(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）  配列ＡＣＧＵＡＵＣＣＣＵＵＵＵＣＧＣＧＵＡ（配列番号２）又は
（ｉｉ）以下：
【化１】
0006297034.tif 000010
に示すアプタマーの予測される二次元構造のとおりに、アプタマーの幹領域内に１個、２個、３個、又は４個の置換を含んでいてもよいことを除いては配列番号２と同一である配列
を含む、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するＲＮＡアプタマー。
【請求項２】
９０ｎＭ±１０％以下のＥｐＣＡＭに対する解離定数を有し、及び/又は配列の長さが１９〜４０塩基の間である、請求項１に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項３】
配列番号２の配列から成る、請求項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項４】
アプタマーの安定性を高める１以上の修飾を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項５】
２’−フルオロ修飾されている、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項６】
ＥｐＣＡＭ＋細胞に特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項７】
ＥｐＣＡＭ＋細胞が癌幹細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項８】
前記細胞が生体内又は試験管内にある、請求項６又は７に記載のアプタマー。
【請求項９】
前記細胞が対象から得られる生物試料に存在する、請求項６又は７に記載のアプタマー。
【請求項１０】
前記細胞が、乳癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、結腸癌幹細胞、肝臓癌幹細胞、肺癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、又は頭頸部の癌幹細胞である請求項６〜９のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１１】
酵素、補欠分子族、蛍光物質、生物発光物質、高電子密度標識、ＭＲＩ用標識及び放射性物質並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される検出可能な標識に結合させた、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーを含む診断剤。
【請求項１２】
生物試料の組織学的検査に使用するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー又は請求項１１に記載の診断剤。
【請求項１３】
毒素、放射性核種及び化学療法剤並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される部分に結合させた請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーを含む抗癌剤。
【請求項１４】
対象から得られる生物試料からＥｐＣＡＭを発現している細胞及び／又は癌幹細胞を単離する、精製する又は濃縮するインビトロの方法であって、前記細胞を請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー又は請求項１１に記載の診断剤に接触させるステップを含む、方法。
【請求項１５】
癌を有するか又は癌を有することが疑われる対象から得られる生物試料においてＥｐＣＡＭを発現している細胞及び／又は癌幹細胞を特定するインビトロの方法であって、前記細胞を請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー又は請求項１１に記載の診断剤に接触させるステップを含む、方法。
【請求項１６】
前記対象が、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、頭頸部の癌、黒色腫又はＥｐＣＡＭ＋細胞が存在する任意の他の癌から選択される癌を有する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象において癌を治療する又は予防するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー又は請求項１３に記載の抗癌剤。
【請求項１８】
ｓｉＲＮＡ又はリボザイムに結合させた請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーを含む送達剤。
【請求項１９】
配列ＡＣＧＵＡＵＣＣＣＵＵＵＵＣＧＣＧＵＡＡＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧＵＣＣＵＵ（配列番号３）を含む、請求項１８に記載の送達剤。
【請求項２０】
薬学上許容可能なキャリア及び／又は賦形剤と一緒に、治療上有効な量の請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー、請求項１３に記載の抗癌剤、又は請求項１８若しくは１９に記載の送達剤を含む組成物。
【請求項２１】
腫瘍の分子イメージングにて使用するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー又は請求項１１に記載の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願及び参照による組み入れ
本明細書で引用される又は参照される文書はすべて、及び本明細書で引用される文書にて引用された又は参照された文書はすべて、本明細書又は参照によって本明細書に組み入れられる文書にて言及されたいかなる製品についての製造元の指示書、説明、製品仕様書及び製品概要とともに、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本開示はＲＮＡアプタマー及びその使用に関するものであり、特に、ＥｐＣＡＭに特異的に結合し、且つ優れた腫瘍浸透能を示すアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００３】
上皮細胞接着分子ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６又はＥＳＡとしても知られる）は上皮細胞間の接着を促進すること、妨害することの双方が可能である多面的な分子である。それは種々のヒト上皮組織にて低レベルで発現される３０〜４０ｋＤａのＩ型のグリコシル化膜タンパク質である。ＥｐＣＡＭはほとんどの固形腫瘍で過剰発現される。たとえば、ＥｐＣＡＭの強い発現は９８％を超える結腸直腸癌患者にて見いだされる。２０年間にわたる研究によって腫瘍形成におけるＥｐＣＡＭの役割が明らかにされている。アポトーシスに拮抗するよりはむしろ、ＥｐＣＡＭは、癌原遺伝子ｃ−ｍｙｃ及びサイクリンＡ及びＥを上方調節する細胞周期の制御に対する直接的な影響によって増殖を誘導し、Ｗｎｔ経路を介して細胞核にシグナルを伝達することによって作用する。
【０００４】
小さな比率の癌細胞が制約を受けない増殖能を持ち、自己再生することができ、分化した癌細胞の子孫を生成することが最近認識されている。これらのいわゆる癌幹細胞（ＣＳＣ）は化学療法及び放射線療法に耐性である。細胞傷害剤及び放射線は主として大部分の腫瘍細胞を殺傷するが、癌幹細胞を見逃すと考えられる。従って、効果的に癌を撲滅するには、癌幹細胞ならびにその子孫細胞を標的とし、排除しなければならない。
【０００５】
上皮細胞接着分子は、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌及び肝臓癌を含む多数の固形腫瘍にて癌幹細胞のマーカーであることが特定されている。種々の癌におけるＥｐＣＡＭの発現は患者の予後に逆相関すると思われる（Baeuerle PAら (2007). Br J Cancer 96:417-23）。抗ＥｐＣＡＭ抗体による最初の臨床試験は目的の臨床応答を提供することができなかった。抗体の大きなサイズがモノクローナル抗体の分布及び送達に対する制約であると考えられる。加えて、抗体依存性の細胞傷害性は、抗体産生の間に大きく変化することができる抗体のＣＨ２における糖質の組成に依存する。従って、標的化された癌治療法には、さらに小さな且つさらに効果的なＥｐＣＡＭを標的とする分子が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在の抗ＥｐＣＡＭ抗体療法の様々な成功を考えて、本発明者らは、ＥｐＣＡＭ癌幹細胞マーカーを標的とするヌクレアーゼ耐性のＲＮＡアプタマーを開発しようと努力した。アプタマーは抗体よりも１０〜２０倍小さいので、それらは最高の組織浸透性を有し、従って癌の標的化では抗体よりも有利である。アプタマーは大きな有望さを示す一方で、免疫組織化学用のプローブとしてのその使用には限定された報告がある。理論に束縛されることを望まないで、組織学プロトコールにて抗体をアプタマーに置き換えることに関連する困難さの１つは、核に存在するヒストンのような正に荷電した部位へのこれらポリアニオンの核酸アプタマーの静電気引力によるその非特異的な染色に由来し得ることが示唆されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、診断潜在力及び治療潜在力を有する、ＥｐＣＡＭに対するＲＮＡアプタマーを記載する。
【０００８】
本開示は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する単離されたＲＮＡアプタマーを提供し、その際、該アプタマーは、配列５’−ＧＣＧＡＣＵＧＧＵＵＡＣＣＣＧＧＵＣＧ−３’（配列番号１）を有するＤＴ３ではない。
【０００９】
本開示は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する単離されたＲＮＡアプタマーを提供し、該アプタマーは配列５’−ＡＣＧＵＡＵＣＣＣＵＵＵＵＣＧＣＧＵＡ−３’（配列番号２）を含む。一例では、ＥｐＣＡＭはヒトのＥｐＣＡＭである。
【００１０】
一例では、本開示のアプタマーは、乳房腫瘍細胞株上で発現されているＥｐＣＡＭに対する約９０ｎＭ以下の解離定数を有する。別の例では、解離定数は約６５ｎＭ以下である。別の例では、解離定数は約４５ｎＭ以下である。別の例では、解離定数はＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞に対して約８７ｎＭである。別の例では、解離定数はＭＣＦ７細胞に対して約６４ｎＭである。別の例では、解離定数はＴ４７Ｄ細胞に対して約４１ｎＭである。
【００１１】
別の例では、本開示のアプタマーは結腸癌細胞株（ＨＴ２９細胞）上で発現されているＥｐＣＡＭに対する約３７ｎＭの解離定数を有する。
【００１２】
別の例では、単離されたＲＮＡアプタマーは配列番号２の配列から本質的に成る。
【００１３】
別の例では、単離されたＲＮＡアプタマーは配列番号２の配列から成る。
【００１４】
別の例では、単離されたＲＮＡアプタマーは配列番号２の配列を含み、その際、配列の長さは１９〜１００塩基の間である。別の例では、配列の長さは１９〜４０塩基の間である。別の例では、配列の長さは１９〜３０塩基の間である。別の例では、配列の長さは１９〜２５塩基の間である。用語「塩基」は本明細書で使用されるとき、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）又はシトシン（Ｃ）であるヌクレオチド塩基又はヌクレオチド残基を意味するように理解される。塩基は、シトシンとグアニン、アデニンとウラシルの間で及びグアニンとウラシルの間で水素結合を形成し得る。
【００１５】
別の例では、配列は、配列番号２の配列の中で１以上の置換を含む。別の例では、配列は、配列番号２の配列の中で少なくとも１、２、３、４、５又は６の置換を含む。別の例では、配列は、配列番号２に係るアプタマーの幹領域の中で少なくとも１、２、３、４、５又は６の置換を含む。一例では、幹領域はアプタマーの予測される二次元構造の領域である。
【００１６】
一例では、アプタマーは、（試験管内又は生体内で）アプタマーの安定性を改善する１以上の修飾を含む（修飾されたアプタマー）。好適な修飾は本明細書の他のどこかで考察される。一例では、ピリミジン塩基は２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾される。別の例では、ＲＮＡアプタマーの３’末端を修飾してそれをヌクレアーゼ消化から保護する。別の例では、５’末端を蛍光色素分子又は逆位ｄＴ又はＰＥＧ分子に結合することによってアプタマーを修飾する。
【００１７】
本開示は、配列番号２の配列を含むアプタマーとＥｐＣＡＭに結合する実質的に同じ能力を有する単離されたＲＮＡアプタマーも提供し、その際、該アプタマーは、配列５’−ＧＣＧＡＣＵＧＧＵＵＡＣＣＣＧＧＵＣＧ−３’（配列番号１）を有するＤＴ３ではない。
【００１８】
一例では、アプタマーはＥｐＣＡＭ＋細胞に特異的に結合する。別の例では、ＥｐＣＡＭ＋細胞は幹細胞である。別の例では、幹細胞は単離された癌幹細である。別の例では、癌幹細胞は、（ｉ）ＥｐＣＡＭを発現していること、（ｉｉ）腫瘍形成性であること、（ｉｉｉ）自己再生が可能であること、（ｉｖ）分化することが可能であること、及び（ｖ）従来の治療法によるアポトーシスに耐性であることを特徴とする。
【００１９】
癌幹細胞は、生物試料のような供給源から単離され、濃縮され、又は精製されるとして代わりに記載され得る。別の例では、癌幹細胞は、ＥｐＣＡＭ＋発現に基づいて濃縮された細胞の集団を表す。別の例では、細胞の集団は少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の癌幹細胞を含む。
【００２０】
一例では、ＥｐＣＡＭを発現している細胞及び／又は癌幹細胞は生体内に存在する。別の例では、ＥｐＣＡＭを発現している細胞及び／又は癌幹細胞は試験管内に存在する。さらなる例では、ＥｐＣＡＭを発現している細胞及び／又は癌幹細胞は対象から得られる生物試料に存在する。
【００２１】
別の例では、本開示のＥｐＣＡＭを発現している細胞及び／又は癌幹細胞は、ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、β−カテニン、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＡＬＤＨ、ＶＬＡ−２、ＣＤ１６６、ＣＤ２０１、ＩＧＦＲ及びＥＧＦ１Ｒを含む１以上の追加の抗原を発現し得る。
【００２２】
別の例では、本開示に係る癌幹細胞は、乳癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、結腸癌幹細胞、肝臓癌幹細胞、肺癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、又は頭頸部の癌幹細胞である。
【００２３】
本開示はまた本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマーを含む診断剤も提供する。
【００２４】
一例では、診断剤は、検出可能な標識に結合させた本開示のＲＮＡアプタマーを含む。
【００２５】
本発明のアプタマーは非特異的な抗体結合に関連し得る合併症を回避するので、優れたシグナル対ノイズの比を提供することが当業者によって理解される。
【００２６】
一例では、本明細書で記載されるような診断剤を用いて生体内又は試験管内にてＥｐＣＡＭを発現している癌幹細胞を検出する。
【００２７】
一例では、本開示のＲＮＡアプタマーを診断で用いて、対象において又は腫瘍を有する又は腫瘍を有することが疑われる対象から得られる生物試料においてＥｐＣＡＭを発現している細胞及び／又は癌幹細胞の存在を検出することができる。アプタマーを検出可能な標識に結合することによって検出を円滑にすることができる。検出可能な標識の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、高電子密度標識、ＭＲＩ用標識及び放射性物質が挙げられる。
【００２８】
本開示はまた、生物試料の組織学的検査で使用するための本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は本明細書で記載されるような診断剤も提供する。組織学的標本を調製する方法は当業者によく知られているであろう。
【００２９】
本開示はまた、本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマーを含む抗癌剤も提供する。
【００３０】
一例では、抗癌剤はある部分に結合させた本開示のＲＮＡアプタマーを含む。部分は、放射線核種、化学療法剤、ｓｉＲＮＡ又は毒素又はそれらの組み合わせから成る群から選択され得る。さらなる例では、抗癌剤は、配列５’−ＡＣＧＵＡＵＣＣＣＵＵＵＵＣＧＣＧＵＡＡＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧＵＣＣＵＵ−３’（配列番号３）を含むＲＮＡアプタマー／サバイビンｓｉＲＮＡの複合体を含む。
【００３１】
一例では、本明細書で記載されるような抗癌剤を用いて対象にて癌を治療する。一例では、対象は、本開示のＲＮＡアプタマーによる治療から恩恵を受けるものである。別の例では、対象は癌を有すると診断されているものである。別の例では、対象は固形腫瘍を有するものである。さらなる例では、対象は、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、頭頸部の癌、又はＥｐＣＡＭ＋細胞が存在する任意の他の癌から選択される癌を有するものである。
【００３２】
本開示のアプタマーをある部分に結合させることができ、アプタマーを用いて、ＥｐＣＡＭを発現している癌幹細胞を含む又は含むことが疑われる腫瘍の部位にその部分を向かわせることができる。部分の例には、癌幹細胞を殺傷するのに使用することができる毒素、放射性核種又は化学療法剤、又はＥｐＣＡＭを発現している細胞を含む腫瘍の位置取りをする若しくは寸法決めをするのに使用することができる造影剤が挙げられる。
【００３３】
本開示のＲＮＡアプタマー含む抗癌剤はさらに１以上の有効成分を含むことができる。
【００３４】
本開示はまた、対象から得られた生物試料からＥｐＣＡＭを発現している細胞及び／又は癌幹細胞を単離する、精製する又は濃縮する方法も提供し、該方法は、本開示のＲＮＡアプタマー又は本開示の診断剤に細胞を接触させることを含む。一例では、方法は試験管内で実施される。
【００３５】
