(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ９５シグナル伝達経路阻害剤を含む、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）治療用医薬組成物であって、
前記ＭＤＳは、ＩＰＳＳ低リスクＭＤＳサブグループおよび／またはＩＰＳＳ中間−１（ｉｎｔ−１）リスクＭＤＳサブグループから選択され、
前記阻害剤が、ＣＤ９５受容体（ＣＤ９５）および／またはＣＤ９５リガンド（ＣＤ９５Ｌ）に結合し、
ここで、
前記阻害剤が、抗体またはそのフラグメントである、または、
前記阻害剤が、細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメント、および、ヒトＦｃドメインまたはその機能性フラグメントを含む、融合タンパク質である、
医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記阻害剤が、ＡＰＧ１０１および／またはその機能性誘導体であり、
ＡＰＧ１０１は、配列番号１のドメインＣＤ９５Ｒ（アミノ酸２６〜１７２）および配列番号１のＩｇＧ１−Ｆｃ（アミノ酸１７２〜４００）を含む、
医薬組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の医薬組成物であって、
ＭＤＳ集団が、赤血球産生中のアポトーシスの増加により特徴付けられる、
医薬組成物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物であって、
前記ＭＤＳ集団が、過剰の芽球を伴わない赤血球産生の重度の欠損により特徴付けられる、
医薬組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物であって、
前記ＭＤＳ集団が、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）および／またはコロニー刺激因子に対して抵抗性であることにより特徴付けられる、
医薬組成物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物であって、
薬学的に許容できる担体、希釈剤および／またはアジュバントを含む医薬組成物として提供される、
医薬組成物。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物であって、
少なくとも１つのさらなる活性成分を含む医薬組成物として提供される、
医薬組成物。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の医薬組成物であって、
５０〜４００ｍｇ／週の合計量で投与される、
医薬組成物。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の医薬組成物であって、
赤血球生成刺激剤をさらに含む、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療での使用のための、ＣＤ９５シグナル伝達経路阻害剤に関し、ここで、ＭＤＳは、ＩＰＳＳ低リスクＭＤＳサブグループおよび／またはＩＰＳＳ中間−１（ｉｎｔ−１）リスクＭＤＳサブグループから選択され、ならびに、ＭＤＳの診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、血液血球減少（特に貧血）へと導く無効性造血により特徴付けられるクローン性造血幹細胞障害であり、しばしば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に進展する。特に、ＭＤＳは、赤血球前駆細胞の増殖の欠損により特徴付けられ得る。これに対応して、ＭＤＳは一般に、形態学、および、血液と骨髄中の芽細胞のパーセンテージに基づいて分類される（Ｆｒｅｎｃｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｒｉｔｉｓｈ（ＦＡＢ）およびＷＨＯ分類）（Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９８２；Ｖａｒｄｉｍａｎら、２００９）。
【０００３】
赤血球産生は、細胞間相互作用に関与する正と負のシグナル間のバランスおよび骨髄赤芽球島中の可溶性因子により調節される。赤血球産生の概略を図１に示す。赤血球系へのＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）のコミットメントは、ＧＡＴＡ−１などの重要な転写因子およびｃ−Ｋｉｔリガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）などのサイトカインの制御下にある。赤血球コンパートメントのサイズは、ＣＦＵ−Ｅおよび前赤芽球の成熟を刺激してそれらのアポトーシスを防止するエリスロポエチンにより上方制御される。赤血球細胞は、メンブレンＣＤ７１（トランスフェリン受容体）の発現を獲得し、その後、より成熟した細胞上にグリコホリンＡ（ＧＰＡ）の発現を獲得する（図１）。
【０００４】
赤血球産生の負の制御は、成熟赤血球前駆細胞上に発現されるＦａｓＬとの相互作用により、Ｆａｓを発現する未熟な赤芽球のアポトーシスに寄与する、Ｆａｓ／ＦａｓＬに依存し（Ｄｅ  Ｍａｒｉａら、１９９９）、そしてまた、分化の同一ステージでの赤芽球の自己調節にもよる（Ｓｏｃｏｌｏｖｓｋｉら、２００８）。カスパーゼ−８活性は明らかでないが、正常の赤血球前駆細胞の成熟はカスパーゼ−３の活性化を必要とする（Ｄｅ  Ｍａｒｉａら、１９９９；Ｚｅｒｍａｔｉら、２００１）。カスパーゼ−３基質の切断は制限される。例えば、ＧＡＴＡ−１は、エリスロポエチン欠乏の条件下におけるカスパーゼ−３の基質であるが、Ｅｐｏ存在下では、細胞基質から核へ移行するＨｓｐ７０との相互作用により、ＧＡＴＡ−１は切断から保護される（Ｒｉｂｅｉｌｅｔａｌ、２００７）。
