(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キセノン装填エコー源性リポソームを含む組成物であって、前記組成物が、出血性脳卒中と診断された対象における出血性脳卒中の治療における使用のためのものであり、有効量の前記組成物が前記対象に投与される、組成物。
【請求項２】
前記組成物が、溶液中で凍結乾燥したリポソームを懸濁させることにより調製され、前記懸濁液が前記対象に投与され、または
前記組成物が、凍結リポソーム懸濁液を解凍することにより調製され、前記懸濁液が前記対象に投与される、
請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記組成物が、凍結保護剤をさらに含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記凍結保護剤が、マンニトールである、請求項３に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
前記キセノン装填エコー源性リポソームが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ＰＥＧ化脂質、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、またはコレステロールを含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記キセノン装填エコー源性リポソームが、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、またはホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
前記キセノン装填エコー源性リポソームが、少なくとも１つのホスファチジルコリン（ＰＣ）、ＰＥＧ化脂質、およびコレステロールを含む、請求項１または６に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記リポソームが０．４〜１０ミクロンの平均サイズを有する、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記治療が、前記対象に前記リポソームからのキセノン放出を促進するのに有効な量で適用される超音波刺激をさらに含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記超音波刺激が、従来の超音波プローブまたは頚椎カラーの超音波装置によって適用される、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記超音波刺激が、約１〜８ＭＨｚの間の周波数、および約０．１〜１．４の間のメカニカルインデックスで適用される、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記出血性脳卒中がくも膜下出血に起因するものである、請求項１に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年８月１０日に出願され、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる、米国仮特許出願第６１／６８２，１３０号、および２０１２年９月２１日に出願された、中国特許出願第２０１２１０３５６９２９．９号の利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＮＳ０６７４５４、ＨＬ０７４００２、およびＨＬ０５９５８６の下、政府支援で行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般的に医学、生化学、および分子生物学の分野に関する。より具体的には、それは、脳卒中の治療のための生物学的保護リポソームを使用する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
脳血管発作（ＣＶＡ）としても知られる血栓性および出血性脳卒中は、併せて、米国における主要な死亡原因の第４位であり、成人障害の最も一般的な原因である。両方の種類の脳卒中は、脳への血液供給における妨害が原因の急速な脳機能の喪失によって特徴付けられる。血栓性脳卒中において、血餅によって引き起こされる脳動脈の閉塞は、脳組織の虚血、または脳の一部への脳血流の閉塞、および最終的には脳損傷をもたらす。逆に、出血性脳卒中において、損傷した血管からの脳の内部または表面上での血液漏出または破裂は、神経学的損傷につながる。脳卒中の種類に関わらず、医学的介入による、血栓症または出血によって引き起こされる急性血管事象に対する脳組織の早期保護は、依然として患者の生命を救うために最も重要な要素である。早期脳組織保護は、鑑別診断および効果的な治療のための安全手段を拡大し得る。発症時の類似した初期症状に関わらず、効果的な治療的介入は、患者が経験している脳卒中の種類に依存する。例えば、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）の投与は、血栓性脳卒中の治療において少なくとも部分的に効果的であると証明されているが、出血性脳卒中の治療には反論が示される。依然として、脳卒中の治療のための新しい効果的な治療、特に脳卒中発症時の即時投与に適した治療の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の実施形態において、キセノン装填エコー源性リポソーム（Ｘｅ−ＥＬＩＰ）を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における脳卒中を治療するための方法が提供される。いくつかの態様において、対象は出血性脳卒中を有することが判明している。さらなる実施形態において、Ｘｅ−ＥＬＩＰを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における原因不明の脳卒中（すなわち、対象がまだ血栓性または出血性脳卒中を有することが判明していない）を治療する方法が提供される。したがって、いくつかの態様において、対象における出血性および血栓性脳卒中の両方（例えば、対象が出血性および／または血栓性脳卒中と診断されている）を治療するための方法が提供される。依然としてさらなる態様において、実施形態の方法は、有効量のＸｅ−ＥＬＩＰを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における頭蓋内動脈瘤、またはくも膜下出血を治療する方法として定義される。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体中にＸｅ−ＥＬＩＰを含む組成物が提供される。
【０００６】
さらなる実施形態において、実施形態の方法および組成物は、（キセノンの代わり、またはそれに加えて）エコー源性リポソーム中に装填された異なる希ガスを用いる。例えば、いくつかの態様において、実施形態に係る使用のためのエコー源性リポソームは、キセノン、ヘリウム、アルゴン、クリプトン、ネオン、またはそれらの混合物で装填される。したがって、いくつかの態様において、キセノン、ヘリウム、アルゴン、クリプトン、またはネオン装填エコー源性リポソームを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における脳卒中を治療するための方法が提供される。さらなる態様において、対象は出血性脳卒中を有することが判明している。さらなる実施形態において、キセノン、ヘリウム、アルゴン、クリプトン、またはネオン装填エコー源性リポソームを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における原因不明の脳卒中（すなわち、対象がまだ血栓性または出血性脳卒中を有することが判明していない）を治療する方法が提供される。したがって、いくつかの態様において、対象における出血性および血栓性脳卒中の両方（例えば、対象が出血性および／または血栓性脳卒中と診断されている）を治療するための方法が提供される。依然としてさらなる態様において、実施形態の方法は、有効量のキセノン、ヘリウム、アルゴン、クリプトン、またはネオン装填エコー源性リポソームを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における頭蓋内動脈瘤、またはくも膜下出血を治療する方法として定義される。いくつかの実施形態において、キセノン、ヘリウム、アルゴン、クリプトン、またはネオン装填エコー源性リポソームを薬学的に許容される担体中に含む組成物が提供される。
【０００７】
さらなる実施形態において、（ａ）Ｘｅ−ＥＬＩＰを含む有効量の第１の組成物を対象に投与することと、（ｂ）組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含む有効量の第２の組成物を対象に投与することと、を含む、対象における血栓性脳卒中を治療する方法が提供される。例えば、ある特定の態様において、Ｘｅ−ＥＬＩＰおよびｔＰＡは、（例えば、Ｘｅ−ＥＬＩＰおよびｔＰＡを含む組成物中で）連続的に、または本質的に同時に投与される。いくつかの態様において、実施形態の方法は、第２の組成物を、第１の組成物の投与の約２、３、４、５、６、７、または８時間後、またはそれ未満に投与することを含む。依然としてさらなる態様において、第１の組成物の投与は、脳卒中発症の約６時間以内である。さらに依然としてさらなる態様において、第２の組成物は、有効量のＸｅ−ＥＬＩＰをさらに含む。さらなる態様において、実施形態の方法は、（ａ）Ｘｅ−ＥＬＩＰを含む有効量の第１の組成物を、脳卒中または原因不明の脳卒中の症状を有する対象に投与することと、（ｂ）対象が血栓性または出血性脳卒中に罹患しているか否かを特定することと、（ｃ）ｔＰＡを含む有効量の第２の組成物を、血栓性脳卒中を有すると特定された対象に投与することと、を含む。
【０００８】
したがって、さらなる実施形態において、Ｘｅ−ＥＬＩＰおよびｔＰＡを含む薬学的組成物が提供される。いくつかの態様において、組成物のｔＰＡは、リポソーム（例えば、エコー源性リポソーム）中に含まれる。さらなる態様において、組成物は少なくとも２つの異なるリポソームのスラリーを含み、第１のリポソームはＸｅ−ＥＬＩＰからなり、および第２のリポソームはｔＰＡからなる（例えば、ｔＰＡリポソームはＸｅを本質的に含まない）。
【０００９】
さらなる実施形態において、希ガス装填ＥＬＩＰ（例えば、Ｘｅ−ＥＬＩＰ）、およびさらなる生物学的活性ガス成分で装填されたリポソーム（例えば、エコー源性リポソーム）を含む薬学的組成物が提供される。例えば、いくつかの態様において、希ガス装填エコー源性リポソームは、Ｈ２Ｓ、および／またはＨ２をさらに含み得る（または、それを含むリポソームと共に投与され得る）。同様に、いくつかの態様において、希ガス装填エコー源性リポソームは、亜酸化窒素、および／または一酸化窒素をさらに含み得る（または、それを含むリポソームと共に投与され得る）。例えば、いくつかの態様において、ガスは、組成物（例えば、異なるガスで装填されたリポソームのスラリー）中の別個のリポソーム中に含まれる。さらなる態様において、２つ以上のガスが、同一のリポソーム中に含まれる。例えば、組成物は、ＸｅおよびＮＯ、ＸｅおよびＮ２ＯまたはＸｅ、ＮＯおよびＮ２Ｏを含むリポソームを含み得る。別の例において、組成物は、ＸｅおよびＨ２、ＸｅおよびＨ２ＳまたはＸｅ、Ｈ２およびＨ２Ｓを含むリポソームを含み得る。さらなる態様において、実施形態のリポソームは、約０．１％〜５％、０．１％〜３％、または０．５％〜２％の間のＨ２Ｓを（リポソーム中の全ガスのパーセントとして）含む。例えば、リポソームは、１％のＨ２Ｓ、および９９％のＸｅを含み得る。さらにさらなる態様において、実施形態のリポソームは、約１％〜５０％、５％〜４０％、または１０％〜４０％の間のＨ２を（リポソーム中の全ガスのパーセントとして）含む。例えば、リポソームは、約３０％のＨ２Ｓ、および約７０％のＸｅを含み得る。
【００１０】
実施形態のある特定の態様は、ｔＰＡを含む組成物に関わる。いくつかの態様において、ｔＰＡは、精製または組み換え哺乳類ｔＰＡ（例えば、ヒトｔＰＡ）である。そのようなｔＰＡ組成物は、薬学的に許容される担体中に含まれ得る。ある特定の態様において、ｔＰＡはリポソーム中に含まれる。ｔＰＡを封入するのに使用するためのリポソームは、任意の他の当技術分野において既知の、または本明細書に詳述されるものから選択され得る。例えば、いくつかの態様において、ｔＰＡは、実施形態のエコー源性リポソーム中に含まれ得る。ある特定の好適な態様において、ｔＰＡを含むリポソームは、本質的にＸｅを含まない（すなわち、ｔＰＡおよびＸｅは同一のリポソーム小胞中に装填されない）。
【００１１】
実施形態に係る組成物は、対象に一連の方法を介して投与され得る。例えば、いくつかの態様において、組成物（例えば、ＸｅまたはｔＰＡ含有組成物）は、静脈内注入を介して、または動脈内注入を介して、静脈内、動脈内、頭蓋内投与される。好適な態様において、実施形態の組成物は、脳卒中発症、または脳卒中の症状の発症の約１、２、３、４、５、６、または８時間後、またはそれ未満などの、脳卒中、または脳卒中の症状の発症の直後に投与される。したがって、いくつかの態様において、実施形態の組成物は、最初の対応者（例えば、看護師または医療技術者）によって投与される。
【００１２】
ある特定の態様において、実施形態の方法は、ＥＬＩＰ組成物（例えば、Ｘｅ−ＥＬＩＰ組成物）の１つ以上の用量を対象に投与することを含む。例えば、いくつかの態様において、対象は、約０．８〜２．８ｍｇ／ｋｇ（ｍｇ−脂質／ｋｇ−対象）の間の用量などの、約０．６〜３．０ｍｇ／ｋｇの間のＸｅ−ＥＬＩＰの用量を投与される。さらなる態様において、対象は、約１．１４ｍｇ／ｋｇまたは約２．２７ｍｇ／ｋｇなどの、約１．０〜２．５ｍｇ／ｋｇの間のＥＬＩＰ組成物の用量を投与される。依然としてさらなる態様において、（例えば、Ｘｅ−ＥＬＩＰの）単一の単位用量を適切な含有手段中に含むＥＬＩＰ組成物が、提供される。例えば、単一の単位用量（すなわち、約６０ｋｇのヒト対象にとって適切な用量）は、約１００〜約３，０００ｍｇ、約２５０〜約２，０００ｍｇ、約２５０〜約１，０００ｍｇ、または約４００〜約９００ｍｇ（例えば、４８０〜９００ｍｇ）の、封入ガスを有するＥＬＩＰ（全脂質重量に基づく）であり得る。依然としてさらなる態様において、Ｘｅ−ＥＬＩＰの単一単位用量は、封入されるＸｅの全体積によって定義され得る。いくつかの態様において、単一用量中のＸｅの全体積は、約０．１〜２．５ｍｌ、０．２〜２．０ｍｌ、または０．５〜１．５ｍｌの間（例えば、約１．０ｍｌの用量）などの、約５ｍｌ未満のＸｅである。したがって、いくつかの特定の態様において、Ｘｅ−ＥＬＩＰの単一単位用量は、２５０〜約１，０００ｍｇの間の脂質、および約０．１〜２．５ｍｌの間のＸｅを、適切な含有手段中に含んで提供される。当業者は、前述の用量範囲のうちのいずれかが、Ｈ２および／またはＨ２Ｓを含むＸｅ−ＥＬＩＰ組成物（この場合、ガス体積は、封入ガスの全量に適用され得る）にもまた適用され得ることを認識するであろう。