ＥｐＣＡＭを発現している細胞を単離する、精製する又は濃縮する方法は当業者に既知であり、本明細書の他のどこかでも記載される。
【００３６】
本開示はまた、対象において又は癌を有する若しくは癌を有すると疑われる対象から得られる生物試料にてＥｐＣＡＭを発現している細胞及び／又は癌幹細胞を特定する方法も提供し、該方法は、本開示の単離されたＲＮＡアプタマー又は本開示の診断剤に細胞を接触させることを含む。
【００３７】
本開示はまた、本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は本明細書で記載されるような抗癌剤を対象に提供することを含む、対象にて癌を治療する又は予防する方法も提供する。
【００３８】
一例では、癌は、ＥｐＣＡＭを発現している細胞及び／又は癌幹細胞が存在する又は存在することが疑われる癌である。別の例では、対象は癌を有すると診断されているものである。別の例では、対象は固形腫瘍を有するものである。さらなる例では、対象は、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、皮膚癌、又はＥｐＣＡＭ＋細胞が存在する任意の他の癌から選択される癌を有するものである。
【００３９】
本開示はまた、薬物での本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は抗癌剤の使用にも関する。
【００４０】
本開示はまた、対象にて癌を治療する又は予防するための本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は抗癌剤の使用にも関する。
【００４１】
本開示はまた、対象にて癌を治療する又は予防するための薬物の製造における本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は抗癌剤の使用にも関する。
【００４２】
本発明はまた、ｓｉＲＮＡ又はリボザイムに結合させた本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマーを含む送達剤にも関する。一例では、送達剤は、配列５’−ＡＣＧＵＡＵＣＣＣＵＵＵＵＣＧＣＧＵＡＡＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧＵＣＣＵＵ−３’を含むＲＮＡアプタマー／サバイビンｓｉＲＮＡ複合体を含む。
【００４３】
本開示はまた、薬学上許容可能なキャリア及び／又は賦形剤と一緒に、治療上有効な量の本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー、抗癌剤又は送達剤を含む組成物も提供する。
【００４４】
本開示はまた、腫瘍の分子イメージングで使用するための本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は本明細書で記載されるような診断剤も提供する。
【００４５】
本発明のＲＮＡアプタマーの腫瘍浸透能は腫瘍の分子イメージングについて抗体を超える明瞭な利点を提供する。たとえば、ＥｐＣＡＭを発現している細胞を持っている腫瘍の検出及びイメージングを円滑にする剤にＲＮＡアプタマーを結合することができる。好適な剤の例には本明細書で記載されるような検出標識が挙げられる。
【００４６】
本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー、診断剤、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物は単独で、又は他の治療手段と併用で使用され得る。たとえば、ＲＮＡアプタマー、診断剤、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物は、化学療法及び／又は放射線療法との併用で使用され得る。理論によって束縛されることを望まないが、化学療法剤又は放射線療法剤は、通常癌幹細胞の子孫細胞である迅速に分割している細胞を第一に標的とすることによって腫瘍を小さくするのに使用することができると仮定されている。診断剤を使用して前の治療手段の有効性を判定し、腫瘍における癌幹細胞の存在又は非存在を検出することによって癌幹細胞を排除することができる。次いで本開示のＲＮＡアプタマーを含有する抗癌剤、送達剤又は医薬組成物を腫瘍の部位に投与して癌幹細胞を特異的に枯渇させることができる。従って、ＲＮＡアプタマーを含有する抗癌剤、送達剤又は医薬組成物を化学療法若しくは放射線療法と一緒に、又は化学療法若しくは放射線療法の治療に続いて用いることができる。癌幹細胞に存在する抗原を標的とする１以上の追加のアプタマーと本開示のＲＮＡアプタマーを併用することができることも企図される。
【００４７】
本開示の各例は、対象にて癌を治療する、予防する又は改善する方法に準用されるように解釈されるべきである。
【００４８】
本開示の各例は、腫瘍の分子イメージングに準用されるように解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】アプタマー及び抗体を用いたパラフィン包埋された組織におけるＥｐＣＡＭの検出を示す図である。（Ａ）乳癌（Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、結腸癌（ＨＴ−２９）及び膠芽細胞腫（Ｕ１１８ＭＧ）の異種移植腫瘍のＥｐＣＡＭアプタマー、ＤＴ３及び２３、対照アプタマー及び抗ＥｐＣＡＭ抗体３２３／Ａ３による免疫蛍光染色（青色：核、赤色：ＥｐＣＡＭ陽性染色）。（Ｂ）抗ＥｐＣＡＭ抗体ＢｅｒＥＰ４によって免疫組織化学法を行い、形態確認のためにヘマトキシリン及びエオシン染色によって腫瘍すべてを評価した。アプタマーの染色は３７℃で１５分間行い、３２３／Ａ３の染色は４℃で一晩行い、ＢｅｒＥＰ４は室温で２０分間行った。蛍光画像はすべて６０×で撮影し、光学顕微鏡画像は２０×で撮影した。画像は少なくとも３回の別々の実験の代表的なものである。尺度棒：５０μｍ。
【図２】ＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラの構造を示す図である。ＥｐＣＡＭアプタマーによって方向づけされるｓｉＲＮＡの生体内送達のためのキメラは、３つの要素、ＥｐＣＡＭアプタマーに連結されるｓｉＲＮＡのガイド鎖（Ａ）、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖（Ｂ）及びリンカーで構成される。図２Ｃは組み立てられたｓｉＲＮＡ／アプタマーのキメラを示す。分子イメージングを円滑にするためにＤｙ６４７蛍光色素をｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の５’末端に連結する（Ｃ）。細胞質におけるＤｉｃｅｒ酵素によるプロセシングの後の予測される最終生成物を（Ｄ）に示す。
【図３】ネイティブアガロースゲルによるキメラの分析を示す図である。アニーリングの後、キメラの長さと個々の成分を２％の非変性アガロースゲルで分析した。ＲＮＡはＧｅｌＳｔａｒで染色した。長い方の鎖の解析は３つのバンド（それぞれ、２５ｂｐ、５５ｂｐ及び２００ｂｐ）を生じ、それは不安定な複合構造（４３ｎｔについてΔＧ−７．５ｋｃａｌ／モル）にたぶん関係する一方で、短い方の鎖についてはたった１本のバンドしか検出されなかった（２０ｂｐ、２１ｎｔについてΔＧ−０．５ｋｃａｌ／モル）。双方の鎖のアニーリングに続いて単一バンドが視覚化された（キメラ５００ｂｐ）ということは、新しい安定な構造が創られた（６４ｎｔについてΔＧ−４２．６ｋｃａｌ／モル）ことを示唆している。
【図４】ＥｐＣＡＭ陽性のＨＴ−２９結腸腺癌細胞によってＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡキメラは特異的に内部移行させられることを示す図である。Ｄｙ６４７標識したＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡキメラを示したヒト癌細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートし、その後、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。各パネル対については、蛍光画像が上にあり、光学（位相差）画像が下にある。（Ａ）ＨＥＫ−２９３Ｔ（ＥｐＣＡＭ陰性）及びＨＴ−２９（ＥｐＣＡＭ陽性）細胞株へのキメラの結合及び細胞内分布。（Ｂ）単一のＨＴ−２９細胞における蛍光標識したＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡキメラの穴あけパターンを示す拡大顕微鏡写真。尺度棒＝２０μｍ。
【図５】乳癌の異種移植モデルにおけるアプタマー／ｓｉＲＮＡキメラの生体内標的化有効性を示す図である。（Ａ）８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの第４乳腺にＴ４７Ｄ乳管癌細胞（ＥｐＣＡＭ陽性）を同所性に異種移植した。腫瘍が約０．２ｃｍ３の体積に達したら、尾静脈注射を介してキメラ（１ナノモル／マウス）とともにＤｙ６４７標識したｓｉＲＮＡ／ＥｐＣＡＭアプタマーキメラを投与した。注射の後、示すように様々な時点でＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩイメージングシステムを用いて蛍光密度を測定した。（Ｂ）キメラの相対的な蛍光シグナル強度／時間の分析結果。各時点の蛍光の値をバックグランド（０分で測定した蛍光の値）に対して正規化した。（Ｃ）注射の４時間後、生きている動物の画像から蛍光が消失したら、図に示した腫瘍及び臓器を切り出し、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩイメージングシステムを用いて直ちに蛍光強度を測定した。（Ｄ）ｓｉＲＮＡ／アプタマーキメラについての生体分布及び腫瘍の取り込みの分析結果。各臓器及び腫瘍からの蛍光の値をバックグランドの蛍光の値で正規化した。相対的なキメラの量は右のヒストグラムにて示す。
【図６】ＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡキメラが介在するサバイビン発現の阻害を示す図である。リポフェクトアミン２０００のような形質移入剤を使用することなく、完全な細胞培養培地（１０％ウシ胎児血清を含有する）にて異なる濃度のキメラ（１０ｎＭ及び４０ｎＭ）と共にＨＴ−２９細胞を２４時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を増殖培地でさらに４８時間インキュベートし、その後、細胞を溶解し、１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、ウエスタン解析を行った。（Ａ）ＨＴ−２９細胞におけるサバイビンタンパク質のウエスタンブロット解析。β−アクチンは内部負荷対照として役立った。（Ｂ）ｓｉＲＮＡ／アプタマーキメラによるサバイビンタンパク質のノックダウン。サバイビンの発現レベルは、サバイビンタンパク質の発現とβ−アクチンタンパク質の発現の比として正規化した。
【図７】キメラの試験管内でのＤｉｃｅｒ処理を示す図である。キメラをヒト組換えＤｉｃｅｒ酵素（１単位／反応）と共に１２時間インキュベートした。Ｄｉｃｅｒ切断の生成物及び非切断の生成物を４％Ｍｅｔａｐｈｅｒアガロースゲル上で視覚化した。陰性対照のキメラはパッセンジャー鎖のないキメラである。ゲル上で２１量体の二本鎖ＲＮＡの位置をマークするのに対照として二本鎖サバイビンのｓｉＲＮＡを用いた。
【図８】試験管内での腫瘍塊へのアプタマー２３の効果的な浸透を示す図である。幹細胞培養培地（２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ及びＥＤＦ及びＢ２７を伴ったＤＭＥＭ／Ｆ１２）にてＨＴ−２９細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。腫瘍塊が約３００〜４００μｍの大きさに達したら、腫瘍塊を、１００ｎＭのＰＥ標識した抗ＥｐＣＡＭ抗体、ＤＹ６４７標識したＥｐＣＡＭアプタマー２３又はＤＹ６４７標識したＥｐＣＡＭには結合しない対照アプタマーと共にインキュベートした。０．５、１、２又は４時間インキュベートした後、腫瘍塊をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光共焦点顕微鏡によって画像化した。各試料について腫瘍塊の位相差画像も撮影した。パネルＡ：抗体ＥｐＣＡＭについての蛍光画像、パネルＢ：腫瘍塊についての位相差画像。パネルＣ：アプタマーＥｐＣＡＭ２３についての蛍光画像、パネルＤ：腫瘍塊についての位相差画像。パネルＥ：アプタマー対照についての蛍光画像、パネルＦ：腫瘍塊についての位相差画像。
【図９】腫瘍塊におけるアプタマーの保持を示す図である。腫瘍塊をＥｐＣＡＭ抗体、アプタマー２３又は対照アプタマーと共に４時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、腫瘍塊をさらに２４時間培養培地にてインキュベートし、その後、共焦点顕微鏡で解析した。パネルＡ：抗体又はアプタマーについての蛍光画像。パネルＢ：腫瘍塊についての位相差画像。
【図１０】腫瘍塊への浸透におけるアプタマー２３の特異性及び選択性を示す図である。ＥｐＣＡＭ抗体又はアプタマー２３と共に別々に４時間インキュベートした後、腫瘍塊をＰＢＳで２回洗浄し、さらに２４時間インキュベートし、その後、共焦点顕微鏡で解析した。パネルＡ：アプタマー２３についての蛍光画像、パネルＢ：腫瘍塊についての位相差画像。パネルＣ：抗ＥｐＣＡＭ抗体についての蛍光画像、パネルＤ：腫瘍塊についての位相差画像。
【図１１】処理後のＣＳＣマーカーの解析を示す図である。ＥｐＣＡＭアプタマー／Ｄｏｘ（Ｂ）又はＤｏｘのみ（Ａ）で処理したＨＴ−２９腫瘍塊におけるＥｐＣＡＭ、ＣＤ４４及びＣＤ２４の発現のフローサイトメトリー解析。
【図１２】生体内での腫瘍増殖に対する試験管内での処理の効果を示す図である。Ｄｏｘ処理細胞又はＥｐＣＡＭアプタマー／Ｄｏｘ処理細胞を投与したマウスにおいて時間に対してＨＴ２９異種移植腫瘍のサイズ（体積）を測定した。
【図１３】生きている動物のイメージングを示す図である。０．７５ナノモルのＤｙ６４７／アプタマー／Ｄｏｘの単回ｉ．ｖ．注射に続くＨＴ２９腫瘍の蛍光の時間経過。
【図１４】アプタマー／Ｄｏｘの生体内処理の有効性を示す図である。ドキソルビシンのみ又はＥｐＣＡＭアプタマー／Ｄｏｘで処理したＨＴ２９異種移植腫瘍を抱えたマウスから摘出した腫瘍（Ａ）。平均腫瘍重量（Ｂ）。
【図１５】ＰＥＧ／アプタマー／Ｄｏｘの生体分布及び生体内安定性を示す図である。ＨＴ−２９結腸癌異種移植（ｓ．ｃ．）を抱えたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＰＥＧ／アプタマー／Ｄｏｘ（５ｍｇＤｏｘ／ｋｇ）をｉ．ｖ．で注射した。アプタマーＥＬＩＳＡを介して測定されたように所与の組織／臓器（ｇで）の重量によって正規化されたＰＥＧ／アプタマーの注射した用量（ＩＤ）パーセンテージ（％）を棒グラフでプロットした。
【図１６】ＣＳＣのマーカー解析の例を示す図である。Ｄｏｘのみでの処理に対するＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡキメラとＤｏｘ（Ｂ）で処理した（ｉ．ｖ．）ＭＣＦ−７／ＡＤＲ腫瘍塊におけるＥｐＣＡＭ、ＣＤ４４及びＣＤ２４のフローサイトメトリーによる発現。
【図１７】ＭＣＦ−７／ＡＤＲ腫瘍異種移植モデル（ｎ＝５）におけるアプタマー／ｓｉＲＮＡキメラによるサバイビンのノックダウンの生体内での有効性を示す図である。ＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡキメラによる生体内での腫瘍標的化ＲＮＡｉの生体内有効性を示すウエスタンブロットによる（Ａ）又は量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）によるサバイビンの発現。
【図１８】３回の処理の後の腫瘍重量を示す図である（ｎ＝８）。ＭＣＦ−７／ＡＤＲ腫瘍の担癌マウスを１、３及び５日目にＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡ／ＰＥＧキメラのｉ．ｖ．ボーラス注射で、２、４、及び６日目にドキソルビシンのｉ．ｖ．ボーラス注射で処理した。最後（３回目）の処理の２日後、腫瘍を取り出し、秤量した。
【００５０】
配列表への手がかり
配列番号１は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するアプタマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するアプタマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するアプタマー／ｓｉＲＮＡキメラのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
一般的な技法及び選択された定義
用語「及び／又は」、たとえば、「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味し、双方の意味又はいずれかの意味について明白な支持を提供するように理解されるべきである。
【００５２】
本明細書に含まれている文書、法令、物質、装置、物品等の考察は、これらの事項のいずれか又はすべてが、本出願の各クレームの優先日の前に存在したので従来技術の基礎の一部を形成する又は本開示に関連する分野における共通する一般的な知識であったという承認として解釈されるべきではない。
【００５３】
本明細書の全体を通して、別段具体的に述べられない又は文脈が別段要求しない限り、単一の工程、物資の組成物、工程の群又は物資の組成物の群は、１つの及び複数の（すなわち、１以上の）これらの工程、物資の組成物、工程の群又は物資の組成物の群を包含するように解釈されるべきである。
【００５４】
本明細書で記載される各例は、別段特に言及されない限り、本開示の他の例のそれぞれ及びすべてに準用されるべきである。
【００５５】
当業者は本開示が具体的に記載されたもの以外の変化及び改変の影響を受け易いことを十分に理解するであろう。本開示はそのような変化及び改変を含むことが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書で個々に又はまとめて引用される又は示される工程、特徴、組成物及び化合物のすべて、並びに当該工程又は特徴の組み合わせのいずれか及びすべて又はいずれか２以上のも含む。
【００５６】
本開示は、本明細書で記載される特定の例によって範囲が限定されるべきではなく、例示のみの目的を対象とする。機能的に同等の生成物、組成物及び方法は明らかに本開示の範囲内である。
【００５７】
