(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）またはノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）からなる群から選択される１以上の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１つの選択性薬剤と、
ｉｉ）前記神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現される標的分子であって、α−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである標的分子に、特異的に結合することができる少なくとも１つの核酸と
を含んでなるコンジュゲートであって、
前記α−シヌクレインｍＲＮＡに特異的に結合することができる核酸が、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４９９〜５１６番（配列番号５）、４４８〜４６５番（配列番号４）および５０２〜５１９番（配列番号６）に位置する領域からなる群から選択されるα−シンクレインｍＲＮＡ内の領域に標的化され、前記ナンバリングが、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する、前記コンジュゲート。
【請求項２】
前記核酸の標的分子への結合がα−シヌクレインの活性の阻害またはα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡのサイレンシングをもたらす、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記選択性薬剤が、三重再取り込み阻害剤、ノルアドレナリン・ドーパミン二重再取り込み阻害剤、セロトニン単独再取り込み阻害剤、ノルアドレナリン単独再取り込み阻害剤およびドーパミン単独再取り込み阻害剤からなる群から選択される、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記選択性薬剤が、下記の構造（Ｉ）：
【化１】
0006386461.tif 000048
［式中、
ｎまたはｍは、それぞれ、０以上６以下の値を有する整数であり；
ｐは、０以上４以下の値を有する整数であり；
Ｒ１は、水素；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ；−ＣＯ２ＲＡ；−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２または−Ｃ（ＲＡ）３であり；ここで、ＲＡの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ２は、水素；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＢ；−ＣＯ２ＲＢ；−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２または−Ｃ（ＲＢ）３であり；ここで、ＲＢの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ３は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＣ；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＣＯ２ＲＣ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＣ；−ＳＯＲＣ；ＳＯ２ＲＣ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；または−Ｃ（ＲＣ）３であり：ここで、ＲＣの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ４は、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；または置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリールであり；
Ｒ５は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＥ；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＣＯ２ＲＥ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＥ；−ＳＯＲＥ；ＳＯ２ＲＥ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；または−Ｃ（ＲＥ）３であり、ここで、ＲＥの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分である。］
およびその薬学上許容される形態を有する三重再取り込み阻害剤である、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記三重再取り込み阻害剤が、構造（ＩＩ）：
【化２】
0006386461.tif 000049
を有する、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現される標的分子に特異的に結合することができる核酸が、ギャップマー、二本鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ活性を有する二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチマイクロＲＮＡ、プレＭｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードするｍＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、リボザイムおよびアプタマーからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはギャップマーである、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記ギャップマーが、４つの２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドのブロックに隣接する１０個のデオキシヌクレオチドの中央ブロックを含んでなる、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記ギャップマーが、配列番号２、配列番号１および配列番号３からなる群から選択される配列からなる、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
構造（ＩＩＩ）：
【化３】
0006386461.tif 000050
［式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は請求項４に定義される通りであり、ｑは０以上２０以下の値を有する整数である。］
およびその薬学上許容される形態を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはギャップマーである、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記ギャップマーが、４つの２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドの２ブロックに隣接する１０個のデオキシヌクレオチドの中央ブロックを含んでなる、請求項１１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４９９〜５１６番（配列番号５）、４４８〜４６５番（配列番号４）および５０２〜５１９番（配列番号６）（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置する領域からなる群から選択されるα−シヌクレインｍＲＮＡ内の領域に標的化される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
前記核酸が、配列番号２、配列番号１または配列番号３からなる群から選択される配列からなる、請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
前記選択性薬剤が、構造（ＩＩ）：
【化４】
0006386461.tif 000051
を有する、請求項１４に定義されるコンジュゲート。
【請求項１６】
構造（ＩＶ）：
【化５】
0006386461.tif 000052
を有する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に定義されるコンジュゲートを含んでなる、医薬。
【請求項１８】
レビー小体の沈着に関連する疾患の治療または予防のための、請求項１〜１６のいずれか一項に定義されるコンジュゲートを含んでなる、医薬。
【請求項１９】
レビー小体の沈着に関連する疾患が、パーキンソン病、レビー小体型認知症および多系統萎縮症の群から選択される、請求項１８に記載の医薬。
【請求項２０】
前記コンジュゲートが脳室内または鼻腔内に投与される、請求項１８または１９に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象とする標的に特異的な核酸と、中枢神経系内の特定の細胞への前記核酸の送達を前記細胞の表面の神経伝達物質輸送体分子に対する親和性によって可能とする基とを含んでなるコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の使用は、細胞の状態を変化させるために効果的であることが証明されている。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の細胞への導入は、細胞中の特定の遺伝子の発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションし、それにより、１以上の生化学的経路に影響を与えるために使用することができる。細胞生理を変化させるために使用される核酸に基づく技術のうち、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、多様な生物体において遺伝子の発現を転写後レベルで調節することに関して与えられた総称である。ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシングは、低分子干渉または「ｓｉＲＮＡ」として知られている相同な短い（２１〜２３ｂｐ）ｄｓＲＮＡ断片を使用して達成され得る。長いｄｓＲＮＡが細胞系に導入されると、細胞酵素のダイサーがそれを切断して低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子とする。この低分子干渉ＲＮＡ分子は、現在ガイドＲＮＡと呼ばれている。ガイドＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(RNA-Induced-Silencing-Comple)（ＲＩＳＣ）を相同な標的ｍＲＮＡに誘導する。ひと度、それが相同なｍＲＮＡ配列とハイブリッド構造を形成すれば、ＲＩＳＣはｍＲＮＡを切断する。結果として、該ｍＲＮＡにコードされているタンパク質はもはや産生されず、それにより遺伝子のサイレンシングが起こる。ＲＮＡ干渉とは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを意味する。
【０００３】
しかしながら、脳の病態のためのＲＮＡｉに基づく治療アプローチの開発の主要な障害は、血液脳関門（ＢＢＢ）である。脳は、血液脳関門（ＢＢＢ）と血液脳脊髄液関門（ＢＣＳＦＢ）の２つの関門システムの存在によって潜在的有毒物質から保護されている。ＢＢＢは、その表面積がＢＣＳＦＢのおよそ５０００倍であることから、血清リガンドの取り込みの主要な経路であると考えられている。ＢＢＢを構成する脳の内皮は、ＣＮＳの多くの障害に対する潜在的薬物の使用の障害となる。原則として、小さな親油性分子だけがＢＢＢを、すなわち、循環系の血液から脳へと通過できる。大型または疎水性の高い多くの薬物が、ＣＮＳ障害の治療に関する動物試験で有望な結果を示している。
【０００４】
直接的脳投与の他、ＲＮＡ干渉分子の全身投与によるＣＮＳ内での遺伝子サイレンシングを達成するための種々の戦略が記載されている。例えば、Kumar et al. (Nature, 2007, 448:39-44)は、ｓｉＲＮＡとノナマーアルギニンを含んでなる狂犬病ウイルス糖タンパク質由来のペプチドのコンジュゲート、および静注後の脳におけるそれらの遺伝子発現サイレンシグ能を記載している。Xia et al. (Pharmaceutical Research, 2007, 24:2309-2316)は、全身送達後に中枢神経系において遺伝子発現サイレンシング能がある、ビオチン化ｉＲＮＡを含んでなるコンジュゲートおよびアビジン−抗トランスフェリン受容体抗体を含んでなるコンジュゲートを記載している。ＷＯ２００９７９７９０は、ｓｉＲＮＡとＡｎｇｉｏｐｅｐとして総称して知られる一連のペプチドを含んでなるコンジュゲートを記載しており、これらは低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）を用いた受容体媒介トランスサイトーシスにより血液脳関門を通過することができ、かつ、前記ペプチドを含んでなるコンジュゲートを全身投与した場合にＣＮＳへの送達を可能とする。ＷＯ２００７１０７７８９は、ＲＮＡ干渉誘導能があり、かつ、ＣＮＳ内に存在する標的に特異的な化合物の使用、および鼻腔内投与の使用によるＣＮＳへの送達を記載している。
【０００５】
シヌクレイン特異的サイレンシング剤およびコンジュゲートの細胞膜を経るまたは血液脳関門を経る移動を助ける種々の分子とのコンジュゲートを示唆している報告がいくつかある。例えば、ＷＯ２０１１０８７８０４は、α−シヌクレイン特異的ｓｉＲＮＡと、コンジュゲートの血液脳関門通過を可能とする狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ由来ペプチドとを含んでなるコンジュゲートを記載している。ＷＯ２０１２０２７７１３は、α−シヌクレイン特異的ｄｓＲＮＡと、脂質部分（コレステロール）、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分などの、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布または取り込みを増強する種々の部分のコンジュゲートを記載している。しかしながら、これらのコンジュゲートは総て、生体膜または生体関門を経た非特異的送達のために意図され、シヌクレインが発現される細胞に対する特異性を付与するものではない。
【０００６】
これらのシステムは総て、全身投与されたｓｉＲＮＡのＣＮＳへの送達を可能とするものの、脳内の特定の細胞種への送達はできない。ＷＯ２０１１１３１６９３は、標的核酸配列に相補的であり、かつ、その発現が標的核酸の発現を抑制または低減する核酸と、高い親和性で神経伝達物質輸送体と結合することができる選択性薬剤とを含んでなるコンジュゲートを開示している。これらのコンジュゲートは、対象とする細胞への特定の核酸の送達に有用である。
【０００７】
中枢神経系に対する特異性が知られているｓｉＲＮＡを送達することができれば、鬱病、認知障害、パーキンソン病、アルツハイマー病などを含む、所与の遺伝子の望ましくない活性／発現により引き起こされる疾患の治療に有用である。
【０００８】
パーキンソン病（ＰＤ）は、患者の運動技能、会話、およびその他の機能をしばしば損なう中枢神経系の変性障害である。パーキンソン病の症状は、黒質緻密部（ＳＮｐｃ）のドーパミン作動性細胞の著しい活性低下から起こる。これらのニューロンは、線条体に投射し、それらの欠損は運動を統制する大脳基底核内の神経回路の活性の変更、本質的には、直接的経路の阻害および間接的経路の興奮をもたらす。直接的経路は運動を促進し、間接的経路は運動を阻害するので、これらの細胞の欠損は運動低下性の運動障害をもたらす。ドーパミンの欠如は、運動野へ興奮性の投射を送る視床の前腹側核の阻害の増強をもたらし、これにより運動低下をもたらす。
【０００９】
ＰＤは、ＳＮｐｃにおけるドーパミンニューロンの進行性欠損およびレビー小体（ＬＢ）と呼ばれる細胞内封入体の存在を特徴とする。神経化学的に、ＰＤは、ミトコンドリア複合体Ｉの機能不全および酸化ストレス指数の増大が顕著である。ＰＤに関して、酸化ストレス、ニトロソ化ストレス、ミトコンドリア機能不全、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集、ならびにアポトーシスを含むいくつかの病理機序が提案されている。ＰＤは、ほとんどの場合で孤発性であるが、ＰＤ症例の一部は家族性であることが示されている。同定されている第１の家族性ＰＤ遺伝子はα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）であり、これは実際に総てのＰＤ患者においてＬＢの主成分である。α−シヌクレインの通常の機能は十分に理解されていない。α−シヌクレインは脂質と結合することができ、ニューロンにおいては、おそらく脂質ラフトを介して前シナプス小胞および原形質膜と会合している。沈着した病的形態のα−シヌクレインは凝集し、正常なタンパク質よりも低い溶解度を示す。３つの点突然変異が家族性ＰＤを引き起こすと記載されているが、ＳＮＣＡ遺伝子の倍加および三倍化がＰＤおよびレビー小体病の一因であることも報告されている。よって、配列変異体を伴わなくとも、α−シヌクレイン負荷はレビー小体病の原因となり得る。
【００１０】
α−シヌクレインは、ミトコンドリアに影響を及ぼし、おそらくアポトーシスを誘導する。実際に、α−シヌクレインと酸化傷害の間の密接な関係の証拠が蓄積しており、突然変異α−シヌクレインの過剰発現はニューロンを、酸化ストレスならびにドーパミンおよび複合体Ｉ阻害剤による傷害に対して感受性とし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてタンパク質のカルボニル化および脂質の過酸化の増大をもたらす。逆に、ミトコンドリア複合体Ｉの機能不全は孤発性ＰＤに関連付けられている。複合体Ｉ依存性酸化傷害および欠陥ミトコンドリア機能は、ＰＤにおけるニューロン変性および細胞死の主因である。このように損なわれたミトコンドリアの機能およびＲＯＳの生産は、ミトコンドリア内膜間腔のシトクロムｃプールレベルを増大し、細胞死アゴニストであるＢａｘが活性化された際のその急速な放出を可能とする。
【００１１】
要約すると、ＰＤの筋書きは、一方でα−シヌクレイン蓄積を増大し、他方でＢａｘを介した細胞死を活性化させるＲＯＳ生産の増大を伴う、ニューロンミトコンドリアの機能不全の状態であるといえる。さらに、α−シヌクレイン蓄積は、続いて細胞のＲＯＳ生産およびニューロン変性の誘導を増大する。
【００１２】
最も広く使用されているＰＤの治療は、種々の形態のＬ−ＤＯＰＡである。しかしながら、ドーパミンニューロンに入るのはＬ−ＤＯＰＡの１〜５％に過ぎない。残りのＬ−ＤＯＰＡは多くの場合、他所でドーパミンへと代謝され、多様な副作用を引き起こす。カルビドパおよびベンセラジドのようなドーパデカルボキシラーゼ阻害剤もまた、それらがＬ−ＤＯＰＡがドーパミンニューロンに達するまでその代謝を妨げる助けをすることからＰＤの治療に使用され、一般に、カルビドパ／レボドパおよびベンセラジド／レボドパの合剤として与えられている。さらに、ドーパミンアゴニストは大きな有効性はないが、一部のドーパミン受容体を刺激することにより作用する。しかしながら、それらはドーパミン受容体の段階的な低感受性化を招き、それによりやがて症状が増長される。
【００１３】
アンチセンスアプローチも有用である可能性があり、ラットおよびマウスの脳において機能することが報告されている。このアプローチは、マウスにおいて明らかなように、ヒトのＣＮＳ機能にα−シヌクレインは実は重要でないという概念に基づくものであるが、おそらくタンパク質レベルの小さな低下であってもＰＤ進行の低下に十分であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、ＰＤ治療薬の開発においてなされた進展にもかかわらず、黒質緻密部におけるドーパミン作動性細胞の活性低下を特異的に防ぐことができる別の化合物の必要性がなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の発明者らは、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡ配列内に、サイレンシング分子を用いて標的化した際にα−シヌクレインｍＲＮＡの切断をもたらす特定の種々の領域を同定した。これは、ＲＮアーゼ−Ｈを介したアッセイでアンチセンスオリゴヌクレオチドを調べること、およびα−シヌクレインｍＲＮＡのダウンレギュレーションを調べることによって示された。さらに、ギャップマー型の好ましいサイレンシング核酸（ｃｕｃｃＣＴＣＣＡＣＴＧＴＣｕｕｃｕ、配列番号２）を三重遮断薬インダトラリンとカップリングした。本発明者らは、鼻腔内投与した場合にインダトラリンが、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体を発現する細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的化できること、およびインダトラリンがドーパミン輸送体（ＤＡＴ）を発現する細胞を含有する脳領域（例えば、黒質）、ノルエピネフリン輸送体ＮＥＴを発現する細胞を含有する脳領域（例えば、青斑核）およびセロトニン輸送体ＳＥＲＴを発現する細胞を含有する脳領域（例えば、縫線核および背側縫線）に蛍光団を標的化できることを示した。さらに、本発明者らはまた、インダトラリンと好ましい候補ギャップマーを含んでなるコンジュゲートの鼻腔内投与がｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより決定されるシヌクレインｍＲＮＡレベルの低下をもたらすことも示した。
【００１６】
本発明によるサイレンシング分子はいくつかの利点を有する。第一に、本サイレンシグ分子は、サイレンシグされるタンパク質が発現される細胞に特異的に標的化され、望まない場所での、そのタンパク質のサイレンシングによる副作用を回避する。第二に、本発明によるサイレンシング分子は、神経伝達物質輸送体を用いて細胞膜を経て輸送される。
【００１７】
よって、第１の態様において、本発明は、
ｉ）ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）またはノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）からなる群から選択される１以上の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１つの選択性薬剤と、
ｉｉ）神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現される標的分子であって、α−シヌクレインまたはα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである標的分子に、特異的に結合することができる少なくとも１つの核酸と
を含んでなるコンジュゲートに関する。
【００１８】
第２の態様において、本発明は、医薬（medicine）において使用するための本発明によるコンジュゲートに関する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、レビー小体の沈着に関連する疾患の治療または予防において使用するための本発明によるコンジュゲートに関する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、構造（ＩＩＩ）：
【化１】
0006386461.tif 000002
［式中、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は下記に定義される通りであり、オリゴヌクレオチドは、標的分子に特異的に結合することができる核酸であり、該標的分子はα−シヌクレインまたはα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである。］
を有するコンジュゲートの合成方法に関し、前記方法は、構造（Ｖ）：
【化２】
0006386461.tif 000003
を有する化合物を、式（ＶＩ）：
【化３】
0006386461.tif 000004
