(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
A鎖、B鎖及び連結部分を含む単鎖インスリンアナローグであって、
前記連結部分が、B鎖のカルボキシ末端をA鎖のアミノ末端と共有結合により連結させて、連続するアミノ酸鎖を形成し、
前記連結部分が、
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR（配列番号：64）、
SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK（配列番号：79)、及び、
SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66)、
前記式中、X50及びX51が別個にアルギニン及びリジンから選択される
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記単鎖インスリンアナローグが、インスリンレセプターにおいてアゴニスト活性を有し、さらに
前記A鎖が、配列GIVDECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX23-R13（配列番号：27）又はGIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23（配列番号：23）を含み、
さらに
前記B鎖が、配列X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF（配列番号：24）又はGEEEEEKGPEHLCGAHLVDALYLVCGDX42GFY（配列番号：22）を含み、
式中、
X8は、スレオニン及びヒスチジンから成る群から選択され；
X9及びX14は、別個にアルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンから選択され；
X15は、アルギニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン又はスレオニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；X23は、アスパラギン又はグリシンであり；
X25は、ヒスチジン及びスレオニンから成る群から選択され；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
R13は、COOH又はCONH2である、前記単鎖インスリンアナローグ。
【請求項２】
前記アナローグが配列番号：68又は90を含むペプチドである、請求項１に記載の単鎖インスリンアナローグ。
【請求項３】
X8、X25及びX30が各々ヒスチジンである、請求項１に記載の単鎖インスリンアナローグ。
【請求項４】
前記B鎖が配列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF（配列番号：104）を含み、該A鎖が配列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：1）を含み、さらに該連結部分が配列SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66）を含み、式中、X50及びX51は別個にアルギニン及びリジンから選択される、請求項1に記載の単鎖インスリンアナローグ。
【請求項５】
前記アナローグが配列番号：68からなるペプチドである、請求項１に記載の単鎖インスリンアナローグ。
【請求項６】
さらに前記アナローグに連結された親水性部分を含み、該親水性部分が、血漿タンパク質、ポリエチレングリコール鎖又は免疫グロブリンのFc部分である、請求項1から5のいずれかに記載の単鎖インスリンアナローグ。
【請求項７】
前記単鎖インスリンアナローグのアミノ酸側鎖が、アルキルアミン、アミド、エーテル、エステル、チオエーテル、又はチオエステル結合を介してアシル基又はアルキル基と共有結合により結び付けられる、請求項1から6のいずれかに記載の単鎖インスリンアナローグ。
【請求項８】
インスリンレセプターにおいてアゴニスト活性を有し、A鎖、B鎖及び連結部分を含む単鎖インスリンアナローグであって、
前記連結部分が、前記B鎖のカルボキシ末端を、前記A鎖のアミノ末端に共有結合により連結して、連続するアミノ酸鎖を形成し、
前記A鎖が、配列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：1）を含み、
前記B鎖が、配列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF（配列番号：104）を含み、さらに
前記連結部分が、配列SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66）からなり、
前記A及びB鎖がジスルフィド結合を介して互いに連結され、
さらに式中、
X50及びX51は別個にアルギニン及びリジンから選択される、前記単鎖インスリンアナローグ。
【請求項９】
請求項1から8のいずれか１項に記載のインスリンアナローグをコードする核酸。
【請求項１０】
請求項1から8のいずれか１項に記載のインスリンアナローグをコードする核酸を含む真核宿主細胞。
【請求項１１】
該細胞がピキア又はCHO細胞である、請求項10に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
インスリンアナローグを製造する方法であって、前記方法が、請求項10に記載の細胞を前記タンパク質が生成される条件下で培養する工程及び前記タンパク質を該培養から回収する工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
U-B構造をさらに含む、請求項1から8のいずれかに記載のインスリンアナローグの誘導体であって、
Uがアミノ酸又はヒドロキシ酸であり、
Bが、Bのカルボキシル部分と該単鎖インスリンアナローグのアミンとの間のアミド結合を介して前記単鎖インスリンアナローグに連結されたN-アルキル化アミノ酸であり、
U、B又はU-Bが連結されている単鎖インスリンアナローグのアミノ酸が非コードアミノ酸であり、さらにまた、
該単鎖インスリンアナローグからU-Bが化学的に切断される半減期（t1/2）が、生理学的条件下のPBS中で少なくとも約1時間から約1週間である、前記誘導体。
【請求項１４】
U-Bが下記式Xの構造を含む、請求項13に記載の誘導体であって、
【化１】
0006392123.tif 000085
式中、
R1及びR2が別個に水素及びC1-C8アルキルから成る群から選択され；
R3はC1-C18アルキルであり；
R4及びR8は各々水素であり；さらに
R5はNH2又はOHである、請求項13に記載の誘導体。
【請求項１５】
前記アナローグが、A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29から選択される1つ以上の位置でアシル化される、請求項14に記載の誘導体。
【請求項１６】
前記アナローグが、A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29から選択される1つ以上の位置でペジル化される、請求項14に記載の誘導体。
【請求項１７】
請求項1から8のいずれか１項に記載の単鎖インスリンアナローグを含む、ダイマー又はマルチマー。
【請求項１８】
請求項1から8のいずれかに記載の単鎖インスリンアナローグ又は請求項13から16のいずれか１項に記載の誘導体、及び医薬的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項1から8のいずれかに記載の単鎖インスリンアナローグ又は請求項13から16のいずれか１項に記載の誘導体の、高血糖症の治療のための医薬の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、米国仮特許出願61/578,052（2011年12月20日出願、前記出願はその全体が参照により本明細書に含まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
背景技術
インスリンは、若年開始糖尿病及び成人開始後期糖尿病の立証済み治療法である。前記ペプチドは低ポテンシー（自然のままのインスリンの約2％から9％）の大きな線状前駆体（プロインスリンと称される）として生合成される。プロインスリンは、タンパク分解による35残基連結ペプチド（Cペプチド）の選択的除去によってインスリンに変換される。インスリン“A鎖”（配列番号：1）及び“B鎖”（配列番号：2）間のジスルフィド結合によって形成された生成ヘテロ二重体（合計51アミノ酸を示す）は、インスリンレセプターに対して高いポテンシーを有する（nM範囲）。自然のままのインスリンは、インスリンレセプターに対し関連するインスリン様増殖因子1レセプターと比較してほぼ100倍の選択的親和性を有するが、2つの異なるインスリンレセプターアイソフォーム（A及びBと称される）に対してはほとんど選択性を示さない。
インスリン様増殖因子1及び2は単鎖線状ペプチドホルモンであり、それらのA鎖及びB鎖配列は高度に相同性である（自然のままのインスリンとほぼ50％相同性を共有する）る。IGF A及びB鎖は“C-ペプチド”によって連結され、前記2つのIGFのC-ペプチドはサイズ及びアミノ酸配列が異なる（第一のものは長さが12アミノ酸、第二のものは8アミノ酸である）。ヒトIGF-1は、配列番号：3に示すタンパク質配列を有する70aaの塩基性ペプチドであり、プロインスリンと43％の相同性を有する（Rinderknecht et al.(1978) J.Biol.Chem.253:2769-2776）。ヒトIGF-2は配列番号：4に示すタンパク質配列を有する67アミノ酸の塩基性ペプチドである。これらIGFは、インスリンA-レセプターアイソフォームよりもBレセプターアイソフォームで極めて低い活性を示す。
【０００３】
出願人らは以前に、インスリンレセプターで高い活性を示す、IGF-1系インスリンペプチドアナローグ（自然のままのB-鎖のGln-PheジペプチドがTyr-Leuに置き換えられている）を同定した（PCT/US2009/068713を参照されたい、前記文献の内容は参照により本明細書に含まれる）。そのようなアナローグ（本明細書ではIGF YLアナローグペプチドという）はインスリンよりも容易に合成され、インスリン及びIGF-1レセプターのためのコアゴニストアナローグ、並びに選択的なインスリンレセプター特異的アナローグの開発を可能にする。
インスリンは、若年開始糖尿病及び成人開始後期糖尿病の立証済み治療法であるが、比較的狭い治療指数を有するものの１つである。理想的なインスリン療法は、日中１回実行（毎日）を提供できるインスリン処方である。自然界では、多数の自然のままのタンパク質の腎クリアランスを阻害するためにグリコシル化を利用し、本明細書で考察するように、生合成時にグリコシル化され得るインスリンアナローグが提供される。より具体的には、本開示のある特徴はインスリンアナローグに関し、前記は、当該タンパク質が真核細胞発現系で発現されるときにO-結合高グリコシル化を受けやすいペプチド配列を含むように改変されてある。
【０００４】
さらにまた、これらインスリンアゴニストアナローグをさらに改変して、治療指数の改善（例えばプロドラッグ化学の利用を通して）、作用時間の延長（例えば血漿タンパク質（例えばアルブミン）の結合、又は他の改変（ペジル化（pegylation）及びアシル化）による）、及び好ましい組織標的誘導（例えばコレステロール又はビタミン様置換基による化学的改変の利用を通して）を示すアナローグを得ることができる。ペプチドリンカー配列（例えばグリコシル化部位を含むペプチドリンカー配列を含む）を用いる単鎖インスリンアナローグの調製はまた新規な構造性の位置を提供する（それらの位置ではこれら化学的改変の多くが有効に機能し得る）。そのような最適化インスリンアナローグは、主としてインスリン依存性糖尿病の治療で用いられるであろう。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書で開示するように、真核細胞発現系によってグリコシル化されるペプチド配列を含むように改変されてあるインスリンアナローグ（analog）が提供される。ある実施態様では、インスリンアナローグは、C-末端ペプチド配列と称されるペプチド配列（CTP：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR；配列番号：64）を含むように改変される。前記ペプチドは、当該タンパク質が真核細胞発現系で発現されるときO-結合高グリコシル化を受けやすい。該CTPペプチドは、当該インスリンアナローグの固有のin vitro活性を低下させることなく、二鎖インスリンアナローグのB鎖のN-末端及び／又はカルボキシ末端に共有結合により連結することができる。さらに驚くべきことは、CTPペプチドを用いてインスリンのB鎖及びA鎖を連結して単鎖インスリンアナローグをも生成できるという事実であり、前記アナローグは、自然のままのプロインスリンC-ペプチドなら不可能な態様で高いin vitroポテンシーをなお維持する。
【０００６】
ある実施態様にしたがえば、A鎖及びB鎖及びCTPペプチドを含むインスリンアナローグが提供される。ある実施態様では、該A鎖は、配列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：1）を含み、B鎖は配列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF（配列番号：96）を含む。より詳細には、該A鎖及びB鎖はジスルフィド結合を介して互いに連結され、前記CTPペプチドは、B鎖のアミノ及び／又はカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様では、該CTPペプチドは配列SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66）を含み、X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン及びリジンから選択される。ある実施態様では、B鎖のカルボキシ末端がA鎖のアミノ末端とCTPペプチドを介して連結された単鎖インスリンアナローグが調製され、さらに別の実施態様では、該単鎖インスリンアナローグは場合によってB鎖のアミノ末端に連結されたCTPを含む。別の実施態様では、インスリンアナローグは二鎖構築物として提供され、CTPペプチドはB鎖のC-末端に共有結合により連結され、場合によって第二のCTPがB鎖のアミノ末端に連結される。CTPペプチドを含む2つ以上の配列が本明細書に開示するインスリンアナローグに連結されるとき、CTPペプチドを含む配列は同じでも異なっていてもよい。in vitro及びin vivoの性状調査は、CTP改変インスリンアナローグがグリコシル化の非存在下で高いポテンシーを有することを明らかにし、したがって、CTPペプチド連結によるインスリンアナローグの改変は、グリコシル化（タンパク質をより長時間持続させる天然の手法）によるインスリン作用の延長のメカニズムを提供する。
【０００７】
なお一層驚くべきことには、出願人らは、A鎖及びB鎖をつなぐ連結部分としてペプチドを用いて単鎖インスリンアナローグを調製するとき、CTPペプチドの正確な配列を維持する必要がないことを見出した。したがって、ある実施態様では、A鎖、B鎖及び連結部分を含む単鎖インスリンアナローグが提供され、ここで該連結部分は少なくとも18アミノ酸のペプチド（例えば18から158，29から87又は29から58アミノ酸のペプチドを含む）を含み、前記はB鎖のカルボキシ末端をA鎖のアミノ末端に共有結合により連結して連続するアミノ酸鎖を形成するが、ただし該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端に直接連結される配列番号：53の18アミノ酸配列フラグメントと同一である18アミノ酸配列を含まないということを条件とする。ある実施態様では、連結部分は、B鎖のカルボキシ末端のアミノ酸に直接連結される連続する29アミノ酸配列を含み、前記連続する29アミノ酸配列を含むアミノ酸の少なくとも58％はセリン又はプロリンである。別の実施態様では、連結部分は、B鎖のカルボキシ末端のアミノ酸に直接連結される連続する29アミノ酸配列を含み、前記連続する29アミノ酸配列は、配列番号：64と55、60、65、75、80、85、90、92又は95％より大きい配列同一性を有するが、ただし該連結部分が、配列番号：53の18アミノ酸配列フラグメントと同一である18アミノ酸配列を含まないことを条件とする。別の実施態様では、連結部分は配列番号：66の配列を含む。ある実施態様では、A鎖は配列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：1）を含み、B鎖は配列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF（配列番号：96）を含む。
【０００８】
さらに別の実施態様では、本明細書に開示するインスリンアナローグをコードする核酸配列もまた、そのような核酸配列を含む原核細胞及び真核細胞と同様に本発明に包含される。ある実施態様にしたがえば、本明細書に開示する改変インスリンアナローグをコードする核酸配列を含む真核宿主細胞を用いて、高グリコシル化インスリンアナローグが生成される。
本明細書に開示するインスリンアナローグは、自然のまま（native）のインスリンB及びA鎖配列、又はヘテロ二重体として互いに連結したときインスリンアゴニスト活性を示す公知のアナローグ若しくはその誘導体のいずれかを含むことができる。本明細書に開示するように、そのようなA鎖及びB鎖ペプチドは、CTPペプチド又はその誘導ペプチドによって互いに連結されて単鎖インスリンアゴニストを形成するか、又はCTPペプチドを、二鎖インスリンヘテロ二重体のA鎖又はB鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端に連結することができる。ある実施態様にしたがえば、B鎖は配列R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45（配列番号：16）を含み、A鎖は配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）を含み、式中、
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；
X8は、ヒスチジン又はフェニルアラニンであり；
X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X10は、イソロイシン又はセリンであり；
X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；
X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、オルニチン又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X36はチロシンであり；
X41は、グルタミン酸、 アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、オルニチン、リジン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45はチロシンであり；
R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及びN-末端アミンから成る群から選択され；さらに
R13は、COOH又はCONH2である。ある実施態様では、X8、X25及びX30は各々ヒスチジンである。
【０００９】
補足的インスリンアゴニストの誘導体も本発明に包含され、前記には、基本的インスリンアゴニストの可溶性を改善する改変が含まれる。ある実施態様では、インスリンアゴニストペプチドの可溶性は、該ペプチドへの親水性部分の共有結合によって強化される。ある実施態様では、該親水性部分は、B鎖のN-末端アミノ酸、又はB鎖の末端に位置するアミノ酸の側鎖（例えばB26-30位のいずれかに存在するリジン）、又は単鎖インスリンアナローグでB鎖をA鎖に結合させる連結部分を含む任意のアミノ酸の側鎖に連結される。ある実施態様では、該親水性部分はアルブミンである（例えばヒト血清アルブミン（HSA）及び組換えヒトアルブミン（rHA）を含む）。ある実施態様では、該親水性部分はポリエチレングリコール鎖であり、約500から約40,000ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。ある実施態様では、該ポリエチレングリコール鎖は、約500から約5,000ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様では、該ポリエチレングリコール鎖は約10,000から約20,000ダルトンの分子量を有する。
アシル化又はアルキル化は、循環時のインスリンアナローグペプチド及びそのプロドラッグ誘導体の半減期を延長する。アシル化又はアルキル化は、有利にはインスリンレセプターでの作用の開始を遅らせ、及び／又は作用の持続時間を延長することができる。本明細書に開示するインスリンアナローグは、親水性部分を連結させた同じアミノ酸の位置で又は異なるアミノ酸の位置で、アシル化又はアルキル化によってさらに改変する事ができる。
【００１０】
本開示に包含されるものはまた、インスリンアナローグ及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物である。ある実施態様にしたがえば、本明細書に開示するインスリンアナローグのいずれか又はその誘導体（好ましくは少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の純度レベル）及び医薬的に許容できる希釈剤、担体又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。そのような組成物は、本明細書に開示するインスリンアゴニストペプチドを、少なくとも0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL又はそれより高い濃度で含むことができる。ある実施態様では、該医薬組成物は、滅菌され場合によって多様な包装容器に保存された水溶液を含む。ある実施態様では、該医薬組成物は凍結乾燥粉末を含む。該医薬組成物はさらに、患者に該組成物を投与するために使い捨て装置を含むキットの部分として包装され得る。該容器又はキットは、周囲室温又は冷蔵温度での保存を明示する付箋を添付できる。
【００１１】
ある実施態様にしたがえば、高グリコシル化インスリンアナローグを製造する方法が提供される。ある実施態様では、該方法は、CTPペプチドを含むインスリンアナローグをコードする遺伝子を含む真核宿主細胞（例えば酵母、マウス又はヒト）を提供する工程、及び該インスリンアナローグ遺伝子の発現を許容する条件下で該細胞を培養する工程を含む。ある実施態様では、該宿主細胞で生成されるグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）がヒト細胞のものと同一のタンパク質グリコシル化を示すように、該宿主細胞はヒトグリコシル化酵素を発現する（米国特許出願公開2004/0018590及び2002/0137134号を参照されたい、前記文献の開示は参照により本明細書に含まれる）。
ある実施態様にしたがえば、インスリン依存患者で血中グルコースレベルを調節する改善方法が提供される。該方法は、本明細書に開示するインスリンアゴニストペプチド、又はその医薬的な塩又は他の誘導体を糖尿病制御に治療的に有効な量で患者に投与する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトインスリンを調製するための二工程合成法の模式図である。前記手順の詳細は実施例1で提供される。
【図２】精製された自然のままのインスリンに対して合成ヒトインスリンのインスリンレセプター特異的結合を比較するグラフである。合成インスリンは図1で詳述するアプローチによって生成した（ここでA7-B7結合は第一のジスルフィド結合の形成である）。グラフに提示したデータが示すように、前記2つの分子は類似の結合活性を有する。
【図３】自然のままのインスリン及びA19インスリンアナローグ（インスリン(p-NH2-F)19）の相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。グラフに提示されたデータが示すように、前記2つの分子は類似の結合活性を有する。
【図４】自然のままのインスリン及びIGF1(YB16LB17)アナローグの相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。グラフに提示されたデータが示すように、前記2つの分子は類似の結合活性を有する。
【図５】ヒトプロインスリン（A鎖（配列番号：1）；B鎖（配列番号：2）；及びC鎖（配列番号：53））並びにインスリン様増殖因子I及びII（IGFI（配列番号：3）及びIGFII（配列番号：4））のアミノ酸配列のアラインメントを示す。前記アラインメントは、これら3つのペプチドが高レベルの配列同一性を共有することを示している（*は、対応するアミノ酸がない空隙を示し、ダッシュ（-）はインスリンに存在するものと同一のアミノ酸を示している）。
【図６】IGF1(YB16LB17)(p-NH2-F)A19プロドラッグ誘導体を調製するために用いられる合成方法の模式図である。固有の誘導体は、芳香族アミンがAib-Alaジペプチドでアシル化されたp-NH2-Fである（前記ペプチドは生理学的条件下で切断されないので陰性コントロールとして機能する）。
【図７】IGF1(YB16LB17)(p-NH2-F)A19及びIGF1(YB16LB17)(p-NH2-F)A19-AiBAlaのジペプチド伸長形の相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。このプロドラッグの合成は図6に示されている（前記合成では、AiBAlaジペプチドはA19に結合される、すなわちIGF1(YB16LB17)(AiBAla)）。前記ペプチドは生理学的条件下では容易には切断されず、したがって活性は極めて低く、このことは、生物活性をサイレンシングするこの部位のジペプチドによるアシル化の能力を示している。これは、プロドラッグの2つの中心的構成要素の1つ、プロドラッグ形の低活性を引き起こす。
【図８】8A−8Cは、本開示にしたがって調製したダイマーの活性を提供する。図8AはIGF-1単鎖ダイマーの構造を示し、前記は、B鎖のアミノ末端の側鎖の間でジスルフィド結合によって一緒に連結された2つの単鎖IGFB16B17アナローグペプチド（IGF-1B鎖[C0H5Y16L17O22P28R29]-A鎖[O9,14,15N18,21]（配列番号：54））を含む。自然のままのインスリンジスルフィド（A6-A11、A7-B7、A20-B19）は示されていないが、ダイマー形として存在する。該ジスルフィドダイマーの単鎖は、矢印で示すように、2つのArg-Gly(B29A1)の選択的タンパク分解消化によって二鎖形に変換され得る。図8Bは、インスリン、単鎖IGFB16B17アナローグペプチドダイマー及び二鎖IGFB16B17アナローグペプチドダイマーの相対的インスリンレセプター結合を示すグラフである。図8Cは、インスリン及び二鎖IGFB16B17アナローグペプチドダイマーのインスリンレセプターリン酸化を誘発する相対的活性を示すグラフである。
【図９】9A−9Cは、IGF1A(Ala)6,7,11,20アミドの(pNH2-F)19上のIGFA鎖ペプチド：(Aib-Pro)のプロドラッグ形の分解を示す。前記ペプチドをpH7.4、37℃で予め定めた時間PBS中でインキュベートした。インキュベーション開始後20分（図9A）、81分（図9B）及び120分（図9C）で、アリコットを採取し、0.1％のTFAで反応を停止させ、分析HPLCで試験した。ピークa（IGF1A(Ala)6,7,11,20(pNH2-F)1アミド）及びb（IGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19アミド）をLC-MSにより同定し、ピーク面積を統合して定量した。データは、IGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19アミドからIGF1A(Ala)6,7,11,20(pNH2-F)1アミドへの時間経過中の偶発的な非酵素性変換を示している。
【図１０】10A及び10Bは、プロドラッグAib,dPro-IGF1YL（A19 4aminoPheを介して連結されたジペプチド）のin vitro活性を示すグラフである。図10Aは、PBS中でインキュベーとしたとき、自然のままのインスリン（4℃で1時間測定）及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（Aib,dPro-IGF1YL）の時間経過中（0時間、2.5時間及び10.6時間）の相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。図10Bは、20％血漿/PBS中にて37℃でインキュベーとしたとき、自然のままのインスリン及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（Aib,dPro-IGF1YL）の時間経過中（0時間、1.5時間及び24.8時間）の相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。グラフに提示したデータが示すように、プロドラッグ形が活性なIGF1YLペプチドに変換されるにつれ、活性の増加がA19IGFプロドラッグ誘導体サンプルから回収される。
【図１１】11A及び11Bは、プロドラッグdK,(N-イソブチルG)-IGF1YL（A19 4aminoPheを介して連結されたジペプチド）のin vitro活性を示すグラフである。図11Aは、PBS中でインキュベーとしたとき、自然のままのインスリン及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（IGF1YL:dK,(N-イソブチルG)）の時間経過中（0時間、5時間及び52時間）の相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。図11Bは、20％血漿/PBS中にて37℃でインキュベーとしたとき、自然のままのインスリン及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（IGF1YL:dK,(N-イソブチルG)）の時間経過中（0時間、1.5時間及び24.8時間）の相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。グラフに提示したデータが示すように、プロドラッグ形が活性なIGF1YLペプチドに変換されるにつれ、活性の増加がA19IGFプロドラッグ誘導体サンプルから回収される。
【図１２】12A及び12Bは、プロドラッグdK(e-アセチル),Sar)-IGF1YL（A19 4aminoPheを介して連結されたジペプチド）のin vitro活性を示すグラフである。図12Aは、PBS中でインキュベーとしたとき、自然のままのインスリン（4℃で1時間測定）及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（IGF1YL：dK(e-アセチル),Sar）の時間経過中（0時間、7.2時間及び91.6時間）の相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。図12Bは、20％血漿/PBS中にて37℃でインキュベーとしたとき、自然のままのインスリン及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（IGF1YL：dK(e-アセチル),Sar）の時間経過中（0時間、9時間及び95時間）の相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。グラフに提示したデータが示すように、プロドラッグ形が活性なIGF1YLペプチドに変換されるにつれ、活性の増加がA19IGFプロドラッグ誘導体サンプルから回収される。
【図１３】自然のままのインスリンヘテロ二重体、IGF-1 A及びB鎖ヘテロ二重体並びに単鎖IGF-1アナローグ（B鎖のカルボキシ末端はIGF-1A鎖のN-末端に直接連結される）の相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。
【図１４】自然のままのインスリンヘテロ二重体、IGF-1、IGF-1デルタヘテロ二重体及び単鎖IGF-1デルタ単鎖アナローグの相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。前記IGF-1デルタアナローグでは、B鎖のカルボキシ末端はIGF-1A鎖のN-末端に、配列GYGSSSOR（配列番号：35）から成るペプチドリンカーを介して直接連結され、前記アナローグは以下のアミノ酸置換を有する自然のままのIGF-1配列を含む：HA8、OA9、OA14、OA15、QA17、NA21、YB16、LB17、OB22。
【図１５】IGF-1レセプター又はA若しくはBサブタイプインスリンレセプターにおける単鎖インスリンアナローグのin vitro結合活性を示す棒線グラフである。前記アナローグでは、自然のままのインスリンB鎖のカルボキシ末端は、自然のままのインスリンA鎖のアミノ末端にIGF-1Cペプチド又はIGF-1Cペプチドの多様な誘導体を介して連結される。B0C1A0インスリンアナローグの命名法では、B0及びA0の表示は、A鎖及びB鎖のインスリン配列を指し、一方、C1はIGF-1Cペプチドを表示する。データが示すように、IGF-1Cペプチドを介してB鎖がA鎖に連結された単鎖インスリンアナローグは強力なインスリンアゴニストである。さらにまた、2位の改変（例えば本来のチロシンのアラニンによる置換）、或いはまたIGF-1C連結ペプチドの最後の4アミノ酸の欠失は、高ポテンシー、インスリン選択性単鎖インスリンアナローグを生じる。
【図１６】式B0C1A0の単鎖インスリンアナローグのIGF-1レセプター又はA若しくはBサブタイプインスリンレセプターにおける相対的in vitro結合活性を示す棒グラフである。前記アナローグでは、連結IGF-1Cペプチドの自然のままの配列が1、2、3、4又は8位で表示のアミノ酸置換によって改変されてある。B0C1A0インスリンアナローグの命名法では、B0及びA0の表示は、A鎖及びB鎖のインスリン配列を指し、一方、C1はIGF-1Cペプチドを表示する。
【図１７】大腸菌（E. coli）での単鎖インスリンアナローグの生合成及び変性条件下での精製の概要図である。本手順の詳細は実施例15で提供される。
【図１８】18A−18Cは、単鎖インスリンアナローグDP20（GEEEEEKGPEHLCGAHLVDALYLVCGDRGFYSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVDECCHRSCDLRRLENYCN；配列番号：68）及びDP19（MGSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGEEEEEKGPEHLCGAHLVDALYLVCGDRGFYGYGSSSRRAPQTGIVDECCHRSCDLRRLENYCN；配列番号：67）のインスリンサブタイプA及びBレセプター並びにIGFレセプターにおける活性を示すグラフである。図18A及び18Bは単鎖インスリンアナローグのインスリンサブタイプAレセプター（図18A）及びインスリンサブタイプBレセプター（図18B）におけるin vitroリン酸化活性を示すグラフである。調べた単鎖インスリンアナローグは連結ペプチドとしてCTPペプチドを含み（DP20；黒丸）；CTPペプチド（配列番号：64）を連結ペプチドとして用いて、該単鎖アナローグがCTPのリジンで切断されて二鎖インスリンを生じ（DP20LysC；黒三角）；CTPペプチド（配列番号：64）がN-末端に位置し、前記を連結ペプチドとして用い（DP22；白逆三角）、該単鎖アナローグがCTPのリジンで切断されて二鎖インスリンを生じ（DP20LysC；白ダイヤ）、これらが自然のままの二鎖インスリン（黒四角）と比較される。DP19（CTP-GE5K-B鎖-C1ペプチド-A鎖）及びDP20（GE5K-B鎖-CTP(K)-A鎖）の完全長配列は配列番号：67及び配列番号：68としてそれぞれ提供される。図18Cは、該単鎖アナローグのIGFレセプターにおける驚くほど低いin vitroリン酸化活性を示し（自然のままのインスリンよりも低い）、該単鎖アナローグの二鎖アナローグへの切断はIGFレセプターにおけるそれらの活性を実質的に増加させる。したがって、該単鎖アナローグ（DP20）は、DP20の二鎖型よりもIGFレセプターと比較してインスリンレセプターに対してより高い選択性を有する。
【図１９】19A−19Cは、自然のままのインスリン（図19A）と比べた、正常マウスにおけるDP19（図19B）及びDP20（図19C）のインスリン用量タイトレーション比較を示すグラフである。インスリン及びインスリンアナローグは27又は90mmol/kgで投与された。
【図２０】20A及び20Bは、自然のままの二鎖インスリン（黒四角）ペプチド及び自然のままのIGF（白丸）と比較した、単鎖インスリンアナローグのin vitroリン酸化活性を示すグラフであり、前記単鎖インスリンアナローグは、連結ペプチドとしてCTPペプチドを含み（DP20；黒丸）；連結ペプチドとして、セリンがアラニンで入れ替えられてあるCTPペプチドを含み（DP20 S2A（配列番号：80）；白逆三角）；連結ペプチドとして、アミノ酸含有量は同じであるが配列が任意抽出されてあるCTPペプチドを含み（DP20R CTP；白ダイヤ、前記連結ペプチドはPPRPPQSASPPDLSPLSGTPSRPSLS（配列番号：69）である）；或いは連結ペプチドとして、自然のままのプロインスリンCペプチドを含む（DP20C0（配列番号：76）；黒三角）。各ペプチドの活性は、インスリンAサブタイプレセプター及びインスリンBサブタイプレセプターの両方で試験された。データが示すように、CTPペプチド又は当該配列の改変誘導体を用いる単鎖インスリンアナローグは、自然のままのプロインスリン又はIGFペプチドと比較して両インスリンレセプターサブタイプで強力なインスリンアゴニストを生じる。
【図２１】単鎖インスリンアナローグのインスリンサブタイプAレセプターにおけるin vitroリン酸化活性を示すグラフである。自然のままの二鎖インスリン（黒四角）及び自然のままのIGF（白逆三角）と比較して、以下のCTPペプチドを含む単鎖アナローグが試験された：プロリンがアラニンで入れ替えられてあるCTPペプチドを連結ペプチドとして含む（DP20PからA（配列番号：70）；黒丸）；連結ペプチドとして自然のままのプロインスリンCペプチドが用いられる（DP20C0（配列番号：71）；黒三角）；連結ペプチドとして自然のままのIGF-1Cペプチドが用いられる（すなわち010：（配列番号：72）；白ダイヤ）；連結ペプチドとしてCTペプチド（配列番号：64）が用いられ、該単鎖アナローグはCTPのリジンで切断されて二鎖インスリンを生じる（DP20LysC；白丸）。データが示すように、プロリン残基がアラニンで入れ替えられてあるCTPペプチドを用いる単鎖インスリンアナローグは、自然のままのプロインスリンペプチドと比較して、インスリンレセプターでインスリンアゴニストとしての活性を保持する。LysCをもつDP20単鎖アナローグの切断は、B鎖カルボキシ末端にCTPペプチドを保持する二鎖インスリンを生じ、前記は自然のままのインスリンに類似するポテンシーを有する。
【図２２】22A及び22Bは、連結ペプチドとしてCTPペプチドを含む単鎖インスリンアナローグのin vitroリン酸化活性を示すグラフである。図22Aは、自然のままの二鎖インスリン（黒四角）ペプチド及び自然のままのIGF（白丸）と比べた、以下のCTPペプチドを含む単鎖アナローグの活性を比較するグラフである：連結ペプチドとして自然のままのプロインスリンCペプチドに連結させたCTPペプチド（DP20CTPC0（配列番号：73）；黒丸）；連結ペプチドとしてCTPペプチドに連結させた自然のままのプロインスリンCペプチド（DP20C0CTP（配列番号：74）；白逆三角）。図22Bは、自然のままの二鎖インスリン（黒四角）ペプチド及び自然のままのIGF（白丸）と比べた、以下のCTPペプチドを含む単鎖アナローグを比較するグラフである：連結ペプチドとしてCTPペプチドに連結させた自然のままのプロインスリンCペプチド（DP20C0CTP（配列番号：74）；黒丸）；連結ペプチドとして末端と末端を連結させた二CTPペプチド（DP202CTP（配列番号：75）；白逆三角）。
【図２３】連結ペプチドとして自然のままの切端プロインスリンCペプチドを含む単鎖インスリンアナローグのインスリンサブタイプAレセプターにおけるin vitroリン酸化活性を示すグラフである。自然のままの二鎖インスリン（黒四角）ペプチド及び連結ペプチドとしてCTPを含むインスリンアナローグ（白ダイヤ）と比較して、以下のCペプチドを含む単鎖インスリンアナローグの活性が示される：最初の6アミノ酸が除去された（DP20C0(desC1-6)（配列番号：76）；黒丸）、又はアミノ酸15-21が除去された（DP20C0(desC15-21)（配列番号：77）；黒三角）、又はアミノ酸27-33が除去された（DP20C0(desC27-33)（配列番号：78）；白逆三角）自然のままのプロインスリンCペプチド。
【図２４】DP20の誘導体（DP25M；よりインスリンに類似するように改変）の活性をインスリン及びDP20と比較した、インスリンサブタイプA及びBレセプター（IRA及びIRB）におけるin vitroリン酸化活性を示すグラフである。
【図２５】25A−25Dは、血中グルコース濃度を低下及び低く維持するヒトインスリンの能力を3つの異なるアシル化インスリンアナローグと比較する、マウス実施の比較インスリン耐性試験の結果を示すグラフである。化合物を2つの異なる濃度で試験した（27nmol/kg及び90nmol/kg）。アシル化インスリンはMIU-41、MIU-36及びMIU-37を含んでいた。MIU-41[B1(H5,H10,Y16,L17)25a：A1(H8,rEC16-K14,N18,N21)]は、A14位に位置するリジン残基に結びつけたガンマグルタミン酸リンカーを介してC16アシル化を有する二鎖インスリンアナローグである。MIU-36[B1(C16-K0,H5,H10,Y16,L17)25a：A1(N18,N21)]は、B鎖のN-末端に連結されたC16アシル化を有する二鎖インスリンアナローグである。MIU-37[B1(H5,H10,Y16,L17,C16rE-K22)25a：A1(N18,N21)]は、B22に位置するリジン残基に結びつけたガンマグルタミン酸リンカーを介してC16アシル化を有する二鎖インスリンアナローグである。
【図２６】26A−26Dは、市場で入手できるアシル化インスリンアナローグ（デテミア（Detemir））の活性をアシル化二鎖インスリンアナローグMIU-55と比較する、マウス実施の比較インスリン耐性試験の結果を示すグラフである。MIU-55[B1(H5,10,Y16,L17,C16rE-K22)25a：A1(N18,N21)]は、B鎖のC-末端5アミノ酸が欠失し、B鎖アミドとして終わる。前記は、Lys B22のε-アミノ基でガンマGluリンカーを介してC16脂肪酸でアシル化される。結果は、MIU-55はデテミアの約1/3のポテンシーを有することを示している（図26A及び26B参照）。前記データはまた、インスリンのアシル化形は非アシル化形よりも長時間作用し、MIU-55はデテミアよりもポテンシーは低いが、デテミアと類似するプロフィールを提示することを示した。図26C及び26Dは、列挙アナローグの投与後の血中グルコースAUC値のデータを提供する。
【図２７】27A−27Dは、市場で入手できるアシル化インスリンアナローグ（デテミア）の活性をアシル化二鎖インスリンアナローグMIU-49と比較する、マウス実施の比較インスリン耐性試験の結果を示すグラフである。MIU-49[B1(C16-rE,H5,Aib9,H10,E13-K17,Y16)25a：A1(N18,N21)]はB鎖のC-末端5アミノ酸が欠失し、Gly B22のα-アミノ基でガンマGluリンカーを介してC16脂肪酸でアシル化される。結果は、MIU-49はデテミアの約1/3のポテンシーを有することを示している（図27A及び27B参照）。前記データはまた、インスリンのアシル化形は非アシル化形よりも長時間作用し、MIU-49はデテミアよりもポテンシーは低いが、デテミアに類似するプロフィールを提示することを示した。図27C及び27Dは、列挙アナローグの投与後の血中グルコースAUC値のデータを提供する。
【図２８】28A−28Dは、C57/Blkマウスを用いたデテミア及びMIU-56についての比較インスリン耐性試験から入手された結果である。MIU-56はインスリン単鎖アナローグB1(H5,Y16,L17)25a-PEG8-K-PEG4-A1(N18,21)であり、A鎖及びB鎖を結合させる連結部分（PEG8-K-PEG4）中のただ1つのリジン残基の側鎖に連結された20kDaのPEGを含んでいる。図28A及び28Bは、血中グルコースレベルを低下及び低く維持するアシル化インスリンアナローグデテミアの能力をペジル化単鎖インスリンアナローグMIU-56に対して比較するインスリン耐性試験の結果を示すグラフである。図28C及び28Dは、それぞれデテミア及びMIU-56を投与したマウスの血中グルコースAUC24hrsを示す。
【図２９】29A−29Fは、C57/Blkマウスを用いたMIU-56及びMIU-57についての比較インスリン耐性試験から入手された結果である。MIU-57は、インスリン単鎖アナローグB1(H5,Y16,L17)25-C1-A1(N18,21)で、B鎖のN-末端に連結された20kDaのPEGを含む。図29A及び29Bは、MIU-56及びMIU-57を比較するインスリン耐性試験の結果を示すグラフである。図29C及び29Dは、MIU-56及びMIU-57を投与したマウスの血中グルコースAUC24hrsをそれぞれ示す。MIU-56及びMIU-57のインスリン用量比較タイトレーションの結果は、20nmol/kgから80nmol/kgの範囲の投薬について類似するプロフィールがマウスで得られることを示している（図29E及び29F参照）。2つのインスリン単鎖アナローグ（B1(H5,Y16,L17)25-C1-A1(N18,21)）が20kDaのPEG鎖を介して頭と頭で連結されたものを含むダイマー（MIU58）を調製した。図29G−29Jは、C57/Blkマウスを用いたMIU-57及びMIU-58についての比較インスリン耐性試験から入手された結果である。図29G及び図29Hは、MIU-57及びMIU-58を比較するインスリン耐性試験の結果を示すグラフである。図29I及び図29Jは、MIU-57及びMIU-58を投与したマウスの血中グルコースAUC24hrsをそれぞれ示す。
【図３０】30A及び30Bは、2つのペジル化インスリン誘導体のインスリン用量比較タイトレーション試験の結果を提供する。前記インスリン誘導体は20kDaのPEGの配置が相違し、PEGはMIU-59のN-末端に連結されているか（図30A）、又はインスリンアナローグMIU-60のアミノ酸B29の側鎖に連結される（A1及びB1アミノ酸はカルバミル化されてある）（図30B）。
【図３１】31A−31Dは、一ペジル化（20K PEG）された自然のままのインスリン誘導体（MIU-59）と比較した、3つの単鎖インスリンアナローグMIU-67、MIU-68及びMIU-69のインスリン用量比較タイトレーション試験のデータを提供する。前記アナローグは各々、それぞれ10kDaのPEG鎖を2つ含んでいる。より詳細には、以下の単鎖インスリンアナローグの活性を比較した：MIU-67（B1(H5,Y16,L17)25-C1(K8)-A1(N18,21)）は2つのPEG鎖（各々10K）を有し、1つはN-末端に連結され、他方は連結部分のアミノ酸8（C8位）に連結されている；MIU-68（B1(H5,Y16,L17, K22)25-C1(K8)-A1(N18,21)）は2つのPEG鎖（各々10K）を有し、1つはN-末端に連結され、他方は連結部分のアミノ酸B22に連結されている；MIU-69（B1(H5,Y16,L17)25-C1(K8)-A1(K14, N18,21)）は2つのPEG鎖（各々10K）を有し、1つはN-末端に連結され、他方はアミノ酸A14に連結されている。各化合物は2つの投薬量で投与された（20及び80nmol/kg）。
【図３２】32A及び32Bでは、糖尿病マウス（db/dbマウス）にペジル化インスリンアナローグを投与し、市場で入手できるインスリンアナローグと前記の相対性活性を比較した。ｘ軸は投与した化合物の濃度を示す（すなわちベヒクルコントロールは30又は90 nmol/kg、ヒュームリン（Humulin）は60nmol/kg、レベミア（Levemir）は30、90及び240）。特に、インスリンアナローグのレベミア及びヒュームリンをペジル化インスリンアナローグMIU-59（自然のままのインスリンアナローグであって20kDaのPEGが1つその末端に連結されている）及びMIU-66（自然のままのインスリンアナローグであって20kDaのPEGが1つその末端に連結され、A鎖及びB鎖のアミノ末端がカルバミル化されている）と比較した。MIU-59及びMIU-66の両方がレベミア及びヒュームリンと比較して活性の改善を示した（図32A（12時間）及び図32B（24時間）を参照されたい）。
【図３３】ジペプチドプロドラッグ成分（MIU-29：[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)]）でアシル化した二鎖インスリンアナローグプロドラッグをその親インスリンアナローグ（MIU-27：[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-)]）と比べた、正常マウス実施比較インスリン耐性試験の結果を示すグラフである。プロドラッグ誘導体MIU-29は、A19位に4-アミノ-フェニルアラニン置換を含み、ここでジペプチドdLys(Ac),NLeuはA19残基の4-アミノ位で共有結合されてあり、ジペプチド成分のリジンの側鎖はC14脂肪酸でアシル化されてある。このジペプチドは生理学的条件下において約5時間の半減期で自己切断されるであろう。MIU-29をex vivoで24時間インキュベートした後、生成化合物（“MIU-29c”と称する）をマウスに投与し、血中グルコースを低下させる能力を親化合物と比較した。図33に示すように、2つの化合物はほぼ同一の性能を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
定義
本発明の説明及び特許請求の範囲では、以下の用語が以下に示す定義にしたがって用いられるであろう。
本明細書で用いられる“約”という用語は、記述された値又は記述された値の範囲が10パーセント大きいか又は小さいことを意味するが、ただし全ての値又は値の範囲をこのより広い定義に当てはめることを意図するわけではない。“約”という用語が先行するそれぞれの値又は値の範囲はまた、記述された絶対値又は絶対値の範囲の具体的なものを包含することが意図される。
本明細書で用いられるように、“プロドラッグ”という用語は、その薬理学的作用を表す前に化学的改変を受ける任意の化合物と定義される。
【００１４】
本明細書で用いられるように、“アミノ酸”は、アミノ及びカルボキシ官能基の両方を含む任意の分子を包含し、該アミノ及びカルボキシル基は同じ炭素（アルファ炭素）に結び付けられる。該アルファ炭素は場合によって1つ又は2つのさらに別の有機置換基を有することができる。本開示の目的のために、アミノ酸をその立体化学を特定することなく指定するときには、アミノ酸のL若しくはD型又はラセミ混合物を包含することが意図される。しかしながら、アミノ酸がその三文字コードによって指定され、上付き数字を含む事例では、三文字コードの前に小文字d及び上付き数字を伴うことによって当該アミノ酸のD型が特定され（例えばdLys-1）、ここで小文字dを欠く指定（例えばLys-1）は、当該アミノ酸の自然のままのL型を特定することが意図される。この命名法では、上付き数字を伴うことによって、インスリンアナローグ配列中のアミノ酸の位置が指定され、ここでインスリンアナローグ配列内に位置するアミノ酸は、N-末端から与えられる連続番号の正の上付き数字によって指定される。インスリンアナローグペプチドのそのN-末端に又は側鎖を介して連結される付加アミノ酸は、0で始まり、さらにそれらが該インスリンアナローグ配列から離れるにつれ負の整数値として増していく。例えば、インスリンアナローグのN-末端に連結されたジペプチドプロドラッグ内のアミノ酸の位置は、aa-1-aa0-インスリンアナローグと表示され、ここでaa0は該ジペプチドのカルボキシ末端アミノ酸を表し、aa-1は該ジペプチドのアミノ末端アミノ酸を示す。
【００１５】
本明細書で用いられるように、“ヒドロキシル酸”という用語は、改変してアルファ炭素アミノ基をヒドロキシル基で入れ替えたアミノ酸を指す。
本明細書で用いられるように、“非コードアミノ酸”という用語は、以下の20のアミノ酸のいずれかのL-異性体ではない任意のアミノ酸を包含する：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。
“ジペプチド”は、ペプチド結合を介するアルファアミノ酸又はアルファヒドロキシル酸と別のアミノ酸との結合によって形成される化合物である。
本明細書で用いられるように、更なる指示が全く無く“化学的切断”という用語は、化学的な共有結合の破壊をもたらす非酵素的反応を包含する。
“生物活性ペプチド”は、生物学的作用をin vitro及び／又はin vivoで示すことができるポリペプチドを指す。
本明細書で用いられるように、一般的にペプチドというとき、改変されたアミノ及びカルボキシ末端を有するペプチドを包含することが意図される。例えば、標準的アミノ酸と称されるアミノ酸配列は、N-末端及びC-末端において標準的アミノ酸とともに、N-末端の対応するヒドロキシル酸及び／又は対応するC-末端アミノ酸が改変されて末端カルボン酸の代わりにアミド基を含むものも同様に包含することが意図される。
【００１６】
本明細書で用いられるように、“アシル化”アミノ酸はアシル基を含むアミノ酸であり、前記は、それが生成された手段に関係なく、天然に存在するアミノ酸にとって自然のままのものではない。アシル化アミノ酸及びアシル化ペプチドを生成する例示的な方法は当業界で公知であり、ペプチドに組み入れる前にアミノ酸をアシル化するもの、又はペプチド合成に続いてペプチドを化学的にアシル化するものを含む。いくつかの実施態様では、アシル基はペプチドに以下の１つ以上を生じさせる：（i）循環時の半減期の延長、（ii）作用の開始の引き延ばし、（iii）作用の持続時間の伸長、（iv）プロテアーゼに対する耐性の改善、及び（v）IGF及び／又はインスリンペプチドレセプターにおけるポテンシーの増加。
本明細書で用いられるように、“アルキル化”アミノ酸はアルキル基を含むアミノ酸であり、前記は、それが生成された手段に関係なく、天然に存在するアミノ酸にとって自然のままのものではない。アルキル化アミノ酸及びアルキル化ペプチドを生成する例示的な方法は当業界で公知であり、ペプチドに組み入れる前にアミノ酸をアルキル化するもの、又はペプチド合成に続いてペプチドを化学的にアルキル化するものを含む。理論に拘束されないが、ペプチドのアルキル化は、ペプチドのアシル化と類似する（同じでないとしたら）効果を達成するであろう（例えば循環時の半減期の延長、作用の開始の引き延ばし、作用の持続時間の伸長、プロテアーゼに対する耐性の改善、及びIGF及び／又はインスリンレセプターにおけるポテンシーの増加）。
【００１７】
本明細書で用いられるように、“医薬的に許容できる担体”という用語は、任意の標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば油/水又は水/油エマルジョン）及び多様なタイプの湿潤剤を含む。前記用語はまた、米国連邦政府の規制庁によって承認された薬剤、又はヒトを含む動物での使用のために米国薬局方に列挙された薬剤のいずれかを含む。
本明細書で用いられるように、“医薬的に許容できる塩”という用語は、親化合物の生物学的活性を維持し、さらに生物学的に又は別な態様で望ましくないものではない化合物の塩を指す。本明細書に開示する化合物の多くは、アミノ基及び／又はカルボキシル基又はそれらに類似する基の存在により、酸及び／又は塩基の塩を形成することができる。
医薬的に許容できる塩基付加塩は無機及び有機塩基から調製できる。無機塩基から誘導される塩には、単に例示すればナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム及びマグネシウム塩が含まれる。有機塩基から誘導される塩には一級、二級及び三級アミンの塩が含まれるが、ただし前記に限定されない。
医薬的に許容できる酸付加塩は無機及び有機酸から調製できる。無機酸から誘導される塩には塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが含まれる。有機酸から誘導される塩には、酢酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、ピルビン酸塩、リンゴ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、桂皮酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、p-トルエン-スルホン酸塩、サリチル酸塩などが含まれる。
【００１８】
本明細書で用いられるように、“親水性部分”という用語は、水に容易に溶解できるか又は容易に水を吸収し、さらに毒性作用がなく哺乳動物種がin vivoで耐性を示す（すなわち生物適合性である）任意の化合物を指す。親水性部分の例には、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-ポリグリコール酸コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシピロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、及び誘導セルロース、例えばヒドロキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロース及び前記のコポリマーの他に天然のポリマー（例えばアルブミン、ヘパリン及びデキストランを含む）が含まれる。
本明細書で用いられるように、“治療する”という用語は、特定の疾患若しくは症状の予防、又は特定の疾患若しくは症状に付随する徴候の緩和、及び／又は前記徴候の防止若しくは除去を含む。例えば、本明細書で用いられるように“糖尿病を治療する”という用語は、一般的にグルコースの血中レベルを正常レベル近くに維持することを指し、与えられた状況に応じて血中グルコースレベルを増減させることを含むことができる。
【００１９】
