(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
孔を備える架橋した水和セルロースマトリクスを含む硫酸化水和セルロース膜であって、
該孔が該膜の一方の主表面から他方の主表面へと延びており、
該水和セルロース膜が吸着物質の分離のために該膜の内表面及び外表面上に硫酸配位子を有し、
前記水和セルロースマトリクスの硫酸化度が１５重量％以上であり、かつ、架橋度が少なくとも０．０５であって、
該水和セルロースマトリックスの架橋がジグリシジルエーテルの群から選択される架橋剤を用いて行われている、硫酸化水和セルロース膜。
【請求項２】
前記膜の平均孔径が０．５μｍ〜５．０μｍである、請求項１に記載の硫酸化水和セルロース膜。
【請求項３】
前記水和セルロースマトリクスの架橋度が０．０５〜０．５である、請求項１または２に記載の硫酸化水和セルロース膜。
【請求項４】
孔径が０．１μｍ〜２０μｍの水和セルロース膜を準備する工程と、
水和セルロースマトリクスのヒドロキシル基と反応する官能基を分子中に少なくとも２つ有する架橋剤を用いて、前記水和セルロースマトリクスを架橋する工程であって、該架橋剤がジグリシジルエーテルの群から選択される工程と、
該架橋した水和セルロースマトリクスを硫酸化する工程とを含み、
該硫酸化が７０℃〜９０℃の温度で行われる、請求項１に記載の硫酸化水和セルロース膜を作製する方法。
【請求項５】
１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル又はエチレングリコールジグリシジルエーテルを架橋剤として使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
架橋溶液中の前記架橋剤の濃度が１０重量％〜３０重量％である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記硫酸化が、前記架橋した水和セルロースマトリクスとルイス塩基−ＳＯ３錯体とを反応させることにより起こる、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記硫酸化がＳＯ３−ピリジン錯体との反応により起こる、請求項４から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
硫酸化溶液中の前記ＳＯ３−ピリジン錯体の濃度が１重量％〜４０重量％である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルス又はウイルス断片の精製のための吸着膜としての請求項１から３のいずれかに記載の硫酸化水和セルロース膜の使用。
【請求項１１】
分子質量が１０７Ｄａより大きいウイルスの精製のための請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
インフルエンザウイルスの精製のための請求項１０又は１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸化水和セルロース膜、それを製造する方法、及びウイルス精製のための吸着膜としての該膜の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ（インフルエンザウイルス）は、インフルエンザウイルスにより引き起こされる上気道及び下気道の感染性の強い急性感染症である。インフルエンザは特に冬場において世界規模の伝染病（エピデミック）として発生し、個々のウイルスがパンデミックを引き起こすこともある。インフルエンザの大流行（アウトブレイク）を抑えるための現在の戦略は、抗ウイルス治療、例えば、ノイラミニダーゼ阻害剤と併せた予防ワクチン接種に基づくものである。大部分の季節性ヒトインフルエンザワクチンは不活化した三価のスプリットビリオンワクチンである。これらは３種の異なるインフルエンザウイルス亜型のウイルス抗原、エンベロープ糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）から構成されている。それぞれの抗原は、洗剤（detergents）（例えば、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）又はＴｗｅｅｎ  ２０（ポリソルベート２０））を用いた膜の可溶化により精製されたウイルス粒子から得られる。
【０００３】
古典的な産生プロセスでは、インフルエンザウイルスは孵化鶏卵において産生されている。このプロセスの規模設定性（scalability：スケーラビリティ）の制限及びそれに関連する問題に加えて、世界市場の高まる需要を満たすのに、鶏卵において個々のパンデミックインフルエンザウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１）を産生することには体系的な難しさがある。最後に、ニワトリタンパク質に対するアレルギー反応の問題はまた、バイオリアクタにおける哺乳動物細胞を用いた産生プロセスがここ数年の間に確立されていることも意味している。ウイルスを細胞培養物中で培養した後、ウイルスを更に純粋な形で使用することができるように、ウイルスを汚染物質（例えば、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ）から分離する必要がある。また、感染物を非感染性の分子又は粒子から分離することが有益である。生物製剤製造プロセスにおいて、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、及び宿主細胞培養物から生じる他のタンパク質が副産物として発生する。これらは一般的に汚染物質とみなされ、作業中に最終生成物から取り除かなければならない。ウイルスの産生では宿主細胞又はウイルス自体のＤＮＡ断片も放出され、これも取り除かなければならない。
【０００４】
クロマトグラフィ精製による固相上へのウイルスの吸着はウイルス精製、とりわけプロセス規模でのウイルス精製において重大な意味を持つ。これには、分子を吸着材料（イオン交換、疎水性又は親水性の吸着剤）に結合し、続く工程において精製した形で溶出することができるという特徴がある。この場合、高収率が達成されるように、吸着プロセスを可逆的に進行させることが重要である。単純な濃縮又は２つ以上の標的物質への分離のいずれかを行うことができ、後者の場合、吸着若しくは脱着のいずれか、又はその両方を選択的にもたらすことができる。この目的で用いられるクロマトグラフィ媒体の主な不利点は相対的に低い選択性であり、溶液中に存在する汚染物質（ＤＮＡ断片及び宿主細胞タンパク質）も吸着材料に結合する可能性があり、そのため最適な結合条件及び溶出条件（ｐＨ、イオン強度及び緩衝系の選択）を求めるのに、長いプロセス開発期間を要する。
【０００５】
