(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類のＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤と、
【化１】
0006393682.tif 000014
からなる群から選択される化合物とを含む、医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも１種類のＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤と組合せて使用するための、
【化２】
0006393682.tif 000015
からなる群から選択される化合物を含む、医薬組成物。
【請求項３】
【化３】
0006393682.tif 000016
からなる群から選択される化合物と組合せて使用するための、少なくとも１種類のＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤を含む、医薬組成物。
【請求項４】
前記ＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡ分子、ＤｓｉＲＮＡ分子、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びリボザイムからなる群から選択される、請求項１〜３の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤が、配列番号１から１７０からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
過剰増殖性疾患を処置するための、請求項１〜５の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、及びグリア芽細胞腫からなる群から選択される過剰増殖性疾患の処置で用いるための、請求項１〜５の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤及び前記化合物が、同時に、逐次に、又は別々に投与される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
医薬組成物を調製するための、少なくとも１種類のＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤と、
【化４】
0006393682.tif 000017
からなる群から選択される化合物との使用。
【請求項１１】
少なくとも１種類のＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤と組合せて使用する医薬組成物を調製するための、
【化５】
0006393682.tif 000018
からなる群から選択される化合物の使用。
【請求項１２】
【化６】
0006393682.tif 000019
からなる群から選択される化合物と組合せて使用する医薬組成物を調製するための、少なくとも１種類のＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤の使用。
【請求項１３】
前記ＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡ分子、ＤｓｉＲＮＡ分子、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びリボザイムからなる群から選択される、請求項１０〜１２の何れか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記ＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤が、配列番号１から１７０からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１０〜１２の何れか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬組成物は、過剰増殖性疾患を処置するために用いられる、請求項１０〜１４の何れか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬組成物は、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、及びグリア芽細胞腫からなる群から選択される過剰増殖性疾患の処置で用いるための、請求項１０〜１４の何れか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシング剤及び前記化合物が、同時に、逐次に、又は別々に投与される、請求項１０から１６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、請求項１０から１７までのいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの併用療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＤＡＣ４は、核ヒストンタンパク質のリシン残基を脱アセチル化し、エピジェネティックに遺伝子発現を抑制するそれらの能力にちなんで伝統的に命名されているヒストンデアセチラーゼのクラスＩＩａファミリーに属する。しかし、過去数十年において、これらのＨＤＡＣは、核と細胞質の両方にある多くの非ヒストンタンパク質を調節することが見出された（Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）  ２０１１：１４６４９３において、Ｙａｏ及びＹａｎｇによってレビューされた）。クラスＩＩａ  ＨＤＡＣに特有な特徴としては、（ｉ）核−細胞質間のシャトルのためのＮＬＳ（核移行シグナル）、及び転写因子及びコリプレッサーのための結合モチーフを含む、保存されたＮ−末端調節領域の存在；（ｉｉ）組織特異的発現；並びに（ｉｉｉ）リン酸化を介在した外因性／内因性刺激への応答が含まれる（Ｐａｒｒａ及びＶｅｒｄｉｎ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０１０）  １０（４）：４５４〜６０）。
【０００３】
ＨＤＡＣ４の高発現は、心筋及び平滑筋、心臓並びに脳にみられる。ＨＤＡＣ４は、コリプレッサー（たとえば、Ｎ−ＣｏＲ及びＳＭＲＴ）並びに他のＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ３及びＨＤＡＣ５）と共同して、組織特異的転写因子（たとえば、ＭＥＦ２、Ｒｕｎｘ２、ｐ５３及びＳＲＦ）に結合することによって、多くの遺伝子の発現を阻害することができる（Ｐａｒｒａ及びＶｅｒｄｉｎ、２０１０、同上）。多くの研究が、異常なＨＤＡＣ４発現及び細胞内局在を発達障害及び神経変性疾患に関連付けている（Ｍａｊｄｚａｄｅｈら、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．（２００８）  １３：１０７２〜８２）。特異的な細胞刺激に応答して、様々なキナーゼ（主にＣＡＭＫ）が、保存されたセリン残基（ヒト中のＳｅｒ−２４６、Ｓｅｒ−４６７及びＳｅｒ−６３２）でＨＤＡＣ４をリン酸化することで、ＨＤＡＣを細胞質内にトラップする１４−３−３タンパク質のドッキング部位（ｄｏｃｋｉｎｇ  ｓｉｔｅ）が形成され、これにより、ＨＤＡＣが介在する抑制から標的プロモーターを解放することができる。これに反して、ＰＰ２Ａ及びＰＰ１ホスファターゼを介した脱リン酸化は、ＨＤＡＣ４  ＮＬＳを露出させ、ＨＤＡＣ４の核移行を促進することが示された（Ｐａｒｒａ及びＶｅｒｄｉｎ、２０１０、同上）。
【０００４】