本開示は、別段指示されない限り、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、細胞生物学及び免疫学の従来の技法を用いて、過度の実験を行わずに実施される。そのような手順は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第２版（１９８９），Ｉ，ＩＩ，及びＩＩＩの全巻；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，本文すべて；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，本文すべて，及びその中でのＧａｉｔによる論文のｐｐｌ−２２；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、ｐｐ３５−８１；Ｓｐｒｏａｔら、ｐｐ８３−１１５；及びＷｕら、ｐｐ１３５−１５１；４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８５）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，本文すべて；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８６）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，本文すべて；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），全シリーズ，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｄ．，Ｔｅｉｃｈｍａｎ，Ｊ．，Ｌｉｅｎ，Ｅ．Ｌａｎｄ  Ｆｅｎｉｃｈｅｌ，Ｒ．Ｌ．（１９７６）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７３：３３６−３４２；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９６３）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４；Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９７９）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編），第２巻，ｐｐ．１−２８４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１２．Ｗｕｎｓｃｈ，Ｅ．編（１９７４）Ｓｙｎｔｈｅｓｅ  ｖｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｎ  ｉｎ  Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌｓ  Ｍｅｔｏｄｅｎ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ（Ｍｕｌｅｒ，Ｅ．編），第１５巻，第４版，Ｐａｒｔｓ  １及び２，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．（１９８４）Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２５，４４９−４７４；Ｈａｎｄｂ���ｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；並びにＡｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第３版（Ｊｏｈｎ  Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ編，２０００），ＩＳＢＮ０１９９６３７９７０，本文すべて、にて記載されている。
【００５８】
本明細書の全体を通して、文脈が別段要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、言及される工程又は要素又は整数又は工程の群又は要素の群又は整数の群の包含を暗示するが、他の工程又は要素又は整数又は工程の群又は要素の群又は整数の群の排除を暗示しないように理解されるであろう。
【００５９】
用語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」又は「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、事項の方法、過程又は組成が引用された工程及び／又は成分を有し、追加の工程又は成分を有さないことを意味するように理解されるべきである。
【００６０】
用語「約」は本明細書で使用されるとき、重量、時間、用量等の量のような測定可能な値を指す場合、特定される量からの±２０％、又は±１０％、さらに好ましくは±５％、一層さらに好ましくは±１％、その上さらに好ましくは±０．１％の変動を、そのような変動が開示される方法を実施するのに適当であるため、包含することが意味される。
【００６１】
用語「アプタマー」は本明細書で使用されるとき一般に、単一の定義された配列のオリゴヌクレオチド又は当該オリゴヌクレオチドの混合物のいずれかを指し、その際、混合物はＥｐＣＡＭに特異的に結合する特性を保持する。本明細書で使用されるとき、「アプタマー」は一本鎖核酸を指す。構造的に、本開示のアプタマーは特異的に結合するオリゴヌクレオチドである。
【００６２】
用語「オリゴヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、ポリデオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ−Ｄ−リボース又はその修飾された形態を含有する）、すなわち、ＤＮＡ、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボース又はその修飾された形態を含有する）、すなわち、ＲＮＡ、及びプリン若しくはピリミジン塩基又は修飾されたプリン若しくはピリミジン塩基のＮ−グリコシド若しくはＣ−グリコシドである他の種類のポリヌクレオチド若しくは脱塩基ヌクレオチドに対して一般的である。本開示によれば、用語「オリゴヌクレオチド」には、従来の塩基、糖残基及びヌクレオチド間結合を伴うものだけでなく、これら３つの部分のいずれか又はすべての修飾を含有するものも含まれる。
【００６３】
用語「ＲＮＡアプタマー」は本明細書で使用されるとき、リボヌクレオチド単位を含むアプタマーである。ＲＮＡアプタマーは本明細書で定義されるようなＲＮＡ類似体も包含することが意味される。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「結合親和性」及び「結合活性」は標的に結合する又は結合しないリガンド分子／アプタマーの傾向を指すように意図され、標的に結合するリガンド分子／アプタマーの結合又は親和性の強度の測定を表す。当該相互作用のエネルギー論は、それらが相互作用する相手の必要な濃度、それらの相手が会合するのが可能である速度及び溶液における結合した分子と遊離の分子の相対的な濃度を定義するので、「結合活性」及び「結合親和性」にて有意である。エネルギー論は本明細書では、とりわけ、解離定数Ｋｄの決定を介して特徴づけられる。当該技術で知られるように低い解離定数は、互いに対する分子のより強い結合及び親和性を示す。一例では、解離定数は少なくとも１０−６Ｍである。別の例では、解離定数は少なくとも１０−８Ｍ及び１０−９Ｍである。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、用語「生物試料」は対象に由来する細胞又は細胞の集団又は若干の組織又は体液を指す。ほとんどの場合、試料は対象から取り出されているが、用語「生物試料」は生体内で分析される、すなわち、対象から取り出すことのない細胞又は組織も指すことができる。多くの場合、「生物試料」は対象に由来する細胞を含有するが、用語は、遺伝子の発現レベルを測定するのに使用することができる、たとえば、血液、唾液又は尿の非細胞性分画のような非細胞性の生物物質も指すことができる。生物試料には、組織生検、針生検、擦り取り（たとえば、頬擦り取り）、全血、血漿、血清、リンパ、骨髄、尿、唾液、痰、細胞培養物、胸膜液、心膜液、腹水液又は脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。生物試料は組織生検及び細胞培養物も含む。生物試料又は組織試料は、たとえば、血液、血漿、血清、腫瘍生検、尿、糞便、痰、脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、皮膚の外区分、呼吸器、腸管及び尿生殖管、涙液、唾液、乳、細胞（血液細胞を含むが、これらに限定されない）、腫瘍、臓器及び試験管内細胞培養成分の試料を含む個体から単離された組織又は流体の試料を指すことができる。一部の実施形態では、試料は、原発腫瘍若しくは転移腫瘍の切除、気管支鏡生検若しくはコア針生検、又は胸膜液の細胞塊に由来する。加えて、穿刺吸引試料も使用することができる。試料は、パラフィン包埋組織又は凍結組織であり得る。試料は、対象から細胞の試料を取り出すことによって得ることができるが、（たとえば、別の人によって単離された）あらかじめ単離された細胞を使用することによって又は生体内で本発明の方法を実施することによって得ることもできる。
【００６６】
用語「に結合する」は本明細書で使用されるとき、ＲＮＡアプタマーが本明細書で記載されるような検出剤、部分、ｓｉＲＮＡ又はリボザイムにつなげられる、連結される又は接合されるいずれかの構成を包含するように意図される。結合を達成する方法は当業者に知られるであろうし、それにはペプチドリンカーを介した、又は鎖全体としてのＲＮＡと剤（たとえば、ｓｉＲＮＡ又はリボザイム）の直接的な化学合成による結合、連結が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
用語「単離される」は本明細書で使用されるとき、他の成分から単離可能な又は精製されるＲＮＡアプタマー又は幹細胞（たとえば、癌幹細胞）を指すように意図される。単離された細胞は天然に存在し得る環境に由来する細胞を指す。単離された細胞は天然で得られた状態に比べて任意の程度に精製され得る。
【００６８】
用語「リガンド」は本明細書で使用されるとき、標的に結合する能力を有する分子又は他の化学実体を指す。リガンドは、ペプチド、オリゴマー、核酸（たとえば、アプタマー）、小分子（たとえば、化合物）、抗体又はその断片、核酸タンパク質融合体、及び／又は他の親和剤を含むことができる。従って、リガンドは、ライブラリ、特にコンビナトリアルライブラリ、たとえば、本明細書で以下に開示されるようなアプタマーライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、又は本明細書の開示を概観したのち当業者に明らかになるであろう他のライブラリを含む任意の供給源に由来することができる。
【００６９】
用語「修飾されたＲＮＡアプタマー」は本明細書で使用されるとき、単位としてのリボヌクレオチドを含有することに加えて、以下：２’−デオキシ、２’−ハロ（２’−フルオロを含む）、２’−アミノ（好ましくは、非置換の、又は１置換された又は２置換された）、２’−モノ−、ジ−又はトリ−ハロメチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−ハロ−置換されたアルキル、２’−アルキル、アジド、ホスホロチオエート、スルフヒドリル、メチルホスホネート、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、ビオチン、キサンチン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、６位にてイオウで置換された又は５位にてハロ若しくはＣ１５アルキル基で置換された２−ヒドロキシ−６−メルカプトプリン及びピリミジン塩基、脱塩基リンカー、３’−デオキシ−アデノシン並びに他の利用可能な「鎖ターミネータ」又は「非伸長」類似体（ＲＮＡの３’末端にて）又は３２Ｐ、３３Ｐ等のような標識の少なくとも１つも含有する高分子を指すことを意味する。上述のすべては、本明細書で開示される標準の合成法を用いてＲＮＡに組み入れることができる。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、用語「治療上有効な量」は、ＥｐＣＡＭを発現している癌幹細胞の数及び／又は癌の１以上の症状を減らす又は抑制するのに十分な、本開示に係るＲＮＡアプタマー、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物の量を意味するように解釈されるべきである。技量のある熟練者は、そのような量は、たとえば、特定の対象及び／又は疾患の種類若しくは重症度若しくはレベルに応じて変化するであろうことに気付くであろう。用語は本開示を特定の量のＲＮＡアプタマーに限定するようには解釈されない。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」又は「治療」又は「治療すること」は、治療上有効な量の本明細書で開示されるようなＲＮＡアプタマー、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物を投与し、癌に関連する又は癌が原因となる臨床状態の少なくとも１つの症状を軽減する又は抑制することを意味するように理解されるべきである。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、用語「予防する」又は「予防すること」又は「予防」は、治療上有効な量の本開示に係るＲＮＡアプタマー、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物を投与し、癌の少なくとも１つの症状の発症又は進行を止める又は妨げる又は遅らせることを意味するように解釈されるべきである。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、用語「特異的に結合する」は、ＲＮＡアプタマーが、代わりの細胞又は物質よりも特定の細胞又は物質により長い時間及び／又はより大きな親和性でさらに頻繁に、さらに迅速に反応する又は会合することを意味するように解釈されるべきである。たとえば、標的タンパク質に特異的に結合するＲＮＡアプタマーは、無関係のタンパク質及び／又はそのエピトープ若しくは免疫原性の断片に結合するよりもより大きな親和性、結合力でさらに容易に及び／又はより長い時間そのタンパク質又はそのエピトープ若しくは免疫原性の断片に結合する。この定義を読むことによって、たとえば、第１の標的に特異的に結合するＲＮＡアプタマーは、第２の標的に特異的に結合してもよいし、又は結合しなくてもよいことも理解される。よって、「特異的な結合」は、別の分子の排他的な結合又は検出できない結合を必ずしも必要としないので、これは用語「選択的結合」によって包含される。一般に、しかし、必ずではなく、結合への参照は特異的結合を意味する。結合の特異性は、一般に環境又は無関係な分子におけるアプタマー及び他の物質に関する解離定数と比べたときの標的に対するアプタマーの比較した解離定数（Ｋｄ）という点で定義される。通常、標的に関するアプタマーのＫｄは環境における標的と無関係な物質又は随伴物質に関するＫｄよりも２倍、５倍又は１０倍小さいであろう。一層さらに好ましくはＫｄは５０倍、１００倍又は２００倍小さいであろう。
【００７４】
用語「ＥｐＣＡＭ＋」又は「ＥｐＣＡＭを発現している細胞」は本明細書で使用されるとき、相互交換可能に使用され得る。用語は好適な手段によって検出することができるＣＤ１３３抗原の細胞表面での発現を包含する。所与のマーカーについて陽性である細胞に対する参照は、それが、マーカーが細胞表面に存在する程度に応じたそのマーカーの低（ｌｏ又はｄｉｍ）発現又は高（ｂｒｉｇｈｔ，ｂｒｉ）発現のいずれかであり得ることを意味し、用語は蛍光の強度に関する。フローサイトメトリーによって測定されるＣＤ４４及びＣＤ２４の発現に関して同じことが適用される。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」はヒト対象又は非ヒト対象を含む任意の対象を意味するように解釈されるべきである。非ヒト対象には、非ヒト霊長類、有蹄動物（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、水牛及びバイソン）、イヌ、ネコ、ウサギ目動物（ウサギ、野ウサギ、及びナキウサギ）、齧歯類動物（マウス、ラット、モルモット、ハムスター及びジャービル）、鳥類及び魚類が挙げられ得る。一例では、対象はヒトである。
【００７６】
アプタマー
アプタマーの幾つかの独特の特性によってそれらは多種多様な分子生物学用途での使用及び潜在的な医薬剤としての使用で魅力的なツールになっている。第１に、ほとんどのアプタマーが高い親和性で標的に結合するということは、ピコモルからナノモルの範囲での典型的な解離定数を示す。アプタマーの結合部位には標的分子の割れ目及び溝が含まれ、多数の現在利用可能な医薬剤と非常に類似する拮抗活性を生じる。第２に、アプタマーは広い範囲の温度及び保存条件にわたって構造的に安定であり、その独特の三次構造を形成する能力を維持する。第３に、アプタマーは、モノクローナル抗体を作出するのに必要とされる高価で且つ作業の多い生物系とは対照的に化学的に合成することができる。
【００７７】
理論に束縛されることを望まないで、ＲＮＡアプタマーは一般に、その標的タンパク質へのＲＮＡアプタマーの理論的に高い親和性並びに修飾されていないＲＮＡよりも大きな、修飾されたＲＮＡの血漿安定性のために多数のグループによって好まれる。
【００７８】
本明細書で開示されるのは、ｓｉＲＮＡ又はリボザイム、化学療法剤、放射性同位元素、毒素及び／又は抗原を運ぶ他の剤の効果的な細胞内送達に使用することができるＥｐＣＡＭ抗原に特異的に結合するＲＮＡアプタマー分子である。
【００７９】
アプタマーは、タンパク質又は小分子のような特定の標的分子に結合する一本鎖のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体である。従ってアプタマーは抗体に類似するオリゴヌクレオチド類似性である。一般に、アプタマーは、これらの範囲に入る長さのオリゴヌクレオチドを従来の技法で調製することができるという点で、約１５〜約１００のヌクレオチド、好ましくは約１５〜約４０のヌクレオチド、さらに好ましくは約２０〜約４０のヌクレオチドを含む。任意でアプタマーはさらに、特異的な結合を達成するのに必要である最低およそ６ヌクレオチド、好ましくは１０、さらに好ましくは１４又は１５のヌクレオチドを含むことができる。標的が置かれる環境の面で適当な相互作用を得ることができるのであれば、１０より短い、たとえば、６量体の配列を含有する結合領域のアプタマーが実現可能である。従って、他の物質による干渉がほとんどないのであれば、求められる結合の特異性及び強度はさらに小さくてもよい。