【０００５】
ＭＤＳ赤血球形成異常症は、Ｆａｓ下流のカスパーゼ−８の異所性活性化と関連する。本出願人のグループ等は、ＣＤ３４＋未熟前駆細胞の表面上に、および、赤血球系前駆細胞に、Ｆａｓが過剰発現されることを以前に示した。ＧＰＡ−陽性赤血球前駆細胞でのＦａｓリガンド発現が開始すると、Ｆａｓ発現は赤血球分化に伴って増加し、赤血球系におけるカスパーゼ−８の異所性活性化をもたらした。これは、新鮮な骨髄細胞（Ｂｏｕｓｃａｒｙら、１９９７）、および、２ステップ液体培養で得られる赤血球細胞（Ｃｌａｅｓｓｅｎｓら、２００２）の中に見られた。レンチウイルスにより（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｌｙ）発現されるアダプターＦＡＤＤのドミナントネガティブ変異体の異所性発現によるＦａｓシグナル伝達の阻害は、カスパーゼ−８活性化を低減させ、ＭＤＳ赤血球前駆細胞におけるアポトーシスを阻害した（Ｃｌａｅｓｓｅｎｓら、２００５）。Ｆａｓ／ＦａｓＬは、正常な赤血球分化を妨げ、ＭＤＳ赤血球細胞でのアポトーシスを誘導するのに寄与し得る。
【０００６】
最近のデータは、赤血球細胞の成熟が、低グレードＭＤＳにおいて重度に損なわれていることを示した。Ｓｏｃｏｌｏｖｓｋｉら（２００７）により記載されるＣＤ７１／ＧＰＡ標識により、赤血球前駆細胞を定量化した。正常な培養と比較して、ＭＤＳ細胞培養では、７日後に、ＣＤ７１ｈｉｇｈ／ＧＰＡｌｏｗ細胞の画分が増加しＣＤ７１ｉｎｔ／ＧＰＡｈｉｇｈが減少することが観察された。赤血球前駆細胞（１４日目）のトランスクリプトーム試験は、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）をコードするＧＹＰＡの発現が２倍減少することを示した。これに加えて、様々な他の赤血球遺伝子が下方制御された。
【０００７】
ＭＤＳは奇病であり（発生率は３〜５／１０００００人／年）、高齢者が多い（中央年齢６５〜７０才）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一般にＭＤＳは、古典的な赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）の投与により治療される。
【０００９】
しかしながら、本発明までは、ＥＳＡに抵抗性のＭＤＳ患者は、治療が困難であった。
【００１０】
したがって、ＭＤＳのための、特に、ＥＳＡに抵抗性のＭＤＳ患者の治療のための、新規の治療選択肢を提供することが、本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一態様は、ＩＰＳＳ低リスクＭＤＳサブグループおよび／またはＩＰＳＳ中間（ｉｎｔ−１リスクＭＤＳサブグループ）から選択される骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療での使用のための、ＣＤ９５シグナル伝達経路阻害剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】赤血球産生の概略。ＨＳＣ：造血幹細胞。ＢＦＵ−Ｅ：バースト形成単位−赤血球、ＣＦＵ−Ｅ：コロニー形成単位−赤血球、ＰＥＲ：前赤芽球、ＥＲＢ：好塩基性赤芽球、ＥＲＰ：多染性赤芽球、ＥＲＡ：好酸性赤芽球、ｒｅｔｉｃｕｌｏ：網状赤血球、ＲＢＣ：赤血球、ＳＣＦ：幹細胞因子、ＥＰＯ：エリスロポエチン。
【図２】正常およびＭＤＳの赤血球産生の負制御。正常の赤血球産生は、ＦａｓＬを発現している成熟細胞（青矢印）により仲介される未熟前駆細胞のＦａｓ−依存性アポトーシスを介した増殖の負制御により調節される。ＭＤＳでは、ＦａｓおよびＦａｓＬが過剰発現され、過剰で不適当なアポトーシスに導く（赤矢印）。
【図３】赤血球産生中のＦａｓおよびＦａｓＬの役割／濃度。
【図４】ＭＤＳ、ｓＡＭＬおよびコントロールにおける、ＦａｓＬ発現。Ａ．ＦａｓＬ  ＲＦＩの分布。Ｂ．コントロールに対してＭＤＳを比較するＲＯＣ分析。
【図５】全生存診断での、ＣＤ４５ｌｏ／ＣＤ３４＋細胞に対するＦａｓ発現の影響。
【図６】メチルセルロース培養１４日目のＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭ増殖に対するＡＰＧ１０１の効果。
【図７】メチルセルロース培養７日目のＣＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｌ増殖に対するＡＰＧ１０１の効果。
【図８】液体培養５日目由来のＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭに対するＡＰＧ１０１の効果。
【図９】赤血球前駆細胞の液体培養での分化フェーズで添加されたＡＰＧ１０１の効果。
【図１０】赤血球細胞分化に対するＡＰＧ１０１の効果。左：ＭＧＧ染色サイトスピン。右：ＣＤ７１／ＧＰＡ二重標識化のフローサイトメトリー分析。
【図１１】ＢＦＵ−Ｅ増殖に対するＡＰＧ１０１の効果。Ｆａｓ−陽性およびＦａｓ−陰性のＭＤＳの間の比較。
【図１２】ＣＤ４５ｌｏｗ細胞上のＦａｓＬ発現による、ＡＰＧ１０１の効果。