親和性クロマトグラフィによって選択性の向上がもたらされる。硫酸化セルロースマトリクスによってインフルエンザウイルス及びヘパリン結合タンパク質に対する選択性が向上することは従来技術より知られている。
【０００６】
特許文献１には、抗凝固剤として使用するためのヘパリン様効果を有するセルロース硫酸塩が開示されている。生理学的条件下における所望の高い長期安定性とともに、抗凝固効果が十分高いことから、セルロースの硫酸化度（グルコピラノース単位のＣ２、Ｃ３及びＣ６原子上のＯＨ基の硫酸基による置換度）は０．８〜２．６である。セルロース硫酸塩は、３つの異なる方法：アミンの存在下でのクロロ硫酸との反応、ＳＯ３−アミド錯体との反応（ここでは例えば、ジメチルホルムアミドをアミドとして使用することができる）、又はＳＯ３−アミン錯体との反応（ここでは例えば、ピリジンをアミンとして使用することができる）により得ることができる。上述の後者の変形形態では、セルロースをＳＯ３−ピリジン錯体と室温にて３０分〜３５分反応させた後に、ＮａＯＨにて中和させる。
【０００７】
特許文献２には、アトピー性湿疹等の皮膚障害のための治療有効成分としてセルロース硫酸塩が開示されている。セルロース硫酸塩はヒアルロニダーゼに対する阻害効果を特徴とし、セルロース硫酸塩の総重量に対する硫酸塩含量は６．５重量％〜１９．０重量％である。調製に際して、初めに結晶性セルロースをピリジン、ジメチルスルホキシド又はジメチルホルムアミド等の溶媒にて予め膨潤させておく。得られた混合物をクロロスルホン酸、ピペリジン−硫酸錯体、ＳＯ３−ピリジン錯体、ＳＯ３−トリメチルアミン錯体又は無水硫酸−ジメチルホルムアミド錯体からなる群より選択される硫酸化試薬に添加する。ここでは後者に述べた錯体が好ましい。
【０００８】
特許文献１及び特許文献２の上述の文献のどちらにも、ウイルスを精製するためのクロマトグラフィ分離材料は何ら開示されていない。このような分離材料はゲルとして市販されており、上述の分子及びウイルスの精製に使用される。ウイルスを精製するのにこれらの媒体を使用することで、ウイルスに対する結合能が低くなるとともに、ウイルス収率が低くなることが多い。ウイルスのサイズは最大５００ｎｍとなる場合があるため孔径が３０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲の粒状クロマトグラフィゲルは全く適していない。そのため、ウイルスは通例、粒子の外表面にしか結合することができず、これにより低い結合能が説明される。
【０００９】
セルロース、デキストラン又はアガロースから構成されるクロマトグラフィゲルの硫酸化、及びインフルエンザウイルスを精製するためのこれらの硫酸化ゲルの使用は従来技術より知られている。例としては、非特許文献１には、「セルファイン  ＧＨ−２５」、「Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ」又は「Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０」をクロロスルホン酸−ピリジン錯体を用いて６５℃〜７０℃で硫酸化した後にＮａＯＨにて中和し、リン酸緩衝生理食塩溶液にて洗浄することにより調製することができる親和性クロマトグラフィゲルが開示されている。このゲルはＢ型肝炎抗原、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−３ウイルス、ＳＶ４０−Ｔ抗原、凝血因子７、８、９及び１１、核酸ポリメラーゼ、インターフェロン又はリゾチーム等のタンパク質の精製に適している。
【００１０】
特許文献３には、アガロース、デキストラン又はセルロースベースの（部分的に）結晶性の多糖ゲルを、クロロスルホン酸又は無水硫酸のピリジンを用いて６５℃〜７０℃で硫酸化する方法が記載されている。多糖ゲルの硫酸化度は概して、０．１％〜４０％であり、セルロースゲルの硫酸化度は特に０．１％〜５％である。ニワトリ胚細胞培養物由来のインフルエンザウイルス又は抗原を硫酸化セルロースゲルにて精製することができる。
【００１１】
特許文献４には、５００ｋＤａのデキストランの「延長剤（extender）」分子が結合した多孔質多糖マトリクス、好ましくはアガロース由来の多孔質多糖マトリクスが開示されており、ここではウイルスを精製するために配位子（ligand）として硫酸基が順にデキストラン分子に結合している。マトリクスはウイルス、好ましくはインフルエンザウイルスをＤＮＡ汚染物質から分離するのに使用され、ここでウイルスは初めにマトリクス上に吸着された後に好適なバッファーにて溶出される。上述のマトリクスを調製するために、硫酸配位子を初めに「延長剤」分子に結合させた後、硫酸化「延長剤」分子を多糖マトリクス上に固定する。
【００１２】
特許文献５には、ニワトリ胚細胞培養物から狂犬病ウイルスを精製するための特許文献３より知られる硫酸化セルロースゲルの使用が開示されている。
【００１３】
特許文献６には、哺乳動物細胞培養物の溶解物から得られる、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２型の単純ヘルペスウイルスの構成要素としての糖タンパク質ｇＡ及びｇＢを精製するための特許文献３より知られる硫酸化セルロースゲルの使用が開示されている。糖タンパク質ｇＡ及びｇＢはアニオン性又は非イオン性界面活性剤の存在下にて精製される。
【００１４】
特許文献７には、ワクチン製造のために日本脳炎ウイルスを精製する方法が開示されており、ここでは特許文献３より知られる硫酸化セルロースゲルが使用されている。
【００１５】
上述の全ての文献において、粒状多孔質ゲル粒子からなるクロマトグラフィ分離媒体が開示されている。この目的上、分画分子量（Molecular weight cut-off：ＭＷＣＯ）が１０７Ｄａ未満の多糖ゲルが硫酸化反応の基材として用いられている。非特許文献２に記載されるように、例えば直径が１００ｎｍより大きく、分子質量（ＭＷ）が１０８Ｄａより大きいインフルエンザウイルス等のウイルスは記載の多孔質分離材料の孔に限られた程度しか浸透することができず、この場合これらの分離材料の結合能は部分的にしか発揮することができない。
【００１６】
粒状吸着剤とは対照的に、吸着膜はウイルスに完全に接近可能な十分に大きい孔を備えている。加えて、吸着膜は２つの主表面間の水圧差を適用することで媒体によって灌流させる可能性が与えられることで、吸着剤内部への濃度勾配方向での吸着剤の純粋な拡散輸送ではなく、高流量にてはるかに迅速に達成することができる対流輸送が実現する。このようにして粒状吸着剤の更に固有の不利点を回避することができる。この不利点は「拡散制限（diffusion limiting）」と称され、吸着剤の粒径が増大するとともに、吸着剤のモル質量が増大するにつれて、吸着平衡を確立するのに要する時間が大幅に増大し、これが吸着速度の低下に繋がるという事実から成り立っている。この理由から、例えばインフルエンザウイルスの精製においてクロマトグラフィゲルでは一般的に、低流量しか実現されない。
