(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびＩＬ−２３結合エンティティを含む二重特異性抗体であって、ＩＬ−２３結合エンティティが２対の免疫グロブリン鎖を含み、各対は１個の軽鎖と１個の重鎖を有し；
ＩＬ−２３軽鎖可変ドメインが配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびにＩＬ−２３重鎖可変ドメインが配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、かつ
ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティが、ＩＬ−２３重鎖のＣ末端に結合している２個のＦａｂフラグメントを含み、ここで、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティのＦａｂの軽鎖可変ドメインが、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、かつＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティのＦａｂの重鎖可変ドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、二重特異性抗体。
【請求項２】
ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびＩＬ−２３結合エンティティのＦａｂの軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびＩＬ−２３結合エンティティのＦａｂの軽鎖が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む定常ドメインを含む、請求項１または２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
ＩＬ−２３結合エンティティの重鎖可変ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１−３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
ＩＬ−２３結合エンティティの重鎖定常ドメインのアイソタイプがＩｇＧである、請求項１−４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
ＩＬ−２３結合エンティティの重鎖定常ドメインのアイソタイプがＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項１−５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
ＩＬ−２３結合エンティティの重鎖定常ドメインのアイソタイプがＩｇＧ４である、請求項１−６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
ＩＬ−２３結合エンティティの重鎖定常ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸残基１−３２６を含む、請求項１−７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびＩＬ−２３結合エンティティのＦａｂの軽鎖が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１−８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティのＦａｂの重鎖可変ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１−９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティのＦａｂの重鎖のＣＨ１が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１−１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
ＩＬ−２３結合エンティティおよびＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティを含む二重特異性抗体の重鎖が配列番号７４のアミノ酸配列を含む、請求項１−１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
二重特異性抗体の軽鎖が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、かつＩＬ−２３結合エンティティおよびＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティを含む二重特異性抗体の重鎖が配列番号７４のアミノ酸配列を含む、請求項１−１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
請求項１−１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項１５】
請求項１−１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の軽鎖および重鎖をコードする、単離核酸。
【請求項１６】
次の作動可能に結合した要素を含む発現ベクター：
転写プロモーター；
請求項１−１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の軽鎖をコードする第一ポリヌクレオチド；
請求項１−１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の重鎖をコードする第二ポリヌクレオチド；および
転写ターミネーター。
【請求項１７】
請求項１６の発現ベクターを含む組み換え宿主細胞であって、軽鎖および重鎖の両方を発現する、細胞。
【請求項１８】
二重特異性抗体の製造方法であって、
コードされた重鎖および軽鎖が発現され、かつ二重特異性抗体を形成する条件下で請求項１７に記戴の細胞を培養し；そして
該細胞により産生された二重特異性抗体を回収することを含む、方法。
【請求項１９】
処置を必要とする哺乳類における、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３の１種以上の上昇した発現により特徴付けられる疾患を処置するための請求項１−１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物であって；該疾患が、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、巨細胞性動脈炎、多発性硬化症（ＭＳ）、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、再発進行型多発性硬化症、大腸炎、関節炎、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、骨関節症、シェーグレン症候群、乾癬、乾癬性関節炎、喘息、臓器同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、または強皮症である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
サイトカイン類は、免疫細胞増殖、発達、分化および／または遊走の誘発ならびに多くの細胞型の増殖および分化の制御を含む多様な生物学的作用を介在する可溶性の、小タンパク質である(例えば、Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul et al., Cell, 76:241 (1994)参照)。サイトカイン誘発免疫機能はまた、免疫細胞の全身または局所蓄積により特徴付けられる、炎症性応答も誘発できる。これらは宿主保護的作用も有するが、このような免疫応答は、応答が自己免疫性障害(例えば多発性硬化症)のような過剰および／または慢性炎症および癌／新生物疾患を含むとき、病理学的結果を生じ得る(Oppenheim et al., eds., Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA (2001); von Andrian et al., New Engl. J. Med., 343:1020 (2000); Davidson et al., New Engl. J. Med., 345:340 (2001); Lu et al., Mol. Cancer Res., 4:221 (2006); Dalgleish et al., Cancer Treat Res., 130:1 (2006))。
【０００２】
ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３は、炎症に関与するサイトカイン類である。ＩＬ−１７Ａは、滑膜線維芽細胞、単球およびマクロファージによるＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−２３のような炎症性サイトカイン類の産生を促進し、この全てが、炎症およびＴｈ１７発生を促進する。ＩＬ−１７ＡはまたＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−５、ＣＸＣＬ−８、ＣＣＬ−２およびＣＣＬ−２０を含む多くのケモカイン類も誘発し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球および好中球の動員に至る(Lundy, S.K., Arthritis Res. Ther., 9:202 (2007))。ＩＬ−１７Ｆは、ＩＬ−１７Ａと最大の相同性(５５％)を共有し、炎症誘発性サイトカインでもある。ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７ＦのいずれもＴｈ１７細胞により産生され、一方他のＩＬ−１７ファミリーメンバーであるＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７ＣおよびＩＬ−１７Ｄは非Ｔ細胞源から産生される。ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆは、ＩＬ−１７Ａホモ二量体およびＩＬ−１７Ｆホモ二量体としてまたはＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体として存在できる(Liang, S.C. et al., J. Immunol., 179:7791-7799 (2007). IL-17A is increased in rheumatoid arthritis sera and synovial fluid, and is present in the T-cell rich areas of the synovium. Shahrara, S., Arthritis Res. Ther., 10:R93 (2005))。ＩＬ−１７Ａはまた骨および軟骨損傷も誘発し得る。ＩＬ−１７の効率的遮断が、ＩＬ−１７Ａホモ二量体、ＩＬ−１７Ｆホモ二量体およびＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体の中和に必要である。
【０００３】
ＩＬ−２３は、さらなる４０kDの異なるβサブユニット(ＩＬ−１２ｐ４０)にジスルフィド結合した１９キロダルトン(kD)４重ヘリカルコアαサブユニット(ＩＬ−２３ｐ１９)を含む、タイプ１ヘテロ二量体である。ＩＬ−２３は、免疫応答の先天性アームと適応性アームを橋渡しする重要なサイトカインであり、抗原攻撃に対する応答の初期に産生され、初期局所免疫応答の発動に必須である。さらに、ＩＬ−２３は、ＮＫ細胞の活性化、Ｔ細胞増殖の増強および抗体産生の制御に中心的役割を有する。ＩＬ−２３はまた、細胞内病原体に対する細胞介在免疫に重要である炎症促進性サイトカイン類(例えば、ＩＦＮ−γ)も制御する。最近の報告では、ヒトにおいて、ＩＬ−２３量増加が、リウマチ性関節炎(ＲＡ)、ライム関節炎、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、クローン病(ＣＤ)、乾癬および多発性硬化症(ＭＳ)を含む数種の自己免疫疾患と関連していることが示されている。ＩＬ−２３ｐ１９ノックアウトマウスは、自己免疫性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、コラーゲン誘発関節炎(ＣＩＡ)および中枢神経系自己免疫性誘発に抵抗性であった。ＩＬ−２３はヒトＴｈ１７細胞の発達に必須ではないが、その生存および／または増殖に必要であるように見える(Paradowska-Gorycka, A., Scandinavian Journal of Immunology, 71:134-145 (2010))。遺伝学的研究は、ＩＬ−２３受容体遺伝子と、ＣＤ、ＲＡおよびグレーブス眼症を含む数種の自己免疫疾患の間の関係を明らかにした。ＩＬ−２３−Ｔｈ１７軸は、自己免疫疾患発症に重大である(Leng et al., Archives of Medical Research, 41:221-225 (2010))。
【発明の概要】
【０００４】
数種の自己免疫疾患に介在し、これを促進するＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３ｐ１９の明らかにされた活性は、これらの標的に拮抗できる分子の臨床的可能性および必要性を説明する。ここに示す本発明は、これらのおよび他の要請を満たす。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】抗体全体およびそのモジュラー要素の略図である。
【図２】リンカーを介して結合した二重特異性抗体の第二のアームのＣ末端Ｆａｂユニットを有する抗体全体を含み、共通軽鎖を使用するｂｉＡｂＦａｂＬと名づけた二重特異性抗体のモデルを示す。
【図３】リンカーを介して結合した二重特異性抗体の第二のアームのＮ末端Ｆａｂユニットを有する抗体全体を含む、ｔａＦａｂと名づけた二重特異性抗体のモデルを示す。重鎖部分と同様に、リンカーを介して結合した二重特異性の各アームに２個の軽鎖がある。
【図４】伝統的抗体に似ているが、しかし、ＣＨ３領域における静電気的相補性会合を介して会合した２個の異なる重鎖を含む、ヘテロ二量体Ｆｃと名づけた二重特異性抗体のモデルを示す。ヘテロ二量体Ｆｃは共通軽鎖を使用する。
【図５】リンカーを介してＦａｂ領域とヒンジの間に挿入された二重特異性抗体の第二のアームのＦｖユニットを有する抗体全体を含む、ＶＣＶＦｃと名づけた二重特異性抗体のモデルを示す。
【図６】リンカーを介してＦａｂ領域とヒンジの間に挿入された二重特異性抗体の第二のアームに単一ドメイン抗体を有する抗体全体を含む、ＶＣＤＦｃと名づけた二重特異性抗体のモデルを示す。
【図７】ＩＬ−２３ｐ１９への強い抗体結合およびＩＬ−１２への交差反応性の欠如を示す、ＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図８】ｋｉｔ２２５アッセイで観察されるＩＬ−２３シグナル伝達の強力な中和を示す。
【図９】７Ｂ７、STELARA(登録商標)(ウステキヌマブ、抗ＩＬ−２３ｐ４０抗体)およびヒトＩＬ−２３受容体が種々のＩＬ−２３ｐ１９アラニンシェービングされた変異体、野生型および精製野生型Ｌ−２３ｐ１９(陽性対照)および陰性対照に結合する能力のBiacore結果を示す。７Ｂ７  ｍＡｂ結合を左カラムに示し、STELARA(登録商標)を中央カラムに示し、ｈＩＬ−２３Ｒ−Ｆｃ結合を右カラムに示す。星印をした４種の変異体を、これらの結果を確認するためのスケールアップのために選択した。
【図１０】ＩＬ−２３アラニン変異体に結合するＩＬ−２３ｐ１９抗体のBiacore動態解析を示す。
【図１１】７Ｂ７抗体(抗ＩＬ−２３ｐ１９)を同定し、選択するために使用した工程を模式的に示す。
【図１２】マーモセットＥＡＥモデルにおける経時的臨床疾患スコアを模式的に示す。
【図１３】マーモセットＥＡＥモデルにおけるＭＲＩ病巣スコアを模式的に示す。
【図１４】マーモセットＥＡＥモデルにおけるＭＲＩ視神経スコアを模式的に示す。
【図１５】インターロイキンにより整列したＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７Ｆを有するＦａｂの全４構造の重層である。
【図１６】ＩＬ−１７Ａ変異体の細胞機能的活性を示すグラフである。
【図１７】ＩＬ−１７Ｆ変異体の細胞機能的活性を示すグラフである。
【図１８】Ｙ１０８Ａ変異を含む変異体の加速されたオフ速度を証明するＢｉＡｂ３に結合する９nM  ＩＬ−１７Ａ変異体およびその組み合わせの模式的重層を示す。
【図１９】ＢｉＡｂ３に結合するＩＬ−１７Ａ変異体のコンピューターによるエネルギー解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
発明の詳細な記戴
本発明は、一つの態様において、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆに結合するＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびｐ１９を介してＩＬ−２３に結合するＩＬ−２３結合エンティティを含む、二重特異性抗体を提供する。本発明はまた、本発明の二重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする単離核酸ならびに該核酸を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞および二重特異性抗体を製造および使用する方法も含む。
【０００７】
他の態様において、本発明は、二重特異性抗体を含む組成物および二重特異性抗体を含むキットならびに二重特異性抗体を含む製品を提供する。
【０００８】
本発明の二重特異性抗体は、炎症誘発性サイトカイン類、例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３ｐ１９の阻害に有用である。本抗体は、ＩＬ−１７Ａホモ二量体、ＩＬ−１７Ｆホモ二量体またはＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体の炎症誘発作用の減少、制限、中和または遮断に使用できる。同様に、本抗体は、ＩＬ−１７Ａホモ二量体、ＩＬ−１７Ｆホモ二量体またはＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体の炎症誘発性作用の低減、制限、中和または遮断に使用できる。このような場合、抗体の抗ＩＬ−２３ｐ１９部分を、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含むＩＬ−１７Ａおよび／またはＩＬ−１７Ｆを産生するであろう新Ｔ細胞の産生の低減、制限、中和または遮断に使用する。ここに記戴する二重特異性抗体は、多発性硬化症(例えば、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および再発進行型多発性硬化症)、炎症性腸疾患、乾癬、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、抗好中球細胞質抗体(ＡＮＣＡ)関連血管炎(ＡＡＶ)および巨細胞性動脈炎のような炎症性障害および自己免疫疾患の処置に使用できる。ここに記戴する二重特異性抗体はまた血管形成を含む癌の処置にも使用できる。例えば、ここに記戴する二重特異性抗体は、多発性骨髄腫誘発骨溶解性骨病の処置に使用できる(Sotomayor, E.M., Blood, 116(18):3380-3382 (2010))。
【０００９】
以下の記戴で、多くの用語を広範に使用する。次の定義を、本発明の理解を容易にするために提供する。
【００１０】
特に断らない限り、単数表現および“少なくとも１個”は、互換的に使用され、１個または１個より多いことを意味する。
【００１１】
“抗体”(Ａｂ)および“免疫グロブリン”(Ｉｇ)は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特異的抗原に結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両者を含む。後者の種類のポリペチドは、例えば、リンパ系で低レベルで、そして骨髄腫で増加したレベルで産生される。それゆえに、ここで使用する用語“抗体”または“抗体ペプチド”は、インタクトな抗体または特異的結合についてインタクトな抗体に匹敵するその抗原結合フラグメントをいい、キメラ、ヒト化、完全ヒトおよび二重特異性抗体を含む。ある態様において、抗原結合フラグメントは、例えば、組み換えＤＮＡ技法により産生される。さらなる態様において、抗原結合フラグメントは、インタクトな抗体の酵素開裂または化学開裂により産生される。抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ)２、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖおよび一本鎖抗体を含むが、これらに限定されない。
【００１２】
ここで使用する用語“単離抗体”は、同定され、その自然環境から分離および／または回収されている抗体をいう。その自然環境への混入は、該抗体の診断的または治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい態様において、抗体は、(１)ローリー法で測定して、抗体の９５重量％を超える、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度までまたは(３)クーマシーブルーまたは好ましくは、銀染色を使用して、還元または非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一なまで、精製される。単離抗体は、該抗体の自然環境の少なくとも１個の成分が存在しない、組み換え細胞内でインサイチュで存在する抗体を含む。通常、しかしながら、単離抗体は、少なくとも１工程の精製により調製する。
【００１３】
用語“アゴニスト”は、他の分子の活性、活性化または機能を高めるタンパク質、ポリペチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、大分子または小分子(１０kD未満)を含む何れかの化合物をいう。
【００１４】
用語“アンタゴニスト”は、他の分子の活性、活性化または機能を減ずるタンパク質、ポリペチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、大分子または小分子(１０kD未満)を含む何らかの化合物をいう。
【００１５】
用語“ポリペチドの結合”は、本発明のリガンドポリペチドの受容体への結合；本発明の受容体ポリペチドのリガンドへの結合；本発明の抗体の抗原またはエピトープへの結合；本発明の抗原またはエピトープの抗体への結合；本発明の抗体の抗イディオタイプ抗体への結合；本発明の抗イディオタイプ抗体のリガンドへの結合；本発明の抗イディオタイプ抗体の受容体への結合；抗本発明の抗イディオタイプ抗体のリガンド、受容体または抗体などを含むが、これらに限定されない。
【００１６】
“二重特異性”または“二機能性”抗体は、２種の異なる重／軽鎖対および２個の異なる結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含むが、これらに限定されない多様な方法で製造できる。例えば、Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)参照。
【００１７】
ここで使用する用語“エピトープ”は、抗体が特異的に結合する抗原の部分をいう。それゆえに、用語“エピトープ”は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合が可能である何らかのタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定因子は、通常アミノ酸または糖側鎖のような、分子の化学的に活性な表面集団から成り、通常特異的三次元構造特性ならびに特異的荷電特性を有する。より具体的に、ここで使用する用語“ＩＬ−１７エピトープ”、“ＩＬ−２３エピトープ”および／または“ＩＬ−２３／ｐ１９エピトープ”は、対応するポリペチドの、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはマウスまたはヒトにおける抗原性活性または免疫原性活性を有する部分をいう。免疫原性活性を有するエピトープは、例えば、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７ＦまたはＩＬ−２３／ｐ１９ポリペチドの動物に抗体応答を誘発する部分である。抗原性活性を有するエピトープは、例えば、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７ＦまたはＩＬ−２３／ｐ１９ポリペチドの、当分野で周知の方法の何れか、例えば、免疫アッセイ、プロテアーゼ消化、結晶解析またはＨ／Ｄ−交換により測定して抗体が免疫特異的に結合する部分である。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。このようなエピトープは本来線形であってよくまたは非連続的エピトープであってよい。それゆえに、ここで使用する用語“立体構造的エピトープ”は、連続した一連のアミノ酸以外の、抗原のアミノ酸間の空間的関係により形成される非連続的エピトープである。
【００１８】
ここで使用する用語“免疫グロブリン”は、実質的に免疫グロブリン遺伝子によりコードされる１個以上のポリペチドからなる、タンパク質をいう。免疫グロブリンの一つの形態が、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、免疫グロブリン鎖の２個の同一対から成り、各対は１個の軽鎖および１個の重鎖を有する。各対において、軽鎖および重鎖可変領域は、一体となって抗原への結合を担い、定常領域は、抗体エフェクター機能を担う。
【００１９】
完全長免疫グロブリン“軽鎖”(約２５kDまたは約２１４アミノ酸)は、ＮＨ２末端の可変領域遺伝子(約１１０アミノ酸)およびＣＯＯＨ末端のカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によりコードされる。完全長免疫グロブリン“重鎖”(約５０kDまたは約４４６アミノ酸)は、同様に可変領域遺伝子(約１１６アミノ酸)および他の上記定常領域遺伝子の１個(約３３０アミノ酸)によりコードされる。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンと分類され、それぞれＩｇＧ(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４)、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとしての抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の“Ｊ”領域により一体となり、重鎖はまた約１０個以上のアミノ酸の“Ｄ”領域も含む(一般に、Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd Edition, Raven Press, NY (1989)), Chapter 7参照(引用によりその全体を本明細書に包含させる))。
【００２０】
免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、３個の超可変領域により中断される“フレームワーク”領域からなる。それゆえに、用語“超可変領域”は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”からのアミノ酸残基(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))および／または“超可変ループ”からのアミノ酸残基(Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))である(この両者とも引用により本明細書に包含させる)。“フレームワーク領域”または“ＦＲ”残基は、ここに定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。それゆえに、“ヒトフレームワーク領域”は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一である(約８５％以上、通常９０〜９５％以上)フレームワーク領域である。成分軽鎖および重鎖の組み合わせフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲの配置および整列をさせる。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。したがって、用語“ヒト化”免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域および非ヒト(通常マウスまたはラット)免疫グロブリン由来の１個以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンをいう。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、“ドナー”と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは“アクセプター”と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、存在するならば、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならず、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上同一である。それゆえに、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、恐らくＣＤＲ以外、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一である。さらに、ヒトフレームワーク領域内の１個以上の残基は、最適抗原結合親和性および特異性を保持するために、親配列に復帰変異させてよい。このような方法で、非ヒト親抗体からのある種のフレームワーク残基は、その免疫原性を最小化しながら、親抗体の結合特性を保持するために、ヒト化抗体に保持される。ここで使用する用語“ヒトフレームワーク領域”は、このような復帰変異を有する領域を含む。“ヒト化抗体”は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、ヒト化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非ヒトであるため、上に定義した典型的キメラ抗体を含まない。
【００２１】
用語“ヒト化”免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域および非ヒト、例えば、マウス、ラットまたはウサギ免疫グロブリン由来の１個以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンをいう。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは“ドナー”と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、“アクセプター”と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、存在するならば、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならず、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上同一である。それゆえに、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、恐らくＣＤＲおよび恐らくフレームワーク領域内の数個の復帰変異アミノ酸残基(例えば、１〜１５残基)以外、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一ｔである。“ヒト化抗体”は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、ヒト化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非ヒトであるため、上に定義した典型的キメラ抗体を含まない。
【００２２】
ここで使用する用語“ヒト抗体”は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーまたは、例えば、Kucherlapati et al. が米国特許番号５,９３９,５９８において記戴した、１個以上のヒト免疫グロブリンが遺伝子導入され、内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【００２３】
用語“遺伝子改変抗体”は、アミノ酸配列が天然抗体から変更されている抗体を意味する。抗体の産生における組み換えＤＮＡ技法の適切性のために、自然抗体で見られるアミノ酸配列にとらわれる必要はなく、抗体は所望の特徴を得るために再設計できる。可能なバリエーションは多く、１個または数個のみのアミノ酸変化から、例えば、可変領域および／または定常領域の完全な再設計までの範囲である。定常領域における変更は、一般に、補体結合、膜との相互作用および他のエフェクター機能のような特徴を改善または変更するために行う。可変領域における変更は、抗原結合特徴を改善するために行う。
【００２４】
“Ｆａｂフラグメント”は、１個の軽鎖ならびに重鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【００２５】
“Ｆａｂ’フラグメント”は、１個の軽鎖ならびにＦ(ａｂ’)２分子を形成するために２個の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成できるようにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に多くの定常領域を含む１個の重鎖を含む。
【００２６】
“Ｆ(ａｂ’)２フラグメント”は、２個の軽鎖ならびに２個の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成できるようにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に定常領域の一部を含む２個の重鎖を含む。
【００２７】
“Ｆｖフラグメント”は、重鎖および軽鎖からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。
【００２８】
“単一ドメイン抗体”は、単一ドメインＦｖユニット、例えば、ＶＨまたはＶＬからなる抗体フラグメントをいう。抗体全体と同様、それは特異的抗原に選択的に結合できる。分子量わずか１２〜１５kDａで、単一ドメイン抗体は、２個の重タンパク質鎖および２個の軽鎖からなる一般的抗体(１５０〜１６０kDａ)よりはるかに小さく、Ｆａｂフラグメント(〜５０kDａ、１個の軽鎖および重鎖の半分)および一本鎖可変フラグメント(〜２５kDａ、１個は軽鎖由来、他方は重鎖由来の２個の可変ドメイン)よりも小さい。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダ科の動物で見られた重鎖抗体から設計された。単一ドメイン抗体のほとんどの研究が、現在重鎖可変ドメインに基づくが、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖由来のナノボディも、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。
【００２９】
ここで使用する用語“モノクローナル抗体”または“ｍＡｂ”または“ＭＡｂ”または“Ｍａｂ”または“ｍａｂ”は、ハイブリドーマテクノロジーにより産生された抗体に限定されない。用語“モノクローナル抗体”または“ｍＡｂ”または“ＭＡｂ”または“Ｍａｂ”または“ｍａｂ”は、真核、原核またはファージクローンの何れかを含む単一クローンに由来する抗体をいい、それが産生された方法には由来しない。
【００３０】
ここで使用する“核酸”または“核酸分子”は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により産生されたフラグメントおよびライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用の何れかにより産生されたフラグメントのような、ポリヌクレオチドをいう。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド(例えばＤＮＡおよびＲＮＡ)または天然に存在するヌクレオチドのアナログ(例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー形態)または両者の組み合わせである単量体である。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分に改変を有してよい。糖修飾は、例えば、１個以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン基およびアジド基での置換を含みまたは糖類は、エーテルまたはエステルとして官能化できる。さらに、糖部分全体を、含窒素糖類および炭素環式糖アナログのような立体的および電子工学的に類似した構造で置き換えることができる。塩基部分の修飾の例は、アルキル化プリン類およびピリミジン類、アシル化プリン類またはピリミジン類または他の周知ヘテロ環式代替物を含む。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはこのような結合の類似結合により結合できる。ホスホジエステル結合の類似結合は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデートなどを含む。用語“核酸分子”はまた、ポリアミド主鎖に結合した天然に存在するまたは修飾された核酸塩基を含むいわゆる“ペプチド核酸”も含む。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。
【００３１】
用語“核酸分子の補体”は、対照ヌクレオチド配列に対して相補的ヌクレオチド配列または逆方向性を有する核酸分子をいう。
【００３２】
用語“縮重ヌクレオチド配列”は、ポリペチドをコードする対照核酸分子と比較して、１個以上の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列をいう。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、ＧＡＵおよびＧＡＣトリプレットは各々Ａｓｐをコードする)。
【００３３】
“遊離核酸分子(isolated nucleic acid molecule)”は、生物のゲノムＤＮＡに統合されていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離されている増殖因子をコードするＤＮＡ分子は、遊離ＤＮＡ分子である。遊離核酸分子の他の例は、生物のゲノムに統合されていない化学合成された核酸分子である。特定の種から遊離されている核酸分子は、その種の染色体の完全ＤＮＡ分子より小さい。
【００３４】
“核酸分子構築物”は、本来存在しない配置で組み合わさり、かつ並置された核酸セグメントを含むように、人的介入により修飾されている、一本鎖または二本鎖の核酸分子をいう。
【００３５】
“相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)”は、逆転写酵素である酵素によりｍＲＮＡ鋳型から形成される一本鎖ＤＮＡ分子である。典型的に、ｍＲＮＡの部分に相補的なプライマーを、逆転写の開始に用いる。当業者はまた、このような一本鎖ＤＮＡ分子とその相補的ＤＮＡ鎖からなる二本鎖ＤＮＡ分子をいうために用語“ｃＤＮＡ”も使用する。用語“ｃＤＮＡ”はまたＲＮＡ鋳型から合成されたｃＤＮＡ分子のクローンもいう。
【００３６】
“プロモーター”は、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的に、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位近位の、遺伝子の５’非コーディング領域に位置する。転写開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしばコンセンサスヌクレオチド配列により特徴付けられる。これらのプロモーター要素は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的要素(ＤＳＥ; McGehee et al., Mol. Endocrinol., 7:551 (1993))、サイクリックＡＭＰ応答要素(ＣＲＥ)、血清応答要素(ＳＲＥ; Treisman, Seminars in Cancer Biol., 1:47 (1990))、グルココルチコイド応答要素(ＧＲＥ)ならびにＣＲＥ／ＡＴＦ、ＡＰ２(Ye et al., J. Biol. Chem., 269:25728 (1994))、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質(ＣＲＥＢ; Loeken, Gene Expr., 3:253 (1993))および八量体因子(一般に、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1987), and Lemaigre et al., Biochem. J., 303:1 (1994)参照)のような他の転写因子の結合部位(O'Reilly et al., J. Biol. Chem., 267:19938 (1992))を含む。プロモーターが誘導型プロモーターであるならば、誘発剤に応答して転写率が上がる。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターであるならば、転写率は誘発剤により制御されない。抑制的プロモーターも知られている。
【００３７】
“制御要素”は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、制御要素は、特定の細胞、組織または小器官で排他的にまたは優先的に転写を可能とする、細胞性因子と結合したヌクレオチド配列である。これらのタイプの制御要素は、“細胞特異的”、“組織特異的”または“小器官特異的”方法で発現される遺伝子と通常結合している。
【００３８】
“エンハンサー”は、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または配向に関係なく、転写効率を上げることができるタイプの制御要素である。
【００３９】
“異種性ＤＮＡ”は、ある宿主細胞内に自然に存在しないＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の集団をいう。特定の宿主細胞に対して異種性のＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ(すなわち、外来性ＤＮＡ)と組み合わさっている限り、宿主細胞種由来のＤＮＡ(すなわち、内在性ＤＮＡ)を含み得る。例えば、転写プロモーターを含む宿主ＤＮＡセグメントに作動可能に結合したポリペチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、異種性ＤＮＡ分子であると見なす。逆に、異種性ＤＮＡ分子は、外来性プロモーターと作動可能に結合している内在性遺伝子を含み得る。他の例として、野生型細胞由来の遺伝子を含むＤＮＡ分子は、該ＤＮＡ分子が野生型遺伝子を欠く変異体細胞に導入されるならば、異種性ＤＮＡと見なされる。
【００４０】
“発現ベクター”は、宿主細胞で発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的に、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常プロモーターの制御下に置かれ、このような遺伝子はプロモーターに“作動可能に結合した”と言われる。同様に、制御要素およびコアプロモーターは、制御要素がコアプロモーターの活性を調節するならば、作動可能に結合している。
【００４１】
“組み換え宿主”は、クローニングベクターまたは発現ベクターのような異種性核酸分子を含む細胞である。本発明では、組み換え宿主の例は、発現ベクターから本発明のアンタゴニストを産生する細胞である。これに対して、このようなアンタゴニストは、該アンタゴニストの“天然源”であって、発現ベクターを欠く細胞により産生され得る。
【００４２】
用語“アミノ末端”および“カルボキシル末端”は、ここでは、ポリペチド内の位置をいうために使用する。矛盾がなければ、これらの用語は、ポリペチドの特定の配列または部分において、近接または対応する位置を意味するために使用する。例えば、ポリペチド内の対照配列において、カルボキシル末端に位置するある種の配列は、対照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも完全ポリペチドのカルボキシル末端ではない。
【００４３】
“融合タンパク質”は、少なくとも２個の遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子により発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば、融合タンパク質は、親和性マトリクスに結合するポリペチドと融合した、ＩＬ−１７ＲＡポリペチドの少なくとも一部を含む。このような融合タンパク質は、親和性クロマトグラフィーを使用して大量のＩＬ−１７Ａを単離するための手段を提供する。
【００４４】
用語“受容体”は、“リガンド”と呼ばれる生理活性分子と結合する細胞関連タンパク質をいう。この相互作用は、リガンドの作用を細胞に伝達する。受容体は膜結合型、細胞質または核であってよく、単量体(例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータ−アドレナリン受容体)または多量体(例えば、ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリスロポエチン受容体およびＩＬ−６受容体)であってよい。膜結合型受容体は、典型的にシグナル伝達に関与する細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインを含む多ドメイン構造により特徴付けられる。ある種の膜結合型受容体において、細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインは、完全機能的受容体を含む別々のポリペチドに位置する。