本明細書で用いられるように、インスリンアナローグの“有効な”量又は“治療的に有効な量”は、インスリンアナローグの非毒性であるが所望の作用を提供するために十分な量を指す。例えば所望される1つの作用は高血糖症の予防又は治療であろう。“有効な”量は対象動物毎に変動し、年齢及び個体の全般的状態、投与態様などにより左右される。したがって、正確な“有効量”を常に特定できるとは限らない。しかしながら、個々の任意の事例における適切な“有効量”を当業者は日常的実験を用いて決定することができる。
“非経口的”という用語は、栄養管を介するのではなくいくつかの他のルート（例えば鼻内、吸入、皮下、筋肉内、脊髄内又は静脈内ルート）によることを意味する。
本出願を通して、文字及び数字による具体的なアミノ酸の位置に関するすべての言及（例えばA5位）は、対応する自然のままのヒトインスリンA鎖（配列番号：1）又はB鎖（配列番号：2）における該A鎖（例えばA5位）若しくはB鎖（例えばB5位）の該当位置に存在するアミノ酸、又は前記の任意のアナローグにおける対応するアミノ酸の位置を指す。例えば、本明細書で更なる説明語が全く無く“B28位”というときは、配列番号：2の第一のアミノ酸が欠失されてあるインスリンアナローグのB鎖の対応するB27位を意味するであろう。同様に、自然のままのB鎖のN-末端に付加されたアミノ酸はB0で始まり、N-末端にアミノ酸が付加されるにつれ増えていく負の値の番号が続く（例えばB-1、B-2...）。
【００２０】
本明細書で用いられるように“自然のままのインスリンペプチド”という用語は、配列番号：1のA鎖及び配列番号：2のB鎖を含む51アミノ酸のヘテロ二重体の他に、配列番号：1及び2を含む単鎖インスリンアナローグを指すことが意図される。本明細書で用いられる“インスリンペプチド”という用語は、更なる説明語がない場合、配列番号：1のA鎖及び配列番号：2のB鎖を含む51アミノ酸のヘテロ二重体の他に、その単鎖インスリンアナローグ（例えば国際特許出願公開公報WO96/34882及び米国特許6,630,348号（前記文献の開示は参照により本明細書に含まれる）に開示されたものを含む）を包含することが意図され、自然のままのA鎖及び／又はB鎖の改変アナローグ及び前記の誘導体を含むヘテロ二重体及び単鎖アナローグが含まれる。そのような改変アナローグは以下を含む：A19、B16又はB25位のアミノ酸の4-アミノフェニルアラニンへの改変；又はA5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29及びB30から選択される位置における1つ以上の置換；又はB1−4及びB26−30のうちのいずれか又は全ての欠失。本明細書で定義するインスリンペプチドはまた、非ペプチド部分（例えばレトロインバーソフラグメント）の挿入又は置換、又は非ペプチド結合（例えばアザペプチド結合（CO のNHによる置換）又は偽ペプチド結合（例えばNH がCH2で置換）又はエステル結合（例えばデプシペプチド（アミド（-CONHR-）の1つ以上がエステル（COOR）結合で置換される））の取り込みによって天然に存在するインスリンから誘導されたアナローグでもよい。
【００２１】
“A19インスリンアナローグ”は、自然のままのインスリンのA鎖の19位に存在する本来のチロシン残基の代わりに4-アミノフェニルアラニン又は4-メトキシフェニルアラニンを有するインスリンペプチドである。
本明細書で用いられるように“IGFB16B17アナローグペプチド”は、A鎖及びB鎖ヘテロ二重体の他にその単鎖インスリンアナローグを含む包括的用語であり、ここでA鎖は配列番号：15のペプチド配列を含みB鎖は配列番号：17の配列を含むが他にもそれら配列のアナローグを含み、ここで該A鎖及び／又はB鎖のアナローグは1−3のさらに別のアミノ酸置換を含むが、ただし該B鎖は配列番号：2の配列を含まず、B16位にチロシン及びB17位にロイシンを含むことを条件とする。
“IGF YLアナローグ”は、配列番号：15のIGF A鎖及び配列番号：28のIGF B鎖を含むペプチドである。
本明細書で用いられるように、“単鎖インスリンアナローグ”という用語は、インスリン又はIGFのA及びB鎖又は前記のアナローグ若しくは誘導体が互いに共有結合して線状ポリペプチド鎖を形成する、構造的に関連するタンパク質の1グループを包含する。本明細書に開示するように、該単鎖インスリンアナローグは、連結部分を介してB鎖のカルボキシ末端とA鎖のアミノ末端との共有結合を含む。
【００２２】
本明細書で用いられるように、更なる説明語の無い“インスリンA鎖”という用語は、配列番号：1の21アミノ酸の他に、インスリンB鎖と結合されたときインスリンレセプターで活性を有する前記の機能的アナローグ及び誘導体を包含することが意図される。例えば、機能的アナローグ及び誘導体には、A19インスリンアナローグのA鎖の他に、当業者に公知である配列番号：1の配列の改変（A4、A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21から選択される位置における1つ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を含む）を含む他のアナローグが含まれる。
本明細書で用いられるように、 更なる説明語の無い“インスリンB鎖”という用語は、配列番号：2の30アミノ酸の他に、インスリンA鎖と結合されたときインスリンレセプターで活性を有する自然のままのB鎖の改変された機能的アナローグを包含することが意図される。例えば、機能的アナローグ及び誘導体は、B16若しくはB25位のアミノ酸の4-アミノフェニルアラニンへの改変、又はB1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B25、B26、B27、B28、B29及びB30から選択される位置におけるアミノ酸の挿入、欠失若しくは置換、又はB1−4及びB26−30位のいずれか若しくは全ての欠失を含む。
【００２３】
“グリコシル化部位”は、グリコシル化（すなわち炭水化物構造の付加）を受けるポリペプチド中の任意のアミノ酸残基又は領域を指す。そのような部位は、典型的には、N-グリコシル化部位（すなわちN-結合を介して炭水化物構造の付加を許容するポリペプチド中の任意のアミノ酸残基又は領域）又はO-グリコシル化部位（すなわちO-結合を介して炭水化物構造の付加を許容するポリペプチド中の任意のアミノ酸残基又は領域）である。
本明細書で用いられるように、“自然のままのものではない（non-native）グリコシル化部位”は、自然のままのペプチドには存在しないグリコシル化部位である。具体的には、以前にはグリコシル化部位が存在しなかった部位にグリコシル化部位を導入するために当該ペプチドの自然のままの配列が改変されてあるか、又は補足アミノ酸が自然のままのペプチドに付加されて、前記補足配列が自然のままの配列と一緒になってグリコシル化部位を導入するか、又は補足アミノ酸がグリコシル化部位を含むかのいずれかである。
本明細書で用いられるように、“高グリコシル化ペプチド”という用語は、既にグリコシル化されてある、2つ以上の自然のままのものではないグリコシル化部位を含むアミノ酸配列を指す。該高グリコシル化ペプチドのグリコシル化部位は、N-結合グリコシル化部位及び／又はO-結合グリコシル化部位を含むことができる。
【００２４】
本明細書で用いられるように、CTPペプチドは、配列SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR（配列番号：64）、配列番号：64の18−28アミノ酸フラグメントを含む配列、又は配列番号：64の18から29アミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を共有する18から29アミノ酸配列を含む配列であるが、ただし、該CTPペプチドが、自然のままのプロインスリンC-ペプチド（配列番号：53）内に含まれる18アミノ酸配列と同一である18アミノ酸配列を含まないことを条件とする。
本明細書で用いられるように、“誘導体”は、例えばペプチドの1つ以上の位置に側鎖中の1つの基（例えばチロシン残基中のニトロ基又はチロシン残基中のヨウ素）を導入することによる、又は遊離カルボン酸基をエステル基又はアミド基へ変換することによる、又はアシル化によりアミノ基をアミドに変換することによる、又はヒドロキシ基をアシル化してエステルにすることによる、又は一級アミンをアルキル化して二級アミンにすることによる、又は親水部分をアミノ酸側鎖に結合することによる、化合物（例えばアミノ酸）の化学的改変（in vitroでの化学的改変を含む）を包含することが意図される。他の誘導体は、ポリペプチド中のアミノ酸残基の側鎖の酸化又は還元によって得られる。
【００２５】
本明細書で用いられるように、更なる説明語の無いIGF A鎖という用語は、自然のままのIGF1又はIGF2（それぞれ配列番号：5及び7）の21アミノ酸配列の他に、当業者に公知のその機能的アナローグを包含することが意図され、前記アナローグは、A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21から選択される位置での1つ以上のアミノ酸置換による配列番号：5及び7の配列の改変を含む。
本明細書で用いられるように、更なる説明語の無い“IGF YL B鎖”という用語は、配列番号：17を含むアミノ酸配列（例えば配列番号：6の配列を含む）の他に、IGF YL B鎖のアナローグ及びその誘導体を包含することが意図され、前記アナローグ及び誘導体は、B16位又はB25位のアミノ酸の4-アミノフェニルアラニンへの改変、又はB1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29及びB30から選択される位置での1つ以上のアミノ酸置換、又はB1−4及びB26−30位のうちのいずれか又はそのすべての欠失を含む。
本明細書で用いられる“同一性”という用語は、2つ以上の配列間の類似性と関係する。同一性は、同一残基の数を残基総数で割り、さらに得られたものに100を掛けて百分率を得ることによって測定される。したがって、厳密に同じ配列の2つのコピーは100％同一性を有し、一方、互いに対してアミノ酸の欠失、付加又は置換を有する2つの配列はより低い同一性を有する。当業者は、いくつかのコンピュータープログラム（例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al.(1993) J.Mol.Biol.215:403-410）のようなアルゴリズムを利用するもの）を配列同一性の決定に利用できることを認識していよう。
【００２６】
本明細書で用いられるように、第二のレセプターに対する第一のレセプターの分子の“選択性”は以下の比に該当する：第一のレセプターにおける当該分子のEC50で割った第二のレセプターにおける当該分子のEC50。例えば、第一のレセプターで1nMのEC50及び第二のレセプターで100nMのEC50を有する分子は、第二のレセプターに対して第一のレセプターで100倍の選択性を有する。
本明細書で用いられるように、アミノ酸の“改変”は、アミノ酸の置換、又はアミノ酸から／アミノ酸へ化学基を付加及び／又は除去することによる当該アミノ酸の誘導を指し、ヒトタンパク質で普通に見出される20アミノ酸の他に非定型的又は天然に存在しないアミノ酸のいずれかによる置換を含む。非定型的アミノ酸の市場供給源には以下が含まれる：シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI）、ケムペップ社（ChemPep Inc., Miami, FL）及びゲンザイムファーマシューティカルズ社（Genzyme Pharmaceuticals, Cambridge, MA）。非定型的アミノ酸は市場の供給業者から購入するか、一から合成するか、又は天然に存在するアミノ酸を化学的に改変若しくは誘導することができる。
本明細書で用いられるように、アミノ酸の“置換”はあるアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基による入れ替えを指す。
【００２７】
本明細書で用いられるように、“保存的アミノ酸置換”は、本明細書では以下の5グループ内における交換と定義される：
I．小さく脂肪族で非極性又はわずかに極性の残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II．極性の陰性荷電残基及びそれらのアミド：Asp、Asn、Glu、Gln、システイン酸及びホモシステイン酸；
III．極性の陽性荷電残基：His、Arg、Lys、オルニチン（Orn）；
IV．大きく脂肪族で非極性の残基；Met、Leu、Ile、Val、Cys、ノルロイシン（Nle）、ホモシステイン；
V．大きい芳香族残基；Phe、Tyr、Trp、アセチルフェニルアラニン。
本明細書で用いられるように、 “ポリエチレングリコール鎖”又は“PEG鎖”という一般的用語は、分枝又は直鎖のエチレンオキシドと水の縮合ポリマーを指し、H(OCH2CH2)nOHの一般式で表される（式中nは少なくとも2である）。“ポリエチレングリコール鎖”又は“PEG鎖”は、その近似平均分子量を示すために数字の接尾辞と組み合わせて用いられる。例えばPEG-5000は、全分子量平均が約5,000ダルトンであるポリエチレングリコール鎖を指す。
【００２８】
本明細書で用いられるように、“ペジル化”という用語及び類似の用語は、化合物にポリエチレングリコール鎖を連結することによってその自然のままの状態から改変されてある化合物を指す。“ペジル化ポリペプチド”は、当該ポリペプチドにPEG鎖が共有結合されたポリペプチドである。
本明細書で用いられるように、“リンカー”は、2つの分離されている実体を互いに結合させる結合、分子又は分子の基である。リンカーは2つの実体に最適な間隙を提供するか、さらに別に該2つの実体の分離を可能にする適応性のある結合を供給することができる。適応性を有する結合には、光切断基、酸不安定性部分、塩基不安定性部分、及び酵素切断基が含まれる。
本明細書で用いられるように、“IGFダイマー”は、リンカーを介して互いに共有結合した2つのIGF YLアナローグペプチド（各々はそれ自体A鎖及びB鎖を含む）を含む複合体である。IGFダイマーという用語は、限定語を一切欠いて用いられるとき、IGFホモダイマー及びIGFヘテロダイマーの両方を包含する。IGFホモダイマーは2つの同一サブユニットを含み、一方、ヘテロダイマーは異なる2つのサブユニットを含むが、ただし2つのサブユニットは実質的に互いに類似する。
【００２９】
本明細書で用いられる“C1-Cnアルキル”（nは1から6であり得る）という用語は、1つから指定された数の炭素原子を有する分枝又は線状アルキル基を表す。典型的なC1-C6アルキルにはメチル、エチル、n-プロピル、iso-プロピル、ブチル、iso-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれるが、ただし前記に限定されない。
本明細書で用いられる“C2-Cnアルケニル”（nは2から6であり得る）という用語は、2つから指定された数の炭素原子及び少なくとも1つの二重結合を有する、オレフィン系不飽和分枝又は線状基を表す。そのような基の例には、1-プロペニル、2-プロペニル(-CH2-CH=CH2)、1,3-ブタジエニル(-CH=CHCH=CH2)、1-ブテニル(-CH=CHCH2CH3)、ヘキセニル、ペンテニルなどが含まれるが、ただし前記に限定されない。
“C2-Cnアルキニル”（nは2から6であり得る）という用語は、2つからnの炭素原子及び少なくとも1つの三重結合を有する、不飽和分枝又は線状基を表す。そのような基の例には、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、1-ペンチニルなどが含まれるが、ただし前記に限定されない。
本明細書で用いられるように、“アリール”という用語は、1つ又は2つの芳香環を有する一環式又は二環式炭素環式環系を指し、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが含まれるが、ただし前記に限定されない。アリール環のサイズ及び置換基又は連結基の存在は、存在する炭素数を指定することによって示される。例えば、“(C1-C3アルキル)(C6-C10アリール)”という用語は、1から3員のアルキル鎖を介して親部分に結合された5から10員アリールを指す。
【００３０】
本明細書で用いられる“ヘテロアリール”という用語は、1つ又は2つの芳香環を有し、さらに少なくとも1つの窒素、酸素又は硫黄原子を芳香環に含む一環式又は二環式環系を指す。ヘテロアリール環のサイズ及び置換基又は連結基の存在は、存在する炭素数を指定することによって示される。例えば、“(C1-Cnアルキル)(C5-C6ヘテロアリール)”という用語は、1から“n”員のアルキル鎖を介して親部分に結合された5又は6員ヘテロアリールを指す。
本明細書で用いられるように、“ハロ”という用語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から成る群の1つ以上のメンバーを指す。
本明細書で用いられるように、さらに別の指定を伴わない“患者”という用語は、任意の家畜化された温血脊椎動物（例えば家畜、ウマ、ネコ、イヌ及び他のペットを含むが、ただし前記に限定されない）及びヒトを包含することが意図される。
本明細書で用いられるように、“単離された”という用語は、その天然の環境から取り出されてあることを意味する。いくつかの実施態様では、アナローグは組換え方法によって作製され、該アナローグは宿主細胞から単離される。
本明細書で用いられるように、“精製された”という用語は、本来の又は天然の環境である分子又は化合物に通常付随する夾雑物を実質的に含まない形態の該分子又は化合物の単離に関係し、元々の組成物の他の成分から分離されたことの結果として純度が高まったことを意味する。 “精製されたポリペプチド”という用語は、本明細書では、他の化合物（核酸、脂質及び炭水化物を含むが、ただしこれらに限定されない）から分離されてあるポリペプチドを表すために用いられる。
【００３１】
“ペプチド模倣体”は、既存のペプチドの一般的構造とは異なる構造を有するが、例えば当該ペプチドの生物学的活性を模倣することによって、既存のペプチドと同様な態様で機能する化学的な化合物を指す。ペプチド模倣体は、典型的には天然に存在するアミノ酸及び／又は非天然アミノ酸を含むが、ペプチド骨格に対する改変もまた含むことができる。例えば、ペプチド模倣体は天然に存在するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、非ペプチド部分（例えばレトロインバーソフラグメント）の挿入又は置換、又は非ペプチド結合（例えばアザペプチド結合（CO のNHによる置換））又は偽ペプチド結合（例えばNH がCH2で置換）又はエステル結合（例えばデプシペプチド（アミド（-CONHR-）の1つ以上がエステル（COOR）結合で入れ替えられる））の取り込みを有する。或いはまた、ペプチド模倣体は天然に存在するアミノ酸を一切欠いていいてもよい。
本明細書で用いられるように、“荷電アミノ酸”又は“荷電残基”という用語は、生理学的pHの水溶液中で陰性に荷電する（すなわち脱プロトン化）又は陽性に荷電する（すなわちプロトン化）側鎖を含むアミノ酸を指す。例えば、陰性に荷電するアミノ酸にはアスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、及びホモグルタミン酸が含まれ、一方、陽性荷電アミノ酸にはアルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。荷電アミノ酸には、ヒトタンパク質で一般的に見出される20アミノ酸中の荷電アミノ酸の他に非定型的又は天然に存在しないアミノ酸が含まれる。
本明細書で用いられるように、“酸性アミノ酸”という用語は、第二のアミノ酸部分（当該アミノ酸のアルファカルボン酸以外）を含むアミノ酸を指し、前記第二のアミノ酸部分には例えば側鎖カルボン酸又はスルホン酸基が含まれる。
【００３２】
略語
インスリンアナローグは以下のように略記されるであろう：
インスリンA鎖及びB鎖は、A鎖については大文字A及びB鎖については大文字Bで示され、ここで上付き文字0（例えばA0又はB0）は、塩基配列がインスリン配列（A鎖：配列番号：1、B鎖：配列番号：2）であることを示し、上付き文字1（例えばA1又はB1）は、塩基配列がIGF-1配列（A鎖：配列番号：5、B鎖：配列番号：62）であることを示す。自然のままのインスリン及びIGFから外れる改変は、A又はB鎖の指示に続く括弧内に示され（例えば[B1(H5,H10,Y16,L17)：A1(H8,N18,N21)]、一文字アミノ酸略語とともに、対応するA鎖又はB鎖中の置換及び置換位置を示す数字を自然のままのインスリンの番号付与を用いて表示される。A鎖とB鎖の間のコロンは二鎖インスリンを示し、一方、ダッシュは共有結合、したがって単鎖アナローグを示す。単鎖アナローグでは、連結部分はA鎖とB鎖の間に含まれるであろう。さらにC1は自然のままのIGF-1Cペプチド（配列番号：13）を指す。
【００３３】
実施態様
ある実施態様にしたがえば、1つ以上のグリコシル化部位を導入するために改変されてあるインスリンアナローグが提供される。ペプチド系医薬のグリコシル化は、該土台ペプチドに対して、血清半減期の延長、機能のin vivo半減期の延長及び分解の低下を含む、補足的利益を付与する。グリコシル化部位のインスリンアナローグへの導入は、インスリンアゴニスト上に炭水化物部分の付加場所を提供し、したがってグリコシル化の能力を有する真核細胞で該インスリンアゴニストが生成されるときに該インスリンアゴニストはグリコシル化される。ある実施態様では、自然のままのインスリンには存在しない新規なグリコシル化部位を付加するために、そのペプチド配列がアミノ酸の付加及び／又は置換によって改変されてあるインスリンアナローグが提供される。ある実施態様では、グリコシル化部位はB鎖のアミノ又はカルボキシ末端に導入でき、単鎖アナローグの事例では、グリコシル化部位は該単鎖アナローグの連結ペプチドに導入できる。さらに別の実施態様では、該単鎖アナローグのB鎖のアミノ末端及び連結部分の両方に少なくとも1つのグリコシル化部位が導入された単鎖アナローグが提供される。
【００３４】
出願人らは、B鎖のカルボキシ末端をA鎖のアミノ末端に結合させる連結部分が18アミノ酸より大きい場合は、高ポテンシーの単鎖インスリンアナローグを調製できることを見出したが、ただし、該連結部分がB鎖のカルボキシ末端に直接連結された自然のままのプロインスリンCペプチドをもたないことを条件とする。この発見にしたがえば、インスリンA鎖、インスリンB鎖及び連結部分を含む単鎖インスリンアナローグが提供され、ここで該連結部分は少なくとも18アミノ酸のペプチド（例えば18から87、29から87、又は29から58アミノ酸を含む）を含み、該連結部分はB鎖のカルボキシ末端をA鎖のアミノ末端と共有結合により連結して連続するアミノ酸鎖を形成する。より詳細には、該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端に直接連結された自然のままのプロインスリンCペプチド（配列番号：53）の配列、又は配列番号：53の連続する18、20、25又は30アミノ酸フラグメントを含まない。ある実施態様では、該連結部分が少なくとも18アミノ酸の配列を含み、該連結部分が自然のままのプロインスリンCペプチド（配列番号：53）の連続する4、8、16、18、20、25又は30アミノ酸を含む単鎖インスリンアナローグが提供されるが、ただし該連結部分はまた、該B鎖のカルボキシ末端に連結された少なくとも8、16、18、24又は29アミノ酸の非C0ペプチドを含むことを条件とする。本明細書で用いられるように、非C0ペプチドは、自然のままのプロインスリンCペプチド（配列番号：53）内に含まれる配列と90％未満の配列同一性を有するか、及び／又は配列番号：53内に含まれる15アミノ酸配列と同一である15アミノ酸配列を含まない任意のペプチドである。ある実施態様では、該非C0ペプチドは1つ以上のN-結合及び／又はO-結合グリコシル化部位を含む。
【００３５】
ある実施態様では、該連結部分は18から145、18から87、29から58アミノ酸のペプチドを含み、前記連結部分は、配列番号：53と80％より高い配列同一性を有する少なくとも18アミノ酸の連続する配列を欠く。いくつかの実施態様では、該連結部分は、アミノ酸残基に加えて又はアミノ酸残基の代わりに他のポリマー物質を含み、例えばポリエチレングリコールを含む。
ある実施態様では、該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端アミノ酸に直接連結された連続する29アミノ酸配列を含み、該連続29アミノ酸配列は、配列番号：66と60、80又は90％より高い配列同一性有するが、ただし該配列は、配列番号：53内に含まれる15アミノ酸配列と同一である15アミノ酸配列を含まないことを条件とする。別の実施態様では、該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端アミノ酸に直接連結された連続する29アミノ酸配列を含み、ここで連続する該29アミノ酸配列を含むアミノ酸の少なくとも58％はセリン及びプロリンから成る群から選択される。
【００３６】
別の実施態様では、該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端アミノ酸に直接連結された連続する29アミノ酸配列を含み、ここで連続する前記29アミノ酸配列は、SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66）と70％、80％、90％より高い配列同一性を有し、式中X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン及びリジンから選択されるが、ただし該配列は、配列番号：53内に含まれる15アミノ酸配列と同一である15アミノ酸配列を含まないことを条件とする。別の実施態様では、該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端アミノ酸に直接連結された連続する29アミノ酸配列を含み、前記連続29アミノ酸配列は配列番号：64のアナローグであり、ここで前記アナローグは、配列番号：64とは1、2、3、4、5又は6つのアミノ酸改変だけ異なり（前記改変はアミノ酸置換、欠失又は挿入から選択される）、さらに別の実施態様では、該アミノ酸改変は保存的アミノ酸置換である。別の実施態様では、該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端アミノ酸に直接連結された連続する29アミノ酸配列を含み、前記連続29アミノ酸配列は（配列番号：64）のアナローグであり、ここで前記アナローグは、（配列番号：64）とは1、2又は3つのアミノ酸置換だけ異なる。
【００３７】
グリコシル化
in vivoタンパク質生成の新生期に、グリコシル化部位を含むインスリンアナローグは、グリコシル化として公知のプロセスで糖（グリコシル）残基が酵素的に付加され得る、更なるプロセッシング（翻訳後改変として知られている）を経ることができる。共有結合により連結されたオリゴ糖側鎖を保持する該生成タンパク質は、グリコシル化タンパク質又は糖タンパク質として知られている。したがって、グリコシル化部位を保持するタンパク質は必ずしもグリコシル化されるとは限らない。ある実施態様にしたがえば、真核細胞発現系で発現されるとき高グリコシル化を受けやすいペプチド配列を含むように改変されてある、インスリンアゴニストアナローグが提供される。
タンパク質のグリコシル化は、対象タンパク質のアミノ酸配列の他に当該タンパク質が発現される宿主細胞に左右される。異なる生物は異なるグリコシル化酵素（例えばグリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ）を生成し、異なる利用可能基質（ヌクレオチド糖）を有することがある。そのような要因のために、タンパク質のグリコシル化パターン及びグリコシル残基組成は、個々のタンパク質が発現される宿主系に応じて異なる可能性がある。本発明で有用なグリコシル残基には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、n-アセチルグルコサミン及びシアリン酸が含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。ある実施態様では、インスリンアナローグは、グリコシル化パターンがヒトであるようなグリコシル残基を含む。
【００３８】
タンパク質グリコシル化の相違はタンパク質の性状の相違を生じ得ることは当業者の知るところである。例えば、微生物宿主（例えば酵母）で生成され、酵母の内因性経路を利用してグリコシル化された治療タンパク質の有効性は、哺乳動物細胞（例えばCHO細胞株又はHEK293細胞）で発現された同じタンパク質と比較して低下し得る。そのような糖タンパク質はまたヒトで免疫原性であり、投与後のin vivo半減期の短縮を示す。ヒト及び他の動物で固有のレセプターが固有のグリコシル残基を認識し、血流中から当該タンパク質の迅速な除去を促進し得る。したがって、医師は、固有のグリコシル化組成及びパターンを有する治療タンパク質、例えばヒト細胞又は目的の対象動物の種特異的細胞で生成されるものと同一又は少なくとも類似するグリコシル化組成及びパターンを有する治療タンパク質を優先することができる。
宿主細胞のものとは異なるグリコシル化タンパク質の発現は、宿主細胞を遺伝的に改変して異種グリコシル化酵素を発現させることによって達成できる。例えば、酵母株を遺伝的に改変して天然に存在しないグリコシル化酵素を発現させ、それによりこれらの酵母株で発現されるグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）は、動物細胞（特にヒト細胞）のものと同一のタンパク質グリコシル化を示す（米国特許出願公開公報2004/0018590及び2002/0137134号を参照されたい（前記文献の開示は参照により本明細書に含まれる））。
【００３９】
自然のままのものではないグリコシル化配列及び自然のままのグリコシル化配列は当業者には公知であり、N結合グリコシル化部位及びO-結合グリコシル化部位が含まれる。N-結合グリコシル化部位は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の酵素的付加のための認識部位として機能するペプチド配列である。トリペプチドのO-結合グリコシル化配列には、アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニンが含まれ、式中Xはプロリンを除く任意のアミノ酸である。したがって、これらのトリペプチドのどちらかのポリペプチド内の存在が、潜在的グリコシル化部位を創り出す。O-結合グリコシル化部位は、ヒドロキシアミノ酸（もっとも一般的にはセリン又はスレオニンであるが、5-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシセリンもまた用いることができる）の側鎖への炭水化物部分の酵素的付加のための認識部位として機能するペプチド配列である。ある実施態様では、O-結合グリコシル化糖はN-アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースである。多数のO-結合グリコシル化部位が当業界で公知であり、文献に報告されている。例えば以下を参照されたい：Ten Hagen et al.(11029) J.Biol.Chem.274(39):27867-74；Hanisch et al.(2001) Glycobiology 11:731-740；及びTen Hagen et al.(2003) Glycobiology 13:1R-16R。
【００４０】
ある実施態様にしたがえば、高グリコシル化インスリンアナローグの製造方法が提供される。前記方法は、自然のままのものではないグリコシル化部位（例えばCTPペプチド配列）を含むように改変されてあるインスリンアナローグをコードする遺伝子を含む真核宿主細胞を提供する工程、及び該インスリンアナローグ遺伝子の発現を可能にする条件下で該細胞を培養する工程を含む。ある実施態様では、該宿主細胞はヒトグリコシル化酵素を発現し、それにより該宿主細胞で生成されるグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）は、ヒト細胞のものと同一のタンパク質グリコシル化を示す（米国特許出願公開公報2004/0018590及び2002/0137134号を参照されたい（前記文献の開示は参照により本明細書に含まれる））。ある実施態様にしたがえば、該真核宿主細胞は、酵母（例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris））又は哺乳動物細胞（CHO又はHEK293細胞）から選択される。
インスリンアナローグ上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、インスリンアナローグへのグリコシドの化学的又は酵素的結合である。これらの方法は、N-又はO-結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞でインスリンアナローグを生成することを必要としないという点で有利である。用いられる結合態様に応じて、糖は、（a）アルギニン及びヒスチジン；（b）遊離カルボキシル基；（c）遊離スルフヒドリル基（例えばシステインのもの）；（d）遊離ヒドロキシル基（例えばセリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもの）；（e）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのもの；又は（f）グルタミンのアミド基に付加できる。グリコシドをペプチドに結合させる方法は以下に記載されている：WO 87/05330（1987年9月11日公開）及びAplin and Wriston (1981) CRC Crit.Rev.Biochem., pp.259-306（前記両文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００４１】
ある実施態様にしたがえば、グリコシル化部位が当該インスリンペプチドに導入されてあるインスリンアナローグが提供される。1つ以上のグリコシル化部位を、アミノ酸置換、欠失又は付加により自然のままのインスリン配列を改変することによって付加できる。ある実施態様では、インスリンアナローグに自然のままのものではない1つ以上のグリコシル化部位を導入するために、インスリンアナローグは、B25−B30アミノ酸の1つ以上の改変、又はA鎖又はB鎖のN-末端若しくはC-末端へのペプチド配列の付加を含むことができる。ある実施態様では、グリコシル化部位を含むペプチドがインスリンB鎖のカルボキシ末端に連結されてあるインスリンアナローグ（二鎖又は単鎖アナローグ）が提供される。ある実施態様では、インスリンB鎖のカルボキシ末端をインスリンA鎖のアミノ末端に共有結合させる連結部分を含む単鎖インスリンアナローグが提供され、ここで該連結部分は18残基より大きいアミノ酸配列を含み、さらに1つ以上のグリコシル化部位を含む。さらに別の実施態様では、各々が少なくとも1つのグリコシル化部位（同じ又は異なる）を含むインスリンアナローグが提供される。ある実施態様では、グリコシル化部位を含む第一のペプチド配列はB鎖のN末端に連結され、グリコシル化部位を含む第二のペプチド配列はA又はB鎖のC-末端に連結される。ある実施態様では、インスリンアナローグは単鎖アナローグであり、該B及びA鎖を結合させる該連結部分が第二のペプチド配列を含む。
【００４２】
オリゴ糖ユニット
高グリコシル化インスリンアナローグの個々のグリコシル化部位に付加されるオリゴ糖ユニットの構造及び数は変動し得る。これらは例えば、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、キシロース、グルクロン酸、イズロン酸及び／又はシアリン酸である。ある実施態様では、高グリコシル化インスリンアナローグは、以下から選択される、自然のままのものではないN-結合及び／又はO-結合炭水化物鎖を含む：
a）哺乳動物型糖鎖、好ましくはCHO細胞によって発現される型の糖鎖；
b）複合N-炭水化物鎖（例えば三アンテナ又は二アンテナ構造）を含む糖鎖、例えば高マンノース及びアセチルグルコサミン分子並びに高末端シアリン酸残基を含む炭水化物が含まれる；
c）場合によって末端シアリン酸残基を有するO-炭水化物鎖を含む糖鎖；
d）アルファ-2,6-シアリルトランスフェラーゼ又はアルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼによってシアリル化された糖鎖；及び／又は
e）3から30又は7から23の間でシアリル-N-アセチルガラクトサミンを提示するシアリル化糖鎖。ある実施態様では、高グリコシル化インスリンアナローグは、アルファ2,6シアリルトランスフェラーゼを安定的に発現しさらにCMP-Neu5Acヒドロラーゼ活性に欠損を示す哺乳動物グリコシル化変異体によって生成され、さらに別の実施態様では該哺乳動物グリコシル化変異体はCHOグリコシル化変異体である。そのようなグリコシル化は、典型的にはN-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、キシロース、グルクロン酸、イズロン酸及び／又はシアリン酸を含む。
本明細書に開示するグリコシルインスリンアナローグは、自然のままのものではないグリコシル化部位に共有結合により連結された少なくとも1つの炭水化物部分を含み、さらに自然のままのグリコシル化部位に共有結合により連結された1つ以上の炭水化物部分を含むことができる。いくつかの実施態様では、高グリコシル化インスリンアナローグはO-結合グリコシル化を含む。他の実施態様では、高グリコシル化インスリンアナローグはN-結合グリコシル化を含む。他の実施態様では、高グリコシル化インスリンアナローグはO-結合及びN-結合グリコシル化の両方を含む。
【００４３】
CTPペプチド
ある実施態様では、グリコシル化部位は、土台インスリンアナローグへのアミノ酸配列の付加によって導入される。より詳細には、出願人らは、C-末端ペプチドと称するペプチド配列（CTP：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR（配列番号：64）（タンパク質が真核細胞発現系で発現されるときO-結合高グリコシル化を生じやすい）は、インスリンアナローグの固有のin vitro活性を損なうことなく該インスリンアナローグに共有結合により連結させることができることを見出した。
ある実施態様にしたがえば、二鎖インスリンアナローグが提供され、ここで該インスリンB鎖及びA鎖はジスルフィド結合によって連結され、該インスリンアナローグは、一般構造(CTPペプチド1)m-(インスリンB-鎖)-(CTPペプチド2)n：(インスリンA-鎖)を有し、式中mは0から4から選択される整数で、nは0から4から選択される整数で、CTPペプチド1及びCTPペプチド2はCTPペプチドを含むアミノ酸配列を表し、CTPペプチド1及びCTPペプチド2は同じ又は異なるアミノ酸配列であり得る。該CTPペプチドは本明細書に開示の任意のCTPペプチドであり得、さらに該インスリンB鎖及びインスリンA鎖は、本明細書に開示の任意の配列又はインスリンレセプターアゴニストとして機能することが知られている任意の配列であり得る。したがって、該CTPペプチドは、二鎖インスリンアナローグのB鎖のアミノ及び／又はカルボキシ末端に、又は単鎖アナローグのB鎖のアミノ末端に及び／又は連結ペプチドとして連結され得る。該CTPペプチドはまた、二鎖インスリンアナローグのA鎖のアミノ若しくはカルボキシ末端に、又は単鎖インスリンアナローグのA鎖のカルボキシ末端に連結され得る。
【００４４】
ある実施態様にしたがえば、A鎖及びB鎖及びCTPペプチドを含むインスリンアナローグが提供され、ここで該CTPペプチドは、（配列番号：64）と少なくとも60、70、80、85、90又は95％の配列同一性を有するペプチドである。ある実施態様では、該CTPペプチドは、（配列番号：64）の18から29アミノ酸領域と少なくとも80、82、84、86、88、90、92、94、96又は98％の配列同一性を共有する18から29アミノ酸配列を含むペプチドである。ある実施態様では、該CTPペプチドは（配列番号：64）のアナローグを含み、ここで前記アナローグは、1つ、1つから2つ、3つから4つ、4つから6つ又は8つまでのアミノ酸改変だけ（配列番号：64）と相違し、該改変はアミノ酸置換、欠失又は挿入である。ある実施態様では、該アナローグは、1つ、1つから2つ、3つから4つ、4つから6つ又は8つまでのアミノ酸置換だけ（配列番号：64）と相違し、該アミノ酸置換は、（配列番号：64）の1−4、7−15、18、20、21、24及び27から選択される1つ以上の位置に存在する。ある実施態様では、該アミノ酸置換は、（配列番号：64）の1、2、3、4、10、13、15及び21から選択される1つ以上の位置に存在する。ある実施態様では、該アミノ酸置換は（配列番号：64）の7、8、9、12、14、18、20、24及び27から選択される1つ以上の位置に存在する。ある実施態様では、該CTPペプチドは、配列番号：66と1つから2つのアミノ酸置換だけ相違する29アミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、該CTPペプチドは配列番号：64のフラグメントを含み、該フラグメントは、配列番号：64内に含まれるアミノ酸配列と同一の連続する18から28アミノ酸配列を表す。ある実施態様では、該CTPペプチドは、配列番号：66、配列番号：64又は配列番号：79から成る。
【００４５】
ある実施態様にしたがえば、CTPペプチドは、配列SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66）（式中、X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン又はリジンである）のペプチドを含むか、又はSSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66）とは1つ又は2つのアミノ酸改変だけ異なるペプチドを含む。ある実施態様では、CTPペプチドは、以下から成る群から選択される配列を含む29アミノ酸の配列である：SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK（配列番号：79）、SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR（配列番号：64）及びSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ（配列番号：65）。ある実施態様では、CTPペプチドは、配列(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n（配列番号：66）を含み、式中、nは1、2、3及び4から成る群から選択される整数であり、さらに別の実施態様では、nは1又は2である。さらに別の実施態様では、第一のCTPペプチドはB鎖のN-末端に連結され、第二のCTPペプチドはB鎖のカルボキシ末端に連結され、ここで第一及び第二のCTPペプチドは、配列番号：79、配列番号：64、配列番号：66及び配列番号：65から成る群からそれぞれ別個に選択される配列を含む。
【００４６】
驚くべきことに、出願人らは、CTPペプチドを用いてインスリンのB鎖及びA鎖をつないで単鎖インスリンアナローグを形成することができ、一方、前記アナローグは自然のままのプロインスリンC-ペプチドなら不可能な態様で高いin vitroポテンシーをなお維持することを見出した。ある実施態様では、B鎖のカルボキシ末端がA鎖のアミノ末端にCTPペプチドを介して連結される単鎖インスリンアナローグが調製される。別の実施態様では、インスリンアナローグは、CTPがB鎖のC-末端に及び／又はB鎖のアミノ末端に共有結合により連結された二鎖構築物として提供される。in vitro及びin vivoの性状調査は、CTP改変インスリンアナローグがグリコシル化の非存在下で高いポテンシーを有することを明らかにし、したがって、CTPペプチド連結によるインスリンアナローグの改変は、グリコシル化（タンパク質をより長時間持続させる天然の手法）によるインスリン作用の延長のメカニズムを提供する。
ある実施態様にしたがえば、A鎖及びB鎖がジスルフィド結合を介して互いに連結され、CTPペプチドがB鎖のアミノ及び／又はカルボキシ末端に共有結合される、二鎖インスリンアナローグが提供される。
【００４７】
単鎖アナローグ
プロインスリンは低ポテンシー前駆体ポリペプチドであり、35残基の連結ペプチド（Cペプチド；配列番号：53）の選択的除去によるタンパク質分解でインスリンに変換される。インスリンB鎖のカルボキシ末端がA鎖のアミノ末端にペプチドリンカーを介して連結された単鎖インスリンアナローグが調製された。ごく一般的な考えは、A鎖及びB鎖を結合させる連結ペプチドは、ポテンシーを維持するために11から12アミノ酸より大きくてはいけないというものである。驚くべきことに、出願人らは、そのままのプロインスリンCペプチドがB鎖のカルボキシ末端に直接連結されないかぎり、18アミノ酸よりはるかに大きいペプチドを連結ペプチドとして用いることができ、該インスリンレセプターでのポテンシーの低下は極めて小さいことを見出した。
ある実施態様では、一般構造B-LM-Aを含む単鎖インスリンアゴニストアナローグが提供される。式中、BはインスリンB鎖を表し、AはインスリンA鎖を表し、LMは、B鎖のカルボキシ末端をA鎖のアミノ末端に連結する連結部分を表す。該インスリンA鎖及びB鎖は、ヘテロ二重体として一緒に連結されたとき機能的な（すなわちインスリンレセプターと結合しこれを活性化できる）インスリンを形成する、公知の任意のインスリン配列であり得、本明細書に開示のものが含まれる。
【００４８】
ある実施態様では、A鎖、B鎖及び連結部分を含む単鎖インスリンアナローグが提供され、ここで、該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端をA鎖のアミノ末端に共有結合により連結し連続するアミノ酸鎖を形成する18アミノ酸のペプチドを含むが、ただし該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端に直接連結された配列番号：53の配列又はそのフラグメントを含まないことを条件とする。出願人らは、自然のままのプロインスリンCペプチドは、該ペプチドがB鎖のカルボキシ末端に結合されるときはインスリン単鎖アナローグのポテンシーに負の影響を有するらしいということを見出した。B鎖と自然のままのプロインスリンCペプチドとの間にCTPペプチドを挿入することによって、プロインスリンそのものと比較してより強力な単鎖インスリンアナローグが生成される（図22参照）。
したがって、驚くほど長い連結ペプチドを有するが基礎にあるインスリンアナローグのポテンシーを維持する単鎖インスリンアナローグを調製することができる。より詳細には、ある実施態様では、該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端に直接連結された自然のままのプロインスリンCペプチド（配列番号：53）の配列、又は配列番号：53の連続する18、20、25又は30アミノ酸フラグメントを含まない少なくとも18アミノ酸の配列を含む。ある実施態様では、自然のままのプロインスリンCペプチド（配列番号：53）の配列、又は配列番号：53の連続する18、20、25又は30アミノ酸フラグメントを含む単鎖インスリンアナローグが提供されるが、ただし、該連結部分はまた、B鎖のカルボキシ末端に直接連結された少なくとも4、8、16、20、24又は28アミノ酸の非C0ペプチドを含むことを条件とする。この状況で“直接連結された”非C0ペプチドを含むインスリンアナローグと言えば、B鎖のカルボキシ末端アミノ酸が非C0ペプチドのアミノ末端アミノ酸に共有結合により連結されることを意味することが意図される。本明細書で用いられるように、非C0ペプチドは、自然のままのプロインスリンCペプチド（配列番号：53）内に含まれる配列と90％未満の配列同一性を有するか、及び／又は配列番号：53内に含まれる15アミノ酸配列と同一の15アミノ酸配列を含まない任意のペプチドである。ある実施態様では、非C0ペプチドは、1つ以上のN-結合及び／又はO-結合グリコシル化部位を含む。ある実施態様では、非C0ペプチドはCTPペプチドを含み、さらに別のある実施態様では、非C0ペプチドはCTP（配列番号：64）である。ある実施態様では、該連結ペプチドが、B鎖のカルボキシ末端に直接連結された第一のCTPペプチド（例えば配列番号：66を含む配列）及びA鎖のアミノ末端に該第一のCTPペプチドを連結する第二のペプチドを含む、単鎖インスリンアナローグが提供される。該第二のペプチドは1から58アミノ酸の任意のアミノ酸配列であり得るが、さらにある実施態様では、第二のペプチドは長さが約1から29アミノ酸である。ある実施態様では、該第二のペプチドは1つ以上のN-結合及び／又はO-結合グリコシル化部位を含む。別の実施態様では、該第二のペプチドは第二のCTPペプチドを含むか、又はプロインスリン、IGF-1又はIGF-2の自然のままのCペプチドを含む。これらの実施態様のいずれにおいても、CTPペプチドを含むさらに別の配列をB鎖のアミノ末端に連結させることができる。
【００４９】
ある実施態様では、該連結部分が、18から174、18から145、18から116、18から97、29から145、29から145、29から116、29から97、29から58アミノ酸残基のペプチドである単鎖インスリンアナローグが提供され、さらに別の実施態様では、該連結部分が合計29から58アミノ酸を含む単鎖インスリンアナローグが提供される。ある実施態様では、該連結部分は18から174、18から145、18から116、18から97、29から145、29から145、29から116、29から97、29から58アミノ酸残基のペプチドであり、ここで、該連結部分は、配列(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n（配列番号：66）を含み、式中、nは1、2又は3で、X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン及びリジンから選択される。いくつかの実施態様では、該連結部分は、当該連結部分のアミノ酸残基に加えて又はアミノ酸残基の代わりに他のポリマー（例えばポリエチレングリコール）を含む。
【００５０】
ある実施態様にしたがえば、 (CTPペプチド1)m-(インスリンB-鎖)-(CTPペプチド2)n-(インスリンA-鎖)の一般構造を有する単鎖インスリンアナローグが提供され、式中mは0から4から選択される整数で、nは1から4から選択される整数で、CTPペプチド1及びCTPペプチド2はCTPペプチドを含むアミノ酸配列を表し、CTPペプチド1及びCTPペプチド2は同じ又は異なるアミノ酸配列であり得る。該CTPペプチドは本明細書に開示の任意のCTPペプチドであり得、さらに該インスリンB鎖及びインスリンA鎖は、本明細書に開示の任意の配列又はインスリンレセプターアゴニストとして機能することが知られている任意の配列であり得る。ある実施態様では、該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端に直接連結された連続する29アミノ酸配列を含み、前記連続する28アミノ酸配列は配列番号：66と95％より高い配列同一性を有する。ある実施態様では、CTPペプチドは、配列SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX52（配列番号：66）（式中、X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン又はリジンから選択される）を含む。別の実施態様では、CTPペプチドは、SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK（配列番号：75）、SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR（配列番号：64）又はSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ（配列番号：65）から成る群から選択される配列を含み、さらに別の実施態様では、CTPペプチドは、配列SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK（配列番号：75）を含む。
【００５１】
また別には、出願人らは、CTPペプチドの一次配列は決定的に重要であるとは思われないことをは見出した（図20に提示のデータを参照されたい）。したがって、ある実施態様では、該連結部分は類似のアミノ酸内容物を共有する少なくとも18アミノ酸の長さを有するペプチドを含む。例えば、ある実施態様では、該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端に直接連結された連続する29アミノ酸の配列を含み、前記連続する29アミノ酸配列を含むアミノ酸の少なくとも58％はセリン及びプロリンから成る群から選択される。さらに別の実施態様では、該連結部分は少なくとも1つのグリコシル化部位を含む。ある実施態様では、該連結部分は、（配列番号：66）のアナローグを含み、前記アナローグは1、2、3、4、5又は6つのアミノ酸置換だけ（配列番号：66）と相違する。ある実施態様では、該連結ペプチドは、アミノ酸置換が（配列番号：66）の1、2、3、4、10、13、15及び21位から選択される1つ以上の場所で生じるCTPペプチドを含む。
【００５２】
出願人らはまた、CTPペプチドのマルチコピーを単鎖アナローグの連結ペプチドとして用いるか、及び／又は単鎖アナローグ若しくは二鎖アナローグでB鎖のアミノ末端に連結できることを見出した。該CTPペプチドの該マルチコピーは配列が同一でも異なっていてもよく、さらに頭対尾又は頭対頭の向きで配置することができる。ある実施態様にしたがえば、配列(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n（配列番号：66）（式中、nは1、2、3又は4から成る群から選択され、X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン及びリジンから選択される）を有するCTPペプチドを含む、インスリンアナローグが提供される。ある実施態様では、インスリンアナローグは二鎖アナローグ又は単鎖アナローグとして提供され、ここで配列(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n（配列番号：66）（式中、nは1、2、3又は4から成る群から選択され、X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン及びリジンから選択される）は、B鎖のアミノ及びカルボキシ末端の両方に連結され、B鎖のアミノ及びカルボキシ末端に位置するCTPペプチドについてはnは同じ又は異なっている。
【００５３】
ある実施態様では、一般構造B-LM-Aを含む単鎖インスリンアゴニストアナローグが提供され、式中、BはインスリンB鎖を表し、AはインスリンA鎖を表し、LMは、B鎖のカルボキシ末端をA鎖のアミノ末端に連結する少なくとも18アミノ酸のペプチド連結部分を表す。該インスリンA鎖及びB鎖は、ヘテロ二重体として一緒に連結されたとき機能的なインスリンを形成する、公知の任意のインスリン配列（本明細書に開示のものが含まれる）であり得る。ある実施態様では、B鎖は、配列R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、A鎖は、GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）を含み、式中、
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X10は、イソロイシン又はセリンであり；
X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；
X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、グルタミン酸、、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸、グルタミン、及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；
R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及び結合から成る群から選択され；さらに
R13は、COOH又はCONH2である。ある実施態様では、B鎖はさらに1から6つの荷電アミノ酸を含むアミノ末端伸長部を含む。
【００５４】
ある実施態様では、一般構造B鎖-LM-A鎖を含む単鎖インスリンアナローグが提供され、ここで、B鎖は配列R22-HLCGSX30LVEALYLVCGERGFF（配列番号：56）を含み、LMはSSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66）の配列を含む連結部分であり、さらにA鎖はGIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13（配列番号：26）の配列を含み、式中、
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；
X21は、アラニン、グリシン又はアスパラギンであり；
X22は、フェニルアラニン及びデスアミノ-フェニルアラニンから成る群から選択され；
X50及びX51がそれぞれ別個にアルギニン及びリジンから成る群から選択され；
R25は、X22VNQ（配列番号：50）、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、AYRPSE（配列番号：11）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、グルタミン酸から成る群から選択される。ある実施態様では、X8及びX30は各々ヒスチジンで、X21はアスパラギンで、R22はX22VNQ（配列番号：50）及びグリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチドから成る群から選択される。さらに別の実施態様では、単鎖インスリンアナローグはまた、B鎖のN-末端に連結されたCTPペプチドを含む。ある実施態様では、該連結部分はペプチド(SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR)nから成り、式中nは1又は2である。ある実施態様では、一般式B鎖-LM-A鎖を含む単鎖インスリンアゴニストが提供され、ここでB鎖は配列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF（配列番号：104）又は以下の位置（B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22及びB23）からそれぞれ別個に選択される1から3つのアミノ酸だけ異なる配列番号：104を含み、A鎖は配列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：1）又は以下の位置（A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21）からそれぞれ別個に選択される1から3つのアミノ酸だけ異なる配列番号：1を含み、さらに連結部分（LM）は配列(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n（配列番号：66）を含み、式中X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン及びリジンから選択され；nは1又は2であるが、ただしB24は介在アミノ酸が全く存在しないで配列番号：66の第一のセリンに直接連結されることを条件とする。
