(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳卒中または虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病または筋萎縮性側索硬化症の予防および／または治療のための医薬組成物または薬剤の製造のための、化合物(E)-N-((8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H,6H,10H)-イリデン)メタンアミンオキシド(F2)および／または化合物(Z)-N-((8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H,6H,10H)-イリデン)メタンアミンオキシド(F3)の使用。
【請求項２】
脳虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症などの神経疾患の治療に適した第一選択療法に関して、同時に、別々にまたは連続的に投与されるアジュバント療法としての使用のための薬剤の製造のための、化合物(E)-N-((8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H,6H,10H)-イリデン)メタンアミンオキシド(F2)および／または化合物(Z)-N-((8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H,6H,10H)-イリデン)メタンアミンオキシド(F3)の使用。
【請求項３】
脳虚血または脳卒中の治療に適した血栓溶解剤に関して、同時に、別々にまたは連続的に投与されるアジュバント療法としての使用のための薬剤の製造のための、化合物(E)-N-((8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H,6H,10H)-イリデン)メタンアミンオキシド(F2)および／または化合物(Z)-N-((8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H,6H,10H)-イリデン)メタンアミンオキシド(F3)の使用。
【請求項４】
該血栓溶解剤が、組織プラスミノーゲン活性化因子(rt-PA)または組換え組織プラスミノーゲン活性化因子(rt-PA)である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
神経保護能力を有し、脳虚血、アルツハイマー病およびパーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症などの神経疾患のための可能性のある効果的な治療を引き起こす化合物を同定し、評価する方法であって、以下のステップ：
a．1種以上の式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロン誘導体およびその二重結合R4N(O)=C(3)におけるEおよびZ幾何異性体：
0006424212.tif 000011
[式中、
R1は、独立して、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、α-ヒドロキシケトン、α-メチルケトン、またはヒドロキシル基、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミンを表す；
R2は、水素原子、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミン、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R3は、水素原子、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R4は、メチル、t-ブチルまたはベンジル基を表す]
ならびに該化合物の医薬的に許容しうる異性体、水和物、塩、多形体およびプロドラッグを選択すること；
ｂ．式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンの神経保護活性の決定を可能にするモデルまたはアッセイを用いて、該活性を決定すること；
ｃ．該神経保護活性を参照化合物または参照値と比較すること；および
ｄ．最大の活性をもつ化合物を選択すること；
を含む方法。
【請求項６】
神経保護能力を有し、脳虚血、アルツハイマー病およびパーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症などの神経疾患のための可能性のある効果的な治療を引き起こす化合物を得る方法であって、以下のステップ：
ａ．1種以上の式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロン誘導体ならびにその二重結合R4N(O)=C(3)におけるEおよびZ幾何異性体：
0006424212.tif 000012
[式中、
R1は、独立して、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、α-ヒドロキシケトン、α-メチルケトン、またはヒドロキシル基、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミンを表す；
R2は、水素原子、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミン、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R3は、水素原子、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R4は、メチル、t-ブチルまたはベンジル基を表す]
ならびに該化合物の医薬的に許容しうる異性体、水和物、塩、多形体およびプロドラッグを選択すること；
ｂ．式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンの神経保護活性の決定を可能にするモデルまたはアッセイを用いて、該活性を決定すること；
ｃ．該神経保護活性を参照化合物または参照値と比較すること；および
ｄ．最大の活性をもつ化合物を選択すること；
ｅ．該選択された化合物を好ましくは実質的に純粋な形態で単離すること；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野、さらに詳しくは、脳卒中または虚血、アルツハイマー病およびパーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症の治療および予防のためのステロイド性ニトロンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質細胞膜酸化が、脳卒中の間に起こり、脳組織および神経細胞の死につながる最も重要な薬理学的事象の1つであることが知られている(Brouns、R.; De Deyn、P. P. The complexity of neurobiological processes in acute ischemic stroke.  Clin. Neurol. Neurosurg. 2009、111、483-495)。したがって、脳卒中の治療のための最も活発な領域の1つは、効率的な治療がなく、癌、冠状動脈性心臓病およびアルツハイマー病に次いで第4の死因である、先進社会における深刻かつ急速に増加する病態である脳卒中によって引き起こされる酸化ストレスの原因となるさまざまなタイプの酸素フリーラジカル(ROS)を遮断することができる強い坑酸化能力と強い神経保護作用を有する新たな透過性作用剤を探すことに焦点を合わせている(Chan、P. H. The role of oxygen radicals in brain injury and edema、in Chow CK(ed): Cellular Antioxidant Defense Mechanisms、Volume III. Boca Raton、Florida、CRC Press、Inc、1988、pp. 89-109)。実際に、ニューロン膜は、二重結合に隣接する位置にあるヒドロキシル、ペルオキシルおよびスーパーオキシド型ROSの作用に特に感受性があり、新たなラジカル連鎖反応、すなわち、新たなより複雑なラジカルを生み出すか、または鉄などの金属と相互作用して新たなさらに毒性の高い有害なラジカルを生成する能力がある非常に反応性のあるアリルラジカルを生成する多価不飽和脂肪酸に富んでいる。
