(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞、組織、器官または生物の状態をモニタリングする方法であって、前記細胞、組織、器官または生物に由来するマイクロ粒子の試料について、
（ａ）ＧＭ１ガングリオシドを含む、コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）と結合するマイクロ粒子における選択されたポリペプチド（「ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチド」）の、
（ｂ）露出したホスファチジルセリンを含む、アネキシンＶと結合するマイクロ粒子における前記選択されたポリペプチド（「アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチド」）
に対する比を確定するステップを含み、このように確定された前記（ｂ）に対する（ａ）の比（「アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比」）が、前記細胞、組織、器官または生物の状態を示す方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、テトラスパニンタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７６０．１を有するＣＤ９、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４３４７．１を有するＣＤ８１、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７１．１を有するＣＤ６３）、Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４１５３．２を有するＲａｂ５ａ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２８５９．１を有するＲａｂ５ｂおよびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４５７４．２を有するＲａｂ５ｃ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４５７１．２を有するＲａｂ−２７ａおよびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４１５４．２を有するＲａｂ−２７ｂ、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６８５２．１を有するＲａｂ３５）、ＬＡＭＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５５２．３を有するＬａｍｐ１およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２２８５．１を有するＬａｍｐ２）、カベオリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７４４．２を有するカベオリン１およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２２４．１を有するカベオリン２）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２１６２０．１を有するトランスフェリン受容体（ＴＲＦＣ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０７０１４５．１を有するクラスリン軽鎖Ａ（ＣＬＴＡ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１８２５．１を有するクラスリン軽鎖Ｂ（ＣＬＴＢ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４８５０．１を有するクラスリン重鎖１（ＣＬＴＣ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６２８３．１を有するＴｓｇ１０１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３７５０６．２を有するＡｌｉｘ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５９３．１を有するＰＡＩ−１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２６２３．２を有するＰＬＧＦ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０２９１２４．１を有するプロカルシトニン、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６２６３．１を有するＳ−１００ｂ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２９０７１．１を有するＴＧＦベータ２（ＴＧＦＢ２）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２４５．１を有するＴＩＭＰ１からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７６０．１を有するＣＤ９を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）と結合する前記試料におけるマイクロ粒子を選択することにより、ＧＭ１ガングリオシドを含む前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含む、またはアネキシンＶと結合する前記試料におけるマイクロ粒子を選択することにより、露出したホスファチジルセリンを含む前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の前に、サイズ排除クロマトグラフィーにより、マイクロ粒子をサイズにより選択するステップをさらに含む、またはそれぞれ前記細胞、組織、器官もしくは生物の状態を示す複数の選択されたポリペプチド種についてのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比を複数含むプロファイルを確定するステップを含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞、組織、器官または生物の状態が、心血管疾患状態を含み、前記ポリペプチドがＣＤ９を含み、前記アネキシンＶ  ＣＤ９マイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドの比が、健常状態と比較して心血管疾患状態においてより高い請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞、組織、器官または生物の状態が、慢性心不全（ＣＨＦ）疾患状態を含み、前記ポリペプチドがＣＤ９を含み、前記アネキシンＶ  ＣＤ９マイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドの比が、健常状態と比較して慢性心不全（ＣＨＦ）疾患状態においてより高い請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞、組織、器官または生物の状態が、急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患状態を含み、前記ポリペプチドがＣＤ９を含み、前記アネキシンＶ  ＣＤ９マイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドの比が、健常状態と比較して急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患状態においてより高い請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞、組織、器官または生物の状態が、子癇前症状態を含み、前記ポリペプチドが、ＰＡＩ−１、ＰＬＧＦ、プロカルシトニン、Ｓ１００ｂ、ＴＧＦβおよびＴＩＭＰ−１のうち１種またはこれらの組み合わせを含み、前記アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチド／組み合わせに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチド／組み合わせの比が、健常状態と比較して子癇前症状態においてより高い請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組み合わせは、ＰＡＩ１とＰＬＧＦ、ＰＡＩ１とプロカルシトニン、ＰＡＩ１とＳ１００ｂ、ＰＡＩ１とＴＧＦベータ２、ＰＡＩ１とＴＩＭＰ１、ＰＬＧＦとプロカルシトニン、ＰＬＧＦとＳ１００ｂ、ＰＬＧＦとＴＧＦベータ２、ＰＬＧＦとＴＩＭＰ１、プロカルシトニンとＳ１００ｂ、プロカルシトニンとＴＧＦベータ２、プロカルシトニンとＴＩＭＰ１、Ｓ１００ｂとＴＧＦベータ２、または、Ｓ１００ｂとＴＩＭＰ１とＴＧＦベータ２もしくはＴＩＭＰ１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）前記マイクロ粒子が、ＣＤ９＋マイクロ粒子を含む、または、
（ｂ）前記マイクロ粒子が、微小胞、エキソソーム、エクトソームもしくはアポトーシス小体を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｃ）前記細胞、組織、器官もしくは生物の状態が、生理学的状態、分化状態、発生状態もしくは代謝状態もしくは病理学的状態を含む、または、
（ｄ）前記細胞、組織、器官もしくは生物の状態が、病的である状態、予後不良の状態、病からの回復の状態、予後良好の状態もしくは健常状態を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｅ）前記試料が、尿、血液、涙、唾液、気管支肺胞洗浄液、腫瘍浸出液、精巣上体液、羊水および乳汁からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記病理学的状態が、疾患状態、ヒト疾患状態、食中毒状態、糖尿病状態、免疫障害状態、神経変性障害状態、発癌性状態、癌性状態または腫瘍状態である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
２以上の試料の間の前記選択されたポリペプチドのレベル、濃度または量を正規化するステップをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記正規化が、ＢＮＰ、ＣＤ９および／またはＴＩＭＰ−１ポリペプチドを参照して行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）細胞、組織、器官または生物の状態の変化を検出するための方法であって、前記細胞、組織、器官または生物の、アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比（または係る比を含むプロファイル）の変化を検出するステップを含み、前記変化が、前記細胞、組織、器官または生物の状態の変化を示す方法、
（ｂ）細胞、組織、器官または生物が、特定の状態にあることを確定するための方法であって、前記方法が、前記細胞、組織、器官または生物の、アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比（または前記比を含むプロファイル）を、前記特定の状態にあることが分かっている細胞、組織、器官または生物の、アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比（または係る比を含むプロファイル）と比較するステップを含む方法、あるいは
（ｃ）細胞、組織、器官または生物における疾患を検出する方法であって、前記細胞、組織、器官または生物から得られた試料において請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法を行うステップと、これにより得られた前記アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比を、罹患した細胞、組織、器官もしくは生物のものであるか、罹患した細胞、組織、器官もしくは生物に由来することが分かっている試料のアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比と比較するステップとを含む方法。
【請求項１８】
（ａ）ＧＭ１ガングリオシドを含む前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップ、および／または
（ｂ）露出したホスファチジルセリンを含む前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップ
を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）が、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）と結合する前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含む、もしくはステップ（ｂ）が、アネキシンＶと結合する前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含む、またはその両方である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）サイズ排除クロマトグラフィーにより、マイクロ粒子をサイズにより選択するステップをさらに含む、
（ｂ）前記マイクロ粒子が、ＣＤ９＋マイクロ粒子を含む、
（ｃ）前記試料が、尿、血液、涙、唾液、気管支肺胞洗浄液、腫瘍浸出液、精巣上体液、羊水および乳汁からなる群から選択される、または
（ｄ）前記マイクロ粒子が、微小胞、エキソソーム、エクトソームもしくはアポトーシス小体を含む請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
マイクロ粒子のアネキシンＶ細画分もしくはマイクロ粒子のＣＴＢ結合細画分またはその両方を選択するステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
分画されたマイクロ粒子試料において、膜タンパク質もしくは内腔タンパク質またはその両方を検出および／または定量化するステップをさらに含む請求項２１に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学および遺伝学の分野に関する。本発明は、医学の分野に関する。