【００４５】
一般に、リガンドの受容体への結合は受容体の立体構造的変化を起こし、これは細胞のエフェクタードメインと他の分子の相互作用を生じ、続いて細胞代謝の変更に至る。しばしば受容体−リガンド相互作用と関連する代謝事象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックＡＭＰ産生増加、細胞性カルシウム動員、膜脂質動員、細胞接着、イノシトール脂質加水分解およびリン脂質加水分解を含む。
【００４６】
用語“発現”は、遺伝子産物の生合成をいう。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡの１個以上のポリペチドへの翻訳を含む。
【００４７】
用語“補体／抗補体対”は、適当な条件下で非共有結合的結合した、安定な対を形勢する非同一部分を意味する。例えば、ビオチンおよびアビジン(またはストレプトアビジン)は、補体／抗補体対のプロトタイプメンバーである。補体／抗補体対の他の例は、受容体／リガンド対、抗体／抗原(またはハプテンまたはエピトープ)対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対などを含む。補体／抗補体対が後に解離することが望まれるとき、補体／抗補体対は、好ましくは１０９Ｍ−１未満の結合親和性を有する。
【００４８】
ここで使用する“治療剤”は、抗体部分にコンジュゲートして治療に有用であるコンジュゲートを生じる分子または原子である。治療剤の例は、薬物、毒素、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素および放射性同位体を含む。
【００４９】
“検出可能標識”は、抗体部分にコンジュゲートして、診断に有用な分子を産生できる分子または原子である。検出可能標識の例は、キレート剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオンまたは他のマーカー部分を含む。
【００５０】
用語“親和性タグ”は、ここで、第二のポリペチドの精製または検出のために第二のポリペチドに結合できるまたは第二のポリペチドの基質への結合部位を提供する、ポリペチドセグメントである。原則として、抗体または他の特異的結合剤が利用可能であるあらゆるペプチドまたはタンパク質を親和性タグとして使用できる。親和性タグは、ポリ−ヒスチジン・トラクト、プロテインＡ(Nilsson et al., EMBO J., 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol., 198:3 (1991))、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(Smith et al., Gene, 67:31 (1988))、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性タグ(Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7952 (1985))、サブスタンスＰ、ＦＬＡＧ(登録商標)ペプチド(Hopp et al., Biotechnology, 6:1204 (1988))、ストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の抗原性エピトープまたは結合ドメインを含む。総論としては、Ford et al., Protein Expression and Purification, 2:95 (1991)参照のこと。親和性タグをコードするＤＮＡ分子は、市販されている(例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)。
【００５１】
“ＩＬ−１７Ａ結合エンティティ”は、そのホモ二量体形態(ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ａ)およびそのヘテロ二量体形態(ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆ)のＩＬ−１７Ａに特異的に結合する抗体のような結合エンティティである。
【００５２】
“ＩＬ−１７Ｆ結合エンティティ”は、そのホモ二量体形態(ＩＬ−１７Ｆ／ＩＬ−１７Ｆ)およびそのヘテロ二量体形態(ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆ)のＩＬ−１７Ｆに特異的に結合する抗体のような結合エンティティである。
【００５３】
“ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティ”は、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆが共有する、同一または類似エピトープ、例えば、連続的または非連続的エピトープを認識し、結合することにより、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆに特異的に結合する、抗体のような結合エンティティである。ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは、ＩＬ−１７Ａホモ二量体、ＩＬ−１７Ｆホモ二量体およびＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体に結合する。
【００５４】
一つの問題は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３ｐ１９が、数種の炎症性および／または自己免疫性障害で過発現し、原因および／または持続可能性と関連付けられていることである。本発明のいくつかの態様が提供する一つの解決手段は、各サイトカインに結合し、各サイトカインの同族受容体を介するシグナル伝達を阻害するまたは減少させる二重特異性抗体、例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体形態の投与によりサイトカイン類が細胞に信号を送るのを阻害するまたは減少させることである。
【００５５】
他の問題は、二重特異性ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−２３ｐ１９二重特異性抗体、例えば、ｂｉＡｂ３の製造に際して遭遇したのは、ＩＬ−１７Ａに高親和性を有し、かつＩＬ−１７Ａの有効な中和剤、例えば、ＩＣ５０である二重特異性抗体の製造の難しさであった。表１に示すマウス親抗体(例えば、キメラ３３９.１５、３３９.１５.３.５、３３９.１５.５.３または３３９.１５.３.６)は、ＩＬ−１７Ａ／Ｆに対して０.３０nMのＩＣ５０およびＩＬ−１７Ｆに対して０.２６nMのＩＣ５０を有したが、ＩＬ−１７Ａに対するＩＣ５０はわずか１１nMであった。ＩＬ−１７Ａのシグナル伝達を阻害または中和する抗体の能力を増強する必要があった。表３に示すとおり、マウス親キメラ３３９.１５およびヒト化親３３９.１３４は、ＩＬ−１７Ａに同等な結合親和性であった。さらに、表８に示すとおり、ヒト化親３３９.１３４がＩＬ−１７Ａを阻害する能力(１.３nMのＩＣ５０)は、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ(０.２７nMのＩＣ５０)およびＩＬ−１７Ｆ(０.２４nMのＩＣ５０)を阻害する能力を比較して、なお顕著に低かった。この問題は、ｂｉＡｂ３のＩＬ−２３ｐ１９抗体の軽鎖(配列番号１７)を使用することにより驚くべきことに解決された。ＩＬ−２３ｐ１９軽鎖を、３３９.１３４のヒト化重鎖と対にしたとき、得られたモノクローナル抗体は、ＩＬ−１７Ａのシグナル伝達を阻害する能力が顕著に高く(表９参照)、ＩＬ−１７Ａに対する親和性が顕著に増加した(表１０参照)。この増強された親和性および中和能を提供し得る、例えば、ｂｉＡｂ３のＩＬ−２３ｐ１９／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ軽鎖によりここで共有されている重要な残基は、実施例９のＸ線結晶解析およびアラニン変異体試験により証明されるとおり、配列番号２のＹ１０８またはＴｙｒ１０８であり得る。
【００５６】
一つの態様において、本発明は、二重特異性抗体、抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の二重特異性抗体は、ＩＬ−１７Ａに結合するＩＬ−１７Ａ結合エンティティおよびｐ１９を介してＩＬ−２３に結合するＩＬ−２３結合エンティテを含む。他の面において、本発明の二重特異性抗体は、ＩＬ−１７Ｆに結合するＩＬ−１７Ｆ結合エンティティおよびｐ１９を介してＩＬ−２３に結合するＩＬ−２３結合エンティテを含む。他の面において、本発明の二重特異性抗体は、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆに結合するＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびｐ１９を介してＩＬ−２３に結合するＩＬ−２３結合エンティテを含む。ｐ１９を介してＩＬ−２３に結合するＩＬ−２３結合エンティテは、以後、ＩＬ−２３に結合する結合エンティティまたは“ＩＬ−２３結合エンティティ”と呼ぶ。ヒトＩＬ−１７Ａのポリヌクレオチド配列を配列番号１に示し、対応するポリペチド配列を配列番号２に示す。ＩＬ−１７Ａポリペチドのシグナル配列は、配列番号２のアミノ酸残基１〜２３である。それゆえに、配列番号２のアミノ酸残基２４〜１５５は成熟ＩＬ−１７Ａポリペチドを構成する。ＩＬ−１７Ａに結合するここに開示する抗体(およびその抗原結合フラグメント)および二重特異性抗体は、成熟ＩＬ−１７Ａポリペチド(配列番号２のアミノ酸残基２４〜１５５)に結合する。ヒトＩＬ−１７Ｆのポリヌクレオチド配列を配列番号３に示し、対応するポリペチド配列を配列番号４に示す。ＩＬ−１７Ｆポリペチドのシグナル配列は、配列番号４のアミノ酸残基１〜３０である。それゆえに、配列番号４のアミノ酸残基３１〜１６３は成熟ＩＬ−１７Ｆポリペチドを構成する。ＩＬ−１７Ｆに結合するここに開示する抗体(およびその抗原結合フラグメント)および二重特異性抗体は、成熟ＩＬ−１７Ｆポリペチド(配列番号４のアミノ酸残基３１〜１６３)に結合する。ＩＬ−２３のヒトｐ１９サブユニットのポリヌクレオチド配列を配列番号５に示し、対応するポリペチド配列を配列番号６に示す。ＩＬ−２３ｐ１９ポリペチドのシグナル配列は、配列番号６のアミノ酸残基１〜１９である。それゆえに、配列番号６のアミノ酸残基２０〜１８９は成熟ＩＬ−２３ｐ１９ポリペチドを構成する。ＩＬ−２３ｐ１９に結合するここに開示する抗体(およびその抗原結合フラグメント)および二重特異性抗体は、成熟ＩＬ−２３ｐ１９ポリペチド(配列番号６のアミノ酸残基２０〜１８９)に結合する。
【００５７】
本発明の一つの面において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは、抗体、すなわち、各対１個の軽鎖と１個の重鎖を有する２対の免疫グロブリン鎖を含み、ＩＬ−２３結合エンティティは、各々軽鎖ならびに重鎖のＣＨ１および可変領域を含む２個のＦａｂフラグメントを含み、ＩＬ−２３結合エンティティのＦａｂフラグメントはＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティの重鎖のＣ末端(Ｆｃ)に結合している。この二重特異性抗体形式をここではｂｉＡｂＦａｂＬと呼ぶ(図２参照)。他の態様において、ＩＬ−２３結合エンティティのＦａｂフラグメントを含む軽鎖ならびに重鎖のＣＨ１および可変領域の各々は、それぞれＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティの軽鎖および重鎖のＮ末端に結合する。この二重特異性抗体形式をここではｔａＦａｂと呼ぶ(図３参照)。
【００５８】
本発明の他の面において、ＩＬ−２３結合エンティティは、抗体、すなわち、各対１個の軽鎖と１個の重鎖を有する２対の免疫グロブリン鎖を含み、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは、各々軽鎖ならびに重鎖のＣＨ１および可変領域を含む２個のＦａｂフラグメントを含み、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティのＦａｂフラグメントは、ＩＬ−２３結合エンティティの重鎖のＣ末端(Ｆｃ)に結合する。この二重特異性抗体形式をここではｂｉＡｂＦａｂＬと呼ぶ(図２参照)。他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティのＦａｂフラグメントを含む軽鎖ならびに重鎖のＣＨ１および可変領域の各々は、それぞれＩＬ−２３結合エンティティの軽鎖および重鎖のＮ末端に結合する。この二重特異性抗体形式をここではｔａＦａｂと呼ぶ(図３参照)。
【００５９】
本発明の他の面において、ＩＬ−２３結合エンティティは軽鎖およびＩＬ−２３重鎖を含み、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは軽鎖およびＩＬ−１７Ａ／Ｆ重鎖を含む。この二重特異性抗体は、ＣＨ３領域において静電気的相補性会合を介して会合している２個の異なる重鎖を含む以外、伝統的抗体に似る。これは共通軽鎖を利用する。この二重特異性抗体形態をここではヘテロ二量体Ｆｃと呼ぶ(図４参照)。
【００６０】
他の態様において、本発明は、抗体、すなわち、各対１個の軽鎖と１個の重鎖を有する２対の免疫グロブリン鎖を含む第一結合エンティティおよびＦｖユニット、すなわち、重鎖および軽鎖由来の可変ドメインを含む第二結合エンティティを含み、ここで、Ｆｖユニットを含む第二結合エンティティが、図５に示すとおり、第一結合エンティティのＦａｂ領域とヒンジの間に位置する、二重特異性抗体を提供する。Ｆｖユニットは、リンカー分子により第一結合エンティティのＦａｂ領域に結合する。より具体的に、Ｆｖユニットは、Ｆａｂフラグメントの軽鎖定常領域に結合した可変軽ドメインおよびＦａｂフラグメントのＣＨ１領域に結合した可変重ドメインを含む。この二重特異性抗体形式をここではＶＣＶＦｃと呼ぶ。ＶＣＶＦｃの第一結合エンティティおよび第二結合エンティティは共通軽鎖を共有せず、ｂｉＡｂＦａｂＬの第一結合エンティティおよび第二結合エンティティは共通軽鎖を共有する。本発明のこの態様の一つの面において、第一結合エンティティはリンパ球抗原、サイトカイン、サイトカイン受容体、増殖因子、増殖因子受容体、インターロイキン(例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−２３)またはインターロイキン受容体に特異的に結合し、第二結合エンティティはリンパ球抗原、サイトカイン、サイトカイン受容体、増殖因子、増殖因子受容体、インターロイキン(例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−２３)またはインターロイキン受容体に特異的に結合する。本発明のこの態様の他の面において、第一結合エンティティはＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティであり、第二結合エンティティはＩＬ−２３結合エンティティである。本発明のこの態様の他の面において、第一結合エンティティはＩＬ−２３結合エンティティであり、第二結合エンティティはＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティである。
【００６１】
他の態様において、本発明は、抗体、すなわち、各対１個の軽鎖と１個の重鎖を有する２対の免疫グロブリン鎖を含む第一結合エンティティおよび単一ドメイン抗体を含む第二結合エンティティを含む二重特異性抗体を提供する。この二重特異性抗体形式をここではＶＣＤＦｃと呼ぶ。ＶＣＤＦｃ二重特異性抗体の図を図６に記戴する。単一ドメイン抗体を含む第二結合エンティティは第一結合エンティティのＦａｂ領域、より具体的にＦａｂフラグメントのＣＨ１領域とヒンジの間に位置する。単一ドメイン抗体は、リンカー分子(例えば、式(Ｇ４Ｓ)２またはＳＳＡＳＴＫＧＰＳ(配列番号８６)により表される１０量体Ｇ４Ｓ)により第一結合エンティティのＦａｂのＣＨ１領域に結合する。本発明のこの態様の一つの面において、第一結合エンティティはリンパ球抗原、サイトカイン、サイトカイン受容体、増殖因子、増殖因子受容体、インターロイキン(例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−２３)またはインターロイキン受容体に特異的に結合し、第二結合エンティティはリンパ球抗原、サイトカイン、サイトカイン受容体、増殖因子、増殖因子受容体、インターロイキン(例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−２３)またはインターロイキン受容体に特異的に結合する。本発明のこの態様の一つの面において、第一結合エンティティはＩＬ−２３結合エンティティであり、第二結合エンティティはＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティである。本発明のこの態様の他の面において、第一結合エンティティはＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティであり、第二結合エンティティはＩＬ−２３結合エンティティである。
【００６２】
結合エンティティのアミノ酸配列は、好ましくはリンパ球抗原、サイトカイン、サイトカイン受容体、増殖因子、増殖因子受容体、インターロイキン(例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−２３)またはインターロイキン受容体に対するヒトおよび／またはヒト化モノクローナル抗体の配列に基づく。
【００６３】
本発明の前記の面の一つの態様において、二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびＩＬ−２３結合エンティティの軽鎖は、各々、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２４の配列を有するＣＤＲ３を含む可変ドメインを含む。他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびＩＬ−２３結合エンティティの軽鎖は、各々、配列番号９のアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む。他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびＩＬ−２３結合エンティティの軽鎖は、各々、配列番号１０のアミノ酸配列を含む定常ドメインを含む。他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびＩＬ−２３結合エンティティの軽鎖の各々は、配列番号９のアミノ酸配列を含む可変ドメインおよび配列番号１０のアミノ酸配列を含む定常ドメインを含む。
【００６４】
本発明の前記の面の他の態様において、二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティの重鎖は、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む可変ドメインを含む。他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティの重鎖は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む。他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティが抗体を含むとき、重鎖定常ドメインは、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２７または配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティがＦａｂフラグメントを含むとき、重鎖のＣＨ１領域は配列番号１４または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【００６５】
本発明の前記の面の他の態様において、二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。所望により、置換、付加または欠失の全ては重鎖可変ドメインのフレームワーク領域内である。所望により、二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、ここで、可変ドメインは配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。所望により、重鎖可変ドメインは配列番号１３のアミノ酸配列を含む。所望により、３個のＩＬ−１７Ａ／Ｆ重鎖可変ドメインＣＤＲは、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を含む。所望により、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ重鎖可変ドメインＣＤＲ１は配列番号２５のアミノ酸配列を有し、重鎖可変ドメインＣＤＲ２は配列番号２６のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変ドメインＣＤＲ３は配列番号２７のアミノ酸配列を有する。ＩＬ−１７Ａ／Ｆおよび／またはＩＬ−２３ｐ１９結合エンティティは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。所望により、置換、付加または欠失の全ては軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域内である。所望により、二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆおよび／またはＩＬ−２３ｐ１９結合エンティティは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを有し、ここで、可変ドメインは配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。所望により、軽鎖可変ドメインは配列番号９のアミノ酸配列を含む。所望により、３個のＩＬ−１７Ａ／Ｆおよび／またはＩＬ−２３ｐ１９軽鎖可変ドメインＣＤＲは、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を含む。所望により、ＩＬ−１７Ａ／Ｆおよび／またはＩＬ−２３ｐ１９軽鎖可変ドメインＣＤＲ１は配列番号２２のアミノ酸配列を有し、ＩＬ−１７Ａ／Ｆおよび／またはＩＬ−２３ｐ１９軽鎖可変ドメインＣＤＲ２は配列番号２３のアミノ酸配列を有し、そしてＩＬ−１７Ａ／Ｆおよび／またはＩＬ−２３ｐ１９軽鎖可変ドメインＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を有する。ＩＬ−２３ｐ１９結合エンティティは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。所望により、置換、付加または欠失の全てＩＬ−２３ｐ１９重鎖可変ドメインのフレームワーク領域内である。所望により、二重特異性抗体のＩＬ−２３ｐ１９結合エンティティは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、ここで、可変ドメインは配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。所望により、ＩＬ−２３ｐ１９重鎖可変ドメインは配列番号７のアミノ酸配列を含む。所望により、３個のＩＬ−２３ｐ１９重鎖可変ドメインＣＤＲは、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を含む。所望により、ＩＬ−２３ｐ１９重鎖可変ドメインＣＤＲ１は配列番号１９のアミノ酸配列を有し、重鎖可変ドメインＣＤＲ２は配列番号２０のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変ドメインＣＤＲ３は配列番号２１のアミノ酸配列を有する。
【００６６】
本発明の前記の面の他の態様において、二重特異性抗体のＩＬ−２３結合エンティティの重鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む可変ドメインを含む。他の態様において、ＩＬ−２３結合エンティティの重鎖は配列番号７のアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む。他の態様において、ＩＬ−２３結合エンティティが抗体を含むとき、重鎖定常ドメインは配列番号８、配列番号１１、配列番号１２７または配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。ある態様において、配列番号８のＣ末端リシンは開裂されており、それゆえに重鎖定常ドメインは配列番号８の残基１〜３２６のアミノ酸配列を含む。他の態様において、ＩＬ−２３結合エンティティがＦａｂフラグメントを含むとき、重鎖のＣＨ１領域は配列番号１４または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【００６７】
本発明の前記の面の他の態様において、二重特異性抗体のＩＬ−２３結合エンティティまたはＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティがＦｖユニットであるとき、軽鎖の可変ドメインは配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２４の配列を有するＣＤＲ３を含む。他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびＩＬ−２３結合エンティティ各々の軽鎖は配列番号９のアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む。
【００６８】
本発明の前記の面の他の態様において、二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティがＦｖユニットであるとき、重鎖の可変ドメインは配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティの重鎖は配列番号１３のアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む。
【００６９】
本発明の前記の面の他の態様において、二重特異性抗体のＩＬ−２３結合エンティティがＦｖユニットであるとき、重鎖の可変ドメインは配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。他の態様において、ＩＬ−２３結合エンティティの重鎖は配列番号７のアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む。
【００７０】
本発明の前記の面の他の態様において、二重特異性抗体のＩＬ−２３結合エンティティのＦａｂフラグメントはＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティの重鎖のＣ末端(Ｆｃ)に結合しまたはＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティのＦａｂフラグメントは、例えば、リンカー分子によりＩＬ−２３結合エンティティの重鎖のＣ末端(Ｆｃ)に結合する(例えば、図２参照)。他の態様において、ＩＬ−２３結合エンティティのＦａｂフラグメントを含む軽鎖ならびに重鎖のＣＨ１および可変領域の各々は、それぞれＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティの軽鎖および重鎖のＮ末端に結合するかまたはＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティのＦａｂフラグメントを含む軽鎖ならびに重鎖のＣＨ１および可変領域の各々は、リンカー分子を介して、それぞれＩＬ−２３結合エンティティの軽鎖および重鎖のＮ末端に結合する(例えば、図３参照)。ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体の他の態様において、第二結合エンティティを含むＦｖユニットの軽鎖可変領域および重鎖可変領域の各々は、リンカー分子を介して、それぞれ第一結合エンティティのＦａｂフラグメントの軽鎖定常領域およびＣＨ１領域に結合する(図５参照)。適切なリンカー分子は当分野で知られ、例えば、短ポリペチドを含む。適切なリンカーは、柔軟性を与えるグリシンおよび溶解度を与えるセリンまたはスレオニンを含む短ポリペチドであり得る。適切なリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１ユニットを含み得る。例えば、リンカーは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１)ｘ(ここで、ｘは１、２または３である)であり得る。所望により、リンカーポリペチドは配列番号１２のアミノ酸配列を有する。ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体の他の態様において、軽鎖のリンカーは配列番号８５のアミノ酸配列を有し、重鎖のリンカーは配列番号８６のアミノ酸配列を有する。
【００７１】
本発明の前記の面の他の態様において、二重特異性抗体は、各々配列番号１６、配列番号１８、配列番号２８、配列番号２９、配列番号７４または配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖の対および各々配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖の対を含む。好ましい態様において、二重特異性抗体は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖の対および各々配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖の対を含む。
【００７２】
本発明の前記の面の他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体(またはその抗原結合フラグメント)またはｂｉＡｂＦａｂＬ(図２参照)、ｔａＦａｂ(図３参照)、ヘテロ二量体Ｆｃ(図４参照)、ＶＣＶＦｃ(図５参照)またはＶＣＤＦｃ(図６参照)のような二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは、(ａ)少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも５×１０−１０Ｍ、少なくとも８×１０−１０Ｍまたは少なくとも少なくとも１×１０−１１Ｍの結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−１７Ａホモ二量体；(ｂ)少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも２×１０−１０Ｍ、少なくとも３×１０−１０Ｍ、少なくとも４×１０−１０Ｍ、少なくとも５×１０−１０Ｍまたは少なくとも１×１０−１１Ｍの結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−１７Ｆホモ二量体；および／または(ｃ)少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも５×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも２×１０−９Ｍ、少なくとも３×１０−９Ｍ、少なくとも４×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも６×１０−９Ｍ、少なくとも７×１０−９Ｍ、少なくとも９×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍまたは少なくとも５×１０−１０Ｍの結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体に結合し、ここで、結合親和性はBiacoreのような表面プラズモン共鳴により測定する。
【００７３】
本発明の前記の面の他の態様において、ＩＬ−２３ｐ１９抗体(またはその抗原結合フラグメント)またはｂｉＡｂＦａｂＬ(図２参照)、ｔａＦａｂ(図３参照)、ヘテロ二量体Ｆｃ(図４参照)、ＶＣＶＦｃ(図５参照)またはＶＣＤＦｃ(図６参照)のような二重特異性抗体のＩＬ−２３ｐ１９結合エンティティは、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも２×１０−１０Ｍ、少なくとも３×１０−１０Ｍ、少なくとも４×１０−１０Ｍ、少なくとも５×１０−１０、少なくとも６×１０−１０、少なくとも７×１０−１０、少なくとも８×１０−１０または少なくとも９×１０−１０、少なくとも１×１０−１１の結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−２３ｐ１９に結合し、ここで、結合親和性はBiacoreのような表面プラズモン共鳴により測定する。
【００７４】
本発明の前記の面の他の態様において、ｂｉＡｂＦａｂＬ(図２参照)、ｔａＦａｂ(図３参照)、ヘテロ二量体Ｆｃ(図４参照)、ＶＣＶＦｃ(図５参照)またはＶＣＤＦｃ(図６参照)のような二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは、(ａ)少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも５×１０−１０Ｍ、少なくとも８×１０−１０Ｍまたは少なくとも少なくとも１×１０−１１Ｍの結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−１７Ａホモ二量体；(ｂ)少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも２×１０−１０Ｍ、少なくとも３×１０−１０Ｍ、少なくとも４×１０−１０Ｍ、少なくとも５×１０−１０Ｍまたは少なくとも１×１０−１１Ｍの結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−１７Ｆホモ二量体；および／または(ｃ)少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも５×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも２×１０−９Ｍ、少なくとも３×１０−９Ｍ、少なくとも４×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも６×１０−９Ｍ、少なくとも７×１０−９Ｍ、少なくとも９×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍまたは少なくとも５×１０−１０Ｍの結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体に結合し；そして二重特異性抗体のＩＬ−２３ｐ１９結合エンティティは少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも２×１０−１０Ｍ、少なくとも３×１０−１０Ｍ、少なくとも４×１０−１０Ｍ、少なくとも５×１０−１０、少なくとも６×１０−１０、少なくとも７×１０−１０、少なくとも８×１０−１０または少なくとも９×１０−１０、少なくとも１×１０−１１の結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−２３ｐ１９に結合し、ここで、結合親和性はBiacoreのような表面プラズモン共鳴により測定する。
【００７５】
本発明の前記の面の他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体(またはその抗原結合フラグメント)または二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは、(ａ)初代ヒト小気道上皮細胞(ＳＡＥＣ)におけるＧ−ＣＳＦのＩＬ−１７Ａによる誘発を０.５pm以下のＩＣ５０で；(ｂ)初代ヒト小気道上皮細胞(ＳＡＥＣ)におけるＧ−ＣＳＦのＩＬ−１７Ｆによる誘発を２.０nM以下、１.５nM以下、１.４nM以下、１.３nM以下、１.２nM以下、１.１nM以下または１.０nM以下のＩＣ５０で；および／または(ｃ)初代ヒト小気道上皮細胞(ＳＡＥＣ)におけるＧ−ＣＳＦのＩＬ−１７Ａ／Ｆによる誘発を１.３nM以下、１.２nM以下、１.１nM以下、１.０nM以下、０.９nM以下、０.８nM以下、０.７nM以下、０.６nM以下または０.５nM以下のＩＣ５０で中和または阻害する。
【００７６】
本発明の前記の面の他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体(またはその抗原結合フラグメント)または二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは、(ａ)ヒト初代線維芽細胞(ＨＦＦＦ)におけるＩＬ−６のＩＬ−１７Ａによる誘発を０.５nM以下、０.４nM以下、０.３nM以下、０.２nM以下、０.１nM以下、０.０９nM以下、０.０８nM以下、０.０７nM以下、０.０６nM以下、０.０５nM以下、０.０４nM以下、０.０３nM以下、０.０２nM以下または０.０１nM以下のＩＣ５０で；(ｂ)ヒト初代線維芽細胞(ＨＦＦＦ)におけるＩＬ−６のＩＬ−１７Ｆによる誘発を３０nM以下、２８nM以下、２６nM以下、２５nM以下、２２nM以下、２０nM以下、１９nM以下、１８nM以下、１７nM以下、１６nM以下、１５nM以下、１４nM以下、１３nM以下、１２nM以下、１１nM以下または１０nM以下のＩＣ５０で；および／または(ｃ)ヒト初代線維芽細胞(ＨＦＦＦ)におけるＩＬ−６のＩＬ−１７Ａ／Ｆによる誘発を３０nM以下、２８nM以下、２６nM以下、２２nM以下、２０nM以下、１８nM以下、１７nM以下、１６nM以下、１５nM以下、１４nM以下、１３nM以下、１２nM以下、１１nM以下、１０nM以下、９.５nM以下、９.４nM以下、９.３nM以下、９.２nM以下、９.１nM以下または９.０nM以下のＩＣ５０で中和または阻害する。
【００７７】
本発明の前記の面の他の態様において、ＩＬ−２３ｐ１９抗体(またはその抗原結合フラグメント)または二重特異性抗体のＩＬ−２３ｐ１９結合エンティティは、(ａ)マウス脾細胞におけるＩＬ−２３誘発ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆ産生を０.５nM以下、０.４nM以下、０.３nM以下、０.２nM以下、０.１nM以下、０.０９nM以下、０.０８nM以下、０.０７nM以下または０.０６nM以下のＩＣ５０で中和または阻害する。
【００７８】
本発明の前記の面の他の態様において、ＩＬ−２３ｐ１９抗体(またはその抗原結合フラグメント)または二重特異性抗体のＩＬ−２３ｐ１９結合エンティティは、活性化初代ヒトＴ細胞におけるＩＬ−２３誘発ＳＴＡＴ３リン酸化を０.１nM以下、０.２nM以下、０.３nM以下、０.４nM以下、０.５nM以下、０.８nM以下、０.９nM以下、０.０１nM以下、０.０２nM以下、０.０３nM以下、０.０４nM以下または０.０５nM以下のＩＣ５０で中和または阻害する。
【００７９】
本発明の前記の面の他の態様において、ｂｉＡｂＦａｂＬ(図２参照)、ｔａＦａｂ(図３参照)、ヘテロ二量体Ｆｃ(図４参照)、ＶＣＶＦｃ(図５参照)またはＶＣＤＦｃ(図６参照)のような二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは、(ａ)少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも５×１０−１０Ｍ、少なくとも８×１０−１０Ｍまたは少なくとも少なくとも１×１０−１１Ｍの結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−１７Ａホモ二量体；(ｂ)少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも２×１０−１０Ｍ、少なくとも３×１０−１０Ｍ、少なくとも４×１０−１０Ｍ、少なくとも５×１０−１０Ｍまたは少なくとも１×１０−１１Ｍの結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−１７Ｆホモ二量体；および／または(ｃ)少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも５×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも２×１０−９Ｍ、少なくとも３×１０−９Ｍ、少なくとも４×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも６×１０−９Ｍ、少なくとも７×１０−９Ｍ、少なくとも９×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍまたは少なくとも５×１０−１０Ｍの結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体と結合する。所望により、二重特異性抗体のＩＬ−２３ｐ１９結合エンティティは少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも５×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも２×１０−１０Ｍ、少なくとも３×１０−１０Ｍ、少なくとも４×１０−１０Ｍ、少なくとも５×１０−１０、少なくとも６×１０−１０、少なくとも７×１０−１０、少なくとも８×１０−１０または少なくとも９×１０−１０、少なくとも１×１０−１１の結合親和性(ＫＤ１)でＩＬ−２３ｐ１９に結合し、ここで、結合親和性はBiacoreのような表面プラズモン共鳴により測定する。所望により、二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは、(ａ)初代ヒト小気道上皮細胞(ＳＡＥＣ)におけるＧ−ＣＳＦのＩＬ−１７Ａによる誘発を０.５pm以下のＩＣ５０で；(ｂ)初代ヒト小気道上皮細胞(ＳＡＥＣ)におけるＧ−ＣＳＦのＩＬ−１７Ｆによる誘発を２.０nM以下、１.５nM以下、１.４nM以下、１.３nM以下、１.２nM以下、１.１nM以下または１.０nM以下のＩＣ５０で；および／または(ｃ)初代ヒト小気道上皮細胞(ＳＡＥＣ)におけるＧ−ＣＳＦのＩＬ−１７Ａ／Ｆによる誘発を１.３nM以下、１.２nM以下、１.１nM以下、１.０nM以下、０.９nM以下、０.８nM以下、０.７nM以下、０.６nM以下または０.５nM以下のＩＣ５０で中和または阻害する。所望により、二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは(ａ)ヒト初代線維芽細胞(ＨＦＦＦ)におけるＩＬ−６のＩＬ−１７Ａによる誘発を０.５nM以下、０.４nM以下、０.３nM以下、０.２nM以下、０.１nM以下、０.０９nM以下、０.０８nM以下、０.０７nM以下、０.０６nM以下、０.０５nM以下、０.０４nM以下、０.０３nM以下、０.０２nM以下または０.０１nM以下のＩＣ５０で；(ｂ)ヒト初代線維芽細胞(ＨＦＦＦ)におけるＩＬ−６のＩＬ−１７Ｆによる誘発を３０nM以下、２８nM以下、２６nM以下、２５nM以下、２２nM以下、２０nM以下、１９nM以下、１８nM以下、１７nM以下、１６nM以下、１５nM以下、１４nM以下、１３nM以下、１２nM以���、１１nM以下または１０nM以下のＩＣ５０で；および／または(ｃ)ヒト初代線維芽細胞(ＨＦＦＦ)におけるＩＬ−６のＩＬ−１７Ａ／Ｆによる誘発を３０nM以下、２８nM以下、２６nM以下、２２nM以下、２０nM以下、１８nM以下、１７nM以下、１６nM以下、１５nM以下、１４nM以下、１３nM以下、１２nM以下、１１nM以下、１０nM以下、９.５nM以下、９.４nM以下、９.３nM以下、９.２nM以下、９.１nM以下または９.０nM以下のＩＣ５０で中和または阻害する。所望により、二重特異性抗体のＩＬ−２３ｐ１９結合エンティティは、活性化初代ヒトＴ細胞におけるＩＬ−２３誘発ＳＴＡＴ３リン酸化を０.１nM以下、０.２nM以下、０.３nM以下、０.４nM以下、０.５nM以下、０.８nM以下、０.９nM以下、０.０１nM以下、０.０２nM以下、０.０３nM以下、０.０４nM以下または０.０５nM以下のＩＣ５０で中和または阻害する。
【００８０】
本発明の前記の面の他の態様において、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖の対および配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖の対を含む二重特異性抗体を、ここで“ｂｉＡｂ１”、“ｂＡｂ１”または“２３／１７ｂＡｂ１”と呼ぶ。各々配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖の対および各々配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖の対を含む二重特異性抗体を、ここでは“ｂｉＡｂ２”、“ｂＡｂ２”または“２３／１７ｂＡｂ２”と呼ぶ。各々配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖の対および各々配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖の対を含む二重特異性抗体を、ここでは“ｂｉＡｂ３”、“ｂＡｂ３”または“２３／１７ｂＡｂ３”と呼ぶ。配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖の対および各々配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖の対を含む二重特異性抗体を、ここでは“ｂｉＡｂ４”、“ｂＡｂ４”または“２３／１７ｂＡｂ４”と呼ぶ。
【００８１】
本発明の前記の面の他の態様において、二重特異性抗体は各々配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖の対および各々配列番号７９のアミノ酸配列を含む軽鎖の対を含み、ここで“ｔａＦａｂ１”と呼ぶ。
