(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色条件下で５０μＭ〜５００μＭの濃度になるのに十分な量で存在するクリスタルバイオレットと、
サポニンを含む透過剤と、を含む、自動粒子分析システムにおいて撮像するために泌尿器液体サンプルの粒子を染色するための粒子造影剤組成物。
【請求項２】
前記透過剤が、染色条件下で約３．５重量％の濃度になるのに十分な量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記クリスタルバイオレットが、染色条件下で約８６μＭの濃度になるのに十分な量で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
抗菌物質を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記クリスタルバイオレットが、染色条件下で約８６μＭの濃度になるのに十分な量で存在し、及び
前記クリスタルバイオレットが、およそ８０％以上の純度である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
塩化ナトリウムと、
少なくとも二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水と、を更に含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の粒子造影剤組成物と泌尿器液体サンプルとを混合して、粒子造影剤組成物の最終濃度がサンプル混合物の重量で約１％〜約２０％であるサンプル混合物を得ることと、
前記サンプル混合物を、セ氏２０度より高い温度で、９０秒未満の間、インキュベートすることと、を含む、自動粒子分析システムにおいて使用して撮像するために泌尿器液体サンプルの粒子を処理する方法。
【請求項９】
前記透過剤が、染色条件下で約３．５重量％の濃度になるのに十分な量で存在し、
前記クリスタルバイオレットが、染色条件下で約８６μＭの濃度になるのに十分な量で存在し、
前記サンプル混合物の重量による粒子造影剤組成物の最終濃度が、約１０％〜約２０％であり、及び
前記サンプル混合物をインキュベートすることが、前記サンプル混合物を、３０℃〜５０℃で、６０秒未満の間、インキュベートすることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプル混合物の重量による粒子造影剤組成物の最終濃度が約１５％であり、
前記サンプル混合物をインキュベートすることが、前記サンプル混合物を、３０℃〜５０℃で、６０秒未満の間、インキュベートすることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプル混合物をインキュベートすることが、前記サンプル混合物を、４０℃〜５０℃で、３０秒〜３５秒、インキュベートすることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記クリスタルバイオレットが、およそ８０％以上の純度であり、
粒子造影剤組成物が、抗菌物質を更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
粒子造影剤組成物が、塩化ナトリウムと、少なくとも二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水とを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サポニンが、染色条件下で約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌの濃度になるのに十分な量で存在する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、全内容が参照により本明細書に組み込まれている、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｕｒｉｎｅ  Ｓａｍｐｌｅｓ」の題名で、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／７９９，０１４号による利益を請求している。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、概して粒子造影剤に関し、またより具体的には、尿サンプルなどの液体サンプル中の粒子を識別し、定量化するために、完全に又は部分的に自動化された装置で使用するための粒子造影剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
尿沈渣分析は、患者の健康状態の全体像を提供するための、最もよく実施されている診断検査の一つである。尿サンプルは、患者の体から採り、後で行う処理及び分析用に試験管に保存しておくことができる。尿サンプル中の有形成分とも呼ばれる特定の特徴的沈渣の出現は、臨床上重要であり得、かつ／又は対象の病的状態を示し得る。
【０００４】
一般的に、異常尿は、血球、上皮細胞、結晶、円柱、又は微生物などの様々な有形成分を含有し得る。例えば、尿サンプルは、血液起源の細胞を含有し得る。赤血球（Erythrocytes）又は赤血球（red  blood  cells）（ＲＢＣ）は、糸球体から尿道までの泌尿生殖器系の任意の箇所での出血（血尿）の結果、尿中に存在し得る。白血球（leukocytes）又はＷＢＣ、好中球、好酸球の存在は、臨床的重要性を有し得る。輝細胞は、比重が１．０１０以下である低張尿で見られる好中球の一種である。リンパ球の存在は、移植後の腎拒絶反応の早期指標として使用されてきた。好酸球は、薬剤性間質性腎炎に関連し、腎臓又は下部尿路から生じる粘液糸が存在し得る。
【０００５】
尿サンプルは、上皮起源の細胞も含有し得る。少数の、腎尿細管細胞とも呼ばれる腎上皮細胞は、正常な剥離によって、健常なヒトの尿の中で発見され得る。しかし、過度の腎尿細管細胞の存在は、活動性腎疾患又は尿細管の損傷を示す。尿中に見られる様々なタイプの上皮細胞（腎、移行又は尿路、及び扁平の上皮細胞）の中で、腎上皮細胞は最も臨床的に重要である。これは、急性尿細管壊死、ウイルス感染症（サイトメガロウイルスなど）、及び腎移植拒絶反応に関連する。腎上皮細胞の存在はまた、発熱、化学的毒素、薬物（とりわけアスピリン）、重金属、炎症、感染症、及び新生物によっても増加する。その上、風疹及び疱疹などのウイルス感染、とりわけサイトメガロウイルスによる感染時には、封入体の存在が認められうる。
【０００６】
尿は、移行上皮細胞又は尿路上皮細胞も含有し得る。移行上皮細胞は、腎盂から男性尿道の遠位部分まで、及び女性の膀胱の基底部（三角部）までの尿路の内側を覆う多層の上皮細胞である。移行上皮細胞を腎上皮細胞と区別するのは困難であり得るが、これらは一般的により大きく、より球形である。健康なヒトの尿には、少数の移行細胞が存在する。数の増加は、感染症に関連する。移行上皮癌では、これらの細胞の大きな凝集塊又は層が認められうる。
【０００７】
尿は、扁平上皮細胞も含有し得る。扁平上皮細胞は、女性の尿道及び男性の尿道の遠位部の内側を覆う。女性の尿に多数の扁平細胞が存在すれば、一般的に、膣の汚染を示している。
【０００８】
尿は、クルー細胞も含有し得る。クルー細胞は、膣起源の別のタイプの扁平細胞であり、尿沈渣に混入して認められ得る。この扁平上皮細胞は、その存在が細菌性膣炎の指標である細菌の膣ガルドネレラ属によって被覆されているか、またはそれらの細菌が付着している。
【０００９】
尿は、卵円形脂肪体、尿細管脂肪、又は尿細管脂肪体をも含有し得る。これらの脂肪体は、脂肪又は脂肪滴で満たされている腎上皮細胞（又はマクロファージ）である。脂肪は、中性脂肪（トリグリセリド）又はコレステロールのいずれかであり得、どちらも同じ臨床的重要性を有する。尿中の卵円形脂肪体の存在は、疾患異常を示し、見過ごしてはならない。これは、尿沈渣中の脂肪円柱及び脂肪滴と共に見られることが多く、ネフローゼ症候群で見られるような大量のタンパク尿に関連している。
【００１０】
尿は、細菌及び酵母菌などの微生物も含有し得る。正常時では、尿は無菌的であるか、又は細菌が存在しない。しかしながら、ｐＨがアルカリ性の尿には、特定の細菌が典型的に見られる。関連する沈渣所見には、ＷＢＣ（好中球）及び円柱（ＷＢＣ、細胞状、粒状、又は細菌性）の存在が含まれ得る。腸起源のグラム陰性桿菌による感染症が最も多いが、感染性微生物はグラム陽性球菌もあり得る。
【００１１】
更に、とりわけ酵母菌感染症に罹患する女性患者による汚染などの膣汚染の結果として、酵母菌が尿中に見られることもある。これは、尿糖の存在により真性糖尿病にも関連する。酵母菌は、皮膚及び環境由来の一般的な汚染物質であり、衰弱患者及び免疫抑制患者又は免疫減弱患者の感染は問題である。
【００１２】
従来から、尿中沈渣の分析は、通常の実験室で顕微鏡を使用して目視検査することによって行われてきた。これらの手法を用いて、尿サンプルを先ず、遠心分離にかけて濃縮する。こうして得られた沈渣を、場合によっては染色し、次いで顕微鏡のスライドに乗せ、手作業による顕微鏡下の測定及び計数にかける。
【００１３】
サンプル調製工程は、遠心分離によって尿沈渣を濃縮することと、場合により顕微鏡染色液を適用して、例えばＲＢＣ、ＷＢＣ、及び上皮細胞などの沈渣タイプ間のコントラストを強化させることとを含むことができる。手作業による計数では、技術者は、湿式マウントスライドを観察して、専門的な判断を利用して目に見える細胞のタイプ又はその外観から識別し、所定の面積内で観察された種々のタイプの尿沈渣の数を手作業で計数する。
【００１４】
尿サンプル中に見られる細胞又は細胞構造を染色するために、様々な染色液が使用されている。例えば、ライト染色液は、光学顕微鏡下の検査用の尿サンプルを染色するために使用されている染色液である。尿サンプルの染色は、染色剤の正確な適用及び細胞構造の適切な保存を確保するために、複数の溶液及び工程を適正な順序で使用することが必要である。第１の工程では、サンプルを分解から保護し、細胞構造を維持するために、固定剤がサンプルに適用され得る。その後、第２の工程で、染色剤が細胞に入れるよう細胞膜を溶解するために、透過剤がサンプルに適用され得る。第３の工程では、適切な構造を染色するために、染色剤がサンプルに適用され得る。サンプルは、観察のために更に濯いでもよく、又は追加の染色液、対比染色液を適用する追加の工程を取り入れてもよく、又は他の作用を行ってもよい。
【００１５】
