(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の初期状態を表す値を算定するコンピュータ実行方法であって、
少なくとも１つの非一過性コンピュータ可読媒体上に記憶された命令を実行するよう構成された少なくとも１つのマイクロプロセッサを含む少なくとも１つの中央処理装置を有するコンピュータによって、核酸配列、前記核酸配列の部分配列、又は前記核酸配列の相補配列を増幅する生化学的増幅手法から得られた（信号、時間）データを受け取るステップを含み、前記（信号、時間）データは、前記生化学的増幅手法で作製され、統計的に有意な生化学的反応レート算定に十分な頻度で繰り返し記録された蓄積増幅生成物に比例する信号を含み、
前記コンピュータによって、前記（信号、時間）データの第１の処理を実行して増幅が起こったかどうかを判定するステップを含み、
増幅が起こらなかったと判定された場合、前記方法を終了させ、
増幅が起こったと判定されると、前記コンピュータによって、前記（信号、時間）データの第２の処理を実行して初期点を識別するステップを含み、前記第２の処理は、スムージングスプラインを前記（信号、時間）データにフィッティングするステップを含み、前記初期点は、前記フィッティングされたスプラインから得られた一次微分最大値であり、
前記コンピュータによって、前記（信号、時間）データの第３の処理を実行し、前記初期点の周りの現在の領域を選択し、そしてモデルを前記現在の領域にフィッティングするステップを含み、
前記コンピュータによって、前記（信号、時間）データの第４の処理を実行し、前記現在の領域について第１の相関係数を決定し、前記現在の領域を所定のステップサイズだけ拡張し、前記拡張された領域について第２の相関係数を決定し、そして第１の相関係数と前記第２の相関係数を比較するステップを含み、
前記第１の相関係数と前記第２の相関係数の差が所定の適合基準内に収まっている場合、前記コンピュータによって、前記拡張領域を前記現在の領域として定めて、前記拡張を繰り返すステップを含み、
前記第１の相関係数と前記第２の相関係数の差が前記所定の適合基準内に収まっていない場合、前記コンピュータによって、前記拡張領域を選択されたデータサブセットとして定めるステップを含み、
前記コンピュータによって、前記データサブセットのための既定の統計的尺度の値を算定するステップを含み、前記値は、前記データサブセットを区切る初期及び最終の時点、前記データサブセットに含まれるデータ点の数、及び前記モデルの既定のパラメータに関する値を含み、
前記コンピュータによって、少なくとも１つの非一過性コンピュータ可読媒体を含むデータベースに前記データサブセット及び前記統計的尺度を記憶させるステップを含み、
前記コンピュータによって、前記モデルの前記パラメータに関する前記値に基づいて前記試料の前記初期状態を表す前記値を算定するステップを含み、
前記コンピュータによって、前記試料の前記初期状態を表す前記値をユーザに表示するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記モデルは、線形モデルであり、前記統計的尺度は、前記線の勾配及びＹ切片を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１の処理は、
前記コンピュータによって、前記（信号、時間）データを所定サイズの多数のサブセグメントに分割するステップと、
前記コンピュータによって、各サブセグメントを、早い時期のデータ点を含む近位信号データ及び遅い時期のデータ点を含む遠位信号データに均等に分割するステップと、
前記コンピュータによって、前記遠位信号データの和及び前記近位信号データの和を求め、前記遠位信号データの前記和を前記近位信号データの前記和で除算することによって各サブセグメントについてセグメント比を算定するステップと、
前記コンピュータによって、最大セグメント比を算定し、前記（信号、時間）データを前記最大セグメント比の位置のところで分離されたベースラインセグメントとプラトーセグメントに分割するステップと、
前記コンピュータによって、前記ベースラインセグメント及び前記プラトーセグメントを近位及び遠位半部に分割し、前記ベースラインセグメントの前記近位半部の前記統計的モードを含む第１のモード及び前記プラトーセグメントの前記遠位半部の前記統計的モードを含む第２のモードを決定するステップと、
前記第１のモードと前記第２のモードの差を含む反応の大きさを算定するステップと、
前記大きさが所定のしきい値を超えていないと判定された場合、前記コンピュータによって、増幅が起こっていないと判定するステップと、
前記大きさが前記所定のしきい値を超えていると判定された場合、前記コンピュータによって、増幅が起こったと判定するステップとを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記所定のセグメントサイズは、前記データ点の数及びデータ分散のうちの少なくとも一方に基づいている、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記試料の前記初期状態を表す前記値は、前記試料中の前記核酸配列の量を表す値である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記方法は、前記試料の複数のアリコートについて反復して実施され、前記方法は、増幅が少なくとも１つのアリコートで起こり、少なくとも１つの別のアリコートでは起こらなかったと判定された場合、前記コンピュータによって、増幅が行われなかったアリコートの数と増幅が行われたアリコートの数の比を算定するステップと、
前記コンピュータによって、前記比の統計的分析に基づいて前記試料中の前記核酸配列の前記量を表す前記値を算定するステップとを更に含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、前記試料の複数のアリコートについて反復して実施され、前記方法は、
増幅が少なくとも２つのアリコートで起こったと判定された場合、前記コンピュータによって、前記少なくとも２つのアリコートの各々について前記モデルの前記パラメータに関する前記値の表形式のコンパイルを作成するステップと、
前記コンピュータによって、前記表形式コンパイル中の値の統計的分析に基づいて前記少なくとも２つのアリコートの各々中の前記核酸配列の前記量を表す前記値を算定するステップとを更に含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、前記試料の複数のアリコートについて反復して実施され、前記方法は、
前記コンピュータによって、前記反復全てから求められた値を用いて前記試料中の前記核酸配列の前記量を表す前記値を算定するステップを更に含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記核酸配列は、非核酸分子に結びつけられ、前記方法は、
前記コンピュータによって、前記試料中の前記核酸配列の前記量を表す前記値に基づいて前記試料中の前記非核酸分子の量を表す値を算定するステップを更に含む、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記生化学的増幅手法は、変性、アニーリング、及び拡張ステップを有するポリメナーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含み、前記信号は、前記拡張ステップで記録される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記生化学的増幅手法は、２プライマー分枝ローリングサイクル増幅（ＲＡＭ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記生化学的増幅手法は、らせん不安定化増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼ媒介増幅（ＲＰＡ）、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、又は持続性配列複製（３ＳＳＲ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記生化学的増幅手法は、数学的に特徴付けられておらず、前記第３の処理は、前記信号の実験的分析から成る、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、複数の試料の各々について実施され、前記生化学的増幅手法は、同一であり、前記生化学的増幅手法の１つ及び／又は２つ以上の実験ファクターがプロセス最適化のために体系的に変えられる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法を実施するための手段を含むリアルタイム信号分析システム。
