(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンブリカ・オフィシナリス抽出物による細胞の処理により、酸化的リン酸化を行ってアデノシン三リン酸を合成するミトコンドリアの能力を改善し、前記ミトコンドリア内のプロトンリークを減少させる、細胞におけるミトコンドリア改善のためのエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項２】
前記組成物中の前記エンブリカ・オフィシナリスの抽出物の質量濃度が２０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである、請求項１に記載のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項３】
前記エンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物は経口組成物である、請求項１に記載のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項４】
前記エンブリカ・オフィシナリスの抽出物の有効量が２１６ｍｇ〜５４０ｍｇである、請求項３に記載のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項５】
前記ミトコンドリアでの予備呼吸能が、前記エンブリカ・オフィシナリスの抽出物により増加する、請求項１に記載のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項６】
酸化的リン酸化中の前記ミトコンドリアでの基礎呼吸が、前記エンブリカ・オフィシナリスの抽出物により増加する、請求項１に記載のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項７】
酸化的リン酸化中の前記ミトコンドリアでの共役効率が、前記エンブリカ・オフィシナリスの抽出物により増加する、請求項１に記載のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項８】
前記ミトコンドリアでのアデノシン三リン酸産生量が、前記エンブリカ・オフィシナリスの抽出物により増加する、請求項１に記載のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項９】
エンブリカ・オフィシナリスの抽出物で処理される細胞が幹細胞であって、前記エンブリカ・オフィシナリスの抽出物による前記幹細胞の処理により前記幹細胞の細胞分裂速度を改善し、ミトコンドリア内のプロトンリークを減少させる、細胞分裂速度の改善のためのエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項１０】
前記組成物中の前記エンブリカ・オフィシナリスの抽出物の質量濃度が５０μｇ／ｍｌ〜１２００μｇ／ｍｌである、請求項９に記載のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項１１】
前記エンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物は経口組成物である、請求項９に記載のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項１２】
前記エンブリカ・オフィシナリスの抽出物の有効量が５４０ｍｇ〜１２９６０ｍｇである、請求項１１に記載のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【請求項１３】
エンブリカ・オフィシナリス抽出物による細胞の処理により、ミトコンドリア内のプロトンリークを減少させる、細胞におけるミトコンドリア改善のためのエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ミトコンドリアを改善する方法、および幹細胞の細胞分裂を促進する方法、より具体的には、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物を用いる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリア（単数形では「ミトコンドリオン」と称される）は、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）合成が生じる場所である。ＡＴＰ
が細胞でエネルギー源として使用されることから、ミトコンドリアは細胞の発電所と言われている。ミトコンドリアは、細胞が必要とするエネルギーを生成するだけでなく、細胞分裂、細胞シグナル伝達、および細胞のアポトーシスにも関与し、ミトコンドリアは細胞分裂周期を制御する能力も有する。
【０００３】
ミトコンドリアがＯＸＰＨＯＳを行うとき、いくつかの副産物が生成されるが、これらの副産物はミトコンドリアの内膜にとって有害である。この有害副産物が細胞中に蓄積されると、重大な損傷を受けた内膜がミトコンドリアの崩壊を引き起こし、その後細胞のアポトーシスが開始される。したがって、ミトコンドリアの能力を改善することは、ミトコンドリアの崩壊による細胞のアポトーシスを防止するために重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、ミトコンドリアを改善する方法および幹細胞の細胞分裂を促進する方法であって、ミトコンドリアが崩壊するのを防止して、それによって細胞のアポトーシスを抑制するのに好適な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の一態様によると、細胞中のミトコンドリアを改善する方法であって、ＯＸＰＨＯＳを行ってＡＴＰを合成するミトコンドリアの能力を改善するために、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物で細胞を処理することを含む方法。
