーション条件下で標的核酸の標的領域へと核酸誘導性ヌクレアーゼを特異的に誘導するのに十分なほど標的領域に対して相補的であるように、核酸ガイド要素が設計され得る。
【００３２】
「ハイブリダイゼーション条件」は、核酸ガイド要素が特異的に標的核酸の標的領域にハイブリダイズする、標的核酸とヌクレアーゼ要素とが相互作用する、又はその両方の条件を含み得る。核酸ガイド要素が標的核酸にハイブリダイズするか否かは、核酸ガイド要素と標的核酸との間の相補性の程度と長さ、並びに標的核酸の標的領域に相補的である核酸ガイド要素の領域の融解温度（ＴＭ）によって知らされてもよい、ハイブリダイゼーション／接触が起こる温度といった因子によって決定される。融解温度は、核酸ガイド要素‐標的核酸の二本鎖の半分がハイブリダイズしたまま残存し、二本鎖の半分が一本鎖に解離する温度を指す。二本鎖のＴｍは、実験的に決定されてもよく、又は以下の式Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（画分Ｇ＋Ｃ）−（６０／Ｎ）｛ここで、Ｎは、鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は１Ｍ未満である｝を使用して予測されてもよい。Sambrook and Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y., Ch. 10)を参照のこと。様々なハイブリダイゼーション条件によって決まる核酸ガイド要素‐標的核酸の二本鎖のＴｍを予測するために、様々なパラメーターによって決まる他のより進化したモデルを使用してもよい。特異的な核酸ハイブリダイゼーションを達成するためのアプローチは、例えばTijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, chapter 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” Elsevier (1993)に見ることができる。
【００３３】
特定の実施形態によると、核酸ガイド要素はＲＮＡガイド要素（又は「ガイドＲＮＡ」）である。ＲＮＡガイド要素は１若しくは複数のＲＮＡ分子を含み得る。例えば、ＲＮＡガイド要素は、ヌクレアーゼ要素（例えば、Ｃａｓ９）を標的核酸に誘導する二本鎖を形成する２つの別々に転写されるＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。他の態様において、ＲＮＡガイド要素は単一のＲＮＡ分子であって、そしてそれは、野生型の単一のガイドＲＮＡに相当し得るか、又はその代わりに、遺伝子操作された単一のガイドＲＮＡであってもよい。特定の実施形態によると、核酸ガイド要素は、単一のガイドＲＮＡがヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を標的核酸に誘導できるｔｒａｃｒＲＮＡ部分に融合したｃｒＲＮＡ部分を含んでいる遺伝子操作された単一のガイドＲＮＡである。
【００３４】
特定の態様において、核酸ガイド要素はＤＮＡガイド要素、例えば、一本鎖又は二本鎖ガイドＤＮＡである。特定の実施形態によると、ガイドＤＮＡは一端又は両方の末端でリン酸化されている。例えば、ガイドＤＮＡは、任意の好適な長さ（例えば、１０〜３０ヌクレオチドの長さを含めた先に記載した任意の長さ）の５’リン酸化ガイドＤＮＡオリゴヌクレオチドであり得る。本発明者らは、斯かるリン酸化ガイドＤＮＡオリゴヌクレオチド及びＴｔｈ Ａｇｏを含んでいる誘導型ヌクレアーゼが、ガイドＤＮＡオリゴヌクレオチドと着目の標的核酸との間の相補性に基づいて、核酸の初期収集物から着目の標的核酸を効率的に減損させることを実証した（例えば、本明細書中の実施例の項を参照のこと）。
先にまとめたように、本開示の方法は、核酸の初期収集物を着目の標的核酸に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼと、該初期収集物から標的核酸を減損させるのに十分な様式下で接触させることを含む。特定の態様において、核酸の初期収集物の核酸誘導型ヌクレアーゼとの接触は、反応混合物中で核酸の初期収集物、核酸ガイド要素、及びヌクレアーゼ要素を組み合わせることを含む。核酸ガイド要素とヌクレアーゼ要素は、反応混合物に加えられる前に（例えば、複合体として）安定して結合し得るか、又はこれらの要素は、その後の互いの結合そして、標的核酸の標的化／減損のために別々に加えられ得る。特定の態様において、接触ステップの少なくとも一部は、ヌクレアーゼ要素が活性であって標的核酸を切断できる条件下で起こる。
【００３５】
核酸の初期収集物を核酸誘導型ヌクレアーゼと接触させる条件は異なっていてもよい。例えば、条件としては、核酸ガイド要素が標的核酸に特異的にハイブリダイズする温度、例えば０℃〜１０℃（例えば、４℃）、１０℃〜２０℃（例えば、１６℃）、２０℃〜３０℃（例えば、２５℃）、３０℃〜４０℃（例えば、３７℃）、４０℃〜５０℃、５０℃〜６０℃、６０℃〜７０℃、又は７０℃〜８０℃を挙げることができる。核酸ガイド要素と標的核酸との間の特異的なハイブリダイゼーションを達成するための因子及びアプローチを本明細書中で先に記載した。特定の態様において、核酸の初期収集物の核酸は、標的核酸への核酸ガイド要素のハイブリダイゼーションを容易にするために、接触ステップの前に一本鎖核酸を生じるように変性（例えば、熱変性）される。
ヌクレアーゼ要素が標的核酸を切断する実施形態によると、接触条件は、利用した特定のヌクレアーゼが活性、例えばヌクレアーゼ活性を持っている温度を含み得る。斯かる温度は異なっていてもよいが、特定の態様において、０℃〜１０℃（例えば、４℃）、１０℃〜２０℃（例えば、１６℃）、２０℃〜３０℃（例えば、２５℃）、３０℃〜４０℃（例えば、３７℃）、４０℃〜５０℃、５０℃〜６０℃、６０℃〜７０℃、又は７０℃〜８０℃の温度を含み得る。
【００３６】
特定のヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性は１若しくは複数の補因子の存在に依存する。斯かるヌクレアーゼ要素が対象方法を実施するために用いられるとき、接触条件は、反応混合物に任意の必須補因子を提供することを含み得る。特定の態様において、（単数若しくは複数の）補因子は、例えばＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、及び／又は同様のものなどの１若しくは複数の二価陽イオンである。
反応混合物は、例えばヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性を呈する好適なｐＨにて接触が起こるのを保証するための１若しくは複数のバッファー（例えば、トリスバッファー、ＰＢＳバッファー、又は同様のもの）を含み得る。例えば、接触条件は、ｐＨ４．５〜８．５、例えば４．５〜５．５、５．５〜６．５、６．５〜７．５又は７．５〜８．５などの反応混合物のｐＨを含み得る。
接触ステップは、核酸の初期収集物、核酸ガイド要素、及びヌクレアーゼ要素の終濃度が標的核酸を減損させるのに好適であるように実施され得る。例えば、核酸の初期収集物の終濃度は０．１ｐｇ／μｌ〜１０μｇ／μｌであり得、核酸ガイド要素の終濃度は２５ｐＭ〜５０μＭであり得、及びヌクレアーゼ要素の終濃度は２５ｐＭ〜５０μＭであり得る。
【００３７】
本発明の態様は、核酸誘導型ヌクレアーゼ、例えば、本明細書中の他の箇所に記載した任意の核酸誘導型ヌクレアーゼを製造する方法を含み得る。核酸誘導型ヌクレアーゼを製造するためのアプローチは異なっていてもよい。特定の態様において、該方法は、同じ又は異なった発現プラスミドから核酸ガイド要素及びヌクレアーゼ要素を発現することを含み得る。プラスミド、並びに核酸ガイド要素及び／又はヌクレアーゼ要素を発現するための関連プロトコールは市販されており、そして、例えばＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼベクター（Life Technologies, Carlsbad, CA）を含む。
【００３８】
特定の実施形態によると、本開示は、着目の標的核酸に特異的な核酸ガイド要素を製造するためのＰＣＲベースの方法を提供する。斯かる方法の一実施形態が図２で図式的に例示される。示したように、使用者は、着目のプロモーター（例えば、Ｔ７、Ｕ６、Ｔ３又は他のプロモーター）配列に相補的な配列；着目の標的核酸に相補的な（例えば、ｒＲＮＡから転写された標的ｃＤＮＡに特異的な）ｓｇＲＮＡガイド配列に相補的な配列；並びにｓｇＲＮＡ足場配列の少なくとも一部に相補的な配列：を含めたオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード「Ｆ」プライマーと明細書中で示される）を設計し得る。このフォワードプライマーは、ｓｇＲＮＡ足場配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（リバース「Ｒ」プライマーと本明細書中で示される）及びｓｇＲＮＡの製造のために有用なその他の配列（例えば、ポリｄＴ領域）に関連して使用され得る。これらのプライマー並びに足場及びその他の望ましい要素を含んでいる鋳型を使用したＰＣＲ増幅は、そこから特定のｓｇＲＮＡがインビトロ転写によって転写され得る、且つ例えば本開示の方法による標的核酸の選択的減損のためのヌクレアーゼに関連して利用される鋳型（「ｓｇＲＮＡのＤＮＡ鋳型」と図２で示される）を作り出す。例えば図２に示した実施形態により、インビトロ転写によってそこからｓｇＲＮＡを製造し得る鋳型の製造のためのフォワード（Ｔ７‐Ｔ１‐ＡｃＧＦＰ及びＴ７‐Ｔ２‐ＡｃＧＦＰ）及びリバース（Ｔ７‐Ｒｅｖ）オリゴヌクレオチドの例を図３に示す。破線の長方形で囲まれた配列はＴ７プロモーター配列である。下線を引いた配列は２０ｂｐのｃｒＲＮＡ配列である。ポリＡ配列は棒線の長方形で囲まれている。