【００５５】
ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグは、GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：83）、GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：84）、GEEEEEKGPEHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：85）、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：88）、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：89）又はGPEHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：90）の配列を含む。ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグのダイマーが提供され、前記には例えば配列番号：88及び配列番号：90を含むホモダイマー又はヘテロダイマーが含まれる。
【００５６】
インスリンA及びB鎖
本発明の単鎖インスリンアゴニストは、ヒトインスリンの自然のままのB及びA鎖配列（それぞれ配列番号：1及び2）又はその公知の任意のアナローグ若しくは誘導体を含むことができ、前記はヘテロ二重体として互いに連結されたときインスリンアゴニスト活性を示す。そのようなアナローグには、例えば1つ以上のアミノ酸の欠失、1つ以上のアミノ酸の置換、及び／又は1つ以上のアミノ酸の挿入（前記は該インスリンアナローグのインスリン活性を破壊しない）だけヒトインスリンのA鎖及びB鎖と相違する、A鎖及びB鎖を有するタンパク質が含まれる。
インスリンアナローグの1つのタイプ、“モノマーインスリンアナローグ”は当業界で周知である。これらはヒトインスリンの即効性アナローグであり、例えば以下のインスリンアナローグが含まれる：
（a）B28位のアミノ酸残基がAsp、Lys、Leu、Val又はAlaで置換され、さらにB29位のアミノアシル残基がLys又はProである；
（b）B27、B28、B29及びB30位のいずれかのアミノアシル残基が欠失しているか、自然のままのものではないアミノ酸で置換されている。ある実施態様では、28位に置換されたAsp、又は28位に置換されたLys及び29位に置換されたプロリンを含むインスリンアナローグが提供される。また別のモノマーインスリンアナローグが以下で開示されている：Chance, et al.,米国特許第5,514,646号；Chance, et al.,米国特許出願No.08/255,297；Brems, et al., Protein Engineering, 5:527-533, 1992；Brange, et al., EPO公開公報No.214,826（1987年3月18日公開）；及びBrange, et al., Current Opinion in Structural Biology, 1:934-940, 1991（前記文献の開示はモノマーインスリンアナローグについて参照により明確に本明細書に含まれる）。
【００５７】
インスリンアナローグはまたアミド化アミノ酸の酸性形で入れ替えることができる。例えばAsnはAsp又はGluで入れ替えることができる。同様に、GlnはAsp又はGluで入れ替えることができる。特に、Asn(A18)、Asn(A21)若しくはAsp(B3) 又はこれら残基の任意の組合せは、Asp又はGluで入れ替えることができる。さらにまた、Gln(A15)若しくはGln(B4)又は両方はAsp又はGluで入れ替えることができる。
本明細書で開示するように、ヒトインスリンのB鎖及びA鎖又はそのアナローグ若しくは誘導体を含む単鎖インスリンアゴニストが提供され、ここでB鎖のカルボキシ末端は連結部分を介してA鎖のアミノ末端に連結される。ある実施態様では、A鎖はGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：1）、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA（配列番号：5）又はGIVEECCFRSCDLALLETYCA（配列番号：7）から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、さらにB鎖は以下を含む：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT（配列番号：2）、GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT（配列番号：6）若しくはAYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFYFSRPA（配列番号：8）、又はB26、B27、B28、B29及びB30に対応する1から5つのアミノ酸が欠失した前記のカルボキシ末端短縮配列、及び各々の配列が、A5、A8、A9、A10、 A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29及びB30から選択される自然のままのインスリンの位置に対応する位置に（図5に示すペプチドアラインメントを参照されたい）、1から5つのアミノ酸置換を含むように改変されているそのような配列のアナローグ。ある実施態様では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。所望のインスリン活性に対して悪影響を与えないこれらの位置の適切なアミノ酸置換は当業者には公知であり、例えば以下の文献に示されている：Mayer, et al., Insulin Structure and Function, Biopolymers.2007;88(5):687-713（前記文献の内容は参照により本明細書に含まれる）。
【００５８】
ある実施態様にしたがえば、単鎖インスリンアナローグペプチドは、インスリンA鎖及びインスリンB鎖又はそのアナローグを含むことができ、ここで該A鎖は、GIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：1）、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA（配列番号：5）又はGIVEECCFRSCDLALLETYCA（配列番号：7）の少なくとも1つとその自然のままのペプチドの全長にわたって少なくとも70％（例えば70％、75％、80％、85％、90％、95％）の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、さらにB鎖は、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT（配列番号：2）、GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT（配列番号：6）若しくはAYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFYFSRPA（配列番号：8）又はB27、B28、B29及びB30に対応する1から4つのアミノ酸が欠失した前記のカルボキシ末端短縮配列の少なくとも1つとその自然のままのペプチドの全長にわたって少なくとも60％（例えば60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％）の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。
【００５９】
補足アミノ酸配列を、本発明の単鎖インスリンアゴニストのB鎖のアミノ末端に、又はA鎖のカルボキシ末端に付加することができる。例えば、一連の陰性荷電アミノ酸をB鎖のアミノ末端に付加することができ、前記アミノ酸は、例えば長さが1から12、1から10、1から8又は1から6アミノ酸を含み、さらに1つ以上の陰性荷電アミノ酸（例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸を含む）を含む。ある実施態様では、B鎖のアミノ末端伸長部は1から6つの荷電アミノ酸を含む。ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグは、配列X60X61X62X63X64X65K（配列番号：19）を含むB鎖アミノ末端伸長部を含み、式中、X60はグリシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸から成る群から選択され、さらにX61、X62、X63、X64及びX65はそれぞれ別個にグルタミン酸又はアスパラギン酸である。ある実施態様では、B鎖アミノ末端伸長部は、配列GX61X62X63X64X65K（配列番号：20）又はX61X62X63X64X65RK（配列番号：21）を含み、式中、X61、X62、X63、X64及びX65はそれぞれ別個にグルタミン酸又はアスパラギン酸である。ある実施態様では、B鎖は配列GEEEEEKGPEHLCGAHLVDALYLVCGDX42GFY（配列番号：22）を含み、式中X42はアラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択される。ある実施態様にしたがえば、開示の単鎖インスリンアナローグは、A鎖上のC-末端カルボキシレートの代わりにC-末端アミド又はエステルを含む。
【００６０】
高ポテンシーの単鎖インスリンアナローグはまた、国際特許出願PCT/2009/068713（前記文献の開示は参照により本明細書に含まれる）に記載されているように、改変IGFI及びIGFIIを土台にして調製できる。より詳細には、自然のままのインスリンのB16及びB17に対応する位置にチロシン-ロイシンジペプチドによる自然のままのIGFアミノ酸の置換を含むIGFI及びIGFIIのアナローグは、インスリンレセプターでポテンシーが10倍増加する。したがって、本明細書に開示する単鎖インスリンアナローグは、IGFI（配列番号：5）又はIGFII（配列番号：7）のA鎖及びIGFI（配列番号：6）又はIGFII（配列番号：8）の改変B鎖又は自然のままのインスリンのB鎖（配列番号：2）を含むことができる。さらにまた、本明細書に開示の単鎖インスリンアナローグは、自然のままのインスリンA鎖又はそのアナローグ、及びIGFI（配列番号：6）又はIGFII（配列番号：8）の改変B7鎖の他に前記B鎖のアナローグを含むことができる。ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグは、IGFI（配列番号：5）A鎖又はそのアナローグ若しくは誘導体及びIGFI（配列番号：6）、IGFII（配列番号：8）の改変B鎖又は自然のままのインスリン（配列番号：2）又はそのアナローグ若しくは誘導体を含む。
【００６１】
単鎖IGF又はインスリンA鎖及びB鎖への補足的改変には、例えば、A19、B16又はB25位（自然のままのインスリンA及びB鎖に対応する）の1つ以上におけるアミノ酸の4-アミノフェニルアラニンへの改変、又はA5、A8、A9、A10、 A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29及びB30（自然のままのインスリンA及びB鎖に対応する）から選択される位置における1つ以上のアミノ酸の置換、又はB1−4及びB26-30位のいずれか又は全ての欠失が含まれる。ある実施態様では、A5、A8、A9、A10、 A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29及びB30から選択される位置の置換は、自然のままのインスリン配列に対して保存的アミノ酸置換である。
ある実施態様にしたがえば、B鎖は配列R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、A鎖は配列配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）を含み、式中、
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X10は、イソロイシン又はセリンであり；
X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；
X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、オルニチン又グルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；
R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及びN-末端アミンから成る群から選択され；さらに
R13は、COOH又はCONH2である。ある実施態様では、X8、X25及びX30は各々ヒスチジンである。さらに別の実施態様では、単鎖インスリンアナローグペプチドは、配列番号：15のA鎖ペプチド配列のアナローグ及び／又は配列番号：16のB鎖ペプチド配列を含み、ここでA鎖及びB鎖のアナローグは各々1−3つのさらに別のアミノ酸置換を含む。
【００６２】
ある実施態様では、構造：IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、式中、IBは、配列R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、LMは本明細書に開示の連結部分であって、IBをIAに共有結合により連結する少なくとも18アミノ酸を有し、IAは、配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）を含み、式中、
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；
X8は、ヒスチジン又はフェニルアラニンであり；
X9及びX14は、それぞれ別個にアルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンから選択され；
X10は、イソロイシン又はセリンであり；
X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；
X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、アルギニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン又はスレオニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；
X21は、アラニン、グリシン又はアスパラギンであり；
X25は、ヒスチジン及びスレオニンから成る群から選択され；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及びN-末端アミンから成る群から選択され；さらに
R13は、COOH又はCONH2であり、さらにここでX45のアミノ酸は該連結部分、LMに直接結合される（すなわち、本明細書で用いられる名称IB-LM-IAは、B鎖カルボキシ末端とA鎖アミノ末端が、さらに別の介在アミノ酸を一切用いることなく連結部分LMに直接連結されることを示すこと意図している）。該連結部分は本明細書に記載のいずれの構造でもよい。
【００６３】
ある実施態様にしたがえば、インスリンペプチドのA鎖が配列GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23（配列番号：23）を含み、さらにB鎖が配列X24LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF（配列番号：24）を含むインスリンアナローグが提供され、
式中、
X8は、スレオニン及びヒスチジンから成る群から選択され；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；
X23は、アスパラギン又はグリシンであり；
X24は、ヒスチジン及びスレオニンから成る群から選択され；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択される。さらに別の実施態様では、B鎖は配列X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1（配列番号：25）を含み、式中、
X22は、フェニルアラニン及びデスアミノ-フェニルアラニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン及びスレオニンから成る群から選択され；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
Z1は、アスパルテート-リジン、リジン-プロリン及びプロリン-リジンから成る群から選択されるジペプチドであり；さらに
B1は、スレオニン、アラニン又はスレオニン-アルギニン-アルギニントリペプチドから成る群から選択される。
【００６４】
ある実施態様にしたがえば、構造：IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、式中、IBは、配列X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF（配列番号：24）を含み、LMは、IBをIAに共有結合により連結する本明細書に開示の連結部分であり、IAは、配列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21（配列番号：26）を含む。ある実施態様にしたがえば、A鎖は、配列GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23（配列番号：23）又はGIVDECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：27）を含み、さらにB鎖は、配列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45（配列番号：28）を含み、
式中、
X8は、ヒスチジン又はフェニルアラニンであり；
X9及びX14は、それぞれ別個にアルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、アルギニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン又はスレオニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；
X21は、アラニン、グリシン又はアスパラギンであり；
X23は、アスパラギン又はグリシンであり；
X25は、ヒスチジン及びスレオニンから成る群から選択され；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、チロシンであり；さらに
R13は、COOH又はCONH2である。ある実施態様では、n及びkの少なくとも1つは1である。
【００６５】
さらに別の実施態様では、A鎖は、配列GIVDECCHX9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：27）を含み、さらにB鎖は、配列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45（配列番号：28）を含み、式中、
X9及びX14は、それぞれ別個にアルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンから選択され；
X15は、アルギニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、オルニチン又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン又はスレオニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；
X21は、アラニン、グリシン又はアスパラギンであり；
X23は、アスパラギン又はグリシンであり；
X25は、ヒスチジン及びスレオニンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；さらに
R13は、COOH又はCONH2である。さらに別の実施態様では、A鎖は、配列GIVDECCHX9SCDLX14X15LX17MX19CX21-R13（配列番号：29）を含み、B鎖は、X25LCGAX30LVDALYLVCGDX42GFX45（配列番号：30）を含み、式中、
X9、X14及びX15は、それぞれ別個にオルニチン、リジン又はアルギニンであり；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；
X21は、アラニン、グリシン又はアスパラギンであり；
X25は、ヒスチジン及びスレオニンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；さらに
R13は、COOH又はCONH2である。ある実施態様では、B鎖は、HLCGAELVDALYLVCGDX42GFY（配列番号：31）、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFY（配列番号：32）、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNPKT（配列番号：33）及びGPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNKPT（配列番号：34）から成る群から選択される（式中、X42はオルニチン、リジン及びアルギニンから成る群から選択される）。さらに別の実施態様では、A鎖は、配列GIVDECCHX9SCDLX14X15LQMYCN-R13（配列番号：36）を含み、式中X5、X14及びX15はそれぞれ別個にオルニチン、リジン又はアルギニンである。
【００６６】
ある実施態様では、一般式IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、式中、IBは、HLCGAELVDALYLVCGDX42GFY（配列番号：31）、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFY（配列番号：32）、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNPKT（配列番号：33）及びGPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNKPT（配列番号：34）から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、LMは本明細書に開示した連結部分である。
【００６７】
ある実施態様にしたがえば、構造：IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、式中、IBは配列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45（配列番号：28）を含み、LMはIBを共有結合によりIAに連結する、本明細書に開示の連結部分であり、IAは、配列GIVEQCCHSICSLYQLENX19CX21-R13（配列番号：37）又はGIVDECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：38）を含み、ここで配列番号：58のC-末端フェニルアラニン残基は、介在アミノ酸を一切存在させずに該連結部分LMと直接共有結合する。ある実施態様にしたがえば、X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45（配列番号：28）- (SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n（配列番号：66）-GIVDECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：27）又はX25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45(Y1)k（配列番号：28）-(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n（配列番号：66）-GIVEQCCHSICSLYQLENX19CX21-R13（配列番号：37）を含む単鎖インスリンアナローグが提供され、式中、
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X14は、チロシン、、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、オルニチン又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；
X21は、アラニン、グリシン又はアスパラギンであり；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；
X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン又はリジンであり、さらにnは1又は2である。
【００６８】
ある実施態様にしたがえば、構造：IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、式中、IBは配列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45（配列番号：28）を含み、LMは本明細書に開示する連結部分であり、A鎖はGIVDECCHX9SCDLX14X15LQMYCN-R13（配列番号：36）を含み、式中、X9、X14及びX15はそれぞれ別個にオルニチン、リジン又はアルギニンであり、R13はCOOH又はCONH2である。
ある実施態様では、B鎖は、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF（配列番号：104）、HLCGAELVDALYLVCGDOGFY（配列番号：39）、GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFY（配列番号：40）、GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFYFNPKT（配列番号：41）及びGPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFYFNKPT（配列番号：42）から成る群から選択され、さらにA鎖はGIVDECCHOSCDLOOLQMX19CN-R13（配列番号：43）又は配列番号：1であり、式中、X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンである。
ある実施態様では、該単鎖インスリンはさらにポリエチレングリコール鎖を含み、前記は、連結部分の側鎖に、又はA鎖のA9、A14及びA15又はB鎖のB0、B1、B10、B22、B28若しくはB29位から成る群から選択される位置に共有結合により連結される。ある実施態様では、該ポリエチレングリコール鎖はB鎖のアミノ末端アミノ酸に共有結合により連結される。
【００６９】
インスリンアナローグの合成
本開示はまた、本明細書に開示のインスリンアナローグのいずれかをコードする核酸の他に、そのような核酸配列を含む宿主細胞に関する。本明細書に開示の単鎖インスリンアナローグは、標準的な技術及び当業者に公知の発現ベクターを用いて発現させることができる。本明細書に開示のインスリンアナローグは、原核（例えば大腸菌）又は真核（酵母、哺乳動物）宿主細胞で発現させることができる。ある実施態様にしたがえば、高グリコシル化インスリンアナローグは、CTPペプチドを含む、本明細書に開示のインスリンアナローグをコードする核酸配列を含む組換え真核宿主細胞を用いて合成される。ある実施態様では、真核宿主細胞は、ヒトグリコシル化遺伝子を発現するように改変された酵母細胞（より典型的には例えばP.パストリス）である。また別には、ある実施態様の宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞（例えばCHO細胞）であり、前記は場合によってヒトグリコシル化遺伝子を発現するように改変されてある。
【００７０】
ある実施態様にしたがえば、高グリコシル化インスリンアナローグを製造する方法が提供され、前記方法は、CTP改変インスリンアナローグをコードする遺伝子を含む宿主細胞を、CTP改変インスリンアナローグタンパク質が生成される条件下で培養する工程を含む。続いて、発現されたタンパク質を培養から回収できる。ある実施態様では、該宿主細胞は、一般式(CTPペプチド1)m-(インスリンB-鎖)-(CTPペプチド2)nのインスリンB鎖を発現する（式中mは0から4から選択される整数で、nは0から4から選択される整数で、さらにCTPペプチド1及びCTPペプチド2はCTPペプチドを含むアミノ酸配列を表し、CTPペプチド1及びCTPペプチド2は同じ又は異なるアミノ酸配列であり得る）。同じ細胞がまたインスリンA鎖を発現することができ、B鎖及びA鎖は、二鎖インスリンとして当該細胞から回収される。また別には、A鎖は別々の宿主細胞で発現され、前記細胞は第一の組換え細胞と共培養されるか又は別々に培養される。
ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグをコードする遺伝子を含む宿主細胞が提供され、前記ではインスリンB鎖のカルボキシ末端をA鎖のアミノ末端に連結する連結部分はCTPペプチドを含む。また別の実施態様では、該遺伝子は、B鎖のN-末端に連結されたCTPペプチドを含む単鎖インスリンアナローグをコードする。ある実施態様では、該遺伝子は、B鎖のN-末端に連結された第一のCTPペプチド、及び第二のCTPペプチドを含む連結部分を含む単鎖インスリンアナローグをコードし、前記第一及び第二のCTPペプチドは同じか又は異なっている。ある実施態様では、CTPペプチドは、配列番号：66、配列番号：64又は配列番号：75から選択される配列を含む。
【００７１】
ある実施態様では、宿主細胞は、一般式(CTPペプチド1)m-(インスリンB-鎖)-(CTPペプチド2)n-(インスリンA-鎖)の単鎖インスリンアナローグを発現し、式中mは0から4から選択される整数で、nは1から4から選択される整数で、CTPペプチド1及びCTPペプチド2はCTPペプチドを含むアミノ酸配列を表し、CTPペプチド1及びCTPペプチド2は同じ又は異なるアミノ酸配列であり得る。該方法は、CTPインスリンアナローグをコードする遺伝子を含む宿主細胞を、前記タンパク質が生成される条件下で培養し、前記タンパク質を培養から回収する工程を含む。
ある実施態様では、インスリンアナローグは単鎖アナローグとして発現され、ここで、連結部分は固有のペプチド切断部位を該連結部分とインスリンA鎖との結合部に含み、さらに該方法は、回収タンパク質を切断して二鎖インスリンアナローグを製造する工程をさらに含む。任意のペプチド切断酵素を用いることができるが、ただし当該認識ペプチドはインスリンB又はA鎖配列内に存在しないことを条件とする。ある実施態様では、連結部分は、配列SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK（配列番号：79）を含み、発現された単鎖インスリンアナローグはLys Cで切断されて、二鎖インスリンアナローグを生じる。ある実施態様では、宿主細胞は、ヒトグリコシル化酵素のみを発現するように改変されてある酵母細胞である。また別の実施態様では、宿主細胞は、例えばCHO細胞を含む哺乳動物細胞株である。
【００７２】
インスリンアナローグのペジル化
本明細書に開示したインスリンアナローグへの親水性部分の共有結合はCTP含有インスリンアナローグの特性をさらに向上させて、開始が遅く持続時間が延長され基本的活性プロフィールを示すアナローグを提供することができる。ある実施態様では、本明細書に開示のインスリンアナローグ（すなわちグリコシル化部位を含むように改変されてある）は、親水性部分を含むようにさらに改変され、前記親水性部分は、A鎖のA9、A14及びA15又はB鎖のB0、B1、B10、B22、B28若しくはB29位から成る群から選択される位置、又はA鎖とB鎖を連結する連結部分の任意の位置でアミノ酸の側鎖に共有結合により連結される。例示的な実施態様では、この親水性部分は、これらの位置のいずれかのLys、Cys、Orn、ホモシステイン又はアセチル-フェニルアラニン残基に共有結合により連結される。ある実施態様では、該親水性部分は、該連結部分のアミノ酸の側鎖に共有結合により連結される。
【００７３】
例示的親水性部分には、例えば分子量が約1,000ダルトンから約40,000ダルトン又は約20,000ダルトンから約40,000ダルトンのポリエチレングリコール（PEG）が含まれる。さらに付け加えられる適切な親水性部分には、プロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばPOG）、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（POG）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、モノ-(C1-C10)アルコキシ-若しくはアリールオキシ-ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリ(ベータ-アミノ酸)（ホモポリマー又はランダムコポリマー）、ポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー（PPG）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、結腸酸（colonic acid）又は他の多糖類ポリマー、フィコール又はデキストラン及び前記の混合物が含まれる。
【００７４】
いくつかの実施態様の親水性部分、例えばポリエチレングリコール鎖は、約500から約40,000ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。ある実施態様では、親水性部分（例えばPEG）は、約500から約5,000ダルトン、又は約1,000から約5,000ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様では、親水性部分（例えばPEG）は、約10,000から約20,000ダルトンの分子量を有する。さらに他の例示的実施態様では、親水性部分（例えばPEG）は、約20,000から約40,000ダルトンの分子量を有する。ある実施態様では、親水性部分（例えばPEG）は、約20,000ダルトンの分子量を有する。ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグの1つ以上のアミノ酸がペジル化され、さらに共有結合により連結されたPEG鎖の結合分子量が約20,000ダルトンである、単鎖インスリンアナローグが提供される。
ある実施態様では、デキストランが親水性部分として用いられる。デキストランは、主としてα1-6結合により連結されたグルコースサブユニットの多糖類ポリマーである。デキストランは、多くの分子量範囲、例えば約1kDから約100kD、約5、10、15又は20kDから約20、30、40、50、60、70、80又は90kDの多くの分子量範囲で入手できる。
線状又は分枝ポリマーが意図される。生成された複合物の調製物は本質的に単分散物又は多分散物であり、ペプチド当たり約0.5、0.7、1、1.2、1.5又は2ポリマー部分であり得る。
【００７５】
ある実施態様では、親水性部分はポリエチレングリコール（PEG）鎖であり、前記は、場合によってA鎖のA9、A14及びA15から成る群から選択される位置で、B鎖のアミノ末端アミノ酸で、B鎖のB10、B22、B28若しくはB29位で、又はA鎖とB鎖を連結する連結部分の任意の位置でアミノ酸の側鎖に連結される。ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグはペプチド連結部分を含み、連結部分のアミノ酸の１つはその側鎖に共有結合されたポリエチレン鎖を有する。ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグはペプチド連結部分を含み、ここで連結部分のアミノ酸はペジル化され、さらにまたA鎖のA9、A14及びA15から成る群から選択される位置で、B鎖のアミノ末端アミノ酸で、B鎖のB10、B22、B28又はB29位で1つ以上のアミノ酸がペジル化される。ある実施態様では、共有結合により連結されるPEG鎖の合計分子量は約20,000ダルトンである。
ある実施態様では、連結部分のアミノ酸の1つがその側鎖に共有結合された20,000ダルトンのポリエチレン鎖を有する、単鎖インスリンアナローグが提供される。別の実施態様では、単鎖インスリンアナローグは、連結部分のアミノ酸の1つに共有結合されたポリエチレン鎖、及びB鎖のアミノ末端アミノ酸若しくはB29のアミノ酸と連結された第二のPEGを含む。ある実施態様では、2つのPEG鎖が単鎖インスリンアナローグに連結されるとき、各PEG鎖は約10,000ダルトンの分子量を有する。
【００７６】
親水性部分（例えばポリエチレングリコール）は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために用いられる任意の適切な条件下で、インスリンアナローグに結合させることができる。当業界で公知の任意の手段を用いることができ、前記手段には、アシル化、還元性アルキル化、ミカエル付加、チオールアルキル化、又はPEG部分の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、エステル、α-ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）を介する標的化合物の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、エステル、α-ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）に対する他の化学選択性結合/連結方法が含まれる。水溶性ポリマーを1つ以上のタンパク質に連結するために用いることができる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジジリン、オキシラン及び5-ピリジルが含まれるが、ただしこれらに限定されない。還元性アルキル化によってペプチドに結合される場合、選択されるポリマーは、ポリマー化の程度が制御されるように一反応性アルデヒドを有するべきである。例えば以下を参照されたい：Kinstler et al., Adv.Drug.Delivery Rev.54: 477-485, 2002；Roberts et al., Adv.Drug Delivery Rev.54: 459-476, 2002；及びZalipsky et al., Adv.Drug Delivery Rev.16: 157-182, 1995。
【００７７】
本発明の具体的な特徴では、チオールを有するインスリンアナローグのアミノ酸残基は、親水性部分（例えばPEG）により改変される。いくつかの実施態様では、該チオールは、ミカエル反応でマレイミド活性化PEGにより改変され、以下に示すチオエーテル結合を含むPEG化ペプチドを生じる：
【００７８】
【化１】
0006392123.tif 000002
【００７９】
いくつかの実施態様では、該チオールは、求核置換反応でハロアセチル活性化PEGにより改変され、以下に示すチオエーテル結合を含むPEG化ペプチドを生じる：
【００８０】
【化２】
0006392123.tif 000003
【００８１】
インスリンアナローグのアシル化
いくつかの実施態様では、インスリンアナローグはアシル基を含むように改変される。アシル基は、インスリンアナローグのアミノ酸に直接又はインスリンアナローグのアミノ酸にスペーサーを介して間接的に共有結合により連結でき、該スペーサーはインスリンアナローグのアミノ酸とアシル基との間に配置される。インスリンアナローグは、親水性部分が連結される同じアミノ酸の位置で、又は異なるアミノ酸の位置でアシル化できる。例えば、アシル化は、A鎖又はB鎖の任意のアミノ酸の他、連結部分内の位置を含む任意の位置で生じ得るが、ただし非アシル化インスリンアナローグによって示される活性がアシル化に際して維持されることを条件とする。非制限的な例として、A鎖のA14及びA15の位置、B鎖のアミノ末端アミノ酸（インスリン系B鎖についてはB1又はIGF系B鎖についてはB2）、B10、B22、B28又はB29の位置、又は連結部分の任意の位置でのアシル化が含まれる。
【００８２】
本発明のある具体的な特徴では、インスリンアナローグ（又はその誘導体若しくは複合物（conjugate））は、インスリンアナローグのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル又はチオールの直接的アシル化によってアシル基を含むように改変される。いくつかの実施態様では、インスリンアナローグは、アミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル又はチオールにより直接アシル化される。いくつかの実施態様では、アシル化はB28又はB29位（自然のままのインスリンA及びB鎖配列のアミノ酸番号付けによる）で生じる。これに関しては、側鎖のアミン、ヒドロキシル又はチオールによるA鎖又はB鎖配列内の1つ以上のアミノ酸置換によって改変されてあるインスリンアナローグが提供される（前記1つ以上のアミノ酸には、例えばA14、A15、B1/B2、B10、B22、B2又はB29（自然のままのインスリンA及びB鎖配列のアミノ酸番号付けによる）又は連結部分の任意の位置のアミノ酸が含まれる）。本発明のいくつかの具体的な実施態様では、インスリンアナローグの直接的アシル化は、B28又はB29位（自然のままのインスリンA及びB鎖配列のアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールにより生じる。
ある実施態様では、インスリンアナローグは下記式Iのアミノ酸を含む：
【００８３】
【化３】
0006392123.tif 000004
【００８４】
式中、nは1から4である。
いくつかの実施態様では、式Iのアミノ酸は、nが4（Lys）又はnが3（Orn）のアミノ酸である。
【００８５】
別の実施態様では、インスリンアナローグは下記式IIのアミノ酸を含む：
【００８６】
【化４】
0006392123.tif 000005
【００８７】
式中nは1から4である。
いくつかの例示的実施態様では、式IIのアミノ酸はnが1（Ser）のアミノ酸である。
【００８８】
さらに別の実施態様では、インスリンアナローグは、下記式IIIのアミノ酸の側鎖チオールを含む：
【００８９】
【化５】
0006392123.tif 000006
【００９０】
式中、nは1から4である。
いくつかの例示的実施態様では、式IIIのアミノ酸はnが1（Cys）のアミノ酸である。
さらに別の実施態様では、インスリンアナローグは二置換アミノ酸を含み、前記アミノ酸は、式I、式II又は式IIIの同じ構造を含むが、ただし式I、式II又は式IIIのアミノ酸のアルファ炭素に結合した水素は第二の側鎖で入れ替えられている。
ある実施態様にしたがえば、アシル化インスリンアナローグは、当該ペプチドとアシル基との間にスペーサーを含む。いくつかの実施態様では、インスリンアナローグは該スペーサーに共有結合され、該スペーサーはアシル基に共有結合される。いくつかの例示的実施態様では、インスリンアナローグは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル又はチオールのアシル化によってアシル基を含むように改変され、該スペーサーは、B28又はB29位（自然のままのインスリンのA及びB鎖のアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖又はスペーサー部分の任意の位置に結合される。スペーサーが結合されるインスリンアナローグのアミノ酸は、スペーサーの結合を許容する部分を含む任意のアミノ酸であり得る。例えば、側鎖-NH2、-OH又は-COOHを含むアミノ酸（例えばLys、Orn、Ser、Asp又はGlu）が適切である。
【００９１】
いくつかの実施態様では、インスリンアナローグとアシル基との間のスペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを含むアミノ酸である（又は側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを含むジペプチド若しくはトリペプチド）。いくつかの実施態様では、該スペーサーは親水性の二官能性スペーサーを含む。具体的な実施態様では、該スペーサーはアミノポリ(アルキルオキシ)カルボキシレートを含む。これに関しては、スペーサーは例えばNH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOHを含むことができ、式中mは1から6の任意の整数で、nは2から12の任意の整数である（例えば8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸で、前記は業者（Peptides International, Inc., Louisville, KY）から市場で入手できる）。ある実施態様では、親水性の二官能性スペーサーは、2つ以上の反応基、例えばアミン、ヒドロキシル、チオール及びカルボキシル基又は前記の任意の組合せを含む。ある種の実施態様では、親水性の二官能性スペーサーはヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様では、親水性の二官能性スペーサーはアミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様では、親水性の二官能性スペーサーはチオール基及びカルボキシレートを含む。
【００９２】
いくつかの実施態様では、インスリンアナローグペプチドとアシル基との間のスペーサーは親水性二官能性スペーサーである。親水性の二官能性スペーサーは当業界では公知である。例えば以下を参照されたい：Bioconjugate Techniques, G.T.Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。ある種の実施態様では、親水性の二官能性スペーサーは2つ以上の反応基、例えばアミン、ヒドロキシル、チオール及びカルボキシル基又は前記の任意の組合せを含む。ある種の実施態様では、親水性二官能性スペーサーはヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様では、親水性の二官能性スペーサーはアミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様では、親水性の二官能性スペーサーはチオール基及びカルボキシレートを含む。カルボキシレート及びヒドロキシル基又はチオール基を含む適切な親水性の二官能性スペーサーは当業界では公知であり、例えば8-ヒドロキシオクタン酸及び8-メルカプトオクタン酸が含まれる。
【００９３】
ある種の実施態様にしたがえば、二官能性スペーサーは、長さが3から10原子のアミノ酸骨格（例えば6-アミノヘキサン酸、5-アミノ吉草酸、7-アミノペンタン酸及び8-アミノオクタン酸）を含む、合成又は天然に存在するアミノ酸であり得る。また別には、スペーサーは、長さが3から10原子（例えば6から10原子）のペプチド骨格を有するジペプチド又はトリペプチドであり得る。インスリンアナローグに結合されるジペプチド又はトリペプチドの各アミノ酸は、それぞれ別個に以下から成る群から選択できる：天然に存在する及び／又は天然に存在しないアミノ酸、例えば以下を含む：天然に存在するアミノ酸（Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr）のD若しくはL異性体のいずれか、又は以下から成る群から選択される天然に存在しないアミノ酸のD又はL異性体のいずれか（β-アラニン（β-Ala）、 N-α-メチル-アラニン（Me-Ala）、アミノ酪酸（Abu）、α-アミノ酪酸（γ-Abu）、アミノヘキサン酸(ε-Ahx)、アミノイソ酪酸（Aib）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノペピリジンカルボン酸、アミノセリン（Ams）、アミノテトラヒドロピラン-4-カルボン酸、アルギニンN-メトキシ-N-メチルアミド、β-アスパラギン酸（β-Asp）、アゼチジンカルボン酸、3-(2-ベンゾチアゾリル)アラニン、α-tert-ブチルグリシン、2-アミノ-5-ウレイド-n-吉草酸（シトルリン、Cit）、β-シクロヘキシルアラニン（Cha）、アセトアミドメチル-システイン、ジアミノブタン酸（Dab）、ジアミノプロピオン酸（Dpr）、ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）、ジメチルチアゾリジン（DMTA）、γ-グルタミン酸、（γ-Glu）、ホモセリン（Hse）、ヒドロキシプロリン（Hyp）、イソロイシンN-メトキシ-N-メチルアミド、メチル-イソロイシン（MeIle）、イソニペコチン酸（Isn）、メチル-ロイシン（MeLeu）、メチルリジン、ジメチル-リジン、トリメチル-リジン、メタノプロリン、メチオニン-スルホキシド（Met(O)）、メチオニン-スルホン（Met(O2)）、ノルロイシン（Nle）、メチル-ノルロイシン（Me-Nle）、ノルバリン（Nva）、オルニチン（Orn）、para-アミノ安息香酸）‘ABA）、ペニシラミン（Pen）、メチルフェニルアラニン（MePhe）、4-クロロフェニルアラニン（Phe(4-Cl)）、4-フルオロフェニルアラニン（Phe(4-F)）、4-ニトロフェニルアラニン（Phe(4-NO2)）、4-シアノフェニルアラニン（(Phe(4-CN)）、フェニルグリシン（Phg）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、3,4-ジヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Sar）、セレノシステイン（Sec）、U-ベンジル-ホスホセリン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸（Sta）、4-アミノ-5-シクロヘキシル-3-ヒドロキシペンタン酸（ACHPA）、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸（AHPPA）、1,2,3,4,-テトラヒドロ-イソキノリン-3-カルボン酸（Tic）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Thi）、U-ベンジル-ホスホチロシン、O-ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、O-(ビス-ジメチルアミノ-ホスホノ)-チロシン、チロシンスルフェートテトラブチルアミン、メチル-バリン（MeVal）、1-アミノ-1-シクロヘキサンカルボン酸（Acx）、アミノ吉草酸、ベータ-シクロプロピル-アラニン（Cpa）、プロペルギルグリシン（Prg）、アリルグリシン（Alg）、2-アミノ-2-シクロヘキシル-プロパン酸（2-Cha）、テトラブチルグリシン（Tbg）、ビニルグリシン（Vg）、1-アミノ-1-シクロプロパンカルボン酸（Acp）、1-アミノ-1-シクロペンタンカルボン酸（Acpe）、アルキル化3-メルカプトプロピオン酸、1-アミノ-1-シクロブタンカルボン酸（Acb）。いくつかの実施態様では、ジペプチドスペーサーは以下から成る群から選択される：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-アミノ酪酸-γ-アミノ酪酸、及びγ-Glu-γ-Glu。
【００９４】
インスリンアナローグペプチドは、長鎖アルカンのアシル化によってアシル基を含むように改変できる。具体的な特徴では、長鎖アルカンはアミン、ヒドロキシル又はチオール基（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール及びヘキサデカンチオール）を含み、前記はインスリンアナローグのカルボキシル基又はその活性化形と反応する。インスリンアナローグのカルボキシル基又はその活性化形は、インスリンアナローグのアミノ酸（例えばグルタミン酸、アスパラギン酸）の側鎖の部分であるか、又はペプチド骨格の部分であり得る。
ある種の実施態様では、該インスリンアナローグは、当該インスリンアナローグに結合されたスペーサーによる長鎖アルカンのアシル化によって、アシル基を含むように改変される。具体的な特徴では、長鎖アルカンはアミン、ヒドロキシル又はチオール基を含み、前記はスペーサーのカルボキシル基又はその活性化形と反応する。カルボキシル基又はその活性化形を含む適切なスペーサーは本明細書に記載され、例えば二官能性スペーサー（例えばアミノ酸）、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー及び疎水性二官能性スペーサーが含まれる。本明細書で用いられるように、“カルボキシル基の活性化形”という用語は、一般式R(C=O)Xを有するカルボキシル基を指す（式中、Xは脱離基であり、Rはインスリンアナローグ又はスペーサーである）。例えば、カルボキシル基の活性化形には塩化アシル（無水物及びエステル）が含まれるが、ただし前記に限定されない。いくつかの実施態様では、活性化カルボキシル基はN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）脱離基を有するエステルである。
【００９５】
長鎖アルカンがインスリンアナローグペプチドによって又はスペーサーによってアシル化される、本発明のこれらの特徴に関しては、該長鎖アルカンは任意のサイズであるか、又は任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは線状でも分枝状でもよい。ある種の特徴では、長鎖アルカンはC4からC30のアルカンである。例えば、該長鎖アルカンは以下のいずれかであり得る：C4アルカン、C6アルカン、C8アルカン、C10アルカン、C12アルカン、C14アルカン、C16アルカン、C18アルカン、C20アルカン、C22アルカン、C24アルカン、C26アルカン、C28アルカン又はC30アルカン。いくつかの実施態様では、長鎖アルカンはC8からC20のアルカン、例えばC14アルカン、C16アルカン又はC18アルカンを含む。
いくつかの実施態様では、インスリンアナローグのアミン、ヒドロキシル又はチオール基はコレステロール酸でアシル化される。具体的な実施態様では、該ペプチドは、アルキル化des-アミノCysスペーサー、すなわちアルキル化3-メルカプトプロピオン酸スペーサーを通してコレステロール酸に連結される。アミン、ヒドロキシル及びチオールを介するペプチドアシル化の適切な方法は当業界では公知である。例えば以下を参照されたい：Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382, 1996；Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62, 1982；及びPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13, 1972（ヒドロキシルによるアシル化の方法に関する）；並びにSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180, 2005（チオールによるアシル化の方法に関する）；Bioconjugate Chem.”Chemical Modifications of Proteins: History and Applications”, pp.1, 2-12, 1990；Hashimoto et al., Pharmacuetical Res.“Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity”Vol.6, No: 2 pp.171-176, 1989。
【００９６】
インスリンアナローグアシル化ペプチドのアシル基は、任意のサイズ、例えば任意の長さの炭素鎖であり、さらに線状でも分枝状でもよい。本発明のいくつかの具体的な実施態様では、アシル基はC4からC30の脂肪酸である。例えば、アシル基は以下のいずれかであり得る：C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸、C30脂肪酸。いくつかの実施態様では、アシル基はC8からC20脂肪酸、例えばC4脂肪酸又はC16脂肪酸である。
また別の実施態様では、アシル基は胆汁酸である。該胆汁酸は任意の適切な胆汁酸であり得る。前記にはコール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びコレステロール酸が含まれるがただしこれらに限定されない。
本明細書に記載のアシル化インスリンアナローグは、親水性部分を含むようにさらに改変できる。いくつかの具体的な実施態様では、該親水性部分はポリエチレングリコール（PEG）鎖を含むことができる。親水性部分の取り込みは適切な手段、例えば本明細書に記載の任意の方法により達成できる。いくつかの実施態様では、アシル化アナローグは、Cys、Lys、Orn、ホモ-Cys又はAc-Pheから成る群から選択されるアミノ酸を含み、該アミノ酸の側鎖は親水性部分（例えばPEG）と共有結合される。ある実施態様では、アシル基は、A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28又はB29（自然のままのインスリンA及びB鎖配列のアミノ酸番号付けによる）位に、場合によってCys、Lys、Orn、ホモ-Cys又はAc-Pheを含むスペーサーを介して結合される。