【００８０】
アプタマーの結合は、アプタマーオリゴヌクレオチドによって形成される二次構造に大きく依存する。ＲＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ（又は類似体）のアプタマーの双方が知られる。たとえば、Ｂｕｒｋｅら、（１９９６）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：６５０−６６６；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）．Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８−２２；Ｈｉｒａｏら、（１９９８）．Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ．４：７５−８９；Ｊａｅｇｅｒら、（１９９８）．ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１７：４５３５；Ｋｅｎｓｃｈら、（２０００）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７５：１８２７１−８；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、（１９９５）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：９５９９−９６１０；並びにＵＳ５７７３５９８；ＵＳ６０２８１８６；ＵＳ６１１０９００；ＵＳ６１２７１１９；及びＵＳ６１７１７９５を参照のこと。
【００８１】
所与の標的についてのアプタマーの選択
ＳＥＬＥＸ（商標）（試験管内選択法）と呼ばれる反復工程を用いて、事実上あらゆる特定の標的に結合するアプタマーを選択することができる。工程はたとえば、ＵＳ５２７０１６３及びＵＳ５４７５０９６に記載されている。ＳＥＬＥＸ（商標）法は、核酸が、種々の二次構造や三次構造を形成する十分な能力及びモノマーでもポリマーでもよい事実上あらゆる化合物とのリガンドとして作用する（すなわち、特異的な結合対を形成する）ようにそのモノマーの範囲内で利用可能な十分な化学的汎用性を有するという独特の見識に基づく。いずれのサイズまたは組成の分子も標的となり得る。
【００８２】
ＳＥＬＥＸ（商標）法は、出発点として無作為化された配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリ又はプールに依存する。オリゴヌクレオチドは修飾された又は未修飾のＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであることができる。一部の例では、プールは１００％無作為の又は部分的に無作為のオリゴヌクレオチドを含む。他の例では、プールは少なくとも１つの固定された配列及び／又は無作為化された配列内に組み入れられる保存された配列を含有する無作為な又は部分的に無作為なオリゴヌクレオチドを含む。他の例では、プールは、少なくとも１つの固定された配列及び／又はオリゴヌクレオチドのプールにおける全分子によって共有される配列を含み得る５’末端及び／又は３’末端での保存された配列を含有する無作為な又は部分的に無作為なオリゴヌクレオチドを含む。固定された配列は、予備選択目的で組み入れられるプールにおけるオリゴヌクレオチドに共通する配列、たとえば、ＣｐＧモチーフ、ＰＣＲプライマーのハイブリッド形成部位、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列（たとえば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７及びＳＰ６）、制限部位、又はホモポリマー配列、たとえば、ポリＡ若しくはポリＴ領域、触媒コア、アフィニティカラムへの選択的結合のための部位、及び対象オリゴヌクレオチドのクローニング及び／又は配列決定を円滑にする他の配列である。保存された配列は、同一標的に結合する多数のアプタマーによって共有される、前述の固定された配列以外の配列である。
【００８３】
プールのオリゴヌクレオチドは好ましくは効率的な増幅に必要な固定された配列並びに無作為化された配列部分を含む。通常、出発プールのオリゴヌクレオチドは３０〜５０の無作為ヌクレオチドの内部領域に隣接する固定された５’及び３’末端配列を含有する。無作為化されたヌクレオチドは、化学合成及び無作為に切断された細胞の核酸からのサイズ選択を含む多数の方法によって作製することができる。試験核酸における配列変異も選択／増幅の反復の前に又はその間で変異誘発によって導入することができ、又は増やすことができる。
【００８４】
オリゴヌクレオチドの無作為配列部分は、任意の長さであることができ、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、修飾された又は非天然のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含むことができる（たとえば、ＵＳ５９５８６９１、ＵＳ５６６０９８５及び国際公開第９２／０７０６５号を参照）。無作為なオリゴヌクレオチドは、当該技術で周知の固相オリゴヌクレオチド合成法を用いてホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成することができる。たとえば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、（１９８６）．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７及びＦｒｏｅｈｌｅｒら、（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８を参照のこと。無作為なオリゴヌクレオチドは、たとえば、トリエステル合成法のような液相法を用いて合成することもできる。たとえば、Ｓｏｏｄら、（１９７７）．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７及びＨｉｒｏｓｅら、（１９７８）．Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９を参照のこと。自動ＤＮＡ合成装置で実施される典型的な合成によってほとんどのＳＥＬＥＸ（商標）実験に十分な数である１０１４〜１０１６の個々の分子が得られる。
【００８５】
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリはＤＮＡ合成機にて自動化学合成によって生成され得る。部分的に無作為な配列は各付加工程で異なるモル比にて４つのヌクレオチドを付加することによって創ることができる。
【００８６】
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリはＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり得る。ＲＮＡライブラリが出発ライブラリとして使用されるべきである例では、それは通常、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ又は修飾されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて試験管内でＤＮＡライブラリを転写することによって生成され、精製される。次いでＲＮＡ又はＤＮＡのライブラリが結合に好都合な条件下で標的と混合され、同一の一般的な選択スキームを用いて結合、分別及び増幅の段階的な反復に供され、結合親和性及び選択性の事実上あらゆる所望の基準を達成する。さらに具体的には、核酸の出発プールを含有する混合物で出発して、ＳＥＬＥＸ（商標）法には、（ａ）結合に好都合な条件下で混合物を標的と接触させる；（ｂ）標的分子に特異的に結合している核酸から未結合の核酸を分別する；（ｃ）核酸／標的の複合体を解離させる；（ｄ）核酸／標的の複合体から解離させた核酸を増幅してリガンドを濃縮した核酸の混合物を得る；及び（ｅ）結合、分別、解離及び増幅を所望なだけ多く再び繰り返して標的分子に対して高度に特異的な、親和性の高い核酸リガンドを得る工程が含まれる。ＲＮＡアプタマーが選択されている例では、ＳＥＬＥＸ（商標）法はさらに（ｉ）工程（ｄ）における増幅の前に核酸／標的の複合体から解離させた核酸を逆転写する；及び（ｉｉ）方法を再度始める前に工程（ｄ）からの増幅した核酸を転写する工程を含む。
【００８７】
選択及び増幅のサイクルは所望の目標が達成されるまで繰り返される。一般に、これは、サイクルの反復にて結合強度の有意な改善が達成されなくなるまでである。通常、核酸アプタマー分子は５〜２０サイクルの手順で選択される。
【００８８】
種々の核酸の一次、二次及び三次構造が存在することが知られる。非ワトソン／クリック型の相互作用に含まれることが最も一般的に示されている構造又はモチーフは、ヘアピンループ、対称及び非対称のバルジ、偽ノット及びそれらの無数の組み合わせと見なされる。そのようなモチーフのほぼすべての知られる場合は、それらが３０以下のヌクレオチドの核酸配列で形成され得ることを示唆している。この理由で、隣接する無作為化された断片を伴うＳＥＬＥＸ（商標）法は、約２０〜約５０の間のヌクレオチドの無作為化した断片を含有する核酸配列と共に開始することが好まれることが多い。
【００８９】
主要のＳＥＬＥＸ（商標）法を改変して多数の特定の目的を達成している。たとえば、ＵＳ５７０７７９６は、屈曲ＤＮＡのような特定の構造的な特徴を持つ核酸分子を選択するためのゲル電気泳動と併せたＳＥＬＥＸ（商標）を記載している。ＵＳ５７６３１７７は、標的分子に結合する及び／又は光架橋する及び／又はそれを光で不活化することが可能である光反応基を含有する核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸ（商標）に基づく方法を記載している。ＵＳ５５６７５８８及びＵＳ５８６１２５４は、標的分子に対する高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと低い親和性を有するオリゴヌクレオチドとの間での分別を高い効率で達成するＳＥＬＥＸ（商標）に基づく方法を記載している。ＵＳ５４９６９３８は、ＳＥＬＥＸ（商標）法を実施した後改善された核酸リガンドを得るための方法を記載している。ＵＳ５７０５３３７はリガンドのその標的に対する共有結合のための方法を記載している。
【００９０】
カウンターＳＥＬＥＸ（商標）は１以上の非標的分子との交差反応性により核酸リガンド配列を排除することによって標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善する方法である。カウンターＳＥＬＥＸ（商標）は、（ａ）核酸の候補混合物を調製する；（ｂ）候補混合物を標的に接触させる、その際、候補混合物に比べて標的に対する高い親和性を有する核酸は候補混合物の残りから分別され得る；（ｃ）候補混合物の残りに由来する高い親和性の核酸を分別する；（ｄ）高い親和性の核酸を標的から解離させる；（ｅ）非標的分子に対して特定の親和性を持つ核酸リガンドが取り除かれるように高い親和性の核酸を１以上の非標的分子に接触させる；及び（ｆ）標的分子のみに対して高い親和性を持つ核酸を増幅して標的分子への結合について相対的に高い親和性と特異性を持つ核酸配列について濃縮された核酸の混合物を得る工程から構成される。ＳＥＬＥＸ（商標）について上述したように、選択及び増幅のサイクルは、所望の目標が達成されるまで必要に応じて繰り返される。
【００９１】
代表的な例では、ＲＮＡアプタマーは、たとえば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２：１８５９−１８６２及びＳｉｎｈａら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、３：１５７−１７１によって記載されたもののような従来の技法を用いて固相支持体カラムにて合成される。最終的なＤＭＴ基は得られたＲＮＡアプタマーから取り外される。或いは、大規模合成が使用されるのであれば、ＲＮＡアプタマーは固相支持体法の規模拡大によって作製することができ、又は特に所望の最終生成物が相対的に短いオリゴヌクレオチドである場合、ＲＮＡアプタマーは液相法を用いて作製することができる。合成法の出発物質は、５’非トリチル化のＲＮＡオリゴリボヌクレオチド又は所望の一次構造の類似体であることができ、それは好ましくは保護された塩基を有することができ、好ましくは固相支持体に結合される。いずれの従来使用される保護基が使用され得る。通常、Ｎ６−ベンゾイルがアデニンに、Ｎ４−ベンゾイルがシトシンに、Ｎ２−イソブチリルがグアニンに、Ｎ２−ベンゾイルが２−アミノプリンに使用される。他の有用な保護基にはフェノキシアセチル（ＰＡＣ）及びｔ−ブトキシアセチル（ＴＡＣ）が挙げられる。便宜上、ＲＮＡアプタマーの合成には塩基にさらに不安定な保護基が使用されるべきであり、当業者はこれらの基を知っている。そのような基は、塩基性条件下では一般に全く安定であるが、一部の加水分解に供され得る生成されたトリホスホネート又はジホスホネートの加水分解を防ぐのに役立つことができる。他の想定される修飾は米国特許第６，０１１，０２０号にて開示されており、それらには、ＰＥＧ又はコレステロールのような生体利用効率を高める分子の共有結合を介した取り込みが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
加えて、たとえば、２’−デオキシ、２’−ハロ、２’−アミノ（非置換の、又は１置換された又は２置換された）、２’−モノ−、ジ−又はトリ−ハロメチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−ハロ−置換されたアルキル、２’−アルキル、アジド、ホスホロチオエート、スルフヒドリル、メチルホスホネート、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、ビオチン、キサンチン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、６位にてイオウで置換された又は５位にてハロ若しくはＣ１-５アルキル基で置換された２−ヒドロキシ−６−メルカプトプリン及びピリミジン塩基、脱塩基リンカー、３’−デオキシ−アデノシン並びに他の利用可能な「鎖ターミネータ」又は「非伸長」類似体（ＲＮＡの３’末端にて）等のようなヌクレオシド類似体をＲＮＡ合成の間に取り込むことができる。さらに、３２Ｐ、３３Ｐ等のような種々の標識を同様に合成の間に取り込むことができ、この方法によって新規のＲＮＡ類似体を生じることができる。他の想定される修飾は米国特許第６，０１１，０２０号に開示されており、それには、逆位ＤＴキャップ又は逆位脱塩基キャップ又はそれらの組み合わせのような３’キャップの取り込みが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
アプタマーの結合親和性
結合親和性は互いに対する分子の結合又は親和性の強さの測定を表す。標的及び他の分子に関する本明細書のアプタマーの結合親和性はＫｄという点で定義される。解離定数は、当該技術で既知の方法によって決定することができ、たとえば、Ｃａｃｅｃｉ，Ｍら、Ｂｙｔｅ（１９８４）９：３４０−３６２にて述べられたもののような方法によって複合体混合物についてさえ計算することができる。解離定数を測定する例は、たとえば、表面プラスモン共鳴分析を記載しているＵＳ７６０２４９５；ＵＳ６５６２６２７、ＵＳ６５６２６２７及びＵＳ２０１２／００４４５８４９にて記載されている。別の例では、Ｋｄは、Ｗｏｎｇ及びＬｏｈｍａｎ，（１９９３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０，５４２８−５４３２によって開示されたもののような二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて確定される。
【００９４】
しかしながら、一部の小さなオリゴヌクレオチドについてＫｄの直接的な決定は困難であり、誤解されやすい高い結果をもたらし得ることが認められている。これらの状況下で、標的又は候補を結合することが知られている物質に関して標的分子又は他の候補物質についての競合結合アッセイを実施することができる。５０％阻害が起きる（Ｋｉ）濃度の値が理想的な条件下ではＫｄと同等である。しかしながら、いかなる場合もＫｉはＫｄより小さくない。従って、Ｋｉの決定は、別の方法ではＫｄの値について最大値を設定する。技術的な困難さがＫｄの正確な測定を不可能にするそれらの状況下では、Ｋｉの測定を好都合に置き換えてＫｄの上限を提供することができる。Ｋｉ値は本開示のアプタマーが標的を結合することを確認するのにも使用することができる。
【００９５】
アプタマーの安定性を改善すること
ホスホジエステル形態でのオリゴヌクレオチドが所望の効果の前に、たとえば、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼのような細胞内及び細胞外の酵素によって体液中で迅速に分解され得るという点で治療剤として核酸を使用することにて遭遇する可能性のある課題の１つが明らかになる。本開示はまた、本明細書で記載されるようなＲＮＡ類似体及び／又はヌクレアーゼ消化からの保護のようなＲＮＡアプタマーの１以上の特徴を改善するように設計された追加の修飾も含む。
【００９６】
本開示で企図されるオリゴヌクレオチドの修飾には、追加の電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用、及び核酸リガンド塩基又は全体としての核酸リガンドに対する流動性を取り込む他の化学基を提供するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
ヌクレアーゼに耐性であるオリゴヌクレオチドを生成する修飾には、１以上の置換ヌクレオチド間結合、改変された糖、改変された塩基、又はそれらの組み合わせも挙げることができる。そのような修飾には、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの置換、骨格の修飾、ホスホロチオエート又はリン酸アルキル修飾、メチル化、並びにイソ塩基イソシチジン及びイソグアノシンのような稀な塩基の対合組み合わせ；キャッピングのような３’及び５’修飾；高分子量の非免疫原性化合物への結合；親油性化合物への結合；及びリン酸骨格修飾が挙げられる。