【図１３】ベースラインでのＣＦＵ−ＬおよびＢＦＵ−Ｅ増殖による、ＢＦＵ−Ｅ増殖に対するＡＰＧ１０１の効果。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明によれば、用語ＣＤ９５、ＣＤ９５ＲおよびＣＤ９５−受容体は、交換可能に用いてよい。さらなる同義語はＡｐｏ−１またはＦａｓであり、本明細書において交換可能に用いてよい。さらに、用語ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ９５−リガンド、および対応する同義語ＦａｓＬ、Ａｐｏ−１Ｌ、ＣＤ１７８またはＴＮＦ−ＳＦ６は、交換可能に用いてよい。
【００１４】
本発明に関して「ＣＤ９５シグナル伝達経路阻害剤」は、ＣＤ９５シグナル伝達経路を、少なくとも部分的に干渉またはブロックする任意の化合物であってよい。好ましい実施態様によれば、「ＣＤ９５シグナル伝達経路阻害剤」は、ＣＤ９５シグナル伝達経路をブロックする。ＣＤ９５シグナル伝達経路の活性を判定および／または評価するための方法は当業者に公知であり、例えば、Ｌａｖｒｉｋらにより記載されている（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０１２  Ｊａｎ；１９（１）：３６−４１  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ９５／Ｆａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｔ  ｔｈｅ  ＤＩＳＣ）。
【００１５】
本発明による阻害剤は、タンパク質レベルおよび／または核酸レベルで作用し得る。タンパク質レベルで作用する阻害剤は、抗体、タンパク質および／または小分子から選択してよい。核酸レベルで作用する阻害剤は、例えばアンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子および／またはリボザイムである。
【００１６】
特に好ましい実施態様によれば、阻害剤は、ＣＤ９５受容体（ＣＤ９５）および／またはＣＤ９５リガンド（ＣＤ９５Ｌ）に結合する。さらなる実施態様では、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ相互作用は、阻害されてよい。
【００１７】
好ましい一実施態様では、本発明による阻害剤は、抗体またはその機能性フラグメントである。抗体である阻害剤は、ＣＤ９５に結合してよいが、もちろん、ＣＤ９５Ｌに結合してもよい。ＣＤ９５Ｌに結合する抗体の例は、Ｎｏｋ−１である。
【００１８】
抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、それらの抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、または単鎖抗体分子）であってよい。抗体は、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−またはＩｇＧ４−タイプであってよい。
【００１９】
抗体は、修飾とともに、または伴わずに用いてよく、例えば、レポーター基またはエフェクター基を用いて共有的または非共有的のいずれかで標識されてよい。
【００２０】
本発明による「抗体フラグメント」は、対応する抗体が有するのと実質的に同一のＣＤ９５および／またはＣＤ９５Ｌ阻害活性を、対応する抗体が行なうおよび／または有するのと本質的に同一の、エピトープ結合部位を示す。
【００２１】
本発明の抗体を産生するための方法は、当業者に公知である。
【００２２】
本発明に含まれる阻害剤の一種は、ＣＤ９５−リガンド阻害剤であってよい。例えば、ＣＤ９５−リガンド阻害剤は、（ａ）阻害性抗−ＣＤ９５リガンド−抗体または上記に概説されるそのフラグメント；（ｂ）可溶性ＣＤ９５受容体分子またはそのＣＤ９５リガンド−結合部分；および（ｃ）ＦＬＩＮＴ、ＤｃＲ３またはそれらのフラグメントから選択されるＣＤ９５−リガンド阻害剤、から選択してよい。
【００２３】
可溶性ＣＤ９５受容体分子は、例えば、膜貫通ドメインを有さない可溶性ＣＤ９５受容体分子がＥＰ−Ａ−０  ５９５  ６５９およびＥＰ−Ａ−０  ９６５  ６３７に記載され、または、ＣＤ９５受容体ペプチドがＷＯ  ９９／６５９３５に記載されている。
【００２４】
Ｆａｓリガンド阻害剤ＦＬＩＮＴまたはＤｃＲ３、またはそれらの可溶性フラグメントなどのフラグメント、例えば、場合により異種ポリペプチド（特にＦｃ免疫グロブリン分子）に融合した細胞外ドメインが、ＷＯ  ９９／１４３３０またはＷＯ  ９９／５０４１３に記載されている。ＦＬＩＮＴおよびＤｃＲ３は、ＣＤ９５リガンドに結合することが可能なタンパク質である。
【００２５】
さらなる実施態様では、阻害剤は、融合タンパク質、特に、ＣＤ９５Ｌに結合する融合タンパク質である。
【００２６】
一実施態様では、ＣＤ９５Ｌ阻害剤は、ＣＤ９５Ｒ分子の細胞外ドメイン、例えば、米国特許第５，８９１，４３４号による成熟ＣＤ９５配列のアミノ酸１〜１７２（ＭＬＧ．．．ＳＲＳ）を含む。このＣＤ９５Ｒ分子の細胞外ドメインは、異種ポリペプチドドメイン、特に、例えばヒトＩｇＧ１分子由来のヒンジ領域を含むＦｃ免疫グロブリン分子に融合されてよい。細胞外ＣＤ９５ドメインおよびヒトＦｃドメインを含む融合タンパク質は、ＷＯ  ９５／２７７３５に記載されている。
【００２７】
したがって、好ましい実施態様によれば、ＣＤ９５Ｌに結合する薬剤は、細胞外ＣＤ９５ドメインおよびＦｃドメイン、特にヒトＦｃドメインを含む、融合タンパク質である。
【００２８】