これらの工程を適切な順序で、適切な時間をかけて行うことが重要である。サンプルが固定される前に透過されると、サンプル中の細胞構造は、固定される前に分解する可能性があり、当初の細胞形態の識別能が失われる。更に、透過工程の前では染色は不可能であるか、又は染色剤が適正に細胞を透過して細胞内の構造を染色することはないであろう。更に、固定、透過、及び染色などの工程のうちいずれかが過度に急速に行われると、細胞の形態は失われ、かつ／又は細胞及びその内部構造が適正に染色されない可能性がある。また、尿の本来のｐＨでは適正に機能できない構成要素の適正な機能を確保するために、他の工程の前にｐＨ調整剤の使用を必要とする場合がある。現在の染色技術は、多数の工程及び長い時間を要する。
【００１６】
現在の染色技術は、一般的にサンプル１の割合に対して造影剤およそ９の割合で、造影剤によるサンプルの希釈を要する。フローサイトメトリーシステムなどの画像ベースの分析システムで使用する場合、混合物の量が多いことは、少なくともその量の混合物の処理に時間を要するという理由で、好ましくないことがある。
【００１７】
自動分析装置は、より普及してきている。尿検査のためのシステムの使用は、一般的に、米国特許第４，４７３，５３０号のＶｉｌｌａ−Ｒｅａｌ著の題名「Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｓａｎｉｔａｒｙ  Ｕｒｉｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔ」、ＭｃＤｏｎａｌｄ著の米国特許第３，８９４，８４５号、題名「Ｕｒｉｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅ」及び同著の米国特許第３，９８８，２０９号、題名「Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅ」、Ｓｃｈｌｕｔｅｒ著の米国特許第４，９７３，４５０号、題名「Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｕｒｉｎａｌｙｓｉｓ」、Ｍａｎｓｏｕｒら著の米国特許第４，６２２，２９８号、題名「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｕｒｉｎｅ」、並びにＰａｒｋｅｒ著の米国特許第５，１３２，２３２号、題名「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ」に記載されている。Ｄｅｉｎｄｏｅｒｆｅｒら著の米国特許第４，６１２，６１４号、題名「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｆｌｕｉｄ  Ｓａｍｐｌｅ」は、サンプルを顕微鏡スライド又はフローセルなどの拡張領域の上に分配することによって尿沈渣を分析する方法を報告している。Ｄｅｉｎｄｏｅｒｆｅｒらは、視覚的に識別可能な特徴のクラス順に並べたアレイで表示される電子画像に変換される、サンプルの複数の光学的静止画像の使用を報告している。しかしながら、これらの初期に開発された尿検査システムの多くは、一般的に、すべての意図される目的に対し、処理能力、精度、及び／又はすべての標的／対象に適合させるために必要な一般的適用可能性が欠如していた。
尿沈渣の測定の自動化には、自動フロー顕微鏡（例えば、フロータイプの自動顕微鏡ｉＱ（登録商標）２００、Ｉｒｉｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）が使用されうる。これらの種類の装置では、予備濃縮なしで、尿サンプルは、平型フローセルに導入され、サンプルがフローセルの中を流れる間に、画像を撮影して保存する。しかしながら、尿沈渣は、その形態が多様化しており、多くの沈渣が損傷を受けており、したがって、画像の決定を良好な精度で行うことは実現が困難である。赤血球（とりわけ異形赤血球）、細菌及び結晶などの小型の沈渣を、外部ユーザーの確認なしに良好な精度で決定することは特に困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第４，４７３，５３０号明細書
【特許文献２】米国特許第３，８９４，８４５号明細書
【特許文献３】米国特許第３，９８８，２０９号明細書
【特許文献４】米国特許第４，９７３，４５０号明細書
【特許文献５】米国特許第４，６２２，２９８号明細書
【特許文献６】米国特許第５，１３２，２３２号明細書
【特許文献７】米国特許第４，６１２，６１４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記の様々な自動化システムは、サンプルの迅速分析に依存している。染色プロセス工程の数及び継続時間は、自動粒子分析システムの速度及び効果の上で制約要因となり得る。自動粒子分析システムは、染色プロセスが短縮されれば、より効果的になり得て、染色プロセスが１回の工程で実施されれば、更により効果的になり得る。更に、自動粒子分析システムは、サンプルの合計サイズが最小に維持されれば、より効果的になり得る。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
自動粒子分析システムにおける撮像に向けて泌尿器の液体サンプルの粒子を染色するための粒子造影剤組成物を開示する。粒子造影剤組成物は、染色条件下で５０μＭ〜５００μＭの濃度になるのに十分な量で存在するクリスタルバイオレットを含み得る。粒子造影剤組成物は、５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃ及びサポニンからなる群から選択される透過剤を更に含み得る。
【００２１】
一実施形態において、透過剤は、染色条件下で約３．５重量％の濃度になるのに十分な量で存在する５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃであり得る。一実施形態において、クリスタルバイオレットは、染色条件下で約８６μＭの濃度になるのに十分な量で存在し得る。一実施形態において、粒子造影剤組成物は、少なくとも二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を更に含み得る。
【００２２】
一実施形態において、粒子造影剤組成物は、抗菌物質を含み得る。いくつかの実施形態において、抗菌物質は、Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００であり得て、粒子造影剤組成物は、染色条件下で約８６μＭの濃度になるのに十分な量で存在する、純度８０％以上のクリスタルバイオレットを含み得る。いくつかの実施形態において、粒子造影剤組成物は、塩化ナトリウムと、少なくとも二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水とをも含み得る。
【００２３】
自動粒子分析システムにおいて使用する撮像用に、泌尿器の液体サンプルの粒子を処理する方法を開示する。この方法は、粒子造影剤組成物と泌尿器液体サンプルとを混合して、粒子造影剤組成物の最終濃度がサンプル混合物の重量で約１％〜約２０％であるサンプル混合物を得ることを含み得る。この方法は、サンプル混合物を、セ氏約２０度より高い温度で、９０秒未満の間、インキュベートすることを更に含み得る。いくつかの実施形態では、粒子造影剤組成物は、染色条件下で５０μＭ〜５００μＭの濃度になるのに十分な量で存在するクリスタルバイオレット並びに５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃは、染色条件下で約３．５重量％の濃度になるのに十分な量で存在し得る。クリスタルバイオレットは、染色条件下で約８６μＭの濃度になるのに十分な量で存在し得る。サンプル混合物の重量による粒子造影剤組成物の最終濃度は、約１０％〜約２０％であり得る。サンプル混合物は、３０℃〜５０℃で、６０秒未満の間、インキュベートされ得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、サンプル混合物の重量による粒子造影剤組成物の最終濃度は約１５％であり、サンプル混合物は、３０℃〜５０℃で、６０秒未満の間、インキュベートされる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、サンプル混合物は、４０℃〜５０℃で、３０秒〜３５秒、インキュベートされる。クリスタルバイオレットは、およそ８０％以上の純度であり得る。いくつかの実施形態において、粒子造影剤組成物は、Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を更に含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、粒子造影剤組成物は、塩化ナトリウムと、少なくとも二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水とを添加することを更に含む。
【００２８】
上記したもの及び本発明の実施形態の多くの他の特徴及び付随する利点は、下記の実施形態への参照により、付随の図と共に考慮されると、明らかとなりより理解されるだろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
染色条件下で５０μＭ〜５００μＭの濃度になるのに十分な量で存在するクリスタルバイオレットと、
５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃ及びサポニンからなる群から選択される透過剤と、を含む、自動粒子分析システムにおいて撮像するために泌尿器液体サンプルの粒子を染色するための粒子造影剤組成物。
（項目２）
前記透過剤が、染色条件下で約３．５重量％の濃度になるのに十分な量で存在する５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記クリスタルバイオレットが、染色条件下で約８６μＭの濃度になるのに十分な量で存在する、項目２に記載の組成物。
（項目４）
少なくとも二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を更に含む、項目３に記載の組成物。
（項目５）
抗菌物質を更に含む、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記クリスタルバイオレットが、染色条件下で約８６μＭの濃度になるのに十分な量で存在し、
前記クリスタルバイオレットが、およそ８０％以上の純度であり、及び
前記抗菌物質が、Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００である、項目５に記載の組成物。
（項目７）
塩化ナトリウムと、
少なくとも二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水と、を更に含む、項目６に記載の組成物。
（項目８）