【００３９】
核酸の初期収集物は異なっていてもよい。着目の核酸の初期収集物の例としては、二本鎖の核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ）の収集物、一本鎖の核酸（例えば、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ）の収集物、二本鎖核酸と一本鎖核酸の混合収集物などが挙げられる。初期収集物の複雑さも異なっていてもよいし、場合によっては、収集物は、５以上、１０以上、２５以上、５０以上、１００以上、２５０以上、５００以上、１０００以上、５，０００以上の異なった配列の異なった核酸、１０，０００、１００，０００以上、５００，０００以上、１００万以上、１億以上、又は１０億以上を含めた数の異なった配列の異なった核酸を含む。核酸の初期収集物はデオキシリボ核酸、リボ核酸、又はその混合物を含み得る。
特定の態様において、着目の核酸の初期収集物は、これだけに限定されるものではないが、単独の細胞、複数の細胞（例えば、培養細胞）、組織、臓器又は生物体、例えば細菌、酵母、又は生物体の収集物（例えばメタゲノムサンプル、例えば複数の生物体を含む海水、多くの異なった細菌種を含む糞便サンプル、頬側スワブなど）、或いは同様のものから単離された核酸サンプルを含めた、着目の核酸起源から単離された核酸（例えば、望ましくない及び所望の核酸）の収集物である。「サンプル」という用語は、本明細書中に使用される場合、当業者が（例えば、本明細書中の他の箇所に記載した切断又は除去により）初期収集物から減損させることを所望する核酸及び／又はタンパク質を含んでいる、典型的には、必須ではないが、液体の形態の、材料又は材料の混合物に関する。特定の態様において、核酸のサンプルは哺乳動物（例えば、ヒト、齧歯動物（例えば、マウス）又は着目のその他の哺乳動物）の細胞、組織、臓器、及び／又は同様のものから単離される。他の態様において、核酸のサンプルは、哺乳動物以外の起源、例えば細菌、酵母、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）、両生類（例えばカエル（例えばツメガエル（Xenopus）））、ウイルス、植物又はその他の非哺乳動物の核酸サンプル起源などからも単離される。特定の実施形態によると、着目の核酸の初期収集物はゲノムＤＮＡではない。
【００４０】
斯かる起源から核酸を単離するための任意の簡便なプロトコール、並びに斯かる起源から核酸を単離するために設計された試薬及びキットが利用され得る。例えば、着目の起源から核酸を単離するためのキット‐例えばClontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA)製のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）、ＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）及びＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ単離キット‐が市販されている。特定の態様において、核酸は、固定された生物学的サンプル、例えばホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から単離される。ＦＦＰＥ組織からの核酸は、市販キット‐例えばClontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA)製のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ又はＲＮＡ単離キットなど‐を使用して単離されてもよい。
特定の実施形態によると、着目の核酸の初期収集物は着目の核酸の前駆収集物から生じる。例えば、着目の核酸の初期収集物は、着目の核酸（例えば、ＲＮＡ）の前駆収集物から転写されたＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）の収集物であってもよい。特定の態様において、着目の核酸の初期収集物は、着目のＲＮＡの前駆収集物から転写されたｃＤＮＡの収集物であり、ここで、該着目のＲＮＡの前駆収集物は、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び／又は同様のものを含んでおり、そして、該減損されるべき標的核酸は、核酸の前駆収集物中に存在するｒＲＮＡから転写されたｃＤＮＡである。
【００４１】
着目のＲＮＡ前駆収集物からの着目のｃＤＮＡ収集物を作り出すことは、ポリメラーゼ媒介伸長反応が起こるのに好適な条件下で、着目のＲＮＡ前駆収集物を好適なポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、適切なｐＨを確保するバッファー要素、１若しくは複数の塩（例えば、ＫＣｌ）、１若しくは複数の金属補因子（例えば、Ｍｇ２＋又はＭｎ２＋）などを組み合わせることによって逆転写反応を実施することを含む。例えば１若しくは複数のヌクレアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮアーゼ阻害剤及び／又はＤＮアーゼ阻害剤）、ＧＣリッチ配列の増幅／複製を容易にするための１若しくは複数の添加剤（例えばＧＣ‐Ｍｅｌｔ(商標)試薬（Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA)）、ベタイン、一本鎖結合タンパク質（例えば、Ｔ４Ｇｅｎｅ３２、コールドショックタンパク質Ａ（ＣｓｐＡ）及び／又は同様のもの、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、１，２‐プロパンジオール又はその組み合わせ）、１若しくは複数の分子密集剤（例えば、ポリエチレングリコール又は同様のもの）、１若しくは複数の酵素安定化要素（例えば、１〜１０ｍＭ（例えば、５ｍＭ）の終濃度で存在するＤＴＴ）、及び／又はポリメラーゼ媒介伸長反応を容易にするのに有用なその他の反応混合物要素といった他の要素が含まれてもよい。
【００４２】
着目のＲＮＡの前駆収集物から着目のｃＤＮＡの収集物を作り出す際に用途が見出されたポリメラーゼとしては、これだけに限定されるものではないが、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、細菌逆転写酵素、グループＩＩイントロン由来の逆転写酵素、その突然変異体、バリアント、誘導体、又は機能的断片が挙げられる。例えば、逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）又はカイコガ逆転写酵素（例えばカイコガＲ２非ＬＴＲエレメント逆転写酵素）であってもよい。特定の態様において、ポリメラーゼは鋳型スイッチングができる。鋳型スイッチングポリメラーゼは、市販されており、Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA)から入手可能なＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ(商標)逆転写酵素及びＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ(商標)逆転写酵素が挙げられる。特定の態様において、２以上の別々のポリメラーゼの混合物が、例えば改善された処理能力、プルーフリーディング及び／又は同様のもののために反応混合物に加えられる。特定の態様において、ポリメラーゼ（例えば、ＭＭＬＶ ＲＴ又はカイコＲＴなどの逆転写酵素）は、５〜２５Ｕ／μＬ、例えば２０Ｕ／μＬを含めた０．１〜２００ユニット／μＬ（Ｕ／μＬ）、例えば０．５〜１００Ｕ／μＬなど、例えば１〜５０Ｕ／μＬなどの終濃度にて反応混合物中に存在する。
【００４３】
特定の態様において、例えば、着目の核酸の初期収集物の核酸サイズを制御するのが望ましいとき、着目の核酸の初期収集物は、着目の核酸の前駆収集物を剪断又は断片化することによって着目の核酸の前駆収集物から作製される。剪断／断片化ストラテジーとしては、これだけに限定されるものではないが、マイクロピペットのチップ又は細いゲージの針に着目の核酸の前駆収集物を１若しくは複数回通過させること、サンプルを霧状にすること、（例えば、Covaris, Inc. (Woburn, MA)製の集束超音波処理装置を使用して）サンプルを超音波処理すること、ビーズ媒介性剪断、（例えば、１若しくは複数のＤＮＡ又はＲＮＡ剪断酵素を使用した）酵素的剪断、例えば二価陽イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、及び／又はＺｎ２＋）を使用した、化学ベースの断片化、断片化バッファー（例えば、高ｐＨバッファー）、及び／又は加熱、或いはより短い着目の核酸の初期収集物を作り出すための着目の核酸の前駆収集物を剪断又は断片化するその他の好適なアプローチが挙げられる。特定の態様において、剪断／断片化によって作り出される着目の核酸の初期収集物は、例えば５０〜１０，０００ヌクレオチドの長さ、１００〜５０００ヌクレオチド、１５０〜２５００ヌクレオチド、２００〜１０００ヌクレオチド、例えば２５０〜５００ヌクレオチドの長さを持っている。