特に好ましい実施態様によれば、ＣＤ９５Ｌに結合する薬剤は、ＡＰＧ１０１またはその機能性フラグメント、アイソフォームおよび／または誘導体である。ＡＰＧ１０１は、ドメインＣＤ９５Ｒ（アミノ酸２６〜１７２；ＥＣＤ細胞外ドメイン）およびＩｇＧ１−Ｆｃ（配列番号１の（アミノ酸１７２〜４００）を含む。ＡＰＧ１０１およびその誘導体は、ＷＯ９５／２７７３５およびＷＯ２００４／０８５４７８に開示されている。
【００２９】
本発明のさらなる実施態様では、阻害剤は、核酸エフェクター分子である。核酸エフェクター分子は、ＤＮＡ；ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ−ハイブリッドであってよい。それは一本鎖または二本鎖であってよい。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスに由来する、または様々な細菌性プラスミド由来の発現ベクターを、標的の臓器、組織または細胞集団へのヌクレオチド配列の送達に用いてよい。そのような構築物を用いて、翻訳不可能なセンスまたはアンチセンスの配列を細胞内に導入してよい。ＤＮＡ中へインテグレーションしなくても、そのようなベクターは、内因性ヌクレアーゼにより無能になるまでＲＮＡ分子の転写を続け得る。一過性発現は、非複製性のベクターを用いて１ヶ月またはそれ以上の間持続し得て、適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合にはさらにより長い。
【００３０】
核酸エフェクター分子は、特に、好ましくはＣＤ９５Ｒおよび／またはＣＤ９５Ｌ遺伝子の発現を阻害することが可能な、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子およびリボザイムから選択してよい。
【００３１】
上記に概説されるように、本発明は、特に、国際的予後予測スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）低リスクＭＤＳサブグループおよび／またはＩＰＳＳ中間−１（ｉｎｔ−１）リスクＭＤＳサブグループから選択される骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療に関する。
【００３２】
ＩＰＳＳは当業者によく知られている。ＡＭＬへの進行および生存に関するＭＤＳの主な予後因子は、血球減少の数および重要性、骨髄芽球の割合、および骨髄染色体異常を含む。それぞれの指標はその重症度に従って評価され、その評価が組み合わされて「スコア」、ＩＰＳＳとなる。
【００３３】
ＩＰＳＳは、有意に異なるＡＭＬへの進行のリスクおよび生存により、低、中間−１（ｉｎｔ−１）、中間−２（ｉｎｔ−２）および高リスクの４つのサブグループに区別する。低およびｉｎｔ−１リスクのサブグループは、しばしば、まとめて≪良好≫または、低リスクＭＤＳとしてグループ化され、中間−２および高リスクサブグループは、≪不良≫または高リスクＭＤＳとしてグループ化される（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９９７）。
【００３４】
低リスクＭＤＳ（低またはｉｎｔ−１  ＩＰＳＳを含む）は、大幅な血球減少をもたらす骨髄前駆細胞のアポトーシスの増加により特徴付けられる。ほとんどの患者において、赤血球細胞は、分化不全およびアポトーシス増加を示す。
【００３５】
したがって、本発明により治療されるＭＤＳサブグループ（すなわち、低リスクまたはｉｎｔ−１  ＩＰＳＳを含む）は、赤血球産生中のアポトーシス増加により特徴付けられ得る。
【００３６】
さらなる実施態様によれば、治療されるＭＤＳサブグループは、過剰の芽球を伴わない赤血球産生の重度の欠損により、さらに特徴付けられ得る。
【００３７】
別の特徴的な特徴では、治療されるＭＤＳサブグループは、古典的な赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）および／またはコロニー刺激因子に抵抗性であってよい。本発明による赤血球生成刺激剤は、赤血球産生を刺激する任意の化合物であってよい。ＥＳＡおよび／またはコロニー刺激因子の例は、限定されないが、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、エポエチンα（Ｐｒｏｃｒｉｔ／Ｅｐｏｇｅｎ）、エポエチンβ（ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ）、ダルベポエチンα（Ａｒａｎｅｓｐ）、メトキシポリエチレングリコール−エポエチンβ（Ｍｉｒｃｅｒａ）およびまたはＩＬ−３またはＩｌ−９のような一部のサイトカインを含む。
【００３８】
治療されるＭＤＳサブグループは、低いバースト形成単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）値および／または低いコロニー形成単位−赤血球（ＣＦＵ−Ｅ）値により特徴付けられ得る。
【００３９】
もちろん、上記の特徴を任意の可能な組み合わせで組み合わせて、治療されるＭＤＳサブグループを説明してよい。
【００４０】
上述のＭＤＳサブグループを考慮して、本発明のさらなる実施態様は、ＢＦＵ−Ｅの数を増加させる阻害剤であり、かつ、コロニー形成単位−顆粒球単球（ＣＦＵ−ＧＭ）に影響を及ぼさず、および／または、白血病細胞の拡大のリスクを増大させない阻害剤の使用に関する。好ましくは、阻害剤は、赤血球前駆細胞の増殖を改善させる化合物であってもよい。
【００４１】
本発明コースにより用いられるＣＤ９５シグナル伝達経路阻害剤は、医薬組成物として提供されてよい。この組成物は、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／またはアジュバントなどを含んでよい。