【００１７】
セルロースベースの硫酸化膜吸着体は水和セルロース膜を硫酸化することで既に製造に成功しており、硫酸化は典型的に、反応に適した溶媒中におけるセルロース膜とルイス塩基−ＳＯ３錯体との反応により達成される。従来の硫酸化多糖ゲルに比べて、硫酸化膜吸着体には下記の利点がある：
―粒状分離材料での拡散「流」とは反対の対流
―可能な限り高い流量
―配位子へのより良好な接近性（accessibility：アクセシビリティ）及びウイルスに対するより高い結合能
―より単純な規模設定性、すなわち低容量の膜吸着体から大容量の膜吸着体への規模の増大。
【００１８】
容量は配位子密度及び利用可能な結合表面に応じた機能であることから、通例、膜の孔径を低減することにより増大するが、流動性及び閉塞特性に関して悪影響を及ぼす場合がある。
【００１９】
特許文献８には血漿からＨＩＶウイルスを除去するための微多孔質膜が開示されており、該微多孔質膜は疎水性基材、例えばポリプロピレン、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンからなり、膜の上にアルコキシアルキルアクリレート、グリシジルアクリレート又はアクリルアミドの鎖がグラフト重合されている。硫酸化セルロースがこの中間グラフト層上に共有結合により固定化されており、ここで、例えば、硫酸化セルロースの遊離ＯＨ基がグラフト鎖の反復単位の官能基、例えばエポキシド基と反応する。ＨＩＶウイルスは硫酸化セルロース単位により主に除去される。
【００２０】
特許文献９には、硫酸化度（スルホニル基含量）が０．５％〜１５％の非架橋の硫酸化セルロース膜の作製方法が開示されており、該セルロース膜は４０℃以下でクロロスルホン酸−ピリジン錯体と反応する。クロロスルホン酸−ピリジン錯体は最大０℃でクロロスルホン酸をピリジンに添加した後、６０℃で反応させ、最大４０℃に冷却することにより調製される。硫酸化セルロース膜は、非架橋の再生セルロース膜（例えば、ワットマン製のＲＣ−５５膜）から作製することができ、タンパク質含有ウイルス断片の精製又は無傷ウイルス粒子の精製のために親和性クロマトグラフィに使用され、続いてインフルエンザワクチン製造に使用する。
【００２１】
非特許文献３には、強化された非架橋のセルロース膜とクロロスルホン酸のピリジン溶液とを３７℃で１２時間反応させることによる硫酸化セルロース膜の作製が開示されている。硫酸化セルロース膜の乾燥膜１ｇ当たり１６μｇの硫黄という硫黄含量は、粒状吸着剤セルファイン（登録商標）  サルフェイト（乾燥膜１ｇ当たり７００μｇ以上の硫黄）よりも顕著に低い。硫酸化セルロース膜は３つのインフルエンザ株、すなわちＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及び「Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４」ウイルスの精製に用いられ、ここでは二本鎖ＤＮＡ又は細胞構成要素等の不要な汚染物質がウイルスの製造に用いられる細胞培養溶液から効果的に除去される。精製に用いられるバッファー溶液中のＮａＣｌ濃度が増大するにつれて（５０ｍＭに対して１５０ｎＭ）、ウイルスに対する膜の吸着能が低減する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）  Ｓ７５又はＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）  Ｃ７５等のカチオン交換膜と比べて、硫酸化セルロース膜では、二本鎖ＤＮＡの喪失が改善され、セルファイン（登録商標）  サルフェイトベースのクロマトグラフィカラムよりもウイルス収率が高くなる。
【００２２】
特許文献１０では、上述の非特許文献３により知られる硫酸化セルロースマトリクスの作製におけるセルロースマトリクスの硫酸化度、ＭＶＡウイルスに対する吸着能、及び細胞培養溶液由来のＤＮＡによる精製ＭＶＡウイルス調製物の汚染に対する反応温度の影響が調査されている。硫酸化における反応温度が増大するにつれて（３５℃、４０℃又は４５℃）、セルロースマトリクスの硫酸化度がセルロースポリマー骨格の重量に対して５．３重量％から１３重量％へと増大し、精製ウイルス調製物におけるＤＮＡ画分は７．４％から１７％へと増大し、精製ＭＶＡウイルスの収率は６６％から８０％へと増大する。硫酸化セルロースマトリクスを用いたウイルス調製物の精製は疎水性相互作用クロマトグラフィの更なる段階と組み合わせることができ、フェニル配位子、ブチル配位子又はヘキシル配位子を有するクロマトグラフィマトリクスが使用される。
【００２３】
特許文献９より知られる方法を用いた場合、相対的に微細な膜（孔径が０．４５μｍのワットマン製のＲＣ−５５膜）を使用しても１５％を超える硫酸化度を実現することはできない。また、ウイルス吸着中に膜の流量の喪失及び閉塞が起こり得ることから、選択された孔径は直径が１００ｎｍより大きいウイルスと結合するのにも不都合である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】欧州特許出願公開第００５３４７３号
【特許文献２】欧州特許出願公開第１６９８６４１号
【特許文献３】欧州特許出願公開第０１７１０８６号
【特許文献４】国際公開第２００８／０３９１３６号
【特許文献５】欧州特許出願公開第０１７１７７１号
【特許文献６】欧州特許出願公開第０１７３２６８号
【特許文献７】欧州特許出願公開第０１７１７６５号
【特許文献８】米国特許第５６６７６８４号
【特許文献９】米国特許第８１７３０２１号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１２／０１７１７５０号
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】ＲＤ２９８０２５Ａ
【非特許文献２】R. W. H. Ruigrok et al. in J. Gen. Virol. (1984), 65, 799-802
【非特許文献３】L. Opitz et al., Biotechnology and Bioengineering. 103 (6), 2009, 1144-1154
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、本発明の目的は、ウイルスの精製、例えばインフルエンザウイルス精製のための膜を提供することであり、該膜は一方で単離される標的化合物に対する高い選択性を有し、他方で高流量にてウイルスの製造に用いられる細胞培養溶液からの二本鎖ＤＮＡ又は細胞構成要素等の望ましくない汚染物質の効率的な除去を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
この目的は特許請求の範囲において特徴付けられる主題により実現される。