【００１３】
依然としてさらなる態様において、実施形態の組成物（例えば、ＥＬＩＰ組成物）は、対象に複数の用量で投与される。例えば、いくつかの態様において、組成物は、対象に２、３、または４回目投与される。ある特定の態様において、第２の用量、または後続の投与の製剤、用量、または経路は、第１の投与と比較して調整され得る。いくつかの態様において、第２の、または後続の投与は、初回投与の約２、３、４、５、６、７、または８時間後、またはそれ未満（例えば、第１の投与後約４〜６時間以内）である。いくつかの態様において、実施形態の組成物は、脳卒中、または脳卒中の症状の発症の約１２時間以内に２回対象に投与される。
【００１４】
好適な態様において、実施形態に係る治療の対象は、対象中のヒトである。しかしながら、いくつかの態様において、対象は、非ヒト霊長類、またはウマ、イヌまたはネコなどの家畜などの非ヒト動物であり得る。さらなる態様において、対象は、突然の記憶喪失、完全なまたは部分的な麻痺、見当識障害、発話困難、突然の視力障害、体の一部のしびれ、突然の重度の頭痛または歩行または平衡困難などの脳卒中の症状を有すると特定される。いくつかの態様において、脳卒中、または脳卒中の症状を有する対象は、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中を有すると特定されていない。依然としてさらなる態様において、対象は、血栓性脳卒中、および／または出血性脳卒中を有すると特定されている。
【００１５】
さらなる態様において、実施形態のＥＬＩＰ組成物の対象への投与は、超音波刺激を、対象にリポソームからのガス放出を促進するのに有効な量で適用することをさらに含む。例えば、超音波刺激は、ＥＬＩＰ組成物の投与の後、またはそれと同時に適用され得る。いくつかの態様において、超音波刺激は、投与の約１０秒、２０秒、３０秒、または１、２、３、４、または５分後、またはそれ未満などの、ＥＬＩＰ組成物（例えば、Ｘｅ−ＥＬＩＰ）の投与後に適用される。ある特定の場合、超音波刺激は、リポソームによる所望のガス放出の部位に、またはその近くに適用される。例えば、脳卒中を有する対象の場合、超音波刺激は、（例えば、頸動脈で）頭または首に適用されることができ、それにより脳の近位でのリポソームペイロードの放出を刺激する。
【００１６】
超音波刺激を対象に適用するための様々な方法が既知であり、実施形態に従って使用され得る。例えば、超音波刺激は、（例えば、刺激を首に与えるために）従来の超音波プローブ、または頚椎カラー超音波装置で適用され得る。対象に適用される超音波刺激の電力および周波数は異なり得るが、一般的にリポソームからのＸｅ放出（例えば、インビボでの放出）を促進するのに有効な量であろう。例えば、超音波刺激は、約１〜８ＭＨｚの間の周波数で、約０．１〜１．４の間の機械的指標で適用され得る。
【００１７】
依然としてさらなる態様において、実施形態の方法は、少なくとも第２の治療剤を対象に投与することをさらに含む。例えば、血栓性脳卒中の場合、第２の治療は、血餅を低減する血栓溶解剤であり得る。さらなる態様において、第２の治療剤は、抗炎症剤または神経保護剤である。いくつかの特定の態様において、例えば、血栓性脳卒中の場合、ｔＰＡが対象に投与される。
【００１８】
ある特定の具体的な態様において、第２の治療剤は、Ｈ２Ｓおよび／またはＨ２装填エコー源性リポソームを含む。いくつかの場合、Ｈ２Ｓおよび／またはＨ２装填エコー源性リポソームおよびＸｅ装填エコー源性リポソームは、同一の組成物中に含まれる。例えば、実施形態の組成物は、別個にＸｅ、Ｈ２Ｓおよび／またはＨ２を含むエコー源性リポソームを含み得る。代替的に、組成物は、２つまたは３つのガス（例えば、Ｘｅ、Ｈ２Ｓ、およびＨ２から選択される２つ以上のガス）を含むエコー源性リポソームを含み得る。
【００１９】
依然としてさらなる態様において、実施形態に係る投与の方法は、液体リポソーム懸濁液を、対象への投与の前に調製することを含む。例えば、いくつかの態様において、液体リポソーム懸濁液は、投与の３０分、１０分、５分、または２分前以内に調製される。例えば、いくつかの態様において、液体リポソーム懸濁液を調製することは、凍結乾燥したリポソームを溶液中で懸濁させること、または凍結リポソーム懸濁液を解凍することを含む。
【００２０】
さらなる態様において、実施形態のＥＬＩＰ組成物は、防腐剤、安定剤、および／または塩などの、追加の成分を含む。いくつかの態様において、ＥＬＩＰ組成物は、少なくとも第１の凍結保護剤を含む。実施形態に係る使用のための凍結保護剤は、マンニトール、グリセロール、トレハロース、１，２−プロパンジオールまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を無制限に含む。
【００２１】
本明細書で使用されるエコー源性リポソームは、超音波によって撮像され得るリポソームを指す。特定の態様において、エコー源性リポソームは、リポソームの疎水性層中に含まれるガスなどの、ガス成分（例えば、Ｘｅ、Ｈ２Ｓ、および／またはＨ２）を含むリポソームである。エコー源性リポソーム組成物、およびそのような組成物を製造するための方法は、例えば、それぞれが本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第５，６１２，０５７号、同第５，８５８，３９９号、および同第７，９７６，７４３号に提供される。いくつかの態様において、実施形態のリポソーム（例えば、ＥＬＩＰ組成物）は、平均粒径によって定義される。例えば、いくつかの態様において、リポソームは、約０．４〜１０ミクロン、または０．８〜１０ミクロン（例えば、約０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ミクロンの平均サイズ）の平均サイズを有する。
【００２２】
幅広い一連の成分が、Ｘｅ、Ｈ２、および／またはＨ２Ｓなどのガスで装填されたＥＬＩＰなどの実施形態のリポソームを製剤化するために使用され得る。例えば、実施形態のリポソームは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）の任意の形態（ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）など）、ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはＰＥＧ化リン脂質の任意の形態、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＰＰＧ）など）の任意の形態、および／またはコレステロールを含み得る。いくつかの態様において、リポソームは、少なくとも１つのＰＣ、ＰＥ、負に帯電した脂質、ＰＥＧ化脂質（例えば、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ）、およびコレステロール分子を含む。いくつかの特定の態様において、リポソームは、ＤＰＰＣ、卵ＰＣ（ＥＰＣ）、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、およびコレステロールを含む。依然としてさらなる態様において、実施形態のリポソームは、ＤＰＰＣ、ＥＰＣ、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、コレステロール、およびキセノンからなる、またはそれらから本質的になる。依然としてさらなる態様において、リポソームは、ＤＰＰＣ、ＥＰＣ、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、コレステロール、Ｘｅ、およびＨ２、Ｈ２Ｓ、またはＨ２およびＨ２Ｓの組み合わせからなる、またはそれらから本質的になる。
【００２３】
本明細書で使用される「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲（複数可）で使用される「含む」という語と共に使用される際、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。
【００２４】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、本開示は代替手段および「および／または」のみを指す定義を支持するものの、代替手段のみを指す、または代替手段が相互に排他的であると明確に示されない限り、「および／または」を意味するために使用される。本明細書に使用される「別の」は、少なくとも第２の、またはそれ以上を意味し得る。
【００２５】
本出願を通して、「約」という用語は、値が、装置の誤差の固有の変動、値を決定するために用いられる方法の固有の変動、または試験対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００２６】
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
対象における出血性脳卒中を治療する方法であって、キセノン装填エコー源性リポソームを含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２）
前記組成物が、静脈内注入を介して、または動脈内注入を介して、静脈内、動脈内、頭蓋内投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
超音波刺激を、前記対象に前記リポソームからのキセノン放出を促進するのに有効な量で適用することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記超音波刺激が、従来の超音波プローブまたは頚椎カラーの超音波装置によって適用される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記超音波刺激が、前記対象の首または頭に適用される、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記超音波刺激が、約１〜８ＭＨｚの間の周波数、および約０．１〜１．４の間の機械的指標で適用される、項目３に記載の方法。
（項目７）
前記投与が、脳卒中発症の６時間以内である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記投与が、脳卒中発症の４、３、２、または１時間以内である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記対象が、ヒトである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記組成物が、前記対象に２回目投与される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記第２の投与が、前記初回投与の約２、３、４、５、６、７、または８時間後である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
第２の治療剤を、前記対象に投与することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記第２の治療剤が、Ｈ２ＳまたはＨ２装填エコー源性リポソームを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記Ｈ２ＳまたはＨ２装填エコー源性リポソーム、および前記Ｘｅ装填エコー源性リポソームが、同一の組成物中に含まれる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記組成物が、２つのガスで装填されたリポソームを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記組成物を投与することが、溶液中で凍結乾燥したリポソームを懸濁させ、前記懸濁液を前記対象に投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記組成物を投与することが、凍結リポソーム懸濁液を解凍し、前記懸濁液を前記対象に投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記組成物が、凍結保護剤をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記凍結保護剤が、マンニトールである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記リポソームが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、またはホスファチジルセリン（ＰＳ）、またはコレステロールを含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記リポソームが、少なくとも１つのＰＣ、ＰＥ、負に帯電した脂質、ＰＥＧ化脂質、およびコレステロール分子を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
（ａ）前記ＰＣが、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、または卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）を含むか、
（ｂ）前記ＰＥＧが、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥを含むか、または
（ｃ）前記ＰＧが、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）を含むか、である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、およびコレステロールを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記リポソームが、ＤＰＰＣ、ＥＰＣ、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、コレステロール、およびキセノンから本質的になる、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記リポソームが０．４〜１０ミクロンの平均サイズを有する、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記対象が出血性脳卒中と診断されている、項目１に記載の方法。