Ｗｉｌｓｏｎらは、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．（２００８）  １９（１０）：４０６２〜７５において、増殖性マウス大腸陰窩（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｃｏｌｏｎ  ｃｒｙｐｔｓ）における強いＨＤＡＣ４発現を報告した。ＨＤＡＣ４又は少数の他のＨＤＡＣのサイレンシング、並びにｐａｎ−ＨＤＡＣ阻害剤を用いた処理により、ＤＮＡ損傷条件下で直接間接を問わずｐ５３を介したｐ２１の上方制御を介してがん細胞の増殖が阻害されることが明らかにされた（Ｂａｓｉｌｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００６）  ２８１（４）：２３４７〜５７；Ｗｉｌｓｏｎら、２００８、同上）。ハイスループット試験で、ヒト胸部腫瘍サンプルが有意なＨＤＡＣ４過剰発現を示し、ヒト癌でのＨＤＡＣ４の潜在的役割が示唆された（Ｗｉｔｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．（２００９）  ２７７（１）：８〜２１）。
【０００５】
近年の研究成果において、いくつかの細胞質内標的が同定されており、それらは、発生、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、アポトーシス及び化学療法耐性の調節におけるＨＤＡＣ４の役割を強調している。ＨＤＡＣ４の活性及びＨＤＡＣ４と細胞質内のＨＩＦ１αとの関係性が、網膜神経細胞の生存にとって必要であることが示された（Ｃｈｅｎ及びＣｅｐｋｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００９）  ３２３（５９１１）：２５６〜９）。ＨＩＦ１α  Ｎ−末端側リシンのＨＤＡＣ４介在性脱アセチル化は、ＨＩＦ１αを安定化させ、その標的遺伝子、即ちＶＥＧＦ及び解糖作用遺伝子（ＬＤＨＡ及びＧｌｕｔ１）の転写を促進する（Ｇｅｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２０１１）  ２８６（４４）：３８０９５〜１０２）。したがって、ＨＤＡＣ４は、低酸素／ストレス条件に適応する細胞を作製し、腫瘍血管新生にも寄与するものと思われる。重要なことに、この報告において、ＨＤＡＣ４についてサイレンシングされた前立腺がん細胞は、低酸素条件でドセタキセル処置に対し、より高い反応性を示した。
【０００６】
ＨＤＡＣ４の過剰発現は、ＳＴＡＴ１の活性化及び核転位によって卵巣がんのシスプラチン耐性を強化することも示されている（脱アセチル化とそれに続くリン酸化）。代わりに、より特異的なＨＤＡＣ４阻害剤であるＡＰＨＡ４ａが、カスパーゼ活性を誘導し、シスプラチン感受性を回復させた（Ｓｔｒｏｎａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０１１）  ７１（１３）：４４１２〜２２）。
【０００７】
ごく最近では、神経細胞の生存及び毛細管拡張性運動失調症（ＡＴ）における、核と細胞質の両方のＨＤＡＣ４の重要性が示された（Ｌｉら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．（２０１２）  １８（５）：７８３〜７９０）。ＡＴＭの欠損に起因するＰＰ２Ａ活性の増大は、ＨＤＡＣ４の核内蓄積及び様々なプロモーターのエピジェネティックな抑制を促進することが示された。対照的に、細胞質内のＨＤＡＣ４は、細胞周期へのリエントリー及びカスパーゼ−３活性化を阻害した。重要なことに、これらの研究成果は、ＰＰ２Ａ活性化が、細胞生存促進性の細胞質内のＨＤＡＣ４を、抗生存性の核内ＨＤＡＣ４へとシフトすることによって、脳内のがん細胞の死滅を促すのに有益であることを立証し得ることから、がん分野においても非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
がんは世界中のすべてのコミュニティを苦しませている壊滅的な疾患であり、先天的な又は後天的な抵抗性は現在用いられている化学療法に関連する主要な問題であることからすると、アポトーシスを誘導する新たながん療法の明確な必要性が当技術分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は、医薬として用いるための、少なくとも１種類のＨＤＡＣ４サイレンシング剤と、式（Ｉ）の化合物との組合せを提供する。式（Ｉ）の化合物は、一般構造：
【化１】
0006393682.tif 000002
（式中、
Ｒ’は、Ｈ又はアルキルであり；
Ｒ’’は、Ｈ又はアルコキシであり；
Ｒ１及びＲ２は、Ｈであるか、又は一緒にオキソを形成し；
Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ若しくはＯＨであるか、又は一緒にオキソを形成し；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ６’、Ｒ７、及びＲ８は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシルアルキル、アルコキシカルボニル、モノアルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群から独立して選択され；
Ｘは、ＣＨ２又はＯであり；
ｎは、０又は１である）
を有する。
【００１０】
一部の実施形態では、ＨＤＡＣ４サイレンシング剤は、ｓｉＲＮＡ分子、ＤｓｉＲＮＡ分子、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びリボザイムからなる群から選択される。一部のさらなる実施形態では、ＨＤＡＣ４サイレンシング剤は、配列番号１から１７０からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００１１】
一部の他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
【化２】
0006393682.tif 000003
からなる群から選択される。
【００１２】
一部の実施形態によると、この組合せは、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、及びグリア芽細胞腫からなる群から選択される過剰増殖性疾患の処置で用いることができる。
【００１３】
一部のさらなる実施形態によると、ＨＤＡＣ４サイレンシング剤及び式（Ｉ）の化合物は、同時に、逐次に、又は別々に投与することができる。
【００１４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の実施形態（単数又は複数）による組合せ及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、過剰増殖性細胞を化学療法剤に対して感作させる方法であって、そのような感作を必要とするヒト又は動物対象においてＨＤＡＣ４遺伝子をサイレンシングすることによって感作する方法を提供する。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、過剰増殖性疾患を処置する方法であって、そのような処置を必要とするヒト又は動物対象において、少なくとも１種類のＨＤＡＣ４サイレンシング剤と本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物とを併用して（concomitantly）、同時に又は逐次に前記対象に投与することによって処置する方法を提供する。
【００１７】
本組合せの医療用途について記載された総ての実施形態は、上述の方法に適用され、逆の場合も同様である。
【００１８】
本発明の他の態様、具体的な実施形態、目的、詳細、及び利点は、以下の図面、詳細な説明及び実施例に示される。
【００１９】