【００４２】
製剤化および投与のための技術に関するさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）の最新版に見ることができる。
【００４３】
本発明で使用される医薬組成物は、制限されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸の手段を含む任意の数の経路により投与してよい。
【００４４】
本発明での使用に適切な医薬組成物は、使用目的を達成するのに有効な量で活性成分が含まれる組成物を含む。有効な投与量の決定は、十分、当業者の能力の範囲内である。治療的に有効な投与量は、特定の状態を治療するのに十分な活性成分（例えば、本発明の核酸またはタンパク質、または抗体）のその量をいう。正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子を踏まえて熟練者により決定される。
【００４５】
用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供する、または、所望の効果を維持するために、調節される。当業者は、十分なレベルの活性部分を提供するための、および／または所望の効果を維持するための、さらなる方法を知っている。考慮され得る因子は、病状の重症度、対象の健康全般、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与の時間および頻度、薬の組み合わせ（単数または複数）、反応感度、および、治療に対する耐性／応答を含む。好ましい実施態様では、ＭＤＳを患っている患者のために投与される本発明によるＣＤ９５シグナル伝達経路阻害剤の合計量は、約５０〜約４００ｍｇ／週、さらに好ましくは約１００〜約２００ｍｇ／週である。好ましい１週間の投与量は、単回投与として、または数回の投与として投与することができる。特に好ましいのは、単回投与であり、特に、単回投与として静脈内投与される１００〜２００ｍｇ／週である。
【００４６】
治療は、数週間持続可能である。それぞれの個々のケースにおいて、治療の持続時間は、監督医師により決定され、例えば、治療の成功、副作用の発生などに基づく。
【００４７】
本発明のさらなる態様によれば、この医薬組成物は、少なくとも１つのさらなる活性成分、例えば、ＭＤＳの治療に一般に用いられる薬剤、例えば５−アザシチジン、デシタビンまたはレナリドミド、赤血球生成刺激剤および／またはアポトーシス−阻害剤を含んでよい。
【００４８】
赤血球生成刺激剤の例は、上記に明記されている。
【００４９】
アポトーシス−阻害剤の例は、カスパーゼ阻害剤、例えば、ｘＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ２、サバイビン、ＴＮＦ−α−阻害化合物、例えば、レブリミド、ポマリドマイド、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質阻害剤などを含む。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、本発明に関する阻害剤を含む医薬組成物であり、赤血球生成刺激剤、特に、上記で定義された赤血球生成刺激剤をさらに含む。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、ＭＤＳの診断のための方法に関し、サンプルでのＣＤ９５Ｌ発現を判定するステップを含み、ここで、ＣＤ９５Ｌ過剰発現は疾患の予測となる。本発明の方法のさらなるステップは、とりわけ、ＭＤＳ以外を原因とする貧血を有する患者サンプル由来などのコントロール値との、決定されたＣＤ９５Ｌ発現値の比較であってよい。
【００５２】
もちろん、本発明の診断方法は、ＩＰＳＳシステムのような公知の方法と組み合わせることができる。
【００５３】
材料および方法
研究室材料
0006297552.tif 000002
【００５４】
骨髄サンプル
正常およびＭＤＳの骨髄サンプルを、パリのＣｏｃｈｉｎ病院の患者から、および、Ｍ．Ｆｏｎｔｅｎａｙ教授によりコーディネートされた多施設の生物学的試験と関係がある関連部門から、胸骨穿刺により回収した。患者は、地元の倫理委員会の推奨に従って、骨髄穿刺の前に、細胞生物学および遺伝子試験に対する彼らのインフォームドコンセントを提供していた。
【００５５】
装置
0006297552.tif 000003
【００５６】
方法
関連のあるＳＯＰ
研究室における現在のＳＯＰを参照し、Ｍ．Ｆｏｎｔｅｎａｙ  ａｎｄ  Ｃ．Ｌａｃｏｍｂｅ  ｉｎ  ２００２によるＧｕｉｄｅ  ｄｅ  Ｂｏｎｎｅ  Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ  ｄｅｓ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｉｇｅ  ｍｅｄｉｃａｌｅにおいて検証した。
0006297552.tif 000004
【００５７】
ツールおよびプラットフォーム
・ＡＰＧ１０１  Ｆａｓ−Ｆｃキメラ（Ａｐｏｇｅｎｉｘ）：Ｆａｓ−依存性アポトーシスの阻害剤；Ａｐｏｇｅｎｉｘ  ＧｍｂＨにより提供。
・ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４：Ａｐｏｇｅｎｉｘより提供の、Ｆａｓの三量体リガンド
・赤血球細胞培養は、記載のとおりに行なった：骨髄ＣＤ３４＋細胞を、ＭＩＤＩ  Ｍａｃｓカラム上に分離し、ＳＣＦ、Ｅｐｏ、ＩＧＦ−１およびデキサメタゾン中で培養して、赤血球系へのＣＤ３４＋細胞コミットメントを誘導し赤血球細胞の増殖を標的とした。１０日後、細胞をＥｐｏおよびインスリン含有培地に転換することにより、赤血球細胞の最終的な成熟が得られる。