【０００２】
特に、本発明は、細胞、組織、器官または生物の生理学的状態または病理学的状態をモニタリングする方法に関する。本発明はまた、癌等の疾患の診断および治療に関する。
【０００３】
米国特許出願第６０／７１３，９９２号、米国特許出願第１２／０６５，５４９号、米国特許出願第１２／０６５，５５１号、米国特許出願第６０／８７８，２２２号、米国特許出願第１２／３７７，３９８号、米国特許出願第６１／０６６，６７１号、米国特許出願第６１／２２７，８６５号および米国特許出願第６１／２５７，１２１号を参照する。国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００３２０６、ＰＣＴ／ＳＧ２００６／０００２３３、ＰＣＴ／ＳＧ２００６／０００２３２、ＰＣＴ／ＳＧ２００７／０００２５７およびＰＣＴ／ＳＧ２００９／００００６２も参照する。
【０００４】
前述の出願、ならびに本願および前述の出願のそれぞれにおいて、前述の出願それぞれの審査手続き中も含み、引用または参照されている各文献（「出願および論文に引用された文献」）、ならびに前述の出願および論文のそれぞれならびに出願および論文に引用された文献のいずれにおいて引用または言及されているいずれの製品のいずれのメーカー説明書またはカタログも、これにより、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。さらに、本明細書において引用されているあらゆる文献、および本明細書において引用されている文献に引用または参照されているあらゆる文献、および本明細書またはこれにより本明細書に援用されているいずれの文献において引用または言及されているいずれの製品のいずれのメーカー説明書またはカタログも、これにより、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。参照することにより本明細書に援用されている文献またはそこに記述されているいずれの教示も、本発明の実施において用いることができる。参照することにより本明細書に援用されている文献は、先行技術であるとは認められない。
【背景技術】
【０００５】
マイクロ粒子が、種々の細胞型により分泌され、細胞型、および細胞または細胞微小環境の病生理学的状態、例えば、アルツハイマー病、ＴＢ感染症、ＨＩＶ感染症、癌、低酸素症、放射線照射、酸化ストレス、せん断応力および曝露活性化補体複合体（exposure activated complement complexes）に応じて異なる可能性があることが十分に確立されている１。マイクロ粒子は、膜小胞である。現在までに、エキソソーム、エクトソーム（ectosome）、アポトーシス小体を含む数種類のマイクロ粒子が存在している２。このようなマイクロ粒子は、タンパク質およびＲＮＡの両方を含有する。これらマイクロ粒子の多くは、生物活性または病理発生のいずれかを増強する生物活性を有することが示されてきた。
【０００６】
尿、血液、涙、唾液、気管支肺胞洗浄液、腫瘍浸出液、精巣上体液、羊水および乳汁等の体液は、多くの膜小胞を含有する。排出物（shedding）として、マイクロ粒子の種類および生物活性は、細胞型、その生理学的状態およびその細胞微小環境に依存し、このようなマイクロ粒子は、診断マーカーまたは予後マーカーの優れた供給源となる可能性がある。このようなマイクロ粒子を枯渇させることによる治療法の可能性もある。しかし、体液におけるこのようなマイクロ粒子の多くの同一性および起源は不明であり、また、おそらく高度に異種起源的である。
【０００７】
したがって、本技術分野において、マイクロ粒子を迅速に濃縮することができるツール、ならびに脂質マイクロ粒子に基づくバイオマーカーまたは治療用途の予測性および頑強性を改善するツールが必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の実施は、他に特段の断りがない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を、当業者の能力の範囲内で利用することができよう。係る技術は、文献において説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、  および  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｂｏｏｋｓ  １〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら（１９９５および定期増補；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｃｈ．９、１３および１６、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、および  Ａ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  および  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  および  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．Ｉ  ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（編）、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編）（１９８８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２）、１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ、Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ編（２００１、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０５６２−９）；およびＬａｂ  Ｒｅｆ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ、Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ、Ｊａｎｅ  Ｒｏｓｋａｍｓ  および  Ｌｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ編、２００２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−６３０−３を参照されたい。これらの一般的な教科書のそれぞれは、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】血清のサイズ分画を示す図である。健常個体由来の血清をセファロース２Ｂ分子ふるいスピンカラムに通した。カラムをＰＢＳで３回洗浄した。  インプット血清、フロースルーおよび洗浄液に由来するアリコートをＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、ゲルを銀で染色（上パネル）またはニトロセルロースにエレクトロブロットして抗ＣＤ９抗体を用いたウエスタンブロットハイブリダイゼーションを行った（下パネル）。
【図２】ＣＴＢアフィニティークロマトグラフィーを示す図である。血清のサイズ排除クロマトグラフィー後のフロースルーおよび洗浄１の画分をプールし、ＣＴＢアフィニティークロマトグラフィーによるＧＭ１ガングリオシドの存在に関して検査した。  画分をビオチン化ＣＴＢとインキュベートし、次に、磁気ビーズに結合されたストレプトアビジン（strepavidin）とインキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。インプット血清、フロースルー（または非結合画分）および洗浄液に由来するアリコートをＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、ゲルを銀で染色（上パネル）またはニトロセルロースにエレクトロブロットして、抗ＣＤ９抗体を用いたウエスタンブロットハイブリダイゼーションを行った（下パネル）。
【図３】ショ糖密度勾配におけるＣＤ９＋マイクロ粒子の沈降を示す図である。２２．８％から６０％ｗ／ｖのショ糖密度勾配において血清を沈降させた。超遠心後に、勾配を等容量で分画した。各画分を秤量し、密度を計算した。  上パネルの上に密度（ｇ／ｍｌ）で表示されている各画分由来のアリコートをＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、ゲルを銀で染色（上パネル）またはニトロセルロースにエレクトロブロットして、抗ＣＤ９抗体を用いたウエスタンブロットハイブリダイゼーションを行った（下パネル）。
【図４】アネキシンＶアフィニティークロマトグラフィーを示す図である。血清をビオチン化アネキシンＶとインキュベートし、次に、磁気ビーズに結合されたストレプトアビジンとインキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。  インプット血清、フロースルー（または非結合画分）および洗浄液に由来する等価なアリコートをＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースにエレクトロブロットして、抗ＣＤ９抗体を用いたウエスタンブロットハイブリダイゼーションを行った。結合（１０×）アリコートは、他のレーンそれぞれにおいて用いたものよりも１０倍多い。
【図５】Ｍｙｃ形質転換ＥＳ由来ＭＳＣ株（Ｍｙｃ−ＨｕＥＳ９．Ｅ１）により馴化された培養培地および血漿を、ショ糖密度勾配上にロードした場合のグラフである。勾配は、２３％から６０％（ｗ／ｖ）の濃度の１４種のショ糖溶液を重層することにより調製した。試料をロードした後、勾配を１８時間、２００，０００ｇ、４℃で超遠心した。  １３画分において、上層から勾配を除去した。１００μＬの各画分を秤量することにより各画分の密度を決定した。各画分におけるＣＤ９＋アネキシンＶ結合微小胞およびＣＤ９＋ＣＴＢ結合微小胞の相対レベルを決定した。
【図６Ａ．６Ｂ】健常個体（Ｈ）および心臓病患者（Ｄ）に由来する血漿を、ビオチン化されたアネキシンＶ（図６Ａ）またはコレラ毒素Ｂ（図６Ｂ）とインキュベートした場合のグラフである。アネキシンＶまたはコレラ毒素Ｂのいずれかと結合する微小胞を、ストレプトアビジンをコンジュゲートした磁気ビーズにより抽出した。これら単離された微小胞におけるタンパク質を、特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡにおいてアッセイした。
【図７】微小胞Ａまたは微小胞Ｂのいずれかにおけるバイオマーカー毎に、心不全患者（ＣＨＦ）、健常個体（Ｃｏｎ）およびＡＭＩ患者（ＡＭＩ）に由来する５〜１０マイクロリットルの血漿を用いた場合の図である。微小胞Ａまたは微小胞ＢのいずれかにおけるＢＮＰ、Ｆｌｔ−１、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ９およびＡＮＰの相対レベルは、先ず、アフィニティークロマトグラフィーにより微小胞を単離し、続いてこのリガンドに特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡを行うことにより決定した。Ｆｌｔ−１およびＣＤ９は、膜結合型タンパク質であり、一方、ＢＮＰ、ＴＩＭＰ−１およびＡＮＰは、内腔タンパク質である。  異なる患者群の微小胞Ａまたは微小胞Ｂにおけるこれらタンパク質の分布を解析した。ＣＨＦおよびＡＭＩ患者は、Ｃｏｎ個体と比べて、微小胞Ｂにおいて有意により高いＢＮＰレベルを有していたが、微小胞Ａにおいては有していなかった。微小胞Ａおよび微小胞Ｂの両方におけるＦｌｔ−１は、Ｃｏｎ個体と比べてＡＭＩ患者でより高かった。  しかし、微小胞ＡにおけるＦｌｔ−１は、ＣＨＦ患者でより低く、微小胞ＢにおけるＦｌｔ−１は、Ｃｏｎ個体と有意に異ならなかった。３つの患者群における微小胞の間で、ＣＨＦ患者における微小胞Ａ関連型ＴＩＭＰ−１のみが、有意に異なっていた、即ち、より高かった。微小胞Ｂではなく微小胞ＡにおけるＣＤ９は、ＣＨＦおよびＡＭＩ患者において有意により高かった。微小胞ＡにおけるＡＮＰは、ＣＨＦおよびＡＭＩ患者で有意により高かった。微小胞Ｂにおいて、ＡＮＰ  Ａは、ＡＭＩ患者でのみ有意により高かった。
【図８】食中毒の症例の血漿ＣＤ９のモニタリングを示すグラフである。上述通りに、食中毒を起こした個体由来の血漿を、発症中および発症３週間後に解析した。３週間置いて採取した健常個体由来の２種の血漿試料を対照とした。食中毒の前（Ａ１）および３週間後（Ａ２）の患者のＣＴＢ画分およびＡｎｎＶ画分（faction）における平均蛍光を、Ｂ１およびＢ２に対してプロットした。Ｂ１およびＢ２は、健常対照から３週間置いて採取した血漿試料であった。
【図９】アッセイの開発を示す図である。先ず、血漿をビオチン化ＣＴＢとインキュベートし、次に、ストレプトアビジンにコンジュゲートした磁気ビーズとインキュベートする。次に、磁気ビーズを磁石により固定化し、ＰＢＳまたは等張性塩溶液で洗浄する。結合した微小胞を、一般的な界面活性剤に基づく細胞溶解バッファーで溶解する。  次に、微小胞の内容物を、活性化ビオチン、例えば、スルホ−ＮＨＳ−ビオチンによりビオチン化する。特異的タンパク質に関してアッセイするため、次に、磁気ビーズにコンジュゲートした、対象とするタンパク質に特異的な抗体を加える。次に、抗体と結合したタンパク質を、磁石により固定化し、十分に洗浄した。ストレプトアビジンにコンジュゲートしたＨＲＰおよびＨＲＰ比色定量的基質またはＨＲＰ蛍光定量的基質を用いてタンパク質を定量化する。
【図１０】子癇前症の臨床診断なしまたはありの妊婦（第三期）の血漿におけるＣＴＢ結合微小胞と比べたアネキシンＶにおけるタンパク質の差次的分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本出願人らは、異なるマイクロ粒子亜集団におけるバイオマーカーの同定および／または階層化に用いることのできる、血漿中に存在する異なる脂質マイクロ粒子を迅速に単離して、その診断、予後またはセラノスティクス（theranostic）の値を改善するための技術について記載する。
【００１１】
本出願人らは、テトラスパニン膜タンパク質であるＣＤ９が、ヒト血漿中のアネキシンＶ結合ホスファチジルセリンまたはコレラ毒素Ｂ鎖（ＣＴＢ）結合ＧＭ１ガングリオシドのいずれかに差次的に濃縮された、２種の血漿微小胞画分を階層化することを実証する。アネキシンＶおよびコレラ毒素Ｂ鎖に対する親和性は、相互に排他的である。脂質と膜タンパク質との関連は、これら２画分が脂質小胞であることを示唆する。
【００１２】
本出願人らは、血漿中のアネキシンＶ結合細画分およびＣＴＢ結合細画分におけるタンパク質またはタンパク質の組み合わせの相対レベルが、個体の健康または病理学的状態に依存することも実証する。