【０００６】
本開示の別の態様によると、幹細胞の細胞分裂を促進する方法であって、幹細胞の細胞分裂速度を改善するために、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物で幹細胞を処理することを含む方法。
【０００７】
本開示によると、ＯＸＰＨＯＳを行ってＡＴＰを合成するミトコンドリアの能力を改善するために、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物で細胞が処理される。詳細に言うと、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物は、ミトコンドリアの内膜を保護および修復するのに好適である。したがって、これは、酸化剤に暴露することによるミトコンドリアの崩壊による細胞のアポトーシスを防止するのに好適である。また、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物は、ＡＴＰ合成、ＳＲＣ、最大呼吸、プロトン漏出の補償、および共役効率などのミトコンドリア呼吸機能を活性化させるのに好適である。さらに、細胞分裂を促進するために、幹細胞がエンブリカ・オフィシナリスの抽出物で処理される。したがって、これは、損傷を受けた細胞または古い細胞を置き換えるために、高い分化能を有する幹細胞をより多く得るのに好適である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本開示は、後述の「発明を実施するための形態」および添付の図面からよりよく理解されるが、これらは例として示されるにすぎず、したがって本開示を制限するものではない。
【０００９】
【図１】エンブリカ・オフィシナリスの抽出物の赤外吸収スペクトルである。
【図２】エンブリカ・オフィシナリスの抽出物の高速液体クロマトグラムである。
【図３】第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態のＡＴＰ合成のための酸素消費速度を示す棒グラフである。
【図４】第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態のミトコンドリアでの基礎呼吸を示す棒グラフである。
【図５】第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態のフリーラジカル漏出を補償するのに必要な酸素消費速度を示す棒グラフである。
【図６】第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態のミトコンドリアでの最大呼吸を示す棒グラフである。
【図７】第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態のミトコンドリアでの予備呼吸能を示す棒グラフである。
【図８】第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態のミトコンドリアでの共役効率を示す棒グラフである。
【図９】第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態の非ミトコンドリア呼吸を示す棒グラフである。
【図１０】第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態のＡＴＰ合成のための酸素消費速度を示す棒グラフである。
【図１１】第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態のミトコンドリアでの基礎呼吸を示す棒グラフである。
【図１２】第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態のフリーラジカル漏出を補償するのに必要な酸素消費速度を示す棒グラフである。
【図１３】第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態のミトコンドリアでの最大呼吸を示す棒グラフである。
【図１４】第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態のミトコンドリアでの予備呼吸能を示す棒グラフである。
【図１５】第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態のミトコンドリアでの共役効率を示す棒グラフである。
【図１６】第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態の非ミトコンドリア呼吸を示す棒グラフである。
【図１７】第５〜第１２の実施形態ならびに第８および第９の比較実施形態の幹細胞からの蛍光強度を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
下記の「発明を実施するための形態」では、開示された実施形態の十分な理解を提供するために、説明の目的で、多くの具体的詳細を記載する。しかしながら、これらの具体的な詳細なしに１つまたは複数の実施形態を実施することができることは明らかである。図面を簡略化するために、周知の構造および装置を概略的に示す場合もある。