項目１に記載の粒子造影剤組成物と泌尿器液体サンプルとを混合して、粒子造影剤組成物の最終濃度がサンプル混合物の重量で約１％〜約２０％であるサンプル混合物を得ることと、
前記サンプル混合物を、セ氏２０度より高い温度で、９０秒未満の間、インキュベートすることと、を含む、自動粒子分析システムにおいて使用して撮像するために泌尿器液体サンプルの粒子を処理する方法。
（項目９）
前記５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃが、染色条件下で約３．５重量％の濃度になるのに十分な量で存在し、
前記クリスタルバイオレットが、染色条件下で約８６μＭの濃度になるのに十分な量で存在し、
前記サンプル混合物の重量による粒子造影剤組成物の最終濃度が、約１０％〜約２０％であり、及び
前記サンプル混合物をインキュベートすることが、前記サンプル混合物を、３０℃〜５０℃で、６０秒未満の間、インキュベートすることを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記サンプル混合物の重量による粒子造影剤組成物の最終濃度が約１５％であり、
前記サンプル混合物をインキュベートすることが、前記サンプル混合物を、３０℃〜５０℃で、６０秒未満の間、インキュベートすることを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記サンプル混合物をインキュベートすることが、前記サンプル混合物を、４０℃〜５０℃で、３０秒〜３５秒、インキュベートすることを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記クリスタルバイオレットが、およそ８０％以上の純度であり、
粒子造影剤組成物が、Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を更に含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
粒子造影剤組成物が、塩化ナトリウムと、少なくとも二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水とを更に含む、項目１２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本明細書は、以下の添付の図面を参照し、異なる図面での同様の参照番号の使用は、同様の又は類似の構成要素を例示することを意図する。
【図１】一実施形態によるサンプル液を運ぶフローセルの概略図である。
【図２】一実施形態による粒子造影剤組成物の調製の概略図である。
【図３】一実施形態による迅速な一段階染色プロセスのフローチャートである。
【図４】一実施形態による迅速な一段階染色プロセスに従って染色した尿サンプルから選択された粒子の代表的な説明図である。
【図５】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図６】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図７】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図８】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図９】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図１０】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図１１】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図１２】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図１３】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図１４】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図１５】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図１６】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図１７】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図１８】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図１９】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図２０】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【図２１】早期の一実施例に従って染色した尿サンプルから選択された粒子の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示は、尿サンプルなどの液体サンプル中で迅速に視覚的識別性をもたらす、驚くべき予期せぬ粒子造影剤組成物に関する。粒子造影剤組成物は、自動フローサイトメトリーシステムにおいて、とりわけ有用であり得る。粒子造影剤組成物は、粒子造影剤及び透過剤の組み合わせから構成される。粒子造影剤組成物は、固定剤及び／又は抗菌物質を含み得る。一実施形態において、粒子造影剤組成物は、クリスタルバイオレット、サポニン、及びＰｒｏｃｌｉｎ  ３００の混合物である。驚くほど有効な実施形態において、染色条件下で、クリスタルバイオレットは、約０．５７ｍＭの濃度になるのに十分な量で存在し、サポニンは、約２３．３重量％の濃度になるのに十分な量で存在し、Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００は、約０．０５重量％の濃度になるのに十分な量で存在し、脱イオン水は約７６．７重量％で存在する。
【００３１】
これらの例示的実施例は、読み手に、本明細書で考察される一般的主題を紹介するために書かれたものであり、開示される内容の範囲を制限することを意図するものではない。以下のセクションは、同様の番号が同様の要素を示す図面を参照して、様々な追加の特徴及び実施例を説明するが、方向性のある説明は、例示的実施形態を説明するために用いられ、例示的実施形態と同様、本開示を制限するために用いられるべきではない。本明細書の説明図に含まれる要素は、縮尺通りに描かれていないことがある。
【００３２】
本明細書に記載の実施形態より以前は、画像ベースの分析用に、生存細胞又は実質的に無傷の細胞を維持したまま、尿サンプル中の粒子／細胞の識別による分類及び下位分類を行うための粒子造影剤組成物の開発及び使用方法（任意選択により、白血球、上皮細胞、細菌の染色を行って識別的可視化を強化するために、フロー中に染色工程及び透過工程を含む）を可能にするプロトコルは刊行されていなかった。
【００３３】
本開示の態様及び実施形態は、例えば、染色液／色素組成物、及び／又はその組み合わせを含む、特定の粒子造影剤組成物が、尿沈渣サンプル分析などの自動化された画像ベースのサンプル分析を実施するために使用されるとき、予想しなかった特性及び効果を持つという驚くべき予想外の発見に基づく。
【００３４】
尿検査−粒子分析システム
本明細書で開示される組成物及び方法は、Ｉｒｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって販売されているＩＱ尿検査など、多くの異なるタイプの尿検査画像システムと共に使用され得る。特に、本明細書に記載の組成物及び方法は、フローセル分析などの画像ベースのサンプル分析と共に使用され得る。このようなフローセル分析の例として、慣習的な公知のフローサイトメトリー法を挙げることができる。更に、本明細書に記載の組成物及び方法は、以下に詳述され、参照により本明細書に組み込まれる２０１４年３月１７日に出願された題名「Ｆｌｏｗｃｅｌｌ，Ｓｈｅａｔｈ  Ｆｌｕｉｄ，ａｎｄ  Ａｕｔｏｆｏｃｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｕｒｉｎｅ  Ｓａｍｐｌｅｓ」、出願番号＿＿／＿＿＿，＿＿＿、の共同出願に更に記載されているフローセル分析システム及び方法と共に有利に使用され得る。
【００３５】
図１は、デジタル画像処理を利用して、サンプル液の流れ３２の中の微細粒子を撮像する構成において、高光学解像度撮像装置２４の視域２３の中にサンプル液（例えば、以下に更に詳述するサンプル混合物）を運ぶための例示的なフローセル２２の概略図である。フローセル２２は、サンプル液供給源２５に連結され、粒子造影剤組成物との接触及び加熱などの処理に供され得る。
【００３６】
フローセル２２は、サンプルの流れを補助するためのシース液供給源２７とも連結され得る。一実施形態において、シース液は、ｐＨが約７．０で、２０℃での比重が１．００７であり、ＩＲＩＳ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から商標名ＬＡＭＩＮＡで入手することができる食塩水である。
【００３７】
サンプル液は、サンプル供給管２９の先端２８の平らな開口部を通ってフローセル２２の内部の、シース液の流れが実質的に確立されている点まで注入され、それによってリボン状のサンプル流の上下に（又は反対側に）安定かつ対称的なシース液の層流が生じる。サンプルシース液は、シース液を注入サンプル液と共に、実質的に細くなる流路に沿って移動させる精密定量ポンプによって供給され得る。一実施形態において、流路が細くなる領域２１で、シース液がサンプル液を包み、圧縮する。したがって、領域２１での流路の厚みの減少は、サンプル流３２の幾何学的集束に寄与し得る。サンプル液リボン３２は、狭小域２１の下流でシース液と共に運ばれ、高光学解像度撮像装置２４の前を、又はそうでなければその視域２３の中を通過して、その際に例えばＣＣＤを使用して、画像が収集される。サンプル液リボンは、シース液と共に排出口３３に向かって流れる。
【００３８】
ここで図示されるように、狭小域２１は、先端の厚みＤＴが基部の厚みＰＴより細くなるように、基部の厚みＰＴを有する流路基部２１ａと、先端の厚みＤＴを有する流路先端部２１ｂとを有し得る。したがって、サンプル液は、基部２１ａから遠く、先端部２１ｂに近い位置で、サンプル管２９の先端２８の中に注入され得る。よって、シース液の流れが領域２１によって圧縮されると、サンプル液がシース液の覆いに入ることができる。
【００３９】
対物レンズ４６を備えた高光学解像度デジタル撮像装置２４は、リボン状のサンプル流３２と交差する光軸に沿って移動する。光センサーアレイ上の焦点を合わせたデジタル画像を解像し収集するために、対物レンズ４６とフローセル２２との間の相対距離は、モータードライブ５４の操作によって変動可能である。