・インビトロ液体培養の間、フローサイトメトリーを用いて赤血球細胞成熟を定量化した。
【００５８】
プロトコル
フローサイトメトリー
ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）およびグリコホリンａ（ＧＰＡ  ＣＤ２３５ａ）に対するモノクローナル抗体を用いた二重標識により、細胞亜集団を同定した。異なるステージの成熟は、ＣＤ７１−／ＧＰＡ−、ＣＤ７１＋／ＧＰＡ−、ＣＤ７１＋／ＧＰＡ＋、そして最後にＣＤ７１−／ＧＰＡ＋細胞であった。アイソタイプのコントロールに対する蛍光強度中央値の比（ＲＦＩ）として、ＣＤ９５標識および発現によりメンブレンＦａｓ発現を定量化した。カットオフ値の範囲に関する真陽性比と偽陽性比の間の関係のグラフ表示である受信者操作曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）（ＲＯＣ）分析を用いて、陽性の閾値が１．８のＲＦＩであることが示された２５のコントロールに対して、１３２のＭＤＳを比較した。アポトーシスを、アネキシンｖ／７−ＡＡＤ標識により測定した。サンプルを、ＦＣ５００装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。
【００５９】
細胞の分離および培養
患者および健康なコントロール対象由来の骨髄サンプルを、胸骨穿刺により回収し、ＭＩＤＩ−ＭＡＣＳイムノアフィニティーカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｃｌａｅｓｓｅｎｓら、２００２）上でＣＤ３４＋細胞を精製した（>８５％  ＣＤ３４＋細胞）。精製されたＣＤ３４＋細胞を、２０％ＢＩＴ（ウシ血清アルブミン、インスリン、ホロトランスフェリン（ｈｏｌｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ））、および、適切なサイトカイン：５０  ｎｇ／ｍＬ幹細胞因子（ＳＣＦ）、１  ＩＵ／ｍＬエリスロポエチン（Ｅｐｏ）、４０  ｎｇ／ｍＬインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、および１０−６Ｍデキサメタゾンを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、最大で培養の１０日目まで培養し、そして、１  ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏおよび１０−６Ｍインスリンを続けた。培養ステップの概略を図３に示す。最大で１０日目まで細胞は活発に分裂し、赤血球成熟をほとんど示さなかった。サイトカインの交換後、ほとんどの細胞が１４日目までに赤芽球に分化した。
【００６０】
正常赤血球細胞における、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４によるアポトーシス誘導
正常赤血球細胞を、増加濃度のＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で処置した。所定の濃度で、赤血球細胞コミットメントの初期段階に添加されたＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の、赤血球細胞増殖に対する影響（ＢＦＵ−Ｅおよび赤血球前駆細胞の全増幅）を測定した。赤血球成熟に先行するカスパーゼ−３活性化の開始前に添加されたＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の影響を試験した。カスパーゼ−３およびターゲットは、その後、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロット分析を続けた。
【００６１】
ヒトにおいて１１ｎＭの結合親和力を有するＣＤ９５Ｌ−Ｔ４／ＡＰＧ１０１複合体の１／１化学量論を考慮すると、培養において試験されるＣＤ９５Ｌ−Ｔ４およびＡＰＧ１０１の濃度は、同じ範囲内（０．０１〜１０μｇ／ｍｌ）であった。
【００６２】
正常赤血球細胞における、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４により誘導されるアポトーシスの、ＡＰＧ１０１による阻害
赤血球細胞増幅の早期または分化の後期のいずれか、または両方において、）事前に決定された濃度のＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で処置する前に、正常赤血球細胞を増加濃度でのＡＰＧ１０１で事前に処置した。重要なことに、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の添加は、ベースラインで高レベルのアポトーシスを伴うサンプルでは阻害された（ａｖｏｉｄｅｄ）。ＡＰＧ１０１の効果を、全体的な赤血球細胞増幅、ＢＦＵ−Ｅ増殖、アポトーシス、カスパーゼ−３活性、カスパーゼ−３のターゲット切断、および分化（ＧＰＡ、細胞診）で評価した。
【００６３】
ＡＰＧ１０１による、ＭＤＳ赤血球細胞アポトーシスの阻害
増加濃度のＡＰＧ１０１（０．００１〜１００μｇ／ｍｌ）を、以下について試験した。
−クローン原性アッセイでのＢＦＵ−Ｅの数
−増幅率
−アポトーシス（カスパーゼ−３活性、ホスファチジルセリン曝露、カスパーゼ−３ターゲット）
−赤血球細胞分化（ＧＰＡ／ＣＤ７１、細胞診、マイクロアレイでの赤血球遺伝子発現）
【００６４】
