(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜における架橋の量を動的に制御するシステムであって、
架橋剤で処理された角膜の選択された領域で架橋反応を活性化させるように構成された光源であって、前記光源は、架橋反応を決定するパラメータに従ってパルスの光の照明を送達するように構成され、前記パラメータは、周波数、放射照度、照射量、又は、オン／オフデューティサイクルの少なくとも１つを含み、前記角膜の領域は、前記架橋反応が、目の状態を矯正する角膜における生物力学的な変化を生じるように選択される、光源と、
前記光源に結合され、前記光源に、前記角膜の選択された領域へ前記パルスの光の照射を適用させる制御装置と、
を有し、
前記制御装置は、さらに、前記光源用に提案されたパラメータのセットに基づいて、一重項分子状酸素を伴わない反応によって発生する算定された架橋反応の量を決定するように構成され、
少なくとも算定された架橋反応の量に従って前記光源の１つ以上のパラメータを調整し、前記制御装置に、前記光源が、少なくとも１つ以上の調整されたパラメータに従ってパルスの光の照射を前記角膜の選択された領域に適用するようにさせる
システム。
【請求項２】
前記角膜における架橋反応をモニターするように構成されたモニターシステムを更に備え、
前記制御装置が、前記モニターシステムからの情報に応じて、前記周波数、前記放射照度、前記照射量、及び、前記オン／オフデューティサイクルの少なくとも１つを調整するように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記角膜の表面に酸素の濃度を提供するために構成された送達装置を更に備え、
前記送達装置が、前記モニターシステムからの情報に応じて、前記角膜の表面に送達される酸素の濃度を調整する、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記送達装置が、
初めに、前記角膜における第１のＯ２含量を決定する第１の気体混合物を最初に提供し、
次いで、前記角膜における第２のＯ２含量を決定する第２の気体混合物を提供し、
前記第１の気体混合物及び前記第２の気体混合物が、異なる量のＯ２を提供し、
前記送達装置が、前記モニターシステムからの情報に応じて前記角膜における架橋の動的制御を提供する、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記角膜の表面に酸素の濃度を提供するために構成された送達装置を更に備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
（ｉ）前記放射照度が、１mW/cm2〜５００mW/cm2の間で、かつ、前記オン／オフデューティサイクルが、１００／１〜１／１００の間にあり、又は、
（ii）前記放射照度が、１mW/cm2〜１０００mW/cm2の間で、かつ、前記オン／オフデューティサイクルが、１０００／１〜１／１０００の間にある、
請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記制御装置は、さらに、前記算定された架橋反応の量を、前記架橋剤の提案された濃度又は前記架橋剤による処置のための提案された浸漬時間の、少なくとも一つに基づいて決定する、
請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記架橋剤は、リボフラビンを含み、
前記制御装置は、三重項励起状態のリボフラビン及び角膜の基質間の反応を決定することによって、一重項分子状酸素を伴わない反応から算定された架橋反応の量を決定する
請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記架橋剤は、リボフラビンを含み、
前記制御装置は、算定された架橋反応の量を少なくとも
Ｒｆ３＊＋ＳＨ→ＲｆＨ●＋Ｓ●、かつ、
２ＲｆＨ●→Ｒｆ＋ＲｆＨ２
という反応であって、Ｒｆは基底状態のリボフラビンを表し、Ｒｆ３＊は三重項励起状態のリボフラビンを表し、ＲｆＨ●はリボフラビンのラジカル形態を表し、ＲｆＨ２はリボフラビンの還元形態を表し、ＳＨは角膜の基質を表し、Ｓ●は角膜の基質のラジカルを表す、反応に従って決定する、
請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記制御装置は、基底状態に対するリボフラビンの還元形態に戻る速度を制御する前記光源用の１つ以上のパラメータを調整する、
請求項９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６９９,２２６号、２０１２年７月１６日に出願された同第６１／６７１,７９８号の優先権を主張し、その出願内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、特に角膜組織で生じた所望の形状変化を安定化するために架橋剤が適用されるときの、パルスの光による角膜の架橋のためのシステム及び方法に関する。
【０００３】
関連技術の説明
近視、円錐角膜、及び、遠視といった、様々な眼障害は、角膜の異常成形を伴う。伴角膜弁レーザ角膜形成術（ＬＡＳＩＫ）は、角膜を通過する光の焦点を眼底に位置する網膜へ適切に合わせられるように、角膜を再形成する多くの矯正処置の１つである。ＬＡＳＩＫ眼手術では、マイクロケラトームと呼ばれる器具が角膜の薄いフラップを切るために使用される。続いて、角膜の被覆が剥がされ、下部の角膜組織がエキシマレーザで所望の形状まで除去される。所望の形状への角膜の再形成後、角膜フラップが所定の位置に戻され、手術は完了する。
【０００４】
角膜を再形成する別の矯正処置としては、角膜熱形成術が、角膜にマイクロ波又は高周波（ＲＦ）帯の電気エネルギーを適用する非侵襲性の処置を提供する。詳細には、角膜内のコラーゲン線維が約６０度で収縮するまで、電気エネルギーが角膜温度を上昇させる。収縮の発現は急速であり、この収縮から生じる応力が、角膜の表面を再形成する。したがって、円形又は環状のパターンを含むがこれに限定されない、特定のパターンに従ったエネルギーの適用により、角膜の外観を平坦化し、眼の視力を改善することができる。
【０００５】
近視、円錐角膜、及び、遠視といった眼障害に対処する際の、ＬＡＳＩＫ又は角膜熱形成術といった処置の成功は、角膜の所望の再形成が達成され安定化されたかどうかに左右される。
【０００６】
概要
本開示の一態様は、眼に適用されたリボフラビンの活性化を制御する方法に関する。方法は、眼の角膜の選択された領域にリボフラビンを適用することと、パルスの光の照明によってリボフラビンを活性化させることにより選択された領域で架橋反応を開始することと、を含む。パルスの光の照明は、放射照度、照射量、及び、オン／オフデューティサイクルを有する。放射照度、照射量、及び、オン／オフデューティサイクルは、光化学的効率を制御するために、リボフラビン架橋反応のための光化学的でキネティックな経路の決定に応じて調整される。
【０００７】
本開示の更なる態様は、角膜組織の架橋を制御するシステムに関する。システムは、角膜の選択された領域に架橋剤を適用するアプリケータを備える。システムはまた、架橋剤を活性化させることによって選択された領域で架橋反応を開始するように構成された光源を備える。光源は、パルスの光の照明及び連続波の照明のうちの少なくとも一つを送達するように構成される。パルスの光源は、放射照度、照射量、及び、オン／オフデューティサイクルを有する。放射照度、照射量、及び、オン／オフデューティサイクルは、光化学的効率を制御して角膜における所望の量の架橋を達成するために、架橋反応のための光化学的でキネティックな経路の決定に応じて調整される。連続波の照明は、架橋剤の各吸収ピークと対応する。システムは、角膜における架橋の量をモニターするように構成されたモニターシステムを更に備える。放射照度、照射量、及び、オン／オフデューティサイクルは任意に、角膜におけるモニターされた架橋の量に応じて更に調整される。
【０００８】
本開示の更に別の態様は、架橋治療を眼に制御可能に適用する方法に関する。方法は、眼に対する生物力学的特徴の所望の変化を決定するために眼の角膜を解析することを含む。方法は、眼の架橋反応の光化学的でキネティックな経路の決定に応じて、角膜に適用されるパルスの光の照明の放射照度、照射量、パルスの光の照明の露光サイクルの期間、及び、パルスの光の照明の暗サイクルの期間から選択される少なくとも１つのパラメータを調整することによって、眼に対する生物力学的特徴の所望の変化を達成することを更に含む。方法は、追加的に、少なくとも１つの調整されたパラメータに従って角膜にパルスの光の照明を送達することによって、架橋剤を活性化させることを含む。
【０００９】
本開示の更なる態様は、角膜における架橋の量を動的に制御するシステムに関する。システムは、角膜に架橋剤を適用するアプリケータを備える。システムは、架橋剤を活性化させるように構成されたパルスの光源を更に備える。パルスの光源は、放射照度、照射量、及び、オン／オフデューティサイクルを有する。放射照度、照射量、及び、オン／オフデューティサイクルは、所望の量の角膜の架橋に基づいて調整される。システムは、追加的に、角膜の表面に酸素を提供するように構成された送達装置を備える。
【００１０】
本開示の追加的な態様は、角膜組織の架橋を制御する方法に関する。方法は、角膜に架橋剤を適用すること、及び、パルスの光の照明によって架橋剤を活性化させることを含む。パルスの光の照明は、放射照度、照射量、及び、オン／オフデューティサイクルを有する。方法はまた、角膜における架橋の量をモニターすること、並びに、モニターされた角膜における架橋の量に応じて放射照度、照射量、及び、オン／オフデューティサイクルを調整することを含む。方法は、角膜の表面に酸素を送達することを更に含む。
【００１１】
本開示のこれらの及び他の態様は、添付図面と併せて閲覧したときに、本開示の実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】角膜内の角膜コラーゲンの分子架橋を開始するために、架橋剤及び活性化因子を眼の角膜に送達するための例示的な送達システムのブロック図である。