【００４０】
粒子造影剤組成物
図２は、一実施形態による粒子造影剤組成物の調製の概略図である。ブロック２０８で、粒子造影剤２０２と透過剤２０４とを混合して、粒子造影剤組成物２１０を作製する。いくつかの実施形態では、任意選択の固定剤２０６も混合する。ブロック２０８での混合は、いかなる順序で行っても、またいかなる好適なやり方で行ってもよい。
【００４１】
代替実施形態において、以下で更に詳述するように、ブロック２０８で、追加の構成要素２１２を、粒子造影剤組成物２１０の一部として混合する。
【００４２】
粒子造影剤組成物２１０は、キットの一部として提供することができる。粒子造影剤組成物２１０は、予め調製された状態で提供されてもよく、または混合しなければならない１種以上の構成要素で提供されてもよい。キットは、本明細書に記載の任意の方法による粒子造影剤組成物の使用上の取扱説明書及び／又はキットの他の任意の構成要素の使用についての取扱説明書も含んでよい。キットはまた、１種以上の緩衝液及び／又は希釈液も含んでよい。キット及び／又は緩衝液は、ｐＨ調整剤、イオン強度調整剤、界面活性剤、キレート剤、糖、糖アルコール、タンパク質安定化剤、及び／又は抗菌物質のうち少なくとも１つを更に含んでよい。他の実施形態において、キットは、清浄液又はフラッシング液も含んでよい。キットはまた、陽性対照及び陰性対照、キャリブレーター、又は対照の標準物質も含んでよい。いくつかの実施形態において、標準物質は、キャリブレーター及び／又は対照を含む標準物質を含んでよい。キットは、キットの構成要素を移すための使い捨てマイクロピペット、チップ又はチューブも含んでよい。
【００４３】
粒子造影剤
粒子造影剤２０２は、尿サンプル中の粒子に視覚的識別性を生じることができる任意の造影剤であってもよい。様々な造影剤が、細胞の様々な部分に反応又は集中することから、これらの特性を利用して、特定の部分又は領域を明示するのに役立てることができる。このような造影剤（例えば染色液）の例として、アルシアンブルー及びアルシアンブルー８６（ＰＡＳ中性及び酸性の粘液物質）、アリザリンレッドＳ、アルラレッドＡＣ（アゾ染料赤色染料＃４０）、アナリンブルー（シュウ酸で増強される繊毛）、オーラミン０、アズールＢ、アズールＣ、ビスマルクブラウン、ブリリアント・ブルーＦＣＦ（クマシー・ブルー）、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアント・グリーン、カルミウム（カルミン酸及びカリウムミョウバンから構成される赤色核染料）、コンゴレッド、クロラゾールブラックＥ（核ブラック、サイトグレー、グリコーゲンピンク）、クレシルバイオレットアセテート、ダローレッド、エオシンブルー、エリトロシンＢ（赤色染料＃３）、エチルエオシン、ファストグリーンＦＣＦ（緑色染料＃３）、フチン（Fuchin）塩基性（核及び鞭毛）、フルオレセイン（マーキュロクロム）、ギムザ−末梢血塗抹標本、ハリスヘマトキシリン−退行性核染色液、インジゴカルミン（青色染料＃２）、ヤーヌスグリーンＢ（ミトコンドリア）、ジェンナー染色液（末梢血塗抹標本）、ライトグリーンイエローイッシュ、マクニール（四色血液染色液）、マラカイトグリーン、メチルオレンジ、マルチウスイエロー、マイヤーのヘマトキシリン−進行性核染色液、メチルバイオレット２Ｂ、メテナミン銀−過ヨウ素酸（Peroidic  acid）、メチレンバイオレット、メイ・グリュンヴァルド−血液学的染色液、ＭＴＴ−ホルマザン染色液、ムシカルミン−原発腫瘍染色液、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレア・ファーストレッドＣ．Ｉ．６０７６０、Ｎａｐｔｈａｌ  ＡＳ、ニトロ・ブルー・テトラゾリウム−ファストホルマザン染料、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パパニコロー染色ＥＡＳ−ブリリアント細胞質染色液、パラローザニリン、パラローザニリン、過ヨウ素酸・シッフ−（ＰＡＳ、特異的炭水化物染色液）、フロキシンＢ（Phyloxine）、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ロマノフスキー−ギムザ、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ（アルファ−ナフトールがミエロイド顆粒を染色する）、スダンＩＶ−トリグリセリドを染色、タルトラジン（アゾ染料黄色＃５）、チオニン−メタクロマチンを染色、トリフェニルテトラゾリウム、ＴＴＣ−フォルマザンレッド染料、トルイジンブルーＯ、ライト染色液（従来の血液塗抹標本のための固定剤、緩衝液及び染色液）、並びにライト・ギムザが挙げられる。
【００４４】
少なからぬ努力と実験を通して、クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、サフラニンＯ、エオシンＹ及びメチルグリーンのうち少なくとも１つを含む粒子造影剤２０２を使用することにより、本明細書中で更に詳述する粒子造影剤組成物２１０において、驚くほど有効な結果を実現できることが判明している。粒子造影剤２０２は、画像ベースの分類及び下位分類のために、生存細胞及び／又は実質的に無傷の細胞を染色するのに有効な量で添加される。粒子造影剤２０２は、２種以上の前記粒子造影剤の任意の組み合わせであってもよい。粒子造影剤２０２は、生体細胞及び／又は実質的に無傷の細胞の識別可能に染色された画像が有効に得られるように選択することができる。
【００４５】
一実施形態において、粒子造影剤２０２は、クリスタルバイオレットを含む。クリスタルバイオレットは、染色条件下で、約５０μＭ〜約５００μＭに達するのに十分な量で存在しうる。本明細書では、用語「染色条件下」は、構成要素がサンプルと混合されている状態を指す。クリスタルバイオレットは、染色条件下で、約５０μＭ〜約５００μＭに達するのに十分な量で存在し得る。クリスタルバイオレットは、染色条件下で約３２０μＭに達するのに十分な量で存在し得る。クリスタルバイオレットが、染色条件下で約０．５７ｍＭに達するのに十分な量で存在すると、驚くほど有効な結果を実現することができる。クリスタルバイオレットが、染色条件下で０．５７ｍＭに非常に近い値に達するのに十分な量で存在すると、驚くほど有効な結果を実現することができる。クリスタルバイオレットは、少なくとも５％の純度まで精製することができる。クリスタルバイオレットは、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度まで精製することができる。クリスタルバイオレットは、少なくとも１００％の純度に精製することができる。粒子造影剤２０２は、クリスタルバイオレット単剤であってもよく、又はクリスタルバイオレットを１種以上の追加の粒子造影剤と混合したものでもよい。
【００４６】
一実施形態において、粒子造影剤２０２は、サフラニンＯを含む。サフラニンＯは、染色条件下で約１００μＭ〜約１０００μＭに達するのに十分な量で存在し得る。サフラニンＯは、染色条件下で約６００μＭ〜約９００μＭに達するのに十分な量で存在し得る。サフラニンＯは、染色条件下で約８５０μＭに達するのに十分な量で存在し得る。サフラニンＯは、染色条件下で約８５０μＭに非常に近い値に達するのに十分な量で存在し得る。サフラニンＯは、少なくとも８０％の純度まで精製することができる。サフラニンＯは、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度まで精製することができる。サフラニンＯは、少なくとも１００％の純度に精製することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、粒子造影剤２０２がクリスタルバイオレット及びサフラニンＯの両方を含むと、驚くほど有効な結果が実現される。クリスタルバイオレットとサフラニンＯとの比は、約０．０５：１〜約５：１（モル濃度／モル濃度）であってよい。クリスタルバイオレットとサフラニンＯとの比は、約３：１（モル濃度／モル濃度）であってよい。クリスタルバイオレットとサフラニンＯとの比は、３：１（モル濃度／モル濃度）に非常に近い比率であってよい。
【００４８】
一実施形態において、粒子造影剤２０２は、ニューメチレンブルーを含む。ニューメチレンブルーは、少なくとも５０％の純度まで精製することができる。ニューメチレンブルーは、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度まで精製することができる。ニューメチレンブルーは、少なくとも１００％の純度に精製することができる。
【００４９】
一実施形態において、粒子造影剤２０２は、エオシンＹを含む。エオシンＹは、少なくとも８０％の純度まで精製することができる。エオシンＹは、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度まで精製することができる。エオシンＹは、少なくとも１００％の純度に精製することができる。
【００５０】
一実施形態において、粒子造影剤２０２は、メチルグリーンを含む。メチルグリーンは、少なくとも８０％の純度まで精製することができる。メチルグリーンは、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度まで精製することができる。メチルグリーンは、少なくとも１００％の純度に精製することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、粒子造影剤２０２は、例えば、撮像のために提示される際のサンプル中の粒子の細胞内含有物の特徴を強化することによって、粒子の視覚的識別性をもたらすのに有効な量のクリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、サフラニンＯ、エオシンＹ及びメチルグリーンを１種以上含む。粒子造影剤２０２は、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、腎尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生生物、卵円形脂肪球、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞集塊、細胞片、及び尿サンプル中に見られる他の細胞、並びにそれらの細胞下構造を含む粒子を増強及び／又は染色するために十分な量で存在し得る。染色は、粒子の特定、識別、計数、特徴付け、及び分析、並びに／又は病的状態、疾患若しくは病態に関連する形態学的特徴の特定を補助することができる。可視化可能な又は視覚的識別性は、任意の光源（例えば、ＵＶ、可視光、ＩＲ）を使用して可視化可能又はそうでなければ検出可能でありうる任意の粒子又は粒子内特徴を含み得る。
