(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノアッセイにおける、ペプチド配列Ｓ又はＳ’を有する７から１２アミノ酸の干渉ペプチドの使用であって、
配列Ｓ’は干渉微生物Ｍ’の抗原タンパク質のペプチド配列に由来し、配列Ｓは検出される微生物Ｍの標的タンパク質のペプチド配列内に含まれ、微生物Ｍは微生物Ｍ’と異なり、
前記配列ＳとＳ’がその長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示し、隣接する少なくとも４のアミノ酸が同一又は類似アミノ酸であり、前記配列ＳとＳ’の長さが同一であるか配列の一端及び／又は他端に１又は２のアミノ酸が配置されることにより相違を示し、
イムノアッセイの検体が配列Ｓが由来する微生物Ｍの標的タンパク質であるか又はこの標的タンパク質に対する抗体ＡｂＭであり、前記微生物ＭはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であり、前記干渉ペプチドは干渉微生物Ｍ’の抗原タンパク質に対するＡｂＭ’抗体の存在に関連する擬陽性結果をブロックする、使用。
【請求項２】
検出される微生物Ｍの標的タンパク質に対する少なくとも一の抗体ＡｂＭの検出を含む、生物サンプル内の微生物Ｍの存在のインビトロイムノアッセイに基づいた検出のための方法であって、該方法は更に、
ａ）ペプチド配列Ｓ又はＳ’を有する７から１２アミノ酸の少なくとも一の干渉ペプチドを提供する工程であって、配列Ｓ’は干渉微生物Ｍ’の抗原タンパク質のペプチド配列に由来し、配列Ｓは検出される微生物Ｍの標的タンパク質のペプチド配列内に含まれ、微生物Ｍは微生物Ｍ’と異なり、前記配列ＳとＳ’がその長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示し、隣接する少なくとも４のアミノ酸が同一又は類似アミノ酸であり、前記配列ＳとＳ’の長さが同一であるか配列の一端及び／又は他端に１又は２のアミノ酸が配置されることにより相違を示す、工程、
ｂ）イムノアッセイに必要である、検出される前記少なくとも一の抗体ＡｂＭに対する少なくとも一の結合パートナーを提供する工程であって、前記少なくとも一の結合パートナーが、抗体が対象とする前記標的タンパク質に由来するか又は標的タンパク質自体であり、ペプチド配列Ｓを含む、工程、
ｃ）干渉微生物Ｍ’の抗原タンパク質に対するＡｂＭ’抗体の存在に関連する擬陽性結果をブロックするためにペプチド配列Ｓ又はＳ’を有する前記少なくとも一の干渉ペプチドの存在下で、イムノアッセイを実施する工程、及び
ｄ）抗体ＡｂＭと結合パートナーの間で形成される複合体の測定により微生物Ｍの存在を検出する工程
を含み、前記微生物ＭはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である、方法。
【請求項３】
検出される微生物Ｍの少なくとも一の標的タンパク質の検出を含む、生物サンプル内の微生物Ｍの存在のインビトロイムノアッセイに基づいた検出のための方法であって、
ａ）イムノアッセイに必要である、前記微生物Ｍの前記少なくとも一の標的タンパク質に対する少なくとも一の結合パートナーを提供する工程、
ｂ）７から１２アミノ酸を有する、少なくとも一の干渉ペプチドＳ又はＳ’を提供する工程であって、配列Ｓ’は干渉微生物Ｍ’の抗原タンパク質のペプチド配列に由来し、配列Ｓは検出される微生物Ｍの標的タンパク質のペプチド配列内に含まれ、微生物Ｍは微生物Ｍ’と異なり、前記配列ＳとＳ’がその長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示し、隣接する少なくとも４のアミノ酸が同一又は類似アミノ酸であり、前記配列ＳとＳ’の長さが同一であるか配列の一端及び／又は他端に１又は２のアミノ酸が配置されることにより相違を示す、工程、
ｃ）干渉微生物Ｍ’の抗原タンパク質に対するＡｂＭ’抗体の存在に関連する擬陽性結果をブロックするために、ペプチド配列Ｓ又はＳ’を有する前記少なくとも一の干渉ペプチドの存在下で、イムノアッセイを実施する工程、及び
ｄ）標的タンパク質と結合パートナーの間で形成される複合体の測定により微生物Ｍの存在を検出する工程
を含み、前記微生物ＭはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である、方法。
【請求項４】
生物サンプル内の、検出される微生物Ｍを代表する被検体のインビトロイムノアッセイに基づいた検出のための方法の特異性を向上するための方法であって、前記被検体が配列Ｓが由来する微生物Ｍの標的タンパク質であるか又はこの標的タンパク質に対する抗体ＡｂＭであって、
前記方法が、イムノアッセイの実施の間に、ペプチド配列Ｓ又はＳ’を有する７から１２アミノ酸の少なくとも一のペプチドの使用を含み、
配列Ｓ’は干渉微生物Ｍ’の抗原タンパク質のペプチド配列に由来し、配列Ｓは検出される微生物Ｍの標的タンパク質のペプチド配列内に含まれ、微生物Ｍは微生物Ｍ’と異なり、前記配列ＳとＳ’がその長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示し、隣接する少なくとも４のアミノ酸が同一又は類似アミノ酸であり、前記配列ＳとＳ’の長さが同一であるか配列の一端及び／又は他端に１又は２のアミノ酸が配置されることにより相違を示し、
前記微生物ＭはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であり、
干渉微生物Ｍ’の抗原タンパク質に対するＡｂＭ’抗体の存在に関連する擬陽性結果をブロックする
ことを特徴とする、方法。
【請求項５】
微生物Ｍ’がウイルス又は細菌であることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の使用又は方法。
【請求項６】
検出される微生物Ｍがウイルスであり、干渉微生物Ｍ’が細菌であることを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の使用又は方法。
【請求項７】
ＨＣＶウイルスと異なる微生物が、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、肺炎レンサ球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、枯草菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス・エントモフィラ（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）及びシュードモナス・プチダ（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ＧＢ−１菌株）から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の使用又は方法。
【請求項８】
配列Ｓ又はＳ’を有するペプチドが、配列番号１の配列を有するＹ７Ｅ−１、配列番号３の配列を有するＡ８Ｅ及び配列番号５の配列を有するＹ７Ｅ−２から選択されることを特徴とする、請求項１から６の何れか一項に記載の使用又は方法。
【請求項９】
配列番号１の配列を有する７から１２アミノ酸のペプチドＹ７Ｅ−１。
【請求項１０】
配列番号３の配列を有する７から１２アミノ酸のペプチドＡ８Ｅ。
【請求項１１】
配列番号４の配列を有する７から１２アミノ酸のペプチドＥ８Ｅ。
【請求項１２】
配列番号５の配列を有する７から１２アミノ酸のペプチドＹ７Ｅ−２。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断分野に関する。特に本発明は、生物サンプル内の微生物の存在のインビトロ免疫学的アッセイベースの検出の文脈において、干渉問題を排除するのに特に有用な新規なペプチドに関するものであり、干渉問題は試験するサンプルと関係がある。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的アッセイベースの検出法は診断分野で広く使用されている。これらの方法によって、ペプチド及びハプテンのタンパク質（抗原／抗体）、例えばステロイド又はビタミンの形で検体を検出することが可能となる。イムノアッセイ法又は免疫酵素試験としても知られる免疫学的アッセイは、検出する検体とこの検体に結合する一個又は複数個のパートナーの間の免疫反応に関する、当業者には広く知られている方法である。このようなイムノアッセイ法の例として、「サンドウィッチ」原理に従い、又は他の場合「競合」原理に従い働くことができるＥＬＩＳＡ、ＥＬＦＡ、ＣＬＩＡ、ＥＣＬＩＡ、ＩＲＭＡ及びＲＩＡなどの方法、並びに免疫検出法、例えば免疫組織化学法、免疫細胞化学法、免疫蛍光法、ウエスタンブロット及びドットブロットに言及することができる。
【０００３】
これらの免疫学的アッセイの結果は、次いで検査室により従事者に与えられ、従事者はそれらを解釈して病状を診断し、その後適切な治療を患者に与える。したがって、これらのアッセイは、それらが偽陰性結果をもたらさない意味において非常に感度が良いこと、及びそれらが偽陽性結果をもたらさない意味において非常に特異的であることの両方が特に重要である。