【請求項１６】
試料の核酸配列の量を表す値を算定するコンピュータ実行方法であって、
リアルタイム増幅検出システムによって、核酸配列、核酸配列の部分配列、又は核酸配列の相補配列と、蛍光染料と、を有する試料の等温増幅を実行するステップを含み、
前記リアルタイム増幅検出システムによって、前記蛍光染料から放射される光を含む信号を繰り返し測定するステップを含み、
前記リアルタイム増幅検出システムによって、各々が、(i)測定信号、及び(ii)前記信号が測定された時間を含む複数のデータ点を有する等温増幅データを記録するステップを含み、前記記録は、統計的に有意な生化学的反応レート算定に十分な頻度で実行され、
少なくとも１つの非一過性コンピュータ可読媒体上に記憶された命令を実行するよう構成された少なくとも１つのマイクロプロセッサを含む少なくとも１つの中央処理装置を有するコンピュータによって、前記リアルタイム増幅検出システムによって記録された前記等温増幅データを受け取るステップを含み、
前記コンピュータによって、前記等温増幅データの第１の処理を実行して増幅が起こったかどうかを判定するステップを含み、
増幅が起こらなかったと判定された場合、前記方法を終了させ、
増幅が起こったと判定されると、前記コンピュータによって、前記等温増幅データの第２の処理を実行して初期点を識別するステップを含み、
前記コンピュータによって、前記等温増幅データの第３の処理を実行し、前記初期点の周りの現在の領域を選択し、そしてモデルを前記現在の領域にフィッティングするステップを含み、
前記コンピュータによって、前記等温増幅データの第４の処理を実行し、前記現在の領域について第１の相関係数を決定し、前記現在の領域を規定のステップサイズだけ拡張し、前記拡張された領域について第２の相関係数を決定し、そして第１の相関係数と前記第２の相関係数を比較するステップを含み、
前記第１の相関係数と前記第２の相関係数の差が設定された最大値を超えていない場合、前記コンピュータによって、前記拡張領域を前記現在の領域として定めて、前記拡張を繰り返すステップを含み、
前記第１の相関係数と前記第２の相関係数の差が前記設定された最大値を超えている場合、前記コンピュータによって、前記拡張領域を選択されたデータサブセットとして定めるステップを含み、
前記コンピュータによって、前記データサブセットのための既定の統計的尺度の値を算定するステップを含み、前記値は、前記データサブセットを区切る初期及び最終の時点、前記データサブセットに含まれるデータ点の数、及び前記モデルの既定のパラメータに関する値を含み、
前記コンピュータによって、少なくとも１つの非一過性コンピュータ可読媒体を含むデータベースに前記データサブセット及び前記統計的尺度を記憶させるステップを含み、
前記コンピュータによって、前記モデルの前記パラメータに関する前記値に基づいて前記試料の前記核酸配列の前記量を表す前記値を算定するステップを含み、
前記コンピュータによって、前記試料の前記核酸配列の前記量を表す前記値をユーザに表示するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
〔関連出願の説明〕
本願は、２０１３年５月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／８２３，５６４号の権益及び優先権主張出願であり、この米国特許仮出願を参照により引用し、その記載内容全体を本明細書の一部とする。
【０００２】
試料中の物質の量の推定（当該物質の検出の失敗を含む）は、種々の分野に有用性を有する。例えば、物質が病原性生物（有機体）の診断に役立つ核酸配列である場合、この特定の核酸配列が試料中で検出不能であるということ又はこれらの配列の量が薬物に応答して減少傾向を示すということを知ることが有用な場合がある。遺伝子診断において、ゲノムＤＮＡ（デオキシリボ核酸）塩基配列のコピー数の推定は、染色体セグメント（部分）の重複又は欠失の診断に役立つ場合がある。例えば、胎児倍数性に関し、ダウン症候群の診断のための判定は、２１番染色体診断配列のコピー数を別の体細胞染色体の診断に役立つ配列のコピー数と比較することによって実施可能である。正確な診断では２１番染色体配列の３つのコピーから２つのコピーを識別することが必要なので、コピー数の差の正確な定量化が必要不可欠である。別の例を疫学、生態学、又は遺伝子発現における研究分野並びに他の分野から引き出すことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
多くの場合、関心のある物質は、直接的には測定することができないほど少ない量で試料中に存在している場合がある。例えば既存の方法と比較して高い信頼性及び／又は高い効率で試料中の物質の僅かな量を算定するために核酸増幅信号収集及び信号分析のための改良方法が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、種々の実施形態において、生化学的増幅反応から得られるデータを分析するシステム及び方法を提供する。幾つかの実施形態では、増幅反応は、連続（非循環）反応であり、データ（例えば、生成物蓄積レートに比例した信号）がこの反応から定期的にサンプリングされる。好ましい実施形態では、本発明は、増幅についての明白な数学的モデルが存在する増幅反応を用いる。変形実施形態では、本発明は、明白なレートモデルが存在しない増幅反応の実験的分析を可能にする。
【０００５】
一観点では、本発明は、試料の初期状態を表す値を算定するコンピュータ実行方法であって、少なくとも１つの非一過性コンピュータ可読媒体上に記憶された命令を実行するよう構成された少なくとも１つのマイクロプロセッサを含む少なくとも１つの中央処理装置を有するコンピュータによって、核酸配列、核酸配列の部分配列、又は核酸配列の相補配列を増幅する生化学的増幅手法からの（信号、時間）データを受け取るステップを含み、（信号、時間）データは、生化学的増幅手法で作製され、統計的に有意な生化学的反応レート算定に十分な頻度で繰り返し記録された蓄積増幅生成物に比例する信号を含む。
【０００６】
幾つかの実施形態では、本方法は、コンピュータによって、（信号、時間）データの第１の処理を実行して増幅が起こったかどうかを判定するステップと、増幅が起こらなかったと判定された場合、本方法を終了させ、増幅が起こったと判定されると、コンピュータによって、（信号、時間）データの第２の処理を実行して初期点を識別するステップとを含む。
【０００７】
幾つかの実施形態では、本方法は、コンピュータによって、（信号、時間）データの第３の処理を実行し、初期点の周りの現在の領域を選択し、そしてモデルを現在の領域にフィッティングするステップを含む。
【０００８】
幾つかの実施形態では、本方法は、コンピュータによって、（信号、時間）データの第４の処理を実行し、現在の領域について第１の相関係数を決定し、現在の領域を所定のステップサイズだけ拡張し、拡張された領域について第２の相関係数を決定し、そして第１の相関係数と第２の相関係数を比較するステップを含む。幾つかの実施形態では、第１の相関係数と第２の相関係数の差が所定の適合（フィット）基準内に収まっている場合、コンピュータによって、拡張領域を現在の領域として定めて、拡張を繰り返すステップとを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、第１の相関係数と第２の相関係数の差が所定の適合基準内に収まっていない場合、コンピュータによって、拡張領域を選択されたデータサブセットとして定めるステップを含む。
【０００９】
幾つかの実施形態では、本方法は、コンピュータによって、データサブセットのための既定の統計的尺度の値を算定するステップを含み、値は、データサブセットを区切る初期及び最終の時点、データサブセットに含まれるデータ点の数、及びモデルの既定のパラメータに関する値を含む。幾つかの実施形態では、本方法は、コンピュータによって、少なくとも１つの非一過性コンピュータ可読媒体を含むデータベースにデータサブセット及び統計的尺度を記憶させるステップを含む。
【００１０】
幾つかの実施形態では、本方法は、コンピュータによって、モデルのパラメータに関する値に基づいて試料の初期状態を表す値を算定するステップと、コンピュータによって、試料の初期状態を表す値をユーザに表示するステップとを含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、第２の処理は、スムージングスプラインを（信号、時間）データにフィッティングするステップを含み、初期点は、フィッティングされたスプラインから得られた一次微分最大値である。
【００１２】