（項目２７）
血栓性または出血性脳卒中を有することが判明していない対象における脳卒中を治療する方法であって、キセノン装填エコー源性リポソームを含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２８）
前記対象が血栓性脳卒中を有することが判明していない、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記組成物が、静脈内注入を介して、または動脈内注入を介して、静脈内、動脈内、頭蓋内投与される、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
超音波刺激を、前記対象に前記リポソームからのガス放出を促進するのに有効な量で適用することをさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記超音波刺激が、従来の超音波プローブまたは頚椎カラーの超音波装置によって適用される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記超音波刺激が、前記対象の首または頭に適用される、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記超音波刺激が、約１〜８ＭＨｚの間の周波数、および約０．１〜１．４の間の機械的指標で適用される、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記投与が、脳卒中発症の６時間以内である、項目２７に記載の方法。
（項目３５）
前記投与が、脳卒中発症の４、３、２、または１時間以内である、項目２７に記載の方法。
（項目３６）
前記対象が、ヒトである、項目２７に記載の方法。
（項目３７）
前記組成物が、前記対象に２回目投与される、項目２７に記載の方法。
（項目３８）
前記第２の投与が、前記初回投与の約２、３、４、５、６、７、または８時間後である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
第２の治療剤を、前記対象に投与することをさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目４０）
前記第２の治療剤が、Ｈ２ＳまたはＨ２装填エコー源性リポソームを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記Ｈ２ＳまたはＨ２装填エコー源性リポソーム、および前記Ｘｅ装填エコー源性リポソームが、同一の組成物中に含まれる、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記組成物を投与することが、溶液中で凍結乾燥したリポソームを懸濁させ、前記溶液を前記対象に投与することを含む、項目２７に記載の方法。
（項目４３）
前記組成物を投与することが、凍結リポソーム懸濁液を解凍し、前記懸濁液を前記対象に投与することを含む、項目２７に記載の方法。
（項目４４）
前記組成物が、凍結保護剤をさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目４５）
前記凍結保護剤が、マンニトールである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記リポソームが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、またはホスファチジルセリン（ＰＳ）、またはコレステロールを含む、項目２７に記載の方法。
（項目４７）
前記リポソームが、少なくとも１つのＰＣ、ＰＥ、負に帯電した脂質、ＰＥＧ化脂質、およびコレステロール分子を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
（ａ）前記ＰＣが、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、または卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）を含むか、
（ｂ）前記ＰＥＧが、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥを含むか、または
（ｃ）前記ＰＧが、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）を含むか、である、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、およびコレステロールを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記リポソームが、ＤＰＰＣ、ＥＰＣ、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、コレステロール、およびキセノンから本質的になる、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記リポソームが０．４〜１０ミクロンの平均サイズを有する、項目２７に記載の方法。
（項目５２）
対象における出血性および血栓性脳卒中の両方を治療する方法であって、キセノン装填エコー源性リポソームを含む有効量の組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
（項目５３）
前記対象が出血性および血栓性脳卒中と診断されている、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記対象が、出血性または血栓性脳卒中を有しているか否かが判明していない、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
（ａ）血栓性または出血性脳卒中を有することが判明していない、脳卒中を有する対象を特定することと、
（ｂ）キセノン装填エコー源性リポソームを含む有効量の組成物を、前記対象に投与することと、を含む、対象における脳卒中を治療する方法。
（項目５６）
（ａ）キセノン装填エコー源性リポソームを含む有効量の第１の組成物を、前記対象に投与することと、
（ｂ）組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含む有効量の第２の組成物を、前記対象に投与することと、を含む、対象における血栓性脳卒中を治療する方法。
（項目５７）
前記ｔＰＡが、リポソーム中に含まれる、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ｔＰＡが、組み換えヒトｔＰＡである、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
前記第２の組成物が、キセノン装填エコー源性リポソームをさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目６０）
前記第１のまたは第２の組成物が、静脈内注入を介して、または動脈内注入を介して、静脈内、動脈内、頭蓋内投与される、項目５６に記載の方法。
（項目６１）
超音波刺激を、前記対象に前記第１の組成物が前記リポソームからのガス放出を促進するのに有効な量で投与される後に適用することをさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目６２）
前記超音波刺激が、従来の超音波プローブまたは頚椎カラーの超音波装置によって適用される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記超音波刺激が、前記対象の首または頭に適用される、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記超音波刺激が、約１〜８ＭＨｚの間の周波数、および約０．１〜１．４の間の機械的指標で適用される、項目５６に記載の方法。
（項目６５）
前記第１の組成物の前記投与が、脳卒中発症の６時間以内である、項目５６に記載の方法。
（項目６６）
前記第１の組成物の前記投与が、脳卒中発症の４、３、２、または１時間以内である、項目５６に記載の方法。
（項目６７）
前記対象が、ヒトである、項目５６に記載の方法。
（項目６８）
前記第２の組成物の前記投与が、前記第１の組成物の投与の約２、３、４、５、６、７、または８時間後に投与される、項目５６に記載の方法。
（項目６９）
前記第１または第２の組成物がさらなる治療剤を含む、項目５６に記載の方法。
（項目７０）
前記さらなる治療剤が、Ｈ２ＳまたはＨ２装填エコー源性リポソームを含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記第１の組成物を投与することが、溶液中で凍結乾燥したリポソームを懸濁させ、前記溶液を前記対象に投与することを含む、項目５６に記載の方法。
（項目７２）
前記第１の組成物を投与することが、凍結リポソーム懸濁液を解凍し、前記懸濁液を前記対象に投与することを含む、項目５６に記載の方法。
（項目７３）
前記第１または第２の組成物が、凍結保護剤をさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目７４）
前記凍結保護剤が、マンニトールである、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記第１の生成物の前記リポソームが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、またはホスファチジルセリン（ＰＳ）、またはコレステロールを含む、項目５６に記載の方法。
（項目７６）
前記リポソームが、少なくとも１つのＰＣ、ＰＥ、負に帯電した脂質、ＰＥＧ化脂質、およびコレステロール分子を含む、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
（ａ）前記ＰＣが、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、または卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）を含むか、
（ｂ）前記ＰＥＧが、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥを含むか、または
（ｃ）前記ＰＧが、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）を含むか、である、項目７５に記載の方法。
（項目７８）
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、およびコレステロールを含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記リポソームが、ＤＰＰＣ、ＥＰＣ、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、コレステロール、およびキセノンから本質的になる、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記第１の生成物の前記リポソームが０．８〜１０ミクロンの平均サイズを有する、項目５６に記載の方法。
（項目８１）
前記対象が血栓性脳卒中と診断されている、項目５６に記載の方法。
（項目８２）
キセノン装填エコー源性リポソーム、およびｔＰＡを含む、薬学的組成物。
（項目８３）
前記ｔＰＡが、リポソーム中に含まれる、項目８２に記載の組成物。
（項目８４）
前記ｔＰＡが、組み換えヒトｔＰＡである、項目８２に記載の組成物。
（項目８５）
Ｘｅ装填エコー源性リポソーム、およびＨ２ＳまたはＨ２で装填されたリポソームを含む、薬学的組成物。
（項目８６）
前記ガスが、前記組成物中の別個のリポソーム中に含まれる、項目８５に記載の組成物。
（項目８７）
前記ガスが、同一のリポソーム中に含まれる、項目８５に記載の組成物。
（項目８８）
Ｘｅ、Ｈ２Ｓ、およびＨ２で装填されたリポソームを含む、項目８５に記載の組成物。
（項目８９）
前記リポソームが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、またはホスファチジルセリン（ＰＳ）、またはコレステロールを含む、項目８２または８５に記載の組成物。
（項目９０）
前記リポソームが、少なくとも１つのＰＣ、ＰＥ、負に帯電した脂質、ＰＥＧ化脂質、およびコレステロール分子を含む、項目８９に記載の組成物。
（項目９１）
（ａ）前記ＰＣが、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、または卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）を含むか、
（ｂ）前記ＰＥＧが、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥを含むか、または
（ｃ）前記ＰＧが、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）を含むか、である、項目９０に記載の組成物。
（項目９２）
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、およびコレステロールを含む、項目９１に記載の組成物。
（項目９３）
前記リポソームが、ＤＰＰＣ、ＥＰＣ、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、コレステロール、およびキセノンから本質的になる、項目９２に記載の組成物。
（項目９４）
Ｘｅ装填エコー源性リポソームを含む薬学的組成物であって、前記リポソームが（１）第１のＰＣ成分と、（２）第２のＰＣ成分と、（３）ＰＥＧ化脂質成分と、（４）ＰＧ成分と、（５）コレステロール成分と、からなり、前記成分が約３０〜６０：１０〜３０：５〜１５：５〜１５：１０〜２０の割合でそれぞれ存在する、薬学的組成物。
（項目９５）
前記成分が約４０〜５０：２０〜３０：５〜１０：５〜１０：１０〜２０の割合でそれぞれ存在する、項目９４に記載の組成物。
（項目９６）