【００２８】
特に、本発明は、孔を備える架橋した水和セルロースマトリクスを含む硫酸化水和セルロース膜であって、該孔は該膜の或る主表面から他方の主表面へと延びており、該水和セルロース膜は吸着物質の分離のために該膜の内表面及び外表面上に硫酸配位子を有する、硫酸化水和セルロース膜を提供する。
【００２９】
本発明によると、硫酸化水和セルロース膜は吸着膜である。言及される吸着膜は孔が一方の側からもう一方の側へと貫通しているシート状吸着剤である。吸着剤は配位子と称される表面官能基を介して流体の特定構成成分との選択的な結合を可能にする多孔質体である。標的物質（複数の場合もあり）及び／又は汚染物質（複数の場合もあり）は本発明では吸着質と称され、２種以上の異なる物質の形態をとることもある。吸着質は個々の分子、会合体（associates）又は粒子とすることができ、標的物質（複数の場合もあり）の場合、ウイルスであることが好ましい。
【００３０】
本発明によると、水和セルロースマトリクスの架橋が達成された後、水和セルロースマトリクスを続くプロセス工程にて硫酸化させる。驚くべきことに、硫酸化する水和セルロース膜の事前の架橋によって、逆浸透水（ＲＯ水）の浸透性の増大、硫酸配位子密度の増大、結合能の向上、及び単離する標的化合物、特にインフルエンザウイルスに対する結合選択性の向上が起こるとみられており、これらの有益な効果は、硫酸化前に架橋していない硫酸化セルロース膜を用いても実現することはできない。特許文献９及び特許文献１０とは対照的に、驚くべきことに架橋したセルロース膜の硫酸化により、従来技術により実現可能なものよりも顕著に高い硫酸配位子密度を実現することができる。
【００３１】
本発明による硫酸配位子密度は硫酸化度により決定され、本発明による硫酸化水和セルロース膜の好ましい実施の形態によれば、水和セルロースマトリクスの硫酸化度は１０重量％以上であり、より好ましくは１５重量％以上であり、特に好ましくは２０重量％を超え、これによってウイルス製造を支持する選択性の改善が起こる。本発明によると、硫酸化度は硫酸化水和セルロースマトリクス上の硫酸基の質量比を意味するものと理解される。硫酸化度は滴定により定量的に求められ、膜上の硫酸基の定量的な量は、例えば水酸化ナトリウム水溶液を用いて求めることができる。
【００３２】
硫酸化度は下記式を用いて本発明に従って求められる：
硫酸化度（重量％単位）＝（ｎ硫酸塩×Ｍ（ＳＯ３）／（ｍセルロース＋（ｎ硫酸塩×Ｍ（ＳＯ３）））×１００％
（式中、
ｍセルロース＝膜当たりのセルロースの質量（μｇ／ｃｍ２）であり、
硫酸基密度ｎ硫酸塩は下記式：
硫酸基密度：ｎ硫酸塩（μｍｏｌ／ｃｍ２）＝ｃ（ＮａＯＨ）×ｔ（ＮａＯＨ）×Ｖ（ＮａＯＨ）×１０００／Ａ
（式中、
ｃ（ＮａＯＨ）は水酸化ナトリウム水溶液滴定液の定量濃度（ｍｏｌ／ｌ単位）であり、
Ｖ（ＮａＯＨ）は当量点（ｐＨ７）で消費される滴定液の量（ｍｌ単位）であり、
ｔ（ＮａＯＨ）は滴定液の補正係数であり、
１０００はｍｏｌ／ｌからμｍｏｌ／ｍｌへの換算係数であり、
Ａは有効フィルター表面（ｃｍ２単位））を用いて決定され、
Ｍ（ＳＯ３）はＳＯ３のモル質量（μｇ／μｍｏｌ単位）である）。
【００３３】
非架橋のセルロース膜の硫酸化と比較すると、硫酸配位子密度は、驚くべきことに本発明によるセルロース膜の架橋により、従来技術の比較例と比べて最大３０倍増大させることができる（表２におけるサンプル１及びサンプル３）。これは平均孔径が０．４５μｍより大きいセルロース膜であっても可能である。
【００３４】
水和セルロース膜の事前の架橋の更なる驚くべき結果は、それに関連する浸透圧の増大、及び硫酸配位子密度が増大するにも関わらず小タンパク質又は汚染物質、例えば宿主細胞タンパク質に対する結合能の低減であり、その結果ウイルス製造に有益な選択性の改善が起こる。
【００３５】
下記のように、本発明による膜を作製する方法は、膜の架橋及び膜の硫酸化という２つの工程にて行うことができる。
【００３６】
架橋度、孔径、並びにその結果として膜の浸透性及び更なる硫酸化反応に対するヒドロキシル基の接近性を、架橋剤の種類、架橋剤の濃度、任意に用いられる架橋触媒の濃度、架橋期間、必要に応じて不活性有機溶媒の種類及び濃度、及び／又は架橋温度により制御することができる。
【００３７】
本発明による硫酸化水和セルロース膜の好ましい実施の形態によると、架橋度は０．０５〜０．５であり、二官能性架橋剤との反応によるセルロースの無水グルコース単位の平均置換度が架橋度（ＤＣ）の基準として選択される。この場合、本発明による架橋度は国際公開第９５／３２７９３号に記載のように、以下のように定義される：
ＤＣ＝３．２４×ΔＭ／Ｍｖ
（式中、
ＤＣ：本発明による膜の架橋度であり、
ΔＭ：出発膜（starting membrane）の初期質量の架橋による本発明による膜の質量増分（％単位）であり、
Ｍｖ：架橋剤のモル質量である）。
【００３８】
二官能性架橋剤から開始し、これらのそれぞれが２つのセルロースモノマー単位と結合すると仮定すると、多くても３つの架橋剤分子が２つのセルロースモノマー単位と反応することができる。これらの合わせたモル質量は３２４ｇ／ｍｏｌである。ＤＣの理論的な最大可能な値は、セルロースモノマー単位の３つの架橋性ヒドロキシル基に起因して多くとも３である。
【００３９】
本発明によると、硫酸化水和セルロース膜は吸着物質の分離、特にウイルスの効率的な精製に適している。これは特に標的物質が膜表面を塞がず、高流量を維持することができるように、本発明による硫酸化水和セルロース膜の分子量カットオフが選択される場合に可能である。所望の標的物質に応じて、標的物質が硫酸化水和セルロース膜内に吸着され、続いて膜から溶出させることができるように分子量カットオフを設定することができる。本発明による膜の平均孔径は好ましくは０．５μｍ〜５．０μｍ、特に好ましくは１．０μｍ〜３．０μｍである。
【００４０】
出発膜：
平均孔径が０．１μｍ〜２０μｍ、好ましくは０．５μｍ〜１５μｍ、より好ましくは１μｍ〜１０μｍの本発明による方法における出発膜として用いられる水和セルロース膜は、例えばL. J. Zeman et al., "Microfiltration and ultrafiltration principles and applications", Marcel Dekker 1996, "Part I", "Chapter 3.1"、独国特許出願公開第１０３２６７４１号及び独国特許出願公開第３４４７６２５号に記載されているような技術分野より知られる慣習的な作製方法により作製する。平均孔径を求めるために、「毛管流ポロメトリー試験（capillary flow porometry test）」を実施した。詳細は「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｆｌｏｗ  Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ  ６．０」（ＣＡＰＷＩＮソフトウェアシステム、Porous Materials Inc．）の操作説明書に見ることができる。