【０００３】
この理由から、ROS捕捉および遮断剤の開発に基づく脳卒中に対して用いられる方策は、恒久的関心と研究の領域である。
【０００４】
このような状況において、ニトロン型の有機化合物は、それらの構造および特性を考慮して、ここ30年間に重要な役割を演じているが、残念ながら、広範な該化合物が試験に付された多くの臨床試験において、それらの推定される有利な活性は、確証されていない(Floyd、R. A.; Kopke、R. D. Choi、C. H.; Foster、S. B.; Doblas、S.; Towner、R. A. Nitrones as therapeutics. Free Radic. Biol. Med. 2008、45、1361-1374)。
【０００５】
その意味において、(Z)-α-フェニル-N-tert-ブチルニトロン(PBN)は、リポタンパク質の酸化を阻害し(Kalyanaraman、B.; Joseph、J.; Parthasarathy、S. The spin trap、α-phenyl N-tert-butylnitrone、inhibits the oxidative modification of low density lipoprotein FEBS Lett. 1991、280、17-20)、赤血球における酸化損傷、フェニルヒドラジンによる脂質か酸化を減少させ(Hill、H. A.; Thornalley、P. J. The effect of spin traps on phenylhydrazine-induced haemolysis. Biochim. Biophys. Acta 1983、762、44-51)、そして、虚血およびMPTP毒性からラットを保護する(Margaill、I.; Plotkine、M.; Lerouet、D. Antioxidant strategies in the treatment of stroke. Free. Radic. Biol. Med. 2005、39、429-443)。
【０００６】
ニトロンNXY-059(Kuroda、S.; Tsuchidate、R.; Smith、M. L.; Maples、K. R.; Siesjo、B. K. Neuroprotective effects of a novel nitrone、NXY-059、after transient focal cerebral ischaemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1999、19、778-787)は、優れた神経保護ROSトラップであるが、臨床試験には再三にわたり失敗している(Macleod、M. R.; van der Worp、H. B.; Sena、E. S.; Howells、D. W.; Dirnagl、U.; Donnan、G. A. Evidence for the efficacy of NXY-059 in experimental focal cerebral ischaemia is confounded by study quality. Stroke 2008、39、2824-2829)。
【０００７】
それにもかかわらず、最適なニトロンを見つけようとする努力は、中止されていない[(a)Goldstein、S.; P. Lestage、P. Chemical and pharmacological aspects of heteroaryl-nitrones. Curr. Med. Chem. 2000、7、1255-1267;(b)Dias、A. G.; Santos、C. E.; Cyrino、F. Z.; Bouskela、E.; Costa、P. R. N-tert-Butyl and N-methyl nitrones derived from aromatic aldehydes inhibit macromolecular permeability increase induced by ischemia/reperfusion in hamsters. Bioorg. Med. Chem. 2009、17、3995-3998;(c)Porcal、W.; P. Hernandez、P.; Gonzalez、M.; Ferreira、A.; Olea-Azar、C.; Cerecetto、H.; Castro、A. Heteroarylnitrones as drugs for neurodegenerative diseases: Synthesis、neuroprotective properties、and free radical scavenger properties. J. Med. Chem. 2008、51、6150-6159;(d)Kim、S.; Bouajila、J.; Dias、A. G.; Cyrino、F. Z.; Bouskela、E.; Costa、P. R.; Nepveu、F. α-phenyl-N-tert-butyl nitrone(PBN)derivatives: Synthesis and protective action against microvascular damages induced by ischemia/reperfusion. Bioorg. Med. Chem. 2007、15、3572-3578;(e)Balogh、G. T.; Vukics、K.; Konczol、A.; Kis-Varga、A.; Gere、A.; Fischer、J. Nitrone derivatives of trolox as neuroprotective agents. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005、15、3012-3015;(f)Becker、D. A.; Ley、J. J.; Echegoyen、L.; Alvarado、R. Stilbazulenyl nitrone(STAZN): A nitronyl-substituted hydrocarbon with the potency of classical phenolic chain-breaking antioxidants. J. Am. Chem. Soc. 2002、124、4678-4684;(g)Dhainaut、A.; Tizot、A.; Raimbaud、E.; Lockhart、B.; Lestage、P.; Goldstein、S. Synthesis、structure、and neuroprotective properties of novel imidazolyl nitrones. J. Med. Chem. 2000、43、2165-2175]。
【０００８】
一方、ステロイドは、認識された生物活性を有する有機化合物であり、それらの活性のうち、中枢神経系に影響を及ぼす炎症過程における神経保護剤として作用する能力は、突出し、脳虚血、アルツハイマー病およびパーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症などの神経疾患につなげられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の記載