【００１１】
どの実施形態も、本開示の原理およびその実用化を正しく説明し、それにより当業者が本開示をよりよく利用できるように、１つの参考例として選択される。本開示の方法は、これらの実施形態の１つにおいて開示される特定の形態に限定されない。これらの実施形態の１つにおいて開示されるいかなる制限も以下の教示を考慮して修正または変更することが可能である。
【００１２】
エンブリカ・オフィシナリスは、フィランサス・エンブリカ、エンブリック、エンブリック・ミロバラン、ミロバラン、インドスグリ、マラッカノキ、またはサンスクリット語のアマリカ（ａｍａｌｉｋａ）に由来するアムラとしても知られる、コミカンソウ科の落葉樹であり、その同名の食用の果実でも知られている。エンブリカ・エンブリカは、インド原産で、中国南部およびマレーシアに分布する。
【００１３】
本開示は、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物を開示する。いくつかの実施形態では、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物は、超臨界流体抽出によりエンブリカ・オフィシナリスの果実から得られ、超臨界流体として通常は二酸化炭素が使用される。いくつかの実施形態では、塩の水溶液、例えば０．１〜５％（ｗ／ｗ）の塩化ナトリウム溶液、塩化カリウム溶液、塩化カルシウム溶液、または塩化マグネシウム溶液、メタノール、エタノール、アセトン、および酢酸エチルを用いてエンブリカ・オフィシナリスの果実を抽出して、初期エキスを得、その後その初期エキスを濾過および精製してエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を得る。
【００１４】
いくつかの実施形態では、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物は、エンブリカニン−Ａとエンブリカニン−Ｂとの混合物３５％〜５５重量％、ポニグルコニン（Ｐｏｎｉｇｌｕｃｏｎｉｎ）４〜１５重量％、ペドゥンクラジン（Ｐｅｄｕｎｃｕｌａｇｉｎ）１０〜２０重量％、ルチン５〜１５重量％、およびガロ−エラジタンノイド（Ｇａｌｌｏ−ｅｌｌａｇｉｔａｎｎｏｉｄ）１０〜３０重量％を含む。エンブリカ・オフィシナリスの抽出物は、複数の特性赤外吸収ピークをそれぞれ３４０３．６±５ｃｍ−１、２９３１．６±５ｃｍ−１、１３８５．０±５ｃｍ−１、１３１８．６±５ｃｍ−１、１６２３．５±５ｃｍ−１、１４５１．３±５ｃｍ−１、１３５２．１±５ｃｍ−１、１２１８．４±５ｃｍ−１、１１４８．６±５ｃｍ−１、１０３５．７±５ｃｍ−１、および３４０３．６±５ｃｍ−１で有する。エンブリカ・オフィシナリスの抽出物は、高速液体クロマトグラムに、複数の特性ピークをそれぞれ１．６２０±０．５分、２．１４８±０．５分、３．２６５±０．５分、および４．３７０±０．５分の保持時間で有する。図１および図２を参照されたい。図１は、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物の赤外吸収スペクトルである。図２は、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物の高速液体クロマトグラムである。
【００１５】
エンブリカニン−Ａ、別名２，３−ジ−Ｏ−ガロイル−４，６−（Ｓ）−ヘキサヒドロキシジフェノイル−２−ケト−グルコノ−ラクトンの構造式は以下のとおりである。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
エンブリカニン−Ｂ、別名２，３，４，６−ビス−（Ｓ）−ヘキサヒドロキシジフェノイル−２−ケト−グルコノ−ラクトンの構造式は以下のとおりである。
【００１８】
【化２】
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【００１９】
ポニグルコニン、別名２，３−ジ−Ｏ−ガロイル−４，６−（Ｓ）−ヘキサヒドロキシジフェノイルグルコン酸の構造式は以下のとおりである。
【００２０】
【化３】
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【００２１】
ペドゥンクラジン、別名２，３，４，６−ビス−（Ｓ）−ヘキサヒドロキシジフェノイル−Ｄ−グルコースの構造式は以下のとおりである。
【００２２】
【化４】
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【００２３】
ルチン、別名３’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラボノ−１，３−Ｏ−ラムノグルコシドの構造式は以下のとおりである。
【００２４】
【化５】
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【００２５】
