(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（６）または（７）から選択される化合物であるクエンチャー：
【化１】
0006297035.tif 000050
前記化学式で、
構造
【化２】
0006297035.tif 000051
は、
【化３】
0006297035.tif 000052
であり、そして
構造
【化４】
0006297035.tif 000053
は
【化５】
0006297035.tif 000054
である。
【請求項２】
前記クエンチャーは、下記化学式（８）乃至（１１）から選択される化合物である請求項１に記載のクエンチャー：
【化６】
0006297035.tif 000055
【請求項３】
前記Ｌ１またはＬ２とリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって連結される支持体（ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を追加で含み、前記リンカーのヒドロキシ基がＤＭＴ（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｇｒｏｕｐ）またはその類似体で保護されることを特徴とする請求項１に記載のクエンチャー。
【請求項４】
前記クエンチャーは、下記化学式（１３）乃至（１７）で表される化合物から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項３に記載のクエンチャー：
【化７】
0006297035.tif 000056
0006297035.tif 000057
前記化学式（１３）乃至（１７）で、Ｙは支持体である。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のクエンチャーが結合しているオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のクエンチャーを含むプローブ。
【請求項７】
請求項５に記載のオリゴヌクレオチドを含む核酸検出用組成物。
【請求項８】
前記プローブは、レポーターとして蛍光物質を含むことを特徴とする請求項６に記載のプローブ。
【請求項９】
前記蛍光物質は、クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）等の蛍光物質系または蛍光物質系の誘導体で構成される群から一つ以上選択されることを特徴とする請求項８に記載のプローブ。
【請求項１０】
下記化学式（６）または（７）で表されるアゾ化合物：
【化８】
0006297035.tif 000058
前記化学式で、
構造
【化９】
0006297035.tif 000059
は、
【化１０】
0006297035.tif 000060
であり、そして
構造
【化１１】
0006297035.tif 000061
は
【化１２】
0006297035.tif 000062
である。
【請求項１１】
下記化学式（６ａ）の化合物と下記化学式（６ｂ）の化合物をアゾカップリング反応を行って化学式（６ｃ）の化合物を得る工程と、
前記化学式（６ｃ）の化合物を得る工程後に、下記化学式（６ｃ）の化合物と下記化学式（６ｄ）の化合物をアゾカップリング反応を行って下記化学式（６）の化合物を得る工程と、
を含む化学式（６）で表されるアゾ化合物の製造方法：
【化１３】
0006297035.tif 000063
前記化学式で、
構造
【化１４】
0006297035.tif 000064
は、
【化１５】
0006297035.tif 000065
であり、そして
構造
【化１６】
0006297035.tif 000066
は
【化１７】
0006297035.tif 000067
である。
【請求項１２】
下記化学式（６ａ）の化合物と下記化学式（６ｂ）の化合物をアゾカップリング反応を行って化学式（６ｃ）の化合物を得る工程と、
化学式（６ｃ）の化合物と下記化学式（７ａ）の化合物をアゾカップリング反応を行って化学式（７）の化合物を得る工程と、
を含む下記化学式（７）で表されるアゾ化合物の製造方法：
【化１８】
0006297035.tif 000068
前記化学式で、
構造
【化１９】
0006297035.tif 000069
は、
【化２０】
0006297035.tif 000070
であり、そして
構造
【化２１】
0006297035.tif 000071
は
【化２２】
0006297035.tif 000072
である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しいアゾ化合物、前記アゾ化合物を含む新規クエンチャー、前記クエンチャーの利用及び前記アゾ化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に関する消光現象とは、光によって励起したエネルギー準位状態になったレポーターであるエネルギー供与体が近接した距離にあるクエンチャーであるエネルギー受け入れ体にエネルギーが転移する現象である（Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，１９９９、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。この時、エネルギー移転効率は、レポーターとクエンチャーとの間の距離と深い関連があって、移転効率は、レポーターとクエンチャーとの間の距離の６乗に反比例する。このため、この二つの間の距離が一定以上離れると、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）消光現象は起きない。
【０００３】
蛍光共鳴エネルギー転移消光現象の一例として、タムラ（ＴＡＭＲＡ）蛍光物質をエネルギー受け入れ体、即ち、クエンチャーとして用いるならば、エネルギー供与体での発光エネルギーはエネルギー受け入れ体の吸光領域内で吸収される。吸収されたエネルギーは、励起したエネルギー準位状態になって、エネルギー受け入れ体の発光領域内で発光する。
【０００４】
このような消光現象は、アゾ化合物からなるクエンチャーである場合でも、エネルギー移転過程は同じである。しかし、エネルギー受け入れ体であるクエンチャーでの発光現象は起きない。この移転過程でのアゾ化合物といったクエンチャーは、熱や他の作用で発光の代わりにエネルギーを放出するとの点が前記物質と異なる。このようなアゾ化合物のようなクエンチャーをダーククエンチャー（Ｄａｒｋ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）と呼ぶ。ダーククエンチャーは、エネルギー移転時、光でない熱でエネルギーを放出するので、蛍光を持たない染料である。蛍光を出すクエンチャーは、分析時クエンチャーとレポーターの蛍光スペクトルが重なるため、背景ノイズを増加させることができる。しかし、ダーククエンチャーは、蛍光スペクトルがなくノイズがないので、このような短所に対する解決策を提供することができる。また、ダーククエンチャーは、２つ以上のレポーター−クエンチャーのプローブを共に使用できるメリットを提供する。
【０００５】
ダーククエンチャーの構造を持つ代表的な化合物として、ＢＨＱクエンチャー誘導体であるＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＢＨＱ３が代表的である（ＷＯ２００１／０８６００１Ａ１）。これらのクエンチャーは、電子供与体であるジアルキるアニリンと電子受容体の性質を持っているアロマチック物質とのジアゾ結合からなり、略５００〜７００ｎｍの波長領域で蛍光を吸収する。しかし塩の構造を持っているクエンチャーの場合、オリゴ合成と精製過程時不安定な様子を見せるが、ＢＨＱ３が一例である。
【０００６】
その他に、ＢＢＱクエンチャー（ＷＯ２００６／０８４０６７Ａ２）とキノン系のクエンチャーであるヨウ化ブラッククエンチャー（ＵＳ７５０４４９５Ｂ２）が挙げられる。しかし、これらのクエンチャーは、前記ＢＨＱクエンチャーより波長吸収能力が落ちる。
【０００７】
一方、クエンチャーは、蛍光物質と連結して化学または生物学分野で主に用いられる。所望の分子、タンパク質、核酸を検出するために、それと相補的に結合できる分子とクエンチャー、そして蛍光物質を連結して蛍光の発光程度を測定して、目的とする物質が存在するかを判断することができる。これは、化学及び生物学領域に進歩的な発達に大きい役割をしている。生物学領域で蛍光共鳴エネルギー転移理論を最もよく応用した分野はリアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎｅ  Ｒａｃｔｉｏｎ、ＲＴ−ＰＣＲ）でのプローブの使用で。プローブとは、塩基配列などの特定部位を検出するのに用いるものであり、最近ではリアルタイム重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で多く用いられている。
【０００８】
プローブの種類は、タックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブとモレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）プローブなどがある。タックマンプローブは、一方の端にはレポーター（エネルギー供与体）を付けて、反対側の端にはクエンチャーを付けたプローブである。重合酵素連鎖反応の進行時、レポーターがクエンチャーの影響から離れてレポーター固有の蛍光を出す。蛍光量は、重合酵素連鎖反応が進行されるほど比例的に増加する。この蛍光量を定量化して、間接的な測定手段として利用する。モレキュラービーコンプローブは、ヘアピン状で、ステムとループで構成されている。重合酵素連鎖反応進行により特定部位に分子ビーコンコンプが付くと、構造が解けると共にクエンチャーの影響圏から離れて蛍光を発散する。
【０００９】
クエンチャーは、蛍光共鳴エネルギー転移理論の消光現象に基づいて、プローブ中でレポーターとのエネルギー移転を説明することができる。従って、プローブでレポーターとクエンチャーとの関係は、プローブの性能に重要な役割を果たす。クエンチャーが、プローブに共に連結されたレポーターの様々な波長領域を吸収するならば、使用できる蛍光物質の限界がなくなって、より検針が容易でかつ、優れたプローブを製作することができる。即ち、クエンチャーが波長を吸収する範囲が広くなると、クエンチャーを様々な蛍光染料と連結してプローブを作ることができるようになる。
【００１０】
そこで、本発明者等は、より効率の良いクエンチャーを開発するために、鋭意努力した結果、新しいアゾ化合物を持つクエンチャーが、クエンチャーとして優秀な性質を持つことを確認して本発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、新しいアゾ化合物及び前記アゾ化合物を含む新規クエンチャーを提供することにある。
本発明の他の目的は、前記クエンチャーを含むオリゴヌクレオチドを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、新規アゾ化合物及び前記アゾ化合物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、下記化学式（１）で表される化合物を含むクエンチャーを提供する:
【化１】
0006297035.tif 000002
前記化学式（１）で、
Ａ１は、下記化学式（２）または化学式（３）の構造を持って、
Ａ２は、置換されたまたは非置換されたＣ６−Ｃ１２のアリーレン基、または置換されたまたは非置換されたＣ４−Ｃ１２のヘテロアリーレン基であり、
Ａ３は、置換されたまたは非置換されたＣ６−Ｃ３０のアリル基、または置換されたまたは非置換されたＣ３−Ｃ３０のヘテロアリル基であり、
【化２】
0006297035.tif 000003
前記化学式（２）で、
Ｚ１乃至Ｚ４は、互いに独立してＣＲ１または窒素であり、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基またはスルホニル基であり、
Ｘ１は、ＣＨ２、ＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｘ２はＣＨまたは窒素であり、
【化３】
0006297035.tif 000004
前記化学式（３）で、
Ｚ５乃至Ｚ９は、互いに独立してＣＲ２または窒素であり、
Ｒ２は、水素、ヒドロキシ基、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ１０のカルボキシ基またはハロゲンであり、
Ｒ９及びＲ１０は、互いに独立して水素またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【００１３】
前記化学式（１）でＡ２は、下記化学式（４）の構造を持つことが好ましい:
【化４】
0006297035.tif 000005
前記  化学式（４）で、
Ｚ１０乃至Ｚ１３は、互いに独立してＣＲ３または窒素であり、
Ｒ３は、水素、ヒドロキシ基、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ＮＲ１１Ｒ１２、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ１０のカルボキシ基、Ｃ６−Ｃ３０のアリールオキシ基、またはハロゲンであり、
Ｒ１１及びＲ１２は、互いに独立して水素またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【００１４】
また前記化学式（１）で、Ａ３は、下記化学式（５）の構造を持つことが好ましい:
【化５】
0006297035.tif 000006
前記化学式（５）で、
Ｚ１４乃至Ｚ１７は、互いに独立してＣＲ４または窒素であり、
Ｒ４は、水素、ヒドロキシ基、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ１０のカルボキシ基、またはハロゲンであり、
Ｒ１３及びＲ１４は、互いに独立して水素またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｚ１８は、ＣＨまたは窒素であり、
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基、ヒドロキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボキシル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボニルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基またはＣ３−Ｃ３０のヘテロアリールである。
【００１５】
本発明の他の目的のために、本発明は、前記クエンチャーを含むオリゴヌクレオチドを提供する。
それと共に、本発明のさらに他の目的のために、本発明は、新規アゾ化合物及びアニリンで１回目のアゾカップリング反応と２回目カップリング反応を順次行う工程を含む前記アゾ化合物の製造方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
下記化学式（１）で表される化合物を含むクエンチャー:
【化２８】
0006297035.tif 000007
前記化学式（１）で、
Ａ１は、下記化学式（２）または化学式（３）の構造を持って、
Ａ２は、置換されたまたは非置換されたＣ６−Ｃ１２のアリーレン基、または置換されたまたは非置換されたＣ４−Ｃ１２のヘテロアリーレン基であり、
Ａ３は、置換されたまたは非置換されたＣ６−Ｃ３０のアリル基、または置換されたまたは非置換されたＣ３−Ｃ３０のヘテロアリル基であり、
【化２９】
0006297035.tif 000008
前記化学式（２）で、
Ｚ１乃至Ｚ４は、互いに独立してＣＲ１または窒素であり、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基またはスルホニル基であり、
Ｘ１は、ＣＨ２、ＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｘ２はＣＨまたは窒素であり、
【化３０】
0006297035.tif 000009
前記化学式（３）で、
Ｚ５乃至Ｚ９は、互いに独立してＣＲ２または窒素であり、
Ｒ２は、水素、ヒドロキシ基、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ１０のカルボキシ基またはハロゲンであり、
Ｒ９及びＲ１０は、互いに独立して水素またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
（項目２）
前記化学式（１）でＡ２は、下記化学式（４）の構造を持つことを特徴とする項目１に記載の化合物を含むクエンチャー:
【化３１】
0006297035.tif 000010
前記化学式（４）で、
Ｚ１０乃至Ｚ１３は、互いに独立してＣＲ３または窒素であり、
Ｒ３は、水素、ヒドロキシ基、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ＮＲ１１Ｒ１２、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ１０のカルボキシ基、Ｃ６−Ｃ３０のアリールオキシ基、またはハロゲンであり、
Ｒ１１及びＲ１２は、互いに独立して水素またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
（項目３）
