(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィーシステムによって、クロマトグラフ分離からのピークを割り当てる方法であって、
クロマトグラフィー分離器に標準物質を注入する工程であって、前記標準物質が第１のキャリブラント濃度を有する第１の分析種と、第２のキャリブラント濃度を有する第２の分析種とを含み、前記第２のキャリブラント濃度が、前記第１のキャリブラント濃度より高い工程と；
前記クロマトグラフィー分離器内で前記標準物質を分離する工程と；
それぞれ、第１の保持時間、第２の保持時間を有する第１のピークと第２のピークとを検出器で測定する工程と；
前記第１のピークが前記第１の分析種に対応するか、または前記第２の分析種に対応するか、および前記第２のピークが前記第１の分析種に対応するか、または前記第２の分析種に対応するかを、前記第１のピークおよび前記第２のピークの面積またはピーク高さのいずれかと、前記第１のキャリブラント濃度および前記第２のキャリブラント濃度に基づく比とに基づいて自動的に判別する工程と；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１の保持時間と前記第２の保持時間とに基づいて、第１の分析種時間間隔と第２の分析種時間間隔とを計算する工程と；
前記クロマトグラフィー分離器に試料を注入する工程であって、前記試料が第１の分析種と第２の分析種とを含む、該工程と；
前記クロマトグラフィー分離器内で前記試料を分離する工程と；
それぞれ、第３の保持時間、第４の分析種保持時間を有する、第３のピークと第４のピークとを前記検出器で測定する工程と；
前記第３の保持時間が前記第１の分析種時間間隔に入る場合は前記第３のピークが前記第１の分析種に対応すること、または前記第３の保持時間が前記第２の分析種時間間隔に入る場合は前記第３のピークが前記第２の分析種に対応することを自動的に出力する工程と；
前記第４の保持時間が前記第１の分析種時間間隔に入る場合は前記第４のピークが前記第１の分析種に対応すること、または前記第４の保持時間が前記第２の分析種時間間隔に入る場合は前記第４のピークが前記第２の分析種に対応することを自動的に出力する工程と；
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の分析種時間間隔が第１の上限と第１の下限とを有し、前記第１の上限が前記第１の保持時間＋前記第１の保持時間の第１の所定の割合であり、前記第１の下限が前記第１の保持時間−前記第１の保持時間の前記第１の所定の割合である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の所定の割合が約０．０５〜約０．２の範囲である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の分析種時間間隔が第２の上限と第２の下限とを有し、前記第２の上限が前記第２の保持時間＋前記第２の保持時間の第２の所定の割合であり、前記第２の下限が前記第２の保持時間−前記第２の保持時間の前記第２の所定の割合である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の所定の割合が約０．０５〜約０．２の範囲である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のピーク、前記第２のピーク、前記第３のピーク、および前記第４のピークの面積またはピーク高さに基づいて、前記試料の第１の分析種濃度と第２の分析種濃度とを自動的に出力する工程、
をさらに含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標準物質を注入する工程を繰り返す工程と；
前記クロマトグラフィー分離器内で前記標準物質を分離する工程を繰り返す工程と；
それぞれ、第５の保持時間、第６の保持時間を有する第５のピークと第６のピークとを検出器で測定する工程と；
前記第５の保持時間と前記第６の保持時間とに基づいて前記第１の分析種時間間隔と前記第２の分析種時間間隔とを再計算する工程と；
をさらに含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第５の保持時間と前記第１の保持時間との絶対値差分が第１の所定の閾値より大きいとき、または前記第６の保持時間と前記第２の保持時間との絶対値差分が第２の所定の閾値より大きいとき、前記クロマトグラフィー分離器を交換する必要があるというメッセージをコンピュータ画面上に出力する工程、
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標準物質が、ＲＦＩＤタグを有する容器に収容され、前記方法が、
前記ＲＦＩＤタグをポーリングして、前記第１の分析種および前記第２の分析種の同一性、ならびに前記第１のキャリブラント濃度と前記第２のキャリブラント濃度とを決定する工程、
をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
クロマトグラフィーカラムの種類を判別する方法であって、
クロマトグラフィー分離器に標準物質を注入する工程であって、前記標準物質が第１のキャリブラント濃度を有する第１の分析種、第２のキャリブラント濃度を有する第２の分析種、第３のキャリブラント濃度を有する第３の分析種を含み、前記第２のキャリブラント濃度が、前記第１のキャリブラント濃度よりも高く、また、第３のキャリブラント濃度が、前記第２のキャリブラント濃度よりも高い工程と；
前記クロマトグラフィー分離器内で前記標準物質を分離する工程と；
各ピークが保持時間、ピーク高さ、およびピーク面積を有する、少なくとも２つのピークを検出器で測定する工程と；