【００９８】
一例では、本開示のアプタマーに結合される非免疫原性の高分子量化合物はポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールである。一例では、骨格修飾はリン酸骨格への１以上のホスホロチオエートの取り込みを含む。別の例では、本開示のアプタマーはリン酸骨格への１０未満の、６未満の又は３未満のホスホロチオエートの取り込みを含む。
【００９９】
アプタマーの有用性
本開示のアプタマー分子を親和性リガンドとして用いて標的分子（たとえば、ＥｐＣＡＭを持っている癌幹細胞）を分離し、精製することができ、プローブとして用いて標的分子（たとえば、ＥｐＣＡＭを持っている癌幹細胞）を追跡し、モニターし、検出し、定量することができ、又は生理的に関連する反応を阻止し、許容し、活性化し、若しくは触媒して治療効果を達成することができる。それらは、医薬剤として作用し、特定の標的に結合し、特定の分子を所望の部位に向かわせることができる。
【０１００】
本開示のＲＮＡアプタマー分子を試験管内の工程、たとえば、アフィニティ精製混合物で用いて標的分子（たとえば、ＥｐＣＡＭを持っている癌幹細胞）を精製することができる。アプタマーは、混入物からの標的分子（たとえば、ＥｐＣＡＭを持っている癌幹細胞）のクロマトグラフィ分離にとって及び細胞培養物又は細胞抽出物からの標的分子の精製にとって理想的である。
【０１０１】
一例では、本開示のＲＮＡアプタマー分子を捕捉剤として用いて標的（たとえば、ＥｐＣＡＭを持っている癌幹細胞）を固相支持体に不動化することができる。固相支持体は、一般にフィルター、ウエハー、ウエハーチップ、膜及び薄膜に関連する構造及び組成を有する基材から構成され得る。しかしながら、固相支持体は、診断、検出又は定量の試験のための試薬を捕捉する若しくは不動化するための樹脂、アフィニティ樹脂、磁気ビーズ又はポリマービーズ、又は診断検出試薬を含む基材から構成され得ることが企図される。
【０１０２】
固相支持体は、ガラス、鋼鉄のような金属の表面及び素材、セラミック素材又はポリマー素材、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド及びフッ化ポリビニリデン等、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない所望の用途に応じたいずれの素材を含み得る。
【０１０３】
ＥｐＣＡＭを発現している癌幹細胞の単離及び精製
幹細胞の分化による成人の細胞の再生の最も良く知られた例は造血系である。造血幹細胞及び前駆細胞のような発生上未成熟な前駆細胞は、分子シグナルに応答して種々の種類の血液細胞及びリンパ系細胞を徐々に形成する。幹細胞は上皮組織及び間葉組織を含む他の組織でも見いだされる。癌幹細胞は、たとえば、正常な幹細胞における遺伝的な損傷の結果として又は幹細胞及び／又は分化した細胞の調節不能な増殖によってこれらの細胞種のいずれかから生じ得る。
【０１０４】
癌幹細胞は、腫瘍形成性の幹細胞、すなわち、広範に又は無制限に増殖する能力を有し、癌細胞の大半を生み出す細胞を含む癌に由来し得る。根付いた腫瘍の中では、ほとんどの細胞は広範に増殖する能力を失っており、新しい腫瘍を形成し、小さなサブセットの癌幹細胞が増殖し、それによって癌幹細胞を再生すると共に腫瘍形成能を欠く腫瘍細胞を生み出す。癌幹細胞は非対称性に及び対称性に分割し、増殖の変わりやすい速度を示し得る。癌幹細胞には、一時的な増幅細胞又は幹細胞特性を再獲得している前駆細胞が含まれ得る。
【０１０５】
幹細胞が単離され得る代表的な癌には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支癌腫、腎細胞癌腫、肝癌、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウイルムズ腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽腫を含む固形腫瘍を特徴とする癌が挙げられる。
【０１０６】
本開示に従って幹細胞を単離する又は濃縮することができる追加の代表的な癌には、悪性度の低い／濾胞状非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中程度の悪性度の／濾胞状ＮＨＬ、中程度の悪性度のびまん性ＮＨＬ、悪性度の高い免疫芽球性ＮＨＬ、悪性度の高い非切断小細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、慢性白血球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、単球性白血病、骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含むＢ細胞リンパ腫及び白血病のような造血系の悪性腫瘍が挙げられる。
【０１０７】
ＥｐＣＡＭを持っている癌幹細胞は本明細書で記載されるようなアプタマー分子を用いて選択され得る。たとえば、蛍光色素に結合しているアプタマーを癌幹細胞の陽性選択に使用することができる。ＥｐＣＡＭは幾つかの正常細胞で発現されることも知られる。しかしながら、ＥｐＣＡＭの発現は癌幹細胞にて上方調節されると考えられる。癌幹細胞のマーカーは通常、同じ起源の分化した細胞又は非腫瘍形成性の細胞よりも少なくとも約５倍大きい、たとえば、少なくとも約１０倍大きい、又は少なくとも約１５倍大きい、又は少なくとも約２０倍大きい、又は少なくとも約５０倍大きい、又は少なくとも約１００倍大きいレベルで発現される。選択工程には、集団にて癌幹細胞ではない癌細胞の排除に使用することができる陰性選択マーカーも含まれ得る。
【０１０８】
本開示を実施することにおいてＥｐＣＡＭを持っている細胞の分離は多数の異なる方法によって達成することができることが理解されるであろう。たとえば、本開示のＲＮＡアプタマーは固相支持体に連結されて粗分離を可能にし得る。分離の効率、関連する細胞傷害性、性能の容易さと速度、及び最新の機器及び／又は技術的技量の必要性に応じて異なる有効性の種々の技法が採用され得る。単離又は精製のための手順には、アプタマーをコーティングした磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティクロマトグラフィ及び固相マトリクスに連結したアプタマーによる「パンニング」が挙げられるが、これらに限定されない。正確な単離又は精製のための技法にはＦＡＣＳが挙げられるが、これに限定されない。ＦＡＣＳを準備する方法は技量のある熟練者には明らかであろう。
【０１０９】
ＥｐＣＡＭを発現している癌幹細胞の濃縮
一例では、本開示のＲＮＡアプタマー分子を対象から得られた生物試料から濃縮する。通常、対象は癌幹細胞を含有する腫瘍を有する又は腫瘍を有することが疑われるものであろう。用語「濃縮された」又は「濃縮」又はその変形は、特定の種類の細胞（すなわち、癌幹細胞）の比率が未処理の細胞の集団（たとえば、試料中の細胞）に比べたとき高い細胞の集団を表すのに本明細書では使用される。
【０１１０】
一例では、癌幹細胞を濃縮した集団は、少なくとも約０．１％、又は０．５％又は１％又は２％又は５％又は１０％又は１５％又は２０％又は２５％又は３０％又は５０％又は７５％のＥｐＣＡＭを持っている癌幹細胞を含む。この点で、用語「癌幹細胞を含む濃縮された細胞集団」は、「用語Ｘ％の癌幹細胞を含む細胞の集団」に対して明白な支持を提供するように解釈され、その際、Ｘ％は本明細書で引用されるようなパーセンテージである。
【０１１１】
一例では、細胞の集団は選択可能な形態でＥｐＣＡＭ＋細胞を含む細胞調製物から濃縮される。この点で、用語「選択可能な形態」は、細胞がＥｐＣＡＭを持っている細胞の選択を可能にするマーカー（たとえば、細胞表面マーカー）を発現していることを意味するように理解されるであろう。
【０１１２】
アプタマー分子を用いた癌の診断
本開示のＲＮＡアプタマー分子を診断目的で試験管内にて用いて悪性腫瘍組織における癌幹細胞の存在を判定することができる。方法にはＥｐＣＡＭ＋癌幹細胞の存在について生物試料を調べることが関与する。たとえば、生物試料を本開示の標識したＲＮＡアプタマーと接触させ得、試料における細胞に特異的に結合するＲＮＡアプタマーの能力を決定する。アプタマーによる結合はＥｐＣＡＭを持っている細胞の存在を指し示す。一例では、ＥｐＣＡＭを持っている細胞は癌幹細胞である。
【０１１３】
本開示のＲＮＡアプタマーを用いて、検出可能なシグナルを与えるレポーター基で標識されている本開示の単離されたＲＮＡアプタマーを対象に投与することによって生体内でＥｐＣＡＭ＋腫瘍を限局することもできる。次いでフローサイトメトリー、顕微鏡、外部シンチグラフィ、放射断層撮影、光学的イメージング又は放射性核種走査を用いて結合したアプタマーを検出することができる。方法を用いて疾患の程度に関して対象にて癌の病期分類を行い、治療法に応答した変化をモニターすることができる。
【０１１４】
ＲＮＡアプタマーを検出可能な標識に結合することによって癌幹細胞の検出を円滑にすることができる。検出可能な標識の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、高電子密度標識、ＭＲＩ用の標識及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例には、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光物質には、ウンベリフォン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例にはルミノールが挙げられる。生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、９４ｍＴｃ、１２４Ｉ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８２Ｒｂ又は３Ｈが挙げられる。
【０１１５】
たとえば、クレノウポリメラーゼ用いた鋳型伸長によって、Ｔ４ＲＮＡリガーゼが介在する連結によって、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによってアプタマーの３’末端での標識を達成することができる。そのチオールが次いでビオチンを結合するのに用いられる過剰のＧＴＰ−β−Ｓと共に試験管内の転写ミックス補完することによって５’末端での標識を達成することができる。加えて、５’又は３’末端のいずれかへの好適な基の直接的な化学結合を用いてアプタマーを標識することができる。
【０１１６】
本開示の抗癌剤
本開示のＲＮＡアプタマー分子をある部分に結合させて使用し、その部分をＥｐＣＡＭ＋細胞、好ましくは癌幹細胞に向かわせることができる。部分の例には、癌幹細胞を殺傷するのに使用することができる毒素、放射性核種又は化学療法剤が挙げられる。
【０１１７】
部分と化学的に合成されるアプタマーによって、又は別に作製されたアプタマーと部分を連結するのに使用される結合、たとえば、非ペプチド共有結合、たとえば、非アミド結合によって、ＲＮＡアプタマーを部分、たとえば、毒素に融合することができる。或いは、ＲＮＡアプタマーと部分が好適なリンカーペプチドのおかげで連結され得る。
【０１１８】
有用な毒素分子には、細胞内に存在する場合、有意に細胞傷害性であるペプチド毒素が挙げられる。毒素の例には、サイトトキシン、酵素活性を撹乱し、それによって癌幹細胞を殺傷する代謝撹乱物質（阻害剤及び活性化剤）、及びエフェクター部分の確定した範囲内で細胞をすべて殺傷する放射性分子が挙げられる。代謝撹乱物質は、正常な機能を変化させるように細胞の代謝を変える分子、たとえば、酵素又はサイトカインである。概して、用語、毒素には腫瘍細胞に死を生じるいずれのエフェクターが含まれる。
【０１１９】
多数のペプチド毒素は一般化された真核細胞受容体結合ドメインを有し、これらの例では、毒素はＥｐＣＡＭを持っていない細胞を殺傷するのを防ぐように修飾されなければならない（たとえば、ＥｐＣＡＭを持っていないが未修飾の毒素に対する受容体を有する細胞を殺傷するのを防ぐように）。そのような修飾は、分子の細胞傷害性機能を保存する方法で為されなければならない。潜在的に有用な毒素には、ジフテリア毒素、コレラ毒素、リシン、０−シガ様毒素（ＳＬＴ−Ｉ、ＳＬＴ−ＩＩ、ＳＬＴ−ＩＩｖ）ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、シガ毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、緑膿菌外毒素、アロリン、サポニン、モデシン及びゲラニンが挙げられるが、これらに限定されない。他の毒素には腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ-α）及びリンホトキシン（ＬＴ）が挙げられる。抗腫瘍活性を有する別の毒素は、腫瘍に対して相当な効能を持つジインエンを含有する抗腫瘍抗生物質であるカリケアミシンγ１である（Zein Nら (1988). Science 240:1198-201）。
【０１２０】
例として、ジフテリア毒素（その配列は既知である）を本開示のＲＮＡアプタマー分子に結合させることができる。ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）から分泌された天然のジフテリア毒素分子は、分子のアミノ末端から出発して、酵素的に活性のある断片Ａ（ＡＡ１〜１９３）と、転移ドメイン及び一般化された細胞結合ドメイン（ＡＡ４７５〜５３５）を含む断片Ｂ（ＡＡ１９４〜５３５）を特徴とすることができる幾つかの機能的ドメインから成る。
【０１２１】
当業者に既知であろう幾つかの方法のいずれかにてＲＮＡアプタマーと毒素部分を連結することができる。たとえば、ＲＮＡアプタマーを毒素（ゲロニン）に結合させる方法はＣｈｕ、ＴＣら、（２００６）.Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６（１２）５９８９−５９９２にて記載されている。
【０１２２】
部分は、局所レベルで生体の免疫系を活性化する又は阻害する免疫系の調節因子であることもできる。たとえば、腫瘍に送達されるサイトカイン、たとえば、ＩＬ−２のようなリンホカインは腫瘍の近傍で細胞傷害性のＴリンパ球又はナチュラルキラー細胞の増殖を引き起こすことができる。
【０１２３】
部分又はレポーター基は、放射性分子、たとえば、放射性ヌクレオチド又はいわゆる感作性物質、たとえば、Ｂａｒｔｈら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｃｔ  １９９０：１００−１０７にて記載されたような「ホウ素中性子捕捉療法」（ＢＮＣＴ）における低エネルギーの中性子のビームに暴露された際のホウ素であることもできる。そのような放射性のエフェクター部分を持つ化合物を用いて腫瘍にて癌幹細胞の増殖を阻害することも、イメージング目的のために癌幹細胞を標識することもできる。
【０１２４】
放射性ヌクレオチドはα、β又はγの粒子を放射することができる単一原子の放射性分子である。α粒子の放射体の方が、短い距離にわたってはるかに高いエネルギーの放射物を放出するので十分に浸透することなく及び正常な組織を損傷することなく効率的であるのでβ又はγの粒子放射体よりも好まれる。好適なα放射性核種には２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ及び２１２Ｂｉが挙げられる。
【０１２５】
放射性分子は直接又は二官能性のキレートによってアプタマーにしっかり連結されなければならない。このキレートは生体内で放射性分子の溶出及び早すぎる放出を許してはならない。Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６５７−６２（１９９１）。例として、本発明にＢＮＣＴを適合させるために、ホウ素の安定な同位元素、たとえば、ホウ素１０を化合物の抗腫瘍部分又はエフェクター部分として選択することができる。癌幹細胞へのアプタマーの特異的な結合によってホウ素は腫瘍細胞に送達され、腫瘍細胞中で又は腫瘍細胞上で濃縮されるであろう。十分な量のホウ素が蓄積するのを可能にする時間の後、約０．０２５ｅＶのエネルギーを有する低エネルギー中性子のビームによって腫瘍をイメージングすることができ、腫瘍にそれを照射することができる。この中性子照射自体は腫瘍の周囲の健常な組織又は腫瘍自体をほとんど損傷しないが、ホウ素１０（たとえば、腫瘍細胞の表面上の）は中性子を捕捉し、それによって不安定な同位元素であるホウ素１１を形成する。ホウ素１１は直ちに核分裂し、リチウム７の核と約２７９００００Ｅｖのエネルギーのあるα粒子を生じる。これらの重い粒子は細胞１個の直径（１０ミクロン）ほどの路程しか有さないので高度に致死性であるが、非常に限局した形態の放射線である。
【０１２６】
本開示の送達剤
細胞へのｓｉＲＮＡ又はリボザイムの送達に本開示のＲＮＡアプタマー分子を用いることができる。好適なｓｉＲＮＡ又はリボザイムの例は状況に左右されるであろう。本開示に従って使用するのに好適であるｓｉＲＮＡ又はリボザイムの例にはＡＴＰ結合性のカセット膜トランスポータ、幹細胞性遺伝子（Ｂｍｉ−１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、β−カテニン、Ｓｍｏ、ネスチン、ＡＢＣＧ２、Ｗｎｔ２及びＳＣＦ等）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）及びサバイビンを標的とするものが挙げられる。
【０１２７】
例として、これは抗ＰＳＭＡアプタマーを用いた従来技術にて実証されている。ＰＳＭＡはクラスリンを被覆した窪みを介してエンドソームに内部移行するという知識に基づいて、抗ＰＳＭＡアプタマーは結合したｓｉＲＮＡを、ＰＳＭＡを発現している細胞に運び、ＰＳＭＡタンパク質に結合したアプタマー／ｓｉＲＮＡは内部移行を介して細胞に侵入することが仮定された。次に、ｓｉＲＮＡ部分はＤｉｃｅｒ複合体によるプロセシングを受け、ＲＮＡが誘導するサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）が介在する遺伝子スプライシング経路に絡む。これらのグループはこれを達成するのに異なる戦略を利用した。Ｃｈｕら、（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３４，ｅ７３は、抗ＰＳＭＡアプタマーとｓｉＲＮＡを会合させるためのビオチン／ストレプトアビジン架橋が介在する結合法を記載している。ＭｃＮａｍａｒａら、（２００６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４，１００５−１０１５は、アプタマーとｓｉＲＮＡを連結させるのに「ＲＮＡのみ」のアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラ法を用いた。Ｗｕｌｌｎｅｒら、（２００８）．Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、８：５５４−５６５によるその後の研究では、著者らは、ＰＳＭＡ陽性の前立腺癌細胞に真核細胞伸長因子２（ＥＥＦ２）のｓｉＲＮＡを送達するのに抗ＰＳＭＡアプタマーを用い、二価のＰＳＭＡアプタマーをこの目的で使用した。著者らは、一価の抗ＰＳＭＡ／ｓｉＲＮＡキメラと比べて二価のアプタマー構築物の遺伝子ノックダウン能が優れていることを明らかにした。