【０００４】
これらのアッセイの感度及び特に特異性を損ねる原因の１つは、試験するサンプルと関係がある干渉の存在である。試験するサンプルの物質が、例えば検体のそれと区別できないシグナルを与え、それにより偽陽性をもたらすことにより、又はそれを減衰し、それによりシグナルが使用するキットの検出閾値未満のとき偽陰性をおそらくもたらすことによって、試験シグナルを改変しそれにより結果の正確な値を改変する反応をもたらすと、毎回干渉が起こる（Tate及びWard、2004）。
【０００５】
免疫学的アッセイの文脈において、偽陽性反応は、アッセイに関して干渉する物質、アッセイに使用する結合パートナーと結合する抗体などが試験するサンプル内に存在することによる、非特異的抗原−抗体反応と関連があることが非常に多い。例えば、特定患者の血清は、使用するアッセイキットの組成の一部である動物免疫グロブリンと反応することができる、例えば予防接種後に生じる動物性タンパク質を対象とするヒト抗体を含有し得る。したがって、それらは異常なアッセイ結果をもたらす可能性がある（Kricka、1999）。干渉内在物質は、健常対象から得たサンプルと、病状があるか又は感染がある対象から得たサンプルの両方に存在する可能性がある。干渉現象は患者の臨床状態とは無関係である。
【０００６】
試験するサンプルと関係がある干渉反応を低減するための様々な方法は既に記載されている。したがって例えば、炭水化物化合物、タンパク質化合物、タンパク質混合物又は加水分解産物を使用することは周知の習慣である（ＥＰ０２６０９０３；ＵＳ４９３１３８５）。修飾タンパク質、及び特にスクシニル化又はアセチル化タンパク質（ＥＰ０５２５９１６）、又は他の場合、原型配列に関して本質的に修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド、例えば本質的にＤ−（アミノ酸）からなるペプチド（ＵＳ６１５３３９３）の使用も記載されている。しかしながら、これらの方法はいずれもアッセイ中の偽陽性の存在を完全に排除することはできず、これらの物質の添加は時折他の干渉さえもたらし、試験の感度を低下させる。
【０００７】
特許出願、国際公開第２００８／０２７９４２号中に記載されたように、例えば同一サンプル中の抗原と抗体の両方を検出することが望まれるとき、他の偽陽性反応は、試験するサンプルではなく、試験に使用する結合パートナー自体に原因がある可能性がある。しかしながら、これらの結合パートナー関係の干渉はアッセイするサンプルと関係がある干渉とは異なり、このタイプの干渉を減らすために使用される方法は、アッセイするサンプルと関係がある干渉を減らすために使用される方法とは異なる。
【０００８】
全ての干渉が排除されるわけではないので、検査室は時折、代替アッセイ又は追加的測定を実施して、彼らの診断試験の結果を実証することを余儀なくされる。したがって、特に偽陽性が問題となるとき、干渉が低減した、又はさらに排除されたアッセイを有することは特に最も重要である。偽陽性であれば、患者に、彼らが必要としない医薬品を施すことになるからである。
【０００９】
本出願人は、あらゆる予想に反して、微生物の存在のインビトロ検出の文脈における免疫学的アッセイ中、試験するサンプルと関係がある干渉が原因の、これらの試験するサンプルにおける偽陽性の検出を排除するため、及びこれが試験の感度を低下させずに、この微生物に由来する特定ペプチド、及びさらにこれら第一ペプチドと少なくとも５０％の同一性を示すが、検出される微生物とは異なる微生物に由来するペプチドを使用することが可能であることを実証している。
【００１０】
実際、本出願人は、検出される微生物Ｍ２とは異なる微生物Ｍ１を対象とする抗体の存在と偽陽性は関係がある可能性があり、前記微生物Ｍ１は中和するのが望ましい干渉及び検出の原因であり、限られた長さにわたり検出される微生物Ｍ２のそれとある程度のペプチド配列同一性を示すこと、及び微生物Ｍ１又はＭ２に属する対応する特定ペプチドの付加によって、試験の感度を損ねずに、これらの偽陽性を排除することができることを実証している。
【発明の概要】
【００１１】
したがって本発明は、それらの配列が、
（ｉ）微生物Ｍ１の抗原タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ１、及び
（ｉｉ）微生物Ｍ１とは異なる微生物Ｍ２の標的タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ２から選択され、
前記配列Ｓ１とＳ２が互いに対してアラインメントされること、それらが７−１２個のアミノ酸と少なくとも４個の同一又は類似隣接アミノ酸のそれらの長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示すこと、それらの長さが同一であること、あるいはそれらが前記配列の一端及び／又は他端に分布する１個又は２個のアミノ酸相違を示すことが理解されることを特徴とする干渉ペプチドに関する。
【００１２】
一つの主題は、検出される微生物Ｍ２の標的タンパク質に対する少なくとも１個の抗体ＡｂＭ２の検出による、生物サンプル内の微生物Ｍ２の存在のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法であって、
ａ）イムノアッセイに必要とされる、検出される前記少なくとも１個の抗体ＡｂＭ２に対する少なくとも１個の結合パートナーを提供する工程であって、前記少なくとも１個の結合パートナーが、抗体が対象とする前記標的タンパク質に由来するか又は標的タンパク質自体である工程、
ｂ）（ｉ）微生物Ｍ２とは異なる微生物Ｍ１の抗原タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ１、及び
（ｉｉ）前記微生物Ｍ２の標的タンパク質のペプチド配列に由来し、前記少なくとも１個の結合パートナーのペプチド配列内に含まれる７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ２から選択される配列を有する少なくとも１個の干渉ペプチドを提供する工程であって、
前記配列Ｓ１とＳ２が互いに対してアラインメントされること、それらが７−１２個のアミノ酸と少なくとも４個の同一又は類似隣接アミノ酸のそれらの長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示すこと、それらの長さが同一であること、あるいはそれらが前記配列の一端及び／又は他端に分布する１個又は２個のアミノ酸相違を示すことが理解される工程、
ｃ）前記少なくとも１個の干渉ペプチドの存在下でイムノアッセイを実施する工程、及び
ｄ）抗体ＡｂＭ２と結合パートナー（一又は複数）の間で形成される複合体の測定により微生物Ｍ２の存在を検出する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【００１３】
別の主題は、検出される微生物Ｍ２の少なくとも１個の標的タンパク質の検出による、生物サンプル内の微生物Ｍ２の存在のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法であって、
ａ）イムノアッセイに必要とされる、前記微生物Ｍ２の前記少なくとも１個の標的タンパク質に対する少なくとも１個の結合パートナーを提供する工程、
ｂ）（ｉ）微生物Ｍ２とは異なる微生物Ｍ１の抗原タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ１、及び
（ｉｉ）前記微生物Ｍ２の標的タンパク質のペプチド配列に由来し、前記少なくとも１個の標的タンパク質のペプチド配列内に含まれる７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ２から選択される配列を有する少なくとも１個の干渉ペプチドを提供する工程であって、
前記配列Ｓ１とＳ２が互いに対してアラインメントされること、それらが７−１２個のアミノ酸と少なくとも４個の同一又は類似隣接アミノ酸のそれらの長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示すこと、それらの長さが同一であること、あるいはそれらが前記配列の一端及び／又は他端に分布する１個又は２個のアミノ酸相違を示すことが理解される工程、
ｃ）前記少なくとも１個の干渉ペプチドの存在下でイムノアッセイを実施する工程、及び
ｄ）標的タンパク質と結合パートナー（一又は複数）の間で形成される複合体の測定により微生物Ｍ２の存在を検出する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【００１４】
さらに別の主題は、
（ｉ）微生物Ｍ１の抗原タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ１、及び
（ｉｉ）前記微生物Ｍ１とは異なる微生物Ｍ２の標的タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ２から選択される配列を有する干渉ペプチドの使用であって、