【図２Ａ】３mW/cm2の連続波の（ＣＷ）照射の間の、０．１％のリボフラビンで飽和された１００μmの角膜フラップより下の酸素の減少及び段階的な補充のグラフである。
【図２Ｂ】３０mW/cm2のパルスの照射の間の、０．１％のリボフラビンで飽和された１００μmの角膜フラップの下の酸素回復のグラフである。
【図３】３分間の３０mW/cm2のＣＷ照射前後の、還元リボフラビンの吸光度のグラフである。
【図４Ａ】４５０nmにおける蛍光、すなわちリボフラビンサンプルのグラフである。
【図４Ｂ】異なるリボフラビン濃度及び深部での、架橋したリボフラビンフラップの相対蛍光のグラフである。
【図５Ａ】様々な浸漬回数及びＵＶＡ照明シナリオに対するブタの角膜の力対変位曲線のグラフである。
【図５Ｂ】様々な浸漬回数及びＵＶＡ照明シナリオに対するブタの角膜の力対変位曲線のグラフである。
【図５Ｃ】様々な浸漬回数及びＵＶＡ照明シナリオに対するブタの角膜の力対変位曲線のグラフである。
【図６】様々なＵＶＡ照明シナリオに対するブタの角膜２００μmフラップの蛍光対波長のグラフである。
【図７Ａ】様々なＵＶＡ照明シナリオに対する４５０nmにおける消化された角膜フラップの蛍光によって測定される架橋のグラフである。
【図７Ｂ】様々なＵＶＡ照明シナリオに対するブタの角膜の力対変位曲線のグラフである。
【図８Ａ】本発明の態様による、架橋剤を適用することによって角膜組織を安定化又は強化する例示的なアプローチを示す。
【図８Ｂ】本発明の態様による、架橋剤としてリボフラビンを適用することによって角膜組織を安定化又は強化する例示的なアプローチを示す。
【図９Ａ】本発明の態様による、架橋剤をＯ２で過飽和にするために利用され得る例示的な装置を示す。
【図９Ｂ】本発明の態様による、架橋剤として過飽和リボフラビンを適用することによって角膜組織を安定化又は強化する例示的なアプローチを示す。
【図１０Ａ】本発明の態様による、キャリアゲルをＯ２で過飽和にするために利用され得る例示的な装置を示す。
【図１０Ｂ】本発明の態様による、Ｏ２で過飽和されたゲルとリボフラビンを混合することによって角膜組織を安定化又は強化する例示的なアプローチを示す。
【図１０Ｃ】本発明の態様による、Ｏ２で過飽和されたゲルを適用することによって角膜組織を安定化又は強化する例示的なアプローチを示す。
【図１１Ａ】本発明の態様による、より高い濃度のＯ２に角膜を暴露するように眼より上でＯ２の定常状態を維持するために利用され得る例示的な装置を示す。
【図１１Ｂ】本発明の態様による、より高い濃度のＯ２に角膜を暴露するように眼より上でＯ２の定常状態を維持するために利用され得る別の例示的な装置を示す。
【図１１Ｃ】より高い濃度のＯ２に角膜を暴露するように眼より上にＯ２の状態を適用することによって角膜組織を安定化又は強化する例示的なアプローチを示す。
【図１２】本発明の態様による、架橋反応をリアルタイムでモニターすること及び所望の架橋の速度を達成するためにＯ２暴露の量を制御することによって角膜組織を安定化又は強化する例示的なアプローチを示す。
【００１３】
説明
本開示の態様は、図１に示されるような、角膜２内の角膜コラーゲンの分子架橋を開始するために架橋剤１３０を眼１の角膜２に送達するための、例示的な送達システム１００の使用に関する。送達システム１００は、架橋剤１３０を角膜２に適用するアプリケータ１３２を備える。送達システム１００は、光源１１０、及び、光を角膜２に方向づける光学素子１１２を備える。送達システム１００はまた、アプリケータ１３２及び光学素子１１２に結合された制御装置１２０を備える。アプリケータ１３２は、角膜２上の特定のパターンに従って、架橋剤１３０を適用するように適合された装置であり得る。アプリケータ１３２は、架橋剤１３０を、角膜の表面２Ａ（例えば、上皮）又は眼１の他の場所に適用することができる。特に、アプリケータ１３２は、角膜２を介した中深度領域２Ｂへの架橋剤の移送又は浸透を容易にするために、角膜の表面２Ａの剥離箇所又は切れ目に架橋剤１３０を適用することができる。
【００１４】
多数の条件及びパラメータが、架橋剤による角膜コラーゲンの架橋に影響を及ぼす。開始要素が紫外線Ａ波（「ＵＶＡ」）の光であるときは、放射照度及び照射量が、架橋量及び架橋速度の両方に影響を及ぼす。ＵＶＡ光は連続的に適用されても（連続波の若しくはＣＷ）又はパルスの光として適用されてもよく、この選択が、架橋の量、速度、及び、程度に影響を及ぼす。ＵＶＡ光がパルスの光として適用される場合には、露光サイクルの期間、暗サイクル、及び、暗サイクル期間に対する露光サイクルの比のすべてが、架橋速度及び結果として生じる角膜補強量の両方に影響を及ぼす。架橋において重要な役割を果たす他の要因としては、架橋剤濃度、温度、角膜の特定の条件（例えば何らかの前の処置が行われたかどうか）、並びに他の要因及びパラメータが挙げられる。
【００１５】
本開示の態様は、架橋の速度及び量へのこれらのパラメータのそれぞれの影響を判定すること、並びに所望の量、速度、及び、（角膜２上の）角膜の補強の位置を達成するための条件を最適化するために、これらのパラメータ間の相互関係を判定することに関する。本開示の態様は、１つ又は複数のパラメータの変化に対する角膜反応をモニターすること、及び、受け取ったフィードバックに基づいて１つ又は複数のパラメータを調整することに関する。
【００１６】
本明細書において説明されるように、本明細書で開示される機器及びアプローチは、角膜２の角膜組織を安定化することによって、眼治療処置の後に所望の形状又は構造変化を保存するために使用され得る。本明細書で開示される機器及びアプローチはまた、眼治療処置から離れて、角膜組織の強度又は生物力学的構造の整合性を強化するために使用され得る。
【００１７】
図１を参照すると、光学素子１１２は、架橋剤１３０を活性化するのに好適な角膜２上の特定のパターンへ、光源１１０により放出される光を方向づけ焦点を合わせるための、１つ以上の鏡又はレンズを備えることができる。光源１１０は、紫外線光子よりも大きな又は小さなエネルギーレベルで光子を代替的に又は追加的に放出することもできるＵＶＡ光源であり得る。送達システム１００はまた、光学素子１１２又はアプリケータ１３２若しくはその両方の動作を制御する制御装置１２０を備える。光学素子１１２及びアプリケータ１３２の動作の態様を制御することにより、制御装置１２０は、架橋剤１３０を受け光源１１０に暴露される角膜２の領域を制御することができる。架橋剤１３０及び光源１１０を受ける角膜２の領域を制御することにより、制御装置１２０は、角膜コラーゲン原線維の架橋によって強化及び安定化される角膜２の特定の領域を制御することができる。一実施態様では、架橋剤１３０は、強化を必要とする角膜２の特定の領域に関係なく、眼１に広く適用され得るが、光源１１０は、強化を必要とする角膜２の特定の領域に方向づけられ、その結果、光源１１０に暴露される角膜２の領域を制御することによって架橋が開始される角膜２の領域を制御することができる。更に、本発明の態様は、角膜２の選択された領域で所望の度合の角膜の補強を達成するために、適用される光の特定の領域を変化させることに関する。
【００１８】
光学素子１１２の動作を制御し、これにより、波長、帯域幅、強度、力、位置、浸透の深さ、及び、処置の期間（露光サイクルの期間、暗サイクル、及び、暗サイクル期間に対する露光サイクルの比）の任意の組み合わせを制御することで光源１１０（すなわち開始要素）から角膜２への送達を正確に制御するために、別の制御装置が使用されてもよい。更に、制御装置１２０の機能は、部分的又は全体的に手動操作と置き換えられ得る。
【００１９】
本明細書において説明される実施形態は、例えば角膜熱形成術アプリケータによって定められる、環状パターンに従って角膜の架橋を開始することができるが、他の実施形態での開始パターンは、特定の形状に限定されない。実際に、エネルギーが非環状パターンで角膜に適用されてもよく、したがって、架橋が、結果として生じる角膜構造の非環状変化に対応する角膜のエリアで開始されてもよい。エネルギーが角膜に適用され得る非環状形状の例は、２００８年５月１日出願の米国特許出願第１２／１１３，６７２号に記載され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
実施形態はまた、多光子励起顕微鏡法の態様を利用することができる。詳細には、特定の波長の単一の光子を角膜２に送達するのではなく、送達システム（例えば、図１の１００）は、架橋を開始するために組み合わさるより長い波長、すなわちより低いエネルギー、の複数の光子を送達する。有利には、長い波長は短い波長よりも低い度合で角膜２内で散乱し、そのため、長い波長の光は短い波長の光よりも効率的に角膜２に浸透することができる。光増感剤による光の吸収は長い波長では極めて少ないため、角膜内の深部における入射した照射光の遮蔽効果もまた、従来の短い波長の照明よりも低減される。これにより、深部にわたる特定の架橋の向上した制御が可能となる。例えば、いくつかの実施形態では、それぞれの光子が、ラジカル（リボフラビン又は光増感剤及び酸素）を放出する架橋剤１３０の分子を励起するために必要なエネルギーの約半分を持つ場合に、２つの光子が利用され得る。架橋剤分子は、両方の光子を同時に吸収するときに、角膜組織に反応性ラジカルを放出するのに十分なエネルギーを吸収する。実施形態はまた、架橋剤分子が反応性ラジカルを放出するために、例えば３、４又は５個の、光子を同時に吸収しなければならないように、より低いエネルギーの光子を利用することができる。複数の光子をほぼ同時に吸収する可能性は低いため、高流束の励起光子が必要とされ、高流束はフェムト秒レーザによって送達され得る。
【００２１】