前記Ａ３は、下記化学式（５）の構造を持つ化合物を含む項目１または項目２に記載のクエンチャー:
【化３２】
0006297035.tif 000011
前記化学式（５）で、
Ｚ１４乃至Ｚ１７は、互いに独立してＣＲ４または窒素であり、
Ｒ４は、水素、ヒドロキシ基、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ１０のカルボキシ基、またはハロゲンであり、
Ｒ１３及びＲ１４は、互いに独立して水素またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｚ１８は、ＣＨまたは窒素であり、
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基、ヒドロキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボキシル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボニルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基またはＣ３−Ｃ３０のヘテロアリールである。
（項目４）
前記クエンチャーは、下記化学式（６）または（７）から選択される化合物を含む項目３に記載のクエンチャー：
【化３３】
0006297035.tif 000012
前記化学式で、
Ｚ１８は、ＣＨ、または窒素であり、
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して水素、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基、ヒドロキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリル基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボキシル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボニルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基またはＣ３−Ｃ３０のヘテロアリールであり、
Ｒ１５乃至Ｒ１８は、互いに独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
（項目５）
前記クエンチャーは、下記化学式（８）乃至（１２）から選択される化合物を含む項目３に記載のクエンチャー：
【化３４】
0006297035.tif 000013
（項目６）
前記Ｌ１またはＬ２とリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって連結される支持体（ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を追加で含み、ＤＭＴ（４，４‘−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｇｒｏｕｐ）またはその類似体で保護されるヒドロキシ基をさらに含むことを特徴とする項目３に記載のクエンチャー。
（項目７）
前記クエンチャーは、下記化学式（１３）乃至（１７）で表される化合物から選択されるいずれか一つを含むことを特徴とする項目６に記載のクエンチャー:
【化３５】
0006297035.tif 000014
前記化学式（１３）乃至（１５）で、Ｙは支持体である。
（項目８）
項目１から７のいずれかにクエンチャーを含むオリゴヌクレオチド。
（項目９）
前記オリゴヌクレオチドは、プローブを含むことを特徴とする項目８に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１０）
項目８に記載のオリゴヌクレオチドを含む核酸検出用組成物。
（項目１１）
前記プローブは、レポーターとである蛍光物質を含むことを特徴とする項目９に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１２）
前記蛍光物質は、クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）等の蛍光物質系または蛍光物質系の誘導体で構成される群から一つ以上選択されることを特徴とする項目１１に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１３）
下記化学式（６）または（７）で表される新規アゾ化合物:
【化３６】
0006297035.tif 000015
前記化学式で、      
Ｚ１８は、ＣＨ、または窒素であり、
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して水素、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基、ヒドロキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリル基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボキシル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボニルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基またはＣ３−Ｃ３０のヘテロアリールであり、
Ｒ１５乃至Ｒ１８は、互いに独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
（項目１４）
下記化学式（６ａ）のアニリンと下記化学式（６ｂ）の化合物をアゾカップリング反応を行って化学式（６ｃ）の化合物を得る工程と、
前記化学式（６ｃ）の化合物を得る工程後に、下記化学式（６ｃ）の化合物と下記化学式（６ｄ）の化合物をアゾカップリング反応を行って下記化学式（６）の化合物を得る工程と、を含む項目１３に記載の化学式（６）で表されるアゾ化合物の製造方法：
【化３７】
0006297035.tif 000016
前記化学式で、      
Ｚ１８は、ＣＨ、または窒素であり、
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して水素、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基、ヒドロキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリル基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボキシル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボニルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基またはＣ３−Ｃ３０のヘテロアリールであり、
Ｒ１５乃至Ｒ１８は、互いに独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
（項目１５）
前記化学式（６ｃ）の化合物を得る工程と、
化学式（６ｃ）の化合物と下記化学式（７ａ）の化合物をアゾカップリング反応を行って化学式（７）の化合物を得る工程と、含む項目１１に記載の下記化学式（７）で表される項目１２に記載のアゾ化合物の製造方法:
【化３８】
0006297035.tif 000017
前記化学式で、      
Ｚ１８は、ＣＨ、または窒素であり、
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して水素、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基、ヒドロキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリル基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボキシル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボニルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基またはＣ３−Ｃ３０のヘテロアリールであり、
Ｒ１５乃至Ｒ１８は、互いに独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の新しいアゾ化合物で構成されたクエンチャーは、強くて広い吸収領域を持っており、既存のクエンチャーに比べてより広い蛍光波長で消光作用をする。従って、本発明のクエンチャーは、エネルギー供与体としてより多様な蛍光染料（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）の使用を可能にする。また、本発明に係るクエンチャーは、オリゴマーと合成及び精製過程で安定性を持つ。生物学的、化学的分野で多様に活用されることができる。
また、本発明に係るアゾ化合物の製造方法は、従来複素環構造を三つ以上含むアゾ化合物は、合成し難い限界を乗り越えて、容易に合成できない複素環構造が三つ以上含まれるアゾ化合物を容易に合成することができるようにする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】各クエンチャーの蛍光発光量（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示すグラフである。
【図２】蛍光物質としてＦＡＭを用いて、クエンチャーとしては本発明のクエンチャーであるクエンチャー５７０及びＢＨＱ１で各々合成されたプローブがリアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）−ＰＣＲで測定されるのを示すグラフである。グラフで、横軸はｃｙｃｌｅ、縦軸は蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す（これは、下記図３乃至図６でも同様である）。
【図３】蛍光物質としてＴＥＴを用いて、クエンチャーとしては本発明のクエンチャーであるクエンチャー５７０及びＢＨＱ１で各々合成されたプローブがリアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）−ＰＣＲで測定されるのを示すグラフである。
【図４】蛍光物質としてＴＡＭＲＡを用いて、クエンチャーとしては本発明のクエンチャーであるクエンチャー５７０及びＢＨＱ１で各々合成されたプローブがリアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）−ＰＣＲで測定されるのを示すグラフである。
【図５】蛍光物質としてＲＯＸを用いて、クエンチャーとしては本発明のクエンチャーであるクエンチャー５７０及びＢＨＱ２で各々合成されたプローブがリアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）−ＰＣＲで測定されるのを示すグラフである。
【図６】蛍光物質としてＴｅｘａｓ−Ｒｅｄを用いて、クエンチャーとしては本発明のクエンチャーであるクエンチャー５７０及びＢＨＱ２で各々合成されたプローブがリアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）−ＰＣＲで測定されるのを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明に対し詳細に説明する。
一観点で、本発明は、下記化学式（１）で表される化合物を含むクエンチャーに関する:
【化６】
0006297035.tif 000018
前記化学式（１）で、
Ａ１は、下記化学式（２）または化学式（３）の構造を持って、
Ａ２は、置換されたまたは非置換されたＣ６−Ｃ１２のアリーレン基、または置換されたまたは非置換されたＣ４−Ｃ１２のヘテロアリーレン基であり、
Ａ３は、置換されたまたは非置換されたＣ６−Ｃ３０のアリル基、または置換されたまたは非置換されたＣ３−Ｃ３０のヘテロアリル基である。
【００１９】
前記「置換」とは、非置換された置換基にさらに置換される場合を意味して、その置換基は、重水素、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル、ハロゲンが置換された（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ３０）アリール、（Ｃ３−Ｃ３０）ヘテロアリール、（Ｃ６−Ｃ３０）アリールが置換された（Ｃ５−Ｃ３０）ヘテロアリール、（Ｃ３−Ｃ３０）シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、トリ（Ｃ１−Ｃ３０）アルキルシリル、トリ（Ｃ６−Ｃ３０）アリールシリル、ジ（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル（Ｃ６−Ｃ３０）アリールシリル、（Ｃ１−Ｃ３０）アルキルジ（Ｃ６−Ｃ３０）アリールシリル、（Ｃ２−Ｃ３０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ３０）アルキニル、シアノ、カルバゾリル、ジ（Ｃ１−Ｃ３０）アルキルアミノ、ジ（Ｃ６−Ｃ３０）アリールアミノ、（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル（Ｃ６−Ｃ３０）アリールアミノ、ジ（Ｃ６−Ｃ３０）アリールボロニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３０）アルキルボロニル、（Ｃ１Ｃ３０）アルキル（Ｃ６−Ｃ３０）アリールボロニル、（Ｃ６−Ｃ３０）アル（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３０）アルキル（Ｃ６−Ｃ３０）アリール、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルオキシ、（Ｃ６−Ｃ３０）アリールオキシ、カルボキシル、ニトロ及びヒドロキシからなる群から選択される一つ以上であることを意味する。
【００２０】
【化７】
0006297035.tif 000019
前記化学式（２）で、
Ｚ１乃至Ｚ４は、互いに独立してＣＲ１または窒素であり、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基またはスルホニル基であり、
Ｘ１は、ＣＨ２、ＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｘ２はＣＨまたは窒素である。
【００２１】
【化８】
0006297035.tif 000020
前記化学式（３）で、
Ｚ５乃至Ｚ９は、互いに独立してＣＲ２または窒素であり、
Ｒ２は、水素、ヒドロキシ基、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ＮＲ９Ｒ１０、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ１０のカルボキシ基またはハロゲンであり、
Ｒ９及びＲ１０は、互いに独立して水素またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【００２２】
前記化学式（１）でＡ２は、下記化学式（４）の構造を持つことが好ましい:
【化９】
0006297035.tif 000021
前記  化学式（４）で、
Ｚ１０乃至Ｚ１３は、互いに独立してＣＲ３または窒素であり、
Ｒ３は、水素、ヒドロキシ基、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ＮＲ１１Ｒ１２、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ１０のカルボキシ基、Ｃ６−Ｃ３０のアリールオキシ基、またはハロゲンであり、
Ｒ１１及びＲ１２は、互いに独立して水素またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【００２３】
前記化学式（１）で、Ａ３は、下記化学式（５）の構造を持つことが好ましい:
【化１０】
0006297035.tif 000022
前記化学式（５）で、
Ｚ１４乃至Ｚ１７は、互いに独立してＣＲ４または窒素であり、
Ｒ４は、水素、ヒドロキシ基、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基、ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ１０のカルボキシ基、またはハロゲンであり、
Ｒ１３及びＲ１４は、互いに独立して水素またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｚ１８は、ＣＨまたは窒素であり、
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基、ヒドロキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボキシル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボニルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基またはＣ３−Ｃ３０のヘテロアリールである。
【００２４】
