(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
かん流バイオリアクタ培養システムであって、
組織培養流体および培養される細胞を含むように構成されたバイオリアクタと、
前記バイオリアクタから、細胞を含む組織培養流体を受容し、一部の細胞を前記組織培養流体から分離し、組織培養流体および細胞の収集産物を提供し、前記バイオリアクタへの組織培養流体および細胞の再循環産物を提供するように構成された細胞保持装置と
を含み、
前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量、開始細胞保持装置容量、および前記開始バイオリアクタ容量／前記開始細胞保持装置容量により計算される開始容量比を有し、
前記システムは、前記開始かん流速度が低下して、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらし、かつ、
前記開始バイオリアクタ容量が増加する、もしくは、前記開始細胞保持装置容量が低下する、もしくは、その両方がされて、前記開始容量比の向上をもたらすように作動する、
かん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項２】
前記開始容量比の向上が、前記開始かん流速度の低下とほぼ同じ割合である、請求項１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項３】
前記開始かん流速度の低下量が、約３分の１量までである、請求項１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項４】
前記開始かん流速度の低下量が、約半分量までである、請求項１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項５】
前記開始バイオリアクタ容量の増加量が、約３分の１量までである、請求項１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項６】
前記開始バイオリアクタ容量の増加量が、約半分量までである、請求項１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項７】
前記開始細胞保持装置容量の減少量が、約３分の１量までである、請求項１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項８】
前記開始細胞保持装置容量の減少量が、約半分量までである、請求項１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項９】
前記細胞が、哺乳類の細胞である、請求項１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項１０】
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＫＢ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳ０細胞からなる群から選択される、請求項９に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項１１】
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞である、請求項１０に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項１２】
前記哺乳類の細胞が、組換えＶＩＩＩ因子（ｒｈＦＶＩＩＩ）を発現する組換え細胞である、請求項９に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項１３】
前記開始かん流速度が、１日あたりに約１から１５容量である、請求項１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項１４】
前記開始容量比の向上量が、約３分の１量までである、請求項１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項１５】
前記開始容量比の向上量が、約半分量までである、請求項１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
【請求項１６】
かん流バイオリアクタシステムを最適化する方法であって、
細胞を含む組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量、開始細胞保持装置容量、および前記開始バイオリアクタ容量／前記開始細胞保持装置容量により計算される開始容量比を有する工程と、
前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらし、かつ、
前記開始バイオリアクタ容量を増加させる、もしくは、前記開始細胞保持装置容量を減少させる、もしくは、その両方をさせて、前記開始容量比の向上をもたらす工程と
を含む、方法。
【請求項１７】
前記開始容量比の向上が、前記開始かん流速度の低下と約同じ割合である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記開始かん流速度の低下量が、約３分の１量までである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記開始かん流速度の低下量が、約半分量までである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記開始バイオリアクタ容量の増加量が、約３分の１量までである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記開始バイオリアクタ容量の増加量が、約半分量までである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記開始細胞保持装置容量の減少量が、約３分の１量までである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記開始細胞保持装置容量の減少量が、約半分量までである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、哺乳類の細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＫＢ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳ０細胞からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳類の細胞が、組換えヒトＶＩＩＩ因子（ｒｈＦＶＩＩＩ）を発現する組換え細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記開始かん流速度が、１日あたりに約１から１５容量である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記開始容量比の向上量が、約３分の１量までである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
前記開始容量比の向上量が、約半分量までである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年１０月１０日に出願された、発明の名称を「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＦＯＲ  ＯＰＴＩＭＩＺＩＮＧ  ＰＥＲＦＵＳＩＯＮ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭ」とする、米国仮出願番号６１／７１２，１９０号（Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．ＢＨＣ１２５０１９（ＢＨ−０２１Ｌ））の優先権を主張し、全ての目的について、その全体が参照により本願明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質、例えば、ｒｈＦＶＩＩＩ（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡにより製造されたＫｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）ＦＳまたはＫＧ−ＦＳの活性成分である、組換えヒトＶＩＩＩ因子タンパク質）は、多くの場合、かん流の連続的な細胞培養プロセスにおいて産生される。このシステムにおける重要な制御パラメータは、細胞特異的かん流速度（本願明細書において、かん流速度またはＣＳＰＲとも呼ばれる）であり、１日あたりに、細胞あたりにかん流された培地の容量（容量／Ｃ／Ｄ）として、または、１日あたりの容量において算出され得る。細胞培養培地は、製造コスト全体にかなり寄与し、このことは、細胞の健康ならびに／または生産収率および生成物品質に関して最適なかん流速度を低くするように使用するのに努力が寄せられている、１つの理由である。さらに、タンパク質の収率が維持され得る場合、より低いかん流速度は、設備能力を向上させ、インフラへの最小の変更により生産の柔軟性を提供する。