（ａ）前記第１のＰＣ成分が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であるか、
（ｂ）前記第２のＰＣ成分が、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）であるか、
（ｃ）前記ＰＥＧ化脂質成分が、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥであるか、または
（ｄ）前記ＰＧ成分が、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）を含むか、である、項目９５に記載の組成物。
（項目９７）
前記組成物が、凍結保護剤をさらに含む、項目８２、８５、または９４のいずれかに記載の組成物。
（項目９８）
前記凍結保護剤が、マンニトールである、項目９７に記載の組成物。
（項目９９）
前記リポソームが０．４〜１０ミクロンの平均サイズを有する、項目８２、８５、または９４のいずれかに記載の組成物。
（項目１００）
前記組成物が、凍結乾燥される、または凍結される、項目８２、８５、または９４のいずれかに記載の組成物。
本発明の他の目的、特性および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好適な実施形態を示すが、例示説明のみの目的でのみ与えられることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明との組み合わせでの、これらの図面のうちの１つ以上への参照によってより良く理解され得る。
【００２８】
【図１】キセノン含有リポソームおよび超音波誘発性キセノン放出の特性評価。（ａ）ガスを有さない従来のリポソーム。（ｂ）加圧凍結法によって製造された、脂質二重層中に溶存ガスまたは気泡として捕捉されたＸｅを有するリポソーム含有Ｘｅ。（ｃおよびｄ）従来のリポソームおよびガス含有リポソームの電子顕微鏡画像は、ガス含有リポソームの広い脂質二重層を示した。従来のリポソーム（ｅ）およびＸｅ含有リポソーム（ｆ）の血管内超音波撮像は、Ｘｅ含有リポソームからの高い超音波反射率を示した。（ｇ）Ｘｅ−ＥＬＩＰからのキセノンの超音波放出は、２つの相を有し、最初の３０分間の高速放出が、１８時間を超えて継続する低速放出によって後続される（半減期４．９７±０．７時間）。超音波は、電力に依存した方法でのＸｅ−ＥＬＩＰからのＸｅの放出を誘発した（ｈ）。
【図２】Ｘｅ−ＥＬＩＰの神経保護効果の時間窓。無処置（ａ）、および再潅流の１０分間（ｂ）、１時間（ｃ）、および３時間（ｄ）後のＸｅ−ＥＬＩＰ（７ｍｇ／ｋｇ）処置ありの、中大脳動脈閉塞の冠状脳切片（ＴＴＣ染色）。白色領域は、中大脳動脈閉塞後の梗塞領域であり、脳の梗塞体積の定量化は、再潅流の１０分および１時間後のＸｅ−ＥＬＩＰ投与が、無処置群と有意に異なることを示した。四肢の配置（ｆ）、ビーム歩行（ｇ）、および格子歩行（ｈ）の神経学的評価は、ＴＴＣ染色と類似した結果を示した。データは、平均±標準誤差である。
【図３】ＢＤＮＦ発現およびアポトーシスに対するＸｅ−ＥＬＩＰの効果。脳卒中の２４時間後の大脳皮質組織における、ＢＤＮＦ（ａ）、ｐｈｏｓ−Ａｋｔ（ｂ）、およびｐｈｏｓ−ＥＲＫ（ｃ）のウエスタンブロット分析は、ＸｅがＢＤＮＦ（ｄ）、全Ａｋｔ（ｅ）、およびｐｈｏｓ−ＥＲＫ（ｆ）の発現を増加させることを示した。偽手術群（ｇ）、脳卒中群（ｈ）、およびＸｅ−ＥＬＩＰ処置ありの脳卒中群（ｉ）からの脳切片の半影領域におけるＴＵＮＥＬ染色は、Ｘｅ−ＥＬＩＰ処置された動物においてアポトーシスの低減を示した。アポトーシスのウエスタンブロットおよび顕微鏡写真は、３つの独立した実験の代表例である。データは、平均±標準偏差である。
【図４】Ｘｅ−ＥＬＩＰの神経保護効果の用量反応。中大脳動脈閉塞の冠状脳切片（ＴＴＣで染色）を、無処置（ａ）、および３．５ｍｇ／ｋｇ（ｂ）、７ｍｇ／ｋｇ（ｃ）、および１４ｍｇ／ｋｇ（ｄ）のＸｅ−ＥＬＩＰありで、撮像した。白色領域は、中大脳動脈閉塞後の梗塞領域である。脳の梗塞体積の定量化を、（ｅ）に示す。四肢の配置（ｆ）、ビーム歩行（ｇ）、および格子歩行（ｈ）の神経学的評価を示されるグラフに提供する。データは、平均±標準誤差である。
【図５】脳虚血上へのＸｅ送達と組み合わされたＩＶ  ｔＰＡの効果。中大脳動脈閉塞の３日後のラットにおける脳梗塞を示す代表的なＴＴＣ染色冠状脳切片を、（ａ）偽、（ｂ）無処置の虚血性脳卒中、（ｃ）ｔＰＡ処置ありの虚血性脳卒中、（ｄ）ｔＰＡと組み合わされるＸｅ−ＥＬＩＰありの虚血性脳卒中、後に撮像した。（ｅ）ｔＰＡ単独で梗塞体積における６９％の低減、およびＩＶ  ｔＰＡと組み合わされるＸｅ−ＥＬＩＰで７５％の低減を示す、処置群間の梗塞サイズの比較。四肢の配置（ｆ）、ビーム歩行（ｇ）、および格子歩行（ｈ）の神経学的評価を、示されるグラフに示す。データは、平均±標準誤差である。
【図６ａ】Ｘｅ−ＥＬＩＰは、血流を回復する前または後に投与される際、神経保護効果を提供する。
【図６ｂ】Ｘｅ−ＥＬＩＰ、および／またはｔＰＡによる示される処置後の動物におけるパーセント血餅質量喪失。
【図７】実施形態のエコー源性リポソームの調製のための例示的なプロトコルを概略的に示す。
【図８】結果は、Ｘｅ−ＥＬＩＰが、フィラメント穿孔くも膜下出血（ＳＡＨ）ラットモデルにおける出血を減少させることを示す。
【図９】結果は、Ｘｅ−ＥＬＩＰが一般的な神経学的評価尺度、およびＳＡＨラットの運動機能を改善することを示す。
【図１０】結果は、Ｘｅ−ＥＬＩＰがニューロンアポトーシス細胞死を防止することを示す。代表的な顕微鏡写真は、出血脳卒中群（上部パネル）、およびＸｅ−ＥＬＩＰ処置ありの出血脳卒中群（下部パネル）からの脳切片のＴＵＮＥＬ染色を示す。左部パネルは、全細胞のＤＡＰＩ染色である。中央パネルは、アポトーシス細胞のトンネル染色である。右部パネルは、統合された画像である。
【図１１】結果は、Ｘｅ−ＥＬＩＰがＳＡＨラットの死亡率を減少させるが、脳水腫および脳血流には大きく影響を与えないことを示す。
【図１２】概略図は、実施例４の実験のタイムラインを示す。
【図１３】ｔＭＣＡＯモデルにおける、Ｘｅ−ＥＬＩＰ、Ｈ２Ｓ／Ｘｅ−ＥＬＩＰ、およびＨ２／Ｘｅ−ＥＬＩＰによる脳卒中処置の結果を示す。（ａ）脳梗塞を示す代表的なＴＴＣ染色冠状脳切片。（ｂ）処置群間の梗塞体積の要約的な比較。（ｃ）各処置群からの脳切片のＴＵＮＥＬ染色のグラフ表示。
【図１４】グラフは、示されるように、四肢の配置、ビーム歩行、および格子歩行によって評価される、示される組成物で処置したラットにおける神経学的障害の行動試験の結果を示す。
【図１５】グラフは、Ｈ２Ｏ２（１０ｍＭ）の細胞毒性に対する、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイを使用した、ヒト脳星状細胞の保護における、Ｘｅ−ＥＬＩＰ試薬の有効性の試験の結果を示す。
【図１６】グラフは、幹細胞におけるＸｅ−ＥＬＩＰ細胞毒性の試験の結果を示す。ＸｅおよびＸｅ−ＥＬＩＰ試薬ではなくＨ２Ｏ２が、マウス胚性幹細胞における有意なＬＤＨ放出を引き起こす。細胞を、Ｘｅ試薬（３ｍｇＥＬＩＰ／３０μｌガス／ｍｌ）、および対照培地で４時間処置し、培養の終了の２時間前に１０ｍＭのＨ２Ｏ２を添加した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
Ｉ．本発明
脳血管発作（ＣＶＡ）としても知られる脳卒中は、米国における主要な死亡原因の第３位であり、成人障害の最も一般的な原因である。脳卒中は、脳への血液供給における妨害が原因の急速な脳機能の喪失によって特徴付けられる。血栓性脳卒中において、脳動脈の閉塞（血餅）が、脳の一部への妨害された血流をもたらす。逆に、出血性脳卒中において、脳内の血管からの血液漏出または破裂は、神経学的損傷につながる。早期治療、および／または外科的介入は、脳卒中から神経学的損傷を軽減するのに極めて重要である。しかしながら、脳卒中の種類に応じて、脳卒中の種類が確実に特定されていない限り、ｔＰＡなどの治療が脳卒中を有する患者に施され得ない程度まで、施される治療は非常に異なる。残念ながら、脳卒中の治療における最も重要な要因は、ｔＰＡなどの治療の有用性を限定する、適時介入である。
【００３０】
本明細書に詳述される研究は、キセノンガス（Ｘｅ−ＥＬＩＰ）を封入する、新種のエコー源性リポソームの合成を実証する。Ｘｅ−ＥＬＩＰ製剤は、封入されたＸｅを、超音波の適用時に、迅速におよび効果的に放出することが実証される（図１）。これらのリポソームを含む組成物もまた、血栓性脳卒中の治療においてだけでなく、驚くべきことに出血性脳卒中の治療においても効果的であると示される（図２、４、８、および９を参照されたい）。したがって、初めて、Ｘｅ−ＥＬＩＰは、脳卒中（または、脳卒中の症状の発症）の直後、および脳卒中の種類が確実に特定され得る前に患者に施され得る治療を表す。したがって、いかなる他の特定された治療とも異なり、Ｘｅ−ＥＬＩＰは、ニューロンを血餅（虚血）および出血の両方から生じる障害から保護し得る。重要なことに、Ｘｅ−ＥＬＩＰは、外科的または他の治療的介入が実行され得る間に、（実際のニューロン損傷および行動試験の両方によって評価されるような）脳を過剰な神経学的損傷から保護することによって、患者の極めて重要な時間を稼ぐ。したがって、この新しい種類の治療は、全ての種類の脳卒中の臨床転帰を有意に改善する可能性を提供する。
【００３１】
興味深いことに、本明細書で詳述される研究は、同様に、Ｘｅ−ＥＬＩＰがｔＰＡ投与と協調して血栓性脳卒中に対して効果的治療を提供することにおいて機能し得ることを実証する（図５を参照されたい）。繰り返すと、Ｘｅ−ＥＬＩＰによる早期治療は、脳卒中診断が評価される間の過剰なニューロン損傷を防止する。ｔＰＡの後続の投与（追加のＸｅ−ＥＬＩＰの有無に関わらず）は、その後血餅破壊を媒介し、ｔＰＡ単独と比較して、有意により良好な臨床転帰をもたらす。
【００３２】
本明細書に提示されるさらなる研究は、Ｘｅ−ＥＬＩＰの神経保護効果が、Ｈ２またはＨ２Ｓガス同時投与（または同時封入されたこれらの投与）によってさらに向上させられ得ることを実証する。図１３〜１４に示されるようにＨ２およびＨ２Ｓの両方は、Ｘｅ−ＥＬＩＰと共に投与される際、梗塞体積をさらに低減し、行動試験によって評価されるストーク対象における転帰をさらに改善することができる。さらに、図１６において実証されるように、（Ｘｅ、またはＸｅおよびＨ２またはＨ２Ｓを含む）ＥＬＩＰ組成物のいずれも、マウスの胚性幹細胞において評価される有意な毒性を示さなかった。したがって、Ｈ２および／またはＨ２ＳのＸｅ−ＥＬＩＰ組成物へのさらなる組み込みは、それらの神経保護有効性をさらに向上させ得る。
【００３３】
ＩＩ．リポソームおよびリポソーム組成物
「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の発生によって形成される、様々な単一または多重膜脂質溶媒を含む総称である。リポソームは、一般的にリン脂質を含む二重層膜を有する小胞構造、および一般的に水性組成物を含む内部媒質を有することとして特徴付けられ得る。本明細書に提供されるリポソームは、単層リポソーム、多重膜リポソーム、および多小胞リポソームを含む。本明細書に提供されるリポソームは、正に荷電した、負に荷電した、または中性のリン脂質からなり得る。ある特定の実施形態において、リポソームは電荷が中性である。
【００３４】
多重膜リポソームは、水性媒質によって分離される複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を含む脂質が過剰の水溶液中で懸濁される際に、自然発生的に生じる。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己転位を受け、水および溶解した溶質を脂質二重層間に捕捉する（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。親油性分子、または親油性領域を有する分子もまた、脂質二重層中に溶解、またはそれと結合し得る。
【００３５】
特定の態様において、撮像され得る、および／または超音波の適切な適用によって妨害され得るエコー源性リポソームを発生させるために、ガスはリポソーム中にカプセル化される。ガス封入の特定の方法を以下に詳述し、実施例１および図１〜７に例証する。
【００３６】
本実施形態に従って使用されるリポソームは、当業者に知られるような異なる方法によって製造され得る。例えば、例えば中性リン脂質ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、および／またはＥＰＣなどのリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）は、アルコールまたは他の有機溶媒中に溶解することができ、その後脂質二重層中への包接のための成分と混合される。混合物は、様々な洗浄剤をさらに含み得る。典型的に、脂質混合物をボルテックスし、ドライアイス／アセトン浴中で凍結し、一晩凍結乾燥する。凍結乾燥した調製剤を長時間−２０℃以下で保管する。必要に応じて、凍結乾燥したリポソームを、例えば０．９％食塩水中で再構成する。
【００３７】
代替的には、リポソームを、脂質を容器、例えばガラス製ナシ型フラスコ内の溶媒中で混合することによって調製し得る。容器は、予想されるリポソームの懸濁液の体積より１０倍大きい体積を有するべきである。回転蒸発器を使用して、約４０℃の負圧下で溶媒を除去する。溶媒は、通常、リポソームの所望の体積に応じて約５分〜２時間以内に除去される。組成物を、乾燥器内で真空下でさらに乾燥し得る。乾燥脂質は、経時的に劣化する傾向のため、一般的に約１週間後に廃棄される。
【００３８】
他の代替的な方法において、リポソームを、他の既知の実験手順に従って調製し得る（例えば、それぞれの関連する部分が本明細書に参照によって組み込まれる、Ｂａｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９６５、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７９、Ｄｅａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｕｓｔｅｒ，１９８３、Ｓｚｏｋａ  ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９７８を参照されたい）。本実施形態に有用であり得る追加のリポソームは、例えば、その全ての全体がこれによって参照により放棄なしに組み込まれる、国際公開第０２／１００４３５Ａ１号、米国特許第５，９６２，０１６号、米国出願第２００４／０２０８９２１号、国際公開第０３／０１５７５７Ａ１号、国際公開第０４０２９２１３Ａ２号、米国特許第５，０３０，４５３号、および米国特許第６，６８０，０６８号に記載されるような、カチオン性リポソームを含む。リポソームを製造する工程は、国際公開第０４／００２４５３Ａ１号においてもまた記載される。中性脂質は、カチオン性リポソームに組み込まれ得る（例えば、Ｆａｒｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ある特定の実施形態において使用され得る様々な中性リポソームは、本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第５，８５５，９１１号に開示される。これらの方法は、それらの水性材料を捕捉するそれぞれの能力、およびそれらのそれぞれの水性空間対脂質の割合において異なる。