【００４４】
特定の実施形態によると、着目の核酸の初期収集物は、核酸の一方又は両方の末端に１若しくは複数の配列決定アダプター構築物を有する核酸（例えば、二本鎖ｃＤＮＡなどの二本鎖ＤＮＡ）を含んでいる。「配列決定プラットフォームアダプター構築物」とは、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）及び／又はＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）配列決定システム）；Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（登録商標）及び／又はＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（登録商標）配列決定システム）；Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩ配列決定システム）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定システム）；Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ＧＳ ＦＬＸ＋及び／又はＧＳジュニア配列決定システム）又は着目のその他の配列決定プラットフォームによって提供された配列決定プラットフォームなどの着目の配列決定プラットフォームによって利用される核酸ドメイン（例えば、配列決定プラットフォームアダプター核酸配列）又はその相補体の少なくとも一部を含んでいる核酸構築物を意味する。斯かる核酸の初期収集物は、例えば、配列決定プラットフォームを使用して核酸の初期収集物中に存在する（単数若しくは複数の）核酸の配列を決定することが望ましいときに、用途が見出された。
【００４５】
核酸（例えばｃＤＮＡ）の初期収集物が配列決定プラットフォームアダプター構築物を含んでいるとき、本開示の方法は、望ましい核酸の配列決定があとに続く、初期収集物中の標的核酸の１若しくは複数の小集団（例えば、ｒＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ若しくはその特定のサブタイプなどの望ましくない配列；又は初期収集物から除去によって減損され、望ましい核酸を濃縮したサンプルを製造するために回収される望ましい配列）の減損において用途を見出された。
配列決定されるべき核酸の両末端にてアダプター配列を利用する配列決定プラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）‐イオンＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）ベースのプラットフォーム）では、標的核酸（例えばｒＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ）における核酸誘導型ヌクレアーゼによる１つの切断事象が、シーケンサーに断片化標的核酸を見えなくしている。
【００４６】
特定の実施形態によると、配列決定プラットフォームアダプター構築物としては、以下から選択される核酸ドメイン：表面に取り付けられる配列決定プラットフォームオリゴヌクレオチド（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定システムにおいてフローセル表面に取り付けられるＰ５又はＰ７オリゴヌクレオチド）に特異的に結合するドメイン（例えば「捕捉部位」又は「捕捉配列」）；配列決定プライマー結合ドメイン（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのＲｅａｄ１又はＲｅａｄ２プライマーがそこに結合し得るドメイン）；バーコードドメイン（例えば、所定のサンプルからの分子ごとに特異的なバーコードを又は「タグ」を作製することによるサンプルの多重化を可能にするために配列決定される核酸のサンプル起源を一意的に同定するドメイン）；バーコード配列決定プライマー結合ドメイン（バーコードを配列決定するのに使用されるプライマーがそこに結合するドメイン）；独特なタグが配列決定される事例の数に基づいた発現レベルの決定のために着目の分子を一意的にマークするための分子同定ドメイン（例えば、４、６又は他の数のヌクレオチドの無作為タグなどの分子指標タグ）；任意の斯かるドメインの相補体；又はあらゆるそれらの組み合わせ、が挙げられる。特定の態様において、バーコードドメイン（例えば、サンプルインデックスタグ）及び分子同定ドメイン（例えば、分子指標タグ）は同じ核酸に含まれていてもよい。
【００４７】
場合によっては、対象方法は、核酸の初期収集物を複数（例えば、「プール」又は「ライブラリ」）の２以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼと接触させることを含む。核酸誘導型ヌクレアーゼは任意の所望の点において異なっていてもよい。例えば、該方法は、プールが単一型のヌクレアーゼ要素（例えば、ヌクレアーゼ活性を有していても或いは切断欠損性であってもよいヌクレアーゼ）及び異なったヌクレオチド配列を有する２種類以上の核酸ガイド要素を含んでいる核酸誘導型ヌクレアーゼのプールを利用してもよい。２種類以上の核酸ガイド要素は、得られた異なる核酸誘導型ヌクレアーゼが単一の標的核酸の複数の領域を標的とするように、複数の異なる標的核酸を標的とするように、複数の異なる標的核酸の複数の領域を標的とするように、などのように設計され得る。
或いは、又は加えて、複数の２以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼが、２以上の型のヌクレアーゼ要素を含んでいてもよい。例えば、該方法は、ヌクレアーゼの起源に関して互いに異なるヌクレアーゼ（例えば、異なる原核生物及び／又は真核生物種からのヌクレアーゼ）、ヌクレアーゼ活性に関して互いに異なるヌクレアーゼ（例えば、プール／ライブラリはヌクレアーゼ活性を有する１若しくは複数のヌクレアーゼ、切断欠損性である１若しくは複数のヌクレアーゼ、１若しくは複数のニッカーゼ、又はあらゆるそれらの組み合わせを含み得る）、ＰＡＭ配列（例えば、プール／ライブラリは異なるＰＡＭ配列を有するガイド核酸を利用するヌクレアーゼを含み得る）の任意の所望の組み合わせ、並びに初期収集物から１以上の標的核酸を減損させるのに好適なヌクレアーゼ要素の任意のその他の組み合わせから成るプール／ライブラリを利用してもよい。
【００４８】
先に記載のとおり、異なるヌクレアーゼ要素のプールは、所望の数の標的核酸の所望のレベルの減損を達成するために、異なる核酸ガイド要素のプールと組み合わせて使用されてもよい。減損は、初期収集物中に存在する標的核酸（例えば１若しくは複数のリボソーマル及び／又はミトコンドリアＲＮＡ）を切断すること、初期収集物から標的核酸を取り出すこと（例えば初期収集物から取り出された標的核酸が濃縮された核酸サンプルの製造）、又はその両方を含み得る。
このように、本開示の態様は、核酸の初期収集物から核酸（例えば、ｒＲＮＡ及び／又はｍｔＲＮＡ由来の核酸）の小集団を選択的に減損させる方法を含む。斯かる実施形態において、該方法は、核酸の初期収集物を該初期収集物から小集団を減損させるのに十分な様式下で核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリと接触させることを含んでよく、ここで、該ライブラリは、核酸の小集団の２以上の構成要素及び／又は単一の構成要素の複数の領域に特異的な２以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含んでいる。これらの実施形態において、ライブラリのサイズは異なっていてもよい。例えば、ライブラリは、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２５以上、１００以上、５００以上、１０００以上、１００００以上、５００００以上、１０００００以上、５０００００以上、又は１００万以上の異なる核酸誘導性ヌクレアーゼなどを含み得る。特定の態様において、ライブラリは、２以上、しかし１００万以下、５０００００以下、１０００００以下、５００００以下、１００００以下、１０００以下、５００以下、１００以下、２５以下、１０以下、５、４、又は３の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む。
【００４９】