以下において、本発明は、添付された図面を参照して好ましい実施形態によって、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】ヒトグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞でのスクランブルｄｓＲＮＡ（Ｓｃｒ．）及びＨＤＡＣ４特異的ｄｓＲＮＡ（ＨＤＡＣ４）のＨＤＡＣ４サイレンシング活性を実証するウェスタンブロットである。
【図１Ｂ】スクランブルｄｓＲＮＡ又はＨＤＡＣ４特異的ｄｓＲＮＡいずれかでの４８時間のトランスフェクション、及び続く既述した薬剤の指示された濃度によるさらに２４時間の処理後の、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞でのアポトーシスの核断片化の量を示す。
【図２Ａ】指示された濃度の化合物による２日間の処理の後の、スクランブルｄｓＲＮＡ又はＨＤＡＣ４  ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＴ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成能を表す。
【図２Ｂ】指示された条件で１ウェル当たりのＴ９８Ｇ細胞コロニーによってカバーされた面積（ｍｅａｓｕｒｅ  ｏｆ  ａｒｅａ）として、図２Ａで示された結果の定量分析を示す。
【図２Ｃ】処理されていない対照細胞と比較した、指示された薬剤で処理されたＴ９８Ｇ細胞コロニーによってカバーされた面積の変化倍率（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）のとして、図２Ａで示された結果の定量分析を示すグラフである。
【図３Ａ】指示された濃度の化合物による２日間の処理の後の、スクランブルｄｓＲＮＡ又はＨＤＡＣ４ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＵ８７ＭＧ−ルシフェラーゼグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成能を表す。
【図３Ｂ】指示された条件で１ウェル当たりのＵ８７ＭＧ−ルシフェラーゼ細胞コロニーによってカバーされた面積として、図３Ａで示された結果の定量分析を示す。
【図３Ｃ】処理されていない対照細胞と比較した、指示された薬剤で処理されたＵ８７ＭＧ−ルシフェラーゼ細胞コロニーによってカバーされた面積の変化倍率として、図３Ａで示された結果の定量分析を示す。
【図４Ａ】ヒトグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞でのスクランブルｄｓＲＮＡ（Ｓｃｒ．）及びＨＤＡＣ４特異的ｄｓＲＮＡ（ＨＤＡＣ４．２）のＨＤＡＣ４サイレンシング活性を実証するウェスタンブロットである。
【図４Ｂ】スクランブルｄｓＲＮＡ又はＨＤＡＣ４．２ｄｓＲＮＡいずれかでの４８時間のトランスフェクション、及び続く既述した薬剤の指示された濃度によるさらに２４時間の処理後の、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞でのアポトーシスの核断片化の量を示す。
【図４Ｃ】指示された濃度の化合物による処理２日後の、スクランブルｄｓＲＮＡ又はＨＤＡＣ４．２ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＴ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成能を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、ＨＤＡＣ４遺伝子をサイレンシングすることが、共通の構造的特徴を有する小分子薬剤のアポトーシス誘導活性を増大させるという驚くべき知見に基づく。
【００２２】
ＨＤＡＣ４遺伝子のサイレンシングと前記薬剤の投与との共存は、アポトーシスレベルの相乗的増加をもたらす。したがって、一態様では、本発明は、ＨＤＡＣ４枯渇(depletion)及び前記薬剤の併用療法を提供する。
【００２３】
ＨＤＡＣ４遺伝子サイレンシングは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含むが、これに限定されない、当技術分野において公知である任意の好適な方法によって得ることができる。ＲＮＡｉに基づく遺伝子サイレンシングのための最も一般的なアプローチは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用である。
【００２４】
ｓｉＲＮＡの原理は、文献に広く提示されている。例として、米国特許公開第２００３／０１４３７３２号、第２００３／０１４８５０７号、第２００３／０１７５９５０号、第２００３／０１９０６３５号、第２００４／００１９００１号、第２００５／０００８６１７号及び第２００５／００４３２６６号を指摘することができる。ｓｉＲＮＡ二重鎖分子は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の標的領域に相補的な配列を含み、センス鎖は前記アンチセンス鎖に相補的な配列を含む。したがって、ｓｉＲＮＡ二重鎖分子は２つの核酸断片から組み立てられ、１つの断片はアンチセンス鎖を含み、第２の断片は前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖を含む。換言すれば、ｓｉＲＮＡは小分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。センス鎖及びアンチセンス鎖は、リンカー分子（ポリヌクレオチドリンカーでもよいし、又は非ヌクレオチドリンカーでもよい）を介して共有結合することができる。アンチセンス鎖及びセンス鎖の長さは異なることができ、それぞれ一般的に約１９から２１ヌクレオチドである。場合によっては、ｓｉＲＮＡは２２、２３又は２４ヌクレオチドを含むことができる。
【００２５】
ＲＮＡｉに基づくＨＤＡＣ４サイレンシングのための別のアプローチは、より長い、一般的に２５〜３５ｎｔのダイサー基質ｓｉＲＮＡ（Ｄｉｃｅｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｉＲＮＡ）（ＤｓｉＲＮＡ）を用いることであり、それは、場合によっては、対応する従来の２１量体ｓｉＲＮＡより強力であることが報告がされている（Ｋｉｍら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ、２００５、２３：２２２〜２２６）。ＤｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでダイサーによって処理されて、活性ｓｉＲＮＡとなる。
【００２６】
細胞では、活性ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖が形成され、標的ｍＲＮＡの標的領域を認識する。このことは、ひいては、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ＝ＲＮＡによって誘導されるサイレンシング複合体）によって、またＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）による追加のＲＮＡの合成において標的ＲＮＡの切断につながり、それはダイサーを活性化させ、追加のｓｉＲＮＡ二重鎖分子をもたらし、それによって応答を増幅することができる。
【００２７】
本明細書で用いる場合、用語「ｄｓＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡとＤｓｉＲＮＡの両方を指す。
【００２８】