【０００３】
比較的高いかん流速度は、十分な栄養が細胞培養物に供給されるのを確保するのに役立つが、生成物の希釈もし、より大きい収集容量をもたらす。一方、低いかん流速度は、生成物の希釈を少なくするであろうが、その安定性に影響を及ぼす。例えば、バイオリアクタ中の条件における分子の滞留時間の増加は、前記分子がプロテアーゼまたはその分解を促進し得る他の因子に曝されるのをもたらし得る。より低いかん流速度は、栄養がその濃度において制限される場合（または、副産物が蓄積される場合）、細胞の性能にも影響を及ぼし得る。このため、単に、前記かん流速度を低くすることは、十分ではない。
【０００４】
したがって、タンパク質生成物の最適な細胞産生についての十分な栄養および副産物のクリアランスを提供するであろう最も低いかん流速度は、より高い収量をもたらすであろう。一方、かん流速度の変更が、生成物の安定性に影響を及ぼさない限り、より少ない組織培養培地（本願明細書において、組織培養流体、組織／細胞培養培地または培地／培地とも呼ばれる）が要求される。このため、前記かん流速度は、細胞特異的生産性および生成物の安定性について最適化されるべきである。
【０００５】
かん流速度の変更は、滞留時間（細胞および生成物がシステムのユニット動作条件に曝される平均時間）にも影響を及ぼす。組換えタンパク質、例えば、組換えＦＶＩＩＩを産生するためのかん流バイオリアクタシステムの２つの重要なユニット動作は、バイオリアクタおよび細胞保持装置（本願明細書において、ＣＲＤとも呼ばれる）、例えば、セトラ中で行う。前記バイオリアクタは、理想的な細胞培養条件（例えば、生理学的温度および十分な酸素添加）のために、最適化および調節される。一方、典型的な細胞保持装置は、細胞を保持し、前記バイオリアクタに細胞を再循環させるように、設計および最適化される。前記ＣＲＤは、典型的には、前記バイオリアクタの理想的な培養条件を提供するように設計されないため、高い細胞濃度と非理想的な条件との組み合わせが、望ましくない状態にある場合がある。これらの条件を軽減するために、冷却等の戦略が、濃縮された細胞集団の代謝速度を低下させるのに使用される。典型的には、前記細胞保持装置中での条件は、細胞の代謝を低下させることが予測され、それは、次に、細胞生産性を低下させる場合がある。
【０００６】
かん流システムでは、細胞（および生成物／副産物）は、前記バイオリアクタと前記細胞保持装置との間を連続的に循環している。このため、細胞は、細胞生産性に有利な条件（すなわち、前記バイオリアクタ中）と、生産性が一般的にはより低い条件（例えば、前記ＣＲＤ中）との間を循環している。外部の最適とは言えない環境（例えば、ＣＲＤ内）でかなりの時間を消費するかん流システム中の細胞の問題は、業界において十分認識されている（Ｂｏｎｈａｍ−Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｅｖｉｔｚ，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｌ．９（９）Ｏｃｔ．２０１１，ｐｐ．２４−３０（非特許文献１）を参照のこと。）。さらに、前記ＣＲＤ中でのより長い細胞の滞留は、細胞が前記バイオリアクタに戻る際に、より長くかかる回収をもたらす場合がある。これは、システムのさらなる生産性の減少をもたらす場合がある。
【０００７】
組換えタンパク質生成物、例えば、ＦＶＩＩＩは、連続的な培地収集により収集され得る。ＦＶＩＩＩ生成物の活性も、前記バイオリアクタ中で使用される温度において、経時的に低下する。このため、かん流速度を低下させることによる滞留時間の増加は、活性な組換えタンパク質生成物のより低い蓄積をもたらす場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｏｎｈａｍ−Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｅｖｉｔｚ，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｌ．９（９）Ｏｃｔ．２０１１，ｐｐ．２４−３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、より低いかん流速度を有し、組換えタンパク質の高い生産性も有する、かん流バイオリアクタシステムおよび方法についての要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、バイオリアクタおよび細胞保持装置を有するかん流バイオリアクタ培養システムが提供される。前記かん流バイオリアクタ培養システムは、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量、および開始細胞保持装置容量を含む。前記システムは、開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での細胞の滞留時間の増加をもたらし、同時に、前記開始バイオリアクタ容量を増加させる、もしくは、前記開始細胞保持容量を減少させる、または、その両方をさせることに関連する。前記システムは、前記ＣＲＤの条件における細胞の最適な滞留時間を達成するように、前記かん流速度、バイオリアクタ作動容量またはＣＲＤ作動容量を変化させることに関連する。
【００１１】
別の態様では、かん流バイオリアクタシステムを最適化する方法が提供される。前記方法は、細胞を含む組織培養流体（本願明細書において、組織培養培地または培地とも呼ばれる）を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量および開始細胞保持装置容量を有する工程と、前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす工程と、前記開始バイオリアクタ容量を増加させる、もしくは、前記開始細胞保持容量を減少させる、または、その両方をさせる工程とを含む。前記方法は、前記ＣＲＤの条件における細胞の最適な滞留時間を達成するように、前記かん流速度、バイオリアクタ作動容量またはＣＲＤ作動容量を変化させることに関連する。
【００１２】
別の方法の態様では、かん流バイオリアクタシステムを最適化する方法が提供される。前記方法は、細胞を含む第１の組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ装置容量および開始細胞保持容量を有する工程と、前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす工程と、前記第１の組織培養流体を、第２の組織培養流体に置き換える工程であって、前記第２の組織培養流体が、前記第１の組織培養流体と比較して、置換えまたは濃度変化により、細胞培養物の個々の成分の調節を有する工程とを含む。
【００１３】
別の方法の態様では、かん流バイオリアクタシステムを最適化する方法が提供される。前記方法は、組換えタンパク質を発現する細胞を含む第１の組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量および開始細胞保持装置容量を有する工程と、前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす工程と、分解を減少させるために、前記組換えタンパク質の安定剤を添加する工程とを含む。
【００１４】
本教示のこれらおよび他の特徴は、本願明細書において説明される。
【００１５】
当業者は、以下に記載される図面が、例示の目的のみであることを理解するであろう。前記図面は、本教示の範囲を限定することを何ら意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、かん流バイオリアクタシステムの模式的な実施形態を示す。
【図２】図２は、ＣＳＰＲの段階的な低下についての、１Ｌでのかん流培養（Ｘ軸、日数）に沿った、Ｙ軸における生細胞密度（菱形）および相対ＣＳＰＲ（四角）のグラフを示す。ＣＳＰＲは、相対単位において提供される。
【図３】図３は、ＣＳＰＲの段階的な低下による、１Ｌでのかん流細胞培養からのサンプルの、生細胞密度（ＶＣＤ；菱形）および、正規化された効力として示された効力（四角）のグラフを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、種々のＣＥＰＲにおける算出効力に対する、観察された平均効力差（％）のバーを示す。算出効力は、１００％に設定される。
【図４Ｂ】図４Ｂは、種々のＣＥＰＲにおける算出効力に対する、観察された平均効力差（％）のグラフを示す。算出効力は、１００％に設定される。
【図５】図５は、ＣＳＰＲの段階的な低下による、１Ｌでのかん流細胞培養中での、グルコースおよび乳酸塩についての代謝データのグラフをＣＳＰＲの相対的変化を伴う時間枠（日数）で示す。
【図６】図６は、上清（培地の消費／培養流体の収集）中でのＦＶＩＩＩ活性の低下のグラフを示す。実験、３７℃で９時間の培養。残存したＦＶＩＩＩ活性は、コントロールの割合において示される。
【図７】図７は、ＦＶＩＩＩ安定性試験からのデータを使用する算出ＦＶＩＩＩ活性と、ＣＳＰＲ低下実験から実験的に測定された活性との比較のグラフを示す。種々のＣＳＰＲレベルにおける算出力価は、初期のＦＶＩＩＩの最初の効力である１００％に対する、％で提供される。