第１のピークが前記第１の分析種、前記第２の分析種、前記第３の分析種、またはこれらの組み合わせに対応するのか、第２のピークが前記第１の分析種、前記第２の分析種、前記第３の分析種、またはこれらの組み合わせに対応するのか、第３のピークが存在するかどうか、および存在する場合、前記第３のピークが前記第１の分析種、前記第２の分析種、または前記第３の分析種に対応するのかを、前記測定したピークの面積または高さのいずれかと、前記第１のキャリブラント濃度、前記第２のキャリブラント濃度、および前記第３のキャリブラント濃度に基づく１つ以上の比とに基づいて自動的に判別する工程と；
クロマトグラフィーカラムの種類を、前記第１の分析種、前記第２の分析種、および前記第３の分析種の溶出順に基づいて自動的に判別する工程と；
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年３月１５日に出願され、「クロマトグラフィーシステムの校正方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｎｇ  ａ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）」という名称の米国非仮特許出願第１３／８３４，８８３号明細書［代理人整理番号１６６３３ＵＳ１／ＮＡＴ］の優先権の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーは、分子の化学分析および分離を行うために広く用いられている分析方法である。クロマトグラフィーは、試料中に存在するマトリックス成分から１種以上の分析種（ａｎａｌｙｔｅ）を分離することを含む。分析種およびマトリックス成分は固定相との親和性を有する。イオン交換クロマトグラフィーでは、固定相は、理想的には様々なレベルの親和性を有する荷電分析種およびマトリックス成分に結合するイオン性部分で誘導体化されている。溶離液は固定相を通って移動し、そのイオン性部分への結合に関して分析種およびマトリックス成分と競合する。溶離液とは、クロマトグラフィーカラムにポンプで送液される液体または緩衝液を表すために使用される用語である。この競合中、分析種とマトリックス成分は、時間に応じて固定相から溶出することにより互いに分離した後、検出器で検出される。幾つかの典型的な検出器の例としては、電気伝導度検出器、紫外可視分光光度計、および質量分析計がある。
【０００３】
クロマトグラフィーカラムは、通常、分析種の同定と分析種の定量の両方を行うために校正プロセスを必要とする。試料溶液のクロマトグラフィーピークの化学的同一性を判定するための校正プロセスの一部として標準液を使用することが多い。標準液は１種以上の分析種を有してもよく、各分析種は既知の所定の濃度である。標準液のクロマトグラムから、標準液中の分析種の保持時間、ピーク高さ、およびピーク面積が得られる。標準液を用いて得られるこのような情報を試料溶液のクロマトグラムと比較して、試料溶液中の成分の化学的同一性を判定し、濃度を算出することができる。例えば、標準液のピーク保持時間を試料溶液のピーク保持時間と相関させて、試料クロマトグラムのピークの化学的同一性を判定することができる。さらに、標準液のピーク面積を使用して、試料クロマトグラムの対応するピーク面積の分析種濃度を比例計算することができる。
【０００４】
標準液の分析種同一性および濃度をクロマトグラフィーデータシステムのメモリ部分に入力することができる。次いで、入力した標準液のパラメータを用いて、ソフトウェアシステムで試料クロマトグラムを処理することができる。しかし、本出願人は、標準液を使用する校正プロセスには、標準液のパラメータをもはや適用不可能にし得るクロマトグラフィーカラムの交換などの幾つかの問題（例えば、保持時間のシフト）があると考える。入力したパラメータのシフトを引き起こし得る他の要因としては、溶離液状態の変化、カラムの劣化、およびカラムの汚染がある。従って、本出願人は、シームレスな校正プロセスで特定のクロマトグラフィーピークの化学的同一性を判別し、関連する濃度を特定する自動プロセスが必要であると考える。本出願人はまた、このシームレスな自動校正プロセスで、クロマトグラフィー性能のドリフトの原因を説明し、カラムを交換する必要があるとき、使用者に通知する必要があるとも考える。
【発明の概要】
【０００５】
クロマトグラフィーシステムの校正方法は、標準液を用いた自動校正方法、試料溶液の自動分析方法、および自動再校正方法を含むことができる。自動校正方法は、クロマトグラフィー分離器（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｏｒ）に標準物質を注入する工程を含む。標準物質は、第１のキャリブラント濃度を有する第１の分析種と、第２のキャリブラント濃度を有する第２の分析種とを含む。クロマトグラフィー分離器内で標準物質を分離することができる。それぞれ、第１の保持時間、第２の保持時間を有する、第１のピークと第２のピークとを検出器で測定することができる。次に、本方法は、第１のピークが第１の分析種に対応するのかまたは第２の分析種に対応するのか、および第２のピークが第１の分析種に対応するのかまたは第２の分析種に対応するのかを、第１のピークおよび第２のピークの面積またはピーク高さのいずれかと、第１のキャリブラント濃度および第２のキャリブラント濃度とに基づく比とに基づいて自動的に判別する。
【０００６】
上記方法に関して、第１の保持時間と第２の保持時間とに基づいて、第１の分析種時間間隔と第２の分析種時間間隔とを計算する工程をさらに含むことができる。クロマトグラフィー分離器に試料を注入することができ、試料は第１の分析種と第２の分析種とを含む。クロマトグラフィー分離器内で試料を分離することができる。それぞれ、第３の保持時間、第４の分析種保持時間を有する、第３のピークと第４のピークとを検出器で測定することができる。次に、本方法は、第３の保持時間が第１の分析種時間間隔に入る場合は第３のピークが第１の分析種に対応すること、または第３の保持時間が第２の分析種時間間隔に入る場合は第３のピークが第２の分析種に対応することを自動的に出力する。さらに、本方法は、第４の保持時間が第１の分析種時間間隔に入る場合は第４のピークが第１の分析種に対応すること、または第４の保持時間が第２の分析種時間間隔に入る場合は第４のピークが第２の分析種に対応することを自動的に出力する。