本開示は、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物で細胞を処理することを含む、細胞中のミトコンドリアを改善する方法を開示する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物で細胞を処理し、組成物中のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物の質量濃度は、２０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。エンブリカ・オフィシナリスの抽出物は、細胞に入ると、ミトコンドリアの内膜を保護および修理することができる。したがって、ＯＸＰＨＯＳによりＡＴＰを合成するミトコンドリアの能力が改善される。詳細に言うと、ミトコンドリアがエンブリカ・オフィシナリスの抽出物により修復されると、ミトコンドリアでのＡＴＰの産生量が増加し、ＯＸＰＨＯＳ中のミトコンドリアでの基礎呼吸が増加し、ミトコンドリアの内膜でのプロトン漏出が減少し、ミトコンドリアでの最大呼吸能が増加し、ミトコンドリアでの予備呼吸能が増加し、ＯＸＰＨＯＳ中のミトコンドリアでのＡＴＰ合成の共役効率が増加する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物は経口投与により提供される。つまり、ヒトがエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を食べる、または飲むことによって、体内の細胞を処理することができる。エンブリカ・オフィシナリスの抽出物を経口投与により提供する場合、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物の有効量は、２１６ｍｇ〜５４０ｍｇである。ヒトにおける有効量は、変換式によって得られる。この変換式は、（ヒトにおける有効量）＝（細胞実験における有効量）×（マウスの体重）×（変換係数）×（ヒトの体重）である。変換係数は、変換係数表から得られる。例えば、マウスの体重が２０ｋｇで、ヒトの体重が６０ｋｇであれば、変換係数は９．０１である。
【００２８】
ミトコンドリアでＯＸＰＨＯＳにより合成されるＡＴＰの産生量が増加すると、細胞成長および細胞分裂のためにＡＴＰの形態で提供されるエネルギーも増加し、それにより細胞増殖が改善される。その結果、幹細胞をエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物で処理し、かつ組成物中のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物の質量濃度が５０μｇ／ｍｌ〜１２００μｇ／ｍｌである場合、幹細胞の細胞分裂速度が増加する。組成物中のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物の質量濃度が５０μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌである場合、幹細胞の細胞分裂速度はより大幅に増加する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、幹細胞を処理するために、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物を経口投与により提供する。エンブリカ・オフィシナリスの抽出物を経口投与により提供する場合、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物の有効量は、５４０ｍｇ〜１２９６０ｍｇである。エンブリカ・オフィシナリスの抽出物の有効量が５４０ｍｇ〜８６４０ｍｇである場合、幹細胞の細胞分裂速度はより大幅に増加する。
【００３０】
経口投与をより便利にするために、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物を加工食品にしてもよく、その加工食品を液体形態、個体形態、粉末形態、顆粒形態、ペースト形態、またはコロイド形態で提供することができる。風味を良くし、投与を便利にするために、加工食品に賦形剤および香味剤を添加することもできる。
【００３１】
賦形剤は、例えば、小麦デンプン、米デンプン、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、デキストリン、シクロデキストリン、乳糖、ブドウ糖、砂糖、還元麦芽糖、シリアロース（ｃｅｒｅａｌｏｓｅ）、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、またはマンニトールである。香味剤は、例えば、竜眼エキス、ライチエキス、グレープフルーツエキス、リンゴ果汁、オレンジ果汁、レモン果汁、ピーチエッセンス、プラムエッセンス、ヨーグルトエッセンス、アセスルファムカリウム、スクラロース、エリスリトール、オリゴ糖、マンノース、キシリトール、異性化糖、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸塩、緑茶、ウーロン茶、バナバ茶、杜仲茶、鉄観音茶、ハトムギ茶、アマチャヅル茶、マコモ茶、または昆布茶である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、着色剤、保存料、粘着付与剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、安定剤、膠化剤、抗酸化剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤など、使用が認められているいくつかの食品添加剤をエンブリカ・オフィシナリスの抽出物の加工食品に添加する。
【００３３】
本開示により、細胞中のミトコンドリアを保護および修復する方法を説明するために、本開示の２つの実施形態および５つの比較実施形態を下記に示す。細胞中のミトコンドリアを保護および修復する方法の効果を説明するために、いくつかの実験データを要約する。