【００３９】
リポソームのサイズは、合成方法に応じて変化する。本実施形態におけるリポソームは、様々なサイズであり得る。ある特定の実施形態において、リポソームは小さく、例えば外径において約１００ｎｍ、約９０ｎｍ、約８０ｎｍ、約７０ｎｍ、約６０ｎｍ未満、または約５０ｎｍ未満である。
【００４０】
そのようなリポソームを調製する際、本明細書に記載される、または当業者に知られるような任意のプロトコルが使用され得る。リポソームの調製の追加の非限定的な例は、それぞれが本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第４，７２８，５７８号、同第４，７２８，５７５号、同第４，７３７，３２３号、同第４，５３３，２５４号、同第４，１６２，２８２号、同第４，３１０，５０５号、および同第４，９２１，７０６号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１号、および同第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０号、英国特許出願第２１９３０９５Ａ号、Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６、Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｍａｙｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．１９８７、Ｍａｙｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、およびＬｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８４、に記載される）。
【００４１】
ある特定の実施形態において、脂質系ナノ粒子は、中性リポソーム（例えば、ＤＯＰＣリポソーム）である。本明細書で使用される「中性リポソーム」または「非荷電リポソーム」は、本質的に中性の正味荷電（実質的に非荷電）を生じる１つ以上の脂質成分を有するリポソームとして定義される。「本質的に中性」または「本質的に非荷電」によって、所与の集団内のあったとしてもほとんどない脂質成分（例えば、リポソームの集団）が、別の成分の反対の電荷によって相殺されない電荷を含む（すなわち、１０％未満、より好適には５％未満、および最も好適には１％未満の成分が非相殺電荷を含む）ことが意味される。ある特定の実施形態において、中性リポソームは、それ自身が生理学的条件下で（すなわち、約ｐＨ７で）中性である主に脂質および／またはリン脂質を含み得る。
【００４２】
本実施形態のリポソームおよび／または脂質系ナノ粒子は、リン脂質を含み得る。ある特定の実施形態において、単一の種類のリン脂質がリポソームの作成において使用され得る（例えば、（全飽和したホスファチジルグリセロールまたはホスファチジルセリンからなる）ＤＰＰＣなどのリン脂質が、リポソームを発生させるために使用され得る）。他の実施形態において、一種類より多いリン脂質が、リポソームを作成するために使用され得る（例えば、ＤＰＰＣおよびＥＰＣ）。
【００４３】
リン脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンを含み、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンは生理学的条件下で（すなわち、約ｐＨ７で）非荷電であるため、これらの化合物は中性リポソームの発生にとって特に有用であり得る。ある特定の実施形態において、リン脂質ＤＯＰＣが、非荷電リポソームを生成するために使用される。ある特定の実施形態において、リン脂質ではない脂質（例えば、コレステロール）が使用され得る。
【００４４】
リン脂質は、グリセロリン脂質およびある特定のスフィンゴ脂質を含む。リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（「ＤＯＰＣ」）、卵ホスファチジルコリン（「ＥＰＣ」）、ジラウロイルホスファチジルコリン（「ＤＬＰＣ」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジステアロイルフォスファチジルクロリン（「ＤＳＰＣ」）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＭＰＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（「ＰＭＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（「ＰＳＰＣ」）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＳＰＰＣ」）、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＬＰＧ」）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（「ＤＳＳＰ」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）、ジミリストイルホスファチジン酸（「ＤＭＰＡ」）、ジパルミトイルホスファチジン酸（「ＤＰＰＡ」）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、ジミリストイルホスファチジルセリン（「ＤＭＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）、脳ホスファチジルセリン（「ＢＰＳ」）、脳スフィンゴミエリン（「ＢＳＰ」）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「ＤＰＳＰ」）、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＡＰＣ」）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＢＰＣ」）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＥＰＣ」）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、パルミトイルオエオイルホスファチジルコリン（「ＰＯＰＣ」）、パルミトイルオエオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＰＯＰＥ」）、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルコリンを含むが、これに限定されない。
【００４５】
リン脂質は、天然または合成源由来であり得る。卵またはダイズホスファチジルコリン、脳ホスファチジン酸、脳または植物ホスファチジルイノシトール、心臓カルジオリピン、および植物または細菌ホスファチジルエタノールアミン（またはこれらの水素化型）などの天然源由来のリン脂質が、ある特定の実施形態において、リン脂質として使用される。いくつかの態様において、（全ｍＰＥＧｍＰＥＧリン脂質または全ホスファチジルエタノールアミンであり得る）ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ＝１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］などのＰＥＧ化脂質が用いられる。
【００４６】
同様に、当業者によって、送達、封入などを最適化するために、様々なリポソーム成分のモル比が調整され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの態様において、リポソームは、ＤＰＰＣ：ＥＰＣ：ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ：ＤＰＰＧ：ＣＨを約３０〜５０：１０〜３０：５〜１５：５〜１５：１０〜２０、または約４０〜５０：２０〜３０：５〜１０：５〜１０：１０〜２０の割合で含む。特定の割合のいくつかの例は、無制限に５０：２０：１０：１０：１５、６０：３０：１０：１０：１２、４６：２３：８：８：１５、４７：２７：９：８：１３、または４８：２８：７：７：１３を含む。
【００４７】
ある特定の実施形態において、脂質系小胞は、ＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子である。ＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子は、カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス−（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）−プロパン）をコレステロールと混合することによって調製される。小胞は、核酸とさらに調製されることができ、核酸が２つの脂質二重層間に凝結しているように見える（「サンドイッチ」と呼ばれる）構造を形成することができる（米国特許第６，７７０，２９１号および同第６，４１３，５４４号）。
【００４８】
Ａ．ガス装填リポソーム
ある特定の実施形態において、本発明は、同時薬物封入によるガス含有リポソームの容易な生成のための方法を提供する。例示的な実施形態（実施例１を参照されたい）において、リン脂質のリポソームおよびコレステロールを、脂質膜を水和させ、超音波処理し、凍結し、解凍する従来の手順によって調製した。発生した脂質は、超音波処理の後に脂質を対象のガスと共に圧力下に配置する段階を含むことによって空気を含有する。平衡の後、試料を凍結させる。その後圧力を、大気圧まで低減させ、懸濁液を解凍する。この手順は、中程度（１０ｍｇ／ｍｌ）濃度での脂質分散により、最大約１０体積％の量の空気の捕捉につながる。封入されるガスの量は、ガス圧力および脂質濃度と共に増加する。０．３２Ｍマンニトールを利用して生理学的オスモル濃度を有する水性相を提供するために、１、２、４、または６気圧を４ｍｇの脂質に適用した。これは、それぞれ１０、１５、２０、および３０μｌのガス封入につながるであろう。本実施形態は任意の特定の機構に限定されないが、ガス封入のための機構は、ほとんどの溶質のように、空気（主に窒素および酸素）が氷に不完全に溶解し、凍結中に生じる氷から排除されるという事実におそらく依存する。その後排除された空気は、脂質被覆によってなんらかの形で安定化される空気ポケットとして溶液から出てくる。これらの調製剤中の空気の存在は、（水溶性薬物を含み得る）それらの水性含量の最大半分が超音波の短い（例えば、１０秒）適用によって放出され得るように、それらを超音波に対して感作にする。
【００４９】
本発明は、ガスをリポソームに、それらが超音波を反射するだけでなく、超音波または他の誘発手段に曝される際にそれらの内容物を放出するように、導入する方法を提供する。実質的に重要なのは、ある特定の実施形態において、凍結と組み合わせて高圧を使用する方法が、非常に単純であり、選択ガスの組み込みと共に溶質の容易な封入を可能にすることである。本方法は超音波造影剤および超音波制御薬物送達系の両方の調製剤に適切である。
【００５０】
水中のガスの溶解性が低いため、リポソームを調製するための従来の手順はガスの組み込みを可能にしない。しかしながら、ヘンリーの法則によると、液体中のガスの溶解性は、そのガスの液体に対する圧力に正比例する。溶液は、ガスの圧力が局所温度における平衡飽和値よりも小さい、それと等しい、またはそれより大きい際に、不飽和、飽和、または過飽和と見なされる。したがって、圧力が増加する場合、溶液中のガス分子濃度が増加し、圧力が低下する場合、過剰ガスが蒸気として放出される。
【００５１】
本発明のある特定の実施形態の圧力−凍結法は、この原理に基づく。凍結の本質的な役割は、ガスおよび溶質分子の両方を、それらの封入を優遇するように、濃縮させることである。実際に、凍結中に空気が放出され、しばしば気泡として結果として生じる氷中に捕捉されるという基本的な現象は、長年にわたって既知であり、さらに、細胞内のその気泡形成は、長期間の細胞および組織の保持における損傷の凍結に有意に貢献する。
【００５２】
エコー源性リポソームを生成する方法の例示的な段階を、以下、特に実施例１および図１〜７に提供する。リポソーム中のガスの組み込みは、圧力に比例する。上記のように、リポソームによるガスの取り込みが第１の段階の溶液中の量に比例する場合、これはヘンリーの法則から予想されるはずである。これはガス捕捉に影響を与えるが、溶存ガス、したがってガス封入に対する大きい影響を有するのは、凍結段階である。本発明はいかなる機構にも限定されないが、凍結が、おそらく２つの目的、溶存ガスの局所濃度を増加させること、およびバルクガス相の小さいポケットの形成の核となること、を果たすと考えられる。ガスは、他の溶質のように、固体の氷よりも液体の水により可溶性である。したがって、氷の結晶が成長するにつれて、溶存ガスは氷から未凍結溶液へと漸進的に置換され、その結果、溶存ガスが次第に液体溶液の絶え間なく減少する体積中に濃縮させられる。溶存ガス濃度が十分に高くなると、ガスの気泡が核となり、成長し得る。核生成理論によると、全溶存ガス圧力と周囲の液体中の周囲気圧との間の差異が、ラプラス圧力（表面張力の影響下での表面の収縮が原因で気泡中に作成される圧力）を超える際に気泡が生じる。
【００５３】