【００５２】
粒子造影剤組成物２１０が２種以上の粒子造影剤２０２を含む実施形態において、各粒子造影剤２０２の量は、粒子の分類及び下位分類のための視覚的識別性に対して、粒子造影剤２０２が、独立した効果、競合効果、及び／又は増強効果を持つかに応じて、適切に調節され得る。
【００５３】
透過剤
いくつかの実施形態において、透過剤２０４は、粒子の膜及び／又は壁の透過剤であってもよい。透過剤２０４は、界面活性剤及び／又は表面張力調整剤を含み得る。いくつかの実施形態において、透過剤２０４は、サポニンを含み得る。代替実施形態において、透過剤２０４は、第４級アンモニウム塩、非イオン性界面活性剤、及び両性イオン性界面活性剤のうち少なくとも１つを含み得る。透過剤は、粒子造影剤２０２の細胞内含有物への近づきやすさを高めるために、細胞の透過性を変化させることができる。透過剤を選択して、迅速な一段階染色手順を可能にするのに十分な量で含めることができる。
【００５４】
非イオン性界面活性剤の例として、（１）ポリオキシエチレンアルキル又はアリールエーテル（ポリエトキシレート）、例えばポリエチレングリコール又はポリオキシエチレンエタノールにエーテル化される直鎖脂肪族疎水性物質、例えばＢｒｉｊ（登録商標）３５、（２）ポリエチレングリコールにエーテル化される分岐鎖脂肪族／芳香族（例えばオクチルフェノール）疎水性物質、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ（登録商標）−１００、（３）ポリエチレングリコールにエーテル化される直鎖脂肪族／芳香族（例えばｎ−ノニルフェノール）疎水性物質、例えばＩｇｅｐａｌ（登録商標）Ｃ０８９７、並びに（４）ポリエチレングリコールにエステル化される直鎖脂肪族（例えばカルボン酸）疎水性物質、例えばＭｙｒｊ（登録商標）５３などを挙げることができる。非イオン性ポリオキシエチレンアルキル又はアリールエーテル（ポリエトキシレート）界面活性剤の例として、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）３０）、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）３５）、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５２）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５８）、ポリオキシエチレン（２）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７２）、ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７６）、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７８）、ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）９２）、ポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）９６）、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）９８）、ポリオキシエチレン（２１）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７２１）、ポリオキシエチレン（１００）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７００）などを挙げることができる。非イオン性界面活性剤の更なる例として、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ（登録商標）−１００（非還元型又は還元型）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４（非還元型又は還元型）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ（登録商標）−１６５、及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ（登録商標）−３０５（非還元型及び還元型）などを挙げることができる。
【００５５】
ある実施形態では、透過剤２０４は、染色条件下で約０．１０ｇ／Ｌから約０．２０ｇ／Ｌの濃度になるのに十分な量で非イオン性界面活性剤（例えばＢｒｉｊ（登録商標）３５）を含み得る。非イオン性界面活性剤は、染色条件下で約０．１０ｇ／Ｌから約０．１６ｇ／Ｌの濃度になるのに十分な量で存在し得る。非イオン性界面活性剤は、約０．０１２ｇ／Ｌから約０．１４ｇ／Ｌの濃度になるのに十分な量で存在し得る。
【００５６】
両性イオン性界面活性剤の例として、ＴＤＡＰＳ（テトラデシルジメチルアンモニオプロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、約１２個から約１６個の炭素原子を有するアルキルＮ，Ｎ−ジメチルＮ−オキシド、ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＯ）、ＤＤＡＰＳ（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）などを挙げることができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、透過剤２０４は、細胞構造を実質的に無傷にしたまま、細胞、膜及び／又は壁の透過性を高めるのに十分な作用剤を含む。いくつかの実施形態において、透過剤２０４は、膜及び／又は壁をより透過性及び／又は多孔質にして、粒子造影剤２０２のアクセスを促進する。
【００５８】
いくつかの実施形態において、透過剤２０４は、粒子造影剤２０２がサンプル中の細胞に入れるようにするのに必要な孔又は開口部を迅速に作ることができるように選択される。
【００５９】
少なからぬ努力と実験を通して、Ｆｔ．Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ、ＦｌｏｒｉｄａのＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＣＤＳ）から入手可能な５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃを含む透過剤２０４を使用することにより、粒子造影剤組成物２１０のいくつかの実施形態において、驚くほど有効な結果を実現できることが判明している。５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃは、サポニンを含む。５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃは、一般的に、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６３２，６７６号に記載されている。５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃを、粒子造影剤組成物２１０の約２３．３重量％の比率で使用すると、驚くほど有効な結果を実現することができる。５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃを、粒子造影剤組成物２１０の約２３．３重量％に非常に近い比率で使用すると、驚くほど有効な結果を実現することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、透過剤２０４は、染色条件下で約０．０１ｍｇ／Ｌから約１００ｍｇ／Ｌの濃度になるのに十分な量で存在するサポニンを含む。いくつかの実施形態において、サポニンは、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１１ｍｇ／Ｌの濃度になるのに十分な量で存在する。驚くほど有効な実施形態において、サポニンは、染色条件下で約０．２ｍｇ／Ｌの濃度になるのに十分な量で存在する。驚くほど有効な実施形態において、サポニンは、染色条件下で０．２ｍｇ／Ｌに非常に近い濃度になるのに十分な量で存在する。サンプルに添加する前のサポニン保存溶液の濃度は、サポニンの最終濃度の１００倍までであり得る。市販のサポニンは純物質ではないので、供給される種々なロットのサポニン粉末には濃度調節を必要とする場合がある。サポニン試薬の容量の変化も補正する場合、所与の尿サンプルに添加するサポニンの濃度を、範囲内で変化させることが可能である。いくつかの実施形態において、サポニンは、第４級アンモニウム置換サポニンエーテルであってもよい。
【００６１】
固定剤
いくつかの実施形態において、固定剤２０６は、染色及び撮像の間、所望の細胞及び細胞構造が確実に分解しないように選択することができる。固定剤の例として、グルタルアルデヒド；ホルムアルデヒド；ジアゾリジニル尿素；架橋剤；等張食塩水中のピクリン酸アンモニア（例えば、メチレンブルー染色用）；エチルアルコール；メタノール（例えば、室温、−２０℃又は−７０℃で）；Ｈｅｉｄｅｎｈａｉｎ’ｓ  Ｓｕｓａ−ＨｇＣｌ２、ＮａＣｌトリクロロ酢酸、ホルマリン；ブワン−ピクリン酸、ホルマリン、酢酸；Ｄｕｂｏｓｅｑ−Ｂｒａｚｉｌ−ブワン（８０％  ＥｔＯＨ含有）；カルノア−ＥｔＯＨ、クロロホルム、酢酸；ツェンカー−ＨｇＣｌ２、Ｋ２ＣｒＯ７、ＮａＳＯ４・Ｈ２Ｏ；アセトカルミン；Ｇａｔｅｎｓｂｙ’ｓ−クロム酸、四酸化オスミウム、ＮａＣｌ；Ｂａｋｅｒ’ｓ−ホルマリン、ＣａＣｌ２；Ｓｍｉｔｈ’ｓ−Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７、ホルマリン、酢酸；１％メチルグリーン、１％酢酸；フェノール、ホルマリン、グリセロール、ゲンチアナバイオレット；シャウディン−ＨｇＣｌ２、ＥｔＯＨ、酢酸；Ｃｈａｍｐｙ’ｓ−クロム酸、Ｋ２ＣｒＯ７、ＯｓＯ４；Ｆｌｅｍｉｎｇ’ｓ−クロム酸、ＯｓＯ４、酢酸；ホルモル−銀−ホルムアルデヒド、ＡｇＮＯ３；Ｓｔｒｅｃｋ’ｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆｉｘａｔｉｖｅ−ブロノポール、ジアゾリジニル尿素、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、クエン酸ナトリウム；ＰＢＳ中１％イミダゾリジニル尿素；グリオキサル：Ｇｌｙｏｆｉｘ、Ｐｒｅｆｅｒ、Ｓａｆｅｆｉｘ、Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ；グライダント−ヒダントイン；ジメチロール尿素；ヒドロキシメチルグリシンナトリウム；カルノフスキー；塩化第二水銀（Ｂ−５）；Ｈｏｌｌａｎｄｅ’ｓなどを挙げることができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、固定剤２０６は、酸化剤、水銀剤、ピクリン酸塩、ｈｅｐｅｓ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ（ＨＯＰＥ）固定剤、又は水溶性保存剤であってもよい。酸化剤の例として、重クロム酸カリウム、クロム酸、過マンガン酸カリウムなどが挙げられる。水銀剤の例として、Ｂ−５、ツェンカー固定剤などが挙げられる。水溶性保存剤の例として、メチルパラベン、プロピルパラベン、ジメチロール尿素、２−ピリジンチオール−１−オキシド、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどが挙げられる。