【００８２】
本発明の前記の面の他の態様において、二重特異性抗体は、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＩＬ−２３重鎖、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＩＬ−１７Ａ／Ｆ重鎖および各々配列番号１７の配列を含む軽鎖の対を含み、ここで“ヘテロ１”と呼ぶ。他の態様において、二重特異性抗体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＩＬ−２３重鎖、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＩＬ−１７Ａ／Ｆ重鎖および各々配列番号１７の配列を含む軽鎖の対を含み、ここで“ヘテロ２”と呼ぶ。
【００８３】
本発明の前記の面の他の態様において、ＶＣＶＦｃ形式の二重特異性抗体(図５参照)は、各々配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖の対と各々配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖の対または各々配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖の対と各々配列番号９４のアミノ酸配列を含む軽鎖の対または各々配列番号９６のアミノ酸配列を含む重鎖の対と各々配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖の対または各々配列番号９８のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む重鎖の対と各々配列番号９４のアミノ酸配列を含む軽鎖の対または各々配列番号１００のアミノ酸配列を含む重鎖の対と各々配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖の対または各々配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖の対と各々配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖の対または各々配列番号１１２のアミノ酸配列を含む重鎖の対と各々配列番号１１４のアミノ酸配列を含む軽鎖の対または各々配列番号１１６のアミノ酸配列を含む重鎖の対と各々配列番号１１８のアミノ酸配列を含む軽鎖の対を含む。
【００８４】
本発明の前記の面の他の態様において、ＩＬ−１７Ａ(配列番号２)およびＩＬ−１７Ｆ(配列番号４)に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含みここで、重鎖可変ドメインは配列番号１３のアミノ酸残基を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号９のアミノ酸残基を含む。所望により、モノクローナル抗体は、ヒト定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む。ＩｇＧ４ヒト定常領域は、Kabatによる２４１位にセリンからプロリン変異を有し得る。所望により、重鎖は配列番号１６、１８、２８、２９または７４のアミノ酸残基を含む。所望により、軽鎖は配列番号１７のアミノ酸残基を含む。所望により、重鎖は配列番号１６、１８、２８、２９または７４のアミノ酸残基を含み、軽鎖は配列番号１７のアミノ酸残基を含む。所望により、二重特異性抗体はモノクローナル抗体を含む。
【００８５】
重鎖および軽鎖定常領域は、ＩｇＧ１.１(配列番号１１、これは配列番号８２によりコードされ得る)、Ｃ末端リシンを欠くＩｇＧ１.１ｆ(配列番号１２７)、Ｃ末端リシンを有するＩｇＧ１.１ｆ(配列番号１２８)、ヒトカッパ定常領域(配列番号１０、これは配列番号８３によりコードされ得る)またはＩｇＧ４.１(配列番号８)を含む。ＩｇＧ４重鎖定常ドメイは、ヒンジ領域、Ｓ２２８Ｐ(EU index numbering system)またはＳ２４１Ｐ(Kabat numbering system)に変異を有する野生型ＩｇＧ４の変異体である。マウス／ヒトキメラ重鎖における、２４１位のセリン(Kabat)(ＩｇＧ１およびＩｇＧ２においてその位置に見られる)のプロリンへの変更は、均一抗体の産生をもたらし、不均一性を排除する。さらに、変異体ＩｇＧ４は、元のキメラＩｇＧ４と比較して顕著に伸びた血清半減期を有し、組織分布の改善を示す。Angal et al., Molecular Immunology, 30(1):105-108 (1993); Schuurman et al., Molecular Immunology, 38:1-8 (2001); Lewis et al., Molecular Immunology, 46:3488-3494 (2009)。
【００８６】
本発明の前記の面の他の態様において、ＩＬ−２３ｐ１９(配列番号６)に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、ここで、重鎖可変ドメインは配列番号７のアミノ酸残基を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号９のアミノ酸残基を含む。所望により、モノクローナル抗体はヒト定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む。所望により、ＩｇＧ４ヒト定常領域は、Kabatによる２４１位にセリンからプロリン変異を有する。所望により、重鎖は配列番号１６、１８、２８、２９または７４のアミノ酸残基を含む。所望により、軽鎖は配列番号１７のアミノ酸残基を含む。所望により、重鎖は配列番号１６、１８、２８、２９または７４のアミノ酸残基を含み、軽鎖は配列番号１７のアミノ酸残基を含む。所望により、二重特異性抗体はモノクローナル抗体を含む。
【００８７】
本発明の前記の面の他の態様において、抗体、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントはＩＬ−２３ｐ１９に特異的にし、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは第一エピトープおよび第二エピトープを含むＩＬ−２３ｐ１９上の非連続的エピトープに結合し、ここで、第一エピトープは配列番号６のアミノ酸残基３３〜５９の少なくとも１個のアミノ酸から成り、第二エピトープは配列番号６のアミノ酸残基８９〜１２５の少なくとも１個のアミノ酸からなる。所望により、抗体、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントは第一エピトープの配列番号６の少なくともアミノ酸残基５４に結合する。所望により、抗体、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントは第一エピトープの配列番号６の少なくともアミノ酸残基５５に結合する。所望により、抗体、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントは第一エピトープの配列番号６の少なくともアミノ酸残基５４および５５に結合する。所望により、抗体、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントは第二エピトープの配列番号６の少なくともアミノ酸残基１１６に結合する。所望により、抗体、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントは第一エピトープの配列番号６の少なくともアミノ酸残基５４および５５にならびに第二エピトープの配列番号６の少なくともアミノ酸残基１１６に結合する。
【００８８】
本発明の前記面の他の態様において、抗体、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントはＩＬ−２３ｐ１９に特異的に結合し、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは第一エピトープおよび第二エピトープを含むＩＬ−２３ｐ１９上の非連続的エピトープに結合し、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは第一エピトープの配列番号６の少なくともアミノ酸残基５４および５５にならびに第二エピトープの配列番号６の少なくともアミノ酸残基１１６に結合する。
【００８９】
本発明の前記面の他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティは、配列番号２の少なくともアミノ酸残基１０８(Ｔｙｒ)を含むエピトープでＩＬ−１７Ａ(ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ａホモ二量体およびＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体)に特異的に結合し、ここで、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティはモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。所望により、ＩＬ−１７Ａ上のエピトープはアラニン変異誘発および／またはＸ線結晶解析により決定する。ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティがＩＬ−１７Ａに結合するエピトープは連続的エピトープでも非連続的エピトープでもよい。
【００９０】
本発明の前記面の他の態様において、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ交差反応性モノクローナル抗体またはその抗原フラグメントは、配列番号２の少なくともアミノ酸残基１０８(Ｔｙｒ)を含むエピトープでＩＬ−１７Ａに結合する。所望により、ＩＬ−１７Ａ上のエピトープはアラニン変異誘発および／またはＸ線結晶解析により決定する。ＩＬ−１７Ａ／Ｆ交差反応性モノクローナル抗体またはその抗原フラグメントがＩＬ−１７Ａに結合するエピトープＩＬ−１７Ａは連続的エピトープでも非連続的エピトープでもよい。
【００９１】
本発明の二重特異性抗体は単独で使用しても、細胞毒性剤との免疫コンジュゲートとして使用してもよい。ある態様において、該薬物は化学療法剤である。ある態様において、該薬物は、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１およびホウ素−１０またはアクチニドのような核分裂性核種を含むが、これらに限定されない放射性同位体である。他の態様において、該薬物はリシン、アブリン、修飾シュードモナスエンテロトキシンＡ、シュードモナス外毒素、カリチアマイシン、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、ジフテリア毒素などを含むが、これらに限定されない毒素または細胞毒性薬物である。抗体のこのような薬物へのコンジュゲーション方法は文献で知られ、直接的および間接的コンジュゲーションを含む。
【００９２】
適切な検出可能分子は、本発明の抗体に直接的または間接的に結合し得る。適切な検出可能分子は、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子などを含む。検出可能または細胞毒性分子の間接的結合について、検出可能または細胞毒性分子を相補性／抗相補性対のメンバーとコンジュゲートでき、ここで、他のメンバーは結合ポリペチドまたは抗体部分に結合する。これらの目的のために、ビオチン／ストレプトアビジンは相補性／抗相補性対の例である。
【００９３】
本発明の二重特異性抗体、抗体および抗原結合フラグメントはまた、例えば、何れかのタイプの分子の抗体の、抗体のエピトープへの結合を妨害しないような共有結合により、修飾された誘導体も含む。適切な誘導体の例は、フコシル化抗体、グリコシル化抗体、アセチル化抗体、ペグ化抗体、リン酸化抗体およびアミド化抗体を含むが、これらに限定されない。本発明の抗体およびその誘導体は、それ自体、既知保護基／ブロッキング基により、タンパク質切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより誘導体化され得る。本発明のある態様において、抗体の少なくとも１個の重鎖はフコシル化されている。ある態様において、フコシル化はＮ結合している。ある好ましい態様において、抗体の少なくとも１個の重鎖は、フコシル化された、Ｎ結合オリゴ糖を含む。
【００９４】
本発明の二重特異性抗体、抗体および抗原結合フラグメントは、本発明の抗体の生物学的特性(例えば、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７Ｆおよび／またはＩＬ−２３の各受容体への結合の阻止、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３の生物学的活性の阻害)を保持した、１個または複数個のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを有する変異体を含む。当業者は１個または複数個のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを有する変異体を製造できる。これらの変異体は、とりわけ、(ａ)１個以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換された変異体、(ｂ)１個以上のアミノ酸がポリペチドに付加されるかポリペチドから欠失された変異体、(ｃ)１個以上のアミノ酸が置換基を含む変異体および(ｄ)ポリペチドが、ポリペチドに有用な特性を付与し得る、例えば、抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分などのような融合パートナー、タンパク質タグまたは他の化学的部分のような他のペプチドまたはポリペチドと融合している変異体を含み得る。本発明の抗体は、ある種由来のアミノ酸残基が他の種由来の対応する残基に保存的または非保存的位置のいずれかで置換されている、変異体も含み得る。他の態様において、非保存的位置でのアミノ酸残基は、保存的または非保存的残基で置換される。遺伝学的技法(抑制、欠失、変異など)、化学的技法および酵素技法を含むこれらの変異体を得る技法は、当業者に知られる。
【００９５】
本発明はまた本発明の二重特異性抗体をコードする単離核酸も含み、これは、例えば、ここに開示する二重特異性抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖、重鎖可変領域、重鎖定常領域、リンカーおよび任意のかつ全ての成分およびその組み合わせを含む。本発明の核酸は、本発明の核酸と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％および最も好ましくは少なくとも約９８％相同性を有する核酸を含む。用語“類似性パーセント”、“同一性パーセント”および“相同性パーセント”は、特定の配列についていうとき、University of Wisconsin GCG(登録商標)ソフトウェアプログラムに示されるとおりに使用する。本発明の核酸はまた相補的核酸も含む。ある例において、配列は、整列したとき完全相補的(ミスマッチなし)である。他の例において、最大約２０％ミスマッチが配列中に存在し得る。本発明のある態様において、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の両者をコードする核酸を提供する。
【００９６】
本発明の核酸を、結合した配列または要素を複製するように、他の遺伝子配列または要素(ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか)を挿入し得る、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、人工染色体(ＢＡＣ、ＹＡＣ)またはウイルスのようなベクターにクローン化できる。ある態様において、発現ベクターは、構成的活性型プロモーターセグメント(例えばＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子またはＬＴＲ配列であるが、これらに限定されない)またはステロイド誘導型ｐＩＮＤベクター(Invitrogen)のような誘導型プロモーター配列を含み、核酸の発現を制御できる。本発明の発現ベクターは、さらに制御配列、例えば、内部リボソーム進入部位を含み得る。発現ベクターは、例えば、トランスフェクションにより細胞に導入できる。
【００９７】
それ故に、他の態様において、本発明は、次の作動可能に結合した要素を含む発現ベクターを提供する；転写プロモーター；本発明の二重特異性抗体の重鎖をコードする核酸分子；および転写ターミネーター。他の態様において、本発明は、次の作動可能に結合した要素を含む発現ベクターを提供する；転写プロモーター；本発明の二重特異性抗体の軽鎖をコードする核酸分子；および転写ターミネーター。このようなベクターを含み、重鎖および軽鎖を発現する組み換え宿主細胞も提供される。
【００９８】
他の態様において、本発明は、次の作動可能に結合した要素を含む発現ベクターを提供する；転写プロモーター；本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖をコードする第一核酸分子；本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖をコードする第二核酸分子；および転写ターミネーター。他の態様において、本発明は、次の作動可能に結合した要素を含む発現ベクターを提供する；第一転写プロモーター；本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖をコードする第一核酸分子；第一転写ターミネーター；第二転写プロモーター；本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖をコードする第二核酸分子；および第二転写ターミネーター。このようなベクターを含み、重鎖および軽鎖を発現する組み換え宿主細胞も提供される。
【００９９】
本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖をコードする核酸および軽鎖をコードする核酸を含む抗体産生細胞は、当分野で知られる技法による二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントの産生に使用できる。本発明は、一つの態様において、重鎖および軽鎖を発現する組み換え宿主細胞を培養し、該細胞により産生された二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントを単離することを含む、本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントの製造方法を提供する。
【０１００】
組み換え宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌細胞または真核細胞、例えば哺乳動物細胞または酵母細胞であり得る。酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベおよびピキア・パストリス細胞を含む。哺乳動物細胞は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ)、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ、ヒト胎児腎細胞２９３、正常イヌ腎臓細胞株、正常ネコ腎臓細胞株、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ＣＯＳ細胞および非腫瘍原性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞、線維芽細胞株、骨髄腫細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ３１細胞、マウスセルトリ細胞、ヒト子宮頸癌細胞、Buffalo系ラット肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳房腫瘍細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ  ５細胞およびＦＳ４細胞を含む。本発明の抗体産生細胞はまた、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ細胞のような、知られる何らかの昆虫発現細胞株を含む。好ましい態様において、細胞は哺乳動物細胞である。他の好ましい態様において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
【０１０１】
抗体産生細胞は、好ましくはＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３結合競合物を実質的に含まない。好ましい態様において、抗体産生細胞は、約１０％未満、好ましくは約５％未満、より好ましくは約１％未満、より好ましくは約０.５％未満、より好ましくは約０.１％未満および最も好ましくは０重量％のＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦまたはＩＬ−２３結合競合物を含む。ある態様において、抗体産生細胞により産生された抗体は、実質的にＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３競合物がない。好ましい態様において、抗体産生細胞により産生された抗体は、約１０％未満、好ましくは約５％未満、より好ましくは約１％未満、より好ましくは約０.５％未満、より好ましくは約０.１％未満および最も好ましくは０重量％のＩＬ−１７およびＩＬ−２３結合競合物を含む。
【０１０２】
抗体精製方法は当分野で知られる。本発明のある態様において、抗体精製方法は、濾過、親和性カラムクロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーおよび濃縮を含む。濾過工程は、好ましくは限外濾過およびより好ましくは限外濾過およびダイアフィルトレーションを含む。濾過は、好ましくは少なくとも約５〜５０回、より好ましくは１０〜３０回および最も好ましくは１４〜２７回行う。親和性カラムクロマトグラフィーは、例えば、PROSEP(登録商標)親和性クロマトグラフィー(Millipore、Billerica、Mass.)を使用して行い得る。好ましい態様において、親和性クロマトグラフィー工程はPROSEP(登録商標)-vAカラムクロマトグラフィーを含む。溶離液を溶媒洗剤で洗浄し得る。カチオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＳＰ−セファロースカチオン交換クロマトグラフィーを含み得る。アニオン交換クロマトグラフィーは、例えば、Q-Sepharose Fast Flowアニオン交換を使用し得る。アニオン交換工程は好ましくは非結合であり、それによりＤＮＡおよびＢＳＡを含む混入物の除去を可能にする。抗体産物は、好ましくは、例えば、Pall DV 20 Nanofilterを使用して、ナノ濾過する。抗体産物を、例えば、限外濾過およびダイアフィルトレーションを使用して濃縮し得る。本方法は、さらに凝集物を除去するための分子ふるいクロマトグラフィーの工程を含み得る。
【０１０３】
二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントはまた、当分野で知られる他の方法により、例えば抗体と抗体フラグメントの化学的カップリングによっても製造できる。
【０１０４】
本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３／ｐ１９のような炎症誘発性サイトカイン類の阻害に有用である。本抗体は、ＩＬ−１７Ａホモ二量体、ＩＬ−１７Ｆホモ二量体および／またはＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体の炎症誘発作用の減少、制限、中和または遮断に使用できる。同様に、本抗体は、ＩＬ−１７Ａホモ二量体、ＩＬ−１７Ｆホモ二量体またはＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体の炎症誘発性作用の減少、制限、中和または遮断に使用できる。このような場合、抗体の抗ＩＬ−２３ｐ１９部分を、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含むＩＬ−１７Ａおよび／またはＩＬ−１７Ｆを産生するであろう新規Ｔ細胞の減少、制限、中和または遮断産生に使用する。ここに記戴する二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントは、多発性硬化症(例えば、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および再発進行型多発性硬化症)、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、乾癬、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎疾患、微小変化型疾患(リポイドネフローゼ)、巣状分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、腎性全身性線維症(ＮＳＦ)、腎性線維化皮膚症、線維化胆汁鬱滞性肝炎、好酸球性筋膜炎(シュールマン症候群)、硬化性粘液水腫(丘疹性ムチン沈着症)、強皮症、硬化性萎縮性苔癬、ＰＯＥＭｓ症候群(クロウ・深瀬症候群、高槻病またはＰＥＰ症候群)、ネフローゼ症候群、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)(血液、骨髄、腎臓、膵臓、肝臓、同所性肝臓、肺、心臓、腸、小腸、大腸、胸腺、同種幹細胞、強度軽減同種、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、静脈、動脈、血管、胃および精巣のような移植片から)、抗好中球細胞質抗体(ＡＮＣＡ)関連血管炎(ＡＡＶ)、巨細胞性動脈炎および多発性骨髄腫誘発骨溶解性骨病のような炎症性障害および自己免疫疾患の処置に使用できる。ここに記戴する二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントはまた血管形成を含む癌の処置に使用できる。
【０１０５】
本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントは、ＩＬ−１７Ａおよび／またはＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３(ｐ１９サブユニットを介して)の活性を阻害でき、それゆえに、新規のおよび存在するＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−１７産生Ｔ細胞(Ｔｈ１７)の産生維持および活性を阻止できる。本発明は、さらに高レベルのＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆおよび／またはＩＬ−２３の存在により特徴付けられる炎症性疾患の処置におけるおよび高レベルのＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆおよび／またはＩＬ−２３の存在により特徴付けられる癌の処置における、本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントの使用に関する。
【０１０６】
本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントは、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ(ホモ二量体およびヘテロ二量体のいずれも含む)およびＩＬ−２３／ｐ１９の活性を遮断、阻害、減少、拮抗または中和でき、それゆえに、これら３種のサイトカイン類の１個または２個のみを標的とする治療よりも有利である。
【０１０７】
本発明の抗体、すなわち、二重特異性抗体は、それゆえに
(１)癌、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群(ＩＢＳ)、嚢胞性線維症、慢性大腸炎、シェーグレン症候群、脾腫、慢性腎疾患(ＣＫＤ)における炎症、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎および急性相応答の誘発と関連する他の疾患のような急性炎症および慢性炎症性疾患の処置におけるＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３を介するシグナル伝達の遮断、阻害、減少、拮抗または中和、および
(２)受容体(例えば、ＩＬ−２３Ｒα、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−１７ＲＡおよびＩＬ−１７ＲＣ)を介する免疫細胞(例えば、リンパ球、単球、白血球)におけるシグナル伝達を予防または阻止するためのインスリン依存性糖尿病(ＩＤＤＭ)、多発性硬化症(ＭＳ)(例えば、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および再発進行型多発性硬化症)、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、シェーグレン症候群、ＩＢＳおよびＩＢＤのような自己免疫疾患の処置におけるＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７ＦまたはＩＬ−２３を介するシグナル伝達の遮断、阻害、減少、拮抗または中和。本発明の抗体を使用したＩＬ−２３Ｒα、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−１７ＲＡおよびＩＬ−１７ＲＣを介するシグナル伝達の遮断、阻害、減少または拮抗は膵臓、腎臓、下垂体および神経細胞の疾患も有利であり、ＩＤＤＭ、非インスリン依存性糖尿病(ＮＩＤＤＭ)、膵炎および膵臓癌
の処置に使用し得る。
【０１０８】
例えば、本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントは、特にＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３／ｐ１９のアンタゴニストとして、炎症性疾患の治療的処置に、多発性硬化症(ＭＳ)(例えば、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および再発進行型多発性硬化症)、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)および癌のような炎症性疾患の処置に有用である。これらのアンタゴニストは、アトピー性および接触性皮膚炎、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、抗好中球細胞質抗体(ＡＮＣＡ)関連血管炎(ＡＡＶ)、巨細胞性動脈炎、多発性硬化症(ＭＳ)(例えば、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および再発進行型多発性硬化症)、大腸炎、内毒血症、関節炎、リウマチ性関節炎(ＲＡ)、シェーグレン症候群、乾癬性関節炎、成人呼吸器疾患(ＡＲＤ)、敗血症性ショック、多臓器不全、特発性肺線維症のような炎症性肺傷害、喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、気道過敏、慢性気管支炎、アレルギー性喘息、乾癬、湿疹、潰瘍性大腸炎およびクローン病のようなＩＢＳおよび炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、ヘリコバクター・ピロリ感染、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎疾患、微小変化型疾患(リポイドネフローゼ)、巣状分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、腎性全身性線維症(ＮＳＦ)、腎性線維化皮膚症、線維化胆汁鬱滞性肝炎、好酸球性筋膜炎(シュールマン症候群)、硬化性粘液水腫(丘疹性ムチン沈着症)、強皮症、硬化性萎縮性苔癬、ＰＯＥＭｓ症候群(クロウ・深瀬症候群、高槻病またはＰＥＰ症候群)、ネフローゼ症候群、移植片拒絶、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)(血液、骨髄、腎臓、膵臓、肝臓、同所性肝臓、肺、心臓、腸、小腸、大腸、胸腺、同種幹細胞、強度軽減同種、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、静脈、動脈、血管、胃および精巣のような移植片から)、腹膜炎症が原因の腹腔内癒着および／または膿瘍(例えば、感染、傷害などが原因)、ネフローゼ症候群、嚢胞性線維症(Tan, H.-L. et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 184(2):252-258 (2011))、溶解性骨疾患(例えば、多発性骨髄腫誘発骨溶解性骨病)(Sotomayor, E.M., Blood, 116(18):3380-3382 (2010))、臓器同種移植片拒絶反応、連鎖球菌細胞壁(ＳＣＷ)誘発関節炎、骨関節症、歯肉炎／歯周症、ヘルペス性間質性角膜炎、再狭窄、川崎病、加齢黄斑変性症(ＡＭＤ；例えば、滲出型ＡＭＤおよび萎縮型ＡＭＤ)(Wei, L. et al., Cell Reports, 2:1151-1158 (Nov. 29, 2012)、免疫介在腎疾患、肝線維症(Meng, F. et al., Gastroenterology, 143:765-776 (2012))、肺線維症(Meng, F. et al., Gastroenterology, 143:765-776 (2012))、肝胆道疾患、心筋炎(Ding, H.-S., Mol. Biol. Rep., 39(7):7473-7478 (Feb. 14, 2012); Valente, A.J. et al., Cellular Signalling, 24:560-568 (2012))、心線維症(Valente, A.J. et al., Cellular Signalling, 24:560-568 (2012))、有害心筋リモデリング(Valente, A.J. et al., Cellular Signalling, 24:560-568 (2012))、アテローム性動脈硬化症(Ding, H.-S., Mol. Biol. Rep., 39(7):7473-7478 (Feb. 14, 2012))、心虚血／再潅流傷害(Ding, H.-S., Mol. Biol. Rep., 39(7):7473-7478 (Feb. 14, 2012))、心不全(Ding, H.-S., Mol. Biol. Rep., 39(7):7473-7478 (Feb. 14, 2012))および前立腺、腎臓、結腸、卵巣および子宮頸の癌および白血病を含むが、これらに限定されないＩＬ−１７および／またはＩＬ−２３発現により特徴付けられる癌／新生���疾患(Tartour et al., Cancer Res., 59:3698 (1999); Kato et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 282:735 (2001); Steiner et al., Prostate, 56:171 (2003); Langowksi et al., Nature, May 10 [Epub ahead of print], (2006))の処置において、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、それらのホモ二量体およびヘテロ二量体およびＩＬ−２３(ｐ１９を介して)(個々にまたは一体となって)と結合、遮断、阻害、減少、拮抗または中和できる。
【０１０９】
例えば、本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントは、炎症性疾患の治療的処置に、特に後天性免疫不全症候群(自己免疫性要素を伴うウイルス疾患であるＡＩＤＳ)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患(ＡＩＥＤ)、自己免疫性リンパ増殖性症候群(ＡＬＰＳ)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ＡＴＰ)、ベーチェット病、心筋症、セリアックスプルー、疱疹状皮膚炎；慢性疲労免疫機能不全症候群(ＣＦＩＤＳ)、慢性炎症性脱髄性多発神経障害(ＣＩＰＤ)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素疾患、クレスト症候群、デゴス病、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス(例えば、小児円板状エリテマトーデス、汎発性円板状エリテマトーデスおよび限局性円板状エリテマトーデス)、凍瘡エリテマトーデス、エリテマトーデス−扁平苔癬重複症候群、エリテマトーデス脂肪織炎、腫脹エリテマトーデス、いぼ状皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、亜急性皮膚エリテマトーデス、急性皮膚エリテマトーデス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スチル病)、若年性リウマチ性関節炎、リウマチ性関節炎(ＲＡ)、メニエール病、混合型結合組織疾患、多発性硬化症(ＭＳ)(例えば、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および再発進行型多発性硬化症)、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、湿疹、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、成人呼吸器疾患(ＡＲＤ)、リウマチ熱、関節炎、サルコイドーシス、強皮症(例えば、進行性全身性硬化症(ＰＳＳ)、全身性硬化症(ＳＳ)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、抗好中球細胞質抗体(ＡＮＣＡ)関連血管炎(ＡＡＶ)、巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、内毒血症、敗血症または敗血症性ショック、毒素ショック症候群、多臓器不全、特発性肺線維症のような炎症性肺傷害、大腸炎、潰瘍性大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、過敏性腸症候群(ＩＢＳ)、ブドウ膜炎、白斑症、ウェゲナー肉芽腫、アルツハイマー病、アトピー性アレルギー、アレルギー、喘息、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、気道過敏、アレルギー性喘息、糸球体腎炎、溶血性貧血、ヘリコバクター・ピロリ感染、腹膜炎症が原因の腹腔内癒着および／または膿瘍(例えば、感染、傷害などが原因)、ネフローゼ症候群、特発性脱髄性多発ニューロパシー、ギランバレー症候群、臓器同種移植片拒絶反応、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎疾患、微小変化型疾患(リポイドネフローゼ)、巣状分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、腎性全身性線維症(ＮＳＦ)、腎性線維化皮膚症、線維化胆汁鬱滞性肝炎、好酸球性筋膜炎(シュールマン症候群)、硬化性粘液水腫(丘疹性ムチン沈着症)、強皮症、硬���性萎縮性苔癬、ＰＯＥＭｓ症候群(クロウ・深瀬症候群、高槻病またはＰＥＰ症候群)、ネフローゼ症候群、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)(血液、骨髄、腎臓、膵臓、肝臓、同所性肝臓、肺、心臓、腸、小腸、大腸、胸腺、同種幹細胞、強度軽減同種、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、静脈、動脈、血管、胃および精巣のような移植片から)、溶解性骨疾患(例えば、多発性骨髄腫誘発溶解性骨疾患)、嚢胞性線維症、加齢黄斑変性(ＡＭＤ；例えば、滲出型ＡＭＤおよび萎縮型ＡＭＤ)、肝線維症、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、心虚血／再潅流傷害、心不全、心筋炎、心線維症、有害心筋リモデリング、糖尿病性網膜症および人工呼吸器誘発肺傷害の処置に、有用である、例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３／ｐ１９に拮抗する。
【０１１０】
したがって、一つの態様において、本発明は、処置を必要とする哺乳動物に二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントの治療有効量を投与することを含む、処置を必要とする哺乳動物における、炎症誘発性サイトカイン類、例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３の１種以上の阻害方法を提供する。好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。本方法は高レベルのＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦまたはＩＬ−２３発現を特徴とする障害の処置に使用し得る。二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントは、他の薬物と共に、同じ製剤としてまたは別々に投与し得る。
【０１１１】
他の態様において、本発明は、哺乳動物にＩＬ−１７Ａ／Ｆポリペチド、そのアゴニストまたはそのアンタゴニスト(例えばＩＬ−１７Ａ／Ｆ交差反応性抗体を含むＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティ)の治療有効量を投与することを含む、処置を必要とする哺乳動物における免疫関連障害の処置方法を提供する。好ましい面において、免疫関連障害は全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、リウマチ性関節炎(ＲＡ)、骨関節症、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、特発性炎症性ミオパシー、シェーグレン症候群、全身性脈管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介在腎疾患、多発性硬化症(ＭＳ)(例えば、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および再発進行型多発性硬化症)、特発性脱髄性多発ニューロパシーまたはギランバレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発神経障害のような中枢および末梢神経系の脱髄性疾患、感染性、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎のような肝胆道疾患、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、クローン病、潰瘍性大腸炎、グルテン感受性腸疾患およびウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫介在皮膚疾患、抗好中球細胞質抗体(ＡＮＣＡ)関連血管炎(ＡＡＶ)、巨細胞性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹のようなアレルギー性疾患、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎のような肺の免疫性疾患、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎疾患、微小変化型疾患(リポイドネフローゼ)、巣状分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、腎性全身性線維症(ＮＳＦ)、腎性線維化皮膚症、線維化胆汁鬱滞性肝炎、好酸球性筋膜炎(シュールマン症候群)、硬化性粘液水腫(丘疹性ムチン沈着症)、強皮症、硬化性萎縮性苔癬、ＰＯＥＭｓ症候群(クロウ・深瀬症候群、高槻病またはＰＥＰ症候群)、ネフローゼ症候群、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)(血液、骨髄、腎臓、膵臓、肝臓、同所性肝臓、肺、心臓、腸、小腸、大腸、胸腺、同種幹細胞、強度軽減同種、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、静脈、動脈、血管、胃および精巣のような移植片から)、溶解性骨疾患(例えば、多発性骨髄腫誘発溶解性骨疾患)、嚢胞性線維症、加齢黄斑変性(ＡＭＤ；例えば、滲出型ＡＭＤおよび萎縮型ＡＭＤ)、肝線維症、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、心虚血／再潅流傷害、心不全、心筋炎、心線維症、有害心筋リモデリング、移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患からなる群から選択される。
【０１１２】