また別には、アシル化インスリンアナローグはスペーサーを含み、ここで該スペーサーはアシル化されかつ改変されて親水性部分を含む。適切なスペーサーの非限定的な例には、Cys、Lys、Orn、ホモ-Cys及びAc-Pheから成る群から選択される1つ以上のアミノ酸を含むスペーサーが含まれる。
【００９７】
インスリンアナローグのアルキル化
いくつかの実施態様では、グリコシル化部位を含むように改変されたインスリンアナローグは、アルキル基を含むようにさらに改変される。該アルキル基は、インスリンアナローグのアミノ酸に直接、又はスペーサーを介してインスリンアナローグのアミノ酸に間接的に共有結合により連結され、ここで該スペーサーは、インスリンアナローグのアミノ酸と該アルキル基との間に位置する。アルキル基は、エーテル、チオエーテル又はアミノ結合を介してインスリンアナローグに結合され得る。例えば、インスリンアナローグは、親水性部分が連結された同じアミノ酸の位置でアルキル化されるか、又は異なるアミノ酸の位置でアルキル化され得る。
アルキル化はインスリンアナローグ内の任意の位置で実施でき、例えばB鎖のC-末端領域内、又は連結部分内の位置が含まれるが、ただしインスリン活性が維持されることを条件とする。本発明の具体的な特徴では、インスリンアナローグは、当該インスリンアナローグのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル又はチオール基の直接アルキル化によってアルキル基を含むように改変される。いくつかの実施態様では、インスリンアナローグは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールにより直接アルキル化される。本発明のいくつかの具体的な実施態様では、インスリンアナローグの直接的アルキル化は、A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28又はB29（自然のままのインスリンA及びB鎖配列のアミノ酸番号付けによる）位のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを通して生じる。
【００９８】
いくつかの実施態様では、インスリンアナローグのアミノ酸は、式I、式II及び式IIIから選択されるアミノ酸を含み、該アルキル基は、式I、式II及び式IIIに含まれる、それぞれアミノ、ヒドロキシル又はチオール基を通して連結される。いくつかの例示的な実施態様では、式Iのアミノ酸はnが4（Lys）又はnが3（Orn）であるアミノ酸である。いくつかの例示的実施態様では、式IIのアミノ酸はnが1（Ser）であるアミノ酸である。式IIのアミノ酸はnが1（Cys）であるアミノ酸である。さらにまた他の実施態様では、側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを含むインスリンアナローグペプチドのアミノ酸は、式I、式II及び式IIIの同じ構造を含む二置換アミノ酸であるが、ただし式I、式II及び式IIIのアミノ酸のアルファ炭素に結合した水素が第二の側鎖で入れ替えらる。
本発明のいくつかの実施態様では、インスリンアナローグは当該ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを含む。いくつかの実施態様では、インスリンアナローグは該スペーサーと共有結合し、該スペーサーは該アルキル基と共有結合する。いくつかの例示的な実施態様では、インスリンアナローグは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル又はチオールのアルキル化によってアルキル基を含むように改変され、ここで該スペーサーは、A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28又はB29（自然のままのインスリンA及びB鎖のアミノ酸番号付けによる）位のアミノ酸の側鎖に結合される。該スペーサーが結合される該インスリンアナローグのアミノ酸は、スペーサーとの結合を許容する部分を含む任意のアミノ酸であり得る（例えば、ただ１ヶ所α-置換されたアミノ酸又はα,α-二置換アミノ酸）。側鎖-NH2、-OH又は-COOHを含む、インスリンアナローグのアミノ酸（例えばLys、Orn、Ser、Asp又はGlu）が適切である。いくつかの実施態様では、インスリンアナローグペプチドとアルキル基との間のスペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸、又は側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むジペプチド又はトリペプチドである。
【００９９】
アルファアミンがアルキル化される事例では、スペーサーアミノ酸はいずれのアミノ酸でもよい。例えば、スペーサーアミノ酸は疎水性アミノ酸、例えばGly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyrであり得る。また別には、スペーサーアミノ酸は酸性残基、例えばAsp及びGluであり得る。例示的な実施態様では、スペーサーアミノ酸は疎水性アミノ酸、例えばGly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-アミノヘキサン酸、5-アミノ吉草酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸であり得る。また別には、スペーサーアミノ酸は酸性残基、例えばAsp及びGluであり得るが、ただしアルキル化が酸性残基のアルファアミンで生じることを条件とする。スペーサーアミノ酸の側鎖アミンがアルキル化される事例では、スペーサーアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸（例えば式Iのアミノ酸、例えばLys又はOrn）である。この事例では、スペーサーアミノ酸のアルファアミン及び側鎖アミンの両方がアルキル化され、それによりペプチドが二アルキル化されることが可能である。本発明の実施態様にはそのような二アルキル化分子が含まれる。
アルキル化がスペーサーのアミノ酸のヒドロキシル基を通して生じるとき、該アミノ酸又はスペーサーのアミノ酸の1つは式IIのアミノ酸であり得る。具体的な例示的実施態様では、該アミノ酸はSerである。アルキル化がスペーサーのアミノ酸のチオール基を通して生じるとき、該アミノ酸又はスペーサーのアミノ酸の1つは式IIIのアミノ酸であり得る。具体的な例示的実施態様では、該アミノ酸はCysである。
【０１００】
いくつかの実施態様では、該スペーサーは親水性二官能性スペーサーを含む。具体的な実施態様では、該スペーサーは、アミノポリ(アルキルオキシ)カルボキシレートを含む。これに関して、スペーサーは、例えばNH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH（式中、mは1から6の任意の整数でnは2から12の任意の整数である）、例えば8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（前記は以下の業者（Peptides International, Inc., Louisville, KY）から市場で入手できる）を含むことができる。いくつかの実施態様では、該インスリンアナローグペプチドと該アルキル基との間のスペーサーは親水性二官能性スペーサーである。ある種の実施態様では、該親水性二官能性スペーサーは、2つ以上の反応基、例えばアミン、ヒドロキシル、チオール及びカルボキシル基又は前記の任意の組合せを含む。ある種の実施態様では、該親水性二官能性スペーサーはヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様では、該親水性二官能性スペーサーはアミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様では、該親水性二官能性スペーサーはチオール基及びカルボキシレートを含む。
【０１０１】
いくつかの実施態様では、該インスリンアナローグペプチドと該アルキル基との間のスペーサーは疎水性二官能性スペーサーである。ある種の実施態様では、該疎水性二官能性スペーサーは2つ以上の反応基、例えばアミン、ヒドロキシル、チオール及びカルボキシル基又は前記の任意の組合せを含む。ある種の実施態様では、該疎水性二官能性スペーサーはヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様では、該疎水性二官能性スペーサーはアミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様では、該疎水性二官能性スペーサーはチオール基及びカルボキシレートを含む。カルボキシレート及びヒドロキシル基又はチオール基を含む、適切な疎水性二官能性スペーサーは当業界で公知であり、例えば、8-ヒドロキシオクタン酸及び8-メルカプトオクタン酸が含まれる。
該スペーサー（例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー又は疎水性二官能性スペーサー）は、長さが3から10原子（例えば6から10原子（例えば6、7、8、9又は10原子））である。より具体的な実施態様では、該スペーサーは長さが約3から10原子（例えば6から10原子）であり、該アルキル基は、C12からC18アルキル基、例えばC14アルキル基、C16アルキル基であり、例えばスペーサー及びアルキル基の全長は14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27又は28原子である。いくつかの実施態様では、スペーサー及びアルキル基の全長は17から28（例えば19から26、19から21）原子である。
【０１０２】
ある実施態様にしたがえば、該二官能性スペーサーは合成又は天然に存在しないアミノ酸で、長さが3から10原子のアミノ酸骨格を含む（例えば6-アミノヘキサン酸、5-アミノ吉草酸、7-アミノヘプタン酸及び8-アミノオクタン酸）。また別には、スペーサーは、長さが3から10原子（例えば6から10原子）のペプチド骨格を有するジペプチド又はトリペプチドであり得る。インスリンアナローグに結合される該ジペプチド又はトリペプチドスペーサーは、天然に存在する及び／又は天然に存在しないアミノ酸（例えば本明細書に教示するアミノ酸のいずれか）で構成され得る。いくつかの実施態様では、該スペーサーは全体的に陰性の荷電を含み、例えば1つ又は2つの陰性荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施態様では、該ジペプチドスペーサーは以下から成る群から選択される：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-アミノ酪酸-γ-アミノ酪酸、及びγ-Glu-γ-Glu。
アミン、ヒドロキシル及びチオールを介するペプチドアルキル化の適切な方法は当業界では公知である。例えば、ウィリアムソンのエーテル合成を用いて、インスリンペプチドとアルキル基との間にエーテル結合を形成できる。さらにまた、アルキルハライドによるペプチドの求核置換反応によってエーテル、チオエーテル又はアミノ結合のいずれかを生成できる。アルキル化されたインスリンアナローグペプチドのアルキル基は任意のサイズ、例えば任意の長さの炭素鎖で、線状又は分枝状であり得る。本発明のいくつかの実施態様では、該アルキル基はC4からC30アルキルである。例えば、該アルキル基は以下のいずれかであり得る：C4アルキル、C6アルキル、C8アルキル、C10アルキル、C12アルキル、C14アルキル、C16アルキル、C18アルキル、C20アルキル、C22アルキル、C24アルキル、C26アルキル、C28アルキル又はC30アルキル。いくつかの実施態様では、該アルキル基はC8からC20アルキル、例えばC14アルキル又はC16アルキルを含む。
【０１０３】
いくつかの具体的な実施態様では、該アルキル基は胆汁酸、例えばコール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びコレステロール酸のステロイド部分を含む。
いくつかの実施態様では、インスリンアナローグは、求核性長鎖アルカンをインスリンアナローグ（求核置換に適切な脱離基を含む）と反応させることによって、アルキル基を含むように改変される。具体的な特徴では、長鎖アルカンの求核基はアミン、ヒドロキシル又はチオール基（例えばオクタデシルアミン、テトラデカノール及びヘキサデカンチオール）を含む。インスリンアナローグの脱離基は、アミノ酸の側鎖の部分であるか、又は該ペプチド骨格の部分であり得る。適切な脱離基には、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲン及びスルホネートエステルが含まれる。
【０１０４】
ある種の実施態様では、インスリンアナローグは、求核性長鎖アルカンをインスリンアナローグ結合スペーサー（ここでスペーサーは脱離基を含む）と反応させることによって、アルキル基を含むように改変される。具体的な特徴では、長鎖アルカンはアミン、ヒドロキシル又はチオール基を含む。ある種の実施態様では、脱離基を含むスペーサーは、本明細書で考察される任意のスペーサー、例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー及び疎水性二官能性スペーサーであり得る（前記はさらに適切な脱離基を含む）。
長鎖アルカンがインスリンアナローグ又はスペーサーによってアルキル化されるとき、該長鎖アルカンは任意のサイズであるか、又は任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは線状でも分枝状でもよい。ある種の特徴では、該長鎖アルカンは、C4からC30アルカンである。例えば、該長鎖アルカンは以下のいずれかであり得る：C4アルカン、C6アルカン、C8アルカン、C10アルカン、C12アルカン、C14アルカン、C16アルカン、C18アルカン、C20アルカン、C22アルカン、C24アルカン、C26アルカン、C28アルカン又はC30アルカン。いくつかの実施態様では、該長鎖アルカンはC8からC20アルカン、例えばC14アルカン、C16アルカン又はC18アルカンを含む。
【０１０５】
さらにまた、いくつかの実施態様では、アルキル化はインスリンアナローグとコレステロール部分との間で生じ得る。例えば、コレステロールのヒドロキシル基は長鎖アルカンの脱離基と入れ替わり、コレステロール-インスリンペプチド生成物を生じる。本明細書に記載するアルキル化インスリンアナローグは、親水性部分を含むようにさらに改変できる。いくつかの具体的な実施態様では、親水性部分は、ポリエチレングリコール（PEG）鎖を含むことができる。親水性部分の取り込みは、任意の適切な手段（例えば本明細書に記載した方法のいずれか）により達成できる。いくつかの実施態様では、インスリンアナローグは、Cys、Lys、Orn、ホモ-Cys又はAc-Pheから選択されるアミノ酸を含むことができ、ここで該アミノ酸の側鎖が親水性部分（例えばPEG）に共有結合される。いくつかの実施態様では、アルキル基は、A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28又はB29（自然のままのインスリンA及びB鎖のアミノ酸番号付けによる）位に、場合によって、Cys、Lys、Orn、ホモ-Cys又はAc-Pheを含み、さらに場合によって別のアミノ酸の側鎖に連結された親水性部分を含むスペーサーを介して結合される。また別には、アルキル化インスリンアナローグはスペーサーを含むことができ、ここで、該スペーサーはアルキル化され、かつ親水性部分を含むように改変されている。適切なスペーサーの非限定的な例には、Cys、Lys、Orn、ホモ-Cys又はAc-Pheから成る群から選択される1つ以上のアミノ酸を含むスペーサーが含まれる。
【０１０６】
複合物
いくつかの実施態様では、グリコシル化部位を含むように改変された、本明細書に開示のインスリンアナローグはさらにアミド化され、カルボキシル化され、リン酸化され、エステル化され、N-アセチル化され、例えばジスルフィド架橋を介して環化され、又は塩に変換され（例えば酸付加塩、塩基付加塩）、及び／又は場合によってダイマー化され、マルチマー化され若しくはポリマー化され、又は複合物化される。本開示はまた、インスリンアナローグが異種部分に連結された複合物を包含する。インスリンアナローグと異種部分との間の複合物化は、共有結合、非共有結合（例えば静電気的相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、塩架橋、疎水性相互作用など）によるか、又は両タイプの結合による。多様な非共有結合性対合形成系（non-covalent coupling system）を用いることができ、前記には、ビオチン-アビジン、リガンド/レセプター、酵素/基質、核酸/核酸結合タンパク質、脂質/脂質結合タンパク質、細胞吸着分子パートナー、又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントが含まれる。いくつかの特徴では、共有結合はペプチド結合である。インスリンアナローグと異種部分との複合物化は間接的又は直接的複合物化であり得るが、前者はリンカー又はスペーサーを必要とし得る。適切なリンカー及びスペーサーは当業界で公知であり、記載した任意のリンカー及びスペーサーが含まれるが、ただしそれらに限定されない。
【０１０７】
本明細書に用いられるように、“異種部分”という用語は“複合物部分”という用語と同義語であり、インスリンアナローグに結合する、インスリンアナローグと別個の任意の分子（化学的又は生化学的な、天然に存在する若しくは存在しない）を指す。インスリンアナローグに連結させることができる例示的な複合物部分には、異種ペプチド若しくはポリペプチド（例えば血漿タンパク質）、標的誘導薬剤、免疫グロブリン若しくはその部分（例えば可変領域、CDR又はFc領域）、診断用標識（例えば放射性同位元素、蛍光団又は酵素標識）、ポリマー（水溶性ポリマーを含む）又は他の治療用若しくは診断用薬剤が含まれるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、インスリンアナローグ及び血漿タンパク質を含む複合物が提供され、ここで前記血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲン及びグロブリンから成る群から選択される。いくつかの実施態様では、該複合物の血漿タンパク質部分はアルブミン又はトランスフェリンである。ある実施態様では、異種部分は、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン（HSA）及び組換えヒト血清アルブミン（rHA）のようなアルブミンを含む）である。いくつかの実施態様の該複合物は、インスリンアナローグ及び1つ以上のポリペプチド、核酸分子、抗体又はそのフラグメント、ポリマー、インスリンアナロガンタムドット（analoguantum dot）、小分子、毒素、診断用薬剤、炭水化物、アミノ酸を含む。
【０１０８】
ポリマー異種部分
いくつかの実施態様では、インスリンアナローグと複合物化される異種部分はポリマーである。いくつかの実施態様では、ポリマーは以下から成る群から選択される：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン及びその誘導体（ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレントレハレートを含む）、アクリル及びメタクリルエステルのポリマー（ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(イソブチルメタクリレート)、ポリ(ヘキシルメタクリレート)、ポリ(イソデシルメタクリレート)、ポリ(ラウリルメタクリレート)、ポリ(フェニルメタクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)及びポリ(オクタデシルアクリレート)を含む）、ポリビニルポリマー（ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリ(ビニルアセテート)及びポリビニルピロリドンを含む）、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそのコポリマー、セルロース（アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ-プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルローストリアセテート及びセルローススルフェートナトリウム塩を含む）、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)及びポリ(エチレンテレフタレート)を含む)並びにポリスチレン。
【０１０９】
いくつかの特徴では、該ポリマーは、以下を含む生物分解性ポリマーである：合成の生物分解性ポリマー(例えば乳酸及びグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリ(オルト)エステル、ポリウレタン、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)及びポリ(ラクチド-コ-カプロラクトン))、及び天然の生物分解性ポリマー、例えばアルギネート並びにデキストラン及びセルロースを含む他の多糖類、コラーゲン、その化学的誘導体(置換、化学基（例えばアルキル、アルキレン）の付加、ヒドロキシル化、酸化及び当業者によって日常的に実施される他の改変)、アルブミン及び他の親水性タンパク質（例えばゼイン及び他のプロラミン並びに疎水性タンパク質）の他に前記の任意のコポリマー及び混合物。一般的に、これらの物質は、酵素的加水分解又はin vivoでの水への曝露によって表面又は全体の腐食により分解される。
いくつかの特徴では、該ポリマーは生物粘着性ポリマー、例えば以下の文献に記載の生物腐食性ヒドロゲル（H.S.Sawhney, C.P.Pathak and J.A.Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587（前記文献の教示は本明細書に含まれる））、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(イソブチルメタクリレート)、ポリ(ヘキシルメタクリレート)、ポリ(イソデシルメタクリレート)、ポリ(ラウリルメタクリレート)、ポリ(フェニルメタクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)及びポリ(オクタデシルアクリレート)である。
【０１１０】
いくつかの特徴では、ポリマーは水溶性ポリマー又は親水性ポリマーである。親水性ポリマーは、本明細書で“親水性異種部分”の項目の下にさらに説明される。適切な水溶性ポリマーは当業界で公知であり、例えば以下が含まれる：ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC；Klucel）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC；Methcel）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ethocel）、ヒドロキシエチルセルロース、多様なアルキルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース、多様なセルロースエーテル、セルロースアセテート、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ビニルアセテート/クロトン酸コポリマー、ポリ-ヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、マレイン酸無水物/メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ナトリウム及びカルシウムポリアクリル酸、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテルコ-マレイン酸無水物、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレングリコール並びにその誘導体、塩及び組合せ。
【０１１１】
ある実施態様では、ポリマーはポリアルキレングリコールであり、例えばポリエチレングリコール（PEG）が含まれる。いくつかの実施態様では、異種部分は炭水化物である。いくつかの実施態様では、該炭水化物は、単糖類（例えばグルコース、ガラクトース、フラクトース）、二糖類（例えばシュクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ糖（例えばラフィノース、スタキオース）、多糖類（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン）である。
いくつかの実施態様では、異種部分は脂質である。前記脂質は、いくつかの実施態様では、脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、N-アシルエタノールアミン、グリセロリピド（例えば、一、二、三置換グリセロール）、グリセロホスホリピド（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴリピド（例えばスフィンゴシン、セラミド）、ステロールリピド（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノ−ルリピド、サッカロリピド、又はポリケチド、油、ロウ、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質である。
【０１１２】
Fc融合異種部分
上記に記したように、いくつかの実施態様では、インスリンアナローグは複合物化、例えば免疫グロブリン又はその部分（例えば可変領域、CDR又はFc領域）と融合される。免疫グロブリンの公知のタイプにはIgG、IgA、IgE、IgD又はIgMが含まれる。Fc領域はIg重鎖のC-末端領域であり、前記は、複数の活性（例えば循環使用（半減期の延長をもたらす）、抗体依存細胞媒介細胞傷害（ADCC）及び補体依存細胞傷害（CDC））を遂行するFcレセプターとの結合に必要である。
例えばいくつかの定義によれば、ヒトIgG重鎖Fc領域は該重鎖のCys226からC-末端に広がる。“ヒンジ領域”は、一般にはヒトIgG1のGlu216からPro230に及ぶ（他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に中心的に含まれるシステインとのアラインメントによって前記IgG1とアラインメントすることができる）。IgGのFc領域は2つの定常ドメイン、CH2及びCH3を含む。ヒトIgG Fc領域のCH2ドメインは、通常アミノ酸231からアミノ酸341に及ぶ。ヒトIgG Fc領域のCH3ドメインは通常アミノ酸342から447に及ぶ。免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメント（又は領域）のアミノ酸の番号付けに関する言及はいずれも以下を基準にする：Kabat et al.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S.Department of Public Health, Bethesda, Md。関連する実施態様では、該Fc領域は、免疫グロブリン重鎖由来の1つ以上の自然のままの又は改変された定常領域を含むことができ、前記領域は、IgG及びIgAのCH1以外の例えばCH2及びCH3領域、又はIgEのCH3及びCH4である。
【０１１３】
適切な複合物部分は、FcRn結合部位を含む免疫グロブリン配列の部分を含む。FcRn（サルベージレセプター）は、免疫グロブリンの循環使用及びそれらの血流循環への返還に必要である。FcRnレセプターに結合するIgGのFc部分の領域は、X-線結晶学により記載されている（Burmeister et al.1994, Nature 372:379）。FcとFcRnとの主要接触領域はCH2とCH3ドメインの結合部に近い。Fc-FcRn接触はいずれもIg重鎖内に存在する。該主要接触部位は、CH2ドメインのアミノ酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及びCH3ドメインのアミノ酸残基385-387、428及び433-436を含む。
【０１１４】
いくつかの複合物部分はFcγR結合部位を含まないことも、又は含むこともある。FcγRはADCC及びCDCに必要である。FcγRとの直接接触をもたらすFc領域内の位置の例は、アミノ酸234−239（下部ヒンジ領域）、アミノ酸265−269（B/Cループ）、アミノ酸297−299（C’/Eループ）及びアミノ酸327−332（F/Gループ）である（Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000）。IgEの下部ヒンジ領域もまたFcRI結合に関係している（Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997）。IgAレセプター結合に必要な残基は以下の文献に記載されている（Lewis et al., J Immunol.175:6694-701, 2005）。IgEレセプター結合に必要なアミノ酸残基は以下の文献に記載されている（Sayers et al., J Biol Chem.279(34):35320-5, 2004）。アミノ酸改変は免疫グロブリンのFc領域に対して実施できる。そのような変種Fc領域は、Fc領域のCH3ドメインの少なくとも1つのアミノ酸改変（残基342−447）及び／又はFc領域のCH2ドメインの少なくとも1つのアミノ酸改変（残基231−341）を含む。FcRnに対する親和性増進を付与すると考えられる変異には、T256A、T307A、E380A及びN434Aが含まれる（Shields et al.2001, J.Biol.Chem.276:6591）。他の変異は、FcRnに対する親和性を顕著に低下させることなく、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB及び／又はFcγRIIIAに対するFc領域の結合を低下させることができる。例えば、Fc領域の297位のAsnのAla又は別のアミノ酸による置換は高度に保存されたN-グリコシル化部位を除去し、さらに免疫原性を低下させると同時に、Fc領域の半減期の延長とともにFcγRとの結合の低下をもたらすことができる（Routledge et al.1995, Transplantation 60:847；Friend et al.1999, Transplantation 68:1632；Shields et al.1995, J.Biol.Chem.276:6591）。FcγRとの結合を低下させるIgG1の233−236位のアミノ酸改変が実施された（Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77；及びArmour et al.1999, Eur.J.Immunol.29:2613）。いくつかの例示的アミノ酸置換は米国特許第7,355,008号及び7,381,408号に記載されている（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【０１１５】
親水性異種部分
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のインスリンアナローグは親水性部分と共有結合される。親水性部分は、タンパク質と活性化ポリマーとの反応に用いられる任意の適切な条件下で該インスリンアナローグと結合できる。当業界で公知のいずれの手段も用いることができ、アシル化、還元性アルキル化、ミカエル付加、チオールアルキル化、又は他の化学選択性複合物化/連結方法（該親水性部分の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α-ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）と標的化合物の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α-ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）による）を介するものが含まれる。該水溶性ポリマーを1つ以上のタンパク質に連結するために用いることができる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジジリン、オキシラン、5-ピリジル及びアルファ-ハロゲン化アシル基（例えばアルファ-ヨード酢酸、アルファ-ブロモ酢酸、アルファ-クロロ酢酸）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。還元性アルキル化によってペプチドに結合される場合、選択されるポリマーはただ1つの反応性アルデヒドを有し、それによりポリマー化が制御されるはずである。例えば以下を参照されたい：Kinstler et al., Adv.Drug.Delivery Rev.54: 477-485, 2002；Roberts et al., Adv.Drug Delivery Rev.54: 459-476, 2002；及びZalipsky et al., Adv.Drug Delivery Rev.16: 157-182, 1995。いくつかの実施態様にしたがえば、該親水性部分（例えばポリエチレングリコール鎖）は、約500から約40,000ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。いくつかの実施態様では、該ポリエチレングリコール鎖は、約500から約5,000ダルトン、又は約1,000から約5,000ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様では、該親水性部分（例えばポリエチレングリコール鎖）は約10,000から約20,000ダルトンの分子量を有する。さらに他の例示的な実施態様では、該親水性部分（例えばポリエチレングリコール鎖）は約20,000から約40,000ダルトンの分子量を有する。線状又は分枝状親水性ポリマーが意図される。生成された複合物の調製物は本質的に単分散性又は多分散性で、ペプチド当たり約0.5、0.7、1、1.2、1.5又は2ポリマー部分を有することができる。
いくつかの実施態様では、該ペプチドの自然のままのアミノ酸は、親水性部分との架橋に適切な側鎖を有するアミノ酸で置換され、該親水性部分の該ペプチドへの結合を促進する。例示的なアミノ酸にはCys、Lys、Orn、ホモ-Cys又はアセチルフェニルアラニン（Ac-Phe）が含まれる。他の実施態様では、親水性基を含むように改変されたアミノ酸は該ペプチドのN-末端又はC-末端に付加される。いくつかの実施態様では、該複合物のペプチドは、該ペプチドのアミノ酸の側鎖と該親水性部分との間の共有結合による連結を介して、親水性部分（例えばPEG）と複合物化される。
【０１１６】
rPEG異種部分
いくつかの実施態様では、該複合物は付属ペプチドと融合されたインスリンアナローグを含み、前記付属ペプチド（例えば組換えPEG（rPEG）分子）は、化学的PEGと類似する伸長構造を形成することができる（前記は、例えば国際特許出願公開WO2009/023270及び米国特許出願公開No.US2008/0286808に記載されたものである）。rPEG分子はポリエチレングリコールではない。いくつかの特徴のrPEG分子は1つ以上のグリシン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン又はプロリンを含むポリペプチドである。いくつかの特徴では、rPEGはホモポリマー、例えばポリ-グリシン、ポリ-セリン、ポリ-グルタミン酸、ポリ-アスパラギン酸、ポリ-アラニン、ポリ-プロリンである。他の実施態様では、rPEGは、2つのタイプのアミノ酸の繰り返し、例えばポリ(Gly-Ser)、ポリ(Gly-Glu)、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Asp)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Ser-Glu)などを含む。いくつかの特徴では、rPEGは3つの異なるタイプのアミノ酸、例えばポリ(Gly-Ser-Glu)を含む。具体的な特徴では、rPEGはインスリンアナローグの半減期を延長する。いくつかの特徴では、rPEGは正味の陽性又は正味の陰性荷電を含む。いくつかの特徴のrPEGは二次構造を欠く。いくつかの実施態様では、rPEGは長さが10アミノ酸以上であり、いくつかの実施態様では長さが約40から約50アミノ酸である。いくつかの特徴の付属ペプチドは、ペプチド結合又はプロテイナーゼ切断部位により本発明のペプチドのN-又はC-末端に融合される。いくつかの特徴のrPEGは親和性タグを含むか、又は5ｋDaより大きいPEGに連結される。いくつかの実施態様では、rPEGは本発明の複合物の流体力学半径、血清半減期、プロテアーゼ耐性を増加させ、さらに、いくつかの特徴では該複合物の免疫原性を低下させる。
【０１１７】
該複合物部分は、該インスリンアナローグの標的アミノ酸残基を、これら標的アミノ酸残基の選択側鎖又はN-若しくはC-末端残基と反応できる誘導有機薬剤と反応させることによって、直接的共有結合を介して当該ペプチドと連結できる。該ペプチド又は該複合物部分の反応基には、例えばアルデヒド、アミノ、エステル、α-ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基が含まれる。誘導薬剤には、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基により複合物化）、N-ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタールアルデヒド、コハク酸無水物又は当業界で公知の他の薬剤が含まれる。また別には、複合物部分は、中間担体（例えば多糖類又はポリペプチド担体）を通して該ペプチドに間接的に連結され得る。多糖類担体の例にはアミノデキストランが含まれる。適切なポリペプチド担体の例には、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、前記のコポリマー及びこれらアミノ酸及び他のもの（例えばセリン）の混合ポリマーが含まれ、生成されたロード担体に所望の溶解性特性を付与する。
【０１１８】
マルチマー
該インスリンアナローグは、リンカーを介して結合された少なくとも2つ、3つ又は4つ以上のペプチドを含むダイマー、トリマー又はより高次のマルチマーであり、ここで少なくとも一方又は両方のペプチドがインスリンアナローグである。ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグは、第二のインスリンポリペプチドのA鎖又はB鎖のどちらかに連結され、前記第二のインスリンポリペプチドはA及びB鎖を含むヘテロ二重体又は第二の単鎖インスリンアナローグである。ダイマーはホモダイマーでもヘテロダイマーでもよい。いくつかの実施態様では、リンカーは、二官能性チオール架橋リンカー及び二官能性アミン架橋リンカーから成る群から選択される。ある種の実施態様では、リンカーはPEG、例えば5ｋDaのPEG、20kDaのPEGである。いくつかの実施態様では、リンカーはジスルフィド結合である。例えば、ダイマーの各モノマーは、Cys残基（例えば末端又は内部に位置するCys）を含み、各Cys残基の硫黄原子はジスルフィド結合の形成に参加できる。本発明のいくつかの特徴では、モノマーは、末端アミノ酸（例えばN-末端又はC-末端）を介して、内部アミノ酸を介して、又は少なくとも一方のモノマーの末端アミノ酸及び他方の少なくとも1つのモノマーの内部アミノ酸を介して結合される。具体的な特徴では、モノマーはN-末端アミノ酸を介しては結合されない。いくつかの特徴では、マルチマーのモノマーは、“尾対尾”の向きで一緒に結び付けられ、各モノマーのC-末端アミノ酸が一緒に結び付けられる。ある実施態様では、ダイマーは2つの単鎖インスリンアナローグを含み、ここで該2つのインスリンアナローグは、各単鎖インスリンアナローグの連結部分に存在するアミノ酸のアミノ酸側鎖を介して互いに連結される。複合物部分は、本明細書に記載の単鎖インスリンアナローグ（ダイマー、トリマー又は高次マルチマーを含む）のいずれにも共有結合により連結することができる。
ある実施態様にしたがえば、本明細書に開示するIGF YL B鎖アナローグを含むマルチマーが提供される（プロドラッグ及びそのデポット誘導体を含む）。該マルチマー（例えばダイマー）はホモダイマーでもヘテロダイマーでもよく、自然のままのインスリン、自然のままのIGF-1、自然のままのIGF-II、インスリンアナローグペプチド及びIGFアナローグペプチドから成る群から選択されるペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、リンカーは、二官能性チオール架橋リンカー及び二官能性アミン架橋リンカーから成る群から選択される。ある種の実施態様では、リンカーはPEG、例えば5ｋDaのPEG、20kDaのPEGである。いくつかの実施態様では、リンカーはジスルフィド結合である。
【０１１９】
制御放出処方物
また別には、本明細書に記載のインスリンアナローグはデポット形に改変され、それにより、本開示のインスリンアナローグが投与された体内に放出される態様が時間及び身体内の位置に関して制御され得る（例えば米国特許4,450,150号を参照されたい）。本開示のインスリンアナローグのデポット形は、例えば本開示のインスリンアナローグ及び多孔質又は無孔物質（例えばポリマー）を含む移植可能な組成物であり、ここで、本開示のインスリンアナローグは、該物質によって被包化されるか若しくは前記物質から拡散されるか、及び／又は該無孔物質の分解によって拡散される。続いて、該デポットは体内の所望の位置に移植され、本開示のインスリンアナローグは、該移植物から予め定められた速度で放出される。
また別には、大きなデポットポリマーを、本明細書に記載のインスリンアナローグに共有結合させた自己切断ジペプチド成分に連結することができる。この実施態様では、該デポットポリマーは、その後で前記ポリマーが非酵素反応を介して予め定めた速度で該アナローグから切断されるまで該インスリンアナローグをその投与部位に効果的に隔離する。自己切断ジペプチドを用いるインスリンアナローグのデポット処方物はPCT/US2009/068713に記載されている（前記文献の開示は参照により本明細書に含まれる）。ある実施態様では、ジペプチドプロドラッグ成分を含むインスリンアナローグが提供され、ここで、該ジペプチドプロドラッグ成分は大きなポリマー（例えばPEG又はデキストラン）に連結される。
【０１２０】
該アナローグを含み、所望のin vivo放出プロフィールを有するように処方された医薬組成物を調製することができる。いくつかの特徴では、該医薬組成物は即時放出、制御放出、持続放出、長期放出、遅延放出又は二相性放出処方物である。制御放出のためのペプチド又は複合物を処方する方法は当業界では公知である。例えば以下を参照されたい：J Pharm 374: 46-52, 2009；及び国際特許出願公開WO 2008/130158；WO2004/033036；WO2000/032218;及び1999/040942。本組成物はさらに、ミセル若しくはリポソーム又は他のいくつかの被包化形を含むことができ、また長期放出形で投与して延長貯蔵及び／又はデリバリー作用を提供することができる。本開示の医薬処方物は、例えば以下を含む任意の管理体制にしたがって投与できる：毎日（1日1回、1日2回、1日3回、1日4回、1日5回、1日6回）、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、毎週、2週間毎、3週間毎、毎月又は2カ月毎。
【０１２１】
インスリンアナローグのプロドラッグ誘導体
本開示はまた、本明細書に開示のインスリンアナローグのプロドラッグアナローグを包含する。有利には、本プロドラッグ処方物は、基礎ペプチドの治療インデックスを改善し、作用の開始を遅らせ、当該インスリンアナローグペプチドの半減期を高める。本開示のプロドラッグの化学作用は活性部位のアミンとの複合物化をもたらしてアミドを形成し、前記アミドは、ジケトピペラジン形成及びプロドラッグ成分の放出に際して親アミンに復帰することができる（国際特許出願PCT/US2009/068713を参照されたい（前記文献の開示は参照により本明細書に含まれる））この新規な生物学的に好ましいプロドラッグの化学作用は、生理学的条件（例えば水性環境でpH約7、37℃）下で偶発的分解をもたらし、酵素分解に依存しない。該プロドラッグアナローグの持続時間はジペプチドプロドラッグ配列の選択によって決定され、したがってプロドラッグ処方物の融通性を可能にする。
ある実施態様では、非酵素性半減期（t1/2）が生理学的条件下で1から100時間であるプロドラッグが提供される。本明細書に開示の生理学的条件は、水性環境で約35から40℃の温度及び約7.0から約7.4のpHを含み、より典型的にはpH7.2から7.4及び36から38℃の温度を含むことが意図される。ある実施態様では、ジペプチド（生理学的条件下でジケトピペラジン形成を経ることができる）は、アミド又はエステル結合を通して共有結合によりインスリンアナローグと連結される（国際出願WO2009/099763及びWO 2010/080607を参照されたい：前記文献の開示は参照により本明細書に含まれる）。
【０１２２】
有利には、切断（したがってプロドラッグの活性化）の速度は、ジペプチド前駆部分の構造及び立体化学とともに求核強度に左右される。本明細書に開示のプロドラッグは、最終的にはインスリン/IGFレセプターによって認識され得る構造に化学的に変換され、この化学的変換速度は、in vivoの生物学的作用の開始時間及び持続時間を決定するであろう。本出願に開示するプロドラッグの化学作用は、付け加えられる化学的添加剤又は酵素に左右されない分子内化学反応を必要とするであろう。変換速度は、ジペプチド置換基の化学的性質及び生理学的条件下での前記の切断によって制御される。生理学的なpH及び温度は高度に規定された範囲内で厳密に調節されるので、プロドラッグから薬剤への変換速度は高度な患者内及び患者間再現性を示すであろう。ある実施態様では、ある単鎖インスリンアナローグのプロドラッグ誘導体が提供され、ここでは該単鎖インスリンアナローグは少なくとも18アミノ酸の連結部分（場合によってグリコシル化部位を含む）を含み、及び／又は場合によって該連結部分のアミノ酸の1つがペジル化される。ある実施態様では、該連結部分は配列番号：66の配列を含む。また別には、或いは該連結部分のアミノ酸のペジル化に加えて、ジペプチドプロドラッグ成分の2つのアミノ酸の1つがペジル化され得る。また別には、或いは上述のペジル化部位と任意に組合せて、該単鎖インスリンプロドラッグ誘導体は、A鎖のA9、A14及びA15から成る群から選択される位置で、B鎖のアミノ末端アミノ酸で、又はB鎖のB10、B22、B28若しくはB29位のいずれかで、又は連結部分の任意の位置でペジル化され得る。
【０１２３】
本明細書に開示するように、インスリンアナローグペプチドが、少なくとも1時間、より典型的には20時間を超えるが100時間未満の延長半減期を有し、さらに固有の化学的不安定性によって駆動される非酵素性反応により生理学的条件で活性形に変換される、プロドラッグが提供される。ある実施態様では、該プロドラッグの非酵素性活性化のt1/2時間は、1−100時間、より典型的には12から72時間であり、ある実施態様では、リン酸緩衝溶液（例えばPBS）にて37℃及びpH7.2で該プロドラッグをインキュベートすることによって測定したとき、該t1/2時間は24−48時間である。ある実施態様では、該プロドラッグの半減期は約1、8、12、20、24、48又は72時間である。ある実施態様では、該プロドラッグの半減期は約100時間以上で、約168、336、504、672又は720時間までの半減期を含み、固有の化学的不安定性によって駆動される非酵素性反応により生理学的条件で活性形に変換される。多様なプロドラッグの半減期は、式t1/2＝0.693/ｋ（式中、ｋは該プロドラッグの分解に関する一次速度定数である）を用いて計算される。ある実施態様では、プロドラッグの活性化は、ペプチドに連結されたアミド結合の切断、並びにジケトピペラジン又はジケトモルフォリン及び活性インスリンアナローグペプチドの形成後に生じる。
【０１２４】
別の実施態様では、ジペプチドプロドラッグ成分はアミド結合を介してインスリンアナローグペプチドに共有結合され、該ジペプチドはさらにジペプチドに連結されたデポットポリマーを含む。ある実施態様では、2つ以上のデポットポリマーが一ジペプチド成分に連結される。ある実施態様では、該デポットポリマーは、ジペプチドプロドラッグ成分を含むアミノ酸の1つの側鎖に連結される。該デポットポリマーは、生物適合性であるように、さらにジペプチドの共有結合によって改変されたインスリンアナローグが注射部位に隔離され続け、及び／又は患者への投与時にその対応するレセプターと相互作用できないように十分なサイズを有するように選択される。その後のジペプチドの切断によって、インスリンアナローグは放出されその目的とする標的と相互作用する。ジペプチド成分保持デポットは、インスリンアナローグの都合のよい任意のアミン基によるアミド結合を介して該インスリンアナローグに連結され得る。前記アミンには、インスリンアナローグのN-末端アミン又は内部の天然若しくは合成アミノ酸のアミン保持側鎖が含まれる。ある実施態様では、ジペプチド成分保持デポットは、該アナローグのA19位に存在する4-アミノフェニルアラニンのアミノ基に連結される。
【０１２５】
ある実施態様にしたがえば、デポットポリマーは当業者に公知の生物適合ポリマーから選択される。該デポットポリマーは、典型的には約20,000から120,000ダルトンの範囲から選択されるサイズを有する。ある実施態様では、該デポットポリマーは、約40,000から100,000又は約40,000から80,000ダルトンの範囲から選択されるサイズを有する。ある実施態様では、該デポットポリマーは、約40,000、50,000、60,000、70,000又は80,000ダルトンのサイズを有する。適切なデポットポリマーには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：デキストラン、ポリラクチド、ポリグリコリド、カプロラクトン系ポリマー、ポリ(カプロラクトン)、ポリ酸無水物、ポリアミン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリホスホエステル、ポリエステル、ポリブチレンテレフタレート、ポリオルトカーボネート、ポリホスファゼン、スクシネート、ポリ(マレイン酸)、ポリ(アミノ酸)、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシセルロース、多糖類、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、並びに前記のコポリマー、ターポリマー及び混合物、並びに生物分解性ポリマー及びそれらのコポリマー（カプロラクトン系ポリマー、ポリカプロラクトン、及びポリエチレンテレフタレート含有コポリマーを含む）。ある実施態様では、該デポットポリマーは、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ酢酸、ポリグリコール酸及び乳酸とグリコール酸のコポリマーから成る群から選択され、ある具体的な実施態様では、デポットポリマーはポリエチレングリコールである。ある実施態様では、デポットポリマーはポリエチレングリコールであり、ジペプチド成分に連結されたデポットポリマーの合計分子量は約40,000から80,000ダルトンである。
【０１２６】
生理学的条件下で分子内分解を促進して活性なインスリンアナローグを放出する、天然又は合成アミノ酸で構成される特定のジペプチドが同定された。該ジペプチドは、該インスリンアナローグに存在するアミノ基に、又は該ペプチド配列の改変によってインスリンアナローグに導入されたアミノ基に（アミド結合を介して）連結され得る。ある実施態様では、ジペプチド構造は、哺乳動物血清に存在するペプチダーゼによる切断に抵抗するように選択される。したがって、ある実施態様では、プロテアーゼの非存在下で切断反応を実施する場合と比較して、血清プロテアーゼの存在下で生理的条件を用いて該反応を実施するとき、生物活性ペプチドからのジペプチドプロドラッグ成分の切断速度は実質的には強化されない（例えば2倍より大きい）。したがって、インスリンアナローグからのジペプチドプロドラッグ成分の切断半減期は、インスリン分解プロテアーゼを含む溶液でのインスリンアナローグからのジペプチドプロドラッグ成分の切断半減期の2倍、3倍、4倍又は5倍を超えない。ある実施態様では、インスリン分解プロテアーゼを含む溶液は血清、より具体的には哺乳動物血清（ヒト血清を含む）である。
【０１２７】
ある実施態様にしたがえば、ジペプチドプロドラッグ成分は構造U-Bを含み、ここでUはアミノ酸又はヒドロキシル酸であり、BはN-アルキル化アミノ酸である。ある実施態様では、U-Bの構造が選択され、ここで該インスリンアナローグからのU-Bの化学的切断は、生理学的条件下のPBS中で約１から約720時間の間に少なくとも約90％が完了する。ある実施態様では、インスリンアナローグペプチドからのU-Bの化学的切断の半減期（t1/2）は、生理学的条件下のPBSで少なくとも約1時間から約1週間である。ある実施態様では、U、B又はU-Bが連結されるインスリンアナローグのアミノ酸は非コードアミノ酸である。いくつかの実施態様では、U及び／又はBはD立体異性体構造のアミノ酸である。いくつかの例示的な実施態様では、UはD立体異性体構造のアミノ酸であり、BはL立体異性体構造のアミノ酸である。いくつかの例示的な実施態様では、UはL立体異性体構造のアミノ酸であり、BはD立体異性体構造のアミノ酸である。いくつかの例示的な実施態様では、UはD立体異性体構造のアミノ酸であり、BはD立体異性体構造のアミノ酸である。ある実施態様では、BはN-アルキル化アミノ酸であるが、プロリンではない。ある実施態様では、アミノ酸Bの該N-アルキル基はC1-C18アルキルであり、ある実施態様では、該N-アルキル化基はC1-C6アルキルである。ある実施態様では、Uは、アルファ炭素で二置換を有するアミノ酸である。
【０１２８】
ある実施態様では、1つ以上のジペプチド成分は、B鎖のN-末端アミノ基又はインスリンアナローグに存在するアミノ酸の側鎖のアミノ基から選択される1つ以上のアミノ基により形成されたアミド結合を通して該インスリンアナローグに連結される。ある実施態様では、インスリンアナローグは2つのジペプチド成分を含み、ここで該ジペプチド成分は場合によってペジル化され、アルキル化され、アシル化され又はデポットポリマーに連結される。ある実施態様にしたがえば、該ジペプチド伸長部は、活性部位に又は活性部位近くに存在するリジン残基の側鎖アミンによりインスリンアナローグと共有結合により連結される。ある実施態様では、該ジペプチド伸長部は合成アミノ酸又は改変アミノ酸を通して結合し、ここで該合成アミノ酸又は改変アミノ酸は、該ジペプチド伸長部の共有結合に適切な官能基を提示する（例えばアミノ-フェニルアラニンの芳香族アミン）。ある実施態様にしたがえば、1つ以上のジペプチド成分は、B鎖のN-末端アミノ基、又は自然のままのインスリンのA19、B16又はB25位に対応する位置に存在する4-アミノ-フェニルアラニン残基の芳香族アミンの側鎖アミノ基から選択されるアミノ基で該インスリンアナローグに連結される。
【０１２９】
ジペプチドプロドラッグ成分は、生理学的条件下において酵素活性の非存在下でインスリンアナローグとの自身のアミド結合を偶発的に切断するように設計される。ある実施態様では、ジペプチドプロドラッグ成分のN-末端アミノ酸はC-アルキル化アミノ酸（例えばアミノイソ酪酸）を含む。ある実施態様では、ジペプチドプロドラッグ成分のC-末端アミノ酸はN-アルキル化アミノ酸（例えばプロリン又はN-メチルグリシン）を含む。ある実施態様では、ジペプチドは、N-末端C-アルキル化アミノ酸とその後にN-アルキル化アミノ酸が続く配列を含む。
出願人らは、A鎖の19位の自然のままのチロシンに対する4-アミノフェニルアラニンアミノ酸部分の選択的挿入は、該インスリンペプチドのポテンシーの低下を生じることなく受け入れられ得ることを見出した（図3参照）。本明細書に開示のジペプチドプロドラッグ成分によるこの活性部位のアミノ基のその後の化学的アミド化はインスリンレセプター結合活性を劇的に低下させ、したがって適切なインスリンプロドラッグを提供する（図7−12参照、前記はインスリン(p-NH2-F)A19と匹敵し得る活性を有することが示されたIGF1Y16L17(p-NH2-F)A19についてのデータを提供する（図4参照））。出願人らは、類似の改変をIGFB16B17アナローグペプチドに実施して、プロドラッグの化学作用のための適切な結合部位を提供できることを見出した。したがって、ある実施態様では、ジペプチドプロドラッグ成分が、インスリン(p-NH2-F)A19又はIGFB16B17インスリンアナローグペプチドのA19 4-アミノフェニルアラニンの芳香環にアミド結合を介して連結され、ここで該ジペプチドのC-末端アミノ酸はN-アルキル化アミノ酸を含み、該ジペプチドのN-末端アミノ酸は任意のアミノ酸である。
【０１３０】
ジペプチドプロドラッグ部分をまたインスリン(p-NH2-F)A19又はIGFB16B17インスリンアナローグペプチドの補足部分に結合させて、インスリン(p-NH2-F)A19又はIGFB16B17インスリンアナローグプロドラッグ誘導体を調製できる。ある実施態様にしたがえば、IGFB16B17インスリンアナローグプロドラッグ誘導体が提供され、前記誘導体は、B鎖のN-末端アミノ基、又は自然のままのインスリンのA19、B16若しくはB25に対応する位置に存在するか又は連結部分に存在する4-アミノ-フェニルアラニン残基の芳香族アミンの側鎖アミノ基にアミド基を介してジペプチドプロドラッグ成分が連結されたB鎖を含む。IGFB16B17インスリンアナローグプロドラッグ誘導体は、自然のままのインスリンA鎖又は自然のままのIGF-1 A鎖又は本明細書に開示した前記の任意のアナローグを含むことができる。ある実施態様では、ジペプチドは、N-末端C-アルキル化アミノ酸とその後に続くN-アルキル化アミノ酸を含む。ある実施態様にしたがえば、単鎖インスリンアナローグプロドラッグ誘導体が提供され、ここで該アナローグを含むA鎖及びB鎖はそれぞれ配列番号：1及び配列番号：2を含むか、又は配列番号：1及び／又は配列番号：2のアナローグを含むことができ、ここで前記アナローグは、自然のままのインスリンと比較して、A19、B16又はB25位に4-アミノフェニルアラニンによるアミノ酸置換、及び／又は自然のままのインスリンのA5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A19及びA21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29及びB30位に対応する位置に1つ以上のアミノ酸置換、又はB1−4及びB26−30に対応する位置のいずれか又は全部の欠失を含む。ある実施態様では、該ジペプチドはインスリンアナローグのB鎖のN-末端アミノ基に連結され、ここでジペプチドのC-末端アミノ酸はN-アルキル化アミノ酸を含み、さらにジペプチドのN-末端アミノ酸は任意のアミノ酸を含むが、ただしジペプチドのC-末端アミノ酸がプロリンであるとき、ジペプチドのN-末端アミノ酸はC-アルキル化アミノ酸を含むことを条件とする。