前記化学式（５）で表されるＡ３を含むクエンチャーは、前記Ｌ１または、Ｌ２中選択されるいずれか一つとリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって連結される支持体（ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を追加で含んでもよい。また、前記クエンチャーは、保護基として、ＤＭＴ（４，４‘−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｇｒｏｕｐ）またはその類似体で保護されるヒドロキシ基をさらに含んでもよい。
【００２５】
前記支持体は、核酸またはポリペプチドなどがクエンチャーと連結されて合成されるのを助ける固体状物質を意味して、クエンチャーとオリゴマーとの結合で３‘側端を固定してオリゴ鎖の合成をより容易にする。前記支持体は、レジン、固体支持体、固体状などのような役割を果たすものを指し示すものを全部含む。前記支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、ポリアクリルアミド、またはこれらの共重合体（ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ）で構成されてもよく、ガラス、シリカ、ＣＰＧ、ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅシリカで構成されてもよい。好ましくは、ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリスチレンから選択される。
【００２６】
本発明のリンカーは、単にクエンチャーと他の物質を連結する役割が主な目的である、このような役割をすることは、いずれも本発明のリンカーになる。本発明のリンカーは、例えば、１乃至６個が連結されているエチレングリコールや炭素鎖が挙げられるが、これに限定されない。このようなリンカーは、反応の官能基や蛍光及び消光作用に及ぼす影響が殆どないか微小である。
【００２７】
また、前記クエンチャー内の反応性を持つ官能基は、ＤＭＴ（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、ＭＭＴ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、トリチル基（ｔｒｉｔｙｌ）、置換されたトリチル基、ｐｉｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ、及びトリアルキルシリル基で構成された群から選択された一つ以上の保護基によって保護されてもよい。この中ＤＭＴが好ましい。本発明のヒドロキシ基は、ＤＭＴによって結合してもよい。オリゴ合成時、ＤＭＴを除去した後所望のオリゴマーを合成することができる。
【００２８】
前記化学式（１）で表される化合物は、好ましくは下記化学式（６）または（７）で表される化合物であるが、これに限定されるのではない：
【化１１】
0006297035.tif 000023
【００２９】
前記化学式で、
Ｚ１８は、ＣＨ、または窒素であり、
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して水素、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基、ヒドロキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリル基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボキシル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボニルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基またはＣ３−Ｃ３０のヘテロアリールであり、
Ｒ１５乃至Ｒ１８は、互いに独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【００３０】
前記化学式（１）で表される化合物は、より好ましくは下記化学式（８）乃至（１２）で表される化合物のうちいずれか一つであってもよいが、これに限定されるのではない：
【化１２】
0006297035.tif 000024
【００３１】
前記化学式（８）乃至（１２）で表される化合物のうちいずれか一つを含むクエンチャーは、オリゴマーとの合成のためにリンカー及び支持体と連結された構造を追加で含んでもよい。この時、リンカーは、カルボキシ基をアミン化させて連結することができる（製造例参照）。支持体は、ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリスチレンが好ましく、より好ましくはＣＰＧである。
【００３２】
また、前記クエンチャーは、官能基をさらに含んでも良く、このような官能基はレポーターとクエンチャーの役割に影響を与えないものが選択される。官能基は、オリゴマーとより効率的に連結できる役割を提供する。従って、前記クエンチャーは、このようなオリゴマー合成のためにオリゴマーと反応が可能な官能基をＤＭＴまたはその誘導体によって保護させることができ、そして支持体と連結される中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）構造を含むことができるものである。
【００３３】
本発明に係る前記クエンチャーは、オリゴマー合成のために下記化学式（１３）乃至（１７）で表される化合物中から選択されるいずれか一つを含むことがさらに好ましい：
【化１３】
0006297035.tif 000025
【化１４】
0006297035.tif 000026
【００３４】
より好ましくは、
前記化学式（１３）乃至（１７）で、Ｙは支持体としてＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）から選択され、これらのうちＣＰＧが好ましい。
化学式（１３）乃至（１７）の構造を含むクエンチャーは、化学式（８）乃至（１２）に各々リンカーによって支持体が連結されており、ヒドロキシ基は、ＤＭＴで保護される。これは、オリゴマーとの連結のための前工程で、反応に特異的なオリゴマーを合成して前記クエンチャーと連結して多様な化学及び生物学の研究に応用することができる。
【００３５】
本発明では、化学式（１３）の構造を含むクエンチャーをクエンチャー５７０、化学式（１４）の構造を含むクエンチャーをクエンチャー５４５、化学式（１５）の構造を含むクエンチャーをクエンチャー６３０、化学式（１６）の構造を含むクエンチャーをクエンチャー６４０、化学式（１７）の構造を含むクエンチャーをクエンチャー５３０と命名した。以下、下記実施例及び図面で用いられた「クエンチャー０００」とは各々本発明のクエンチャーを示す。
【００３６】
本発明の一実施例で、クエンチャー５７０、クエンチャー６３０、及びクエンチャー６４０と、既存の公示されたクエンチャーであるＢＨＱ１、及びＢＨＱ２の蛍光発光量を測定した結果、本発明に係るクエンチャーは、公示されたクエンチャーＢＨＱより広い波長範囲で蛍光を吸収できることを示す（図１参照）。特に、クエンチャー５７０は、既存の一つのクエンチャーの蛍光波長範囲に対する消光作用の範囲に比べて相対的により広い蛍光波長領域で消光作用をする消光能力を有しており、従来ＢＨＱ１及びＢＨＱ２の消光範囲をクエンチャー５７０だけで消光が可能にする。これは、本発明に係るクエンチャーは蛍光物質のエネルギー受け入れ体であり、電子供与体と電子受容体に官能基の効率的な配置によって、強くて広い吸収領域が可能になって、クエンチャーの機能を効率的に行うことができることを示す。
【００３７】
他の観点において、本発明は、前記クエンチャーを含むオリゴヌクレオチドに関する  。本発明のクエンチャーは、オリゴヌクレオチドに結合して、生物学的分析、または化学的分析に用いることができる。このような分析の目的に応じて、前記オリゴヌクレオチドは適切に変形が可能である。
【００３８】
前記オリゴヌクレオチドは、１乃至数百個のヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡを共に含む。また、これらの類似体、例えば前記ヌクレオチドに化学的変更が加えられたもの、または、糖が結合したものなど通常の技術者が容易に変形を加えることができるもの等を全部含み、一本鎖または二重鎖からなるものを全部含むものを意味する。
【００３９】
前記オリゴヌクレオチドは、プローブを含むことが好ましい。このようなプローブは、ターゲットになる核酸と相補的に結合できるプローブであることがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００４０】
前記プローブは、核酸、ペプチド、糖類、オリゴヌクレオチド、タンパク質、抗体またはこれらの組み合わせから選択されてもよいが、これらに限定されない。
【００４１】
また、前記プローブは、蛍光物質を含むことが好ましい。含まれる蛍光物質は、クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）等で構成される蛍光物質系またはこれらの蛍光物質系の誘導体から選択される一つ以上を含んでもよい。また、本発明に係るクエンチャーは、波長の吸収範囲が広いため、レポーターとして種々の蛍光物質の使用を可能にして、前記蛍光物質に限定されない。
【００４２】
このようなオリゴヌクレオチドは、化学的、生物学的領域で多様に活用できる。特に、リアルタイム重合酵素連鎖反応またはマイクロアッセイ（ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ）等で有用に用いられるが、これらに限定されい。
【００４３】
そこで、本発明は、前記オリゴヌクレオチドを含む核酸検出用組成物に関する。前記組成物は、標的核酸に相補的に結合できるオリゴヌクレオチドを含み、標的核酸を特異的に検出することができる。また、前記組成物は通常の技術者が明らかに採択可能な検出用組成物に含まれてもよい組成をさらに含んでもよい。
【００４４】
また、本発明は、前記プローブを利用して目的する核酸やタンパク質を探針できる方法を提供することができる。このような方法は、本発明に係るプローブと目的する物質を有しているサンプルを接触する工程と、蛍光量を分析する工程と、を含む。
【００４５】
本発明は、下記化学式（６）または（７）で表される新規アゾ化合物に関する:
【化１５】
0006297035.tif 000027
【００４６】
前記化学式で、
Ｚ１８は、ＣＨ、または窒素であり、
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して水素、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基、ヒドロキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリル基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボキシル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボニルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基またはＣ３−Ｃ３０のヘテロアリールであり、
Ｒ１５乃至Ｒ１８は、互いに独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【００４７】
また、本発明は、三つ以上のヘテロ環を含むアゾ化合物の製造方法に関する。具体的に、本発明は下記化学式（６）と  化学式（７）で表されるアゾ化合物の製造方法を提供する。
【００４８】
本発明に係る下記化学式（６）で表されるアゾ化合物の製造方法は、
下記化学式（６ａ）のアニリンと下記化学式（６ｂ）の化合物をアゾカップリング反応を行って化学式（６ｃ）の化合物を得る工程と、
前記化学式（６ｃ）の化合物を得る工程後に、下記化学式（６ｃ）の化合物と下記化学式（６ｄ）の化合物をアゾカップリング反応を行って下記化学式（６）の化合物を得る工程と、を含む：
【化１６】
0006297035.tif 000028
前記化学式で、 
Ｚ１８は、ＣＨ、または窒素であり、
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して水素、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基、ヒドロキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリル基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボキシル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボニルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基またはＣ３−Ｃ３０のヘテロアリールであり、
Ｒ１５乃至Ｒ１８は、互いに独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【００４９】
また、本発明に係る下記化学式（７）で表されるアゾ化合物の製造方法は、
前記化学式（６ｃ）の化合物を得る工程と、
化学式（６ｃ）の化合物と下記化学式（７ａ）の化合物をアゾカップリング反応を行って化学式（７）の化合物を得る工程と、を含む:
【化１７】
0006297035.tif 000029
前記化学式で、 
Ｚ１８は、ＣＨ、または窒素であり、
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して水素、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリール基、ヒドロキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０のアリル基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボキシル基、Ｃ１−Ｃ３０のカルボニルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ３０のアルキル基またはＣ３−Ｃ３０のヘテロアリールであり、
Ｒ１５乃至Ｒ１８は、互いに独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ基またはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【００５０】
従来、三つ以上のヘテロ環を含むアゾ化合物の合成は容易ではなく、これにより、三つ以上のヘテロ環を含むアゾ化合物が具体的に開示された例は殆どない。
【００５１】
本発明に係るアゾ化合物の製造方法は、三つ以上のヘテロ環を含むアゾ化合物に対する合成を特徴とし、本発明によると、開始化合物であるアニリンで１回目のアゾカップリング反応を進めた後、２回目のアゾカップリング反応を進める工程を持つことを特徴とする三つ以上のヘテロ環を含むアゾ化合物の製造方法を提供する。
【００５２】
既存の公示方法であるアニリンに連結された二つのヘテロ環化合物を先に連結して、連結された二つのヘテロ環化合物をアニリンにアゾカップリング反応によって連結する方法は、実際の合成に当たり容易ではない。
【００５３】
そこで、本発明は、三つ以上のヘテロ環を含むアゾ化合物を容易に合成できる方法を提供することができる。本発明に係るアゾ化合物の製造方法は、２回のカップリング反応を順次進めることを特徴とする。
【００５４】
従来には  電子求引性基（ＥＷＧ、ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）を用いる合成法が公示されているが、強力な電子求引性基を導入すると、２次結合時反応性が顕著に落ちて、反応の進行が容易ではない限界点を持つ。従って、アゾ結合を介したクエンチャー化合物を合成時、１次アゾ結合を介して合成されたアゾ化合物が、強い電子求引性基を持っていれば、電子求引性基の強い電子求引作用により、１次アゾ化合物の塩基度が落ちる。このような理由から２次アゾ結合時、反応が進行し難くなる。それに対する解決策として本発明のアゾ化合物の製造方法は、１次アゾ結合で電子供与基を持っている化合物で反応を進行させる。アンモニウム塩とアゾニウム塩との競争反応で、アゾニウム塩の生成を優勢にするために、反応速度の調節と適切な溶媒の選択を考慮しなければならない。その後、強い電子求引性基を持っている化合物と２次アゾ結合を進める。１、２次アゾ結合の反応性を高めるために、温度、溶媒、ｐＨなどといった反応条件を効率的に調節して反応性を最大化させる。このような限界を克服するために、電子供与基から合成を始めて、最終電子求引性基を２次アゾ結合を導入することで、強力な電子求引性基を導入したクエンチャーを最終合成することができた。
【００５５】
以下、本発明の理解を助けるために、好ましい製造例及び実施例を提示する。下記製造例及び実施例は、理解を助けるために本発明を例示するだけであって、本発明の内容が下記製造例及び実施例に限定されるのではない。また、本明細書で用いられる用語、技術などは、特に限定されない限り、本発明が属する技術分野で一般に用いられる意味として用いられる。
【００５６】
＜製造例１＞化学式（１３）の化合物（クエンチャー５７０）の製造
【化１８】
0006297035.tif 000030
【化１９】