【図８Ａ】図８Ａは、バイオリアクタおよび細胞保持装置の種々の比を使用する、生細胞密度ならびに、ターゲットのＣＳＰＲ速度のグラフを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、バイオリアクタおよび細胞保持装置の種々の比を使用する、生細胞密度ならびに、バイオリアクタサンプル中でのＦＶＩＩＩ効力のグラフを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、サンプルにおけるグルタミンおよびグルタミン酸塩の濃度のグラフを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＦＶＩＩＩ産生細胞の特異的増殖速度のグラフを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、種々のＣＳＰＲおよびバイオリアクタ作動容量におけるバイオリアクタシステムの生産性のグラフを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、種々の培養ＣＳＰＲにおける１Ｌでの培養あたりの算出された生産性のグラフを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、添加された安定剤が、滞留時間がバイオリアクタ中で増加することにより、効力損失を（用量依存的に）低下させ得る（約１３−１５％）が、合計損失については補償しない（約２３％）ことを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、添加された安定剤が、滞留時間がバイオリアクタ中で増加することにより、効力損失を（用量依存的に）低下させ得る（約１３−１５％）が、合計損失については補償しない（約２３％）ことを示す。
【図１２】図１２は、実施形態に基づくかん流バイオリアクタシステムを最適化する方法を図示するフローチャートを示す。
【図１３】図１３は、実施形態に基づくかん流バイオリアクタシステムを最適化する別の方法を図示する別のフローチャートを示す。
【図１４】図１４は、実施形態に基づくかん流バイオリアクタシステムを最適化する別の方法を図示するさらに別のフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の実施形態は、かん流細胞培養システムの向上した生産能力についての方法およびシステムを提供する。
【００１８】
かん流速度を低下させることは、前記ＣＲＤおよび前記バイオリアクタ中での細胞（および組換えタンパク質／ＦＶＩＩＩ生成物）の滞留時間を増加させ、活性な組換えタンパク質生成物、例えば、ＦＶＩＩＩの産生の低下をもたらす。特定の実施形態では、前記かん流速度の低下は、前記ＣＲＤに対するバイオリアクタの相対容量を変化させることにより補償される。一部の実施形態では、前記容量の変化は、前記かん流速度の低下と約同じ割合である。例えば、かん流速度の半分の低下は、前記ＣＲＤに対するバイオリアクタの容量比を同時に二倍にすることにより達成される。本発明の実施形態に基づくシステムおよび方法は、組換えタンパク質生成物の強固な産生をもたらし得る。かん流速度の低下は、（１又は複数の）タンパク質生成物の分解を減少させるために、組織培養培地の成分の調節、または、安定剤（例えば、組換えＦＶＩＩＩ、すなわち、ｒＦＶＩＩＩについてのカルシウム）の添加によっても補償され得る。
【００１９】
前記かん流細胞培養システムは、２つの重要なユニット動作：条件が組換えタンパク質の産生（例えば、ｒＦＶＩＩＩ）に一般的に最適なバイオリアクタ、および、酸素コントロールの欠如および前記バイオリアクタ中での生理学的温度と比較して、一般的に低い動作温度のために、条件が組換えタンパク質生成物／ｒＦＶＩＩＩ産生に最適でないＣＲＤ（例えば、セトラ）を含む。このため、前記細胞培養物は、細胞生産性および組換えタンパク質生成物／ｒＦＶＩＩＩ産生を誘導する、および、誘導しない環境間の配管により連続的に循環する。さらに、前記バイオリアクタに対して前記ＣＲＤ内の前記細胞の滞留時間が長いほど、より低いからより高い細胞代謝状態の細胞の遷移により、生産性の予測された損失が大きくなる。
【００２０】
図１は、かん流バイオリアクタ培養システム１００の実施形態のブロック図を図示する。かん流バイオリアクタ培養システム１００は、バイオリアクタ流入口１０５およびバイオリアクタ排出口１０６を有するバイオリアクタ１０１を含む。バイオリアクタ１０１は、組織培養流体（ＴＣＦ）および培養される細胞を保持するように構成された培養チャンバを含む。かん流バイオリアクタ培養システム１００は、細胞保持装置（ＣＲＤ）１０２を含む。細胞保持装置１０２は、細胞凝集トラップまたは他の適切な細胞セパレータを含み得る。細胞保持装置１０２は、前記組織培養流体および前記細胞を、バイオリアクタ１０１に再循環するための排出口１０７を有する。細胞保持装置１０２は、別の排出口１０８も有する。排出口１０８は、組換えタンパク質生成物の単離および精製のために、少量の細胞のみを含む組織培養流体の収集産物を、無細胞収集物１０４に送る。かん流バイオリアクタ培養システム１００は、培地容器１０３も含む。培地容器１０３は、新鮮な組織培養流体を、流入口１０５を介して、前記バイオリアクタに送る。かん流バイオリアクタシステム１００は、生物製剤、例えば、凝固因子の産生に使用され得る。例えば、かん流バイオリアクタ培養システム１００および本願明細書に記載された方法は、任意のタンパク質生成物、例えば、組換えタンパク質生成物、例えば、凝固因子、例えば、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子もしくはＩＸ因子または他の適切な因子もしくは物質を製造するのに使用され得る。
【００２１】
システムの実施形態において、かん流バイオリアクタ培養システム１００が提供される。このシステムは、組織培養流体および培養される細胞を含むように構成されたバイオリアクタ１０１と、バイオリアクタ１０１から、細胞を含む組織培養流体を受容し、一部の細胞を前記組織培養流体から分離し、組織培養流体および細胞の収集産物を提供し、バイオリアクタ１０１への組織培養流体および細胞の再循環産物を提供するように構成されたＣＲＤ１０２とを含む。システム１００は、開始かん流速度（第１のかん流速度）、開始バイオリアクタ容量（第１のバイオリアクタ容量）、開始細胞保持装置容量（第１の開始細胞保持装置容量）および前記開始バイオリアクタ容量と開始細胞保持装置容量との開始容量比（第１の容量比）を有する。１つ以上の実施形態では、前記開始かん流速度が（第２のかん流速度に）低下して、バイオリアクタ１０１および細胞保持装置１０２中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす。さらに、または、代替的に、前記開始バイオリアクタ容量が（第２のバイオリアクタ容量に）増加する、もしくは、前記開始細胞保持装置容量が（第２の細胞保持装置容量に）減少する、もしくは、その両方をして、前記開始容量比の（第２の容量比への）向上をもたらす。
【００２２】
１つ以上の実施形態では、前記開始容量比の向上は、前記開始かん流速度の低下と約同じ割合である。特定の実施形態では、前記開始かん流速度の低下量は、約３分の１から約３分の２量の範囲である。他の実施形態では、前記開始かん流速度の低下量は、約３分の１量までである。他の実施形態では、前記開始かん流速度の低下量は、約半分量までである。さらに他の実施形態では、前記開始かん流速度の低下量は、約３分の２量までである。一部の実施形態では、前記開始バイオリアクタ容量の増加量は、約３分の１から約３分の２量までである。他の実施形態では、前記開始バイオリアクタ容量の増加量は、約３分の１量までである。他の実施形態では、前記開始バイオリアクタ容量の増量量は、約半分量までである。さらに他の実施形態では、前記開始バイオリアクタ容量の増加量は、約３分の２量までである。
【００２３】
１つ以上の実施形態では、前記開始細胞保持装置容量の減少量は、約３分の１から約３分の２量までである。一部の実施形態では、前記開始細胞保持装置容量の減少量は、約３分の１量までである。一部の実施形態では、前記開始細胞保持装置容量の減少量は、約半分量までである。さらに他の実施形態では、前記開始細胞保持装置容量の減少量は、約３分の２量までである。
【００２４】
１つ以上の実施形態では、前記開始容量比の向上量は、約３分の１から約３分の２量までである。一部の実施形態では、前記開始容量比の向上量は、約３分の１量までである。一部の実施形態では、前記開始容量比の向上量は、約半分量までである。さらに他の実施形態では、前記開始容量比の向上量は、約３分の２量までである。特定の実施形態では、前記開始かん流速度は、１日あたりに約１から１５容量である。
【００２５】