必ずしもそうであるとは限らないが、一般的に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖及びセンス鎖はともに、少数の、一般的に１から３ヌクレオチドの３’末端突出部分を含む。３’突出部分は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドなどの１つ又は複数の改変ヌクレオチドを含むことができる。アンチセンスの５’末端は、一般的にリン酸基（Ｐ）である。末端リン酸基（Ｐ）を有するｄｓＲＮＡ二重鎖は、一本鎖アンチセンスよりも細胞に与えるのが容易である。場合によっては、センス鎖、又はアンチセンス鎖とセンス鎖の両方の５’末端が、Ｐ基を含むことができる。
【００２９】
正常な改変されていないＲＮＡは、生細胞に存在するリボヌクレアーゼ酵素によるその分解のために、生理学的条件下で低い安定性を有する。オリゴヌクレオチドが外部から投与される場合には、化学的及び酵素的分解に対するその安定性を強化するように、公知の方法によってその分子を改変することが非常に望ましい。
【００３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて外部から投与されるヌクレオチドの改変は、当技術分野で広く記載されている（たとえば、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０２５５４８７）。主として、ヌクレオチドの任意の部分、すなわちリボース糖、塩基及び／又はヌクレオチド間のリン酸ジエステル鎖を改変することができる。たとえば、リボース単位から２’−ＯＨ基を除去して２’−デオキシリボヌクレオチドを与えることは、向上した安定性をもたらす。この基での他の改変：アルキル、アルケニル、アリル、アルコキシアルキル、ハロ、アミノ、アジド又はスルフヒドリル基によるリボース２’−ＯＨ基の置換も以前に開示されている。リボース単位での他の改変も実施することができる：固有のより高い安定性を形成するために、リボースの２’位と４’位との間にメチレン結合を含有するロックされた核酸（ＬＮＡ）を使用することができる。
【００３１】
さらに、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合は、たとえば、１つ又は複数の酸素を硫黄、アミノ、アルキル又はアルコキシ基で置換するように改変することができる。ヌクレオチドの塩基もまた、改変することができる。
【００３２】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、リボース糖での１つ若しくは複数の２’−ヒドロキシル基の改変、及び／又は１つ若しくは複数のヌクレオチド間のホスホジエステル結合の改変、及び／又はリボース糖の２’位と４’位との間の１つ若しくは複数のロック核酸（ＬＮＡ）改変を含む。
【００３３】
特に好ましい改変は、たとえば、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−ハロ、たとえばフルオロ、又は２’−メトキシエチルによる１つ若しくは複数の２’−ＯＨ基の置換である。特に好ましいものは、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の一部の改変、例えば、ホスホロチオアート結合によって置換されたオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡがそれらのＨＤＡＣ４サイレンシング能力を保持する限り、ホスホロチオアート、ホスホルアミダート、メチルホスホナート、キラルメチルホスホナート、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むがこれらに限定されない、１つ若しくは複数の合成又は天然のヌクレオチド類似体をｄｓＲＮＡは含有することができる。
【００３５】
上記の改変は、単に非制限的な例であることが強調されるべきである。
【００３６】
ＲＮＡｉに関する課題の１つは、対応するｍＲＮＡのための強力なｄｓＲＮＡの同定である。不完全な相補性を有する遺伝子は、ｄｓＲＮＡによって意図せずして下方制御され、データ解読及び潜在毒性に関する問題につながることに注意すべきである。しかし、これは、設計アルゴリズムで適切なｄｓＲＮＡを慎重に設計することによって部分的に対処することができる。これらのコンピュータプログラムは、ｄｓＲＮＡのサイレンシング効果を高める特徴である、ＧＣ含量量が低く、内部反復が欠如し、５末端がＡ／Ｕに富み、及び、局所の遊離結合エネルギーが高い配列範囲を見出すために、一連の法則で所与の標的配列をふるい分ける。
【００３７】
ＨＤＡＣ４特異的ｄｓＲＮＡは当技術分野で入手可能であり、さらにｄｓＲＮＡ分子は、市販及び非市販のアルゴリズムを用いて設計することができる。この目的のために、ｓｉＲＮＡアルゴリズムプログラム、たとえばＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  ＯｐｅｒｏｎのＯｎｌｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌ、ＤｈａｒｍａｃｏｎのｓｉＲＮＡ設計ツール及びＣｕｉらによって開発されたスタンドアロンプログラムに、ＨＤＡＣ４の完全長ｃＤＮＡ配列を入れることができる（Ｃｏｍｐｕｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．（２００４）７５（１）：６７〜７３）。理想的には、標的外れを逃れられないｓｉＲＮＡを除去するために、アルゴリズムによって生成されたｓｉＲＮＡ配列を、次にゲノム全体のＤＮＡ配列アラインメント（ＢＬＡＳＴ）を通してスクリーニングする。換言すると、標的遺伝子（ＨＤＡＣ４）以外の遺伝子と合致するさらに短い配列領域を有するこれらすべてのｓｉＲＮＡが、さらなる使用のために非常に貴重であるとみなされるべきである。本発明の様々な実施形態での使用に好適なＨＤＡＣ４特異的ｓｉＲＮＡの非限定的な例を表１に掲載する。
【００３８】
ＨＤＡＣ４特異的ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを分解するそれらの能力を試験するために、異なる細胞系にトランスフェクトすることができる。さらに、ＨＤＡＣ４の翻訳の減少は、ＨＤＡＣ４特異的抗体で、ｓｉＲＮＡ処理後のＨＤＡＣ４タンパク質の量を測定することによって、タンパク質レベルで研究することができる。
【表１−１】
0006393682.tif 000004
【表１−２】
0006393682.tif 000005
【表１−３】
0006393682.tif 000006
【表１−４】
0006393682.tif 000007
【表１−５】
0006393682.tif 000008
【００３９】
好適なｄｓＲＮＡには、参照ｄｓＲＮＡ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｓＲＮＡ）と類似した結合特性及びＨＤＡＣ４サイレンシング活性を有する限り、配列番号１から１６５と８０％を超える配列同一性、たとえば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はさらに１００％の配列同一性を有するものが含まれる。
【００４０】
本発明の様々な実施形態で使用するのに好適なさらなるＨＤＡＣ４特異的ｄｓＲＮＡは、当技術分野で公知の方法によって設計及び合成することができる。そのような単離された任意のｄｓＲＮＡは、ＨＤＡＣ４遺伝子をサイレンシングするために、ＨＤＡＣ４  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的でなければならない。
【００４１】