【００６３】
少なからぬ努力と実験を通して、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、及びジアゾリジニル尿素のうち少なくとも１つを含む固定剤２０６の使用により、粒子造影剤組成物２１０のいくつかの実施形態において、驚くほど有効な結果を実現することができることが判明している。
【００６４】
いくつかの実施形態において、０．１重量％以下のグルタルアルデヒドを含む固定剤２０６を使用することによって、驚くほど有効な結果を実現することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、２１６ｍＭ又は約２１６ｍＭのジアゾリジニル尿素を含む固定剤２０６を使用することによって、驚くほど有効な結果を実現することができる。
【００６６】
追加の構成要素
いくつかの実施形態において、任意選択の追加の構成要素２１２は、任意選択によりブロック２０８で混合して、粒子造影剤組成物２１０にすることができる。追加の構成要素２１２の例として、ｐＨ調整剤、緩衝剤、糖、糖アルコール、浸透圧調整剤、タンパク質安定化剤、抗菌物質、イオン強度調整剤、界面活性剤、及びキレート剤などを挙げることができる。いくつかの実施形態では、粒子造影剤組成物２１０にリン酸緩衝生理食塩水を含めると、驚くほど有効な結果を実現することができる。いくつかの実施形態において、粒子造影剤組成物２１０は、ｐＨを３又は約３に維持するためにｐＨ調整剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、尿サンプルのｐＨ又はその付近のｐＨを維持するために、粒子造影剤組成物２１０にｐＨ調整剤を含めると、驚くほど有効な結果を実現することができる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、粒子造影剤組成物２１０は、１種以上の糖及び／若しくは糖アルコール、又は他の膜安定化剤を含む。溶液中の糖及び糖アルコールは、細胞／細胞膜を保護するために役立ち得る。好適な糖の例として、トレハロース、マルトース、スクロース、グリセロール、マルツロース、イソマルトース、セロビオース、ラクツロース、ゲンチオビュロース（gentiobulose）、メリビオース、マンノビオース、パラチノース、コージビオース、ニゲロース、ソホロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、イノシトール、ラムニトール、フシトール、リビトール、トレイトール、エリトリトール、及びグルシトールが挙げられる。とりわけ、糖トレハロースは、サポニンによる溶血を阻害することが判明している。粒子造影剤組成物２１０は、染色条件下で約５〜約２００ｍＭの濃度になるのに十分な量のトレハロースを含み得る。トレハロースは、染色条件下で約１０〜約１００ｍＭの濃度になるのに十分な量で含まれ得る。トレハロースは、染色条件下で約６７．７ｍＭの濃度になるのに十分な量で含まれ得る。トレハロースは、タンパク質と膜の両方の安定化剤であり、乾燥、加熱、凍結、及び／又は酵素による組織分離の極限状態において細胞の完全性を維持するために使用することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、粒子造影剤組成物２１０は、尿の不安定化効果に対抗する１種以上のタンパク質安定化剤又は他の適合性の溶質を含む。好適なタンパク質安定化剤の例として、メチルアミン及びアミノ酸タンパク質安定化剤、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、トリメチルアミン、グリセロホスホリルコリン、ベタイン、グリシンベタイン、ピペコール酸（pipercolate）ベタイン、サルコシン、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−グルタミン−Ｉ−アミド、Ｎ−アセチルグルタミニルグルタミンアミド、タウリン、ジメチルタウリン、ヒポタウリン、Ｎ−メチルタウリン、チオタウリン、オクトピン、アルギニン、グリシン、ジメチルグリシン、Ｎ−トリメチルグリシン、エコトイン（ecotoine）、プロリン、プロリンベタイン、ベータ−アラニン、グルタメート、グルタメートベタイン、Ｎ−アセチル−ベータリジン、コリン−ｏ−スルフェート、ＧＡＢＡ、ホマリン、及びジメチルスルホノプロピオネートが挙げられる。ある実施形態では、適合性の溶質を用いる戦略で、細胞タンパク質を安定化させたまま、尿サンプル中の細胞の染色強度を高めることができる。トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）は、尿中に見られる尿素及び塩化ナトリウムによるタンパク質可溶化（不安定化）を中和することができる。ＴＭＡＯは、タンパク質不安定化剤２の割合に対してＴＭＡＯ  １の割合の比率でタンパク質不安定化剤の効果のバランスをとることができる。いくつかの実施形態において、粒子造影剤組成物２１０は、染色条件下で約５ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度になるのに十分な量のＴＭＡＯを含み得る。
【００６９】
いくつかの実施形態において、粒子造影剤組成物２１０は、ｐＨを調整するための緩衝液を含み得る。緩衝液は、少なくとも１種の好適な粘性剤／調整剤、固定剤、イオン強度調整剤、界面活性剤、及び洗浄剤も含み得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、粒子造影剤組成物２１０は、粘度調整剤を含み得る。いくつかの実施形態において、粘度調整剤は、グリセロールであってもよい。グリセロールの百分率は、特定のサンプルの所望の性質及び使用する分析装置によって変化し得る。粘度調整剤の例として、ＰＶＰ、天然親水コロイド（及び誘導体）、例えばカラギナン、ローカストビーンガム、グアーガム、及びゼラチン；糖（及び誘導体）、例えばデキストロース、フルクトース；ポリデキストロース；デキストラン；ポリデキストラン；サッカリド；並びに多糖；半合成親水コロイド（及び誘導体）、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース；合成親水コロイド（及び誘導体）、例えばＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）などを挙げることができる。
【００７１】
迅速な一段階染色プロセス
図３は、一実施形態による迅速な一段階染色プロセス３００のフローチャートである。迅速な一段階染色プロセス３００は、いくつかの下位工程を含み得るが、用語「一段階」は、染色手順の間、サンプルを複数の異なる溶液に導入する必要がないことを証明するために使用される。粒子造影剤組成物２１０は、図２を参照して上述したように、ブロック３０２で調製される。任意選択により、いくつかの実施形態において、任意の粒子造影剤２０２などの構成要素は、ブロック３０６で精製され得る。粒子造影剤２０２の精製により、サンプルとの接触時に形成される沈降物のレベルを低下させることができ、これによりバックグラウンドを低下させて、画像ベースの尿サンプル分析の結果を改善し、画像若しくは湿式マウント、又は手作業で行った顕微鏡検査を更に見直す必要を減らすことができる。
【００７２】
ブロック３０８で、粒子造影剤組成物２１０をサンプルと混合する。粒子造影剤組成物２１０は、同時に混合することなどの任意の好適な方法で、サンプルと混合することができる。ブロック３０８での混合は、特定量の粒子造影剤組成物２１０でサンプルを希釈することを含み得る。サンプルは、粒子造影剤組成物２１０で希釈され得る。希釈液の量は、画像ベースの分析時にフレーム当たり最適数の細胞を提供するように選択することができる。
【００７３】
少なからぬ努力と実験を通して、粒子造影剤組成物２１０のいくつかの実施形態において、結果として得られるサンプル混合物中、最大２０％（ｖ／ｖ）の粒子造影剤組成物２１０を、サンプルと混合すると、驚くほど有効な結果を実現することができることが判明している。結果として得られるサンプル混合物中の粒子造影剤組成物２１０の百分率は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％（ｖ／ｖ）であってもよい。粒子造影剤阻止組成物２１０を、結果として得られるサンプル混合物中で１５％粒子造影剤組成物２１０の百分率（すなわち、８５％のサンプル）で、サンプルと混合することによって、驚くほど有効な結果を実現することができる。
【００７４】
少なからぬ努力と実験を通して、１５％以下の百分率で尿サンプルと混合するように配合された粒子造影剤組成物２１０のいくつかの実施形態において、驚くほど有効な結果を実現することができることが判明している。希釈度が低いサンプルの染色により、画像ベースの尿サンプル分析システムは非常に有効となりうる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、インキュベーションに関して以下で記述される任意の温度などの上昇した温度で、サンプルを粒子造影剤組成物２１０と混合する。
【００７６】
特定の実施形態において、サンプルは、調製又は処理（例えば、濃縮、希釈）の後で、粒子造影剤組成物２１０と混合することができる。
【００７７】
本明細書では、混合したサンプルと粒子造影剤組成物２１０を、サンプル混合物と呼ぶ。
【００７８】
ブロック３１０で、サンプル混合物を、特定の時間をかけて特定の温度でインキュベートする。インキュベーションは、細胞又はそれらの内部構造の透過性を高めることができ、粒子造影剤２０２をより良好に細胞又は細胞組織に浸透させることができる。インキュベーションの時間及び温度は、粒子造影剤組成物２１０が、サンプルを適正に透過し、固定し、染色できるように選択することができる。
【００７９】