凍結がガスを水性相から放出することは明らかであるが、そのように放出される気泡が凍結分散液中のどこに存在するのかは不明である。分散液が超音波反射性となるためには、高い音響インピーダンスの表面を有する空気のポケットが存在しなくてはならない（図１に示す）。ガスは、空気に対して比較的低い表面張力を有する、脂質二重層の疎水性内部と接触する溶液から出てき得るが、トレハロースの空気組み込みに対する効果は、より複雑な工程が関わることを示す。（それ自身の、または水のいずれかの）結晶化よりもむしろガラス形成を優遇することによって、凍結保護剤として機能するトレハロースは、マンニトールがしたよりもはるかに少ないエコー源性を支持した。マンニトールは、冷却時に溶液から容易に結晶化することにおいて、糖類の中でかなり特徴的である。以前は、マンニトール溶液を凍結することがリポソームに損傷を与えることが提起された。損傷した膜の表面の極性−非極性境界面は、急速に減圧されるダイバーに影響を与える減圧病において窒素気泡の放出の核生成の好適な部位であり得るという数年前になされた提案は、その発見と一致し、核生成理論に基づく。
【００５４】
繰り返すと、本発明はいかなる特定の機構にも限定されないが、以下は、ガス含有リポソーム形成工程の一部であると考えられる。氷形成中の液体相の過飽和は、初期の空気ポケットの生成を引き起こすはずであるが、もしそうであるとすれば、圧力を元の周囲気圧に低減する前に試料が解凍される際に、エコー輝度が特に低くあるはずはないため、これが全体的な話である可能性は低い。これらの条件下、氷は融解し、生成された水は本質的に脱気されるため、（全ての形態の）脂質に結合した空気は、この水中に拡散するであろう。一方、第１に圧力が低下させられ、第２に試料が解凍される際、最初に融解する溶液中の空気濃度は、それが加圧時に懸濁液中に溶解した空気のほとんどを含有するため、高くある。その高い溶質（マンニトール）含量のため、リポソームの環境中の氷は、最初に融解し、脂質を周囲（１気圧）気圧に即時に曝すであろう。この最初に融解する相は、空気で非常に過飽和されるだけでなく、前段落に記載されるように、周囲気圧に曝される際に成長する空気ポケットを含有する可能性もまたある。したがって、空気は溶液から出てきて、凍結中におそらく形成されたガス核を拡大するであろう。結果は、脂質の単層によって安定化される空気ポケットの形成である。
【００５５】
さらに、ガス（例えば、Ｘｅ）および水性溶質の同時封入は、それが超音波の適用によるリポソーム内容物の放出を可能にするため、薬物送達において利点を有する。音響的活性リポソームは超音波をもまた反射するため、超音波の適用の部位に従って薬物の放出を局所化することだけでなく、それが送達のために活性化されている間に治療剤を撮像することもまた可能である。さらに、リポソーム自身の分子標的化が可能である。
【００５６】
リポソーム内容物を放出し、工程の画像を提供することに加えて、超音波は、薬物送達と共同作用する組織に対して効果、すなわち、薬物のその標的への到達を促進し得る超音波の空洞化効果を有し得る。例えば、従来の方法は、部位特異的薬物の送達が、薬物が充填された造影微小気泡を、標的領域内で高強度の超音波によって破壊することによって達成可能であることを発見した（Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ１９９６；１５（８）：５７７−８４．）。さらに、Ｓｈｏｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ２０００；１０１（２２）：２５５４−６．）は、アルブミン被覆微小気泡が、アデノウイルス導入遺伝子を、ラットの心筋にＵＳ媒介微小気泡破壊を介して効果的に送達するために使用され得ることを発見した。従来の研究は、音響的活性リポソームの存在下での超音波の同時適用による、プラスミドＤＮＡの向上した取り込みをもまた発見している（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３；７（５）：４２２Ｐａｒｔ２）。
【００５７】
エコー源性リポソームの超音波刺激に対する感度は、リポソーム組成物、封入ガス、および／または超音波適用パラメータを変化させることによってさらに改善させられ得る可能性がある。脂質二重層は、リポソームの脂質殻が表面交代の直後に急速に再封止するように、それに自己封止特性を付与する傾向がある疎水性相互作用によって結合される。したがって、脂質膜の剛性を変更することは、それの超音波に対する反応に影響を与えると考えられる。最適なガスの選択は、リポソーム中の高体積、および血流中の低速度の放出の両方に作用する。最も効果的な超音波振動は、組織が維持し得る最高強度での小さい数であるようである。
【００５８】
Ｂ．リポソームの標的化
標的化送達は、リポソームのそれらのペイロードを送達する能力を損なうことなく、リガンドを添加することによって達成される。これが特定の細胞、組織、および臓器（例えば、脳内の特定の部位）への送達を可能にすることが企図される。リガンド系送達系の標的化特異性は、異なる細胞型上のリガンド受容体の分布に基づく。標的化リガンドは、非共有結合的または共有結合的のいずれかでナノ粒子と結合することができ、本明細書に説明される様々な方法によってナノ粒子に接合することができる。
【００５９】
本実施形態のリポソームを標的化するために使用され得る分子の例は、抗体（またはその分屑）およびアプタマーを含む。代替的にまたは追加的に、細胞透過性ペプチドがリポソームを細胞に直接送達するために使用され得ることが企図される。
【００６０】
ＩＩＩ．薬学的組成物および投与の経路
リポソーム（例えば、リポソームを含むガス）の臨床適用が実行される場合、リポソーム複合体を、意図される利用に適切な薬学的組成物として調製することが必要であろう。一般的に、これは発熱因子、ならびにヒトまたは動物に対して有害であり得るいかなる他の不純物をも本質的に含まない薬学的組成物を調製することを必要とするであろう。一般的に、複合体を安定させ、標的細胞による取り込みを可能にする適切な緩衝液を用いることもまた所望であろう。本発明の水性組成物は、以上に説明されるようにリポソーム中に封入され、さらに薬学的に許容される担体、または水性媒体内で分散する有効量のＸｅを含む。そのような組成物は、接種材料ともまた呼ばれる。「薬学的に」または「薬理学的に許容される」という語句は、動物、またはヒトに投与される際に、適切に、副作用、アレルギーまたは他の有害反応を生成しない組成物を指す。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、被覆、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、および同様物を含む。薬学的活性物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当技術分野で既知である。任意の従来の媒体または剤が活性成分と不適合である場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【００６１】
治療組成物の溶液は、ドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、これらの混合物中、および油中で調製され得る。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製剤は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有する。本発明の治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかで注射可能な組成物の形態で有利に投与され、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。これらの調製剤は、乳化もまたされ得る。そのような目的のための典型的な組成物は、薬学的に許容される担体を含む。例えば、組成物は、１ミリリットルのリン酸緩衝食塩水当たり、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、または最大約１００ｍｇのヒト血清アルブミンを含有し得る。他の薬学的に許容される担体は、水溶液、塩、防腐剤、緩衝液、および同類物を含む非毒性賦形剤を含む。
【００６２】
非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、食塩水溶液、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなどの非経口溶媒を含む。静脈内溶媒は、液体および栄養補填剤を含む。防腐剤は、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスを含む。薬学的組成物の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、既知のパラメータに従って調整される。添加製剤は、経口投与に適切である。経口製剤は、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、および同類物などの典型的な賦形剤を含む。組成物は、一般的に溶液または懸濁液の形態を取る。
【００６３】
本実施形態の治療組成物は、標準的な薬学的調製剤を含み得る。本発明に係る治療組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的な経路を介する。この場合、静脈内注射または注入が好適であり得る。そのような組成物は、生理学的に許容される担体、緩衝液、または他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として通常投与されるであろう。
【００６４】
有効量の治療組成物は、意図される目標に基づいて決定される。「単位用量」または「用量」という用語は、対象において使用するために適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所定量の治療組成物であって、その投与、すなわち、適切な経路および治療計画に関する、以上に説明するような所望の反応を生成するために計算される、所定量の治療組成物を含有する。治療および単位用量の数の両方に係る投与される量は、所望の保護に依存する。
【００６５】
治療の有効用量の範囲は、動物試験で決定される有効用量から推定され得る。一般的に、ｍｇ／ｋｇでのヒト等価用量（ＨＥＤ）は、以下の式に従って計算され得る（例えば、本明細書に参照によって組み込まれる、Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２２（３）：６５９−６６１，２００８を参照されたい）。
ＨＥＤ（ｍｇ／ｋｇ）＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）Ｘ（動物Ｋｍ／ヒトＫｍ）
【００６６】
Ｋｍ係数の使用は、変換において、体重のみよりもむしろ体表面積（ＢＳＡ）に基づく、より正確なＨＥＤ値をもたらす。ヒトおよび様々な動物のＫｍ値は、既知である。例えば、（１．６ｍ２のＢＳＡを有する）平均６０ｋｇのヒトのＫｍは３７であるのに対し、２０ｋｇの子ども（ＢＳＡ０．８ｍ２）は２５のＫｍを有するであろう。マウス３Ｋｍ（０．０２ｋｇの重量および０．００７のＢＳＡの場合）、ハムスター５Ｋｍ（０．０８ｋｇの重量および０．０２のＢＳＡの場合）、ラット６Ｋｍ（０．１５ｋｇの重量および０．０２５のＢＳＡの場合）、およびサル１２Ｋｍ（３ｋｇの重量および０．２４のＢＳＡの場合）を含む、いくつかの関連する動物モデルのＫｍもまた既知である。
【００６７】
治療組成物の正確な量は、施術者の判断に依存し、各個人に特有である。それにも関わらず、計算されるＨＥＤ用量は、一般的な指針を提供する。用量に影響を与える他の要因は、患者の身体的および臨床状態、投与の経路、治療および効力の意図される目標、特定の治療製剤の安定性および毒性を含む。本実施形態について、ヒト（成人）における治療リポソーム（例えば、Ｘｅ−ＥＬＩＰ）用量の量は、約０．５６８ｍｇ／ｋｇより多いことが想定される。例えば、ヒト用量の範囲は、約０．６〜３．０ｍｇ／ｋｇの間、約０．８〜２．８ｍｇ／ｋｇの間、または約１．０〜２．５ｍｇ／ｋｇの間であり得る。いくつかの特定の態様において、Ｘｅ−ＥＬＩＰはヒト対象に１．１４ｍｇ／ｋｇ〜約２．２７ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される。
【実施例】
【００６８】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を実証するために含まれる。後続する実施例において開示される技術は、本発明の実施においてよく機能すると発明者によって発見された技術を表し、したがってその実施のための好適な様式を構成すると考えられ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変更が行われることができ、依然として同類または類似の結果を、本発明の精神および範囲から逸脱せずに得ることを理解するべきである。
（実施例１）
Ｘｅ−ＥＬＩＰ生成および実験方法
【００６９】
Ｘｅ−ＥＬＩＰ生成
Ｘｅ−ＥＬＩＰを、図７に概略的に図示される凍結解凍プロトコルを使用して生成した（本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第７，９７６，７４３号をもまた参照されたい）。簡潔には、リポソームは、Ｌ−α−ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０  ＰＥＧ２０００  ＰＥ）、およびコレステロール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）からなった。５ミリグラムの脂質をクロロホルム中で混合し、溶媒をアルゴンによって５０℃の水浴中で蒸発させ、ガラス製バイアル上に薄膜を形成した。脂質膜を、真空下に４〜６時間、完全な溶媒除去のために配置した。乾燥した脂質膜を、０．３２ｍｏｌ／Ｌのマンニトールによって１ミリリットル当たり脂質１０ｍｇの濃度まで水和させ、５分間の超音波処理を後続させた。超音波処理したリポソームを、テフロン（登録商標）ゴム製セプタムで封止されたキャップを有する２ｍＬガラス製バイアルに移した。６ミリリットルのＸｅ（１００％）（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｇａｓ  Ｉｎｃ，Ｅａｔｏｎｔｏｗｎ，ＮＪ）を、２７ゲージ１／２インチ針に取り付けられた１２ｍＬ注射器を有するテフロン（登録商標）ゴム製セプタムを通してガラス製バイアルに注入した（この段階では、他のガスおよび／またはガス混合物が組み込まれ得ることに留意すること）。加圧されたリポソーム分散液を、−７０℃で、ドライアイスによって少なくとも３０分間凍結した。キャップを除去することによってバイアルを加圧解除した後、リポソーム分散液を解凍した。Ｘｅ−ＥＬＩＰの構造およびガス保持特性を、図１に示す。