【０００７】
上記方法に関して、第１の分析種時間間隔は第１の上限と第１の下限とを有し、第１の上限は第１の保持時間＋第１の保持時間の第１の所定の割合であり、第１の下限は第１の保持時間−第１の保持時間の第１の所定の割合である。第１の所定の割合は約０．０５〜約０．２の範囲であってもよい。
【０００８】
上記方法に関して、第２の分析種時間間隔は第２の上限と第２の下限とを有し、第２の上限は第２の保持時間＋第２の保持時間の第２の所定の割合であり、第２の下限は第２の保持時間−第２の保持時間の第２の所定の割合である。第２の所定の割合は約０．０５〜約０．２の範囲であってもよい。
【０００９】
上記方法に関して、それは、第１のピーク、第２のピーク、第３のピーク、および第４のピークの面積またはピーク高さに基づいて、試料の第１の分析種濃度と第２の分析種濃度とを自動的に出力する工程をさらに含むことができる。
【００１０】
上記方法に関して、それは、標準物質を注入する工程を繰り返す工程と、クロマトグラフィー分離器内で標準物質を分離する工程を繰り返す工程とをさらに含むことができる。それぞれ、第５の保持時間、第６の保持時間を有する、第５のピークと第６のピークとを検出器で測定することができる。次に、第５の保持時間と第６の保持時間とに基づいて第１の分析種時間間隔と第２の分析種時間間隔とを再計算することができる。
【００１１】
上記方法に関して、それは、第５の保持時間と第１の保持時間との絶対値差分が第１の所定の閾値より大きいとき、または第６の保持時間と第２の保持時間との絶対値差分が第２の所定の閾値より大きいとき、クロマトグラフィー分離器を交換する必要があるというメッセージをコンピュータ画面上に出力する工程をさらに含むことができる。
【００１２】
上記方法に関して、ＲＦＩＤタグを有する容器に標準物質を収容することができる。ＲＦＩＤタグを読み取ってまたはポーリングして、第１の分析種および第２の分析種の同一性、ならびに標準物質の第１のキャリブラント濃度と第２のキャリブラント濃度とを算出することができる。
【００１３】
クロマトグラフィーカラムの種類を判別する方法を記載する。それは、クロマトグラフィー分離器に標準物質を注入する工程を含むことができる。標準物質は、第１のキャリブラント濃度を有する第１の分析種と、第２のキャリブラント濃度を有する第２の分析種と、第３のキャリブラント濃度を有する第３の分析種とを含むことができる。クロマトグラフィー分離器内で標準物質を分離することができる。少なくとも２つのピークを検出器で測定することができ、各ピークは保持時間、ピーク高さ、およびピーク面積を有する。次に、本方法は、第１のピークが第１の分析種、第２の分析種、第３の分析種、またはこれらの組み合わせに対応するのか、第２のピークが第１の分析種、第２の分析種、第３の分析種、またはこれらの組み合わせに対応するのか、第３のピークが存在するかどうか、および存在する場合、第３のピークが第１の分析種、第２の分析種、または第３の分析種に対応するのかを、測定したピークの面積または高さのいずれかと、第１のキャリブラント濃度、第２のキャリブラント濃度、および第３のキャリブラント濃度に基づく１つ以上の比とに基づいて自動的に判別する。本方法はまた、クロマトグラフィーカラムの種類を第１の分析種、第２の分析種、および第３の分析種の溶出順に基づいて自動的に判別する。
【００１４】
本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の現在好ましい実施形態を示し、前述の概要および後述の詳細な説明と共に、本発明の特徴を説明する役割を果たす（ここで、同様の番号は同様の要素を示す）。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】標準液を用いたクロマトグラフィーシステムの自動校正方法を示すフローチャートであり、クロマトグラフィーカラムの種類を判定する自動的方法を提供していてもよい。
【図２】試料をクロマトグラフィーにより分離する方法と、分析種同一性を判定し、分析種濃度を算出する自動的方法とを示すフローチャートである。
【図３】ドリフトの原因を説明し、クロマトグラフィーカラムを交換する必要があるとき、使用者に通知する自動的方法を提供していてもよい、クロマトグラフィーシステムを再校正する自動的方法を示すフローチャートである。
【図４】標準液（Ａ）、試料溶液（Ｂ）、およびその後の標準液（Ｃ）の再注入に関する一連のクロマトグラムを示す。
【図５】本明細書に記載のクロマトグラフィー方法に使用するのに好適なクロマトグラフィーシステムの一実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の詳細な説明は図面を参照して読むものとし、様々な図面中の同様の要素には同一の番号を付けている。図面は、必ずしも縮尺通りに記載されておらず、選択された実施形態を示し、本発明の範囲を限定しようとするものではない。詳細な説明は、本発明の原理を例として説明しているに過ぎず、限定しようとするものではない。この説明により、当業者が本発明を製造し、使用できるようになることが明らかであり、それは本発明を実施する最良の形態であると現在考えられているものを含む、本発明の幾つかの実施形態、適応形態、変形形態、代替形態、および使用について記載している。本明細書で使用する場合、任意の数値または範囲に関する「約」または「およそ」という用語は、構成要素の一部または集合が本明細書に記載のその所期の目的にかなうように機能を果たすことを可能にする好適な寸法公差を示す。
【００１７】