【００４１】
本発明によると、水和セルロース膜が形成される場合、セルロースエステル膜は、任意に下記の前処理を受け、好適な鹸化媒体を用いて鹸化されていることが好ましい。前処理媒体の種類に応じて、セルロースエステル膜は鹸化工程にて乾燥状態で又は湿潤状態で使用することができる。
【００４２】
セルロースエステル膜はセルロースモノアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースブチレート及びセルロースアセトブチレート若しくは他の好適なセルロースエステル、若しくはセルロースニトレート、メチルセルロース若しくはエチルセルロース、又はそれらの混合物に基づくものとすることができ、セルロースアセテート（複数の場合もあり）、特にセルロースジアセテートが好ましい。この場合、セルロースエステル膜は鹸化工程前に好適な媒体にて前処理することができ、ここでの前処理媒体はセルロースエステルに対する溶解又は軟化効果を有する１つ又は複数の添加剤を含んでいる。好適な添加剤はとりわけ酸、特に酢酸等のカルボン酸、並びにジアセチン、トリアセチン及びスルホラン等のセルロースエステルのための水溶性軟化剤である。
【００４３】
鹸化媒体は好ましくはアルカリ化合物、好ましくはアルカリ金属水酸化物を含む。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化リチウムの水溶液を使用することが特に好まれる。アルカリ金属水酸化物と、アルカリ金属炭酸塩、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素ナトリウム、及び／又は三リン酸ナトリウム、三リン酸カリウム、ケイ酸ナトリウム及びケイ酸カリウム等の他のアルカリ化合物との混合物を使用してもよい。
【００４４】
結果として生じる水和セルロース膜は任意の適切な厚さを有することができる。膜の厚さは好ましくは５０μｍ〜５００μｍの範囲、より好ましくは１００μｍ〜３００μｍの範囲である。得られる水和セルロース膜はシート状の膜として又は円筒状に形成することができる。円筒状の膜は中空繊維膜、毛管膜又は管状膜と称される。
【００４５】
架橋：
架橋剤はセルロース膜のヒドロキシル基と反応する官能基を分子中に少なくとも２つ有し、それによりセルロース膜の架橋を可能にするものである。例えば、セルロース膜の架橋は、セルロースポリマー鎖のヒドロキシル基に対して反応性のある官能基を少なくとも２つ有する上述の架橋剤により、２つのセルロースポリマー鎖の（分子間）連結又はセルロースポリマー鎖の反復単位の（分子内）連結を介して達成される。用いることができる架橋剤は原則、何ら特定の制限を受けることなく、当業者であれば、続く硫酸化の反応条件に対して架橋剤を選択することができる。しかしながら、架橋工程においては、ジエポキシド化合物、又は更にセルロースのヒドロキシル基と反応性のある反応性官能基を少なくとも２つ有する他の化合物、例えばジイソシアネート、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジメチル尿素、ジメチルエチレン尿素、ジメチルクロロシラン、ビス（２−ヒドロキシエチルスルホン）、ジビニルスルホン、アルキレンジハライド、ヒドロキシアルキレンジハライド及びジグリシジルエーテルを使用することが好まれる。架橋工程にジエポキシド化合物を使用することが特に好まれる。
【００４６】
ジグリシジルエーテルの群でも、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル及びポリエチレングリコールジグリシジルエーテルが好まれる。
【００４７】
架橋剤として１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル又はエチレングリコールジグリシジルエーテルを使用することが特に好まれる。
【００４８】
任意に異なる架橋剤の混合物を使用してもよい。
【００４９】
架橋は水性媒体、有機溶媒又は更には水と有機溶媒との混合物にて行うことができる。架橋は水性媒体にて行うのが好ましい。
【００５０】
水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム等の架橋触媒を使用して、架橋剤によるセルロースの架橋を促進するのも好まれる。
【００５１】
架橋工程に用いられる媒体の温度は約４℃〜最大で架橋媒体の沸点とすることができ、５℃〜約８５℃の範囲の温度が好ましい。２０℃〜４０℃の温度が特に好まれる。
【００５２】
架橋期間は通例、数分〜最大で数日であり、１５℃〜３０℃で１２時間〜７日間の架橋期間が好ましい。１日〜３日の架橋期間が特に好まれる。本発明による膜を作製するための本発明による方法の好ましい実施の形態では、架橋溶液中の架橋剤の濃度は１０重量％〜３０重量％である。
【００５３】
上記のように、本発明による硫酸化水和セルロース膜の架橋度は、少なくとも０．０５、より好ましくは少なくとも０．０７、特に好ましくは少なくとも０．１である。架橋度の閾値上限は好ましくは０．５、より好ましくは０．４、特に好ましくは０．３である。
【００５４】
更に有益には、本発明による膜は架橋に起因して化学安定性がより高く、そのため続く硫酸化プロセス中においてより高い反応温度（最大９０℃）に耐えることができる。
【００５５】
硫酸化：
硫酸化は架橋した水和セルロース膜とルイス塩基−ＳＯ３錯体との反応により達成される。この反応は、アミンの存在下でのクロロ硫酸を用いて、ＳＯ３−アミド錯体との反応（ここではジメチルホルムアミドがアミドとして好ましく使用され得る）により、又はＳＯ３−アミン錯体との反応（ここではピリジン又はトリメチルアミンがアミンとして好ましく使用され得る）により達成することができる。ＳＯ３−ピリジン錯体がこの反応に特に好ましい。
【００５６】
硫酸化溶液中のＳＯ３−ピリジン錯体の濃度は通例、１重量％〜４０重量％であり、１０重量％〜３０重量％の濃度が特に好まれる。
【００５７】
通例、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン又は２−ピロリドン等の非プロトン性極性溶媒を、ＳＯ３−アミン錯体との反応の溶媒として使用することができる。２−ピロリドンが特に好まれる。
【００５８】
反応期間は３０分〜２４時間であり、１時間〜４時間の反応期間が特に好まれる。
【００５９】
反応温度は２０℃〜９０℃であり、７０℃〜９０℃の反応温度が特に好まれる。
【００６０】
本発明は下記実施例及び図１〜図３を用いて詳細に説明される。これらを示す。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明による膜の硫酸化度、ＲＯ水に対する浸透性、及びリゾチームに対する結合能に対する架橋度の影響を示す図である。