本開示の態様はさらに、核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリを作製する方法を含む。斯かる方法は、図２に示し、先に記載したＰＣＲベースのアプローチを使用した複数の異なる核酸ガイド要素の製造を含み得る。特定の実施形態において、該方法は、複数の異なるガイド核酸を、核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリを製造するのに十分な様式下で１若しくは複数の異なるヌクレアーゼと組み合わせることを含む。ヌクレアーゼは異なっていてもよく、場合によっては、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）又はＡｇｏヌクレアーゼであり、そしてそれは独立に、切断活性を有していても、又は有していなくてもよい。製造したライブラリのサイズは、異なってもよく、場合により、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２５以上、１００以上、５００以上、１０００以上、１０，０００以上、５０，０００以上、１００，０００以上、５００，０００以上、又は１００万以上の異なる核酸誘導性ヌクレアーゼなどを含み得る。特定の態様において、製造したライブラリは、２以上、しかし１００万以下、５００，０００以下、１００，０００以下、５０，０００以下、１０，０００以下、１０００以下、５００以下、１００以下、２５以下、１０以下、５、４、又は３の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む。場合によっては、核酸ガイドは、別別々のｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、又はその機能エレメントを含んでいる要素、例えばｓｇＲＮＡ、を含んでいる。場合によっては、該方法は、例えば核酸ガイドをコードするプラスミドから核酸ガイドを発現することによって、又は先により詳細に記載した及び図２で示したものなどの、ＰＣＲ及びインビトロにおける転写によって、核酸ガイドを製造することを含む。特定の実施形態によると、核酸ガイドは、（例えば、標準的なオリゴヌクレオチド合成のように）固相合成法によって製造される。
【００５０】
場合によっては、製造したライブラリの核酸誘導型ヌクレアーゼはそれぞれ、核酸ガイド要素（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡガイド要素）及びヌクレアーゼ要素、例えばＣａｓヌクレアーゼ要素（Ｃａｓ９など）、アルゴノートヌクレアーゼ要素（例えば、Ｔｔｈ Ａｇｏ、Ａｇｏ２、又は同様のもの）を含んでいる。ヌクレアーゼ要素は、切断活性を呈していても又は切断欠損性突然変異体であってもよい。所望であれば、ヌクレアーゼ要素は先に記載したようなタグをさらに含んでもよい。
組成物もまた本開示によって提供される。特定の態様において、該組成物は、複数の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含んでいる。複数の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼは、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２５以上、１００以上、５００以上、１０００以上、１０，０００以上、５０，０００以上、１００，０００以上、５００，０００以上、又は１００万以上の異なる核酸誘導性ヌクレアーゼなどを含み得る。特定の態様において、複数の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼは、２以上、しかし１００万以下、５００，０００以下、１００，０００以下、５０，０００以下、１０，０００以下、１０００以下、５００以下、１００以下、２５以下、１０以下、５、４、又は３の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む。
【００５１】
特定の実施形態によると、異なる核酸誘導型ヌクレアーゼは以下の：該核酸誘導型ヌクレアーゼは異なるヌクレアーゼ要素を有すること、及び／又は核酸誘導型ヌクレアーゼは異なるヌクレオチド配列から成る核酸ガイド要素を有すること、に基づいて異なる。例えば、異なる核酸誘導型ヌクレアーゼは、同じ標的核酸の異なる領域に相補的な異なる配列を有するガイド要素に基づいて同じ標的核酸の異なる領域を標的とし得る、及び／又は異なる核酸誘導型ヌクレアーゼは、異なる標的核酸に相補的な異なる配列を有するガイド要素に基づいて異なる標的核酸、及び／又は標的配列のアレイを広げるような異なるＰＡＭ配列要件を有する異なる種類のヌクレアーゼ（例えば異なるＣａｓ９種）を標的とし得る。
【００５２】
対象の組成物はあらゆる適切な環境に存在してもよい。一実施形態によれば、組成物は、反応管（例えば0.2 mlの管、0.6 mlの管、1.5 mlの管など）又はウェルに存在する。ある態様では、組成物は、２以上（例えば複数）の反応管又はウェル（例えば、96ウェルプレートのようなプレート）に存在する。管及び／又はプレートはあらゆる適切な材料、例えばポリプロピレンなどから形成されてもよい。ある態様では、組成物が存在する管及び／又はプレートにより、（例えば、ヒートブロック、水槽、サーモサイクラ及び／又はその同様なものなどに置かれたとき）熱が組成物に効率的に伝達され、そのため、組成物の温度が、例えば特定の酵素反応が生じるために必要な短時間で変更され得る。特定の実施形態によれば、組成物は、壁が薄いポリプロピレン管、又は壁が薄いポリプロピレンウェルを有するプレートに存在する。特定の実施形態において、反応が固体表面又はビーズで生じることが便利であり、このような場合、ビオチン連鎖のような本技術分野で公知の方法によって、又は支持体上で進めることが可能な共有結合及び反応によって核酸の初期収集物又は（単数若しくは複数の）核酸誘導型ヌクレアーゼを固体支持体又はビーズに取り付けてもよい。
【００５３】
対象の組成物のための他の適切な環境として、例えばマイクロ流体チップ（例えば「ラブオンチップデバイス」）がある。組成物は、組成物の温度を所望の温度にすべく構成された機器、例えば温度制御された水槽、ヒートブロックなどに存在してもよい。組成物の温度を所望の温度にすべく構成された機器は、組成物の温度を一連の異なる所望の温度に夫々適切な時間で設定すべく構成されてもよい（例えば、機器はサーモサイクラであってもよい）。
【００５４】
減損の標的とされる核酸は、対象方法の実施者によって選択された任意の標的核酸である。一実施形態によると、標的核酸は初期ＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ又はｍｔＲＮＡ及びＲＮＡの逆転写生成物でないもの）である。特定の態様において、標的核酸は初期ＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ又はｍｔＲＮＡ）の逆転写産物（ＤＮＡ）である。ＲＮＡ（例えば、最初に転写されたＲＮＡ）は、これだけに限定されるものではないが、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ミトコンドリアＲＮＡ（ｍｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、長鎖型非コーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作動性低分子干渉ＲＮＡ（ｔａ‐ｓｉＲＮＡ）、天然型低分子干渉ＲＮＡ（ｎａｔ‐ｓｉＲＮＡ）、トランスファーメッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、低分子Ｃａｊａｌボディー特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、エンドリボヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、低分子テンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、シグナル認識ＲＮＡ、テロメアＲＮＡ、リボザイム、及びそのＲＮＡタイプ又はそのサブタイプの任意の組み合わせを含めた任意のタイプのＲＮＡ（又はそのサブタイプ）であり得る。標的核酸が初期ＲＮＡの転写産物であるとき、該方法は、サンプル中の斯かる転写産物のすべてのタイプ（例えば、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、マイクロＲＮＡなど）又は斯かる転写産物の１若しくは複数の特定のタイプを減損させることを含み得る。特定の態様において、標的核酸はリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）鋳型の転写産物である。斯かる場合のｒＲＮＡ鋳型は、真核生物の２８Ｓ、２６Ｓ、２５Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ ｒＲＮＡ又はそれらの任意の組み合わせであり得る。他の態様において、ｒＲＮＡ鋳型は、原核生物の２３Ｓ、１６Ｓ、５Ｓ ｒＲＮＡ又はそれらの任意の組み合わせであり得る。対象方法は、リボソームＲＮＡから生じたもの以外のＲＮＡ転写産物を減損させる際の用途が見出された。例えば、標的核酸はメッセンジャーＲＮＡの転写産物（ｍＲＮＡ）、例えば、高度に発現されているが、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡ（例えば、全体又はポリＡ＋血液ＲＮＡのサンプル中のグロブリンｍＲＮＡ）のプールとは臨床的に無関係なｍＲＮＡ、であり得る。ミトコンドリアＲＮＡ（ｍｔＲＮＡ）、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びそれらの任意の組み合わせを含めた他のタイプのＲＮＡ転写産物が減損の標的とされてもよい。標的転写産物は、例えば細菌ＲＮＡ又は酵母ＲＮＡなどの特定の生物体からのＲＮＡの生成物であってもよい。特定の実施形態によると、標的核酸はゲノムＤＮＡではない。