【００３４】
以下の実施形態は、Ｐ６継代の脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）を用いて実施する。実験試料の準備として、合計８０００個の脂肪由来幹細胞を細胞培養プレートの各ウェルに播種し、その後その脂肪由来幹細胞を培地とともに２４時間インキュベートし、その後ウェルから培地を除去する。脂肪由来幹細胞中のミトコンドリアに対する損傷のシミュレーションは、脂肪由来幹細胞を２００ｍＭ（モル濃度）のＨ２Ｏ２溶液に３０分間暴露することにより実施し、前述の暴露後、脂肪由来幹細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。
【００３５】
いくつかの実験では、幹細胞が配置された、培地を含まない細胞培養プレートのウェルに、既定の質量濃度のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物を添加し、そのウェル中の脂肪由来幹細胞をエンブリカ・オフィシナリスの抽出物とともに２４時間インキュベートする。次いで、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物をウェルから除去し、ウェルに２００ｍＭのＨ２Ｏ２溶液を添加して、脂肪由来幹細胞をそのＨ２Ｏ２溶液に３０分間浸漬する。次いで、その脂肪由来幹細胞をＰＢＳで洗浄する。次いで、細胞培養プレート中の細胞の酸素消費速度をＳｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦアナライザーで測定する。
【００３６】
Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦアナライザーは、以下のステップにより幹細胞の酸素消費速度を測定する。第１のステップでは、幹細胞の基礎呼吸を検出する。第２のステップでは、ミトコンドリアのＡＴＰを合成する活性を低下させるように何らかのＡＴＰ合成阻害剤を添加し、この酸素消費速度の減少はＡＴＰ合成のための酸素消費速度と等しくなる。第３のステップでは、ＡＴＰ合成を中断させるように、ミトコンドリアの内膜の電子伝達系に損傷を与えない適切な質量濃度の何らかの抗共役剤を添加し、ミトコンドリアでの最大呼吸を評価する。第４のステップでは、ミトコンドリアでの呼吸を完全に停止させるように、何らかの電子伝達系阻害剤を添加し、背景値は、ミトコンドリアでの非ミトコンドリア呼吸と等しくなる。
【００３７】
いくつかのパラメータは、以下の式により得ることができる。
ミトコンドリアでの基礎呼吸＝（細胞での基礎呼吸）−（ミトコンドリアでの非ミトコンドリア呼吸）、
フリーラジカル漏出を補償するのに必要な酸素消費速度＝（ミトコンドリアでの基礎呼吸）−（ＡＴＰ合成のための酸素消費速度）、
ミトコンドリアでの予備呼吸能＝（ミトコンドリアでの最大呼吸）−（ミトコンドリアでの基礎呼吸）、および
ミトコンドリアでの共役効率＝（ＡＴＰ合成のための酸素消費速度）／（ミトコンドリアでの基礎呼吸）。
【００３８】
本開示の２つの実施形態および５つの比較実施形態の詳細な実験データを下記の表１に示す。表１に示す実験データは、幹細胞の数により正規化したものである。
【００３９】
【表１】
0006329234.tif 000007
【００４０】
図３〜図９を参照されたい。図３は、第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態による、ＡＴＰ合成のための酸素消費速度を示す棒グラフである。図４は、第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態による、ミトコンドリアでの基礎呼吸を示す棒グラフである。図５は、第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態による、フリーラジカル漏出を補償するのに必要な酸素消費速度を示す棒グラフである。図６は、第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態による、ミトコンドリアでの最大呼吸を示す棒グラフである。図７は、第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態による、ミトコンドリアでの予備呼吸能を示す棒グラフである。図８は、第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態による、ミトコンドリアでの共役効率を示す棒グラフである。図９は、第１の実施形態、第２の実施形態、および第１〜第５の比較実施形態による、非ミトコンドリア呼吸を示す棒グラフである。
【００４１】
図３に示すように、第１および第２の実施形態におけるＡＴＰ合成のための酸素消費速度は、第１〜第５の比較実施形態のものよりも高値である。図４に示すように、第１および第２の実施形態におけるミトコンドリアでの基礎呼吸は、第１〜第５の比較実施形態のものよりも高値である。図５に示すように、第１および第２の実施形態におけるプロトン漏出を補償するのに必要な酸素消費速度は、第１〜第５の比較実施形態のものよりも低値である。図６に示すように、第１および第２の実施形態におけるミトコンドリアでの最大呼吸は、第１〜第５の比較実施形態のものよりも高値である。図７に示すように、第１および第２の実施形態におけるミトコンドリアでの予備呼吸能は、第１〜第５の比較実施形態のものよりも高値である。図８に示すように、第１および第２の実施形態におけるミトコンドリアでの共役効率は、第１〜第５の比較実施形態のものよりも高値である。図９に示すように、第１および第２の実施形態におけるミトコンドリアでの非ミトコンドリア呼吸は、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物がミトコンドリアでの酸素消費速度に影響を与えるが、非ミトコンドリア細胞小器官での酸素消費速度には影響を与えないことから、第１〜第５の比較実施形態のものと有意な差は認められない。