【図２】インフルエンザウイルス及びリゾチームに対する動的結合能を示す図である。
【図３】ＨＣＰ溶液（「宿主細胞タンパク質（host cell protein）」溶液）が投入された、従来技術の硫酸化多糖ゲル及び本発明の硫酸化セルロース膜の破過曲線を示す図である。
【実施例】
【００６２】
５つの異なる膜を、架橋の影響を説明するために機能化した。２つの異なる硫酸化方法を同じ孔径の架橋した水和セルロース膜及び非架橋の水和セルロース膜（比較例）の両方に適用した（サンプル１〜サンプル４）。
【００６３】
更なるサンプルを調製し、これを実施例１に従って架橋し、実施例２に従って硫酸化した（サンプル５）。このサンプルは平均孔径が１．２μｍとより狭い出発膜を硫酸化に使用したという点でサンプル１〜サンプル４とは異なる。膜サンプルは全て、実施例５〜実施例８に従って特徴付けられた。結果は表２にまとめている。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）  Ｓサンプルはスルホン酸配位子を有する水和セルロース膜である。
【００６４】
図１は、架橋度の増大が硫酸化度の増大をもたらすだけでなく、ＲＯ水の流量の増大ももたらすことを示している。加えて、本発明に従って架橋した硫酸化膜は、実験によりリゾチーム等の負に帯電した小タンパク質に対する顕著に低い動的結合能を示すことから、汚染物質と比べてインフルエンザウイルスに対してより高い選択性を有している。図１の硫酸化度は重量％にて述べられている。表１には、図１の膜を作製するのに用いた架橋溶液の組成の詳細が含まれる。
【００６５】
図２は、本発明によるサンプル２、サンプル４及びサンプル５の膜が、比較例として選択されたサンプル１及びサンプル３の膜よりもインフルエンザウイルスに対してより高い動的結合能を有することから、明白により良好な結合特性を有することを示している。サンプル５の膜はサンプル１及びサンプル３と比べてインフルエンザウイルスに対して少なくとも１０倍高い動的結合能を有する。加えて、サンプル２、サンプル４及びサンプル５の膜では、リゾチーム等の正に帯電した小タンパク質の汚染物質に対する結合能が非架橋のサンプル１及び３、並びにカチオン交換スルホン酸基を配位子として有する「Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）  Ｓ」膜のものの僅か１／３である。したがって本発明によるサンプル５の膜は調べた全てのサンプルの中でインフルエンザウイルスとの結合に対する最大の選択性を有している。
【００６６】
図２における「Ｅ＋１２」という記述は「×１０１２」を意味する。
【００６７】
図３に表されるＨＣＰ溶液（宿主細胞タンパク質（host cell protein）溶液）による破過曲線は、サンプル４の硫酸化膜が、従来の硫酸化多糖ゲルとは異なり、実際には宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）等の汚染物質と全く結合しないことを示している。この際、ＪＮＣ社製のセルファイン（登録商標）  Ｓｕｌｆａｔｅ及びＧＥヘルスケア社製のＣａｐｔｏ（登録商標）  ＤｅＶｉｒＳを比較に用いた。本発明によるサンプル４の膜では、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の即時の破過が起こり、このことはこの膜がＨＣＰと全く結合しないことを証明するものである。比較例とみなされる硫酸化ゲルでは、最初に用いたＨＣＰ溶液のＵＶシグナルは、１００ｍｌのカラム容量（ＣＶ［ｍｌ］＝カラム容量（ｍｌ単位））後にのみ再現され、このことは硫酸化ゲルがこれらの汚染物質と相当程度結合していることを証明するものである。ＨＣＰ等の汚染物質は、膜材料に結合することができず、そのためウイルスの溶出後には溶出液に見られないことから、上記の本発明による膜の特性はウイルス精製における大きな利点である。この理由から、更なる汚染物質排除工程を省くことができ、精製プロセスの総コストが大幅に削減される。本発明による膜におけるより高い硫酸配位子密度は汚染物質の結合には悪影響はなく、所望のようにインフルエンザウイルスに対する結合能のみを選択的に改善することも本明細書から明らかとなる。
【００６８】
実施例１：セルロースマイクロフィルター膜の架橋
架橋反応は２０℃〜２５℃で行う。１０％の水酸化ナトリウム水溶液を、予め投入しておいた量（ｇ単位）の逆浸透水に添加し、撹拌する。次いで、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（シグマアルドリッチ社、カタログ番号２２０８９２）を添加し、均質な溶液が形成されるまで撹拌する。架橋度は架橋溶液中の１，４−ブタンジオールグリシジルエーテルの濃度により制御することができる。本実施例にて調製された架橋溶液中の逆浸透水、水酸化ナトリウム水溶液及び１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＵＤＧＥ）のそれぞれの量、並びに本発明による膜の得られる架橋度を表１にまとめている。
【００６９】
【表１】
0006368781.tif 000002
【００７０】
Sartorius Stedim Biotech GmbH製の乾燥セルロースマイクロフィルター膜のＤＩＮ  Ａ４シート（１０１４２Ｖタイプ）を架橋溶液で完全に湿らせた後、密閉したポリエチレンバッグ内で７日間保存する。架橋反応の完了後、マイクロフィルター膜を、逆浸透水を流すことによって１０分すすぎ、次いで８０℃で１０分〜１２分、対流式オーブンにて乾燥させた。
【００７１】
上記で定義された架橋度を求めるために下記の手法を行う：１０１４２Ｖタイプの非架橋のセルロース膜を１１０℃で５分、ザルトリウス水分計（ＭＡ１００タイプ）にて乾燥させ、その重量ｍＡを求める。次いで、膜を架橋溶液で湿らせる。架橋剤で処理されていない更なるブランクサンプルを秤量して、浸出性構成要素に起因する重量損失を求める。７日の架橋時間の後、膜を、ＲＯ水を流すことによって１０分すすぎ、次いで８０℃で１０分、対流式オーブンにて事前に乾燥させ、最後に出発膜として５分、水分計上で乾燥させ、ｍｖを求める。架橋剤で処理されていないブランクサンプルを用いて、浸出性構成要素の質量ｍＢを求める。定義される値に必要とされる質量の増大率ΔＭは下記のように与えられる：
ΔＭ＝１００％×（（ｍｖ−ｍＡ−ｍＢ）／（ｍＡ−ｍＢ））、
（式中、
ｍｖは架橋した膜の質量であり、
ｍＡは非架橋の膜の質量であり、
ｍＢはブランクサンプルの浸出性構成要素の質量である）。
【００７２】
実施例２：２−ピロリドン及びピリジン−三酸化硫黄錯体による硫酸化
２ｇのピリジン−三酸化硫黄錯体（シグマアルドリッチ社、カタログ番号８４７３７−５００ｇ）を８ｇの２−ピロリドンに撹拌しながら添加する。反応容器を密封する。次いで混合物を７０℃ヘと温度制御すると、ピリジン−三酸化硫黄錯体が溶解し、黄土色の硫酸化溶液が形成される。