【００７０】
ＭＣＡ閉塞のラットモデル
全ての動物実験は、ヒューストンのテキサス大学健康科学センターのＡｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラット（２６０〜２８０ｇ、Ｈａｒｌｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、水の自由な利用を与えて、手術前に２４時間絶食させた。手術前に、げっ歯類を、イソフロランの連続的な流れを有する封止した誘導室中（メラニーに問い合わせること）に５分間配置することによって、麻酔を誘導した。マーカイン（２ｍｇ／ｋｇ）を手術部位に皮下注射し、局所鎮痛を提供した。右中大脳動脈（ＭＣＡ）を２時間、以前説明した腔内縫合法を使用して閉塞することによって、脳虚血を誘導した（本明細書に参照によって組み込まれる、Ｂｒｉｔｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１０）。簡潔には、ＭＣＡを閉塞する前に、１ｍｍ直径の穿頭孔を頭蓋に作成して、局所脳潅流（ＣＰ）測定を促進した。次に、右総頸動脈（ＣＣＡ）を、正中線首切開によって曝した。その後、右外頸動脈（ＥＣＡ）を、その遠位端部付近で結紮した。内部動脈を単離し、隣接する組織から分離した。加工２５ｃｍ４−０ナイロンモノフィラメントを、右ＥＣＡから前進させ、右ＭＣＡに２時間挿入して、虚血を誘発した。ＭＣＡを通る局所血流の断絶を、虚血性領域上に、ブレグマに対して２ｍｍ後側および６ｍｍ側方に配置されたレーザードップラー流量計によって実証した。全ての実験において、虚血中に体温を３７℃に維持した。ポリエチレンカテーテルを、右大腿動脈中に圧力記録のために導入した。
【００７１】
治療時間窓の決定
動物を、４つの群（各群中ｎ＝８）、（１）無処置群−ＭＣＡ閉塞のみ、（２）処置群「ａ」−再潅流の１０分後にＸｅ−ＥＬＩＰ投与、（３）処置群「ｂ」再潅流の６０分後にＸｅ−ＥＬＩＰ投与、（４）処置群「ｃ」再潅流の１８０分後にＸｅ−ＥＬＩＰ投与、に無作為に分割した。各処置群中の全てのラットに、右内頸動脈に修正ＰＥＳＯチューブによってカニューレを挿入することによって、２００μｌのＸｅ−ＥＬＩＰを４分間かけて投与した。Ｘｅ−ＥＬＩＰ投与中、ＩＣＡを、０．１８ＭＰａのピーク間圧力振幅（１Ｗ／ｃｍ２ダイヤル設定）で１ＭＨｚの連続波超音波に曝した。神経学的評価を、後続する３日間にわたって行った。ＭＣＡＯ後の３日目、２％２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）染色によって梗塞体積を決定した。
【００７２】
用量依存性およびＸｅ−ＥＬＩＰ投与の効果の決定
動物を、４つの群（各群中ｎ＝８）、（１）無処置群−ＭＣＡ閉塞のみ、（２）処置群「ａ」−１００μｌ用量のＸｅ（１０ｍｇＸｅ−ＥＬＩＰ／ｍｌ）を受けた、（３）処置群「ｂ」−２００μｌ用量のＸｅ−ＥＬＩＰ（１０ｍｇＸｅ−ＥＬＩＰ／ｍｌ）を受けた、（３）処置群「ｃ」−４００μｌ用量のＸｅ−ＥＬＩＰ（１０ｍｇＸｅ−ＥＬＩＰ／ｍｌ）を受けた、に無作為に分割した。各処置群の全てのラットが、右内頸動脈に修正ＰＥＳＯチューブによってカニューレを挿入することによって、Ｘｅ−ＥＬＩＰを再潅流の６０分後に受けた。Ｘｅ−ＥＬＩＰ投与中、ＩＣＡを、０．１８ＭＰａのピーク間圧力振幅（１Ｗ／ｃｍ２ダイヤル設定）で１ＭＨｚの連続波超音波に曝した。梗塞体積を、ＭＣＡＯの３日後にＴＴＣ染色によって決定した。神経学的評価を、後続する３日間にわたって行った。ＭＣＡＯ後の３日目、２％ＴＴＣ染色によって梗塞体積を決定した。
【００７３】
神経学的評価
マウスにおける全ての行動試験を、静かな低照度の室内で、処置群に関して盲検で観察者が行った。手術後１、２、および３日目において、各動物を運動機能および神経学的転帰について、四肢の配置、ビーム歩行、および格子歩行能力を記録することによって試験した。
【００７４】
四肢の配置を、動物をその尻尾でテーブル上に吊るす間に、その頭を上げ、その前肢をテーブルに向けて伸ばす動物の能力を観察することによって評価した（得点ゼロ−無反応、反応が鈍いまたは遅延する際１〜１０の得点、反応が急速および完全に実行される際２の得点）。ビーム（２．５ｘ２．５ｘ８０ｃｍ）を横切って歩く能力を、ビームを横切って移動する間に平衡を維持する能力を観察することによって評価した。反応得点を以下のように割り当てた。得点ゼロ−足を滑らさずにビームを横断した、得点１−ビームの側方を把持しながら横断した、得点２−ビームをはって横切ることに困難を示したが横断することができた、得点３−歩行困難が原因でビームを横断するのに１０秒超を必要とした、得点４−ビームを横断することができなかった、得点５−身体またはいずれの四肢もビーム上に動かすことができなかった、得点６−１０秒を超えてビーム上に留まることができなかった。格子歩行能力を、動物をステンレス鋼格子床（２ｃｍｘ２ｃｍのメッシュサイズを有する２０ｃｍｘ４０ｃｍ）上に配置することによって評価した。全歩数を、最大５０歩まで計数した。格子を抜け落ちた前肢または後肢の誤配置によって定義される、足フォールト誤差の数を記録した。
【００７５】
梗塞体積測定
動物を、３日目に神経学的評価に後続して屠殺した。脳を摘出した。Ｊａｃｏｂｏｗｉｔｚ脳スライサーを使用して、梗塞体積決定のための、ＰＢＳ中２０分間３ｒＣでの２％２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）による染色前に、２ｍｍ厚の冠状切片に切断した。染色した切片を、保管のために、１０％リン酸緩衝ホルマリンに移した。切片を、Ｐｏｌａｒｏｉｄ土地用三脚に取り付けたＣａｎｏｎＧ７  １０．０メガピクセルカメラで、８．５ｃｍの物体距離で撮影した。画像を転送し、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ−Ｐｌｕｓで分析して、梗塞体積を計算した。梗塞体積を、均等にスライスした（１ｍｍ）脳切片上の梗塞領域を測定し、それらを合計することによって計算した（シンプソンの法則）。脳全体の体積に対する正規化梗塞体積を、ＴＴＣ未染色の（梗塞した）組織の体積を脳全体のそれで割ることによって計算した。
【００７６】
ゲル電気泳動および免疫ブロット
動物を、３つの群、１）無虚血での偽手術、２）無処置での２時間のＭＣＡＯ、および３）Ｘｅ−ＥＬＩＰ（４００μｌ）動脈内投与に後続する２時間のＭＣＡＯおよび１時間の再潅流、に供した。脳組織スライスを回収し、プロテアーゼ阻害剤、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ、１ｍＭ）、およびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含有する１ｍｌのＲＩＰＡ（ラジオイムノ沈降アッセイ）緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で均質化した。脳組織を、脳卒中発症の７および２４時間後に摘出した。細胞タンパク質全体を抽出し、ＳＯＮＩＣＳ  Ｖｉｂｒａ  Ｃｅｌｌ（ＳＯＮＩＣＳ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ  Ｉｎｃ，ＣＴ，ＵＳＡ）で３回超音波処理した。上清を回収し、タンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質（８０ｇ）を装填し、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で、トリス−グリシンランニング緩衝液系の電気泳動によって２時間分離し、その後ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）に移した。非哺乳類ブロッキング試薬（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＥ，ＵＳＡ）中で、Ｔｗｅｅｎ−２０なしで１時間ブロッキングした後、膜をＢＤＮＦ（１：２５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、リン酸化ＡＫＴ（１：２５０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）、または全Ａｋｔ（１：５００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）、およびホスホ−ＥＲＫ１／２（１：２５０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）またはＥｒｋ１／２（：５００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）の一次抗体で、４℃で一晩インキュベートした。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含有するトリス緩衝食塩水で洗浄した後、膜をＩＲＤｙｅ８００ＣＷ  Ｄｋｙ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｈ＋Ｌ）（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＥ，ＵＳＡ）で、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ０．１％中での徹底的な洗浄の後（濯ぎ２回および洗浄３回Ｘ５分）、ブロットを、オデッセイ赤外線撮像システム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＥ，ＵＳＡ）によって可視化した。等価のタンパク質装填を確保するために、膜を抗ｂ−アクチン（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）によって１時間室温で再プローブし、その後ＩＲＤｙｅ６８０  Ｌ  Ｔ  Ｇｔ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＥ，ＵＳＡ）で１時間インキュベートした。膜を、同一のオデッセイ赤外線撮像システムを使用して走査した。全てのタンパク質バンドの光学密度を、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用することによって分析した。全ての標的タンパク質を、ｂ−アクチンに正規化することによって定量化し、対応する対照群の折り畳みとして計算した。
【００７７】
統計分析
ノンパラメトリック統計分析を、２つの群に対してウィルコクソン順位検定、または複数の群に対してクラスカルウォリス分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行い、ほとんどの実験について平均および標準偏差として報告した。広範囲の比較において差異が検出された場合、全ての群の平均順位の複数の比較を、全ての一対比較のために行った。処置群間の神経学的転帰比較を、中央値および４分位数として報告した。Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ（Ｖｅｒｓｉｏｎ９、ＳｔａｔＳｏｆｔ  Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｓａ，ＯＫ）ソフトウェアを統計分析のために利用した。ｐ＜０．０５を有意と考えた。
（実施例２）
脳卒中の治療としてのＸｅ−ＥＬＩＰ
【００７８】
Ｘｅ−ＥＬＩＰを１〜４ｍｇ／ラット（３．５、７、および１４ｍｇ／ｋｇ）の用量範囲で脳卒中発症の３時間後に、右一過性血管内フィラメント中大脳動脈（ＭＣＡＯ）の閉塞（２時間）を有する雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットモデルに注射することによって、用量依存性Ｘｅ−ＥＬＩＰ治療を最初に調査した。７ｍｇ／ｋｇ、または１４ｍｇ／ｋｇのＸｅ−ＥＬＩＰを脳卒中発症の３時間後に受けた処置群は、正規化梗塞サイズを６．０±２％（ｐ＝０．０４）および３．７±２％（ｐ＝０．００２）までそれぞれ低減させた（図４ａ〜ｅ）。この試験は、脳卒中発症の３時間以内に２〜４ｍｇを超える用量（例えば、７ｍｇ／ｋｇ以上）で投与されるＸｅ−ＥＬＩＰが、最良の神経保護を提供することを実証する。
【００７９】
神経学的損傷の行動評価を、四肢の配置、ビーム歩行、および格子歩行能力を、静かな低照度の室内で観察者盲検方法で手術の１、２、および３日後に記録することによって行った。結果を図４ｆ〜ｈに示し、７ｍｇ／ｋｇまたは１４ｍｇ／ｋｇで処置した動物における非常に有意な行動改善を実証する。
【００８０】
Ｘｅ−ＥＬＩＰの治療時間窓を、その後ラットフィラメントＭＣＡＯおよび血栓性ＭＣＡＯモデルの両方についてさらに調査した。Ｘｅ−ＥＬＩＰを、上行右総頸動脈を通して、脳卒中発症の２、３、および５時間後（再潅流の１０分、１時間、および３時間後）にフィラメントＭＣＡＯモデルに投与した。無処置群において、大きい梗塞が生じ、脳全体の１６±５．２％（２２８±７４ｍｍ３）の正規化梗塞体積を有する大脳皮質および線条体に主に作用した（図２ａ、ｅ）。脳卒中発症の１０分および２時間後のＸｅ−ＥＬＩＰ投与は、正規化梗塞サイズを１５±５．１％（対照）から４．９±１．２％（ｐ＝０．００５）、および６．０±３．４％（ｐ＝０．００２）までそれぞれ低減した（図２ａ〜ｅ）。ＭＣＡ閉塞および再潅流の最初の時間中、深部体温において群間の差異は存在しなかった。
【００８１】
神経学的損傷の行動評価を、四肢の配置、ビーム歩行、および格子歩行能力を、静かな低照度の室内で観察者盲検方法で手術の１、２、および３日後に記録することによって行った。脳卒中発症の３時間後にＸｅ−ＥＬＩＰを投与した群は、行動課題を行うことにおいてわずかな改善を実証した。１０分および１時間にＸｅ−ＥＬＩＰを投与した群の両方は、１日目から全ての行動試験において改善した動作を実証し、全ての試験において３日目までに著しい改善を有した（図２ｆ〜ｈ）。過剰な細胞外グルタミン酸の蓄積が引き起こす興奮毒性効果を虚血の早期事象において吸収する間に、キセノンがニューロン損傷をグルタミン酸受容体（ＮＭＤＡ）拮抗薬として保護することが実証された。
【００８２】