クロマトグラフィーを用いた分析種の分析は、分析種に関する細目を解析ソフトウェアに入力することを必要とする。クロマトグラフィーカラムによって小さな差があるため、溶離液状態の変化のため、またはカラムが劣化するまたは汚染されて起こる経時的変化のため、この情報の変更を頻繁に行わなければならない。標準液は、濃度値の比が正確に調整された２種以上のキャリブラントを含むことができ、その結果として、正確に制御された検出器応答比が得られる。これにより、カラムの変化、または使用中のカラムの汚染にもかかわらず各分析種をソフトウェアで自動的に同定することが可能となる。本明細書に記載の標準液は、化学的バーコードと称することもできる。
【００１８】
クロマトグラフィー分析中に、分析種の細目をクロマトグラフィー解析ソフトウェアに入力する必要がある。入力できるパラメータには分析種同一性および分析種濃度が含まれる。これらのパラメータを好適な積分パラメータと共に入力した後、解析ソフトウェアで分析種を分析報告の一部として自動的に同定する。しかし、ソフトウェアシステムが分析種を誤同定するのはよくあることである。これには幾つかの一般的な原因がある。例えば、１つのカラムに関するパラメータを入力した後、新しいカラムに取り替えると、前者のカラムに関して入力されたパラメータは、新しいカラムに使用するのに適していないことがある。クロマトグラフィー解析ソフトウェアの使用中に、分析種パラメータの頻繁な調節が必要となることが多い。このような変更を行わないと分析報告で分析種を誤って同定することになるため、このようなエラーが生じないように分析者の側に警戒が絶えず要求される。さらに、移動相の変更または分離温度の変化などにより分離の分析条件が変化すると、保持特性は、分析種保持パラメータの変更が必要となるほど頻繁にシフトする。さらに、強吸着汚染不純物の注入によりカラムが劣化するまたは汚染されるため、クロマトグラフィー解析ソフトウェアによる分析種の正確な同定を確実に行うには分析種保持パラメータの変更が必要となるほど、保持が低下する可能性がある。
【００１９】
正確に制御された検出器応答比に規定の１組の分析種濃度を使用する化学的バーコードにより、カラムの変化、標準物質の分析中のカラムの汚染方法にかかわらず、ピーク面積情報を使用することによりソフトウェアで各分析種を自動的に同定することが可能となり、ピーク面積情報は、クロマトグラム中の各分析種を保持時間または保持順にかかわらずクロマトグラフィー解析ソフトウェアで自動的に同定することができるようにコードされる。例えば、標準物質中に４種の成分があり、ピーク面積が：ピーク１は１０００、ピーク２は２０００、ピーク３は３０００、およびピーク４は４０００となるように標準物質が構成されている場合、ソフトウェアで１：２：３：４の面積比パターンを検索して、４種の分析種を同定する。ここでは分析種面積は任意であり、任意の面積比を使用することができるが、但し、ソフトウェアがその比を、検出限界付近で操作することによって起こるエラーが回避されるほど十分高い精度で評価できるものとする。ピーク１がフッ化物イオンであり（または面積１０００のピーク＝フッ化物イオン）、ピーク２が塩化物イオンであり、ピーク３が臭化物イオンであり、ピーク４が硝酸イオンであるという情報もソフトウェアでメモリに記憶した場合、ソフトウェアで各ピークを自動的に標識し、各ピークの相対面積に基づいてその位置を特定することができる。
【００２０】
以下では、クロマトグラフィーシステムの校正方法をより詳細に説明する。クロマトグラフィーシステムの校正方法は、標準液を用いた自動校正方法（図１）、試料溶液の自動分析方法（図２）、およびドリフトおよびクロマトグラフィーパラメータの変化の原因を説明する自動再校正方法（図３）を含む。
【００２１】
図１は、標準液を用いてクロマトグラフィーシステムを自動的に校正する方法１００を示すフローチャートである。方法１００は、標準液を注入する工程（工程１０２）と、標準物質をクロマトグラフィーにより分離する工程（工程１０４）と、標準物質のクロマトグラフィーピークを測定する工程（工程１０６）と、標準物質のピークの分析種同一性を自動的に判定する工程（工程１０８）と、保持時間に基づいて分析種時間間隔を計算する工程（工程１１０）と、任意選択的な工程としてクロマトグラフィーカラムの種類を自動的に判定する工程（工程１１２）とを含んでもよい。
【００２２】
工程１０２では、標準液をクロマトグラフィー分離器に注入することができる。１種以上の所定の分析種を正確に調整された濃度で含有する標準液を、クロマトグラフィーシステムの品質管理および校正に使用することができる。標準液は、第１のキャリブラント濃度を有する第１の分析種と、第２のキャリブラント濃度を有する第２の分析種とを含むことができる。一実施形態では、分析種は、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、および硝酸イオンなどのアニオンであってもよい。第１のキャリブラント濃度と第２のキャリブラント濃度は所定の濃度であるため、キャリブラント濃度に基づく比を計算することができる。
【００２３】
一実施形態では、４種のアニオン成分を有する標準液は、１ｐｐｍのフッ化物イオン、３ｐｐｍの塩化物イオン、１０ｐｐｍの臭化物イオン、および１０ｐｐｍの硝酸イオンを含むことができる。さらに、７種の成分を含むアニオン標準液の一例は、１ｐｐｍのフッ化物イオン、３ｐｐｍの塩化物イオン、５ｐｐｍの亜硝酸イオン、１０ｐｐｍの臭化物イオン、１０ｐｐｍの硝酸イオン、１５ｐｐｍの硫酸塩、および１５ｐｐｍのリン酸塩を含むことができる。カチオン標準液の一例は、０．５ｐｐｍのリチウム、２ｐｐｍのナトリウム、２．５ｐｐｍのアンモニウム、５ｐｐｍのカリウム、２．５ｐｐｍのマグネシウムおよび５ｐｐｍのカルシウムを含むことができる。
【００２４】
次いで、標準液をクロマトグラフィー分離器内で分離することができる（工程１０４）。試料の分離は、複数の分析種を個別の量の分析種に分離してクロマトグラフィーカラムから溶出させる、試料の物理的変換であることに留意されたい。一実施形態では、検出器は、分離された分析種のコンダクタンスを測定する電気伝導度検出器であってもよい。通常、コンダクタンスは、シーメンス（Ｓ）の単位で測定される。分析種およびマトリックス成分がカラムから溶出した後、それらを検出器で信号ピークとして測定することができる（工程１０６）。一実施形態では、図４のクロマトグラムＡに示すように、それぞれ第１の保持時間ｔ１と第２の保持時間ｔ２を有する第１のピークＰ１と第２のピークＰ２があってもよい。簡潔にするためピークＰ１およびＰ２は線として示されており、ピークは、ガウス形（Ｇａｕｓｓｉａｎ）などのクロマトグラムで通常観測される他の形状であってもよいことに留意されたい。