【００１３】
本出願人らは、健常個体におけるアネキシンＶ結合細画分およびＣＴＢ結合細画分におけるＣＤ９の相対レベルが、類似していることを観察する。病気の（または病気のリスクがある）個体、例えば、食中毒またはＰＣＩもしくは粥腫切除術を行っている心臓病患者は、細画分において異なる分布レベルのＣＤ９を有する。例えば、食中毒を起こした個体は、健常個体よりも、ＣＴＢ結合細画分においてより高いレベルのＣＤ９を有するが、類似のレベルのアネキシンＶ結合細画分を維持する。
【００１４】
他方では、ＰＣＩまたは粥腫切除術を行っている心臓病患者は、ＣＴＢ結合細画分において健常個体に存在するレベルと類似のレベルのＣＤ９を有するが、アネキシンＶ結合細画分においてより高いレベルのＣＤ９を有する。
【００１５】
したがって、血漿中のアネキシンＶ結合細画分およびＣＴＢ結合細画分におけるタンパク質の相対レベルの測定は、個体の健康または病理学的状態の評価に用いることができる。
【００１６】
［状態のモニタリング］
本出願人らは、細胞、組織、器官または生物の状態をモニタリングする方法を提供する。
【００１７】
この方法は、細胞、組織、器官または生物に由来するマイクロ粒子の試料について、第１の種類のマイクロ粒子における選択されたポリペプチドの量の、第２の種類のマイクロ粒子における選択されたポリペプチドの量に対する比を確定するステップを含むことができる。
【００１８】
この比は、第１の種類のマイクロ粒子におけるポリペプチドの量の、第２の種類のマイクロ粒子におけるポリペプチドの量と比較した、即ち、２種類のマイクロ粒子間の比であり得る。
【００１９】
第１の種類のマイクロ粒子は、ＧＭ１ガングリオシドを含むマイクロ粒子（便宜上「ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子」と称される）であり得る。第１の種類のマイクロ粒子は、コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）と結合することができ、便宜上「ＣＴＢ−微小胞」と称される。
【００２０】
第２の種類のマイクロ粒子は、露出したホスファチジルセリン（phosphotidylserine）を含むマイクロ粒子であり得る。第２の種類のマイクロ粒子は、アネキシンＶと結合することができる（便宜上「アネキシンＶマイクロ粒子」または「ＡＶ−微小胞」と称される）。
【００２１】
便宜上、本出願人らは、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子である第１の種類のマイクロ粒子におけるポリペプチドの存在、量、質量または数等を、「ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチド」と称する。同様に、本出願人らは便宜上、アネキシンＶマイクロ粒子である第２の種類のマイクロ粒子におけるポリペプチドの存在、量、質量または数等を、「アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチド」と称する。また一方で、本出願人らは便宜上、上述の比を、「アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比」と称する。
【００２２】
ポリペプチドは、テトラスパニンタンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ６３）、Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅ（例えば、Ｒａｂ５ａ、Ｒａｂ５ｂおよびＲａｂ５ｃ、Ｒａｂ−２７ａおよびＲａｂ−２７ｂ、Ｒａｂ３５）、ＬＡＭＰ（例えば、Ｌａｍｐ１およびＬａｍｐ２）、カベオリン（例えば、カベオリン１およびカベオリン２）、トランスフェリン受容体（ＴＲＦＣ）、クラスリン軽鎖Ａ（ＣＬＴＡ）、クラスリン軽鎖Ｂ（ＣＬＴＢ）、クラスリン重鎖１（ＣＬＴＣ）、Ｔｓｇ１０１、Ａｌｉｘ、ＰＡＩ−１、ＰＬＧＦ、プロカルシトニン、Ｓ−１００ｂ、ＴＧＦベータ２（ＴＧＦＢ２）、ＴＩＭＰ１からなる群から選択され得る。ポリペプチドは、ＣＤ９を含み得る。
【００２３】
この方法は、マイクロ粒子が、ＣＤ９＋マイクロ粒子を含むようなものであり得る。方法は、マイクロ粒子が、微小胞、エキソソーム、エクトソームまたはアポトーシス小体を含むようなものであり得る。
【００２４】
特に、本出願人らは、細胞、組織、器官または生物の状態をモニタリングする方法であって、細胞、組織、器官または生物に由来するマイクロ粒子の試料について、（ａ）ＧＭ１ガングリオシドを含む、好ましくはコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）に結合するマイクロ粒子における選択されたポリペプチド（「ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチド」）の、（ｂ）露出したホスファチジルセリンを含む、好ましくはアネキシンＶに結合するマイクロ粒子における選択されたポリペプチド（「アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチド」）に対する比を確定するステップを含み、このように確定された（ｂ）に対する（ａ）の比（「アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比」）が、細胞、組織、器官または生物の状態を示し、ポリペプチドが、テトラスパニンタンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ６３）、Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅ（例えば、Ｒａｂ５ａ、Ｒａｂ５ｂおよびＲａｂ５ｃ、Ｒａｂ−２７ａおよびＲａｂ−２７ｂ、Ｒａｂ３５）、ＬＡＭＰ（例えば、Ｌａｍｐ１およびＬａｍｐ２）、カベオリン（例えば、カベオリン１およびカベオリン２）、トランスフェリン受容体（ＴＲＦＣ）、クラスリン軽鎖Ａ（ＣＬＴＡ）、クラスリン軽鎖Ｂ（ＣＬＴＢ）、クラスリン重鎖１（ＣＬＴＣ）、Ｔｓｇ１０１、Ａｌｉｘ、ＰＡＩ−１、ＰＬＧＦ、プロカルシトニン、Ｓ−１００ｂ、ＴＧＦベータ２（ＴＧＦＢ２）、ＴＩＭＰ１からなる群から選択され、好ましくは、ポリペプチドがＣＤ９を含む方法を提供する。
【００２５】
本出願人らは、細胞、組織、器官または生物が、特定の状態にあることを確定するための方法をさらに提供する。この方法は、細胞、組織、器官または生物のアネキシンＶマイクロ粒子に対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドポリペプチドの比（またはこのような比を含むプロファイル）を、係る特定の状態であることが分かっている細胞、組織、器官または生物のアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比（またはこのような比を含むプロファイル）と比較するステップを含み得る。
【００２６】
単一のポリペプチドの使用に加えて、またはその代わりに、選択されたポリペプチドの組み合わせを用いることもできる。したがって、本出願人らが、（例えば比を確定するための量の比較により）ポリペプチドについて言及する場合、このような言及は、例えばポリペプチドの組み合わせの量を確定または比較することによる、ポリペプチドの組み合わせへの言及を含むと解釈するべきである。
【００２７】
方法は、ＧＭ１ガングリオシドを含む試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含み得る。これは、例えば、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）に結合する試料におけるマイクロ粒子を選択することにより行うことができる。
【００２８】
方法は、露出したホスファチジルセリンを含む試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含み得る。これは、例えば、アネキシンＶに結合する試料におけるマイクロ粒子を選択することにより行うことができる。
【００２９】
方法は、マイクロ粒子をサイズにより選択するステップをさらに含み得る。サイズ選択ステップは、サイズ排除クロマトグラフィーを含み得る。これを行う場合、サイズ選択ステップは、第１のステップ、例えば、上述のステップ（ａ）の前に実行することができる。
【００３０】
ポリペプチドの「量」の決定が言及されている場合、ポリペプチドの質量、数、濃度等の決定または確定へと拡張されることを理解されたい。ポリペプチドの比（または組み合わせの比）について言及されている場合、第２の状態よりも第１の状態において「より高い」ことは、比が、第２の状態と比較して第１の状態においてｐ値＜０．０１であり統計学的に異なることを意味するものと解釈することができる。
【００３１】
このように確定された比は、細胞、組織、器官または生物の状態を示すことができる。
【００３２】
方法は、細胞、組織、器官または生物の状態が、生理学的状態、分化状態、発生状態または代謝状態または病理学的状態、例えば、疾患状態、ヒト疾患状態、食中毒状態、糖尿病状態、免疫障害状態、神経変性障害状態、発癌性状態、癌性状態または腫瘍状態を含むようなものであり得る。
【００３３】
例えば、状態は、ヒト免疫不全ウイルス（Immunovirus）（ＨＩＶ）感染状態、結核（ＴＢ）感染状態、ウシ海綿状脳症（Bovine Spongiform Encephalitis）（ＢＳＥ）感染状態または治療法の状態、例えば、治療を受けている患者であり得る。
【００３４】
方法は、細胞、組織、器官または生物の状態が、病的である状態、予後不良の状態、病からの回復の状態、予後良好の状態または健常な状態を含むようなものであり得る。
【００３５】
方法は、試料が、汗、尿、血液、涙、唾液、気管支肺胞洗浄液、腫瘍浸出液、精巣上体液、羊水および乳汁からなる群から選択されるようなものであり得る。
【００３６】
試料が、生物のものである場合、生物は、任意の動物または植物を含んでもよい。生物は、ヒト等の哺乳類を含み得る。
【００３７】
方法は、上述のいずれかの組み合わせを含むようなものであり得る。
【００３８】
［ポリペプチド］
ポリペプチドは、その存在、量、質量または数等が決定され得る任意の適したポリペプチドであってもよい。
【００３９】
このような決定は、タンパク質またはポリペプチドに応じて、本技術分野において公知の任意の適した手段により行ってもよい。このような決定方法の例として、質量分析、分光光度法、ＵＶ吸収等が挙げられる。
【００４０】
コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＧ５６９００．１を有し得る。
【００４１】
アネキシンＶは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ４００４７．１またはＡＡＢ６０６４８．１を有し得る。
【００４２】
ポリペプチドは、テトラスパニンタンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ６３）、Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅ（例えば、Ｒａｂ５ａ、Ｒａｂ５ｂおよびＲａｂ５ｃ、Ｒａｂ−２７ａおよびＲａｂ−２７ｂ、Ｒａｂ３５）、ＬＡＭＰ（例えば、Ｌａｍｐ１およびＬａｍｐ２）、カベオリン（例えば、カベオリン１およびカベオリン２）、トランスフェリン受容体（ＴＲＦＣ）、クラスリン軽鎖Ａ（ＣＬＴＡ）、クラスリン軽鎖Ｂ（ＣＬＴＢ）、クラスリン重鎖１（ＣＬＴＣ）、Ｔｓｇ１０１、Ａｌｉｘ、ＰＡＩ−１、ＰＬＧＦ、プロカルシトニン、Ｓ−１００ｂ、ＴＧＦベータ２（ＴＧＦＢ２）、ＴＩＭＰ１からなる群から選択され得る。ポリペプチドは、ＣＤ９を含み得る。
【００４３】
ＣＤ９は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７６０．１を有するポリペプチドを含み得る。ＣＤ８１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４３４７．１を有するポリペプチドを含み得る。ＣＤ６３は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７１．１を有するポリペプチドを含み得る。Ｒａｂ５ａは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４１５３．２を有するポリペプチドを含み得る。Ｒａｂ５ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２８５９．１を有するポリペプチドを含み得る。Ｒａｂ５ｃは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４５７４．２を有するポリペプチドを含み得る。Ｒａｂ−２７ａは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４５７１．２を有するポリペプチドを含み得る。Ｒａｂ−２７ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４１５４．２を有するポリペプチドを含み得る。Ｒａｂ３５は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６８５２．１を有するポリペプチドを含み得る。Ｌａｍｐ１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５５２．３を有するポリペプチドを含み得る。Ｌａｍｐ２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２２８５．１を有するポリペプチドを含み得る。カベオリン１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７４４．２を有するポリペプチドを含み得る。カベオリン２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２２４．１を有するポリペプチドを含み得る。トランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２１６２０．１を有するポリペプチドを含み得る。クラスリン軽鎖Ａ（ＣＬＴＡ）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０７０１４５．１を有するポリペプチドを含み得る。クラスリン軽鎖Ｂ（ＣＬＴＢ）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１８２５．１を有するポリペプチドを含み得る。クラスリン重鎖１（ＣＬＴＣ）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４８５０．１を有するポリペプチドを含み得る。Ｔｓｇ１０１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６２８３．１を有するポリペプチドを含み得る。Ａｌｉｘは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３７５０６．２を有するポリペプチドを含み得る。ＰＡＩ１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５９３．１を有するポリペプチドを含み得る。ＰＬＧＦは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２６２３．２を有するポリペプチドを含み得る。プロカルシトニンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０２９１２４．１を有するポリペプチドを含み得る。Ｓ１００ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６２６３．１を有するポリペプチドを含み得る。ＴＧＦＢ２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２９０７１．１を有するポリペプチドを含み得る。およびＴＩＭＰ１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２４５．１を有するポリペプチドを含み得る。