生物サンプル内の検出する前記微生物Ｍ２を表す検体のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法において、前記配列Ｓ１とＳ２が互いに対してアラインメントされること、それらが７−１２個のアミノ酸と少なくとも４個の同一又は類似隣接アミノ酸のそれらの長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示すこと、それらの長さが同一であること、あるいはそれらが前記配列の一端及び／又は他端に分布する１個又は２個のアミノ酸相違を示すことが理解される使用に関する。
【００１５】
別の主題は、イムノアッセイの実施中に、
（ｉ）微生物Ｍ２とは異なる微生物Ｍ１の抗原タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ１、及び
（ｉｉ）微生物Ｍ２の標的タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ２から選択される配列を有する少なくとも１個の干渉ペプチドであって、
前記配列Ｓ１とＳ２が互いに対してアラインメントされること、それらが７−１２個のアミノ酸と少なくとも４個の同一又は類似隣接アミノ酸のそれらの長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示すこと、それらの長さが同一であること、あるいはそれらが前記配列の一端及び／又は他端に分布する１個又は２個のアミノ酸相違を示すことが理解される干渉ペプチドの使用を含むことを特徴とする、生物サンプル内の検出される微生物Ｍ２を表す検体のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法の特異性を改善するための方法に関する。
【００１６】
本出願人は、あらゆる予想に反して、微生物Ｍ２を検出するためのイムノアッセイの実施中に、試験するサンプルと関係がある偽陽性の検出を、特定ペプチドの使用によって、低減する、又はさらに排除することができることを示しており、これらのペプチドは以下の特徴を有する：
それらは微生物Ｍ２とは異なる微生物Ｍ１の抗原タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ１を有する、又はそれらは検出される微生物Ｍ２の標的タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ２を有する、
配列Ｓ１とＳ２が互いに対してアラインメントされる、
配列Ｓ１とＳ２が７−１２個のアミノ酸と少なくとも４個の同一又は類似隣接アミノ酸のそれらの長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示す、
配列Ｓ１とＳ２が同一の長さを有すること、又はそれらが前記配列の一端及び／又は他端に分布する１個又は２個のアミノ酸長相違を示す。
【００１７】
明快にするため、一般化することが望ましいとき、本発明の目的で使用する干渉ペプチドは、このペプチドが配列Ｓ１又はＳ２を有していようと、したがってそれが微生物Ｍ１又はＭ２に由来しようと、配列Ｓを有するペプチドと呼ぶ。したがって配列Ｓを有するペプチドを単離するために使用したペプチドは、この選択が完全に任意であるという認識で、配列Ｓ’を有するペプチドと呼ぶ。配列Ｓ１とＳ２を有する２個のペプチド、及びしたがってＳとＳ’が使用可能であり、本発明による干渉ペプチドとして使用され、したがってそれを選択して、配列Ｓ’を有するペプチドとして配列Ｓ１又はＳ２を有する干渉ペプチドを指すことが可能であるからである。
【００１８】
言い換えると、本発明の目的で使用する干渉ペプチドは、微生物Ｍの抗原タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓを有する干渉ペプチドであり、前記配列Ｓは微生物Ｍと異なる微生物Ｍ’の標的タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸の異なるペプチド配列Ｓ’とアラインメントされており、前記配列ＳとＳ’は７−１２個のアミノ酸と少なくとも４個の同一又は類似隣接アミノ酸のそれらの長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示すこと、それらの長さは同一であること、又はそれらは前記配列の一端又は他端に分布する１個又は２個のアミノ酸相違を示すことが理解される。
【００１９】
配列Ｓを有するこのペプチドは、検出するのが望ましくない微生物（Ｍ又はＭ’）に対してサンプルを中和するのに特に有用であり、前記微生物が検出される微生物（それぞれＭ’又はＭ）に対して干渉をもたらす。したがって、検出するのが望ましくない前記微生物は干渉微生物と呼ぶことができる。
【００２０】
言い換えると、検出する標的微生物が微生物Ｍであるとき、標的微生物由来の配列Ｓを有するペプチドは、干渉微生物Ｍ’を中和するよう働く。他方で、検出する標的微生物が微生物Ｍ’であるとき、したがって干渉微生物由来の配列Ｓを有するペプチドは、干渉微生物Ｍを中和するよう働く。
【００２１】
明快にするため、検出するのが望ましい微生物は、当然ながらこの名称は任意であり、それを選択して微生物Ｍ１と呼ぶことが可能であるという認識で、ここでは微生物Ｍ’又はＭを表す微生物Ｍ２と示す。
【００２２】
言い換えると、前に定義した本発明の配列Ｓを有する干渉ペプチドは、微生物Ｍ又は微生物Ｍ’の検出のために使用する。
【００２３】
その存在を検出することが望ましい微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）は、確実な診断を実施して治療又はフォローアップを施す、又はその蔓延を制限することが必要である病状を引き起こす任意の微生物である。微生物は、当業者によく知られているウイルス、細菌又は酵母であってよい。
【００２４】
ウイルスの非制限的な例として、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＧ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２などのヒト免疫不全ウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１などのインフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、麻疹ウイルス、ＪＣウイルスなどに言及することができる。
【００２５】
細菌の非制限的な例として、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）などのブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などのレンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及びバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）に言及することができる。
【００２６】
酵母の非制限的な例として、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に言及することができる。
【００２７】
用語「微生物Ｍ２の標的タンパク質」は、イムノアッセイ法によって検出することができ、又は他の場合さらにイムノアッセイ法によって検出可能である抗体応答を感染宿主の一部でもたらす、前記微生物のゲノムによってコードされ前記微生物による感染中に生じるタンパク質を意味するものとする。したがって例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の場合、標的タンパク質は、例えばコア、ＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５タンパク質であってよい。ＨＩＶ−１ウイルスに関しては、例えば、Ｅｎｖ（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１）、Ｇａｇ（ｐ５５及びその成熟プロセシング型、ｐ２４カプシド、ｐ１７マトリックスなど）、Ｐｏｌ（逆転写酵素及びインテグラーゼ）、Ｔａｔ、Ｎｅｆ及びＲｅｖタンパク質に言及することができる。別の例として、細菌黄色ブドウ球菌のＥｍｐ（細胞外マトリックスタンパク質結合タンパク質）若しくはＰＶＬ（パントンバレンタインロイコシジン）タンパク質、又は細菌肺炎レンサ球菌のリボソーム低分子サブユニットメチルトランスフェラーゼＨ、延長因子Ｐ又は他の場合ＤｎａＫシャペロンタンパク質に言及することができる。当然ながら当業者は、検出したい微生物の様々な標的タンパク質を完全に理解している。
【００２８】
表現「検出される微生物Ｍ２（それぞれＭ’又はＭ）と異なる微生物Ｍ１（Ｍ又はＭ’）」は、微生物Ｍ２自体ではない任意の微生物を意味するものとする。微生物Ｍ１とＭ２は、同じ性質の微生物（ウイルス、細菌、酵母）及び同じ科に属する微生物（例えば検出される微生物Ｍ２はＨＣＶウイルスであってよく、他の微生物はＨＢＶウイルスである）、又は別の科に属する微生物であってよい（例えば検出するウイルスはＨＣＶウイルスであり、他の微生物はＨＩＶ−１ウイルスである）。微生物Ｍ１とＭ２は、異なる性質の微生物であってよい（ウイルス／細菌、ウイルス／酵母、細菌／酵母）。これらの微生物は、各々の患者が遭遇し、それらに対して患者が抗体応答を発症し得る微生物である。