ここで、かん流バイオリアクタ培養システム１００を最適化する方法は、図１２を参照して説明されるであろう。かん流バイオリアクタ培養システム１００を最適化する一方法２００は、２０１において、細胞を含む組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度（第１のかん流速度）、開始バイオリアクタ容量（第１のバイオリアクタ容量）、開始細胞保持装置容量（第１の細胞保持装置容量）および前記開始バイオリアクタ容量と前記開始細胞保持容量との開始容量比（第１の容量比）を有する工程を含む。前記方法は、さらに、２０２において、前記開始かん流速度を（第２のかん流速度に）低下させ、２０３において、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらし、および／または、２０４において、前記開始バイオリアクタ容量を（第２のバイオリアクタ容量に）増加させる、もしくは、前記開始細胞保持容量を（第２の細胞保持容量に）減少させる、もしくは、その両方をさせて、前記開始容量比の（第２の容量比への）向上をもたらすかのいずれかをする工程を含む。
【００２６】
一部の実施形態では、前記開始容量比の向上は、前記開始かん流速度の低下と約同じ割合である。一部の実施形態では、前記開始かん流速度の低下量は、約３分の１から約３分の２量の範囲である。他の実施形態では、前記開始かん流速度の低下量は、約３分の１量までである。他の実施形態では、前記開始かん流速度の低下量は、約半分量までである。さらに他の実施形態では、前記開始かん流速度の低下量は、約３分の２量までである。
【００２７】
特定の実施形態では、前記開始バイオリアクタ容量の増加量は、約３分の１から約３分の２量までである。一部の実施形態では、前記開始バイオリアクタ容量の増加量は、約３分の１量までである。他の実施形態では、前記開始バイオリアクタ容量の増加量は、約半分量までである。さらに他の実施形態では、前記開始バイオリアクタ容量の増加量は、約３分の２量までである。
【００２８】
他の実施形態では、前記開始細胞保持装置容量の減少量は、約３分の１から約３分の２量までである。一部の実施形態では、前記開始細胞保持装置容量の減少量は、約３分の１量までである。他の実施形態では、前記開始細胞保持装置容量の減少量は、約半分量までである。さらに他の実施形態では、前記開始細胞保持装置容量の減少量は、約３分の２量までである。
【００２９】
一部の実施形態では、前記開始容量比の向上量は、約３分の１から約３分の２量までである。一部の実施形態では、前記開始容量比の向上量は、約３分の１量までである。他の実施形態では、前記開始容量比の向上量は、約半分量までである。さらに他の実施形態では、前記開始容量比の向上量は、約３分の２量までである。特定の実施形態では、前記開始かん流速度は、１日あたりに約１から１５容量である。
【００３０】
ここで、かん流バイオリアクタ培養システム１００を最適化する別の方法は、図１３を参照して説明されるであろう。かん流バイオリアクタ培養システム１００を最適化する一方法３００は、３０１において、細胞を含む第１の組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度（第１のかん流速度）、開始バイオリアクタ容量および開始細胞保持装置容量を有する工程を含む。さらに、方法３００は、３０２において、前記開始かん流速度を（第２のかん流速度に）低下させる工程を含む。これは、３０３において、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす。方法３００は、さらに、３０４において、前記第１の組織培養流体を、第２の組織培養流体に置き換える工程であって、前記第２の組織培養流体が、前記第１の組織培養流体と比較して、新たな成分を添加することなく、前記第１の組織培養流体における個々の成分の向上した濃度を有する工程を含む。例えば、前記向上した濃度は、前記第１の組織培養流体の個々の成分の約１から１０倍の範囲で、または、前記第１の組織培養流体の個々の成分の約１．２から約５倍の範囲で、濃度を向上させることを含み得る。シスチンは、システインで置き換えられ得る。
【００３１】
一部の実施形態では、前記第１の組織培養流体は、アミノ酸を含み得る。前記アミノ酸は、例えば、天然由来のアミノ酸のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、前記第２の組織培養流体は、例えば、前記第１の組織培養流体に存在する濃度の約１．１から約１０倍の範囲で向上した、向上した濃度の１つ以上の前記アミノ酸を有し得る。一部の実施形態では、前記第２の組織培養流体は、前記第１の組織培養流体に存在する濃度の約１．２から約５倍、またはさらに、約１．２から約２倍の範囲で、向上した濃度の１つ以上の前記アミノ酸を有し得る。一部の実施形態では、向上した前記アミノ酸は、前記第１の組織培養流体に存在するアミノ酸全体の約５０％から約７５％の範囲であり得る。一部の実施形態では、前記第２の組織培養流体は、前記第１の組織培養流体より、約１．１から約１２倍以上のシステインを有するように、前記アミノ酸であるシスチンはさらなるシステインにより置き換えられ得る。他の濃度範囲および／または割合が使用され得る。
【００３２】
一部の実施形態では、前記第１の組織培養流体は、塩を含み得る。前記塩は、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硝酸鉄、二酸化セレン、塩化カルシウムおよび／または組織培養流体中に見出され得る他の塩を含み得る。一部の実施形態では、前記第２の組織培養流体は、前記第１の組織培養流体に存在する濃度の約１．１から約１０倍の範囲で、向上した濃度の１つ以上の前記塩を有し得る。他の実施形態では、前記第２の組織培養流体は、前記第１の組織培養流体に存在する濃度の約１．２から約５倍、または、約１．２から約２倍の範囲で、向上した濃度の１つ以上の前記塩を有し得る。一部の実施形態では、向上した前記塩は、前記第１の組織培養流体に存在する塩全体の約５０％から約７５％の範囲であり得る。他の濃度範囲および／または割合が使用され得る。
【００３３】
一部の実施形態では、前記第１の組織培養流体は、ビタミンを含み得る。前記ビタミンは、ビオチン、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ヒポキサンチン、イノシトール、ナイアシンアミド、ビタミンＣ、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、チミジン、ビタミンＢ−１２、ピリドキサール、プトレシンおよび／または組織培養流体中に見出され得る他のビタミンを含み得る。一部の実施形態では、前記第２の組織培養流体は、前記第１の組織培養流体に存在する濃度の約１．１から約５倍の範囲で、向上した濃度の１つ以上の前記ビタミンを有し得る。他の実施形態では、前記第２の組織培養流体は、前記第１の組織培養流体に存在する濃度の約１．２から約３倍の範囲で、向上した濃度の１つ以上の前記ビタミンを有し得る。一部の実施形態では、向上した前記ビタミンは、前記第１の組織培養流体に存在するビタミン全体の約５０％から約７５％の範囲であり得る。他の濃度範囲および／または割合が使用され得る。
【００３４】
一部の実施形態では、前記第１の組織培養流体は、上記列記されたもの以外の１つ以上の成分（「他の成分」）を含み得る。前記他の成分は、デキストロース、マンノース、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッド、グルタチオン、リノレン酸、リポ酸、エタノールアミン、メルカプトエタノール、オルトホスホリルエタノールアミンおよび／または組織培養流体中に見出され得る他の成分を含み得る。一部の実施形態では、前記第２の組織培養流体は、前記第１の組織培養流体に存在する濃度の約１．１から約１０倍の範囲で、向上した濃度の１つ以上の前記「他の成分」を有する。一部の実施形態では、前記第２の組織培養流体は、前記第１の組織培養流体に存在する濃度の約１．２から約５倍、または、約１．２から約２倍の範囲で、向上した濃度の１つ以上の前記「他の成分」を有する。一部の実施形態では、向上した１つ以上の前記「他の成分」は、前記第１の組織培養流体に存在する「他の成分」全体の約５０％から約７５％の範囲であり得る。他の濃度範囲および／または割合が使用され得る。
【００３５】
ここで、かん流バイオリアクタ培養システムを最適化する別の方法４００は、図１４を参照して説明されるであろう。かん流バイオリアクタシステム１００を最適化する方法４００は、４０１において、組換えタンパク質を発現する細胞を含む第１の組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度（第１のかん流速度）、開始バイオリアクタ容量および開始細胞保持装置容量を有する工程を含む。方法４００は、さらに、４０２において、前記開始かん流速度を（第２のかん流速度に）低下させ、４０３において、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす工程を含む。方法４００は、４０４において、前記組換えタンパク質の分解を軽減する安定剤を添加する工程も含む。特定の実施形態では、前記安定剤は、カルシウムである。図１１Ａ−１１Ｂに示されるように、安定剤の添加は、バイオリアクタ中での滞留時間の増加による、効力損失（約１３−１５％）を低下させる。
【００３６】