【０１３１】
ある実施態様では、該ジペプチドプロドラッグ成分は下記式Xの一般構造を含む：
【０１３２】
【化６】
0006392123.tif 000007
【０１３３】
式中、
R1、R2、R4及びR8は、それぞれ別個にH、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4 アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6シクロアルキル)、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)、及びC1-C12アルキル(W)C1-C12アルキル(式中Wは、N、S及びOから成る群から選択されるヘテロ原子である)から成る群から選択されるか、又はR1及びR2はそれらが結合する原子と一緒になってC3-C12シクロアルキル又はアリールを形成するか；又はR4及びR8はそれらが結合する原子と一緒になってC3-C6シクロアルキルを形成し；
R3は、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)NH2、(C1-C18アルキル)SH、(C0-C4アルキル)(C3-C6)シクロアルキル、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4 アルキル)(C6-C10アリール)R7、及び(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり；
R6はH、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR2は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7はH及びOHから成る群から選択される。ある実施態様では、該プロドラッグ成分がインスリンアナローグのN-末端アミンに連結され、さらにR4及びR3が、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成するとき、R1及びR2の少なくとも1つはH以外である。ある実施態様では、該ジペプチド成分のアミノ酸側鎖は、血清アルブミンと結合するために十分なサイズのアシル基でアシル化される。該アシル基は線状でも分枝状でもよく、ある実施態様では、C16からC30脂肪酸である。例えば、該アシル基は、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸又はC30脂肪酸のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、該アシル基はC16からC20脂肪酸、例えばC18脂肪酸又はC20脂肪酸である。
【０１３４】
ある実施態様では、式Xのプロドラッグ成分が提供され、
式中、
R1はH及びC1-C8アルキルから成る群から選択され；
R2、R8及びR4は、それぞれ別個にH、C1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、(C1-C4アルキル)OH、(C1-C4アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4 アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6シクロアルキル)、
(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7及びCH2(C5-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR1及びR2はそれらが結合する原子と一緒になってC3-C8シクロアルキル環を形成し；
R3は、C1-C8アルキル、(C1-C4アルキル)OH、(C1-C4アルキル)SH、(C1-C4アルキル)NH2、(C3-C6)シクロアルキルから成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって5又は6員複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり；
R6はHであるか、又はR6及びR2は、それらが結合する原子と一緒になって5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7はH及びOHから成る群から選択され、R8はHである。ある実施態様では、R3はC1-C8アルキルでありR4は、H、C1-C6アルキル、CH2OH、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7及びCH2(C5-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって5又は6員複素環式環を形成する。さらに別の実施態様では、R5はNHR6であり、さらにR8はHである。
【０１３５】
ある実施態様にしたがえば、該ジペプチド成分は下記式Xの一般構造を有する化合物を含む：
【０１３６】
【化７】
0006392123.tif 000008
【０１３７】
式中、
R1、R2、R4及びR8は、それぞれ別個にH、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4 アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6シクロアルキル)、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)、及びC1-C12アルキル(W1)C1-C12アルキル（式中W1はN、S及びOから成る群から選択されるヘテロ原子である）から成る群から選択されるか、又はR1及びR2はそれらが結合する原子と一緒になってC3-C12シクロアルキルを形成するか、又はR4及びR8は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C6シクロアルキルを形成し；
R3は、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)NH2、(C1-C18アルキル)SH、(C0-C4アルキル)(C3-C6)シクロアルキル、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及び(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり；
R6はH、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7は、H、OH、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4 アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択される。
【０１３８】
別の実施態様では、該ジペプチドプロドラッグ成分は下記の一般構造を含む：
【０１３９】
【化８】
0006392123.tif 000009
【０１４０】
式中、
R1及びR8はそれぞれ別個にH又はC1-C8アルキルであり；
R2及びR4はそれぞれ別個にH、C1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、(C1-C4アルキル)OH、(C1-C4アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+) NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6 シクロアルキル)、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及びCH2(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR1及びR2はそれらが結合する原子と一緒になってC3-C12シクロアルキルを形成し；
R3は、C1-C8アルキル、(C1-C4アルキル)OH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)SH、(C3-C6)シクロアルキルから成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって5又は6員の複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり；
R6はH、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR2はそれらが結合する原子と一緒になって5又は6員の複素環式環を形成し；さらに
R7は、H、OH、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4 アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択されるが、ただし、R4及びR3はそれらが結合する原子と一緒になって5又は6員の複素環式環を形成するとき、R1及びR2はともにHでないことを条件とする。ある実施態様では、R7はH又はOHである。ある実施態様では、ジペプチドプロドラッグ成分の第一のアミノ酸及び／又は第二のアミノ酸はD立体異性体構造のアミノ酸である。
【０１４１】
さらに別の実施態様では、式Xのプロドラッグ成分が提供され、式中、
R1はH及び C1-C8アルキルから成る群から選択され；さらに
R2及びR4はそれぞれ別個にH、C1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、(C1-C4アルキル)OH、(C1-C4アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6 シクロアルキル)、 (C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及びCH2(C5-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR1及びR2はそれらが結合する原子と一緒になってC3-C8シクロアルキル環を形成し；
R3は、C1-C8アルキル、(C1-C4アルキル)OH、(C1-C4アルキル)SH、(C1-C4アルキル)NH2、(C3-C6)シクロアルキルから成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって5又は6員の複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり；
R6はHであるか、又はR6及びR2はそれらが結合する原子と一緒になって5又は6員の複素環式環を形成し；
R7は、H、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4 アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択され、さらにR8はHであるが、ただし、該ペプチド成分がN-末端アミンに連結され、R4及びR3が、それらが結合する原子と一緒になって5又は6員の複素環式環を形成するとき、R1及びR2はともにHでないことを条件とする。ある実施態様では、該ジペプチドプロドラッグ成分の第一のアミノ酸及び／又は第二のアミノ酸はD立体異性体構造のアミノ酸である。
【０１４２】
他の実施態様では、該ジペプチドプロドラッグ成分は式Xの構造を有し、式中、
R1及びR8は、それぞれ別個にH又はC1-C8アルキルであり；
R2及びR4はそれぞれ別個にH、C1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、(C1-C4アルキル)OH、(C1-C4アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6 シクロアルキル)、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及びCH2(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR1及びR2はそれらが結合する原子と一緒になってC3-C12シクロアルキル環を形成し；
R3はC1-C18アルキルであり；
R5はNHR6であり；
R6はH又はC1-C8アルキルであり；さらに
R7は、H、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4 アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択され。
【０１４３】
さらに別の実施態様では、該ジペプチドプロドラッグ成分は式Xの構造を有し、式中、
R1及びR2は、それぞれ別個にC1-C18アルキル又は(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7であるか、又はR1及びR2は-(CH2)p(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C18アルキルであり；
R4及びR8は各々水素であり；
R5はNH2であり；さらに
R7は、水素、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4 アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択される。
さらに別の実施態様では、該ジペプチドプロドラッグ成分は式Xの構造を有し、式中、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C4アルキル)NH2、及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択されるか、又はR1及びR2は、(CH2)p(式中pは2−9である) により連結され；
R3は、C1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4はそれらが結合する原子と一緒になって4−12複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択され；
R5はNH2であり；さらに
R7は、H、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4 アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択されるが、ただしR1及びR2はともに水素ではなく、R4及びR8の少なくとも1つは水素であるということを条件とする。
【０１４４】
別の実施態様では、該ジペプチドプロドラッグ成分は式Xの構造を有し、式中、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及び(C1-C4アルキル)NH2から成る群から選択されるか、又はR1及びR2は、(CH2)p(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C8アルキルであるか、又はR3及びR4はそれらが結合する原子と一緒になって4−6複素環式環を形成し；
R4は水素及びC1-C8アルキルから成る群から選択され；
R8は水素であり；さらに
R5はNH2であるが、ただしR1及びR2はともに水素ではないことを条件とする。
さらに別の実施態様では、該ジペプチドプロドラッグ成分は式Xの構造を有し、式中、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及び(C1-C4アルキル)NH2から成る群から選択され；
R3は、C1-C6アルキルであり；
R4及びR8は各々水素であり；さらに
R5はNH2であるが、ただしR1及びR2はともに水素ではないことを条件とする。
別の実施態様では、該ジペプチドプロドラッグ成分は式Xの構造を有し、式中、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及び(C1-C4アルキル)NH2から成る群から選択されるか、又はR1及びR2は(CH2)p(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C8アルキルであり；
R4は(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7であり；
R5はNH2であり；
R7は、水素、C1-C8アルキル及び(C0-C4アルキル)OHから成る群から選択され；
R8は水素であるが、ただしR1及びR2はともに水素ではないことを条件とする。
【０１４５】
別の実施態様では、該ジペプチドプロドラッグ成分は式Xの構造を有し、式中、
R1は、水素、C1-C8アルキル及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択され；
R2は水素であり；
R3はC1-C18アルキルであり；
R4及びR8は各々水素であり；
R5はNHR6又はOHであり；
R6はH、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1はそれらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員の複素環式環を形成し；さらに
R7は、水素、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4 アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択されるが、ただしR1がアルキル又は(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7である場合、R1及びR6は、それらが結合する原子と一緒になって4−11複素環式環を形成することを条件とする。
【０１４６】
ある実施態様では、A鎖及びB鎖を含む単鎖インスリンアナローグが提供され、ここでB鎖のカルボキシ末端は、CTPペプチドを含む連結部分を介して前記A鎖のアミノ末端に連結される。ある実施態様では、構造：IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、ここでIBは配列R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、LMは、配列番号：66のペプチド又は少なくとも58％のアミノ酸がセリン若しくはプロリンである連続する29アミノ酸配列を含む連結部分であり、該連結部分はIBをIAに共有結合により連結し、さらにIAは、配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）を含み、ここでX45と指定されるアミノ酸は、該連結部分に直接結合されるフェニルアラニン又はチロシンである。ある実施態様では、構造：IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、ここでIBは、配列J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45（配列番号：16）又は配列番号：16の5、6、9、10、16、18、19及び21位から選択される1から3つのアミノ酸改変だけ配列番号：16と異なる配列を含み、LMは、配列番号：66のペプチド又は少なくとも58％のアミノ酸がセリン若しくはプロリンである連続する29アミノ酸配列を含む連結部分であり、該連結部分はIBをIAに共有結合により連結し、さらにIAは、配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）又は配列番号：16の5、8、9、10、14、15、17、18及び21位から選択される1から3つのアミノ酸改変だけ配列番号：15と異なる配列を含み、JはH又はU-Bの一般構造（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸であり、Bはアミド結合により連結されるN-アルキル化アミノ酸である）を含むジペプチド成分であり；
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X9は、セリン、アルギニン、オルニチン、リジン又はアラニンであり；
X10は、イソロイシン又はセリンであり；
X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；
X14は、チロシン、アルギニン、オルニチン、リジン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、オルニチン、リジン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、XはOH又はNHR10（R10は、H又は一般構造U-B（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸で、BはN-アルキル化アミノ酸である）を含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０１４７】
【化９】
0006392123.tif 000010
【０１４８】
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X36は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、X12はOH及びNHR11（R11は一般構造U-Bを含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０１４９】
【化１０】
0006392123.tif 000011
【０１５０】
X41は、グルタミン酸、 アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、オルニチン、リジン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、X13は、H、OH及びNHR12（R12はH又は一般構造U-Bを含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０１５１】
【化１１】
0006392123.tif 000012
【０１５２】
R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及びN-末端アミンから成る群から選択され；
R23は、結合又は1から6つの荷電アミノ酸を含むアミノ酸配列であり；さらに
R13はCOOH又はCONH2である。ある実施態様では、R10、R11及びR12の1つだけがU-Bである。ある実施態様では、X12はOHであり、X13はH又はOHであり、さらにJ及び／又はXはU-Bである。ある実施態様では、X12はOHであり、X13はOHであり、R23は結合であり、JはHであり、さらにXはU-Bである。さらに別の実施態様では、X28、X25及びX30は各々ヒスチジンである。ある実施態様では、該連結部分は、配列SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK（配列番号：79）又はSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR（配列番号：64）を含む。別の実施態様では、該単鎖インスリンアナローグペプチドは、配列番号：15のA鎖ペプチド配列及び配列番号：16のB鎖ペプチド配列を含む。ある実施態様では、R23は結合であるか、又はアミノ酸配列X60X61X62X63X64X65K（配列番号：19）を含み、式中X60は、グリシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸から成る群から選択され、さらにX61、X62、X63、X64及びX65はそれぞれ別個にグルタミン酸又はアスパラギン酸である。ある実施態様では、UはC-アルキル化アミノ酸又はC-アルキル化ヒドロキシル酸であり、BはN-アルキル化アミノ酸である。
【０１５３】
ある実施態様では、構造：IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、式中、IBは、配列J-R23R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCG ERGFF（配列番号：24）を含み、LMは本明細書に開示のCTPペプチドを含む連結部分であり、IAは、配列GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23（配列番号：23）を含み、式中、
X8は、スレオニン及びヒスチジンから成る群から選択され；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X19は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、XはOH又はNHR10（R10は、H又は一般構造U-B（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸で、BはN-アルキル化アミノ酸である）を含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０１５４】
【化１２】
0006392123.tif 000013
【０１５５】
X23はアスパラギン又はグリシンであり；
X25は、ヒスチジン及びスレオニンから成る群から選択され；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
R22は、FVNQ（配列番号：10）、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及びN-末端アミンから成る群から選択され；さらに
R23は、結合又は1から6つの荷電アミノ酸を含むアミノ配列である。
【０１５６】
さらに別の実施態様では、B鎖は配列X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1（配列番号：25）を含み、式中、
X22は、フェニルアラニン及びデスアミノ-フェニルアラニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン及びスレオニンから成る群から選択され；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
Z1は、アスパルテート-リジン、リジン-プロリン及びプロリン-リジンから成る群から選択されるジペプチドであり；さらに
B1は、スレオニン、アラニン又はスレオニン-アルギニン-アルギニントリペプチドから成る群から選択される。
ある実施態様にしたがえば、構造：IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、式中、IBは配列X25LCGX29X30LVEALYLVCG ERGFF（配列番号：24）を含み、LMはIBとIAを共有結合により連結する本明細書に開示の連結部分であり、IAは配列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21（配列番号：26）を含み、ここで、配列番号：24のC-末端フェニルアラニン残基は、介在アミノ酸を全く存在させることなく連結部分LMに直接共有結合される。
【０１５７】
ある実施態様では、構造：IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、式中、IBは配列J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45（配列番号：28）を含み、LMは本明細書に開示の連結部分であり、IAは配列GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：15）を含み、式中、
Jは、H又はU-Bの一般構造（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸であり、Bはアミド結合により連結されるN-アルキル化アミノ酸である）を含むジペプチド成分であり；
X4は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり；
X8は、ヒスチジン又はフェニルアラニンであり；
X9及びX14は、それぞれ別個にアルギニン、オルニチン、リジン又はアラニンから選択され；
X15は、アルギニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン又はスレオニンであり；
X19は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、XはOH又はNHR10（R10は、H又は一般構造U-B（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸で、BはN-アルキル化アミノ酸である）を含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０１５８】
【化１３】
0006392123.tif 000014
【０１５９】
X21は、アラニン、グリシン又はアスパラギンであり；
R22は、共有結合、AYRPSE（配列番号：11）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド及びグルタミン酸から成る群から選択され；
R23は、結合又は1から6つの荷電アミノ酸を含むアミノ酸配列であり；
X25は、ヒスチジン及びスレオニンから成る群から選択され；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、X13は、H、OH及びNHR12（R12は一般構造U-Bを含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；さらに
【０１６０】
【化１４】
0006392123.tif 000015
【０１６１】
R13は、COOH又はCONH2であるが、ただしJ、X及びX13の１つ及び１つだけがU-Bを含むことを条件とする。ある実施態様では、JはHであり、X13はOHであり、XはNH-U-Bである。
【０１６２】
ある実施態様では、ジペプチドプロドラッグ成分のU及びBは、哺乳動物血清中の酵素によってインスリンペプチドからU-Bジペプチドが酵素的に切断されることを阻害するように選択される。ある実施態様では、U及び／又はBは、生理学的条件下のPBS中でのインスリンペプチドからのU-B切断半減期が、インスリン分解プロテアーゼを含む溶液中での該インスリンペプチドからのU-B切断半減期の2倍を超えない（すなわち、インスリンプロドラッグからのU-B切断は、酵素非存在下での同一条件と比較してプロテアーゼ存在下及び生理学的条件下で2倍より速い速度では生じない）ように選択される。ある実施態様では、U、B、又はU-Bが連結されるインスリンペプチドのアミノ酸は非コードアミノ酸である。ある実施態様では、U及び／又はBはD立体異性体構造のアミノ酸である。いくつかの例示的な実施態様では、UはD立体異性体構造のアミノ酸であり、BはL立体異性体構造のアミノ酸である。いくつかの例示的実施態様では、UはL立体異性体構造のアミノ酸であり、BはD立体異性体構造のアミノ酸である。いくつかの例示的実施態様では、UはD立体異性体構造のアミノ酸であり、BはD立体異性体構造のアミノ酸である。ある実施態様では、U-Bは、本明細書に定義した式Xの構造を含むジペプチドである。ある実施態様では、BはN-アルキル化アミノ酸であるが、プロリンではない。
【０１６３】
ある実施態様にしたがえば、B鎖のカルボキシ末端はA鎖のアミノ末端に連結部分を介して連結される、ヒトインスリンのA鎖及びB鎖を含む単鎖インスリンアゴニストポリペプチド又はそのアナローグ若しくは誘導体が提供される。ある実施態様では、該連結部分は、6−16のモノマーユニットのポリエチレングリコール及びCTPペプチドを含む。
ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグは構造IB-LM-IAを含み、ここで、IBは配列J-R23R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45（配列番号：16）を含み、LMは本明細書に開示のCTPペプチドを含む連結部分であり、さらにIAは配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）を含み、式中、
Jは、H又はU-Bの一般構造（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸であり、Bはアミド結合により連結されるN-アルキル化アミノ酸である）を含むジペプチド成分であり；
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X10は、イソロイシン又はセリンであり；
X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；
X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、XはOH、OCH3又はNHR10（R10は、H又は一般構造U-B（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸で、BはN-アルキル化アミノ酸である）を含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０１６４】
【化１５】
0006392123.tif 000016
【０１６５】
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X36は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、X12はOH及びNHR11（R11は一般構造U-Bを含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０１６６】
【化１６】
0006392123.tif 000017
【０１６７】
X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、X13は、H、OH及びNHR12（R12はH又は一般構造U-Bを含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０１６８】
【化１７】
0006392123.tif 000018
【０１６９】
R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及び結合から成る群から選択され；
R23は、結合又は1から6つの荷電アミノ酸を含むアミノ酸配列であり；さらに
R13はCOOH又はCONH2であるが、ただしU、B又はU-Bが連結される該単鎖インスリンアゴニストが非コードアミノ酸であることを条件とする。ある実施態様では、構造IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、ここでIBは配列R23R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、LMは本明細書に開示のCTPペプチドを含む連結部分であり、さらにIAは配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）を含み、式中
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X10は、イソロイシン又はセリンであり；
X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；
X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、XはOH又はNHR10（R10は、H又は一般構造U-B（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸で、BはN-アルキル化アミノ酸である）を含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０１７０】
【化１８】
0006392123.tif 000019
【０１７１】
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；
R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及び結合から成る群から選択され；
R23は、H又は1から6つの荷電アミノ酸を含むアミノ酸配列であり；さらに
R13は、COOH又はCONH2である。ある実施態様では、n又はkの少なくとも1つは1である。ある実施態様では、n及びkはともに1である。さらに別の実施態様では、B鎖のカルボキシ末端は、F、Y、FN、YT、FNK、YTP、FNPK（配列番号：47）、FNKP（配列番号：45）、YTPK（配列番号：46）、YTPKT（配列番号：12）、YTKPT（配列番号：48）、FNKPT（配列番号：44）及びFNPKT（配列番号：49）から成る群から選択される補足アミノ酸伸長部を含む。ある実施態様では、R23及びR22は、AYRPSE（配列番号：11）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及びHから成る群から選択される。
【０１７２】
ある実施態様では、R23はH又は4から7アミノ酸のアミノ酸配列であり、後者では、N-末端アミノ酸はグリシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸から成る群から選択され、C-末端アミノ酸はリジンであり、さらに当該配列の他のアミノ酸はそれぞれ別個にグルタミン酸及びアスパラギン酸から成る群から選択される。さらにR22は、AYRPSE（配列番号：11）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及びHから成る群から選択される。
ある実施態様では、U-Bは下記式Xの構造を含み：
【０１７３】
【化１９】
0006392123.tif 000020
【０１７４】
式中、
R1、R2、R4及びR8はそれぞれ別個にH、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6シクロアルキル)、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10 アリール)R7、(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)、及びC1-C12アルキル(W1)C1-C12アルキルから成る群から選択され、W1はN、S及びOから成る群から選択されるヘテロ原子であるか、又は
R1及びR2は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C12シクロアルキル又はアリールを形成するか；又は 
R4及びR8は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C6シクロアルキルを形成し；
R3は、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)NH2、(C1-C18アルキル)SH、(C0-C4アルキル)(C3-C6)シクロアルキル、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及び(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり;
R6は、H、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7は、H、OH、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択される。ある実施態様ではR1又はR2のどちらかはH以外である。
【０１７５】
別の実施態様では、構造IB-LM-IAを含む単鎖インスリンアナローグが提供され、ここで、IBは配列J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、LMは本明細書に開示するCTPペプチドを含む連結部分を含み、さらにIAは配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）を含み、式中、
Jは、H又はU-B（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸で、Bはアミド結合により連結されたN-アルキル化アミノ酸である）の一般構造を含むジペプチドであり、
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X10は、イソロイシン又はセリンであり；
X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；
X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、XはOH又はNHR10（R10は、H又は一般構造U-B（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸で、BはN-アルキル化アミノ酸である）を含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０１７６】
【化２０】
0006392123.tif 000021
【０１７７】
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、X13は、H、OH及びNHR12（R12はH又は一般構造U-Bを含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０１７８】
【化２１】
0006392123.tif 000022
【０１７９】
R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及び結合から成る群から選択され；
R23は、結合又は1から6つの荷電アミノ酸を含むアミノ酸配列であり；さらに
R13は、COOH又はCONH2である。さらに別の実施態様では、B鎖のカルボキシ末端は、F、Y、FN、YT、FNK、YTP、FNPK（配列番号：47）、FNKP（配列番号：45）、YTPK（配列番号：46）、YTPKT（配列番号：12）、YTKPT（配列番号：48）、FNKPT（配列番号：44）及びFNPKT（配列番号：49）から成る群から選択される補足アミノ酸伸長部を含む。
ある実施態様では、R23は、結合又はX60X61X62X63X64X65K（配列番号：19）であり、式中、X60はグリシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸から成る群から選択され、さらにX61、X62、X63、X64及びX65は、それぞれ別個にグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、さらにR13は、COOH又はCONH2である。
【０１８０】
ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグは構造IB-LM-IAを含み、ここでIBは配列J- R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45（配列番号：16）を含み、LMは本明細書に開示したCTPペプチドを含む連結部分であり、IAは配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）を含む。ある実施態様では、B鎖のカルボキシ末端は、F、Y、FN、YT、FNK、YTP、FNPK（配列番号：47）、FNKP（配列番号：45）、YTPK（配列番号：46）、YTPKT（配列番号：12）、YTKPT（配列番号：48）、FNKPT（配列番号：44）及びFNPKT（配列番号：49）から成るアミノ酸末端伸長部を有する。
ある実施態様では、R23は、N-末端アミン又はX60X61X62X63X64X65K（配列番号：19）であり、式中、X60はグリシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸から成る群から選択され、さらにX61、X62、X63、X64及びX65は、それぞれ別個にグルタミン酸又はアスパラギン酸である。ある実施態様にしたがえば、ジペプチド成分U-Bは下記式Xの構造を含む：
【０１８１】
【化２２】
0006392123.tif 000023
【０１８２】
式中、
（a）R1、R2、R4及びR8はそれぞれ別個にH、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6シクロアルキル)、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10 アリール)R7、(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)、及びC1-C12アルキル(W1)C1-C12アルキルから成る群から選択され、W1はN、S及びOから成る群から選択されるヘテロ原子であるか、又は
（ii）R1及びR2は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C12シクロアルキル又はアリールを形成するか；又は 
（iii）R4及びR8は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C6シクロアルキルを形成し；
（b）R3は、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)NH2、(C1-C18アルキル)SH、(C0-C4アルキル)(C3-C6)シクロアルキル、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及び(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；
（c）R5はNHR6又はOHであり;
（d）R6は、H、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR2は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
（e）R7はH及びOHから成る群から選択される。ある実施態様では、R1又はR2のどちらかはH以外である。
ある実施態様にしたがえば、ジペプチド成分U-Bは下記の構造を含む：
【０１８３】
【化２３】
0006392123.tif 000024
【０１８４】
式中、
R1、R2、R4及びR8はそれぞれ別個にH、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6シクロアルキル)、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10 アリール)R7、(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)、及びC1-C12アルキル(W1)C1-C12アルキルから成る群から選択され、W1はN、S及びOから成る群から選択されるヘテロ原子であるか、又は
R1及びR2は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C12シクロアルキルを形成するか；又は R4及びR8は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C6シクロアルキルを形成し；
R3は、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)NH2、(C1-C18アルキル)SH、(C0-C4アルキル)(C3-C6)シクロアルキル、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及び(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり;
R6は、H、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7は、水素、OH、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択される。ある実施態様では、R1又はR2のどちらかはH以外である。
【０１８５】
ある具体的な実施態様では、ジペプチド成分は式Xの構造を含み、式中、
R1及びR2は、それぞれ別個にC1-C18アルキル又はアリールであり；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4はそれらが結合する原子と一緒になって4−12員複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル及びアリールから成る群から選択され；さらに
R5はアミン又はヒドロキシルである。
別の具体的な実施態様では、ジペプチド成分は式Xの構造を含み、式中、
R1は水素、C1-C18アルキル又はアリールから選択されるか、又はR1及びR2は-(CH2)p-（pは2−9である）により連結され；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4はそれらが結合する原子と一緒になって4−6員複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル及びアリールから成る群から選択され；さらに
R5はアミン又はN-置換アミンである。
別の具体的な実施態様では、ジペプチド成分は式Xの構造を含み、式中、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル及びアリールから成る群から選択され；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4はそれらが結合する原子と一緒になって4−6員複素環式環を形成し；
R4及びR8は各々水素であり；さらに
R5は、アミン、N-置換アミン及びヒドロキシルから成る群から選択される。
【０１８６】
ある実施態様にしたがえば、単鎖インスリンアナローグのプロドラッグ形は構造IB-LM-IAを含み、ここでIBは配列R22HLCGSX30LVEALYLVCG ERGFF（配列番号：56）又はX22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1（配列番号：25）を含み、LMは本明細書に開示したCTPペプチドを含む連結部分であり、さらにIAは配列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13（配列番号：26）又はGIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：15）を含み、式中、
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X9は、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X14は、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、下記一般構造のアミノ酸であり；
【０１８７】
【化２４】
0006392123.tif 000025
【０１８８】
式中、
m1は1から3の範囲の整数であり；
R1、R2、R4及びR8はそれぞれ別個にH、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6シクロアルキル)、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10 アリール)R7、(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)、及びC1-C12アルキル(W1)C1-C12アルキルから成る群から選択され、W1はN、S及びOから成る群から選択されるヘテロ原子であるか、又は
R1及びR2は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C12シクロアルキル又はアリールを形成するか；又はR4及びR8は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C6シクロアルキルを形成し；
R3は、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)NH2、(C1-C18アルキル)SH、(C0-C4アルキル)(C3-C6)シクロアルキル、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及び(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり;
R6は、H、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7は、水素、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択され；
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；
X22は、フェニルアラニン及びデスアミノ-フェニルアラニンから成る群から選択され；
X23は、アスパラギン又はグリシンであり；
X25は、ヒスチジン及びスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
Z1は、アスパルテート-リジン、リジン-プロリン及びプロリン-リジンから成る群から選択されるジペプチドであり；さらに
B1は、スレオニン、アラニン又はスレオニン-アルギニン-アルギニントリペプチドから成る群から選択される。
R22は、X22VNQ（配列番号：50）、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン及びN-末端アミンから成る群から選択され；さらに
R13は、COOH又はCONH2である。ある実施態様では、m1は1である。ある実施態様にしたがえば、単鎖インスリンアナローグは構造IB-LM-IAを含み、ここでIBは配列X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1（配列番号：25）を含み、LMは本明細書に開示したCTPペプチドを含む連結部分であり、さらにIAは配列GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：15）を含む。
【０１８９】
ある実施態様では、単鎖インスリンアナローグは式：IB-LM-IAの化合物を含み、ここでIBは配列GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT（配列番号：6）又はGPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNPKT（配列番号：52）を含むIGF YL B鎖を表し、LMは配列番号：66を含む連結部分を表し、さらにIAは配列GIVDECCHRSCDLRRLEMX19CA-R13（配列番号：61）又はGIVDECCHOSCDLOOLQMX19CN-R13（配列番号：43）又は自然のままのインスリン配列GIVEQCCTSICSLYQLENX19CN-R13（配列番号：61）を含むIGF A鎖を表し、ここで、
X18はヒスチジン又はフェニルアラニンであり；
X19は、下記一般構造のアミノ酸であり；
【０１９０】
【化２５】
0006392123.tif 000026
【０１９１】
式中、XはOH又はNHR10から成る群から選択され、ここでR10は下記一般構造を含むジペプチドであり；
【０１９２】
【化２６】
0006392123.tif 000027
【０１９３】
R1はH及びC1-C8アルキルから成る群から選択され；
R2及びR4はそれぞれ別個にH、C1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、(C1-C4アルキル)OH、(C1-C4アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+) NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6 シクロアルキル) 、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7及びCH2(C5-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR1及びR2はそれらが結合する原子と一緒になってC3-C6シクロアルキルを形成し；
R3は、C1-C8アルキル、(C1-C4アルキル)OH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)SH、(C3-C6)シクロアルキルから成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって5又は6員の複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり；
R6はHであるか、又はR6及びR2はそれらが結合する原子と一緒になって5又は6員の複素環式環を形成し； 
R7は、H及びOHから選択され；さらに
R8はHであり；さらに
R13及びR14は、それぞれ別個にCOOH又はCONH2である。ある実施態様では、R1又はR2のどちらかはH以外である。本発明はまた、本明細書に開示したインスリンアナローグのA鎖及びB鎖の任意の組合せを包含し、前記ペプチドは、式IB-LM-IAの単鎖インスリンアナローグとして本明細書に開示の連結部分を介して一緒に連活される。
【０１９４】
ジペプチドプロドラッグ成分
ジペプチドプロドラッグ成分の置換基及び該インスリンアナローグへのその付加部位を選択して、所望の半減期を有する、本明細書に開示したインスリンアナローグのプロドラッグアナローグを提供できる。例えば、下記構造を含むジペプチドプロドラッグ成分がインスリンアナローグB鎖のN-末端アミノ酸のアルファアミノ基に連結されるとき、
【０１９５】
【化２７】
0006392123.tif 000028
【０１９６】
生理学的条件下のPBS中で約1時間のt1/2を有する化合物が以下の場合に提供される：