幾つかの実施形態では、モデルは、線形モデルであり、統計的尺度は、線の勾配及びＹ切片を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、第１の処理は、コンピュータによって、（信号、時間）データを所定サイズの多数のサブセグメントに分割するステップと、コンピュータによって、各サブセグメントを、早い時期のデータ点を含む近位信号データ及び遅い時期のデータ点を含む遠位信号データに均等に分割するステップと、コンピュータによって、遠位信号データの和及び近位信号データの和を求め、遠位信号データの和を近位信号データの和で除算することによって各サブセグメントについてセグメント比を算定するステップとを含む。
【００１４】
幾つかの実施形態では、第１の処理は、コンピュータによって、最大セグメント比を算定し、（信号、時間）データを最大セグメント比の位置のところで分離されたベースラインセグメントとプラトーセグメントに分割するステップと、コンピュータによって、ベースラインセグメント及びプラトーセグメントを近位及び遠位半部に分割し、ベースラインセグメントの近位半部の統計的モードを含む第１のモード及びプラトーセグメントの遠位半部の統計的モードを含む第２のモードを決定するステップと、第１のモードと第２のモードの差を含む反応の大きさを算定するステップとを含む。幾つかの実施形態では、大きさが所定のしきい値を超えていないと判定された場合、第１の処理は、コンピュータによって、増幅が起こっていないと判定するステップを含む。幾つかの実施形態では、第１の処理は、大きさが所定のしきい値を超えていると判定された場合、コンピュータによって、増幅が起こったと判定するステップを含む。
【００１５】
幾つかの実施形態では、所定のセグメントサイズは、データ点の数及びデータ分散のうちの少なくとも一方に基づく。
【００１６】
幾つかの実施形態では、試料の初期状態を表す値は、試料中の核酸配列の量を表す値である。幾つかの実施形態では、本方法は、試料の複数のアリコートについて反復して実施される。
【００１７】
幾つかの実施形態では、試料の複数のアリコートについて反復して実施された本方法は、増幅が少なくとも１つのアリコートで起こり、少なくとも１つの別のアリコートでは起こらなかったと判定された場合、コンピュータによって、増幅が行われなかったアリコートの数と増幅が行われたアリコートの数の比を算定するステップと、コンピュータによって、比の統計的分析に基づいて試料中の核酸配列の量を表す値を算定するステップとを更に含む。
【００１８】
幾つかの実施形態では、試料の複数のアリコートについて反復して実施された本方法は、増幅が少なくとも２つのアリコートで起こったと判定された場合、コンピュータによって、少なくとも２つのアリコートの各々についてモデルのパラメータに関する値の表形式のコンパイルを作成するステップと、コンピュータによって、表形式コンパイル中の値の統計的分析に基づいて少なくとも２つのアリコートの各々中の核酸配列の量を表す値を算定するステップとを更に含む。
【００１９】
幾つかの実施形態では、反復して実施された本方法は、コンピュータによって、反復全てから求められた値を用いて試料中の核酸配列の量を表す値を算定するステップを更に含む。
【００２０】
幾つかの実施形態では、核酸配列は、非核酸分子に結びつけられ、本方法は、コンピュータによって、試料中の核酸配列の量を表す値に基づいて試料中の非核酸分子の量を表す値を算定するステップを更に含む。
【００２１】
幾つかの実施形態では、生化学的増幅手法は、変性、アニーリング、及び拡張ステップを有するポリメナーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含み、信号は、拡張ステップで記録される。幾つかの実施形態では、生化学的増幅手法は、２プライマー分枝ローリングサイクル増幅（ＲＡＭ）を含む。幾つかの実施形態では、生化学的増幅手法は、らせん不安定化増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼ媒介増幅（ＲＰＡ）、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、又は持続性配列複製（３ＳＳＲ）を含む。
【００２２】
幾つかの実施形態では、生化学的増幅手法は、数学的に特徴付けられておらず、第３の処理は、信号の実験的分析から成る。
【００２３】
幾つかの実施形態では、本方法は、複数の試料の各々について実施され、生化学的増幅手法は、同一であり、生化学的増幅手法の１つ及び／又は２つ以上の実験ファクターがプロセス最適化のために体系的に変えられる。
【００２４】
幾つかの実施形態では、本発明は、上述の方法を実施するための手段を含む。
【００２５】
本発明の別の特徴及び別の利点について以下に更に説明する。この発明の概要の項の記載は、本発明の或る特定の特徴の説明に係るに過ぎず、本発明の範囲をなんら限定するものではない。この発明の概要の項で本発明の特定の特徴若しくは実施形態又は１つ又は２つ以上の特徴を含めるのを説明しなかったとしても、このことが特許請求の範囲に記載された本発明を限定するものと解されてはならない。
【００２６】
上記発明の概要並びに本願の要旨の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と関連して読まれると、良好に理解されよう。本願の方法を説明する目的で、図面には好ましい実施形態が示されている。しかしながら、理解されるべきこととして、本願の要旨は、図示の配置及び器械構成そのものに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する（サイクル、信号）データ対及び２プライマー分枝ローリングサイクル（ＲＡＭ）反応に関する（時間、信号）データ対のグラフ図であってＰＣＲ反応からの例示の信号とサイクルのデータの関係を示す図であり、横軸が熱サイクルのカウント（計数）を記録し、縦軸が反応の累積増幅に比例した信号を記録し、１つのデータ点（黒丸として示されている）が各熱サイクルについて得られ、このデータにフィッティングされたスムージングスプラインによって生じた線によって図形データ点が結びつけられ、ベースライン（baseline）域及びプラトー（plateau）がラベル表示されている図である。
【図１Ｂ】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する（サイクル、信号）データ対及び２プライマー分枝ローリングサイクル（ＲＡＭ）反応に関する（時間、信号）データ対のグラフ図であってＲＡＭ反応からの例示の信号と時間データの関係を示す図であり、横軸が分で表された経過反応時間を記録し、縦軸が反応の累積増幅に比例した信号を記録し、１つのデータ点（白丸として示されている）が３〜５秒間隔で得られ、このデータにフィッティングされたスムージングスプラインによって生じた線によって図形データ点が結びつけられ、ベースライン域及びプラトーがラベル表示されている図である。
【図１Ｃ】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する（サイクル、信号）データ対及び２プライマー分枝ローリングサイクル（ＲＡＭ）反応に関する（時間、信号）データ対のグラフ図であって縦軸が反応の累積増幅の対数に比例した信号を記録するよう変換された図１Ａのデータを示す図であり、矢印で示された箇所がスムージングスプラインの最大一次微分値である状態を示す図である。
【図１Ｄ】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する（サイクル、信号）データ対及び２プライマー分枝ローリングサイクル（ＲＡＭ）反応に関する（時間、信号）データ対のグラフ図であって縦軸が反応の累積増幅の対数に比例した信号を記録するよう変換された図１Ｂのデータを示す図であり、矢印で示された箇所がスムージングスプラインの最大一次微分値である状態を示す図である。
【図２】幾つかの実施形態に従って単一増幅反応のコンピュータ実行評価のための例示の流れ図である。
【図３】幾つかの実施形態に従って増幅が起こったかどうかのコンピュータ実行評価のための例示の流れ図である。
【図４Ａ】図１Ｂのデータの詳細図であり、増幅信号がバックグラウンド信号レベルを超え始めたときの増幅反応中の時点における個々のデータ点のうちの局所データ分散を示す図である。
【図４Ｂ】増幅反応が起こったかどうかを判定するために用いられる方法の例示の観点を示す図であって、白丸が図１Ｂのデータ点を表し、グレーで塗りつぶした菱形がセグメント比であり、垂直線が最大セグメント比を示し、最大セグメント比の位置が大きなセグメント（両方向を指し示す矢印）を定め、ベースラインを含む近位セグメント、及びプラトーを含む遠位セグメントを定め、大きいセグメントが近位及び遠位半部に分割され、サブセグメントが、モード値がデータから割り出される「モードボックス（mode box）」で示されたグレーのボックスによりマーク付けされたベースライン信号領域及びプラトー信号領域を含む状態を示す図であり、図４Ｂの右側は、図形の円がモードを表しているモードボックス及びモード相互間の差として定められた反応の大きさの略図である。