ＶＩＩＩ因子産生用の例示となるかん流培養システムは、例えば、発明の名称が「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｕｎｄｅｒ  Ｌｏｗ  Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｄｉｏｘｉｄｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ」である米国特許第６，３３８，９６４号、および、Ｂｏｅｄｅｋｅｒ，Ｂ．Ｇ．Ｄ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｓｔａｓｉｓ，２７（４），ｐａｇｅｓ  ３８５−３９４、および、２０１２年１月１８日に出願された米国仮出願番号第６１／５８７，９４０号に記載されている。それらの全開示は、参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。バイオリアクタ１０１および細胞保持装置１０２は、当該分野において公知である。特定の実施形態では、細胞保持装置１０２は、さらに、前記組織培養流体および細胞の再循環産物を受容し、前記組織培養流体および細胞の再循環産物から、細胞凝集物を分離し、残りの組織培養流体および細胞を、バイオリアクタ１０１に戻すように構成された細胞凝集トラップを含む。
【００３７】
細胞培養は、予め増殖させた培養物から、細胞を播種することにより開始され得る。典型的なバイオリアクタのパラメータは、適切な条件、例えば、約３７℃での温度、約６．８のｐＨ、約５０％の空気飽和の溶存酸素（ＤＯ）、および適切に一定の液体容量下に（例えば、自動的に）維持され得る。バイオリアクタの他のパラメータが使用され得る。ＤＯおよびｐＨは、市販のプローブを使用して直接接続されて測定され得る。前記バイオリアクタのプロセスは、バッチにおいて開始されるか、または、最初の細胞濃度を向上させるのが可能なバッチモードに供給され得る。これに、かん流段階を続け得る。その場合、前記細胞培養培地は、流入口１０５を通してバイオリアクタ１０１内に連続的に注入され、前記細胞を含む組織培養流体は、排出口１０６を通して排出される。組織培養流体の流速は、前記細胞の濃度と比例して、調節および向上され得る。定常状態または安定したかん流プロセスは、前記細胞の濃度がバイオリアクタ１０１中でのターゲットレベル（例えば、１×１０６個／ｍＬを越える）を達成する際に確立されることができ、この濃度で制御されることができる。この時点で、前記流速は、一定に保持され得る。前記細胞の密度は、例えば、かん流バイオリアクタシステム１００において、１ミリリットルあたりに約４００万から約４０００万個の間で保持され得る。
【００３８】
公知の下流の実行が、本願明細書に記載されたシステムおよび方法を使用して産生される前記組換えタンパク質を使用および精製するのに使用され得る。典型的な精製プロセスは、細胞分離、濃縮、沈降、クロマトグラフィーおよびろ過等を含み得る。他の精製プロセスも可能である。
【００３９】
前記細胞は、任意の真核生物または原核生物の細胞、例えば、哺乳類の細胞、植物の細胞、昆虫の細胞、酵母の細胞および細菌の細胞であり得る。前記細胞は、任意の生物製剤タンパク質生成物を作製する任意の細胞であり得る。前記細胞は、１つ以上の組換えタンパク質生成物を発現するように遺伝子操作された組換え細胞であり得る。前記細胞は、抗体分子を発現していることができる。前記生成物は、任意のタンパク質生成物、例えば、組換えタンパク質生成物、例えば、凝固因子、例えば、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子およびＸ因子等であり得る。一部の実施形態では、前記細胞は、哺乳類の細胞、例えば、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨＫＢ（腎臓とＢ細胞とのハイブリッド）細胞、ＨＥＫ（ヒト胎児性腎臓）細胞およびＮＳ０細胞等である。前記哺乳類の細胞は、ＶＩＩＩ因子を発現する組換え細胞であり得る。
【００４０】
組織培養培地としても公知の前記組織培養流体は、任意の適切な種類の組織培養培地であり得る。例えば、前記組織培養流体は、他のサプリメント、例えば、鉄、プルロニックＦ−６８またはインスリンを添加されたＪＲＨ（Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）により製造された市販のＤＭＥＭ／Ｆ１２配合に基づく培地組成物であることができ、基本的に、他のタンパク質を含まないことができる。錯化剤、例えば、ヒスチジン（ｈｉｓ）および／またはイミノジ酢酸（ＩＤＡ）が使用されることができ、および／または、有機バッファー、例えば、ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）および／またはＴＲＩＺＭＡ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノエタン）が使用され得る。それらは全て、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）から取得され得る。一部の実施形態では、前記組織培養流体は、公知の濃度のこれらの錯化剤および／または有機バッファーを、個々にまたは組み合わせで添加され得る。一部の実施形態では、組織培養流体は、ＥＤＴＡ、例えば、５０μＭ、または、別の適切な金属（例えば、鉄）のキレート剤を含み得る。他の組成物、配合、サプリメント、錯化剤および／またはバッファーが使用され得る。
【００４１】
前記開始かん流速度は、例えば、ＦＤＡにより承認された生物製剤の生物学的ライセンスにより設定されたかん流速度であり得る。前記開始かん流速度は、例えば、最適化されると考えられるものであり得る。前記開始バイオリアクタ容量および開始細胞保持装置容量も、例えば、生物製剤の生物学的ライセンスにおいて設定されるものであることができ、または、具体的なシステムについて他の方法で最適化されるのが考慮される。前記開始かん流速度、前記開始バイオリアクタ容量または細胞保持装置容量は、例えば、前記システムの製造メーカにより推奨されるものであることもできる。開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量および／または細胞保持装置容量は、動作中に使用される実際の値である必要がないことに留意されたい。むしろ、このような開始値は、単に、動作中に使用される前記かん流速度、バイオリアクタ容量および／または細胞保持装置容量の選択に使用され得る。前記バイオリアクタ容量および／または細胞保持装置容量は、動作または作動の容量であり得る。
【００４２】
前記滞留時間は、前記細胞および前記生成物がシステム１００のユニット動作の条件に曝される平均時間である。２つの重要なユニット動作は、バイオリアクタ１０１および細胞保持装置１０２である。
【００４３】
本教示の態様は、さらに、下記実施例を考慮して理解され得る。下記実施例は、本教示の範囲を制限すると何ら解釈されないべきである。
【００４４】
［実施例］
［実施例１］：開始かん流速度低下および培地成分増加の効果
この実施例では、濃縮した培地ならびに、１Ｌの作動容量で操作され、細胞保持用の３７５ｍｌのセトラ型細胞保持装置１０２を備えるバイオリアクタ容器１０１を使用した。ＫＧ−ＦＳの活性成分であるｒｈＦＶＩＩＩを産生するＢＨＫ細胞を、約２５×１０６個／ｍＬの細胞密度で定常状態に達するまで増殖させた。この実施形態では、前記開始かん流速度（コントロール速度）を、１１容量／日の速い速度で５日間維持した。２つのシステムを設定した。実験のシステムでは、新たなＶＭ２培地を使用して、かん流速度を、測定した細胞密度に基づいて、収集ポンプスピードを調節することにより、前記最初のかん流速度の０．８３、０．６７および０．５の割合に段階的に低下させた。前記培養を、各かん流速度レベルにおいて５日間維持し、サンプルを、効力試験用に収集した（表１）。細胞生存率（図２）および代謝（図５）は、かん流速度の変化により有意な影響を受けなかった。乳酸塩は、より低いかん流速度において増加したが、それは、１１容量／Ｄのかん流速度で運転した、前記運転の後半部分におけるコントロールのバイオリアクタにおいても増加した（図５）。増殖速度は、前記かん流速度に対してなされた変更により明らかな影響を受けなかった。パージ速度を変化させなかったか、生細胞密度（ＶＣＤ）が、かん流速度低下実験に沿って、高く一定に維持されたかのいずれかのためである（図２）。別のコントロールシステムでは、１１容量／日のかん流速度を、運転全体を通して維持した（図示せず）。収集されたサンプルを、ＦＶＩＩＩ活性について分析した。
【表１】
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【００４５】
Ｒ３は、修飾されたＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）系培地であり、ＶＭ２は、濃縮したＤＭＥＭ−Ｆ１２系培地（特定の改良を含む）である。示した通り、かん流速度低下の全段階について、ＦＶＩＩＩ力価が向上した（図４Ａ−４Ｂ）。５．５容量／日のかん流速度レベルでは、平均効力は、１１容量／日の最初のかん流速度でのそれと比較して、約５０％高かった（図３）。コントロール発酵槽では、ＦＶＩＩＩ活性は、一定レベルのままであった（図示せず）。ただし、かん流速度を半分に低下させた場合、効力は、約５０％まで向上したが、算出効力とは一致しなかった。前記算出効力は、ユニット動作あたりに同じ産物を得るために、１００％の向上（すなわち、前記かん流速度を半分に低下させた場合には、二倍の効力）であるべきである。