本開示の態様、例えば架橋剤の送達及び活性化のためのパラメータの調整は、所望の架橋を達成するのに必要な時間を短縮するために利用され得る。例示的な実施態様では、時間は数分から数秒へ短縮され得る。いくつかの構成は、５mW/cm2の放射照度で開始要素（すなわち、光源１１０）を適用することができるが、本開示の態様は、所望の架橋を達成するのに必要な時間を短縮させるために、より大きな放射照度の開始要素、例えば５mW/cm2の倍数、を適用させることができる。高度に加速された架橋は、フィードバックシステムと組み合わせてレーザ走査技術を使用するときに、特に可能となる。角膜２に吸収されるエネルギーの総照射量は、有効照射量として説明され得、これは、角膜の表面２Ａのエリアを通過して吸収されるエネルギー量である。例えば、角膜の表面２Ａの領域に対する有効照射量は、例えば、５J/cm2、又は、２０J/cm2若しくは３０J/cm2と同程度の大きさとなり得る。説明される有効照射量は、エネルギーの単回適用、又はエネルギーの反復適用によって送達され得る。
【００２２】
本開示の態様は、特に角膜組織において生じた所望の形状変化を安定させるために架橋剤が適用されるときに、特定のデューティサイクル及び周波数のパルスの光を送達するシステム及び方法を提供する。リボフラビンによる角膜の架橋は、円錐角膜及びＬＡＳＩＫ後拡張症などの、疾患における、角膜拡張を安定化及び／又は低減させるためにリボフラビンを光活性化すべくＵＶＡ光を使用する手法である。角膜の架橋は、角膜組織内に追加的な化学結合を生成することにより角膜強度を改善する。
【００２３】
本開示の態様によれば、システム及び方法は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を利用することによって、光源を電子的にオン及びオフにすることによって、並びに／又は機械的若しくは光電子（例えばポッケルスセル）シャッタ若しくは機械的チョッパ若しくは回転アパーチャを使用することによって、パルスの光を生じさせる。ＤＭＤ技術は、空間的並びに時間的に開始光の適用を変化させるために使用され得る。ＤＭＤ技術を使用して、制御された光源は、ＤＭＤとして知られる、半導体チップ上にマトリクス状に置かれた微視的に小さな鏡によって生成される精密な空間パターンで開始光を発射する。それぞれの鏡は、発射光のパターンにおける１つ以上の画素を表す。光が発射される力及び期間は、他の箇所に記載されるように決定される。本開示の他の態様によれば、パルスの光は、任意の好適なやり方で発生し得る。
【００２４】
リボフラビンは、放射照度の増加に応じて大幅に、（可逆的若しくは不可逆的に）不活化されるか及び／又は光分解される。リボフラビンは、放射エネルギー、特に光、を吸収するときに、光増感を行う。Ｉ型及びＩＩ型の、リボフラビン光増感のための２つの主要な光化学的でキネティックな経路が存在する。Ｉ型及びＩＩ型機構の両方に関係した主要な反応のいくつかは、以下の通りである：
【００２５】
Ｉ型及びＩＩ型機構に共通の反応
Ｒｆ→Ｒｆ＊１，Ｉａｂｓ                                     （１）
Ｒｆ＊１→Ｒｆ，ｋ１                                       （２）
Ｒｆ＊１→Ｒｆ＊３，ｋ２                                     （３）
【００２６】
Ｉ型機構
Ｒｆ３＊＋ＳＨ→（ＲＦ●−＋ＳＨ●＋）→ＲｆＨ●＋Ｓ●，ｋ３    （４）
２ＲｆＨ●→Ｒｆ＋ＲｆＨ２，ｋ４                            （５）
ＲｆＨ２＋Ｏ２→Ｒｆｏｘ＋Ｈ２Ｏ２，ｋ５                       （６）
【００２７】
ＩＩ型機構
Ｒｆ３＊＋Ｏ２→Ｒｆ＋１Ｏ２，ｋ６                            （７）
ＳＨ＋１Ｏ２→Ｓｏｘ，ｋ６                                   （８）
【００２８】
Ｒｆは、基底状態のリボフラビンを表す。Ｒｆ＊１は、励起一重項状態のリボフラビンを表す。Ｒｆ＊３は、三重項励起状態のリボフラビンを表す。Ｒｆ●−は、リボフラビンの還元ラジカルアニオン形態である。ＲｆＨ●は、リボフラビンのラジカル形態である。ＲｆＨ２は、リボフラビンの還元形態である。ＳＨは、基質である。ＳＨ●＋は、中間ラジカルカチオンである。Ｓ●は、ラジカルである。Ｓｏｘは、基質の酸化形態である。Ｒｆｏｘは、（ＲｆＨ２の特性とは異なり）リボフラビンの特性と類似するＵＶＡ吸収及び増感剤特性を有したデューテロフラビン（７,８−ジメチル−１０−（ホルミルメチル）イソアロキサジン）である。
【００２９】
リボフラビンは、反応（１）〜（３）に示されるように三重項励起状態Ｒｆ＊３に励起される。三重項励起状態Ｒｆ＊３から、リボフラビンは、一般にＩ型又はＩＩ型フォトメカニカル機構に従って、更に反応する。
【００３０】
先のＩ型機構は低い酸素濃度において望ましく、ＩＩ型機構は高い酸素濃度において望ましい。Ｉ型機構では、基質が、水素原子又は電子の伝達によってラジカル又はラジカルイオンをそれぞれ生じさせるように、増感剤の励起状態と反応する。ＩＩ型機構では、励起した増感剤が、一重項分子状酸素を形成するために、酸素と反応する。次いで、一重項分子状酸素が、追加的な架橋結合を作り出すために、組織に反応する。
【００３１】
角膜の酸素濃度は、ＵＶＡ放射照度及び温度によって変化し、ＵＶＡ露光の初めにすばやく減少する。酸素濃度は、（例えば、図２Ａに示されるような）３mW/cm2の放射照度に対しては約１０〜１５秒以内で、３０mW/cm2の放射照度に対しては約３〜５秒以内で枯渇する傾向にある。特定のデューティサイクル、周波数、及び、放射照度のパルスの光を利用して、Ｉ型及びＩＩ型光化学的でキネティックな機構両方からの入力が、最大量の光化学的効率を達成するために最適化され得る。更に、パルスの光を利用することによって、リボフラビンを伴う反応の速度を調整することが可能となる。反応速度は、必要に応じて、例えば放射照度、照射量、オン／オフデューティサイクル、リボフラビン濃度、浸漬時間などの、パラメータのうちの１つを調整することによって、増加又は減少され得る。更に、反応及び架橋速度に影響を及ぼす追加的な成分が、角膜に添加されてもよい。
【００３２】
本開示の一態様は、不活性化した（還元）リボフラビンがＩ型反応で基底状態のリボフラビンに戻ることを可能にすることによって、及び、良好な光子変換効率が得られるＩＩ型反応での酸素摂取速度の低減を可能にすることによって、光子最適化を達成することに関する。
【００３３】
Ｉ型反応における不活性化した（還元）リボフラビンが基底状態へ戻る速度、及び、ＩＩ型反応における酸素摂取速度は、多くの要因によって決定される。これらの要因としては、パルスの光処置のオン／オフデューティサイクル、パルスのレート周波数、放射照度、及び、照射量が挙げられるが、これらに限定されない。更に、リボフラビン濃度、浸漬時間、及び、酸化剤を含む他剤の添加が、酸素摂取速度に影響を及ぼす。デューティサイクル、パルスのレート周波数、放射照度、及び、照射量を含むこれらの及び他のパラメータは、最適光子効率を達成し、リボフラビン光増感のためのＩ型及びＩＩ型光化学的でキネティックな機構の両方を効率的に使用するために、最適化される。更に、これらのパラメータは、最適化学増幅効果を達成するように、最適化される。
【００３４】
本開示の態様によれば、パルスの光の処置のために、オン／オフデューティサイクルは約１００／１〜約１／１００の間にあり；放射照度は約１mW/cm2〜約５００mW/cm2平均放射照度の間にあり、パルスのレートは約０．１Hz〜約１０００Hzの間にある。
【００３５】
本開示の態様によれば、パルスの光の処置のために、オン／オフデューティサイクルは約１０００／１〜約１／１０００の間にあり；放射照度は約１mW/cm2〜約１０００mW/cm2平均放射照度の間にあり、パルスのレートは約１０００Hz〜約１００，０００Hzの間にある。これらの平均は、高いレートが可能なＬＥＤシステムの代わりにＱスイッチレーザ光源を使用することに基づく。本開示の更なる態様によれば、レーザ光源は、調整可能なパルスの光源、ＬＥＤシステム、非常に長いオン時間デューティサイクルのアーク光源若しくは白熱、又は任意の他の好適な光源であり得る。
【００３６】
０．１Hz〜約１０００Hz、又は１０００Hz〜約１００，０００Hzのパルスのレートは、Investigative Ophthalmology & Visual Science, April 2012, Vol. 53, No. 4の２３６０〜２３６７ページ（２０１２年４月）に、Kamaevらによって詳述されるように、光化学的でキネティックに基づいて選択され得、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示の態様によれば、パルス長は、長くても−１若しくは数秒程度でも−、又は短くても−１秒の一部分程度でもよい。
【００３７】
リボフラビンによる角膜の架橋の光化学的でキネティックな態様によれば、パルスの光の照明は、同じ量又は照射量の送達されるエネルギーで連続波の照明により達成され得るよりも角膜組織の強い又は弱い補強を生成するために、使用され得る。好適な長さ及び周波数の光パルスが、最適化学増幅を達成するために使用され得る。
【００３８】
図２Ａは、２５度で３mW/cm2のＵＶＡ照射の間、０．１％のリボフラビンで飽和された、１００μmの厚さのブタ角膜フラップより下の溶存酸素の減少及び段階的な補充の曲線のグラフである。酸素濃度（mg/L）は、約１５秒でゼロまで下がり、約１０分後に段階的に増加し始め、３０分後に開始値の約１／１０に戻る。
【００３９】
図２Ｂは、１００μmの厚さの角膜フラップの下での酸素回復のグラフである。角膜フラップは、３０mW/cm2のＵＶＡ照射の間、０．１％のリボフラビンで飽和された。照射は、３秒オン／３秒オフサイクルでパルス化された。リボフラビン液滴は、９０秒毎に角膜に添加された。この例では、酸素濃度が段階的に増加し始めるのに約３分、及び、酸素濃度が０．１mg/L.まで増加するのに約６分を必要とした。
【００４０】
ＵＶＡ露光の最初の１０〜１５秒の間に存在する、好気条件下で、基質（角膜マトリクスのプロテオグリカンコアタンパク質及びコラーゲン）の増感光酸化が、主に、一重項分子状酸素などの光化学的に発生した反応性酸素種との反応によって、生じる。これは、ＩＩ型光化学的機構と一致する。最初の１０〜１５秒の後、酸素は完全に減少し、基質とリボフラビンとの間の反応は、主にＩ型光化学的機構と一致するようになる。照明期間の中間を越えて、角膜の酸素濃度は、ＩＩ型機構が追加的な役割を果たし始めることができる濃度まで、ゆっくりと増加する。この段階の間、寄与度の高まりは、酸素によって変化する二次ラジカル反応の増大、並びに一重項酸素媒介の架橋から予想される。