【００４４】
したがって、本出願人らは、ポリペプチドを選択するステップと、マイクロ粒子の試料における、アネキシンＶマイクロ粒子における選択されたポリペプチドと比較した、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子における選択されたポリペプチドの質量、数、量等の比を確定するステップとを含む方法について記載する。マイクロ粒子の試料は、細胞、組織、器官または生物中に存在する試料であってもよく、細胞、組織、器官または生物の試料であってもよく、または細胞、組織、器官または生物に由来する試料であってもよく、その他であってもよい。
【００４５】
（ポリペプチドの組み合わせ）
上に記す通り、単一のポリペプチドの検出の代わりに、あるいはまたはそれに加えて、２種以上のポリペプチドのいずれかの組み合わせを用いることができる。よって、本出願人らは、２種以上のポリペプチドの組み合わせが選択され、細胞、組織、器官もしくは生物に由来する試料、または細胞、組織、器官もしくは生物の試料中における、第２の種類のマイクロ粒子において検出されたそれらの質量、数、量等と比較した、第１の種類のマイクロ粒子において検出されたそれらの質量、数、量等が、第２の種類のマイクロ粒子において検出されたそれらの質量、数、量等と比較される方法について記載する。このように確定された比は、細胞、組織、器官または生物の状態を示す。
【００４６】
例えば、ＰＡＩ−１、ＰＬＧＦ、プロカルシトニン、Ｓ−１００ｂ、ＴＧＦベータ２、ＴＩＭＰ１のうちいずれか２種以上の組み合わせを用いることができる。本出願人らは、例えば、子癇前症を含む状態の検出における、例えば、（ａ）ＰＡＩ１およびＰＬＧＦ、（ｂ）ＰＡＩ１およびプロカルシトニン、（ｃ）ＰＡＩ１およびＳ１００ｂ、（ｄ）ＰＡＩ１およびＴＧＦベータ２、（ｅ）ＰＡＩ１およびＴＩＭＰ１、（ｆ）ＰＬＧＦおよびプロカルシトニン、（ｇ）ＰＬＧＦおよびＳ１００ｂ、（ｈ）ＰＬＧＦおよびＴＧＦベータ２、（ｉ）ＰＬＧＦおよびＴＩＭＰ１、（ｊ）プロカルシトニンおよびＳ１００ｂ、（ｋ）プロカルシトニンおよびＴＧＦベータ２、（ｌ）プロカルシトニンおよびＴＩＭＰ１、（ｍ）Ｓ１００ｂおよびＴＧＦベータ２、（ｎ）Ｓ１００ｂおよびＴＩＭＰ１、ならびに（ｏ）ＴＧＦベータ２およびＴＩＭＰ１のうちいずれか１つ以上の使用について記載する。
【００４７】
（ポリペプチドプロファイル）
方法は、複数の選択されたポリペプチド種のための、アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比を複数含むプロファイルを確定するステップを含み得る。プロファイルのそれぞれは、細胞、組織、器官または生物の状態を示すことができる。即ち、２種以上のポリペプチド種を用いることができる（即ち、２種以上のポリペプチド種について得られる比）。
【００４８】
例えばＣＤ９ポリペプチドの、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの、アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比（または組み合わせの組み合わせに対する比）について言及する場合、第２の状態よりも第１の状態において「より高い」ということは、比が、第２の状態と比較して、第１の状態においてｐ値＜０．０１であり統計学的に異なることを意味すると解釈することができる。ポリペプチドの組み合わせの量が決定される場合も同様である。
【００４９】
（正規化）
方法は、正規化のステップをさらに含み得る。係るステップは、いずれか１種以上のタンパク質またはポリペプチドの含量または濃度が、異なる試料にわたって同一であることを決定または確実にするステップを含み得る。
【００５０】
本明細書に記載されている方法および組成物に適用される正規化ステップは、その濃度が任意の２種の試料にわたって同一であることが知られているポリペプチドを活用することができる。
【００５１】
したがって、本明細書に記載されている方法は、正規化ステップを含み得る。正規化ステップは、１種以上の試料における特定のポリペプチドのレベル、濃度または量を調整するステップを含み得る。正規化ステップは、特定のポリペプチドのレベル、濃度または量（正規化前）が互いに実質的に異なる２種以上の試料において行うことができる。正規化ステップは、正規化の後に、２種以上の試料における特定のポリペプチドのレベル、濃度または量が実質的に同一となるようなものであり得る。
【００５２】
正規化ステップは、２種の試料のうち一方または他方を希釈または濃縮して、一方または両方の試料における特定のポリペプチドのレベル、濃度または量を増加または減少させるステップを含み得る。
【００５３】
あるいはまたはその上、正規化ステップは、選択された２種以上の試料について、試料間の特定のポリペプチドのレベル、濃度または量の比を決定するステップを含み得る。これは、対象とする試料群のそれぞれにおいて同一のレベル、濃度または量を有することが分かっている参照ポリペプチドを参照することにより達成することができる。参照ポリペプチドは、ＢＮＰ、ＣＤ９およびＴＩＭＰ−１のうち１種以上を含み得る。
【００５４】
正規化ステップが、このような比の決定を含む場合、試料の濃縮または希釈は必要とされない可能性があることが認められよう。
【００５５】
（ＢＮＰポリペプチドを用いた正規化）
本出願人らは、慢性心不全（ＣＨＦ）疾患を患っている（または患うリスクがある）細胞、組織、器官または生物におけるアネキシンＶマイクロ粒子におけるＢＮＰポリペプチドのレベルが、慢性心不全（ＣＨＦ）疾患を患っていない（または患うリスクがない）細胞、組織、器官または生物、例えば、健常個体におけるＢＮＰポリペプチドのレベルと統計学的に有意差がないことを確定した。
【００５６】
同様に、本出願人らは、急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患を患っている（患うリスクがある）細胞、組織、器官または生物におけるアネキシンＶマイクロ粒子におけるＢＮＰポリペプチドのレベルが、急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患を患っていない（患うリスクがない）細胞、組織、器官または生物、例えば、健常個体におけるＢＮＰポリペプチドのレベルと統計学的に異ならないことを確定した。
【００５７】
したがって、細胞、組織、器官または生物におけるアネキシンＶマイクロ粒子におけるＢＮＰタンパク質またはＢＮＰポリペプチドのレベルまたは濃度または含量は、本明細書に記載されている方法において使用可能な他のマーカーのいずれか、例えばＣＤ９のレベルの正規化に用いることができる。係る正規化は、アネキシンＶマイクロ粒子もしくはＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子のいずれかまたはその両方においてもたらされ得る。
【００５８】
（ＴＩＭＰ−１ポリペプチドおよびＣＤ９ポリペプチドを用いた正規化）
本出願人らは、慢性心不全（ＣＨＦ）疾患を患っている（患うリスクがある）細胞、組織、器官または生物におけるＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子におけるＴＩＭＰ−１ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２４５．１）およびＣＤ９ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７６０．１）のレベルが、慢性心不全（ＣＨＦ）疾患を患っていない（患うリスクがない）細胞、組織、器官または生物、例えば、健常個体におけるＴＩＭＰ−１およびＣＤ９ポリペプチドのレベルと統計学的に異ならないことを確定した。
【００５９】
同様に、本出願人らは、急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患を患っている（患うリスクがある）細胞、組織、器官または生物におけるＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子におけるＴＩＭＰ−１ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２４５．１）およびＣＤ９ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７６０．１）のレベルが、急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患を患っていない（患うリスクがない）細胞、組織、器官または生物、例えば、健常個体におけるＴＩＭＰ−１ポリペプチドおよびＣＤ９ポリペプチドのレベルと統計学的に異ならないことを確定した。
【００６０】
したがって、細胞、組織、器官または生物におけるＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子におけるＴＩＭＰ−１タンパク質もしくはポリペプチドまたはＣＤ９タンパク質もしくはポリペプチド（またはその両方）のレベルまたは濃度または含量は、本明細書に記載されている方法において使用可能な他のマーカーの、いずれの正規化にも用いることができる。係る正規化は、アネキシンＶマイクロ粒子もしくはＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子のいずれかまたはその両方においてもたらされ得る。
【００６１】
［心血管疾患状態の確定］
本出願人らは、心血管疾患を患っている（患うリスクがある）細胞、組織、器官または生物のＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドＣＤ９に対する比が、正常または健常な細胞、組織、器官または生物、即ち、心血管疾患を患っていない細胞、組織、器官または生物における同系のＣＤ９比（即ち、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドＣＤ９に対する比）よりも高いことを実証する。
【００６２】
したがって、本出願人らは、対象とする細胞、組織、器官または生物、好ましくは、生物の心血管疾患状態を確定する方法について記載する。したがって、上述の方法は、細胞、組織、器官または生物の状態が、心血管疾患状態および健常状態を含むようなものであり得る。ポリペプチドは、この場合、ＣＤ９を含み得る。ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドのアネキシンＶ  ＣＤ９マイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、健常状態と比較して心血管疾患状態においてより高くなり得る。上述の任意の組み合わせを行ってもよい。
【００６３】
方法は、対象とする細胞、組織、器官もしくは生物のマイクロ粒子の試料または対象とする細胞、組織、器官もしくは生物に由来するマイクロ粒子の試料を用意するステップを含み得る。ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子、即ち、ＧＭ１ガングリオシドを含む、好ましくはコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）に結合するマイクロ粒子におけるＣＤ９の量が確定される。アネキシンＶマイクロ粒子、即ち、露出したホスファチジルセリンを含む、好ましくはアネキシンＶに結合するマイクロ粒子におけるＣＤ９の量が確定される。続いて、アネキシンＶマイクロ粒子におけるＣＤ９の量と比較した、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子におけるＣＤ９の量の間の比が確定される。この比は、正常または健常な細胞、組織、器官または生物（即ち、心血管疾患を患っていない）の、ＣＤ９のＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比と比較される。
【００６４】
対象とする細胞、組織、器官または生物についての比が、対象とする「正常」な細胞、組織、器官または生物に由来する比よりも高い場合、対象とする細胞、組織、器官または生物は、心血管疾患を患っているまたはこれを患うリスクがあると決定される。
【００６５】
［慢性心不全（ＣＨＦ）状態の確定］
本出願人らは、慢性心不全（ＣＨＦ）疾患を患っている（患うリスクがある）細胞、組織、器官または生物のＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドＣＤ９に対する比が、正常または健常な細胞、組織、器官または生物、即ち、慢性心不全（ＣＨＦ）疾患を患っていない細胞、組織、器官または生物における同系ＣＤ９比（即ち、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドＣＤ９に対する比）よりも高いことを実証する。
【００６６】
したがって、本出願人らは、対象とする細胞、組織、器官または生物、好ましくは、生物の慢性心不全（ＣＨＦ）疾患状態を確定する方法について記載する。したがって、この方法は、細胞、組織、器官または生物の状態が、慢性心不全（ＣＨＦ）疾患状態および健常状態を含むようなものであり得る。ポリペプチドは、ＣＤ９を含み得る。ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドのアネキシンＶ  ＣＤ９マイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、健常状態と比較して、慢性心不全（ＣＨＦ）疾患状態においてより高くなり得る。上述の任意の組み合わせを行ってもよい。