Ｆａｓは骨髄ＣＤ３４＋細胞画分で過剰発現されることが以前に示された。そこで、ＭＤＳサンプル中の赤血球と顆粒球前駆細胞との間での比較を、それぞれの系に特異的な培養条件で行なった。ＡＰＧ１０１での処置が、カスパーゼ−３活性の正常なカイネティクスを復元させるかどうか、および、カスパーゼ−３のターゲット切断を防ぐかどうか、試験した。
【００６５】
メチルセルロースアッセイ
Ｆｉｃｏｌｌグラジエント後の骨髄穿刺液から分離された単核細胞を、ウシ胎仔血清、ＢＳＡおよびサイトカイン（ＩＬ３  ０．１  ＵＩ／ｍｌ、ＩＬ６  １０  ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ−ＣＳＦ  ５  ｎｇ／ｍｌ、ＥＰＯ  １  ＵＩ／ｍｌ、および、ＳＣＦ  ２０  ｎｇ／ｍｌ、１０６細胞／ｍｌの濃度）を含む、０．８％メチルセルロースにまいた。ＣＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｌを培養の７日目にカウントし、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＦＭを１４日目にカウントした。増加濃度のＡＰＧ１０１を添加した。
【００６６】
統計
生物学的データを、中央値±平均の標準誤差として分析した。ＦａｓおよびＦａｓＬアッセイに関するフローサイトメトリーの感度および特異性を、受信者操作曲線（ＲＯＣ）を用いて評価し、閾値を推定した。スチューデントｔ−検定（Ｅｘｃｅｌ  ２００３ソフトウェア、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いて連続変数を比較した。カプラン−マイアー推定量を用いて、試験中の母集団の２つのサブグループにおける、全生存に対するＦａｓおよびＦａｓＬの影響を経時的に評価し、Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ検定と比較した。全ての統計分析は両側であり、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。統計分析はＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて行なった。
【００６７】
結果
ＦａｓＬ発現およびＭＤＳ診断
ＦａｓＬの発現を、８４人のＭＤＳ、２１人のｓＡＭＬおよび１７人のコントロールにおいて、ＣＤ４５ｌｏｗ／ＣＤ３４＋およびＣＤ７１＋骨髄細胞集団の両方で測定した。ＦａｓＬは、ｓＡＭＬまたはコントロールよりも、ＭＤＳにおいて有意に上昇し（図４Ａ）、ＲＯＣによれば、陽性の閾値は６であった。ＭＤＳをコントロールと比較したところ、ＭＤＳとコントロールとの間を区別するＦａｓＬ発現の予測値は良好であった（曲線の下の領域：０．７３；Ｐ＝０．００２；図４Ｂ）。
【００６８】
診断でＦａｓ発現の値が知られた１６６人のＭＤＳまたはｓＡＭＬ患者について、および、診断でＦａｓＬの値が知られた４２人のＭＤＳ／ｓＡＭＬ患者において、臨床情報を収集し、予後に対するＦａｓまたはＦａｓＬ発現の影響を分析した。１６６人のＭＤＳ患者のグループでは、４１％がＦａｓに関して陽性であり、年齢、性別、ヘモグラムパラメーター、骨髄芽球（％）、多系列の形成異常、核型、ＩＰＳＳおよび治療に関して、いかなる違いも示さなかった。Ｆａｓ発現は、全生存に対して影響は何もなかった（図５）。さらに、Ｆａｓ発現は、ＥＰＯに対する応答の予測にならなかった。
【００６９】
ＭＤＳ／ｓＡＭＬを有する４２人の患者のグループでは、１８人の患者がＦａｓＬ（ＲＦＩ≧５）に関して陽性であった。Ｈｂレベルおよび全生存中央値は、ＦａｓＬ−陽性およびＦａｓＬ−陰性患者において同等であった（それぞれ、Ｐ＝０．５７およびＰ＝０．９７）。さらに、患者の小集団（ｎ＝２２）でのＦａｓＬ発現は、治療に対する応答の予測にならなかった。
【００７０】
要するに、これらのデータは、ＦａｓおよびＦａｓＬがＭＤＳで過剰発現されたことを示し、ＦａｓＬの過剰発現はＭＤＳの予測となる。Ｆａｓ−発現とＦａｓＬ−発現のいずれも、全生存に関する予後パラメーターにはならない。
【００７１】
造血前駆細胞の増殖に対する、ＡＰＧ１０１の効果
試験は、過剰の可溶性Ｆａｓ（Ｆａｓ：Ｆｃ）によるＦａｓＬのブロッキング、および、アダプターＦＡＤＤのドミナントネガティブな形態の異所性発現を介したＦａｓシグナル伝達の崩壊が、ＢＦＵ−Ｅ増殖を助けたことを示している。メチルセルロース分析での、赤血球および顆粒単球前駆細胞に対する、増加濃度のＡＰＧ１０１（０、０．０１、０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）の効果を分析したところ、ＡＰＧ１０１はＣＦＵ−ＧＭ増殖を刺激しないが、適度のポジティブな効果がＢＦＵ−Ｅ増殖について見られることが明らかになった（図６）。
【００７２】
さらに、成熟赤血球前駆細胞の増殖（ＣＦＵ−Ｅ）に対するＡＰＧ１０１の効果、および、白血病性芽球の応答を、メチルセルロース培養の７日目に、ＣＦＵ−Ｌ（少なくとも５０細胞の非赤血球クラスター）の数をカウントすることにより分析した（図７）。ＡＰＧ１０１は、ＲＡＥＢ２患者（診断で１０％を超える芽球を有するＭＤＳ）由来のサンプルにおいてさえ、ＣＦＵ−Ｅ増殖を助けず、および、ＣＦＵ−Ｌの数を増加させないことが分かり、ＡＰＧ１０１が白血病性芽球の増殖を刺激しないことが示された。
【００７３】