R1及びR2はそれぞれ別個にC1-C18アルキル又はアリールであるか、又はR1及びR2は-(CH2)p(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C18アルキルであり；
R4及びR8は各々水素であり；さらに
R5はアミンである。
他の実施態様では、N-末端で連結され、さらに約1時間のt1/2を有するプロドラッグは、下記構造を有するジペプチドプロドラッグ成分を含む：
【０１９７】
【化２８】
0006392123.tif 000029
【０１９８】
式中、
R1及びR2は、それぞれ別個にC1-C18アルキル又は(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7であるか、又はR1及びR2は-(CH2)p(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C18アルキルであり；
R4及びR8は各々水素であり； 
R5はNH2であり；
R7は、水素、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択され；さらに
R8はHである。
また別にある実施態様では、インスリンアナローグプロドラッグ誘導体が提供され、ここで該ジペプチドプロドラッグは、該インスリンアナローグB鎖のN-末端アミノ酸のアルファアミノ基に連結され、さらに該プロドラッグは生理学的条件下のPBS中で約6から約24時間のt1/2を有する。ある実施態様では、生理学的条件下のPBS中で約6から約24時間のt1/2を有するインスリンアナローグプロドラッグ誘導体が提供され、ここで該プロドラッグ成分は式Xの構造を有し、さらに
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル及びアリールから成る群から選択されるか、又はR1及びR2は-(CH2)p(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4はそれらが結合する原子と一緒になって4−12員の複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及びアリールから選択され；さらに
R5はアミンであるが、ただし、R1及びR2はともに水素ではなく、R4又はR8の1つが水素であることを条件とする。
【０１９９】
さらに別の実施態様では、インスリンアナローグプロドラッグ誘導体が提供され、ここで、該ジペプチドプロドラッグは、該インスリンアナローグB鎖のN-末端アミノ酸のアルファアミノ基に連結され、さらに該プロドラッグは生理学的条件下のPBS中で約72から約168時間のt1/2を有する。ある実施態様では、生理学的条件下のPBS中で約72から約168時間のt1/2を有するインスリンアナローグプロドラッグ誘導体が提供され、ここで該プロドラッグ成分は式Xの構造を有し、さらに
R1は、水素、C1-C8アルキル及びアリールから成る群から選択され；
R2はHであり；
R3はC1-C18アルキルであり；
R4及びR8は各々水素であり；さらに 
R5は、アミン又はN-置換アミン又はヒドロキシルであるが、ただし、R1がアルキル又はアリールである場合、R1及びR5はそれらが結合する原子と一緒になって4−11員の複素環式環を形成することを条件とする。
【０２００】
いくつかの実施態様では、該インスリンアナローグB鎖ペプチドのN-末端アルファアミノ酸に連結されたジペプチドプロドラッグ成分を有し、さらに例えば約12から約72時間、又はいくつかの実施態様では約12から約48時間のt1/2を有するプロドラッグは、下記構造のジペプチドプロドラッグ成分を含み：
【０２０１】
【化２９】
0006392123.tif 000030
【０２０２】
式中、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C4アルキル)NH2及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択されるか、又はR1及びR2は-(CH2)p(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4はそれらが結合する原子と一緒になって4−12員の複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択され；
R5はNH2であり；さらに
R7は、H、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択されるが；
ただし、R1及びR2はともに水素ではなく、R4又はR8の1つが水素であることを条件とする。
いくつかの実施態様では、該インスリンアナローグB鎖ペプチドのN-末端アミノ酸に連結されたジペプチドプロドラッグ成分を有し、さらに例えば約12から約72時間、又はいくつかの実施態様では約12から約48時間のt1/2を有するプロドラッグは、下記構造のジペプチドプロドラッグ成分を含み：
【０２０３】
【化３０】
0006392123.tif 000031
【０２０４】
式中、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及び(C1-C4アルキル)NH2から成る群から選択されるか、又はR1及びR2は(CH2)p(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C8アルキルであるか、又はR3及びR4はそれらが結合する原子と一緒になって4−6員の複素環式環を形成し；
R4は、水素及びC1-C8アルキルから成る群から選択され；さらに
R5はNH2であるが；
ただし、R1及びR2はともに水素ではないことを条件とする。
他の実施態様では、該インスリンアナローグB鎖ペプチドのN-末端アミノ酸に連結されたジペプチドプロドラッグ成分を有し、さらに例えば約12から約72時間、又はいくつかの実施態様では約12から約48時間のt1/2を有するプロドラッグは、下記構造のジペプチドプロドラッグ成分を含み：
【０２０５】
【化３１】
0006392123.tif 000032
【０２０６】
式中、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及び(C1-C4アルキル)NH2から成る群から選択され；
R3はC1-C6アルキルであり；
R4は水素であり；さらに
R5はNH2であるが；
ただし、R1及びR2はともに水素ではないことを条件とする。
いくつかの実施態様では、該インスリンアナローグB鎖ペプチドのN-末端アミノ酸に連結されたジペプチドプロドラッグ成分を有し、さらに例えば約12から約72時間、又はいくつかの実施態様では約12から約48時間のt1/2を有するプロドラッグは、下記構造のジペプチドプロドラッグ成分を含み：
【０２０７】
【化３２】
0006392123.tif 000033
式中、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル、(C1-C4アルキル)NH2から成る群から選択されるか、又はR1及びR2は(CH2)p(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C8アルキルであり；
R4は(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7であり；
R5はNH2であり；さらに
R7は、水素、C1-C8アルキル及び(C0-C4アルキル)OHから成る群から選択されるが；
ただし、R1及びR2はともに水素ではないことを条件とする。
【０２０８】
さらにまた、該インスリンアナローグB鎖ペプチドのN-末端アルファアミノ酸に連結されたジペプチドプロドラッグ成分を有し、さらに例えば約72から約168時間のt1/2を有するプロドラッグが提供され、ここで該ジペプチドプロドラッグ成分は下記構造を有し：
【０２０９】
【化３３】
0006392123.tif 000034
【０２１０】
式中、
R1は、水素、C1-C8アルキル及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択され；
R3はC1-C18アルキルであり；
R4及びR8は各々水素であり；
R5はNHR6又はOHであり；
R6はH、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1はそれらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員の複素環式環を形成し；さらに
R7は、水素、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4 アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択されるが、ただしR1がアルキル又は(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7である場合、R1及びR5は、それらが結合する原子と一緒になって4−11複素環式環を形成することを条件とする。
【０２１１】
いくつかの実施態様では、ジペプチドプロドラッグ成分は、該インスリンアナローグの内部アミノ酸の側鎖アミンに連結される。この実施態様では、例えば約1時間のt1/2を有するプロドラッグは下記構造を有する：
【０２１２】
【化３４】
0006392123.tif 000035
【０２１３】
R1及びR2は、それぞれ別個にC1-C8アルキル又は(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7であるか、又はR1及びR2は-(CH2)p-(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C18アルキルであり；
R4及びR8は各々水素であり；
R5はNH2であり；さらに
R7は、水素、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択される。
さらにまた、例えば約6から約24時間のt1/2を有し、さらに内部アミノ酸側鎖に連結されたジペプチドプロドラッグ成分を有するプロドラッグが提供され、ここで、該プロドラッグは下記構造を有するジペプチドプロドラッグ成分を含む：
【０２１４】
【化３５】
0006392123.tif 000036
【０２１５】
式中、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択されるか、又はR1及びR2は-(CH2)p-(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4は、それらが結合する原子と一緒になって4−12複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル又は(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7であり；
R5はNHR6であり；
R6はH又はC1-C8アルキルであるか、又はR6及びR2は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7は、水素、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択されるが；
R1及びR2はともに水素ではなく、R4又はR8の少なくとも1つは水素であるということを条件とする。
【０２１６】
さらにまた、例えば約72から約168時間のt1/2を有し、さらにインスリンアナローグの内部アミノ酸側鎖に連結されたジペプチドプロドラッグ成分を有するプロドラッグが提供され、ここで、該ジペプチドプロドラッグ成分は下記構造を有する：
【０２１７】
【化３６】
0006392123.tif 000037
【０２１８】
式中、
R1は、水素、C1-C18アルキル及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択され；
R3はC1-C18アルキルであり；
R4及びR8は各々水素であり；
R5はNHR6又はOHであり；
R6はH又はC1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7は、水素、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4 アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択されるが；
ただしR1及びR2がともにそれぞれ別個にアルキル又は(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7である場合、R1又はR2のどちらかが(CH2)p(式中pは2−9である) によりR5に連結されることを条件とする。
【０２１９】
いくつかの実施態様では、ジペプチドプロドラッグ成分は該インスリンアナローグの内部アミノ酸の側鎖アミンに連結され、ここで該内部アミノ酸は下記式Vの構造を含み：
【０２２０】
【化３７】
0006392123.tif 000038
【０２２１】
式中、nは1から4の整数である。いくつかの実施態様ではnは3又は4であり、さらにいくつかの実施態様では内部アミノ酸はリジンである。いくつかの実施態様では、ジペプチドプロドラッグ成分は、インスリンアナローグのB鎖の28又は29位に位置するアミノ酸の側鎖の第一アミンに連結される。
式Xのジペプチドプロドラッグ成分が芳香族アミノ酸のアリール基のアミノ置換基に連結される実施態様では、プロドラッグ、プロドラッグ成分の置換基を選択して、所望の活性化時間を提供できる。例えば、下記式IVの構造のアミノ酸を含む、本明細書開示の任意のインスリンアナローグのプロドラッグアナローグの半減期は、R1、R2、R3、R4、R5及R8の置換基を変更することによって選択できる：
【０２２２】
【化３８】
0006392123.tif 000039
【０２２３】
式中、m1は0から3の整数である。
ある実施態様では、式Vのアミノ酸は、自然のままのインスリンのA19、B16又はB25位に対応するアミノ酸に存在し、ある具体的な実施例では、式Vのアミノ酸はインスリンアナローグのA19位に位置し、m1は1である。ある実施態様では、式IVの構造を含み、生理学的条件下のPBSで約1時間のt1/2を有するインスリンアナローグプロドラッグ誘導体が提供される。ある実施態様では、生理学的条件下のPBSで約1時間のt1/2を有するインスリンアナローグプロドラッグ誘導体は式IVの構造を含み、ここで、
R1及びR2は、それぞれ別個にC1-C18アルキル又はアリールであり；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4は、それらが結合する原子と一緒になって4−12複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル及びアリールから成る群から選択され；さらに
R5はアミン又はヒドロキシルである。ある実施態様では、m1は1である。
ある実施態様では、ジペプチドプロドラッグ成分は、インスリンアナローグの芳香族アミノ酸のアリール基に存在するアミンを介して該インスリンアナローグに連結され、ここで該プロドラッグは、例えば約1時間のt1/2を有し、さらに下記のジペプチド構造を有する：
【０２２４】
【化３９】
0006392123.tif 000040
【０２２５】
式中、
R1及びR2は、それぞれ別個にC1-C18アルキル又は(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7であり；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4は、それらが結合する原子と一緒になって4−12複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択され；
R5はNH2又はOHであり；さらに
R7は、水素、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択される。
別の実施態様では、式IVの構造（m1は0から3の整数である）を含み、生理学的条件下のPBSで約6から約24時間のt1/2を有するインスリンアナローグプロドラッグ誘導体が提供される。ある実施態様では、生理学的条件下のPBSで約6から約24時間のt1/2を有するインスリンアナローグプロドラッグは式IVの構造を含み、ここで、
R1は水素、C1-C18アルキル及びアリールから成る群から選択されるか、又はR1及びR2は-(CH2)p-(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4は、それらが結合する原子と一緒になって4−6複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル及びアリールから成る群から選択され；
R5はアミン又はN-置換アミンである。ある実施態様では、m1は1である。
【０２２６】
ある実施態様では、芳香族アミノ酸を介して連結されるジペプチドプロドラッグ成分を有し、さらに例えば約6から約24時間のt1/2を有するプロドラッグが提供され、ここで該ジペプチドは下記の構造を含む：
【０２２７】
【化４０】
0006392123.tif 000041
【０２２８】
式中、
R1は、水素、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C4アルキル)NH2及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択され；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4はそれらが結合する原子と一緒になって4−6員の複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択され；
R5はNHR6であり；
R6はH、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7は、水素、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択される。
別の実施態様では、式IVの構造（m1は0から3の整数である）を含み、生理学的条件下のPBSで約72から約168時間のt1/2を有するインスリンアナローグプロドラッグ誘導体が提供される。ある実施態様では、生理学的条件下のPBSで約72から約168時間のt1/2を有するインスリンアナローグプロドラッグは式IVの構造を含み、ここで、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及びアリールから成る群から選択され；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4は、それらが結合する原子と一緒になって4−6員の複素環式環を形成し；
R4及びR8は各々水素であり；さらに
R5は、アミン、N-置換アミン及びヒドロキシルから選択される。ある実施態様では、m1は1である。
【０２２９】
ある実施態様では、芳香族アミノ酸を介して連結されたジペプチドプロドラッグ成分を有し、さらに例えば約72から約168時間のt1/2を有するプロドラッグが提供され、ここで前記ジペプチドは以下の構造を含み：
【０２３０】
【化４１】
0006392123.tif 000042
【０２３１】
式中、
R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル、(C1-C4アルキル)COOH、及び(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7から成る群から選択されるか、又はR1及びR5は、それらが結合する原子と一緒になって4−11員の複素環式環を形成し；
R3は、C1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4はそれらが結合する原子と一緒になって4−6員の複素環式環を形成し；
R4は水素であるか、又はR3とともに4−6員の複素環式環を形成し；
R8は水素であり；
R5はNHR6又はOHであり；
R6はH又はC1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7は、水素、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4 アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択される。
【０２３２】
ある実施態様にしたがえば、式Xのジペプチドは、大きなポリマーを含むようにさらに改変され、前記ポリマーは、インスリン又はIGF-1レセプターと相互作用する当該インスリンアナローグの能力に干渉する。その後のジペプチドの切断によって、該ジペプチド複合体からインスリンアナローグが放出され、放出されたインスリンアナローグは完全な活性を有する。ある実施態様にしたがえば、式Xのジペプチドは、大きなポリマーを含むようにさらに改変され、前記ポリマーは、インスリン又はIGF-1レセプターと相互作用する当該結合されたインスリンアナローグの能力に干渉する。ある実施態様にしたがえば、該インスリンアナローグは、下記式Xの一般構造をのジペプチドを含み：
【０２３３】
【化４２】
0006392123.tif 000043
【０２３４】
ここで、式Xのジペプチドのアミノ酸側鎖の1つはペジル化又はアシル化される。
ある実施態様では、構造IB-LM-IAを含むインスリンアナローグが提供され、ここでIBは配列J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45（配列番号：16）を含み、LMは本明細書に開示したCTPペプチドを含む連結部分（例えば配列番号：66の配列を含む連結ペプチドを含む）であり、IAは配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13（配列番号：55）を含み、式中、
JはH又は式Xのジペプチド成分であり；
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X10は、イソロイシン又はセリンであり；
X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；
X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、XはOH又はNHR10（R10は、H又は式Xの一般構造を含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０２３５】
【化４３】
0006392123.tif 000044
【０２３６】
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、X13はH、OH及びNHR12（R12は、H又は式Xの一般構造を含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０２３７】
【化４４】
0006392123.tif 000045
【０２３８】
R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及びN-末端アミンから成る群から選択され；
R23は、結合又はX60X61X62X63X64X65K（配列番号：19）であり、式中、X60はグリシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸から成る群から選択され、さらにX61、X62、X63、X64及びX65は、それぞれ別個にグルタミン酸又はアスパラギン酸であり；さらに
R13はCOOH又はCONHであり；
さらに式Xのジペプチドはアシル化又はペジル化される。ある実施態様では、Jは、式Xのアシル化又はペジル化されたジペプチドを含む。
【０２３９】
本明細書に開示したインスリンアナローグ及びそのプロドラッグ誘導体をさらに改変して、生理学的pHの水溶液中での該ペプチドの溶解性を改善し、一方、該ペプチドの腎浄化を妨げることによって該ペプチドの有効持続時間を強化することができる。ペプチドは、血漿タンパク質と比較したとき、それらの相対的に小さい分子サイズのために容易に浄化される。40kDaより大きいペプチド分子量の増加は腎閾値を超え、血漿中での持続時間を顕著に引き延ばす。したがって、ある実施態様では、該ペプチドプロドラッグは、共有結合により連結された親水性部分を含むようにさらに改変される。
ある実施態様では、該親水性部分は、血漿タンパク質、ポリエチレングリコール鎖又は免疫グロブリンのFc部分である。したがって、ある実施態様では、本開示のインスリンアナローグは、アミノ酸の側鎖に共有結合により連結された1つ以上の親水性基を含むようにさらに改変される。
ある実施態様にしたがえば、本明細書に開示したインスリンプロドラッグは、B鎖のN-末端アミノ酸又はB鎖のカルボキシ末端（例えば配列番号：9の28位を含む）に位置するアミノ酸リジン（又は他の適切なアミノ酸）の側鎖のどちらかに、親水性部分を連結することによってさらに改変される。ある実施態様では、単鎖インスリンプロドラッグ誘導体が提供され、ここで、該連結部分のアミノ酸の1つは、ペプチドリンカーの側鎖に親水性部分を連結することによって改変される。ある実施態様では、改変されるアミノ酸はシステイン、リジン又はアセチルフェニルアラニンである。
【０２４０】
ある実施態様にしたがえば、式Xのジペプチド成分が、さらにポリエチレングリコール、アルキル又はアシル基を含む、インスリンアナローグのプロドラッグ誘導体が提供される。ある実施態様では、1つ以上のポリエチレングリコール鎖が式Xのジペプチドに連結され、ポリエチレングリコール鎖の合計分子量は、約20,000から約80,000ダルトン、又は40,000から80,000ダルトン又は40,000から60,000ダルトンの範囲である。ある実施態様では、約40,000ダルトンの分子量を有する少なくとも1つのポリエチレングリコール鎖が、式Xのジペプチドに連結される。別の実施態様では、式Xのジペプチドは、血清アルブミンと結合させるために、したがって投与に際してIGFB16B17アナローグペプチドを不活性化するために十分なサイズのアシル基でアシル化される。該アシル基は線状でも分枝状でもよく、ある実施態様では、C16からC30脂肪酸である。例えば、アシル基は、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸、又はC30脂肪酸のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、アシル基はC16からC20脂肪酸、例えばC18脂肪酸又はC20脂肪酸である。
別の実施態様では、本明細書に開示のインスリンアナローグペプチド及びそのプロドラッグアナローグは、インスリンアナローグペプチドのA鎖のカルボキシ若しくはアミノ末端に、又はB鎖のアミノ末端に改変アミノ酸を付加することによってさらに改変され、ここで該付加アミノ酸は、該アミノ酸に連結された親水性部分を含むように改変される。ある実施態様では、C-末端に付加されるアミノ酸は改変されたシステイン、リジン又はアセチルフェニルアラニンである。ある実施態様では、該親水性部分は、血漿タンパク質、ポリエチレングリコール鎖及び免疫グロブリンのFc部分から成る群から選択される。
【０２４１】
ある実施態様では、親水性基はポリエチレングリコール鎖であり、ある実施態様では、2つ以上のポリエチレングリコール鎖がインスリンアナローグの2つ以上のアミノ酸側鎖に共有結合により結び付けられる。ある実施態様にしたがえば、親水性部分は、A10、B28、B29、A鎖のC-末端又はB鎖のN-末端（自然のままのインスリンに対応する位置）に一致する位置で、本明細書に開示したインスリンアナローグのアミノ酸側鎖に共有結合により結び付けられる。多数のポリエチレングリコール鎖を有するインスリンアナローグ及びそれらのプロドラッグ誘導体の場合、ポリエチレングリコール鎖は、B鎖のN-末端アミノ酸に、又はB鎖のカルボキシ末端に位置するリジンアミノ酸の側鎖に結び付けられるか、又は当該ペプチドのC-末端にただ1つのアミノ酸を添加し、該添加アミノ酸の側鎖にポリエチレングリコール鎖を連結させることによって付加され得る。ある実施態様にしたがえば、ポリエチレングリコール鎖又は他の親水性部分が、該ジペプチドプロドラッグ成分を含む2つのアミノ酸の一方の側鎖に連結される、プロドラッグ誘導体が提供される。ある実施態様では、該ジペプチドプロドラッグ成分はリジン（D又はL立体異性体構造）を含み、該リジンの側鎖アミンにポリエチレングリコール鎖が結合される。
ある実施態様にしたがえば、本明細書に開示したインスリンアナローグペプチド又はそのプロドラッグ誘導体はアミノ酸置換によってさらに改変され、ここで該置換アミノ酸は、親水性部分（例えばポリエチレングリコールを含む）との架橋に適切な側鎖を含む。ある実施態様では、自然のままのインスリンのA5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、B1、B2、B3、B4、B5、B13、B14、B17、B21、B22、B26、B27、B28、B29及びB30に対応する位置の自然のままのアミノ酸が、リジン、システイン又はアセチルフェニルアラニン残基で置換され（又はリジン、システイン又はアセチルフェニルアラニンがC-末端に添加され）、ポリエチレングリコール鎖の共有結合付加を可能にする。
【０２４２】
ある実施態様では、インスリンアナローグ又はそのプロドラッグ誘導体は、一システイン置換又は該インスリンアナローグのアミノ若しくはカルボキシ末端への一システイン残基添加を有するか、又はインスリンプロドラッグ誘導体の連結部分若しくはジペプチド成分内のアミノ酸が少なくとも1つのシステイン残基で置換され、ここで該システイン残基の側鎖はチオール反応性試薬でさらに改変される。前記チオール反応性試薬には、例えばマレイミド、ビニルスルホン、2-ピリジルチオ、ハロアルキル及びハロアシルが含まれる。これらのチオール反応性試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシル及びエーテル基とともに他の親水性部分（例えばポリエチレングリコールユニット）を含むことができる。また別の実施態様では、インスリンアナローグ又はそのプロドラッグ誘導体は、一リジン置換又は該インスリンアナローグのアミノ若しくはカルボキシ末端への一リジン残基添加を有するか、又はインスリンプロドラッグ誘導体の連結部分若しくはジペプチド成分内のアミノ酸がリジンで置換され、さらに該置換リジン残基の側鎖が、アミン反応性試薬、例えばカルボン酸の活性エステル（スクシンイミド、無水物など）又は親水性部分（例えばポリエチレングリコール）のアルデヒドを用いてさらに改変される。
【０２４３】
ある実施態様にしたがえば、医薬組成物が提供され、前記組成物は、好ましくは少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の純度レベルの本明細書に開示の新規なインスリンアナローグのいずれか、及び医薬的に許容できる希釈剤、担体又は賦形剤を含む。そのような組成物は、本明細書に開示のインスリンアナローグを、少なくとも0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL又はそれ以上の濃度で含むことができる。ある実施態様では、該医薬組成物は水溶液を含み、前記は滅菌され、場合によって多様な包装容器に入れて保存される。他の実施態様では、該医薬組成物は凍結乾燥粉末を含む。該医薬組成物はさらに、患者に該組成物を投与するための使い捨て装置を含むキットの部分として包装できる。該容器又はキットには、周囲室温又は冷蔵温度での保存のためにラベルを貼付してもよい。
【０２４４】
ある実施態様では、第一及び第二のインスリンアナローグプロドラッグ誘導体の混合物を含む組成物が提供され、該第一及び第二のインスリンアナローグプロドラッグ誘導体は、プロドラッグ成分の構造を基準にして互いに相違する。より詳細には、第一のインスリンアナローグプロドラッグ誘導体は、第二のインスリンアナローグプロドラッグ誘導体のジペプチドプロドラッグ成分と実質的に異なる半減期を有するジペプチドプロドラッグ成分を含むことができる。したがって、該ペプチド成分の置換基を選択し又は異なる組合せを提供することによって、所望の時間枠にわたって及び固有の時間的間隔にしたがって制御された態様で活性化される、インスリンアナローグプロドラッグ誘導体の混合物を含む組成物の調製が可能となるであろう。例えば、食事時に活発なインスリンアナローグペプチドが放出され、その後夜間のインスリンアナローグペプチドの活性化が続き、活性化の時間に基づいて適切な用量が放出されるように組成物を処方することができる。
別の実施態様では、医薬組成物は、本明細書に開示のインスリンアナローグプロドラッグ誘導体及び自然のままのインスリン又は公知の生物活性なインスリンアナローグの混合物を含む。ある実施態様では、該混合物は、インスリンアナローグ及び自然のままのインスリン又は公知の生物活性なインスリンアナローグを連結させたヘテロ二重体の形態でもよい。該ダイマーは、別のインスリンアナローグに又はジスルフィド連結A鎖B鎖インスリンヘテロ二重体に連結されたインスリンアナローグペプチドを含むことができる。該混合物は、1つ以上のインスリンアナローグ、自然のままのインスリン又は公知の生物活性なインスリンアナローグを、前記のプロドラッグ誘導体又は前記のデポット誘導体又は他の複合物形で、さらにそれらの任意の組合せで含むことができる。
【０２４５】
開示したインスリンアナローグ及びそれらの対応するプロドラッグ誘導体は、インスリンペプチドについて以前に記載された任意の使用に対して適切であると考えられる。したがって、本明細書に記載したインスリンアナローグ及びそれらの対応するプロドラッグ誘導体を用いて高血糖症を治療するか、又は高い血中グルコースレベルから生じる他の代謝性疾患を治療することができる。したがって、本発明は、高い血中グルコースレベルをもつ患者の治療で使用される、本明細書に開示したインスリンアナローグ又はそのプロドラッグ誘導体及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物を包含する。ある実施態様にしたがえば、本明細書に開示したインスリンアナローグを用いて治療される患者は家畜化動物であり、別の実施態様では、治療される患者は人間である。
本開示にしたがって高血糖症を治療する1つの方法は、本開示のインスリンアナローグ又はそのデポット若しくはプロドラッグ誘導体を標準的な投与ルート（非経口的（例えば静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内、包膜内、皮内、直腸内）、経口的、鼻内又は吸入によるルートを含む）を用いて患者に投与する工程を含む。ある実施態様では、該組成物は皮下又は筋肉内に投与される。ある実施態様では、該組成物は非経口的に投与され、該インスリンアナローグ又はそのプロドラッグ誘導体は注射筒に一括充填される。
【０２４６】
本明細書に開示のインスリンアナローグ又はそのデポット若しくはプロドラッグ誘導体は、単独で又は他の抗糖尿病薬剤と併用して投与できる。当業界で公知の又は研究中の抗糖尿病薬剤には以下が含まれる：自然のままのインスリン、自然のままのグルカゴン又はその機能的アナローグ、スルホニルウレア、例えばトルブタミド（Orinase）、アセトヘキサミド（Dymelor）、トラザミド（Tolinase）、クロルプロパミド（Diabinese）、グリピジド（Glucotrol）、グリブリド（Diabeta, Micronase, Glynase）、グリメピリド（Amaryl）又はグィクラジド（Diamicron）；メグリチニド、例えばレパグリニド（Prandin）又はナテグリニド（Starlix）；ビグアニド、例えばメトフォルミン（Glucophage）又はフェンフォルミン；チアゾリジンジオン、例えばロシグリタゾン（Avandia）、ピオグリタゾン（Actos）又はトログリタゾン（Rezulin）又は他のPPARγ阻害剤；炭水化物消化を阻害するアルファグルコシダーゼ阻害剤、例えばミグリトール（Glyset）、アカルボース（Precose/Glucobay）；エクセナチド（Byetta）又はプラムリンチド；ジペプチジルペプチダーゼ-4（DPP-4）阻害剤、例えばビルダグリプチン又はシタグリプチン；SGLT（ナトリウム依存グルコーストランスポーター1）阻害剤；又はFBPase（フラクトース1,6-ビスホスファターゼ）阻害剤。
【０２４７】
本明細書に開示したインスリンアナローグ、又はそのデポット若しくはプロドラッグ誘導体を含む医薬組成物を処方し、標準的な医薬的に許容できる担体及び当業者に公知の投与ルートを用いて患者に投与できる。したがって、本開示はまた、本明細書に開示した1つ以上のインスリンアナローグ（又はそのプロドラッグ誘導体）又は医薬的に許容できるその塩を、医薬的に許容できる担体と一緒に含む医薬組成物を包含する。ある実施態様では、該医薬組成物は、リン酸緩衝系に約4.0から約7.0のpHで1mg/mLの濃度のインスリンアナローグを含む。該医薬組成物は唯一の医薬的に活性な成分として該インスリンアナローグを含むことができるが、また該インスリンアナローグペプチドは1つ以上の補足的活性物質と組み合わせることもできる。
本明細書に記載した全ての治療方法、医薬組成物、キット及び他の類似の実施態様は、インスリンアナローグペプチド又はそのプロドラッグ誘導体が、医薬的に許容できる前記の全ての塩を含むことを意図する。
ある実施態様では、キットは、患者にインスリンアナローグ組成物を投与するための装置とともに提供される。キットはさらに多様な容器を、例えばバイアル、チューブ、ビンなどを含むことができる。好ましくは、キットはまた使用のための指示を含むであろう。ある実施態様にしたがえば、キットの装置は、組成物がエーロゾル装置に予め充填されたエーロゾル調剤装置である。別の実施態様では、キットは注射筒及び注射針を含み、さらにある実施態様では、インスリンアナローグ組成物は注射筒に予め充填される。
本発明の化合物は、標準的な合成方法、組換えDNA技術、又はペプチド及び融合タンパク質を調製する他の任意の方法によって調製される。ある種の非天然アミノ酸は標準的な組換えDNA技術で発現させることはできないが、それらの調製技術は当業界で公知である。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物は、標準的なペプチド化学反応に加えて、利用可能なときは標準的な有機化学反応によって合成できる。
【０２４８】
本開示にしたがって以下の例示的な実施態様が提供される：
1．A鎖、B鎖及び連結部分を含む単鎖インスリンアナローグ、ここで前記連結部分は、B鎖のカルボキシ末端をA鎖のアミノ末端に共有結合により連結して連続するアミノ酸鎖を形成する、18アミノ酸のペプチドを含むが、ただし該連結部分は、B鎖のカルボキシ末端に直接連結された配列番号：53の18アミノ酸と同一の18アミノ酸を含まないことを条件とする。
2．前記連結部分が合計18から158アミノ酸残基を含む、実施態様1の単鎖インスリンアナローグ。
3．前記連結部分が合計28から56アミノ酸を含む、実施態様1の単鎖インスリンアナローグ。
4．前記連結部分が、B鎖のカルボキシ末端アミノ酸に直接連結された、連続する29アミノ酸の配列を含み、前記連続する29アミノ酸の配列が、SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66）（式中、X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン及びリジンから選択される）と90％より高い配列同一性を有する、実施態様2又は3の単鎖インスリンアナローグ。
5．前記連結部分が、B鎖のカルボキシ末端アミノ酸に直接連結された、連続する29アミノ酸の配列を含み、前記連続する29アミノ酸の配列を含むアミノ酸の少なくとも58％がセリン及びプロリンから成る群から選択される、実施態様2又は3の単鎖インスリンアナローグ。
6．前記インスリンアナローグがさらに自然のままのものではないグリコシル化部位を含む、実施態様2、3、4又は5の単鎖インスリンアナローグ。
7．前記連結部分がグリコシル化部位を含む、実施態様2、3、4又は5の単鎖インスリンアナローグ。
8．前記連結部分がN-結合グリコシル化部位を含む、実施態様7の単鎖インスリンアナローグ。
9．前記連結部分がO-結合グリコシル化部位を含む、実施態様7又は8の単鎖インスリンアナローグ。
10．前記連結部分がグリコシル化される、実施態様6−8のいずれかのインスリンアナローグ。
11．前記連結部分が（配列番号：64）のアナローグを含み、前記アナローグが、1から6つのアミノ酸置換だけ（配列番号：64）と相違する、実施態様2又は3の単鎖インスリンアナローグ。
12．前記連結部分が（配列番号：66）を含む、単鎖インスリンアナローグ。
13．配列SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66）、SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ（配列番号：93）又はMGSSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ（配列番号：93）が、B鎖のアミノ末端に連結され、場合によって1から5つの酸性アミノ酸とその後に続くアルギニン又はリジンから成る介在配列を有する、実施態様1−12のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
14．前記連結部分が、配列SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK（配列番号：79）又はSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR（配列番号：64）を含む、実施態様1−13のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
15．前記A鎖が配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）を、さらに前記B鎖が配列R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、式中、X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；X10は、イソロイシン又はセリンであり；X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；X17は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸、オルニチン又リジンであり；X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及び結合から成る群から選択され；さらにR13は、COOH又はCONH2である、実施態様1−14のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
16．前記A鎖が配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13（配列番号：55）を、前記B鎖がX25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、さらに式中、X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；X5は、グルタミン酸又はグルタミンであり；X8は、スレオニン、ヒスチジン又はフェニルアラニンであり；X9は、セリン、アルギニン、オルニチン又はアラニンであり；X10は、セリン又はイソロイシンであり；X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；X14は、アルギニン、チロシン、オルニチン又はアラニンであり；X15は、グルタミン、アルギニン、アラニン、オルニチン又はロイシンであり；X18は、メチオニン、アスパラギン又はスレオニンであり；X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；X21は、アラニン、グリシン又はアスパラギンであり；X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；X29は、アラニン、グリシン又はセリンであり；X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸又はシステイン酸であり；X33は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり；X34は、アラニン又はスレオニンであり；X41は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり；X42は、アラニン、オルニチン又はアルギニンであり；X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；さらにR13は、COOH又はCONH2である、実施態様15の単鎖インスリンアナローグ。
17．B鎖がさらに1から6つの荷電アミノ酸を含むアミノ末端伸長部を含む、実施態様15−16のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
18．B鎖が配列R22-HLCGSX30LVEALYLVCGERGFF（配列番号：56）又はR24-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、さらにA鎖が配列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13（配列番号：26）又はGIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：15）を含み、式中、X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；X8は、ヒスチジンスレオニン又はフェニルアラニンであり；X9は、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり； X14は、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；X17はグルタミン又はグルタミン酸であり；X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；X22はフェニルアラニン及びデスアミノ-フェニルアラニンから成る群から選択され；X23はアスパラギン又はグリシンであり；X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；X29は、アラニン及びグリシンから成る群から選択され；X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；R22は、X22VNQ（配列番号：50）、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン及び結合から成る群から選択され；R24は、AYRPSE（配列番号：11）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及び結合から成る群から選択され；
さらにR13は、COOH又はCONH2である、実施態様1−17のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
19．X8、X25及びX30が各々ヒスチジンである、実施態様18の単鎖インスリンアナローグ。
20．式中、X4がアスパラギン酸であり；X9がアルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；X21がアラニン、グリシン又はアスパラギンであり；X29がアラニンであり；X33がアスパラギン酸であり；X34がアラニンであり；X41がアスパラギン酸であり；さらにR22がグリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチドである、実施態様15−19のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
21．前記アナローグに連結された親水性部分をさらに含む、実施態様1−20のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
22．該親水性部分が、血漿タンパク質、ポリエチレングリコール鎖又は免疫グロブリンのFc部分である、実施態様21の単鎖インスリンアナローグ。
23．該親水性部分が、B鎖のN-末端アミノ酸又は該連結部分のアミノ酸側鎖に連結されたポリエチレングリコールである、実施態様21の単鎖インスリンアナローグ。
24．前記単鎖インスリンアゴニストのアミノ酸側鎖が、アルキルアミン、アミド、エーテル、エステル、チオエーテル又はチオエステル結合を介して、アシル基又はアルキル基と共有結合により結び付けられる、実施態様1−23のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
25．A鎖、B鎖及びCTPペプチドを含むインスリンアナローグであって、前記A鎖が配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13（配列番号：55）を含み、前記B鎖が配列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、さらに前記CTPペプチドが配列(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n（配列番号：66）又はMGSSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQEEEEEX51（配列番号：93）を含み、ここで前記A及びB鎖が互いにジスルフィド結合を介して連結され、前記CTPペプチドがB鎖のアミノ又はカルボキシ末端に共有結合され、さらに式中、nは1から3の整数であり；X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；X5は、グルタミン酸又はグルタミンであり；X8は、スレオニン、ヒスチジン又はフェニルアラニンであり；X9は、セリン、アルギニン、オルニチン又はアラニンであり；X10は、セリン又はイソロイシンであり；X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；X14は、アルギニン、チロシン、オルニチン又はアラニンであり；X15は、グルタミン、アルギニン、アラニン、オルニチン又はロイシンであり；X18は、メチオニン、アスパラギン又はスレオニンであり；X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；X21は、アラニン、グリシン、又はアスパラギンであり；X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；X29は、アラニン、グリシン又はセリンであり；X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸又はシステイン酸であり；X33は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり；X34は、アラニン又はスレオニンであり；X41は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり；X42は、アラニン、オルニチン又はアルギニンであり；X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；X50及びX51は、それぞれ別個にアルギニン及びリジンから選択され；さらにR13は、COOH又はCONH2である、前記インスリンアナローグ。
26．前記CTPペプチドがB鎖のアミノ末端に共有結合されN-末端CTPペプチドを提供する、実施態様25のインスリンアナローグ。
27．前記CTPペプチドがB鎖のカルボキシル末端に共有結合されC-末端CTPペプチドを提供する、実施態様25のインスリンアナローグ。
28．前記B鎖のカルボキシ末端がA鎖のアミノ末端にペプチドリンカーを介して共有結合により連結されて連続するアミノ酸鎖を形成し、前記ペプチドリンカーは前記CTPペプチドを含み、リンカーCTPペプチドを提供する、実施態様25又は27のインスリンアナローグ。
29．C-末端CTPペプチド、N-末端CTPペプチド及びリンカーCTPペプチドが、(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ)n（配列番号：92）、(SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK)n（配列番号：64）及び(SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR)n（配列番号：64）から成る群から、それぞれ別個に選択される配列を含み、さらに式中、nが1又は2である、実施態様25、26、27又は28のインスリンアナローグ。
30．nが1であり、リンカーCTPペプチドが、配列SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK（配列番号：79）を含む、実施態様29のインスリンアナローグ。
31．B鎖が、該B鎖のカルボキシ末端に連結された配列SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66）、及び該B鎖のアミノ末端に連結された配列MGSSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQEEEEEX51（配列番号：93）を含む、実施態様25−30のいずれかのインスリンアナローグ。
32．CTPペプチドがグリコシル化される、実施態様25−31のいずれかのインスリンアナローグ。
33．B鎖が配列R22-HLCGSX30LVEALYLVCGERGFF（配列番号：56）又はR24-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、さらにA鎖が配列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13（配列番号：26）又はGIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：15）を含み、式中、X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；X9は、セリン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；X14は、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；X17は、グルタミン又はグルタミン酸であり；X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；X22はフェニルアラニン及びデスアミノ-フェニルアラニンから成る群から選択され；X23はアスパラギン又はグリシンであり；X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；X29は、アラニン及びグリシンから成る群から選択され；X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；R22は、X22VNQ（配列番号：50）、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン及び結合から成る群から選択され；R24は、AYRPSE（配列番号：11）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及び結合から成る群から選択され；さらにR13は、COOH又はCONH2である、実施態様25−32のいずれかのインスリンアナローグ。
34．式中、X8、X25及びX30が各々ヒスチジンである、実施態様33のインスリンアナローグ。
35．式中、X4がアスパラギン酸であり；X9が、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；X21が、アラニン、グリシン又はアスパラギンであり；X29がアラニンであり；X33がアスパラギン酸であり；X34がアラニンであり；X41がアスパラギン酸であり；さらにR22がグリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチドである、実施態様33又は34のインスリンアナローグ。
36．B鎖が配列R25-HLCGSX30LVEALYLVCGERGFF（配列番号：56）を含み、CTPペプチドが配列番号：66の配列を含み、さらにA鎖がGIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13（配列番号：26）の配列を含み、式中、X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；X21は、アラニン、グリシン又はアスパラギンであり；X22はフェニルアラニン及びデスアミノ-フェニルアラニンから成る群から選択され；R25は、X22VNQ（配列番号：50）、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、ATRPSE（配列番号：11）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、グルタミン酸から成る群から選択される、実施態様25−35のいずれかのインスリンアナローグ。
37．該B鎖のN-末端に連結されたCTPペプチドをさらに含む、実施態様36のインスリンアナローグ。
38．前記アナローグに連結された親水性部分をさらに含む、実施態様25−37のいずれかのインスリンアナローグ。
39．該親水性部分が、B鎖のN-末端アミノ酸又は該連結部分のアミノ酸側鎖に連結されたポリエチレングリコールである、実施態様38のインスリンアナローグ。
40．該インスリンアゴニストのアミノ酸側鎖が、アルキルアミン、アミド、エーテル、エステル、チオエーテル、又はチオエステル結合を介してアシル基又はアルキル基と共有結合により結び付けられる、実施態様25−39のいずれかのインスリンアゴニスト。
41．実施態様1−37のいずれかのインスリンアナローグをコードする核酸配列。
42．実施態様41のインスリンアナローグをコードする核酸配列を含む真核宿主細胞。
43．該細胞が哺乳動物宿主細胞である、実施態様42の宿主細胞。
44．該細胞がピキア（Pichia）又はCHO細胞である、実施態様42の宿主細胞。
45．高グリコシル化インスリンアナローグを製造する方法であって、前記方法が、実施態様42の細胞を前記タンパク質が生成される条件下で培養する工程及び前記タンパク質を該培養から回収する工程を含む、前記製造方法。
46．該インスリンアナローグが単鎖アナローグとして発現され、前記方法が、該回収タンパク質を切断して二鎖インスリンアナローグを生成する工程をさらに含む、実施態様45の方法。