【００６７】
方法は、対象とする細胞、組織、器官もしくは生物のマイクロ粒子の試料または対象とする細胞、組織、器官もしくは生物に由来するマイクロ粒子の試料を用意するステップを含み得る。ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子、即ち、ＧＭ１ガングリオシドを含む、好ましくはコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）に結合するマイクロ粒子におけるＣＤ９の量が確定される。アネキシンＶマイクロ粒子、即ち、露出したホスファチジルセリンを含む、好ましくはアネキシンＶに結合するマイクロ粒子におけるＣＤ９の量が確定される。続いて、アネキシンＶマイクロ粒子におけるＣＤ９の量と比較した、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子におけるＣＤ９の量の間の比が確定される。この比は、正常または健常な細胞、組織、器官または生物（即ち、慢性心不全（ＣＨＦ）疾患を患っていない）のＣＤ９のＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比と比較される。
【００６８】
対象とする細胞、組織、器官または生物の比が、対象とする「正常」な細胞、組織、器官または生物に由来する比よりも高い場合、対象とする細胞、組織、器官または生物は、慢性心不全（ＣＨＦ）疾患を患っている、またはそれを患うリスクがあると決定される。
【００６９】
［急性心筋虚血（ＡＭＩ）状態の確定］
本出願人らは、急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患を患っている（患うリスクがある）細胞、組織、器官または生物のＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドＣＤ９に対する比は、正常または健常な細胞、組織、器官または生物、即ち、急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患を患っていない細胞、組織、器官または生物における同系ＣＤ９比（即ち、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドＣＤ９に対する比）よりも高いことを実証する。
【００７０】
したがって、本出願人らは、対象とする細胞、組織、器官または生物、好ましくは、生物の急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患状態を確定する方法について記載する。この方法は、細胞、組織、器官または生物の状態が、急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患状態および健常状態を含むようなものであり得る。ポリペプチドは、ＣＤ９を含み得る。ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ＣＤ９ポリペプチドのアネキシンＶ  ＣＤ９マイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、健常状態と比較して、急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患状態においてより高くなり得る。上述の任意の組み合わせを行ってもよい。
【００７１】
方法は、対象とする細胞、組織、器官もしくは生物のマイクロ粒子の試料または対象とする細胞、組織、器官もしくは生物に由来するマイクロ粒子の試料を用意するステップを含み得る。ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子、即ち、ＧＭ１ガングリオシドを含む、好ましくはコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）に結合するマイクロ粒子におけるＣＤ９の量が確定される。アネキシンＶマイクロ粒子、即ち、露出したホスファチジルセリンを含む、好ましくはアネキシンＶに結合するマイクロ粒子におけるＣＤ９の量が確定される。続いて、アネキシンＶマイクロ粒子におけるＣＤ９の量と比較した、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子におけるＣＤ９の量の間の比が確定される。この比は、正常または健常な細胞、組織、器官または生物（即ち、急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患を患っていない）のＣＤ９  ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比と比較される。
【００７２】
対象とする細胞、組織、器官または生物の比が、対象とする「正常」な細胞、組織、器官または生物に由来する比よりも高い場合、対象とする細胞、組織、器官または生物は、急性心筋虚血（ＡＭＩ）疾患を患っている、またはこれを患うリスクがあると決定される。
【００７３】
［子癇前症状態の確定］
本出願人らは、子癇前症を患っている（患うリスクがある）細胞、組織、器官または生物の、アネキシンＶマイクロ粒子に対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子におけるポリペプチドの量またはポリペプチドの組み合わせの量の比が、正常または健常な細胞、組織、器官または生物、即ち、子癇前症を患っていない細胞、組織、器官または生物における同系のポリペプチド／組み合わせ比（即ち、アネキシンＶマイクロ粒子におけるポリペプチドの量またはポリペプチドの組み合わせの量に対する、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子におけるポリペプチドの量またはポリペプチドの組み合わせの量の比）よりも高いことを実証する。
【００７４】
したがって、本出願人らは、対象とする細胞、組織、器官または生物、好ましくは生物の子癇前症状態を確定する方法について記載する。
【００７５】
したがって、上述の方法は、細胞、組織、器官または生物の状態が、子癇前症状態および健常状態を含むようなものであり得る。ポリペプチドは、ＰＡＩ−１、ＰＬＧＦ、プロカルシトニン、Ｓ１００ｂ、ＴＧＦβおよびＴＩＭＰ−１からなる群から選択され得る。
【００７６】
上述のポリペプチドのうち２種以上のいずれかの組み合わせを用いることができる。係る組み合わせは、ＰＡＩ１およびＰＬＧＦ、ＰＡＩ１およびプロカルシトニン、ＰＡＩ１およびＳ１００ｂ、ＰＡＩ１およびＴＧＦベータ２、ＰＡＩ１およびＴＩＭＰ１、ＰＬＧＦおよびプロカルシトニン、ＰＬＧＦおよびＳ１００ｂ、ＰＬＧＦおよびＴＧＦベータ２、ＰＬＧＦおよびＴＩＭＰ１、プロカルシトニンおよびＳ１００ｂ、プロカルシトニンおよびＴＧＦベータ２、プロカルシトニンおよびＴＩＭＰ１、Ｓ１００ｂおよびＴＧＦベータ２、Ｓ１００ｂおよびＴＩＭＰ１、ならびにＴＧＦベータ２およびＴＩＭＰ１からなる群から選択され得る。
【００７７】
生物は、妊娠中の哺乳類、例えば、妊娠中のヒト等、妊娠中の生物を含み得る。妊娠中の生物は、妊娠第一期、第二期または第三期であり得る。
【００７８】
ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチド／組み合わせの、アネキシンＶ  ＣＤ９マイクロ粒子ポリペプチド／組み合わせに対する比は、健常状態と比較して、子癇前症状態においてより高くなり得る。
【００７９】
方法は、対象とする細胞、組織、器官または生物のマイクロ粒子の試料または対象とする細胞、組織、器官または生物に由来するマイクロ粒子の試料を用意するステップを含み得る。ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子、即ち、ＧＭ１ガングリオシドを含む、好ましくはコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）に結合するマイクロ粒子における、ＰＡＩ−１、ＰＬＧＦ、プロカルシトニン、Ｓ１００ｂ、ＴＧＦβ、もしくはＴＩＭＰ−１、または、ＰＡＩ１およびＰＬＧＦ、ＰＡＩ１およびプロカルシトニン、ＰＡＩ１およびＳ１００ｂ、ＰＡＩ１およびＴＧＦベータ２、ＰＡＩ１およびＴＩＭＰ１、ＰＬＧＦおよびプロカルシトニン、ＰＬＧＦおよびＳ１００ｂ、ＰＬＧＦおよびＴＧＦベータ２、ＰＬＧＦおよびＴＩＭＰ１、プロカルシトニンおよびＳ１００ｂ、プロカルシトニンおよびＴＧＦベータ２、プロカルシトニンおよびＴＩＭＰ１、Ｓ１００ｂおよびＴＧＦベータ２、Ｓ１００ｂおよびＴＩＭＰ１、もしくはＴＧＦベータ２およびＴＩＭＰ１の組み合わせの量が確定される。
【００８０】
アネキシンＶマイクロ粒子、即ち、露出したホスファチジルセリンを含む、好ましくはアネキシンＶに結合するマイクロ粒子における、選択されたポリペプチドまたはポリペプチドの組み合わせの量も確定される。続いて、アネキシンＶマイクロ粒子におけるＣＤ９のポリペプチドまたは組み合わせの量と比較した、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子におけるポリペプチドまたは組み合わせの量の間の比が確定される。この比は、正常または健常な細胞、組織、器官または生物（即ち、子癇前症を患っていない）の、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドまたは組み合わせの量のアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドまたは組み合わせの量に対する比と比較される。
【００８１】
対象とする細胞、組織、器官または生物の比が、対象とする「正常」な細胞、組織、器官または生物に由来する比よりも高い場合、対象とする細胞、組織、器官または生物は、子癇前症を患っている、またはこれを患うリスクがあると決定される。
【００８２】
［状態の変化のモニタリング］
本明細書に記載されている方法および組成物に従って、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、細胞、組織、器官または生物の状態の様々な変化のモニターに用いることができる。
【００８３】
したがって、本出願人らは、細胞、組織、器官または生物の状態の変化を検出するための方法について記載する。この方法は、細胞、組織、器官または生物の、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比（または係る比を含むプロファイル）の変化を検出するステップを含み得る。係る変化は、細胞、組織、器官または生物の状態の変化を示すことができる。
【００８４】
係る状態の細胞、組織、器官または生物の変化は、生理学的状態の変化を含み得る。生理学的状態は、分化状態を含み得る。即ち、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、細胞、組織、器官または生物が、分化したか未分化であるかの決定に用いることができる。生理学的状態は、発生状態または発生段階を含み得る。
【００８５】
よって、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、細胞、組織、器官または生物が、胚性状態または段階、胎児状態または段階、新生児状態または段階、乳児状態または段階、若年状態または段階、幼児状態または段階、青年状態または段階、成体状態または段階等のものであるまたはそれらに由来するかの決定に用いることができる。
【００８６】
細胞、組織、器官または生物の、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比を時間間隔にわたってモニターまたは追跡して、状態の変化を確定またはモニターまたは検出することができる。
【００８７】
細胞、組織、器官または生物の状態の確定または決定について言及する場合、これが、その状態自体の確定または決定と共に、細胞、組織、器官または生物が、その状態に遷移するまたはこれに向かうリスクがあるか否か（およびその程度）の確定または決定を包含すると理解されるであろうことが理解されよう。即ち、状態の確定は、その状態に進行するまたはこれを患うリスクの確定を含む。
【００８８】
［疾患の検出および治療］
本出願人らは、細胞、組織、器官または生物における疾患を検出する方法であって、その細胞、組織、器官または生物からまたはそれらの試料を得るステップと、上に記す方法を試料について行うステップと、これにより得られたＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比を、罹患した細胞、組織、器官または生物のものであることまたはこれらに由来することが分かっている試料のＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比と比較するステップとを含む方法について記載する。
【００８９】
本出願人らは、細胞、組織、器官または生物における疾患を治療または予防する方法であって、上に記す細胞、組織、器官または生物における疾患を検出するステップと、該疾患のための治療を細胞、組織、器官または生物に施すステップとを含む方法についてさらに記載する。
【００９０】
方法は、試料が、尿、血液、涙、唾液、気管支肺胞洗浄液、腫瘍浸出液、精巣上体液、羊水および乳汁からなる群から選択されるようなものであり得る。
【００９１】
方法は、マイクロ粒子が、微小胞、エキソソーム、エクトソームまたはアポトーシス小体を含むようなものであり得る。
【００９２】
［マイクロ粒子］
マイクロ粒子は、微小胞等、小胞を特に含み得る。マイクロ粒子は、エキソソームを含み得る。
【００９３】
マイクロ粒子は、脂質二重層により画定された小胞または扁平な球体を含み得る。マイクロ粒子は、４０〜１００ｎｍの直径を含み得る。マイクロ粒子は、エンドソーム膜の内向きの出芽（budding）により形成され得る。マイクロ粒子は、約１．１３〜１．１９ｇ／ｍｌの密度を有し、ショ糖勾配において浮遊し得る。マイクロ粒子は、コレステロールおよびスフィンゴミエリンならびにＧＭ１、ＧＭ３、フロチリンおよびｓｒｃタンパク質キナーゼＬｙｎ等の脂質ラフトマーカーが豊富であり得る。
【００９４】
マイクロ粒子を単離する方法は、本技術分野において公知のものであり、後述する実施例と共に、国際特許公報ＷＯ２００９／１０５０４４等の文献において詳細に記載されている。
【００９５】
本出願人らは、特に、異なるマイクロ粒子亜集団におけるバイオマーカーの同定および／または階層化に用いることのできる、血漿中に存在する異なる脂質マイクロ粒子を迅速に単離して、その診断、予後またはセラノスティクスの値を改善するための技術について記載する。
【００９６】