【００５５】
特定の態様において、標的分子は標的核酸であり、そして、初期収集物中に存在するイントロン又は遺伝子間ＤＮＡを切断することによって又はエクソン配列を直接捕捉することによってエクソンＤＮＡのサンプルを濃縮すること（例えば着目の種類のエキソームに対応する核酸のサンプルを濃縮すること）が所望されるとき、標的核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えばイントロン又は遺伝子間ＤＮＡである。特定の態様において、インビトロにおける転写に使用されるものなどのＤＮＡベースのプラスミド／ベクターは、新たに転写されたＲＮＡの核酸サンプルを濃縮するために、例えば、インビトロ転写反応の完了後の、切断による減損のための標的とされ得る。
本開示の方法を実施するとき、（単数若しくは複数の）核酸誘導型ヌクレアーゼは、特定の標的核酸の切断頻度及び得られる断片のサイズが対象方法の実施者によって選択されるように設計され得る。例えば、先に記載したように、標的核酸内の異なる配列を標的とする２以上の核酸誘導型ヌクレアーゼは、斯かる標的核酸が３以上の断片に切断されることが望ましいときに、多重様式下で使用され得る。標的核酸の標的配列は、所望のサイズの断片、例えば、スピンカラム、アルコール沈殿、及び／又は同様のものを使用してサンプルから取り除かれるほど十分に小さい断片、を生じるように選択され得る。
【００５６】
有用性
対象方法は、さまざまな異なる適用、例えば、着目のサンプルから無関係の及び／又は望ましくない分子を減損させるのが望ましい場合；その後の回収のためにサンプルから着目の核酸を取り出すことによって着目の核酸を減損させることが望ましい場合（その結果、着目の核酸が濃縮されたサンプルを製造する）；及び／又は同様のもの、における用途が見出された。無関係の及び／又は望ましくない分子を減損させるか、又は濃縮サンプルを製造するために望ましい分子を取り出すことによって、サンプルの複雑さが低減され、そしてサンプルは着目の分子が濃縮される。着目の分子が核酸であるときに、低減された複雑さと着目の核酸の濃縮は、核酸増幅、核酸配列決定、遺伝子発現分析（例えば、アレイハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ‐ＰＣＲ、大規模並列配列決定などによる）、着目の治療用核酸がその中に含まれている医薬組成物の調製、及び低減されたサンプルの複雑さと着目の核酸の濃縮が有益であるその他の適用などの下流適用を容易にし得る、及び／又はその結果を改善し得る。
【００５７】
例として、対象方法の特定の実施形態は、配列決定ライブラリから核酸を減損させることを含む。例えば、初期収集物は、着目の配列決定プラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）又はＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）ベースの配列決定プラットフォームなどの高速大量処理又は「次世代」配列決定プラットフォーム）で配列決定されるべき核酸の収集物であり得るが、該収集物はその収集物中の着目（例えば、研究又は臨床の着目）の核酸配列を得ることを複雑にする又は妨害する可能性がある無関係の又は望ましくない核酸を含んでいる。無関係の又は望ましくない核酸は、例えば、核酸誘導型ヌクレアーゼ媒介性切断、又は本開示の方法を使用した初期収集物からの斯かる配列の除去によって着目の配列が濃縮された配列決定サンプルを製造することによって、本開示の方法を使用して、低減又は排除され得る。
【００５８】
特定の態様において、標的核酸（例えば、ｒＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、又は同様のもの由来の核酸などの無関係の又は望ましくない核酸）の減損は、配列決定プラットフォームにとって標的核酸を見えなくする。すなわち、減損された（例えば、切断された）標的核酸は、着目の配列決定プラットフォームによる配列決定にとってもはや好適ではない。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）及びＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）ベースの配列決定プラットフォームは、核酸の各末端にアダプターを有している核酸を必要とする。特定の実施形態によると、核酸の初期収集物の核酸は、各末端に配列決定アダプターを含んでおり、ここで、標的核酸（例えばｒＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ）の選択的減損は、標的核酸を、そのいずれもがＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）又はＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）ベースの配列決定プラットフォームによる配列決定に必要とされる各末端の配列決定アダプターを含まない、少なくとも２つの断片に切断することを含む。このように、標的核酸は、配列決定プラットフォームにとって見えくなり、その結果、配列決定プラットフォームに対する「負荷」、及び配列決定結果の複雑さを低減する。
【００５９】
特定の態様において、着目の配列決定プラットフォームが核酸の一方の末端にアダプターを含んでいることを必要とするだけのとき、標的核酸は、例えば、得られた断片のすべて又は大部分の長さが配列決定プラットフォームで配列決定するには短かすぎるように標的核酸を切断することによって、該プラットフォームによる配列決定にとって不適当にする。これは、標的核酸内の一か所で、又は二か所以上で標的核酸を切断して、例えば、配列決定プラットフォームがより長い核酸を必要とするか又は断片が配列決定前に精製手順（例えば、ＳＰＲＩビーズベースの精製などのビーズ精製）中に失われるために、該配列決定プラットフォームにより配列決定されるには不十分な長さの断片を作り出すことによって達成され得る。切断される（単数若しくは複数の）位置及び切断部位の間の（単数若しくは複数の）距離は、例えば、着目の標的核酸に関する入手可能な核酸配列情報を使用し、そして、（単数若しくは複数の）選択した切断部位に相補的な配列を有する（単数若しくは複数の）核酸ガイド要素を設計することによって、所望の長さの切断断片を作り出すように対象方法の実施者によって選択され得る。このように、標的核酸は、配列決定プラットフォームにとって見えなくなるので、配列決定プラットフォームの負荷及び配列決定結果の複雑さが低減される。
【００６０】
先に記載したとおり、本開示の方法はまた、核酸の初期収集物から１若しくは複数の型の着目の核酸を選択的に回収する際に用途が見出された。例えば、特定の態様において、核酸の初期収集物から１若しくは複数の型の標的核酸を減損させることは、標的核酸／核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体の形成を介して核酸標的を捕捉し、次に、例えば、下流分析（例えば、定量分析、配列分析、及び／又は同様のもの）のために該複合体から標的核酸を回収することを含む。標的核酸の捕捉及び回収のためのアプローチは、例えば、本明細書中で先に記載した（特定の態様において、エピトープ／アフィニティータグを含んでいるヌクレアーゼ要素によって容易にされる）親和性ベースのアプローチを含んでいる。従って、対象方法は、核酸の収集物から１若しくは複数の着目の標的核酸を選択的に得る際に用途が見出され、そしてそれは、特定の態様において、核酸の複合収集物（例えば、全ＲＮＡサンプルの逆転写によって作り出されたｃＤＮＡの収集物、ゲノムライブラリからのエクソン、又はその他の着目の複合核酸収集物）である。
【００６１】
キット
対象方法を実施するのに有用なキットもまた本開示によって提供される。該キットは、対象方法及び組成物に関連する先に記載した任意の要素の１以上を含み得る。例えば、該キットは、核酸ガイド要素がインビトロ転写によってそれから製造され得るＰＣＲ増幅産物を作り出すためのプライマー及び鋳型を含み得る。斯かる試薬は、図２に示し、本明細書中で先に記載した核酸ガイド要素（例えば、ｓｇＲＮＡ）を製造するための方法を実施する際に有用である任意の試薬を含み得る。特定の態様によると、該キットは、キットの使用者によって提供されたフォワードプライマーに関連して使用するためのリバースプライマーを含んでいて、ここで、該フォワードプライマーの少なくとも一部が使用者による減損のために選択された標的核酸に相補的な核酸配列を含んでいる。
【００６２】