47．連結部分が配列SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK（配列番号：79）を含む、実施態様1−46のいずれかの方法。
48．さらに構造U-Bを含み、式中、Uがアミノ酸又はヒドロキシ酸であり、Bが、Bのカルボキシル部分と前記単鎖インスリンアナローグのアミンとの間のアミド結合を介して該単鎖インスリンアナローグに連結されたN-アルキル化アミノ酸であり、U、B又はU-Bが連結される単鎖インスリンアナローグのアミノ酸が非コードアミノ酸であり、さらに、該単鎖インスリンアナローグからU-Bが化学的に切断される半減期（t1/2）が、生理学的条件下のPBS中で少なくとも約1時間から約1週間である、実施態様1−47のいずれかのインスリンアナローグの誘導体。
49．前記インスリンアナローグが、GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）のA鎖配列を含み、式中、X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；X10は、イソロイシン又はセリンであり；X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；X17は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸、オルニチン又リジンであり；X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；X19は4-アミノフェニルアラニンであり；X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；さらに、U-Bは、Bのカルボキシル部分とA19位の4-アミノフェニルアラニンのパラアミンとの間のアミド結合により単鎖インスリンアゴニストと連結される、実施態様48の誘導体。
50．式中、X4はアスパラギン酸であり；X5はグルタミン酸であり；X8は、ヒスチジン又はフェニルアラニンであり；X9は、アルギニン、リジン又はオルニチンであり；X10はセリンであり；X12はアスパラギン酸であり；X14及びX15は、それぞれ別個にアルギニン、リジン又はオルニチンであり；X17は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸、オルニチン又はリジンであり；X18はメチオニンであり；さらに、X21は、アラニン又はアスパラギンである、実施態様48又は49の誘導体。
51．構造U-Bの第一のアミノ酸及び／又は第二のアミノ酸がD立体異性体構造のアミノ酸である、実施態様47−49のいずれかの誘導体。
52．U-Bが下記式Xの構造を含み、
【０２４９】
【化４５】
0006392123.tif 000046
【０２５０】
式中、
R1、R2、R4及びR8はそれぞれ別個にH、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6シクロアルキル)、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10 アリール)R7、(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)、及びC1-C12アルキル(W1)C1-C12アルキルから成る群から選択され、W1はN、S及びOから成る群から選択されるヘテロ原子であるか、又は
R1及びR2は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C12シクロアルキル又はアリールを形成するか；又は 
R4及びR8は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C6シクロアルキルを形成し；
R3は、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)NH2、(C1-C18アルキル)SH、(C0-C4アルキル)(C3-C6)シクロアルキル、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及び(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり;
R6は、H、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7は、H、OH、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択される、実施態様49の誘導体。
53．式中、R1及びR2は、それぞれ別個にC1-C18アルキル又はアリールであり；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4は、それらが結合する原子と一緒になって4−6複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル及びアリールから成る群から選択され；さらに
R5はアミン又はヒドロキシルである、実施態様52の誘導体。
54．式中、R1は、水素、C1-C18アルキル及びアリールから成る群から選択されるか、又はR1及びR2は-(CH2)p(式中pは2−9である) により連結され；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4は、それらが結合する原子と一緒になって4−6員複素環式環を形成し；
R4及びR8は、それぞれ別個に水素、C1-C18アルキル及びアリールから成る群から選択され；さらに、R5はアミン又はN-置換アミンである、実施態様52の誘導体。
55．式中、R1及びR2は、それぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及びアリールから成る群から選択され；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4は、それらが結合する原子と一緒になって4−6員複素環式環を形成し；
R4及びR8は各々水素であり；さらに
R5はアミン、N-置換アミン及びヒドロキシルから成る群から選択される、実施態様52の誘導体。
56．構造U-B又は連結部分のアミノ酸に連結された親水性部分をさらに含む、実施態様48−55のいずれかの誘導体。
57．親水性部分が、ポリエチレングリコール又はアルブミンである、実施態様56の誘導体。
58．単鎖インスリンアナローグは構造IB-LM-IAを含み、ここでIBは配列J-R23R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45（配列番号：16）を含み、LMは、B鎖のカルボキシ末端をA鎖のアミノ末端に共有結合により連結して連続するアミノ酸鎖を形成する18アミノ酸の配列を含む連結部分であるが、ただし、該連結部分はB鎖のカルボキシ末端に直接連結された配列番号：53の18アミノ酸の配列と同一の18アミノ酸の配列を含まないことを条件とし、さらにIAは配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13（配列番号：55）を含み、式中、
Jは、H又はU-Bの一般構造を含むジペプチド（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸であり、Bはアミド結合を介して連結されたN-アルキル化アミノ酸である）であり；X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；X10は、イソロイシン又はセリンであり；X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；X19は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、XはOH又はNHR10（R10は、H又は一般構造U-B（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸で、BはN-アルキル化アミノ酸である）を含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０２５１】
【化４６】
0006392123.tif 000047
【０２５２】
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され； X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；X36は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、X12はOH及びNHR11（R11は一般構造U-Bを含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０２５３】
【化４７】
0006392123.tif 000048
【０２５４】
X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；X45は、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、X13は、H、OH及びNHR12（R12はH又は一般構造U-Bを含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０２５５】
【化４８】
0006392123.tif 000049
【０２５６】
R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及び結合から成る群から選択され；R23は、結合又は1から6つの荷電アミノ酸を含むアミノ酸配列であり；さらにR13はCOOH又はCONH2であるが、ただしU、B、又はU-Bが連結される単鎖インスリンアゴニストのアミノ酸は非コードアミノ酸であることを条件とする。
59．式中、X19が、下記一般構造のアミノ酸であり（式中、XはOH又はNHR10（R10は、H又は一般構造U-B（Uはアミノ酸又はヒドロキシル酸で、BはN-アルキル化アミノ酸である）を含むジペプチド成分である）から成る群から選択される）；
【０２５７】
【化４９】
0006392123.tif 000050
【０２５８】
さらに、X36及びX45はともにチロシンである、実施態様58の単鎖アナローグ。
60．前記連結部分が、B鎖のカルボキシ末端アミノ酸に直接連結された連続する29アミノ酸の配列を含み、前記連続する28アミノ酸の配列が配列番号：64と95％より高い配列同一性を有する、実施態様58又は59の単鎖インスリンアナローグ。
61．前記連結部分が（配列番号：64）のアナローグを含み、前記アナローグが1から6つのアミノ酸置換だけ（配列番号：64）と相違する、実施態様58又は59の単鎖インスリンアナローグ。
62．前記連結部分が（配列番号：66）を含み、式中、X50及びX51がそれぞれ別個にアルギニン又はリジンである、実施態様58又は59の単鎖インスリンアナローグ。
63．前記連結部分がSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK（配列番号：64）を含む、実施態様59の単鎖インスリンアナローグ。
64．式中、X4はアスパラギン酸であり；X5はグルタミン酸であり；X8は、ヒスチジン又はフェニルアラニンであり；X9は、アルギニン、リジン又はオルニチンであり；X10はセリンであり；X12はアスパラギン酸であり；X14及びX15は、それぞれ別個にアルギニン、リジン又はオルニチンであり；X17は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸、オルニチン又はリジンであり；X18はメチオニンであり；さらに、X21は、アラニン又はアスパラギンである、実施態様59−63のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
65．U-Bが下記式Xの構造を含み：
【０２５９】
【化５０】
0006392123.tif 000051
【０２６０】
式中、
R1、R2、R4及びR8はそれぞれ別個にH、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6シクロアルキル)、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10 アリール)R7、(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)、及びC1-C12アルキル(W1)C1-C12アルキルから成る群から選択され、W1はN、S及びOから成る群から選択されるヘテロ原子であるか、又はR1及びR2は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C12シクロアルキル又はアリールを形成するか；又はR4及びR8は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C6シクロアルキルを形成し；
R3は、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)NH2、(C1-C18アルキル)SH、(C0-C4アルキル)(C3-C6)シクロアルキル、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及び(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり;
R6は、H、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7は、H、OH、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択されるが、ただしR4及びR3が、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成するとき、R1及びR2はともにH以外であることを条件とする、実施態様59から64のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
66．構造U-B又は連結部分のアミノ酸に連結された親水性部分をさらに含む、実施態様59−65のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
67．該親水性部分がポリエチレングリコール又はアルブミンである、実施態様66の単鎖インスリンアナローグ。
68．IAが、配列GIVEQCCTSICSLYQLENX19CX21-R13（配列番号：95）、GIVEQCCHSICSLYQLENX19CX21-R13（配列番号：37）又はGIVDECCHRSCDLRRLEMX19CX21-R13（配列番号：51）を含み、さらにIBが、配列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRT（配列番号：94）、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT（配列番号：2）、GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT（配列番号：6）又はGPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNPKT（配列番号：52）を含み、さらに21位のXaaがアラニン、グリシン又はアスパラギンである、実施態様59−67のいずれかの単鎖インスリンアナローグ。
69．該連結部分が、配列(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n（配列番号：66）を含み、式中、nは1、2又は3から成る群から選択される整数であり；さらにX50及びX51は、それぞれ別個にアルギニン又はリジンである、実施態様68の単鎖インスリンアナローグ。
70．前記アナローグが、A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29から選択される1つ以上の位置で、該連結部分のアミノ酸側鎖の側鎖で、又はジペプチドU-Bのアミノ酸の側鎖でアシル化される、実施態様59−69のいずれかの単鎖インスリンアゴニスト。
71．前記アナローグが、A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29から選択される1つ以上の位置で、該連結部分のアミノ酸側鎖の側鎖で、又はジペプチドU-Bのアミノ酸の側鎖でペジル化される、実施態様59−69のいずれかの単鎖インスリンアゴニスト。
72．実施態様1−71のいずれかの単鎖インスリンアゴニストを含むダイマー又はマルチマー。
73．実施態様1−72のいずれかの単鎖インスリンアゴニスト又はそのプロドラッグ誘導体及び医薬的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
74．実施態様73の医薬組成物の有効量を投与する工程を含む、糖尿病の治療方法。
75．高血糖症の治療用医薬の製造における、実施態様1−72のいずれかの化合物の使用。
76．糖尿病治療のための実施態様1−72のいずれかの化合物の使用。
【実施例１】
【０２６１】
インスリンA及びB鎖の合成
Boc化学作用を用いて、インスリンA及びB鎖を4-メチルベンゾヒドリルアミン(4-methylbenzhyryl amine)（MBHA）樹脂又は4-ヒドロキシメチル-フェニルアセトアミドメチル（PAM）樹脂で合成した。HE／p-クレゾール（95：5）を0℃で1時間用いて、ペプチドを切断した。HF除去及びエーテル沈殿に続いて、ペプチドを50％酢酸水溶液に溶解し凍結乾燥させた。また別には、ペププチドはFmoc化学作用を用いて合成した。前記ペプチドは、トリフルオロ酢酸（TFA）／トリイソプロピルシラン（TIS）／H2O（95：2.5：2.5）を室温で2時間用いて樹脂から切断した。ペプチドを過剰量のジエチルエーテルの添加により沈殿させ、ペレットを酸性緩衝水に溶解した。ペプチドの品質はRP-HPLCによってモニターし、質量分析（ESI又はMALDI）によって確認した。
インスリンA鎖は、アミノ酸7位のただ1つの遊離システインを用い、他の全てのシステインはアセトアミドメチルA-(SH)7(Acm)6,11,20として保護して合成した。インスリンB鎖は、7位のただ1つの遊離システインを用い、他のシステインはアセトアミドメチルB-(SH)7(Acm)19として保護して合成した。粗ペプチドは通常のRP-HPLCによって精製した。
合成したA及びB鎖は、図1に概略した一般的な方法にしたがって、それらの自然のままのジスルフィド結合により互いに連結させた。対応するB鎖を、DMF又はDMSOへの溶解及び2,2’-ジチオビス(5-ニトロピリジン)（Npys）と1：1のモル比及び室温で反応させることによってCys7-Npysに活性化させた。前記活性化をRP-HPLCでモニターし、生成物はESI-MSで確認した。
第一のB7-A7ジスルフィド結合は、対応するA-(SH)7(Acm)6,11,20及びB-(Npys)7(Acm)19を1：1のモル比で総ペプチド濃度を10mg/mLに溶解することによって形成した。鎖の結合反応が完了したとき、混合物を50％の酢酸水の濃度に稀釈した。最後の2つのジスルフィド結合はヨウ素の添加により同時に形成された。40倍モル過剰のヨウ素を前記溶液に添加し、この混合物を室温でさらに1時間攪拌した。アスコルビン酸水溶液を添加して反応を終了させた。混合物をRP-HPLCで精製し、最終化合物をMALDI-MSによって確認した。図2及び表1のデータに示すように、この方法にしたがって調製した合成インスリンは、インスリンレセプター結合について精製インスリンと良好な類似を示す。
改変アミノ酸（例えばA19位の4-アミノフェニルアラニン）を含むインスリンペプチドもまた、非コードアミノ酸のタンパク質への取り込みを可能にする系を用いてin vivoで合成できる。前記系は、例えば米国特許第7,045,337号及び7,083,970号に教示された系を含む。
【０２６２】
表1：自然のままのインスリンと比較した合成インスリンの活性
0006392123.tif 000052
【実施例２】
【０２６３】
還元アルキル化によるアミン基（N-末端及びリジン）のペジル化
a．合成
インスリン（又はインスリンアナローグ）、mPEG20k-アルデヒド及びNaBH3CN（モル比1：2：30）を酢酸緩衝液（pH4.1−4.4）に溶解した。該反応溶液は、0.1NのNaCl、0.2N酢酸及び0.1NのNa2CO3で構成されていた。インスリンペプチド濃度は約0.5mg/mLであった。反応は室温で6時間にわたって生じた。反応の程度はRP-HPLCでモニターし、反応収量は約50％であった。
b．精製
反応混合物を0.1％のTFAで2−5倍に稀釈し、調製RP-HPLCカラムに適用した。HPLC条件：C4カラム、流速は10mL/分、A緩衝液は水に10％ACN及び0.1％TFA、B緩衝液はACNに0.1％TFA、直線状グラジエントはB％から0−40％（0−80分）。PEG-インスリン又はアナローグは約35％緩衝液Bで溶出された。所望の化合物はMALDI-TOEによって立証し、続いてスルフトリシス又はトリプシン分解による化学的改変を実施した。
N-ヒドロキシスクシンイミドアシル化によるアミン基（N-末端及びリジン）のペジル化
a．合成
インスリン（又はインスリンアナローグ）をmPEG20k-NHSとともに0.1Nのビシン緩衝液（pH8.0）に1：1のモル比で溶解した。インスリンペプチド濃度は約0.5mg/mLであった。反応の進行はHPLCでモニターした。反応収量は室温で2時間後に約90％であった。
b．精製
反応混合物を2−5倍に稀釈し、RP-HPLCにロードした。HPLC条件：C4カラム、流速は10mL/分、A緩衝液は水に10％ACN及び0.1％TFA、B緩衝液はACNに0.1％TFA、直線状グラジエントはB％から0−40％（0−80分）。PEG-インスリン又はアナローグは約35％Bで収集された。所望の化合物はMALDI-TOEによって立証し、続いてスルフトリシス又はトリプシン分解による化学的改変を実施した。
フェニルアラニンの芳香環のアセチル基の還元アミノ化ペジル化
a．合成
インスリン（又はインスリンアナローグ）、mPEG20k-ヒドラジド及びNaBH3CN（モル比1：2：20）を酢酸緩衝液（pH4.1−4.4）に溶解した。該反応溶液は、0.1NのNaCl、0.2N酢酸及び0.1NのNa2CO3で構成されていた。室温、24時間のインスリン又はインスリンアナローグの濃度は約0.5mg/mLであった。反応の進行はHPLCでモニターした。反応の変換は約50％であった（HPLCによって計算）。
b．精製
反応混合物を2−5倍に稀釈し、RP-HPLCにロードした。HPLC条件：C4カラム、流速は10mL/分、A緩衝液は水に10％ACN及び0.1％TFA、B緩衝液はACNに0.1％TFA、直線状グラジエントはB％から0−40％（0−80分）。PEG-インスリン又はPEG-インスリンアナローグは約35％Bで収集された。所望の化合物はMALDI-TOEによって立証し、続いてスルフトリシス又はトリプシン分解による化学的改変を実施した。
【実施例３】
【０２６４】
インスリンレセプター結合アッセイ：
各ペプチドのインスリン又はIGF-1レセプターに対する親和性を、シンチレーションプロクシミティ技術を利用する競合結合アッセイで測定した。該ペプチドの連続3倍希釈をトリス-Cl緩衝液（0.05Mトリス-HCl（pH7.5）、0.15MのNaCl、0.1％w/vのウシ血清アルブミン）で作製し、96ウェルプレート（Corning Inc., Acton, MA）にて0.05nMの(3-[125I]-ヨードチロシル)A TyrA14インスリン又は(3-[125I]-iodotyrosyl)IGF-1（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）と混合した。ヒトインスリン又はIGF-1レセプターを過剰発現する細胞から調製した形質膜フラグメントの1−6マイクログラムのアリコットが各ウェルに存在し、ポリエチレンイミン処置コムギ胚芽アグルチニンA型シンチレーションプロクシミティアッセイビーズ（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を0.25mg/ウェルで添加した。800rpmで5分振盪した後で、プレートを室温で12時間インキュベートし、放射能をMicroBeta 1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で測定した。非特異的結合（NSB）の放射能を、テストサンプルの最高濃度の4倍濃度過剰の“コールド”の自然のままのリガンドを有するウェルで測定した。競合物を含まないウェルで全結合放射能を検出した。特異的結合パーセントを以下のように計算した：特異的結合パーセント＝（結合NSB／全結合NSB）ｘ100。IC50値はオリジンソフトウェア（Origin software, OriginLab, Northampton, MA ）を用いて決定した。
【実施例４】
【０２６５】
インスリンレセプターリン酸化アッセイ：
レセプターのリン酸化をインスリン又はインスリンアナローグによって測定するために、レセプターをトランスフェクトしたHEK293細胞を96ウェルの組織培養プレート（Costar #3596, Cambridge, MA）にプレートし、ダルベッコー改変イーグル培養液（DMEM（ Dulbecco’s modified Eagle medium ））で5％CO2及び90％湿度下にて16−20時間37℃で培養した。前記培養液は100IU/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、10mM HEPES及び0.25％のウシ増殖血清（HyClone SH30541, Logan, UT）が補充されてあった。インスリン又はインスリンアナローグの連続希釈を、0.5％ウシ血清アルブミン（Roche Applied Science #100350, Indianapolis, IN）補充DMEMで調製し、接着細胞を含むウェルに添加した。5％CO2を含む湿潤雰囲気にて37℃で15分インキュベートした後、細胞を5％パラホルムアルデヒドで20分間室温にて固定し、リン酸緩衝食塩水（pH7.4）で2回洗浄し、さらにPBS中の2％ウシ血清アルブミンで1時間封鎖した。続いて前記プレートを3回洗浄し、製造業者の推奨にしたがって2％ウシ血清アルブミン含有PBSで再構成したセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ホスホチロシン抗体（Upstate biotechnology #16-105, Temecula, CA）を充填した。室温で3時間インキュベートした後、前記プレートを4回洗浄し、0.1mLのTMBシングルソリューション基質（single solution substrate, Invitrogen, #00-2023, Carlbad, CA）を各ウェルに添加した。発色は5分後に1NのHClを添加して停止させた。450nmでの吸収をタイターテックマルチスキャンMCC340（Titertek Multiscan, ThermoFisher, Pittsburgh, PA）で測定した。吸収対ペプチド濃度用量応答曲線をプロットし、EC50値をオリジンソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を用いて決定した。
【実施例５】
【０２６６】
モデルジペプチドの切断速度の決定（PBS中）
ジペプチドN-末端伸長部の切断速度を試験することができるモデルペプチドとして、特定のヘキサペプチド（HSRGTF-NH2；配列番号：57）を用いた。モデルペプチド結合樹脂にBoc保護サルコシン及びリジンを連続的に付加してペプチドA（Lys-Sar-HSRGTF-NH2；配列番号：58）を生成して、ジペプチド伸長モデルペプチドを調製した。ペプチドAはHFによって切断し、調製用HPLCによって精製した。
HPLCを用いる調製的精製：
精製は、シリカ系1ｘ25cmのVydac C18（粒子サイズ5μ、孔サイズ300Å）カラムでHPLC分析を用いて実施した。以下の装置を用いた：ウォーターアソシエーツ（Waters Associates）モデル600ポンプ、インジェクターモデル717、及びUV検出装置モデル486。全サンプルについて230nmの波長を用いた。溶媒Aは蒸留水中に10％CH3CN／0.1％TFAを含み、溶媒BはCH3CN中に0.1％TFAを含んでいた。直線状グラジエントを用いた（2時間で0−100％）。流速は10mL/分で、分画サイズは4mLであった。約150mgの粗ペプチド、30mgの精製ペプチドが得られた。
ペプチドAをPBS緩衝液に1mg/mLの濃度で溶解した。前記文献は参照により本明細書に含まれる溶液を37℃でインキュベートした。サンプルを5h、8h、24h、31h及び47hで分析のために収集した。ジペプチド切断は等体積の0.1％TFAによりpHを低下させることによって停止させた。切断速度をLC-MSによって定性的にモニターし、HPLCによって定量的に調べた。ピークシンプルクロマトグラフィーソフトウェアを用いて、保持時間及び相対的ピーク面積をプロドラッグ及び親モデルペプチドについて定量した。
質量分析を用いる分析：
標準的なESIイオン供給源付きSciex API-IIIエレクトロスプレー四極質量分析計を用いて、質量スペクトルを入手した。用いたイオン化条件は下記のとおりである：陽イオンモードのESI；イオンスプレー電圧は3.9kV；オリフィス電位は60V。使用した霧状化及びカーテンガスは流速0.9L/分の窒素であった。質量スペクトルは、0.5Th/ステップ及び2msec持続時間で600から1800トンプソンまで記録した。サンプル（約1mg/mL）を1％の酢酸を含む50％水性アセトニトリルに溶解し、外部注射筒ポンプによって5μL/分の速度で導入した。造業者（Millipore Corporation, Billerica, MA）によって提供された指示にしたがい、0.6μLのC4樹脂を含むZipTip固相抽出チップを用いて、PBSに溶解したペプチドを分析前に脱塩した。
HPLCを用いた分析：
214nmでのUV検出装置及び150mmｘ4.6mmのC8 Vydacカラムが搭載されている、ベックマンシステムゴールドクロマトグラフィー（Beckman System Gold Chromatography）系を用いて、HPLC分析を実施した。流速は1mL/分であった。溶媒Aは蒸留水中に0.1％TFAを含み、溶媒Bは90％のCH3CN中に0.1％TFAを含んでいた。直線状グラジエントを用いた（10分で0から30％B）。ピークシンプルクロマトグラフィーソフトウェアを用いて、データを収集し分析した。
対応するペプチドについて、切断速度を決定した。プロペプチド及びモデル親ペプチドの濃度をそれらの対応するピーク面積によって決定した。プロドラッグの一次解離速度定数は、多様な時間間隔におけるプロドラッグの濃度の対数をプロットすることによって決定された。このプロットの勾配は速度定数‘k’を提供する。種々のプロドラッグの切断半減期は、式t1/2＝0.693/kを用いて計算された。このモデルペプチドHSRGTF-NH2（配列番号：57）のLys-Sar伸長部の半減期は14.0hであると決定された。
【実施例６】
【０２６７】
全てのD異性体モデルペプチドを用いて決定された血漿中のジペプチド切断速度半減期
追加のモデルヘキサペプチド（dHdTdRGdTdF-NH2、配列番号：59）を用いて、血漿中でのジペプチド切断速度を決定した。各アミノ酸のD異性体（ただしプロドラッグ伸長部は除く）を用いて、該モデルペプチドの酵素的切断を防止した。このモデルD異性体ヘキサペプチドはL-異性体と類似の態様で合成された。ペプチドAについて以前に報告したようにN-末端にサルコシン及びリジンを連続的に付加して、ペプチドB（dLys-dSar-dHdTdRGdTdF-NH2、配列番号：60）を調製した。
対応するプロペプチドについて切断速度を決定した。プロペプチド及びモデル親ペプチドの濃度をそれらの対応するピーク面積によって決定した。プロドラッグの一次解離速度定数は、多様な時間間隔におけるプロドラッグの濃度の対数をプロットすることによって決定された。このプロットの勾配は速度定数‘k’を提供する。このモデルペプチドdHdTdRGdTdF-NH2（配列番号：59）のLys-Sar伸長部の半減期は18.6hであると決定された。
【実施例７】
【０２６８】
モデルヘキサペプチド（HSRGTF-NH2；配列番号：57）に連結される付加ジペプチドの切断速度を、実施例5に記載した方法を用いて決定した。これらの実験で得られた結果を表2及び3に提示する。
【０２６９】
表2：N-末端パラ-アミノ-Pheの側鎖に連結されたジペプチドU-Bのモデルヘキサペプチド（HSRGTF-NH2；配列番号：57）からのPBS中での切断：
【０２７０】
【化５１】
0006392123.tif 000053
【０２７１】
0006392123.tif 000054
【０２７２】
表3：1位（X）のヒスチジン（又はヒスチジンアナローグ）に連結されたジペプチドU-BのPBS中でのモデルヘキサペプチド（XSRGTF-NH2；配列番号：61）からの切断
NH2-U-B-XSRGTF-NH2（配列番号：61）
0006392123.tif 000055
【実施例８】
【０２７３】
プロドラッグ構築に適切な構造を有するインスリンアナローグの同定
A鎖の19位はインスリン活性のために重要な部位であることは知られている。したがって、プロドラッグ成分の付加を可能にするこの部位の改変が所望される。特有のA19インスリンアナローグを合成し、インスリンレセプターにおけるそれらの活性の特徴を調べた。2つの高度に活性な構造アナローグをA19位で同定したが、第二の活性部位である芳香族残基（B24）の比較し得る構造変化については同じように完全な活性をもつインスリンアナローグは同定できなかった。
表4及び5は、インスリンレセプターにおける完全な活性に対するA19位の高度な構造的保存を示す（レセプター結合は実施例3に記載したアッセイを用いて決定した）。表4は、A19に改変を有するインスリンの2つだけが自然のままのインスリンに類似するレセプター結合活性を表すことを示す。4-アミノインスリンアナローグについては、3つの別々の実験のデータが提供される。“活性（試験上）”と表示した欄は、同時に実施した2つの別々の実験で自然のままのインスリンに対して該インスリンアナローグのパーセント結合を比較する。“活性（0.60nM）”と表示した欄は、このアッセイを用いてインスリン結合について得られた文献上の（historical）平均値に対する該インスリンアナローグの相対的パーセント結合である。どちらのアッセイでも、2つのA19インスリンアナローグ（4-アミノフェニルアラニン及び4-メトキシフェニルアラニン）は、自然のままのインスリンとほぼ等価のレセプター結合を示す。図3は、インスリンレセプターに対する自然のままのインスリン及びA19インスリンアナローグの対応する比結合を示すグラフである。表5は、自然のままのインスリンと等価の結合活性を示す2つのA19インスリンアナローグ（4-アミノ及び4-メトキシ）はまた、該インスリンレセプターで等価の活性を提示することを示すデータを提供する（レセプター活性は実施例4に記載したアッセイを用いて決定した）。
【０２７４】
表4：A19インスリンアナローグのインスリンレセプター結合活性
0006392123.tif 000056
【０２７５】
表5：A19インスリンアナローグのインスリンレセプターリン酸化活性
0006392123.tif 000057
【実施例９】
【０２７６】
インスリン様増殖因子（IGF）アナローグIGF1(YB16LB17)
出願人らは、IGFアナローグは、インスリンレセプターで自然のままのインスリンと類似の活性を示すことを見出した。より具体的には、IGFアナローグ、IGF1(YB16LB17)は、自然のままのIGF A鎖（配列番号：5）及び改変B鎖（配列番号：6）を含み、自然のままのIGF B鎖（配列番号：3）の15及び16位の本来のグルタミン及びフェニルアラニンが、それぞれチロシン及びロイシン残基で入れ替えられている。図6及び下記の表6に示すように、IGF1(YB16LB17)及び自然のままのインスリンの結合活性は、それぞれがインスリンレセプターの極めて強力なアゴニストであることを示している。
【０２７７】
表6
0006392123.tif 000058
【実施例１０】
【０２７８】
IGFプロドラッグアナローグ
A19インスリンアナローグの活性を基準にして（実施例5参照）、IGF1 A:B(YB16LB17)アナローグに対して類似の改変を実施し、インスリンレセプターに結合しインスリンレセプター活性を亢進するその能力を調べた。図6は、IGF1 A:B(YB16LB17) とともにそのジペプチド伸長アナローグ[IGF1 A:B(YB16LB17)A19-AiBAlaアミド]を調製する一般的な合成模式図を提供する。ここで、前記IGF1 A:B(YB16LB17)の調製では、本来のチロシンは4-アミノフェニルアラニンと入れ替えられ[IGF1 A:B(YB16LB17)(p-NH2-F)A19アミド]、さらに[IGF1 A:B(YB16LB17)A19-AiBAlaアミド]の調製では、AiB及びAlaを含むジペプチドは、A19 4-アミノフェニルアラニンとのアミド結合により該ペプチドに連結される。図7及び表7に示すように、IGFアナローグ、IGF1 (YB16LB17) A(p-NH2-F)19は、インスリンレセプターと特異的に結合するが、一方、当該アナローグのジペプチド伸長アナローグはインスリンレセプターに特異的に結合できない。該ジペプチド伸長部分は、ジペプチドの偶発的切断を可能にする適切な構造を欠き（該ペプチドの第二の位置にN-アルキル化アミノ酸を欠く）、したがってインスリンレセプター結合の回復が生じないということに留意されたい。
改変アミノ酸（例えばA19位の4-アミノフェニルアラニン）を含むIGF1 A:B(YB16LB17)インスリンアナローグペプチドはまた、タンパク質に非コードアミノ酸を取り込むことを可能にする系を用いてin vivoで合成することができる（前記系には、例えば米国特許第7,045,337号及び7,083,970号に教示された系が含まれる）。
表7
0006392123.tif 000059
IGFYB16B17アナローグペプチドのさらに別のプロドラッグアナローグを調製した（前記アナローグペプチドでは、ジペプチドプロドラッグ成分（アラニン-プロリン）は、A鎖 (IGF1(Y B16LB17)(AlaPro)A-1,0)のアミノ末端にアミド結合を介して連結された）。表8に示すように、IGF1(Y B16LB17)(AlaPro)A-1,0はインスリンレセプターに対する親和性を低下させた。表3のデータを基準にすれば、該ジペプチドプロドラッグ成分は、当該ジペプチドプロドラッグ成分の偶発的な切断を可能にする適切な構造を欠き、したがってこのインスリンレセプター結合の検出は、該プロドラッグ成分の切断の結果ではないことに留意されたい。
【０２７９】
表8
0006392123.tif 000060
【実施例１１】
【０２８０】
追加的IGFインスリンアナローグ
IGF1(YB16LB17)ペプチド配列の更なる改変によって、インスリン及びIGF1レセプターでそれらのポテンシーが変動するさらに別のIGFインスリンアナローグが明らかになった。これらのアナローグの各々について表9に結合データ（実施例3のアッセイを用いる）を提示する。これらのアナローグでは、改変の位置は、自然のままのインスリンペプチドの対応する位置を基準に示される（DPI＝des B26−30）。例えば、本明細書で、更なる説明が一切なく“28位”と言えば、配列番号：2の最初のアミノ酸が欠失したインスリンアナローグのB鎖の対応する27位を意味する。したがって、 “B(Y16)”という一般的呼称は、自然のままのIGF-1配列（配列番号：3）のB鎖の15位のチロシン残基の置換を指す。インスリン及びIGFアナローグの相対的レセプター結合に関するデータは表9に提供され、IGFアナローグ刺激リン酸化に関するデータ（実施例4のアッセイを用いる）は表10に提供される。
【０２８１】
表9
0006392123.tif 000061
表9（続き）
0006392123.tif 000062
【０２８２】
表10
0006392123.tif 000063
表10（続き）
0006392123.tif 000064
【実施例１２】
【０２８３】
IGF1ジペプチド伸長(p-NH2-F)A19アミドアナローグのジペプチド半減期
多様なIGF-1ペプチドからの(pNH2-Phe)アミド連結ジペプチドAibProのの切断を測定して、ジペプチド切断におけるペプチド配列又はヘテロ二重体の影響を決定した。試験したペプチドの結果は表11に示され、当該データは、IGF1 B:A(YB16LB17)ペプチドの半減期の研究のためにIGF1-A鎖単独が良好なモデルであることを明示した。
【０２８４】
表11
0006392123.tif 000065
ジスルフィド結合A鎖及びB鎖構築物（IGF1 A:B(Y B16LB17)）とIGF A鎖プロドラッグアナローグの比較によって、この2つの化合物は該プロドラッグ形について同様な半減期を有することが明示された。AibAlaアナローグは切断されず、したがってプロドラッグではないが、該改変は、インスリンアナローグIGF1 A:B(Y B16LB17)(pNH2-F)A19アミドを不活化できることを示すために役立つ。したがって、IGF1 A鎖単独が、IGF1 B:A(Y B16LB17)アナローグペプチドのプロドラッグ半減期の研究に良好なモデルであると決定された。AibAlaアナローグは切断されず、したがってプロドラッグではないが、該改変がインスリンアナローグIGF1 A:B(Y B16LB17)(pNH2-F)A19アミドを不活化できることを示すために役立つ。単純化するために、プロドラッグ半減期は、B鎖の非存在下でIGF1 A鎖のみを用いて決定した。各ペプチドの半減期は実施例5に記載したように決定した。データは表12に提示する。
【０２８５】
表12：IGF1ジペプチド伸長(pNH2-F)A19アミドアナローグのジペプチド半減期
0006392123.tif 000066
ジペプチドプロドラッグ成分の置換基を変更することによって、プロドラッグの半減期は2時間から＞100時間まで変動し得ることがデータによって示された。
IGF1-A(pNH2F)19を土台にするペプチドを用い、さらにA19位の4-アミノフェニルアラニンを介して連結されるジペプチドプロドラッグ成分のアミノ酸組成を変更して、追加的プロドラッグアナローグペプチドを調製した。ジペプチドの半減期は、PBS及び20％血漿/PBS（すなわち血清酵素の存在下）の両方で種々の構築物について測定した。これらの結果は表13に提供される。試験した4つのペプチドのうち3つが血清酵素によって影響されないことをこれらの結果は示している。
【０２８６】
表13：IGF1-A(pNH2F)19のジペプチドの半減期
0006392123.tif 000067
【実施例１３】
【０２８７】
時間経過中のIGFB16B17アナローグペプチドのレセプター結合
IGFB16B17アナローグペプチドのプロドラッグ処方物を調製し、実施例3のインスリンレセプター結合アッセイを用いて、時間経過中のそれらの分解を測定した。本アッセイに用いたペプチドは下記のように調製した。
ジペプチド-IGF1 Aアナローグ
特に指定がなければ、Boc化学反応を意図するペプチドアナローグの合成で利用した。選択のジペプチドH2N-AA1-AA2-COOHを、IGF1A (Ala)6,7,11,20の(pNH2-Phe)19に添加した。MBHA樹脂上でIGF1 A鎖C-末端トリペプチドBoc(Fmoc-pNH-Phe)-Ala-Alaを合成した。20％ピペリジン/DMFで室温にて30分処理しFmocを除去した後、3倍過剰のアミノ酸、PyBop、DIEA及び触媒量のピリジンを用いてA19でp-アミノベンジル側鎖にFmoc-AA2を結合させた。残りのIGF1 A鎖(Ala)6,7,11,20配列のBoc化学反応はアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）430Aペプチド合成装置を用いて完了させ、IGF1 A鎖(Boc)0(Ala)6,7,11,20(Fmoc-AA2-pNH-Phe)19-MBHAを得た。AA2のN-末端からFmoc基を除去した後、続いて3倍過剰のアミノ酸、DEPBT及びDIEAを用いてBoc-AA1を該アミンに結合させた。A鎖に残留する2つのBoc基をTFAによって除去し、続いてHF切断を実施してIGF-1 A-鎖(Ala)6,7,11,20(H2N-AA1-AA2-pNH-Phe)19アミドを得た。AA1がd-リジンの場合には、Boc除去前にε-アミンのアセチル化を実施した。ジペプチド-IGF1 A鎖アナローグを半調製用RP-HPLCによって精製し、分析用RP-HPLC及びMALDI質量分析によって性状を調べた。
【０２８８】
ジペプチド-IGF-1(YL)アナローグ
直前に記載したように（ただしPAM樹脂をIGF1 A鎖の合成に用いた）、IGF1 A鎖(Acm)6,11,20の(pNH2-Phe)19に選択したジペプチドH2N-AA1-AA2-COOHを添加し、HF-切断に際してC-末端酸を得た。MBHA樹脂上でIGF-1 B鎖(YB16LB17)(Acm)19を合成してC-末端アミドを得た。CysB7の遊離チオールを、100％DMSO中にて1：1モル比でDTNPとの反応によりNpysによって改変した。精製ジペプチド-IGF1 A鎖及びIGF1 B鎖(YB16LB17)アナローグを、模式図1に示す“1+2”二工程鎖結合手法を用いて合集させた。中間精製及び最終精製を半調製用RP-HPLCで実施し、分析用RP-HPLC及びMALDI質量分析で性状を調べた。
このIGFB16B17アナローグペプチドプロドラッグをPBS（pH7.4）中にて37℃でインキュベートし、予め定めた時間間隔でアリコットを採取し、更なる分解を0.1％TFAで停止し、前記アリコットを分析用HPLC分析に付した。ピークa及びb（IGFB16B17アナローグペプチドのプロドラッグ形及び活性形を表す）をLC-MSで同定し、HPLCのピーク面積の積分によって定量した。図9A−9Cは、IGFB16B17アナローグペプチドプロドラッグ：IGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19の分解におけるHPLC分析の結果を示す。アリコットは、PBS中での該プロドラッグのインキュベーション開始後20分（図9A）、81分（図9B）及び120分（図9C）で採取した。データは、時間経過の間のIGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19アミドからIGF1A(Ala)6,7,11,20(pNH2-F)1アミドへの偶発的な非酵素性変換を示す。
IGFB16B17アナローグペプチドのプロドラッグ形からそれらの活性形への分解もまた、実施例3のin vitroアッセイを用いてインスリンレセプターと結合する該化合物の能力を基準に測定した。図10A及び10Bは、プロドラッグAib,dPro-IGF1YL（A19 4-アミノPheにより連結されたジペプチド）のin vitro活性を示すグラフである。図10Aは、PBS中でインキュベートした自然のままのインスリン（4℃、1時間で測定）及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（Aib,dPro-IGF1YL）の時間経過における（0時間、2.5時間及び10.6時間）相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。図10Bは、20％血漿/PBSにて37℃でインキュベートした自然のままのインスリン及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（Aib,dPro-IGF1YL）の時間経過における（0時間、1.5時間及び24.8時間）相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。グラフに提示したデータが示すように、プロドラッグ形が活性なIGF1YLペプチドに変換されるにつれ、A19 IGFプロドラッグ誘導体サンプルから活性の増加が回復する。IGFB16B17アナローグペプチドの活性はインスリンレセプター結合に関して測定され、根幹のIGFB16B17アナローグペプチドは自然のままのインスリンよりも高い活性を有するために、インスリンに比べて100％を超える活性があり得る。
図11A及び11Bは、プロドラッグdK,(N-イソブチルG)-IGF1YL（A19 4-アミノPheにより連結されたジペプチド）のin vitro活性を示すグラフである。図11Aは、PBS中でインキュベートした自然のままのインスリン（4℃、1時間で測定）及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（IGF1YL：dK,(N-イソブチルG)）の時間経過における（0時間、5時間及び52時間）相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。図11Bは、20％血漿/PBSにて37℃でインキュベートした自然のままのインスリン及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（IGF1YL：dK,(N-イソブチルG)）の時間経過における（0時間、3.6時間及び24.8時間）相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。グラフに提示したデータが示すように、プロドラッグ形が活性なIGF1YLペプチドに変換されるにつれ、A19 IGFプロドラッグ誘導体サンプルから活性の増加が回復する。
図12A及び12Bは、プロドラッグdK(e-アセチル,Sar)-IGF1YL（A19 4-アミノPheにより連結されたジペプチド）のin vitro活性を示すグラフである。図12Aは、PBS中でインキュベートした自然のままのインスリン（4℃、1時間で測定）及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（IGF1YL：dK(e-アセチル),Sar）の時間経過における（0時間、7.2時間及び91.6時間）相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。図12Bは、20％血漿/PBSにて37℃でインキュベートした自然のままのインスリン及びA19 IGFプロドラッグ誘導体（IGF1YL：dK(e-アセチル),Sar）の時間経過における（0時間、9時間及び95時間）相対的インスリンレセプター結合を比較するグラフである。グラフに提示したデータが示すように、プロドラッグ形が活性なIGF1YLペプチドに変換されるにつれ、A19 IGFプロドラッグ誘導体サンプルから活性の増加が回復する。
【実施例１４】
【０２８９】
単鎖インスリンアナローグの生合成及び精製
IGF-IC鎖を介して連結された自然のままのインスリンB及びA鎖を含むインスリン-IGF-Iミニジーン（B0-C1-A0）を、酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）での組換えタンパク質の構成的発現及び精製のために、発現ベクターpGAPZαA（Invitrogenから購入）にGAPプロモーター（グリセロアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH））下でクローニングした。培養液中への前記組換えタンパク質の分泌のために、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）α-接合因子リーダーシグナルをコードするN-末端ペプチドに前記ミニジーンを融合させた。自然のままのアミノ末端をもつミニジーンの分泌のために、前記ミニジーンと前記先導α-接合因子配列との間にKex2切断部位を用いて該リーダー配列を切断した。B0C1A0ミニジーンの1位(G1A)、2位(Y2A)、3位(G3A)、4位(S4A)、5位(S5A)、6位(S6A)、7位(R7A)、8位(R8A)、10位(P10A)、11位(Q11A)、及び12位(T12A)のCペプチドにアラニン単一部位変異を導入した。
B0C1A0を含むミニジーン（11のアラニン変異体）及び他の精選誘導体を用いエレクトロポレーションによって酵母ピキア・パストリスを形質転換した。陽性の形質転換体を最少メタノールプレートで選別し、各ピキア単離体のゲノム調製を実施し、該構築物の酵母ゲノムへの組み込みをPCRによって確認した。833塩基対のPCR生成物がアガロースゲル上で可視化された。これらインスリンアナローグを対応する酵母株の発酵によって製造した。500mLのベックマン遠心管で5K、20分遠心して酵母細胞をペレットにし、培養液をその後のタンパク質精製のために維持した。
増殖培地上清を0.2μmのミリポアフィルターでろ過した。最終体積20％になるように上清にアセトニトリル（ACN）を添加した。20％のACN水で予め平衡化させたアンバーライト（Amberlite（Sigma））XAD7HP樹脂で、前記上清を精製した。続いて前記樹脂を30mLの20％ACN水で2回洗浄し、さらに0.1％TFA含有30％ACN水で夾雑物を除去した。部分精製インスリンアナローグを0.1％TFA含有54％ACN水で溶出させ、凍結乾燥させた。凍結乾燥サンプルを0.025MのNH3HCO3（pH8）に懸濁し、ルナ（Luna）C18カラム（10μm粒子サイズ、300Å孔サイズ）で精製した。タンパク質は、20−60％のACM水の直線状グラジエントを用いてカラムから溶出させた。MALDI-MS陽性分画をプールし、その後の凍結乾燥のために使い捨てバイアルに移した。続いて、凍結乾燥サンプルを0.1％TFA含有20％ACN水に再懸濁し、さらにルナC18カラム（10μm粒子サイズ、300Å孔サイズ）で精製した。タンパク質は、0.1％のTFAを含む18−54％のACN水の直線状グラジエントを用いてカラムから溶出させた。タンパク質溶出は280nm吸収でモニターした。MALDI-TOF MS陽性分画をC8分析用カラムで分析して純度を担保した。
図15は単鎖インスリンアナローグのポテンシーを示す。B0-C1-A0アナローグは、インスリンレセプターアイソフォーム及びIGF-1レセプターの両方で等しく有効なポテンシーを示した。2位のチロシンからアラニンへの変異又はC9−12の欠失によるC-ペプチドの8アミノ酸への短縮は、IGF-1レセプター活性の有意な低下によるインスリン作用の特異性の選択的強化を提供した。表14A及び14Bに提供したデータもまた参照されたい。
【０２９０】
表14A：インスリン結合及びリン酸化の分析（B0C1A0）
0006392123.tif 000068
【０２９１】
表14B：IGF-1結合及びリン酸化の分析（B0C1A0）
0006392123.tif 000069
【０２９２】
図16は、C-ペプチドの2及び3位はIGF-1レセプターにおける改変に最も鋭敏であることを示し、インスリンレセプターは改変に対して比較的免疫を有することを証明している。最後に、図17及び18は、結合親和性（IC50）とチロシンリン酸化による生化学的シグナリング（EC50）との比として単鎖インスリン変異体のin vitro分析を示す。前記2つのそれぞれ別個の測定は顕著な一致を示し、したがって構造-機能分析におけるこのin vitroアプローチの有効性を立証する。アナローグの全てが一桁のナノモル活性を維持し、ある種の特定のアナローグはポテンシーがわずかに強化されることを示している（一桁の低ナノモル）。もっともインスリン選択性であるアナローグは、C-ペプチドの最後の4残基は既に失われているが、C-ペプチドの2位にアラニン変異を有するものであるか、或いは前記2つの変化が組み合わさったものであった。
【実施例１５】
【０２９３】
原核細胞のための生合成の手順
1．大腸菌での自然のままの発現によるDP20の発現及び精製
DP20遺伝子をコドン最適化に付し合成して、LIC-SUMOベクターでクローニングした。LIC-SUMOはpET22b（Novagen）から改変され、SUMOと標的タンパク質配列との間にTEVプロテアーゼ切断部位を有するN-末端融合タグとしてsumo配列をもつ。
DP20をOrigamiB(DE3)（Novagen）で発現させた。50μg/mLアンピシリン、25μg/mLカナマイシン及び5μg/mLテトラサイクリンを含むルリア（Luria）ブロス培地で細胞を培養した。OD600nmが37℃で0.8−1.0に達したときに、培養を16℃に移した。IPTGを前記培養に0.2mMの濃度で添加した。培養を一晩継続し、5000rpmで15分間遠心分離して細胞を採集した。
細胞ペレットを溶解緩衝液に再懸濁した（前記緩衝液は50mMリン酸ナトリウム、300mMのNaCl、10mMイミダゾールから成る）。細胞を超音波処理によって溶解させた（1秒ON、2秒OFFの180サイクル）。溶解物を15000rpmで30分間遠心分離した。上清を予め溶解緩衝液で平衡化したNi-NTA（Qiagen）カラムに適用した。カラムを緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、300mMのNaCl、40mMイミダゾール）で洗浄した。DP20を溶出緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、300mMのNaCl、500mMイミダゾール）で溶出させた。
Ni-カラムから溶出させたDP20をTEVプロテアーゼで一晩4℃にて消化した。pHを2−3に調整した後、前記サンプルをシリカ系C8 HPLCカラム（Phenomenex）でクロマトグラフィーによって精製した。サンプルを前記カラムに適用し、0.15％TFA（水性）中の15％−25％アセトニトリルのグラジエントで溶出させた。所望のタンパク質であることは分析用HPLC及び質量分析によって確認した。DP20を含む分画をプールして凍結乾燥させた。
【０２９４】
2．大腸菌での変性条件下におけるDP31の発現及び精製
DP31の遺伝子をコドン最適化に付して合成し、LIC-SUMOベクターでクローニングした。LIC-SUMOはpET22b（Novagen）から改変され、SUMOと標的タンパク質配列との間にTEVプロテアーゼ切断部位を有するN-末端融合タグとしてsumo配列をもつ。
DP31をOrigamiB(DE3)（Novagen）で発現させた。50μg/mLアンピシリン、25μg/mLカナマイシン及び5μg/mLテトラサイクリンを含むルリア（Luria）ブロス培地で細胞を培養した。OD600nmが37℃で0.8−1.0に達したときに、培養を16℃に移した。IPTGを前記培養に0.2mMの濃度で添加した。培養を一晩継続し、5000rpmで15分間遠心分離して細胞を採集した。
変性条件下で単鎖アナローグを合成する一般的工程は図17に示されている。細胞ペレットを溶解緩衝液に再懸濁した（前記緩衝液は50mMリン酸ナトリウム、300mMのNaCl、10mMイミダゾール、8M尿素から成る）。溶解は超音波処理によって実施した（1秒ON、2秒OFFの180サイクル）。溶解物を15000rpmで30分間遠心分離した。上清を予め溶解緩衝液で平衡化したNi-NTA（Qiagen）カラムに適用した。カラムを50mMリン酸ナトリウム、300mMのNaCl、40mMイミダゾールで洗浄した。DP31を50mMリン酸ナトリウム、300mMのNaCl及び500mMイミダゾールで溶出させた。