【図５Ａ】１組の複製反応からの結果を評価するための概念的説明及び原理を示す図であって３つの高い高濃度試料を示す図である。
【図５Ｂ】１組の複製反応からの結果を評価するための概念的説明及び原理を示す図であって理想的な希釈後におけるこれら３つの試料を示す図である。
【図５Ｃ】１組の複製反応からの結果を評価するための概念的説明及び原理を示す図であって時間の経過による理想的な指数関数的増幅生成物蓄積を示す図である。
【図５Ｄ】１組の複製反応からの結果を評価するための概念的説明及び原理を示す図であって図５Ｃの対数変換を示す図である。
【図５Ｅ】１組の複製反応からの結果を評価するための概念的説明及び原理を示す図であって理想化されたリアルタイム増幅データを図５Ｄの増幅トレース上に重ね合わせた図である。
【図５Ｆ】１組の複製反応からの結果を評価するための概念的説明及び原理を示す図であって図５Ｅの勾配及び切片を１つの勾配と切片のプロットで示す図である。
【図５Ｇ】１組の複製反応からの結果を評価するための概念的説明及び原理を示す図であって統計誤差が図５Ｅから得られたデータの勾配及び切片をどのように変更するかを示す図である。
【図５Ｈ】１組の複製反応からの結果を評価するための概念的説明及び原理を示す図であって図５Ｇに示された統計誤差が図５Ｆの場合のようにプロットされた場合にどのように見えるかを示す図である。
【図６Ａ】図１Ｄに示されている増幅データへの且つこの増幅データに対する複製反応への説明対象方法の例示の適用を示す図であって図２に示されている手法によって図１Ｄに示されている増幅データから選択された４４個の点の集まりを示す図であり、黒丸が［時間、ｌｏｇ（信号）］データ点を表し、データ点と交差する線が線形回帰によって集められた点にフィッティングされた状態を示す図である。
【図６Ｂ】図１Ｄに示されている増幅データへの且つこの増幅データに対する複製反応への説明対象方法の例示の適用を示す図であってベースラインからの初期点がなく且つプラトーからの端点のない図１Ｄからのデータ点のサブセットを示す図であり、データ点を通り且つ横軸まで延びる線が図６Ａに示されている回帰線の勾配及び切片を用いてプロットされた状態を示す図である。
【図６Ｃ】図１Ｄに示されている増幅データへの且つこの増幅データに対する複製反応への説明対象方法の例示の適用を示す図であってプラトーからの端点がない図１Ｄからのデータを示す図であり、横軸が図５Ｅの単一のデータトレースと同様な模様を形成するよう延長され、データ点を通り且つ縦軸まで延びる線が図６Ｂに示されている線と同様、図６Ａに示されている回帰線の勾配及び切片を用いてプロットされた状態を示す図である。
【図６Ｄ】図１Ｄに示されている増幅データへの且つこの増幅データに対する複製反応への説明対象方法の例示の適用を示す図であって図６Ｃから得られたデータを示す図であり、複製反応である反応から割り出された３つの同様に決定された回帰線を図１Ｄに示されているデータの源である反応に追加した状態を示す図であり、結果として生じる模様が図５Ｇに示されているように予想される結果に似ている状態を示す図である。
【図７Ａ】２つの互いに異なるＲＡＭテンプレート希釈から開始された複製反応の２つの組から得られたデータを示す図であって結果の両方の組に関し、初期パネル及びポストデータ品質管理パネル（post-data-quality-control)が示されている図であり、最大希釈テンプレート試料から得られた勾配と切片の対を示す図であり、品質管理基準により識別された点が薄く円で描かれている図である。
【図７Ｂ】２つの互いに異なるＲＡＭテンプレート希釈から開始された複製反応の２つの組から得られたデータを示す図であって結果の両方の組に関し、初期パネル及びポストデータ品質管理パネルが示されている図であり、データ品質メトリクスに合格した同一希釈から得られたデータ点を示す図であり、図７Ｂの破線がデータ点の見かけ上負の勾配のクラスタに平行な状態で整列している状態を示す図である。
【図７Ｃ】２つの互いに異なるＲＡＭテンプレート希釈から開始された複製反応の２つの組から得られたデータを示す図であって結果の両方の組に関し、初期パネル及びポストデータ品質管理パネルが示されている図であり、テンプレートの不存在に起因して増幅する上での幾つかの失敗（ポアソン失敗率）を含むのが依然として予想される希釈度の小さいテンプレート試料から得られた勾配と切片の対を示す図である。
【図７Ｄ】２つの互いに異なるＲＡＭテンプレート希釈から開始された複製反応の２つの組から得られたデータを示す図であって結果の両方の組に関し、初期パネル及びポストデータ品質管理パネルが示されている図であり、データ品質メトリクスに合格した同一希釈から得られたデータ点を示す図であり、７Ｄの破線がデータ点の見かけ上負の勾配のクラスタに平行な状態で整列している状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、核酸配列の分子定量化に関し、リアルタイムデータ収集及びリアルタイム信号分析を技術改良するシステム及び方法を提供する。幾つかの実施形態において、かかる技術改良は、これまでエンドポイント法でしか分析できなかった核酸定量化のための限界希釈法に利用される。
【００２９】
本明細書で用いられる「配列（sequence）」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を構成するヌクレオチド塩基の順序、数、及び同定又はこの分子のサブセットを構成するヌクレオチド塩基の順序、数、及び同定を意味している。本明細書で用いられる「定量化（quantification）」は、所与の使用中における指定された配列の数の決定を意味する。幾つかの実施形態では、試料は、液体の形態である場合があり、定量化の単位は、液体の体積当たりの配列の数で表される場合がある。略号である“ｌｏｇ”は、対数変換を表すために用いられている（例えば、“ｌｏｇ（信号）”）。
【００３０】
本明細書で用いられる「分取（aliquoting）」は、多数の等量の小さな体積への初期体積の分配を意味し、「アリコート（aliquot）」は、かかる多数の等しい小さな体積（ボリューム）を意味している。本明細書で用いられる「反応コア混合物（reaction core mixture ）」は、典型的には１種類又は２種類以上の酵素、所望のイオン強度及びイオン組成を定めるイオン成分、及び反応ｐＨを調整するためのバッファー（緩衝液）を含む（これらには限定されない）生化学的増幅混合物の成分を意味している。反応コア混合物は、最終反応濃度よりも高い初期濃度でアセンブルされるのが良く、その結果、反応コア混合物は、液体ボリュームの添加により最終反応濃度に至らされるのが良く、この液体ボリュームは、場合によっては、評価分析されるべき試料である。本明細書で用いられる「反応混合物（reaction mixture）」は、最終反応濃度での反応コア混合物を含み、この場合、反応混合物は、増幅テンプレート（増幅対象）を含むのが良い。本明細書で用いられる「複製反応（replicate reaction）」は、反応混合物を名目上理想的な反応チャンバに分取することを意味し、これとは対照的に、「複製アッセイ（replicate assay）」は、名目上理想的な反応チャンバ内での反応コア混合物のアリコートを意味し、この場合、試料ボリュームは、これらアリコートに個々に添加される。
【００３１】
関心のある物質は、多くの場合、分析のために集められた試料中に少量で存在する。物質の量の推定のための生化学的方法は、かかる物質の特異的増幅又はこの物質に取り付けられたマーカの特異的増幅である。増幅の量に比例した信号を増幅プロセス中又は増幅プロセス後に測定する。増幅の量及び速度が既知である場合、かかる信号を用いると、開始物質の量を推定することができる。増幅の性状及び増幅の程度が所与の場合、初期量の推定は、預金残高にたとえて類推により説明できる。預金残高の現在金額並びに連続複利及び利子の付く時点が既知である場合、当初の金額を計算することができる。計算を行うためには預金時における利率と期間の両方を知らなければならない。
【００３２】