脳卒中発症の２時間後（再潅流の１０分後）のＸｅ−ＥＬＩＰの治療時間窓は、治療効果を示した。臨床設定において、脳卒中治療のためのｔＰＡ投与は、その限られた治療時間窓によって限定される。８５％の脳卒中は循環する血餅による脳動脈の閉塞が原因であるものの、１５％の脳卒中は出血性である。ＩＶ  ｔＰＡは、出血脳卒中の血栓性脳卒中からの排除まで投与され得ない。したがって、ｔＰＡ治療時間窓を延長するためのＩＶ  ｔＰＡ前の神経保護剤投与は、非常に有望な臨床に関連する戦略である。したがって、Ｘｅ−ＥＬＩＰ投与の神経保護効果を、脳卒中発症の２時間後の、しかし再潅流前後にさらに調査した。処置の前後のＸｅ−ＥＬＩＰによる脳梗塞の低減を、図６ａに示す。再潅流前および再潅流後のＸｅ−ＥＬＩＰは、正規化梗塞サイズを８６±１２％、および６７±７％だけそれぞれ低減した。
【００８３】
虚血性脳卒中発症の４．５時間以内のｔＰＡの投与は、臨床的利益を有すると示されている依然として唯一の処置である。神経保護組み合わせ治療は、虚血性ニューロン損傷の有害効果を最小化し得る。Ｘｅ−ＥＬＩＰのｔＰＡ活性に対する効果を試験するために、Ｘｅ−ＥＬＩＰの存在下でのｔＰＡの血栓溶解効率を、ブタ血餅上でｔＰＡ単独と比較した。ｔＰＡの血栓溶解効果を、３０分間の遊離Ｘｅ（Ｘｅ飽和溶液）との組み込み後に阻害した。ｔＰＡがＸｅ−ＥＬＩＰに組み込まれる際、それは、ｔＰＡ単独と同一の血栓性効果を有した。これは、ｔＰＡとの相互作用からのＥＬＩＰのＸｅに対する保護効果を実証した（図６ｂ）。
【００８４】
ラット塞栓性脳卒中モデルにおけるＸｅ−ＥＬＩＰの治療効果を、その後調査した。雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラット（ｎ＝１６）において、１３ｍｍ長の血餅を中大脳動脈に注射することによって血栓性脳卒中を誘導した。処置群において、ｔＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を、閉塞の発症の２時間後に静脈内注入した。Ｘｅ−ＥＬＩＰを、ＩＶ  ｔＰＡの前に静脈内に投与した。連続波超音波（１ＭＨｚ、５０％負荷サイクル、０．５Ｗ／ｃｍ２）を適用して、Ｘｅ−ＥＬＩＰ投与の５分間中のＥＬＩＰからのＸｅ放出を誘発した。無処置の血栓性脳卒中対照群は、最大の損傷および梗塞サイズ（脳全体の１７±５％）を示した（図５ａ〜ｅ）。ｔＰＡ処置は、損傷および梗塞サイズを５．２±０．４％（ｐ＝０．０２５対脳卒中）まで低減した。Ｘｅ−ＥＬＩＰと組み合わされるｔＰＡ処置は、梗塞サイズを１．５±０．４％（ｐ＝０．０５対ｔＰＡ群）までさらに低減した。行動欠点は、梗塞体積と逆相関した。レーザードップラー流量計によって観察された局所血流速度は、ｔＰＡおよびｔＰＡ＋Ｘｅ−ＥＬＩＰ治療群の両方において類似した（図５ｆ〜ｈ）。この試験は、１ＭＨｚの超音波の適用によって放出されるＥＬＩＰ封入キセノンの神経保護効果を実証した。Ｘｅ−ＥＬＩＰは、ｔＰＡ血栓溶解活性に影響を与えずに、ｔＰＡと組み合わせて使用され得る。処置条件から生じる死亡率を、以下の表１に示す。
【００８５】
【表１】
0006297040.tif 000002
【００８６】
Ｘｅ−ＥＬＩＰのＢＤＮＦ発現およびアポトーシスに対する効果をもまた評価した（例えば、図３を参照されたい）。脳卒中の２４時間後の大脳皮質組織における、ＢＤＮＦのウエスタンブロット分析（ａ）、ｐｈｏｓ−Ａｋｔ（ｂ）、およびｐｈｏｓ−ＥＲＫ（ｃ）は、ＸｅがＢＤＮＦ（ｄ）、全Ａｋｔ（ｅ）、およびｐｈｏｓ−ＥＲＫ（ｆ）の発現を増加させることを示した（図３ａ〜ｆ）。偽手術群（ｇ）、脳卒中群（ｈ）、およびＸｅ−ＥＬＩＰ処置ありの脳卒中群（ｉ）からの脳切片の半影領域におけるＴＵＮＥＬ染色は、Ｘｅ−ＥＬＩＰ処置された動物においてアポトーシスの低減を示した（図３）。アポトーシスのウエスタンブロットおよび顕微鏡写真は、３つの独立した実験の代表例である。データは、平均±標準偏差である。
（実施例３）
Ｘｅ−ＥＬＩＰは出血性脳卒中における効果的保護を提供する
【００８７】
Ｘｅ−ＥＬＩＰ組成物を、実施例１で詳述されるように生成した。Ｘｅ−ＥＬＩＰ有効性を評価するために、くも膜下出血のラットモデルを用いた。簡潔には、２６０〜２８０グラムの間の体重の健康な雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系ラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を取得した。全ての手術手順を、解剖顕微鏡下で麻酔した動物に対して行った。右外頸動脈を単離し、４．０加工鋭利ナイロンモノフィラメントを内部動脈を通して導入して、中大脳動脈を穿孔した。モノフィラメントを即時に撤回して、中大脳動脈への血流を再開させた。血流を観察して、出血を確認した。
【００８８】
出血の誘導に後続して、キセノンの循環するＸｅ−ＥＬＩＰからの脳内への放出を誘発するための内頸動脈上への同時超音波適用（０．５ＭＰａ）と共に、Ｘｅ−ＥＬＩＰ（６００μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）を５分間、大腿静脈を通して注入した。神経学的および行動試験を手術後３日間行った。出血の程度を評価するためのＳＡＨ等級付け、水腫およびアポトーシスを確認するためのＴＵＮＥＬ染色を評価するための脳水含有のために、神経学的および行動評価後３日目に動物を屠殺した。
【００８９】
脳組織の理学的検査からの結果を図８に示す。得点化のために基底槽を６つの部分に分割した。出血をこれらの部分のうちのそれぞれにおいて評価し、０〜３（０：無ＳＡＨ、１：最小ＳＡＨ、２：認識可能な動脈を有する中程度の血餅、３：血餅が動脈を閉塞）に得点化した。総得点を合計し、出血の重症度を、０〜７：軽度のＳＡＨ、８〜１２：中程度のＳＡＨ、１３〜１８：重度のＳＡＨ、として計測した。Ｘｅ−ＥＬＩＰは、フィラメント穿孔くも膜下出血（ＳＡＨ）ラットモデルにおける出血を減少させる。
【００９０】
処置したラットの行動試験の結果を図９に示す。下部パネルは、動物が対象であった一連の行動試験を図示する。神経学的評価、ビームおよび格子歩行の結果を、上部パネルのグラフに示す。いずれの場合においても、Ｘｅ−ＥＬＩＰで処置したラットが、無処置のラットよりも、有意により良く動作した。実際に、ＴＵＮＥＬ染色を使用した脳切片の顕微鏡検査（図１０）は、出血脳卒中群からの脳切片、上部パネル、が、Ｘｅ−ＥＬＩＰ処置をした出血脳卒中群、下部、と比較して、有意により多いアポトーシス細胞を有することを示した（中央パネルを比較されたい）。おそらく最も重要なことに、Ｘｅ−ＥＬＩＰ処置は、ＳＡＨラットの死亡率を減少させたが、脳水腫および脳血流に対して有意な効果を示さなかった（図１１）。脳水腫は、脳卒中の、主要な生命を脅かす合併症である。それは、くも膜下出血、血管攣縮、および虚血性再潅流損傷にしばしば関連付けられる。本明細書に示される結果は、１つのガス（Ｘｅ）のみを含有するＥＬＩＰ製剤が、脳水腫および血管活性に影響を与えないことを実証する。脳卒中後の水素の投与が、血液脳関門透過性を減少させることによって脳水腫を除去することができ、Ｈ２Ｓが血管攣縮を抗炎症効果によって阻害することが示されている。したがって、いくつかの態様において、水素ガスおよび／または硫化水素ガスをＸｅ−ＥＬＩＰと共に同時封入する製剤は、脳水腫および脳血管攣縮に対して効果を追加しているだろう。
（実施例４）
Ｈ２およびＨ２ＳはＸｅ−ＥＬＩＰ有効性を向上させる
【００９１】
試験は、次にＸｅの水素または硫化水素とのＥＬＩＰへの同時封入を評価するために実行した。ＥＬＩＰは、リン脂質およびコレステロールからなり、実施例１で詳述されるように生成した。しかしながら、この場合、３０％水素＋７０％ガスキセノンまたは１％硫化水素＋９９％キセノンの混合物をＥＬＩＰに、１００％Ｘｅの使用に加えて加圧−凍結法によって装填した。
【００９２】
有効性実験の設計を、図１２にグラフ表示する。示されるように、Ｈ２／Ｘｅ−ＥＬＩＰまたはＨ２Ｓ／キセノンＥＬＩＰの治療効果を試験するために、それぞれの４００μｌ（追加のＸｅ−ＥＬＩＰ単独中）をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットに、右中大脳動脈閉塞後（３時間で）別個に静脈内投与した。内頸動脈上に向けた１メガヘルツ低振幅（０．１８ＭＰａ）連続波超音波を使用して、循環するＸｅ−ＥＬＩＰからのガス放出を誘発した。
【００９３】
その後動物を行動試験に供し、存在する物理的損傷を評価するためにそれらの脳を検査した。図１３ａおよびｂに示されるように、Ｈ２およびＨ２Ｓの添加の両方は、処置したラットの脳内の正規化梗塞体積を低減するＸｅ−ＥＬＩＰの能力をさらに増加させた。図１３ｃに示されるように、Ｈ２Ｓの添加は、処置したラットの脳内のＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を低減するＸｅ−ＥＬＩＰの能力をさらに増加させ、ニューロン細胞損傷を低減させることを示した。処置したラットの脳内の血管壁にわたる好中球浸潤の分析は、Ｈ２Ｓによって向上した、Ｘｅ−ＥＬＩＰの処置に後続して減少した浸潤を示した。血管壁にわたる好中球移動の阻害は、Ｈ２Ｓ／Ｘｅ−ＥＬＩＰ神経血管単位保護のための１つの潜在的な機構である。
【００９４】
おそらくより重要なことに、Ｈ２またはＨ２Ｓと組み合わせられるＸｅ−ＥＬＩＰ治療した動物は、四肢の配置、ビーム歩行、および格子歩行を含む行動試験においてより良く動作する傾向もまたあった（図１４）。特に、組み合わせ治療は、対照（無処置）のラット、およびＸｅ−ＥＬＩＰ単独で処置したラットの両方と比較して、格子歩行能力の改善において有意により良くあることを示した。
（実施例５）
培養ヒト脳星状細胞の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）細胞毒性または酸化ストレスに対するＸｅ−ＥＬＩＰ保護
【００９５】
ヒト脳星状細胞は、神経細胞機能および酸化ストレスに対する生存を維持することにおいて重要な役割を果たす。培養したヒト脳星状細胞のＨ２Ｏ２への露出は、有意な損傷を細胞に引き起こし、それらが大量のＬＤＨを放出することを引き起こした。しかしながら、脳細胞のＸｅ−ＥＬＩＰ試薬による前処置は、ＬＤＨ放出を著しく低減し（図１５）、Ｘｅ−ＥＬＩＰの酸化ストレスによって損傷した脳細胞に対する保護効果を示した。ＥＬＩＰ単独で治療した細胞、または対照媒体内に、保護効果は全く、またはほとんど見られなかった（図１５）。
（実施例６）
Ｘｅ−ＥＬＩＰはマウス幹細胞に対して細胞毒性を有さない
【００９６】
マウス胚性幹細胞を、それらをＨ２Ｏ２でＸｅ−ＥＬＩＰの存在下または非存在下で、処置するまたはしない際の、それらの成長および生存について検査した。細胞生存率を、ＬＤＨの放出を評価することによって決定した。Ｘｅまたは他のガスで装填される、またはされないＥＬＩＰの存在下で、培養内のＬＤＨレベルは、依然として有意なレベルに留まった（図１６）。一方、Ｈ２Ｏ２（１０ｍＭ）の添加で、酸化ストレス剤Ｈ２Ｏ２への露出の２時間以内に有意なＬＤＨ放出が見られた（図１６）。
＊＊＊
【００９７】
本明細書に開示され、主張される方法のうちのすべては、本開示を考慮して、必要以上の実験なしに行われ、実行され得る。本発明の組成物および方法は好適な実施形態に関して記載されているが、方法、および本明細書に記載される方法の段階、または一連の段階に、本発明の概念、精神および範囲から逸脱せずに、変動が適用され得ることは当業者に明らかであろう。最も具体的には、化学的、および生理学的の両方で説明されるある特定の剤が、同一の、または類似した結果を達成しながらも、本明細書に記載される剤の代替とされ得ることは明らかであろう。当業者に明らかな、全てのそのような類似した代替物および修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。
【００９８】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に明記されるそれらに対して補助的な、例示的な手順の、または他の詳細を提供する程度まで、本明細書に参照によって具体的に組み込まれる。
米国特許第４，１６２，２８２号
米国特許第４，３１０，５０５号
米国特許第４，５３３，２５４号
米国特許第４，７２８，５７５号
米国特許第４，７２８，５７８号
米国特許第４，７３７，３２３号
米国特許第４，９２１，７０６号
米国特許第５，０３０，４５３号
米国特許第５，６１２，０５７号
米国特許第５，８５５，９１１号
米国特許第５，８５８，３９９号
米国特許第５，９６２，０１６号
米国特許第６，４１３，５４４号
米国特許第６，６８０，０６８号
米国特許第６，７７０，２９１号
米国特許第７，９７６，７４３号
米国出願第２００４／０２０８９２１号
国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１号
国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４号
英国特許出願第２１９３０９５Ａ号
国際公開第０２／１００４３５Ａ１号
国際公開第０３／０１５７５７Ａ１号
国際公開第０４／００２４５３Ａ１号
国際公開第０４／０２９２１３Ａ２号
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Ｄｅａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｕｓｔｅｒ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，Ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，（Ｏｓｔｒｏ  Ｍ．Ｊ．Ｅｄ．），Ｃｈａｐｔｅｒ１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３．
Ｆａｒｈｏｏｄｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３５：２８９−２９５，１９９５．
Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ，Ｗｅｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．８７−１０４，１９９１．
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Ｈｏｐｅｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８１２：５５，１９８５．
Ｈｕａｎｇｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７（５）：４２２Ｐａｒｔ２，２００３．
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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