【００４１】
架橋の後様々な深部で行われ、応力−歪み挙動又はコラーゲン蛍光分析によってテストされた、角膜フラップの調査は、角膜の補強が主に角膜支質の前部２００μmに存在することを示唆する。ＵＶＡ暴露された角膜のコラーゲンの蛍光の増加は、角膜の機械的な補強に関連し、以下で更に説明されるように角膜の表面から２００〜３００μmの深部で検出され得る。
【００４２】
ＵＶＡ放射が酸素減少の直後に停止される場合には、酸素濃度は、図２Ａ及び図２Ｂに示されるように増加し（補充され）始める。酸素は、ラジカル種と相互反応して鎖終結過酸化物分子を形成することにより、フリーラジカル光重合反応を阻害することが可能であるので、過剰な酸素は、角膜の架橋プロセスにおいて有害であり得る。パルスのレート、放射照度、照射量、及び、他のパラメータは、最適化された酸素再生速度を達成するように調整され得る。酸素再生速度を計算及び調整することは、所望の量の角膜の補強を達成するために反応パラメータを調整する別の例である。
【００４３】
溶存フリー酸素は、酸素センサの位置及び角膜フラップより下だけではなく、上記の角膜フラップの全体にわたって大幅に減少する。酸素含量は、酸素の拡散が反応のキネティックに対応することが可能な非常に薄い角膜層を除き、様々な化学反応によって、角膜の全体にわたって減少し得る。この拡散制御されるゾーンは、酸素を摂取する基質の反応能が減少するにつれて、角膜内へより深く段階的に移動することになる。
【００４４】
角膜内の酸素測定は、リボフラビンによる架橋のための主な光増感機構がＵＶＡ光による照明の開始時の非常に短い初期のＩＩ型光化学的機構の後のＩ型経路であることを示唆する。照明期間の中間を越えて、角膜の酸素濃度は、ＩＩ型機構が追加的な役割を果たし始めることができる濃度まで、先の図２Ａ及び図２Ｂに示されるように、ゆっくりと増加する。
【００４５】
角膜の架橋のための機構は、先の式（６）に表される追加的な経路でキネティックなによって開始する。短時間（数秒）後、酸素は減少し、図２Ａに示されるように利用可能な酸素はほとんど存在しない。これらの嫌気条件下で、Leuco-Deuteroflavin＋Ｈ２Ｏ２が、HeldmanらのHandbook of Food Engineering（第２版）CRC Press（２００６年）に説明されるように形成される。Leuco-Deuteroflavinは、３６０nmで吸収が小さく、光増感を欠き、したがって、ラジカルを生成することができない。Leuco-Deuteroflavinは、本明細書において、還元フラビン、還元リボフラビン、ＲｆＨ２、及び、FlredH2と呼ばれる。
【００４６】
還元リボフラビンは、先の式（６）に示されるような酸化反応を行う。分子状酸素による還元リボフラビンの酸化は、不可逆的で、自己触媒的であり、（ビニルモノマー、ビス（アクリルアミド）を有するアクリルアミド、などの場合のように）ラジカル重合を開始することができるフリーラジカルの生成を伴う。酸素による還元リボフラビンの自己触媒的な酸化は、Massey, VのActivation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins, J. Biol. Chem.（１９９４年）269, 22459-22462に記載される反応によって説明される。
【００４７】
特定の状況に応じて、還元リボフラビンの酸化速度を高速化又は低速化する必要性が存在し得る。多数のパラメータが、還元リボフラビンの反応速度及び架橋速度に影響を及ぼす。
【００４８】
パルスの光照射の間に、ＵＶＡ光がオフにされる（又は低い値まで下げられる）とき、Masseyによって説明される多くの経路に従って、酸素は、Leuco-Deuteroflavinの近くで局所的に再生され、光を再び吸収することにより架橋のためのラジカルを生成することが可能なDeuteroflavinに、Leuco-Deuteroflavinを変換する。したがって、改善された光子効率が、Deuteroflavinの再生を通じたオン／オフサイクルの適切なタイミングによって達成される。Deuteroflavinの再生は、連続波の照明及び連続的な嫌気条件下よりも、所与の光エネルギー照射量に対するラジカル生成の高い全濃度を可能にする。
【００４９】
酸素は、天然の酸化剤であり、本開示の態様による酸化剤として使用される。本開示の更なる態様によれば、酸素及び／又は他の酸化剤が利用され；このような酸化剤は、処方剤に添加されても又は好適な方法で角膜に投与されてもよい。
【００５０】
本開示の他の実施形態によれば、還元リボフラビンは、酸素を含有し還元リボフラビンを酸化させることが可能な好適な薬剤に浸漬され得る。一実施形態によれば、ビタミンＢ１２が、還元リボフラビン及び／又は角膜に任意の好適なやり方で添加され得る。ビタミンＢ１２は、酸素を保持することが可能なコバルト分子を含有し、その結果、酸素保存リザーバを生成する。還元リボフラビンは、ビタミンＢ１２又は別の好適な酸素担持剤によって過飽和されてもよい。ビタミンＢ１２などの好適な薬剤は、パルスの光の適用と共に提供されてもよい。適切なレベルの酸素が、様々な可逆酸素担体によって維持され得る。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Yang N., Oster GのDye-sensitized photopolymerization in the presence of reversible oxygen carriers. J. Phys. Chem. 74, 856-860 （１９７０年）を参照。
【００５１】
角膜の補強は、円形又は環状のパターンを含むがこれらに限定されない、特定のパターンに従って角膜に適用され得、角膜の外観を平坦化し、眼の視力を改善することができる。例えば、多少の角膜の補強が、角膜の中心ではなく、角膜の外縁に所望され得る。本開示の態様は、角膜の外径上で多くの角膜の補強を達成すること、及び、外径から角膜の中心へ向かって角膜の補強の量を段階的に減少させることに関する。本開示の他の態様は、所定の一連の特徴に基づいて多くの角膜の補強を必要とする角膜の領域を選択すること、及び、パルスの光の流量を変化させることによって多くの角膜の補強をこれらの選択された領域に適用することに関する。本開示のある態様によれば、パルスの光は、異なる放射照度、照射量、及び／又は、異なるデューティサイクルによって角膜の異なる各エリアに適用され得、角膜の補強のレベル又は角膜の補強勾配の異なる各エリアをもたらす。所望のレベルの角膜の補強を達成するためにパルスの光の流量を変化させることは、特定の、目標とされる結果を達成するために、架橋反応のパラメータを調整する別の例である。更に、角膜の選択された領域で所望のレベルの角膜の補強を達成するためにパルスの光の流量を変化させることは、眼の形状変化のより精密かつ正確な制御を可能にする。
【００５２】
選択されたパターンに従ってＵＶ光などの開始要素を適用するためのアルゴリズムは、例えば２０１１年３月１８日に出願の米国特許出願第１３／０５１６９９号に説明され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
従来、励起リボフラビンの三重項の直接攻撃による経路（Ｉ型機構）、一重項酸素による経路（ＩＩ型）、及び、（以下のスキームに確認されるような）還元リボフラビン（ＲＦＨ２）が酸素と相互作用するときのフリーラジカルの生成による経路の：架橋をもたらす少なくとも３つの異なる経路が利用され得る。
【００５４】
（２つの水素原子が側鎖によって芳香核に供給される）リボフラビンＲＦＨ２の還元形態は、リボフラビンの嫌気光分解によって作り出され（Holmstrom１９６１年）、４４５nmにおける吸収の低減により観察される。
【００５５】
ここで図３を参照すると、グラフは、３０mW/cm2の放射照度で３分間照射された後の還元リボフラビンＲｆＨ２の０．２mmの光経路の吸光度に対する、リボフラビンの初期サンプルの０．２mmの光経路の吸光度を示す。４４５nmの波長で、初期サンプルの吸光度は約０．５４３であるが、照射されたサンプルの吸光度は約０．３４０である。
【００５６】
ＲＦＨ２は、自動酸化可能で、酸素の存在下、高度に感光性の蛍光及び吸収（４４５nm）Deuteroflavin（７，８−ジメチル−１０−（ホルミルメチル）イソアロキサジン）をもたらす。還元リボフラビン溶液は、ＥＤＴＡの存在下、可視光によるリボフラビンの照射により窒素下で調製され、酸素の不存在下で保存され得る。酸素との反応は、（初期条件に応じて）数百ミリ秒の間に完了し、（Masseyに説明されるように）フリーラジカルを介して進行し、ビニルモノマーの重合を開始することが可能である。酸素との反応の速度は、水の代わりにフラビン溶液に酸素を溶解することによって、増加し得る。
【００５７】
実施例１−角膜サンプルの蛍光
ＲＦＨ２を、リボフラビン溶液（ＥＤＴＡあり及びなし、１％のＥＤＴＡ、０．１％のリボフラビン）の照射によって調製し、浅い密閉石英キュベット内で（酸素を除去するために）アルゴンで飽和した。次いで、追加的なＵＶ光の不存在下で、ブタ角膜フラップを、これらの溶液中に直接配置した。１〜２分後、この処置を、ＲＦＨ２を含有する新鮮な溶液で数回繰り返した。次いで、角膜フラップを、蒸留水で洗浄し、パパイン緩衝液で消化し、フラップの蛍光を測定した。
【００５８】
図４Ａに確認されるように、予備ＵＶＡ暴露されたリボフラビン溶液で処理された角膜サンプルの蛍光は、純粋な、暴露されないリボフラビンによって洗浄された角膜サンプルの蛍光より高かった。これは、ＲＦＨ２の酸化が角膜内の一部の架橋を生じさせることが可能であることを示すことができるが、観察された蛍光は、ＵＶＡに直接暴露された角膜フラップで一般に観察されるものよりも大幅に低かった。蛍光は、ＥＤＴＡなどの還元剤を有するリボフラビン溶液の照射によって調製されたサンプルに対して、最も高かった。したがって、ＲｆＨ２の架橋効率を増加させる１つの方法は、リボフラビンのための還元剤を有する溶液でリボフラビンを使用することである。還元剤としては、ＥＤＴＡ、アスコルビン酸、糖、アミン、アミノ酸、及び、任意のこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これは、角膜原線維との所望のレベルの架橋を達成するために架橋反応のパラメータを修正する別の例である。本発明の一態様によれば、約０．００１％のリボフラビンから約１．０％のリボフラビンの間のリボフラビン濃度が利用され得る。