【００２９】
一実施態様によれば、微生物Ｍ２はウイルス又は細菌である。別の実施態様によれば、微生物Ｍ２がウイルスであり微生物Ｍ１が細菌であり、又は他の場合微生物Ｍ２が細菌であり微生物Ｍ１がウイルスである。
【００３０】
一実施態様によれば、ウイルスはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であり、ウイルスと異なる微生物は、特に黄色ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）及びシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ＧＢ−１菌株）から選択される細菌である。
【００３１】
別の実施態様によれば、ウイルスはヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１であり、ウイルスと異なる微生物は肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。
【００３２】
表現「検出される微生物Ｍ２と異なる微生物Ｍ１（又は干渉微生物）の抗原タンパク質」は、生物サンプルを得る患者でもある感染宿主の一部において抗体応答を誘導する、前記微生物Ｍ１のタンパク質を意味するものとする。ここでも当業者は、検出が問題であるとき前に記載した標的タンパク質に対応する微生物Ｍ１の抗原タンパク質を知っており、さらに当業者は、抗原性であるか又は他の場合標的タンパク質と呼ばれる微生物のタンパク質と、非抗原性であるか又は他の場合非標的タンパク質と呼ばれるタンパク質を容易に区別することができる。
【００３３】
当業者は、前に示したように、表現「抗原タンパク質」と表現「標的タンパク質」は、検出法における微生物に関してのみ、すなわち検出するのが望ましい微生物に関して（したがって標的タンパク質を指す）、又は中和するのが望ましい微生物に関して（したがって抗原タンパク質を指す）、区別する必要があることも理解している。したがって、この２つの用語を区別せず使用することになり、その使用を照合せず配列Ｓを有する干渉ペプチド自体に関して同一であることが理解される。
【００３４】
本発明による配列Ｓ及びＳ’を有する、したがって配列Ｓ１又はＳ２を有するペプチドは、抗体のパラトープにより認識されるアミノ酸長に相当する７−１２個のアミノ酸を有する。一実施態様によれば、配列Ｓ１及びＳ２は８−１０個のアミノ酸を有する。
【００３５】
別の実施態様によれば、配列Ｓを有する干渉ペプチドは以下から選択される：
配列番号１の配列を有するＹ７Ｅ−１、配列番号２の配列を有するペプチドＶ７Ｅである配列Ｓ’を有するペプチド、
配列番号２の配列を有するＶ７Ｅ、配列番号１の配列を有するペプチドＹ７Ｅ−１である配列Ｓ’を有するペプチド、
配列番号３の配列を有するＡ８Ｅ、配列番号４の配列を有するペプチドＥ８Ｅである配列Ｓ’を有するペプチド、
配列番号５の配列を有するＹ７Ｅ−２、配列番号４の配列を有するペプチドＥ８Ｅである配列Ｓ’を有するペプチド、
配列番号６の配列を有するＤ８Ｅ、配列番号４の配列を有するペプチドＥ８Ｅである配列Ｓ’を有するペプチド、
配列番号４の配列を有するＥ８Ｅ、配列番号３の配列を有するペプチドＡ８Ｅ又は配列番号５の配列を有するＹ７Ｅ−２又は配列番号６の配列を有するＤ８Ｅである配列Ｓ’を有するペプチド、
配列番号７の配列を有するＥ８Ｌ−１、配列番号８の配列を有するペプチドＥ８Ｌ−２である配列Ｓ’を有するペプチド、及び
配列番号８の配列を有するＥ８Ｌ−２、配列番号７の配列を有するペプチドＥ８Ｌ−１である配列Ｓ’を有するペプチド。
【００３６】
これらの様々なペプチドの中で、配列番号２の配列を有するＨＣＶペプチドＶ７Ｅは特許出願ＥＰ０５８２２４３Ａ中に既に記載されている。しかしながら、このペプチドは免疫原としては記載されていない。それは、試験するサンプルと関係がある偽陽性を排除するために使用する干渉ペプチドとして一度も記載されていない。他のペプチドは新しく、本発明の主題となる。
【００３７】
したがって本発明は、
（ｉ）微生物Ｍ１の抗原タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ１、及び
（ｉｉ）微生物Ｍ１とは異なる微生物Ｍ２の標的タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ２から選択される配列を有する干渉ペプチドであって、
前記配列Ｓ１とＳ２が互いに対してアラインメントされること、それらが７−１２個のアミノ酸と少なくとも４個の同一又は類似隣接アミノ酸のそれらの長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示すこと、それらの長さが同一であること、あるいはそれらが前記配列の一端及び／又は他端に分布する１個又は２個のアミノ酸相違を示すこと、及び配列番号２の配列を有するペプチドＶ７Ｅが除外されることが理解される干渉ペプチドに関する。
【００３８】
言い換えると、本発明は、微生物Ｍの抗原タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸の配列Ｓを有する干渉ペプチドであって、前記配列Ｓは微生物Ｍと異なる微生物Ｍ’の標的タンパク質のペプチド配列に由来する７−１２個のアミノ酸のペプチド配列Ｓ’に対してアラインメントされており、前記配列ＳとＳ’が互いに対してアラインメントされること、それらが７−１２個のアミノ酸と少なくとも４個の同一又は類似隣接アミノ酸のそれらの長さにわたり少なくとも５０％の同一性を示すこと、それらの長さが同一であること、あるいはそれらが前記配列の一端及び／又は他端に分布する１個又は２個のアミノ酸相違を示すこと、及び配列番号２の配列を有するペプチドＶ７Ｅが除外されることが理解される干渉ペプチドに関する。
【００３９】
特定の一実施態様によれば、本発明は以下のペプチド：配列番号１の配列を有するＹ７Ｅ−１、配列番号３の配列を有するＡ８Ｅ、配列番号４の配列を有するＥ８Ｅ、配列番号５の配列を有するＹ７Ｅ−２、配列番号６の配列を有するＤ８Ｅ、配列番号７の配列を有するＥ８Ｌ−１及び配列番号８の配列を有するＥ８Ｌ−２に関する。
【００４０】
用語「少なくとも５０％の同一性」は、各配列のアミノ酸の少なくとも半分が同一又は類似である事実を意味するものであり、これら２個の配列が少なくとも４個の同一又は類似隣接アミノ酸を示すことは理解される。
【００４１】
一般に用語「類似アミノ酸」は、それが配列中の原型アミノ酸を置換するとき又はそれが不在のとき、前記配列の抗原反応性の如何なる破壊も引き起こさないアミノ酸を指す。
【００４２】
特に好ましいアナログは、保存性の置換、即ち一アミノ酸ファミリーで起こる置換を含む。ファミリーの観点で、当業者によく知られる幾つかのアミノ酸分類が存在する。したがって一分類例によれば、アミノ酸は４ファミリー、即ち（１）アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性アミノ酸、（２）リシン、アルギニン及びヒスチジンなどの塩基性アミノ酸、（３）ロイシン、イソロイシン及びメチオニンなどの非極性アミノ酸、及び（４）グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンなどの極性無電荷アミノ酸に分けることができる。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは時折芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンとイソロイシン又はバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、スレオニンとセリンの単離的置換、又は一アミノ酸と構造的関連がある別のアミノ酸の類似した保存的置換は、生物活性に対して大きな影響を与え得ないことは妥当に予想することができる。生物活性に対するアミノ酸置換の影響を予想するための方法の別の例は、Ｎｇ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、２００１によって記載されている。
【００４３】
配列ＳとＳ’（Ｓ１とＳ２）は互いに対してアラインメントされ、長さが同一であるか、あるいはそれらは前記配列の一端及び／又は他端に分布する１個又は２個のアミノ酸相違を示す。言い換えると、配列ＳとＳ’（Ｓ１とＳ２）は少なくとも７アミノ酸の共通配列を有し、前に記載した保存的置換又は欠失により、そのアミノ酸は同一又は類似であり、それらの長さが異なるとき、この共通配列に対して追加的アミノ酸を、一端に（１個又は２個のアミノ酸）、他端に（１個又は２個のアミノ酸）、又は両端に加える（各側に無関連に１個又は２個のアミノ酸）。したがって、Ｘが共通配列である場合、Ａｎは末端に位置するアミノ酸の差であり、ｎは１−４の整数であり、本発明のペプチドのアラインメントは以下のように表すことができる：