したがって、本出願人らは、マイクロ粒子を含有する試料を処理する方法であって、（ａ）ＧＭ１ガングリオシドを含む試料におけるマイクロ粒子を選択するステップ、および／または（ｂ）露出したホスファチジルセリンを含む試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含む方法を提供する。
【００９７】
方法は、ステップ（ａ）が、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）に結合する試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含む、もしくはステップ（ｂ）が、アネキシンＶに結合する試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含む、またはその両方であるようなものであり得る。
【００９８】
方法は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより、マイクロ粒子をサイズにより選択するステップをさらに含むようなものであり得る。
【００９９】
方法は、マイクロ粒子が、ＣＤ９＋マイクロ粒子を含むようなものであり得る。
【０１００】
特に、本出願人らは、マイクロ粒子関連タンパク質の検出のために、血漿由来の脂質マイクロ粒子のアネキシンＶ結合細画分およびＣＴＢ結合細画分を迅速に単離するための方法を提供する。アネキシンＶ結合細画分およびＣＴＢ結合細画分の脂質マイクロ粒子亜集団の迅速な単離は、さらにより画定された血漿細画分へと公知の疾患バイオマーカーを階層化して、その診断、予後またはセラノスティクスの値を改善するための手段をもたらすことができる。
【０１０１】
本出願人らは、マイクロ粒子を含有する試料を分画するための方法を提供する。この方法は、マイクロ粒子のアネキシンＶ細画分もしくはマイクロ粒子のＣＴＢ結合細画分またはその両方を選択するステップを含み得る。方法は、上に記す方法を行うステップを含み得る。
【０１０２】
方法は、分画されたマイクロ粒子試料における、膜タンパク質もしくは内腔タンパク質またはその両方を検出および／または定量化するステップをさらに含み得る。
【０１０３】
本出願人らは、精製されたマイクロ粒子試料であって、（ａ）試料における実質的に全てのマイクロ粒子が、コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）に結合することができるが、アネキシンＶに結合することができない試料、または（ｂ）試料における実質的に全てのマイクロ粒子が、アネキシンＶに結合することができるが、コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）に結合することができない試料を提供する。
【０１０４】
［病理学的状態のモニタリング］
細胞、組織、器官または生物の状態は、疾患状態等の病理学的状態を含み得る。よって、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、細胞、組織、器官もしくは生物の病理学的状態または正常状態から病理学的状態への変化のモニターに用いることができる。
【０１０５】
ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、細胞、組織、器官または生物が、正常（未罹患）状態にあるか罹患状態にあるかの検出に用いることができる。これは、正常、未罹患状態から罹患状態への細胞、組織、器官または生物の進行のモニターに用いることができる。これは、細胞、組織、器官または生物の疾患の段階のモニターに用いることができる。疾患は、細胞、組織、器官または生物が患うまたは患い得る様々な疾患のいずれかを含み得る。
【０１０６】
一般に、疾患状態は、肥大型心筋症、細菌性心内膜炎、無脳回症、筋萎縮性側索硬化症、眩暈、ファロー四徴症、心筋炎、アルコール依存症、貧血症、腕神経叢、ニューロパチー、痔核、先天性心疾患、円形脱毛症、鎌状赤血球貧血症、僧帽弁逸脱症、自律神経系疾患、異常性、アルツハイマー病、狭心症、直腸疾患または催不整脈性右のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１０７】
疾患状態は、心室異形成、酒さ性ざ瘡、弱視、強直性脊椎炎、心房細動、心タンポナーデ、後天性免疫不全症候群、アミロイドーシス、摂食障害、不安症、自閉症、脳新生物、中枢神経系疾患、色覚異常、動脈硬化症、背部痛、乳房疾患、中枢神経系感染症、結腸直腸新生物、関節炎、ベーチェット症候群、乳房新生物、脳性麻痺、感冒、喘息、双極性障害、熱傷または頸部新生物のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１０８】
疾患状態は、コミュニケーション障害、粥状動脈硬化、盲目、カンジダ症、シャルコー・マリー病、クローン病、注意欠陥障害、脳損傷、白内障、潰瘍性大腸炎、累積外傷性障害、嚢胞性線維症、発達障害、摂食障害、丹毒、線維筋痛症、褥瘡、糖尿病、肺気腫、大腸菌感染症、毛包炎、嚥下障害、糖尿病性足病変または脳炎のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１０９】
疾患状態は、食道性疾患、食物過敏症、認知症、ダウン症候群、日本脳炎、眼新生物、食中毒、デング熱、失読症、子宮内膜症、ファブリー病、胃腸炎、抑うつ、ジストニア、癲癇、慢性疲労症候群、胃食道逆流、ゴーシェ病、血液学的疾患、ヒルシュスプルング病、水頭症、甲状腺機能亢進症、歯肉炎、血友病、組織球増殖症、多汗症、低血糖、緑内障、肝炎およびｈｉｖ感染症のうちいずれか１種以上を含み得る。例えば、状態は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染状態、結核（ＴＢ）感染状態、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）感染状態または治療法の状態、例えば、治療を行っている患者であり得る。
【０１１０】
疾患状態は、高シュウ酸尿症、甲状腺機能低下症、糖原貯蔵障害、肝レンズ核変性症、ホジキン病、過敏症、免疫不全症候群、頭痛、ヘルニア、ホルト・オーラム症候群、高血圧、不能、うっ血性心不全、性器ヘルペス、ハンチントン病、肺高血圧、失禁、不妊症、白血病、全身性エリテマトーデス、マズラ菌症、精神遅滞、炎症、肝臓新生物、ライム病、マラリアまたは先天性代謝異常のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１１１】
疾患状態は、炎症性腸疾患、ｑｔ延長症候群、リンパ管筋腫症、麻疹、片頭痛、インフルエンザ、腰痛、リンパ浮腫、メラノーマ、口腔先天異常、ラテックスアレルギー、閉塞性肺疾患、リンパ腫、髄膜炎、ムコ多糖症またはハンセン病のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１１２】
疾患状態は、肺新生物、黄斑変性症、閉経、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋筋膜性疼痛症候群、変形性関節症、膵臓新生物、消化性潰瘍、重症筋無力症、悪心、骨粗鬆症、パニック障害、ペルシャ湾症候群、骨髄腫、聴神経腫瘍、中耳炎、対麻痺、フェニルケトン尿症、骨髄増殖性障害、眼振、卵巣新生物またはパーキンソン病のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１１３】
疾患状態は、褐色細胞腫、心筋疾患、日和見感染症、疼痛、毛様体扁平部炎、恐怖症性障害、心筋梗塞、遺伝性視神経萎縮症、膵臓疾患、シラミ寄生症、ペスト、ポイズンアイビー皮膚炎、プリオン病、反射性交感神経性ジストロフィー、統合失調症、内気、灰白髄炎、前立腺疾患、気道疾患、強皮症、シェーグレン症候群またはリウマチ性多発筋痛症のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１１４】
疾患状態は、前立腺新生物、レストレスレッグス、脊柱側弯症、皮膚疾患、ポリオ後症候群、乾癬、網膜疾患、壊血病、皮膚新生物、前癌性状態、狂犬病、網膜芽細胞腫、性交障害、睡眠障害、妊娠、奇病、サルコイドーシス、性行為感染性疾患、痙性斜頸または脊髄損傷のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１１５】
疾患状態は、吃音、精巣新生物、抜毛癖、尿路感染症、脊椎癒合不全、化学物質関連障害、サラセミア、三叉神経痛、泌尿生殖器疾患、脊髄小脳変性症、乳児突然死、血栓症、結核、血管性疾患、斜視、自殺、耳鳴、結節性硬化症、ウイルス性疾患、外傷後ストレス障害、脊髄空洞症、トゥレット症候群、ターナー症候群または視覚障害のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１１６】
疾患状態は、心理的ストレス、顎関節機能不全症候群、トラコーマ、尿失禁、嘔吐、フォン・ヴィルブランド病、腎性骨異栄養症、細菌感染症、消化器系新生物、骨新生物、外陰部疾患、子宮外妊娠、マダニ媒介疾患、マルファン症候群、加齢、ウィリアムズ症候群、血管形成因子、蕁麻疹、敗血症、吸収不良症候群または創傷および損傷のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１１７】
疾患状態は、脳血管発作、多種化学物質過敏症、眩暈、水腎症、黄熱、神経原性関節症、肝細胞性がん、多形性腺腫、ファーター膨大部、メッケル憩室、円錐角膜皮膚、疣贅、シックビルディング症候群、泌尿器疾患、虚血性視神経ニューロパチー、総胆管結石、耳鼻咽喉疾患、上大静脈症候群、副鼻腔炎、橈骨骨折、変形性骨炎、絨毛性新生物、軟骨肉腫または読字（reading）および頸動脈狭窄のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１１８】
疾患状態は、静脈瘤、クロイツフェルト・ヤコブ症候群、胆嚢疾患、関節置換術、白斑、鼻部疾患、環境病、巨大結腸症、肺炎、前庭疾患、クリプトコッカス症、帯状疱疹、卵管新生物、感染症、不整脈、グルコース不耐性、神経内分泌腫瘍、疥癬のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１１９】
疾患状態は、アルコール性肝炎、寄生虫症、卵管炎、クリプトコッカス髄膜炎、頭蓋内動脈瘤、悲嘆、結石、色素性母斑、直腸新生物、真菌症、血管腫、結腸新生物、ビタミンＡ過剰症、腎石灰化症、腎臓新生物、ビタミン、カルチノイド腫瘍、セリアック病、下垂体疾患、脳死、胆道疾患または前立腺炎のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１２０】
疾患状態は、医原性疾患、胃腸出血、腺がん、中毒性巨大結腸症、被切断者、脂漏性角化症、骨髄炎、バレット食道、出血、胃新生物、水痘、胆嚢炎または軟骨腫のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１２１】
疾患状態は、細菌感染症および真菌症、副甲状腺新生物、精索捻転、腺腫、扁平苔癬、肛門腺新生物、脂肪腫、足白癬、アルコール性肝疾患、神経線維腫症、リンパ性疾患、高齢者虐待、湿疹、憩室炎、がん、膵炎、アメーバ症、妊娠合併症、腎盂腎炎、感染性単核球症または動脈瘤のうちいずれか１種以上を含み得る。
【０１２２】
疾患状態は、例えば、ヒトの妊婦等の妊娠中の生物における子癇前症を含み得る。妊娠中の生物は、妊娠第一期、妊娠第二期または妊娠第三期であり得る。試料は、例えば、妊娠第三期の妊婦から採取し、本明細書に記載されている解析に付して、その妊婦が子癇前症を患っている、またはこれを患うリスクがあるか確認することができる。
【０１２３】
特に、疾患状態は、糖尿病、免疫障害、神経変性障害または癌または腫瘍等の疾患を含み得る。よって、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、上に挙げられる疾患のいずれかを患っているまたはこれを患う傾向がある細胞、組織、器官または生物の状態のモニターに用いることができる。
【０１２４】
［回復のモニタリング］
血漿ＣＤ９レベルなどのタンパク質レベルは、例えば、食中毒の発症中に、単一の個体における２種の異なるマイクロ粒子集団（即ち、アネキシンＶ結合細画分およびＣＴＢ結合細画分）においてモニターして、患者における損傷、回復およびベースラインをモニターすることができる。
【０１２５】
一方の集団におけるＣＤ９のレベルは、組織損傷を示し得るが、他方におけるＣＤ９のレベルは、組織修復を示し得る。これら２集団の相対レベルを測定することにより、患者が、より多くの組織損傷を有する（即ち、病的、予後不良）か、組織修復を開始した（即ち、回復、予後良好）か、良好な健康状態であるかを決定することができる。
【０１２６】
ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの、アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、患者の予後を示すように用いることもできる。
【０１２７】
［生物試料］
本明細書に記載されている方法および組成物は、その状態をモニターするための、細胞により分泌されたＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの、アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比に関与する。好都合には、比は、細胞の分泌物を含む生物試料を採取することにより決定することができる。
【０１２８】
細胞が、生物に含まれる場合、試料は、実質的にあらゆる生物の体液（血液、鼻咽頭分泌物、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および腟分泌物等が挙げられるがこれらに限定されない）、発汗ならびに精液等が挙げられるがこれらに限定されないものを任意の数含み得る。
【０１２９】
［マイクロ粒子の調製］
ＣＴＢ結合マイクロ粒子またはアネキシンＶ結合マイクロ粒子は、次のプロトコールを用いて血漿（または他の体液）から調製することができる。
【０１３０】
１０μＬの血漿を、１００μＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４における０．１μｇのビオチン化コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）（ＳＢＬ  Ｖａｃｃｉｎ  ＡＢ）または０．１μｇのビオチン化アネキシンＶ（ＡＶ）（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）と１時間、３７℃、８００ｒｐｍで振盪しつつインキュベートした。その間に、１００μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄の後、血漿−ＣＴＢまたは血漿−ＡＶ反応ミックスを、洗浄したビーズに添加し、８００ｒｐｍで振盪しつつ３０分間インキュベートした。ビーズを磁石で固定化し、上清を除去した。次に、ビーズを２００μｌのＰＢＳで三度洗浄し、各回ビーズを磁石で固定化した後に洗浄液を除去した。