増幅量から初期量を計算する方法の精度は、増幅の性状の知識に依存しており、初期量の計算のためには、増幅プロセスの数学的モデルが好ましい。生化学的増幅の場合、数学的モデルは、生化学的反応メカニズムから導き出される。分子診断学において有用な２つの増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と２プライマー（ＤＮＡ断片）分枝ローリングサークル増幅（ＲＡＭ）である。ＰＣＲ及びＲＡＭ反応のモデルの予測するところによれば、各反応が理想的には指数関数的増幅を呈するはずである。他の増幅方法は、モデルを共有することができるが、互いに異なる生化学的方法による増幅を達成し、例えば、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、熱サイクルなしでＰＣＲに似たメカニズムを実行する。さらに別の増幅方法は、機械論的図表を用いて説明されているが、公式の数学的モデル（例えば、ループ媒介等温増幅、即ちＬＡＭＰ）には依然として変えられてははいない。
【００３３】
増幅による核酸の測定は、当初、標的配列の存在又は不存在を明らかにするものと解されたエンドポイント手法及び場合によっては、標的量の暫定的な評価であった。標的量の推定は、増幅生成物（産物）の量に比例した信号を繰り返し検出したり記録したりする機器の出現によって大幅に向上した。かかる機器は、リアルタイム増幅検出システムと呼ばれており、かかるシステムは、増幅反応の進展に比例する信号を提供する。リアルタイム増幅検出システムで実施される増幅反応は、リアルタイム反応と呼ばれる。
【００３４】
図１Ａ〜図１Ｄは、ＰＣＲ反応及びＲＡＭ反応から生じたリアルタイム反応結果からのプロットされたデータの例を提供している。リアルタイムＲＡＭ又はＰＣＲ反応では、早い時期の増幅生成物は、かかる早い時期の増幅生成物に起因して生じる信号が基底のレベル、即ちベースライン（例えば図１Ａ及び図１Ｂ参照）よりも上昇しないので、直接的には観察されず、増幅前信号は、機器ノイズ又は他のファクターに由来する。初期基底信号に続き、移行期間が生じ、この移行期間では、観察される信号は、基底ノイズと増幅信号の和であり、この移行期間は、増幅生成物に起因して生じる信号が基底ノイズレベルよりも大きい点まで増幅生成物が蓄積すると、発生する。理想的には、時間に対する信号の指数関数的変化が基底レベルからの移行に続く。指数関数的変化の期間に続き、増幅レートは、制限されたボリュームでの指数関数的反応について予想される通りに遅い（この増幅レートの変化は、少なくとも１つには反応体の制約、反応上の化学的性質の変化又は生成物阻害に起因している）。ＲＡＭ（図１Ｂ）とＰＣＲ（図１Ａ）の両方では、指数関数的成長レートは、プラトーまで減少し、その後、信号は、時間に関して著しくは変化しない。
【００３５】
ＲＡＭ及びＰＣＲは、図１に示されているようにリアルタイム反応において同様な蛍光信号曲線を生じさせる。しかしながら、等温ＲＡＭ反応とＰＣＲに固有の熱サイクルとの間には実質的な違いが存在する。熱サイクルは、ＰＣＲプロセスの必要な構成要素である。ＰＣＲ反応進行中におけるリアルタイム測定により、熱サイクル１回当たりに単一の観察が得られ又は熱サイクル１回当たり単一の統計的総和が得られる。分別サイクルにおけるＰＣＲ生成物収率を推定することができるが、当該技術分野の現状では、測定されることはなく又は分析されることはない。ＰＣＲに関するありふれた分析方法は、信号しきい値で分別サイクルをコンピュータ計算することであり、分別サイクルは、サイクルしきい値（Ｃｔ）又は定量化サイクル（Ｃｑ）として報告される。
【００３６】
増幅が指数関数的段階にある少数のＰＣＲサイクルが存在する。指数関数的信号変化の特徴を示すサイクルを識別することは、指数関数的段階にあるときにだけ分画サイクルが入力テンプレートレベルを反映するとみなされるので重要である。理想的には、Ｃｔ／Ｃｑが推定される分画サイクルは、増幅の指数関数的変化領域内にあるはずである。しかしながら、指数関数的段階ＰＣＲサイクルが不足していることにより、かかるサイクルを識別することは、単純な又は容易なプロセスではない。
【００３７】
ＲＡＭ反応を離散的サイクル依存プロセスではなく、連続時間依存プロセスとして分析することができ、蛍光しきい値に達するまでの時間は、リアルタイムＰＣＲのサイクルしきい値に対応した応答時間（Ｒｔ）として示される。等温増幅の自然単位は、熱サイクル１回当たりの生成物収率がＰＣＲの自然単位であるのと全く同様に、時間当たりの生成物収率単位である。サイクル数とは異なり、時間は、連続的であり、時間を無限に細分することはできず、従って、等温増幅の生成物収率測定頻度は、機器能力によって制限されるに過ぎない。
【００３８】
指数関数的段階ＰＣＲサイクルについての知見の有用性は、ＰＣＲ分析のための種々の方法を記載するものとして２０年以上も後になって続く一連の刊行物の発行の動機づけとなった。これら方法は、一般に２つのグループに分けることができ、第１は、パラメータをデータにフィッティングさせることにより数学モデルをフィッティングさせようとするパラメトリック方法であり、第２は、データから統計的尺度を直接引き出すノンパラメトリック方法である。指数関数的段階信号算定に対するノンパラメトリック方式としては、信号に対する数学的演算、例えば、サイクルデータに対する信号の第２微分値が最大の状態にある分画サイクルをコンピュータ計算することが挙げられる。パラメトリック又はモデルフィッティング方法は、コンピュータ計算を多用するプロセスである。報告された手法の中には、類似性を備えた数学的オブジェクトを反応信号全体（ベースライン、増幅、信号プラトー）にフィッティングするものがある。報告された手法の中には、代替的に改良されたモデルフィッティング技術を有するものもあり、これらコンピュータアプリケーションは、フィッティングされたモデルのパラメータ及びフィッティングされたオブジェクトの分析点又は領域を見出す。
【００３９】
ＰＣＲ指数関数的増幅段階の識別には少なくとも２つの動機づけ、即ち、Ｃｔ／Ｃｑの決定及びＰＣＲ反応効率の決定がある。多数のＰＣＲ反応の正確な比較では、各反応の効率の推定が必要である。理想的には、各ＰＣＲサイクルは、従来のサイクルの２倍の生成物を生じさせるべきである。しかしながら、最適以下のプライマー、試料中の増幅阻害因子、又は最適以下の反応上の化学的性質を含む種々のファクターの結果として、理想的な指数関数的成長には至らない成長が生じる場合があり、従って、互いに異なる効率を有する２つのＰＣＲ反応の比較により、初期量の不正確な推定値が生じる場合がある。
【００４０】
相当な技術的労力がＰＣＲ効率の設定に向けられ、例えば、www.gene-quantification.de/efficiency.htmlでのオンライン文献目録では、ＰＣＲ効率の尺度を定義して適用する種々の観点に専念した５０を超える刊行物が掲げられている。これらの刊行物及び他の刊行物は、ＰＣＲデータの領域の定義及び分析の例を提供している。しかしながら、パラメトリックモデル化では、今日までフィッティングされたモデルは、ＰＣＲで理想的に観察される指数関数的成長ではなく、フィッティングされたモデルは、指数関数的領域を見出すために用いられている。
【００４１】
現行のＰＣＲ方法における指数関数的領域を見出す幾つかのモデルを利用した方法に対する本質的な入口は、時間の経過につれて大きくは変化しない早い時期の信号として定義される信号ベースラインを見出すことである。ＰＣＲベースラインを見出す種々の方法について説明した。
【００４２】
特異性のある核酸配列検出の実用的な用途では、多数の試料相互の比較を必要とし、かかる試料は、例えば、増幅に関するポジティブコントロール（陽性対照）及び／又は既知の標的の標準濃度の組を含む。標的分子の数値単位で表される絶対定量は、ディジタルＰＣＲの採用によって証拠付けられるようにエンドポイント検出及び統計的分析を優先してリアルタイム方法を破棄するリアルタイム増幅モニタによってはまだ達成されていない。しかしながら、ＰＣＲによる正確な定量化は、実用的な制約と理論的な制約の両方に直面した。実際問題として、反応ごとの効率測定が困難なので、ＰＣＲ定量化が制限され、限界希釈でのポアソンの分散では、理論的には難題である反応ごとの５〜１０個以下のテンプレートコピーでの定量化が行われた。研究者の中には、リアルタイム信号分析の利用を諦め、その代わりに、試料希釈後におけるテンプレートコピー数のエンドポイント検出及び統計的推測を用いることによってポアソン限界希釈効果を問題から利点に転換させた。
【００４３】
ポアソン統計は、この関係において、少数の事象の分布を説明する。例えば、１０個のマーブルを１０個のカップ内にランダムにトスした場合、１個のカップには２個のマーブルが入る場合があり、別のカップにはマーブルが入らない場合がある。トスされるマーブルの数がカップの数よりも少ない場合、カップの中には、空になることが確実なものがあり、カップの数が所与の場合、マーブルの元の数を推定するために空のカップと空ではないカップの比を利用することができる。ポアソン分布は、或る数のマーブルが幾つのカップに入るかを予測するために使用できる統計学的ツールである。トスした後、ポアソン分布は、カップの標本からのマーブルのカウントから、マーブルが幾つトスされたかを予測するために使用できる。ポアソン分布は、分子診断学のための試料の希釈によるパーティショニングのための適当なモデルである。