【００４２】
図３〜図９に示される結果によると、第１および第２の実施形態において、ミトコンドリアでの基礎呼吸は、主にＡＴＰ合成のために使用され、それによりＡＴＰの産生量が増加し、すなわちミトコンドリアでの共役効率が増加する。さらに、プロトン漏出を補償するのに必要な酸素消費速度が減少し、それにより膜間腔にプロトンを輸送するための酸素消費速度が減少するが、これはミトコンドリアの内膜がエンブリカ・オフィシナリスの抽出物によって修復および保護されていることを示す。
【００４３】
前述の実験データによると、質量濃度２０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌのエンブリカ・オフィシナリスの抽出物で処理されたミトコンドリアは修復および保護され、それによってミトコンドリアの内膜が酸化剤による損傷を受けるのが防止される。また、一部の損傷を受けた内膜はエンブリカ・オフィシナリスの抽出物により修復され、それによりプロトンイオンが膜間腔から内膜を通ってミトコンドリア基質に漏出するのが防止され、それによってプロトンを膜間腔に再輸送するための酸素消費量が減少する。
【００４４】
本開示により、ミトコンドリア呼吸機能を活性化する方法を説明するために、本開示の２つのさらなる実施形態および２つのさらなる比較実施形態を下記に示す。ミトコンドリア呼吸機能を活性化する方法の効果を説明するために、いくつかの実験データを要約する。
【００４５】
以下の実施形態は、ヒト線維芽細胞を用いて実施される。実験試料の準備として、合計８０００個のヒト線維芽細胞を細胞培養プレートの各ウェルに播種し、その後そのヒト線維芽細胞を培地とともに２４時間インキュベートし、その後ウェルから培地を除去する。
【００４６】
本開示の第３の実施形態において、合計１ｍｌの新しい培地および合計５０μｇのエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を細胞培養プレートのウェルに添加し、ヒト線維芽細胞を培地およびエンブリカ・オフィシナリスの抽出物とともに２４時間インキュベートする。
【００４７】
第６の比較実施形態において、合計１．０ｍｌの新しい培地を細胞培養プレートのウェルに添加し、ヒト線維芽細胞を培地とともに２４時間インキュベートする。
【００４８】
本開示の第４の実施形態において、ヒト線維芽細胞が配置された、培地を含まない細胞培養プレートのウェルに、質量濃度５０μｇ／ｍｌのエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物を添加し、そのヒト線維芽細胞をエンブリカ・オフィシナリスの抽出物とともに２４時間インキュベートする。次いで、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物をウェルから除去し、ウェルに２００ｍＭのＨ２Ｏ２溶液を添加して、ヒト線維芽細胞をそのＨ２Ｏ２溶液に３０分間浸漬する。次いで、そのヒト線維芽細胞をＰＢＳで洗浄する。
【００４９】
第７の比較実施形態において、２００ｍＭのＨ２Ｏ２溶液をウェルに添加し、ヒト線維芽細胞をそのＨ２Ｏ２溶液に３０分間浸漬する。次いで、そのヒト線維芽細胞をＰＢＳで洗浄する。
【００５０】
第３の実施形態および第６の比較実施形態の詳細な実験データを下記の表２に示す。表２に示す実験データは、幹細胞の数により正規化したものである。
【００５１】
【表２】
0006329234.tif 000008
【００５２】
図１０〜図１６を参照されたい。図１０は、第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態による、ＡＴＰ合成のための酸素消費速度を示す棒グラフである。図１１は、第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態による、ミトコンドリアでの基礎呼吸を示す棒グラフである。図１２は、第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態による、フリーラジカル漏出を補償するのに必要な酸素消費速度を示す棒グラフである。図１３は、第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態による、ミトコンドリアでの最大呼吸を示す棒グラフである。図１４は、第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態による、ミトコンドリアでの予備呼吸能を示す棒グラフである。図１５は、第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態による、ミトコンドリアでの共役効率を示す棒グラフである。図１６は、第３および第４の実施形態ならびに第６および第７の比較実施形態による、非ミトコンドリア呼吸を示す棒グラフである。
【００５３】