を有するカルボキシ修飾オリゴヌクレオチドと反応させることを含んでなる。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドが標的分子に特異的に結合することができる核酸であり、該標的分子がα−シヌクレインまたはα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである、構造（ＶＩ）を有する化合物に関する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、
ｉ）ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）またはノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）からなる群から選択される１以上の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１つの選択性薬剤と、
ｉｉ）撮像剤（imaging agent）と
を含んでなるコンジュゲートに関する。
【００２３】
最後の態様において、本発明は、神経伝達物質輸送体を発現する細胞を撮像するための方法であって、前記細胞を本発明によるコンジュゲートと接触させることを含んでなり、前記コンジュゲートの選択性薬剤形成部分が前記細胞により発現される神経伝達物質輸送体に特異的に結合する方法に関する。
【００２４】
本発明のこれらのおよびその他の目的は、続いての詳細な説明の節にさらに記載されるが、それらは本発明を限定することを意図するものではない。特に断りのない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料は本発明の実施に使用可能である。本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含んでなる」およびその変形は、他の技術的特徴、付加物、成分、または工程を排除することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】オリゴ抗５ＨＴＩＡをインダトラリン(indrataline)とともに鼻腔内受容したマウスには、（Ｒ）−（＋）−８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）テトラリンヒドロブロミド（８−ＯＨ−ＤＰＡＴ、選択性５−ＨＴ１ＡＲアゴニスト）により誘発される低体温応答がないことを示す。マウスは、ｉ）ビヒクル（ＰＢＳ）、ｉｉ）インダトラリンナンセンスｓｉＲＮＡ（ＩＮＤ−ｎｓ−ｓｉＲＮＡ）、ｉｉｉ）３０μｇインダトラリン−１Ａ７７  ｓｉＲＮＡ（ＩＮＤ−１Ａ７７−ｓｉＲＮＡ、ｉｖ）３０μｇセルトラリン−１ａ７７  ｓｉＲＮＡ（ＳＥＲＴ−１ａ７７−ｓｉＲＮＡ）またはｖ）１００μｇインダトラリン−１Ａ７７−ｓｉＲＮＡ（ＩＮＤ−１Ａ７７  ｓｉＲＮＡ）を受容した。体温は８−ＯＨ−ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）５分前と１５、３０、６０および１２０分後に評価した。値は各群５個体のマウスからの平均体温変化±ＳＥＭとして示す。
【図２】候補分子選択のために行ったＲＮアーゼＨアッセイを示す。ヒトαシヌクレインｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写後、このｍＲＮＡを精製し、この酵素の可能性のあるインデューサーとしての個々の配列の活性を測定するためにＲＮアーゼＨアッセイを行った。要約すると、ｍＲＮＡ（１００ｎＭ）をバッファー中、５倍過剰の種々の分子（５００ｎＭ）とともに３７℃で７．５分間インキュベートした。その後、反応を停止させ、サンプルをアガロースゲルに流し、ＵＶで可視化した。配列はヒト、マウスまたは両方に特異的であった。選択配列（候補）は、それらのＲＮアーゼＨ活性誘導能、それらの種間相同性、ならびにβおよびγシヌクレインとの相同性の欠如に関して選択した。
【図３】本発明によるコンジュゲートのスキームを示す。これは、Ｃ１０リンカーにより連結された選択性薬剤としてのインダトラリンと１８塩基のギャップマーを含んでなる。
【図４】嗅球（ＢＯ）、黒質（ＳＮｃ／ＶＴＡ）、背側縫線（ＤＲ）および正中縫線（ＭｎＲ）における本発明による候補分子１２３２、１２３３および１２３４によるα−シヌクレインｍＲＮＡ発現の阻害を示す。
【図５】孤発性パーキンソン病（ＰＤ）を有する個体から得られた死後脳サンプルに由来する黒質（ＳＮ）中央部および外側部の分析を示す。ＰＤにおいて、ＳＮは広範な組織損傷を示す。結果は、ＰＤの病理に洞察を与える。
【図６】シンタフィリンｍＲＮＡのアラインメントを示す。ヒト、アカゲザル(macaca mulata)およびマウスシンタフィリンｍＲＮＡをＣＬＣ配列ビューア(wiewer）ソフトウエアでアラインし、それらと候補１２３４の間の推定相同性を見つけ出す解析を行った（ヒトのα−シヌクレインｍＲＮＡと共通する候補１２３４の１５ｎｔを四角で示す）。
【図７】本発明による好ましいコンジュゲート分子１２３３（ＮＬＦ−ＰＤ１２３３）のスキームを示す。
【図８Ａ】ウエスタンブロットによる黒質緻密部（ＳＮｃ）におけるα−シヌクレインタンパク質レベルを示す（Ａ）。β−アクチン（Ｂ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（Ｃ）に対して正規化したα−シヌクレインのＳＮｃ／ＶＴＡレベル、ならびにβ−アクチンに対して正規化したＴＨのレベル（Ｄ）。Ｎ＝８〜１０。有意性：ニューマン−コイルス多重比較検定（＊ＰＢＳに対してｐ＜０．０５）。領域抽出の対照として、β−アクチンに対するＴＨレベルが平均の２分の１未満であった動物は分析に含まなかった。
【図８Ｂ】ウエスタンブロットによる黒質緻密部（ＳＮｃ）におけるα−シヌクレインタンパク質レベルを示す（Ａ）。β−アクチン（Ｂ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（Ｃ）に対して正規化したα−シヌクレインのＳＮｃ／ＶＴＡレベル、ならびにβ−アクチンに対して正規化したＴＨのレベル（Ｄ）。Ｎ＝８〜１０。有意性：ニューマン−コイルス多重比較検定（＊ＰＢＳに対してｐ＜０．０５）。領域抽出の対照として、β−アクチンに対するＴＨレベルが平均の２分の１未満であった動物は分析に含まなかった。
【図８Ｃ】ウエスタンブロットによる黒質緻密部（ＳＮｃ）におけるα−シヌクレインタンパク質レベルを示す（Ａ）。β−アクチン（Ｂ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（Ｃ）に対して正規化したα−シヌクレインのＳＮｃ／ＶＴＡレベル、ならびにβ−アクチンに対して正規化したＴＨのレベル（Ｄ）。Ｎ＝８〜１０。有意性：ニューマン−コイルス多重比較検定（＊ＰＢＳに対してｐ＜０．０５）。領域抽出の対照として、β−アクチンに対するＴＨレベルが平均の２分の１未満であった動物は分析に含まなかった。
【図８Ｄ】ウエスタンブロットによる黒質緻密部（ＳＮｃ）におけるα−シヌクレインタンパク質レベルを示す（Ａ）。β−アクチン（Ｂ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（Ｃ）に対して正規化したα−シヌクレインのＳＮｃ／ＶＴＡレベル、ならびにβ−アクチンに対して正規化したＴＨのレベル（Ｄ）。Ｎ＝８〜１０。有意性：ニューマン−コイルス多重比較検定（＊ＰＢＳに対してｐ＜０．０５）。領域抽出の対照として、β−アクチンに対するＴＨレベルが平均の２分の１未満であった動物は分析に含まなかった。
【図９Ａ】ウエスタンブロットによる線条体におけるα−シヌクレインタンパク質レベルを示す（Ａ）。β−アクチン（Ｂ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（Ｃ）に対して正規化したα−シヌクレインの線条体レベル、ならびにβ−アクチンに対して正規化したＴＨのレベル（Ｄ）を示す。Ｎ＝８〜１０。有意性：ニューマン−コイルス多重比較検定（＊ＰＢＳに対してｐ＜０．０５）。領域抽出の対照として、β−アクチンに対するＴＨレベルが平均の２分の１未満であった動物は分析に含まなかった。
【図９Ｂ】ウエスタンブロットによる線条体におけるα−シヌクレインタンパク質レベルを示す（Ａ）。β−アクチン（Ｂ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（Ｃ）に対して正規化したα−シヌクレインの線条体レベル、ならびにβ−アクチンに対して正規化したＴＨのレベル（Ｄ）を示す。Ｎ＝８〜１０。有意性：ニューマン−コイルス多重比較検定（＊ＰＢＳに対してｐ＜０．０５）。領域抽出の対照として、β−アクチンに対するＴＨレベルが平均の２分の１未満であった動物は分析に含まなかった。
【図９Ｃ】ウエスタンブロットによる線条体におけるα−シヌクレインタンパク質レベルを示す（Ａ）。β−アクチン（Ｂ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（Ｃ）に対して正規化したα−シヌクレインの線条体レベル、ならびにβ−アクチンに対して正規化したＴＨのレベル（Ｄ）を示す。Ｎ＝８〜１０。有意性：ニューマン−コイルス多重比較検定（＊ＰＢＳに対してｐ＜０．０５）。領域抽出の対照として、β−アクチンに対するＴＨレベルが平均の２分の１未満であった動物は分析に含まなかった。
【図９Ｄ】ウエスタンブロットによる線条体におけるα−シヌクレインタンパク質レベルを示す（Ａ）。β−アクチン（Ｂ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（Ｃ）に対して正規化したα−シヌクレインの線条体レベル、ならびにβ−アクチンに対して正規化したＴＨのレベル（Ｄ）を示す。Ｎ＝８〜１０。有意性：ニューマン−コイルス多重比較検定（＊ＰＢＳに対してｐ＜０．０５）。領域抽出の対照として、β−アクチンに対するＴＨレベルが平均の２分の１未満であった動物は分析に含まなかった。
【図１０】マウスにおける非修飾１２３３（ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３）とその３’保護誘導体の血漿濃度を示す。
【図１１】サルにおける静脈内（ＩＶ）投与後の１２３３（ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３）の血中濃度を示す。データは平均値として表す。
【図１２】サルにおける鼻腔内（ＩＮ）投与後の１２３３（ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３）のＣＳＦ（脳脊髄液）中濃度および血中濃度を示す。データは平均値として表す。
【図１３】マウスにおける静脈内投与後の非修飾１２３３（ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３）の組織濃度を示す。
【図１４】マウスにおける静脈内投与後の非修飾１２３３（ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３）および代謝産物の組織濃度を示す。
【図１５】マウスにおける静脈内投与後の１２３３（ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３）の３’保護誘導体の組織濃度を示す。
【図１６】マウスにおける静脈内投与後の１２３３（ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３）の３’保護誘導体および代謝産物の組織濃度を示す。
【図１７】ビヒクル（ＰＢＳ）または１２３３（ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３、連続４日、１ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した動物における、ＨＰＬＣにより測定したベラトリジン誘発ドーパミン放出の微小透析ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを示す。
【図１８】ビヒクル（ＰＢＳ）または１２３３（ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３、連続４日、１ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した動物における、ＨＰＬＣにより測定した細胞外ドーパミンの微小透析ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明者らは、神経伝達物質輸送体に特異的に結合することができる分子に、より詳しくは前記輸送体の阻害剤に、核酸を共有結合させることにより、その神経伝達物質輸送体を発現する対象細胞に前記核酸を特異的に標的化できることを見出した。特に、著者らは、ＤＡＴ、ＳＥＲＴまたはＮＥＴ神経伝達物質輸送体に対する選択性薬剤とカップリングされた、α−シヌクレインｍＲＮＡの特定の領域を標的とする核酸が、α−シヌクレインｍＲＮＡの発現レベルを低減できることを示した。
【００２７】
Ａ．本発明のコンジュゲート
第１の態様において、本発明は、
ｉ）ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）またはノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）からなる群から選択される１以上の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１つの選択性薬剤と、
ｉｉ）神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現される標的分子であって、α−シヌクレインまたはα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである標的分子に、特異的に結合することができる少なくとも１つの核酸と
を含んでなるコンジュゲートに関する。
【００２８】
用語「コンジュゲート（conjugate）」は、本明細書で使用する場合、２つ以上の個々の化合物の共有結合から得られるいずれの化合物も意味する。本発明では、コンジュゲートは、共有結合されている選択性薬剤と核酸を含んでなる分子を意味し、前記の結合は直接的または架橋化合物を介したものである。
【００２９】
用語「共有結合（covalent coupling）」または「共有結合（covalent attachment）」は、核酸と選択性薬剤が相互に直接共有結合的に連結されているか、またはリンカー、または架橋、または１もしくは複数のスペーサー部分などの１または複数の介在部分によって相互に間接的に共有結合的に連結されていることを意味する。
【００３０】
Ａ．１．本発明のコンジュゲートの選択性薬剤
「１以上の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する選択性薬剤」という用語は、本明細書で使用する場合、神経伝達物質輸送体に結合するいずれの物質も意味する。この結合特異性が、前記選択性薬剤に結合された分子の、前記神経伝達物質輸送体を含有する細胞、組織または器官への送達を可能とする。このように、前記選択性薬剤を担持するコンジュゲートは、動物に投与した場合またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで種々のタイプの細胞の集団と接触させた場合に、前記細胞に特異的に指向される。
【００３１】
本明細書で使用する場合、第１の分子の第２の分子への特異的結合は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる様式での第１の分子の前記第２の分子への結合能を意味する。本発明による選択性薬剤は、標的（神経伝達物質輸送体）に対して少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍまたはそれを超えるＫｄを示し得る。
【００３２】
用語「神経伝達物質輸送体」は、本明細書で使用する場合、ニューロンの細胞膜を貫通し、その主要な機能がこれらの膜を経て神経伝達物質を運ぶことおよび細胞内の特定の場所へのそれらのさらなる輸送を指示することである、膜輸送タンパク質種に属すタンパク質を意味する。本発明の選択性薬剤により標的化され得る神経伝達物質輸送体としては、限定されるものではないが、ニューロンおよびグリア細胞の原形質膜に存在し、細胞外間隙から細胞内に神経伝達物質を送り込む取り込み担体が含まれる。このプロセスは、原形質膜内外のＮａ＋勾配、特にＮａ＋の共輸送によるものである。タンパク質の２つのファミリーが同定されている。１つのファミリーには、ＧＡＢＡ、モノアミン（例えば、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニン）、ならびにグリシンおよびプロリンなどのアミノ酸の輸送体が含まれる。共通の構造成分としては、１２の推定膜貫通α−ヘリックスドメイン、細胞質Ｎ末端およびＣ末端、ならびに膜貫通ドメイン３と４を隔てるグリコシル化された大きな細胞外ループが含まれる。この相同タンパク質のファミリーは、細胞内へのＮａ＋およびＣｌ−イオンと神経伝達物質の共輸送からそれらのエネルギーを引き出す（Ｎａ＋／Ｃｌ−神経伝達物質輸送体）。第２のファミリーには、グルタミン酸などの興奮性アミノ酸の輸送体が含まれる。共通の構造成分としては、６〜１０の推定膜貫通ドメイン、細胞質Ｎ末端およびＣ末端、ならびに細胞外ループにおけるグリコシル化が含まれる。これらの興奮性アミノ酸輸送体は、Ｃｌ−非依存的ではなく、細胞内Ｋ＋イオンを必要とし得る（Ｎａ＋／Ｋ＋神経伝達物質輸送体）(Liu, Y. et al. (1999) Trends Cell Biol. 9: 356-363)。
【００３３】
本発明の選択性薬剤により標的化され得る神経伝達物質輸送体としてはまた、細胞内小胞膜、一般には、シナプス小胞に存在する神経伝達物質輸送体も含まれ、この主要な機能は、シナプス伝達の際の小胞の内容物のエキソサイトーシス前に、細胞質から小胞へ神経伝達物質を集中させることである。小胞輸送は、Ｈ＋−ＡＴＰアーゼによって生じる小胞膜内外の電気化学的勾配を使用する。２つのタンパク質ファミリーが小胞への神経伝達物質の輸送に関与している。１つのファミリーは、主としてプロトン交換を用いて分泌小胞への輸送を駆動し、モノアミンおよびアセチルコリンの輸送体を含む。例えば、モノアミン輸送体は、２つの管腔プロトンを細胞質の伝達物質の各分子と交換する。第２のファミリーはギャバ輸送体を含み、シナプス小胞内部の正電荷に頼るものである。これら２つの小胞輸送体は互いに配列類似性を示さず、原形質膜担体の構造とは異なる構造を有する(Schloss, P. et al.(1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6: 595-599; Liu, Y. et al. (1999) Trends Cell Biol. 9: 356-363)。
【００３４】
好ましい実施形態では、選択性薬剤はペプチドでない。
【００３５】
本発明の選択性薬剤で標的化され得る神経伝達物質輸送体の特定の種類としては、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）およびノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）が含まれる。
【００３６】
用語「ドーパミン輸送体」または「ＤＡＴ」または「ＳＬＣ６Ａ３」とは、シナプス間隙から神経伝達物質ドーパミンを輸送し、それを周囲の細胞に沈着させ、このようにして神経伝達物質のシグナルを伝達する内在性膜タンパク質としての分子を意味する。ヒトＳＬＣ６Ａ３（溶質油層担体ファミリー６、神経伝達物質輸送体、ドーパミン、メンバー３）遺伝子はＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（２０１２年１０月７日バージョン）に受託番号ＮＧ＿０１５８８５．１で寄託され、ヒトＳＬＣ６Ａ３  ｍＲＮＡは受託番号ＮＭ＿００１０４４．４で寄託されている。ヒトドーパミン輸送体タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＮＰ＿００１０３５．１で寄託されている。
【００３７】
用語「セロトニン輸送体」または「ＳＥＲＴ」または「ＳＬＣ６Ａ４」、本明細書で使用する場合、神経伝達物質セロトニンをシナプス間隙からシナプス前ニューロンへ輸送する内在性膜タンパク質としてのポリペプチドを意味する。ヒトＳＬＣ６Ａ４（溶質輸送担体ファミリー４、神経伝達物質輸送体、セロトニン、メンバー４）遺伝子はＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（２０１２年１０月２１日バージョン）に受託番号ＮＧ＿０１１７４７．１で寄託され、ヒトＳＬＣ６Ａ４  ｍＲＮＡは受託番号ＮＭ＿００１０４５．４で寄託されている。ヒトセロトニン輸送体タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＮＰ＿００１０３６．１で寄託されている。ヒト、ラット、マウスおよびウシＳＥＲＴの配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにそれぞれ受託番号Ｐ３１６４５、Ｐ３１６５２、Ｑ６０８５７およびＱ９ＸＴ４９として提供されている。５−ＨＴ１ＡＲ  ｃＤＮＡを標的とする核酸の場合と同様に、それが対応するｍＲＮＡまたは前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベルに実質的な阻害をもたらす限り、ＳＥＲＴ  ｃＤＮＡのいずれの領域も標的化することができる。よって、好適なＳＥＲＴ特異的核酸は、前記細胞を供試核酸と接触させた後にＳＥＲＴを発現する細胞においてＳＥＲＴ  ｍＲＮＡまたはＳＥＲＴタンパク質のレベルを測定することによって上記のように同定することができる。
【００３８】
用語「ノルエピネフリン輸送体」または「ＮＥＴ」または「ＳＬＣ６Ａ２」は、シナプス間隙に放出されたノルエピネフリン(norepinephrinee)を再びシナプス前ニューロンに輸送する膜貫通タンパク質としての分子を意味する。ヒトＳＬＣ６Ａ２（溶質輸送担体ファミリー６、神経伝達物質輸送体、ノルアドレナリン、メンバー２）遺伝子は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（２０１２年１０月２１日バージョン）に受託番号ＮＧ＿０１６９６９．１で寄託されている。ヒトノルエピネフリン輸送体に関しては４つの転写産物がＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。ｍＲＮＡ転写変異体１（ｍＲＮＡ１）は、より長いアイソフォームまたはアイソフォーム１をコードするヒトノルエピネフリン輸送体の転写変異体である。このｍＲＮＡ１は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＮＭ＿００１１７２５０４．１で寄託されている。ｍＲＮＡ転写変異体２（ｍＲＮＡ２）は、変異体１に比べて、コード領域を含む代替の３’エキソンを有する転写変異体である。このｍＲＮＡ２は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＮＭ＿００１１７２５０１．１で寄託されている。ｍＲＮＡ写変異体３（ｍＲＮＡ３）は、変異体１に比べて、コード領域を含む代替の３’エキソンを有する転写変異体である。このｍＲＮＡ３は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＮＭ＿００１０４３．３で寄託されている。ｍＲＮＡ転写変異体４（ｍＲＮＡ４）は、変異体１に比べて、５’および３’コード領域を含む代替の５’および３’配列を有する転写変異体である。このｍＲＮＡ４は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＮＭ＿００１１７２５０２．１で寄託されている。４つのヒトタンパク質アイソフォームが、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＮＰ＿００１１６５９７５．１、ＮＰ＿００１１６５９７２．１、ＮＰ＿００１０３４．１およびＮＰ＿００１１６５９７３．１で寄託されている。
【００３９】
特定の実施形態では、選択性薬剤は、三重再取り込み阻害剤、ノルアドレナリン・ドーパミン二重再取り込み阻害剤、セロトニン単独再取り込み阻害剤、ノルアドレナリン単独再取り込み阻害剤およびドーパミン単独再取り込み阻害剤からなる群から選択される。
【００４０】
用語「三重再取り込み阻害剤」または「ＴＲＩ」は、セロトニン、ノルエピネフリンおよびドーパミン再取り込み阻害剤（ＳＮＤＲＩ）としても知られ、それぞれセロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）、ノルエピネフリン(norepinephrinee)輸送体（ＮＥＴ）、およびドーパミン輸送体（ＤＡＴ）の作用を遮断することによりモノアミン神経伝達物質であるセロトニン（５−ＨＴ）、ノルエピネフリン(norepinephrinee)（ノルアドレナリン、ＮＡ）およびドーパミン（ＤＡ）の再取り込み阻害剤として同時に作用する分子を意味する。これは続いて、これらの神経伝達物質の細胞外濃度の上昇、従って、セロトニン作動性、ノルアドレナリン作動性またはアドレナリン作動性、およびドーパミン作動性の神経伝達の増強をもたらす。特定の実施形態では、本発明の三重再取り込み阻害剤は、ドーパミン、セロトニン、ノルエピネフリン三重再取り込み阻害剤である。