人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）前駆体は、ＲＮＡｉを媒介するのに好適な別のクラスの小分子ＲＮＡである。一般的に、人工ｍｉＲＮＡ前駆体は、長さが約２１〜２５ヌクレオチドであり、それらは、１から３つ、一般的に２つのオーバーハンギング３’ヌクレオチドを有することができる。ＨＤＡＣ４サイレンシング人工ｍｉＲＮＡ前駆体は、当技術分野で公知の方法によって設計及び合成することができる。
【００４２】
ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｓ）は、ＨＤＡＣ４をサイレンシングするさらに別の方法である。ｓｈＲＮＡは、ｉ）標的遺伝子に由来する、一般的に１９から２９ヌクレオチドの範囲の短いヌクレオチド配列；ｉｉ）一般的に４から２３ヌクレオチドの間の範囲のループ；及びｉｉｉ）一般的に１９から２９ヌクレオチドの範囲の、最初の標的配列に逆相補的なショートヌクレオチド配列からなる。ＨＤＡＣ４サイレンシングｓｈＲＮＡは、当業者に公知の手段及び方法によって設計及び合成することができる。ＨＤＡＣ４特異的ｓｈＲＮＡの非限定的な例には、表２に掲載のものが含まれる。
【表２】
0006393682.tif 000009
【００４３】
ＨＤＡＣ４サイレンシングはアンチセンス療法によって得ることもでき、その場合、比較的短い（一般的に１３〜２５ヌクレオチド）合成一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドが、対応するｍＲＮＡに結合することによってＨＤＡＣ４遺伝子を不活性化する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、改変されなくても又は化学的に改変されてもよい。一部の実施形態では、リボースの２’位の水素は、メチルなどＯ−アルキル基によって置き換えられる。さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないがＰＮＡを含む１つ若しくは複数の合成又は天然のヌクレオチド類似体を含有することができる。
【００４４】
さらに、ＨＤＡＣ４サイレンシングは、ＨＤＡＣ４  ｍＲＮＡを切断するリボザイムによって得ることができる。リボザイム技術は、たとえば、Ｌｉらによって、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００７、９６：１０３〜４３に記載されている。
【００４５】
本明細書で用いる場合、用語「ＨＤＡＣ４サイレンシング」は、ＨＤＡＣ４遺伝子発現の完全な又は部分的な低減を指す。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ４特異的ｄｓＲＮＡ、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、又はそれらの任意の組合せがヒト又は動物対象に導入される場合、ＨＤＡＣ４遺伝子発現は、少なくとも５０％、又は少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％低減される。
【００４６】
本発明の様々な実施形態での使用に好適な化合物には、表３に掲載されるもの、及びそれらの任意の立体異性体、塩、溶媒和物、又はプロドラッグが含まれる。一実施形態では、好適な化合物は、一般式（Ｉ）：
【化３】
0006393682.tif 000010
（式中、
Ｒ’は、Ｈ又はアルキルであり；
Ｒ’’は、Ｈ又はアルコキシであり；
Ｒ１及びＲ２は、Ｈであるか、又は一緒にオキソを形成し；
Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ若しくはＯＨであるか、又は一緒にオキソを形成し；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ６’、Ｒ７、及びＲ８は、独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシルアルキル、アルコキシカルボニル、モノアルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群から選択され；
Ｘは、ＣＨ２又はＯであり；
ｎは、０又は１である）を有する。
【００４７】
本明細書で用いる場合、語句「式を有する（ｈａｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍｕｌａ）」は、限定していることを意図せず、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が一般に用いられるのと同じように用いられる。
【００４８】
上で言及される用語「アルキル」には、直鎖状と分枝状の両方のＣ１〜６アルキル基、たとえば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。一部の実施形態では、アルキル基は、１から３個の炭素原子を含有するＣ１〜３アルキル基である。
【００４９】
本明細書で用いる場合、用語「アルコキシ」は、直鎖状と分枝状の両方のＣ１〜６アルコキシ基、たとえば、メトキシ、エトキシ、プロポキシなどを指す。一部の実施形態では、アルコキシ基は、１から３個の炭素原子を含有するＣ１〜３アルコキシ基である。
【００５０】
本明細書で用いる場合、用語「ヒドロキシアルキル」は、−ＯＨによって置換された前述のＣ１〜６アルキル基のいずれかを指す。
【００５１】
本明細書で用いる場合、用語「アルコキシカルボニル」は、−ＣＯＯＨによって置換された前述のＣ１〜６アルコキシ基のいずれかを指す。
【００５２】
用語「アミノ」は、−ＮＨ２を指す。
【００５３】
用語「モノアルキルアミノ」は、１つのアミノ基(an amino group)で置換された前述のアルキル基のいずれかを含む。
【００５４】
用語「ジアルキルアミノ」は、２つのアミノ基で置換された前述のアルキル基のいずれかを指す。
【００５５】
本明細書で用いる場合、用語「立体異性体」は、空間でのそれらの原子の配向だけが異なる個々の分子のすべての異性体の一般用語である。立体異性体は、鏡像異性体及び他の鏡像ではない２つ以上のキラル中心を有する化合物の異性体（ジアステレオマー）を含む。
【００５６】
本明細書で用いる場合、用語「キラル中心」又は「不斉中心」は、４つの異なる基が結合している炭素原子を指す。
【００５７】
用語「鏡像異性体」は、その鏡像上の、重ね合わすことができず、したがって光学的に活性である分子を指し、そこで、鏡像異性体は偏光面を一方向に回転させ、その鏡像は偏光面を反対方向に回転させる。
【００５８】
用語「ラセミ」は、鏡像異性体の等分の混合物を指し、これは光学的に不活性である。
【００５９】
開示された化合物のいずれも、薬学的に許容される塩に変換することができる。薬学的に許容される塩は、それが非毒性である限り特に限定されない。無機又は有機の塩基との塩の非限定的な例には、アルカリ金属塩（たとえばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（たとえばカルシウム塩、マグネシウム塩など）、アンモニウム塩、アミン塩（たとえばトリエチルアミン塩）などが含まれる。無機酸（たとえば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など）に由来する酸付加塩、及び有機酸（たとえば酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸など）に由来する塩の非限定的な例。
【００６０】
開示された化合物のいずれも、後述の医薬組成物のためのプロドラッグとして用いることができる。本明細書で用いる場合、用語「プロドラッグ」は、投与後に、たとえば代謝されることによってｉｎ  ｖｉｖｏで活性薬剤に変換することができる任意の化合物を指す。
【００６１】
式（Ｉ）を有する化合物の非限定的な例には、表３に掲載されるスタウロスポリン（ＳＴＳ）、ＰＫＣ４１２、Ｋ２５２ａ、ＵＣＮ−０１、ＣＥＰ−７０１、及びＳＢ−２１８０７８が含まれる。