【００４４】
本発明は、種々の実施形態において、増幅を用いた分子測定法の技術改良をもたらす。本明細書における説明は、ＲＡＭ（図１Ｂ）を用いた増幅から得られたデータに関して行われるが、本発明は、この反応メカニズムには限定されない。例えば、変形実施形態では、他の等温システムが高頻度サンプリングに使用できる。本明細書において説明する方法は、数学的に定義された領域をフィッティングする十分な試料を得ることができる増幅方法であればどのような増幅方法についても有用性がある。適当な増幅方法の例としては、ＲＡＭ、プライマージェネレーション−ローリングサイクル増幅、再結合タンパク質（ＲＰＡ）による増幅、サークル基質上におけるループ媒介増幅、ビーコンによるリアルタイムＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）、及びヘリカーゼ媒介等温ＰＣＲ（ＨＤＡ）が挙げられるが、これらには限定されない。
【００４５】
ＰＣＲは、本明細書に説明した意味では一様にはサンプリングされない。と言うのは、ＰＣＲサイクル１回につきただ１つのデータ点が観察される（又はコンピュータ計算される）からである。サンプリングは、規則的であるが、反応は、関心のある指数関数的信号変化領域では一様にはサンプリングされない。変形実施形態では、本明細書において提供する方法は、適当な生成物蓄積又は生成物蓄積マーカ検出システムにより熱サイクル動作ＰＣＲの一様なサンプリングに利用できるが、非一様な反応環境（例えば、熱的変性サイクル、サーマルランピング（thermal ramping ）において時間に対する生成物蓄積の異なるレートについての矯正を行うことが好ましい場合がある。反応温度データは、好ましくは、各時点及び生成物測定について記録される。
【００４６】
従来の方法は、反応時間を決定するためにＲＡＭ反応の増幅領域及びこのＲＡＭ反応のベースラインに対する指数関数的モデルの適合又は当てはめによって生じる線の交差を用いるものであった。かかるコンピュータ計算では、ベースラインの定義（上述したように、自明の操作ではない）が必要であり、上述したように、かかるコンピュータ計算は、効率をコンピュータ計算し又は考慮するわけではない。
【００４７】
図２は、幾つかの実施形態による単一増幅反応についてのコンピュータ実行評価のための例示の流れ図を示している。ステップ２０２では、増幅データを表中に読み込み、ステップ２０４では、有意の増幅が起こったかどうかの決定を行う（これについては、例えば図３を参照されたい）。増幅が起こっていない場合、ステップ２０６においてこの結果に注目し、ステップ２１８において評価を終了させる。増幅が起こった場合、ステップ２０８において評価に関する初期点を選択する。ステップ２１０において、初期点から追加の点を追加し、ステップ２１２において追加の点を評価し、ついには、次の点により点の集まりが所定の評価基準に関して不合格になる。ステップ２１４において点の選択された集まりを評価して適合パラメータをコンピュータ計算し、ステップ２１６において点の選択された集まりの統計的尺度を記録し（例えば、表に書き込み）、ステップ２１８において現在の反応の評価を終了させる。
【００４８】
図３は、幾つかの実施形態に従って増幅が起こったかどうかのコンピュータ実行評価（ステップ２０４）に関する例示の流れ図を示している。幾つかの実施形態では、ステップ３０２においてアルゴリズムへの入力データは、例えば図２のステップ２０２において得られた１組の（時間、信号）データである。ステップ３０４においてかかるデータを多数のセグメントに均等に細分する。セグメントを近位半部及び遠位半部に分割し、セグメント比をステップ３０６でコンピュータ計算し、ステップ３０８において、最大サブセグメント比を求める。ステップ３１０において、信号データのモードを決定し、反応の大きさをベースラインモードとプラトーモードとの差として定める。ステップ３１２において大きさの差を評価する。大きさがあらかじめ設定されたしきい値よりも大きい場合（ステップ３１２において“ＹＥＳ”）、ステップ３１６において増幅が起こったものとみなされ、ステップ３１８において図３の分析は終了し、図２の分析は、ステップ２１８に続き、もしそうでない場合（ステップ３１２において“ＮＯ”）、ステップ３１４において反応が起こらなかったものとみなされ、図３の分析は、ステップ３１８で終了し、図２の分析は、ステップ２０６に進む。
【００４９】
モデルのパラメータ（例えば、ステップ２１６で記録されている）に関する値に基づき、本発明は、試料の初期状態を表す値を算定するステップを更に含む。幾つかの実施形態では、この値は、使用中の核酸配列の量を表す値である。例えば、システムは、コピー数（例えば、ダウン症候群胎児診断に関し、正常な正倍数性補体について２１番染色体の２コピー）の推定をユーザに表示することができる。別の実施形態では、プロセス最適化のため、システムは、ユーザにメッセージ、例えば「条件Ａの結果として、条件Ｂと比較して勾配が０．１倍増しになる」表示することができる。本発明のシステム及び方法は、適合性のある多目的ツールであり、先の実施例は、２つの例示の使用から多くの考えられる出力ディスプレイのうちの２つだけを表している。
【００５０】
図１Ｂ及び図１Ｄは、典型的な等温増幅反応（ＲＡＭ反応）からの高頻度で集められたデータ点を示している。これらデータは、以下に説明するように図２及び図３の流れ図に示されているステップによって分析されたものである。本明細書において説明する方法により提供されるデータ密度は、局所データ分散を大まかな傾向変動から識別するための統計学的方法を必要とした。図４Ａは、増幅信号が当初、ベースラインよりも立ち上がっている領域における（時間、信号）データ点の分散を示している。
【００５１】
１組の（時間、信号）データを評価し（ステップ２０２）、増幅が起こったかどうかに関する判定（ステップ２０４）を図３に示されたプロセスに従って次のように行った。ステップ３０２での反応データ入力を多数のセグメントに細分し（ステップ３０４）、セグメントサイズは、データ点の数及びデータ分散に応じて変化する場合がある。各セグメントを信号データ点の早い時期の組及び信号データ点の遅い時期の組に均等に分割した。遠位信号データの和を近位信号データの和で除算することによって各セグメントについてのセグメント比をコンピュータ計算した（ステップ３０６）。セグメント比の組を図４Ｂに菱形によって図形表示する。最大セグメント比を求め（ステップ３０８）、これを用いて２つの大きなデータセグメント、即ち、データの開始から最大セグメント比まで延びるベースラインセグメント及び最大セグメント比から最後のデータ点までのプラトーセグメントを定めた（大きなセグメントは、図４Ｂに示されている）。これら大きなセグメントを半部によって図４Ｂの図形ボックスに示された近位ベースラインセグメント及び遠位プラトーセグメントに細分した。各サブセグメントの統計的モードを決定し、反応の大きさを近位ベースラインセグメントのモードと遠位プラトーセグメントのモードとの差として定めた（ステップ３１０）。大きさが既定の値よりも大きかった場合（ステップ３１２において“ＹＥＳ”）、反応を増幅信号を有するものとして評価し（ステップ３１６）、もしそうでなければ（ステップ３１２において“ＮＯ”）、反応を増幅が生じていないものとして評価した（ステップ３１４）。
【００５２】
変形実施形態では、反応が起こったかどうかについてのコンピュータ実行評価のための他のプロセスをステップ２０４の条件について用いるのが良く、かかるプロセスは、データセットごとに複雑さ及びコンピュータ計算時間の面でばらつきを呈する場合があり、この方法は、図３及び図４Ｂに記載されると共に示されているプロセスには限定されない。例えば、他の実施形態では、増幅が起こっていること／増幅が起こっていないことは、スプライン当てはめパラメータの分析によって又はシグモイドモデル（幾つかのＰＣＲ分析方法で行われているように）のパラメトリックフィッティングによって検出できる。
【００５３】