0006297035.tif 000031
１−１．１工程化合物の製造−アミン化（Ａｍｉｎａｔｉｏｎ）
エン−エチルアニリン３０ｇ（２５０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、エチルアクリレート３７．２ｇ（３７０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）、セリウム（ＩＶ）硝酸アンモニウムト１３．５７ｇ（２５ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ）を投入した攪拌する。６０℃に温度を上げて１５時間攪拌する。常温に温度を下げて、メチレンクロライドで抽出する。抽出液は、硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮してコラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物４７ｇ（黄色の液体、８５．８％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  7.27~7.20ppm  (2H,  t),  6.73~6.67ppm  (3H,  m),4.20~4.11ppm  (2H,  q),  3.67~3.61ppm  (2H,  t),  3.43~3.35ppm  (2H,  q),  2.63~2.57ppm  (2H,  t),  1.31~1.24ppm  (3H,  t),  1.19~1.14ppm  (3H,  t)
【００５７】
１−２．２工程化合物の製造−１回目のアゾカップリング（Ａｚｏ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
ニトロシル硫酸１０．３７ｇ（３２．６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、塩酸５０ｍｌ、メタノール１５０ｍｌを投入して攪拌する。−７８℃に温度を下げて２０分間攪拌する。２，５−メトキシアニリン５ｇ（３２．６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をメタノール１００ｍｌに溶かして滴下した後、室温に上げて２時間攪拌する。
メタノールに溶かした１工程化合物７．９５ｇ（３５．９１ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を滴下した後、１時間攪拌する。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ６〜８になるまで中和する。中和が完了して、１５時間攪拌する。減圧濃縮してメタノールを除去する。メチレンクロライドで抽出する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物５．８７ｇ（橙色の液体、４６．７％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  7.90~7.86ppm  (2H,  d),  7.27~7.25ppm  (1H,  s),  7.01~6.93ppm  (2H,  m),  6.75~6.72ppm  (2H,  d),  4.20~4.12ppm  (2H,  q),  3.99~3.97ppm  (3H,  s),  3.84~3.82ppm  (3H,  s),  3.75~3.69ppm  (2H,  t),  3.50~3.44ppm  (2H,  q),  2.67~2.61ppm  (2H,  t),  1.30~1.18ppm  (6H,  m)
【００５８】
１−３．３工程化合物の製造−２回目のアゾカップリング（Ａｚｏ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
硝酸ナトリウム１．０５ｇ（１５．２３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、リン酸１５０ｍｌを投入して攪拌する。０℃に温度を下げて２０分間攪拌する。４−アミノピリジン１．４３ｇ（１５．２３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を投入する。室温で３０分間攪拌する。２工程化合物５．８７ｇ（１５．２３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を酢酸５０ｍｌに溶かす。滴下した後、１時間攪拌する。蒸溜水２００ｍｌを投入して、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ４〜８になるまで中和した後、１５時間攪拌する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物１．６ｇ（暗い紫色の固体、２１．４％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  8.81~8.78ppm  (2H,  d),  7.96~7.92ppm  (2H,  d),  7.74~7.71ppm  (2H,  d),  7.50~7.48ppm  (1H,  s),  7.47~7.45ppm  (1H,  s),  6.77~6.74ppm  (2H,  d),  4.22~4.14ppm  (2H,  q),  4.10~4.08ppm  (3H,  s),  4.06~4.04ppm  (3H,  s),  3.79~3.73ppm  (2H,  t),  3.54~3.48ppm  (2H,  q),  2.70~2.64ppm  (2H,  t),  1.31~1.21ppm  (6H,  m)
【００５９】
１−４．４工程化合物の製造−加水分解（Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）
３工程化合物１．４９ｇ（３．０４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メタノール２００ｍｌ、メチレンクロライド２００ｍｌを投入して攪拌する。１Ｎ水酸化ナトリウム９．１１ｍｌ（９．１１ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を投入して、３日間攪拌する。１Ｎ水酸化ナトリウム３．０４ｍｌ（３．０４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を追加投入して、１日間攪拌した後、減圧濃縮する。蒸溜水４００ｍｌを投入して攪拌する。１Ｎ塩酸でｐＨ６〜８になるまで中和する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物１．９ｇ（暗い紫色の固体）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  8.77~8.74ppm  (2H,  d),  7.93~7.89ppm  (2H,  d),  7.76~7.73ppm  (2H,  d),  7.47~7.45ppm  (1H,  s),  7.45~7.43ppm  (1H,  s),  6.80~6.76ppm  (2H,  d),  4.09~4.07ppm  (3H,  s),  4.05~4.03ppm  (3H,  s),  3.83~3.77ppm  (2H,  t),  3.59~3.51ppm  (2H,  q),  2.76~2.70ppm  (2H,  t),  1.29~1.23ppm  (3H,  t)
【００６０】
１−５．５工程化合物の製造−アミン保護化（Ａｍｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）
６−アミノカプリン酸１０ｇ（７６．２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、トリエチルアミン３１．８ｍｌ（２２８．６ｍｍｏｌ、３ｅｑ）、メタノール７６ｍｌを投入して攪拌する。エチルトリフルオロアセテート１１．９ｇ（８３．７６ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を投入して、１５時間攪拌する。減圧濃縮する。エチルアセテートで抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物１６．９ｇ（９８．０％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  DMSO−d6)：  11.97~11.95ppm  (1H,  s),  9.38~9.36ppm  (1H,  s),  3.18~3.10ppm  (2H,  q),  2.21~2.14ppm  (2H,  t),  1.53~1.41ppm  (4H,  m),  1.29~1.18ppm  (2H,  m)
【００６１】
１−６．６工程化合物の製造−ＮＨＳエステル化（Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
５工程化合物５．２８ｇ（２３．２４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メタノール１２０ｍｌ、ピリジン９．３８ｍｌ（１１６．２ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を投入して攪拌する。エン−スクシンイミジルトリフルオロアセテート８．８１ｇ（４１．８３ｍｍｏｌ、１．８ｅｑ）を投入して１日間攪拌する。減圧濃縮する。メチレンクロライドで抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮する。真空乾燥して所望の化合物７．０８ｇ  （白色の固体、９４．８％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  6.80~6.78ppm  (1H,  s),  3.40~3.32ppm  (2H,  q),  2.84~2.82ppm  (4H,  s),  2.64~2.58ppm  (2H,  t),  1.83~1.73ppm  (2H,  m),  1.67~1.57ppm  (2H,  m),  1.52~1.44ppm  (2H,  m)
【００６２】
１−７．７工程化合物の製造−アミド化（Ａｍｉｄａｔｉｏｎ）（Ｃ６−Ｓｐａｃｅｒ）及び  ＤＭＴ添加
６工程化合物１ｇ（３ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）、ジメチルホルムアミド５ｍｌ、３−アミノ−１，２−プロパンジオール０．２３ｇ（２．５７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を投入して１時間攪拌する。メチレンクロライド５０ｍｌを投入して０℃に温度を下げる。ディエムティクロライド１．１３ｇ（３．３３ｍｍｏｌ、１．３ｅｑ）を投入して攪拌する。トリエチルアミン０．８４ｍｌ（６．０５ｍｍｏｌ、２．４ｅｑ）をメチレンクロライド１０ｍｌに希釈して滴下する。室温で１５時間攪拌する。減圧濃縮する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．９８ｇ（薄い黄色の固体、６４．５％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  7.42~7.20ppm  (9H,  m),  6.84~6.80ppm  (4H,  d),  5.87~5.85ppm  (1H,  t),  3.94~3.82ppm  (1H,  m),  3.79~3.77ppm  (6H,  s),  3.59~3.47ppm  (1H,  m),  3.37~3.10ppm  (5H,  m),  2.12~2.07ppm  (2H,  t),  1.64~1.50ppm  (4H,  m),  1.35~1.26ppm  (2H,  m)
【００６３】
１−８．８工程化合物の製造−アミン脱保護化（Ａｍｉｎｅ  Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）
７工程化合物０．９８ｇ（１．６２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メタノール４ｍｌを投入して攪拌する。アンモニア溶液（２５％）３０ｍｌ（２１３．９８ｍｍｏｌ、１３２ｅｑ）を滴下と、１５時間攪拌する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．８ｇ（薄い黄色の固体、９７％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  7.42~7.14ppm  (9H,  m),  6.83~6.79ppm  (4H,  d),  6.04~6.02ppm  (1H,  t),  3.87~3.79ppm  (1H,  m),  3.78~3.76ppm  (6H,  s),  3.59~3.50ppm  (1H,  m),  3.22~3.07ppm  (3H,  m),  2.66~2.60ppm  (2H,  t),  2.12~2.06ppm  (2H,  t),  1.62~1.52ppm  (2H,  m),  1.43~1.35ppm  (2H,  m),  1.33~1.25ppm  (2H,  m)
【００６４】
１-９．９工程化合物の製造−アミド化（Ａｍｉｄａｔｉｏｎ）（  Ｃ９−Ｓｐａｃｅｒ）
４工程化合物１．９ｇ（４．１１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ビス−２−オキソ−３−オキサゾリジニルホスホリッククロライド２ｇ（４．５２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．６１ｇ（４．５２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、８工程化合物２．２９ｇ（４．５２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、メチレンクロライド１Ｌを投入して攪拌する。トリエチルアミン２．８５ｍｌ（２０．５４ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を投入して、１５時間攪拌する。減圧濃縮する。エチルアセテートで抽出する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物２．１ｇ（暗い紫色の固体、５３、７％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  8.82~8.79ppm  (2H,  d),  7.93~7.90ppm  (2H,  d),  7.74~7.71ppm  (2H,  d),  7.49~7.47ppm  (1H,  s),  7.46~7.44ppm  (1H,  s),  7.44~7.17ppm  (9H,  m),  6.83~6.79ppm  (4H,  d),  6.76~6.72ppm  (2H,  d),  6.02~5.97ppm  (1H,  t),  5.90~5.85ppm  (1H,  t),  4.08~4.06ppm  (3H,  s),  4.04~4.02ppm  (3H,  s),  3.88~3.81ppm  (1H,  m),  3.81~3.75ppm  (7H,  m),  3.58~3.47ppm  (5H,  m),  3.28~3.08ppm  (6H,  m),  2.52~2.47ppm  (2H,  t),  2.11~2.05ppm  (2H,  t),  1.62~1.42ppm  (4H,  m),  1.34~1.18ppm  (5H,  m)
【００６５】
１−１０．１０工程化合物の製造−サクシニル化（Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ）
９工程化合物１．９７ｇ（２．０７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、無水コハク酸０．６２ｇ（６．２２ｍｍｏｌ、３ｅｑ）、エン−エン−ジメチルアミノピリジン２５ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ）、ピリジン８０ｍｌを投入して攪拌する。６０℃に温度を上げて１５時間攪拌する。無水コハク酸０．６２ｇ（６．２２ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を追加投入して、１日間攪拌する。エン−エン−ジメチルアミノピリジン２５ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ、０.１ｅｑ）を追加投入して、１日間攪拌する。常温に温度を下げて、減圧濃縮する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物１．７６ｇ（暗い紫色の固体、８０．９％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  8.76~8.73ppm  (2H,  d),  7.92~7.88ppm  (2H,  d),  7.73~7.70ppm  (2H,  d),  7.48~7.46ppm  (1H,  s),  7.43~7.19ppm  (10H,  m),  6.83~6.80ppm  (4H,  d),  6.74~6.71ppm  (2H,  d),  6.50~6.46ppm  (1H,  m),  6.43~6.39ppm  (1H,  t),  5.24~5.20ppm  (1H,  m),  4.08~4.06ppm  (3H,  s),  4.04~4.02ppm  (3H,  s),  3.89~3.72ppm  (9H,  m),  3.57~3.45ppm  (7H,  m),  3.37~3.19ppm  (6H,  m),  2.58~2.50ppm  (2H,  t),  2.18~2.11ppm  (2H,  t),  1.69~1.40ppm  (4H,  m),  1.32~1.17ppm  (5H,  m)