【表３−１】
0006393682.tif 000011
【表３−２】
0006393682.tif 000012
【表３−３】
0006393682.tif 000013
【００６２】
ＨＤＡＣ４  ｄｓＲＮＡ及び式（Ｉ）の化合物の投与は、併用(concomitant)、同時又は逐次であってよい。
【００６３】
ＨＤＡＣ４特異的ｄｓＲＮＡの送達は、基本的に異なる２つの方法：１）当該オリゴヌクレオチドをコードし、発現構築物に配設される核酸配列の内因性転写、又は２）当該オリゴヌクレオチドの外来性送達で達成することができる。
【００６４】
内因性転写のために、当技術分野で公知の方法を用いて、ＨＤＡＣ４特異的ｄｓＲＮＡを好適な発現系に挿入することができる。そのような発現系の非限定的な例には、当技術分野で公知の１つ又は複数の誘導可能なプロモーターが有し又は有しない、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、他のウイルスベクター、発現カセット、及びプラスミド、たとえばペグ化された免疫リポソーム（ＰＩＬ）にカプセル化されたものが含まれる。ｄｓＲＮＡ鎖は両方とも、同じ若しくは別々のプロモーターから単一の発現構築物で発現させてもよく、又は、これら鎖を別々の発現構築物で発現させてもよい。
【００６５】
前述の発現系は、ＨＤＡＣ４サイレンシング人工ｍｉＲＮＡ前駆体及びｓｈＲＮＡの送達のために用いることもできる。
【００６６】
一般的に、発現構築物は、ヒト又は動物対象（たとえばイヌ対象）への投与前に、医薬組成物に製剤化される。投与は、全身及び局所の送達を含む、当技術分野で公知の任意の好適な方法によって実施することができる。製剤は、当業者に知られているように、意図された投与経路次第である。例として、発現構築物は薬学的に許容される担体若しくは希釈剤で送達することができ、又は、好適な徐放性組成物に包埋することができる。場合によっては、医薬組成物は、発現構築物を生成する１つ又は複数の細胞を含有することができる。ＲＮＡｉ送達のために細菌を用いることもできる。たとえば、組換えで遺伝子操作された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達後に哺乳動物細胞に入り、ｓｈＲＮＡを移送することができる。関連したアプローチは、たとえばサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来するミニ細胞を用いることである。
【００６７】
外来性送達のためには、ｄｓＲＮＡ分子は一般的に、リポソーム若しくは脂質をベースとした担体、コレステロールコンジュゲート、又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体形成させる。有望な新しいアプローチは、ｄｓＲＮＡを安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）と複合体を形成させることである。外来性送達のための好適な投与経路には、前記複合体形成の有無にかかわらず、当業者に公知の非経口送達（たとえば静脈内注射）、腸内送達（たとえば経口）、限局投与、局所投与（たとえば皮膚又は経皮）が含まれるが、これらに限定されない。通常、腫瘍の外科的切除が第一次臨床介入であるので、ｄｓＲＮＡは切除された腫瘍腔へ直接投与してもよい。
【００６８】
式（Ｉ）の化学療法剤は、それらに限定されないが、ＨＤＡＣ４特異的ｄｓＲＮＡの投与のために掲載されるものを含む当技術分野で公知の任意の好適な経路によって、ヒト又は動物対象に投与することができる。
【００６９】
本併用療法では、ｄｓＲＮＡ分子及び式（Ｉ）の化合物は、同じ又は別々の医薬組成物に製剤化することができる。別々の医薬組成物が用いられる場合は、投与は、併用（concomitant）、同時又は逐次であってよい。ｄｓＲＮＡ分子及び式（Ｉ）の化合物のための製剤及び／又は投与経路は、互いに独立して選択することができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つ又は複数の異なるＨＤＡＣ４サイレンシングｄｓＲＮＡ及び／又は式（Ｉ）の１つ又は複数の化学療法剤を含むことができる。
【００７０】
医薬組成物は、投与に好適な任意の適切な薬理学的担体で投与することができる。それらは、ヒト又は動物の患者でがんなどの過剰増殖性疾患の予防、緩和、防止又は治癒をもたらす任意の形態で投与することができる。
【００７１】
非経口投与又は局所投与のために、ｄｓＲＮＡ及び／又は式（Ｉ）の化合物は、たとえば、溶液、懸濁液又は乳液として製剤化することができる。必要に応じて、製剤は、水性若しくは非水性の溶媒、共溶媒、可溶化剤、分散若しくは湿潤剤、懸濁剤及び／又は粘度剤を含むことができる。非水性溶媒の非限定的な例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、及び注射可能な有機エステルである。水性担体は、たとえば、水、水−アルコール溶液であり、これには生理食塩水及び緩衝医療用非経口ビヒクル（塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖溶液、ブドウ糖＋塩化ナトリウム溶液、ラクトース含有リンガー溶液、又は固定油を含む）が含まれる。静脈内ビヒクルの非限定的な例は、体液及び栄養補液、電解質補液、たとえば、リンゲルのブドウ糖溶液に基づくものなどが含まれる。水性組成物は、目標のｐＨ範囲に応じて好適な緩衝剤、たとえばリン酸ナトリウム及びカリウム、クエン酸塩、酢酸塩、炭酸塩又はグリシン緩衝液を含むことができる。張性調整剤としての塩化ナトリウムの使用も有益である。組成物は、他の賦形剤、たとえば安定化剤又は保存料も含むことができる。有益な安定化剤には、界面活性剤（ポリソルベート２０＆８０、ポロキサマー４０７）、ポリマー（ポリエチレングリコール、ポビドン）、炭水化物（スクロース、マンニトール、グルコース、ラクトース）、アルコール（ソルビトール 、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール）、好適なタンパク質（アルブミン）、好適なアミノ酸（グリシン、グルタミン酸）、脂肪酸（エタノールアミン）、抗酸化剤（アスコルビン酸、システインなど）、キレート化剤（ＥＤＴＡ塩、ヒスチジン、アスパラギン酸）又は金属イオン（Ｃａ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｍｎ）が含まれる。有益な保存剤には、ベンジルアルコール、クロルブタノール、塩化ベンザルコニウム、及びおそらくパラベンがある。
【００７２】
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、散剤及び顆粒剤が含まれるが、これらに限定されない。そのような固体剤形では、ｄｓＲＮＡ及び／又は式（Ｉ）の化合物は、スクロース、ラクトース又はデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合されてよい。そのような剤形は、慣例通り、医薬用補助物質、たとえばステアリン酸潤滑剤又は香味剤（ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）などを含むこともできる。固体の経口製剤は、有効成分の放出を調節する腸溶性又は他のコーティングで調製することもできる。
【００７３】
経口投与のための液体剤形の非限定的な例には、当技術分野で一般に用いられる、水及びアルコールなどの不活性の非毒性希釈剤を含有する、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤が含まれる。そのような組成物は、湿潤剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、甘味剤及び香味剤などの補助薬を含むこともできる。