関心のある初期点の識別（ステップ２０８）は、スムージングスプラインをデータにフィッティングすることによって達成された（スムージングスプラインは、図１Ｄにグレーの線で表されている）。第１微分最大値をフィッティングしたスプラインによって得て、ステップ２０８を終了させた。変形実施形態では、初期点を選択する他の方法を利用することができる（例えば、セグメント的評価を用いることができ、この場合、データセット全体をセグメント化し、Ｒ＾２相関係数を各セグメントについて求め、最適セグメントを選択し、或いは、スプライン当てはめからの二次微分値を用いても良い）。第１微分最大値周りの固定された領域を選択し、次に、線形モデルを第１微分最大値周りのこの領域にフィッティングさせた。相関係数（Ｒ＾２）を現在の領域についてコンピュータ計算した。次に、この領域を規定されたステップサイズについて拡張し（ステップ２１０）、第２相関係数（Ｒ＾２）を拡張領域についてコンピュータ計算した。第１の相関係数と第２の相関係数の差が設定された最大値を超えていなかった場合（ステップ２１２において“ＹＥＳ”）、拡張領域を現在の領域として再定義した。そうでない場合（ステップ２１２において“ＮＯ”）、現在の領域を現在の反応について好ましいデータサブセットとしてみなし、このサブセットを説明する統計的尺度（ステップ２１４）をデータ表に書き込んだ（ステップ２１６）。この実施例では、かかるサブセットのこの尺度は、［ｌｏｇ（信号）、時間］データへの最小自乗線形回帰当てはめ、勾配及びＹ切片、相関係数（Ｒ＾２）、分散、及びサブセットの開始及び終了を定める時点を含んでいた。変形実施形態では、他の統計的尺度又はこれらの他の組み合わせを利用することができる。図６Ａは、図１Ｄのデータから説明されるように抽出されたサブセットのデータ点を示し、フィッティングされた線が上述したようにｌｏｇ−線形データにフィッティングされた線形回帰モデルから導き出された勾配及びＹ切片によって生じる。
【００５４】
Ｙ切片は、フィッティングされた線がＹ軸と交差する点である。このＹ切片は、時刻０（ゼロ）での仮想の蛍光信号であり、時刻０での大きな初期テンプレートは、勾配が等しい場合、大きなＹ切片を有することになる。Ｙ軸は、コピー数ではなく信号の単位で区別され、従って、Ｙ軸切片は、公称０（ゼロ）レベル未満である場合がある。等温反応における勾配は、経時的な生成物の増分であり、ＰＣＲ均等方式は、効率的であり、即ち、熱サイクル１回当たりの生成物の増分である。反応ごとの効率尺度は、ＰＣＲについて長く実現が要望されているが、まだ達成されていない目的であり、本明細書において提供されている高頻度データサンプリング及び分析は、等温増幅についてこの目的を達成している。
【００５５】
反応ごとの勾配のスコアとＹ切片スコアは、アプリオリに、等温反応の解釈において重要である。勾配及び切片の重要性は、図５Ａ〜図５Ｈに概念的に説明されており、その後、実験データが更に提示される。ＤＮＡ塩基配列の互いに異なる濃度を含む３つの試料溶液を考察すると共にこれら濃度がＤＮＡ濃度測定にとって十分であると想定する。例えば、適当な色素の添加後の蛍光発光量を測定することによって）。これら測定を図５Ａに示されているように縦軸上に点として表すことができ、この場合、試料の量は、比１：２：４の倍加として表される。
【００５６】
各々が理想的に希釈されるべき同一の３つの溶液から試料を想定し（この希釈は、コピー数の比を維持している）、ＤＮＡ塩基配列の直接的な測定は、もはや可能ではなく、最大希釈により、最も小さなＤＮＡコピー数が試料１つ当たり１コピーという少ないものである。図５Ｂは、縦軸上の希釈された試料の（今や、直接的には測定できない）ＤＮＡ濃度を表している。希釈された試料が理想的な指数関数的増幅システムによって増幅されるものと想定し、その結果、図５Ｃは、経時的な生成物蓄積量としての増幅プロセスを示している。図５Ｄは、時間に対してプロットされた生成物収率の対数変換を表しており、その結果、時間に対するｌｏｇ（生成物量）の直線関係が得られる。
【００５７】
図５Ｅは、理想化された増幅時間経過とリアルタイム信号トレースの表示（例えば図１Ｄ）を重ね合わせることによって指数関数的増幅のリアルタイムモニタにおいて何が見えるかを示している。この理想化されたシステムでは、増幅時間経過の勾配は、全て等しく、等温増幅では、これは、経時的な生成物合成の等しいレートを示しており、ＰＣＲでは、等しい勾配は、等しい反応効率を示している。したがって、図５Ｆでは、図５Ｅの時刻ゼロ切片が縦軸上にプロットされると共にこの切片に対応した（等しい）勾配が横軸上にプロットされた場合、その結果が増幅された初期基質量の対数に比例した点の垂直に整列した組である。図５Ｆの縦のデータは、図５Ｂの開始物質の比の理想化された実験的決定結果である。
【００５８】
実際の増幅システムでは、実験ノイズが勾配の推定値に統計誤差をもたらし、複製は、この統計誤差の大きさの推定手段となる。図５は、各複製反応が勾配及び切片をもたらす複製増幅反応を示している。図５Ｇは、切片変化の際の勾配変化の結果を示しており、この場合、大きな勾配の結果として、小さな切片が生じる。したがって、勾配が増大するスケールでプロットされた場合、対応の切片は、図５Ｈに示されているように大きさが減少する。
【００５９】
図６Ａ〜図６Ｄは、図５Ａ〜図５Ｈの理論的処理の幾つかの観点を示す実験データを示している。図６Ａは、図２に示された手法によって図１Ｄのデータから識別されたデータ点並びにこれらデータにフィッティングされる線形モデルによって定められた線を示している。図６Ｂは、ベースラインからプラトーまでの図１Ｄのデータの大きなサブセットにわたるかかるフィットされた線を示している。図６Ｃは、フィットされた線のＹ切片を示すために延長された縦軸上における全てのベースラインデータを示し、図６Ｄは、３つの追加の複製反応から得られたデータを示しており、図５Ｇの概念化を実験データで説明している。
【００６０】
図１Ａ〜図１Ｄ及び図６Ａ〜図６Ｄの図形が引き出される実験データは、一本鎖ＤＮＡサークルの単一のソースストックから作られた２つの互いに異なる希釈度を含んでいた。希釈量を計算して各希釈度の幾つかのアリコートがポアソン統計から予測されてテンプレート分子のない幾つかのアリコートを含むようなものであるようにした。各希釈度のアリコートを反応コア混合物に添加して２つの反応混合物を作製し、この反応混合物を多数の反応チャンバに分取した。４５の複製ＲＡＭ反応を各反応混合物についてリアルタイム機器で実施し、この機器をリアルタイムデータが考えられる限り最も短い時間間隔で得られるようプログラムした。これらデータを統計学用の“Ｒ”システムで実行される１組のスクリプトによって処理して各反応を図２及び図３の流れ図に示されているプロセスによって評価した。統計学的尺度の表を増幅が検出された反応について作成し、増幅が検出されなかった反応の数を同様に記録した。
【００６１】
図７Ａ及び図７Ｂは、２種類の希釈度のうちのより高い方の希釈度から得られたデータのプロットを示している。図７Ａの１７のデータ点は、各陽性反応の勾配及び切片を示している。約６２％の失敗率は、反応１回当たりの０．４７テンプレート分子のポアソン推定平均値を示唆している。初期統計的評価の示すところによれば、図７Ａの１７のデータ点のうちの３つは、低いＲ＾２相関係数及び遅い応答時間を示し、これらのデータは、考察から除外され、残りの部分が図７Ｂに見えている。これらの点は、図５Ｈに示されているように負の勾配に沿って下降している。ポアソン統計を適用することにより、更に、０．４７のポアソン平均値での４５の試料に関し、試料１つ当たり１つのテンプレートの割合で約１３の試料が期待され、試料１つ当たり２つのテンプレートの割合で約３の試料が期待され、３つのテンプレートによって１つの試料を理解する約５０％の可能性が存在する。図７Ｂにプロットされた破線の示すところによれば、図５Ｈから予想される多数の斜めの線がデータ点の一貫したグループを互いに区切っている。
【００６２】
上述したように、調製された第２の希釈度は、試料１つ当たりのテンプレート分子の４倍増しの数を有するよう設計された。図７Ｃ及び図７Ｄは、図７Ａ及び図７Ｂと同様なプロットを示しており、図７Ｃは、希釈度の低い試料から得られたデータ点の全てを示し、図７Ｄは、異常値として排除されたデータ点を示している。４５の複製反応のうちの３つの失敗は、反応チューブ１本当たり約２．７のテンプレート分子のポアソン平均値を示唆している。図７Ｄの場合のように斜めの分離線を引くことにより、ポアソン予想と一貫したデータ点の分布が明らかになっている。
【００６３】
図７Ａ〜図７Ｄに示されている結果の実証するところによれば、本発明の方法は、唯一のテンプレート分子を含む増幅反応の識別を容易にすることができる。小さなコピー数を推定するための勾配と切片のプロットの本発明による使用は、今やディジタルＰＣＲの受け持つ一般的分野においてである。現時点において実施されているように、複製反応により得られる生成物のみ／生成物なしの比がディジタルＰＣＲアッセイの統計的分析で用いられ、リアルタイムデータは、収集されない。ここに示されている結果は、適当な希釈度により作られている試料に対する等温反応から得られたリアルタイムデータを収集するという有用性又は適当な濃度の非希釈試料に関するアッセイの有用性を示している。単一のテンプレート分子を含む増幅反応の識別の有用性としては、単一分子反応のカウントを増幅し損なってゼロテンプレート分子を含むものと解される反応の比率と組み合わせた場合の標的濃度推定の効率が潜在的に高いことが挙げられる。さらに、標的濃度推定のそれ以上の効率は、２テンプレート分子増幅の数を推定できる場合の結果として生じ、そしてそれよりも大きなテンプレート分子数について同様である。