【００４１】
用語「二重再取り込み阻害剤」は、２つの神経伝達物質輸送体の再取り込みを同時に阻害することができる分子を意味する。特定の実施形態では、本発明の二重再取り込み阻害剤は、ノルエピネフリン・ドーパミン二重再取り込み阻害剤である。
【００４２】
用語「単独再取り込み阻害剤」は、特定の神経伝達物質輸送体における再取り込みを阻害することができる分子を意味する。本発明の特定の実施形態では、単独再取り込み阻害剤は、ドーパミン単独再取り込み阻害剤である。
【００４３】
用語「ドーパミン再取り込み阻害剤」または「ＤＲＩ」は、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）の作用を遮断することにより神経伝達物質ドーパミンの再取り込み阻害剤として作用する。これは続いて、ドーパミンの細胞外濃度の上昇、従って、ドーパミン作動性の神経伝達の増強をもたらす。好適なＤＲＩとしては、限定されるものではないが、アミネプチン、ベンズアトロピン／ベンズトロピン、ブプロピオン、デクスメチルフェニデート、エスケタミン、エチベンザトロピン／エチブ(Ethybe)、ポナリド、フェンカンファミン、フェンカミン、ケタミン、レフェタミン、メジホキサミン、メソカーブ(Mesocarb)、メチルフェニデート、ネフォパム、ノミフェンシン、ピプラドロール、プロリンタン、ピロバレロン、チレタミンおよびトリペレナミンなどの医薬；アルトロパン、アンホネリン酸、ベノシクリジン、ブラソフェンシン、ブロマンタン、ＤＢＬ−５８３、ジクロロパン、ジクロフェンシン、ジエチシクリジン、ジフルオロピン、ガシクリジン、ＧＢＲ−１２，９３５、インダトラリン、イオフルパン、イオメトパン、マニファキシン、ラダファキシン、タメトラリン、テソフェンシン、トロパリルおよびバノキセリンなどの研究化学物質が挙げられる。好適なＤＲＩは、Kula et al., (Life Sciences 34: 2567-2575, 1984)により公開されている方法を用いて記載のように実施される、ラット線条体から調製されるシナプトソーム調製物によるドーパミンの高親和性取り込みの阻害における推定ＤＲＩの能力の決定などの当業者に公知のアッセイを用いて同定することができる。
【００４４】
用語「ノルエピネフリン(norepinephrinee)−ドーパミン再取り込み阻害剤」または「ＮＤＲＩ」は、本明細書で使用する場合、それぞれノルエピネフリン(norepinephrinee)輸送体（ＮＥＴ）およびドーパミン輸送体（ＤＡＴ）の作用を遮断することにより、神経伝達物質ノルエピネフリン(norepinephrinee)およびドーパミンの再取り込み阻害剤として作用する化合物を意味する。これは続いて、ノルエピネフリン(norepinephrinee)およびドーパミン両方の細胞外濃度の上昇、従って、アドレナリン作動性およびドーパミン作動性の神経伝達の増強をもたらす。本発明のコンジュゲートにおいて使用するための好適なＮＤＲＩとしては、限定されるものではないが、アミネプチン（Ｓｕｒｖｅｃｔｏｒ、Ｍａｎｅｏｎ、Ｄｉｒｅｃｔｉｎ）、ブプロピオン（Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ、Ｚｙｂａｎ）、デクスメチルフェニデート（Ｆｏｃａｌｉｎ）、フェンカンファミン（Ｇｌｕｃｏｅｎｅｒｇａｎ、Ｒｅａｃｔｉｖａｎ）、フェンカミン（Ａｌｔｉｍｉｎａ、Ｓｉｃｏｃｌｏｒ）、レフェタミン（Ｓａｎｔｅｎｏｌ）、メチルフェニデート（Ｒｉｔａｌｉｎ、Ｃｏｎｃｅｒｔａ）、ノミフェンシン（Ｍｅｒｉｔａｌ）、ピプラドロール（Ｍｅｒｅｔｒａｎ）、プロリンタン（Ｐｒｏｍｏｔｉｌ、Ｋａｔｏｖｉｔ）、ピロバレロン（Ｃｅｎｔｒｏｔｏｎ、Ｔｈｙｍｅｒｇｉｘ）、ネフォパム（Ａｃｕｐａｎ）、アドハイパーフォリン（セイヨウオトギリソウ(Hypericum perforatum)（セント・ジョーンズ・ワート）に見られる）、ハイパーフォリン（セイヨウオトギリソウ（セント・ジョーンズ・ワート）に見られる）、コカイン、デスオキシピプラドロール（２−ＤＰＭＰ）、ジフェニルプロリノール（Ｄ２ＰＭ）、メチレンジオキシピロバレロン（ＭＤＰＶ）、シロバミン、マニファキシン（ＧＷ−３２０，６５９）、ラダファキシン（ＧＷ−３５３，１６２）、タメトラリン（ＣＰ−２４，４４１）が挙げられる。
【００４５】
用語「セロトニン再取り込み阻害剤」または「ＳＲＩ」は、セロトニン取り込みを遮断することができる分子を意味し、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）（他の神経伝達物質に実質的に影響を及ぼさずにセロトニン取り込みを特異的に遮断する）ならびにセロトニン−ノルエピネフリン(norepinephrinee)再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）およびセロトニン−ノルエピネフリン(norepinephrinee)−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＳＮＤＲＩ）などの非選択的セロトニン再取り込み阻害剤の両方が含まれる。
【００４６】
用語「セロトニン選択的再取り込み阻害剤」または「ＳＳＲＩ」は、他の神経伝達物質再取り込みまたは輸送体系に実質的に影響を及ぼさないセロトニン(serotinine)再取り込みの選択的阻害剤を意味する。これらの化合物は、主としてシナプス前セロトニン作動性細胞に作用し、神経伝達物質セロトニンの細胞外レベルの上昇、それによるシナプス後受容体と結合するために利用可能なセロトニンのレベルの上昇、および脳におけるこのモノアミン作動性神経伝達物質の活性の欠損の復帰をもたらす。ＳＳＲＩの具体的非限定例としては、セルトラリン（ＣＡＳ  ７９６１７−９６−２）、セルトラリン構造類似体、フルオキセチン（ＣＡＳ  ５４９１０−８９−３）、フルボキサミン（ＣＡＳ  ５４７３９−１８−３）、パロキセチン（ＣＡＳ  ６１８６９−０８−７）、インダプリン（ＣＡＳ  ６３７５８−７９−２）、ジメルジン（ＣＡＳ  ５６７７５−８８−３）、シタロプラム（ＣＡＳ  ５９７２９−３３−８）およびエスシタプラム（ＣＡＳ  ２１９８６１−０８−２）が挙げられる。所与の化合物がＳＳＲＩとして作用しているかどうかを判定するためのアッセイは、例えば、本質的にKoe et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther., 1983, 226:686-700)に記載のように、セロトニンのｅｘ  ｖｉｖｏ取り込みを低下させ、静脈内［３Ｈ］ノルエピネフリン(norepinephrinee)のラット心臓取り込みに影響を及ぼさずにｐ−クロロアンフェタミンのセロトニン枯渇作用に拮抗する能力である。
【００４７】
用語「セロトニン−ノルエピネフリン(norepinephrinee)再取り込み阻害剤」または「ＳＮＲＩ」は、セロトニン輸送体を遮断することによりセロトニンの再取り込みを、そしてノルエピネフリン(norepinephrinee)輸送体を遮断することによりノルエピネフリン(norepinephrinee)の再取り込みを阻害することができる化合物系列を意味する。この系列には、ベンラファキシン（ＣＡＳ  ９３４１３−６９−５）、デスベンラファキシン（ＣＡＳ  ９３４１３−６２−８）、デュロキセチン（ＣＡＳ  １１６５３９−５９−４）、ミルナシプラン（ＣＡＳ  ９２６２３−８５−３）、シブトラミン（１０６６５０−５６−０）、トラマドール（ＣＡＳ  ２７２０３−９２−５）およびビシファジン（ＣＡＳ  ７１１９５−５７−８）などの化合物が含まれる。所与の化合物がＳＮＲＩとして作用しているかどうかを判定するためのアッセイは、例えば、本質的にBolden-Watson C, Richelson E. (Life Sci. 1993; 52(12):1023-9)に記載のように、脳のシナプトソームによるセロトニンおよびノルエピネフリン(norepinephrinee)の取り込みを低下させる能力である。ＳＮＲＩの特定のタイプは、三環を含んでなる一般分子構造を有するＳＮＲＩとしての三環系抗鬱薬である。三環系抗鬱薬の中でも、直鎖三環系、例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、ドキセピン、ケチプラミン、ミアンセリン、ドチエピン、アモキサピン、ジベンゼピン、メリトラセン、マプロチリン、フルペンチキソール、アザフェン、チアネプチンおよび類似の活性を示す関連化合物が優れている。アンギュラー型三環系としては、インドリリン、クロダゾン、ノミフェンシン、および関連化合物が含まれる。様々な他の構造的に多様な抗鬱薬、例えば、イプリンドール、ウェルブトリン、ニアラミド、ミルナシプラン、フェネルジンおよびトラニルシプラミンも同様の活性を生じることが示されている。それらは三環系抗鬱薬と機能的に等価であり、従って、本発明の範囲内に含まれる。よって、三環系抗鬱薬という用語は、本発明者により、広範なクラスの上記抗鬱薬を、共通の特性を有する関連化合物（それらは総て、抗鬱活性を有する）とともに包含することが意図され、これらには限定されるものではないが、アミトリプチリン、アミトリプチリンオキシド、カルバマゼピン、ブトリプチリン、クロミプラミン、デメキシプチリン、デシプラミン、ジベンゼピン、ジメタクリン、ドスレピン／ドチエピン、ドキセピン、イミプラミン、イミプラミンオキシド、イプリンドール、ロフェプラミン、メリトラセン、メタプラミン、ニトロキシアゼピン、ノルトリプチリン、ノキシプチリン、プレガバリン、プロピゼピン、プロトリプチリン、キヌプラミンおよびトリミプラミンなどの化合物が含まれる。
【００４８】
用語「ノルアドレナリン再取り込み阻害剤」、「ＮＲＩ」、「ＮＥＲＩ」、アドレナリン作動性再取り込み阻害剤」または「ＡＲＩ」は、ノルエピネフリン(norepinephrinee)輸送体（ＮＥＴ）の作用を遮断することによりノルアドレナリンおよびアドレナリンの再取り込みを遮断することができる化合物系列を意味する。この系列の化合物には、他のモノアミン輸送体に影響を及ぼさずにＮＥＴを排他的に遮断する選択的ＮＲＩ、ならびにノルエピネフリン(norepinephrinee)輸送体およびセロトニン(serotinine)輸送体（上記参照）を遮断するＳＮＲＩ、ノルエピネフリン(norepinephrinee)およびドーパミン輸送体（下記参照）を遮断するノルエピネフリン(norepinephrinee)−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）、三環系抗鬱薬および四環系抗鬱薬（上記参照）などの非選択的ＮＲＩが含まれる。本発明に十分な(adequalte)、好適な選択的ＮＲＩとしては、限定されるものではないが、アトモキセチン／トモキセチン（ＳｔｒａｔｔｅｒａまたはＣＡＳ  ８３０１５−２６−３）、マジンドール（Ｍａｚａｎｏｒ、ＳａｎｏｒｅｘまたはＣＡＳ  ２２２３２−７１−９）、レボキセチン（Ｅｄｒｏｎａｘ、ＶｅｓｔｒａまたはＣＡＳ  ９８８１９−７６−２）およびビロキサジン（ＶｉｖａｌａｎまたはＣＡＳ  ４６８１７−９１−８）が挙げられる。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、三重再取り込み(reupatake)阻害剤である選択性薬剤を含んでなる。本発明の好ましい実施形態では、選択性薬剤は、下記の構造（Ｉ）：
【化４】
0006386461.tif 000005
［式中、
ｎまたはｍは、それぞれ０以上６以下の値を有する整数であり；
ｐは、０以上４以下の値を有する整数であり；
Ｒ１は、水素；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ；−ＣＯ２ＲＡ；−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２または−Ｃ（ＲＡ）３であり；ここで、ＲＡの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ２は、水素；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＢ；−ＣＯ２ＲＢ；−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２または−Ｃ（ＲＢ）３であり；ここで、ＲＢの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ３は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＣ；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＣＯ２ＲＣ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＣ；−ＳＯＲＣ；ＳＯ２ＲＣ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；または−Ｃ（ＲＣ）３であり：ここで、ＲＣの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ４は、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；または置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリールであり；
Ｒ５は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＥ；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＣＯ２ＲＥ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＥ；−ＳＯＲＥ；ＳＯ２ＲＥ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；または−Ｃ（ＲＥ）３であり、ここで、ＲＥの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分である。］
およびその薬学上許容される形態を有する三重再取り込み阻害剤である。
【００５０】
本発明のより好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートの選択性薬剤は、下記の構造（ＩＩ）：
【化５】
0006386461.tif 000006
を有する三重再取り込み阻害剤であり、この構造（ＩＩ）を有する選択性薬剤は、（１Ｒ，３Ｓ）−３−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−アミンまたはインダトラリンとしても知られる。
【００５１】
Ａ．２．本発明のコンジュゲートの核酸
本発明によるコンジュゲートの第２の成分は、前記神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現される標的分子に特異的に結合することができる核酸であり、前記標的分子は、α−シヌクレインまたはα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである。
【００５２】
用語「α−シヌクレイン」は、本明細書で使用する場合、交換可能なアポリポタンパク質のクラスＡ２脂質結合ドメインと類似性を有する保存性の高いα−ヘリックス脂質結合モチーフを含有し、かつ、パーキンソン病、アルツハイマー病およびレビー小体病などのある種の神経系疾患に見られるレビー小体と呼ばれる細胞内凝集物を形成し得る、シヌクレインメンバーファミリー（α−シヌクレイン、β−シヌクレインおよびγ−シヌクレイン）のポリペプチドを意味する。
【００５３】
ヒト、ラット、マウスおよびウシα−シヌクレインの配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに、それぞれ受託番号Ｐ３７８４０、Ｐ３７３７７、Ｏ５５０４２およびＱ３Ｔ０Ｇ８として提供されている。５−ＨＴ１ＡＲ  ｃＤＮＡを標的とする核酸の場合と同様に、α−シヌクレイン特異的核酸は、上記のようないずれかの方法を用いて同定または選択することができ、対応するｍＲＮＡまたは前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベルに実質的阻害を誘導するそれらの能力に関して試験することができる。よって、好適なα−シヌクレイン特異的核酸は、上記のように、前記細胞を供試核酸と接触させた後にα−シヌクレインを発現する細胞においてα−シヌクレイン  ｍＲＮＡまたはα−シヌクレインタンパク質のレベルを測定することによって同定することができる。
【００５４】
一般に、本発明の核酸は、標的分子の機能を阻害すること、すなわち、α−シヌクレインを阻害することができる。よって、標的分子がα−シヌクレインｍＲＮＡであれば、核酸は、α−シヌクレインｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって作用し、前記ｍＲＮＡによりコードされるα−シヌクレインタンパク質のレベルの低下をもたらす。標的分子がα−シヌクレインタンパク質であれば、核酸（一般に、アプタマー）は、タンパク質の活性を阻害することにより作用する。
【００５５】
用語「核酸」は、本明細書で使用する場合、２以上のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体分子ならびに天然核酸に構造上類似するが、天然の核酸とは（例えば、化学修飾によって）１以上の核酸骨格（例えば、天然核酸のリン酸）、核酸の糖（例えば、天然ＤＮＡではデオキシリボース、天然ＲＮＡではリボース）、および核酸の塩基（例えば、天然核酸のアデノシン、シトシン、グアニン、チミジン、またはプリン）が異なる分子を有するポリマーを意味する。
【００５６】
オリゴヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドであってよく、限定されるものではないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを含む。二本鎖核酸が使用される場合、これらは標的核酸と相補的な第１のセンス鎖とそのセンス鎖と相補的な第２のアンチセンス鎖を含んでなり、これにより、第１鎖と第２鎖の間での塩基対形成により二本鎖ＤＮＡの形成が可能である。
【００５７】
用語「アンチセンス鎖」は、標的配列と実質的に相補的な領域を含む二本鎖核酸の鎖を意味する。相補性領域が標的配列と完全に相補的でない場合、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチド２〜７個外側にミスマッチが最も許容される。用語「センス鎖」は、本明細書で使用する場合、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖を意味する。
【００５８】
本発明の特定の実施形態では、神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現される標的分子に特異的に結合することができる核酸配列は、ギャップマー、二本鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ活性を有する二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチマイクロＲＮＡ、プレＭｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードするｍＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、リボザイムおよびアプタマーからなる群から選択される。
【００５９】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含んでなるアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを送達する能力は、例えば、Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, (1988)およびvan der Krol et al., BioTechniques 6:958, (1988)に記載されている。
【００６０】
本明細書で使用する場合、用語「リボザイム」または「ＲＮＡ酵素」または「触媒ＲＮＡ」は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子を意味する。多くの天然リボザイムが、それらの固有のホスホジエステル結合の１つの加水分解、または他のＲＮＡ内の結合の加水分解を触媒するが、それらはリボソームのアミノトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡリガーゼのリガーゼ活性、および従来のタンパク質酵素により遂行される他のいくつかの化学反応を触媒することも分かっている。
【００６１】
「アプタマー」は、本明細書で使用する場合、結合が「相補的」でない、すなわち、核酸リガンドと標的核酸配列の間の塩基対形成によらない、標的分子上の２以上の部位と結合する核酸リガンドを意味する。アプタマーは、ポリペプチドを含め、想定できるいずれの標的にも結合するものを設計することができる。アプタマーは、慣用の生体分子である抗体のものと競合する分子認識特性を付与するので、生物工学適用および治療適用に有用性を与える。それらの選択的認識に加え、アプタマーは、試験管内で完全に操作することができ、化学合成により容易に生産され、望ましい保存特性を備え、かつ、治療適用において免疫原性をほとんどまたは全く惹起しないことから、抗体に優る利点を提供する。アプタマーは、「ＳＥＬＥＸ」(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) (Shamah et al, Acc. Chem. Res. 2008, 41 pp. 130-8)として当技術分野の現状で知られている方法論で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏパーティション、選択および増幅を何回か繰り返すことによって合成することができる。あるいは、アプタマーは、例えば、段階的固相により合成することができる。
【００６２】
本発明の核酸は、核酸塩基、糖および／またはヌクレオチド間結合に１以上の修飾を含んでもよい。
【００６３】
核酸の１以上の骨格残基に対する修飾は、下記のうちの１以上を含んでなり得る：２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−ＡＩＩｙＩ、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）などの２’糖修飾；４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋を含む４’糖修飾；ロックド核酸(Locked Nucleic Acid)（ＬＮＡ）；ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid)（ＰＮＡ）；インターカレーティング核酸(Intercalating nucleic acid)（ＩＮＡ）；ツイストインターカレーティング核酸(Twisted intercalating nucleic acid)（ＴＩＮＡ）；ヘキシトール核酸(Hexitol nucleic acids)（ＨＮＡ）；アラビノ核酸(arabinonucleic acid)（ＡＮＡ）；シクロヘキサン核酸(cyclohexane nucleic acids)（ＣＮＡ）；シクロヘキセニル核酸(cyclohexenylnucleic acid)（ＣｅＮＡ）；トレオシル核酸(threosyl nucleic acid)（ＴＮＡ）；モルホリノオリゴヌクレオチド；ギャップマー；ミックスマー；インコーポレーションアルギニンリッチペプチド；合成ＲＮＡへの５’−リン酸の付加；ＲＮＡアプタマー((Que-Gewirth NS, Gene Ther. 2007 Feb;14(4):283-91.)；特定のＲＮＡアプタマーの対象に対する解毒薬で調節したＲＮＡアプタマー（Oney S, Oligonucleotides. 2007 Fall;17(3):265-74参照）またはそれらの任意の組合せ。
【００６４】
核酸の１以上のヌクレオシド間結合に対する修飾は、下記のうちの１以上を含んでなり得る：ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオエートおよびホスホルアニリダート、またはそれらの任意の組合せ。
【００６５】