0006357425.tif 000002
【００４４】
したがってアミノ酸の最大差は４である。
【００４５】
当業者は、当業者によく知られているＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ及びＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｅのプロットを参照して、生物活性に如何なる大きな影響も与えずに変化を許容し得る配列の領域を容易に決定する。
【００４６】
一実施態様によれば、配列ＳとＳ’（Ｓ１とＳ２）に共通である配列のアミノ酸は以下の特徴の少なくとも１つに従う：
それらは同一である、
それらがアナログを示す場合、それらは最大１個又は２個のアナログを示す、
保存的置換によりそれらは最大３個のアナログを示す、
欠失によりそれらは最大１個又は２個のアナログを示す。
【００４７】
別の実施態様によれば、少なくとも４個の隣接アミノ酸は以下の特徴の少なくとも１つに従う：
保存的置換によりそれらは同一又は類似である、
それらがアナログを示すとき、アナログの最大１個又は２個がある。
【００４８】
本発明のさらに別の実施態様によれば、２個の配列ＳとＳ’（Ｓ１とＳ２）は、ペプチド分子の所定の長さにわたり少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５−６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０−９０％の配列同一性、並びに５０％を超える任意の値及び最大１００％も示す。
【００４９】
本発明のペプチドは、偽陽性を与え得る生物サンプル中の微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）の存在の決定中、免疫学的アッセイ法の偽陽性を低減する、又はさらに排除するのに特に有用であり、これらの偽陽性は、検出される微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）とは異なる微生物Ｍ１（それぞれＭ又はＭ’）を対象とする抗体の存在によって引き起こされる（それらはＡｂＭ１又はそれぞれＡｂＭ若しくはＡｂＭ’と呼ばれる）。
【００５０】
検出される微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）の存在の検出を実施するため、検出される微生物Ｍ２の標的タンパク質を対象とする少なくとも１つの抗体の検出を実施する（その抗体はＡｂＭ２又はそれぞれＡｂＭ’若しくはＡｂＭと呼ばれる）、又は前に記載した少なくとも１つの標的タンパク質の検出のいずれか、又は両方を実施する。後者の場合、組合せ法又はコンボ法が言及される。
【００５１】
生物サンプル内の微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）の存在のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法が、検出される微生物Ｍ２の標的タンパク質に対する少なくとも１個の抗体ＡｂＭ２の検出を含むか又はその検出からなるとき、前記方法は、
ａ）イムノアッセイに必要とされる、検出される前記少なくとも１個の抗体ＡｂＭ２に対する少なくとも１個の結合パートナーを提供する工程であって、前記少なくとも１個の結合パートナーが、抗体が対象とする前記標的タンパク質に由来するか又は標的タンパク質自体である工程、
ｂ）前に定義した少なくとも１個の干渉ペプチドを提供する工程であって、配列Ｓ１が検出される微生物Ｍ２と異なる微生物Ｍ１に属し、配列Ｓ２が前記少なくとも１個の結合パートナーのペプチド配列中に含まれることが理解される工程、
ｃ）前記少なくとも１個の干渉ペプチドの存在下でイムノアッセイを実施する工程、及び
ｄ）抗体ＡｂＭ２と結合パートナー（一又は複数）の間で形成される複合体の測定により微生物Ｍ２の存在を検出する工程を含む又はそれらからなる。
【００５２】
検出される微生物Ｍ２が配列Ｓを有するペプチドが属する微生物であるとき（したがってそれが微生物Ｍである）、生物サンプル内の微生物Ｍの存在のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法が、検出される微生物Ｍの標的タンパク質に対する少なくとも１個の抗体ＡｂＭの検出を含むか又はその検出からなり、前記方法は、
ａ）前に定義したペプチド配列Ｓを有する少なくとも１個の干渉ペプチドを提供する工程、
ｂ）イムノアッセイに必要とされる、検出される前記少なくとも１個の抗体ＡｂＭに対する少なくとも１個の結合パートナーを提供する工程であって、前記少なくとも１個の結合パートナーが、抗体が対象とする前記標的タンパク質に由来するか又は標的タンパク質自体であり、ペプチド配列Ｓを含む工程、
ｃ）ペプチド配列Ｓを有する前記少なくとも１個の干渉ペプチドの存在下でイムノアッセイを実施する工程、及び
ｄ）抗体ＡｂＭと結合パートナー（一又は複数）の間で形成される複合体の測定により微生物Ｍの存在を検出する工程を含む又はそれらからなる。
【００５３】
検出される微生物Ｍ２が、配列Ｓを有するペプチドが属する微生物ではなく、配列Ｓ’を有するペプチドが属する微生物であるとき（したがってそれが微生物Ｍ’である）、生物サンプル内の微生物Ｍ’の存在のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法が、検出される微生物Ｍ’の標的タンパク質に対する少なくとも１個の抗体ＡｂＭ’の検出を含むか又はその検出からなり、前記方法は、
ａ）前に定義したペプチド配列Ｓを有する少なくとも１個の干渉ペプチドを提供する工程、
ｂ）イムノアッセイに必要とされる、検出される前記少なくとも１個の抗体ＡｂＭ’に対する少なくとも１個の結合パートナーを提供する工程であって、前記少なくとも１個の結合パートナーが、抗体が対象とする前記標的タンパク質に由来するか又は標的タンパク質自体であり、前に定義したペプチド配列Ｓ’を含む工程、
ｃ）ペプチド配列Ｓを有する前記少なくとも１個の干渉ペプチドの存在下でイムノアッセイを実施する工程、及び
ｄ）抗体ＡｂＭ’と結合パートナー（一又は複数）の間で形成される複合体の測定により微生物Ｍ’の存在を検出する工程を含む又はそれらからなる。
【００５４】
表現「前記少なくとも１個の結合パートナーが、抗体が対象とする前記標的タンパク質に由来するか又は標的タンパク質自体である」は、結合パートナーが、アッセイするサンプルの抗体と結合することができる、前に記載した標的タンパク質又は他の場合その断片であることを意味するものとする。
【００５５】
生物サンプル内の微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）の存在のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法が、検出される微生物Ｍ２の少なくとも１個の標的タンパク質の検出を含むか又はその検出からなるとき、前記方法は、
ａ）イムノアッセイに必要とされる、前記微生物Ｍ２の前記少なくとも１個の標的タンパク質に対する少なくとも１個の結合パートナーを提供する工程、
ｂ）前に定義した少なくとも１個の干渉ペプチドを提供する工程であって、配列Ｓ１が検出される微生物Ｍ２と異なる微生物Ｍ１に属し、配列Ｓ２が前記少なくとも１個の標的タンパク質のペプチド配列中に含まれることが理解される工程、
ｃ）前記少なくとも１個の干渉ペプチドの存在下でイムノアッセイを実施する工程、及び
ｄ）標的タンパク質と結合パートナー（一又は複数）の間で形成される複合体の測定により微生物Ｍ２の存在を検出する工程を含む又はそれらからなる。
【００５６】
検出される微生物Ｍ２が配列Ｓを有するペプチドが属する微生物であるとき（したがってそれが微生物Ｍである）、生物サンプル内の微生物Ｍの存在のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法が、検出される微生物Ｍの少なくとも１個の標的タンパク質の検出を含むか又はその検出からなり、前記方法は、
ａ）イムノアッセイに必要とされる、前記微生物Ｍの前記少なくとも１個の標的タンパク質に対する少なくとも１個の結合パートナーを提供する工程、
ｂ）前に定義した配列Ｓを有する少なくとも１個の干渉ペプチドを提供する工程であって、前記配列Ｓが前記少なくとも１個の標的タンパク質のペプチド配列内に含まれる工程、
ｃ）配列Ｓを有する前記少なくとも１個の干渉ペプチドの存在下でイムノアッセイを実施する工程、及び
ｄ）標的タンパク質と結合パートナー（一又は複数）の間で形成される複合体の測定により微生物Ｍの存在を検出する工程を含む又はそれらからなる。
【００５７】
検出される微生物Ｍ２が、配列Ｓを有するペプチドが属する微生物ではなく、配列Ｓ’を有するペプチドが属する微生物であるとき（したがってそれが微生物Ｍ’である）、生物サンプル内の微生物Ｍ’の存在のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法が、検出される微生物Ｍ’の少なくとも１個の標的タンパク質の検出を含むか又はその検出からなり、前記方法は、