他の態様において、本発明は、処置を必要とする哺乳動物に本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントの治療有効量を投与することを含む、そのような処置を必要とする哺乳動物における炎症の阻止方法を提供する。好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。炎症は、多発性硬化症(ＭＳ)(例えば、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および再発進行型多発性硬化症)、慢性炎症、シェーグレン症候群、自己免疫性糖尿病、リウマチ性関節炎(ＲＡ)および他の関節炎状態、喘息、全身性硬化症、アトピー性皮膚炎、抗好中球細胞質抗体(ＡＮＣＡ)関連血管炎(ＡＡＶ)、巨細胞性動脈炎、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、デゴス病、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス(例えば、小児円板状エリテマトーデス、汎発性円板状エリテマトーデスおよび限局性円板状エリテマトーデス)、凍瘡エリテマトーデス、エリテマトーデス−扁平苔癬重複症候群、エリテマトーデス脂肪織炎、腫脹エリテマトーデス、いぼ状皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、亜急性皮膚エリテマトーデス、急性皮膚エリテマトーデス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病、溶解性骨疾患(例えば、多発性骨髄腫誘発溶解性骨疾患)、嚢胞性線維症、加齢黄斑変性(ＡＭＤ；例えば、滲出型ＡＭＤおよび萎縮型ＡＭＤ)、肝線維症、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、心虚血／再潅流傷害、心不全、心筋炎、心線維症、有害心筋リモデリング、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群(ＩＢＳ)、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎疾患、微小変化型疾患(リポイドネフローゼ)、巣状分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、腎性全身性線維症(ＮＳＦ)、腎性線維化皮膚症、線維化胆汁鬱滞性肝炎、好酸球性筋膜炎(シュールマン症候群)、硬化性粘液水腫(丘疹性ムチン沈着症)、強皮症、硬化性萎縮性苔癬、ＰＯＥＭｓ症候群(クロウ・深瀬症候群、高槻病またはＰＥＰ症候群)、ネフローゼ症候群、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)(血液、骨髄、腎臓、膵臓、肝臓、同所性肝臓、肺、心臓、腸、小腸、大腸、胸腺、同種幹細胞、強度軽減同種、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、静脈、動脈、血管、胃および精巣のような移植片から)からなる群から選択される疾患と関連し得る。二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントは、他の薬物、例えば抗炎症剤と共に、同じ製剤としてまたは別々に投与し得る。
【０１１３】
他の態様において、本発明は、ここに記戴する抗体、例えば、二重特異性抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を製造することが知られる方法に従い製剤でき、それにより治療タンパク質を、薬学的に許容される担体の混合物に合わせる。組成物は、その投与が受容患者が許容できるならば、“薬学的に許容される担体”と考えられる。無菌リン酸緩衝化食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は当業者に周知である。例えば、Gennaro, ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing Company (1995)参照。
【０１１４】
医薬使用のために、本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体は、慣用方法に従い、非経腸、特に静脈内または皮下送達するために製剤される。静脈内投与はボーラス注入、例えば、ミニポンプまたは他の適当なテクノロジーを使用する制御放出または典型的に１〜数時間の時間にわたる注入により得る。一般に、医薬製剤は、食塩水、緩衝化食塩水、５％デキストロース水溶液などのような薬学的に許容される担体と組み合わせて、本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を含む。製剤は、さらに１種以上の添加物、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質喪失を防止するためのアルブミンなどを含み得る。このような組み合わせ治療を使用するとき、二重特異性抗体を含む抗体を、単一製剤中に組み合わせても、別々の製剤で投与してもよい。製剤方法は当分野で周知であり、例えば、引用により本明細書に包含させるGennaro, ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA (1990)に開示されている。治療的投与量は、一般に０.１〜１００mg／患者体重kg／日、好ましくは０.５〜２０mg／kg／日であり、正確な投与量は、処置する状態の性質および重症度、患者の特性などを考慮して、医師が認められている標準に従い決定する、投与量の決定は当業者の通常技術レベルの範囲内である。より一般的に、抗体を１週間かけてまたはそれより短く、しばしば１〜３日間かけて投与する。一般に、投与する抗体の投与量は、患者の年齢、身長、体重、性別、一般的状態および病歴のような因子により変わる。典型的に、レシピエントに、約１pg／kg〜１０mg／kg(薬物重量／患者体重)の範囲である抗体を与えるのが望ましいが、状況によってはこれより低い投与量または高い投与量も投与し得る。
【０１１５】
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体の対象への投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、局所カテーテルを介する潅流または直接病巣内注射によるものであり得る。治療的抗体を注射により投与するとき、投与は連続的注入でも１回または複数回ボーラスでもよい。
【０１１６】
さらなる投与経路は経口、粘膜、肺および経皮を含む。経口送達は、ポリエステルマイクロスフェア、ゼインマイクロスフェア、プロテイノイドマイクロスフェア、ポリシアノアクリレートマイクロスフェアおよび脂質系が適する(例えば、DiBase et al., “Oral Delivery of Microencapsulated Proteins”, in Sanders et al., eds., Protein Delivery: Physical Systems, pp. 255-288, Plenum Press (1997)参照)。鼻腔内送達の可能性は、このような方法でのインスリン投与により例証されている(例えば、Hinchcliffe et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 35:199 (1999)参照)。本発明の抗体を含む乾燥または液体粒子を製造し、乾燥粉末ディスペンサー、液体エアロゾル発生装置またはネブライザーを使用して吸入投与できる(例えば、Pettit et al., TIBTECH, 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 35:235 (1999)参照)。この試みは、エアロゾル化インスリンを肺に送達する携帯電子吸入器であるＡＥＲＸ(登録商標)糖尿病管理システムが例である。４８,０００kDａほど大きいタンパク質が、低周波数超音波を利用して治療濃度で皮膚を通過して送達されることが試験で示されており、これは経皮的投与の可能性を例証する(Mitragotri et al., Science, 269:850 (1995))。エレクトロポレーションを使用する経皮送達は、ＩＬ−１７およびＩＬ−２３／ｐ１９結合活性を有する分子を投与する他の手段を提供する(Potts et al., Pharm. Biotechnol., 10:213 (1997))。
【０１１７】
治療の目的で、本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物を、治療有効量で患者に投与する。本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体と薬学的に許容される担体の組み合わせは、投与される量が生理学的に意味があるならば、“治療有効量”で投与されたと見なされる。薬物は、その存在により受容患者の生理学に検出可能な変化がもらされるならば、生理学的に意味がある。例えば、炎症の処置に使用する薬物は、その存在が炎症性応答を軽減するならば、生理学的に意味がある。有効処置は多様な方法で評価し得る。一つの態様において、有効処置は炎症の軽減により決定する。他の態様において、有効処置は炎症阻害により示される。さらに別の態様において、有効治療は、体重増加、体力回復、疼痛軽減、好調および患者からの体調良好の主観的指標のような徴候を含む、患者の健康の増加により測定する。
【０１１８】
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を含む医薬組成物は、液体形態、エアロゾルまたは固形で提供できる。液体形態の例は、注射溶液および経口懸濁液である。固形の例は、カプセル剤、錠剤および徐放形態を含む。後者の形態は、ミニ浸透圧ポンプおよびインプラントにより例示される(Bremer et al., Pharm. Biotechnol., 10:239 (1997); Ranade, “Implants in Drug Delivery”, in Ranade et al., eds., Drug Delivery Systems, pp. 95-123, CRC Press (1995); Bremer et al., “Protein Delivery with Infusion Pumps”, in Sanders et al., eds., Protein Delivery: Physical Systems, pp. 239-254, Plenum Press (1997); Yewey et al., “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant”, in Sanders et al., eds., Protein Delivery: Physical Systems, pp. 93-117, Plenum Press (1997))。
【０１１９】
リポソームは、対象に静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下または経口投与、吸入または鼻腔内投与により治療ポリペチドを送達する一つの手段である。リポソームは、水性区画を囲む１個以上の脂質二重層からなる顕微鏡的小胞である(一般に、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 12(Suppl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs, 46:618 (1993), and Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", in Ranade et al., eds., Drug Delivery Systems, pp. 3-24, CRC Press (1995)参照)。リポソームは、細胞膜と組成が類似し、その結果、リポソームは安全に投与でき、生分解性である。製造法によって、リポソームは単層または多重膜であってよく、リポソームは、０.０２μmから１０μmを超える範囲の直径で様々なであり得る。多様な薬物をリポソームに封入でき、疎水性薬物は二重層に分配され、親水性剤は内部水性間隙に分配される(例えば、Machy et al., Liposomes in Cell Biology and Pharmacology, John Libbey (1987), and Ostro et al., American J. Hosp. Pharm., 46:1576 (1989)参照)。さらに、リポソームのサイズ、二重層数、脂質組成ならびにリポソームの電荷および表面特徴を変えることにより、封入された薬物の治療利用濃を制御することが可能である。
【０１２０】
リポソームは、実質的にあらゆるタイプの細胞により吸収され、その後封入された薬物をゆっくり放出できる。あるいは、吸収されたリポソームは、食細胞である細胞に取り込まれる。エンドサイトーシの後、リポソーム脂質のリソソーム内分解および封入薬物の放出が起こる(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 446:368 (1985))。静脈内投与後、小リポソーム(０.１〜１.０μm)は典型的に主に肝臓および脾臓に位置する網内皮系の細胞により取り込まれ、一方３.０μmより大きいリポソームは肺に沈着する。小さいリポソームの網内皮系細胞による優先的取り込みが、マクロファージおよび肝臓の腫瘍への化学療法剤送達に使用されている。
【０１２１】
網内皮系は、大投与量のリポソーム粒子での飽和または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化を含むいくつかの方法により回避できる(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta, 802:428 (1984))。さらに、糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質のリポソーム膜への取り込みが、網内皮系による取り込みを顕著に減少させることが示されている(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1068:133 (1991);Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993))。
【０１２２】
リポソームはまた、リン脂質組成を変えることによりまたは受容体またはリガンドをリポソームに挿入させることにより特定の細胞または臓器を標的とするようにも製造できる。例えば、高含量の非イオン性界面活性剤を有して製造したリポソームは肝臓を標的とするために使用されている(早川らの特開平０４−２４４０１８；Kato et al., Biol. Pharm. Bull., 16:960 (1993))。これらの製剤は、ダイズホスファチジルコリン、α−トコフェロールおよびエトキシル化水素化ヒマシ油(Ｈ共６０)をメタノール中で混合し、混合物を減圧下濃縮し、混合物を水で再構成することにより製造された。ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)とダイズ由来ステリルグルコシド混合物(ＳＧ)およびコレステロール(Ｃｈ)のリポソーム製剤も肝臓を標的とすることが示されている(Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull., 20:881 (1997))。
【０１２３】
あるいは、抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミンおよび輸送タンパク質のような種々のターゲティングリガンドを、リポソーム表面に結合できる。例えば、リポソームを、分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、肝臓細胞表面上に排他的に発現されるアシアロ糖タンパク質(ガラクトース)受容体を標的にできる(Kato et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull., 20:259 (1997))。同様に、Wu et al., Hepatology, 27:772 (1998)は、リポソームをアシアロフェチュインで標識することによりリポソーム血漿半減期が短くなり、肝細胞によるアシアロフェチュイン標識リポソーム取り込みが大きく増強されることを示している。他方で、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェチュインの前注射により阻害できる(Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull., 20:259 (1997))。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝臓細胞にターゲティングさせる他の方法を提供する(Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 94:11681 (1997))。さらに、Geho et al. 米国特許番号４,６０３,０４４は、肝臓の特定代謝細胞と関連する肝胆道受容体に特異性を有する、肝細胞指向性リポソーム小胞送達系を記戴する。
【０１２４】
組織ターゲティングのためのより一般的な試みとして、標的細胞を、標的細胞により発現されるリガンドに特異的なビオチニル化抗体で前標識化する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 32:99 (1998))。遊離抗体の血漿消失後、ストレプトアビジン結合リポソームを投与する。他の試みにおいて、ターゲティング抗体を直接リポソームに結合する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 32:99 (1998))。
【０１２５】
抗体を、タンパク質マイクロカプセル化の一般的技法を使用してリポソームに封入できる(例えば、Anderson et al., Infect. Immun., 31:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res., 50:1853 (1990), and Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1063:95 (1991), Alving et al. “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies”, in Gregoriadis, ed., Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, p. 317, CRC Press (1993), Wassef et al., Meth. Enzymol., 149:124 (1987)参照)。上記のとおり、治療に有用なリポソームは多様な成分を含み得る。例えば、リポソームは、ポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含み得る(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993))。
【０１２６】
分解性ポリマーマイクロスフェアが、治療タンパク質の高全身性レベルを維持するために設計されている。マイクロスフェアは、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(ＰＬＧ)、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生分解性エチルビニルアセテートポリマーのような分解性ポリマーから製造し、ここで、タンパク質がポリマー内に封入されている(Gombotz et al., Bioconjugate Chem., 6:332 (1995); Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery”, in Ranade et al., eds., Drug Delivery Systems, pp. 51-93, CRC Press (1995); Roskos et al., “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery”, in Sanders et al., eds., Protein Delivery: Physical Systems, pp. 45-92, Plenum Press (1997); Bartus et al., Science, 281:1161 (1998); Putney et al., Nature Biotechnology, 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:548 (1998))。ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)被覆ナノ球体も、治療タンパク質の静脈内投与用担体を提供する(例えば、Gref et al., Pharm. Biotechnol., 10:167 (1996)参照)。
【０１２７】
本製剤は、処置する特定の適応症の必要に応じて、１種を超える活性化合物を含むこともでき、好ましくは互いに不利に作用しない相補的活性剤を含むものである。これとは別にまたはこれに加えて、本組成物は、例えば、細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤または増殖阻害剤のような、その機能を増強する薬物を含むことができる。このような分子は、意図する目的に有効である量で組み合わせて適切に使用される。
【０１２８】
一つの態様において、本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を組み合わせ治療で、すなわち、自己免疫性障害および炎症性疾患のような病態または障害の処置に有用な他の薬物、例えば、治療剤と組み合わせて投与する。この文脈での用語“組み合わせ”は、複数薬物を、一緒にまたは逐次的に、実質的に同時に投与する。逐次的に投与するとき、第二の化合物の投与開始時に、２種の化合物の最初のものは好ましくは処置部位で有効濃度でなお検出可能とする。
【０１２９】
例えば、組み合わせ治療は、下にさらに詳述するとおり、１種以上の付加的治療剤、例えば、１種以上のサイトカインおよび増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤および／または細胞毒性または細胞増殖抑制剤と共製剤されるおよび／または併用される、１種以上の本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を含み得る。さらに、１種以上のここに記戴する抗体、例えば、二重特異性抗体を、ここに記戴する治療剤の２種以上と組み合わせで使用できる。このような組み合わせ治療は、有利に投与する治療剤の低投与量を使用し、それゆえに、個々の単剤療法による毒性または効果の複雑化の可能性を避け得る。
【０１３０】
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体と組み合わせて使用する好ましい治療剤は、炎症性応答の異なる段階を妨害する薬物である。一つの態様において、１種以上のここに記戴する抗体、例えば、二重特異性抗体を、他のサイトカインまたは増殖因子アンタゴニスト(例えば、可溶性受容体、ペプチド阻害剤、小分子、リガンド融合物)；または他の標的と結合する抗体またはその抗原結合フラグメント(例えば、他のサイトカイン類または増殖因子、その受容体または他の細胞表面分子に結合する抗体)；および抗炎症性サイトカイン類またはそのアゴニストのような１種以上の付加的薬物と共製剤および／または併用し得る。ここに記戴する抗体と組み合わせて使用できる薬物の非限定的例は、１種以上のインターロイキン(ＩＬ)またはその受容体のアンタゴニスト、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２およびＩＬ−３１のアンタゴニスト；腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、ＬＴ、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦのようなサイトカイン類または増殖因子またはその受容体のアンタゴニストを含むが、これらに限定されない。本発明の抗体はまた、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０(例えば、ＣＤ２０阻害剤リツキシマブ(リツキサン(登録商標)))、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０(Ｂ７.１)、ＣＤ８６(Ｂ７.２)、ＣＤ９０またはＣＤ１５４を含むそのリガンド(ｇｐ３９またはＣＤ４０Ｌ)またはＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１およびＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１のような細胞表面分子に対する阻害剤、例えば、抗体とも組み合わせできる(Yusuf-Makagiansar et al., Med. Res. Rev., 22:146-167 (2002))。１種以上のここに記戴する抗体、例えば、二重特異性抗体と組み合わせて使用できる好ましいアンタゴニストは、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２およびＩＬ−３１のアンタゴニストを含む。
【０１３１】
このような薬物の例は、ＩＬ−１２(好ましくはヒトＩＬ−１２)に結合するキメラ、ヒト化、ヒトまたはインビトロ産生抗体(またはその抗原結合フラグメント)、例えば、ＷＯ００／５６７７２に開示の抗体のようなＩＬ−１２アンタゴニスト；ＩＬ−１２受容体阻害剤、例えば、ヒトＩＬ−１２受容体に対する抗体；およびＩＬ−１２受容体、例えば、ヒトＩＬ−１２受容体の可溶性フラグメントを含む。ＩＬ−１５アンタゴニストの例は、ＩＬ−１５またはその受容体に対する抗体(またはその抗原結合フラグメント)、例えば、キメラ、ヒト化、ヒトまたはインビトロ産生抗体ｔｏヒトＩＬ−１５またはその受容体、ＩＬ−１５受容体の可溶性フラグメントおよびＩＬ−１５結合タンパク質を含む。ＩＬ−１８アンタゴニストの例は、ヒトＩＬ−１８に対する抗体、例えば、キメラ、ヒト化、ヒトまたはインビトロ産生抗体(またはその抗原結合フラグメント)、ＩＬ−１８受容体の可溶性フラグメントおよびＩＬ−１８結合タンパク質(ＩＬ−１８ＢＰ)を含む。ＩＬ−１アンタゴニストの例は、Ｖｘ７４０のようなインターロイキン−１−変換酵素(ＩＣＥ)阻害剤、ＩＬ−１アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−１ＲＡ(アナキンラ、ＫＩＮＥＲＥＴ(登録商標)、Amgen)、ｓＩＬ１ＲＩＩ(Immunex)および抗ＩＬ−１受容体抗体(またはその抗原結合フラグメント)を含む。
【０１３２】
ＴＮＦアンタゴニストの例は、(ヒュミラ(登録商標)、Ｄ２Ｅ７、ヒトＴＮＦ−アルファ抗体)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(ヒト化抗ＴＮＦ−アルファ抗体；Celltech/Pharmacia)、ｃＡ２(キメラ抗ＴＮＦ−アルファ抗体のようなＴＮＦ(例えば、ヒトＴＮＦ−アルファ)に対するキメラ、ヒト化、ヒトまたはインビトロ産生抗体(またはその抗原結合フラグメント)；レミケード(登録商標)、Centocor)；抗ＴＮＦ抗体フラグメント(例えば、CPD870)；ＴＮＦ受容体の可溶性フラグメント、例えば、ｐ５５またはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体またはその誘導体、例えば、75kdTNFR-IgG(７５kD  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質、エンブレル(登録商標)；Immunex)、p55 kdTNFR-IgG(５５kD  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質(レネルセプト))；酵素アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦ−アルファ変換酵素(ＴＡＣＥ)阻害剤(例えば、アルファ−スルホニルヒドロキサム酸誘導体およびＮ−ヒドロキシホルムアミドＴＡＣＥ阻害剤GW 3333、-005または-022)；およびTNF-bp/s-TNFR(可溶性ＴＮＦ結合タンパク質)を含む。好ましいＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ受容体の可溶性フラグメント、例えば、ｐ５５またはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体またはその誘導体、例えば、75kdTNFR-IgGおよびＴＮＦ−アルファ変換酵素(ＴＡＣＥ)阻害剤である。
【０１３３】
他の態様において、１種以上のここに記戴する抗体、例えば、二重特異性抗体を、ＩＬ−１３アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−１３に対する可溶性ＩＬ−１３受容体(ｓＩＬ−１３)および／または抗体；ＩＬ−２アンタゴニスト、例えば、DAB 486-IL-2および／またはDAB 389-IL-2(ＩＬ−２融合タンパク質、Seragen)および／またはＩＬ−２Ｒに対する抗体、例えば、抗Ｔａｃ(ヒト化抗ＩＬ−２Ｒ、Protein Design Labs)の１種以上と組み合わせて投与し得る。さらに別の組み合わせは、非枯渇抗ＣＤ４阻害剤(DEC-CE9.1/SB 210396；非枯渇霊長類化抗ＣＤ４抗体；IDEC/SmithKline)と組み合わせた１種以上の本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体、アンタゴニスト小分子および／または阻害抗体である。さらに他の好ましい組み合わせは、抗体、可溶性受容体またはアンタゴニストリガンドを含む同時刺激経路ＣＤ８０(Ｂ７.１)またはＣＤ８６(Ｂ７.２)のアンタゴニスト；ならびにｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド(ＰＳＧＬ)、抗炎症性サイトカイン類、例えば、ＩＬ−４(DNAX/Schering)；ＩＬ−１０(SCH 52000；組み換えIL-10 DNAX/Schering)；ＩＬ−１３およびＴＧＦ−ベータおよびそのアゴニスト(例えば、アゴニスト抗体)を含む。
【０１３４】
他の態様において、１種以上の本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を、１種以上の抗炎症性薬物、免疫抑制剤または代謝または酵素阻害剤を共製剤および／または併用できる。ここに記戴する抗体と組み合わせて使用できる薬物または阻害剤の非限定的例は、非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)、例えば、イブプロフェン、テニダップ、ナプロキセン、メロキシカム、ピロキシカム、ジクロフェナクおよびインドメタシン；スルファサラジン；プレドニゾロンのようなコルチコステロイド；サイトカイン抑制性抗炎症剤(ＣＳＡＩＤ)；ヌクレオチド生合成阻害剤、例えば、プリン生合成阻害剤、葉酸アンタゴニスト(例えば、メトトレキサート(Ｎ−[４−[[(２,４−ジアミノ−６−プテリジニル)メチル]メチルアミノ]ベンゾイル]−Ｌ−グルタミン酸)；およびピリミジン生合成阻害剤、例えば、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ(ＤＨＯＤＨ)阻害剤を含むが、これらに限定されない。１種以上の本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体と組み合わせて使用する好ましい治療剤は、ＮＳＡＩＤ、ＣＳＡＩＤ、(ＤＨＯＤＨ)阻害剤(例えば、レフルノミド)および葉酸アンタゴニスト(例えば、メトトレキサート)を含む。
【０１３５】
さらなる阻害剤の例は、１種以上のコルチコステロイド(経口、吸入および局所注射)；免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムス(FK-506)；およびｍＴＯＲ阻害剤、例えば、シロリムス(ラパマイシン−ラパミューン(登録商標)またはラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体(例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、CCI-779)；ＴＮＦ−アルファまたはＩＬ−１(例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤)のような炎症誘発性サイトカイン類のシグナル伝達を妨害する薬物；ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブおよびその変異体；ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えば、R973401(ホスホジエステラーIV型阻害剤)；ホスホリパーゼ阻害剤、例えば、細胞質ホスホリパーゼ２(ｃＰＬＡ２)阻害剤(例えば、トリフルオロメチルケトンアナログ)；血管内皮細胞増殖因子または増殖因子受容体阻害剤、例えば、ＶＥＧＦ阻害剤および／またはＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤；および血管形成阻害剤を含む。本発明の抗体と組み合わせて使用するために好ましい治療剤は、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムス(FK-506)；ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、シロリムス(ラパマイシン)またはラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体(例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、CCI-779)；ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブおよびその変異体；およびホスホリパーゼ阻害剤、例えば、細胞質ホスホリパーゼ２(ｃＰＬＡ２)阻害剤、例えば、トリフルオロメチルケトンアナログを含む。
【０１３６】
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体と組み合わせて使用でききるさらなる治療剤の例は、１種以上の６−メルカプトプリン類(６−ＭＰ)；アザチオプリンスルファサラジン；メサラジン；オルサラジン；クロロキン／ヒドロキシクロロキン(PLAQUENIL(登録商標))；ペニシラミン；金チオリンゴ酸(筋肉内および経口)；アザチオプリン；コルヒチン；ベータ−２アドレナリン受容体アゴニスト(サルブタモール、テルブタリン、salmeteral)；キサンチン類(テオフィリン、アミノフィリン)；クロモグリケート；ネドクロミル；ケトチフェン；イプラトロピウムおよびオキシトロピウム；ミコフェノール酸モフェチル；アデノシンアゴニスト；抗血栓剤；補体阻害剤；およびアドレナリン剤を含む。
【０１３７】
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を組み合わせ得る、関節炎障害(例えば、リウマチ性関節炎、炎症性関節炎、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、骨関節症および乾癬性関節炎)の処置または予防のための薬物の非限定的例は、１種以上のここに記戴するＩＬ−１２アンタゴニスト；ＮＳＡＩＤ；ＣＳＡＩＤ；ＴＮＦ、例えば、ここに記戴するＴＮＦ−アルファ、アンタゴニスト；ここに記戴する非枯渇抗ＣＤ４抗体；ここに記戴するＩＬ−２アンタゴニスト；抗炎症性サイトカイン類、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＧＦ−アルファまたはそのアゴニスト；ここに記戴するＩＬ−１またはＩＬ−１受容体アンタゴニスト；ここに記戴するホスホジエステラーゼ阻害剤；ここに記戴するＣｏｘ−２阻害剤；イロプロスト；メトトレキサート；サリドマイドおよびサリドマイド関連薬物(例えば、Celgen)；レフルノミド；プラスミノーゲン活性化阻害剤、例えば、トラネキサム酸；サイトカイン阻害剤、例えば、T-614；プロスタグランジンＥ１；アザチオプリン；インターロイキン−１変換酵素(ＩＣＥ)阻害剤；ｚａｐ−７０および／または１ｃｋ阻害剤(チロシンキナーゼｚａｐ−７０または１ｃｋ阻害剤)；ここに記戴する血管内皮細胞増殖因子または血管内皮細胞増殖因子受容体の阻害剤；ここに記戴する血管形成阻害剤；コルチコステロイド抗炎症性薬物(例えば、ＳＢ２０３５８０)；ＴＮＦ変換酵素阻害剤；ＩＬ−１１；ＩＬ−１３；ＩＬ−１７阻害剤；金；ペニシラミン；クロロキン；ヒドロキシクロロキン；クロラムブシル；シクロホスファミド；シクロスポリン；全身リンパ組織放射線照射；抗胸腺細胞グロブリン；ＣＤ５−毒素；経口投与ペプチドおよびコラーゲン；ロベンザリット二ナトリウム；サイトカイン制御剤(ＣＲＡ)HP228およびHP466(Houghten Pharmaceuticals, Inc.)；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals, Inc.)；可溶性補体受容体１(TP 10；T Cell Sciences, Inc.)；プレドニゾン；オルゴテイン；グリコサミノグリカンポリスルフェート；ミノサイクリン(MINOCIN(登録商標))；抗ＩＬ２Ｒ抗体；海洋および植物性脂質(魚および植物種子脂肪酸)；オーラノフィン；フェニルブタゾン；メクロフェナム酸；フルフェナム酸；静脈内免疫グロブリン；ジロートン；ミコフェノール酸(RS-61443)；タクロリムス(FK-506)；シロリムス(ラパマイシン)；アミプリロース(テラフェクチン)；クラドリビン(２−クロロデオキシアデノシン)；およびアザリビンを含む。好ましい組み合わせは、メトトレキサートまたはレフルノミドおよび中度および重度リウマチ性関節炎例においては、シクロスポリンと組み合わせた１種以上の本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体である。
【０１３８】
関節炎障害の処置のために１種以上の本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体と組み合わせて使用するための阻害剤の好ましい例は、ＴＮＦアンタゴニスト(例えば、ＴＮＦに結合するキメラ、ヒト化、ヒトまたはインビトロ産生抗体またはその抗原結合フラグメント；ＴＮＦ受容体の可溶性フラグメント、例えば、ｐ５５またはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体またはその誘導体、例えば、75kdTNFR-IgG(７５kD  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質、エンブレル(登録商標))、ｐ５５kD  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；ＴＮＦ酵素アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦ−アルファ変換酵素(ＴＡＣＥ)阻害剤)；ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２のアンタゴニスト；Ｔ細胞およびＢ細胞枯渇剤(例えば、抗ＣＤ４または抗ＣＤ２２抗体)；小分子阻害剤、例えば、メトトレキサートおよびレフルノミド；シロリムス(ラパマイシン)およびそのアナログ、例えば、ＣＣＩ−７７９；ｃｏｘ−２およびｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤ；ｐ３８阻害剤、ＴＰＬ−２、Ｍｋ−２およびＮＦκＢ阻害剤；ＲＡＧＥまたは可溶性ＲＡＧＥ；Ｐ−セレクチンまたはＰＳＧＬ−１阻害剤(例えば、小分子阻害剤、それに対する抗体、例えば、Ｐ−セレクチンに対する抗体)；エストロゲン受容体ベータ(ＥＲＢ)アゴニストまたはＥＲＢ−ＮＦκＢアンタゴニストを含む。１種以上の本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体と併用および／または共製剤できる最も好ましい付加的治療剤は、１種以上のＴＮＦ受容体の可溶性フラグメント、例えば、ｐ５５またはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体またはその誘導体、例えば、75kdTNFR-IgG(７５kD  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質、エンブレル(登録商標))；メトトレキサート、レフルノミドまたはシロリムス(ラパマイシン)またはそのアナログ、例えば、CCI-779を含む。
【０１３９】
１種以上の本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体と組み合わせて多発性硬化症(例えば、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および再発進行型多発性硬化症)の処置または予防するための薬物の非限定的例は、インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ１ａ(例えば、アボネックス(登録商標)、Biogen)およびインターフェロン−１ｂ(ベタセロン(登録商標)、Chiron/Berlex)；コポリマー１(Cop-１；コパキソン(登録商標)、Teva Pharmaceutical Industries, Inc.)；ジメチルフマレート(例えば、ＢＧ−１２；Biogen)；高圧酸素；静脈内免疫グロブリン；クラドリビン；ここに記戴するＴＮＦアンタゴニスト；コルチコステロイド；プレドニゾロン；メチルプレドニゾロン；アザチオプリン；シクロホスファミド；シクロスポリン；シクロスポリンＡ、メトトレキサート；４−アミノピリジン；およびチザニジンを含み得る。本発明の抗体と組み合わせて使用できるさらなるアンタゴニストは、他のヒトサイトカイン類または増殖因子に対する抗体またはアンタゴニスト、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＥＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−１１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦを含む。ここに記戴する抗体を、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０またはそれらのリガンドのような細胞表面分子に対する抗体を含む。１種以上の本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体をまたメトトレキサート、シクロスポリン、FK-506、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンのようなコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン剤、ここに記戴する炎症誘発性サイトカイン類によるシグナル伝達を妨害する薬物、ＩＬ−１ｂ変換酵素阻害剤(例えば、Ｖｘ７４０)、抗Ｐ７、ＰＳＧＬ、ＴＡＣＥ阻害剤、キナーゼ阻害剤のようなＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン類、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、ここに記戴する可溶性サイトカイン受容体およびその誘導体および抗炎症性サイトカイン類(例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＧＦ)を含む。
【０１４０】
本発明の抗体を組み合わせることができる多発性硬化症(例えば、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および再発進行型多発性硬化症)治療剤の好ましい例は、ジメチルフマレート(例えば、BG-12；Biogen)、インターフェロン−ベータ、例えば、ＩＦＮ−ベータ−１ａおよびＩＦＮ−ベータ−１ｂ；コパキソン(登録商標)、コルチコステロイド、ＩＬ−１阻害剤、ＴＮＦ阻害剤、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ８０に対する抗体、ＩＬ−１２アンタゴニストを含む。
【０１４１】
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を組み合わせることができる炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)を処置または予防するための薬物の非限定的例は、ブデソニド；上皮細胞増殖因子；コルチコステロイド；シクロスポリン；スルファサラジン；アミノサリチレート；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；ｌｉｐオキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；抗ＩＬ−１モノクローナル抗体；抗ＩＬ−６モノクローナル抗体(例えば、抗ＩＬ−６受容体抗体および抗ＩＬ−６抗体)；増殖因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；ここに記戴するＴＮＦアンタゴニスト；ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３および／またはＴＧＦ.ベータ。サイトカイン類またはそのアゴニスト(例えば、アゴニスト抗体)；ＩＬ−１１；プレドニゾロン、デキサメサゾンまたはブデソニドのグルクロニドまたはデキストラン抱合プロドラッグ；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals, Inc.)；可溶性補体受容体１(TP10；T Cell Sciences, Inc.)；徐放性メサラジン；メトトレキサート；血小板活性化因子(ＰＡＦ)のアンタゴニスト；シプロフロキサシン；およびリグノカインを含む。
【０１４２】
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を組み合わせることができる乾癬の処置または予防のための薬物の非限定的例は、コルチコステロイド；ビタミンＤ３およびそのアナログ；レチノイド類(例えば、ソリアタン)；メトトレキサート；シクロスポリン、６−チオグアニン；アキュテイン；ハイドレア；ヒドロキシウレア；スルファサラジン；ミコフェノール酸モフェチル；アザチオプリン；タクロリムス；フマル酸エステル；アメビブ(登録商標)、エンブレル(登録商標)、ヒュミラ(登録商標)、ラプティバおよびレミケード(登録商標)、ウステキヌマブおよびXP-828Lのような生物製剤；光線療法；および光化学治療(例えば、ソラレンと紫外線光線療法の組み合わせ)を含む。
【０１４３】