図１０〜図１６に示される結果によると、第３の実施形態において、ミトコンドリアの内膜は、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物により保護されている。その結果、質量濃度５０μｇ／ｍｌのエンブリカ・オフィシナリスの抽出物で処理されたミトコンドリアは、ミトコンドリアの崩壊を阻止するように保護され、それによってヒト線維芽細胞の呼吸を改善してミトコンドリア呼吸機能を活性化する。さらに、第４の実施形態において、ミトコンドリアの内膜は、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物により保護され、それによりミトコンドリアがＨ２Ｏ２溶液による損傷を受けるのが防止される。図１０〜図１６に示すように、第４の実施形態は、第７の比較実施形態よりも良好なＡＴＰ合成のための酸素消費速度、ミトコンドリアでの基礎呼吸、プロトン漏出を補償するのに必要な酸素消費速度、ミトコンドリアでの最大呼吸、ミトコンドリアでの呼吸能、ミトコンドリアでの共役効率、および非ミトコンドリア呼吸を示している。
【００５４】
本開示により、幹細胞の細胞分裂を促進する方法を説明するために、本開示の８つのさらなる実施形態および２つのさらなる比較実施形態を下記に示す。細胞分裂を促進する方法の効果を説明するために、いくつかの実験データを要約する。
【００５５】
以下の実施形態は、Ｐ６継代のＡＤＳＣを用いて実施する。実験試料の準備として、合計２０００個の脂肪由来幹細胞を細胞培養プレートの各ウェルに播種し、その後その脂肪由来幹細胞を培地とともに２４時間インキュベートし、その後ウェルから培地を除去する。
【００５６】
いくつかの実験では、幹細胞が配置された、培地を含まない細胞培養プレートのウェルに、既定の質量濃度のエンブリカ・オフィシナリスの抽出物を含む組成物を添加し、そのウェル中の幹細胞をエンブリカ・オフィシナリスの抽出物とともに２４時間インキュベートする。次いで、１０％（ｖ／ｖ）のアラマーブルーを含む培地をウェルに添加し、その幹細胞を、アラマーブルーを含む培地とともに４時間インキュベートする。幹細胞のミトコンドリア中の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）は、アラマーブルー試薬を検出可能なピンク色の蛍光産物に変換し、その蛍光強度を測定して、ウェル中の幹細胞の数を判定する。
【００５７】
本開示の８つの実施形態および２つの比較実施形態の詳細な実験データを以下の表３に示す。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
図１７は、第５〜第１２の実施形態ならびに第８および第９の比較実施形態の幹細胞からの蛍光強度を示す棒グラフである。図１７に示すように、第８の比較実施形態における蛍光強度をベースライン値とすると、第５の実施形態における蛍光強度は、第８の比較実施形態のものよりも約１．２０倍高く、第６の実施形態における蛍光強度は、第８の比較実施形態のものよりも約１．２２倍高く、第７の実施形態における蛍光強度は、第８の比較実施形態のものよりも約１．２７倍高く、第８の実施形態における蛍光強度は、第８の比較実施形態のものよりも約１．２８倍高く、第９の実施形態における蛍光強度は、第８の比較実施形態のものよりも約１．２８倍高く、第１０の実施形態における蛍光強度は、第８の比較実施形態のものよりも約１．２３倍高く、第１１の実施形態における蛍光強度は、第８の比較実施形態のものよりも約１．１２倍高く、第１２の実施形態における蛍光強度は、第８の比較実施形態のものよりも約１．１０倍高い。より強い蛍光強度は、幹細胞のミトコンドリア中の酵素によって、より多量のアラマーブルーがピンク色の蛍光産物に変換されていることを示し、それにより細胞培養プレートのウェル中により多くの幹細胞が存在することを示す。図９に示す結果によると、質量濃度５０μｇ／ｍｌ〜１２００μｇ／ｍｌのエンブリカ・オフィシナリスの抽出物で処理された幹細胞は、高い細胞分裂速度を有し、それによりウェル中の細胞数が増加している。幹細胞が質量濃度５０μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌのエンブリカ・オフィシナリスの抽出物で処理された場合、細胞分裂の促進がより良好である。
【００６０】
本開示によると、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物で細胞を処理して、ＯＸＰＨＯＳを行ってＡＴＰを合成するミトコンドリアの能力を改善する。詳細に言うと、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物は、ミトコンドリアの内膜を保護および修復するのに好適である。したがって、これは、酸化剤に暴露することによるミトコンドリアの崩壊による細胞のアポトーシスを防止するのに好適である。また、エンブリカ・オフィシナリスの抽出物は、ＡＴＰ合成、ＳＲＣ、最大呼吸、プロトン漏出の補償、および共役効率などのミトコンドリア呼吸機能を活性化させるのに好適である。さらに、幹細胞は、細胞分裂を促進するためにエンブリカ・オフィシナリスの抽出物で処理される。したがって、これは、損傷を受けた細胞または古い細胞を置き換えるために、高い分化能を有する幹細胞をより多く得るのに好適である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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