【００６６】
１−１１．１１工程化合物の製造−ＬＣＡＡ−ＣＰＧカップリング化（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
エルシエイシピジ３ｇ、１０工程化合物０．４４ｇ（０．４１８ｍｍｏｌ、３．５ｅｑ）、ビス−２−オキソ−３−オキサゾリジニルホスホリッククロライド０．１８ｇ（０.４１８ｍｍｏｌ、３．５ｅｑ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．０６ｇ（０．４１８ｍｍｏｌ、３．５ｅｑ）、メチレンクロライド３５ｍｌ、トリエチルアミン０．２９ｍｌ（２．０９ｍｍｏｌ、１７．５ｅｑ）を投入する。常温で１日間反応する。ろ過して、メタノールで洗浄する。ろ過物を真空乾燥して所望の化合物２．９ｇ（紫色の固体）を得る。
【００６７】
１−１２．１２工程化合物の製造−キャッピング（Ｃａｐｐｉｎｇ）
１１工程化合物２．９ｇ、ピリジン３５ｍｌ、無水酢酸３．５９ｍｌ（３８ｍｍｏｌ、９１ｅｑ）、１−メチルイミダゾール３．０３ｍｌ（３８ｍｍｏｌ、９１ｅｑ）を投入した後、１日間反応する。ろ過して、メタノールで洗浄する。ろ過物を真空乾燥して所望の化合物２．８ｇ（紫色の固体）を得る。
【００６８】
＜製造例２＞化学式（１６）の化合物（クエンチャー６４０）合成
【化２０】
0006297035.tif 000032
【化２１】
0006297035.tif 000033
２−１．１工程化合物の製造−プロパンオール（Ｐｒｏｐａｎｏｌ）置換
エン−（２−アセトキシエチル）アニリン１２．３ｇ（６８．６３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れて水４０ｍｌを入れた後、３−クロロ−１−プロパンオール１９．８６ｇ（２０５．９０ｍｍｏｌ、３ｅｑ）と炭酸カルシウム６．８７ｇ（６８．６３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れて１００℃で１９時間攪拌する。常温に温度を下げてエチルアセテートで抽出する。抽出液は硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮してコラムで分離する。減圧濃縮して所望の化合物１３．８ｇ（黄色の液体、８４％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  7.23~7.19ppm  (2H,  m),  6.79~6.75ppm  (3H,  m),  4.25~4.19ppm  (2H,  t),  3.71~3.66ppm  (2H,  t),  3.59~3.54ppm  (2H,  t),  3.48~3.43ppm  (2H,  t),  2.66~2.82ppm  (1H,  s,  H−OH),  2.05~2.03ppm  (3H,  s,  H−Ac),  1.90~1.76ppm  (2H,  m)
【００６９】
２−２．２工程化合物の製造−１回目のアゾカップリング（Ａｚｏ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
ニトロシル硫酸８．４ｇ（２６．１２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、塩酸４．８ｍｌ  （５２．２４ｍｍｏｌ、２ｅｑ）、メタノール４００ｍｌを投入して攪拌する。−７８℃に温度を下げて２０分間攪拌する。２，５−メトキシアニリン４ｇ（２６．１２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をメタノール１００ｍｌに溶かして滴下した後、室温に上げて２時間攪拌する。メタノールに溶かした１工程化合物１２．５ｇ（５２．２４ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を滴下した後、１時間攪拌する。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ６〜８になるまで中和する。中和が完了して、１５時間攪拌する。減圧濃縮してメタノールを除去する。メチレンクロライドで抽出する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物５．６ｇ（赤色液体、５３％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  7.89~7.85ppm  (2H,  d),  7.27~7.25ppm  (1H,  d),  7.02~6.92ppm  (2H,  m),  6.82~6.78ppm  (2H,  d),  4.30~4.25ppm  (2H,  t),  3.98~3.97ppm  (3H,  s),  3.83~3.82ppm  (3H,  s),  3.76~3.66ppm  (4H,  m),  3.60~3.55ppm  (2H,  t),  2.03~2.02ppm  (3H,  s),  1.94~1.87ppm  (2H,  m),  1.65~1.64ppm  (1H,  s)
【００７０】
２−３．３工程化合物の製造−２回目のアゾカップリング（Ａｚｏ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
２−アミノ−６−ニトロ−ベンゾチアゾール２．３ｇ（１２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れて０℃に温度を下げた後、リン酸５０ｍｌを投入した後、硝酸ナトリウム０．８３ｇ（１２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れて１時間攪拌する。２工程化合物４．８ｇ（１２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を酢酸３０ｍｌに溶かして滴下する。０℃に温度を下げた後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を入れてｐＨ８〜９にした後、常温で１５時間攪拌する。固体をろ過した後得た固体にメタノール６００ｍｌを入れて２時間沸かす。常温に温度を下げた後、沈殿物をろ過する。メタノールで洗浄した後、固体を真空乾燥して所望の化合物３.２ｇ（赤褐色固体、４４％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  8.81~8.80ppm  (1H,  s),  8.42~8.36ppm  (1H,  d),  8.25~8.21ppm  (1H,  d),  7.96~7.93ppm  (2H,  d),  7.68~7.67ppm  (1H,  s),  7.41~7.40ppm  (1H,  s),  6.87~6.83ppm  (2H,  d),  4.31~4.30ppm  (2H,  t),  4.13~4.12ppm  (3H,  s),  4.03~4.02ppm  (3H,  s),  3.77~3.75ppm  (4H,  m),  3.70~3.60ppm  (2H,  t),  2.05~2.06ppm  (3H,  s),    2.00~1.90ppm  (2H,  m)
【００７１】
２−４．４工程化合物の製造−ＤＭＴ保護化（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）
３工程化合物２．１ｇ（３．４６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れて、メチレンクロライド１００ｍｌに溶かした後、トリエチルアミン１．１６ｇ（１１．３９ｍｍｏｌ）を入れる。ディエムティクロライド１．６４ｇ（４．８４ｍ  ｍｏｌ）を入れて常温で２時間攪拌する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。減圧濃縮してコラムで分離する。減圧濃縮して所望の化合物２ｇ（赤褐色固体、６３％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  8.76~8.74ppm  (1H,  d),  8.34~8.30ppm(1H,  dd),  8.20~8.16ppm  (1H,  d),  7.90~7.86ppm  (2H,  d),  7.64~7.63ppm(1H,  s),  7.48~7.44ppm  (2H,  d),7.38~7.20ppm  (8H,  m),  6.88~6.78ppm  (6H,  m),  4.28~4.23ppm  (2H,  t),  4.12~4.11ppm  (3H,  s),  4.03~4.02ppm  (3H,  s),  3.80~3.78ppm  (6H,  s),  3.64~3.59ppm  (4H,  t),  3.22~3.17ppm  (2H,  t),  2.05~2.04ppm  (3H,  s),  1.98~1.92ppm  (2H,  m)
【００７２】
２−５．５工程化合物の製造−加水分解（Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）
４工程化合物２ｇ（２．２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メタノール１５０ｍｌ、メチレンクロライド１５０ｍｌを投入して攪拌する。１Ｎ水酸化ナトリウム１００ｍｌを投入して、３日間常温で攪拌する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物１．３ｇ（赤褐色の固体、６８％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  8.74~8.73ppm  (1H,  s),  8.33~8.30ppm  (1H,  d),  8.18~8.15ppm  (1H,  d),  7.87~7.83ppm  (2H,  d),  7.62~7.61ppm  (1H,  s),  7.43~6.80ppm  (16H,  m),  4.09~4.08ppm  (3H,  s),  4.00~3.99ppm  (3H,  s),  3.78~3.76ppm  (8H,  m),  3.61~3.60ppm  (2H,  t),  3.53~3.52ppm  (2H,  t),  3.17~3.16ppm  (2H,  t),  1.92~1.91ppm  (2H,  m)
【００７３】
２−６．６工程化合物の製造−サクシニル化（Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ）
５工程化合物１.  ３ｇ（１．５０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）とピリジン１００ｍｌを入れて完全に溶かす。エン−エン−ジメチルアミノピリジン０．０１８ｇ（０．１５ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ）と無水コハク酸０．５ｇ（４．５０ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を入れて５０℃で１５時間攪拌する。真空ポンプを利用してピリジンを除去した後、メチレンクロライドで抽出する。抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮してコラムで分離する。減圧濃縮して所望の化合物０．８５ｇ（赤褐色固体、５７％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  8.75~8.74ppm  (1H,  s),  8.33~8.30ppm  (1H,  d),  8.20~8.16ppm  (1H,  d),  7.89~7.85ppm  (2H,  d),  7.63~7.60ppm  (1H,  s),  7.47~6.70ppm  (16H,  m),  4.35~4.27ppm  (2H,  t),  4.11~4.10ppm  (3H,  s),  4.02~4.01ppm  (3H,  s),  3.79~3.78ppm  (6H,  s),  3.62~3.61ppm  (4H,  m),  3.19~3.18ppm  (2H,  t),  2.66~2.60ppm  (4H,  m),  1.93~1.92ppm  (2H,  m)
【００７４】
２−７．７工程化合物の製造−ＬＣＡＡ−ＣＰＧカップリング（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
エルシエイシピジ１ｇ、第６工程化合物０．０８ｇ（０．０８３ｍｍｏｌ、２ｅｑ）、ビス−２−オキソ−３−オキサゾリジニルホスホリッククロライド０．０３ｇ（０．０６６ｍｍｏｌ、１．６ｅｑ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．０１ｇ（０．０６６ｍｍｏｌ、１．６ｅｑ）、メチレンクロライド１０ｍｌ、トリエチルアミン０．０４２ｍｌ（０．４１ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を投入する。常温で１５時間反応する。ろ過して、メタノールで洗浄する。ろ過物を真空乾燥して所望の化合物０．８ｇ（青色固体）を得る。
【００７５】
２−８．８工程化合物の製造−キャッピング（Ｃａｐｐｉｎｇ）
７工程化合物０．８ｇ、ピリジン３５ｍｌ、無水酢酸１．２３ｍｌ、１−メチルイミダゾール０．８ｍｌを投入した後、２時間反応する。ろ過して、メタノールで洗浄する。ろ過物を真空乾燥して所望の化合物０．６９ｇ（青色固体）を得る。
【００７６】
＜製造例３＞化学式（１５）の化合物（クエンチャー６３０）の製造
【化２２】
0006297035.tif 000034
【化２３】
0006297035.tif 000035
３−１．１工程化合物の製造−アミン化（Ａｍｉｎａｔｉｏｎ）
エン−エチルアニリン３０ｇ（２５０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、エチルアクリレート３７．２ｇ（３７０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）、セリウム（ＩＶ）アムモニウムナイトレート１３．５７ｇ（２５ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ）を投入して攪拌する。６０℃に温度を上げて１５時間攪拌する。常温に温度を下げて、メチレンクロライドで抽出する。抽出物は硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。減圧濃縮してコラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物４７ｇ（黄色の液体、８５．８％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  7.27~7.20ppm  (2H,  t),  6.73~6.67ppm  (3H,  m),  4.20~4.11ppm  (2H,  q),  3.67~3.61ppm  (2H,  t),  3.43~3.35ppm  (2H,  q),  2.63~2.57ppm  (2H,  t),  1.31~1.24ppm  (3H,  t),  1.19~1.14ppm  (3H,  t)
【００７７】
３−２．２工程化合物の製造−１回目のアゾカップリング（Ａｚｏ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
ニトロシル硫酸１７．３７ｇ（５４．６７ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）、塩酸７．６ｇ、メタノール４００ｍｌを投入して攪拌する。−７８℃に温度を下げて１０分間攪拌する。２−メトキシ−５−メチルアニリン５ｇ（３６．４５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をメタノール５０ｍｌに溶かして滴下する。室温で１時間攪拌する。１工程化合物８．８７ｇ（４０．０９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）をメタノールに溶かして滴下した後、２時間攪拌する。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した後、１５時間攪拌する。減圧濃縮してメタノールを除去する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は、硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物６．２６ｇ（橙色の液体、４６．５％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  7.90~7.86ppm  (2H,  d),  7.27~7.25ppm  (1H,  s),  7.01~6.93ppm  (2H,  m),  6.75~6.72ppm  (2H,  d),  4.20~4.12ppm  (2H,  q),  3.99~3.97ppm  (3H,  s),  3.84~3.82ppm  (3H,  s),  3.75~3.69ppm  (2H,  t),  3.50~3.44ppm  (2H,  q),  2.67~2.61ppm  (2H,  t),  1.30~1.18ppm  (6H,  m)