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を組み合わせることができる炎症性気道／呼吸器疾患(例えば、慢性閉塞性肺障害、喘息)の処置または予防のための薬物の非限定的例は、ベータ２−アドレナリン受容体アゴニスト(例えば、サルブタモール(アルブテロールＵＳＡＮ)、レバルブテロール、テルブタリン、ビトルテロール)；長時間作用型ベータ２−アドレナリン受容体アゴニスト(例えば、サルメテロール、フォルモテロール、バンブテロール)；アドレナリンアゴニスト(例えば、吸入エピネフリンおよびエフェドリン錠剤)；抗コリン剤(例えば、イプラトロピウムブロマイド)；吸入ステロイド類と長時間作用型気管支拡張剤の合剤(例えば、フルチカゾン／サルメテロール(米国ではアドベアー(登録商標)および英国ではセレタイド))またはブデソニド／フォルモテロール(シムビコート(登録商標)))；吸入グルココルチコイド(例えば、シクレソニド、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン)；ロイコトリエン修飾因子(例えば、モンテルカスト、ザフィルカスト、プランルカストおよびジロートン)；肥満細胞安定化剤(例えば、クロモグリケート(クロモリン)およびネドクロミル)；抗ムスカリン／抗コリン剤(例えば、イプラトロピウム、オキシトロピウム、チオトロピウム)；メチルキサンチン(例えば、テオフィリン、アミノフィリン)；抗ヒスタミン剤；ＩｇＥブロッカー(例えば、オマリズマブ)；Ｍ.sub.3ムスカリンアンタゴニスト(抗コリン)(例えば、イプラトロピウム、チオトロピウム)；クロモン(例えば、クロモグリケート、ネドクロミル)；キサンチン(例えば、テオフィリン)；およびＴＮＦアンタゴニスト(例えば、インフリキシマブ、アダリムマブおよびエタネルセプト)を含む。
【０１４４】
一つの態様において、本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を、免疫応答、例えば、移植片拒絶の制御に関与する他の標的を指向する１種以上の抗体と組み合わせて使用できる。
【０１４５】
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体を組み合わせることができる免疫応答を処置または予防するための薬物の非限定的例は、ＣＤ２５(インターロイキン−２受容体−ａ)、ＣＤ１１ａ(LFA-1)、ＣＤ５４(ICAM-1)、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４(ＣＤ８０(Ｂ７.１)、例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ−アバタセプト(オレンシア(登録商標)))、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＯＳおよび／またはＣＤ８６(Ｂ７.２)を含むが、これらに限定されない、他の細胞表面分子に対する抗体を含む。さらに別の態様において、本発明の抗体を、シクロスポリンＡまたはFK-506のような１種以上の一般的免疫抑制剤と組み合わせて使用する。
【０１４６】
他の態様において、抗体を、自己免疫性障害、炎症性疾患などに対するワクチンアジュバントとして使用する。これらのタイプの障害の処置のためのアジュバントの組み合わせは、自己免疫に関与する標的となる自己の抗原、すなわち、自己抗原、例えば、ミエリン塩基性タンパク質；炎症性自己抗原、例えば、アミロイドペプチドタンパク質または移植片抗原、例えば、アロ抗原由来の広範な抗原と組み合わせて使用するのに適する。抗原は、糖類、タンパク質、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、自己抗原、アミロイドペプチドタンパク質、移植片抗原、アレルゲンまたは他の巨大分子成分のいずれかのタンパク質由来のペプチドまたはポリペチドならびにフラグメントを含み得る。ある例において、１個を超える抗原が抗原性組成物に含まれる。
【０１４７】
例えば、本発明のアジュバント組み合わせを含む、脊椎動物宿主においてアレルゲンに対する応答を緩和するための望ましいワクチンは、アレルゲンまたはそのフラグメントを含むものを含む。このようなアレルゲンの例は、引用により全体を本願明細書に包含させる米国特許番号５,８３０,８７７およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５１２５９に記戴されており、花粉、昆虫毒液、動物鱗屑、真菌胞子および薬物(例えばペニシリン)を含む。ワクチンは、アレルギー性反応の既知原因であるＩｇＥ抗体産生を妨害する。他の例において、本発明のアジュバント組み合わせを含む、脊椎動物宿主におけるアミロイド沈着により特徴づけられる疾患の予防または処置に望ましいワクチンは、アミロイドペプチドタンパク質(ＡＰＰ)の一部を含むものを含む。この疾患は、アルツハイマー病、アミロイド症またはアミロイド形成的疾患と様々に呼ばれる。それゆえに、本発明のワクチンは、本発明のアジュバント組み合わせに加えて、ＡβペプチドならびにＡβペプチドのフラグメントおよびＡβペプチドまたはそのフラグメントに対する抗体を含む。
【０１４８】
他の態様において、医薬組成物は、本発明の抗体、二重特異性抗体または抗原結合フラグメントを含む容器を含むキットとして提供され得る。本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体は、１回または複数回投与用の注射溶液の形でまたは注射前に再構成する無菌粉末として提供できる。あるいは、このようなキットは、抗体、例えば、二重特異性抗体投与用の乾燥粉末ディスペンサー、液体エアロゾル発生装置またはネブライザーを含み得る。このようなキットは、さらに医薬組成物の適応症および使用に対する書面情報を含み得る。さらに、このような情報は、本抗体組成物がＩＬ−１７およびＩＬ−２３に過敏症であることが知られている患者に禁忌であるとの記戴を含み得る。
【０１４９】
さらなる態様において、本発明は、(ａ)ここに記戴する抗体、二重特異性抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物；(ｂ)該組成物を含む容器；および(ｃ)該抗体の免疫関連疾患の処置における使用を記戴する、該容器上に添付されたラベルまたは該容器に挿入された中入れ書を含む製品を提供する。
【０１５０】
他の面において、本組成物は、例えば、さらなる抗体または抗炎症性、細胞毒性または化学療法剤であり得る、さらなる活性成分を含む。好ましくは、組成物は無菌である。
【０１５１】
ここに記戴する抗体、二重特異性抗体および抗原結合フラグメントはまた例えば、多発性硬化症(ＭＳ)(例えば、再発寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および再発進行型多発性硬化症)、過敏性腸症候群(ＩＢＳ)、潰瘍性大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、抗好中球細胞質抗体(ＡＮＣＡ)関連血管炎(ＡＡＶ)、巨細胞性動脈炎、多発性硬化症(ＭＳ)、大腸炎、内毒血症、関節炎、リウマチ性関節炎(ＲＡ)、骨関節症、シェーグレン症候群、乾癬、乾癬性関節炎、成人呼吸器疾患(ＡＲＤ)、敗血症性ショック、多臓器不全、特発性肺線維症のような炎症性肺傷害、喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、気道過敏、慢性気管支炎、アレルギー性喘息、湿疹、ヘリコバクター・ピロリ感染、腹膜炎症が原因の腹腔内癒着および／または膿瘍(例えば、感染、傷害などが原因)、ネフローゼ症候群、特発性脱髄性多発ニューロパシー、ギランバレー症候群、臓器同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎疾患、微小変化型疾患(リポイドネフローゼ)、巣状分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、腎性全身性線維症(ＮＳＦ)、腎性線維化皮膚症、線維化胆汁鬱滞性肝炎、好酸球性筋膜炎(シュールマン症候群)、硬化性粘液水腫(丘疹性ムチン沈着症)、強皮症、硬化性萎縮性苔癬、ＰＯＥＭｓ症候群(クロウ・深瀬症候群、高槻病またはＰＥＰ症候群)、ネフローゼ症候群、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)(血液、骨髄、腎臓、膵臓、肝臓、同所性肝臓、肺、心臓、腸、小腸、大腸、胸腺、同種幹細胞、強度軽減同種、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、静脈、動脈、血管、胃および精巣のような移植片から)、溶解性骨疾患(例えば、多発性骨髄腫誘発溶解性骨疾患)、嚢胞性線維症、加齢黄斑変性(ＡＭＤ；例えば、滲出型ＡＭＤおよび萎縮型ＡＭＤ)、肝線維症、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、心虚血／再潅流傷害、心不全、心筋炎、心線維症、有害心筋リモデリング、移植片拒絶、連鎖球菌細胞壁(ＳＣＷ)誘発関節炎、歯肉炎／歯周症、ヘルペス性間質性角膜炎、グルテン感受性腸疾患再狭窄、川崎病および免疫介在腎疾患を含む、免疫関連および炎症性疾患の処置用の医薬および薬物の製造にも有用である。具体的な面において、このような医薬および薬物は、本発明の二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントの治療有効量を薬学的に許容される担体と共に含む。ある態様において、混合物は無菌である。
【０１５２】
ここに引用する全ての特許、特許出願および刊行物および電子化資料(例えば、GENBANK(登録商標)アミノ酸およびヌクレオチド配列寄託)の完全な開示を、引用により本明細書に包含させる。前記の詳細な記戴および実施例は、理解を明りょう化するためにのみ示す。不必要な限定はそこから解釈されるべきではない。本発明は、示し、記戴する正確な詳細事項に限定されず、当業者に明らかなバリエーションは、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に包含される。
【０１５３】
本発明は、さらに次の非限定的実施例により説明する。
【実施例】
【０１５４】
実施例１
マウス抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体のヒト化
ハイブリドーマクローン選択および可変領域同定
組み換えヒトタンパク質ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆを、ZymoGenetics Inc.、Bristol-Myers Squibb Company(Seattle, WA, USA)でＨＥＫ２９３一過性発現系を使用して製造した。ＢＡＬＢ／ｃマウス(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)を、ＢＳＡにコンジュゲートした組み換えヒトＩＬ−１７Ｆで免疫化および追加免疫し、ＢＳＡにコンジュゲートした組み換えヒトＩＬ−１７Ａで免疫化した。最高抗ＩＬ−１７Ｆおよび抗ＩＬ−１７Ａ抗体結合活性を含む血清を有するマウスを、ＩＬ−１７Ｆの最終融合前追加免疫した。４日後、脾細胞およびリンパ節細胞をＡｇ８.６５３骨髄腫細胞と融合させ、抗体産生ハイブリドーマを作成した。ハイブリドーマ培養上清を、プレート式ＥＬＩＳＡにおよりＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−１７Ａ結合をスクリーニングし、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−１７Ａ中和をＩＬ−１７Ａ／Ｆ細胞アッセイでスクリーニングした。ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−１７Ａの両方に結合し、中和する上清サンプルに対応するハイブリドーマ細胞を、目的の中和モノクローナル抗体を産生するモノクローナルハイブリドーマである３３９.１５.３.５(命名３３９.１５)を単離するためにクローン化した。ハイブリドーマ３３９.１５を、ISOSTRIP(登録商標)Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Roche, Indianapolis, IN, USA)を使用してアイソタイプ分類し、ＲＮＡをQIAGEN(登録商標)RNeasy kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)を使用して単離した。可変領域を、５’ＲＡＣＥテクノロジーおよびマウス定常領域配列に対して設計した遺伝子特異的３’プライマーを利用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech, Mountain View, CA, USA)を使用してクローン化した。重および軽可変領域配列を、TOPO(登録商標)TA Cloning Kit for Sequencing(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を使用してクローンした。遺伝子配列を、ハイブリドーマ３３９.１５から精製した抗体で実施したＮ末端アミノ酸配列決定と配列を比較することにより確認した。
【０１５５】
可変領域配列を３３９.１５.３.５、３３９.１５.５.３および３３９.１５.３.６からクローン化し、全く同じ可変領域配列を含むことが示された。３３９.１５.３.５からの配列を後のヒト化に使用し、３３９.１５.３.６ハイブリドーマクローンを、２００６年１１月７日にAmerican Type Tissue Culture Collection(ＡＴＣＣ、10801 University Blvd, Manassas, VA 20110-2209)特許寄託機関に、原寄託としてブタベスト条約の下寄託し、ＡＴＣＣ(登録商標)特許受託番号ＰＴＡ−７９８８が与えられた。ハイブリドーマクローン３３９.１５.３.６(ＡＴＣＣ(登録商標)特許受託番号ＰＴＡ−７９８８)および３３９.１５.５.３(ＡＴＣＣ特許受託番号ＰＴＡ−７９８７)はまた、例えば、米国特許番号７,７９０,１６３、７,９１０,７０３および８,３３３,９６８に開示されている。
【０１５６】
キメラおよびヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ可変領域配列の分子モデリング
全可変領域モデルを構築し、MOE Software Suite, Version 2008(Chemical Computing Group, Montreal, Canada)を使用して見た。
【０１５７】
抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆヒト化抗体設計
マウス相補性決定領域(ＣＤＲ)をヒト生殖系列フレームワーク配列に移植した。配列を、V-Base(MRC, Center for Protein Engineering, UK)で生殖系列アミノ酸配列と比較した。ＶＨ１−０３である１個の生殖系列遺伝子を可変重領域として選択した。数個の生殖系列遺伝子を可変軽領域として選択した；ＶＫＶＩ  Ａ２６、ＶＫＩ  Ａ２０、ＶＫＶＩ  Ａ１４、ＶＫＩＩＩ  Ｌ６およびＶＫＩ  Ｌ１４。ＶＫＶＩ生殖系列遺伝子ファミリーはマウス配列に最高相同性を示したが、しかしながら、ヒト抗体レパートリー中の表される生殖系列ファミリー下にあったため、高相同性を有する他の生殖系列ファミリーも考慮した。マウスKabat定義ＣＤＲ領域を、重鎖および軽鎖の両者について、ヒトKabat定義フレームワーク領域に移植した。
【０１５８】
ヒト化抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体の構築、発現および精製
ヒト化可変領域配列は、GeneART, Inc.(GeneART, Inc. Burlingame, CA, USA)に注文して入手した。ヒト化およびマウス可変領域配列をヒトカッパ定常領域(配列番号１０)またはＦｃ  γ受容体Ｉ結合および補体を固定する能力の低下が生じる変異を有している野生型ＩｇＧ１のエフェクター・マイナス変異体であるＩｇＧ１.１(配列番号１１)(Gross et al., Immunity, 15:289-302 (2001))と、重複ＰＣＲ(Horton et al., Gene, 77:61-68 (1989))および／またはｐＴＴ５、ＨＥＫ２９３−６Ｅ一過性発現ベクターにクローニングされた制限酵素を使用して、融合させた(NCR Biotechnology Research Institute, Ottawa, ON, CAN)。全構築物をmod2610(ATGCGGCGGAGAGGCTGGTCCTGGATCTTCCTGTTTCTGCTGAGCGGAACAGCCGGCGTGCTGAGC、配列番号３０)シグナル配列を使用して発現させたが、アミノ酸配列MRRRGWSWIFLFLLSGTAGVLS(配列番号３１)をコードする任意の核酸配列を使用し得る。ＨＥＫ２９３−６Ｅ懸濁細胞に、ポリエチレンイミン試薬を使用して発現構築物を遺伝子導入し、５mM  Ｌ−グルタミンおよび２５μg／mL  Ｇ４１８添加Ｆ１７培地(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)で培養した。２４時間後、２０％Tryptone NI(Organotechnie SAS, La Courneuve, FR)の体積の１／４０を添加した。トランスフェクション約１２０時間後、条件培地を回収し、０.２μmフィルターを通した。タンパク質を、Mab Select SuRe Affinity Chromatography(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)とSUPERDEX(登録商標)Size Exclusion Chromatography(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)の組み合わせを使用して濾過条件培地から精製した。含量をＵＶ−Ａ２８０nmから概算し、品質を分析的分子ふるい高速液体クロマトグラフィー、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより評価した。
【０１５９】
抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆヒト化パネルバイオアッセイ活性；ＮＩＨ／３Ｔ３／ＫＺ１７０  ＮＦ−κＢ誘発によるヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆ活性を測定するためのＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ
マウス線維芽細胞株(ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣ(登録商標)#CRL-1658)にＫＺ１７０と命名されたＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターを安定に遺伝子導入し、クローンアウトした(cloned out)。ＮＩＨ／３Ｔ３／ＫＺ１７０クローン１細胞を、９６ウェル、白色不透明、充填底ルシフェラーゼプレート(Corning Incorporated, Corning, NY)中、プレーティング培地(ＤＭＥＭ＋３％ＦＢＳ、１mM  ピルビン酸ナトリウム、２mM  Ｌ−グルタミン(HyClone Laboratories, South Logan, UT))に１０,０００細胞／ウェルで播種し、一夜、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。翌日組み換えヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦまたはＩＬ−１７Ｆ(ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, USA)の連続希釈を、アッセイ培地(ＤＭＥＭ＋０.５％ＢＳＡ、１mM  ピルビン酸ナトリウム、２mM  Ｌ−グルタミン、１０mM  ＨＥＰＥＳ(HyClone Laboratories, South Logan, UT))で行い、細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。さらに、本アッセイを使用して、ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆ活性の中和を測定した。ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦまたはＩＬ−１７Ｆの最大半量濃度(ＥＣ５０、５０％有効濃度)を、ここに記戴したアッセイ倍地中の抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体の連続希釈物と併せ、細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、細胞を溶解し、Berthold Centro XS3 Luminometer(Berthold Technologies, Wildbad, Germany)で、フラッシュ基質(Promega Corporation, Madison, WI)を使用して、製造業者の指示に従い読んだ。平均蛍光強度の増加(ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター活性化による)は、ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ受容体−リガンド相互作用の指標であった。平均蛍光強度の減少は、ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ受容体−リガンド相互作用の中和の指標であった。ＩＣ５０(５０％阻害濃度)値を、各抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体についてGraphPad Prism 4ソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego CA)を使用して計算した。
【０１６０】
抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆヒト化ＣＤＲ移植およびキメラパネルバイオアッセイ活性；ＮＩＨ／３Ｔ３／ＫＺ１７０  ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ結果
ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆは、用量依存的方法でＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターの活性化を誘発し、ＥＣ５０濃度はＩＬ−１７Ａに対して０.１５nM、ＩＬ−１７Ａ／Ｆに対して０.５０nMおよびＩＬ−１７Ｆに対して０.５０nMと決定された。表１および２は、ここに記戴する抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体のＩＣ５０データ例を示す。
【表１】
0006362587.tif 000002
【０１６１】
フレームワークを移植した抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆヒト化ＣＤＲの復帰変異パネルの
バイオアッセイ活性表：ＮＩＨ／３Ｔ３／ＫＺ１７０  ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ結果
【表２】
0006362587.tif 000003
【０１６２】
抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆヒト化パネルBiacore活性；表面プラズモン共鳴(Biacore)を介するヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆに対する結合親和性測定
ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆモノクローナル抗体を、表面プラズモン共鳴を使用してヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ａ／ＦおよびヒトＩＬ−１７Ｆに対するそれらの結合親和性を評価した。
【０１６３】
運動速度定数および平衡解離定数を、表面プラズモン共鳴を介してヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体とヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆの相互作用について測定した。会合速度定数(ｋａ(Ｍ−１ｓ−１))は、抗原−抗体複合体形成の速度を反映する値である。解離速度定数(ｋｄ(ｓ−１))はこの複合体の安定製を反映する値である。解離速度定数を会合速度定数で割ることにより(ｋｄ／ｋａ)平衡解離定数(ＫＤ(Ｍ))が得られる。この値は相互作用の結合親和性を表す。類似のＫＤを有する抗体は広範に異なる会合および解離速度定数を有し得る。結果として、抗体のｋａおよびｋｄ両者の測定は、抗体−抗原相互作用の親和性をより一意的に表す助けとなる。
【０１６４】
結合動態および親和性試験をBIACORE(登録商標)T100システム(GE Healthcare, Piscataway, NJ)で行った。BIACORE(登録商標)T100の方法は、BIACORE(登録商標)T100 Control Software, v 2.0を使用してプログラム化した。これらの実験のために、ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体をヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマ抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)またはヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマ抗体(Jackson ImmunoResearch)を介してＣＭ４センサーチップ上に捕捉した。ＩＬ−１７分子での結合実験を、１０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.０５％界面活性剤Ｐ２０(GE Healthcare)、１mg／mL  ウシ血清アルブミン、ｐＨ７.４の緩衝液中、２５℃で行った。
【０１６５】
捕捉抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマを、１０mM  酢酸ナトリウムｐＨ５.０で２０μg／mL濃度まで希釈し、アミンカップリング化学(ＥＤＣ：ＮＨＳ)を使用して、ＣＭ４センサーチップの全４個のフローセルに共有結合により固定化した。抗体固定後、フローセル上の残った活性部位を１Ｍエタノールアミンでブロックした。約５０００ＲＵの捕捉抗体密度を得た。ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体を、６０〜１５０ＲＵの範囲の密度でＣＭ４チップのフローセル２、３または４に捕捉した。固定化表面への試験抗体の捕捉を１０μL／分の流速で行った。BIACORE(登録商標)装置は、センサーチップ表面上に結合したタンパク質質量を測定し、それゆえに、試験抗体の補足を各サイクルで確認した。ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦまたはＩＬ−１７Ｆの連続希釈(ZymoGenetics, A Bristol-Myers, Squibb Company, Seattle, WA, USA)を、１００nM〜０.０３２nM(１：５連続希釈)で調製した。連続希釈物を表面の上に注入し、センサーチップに捕捉された試験抗体に特異的に結合させた。各抗原濃度の２回の注入を７分の会合時間および１５分の解離時間で行った。動態学的結合試験を５０μL／分の流速で行った。サイクルの間に、フローセルを２０mM  塩酸で洗浄して、表面を再生させた。この洗浄工程により、捕捉試験抗体および結合抗原を固定化抗体表面から除去した。試験抗体は、その後次サイクルで再び捕捉された。
【０１６６】
データをBIACORE(登録商標)T100 Evaluationソフトウェア(version 2.0)を使用してコンパイルした。データを、対照フローセルおよびブランク注入を減算することにより処理した。ベースライン安定性を評価して、再生工程が一連の注入の間中一定の結合表面を提供することを確認した。二個の注入曲線を再現性のために確認した。二価ＩＬ−１７分子の二価抗体への結合に基づき、二価検体結合相互作用モデルは、ＩＬ−１７分子との相互作用に適すると決定された。二価検体モデルは以前West, A.P. et al., Biochemistry, 39:9698-9708 (2000);およびWest, A.P. et al., J. Mol. Biol., 313:385-397 (2001)により記戴されている。二価検体モデル下の親和性定常(ＫＤ１を、表面プラズモン共鳴により決定した速度定数の比(ｋｄ１／ｋａ１)から計算し得る。対照を減算した曲線を、複数Ｒmaxと１に設定したＲＩを用いる適当な結合モデルに包括的に適合させた。データは、この結合モデルによく適合し、実験結合曲線と理論的結合曲線は良好に一致した。適合に関連するカイ２および標準誤差は低かった。残余に傾向はなかった。
【０１６７】
抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆヒト化パネルBiacore活性
ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆとの結合実験の結果を、それぞれ表３、４および５に示す。
ＩＬ−１７Ａに対する抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆヒト化抗体結合親和性ｆｏｒ  
【表３】
0006362587.tif 000004
【０１６８】
ＩＬ−１７Ａ／Ｆに対する抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆヒト化抗体結合親和性
【表４】
0006362587.tif 000005
【０１６９】
ＩＬ−１７Ｆに対する抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆヒト化抗体結合親和性
【表５】
0006362587.tif 000006
【０１７０】
実施例２
７Ｂ７抗体選択およびハイブリドーマ産生
図１１に示す結合および遮断特性に基づき、抗体をグループ分けするための表面プラズモン共鳴テクノロジー(Biacoreを使用)によるエピトープビニング法。
抗体を、
１. ＩＬ−２３のｐ１９サブドメインにのみ特異的に結合する；
２. ＩＬ−２３受容体(ＩＬ−２３Ｒ)のみを特異的にブロックし、ＩＬ−１２受容体(ＩＬ−１２Ｒ)をブロックしない；および
３. ＩＬ−２３のｐ４０サブドメインと特異的に結合する何らかの抗体と競合しない
能力に基づきグループ分けおよび選択した。
【０１７１】
ＩＬ−２３のｐ１９またはｐ４０サブドメインおよびＩＬ−２３ＲまたはＩＬ−１２Ｒに選択性を有することが予め知られた抗体のような物質を、BIACORE(登録商標)ＣＭ５チップ上にコートするために選択した。コーティング密度は、５００〜８０００共鳴単位(ＲＵ)で変化した。ビニングすべき抗体を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート中１０〜１００μg／mLの範囲の出発濃度から８濃度まで連続的にタイトレーションした(１：２または１：３)。ウェルの各々に、１０nMのＩＬ−２３抗原を添加した。プレート上の抗体を抗原と複合体を形成させ、一夜、４℃で平衡に到達させた。複合体を、２分間、２０μL／分の流速でＣＭ５チップ上に注入した。２分間の最後の結合共鳴単位(ＲＵ)としてのシグナルを記録した。抗体−抗原複合体は、チップ上にコートと競合できたかまたは競合しなかった。複合体中の抗体と抗原がチップ上の物質と競合できたならば、抗体濃度を挙げると、結合ＲＵは減少し、競合しないならば、結合ＲＵは増加した。この観察に基づき、全抗ＩＬ２３抗体を、その結合選択性および競合能に従いビニングした。
【０１７２】
Milpitas, CAのMedarex coloniesからのトランスジェニックＨＣｏ１２  Ｊ／Ｋ  ＨＵＭＡＢ(登録商標)マウスを、ＲＩＢＩアジュバント中組み換えヒトＩＬ−２３−ｈｉｓで免疫化した。
免疫化マウスからの血清を、修飾間接的デュアルＥＬＩＳＡによりＩＬ−２３特異的抗体の発現について試験した。簡単にいうと、マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)、９６ウェル平底、#9018)をＰＢＳ中２.５μg／mlのマウス抗ｈｉｓタンパク質で、５０μl／ウェルでコートし、４℃で一夜インキュベートし、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロックした。２.５μg／mlのＨｕＩＬ−２３またはＨｕＩＬ−１２を、５０μl／ウェルでの捕捉のためにプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎで洗浄し、血清希釈物を添加し、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＨＲＰと結合したヤギ抗ヒトガンマ重鎖(Jackson ImmunoResearch Cat. 109-036-098)と１時間インキュベートした。３回洗浄後、プレートをＡＢＴＳ(Moss, CAT #ABTS-1000)基質で展開し、４１５nmでＯＤを分析した。データを分析し、背景の少なくとも２倍の抗原正シグナルを生じる血清の最高希釈として定義される血清力価として表した。マウス２１５０９４を、コホート中の他のマウスと比較してＩＬ−２３に対する高い力価と低いＩＬ−１２との交差反応性に基づき、ハイブリドーマ産生のために選択した(表６参照)。
【表６】
0006362587.tif 000007
【０１７３】
マウス２１５０９４の遺伝子型を下記表７に示す。
【表７】
0006362587.tif 000008
【０１７４】
マウス２１５０９４からの脾臓を、融合２３７８と名づけた方法におけるCytoPulse大チャンバー細胞融合エレクトロポレーションデバイスを使用した電場に基づく電気融合によりマウス骨髄腫細胞(ATCC CRL-1580)とのハイブリドーマ産生に使用した。
【０１７５】
得られたハイブリドーマからの条件培地を最初に標準的自動化アッセイでヒトＩｇＧ  γ／κ発現についてスクリーニングし、続いて先に記戴したとおり特異的クローンを同定するためにカウンタースクリーンＥＬＩＳＡでＩＬ−２３結合についてＥＬＩＳＡを行った。試験についてのハイブリドーマ選択基準は、ｈｕＩＬ２３プレートについては１.５を超えるＯＤおよびｈｕＩＬ１２について０.１５未満のＯＤのサンプルであった。
【０１７６】
融合２３７８により計８２７のヒトＩｇＧ陽性ハイブリドーマが産生され、そのうち１２８がＩＬ−２３特異的であった。ハイブリドーマ７Ｂ７を、抗ｐ１９および抗ｐ４０陽性対照抗体と比較したとき、ＩＬ−２３に対する強い結合およびＩＬ−１２に対する交差反応性の欠如に基づいてさらに試験し、ＥＬＩＳＡにより選択した７Ｂ７を含むハイブリドーマの例を図７に示す。サブクローン７Ｂ７.Ｄ４のアイソタイプは、ＥＬＩＳＡによりヒトＩｇＧ１、カッパと確認された。
【０１７７】
全ＩＬ−２３ｐ−１９特異的ＭＡｂからのハイブリドーマ条件培地を、細胞アッセイでＩＬ−２３中和活性についてスクリーニングした。Ｔ細胞慢性リンパ性白血病患者から確立されたヒトＴ細胞株であるＫｉｔ２２５は、用量依存的ＳＴＡＴ３リン酸化(ｐＳＴＡＴ３)でＩＬ−２３に応答することが示されている。ハイブリドーマ条件培地または対照中和抗ｐ１９抗体添加または非添加でのＥＣ５０のヒトＩＬ−２３を、細胞刺激のために１５分使用した。細胞を溶解し、ＩＬ−２３依存性ＳＴＡＴ３リン酸化阻害をＥＬＩＳＡにより決定し(Cell Signaling Technology, PATHSCAN(登録商標)Cat #7300)、ここで、Ｏ.Ｄ.減少はｐＳＴＡＴ３レベル減少の指標である。ハイブリドーマ７Ｂ７をサブクローニングのために選択し、さらにＫｉｔ２２５アッセイで観察され、図８に示すＩＬ−２３シグナル伝達の強力な中和に基づき特徴づけした。
【０１７８】
上記のものに準じたアッセイを使用して、ＩＬ−２３の選択的結合およびＩＬ−２３シグナル伝達の中和が７Ｂ７サブクローン１４１３.２３７８.７Ｂ７.Ｄ４.Ｈ２で証明され、これを続いて配列決定に付した(ＩＬ−２３ｐ１９  ７Ｂ７重鎖可変ドメインは配列番号７に示し、軽鎖可変ドメインは配列番号９に示す)。
【０１７９】
実施例３
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体の産生
哺乳動物抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性分子の構築および発現
部分的または全遺伝子をGeneART, Inc.(GeneART, Inc. Burlingame, CA, USA)またはGenScript(GenScript, Piscataway, NJ, USA)で合成し、ｐＴＴ５、ＨＥＫ２９３−６Ｅ一過性発現ベクター(NCR Biotechnology Research Institute, Ottawa, ON, Canada)に制限酵素クローニングを介して導入した。ＭＶＣ１０５９(配列番号６２)およびＭＶＣ１０６１(配列番号６０)は、GenScript(GenScript, Piscataway, NJ, USA)から完全構築物としてオーダーされた。全構築物をｍｏｄ２６１０(配列番号３０)シグナル配列を使用して発現させた。ｂｉＡｂＦａｂＬは二重特異性抗体であり、これは、リンカーを介して結合した二重特異性の第二のアームのＣ末端Ｆａｂユニットを有する抗体全体を含み(例えば、１０量体Ｇ４Ｓ)、共通軽鎖を使用する(図２参照)。ｔａＦａｂは二重特異性抗体であり、これは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１)ｘ(ここで、ｘは１、２または３である)および配列番号１２のリンカーのようなリンカーを介して結合した二重特異性の第二のアームのＮ末端Ｆａｂユニットを有する抗体全体を含む。重鎖部分として、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１)ｘ(ここで、ｘは１、２または３である)および配列番号１２のリンカーのようなリンカーを介して結合した二重特異性の各アームについて２個の軽鎖が存在する(図３参照)。ヘテロ二量体Ｆｃは伝統的抗体に似た二重特異性抗体であるが、しかしながら、ＣＨ３領域で静電気的相補性会合を介して会合した２個の異なる重鎖を含む。ヘテロ二量体Ｆｃは共通軽鎖を使用する(図４参照)。重鎖および軽鎖定常領域は、ＩｇＧ１.１(配列番号１１、これは配列番号８２によりコードされ得る)、Ｃ末端リシンを欠くＩｇＧ１.１ｆ(配列番号１２７)、Ｃ末端リシンを有するＩｇＧ１.１ｆ(配列番号１２８)、ヒトカッパ定常領域(配列番号１０、これは配列番号８３によりコードされ得る)またはＩｇＧ４.１(配列番号８)を含む。ＩｇＧ４重鎖定常ドメインはヒンジ領域、Ｓ２２８Ｐ(EU index numbering system)またはＳ２４１Ｐ(Kabat numbering system)に変異を有する野生型ＩｇＧ４の変異体であり得る。マウス／ヒトキメラ重鎖における２４１位のセリン(Kabat)のプロリン(ＩｇＧ１およびＩｇＧ２においてその位置に見られる)への変更は均一抗体の産生に至り、不均一性を無くす。さらに、変異体ＩｇＧ４は、元のキメラＩｇＧ４と比較して、顕著に伸びた血清半減期を有し、組織分布の改善を示す。Angal et al., Molecular Immunology, 30(1):105-108 (1993); Schuurman et al., Molecular Immunology, 38:1-8 (2001); Lewis et al., Molecular Immunology, 46:3488-3494 (2009)。
【０１８０】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞(ＤＨ１０Ｂ)の形質転換を、１μlの酵母ＤＮＡ調製物および２０μlの大腸菌細胞を使用して行った。細胞を、２.０kV、２５μFおよび４００オームでエレクトロパルスした。エレクトロポレーション後、６００μl  ＳＯＣ(２％BACTO(登録商標)トリプトン(Difco, Detroit, MI)、０.５％酵母抽出物(Difco)、１０mM  ＮａＣｌ、２.５mM  ＫＣｌ、１０mM  ＭｇＣｌ２、１０mM  ＭｇＳＯ４、２０mM  グルコース)を添加し、細胞を、２個のＬＢ  ＡＭＰプレート(ＬＢブロス(Lennox)、１.８％BACTO(登録商標)寒天(Difco)、１００mg／Ｌ  アンピシリン)に５０μlおよび５５０μl当量で播種した。
【０１８１】
各構築物からの５個のコロニーを配列分析に付した。正確な配列を含む１個のクローンを選択した。ＤＮＡ配列決定を、ABI PRISM(登録商標)BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用して行った。シークエンシング反応物を、Edge BioSystems Preforma Centriflexゲル濾過カートリッジ(Gaithersburg, MD)を使用して精製し、Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA)で流した。得られた配列データをまとめ、SEQUENCHER(登録商標)ｖ４.６ソフトウェア(GeneCodes Corporation, Ann Arbor, MI)を使用して編集した。正確な配列を含む１個のクローンを選択し、大規模プラスミドＤＮＡを製造業者の指示に従い市販のキット(QIAGEN(登録商標)Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA)を使用して単離した。
【０１８２】
ＨＥＫ２９３−６Ｅ懸濁細胞にポリエチレンイミン試薬を使用して発現構築物を遺伝子導入し、５mM  Ｌ−グルタミンおよび２５μg／mL  Ｇ４１８添加Ｆ１７培地(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)で培養した。２４時間後、２０％Tryptone NI(Organotechnie SAS, La Courneuve, FR)の体積の１／４０を添加した。トランスフェクション約１２０時間後、条件培地を回収し、０.２μmフィルターを通した。タンパク質を、Mab Select SuRe Affinity Chromatography(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)とSUPERDEX(登録商標)Size Exclusion Chromatography(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)の組み合わせを使用して濾過条件培地から精製した。含量をＶ−Ａ２８０nmから概算し、品質を分析的分子ふるい高速液体クロマトグラフィー、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより評価した。
【０１８３】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体組成物
抗体全体およびそのモジュラー要素を図１に記戴する。ｂｉＡｂＦａｂＬ形態を図２に記戴する。ｔａＦａｂ形態を図３に記戴する。ヘテロ二量体Ｆｃ形態を図４に記戴する。ＶＣＶＦｃ形態を図５に記戴する。ＶＣＤＦｃ形態を図６に記戴する。
【０１８４】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；ＮＦ−κＢ誘発によるヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆ活性を測定するためのＮＩＨ／３Ｔ３／ＫＺ１７０  ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ
このアッセイの材料および方法は、上の実施例１に記戴したとおりである。
【０１８５】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；ホスホ−ＳＴＡＴ３誘発によるヒトＩＬ−２３活性を測定するためのＢａｆ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ
マウス骨髄由来細胞株(Ｂａｆ３)にヒトＩＬ−２３ＲαおよびヒトＩＬ−１２Ｒβ１を安定的に遺伝子導入し、クローン化した。Ｂａｆ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１クローン６細胞をアッセイ培地(１０％ウシ胎児血清、２mM  Ｌ−グルタミン、１mM  ピルビン酸ナトリウム(HyClone Laboratories, South Logan, UT)および２μM  β−メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO))添加ＲＰＭＩ  １６４０)で３回洗浄し、９６ウェル、丸底組織培養プレートに５０,０００細胞／ウェルで播種した。組み換えヒトＩＬ−２３(ZymoGenetics、Bristol-Myers Squibb Company、Seattle WA, USA)の連続希釈をアッセイ培地中で調製し、細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で１５分インキュベートした。さらに、本アッセイをまたＩＬ−２３活性の中和の測定のためにも使用した。最大半量濃度(ＥＣ５０、５０％有効濃度)のＩＬ−２３をここに記戴した抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体の連続希釈物と併せ、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で１５分、アッセイ倍地中でインキュベートして、細胞を添加した。プレインキュベーション後、処置物を細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で１５分インキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、氷の上に置いて、製造業者の指示に従い反応を停止させた(BIO-PLEX(登録商標)Cell Lysis Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。細胞を２０００rpmで４℃で５分遠沈させ、培地を廃棄した。５０μL／ウェル溶解緩衝液を各ウェルに添加し、ライセートを氷上でピペット中を５回上下させ、プレートシェーカー上で２０分、３００rpmで４℃で撹拌した。プレートを３２００rpmで、４℃で２０分遠心分離した。上清を回収し、−８０℃での保存のために新規マイクロタイタープレートに移した。