【００７３】
７０℃に加熱したすりガラス蓋を備えた８０ｍｌ容の秤量ボトルの底に、７０℃に加熱した３．８ｇの新たに調製した硫酸化溶液をピペッティングした。非架橋の膜（比較例、１０１４２Ｖタイプの実施例１の出発膜）及び実施例１に従って架橋した膜の円筒状の乾燥セルロースマイクロフィルター膜ディスク（直径７０ｍｍ）を連続して硫酸化溶液中に入れ、この際にこれらの膜ディスクが自然と湿潤する。次いで反応容器を即座に密封する。
【００７４】
その後、反応容器を７０℃で４時間、対流式乾燥キャビネットにて保存する。続いて、硫酸化セルロースマイクロフィルター膜を、逆浸透水を流すことによって１０分すすぎ、１００ｇの１Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で５分振盪した後、逆浸透水を流した状態で５分すすぐ。次いで膜を１００ｇの３０重量％グリセロール及び７０重量％水の溶液中で５分振盪し、続いて８０℃で１０分乾燥させる。
【００７５】
実施例３：ピリジン及びクロロスルホン酸による硫酸化
ピリジン（シグマアルドリッチ、カタログ番号２７０９７０−１Ｌ）及びクロロスルホン酸（シグマアルドリッチ、カタログ番号５７１０２４−１００Ｇ）を使用前に−１８℃まで冷却する。激しく撹拌しながら、６０ｍｌのクロロスルホン酸を１０００ｍｌのピリジンに１５分かけて等圧滴下漏斗及び乾燥管を介して滴加し、温度は５℃を超えてはならず、ここでは白色固体が沈殿する。
【００７６】
次いで混合物を密封し、固体が完全に溶解するまで水浴にて撹拌しながら６５℃まで加熱する。その後、このようにして得られた硫酸化溶液を１時間かけて４０℃まで冷却する。
【００７７】
幅３．３ｃｍ及び長さ２１ｃｍの、非架橋の膜ストリップ（実施例１の比較例）及び実施例２の膜ストリップを合計１８ストリップ、粗いＰＰ織物で巻き、５００ｍｌ容のポリプロピレンねじ口瓶に移す。４０℃に温度制御した硫酸化溶液をねじ口瓶に移す。ねじ口瓶を密封する。
【００７８】
反応容器を４０℃で２０分振盪する。次いで膜フィルターストリップをすすぎ、下記のように含浸させる：
―逆浸透水を１０分流し、
―１０００ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌと１０分振盪させ、
―逆浸透水を１０分流し、
―３０重量％グリセロール及び７０重量％水の溶液中で１０分振盪する。
【００７９】
次いで、これらを８０℃で少なくとも１２時間乾燥させる。
【００８０】
実施例４：マイクロフィルター膜の浸透性の決定
４７ｍｍ径のディスクを実施例３による硫酸化セルロースマイクロフィルター膜から打ち抜く。これらを逆浸透水にて湿らせ、逆浸透水を流して５分すすぐ。打ち抜いたブランクを１６２４９タイプのザルトリウス加圧式フィルターホルダーに組み込む。測定は２０℃〜２５℃及び０．１ｂａｒの陽圧で行う。１００ｇの媒体を膜フィルターに通すのにかかる時間を測定する。このようにして求められた流量の単位はｍｌ／（ｃｍ２・分・ｂａｒ）で示される。逆浸透水及びｐＨ７の１０ｍＭ  リン酸カリウムバッファーの両方を媒体として使用する。
【００８１】
これらのディスクは流量を求めた後の更なる調査に使用することができる。
【００８２】
実施例５：滴定による硫酸化度の定量的決定
３０ｍｍ径のディスクを、丸パンチを用いて硫酸化セルロースマイクロフィルター膜から打ち抜く。３０ｍｍ径の打ち抜いたブランクを、デッドボリュームを最適化したフィルターホルダーに組み込む。有効フィルター表面は５．７ｃｍ２である。気泡を排除しながら、フィルターホルダーに逆浸透水を満たす。フィルターホルダーをワトソン・マーロー社製の多重チャンネルカートリッジポンプ（２０５  Ｕタイプ）に接続し、そのラインには気泡が含まれていない。カートリッジポンプ出力はおよそ５ｍｌ／分である。次いで下記の媒体：１Ｍ  ＮａＣｌ、１Ｍ  ＨＣｌ、１ｍＭ  ＨＣｌ、逆浸透水を順番にそれぞれ４分間、膜フィルターに通して送り込む。
【００８３】
その後、磁気撹拌子の入った４０ｍｌ容のガラスビーカーをフィルターホルダーの出口側の下に置く。次いで１Ｍ  ＮａＣｌを更に４分供給する。続いて回収した溶出液を、電位差滴定指示を用いて滴定する。滴定液は５．０ｍＭ  水酸化ナトリウム水溶液である。このため、５ｍＭ  水酸化ナトリウム水溶液の消費量をｐＨ７．０での当量点まで求める。消費される水酸化ナトリウム水溶液の定量的量は膜上の硫酸基の定量的量に正比例する。利用可能な膜の有効表面及び水酸化ナトリウム水溶液の消費及び更に１ｃｍ２当たりのセルロースの質量から、硫酸化セルロース上における硫酸基の質量比である硫酸化度を算出することができる。
【００８４】
式：
硫酸基密度：
ｎ硫酸塩（μｍｏｌ／ｃｍ２）＝ｃ（ＮａＯＨ）×ｔ（ＮａＯＨ）×Ｖ（ＮａＯＨ）×１０００／Ａ
（式中、
ｃ（ＮａＯＨ）は水酸化ナトリウム水滴定液の定量濃度（ｍｏｌ／ｌ単位）であり、
Ｖ（ＮａＯＨ）は当量点（ｐＨ７）で消費される滴定液の量（ｍｌ単位）であり、
ｔ（ＮａＯＨ）は滴定液の補正係数であり、
１０００はｍｏｌ／ｌからμｍｏｌ／ｍｌへの換算係数であり、
Ａは有効フィルター表面（ｃｍ２単位）である）であり、
Ｍ（ＳＯ３）はＳＯ３のモル質量（μｇ／μｍｏｌ単位）である）。
【００８５】
式：
硫酸化度（重量％単位）＝（ｎ硫酸塩×Ｍ（ＳＯ３）／（ｍセルロース＋（ｎ硫酸塩×Ｍ（ＳＯ３）））×１００％
（式中、
ｍセルロースは打ち抜いたブランク１ｃｍ２当たりのセルロース質量（μｇ単位）である）。
【００８６】
サンプル１〜サンプル５の硫酸化度の結果を表２にまとめている。
【００８７】
実施例６：リゾチームに対する結合能の決定：
それぞれ有効膜表面が１７．６ｃｍ２である膜サンプルを、３５ｍｌの１０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ＫＰｉ）（ｐＨ７．０）中にて５分間、約８０の毎分回転数（ｒｐｍ）で３回振盪した後、３５ｍｌの２ｍｇ／ｍｌリゾチームの１０ｍＭ  Ｋｐｉ溶液（ｐＨ７．６）中に２０℃〜２５℃で１２時間〜１８時間おく。次いで膜サンプルを毎回３５ｍｌの１０ｍＭ  ＫＰｉバッファー（ｐＨ７．０）にて２×１５分すすぐ。その後、膜サンプルを２０ｍｌの１０ｍＭ  ＫＰｉバッファー（ｐＨ７．０）及び１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中で振盪する。溶出したタンパク質の量を、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することにより求める。
【００８８】
サンプル１〜サンプル５及びＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）  Ｓについてのリゾチームに対する結合能の結果を表２にまとめている。