【０１３１】
［ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比］
ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子におけるポリペプチドの含量の、アネキシンＶマイクロ粒子におけるポリペプチドの含量に対する比として単純に計算することができる。
【０１３２】
あるいは、またはその上、細胞状態の変化の結果として変化しないことが分かっている、アネキシンＶマイクロ粒子における別のポリペプチドの含量に対するＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子におけるそのポリペプチドの含量は、内部対照として用いることができる。
【０１３３】
よって、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比の変化のモニタリングの代わりに、またはこれに加えて、第２の比に対する第１の比の比をモニタリング目的に用いることができる。ここで、第１の比は、細胞状態の変化の結果として変化することが分かっている、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの、アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比であり、第２の比は、細胞状態の変化の結果として変化しないことが分かっている、ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比である。
【０１３４】
［ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比のプロファイル］
ＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの、アネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比の決定に代えて、またはこれに加えて、それぞれが細胞の状態を示す、複数の選択されたポリペプチド種についてのＧＭ１ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンＶマイクロ粒子ポリペプチドに対する比を複数含むプロファイルを確定することもできる。このようなプロファイルの変化は、細胞の状態をモニターする手段としてモニターすることができる。プロファイルは、複数の選択されたポリペプチド種それぞれに結合し、それらの間を区別することのできる複数の結合剤を含むアレイとのハイブリダイゼーション等の、当技術分野において公知の任意の手段により確定することができる。
【実施例】
【０１３５】
［例１．正常個体の血清からのＣＤ９＋マイクロ粒子の濃縮］
この試験において、本出願人らは先ず、ＣＴＢが、血清におけるＣＤ９＋マイクロ粒子と結合するか決定した。ＣＴＢと結合したＣＤ９が存在しなかったため、本出願人らは、ショ糖密度勾配における血清ＣＤ９＋マイクロ粒子の沈降密度を決定し、血清におけるＣＤ９が、エキソソームよりも高い沈降密度を有することを見出した。
【０１３６】
ＣＴＢ結合の欠如及び高い沈降密度は、ＣＤ９＋マイクロ粒子が、アポトーシス小体であることを示唆した。次に、アネキシンＶへのＣＤ９の結合により、このことを確認した。
【０１３７】
［例２．材料と方法  −  サイズ排除クロマトグラフィー］
２ｍＬのセファロース（登録商標）２Ｂ樹脂（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ  ｎｏ．２Ｂ３００）を、ピペットを用いてスピンカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃａｔ  ｎｏ．７３２−６００８）に入れ、８００ｇで１分間スピンした。上清を除去し、１ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加し、続いて８００ｇで１分間スピンすることにより洗浄した。次に、１ｍＬのヒト血清をロードし、カラムを８００ｇで１分間スピンした。
【０１３８】
フロースルーを収集し、各回１ｍＬのＰＢＳを用いてこのプロセスを三度反復した。３つの洗浄画分を収集した。各画分の２０μＬを４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。ゲルは、ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ（商標）銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）で染色、またはニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。膜を１：５０希釈のマウス抗ヒトＣＤ９抗体によりプローブ処理し、続いて１：１２５０希釈のＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ抗体で処理した。
【０１３９】
全抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した。結合した抗体を、ＨＲＰ増強化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて可視化し、Ｘ線フィルムに露光した。
【０１４０】
［例３．材料と方法  −  コレラ毒素Ｂアフィニティークロマトグラフィー］
分子ふるいから得られた２００μＬの血清フロースルーを、１００μＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４における０．１μｇのビオチン化コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１時間、室温にて８００ｒｐｍで振盪しつつインキュベートした。１００μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、反応ミックスを添加し、８００ｒｐｍで振盪しつつ３０分間インキュベートした。
【０１４１】
ビーズを磁石で固定化し、上清または非結合画分を除去した。次に、ビーズを１００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、各回ビーズを磁石で固定化した後に洗浄液を除去した。１００μｌの変性／還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーにおいてビーズを煮沸して、残存する結合したタンパク質を溶出させた。等容量の非結合画分、洗浄液、溶出および結合した画分を、４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。
【０１４２】
ゲルは、銀で染色、またはニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。膜を１：５０希釈のマウス抗ヒトＣＤ９抗体でプローブ処理した。二次抗体は、１：１２５０のＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ抗体であった。全抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した。結合した抗体を、ＨＲＰ増強化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて可視化し、Ｘ線フィルムに露光した。
【０１４３】
［例４．材料と方法  −  ショ糖勾配］
２２．８％から６０％の濃度を有する１４種のショ糖溶液を調製し、最も濃縮された溶液から始めて、超遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．、ＣＡ）において順次重層した。５００μＬのヒト血清をその上にロードし、続いて１６．５時間、２０００００ｇ、４℃で、ＳＷ６０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．）において超遠心した。遠心分離後に、勾配の上層から始めて３２０μＬの１３画分を収集した。
【０１４４】
固定容量を秤量することにより、各画分の密度を決定した。２０μＬの各画分を、４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。ゲルは、ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ(商標)銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）で染色、またはニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。膜を１：５０希釈のマウス抗ヒトＣＤ９抗体でプローブ処理し、続いて１：１２５０希釈のＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ抗体で処理した。全抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した。
【０１４５】
結合した抗体を、ＨＲＰ増強化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて可視化し、Ｘ線フィルムに露光した。ショ糖勾配から得られた画分９〜１３をプールし、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して一晩透析した。プールした画分を、２０μＬになるよう濃縮した。
【０１４６】
［例５．材料と方法  −  アネキシンＶアフィニティークロマトグラフィー］
ショ糖勾配から得られたプール画分のうち２０μＬを、２０μＬの５×アネキシンＶ結合バッファー（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と混合し、水により最終容量１００μＬとした。このプール画分試料のうち９０μＬを、１０μＬのアネキシンＶと１時間、室温にて８００ｒｐｍで振盪しつつインキュベートした。
【０１４７】
１００μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、反応ミックスを添加し、８００ｒｐｍで振盪しつつ３０分間インキュベートした。ビーズを磁石で固定化し、上清または非結合画分を除去した。次に、ビーズを１００μｌのＰＢＳで４回洗浄し、各回ビーズを磁石で固定化した後に洗浄液を除去した。
【０１４８】
１００μｌの変性／還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーにおいてビーズを煮沸して、残存する結合したタンパク質を溶出させた。等容量の非結合画分、洗浄液、溶出および結合した画分を、４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。ゲルをニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。
【０１４９】
膜を１：５０希釈のマウス抗ヒトＣＤ９抗体でプローブ処理した。二次抗体は、１：１２５０のＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ抗体であった。全抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した。
【０１５０】
結合した抗体を、ＨＲＰ増強化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて可視化し、Ｘ線フィルムに露光した。
【０１５１】
［例６．健常個体の血清におけるＣＤ９は、アネキシンＶに結合するが、ＣＴＢに結合しない］
健常個体ＣＴＢの血清においてＣＤ９＋マイクロ粒子が存在するか決定するため、血清を先ずサイズ分画して、大型の粒子を濃縮し、アルブミン等の豊富な小型の血清タンパク質を除去した。次に、分画された血清をＣＴＢとインキュベートして、血清におけるＣＤ９が、アネキシンＶとまたはアネキシンＶに結合するか決定した。
【０１５２】
［例７．結果  −  大型のＣＤ９＋マイクロ粒子が、ＣＴＢによって健常個体の血清において存在する］
結果を図１に示す。
【０１５３】
血清のサイズ分画は、フロースルーおよび洗浄１の画分におけるＣＤ９の濃縮をもたらし、小型のタンパク質であるＣＤ９が、大型の複合体と会合するに相違ないことを示唆する。
【０１５４】
［例８．結果  −  ＣＤ９＋マイクロ粒子は、ＣＴＢと結合しない］
結果を図２の上パネルに示す。
【０１５５】
ＣＤ９を含むタンパク質の多くは、ＣＴＢと結合しない（下パネル）。したがって、健常個体の血清におけるＣＤ９＋マイクロ粒子は、ＣＴＢと結合せず、ＧＭ１ガングリオシドを有さない。健常個体の血清におけるＣＤ９＋マイクロ粒子は、エキソソームではない。
【０１５６】
［例９．結果  −  ＣＤ９＋マイクロ粒子は、高い沈降密度を有する］
結果を図３に示す。
【０１５７】
健常個体の血清におけるＣＤ９＋マイクロ粒子の種類を同定するため、ショ糖密度勾配において血清を分画し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットハイブリダイゼーションにより画分を解析した。ＣＤ９＋マイクロ粒子は、１．１８１〜１．２２６ｇ／ｍｌの密度において沈降した。この密度は、アポトーシス小体に予想される密度であり、１．１３〜１．１９ｇ／ｍｌであるエキソソームのものではない（Ｔｈｅｒｙ、Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉら、２００９）。
【０１５８】
［例１０．結果  −  健常個体の血清におけるＣＤ９＋マイクロ粒子は、アネキシンＶと結合する］
結果を図４に示す。
【０１５９】
ＣＤ９＋マイクロ粒子の一部がアポトーシス小体であることを確認するため、本出願人らは、このようなマイクロ粒子が、アネキシンＶと結合することができるか決定する。さらに１０結合画分をゲルにロードした場合にのみＣＤ９が検出されるため、高密度ＣＤ９＋マイクロ粒子の一部（全てではない）は、アネキシンＶと結合することができる。
【０１６０】
［例１１．結論］
健常個体の血清は、ＣＤ９＋マイクロ粒子を含有する。しかし、このようなマイクロ粒子は、エキソソームではないか、このようなマイクロ粒子のごく僅かな比率がエキソソームである。これらは、ＣＴＢと結合せず、したがって、エキソソーム膜の顕著な特色である、脂質ラフトに高度に濃縮されたＧＭ１ガングリオシドまたは脂質が殆どないか、全くない。
【０１６１】