【０１２８】
本開示のＲＮＡアプタマー分子を用いて種々の固形腫瘍におけるＥｐＣＡＭ＋癌幹細胞に積荷を送達することができる。ゲロニンはタンパク質合成の過程を阻害し、細胞傷害性であるリボソームの毒素である。しかしながら、それは膜不透過性であり、細胞に侵入するためには先導役を必要とする。従って、本開示のＲＮＡアプタマー分子を利用して膜不透過性の毒性有効積荷を癌幹細胞に送達することができる。
【０１２９】
細胞傷害性の化学療法剤に対する腫瘍の耐性は、部分的には癌細胞への不十分な送達及び取り込み、及びさらに重要には癌細胞による流出による。Ｄｈａｒら、（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５：１７３５６−１７３６１にて記載されたように、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ＰＬＧＡに由来する生分解性のナノ粒子（ＮＰ）を用いてこの課題に対処した。手短には、２つのアルキル鎖を導入することによってシスプラチンをそのプロドラッグ、Ｐｔ（ＩＶ）化合物に変換した。これによって化合物の疎水性を高め、ＮＰの疎水性コア内へのパッケージングの工程が容易になった。ナノ沈殿工程の間にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をコポリマーとして用いてＰＬＧＡ／ＰＥＧナノ粒子を合成した。ＰＬＧＡ／ＰＥＧ／ＮＰの表面はＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）アプタマーで装飾した。ＬＮＣａＰ細胞と共にインキュベートするとＮＰはエンドサイトーシスを受け、細胞質の還元過程によって、アルキル化されたプロドラッグはシスプラチンに変換された。
【０１３０】
本開示はまた同時に存在する薬物送達剤及び造影剤としてのＲＮＡアプタマー分子の使用にまで及ぶ。これは、蛍光量子ドット（ＱＤ）の表面にアプタマーを結合することによって達成することができる。次に、ＱＤ／アプタマーの複合体をＤｏｘと共にインキュベートし、ＱＤ／アプタマー／Ｄｏｘナノ粒子を形成する。Ｄｏｘ及びＱＤは双方とも蛍光分子である。しかしながら、ＱＤ／アプタマー／Ｄｏｘナノ粒子におけるそれらの近接性のために、二蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）機構によってそれらは互いの蛍光を消光する。従って、ＱＤ／アプタマー／Ｄｏｘナノ粒子は非蛍光である。しかしながら、前立腺癌細胞におけるＰＳＭＡが介在するエンドサイトーシスを介したＱＤ／アプタマー／Ｄｏｘナノ粒子の内部移行によってＱＤ／アプタマー／Ｄｏｘナノ粒子からＤｏｘが放出され、それはＤｏｘ及びＱＤ双方による蛍光の回復を生じる。
【０１３１】
医薬組成物
本開示の一例では、本開示に係るＲＮＡアプタマー、抗癌剤又は薬剤送達剤は薬学上許容可能なキャリア及び／又は賦形剤を含む組成物の形態で投与される。組成物の賦形剤又は他の要素は投与に使用される経路及び装置に従って適合させることができる。
【０１３２】
用語「キャリア」及び「賦形剤」は、活性化合物の保存、投与及び／又は生物活性を円滑にするために当該技術で従来使用される物質の組成である（たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)を参照）。キャリアは活性化合物の望ましくない副作用も軽減し得る。好適なキャリアは、たとえば、安定であり、キャリアにおける他の成分と反応することができない。一例では、キャリアは治療で採用される投与量及び濃度にて受容者における有意な局所性又は全身性の有害効果を生じない。
【０１３３】
本開示に好適なキャリアには、従来使用されているもの、たとえば、水、生理食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンガー溶液、緩衝溶液、ヒアルロナンが挙げられ、グリコールは特に（等張な場合）溶液にとって例となる液体キャリアである。好適な医薬キャリア及び賦形剤には、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。
【０１３４】
たとえば、抗酸化剤、緩衝溶液、静菌剤等のような他の一般的な添加剤を加えることができる。注射溶液、丸薬、カプセル、顆粒剤又は錠剤を調製するために、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに加えることができる。
【０１３５】
本開示のＲＮＡアプタマーを含有する抗癌剤又は薬剤送達剤を非経口で（たとえば、静脈内、皮下、局所又は腹腔内への注射）投与することができる。抗癌剤の有効な投与量は、体重、年齢、性別、全身状態、食事、投与回数、投与方法、排泄及び疾患の重症度に従って決定することができる。一例では、抗癌剤又は薬剤送達剤は１０〜９５重量％のＲＮＡアプタマーを含有する。別の例では、抗癌剤又は薬剤送達剤は２５〜７５重量％のＲＮＡアプタマーを含有する。
【０１３６】
投与回数は１日に１回又は数回であり得る。
【０１３７】
一例では、ＲＮＡアプタマーの有効な細胞内含量はおよそ１ｎＭ〜１０００ｎＭである。別の例では、ＲＮＡアプタマーの有効な細胞内含量は好ましくは１００ｎＭ〜５００ｎＭである。しかしながら、アプタマーの投与量は上記範囲を下回っても上回ってもよい。
【０１３８】
アプタマーの併用
本開示の単離されたＲＮＡアプタマー分子は単独で、又は本明細書で記載される方法に係る１以上の追加のＲＮＡアプタマーとの併用で使用することができる。一例では、癌幹細胞の検出、精製又は濃縮を円滑にするＲＮＡアプタマーと本開示のＲＮＡアプタマー分子を併用することができる。一例では、追加のＲＮＡアプタマーはＣＤ１３３＋細胞に特異的に結合するものである。一例では、追加のＲＮＡアプタマーは配列５’−ＣＣＣＵＣＣＵＡＣＡＵＡＧＧＧ−３’を含む。別の例では、追加のＲＮＡアプタマーは配列５’−ＣＡＧＡＡＣＧＵＡＵＡＣＵＡＵＵＣＵＧ−３’を含む。
【０１３９】
キット
本開示は本明細書で開示される方法を実施するための診断キットも提供する。一例では、診断キットはＥｐＣＡＭを発現している細胞（癌幹細胞）を検出するための本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は診断剤を含む。
【０１４０】
キットは緩衝剤及び安定化剤のような補助剤も含み得る。診断キットはさらにバックグランドの干渉を減らす剤、対照試薬及び試験を行うための装置を含み得る。診断キットの使い方に関する指示書も一般に含まれる。
【０１４１】
本開示の広く一般的な範囲から逸脱することなく上述の実施形態に対して多数の変化及び／又は改変が為され得ることが当業者によって十分に理解されるであろう。従って、本実施形態はあらゆる点において説明として見なされるべきであって、限定として見なされるべきではない。
【０１４２】
実施例
方法
アプタマー
以前記載された（Shigdar Sら (2011). Cancer Sci 102:991-998）ようにヒトＥｐＣＡＭに対するアプタマーを生成し、性状分析した。アプタマーＤＴ３及び対照アプタマーは以前記載された（上記Shigdar Sら）が、アプタマー２３は、その５’末端に近赤外線蛍光色素ＴＹＥ６６５を結合させた１９塩基のヌクレオチドである。本発明者らの以前のアプタマーと同様の方法（上記Shigdar Sら）を用いてこのアプタマーを性状分析した。
【０１４３】
細胞株及び培養及び異種移植モデル
この試験に用いたヒト臓器の細胞株はアメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。それらは、膠芽細胞腫Ｕ１１８−ＭＧ、乳癌ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＴ４７Ｄ、並びに結腸直腸腺癌ＨＴ−２９だった。細胞は、１０％ウシ胎児血清で補完したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（オーストラリア、ビクトリア州のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ−２９及びＵ１１８−ＭＧ）又は１０％ウシ胎児血清を伴ったロズウェルパークメモリアルインスティテュート１６４０（ＲＰＭＩ１６４０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）による培養にて増殖させ、維持した。細胞は、５％ＣＯ２を含有する湿気のある雰囲気にて３７℃で維持した。異種移植試験については、トリプシン処理によって単個細胞懸濁液を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｆｏｘｎ１ｎｕメスマウスにおける移植のために０．１ｍＬのＰＢＳに再懸濁させた。腫瘍がいったんおよそ５〜８ｍｍ３に達したら、それらを切除し、１０％の中性緩衝化ホルマリンで固定し、その後、処理し、包埋した。動物の処置はすべて科学目的での動物の管理及び使用のためのオーストラリア実務規則に従ってディーキン大学動物倫理員会によって認可された。
【０１４４】
免疫組織化学
ポリリジンを被覆したスライド上で異種移植腫瘍のそれぞれに由来する切片を４μｍに切断し、その後、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒによって脱パラフィンを行い、エタノール勾配によって再水和を行った。トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ９．０）を用いてマイクロ波オーブンにて２０分間、熱誘導の抗原賦活化を行い、スライドを冷却した後、リン酸緩衝生理食塩水における０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ及び１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によるブロッキングを２０分間行った。ブロッキング工程に続いて、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでスライドを２分間、２回洗浄し、その後、アプタマー又は抗体のいずれかと共にインキュベートした。アプタマーは以前記載された（上記Shigdar Sら）ように調製した。手短には、アプタマーを８５℃に５分間加熱し、室温に１０分間冷却し、次いで３７℃で１５分間加熱した。５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０％のデキストラン硫酸及び５００μｇ／ｍＬのヘパリンを含有するＰＢＳの溶液にて１００ｎＭ濃度でのアプタマーと共に３７℃で１５分間スライドをインキュベートした。次いでスライドを各５分間３回洗浄し、その後、ビスベンズイミドヘキスト３３３４２（３μｇ／ｍＬ）と共に１０分間インキュベートした。次いでＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤを用いてスライドを標本にし、カバーグラスをかけてＦｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０ｉレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。直接比較に使用した画像はすべて同一の露出パラメータで撮影し、デジタルコントラストの変更又はバックグランドの差し引きを行わずに提示した。抗ＥｐＣＡＭ抗体３２３／Ａ３（ａｂ８６０１，Ａｂｃａｍ）を用いて抗体染色を行った。抗体染色に先立って、上記で記載されたのと同じプロトコールに従ってスライドを洗浄し、ブロックした。抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度に調製し、スライドを４℃で一晩インキュベートした。次いでスライドを５分間３回洗浄し、その後、１０μｇ／ｍＬの濃度でのヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７複合体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に２時間インキュベートし、その後洗浄し、ビスベンズイミドヘキスト３３３４２で染色し、カバーグラスをかけた。陰性対照のスライドは一次抗体をＰＢＳに置き換えることによって得た。さらに、標準のプロトコールに従ってジーロングのＳｔ.Ｊｏｈｎ  ｏｆ  Ｇｏｄ病理研究所にて、ヘマトキシリン及びエオシン並びに抗ＥｐＣＡＭ抗体ＢｅｒＥＰ４でスライドを染色した。
【０１４５】
フローサイトメトリー解析
８０％の集密度でトリプシン処理によって細胞を回収し、洗浄用緩衝液（５ｍＭのＭｇＣｌ２を伴ったＤＰＢＳ）に再懸濁させ、数を数えた。遠心（１０００×ｇで５分間）に続いて、細胞ペレットをアッセイ用緩衝液（５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、０．２％［ｗ／ｖ］のアジ化ナトリウム及び５％ＦＣＳで補完したＤＰＢＳ）に再懸濁させ、１×１０６個／ｍＬに希釈した。ブロッキング工程は４℃で行った。アプタマーの結合は３７℃で３０分間又は４℃で１時間行い、結合アッセイすべてにおいて塩化マグネシウムの最終濃度は２．５ｍＭだった。
標的タンパク質へのアプタマーの結合を確認するために、以前記載された方法（Willkomm及びHartmann (2005). Weinheim, Wiley-VCH GmbH & Co. KGaA 1:86-94)に従って反復回のＲＮＡをその３’末端にてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した。全体を通して琥珀色の試験管を用いて光漂白をできるだけ抑えた。手短には、過ヨウ素酸ナトリウムで試料を酸化した。１０ｍＭのエチレングリコールの添加によって酸化を終了させ、その後エタノール沈殿を行った。３０モル過剰でＦＩＴＣを加え、４℃で一晩、反応を完了させた。１００μＬの結合緩衝液（５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡで補完したＤＰＢＳ）にて氷上で１時間、１μＭのＦＩＴＣ標識ＲＮＡをトリプシン処理した５×１０５個のＫａｔｏＩＩＩ細胞又はＵ１１８−ＭＧ細胞と共にインキュベートし、その後、３回洗浄し、３００μＬのアッセイ用緩衝液に再懸濁させた。各試料の５０，０００事象をカウントすることによってＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により蛍光強度を測定した。未選択ライブラリに由来するＦＩＴＣ標識ＲＮＡを用いて非特異的結合を測定した。Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及び共同研究者ら(Liら (2009). J. Proteome Res 8:2438-48)によって記載された方法に従って、ゼロ回でのＲＮＡの標的細胞への結合の蛍光強度並びに陰性対照細胞への結合の蛍光強度を差し引いた後、各回の結合を算出した。ＰＢＳ中の２．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム及び０．５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡ分解酵素Ａによる染色によって死細胞にゲートをかけ、それを解析から除外した。
【０１４６】
共焦点顕微鏡
標識の２４時間前に、ガラスボトム８−チャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ，Ｎｕｎｃ）にてｃｍ２当たり７５，０００個の密度で細胞を播いた。ＤＹ６４７／Ｅｐ２３及び対照アプタマーをフローサイトメトリーと同じ方法で調製した。培地の除去に続いて、細胞をアッセイ用緩衝液にて３７℃で１５分間インキュベートし、２回洗浄した後、２．５ｍｇのＭｇＣｌ２を伴った１００ｎＭのアプタマーと共に３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベートの最後の１５分の間にビスベンズイミドヘキスト３３３４２（３μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）を細胞に加えた。アプタマー溶液を取り除き、細胞を結合用緩衝液で各５分間３回洗浄した後、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０ｉレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて視覚化した。
【０１４７】
エンドサイトーシスの阻害
軽微な改変を伴うが原則的には共焦点顕微鏡について記載されたようにこれを実施した。手短には、カリウムを枯渇させた緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１ｍＭのＣａＣｌ２）又は高張の緩衝液（３ｍＭのＫＣｌ及び４５０ｍＭのスクロースを含有するカリウムを枯渇させた緩衝液）のいずれかで細胞を３７℃にて１時間予備処理した。これらの緩衝液はアプタマーとのインキュベート工程及びすすぎ工程すべてにおいても使用した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合させたヒトのトランスフェリンの内部移行を定量的に特徴づけることによってエンドサイトーシスを阻害することにおけるこれらの処理の有効性を検証した。予備処理後、トランスフェリン（５μｇ／ｍＬ）を細胞に加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を各緩衝液で３回洗浄し、ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。
【０１４８】
トランスフェリンによるアプタマーの共局在化