場合によっては、該キットは：ｓｇＲＮＡ足場鋳型ドメインを含んでいるベクター；ＰＣＲ反応においてベクターと使用するために構成されたリバースプライマー；及びＲＮＡポリメラーゼを含む。場合によっては、リバースプライマーは、ポリＡドメイン及びｓｇＲＮＡ足場ドメインを含む。ＲＮＡポリメラーゼは異なっていてもよいが、いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ポリメラーゼである。所望であれば、キットはさらに、１若しくは複数のＤＮＡポリメラーゼ；ＰＣＲバッファー；切断活性を有していても又は有していなくてもよいヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ、Ａｇｏ、又は他のヌクレアーゼ）；対照核酸などを含む。
対象のキットの要素は別々の容器に存在してもよく、又は複数の要素が１つの容器に存在してもよい。例えば、キットが、インビトロ転写によってそこからＲＮＡガイド要素が製造される鋳型ＤＮＡを作り出すためのプライマーを含んでいるとき、プライマーは、別々の容器内に又はキットの第二の要素（例えば、バッファー又は同様のもの）を含んでいる容器内に提供されてもよい。
【００６３】
上述した要素に加えて、対象のキットは、対象方法を実行するためにキットの要素を使用するための取扱説明書を更に備えている。対象方法を実行するための取扱説明書は、適切な記録媒体に記録され得る。例えば、取扱説明書は紙又はプラスチックのような基材に印刷されてもよい。従って、取扱説明書は、キット内に添付文書としてキット又はその要素の容器のラベルなどに（つまり包装体又は補助包装体に付随して）存在してもよい。他の実施形態では、取扱説明書は、例えば携帯用フラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、などの適切なコンピュータ可読記憶媒体に存在する電子保存データファイルとして存在する。更に他の実施形態では、実際の取扱説明書がキット内に存在しないが、リモートソースから、例えばインターネット経由で取扱説明書を得る手段が設けられている。本実施形態の一例は、取扱説明書を閲覧及び／又はダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。取扱説明書と同様に、取扱説明書を得る手段が適切な基板に記録されている。
【００６４】
以下の例は例示のために提供されるものであり、制限のために提供されるものではない。
【実施例】
【００６５】
実施例１：標的ＰＣＲ断片の減損
この実施例では、核酸誘導型ヌクレアーゼを製造し、概念実証として、ｒＲＮＡ配列に対応する標的配列を有するＰＣＲ産物を減損するのに使用した。図２に概説し、先に記載した方法を使用して、２つの異なるｓｇＤＮＡ鋳型（ＣＭＢＯ６４０及びＣＭＢＯ６４１）をＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ＨＤポリメラーゼ（Clontech Laboratories, Mountain View, CA）を使用したＰＣＲによって作り出した。ＰＣＲ産物は、図４に示したゲル画像において主な（下側の）バンドとして見られる。１００〜１２０ｎｇの鋳型を、対応するｓｇＲＮＡの製造のためにＴａｋａｒａ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼマニュアルに従ってインビトロ転写反応に使用した。
インビトロ転写したＣＭＢＯ６４０（７２ｎｇ／μｌ）及びＣＭＢＯ６４１（９０ｎｇ／μｌ）ｓｇＲＮＡを、次に、Ｃａｓ９（５００ｎｇ）と組み合わせたときの、ｒＲＮＡ配列に対応する配列を有するＰＣＲ産物（２６０ｎｇ）を切断するそれらの能力について試験した。結果を図５に提供する。示したとおり、Ｃａｓ９、ＣＯＭＢＯ６４０及び／又はＣＯＭＢＯ６４１ ｓｇＲＮＡ、及びＰＣＲ産物を組み合わせることで、ＰＣＲ産物の切断がもたらされた。
【００６６】
実施例２：完全長１８Ｓ ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの多重減損
この実施例では、異なる標的配列特異性を有する２つの別々のｓｇＲＮＡが、完全長１８Ｓ ｒＲＮＡに対応する配列を有する標的ＤＮＡを減損するために併用した（すなわち、多重様式下で）使用できることを示す。図６に提供したゲル画像で示したとおり、Ｃａｓ９と第一のｓｇＲＮＡを含んでいる核酸誘導型ヌクレアーゼ（「ｓｇＲＮＡ１」、左から４番目のレーン）及びＣａｓ９と第二のｓｇＲＮＡを含んでいる核酸誘導型ヌクレアーゼ（「ｓｇＲＮＡ２」、左から５番目のレーン）は、完全長１８Ｓ ｒＲＮＡに対応する配列を有する標的ＤＮＡを別の箇所で別々に切断することができる。２つの核酸誘導型ヌクレアーゼがともに標的ＤＮＡに組み合わせられるとき（左から６番目のレーン）、標的ＤＮＡはそれぞれの切断部位の両方で切断され、多重標的減損が起こったことを示唆する。
【００６７】
実施例３：次世代配列決定ライブラリからの望ましくない配列の減損
この実施例では、核酸誘導型ヌクレアーゼが次世代配列決定ライブラリから好ましくない配列を減損する能力を試験した。ヒト脳全ＲＮＡから転写したｃＤＮＡの次世代配列決定ライブラリをｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９核酸誘導型ヌクレアーゼによって処理して、該ライブラリの配列決定前に、１８Ｓ ｒＲＮＡに対応するｃＤＮＡの１０２２〜１０４１位における切断によって１８Ｓ ｒＲＮＡに対応するｃＤＮＡを減損した。得られた配列をｒＲＮＡに対してマッピングし、そして、１０２２〜１０４１と重なる読み取り数をｒＲＮＡに対するマッピングの読み取り総数で割った。その比をプロットし、対照に対して正規化した。
図７のパネルＡに示したように、標的配列の減損は、Ｃａｓ９と特異的なガイドＲＮＡの両方で処理したライブラリでのみ起こった。
【００６８】
別々の実験では、１８Ｓ ｒＲＮＡに対応する標的ｃＤＮＡを、５０ｂｐ毎にその全長に沿って標的ｃＤＮＡを標的とするｓｇＲＮＡプールを使用して分解した。３５ ｓｇＤＮＡ鋳型（図２に示したアプローチを使用して）をＰＣＲ増幅し、次に、貯留したインビトロ転写反応物中の対応する３５ ｓｇＲＮＡをインビトロで転写することによって、該プールを製造した。異なるｓｇＲＮＡ配列から成る大量の複合収集物が、（異なる標的特異的配列を有するｓｇＲＮＡを用いて標的を越えてタイリング（tiling）することにより）単一の標的を減損するか又はｓｇＲＮＡから成る収集物を使用した多重標的を減損するための１つの反応で作製できる場合、これは図２に示した本開示の方法の主要な利点の１つである。
【００６９】
この実験では、完全長の１８Ｓ ＲＮＡ（２５ｎｇ）に対応する標的及び５５ｎｇの５８００ｂｐのプラスミドｉＰＣＲ生成物（２８Ｓ ｒＲＮＡの代用として使用される）を含むモデル標的を使用した。この比は、減損のない２０ｎＭのＲＮＡ‐Ｓｅｑライブラリの１８Ｓと２８Ｓ ｒＲＮＡの（質量における）比に近似している。図７のパネルＢに示すように、１８Ｓ断片はｓｇＲＮＡプールを用いた処理によって徹底的に減損又は分解したのが、ｉＰＣＲ断片は影響を受けなかった。標的核酸の減損は、シーケンサー（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンサー）における標的のクラスタリングの欠陥をもたらすが、よくても、切断後に標的はその末端の一方に配列決定アダプターを持っているだけだからである。或いは、減損した標的断片は、それらが精製（例えば、ＳＰＲＩビーズ精製）後に無くなり、それにより配列決定に利用できなくなるのに十分なほど小さい。
【００７０】
実施例４：核酸誘導型ヌクレアーゼのプールを使用した１８Ｓ ｒＲＮＡの減損
この実験では、配列決定ライブラリを、SMARTer Stranded RNA‐Seq Kit（Clontech）を使用して１００ｎｇのHuman Brain Total RNA（Clontech）から作り出した。７０ｎｇのライブラリを、２０μｌの１Ｘ ＮＥＢ３．１バッファー中で０、２、又は５μｇの遺伝子組み換えにより精製したＣａｓ９及び０又は１９１ｎｇの先の実験で記載の３５ ｓｇＲＮＡプールと共に３７℃にて１時間インキュベートした。次に、Ｃａｓ９を７０℃にて１０分間、熱不活性化した。次に、ライブラリを貯留し、ＭｉＳｅｑ装置により配列決定した。得られた配列を、ＳＴＡＲアライナーを使用して同時にヒトゲノム、ｈｇ１９、及びｒＲＮＡ転写産物に対してマッピングした。図８は、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡプールの両方での処理のみによって生じる、１８Ｓ ｒＲＮＡ転写産物の配列網羅率の低下を例示する。１８Ｓ ｒＲＮＡに対してマッピングされた配列決定読み取り数を、図９で配列決定し、プロットした読み取り総数に対して正規化し、そして、１８Ｓ 転写産物に対して配列マッピングにおける〜７５％の低下を実証した。
【００７１】
実施例１〜４：配列情報
実施例１〜４に記載したｓｇＲＮＡは、以下の標的特異的配列を有する図１に示したｓｇＲＮＡ足場を含んでいた：
実施例１及び２で使用したｓｇＲＮＡ１：UUAUCAGAUCAAAACCAACC（配列番号０１）
実施例１、２及び３で使用したｓｇＲＮＡ２：UAAUCAAGAACGAAAGUCGG（配列番号０２）
実施例３及び４で使用した３５ ｓｇＲＮＡのプール：（配列番号０３〜３７）
【００７２】
【表１】
0006416939.tif 000002
【００７３】
実施例５：アルゴノート（Ａｇｏ）による標的核酸の減損