【００２５】
次に、方法１００は、標準液クロマトグラム中の標準物質のピークの分析種同一性を自動的に判定する（工程１０８）。換言すれば、本方法は、どのピークがどの分析種に対応するのかを判定する。例えば、本方法は、第１のピークが第１の分析種に対応するのかまたは第２の分析種に対応するのかを自動的に判別する。同様に、本方法は、第２のピークが第１の分析種に対応するのかまたは第２の分析種に対応するのかを自動的に判別する。この自動判別は、第１のピークと第２のピークの面積またはピーク高さに基づいて行うことができる。注入前の標準液の組成に関する事前の知見を用いて、第２のキャリブラント濃度［Ａ２］と第１のキャリブラント濃度［Ａ１］とに基づく比を計算することができる。例えば、単位濃度当たりの第１の分析種に対する検出器の感度と第２の分析種に対する感度が同じであると仮定すると、第２のキャリブラント濃度が第１のキャリブラント濃度より２倍高い場合、比の値（Ａ２：Ａ１）は２となり得る。比の値に第１のピーク面積を乗じて、その積の値が第２のピーク面積に対応するかどうかを調べることができ、そのようになる場合、第１のピークは第１の分析種に対応し、第２のピークは第２の分析種に対応することになる。同様に、比の値に第２のピーク面積を乗じて、その積の値が第１のピーク面積に対応するかどうかを調べることができ、そのようになる場合、第２のピークは第１の分析種に対応し、第１のピークは第２の分析種に対応することになる。本明細書に記載のように、保持時間を用いることなく分析種同一性が計算されることに留意されたい。これにより、２種以上のクロマトグラフィーカラムについて分析種同一性を自動的に計算することが可能になる。
【００２６】
特定の状況下では、検出器信号の応答感度が、標準液中の第１の分析種Ａ１と、第２の分析種Ａ２とで異なる可能性がある。式ｋ×［Ａ１］／［Ａ２］（式中、ｋ＝感度値である）を用いて、第１のキャリブラント濃度［Ａ１］と第２のキャリブラント濃度［Ａ２］とに基づく比を算出することができる。例えば、検出器は、単位濃度当たりの第１の分析種Ａ１に対する感度の方が第２の分析種Ａ２に対する感度より１０倍高く、従って、ｋ＝１０である。ピーク面積比２：１（Ａ１：Ａ２）の標準液を構成するために、第２のキャリブラント濃度［Ａ２］は第１のキャリブラント濃度［Ａ１］より５倍高い必要がある。上記式を用いて、比２を計算することができる（例えば、１０×１／５＝２）。従って、工程１０８を行い、検出器で第１の分析種Ａ１に対する感度と第２の分析種Ａ２に対する感度が異なるとき、キャリブラント濃度と感度値とに基づく比を計算して分析種同一性を判定することができる。
【００２７】
標準液のピークの化学的同一性を判別したところで、保持時間に基づいて分析種時間間隔を計算することができる（工程１１０）。分析種時間間隔を使用して、試料溶液のクロマトグラフィーピークの化学的同一性を判別することができる。さらに、分析種時間間隔を使用して積分パラメータを設定し、ピーク下の面積を算出することができる。それぞれ第１の保持時間ｔ１と第２の保持時間ｔ２に基づいて、第１の分析種時間間隔ｔAN1と第２の分析種時間間隔ｔAN2を計算することができる（図４のクロマトグラムＡ）。より詳細には、第１の分析種時間間隔ｔAN1は、図４に示すように、第１の上限ｔUL1と第１の下限ｔLL1とを有することができる。第１の上限ｔUL1は第１の保持時間ｔ１＋第１の保持時間ｔ１の第１の所定の割合であってもよく、第１の下限ｔLL1は第１の保持時間ｔ１−第１の保持時間ｔ１の第１の所定の割合であってもよい。一実施形態では、第１の所定の割合は約０．０５〜約０．２の範囲であってもよい。例えば、第１の保持時間の第１の所定の割合は０．１×ｔ１であってもよい。
【００２８】
第１の分析種時間間隔ｔAN1と同様に、第２の分析種時間間隔ｔAN2は、図４に示すように、第２の上限ｔUL2と第２の下限ｔLL2とを有することができる。第２の上限ｔUL2は第２の保持時間ｔ２＋第２の保持時間ｔ２の第２の所定の割合であってもよく、第２の下限ｔLL2は第２の保持時間ｔ２−第２の保持時間ｔ２の第２の所定の割合であってもよい。第２の所定の割合は約０．０５〜約０．２の範囲であってもよい。例えば、第２の保持時間の第２の所定の割合は０．１×ｔ２であってもよい。
【００２９】
工程１１０の後、方法１００は、クロマトグラフィーカラムの種類を自動的に判定する任意選択的な工程１１２に移行しても、または図２に示す試料溶液を分析する自動的方法２００に移行してもよい。任意選択的な工程１１２については後述することに留意されたい。図２に示すように、方法２００は、試料を注入する工程（工程２０２）と、試料をクロマトグラフィーにより分離する工程（工程２０４）と、試料のクロマトグラフィーピークを測定する工程（工程２０６）と、試料のピークの分析種同一性を自動的に判定する工程（工程２０８）と、試料のピークに対応する分析種濃度を自動的に算出する工程（工程２１０）とを含んでもよい。
【００３０】
試料をクロマトグラフィー分離器に注入することができ、試料は、例えば、第１の分析種と第２の分析種などの１種以上の分析種を含む（工程２０２）。試料をクロマトグラフィー分離器内で分離することができる（工程２０４）。検出器は分離された分析種を、関連する保持時間を有するクロマトグラフィーピークの形態で、検出器を用いて測定することができる（工程２０６）。一実施形態では、図４のクロマトグラムＢに示すように、それぞれ第３の保持時間ｔ３と第４の分析種保持時間ｔ４を有する第３のピークＰ３と第４のピークＰ４を検出器で測定することができる。次いで、関連する保持時間が特定の分析種時間間隔内に入るとき、測定したピークの分析種同一性をシステムで自動的に判定することができる（工程２０８）。分析種同一性を判定した後、それをソフトウェアユーザーインターフェースを介して使用者に出力することができる。