Ni-カラムクロマトグラフィーで精製したDP31をTEVプロテアーゼで一晩4℃にて消化した。また別には、該リーダーペプチドは、トリプトファン切断部位（W）を用いて切断するか、又は単鎖インスリンアナローグ内にリジンが存在しないときは挿入したリジン残基でLysC切断を用いて切断してもよい。溶液のpHを10.5に調整し、グリシン及びシステインをそれぞれ20mM及び4mMの濃度に添加した。前記タンパク質をジスルフィド酸化し、24−48時間にわたって折り畳んだ。pHを2−3に調整した後、前記サンプルをシリカC8 HPLCカラム（Phenomenex）でクロマトグラフィーによって精製した。DP-31は0.15％TFA（水性）中の15％−25％アセトニトリルで溶出させた。所望のタンパク質であることは分析用HPLC及び質量分析によって確認した。DP31を含む分画をプールして凍結乾燥させた。
【実施例１６】
【０２９５】
ピキア・パストリスでのDP31の発現及び精製
DP31のコドン最適化遺伝子を合成しpPICZα（Invitrogen）で合成する。該構築物は、Kex2切断部位とDP31遺伝子との間に配置されたスペーサーペプチドEEAEAEAEPKを含んでいるであろう。プラスミドpPICZα-DP31をSacIで開き（線状化し）、P.パストリス株X-33（Invitrogen）でエレクトロポレーションを実施した。形質転換酵母クローンをゼオシン（Zeocin）プレート（濃度を高めたゼオシンを含む）で選別する。もっとも生命活力の高いクローン（ゼオシン濃度が最高）を選別し、DP31タンパク質の発現に用いる。
選別したP.パストリス細胞を100mLのYPD培地（1％酵母抽出物、2％ペプトン、2％デキストロース）に接種し、30℃及び220rpmで24時間震盪する。続いて前記接種物を2LのBMGY培地（1％酵母抽出物、2％ペプトン、100mMリン酸カリウム（pH6.0）、1.34％のYNB、4ｘ10-5のビオチン、1％グリセロール）に加え、OD600nmが5−6に達するまで30℃、220rpmで震盪する。続いて5000rpmで5分間4℃にて遠心分離して細胞を採集し、1LのBMMY培地（1％酵母抽出物、2％ペプトン、100mMリン酸カリウム（pH6.0）、1.34％のYNB、4ｘ10-5のビオチン、0.5％メタノール）に再懸濁しDP31の生成を誘導する。誘導期の間ずっと（4−6日）、24時間毎にメタノールを最終濃度1.0％（v/v）に補充する。5000rpmで15分間遠心分離して培地を清澄にし、XAD7HPカラム（Rohm and Haas）にロードする。前記カラムを15％エタノール含有5％酢酸で、その後5％酢酸で繰り返し洗浄して不純物を除去する。5％酢酸を含む45％エタノールを用いDP31をカラムから溶出させる。続いて蒸発させることによって溶出タンパク質を濃縮し、実施例15に提供したものと同じ条件を用い、調製用HPLCによりさらに精製する。
【実施例１７】
【０２９６】
CHO真核細胞でのDP31の発現及び精製
CHO細胞でDP31を発現させるために、合成遺伝子（下図参照）を合成し、NheI及びNotI部位を含むpcDNA3.1につなぐ。
0006392123.tif 000070
DP31のN-末端に融合させたヒト成長ホルモン（hGH）は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって容易に検出できる。前記はまた発現を強化し、さらに分泌を指令する。8つのヒスチジン残基及びTEVプロテアーゼ切断部位をhGHとDP31の間に配置して、精製及び当該融合パートナーのタンパク分解除去を容易にする。
Fugene6トランスフェクション試薬（Roche）を用いて、pCDND3.1-hGH-DP31プラスミドをCHO細胞にトランスフェクトする。安定な細胞株を200μg/mLのゼオシンを含む培地でスクリーニングする。安定細胞株を増幅し、無血清培養液（EX-cell 301 JRH Biosciences）に順応させ850cm2のローラーボトルで増殖するまでに増加させる。各ローラーボトルで100mLの培養液を維持し、3日毎に10本のローラーボトルより1リットルの条件付け培養液の製造を可能にする。
前記条件付け無血清培養液を遠心分離し、さらにろ過して細胞屑を除去する。続いてトリス及びNaClを前記培養液にそれぞれ20mM及び300mMの濃度に添加する。続いてpHを8.0に調整し、前記培養液をNi-NTAカラムに適用する。前記カラムを5倍のベッド体積の20mMトリス、20mMイミダゾール、300mM NaCl（pH8）で洗浄する。伸長DP31融合タンパク質を20mMトリス、500mMイミダゾール、500mM NaCl（pH8）で溶出させる。この融合タンパク質をTEVプロテアーゼで消化し、さらに実施例15に開示した条件と同じ条件を用い調製用HPLCによって精製する。
【実施例１８】
【０２９７】
CTP含有単鎖インスリンアナローグのレセプター結合
インスリン又はIGF-1レセプターに対する各ペプチドの親和性を実施例3に記載の競合結合アッセイで測定し、さらに該インスリンアナローグのインスリンサブタイプA及びサブタイプBレセプターリン酸化活性を、実施例4に記載のレセプタートランスフェクトHEK293細胞を用いて測定した。化合物の各々をそれらのHMEC細胞分裂誘導能力についてもまた試験した。結果を表15に提供する。被検化合物には以下が含まれる：
DP19：CTP-E5K-B鎖-Cペプチド-A鎖（配列番号：67）；
DP20：GE5K-B鎖-CTP(K)-A鎖（配列番号：68）；及び
DP22：CTP-E5R-B鎖-CTP(K)-A鎖（配列番号：91）。
【０２９８】
表15
0006392123.tif 000071
【０２９９】
図18Aは、インスリンサブタイプAレセプターでリン酸化を誘導するDP20及びDP22の能力の自然のままのインスリン及びIGF-1との比較を示すグラフである。この実験で各化合物について得られたEC50値（nM）は以下のとおりであった：
0006392123.tif 000072
図18Bは、インスリンサブタイプBレセプターでリン酸化を誘導するDP19及びDP20の能力の自然のままのインスリン及びIGF-1との比較を示すグラフである。この実験で各化合物について得られたEC50値（nM）は以下のとおりであった：
0006392123.tif 000073
図18Cは、IGF-1レセプターでリン酸化を誘導するDP20及びDP22の能力の自然のままのインスリン及びIGF-1との比較を示すグラフである。この実験で各化合物について得られたEC50値（nM）は以下のとおりであった：
0006392123.tif 000074
図19A−19Cは、ヒトインスリンと2つのCTP含有単鎖インスリンアナローグの能力を比較する、マウスで実施した比較インスリン耐性試験の結果を示す。データに示されているように、D19（B鎖のN-末端に連結されたCTPを有する）及びD20（連結部分としてCTPを有する）の両方が強力なインスリンレセプターアゴニストである。
該CTPペプチドは高い含有量のセリン及びプロリン残基を有する。セリン残基がCTPにその驚くべき活性を与えるために機能しているのか否かを決定するために、CTP連結ペプチドのセリンをアラニンで置換し、インスリンサブタイプA及びBレセプターによってリン酸化を誘導する該アナローグの能力を測定した。さらにまた、B及びA鎖の間の連結部分として機能するCTPを有する単鎖インスリンアナローグを調製した（前記ではCTPを構成するアミノ酸は同じであるが、CTPペプチドの配列はランダム化されている（DP20RCTP））。さらに別のアナローグをDP20の構造を基準にして調製した（前記では連結ペプチドは自然のままのプロインスリンCペプチドを含む）。図20A及び20Bは、それぞれインスリンサブタイプB及びサブタイプAレセプターによってリン酸化を誘導するインスリンアナローグの活性を示すグラフである。各アナローグのIC50は表16A及び17Bに提供される。
【０３００】
表16A：インスリンレセプターサブタイプAにおけるリン酸化
0006392123.tif 000075
表16B：インスリンレセプターサブタイプBにおけるリン酸化
0006392123.tif 000076
これらのデータは、連結部分としてCTPペプチドをふくむ単鎖インスリンアナローグは、たとえセリンがアラニンで置換されてあったとしても、又は該配列がランダム化されてあったとしても、自然のままのプロインスリン若しくはIGFペプチドと比較して両方のインスリンレセプターで、又は自然のままのプロインスリン若しくはIGFペプチドと比較して両方のインスリンレセプターサブタイプでなおポテンシーを維持することを示している。
CTPペプチドのインスリン単鎖連結部分としての機能性をさらに究明するために、さらに追加の単鎖アナローグを調製した。単鎖アナローグは、プロリンがアラニンで入れ替えられてある（DP20PからA（配列番号：70））CTPペプチドを連結ペプチドとして含んでいて、その活性を、自然のままのプロインスリンCペプチド、自然のままのIGF_1Cペプチド又は当該Cペプチドのカルボキシ末端で切断されたCペプチドのいずれかを有するように改変されたDP20と比較した。これらの化合物のインスリンサブタイプAレセプターにおける活性を図21に示す。CTPペプチドのプロリンがアラニンで置換されてあるCTPペプチド連結部分を含む単鎖アナローグは、なおインスリンレセプターでかなりの活性（自然のままのIGF-1の活性と同等）を有する。さらにまた、連結部分としてCTPペプチドを含む単鎖インスリンアナローグが、該CTPと該インスリンA鎖との間の連結部で切断されるとき、生じた二鎖アナローグは自然のままの二鎖インスリンと少なくとも同じ程度に強力である。
【０３０１】
自然のままのプロインスリンCペプチドがインスリンレセプターを活性化するインスリンの能力を妨げるか否かを解明するために、CTPペプチドと自然のままのプロインスリンCペプチドの両方を含む連結部分を含む単鎖インスリンアナローグを構築した。自然のままのCペプチドを、B鎖とCTPペプチドの間（DP20 C0CTP（配列番号：74））、又はCTPペプチドとA鎖の間（DP20 CTPC0（配列番号：73））のどちらかに挿入した。追加のアナローグもまた調製し、前記は連結部分として頭対尾で連結した2つのCTPペプチドを含んでいた（DP20 2CTP（配列番号：75））。図22A及び22Bは、これらの単鎖インスリンアナローグのin vitroリン酸化活性を示すグラフである。これらのデータが示すように、全てのインスリンアナローグがインスリンレセプターで活性を有するようであるが、DP20 CTPC0がDP20 C0CTPよりも強力なようである。さらにまた、連結ペプチドとして2つのCTPペプチドを含む単鎖アナローグもまたインスリンアゴニストとして活性を有するようである。
自然のままのプロインスリンCペプチドのあるセグメントの除去が、当該配列の単鎖アナローグの連結部分としての使用を可能にするか否かを解明するために、自然のままのプロインスリンCペプチド配列で一連の6アミノ酸欠失を実施した。自然のままのプロインスリンCペプチドをCTPペプチドと同じサイズに調整するために、6アミノ酸を除去した。したがって、最初の6アミノ酸を除去するか（DP20 C0 (desC1-6)（配列番号：76））、アミノ酸15−21を除去するか（DP20 C0 (desC15-21)（配列番号：77））、又はアミノ酸27−33を除去した（DP20 C0 (desC27-33)（配列番号：78））自然のままのプロインスリンCペプチドを連結部分として用いて、単鎖アナローグを調製した。図23は、自然のままの二鎖インスリン及び連結ペプチドとしてCTPを有するインスリンアナローグと比較した、単鎖インスリンアナローグのインスリンサブタイプAレセプターにおけるin vitroリン酸化活性を示すグラフである。自然のままのプロインスリンCペプチドの切端形を含む単鎖インスリンアナローグの各々がインスリンサブタイプAレセプターで貧弱な活性を示し、一方、DP20は自然のままのホルモンとほぼ同等であった。
【実施例１９】
【０３０２】
単鎖インスリン系CTPアナローグ
CTPペプチドを連結部分として含む単鎖インスリンアナローグで自然のままのインスリン配列の活性を解明するために、DP25Mペプチドを構築した：GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRTSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：81）。この化合物を、インスリンサブタイプA（IRA-DP25M）及びサブタイプB（IRB-D25M）での活性について試験し（図24参照）、前記化合物は活性を有するが、対応するDP20アナローグの約1/3から1/4の活性であることが見出された。したがって、カルボキシ末端の5アミノ酸がB鎖から除去されたDP25Mの一連の誘導体を調製した：
DP30：GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF-----SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：83）
DP31：GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF-----SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：84）、及び
DP32：GEEEEEKGPEHLCGSHLVEALYLVCGERGFF-----SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：85）
これらの化合物の活性をインスリンサブタイプA及びBレセプターの他にIGF-1レセプターで試験し、さらに連結部分としてIGF-1 Cペプチドを用いて単鎖アナローグの活性と比較する：
DR3：GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRTGYGSSSRRAPQTGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：86）
DR4：GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRTGAGSSSRRAPQTGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：87）
【０３０３】
結果を表17A及び17Bに提供する。データが示すように、DP30及びDP31は非常に強力なインスリンアゴニストであり、自然のままのインスリンのポテンシーに近づきつつ、しかもDR3及びDR4と比較してIGF-1レセプターに対するよりも高い選択性を両インスリンレセプターに対して有する（表17A）。さらにまた、DP30及びDP31とDP25との比較によってDP25はDP30及びDP31ほど強力ではないことが明らかとなり、インスリンB鎖の最後の5アミノ酸は単鎖インスリンアナローグで必要ではないことを示している（表17B参照）。ただ1つのアナローグDP31をCTPペプチドとA鎖の間で切断したとき（DP31 LysC）、生じた二鎖アナローグのポテンシーはインスリンレセプターでわずかに上昇するが、IGF-1レセプターでのその活性は実質的に増加する。これらの結果に合致して、DR3及びDR4は、HMEC細胞の細胞増殖刺激においてDP30及びDP31よりも高い活性を有することが見出された。DP30及びDP31は、HMEC細胞の細胞増殖刺激で自然のままのインスリンと同様な活性を有することが見出された。
【０３０４】
表17A
0006392123.tif 000077
表17B
0006392123.tif 000078
【実施例２０】
【０３０５】
アシル化インスリンアナローグ
比較インスリン耐性試験をマウスで実施して、低濃度の血中グルコースを持続させる能力をヒトインスリンと3つの異なるアシル化インスリンアナローグとで比較した。前記化合物を異なる2つの濃度（27nmol/kg及び90nmol/kg）で試験した。アシル化インスリンにはMIU-41（A14位に位置するリジン残基に結び付けられたガンマグルタミン酸リンカーを介してC16アシル化を有する二鎖インスリンアナローグ）、MIU-36（B鎖のN-末端に連結されたC16アシル化を有する二鎖インスリンアナローグ）、及びMIU-37（B22位に位置するリジン残基に結び付けられたガンマグルタミン酸リンカーを介してC16アシル化を有する二鎖インスリンアナローグ）が含まれていた。3つのアシル化インスリンアナローグは全て、自然のままのインスリンと比較して、8時間後ですら、より基底量で持続性の低グルコースレベルを提供した（図25A−25D参照）。
図26A−26Dは、市場で入手可能なアシル化インスリンアナローグ（デチマー（Detimer））の能力をアシル化二鎖インスリンアゴニストMIU55と比較した、マウス実施の比較インスリン耐性試験の結果を示す。MIU55 [B1(H5,10,Y16,L17,C16rE-K22)25a：A1(N18,N21)]はB鎖のC-末端5アミノ酸が欠失し、ガンマGluリンカーを介してLys B29のε-アミノ基でC14脂肪酸（ミリストイル酸）によりアシル化されている。これらの結果は、MIU-55のポテンシーはデチマーの約1/3であることを示している（図26A及び26B参照）。これらのデータは、インスリンのアシル化形は非アシル化形より作用時間が長く、MIU-55はデチマーよりポテンシーは低いがデチマーと類似のプロフィールを提示することを示している。図26C及び26Dは、列挙したアナローグの投与後の血中グルコースAUC値に関するデータを提供する。インスリン耐性試験におけるデチマーとMIU-55との比較は同様な結果を示している（図27A−27D参照）。MIU-49 [B1(C16-rE0,H5,Aib9,H10,E13-K17,Y16)25a： A1(N18,N21)]は、B鎖のC-末端5アミノ酸が欠失し、ガンマGluリンカーを介してGly B2のα-アミノ基でC16脂肪酸によりアシル化された二鎖インスリンアゴニストである。さらにまた、これらのデータは、、MIU-49のポテンシーはデチマーの約1/3であること（図27A及び32B参照）、MIU-49はデチマーよりポテンシーは低いがデチマーと類似のプロフィールを提示することを示している。
【実施例２１】
【０３０６】
ペジル化インスリンアナローグ
多様なペジル化インスリンアナローグを調製し、in vitroで試験した。表18は、自然のままのインスリンと比較した各アナローグのパーセント活性を示す。
【０３０７】
表18：ペジル化IGF-1及びインスリンアナローグ
0006392123.tif 000079
比較インスリン耐性試験をマウスで実施し、アシル化インスリンアナローグDetimirの能力をペジル化単鎖インスリンアナローグMIU 56（B1(H5,Y16,L17)25a-PEG8-K-PEG4-A1(N18,21)）と比較した。この単鎖アナローグは、A鎖とB鎖をつなぐ連結部分（PEG8-K-PEG4）内のただ1つのリジン残基の側鎖に連結された20kDaのPEGを含む。図28A−28Dに示すように、ペジル化アナローグは24時間の作用の持続的継続を示し、さらにその開始は、24時間にわたる持続的作用のために要求される投薬量で動物の鎮静を回避するために十分に緩やかである。図28C及び28Dは、Detimir及びMIU-56を投与したマウスにおける血中グルコースAUC24hrsをそれぞれ示す。同様な結果が別のペジル化単鎖インスリンアナローグMIU-57についても得られた（図29A−29D参照）。MIU-57は、B鎖のN-末端の側鎖に連結された20kDaのPEGを含むインスリン単鎖アナローグ（B1(H5,Y16,L17)25-C1-A1(N18,21)）である。図29A及び29Bは、連結部分でペジル化されるか（MIU-56）又はB鎖のN-末端でペジル化された（MIU-57）単鎖インスリンアナローグのインスリン用量比較滴定をそれぞれ示す。図29C及び29Dは、MIU-56及びMIU-57を投与したマウスにおける血中グルコースAUC24hrsをそれぞれ示す。これらのデータは、これらアナローグがかわらず強力であり、自然のままのインスリンと比較して治療インデックスの改善を有することを示す。MIU-56及びMIU-57のインスリン用量比較滴定の結果は、類似のプロフィールが20nmol/kgから80nmol/kgの範囲の投薬量についてマウスで得られることを示している（図29E及び29F参照）。
【０３０８】
ダイマー（MIU-58）を調製した。前記は、20kDaのPEGを介して頭対頭で連結された2つのインスリン単鎖アナローグ（B1(H5,Y16,L17)25-C1-A1(N18,21)）を含む。図29G−29Jは、C57/Blkマウスを使用したMIU-57及びMIU-58についての比較インスリン耐性試験から得られた結果を示す。図29G及び29Hは、MIU-57とMIU-58を比較したインスリン耐性試験の結果を示すグラフである。図29I及び29Jは、MIU-57及びMIU-58を投与したマウスにおける血中グルコースAUC24hrsをそれぞれ示す。このダイマーは、親化合物よりもポテンシーは低いが、なお活性を示す。
図30A及び30Bは、2つのペジル化された自然のままのインスリンのヘテロダイマーの比較インスリン用量滴定のデータを提供する。前記アナローグは、自然のままのジスルフィド結合を介して連結され、さらにB鎖のN-末端又はB29位（カルバミル化されたA及びB鎖のアミノ末端を有する）に連結された20kDaのPEGを有するように改変された2つの自然のままのインスリンA及びB鎖を含む。これらのデータは、これら化合物はそれらのin vitro活性にわずかな相違を有するが（表18参照）、それらはマウスで同様なin vivo態様を提示することを示す。両化合物はかわらず強力であり、ペジル化されていない自然のままのインスリンと比較して治療インデックスの改善を有する（緩徐な開始、24時間の持続的活性及び応答の相対的な平坦さ）。
共有結合により連結された2つ以上のポリエチレングリコールを有するインスリンアナローグをまた構築して、そのN-末端にただ1つの20kDa PEGを連結させた自然のままのインスリンアナローグと比較した。より詳細には、N-末端及び連結部分のアミノ酸8（C8）に連結された2つのPEG（各々10K）を有する単鎖インスリンアナローグ（B1(H5,Y16,L17)25-C1(K8)-A1(N18,21)）、N-末端及びアミノ酸B22に連結された2つのPEG（各々10K）を有する単鎖インスリンアナローグ（B1(H5,Y16,L17, K22)25-C1(K8)-A1(N18,21)）、並びにN-末端及びアミノ酸A14に連結された2つのPEG（各々10K）を有する単鎖インスリンアナローグ（B1(H5,Y16,L17)25-C1(K8)-A1(K14, N18,21)）の活性を比較した。図31A−31Dは、自然のままの一ペジル化インスリン誘導体と比較した前記3つのペジル化インスリンアナローグの比較インスリン用量滴定のデータを提供する。in vitro活性は少なくとも10x劇的に低下する。しかしながら、in vivoのデータはいくらかのポテンシーの低下を示すが、二重ペジル化インスリンアナローグはなお有効である（特に連結部分でペジル化されたアナローグについて）。したがって、長さが10kDaの2つのPEG鎖を有するインスリンアナローグを調製することができ、前記は非ペジル化インスリンアナローグと比較して治療インデックスの改善を提供する。さらにまた、単鎖アナローグの連結部分でのペジル化はペジル化の好ましい部位であるように思われる。
糖尿病マウス（db/dbマウス）にペジル化インスリンアナローグを投与し、市場で入手可能なインスリンアナローグとそれらの有効性を比較した。特に、インスリンアナローグレベミア（Levemir）及びヒュームリン（Humulin）を、ペジル化インスリンアナローグMIU-59（そのN-末端に連結されたただ1つの20kDa PEGを有する自然のままのインスリンアナローグ）及びMIU-66（そのN-末端並びにカルバミル化されたA及びB鎖のアミノ末端に連結されたただ1つの20kDa PEGを有する自然のままのインスリンアナローグ）と比較した。MIU-59及びMIU-66の両方がレベミア及びヒュームリンと比較して改善された活性を示す（図32A及び32Bを参照）。
【実施例２２】
【０３０９】
インスリンプロドラッグアナローグの比較インスリン耐性
正常なマウスにインスリンヘテロダイマーアナローグ[B1(Y16,L17,Y25)29a：A1(aF19-NH2)]、又はそのプロドラッグ誘導体のどちらかを投与した。前記プロドラッグ誘導体[B1(Y16,L17,Y25)29a：A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)]は、A19位に4-アミノ-フェニルアラニン置換を有し、ここではジペプチドdLys(Ac),NLeuがA19残基の4-アミノ位に共有結合により連結されている。このジペプチドは、生理学的条件下で約5時間の半減期で自己切断される。前記プロドラッグ誘導体[B1(Y16,L17,Y25)29a：A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)]を24時間ex vivoでインキュベートした後、生じた化合物をマウスに投与し、血中グルコースを低下させるその能力を親化合物と比較した。図33に示すように、前記2つの化合物はほぼ同一のパフォーマンスを示した。
前記インスリンプロドラッグアナローグのアシル化を精査して、in vivoでの保持時間が強化されるか否かを決定した。MU42 [B1(Y16,L17,Y25)29a：A1(dLys(rE-C14),Sar-aF19)]（前記はアシル化ジペプチドプロドラッグ成分を有する）のin vitro活性は、非アシル化プロドラッグと比較して、37℃で30％のCAN/PBS（pH7.4）でex vivoによりインキュベートされる時間とともに増加する。予備インキュベーション工程無しに投与されるMIU42プロドラッグを用いて実施される（図34B）比較インスリンポテンシー試験は、非プロドラッグ親化合物（MIU-27；図34A）と比較して、このプロドラッグは非常に強力とは言えないことを示している。したがって、少なくともマウスでは、アシル化は所望のプロフィールをもたらさない。このことはまた、B29位にアシル化を有するアシル化インスリンアナローグMIU-46[B1(H5,10 Y16,L17,Y25, K29-C14)28a：A1(N18,21, aF19NH2)]についてもあてはまることが判明した。前記化合物は、マウスによるin vivoで試験したときには十分なin vivoポテンシー又は基本的プロフィールを示さなかった（データは示されていない）。
【実施例２３】
【０３１０】
CTP含有単鎖インスリンアナローグとC-タンパク質単鎖インスリンアナローグとのレセプター結合の比較
4つの単鎖インスリンアナローグ（DR3、DR4、DP30及びDP31）のインスリンサブタイプA及びサブタイプBレセプターにおけるリン酸化活性を、実施例4に記載したレセプタートランスフェクトHEK293細胞を用いて測定した。DR5及びDR4は、B鎖と A鎖をつなぐ連結部分としてIGF-1 Cペプチドを有する単鎖インスリンアナローグである。DP30及びDP31は、C-末端切端B鎖（最後の5つのカルボキシアミノ酸が除去されている）とA鎖をつなぐ連結部分としてIGF-1 Cペプチドを有する単鎖インスリンアナローグである。
これらの構築物の完全な配列を以下に提供する：
DR3：GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRTGYGSSSRRAPQTGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：96）
DR4：GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRTGAGSSSRRAPQTGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：97）
DP30：GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：98）
DP31：GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：99）。
DR3及びDR4は、IGF1 Cペプチド内の自然のままのチロシンの置換で互いに相違し、DR4ではアラニンで置換されている。DP30及びDP31は、CTPペプチドの末端アルギニンのリジンによる置換で互いに相違する（リジンによる置換は単鎖インスリンアナローグの二鎖インスリンへの切断を可能にする）。DR3及びDR4は、A及びBサブタイプインスリンレセプターでほぼ同等の活性を有する高ポテンシーアナローグである（表19参照）。DR4は、置換YC2AのためにIGF1レセプターでほぼ10倍活性が低い。DP30及びDP31もまた高ポテンシーアナローグであり、前記は、A及びBサブタイプインスリンレセプターでほぼ同等の活性を有し（表19参照）、IGF1活性ではポテンシーは低い（IGF1でのDP30の活性について数値は決定されなかったが、当該活性はDP31の活性と類似することに留意されたい）。
2つの追加の単鎖インスリンアナローグ（DP25M及びDP31LysC）のインスリンサブタイプA及びサブタイプBレセプターにおける、DP30及びDP31と比較されるリン酸化活性を、レセプタートランスフェクトHEK293細胞を用いて測定した。DP31LysCは、CTPペプチドをA鎖のN-末端に連結するリジンで切断されてあるDP31構築物であり、したがってCTPペプチドがB鎖のカルボキシ末端に結合したままの二鎖インスリンアナローグを生じる。切断後、インスリン活性はわずかに増加するが（ほぼ2X）、IGF活性はほぼ20倍増加する。
DP25Mは、連結部分としてCTPペプチドを含む単鎖インスリンアナローグであり、前記は、完全長B鎖が当該構築で用いられるという点を除きDP30と構造が類似する。具体的には、DP25Mは以下の配列を含む：GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRTSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：100）。この化合物はインスリンレセプターでより低い活性を有する。
表19及び20に提示したデータは、インスリン及びそれらの誘導体を長時間にわたって、いつでもというわけではないが一緒に並べて試験したいくつかのデータ点を合集させたものである。結果的に、平均するということは各アナローグ間の小さな活性の相違を識別する能力を低下させる可能性があるが、これらのデータは、対応するインスリン及びIGFレセプターにおける個々の化合物の各々の包括的活性及び被検化合物の全体的な相対活性を反映する。
【０３１１】
表19
0006392123.tif 000080
【０３１２】
表20
0006392123.tif 000081
【０３１３】
ヒト乳房上皮細胞の増殖：
インスリンアナローグのマイトジェンポテンシャルを測定するために、ヒト乳房上皮細胞（HMEC #CC-2551, Cambrex East Rutherford, NJ）を完全MEGM（#CC-3051, Cambrex, East Rutherford, NJ）で90％コンフルエンシーとなるまで培養した。前記細胞をTrypLEエクスプレス（TrypLE Express, Invitrogen Grand Island, NY）を用いてトリプシン消化し、ダルベッコー改変イーグル培養液（Dubecco’s Modified Eagle Medium, HyClone, Logan, UT）で洗浄し、インスリン欠如MEGM薬包キット（#CC-3150, Cambrex East Rutherford, NJ）で再構成し、サイトスター-T（Cytostar-T）シンチレートマイクロプレート（#RPNQ0162, Perkin-Elmer, Waltham, MA）に40％コンフルエンシーでシードした。試験アナローグ（組換えヒトインスリン）（Eli Lilly & Co Indianapolis, IN）及び合成ヒトインスリン様増殖因子（IGF-1）の連続5倍希釈を無菌的ストックからインスリン欠如MEGMで調製し、HMECを含むサイトスター-Tプレートに移した。前記プレートを5％CO2及び90％湿度にて37℃で4時間インキュベートした。前記細胞を0.1mCi/ウェルの[14C]-チミジン（#NEC568050UC, Perkin-Elmer, Waltham, MA）でパルスし、5％CO2を含む湿潤雰囲気中で37℃、48時間インキュベートした。
インキュベーションの終了時に、プレートの各ウェルのシグナルをマイクロベータ（MicroBeta）1640シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Waltham, MA）で1分間読み取り、さらに72時間インキュベーションを継続し24時間間隔でプレートを読み取った。ペプチド濃度に対する毎分のカウント（CPM）として結果をプロットし、オリジン（Origin）ソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を用いてEC50値を決定した。
表21に提示したデータは、細胞と個々のアナローグとの接触後、24、48、72時間に測定したポテンシーの平均である。期待した通り、IGF-1は、増殖刺激がインスリンよりもはるかに強力である（約30倍の相違）。ランタス（Sanofi-Aventisが販売する長時間作用性の基本的インスリンアナローグである）は、自然のままのインスリンよりも強力なマイトジェンであり、IGF-1とポテンシーが類似する。DP3及びDP4もまた強力なマイトジェンであり、自然のままのインスリンよりもはるかに強力である。これはおそらく、A及びB鎖をつなぐ連結部分として用いたIGF-1 Cペプチドの存在による。C2チロシンのアラニンへの置換は、DP3と比較してDP4のマイトジェン活性を低下させることに留意されたい。しかしながら、DP4は、自然のままのインスリンよりも10倍強力なままである。
DP30、DP31及びDP25Mの増殖活性は、自然のままのインスリンのそれにより近く、のみならずこれらのアナローグは自然のままのインスリンよりも増殖活性が低くすらある。単鎖インスリンアナローグDP31の切断は、IGF-1よりも高い増殖活性を示す二鎖アナローグを生じることに留意されたい。
【０３１４】
表21
0006392123.tif 000082
【実施例２４】
【０３１５】
単鎖インスリンアナローグの連結部分としての短縮CTPペプチドの比較
インスリン及びIGF-1レセプターにおける活性に関してCTPペプチドの構造と活性の関係を解明するために、CTPペプチドのフラグメントを用いて単鎖インスリンアナローグを調製した。以下のような3つの構築物を調製した：
DP47：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：101）
DP48：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：102）
DP49：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：103）。
D47は自然のままのインスリンA及びB鎖を表し、ここで5つのC-末端アミノ酸は欠失されてあり、B鎖は、CTPの最初の12アミノ酸を表す12アミノ酸のリンカー（DesV, CTP最初の12AA）によってA鎖に連結される。12のアミノ酸が選択されたのは、これがIGF-1Cペプチドのサイズだからである。DP48は自然のままのインスリンA及びB鎖を表し、ここで5つのC-末端アミノ酸は欠失されてあり、B鎖は、CTPの最初の12アミノ酸及びCTPの最後の5アミノ酸を表す17アミノ酸のリンカーによってA鎖に連結される。DP49は自然のままのインスリンA及びB鎖を表し、ここで5つのC-末端アミノ酸は欠失されてあり、B鎖は、CTPの最初の6アミノ酸及びCTPの最後の6アミノ酸を表す12アミノ酸のリンカー（DesV, CTP最初の6AA及び最後の6AA）によってA鎖に連結される。実施例4に記載のレセプタートランスフェクトHEK293細胞を用いて測定した、これら3つの化合物の活性は表22に示されている。
このアッセイでは、自然のままのインスリンは、A及びBレセプターの両方で同じポテンシーを示す。しかしながら、DP31については、前記は、活性化の単の好ましいレセプターであるインスリンサブタイプBレセプターに対して選択性を有する。さらにまた、DP31は、IGF-1レセプターで自然のままのインスリンよりもポテンシーが低くさえある。IGF-1レセプターと比較してインスリンレセプターに対する選択性は、CTPペプチドのサイズが減少するにつれ低下するように思われる（DP49＞DP48＞DP47）。
【０３１６】
表22
0006392123.tif 000083
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕A鎖、B鎖及び連結部分を含む単鎖インスリンアナローグであって、前記連結部分が、B鎖のカルボキシ末端をA鎖のアミノ末端と共有結合により連結させて、連続するアミノ酸鎖を形成し、前記連結部分がCTPペプチドを含み、
前記CTPペプチドが、
配列SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR（配列番号：64）を含むアミノ酸配列、
配列番号：64の18−28アミノ酸フラグメントを含む配列、又は
配列番号：64の18から29アミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を共有する18から29アミノ酸配列を含む配列を含むが、
ただし、該連結部分が、該B鎖のカルボキシ末端に直接連結された配列番号：53の18アミノ酸配列と同一である18アミノ酸配列を含まないことを条件とする、前記単鎖インスリンアナローグ。
〔２〕前記連結部分が合計18から158アミノ酸残基を含む、前記〔1〕に記載の単鎖インスリンアナローグ。
〔３〕前記連結部分が合計28から56アミノ酸を含む、前記〔1〕に記載の単鎖インスリンアナローグ。
〔４〕前記連結部分が、B鎖のカルボキシ末端アミノ酸に直接連結された、連続する29アミノ酸配列を含み、前記連続する29アミノ酸配列が、SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51（配列番号：66）と90％より高い配列同一性を有し、前記式中でX50及びX51がそれぞれ別個にアルギニン及びリジンから選択される、前記〔2〕又は〔3〕に記載の単鎖インスリンアナローグ。
〔５〕前記インスリンアナローグがさらに、自然のままのインスリンに対して自然のままのものではないグリコシル化部位を含む、前記〔2〕、〔3〕又は〔4〕に記載の単鎖インスリンアナローグ。
〔６〕前記連結部分がN-結合グリコシル化部位を含む、前記〔5〕に記載の単鎖インスリンアナローグ。
〔７〕前記連結部分がO-結合グリコシル化部位を含む、前記〔5〕に記載の単鎖インスリンアナローグ。
〔８〕前記連結部分が（配列番号：64）のアナローグを含み、前記アナローグが1つから6つのアミノ酸置換によって（配列番号：64）とは異なる、前記〔2〕又は〔3〕に記載の単鎖インスリンアナローグ。
〔９〕前記連結部分が配列番号：66又は配列番号：79を含む、前記〔4〕に記載の単鎖インスリンアナローグ。
〔１０〕前記〔1〕、〔4〕、〔8〕又は〔9〕のいずれかに記載の単鎖インスリンアナローグであって、
前記A鎖が、配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：18）を含み、
さらに
前記B鎖が、配列R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、式中、
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X5は、グルタミン又はグルタミン酸であり；
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X10は、イソロイシン又はセリンであり；
X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；
X14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸、オルニチン又リジンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；
R22は、AYRPSE（配列番号：11）、FVNQ（配列番号：10）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及び結合から成る群から選択され；さらに
R13は、COOH又はCONH2である、前記単鎖インスリンアナローグ。
〔１１〕前記〔10〕に記載の単鎖インスリンアナローグであって、
前記A鎖が、配列GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23（配列番号：23）を含み、
さらに
該B鎖が、配列X24LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF（配列番号：24）を含み、
式中、
X8は、スレオニン及びヒスチジンから成る群から選択され；
X17は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；X23は、アスパラギン又はグリシンであり；
X24は、ヒスチジン及びスレオニンから成る群から選択され；
X29は、アラニン、グリシン及びセリンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択される、前記単鎖インスリンアナローグ。
〔１２〕前記〔10〕に記載の単鎖インスリンアナローグであって、
該B鎖が、配列R22-HLCGSX30LVEALYLVCGERGFF（配列番号：56）又は
R24-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、さらに
該A鎖が、配列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13（配列番号：26）又は
GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13（配列番号：15）含み、
式中、
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X8は、ヒスチジン、スレオニン又はフェニルアラニンであり；
X9は、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X14は、アルギニン、リジン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン又はロイシンであり；
X17は、グルタミン又はグルタミン酸であり；
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はスレオニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、 ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びメチオニンから成る群から選択され；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン及びグリシンから成る群から選択され；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸から成る群から選択され；
X33は、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸から成る群から選択され；
X34は、アラニン及びスレオニンから成る群から選択され；
X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンから成る群から選択され；
X42は、アラニン、リジン、オルニチン及びアルギニンから成る群から選択され；
X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；
R22は、X22VNQ（配列番号：50）、バリン-アスパラギン-グルタミントリペプチド、アスパラギン-グルタミンジペプチド、グルタミン及び結合から成る群から選択され；
R24は、AYRPSE（配列番号：11）、PGPE（配列番号：9）、グリシン-プロリン-グルタミン酸トリペプチド、プロリン-グルタミン酸ジペプチド、グルタミン、グルタミン酸及び結合から成る群から選択され；さらに
R13は、COOH又はCONH2である、前記単鎖インスリンアナローグ。
〔１３〕X8、X25及びX30が各々ヒスチジンである、前記〔12〕に記載の単鎖インスリンアゴニスト。
〔１４〕前記B鎖が配列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF（配列番号：104）を含み、該A鎖が配列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN（配列番号：1）を含み、さらに該連結部分が配列(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n（配列番号：66）を含み、式中、X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン及びリジンから選択され、nは1又は2である、前記〔11〕に記載の単鎖インスリンアゴニスト。
〔１５〕さらに前記アナローグに連結された親水性部分を含み、該親水性部分が、血漿タンパク質、ポリエチレングリコール鎖又は免疫グロブリンのFc部分である、前記〔1〕から〔14〕のいずれかに記載の単鎖インスリンアナローグ。
〔１６〕前記単鎖インスリンアゴニストのアミノ酸側鎖が、アルキルアミン、アミド、エーテル、エステル、チオエーテル、又はチオエステル結合を介してアシル基又はアルキル基と共有結合により結び付けられる、前記〔1〕から〔15〕のいずれかに記載の単鎖インスリンアゴニスト。
〔１７〕A鎖、B鎖及びCTPペプチドを含むインスリンアナローグであって、
前記A鎖が、配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13（配列番号：55）を含み、
前記B鎖が、配列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45（配列番号：17）を含み、さらに
前記CTPペプチドが、配列(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n（配列番号：66）又はMGSSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQEEEEEX51（配列番号：93）を含み、
前記A及びB鎖がジスルフィド結合を介して互いに連結され、前記CTPペプチドがB鎖のアミノ又はカルボキシ末端に共有結合され、
さらに式中、
nは1から3より選択される整数であり；
X4は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり；
X5は、グルタミン酸又はグルタミンであり；
X8は、スレオニン、ヒスチジン又はフェニルアラニンであり；
X9は、セリン、アルギニン、オルニチン又はアラニンであり；
X10は、セリン又はイソロイシンであり；
X12は、セリン又はアスパラギン酸であり；
X14は、アルギニン、チロシン、オルニチン又はアラニンであり；
X15は、グルタミン、アルギニン、アラニン、オルニチン又はロイシンであり；
X18は、メチオニン、アスパラギン又はスレオニンであり；
X19は、チロシン、4-メトキシ-フェニルアラニン又は4-アミノフェニルアラニンであり；X21は、アラニン、グリシン又はアスパラギンであり；
X25は、ヒスチジン又はスレオニンであり；
X29は、アラニン、グリシン又はセリンであり；
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸又はシステイン酸であり；
X33は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり；
X34は、アラニン又はスレオニンであり；
X41は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり；
X42は、アラニン、オルニチン又はアルギニンであり；
X45は、チロシン又はフェニルアラニンであり；
X50及びX51はそれぞれ別個にアルギニン及びリジンから選択され、；さらに
R13は、COOH又はCONH2である、前記インスリンアナローグ。
〔１８〕前記B鎖のカルボキシ末端が、ペプチドリンカーを介して該A鎖のアミノ末端に共有結合により連結されて連続するアミノ酸鎖を形成し、前記ペプチドリンカーが前記CTPペプチドを含む、前記〔17〕に記載のインスリンアナローグ。
〔１９〕該CTPペプチドが、(SSSSX50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ)n（配列番号：92）、(SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK)n（配列番号：79）及び(SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR)n（配列番号：64）から成る群からそれぞれ別個に選択される配列を含み、式中nが1又は2である、前記〔17〕又は〔18〕に記載のインスリンアナローグ。
〔２０〕前記〔1〕から〔19〕のいずれかに記載のインスリンアナローグをコードする核酸配列。
〔２１〕前記〔20〕に記載のインスリンアナローグをコードする核酸配列を含む真核宿主細胞。
〔２２〕該細胞がピキア又はCHO細胞である、前記〔21〕に記載の宿主細胞。
〔２３〕高グリコシル化インスリンアナローグを製造する方法であって、前記方法が、前記〔21〕に記載の細胞を前記タンパク質が生成される条件下で培養する工程及び前記タンパク質を該培養から回収する工程を含む、前記方法。
〔２４〕U-B構造をさらに含む、前記〔1〕から〔23〕のいずれかに記載のインスリンアナローグの誘導体であって、
Uがアミノ酸又はヒドロキシ酸であり、
Bが、Bのカルボキシル部分と該単鎖インスリンアナローグのアミンとの間のアミド結合を介して前記単鎖インスリンアナローグに連結されたN-アルキル化アミノ酸であり、
U、B又はU-Bが連結されている単鎖インスリンアナローグのアミノ酸が非コードアミノ酸であり、さらにまた、
該単鎖インスリンアナローグからU-Bが化学的に切断される半減期（t1/2）が、生理学的条件下のPBS中で少なくとも約1時間から約1週間である、前記誘導体。
〔２５〕U-Bが下記式Xの構造を含む、前記〔24〕に記載の誘導体であって、
【化１】
0006392123.tif 000084
式中、
R1、R2、R4及びR8はそれぞれ別個にH、C1-C18アルキル、C2-C18アルケニル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)SH、(C2-C3アルキル)SCH3、(C1-C4アルキル)CONH2、(C1-C4アルキル)COOH、(C1-C4アルキル)NH2、(C1-C4アルキル)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4アルキル)(C3-C6シクロアルキル)、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10 アリール)R7、(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)、及びC1-C12アルキル(W1)C1-C12アルキルから成る群から選択され、W1はN、S及びOから成る群から選択されるヘテロ原子であるか、又は
R1及びR2は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C12シクロアルキル又はアリールを形成するか；又は 
R4及びR8は、それらが結合する原子と一緒になってC3-C6シクロアルキルを形成し；
R3は、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)NH2、(C1-C18アルキル)SH、(C0-C4アルキル)(C3-C6)シクロアルキル、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及び(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から選択されるか、又はR4及びR3は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；
R5はNHR6又はOHであり;
R6は、H、C1-C8アルキルであるか、又はR6及びR1は、それらが結合する原子と一緒になって4、5又は6員複素環式環を形成し；さらに
R7は、H、OH、C1-C18アルキル、C2-C18 アルケニル、(C0-C4アルキル)CONH2、(C0-C4アルキル)COOH、(C0-C4アルキル)NH2、(C0-C4アルキル)OH及びハロから成る群から選択される、前記誘導体。
〔２６〕R1及びR2がそれぞれ別個にC1-C18アルキル又はアリールであり；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4は、それらが結合する原子と一緒になって4−12複素環式環を形成し；
R4及びR8はそれぞれ別個に水素、C1-C18アルキル及びアリールから成る群から選択され；さらに
R5はアミン又はヒドロキシルである、前記〔25〕に記載の誘導体。
〔２７〕R1及びR2がそれぞれ別個に水素、C1-C8アルキル及びアリールから成る群から選択され；
R3はC1-C18アルキルであるか、又はR3及びR4は、それらが結合する原子と一緒になって4−6複素環式環を形成し；
R4及びR8は各々水素であり；さらに
R5はアミン、N-置換アミン及びヒドロキシルから成る群から選択される、前記〔25〕に記載の誘導体。
〔２８〕前記アナローグが、A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29から選択される1つ以上の位置で、該連結部分のアミノ酸側鎖の側鎖で、又はU-Bジペプチドのアミノ酸の側鎖でアシル化される、前記〔27〕に記載の単鎖インスリンアゴニスト。
〔２９〕前記アナローグが、A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29から選択される1つ以上の位置で、該連結部分のアミノ酸側鎖の側鎖で、又はU-Bジペプチドのアミノ酸の側鎖でペジル化される、前記〔27〕に記載の単鎖インスリンアゴニスト。
〔３０〕前記〔1〕から〔29〕のいずれかに記載の単鎖インスリンアゴニストを含む、ダイマー又はマルチマー。
〔３１〕前記〔1〕から〔30〕のいずれかに記載の単鎖インスリンアゴニスト又はそのプロドラッグ若しくは誘導体、及び医薬的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
〔３２〕前記〔1〕から〔30〕のいずれかに記載の化合物の、高血糖症の治療のための医薬の製造における使用。
【図１】
0006392123.tif 000086
【図２】
0006392123.tif 000087
【図３】
0006392123.tif 000088
【図４】
0006392123.tif 000089
【図５】
0006392123.tif 000090
【図６】
0006392123.tif 000091
【図７】
0006392123.tif 000092
【図８Ａ】
0006392123.tif 000093
【図８Ｂ】
0006392123.tif 000094
【図８Ｃ】
0006392123.tif 000095
【図９Ａ−Ｃ】
0006392123.tif 000096
【図１０Ａ】
0006392123.tif 000097
【図１０Ｂ】
0006392123.tif 000098
【図１１Ａ】
0006392123.tif 000099
【図１１Ｂ】
0006392123.tif 000100
【図１２Ａ】
0006392123.tif 000101
【図１２Ｂ】
0006392123.tif 000102
【図１３】
0006392123.tif 000103
【図１４】
0006392123.tif 000104
【図１５】
0006392123.tif 000105
【図１６】
0006392123.tif 000106
【図１７】
0006392123.tif 000107
【図１８Ａ】
0006392123.tif 000108
【図１８Ｂ】
0006392123.tif 000109
【図１８Ｃ】
0006392123.tif 000110
【図１９Ａ】
0006392123.tif 000111
【図１９Ｂ】
0006392123.tif 000112
【図１９Ｃ】
0006392123.tif 000113
【図２０Ａ】
0006392123.tif 000114
【図２０Ｂ】
0006392123.tif 000115
【図２１】
0006392123.tif 000116
【図２２Ａ】
0006392123.tif 000117
【図２２Ｂ】
0006392123.tif 000118
【図２３】
0006392123.tif 000119
【図２４】
0006392123.tif 000120
【図２５Ａ−Ｂ】
0006392123.tif 000121
【図２５Ｃ】
0006392123.tif 000122
【図２５Ｄ】
0006392123.tif 000123
【図２６Ａ−Ｂ】
0006392123.tif 000124
【図２６Ｃ】
0006392123.tif 000125
【図２６Ｄ】
0006392123.tif 000126
【図２７Ａ．２７Ｃ】
0006392123.tif 000127
【図２７Ｂ】
0006392123.tif 000128
【図２７Ｄ】
0006392123.tif 000129
【図２８Ａ−Ｂ】
0006392123.tif 000130
【図２８Ｃ】
0006392123.tif 000131
【図２８Ｄ】
0006392123.tif 000132
【図２９Ａ−Ｂ】
0006392123.tif 000133
【図２９Ｃ−Ｄ】
0006392123.tif 000134
【図２９Ｅ−Ｆ】
0006392123.tif 000135
【図２９Ｇ−Ｊ】
0006392123.tif 000136
【図３０Ａ−Ｂ】
0006392123.tif 000137
【図３１Ａ−Ｄ】
0006392123.tif 000138
【図３２Ａ−Ｂ】
0006392123.tif 000139
【図３３】
0006392123.tif 000140
【配列表】
0006392123000001.app