ある実施形態では、粒子造影剤組成物２１０は、界面活性剤を含むことができ、インキュベーション中の高温加熱を用いて、膜の透過を実現してＲＢＣの完全性を維持し、所望の解像度で、ＷＢＣ、上皮細胞及び細菌の染色効力を更に実現することができる。
【００８０】
少なからぬ努力と実験を通して、サンプル混合物を、約４０℃〜約５０℃の温度で、約１〜９０秒間インキュベートすることを含む、粒子造影剤組成物２１０のいくつかの実施形態において、驚くほど有効な結果を実現することができることが判明している。サンプル混合物は、約４１℃〜約４４℃の温度まで加熱することができる。サンプル混合物は、１〜６０秒間インキュベートすることができる。サンプル混合物は、３０〜３５秒間インキュベートすることができる。サンプル混合物は、３０秒未満の間インキュベートすることができる。いくつかの実施形態において、サンプル混合物を、約４２℃〜約４３℃で、約３０秒間インキュベートすることによって、驚くほど有効な結果を実現することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ブロック３０８での混合及びブロック３１０でのインキュベーションは、撮像装置でのサンプル混合物の処理に要する時間、並びに撮像装置ラインの洗浄及び／又は浄化に要する時間とおよそ同等又はそれより短い時間で完了する。このような方法で、第２のサンプル混合物を混合してインキュベートする間に、第１のサンプル混合物を撮像することができる。第１のサンプル混合物を撮像して、撮像装置を浄化した後、第２のサンプル混合物を直ちに撮像することができる。
【００８２】
代替実施形態において、ブロック３０８での混合及びブロック３１０でのインキュベーションは、撮像装置でのサンプル混合物の処理に要する時間、並びに撮像装置ラインの洗浄及び／又は浄化に要する時間の２倍未満の時間で完了する。このような方法で、第１のサンプル混合物を撮像する間に、第２のサンプル混合物の撮像の準備を整えることができ、第３のサンプル混合物及び第４のサンプル混合物を、混合してインキュベートするプロセスにかけることができる。第１のサンプル混合物を撮像して、撮像装置を浄化した後、第２のサンプル混合物を直ちに撮像することができる。第３のサンプル混合物は、その混合及びインキュベーションを終えることができ、第４のサンプル混合物は、まだ混合及びインキュベーションが行われていてよい。第２のサンプル混合物を撮像して、撮像装置を浄化した後、第３のサンプル混合物を直ちに撮像することができ、その間に、第４のサンプル混合物は、混合及びインキュベーションの終了段階に入り、第５のサンプル混合物は、混合及びインキュベーションを開始する。このプロセスを無限に継続して、サンプル混合物を連続して撮像することができる。
【００８３】
少なからぬ努力と実験を通して、粒子造影剤組成物２１０の特定の実施形態、粒子造影剤組成物２１０をサンプルと混合する特定の方法、及びサンプル混合物をインキュベートする特定の方法の組み合わせを通して、驚くほど有効な結果を実現することができることが判明している。
【００８４】
詳細には、染色条件下で約０．５７ｍＭの、純度が８０％以上のクリスタルバイオレット、２３．３重量％の５  ＰＤ  Ｌｙｔｉｃ、及び０．０５％のＰｒｏｃｌｉｎ  ３００を含む粒子造影剤組成物２１０を使用し、この粒子造影剤２１０をサンプルと混合して、サンプル混合物の重量による粒子造影剤組成物の濃度を約１５％から約２０％とし、結果として得たサンプル混合物を、約４０℃から約５０℃で、約３０〜３５秒の間インキュベートすることによって、驚くほど有効な結果を実現することができる。
【００８５】
特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、尿対試薬比が比較的高いサンプルの迅速な染色を可能にする。特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、種々の細胞成分、核分葉及び粒状構造が明確に区別できるように、サンプルを迅速に染色することを可能にする。特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、超生体染色に適している。特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、粒子の分類及び下位分類のために視覚的識別性をもたらす。特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、血清、脳脊髄液、胸膜液、滑液、精液、腹水、羊水、洗浄液、骨髄吸引液、流出液、滲出液、又は血液サンプル中の粒子の細胞内含有物の特徴を強化する上で有効である。特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、血小板、網状赤血球、有核赤血球、芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、円柱、細菌、上皮、及び／又は寄生生物を染色する上で有効である。特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、例えば一次及び二次顆粒の分染又は強調に基づく未成熟顆粒球の下位分類又はその寿命の決定の補助などのために、例えば、細胞中の一次及び二次顆粒の分染を提供することによって、粒子の分類及び下位分類のための視覚的識別性をもたらす上で有効である。特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、白血球の分類及び下位分類を含め、白血球、上皮細胞及び／又は細菌を計数して特徴付けするための視覚的識別性をもたらす上で有効である。有形成分の同定を、促進することができる。特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、生体細胞及び／又は生存細胞及び／又は構造が実質的に無傷のままである細胞に視覚的識別性をもたらす上で有効である。特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、細菌、寄生生物、又はトリコモナスを染色する上で有効である。特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、状態、疾患、感染症及び／若しくは症候群の診断を特定、予測、診断、予後を判定、かつ／若しくは支持する、かつ／又は対象が治療に反応性であるか非反応性であるかをモニターする上で有効である。特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順は、円柱の下位分類に役立てることができる、尿円柱中の細胞及び／又は細胞成分封入体の染色に有効である。
【００８６】
本明細書に記載の特定の有効な粒子造影剤組成物２１０及び染色手順によって可能になる迅速な染色は、手作業又は半自動の撮像及び／又は分析手順と共に利用可能である。
【００８７】
少なからぬ努力と実験を通して、表１に列挙されるように構成される粒子造影剤組成物２１０を使用すると、驚くほど有効な結果を実現することができることが判明している。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
図４は、表１に記載する粒子造影剤組成物２１０で染色した、及び上記の迅速な一段階染色手順を使用して染色した尿サンプル、詳細には３００μＬの表１に明記の粒子造影剤組成物２１０を試験管にピペットで移し、１．７ｍＬの尿サンプルと混合し、その後、サンプル混合物を６０℃の水浴中で３０秒間温めることによって染色した尿サンプルから選択される粒子の代表的説明図である。赤血球、白血球、扁平上皮細胞、円柱、結晶、及び酵母は、視覚的に識別可能である。
【００９０】
少なからぬ努力と実験を通して、表２に列挙されるように構成される粒子造影剤組成物２１０を使用すると、驚くほど有効な結果を実現することができることが判明している。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
少なからぬ努力と実験を通して、表３に列挙されるように構成される粒子造影剤組成物２１０を使用すると、驚くほど有効な結果を実現することができることが判明している。
【００９３】
【表３】
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【００９４】
少なからぬ努力と実験を通して、表４に列挙されるように構成される粒子造影剤組成物２１０を使用すると、驚くほど有効な結果を実現することができることが判明している。
【００９５】
【表４】
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【００９６】
いくつかの実施形態において、本開示の粒子造影剤組成物によって染色した撮像細胞の特徴を表５に記載する。
【００９７】
【表５】
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【００９８】
特定の実施形態において、粒子造影剤組成物２１０を、安定性、保存しやすさ、処分しやすさ、及び／又は少ない毒性が得られるように、配合する。
【００９９】
初期の実験
以下の実施例について記載するように、上で開示した実施形態を得るために、多数の染色組成物及び方法を試験し、改良した。
【０１００】
初めに実施例１では、粒子造影剤組成物は、６７μＭの０．１％クリスタルバイオレット、３．５％の５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、並びに３３２μＭのＮａＰＯ４及び１８８μＭのＫＰＯ４を有するリン酸緩衝生理食塩水を含んでいた。粒子造影剤組成物を、２．５５ｍＬの尿サンプルと混合した。図５に示す結果は、明るすぎて、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例２を試みた。
【０１０１】
次の実施例２では、粒子造影剤組成物は、８６μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、並びに３１２μＭのＮａＰＯ４及び１７７μＭのＫＰＯ４を有するリン酸緩衝生理食塩水を含んでいた。粒子造影剤組成物を、２．５５ｍＬの尿サンプルと混合した。図６に示す結果は、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例３を試みた。
【０１０２】
次の実施例３では、粒子造影剤組成物は、クリスタルバイオレット染色液、脱イオン水、及び追加の希釈液を尿サンプルと混合して、それぞれ８６μＭ、１３．５％、及び１％の濃度を含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図７に示す結果は、非常に明るく染色され、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例４を試みた。