【０１８６】
捕捉ビーズ(BIO-PLEX(登録商標)Phospho-STAT3 Assay, Bio-Rad Laboratories)を５０μLの１：１希釈ライセートと併せ、製造業者の指示に従い９６ウェルフィルタープレートに添加した(BIO-PLEX(登録商標)Phosphoprotein Detection Kit, Bio-Rad Laboratories)。アルミホイルで覆ったプレートを、一夜、室温で３００rpmで振盪させながらインキュベートした。プレートをマイクロタイター真空装置に移し、洗浄緩衝液で３回洗浄した。２５μL／ウェル検出抗体添加後、ホイルで覆ったプレートを、室温で３０分、３００rpmで振盪させながらインキュベートした。プレートを濾過し、洗浄緩衝液で３回洗浄した。ストレプトアビジン−ＰＥ(５０μL／ウェル)を添加し、ホイルで覆ったプレートを、室温で１５分、３００rpmで振盪させながらインキュベートした。プレートを濾過し、ビーズ再懸濁緩衝液で３回洗浄した。最後の洗浄後、ビーズをビーズ懸濁緩１２５μL／ウェルのビーズ懸濁緩衝液に再懸濁し、３０秒振盪させ、製造業者の指示に従いアレイリーダーで読んだ(BIO-PLEX(登録商標)100、Bio-Rad Laboratories)。データを分析ソフトウェア(BIO-PLEX(登録商標)Manager 4.1, Bio-Rad Laboratories)を使用して分析した。ライセートに存在するリン酸化ＳＴＡＴ３転写因子のレベル増加は、ＩＬ−２３受容体−リガンド相互作用の指標であった。ライセートに存在するリン酸化ＳＴＡＴ３転写因子のレベルの減少は、ＩＬ−２３受容体−リガンド相互作用の中和の指標であった。ＩＣ５０(５０％阻害濃度)値を、GraphPad Prism 4ソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego CA)を使用して各抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体について計算した。
【０１８７】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；ＮＩＨ／３Ｔ３／ＫＺ１７０  ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイおよびＢａｆ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ結果
ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆは、用量依存的方法でＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターの活性化を誘発し、ＥＣ５０濃度はＩＬ−１７Ａに対して０.３３nM、ＩＬ−１７Ａ／Ｆに対して１nMおよびＩＬ−１７Ｆに対して１nMであり、ＩＬ−２３は、用量依存的方法でＳＴＡＴ３リン酸化を誘発し、ＥＣ５０濃度は０.０２nMであると決定された。抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体に対するＩＣ５０データを下の表８に示す。
【０１８８】
抗ヒトＩＬ−２３／１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体表
【表８】
0006362587.tif 000009
＊配列番号１７のアミノ酸配列は配列番号７０の配列によりコードされ得る；配列番号２８のアミノ酸配列は配列番号７１の配列によりコードされ得る；配列番号１８のアミノ酸配列は配列番号７２の配列によりコードされ得る；配列番号２９のアミノ酸配列は配列番号７５の配列によりコードされ得る。
【０１８９】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；Ｇ−ＣＳＦ誘発によるヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＡＦおよびＩＬ−１７Ｆ活性を測定するための初代ヒトＳＡＥＣアッセイ
初代ヒト小気道上皮細胞(ＳＡＥＣ)を、９６ウェル平底組織培養プレート(Corning Incorporated, Corning, NY)中８,０００細胞／ウェルで気管支上皮細胞用増殖培地(ＳＡＧＭ)(細胞および培地：Lonza, Walkersville, MD)で播種し、および一夜、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。翌日ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦまたはＩＬ−１７Ｆ(ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, USA)の連続希釈をＳＡＧＭ培地に調製し、細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。さらに、本アッセイをＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆ活性の中和の測定に使用した。最大半量濃度(ＥＣ５０、５０％有効濃度)のＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦまたはＩＬ−１７Ｆを、ここに記戴した抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体の連続希釈物とＳＡＧＭ培地中で併せ、細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後上清を遠沈し、回収し、処理の準備ができるまで−８０℃で凍結した。上清中のヒトＧ−ＣＳＦタンパク質レベルを、市販のビーズ利用ヒトＧ−ＣＳＦサイトカインＥＬＩＳＡを製造業者の指示に基づき使用して測定した(Procarta/Affymetrix, Santa Clara, CA)。上清中のヒトＧ−ＣＳＦレベル上昇はヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ受容体−リガンド相互作用の指標であった。上清中のヒトＧ−ＣＳＦレベル減少はヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ受容体−リガンド相互作用中和の指標であった。ＩＣ５０(５０％阻害濃度)値を、GraphPad Prism 4ソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego CA)を使用して各抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体について計算した。
【０１９０】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；初代ヒトＳＡＥＣアッセイ結果
ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆは用量依存的方法でヒトＧ−ＣＳＦ産生を誘発し、ＥＣ５０濃度はＩＬ−１７Ａについて０.０３nM、ＩＬ−１７Ａ／Ｆについて３nMおよびＩＬ−１７Ｆについて３nMと決定された。試験した二重特異性抗体は、２３／１７ｂＡｂ１(配列番号２８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ２(配列番号１８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ３(配列番号７４および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ４(配列番号２９および配列番号１７)を含む。ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体３３９−１３４  ｍＡｂ(配列番号６５および配列番号６７)も試験した。抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体のＩＣ５０データを下の表９に示す。このデータは、抗ＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体が、ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ介在ＩＬ−６産生を阻害し、同等に強力であったことを示す。
【０１９１】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；ＩＬ−６誘発によるヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆ活性を測定するための初代ヒト線維芽細胞アッセイ
初代ヒト線維芽細胞株(ＨＦＦＦ２、Cat #86031405, Health Protection Agency Culture Collections, Porton Down Salisbury, UK)を、９６ウェル平底プレート(Corning Incorporated, Corning, NY)中、アッセイ培地(１０％ＦＢＳおよび２mM  Ｌ−グルタミン(HyClone Laboratories, South Logan, UT)添加ＤＭＥＭ)中５,０００細胞／ウェルで播種し、一夜、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。翌日組み換えヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＡＦまたはＩＬ−１７Ｆ(ZymoGenetics、Bristol-Myers Squibb Company、Seattle, WA 98117)の連続希釈をアッセイ培地中で調製し、細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。さらに、本アッセイを使用して、ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆ活性の中和を測定した。ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦまたはＩＬ−１７Ｆの最大半量濃度(ＥＣ５０、５０％有効濃度)を、アッセイ培地中でここに記戴した抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体の連続希釈物と併せ、細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後上清を遠沈し、回収し、処理可能となるまで−８０℃で凍結した。上清中のヒトＩＬ−６タンパク質レベルを、市販のビーズ利用ヒトＩＬ−６サイトカインＥＬＩＳＡを、製造業者の指示に従い使用して測定した(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。上清中のヒトＩＬ−６レベル増加はヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ受容体−リガンド相互作用の指標であった。上清中のヒトＩＬ−６レベル減少は、ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ受容体−リガンド相互作用中和の指標であった。ＩＣ５０(５０％阻害濃度)値を、GraphPad Prism 4ソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego CA)を使用して各抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体について計算した。
【０１９２】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；初代ヒト線維芽細胞アッセイ結果
ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７ＦはヒトＩＬ−６産生を用量依存的方法で誘発し、ＥＣ５０濃度は、ＩＬ−１７Ａについて０.０８nM、ＩＬ−１７ＡＦについて２５nMおよびＩＬ−１７Ｆについて２５nMと決定された。試験した二重特異性抗体は２３／１７ｂＡｂ１(配列番号２８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ２(配列番号１８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ３(配列番号７４および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ４(配列番号２９および配列番号１７)を含む。ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体３３９−１３４  ｍＡｂ(配列番号６４および配列番号６６)も試験した。抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体のＩＣ５０データを下の表９に示す。これらのデータは、抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体がヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ介在ＩＬ−６産生を阻害し、同等に強力であったことを示す。
【０１９３】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；マウスＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆ誘発によるヒトＩＬ−２３活性を測定するためのマウス脾細胞アッセイ
マウス脾細胞の単一細胞懸濁液を、ＢＡＬＢ／ｃマウスから回収した脾臓全体から調製した。赤血球をＡＣＫ緩衝液(０.０１０Ｍ  ＫＨＣＯ３、０.０００１Ｍ  ＥＤＴＡ、０.１５０Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、ｐＨ７.２)で溶解後、脾細胞を洗浄し、アッセイ培地(１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、１mM  ピルビン酸ナトリウム、２mM  Ｌ−グルタミン、１０mM  ＨＥＰＥＳ、１００ユニット／mL  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ(HyClone Laboratories, South Logan, UT)、５０μM  ２−メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)および５０ng／mlヒトＩＬ−２(R&D Systems, Minneapolis, MN)添加ＲＰＭＩ  １６４０)に再懸濁した。脾細胞を、９６ウェル丸底プレートに５００,０００細胞／ウェルで播種した。組み換えヒトＩＬ−２３(BDC 50220AN087ヘテロ二量体材料)の連続希釈をアッセイ培地中で調製し、細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。さらに、本アッセイを、ヒトＩＬ−２３活性の中和の測定にも使用した。ヒトＩＬ−２３の最大半量濃度(ＥＣ５０、５０％有効濃度)を、ここに記戴した抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体の連続希釈物と併せ、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で１５分、アッセイ倍地中でインキュベートして、細胞を添加した。プレインキュベーション後、処置物を細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後上清を遠沈し、回収し、処理可能となるまで−８０℃で凍結した。上清中のマウスＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆのタンパク質レベルを、市販のプレート式マウスＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆ  ＥＬＩＳＡを製造業者の指示に従い使用して測定した(eBiosciences, San Diego, CA)。上清中のマウスＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆレベル増加はＩＬ−２３受容体−リガンド相互作用の指標であった。上清中のマウスＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆレベル減少はＩＬ−２３受容体−リガンド相互作用中和の指標であった。ＩＣ５０(５０％阻害濃度)値を、GraphPad Prism 4ソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego CA)を使用して各抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体について計算した。
【０１９４】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；マウス脾細胞アッセイ結果
ヒトＩＬ−２３はマウスＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆを用量依存的方法で誘発し、ＥＣ５０濃度は０.０１nMであると決定された。試験した二重特異性抗体は２３／１７ｂＡｂ１(配列番号２８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ２(配列番号１８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ３(配列番号７４および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ４(配列番号２９および配列番号１７)を含む。抗ヒトＩＬ−２３.６(７Ｂ７)ｍＡｂ(配列番号６８および配列番号１７)も試験した。抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体のＩＣ５０データを下の表９に示す。このデータは抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体がＩＬ−２３誘発マウスＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆ産生を阻害することを示す。
【０１９５】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；ホスホ−ＳＴＡＴ３誘発によるヒトＩＬ−２３活性測定のための初代ヒトＴ細胞ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ
白血球フェレーシスＰＢＭＣ：正常ヒトドナー(ZymoGeneticsの正常ドナープール)を無作為に選択し、ＦＨＣＲＣ(Seattle, WA)で自発的に血液浄化した。白血球フェレーシスＰＢＭＣはZymoGeneticsに無菌採血バッグで輸送された。細胞を無菌５００mLプラスチック製ビンに注加し、１mM  ＥＤＴＡ(HyClone Laboratories, South Logan, UT)添加室温ＰＢＳで４００mLに希釈し、２５０mL円錐管に移した。２５０mLチューブを１５００rpmで１０分遠心分離して、細胞をペレット化した。細胞上清を除去し、廃棄した。細胞ペレットを併せ、１mM  ＥＤＴＡ添加４００mL  ＰＢＳに添加した。細胞懸濁液(２５mL／チューブ)を５０mL円錐管中のFICOLL(登録商標)(２０mL／チューブ)に重層した(計１６本のチューブ)。チューブを２０００rpmで２０分、室温で遠心分離した。白血球および残存血小板を含む界面層(“バフィーコート”)を回収し、貯留し、１mM  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳで血小板の大多数が除去されるまで反復洗浄した。白血球を１００mLの氷冷凍結保存培地(７０％ＲＰＭＩ  １６４０、２０％ＦＣＳ、１０％ＤＭＳＯ(HyClone Laboratories))に懸濁し、無菌クライオバイアル(１mL細胞／バイアル)に分注した。クライオバイアルを−８０℃冷凍庫に２４時間入れ、液体窒素冷凍庫に移した。典型的アフェレーシスにより生じる白血球は０.５〜１.０×１０１０細胞である。この方法で処理されたアフェレーシス細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球および樹状細胞を含む。
【０１９６】
活性化Ｔ細胞の調製：Ｔ細胞は、ＩＬ−１２受容体を発現するために活性化し、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３に応答可能でなければならない。凍結保存白血球フェレーシスＰＢＭＣを融解し、無菌５０mL円錐管に移し、５０mLの温アッセイ培地(１０％ＦＢＳ(HyClone Laboratories)含有ＲＰＭＩ  １６４０)で洗浄し、３７℃水浴で１時間インキュベートして、細胞を回復させた。細胞を遠心分離し、細胞上清を廃棄した。細胞ペレットをアッセイ培地に再懸濁し、無菌１６２cm２組織培養フラスコに５μg／mL  ＰＨＡ−Ｍ(Roche, Basel, Switzerland)を含む９０mLアッセイ培地中、２×１０７細胞／フラスコで分配した。細胞を、計５日間、３７℃の加湿インキュベーター中で培養した。細胞を４日目の午後の採取まで“休息”させ、培養培地をＰＨＡ無しの新鮮アッセイ培地に置き換え、５日間の培養期間の残りのためにインキュベーターに戻した。
【０１９７】
ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ：活性化ヒトＴ細胞を培養５日目に採取し、新鮮アッセイ培地に再懸濁し、２×１０５細胞／ウェルでＵ底９６ウェルプレートに播種した。組み換えヒトＩＬ−２３(BDC 50220AN087ヘテロ二量体材料)の連続希釈をアッセイ培地中で調製し、細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で１５分インキュベートした。さらに、本アッセイをまたＩＬ−２３活性の中和の測定のためにも使用した。最大半量濃度(ＥＣ５０、５０％有効濃度)のＩＬ−２３をここに記戴する抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７ＡＦ抗体と併せ、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で１５分、アッセイ倍地中でインキュベートして、細胞を添加した。プレインキュベーション後、処置物を細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で１５分インキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、氷の上に置いて、製造業者の指示に従い反応を停止させた(BIO-PLEX(登録商標)Cell Lysis Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。細胞を２０００rpmで４℃で５分遠沈させ、培地を廃棄した。５０μL／ウェル溶解緩衝液を各ウェルに添加し、ライセートを氷上でピペット中を５回上下させ、プレートシェーカー上で２０分、３００rpmで４℃で撹拌した。プレートを３２００rpmで、４℃で２０分遠心分離した。上清を回収し、−８０℃での保存のために新規マイクロタイタープレートに移した。
【０１９８】
捕捉ビーズ(BIO-PLEX(登録商標)Phospho-STAT3 Assay, Bio-Rad Laboratories)を５０μLの１：１希釈ライセートと併せ、製造業者の指示に従い９６ウェルフィルタープレートに添加した(BIO-PLEX(登録商標)Phosphoprotein Detection Kit, Bio-Rad Laboratories)。アルミホイルで覆ったプレートを、一夜、室温で３００rpmで振盪させながらインキュベートした。プレートをマイクロタイター真空装置に移し、洗浄緩衝液で３回洗浄した。２５μL／ウェル検出抗体添加後、ホイルで覆ったプレートを、室温で３０分、３００rpmで振盪させながらインキュベートした。プレートを濾過し、洗浄緩衝液で３回洗浄した。ストレプトアビジン−ＰＥ(５０μL／ウェル)を添加し、ホイルで覆ったプレートを、室温で１５分、３００rpmで振盪させながらインキュベートした。プレートを濾過し、ビーズ再懸濁緩衝液で３回洗浄した。最後の洗浄後、ビーズをビーズ懸濁緩１２５μL／ウェルに再懸濁し、３０秒振盪させ、製造業者の指示に従いアレイリーダーで読んだ(BIO-PLEX(登録商標)100、Bio-Rad Laboratories)。データを分析ソフトウェア(BIO-PLEX(登録商標)Manager 4.1, Bio-Rad Laboratories)を使用して分析した。ライセートに存在するリン酸化ＳＴＡＴ３転写因子のレベル増加は、ＩＬ−２３受容体−リガンド相互作用の指標であった。ライセートに存在するリン酸化ＳＴＡＴ３転写因子のレベルの減少は、ＩＬ−２３受容体−リガンド相互作用の中和の指標であった。ＩＣ５０(５０％阻害濃度)値を、GraphPad Prism 4ソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego CA)を使用して各抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体について計算した。
【０１９９】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；初代ヒトＴ細胞ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ結果
ヒトＩＬ−２３用量依存的方法でＳＴＡＴ３リン酸化を誘発し、ＥＣ５０濃度は０.０２nMであると決定された。試験した二重特異性抗体は２３／１７ｂＡｂ１(配列番号２８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ２(配列番号１８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ３(配列番号７４および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ４(配列番号２９および配列番号１７)を含む。抗ヒトＩＬ−２３.６(７Ｂ７)ｍＡｂ(配列番号６８および配列番号１７)も試験した。抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体のＩＣ５０データを下の表９に示す。
【０２００】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；初代ヒトＳＡＥＣアッセイ、初代ヒト線維芽細胞アッセイ、マウス脾細胞アッセイおよび初代ヒトＴ細胞ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ結果
【表９】
0006362587.tif 000010
【０２０１】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体共結合活性；ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−７Ａ／ＦまたはＩＬ−Ｆの阻害と同時のヒトＩＬ−２３への結合を測定するための、初代ヒト線維芽細胞アッセイ。ヒトＩＬ−２３の阻害と同時のヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−７Ａ／ＦまたはＩＬ−１７Ｆへの結合を測定するための初代ヒトＴ細胞ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ。
【０２０２】
初代ヒト線維芽細胞アッセイを、過剰量のＩＬ−２３の３０nM存在下で行った。初代ヒトＴ細胞ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイを過剰量のＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆの３０nM存在下で行った。
【０２０３】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体バイオアッセイ共結合結果
試験した二重特異性抗体は２３／１７ｂＡｂ１(配列番号２８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ２(配列番号１８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ３(配列番号７４および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ４(配列番号２９および配列番号１７)を含むおよび２３／１７ｔａＦａｂ１(配列番号７６および配列番号７８)。抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体は、ヒトＩＬ−２３存在下で試験したとき、ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ阻害を妨害しなかった。抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体は、ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ存在下で試験したとき、ヒトＩＬ−２３阻害を妨害しなかった。
【０２０４】
表面プラズモン共鳴(Biacore)を介する抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体のヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７ＦおよびヒトＩＬ−２３への結合親和性の測定
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体を、表面プラズモン共鳴を使用して、ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ヒトＩＬ−１７ＦおよびヒトＩＬ−２３に対する結合親和性を評価した。
【０２０５】
運動速度定数および平衡解離定数を、表面プラズモン共鳴を介する抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体とヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７ＦおよびヒトＩＬ−２３の相互作用について測定した。会合速度定数(ｋａ(Ｍ−１ｓ−１))は、抗原−抗体複合体形成の速度を反映する値である。解離速度定数(ｋｄ(ｓ−１))はこの複合体の安定製を反映する値である。解離速度定数を会合速度定数で割ることにより(ｋｄ／ｋａ)平衡解離定数(ＫＤ(Ｍ))が得られる。この値は相互作用の結合親和性を表す。類似のＫＤを有する抗体は広範に異なる会合および解離速度定数を有し得る。結果として、抗体のｋａおよびｋｄ両者の測定は、抗体−抗原相互作用の親和性をより一意的に表す助けとなる。
【０２０６】
結合動態および親和性試験をBIACORE(登録商標)T100システム(GE Healthcare, Piscataway, NJ)で行った。BIACORE(登録商標)T100の方法は、BIACORE(登録商標)T100 Control Software, v 2.0を使用してプログラム化した。これらの実験のために、モノクローナルおよび二重特異性抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマ抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を介してＣＭ４センサーチップに捕捉した。ヒトＩＬ−１７分子との結合実験を、１０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.０５％界面活性剤Ｐ２０(GE Healthcare)、１mg／mL  ウシ血清アルブミン、ｐＨ７.４の緩衝液中、２５℃で実施した。ＩＬ−２３／ＩＬ−１２Ｂヘテロ二量体との結合実験を、１０mM  ＨＥＰＥＳ、５００mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.０５％界面活性剤Ｐ２０(Biacore)、１mg／mL  ウシ血清アルブミン、ｐＨ７.４緩衝液中、２５℃で実施した。
【０２０７】
捕捉抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマを、１０mM  酢酸ナトリウムｐＨ５.０で２０μg／mL濃度まで希釈し、アミンカップリング化学(ＥＤＣ：ＮＨＳ)を使用して、ＣＭ４センサーチップの全４個のフローセルに共有結合により固定化した。抗体固定後、フローセル上の残った活性部位を１Ｍエタノールアミンでブロックした。約５０００ＲＵの捕捉抗体密度を得た。抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体を、６０〜１５０ＲＵの範囲の密度でＣＭ４チップのフローセル２、３または４に捕捉した。固定化表面への試験抗体の捕捉を１０μL／分の流速で行った。BIACORE(登録商標)装置は、センサーチップ表面上に結合したタンパク質質量を測定し、それゆえに、試験抗体の補足を各サイクルで確認した。ヒト組み換えＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦまたはＩＬ−１７Ｆ(ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, USA)の連続希釈を、１００nM〜０.０３２nM(１：５連続希釈)で調製し、同時にヒト組み換えＩＬ−２３(ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, USA)の連続希釈を、２００nM〜０.０６４nM(１：５連続希釈)で調製した。連続希釈物を表面の上に注入し、センサーチップに捕捉された試験抗体に特異的に結合させた。各抗原濃度の２回の注入を７分の会合時間および１５分の解離時間で行った。動態学的結合試験を５０μL／分の流速で行った。サイクルの間に、フローセルを２０mM  塩酸で洗浄して、表面を再生させた。この洗浄工程により、捕捉試験抗体および結合抗原を固定化抗体表面から除去した。試験抗体は、その後次サイクルで再び捕捉された。
【０２０８】
データをBIACORE(登録商標)T100 Evaluationソフトウェア(version 2.0)を使用してコンパイルした。データを、対照フローセルおよびブランク注入を減算することにより処理した。ベースライン安定性を評価して、再生工程が一連の注入の間中一定の結合表面を提供することを確認した。二個の注入曲線を再現性のために確認した。二価ＩＬ−１７分子の二価抗体への結合に基づき、二価検体結合相互作用モデルは、との相互作用に適すると決定されたＩＬ−１７分子。ＩＬ−２３／ＩＬ−１２Ｂヘテロ二量体の二価抗体への結合に基づき、１：１結合相互作用モデルは、ＩＬ−２３分子との相互作用に適すると決定された。対照を減算した曲線を、複数Ｒmaxと１に設定したＲＩを用いる適当な結合モデルに包括的に適合させた。データは、この結合モデルによく適合し、実験結合曲線と理論的結合曲線は良好に一致した。フィットに関連するカイ２および標準誤差は低かった。残余に傾向はなかった。
【０２０９】
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体Biacore活性
ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆとの結合実験の結果を、それぞれ表１０、１１および１２に示す。ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１２Ｂヘテロ二量体との結合実験の結果を表１３に示す。
【０２１０】
ＩＬ−１７Ａに対する抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体結合親和性
【表１０】
0006362587.tif 000011
【０２１１】
ＩＬ−１７Ａ／Ｆに対する抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体結合親和性
【表１１】
0006362587.tif 000012
【０２１２】
ＩＬ−１７Ｆに対する抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体結合親和性
【表１２】
0006362587.tif 000013
【０２１３】
ＩＬ２３／ＩＬ−１２Ｂに対する抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体結合親和性
【表１３】
0006362587.tif 000014
【０２１４】
表面プラズモン共鳴(Biacore)を介する抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体へのＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−２３の同時共結合
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体を、ＩＬ−２３およびＩＬ−１７Ａ／Ｆ両者の同時共結合の能力について表面プラズモン共鳴を介して評価した。
【０２１５】
第一配向での共結合実験について、ヒトＩＬ−１７分子を、アミンカップリング化学(ＥＤＣ：ＮＨＳ)を使用してＣＭ５センサーチップのフローセル２〜４に共有結合により固定化した。固定化後、フローセル上の残った活性部位を１Ｍエタノールアミンでブロックした。ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆ(ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, USA)をそれぞれフローセル２、３または４に固定化した。これらの分子の固定化レベルは４５００〜５２００ＲＵの範囲であった。フローセル１を対照表面として使用した。二重特異性抗体を続いて２５μg／mLまたは５０μg／mLに希釈し、表面上を流し、センサーチップのフローセル２〜４に捕捉させた。二重特異性抗体の捕捉後、ＩＬ−２３／ＩＬ−１２Ｂヘテロ二量体(ZymoGenetics、Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, USA)を５００nMに希釈し、共結合を証明するために表面上を流した。結合試験を１０μL／分の流速で、会合時間１０分および解離時間５分で行った。
【０２１６】
第二の配向での共結合実験について、マウス抗ヒトＩＬ−１２  (ｐ４０／ｐ７０)モノクローナル抗体(BD Pharmingen, San Jose, CA)を、アミンカップリング化学(ＥＤＣ：ＮＨＳ)を使用してＣＭ５センサーチップのフローセル１〜４に共有結合により固定化した。固定化後、フローセル上の残った活性部位を１Ｍエタノールアミンでブロックした。ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１２Ｂヘテロ二量体(ZymoGenetics、Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, USA)を５００nMに希釈し、ＩＬ−１２Ｂサブユニットを介してフローセル１〜４に捕捉した。ＩＬ−２３／ＩＬ−１２Ｂの捕捉レベルは約４０００ＲＵであった。二重特異性抗体を続いて２５μg／mLまたは５０μg／mLに希釈し、表面上を流し、センサーチップのフローセル２〜４にヒトＩＬ−２３サブユニットを介して捕捉した。フローセル１を対照表面として使用した。二重特異性抗体の捕捉後、ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆ(ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, USA)を５００nMに希釈し、共結合を証明するために表面上を流した。結合試験を１０μL／分の流速で、会合時間１０分および解離時間５分で行った。
【０２１７】
全結合実験を、２５℃で、１０mM  ＨＥＰＥＳ、５００mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.０５％界面活性剤Ｐ２０(GE Healthcare)、１mg／mL  ウシ血清アルブミン、ｐＨ７.４緩衝液中で行った。サイクルの間、フローセルを２０mM  塩酸で洗浄して、表面を再生させた。この洗浄工程は、捕捉試験抗体および何らかの結合抗原の両者をチップ表面から除去した。データをBIACORE(登録商標)T100 Evaluationソフトウェア(version 2.0)を使用してコンパイルした。データを、対照フローセルおよびブランク注入を減算することにより処理した。ベースライン安定性を評価して、再生工程が一連の注入の間中一定の結合表面を提供することを確認した。
【０２１８】
表面プラズモン共鳴(Biacore)を介する抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体ＶへのＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−２３の同時共結合の結果
試験した二重特異性抗体は２３／１７ｂＡｂ１(配列番号２８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ２(配列番号１８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ３(配列番号７４および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ４(配列番号２９および配列番号１７)を含むおよび２３／１７ｔａＦａｂ１(配列番号７６および配列番号７８)。Ａｌｌ二重特異性抗体はヒトＩＬ−２３およびヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆの両者に同時共結合でき、本二重特異性抗体の両アームが機能的であることが証明された。
【０２１９】
表面プラズモン共鳴(Biacore)を介する抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ特異的結合の測定
抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体を、表面プラズモン共鳴を介して、ヒトＩＬ−１７Ｂ、ヒトＩＬ−１７Ｃ、ヒトＩＬ−１７ＤおよびヒトＩＬ−１７Ｅ(ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, USA)に対する交差反応性の欠如を試験した。
【０２２０】
結合試験を、BIACORE(登録商標)T100(GE Healthcare, Piscataway, NJ)で行った。本方法を、BIACORE(登録商標)T100 Control Software, v 2.0を使用してプログラム化した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマ特異的抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を、アミンカップリング化学(ＥＤＣ：ＮＨＳ)を使用してＣＭ４センサーチップのフローセル１〜３に固定化した。精製二重特異性抗体を、続いて約１５０ＲＵの密度でセンサーチップのフローセル２またはフローセル３に捕捉した。フローセル１を対照表面として使用した。
【０２２１】
ヒトＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７ＤおよびＩＬ−１７Ｅ(ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, USA)を捕捉抗体表面(フローセル２)上を注入し、対照フローセル(フローセル１)を５００nM、１００nM、２０nMおよび４nM濃度で注入した。この実験の組の陽性対照として、ヒトＩＬ−２３(ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, USA)を１００nM、２０nM、４nMおよび０.８nMで注入した。結合試験を流速５０μL／分、会合時間５分および解離時間５分で行った。膳結合実験を、２５℃で１０mM  ＨＥＰＥＳ、５００mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.０５％界面活性剤Ｐ２０(GE Healthcare)、１mg／mL  ウシ血清アルブミン、ｐＨ７.４緩衝液中で行った。サイクルの間、フローセルを２０mM  塩酸で洗浄して、表面を再生させた。この洗浄工程は、捕捉試験抗体および何らかの結合抗原の両者をチップ表面から除去した。データをBIACORE(登録商標)T100 Evaluationソフトウェア(version 2.0)を使用してコンパイルした。データを、対照フローセルおよびブランク注入を減算することにより処理した。ベースライン安定性を評価して、再生工程が一連の注入の間中一定の結合表面を提供することを確認した。
【０２２２】
表面プラズモン共鳴(Biacore)を介する抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体のＩＬ−１７Ａ／Ｆ特異的結合結果
ヒトＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７ＤまたはＩＬ１７Ｅの二重特異性抗体への結合は観察されなかった。試験した二重特異性抗体は２３／１７ｂＡｂ１(配列番号２８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ２(配列番号１８および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ３(配列番号７４および配列番号１７)、２３／１７ｂＡｂ４(配列番号２９および配列番号１７)を含む。対照的に、ＩＬ−２３陽性対照は、先の試験と一致する用量依存的結合を示した。
【０２２３】
実施例４
抗ヒトＩＬ−２３／１７Ａ／Ｆ  ｂＡｂは、マウスにおけるマウスＫＣ(ＣＸＣＬ１)のヒトＩＬ−１７Ａ、ＦおよびＡＦ介在血清濃度増加を阻止する