ロックド核酸（ＬＮＡ）は、よく接近不能ＲＮＡとも呼ばれる、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’炭素と４’炭素を連結する付加的な架橋（Ｏ２’，Ｃ４’−メチレンブリッジ）で修飾される。この架橋は、Ａ型のＤＮＡまたはＲＮＡによく見られる、３’エンド構造立体配座でリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオチドは、所望により、核酸においてＤＮＡまたはＲＮＡ塩基と混合することができる。このようなオリゴマーは市販されている。ロックされたリボース立体配座は、塩基のスタッキングおよび骨格の予備構成を増進する。これは、高いミスマッチ識別能を備えるだけでなく、熱安定性（融解温度）およびＬＮＡ修飾核酸のハイブリダイゼーション親和性を著しく高める。これらの特性は、それらをアンチセンスに基づく技術に極めて有用とする。さらに、ＬＮＡ抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドは霊長類で試験されており、有望な結果と毒性の低さが示されている。
【００６６】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡまたはＲＮＡに類似する人工的に合成されたポリマーであり、生物学的研究および医学的処置に使用される。ＰＮＡは、自然界に存在することは知られていない。ＤＮＡおよびＲＮＡはそれぞれデオキシリボースおよびリボースの糖骨格を有するが、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合により連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の繰り返しから構成される。この骨格に、メチレンカルボニル結合により様々なプリンおよびピリミジン塩基が結合される。ＰＮＡは、ペプチドと同様に、最初の（左側）の位置にＮ末端、右側にＣ末端がくるように描かれる。ＰＮＡの骨格は電荷の無いリン酸基を含むので、ＰＮＡ／ＤＮＡ鎖間の結合は、静電反発が無いためにＤＮＡ／ＤＮＡ鎖間よりも強い。混合塩基ＰＮＡ分子は、塩基対認識に関してまさにＤＮＡ分子を模倣するものである。ＰＮＡ／ＰＮＡ結合は、ＰＮＡ／ＤＮＡ結合よりも強い。
【００６７】
モルホリノは、天然の核酸構造の再設計産物である合成分子である。モルホリノとＤＮＡまたはＲＮＡの間の構造上の違いは、モルホリノも標準的な核酸塩基を有するが、それらの塩基がデオキシリボース／リボース環ではなく６員モルホリン環に結合され、かつ、非依存性ホスホロジアミデートサブユニット間結合が陰イオン性ホスホジエステル結合に置き換わっていることである。モルホリノは、ＰＭＯ（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド）とも呼ばれることがある。６員モルホリン間は、化学式Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２）２−ＮＨを有する。
【００６８】
ギャップマーまたは「ギャップオリゴマー化合物」は、ＤＮＡ窓または「ギャップ」が、それ以外の点では通常の、または修飾された、「ウイング」として知られるＲＮＡオリゴヌクレオチドに挿入されたＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドプローブである。この修飾はオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性およびプローブと標的の相互作用のアビディティを高め、その結果、より短いプローブが効果的に使用できる。好ましくは、ウイングは、内部ブロックをヌクレアーゼ分解から保護する２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）または２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾リボヌクレオチドである。さらに、ギャップまたはウイングを形成するヌクレオチドは、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合によって連結されてよく、従って、それはＲＮアーゼ分解に対して耐性となる。加えて、ウイングを形成するヌクレオチドはまた、３’メチルホスホネート結合によって連結された塩基を組み込むことによって修飾されてもよい。
【００６９】
用語「ＲＮＡ干渉」またはＲＮＡｉは、真核細胞で起こり得る配列特異的転写後遺伝子抑制のプロセスである。一般に、このプロセスは、特定の配列のｍＲＮＡの、その配列と相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により誘導される分解を含む。このｄｓＲＮＡは、ＲＮアーゼタイプＩＩＩ（Ｄｉｃｅｒ）により前記ＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換することによって遺伝子発現のサイレンシングを起こすことができる。これらのｓｉＲＮＡ鎖の一方は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(RNA-induced silencing complex)（ＲＩＳＣ）と呼ばれるリボヌクレオタンパク質複合体に組み込まれる。ＲＩＳＣ複合体は、この一本鎖ＲＮＡを用いて、ＲＩＳＣに組み込まれたｓｉＲＮＡのＲＮＡ鎖と少なくとも部分的に相補的なｍＲＮＡ分子を特定し、それらは分解されるかまたはそれらの翻訳の阻害を受ける。このように、ＲＩＳＣに組み込まれたｓｉＲＮＡ鎖はガイド鎖またはアンチセンス鎖として知られている。トランジェント鎖またはセンス鎖として知られる他方の鎖は、ｓｉＲＮＡから除去され、標的ｍＲＮＡと部分的に相同である。ＲＩＳＣ複合体による標的ｍＲＮＡの分解は、前記ｍＲＮＡおよびそれによりコードされている対応するタンパク質の発現レベルの低下をもたらす。さらに、ＲＩＳＣはまた、標的ｍＲＮＡの翻訳の阻害による発現の低下も生じ得る。
【００７０】
本発明のコンジュゲートの核酸は、ＤＡＴ、ＳＥＲＴおよびＮＥＴからなる群から選択される神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現される標的分子α−シヌクレインに特異的に結合することができる。核酸と標的分子の結合は、標的分子が、核酸の配列と相補的な配列を含む核酸である場合に、ワトソン−クリック相互作用を介して起こり得る。あるいは、標的分子がポリペプチドである場合には、本発明のコンジュゲートの核酸は前記分子と相互作用することもでき、この場合、核酸はアプタマーとして働く。
【００７１】
本発明によるコンジュゲートにより含まれる核酸は、α−シヌクレインと、α−シヌクレインｍＲＮＡの特定の標的領域で特異的に結合する。従って、本発明のコンジュゲートにより含まれる核酸がα−シヌクレインｍＲＮＡと結合する場合、前記核酸は、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４４８〜４６５番（配列番号４）、４９９〜５１６番（配列番号５）および５０２〜５１９番（配列番号６）（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列(alpha-synucleic sequence)の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置する領域からなる群から選択されるα−シヌクレインｍＲＮＡ内の領域に標的化される。
【００７２】
用語「サイレンス」および「の発現を阻害する」、「の発現をダウンレギュレートする」、「の発現を抑制する」などは、それらが標的遺伝子を指す限りにおいて、本明細書においては、標的遺伝子が転写されて標的遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞または細胞群から単離することができる標的ｍＲＮＡの量が、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるがそのように処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して減少することにより示されるような、標的遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制を意味する。阻害の程度は通常以下のように表される：
［（対照細胞中のｍＲＮＡ）−（処理細胞中のｍＲＮＡ）＊１００パーセント］／（対照細胞中のｍＲＮＡ）
【００７３】
あるいは、阻害の程度は、標的遺伝子発現に機能的に関連するパラメーター、例えば、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の量またはある表現型を示す細胞の数の減少に関して示すこともできる。原則として、標的ゲノムサイレンシングは、構成的にまたはゲノム操作により標的を発現する任意の細胞において、いずれの適当なアッセイによって測定してもよい。しかしながら、所与の核酸がある程度標的遺伝子の発現を阻害するかどうか、従って、本発明に含まれるかどうかを決定するために参照が必要とされる場合に、下記の実施例で提供されるアッセイおよび当技術分野で公知のアッセイがそのような参照として役立つであろう。例えば、ある例では、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、標的遺伝子の発現は、少なくとも約５パーセント、１０パーセント、１５パーセント、２０パーセント、２５パーセント、３０パーセント、３５パーセント、４０パーセント、４５パーセント、または５０パーセント抑制される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、標的遺伝子は、少なくとも約６０パーセント、７０パーセント、または８０パーセント抑制される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、標的遺伝子は、少なくとも約８５パーセント、９０パーセント、または９５パーセント抑制される。
【００７４】
例えば、本発明による核酸配列は、標的遺伝子α−シヌクレインを発現する細胞中に導入することができる。細胞中の標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットまたは任意の他の標準的方法を使用することにより検出することができる。あるいは、標的ｍＲＮＡによりコードされているポリペプチドのレベルは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたは任意の他の免疫学的または非免疫学的方法を使用して測定することができる。ｓｉＲＮＡ配列の導入後の、遺伝子によりコードされているｍＲＮＡまたはそのタンパク質の発現レベルの実質的変化は、標的遺伝子の発現の抑制におけるｓｉＲＮＡ配列の有効性を示す。ある特定の例では、他の遺伝子の発現レベルもｓｉＲＮＡ配列の導入前後にモニタリングされる。標的遺伝子発現に対して阻害効果を有するが他の遺伝子の発現には有意に影響しないｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。他の特定の例では、複数のｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ配列を同じ標的細胞に導入することができる。これらのｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列は、標的遺伝子発現を特異的に阻害するが、他の遺伝子の発現は阻害しない。さらに別の特定の例では、標的遺伝子および他の１または複数の遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ配列を使用することができる。
【００７５】
本発明によれば、α−シヌクレインｍＲＮＡに特異的に結合することができる核酸は、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４４８〜４６５番（配列番号４）、４９９〜５１６番（配列番号５）および５０２〜５１９番（配列番号６）（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列(alpha-synucleic sequence)の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置する領域からなる群から選択されるα−シヌクレインｍＲＮＡ内の特定の領域に標的化される。
【００７６】
本発明のコンジュゲートの特定の実施形態では、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４４８〜４６５番（配列番号４）、４９９〜５１６番（配列番号５）および５０２〜５１９番（配列番号６）（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列(alpha-synucleic sequence)の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置する領域からなる群から選択される領域内のα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡに特異的に結合することができる核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはギャップマーである。
【００７７】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性が阻害されるべきα−シヌクレインをコードする核酸の転写および／または翻訳を阻害する。アンチセンス核酸は、従来の塩基相補性により、または例えば、二重らせんの主溝における特定の相互作用を介して二本鎖ＤＮＡに結合する場合に、薬物の潜在標的に結合され得る。一般に、これらの方法は、当技術分野で一般に使用されている一定範囲の技術を意味し、それらにはオリゴヌクレオチド配列への特異的結合に基づくいずれの方法も含む。
【００７８】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞内で転写された際にα−シヌクレインをコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも１つのユニークな部分に相補的なＲＮＡを産生する発現プラスミドとして分布させることができる。あるいは、アンチセンス構築物は、細胞に導入された際に、標的核酸のｍＲＮＡおよび／または遺伝子配列とハイブリダイズする遺伝子発現の阻害をもたらす、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成されるオリゴヌクレオチドプローブである。このようなオリゴヌクレオチドプローブは好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに耐性のある修飾オリゴヌクレオチドであり、従って、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて安定である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしてのその使用のための核酸分子の例は、ホスホルアミダート、ホスホチオネートおよびメチルホスホネートのＤＮＡ類似体である（米国特許第５１７６９９６号；同第５２６４５６４号；および同第５２５６７７５号も参照）。さらに、アンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築するための一般的な試み(general approximations)は、例えば、Van der Krol et al., BioTechniques 6: 958-976, 1988; and Stein et al., Cancer Res 48: 2659-2668, 1988に総説されている。
【００７９】
まず、遺伝子発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を行うことが好ましい。好ましくは、これらの研究では、そのオリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子阻害と非特異的生体作用を識別する対照を使用する。また好ましくは、これらの研究では、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルをＲＮＡまたはタンパク質の内部対照のレベルと比較する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を、対照オリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と比較することができる。好ましくは、対照オリゴヌクレオチドは、アッセイされるオリゴヌクレオチドとおよそ同じ長さであり、オリゴヌクレオチド配列は、標的配列との特異的ハイブリダイゼーションを妨げることが必然となると思われるなるほどにはアンチセンス配列と異ならない。
【００８０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物またはそれらの誘導体もしくは改変型であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、そのハイブリダイゼーション能などを改良するために、塩基、糖基またはリン酸骨格で改変することができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、それらを宿主細胞の受容体に向かわせるため）または細胞膜を経る輸送を促進するための薬剤（例えば、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556, 1989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652, 1987;ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０９８１０号)または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／１０１３４号）、インターカレート剤（例えば、Zon, Pharm. Res. 5: 539-549, 1988参照）などの他の結合基を含んでもよい。この目的で、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤などとコンジュゲートすることができる。
【００８１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾塩基の少なくとも１つの基を含んでなり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、限定されるものではないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１つの修飾糖基も含んでなり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、中性ペプチド(neutral peptide)と類似の骨格を含んでもよい。このような分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーとして知られ、例えば、Perry-O’Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 14670, 1996, およびEglom et al., Nature 365: 566, 1993に記載されている。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含んでなる。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオチドである。
【００８２】
標的ｍＲＮＡ配列のコード領域と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが使用できるが、転写された非翻訳領域と相補的なものも使用可能である。
【００８３】
場合によっては、アンチセンスについて内因性ｍＲＮＡ翻訳を抑制するために十分な細胞内濃度を達成することが難しいことがある。従って、好ましい試み(approximation)では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下に置かれている組換えＤＮＡ構築物を使用する。あるいは、標的遺伝子発現は、体内の標的細胞において遺伝子調節領域（すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列に三重ヘリックス構造を採らせて遺伝子転写を妨げることによって低下させることもできる（一般に、Helene, Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84, 1991参照）。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスモルホリンである。
【００８４】
ギャップマーは、ＤＮＡ窓または「ギャップ」が、それ以外の点では通常の、または修飾された、「ウイング」として知られるＲＮＡオリゴヌクレオチドに挿入されたＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドプローブである。好ましくは、ウイングは、内部ブロックをヌクレアーゼ分解から保護する２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）または２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾リボヌクレオチドである。より好ましくは、ウイングは、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである。さらに、ギャップまたはウイングを形成するヌクレオチドは、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合によって連結されてよく、従って、それはＲＮアーゼ分解に対して耐性となる。加えて、ウイングを形成するヌクレオチドはまた、３’メチルホスホネート結合によって連結された塩基を組み込むことによって修飾されてもよい。
【００８５】
本発明によるコンジュゲートの特定の好ましい実施形態では、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４４８〜４６５番（配列番号４）、４９９〜５１６番（配列番号５）および５０２〜５１９番（配列番号６）（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列(alpha-synucleic sequenc)の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置する領域からなる群から選択される領域内のα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡに特異的に結合することができる核酸は、４つの２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドのブロックに隣接する（flanked by blocks）１０個のデオキシヌクレオチドの中央ブロックを含んでなるギャップマーである。
【００８６】
より好ましい実施形態では、ギャップマーは、配列番号１、配列番号２または配列番号３からなる群から選択される配列からなる。
【化６】
0006386461.tif 000007
【００８７】
本発明のコンジュゲートの別の実施形態では、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４４８〜４６５番（配列番号４）、４９９〜５１６番（配列番号５）および５０２〜５１９番（配列番号６）（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列(alpha-synucleic sequenc)の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置する領域からなる群から選択される領域内のα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡに特異的に結合することができる核酸は。特に、干渉ＲＮＡは、低分子（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含んでなる群から選択される。
【００８８】