この実施例では、標的核酸を減損させるアルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質の能力を評価した。Ｈｉｓタグ付与したＴｔｈ Ａｇｏを発現させ、そして、精製した（図１０、パネルＡ）。５’ＦＡＭ標識したｓｓＤＮＡの代表的な標的の減損は、５００ｎＭの一本鎖ＤＮＡ、Ｔｔｈ Ａｇｏ、及び１００ｎＭの標的一本鎖ＤＮＡに相補的な５’リン酸化ターゲッティングオリゴヌクレオチドと組み合わせ、７５℃にて１時間インキュベートすることによって実施した。図１０、パネルＢに示したとおり、一本鎖標的はＡｇｏの不存在下で切断されなかったが（一番右側のレーン）、様々なＡｇｏ濃度でのＡｇｏとターゲッティングオリゴヌクレオチドの存在下で切断された。図１１は、同様であるが、２０ｎＭのｓｓＤＮＡ標的と５０ｎＭのガイドＤＮＡを用いた実験が一般的なライブラリ濃度の減損を代表することを実証する。
【００７４】
実施例５では、以下のガイドＤＮＡオリゴ：
【表２】
0006416939.tif 000003
及びターゲッティングオリゴ：
【表３】
0006416939.tif 000004
であった。
【００７５】
実施例６：アルゴノート（Ａｇｏ）による収集物からの標的核酸の減損
実施例５で実証されたように、アルゴノートは溶液中で標的ｓｓＤＮＡ分子を減損させることができる。所望であれば、標的は二本鎖であり、該二本鎖材料は、例えば熱若しくは高いｐＨを用いるなどした変性によって、又はエキソヌクレアーゼ処理によって非標的鎖を分解することによって一本鎖に変換され得る。例えば、混合物は、その一方だけが５’リン酸化されている、一般的な対のＰＣＲプライマーによって増幅され得る。次に、増幅産物をλエキソヌクレアーゼで処理して、ｓｓＤＮＡ生成物を得ることができる。次に、このｓｓＤＮＡ生成物を、Ａｇｏ及びターゲッティングオリゴヌクレオチドによる切断の基質として使用することができる。
【００７６】
実施例７：標的配列の回収
この実施例では、Ｃａｓ９の６ｘＨＮタグ付与Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ突然変異体（本明細書中ではｄＣａｓ９とも呼ばれる）を発現させ、そして、Ｅ．コリ（E. coli）において精製した（図１２、パネルＡ）。ＲＮＡ‐Ｓｅｑライブラリを、１００ｎｇのHuman Brain PolyA-plus RNA（Clontech）及びSMARTer Stranded RNA‐Seqキット（Clontech）から作り出した。１０ｎｇのライブラリを、１０μｌの１Ｘ ＮＥＢ３．１中で〜１．２５μｇのｄＣａｓ９及びヒト５Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ、２８Ｓ、ｍｔ１２Ｓ、及びｍｔ１６Ｓ配列に対して〜５０ｂｐごとに設計した７６ｎｇの１９０ｓｇＲＮＡのプールを組み合わせた。混合物を３７℃にて１時間インキュベートした。次に、１０μｇのサケ精子ＤＮＡ（Life Technologies）を加え、そして、反応を３７℃にて３０分間さらに続けた。１０のμｌのＮＥＢ３中で平衡化した５μｌのＴＡＬＯＮ磁性ビーズ（Clontech）を管に加え、回転させながら２５℃にて３０分間インキュベートした。該ビーズを２００μｌのＮＥＢで二度洗浄した。５０μｌのSeqAmp PCR Mastermix（１Ｘ ＳｅｑＡｍｐ Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌのＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ、２５０ｎＭのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５、及びＰ７ＰＣＲプライマー）を洗浄したビーズに加え、１５サイクルのＰＣＲ（９４℃１分間、１５×（９８℃‐１５ｓ、５５℃‐１５ｓ、６８℃‐３０ｓ））で増幅した。増幅産物を、製造業者の取扱説明書に従って５０μｌのＡＭＰｕｒｅビーズ（Beckman）を用いて精製し、２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．５、０．１％ Ｔｗｅｅｎ‐２０中で溶出した。次に、ライブラリをＭｉＳｅｑ装置で配列決定した。得られた配列を、ＳＴＡＲアライナーを使用して同時にヒトゲノム、ｈｇ１９、及びｒＲＮＡ転写産物に対してマッピングした。ｒＲＮＡに対してマッピングした読み取りをPicard RNA‐Seq Metricsによって同定し、そしてｒＲＮＡに対してマッピングした配列の相対量を図１２、パネルＢにプロットし、未処理のライブラリに対して〜３４０％の濃縮を示した。この実施例は、核酸誘導型ヌクレアーゼが核酸の初期収集物からの標的核酸の除去によって標的核酸を減損させるために、その後の標的核酸の回収及びそれを濃縮したサンプル製造のために使用されうることを実証する。
添付の特許請求の範囲の条項に関わらず、本開示は以下の付記の条項によっても定義される：
【００７７】
付記１．
核酸の初期収集物から標的核酸を選択的に減損させる方法であって：
該初期収集物から標的核酸を減損させるのに十分な様式下で、核酸の収集物を標的核酸に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼと接触させること、
を含む方法。
付記２．
前記標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）である、付記１に記載の方法。
付記３．
前記標的核酸が二本鎖核酸である、付記１又は２に記載の方法。
付記４．
前記標的核酸が一本鎖核酸である、付記１又は２に記載の方法。
付記５．
前記核酸誘導型ヌクレアーゼが、ＲＮＡガイド要素及びヌクレアーゼ要素を含む、付記１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【００７８】
付記６．
前記ヌクレアーゼ要素がＣａｓヌクレアーゼ要素を含む、付記５に記載の方法。
付記７．
前記Ｃａｓヌクレアーゼ要素が切断活性を呈し、且つ、前記方法が標的核酸の切断をもたらして、標的核酸の初期収集物を減損させる、付記６に記載の方法。
付記８．
前記Ｃａｓヌクレアーゼ要素が切断欠損性突然変異体であり、且つ、前記方法が標的核酸／核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体を含む生成物組成物の製造をもたらす、付記６に記載の方法。
付記９．
前記方法が生成物組成物の他の構成要素から複合体を分離することをさらに含む、付記８に記載の方法。
付記１０．
前記Ｃａｓヌクレアーゼ要素がタグをさらに含む、付記９に記載の方法。
【００７９】
付記１１．
前記方法が、標的核酸を複合体から回収することをさらに含む、付記１０に記載の方法。
付記１２．
前記核酸誘導型ヌクレアーゼが、ＤＮＡガイド要素及びヌクレアーゼ要素を含む、付記１〜４のいずれか１項に記載の方法。
付記１３．
前記ヌクレアーゼ要素がＴｔｈ Ａｇｏヌクレアーゼ要素を含む、付記１２に記載の方法。
付記１４．
前記方法が、核酸の初期収集物を複数の２以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼと接触させることを含む、付記１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
付記１５．
核酸の初期収集物から核酸の小集団を選択的に減損させる方法であって：
初期収集物から小集団を減損させるのに十分な様式下で、核酸の初期収集物を核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリと接触させること、
を含み、ここで、該ライブラリは核酸の小集団の１若しくは複数の構成要素に特異的な２以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含んでいる、方法。
【００８０】
付記１６．
前記小集団がデオキシリボ核酸を含む、付記１５に記載の方法。
付記１７．
前記小集団が二本鎖核酸を含む、付記１５又は１６に記載の方法。
付記１８．
前記小集団が一本鎖核酸を含む、付記１５又は１６に記載の方法。
付記１９．
前記ライブラリが５以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記１５又は１６に記載の方法。
付記２０．
前記５以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼが、異なる配列の核酸ガイド要素を有する、付記１９に記載の方法。
【００８１】
付記２１．
前記核酸誘導型ヌクレアーゼがそれぞれＲＮＡガイド要素及びヌクレアーゼ要素を含む、付記１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
付記２２．
前記ヌクレアーゼ要素がＣａｓヌクレアーゼ要素を含む、付記２１に記載の方法。
付記２３．
前記Ｃａｓヌクレアーゼ要素が切断活性を呈し、且つ、前記方法が小集団の切断をもたらして、小集団の初期収集物を減損させる、付記２２に記載の方法。
付記２４．
前記Ｃａｓヌクレアーゼ要素が切断欠損性突然変異体であり、且つ、前記方法が小集団核酸／核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体を含む生成物組成物の製造をもたらす、付記２２に記載の方法。