【００７８】
３−３．３工程化合物の製造
２−アミノ−６−ニトロ−ベンゾチアゾール１．５９ｇ（８．１２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れて０℃に温度を下げた後、リン酸４２ｍｌを投入した後、硝酸ナトリウム０．５６ｇ（８．１２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れて１時間攪拌する。２工程化合物３ｇ  （８．１２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を酢酸１５ｍｌに溶かして滴下する。０℃に温度を下げた後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を入れて中和させた後、常温で１５時間攪拌する。固体をろ過した後２０ｍｌメチレンクロライドに溶かしてエタノール５００ｍｌで沈殿させてろ過する。固体を真空乾燥して所望の化合物１．５ｇ（暗い茶色の固体、３２％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  8.82~8.81ppm  (1H,  d),  8.41~8.37ppm  (1H,  d),  8.28~8.24ppm  (1H,  d),  7.95~7.91ppm  (2H,  d),  7.66~7.60ppm  (2H,  d),  6.77~6.74ppm  (2H,  d),  4.22~4.14ppm  (2H,  q),  4.05~4.04ppm  (3H,  s),  3.79~3.73ppm  (2H,  t),  3.55~3.50ppm  (2H,  q),  2.78~2.77ppm  (3H,  s),  2.70~2.64ppm  (2H,  t),  1.31~1.21ppm  (6H,  m)
【００７９】
３−４．４工程化合物の製造−加水分解（Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）
３工程化合物１．５ｇ（２．６１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メチレンクロライド５０ｍｌ、エタノール５０ｍｌを投入して攪拌する。水酸化カリウム３．８８ｇ（６９．１５ｍｍｏｌ、２６．５ｅｑ）を水４０ｍｌに溶かして滴下した後、３０℃で２日間攪拌する。減圧濃縮する。１Ｎ塩酸でｐＨ４〜５になるまで中和する。固体をろ過して水とメタノールで洗浄する。固体を真空乾燥して所望の化合物０．９ｇ（暗い茶色の固体、６３％）を得る。
【００８０】
３−５．５工程化合物の製造−アミド化（Ａｍｉｄａｔｉｏｎ）（  Ｃ９−Ｓｐａｃｅｒ）
４工程化合物０．９ｇ（１．６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ビス−２−オキソ−３−オキサゾリジニルホスホリッククロライド０．７３ｇ（１．６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．２２ｇ（１．６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、実施例１の８工程化合物０．８３ｇ（１．６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メチレンクロライド８０ｍｌを投入して攪拌する。トリエチルアミン０．８３ｇ（８．２０ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を投入して、１５時間攪拌する。メチレンクロライドで抽出する。抽出物は硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物１．５５ｇ（暗い青色の固体、９１％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  8.64~8.62ppm  (1H,  d),  8.26~8.22ppm  (1H,  m),  8.16~8.12ppm  (1H,  d),  7.76~7.72ppm  (2H,  d),  7.53~7.52ppm  (1H,  s),  7.46~7.45ppm  (1H,  s),  7.41~7.37ppm  (2H,  d),  7.30~7.16ppm  (7H,  m),  6.82~6.78ppm  (4H,  d),  6.68~6.63ppm  (2H,  d),  6.22~6.18ppm  (1H,  t),  5.90~5.85ppm  (1H,  t),  3.98~3.97ppm  (3H,  s),  3.87~3.86ppm  (1H,  s),  3.76~3.75ppm  (6H,  s),  3.57~3.48ppm  (4H,  m),  3.37~3.36ppm  (1H,  s),  3.28~3.07ppm  (6H,  m),  2.66~2.65ppm  (3H,  s),  2.64~2.60ppm  (1H,  d),  2.51~2.46ppm  (2H,  t),  2.11~2.05ppm  (2H,  t),  1.60~1.43ppm  (4H,  m),  1.34~1.16ppm  (4H,  m)
【００８１】
３−６．６工程化合物の製造−サクシニル化（Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ）
５工程化合物１．５５ｇ（１．５０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、無水コハク酸０．４５ｇ（４．４９ｍｍｏｌ、３ｅｑ）、エン−エン−ジメチルアミノピリジン０．０２ｇ（０．１５ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ）、ピリジン３０ｍｌを投入して５０℃で２０時間攪拌する。常温に温度を下げて、減圧濃縮する。メチレンクロライドで抽出する。抽出物は、硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラム（メチレンクロライド：メタノール＝２０：１）で分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物１．３８ｇ（暗い紫色の固体、８１％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)：  8.79~8.78ppm  (1H,  d),  8.40~8.35ppm  (1H,  dd),  8.27~8.23ppm  (1H,  d),  7.91~7.87ppm  (2H,  d),  7.65~7.57ppm  (2H,  m),  7.43~7.39ppm  (2H,  d),  7.31~7.19ppm  (7H,  m),  6.84~6.80ppm  (4H,  d),  6.75~6.71ppm  (2H,  d),  6.38~6.37ppm  (1H,  m),  6.01~6.00ppm  (1H,  t),  5.21~5.20ppm  (1H,  s),  4.04~4.03ppm  (3H,  s),  3.91~3.70ppm  (8H,  m),  3.50~3.18ppm  (9H,  m),  2.79~2.65ppm  (8H,  m),  2.54~2.51ppm  (2H,  t),  2.15~2.12ppm  (2H,  t),  1.66~1.49ppm  (4,  m),  1.35~1.19ppm  (4H,  m)
【００８２】
３−７．７工程化合物の製造−ＬＣＡＡ−ＣＰＧカップリング（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
エルシエイエイシピジ２ｇ、第６工程化合物０．１８ｇ（０．１６ｍｍｏｌ、２ｅｑ）、ビス−２−オキソ−３−オキサゾリジニルホスホリッククロライド０．０７ｇ（０．１６ｍｍｏｌ、２ｅｑ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．０２ｇ（０．１６ｍｍｏｌ、２ｅｑ）、メチレンクロライド３０ｍｌ、トリエチルアミン０．０９ｇ（０．８８ｍｍｏｌ、１１ｅｑ）を投入する。２０時間反応する。反応終了後、反応額をろ過した後メタノールで洗浄した後、真空乾燥して所望の化合物２ｇを得る。
【００８３】
３−８．工程化合物の製造−キャッピング（Ｃａｐｐｉｎｇ）
７工程化合物２．９ｇ、ピリジン４０ｍｌ、無水酢酸５ｍｌ、１−メチルイミダゾール３．２ｍｌを投入した後、１時間反応する。ろ過して、メタノールで洗浄する。ろ過物を真空乾燥して所望の化合物２３．５ｇ（紫色の固体）を得る。
【００８４】
＜製造例４＞化学式（１４）の化合物（クエンチャー５４５）の製造
【化２４】
0006297035.tif 000036
【化２５】
0006297035.tif 000037
４−１．１工程化合物の製造−アミン化（Ａｍｉｎａｔｉｏｎ）
エン−エチルアニリン１０ｇ（８３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、エチルアクリレート１２．５ｇ（１２０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）、セリウム硝酸アンモニウム４．５ｇ（８．３ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ）を投入して攪拌する。６０℃に温度を上げて１日間攪拌する。常温に温度を下げて、メチレンクロライドで抽出する。抽出液は硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮してコラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物１２．５３ｇ（６８．２％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :7.25~7.17(2H,  t),  6.71~6.64(3H,  m),  4.18~4.09(2H,  q),  3.65~3.58(2H,  t),  3.41~3.32(2H,  q),  2.61~2.54(2H,  t),  1.28~1.21(3H,  t),  1.17~1.08(3H,  t)
【００８５】
４−２．２工程化合物の製造−１回目のアゾカップリング（Ａｚｏ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
ニトロシル硫酸１７．３７ｇ（５４．６７ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）、塩酸２０ｍｌ、メタノール２０ｍｌを投入して攪拌する。−７８℃に温度を下げて２０分間攪拌する。２，５−メトキシアニリン５ｇ（３６．４５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をメタノール１２０ｍｌに溶かして滴下した後、室温に上げて１時間攪拌する。
メタノールに溶かした１工程化合物８．８７ｇ（４０．０９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を滴下した後、１時間攪拌する。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ６〜８になるまで中和する。中和が完了して、１日間攪拌する。減圧濃縮してメタノールを除去する。メチレンクロライドで抽出する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物６．２６ｇ（４６．５％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :7.88~7.85  (2H,  d),  7.44~7.42  (1H,  s),  7.17~7.14  (1H,  d),  6.96~6.93  (1H,  d),  6.75~6.71  (2H,  d),  4.20~4.08  (2H,  m),  4.00~3.95  (3H,  s),  3.74~3.69  (2H,  m),  3.51~3.44  (2H,  q),  2.67~2.62  (2H,  t),  2.34~2.32  (3H,  s),  1.32~1.19  (6H,  m)
【００８６】
４−３．３工程化合物の製造−２回目のアゾカップリング（Ａｚｏ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
硝酸ナトリウム０．７９ｇ（１１．４０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、リン酸１０ｍｌを投入して攪拌する。０℃に温度を下げて２０分間攪拌する。４−アミノピリジン１．０７ｇ（１１．４０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を投入する。室温で３０分間攪拌する。２工程化合物４．２１ｇ（１１．４０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を酢酸６０ｍｌに溶かす。滴下した後、１時間攪拌する。蒸溜水１００ｍｌを投入して、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ４〜８になるまで中和した後、１日間攪拌する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．２５ｇ（４．６％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :8.82~8.80  (2H,  d),  7.93~7.90  (2H,  d),  7.74~7.72  (2H,  d),  7.60~7.58  (1H,  s),  7.45~7.43  (1H,  s),  6.76~6.73  (2H,  d),  4.20~4.13  (2H,  q),  4.05~4.01  (3H,  s),  3.77~3.72  (2H,  t),  3.52~3.47  (2H,  q),  2.75~2.73  (3H,  s),  2.68~2.63  (2H,  t),  1.30~1.21  (6H,  m)
【００８７】
４−４．４工程化合物の製造−加水分解（Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）
３工程化合物０．２５ｇ（０．５３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メタノール２０ｍｌ、メチレンクロライド２０ｍｌを投入して攪拌する。１Ｎ水酸化ナトリウム１．５８ｍｌ（１．５８ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を投入して、３日間攪拌する。１Ｎ水酸化ナトリウム１．５８ｍｌ（１．５８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を追加投入して、１日間攪拌した後、減圧濃縮する。蒸溜水１００ｍｌを投入して攪拌する。１Ｎ塩酸でｐＨ４〜７になるまで中和する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．２４ｇを得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :8.79~8.77  (2H,  d),  7.92~7.89  (2H,  d),  7.74~7.71  (2H,  d),  7.59~7.57  (1H,  s),  7.43~7.41  (1H,  s),  6.78~6.75  (2H,  d),  4.05~4.03  (3H,  s),  3.77~3.75  (2H,  t),  3.54~3.51  (2H,  q),  2.75~2.72  (5H,  m),  1.27~1.22  (3H,  t)
【００８８】
４−５．５工程化合物の製造−アミン保護化（Ａｍｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）
６−アミノカプリン酸１５ｇ（１１４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、トリエチルアミン４８ｍｌ（３４２ｍｍｏｌ、３ｅｑ）、メタノール２３０ｍｌを投入して攪拌する。エチルトリフルオロアセテート１５ｍｌ（１２５ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を投入して、１日間攪拌する。減圧濃縮する。エチルアセテートで抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物１６．６７ｇ（６４％）を得る。