【００４６】
測定値と算出値との間の差は、全低下段階について、５．５容量／日（通常のかん流速度の半分、通常のかん流速度における半分の培地容量）において期待されたより約２３％低く向上した（図４Ａ−４Ｂ）。
【００４７】
新たなＶＭ２培地を含む、半分の培地容量（約半分の培地コスト）を使用することによりかん流速度を低下させることにより、通常のかん流発酵と比較して、収集物中に（同じ産物を提供する１００％以上に代えて）約５０％以上のＦＶＩＩＩ活性が存在した。
【００４８】
観察力価と算出力価との間の比較は、測定されたＦＶＩＩＩ活性が、前記算出値と比較してより低かったことを示す。したがって、前記細胞培養システムの生産性は、より低いかん流速度において、より低いことが見出された。
【００４９】
［実施例２］：ＦＶＩＩＩの安定性
ＦＶＩＩＩ活性の不安定化における滞留時間の影響の実験について、定常状態のかん流培養からの新鮮なバイオリアクタサンプルを使用した。
【００５０】
ＦＶＩＩＩのさらなる産生を防止するために、細胞を、遠心により除去した。上清を、インキュベータ中での３７℃におけるローラチューブ中での細胞培養刺激条件下においてインキュベートした。
【００５１】
規定の時点において、サンプルを、ＦＶＩＩＩ測定用に採取した。結果は、インキュベーションの１日目の内に、１００％から約６０％のＦＶＩＩＩ活性の大きな低下を示し、さらなるインキュベーション中でのより遅い低下を示した（図６）。
【００５２】
明らかに、滞留時間の増加は、ＦＶＩＩＩ活性に不都合な影響を及ぼす。
【００５３】
ＦＶＩＩＩ活性の時間依存性低下からのデータを使用して、かん流速度低下実験（実施例１）中における、増加した滞留時間から生じるＦＶＩＩＩ活性の理論的低下を算出し、図４Ａ−４Ｂに示した実験活性に対して、それを比較した。前記比較から、観察力価と算出力価との間の差が、部分的に、低下したかん流速度における長い滞留時間中でのＦＶＩＩＩ不安定性の結果であり得ることが示される（図６）。ただし、ＦＶＩＩＩ安定性の損失は、低下したかん流速度における効力低下の全体を説明していない。
【００５４】
［実施例３］：バイオリアクタ作動容量増加に結び付けられたかん流速度低下
実施例２は、かん流速度低下が、より長い滞留時間によるＦＶＩＩＩ効力の損失により限定されたことを示す。
【００５５】
長い滞留時間の負の効果を克服するために、細胞保持装置容量（例えば、セトラ容量）に対するバイオリアクタ作動容量の比の向上を試験した。
【００５６】
かん流培養を、表２にまとめたように、作動容量の増加に結び付けられたかん流速度低下により行った。細胞を、９×１０６個／ｍＬでの播種後約３日以内に、約２４×１０６個／ｍＬの定常状態の細胞密度に増殖させた。１１容量／日（１×）の通常のかん流速度における約１４日間（期間１）のデータセットを収集した後、かん流速度を、収集流量を低下させ、約２４×１０６個／ｍＬの一定の細胞密度を維持することにより、１２日間、８．５容量／ｄ（０．７８×）をターゲットとした（期間２）。１２日間の細胞培養後、バイオリアクタ１０１の作動容量を、レベルセンサに対する調節により１Ｌから１．３Ｌに増加させた（期間３）。細胞密度を、２４×１０６個／ｍＬで維持し、かん流速度を、８．５容量／ｄをターゲットとした（表２、図８Ａ）。
【００５７】
標準的なＤＭＥＭ−Ｆ１２系産生培地を、この実験に使用した。前記培地は、明らかに、試験したかん流速度での、通常の細胞培養性能のための十分な栄養を含む。グルコース濃度は、低下したかん流速度中に、約０．８ｇ／Ｌを上回ったままであった。グルタミン濃度は、前記かん流速度が８．５容量／日（０．７８×）であった期間中に、約１ｍＭであった。細胞増殖速度に影響を及ぼさないことが、前記かん流速度を低下させ、または、前記バイオリアクタの作動容量を増加させることに基づいて明らかとなった（図９）。
【表２】
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【００５８】
サンプルのＦＶＩＩＩ活性は、前記かん流速度を、１１容量／日（１×）から８．５容量／日（０．７８×、図８Ｂ）に低下させた後に、約１０％高かった。前記システムの算出生産性は、期間１中に約８６％の生産性に低下した（図１０Ａ−１０Ｂ、表１）。これは、実施例２に基づいた（図４Ａ−４Ｂ）。
【００５９】
期間３において、バイオリアクタ１０１の作動容量／ＣＲＤ１０２の作動容量の作動容量比は、１×から１．３×に向上し、一方、０．７８×の低下したかん流速度を維持したため、ＣＲＤ容量に対する培養容量の比が向上して、ＣＲＤ１０２中での培養滞留時間および細胞生産性の損失、の低下をもたらす。
【００６０】
実際に、ＦＶＩＩＩ活性は、この期間中に向上した（図１０Ａ−１０Ｂを参照のこと。）。
【００６１】
算出されたシステムの生産性は、１×作動容量および１１容量／日（１×）のかん流速度による前記システムの生産性と比較して、１２７％に向上を示した。これは、１．３×作動容量についての、１３０％の算出生産性に近い（図１０Ａ−１０Ｂ、表３）。
【００６２】
１×培養容量に正規化された、期間３の算出生産性は、標準的な条件下における培養の生産性とほぼ同じであった（９８％  ｖｓ  １００％、表３）。
【００６３】
これは、細胞特異的かん流速度ＣＳＰＲを、少なくとも３０％まで低下させるが、細胞特異的で、システム全体の生産性を維持する可能性があることを説明する。収集物中のＦＶＩＩＩの濃度が比例的に向上したためである。
【表３】
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【００６４】
１１容量／日および８．５容量／日は、１×および０．７８×それぞれに対応する。細胞密度は、おおよそ２４×１０６個／ｍＬであった。ＦＶＩＩＩの総滞留時間は、生産的なバイオリアクタ中（バイオリアクタ容量ＶｐｒにおけるＴｐｒ）と、非生産的なセトラ（セトラ容量ＶｎｐｒにおけるＴｎｐｒ）とでの滞留時間から構成される。このため、ＦＶＩＩＩについての平均滞留時間（ＴＲ）は、下記の通りである（Ｖｍｅｄｉａ：２４時間あたりの培地の総容量）：
ＴＲ＝Ｔｐｒ＋Ｔｎｐｒ＝Ｖｐｒ／Ｖｍｅｄｉａ×２４時間＋Ｖｎｐｒ／Ｖｍｅｄｉａ×２４時間
表４において、種々の発酵条件の滞留時間を示す。生産性は、Ｔｎｐｒと反比例して相関する。Ｔｐｒ増加の効果は、生産性における影響をほとんど有さないと思われる。
【００６５】
本ＦＶＩＩＩ産生システムのＴｎｐｒは、より小さいセトラ／バイオリアクタ容量により、１１容量／日の同じかん流速度および細胞密度を使用する１Ｌでの作動容量システムの約半分のＴｎｐｒのみである。
【表４】
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【００６６】
［実施例４］：実施例１−３についての材料と方法
かん流細胞培養
スケールアップのために、ＫＧ−ＦＳの活性成分である組換えヒトＦＶＩＩＩを発現する組換えＢＨＫ細胞を、Ｒ３産生培地を使用して、振とうフラスコ中に播種した。フラスコを３５．５℃および３０ｒｐｍでインキュベートし、連続的に、所望量の細胞が存在するまで分割した。
【００６７】
スケールアップからの細胞を、９×１０６ｖｃ／ｍＬで、ＤＡＳＧＩＰコントロールステーション上で、１Ｌの作動容量における１．５ＬのＤＡＳＧＩＰ容器内に播種した。前記作動容量を、培地ポンプを制御するレベルセンサにより一定に維持した。
【００６８】
かん流を、ＣＲＤ（例えば、０．３７５ｍＬ容量のセトラ）を使用して、細胞蓄積中での７．３容量／日、および、定常状態での１１容量／日のターゲットＣＳＰＲにおいて、測定された細胞密度に応じた収集ポンプの調節により確立した。かん流速度を、予め較正した収集ポンプから算出したが、収集容量を測定することによっても確認した。実際のかん流速度は、較正により予測された容量に、一貫して等しかった。温度を、ステーションのサーモスタットを使用して、３５．５℃で制御した。前記ＣＲＤの温度を、前記ＣＲＤに導く配管を、１６−１８℃に設定した冷蔵した水浴中で冷却することにより、２０−２３℃で制御した。通気を、溶存酸素コントローラにより制御されたガス中における酸素割合によるシリコーンチューブ通気装置により提供した。定常状態中での典型的な酸素割合は、７０％から８０％であった。背圧を、０．５から０．６ｂａｒで維持した。定常状態における細胞密度を、２５×１０６ｖｃ／ｍＬをターゲットとし、十分な溶存酸素を維持するのに制御した。補助的な通気を、５Ｌ／時間のヘッドスペース通気により提供した。培養ｐＨを、４％  炭酸ナトリウム溶液の添加により、６．８５のターゲットに制御した。
【００６９】
前記かん流速度を低下させるために、収集ポンプを、適切なポンプ速度に設定した。一方、細胞密度を、一定に維持した。酸素供給を、コントロール設定点に合致するように調節した。
【００７０】
必要に応じて、作動容量比の１×から１．３×への向上を、前記レベルセンサを適切な位置に引き上げることにより達成した。酸素供給を、要求されるレベルにおいて細胞密度を維持するために、ガス混合物中の酸素割合を向上させることにより調節した。
【００７１】