【０１０３】
次の実施例４では、粒子造影剤組成物は、クリスタルバイオレット染色液及び脱イオン水を尿サンプルと混合して、それぞれ８６μＭ及び１３．５％の濃度を含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図８に示す結果は、淡い染色を示し、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例５を試みた。
【０１０４】
次の実施例５では、粒子造影剤組成物は、１５０μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、３０．６％の脱イオン水、及び０．００３７ｍｇ／ｍＬのサポニンを含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図９に示す結果は、過度に染色された粘液を含んでおり、粒子及び細胞を適正に識別するには有効効果的でなかった。染色を改善するために、実施例６を試みた。
【０１０５】
次の実施例６では、粒子造影剤組成物は、５２μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、１１．３％の脱イオン水、及び０．００７５ｍｇ／ｍＬのサポニンを含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図１０に示す結果は、明るすぎて、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例７を試みた。
【０１０６】
次の実施例７では、粒子造影剤組成物は、１００μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、９．４％の脱イオン水、及び０．００７５ｍｇ／ｍＬのサポニンを含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図１１に示す結果は、明るすぎて、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例８を試みた。
【０１０７】
次の実施例８では、粒子造影剤組成物は、９１μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、並びに２０３μＭのＮａＰＯ４及び１１５μＭのＫＰＯ４を有するリン酸緩衝生理食塩水を含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図１２に示す結果は、過度に染色された粘液を含んでおり、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例９を試みた。
【０１０８】
次の実施例９では、粒子造影剤組成物は、１５０μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、７．３％の脱イオン水、及び０．００７５ｍｇ／ｍＬのサポニンを含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図１３に示す結果は、過度に染色された粘液を含んでおり、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例１０を試みた。
【０１０９】
次の実施例１０では、粒子造影剤組成物は、１５０μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、及び８．８％の脱イオン水を含んでいた。粒子影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図１４に示す結果は、不均一な染色を含み、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例１１を試みた。
【０１１０】
次の実施例１１では、粒子造影剤組成物は、１５０μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、８．８％の脱イオン水、０．００７５ｍｇ／ｍＬのサポニン、及び０．０３％のグルタルアルデヒドを含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図１５に示す結果は、過度に染色された粘液を含んでおり、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例１２を試みた。
【０１１１】
次の実施例１２では、粒子造影剤組成物は、８６μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５０％  Ｅｒｙｔｈｒｏｌｙｚｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製）、並びに３１２μＭのＮａＰＯ４及び１７７μＭのＫＰＯ４を有するリン酸緩衝生理食塩水を含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図１６に示す結果は、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例１３を試みた。
【０１１２】
次の実施例１３では、粒子造影剤組成物は、２８５μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、並びに１０４０μＭのＮａＰＯ４及び５９０μＭのＫＰＯ４を有するリン酸緩衝生理食塩水を含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．０ｍＬの尿サンプルと混合した。図１７に示す結果は、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例１４を試みた。
【０１１３】
次の実施例１４では、粒子造影剤組成物は、２８μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、並びに１０４μＭのＮａＰＯ４及び０．０５９μＭのＫＰＯ４を有するリン酸緩衝生理食塩水を含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．９ｍＬの尿サンプルと混合した。図１８に示す結果は、粒子及び細胞を適正に識別するには有効でなかった。染色を改善するために、実施例１５を試みた。
【０１１４】
次の実施例１５では、粒子造影剤組成物は、９１μＭのクリスタルバイオレット、３．５％のサポニン／ピロ硫酸カリウム溶液を含んでおり、リン酸緩衝生理食塩水は含んでいなかった。粒子造影剤組成物を、１．８５０ｍＬの尿サンプルと混合した。図１９に示す結果は、過度に染色された粘液を含んでおり、結果として有効な染色でなかった。染色を改善するために、実施例１６を試みた。
【０１１５】
次の実施例１６では、粒子造影剤組成物は、８６μＭのクリスタルバイオレット、３．５％の５０％  Ｅｒｙｔｈｒｏｌｙｚｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製）、並びに３１２μＭのＮａＰＯ４及び１７７μＭのＫＰＯ４を有するリン酸緩衝生理食塩水を含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図２０に示す結果は、十分な暗さと明瞭性で染色されていない。染色を改善するために、実施例１７を試みた。
【０１１６】
次の実施例１７では、粒子造影剤組成物は、８６μＭのクリスタルバイオレット、３．５％のサポニン／ピロ硫酸カリウム溶液、並びに３１２μＭのＮａＰＯ４及び１７７μＭのＫＰＯ４を有するリン酸緩衝生理食塩水を含んでいた。粒子造影剤組成物を、１．７ｍＬの尿サンプルと混合した。図２１に示す結果は、十分な暗さと明瞭性で染色されていない。染色を改善するために、本明細書に開示した粒子造影剤組成物の追加の実施形態を試みた。
【０１１７】
多くの初期実施例において、粒子造影剤の濃度は、以下の表６に記載のトレハロース（ＴＲＥ）、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ  １１０７（Ｔ１１０７）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ  ９０Ｒ４（Ｔ９０Ｒ４）、クリスタルバイオレット（ＣＶ）、サフラニンＯ（Ｓ０）、サポニン（ＳＡＰ）、塩化ジエチルアミン（ＤＥＡ）、塩化ジメチルアミン（ＤＭＡ）、及びジアゾリジニル尿素（ＤＵ）の様々なバリエーションを含んでいた。
【０１１８】
【表６−１】
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【０１１９】
【表６−２】
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【０１２０】
実施例１８〜７６は、細胞を識別するための最適な結果を提供しなかった。
【０１２１】
本開示で論じた全ての特許、特許公開、特許出願、雑誌論文、書籍、技術文献などは、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
本明細書で使用されるいかなる見出しは、整理目的のみのものであり、決して本開示又は請求項を制限するものと解釈されない。
【０１２３】
図面中に示し、上記で説明したものと異なる構成要素の配置、並びに、示されていない、すなわち説明されていない構成要素及び工程は可能である。同様に、一部の特徴及びサブコンビネーションは有用なものであり、他の特徴及びサブコンビネーションに関係なく使用できる。本発明の実施形態は、限定目的ではなく例示目的で説明しており、本発明の読者には、別の実施形態が明らかになるであろう。特定の場合では、方法工程又は操作が異なる順序で実施、つまり実行されてよく、あるいは、操作を追加、削除、又は変更してもよい。本発明の特定の態様では、ある要素若しくは構造を提供するため、又は、ある機能を実行するために、単一の構成要素を複数の構成要素と置き換えてよく、複数の構成要素を単一の構成要素と置き換えてよいことが理解され得る。かかる置換が本発明の特定の実施形態の実行に有効でない場合を除き、かかる置換は本発明の範囲内であると見なされる。したがって、本発明は、上記の、又は図に示した実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態及び変更がなされてよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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