【００３１】
分析種同一性自動判定工程２０８では、本方法は、第３の保持時間ｔ３が第１の分析種時間間隔ｔAN1に入る場合は第３のピークＰ３が第１の分析種に対応するかどうか、または第３の保持時間ｔ３が第２の分析種時間間隔ｔAN2に入る場合、第３のピークＰ３が第２の分析種に対応することを判定する。保持時間がｔLLより大きく、ｔULより小さい場合、保持時間は分析種時間間隔に入ることに留意されたい。本方法は、第４の保持時間ｔ４が第１の分析種時間間隔ｔAN1に入る場合は第４のピークＰ４が第１の分析種に対応するかどうか、または第４の保持時間ｔ４が第２の分析種時間間隔ｔAN2に入る場合は第４のピークＰ４が第２の分析種に対応することも判定する。
【００３２】
試料のピークの分析種同一性を判定する方法を説明してきたが、以下では、試料ピークの分析種濃度を自動的に算出する方法である工程２１０について説明する。第１のピーク、第２のピーク、第３のピーク、および第４のピークの面積またはピーク高さに基づいて、試料の第１の分析種濃度と第２の分析種濃度を計算する。多くの場合、分析種濃度の計算にピーク面積を使用し、ここで、ピーク面積は分析種時間間隔中の信号の積分である。しかし、他の場合には、ピーク高さを使用して回帰分析により分析種濃度を計算できるとき、ピーク面積ではなくピーク高さを使用する方が好都合なことがある。一実施形態では、第１のピーク面積と第２のピーク面積を使用して、回帰分析により第１の分析種と第２の分析種の校正係数を求めることができる。校正後、第３のピーク面積と第４のピーク面積を使用し、求められた校正係数を用いて試料の第１の分析種濃度と第２の分析種濃度を計算することができる。
【００３３】
工程２１０後、方法２００は、再度、方法２００の実施に移行し、もう一度試料注入を行ってもよく、またはそれは再校正方法３００に移行してもよい。試料注入を所定の回数行ったとき、所定の時間が経過した後、またはカラム、溶離液組成、もしくは温度などのクロマトグラフィーパラメータが変化した後、本方法２００は再校正方法３００に移行してもよい。一実施形態では、標準物質の校正１００を実施してから経過した所定の時間は１０分〜約８時間の範囲であってもよい。
【００３４】
図３に示すように、方法３００は標準物質を再注入する工程（工程３０２）と、標準物質のクロマトグラフィーによる分離を繰り返す工程（工程３０４）と、標準物質のクロマトグラフィーピークの測定を繰り返す工程（工程３０６）と、保持時間に基づいて分析種時間間隔を再計算する工程（工程３０８）と、標準物質の保持時間と再注入された標準物質の保持時間との絶対値差分を求める工程（工程３１０）とを含んでもよい。絶対値差分が所定の閾値以下である場合、方法３００は再計算した分析種時間間隔を用いて方法２００に戻る。しかし、絶対値差分が所定の閾値より大きい場合、方法３００はクロマトグラフィーカラムの交換が必要であるというメッセージを出力する（工程３１２）。工程３１０は、保持時間の変化が小さく、クロマトグラフィーカラムの性能仕様と一致した通常の操作上のばらつきの一部であるかどうかを判定し、その場合、再校正は適切であることに留意されたい。しかし、保持時間の変化がかなり大きくなり、正常な操作上のばらつきの範囲を越え、クロマトグラフィーカラムを新しいものと交換する必要があることを示すことがある。所定の閾値は絶対値差分（例えば、保持時間の絶対的時間シフト）に基づいても、または絶対値％差（ａｂｓｏｌｕｔｅ ％ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）に基づいてもよいことに留意されたい。絶対値％差では、それは、主要分析種の保持時間などの、特定の保持時間の約５％〜約５０％の範囲であってもよい。
【００３５】
工程３０６に関して、検出器は分離された分析種を、関連する保持時間を有するクロマトグラフィーピークの形態で、検出器を用いて測定することができる。一実施形態では、図４のクロマトグラムＣに示すように、それぞれ第５の保持時間ｔ５と第６の分析種保持時間ｔ６を有する第５のピークＰ５と第６のピークＰ６を検出器で測定することができる。
【００３６】
工程３０８に関して、それぞれ第５の保持時間ｔ５と第６の保持時間ｔ６に基づいて、第１の分析種時間間隔ｔAN1と第２の分析種時間間隔ｔAN2を再計算することができる。図４のクロマトグラムＣに示すように、第１の分析種時間間隔ｔAN1と第２の分析種時間間隔ｔAN2はドリフトまたは他のクロマトグラフィーパラメータ変化のためシフトする可能性がある。
【００３７】
工程３１０に関して、第５の保持時間ｔ５と第１の保持時間ｔ１との絶対値差分が第１の所定の閾値より大きいとき、または第６の保持時間ｔ６と第２の保持時間ｔ２との絶対値差分が第２の所定の閾値より大きいとき、クロマトグラフィー分離器を交換する必要があるというメッセージをコンピュータ画面上に出力することができる。あるいは、Ｐ１の絶対値％差は、ｔ５からｔ１を減じ、それをｔ１で除し、１００を乗じて、その絶対値を取ること（即ち、
【数１】
0006357527.tif 000002
）により計算することができる。Ｐ２の絶対値％差は、ｔ６からｔ２を減じ、それをｔ２で除し、１００を乗じて、その絶対値を取ること（即ち、
【数２】
0006357527.tif 000003
）により計算することができる。
【００３８】
分析種保持時間の変化に加えて、他の基準を、カラムを交換すべきときを特定するための判断基準として使用することができる。例えば、図４の第１のピークと第２のピークなどの１対のピークが、指定された最小分離能または指定された最小保持時間を有する必要があり得、これらのパラメータのどちらかが工場で設定された最小値未満、または使用者が設定した最小値未満になったとき、ソフトウェアで使用者に自動的に通知することができる。