【００５９】
（元の材料、又はパパイン溶液のような酵素によって消化された材料などの）コラーゲンの蛍光強度は、その剛度と直線的に相関することが見出された。例えば、この相関は、ChaiらのQuantitative Assessment of UVA-Riboflavin Corneal Cross-Linking Using Nonlinear Optical Microscopy. Investigative Opthalmology & Visual Science, June 2011, Vol. 52, No. 7（２０１１年）に角膜コラーゲンに対して報告され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。この相関は、RolandiらのCorrelation of Collagen-Linked Fluorescence and Tendon Fiber Breaking Time. Gerontology 1991;27:240-243にウィスターラットのコラーゲン線維に対して報告され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。この相関は、FiteらのNoninvasive Multimodal Evaluation of Bioengineered Cartilage Constructs Combining Time-Resolved Fluorescence and Ultrasound Imaging. Tissue Eng: Part C Vol. 17, Number 4, 2011に軟骨形成サンプルのコラーゲンに対して報告され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。この相関は、VerzijlらのCrosslinking by Advanced Glycation End Products Increases the Stiffness of the Collagen Network in Human Articular Cartilage. Arthritis & Rheumatism Vol. 46, No. 1, January 2002の１１４〜１２３ページにヒト関節軟骨のコラーゲン網に対して報告され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
架橋効果は、より高いリボフラビン濃度で減少する傾向にある。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Song P., Metzler DのPhotochemical Degradation of Flavins - IV. Studies of the Anaerobic Photolysis of Riboflavin. Photochemistry and Photobiology, Vol. 6, ６９１〜７０９ページ、１９６７年を参照（リボフラビンの遮蔽効果、及び、リボフラビン自体によるその三重項状態の消光（濃度消光）が考慮される必要があること、光化学的開裂の生成物が蓄積するにつれて速やかに生成物が量子収量を減少させることを説明する）。
【００６１】
実施例２−１００μm及び２００μmの深部での架橋した角膜フラップのコラーゲン結合蛍光の測定
材料及び方法
ブタの全眼球（SiouxPreme Packing Co.、アイオワ州、スーシティー；氷詰めされた食塩水に入れて出荷される）を室温（２５度）に温めた。次いで、角膜を、鈍い外科用メス刃によって上皮除去し、０．９％の食塩水の０．１、０．２５、又は０．５％のリボフラビン溶液を、架橋の前に２０分間それぞれの角膜の頂部に適用した。全角膜を、３６５nm光源（UV LED NCSU033B[T]、Nichia Co.、日本、徳島）によって、決定された時間、選択された放射照度（３又は３０mW/cm2）でトップハットビームにより照射し（３％二乗平均平方根）、放射照度を角膜の表面で電力センサ（model PD-300-UV; Ophir, Inc.,、イスラエル、エルサレム）により測定した。
【００６２】
角膜フラップ（それぞれ厚さ１００μm、１つずつ）を、Intralase femtosecond laser（Abbott Medical Optics、カリフォルニア州、サンタアナ）を用いて眼から切除した。角膜フラップの平均厚さを、超音波Pachymeter（DGH Technology、ペンシルベニア州、エクストン）により眼からの切除前後の測定値間の差として算定した。洗浄水のリボフラビンが４５５nmにおける吸光度測定（Thermo Scientific Evolution 300/600 UV-Vis Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、ウォルサム）で検出不可能となるまで、フラップを蒸留水で洗浄した。次いで、重量変化が１０％未満になるまで、フラップを真空乾燥した（Rotary vane vacuum pump RV3 A652-01-903, BOC Edwards、英国、ウェスト・サセックス）。
【００６３】
それぞれのフラップ（１mg）を、６５度で２時間、０．５mLのパパイン緩衝液［1x PBS（pH７．４）、２mMのＬ−システイン、及び、２mMのＥＤＴＡ］の２．５単位／mLのパパイン（Papaya latex由来, Sigma）で消化した。パパイン消化物を、２２００×Ｇで３０秒間遠心分離し（Mini centrifuge 05-090-100, Fisher Scientific）、１×ＰＢＳ溶液で３倍に希釈し、溶液の蛍光を、QM-40 Spectrofluorometer（hoton Technology Int.,ロンドン、カナダ、オンタリオ）でλｅｘ＝３６０nmの励起によって測定した。組織の不存在下で蛍光を測定し、サンプルの蛍光からこの値を減算することによって、パパイン緩衝液の蛍光を考慮した。
【００６４】
結果
切除されたサンプルの蛍光は、同じ厚さを有する非架橋サンプルに対する相対値であり、図４Ｂに示される。架橋後の角膜蛍光は（すべてのサンプルが同じＵＶＡ照射量、５．４J/cm2に暴露された）、低い放射照度及び低いリボフラビンの濃度で長い期間ＵＶＡに暴露されたサンプルに対して大きいことが示される。角膜蛍光はまた、角膜の最初の１００μmのほうが次の１００μmよりも大きい。最も高い角膜蛍光は、最初の１００μmで、０．１％のリボフラビン溶液に浸漬され３mW/cm2.で照射されたサンプルに対して観察された。
【００６５】
実施例３
到着の際に、ブタの眼の過剰な筋組織を除去し、（３７度に設定された）培養器内で食塩水中に３０分間配置した。次いで、眼を、上皮除去し、３７度で２０分間０．１％のリボフラビン溶液中に配置した。眼を溶液から除去し、生理的ＩＯＰを適用した。次いで、眼を、ＵＶＡ源及びシャッタシステムの下に配置し、図５Ａ〜５Ｃに示されるように、指示されたプロトコルに従って照射した。リボフラビン液滴を、ＵＶＡ適用の間、１．５分毎に適用した。照射した後、角膜の厚さを、厚度計によって測定した。次いで、サンプルをフェムト秒レーザの下に配置し、〜２００μmのフラップを切った。フラップを、二軸材料試験機（CS-BIO TESTER 5000, CellScale、カナダ、オンタリオ州ウォータールー）に位置決定し、破損まで引き伸ばした。次いで、サンプルを、蒸留水でリンスし、将来のパパイン消化及び蛍光分析のために凍結させた。
【００６６】
図５Ａは、様々な浸漬回数及びＵＶＡ照明シナリオに対するブタの角膜の力対変位曲線を示す。図５Ａは、計５．４J/cm2の送達される照射量で、３０mW/cm2の連続波の照明で照射されたサンプル３に対する、３mW/cm2の連続波の照明で照射された０．２５％のリボフラビンサンプル２の異なる生物力学的剛度を示す実験の結果である。計５．４J/cm2の送達される照射量で３０mW/cm2連続で照射された０．２５％のリボフラビンサンプル３の生物力学的剛度は、同じ条件下で照射された０．１％のリボフラビンサンプル４の生物力学的剛性と類似した。それぞれのサンプルに対して計５．４J/cm2の送達される照射量で、３秒オン／３秒オフデューティサイクルの３０mW/cm2のパルスの光で照射された０．２５％のリボフラビンサンプル６の生物力学的剛度は、２秒オン／４秒オフデューティサイクルの６０mW/cm2のパルスの光で照射された０．２５％のリボフラビンサンプル７の生物力学的剛性と類似した。３秒オン／３秒オフデューティサイクルの３０mW/cm2のパルスの光で照射された０．１％のリボフラビンサンプル８の生物力学的剛度は、サンプル６及び７の双方よりも高かった。計３５．１J/cm2の送達される照射量で３０mW/cm2の連続波の照明で照射されたリボフラビンサンプル５の生物力学的剛度は、サンプル６、７、３、４及び１（０．２５％のリボフラビン濃度を有する対照サンプル）に対するものよりも高く、サンプル２に対するものよりも低かった。サンプル４は３０分間リボフラビンで浸漬され、すべての他のサンプルは１時間リボフラビンで浸漬された。
【００６７】
図５Ａは、角膜の架橋に関する種々の異なるパラメータの影響を示す。種々のパラメータ−放射照度、連続波の対パルスの照明、パルスの光の照明のオン／オフデューティサイクル、リボフラビン濃度、及び、他のパラメータ−はすべて、生物力学的剛度に対して影響を有する。
【００６８】