【００７４】
医薬組成物は、要求に応じて再構成される濃縮形態又は粉末の形態で提供することができる。凍結乾燥する場合には、ポリマー（ポビドン、ポリエチレングリコール、デキストラン）、糖（スクロース、グルコース、ラクトース）、アミノ酸（グリシン、アルギニン、グルタミン酸）及びアルブミンを含む、特定の凍結保存防止剤が好ましい。再構成のための溶液がパッケージに添付される場合は、それは、たとえば注射用の滅菌された水若しくは塩化ナトリウム溶液、又はデキストロース若しくはグルコース溶液からなることができる。
【００７５】
本医薬製剤を製剤化するための手段及び方法は当業者に公知であり、それ自体公知である方法、たとえば、従来の混合、造粒、溶解、凍結乾燥又は類似のプロセスによって製造することができる。
【００７６】
本併用療法は、それらに限定されないが、神経膠腫、星状細胞腫、及びグリア芽細胞腫を含む、ヒト又は動物の脳がんを処置するために用いることができる。
【００７７】
本明細書で用いる場合、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患の完全な治癒だけでなく、疾患又はそれに関連する症状の防止、軽減及び改善も指す。
【００７８】
ｄｓＲＮＡと式（Ｉ）の化合物との組合せの「効果的な量」とは、腫瘍の有害作用が最低限で改善される量を意味する。本併用療法の投与のための量及びレジメンは、癌関連の障害を処置する臨床分野の当業者なら容易に決定することができる。一般に、本併用療法の投薬量は、処置される患者の年齢、性別及び健康状態；もしあれば併行処置の種類；処置の頻度及び所望の効果の性質；組織傷害の程度；症状の継続期間；並びに個々の医師によって調整される他の変数（ｖａｒｉａｂｌｅｓ）などの考慮事項によって決まる。所望の結果を得るために、所望の用量を１回又は複数回の適用で投与することができる。本実施形態による医薬組成物は、単位剤形で提供することができる。
【００７９】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約０．０１μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約１．０μｇ／ｋｇから約１０μｇ／ｋｇの投薬量範囲内の有効量で投与することができる。ｄｓＲＮＡは１日単回用量で投与してもよく、又は１日当たりの総投薬量を、たとえば１日に２回、３回若しくは４回の分割用量で投与してもよい。
【００８０】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、約０．１μｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇ、又は約１．０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの投薬量範囲内の有効量で投与することができる。式（Ｉ）の化合物は１日単回用量で投与してもよく、又は１日当たりの総投薬量を、たとえば１日に２回、３回若しくは４回の分割用量で投与してもよい。投薬スケジュールは、ｄｓＲＮＡの投薬スケジュールと独立して選択することができる。
【００８１】
技術が進歩するに従って、発明の概念を様々な方法で実施することができることは、当業者にとって明らかである。発明及びその実施形態は、後述する実施例に限定されず、特許請求の範囲の範囲内で異なっていてもよい。
【００８２】
技術が進歩するに従って、発明の概念を様々な方法で実施することができることは、当業者にとって明らかである。発明及びその実施形態は、後述する実施例に限定されず、特許請求の範囲の範囲内で異なっていてもよい。
【実施例】
【００８３】
材料及び方法
真核生物の細胞培養及び小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクション：本試験のために、Ｔ９８Ｇヒトグリア芽細胞腫細胞系を使用した。３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気内で、１０％熱不活性化ＦＣＳ及びペニシリン（１００単位／ｍＬ）−ストレプトマイシン（１００Ａｇ／ｍＬ）を加えたイーグル（Ｅａｇｌｅ）のＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で細胞を培養した。製造業者の使用説明書に従って、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ）トランスフェクションを実施した。トランスフェクションは、フォワードトランスフェクションプロトコルを用いて実施した。以下のｓｉＲＮＡ配列を使用した：スクランブルされた（５’−ＧＵＡ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＣＧＧ  Ｃ−３’；配列番号１７１）、ＨＤＡＣ４（５’−ＵＣＡ  ＵＡＣ  ＡＣＧ  ＡＧＧ  ＣＣＵ  ＧＵＣ  ＧＵＵ−３’；配列番号２）、ＨＤＡＣ４．２（５’−ＡＡＡ  ＵＵＡ  ＣＧＧ  ＵＣＣ  ＡＧＧ  ＣＵＡ  ＡＵＵ−３’；配列番号５）。
【００８４】
化学的阻害剤及び薬剤：ＰＫＣ４１２をＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから、ＧＯ６９７６をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。スタウロスポリン（ＳＴＳ）、Ｋ２５２ａ、ＣＥＰ−７０１、ＵＣＮ−０１をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、アルシリアフラビン−Ａ（Ａｒｃｙｒｉａｆｌａｖｉｎ−Ａ）、Ｋ２５２ｃ及びＳＢ２１８０７８をＴｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから、レベッカマイシン（Ｒｅｂｅｃｃａｍｙｃｉｎ）をＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから、エンザスタウリン（Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ）をＬＣ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。すべての化学物質は、ＤＭＳＯで５又は１０ｍＭストック溶液として再構成し、−２０℃で冷凍保存した。
【００８５】
ウェスタンブロット法及び抗体：培養及び処理された細胞を２×ＳＤＳ試料緩衝液／Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に溶解し、沸騰させ、１０％アクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。膜をブロックし、５％ミルク−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で一次抗体の必要な希釈溶液及び二次抗体の１：５０００希釈溶液と一緒に必要な時間インキュベートし、増強化学発光（ＥＣＬ）によって現像した。抗ＨＤＡＣ４（クローンＨ−９２）（１：１０００希釈溶液）及び抗アクチン（クローンＡＣ−４０）（１：１０，０００希釈溶液）抗体を、それぞれＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。フィルムの定量分析は、ＭＣＩＤ５＋画像アナライザーを用いて実施した。
【００８６】