共焦点顕微鏡について以前記載されたようにＴ４７Ｄ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＴ２９及びＵ１１８ＭＧの細胞を調製した。培地の除去に続いて、５％（ｖ／ｖ）の血清を含有するブロッキング緩衝液にて３７℃で１５分間細胞をインキュベートし、結合緩衝液で２回洗浄した後、２００ｎＭのアプタマーと共に３７℃で３０分間インキュベートした。アプタマー溶液を取り除き、結合緩衝液で細胞を各５分間３回洗浄した。次いで細胞にトランスフェリンを加え、２時間インキュベートした後、最終の１５分間のインキュベートの間に細胞にビスベンズイミドヘキスト３３３４２（３μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）を加えた。結合緩衝液で細胞を各５分間３回洗浄した後、ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０ｉレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。
【０１４９】
ＥｐＣＡＭアプタマー
ヒトのＥｐＣＡＭのｃＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯにクローニングした。組換えの６×ヒスチジンのタグを付けたＥｐＣＡＭをＨＥＫ２９３Ｔにて一時的に発現させ、以前記載された（Yeong SSら (2006) J Biol. Chem. 281 (41): 30768-81）ように全細胞の溶解物を調製した。結合緩衝液（５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ及び０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含有するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ））にてＤＥＬＦＩＡ抗マウス−ＩｇＧを被覆したプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号４００７−００１０）の各ウェルを１μｇ／ｍＬの抗Ｈｉｓモノクローナル抗体と共に１時間インキュベートし、２３℃にてＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって１時間ブロックし、その後、結合用緩衝液で何回も洗浄した。組換えＥｐＣＡＭを含有する細胞溶解物をウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートし、その後、結合緩衝液で６回洗浄した。ＥｐＣＡＭの細片を湿った環境で使用まで４℃にて保持した。
【０１５０】
アプタマーの切り詰め
本開示の切り詰めたアプタマーを生成するために、所望の配列のセンス及びアンチセンスのＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。ＥｐＤＴ１（第１の切り詰め）は、センスオリゴヌクレオチド５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＣＣＧＴＡＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＧＴＴＡＣＣＣＧＧＴＣＧＴＡＣＡ  ＧＣＴＣＧ−３’及びアンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＧＡＣＣＧＧＧＴＡ  ＡＣＣＡＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＴＡＣＧＧＡＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’に由来し、ＥｐＤＴ３（第３の切り詰め）はセンスオリゴヌクレオチド５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡ  ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＧＡＣＴＧＧＴＴＡＣＣＣＧＧＴＣＧ−３’及びアンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＡＣＣＧＧＧＴＡＡＣＣＡＧＴＣＧＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’に由来した。アプタマー２３はセンスオリゴヌクレオチド５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＣＧＴＡＴＣＣＣＴＴＴＴＣＧＣ  ＧＴＡ−３’及びアンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ＴＡＣＧＣＧＡＡＡＡＧＧＧＡＴＡＣＧＴ−３’に由来した（Ｔ７  ＲＮＡプロモータ配列に下線を引く）。オリゴヌクレオチドの各対は、１×ＰＥＩ緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．１ＭのＭｇＣｌ２、０．５ＭのＮａＣｌ及び０．１Ｍのジチオスレイトール）にて等モル比で混合し、９０℃で５分間加熱し、室温にゆっくり冷却した後、エタノール沈殿を行った。試験管内での転写及びＦＩＴＣ標識は上述のように行った。このクローン（ＥｐＤＴ３）の最終切り詰めである５’−ＧＣＧＡＣＵＧＧＵＵＣＣＣＧＧＵＣＧｄＴ−３’のフルオロピリミジン版も５’−ＤＹ６４７蛍光タグ及び３’逆位デオキシチミジン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）と共に化学的に合成した。ＥｐＣＡＭ陽性及び陰性の細胞株並びに陰性対照（２−Ｏ−メチル−ピリミジン）アプタマー（５’−ＤＹ６４７−ｍＧＣｍＧＡＣＵｍＧｍＧＵＵｍＡＣＣＣｍＧｍＧ  ＵＣｍＧｄＴ−３’）を用いて本明細書で記載されるようにＤＹ６４７／ＥｐＤＴ３の結合親和性を測定した。
【０１５１】
アプタマーの親和性の測定
ＥｐＣＡＭ陽性及び陰性の細胞株並びに陰性対照（２−Ｏ−メチル−ピリミジン）アプタマー（５’−ＤＹ６４７−ｍＧＣｍＧＡＣＵｍＧｍＧＵＵｍＡＣＣＣｍＧｍＧ  ＵＣｍＧｄＴ−３’）と共にフローサイトメトリーを用いて、細胞表面に発現されたネイティブなＥｐＣＡＭに対する上手く行った２−フルオロピリミジンＲＮＡアプタマー種の平衡解離定数（Ｋ’ｄ）を測定した。ＫａｔｏＩＩＩ細胞又はＵ１１８ＭＧ細胞（５×１０５個）を先ずアッセイ用緩衝液でインキュベートし、その後結合緩衝液で２回洗浄した後、１００μＬのアッセイ用緩衝液における一連の濃度（見かけのＫ’ｄのおよそ１０倍前後）のＦＩＴＣ標識したアプタマーと共に氷上で１時間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１５０μＬのアッセイ用緩衝液に再懸濁させ、フローサイトメトリー解析に供した。ＦＩＴＣ標識の未選択ライブラリを別の陰性対照として用いた。未選択ライブラリの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をアプタマー／標的細胞のそれから差し引いて特異的結合のＭＦＩを生成した。各アプタマーのＫ’ｄは、方程式：
［結合したアプタマー］／［アプタマー］＝−（１／ＫＤ）×［結合したアプタマー］＋（［Ｔ］ｔｏｔ／ＫＤ）
（式中、［Ｔ］ｔｏｔは標的の総濃度を表す）
に従ってＳｃａｔｃｈａｒｄ解析によって決定した。
【０１５２】
ＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラの設計及び生成
２本のＲＮＡ鎖を合成し、長鎖を２’−フルオロピリミジンで化学的に修飾した。長鎖では、１９ｎｔのＥｐＣＡＭアプタマーは２つのアミノ酸の架橋を介してサバイビンのｓｉＲＮＡ（Carvalho Aら (2003) J Cell Science 116:2987-2998)）のガイド鎖に共有結合する一方で、サバイビンｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖は短鎖として合成された。長鎖（Ａ）及び短鎖（Ｂ）は双方とも、それぞれ４３ｎｔ及び２１ｎｔについて−７．５ｋｃａｌ／モル及び−０．５ｋｃａｌ／モルの遊離エネルギーを持つ不安定な二次構造を有する。それに対して、理論的にはアニーリングの後、予想されるキメラは６４ｎｔについて−４２．６ｋｃａｌ／モルの遊離エネルギー持つはるかに安定な構造を有する。このことは、アニーリングの後、これら２つの別々の鎖が予想されるアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラ（Ｃ）を創る可能性が高いことを意味する。さらに、２ｎｔ（ＵＵ）オーバーハングはアニーリングの後創られ、それはｓｉＲＮＡのガイド鎖の３’末端からのキメラのＤｉｃｅｒ酵素消化を促し、最終的に予想される２１量体のｓｉＲＮＡを生じる。蛍光分子（ＤＹ６４７）を短鎖の５’末端に加え、それは、画像解析を円滑にするだけでなく、キメラの構造対称性にも寄与し、Ｄｉｃｅｒ処理の後予想されるｓｉＲＮＡを生じる。
【実施例１】
【０１５３】
化学抗体を用いた免疫組織化学
デキストラン硫酸及びヘパリンの存在下でインキュベートすると、抗ＥｐＣＡＭアプタマーＤＴ３及び２３は、１００ｎＭの濃度にて３７℃１５分間でＴ４７Ｄ、ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヒト乳癌異種移植片の非常に感度の高い染色を示した（図１）。実際、Ｔ４７Ｄ及びＭＣＦ７よりもはるかに低い量のＥｐＣＡＭを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片の切片の弱い染色によって明らかにされたように、染色パターンは乳房腫瘍細胞の表面に見られるＥｐＣＡＭ発現のレベルによく相関する。同様に、染色は特異性が高いことが示され、ＥｐＣＡＭを発現しないＵ１１８ＭＧ異種移植片では染色は検出されず、異種移植片切片のいずれにおいても対照アプタマーでは染色されなかった。最適化の過程で、酵素消化のような他の抗原賦活化法と同様に、パラフィン包埋組織を染色するのに知られる唯一の他のアプタマーと共に以前上手く利用された（Zeng Zら (2010). Mod Pathol. 23:1553-1558）ものに対して抗原賦活化法を試した。Ｚｅｎｇと共同研究者らが３７℃で行われた抗原賦活化によるアプタマーの上手く行った染色を示した（上記、Zeng Zら）一方で、本結果は同調しなかった。代わりに、本発明者らは、９６〜１００℃で２０分間行った抗原賦活化が感度の高い且つ特異的な染色に高度に効果的であることを見いだした。
【０１５４】
２つのＥｐＣＡＭアプタマーによってＨＴ−２９異種移植片切片で達成された劇的に異なる染色に言及するのは興味深い（図１）。双方のアプタマーの結合親和性はフローサイトメトリーによる本試験で使用された５つの細胞株すべてに対して特徴づけられており、結果を表１に示す。
【０１５５】
【表１】
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【０１５６】
これらの細胞株に対する異なる親和性は、双方のアプタマーがＥｐＣＡＭ分子の異なる部分を認識することを示している。反応性における矛盾は、アプタマーＤＴ３が結合するエピトープが、抗原賦活化に続いて失われている又はアクセス不能のままであることから生じることがもっともらしく思われる。
【実施例２】
【０１５７】
アプタマーは抗体よりもＥｐＣＡＭを検出するのに感度が高い
図１及び図２で示すように、抗ＥｐＣＡＭ抗体３２３／Ａ３を用いた３種の異なる乳癌異種移植片についての抗体染色の強度はアプタマー、特にアプタマー２３のそれよりもはるかに弱い。しかしながら、抗体３２３／Ａ３はＨＴ−２９結腸直腸癌異種移植片の中程度から強い染色を示した。彼らの研究室内で使用された蛍光染色のプロトコールの限界の可能性を排除するために、本発明者らは臨床病理研究室に相談し、結果を確認した。その研究室で使用中の標準のＥｐＣＡＭ染色は抗ＥｐＣＡＭ抗体ＢｅｒＥＰ４である。病理診断の実践で使用されるこの抗体についての日常のプロトコールに従って、本発明者らは３２３／Ａ３抗体を用いて達成されたものと類似する異種移植腫瘍すべての染色を得たということは、本アプタマーが病理で使用中の標準の抗体よりもはるかに感度が高いことを示している。
【０１５８】
【表２】
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【実施例３】
【０１５９】
低レベルの発現でのＥｐＣＡＭの検出
ここで調べられたヒト癌細胞株すべての間で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は最も少ない量のＥｐＣＡＭを発現する（ＭＣＦ７における２２２．１×１０３結合部位／細胞に対してＭＤＡ−ＭＢ−２３１における１．７×１０３結合部位／細胞）（Prang Nら (2005). Br J Cancer 92:342-349）。興味深いことに、２種のアプタマー（ＤＴ３及び２３）はＭＤＡ−ＭＢ−２３１の異種移植腫瘍にてＥｐＣＡＭを上手く検出することができた一方で、２種の抗体はこの乳癌異種移植片のごくわずかな染色を示した（図１）。実際、抗体染色を用いて、フローサイトメトリー及び免疫組織化学試験の双方にて（Keller PJら (2010) Breast Cancer Res 12:R87）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＥｐＣＡＭ陰性として分類されるような低レベルのＥｐＣＡＭの発現を有することが以前報告されている（上記Prang Nら）。対照的に、本発明者らはここで、ＲＮＡアプタマーは匹敵する濃度で、低レベルのＥｐＣＡＭを確実に検出することができることを、抗体がそうはできない腫瘍にて明らかにしている。これらの結果は将来の診断応用のためのこれらアプタマーの有望な潜在性を示唆している。
【実施例４】
【０１６０】
ＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラ
サバイビンのｓｉＲＮＡの有効性の確認及びＥｐＣＡＭの中程度の結合親和性を示す以前の結果の確認に続いて、本発明者らはＥｐＣＡＭアプタマーとサバイビンのｓｉＲＮＡを用いて最初のアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラを設計した（図２）。これら２つのＲＮＡ鎖の二次構造は「Ｎｅｐａｃｋ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｕｐａｃｋ．ｏｒｇ）を用いて予測した。
【実施例５】
【０１６１】
アニーリング後に創られたアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラ
予想されたアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラを創るための長鎖及び短鎖双方の上手く行くアニーリング（９５℃で５分間）を確認するために、ネイティブの高感度アガロースゲル（４％）を使用した。図３から理解できるように、キメラについて明確なバンドが観察されたということは、アニーリングを介して、以前の構造解析を裏付ける安定なキメラ構造が創られていることを示している（図２）。
【実施例６】
【０１６２】
ＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラは試験管内でＥｐＣＡＭ陽性癌細胞株に結合し、その中に内部移行する
図４は、アプタマーへのｓｉＲＮＡの結合がアプタマーの内部移行能に影響を有さなかったことを示している。これらの結果は非特異的結合の欠如と併せて、ＥｐＣＡＭ陰性細胞株ＨＥＫ−２９３Ｔへの内部移行がないことによって示されるように、この複合体がＥｐＣＡＭ陽性細胞株へのｓｉＲＮＡの効率的な送達分子として作用するはずであることを示している。
【実施例７】
【０１６３】
ＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラは生体内でＥｐＣＡＭを発現している腫瘍を標的とする
図５に示すように、注射の後、ＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラは腫瘍にて特異的に濃縮することができ、この結果は４時間の中で連続して検出することができ、ピークはほぼ１時間の時点に存在した。腫瘍及び臓器を切り出し、試験管内で測定すると、アプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラからの蛍光は依然として腫瘍から、心臓、肝臓、脾臓及び肺よりも大きな強度で検出することができた。腎臓における高い蛍光シグナルは相対的に多い血流体積とキメラの小さな体積（約４ｎＭ及び血管を介して部分的に拡散することができた）から多分生じた。理論的に、ＰＥＧ化のようなさらなる修飾及び完全な化学修飾を介して、さらに良好な血漿安定性及び腎臓や肝臓での蓄積の低さが達成され得る。
【実施例８】
【０１６４】
キメラは内部移行の後、Ｄｉｃｅｒ酵素によって認識され得る
ＥｐＣＡＭアプタマー／サバイビンｓｉＲＮＡのキメラ（６４ｎｔのＲＮＡオリゴヌクレオチド）のサバイビンタンパク質の発現を阻害する能力を対照のサバイビンｓｉＲＮＡ（図２Ｃにて緑色で印を付けたパッセンジャー鎖を含まないキメラのより長い鎖）と比較した。図６で示す結果は、キメラはいったん細胞質に送達されるとＤｉｃｅｒ酵素によって上手く処理されて細胞にて２１量体のｓｉＲＮＡを生じたことを示している。実際、図７に示すように、試験管内でのＤｉｃｅｒ消化の解析では、アプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラは組換えＤｉｃｅｒ酵素によって上手く切断されて適切に処理された２１量体のｓｉＲＮＡを生じた。
【実施例９】
【０１６５】
キメラは試験管内で遺伝子サイレンシング能を示す
図６から理解できるように、形質移入剤を含まないキメラとの２４時間のインキュベートの後、ＥｐＣＡＭアプタマー／サバイビンｓｉＲＮＡのキメラは、２０ｎＭ及び１００ｎＭの用量で遺伝子サイレンシング能（それぞれ５８．４％及び７９．８％）を示した。このことは、このキメラが細胞培養及び動物体内の双方でＥｐＣＡＭ陽性細胞を標的とすることができるだけでなく（図４及び図５）、形質移入剤を必要とすることなく試験管内での遺伝子サイレンシングも生じることを示唆した。
【実施例１０】
【０１６６】
ＥｐＣＡＭアプタマーは試験管内で抗ＥｐＣＡＭ抗体よりもはるかに良好に腫瘍塊に浸透する