脳卒中の治療のための新たなニトロンの合成および生物学的評価を目的とする最近の調査[(a)Abdelouahid、S.; Soriano、E.; Revuelta、J.; Valderas、C.; Chioua、M.; Garrido、I.; Bartolome、B.; Tomassolli、I.; Ismaili、L.; Gonzalez-Lafuente、L.; Villarroya、M.; Garcia、A. G.; Oset-Gasque M. J.; Marco-Contelles、J. Synthesis、structure、theoretical and experimental in vitro antioxidant/pharmacological properties of α-aryl、N-alkyl nitrones、as potential agents for the treatment of cerebral ischemia. Bioorg. Med. Chem. 2011、19、951-960;(b)Chioua、M.; Sucunza、D.; Soriano、E.; Hadjipavlou-Litina、D.; Alcazar、A.; Ayuso、I.; Oset-Gasque、M. J.; Gonzalez、M. P.; Monjas、L.; Rodriguez-Franco、M. I.; Marco-Contelles、J.; Samadi、A. α-Aryl-N-alkyl Nitrones、as Potential Agents for Stroke Treatment: Synthesis、Theoretical Calculations、Antioxidant、Anti-inflammatory、Neuroprotective and Brain-Blood Barrier Permeability Properties、J. Med. Chem. 2012、55、153-168;(c)Arce、C.; Diaz-Castroverde、S.; Canales、M. J.; Marco-Contelles、J.; Samadi、A.; Oset-Gasque、M. J.; Gonzalez、M.P. Drugs for stroke: Action of nitrone(Z)-N-(2-bromo-5-hydroxy-4-methoxybenzylidene)-2-methylpropan-2-amine oxide on rat cortical neurons in culture subjected to oxygen-glucose-deprivation. Eur. J. Med. Chem. 2012、55、475-479]に照らして、そして、上記現在の先行技術に基づいて、「ステロイド」モチーフともう1つの「ニトロン」モチーフを組み合わせ、並置する研究室において、ハイブリッド分子が開発され、「ステロイド性ニトロン」と称する新たな化学種が得られている。
【００１０】
ステロイド性ニトロンは、長年知られているが[(a)Weintraub、P. M.; Tiernan、P. L. ステロイド性ニトロン、J. Org. Chem. 1974、39、1061-1065;(b)Joseph、S. P.、Dhar、D. N. Reaction of chlorosulfonyl isocyanate with nitrones: An efficient method for the synthesis of cyclic enamides and 2H-pyrroles. Tetrahedron 1988、44、5209-5214;(c)Hwu、J. R.; Khoudary、K. P.; Tsay、S.-C. Selectivity of the bulky proton-containing reagent N-methyl-N,O-bis(trimethylsilyl)hydroxylamine in the formation of nitrones、J. Organometallic Chem. 1990、399、C13-C17;(d)Barton、D. H. R.; Day、M. J.; Hesse、R. H. A new rearrangement of ketonic nitrones: A convenient alternative to the Beckmann rearrangement. J. Chem. Soc.; Perkin Trans. 1975、1764-1767;(e)Barton、D. H. R.; Choi、L. S. L.; Lister-James、J.; Hesse、R. H. Preparation and reactions of steroidal cross-conjugated 3-nitrones. J. Chem. Soc.; Perkin Trans. 1982、2599-2606]、特定の疾患に対する確定した療法におけるその薬理活性および可能な適用は、驚いたことに、ほとんど活用および探求されていない [(a)Blasig、L. E.; Mertsch、K.; Haseloff、R. F. Nitronyl nitroxides、a novel group of protective agents against oxidative stress in endothelial cells forming the blood-brain-barrier、Neuropharmacology 2002、43、1006-1014;(b)Robinson、A. J.; of Lucca、I.; Drummond、S.; Bosewell、G. A. ステロイド性ニトロン inhibitors of 5α-reductase、Tetrahedron Lett. 2003、44、4801-4804]。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、この特許は、脳卒中または虚血、アルツハイマー病およびパーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症の治療のための可能性のある作用剤および薬物としての、血液脳関門に対する透過性が高い、神経保護作用、坑酸化作用を有する式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンならびにそのEおよびZ幾何異性体の使用を記載し、ここで、式(Ia-c)は、
0006424212.tif 000002
0006424212.tif 000003
0006424212.tif 000004
であり、式中、
R1は、独立して、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、α-ヒドロキシケトン、α-メチルケトン、またはヒドロキシル基、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミンを表す；
R2は、水素原子、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミン、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；
R3は、水素原子、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R4は、メチル、t-ブチルまたはベンジル基を表す。
【００１２】
化合物のこのファミリーの従来の例ではあるが非限定的な例は、以下の反応工程式にしたがって、N-メチルヒドロキシルアミンとの反応によって、4-コレステン-3-オンまたは5-コレステン-3-オンから製造される、
(E)-N-((8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H,6H,10H)-イリデン)メタンアミンオキシド(F2)および
(Z)-N-((8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H,6H,10H)-イリデン)メタンアミンオキシド(F3)である。
【００１３】
0006424212.tif 000005
【００１４】