ＤＭＤが、照明のために使用されてもよい。ＤＭＤによって、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年４月３日に出願の米国特許出願第１３／４３８,７０５号及び２０１１年３月１８日に出願の米国特許出願第１３／０５１６９９号に説明されるような、トポグラフィー誘導された架橋を実行することができる。トポグラフィーと関連したアルゴリズムは、いくらかの異なる空間的及び時間的な放射照度及び照射量プロファイルを使用して生成され得る。
【００６９】
これらの空間的及び時間的な照射量プロファイルは、連続波の照明を使用して生成されてもよいが、先に説明されたような種々の周波数及びデューティサイクル流量で照明源をパルスの化することによって、パルスの照明を介して変化してもよい。また、ＤＭＤは、連続波の照明を使用して最終的な可撓性をもたらすために、各画素毎のベースで、異なる周波数及びデューティサイクルを変調することが可能であり得る。第３の変形例では、パルスの照明、及び、変調したＤＭＤ周波数とデューティサイクルとの組み合わせの双方が、組み合わせられ得る。これは、特定の量の空間的に決定された角膜の架橋を可能にする。この空間的に決定された架橋は、リアルタイム変調される角膜の架橋のために、線量法、干渉法、光干渉断層法（ＯＣＴ）、角膜トポグラフィー等と組み合わされてもよい。追加的に、臨床前患者情報が、特定の処置前プランを生成するために、有限要素生物力学的コンピュータモデリングと組み合わされてもよい。
【００７０】
ＤＭＤの画素固有の変調能力、及び、続く変調した周波数、デューティサイクル、放射照度並びに角膜に送達される照射量に基づく剛度付与のため、複雑な生物力学的剛度パターンが、様々な量の屈折矯正を斟酌するために、角膜に付与され得る。これらの屈折矯正としては、近視、遠視、乱視、不正乱視、老視、及び、円錐角膜、ペルーシド角膜辺縁疾患、ＬＡＳＩＫ後拡張症などの眼疾患のための並びに角膜の生物力学的変質／変性などの他の疾患のための複雑な角膜の屈折面矯正、の組み合わせが挙げられ得る。
【００７１】
ＤＭＤシステム及び方法の固有の利点は、ランダム化された非同期のパルスのトポグラフィーパターニングを可能にし、先に説明されたような２Hzと８４とHzとの間のパルスの周波数に対する光過敏性てんかん発作又はフリッカーバーティゴの誘発の可能性を排除する非周期的でかつ均一に現れる照明を生成することである。
【００７２】
したがって、連続波の照明に代わるパルスの光の適用は、生物力学的剛度に対して影響を有する。これは、架橋を最適化する際に変更され得る更にもう１つのパラメータである。
【００７３】
Bucha効果と呼ばれるときもある、フリッカーバーティゴは、比較的明るい光の低周波数の点滅（又は発光）への暴露によって引き起こされる脳−細胞活動の平衡異常である。それは、ヒトの脳波の周波数にほぼ一致する、１Hz〜２０Hzのストロボ光発光の方向感覚喪失−、めまい−、及び、嘔気−誘導効果である。効果は、てんかん（特に光過敏性てんかん）によって引き起こされる発作に類似するが、てんかんの履歴のある人に制限されない。米国では、連邦機関によって提供されるウェブサイトには、リハビリテーション法の第５０８条が適用される。法は、２Hzと５５Hzとの間の周波数でスクリーンを点滅させることを回避するようにページが設計されなければならないと定める。第５０８条の規制は、現在修正されており、完了するときには、WCAG 2.0と同じ基準を使用すると予想される。（第５０８条サブパートＢ−技術基準、１１９４．２１ソフトウエアアプリケーション及びオペレーティングシステム−（ｋ）ソフトウエアは、２Hzと５５Hzとの間の発光又は明滅周波数を有する発光又は明滅するテキスト、オブジェクト、又は他の要素を使用してはならない）光過敏性発作は、光を発光若しくは点滅すること、又は幾何学形状若しくはパターンを速やかに変化させることのどちらかによって誘発される発作である。てんかんを有する多くの人が、発作を起こすまで、ある種類の光又は点滅するパターンに過敏性であることに気づいていない。てんかんを患う人の５％未満が、光過敏性である。これは、４，０００人のうち約１人が光過敏性を患っていることを意味し−米国人口のうちの１００，０００人未満に相当する。一人一人の感受性の特徴は、特有である。ある光過敏性の人が、所与の光ディスプレイに全く敏感ではない場合がある。しかし、光のあらゆる公衆ディスプレイが、光過敏性てんかん患者に一様に影響を及ぼすであろうことは明らかであり−したがって、高度な精励は、発作を誘発し得るディスプレイを排除する努力となる。１５〜２０Hzの範囲が最も懸念が大きいことが十分に立証されているが、一部の人は５Hzと同程度に遅い、一部の人は８４Hzと同程度に高い発光に敏感である。
【００７４】
図５Ｂは、様々な露光時間を有するパルスの光によって照射されたブタの角膜のサンプルの力対変位曲線、並びに連続波の照明によって照射されたサンプルの曲線、及び、対照サンプルの曲線を示す。パルスの光によって照射されたすべてのサンプルは、０．１％のリボフラビン濃度を有し、３秒のオフサイクル及び変更された露光（「オン」）サイクルで、３０mW/cm2のパルスの光によって照射された。４．５秒の露光サイクルを有したサンプル２は、サンプル３又は１よりも僅かに低い生物力学的剛度を有した。このように、露光サイクルの期間は、同じ放射照度及び暗期間で角膜の補強の量に影響を及ぼす。したがって、本開示の態様は、単位力当たりの変位の比に影響を及ぼす。これは、架橋を最適化する際に変更され得る更にもう１つのパラメータである。
【００７５】
図５Ｃは、変更された暗期間を有するパルスの光によって照明されたブタの角膜のサンプルの力対変位曲線、並びに連続的な照明によって照射されたサンプルの曲線、及び、対照サンプルの曲線を示す。３mW/cm2の連続波の照明によって照射された０．１％のリボフラビン濃度を有するサンプル１が、最も高い生物力学的剛度を有した。３秒オン／４．５秒オフ（サンプル２）及び３秒オン／３秒オフ（サンプル４）デューティサイクルで３０mW/cm2のパルスの光によって照射された０．１％のリボフラビン濃度を有するサンプルは、僅かに低い生物力学的剛度を有し、次いで、降順に、３秒オンサイクル並びに１．５（サンプル５）、０．７５（サンプル６）、及び、０．２５（サンプル７）秒オフ（暗期）サイクルで３０mW/cm2のパルスの光によって照射されたサンプルが続いた。３mW/cm2の連続波の照明によって照射された０．２５％のリボフラビン濃度を有するサンプル２が、サンプル１及び３〜７から離れて最も低い生物力学的剛度を有した。このように、暗期間は、同じ放射照度及び露光期間であっても角膜の補強の量に影響を及ぼす。これは、架橋を最適化する際に変更され得る更にもう１つのパラメータである。
【００７６】
図５Ａ〜５Ｃのグラフは、種々の異なるパラメータ−連続波の照明の代わりにパルスの照明を適用すること、種々のオン／オフデューティサイクル、放射照度、照射量、リボフラビン濃度、及び、浸漬時間−がすべて生物力学的剛度に対して影響を有することを示す。これらのパラメータは、角膜上又は角膜内の任意の場所に最適又は所望の量の角膜の剛性を達成するように、修正され得る。
【００７７】
補完的実験では、ブタの眼を、上皮除去し、２０分間０．１％のリボフラビン溶液に配置した。眼を溶液から除去し、生理学的ＩＯＰを適用した。フラップを、フェムト秒レーザを使用して切り、Ｏ２センサをフラップの下に配置した。ＵＶＡ照明を指示されたように投射し、リボフラビン液滴を、送達される照射量の間、９０秒毎に適用した。パルスの光線量を使用してフラップを架橋した後、フラップを除去し、先に説明されたように機械的に試験した。
【００７８】
Ｏ２センサからの結果（図２Ｂ）は、パルスの光照射下で、酸素が、パルスの光のデューティサイクルによって、周期的に僅かに増加することを示す。パルスの光サイクルの暗期の間に局所的に利用可能なＨ２Ｏ２は、先に説明されたように還元リボフラビンの再活性化及びDeuteroflavin（Ｒｆｏｘ）への変換を許容することが可能なシステム内に戻って、少量の酸素を実際に供給するように見える。表面からの単独の酸素の拡散は、これらの観察を説明するために、より多くの時間を要する。
【００７９】
実施例４−連続波の照明によって照射されたサンプル対パルスの光の照明によって照射されたサンプルの蛍光
別の補完的実験では、ブタの全眼球（SiouxPreme Packing Co.、アイオワ州、スーシティー；氷詰めされた食塩水に入れて出荷される）を室温（２５度）に温めた。次いで、角膜を、鈍い外科用メス刃によって上皮除去し、０．９％の食塩水の０．１のリボフラビン溶液を、培養器内で架橋の前に２０分間それぞれの角膜の頂部に適用した。全角膜を、３６５nm光源（UV LED NCSU033B[T]、Nichia Co.、日本、徳島）によって、決定された時間、連続波の照明又はパルスの照明３秒オン／３秒オフのどちかによる３０mW/cm2の選択された放射照度で、トップハットビームにより照射した（３％二乗平均平方根）。角膜フラップ（厚さ２００μm）を、Intralase femtosecond laser（Abbott Medical Optics、カリフォルニア州、サンタアナ）を用いて眼から切除した。角膜フラップの平均厚さを、超音波Pachymeter（DGH Technology、ペンシルベニア州、エクストン）により眼からの切除前後の測定値間の差として算定した。
【００８０】
洗浄水のリボフラビンが４５５nmにおける吸光度測定（Thermo Scientific Evolution 300/600 UV-Vis Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、ウォルサム）で検出不可能となるまで、フラップを蒸留水で洗浄した。次いで、重量変化が１０％未満になるまで、フラップを真空乾燥した（Rotary vane vacuum pump RV3 A652-01-903, BOC Edwards、英国、ウェスト・サセックス）。それぞれのフラップ（１mg）を、６５度で２時間、０．５mLのパパイン緩衝液［1x PBS（pH７．４）、２mMのＬ−システイン、及び、２mMのＥＤＴＡ］の２．５単位／mLのパパイン（Papaya latex, Sigma由来）で消化した。パパイン消化物を、２２００×Ｇで３０秒間遠心分離し（Mini centrifuge 05-090-100, Fisher Scientific）、１×ＰＢＳ溶液で３倍に希釈し、溶液の蛍光を、QM-40 Spectrofluorometer（hoton Technology Int.,ロンドン、カナダ、オンタリオ）でλｅｘ＝３６０nmの励起によって測定した。