【００３９】
前述のように、使用者は、方法１００に使用される標準液に関連する校正パラメータを入力することができる。しかし、ＲＦＩＤタグを使用して、これらのパラメータをシームレスに且つ自動的に転送することができる。一実施形態では、標準液はＲＦＩＤタグを有する容器に収容される。ＲＦＩＤタグは関連する校正パラメータを有するメモリ部分を有することができ、情報をクロマトグラフィーシステムに転送することができる。このような情報は、第１の分析種と第２の分析種の同一性、ならびに第１のキャリブラント濃度および第２のキャリブラント濃度を含むことができる。あるいは、情報は、システムで標準物質の関連パラメータを特定することを可能にする部品番号または数値コードであってもよい。クロマトグラフィーシステムは、データをシステムに転送することができるようにＲＦＩＤタグを無線で問い合わせるまたはポーリングすることができるＲＦＩＤ読み取り装置をオートサンプラー内に備えてもよい。あるいは、標準物質容器を指定された標準物質ホルダに入れた後、標準物質容器からの情報が機器で自動的に読み取られるように、標準物質容器は機器に関連する指定された記憶位置を有することができる。さらに、希釈情報も校正ソフトウェアに自動的にロードされるように、標準物質の希釈倍率も標識情報にコードすることができる。
【００４０】
図１の工程１１２を参照すると、方法１００はまた、クロマトグラフィーカラムの種類を判別する工程も含むことができる。例えば、その種類としては、ＩｏｎＰａｃ  ＡＳ４Ａ−ＳＣカラム、ＩｏｎＰａｃ  ＡＳ１２Ａカラム、またはＩｏｎＰａｃ  ＡＳ１４カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから市販）を挙げることができる。以下では、３種の分析種を含有する標準液を用いてクロマトグラフィーカラムの種類の自動判定を行う方法１００について説明する。標準液は、第１のキャリブラント濃度を有する第１の分析種と、第２のキャリブラント濃度を有する第２の分析種と、第３のキャリブラント濃度を有する第３の分析種とを含有する。クロマトグラフィー分離器内で標準物質を分離した（工程１０４）後、少なくとも２つのピークを検出器で測定することができ、各ピークは保持時間、ピーク高さ、およびピーク面積を有する（工程１０６）。２種のこれらの分析種が共溶出する場合、ピークが２つしかない場合があることに留意されたい。次に、測定した各ピークの分析種同一性を自動的に判定することができる（工程１０８）。本方法は、標準液の特定の分析種への第１のピーク、第２のピーク、および第３のピーク（存在する場合）の対応を、測定したピークの面積または高さのいずれかと、第１のキャリブラント濃度、第２のキャリブラント濃度、および第３のキャリブラント濃度に基づく１つ以上の比とに基づいて判定する。試料中の分析種の溶出順を判定した後、クロマトグラフィーカラムの種類を自動的に判別することができる（工程１１２）。溶出順は、クロマトグラフィーカラムから出力されたピークの時系列順を示す。様々な種類のカラムに関する分析種の溶出順をクロマトグラフィーシステムのメモリ部分に記憶できることに留意されたい。
【００４１】
クロマトグラフィーカラム同定の一例として、標準液は４種の分析種を有することができる。この標準液は第１の分析種としてフッ化物イオン、第２の分析種として塩化物イオン、第３の分析種として臭化物イオン、および第４の分析種として硝酸イオンを有する。第１の分析種、第２の分析種、第３の分析種、および第４の分析種は、それぞれ第１の分析種濃度、第２の分析種濃度、第３の分析種濃度、および第４の分析種濃度を有する。第２の分析種濃度は第１の分析種濃度より２倍高くてもよく、第３の分析種濃度は第１の分析種濃度より３倍高くてもよく、第４の分析種濃度は第１の分析種濃度より４倍高くてもよい。
【００４２】
分析種ピークの溶出順はクロマトグラフィーカラムの種類により変わり得ることに留意されたい。例えば、第１の種類のカラムを用いると、溶出順は、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、および硝酸イオンであり、フッ化物イオンに対して正規化したピーク面積比は１：２：３：４となり得る。しかし、第２の種類のクロマトグラフィーカラムを用いると、溶出順は、フッ化物イオン、塩化物イオン、硝酸イオン、および臭化物イオンに変化し、フッ化物イオンに対して正規化したピーク面積比は１：２：４：３となり得る。標準液を同定するための自動同定プロセスは保持時間値ではなく、ピーク面積比に基づくため、本明細書に記載の校正方法は、異なる溶出時間順を有する２種以上のクロマトグラフィーカラムで行うことができる。
【００４３】
分析種ピークは、クロマトグラフィーカラムの種類により共溶出し得ることにも留意されたい。例えば、第３の種類のカラムを用いると、４種の分析種のうちの２種が共溶出し得る。臭化物イオンと硝酸イオンは一緒に共溶出し、その結果、溶出順はフッ化物イオン、塩化物イオン、および臭化物イオン／硝酸イオンとなり、フッ化物イオンに対して正規化したピーク面積比は１：２：７となり得る。
【００４４】
上記標準液の自動分析で、標準液クロマトグラムに関して多くの順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を分析することができる。２種の分析種が共溶出する場合、自動分析は、１：２：７、１：５：４、３：３：４、５：２：３等を含む順列に関して照会することができる。従って、同じ標準液を使用し、２種以上のクロマトグラフィーカラムについて自動的に分析することができる。
【００４５】
さらに、カラム選択性パラメータおよび溶出順が分かると、標準物質情報と表にした異なる選択性を有する１組のカラムに関する保持情報との組み合わせも可能となり、この参照情報と比較するだけでカラムの種類の判別を行うことが可能となる。
【００４６】