さらに、本発明を通して例として言及する任意の化合物を、脳虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症などの神経疾患の治療に適した第一選択療法に関して、個別または併用で、特に、同時に、別々にまたは連続的に投与されるアジュバント療法として用いることができる。この意味において、血栓溶解剤として、同時に、別々にまたは連続的に投与される式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンは、脳虚血、特に、急性脳虚血の治療に特に適した療法をもたらす。
【００１５】
したがって、本発明の1つの態様は、脳虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症などの神経疾患の治療に適した第一選択療法に関して、同時に、別々にまたは連続的に投与されるアジュバント療法として用いるための、式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロン誘導体ならびにその二重結合R4N(O)=C(3)におけるEおよびZ幾何異性体を含む組成物に関し、ここで、式(Ia-c)は、
0006424212.tif 000006
であり、式中、
R1は、独立して、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、α-ヒドロキシケトン、α-メチルケトン、またはヒドロキシル基、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミンを表す；
R2は、水素原子、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミン、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R3は、水素原子、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R4は、メチル、t-ブチルまたはベンジル基を表す。ステロイド性ニトロン誘導体が、コレステロニトロンF2およびF3から選ばれるのが好ましい。
【００１６】
あるいは、本発明のこの態様は、脳虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症などの神経疾患の治療に適した第一選択療法に関して、同時に、別々にまたは連続的に投与されるアジュバント療法としての使用のための薬剤の製造のための前記と同意義のステロイド性ニトロン誘導体を含む組成物の使用に関する。ステロイド性ニトロン誘導体が、コレステロニトロンF2およびF3から選ばれるのが好ましい。
【００１７】
本発明のもう1つの態様は、脳虚血の治療に適した第一選択療法に関して、同時に、別々にまたは連続的に投与されるアジュバント療法としての使用のための薬剤の製造のための前記と同意義のステロイド性ニトロン誘導体、好ましくはコレステロニトロンF2およびF3から選ばれるステロイド性ニトロン誘導体を含む組成物に関し、ここで、最初または第一選択治療は、血栓溶解剤の使用、好ましくは組織プラスミノーゲン活性化因子(rt-PA)の使用を含む。
【００１８】
さらに、本発明は、迅速かつ必要に応じてロボットのように、神経保護能力を有し、脳虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症などの神経疾患のための可能性のある効果的な治療を引き起こす化合物を同定および評価する方法に関する。
【００１９】
式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロン誘導体ならびにその二重結合R4N(O)=C(3)におけるEおよびZ幾何異性体は、該薬物のスクリーニングを行うために用いられ、ここで、式(Ia-c)は、
0006424212.tif 000007
であり、式中、
R1は、独立して、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、α-ヒドロキシケトン、α-メチルケトン、またはヒドロキシル基、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミンを表す；
R2は、水素原子、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミン、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R3は、水素原子、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R4は、メチル、t-ブチルまたはベンジル基を表す。
【００２０】
式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンの神経保護活性を検証し、最大活性をもつ化合物の選択を可能にするために、それに適した任意のインビトロまたはインビボモデルまたはアッセイを用いて、それらの神経保護能力を決定する。該モデルまたはアッセイは、当業者には周知である；それにもかかわらず、単に例示として、式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンの神経保護活性を決定するための可能性があるアッセイは、細胞の生存が決定される、ラットの大脳皮質から採取された、6〜8日間培養される初代神経培養であり(Quevedo、C、Salinas、M、Alcazar、A. Initiation factor 2B activity is regulated by protein phosphatase 1、which is activated by the mitogen-activated protein kinase-dependent pathway in insulin-like growth factor 1-stimulated neuronal cells. J. Biol. Chem. 2003、278、16579-16586)、以下のプロトコルにしたがって、酸素-グルコース枯渇(OGD)に付される(Chioua M、Sucunza D、Soriano E、Hadjipavlou-Litina D、Alcazar A、Ayuso I、Oset-Gasque MJ、Gonzalez MP、Monjas L、Rodriguez-Franco MI、Marco-Contelles J、Samadi A. α-aryl-N-alkyl nitrones、as potential agents for stroke treatment: synthesis、theoretical calculations、antioxidant、anti-inflammatory、neuroprotective、and brain-blood barrier permeability properties. J Med Chem. 2012、55、153-168)：
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムを用いて、ブロミド(MTT)細胞の生存を測定する。このように、4時間のOGD(OGD 4時間)への神経培養物の曝露により、細胞の生存能力は67.3%(p＜0.0001 コントロール100%に対して、1標本検定)に有意に減少し、これは、再かん流の24時間後に部分的に戻ったが(R24時間、76.1%；p＜0.0022 OGD 4時間に対して、スチューデントのt-検定)、24時間の時点でコントロール値には到達しない(p＜0.0001 コントロール100%に対して、1標本t-検定)。この意味において、式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンの神経保護能力を評価するために、参照化合物として周知の神経保護剤であるシチコリンを用い、再かん流期間の開始時に、ニトロンを初代培養物に加える。シチコリンに対して、神経保護能力を有する式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンが選ばれる。