用語低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）は、ＲＮＡ干渉経路を誘導する低分子の阻害性ＲＮＡ二重鎖を意味する。これらの分子は様々な長さであってよく（一般に１８〜３０塩基対）、アンチセンス鎖にそれらの標的ｍＲＮＡとの様々な程度の相補性を含む。総てではないが一部のｓｉＲＮＡは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’または３’末端に対合しないオーバーハング塩基を有する。用語「ｓｉＲＮＡ」は、２本の分離した鎖の二重鎖を含む。本明細書で使用する場合、ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ分子に限定されず、モルホリノなどの、１以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを有する核酸をさらに包含する。
【００８９】
本発明による特に好ましいｓｉＲＮＡは、４９９〜５１７番（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列(alpha-synucleic sequenc)の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置するα−シヌクレインｍＲＮＡ内の領域に標的化される。
【化７】
0006386461.tif 000008
【００９０】
用語「ｓｈＲＮＡ」または「短鎖ヘアピンＲＮＡ」は、本明細書で使用する場合、２本の鎖が、一方の鎖の３’末端と対応する他方の鎖の５’末端との間で中断されないヌクレオチド鎖により連結されて二重鎖構造を形成しているｄｓＲＮＡを意味する。
【００９１】
用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、遺伝子発現を調節することができる、一般に約２１〜２３ヌクレオチド長の短い一本鎖ＲＮＡ分子を意味する。ｍｉＲＮＡは、合成品（すなわち、組換え型）であっても天然物であってもよい。天然ｍｉＲＮＡは遺伝子によりコードされ、ＤＮＡから転写され、一次転写産物（「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」）からプロセシングされて短いステム−ループ構造（「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」）となり、最終的に成熟ｍｉＲＮＡとなる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１以上のｍＲＮＡ分子と部分的に相補的であり、ＲＮＡ干渉に類似したプロセスを介して、またはｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより、遺伝子発現のダウンレギュレーションを行う。
【００９２】
別の実施形態では、本発明のコンジュゲートの核酸は、α−シヌクレインｍＲＮＡを特異的にサイレンシングすることができるｍｉＲＮＡである。好適なα−シヌクレイン特異的ｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｍｉＲ−７（Proc.Natl.Acad.Si.USA, 2009, 106: 13052-13057参照）およびｍｉＲ−１５３（J Biol Chem 2010 285(17): 12726-12734参照）が挙げられる。ヒトｍｉＲＮＡ  ７−１配列はＮＣＢＩに受託番号ＮＲ＿０２９６０５（配列番号１０）で、ヒトｍｉＲＮＡ  ７−２は受託番号ＮＲ＿０２９６０６（配列番号１１）で、ヒトｍｉＲＮＡ  ７−３は受託番号ＮＲ＿０２９６０７（配列番号１２）で存在する。ヒトｍｉＲＮＡ  １５３−１はＮＣＢＩに受託番号ＮＲ＿０２９６８８（配列番号１３）で、ｍｉＲＮＡ  １５３−２は受託番号ＮＲ＿０２９６８９（配列番号１４）で存在する。
【００９３】
本発明によるｍｉＲ−７は、配列：
【化８】
0006386461.tif 000009
を有する。
【００９４】
本発明によるｍｉＲ−１５３は、配列：
【化９】
0006386461.tif 000010
を有する。
【００９５】
所与の２つの核酸配列をペアごとにアラインメントするための方法は当業者に広く知られ、ＢＬＡＳＴＮ[BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]タイプの標準的アルゴリズムにより、デフォルトパラメーターを用いて行うことができる。複数の核酸配列のアラインメント法は、ＣＬＵＳＴＡＬＷ(Thompson JD et al, Nucleic Acids Res, 1994, 22:4673-4680)タイプの標準的アルゴリズムにより、デフォルトパラメーターを用いて行うことができる。
【００９６】
本発明のコンジュゲートの干渉ＲＮＡが二本鎖干渉ＲＮＡである場合、本発明によるコンジュゲートは、１つの選択性薬剤、１または２つの選択性薬剤を含んでなり得る。特定の実施形態では、第１の選択性薬剤と第２の選択性薬剤は同じ選択性薬剤である。別の実施形態では、第１の選択性薬剤は第２の選択性薬剤とは異なる。本発明のコンジュゲートの第２の選択性薬剤は、前述のようにドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）またはノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）からなる群から選択される１以上の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する。本発明によるコンジュゲートが二本鎖干渉ＲＮＡと１つの選択性薬剤を含んでなる場合、選択性薬剤は、干渉ＲＮＡのセンス鎖の５’末端にコンジュゲートさせるか、または干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖の５’側にコンジュゲートさせることができる。本発明によるコンジュゲートが二本鎖干渉ＲＮＡと２つの選択性薬剤を含んでなる場合、第１の選択性薬剤は干渉ＲＮＡのセンス鎖の５’末端にコンジュゲートされ、第２の選択性薬剤は干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖の５’側にコンジュゲートされる。
【００９７】
特定の実施形態では、本発明によるコンジュゲートは、干渉ＲＮＡ、第１の選択性薬剤および第２の選択性薬剤を含んでなる。より詳しい実施形態では、本コンジュゲートの第２の選択性薬剤は、第１の選択性薬剤が連結されたポリヌクレオチド（干渉ＲＮＡ）の反対の末端に連結される。特定の実施形態では、本コンジュゲートの第２の選択性薬剤は、第１の選択性薬剤に連結されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの一方の末端に連結される。特定の実施形態では、本コンジュゲートの第２の選択性薬剤は、第１の選択性薬剤に連結されたポリヌクレオチドの同じ末端に、前記末端に結合された多官能性リンカーによって連結される。
【００９８】
Ａ．３．本発明のコンジュゲートのリンカー領域
核酸および選択性薬剤は、直接結合させてもよい。しかしながら、両部分が連結基によって連結されていることが好ましい。
【００９９】
用語「連結基」、「リンカー」、「架橋基」およびそれらの文法上同等な語は、化合物の２つの部分を連結する有機部分を意味して本明細書で使用される。選択性薬剤は核酸内のいずれのセンスまたはアンチセンスヌクレオチドにも結合させることができるが、好ましくは、３’末端ヌクレオチドおよび／または５’末端ヌクレオチドを介して結合させることができる。内部コンジュゲートは直接結合させてもよいし、またはリボース基の２’位のヌクレオチドにもしくは別の好適な位置にリンカーを介して間接的に結合させてもよい。
【０１００】
核酸が二本鎖核酸である場合、コンジュゲートは、センス３’末端ヌクレオチド、センス５’末端ヌクレオチド、アンチセンス３’末端ヌクレオチド、および／またはアンチセンス５’末端ヌクレオチドに結合させることができる。
【０１０１】
定義または慣例によって制限されることを望むものではないが、本出願では、リンカーの長さは、コンジュゲート部分とリンカーを連結する原子と、それを介してリンカーがオリゴヌクレオチドに結合されているオリゴヌクレオチドと会合している末端リン酸部分の酸素原子との間の最短距離に当たる原子数を数えることによって表される。リンカーが１以上の環構造を含んでなる場合、最短経路に当たる環前後の原子を数えることが好ましい。
【０１０２】
本発明において使用するための好適なリンカー基としては、限定されるものではないが、修飾または非修飾ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリマー、糖、炭水化物、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールなどのポリアルキレン、ポリアルコール、ポリプロピレン、エチレンとプロピレングリコールの混合物、ポリアルキルアミン、ポリリジンおよびスペルミジンなどのポリアミン、ポリ（アクリル酸エチル）などのポリエステル、ポリホスホジエステル、脂肪族、およびアルキレンが挙げられる。さらに、ω−アミノ−１，３−ジオール、ω−アミノ−ｌ，２−ジオール、ヒドロキシプロリノール、ω−アミノ−アルカノール、ジエタノールアミン、ω−ヒドロキシ−ｌ，３−ジオール、ω−ヒドロキシ−ｌ，２−ジオール、ω−チオ−ｌ，３−ジオール、ω−チオ−１，２−ジオール、ω−カルボキシ−ｌ，３−ジオール、ω−カルボキシ−１，２−ジオール、コ−ヒドロキシ−アルカノール、ω−チオ−アルカノール、ω−カルボキシ−アルカノール、官能基化オリゴエチレングリコール、アリルアミン、アクリル酸、アリルアルコール、プロパルギルアミン、プロパルギルアルコール、およびその他に基づくリンカー／リンカー化学も、適当な長さのリンカーを作製するために本文脈で適用可能である。
【０１０３】
リンカーはまた、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに他の所望の特性、すなわち，高い水溶性、コンジュゲート部分とオリゴヌクレオチド間の分離の最適な距離、柔軟性（またはその欠如）、特定の配向、分岐その他を付与し得る。
【０１０４】
好ましくは、前記連結基は、下記の構造：
【化１０】
0006386461.tif 000011
を有し、ここで、
ｍ、ｎおよびｐは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択され、
ｍ＋ｎ＋ｐの和は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８から選択される整数であり、かつ、
ｋは、０または１である。
【０１０５】
好ましい実施形態では、ｐは５であり、ｎは２であり、ｋは１であり、かつ、ｍは６であって、リンカーは、構造：
【化１１】
0006386461.tif 000012
となる。
【０１０６】
別の好ましい実施形態では、ｐは５であり、ｎおよびｋは０であり、かつ、ｍは６であって、リンカーは、構造：
【化１２】
0006386461.tif 000013
となる。
【０１０７】
特定の実施形態では、リンカーは、選択性薬剤に対して２以上のカップリングを含んでなる。好ましい実施形態では、リンカーは二価または三価のリンカーであり、すなわち、それぞれ２または３分子の選択性薬剤がカップリングすることができる。
【０１０８】
２分子以上の選択性薬剤がリンカーを介して核酸とカップリングしている場合、前記分子は同じ選択性薬剤でも異なる選択性薬剤でもよい。
【０１０９】
特定の実施形態では、二価または三価のリンカーは、下式：
【化１３】
0006386461.tif 000014
を有し、式中、
ｍ、ｍ’、ｍ’’、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｐ、ｐ’、ｐ’’、ｒ、ｒ’、ｒ’’、ｓ、ｓ’、ｓ’’、ｔおよびｕは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から独立に選択され；
ｋ、ｋ’、ｋ’’およびｖは、０および１から独立に選択され；かつ
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＯ、Ｃ（Ｏ）ＯおよびＣ（Ｏ）ＮＨから独立に選択される。
【０１１０】
上記の基の価数に依存して、分岐リンカーは対称的であっても非対称的であってもよい。
【０１１１】
特定の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎおよびｎ’が２であり、ｋおよびｋ’が１であり、かつ、ｍおよびｍ’が６である上記に示される二価のリンカーである。特定の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎ，ｎ’、ｋおよびｋ’が０であり、かつ、ｍおよびｍ’が６である上記に示される二価のリンカーである。
【０１１２】
特定の実施形態では、リンカーは、ｒおよびｒ’が４であり、ｓおよびｓ’が１であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表す上記に示される二価のリンカーである。別の実施形態では、リンカーは、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣＨ２を表す上記に示される二価のリンカーである。
【０１１３】
特定の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎおよびｎ’が２であり、ｋおよびｋ’が１であり、ｍおよびｍ’が６であり、ｒおよびｒ’が４であり、ｓおよびｓ’が１であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表す上記に示される二価のリンカーである。
【０１１４】
別の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎおよびｎ’が２であり、ｋおよびｋ’が１であり、ｍおよびｍ’が６であり、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣＨ２を表す上記に示される二価のリンカーである。
【０１１５】
別の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎ、ｎ’、ｋおよびｋ’が０であり、ｍおよびｍ’が６であり、ｒおよびｒ’が４であり、ｓおよびｓ’が１であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表す上記に示される二価のリンカーである。
【０１１６】
別の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎ、ｎ’、ｋおよびｋ’が０であり、ｍおよびｍ’が６であり、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣＨ２を表す上記に示される二価のリンカーである。
【０１１７】
特定の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’およびｎ’’が２であり、ｋ、ｋ’およびｋ’’が１であり、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６である上記に示される三価のリンカーである。特定の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｋ、ｋ’およびｋ’’が０であり、かつ、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６である上記に示される三価のリンカーである。
【０１１８】
特定の実施形態では、リンカーは、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記に示される三価のリンカーである。
【０１１９】
別の実施形態では、リンカーは、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記で示される三価のリンカーである。
【０１２０】
特定の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’およびｎ’’が２であり、ｋ、ｋ’およびｋ’’が１であり、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記に示される三価のリンカーである。
【０１２１】
別の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’およびｎ’’が２であり、ｋ、ｋ’およびｋ’’が１であり、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記に示される三価のリンカーである。
【０１２２】
別の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｋ、ｋ’およびｋ’’が０であり、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記に示される三価のリンカーである。
【０１２３】
別の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｋ、ｋ’およびｋ’’が０であり、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記に示される三価のリンカーである。
【０１２４】
本発明による特に好ましい架橋基は下記の構造：
−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
を有し、ここで、
ＡおよびＢは、単糖、アルキル鎖および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールからなる群から独立に選択されるモノマー単位を表し；
ａおよびｂは、０〜５０の範囲の整数であり；
ｃは、０〜３０の範囲の整数であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、カルバメート、メチルスルホネート、グアニジニウム、スルファメート、スルファミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、スルホン、アミドおよびそれらの混合物からなる群から独立に選択される架橋化合物であり；かつ
ｄは、０または１である。
【０１２５】
特定の実施形態では、架橋基は、構造：
−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
を有し、ここで、ｂおよびｄは０であり、ｃは１であり、Ａはアルキル鎖であり、かつ、Ｌ２はホスホジエステル結合である。
【０１２６】
Ａ．４．本発明のコンジュゲートの標的化部分
本発明のコンジュゲートの別の修飾として、核酸の活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１以上の部分またはコンジュゲートを、核酸または保護基に化学的に連結することを含む。このような部分としては、限定されるものではないが、コレステロール部分(Letsinger et al, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 199, 86, 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al, Biorg. Med. Chem. Let., 1994 4 1053-1060)などの脂質部分、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール(Manoharan et al, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al, EMBO J, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et a/., Biochimie, 1993, 75, 49-54)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチル−アンモニウム  ｌ，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈホスホネート(Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 969-973)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et ai, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)が挙げられる。
【０１２７】
あるいは、細胞分布を増大させることができる部分は、生物障壁中に存在する特定の輸送体を用い、受容体を介するエンドサイトーシスの使用により生物障壁を経て特異的に輸送され得る低分子量化合物またはポリペプチドであってもよい。取り込み受容体および担体の広いアレイは、さらに多数の受容体特異的リガンドとともに、当技術分野で公知である。本発明による使用のための、エンドサイトーシスおよび／またはトランスサイトーシスを媒介する受容体に対する好ましいリガンドとしては、例えば、チアミン輸送体、葉酸受容体、ビタミンＢ１２受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、α（２，３）−シアロ糖タンパク質受容体（例えば、受容体特異的リガンドとしてラマ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなるＦＣ５およびＦＣ４４ナノボディを伴う）、トランスフェリン−１および−２受容体、スカベンジャー受容体（クラスＡもしくはＢ、タイプＩ、ＩＩもしくはＩＩＩ、またはＣＤ３６もしくはＣＤ１６３）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体（ＬＲＰｌ、タイプＢ）、ＬＲＰ２受容体（メガリンまたは糖タンパク質３３０としても知られる）、ジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ、これはヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の膜結合前駆体である）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、サブスタンスＰ受容体、グルタチオン受容体、グルタミン酸受容体およびマンノース６リン酸受容体に対する、またはそれらに特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０１２８】
本発明による使用のための、これらの受容体と結合する好ましいリガンドとしては、例えば、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、α−２−マクログロブリン（α２Ｍ）、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）、ラクトフェリン、デスモテプラーゼ、組織型およびウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ／ｕＰＡ）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤（ＰＡＩ−Ｉ）、ｔＰＡ／ｕＰＡ：ＰＡＩ−ｌ複合体、メラノトランスフェリン（またはＰ９７）、トロンボスポンジン１および２、肝リパーゼ、第ＶＩＩａ因子／組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、アベタール−４０、アミロイド−β前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、Ｃｌ阻害剤、補体Ｃ３、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）、シュードモナス外毒素Ａ、ＣＲＭ６６、ＨＩＶ−Ｉ  Ｔａｔタンパク質、ライノウイルス、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ−３）、スピンゴ脂質活性化タンパク質（ＳＡＰ）、妊娠帯タンパク質、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補助因子ＩＩ、αｌ−アンチトリプシン、熱ショックタンパク質９６（ＨＳＰ−９６）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アポリポタンパク質Ｊ（ａｐｏＪ、またはクラステリン）、ａｐｏＪおよびａｐｏＥに結合したＡＢＥＴＡ、アプロチニン、ａｎｇｉｏ−ｐｅｐｌ、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、トランスフェリン、インスリン、レプチン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、レクチン、ペプチド模倣および／またはヒト化モノクローナル抗体または前記受容体に特異的なペプチド（例えば、ヒトトランスフェリン受容体に結合する配列ＨＡＩＹＰＲＨ（配列番号１７）およびＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号１８）、または抗ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）モノクローナル抗体Ａ２４）、ヘモグロビン、ジフテリア毒素ポリペプチド鎖の非毒性部分、ジフテリア毒素Ｂ鎖の全体または一部（ＤＴＢ−Ｈｉｓを含む（Spilsberg  et  al.,2005,Toxicon., 46(8):900-6により記載））、ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７の非毒性変異体の全体または一部、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｅ（例えば、ナノ粒子上のポリソーブ−８０コーティングに結合後）、ビタミンＤ結合タンパク質、ビタミンＡ／レチノール結合タンパク質、ビタミンＢ１２／コバラミン血漿担体タンパク質、グルタチオンおよびトランスコバラミン−Ｂ１２からなる群から選択されるリガンドが挙げられる。