サブＧ０／Ｇ１画分評価によるアポトーシスアッセイ：ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色された断片化核を含有するサブＧ０／Ｇ１画分の百分率を、アポトーシス細胞の目安とした。３．５〜４×１０４個の細胞を２４ウェルプレートに蒔き、ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトさせ、次に新鮮な培地で指示された濃度の試験化合物で処理した。２４時間の処理の後、浮遊細胞と付着細胞の両方を遠心分離によって収集した。細胞ペレットは、ＰＢＳに４０ｍＭのクエン酸三ナトリウム（Ｔｒｉ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）（Ｍｅｒｃｋ）、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する、４００μｌの低張ＰＩ緩衝液に再懸濁させ、暗所で１０分間室温でインキュベートした。ＰＩで染色した核のフローサイトメトリー分析を実施し、記録したデータは、ＦＡＣＳｃａｎのフローサイトメーター及びソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をそれぞれ用いて分析した。
【００８７】
コロニー形成アッセイ：６ウェルプレートに超低密度（４〜６×１０３）で蒔いた細胞を、それらが小さなコロニーを形成するまで約７日間増殖させた。次に製造業者の使用説明書に従って、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、これらの細胞をスクランブルｓｉＲＮＡ又はＨＤＡＣ４  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトさせた。４８時間後、指示された濃度の化学薬剤でさらに４８時間処理をした。細胞コロニーをＰＢＳで洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、各々室温で１５分間０．２％クリスタルバイオレット溶液（１０％エタノールで作製）で染色した。過剰な染色剤は、ＰＢＳによる反復洗浄によって除去した。プレートを乾燥し、Ｅｐｓｏｎ  ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ  Ｖ７００スキャナで撮影し、ＩｍａｇｅＪで分析した。
【００８８】
統計分析：２群のデータの平均値間の差の有意水準を、当該試料平均間で、等しい分散を仮定する独立スチューデントｔ検定を用いて評価した。すべてのｐ値は両側性であった。確率値ｐ＜０．０５のパラメーターは統計的に有意なものとして表され、ｐ＜０．００１は非常に有意な差として表された。
【００８９】
結果
がん細胞の生存及び異なる化学薬剤への感受性に及ぼすＨＤＡＣ４阻害の影響を研究するために、まずは、ヒトグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞を、スクランブルｓｉＲＮＡ（配列番号１７１に表される非標的ｓｉＲＮＡ）又はＨＤＡＣ４特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号２に表される）で７２時間、一時的にトランスフェクトさせた。ＨＤＡＣ４特異的ｓｉＲＮＡによる有効なタンパク質の下方制御を、免疫ブロット法によって示した（図１Ａ）。
【００９０】
正常又は低減されたレベルのＨＤＡＣ４を含有するＴ９８Ｇ細胞（スクランブルｓｉＲＮＡ又はＨＤＡＣ４  ｓｉＲＮＡでそれぞれトランスフェクトさせた細胞）を、スタウロスポリン（ＳＴＳ）、並びに、ＰＫＣ４１３、Ｋ２５２ａ、ＵＣＮ−０１、ＣＥＰ−７０１、ＳＢ−２１８０７８、ＧＯ−６９７６、エンザスタウリン、Ｋ２５２ｃ、アルシリアフラビン  Ａ及びレベッカマイシンを含むＳＴＳと構造的に関連のある誘導体で処理した。処理はトランスフェクションの４８時間後に与えた。２４時間の薬剤処理の後、細胞を低張緩衝液に溶解し、それらの核をヨウ化プロピジウムを用いて染色した。染色された細胞の溶解産物を、断片化核のサブＧ０／Ｇ１画分を評価するために、フローサイメトリー（ＦＡＣＳ）によって分析した（図１Ｂ）。核の凝縮及び断片化はアポトーシスの重要な生化学的特徴であり、サブＧ０／Ｇ１分析はアポトーシスの検出のために広く使われている（Ａｆａｎａｓ’ｅｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９８６、１９４（２）：３４７〜５０；  Ｐｒｏｓｐｅｒｉら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９１、１２（４）：３２３〜３２９）。このスクリーニングによって、ＨＤＡＣ４  ｓｉＲＮＡを併用した場合、グリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞の非常に高いアポトーシスを促す５つの強力な細胞死促進薬剤を同定した。
【００９１】
次に、選択された強力な薬剤の有効性を、非腫瘍形成性（ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ）Ｔ９８Ｇ及び高度腫瘍形成性（ｈｉｇｈｌｙ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ）Ｕ８７ＭＧ−ルシフェラーゼ（ルシフェラーゼを発現するＵ８７ＭＧ細胞）グリア芽細胞腫細胞系でのコロニー形成アッセイによって試験した。この実験のために、これらの細胞を小さなコロニーの形成まで低密度において６ウェルプレートで増殖させ、それらの細胞は、次にスクランブルｓｉＲＮＡ又はＨＤＡＣ４特異的ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトさせ、続いて指示された濃度のＳＴＳ、ＰＫＣ４１２、Ｋ２５２ａ、ＵＣＮ−０１及びＣＥＰ−７０１でさらに４８時間処理した。コロニーをホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、画像をＩｍａｇｅ  Ｊで分析した。両細胞系で、ＨＤＡＣ４減少又は化学薬剤処理単独のいずれもコロニー形成能力を中程度低減したが、これら２つの処理の組合せはコロニー増殖の非常に高度の減少をもたらした（図２Ａ〜２Ｃ及び３Ａ〜３Ｃ）。ＳＴＳ誘導体ＣＥＰ−７０１を用いた処理はＵ８７ＭＧ細胞においてあまり有効ではないことが見出され（図３Ｃ）、Ｔ９８Ｇ細胞と比べて、これらの細胞における薬剤耐性の程度がより高い可能性が示唆された（図２Ｃ）。最も重要なことに、誘導体Ｋ２５２ａは、特にＨＤＡＣ４を減少させた両細胞系のコロニー増殖を非常に強力に低減させた。
【００９２】
ｓｉＲＮＡの標的外作用の可能性を排除するために、Ｔ９８Ｇ細胞での別のＨＤＡＣ４特異的ｓｉＲＮＡ（ＨＤＡＣ４．２；配列番号５）も試験した。このｓｉＲＮＡもまた、ウェスタンブロット法で示されるように、ＨＤＡＣ４タンパク質発現レベルを阻害し（図４Ａ）、ＳＴＳ処理におけるアポトーシスのレベルを増大させた（図４Ｂ）。これらの結果は、ＨＤＡＣ４．２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞をＳＴＳ並びにその有効な誘導体であるＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａで処理すると、コロニー増殖が減少したことによって裏付けられた（図４Ｃ）。
【図１Ａ】
0006393682.tif 000020
【図１Ｂ】
0006393682.tif 000021
【図２Ａ】
0006393682.tif 000022
【図２Ｂ】
0006393682.tif 000023
【図２Ｃ】
0006393682.tif 000024
【図３Ａ】
0006393682.tif 000025
【図３Ｂ】
0006393682.tif 000026
【図３Ｃ】
0006393682.tif 000027
【図４Ａ】
0006393682.tif 000028
【図４Ｂ】
0006393682.tif 000029
【図４Ｃ】
0006393682.tif 000030
【配列表】
0006393682000001.app