【００２１】
さらなる例示として、より高い神経保護能力を有する式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンを選択することを可能にする第二のモデルは、従来の４血管閉塞法にしたがって成体ラットにおける全脳虚血を誘発することによるモデルである[(a)Martin de la Vega C、Burda J、Nemethova M、Quevedo C、Alcazar A、Martin ME、Salinas M. Possible mechanisms involved in the down-regulation of translation during transient global ischaemia in the rat brain. Biochem J 2001、357、819-826;(b)Garcia-Bonilla L、Cid C、Alcazar A、Burda J、Ayuso I、Salinas M. Regulation proteins of eukaryotic initiation factor 2-alpha subunit(eIF2a)phosphatase、under ischemic reperfusion and tolerance. J Neurochem 2007、103、1368-1380;(c)Ayuso MI、Hernandez-Jimenez M、Martin ME、Salinas M、Alcazar A. New hierarchical phosphorylation pathway of the translational repressor eIF4E-binding protein 1(4E-BP1)in ischaemia-reperfusion stress. J Biol Chem 2010、285、34355-34363]。
【００２２】
したがって、2つの椎骨動脈を完全に焼灼し、24時間後、小さいクランプを用いる15分間の頸動脈閉塞によって虚血を誘発する；次いで、クランプを外し、再かん流を行う。5日後(R5d)、動物を犠牲にする。式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンの神経保護能力を決定するために、動物を再かん流期間の開始時から式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンで処置する。神経死によるストレス誘発性IRに関するステロイド性ニトロンの保護作用は、フルオロジェイドBを用いて観察することができ(Burda J、Matiasov M、Gottlieb M、Danielisov V、Nemethov M、Garcia L、et al. Evidence for a role of second pathophysiological stress in prevention of delayed neuronal death in the hippocampal CA1 region. Neurochem Res 2005、30、1397-1405)、蛍光顕微鏡下で見ることができる。これらの実験は、さまざまなステロイド性ニトロンが神経死を減少させるかどうかを明らかにし、したがって、より高い神経保護能力を有するステロイド性ニトロンを選択することができる。
【００２３】
したがって、本発明のさらなる態様は、迅速かつ必要に応じてロボットのように、神経保護能力を有し、脳虚血、アルツハイマー病およびパーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症などの神経疾患のための可能性のある効果的な治療を引き起こす化合物を同定し、評価する方法であって、以下のステップ：
1種以上の式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロン誘導体ならびにその二重結合R4N(O)=C(3)におけるEおよびZ幾何異性体：
0006424212.tif 000008
[式中、
R1は、独立して、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、α-ヒドロキシケトン、α-メチルケトン、またはヒドロキシル基、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミンを表す；
R2は、水素原子、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミン、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R3は、水素原子、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R4は、メチル、t-ブチルまたはベンジル基を表す]
を選択すること；
式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンの神経保護活性の決定を可能にするモデルまたはアッセイ、好ましくは本発明を通して説明される任意の方法またはアッセイを用いて、該活性を決定すること；
該神経保護活性を参照化合物または参照値と比較すること；および
最大の活性をもつ化合物を選択すること；
を含む方法に関する。
【００２４】
さらに、本発明のもう1つの態様は、迅速かつ必要に応じてロボットのように、神経保護能力を有し、脳虚血、アルツハイマー病およびパーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症などの神経疾患のための可能性のある効果的な治療を引き起こす化合物を得る方法であって、以下のステップ：
1種以上の式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロン誘導体ならびにその二重結合R4N(O)=C(3)におけるEおよびZ幾何異性体：
0006424212.tif 000009
[式中、
R1は、独立して、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、α-ヒドロキシケトン、α-メチルケトン、またはヒドロキシル基、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミンを表す；
R2は、水素原子、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル、置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第1級、第2級アミン；2つの置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有する第3級アミン、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R3は、水素原子、またはアシルオキシ基(OCOX)を表し、ここで、Xは、置換または非置換C1-C10アルキルラジカル、フェニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノまたは置換または非置換C1-C10アルキルラジカルを有するエーテル基で置換された芳香環、複素環式ピロール、ピリジン、インドール、フランまたはチオフェノール環でありうる；および
R4は、メチル、t-ブチルまたはベンジル基を表す]
を選択すること；
式(Ia-c)で示されるステロイド性ニトロンの神経保護活性の決定を可能にするモデルまたはアッセイ、好ましくは本発明を通して説明される任意の方法またはアッセイを用いて、該活性を決定すること；
該神経保護活性を参照化合物または参照値と比較すること；および
最大の活性をもつ化合物を選択すること；
該選択された化合物を好ましくは実質的に純粋な形態で単離すること；