ＥｐＣＡＭアプタマー又はＥｐＣＡＭ抗体の腫瘍に浸透する能力を調べるために、本発明者らは試験管内での三次元腫瘍塊モデルを使用した。高レベルのＥｐＣＡＭを発現するヒト結腸腺癌細胞ＨＴ−２９及びＥｐＣＡＭを発現しないヒト腎臓細胞ＨＥＫ２９３を幹細胞培養培地（２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ及びＦＧＦ及びＢ２７を伴ったＤＭＥＭ／Ｆ１２）にて培養した。腫瘍塊が約３００〜４００μｍのサイズに達したら、腫瘍塊を１００ｎＭのＰＥ標識した抗ＥｐＣＡＭ抗体、Ｄｙ６４７標識したＥｐＣＡＭアプタマー２３、又はＤｙ６４７標識したＥｐＣＡＭに結合しない対照アプタマーと共にインキュベートした。示した時間のインキュベートの後、腫瘍塊をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光共焦点顕微鏡を介してイメージングした。腫瘍塊の位相差画像も各試料について撮影した。図８は、ＥｐＣＡＭ抗体が４時間後でさえ、腫瘍塊の表面の数層の細胞にしか浸透できなかったことを示している。際立って対照的に、ＥｐＣＡＭアプタマー２３は、インキュベートの３０分後腫瘍塊のコア又は中心に浸透する一方で、ＥｐＣＡＭに結合しない対照アプタマー腫瘍塊への限定した非特異的な結合を示したに過ぎなかった。腫瘍塊をＥｐＣＡＭ抗体、アプタマー２３又は対照アプタマーと共に４時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した後、腫瘍塊を培養培地でさらに２４時間インキュベートし、その後共焦点顕微鏡観察を行う保持試験を実施した。図９に示すように、ＥｐＣＡＭ抗体については検出可能な蛍光はなかった。対照アプタマーについては非常に弱いシグナル（バックグランドノイズに近い）があった。逆に、腫瘍塊全体にわたってアプタマー２３についての明瞭に検出可能なシグナルがあった。このことは、アプタマー２３が腫瘍塊のコアに浸透できるだけでなく、少なくとも２４時間腫瘍細胞によって保持され、それはその効率的な内部移行による可能性が最も高いことを実証している。ＥｐＣＡＭの標的化の特異性及び選択性は、アプタマー２３がＥｐＣＡＭを発現しないＨＥＫ２９３Ｔ腫瘍塊への最低限の結合を示した図１０に示すデータによってさらに実証された。
【０１６７】
パート１実施例１１〜１４：ＥｐＣＡＭアプタマー誘導性の化学療法薬の送達は、癌ではない幹細胞のみを殺傷することが知られた剤を試験管内及び生体内の双方で癌幹細胞を殺傷する剤に変換する。
【実施例１１】
【０１６８】
遊離のＤｏｘではなくアプタマー２３／Ｄｏｘの複合体が試験管内で癌幹細胞を標的とする
非接着性の無血清条件下にて、癌幹細胞（ＣＳＣ）及び前駆細胞のみが生き残り、自己再生を受け、並びに増殖して腫瘍塊を形成する。本発明者は、３μＭの遊離のＤｏｘ、３μＭ相当のアプタマーに結合したＤｏｘ、３μＭのＤｏｘ／陰性対照アプタマー又は溶媒対照の存在下で超低接着性の９６ウェルプレートに種々の細胞用量のＨＴ−２９結腸癌細胞の単個細胞懸濁液を５日間入れることによってアプタマー／Ｄｏｘの癌幹細胞を標的化する能力を調べた。腫瘍塊（＞５０μｍのサイズ）の数を数えた。Ｄｏｘは非ＣＳＣのみを殺傷するという臨床試験及び前臨床試験双方の以前の知見と一致して、３μＭの遊離のＤｏｘはＨＴ−２９腫瘍塊の形成に影響を有さなかった（表３）
【０１６９】
【表３】
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【０１７０】
対照的に、ＥｐＣＡＭアプタマーで結合された３μＭのＤｏｘは腫瘍塊の数を有意に減らした。対照アプタマーで結合されたＤｏｘは、多分細胞による非特異的な取り込みのために腫瘍塊形成にわずかな影響のみを有した。ＣＳＣ２３を標的とすることが知られるサリノマイシン（Ｓａｌ）を陽性対照として用いて我々のアッセイの正当性を立証した。さらに本発明者は、ＥｐＣＡＭが肝臓のＣＳＣマーカーであることが示されている肝細胞癌細胞株（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）を用いて類似の結果が得られたので（表３一番下）、アプタマー／ＤｏｘによるＨＴ−２９の腫瘍塊形成の阻害が１つの特定の腫瘍細胞株に限定されるものではないことを確認した。我々はさらに、腫瘍塊の計数と同様に自己再生能をさらに良く評価する腫瘍塊の継代のための非常に異なる系を用いる超低接着性６ウェル方式アッセイを採用した最初の結果を確認した（データは示さず）。アプタマー／Ｄｏｘの処理が試験管内でＣＳＣを標的とする最終的な指標は、ＨＴ−２９における確立したＣＳＣマーカーのＦＡＣＳ解析、ＥｐＣＡＭ高／ＣＤ４４高／ＣＤ２４高に由来した。図１１Ｂに示すように、アプタマー／Ｄｏｘで処理したＨＴ−２９の腫瘍塊では、たった０．５２％のＥｐＣＡＭ高／ＣＤ４４高／ＣＤ２４高細胞しかなく、それぞれ遊離のＤｏｘ群の９１％（図１１Ａ）又は対照アプタマー／Ｄｏｘ群の９２．１％と極めて対照的だった。
【実施例１２】
【０１７１】
ＥｐＣＡＭアプタマー／Ｄｏｘは生体外で癌幹細胞を標的とする
腫瘍塊形成は生体内での腫瘍形成性の代理アッセイなので、本発明者は試験管内で処理した細胞が異種移植の際、腫瘍を生成できるのかどうかを調べた。３μＭの遊離のＤｏｘ又はアプタマー／ＤｏｘでＨＴ−２９細胞を５日間処理し、１×１０４個又は１×１０５個の処理した細胞（マトリゲルと混合して）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝５）に皮下注射した。図１２及び表４に示すように、遊離のＤｏｘで処理した細胞は調べたマウスすべてにおいて腫瘍を形成したが、アプタマー／Ｄｏｘ処理した腫瘍移植を受けた後５０日目でマウスの細胞に腫瘍は検出されなかった。
【０１７２】
【表４】
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【実施例１３】
【０１７３】
ＥｐＣＡＭアプタマー／Ｄｏｘは生体内で結腸ＣＳＣを標的とする
本発明者は先ず、オンサイトＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ画像ステーションによる生きている動物のイメージングを介して生体内でアプタマー／Ｄｏｘの複合体が腫瘍を効率的に標的とすることができるかどうかを検討した。図１３に示すように、Ｄｙ６４７標識したアプタマー／Ｄｏｘはｉ．ｖ．注射後５分でＨＴ−２９異種移植腫瘍（ｓ．ｃ．で約５ｍｍのサイズ）に蓄積し、腫瘍におけるシグナルは約２時間続いた。代表的な極度限界希釈／異種移植アッセイ（ＥＬＤＡ）を用いて生体内で、アプタマー／ＤｏｘのＣＳＣを標的とする能力をさらに調べた。この目的で、本発明者は１×１０６個のＨＴ２９細胞をｓ．ｃ．でＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。腫瘍が３ｍｍのサイズに達したら、マウスを無作為化し、１日５ｍｇ／ｋｇの用量で遊離のＤｏｘ、ＥｐＣＡＭアプタマー／Ｄｏｘ、又は対照のアプタマー／Ｄｏｘのいずれかの尾静脈注射によって３日間連続して処理した。最後の処理の１週間後マウスを屠殺した。図１４に示すように、たった３回の注射の後、アプタマー／Ｄｏｘ処理群の腫瘍は、遊離のＤｏｘ又は対照アプタマーに結合されたＤｏｘよりも統計的に有意に小さかった／軽かった。繰り返した実験及び処理された腫瘍から調製した単個細胞懸濁液（図１４に示すような）及びＥＬＤＡ（極度限界希釈アッセイ）によってＣＳＣの頻度に対する効果を評価した。表５に示すように、ＥｐＣＡＭアプタマー／Ｄｏｘの複合体は、播種後９週間で判定されたように生体内で腫瘍形成性を有意に低下させることができた。
【０１７４】
【表５】
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【実施例１４】
【０１７５】
ＥｐＣＡＭアプタマーの５’末端への２０ｋＤａのＰＥＧの結合はその生体分布及び腫瘍標的化を改善する
ＰＥＧ／アプタマー／Ｄｏｘ（５ｍｇのＤｏｘ／ｋｇ）をｉ．ｖ．で担癌マウスに注射した。アプタマーＥＬＩＳＡを介して測定した所与の組織／臓器の重量によって正規化したＰＥＧ／アプタマーのパーセンテージ（％）ＩＤを図１５で示す棒グラフにてプロットした。
【０１７６】
総合すれば、実施例１１〜１４のデータは、ＥｐＣＡＭ−２３が指図するＲＮＡアプタマー／ドキソルビシンの複合体は試験管内及び生体内の双方にて癌幹細胞を標的とすることができることを示している。
【０１７７】
パート２：実施例１５〜１７：ＥｐＣＡＭアプタマー誘導性のｓｉＲＮＡの送達は生体内での癌幹細胞の効果的な標的化を介して化学療法剤耐性を克服する。
【実施例１５】
【０１７８】
ＥｐＣＡＭアプタマーが介在するｓｉＲＮＡの送達は試験管内で癌幹細胞を標的とする
ドキソルビシン（Ｄｏｘ）はそれ自体では癌幹細胞を殺傷しない。本発明者はサバイビンｓｉＲＮＡのＣＳＣを標的とする送達はＣＳＣをＤｏｘに対して感受性にするという仮説を立てた。実際、２０ｎＭのキメラ足す３００ｎＭのＤｏｘによる７２時間の処理（形質移入剤を含まずに）の後、腫瘍塊アッセイの１回目と２回目の双方で腫瘍様塊の数で約８０％の減少があった（示さず）ということは、癌幹細胞の有意な部分が排除されていることを示している。本発明者はさらに、極度限界希釈法と組み合わせてＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの第４鼠径乳房脂肪体に処理した細胞を異種移植してＣＳＣの頻度（移植後４０日目で）を評価することによって癌幹細胞の腫瘍形成性に対するキメラ足すＤｏｘの効果を確認した（表６）。最終的に図１６で示すように、キメラ足す３００ｎＭのＤｏｘによる試験管内での腫瘍塊の処理は、遊離のＤｏｘのみに比べて乳癌ＣＳＣ（ＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）の有意な減少を生じた（図１６）一方で、溶媒対照又は陰性対照のキメラ足すＤｏｘで処理した細胞ではＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−集団はそれぞれ約２２．５％及び２１．７％残っていた。これらの結果は、ＥｐＣＡＭアプタマー／サバイビンｓｉＲＮＡのキメラは試験管内でのＭＣＦ７／ＡＤＲ乳癌薬剤耐性モデルにて癌幹細胞を標的とすることを立証している。
【０１７９】
【表６】
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【実施例１６】
【０１８０】
ＥｐＣＡＭアプタマーは生体内にてｓｉＲＮＡを異種移植腫瘍に送達し、癌幹細胞を標的とする
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにて部位当たり３×１０６個のＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞（マトリゲルと混合して）を移植することによって同所性乳癌モデルを確立した。腫瘍が約２００ｍｍ３の体積に達したら、我々は尾静脈注射を介した処理を開始した。１、３及び５日目に１ナノモルのＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラのｉ．ｖ．（ボーラス）注射によって、及び２、４及び６日目に５ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンのｉ．ｖ．（ボーラス）注射によってマウス（ｎ＝５）を処理した。１０日目に動物を安楽死させ、腫瘍を回収し、異種移植及び生体内極度限界希釈解析に供した。図１７に示すように、サバイビンのｍＲＮＡ及びタンパク質を約６０％ノックダウンする能力によってキメラ（ＰＥＧなし）の生体内での有効性が明らかにされた。重要なことに、腫瘍（移植後５０日目）の癌幹細胞、自己再生及び腫瘍形成性の際立った特徴を評価する異種移植／極度限界希釈解析から明らかなように、Ｄｏｘの処理と併用したサバイビンｓｉＲＮＡのＥｐＣＡＭが標的化した送達は生体内でＭＣＦ７／ＡＤＲ腫瘍にて癌幹細胞の実質的な部分を排除した（表７）。
【０１８１】
【表７】
0006297034.tif 000008
【実施例１７】
【０１８２】
ＥｐＣＡＭ／ｓｉＲＮＡのキメラの薬物動態の改善は処理の有効性をさらに向上させる
その全身性の循環時間を延ばすために、ｓｉＲＮＡ／アプタマーのキメラの５’末端に２０ｋＤａのＰＥＧを連結した。次いで本発明者は部位当たり３×１０６個のＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞（マトリゲルと混合して）を移植することによって同じ同所性乳癌モデルを用いた。腫瘍が約２００ｍｍ３の体積に達したら、我々は処理を開始した。１、３及び５日目に１ナノモルのＥｐＣＡＭアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラのｉ．ｖ．（ボーラス）注射によって、及び２、４及び６日目に５ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンのｉ．ｖ．（ボーラス）注射によってマウス（ｎ＝８）を処理した。最後（３回目）の処理後２日目に腫瘍を取り出し、その重量を測定し、処理群及び種々の対照群における乳癌幹細胞マーカー（ＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーを介して検討した。図１８に示すように、ＥｐＣＡＭ２３アプタマー／サバイビンｓｉＲＮＡのキメラ足すドキソルビシンで処理したマウスに由来する腫瘍は、遊離のドキソルビシンで処理した群を含む他の処理群よりも腫瘍の総塊（重量）を有意に低下させた。さらに、乳癌幹細胞マーカー陽性細胞の比率から判断して、ＥｐＣＡＭ２３アプタマー／サバイビンｓｉＲＮＡのキメラ足すドキソルビシンによる処理は乳癌幹細胞のプールを劇的に減らした（表８）。
【０１８３】
総合すると、生体内でのＥｐＣＡＭ２３アプタマー誘導性のｓｉＲＮＡの癌幹細胞への送達は化学療法剤耐性の発生を防ぐことによって処理の有効性を向上させる。
【０１８４】
【表８】
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備考
【０１８５】
組織病理切片にて癌の生体マーカータンパク質の発現を検出するための感度の高い且つ信頼できる方法は、病変の根底にある分子情報に基づくオーダーメイド医療にとって必須である。ＥｐＣＡＭは原発性及び転移性双方の乳癌で実証されたその過剰発現を伴う癌の生体マーカーである。そのような患者の有害臨床転帰は特に転移におけるＥｐＣＡＭの高い発現と関連する。加えて、胆嚢癌、卵巣癌及び膵臓癌の予後不良はＥｐＣＡＭの過剰発現とも関連する。実際、たとえば、内分泌療法及びトラツズマブのような現在の標的化療法へのその耐性を考えると、三重陰性乳癌におけるＥｐＣＡＭの発現は免疫療法の好適な標的であり得ることが示唆されている。完全にヒト化されたモノクローナル抗ＥｐＣＡＭ抗体、アデカツムマブ（ＭＴ２０１）を用いた試験では、転移乳癌の患者は新しい転移の比率の低下と共に用量依存性で標的依存性の臨床応答を示した。
【０１８６】
免疫組織化学の試験と幾つかのＥｐＣＡＭの免疫療法臨床試験の成績とに続いて、免疫療法の使用の多さ及び高レベルのＥｐＣＡＭを発現している腫瘍の治療への抗ＥｐＣＡＭ抗体の使用を考えて、癌患者においてＥｐＣＡＭの発現のレベルを調べることが提案されている。実際、抗ＥｐＣＡＭ免疫療法の一部の臨床試験の失敗は治療されるべき腫瘍におけるＥｐＣＡＭ発現の事前の知識の欠如に関連し得ることが示唆されている。ここで本発明者らは、アプタマーが組織診断に特に好適であり、組織診断用の抗体よりも優れることを明らかにしている。これらのアプタマーを化学抗体として使用する試みでは広範な最適化が必要とされた一方で、これらのプローブが核酸なので、その場でのハイブリッド形成に使用される類似の方法と共に従来の抗体染色の組み合わせ法を必要とし得るという認識は大きな成功であると判明した。デキストラン硫酸の使用は核酸のハイブリッド形成の速度を加速するのでアプタマーのインキュベートに必要な時間を減らすことを示している一方で、ヘパリンはハイブリッド形成の手順でバックグランドの結合を減らすことが示されている。これら２つの試薬のいずれかをハイブリッド形成の緩衝液で除外すると、インキュベート時間を長くしても陽性染色は達成されなかった。実際、この方法は、ＥｐＣＡＭの染色について調べたアプタマーすべてで上手く行った。我々は、この改善されたプロトコールがパラフィン包埋組織の染色にて他のアプタマーも使用について非常に有効であることが判明することを期待している。
【０１８７】
この試験では、以前のアプタマーＤＴ３はＨＴ−２９の異種移植片切片の染色を示さなかった一方で、調べた他のアプタマーであるアプタマー２３は強い陽性染色を示した。可能性の１つは、ＥｐＣＡＭ分子上でＤＴ３が結合する特定のエピトープが失われているかもしれない又はこの特定の腫瘍におけるそのエピトープを覆い隠す細胞表面上の他の抗原のせいで、そのエピトープがアクセス不能のままなのかもしれないということである。しかしながら、３種の乳癌異種移植片で見られた陽性の反応性を考えると、エピトープの喪失が関与することは考えにくい。或いは、この特定のエピトープは抗原賦活化に続いて異種移植腫瘍上で覆い隠されたままである。同様に、アプタマーＤＴ３がこの細胞株に対して有する低い親和性も役割を担い得るし、免疫染色の欠如もたらすこれら２つの因子の組み合わせであり得る。
【０１８８】
パラフィン包埋組織における低レベルの抗原を検出することにおける本アプタマーの能力と同じ腫瘍を染色するのに試された従来の抗原の失敗との間の著しい違いは興味深い。アプタマーは抗体よりも１０〜２０倍小さいので（６ｋＤａ対１５０ｋＤａ）、抗体より多くのアプタマーが所与の標的分子に結合することが可能である。加えて、小さいサイズのアプタマーは組織病理スライドにて細胞の層に効果的に浸透するのを促進し得る。このことは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株が一般に、その発現を検出する抗体の無能のせいでＥｐＣＡＭ陰性であると見なされるのに、本発明者らがパラフィン包埋組織のアプタマー染色を介してこの細胞株の表面上でＥｐＣＡＭの発現を検出することができる理由の１つであり得る。ことによると、低レベルのＥｐＣＡＭ発現は従来の抗体染色を用いた診断の間、見落とされているのかも知れない。
【０１８９】
この試験は、異種移植腫瘍を用いて組織学試薬として本ＥｐＣＡＭアプタマーを性状分析している。この理由の１つは適当なヒト組織を入手する困難さによる。しかしながら、異種移植腫瘍は少なくとも他によって検討された腫瘍にて生体内で正確に腫瘍の組織学を大部分反復することが提示されている。この試験で使用した異種移植腫瘍の組織病理は病理学者によって確認されている。この原理証明試験の結果は、アプタマーが化学的抗体として機能することが可能であるだけでなく、少なくとも調べたＥｐＣＡＭ抗体を伴った従来の抗体よりも感度が高いことも実証している。アプタマーが化学的に容易に合成され得ることを考えると、この試験は将来の組織病理診断にてこれらの化学的抗体を応用することに道を開くものである。
【０１９０】
本結果は、アプタマーが生体マーカー及び癌幹細胞の研究からの発見を病理診断実務に変換してオーダーメイド医療に対する患者のさらに良好な層別化を可能にする堅牢で費用効率が高いツールを提供することができることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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