ａ）イムノアッセイに必要とされる、前記微生物Ｍ’の前記少なくとも１個の標的タンパク質に対する少なくとも１個の結合パートナーを提供する工程、
ｂ）前に定義した配列Ｓを有する少なくとも１個の干渉ペプチドを提供する工程であって、対応する配列Ｓ’が前記少なくとも１個の標的タンパク質のペプチド配列内に含まれることが理解される工程、
ｃ）配列Ｓを有する前記少なくとも１個の干渉ペプチドの存在下でイムノアッセイを実施する工程、及び
ｄ）標的タンパク質と結合パートナー（一又は複数）の間で形成される複合体の測定により微生物Ｍ’の存在を検出する工程を含む又はそれらからなる。
【００５８】
検索する標的タンパク質に対する結合パートナーによって、抗体、抗体分画、ナノフィチン、この抗原に対する受容体、又は検索する標的タンパク質との相互作用があることが知られる任意の他のタンパク質に言及することができる。
【００５９】
結合パートナー抗体は、例えばポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかである。
【００６０】
ポリクローナル抗体は、微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）がウイルスである場合、標的タンパク質又は不活性化及び／又は分画ウイルス粒子を用いた、又は微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）が細菌である他の場合、細菌タンパク質の細菌性溶解物若しくは抽出物を用いた動物の免疫処置、次に、前記動物からの血清サンプルの入手、及び他の血清成分からの前記抗体の分離により、特に抗体、特に前記標的タンパク質によって特異的に認識される抗原が結合したカラムにおけるアフィニティークロマトグラフィーにより、精製型での所望の抗体の回収により得ることができる。
【００６１】
モノクローナル抗体はハイブリドーマ技法により得ることができ、その一般的な原理は本明細書で以後要約する。
【００６２】
最初に、動物、一般にマウスを、微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）がウイルスである場合、対象の標的タンパク質又は不活性化及び／又は分画ウイルス粒子を用いて、又は微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）が細菌である他の場合、細菌タンパク質の細菌性溶解物若しくは抽出物を用いて免疫処置し、したがって前記動物のＢリンパ球はこの抗原に対する抗体を産生することができる。これらの抗体産生リンパ球は、次いで「不死化」ミエローマ細胞（実施例中ではネズミ）と融合させてハイブリドーマが生じる。特定抗体を産生し無限に増殖することが可能である細胞の選択を、このように得た細胞の異種混合物を使用して次いで実施する。各ハイブリドーマはクローンの型で増殖し、各々が、例えばＥＬＩＳＡにより、一次元又は二次元イムノトランスファー（ウエスタンブロット）により、免疫蛍光法により、又はバイオセンサーを使用して、前記標的タンパク質に対するその認識性を試験することができる、モノクローナル抗体の産生をもたらす。このように選択したモノクローナル抗体は、特に前に記載したアフィニティークロマトグラフィー技法に従い後に精製する。
【００６３】
モノクローナル抗体は、当業者によく知られている技法を使用して、遺伝子操作によって得られる組換え抗体であってもよい。
【００６４】
抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、さらにｓｃＦｖ（単鎖可変断片）及びｄｓＦｖ（二本鎖可変断片）鎖に言及することができる。これらの機能性断片は、特に遺伝子操作によって得ることができる。
【００６５】
ナノフィチン（商品名）は、抗体と同様に生物学的標的に結合することができ、したがってそれを検出すること、それを捕捉すること、又は生物内でそれを非常に簡単に標的化することができる低分子タンパク質である。
【００６６】
検出される微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）を表す検体とも呼ばれる、タンパク質及び／又は抗体を検出するかどうかとは無関係に、結合パートナーには、それらが検出する検体に対して特異的又は非特異的であり得るという共通の事実がある。結合パートナーがこれらの検体に独占的又はほぼ独占的に結合することができるとき、それらは特異的であると言われる。これらの検体に対する結合の選択性が弱く、したがって結合パートナーが、他のタンパク質若しくは抗体などの他のリガンドと結合し得るとき、それらは非特異的であると言われる。好ましい一実施態様によれば、特異的結合パートナーが好ましい。
【００６７】
本発明の方法において検索する検体に対して特異的又は非特異的である、これらの結合パートナーは、実施するイムノアッセイの文脈において捕捉試薬として、検出試薬として、又は捕捉及び検出試薬として使用することができる。
【００６８】
当然ながら、例えば「イムノアッセイ」における用語「免疫」は、本出願においては、結合パートナーが抗体などの免疫学的パートナーであることを、厳密に示すものとして考えるべきではない。実際当業者も、リガンドとも呼ばれる結合パートナーが免疫学的パートナーでなく、例えばアッセイを設計した検体の受容体であるとき、この用語を広く使用している。したがって、用語「免疫」が頭字語ＥＬＩＳＡ中に含まれていても「リガンド結合アッセイ」とも広く呼ばれる非免疫学的結合パートナーを使用するアッセイに関しては、ＥＬＩＳＡアッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ）に言及することが一般的な習慣である。明快にするため、本出願人は、それが免疫学的パートナーでないときでさえ結合パートナーを使用する任意のアッセイに関して、用語「免疫」を本出願全体で使用する。
【００６９】
イムノアッセイの実施は、検出される微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）及び使用する結合パートナーに従いその試験を適応させる当業者には広く知られている工程である。
【００７０】
この方法中、本発明の一つ又は複数のペプチドを加え、当業者はそれに応じて試験条件を適応させる。イムノアッセイ法は、本発明による１、２、３又は４個の干渉ペプチドの使用を含むことが好ましい。
【００７１】
干渉ペプチド（一又は複数）を、イムノアッセイの開始前、又はイムノアッセイの抗原−抗体反応工程のいずれか１つにおいて、アッセイする生物サンプルに加える。１工程イムノアッセイの場合、干渉ペプチドが存在する、又は生物サンプルが捕捉相と反応するとき加える。２工程イムノアッセイの場合、干渉ペプチドを捕捉中、又は露呈中、又は両方において加える。如何なる場合も、露呈工程（基質の添加及びシグナルの可視化又は検出）前に干渉ペプチドを加える。
【００７２】
検体と結合パートナーの間で形成される複合体の測定による微生物Ｍ２（Ｍ’又はＭ）の存在の検出は、直接的又は間接的手段などの、当業者に知られるイムノアッセイの可視化の任意の方法によって実施することができる。
【００７３】
直接的検出、即ち標識により実施されない検出の場合、例えば表面プラズモン共鳴によって、又は伝導性ポリマーを含む電極でのサイクリックボルタンメトリーによって、免疫反応を観察する。
【００７４】
間接的検出は、検出試薬と呼ばれる結合パートナー、又は標的タンパク質自体又は一つ若しくは複数のその断片のいずれかの標識によって実施する。
【００７５】
用語「標識」は、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に生成することができる標識試薬の結合を意味するものとする。これらの標識試薬の非制限的一覧は以下のものからなる：
・例えば比色定量分析、蛍光又は発光により検出可能なシグナルを生成する酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、
・発色団、例えば蛍光、発光又は色素化合物、
・放射性分子、例えば３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ、及び
・Ａｌｅｘａｓ又はフィコシアニンなどの蛍光分子。
【００７６】
間接的検出系、例えばアンチリガンドと反応することができるリガンドを使用することもできる。リガンド／アンチリガンド対は当業者によく知られており、例えばその例は以下の対、ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／そのポリヌクレオチドと相補的な配列である。この場合、結合パートナーを有するのはリガンドである。アンチリガンドは前段落中に記載した標識試薬を使用して直接検出可能であり、又はリガンド／アンチリガンドを使用してそれ自体検出可能であり得る。
【００７７】
これらの間接的検出系は、特定条件下において、シグナルの増幅をもたらす可能性がある。このシグナル増幅技法は当業者にはよく知られており、以前の特許出願、ＦＲ９８／１００８４、又は本出願人による国際公開第Ａ−９５／０８０００号、又はＣｈｅｖａｌｉｅｒ等、１９９７による記事を参照することができる。