【００８９】
1H  NMR  (300MHz,  DMSO−d6)  :11.99~11.97  (1H,  s),  9.39~9.37  (1H,  s),  3.20~3.12  (2H,  q),  2.22~2.16  (2H,  t),  1.55~1.41  (4H,  m),  1.31~1.19  (2H,  m)
【００９０】
４−６．６工程化合物の製造−ＮＨＳエステル化（Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
５工程化合物５．２８ｇ（２３．２４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メタノール１２０ｍｌ、ピリジン９.３８ｍｌ（１１６．２ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を投入して攪拌する。エン−スクシンイミジルトリフルオロアセテート８．８１ｇ（４１．８３ｍｍｏｌ、１．８ｅｑ）を投入して１日間攪拌する。減圧濃縮する。メチレンクロライドで抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮する。真空乾燥して所望の化合物７．０８ｇ（白色固体、９４．８％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3):  6.80~6.78ppm  (1H,  s),  3.40~3.32ppm  (2H,  q),  2.84~2.82ppm  (4H,  s),  2.64~2.58ppm  (2H,  t),  1.83~1.73ppm  (2H,  m),  1.67~1.57ppm  (2H,  m),  1.52~1.44ppm  (2H,  m)
【００９１】
４−７．７工程化合物の製造−アミド化（Ａｍｉｄａｔｉｏｎ）（Ｃ６−Ｓｐａｃｅｒ）及び  ＤＭＴ添加
６工程化合物１．１７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ジメチルホルムアミド６ｍｌ、３−アミノ−１，２−プロパンジオール０．４９ｇ（５．４２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を投入して１日間攪拌する。メチレンクロライド５０ｍｌを投入して０℃に温度を下げる。ディエムティクロライド１．８３ｇ（５．４２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を投入して攪拌する。トリエチルアミン３．０３ｍｌ（２１．６８ｍｍｏｌ、４ｅｑ）をメチレンクロライド１０ｍｌに希釈して滴下する。室温で４時間攪拌する。減圧濃縮する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．９２ｇ（４１．９％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :7.55~7.53  (1H,  s),  7.43~7.39  (2H,  m),  7.32~7.15  (7H,  m),  6.83~6.78  (4H,  d),  6.17~6.15  (1H,  s),  3.87~3.85  (1H,  m),  3.75~3.73  (6H,  s),  3.68~3.65  (1H,  m),  3.53~3.46  (1H,  m),  3.32~3.22  (2H,  m),  3.20~3.09  (2H,  m),  2.11~2.04  (2H,  t),  1.61~1.46  (4H,  m),  1.33~1.24  (2H,  m)
【００９２】
４−８．８工程化合物の製造−アミン脱保護化（Ａｍｉｎｅ  Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）
７工程化合物０．８４ｇ（１．３９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メタノール５ｍｌを投入して攪拌する。アンモニア溶液（２５％）４．２６ｍｌ（２７．８ｍｍｏｌ、２０ｅｑ）を滴下して、１日間攪拌する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．７８ｇ（＞１００％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :7.42~7.38  (2H,  m),  7.31~7.17  (7H,  m),  6.83~6.78  (4H,  d),  6.61~6.59  (1H,  s),  3.91~3.89  (1H,  m),  3.76~3.74  (6H,  s),  3.54~3.48  (2H,  m),  3.20~3.09  (2H,  m),  2.93~2.89  (2H,  m),  2.16~2.10  (2H,  m),  1.70~1.56  (4H,  m),  1.38~1.31  (2H,  m)
【００９３】
４−９．９工程化合物の製造−アミド化（Ａｍｉｄａｔｉｏｎ）（  Ｃ９−Ｓｐａｃｅｒ）
４工程化合物０．２４ｇ（０．５４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ビス−２−オキソ−３−オキサゾリジニルホスホリッククロライド０．２６ｇ（０．５９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．０８ｇ（０．５９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、８工程化合物０．３ｇ（０．５９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、メチレンクロライド１００ｍｌを投入して攪拌する。トリエチルアミン０．３７ｍｌ（２．６９ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を投入して、１５時間攪拌する。減圧濃縮する。エチルアセテートで抽出する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．４６ｇ（９１．１％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :8.82~8.79  (2H,  d),  7.91~7.88  (2H,  d),  7.74~7.72  (2H,  d),  7.59~7.57  (1H,  s),  7.43~7.34  (3H,  m),  7.30~7.18  (7H,  m),  6.82~6.79  (4H,  d),  6.75~6.72  (2H,  d),  5.94~5.92  (1H,  t),  5.83~5.82  (1H,  t),  4.03~4.01  (3H,  s),  3.86~3.80  (1H,  m),  3.77~3.74  (6H,  s),  3.57~3.44  (4H,  m),  3.27~3.08  (6H,  m),  2.76~2.74  (3H,  s),  2.51~2.40  (2H,  t),  2.10~2.05  (2H,  t),  1.61~1.42  (4H,  m),  1.31~1.17  (5H,  m)
【００９４】
４−１０.１０工程化合物の製造−サクシニル化（Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ）
９工程化合物０．４６ｇ（０．４９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、無水コハク酸０．２５ｇ（２．４６ｍｍｏｌ、５ｅｑ）、エン−エン−ジメチルアミノピリジン０．０３ｇ（０．２５ｍｍｏｌ、０．５ｅｑ）、ピリジン３５ｍｌを投入して攪拌する。６０℃に温度を上げて１日間攪拌する。常温に温度を下げて、減圧濃縮する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は、硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．０３ｇ（５．９％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :8.83~8.81  (2H,  d),  7.92~7.89  (2H,  d),  7.74~7.73  (2H,  d),  7.60~7.58  (1H,  s),  7.43~7.33  (3H,  m),  7.31~7.17  (7H,  m),  6.83~6.80  (4H,  d),  6.74~6.71  (2H,  d),  6.45~6.35  (1H,  s),  5.31~5.17  (1H,  s),  4.05~4.03  (3H,  s),  3.79~3.77  (1H,  m),  3.76~3.74  (6H,  s),  3.48~3.46  (4H,  m),  3.26~3.18  (6H,  m),  2.90~2.60  (7H,  m),  2.64~2.62  (2H,  m),  2.53~2.43  (2H,  m),  1.60~1.28  (4H,  m),  1.25~1.18  (5H,  m)
【００９５】
４−１１．１１工程化合物の製造−ＬＣＡＡ−ＣＰＧカップリング化（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
エルシエイシピジ１６．８ｇ、１０工程化合物１．１４ｇ（１．１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ビス−２−オキソ−３−オキサゾリジニルホスホリッククロライド０．５ｇ（１．１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．１５ｇ（１．１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メチレンクロライド１００ｍｌ、トリエチルアミン０.６ｍｌ（５．５ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を投入する。常温で１日間反応する。ろ過して、メタノールで洗浄する。ろ過物を真空乾燥して所望の化合物１７．１６ｇ（紫色の固体）を得る。
【００９６】
４−１２．１２工程化合物の製造−キャッピング（Ｃａｐｐｉｎｇ）
１１工程化合物１７．１６ｇ、ピリジン９０ｍｌ、無水酢酸３．５９ｍｌ  （３８ｍｍｏｌ）、１−メチルイミダゾール１８ｍｌ（２２５ｍｍｏｌ）を投入した後、１．５時間反応する。ろ過して、メタノールで洗浄する。ろ過物を真空乾燥して所望の化合物１６．７ｇを得る。
【００９７】
＜製造例５＞化学式（１７）の化合物（クエンチャー５３０）の製造
【化２６】
0006297035.tif 000038
【化２７】
0006297035.tif 000039
５−１．１工程化合物の製造−アミン化（Ａｍｉｎａｔｉｏｎ）
エン−エチルアニリン１０ｇ（８３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、エチルアクリレート１２．５ｇ（１２０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）、セリウム（  ）硝酸アンモニウムト４．５ｇ（８．３ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ）を投入して攪拌する。６０℃に温度を上げて１日間攪拌する。常温に温度を下げて、メチレンクロライドで抽出する。抽出液は、硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮してコラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物１２．５３ｇ（６８．２％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :7.25~7.17(2H,  t),  6.71~6.64(3H,  m),  4.18~4.09(2H,  q),  3.65~3.58(2H,  t),  3.41~3.32(2H,  q),  2.61~2.54(2H,  t),  1.28~1.21(3H,  t),  1.17~1.08(3H,  t)
【００９８】
５−２．２工程化合物の製造−１回目のアゾカップリング（Ａｚｏ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
ニトロシル硫酸３．６７ｇ（５３．１２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を投入して０℃に温度を下げて５分間攪拌する。リン酸１００ｍｌを入れて２０分間攪拌する。４−アミノピリジン５ｇ（５３、１２ｍｍｏｌ）を投入して、４０分間攪拌する。中和させた後、室温で１日間攪拌する。
メチレンクロライドで抽出する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物２．０７ｇ（２５．６％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :8.70~8.68  (2H,  d),  7.76~7.73  (1H,  d),  7.63~7.61  (2H,  d),  6.29~6.26  (2H,  m),  4.41~4.13  (2H,  br),  3.97~3.95  (3H,  s)
【００９９】
５−３．３工程化合物の製造−２回目のアゾカップリング（Ａｚｏ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
硝酸ナトリウム０．６３ｇ（９．０７ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）、リン酸２０ｍｌを投入して攪拌する。０℃に温度を下げて２０分間攪拌する。２工程化合物２．０７ｇ（９．０７ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を酢酸３０ｍｌに溶かす。滴下した後、４０分間攪拌する。１工程化合物１．３４ｇ（６．０５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトン２０ｍｌに溶かして投入する。４０分間攪拌する。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した後、１日間攪拌する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は、硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．１１ｇ（３．９％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :8.80~8.78  (2H,  d),  7.93~7.90  (2H,  d),  7.86~7.83  (1H,  d),  7.72~7.70  (2H,  d),  7.60~7.58  (1H,  s),  7.55~7.52  (1H,  d),  6.78~6.75  (2H,  d),  4.21~4.14  (5H,  m),  3.78~3.73  (2H,  t),  3.56~3.49  (2H,  q),  2.69~2.65  (2H,  t),  1.30~1.22  (6H,  m)
【０１００】
５−４．４工程化合物の製造−加水分解（Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）
３工程化合物０．０７ｇ（０．１５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メタノール１０ｍｌ、メチレンクロライド１０ｍｌを投入して攪拌する。１Ｎ水酸化ナトリウム０．４６ｍｌ（０．４６ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を投入して、１日間攪拌する。１Ｎ水酸化ナトリウム１．５８ｍｌ（１．５８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を追加投入して、１日間攪拌した後、減圧濃縮する。蒸溜水５０ｍｌ投入して攪拌する。１Ｎ塩酸でｐＨ４になるまで中和する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．０６ｇ（９２．８％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :8.77~8.75  (2H,  d),  7.90~7.87  (2H,  d),  7.83~7.80  (1H,  d),  7.73~7.71  (2H,  d),  7.59~7.57  (1H,  s),  7.53~7.50  (1H,  d),  6.80~6.77  (2H,  d),  4.14~4.12  (3H,  s),  3.79~3.77  (2H,  t),  3.56~3.53  (2H,  q),  2.75~2.71  (2H,  t),  1.30~1.22  (3H,  m)