【００６４】
変形実施形態では、本発明の方法をディジタルＰＣＲに利用することができる。ディジタルＰＣＲは、幾つかのゼロを必要とし、かくして、反応１回当たりの平均コピー数が大きい場合に多数のウェルを必要とする。オプションとして規格のために幾つかのウェルが追加された本明細書において開示される方法に基づくシステムは、有利には、任意のゼロウェルなしで正確な濃度推定値をもたらすことができる。
【００６５】
本明細書において説明する方法は又、アッセイ最適化に使用できる。本発明は、１テンプレート増幅を２テンプレート、３テンプレート、又は４以上のテンプレート増幅から識別することは、標的数グループ分け（図７Ｂ及び図７Ｄに示されている）が良好に分離される場合に一層高い信頼度で行える。加うるに、反応条件の実験的操作により、図７Ｂ及び図７Ｄに破線で示された図示の標的数グループの多数の分離が可能である場合がある。さらに、本発明の方法は、反応レート算定精度を向上させることができる。
【００６６】
反応レートに関する数学モデルが規定されてはいないが密度の高いサンプリングデータを得ることができる場合、データを上述したようにサンプリングすることができる。幾つかの実施形態では、本発明は、かかるデータの各種導関数である増幅レートが変化する領域を用いて変曲点を見出すことを想定しており、これらの点を例えば、実験的に定められたファクターと相関させることができ、そしてプロセス最適化のために用いることができる。
【００６７】
新規な等温増幅方法の説明を続けているが、反応メカニズムを解明すると共に反応条件を最適化する目下の要望が存在する。統計的実験計画（ＤＯＥ）を用いたプロセス最適化は又、本明細書において開示する方法から恩恵を受けることになる。ＤＯＥでは、多数の実験ファクター（例えば、試薬濃度、又は反応条件、例えば温度）を体系的に変化させ、そしてかかる変化の作用効果を測定し、ＤＯＥの強み（長所）は、ファクターの組み合わせが別々のファクターの効果の和よりも高い効果を有する場合に相互作用するファクターの検出である。かかる実験の分析は、記述データの多様性及び詳細によって容易になり、従って、生化学的増幅反応に利用されるＤＯＥ方法は、反応プロセスの詳細な記録に起因して本明細書において開示する方法から大きな恩恵を受けることになる。
【００６８】
増幅方法の中には、線形モデルを生のデータかＲＡＭ又はＰＣＲについて用いられる対数変換後のデータかのいずれかにフィッティングさせることができるデータサブセットを生じさせることができないものがある。線形モデルをフィッティングさせることができない場合、本発明の方法により得られるデータ密度は、良好に定義された線形モデルのフィッティングを可能にすることによって依然として有利であることが分かり、これらモデルは、反応機構を説明する上で有用な場合がある。良好に定義されたモデルをフィッティングさせることができない場合、本明細書において開示する方法によって明らかにされるデータ密度は、例えば多項式スプラインの実験的なピースワイズ又はセグメントワイズフィッティングにおいて依然として有利に使用できる。
【００６９】
本明細書において説明する方法の利用分野は、高頻度生化学的増幅データ収集及び分析の有用性に関するほんの僅かな例しか示していない。ノイズ信号の自動検出及び他の品質管理用途が別の実施形態で想定される。本明細書において開示する本発明の方法は、多くの分析分野において利用できる有意なパラメータの向上した推定を向上させることができる。
【００７０】
本発明の基本的な新規な特徴を本発明の好ましい且つ例示の実施形態に適用された状態で図示すると共に説明したが、理解されるように、開示した発明の形態及び細部における省略、置換及び変更は、本発明の精神から逸脱することなく、当業者によって実施できる。さらに、容易に明らかなように、当業者には多くの改造及び変更が容易に想到できる。それ故、本発明を図示すると共に説明した構成及び作用そのものに限定することが望まれているわけではなく、従って、全ての適当な改造的均等例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲の記載にのみ基づいて定められることが意図されている。
【００７１】
実施例１
【００７２】
この実施例は、本発明の幾つかの実施形態による一本鎖核酸標的の増幅を説明している。ヒトの第Ｖ因子遺伝子の野生型遺伝子座に特有の遺伝子固有の終点を備えたＣ−プローブを以下に説明するように５′リン酸化し、次に環状化し、そして増幅して２プライマー分枝ローリングサイクル（ＲＡＭ）増幅及び分析のための増幅基質を提供した。
【００７３】
９μＭまでの合成リゲーション標的TgtFctVWT＋(5'pAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTG)(SEQ ID NO: 1)と、６μＭまでのＣ−プローブCpr8FVWtl(5'GCCTGTCCAGGGATCTGCTCTTACAATACGAGAACACCCGATTGAGAGAGTTTGGAAGTGTAGGCGTGAAGTCCATAACACATACCTGTATTCCTC)(SEQ ID NO: 2)と、１×までのＴａｑＤＮＡリガーゼバッファー（マサチューセッツ州イプスウィッチ所在のニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs））と、０．８単位／μｌまでのＴａｑＤＮＡリガーゼ（マサチューセッツ州イプスウィッチ所在のニュー・イングランド・バイオラブズ）と、１００μｌ容積までの水とを混合することによってリゲーション反応を実施した。反応混合物を初期変性のために９５℃で３０秒培養し、次に、以下の方式、即ち、ハイブリッド形成のために３０℃で１分間、リゲーションのために６５℃で３０秒間、次に変性のために９０℃で１０秒間を５回繰り返した。
【００７４】
考えられる誤差の原因、即ち、平均ゼロ効果を有するランダム誤差及び１００％未満の真の百分率の結果として低いテンプレート濃度が生じる１００％最適仮定条件に基づく誤差を念頭に置いて、環状の一本鎖ＤＮＡテンプレート濃度の推定を行った。先の誤差形式の例としては、Ｃ−プローブへの消衰係数のアルゴリズム割り当て、分光測定の際の誤差及び液体取り扱い誤差が挙げられる。理想化された１００％仮定としては、Ｃ−プローブの１００％がフルレングスであり且つ標的上でのハイブリッド形成後にリゲーション可能であるという仮定、Ｃ−プローブの１００％がキナーゼ酵素への暴露後にリン酸化されるという仮定、及びリゲーション可能なリン酸化Ｃ−プローブの１００％が上述のリゲーション方式後に環状化されるという仮定が挙げられる。ゼロ平均ランダム誤差及び１００％Ｃ−プローブ競合を仮定して、リゲーション混合物を２種類の計算濃度に希釈し、４倍の希釈度差を生じさせ、すると、複製反応を設計複製数及び反応ボリュームで実施したとき、各希釈は、テンプレート分子の全くない状態の少なくとも１つの増幅反応をもたらすはずである。
【００７５】
２×の等温反応緩衝液と０．２６単位／μｌの Bst Pol2 WS（マサチューセッツ州イプスウィッチ所在のニュー・イングランド・バイオラブズ）と０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、及び０．５×エバ・グリーン（Eva Green）（カリフォルニア州ヘイワード所在のバイオティウム・インコーポレーテッド（Biotium Inc.））とを含む２×のＲＡＭコア反応混合物を作製した。各々が２．４μＭのＲＡＭフォワードプライマーCpr8FVFwd76＿18(5'ATGGACTTCACGCCTACA)(SEQ ID NO: 3)、２μＭのＲＡＭリバースプライマーCpr8FVRvs87＿18(5'TGTATTCCTCGCCTGTCC)(SEQ ID NO: 4)、２μＭフルオロセイン（カリフォルニア州ハークルズ所在のバイオラッド（BioRad））ＤＭＳＯ溶液を含む２種類の２×プライマー−テンプレート混合物を調製し、各プライマー−テンプレート混合物を上述したように調製されたテンプレート希釈液の添加によって最終の容積にした。等量の２×コア反応混合物及び２つの２×プライマー−テンプレート混合物のうちの一方を混合することによって反応混合物を作り、次に、２０μｌ反応混合物を９６ウェルプレートのウェル中に分取した。iCyclerリアルタイム機器（カリフォルニア州ハークルズ所在のバイオラッド）でリアルタイム反応を行って連続リアルタイムデータを収集した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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