【００８１】
組織の不存在下で蛍光を測定し、サンプルの蛍光からこの値を減算することによって、パパイン緩衝液の蛍光を考慮した。以下に確認される結果は、架橋の量と直接関連する確認された蛍光の量が、行われた同じフラップの生物力学的測定とほとんど同じ割合で、パルスの照明では連続波の照明に対して大きいことを確証する。
【００８２】
ここで図６を参照すると、蛍光対波長曲線のグラフが示される。４５５nmで、蛍光は、３秒オン／３秒オフサイクルで３０mW/cm2のパルスの光の照明によって照射されたサンプルに対して最も高かった−約２０，０００カウント／秒−。３０mW/cm2の連続的な照明で照射されたサンプルに対する蛍光は、約４０％小さく、すなわち約１２０００カウント／秒であった。これは、連続波の照明と対比してパルスの光の照明の適用が角膜における架橋に影響を及ぼすことを実証する更に別の例である。
【００８３】
実施例５−４５０nmにおける消化された角膜フラップの蛍光によって測定される架橋
屠畜場からのブタ眼（SiouxPreme、アイオワ州、スーシティー）を、食塩水中でリンスした。眼を洗浄し、上皮を除去した。眼を、スタンド上の、水に圧縮酸素をバブリングする管を有した、水である程度充填された大きなビーカの中央に配置した。眼に対する湿った酸素化環境を生成するように、実験の間特定の時間に、酸素をオンにした。頂部で溶液を保持するためにゴムリングを使用することによって、３７度に設定された培養器内で眼を０．１％のリボフラビン、ｄＨ２Ｏ溶液で２０分間浸漬した。全角膜を、３６５nm光源（UV LED NCSU033B[T]、Nichia Co.、日本、徳島）によって、決定された時間、放射照度（３０秒毎に１滴の溶液を添加させて３０mW/cm2で３分間ＣＷ、又は１分毎に１滴の溶液を添加させて３mW/cm2で３０分間ＣＷ、又は１分毎に１滴の溶液を添加させて３０mW/cm2でシャッタシステム（Lambda SC Smart Shutter, Sutter Instrument、カリフォルニア州ノヴァト）を使用して−１．５秒オン／３秒オフ−パルスの光に対して９分間）で、トップハットビームにより照射した（３％二乗平均平方根）。放射照度を角膜の表面で電力センサ（model PD-300-UV; Ophir, Inc.,、イスラエル、エルサレム）により測定した。
【００８４】
角膜フラップ（厚さ約３８０μm）を、Intralase femtosecond laser（Abbott Medical Optics、カリフォルニア州、サンタアナ）を用いて眼から切除した。角膜フラップの平均厚さを、超音波Pachymeter（DGH Technology、ペンシルベニア州、エクストン）により眼からの切除前後の測定値間の差として算定した。フラップを、蒸留水で１５回洗浄し、次いで、重量変化が１０％未満になるまで、真空乾燥した（Rotary vane vacuum pump RV3 A652-01-903, BOC Edwards、英国、ウェスト・サセックス）。それぞれのフラップ（２mg）を、６５度で２．５時間、１mLのパパイン緩衝液［1x PBS（pH７．４）、２mMのＬ−システイン、及び、２mMのＥＤＴＡ］の２．５単位／mLのパパイン（Papaya latex, Sigma由来）で消化した。パパイン消化物を、２２００×Ｇで２０秒間遠心分離し（Mini centrifuge 05-090-100, Fisher Scientific）、１×ＰＢＳ溶液で０．５倍に希釈し（換言すれば０．５mLのＰＢＳを１mLの溶液に添加し）、溶液の蛍光を、QM-40 Spectrofluorometer（hoton Technology Int.,ロンドン、カナダ、オンタリオ）でλｅｘ＝３６０nmの励起によって測定した。組織の不存在下で蛍光を測定し、サンプルの蛍光からこの値を減算することによって、パパイン緩衝液の蛍光を考慮した。
【００８５】
図７Ａは、４５０nmにおける消化された角膜フラップの蛍光によって測定される架橋の量のグラフである。眼を、上皮除去し、０．１％のリボフラビンで２０分間浸漬し、通常の大気環境又は湿った酸素化環境に置き、３０mW/cm2又は３mW/cm2のＵＶ光で、３０秒毎に１滴の溶液で３分間ＣＷによって、又は１分毎に１滴の溶液で３０分間ＣＷによって、又は１分毎に１滴の溶液で９分間パルスの光（１．５秒オン／３秒オフ）によって照射した。下記の表２に示される以下の処置を、図７Ａに示されるサンプルのそれぞれに適用した：
【００８６】
【表１】
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【００８７】
図７Ａに示されるように、パルスのＵＶ光を伴う湿った酸素化環境は、角膜内で行われる架橋の量を大幅に増加させる。リボフラビンと紫外（ＵＶ）光との組み合わせの適用は、角膜の表面を滅菌する。リボフラビンは、ＵＶ光の吸収を増加させる光増感剤として機能する。結果として生じるＵＶ光の吸収は、ＤＮＡ及びＲＮＡ損傷を誘発することができ、結果として、ウイルス、細菌、及び、他の病原体をその場で死滅させるために効果的である。
【００８８】
湿った酸素環境及びパルスのＵＶ光は、別々に与えられるときに架橋の量をある程度増加させ、同時に与えられるときに架橋の量を非常に大きく増加させる。増加した架橋は、数多く増加したラジカルの生成を伴う。ラジカルは、眼に存在する有害菌を排除するのに役立つ。したがって、湿った酸素化環境及びパルスのＵＶ光は、角膜内のウイルス、細菌、及び、他の病原体のより効率的な排除をもたらし、組織における任意の損傷又は他の望ましくない影響を最小化しながら無菌環境を生成する。これは、連続波の照明と対比してパルスの光の照明の適用が角膜における架橋の量に影響を及ぼすことを実証する更に別の例である。
【００８９】
図７Ｂは、酸素を伴う照射のパルスの光によって照明されたブタの角膜のサンプルの力対変位曲線、並びに連続的な照明によって照射されたサンプルの曲線、及び、対照サンプルの曲線を示す。酸素及び３秒オン／３秒オフデューティサイクルを伴う３０mW/cm2のパルスの光の照明によって照射されたサンプル３が最も高い生物力学的剛度を有し、次いで、酸素及び同じオン／オフデューティサイクルを伴う４５mW/cm2のパルスの光の照明によって照射されたサンプル４が続いた。３mW/cm2及び３０mW/cm2の連続波の照明によって照射されたサンプルがより低い生物力学的剛度を有し、次いで、対照サンプルが続いた。したがって、酸素の添加は、同じオン／オフデューティサイクルであっても、角膜の補強の量に影響を及ぼす。これは、架橋を最適化する際に変更され得る更にもう１つのパラメータである。
【００９０】
酸素は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／９０９,２２８号に詳述されるような、多数の異なる方法で架橋処置の間に適用されてもよいと考えられる。例えば、図８Ａを参照すると、角膜熱形成術又はＬＡＳＩＫ手術などの、処置が、角膜の構造変化を生じさせ所望の形状変化を作り出すために、ステップ２１０で適用される。ステップ２２０では、角膜組織が、架橋剤２２２によって処置される。架橋剤は、処置組織上に及び／又は処置組織の周囲の各エリアに直接適用され得る。いくつかの実施形態では、架橋剤は、点眼瓶、シリンジなどによって広く送達される眼科溶液であり得る。代替的に、架橋剤は、適切な軟膏アプリケータによって眼軟膏として選択的に適用されてもよい。次いで、架橋剤２２２が、ステップ２３０で開始要素２３２によって活性化される。架橋剤２２２の活性化は、例えば、対応するエネルギー又は光源からのマイクロ波又は光の適用によって熱的に誘発され得る。コラーゲン原線維間の結果として生じる架橋は、角膜構造の変化に抵抗を提供する。
【００９１】
図８Ｂが更に示すように、リボフラビンが、ステップ２２０で架橋剤２２２’として角膜組織に適用される。更に、ＵＶ光源からの光が、リボフラビンで処置された角膜の各エリアの架橋を開始するために、ステップ２３０で開始要素２３２’として適用され得る。具体的には、適用されたリボフラビンが角膜組織に反応性酸素ラジカルを放出するようにさせることで、ＵＶ光が架橋反応を開始する。先に説明されたように、リボフラビンは、角膜組織内で架橋を生じさせる一重項酸素にＯ２を変換するための増感剤としての機能を果たす。
【００９２】
人体組織では、Ｏ２含量が外気と比較して非常に低い。しかしながら、角膜における架橋の速度は、角膜が光活性化光によって照射されるときのＯ２の濃度に関連する。したがって、所望の量の架橋が達成されるまで架橋の速度を制御するために、照射の間能動的にＯ２の濃度を増加又は減少させることが有利であり得る。
【００９３】
本発明の態様によるアプローチは、Ｏ２でリボフラビンを過飽和にすることを伴う。したがって、リボフラビンが眼に適用されるときに、より高い濃度のＯ２が、リボフラビンと共に角膜に直接送達され、リボフラビンが光活性化光に暴露されるときの一重項酸素へのＯ２の変換に影響を及ぼす。図９Ａに示されるように、リボフラビン２２２’は、密閉型容器、例えばバイアル３００の、増加したＯ２圧３０５の下に保存され得る。増加したＯ２圧３０５は、リボフラビン２２２”におけるＯ２の高い平衡濃度をもたらす。容器３００の壁３１０は、好ましくは、リボフラビン２２２’の分解を最小化するために、不透明であるか、又は別途、可視、ＵＶ、若しくは他の光が容器内部３０１に入ることを防止する。したがって、図９Ｂを参照すると、過飽和リボフラビン２２２’がステップ２２０で適用されるように、ステップ２１５は、リボフラビン２２２’をＯ２で過飽和にする。
【００９４】
本発明の他の態様によれば、リボフラビン２２２’をＯ２で過飽和にするのではなく、ゲル（例えばメチルセルロースゲル）などの別の物質が、Ｏ２によって飽和又は過飽和され得る。図１０Ａに示されるように、ゲル４２１は、密閉型容器、例えばバイアル４００の、内部４０１で増加したＯ２圧４０５の下に保存され得る。増加したＯ２圧４０５は、ゲル４２１におけるＯ２の高い平衡濃度をもたらす。次いで、ゲルは、Ｏ２のキャリアとしての機能を果たすことができる。