【０１２９】
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、コンジュゲートの生体膜を経た輸送を促進する基をさらに含んでなる。好ましくは、この基は両親媒性である。例示的薬剤としては、限定されるものではないが、ペネトラチン、アミノ酸４８〜６０を含んでなるＴａｔタンパク質の断片、シグナル配列に基づくペプチド、ＰＶＥＣ、トランスポータン、両親媒性モデルペプチド、Ａｒｇ９、細菌細胞壁透過ペプチド、ＬＬ−３７、セクロピン  Ｐ１、α−デフェンシン、β−デフェンシン、バクテネクチン、ＰＲ−３９およびインドリシジンが挙げられる。薬剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣物、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含め、それは修飾が可能である。ヘリックス剤は好ましくはα−ヘリックス剤であり、好ましくは、親油相および脂質親和相を持つ。
【０１３０】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。ペプチド模倣物（本明細書ではオリゴペプチド模倣物とも呼ばれる）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチドまたはペプチド模倣物部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る（例えば、表４参照）。
【０１３１】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、エンドソーム溶解性リガンドをさらに含んでなる。エンドソーム溶解性リガンドは、エンドソームの溶解および／または本発明の組成物もしくはその成分の、エンドソームからその細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解性リガンドは、ｐＨ依存的膜活性および膜融合性を示すポリ陰イオン性のペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。特定の実施形態では、エンドソーム溶解性リガンドは、エンドソームｐＨにおいてその活性立体配座を想定する。「活性立体配座」は、エンドソーム溶解性リガンドがエンドソームの溶解および／または本発明の組成物もしくはその成分の、エンドソームからその細胞の細胞質への輸送を促進する立体配座である。例示的エンドソーム溶解性リガンドとしては、ＧＡＬ４ペプチド(Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972)、ＥＡＬＡペプチド(Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586)、およびそれらの誘導体(Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68)、ＩＮＦ−７ペプチド、Ｉｎｆ  ＨＡ−２ペプチド、ｄｉＩＮＦ−７ペプチド、ｄｉＩＮＦ３ペプチド、ＧＬＦペプチド、ＧＡＬＡ−ＩＮＦ３ペプチドおよびＩＮＦ−５ペプチドが挙げられる。特定の実施形態では、エンドソーム溶解性成分は、ｐＨの変化に応答して電荷の変化またはプロトン化を受ける化学基（例えば、アミノ酸）を含み得る。エンドソーム溶解性成分は、直鎖であっても分岐型であってもよい。
【０１３２】
Ａ．５．本発明のコンジュゲートの保護基
本発明のコンジュゲートの核酸形成部分は、生体の種々の体液およびコンパートメントを経たそれらの輸送中に、ヌクレアーゼ（エンド／エキソヌクレアーゼ）などの分解因子から保護されなければならない。この目的で、オリゴヌクレオチドは、酵素的消化に耐性を持ち、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性およびバイオアベイラビリティを改善するように設計される。核酸は、ヌクレアーゼに媒介される分解を防ぐ基の存在により化学的に修飾されることが好ましい。
【０１３３】
本発明の目的では、「キャップ構造」または「保護基」は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学修飾を意味すると理解すべきである。５’キャップの限定されない例として、反転した塩基脱落残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；改変塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオネート架橋基；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分；３’−３’−反転塩基脱落部分；３’−２’−反転ヌクレオチド部分；３’−２’−塩基脱落部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホロアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオネート；ホスホロジチオネート；または架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。詳細は引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ９７／２６２７０に記載されている。３’キャップとしては、例えば、４’，５’−メチレンヌクレオチド；ｌ−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド：４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；ｌ，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’−５’−反転(inveiled)塩基脱落部分；５’−ホスホロアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５‘−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホロアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分が挙げられる。Beaucage and Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925もまた参照（この内容は引用することにより本明細書の一部とされる）。特定の実施形態では、保護基は、反転ヌクレオチド部分を含んでなる。特定の実施形態では、保護基は、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。末端５’−５’または３’−３’結合を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ分解に対して耐性が高い。反転ｄＴなどの反転ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端に組み込むことができ、これにより、３’エキソヌクレアーゼによる分解とＤＮＡポリメラーゼによる伸長の両方を阻害する３’−３’結合が得られる。
【０１３４】
特定の実施形態では、反転ヌクレオチドは、選択性薬剤と結合されてない本発明の核酸の一末端または両末端に組み込まれる。特定の実施形態では、反転ヌクレオチドは反転ｄＴである。特定の好ましい実施形態では、保護基は、選択性薬剤と結合されていない本発明の核酸の一末端または両末端、好ましくは３’末端に位置し、反転ヌクレオチド部分、より詳しくは、反転ｄＴを含んでなる。
【０１３５】
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートの核酸配列に結合されたキャップ構造は、以下の一般的構造
Ｍ−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
を有し、ここで、
Ｍは、Ｈ、脂質部分または上記で定義されたターゲティング基であり；
ＡおよびＢは、単糖および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールからなる群から独立に選択されるモノマー単位を表し；
ａおよびｂは０〜５０の範囲の整数であり；
ｃは０〜３０の範囲の整数であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、カルバメート、メチルホスホネート、グアニジニウム、スルファメート、スルファミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、スルホン、アミドおよびそれらの混合物からなる群から独立に選択される架橋化合物であり；
ｄは０または１である。
【０１３６】
脂質部分は、本明細書中で使用する場合、限定されるものではないが、脂肪、油脂、精油、ワックス、ステロイド、ステロール、リン脂質、糖脂質、スルホリピド、アミノリピド、クロモリピド（リポクローム）、および脂肪酸を含む、親油性または両親媒性の性質を有する有機化合物を意味する。用語「脂質」は、天然脂質および合成生産脂質の両方を包含する。脂質部分は、通常、オリゴヌクレオチドの親油性を増大させ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるオリゴヌクレオチド構造の細胞内取り込みを助長する。使用され得る好適な脂質として、脂肪酸；脂肪；油；ワックス；コレステロール；ステロール；ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫなどの脂溶性ビタミン；モノグリセリド；ジグリセリド、ならびにリン脂質が挙げられる。好ましい脂肪酸は、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ドコサン酸（Ｃ２２）、およびリトコール酸とオレイルアミンとのハイブリッド（リトコール−オレイルアミン、Ｃ４３）からなる群から選択されるものである。脂質は、標的組織、標的細胞、投与経路、オリゴヌクレオチドがたどると予想される経路などを考慮に入れることによって状況に応じて当業者が選択できる。
【０１３７】
用語「単糖」は、本明細書で使用する場合、当技術分野において周知であり、ブロックまたは部分を構成するより小さい糖にさらに分解することのできない単一の糖単位からなる糖の単純形態を意味する。このコンジュゲーション基として好ましい糖部分は、フラノース、フルクトース、グルコース、ガラクトース、マンノース、修飾単糖、シアル酸およびエリトロースおよびそれらの混合物からなる群から選択される。単糖は、その線状または環状形態（ヘミアセタール環状異性体）にあり得る。フラノースは、Ｄ−リボースまたはフルクトース残基（Ｄ−（−）−フルクトフラノース）などの５員フラン系環を含む任意の単純糖である。単糖の組合せで、複数の糖構造物を得ることができる。フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）およびガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、二糖類のサッカロースもしくはラクトース、または多糖類のイヌリン、デキストリン、デンプンもしくはグリコーゲンと同様に特に着目される組合せである。
【０１３８】
用語「アルキレングリコール」、「ポリ（アルキレングリコール）」、「アルキレンオキシド」は、本明細書で使用する場合、一般式
−Ｏ−［（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−］ｎ−
を共有するポイエチレンポリマー系列を包含し、式中、
ｍは各アルキレングリコール単位中に存在するメチレン基の数を表し、ｎは反復単位の数を表し、従って、ポリマーのサイズまたは長さを表す。この用語は、限定されるものではないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジアルキレングリコール（例えば、ジエチレングリコール）、トリアルキレングリコール（例えば、トリエチレングリコール）、および上記のグリコールの対応するモノアルキルエーテルおよびジアルキルエーテルなどのグリコールが挙げられ、ここで、アルキルエーテルは１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルエーテル（例えば、メチル、エチル、プロピルエーテルなど）である。
【０１３９】
他の実施形態では、それは、炭素原子が２〜２０個の任意の線状または分岐型分子であってよい（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールモノマー単位、またはａおよびｂの価に応じて、数個の（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールモノマー単位を有するポリアルキレングリコールポリマーを有する。好ましくは、アルキレングリコール基は、Ｃ１６−Ｃ２０アルキレングリコールから選択される。さらにより好ましくは、アルキレングリコール基はＣ１８アルキレングリコールである
【０１４０】
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、ｂおよびｄが０であり、ｃが１であり、Ａがアルキル鎖であり、Ｌ２がホスホジエステル結合であるキャップ構造を有する。
【０１４１】
本発明のコンジュゲートに適切な保護基として、限定されるものではないが、
Ｍ−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
・ＭがＨであり、ｄが０であり、ＡがＰＥＧであり、Ｂが糖であり、ａおよびｂがそれぞれ１であり、かつ、Ｌ１およびＬ２がホスホジエステル結合である上式に相当するＰＥＧ＋糖；
・ＡがＰＥＧであり、Ｂが糖であり、ａが１であり、ｂが２であり、ＭがＨであり、ｄが０であり、かつ、Ｌ１およびＬ２がホスホジエステル結合である上式に相当するＰＥＧ＋（糖）２；
・ＡがＰＥＧであり、Ｂが糖であり、ａが２であり、ｂが１であり、ＭがＨであり、ｄが０であり、かつ、Ｌ１およびＬ２がホスホジエステル結合である上式に相当する（ＰＥＧ）２＋糖；
・ＡがＰＥＧであり、Ｂが糖であり、ａが３であり、ｂが１であり、ＭがＨであり、ｄが０であり、かつ、Ｌ１およびＬ２がホスホジエステル結合である上式に相当する（ＰＥＧ）３＋糖；
・ＡがＰＥＧであり、Ｂが糖であり、ａが５であり、ｂが１であり、ＭがＨであり、ｄが０であり、かつ、Ｌ１およびＬ２がホスホジエステル結合である上式に相当する（ＰＥＧ）５＋糖
が挙げられる。
【０１４２】
用語「ＰＥＧ」および「糖」は、本質的に上記のように使用され、糖としてのフラノースとＣ３、Ｃ９およびＣ１８のスペーサーの群から選択されるＰＥＧを含む。
【０１４３】
本発明はまた、コンジュゲートが選択性薬剤と結合されてないポリヌクレオチドの一末端または両末端に結合された保護基をさらに含んでなることを企図する。
【０１４４】
Ｂ．本発明のコンジュゲートの構造
本発明によるコンジュゲートの種々の要素は種々の様式で配列することができ、本発明の一部を成す(frorm)。従って、選択性薬剤は核酸の５’末端および／または３’末端にカップリングさせることができる。好ましくは、選択性薬剤は核酸の５’末端にカップリングさせる。さらに、核酸と選択性薬剤とは、直接連結してもよいし、またはリンカーにより接続してもよい。同様に、リンカーも核酸の５’末端および／または３’末端にカップリングさせることができる。好ましくは、リンカーは核酸の５’末端にカップリングさせる。従って、本発明の核酸が単一の核酸鎖を含有する場合、可能な配置は、
・５’末端に結合された選択性薬剤を含んでなる核酸、
・３’末端に結合された選択性薬剤を含んでなる核酸、
・５’末端に結合された選択性薬剤と３’末端に結合された保護基を含んでなる核酸、
・５’末端に結合された保護基と３’末端に結合された選択性薬剤を含んでなる核酸、
・第１および第２の選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、両選択性薬剤が、核酸の５’末端に連結されている二官能性リンカーの２つの末端に連結されている核酸、
・第１および第２の選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記第１および第２の選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、両選択性薬剤が、核酸の３’末端に連結されている二官能性リンカーの２つの末端に連結されている核酸、
・４つの選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、選択性薬剤の２つは核酸の５’末端に連結されている第１の二官能性リンカーの両末端に連結され、選択性薬剤の２つは核酸の３’末端に連結されている第２の二官能性リンカーの両末端に連結されている核酸、
である。
【０１４５】
コンジュゲートが単一の核酸鎖と２つの選択性薬剤を含有する好ましい実施形態では、第１の選択性薬剤および第２の選択性薬剤は両方とも三重再取り込み阻害剤（好ましくは、  インダトラリン）であり、前記核酸の５’末端および３’末端に連結されている。
【０１４６】
コンジュゲートが単一の核酸鎖と２つの選択性薬剤を含有する別の好ましい実施形態では、第１の選択性薬剤はセロトニン再取り込み阻害剤（ＳＲＩ）（好ましくは、セルトラリン）であり、第２の選択性薬剤はノルエピネフリン(norepinephrinee)ドーパミン二重再取り込み阻害剤(inhibitor)（ＮＤＲＩ）であり、前記核酸の５’末端に連結されている。より好ましい実施形態では、ＳＲＩは前記核酸の５’末端に連結され、ＮＤＲＩは前記核酸の３’末端に連結されている。別の好ましい実施形態では、ＳＲＩは前記核酸の３’末端に連結され、ＮＤＲＩは前記核酸の５’末端に連結されている。
【０１４７】
別の実施形態では、前記核酸は、核酸分子の一末端に多官能性リンカーによって結合された２つ以上のリガンドを含有してよい。従って、別の実施形態では、前記核酸は、５’末端に結合された二機能性リンカーを含有してよく、前記二機能性リンカーの各末端は三重再取り込み阻害剤（好ましくは、インダトラリン(indtaraline））とカップリングされている。別の実施形態では、前記核酸は、５’末端に結合された二機能性リンカーを含有してよく、前記二機能性リンカーの第１の末端はＳＲＩ（好ましくは、セルトラリン(sertonine)）とカップリングされ、前記二機能性リンカーの第２の末端はＮＤＲＩに連結されている。
【０１４８】
別の実施形態では、前記核酸は、５’または３’末端のいずれかに結合された三官能性リンカーを含有し、前記三官能性リンカーの各末端はリガンドに結合されている。好ましい実施形態では、前記三官能性リンカーの３つの末端は、同じであっても異なってもよい三重再取り込み阻害剤に連結されている。好ましい実施形態では、前記核酸分子は３つのインダトラリン分子に連結されている。
【０１４９】
それに加えて、本発明のコンジュゲートは、標的分子の発現を調節する２つ以上の核酸鎖を含み得る。例えば、本発明の構築物は、所与の標的分子の異なった領域を標的としたホスホジエステルを介して直列に連結された５個までの異なる核酸を含むことができる。
【０１５０】
さらに、核酸が二本鎖核酸であるこれらの場合には、選択性薬剤はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖にカップリングさせてもよく、直接カップリングしてもよいし、またはリンカー基によりカップリングしてもよい。
【０１５１】
本発明のコンジュゲートの核酸形成部分は、生体の種々の体液およびコンパートメントを経たそれらの輸送中に、ヌクレアーゼ（エンド／エキソヌクレアーゼ）などの分解因子から保護されなければならない。この目的で、オリゴヌクレオチドは、酵素的消化に耐性を持ち、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性およびバイオアベイラビリティを改善するように設計される。細胞エキソヌクレアーゼは、標的として遊離型の５’末端を用いる。従って、一本鎖核酸の場合、選択性薬剤は核酸の５’側にカップリングされると安定化部分として働き得る。しかしながら、選択性薬剤が３’末端に連結された二本鎖核酸または一本鎖核酸を含んでなるコンジュゲートの場合、コンジュゲートは、通常はエキソヌクレアーゼの活性による核酸の分解を防ぐ基である安定化部分またはキャップ構造をさらに含み得る。二本鎖核酸の場合、下記の可能な配置が存在する。
［１］選択性薬剤は一方の鎖の５’末端に結合され、この場合、反対鎖の５’末端にキャップ構造を結合することが有用である。さらに、キャップ構造は、１つまたは２つの３’末端にも存在してよい。
［２］選択性薬剤は一方の鎖の３’末端に結合され、この場合、センス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端にキャップ構造を結合することが有用である。さらに、キャップ構造は、遊離３’末端に存在してよい。
［３］同じであっても異なっていてもよい２つ以上の選択性薬剤を含んでなるコンジュゲート、この場合、選択性薬剤はセンス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端にカップリグされている。場合により、キャップ構造は、１つまたは２つの遊離３’末端とカップリングされ得る。
【０１５２】
好ましい実施形態では、核酸は、選択性薬剤がアンチセンス鎖の５’末端に連結され、保護基がセンス鎖の５’末端に連結された二本鎖ＲＮＡである。なおさらに好ましい実施形態では、保護基は、構造
Ｍ−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
を有し、ここで、ＭはＨであり、ｄは０であり、Ａはポリエチレングリコール(polyehtylene glycol)のＣ１８スペーサーであり、Ｂはフラノースであり、ａは２であり、ｂおよびｃは１であり、かつ、Ｌ２およびＬ３はホスホジエステル結合である。
【０１５３】
別の実施形態では、前記核酸は、核酸鎖の一末端に多官能性リンカーによって結合された２つ以上のリガンドを含有してよい。好ましくは、リガンドはセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの５’末端と結合されている。従って、別の実施形態では、前記核酸は、センス鎖の５’末端に結合された二機能性リンカーを含有してよく、前記二機能性リンカーの各末端は三重再取り込み阻害剤（好ましくは、インダトラリン(indtaraline））とカップリングされている。別の実施形態では、前記核酸は、センス鎖の５’末端に結合された二機能性リンカーを含有してよく、前記二機能性リンカーの第１の末端はＳＲＩ（好ましくは、セルトラリン(sertonine)）とカップリングされ、前記二機能性リンカーの第２の末端はＮＤＲＩに連結されている。別の実施形態では、前記核酸は、アンチセンス鎖の５’末端に結合された二機能性リンカーを含有してよく、二機能性リンカーの各末端は三重再取り込み阻害剤（好ましくは、インダトラリン(indtaraline））とカップリングされている。別の実施形態では、前記核酸は、アンチセンス鎖の５’末端に結合された二機能性リンカーを含有してよく、前記二機能性リンカーの第１の末端はＳＲＩ（好ましくは、セルトラリン(sertonine)）にカップリングされ、前記二機能性リンカーの第２の末端はＮＤＲＩに連結されている。
【０１５４】
別の実施形態では、前記核酸は、センス鎖、アンチセンス鎖のいずれかまたはその両方の５’または３’末端のいずれかに結合された三官能性リンカーを含有し、前記三官能性リンカーの各末端はリガンドに結合されている。好ましい実施形態では、前記三官能性リンカーの３つの末端は、同じであっても異なってもよい三重再取り込み阻害剤に連結されている。好ましい実施形態では、センス核酸鎖の５’末端は３つのインダトラリン分子に連結されている。
【０１５５】
本発明のコンジュゲートは、