さらに、全てではないとしても大部分のマイクロ粒子は、エキソソームの１．１３〜１．１９ｇ／ｍｌの密度ではなく１．１８１〜１．２２６ｇ／ｍｌのショ糖における沈降密度を有する、高密度マイクロ粒子である。その代わりに、かなりの比率が、露出したＰＳを含有する高密度アポトーシス小体であった。残りのマイクロ粒子は、依然としてアポトーシス小体であり得るが、これは検証する必要がある。健常個体の血清における低レベルのＣＴＢ結合ＣＤ９＋マイクロ粒子は、血清におけるＣＴＢ結合ＣＤ９＋マイクロ粒子に由来する、疾患または疾患感受性のいずれかのバイオマーカーの予測性を増加させるであろう。
【０１６２】
エキソソームが、ニューロンおよび免疫細胞における細胞間連絡の媒体として分泌され（Ｓｍａｌｈｅｉｓｅｒ、２００７；Ｔｈｅｒｙ、Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉら、２００９）、多くの疾患関連タンパク質が、エキソソームにおいて分泌されることが報告されている（例えば、アルツハイマー病におけるベータ−アミロイドペプチド（Ｒａｊｅｎｄｒａｎ、Ｈｏｎｓｈｏら、２００６）、結核菌（M. tuberculosis）感染Ｊ７７４細胞におけるマイコバクテリアタンパク質（Ｇｉｒｉ、Ｋｒｕｈら、２０１０）、腫瘍抗原（Ｔａｙｌｏｒ  および  Ｇｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ  ２００５））ことを考慮すると、健常個体の血清におけるＣＴＢ結合ＣＤ９＋マイクロ粒子の低いベースラインに関する本出願人らの観察は、関連する良好な健康の指標であり得、その上昇は、疾患、疾患損傷または組織修復のための細胞連絡の増加のセンチネルであり得る。
【０１６３】
したがって、マイクロ粒子のこの集団の解析は、疾患の診断または予後のためのより予測的なバイオマーカーをもたらす可能性が高い。
【０１６４】
［例１２．血漿およびＭＳＣ馴化培地における脂質微小胞間の差］
（材料と方法）
Ｍｙｃ形質転換ＥＳ由来ＭＳＣ株（Ｍｙｃ−ＨｕＥＳ９．Ｅ１）により馴化した培養培地および血漿を、ショ糖密度勾配上にロードした。勾配は、２３％から６０％（ｗ／ｖ）濃度の１４種のショ糖溶液を重層することにより調製した。
【０１６５】
試料をロードした後、１８時間、２００，０００ｇ、４℃で勾配を超遠心した。１３画分において、上層から勾配を除去した。１００μＬの各画分を秤量することにより、各画分の密度を決定した。各画分におけるＣＤ９＋アネキシンＶ結合微小胞およびＣＤ９＋ＣＴＢ結合微小胞の相対レベルを決定した。
【０１６６】
（結果）
図５を参照されたい。
【０１６７】
血漿におけるＣＤ９＋微小胞は、主としてアネキシンＶ結合性であるが、ＭＳＣ馴化培地における微小胞は、主としてコレラ毒素Ｂ鎖（ＣＴＢ）結合性である。
【０１６８】
血漿におけるＣＴＢ結合微小胞は、２種の弁別的ショ糖密度１．２１〜１．５９および１．１７３ｇ／ｍｌ超において浮遊するが、ＣＴＢ結合微小胞は、１種の密度、即ち、１．０６５〜１．１９１ｇ／ｍｌにおいて浮遊する。
【０１６９】
注記：血漿およびＭＳＣ馴化培地におけるＣＤ８１＋微小胞は、ＣＤ９＋微小胞と同一の分布プロファイルを提示する。
【０１７０】
［例１３．心臓病患者および健常個体の血漿におけるＣＴＢ結合微小胞と比較したアネキシンＶ結合微小胞におけるタンパク質の分布］
（材料と方法）
図６Ａおよび図６Ｂを参照されたい。
【０１７１】
健常個体（Ｈ）および心臓病患者（Ｄ）に由来する血漿を、ビオチン化アネキシンＶ（図６Ａ）またはコレラ毒素Ｂ（図６Ｂ）とインキュベートした。アネキシンＶまたはコレラ毒素Ｂのいずれかと結合する微小胞を、ストレプトアビジンコンジュゲート磁気ビーズにより抽出した。このような単離された微小胞におけるタンパク質を、ＥＬＩＳＡにおいて特異的抗体を用いてアッセイした。
【０１７２】
（結果）
アネキシンＶおよびＣＴＢ結合血漿微小胞における数種のタンパク質は、健常個体および例えば心臓関連の診療所における患者の間で差次的に分布する。
【０１７３】
アネキシンＶと結合するがＣＴＢと結合しない血漿微小胞におけるＣＤ９、ＣＤ８１およびＴＩＭＰ１は、健常個体よりも患者において有意に高い。
【０１７４】
ＣＴＢと結合するがアネキシンＶと結合しない血漿微小胞におけるＡＮＰは、健常個体よりも患者において有意に高い。
【０１７５】
集団サイズがより大きいおよび／または疾患がより狭く定義される場合、他のタンパク質は、患者対健常個体の２種の微小胞において有意に異なる分布プロファイルを提示し得る。
【０１７６】
心臓病患者対健常個体の血漿微小胞における差の評価に用いることができる他のバイオマーカーは、ＢＮＰ、エンドセリン、レンニン、アンジオテンシンＩＩ、トロポニン、ミオシン、ＩＬ６、ＩＬ１、ＩＬ１０、ＴＮＦα、ＴＧＦβである。
【０１７７】
［例１４．慢性心不全（ＣＨＦ）患者および急性心筋虚血（ＡＭＩ）患者の血漿におけるＣＴＢ結合微小胞と比較したアネキシンＶ結合微小胞におけるタンパク質の分布］
バイオマーカーアッセイのために血漿微小胞を分画することができる実行可能性および値を評価するため、本出願人らは、より限定的な患者群：慢性心不全（ＣＨＦ）患者および急性心筋虚血（ＡＭＩ）患者に由来する血漿試料に本技術を適用した。対照は、健常個体（ｃｏｎ）由来の血漿である（図７）。
【０１７８】
（材料と方法）
微小胞Ａまたは微小胞Ｂのいずれかにおけるバイオマーカー毎に、心不全患者（ＣＨＦ）、健常個体（Ｃｏｎ）およびＡＭＩ患者（ＡＭＩ）に由来する５〜１０マイクロリットルの血漿を用いた。先ずアフィニティークロマトグラフィーにより微小胞を単離し、続いてリガンドに特異的な抗体を用いてＥＬＩＳＡを行うことにより、微小胞ＡまたはＢのいずれかにおけるＢＮＰ、Ｆｌｔ−１、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ９およびＡＮＰの相対レベルを決定した。Ｆｌｔ−１およびＣＤ９は、膜結合型タンパク質であるが、ＢＮＰ、ＴＩＭＰ−１およびＡＮＰは、内腔タンパク質である。
【０１７９】
異なる患者群の微小胞ＡまたはＢにおけるこれらのタンパク質の分布を解析した。ＣＨＦおよびＡＭＩ患者は、Ｃｏｎ個体と比べて、微小胞Ａではなく微小胞Ｂにおいて有意により高いＢＮＰレベルを有していた。微小胞ＡおよびＢ両方におけるＦｌｔ−１は、Ｃｏｎ個体よりもＡＭＩ患者で高かった。
【０１８０】
しかし、微小胞ＡにおけるＦｌｔ−１は、ＣＨＦ患者でより低く、微小胞ＢにおけるＦｌｔ−１は、Ｃｏｎ個体と有意に異ならなかった。３つの患者群における微小胞の中で、ＣＨＦ患者における微小胞Ａ関連型ＴＩＭＰ−１のみが、有意に異なっていた、即ち、より高かった。
【０１８１】
微小胞Ｂではなく微小胞ＡにおけるＣＤ９は、ＣＨＦおよびＡＭＩ患者において有意により高かった。微小胞ＡにおけるＡＮＰは、ＣＨＦおよびＡＭＩ患者で有意により高かった。微小胞Ｂにおいて、ＡＮＰ  Ａは、ＡＭＩ患者のみで有意により高かった。
【０１８２】
（結果）
図７を参照されたい。
【０１８３】
ＣＴＢまたはアネキシンいずれかに対する親和性により単離された微小胞（図７）は、それらの異なるタンパク質プロファイルにより実証される通り、互いに異なる（図７）。差は、疾患特異的でもあった。例えば、ＣＨＦ、ＡＭＩおよびｃｏｎのアネキシンＶ結合微小胞画分におけるＢＮＰレベルは、全３種の患者群において有意に異ならなかった。
【０１８４】
しかし、ＣＨＦおよびＡＭＩのＣＴＢ結合微小胞画分におけるＢＮＰレベルは、対照よりも有意に高かった。他方では、アネキシン（図７）画分におけるＡＮＰは、ｃｏｎ群と比較して、ＣＨＦ群およびＡＭＩ群の両方において有意により高かったが、ＣＴＢ画分におけるＡＮＰは、ＡＭＩ群のみにおいて有意により高かった。
【０１８５】
［例１５．食中毒の症例の血漿ＣＤ９のモニタリング］
食中毒を起こした個体由来の血漿を、発症中及び発症３週間後に上述通りに解析した。健常個体から３週間置いて採取した２種の血漿試料を対照とした。
【０１８６】
結果を図８に示す。食中毒の前（Ａ１）および３週間後（Ａ２）の患者のＣＴＢ画分およびＡｎｎＶ画分における平均蛍光を、Ｂ１およびＢ２に対しプロットした。Ｂ１およびＢ２は、健常対照から３週間置いて採取した血漿試料であった。
【０１８７】
［例１６．ＣＴＢまたはアネキシンＶ結合微小胞いずれかの単離を微小胞における膜タンパク質および内腔タンパク質の定量化に結びつけるためのアッセイの開発］
（材料と方法）
図９を参照されたい。
【０１８８】
先ず血漿をビオチン化ＣＴＢとインキュベートし、次に、ストレプトアビジンコンジュゲート磁気ビーズとインキュベートする。次に、磁気ビーズを磁石で固定化し、ＰＢＳまたは等張性塩溶液で洗浄する。結合した微小胞を一般的な界面活性剤に基づく細胞溶解バッファーで溶解する。
【０１８９】
次に、微小胞内容物を活性化ビオチン、例えば、スルホ−ＮＨＳ−ビオチンによりビオチン化する。特異的タンパク質をアッセイするため、次に、対象とするタンパク質に特異的な抗体をコンジュゲートした磁気ビーズを添加する。次に、抗体に結合したタンパク質を磁石により固定化し、十分に洗浄する。
【０１９０】
ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ、およびＨＲＰ比色定量的基質またはＨＲＰ蛍光定量的基質を用いてタンパク質を定量化する。
【０１９１】
［例１７．結論］
本技術は、単離された微小胞における膜タンパク質および内腔タンパク質の両方に関して定量的にアッセイすることができる。本出願人らは、膜タンパク質および内腔タンパク質の両方を検出することができる（図７）。膜タンパク質および内腔タンパク質の両方を検出するための方法を図８において模式的に描写する。
【０１９２】
［例１８．子癇前症の臨床診断ありまたはなしの妊婦（第三期）の血漿におけるＣＴＢ結合微小胞と比較したアネキシンＶ結合微小胞におけるタンパク質の差次的分布  −  単一ポリペプチド］
アネキシンＶ（ＡＶ）またはコレラ毒素Ｂ鎖（ＣＴＢ）結合微小胞いずれかにおけるバイオマーカー毎に（下表Ｅ１およびＥ２を参照）、子癇前症なし（対照）および臨床的に診断された子癇前症あり（子癇前症）の第三期妊婦由来の５〜１０マイクロリットルの血漿を得た。
【０１９３】
アネキシンＶ（ＡＶ）またはコレラ毒素Ｂ鎖（ＣＴＢ）結合微小胞のいずれかにおけるＰＡＩ−１、ＰＬＧＦ、プロカルシトニン、Ｓ１００ｂ、ＴＧＦβおよびＴＩＭＰ−１の相対レベルを、後述する通りに測定した。
【０１９４】
簡潔に説明すると、先ずＡＶ結合微小胞またはＣＴＢ結合微小胞をアフィニティークロマトグラフィーにより単離し、単離した微小胞を溶解して、微小胞に関連するタンパク質を放出させ、続いて、放出されたタンパク質をビオチン化した。次に、標的化された対象とするタンパク質を、ＨＲＰにコンジュゲートした特異的抗体および蛍光ＨＲＰ基質を用いてアッセイした。
【０１９５】
図１０は、妊婦（第三期）の血漿におけるアネキシンＶおよび／またはＣＴＢ結合微小胞におけるＰＡＩ−１、ＰＬＧＦ、プロカルシトニン、Ｓ１００ｂ、ＴＧＦβおよびＴＩＭＰ−１が、子癇前症の臨床診断なしまたはありの女性において有意な定量的差異（ｐ＜０．０５）を提示することを実証する。
【０１９６】
したがって、これらの微小胞に被包されたタンパク質は、子癇前症の診断用となるバイオマーカーとして用いることができる。
【０１９７】
［例１９．子癇前症の臨床診断なしまたはありの妊婦（第三期）の血漿におけるＣＴＢ結合微小胞と比較したアネキシンＶ結合微小胞におけるタンパク質の差次的分布  −  ポリペプチドの組み合わせ］
同一の血漿微小胞または異なる微小胞のいずれかにおいて２種のタンパク質を組み合わせて用いると、これらのマーカーの診断力は、大幅に改善される（図１０）。
【０１９８】
ロジスティック回帰モデル（Ｍｏｏｒｅら、２００８）を用いて、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成し、ＣＴＢ結合微小胞またはＡＶ結合微小胞における各マーカーまたは２種の異なるマーカーの組み合わせの曲線下面積を計算した（下表Ｅ１および表Ｅ２）。例えば、ＣＴＢ微小胞におけるＰＡＩ−１およびＰＬＧＦの曲線下面積は、それぞれ０．９７２および０．８３３であった。
【０１９９】
ＰＡＩ−１およびＰＬＧＦを組み合わせた場合、曲線下面積は、１．０に増加した（下表Ｅ１）。
【表１】
0006329078.tif 000002
【０２００】
同様に、ＡＶ微小胞における２種以上のマーカーの組み合わせ、例えば、ＰＬＧＦおよびプロカルシトニンも、これらそれぞれの曲線下面積を、それぞれ０．８８９および０．８６１から１．０へと改善した（下表Ｅ２）。
【表２】
0006329078.tif 000003
【０２０１】
これらの実施例は、２種以上を組み合わせた場合の、子癇前症を診断するためのこれらバイオマーカーの頑強性を図解する。
【０２０２】
＜参考文献＞
【表３Ａ】
0006329078.tif 000004
【表３Ｂ】
0006329078.tif 000005
【０２０３】
本文献において言及されている出願および特許のそれぞれ、ならびに上述の出願および特許のそれぞれにおいて、出願および特許それぞれの審査手続き中も含み、引用または参照されている各文献（「出願に引用された文献」）、ならびに出願および特許のそれぞれならびに出願に引用された文献のいずれかにおいて引用または言及されているいずれかの製品のためのいずれのメーカー説明書またはカタログも、これにより、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。さらに、本明細書において引用されているあらゆる文献、および本明細書において引用されている文献において引用または参照されているあらゆる文献、および本明細書において引用または言及されているいずれかの製品のためのいずれかのメーカー説明書またはカタログは、これにより、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０２０４】
本発明の範囲および精神から逸脱することのない、本発明の記載されている方法およびシステムの様々な修正および変化は、当業者であれば明らかとなろう。特定の好ましい実施形態との関連において本発明を説明してきたが、請求されている本発明を、係る特定の実施形態に過度に限定するべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連する分野の当業者にとって明らかな、記載されている発明を実施するための形態の様々な修正は、特許請求の範囲内にあることが企図される。
【図１】
0006329078.tif 000006
【図２】
0006329078.tif 000007
【図３】
0006329078.tif 000008
【図４】
0006329078.tif 000009
【図５】
0006329078.tif 000010
【図６Ａ】
0006329078.tif 000011
【図６Ｂ】
0006329078.tif 000012
【図７】
0006329078.tif 000013
【図８】
0006329078.tif 000014
【図９】
0006329078.tif 000015
【図１０】
0006329078.tif 000016