【００７８】
使用する標識のタイプに応じて、当業者は、任意のタイプの測定装置、例えば分光光度計、分光蛍光計、又は他の場合高解像度カメラを使用して検出可能なシグナルの標識又は発光の可視化を可能にする試薬を加える。
【００７９】
本発明の方法を実施することができる生物サンプルは、イムノアッセイを実施することができる、微生物（抗原、抗体）を表す検体を含有し得る任意の生物サンプルである。これらのサンプルは当業者に広く知られている。このようなサンプルの例として、血清、血漿、血液、全血、尿又は脳脊髄液などの生体液だけでなく、さらに組織、便などに言及することができる。生物サンプルは、人間、ヒツジ類、蓄牛、ヤギ科のメンバー、イヌ科のメンバーを含めた哺乳動物、魚類及び鳥類種などの、病原性微生物の存在を検出することが必要である任意の動物に由来する。本出願人は、あらゆる予想に反して、検出される微生物Ｍ２と異なる微生物を対象とする抗体ＡｂＭ１を、これらのサンプルが含有する可能性もあること、及び試験の偽陽性結果をもたらすのはこれらの抗体であることを示している。
【００８０】
生物サンプルは事前工程で処理することができる。例えば、検出する抗原の露出を促進する酸性条件を使用することができる。イオン型又は非イオン型の洗浄剤、例えばトリトンＸ１００又はＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）又はポリ（オキシエチレン）誘導体、例えばＮＰ４０を使用することができる。
【００８１】
したがって本発明のペプチドの使用は、任意のイムノアッセイ法において特に有用である。したがって本発明の別の主題は、生物サンプル内の検出される微生物を表す検体のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法における、前に定義した配列Ｓを有する干渉ペプチドの使用に関する。
【００８２】
本発明のペプチドの有用性は偽陽性の排除、したがって試験の特異性の改善にあるので、別の主題は、イムノアッセイの実施中に、前に定義した配列Ｓを有する少なくとも１個の干渉ペプチドの使用を含むことを特徴とする、生物サンプル内の検出される微生物を表す検体のインビトロイムノアッセイベースの検出のための方法の特異性を改善するための方法に関する。
【００８３】
本発明は、非制限的な例示により与える以下の実施例によって、及びさらに図１−４によってより明確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ＨＣＶペプチドＶ７Ｅ−１と黄色ブドウ球菌ペプチドＹ７Ｅ−１の間のアラインメントを示す図である。
【図２】ＨＣＶペプチドＥ８Ｅと肺炎レンサ球菌ペプチドＡ８Ｅ（図２Ａ）、枯草菌ペプチドＹ７Ｅ−２（図２Ｂ）、及びシュードモナス・エントモフィラ又はシュードモナス・プチダ（ＧＢ−１菌株）ペプチドＤ８Ｅ（図２Ｃ）の間のアラインメントを示す図である。
【図３】ＨＩＶ−１ペプチドＥ８Ｌ−２と肺炎マイコプラズマペプチドＥ８Ｌ−１の間のアラインメントを示す図である。
【図４】ＨＣＶペプチドＥ８Ｅと肺炎レンサ球菌ペプチドＡ６Ｍの間のアラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
図面中、「．」は前述の位置に存在するアミノ酸に対するアミノ酸同一性を表し、「−○」は所与の位置における欠失を表す。
【実施例】
【００８６】
実施例１：  干渉ペプチドＹ７Ｅ−１（黄色ブドウ球菌）及びＶ７Ｅ（ＨＣＶ）
ＨＣＶ又は黄色ブドウ球菌による感染を診断するためのイムノアッセイの特異性を改善するため、本発明による２つの干渉ペプチドを定義した。
【００８７】
ペプチドＹ７Ｅ−１は、黄色ブドウ球菌の細胞外マトリックスタンパク質結合タンパク質Ｅｍｐのアミノ酸３２２−３３０に相当するペプチド配列ＹＳＰＴＨＹＶＰＥ（配列番号１）を有する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースの受託番号Ｑ８ＮＸＩ８）。このペプチドＹ７ＥはＨＣＶペプチドＶ７Ｅとアラインメントし、そのペプチド配列はＶＳＰＴＨＹＶＰＥ（配列番号２）であり、それはＨＣＶのＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸２１８−２２６に相当する（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ参照配列に従い番号処理、受託番号はＮＰ＿７５１９２６である）。
【００８８】
ペプチドＹ７Ｅ−１とＶ７Ｅのアラインメントは図１中に示す。ペプチドＹ７Ｅ−１とＶ７Ｅは、９アミノ酸の共通長に関して８９％の同一性を有する。
【００８９】
実施例２：  干渉ペプチドＥ８Ｅ（ＨＣＶ）及びＡ８Ｅ（肺炎レンサ球菌）、Ｙ７Ｅ−２（枯草菌）、及びＤ８Ｅ（シュードモナス・エントモフィラ又はシュードモナス・プチダＧＢ−１菌株）
ＨＣＶ、肺炎レンサ球菌、枯草菌、又はシュードモナス・エントモフィラ若しくはシュードモナス・プチダＧＢ−１菌株による感染を診断するためのイムノアッセイの特異性を改善するため、本発明による数個の干渉ペプチドを定義した。
【００９０】
ペプチドＡ８Ｅは、肺炎レンサ球菌のリボソーム低分子サブユニットメチルトランスフェラーゼＨタンパク質のアミノ酸６４−７３に相当するペプチド配列ＡＱＫＲＬＡＰＹＩＥ（配列番号３）を有する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースの受託番号Ｃ１ＣＰＬ０）。このペプチドはＨＣＶペプチドＥ８Ｅとアラインメントし、そのペプチド配列はＥＣＳＱＨＬＰＹＩＥ（配列番号４）であり、それはＨＣＶのＮＳ４Ａタンパク質のアミノ酸５３−５４に相当し（ＮＰ＿７５１９２５）、ＨＣＶのＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸１−８（ＮＰ＿７５１９２６）と融合する。ペプチドＡ８ＥとＥ８Ｅのアラインメントは図２Ａ中に示す。ペプチドＡ８ＥとＥ８Ｅは、１０アミノ酸の共通長に関して５０％の同一性を有する。
【００９１】
肺炎レンサ球菌以外の微生物のペプチドも、本発明のＨＣＶペプチドＥ８Ｅとアラインメントさせることができる。ペプチドＹ７Ｅ−２は、枯草菌メチオニン結合リポタンパク質ｍｅｔＱのアミノ酸８４−９２に相当するペプチド配列ＹＦＱＨＩＰＹＬＥ（配列番号５）を有する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースの受託番号Ｏ３２１６７）。ペプチドＹ７Ｅ−２とＥ８Ｅのアラインメントは図２Ｂ中に示す。ペプチドＹ７Ｅ−２とＥ８Ｅは、９アミノ酸の共通長に関して５５％の同一性を有する。
【００９２】
ペプチドＤ８Ｅはペプチド配列ＤＩＤＡＶＬＰＹＩＥ（配列番号６）を有し、それはシュードモナス・エントモフィラの延長因子Ｐタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースの受託番号Ｑ１ＩＤ３５）及びシュードモナス・プチダ（ＧＢ−１菌株）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースの受託番号Ｂ０ＫＵＮ５）のアミノ酸９７−１０６に相当する。ペプチドＤ８ＥとＥ８Ｅのアラインメントは図２Ｃ中に示す。ペプチドＤ８ＥとＥ８Ｅは、１０アミノ酸の共通長に関して５０％の同一性を有する。
【００９３】
実施例３：  干渉ペプチドＥ８Ｌ−１（肺炎マイコプラズマ）及びＥ８Ｌ−２（ＨＩＶ−１）
ＨＩＶ−１又は肺炎マイコプラズマによる感染を診断するためのイムノアッセイの特異性を改善するため、本発明による干渉ペプチドを定義した。
【００９４】
ペプチドＥ８Ｌ−１は、肺炎マイコプラズマＭ１２９ｔＲＮＡ（グアニン−Ｎ（１）−）−メチルトランスフェラーゼタンパク質のアミノ酸２００−２０９に相当するペプチド配列ＥＡＹＲＫＥＱＱＬＬ（配列番号７）を有する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースの受託番号Ｐ７５１３２）。このペプチドはＨＩＶ−１ペプチドＥ８Ｌ−２とアラインメントし、そのペプチド配列はＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬ（配列番号８）であり、それはＨＩＶ−１のｇｐ１６０エンベロープ糖タンパク質のアミノ酸５８４−５９３に相当する（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ参照配列に従い番号処理、受託番号はＮＰ＿０５７８５６である）。このウイルスの大きな遺伝的変動を考慮すると、正確な位置は１つのＨＩＶ−１菌株と別の菌株で変わる可能性がある。ペプチドＥ８Ｌ−１とＥ８Ｌ−２のアラインメントは図３中に示す。ペプチドＥ８Ｌ−１とＥ８Ｌ−２は、１０アミノ酸の長さに関して７０％の同一性を有する。
【００９５】
実施例４：  本発明による干渉ペプチドの使用による抗ＨＣＶ抗体に関するイムノアッセイの特異性の改善
Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断は、第３世代免疫酵素血清検査であり特定検査に関してタンパク質コア、ＮＳ３、及びＮＳ４、及びＮＳ５を対象とする抗体を実証するイムノアッセイを使用して、現在実施されている。これらの検出抗ＨＣＶ抗体は現在又は過去の感染の証拠である。
【００９６】
抗ウイルス抗体の実証を可能にする免疫酵素血清検査は、マイクロプレートにおいて、自動的又は手動的に、又は他の場合Ｖｉｄａｓ（登録商標）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）などの自動式免疫分析用デバイスを使用して実施することができる。この場合、検査の全ての工程はこの装置により自動的に実施される。様々な免疫酵素技法、及び特にＥＬＩＳＡは当業者によく知られており、その主な原理、及びさらにプロトコール例は、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓにより刊行されたＪｏｈｎ  Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒによる書籍「Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ」、第２版中に記載されている（ＤＯＩ：１０．１００７／９７８−１−６０３２７−２５４−４）。
【００９７】
使い捨てチップ（ＳＰＲ（登録商標））は、固相及びピペッティングシステムの両方として働く。チップの表面は、ＨＣＶコア、ＮＳ３及びＮＳ４タンパク質を対象とする抗体の検出用の抗原でコーティングされている。第一工程では、サンプルを希釈し、次いでチップ内を上下に吸引する。サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体は、チップ内に存在する抗原に結合する。洗浄工程によって非結合化合物を除去する。第二工程中、組換えアルカリホスファターゼと結合した、Ｆａｂ’型の（マウス）抗ヒト免疫グロブリン（抗ＩｇＧ）モノクローナルＩｇＧをチップ内で上下に吸引し、固相の抗原と結合した試験サンプル由来の抗ＨＣＶヒトＩｇＧと結合する。再度、洗浄工程によって非結合化合物を除去する。最終露呈工程中、基質（４−メチルウンベリフェリルホスフェート）をチップ内で上下に吸引し、結合体の酵素はこの基質の加水分解に関する反応を触媒し、産物（４−メチルウンベリフェロン）を生成し、その放出蛍光は４５０ｎｍで測定する。蛍光シグナルの値は、サンプル中に存在する抗体の濃度に比例する。検査の最後に、１に戻した標準Ｓ１の値（装置内に保存された値）で得られた値を割ることによって、装置により指数の形で、結果を自動式に計算する。したがって、その指数が１以上であるサンプルは免疫酵素検査によって陽性であると考え（抗ＨＣＶ抗体の存在）、その指数が１未満であるサンプルは陰性であると考える（抗ＨＣＶ抗体の不在）。以下の段落中では、このＨＣＶ抗体アッセイ手順は「操作モード１」と呼び、これはペプチドに干渉しない抗ＨＣＶ抗体のアッセイに相当する。
【００９８】
試験サンプル中に含有される要素が原因の、抗ＮＳ４抗体の検出用の操作モード１の抗原の非特異的認識と関係がある干渉を減らすため、実施例１及び２中で定義した様々な干渉ペプチドを使用した。これらは、検出するウイルス（微生物Ｍの検出用の本発明の配列Ｓを有するペプチドの使用）、又は検出するウイルスと異なる微生物（微生物Ｍ’の検出用の本発明の配列Ｓを有するペプチドの使用）のいずれかに属するペプチドである。これらのペプチドは、ポリマー１ｇ当たり０．１−１．０ｍｍｏｌのアミンを含有するポリスチレンタイプのポリマーを使用する、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６２及びＦｉｅｌｄｓ及びＮｏｂｌｅ、１９９０により記載された固相ペプチド合成などの、当業者によく知られる手順に従い化学合成により生成した。化学合成の最後に、約２時間トリフルオロ酢酸−エタンジチオール−トリイソプロピルシラン−水（９４／２．５／１／２．５Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）混合物の存在下において、ペプチドを脱保護状態にしてポリマーから切断することができる。ポリマーの排除後、０℃でジエチルエーテルからの沈降によりペプチドを抽出する。それらは、高速液体クロマトグラフィーなどの技法により精製することができる。適切な精製分画の凍結乾燥は、質量分析法、高速液体クロマトグラフィー又はアミノ酸分析などの、標準的な物理化学的技法により特徴付けすることができる均質なペプチドをもたらす。
【００９９】
ＨＣＶ感染に関して陰性であり、Ｒｈｏｎｅ−Ａｌｐｅｓ「Ｃｅｎｔｒｅｓ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓａｎｇｕｉｎｅ」［血液バンク］由来の数百の血清サンプルをスクリーニングして、干渉問題を提示するサンプルを同定した。これを実施するため、Ｖｉｄａｓ自動式デバイスを使用し、操作モード１に従いサンプルをアッセイした。操作モード１に従い陽性であった血清のみを選択した（指数≧１）。
【０１００】
操作モード１の結果と「Ｃｅｎｔｒｅｓ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓａｎｇｕｉｎｅ」［血液バンク］により確定した陰性状態の結果の間のこのような差によって、干渉問題を定義する偽陽性血清を選択することができる。
【０１０１】
本発明による干渉ペプチドの使用が試験の感度を損ねないことを示すため、市販の血清プール（Ｔｒｉｎａ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ  ＡＧ）由来の陽性コントロールサンプルＣ１もアッセイした。
【０１０２】
表１は、干渉問題を提示する７個の血清、及び陽性コントロールＣ１について、ペプチドＶ７Ｅ（配列番号２）又はペプチドＹ７Ｅ（配列番号１）の存在有り又は無しで「操作モード１」に従い実施したアッセイの結果を与える。これらのペプチドは、免疫酵素検査プロトコールの第一工程中、試験するサンプルの希釈に相当する５μｇ／ｍｌの濃度で加え、固相上に存在した抗原とそれらをインキュベートした。
0006357425.tif 000003
【０１０３】
アッセイ中、ペプチドＹ７Ｅの添加によって全血清における干渉を完全に中和することができる。ペプチドＶ７Ｅは、７個中４個の血清における干渉を部分的に中和することができる。さらに、干渉ペプチドの使用が試験の感度を損ねることはない。
【０１０４】
同様に表２は、干渉問題を提示する他の２つの血清、及び陽性コントロールについて、ペプチドＥ８Ｅ（配列番号４）、ペプチドＡ８Ｅ（配列番号３）、又は他の場合ペプチドＡ６Ｍ（配列番号９）の存在有り又は無しで、抗ＨＣＶ抗体検出プロトコールの操作モード１に従い実施したアッセイの結果を与える。これらのペプチドは、免疫酵素検査プロトコールの第一工程中、試験するサンプルの希釈に相当する１μｇ／ｍｌの濃度で加え、固相上に存在した抗原とそれらをインキュベートした。
【０１０５】
そのペプチド配列がＡＰＹＩＥＫＧＭ（配列番号９）であるペプチドＡ６Ｍも、リボソーム低分子サブユニットメチルトランスフェラーゼＨタンパク質のアミノ酸６９−７６に相当する肺炎レンサ球菌ペプチドである（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースの受託番号Ｃ１ＣＰＬ０）。このペプチドは本発明による干渉ペプチドではない。それは、特許請求するアラインメントの定義に相当しないからである（図４参照）。実際、このペプチドはＨＣＶペプチドＥ８Ｅと同一の４個の隣接アミノ酸を有し、８アミノ酸長であるとしても、その配列はＥ８Ｅのそれに対してアラインメントされていない。この点において、このペプチドＡ６Ｍは、表２中に示す実験中では陰性コントロールとして使用する。
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【０１０６】
アッセイ中、ペプチドＥ８Ｅ、又は他の場合ペプチドＡ８Ｅの添加によって２個中２個の血清における干渉を完全に中和することができる。本発明によるペプチドではないペプチドＡ６Ｍは、如何なる血清においても干渉を中和することができない。再度ここでも、試験の感度が損なわれることはない。
参照文献
Chevalier et al., 1997, J Histochem Cytochem, 45, 481-491
Kricka LJ, 1999, Clinical Chemistry 45(7): 942-956
Fields GB, Noble RL., 1990, Int J Pept Protein Res., 35(3):161-214
Merrifield, 1962, J. Am. Chem. Soc. 85:2149
Ng and Henikoff, 2001, Genome Res 11: 863-874
Tate J and Ward G, 2004, Clin Biochem Rev, 25: 105-120
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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