【０１０１】
５−５．５工程化合物の製造−アミン保護化（Ａｍｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）
６−アミノカプリン酸１５ｇ（１１４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、トリエチルアミン４８ｍｌ（３４２ｍｍｏｌ、３ｅｑ）、メタノール２３０ｍｌを投入して攪拌する。エチルトリフルオロアセテート１５ｍｌ（１２５ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を投入して、１日間攪拌する。減圧濃縮する。エチルアセテートで抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物１６．６７ｇ（６４％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  DMSO−d6)  :11.99~11.97  (1H,  s),  9.39~9.37  (1H,  s),  3.20~3.12  (2H,  q),  2.22~2.16  (2H,  t),  1.55~1.41  (4H,  m),  1.31~1.19  (2H,  m)
【０１０２】
５−６．６工程化合物の製造−ＮＨＳエステル化（Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
５工程化合物５．２８ｇ（２３．２４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メタノール１２０ｍｌ、ピリジン９．３８ｍｌ（１１６．２ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を投入して攪拌する。エン−スクシンイミジルトリフルオロアセテート８．８１ｇ（４１．８３ｍｍｏｌ、１．８ｅｑ）を投入して１日間攪拌する。減圧濃縮する。メチレンクロライドで抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮する。真空乾燥して所望の化合物７．０８ｇ（白色の固体、９４．８％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3):  6.80~6.78ppm  (1H,  s),  3.40~3.32ppm  (2H,  q),  2.84~2.82ppm  (4H,  s),  2.64~2.58ppm  (2H,  t),  1.83~1.73ppm  (2H,  m),  1.67~1.57ppm  (2H,  m),  1.52~1.44ppm  (2H,  m)
【０１０３】
５−７．７工程化合物の製造−アミド化（Ａｍｉｄａｔｉｏｎ）（Ｃ６−Ｓｐａｃｅｒ）及び  ＤＭＴ添加
６工程化合物１．１７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ジメチルホルムアミド６ｍｌ、３−アミノ−１，２−プロパンジオール０．４９ｇ（５．４２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を投入して１日間攪拌する。メチレンクロライド５０ｍｌを投入して０℃に温度を下げる。ディエムティクロライド１．８３ｇ（５．４２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を投入して攪拌する。トリエチルアミン３．０３ｍｌ（２１．６８ｍｍｏｌ、４ｅｑ）をメチレンクロライド１０ｍｌに希釈して滴下する。室温で４時間攪拌する。減圧濃縮する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は、硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．９２ｇ（４１．９％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :7.55~7.53  (1H,  s),  7.43~7.39  (2H,  m),  7.32~7.15  (7H,  m),  6.83~6.78  (4H,  d),  6.17~6.15  (1H,  s),  3.87~3.85  (1H,  m),  3.75~3.73  (6H,  s),  3.68~3.65  (1H,  m),  3.53~3.46  (1H,  m),  3.32~3.22  (2H,  m),  3.20~3.09  (2H,  m),  2.11~2.04  (2H,  t),  1.61~1.46  (4H,  m),  1.33~1.24  (2H,  m)
【０１０４】
５−８．８工程化合物の製造−アミン脱保護化（Ａｍｉｎｅ  Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）
７工程化合物０．８４ｇ（１．３９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メタノール５ｍｌを投入して攪拌する。アンモニア溶液（２５％）４．２６ｍｌ（２７．８ｍｍｏｌ、２０ｅｑ）を滴下して、１日間攪拌する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は、硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．７８ｇ（＞１００％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :7.42~7.38  (2H,  m),  7.31~7.17  (7H,  m),  6.83~6.78  (4H,  d),  6.61~6.59  (1H,  s),  3.91~3.89  (1H,  m),  3.76~3.74  (6H,  s),  3.54~3.48  (2H,  m),  3.20~3.09  (2H,  m),  2.93~2.89  (2H,  m),  2.16~2.10  (2H,  m),  1.70~1.56  (4H,  m),  1.38~1.31  (2H,  m)
【０１０５】
５−９．９工程化合物の製造−アミド化（Ａｍｉｄａｔｉｏｎ）（Ｃ９−Ｓｐａｃｅｒ）
４工程化合物０．２３ｇ（０．５４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ビス−２−オキソ−３−オキサゾリジニルホスホリッククロライド０．２６ｇ（０．５９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．０８ｇ（０．５９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、８工程化合物０．３ｇ（０．５９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、メチレンクロライド１００ｍｌを投入して攪拌する。トリエチルアミン０．３７ｍｌ（２．６９ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を投入して、１５時間攪拌する。減圧濃縮する。エチルアセテートで抽出する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．４２ｇ（８４．２％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :8.80~8.78  (2H,  d),  7.93~7.90  (2H,  d),  7.86~7.83  (1H,  d),  7.72~7.70  (2H,  d),  7.60~7.58  (1H,  s),  7.55~7.52  (1H,  d),  7.46~7.38  (2H,  m),  7.31~7.17  (7H,  m),  6.82~6.78  (4H,  d),  6.78~6.75  (2H,  d),  6.50~6.44  (1H,  t),  6.15~6.13  (1H,  s),  4.04~4.02  (3H,  s),  4.00~3.98  (3H,  s),  3.88~3.86  (1H,  m),  3.75~3.73  (8H,  m),  3.55~3.21  (4H,  m),  3.23~3.07  (4H,  m),  2.48~2.46  (2H,  t),  2.10~2.04  (2H,  t),  1.58~1.42  (4H,  m),  1.29~1.15  (5H,  m)
【０１０６】
５−１０．１０工程化合物の製造−サクシニル化（Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ）
９工程化合物０．４６ｇ（０．４９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、無水コハク酸０．２５ｇ（２．４６ｍｍｏｌ、５ｅｑ）、エン−エン−ジメチルアミノピリジン０．０３ｇ（０．２５ｍｍｏｌ、０．５ｅｑ）、ピリジン３５ｍｌを投入して攪拌する。６０℃に温度を上げて１日間攪拌する。常温に温度を下げて、減圧濃縮する。メチレンクロライドで抽出する。抽出液は硫酸ナトリウムで乾燥してろ過する。ろ過液を減圧濃縮して、コラムで分離する。減圧濃縮して真空乾燥して所望の化合物０．０３ｇ（６．７％）を得る。
1H  NMR  (300MHz,  CDCl3)  :8.77~8.75  (2H,  d),  7.90~7.87  (2H,  d),  7.83~7.80  (1H,  d),  7.73~7.71  (2H,  d),  7.59~7.57  (1H,  s),  7.53~7.50  (1H,  d),  7.48~7.38  (2H,  m),  7.32~7.18  (7H,  m),  6.84~6.80(4H,  d),  6.80~6.77  (2H,  d),  6.40~6.38  (1H,  t),  5.93~5.91  (1H,  t),  5.24~5.22  (1H,  m),  4.08~4.06  (3H,  s),  4.04~4.02  (3H,  s),  3.91~3.82  (2H,  m),  3.79~3.77  (8H,  m),  3.50~3.46  (2H,  m),  3.29~3.17  (4H,  m),  2.72~2.50  (6H,  m),  2.05~1.96  (2H,  t),  1.64~1.49  (4H,  m),  1.36~1.18  (5H,  m)
【０１０７】
５−１１．１１工程化合物の製造−ＬＣＡＡ−ＣＰＧカップリング化（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
エルシエイシピジ１６．８ｇ、１０工程化合物１．１４ｇ（１．１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ビス−２−オキソ−３−オキサゾリジニルホスホリッククロライド０．５ｇ（１．１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．１５ｇ（１．１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、メチレンクロライド１００ｍｌ、トリエチルアミン０．６ｍｌ（５．５ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を投入する。常温で１日間反応する。ろ過して、メタノールで洗浄する。ろ過物を真空乾燥して所望の化合物１８．０３ｇを得る。
【０１０８】
５−１２．１２工程化合物の製造−キャッピング（Ｃａｐｐｉｎｇ）
１１工程化合物１８．０３ｇ、ピリジン９０ｍｌ、無水酢酸３．５９ｍｌ（３８ｍｍｏｌ）、１−メチルイミダゾール１８ｍｌ（２２５ｍｍｏｌ）を投入した後、１．５時間反応する。ろ過して、メタノールで洗浄する。ろ過物を真空乾燥して所望の化合物１５．００ｇを得る。
前記製造例で製造された生成物の１Ｈ  ＮＭＲ分析は割り当てられた構造と一致した。
【実施例】
【０１０９】
＜実施例１＞オリゴヌクレオチドを利用した蛍光量測定
前記本発明に用いられたクエンチャーの蛍光発光量を確認するために、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（表１）を鋳型鎖にして、３'末端にＢＨＱ１、ＢＨＱ２、クエンチャー５７０、クエンチャー６３０、クエンチャー６４０を各々バインディングさせて合成したオリゴヌクレオチドを利用して蛍光発光性能を２００ｎｍ〜１０００ｎｍまで確認した。
本発明の蛍光発光を確認するために、Ｏｐｔｉｚｅｎ  ＰＯＰ（分光光度計、Ｍｅｃａｓｙｓ社）装備を利用して下記順序により反応した。
（１）各合成されたクエンチャーは、１００ｐｍｏｌｅ／ｕｌに希釈して１ｎｍｏｌｅを反応させる。
（２）表２のように最終体積１００ｕｌで分光光度計で２００ｎｍ〜１０００ｎｍまで蛍光を測定する。
【０１１０】
【表１】
0006297035.tif 000040
【０１１１】
【表２】
0006297035.tif 000041
その結果、各クエンチャーの蛍光が発散されることを確認して、その結果は図１に示した。
【０１１２】
＜実施例２＞クエンチャー５７０を利用したＲＴ−ＰＣＲ分析
クエンチャー５７０で合成されたプローブでＲＴ−ＰＣＲでの性能を確認するために、λファージＤＮＡ（Ｌａｍｂｄａ  ｐｈａｇｅ  ＤＮＡ、バイオニア）を鋳型鎖にしてＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとプローブをデザインした（表３）。
前記本発明に用いられたプローブは、２５ｍｅｒで５'末端に蛍光表紙ファム（ＦＡＭ）、テト（ＴＥＴ）、タムラ（ＴＡＭＲＡ）、ロックス（ＲＯＸ）とテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ）で標識し、３‘末端にはクエンチャー５７０で標識して、対照群として５’末端に蛍光表紙ファム（ＦＡＭ）、テト（ＴＥＴ）、タムラ（ＴＡＭＲＡ）、ロックス（ＲＯＸ）とテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ）で標識して、３'末端にＢＨＱ１、ＢＨＱ２で標識したプローブを用いた。
本発明のリアルタイム定量核酸増幅反応のために、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＤｕａｌＳｔａｒＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（バイオニア社）を利用して、リアルタイム遺伝子増幅装置（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ）のエキシサイクラー（Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ、バイオニア社）装備を利用して下記順序に従って反応を進めた。
（１）Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ（１０ｎｇ／ｕｌ〜１０ｐｇ／ｕｌ）１０−フォルド（ｆｏｌｄ）で準備する。
（２）表４のように試料を合計２０ｕｌずつ準備する。
（３）表５のような条件でＲＴ−ＰＣＲを行う。
【０１１３】
【表３】
0006297035.tif 000042
【０１１４】
【表４】
0006297035.tif 000043
【０１１５】
【表５】
0006297035.tif 000044
その結果、クエンチャー５７０の優秀な消光性能を確認することができた。
【０１１６】
下記表６乃至表１０は、前記ＲＴ−ＰＣＲ実験（図２乃至図６）に対する各々のＣｔ（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を示す。
表６〜表１０までのＣｔの値は、１０−ｆｏｌｄ別ＤＮＡ濃度に応じて測定されるサイクルを記録したもので、本発明に係るクエンチャーを用いる場合、ＤＮＡ濃度に応じて約３.３Ｃｔが差が生じるように測定されることから、これはＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲで安定的に増幅が良好できることを示す。従って、本発明のクエンチャーが既存のクエンチャーであるＢＨＱに劣らない消光能力を持つことを確認することができた。
【０１１７】
【表６】
0006297035.tif 000045
【０１１８】
【表７】
0006297035.tif 000046
【０１１９】
【表８】
0006297035.tif 000047
【０１２０】
【表９】
0006297035.tif 000048
【０１２１】
【表１０】
0006297035.tif 000049
【０１２２】
以上、本発明は、前記で記述された実施例によって限定されず、通常の技術者によって変形及び変更可能であり、その他種々の物学的、化学的分野で利用可能であり、これは添付された請求項で定義される本発明の趣旨と範囲に含まれる。
【図１】
0006297035.tif 000073
【図２】
0006297035.tif 000074
【図３】
0006297035.tif 000075
【図４】
0006297035.tif 000076
【図５】
0006297035.tif 000077
【図６】
0006297035.tif 000078
【配列表】
0006297035000001.app