前記細胞培養のサンプルを、リアクタ容器から、外部サンプルポンプ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  １０１Ｕ／Ｒ、Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して取り出し、細胞計数システム（Ｃｅｄｅｘ  ＸＳ分析器、Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ、ＵＫ）を使用して、細胞密度および生存率ならびに２つのＹＳＩ  ２７００ｓ（一方は、グルコースおよび乳酸塩を測定し、他方は、グルタミンおよびグルタミン酸塩を測定）を分析した。前記サンプル中のＶＩＩＩ因子を、（２０ｍＭへの）カルシウムの添加により安定化させ、−７０℃で凍結させ、発色性アッセイによりｒＦＶＩＩＩ（組換えＦＶＩＩＩ）の効力について、後に分析した。
【００７２】
前記発色性の効力アッセイ法は、色の強度が、前記サンプル中のＶＩＩＩ因子の活性に比例する、２つの連続的な工程を含む。第１の工程では、Ｘ因子を、その補因子であるＶＩＩＩａと共にＩＸａ因子により、最適量のカルシウムイオンおよびリン脂質の存在において、Ｘａ因子に活性化する。Ｘ因子の活性化の割合が、ＶＩＩＩ因子量に単純に依存するように、過剰量のＸ因子が存在する。第２の工程では、Ｘａ因子は、発色性物質を加水分解して、発色団を生成する。色強度を、光度測定的に４０５ｎｍで読み取る。未知の効力を算出し、前記アッセイの妥当性を、線形回帰統計法を使用して確認する。活性を、１ｍＬあたりの国際単位（ＩＵ／ｍＬ）で報告する。
【００７３】
ＦＶＩＩＩ安定性試験
１４ｍＬの無細胞（遠心）培養上清を、１１容量／ｄの細胞特異的かん流速度での通常のＲ３培地中で増殖させた、１Ｌの作動容量のかん流培養物から収集し、５０ｍＬの通気キャップ付き回転チューブに移した。前記上清サンプルを、コントロールとなる、２０ｍＭ  カルシウムと共に凍結させた。前記チューブを、３７℃、５％  ＣＯ２および８０％湿度において、３０ｒｐｍでインキュベートした。規定の時点で、サンプルを取り出し、必要に応じて、カルシウムを、２０ｍＭの最終濃度に、全サンプルがなるように添加し、ＦＶＩＩＩ活性について試験するまで、−８０℃で保存した。全ての実験を、ダプリケートで行った。
【００７４】
培地配合
濃縮培地ＶＭ２の設計
ＶＭ２培地について、ほとんどの成分を、２×濃度で使用した。１：１の比でのＤＭＥＭ／Ｆ１２に基づく標準的なＲ３培地に対する変更は、下記の通りである。アミノ酸の濃度を、その消費速度に基づいて決定し、消費培地分析実験において算出した。低い溶解性のシスチンを、より高い濃度の（より高い溶解性の）システインで置き換えた。グルタミンを、１０ｍＭ（前記Ｒ３培地濃度の２×）で含ませた。マグネシウムを、標準的なＲ３培地におけるのと同じ濃度で使用した。微量元素を、１×で使用した二酸化セレンを除いて、２×濃度で使用した。カルシウムを、２×濃度で含ませた。グルコースおよびマンノースを、１ｇ／Ｌおよび３ｇ／Ｌでそれぞれ維持した。すなわち、標準的なＲ３培地におけるのと同じに維持した。グルタミン濃度を、１０ｍＭに設定した。オレイン酸、コレステロール、インスリンおよび任意の他の添加剤も、通常のＲ３（ＤＭＥＭ／Ｆ１２  １：１）培地におけるのと同じ濃度で使用した。重要なことは、（前記Ｒ３修飾ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に存在しない）新たな培地成分を、ＶＭ２に導入せず、特定の成分の濃度のみを変更した。
【００７５】
実施例１−４に関する注釈のまとめ
濃縮培地の配合を、ＦＶＩＩＩ産生に使用した１１容量／ｄのＣＳＰＲの約半分のＣＳＰＲレベルにおいて、十分な栄養レベルを維持するために設計した。ＣＳＰＲレベルを、（ＤＭＥＭ／Ｆ１２に基づく）通常のＲ３産生培地栄養を使用して、１１から８．５容量／日に低下させ得ることを示した。このことは、栄養制限および／または副産物の毒性廃棄物の蓄積が、試験した低下したＣＳＰＲにおいて限定しないことを示す。
【００７６】
低下したかん流速度において、ＦＶＩＩＩ効力が向上したが、その向上は、同じ細胞特異的生産性を想定する、算出されたものより低かった。
【００７７】
ＦＶＩＩＩ安定性実験は、細胞培養システム中でのより長い滞留時間が、おそらく分解によるＦＶＩＩＩ効力の損失をもたらすことを示す。（無細胞）安定性実験におけるＦＶＩＩＩ活性の低下は、ＣＳＰＲ低下中での理論的なＦＶＩＩＩ効力とのギャップを、部分的にのみ説明する。
【００７８】
本１Ｌ作動容量かん流システムのバイオリアクタ／ＣＲＤ容量比は、２．６７である。バイオリアクタ／ＣＲＤ作動容量の１．３への向上により、前記容量比は、３．４７に向上した。
【００７９】
ＣＲＤに対するバイオリアクタの容量の比を変化させることにより、かん流培養中での細胞の生産性は、８．５容量／日のＣＳＰＲにおいて、１１容量／ｄのＣＳＰＲでの前記システムの生産性と同じレベル近くに向上した。
【００８０】
経済的な観点から、このことは、新鮮な培地容量を減少させることによる上流プロセスにおける、および、少なくとも１．３の因数によるより少ない収集容量による下流プロセスにおける、コストを抑えることを意味するであろう。
【００８１】
ＦＶＩＩＩ含有培地の滞留時間ＴＲは、ＴｐｒおよびＴｎｐｒに分布される。上記実施例は、主にＴｎｐｒが、前記システムの生産性に影響を及ぼすことを説明する。
【００８２】
このため、生産性の最適化についての別の戦略は、前記ＣＲＤ（例えば、セトラ）およびそれに連結された配管の容量を最小化することによる、Ｔｎｐｒの最少化であり得る。
【００８３】
（ＣＳＰＲ８．５容量／ｄでのＲ３培地を使用する）グルタミン濃度を、０．６ｍＭ超とした。先の研究におけるそれは、増殖速度が制限されるのを下回る濃度であった。増殖制限は、約２４×１０６個／ｍＬの細胞密度による記載された条件下において観察されなかった。
【００８４】
標準的なＲ３培地における５ｍＭと比較して、１０ｍＭ  グルタミンを含む濃縮培地ＶＭ２を使用して、前記グルタミン濃度を、５．５容量／日と同じ低さのＣＳＰＲ速度でも、２ｍＭを十分上回るのを維持できた。増殖における影響は、これらの条件下では観察されなかった。
【００８５】
本教示は、種々の実施形態に関連して記載されるが、本教示は、このような実施形態に限定されないことを意図する。反対に、本教示は、当業者により解釈されるであろうように、種々の代替手段、修飾および均等物を包含する。さらに、この出願に引用された全ての文献および類似の材料、例えば、制限されず、特許、特許出願、論文、本、学術論文は、任意の目的のために、その全体が参照により、本願明細書に明確に包含される。本願明細書に使用されるセクションの見出しは、組織化の目的のためのみであり、記載された主題を制限すると何ら解釈されるべきではない。
（項目１）
かん流バイオリアクタ培養システムであって、
組織培養流体および培養される細胞を含むように構成されたバイオリアクタと、
前記バイオリアクタから、細胞を含む組織培養流体を受容し、一部の細胞を前記組織培養流体から分離し、組織培養流体および細胞の収集産物を提供し、前記バイオリアクタへの組織培養流体および細胞の再循環産物を提供するように構成された細胞保持装置と
を含み、
前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量、開始細胞保持装置容量および前記開始バイオリアクタ容量と前記開始細胞保持装置容量との開始容量比を有し、
前記開始かん流速度が低下して、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらすか、または、
前記開始バイオリアクタ容量が増加する、もしくは、前記開始細胞保持容量が低下する、もしくは、その両方がされて、前記開始容量比の向上をもたらすかのいずれかをする、
かん流バイオリアクタ培養システム。
（項目２）
前記開始かん流速度が低下して、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらし、前記開始バイオリアクタ容量が増加する、もしくは、前記開始細胞保持容量が低下する、または、その両方がされて、前記開始容量比の向上をもたらす、項目１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目３）
前記開始容量比の向上が、前記開始かん流速度の低下とほぼ同じ割合である、項目２に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目４）
前記開始かん流速度の低下量が、約３分の１量までである、項目２に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目５）
前記開始かん流速度の低下量が、約半分量までである、項目２に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目６）
前記開始バイオリアクタ容量の増加量が、約３分の１量までである、項目２に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目７）
前記開始バイオリアクタ容量の増加量が、約半分量までである、項目２に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目８）