を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】1または5 μMの濃度の、コレステロニトロンF3ではなくてコレステロニトロンF2の添加が、再かん流中にどのように有意に神経細胞の生存能力を増加させたかを示し、コントロール値(1または5 μMのコレステロニトロンF2についてそれぞれ89.1および95.5%; ANOVA、p＜0.0001；およびp＜0.01、R24hと比較したpost-Dunnett検定)は、ほとんど5 μMの濃度に達した。
【図２】R5d実験が、どのように細胞の生存能力の顕著な減少を誘発させたかを示す(77.7%; p＜0.0001 コントロールの100%に対して、1サンプルのｔ検定)。
【図３】コレステロニトロンF2で処置された動物が、どのように5日後実験(R5d)においてCA1領域(CA1)におけるアポトーシス死の有意な減少を示したかを示す(食塩水およびコレステロニトロンF2で処置された動物についてそれぞれ、70.4±2.4細胞／フィールド対55.1±3.4細胞／フィールド；ANOVA、p＜0.0001；およびp＜0.01、post-Newman-Keuls検定)。
【図４】担体で処置された動物の脳切片(R5d)が、どのようにCA1領域、大脳皮質および外側皮質においてコレステロニトロンで処置された動物の脳切片よりも高レベルのTUNEL-陽性細胞を示したかを示す。したがって、結果は、コレステロニトロンF2で処置された動物において、再かん流の5日後(R5d)にCA1領域で、神経細胞アポトーシス死が有意に減少したことを示した(担体およびコレステロニトロンで処置された動物についてそれぞれ、64.1±7.1の核／フィールド対48.5±0.4の核／フィールド；ANOVA、p＜0.0001；およびp＜0.01、post-Newman-Keuls検定)。
【図５】OGDに曝露され、示した濃度のF2、F3およびF2：F3(1：1比、F2＋F3)の混合物で処置された神経培養物中の神経細胞の生存能力を示す。F2および／またはF3は、回復期間の開始時に添加した。回復の24時間後に神経細胞の生存能力を評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下の実施例は、本発明を説明することに役立つものであって、本発明を限定するものではない。
【００２７】
実施例
コフラー装置にて融点を決定したが、補正はしない。溶媒としてCDCl3またはDMSO-d6を用い、これらの重水素化溶媒のピークを内部標準として用い(CDCl3：7.27(D)、77.2(C)ppm；D2O: 4.60 ppmおよびDMSO-d6：2.49(D)、40(C))、室温にて、それぞれ300、400または500 MHzで、および75、100または125 MHzで1H NMRおよび13C NMRスペクトルを得た。標準的NMR実験(1H、13C-DEPT、1H、1H-COSY、gHSQC、gHMBC)で得られたデータにしたがって、化合物の化学シフトの割り当てを決定する。API-ESタイプのイオン化源を備えた装置にて、GC/MS質量分析を行った。CQO(CSIC、マドリッド)にて微量分析を行った。F254シリカゲルプレートにて、薄層クロマトグラフィーを行い、次いで、視覚化のために紫外線またはニンヒドリン展開液、アニスアルデヒドおよびホスホモリブデン酸-H2SO4を用いた。すべての反応を、無水溶媒を用いて行った。クロマトグラフィーカラムは、0.06 mmシリカゲルカラム(230メッシュ)であった。
【実施例１】
【００２８】
ニトロン合成のための一般的方法
ケトン(1 mmol)、Na2SO4(3 mmol)およびトリエチルアミン(2 mmol)をEtOHに懸濁させ、ヒドロキシルアミン塩酸塩(1.5 mmol)で処理した。混合物を30秒間攪拌し、電子レンジ(250 W)で90℃にて照射した。反応が完了したと決定された時点で、溶媒を真空除去し、水で希釈し、AcOEtで抽出し、Na2SO4で乾燥し、ろ過し、蒸発した。カラムクロマトグラフィーによって残渣を精製した。
【００２９】
方法A
一般的方法にしたがって、エタノール(10 mL)中、4-コレステン-3-オン(385 mg、1 mmol)、Na2SO4(426 mg、3 mmol)、Et3N(0.30 mL、2 mmol)およびN-メチルヒドロキシルアミン塩酸塩(126 mg、1.5 mmol)を3時間反応させ、カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2/MeOH1%〜2%)に付し、ChN F2およびChN F3(396 mg、96%、1:3比にて)を得た。
【００３０】
方法B
一般的方法にしたがって、エタノール(10 mL)中、5-コレステン-3-オン(385 mg、1 mmol)、Na2SO4(426 mg、3 mmol)、Et3N(0.30 mL、2 mmol)およびN-メチルヒドロキシルアミン塩酸塩(126 mg、1.5 mmol)を2時間反応させ、カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2/MeOH1%〜2%)に付し、ChN F2およびChN F3(407 mg、98%、1:3比にて)を得た。
【００３１】
ChN(F2): 白色固体; Rf(0.21、CH2Cl2/MeOH、5%); mp 139-141℃; IR(KBr)ν 2939、2868、2849、1466、1215 cm-1; 1H NMR(400 MHz、CDCl3)δ 5.97(d、J= 2.0 Hz、1H、4CH)、3.72(s、3H、NCH3)、3.23(d、J= 18.4 Hz、1H、2CH)、2.34(m、2H、6CH2)、2.21(m、1H、2CH)、1.99(m、2H、CH2)、1.80(m、2H、CH2)、1.60(s、3H、CH3)、1.36(m、10H、5CH2)、1.12(m、6H、6CH2)、1.04(s、3H、19CH3)、0.99(m、2H、CH2)、0.91(d、J = 6.4 Hz、3H、21CH3)、0.88(d、J = 1.3 Hz、3H、26CH3)、0.86(m、3H、27CH3)、0.70(s、3H、18CH3); 13C NMR(101 MHz、CDCl3)δ 156.8(3C)、146.4(5C)、112.9(4CH)、56.1(17CH)、55.9(14CH)、53.5(9CH)、46.0(13C)、42.3(NCH3)、39.6(C)、39.4(C)、37.9(10C)、36.1(C)、35.77(C)、35.73(C)、34.4(C)、33.4(C)、32.2(25CH2)、28.1(16CH2)、27.9(2CH2)、24.2(15CH2)、23.8(24CH2)、22.7(26CH3)、22.5(27CH3)、21.4(CH2)、21.3(11CH)、18.6(19CH3)、17.8(21CH3)、11.9(18CH3)。MS(EI)m/z: 413(M、37%)+、398(M-CH3、27%)、397(M-O、70)、137(C8H11NO、100%); MS(ESI)m/z: 414.2(M＋H)+、436.2(M＋Na)+、827.8(2M)+、849.7(2M＋Na)+、C28H47NOについての計算値: C、81.29; H、11.45; N、3.39。実測値: C、80.98; H、12.19; N、3.44。
【００３２】