ＭＤＳの赤血球産生に対するＡＰＧ１０１の効果に関するさらなる見解を得るために、ＭＤＳ患者由来のＣＤ３４＋骨髄細胞を分離し、コミットメントのための「赤血球条件」下でまいた。液体培養の５日目に細胞を採取し、それからメチルセルロースにまいて、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭの数を評価した。図７に示すように、ＢＦＵ−Ｅの初期数は、コントロールに比べてＭＤＳにおいて減少した。ＡＰＧ１０１は、ＢＦＵ−Ｅの数の３倍増加を誘導したが、正常レベルに到達しなかった。ＣＦＵ−ＧＭは、ＢＦＵ−Ｅよりもひどくない減少であり、ＡＰＧ１０１により影響を受けなかった。これらの結果は、赤血球系に対するＡＰＧ１０１の特異的な効果を示唆する。
【００７４】
赤血球産生中の、細胞分化に対するＡＰＧ１０１の効果を調べるために、培養をＥｐｏ&インスリンに転換するとき（ＦａｓＬ発現の開始と同時）に、異なる濃度のＡＰＧ１０１を細胞培養に添加した。培養の１４日目に、全細胞数は平均６０％増加し、アポトーシスが最大で３３％まで減少することが分かった（図９）。
【００７５】
ＡＰＧ１０１は赤血球細胞の分化に対して効果がなく、より重要なことには、細胞成熟をブロックしなかった（図１０）。
【００７６】
薬の恩恵を受けることのできる患者群を線引きするため、メチルセルロース分析からのデータを、初期臨床的および生物学的特徴に従って再分析した。メチルセルロース分析は、Ｅｐｏに対する応答を予測するのに便利なツールとして以前に検証され、赤血球産生の質と良く相関する（Ｆｒｉｓａｎら 、２０１０）。
【００７７】
最初に、クローン原性分析を、Ｆａｓの初期発現に従って分析した。図１１に示すように、１０  μｇ／ｍｌのＡＰＧ１０１存在下でのＢＦＵ−Ｅ増殖の改善は、Ｆａｓ−陽性患者およびＦａｓ−陰性患者において有意差がなかった。
【００７８】
次に、ＡＰＧ１０１の効果を、ＣＤ７１−陽性の集団でのＦａｓＬの発現に従って分析した。このシリーズでは、陽性の閾値は２．８であった。ＦａｓＬ−陽性ＭＤＳは３．７の中央値ｆａｓＬ  ＲＦＩを有し、ＦａｓＬ−陰性患者は２．２の中央値ＦａｓＬ  ＲＦＩを有した。ＡＰＧ１０１の効果は、高−ＦａｓＬ−発現を示すＦａｓＬ−陽性患者と低−ＦａｓＬ−発現を示すＦａｓＬ−陰性患者との間で違いがなかった。
【００７９】
３つ目に、診断でのＣＦＵ−Ｌ初期増殖およびＢＦＵ−Ｅ増殖に対するＡＰＧ１０１の効果の間の正の相関が求められた。過剰の白血病性クラスターを有する患者では、ＡＰＧ１０１はＢＦＵ−Ｅ増殖を助けることができなかったが、ＣＦＵ−Ｌの初期増殖の低い患者では、ＢＦＵ−Ｅの数を非常に効率的に増加させた（図１３、左）。
【００８０】
最後に、ＡＰＧ１０１は、赤血球産生が保存された患者よりも、ベースラインでの赤血球産生が非常に変更されたＭＤＳ患者由来の骨髄細胞において、ＢＦＵ−Ｅ増殖をより効率的に改善した（図１３、右）。
【００８１】
要約
赤血球産生の重度な障害を有する低グレードおよびＩＮＴ−１グレードのＭＤＳ患者由来の造血幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）のインビトロ培養において、ＡＰＧ１０１が、赤血球細胞の増殖を助けることが示された。ＡＰＧ１０１は、白血病細胞の増殖を促進しなかったので、白血病細胞の拡大のリスクを増大させなかった。
【００８２】
ＦａｓＬの過剰発現は疾患の予測となった。しかしながら、ＦａｓもＦａｓＬ発現も、全生存に対する影響を有することは明確には示されなかった。
【００８３】
Ｆａｓは、貧血で生じる造血前駆細胞のアポトーシス細胞死の主な主体の一つである。したがって、可溶性Ｆａｓ受容体（すなわちＡＰＧ１０１０）を用いた、ＦａｓとＦａｓＬとの相互作用の阻害は、ＭＤＳ患者において、赤血球産生を助けることができる。
【００８４】
ＡＰＧ１０１は、赤血球産生が重度に欠損し過剰の白血病性芽球がないＭＤＳ患者のサブグループにおいて、赤血球細胞の増殖を助ける。ＡＰＧ１０１は、ＣＦＵ−Ｌのカウントにより評価されるように、白血病細胞の増殖を刺激しなかったが、ＡＰＧ１０１は、診断で過剰のＣＦＵ−Ｌを示す患者において、ＢＦＵ−Ｅ増殖を助けることはできなかった。まとめると、ＡＰＧ１０１は、診断で赤血球産生の障害が重度であり芽球が過剰でないＭＤＳを有する患者由来の造血幹細胞において、ＢＦＵ−Ｅ増殖を助けるのに効果的である。これらの患者は、Ｆａｓの過剰発現および高レベルのアポトーシスに一部起因して、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）に対して抵抗性であることが以前に分かっていた（Ｆｒｉｓａｎら、２０１０）。
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【図１】
0006297552.tif 000005
【図２】
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【図３】
0006297552.tif 000007
【図４Ａ】
0006297552.tif 000008
【図４Ｂ】
0006297552.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006297552.tif 000013
【図９】
0006297552.tif 000014
【図１０】
0006297552.tif 000015
【図１１】
0006297552.tif 000016
【図１２】
0006297552.tif 000017
【図１３】
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【配列表】
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