付記２５．
前記方法が、生成物組成物の他の構成要素から複合体を分離することをさらに含む、付記２４に記載の方法。
【００８２】
付記２６．
前記Ｃａｓヌクレアーゼ要素がタグをさらに含む、付記２５に記載の方法。
付記２７．
前記方法が、小集団核酸を複合体から回収することをさらに含む、付記２６に記載の方法。
付記２８．
前記核酸誘導型ヌクレアーゼがそれぞれＤＮＡガイド要素及びＴｔｈ Ａｇｏヌクレアーゼ要素を含む、付記１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
付記２９．
前記核酸の初期収集物が次世代配列決定（ＮＧＳ）核酸収集物を含む、付記１５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
付記３０．
前記小集団が配列決定することを望まない配列を含む、付記２９に記載の方法。
【００８３】
付記３１．
前記方法が、小集団を減損したＮＧＳ核酸収集物の配列決定をさらに含む、付記３０に記載の方法。
付記３２．
複数の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む組成物。
付記３３．
前記組成物が５以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記３２に記載の組成物。
付記３４．
前記組成物が２５以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記３３に記載の組成物。
付記３５．
前記組成物が１００以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記３４に記載の組成物。
【００８４】
付記３６．
前記組成物が５００以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記３５に記載の組成物。
付記３７．
前記組成物が１０００以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記３６に記載の組成物。
付記３８．
前記核酸誘導型ヌクレアーゼが、異なる配列の核酸ガイド要素を有する、付記３２〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
付記３９．
前記核酸誘導型ヌクレアーゼがそれぞれＲＮＡガイド要素及びヌクレアーゼ要素を含む、付記３２〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
付記４０．
前記ヌクレアーゼ要素がＣａｓヌクレアーゼ要素を含む、付記３９に記載の組成物。
【００８５】
付記４１．
前記Ｃａｓヌクレアーゼ要素が切断活性を呈する、付記４０に記載の組成物。
付記４２．
前記Ｃａｓヌクレアーゼ要素が切断欠損性突然変異体である、付記４０に記載の組成物。
付記４３．
前記Ｃａｓヌクレアーゼ要素がタグをさらに含む、付記４２に記載の組成物。
付記４４．
前記核酸誘導型ヌクレアーゼがそれぞれＤＮＡガイド要素及びヌクレアーゼ要素を含む、付記３２〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
付記４５．
前記ヌクレアーゼ要素がＴｔｈ Ａｇｏヌクレアーゼ要素を含む、付記４４に記載の組成物。
【００８６】
付記４６．
核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリを作製する方法であって：
核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリを製造するのに十分な様式下で、複数の異なるガイド核酸をヌクレアーゼと組み合わせること、
を含む方法。
付記４７．
前記ヌクレアーゼがＣａｓヌクレアーゼである、付記４６に記載の方法。
付記４８．
前記Ｃａｓヌクレアーゼが切断活性を含む、付記４７に記載の方法。
付記４９．
前記Ｃａｓヌクレアーゼが切断欠損性突然変異体である、付記４７に記載の方法。
付記５０．
前記ライブラリが５以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記４６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【００８７】
付記５１．
前記ライブラリが２５以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記５０に記載の方法。
付記５２．
前記ライブラリが１００以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記５１に記載の方法。
付記５３．
前記ライブラリが５００以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記５２に記載の方法。
付記５４．
前記ライブラリが１０００以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記５３に記載の方法。
付記５５．
前記核酸ガイドが、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、付記４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【００８８】
付記５６．
前記核酸ガイドがｓｇＲＮＡを含む、付記４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
付記５７．
前記方法が核酸ガイドの製造をさらに含む、付記１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
付記５８．
前記核酸ガイドが、該核酸ガイドをコードするベクターから核酸ガイドを発現することによって製造される、付記５７に記載の方法。
付記５９．
前記核酸ガイドが、インビトロ転写プロトコールを使用して製造される、付記５７に記載の方法。
付記６０．
以下の：
ｓｇＲＮＡ足場鋳型ドメインを含むベクター；
ＰＣＲ反応においてベクターと共に使用するために構成されたリバースプライマー；及び
ＲＮＡポリメラーゼ、
を含むキット。
【００８９】
付記６１．
前記リバースプライマーが、ポリＡドメイン及びｓｇＲＮＡ足場ドメインを含む、付記６０に記載のキット。
付記６２．
前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ポリメラーゼである、付記６０〜６１のいずれか１項に記載のキット。
付記６３．
前記キットがＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、付記６０〜６２のいずれか１項に記載のキット。
付記６４．
前記キットがＰＣＲバッファーをさらに含む、付記６０〜６３のいずれか１項に記載のキット。
付記６５．
前記キットがヌクレアーゼをさらに含む、付記６０〜６４のいずれか１項に記載のキット。
【００９０】
付記６６．
前記ヌクレアーゼがＣａｓヌクレアーゼである、付記６５に記載のキット。
付記６７．
前記Ｃａｓヌクレアーゼが切断活性を含む、付記６６に記載のキット。
付記６８．
前記Ｃａｓヌクレアーゼが切断欠損性突然変異体である、付記６６に記載のキット。
【００９１】
上記の発明は、理解の明瞭化のために、図示及び例示によりある程度詳しく説明されているが、ある変更及び調整が、本発明の趣旨又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく本発明になされてもよいことが、本発明の教示を考慮すると当業者に容易に明らかとなる。
【００９２】
従って、前述の内容は本発明の本質を単に示しているに過ぎない。本明細書に明示的に説明されていないか又は示されていないが、本発明の本質を具体化して本発明の趣旨及び範囲に含まれる様々な構成を当業者が考案することが可能であることが明らかである。更に、本明細書に述べられている全ての例及び条件的な用語は、本発明の本質と、本技術分野を進展させるために本発明者により与えられた概念とを理解する際に読者を支援することを本質的に意図するものであり、このように具体的に述べられた例及び条件に限定するものではないと解釈されるべきである。更に、本発明の本質、態様及び実施形態だけでなく、本発明の具体的な例を述べている本明細書における全ての記載は、本発明の構造的且つ機能的な等価物の両方を含むことを意図するものである。加えて、このような均等物は、現時点で既知の均等物及び今後開発される均等物の両方、すなわち構造に関わらず同一の機能を有する開発された全ての要素を含むことを意図するものである。従って、本発明の範囲は、本明細書に示され説明された例示的な実施形態に制限されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲により具体化される。
【図１】
0006416939.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
0006416939.tif 000017
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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