ＩＬ−１７Ａ、ＦおよびＡＦは、宿主防御に役割を有するが、特に異常な高レベルでまたは慢性条件下で産生されたとき、疾患病理にも貢献する多くの下流因子の産生を誘発できる。これらの下流メディエーターの一つは、重要な好中球化学誘引物質活性を有し、炎症において役割を有するケモカインであるＣＸＣＬ１(ヒトにおけるＧＲＯ−αまたはマウスにおけるＫＣとしても知られる)である。抗ヒトＩＬ２３／１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体(ｂＡｂ)がマウスにおけるＧＲＯ−αのＩＬ−１７Ａ、ＦおよびＡＦ介在増加を阻害する能力を、ｂＡｂがインビボ設定でＩＬ−１７誘発活性に対して有効であり、それゆえに、ｂＡｂがＩＬ−１７Ａ、ＦまたはＡＦが役割を有するヒト疾患の処置に有用であることを示すために、評価した。しかしながら、これらのｂＡｂがマウスＩＬ−１７Ａ、ＦまたはＡＦ交差反応しないため、ＧＲＯ−α(またはマウスの場合、ＧＲＯ−αのマウスアナログであるＫＣ産生を誘発)産生のためにヒト(ｈ)ＩＬ−１７Ａ、ＦまたはＡＦのマウスへの送達が必要であり、これらは、その後抗ヒトＩＬ２３／１７Ａ／Ｆ  ｂＡｂの存在下に中和できた。
【０２２４】
これらの実験のために、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(７〜９週齢)を使用した。１８時間目に、マウスに表１４および１５の左手側カラムに示すとおり媒体(ＰＢＳ)または抗ヒトＩＬ−２３／１７Ａ／Ｆ  ｂＡｂの１個の投与量の腹腔内(ｉ.ｐ.)注射を受けた。０時間目に、マウスは次の０.１７５mg／kg  ｈＩＬ−１７Ａ、０.９mg／kg  ｈＩＬ−１７Ｆまたは０.５mg／kg  ｈＩＬ−１７ＡＦの組み換えヒトタンパク質の１個の皮下(ｓ.ｃ.)注射を受けた。対照マウスは、ｈＩＬ−１７タンパク質の１個の代わりに、媒体(ＰＢＳ)のｓ.ｃ.注射を受けた。２時間後、マウスをイソフルランガス麻酔下眼窩後洞(retro-orbital sinus)から採血し、血清を血液の遠心分離後に回収し、血清を、製造業者(Quantikine Mouse CXCL1/KC Immunoassay, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)の指示に従い、市販のＥＬＩＳＡを使用して血清ＫＣ濃度を分析するまで、８０℃で貯蔵した。
【０２２５】
表１４および１５に示すとおり、ｂＡｂで処置したマウスは、ｈＩＬ−１７Ａ、ＦまたはＡＦ誘発血清ＫＣ(ＣＸＣＬ１)濃度の阻害の用量依存的増加を示し、ｂＡｂがこれらのＩＬ−１７リガンドが介在する活性の減少に有効であることが示された。ＣＸＣＬ１はＩＬ−１７Ａ、ＦまたはＡＦに応答した生物学的読み取りの一例に過ぎず、同様に評価項目測定として使用できるＩＬ−１７Ａ、ＦまたはＡＦが役割を有する疾患に役割を有する多くの他の重要な下流読み取りがある。
【０２２６】
【表１４】
0006362587.tif 000015
【０２２７】
【表１５】
0006362587.tif 000016
【０２２８】
実施例５
抗ヒトＩＬ−２３／１７Ａ／Ｆ  ｂＡｂは、マウスにおけるマウスＩＬ−１７ＡＦおよびＦの血清濃度のヒトＩＬ−２３介在増加を阻止する
ＩＬ−２３はＴｈ１７細胞の分化の誘発が可能であり、当該細胞は、続いて、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−１７ＡＦの産生を導き得る。これらのサイトカイン類は、多くの疾患と関連付けられており、ＩＬ−２３およびＩＬ−１７Ａ、ＦおよびＡＦを阻害できる治療剤がこれらの疾患の処置に有用である。抗ヒトＩＬ２３／１７Ａ／Ｆ二重特異性抗体(ｂＡｂ)がマウスにおけるＩＬ−１７Ａ、ＦおよびＡＦのＩＬ−２３介在増加を減少させる能力を、ｂＡｂがインビボ設定でＩＬ−２３誘発活性に対して有効であり、ＩＬ−２３およびＴｈ１７細胞が役割を有するヒト疾患の処置にｂＡｂが有用であることを示すために、評価した。しかしながら、これらのｂＡｂがマウスＩＬ−２３と交差反応しないため、マウスＩＬ−１７ＦおよびＡＦの産生の誘発のためにヒト(ｈ)ＩＬ−２３をマウスに送達することが必要であり、これは、その後抗ヒトＩＬ２３／１７Ａ／Ｆ  ｂＡｂ存在下で中和できた。マウスＩＬ−１７Ａの濃度はマウス血清中で正確に測定するには低すぎたが、血清ＩＬ−１７ＦおよびＡＦで観察された傾向と比較して、傾向は類似していると予測された。
【０２２９】
これらの実験のために、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(７〜９週齢)を使用した。１日目の午前１０：３０に、各々５μgのマウス(ｍ)ＩＬ−２を腹腔内(ｉ.ｐ.)注射を介して投与された。２日目の午前８：３０に、マウスは、表１６の左手側カラムに示すとおり、媒体(ＰＢＳ)または抗ヒトＩＬ−２３／１７Ａ／Ｆ  ｂＡｂの１個の投与量のｉ.ｐ.注射を受けた。２日目の午前１１時にマウスは各々５マイクログラムのｍＩＬ−２および１０マイクログラムのｈＩＬ−２３を受け、２日目の午後５：２０に、マウスはｍＩＬ−２およびｈＩＬ−２３の各々１０マイクログラムをｉ.ｐ.注射を介して受けた。３日目の午前９：３０に、マウスの各々は、さらに５マイクログラムのｍＩＬ−２および１０マイクログラムのｈＩＬ−２３をｉ.ｐ.注射により受けた。３日目の午後４：３０に、マウスをイソフルランガス麻酔下眼窩後洞(retro-orbital sinus)から採血し、血清を血液の遠心分離後に回収し、マウスＩＬ−１７ＦおよびＡＦの血清濃度を、これらの成分を特異的に測定するＥＬＩＳＡおよびルミネックスアッセイを使用して分析するまで、血清を−８０℃で貯蔵した。
【０２３０】
表１６に示すとおり、ｂＡｂで処置したマウスは、マウス１７ＦまたはＡＦのｈＩＬ−２３誘発血清濃度の阻害の用量依存的増加を示し、ｂＡｂがｈＩＬ−２３が介在する活性の減少に有効であることが示された。
【表１６】
0006362587.tif 000017
【０２３１】
実施例６
ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体
哺乳動物ＶＣＶＦｃ二重特異性分子の構築および発現
遺伝子全体をGenScript(GenScript, Piscataway, NJ, USA)で合成し、ｐＴＴ５、ＨＥＫ２９３−６Ｅ一過性発現ベクター(NCR Biotechnology Research Institute, Ottawa, ON, CAN)に制限酵素クローニングを介して導入した。ほとんどの構築物はｍｏｄ２６１０(配列番号３０)シグナル配列を使用して発現させた。ＶＣＶＦｃは二重特異性抗体であり、これは、リンカー(例えば、いずれかの鎖について１０量体Ｇ４Ｓまたは軽鎖についてＲＴＶＡＡＰＳ(配列番号８５)および重鎖についてＳＳＡＳＴＫＧＰＳ(配列番号８６)であるが、これらに限定されない)を介してＦａｂ領域とヒンジの間に挿入された二重特異性の第二のアームのＦｖユニットを有する抗体全体を含む。ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体の図を図５に示す。
【０２３２】
ＨＥＫ２９３−６Ｅ懸濁細胞にポリエチレンイミン試薬を使用して発現構築物を遺伝子導入しおよび５mM  Ｌ−グルタミンおよび２５μg／mL  Ｇ４１８添加Ｆ１７培地(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)で培養した。２４時間後、２０％Tryptone NI(Organotechnie SAS, La Courneuve, FR)の体積の１／４０を添加した。トランスフェクション約１２０時間後、条件培地を回収し、０.２μmフィルターを通した。タンパク質を、Mab Select SuRe Affinity Chromatography(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)とSUPERDEX(登録商標)Size Exclusion Chromatography(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)の組み合わせを使用して濾過条件培地から精製した。含量をＶ−Ａ２８０nmから概算し、品質を分析的分子ふるい高速液体クロマトグラフィー、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより評価した。
【０２３３】
ＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；ＮＦ−κＢ誘発によるヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆ活性を測定するためのＮＩＨ／３Ｔ３／ＫＺ１７０  ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ
バイオアッセイを上の実施例１に記戴のとおり実施した。
【０２３４】
ＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；ホスホ−ＳＴＡＴ３誘発によるヒトＩＬ−２３活性を測定するためのＢａｆ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ
バイオアッセイを上の実施例３に記戴のとおり実施した。
【０２３５】
ＰＤＧＦ−Ｃ／ＰＤＧＦ−Ｄ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；ヒトＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄ分裂促進的活性を測定するための正常ヒト肺線維芽細胞(ＮＨＬＦ)増殖アッセイ
初代正常ヒト肺線維芽細胞株(ＮＨＬＦ、CC-2512、Lonza, Walkersville, MD)を、１,０００細胞／ウェルで、増殖培地(FGM-2 BulletKit、Lonza, Walkersville, MD)に播種し、一夜、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。翌日培地を除去し、組み換えヒトＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄ(ZymoGenetics)の連続希釈をアッセイ培地(０.１％ＢＳＡ添加ＦＢＭ、Lonza, Walkersville, MD)に調製し、細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。さらに、本アッセイをＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄ活性の中和の測定に使用した。最大下濃度のＰＤＧＦ−ＣまたはＰＤＧＦ−Ｄを、ここに記戴する抗ヒトＰＤＧＦ−Ｃ／Ｄまたは抗ヒトＰＤＧＦＲα／β  ＶＣＶＦｃ抗体の連続希釈とアッセイ培地中で併せ、細胞を入れたプレートに添加し、一緒に３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。細胞を１μCi／ウェルのチミジン[メチル−３Ｈ](PerkinElmer, Waltham, MA)でパルスし、３７℃、５％ＣＯ２でさらに２４時間インキュベートした。インキュベーション後、分裂促進的活性を、３Ｈ−チミジン取り込み量の測定により評価した。培地を除去し、細胞を１０分、３７℃でトリプシン処理し、FilterMate harvester(Packard Instrument Co., Meriden, CT)に回収し、製造業者の指示に従い、TOPCOUNT(登録商標)マイクロプレートシンチレーションカウンター(Packard Instrument Co., Meriden, CT)で読んだ。３Ｈ−チミジン取り込み増加がＰＤＧＦ−ＣまたはＰＤＧＦ−Ｄ受容体−リガンド相互作用の指標であった。３Ｈ−チミジン取り込み減少がＰＤＧＦ−ＣまたはＰＤＧＦ−Ｄ受容体−リガンド相互作用中和の指標であった。ＩＣ５０(５０％阻害濃度)値を、GraphPad Prism 4ソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego CA)を使用して各ＰＤＧＦ−Ｃ／ＰＤＧＦ−ＤまたはＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦＲβ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体について計算した。
【０２３６】
ＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；ＮＩＨ／３Ｔ３／ＫＺ１７０  ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイおよびＢａｆ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ結果
ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆは、用量依存的方法でＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターの活性化を誘発し、ＥＣ５０濃度はＩＬ−１７Ａについて０.１５nM、ＩＬ−１７Ａ／Ｆについて０.５nMおよびＩＬ−１７Ｆについて０.５nMと決定され、ＩＬ−２３は用量依存的方法でＳＴＡＴ３リン酸化を誘発し、ＥＣ５０濃度は０.０２nMであると決定された。抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体のＩＣ５０データを下の表１７、１８および１９に示す。
【０２３７】
ＩＬ−２３／１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体表
【表１７】
0006362587.tif 000018
【０２３８】
【表１８】
0006362587.tif 000019
【０２３９】
【表１９】
0006362587.tif 000020
【０２４０】
ＰＤＧＦ−Ｃ／ＰＤＧＦ−ＤおよびＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦβ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；正常ヒト肺線維芽細胞(ＮＨＬＦ)増殖アッセイ結果
ＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄは、ＮＨＬＦ細胞増殖を用量依存的方法で誘発し、最大下濃度はＰＤＧＦ−Ｃについて０.１nMおよびＰＤＧＦ−Ｄについて６nMと決定された。表２０および表２１は、ＰＤＧＦ−Ｃ／ＰＤＧＦ−Ｄまたはここに記戴するＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦＲβ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体のＩＣ５０データを示す。
【０２４１】
ＰＤＧＦ−Ｃ／ＰＤＧＦ−Ｄ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体表
【表２０】
0006362587.tif 000021
【０２４２】
ＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦＲβ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体表
【表２１】
0006362587.tif 000022
【０２４３】
ＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；ＩＬ−６誘発によるヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆ活性を測定するための初代ヒト線維芽細胞アッセイ
【０２４４】
バイオアッセイを上の実施例３に記戴のとおり実施した(pertextured)
ＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体バイオアッセイ活性；初代ヒト線維芽細胞アッセイ結果
ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７ＦはヒトＩＬ−６産生を用量依存的方法で誘発し、ＥＣ５０濃度はＩＬ−１７Ａについて０.０８nM、ＩＬ−１７Ａ／Ｆについて２５nMおよびＩＬ−１７Ｆについて２５nMと決定された。抗ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体２３／１７ＶＣＶ２(配列番号９１および配列番号９３)。表２２は、ここに記戴するＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体の実施例ＩＣ５０データを示す。
【表２２】
0006362587.tif 000023
【０２４５】
ＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体共結合活性；ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−７Ａ／ＦまたはＩＬ−Ｆの阻害と同時にヒトＩＬ−２３への結合を測定するための初代ヒト線維芽細胞アッセイ。ヒトＩＬ−２３の阻害と同時にヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−７Ａ／ＦまたはＩＬ−１７Ｆへの結合を測定するための初代ヒトＴ細胞ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ。
初代ヒト線維芽細胞アッセイを、過剰量のＩＬ−２３の３０nM存在下で行った。初代ヒトＴ細胞ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイを、過剰量のＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆの３０nM存在下で行った。
【０２４６】
ＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体バイオアッセイ共結合結果
二重特異性抗体２３／１７ＶＣＶ２(配列番号９１および配列番号９３)は、ヒトＩＬ−２３存在下で試験したとき、ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ阻害を妨害しなかった。二重特異性抗体２３／１７ＶＣＶ２は、ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｆ存在下で試験したとき、ヒトＩＬ−２３阻害を妨害しなかった。
【０２４７】
表面プラズモン共鳴(Biacore)を介するヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７ＦおよびヒトＩＬ−２３に対するＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体の結合親和性の測定
結合活性を上の実施例３に記戴のとおり決定した。
【０２４８】
ＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体Biacore活性
ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−１７Ｆとの結合実験の結果を、それぞれ表２３、２４および２５に示す。ヒトＩＬ−２３／ＩＬ−１２Ｂヘテロ二量体との結合実験の結果を表２６に示す。
【０２４９】
ＩＬ−１７Ａに対するＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体結合親和性
【表２３】
0006362587.tif 000024
【０２５０】
【表２４】
0006362587.tif 000025
【０２５１】
【表２５】
0006362587.tif 000026
【０２５２】
【表２６】
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【０２５３】
表面プラズモン共鳴(Biacore)を介するＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体へのＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−２３の同時共結合
このアッセイを上の実施例３に記戴のとおり実施した。
【０２５４】
表面プラズモン共鳴(Biacore)を介するＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−２３のＩＬ−２３／ＩＬ−１７Ａ／Ｆ  ＶＣＶＦｃ二重特異性抗体への同時共結合の結果
二重特異性抗体２３／１７ＶＣＶ２(配列番号９１および配列番号９３)は、ヒトＩＬ−２３およびヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆの両者に同時に共結合可能であり、本二重特異性抗体の両アームが機能的であることが証明された。
【０２５５】
実施例７
ＩＬ−２３ｐ１９エピトープマッピング
この実施例７に記戴した分析は、ＩＬ−２３ｐ１９抗体(７Ｂ７抗体またはＭａｂ、７Ｂ７  ＦａｂおよびｂｉＡｂ３、その全て配列番号７に示す重鎖可変ドメインおよび配列番号９に示す軽鎖可変ドメインを有する)が結合するＩＬ−２３ｐ１９上のエピトープ残基を同定することを目的とした。Ｆａｂ  ７Ｂ７、７Ｂ７抗体およびｂｉＡｂ３は、ＩＬ−２３ｐ１９上のそのエピトープに関する限りは互換性であるために、種々の段階で結合試験にも使用している。
【０２５６】
エピトープ上のタンパク分解性消化およびペプチドデータ
ＩＬ−２３ｐ１９抗体のマススペクトロメトリーエピトープ配列分析は、エピトープ抽出およびエピトープ切除方法の両者に基づいた(Parker et al., “MALDI/MS-based epitope mapping of antigens bound to immobilized antibodies”, Mol. Biotechnol., 20(1):49-62 (Jan. 2002))。いずれの場合も、ＩＬ−２３ｐ１９抗体は、２mg  ｍＡｂ／１ml床体積の平均密度で表面活性化ビーズ上の抗体の１級アミンを介して直接固定化した。ＩＬ−２３  ｈｉｓ−ｔａｇ抗原からのペプチドを、還元およびアルキル化有りまたは無しで産生した。抗原ＩＬ−２３の還元は、１時間、３７℃の５０mM  ジチオスレイトールのＰＢＳ溶液および４Ｍ  グアニジンＨＣｌとのインキュベーションにより実施した。この後、３０分、室温で１００mM  ヨードアセトアミドでアルキル化した。還元およびアルキル化したＩＬ−２３を、断片化前にＰＢＳに対して一夜透析した。エピトープ抽出のために、抗原ペプチドを、エンドプロテイナーゼ群のトリプシン、キモトリプシン、ｌｙｓ−Ｃ、ａｒｇ−Ｃ、ａｓｐ−Ｎおよびまたはｇｌｕ−Ｃで、酵素対抗原比２％(ｗ／ｗ)まででタンパク分解性消化させた。インキュベーションを、３７℃で２時間〜一夜の範囲のインキュベーション時間で実施した。得られたペプチドを、室温で３０分抗体樹脂と混合した。この樹脂を、あらゆる非特異的結合ペプチドを除去するために３回洗浄した。全ての消化、インキュベーションおよび洗浄工程をＰＢＳ  ｐＨ７中で実施した。酵素消化前にインタクトな抗原を抗体と３０分、室温インキュベーションする以外、エピトープ切除は同じプロトコールに従った。両方法で、抗体結合ペプチドを溶出し、ＥＳＩ−ＭＳで分析した。
【０２５７】
これらのデータは、ＩＬ−２３ｐ１９抗体が、ＩＬ−２３ｐ１９に３ペプチド領域を含む非連続的エピトープを含むことを示す。合成ペプチドを産生して、さらにこれらの３ペプチド領域を分析し、その結合をＥＬＩＳＡおよびマススペクトロメトリーの両者で試験し、分析した。これらの観察に基づき、次のペプチドがＩＬ−２３ｐ１９抗体エピトープの配列を表すことが示される：
ペプチド１：WQRLLLRFKILR(配列番号６の残基１５６〜１６７)
ペプチド２：SAHPLVGHMDLR(配列番号６の残基４６〜５７)
ペプチド３：IHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLP(配列番号６の残基９３〜１１７)。
【０２５８】
ＨＤＸ−ＭＳによるＩＬ−２３エピトープマッピング
水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)方法は、主鎖アミド水素原子の重水素交換の速度および程度をモニタリングすることにより溶液中のタンパク質配座的および立体構造的動態をプローブする。ＨＤＸのレベルは、主鎖アミド水素原子の溶媒到達性およびタンパク質の配座による。ＨＤＸによるタンパク質質量増加はＭＳにより厳密に測定できる。この技術を酵素消化と組み合わせたとき、ペプチドレベルでの構造特性を分解でき、表面に露出したペプチドを内部に折りたたまれたものと区別できる。典型的に、重水素標識および後のクエンチング実験を実施し、その後オンラインペプシン消化、ペプチド分離およびＭＳ分析を行う。ＨＤＸ−ＭＳによるＩＬ−２３におけるＢＭＳ−９８６１１３のエピトープマッピングの前に、非重水素化実験を実施して、ＩＬ−２３(４.４mg／mL)およびＩＬ−２３／ＢＭＳ−９８６１１３(１：１モル比、４.４mg／mLおよび３.３６mg／mL)に対して一般的消化性ペプチドのリストを作成し、ＩＬ−２３について配列包括度９７％を達成した。この実験で、１０mM  リン酸緩衝液(ｐＨ７.０)を標識工程中使用し、続いてクエンチング緩衝液(２００mM  リン酸緩衝液と１.５Ｍ  ＧｄｎＣｌおよび０.５Ｍ  ＴＣＥＰ、ｐＨ２.５、１：１、ｖ／ｖ)を添加した。エピトープマッピング実験のために、５μLの各サンプル(ＩＬ−２３またはＩＬ−２３／ＢＭＳ−９８６１１３(１：１モル比))を６５μL  ＨＤＸ標識緩衝液(Ｄ２Ｏ中１０mM  リン酸緩衝液、ｐＤ７.０)と混合し、室温(〜２５℃)で標識反応を開始させた。反応を種々の時間行った：２０秒、１分、１０分、６０分および２４０分。各標識反応時間の最後に、クエンチング緩衝液(１：１、ｖ／ｖ)添加により反応を終了させ、クエンチしたサンプルを分析のためにWaters HDX-MSシステムに注入した。観察された一般的消化性ペプチドを、ＢＭＳ−９８６１１３非存在下／存在下の重水素取り込みレベルについてモニタリングした。ＨＤＸ−ＭＳによるＩＬ−２３中の抗ＩＬ−２３  ７Ｂ７Ｆａｂ(４.９１mg／mL)のエピトープマッピングは同じプロトコルに従った。
【０２５９】
ＩＬ−２３との複合体およびＩＬ−２３とのｂｉＡｂ３における抗ＩＬ−２３  ７Ｂ７Ｆａｂのエピトープマッピングは、ｂｉＡｂ３が、ＩＬ−２３ｐ１９に５ペプチド領域を含む非連続的エピトープを有することを示す。相対的重水素取り込みレベルに基づき、５ペプチド領域を領域１＞２＞３＞４＞５と順位付けでき、領域１が重水素取り込みで最も顕著に変化し、領域５が重水素取り込みで最も顕著でない変化をする。ＩＬ−２３ｐ１９抗体についてＨＤＸ−ＭＳにより決定したＩＬ−２３ｐ１９上の５ペプチド領域は次のとおりである：
領域１：PDSPVGQL(配列番号６の残基１１７〜１２４)；
領域２：IFTGEPSLL(配列番号６の残基１０８〜１１６)；
領域３：KILRSLQAF(配列番号６の残基１６４〜１７２)；
領域４：QQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMD(配列番号６の残基３４〜５５)；および
領域５：CLQRIHQGLIFYEKLLG(配列番号６の残基８９〜１０５)。
【０２６０】
コンピューターによるエピトープ予測およびアラニンシェーブ変異体の設計
アラニンシェーブ変異誘発は、結合のエピトープにおけるアミノ酸側鎖を除去するための、同じ構築物における複数残基のアラニンへの変異のためのストラテジーである(Wells, J.A., “Systemic mutational analyses of protein-protein interfaces”, Enzym., 202:390-411 (1991))。７Ｂ７ＦａｂおよびｂｉＡｂ３との潜在的エピトープにおける残基の関与に対する多くの情報源を組み合わせて、局所アラニンシェーブ変異体の標的リストを作成した。ＨＤＸ(この実施例７中の上記参照)およびタンパク分解性消化ペプチドマッピング(この実施例７中の上記参照)の両者の間の重複領域に含まれる残基を、ＩＬ−２３ｐ１９ドメインの配列上にマッピングし、一般的残基の３個の線形領域を領域Ａ、ＢおよびＣとして同定した。領域Ａは配列番号６のアミノ酸残基３３〜５９に対応する。領域Ｂは配列番号６のアミノ酸残基８９〜１２５に対応する。領域Ｃは配列番号６のアミノ酸残基１４４〜１７３に対応する。側鎖が露出している(溶媒接触面積、ＳＡＳＡ)、そして、それゆえに、ＩＬ−２３のｐ１９ドメインのタンパク質表面上に位置するであろう残基を計算するために、ＩＬ−２３ヘテロ二量体の社内構造を使用した。ＩＬ−２３のｐ１９ドメインにおける各残基について、アミノ酸タイプの接触可能表面対標準的露出表面比を計算し、残基を瓶に分類した。残基を、次の＜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、＞９０％露出の到達性瓶に入れた。各アミノ酸タイプの標準的残基可触性を、伸張トリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙについて計算した。実施した第二の計算はＯＤＡ(最適ドッキング面積)であり、これは、起こり得るタンパク質−タンパク質相互作用表面の予測に有用である。本方法は、最低ドッキング脱溶媒和エネルギーを有する最適表面パッチを同定する。ＯＤＡを、ＩＬ−２３のｐ１９ドメインについて計算し、これらの結果を変異誘発のために残基の優先順位をつけるために使用した。
【０２６１】
これら３領域(Ａ、Ｂ、Ｃ)中の残基を、ＯＤＡおよびＳＡＳＡ計算の両者での高得点に基づき優先順位をつけ、また複合体化していないＩＬ−２３に対する水素−重水素交換の程度に基づき加重した(ペプチド＃１＞＃２＞＃３＞＃４＞＃５)。マウスと非一致である領域をアラニンシェーブ変異体の変わりにマウス交換変異体としてクローン化し、これは、小規模試験で結合に影響を示さなかった。伸長ループにおける残基の線形配列を含むＭ７以外、残基を、ＩＬ−２３(Ｍ５、Ｍ６、Ｍ８)のＸ線結晶構造に対してそれらをマッピングして、非線形エピトープに併せた。さらなるバックアップ変異体を、優勢に線形残基(Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１)のサブエピトープを用いて作製した。この方法で設計したアラニンシェーブ変異体を下の表２７に示す。
【表２７】
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【０２６２】
ＩＬ−２３エピトープマッピングアラニン変異体のクローニング、発現および精製
非タグ付野生型ＩＬ−２３  ｐ４０サブユニットエントリーベクター構築物をＰＣＲにより作製し、ＰＣＲフラグメントのフィデリティーを配列決定により確認した。一過性発現構築物をGateway LR組換えにより製造し、配列を確認した。Ｈｉｓタグ付野生型ＩＬ−２３  ｐ１９サブユニット構築物および全変異体構築物をＰＣＲにより作製し、一過性発現ベクターに直接クローン化した。全ＰＣＲフラグメントのフィデリティーを配列決定により確認した。野生型対照を作製するために、非タグ付野生型ＩＬ−２３  Ｐ４０サブユニットを、ＩＬ−２３複合体精製のために４Ｌ規模でＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞にＨｉｓタグ付野生型Ｐ１９サブユニットと共に一過性にとも発現させた。簡単にいうと、１×１０６細胞／mlのＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に、０.５(ｐ１９)／０.５(ｐ４０)／１.５(ＰＥＩ)比で発現プラスミド／ＰＥＩ複合体を遺伝子導入した。トリプトンＮ１フィードを２４時間後に添加し、細胞をトランスフェクション１２０時間後に採取した。条件培地を０.２μMフィルターで濾過した。７個のＨｉｓタグ付ＩＬ−２３  ｐ１９変異体構築物に、上記の同じトランスフェクションプロトコルに従い、３０ml規模で非タグ付野生型ＩＬ−２３  ｐ４０サブユニットを共遺伝子導入した。条件培地を分析のために移動し、全変異体の発現を抗Ｈｉｓウェスタンブロットにより確認した。予備的結合結果に基づき、変異体Ｍ５、Ｍ７、Ｍ９およびＭ１０を選択し、同じトランスフェクションプロトコルで２Ｌ規模にスケールアップした。野生型も２Ｌにスケールアップした。スケールアップした２リットルのＨＥＫ細胞でＩＬ−２３の野生型および変異体を採取し、上清を濃縮し、１０kDａ膜を用いる接線流濾過によりＰＢＳに緩衝液を交換した。タンパク質を、次いで固定化ニッケル親和性クロマトグラフィーで精製した。野生型を４０mM  イミダゾールで溶出し、緩衝液をゲル濾過クロマトグラフィーを脱塩することによりＰＢＳ(５.６mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、１.１mM  ＫＨ２ＰＯ４、１５４mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７.４)に交換した。野生型の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで＞９５％であることが決定された。変異体を４０mM  イミダゾールで洗浄し、５００mM  イミダゾールで溶出した。溶出プールを、ＰＢＳ(７mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、３mM  ＮａＨ２ＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７.１)に対して透析することにより緩衝液交換した。変異体の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで＞９５％であることが決定された。アラニンシェーブ変異誘発により同定された重要な残基でのＨｉｓタグ付ＩＬ−２３ｐ１９の単一アラニン変異体を、遺伝子合成により作製し、一過性トランスフェクションベクターにクローン化した。発現および精製は、親和性精製したＭ３５Ａ以外、アラニンシェーブ変異体に準じた。
【０２６３】
ＩＬ−２３変異体のＩＬ−２３ｐ１９抗体に対するBiacore結合分析
全７種のアラニン変異体(表２７参照)の３０mL  小規模発現の結合を、ＰＢＳＴ(７mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、３mM  ＮａＨ２ＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７.４)中、２５℃でBIACORE(登録商標)T100上の表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ、Biacore)により測定した。関連抗体および受容体を、ＣＭ５センサーチップ上の２０００ＲＵでのプロテインＡ固定化により約６０ＲＵのレベルで捕捉した。ｂｉＡｂ３に加えて、MerckのＩＬ−２３  ｐ１９  ｍＡｂ(７Ｇ１０)およびSTELARA(登録商標)(ＩＬ−１２／ＩＬ−２３  ｐ４０  ｍＡｂ)をドメイン結合の対照として使用した。さらに、ＩＬ−２３の市販受容体ｈＩＬ−２３Ｒ−ＦｃおよびｈＩＬ−１２Ｒβ１−Ｆｃ(いずれもR&D Systemsから))を対照として使用した。上清をＰＢＳＴで１：５希釈し、３０μL／分、ｍＡｂ上または３分受容体表面に注入し、解離時間後、１０mM  グリシン、ｐＨ２.０で再生した。分析前に、捕捉抗体がないプロテインＡの対照表面に対する結合を全特異的結合曲線から減算した。図９に示す結果は注入の終了１０秒前の応答を示す。
【０２６４】
Biacore結果は、ＩＬ−２３アラニンシェーブ変異体がｐ４０特異的抗体およびｐ１９特異的ＩＬ−２３受容体に対する結合を維持することを示す(恐らく受容体結合部位を描写するＭ８以外)。他のＩＬ−２３ｐ１９  ｍＡｂおよびＩＬ−１２Ｒβ１−Ｆｃの結合も行い、図９の結果と一致した。Ｍ５変異体は７Ｂ７Ｍａｂへの結合の劇的な減少を示すが、Ｍ９およびＭ１０は７Ｂ７Ｍａｂへの結合の一部の減少を示す(図１０参照)。Ｍ７は抗体または対照への結合にいかなる影響も示さない。それゆえに、これら４種の変異体をスケールアップおよび精製に選択し、ＩＬ−２３ｐ１９抗体に対する結合を喪失した３変異体(７Ｂ７抗体またはＭａｂ、７Ｂ７  ＦａｂおよびｂｉＡｂ３、その全て配列番号７に示す重鎖可変ドメインおよび配列番号９に示す軽鎖可変ドメインを有する)およびＭ７を対照として選択した。
【０２６５】
精製変異体のBiacore分析は、野生型および変異体ＩＬ−２３を２５nMに希釈し、１.５nMまで連続的に１：２までタイトレーションして減らした以外、上清と同じアッセイ形式を使用した。精製ＩＬ−２３変異体で得られた全ての結果は、上清発現で得られたデータを確認した。データを１：１ラングミュア結合モデルに適合させ、図１０および表２８に示すKd値を決定した。ＩＬ−２３ｐ１９抗体(７Ｂ７抗体またはＭａｂ、７Ｂ７  ＦａｂおよびｂｉＡｂ３、その全て配列番号７に示す重鎖可変ドメインおよび配列番号９に示す軽鎖可変ドメインを有する)に対するＭ５結合で観察された参照の１−２ＲＵを減算した結合を、Ｍ９およびＭ１０の動態解析により決定した平均Ｒmaxを使用したBIAsimulationソフトウェア２.１を使用して模倣した。親和性は≧３３０μMと概算され、表２８に示すとおり野生型より１５００倍弱いKdであった。
【表２８】
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【０２６６】
単一アラニン変異体のBiacore分析を、Ｍ５、Ｍ９およびＭ１０アラニンシェーブ変異体により示された非線形エピトープを確認するために行った。３個の線形領域Ａ、ＢおよびＣにおけるほとんどの単一アラニン変異体は、７Ｂ７  ｍＡｂまたはｂｉＡｂ３に対する結合に変化を示さなかった。試験した１４個中３個のＩＬ−２３の単一アラニン変異体のみが、１kcal／moleを超える顕著な結合親和性減少を示した。アラニンシェーブ変異体Ｍ５、Ｍ９およびＭ１０で重複する重要な残基についての親和性およびΔΔＧ値を表２９に示し、線形領域Ｂにおける１個の主要な残基および線形領域Ａにおける２個の残基がＩＬ−２３ｐ１９抗体−ＩＬ−２３複合体の結合エネルギーに優勢に貢献することが示された。
【表２９】
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【０２６７】
ＢａＦ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントにおけるＩＬ−２３誘発ＳＴＡＴ３リン酸化
マウス骨髄由来細胞株(ＢａＦ３)にヒトＩＬ−２３ＲαおよびヒトＩＬ−１２Ｒβ１を安定的に遺伝子導入し、完全長受容体およびクローン化した。ＳＴＡＴ３のリン酸化のＩＬ−２３誘発を、ＩＬ−２３アラニンシェーブ変異体についてＥＬＩＳＡでモニターした。ＢａＦ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１(クローン６)細胞をアッセイ培地で３回洗浄し、９６ウェル丸底組織培養プレートに５０,０００細胞／ウェルで播種した。ＢａＦ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１細胞は、ＳＴＡＴ３のリン酸化によりＩＬ−２３に用量依存的方法で応答した。ＩＬ−２３シグナル伝達の抗体阻害を評価するために、ＥＣ５０濃度の２０pM  ＩＬ−２３を３３nM〜０.５６pMの各抗体の３倍連続希釈と前混合し、３７℃で１５分、アッセイ培地でインキュベートし、細胞に添加した。プレインキュベーション後、処置剤を、細胞を含むプレートに２個ずつ添加し、３７℃で１５分インキュベートして、ＳＴＡＴ３のリン酸化を刺激した。刺激を氷冷洗浄緩衝液添加により停止し、製造業者の指示に従い細胞を溶解した(Bio-Rad Laboratories細胞溶解キット、Cat #171-304012)。製造業者の指示に従いリン酸化ＳＴＡＴ３レベルをＥＬＩＳＡ(Bio-Rad Laboratoriesホスホ−ＳＴＡＴ３(Ｔｙｒ７０５)キット、Cat #171-V22552)により決定した。データを分析し、ＩＣ５０値をGraphPad Prism 4ソフトウェアを使用して計算した。全ＩＬ−２３アラニンシェーブ変異体および全ＩＬ−２３アラニン単一変異体は、ＢａＦ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントでのｐＳＴＡＴ３活性誘発に関して活性であり、ｗｔ  ＩＬ−２３(非タグ付およびタグ付)と同等な効力であった(表３０)。ＩＬ−２３アラニンシェーブ変異体誘発ｐＳＴＡＴ３のｂｉＡｂ３、STELARA(登録商標)(ＩＬ−１２／ＩＬ−２３  ｐ４０  ｍＡｂ)およびMerckのＩＬ−２３ｐ１９抗体(７Ｇ１０)による阻害の結果を表３１に示す。ｂｉＡｂ３は、ＢａＦ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントで、ｗｔ  ＩＬ−２３およびＩＬ−２３Ｍ７アラニンシェーブ変異体の生物学的活性を同等な効力で中和し、Ｍ９およびＭ１０を低い効力で中和するが、Ｍ５の生物学的活性を中和しない。ＢａＦ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントで、STELARA(登録商標)ＩＬ−１２  ｐ４０  ｍＡｂは、ｗｔ  ＩＬ−２３および全ＩＬ−２３アラニンシェーブ変異体の生物学的活性を同等な効力で中和する。陽性対照Merck  ＩＬ−２３  ｐ１９  ｍＡｂ(７Ｇ１０)は、ＢａＦ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントで、ＩＬ−２３、Ｍ７、Ｍ９およびＭ１０アラニンシェーブ変異体の生物学的活性を同等な効力で中和し、Ｍ５の生物学的活性を中和しない。
【表３０】
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【０２６８】
単一ＩＬ−２３ｐ１９変異(Ｈ５３Ａ、Ｍ５４ＡおよびＤ５５Ａ)を構築し、ＢａＦ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントにおけるｐＳＴＡＴ３を誘発する単一ＩＬ−２３ｐ１９変異ポリペチドを阻害する７Ｂ７、STELARA(登録商標)(ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０  ｍＡｂ)およびMerckのＩＬ−２３ｐ１９抗体(７Ｇ１０)(表３１)のＩＣ５０値を決定した。７Ｂ７  ｍＡｂは、ＢａＦ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントで、ｗｔ  ＩＬ−２３と比較して、ＩＬ−２３アラニン単一変異体Ｈ５３Ａ、Ｅ１１２ＡおよびＤ１１８Ａの生物学的活性を同等の効力で中和し、Ｍ５４ＡおよびＤ５５Ａ変異体は顕著に低い効力で中和し、Ｌ１１６Ａ変異体の生物学的活性を中和しない(表３１)。STELARA(登録商標)ＩＬ−１２  ｐ４０  ｍＡｂは、ＢａＦ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントのｗｔ  ＩＬ−２３と比較して、全ＩＬ−２３アラニン単一変異体の生物学的活性を同等の効力で中和する。Merck  ＩＬ−２３  ｐ１９  ｍＡｂは、ＢａＦ３／ｈｕＩＬ−２３Ｒα／ｈｕＩＬ−１２Ｒβ１トランスフェクタントで、中和しないＩＬ−２３  Ｅ１１２Ａ変異体以外、全ＩＬ−２３アラニン単一変異体の生物学的活性をｗｔ  ＩＬ−２３と比較して同等な効力で阻害する。
【表３１】
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【０２６９】
全てのこれらの結果をまとめると、ＩＬ−２３の７Ｂ７  ｍＡｂ阻害はアミノ酸残基Ｍ５４、Ｄ５５およびＬ１１６を必要とするが、アミノ酸残基Ｈ５３、Ｅ１１２またはＤ１１８を必要としない。STELARA(登録商標)およびMerck抗体は、活性を失うことなくＩＬ−２３アラニン単一変異体Ｍ５４Ａ、Ｄ５５ＡおよびＬ１１６Ａを阻害できたため、ＩＬ−２３Ｍ５４、Ｄ５５およびＬ１１６アラニン変異体で見られた活性喪失は７Ｂ７  ｍＡｂおよびｂｉＡｂ３に特異的であることが示唆される。
【０２７０】
ＩＬ−２３変異体および７Ｂ７  Ｆａｂ複合体のオリゴマー状態分析
ヘテロ二量体ＩＬ−２３変異体のオリゴマー状態および７Ｂ７  Ｆａｂと複合体形成する能力を確認するために、タンパク質を、Shodex Protein KW-803カラムで、２００mM  Ｋ２ＰＯ４(ＨＣｌでｐＨ６.８)、１５０mM  ＮａＣｌおよび０.０２％ナトリウムアジドを含む緩衝液(０.１μm濾過)中、０.５mL／分の流速で、ダイオードアレイ吸光度検出器を備えたAGILENT(登録商標)1100シリーズＨＰＬＣを使用して、分析的分子ふるいクロマトグラフィー(ＳＥＣ−ＭＡＬＳ)分離により試験した。Wyatt Technology MINIDAWNＴＭ TREOS(登録商標)レーザー光散乱装置をＨＰＬＣの下流に、続いてWyatt OPTILAB(登録商標)T-REXＴＭ示差屈折計を配管した。各ＩＬ−２３サンプル６０μgを、１０.３μM濃度で濾過後注入した。複合体形成について、６０μgの７Ｂ７  Ｆａｂを６％モル濃度過剰で混合し、１０.９μM濃度のＩＬ−２３タンパク質と、室温で３〜６時間インキュベートし、クロマトグラフィー分離した。粒子を、スピンフィルター(NANOSEP(登録商標)MF、０.２μm、Pall Corporation)を用いてタンパク質サンプルから除去し、注入した。データをASTRA(登録商標)６(Wyatt)およびChemstation(Agilent)で分析した。全変異体は、野生型と同様、大部分単量体であった。Ｍ５変異体は、Ｆａｂとのプレインキュベーション後顕著な複合体形成を示さず、Ｍ５  ＩＬ−２３単独が溶出する場所に近接して溶出し、本実験の１０μM濃度範囲では、たとえ複合体が形成されたとしても、わずかであることが示された。Ｍ７は複合体形成し、野生型と類似して溶出された。Ｍ９およびＭ１０変異体は、これらの濃度で複合体を形成したが、野生型より幾分分子量が小さく、保持時間は野生型およびＭ７よりわずかに遅く、７Ｂ７に対するこれらの親和性が野生型およびＭ７よりも弱いことが示唆された。１４種の単一アラニン変異体のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析は、野生型に類似して、全てが大部分単量体であり、Ｌ１１６Ａ変異体のみが、遅くシフトされた溶出時間および複合体の予測質量のわずかな減少を示し、７Ｂ７  Ｆａｂに対するＩＬ−２３の親和性の減少が示唆された。これらの結果は、これらのＬ１１６Ａに対するKdのBiacoreシフトに一致する。Ｄ５４ＡおよびＭ５５ＡとＦａｂの複合体の親和性減少の影響は、このアッセイ条件下では解明できなかった。
【０２７１】
ＩＬ−２３変異体の示差走査熱量測定
野生型および変異体ＩＬ−２３ヘテロ二量体の熱的安定性プロファイルを、MICROCAL(登録商標)VP-capillary DSC装置を使用して示差走査熱量測定(ＤＳＣ)により測定した。ＰＢＳ(７mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、３mM  ＮａＨ２ＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７.１)中の０.７mg／mlタンパク質サンプルを、１０〜１００℃で９０ｏ／時間で走査し、得られたサーモグラムを緩衝液ブランク減算および当てはめ法に付した。各分子の変性は、２個のアンフォールディング転移により特徴付けられ、各転移の適合させた転移中点(Ｔｍ)値は、野生型から１〜４℃以内であった。結果は、アラニンシェーブ変異体も、１４種の単一アラニン変異体も、野生型に対して顕著な熱的不安定化を示さないことを示す。