（ｉ）ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）またはノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）からなる群から選択される１以上の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１つの選択性薬剤と、
（ｉｉ）神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現される標的分子であって、α−シヌクレインまたはα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである標的分子に、特異的に結合することができる少なくとも１つの核酸と
を含んでなる。
【０１５６】
より好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、構造（ＩＩＩ）：
【化１４】
0006386461.tif 000015
およびその薬学上許容される形態を有し、式中、
ｎまたはｍは、それぞれ０以上６以下の値を有する整数であり；
ｐは、０以上４以下の値を有する整数であり；
ｑは、０以上２０以下の値を有する整数であり；
Ｒ１は、水素；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ；−ＣＯ２ＲＡ；−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２または−Ｃ（ＲＡ）３であり；ここで、ＲＡの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ３は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＣ；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＣＯ２ＲＣ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＣ；−ＳＯＲＣ；ＳＯ２ＲＣ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；または−Ｃ（ＲＣ）３であり：ここで、ＲＣの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ４は、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；または置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリールであり；
Ｒ５は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＥ；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＣＯ２ＲＥ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＥ；−ＳＯＲＥ；ＳＯ２ＲＥ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；または−Ｃ（ＲＥ）３であり、ここで、ＲＥの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分である。
【０１５７】
本発明のコンジュゲートの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはギャップマーである。好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲート(conjutate)のギャップマーは、４つの２’−Ｏメチル修飾リボヌクレオチドの２ブロックに隣接する１０個のデオキシヌクレオチドの中央ブロックを含んでなる。
【０１５８】
本発明によるコンジュゲートの特定の好ましい実施形態では、α−シヌクレインをコードするｍＲＮＡと、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４４８〜４６５番（配列番号４）、４９９〜５１６番（配列番号５）および５０２〜５１９（配列番号６）（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列(alpha-synucleic sequence)の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置する領域からなる群から選択される領域で特異的に結合することができるオリゴヌクレオチド。より好ましい実施形態では、ギャップマーは、配列番号１、配列番号２または配列番号３からなる群から選択される配列からなる。
【０１５９】
本発明のコンジュゲートの特定の実施形態では、選択性薬剤は、構造（ＩＩ）：
【化１５】
0006386461.tif 000016
を有する。
【０１６０】
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、下記の構造（ＩＶ）：
【化１６】
0006386461.tif 000017
を有し、式中、オリゴヌクレオチドは、α−シヌクレインをコードするｍＲＮＡと、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４４８〜４６５番（配列番号４）、４９９〜５１６番（配列番号５）および５０２〜５１９（配列番号６）（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置する領域からなる群から選択される領域で特異的に結合することができる核酸を含んでなる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３からなる群から選択される配列を有する。
【０１６１】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、センス鎖の５’末端が保護基とカップリングされ、アンチセンス鎖の５’末端が選択性薬剤とカップリングされ、保護基が構造：
Ｍ−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
を有し、
式中、ＭはＨであり、ｄは０であり、Ａはポリエチレングリコール(polyehtylene glycol)のＣ１８スペーサーであり、Ｂはフラノースであり、ａは２であり、ｂおよびｃは１であり、かつ、Ｌ２およびＬ３はホスホジエステル結合である、
二本鎖核酸を含んでなる。
【０１６２】
本発明の意味において、保護基は、連結化合物によってオリゴヌクレオチドの５’−ＯＨ基または３’−ＯＨ基に連結されてよい。
【０１６３】
例えば、単一のオリゴヌクレオチド分子中には、そのオリゴヌクレオチドが二本鎖であるか一本鎖であるかによって可変数、一般に２〜４の式（ＩＩ）の基を連結することが可能であり、ただし、前記架橋は５’−ＯＨおよび／または３’−ＯＨを介してなされる。また、式（Ｉ）のいくつかの基の鎖をオリゴヌクレオチドに連結することも可能であり、前記式（Ｉ）の基は、分子間および／またはオリゴヌクレオチドとの間でホスホジエステル結合を生じるホスホラミダイトで誘導体化されたものなどの連結化合物によって互いに連結される。また、オリゴヌクレオチド構築物は、オリゴヌクレオチドの一末端に連結された式（Ｉ）のいくつかの基とそのオリゴヌクレオチドの別の末端に連結された式（Ｉ）の別の基を含有してもよい。
【０１６４】
また、本発明ヌクレオチド構築物は、オリゴヌクレオチドの２本の鎖の５’−ＯＨ末端および３’−ＯＨ末端のあり得る総ての組合せで配置された、または式（Ｉ）の基に連結された、２つ以上の標的化薬剤を含有することもできる。さらに、２つ以上の標的化薬剤が存在する場合、これらは式（Ｉ）の基および／またはオリゴヌクレオチド(oligonuclotide)に直列で連結することもできる。
【０１６５】
オリゴヌクレオチド構築物が２つ以上の標的化薬剤を含有する場合、種々の組合せが可能である。例えば、保護基は、オリゴヌクレオチドの鎖の一方の５’−ＯＨ末端基または３’−ＯＨ末端基に連結することができる。別のあり得る組合せとしては、一方のオリゴヌクレオチド鎖の５’−ＯＨ基に連結された薬物化合物と、他方のオリゴヌクレオチド鎖に結合された式（Ｉ）の基の末端単位に連結された一連のアプタマーとを含む。
【０１６６】
Ｃ．本発明の医薬組成物
本発明者らは、本発明のコンジュゲートが本発明のコンジュゲートの核酸配列により標的化されるα−シヌクレインｍＲＮＡの発現を調節する能力を有することを見出した。特に、ＮＣＢＵ受託番号ＮＭ＿０００３４５のようなヒト−シヌクレインｍＲＮＡの４４８〜４６５（配列番号４）、４９９〜５１６（配列番号５）および５０２〜５１９（配列番号６）の領域を標的とするギャップマーを含んでなるコンジュゲートは、嗅球（ＢＯ）、黒質（ＳＮｃ／ＶＴＡ）、背側縫線核（ＤＲ）におけるα−シヌクレイン発現の低下を効果的に誘導することができる（実施例３および図４参照）。
【０１６７】
従って、当業者は、本発明のコンジュゲートが、本発明のコンジュゲート中に存在する核酸により標的とされる遺伝子の発現レベル、すなわち、α−シヌクレインの発現レベルの低下から利益を得る疾患の治療のために適していることを認識するであろう。よって、別の態様において、本発明は医薬に使用するための本発明によるコンジュゲートに関する。あるいは、本発明は、薬剤の製造のための本発明によるコンジュゲートの使用に関する。加えて、本発明はまた、本発明によるコンジュゲートと薬学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物にも関する。
【０１６８】
適当な量の本発明のオリゴヌクレオチド構造物は、薬学上許容される賦形剤および／または担体とともに処方して医薬組成物とすることができる。本発明によるコンジュゲートを含む組成物は、種々の経路により対象に送達することができる。例示的経路としては、線条体内、脳室内、髄腔内、実質内（例えば、線条体内）、鼻内、および眼内送達が挙げられる。組成物は、例えば、静脈内、皮下または筋肉注射により全身送達することもでき、それはコンジュゲートの末梢ニューロンへの送達に特に有用である。加えて、本発明のコンジュゲートを鼻内に投与することも可能で、それにより非侵襲的投与様式による全身投与が可能になる。心室内投与も適切な場合がある。好ましい送達経路は脳へ直接、例えば、脳室もしくは脳の視床下部へ、または脳の側方もしくは背側領域への送達である。
【０１６９】
本発明の医薬組成物は、複数の異なるコンジュゲートを含んでなってもよく、これらの異なるコンジュゲートは、同じ標的分子の異なる領域を標的とする核酸を含んでなる。よって、本医薬組成物は、それぞれ異なる核酸を含んでなる少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つおよびそれを超える異なるコンジュゲート(conjugataes)を含んでなり得る。
【０１７０】
当業者は、Remington's Pharmaceutical Science (第17版, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985)およびGoodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics (第8版, Pergamon Press, Elmsford, N.Y., 1990)（いずれも引用することにより本明細書の一部とされる）などの広く知られ利用可能な資料で論じられている原理および手順に精通している。
【０１７１】
本発明の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、標準的手順に従ってヒトおよび他の哺乳動物への送達投与に適合した医薬組成物として処方される。通常、静脈内または心室内投与用の組成物は無菌等張緩衝水溶液である。
【０１７２】
必要な場合、組成物は、注射部位における疼痛を緩和するために可溶化剤および局所麻酔薬も含み得る。一般に、成分は、アンプルまたは有効剤の量を示すサシェなどの気密容器中で、例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、個別にまたは単位投与形中に一緒に混合して供給される。組成物を点滴注入により投与すべき場合、製薬等級の無菌水または生理食塩水を含む点滴瓶を用いて投薬することができる。組成物が注射により投与される場合、成分を投与前に混合することができるように、無菌注射水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１７３】
静脈内投与以外の場合、組成物は少量の加湿剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、ゲル、ポリマー、または徐放性処方物とすることができる。組成物は、当技術分野において公知の従来の結合剤および担体を用いて処方することができる。処方物は、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカライド、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体、医薬の製造における機能性が十分確立されている不活性担体を含むことができる。リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなどへのカプセル化を含む種々の送達系が知られており、本発明の治療薬を投与するために使用することができる。
【０１７４】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートを含有する治療薬は、中性または塩形態として処方することができる。薬学上許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されたものなどの遊離アミノ基を伴って形成されたもの、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたものなどの遊離カルボキシル基を伴って形成されたものが挙げられる。
【０１７５】
Ｄ．本発明のコンジュゲートの治療的使用
本発明のコンジュゲートは、ＤＡＴ、ＳＥＲＴおよびＮＥＴからなる群から選択される神経伝達物質輸送体を発現する細胞においてα−シヌクレイン遺伝子をノックダウンすることにより改善され得る任意の疾患の治療のために使用することができる。当業者は、本コンジュゲートが細胞内でのタンパク質α−シヌクレインの異常発現（例えば、レビー小体におけるα−シヌクレインの蓄積）を特徴とする疾患の治療に、またはα−シヌクレインタンパク質は正常なレベルで発現されるが、前記標的タンパク質の発現を低下させることにより改善され得る疾患に有用であることを理解するであろう。
【０１７６】
よって、別の態様において、本発明は、レビー小体の沈着に関連する疾患の治療または予防において使用するための、
ｉ）ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）またはノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）からなる群から選択される１以上の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１つの選択性薬剤と、
ｉｉ）神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現される標的分子であって、α−シヌクレインまたはα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである標的分子に特異的に結合することができる少なくとも１つの核酸と
を含んでなる、本発明のコンジュゲートに関する。
【０１７７】
あるいは、本発明は、レビー小体の沈着に関連する疾患の治療を目的とする薬剤の製造のための、本発明によるコンジュゲートの使用に関する。
【０１７８】
あるいは、本発明は、それを必要とする対象においてレビー小体の沈着に関連する疾患を予防および／または(anto/or)治療するための方法であって、前記対象への治療上有効な量の本発明によるコンジュゲートの投与を含んでなる方法に関する。
【０１７９】
用語「レビー小体の沈着に関連する疾患」は、異常なニューロンのα−シヌクレイン封入の形成を生じるα−シヌクレイン代謝の障害を特徴とする病態を意味する。より詳しくは、レビー小体障害は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、ＰＤ型認知症（ＰＤＤ）および多系統萎縮症を含む。特定の実施形態では、レビー小体の沈着に関連する疾患は、パーキンソン病、レビー小体(Lewis bodies)型認知症および多系統萎縮症からなる群から選択される。
【０１８０】
パーキンソン病（ＰＤ）は、患者の運動技能、会話、およびその他の機能をしばしば損なう中枢神経系の変性障害である。パーキンソン病の症状は、黒質緻密部（ＳＮｐｃ）のドーパミン作動性細胞の著しい活性低下から起こる。これらのニューロンは、線条体に投射し、それらの欠損は運動を統制する大脳基底核内の神経回路の活性の変更、本質的には、直接的経路の阻害および間接的経路の興奮をもたらす。直接的経路は運動を促進し、間接的経路は運動を阻害するので、これらの細胞の欠損は運動低下性の運動障害をもたらす。ドーパミンの欠如は、運動野へ興奮性の投射を送る視床の前腹側核の阻害の増強をもたらし、これにより運動低下をもたらす。
【０１８１】
ＰＤは、ＳＮｐｃにおけるドーパミンニューロンの進行性欠損およびレビー小体（ＬＢ）と呼ばれる細胞内封入体の存在を特徴とする。神経化学的に、ＰＤは、ミトコンドリア複合体Ｉの機能不全および酸化ストレス指数の増大が顕著である。ＰＤに関して、酸化ストレス、ニトロソ化ストレス、ミトコンドリア機能不全、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集、ならびにアポトーシスを含むいくつかの病理機序が提案されている。ＰＤは、ほとんどの場合で孤発性であるが、ＰＤ症例の一部は家族性であることが示されている。同定されている第１の家族性ＰＤ遺伝子はα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）であり、これは実際に総てのＰＤ患者においてＬＢの主成分である。α−シヌクレインの通常の機能は十分に理解されていない。α−シヌクレインは脂質と結合することができ、ニューロンにおいては、おそらく脂質ラフトを介して前シナプス小胞および原形質膜と会合している。沈着した病的形態のα−シヌクレインは凝集し、正常なタンパク質よりも低い溶解度を示す。３つの点突然変異が家族性ＰＤを引き起こすと記載されているが、ＳＮＣＡ遺伝子の倍加および三倍化がＰＤおよびレビー小体病の一因であることも報告されている。よって、配列変異体を伴わなくとも、α−シヌクレイン負荷はレビー小体病の原因となり得る。
【０１８２】
レビー小体型認知症（ＤＬＢ）は、レビー小体型認知症、びまん性レビー小体病、皮質性レビー小体病またはレビー型老人性認知症としても知られる。この疾患は、アルツハイマー病およびパーキンソン病と密接に関連し、解剖学的には、死後の脳の組織学で検出可能なニューロンにおけるα−シヌクレインおよびユビキチンタンパク質の凝集塊であるレビー小体の存在を特徴とする。
【０１８３】
多系統萎縮症またはＭＳＡは、特定の脳領域における神経細胞の変性に関連する神経変性疾患である。細胞変性の結果として、患者において、運動、バランス、および膀胱制御または血圧調節などの身体の他の自律機能による問題を生じる。
【０１８４】
特定の好ましい実施形態では、本発明によるコンジュゲートは、脳室内または鼻腔内に投与される。
【０１８５】
Ｅ．本発明のコンジュゲートの合成
本発明のコンジュゲートは、一般に、有機合成における標準的手順を用いて合成される。当業者ならば、合成の厳密なステップは、合成すべきコンジュゲートの厳密な構造によって異なること認識するであろう。例えば、コンジュゲートが選択性薬剤にその５’末端を介してコンジュゲートされた単一の核酸鎖を含んでなる場合、合成は、通常、アミノ活性化オリゴヌクレオチドと反応性の活性化選択性試薬とを接触させることにより実施される。
【０１８６】
コンジュゲートが二本鎖核酸を含んでなる場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は標準的な分子生物学の手順を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで別々に合成され、アニリングルされる。典型的なコンジュゲートでは、第１の核酸鎖が選択性薬剤を担持し、第２の核酸鎖が保護基を担持する。さらにより好ましい実施形態では、選択性薬剤は第１の核酸鎖の５’末端とカップリングされ、かつ／または保護基は第２の核酸鎖の５’末端に結合されるが、選択性薬剤または保護基の付加は核酸鎖の３’末端に行うこともできる。
【０１８７】
コンジュゲートの合成は、以下のように行うことができる。
［１］構造
選択性薬剤−［オリゴヌクレオチド］−３’
を有するコンジュゲートは一般に下記の工程を用いて合成される。
（ｉ）選択性薬剤を活性化する。好ましくは、選択性薬剤の活性化基はスクシンイミド基またはアミノ基である。選択性薬剤が第一または第二アミノ基を担持した場合、活性化されたオリゴヌクレオチドは選択性薬剤内のアミノ基と反応し得るので、この活性化は必要でない場合がある、
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドをその５’末端で活性化する。好ましくは、オリゴヌクレオチドの活性化基はアミノ基（選択性薬剤がスクシンイミド基により活性化された場合）またはカルボキシル基（選択性薬剤がアミン基により活性化されたか、またはアミノ基を含有する場合）である、および
（ｉｉｉ）活性化された選択性薬剤と活性化されたオリゴヌクレオチドとを２つの活性化基間の反応に適した条件下で接触させる。
【０１８８】
［２］構造
保護基−［センス鎖］−３’
３’−［アンチセンス鎖］−選択性薬剤
を有するコンジュゲートは一般に下記の工程を用いて合成される。
（ｉ）選択性薬剤を活性化する。好ましくは、選択性薬剤の活性化基はスクシンイミドまたはアミノ基である。
（ｉｉ）センス鎖をその５’末端で活性化する。好ましくは、オリゴヌクレオチドの活性化基はアミノ基（選択性薬剤がスクシンイミド基により活性化された場合）またはカルボキシル基（選択性薬剤がアミン基により活性化された場合）である、
（ｉｉｉ）活性化された選択性薬剤と活性化されたセンス鎖を、２つの活性基間の反応に適した条件下で接触させる、
（ｉｖ）固定化したアンチセンス鎖に保護基を付加する。この工程は好ましくは反応性基がアセチル化またはベンジル化（フラノース基）、２−シアノエチル化（ホスホジエステル結合）およびＦＭＯＣ（環外アミノ基）により封鎖されているオリゴヌクレオチドを用いて行われる、
（ｖ）センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングする。
【０１８９】
本発明のコンジュゲートは、当業者により知られた技術を用いて調製することができる。コンジュゲートの合成は、官能基の選択的保護および脱保護を含み得る。好適な保護基は当業者に周知である。例えば、有機化学における保護基の総説は、Wuts, P.G.M. and Greene T.W. Protecting Groups in Organic Synthesis (第4版 Wiley-Interscience)、およびKocienski P.J. Protecting Groups (第3版 Georg Thieme Verlag)で提供されている。
【０１９０】
本発明に関して、以下の用語は下記で詳細に示す意味を有する。
用語「Ｃ１−Ｃ６アルキル」は、不飽和を含まず、単結合により分子の残りの部分に連結している１〜６個の、好ましくは１〜３個の（Ｃ１−Ｃ３アルキル）炭素原子を有する炭素原子と水素原子からなる線状または分岐型の炭化水素基を意味する。アルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシルなどのアルキル基が挙げられる。好ましくは、アルキルはメチルを意味する。
【０１９１】
用語「ハロゲン」は、ブロモ、クロロ、ヨードまたはフルオロを意味する。
【０１９２】
用語「ハロアルキル」は、少なくとも１個の水素原子がハロゲンにより置き換えられた上記で定義されるアルキル基を意味する。ハロアルキル基の例としては、限定されるものではないが、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＨＦ２、ＣＦ２ＣＦ３が挙げられる。好ましくは、ハロアルキルはＣＦ３を意味する。
【０１９３】
用語「Ｃ６−Ｃ１０アリール」は、例えばフェニル、ナフチルおよびジフェニルを含む、炭素−炭素結合により結合したまたは縮合した１または２個の芳香族核を含んでなる、６〜１０個の間の炭素原子を有する芳香族基を意味する。好ましくは、「アリール」はフェニルを意味する。