ChN(F3): 白色固体: Rf(0.20、CH2Cl2/MeOH、5%); mp 153-5℃。IR(KBr)ν 2936、2868、1629、1214 cm-1; 1H NMR(400 MHz、CDCl3)δ 6.78(s、1H、4CH)、3.66(s、3H、NCH3)、2.44(m、4H、2CH2)、1.88(m、4H、2CH2)、1.37(m、14H、7CH2)、1.04(s、3H、19CH3)、0.98(m、2H、CH2)、0.91(d、J= 6.4 Hz、3H、21CH3)、0.88(d、J = 1.4 Hz、3H、26CH3)、0.85(d、J = 1.4 Hz、3H、27CH3)、0.70(s、3H、18CH3); 13C NMR(101 MHz、CDCl3)δ 123.7(3C)、120.3(5C)、113.7(4CH)、56.0(17CH)、55.9(14CH)、53.5(9CH)、46.4(13C)、42.3(NCH3)、39.6(C)、39.4(C)、37.9(10C)、36.0(C)、35.72(C)、35.71(C)、35.4(C)、32.9(C)、32.2(C)、28.1(C)、27.9(C)、24.1(16CH2)、23.7(15CH2)、23.6(24CH2)、22.7(26CH3)、22.5(27CH3)、21.3(11CH2)、18.6(19CH3)、17.8(21CH3)、11.9(18CH3)。MS(EI)m/z: 413(M、37%)+、398(M-CH3、27%)、397(M-O、70)、137(C8H11NO、100%); MS(ESI)m/z: 414.2(M＋H)+、827.8(2M)+、849.7(2M＋Na)+。C28H47NOについての計算値: C、81.29; H、11.45; N、3.39。実測値: C、81.03; H、11.33; N、3.30。
【００３３】
虚血に対する神経保護の薬理学的評価
コレステロニトロンF2およびF3の神経保護能力は、ラットの大脳皮質から採取され、6〜8日間培養された一次神経培養物において決定されており(Quevedo、C、Salinas、M、Alcazar、A. Initiation factor 2B activity is regulated by protein phosphatase 1、which is activated by the mitogen-activated protein kinase-dependent pathway in insulin-like growth factor 1-stimulated neuronal cells. J. Biol. Chem. 2003、278、16579-16586)、酸素-グルコース枯渇(OGD)に付されており(Chioua M、Sucunza D、Soriano E、Hadjipavlou-Litina D、Alcazar A、Ayuso I、Oset-Gasque MJ、Gonzalez MP、Monjas L、Rodriguez-Franco MI、Marco-Contelles J、Samadi A. α-aryl-N-alkyl nitrones、as potential agents for stroke treatment: synthesis、theoretical calculations、antioxidant、anti-inflammatory、neuroprotective、and brain-blood barrier permeability properties. J Med Chem. 2012、55、153-168)、枯渇は以下のプロトコルにしたがって行われる：
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を用いて、細胞の生存能力を測定した。したがって、4時間のOGDへの神経培養物の曝露(OGD 4時間)により、細胞の生存能力は67.3%(p＜0.0001 コントロール100%に対して、1標本検定)に有意に減少し、これは、再かん流の24時間後に部分的に戻ったが(R24時間、76.1%；p＜0.0022 OGD 4時間に対して、スチューデントのt-検定)、24時間の時点でコントロール値には到達しない(p＜0.0001 コントロール100%に対して、1標本t-検定)(図1)。
【００３４】
それぞれ0.1〜100 μMおよび0.5〜10 μMの濃度範囲のコレステロニトロンF2およびF3を再かん流期間の開始時に加え、参照化合物として周知の神経保護剤であるシチコリンを用いてそれらの神経保護能力を評価した(Adibhatla、RM、Hatcher、JF、Dempsey、RJ. シチコリン: neuroprotective mechanisms in cerebral ischemia. J. Neurochem. 2002、80、12-23)。1 μM〜1 mMのさまざまな濃度にてシチコリンを試験し、10および100 μM(それぞれ87.4および88.1%)にて神経保護効果を見い出し、100 μMの効果は、R24hにて得られる値と比較して有意であった[分散分析(ANOVA)、p＜0.0021; およびp＜0.01、post-Dunnett検定]。
【００３５】
1または5 μMの濃度の、コレステロニトロンF3ではなくてコレステロニトロンF2の添加は、再かん流中に有意に神経細胞の生存能力を増加させ、5 μMの濃度に、コントロール値は、ほとんど達した(1または5 μMのコレステロニトロンF2についてそれぞれ89.1および95.5%; ANOVA、p＜0.0001；およびp＜0.01、R24hと比較したpost-Dunnett検定)(図1)。
【００３６】
5 μMにて、コレステロニトロンF2によって誘発される神経保護は、シチコリンによって誘発される神経保護と比較すると、シチコリンで観察されるよりも有意に高い神経保護をもたらした(表1)。
【００３７】
表1
OGD条件下での神経培養物におけるコレステロニトロンF2およびF3の神経保護効果
0006424212.tif 000010
【００３８】
対照的に、コレステロニトロンF3は、有意な神経保護能力を示さなかった。
【００３９】
培養された神経細胞における虚血損傷に対するコレステロニトロンF2およびF3の神経保護能力を評価し、長期再かん流条件をシミュレートするために、培養物を4時間のOGDに曝露させ、次いで、細胞を5日間の再かん流に付した(R5d)。
【００４０】
コレステロニトロンF2およびF3(1.0および5.0 μMの濃度にて)を、再かん流期間の開始時に加え、再かん流の48時間後、MTTのプロトコルにしたがって、参照分子シチコリンを再度用いて、それらの長期神経保護能力を評価した(上記参照)。
【００４１】
R5d実験は、細胞の生存能力において著しい減少を誘発した(77.7%; p＜0.0001 コントロールの100%に対して、1サンプルのｔ検定)(図2)。100 μMの濃度で試験したシチコリンは、R5d実験において、再かん流の開始時の添加(無地バー)または再かん流の48時間後の添加(ストライプバー)の両方において、どのような神経保護も生み出さなかった(それぞれ6.0および74.6%；ANOVA、p = 0.786)。
【００４２】
対照的に、1および5 μMの濃度のコレステロニトロンF2(またはF3)の添加は、神経細胞の生存能力において、第5日に観察されるコントロール値を超える著しい増加は生み出さなかった(1および5 μMのコレステロニトロンF2についてそれぞれ110.6および118.2%；1および5 μMのコレステロニトロンF3についてそれぞれ105.6および118.6%；ANOVA、p＜0.0001;およびp＜0.01、Dunnett検定)図2、無地バー)。
【００４３】
さらに、再かん流の48時間後に添加されたコレステロニトロンF2(1 μM)またはコレステロニトロンF3(5 μM)(ストライプバー)は、R5d実験において神経細胞の生存能力を有意に増加させた((1および5 μMのコレステロニトロンF2およびF3についてそれぞれ95.7および97.8%；ANOVA、p＜0.0001;およびp＜0.05、R5dと比較して、Dunnett検定にしたがって)(図2、ストライプバー)。
【００４４】
要約すると、虚血後のコレステロニトロンによる神経保護は、長期有効性を有し、それは、シチコリンがもはやどのような効果も示さない処置の48時間後でも維持された。
【００４５】