【０２７２】
ＩＬ−２３変異体のフーリエ変換赤外スペクトロスコピー(ＦＴ−ＩＲ)分析
ＩＬ−２３のアラニンシェーブ変異体および野生型の二次構造比較を、路長〜７μmおよび６３２.８nmのＮｅ−ＨｅレーザーのＣａＦ２窓を用いるBiotools Prota FT-IR装置でＦＴ−ＩＲスペクトロスコピーを使用して行った。データを２cm−１の解像度で集め、Prota/Bomem-GRAMS/31 AIソフトウェアで分析した。各サンプルを２回ずつ測定し、方法変動性は約３％であった。二次構造内容物を、構造感受性であるためにアミドＩピークを使用して計算した。ほぼ同等量のα螺旋およびβシートが、α螺旋について１６３７cm−１のピークおよびβシートについて１６３７cm−１のピークならびに１６８７cm−１のショルダーにより示されるとおり、全ＩＬ−２３サンプルで観察された。全体として、野生型ＩＬ−２３と比較して、アラニンシェーブ変異体でＦＴ−ＩＲスペクトルおよび計算された二次構造結果に顕著な差は観察されなかった。
【０２７３】
ＩＬ−２３変異体の円二色性(ＣＤ)分析
ＣＤスペクトロスコピーを使用したＩＬ−２３のアラニンシェーブ変異体および野生型の二次構造比較を、Jasco J-815分光光度計を使用して行った。スペクトルを、ＰＢＳ  ｐＨ７.１中、０.２５mg／mL  ＩＬ−２３タンパク質濃度で、１mm路長セルを２５℃で使用して、３００〜１９０nmで０.１nmデータ間隔で、５０nm／分走査速度、１nmバンド幅および２蓄積で回収した。全体的に、円二色性を使用して、野生型ＩＬ−２３と比較してアラニンシェーブ変異体で二次構造プロファイルに顕著な差は観察されなかった。
【０２７４】
ＩＬ−２３変異体の核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピー分析
プロトンＮＭＲは、原子について詳しく立体構造状態を評価することを可能にする、高度に感受性の技術である。１Ｄ  １Ｈ  ＮＭＲスペクトルが、各４種の変異体(Ｍ５、Ｍ７、Ｍ９、Ｍ１０)および野生型ＩＬ２３タンパク質で必要であった。全タンパク質を同時にＮＭＲ緩衝液(８％Ｄ２Ｏ／９２％Ｈ２Ｏ中ＰＢＳ)に対して透析し、サンプル調製による潜在的差異を除いた。さらに、１Ｈシグナル強度を、野生型スペクトルに対して規準化することによりタンパク質濃度差異について補正した。全ＮＭＲデータを、３２℃で６００MHzで走査するBruker Avance 3スペクトロメーターで回収した。１Ｄ  ＮＭＲスペクトルを、Watergate、WETおよびWaterフリップバック選択的励起パルススキームを使用して溶媒および添加物抑制について最適化した標準的ブルカー・パルス配列(ＺＧ)を使用して獲得した。２０４８走査が、各スペクトルで平均したシグナルであった。コサイン２乗アポダイゼーションを、フーリエ変換前に適用し、一次多項式ベースライン補正を、ベースラインの外観の平坦化のために使用した。各タンパク質のスペクトルの各々の試験は、各変異体タンパク質が、スペクトルの高磁場(＜０.５ppm)および低磁場(＞６.５ppM)領域の両方で十分に分散した共鳴により証明されるとおり、適切に折りたたまれていた。高磁場メチル共鳴はインタクトな疎水性コアの存在を示し、低磁場アミドプロトンは、十分に形成された二次構造(アルファ螺旋およびベータシート)の存在を反映する。野生型ＩＬ２３のスペクトルとの比較は極めて近い適合を示し、アミノ酸置換により誘発されるタンパク質構造の大きな立体構造変化の存在を除外する。さらに、ＮＭＲ結果はまたＭ５における活性の余分な喪失が、Ｍ５における変異部位での構造完全性の余分な大きな破壊により起こった可能性がないことも示す。Ｍ５は、Ｍ９よりも主成分分析で野生型タンパク質に相当近いという事実は、Ｍ９にない次のＭ５変異、すなわち、Ｈ５３Ａ、Ｍ５４ＡおよびＥ１１２Ａが、Ｍ５構造の破壊のほとんどの原因ではないことを示す。芳香族残基が除去された変異体Ｍ７およびＭ９で、主成分分析において、互いにもっと類似しているように見えることも観察された。全単一変異体は、Ｄ１１８ＡおよびＭ５４Ａ以外野生型と類似しているように見えたが、しかしながら他の対照は、これらの変異体が野生型に類似する安定性および活性を維持することを示した。
【０２７５】
ＩＬ−２３エピトープ分析の要約
アラニンシェーブおよび単一変異誘発の方法を使用して、７Ｂ７  Ｆａｂ、７Ｂ７抗体およびｂｉＡｂ３に含まれる７Ｂ７  ＦａｂについてｈＩＬ−２３のエピトープをマッピングした。タンパク分解性消化ＬＣＭＳ分析、ペプチド結合、水素／重水素交換マススペクトロメトリー、溶媒接触面積計算およびドッキングアルゴリズム計算により作成したエピトープ情報を使用して、標的変異誘発ストラテジーを行った。ＳＰＲによる小規模スクリーニングおよび選択精製変異体のスケールアップは、７Ｂ７／ｂｉＡｂ３結合ｈＩＬ−２３に対する特異的エピトープを決定した。Ｍ５変異体は、７Ｂ７／ｂｉＡｂ３への結合の劇的減少を示しながら、野生型と同等の機能的活性、ｐ４０およびｐ１９特異的試薬への結合、単量体オリゴマー状態、熱的安定性および二次構造特性を維持した。Ｍ５変異体は、７Ｂ７／ｂｉＡｂ３への結合の劇的減少を示したが、各々Ｍ５と同じ２個の変異残基を含むＭ９およびＭ１０の各々は、７Ｂ７／ｂｉＡｂ３への結合の部分的喪失を示した。Ｍ５  ＩＬ−２３変異体の親和性は、７Ｂ７／ｂｉＡｂ３に対して≧３００nMであり、これは、野生型ＩＬ−２３より約１,５００倍弱く、Ｍ５変異体における残基が、ＩＬ−２３への７Ｂ７／ｂｉＡｂ３結合のエピトープを規定することを示す。それゆえに、データは、７Ｂ７／ｂｉＡｂ３抗体がＩＬ−２３のｐ１９サブユニット上の非連続的エピトープに結合することを示す。ＩＬ−２３ｐ１９上のこの非連続的エピトープは、少なくとも２個のエピトープ領域(領域Ａ(配列番号６のアミノ酸残基３３〜５９)および領域Ｂ(配列番号６のアミノ酸残基８９〜１２５))を含む。特異的に、ＩＬ−２３ｐ１９の第一エピトープまたは領域Ａについて、配列番号６のアミノ酸残基５４(Ｍｅｔ)および５５(Ａｓｐ)が、７Ｂ７／ｂｉＡｂ３がＩＬ−２３ｐ１９に結合する能力について相当量の結合エネルギーに貢献する。ＩＬ−２３ｐ１９の第二エピトープまたは領域Ｂに関して、アミノ酸残基１１６(Ｌｅｕ)は、７Ｂ７／ｂｉＡｂ３のＩＬ−２３ｐ１９への結合能にエネルギー的に貢献する領域Ｂ内の主要残基である。
【０２７６】
実施例８
マーモセットＥＡＥモデル
背景および原理
多発性硬化症(ＭＳ)は、脳および脊髄におけるミエリンの喪失により特徴付けられる、中枢神経系(ＣＮＳ)の慢性自己免疫性、炎症性、神経変性疾患である。疾患開始の根底となるメカニズムは明らかには理解されていないが、多発性硬化症の臨床的進行に寄与する疾患経過は炎症、脱髄および軸索喪失または神経変性である。マクロファージおよびミクログリアがＣＮＳの主免疫細胞である。これらの細胞ならびにＴ細胞、好中球、アストロサイトおよびミクログリアが、例えば、多発性硬化症の、免疫関連病理に貢献し得る。さらに、ミエリン塩基性タンパク質(ＭＢＰ)、プロテオリピドタンパク質(ＰＬＰ)、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質(ＭＯＧ)および恐らく他のミエリンタンパク質を含む数個のミエリンタンパク質に対するＴ細胞反応性／自己免疫が、多発性硬化症の疾患状態および病理の誘発および永続化と関連付けられている。自己反応性Ｔ細胞とミエリンタンパク質のこの相互作用が、とりわけＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１７を含む炎症誘発性サイトカイン類の誘発を起こし得る。さらなる因果関係は、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞およびマクロファージ活性化、ケモカイン類および接着分子上方制御および血液脳関門破壊である。次の病理はオリゴデンドロサイトおよび軸索の喪失および脱髄“プラーク”の形成である。プラークは、ミエリン鞘がもはや存在せず、脱髄軸索がグリア性瘢痕組織内に包埋されている病巣からなる。脱髄はまた自己抗体によるミエリン抗原の特異的認識およびオプソニン化と、続く補体および／または活性化マクロファージ介在破壊によっても起こり得る。進行性多発性硬化症において観察された不可逆性神経学機能障害を主に担うと考えられているのが、この軸索喪失および神経変性である。
【０２７７】
多発性硬化症(ＭＳ)は、疾患進行により特徴付けられる４タイプに分類される。
(１)再発寛解型ＭＳ(ＲＲＭＳ)。ＲＲＭＳは、再発(症状再燃の発作)と、続く寛解(回復の期間)により特徴付けられる。症状は軽度〜重度の再発で変化し得て、寛解は数日または数ヶ月続き得る。ＭＳを有する人の８０％以上が再発寛解型サイクルで開始する。
(２)二次性進行型ＭＳ(ＳＰＭＳ)。ＳＰＭＳは、再発寛解型ＭＳを有する人においてしばしば発症する。ＳＰＭＳにおいて、再発および部分的回復は起こるが、身体障害はサイクルの間に消えない。その代わり、身体障害の着実な進行が発作のサイクルに取って代わるまで進行性に悪化する。
(３)一次性進行型ＭＳ(ＰＰＭＳ)。ＰＰＭＳは、発症時からゆっくりかつ着実に進行する。寛解期がなく、症状は一般に強度が下がることはない。ＭＳを有する人の約１５パーセントがＰＰＭＳを有する。
(４)再発進行型ＭＳ(ＰＲＭＳ)。この相対的に稀なＭＳのタイプにおいて、寛解期の間に人は着実に悪化する症状と、発作の両方を経験する。
メイヨ・クリニック(インターネット上のサイトmayoclinic.org/multiple-sclerosis/types)。
【０２７８】
ヒト多発性硬化症の経過には、多くの臨床的および病理学的不均一性がある。症状はしばしば１８〜５０歳の間に始まるが、何歳でも始まり得る。多発性硬化症の臨床症状は軽度視覚障害および頭痛から失明、重度運動失調および麻痺まで変わり得る。患者の大多数(約７０〜７５％)は再発寛解型多発性硬化症を有し、疾患症状は、約数時間〜数日間再発し、はるかに遅い回復が続き得て、寛解段階での症状の欠如は珍しくはない。再発および寛解の発生率および頻度は大きく変わり得るが、時間の経過と共に、回復期は不完全となり、発生が遅くなり得る。この場合の疾患のこの悪化は二次性進行型多発性硬化症と分類され、多発性硬化症患者の約１０〜１５％で起こる。残りの１０〜１５％の患者は一次性進行型多発性硬化症と診断され、疾患症状および身体的機能障害が疾患進行を通して、一定速度で進行する。
【０２７９】
ＩＬ−２３およびＩＬ−１７のいずれも、多発性硬化症のヒトおよび、多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(ＥＡＥ)を経験したマウスの中枢神経系で過剰発現される。ＥＡＥをミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(ＭＯＧ)３５−５５ペプチド−またはプロテオリピドペプチド(ＰＬＰ)に誘発したとき、マウスで過発現が観察される。さらに、ＩＬ−２３／ｐ１９またはＩＬ−１７の中和は、マウスでＥＡＥ症状を改善させる(Park et al, Nat Immunol. 6:1133 (2005); and Chen et al, J Clin Invest. 116:1317 (2006))。
【０２８０】
方法
実験的自己免疫性脳脊髄炎(ＥＡＥ)は、ＭＳのある種の側面を再現する十分に特徴付けられ、再現性のある動物モデルである。ＥＡＥは、齧歯類およびコモンマーモセットのような非ヒト霊長類で誘発される。Genain, C. P. and Hauser, S. L., “Creation of a model for multiple sclerosis in Callithrix jacchus marmosets,” J. Mol. Med., 75:187-197 (1997)。マーモセットＥＡＥにおいて、動物を組み換えヒトミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(ｒＨｕＭＯＧ)で免疫化して、ヒト多発性硬化症と酷似した疾患の発症を誘発する。このモデルの公開された試験は、免疫原として完全フロインドアジュバント(ＣＦＡ)に乳化したＭＯＧを一回接種で使用している。公開された方法でマーモセットにＥＡＥを誘発した我々の以前の試みは、ＭＯＧ注射２３〜１４２日後の臨床症状の発症に至った(データは示していない)。このスケジュールは前臨床有効性試験には長すぎると考えたため、疾患を誘発するための初回刺激投与と、続く追加免疫を用いる修飾プロトコルを用いた。本実験で記戴した刺激／追加免疫プロトコルを使用して、我々は、ＥＡＥのこの非ヒト霊長類モデルにおけるＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティおよびＩＬ−２３結合エンティティを有するサロゲート二重特異性抗体の活性を評価した。サロゲート二重特異性抗体は、ｂｉＡｂ−１、ｂｉＡｂ−２、ｂｉＡｂ−３およびｂｉＡｂ−４と同じＩＬ−１７  Ａ／Ｆ結合エンティティを有するが、ｂｉＡｂ−３のＩＬ−２３結合エンティティとしてサロゲートＩＬ−２３結合エンティティを有するｂｉＡｂＦａｂＬ(図２参照)であり、例えば、マーモセットＩＬ−２３ｐ１９に対して低い親和性を有する。したがって、代替ＩＬ−２３結合エンティティをサロゲート二重特異性抗体に使用した。サロゲート二重特異性抗体において使用した代替ＩＬ−２３結合エンティティは、図１３および図１４においてＩＬ−２３  ｍＡｂとして同定されたものと同じＩＬ−２３結合エンティティであった。
【０２８１】
ＥＡＥ誘発のために、ｒＨｕＭＯＧ(BlueSky Biotech, Worcester, MA)を無菌ＰＢＳで０.６６mg／mlに希釈し、５mg／mLの結核菌Ｈ３７  ＲＡ(Difco # 231141)を含む不完全フロインドアジュバント(ＩＦＡ、Sigma #F5506)の等量と乳化した。３００μLの最終ＣＦＡ／ＭＯＧ混合物(０.３３mg／mLのＭＯＧおよび２.５mg／mlのＨ３７ＲＡ含有)を、各動物の剪毛した肩部分の２箇所に注射した(１５０μl×２注射部位)。全マーモセットを、同じ日(０日目)にＣＦＡ／ＭＯＧで免疫化した。
【０２８２】
２１日目に、動物に、剪毛した腰部／臀部の２注射部位に注射したＩＦＡ／ＭＯＧで追加免疫した(Ｈ３７  ＲＡ無しで上記のとおり調製)。マーモセットを、刺激および追加免疫接種のためにケタミン(１５mg／kg)ＩＭ注射により麻酔した。
【０２８３】
サロゲートＩＬ−２３／１７  ＡＦ  ｂＡｂ(ＩｇＧ４.１ｋ)を２０mM  コハク酸、１５０mMアルギニン緩衝液(ｐＨ５.６)で製剤した。投与を、ＣＦＡ／ＭＯＧの刺激接種１日前に開始した。動物にプラセボ(ＰＢＳ、ＳＣ、２回／週)またはＩＬ−２３／１７  ＡＦ  ｂＡｂ(７mg／kg、ＳＣ、２回／週)を与えた。他の処置群は、ＢＭＳ−９３８７９０(ＩＬ−２３アドネクチン；３mg／kg、ＳＣ、２回／週)、ＡＤＸ＿ＰＲＤ１６５１(ＩＬ−２３／１７ビネクチン(binectin)、１０mg／kg、ＳＣ、２回／週)およびサロゲートＩＬ−２３  ｍＡｂ  ＩｇＧ４.１(ＩＬ−２３.１５−ｇ４Ｐ、９mg／kg、ＳＣ、２回／週)を含んだ。投与量を実験期間中、火曜日および金曜日に投与した。個々の体重を毎週記録し、動物に個々の体重に基づき投与した。全ＳＣ投与量を、側腹部にアルコールの局所塗布後投与した。投与毎に投与部位を変えた(左側または右側)。実験開始時の処置群は、８匹の動物／群から成った(雄雌混在)。動物は意識があり、薬物注射時は手で押さえた。
【０２８４】
疾患状態の視覚的評価を、１２日目に開始して毎日行った。評価を行い、２名の研究者の合意により記録した。臨床スコアは、下の表３２に記戴するとおき、公開された疾患スコアの改変に基づいた。
【表３２】
0006362587.tif 000033
【０２８５】
結果
群あたりのＥＡＥ疾患の徴候／症状を有する動物の数は次のとおりであった。
群Ａ(ＰＢＳ)：７匹中５匹のマーモセット(７１％)がＥＡＥ様疾患および／または神経性機能不全を実験中の同じ点で示した。疾患症状は失明および麻痺から成った。
群Ｂ(ＩＬ−２３アドネクチン、ＢＭＳ−９３８７９０)：６匹中１匹のマーモセット(１７％)がＥＡＥ様疾患を示した。疾患症状は進行性失明および麻痺から成った。
Ｃ群(ＩＬ−２３／１７ビネクチン、ＡＤＸ＿ＰＲＤ１６５１)：７匹中６匹のマーモセット(８６％)がＥＡＥ様疾患を示した。しかしながら、３匹の動物は、ＥＡＥ徴候／症状の証拠が１日しか観察されなかった。
Ｄ群(ＩＬ−２３  ｍＡｂ)：６匹中３匹のマーモセット(５０％)がＥＡＥ様疾患を示した。失明が多かった。
Ｅ群(ＩＬ−２３／１７  ＡＦ  ｂＡｂ)：８匹中４匹のマーモセット(５０％)がＥＡＥ様疾患を示し、この４匹の動物中３匹は、“正”スコアが１日しか観察されない一過性症状であった。疾患は、ほとんど動作緩慢または動作緩慢のような軽度な症状から成った。
【０２８６】
群Ａ(ＰＢＳ)の疾患発生率と比較して、他の処置群の各々における疾患発生率の差異は統計学的に有意ではなかった(ｐ＞０.０５、フィッシャーの直接確率検定)。
【０２８７】
本実験における動物の小サブセットは、ＥＡＥのより重度の徴候／症状を発症し、数匹のマーモセットは、予め決められたヒトエンドポイントに従うために安楽死が必要であった。安楽死を必要とした各群の動物数は次のとおりである：群Ａ(２)；群Ｂ(１)；Ｃ群(１)；Ｄ群(０)；Ｅ群(０)。
【０２８８】
ＥＡＥ症状の結果、人的理由のために安楽死させた動物は、安楽死時に臨床的重症度スコア“４”を割り当て、群平均臨床的重症度スコアを計算する目的で、実験の残り期間も維持した。図１２は、実験経過中の各群の平均臨床的重症度スコアを示す。群Ａ(ＰＢＳ)は、実験の最後までにピークスコア約１.６に達した。他の全群は低い臨床スコアを示し、Ｅ群(ＩＬ−２３／１７  ＡＦ  ｂＡｂ)が、ＥＡＥ疾患の何らかの徴候が明らかであった短い期間(〜１週間)のみ示した。各群の限られた動物数および群内のＥＡＥ疾患スコアの動物間可変性のために、群Ａ(ＰＢＳ)と他の処置群の間のいずれの差も統計学的有意ではなかった(マンホイットニーＵ検定)。
【０２８９】
要約すると、この実験は評価した数種の化合物によるマーモセットＥＡＥモデルの疾患重症度の減少および疾患発生率の減少の傾向を示した。全体として、ＩＬ−２３／１７  ＡＦ  ｂＡｂ(ＩｇＧ４.１ｋ)で処置した動物は、最も有益な結果を経験したと考えられるが(図１２)、群間の差は統計学的有意ではなかった。ＩＬ−２３／１７  ＡＦ  ｂＡｂで処置した動物がＩＬ−２３  ｍＡｂのみで処置した動物よりも良好に保護されるとの治験は、ＩＬ−２３経路およびＩＬ−１７ＡＦ経路両方のデュアルターゲティングが、多発性硬化症を含むが、これに限定されないこれらのサイトカイン経路が役割を有するヒト疾患の処置に大きな効果をもたらすことを示唆する。
【０２９０】
死後ＭＲＩ
実験の最後に、生存していたマーモセットを剖検した。頭蓋冠を除去し、脳を、原位置でホルマリン中３週間固定した。白質および視索における病巣を評価するために、Ｔ２Ｗおよびプロトン密度ＭＲＩ走査を、次のパラメートを使用して、７２mm  Quad RFコイルを用いるBruker Biospec 7Tシステムで行った：総走査時間〜１５〜２０分／サンプル、２３軸位像を集めた、ＴＲ／ＴＥ＝５０００／２０ms、スライス厚＝１.２mm、ＦＯＶ＝４cm、マトリクス＝２５６×２５６、面内解像度＝１５６mm２。
【０２９１】
走査を審査し、半定量的解釈を、各群の動物の全ＭＲＩ画像の審査後、３名の放射線科医の解読の合意により行った。病巣採点法は、全脳を覆う白質における病巣数に基づいた。視神経採点法は、視索および神経における炎症を反映する腫脹およびシグナル強度増加に基づいた。
【０２９２】
全体として、媒体群と比較してＩＬ−２３／１７  ＡＦ  ｂＡｂ群で病巣負荷の有意な(ｐ＜０.０５)が観察された(図１３)。視索スコアも、媒体と比較してＩＬ−２３／１７  ＡＦ  ｂＡｂ群で有意に減少した(図１４)。他の処置群は、これらのＭＲＩ測定のいずれでも媒体処置群と有意に異ならなかった。それゆえに、臨床疾患スコアに一致して、ＩＬ−２３／１７  ＡＦ  ｂＡｂで処置した動物群が、最低平均ＭＲＩ値を有し、同様に、ＩＬ−２３経路およびＩＬ−１７ＡＦ経路両者のデュアルターゲティングがヒトにおける疾患の処置で大きな効果をもたらすことが示唆される。
【０２９３】
実施例９
ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆエピトープマッピング
本実施例９に記戴した分析は、ｂｉＡｂ３(配列番号１３に示す重鎖可変ドメインおよび配列番号９に示す軽鎖可変ドメイン)のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティが結合するＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆのエピトープ残基の同定を目的とする。
【０２９４】
ｂｉＡｂ３とマウス親(３３９.１５.５.３)のエピトープ間の重要な差異を同定するためのストラテジーは、変異体を分析するためのＸ線結晶解析、部位特異的変異誘発、インシリコ変異誘発ならびに結合および機能アッセイを利用する。ｂｉＡｂ３のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティの重鎖可変ドメインは、クローン３３９.１５.５.３、クローン３３９.１５.３.６またはクローン３３９.１５.５.３の重鎖可変ドメインのヒト化バージョンである。ｂｉＡｂ３とクローン３３９.１５.５.３、クローン３３９.１５.３.６またはクローン３３９.１５.５.３のＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合エンティティの重鎖ＣＤＲ残基は同一である。しかしながら、２個のｍＡｂは、その重鎖可変ドメインフレームワーク領域が異なる。２個のｍＡｂは異なる軽鎖を有し、それゆえに各ｍＡｂの軽鎖と接触するＩＬ−１７の残基を本実験で焦点を当てた。
【０２９５】
Ｘ線結晶解析
ＩＬ１７Ａ  Ｆａｂ複合体およびＩＬ１７Ｆ  Ｆａｂ複合体の結晶解析を、エピトープ／パラトープ残基予測および埋没表面決定のための接触表面モデリングのための接触界面残基を決定するために実施した。三次元構造も、モデル化結晶構造複合体に基づくタンパク質変異体エネルギー計算のために使用した。
【０２９６】
各抗体のＦａｂを大腸菌株ＢＬ２１(ヒト化３３９−１３４)またはＢＬ２１  Ｓｔａｒ(ＢｉＡｂ)でクローン化し、ペリプラズムで発現させた。両者の精製は、ＩＭＡＣと続くＳＥＣを含んだ。ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆを大腸菌株Ｗ３１１０で封入体として発現させ、再折りたたみし、その後数工程の精製を行った。
【０２９７】
ｂｉＡｂ３(配列番号１３の重鎖可変ドメインおよび配列番号１５の重鎖ＣＨ１ドメイン；および配列番号１７の軽鎖)の  ＩＬ−１７アーム由来のＦａｂおよび親のヒト化リード(ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体３３９−１３４  ｍＡｂ(配列番号６５および配列番号６７)由来のＦａｂを、ヒトＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７Ｆと複合体化した。ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７ＦとＢｉＡｂ３およびヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体３３９−１３４  ｍＡｂの複合体形成をＳＥＣでモニターした。
【０２９８】
各４種の複合体の共結晶を、広範なスクリーニングと続く結晶化条件の最適化により作製した。各サンプルのデータセットを、ＡＰＳ  ＬＳ−ＣＡＴビームラインで集めた。
【表３３】
0006362587.tif 000034
【０２９９】
各構造を、CCP4 suiteのPhaser MRを使用した分子置換により決定した。ＩＬ−１７Ａ検索モデルはPDB ID 2VXS由来であった。ＩＬ−１７Ｆ検索モデルはPDB ID 1JPYから取った。各Ｆａｂについて、検索モデルを、超可変ループを欠失させたPDB ID 3IDX由来のヒト化Ｆａｂを使用して定常ドメインおよび可変ドメインについて作製した。最終モデルを、CootにビルドしたREFMAC5および手動モデルにおける繰り返しの精密化の後に得た。さらに、Autobusterでのさらなる精密化および地図作製を、低解像度構造の全てのモデル構築および精密化のために行った。データ採取および精密化のための結晶学的な統計を、表３４にヒト化親Ｆａｂ構造についておよび表３５にヒト化リードＦａｂ構造について示す。各構造を、社内サーバーで起動させるためにダウンロードしていたMolProbityを使用して、配置について評価した。
【０３００】
【表３４】
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【０３０１】
【表３５−１】
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【表３５−２】
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【０３０２】
各Ｆａｂは、主にＩＬ−１７ホモ二量体の主に一半部位に、主にその重鎖を介しておよび程度は少ないが軽鎖を介して結合した。ヒト化親およびヒト化リードＦａｂの結合の差異は、ヒト化リードＦａｂの高い親和性と一致するように見える。
【０３０３】
全体的に、ＩＬ−１７／ＢＭＳ  Ｆａｂ複合体の各々は同じ全体的構造を示し、１個のＦａｂが主にＩＬ−１７ホモ二量体の一半部位を認識した(図１５)。それゆえに、結合化学量論は、結晶学上２個のＦａｂ対１個のＩＬ−１７ホモ二量体(または２個のＦａｂ対２個のＩＬ−１７プロトマー)であることが示される。インターロイキンとの相互作用の大部分は、重鎖と、抗体−抗原相互作用の心臓部を形成する超可変ループ３(または相補性決定領域ＣＤＲ３)との間で形成される。さらに、重鎖のＣＲＤ２の数個の残基がインターロイキンと相互作用する。重鎖のＣＤＲ１は、インターロイキンと意味のある相互作用はしないように見える。軽鎖について、ＣＤＲ３は、ＩＬ−１７の認識に関与する。軽鎖のＣＤＲ１も弱い、長距離の結合相互作用を提供するように見える。
【０３０４】
結晶構造配位を使用して、先に記戴されたとおり接触界面を定義し(S. Sheriff., “Some Methods for Examining the Interaction between Two Molecules,” Immunomethods, 3:191-196 (1993))、そこでは、接触残基を規定する最小の定義は、CONTACSYMのプログラムから導いた(Sheriff, S., Hendrickson, W.A., and Smith, J.L. (1987). Structure of Myohemerythrin in the Azidomet State at 1.7/1.3 Å Resolution. J. Mol. Biol. 197, 273-296)。相互作用により少なくとも一部埋没している残基を規定する接触面の定義は、プログラムMSから導いた(Connolly, M.L. (1983). Analytical Molecular Surface Calculation. J. Appl. Crystallogr. 16, 548-558)。
【表３６】
0006362587.tif 000038
アスタリスク(＊)を付した残基は、複合体接触面で接触する。
アスタリスクのない残基は、複合体接触界面で完全に埋没する。
【０３０５】
ＦａｂとＩＬ−１７Ａ(配列番号２)の主相互作用は、残基Ｌ９７およびＨ１０９〜Ｎ１１１の残基のストレッチであるように見える(図１５)。Ｉ１００、Ｇ９８、Ｎ１１１、Ｓ１１２、Ｖ１１３およびＰ１１４は、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆで保存されている(配列番号２またはＩＬ−１７Ａのアミノ酸残基Ｉ１００、Ｇ９８、Ｎ１１１、Ｓ１１２、Ｖ１１３およびＰ１１４は、配列番号４またはＩＬ−１７Ｆのアミノ酸残基Ｉ１０８、Ｇ１０６、Ｎ１１９、Ｓ１２０、Ｖ１２１およびＰ１２２に対応する)。それゆえに、この初期構造を得た後、ヒト化親Ｆａｂ  Ａ３０５２Ｆが、ＩＬ−１７Ａで見られたものと本質的に同じ方法でＩＬ−１７Ｆに結合すると予測した。しかしながら、これらの残基付近に、ＩＬ−１７ＡのＫ９３(１７ＦのＱ１０１)、ＩＬ−１７ＡのＨ９５(１７ＦのＮ１０４)、ＩＬ−１７ＡのＹ１０８(１７ＦのＩ１１６)およびＩＬ−１７ＡのＨ１０９(１７ＦのＳ１１７)のようなＩＬ−１７Ａ(配列番号２)とＩＬ−１７Ｆ(配列番号４)で異なる数残基がある。ＩＬ−１７Ａ(配列番号２)のＣ末端もまた残基Ｐ１４９およびＩ１５０を介してＦａｂと結合するように見え、これらの残基はＩＬ−１７Ｆ(配列番号４)の残基Ｐ１５７およびＶ１５８に対応する。しかしながら、ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆの差異は、全体的抗体−抗原相互作用を顕著に変えるとは予測されなかった。
【０３０６】
２.８５Å解像度のヒト化親Ｆａｂとの比較において、３.４Å解像度のヒト化リードＦａｂは、同じ重鎖配列により予測されるとおり、重鎖とインターロイキンの間の極めて類似した相互作用を示した。対照的に、これら２種のＦａｂの軽鎖は完全に異なり、予想どおり、これらの残基は、異なる方法でインターロイキンと統合した。ｂｉＡｂ  Ｆａｂは、ＣＤＲ３の残基が１個少なく、それにより、ループがインターロイキン上を伸びることが可能となり、ｂｉＡｂ  ＦａｂのＧ９３の主鎖酸素(配列番号９のＧ９３または配列番号２７のＧ４)が、配列番号２(ＩＬ−１７Ａ)のＹ１０８の主鎖窒素と直接水素結合を形成することが可能となる。同じ原子(ヒト化親Ｆａｂにおける配列番号６７のＮ９１の主鎖酸素)は、親Ｆａｂにおける位置から２.３Å離れ、インターロイキンと水素結合することが不可能であった。さらに、ＷＮからＹＧへの変化は、ＣＤＲ１のＹ３３(配列番号９のＹ３３)が、低親和性親Ｆａｂにおけるその位置に対して５.１Å近くインターロイキンに接近でき、それによりＩＬ−１７Ａ(配列番号２)のＨ１０９とさらなるパッキング相互作用を得る。最終的に、ｂｉＡｂ  ＦａｂのＹ９６(配列番号９のＹ９６)は、重鎖のＮ１０６(配列番号１３のＮ１０６)と水素結合を形成でき、インターロイキン(ＩＬ−１７Ａ)のＹ１０８(配列番号２のＹ１０８)主鎖酸素との水素結合での整列を可能とする。全体として、ｂｉＡｂ  ＦａｂのＣＤＲ３の接触面におけるこれらの変化はその高親和性と一致し、下に示すとおり部位特異的変異誘発により試験している。
【０３０７】
不運なことに、結晶構造は、マウス親ＦａｂとＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７Ｆからなる複合体で得られなかった。これは、これらの複合体の相互作用の最適化の条件が、ヒト化親およびリードＦａｂの好結果の結晶化に使用したものと異なることを示唆する。
【０３０８】
個々の残基接触の解釈に加えて、インターロイキンに結合するヒト化親ＦａｂとｂｉＡｂの差異の他の指標を、ＩＬ１７／Ｆａｂ複合体の相互作用領域により埋没した総表面積の計算によりキャプチャーできる。この分析は、最高解像度であり、最も信頼性のある比較ができるはずであるため、ＩＬ−１７Ａ  Ｆａｂ複合体のＭＳアルゴリズムを使用して、実施した。ＩＬ−１７Ｆを伴う２個の構造は３.５Åを超え、この分析で信頼性があるとは見なされなかった。親Ｆａｂは、ＩＬ−１７Ａ上で７２０Å２埋没し、一方ｂｉＡｂ  Ｆａｂは８２０Å２埋没した(表３７参照)。表面積のこの差異(１００Å２)は、ＩＬ−１７Ａに対するリードＡｂの増加した測定結合親和性により支持される。興味深いことに、多くのアミノ酸について伸長側鎖配座による表面積は１００Å２未満である(Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｖ)(Atlas of Protein Side-Chain Interactions V1. Singh and Thornton 1992, 6-11参照)。したがって、この測定全体で、リードと親構造のＩＬ−１７Ａ上の結合エピトープ差異は、約１残基当量というべきである。
【表３７】
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【０３０９】
アラニンシェーブ変異体のコンピューターによるエピトープ予測および設計
親およびリードＦａｂの結合動態に対するＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆエピトープ残基の異なる貢献を詳細に特徴付けるために、Ｘ線結晶解析により同定した結合接触面における残基を、ヒト親ｍＡｂおよびｂｉＡｂの結合差異をさらに区別化するために部位特異的変異のために選択した。
【０３１０】
一分子上の個々のおよび複数変異の選択のために多様な基準を用いて、試験用の代表的および情報的変異体の組を選択した。上に記戴したＩＬ−１７Ａ／親Ｆａｂ、ＩＬ−１７Ｆ／リードＦａｂの結晶構造を、変異すべき残基の選択の情報のために使用した。リガンド−Ｆａｂ相互作用接触面の残基を選択したが、Ｆａｂ軽鎖残基と接触している残基に焦点を当てた。１個のＦａｂでは結晶構造の定義が不十分であるが、他では十分である領域も、親対ｂｉＡｂとの複合体内の残基移動度における差異を示唆し得るために、選択した。さらに、相同ＩＬ−１７  Ａ／Ｆ残基が異なる残基位置も、Ｆａｂ結合の変化に対する耐容性を示し得るためまたは親およびｂｉＡｂ  Ｆａｂに対する異なる結合親和性に貢献し得るために選択した。接触面を、親対ｂｉＡｂ  Ｆａｂとの複合体におけるエネルギー差異を探すために、提案された変異体を用いてモデル化した。接触残基群(アラニンシェーブ変異体)を併せて、結合親和性に相加的または相乗的変化を有する変異体を作製した。実験的分析のために製造した各インターロイキンの変異体を表３８および３９に示す。
【０３１１】
【表３８】
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【０３１２】
【表３９】
0006362587.tif 000041
【０３１３】
ＩＬ−１７ＡおよびＦエピトープマッピングアラニン変異体のクローニングおよび発現
ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆの変異体構築物を遺伝子合成により製造し、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞での発現のために一過性トランスフェクションベクターにクローン化した。１×１０６細胞／mlの３０mL培養物のＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に、発現プラスミド／ＰＥＩ複合体を遺伝子導入し、細胞をトランスフェクション１２０時間後に採取した。
【０３１４】
ＩＬ−１７ＡおよびＦ変異体のBiacore濃度分析
ＨＥＫ採取上清におけるＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆの各アラニン変異体の濃度を、抗ｈｉｓ  Ｆａｂ  Biacoreセンサー表面上の捕捉レベルにより定量した。プロテインＡおよびｈｕＩｇＧ表面も、上清の非特異的結合を評価するための対照として固定化した(非特異的結合は観察されなかった)。各上清の濃度を、８０μg／mL〜０.０３９μg／mLの範囲の精製ＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓまたはＩＬ−１７Ｆ−ｈｉｓの標準曲線を使用して定量した。検量線を、０.３１２５〜０.００３９μg／mLのデータについて線形曲線に適合させた。上清を１：２０、１：６０および１：１８０希釈で流し、標準曲線の線形範囲での複数測定を可能とした。
【０３１５】
ＩＬ−１７Ａ変異体８の発現は有意に減少した(野生型の発現レベルのわずか約１０％)。ＩＬ−１７Ｆ変異体Ｍ２、Ｍ３、Ｍ７およびＭ９の発現は有意に減少していた。ＩＬ−１７ＦのＭ９変異体は実質的に検出不可能であり、ＩＬ−１７ＦＭ２およびＭ７変異体は、野生型発現レベルの５％未満であった。
【表４０】
0006362587.tif 000042
【０３１６】
ＩＬ−１７バイオアッセイ(ＮＩＨ／３Ｔ３／ＫＺ１７０  ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ)
マウス線維芽細胞株(ＮＩＨ／３Ｔ３、ATCC# CRL-1658)にＫＺ１７０と命名されたＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターを安定に遺伝子導入し、クローンアウトした(cloned out)。ＮＩＨ／３Ｔ３／ＫＺ１７０クローン１細胞を、１０,０００細胞／ウェルで、９６ウェル白色不透明ルシフェラーゼプレートに添加し、一夜、３７℃でインキュベートした。翌日、Biacore決定濃度を使用した、組み換えヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ａアラニン変異体およびＩＬ−１７Ｆアラニン変異体の連続希釈をアッセイ培地中に調製し、細胞を入れたプレートに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、細胞を溶解し、Berthold Centro XS3 Luminometerで、製造業者の指示に従いフラッシュ基質を使用して測定した。平均蛍光強度の増加(ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター活性化による)はＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７Ｆ受容体−リガンド相互作用の指標であった。ＥＣ５０(５０％有効濃度)値を、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆアラニン変異体について各GraphPad Prism(登録商標)４ソフトウェアで計算した。
【０３１７】
ＩＬ−１７Ａ変異体の全て細胞機能的活性を示したが、幾つかは、野生型に対して活性が数倍喪失した(図１６)。Ｍ３以外の全ＩＬ−１７Ｆ変異体は、細胞機能的活性を示したが、変異体中３種(Ｍ２、Ｍ５、Ｍ１０)は活性の有意な減少を示した(図１７)。
【０３１８】
ＢｉＡｂ３および他の関連抗体への結合についてのＩＬ−１７ＡおよびＦ変異体のBiacore結合分析
Biacore結合アッセイで使用した抗体は、ｂｉＡｂ３(配列番号７に示す重鎖可変ドメインおよび配列番号９に示す軽鎖可変ドメイン)およびマウス親抗体３３９.１５.５.３(３３９.１５.３.５および３３９.１５.３.６と同じ可変領域配列を含む)であった。ISOSTRIP Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Roche, Indianapolis, IN, USA)を使用したアイソタイピングは、３３９.１５.５.３抗体がヒト化に使用した３３９.１５.３.５と同様ＩｇＧ２ａ／カッパであることを証明した。配列またはアイソタイプ差異は、３３９.１５.３.５および３３９.１５.５.３の間で測定されなかった。
【０３１９】
全１２種のＩＬ−１７Ａおよび１０種のＩＬ−１７Ｆアラニン変異体の３０mL発現からの上清およびそれぞれの野生型対照上清の結合(表４１および表４２参照)を、ＨＢＳ−ＥＰ(１０mM  ＨＥＰＥＳ、３mM  ＥＤＴＡ、１５０mM  ＮａＣｌ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７.４)中、Biacore T100で２５℃の表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ、Biacore))により測定した。関連抗体および受容体は、ＣＭ５センサーチップ上に３０００ＲＵで固定化されたプロテインＡにより約１５０〜２５０ＲＵレベルで捕捉された。ｂｉＡｂ３および親ｍＡｂ(３３９.１５.３.５)に加えて、他の抗ＩＬ−１７  ｍＡｂをドメイン結合の対照として使用した。さらに、ＩＬ−１７Ａの市販受容体を対照として使用した。ｈＩＬ−１７ＲＡ−Ｆｃ(R&D Systemsから)、しかし、適切なＩＬ−１７ＲＣ試薬はこのアッセイについて同定されなかった。上清を抗ｈｉｓ定量決定濃度に基づき、９nM濃度にＨＢＳ−ＥＰで希釈し、１：３連続希釈し、３０μL／分でｍＡｂ上または受容体表面に９０秒注入し、解離時間後、１０mM  グリシン、ｐＨ１.５で再生した。ＩＬ−１７ＡＭ２およびＩＬ−１７ＦＭ１も、ｂｉＡｂ捕捉表面で結合シグナルがわずかしか観察されなかったかまたはまったく観察されなかったため、高濃度(上清の発現レベルで４００〜５００nM範囲)で流した。分析前に、捕捉抗体がないプロテインＡの対照表面に対する結合を全特異的結合曲線から減算した。全滴定曲線を１：１ラングミュア結合モデルに適合させ、図１８および表４１および４２に示すkD値を決定した。
【０３２０】
Biacore結果は、ＩＬ−１７Ａ変異体Ｍ１、Ｍ２、Ｍ６、Ｍ１０およびＭ１１がＢｉＡｂに対する結合親和性の減少を示し、親抗体と比較して結合エピトープ差異に寄与する残基を含むことを証明した。これらの変異体のほとんどは、恐らく、受容体結合部位が変えられているために、ＩＬ−１７ＲＡ−Ｆｃに対する結合で３〜１５倍の減少(Ｍ１では４５倍)を示した。しかしながら、細胞性潜在力は、ＢｉＡｂ３相互作用に影響を受けた全変異体で数倍以内で維持され、これらの受容体破壊が機能のために重要ではないことを示唆した。
【０３２１】
ＩＬ−１７Ｆ変異体Ｍ１、Ｍ２、Ｍ７およびＭ８は、ｂｉＡｂに対する結合親和性の減少を示したが、しかしながらこれらの同じ変異体は、親抗体に対する結合親和性の同等な減少を示し、ＩＬ−１７Ａにおける親とｂｉＡｂの間のエピトープ変化がＩＬ−１７Ｆに翻訳されないことを示す。これらの４種の変異体は、細胞機能アッセイにおいて野生型ＩＬ−１７Ｆと同様の能力を維持したが、しかしながら他の変異体の多くはそうではなく、これは我々のＩＬ−１７Ｆ変異誘発の解明を制限した。
【０３２２】
【表４１】
0006362587.tif 000043
【０３２３】
【表４２】
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ＮＭ  −  変異体が検出可能レベルで発現されなかったため測定せず。
【０３２４】
インシリコ変異誘発
エネルギー分析をＩＬ−１７Ａ−親Ｆａｂ、ＩＬ−１７Ａ−リードＦａｂおよびＩＬ−１７Ｆ−リードＦａｂで行った。複合体のＸ線構造が不完全であったため、タンパク質モデリングを使用して、標準的プロトコルを使用した欠損アミノ酸側鎖において構築することにより構造モデルを完全にした(Maestro protein preparation wizard and Prime side chain modeling)。構造モデルを使用して、野生型タンパク質(ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７Ｆ)または変異体ＩＬ−１７分子とＦａｂの相互作用エネルギーを計算した。相互作用エネルギーは、計算されたＦａｂのＩＬ−１７(リガンドとして処理)への親和性の指標である。変異体タンパク質の安定性およびデルタ安定性を計算するために、ソフトウェアMOE(ver. 2012.10, Chemical Computing Group)を使用した。コンピューターによる部位特異的変異誘発のために残基スキャニングプロトコルを使用して変異を作製し、親和性および安定性計算を行った。
【０３２５】
コンピューターによる予測結合エネルギーと、ＩＬ−１７Ａ変異体に対するBiacore親和性から決定された計算されたΔΔＧ値の比較を図１９に示す。図１９に同定するＩＬ−１７Ａ変異体のラベルは誤っている。図１９に同定したＩＬ−１７Ａ変異体の配列番号２ナンバリングは、本来より少ない。変異体は、表３８に同定したとおりである。例えば、図中、Ｎ１０４Ａ、Ｙ１０７ＡおよびＨ１０８ＡはＮ１０５Ａ、Ｙ１０８ＡおよびＨ１０９Ａであるべきである等である。この比較は、一団の変異体のBiacoreエネルギーの傾向が、結合接触面のコンピューターによるエネルギー予測と一致することを示す。マウス親へのＩＬ−１７Ａ結合の分析は、該複合体が結晶化に失敗し、許容されるモデルが作製できなかったために不可能であった。ＩＬ−１７Ｆ変異体のＢｉＡｂ３への結合の結果を作成する試みにおいて、恐らく、これらに使用した構造の解像度が低く、必要な残基情報が欠損していたため、不一致な結果が生じた。
【０３２６】
ＩＬ−１７Ａ＆Ｆエピトープマッピングの要約
ＢｉＡｂ３およびマウス親(３３９.１５.５.３)のエピトープの間の重要な差異を同定するストラテジーは、Ｘ線結晶解析、部位特異的変異誘発、インシリコ変異誘発ならびに変異体を分析するための結合および機能アッセイを利用した。２個のｍＡｂは軽鎖が異なり、それゆえに各ｍＡｂの軽鎖と接触している残基を実験の焦点とした。
【０３２７】
ＩＬ−１７Ａ変異誘発は、良好な発現および合理的細胞性潜在力を有する変異体をもたらした。ｂｉＡｂ３への結合についてΔΔＧの有意な変化が、Ｙ１０８Ａを含む全変異体で測定され、０.５kcal／mole変化がＹ１０８単一点変異体で測定された。ΔΔＧにおけるこれらの変化はマウス親抗体への結合では観察されず、Ｙ１０８がマウス親ｍＡｂと比較してｂｉＡｂ３のＩＬ−１７Ａのエピトープにおける新規残基であることが示唆される。エネルギーデータは、結晶構造の接触面分析と一致し、この残基がマウス親と比較してｂｉＡｂ３で異なる軽鎖と相互作用し、Ｙ１０８Ａがマウス親と比較してｂｉＡｂ３軽鎖のＣＤＲ３の差異によりｂｉＡｂ３により近くなることを示す。マウス親抗体の結合への影響があることが示された唯一のＩＬ−１７Ａ変異体は、重鎖残基と相互作用するものであり、軽鎖がマウス親抗体のＩＬ−１７Ａへの結合にあまり役割を果たしていないことを示す。
【０３２８】
ＩＬ−１７Ｆ変異誘発は、はるかに可変であり、発現レベルが低く、効力が有意に喪失した変異体の一団をもたらした。ＩＬ−１７Ｆで得た結晶構造もＩＬ−１７Ａ構造よりも解像度が悪かった。これは、ＩＬ−１７Ｆが変異誘発を受け入れる余地がなく、潜在的により動的な性質であることを示唆する。しかしながら、ｂｉＡｂ３への結合が減少した変異体はまたマウス親ｍＡｂへの結合も減少した。そして、ｍＡｂ結合が減少したこれら全ての変異体は合理的な効力のものであり、低いが、分析に十分な、発現レベルであった。
【０３２９】
前記から、本発明の具体的態様を説明の目的でここに記戴しているが、種々の修飾を本発明の精神および範囲から逸脱することなくなし得ることは認識される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による以外に限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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