【００８９】
実施例７：宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の結合
宿主細胞タンパク質の結合を求めるために、１０倍濃度のＨＣＰのＰＢＳバッファー溶液（リン酸緩衝生理食塩溶液、ｐＨ７．４）を抗体なしで使用し、契約生産者（contract producer）の場合はチャイニーズハムスター卵巣細胞株の「擬似（mock）」操作（抗体産生のない細胞株の培養）にて調製する。ＨＣＰ溶液を２０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）にて１：１０で希釈して、導電率をＮａＣｌの添加により１０ｍＳ／ｃｍに調整する。膜に充填するために１０００ｍｌの希釈ＨＣＰ溶液を使用する。ＨＣＰ濃度は手順仕様書に従ってＥＬＩＳＡ法（「酵素結合免疫吸着測定法  ＥＬＩＳＡ  Ｃｙｇｎｕｓ  ＣＭ０１５」）を用いて求める。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の濃度は７μｇ／ｍｌである。
【００９０】
３つの膜層（サンプル４）を膜ホルダーに固定する。膜ホルダーにおける膜積層の膜表面は１５ｃｍ２であり、流入表面は５ｃｍ２であり、層の高さ（膜積層の厚さ）は７５０μｍである。膜ホルダーにおける膜を２０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）にて洗い流し、空気置換を行った後、ＧＥヘルスケア社製の「Ａｋｔａ（登録商標）  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００」クロマトグラフィシステムに接続する。
【００９１】
次いで、膜又は膜積層を、４つの工程を含む試験プログラムを用いてＨＣＰ結合に関して調べる。試験プログラムの４つの工程は以下に詳細に示す：
１．１０ｍｌの導電率が１０ｍＳ／ｃｍである２０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）を用いて膜を平衡化する工程、
２．１００ｍｌのＨＣＰ溶液を膜に充填する工程、
３．１０ｍｌの２０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４、導電率１０ｍＳ／ｃｍ）で洗浄する工程、及び、
４．１０ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌの２０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）にて溶出する工程。
【００９２】
全ての工程を１０ｍｌ／分の流量にて行う。全ての工程において、吸光度を膜ユニットの後ろにある検出器で２８０ｎｍにおいて測定する。破過曲線を図３に示す。
【００９３】
実施例８  小さい不活化インフルエンザウイルスに対する結合能の決定
インフルエンザＡプエルトリコ／８／３４、Ｈ１Ｎ１は接着ＭＤＣＫ細胞（ＧＭＥＭ培地）にて産生する（Y. Genzel et al., Vaccine 22 (2004), 2202-2208を参照）。培養後、培養ブロスを２つのろ過工程にて連続して濾過し（孔径５μｍ及び０．６５μｍのフィルター厚、GE Water & Process Technologies）、続いて３ｍＭ  β−プロピオラクトンにて３７℃で２４時間、化学的に不活化する。不活化後、溶液を更に清澄化し（０．４５μｍの膜フィルター、GE Water & Process Technologies）、続いてクロスフロー濾過（７５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、GE Healthcare）により２０倍に濃縮する（B. Kalbfuss et al., Biotechnol. Bioeng. 97 (1), 2007, 73-85を参照）。濃縮サンプルを使用に必要となるまで−８０℃で保存する。
【００９４】
凍結ウイルスアリコート（３×２ｍｌ）を水浴内にて解凍し、混合して、９０００ｇで１０分遠心分離する。続いて、上清を結合バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、（ｐＨ７．４）及び５０ｍＭ  ＮａＣｌ）にて１：３で希釈する。
【００９５】
このようにして調製した溶液を動的結合能の決定に用いる。全ての実験をＧＥヘルスケア製の「Ａｋｔａ（登録商標）  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００」クロマトグラフィシステムにて行った。本実験にて試験したユニットは、流入表面０．３６ｃｍ２及びカラム体積（bed volume）０．１４ｍｌの１５個の膜層からなるものである。平衡化は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０  ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて行う。平衡化後、２６ｍｌのウイルス溶液をユニットに投入し、２ｍｌの画分を連続して回収する。投入中の流量は１ｍｌ／分である。ヘマグルチニン（ＨＡ）活性を様々な画分において定量する。投入後、ベースラインに達するまで膜ユニットを平衡化バッファーにてすすぎ、続いて１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）にて溶出する。溶出液及びすすぎ画分も回収し、それらのＨＡ活性も分析した。
【００９６】
ウイルス濃度を連続流画分において求め、赤血球凝集アッセイにて定量する（B. Kalbfuss et al., Biologicals 36 (2008), 145-161を参照）。インフルエンザウイルスに対する結合能を全てのサンプルにおいて測定し、その結合能を１０％、２５％及び５０％の破過、すなわち分離材料の体積当たりの結合したウイルスの量が開始溶液のウイルス濃度の１０％又は２５％又は５０％まで達するとき、を算出する。動的結合能は下記のように算出した：
Ｃ０：開始溶液におけるウイルス濃度（ウイルス粒子数／ｍｌ＝粒子数／ｍｌ）
Ｖｘ：ｘ％の破過まで達した際の投入量（ｍｌ）
Ａｘ：ｘ％の破過まで達した際の連続流におけるウイルス粒子の数
ＶＢ：試験ユニットのカラム体積
ｘ％の破過までの動的結合能（粒子数／ｍｌ）＝（Ｖｘ×Ｃ０−Ａｘ）／ＶＢ
【００９７】
サンプル１〜サンプル５及びＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）  Ｓの結合能の結果を表２にまとめている。
【００９８】
【表２】
0006368781.tif 000003
【図１】
0006368781.tif 000004
【図２】
0006368781.tif 000005
【図３】
0006368781.tif 000006