方法１００を参照すると、ソフトウェアでピークを正確に割り当てるためには、ソフトウェアが標準物質の同一性を認識している必要がある。標準物質は部品番号もしくは数値コードで数値的に識別することができるか、または標準物質はバーコードもしくはＲＦＩＤタグで識別することができる。このような情報が標準物質を収容するオートサンプラーバイアル上に配置されている場合、機器を校正する前に数値コード、ＲＦＩＤタグまたはバーコードを機器に呈示することができるか、または機器でＲＦＩＤタグもしくはバーコードを自動的に読み取ることができる。あるいは、標準物質容器を指定された標準物質ホルダに入れた後、標準物質容器からの情報が機器で自動的に読み取られるように、標準物質容器は機器に関連する指定された記憶位置を有することができる。さらに、希釈情報も校正ソフトウェアに自動的にロードされるように、標準物質の希釈倍率を標準物質情報にコードすることもできる。
【００４７】
以下では、本明細書に記載の本発明に使用するのに好適な一般的なクロマトグラフィーシステムについて説明する。図５は、オートサンプラー５２２、ポンプ５０２、電解質溶離液生成装置５０３、触媒式除去装置５０８、脱気アセンブリ５１０、注入弁５１２、クロマトグラフィー分離装置５１４、検出器５１６、マイクロプロセッサ５１８、およびＲＦＩＤ読み取り装置５２４を備える、クロマトグラフィーシステム５００の一実施形態を説明する。リサイクルライン５２０を使用して、液体を検出器５１６の出口から脱気アセンブリ５１０の入口に送液してもよい。
【００４８】
液体供給源から液体をポンプで送液し、電解質溶離液生成装置５０３に流体接続されるように、ポンプ５０２を構成することもできる。電解質溶離液生成装置５０３は、例えば、ＫＯＨまたはメタンスルホン酸などの溶離液を生成するように構成される。触媒式除去装置５０８は、触媒反応によりガスを除去するように構成される。触媒式除去装置５０８は、例えば、水素と酸素を結合させて水にし、過酸化水素およびオゾンを分解することができる白金または他の材料などの触媒を含んでもよい。触媒式除去装置に関する詳細は、米国特許第７，３２９，３４６号明細書および米国特許第８，０４３，５０７号明細書に記載されており、これらは参照により本明細書に援用される。脱気アセンブリ５１０を使用して、触媒式除去装置５０８で除去されない残留ガスを除去してもよい。一実施形態では、残留ガスは二酸化炭素、水素、および酸素であってもよい。検出器５１６の下流にあるリサイクルライン５２０でリサイクルされた液体を使用して、脱気アセンブリ５１０からガスを排出することができる。注入弁５１２を使用して、一定量の液体試料を溶離液流に注入することができる。クロマトグラフィー分離装置５１４を使用して、液体試料中に存在する様々なマトリックス成分を目的の分析種から分離することができる。クロマトグラフィー分離装置５１４の出口を検出器５１６に流体接続し、液体試料の分離された化学成分が存在するかどうかを判断することができる。
【００４９】
検出器５１６は、紫外可視分光計、蛍光分光計、電気化学検出器、電気伝導度検出器、電荷検出器、またはこれらの組み合わせの形態であってもよい。荷電バリア（ｃｈａｒｇｅｄ  ｂａｒｒｉｅｒ）および２つの電極に基づく電荷検出器に関する詳細は、米国特許出願公開第２００９０２１８２３８号明細書に記載されており、参照によりその内容全体が本明細書に援用される。リサイクルライン５２０が必要でない状況では、検出器５１６は質量分析計または荷電化粒子検出器の形態であってもよい。荷電化粒子検出器は流出液流（ｅｆｆｌｕｅｎｔ  ｆｌｏｗ）を噴霧して荷電粒子を生成し、これを分析種濃度に比例した電流として測定することができる。荷電化粒子検出器に関する詳細は、米国特許第６，５４４，４８４号明細書および米国特許第６，５６８，２４５号明細書に記載されており、これらは参照によりその内容全体が本明細書に援用される。
【００５０】
電気回路はマイクロプロセッサ５１８とメモリ部分とを備えてもよい。マイクロプロセッサ５１８を使用して、クロマトグラフィーシステム５００の操作を制御することができる。マイクロプロセッサ５１８はクロマトグラフィーシステム５００に内蔵されていても、またはクロマトグラフィーシステム５００と通信するパーソナルコンピュータの一部であってもよい。マイクロプロセッサ５１８は、オートサンプラー５２２、ＲＦＩＤ読み取り装置５２４、ポンプ５０２、電解質溶離液生成装置５０３、注入弁５１２、および検出器５１６などのクロマトグラフィーシステムの１つ以上の構成要素と通信し、それらを制御するように構成されてもよい。クロマトグラフィーシステム５００は、標準液と試料溶液を分析し、化学成分および関連する濃度値を特定するのに使用される特定の装置であることに留意されたい。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、当業者にはこのような実施形態は例として提供されているに過ぎないことが明らかであろう。多くの変形形態、変更形態、および代替形態が当業者に想到されるが、これらは本発明から逸脱するものではない。本発明を特定の変形形態および説明図に関して説明してきたが、本発明は記載される変形形態および図に限定されるものではないことが当業者には分かるであろう。さらに、前述の方法および工程が特定の順番で行われる特定の事象を示す場合、特定の工程の順序を変更してもよく、このような変更は本発明の変形形態によるものであることが当業者には分かるであろう。さらに、これらの工程の幾つかは、前述のように逐次的に行うことができるだけでなく、可能な場合、並列処理で同時に行うこともできる。従って、本発明の変形形態が特許請求の範囲に記載されている本発明の開示および均等物の趣旨に入る限り、本特許はそれらの変形形態も包含するものとする。
【図１】
0006357527.tif 000004
【図２】
0006357527.tif 000005
【図３】
0006357527.tif 000006
【図４】
0006357527.tif 000007
【図５】
0006357527.tif 000008