前記開始細胞保持容量の減少量が、約３分の１量までである、項目２に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目９）
前記開始細胞保持容量の減少量が、約半分量までである、項目２に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目１０）
前記細胞が、哺乳類の細胞である、項目２に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目１１）
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＫＢ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳ０細胞からなる群から選択される、項目１０に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目１２）
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞である、項目１１に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目１３）
前記哺乳類の細胞が、組換えＶＩＩＩ因子（ｒｈＦＶＩＩＩ）を発現する組換え細胞である、項目１０に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目１４）
前記ｒＨＦＶＩＩＩが、ＫＧ−ＦＳの活性成分である、項目１３に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目１５）
前記開始かん流速度が、１日あたりに約１から１５容量である、項目２に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目１６）
前記開始容量比の向上量が、約３分の１量までである、項目２に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目１７）
前記開始容量比の向上量が、約半分量までである、項目２に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
（項目１８）
かん流バイオリアクタシステムを最適化する方法であって、
細胞を含む組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量、開始細胞保持装置容量および前記開始バイオリアクタ容量と前記開始細胞保持容量との開始容量比を有する工程と、
前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらすか、または、
前記開始バイオリアクタ容量を増加させる、もしくは、前記開始細胞保持装置容量を減少させる、もしくは、その両方をさせて、前記開始容量比の向上をもたらすかのいずれかをする工程と
を含む、方法。
（項目１９）
前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす工程と、
前記開始バイオリアクタ容量を増加させ、もしくは、前記開始細胞保持装置容量を減少させ、もしくは、その両方をさせて、前記開始容量比の向上をもたらす工程と
をさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記開始容量比の向上が、前記開始かん流速度の低下と約同じ割合である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記開始かん流速度の低下量が、約３分の１量までである、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記開始かん流速度の低下量が、約半分量までである、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記開始バイオリアクタ容量の増加量が、約３分の１量までである、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記開始バイオリアクタ容量の増加量が、約半分量までである、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記開始細胞保持容量の減少量が、約３分の１までである、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
前記開始細胞保持容量の減少量が、約半分量までである、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
前記細胞が、哺乳類の細胞である、項目１８に記載の方法。
（項目２８）
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＫＢ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳ０細胞からなる群から選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞である、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記哺乳類の細胞が、組換えヒトＶＩＩＩ因子（ｒｈＦＶＩＩＩ）を発現する組換え細胞である、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
前記ｒＨＦＶＩＩＩが、ＫＧ−ＦＳの活性成分である、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記開始かん流速度が、１日あたりに約１から１５容量である、項目１８に記載の方法。
（項目３３）
前記開始容量比の向上量が、約３分の１量までである、項目１８に記載の方法。
（項目３４）
前記開始容量比の向上量が、約半分量までである、項目１８に記載の方法。
（項目３５）
かん流バイオリアクタシステムを最適化する方法であって、
細胞を含む第１の組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量および開始細胞保持容量を有する工程と、
前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす工程と、前記第１の組織培養流体を、第２の組織培養流体に置き換える工程であって、前記第２の組織培養流体が、前記第１の組織培養流体と比較して、新たな成分を添加することなく、前記第１の組織培養流体における個々の成分の向上した濃度を有する工程と
を含む、方法。
（項目３６）
前記細胞が、哺乳類の細胞である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＫＢ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳ０細胞からなる群から選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞である、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記哺乳類の細胞が、組換えヒトＶＩＩＩ因子（ｒｈＦＶＩＩＩ）を発現する組換え細胞である、項目３５に記載の方法。
（項目４０）
前記ｒＨＦＶＩＩＩが、ＫＧ−ＦＳの活性成分である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
かん流バイオリアクタシステムを最適化する方法であって、
組換えタンパク質を発現する細胞を含む第１の組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量および開始細胞保持装置容量を有する工程と、
前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす工程と、前記組換えタンパク質の分解の安定剤を添加する工程と
を含む、方法。
（項目４２）
前記細胞が、哺乳類の細胞である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＫＢ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳ０細胞からなる群から選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記哺乳類の細胞が、ＢＨＫ細胞である、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記哺乳類の細胞が、ＶＩＩＩ因子（ｒｈＦＶＩＩＩ）を発現する組換え細胞である、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
前記ｒＨＦＶＩＩＩが、ＫＧ−ＦＳの活性成分である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記安定剤が、カルシウムである、項目４１に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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