【００９５】
図１０Ｂを参照すると、ステップ２１６はゲル４２１をＯ２で飽和し、ステップ２１７は過飽和ゲル４２１をリボフラビン２２２’と混合し、その結果、リボフラビン２２２’及び過飽和ゲル４２１を含有する混合物４２２がステップ２２０で適用される。代替的に、図１０Ｃを参照すると、ステップ２１６はゲル４２１をＯ２で飽和し、ステップ２２５は、リボフラビン２２２’が角膜に適用された後に、ゲル４２１を角膜に適用する。図１０Ａ及び図１０Ｂの双方で、リボフラビン２２２’がＵＶ光によって活性化されるときに、ゲル４２１はＯ２の存在を増加させる。
【００９６】
本発明の追加的な態様によれば、選択された量のＯ２に角膜を暴露しＯ２を角膜に入らせるために、定常状態のＯ２が角膜の表面で維持され得る。次いで、光活性化光が、所望のＯ２含量を有する角膜に適用され得る。
【００９７】
図１１Ａに示されるように、リング５００が、照射の間、角膜２にＯ２を供給するために、眼１上に配置される。リング５００は、リボフラビンによって処置された角膜２に、Ｏ２の定常流を向ける１つ以上のポート５０２を含む。流れは、角膜２に対して高圧でＯ２を適用し、結果として、より多くのＯ２が、角膜組織におけるリボフラビンの照射の間に利用可能となる。リング５００は任意に、吸引によって適所に保持されてもよい。
【００９８】
図１１Ｂが示すように、別の実施形態では、ポート５１２を介したＯ２の供給を受けるエンクロージャ５１０が、Ｏ２の定常状態を確立するために、眼上に配置される。エンクロージャ５１０は、吸引リング５１２によって適所に保持され得る。図１１Ｂに示されるように、エンクロージャ５１０は、カップ状の構造であり得る。エンクロージャ５１０は、角膜２の表面に対してＯ２をより高い圧力で、例えば周辺より高い圧力で、維持する。エンクロージャ５１０内の、角膜２の表面より上のＯ２の濃度は、１００％に近づくことが可能である。エンクロージャ５１０内のＯ２は、より多くのＯ２を、角膜組織におけるリボフラビンの照射で利用可能にする。角膜２を照射して角膜２に適用されたリボフラビンを活性化させるために光活性化光がエンクロージャ５１０を通過することができるように、エンクロージャ５１０の壁５１４の少なくとも一部分は半透明であり得る。代替的に、光源が、エンクロージャ内に設けられてもよい。エンクロージャ５１０はまた、気体を放出させる弁を含んでもよい。
【００９９】
したがって、図１１Ｃを参照すると、リボフラビン２２２’による架橋を開始するために光活性化光２３２’がステップ２３０で適用される前に、ステップ２２７は、角膜の表面より上にＯ２の定常状態を確立する。
【０１００】
図１２を参照すると、架橋の速度が、リアルタイムでモニターされ得、Ｏ２の濃度が、所望の量の架橋を達成するために動的に増加又は減少させられ得る。図１２が示すように、角膜組織は、ステップ２２０でリボフラビン２２２’によって処置される。ステップ２２８で、第１の量のＯ２が、角膜組織にＯ２を導入して照射の間角膜において第１の濃度のＯ２を確立するために、角膜の表面より上に提供される。図１１Ａ及び図１１Ｂに関連して説明される装置が、角膜の表面より上に提供されるＯ２の量を変化させるために利用されてもよい。次いで、リボフラビン２２２’が、ＵＶ光２３２’によって、ステップ２３０で活性化される。
【０１０１】
ステップ２４０で、リボフラビン２２２’の活性化から生じる架橋の量がモニターされる。架橋をモニターする一手法は、角膜複屈折を測定し、角膜組織の構造を決定するために偏光分析法を利用する。特に、手法は、角膜組織に偏光を適用することによって、角膜構造上の架橋の効果を測定する。角膜支質は異方性で、その屈折率は方向に左右される。角膜は、角膜の表面に直交する速軸及び角膜の表面に接する遅軸（又は角膜偏光軸）を有した、曲線状の二軸結晶のように挙動する。したがって、眼球光学系を二重に通過した後、生体の眼から出る光線は、眼球構造（光学的に不活性な体液を除く）の偏光特性に関する情報を含む。架橋から生じる構造変化をモニターするために複屈折を使用する手法は、２０１０年１０月１日に出願の米国特許仮出願第６１／３８８,９６３号に更に説明され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。従来のコンピュータハードウェア又は類似の処理ハードウェアを利用した、制御装置が、架橋の量をモニターするために使用され得る。このようなハードウェアは、従来のコンピュータディスクなどのコンピュータ可読媒体に保存又は固定されるプログラムされた指示を読み取り、実行することによって作動することができる。モニターのハードウェアに結合されることに加えて、制御装置は、角膜の表面より上にＯ２を提供する装置（単数又は複数）に結合されてもよく、装置（単数又は複数）を自動で制御してもよい。
【０１０２】
ステップ２４０におけるリアルタイムモニターによる情報に基づき、ステップ２５０は、角膜組織に別の量のＯ２を導入しステップ２６０におけるＵＶ光２３２’による照射の間第２の濃度のＯ２に角膜を暴露するために、眼より上に第２の量のＯ２を提供する。ステップ２４０、２５０、及び、２６０は、架橋の速度を動的に制御するために照射の間Ｏ２の濃度を変化させるように何回か繰り返され得る。
【０１０３】
ステップ２２８における第１の量のＯ２はステップ２５０における第２の量のＯ２より多くてもよく、又はその逆であってもよい。第１の濃度から第２の濃度へ角膜の暴露を変化させることが、角膜組織における架橋の速度を所望の通りに変化させる。ステップ２４０からの情報が第１の量のＯ２が低すぎることを示す場合には、ステップ２５０は、第１の量のＯ２よりも多い第２の量のＯ２を提供する。逆に、ステップ２４０からの情報が第１の量のＯ２が高すぎることを示す場合には、ステップ２５０は、第１の量のＯ２よりも多い第２の量のＯ２を提供する。ステップ２５０で第２の量のＯ２を提供する前に、例えばエンクロージャ５１０から、第１の量のＯ２を除去することが必要であり得る。
【０１０４】
いくつかの場合には、ステップ２６０における照射の間角膜組織のＯ２の量を最小化又は低減させるために、ステップ２５０において実質的にゼロのＯ２を提供することが望ましい。したがって、ステップ２５０は、角膜の表面より上に非Ｏ２要素又は物質を導入することができる。例えば、窒素ガス（Ｎ２）は、図１１Ａ及び図１１Ｂに示される装置５００及び５１０によって供給されたＯ２を置き換えることができる。
【０１０５】
先に説明された実施形態は架橋剤としてリボフラビンを利用するが、他の物質が架橋剤として利用されてもよいことが理解される。光活性化光３３２’としては、例えば、ＵＶ光又は緑色光が挙げられ得る。
【０１０６】
本明細書において説明される架橋処置の態様は、角膜組織の追加的な安定化を必要とし得る任意の眼治療と組み合わせて適用され得る。いくつかの実施形態では、架橋処置は、乱視矯正角膜切開眼手術（ＡＫ）と組み合わされ得る。ＡＫは乱視を矯正する外科的処置であり、この処置では、丸みを帯びた形状に角膜を弛緩させるために、異形の角膜の最も急勾配の部分で切開が施される。ＡＫは、多くの場合白内障手術と組み合わせて利用される。ＡＫによって生じる形状変化は、架橋処置によって安定化され得る。同様に、架橋処置は、放射状角膜切開（ＲＫ）と組み合わされ得る。放射状角膜切開は近視を矯正する外科的処置であり、この処置では、矯正的な形状変化を引き起こすために、角膜に放射状の切開が施される。矯正的な形状変化の安定化に加えて、架橋剤を適用する効果はまた、ＡＫ又はＲＫの間、より小さな切開を使用可能にする。
【０１０７】
本開示の態様は、眼に架橋剤を適用するパラメータ、及び、架橋剤を活性化させるパラメータをモニター及び最適化することに関する。多種多様な要因が、架橋反応の速度、及び架橋により達成される生物力学的剛度の量に影響を及ぼす。これらの要因としては、リボフラビン濃度、角膜上の条件、温度、酸化剤の存在、リボフラビンを活性化させるために適用される照明の形式、放射照度、照射量、適用される照明のオン／オフデューティサイクル、並びに他の要因が挙げられる。これらの要因の多数は互いに関連し、換言すれば、一方の要因を変化させることが、もう一方の要因に対する想定外の影響を有することがあり得る。
【０１０８】
本開示の態様は、架橋の速度及び量へのこれらのパラメータのそれぞれの影響を判定すること、並びに所望の量、速度、及び、角膜の補強の位置を達成するための条件を最適化するために、これらのパラメータ間の相互関係を判定することに関する。本開示の態様は、１つ又は複数のパラメータの変化に対する角膜反応をモニターすること、及び、受け取ったフィードバックに基づいて１つ又は複数のパラメータを調整することに関する。
【０１０９】
先に説明された実施形態は階段状のオン／オフパルスの光の関数を利用することができるが、角膜に光を適用する他の関数が類似の効果を達成するために利用されてもよいことが理解される。例えば、光は、正弦関数、鋸歯状関数、若しくは他の複雑な関数若しくは曲線、又は関数若しくは曲線の任意の組み合わせによって、角膜に適用され得る。実際、オン／オフ値間に、より緩やかな移行がある場合には、関数は「実質的に」階段的であり得ると理解される。更に、放射照度は、オフサイクルの間ゼロの値まで減少する必要はなく、オフサイクルの間ゼロより大きくてもよいと理解される。本開示の効果は、２つ以上の値の間で放射照度を変化させる曲線によって角膜に光を適用することにより達成され得る。
【０１１０】
本開示が多数の例示的な実施形態及び実施態様と関連して説明されたが、本開示は、その通りに限定されず、むしろ様々な修正物及び等価的な構成を網羅する。更に、本発明の態様は別々の実施形態で説明されるが、本明細書において説明される２つ以上の実施形態による特徴が単一の実施形態に組み合わされてもよいと考えられる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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