従来の4血管閉塞法にしたがって、成体ラットにおいて全脳虚血を誘発した[(a)Martin de la Vega C、Burda J、Nemethova M、Quevedo C、Alcazar A、Martin ME、Salinas M. Possible mechanisms involved in the down-regulation of translation during transient global ischaemia in the rat brain. Biochem J 2001、357、819-826;(b)Garcia-Bonilla L、Cid C、Alcazar A、Burda J、Ayuso I、Salinas M. Regulation proteins of eukaryotic initiation factor 2-alpha subunit(eIF2a)phosphatase、under ischemic reperfusion and tolerance. J Neurochem 2007、103、1368-1380;(c)Ayuso MI、Hernandez-Jimenez M、Martin ME、Salinas M、Alcazar A. New hierarchical phosphorylation pathway of the translational repressor eIF4E-binding protein 1(4E-BP1)in ischemia-reperfusion stress. J Biol Chem 2010、285、34355-34363]。
【００４６】
したがって、2つの椎骨動脈を完全に焼灼し、24時間後、小さいクランプを用いる15分間の頸動脈閉塞によって虚血を誘発する；次いで、クランプを外し、再かん流を行う。5日後(R5d)、動物を犠牲にする。動物を、担体として食塩水中の10%エタノールで希釈し、再かん流期間の開始時から腹腔内投与されるたコレステロニトロンF2で処置した。10匹の動物を試験した；担体で処置した5匹の動物のうちの1匹は、再かん流の2日後に死んだ。動物実験で用いたすべてのプロトコルは、Ramon y Cajal病院(マドリッド)の倫理委員会によって承認されたガイドラインにしたがって行われた。ラットの4血管閉塞大脳虚血モデルでは、海馬のCA1領域において、短期の虚血期間後の遅延性神経変性がもたらされる[(a)Kirino T. Delayed neuronal death。Neuropathology 2000、20、S95-S97;(b)Pulsinelli WA、Brierley JB、Plum F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischaemia. Ann Neurol 1982、11、491-498;(c)Burda J、Matiasov M、Gottlieb M、Danielisov V、Nemethov M、Garcia L et al. Evidence for a role of second pathophysiological stress in prevention of delayed neuronal death in the hippocampal CA1 region. Neurochem Res 2005、30、1397-1405)]。このモデル実験では、虚血後3〜7日の再かん流は、CA1における有意な神経細胞死を誘発する(Ayuso MI、Martinez-Alonso E、Cid C、de Lecinana MA、Alcazar. The translational repressor eIF4E-binding protein 2 (4E-BP2) correlates with selective delayed neuronal death after ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. At press、doi: 10.1038/jcbfm.2013.60)。CA1領域における神経細胞の選択的神経変性は、大脳皮質において観察されたものと比較して明らかであった。
【００４７】
動物を、再かん流期間の開始時から0.1 mg/kgの用量のコレステロニトロンF2で処置し、神経細胞死は、第5日において誘発された(R5d)。神経細胞死によるストレス誘発性IRに対するコレステロニトロンF2の保護効果を、フルオロジェイドBを用いて観察し(Burda J、Matiasov M、Gottlieb M、Danielisov V、Nemethov M、Garcia L et al. Evidence for a role of second pathophysiological stress in prevention of delayed neuronal death in the hippocampal CA1 region. Neurochem Res 2005、30、1397-1405)、蛍光顕微鏡下で見ることができた。これらの実験は、コレステロニトロン処置が、海馬のCA1領域において神経細胞死を有意に減少させることを明らかにした。結果は、コレステロニトロンで処置された動物が、5d実験(R5d)において、CA1領域(CA1)におけるアポトーシス死の有意な減少を示すことを明らかにした(食塩水およびコレステロニトロンF2で処置された動物についてそれぞれ、70.4±2.4細胞／フィールド対55.1±3.4細胞／フィールド；ANOVA、p＜0.0001；およびp＜0.01、post-Newman-Keuls検定)(図3、CA1)。影響は、CA1領域におけるものよりも非常に限定されたものであったが、虚血によって誘発された神経細胞死は、大脳皮質(C)および外側皮質(LC)においても観察された。さらに、コレステロニトロンF2による神経虚血性損傷の減少を、大脳皮質において観察することができた(担体およびコレステロニトロンで処置された動物についてそれぞれ、6.7±3.5細胞／フィールド対0±0.1細胞／フィールド；p＜0.05、スチューデントのt-検定)(図3)。
【００４８】
TUNEL法を用いるR5d実験において、CA1領域におけるアポトーシスの誘発が特に実証された。(Ayuso MI、Martinez-Alonso E、Cid C、de Lecinana MA、Alcazar A. The translational repressor eIF4E-binding protein 2 (4E-BP2) correlates with selective delayed neuronal death after ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. At press、doi: 10.1038/jcbfm.2013.60)。担体で処置された動物の脳切片(R5d)は、CA1領域、大脳皮質および外側皮質においてコレステロニトロンで処置された動物の脳切片よりも高レベルのTUNEL-陽性細胞を示した(図4)。結果は、コレステロニトロンF2で処置された動物において、再かん流の5日後(R5d)にCA1領域で、神経細胞アポトーシス死が有意に減少したことを示した(担体およびコレステロニトロンで処置された動物についてそれぞれ、64.1±7.1の核／フィールド対48.5±0.4の核／フィールド；ANOVA、p＜0.0001；およびp＜0.01、post-Newman-Keuls検定)(図4、CA1)。同時に、上述の結果と一致して、コレステロニトロンによって引き起こされるアポトーシス死の減少は、大脳皮質および外側皮質においても観察された(大脳皮質では、担体およびコレステロニトロンで処置された動物についてそれぞれ、7.2±3.8の核／フィールドおよび1±0.5の核／フィールド；外側皮質では、担体およびコレステロニトロンで処置された動物についてそれぞれ、13.3±6.2の核／フィールドおよび4.3±1.4の核／フィールド)(図4)。
【００４９】
要約すると、神経細胞培養物およびCA1において神経保護効果を有することが判っている濃度でのコレステロニトロンF2による虚血動物の薬物治療は、虚血再かん流後のこの領域におけるアポトーシス死を有意に減少させると結論付けることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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