【０１９４】
用語「ヘテロシクリル」は、炭素原子と窒素、酸素、および硫黄およびからなる群から選択される１〜５個のヘテロ原子とからなり、部分的もしくは完全飽和または芳香族（「ヘテロアリール」）であり得る、安定な３〜１０員環基、好ましくは、５員または６員環を意味する。本発明の目的では、この複素環はモノシクリル、ビシクリルまたはトリシクリル環構造であり得、縮合環の系を含み得る。特定の実施形態では、ヘテロシクリル基はスクシンイミドである。
【０１９５】
上記の式（ＩＩＩ）により表される本発明の化合物は、キラル中心の存在に応じて立体異性体を含み得る。単一の異性体、鏡像異性体またはジアステレオ異性体およびそれらの混合物は本発明の範囲内にある。
【０１９６】
特に断りのない限り、本発明において使用する化合物は、１以上の同位体が富化された原子が存在することのみが異なる化合物を含むことが意図される。例えば、水素の重水素もしくはトリチウムによる置換、または炭素の１３Ｃもしくは１４Ｃが富化された炭素による置換、または１５Ｎが富化された窒素による置換を除き、本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内にある。
【０１９７】
アミノ誘導体化核酸および活性化三重再取り込み阻害剤を用いた合成
第一の実施形態において、本発明によるコンジュゲートは、アミノ誘導体化核酸と構造（Ｉ）を有する化合物またはその類似体の活性化された誘導体形態をカップリングさせることによって得ることができる。特定の実施形態では、活性化された誘導体形態は、下記構造（ＶＩＩ）による、Ｒ２がＨである構造（Ｉ）を有する化合物の誘導体であり、
【化１７】
0006386461.tif 000018
式中、
ｎまたはｍは、それぞれ０以上６以下の値を有する整数であり；
ｐは、０以上４以下の値を有する整数であり；
ｑは、０以上２０以下の値を有する整数であり；
Ｒ１は、水素；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ；−ＣＯ２ＲＡ；−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２または−Ｃ（ＲＡ）３であり；ここで、ＲＡの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ３は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＣ；-Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＣＯ２ＲＣ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＣ；−ＳＯＲＣ；ＳＯ２ＲＣ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；または−Ｃ（ＲＣ）３であり；ここで、ＲＣの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ４は、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；または置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリールであり；
Ｒ５は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＥ；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＣＯ２ＲＥ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＥ；−ＳＯＲＥ；ＳＯ２ＲＥ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；または−Ｃ（ＲＥ）３であり、ここで、ＲＥの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり
Ｒ６は、カルボニル活性化基である。
【０１９８】
用語「カルボニル活性化基」は、カルボニルに求核付加を受けやすくするカルボニルの置換基を意味する。特定の実施形態では、それはカルボニル基とともにアンヒドリド、酸ハリドまたはエステル基を形成する。好ましい実施形態では、カルボニル活性化基は、ハロゲン、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＲ’、−ＳＲ’’から選択され；Ｒ、Ｒ’およびＲ’’は独立にＣ１−Ｃ６アルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから選択される。
【０１９９】
用語「カルボニル活性化基」は、カルボン酸基のカルボニルを例えば、アンヒドリド、カルボン酸ハリド、カルボジイミド、ハロゲン化剤、ジスルフィドなどの求核付加をより受けやすいものに変換する化合物を意味する。特定の実施形態では、カルボニル活性化基は、ハロゲン化剤(halogentaing agent)、Ｒ（Ｏ）ＣＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＲＣ（Ｏ）ハロゲン、Ｒ’ＯＨ、Ｒ’’ＳＨ、Ｒ’’ＳＳＲ’’から選択され；ここで、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’は独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから選択される。
【０２００】
特定の実施形態では、カルボニル活性化基は、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドである。この場合、反応は好ましくは、さらなるカルボニル活性化基の存在下で実施される。
【０２０１】
このプロセスに好適なカルボニル活性化基としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などのカルボジイミド、ならびに１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）および１−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）などのトリアゾロールが含まれる。好ましい実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、ジイソプロピルカルボジイミドの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、活性化誘導体を得る。
【０２０２】
特定の実施形態では、Ｒ６は、スクシンイミドオキシ基である。よって、別の実施形態では、本発明によるコンジュゲートは、アミノ誘導体化核酸とセルトラリンまたはその類似体の活性化誘導体形態をカップリングさせることにより得ることができ、ここで、選択性薬剤の活性化誘導体は、式（ＶＩＩＩ）の化合物であり、
【化１８】
0006386461.tif 000019
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ｎ、ｍ、ｐおよびｑは上記で定義される通りである。
【０２０３】
特定の実施形態によれば、式（ＶＩＩＩ）の活性化化合物は、化合物：
【化１９】
0006386461.tif 000020
である。
【０２０４】
一実施形態によれば、本発明による化合物は、下記を含んでなる一連の手順によって調製することができる。
ａ）式（Ｖ）
【化２０】
0006386461.tif 000021
の化合物と、式（ＩＸ）：
【化２１】
0006386461.tif 000022
［式中、ｐは上記で定義される通りであり、ＺはハロゲンまたはＯＨであり、かつ、ＰＧはアミン保護基である。］
のアシル化剤を反応させて、式（Ｘ）：
【化２２】
0006386461.tif 000023
の化合物を得ること。
【０２０５】
アミンに対する慣用の保護基としては、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート、ベンジルカルバメート、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート、２−トリメチルシリルエチルカルバメート、９Ｈ−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ）カルバメート、アリルカルバメートまたはニトロフェニルカルバメートなどのカルバメート；ホルムアミド、アセトアミド、トリフルオロアセトアミド、スルホンアミド、トリフルオロメタンスルホニルアミドまたはｔｅｒｔ−ブチルスルホニルアミドなどのアミド；ならびにｐ−メトキシフェニルアミン、ベンジルアミン、ｐ−メトキシベンジルアミン、３，４−ジメトキシベンジルアミン、ジメトキシトリチルアミンまたはモノメトキシトリチルアミンなどのアリールまたはアリールアルキル(arylakylamines)が含まれる。特定の実施形態では、式（ＩＸ）のアシル化剤は、９Ｈ−フルオレニルメトキシカルボニル−６−アミノヘキサン酸である。
【０２０６】
式（Ｖ）の化合物は、次に、例えば、米国特許第６４５５７３６号に記載のとおりに調製することができる。特に、式（Ｖ）の化合物がセルトラリンである場合、それは対応するクロロ水和物（市販）から、アルカリまたはアルカリ土類カーボネートカーボネートまたはヒドロキシド、アンモニアまたはアミン、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ピペリジン、モルホリンなどの有機または無機塩基を含む好適な塩基で処理することによって得ることができる。
【０２０７】
ｂ）式（Ｖ）の化合物のアミノ保護基を脱保護して式（ＸＩ）：
【化２３】
0006386461.tif 000024
の化合物を得ること。
【０２０８】
好適な脱保護条件は、例えば、Protecting Groups in Organic Synthesis (Wuts, P.G.M. and Greene T.W., 第4版 Wiley-Interscience)およびProtecting Groups (Kocienski P.J., 第3版Georg Thieme Verlag)において、当業者に公知である。特定の実施形態では、保護基は、ピペリジン、モルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジイソプロピルエチルアミンまたはジメチルアミノピリジンなどのアミンの存在下、好ましくは、ピペリジンの存在下で除去される。
【０２０９】
ｃ）式（ＸＩ）の化合物を式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩＩ）：
【化２４】
0006386461.tif 000025
［式中、ｎは上記で定義される通りであり、ＺはハロゲンまたはＯＨである。］
のアシル化剤を反応させて式（ＸＩＶ）：
【化２５】
0006386461.tif 000026
の化合物を得ること。
【０２１０】
特定の実施形態では、アシル化剤は無水コハク酸である。
【０２１１】
ｄ）式（ＸＩＶ）の化合物をカルボニル活性化基で処理すること。
【０２１２】
用語「カルボニル活性化基」は、カルボン酸基のカルボニルを、例えば、アンヒドリド、カルボン酸ハリド、カルボジイミド、ハロゲン化剤、ジスルフィドなどの求核付加をより受けやすいものに変換する化合物を意味する。特定の実施形態では、カルボニル活性化基は、ハロゲン化剤(halogentaing agent)、Ｒ（Ｏ）ＣＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＲＣ（Ｏ）ハロゲン、Ｒ’ＯＨ、Ｒ’’ＳＨ、Ｒ’’ＳＳＲ’’から選択され；ここで、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’は独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから選択される。
【０２１３】
特定の実施形態では、カルボニル活性化基は、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドである。この場合、反応は好ましくは、さらなるカルボニル活性化基の存在下で実施される。
【０２１４】
よって、特定の実施形態では、工程ｄ）は、式（ＸＩＶ）の化合物をさらなるカルボニル活性化基の存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドで処理することを含んでなる。
【０２１５】
このプロセスに好適なカルボニル活性化基としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などのカルボジイミド、ならびに１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）および１−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）などのトリアゾロールが含まれる。好ましい実施形態では、式（ＸＩＶ）の化合物をジイソプロピルカルボジイミドの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて活性化誘導体を得る。
【０２１６】
別の態様によれば、本発明は、式（Ｘ）
【化２６】
0006386461.tif 000027
［式中、Ｒ１〜Ｒ５、ｍ、ｎ、ｏ、ｐおよびＰＧは上記で定義される通りである。］
の中間体を対象とする。
【０２１７】
好ましい実施形態では、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２〜Ｒ５は水素であり、ＸおよびＹはクロリドであり、Ｗは水素であり、ｐは５であり、ＰＧは９Ｈ−フルオレニルメトキシカルボニルである。より好ましくは、式（Ｘ）の化合物は化合物：
【化２７】
0006386461.tif 000028
である。
【０２１８】
別の態様によれば、本発明は、式（ＸＩ）
【化２８】
0006386461.tif 000029
［式中、Ｒ１〜Ｒ５、ｍ、ｎ、ｏおよびｐは上記で定義される通りである。］
の中間体を対象とする。
【０２１９】
より好ましくは、式（ＶＩＩ）の化合物は、化合物：
【化２９】
0006386461.tif 000030
である。
【０２２０】
別の態様によれば、本発明は、式（ＸＩＶ）
【化３０】
0006386461.tif 000031
［式中、Ｒ１〜Ｒ５、ｍ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑは上記で定義される通りである。］
の中間体を対象とする。
【０２２１】
より好ましくは、式（ＶＩＩ）の化合物は、
【化３１】
0006386461.tif 000032
である。
【０２２２】
別の態様によれば、本発明は、式（ＸＶ）
【化３２】
0006386461.tif 000033
［式中、Ｒ１〜Ｒ６、ｍ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑは上記で定義される通りである。］
の中間体を対象とする。
【０２２３】
より好ましくは、式（ＸＶ）の化合物は、化合物：
【化３３】
0006386461.tif 000034
である。
【０２２４】
選択性薬剤に結合されるｓｉＲＮＡ鎖は、M.J. Gait. IRL Press-1985により編集された“Oligonucleotide synthesis, a practical approach.”に開示されている方法に従って固相支持体上での段階的固相合成によって形成される。
【０２２５】
選択性薬剤をコンジュゲートするためには、オリゴヌクレオチドはアミノ誘導体化する必要がある。これは５’末端または３’末端で行うことができる。好ましい実施形態では、選択性薬剤は５’末端に結合されている。
【０２２６】
本発明の合成の一実施形態によれば、本発明によるコンジュゲートは、選択性薬剤と式：
【化３４】
0006386461.tif 000035
のアミノ修飾オリゴヌクレオチドを反応させることによって調製することができる。
【０２２７】
アミノリンカー修飾因子を用いてオリゴヌクレオチドを活性化するための一般手法は一般に、以下のスキームに従う。
【化３５】
0006386461.tif 000036
【０２２８】
オリゴヌクレオチドの５’−ＯＨ基をアミノリンカーにカップリングした後、アミン保護基を既知の条件下で除去する。例えば、ＴＦＡ保護アミノ誘導体はアンモニアで処理することにより脱保護でき、ＭＭＴ保護アミノ誘導体は酢酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸またはトリフルオロ酢酸で処理することにより脱保護できる。
【０２２９】
アミノ修飾オリゴヌクレオチドの一般合成法
（ｉ）無水アセトニトリル中にリンカー／修飾因子分子（真空乾燥）の溶液（市販のほとんどのアミダイト中で０．１Ｍ溶液が使用される）を作製し、それを合成装置（Ｙ）の外部リザーバーに入れる、
（ｉｉ）必要なオリゴヌクレオチド配列の合成の開始時に、Ｙ塩基を５’末端に付加する、これによりＹリザーバーからのリンカー／修飾因子分子の、オリゴヌクレオチド配列の末端へのカップリングが可能となる、
（ｉｉｉ）適当なカップリングサイクルを用いて合成を開始する。同じカップリングサイクルを用いて、リンカー／修飾因子分子のカップリングも行う、
（ｉｖ）オリゴヌクレオチド合成の終了時に、支持体を洗浄し、最後に支持体をガスで乾燥させる、
（ｖ）固相支持体をカラムから取り出し、それをねじ口バイアルに移し、２段階の脱保護を完了させる。
【０２３０】
アミノ修飾オリゴヌクレオチドは、選択性薬剤とのさらなるコンジュゲーションのために脱保護されなければならない。この目的で、オリゴヌクレオチド中の残存する保護基を総て次のように除去する。２０％ｖ／ｖのメチルアミン（水溶液４０％ｗ／ｖ）および８０％ｖ／ｖの飽和アンモニア溶液（３０〜３２％ｗ／ｖのＮＨ３を含有する）を含有する５００μｌの混合物をオリゴヌクレオチド（２００ｎｍｏｌ規模）の入ったエッペンドルフ管に加えた。この管を密閉して４５分間６５℃の温度に加熱した。この手順によりヌクレオチドのリン原子における保護基（フラノースのアセチル化またはベンゾイル化およびホスホジエステル結合の２−シアノエチル化）および環外アミノ基の保護基（Ｂｚ、Ａｃ、ＩＢｕ）が排除される。次に、この混合物を冷却し、濾過し、上清を乾燥させた。残留ペレットを１Ｍトリエチルアミン−ＨＦと３時間６５℃で反応させて保護基をヌクレオチド（２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ＴＢＤＭＳ）の２’で切断した。最後に、得られた溶液をセファデックスカラムで脱塩すると、アミノ修飾５’−オリゴヌクレオチドが残った。
【０２３１】
アミノ修飾因子リンカーを３’ＯＨ末端に組み込む場合、対応するポリマー支持体（ＣＰＧボール）を使用するべきであり、合成スキームは下図に相当する：
【化３６】
0006386461.tif 000037
（加水分解は水酸化アンモニウムまたはＢｅｃｋｍａｎ試薬を使用することにより行うことができる）（メチルアミン：水酸化アンモニウム）。
【０２３２】
両場合とも、脱保護工程は同じであり、このようなイベントでのコンジュゲーションアプローチもまた同じであるが、効率は異なる。ほとんどの場合、５’−アミノ誘導体化でより良い結果が達成される。
【０２３３】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、予め二価または三価のホスホルアミドと反応させる。このようにして２つまたは３つのカップリング位置(copupling positions)を有する化合物を得ることができ、その結果、２分子または３分子の選択性薬剤がオリゴヌクレオチドとカップリングされ得る。前記２分子または３分子の選択性薬剤は、同じであっても異なっていてもよい。
【０２３４】
特定の実施形態では、２分子または３分子の同じ選択性薬剤がオリゴヌクレオチドとカップリングされる。別の実施形態では、２つまたは３つの異なる選択性薬剤がオリゴヌクレオチドとカップリングされる。
【０２３５】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドを、２価または３価のホスホラミダイトと反応させる。
【０２３６】
ヒドロキシ保護基、ならびに好適な保護および脱保護条件は、例えば、Protecting Groups in Organic Synthesis (Wuts, P.G.M. and Greene T.W., 第4版 Wiley-Interscience)およびProtecting Groups (Kocienski P.J., 第3版 Georg Thieme Verlag) において、当業者に公知である。
【０２３７】
特定の実施形態では、ヒドロキシ保護基は、エーテル、シリルエーテル、エステル、スルホネート、スルフェネート、スルフィネート、カーボネートおよびカルバメートから選択される。好ましい実施形態では、ヒドロキシル保護基は、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル(tetrehydropyranyl)（ＴＨＰ）、トリチル（Ｔｒ）、９Ｈ−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、およびトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテルから選択される。好ましくは、ＰＧ、ＰＧ’およびＰＧ’’は独立にＨ、ＤＭＴおよびＦｍｏｃから選択される。
【０２３８】
カルボキシ誘導体化核酸と活性化三重取り込み阻害剤を用いる合成
別の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、アミノ誘導体化選択性薬剤とカルボキシル誘導体化オリゴヌクレオチドのコンジュゲーションにより得られる。特に、本発明のコンジュゲートは構造（ＩＩＩ）：
【化３７】
0006386461.tif 000038
およびその薬学上許容される形態を有し、式中、
ｎまたはｍは、それぞれ０以上６以下の値を有する整数であり；
ｐは、０以上４以下の値を有する整数であり；
ｑは、０以上２０以下の値を有する整数であり；
Ｒ１は、水素；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ；−ＣＯ２ＲＡ；−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２または−Ｃ（ＲＡ）３であり；ここで、ＲＡの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ３は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＣ；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＣＯ２ＲＣ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＣ；−ＳＯＲＣ；ＳＯ２ＲＣ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；または−Ｃ（ＲＣ）３であり：ここで、ＲＣの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ４は、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；または置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリールであり；
Ｒ５は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＥ；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＣＯ２ＲＥ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＥ；−ＳＯＲＥ；ＳＯ２ＲＥ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；または−Ｃ（ＲＥ）３であり、ここで、ＲＥの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり、
かつ、オリゴヌクレオチドは、標的分子に特異的に結合することができる核酸であり、前記標的分子はα−シヌクレインまたはα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである。
【０２３９】
（ＩＩＩ）の構造を有するコンジュゲートの合成方法は、（Ｖ）：
【化３８】
0006386461.tif 000039
の構造を有する化合物と、式（ＶＩ）：
【化３９】
0006386461.tif 000040
を有するカルボキシ修飾オリゴヌクレオチドを反応させることを含んでなる。
【０２４０】
よって、本発明はまた、オリゴヌクレオチドが、標的分子に特異的に結合することができる核酸であり、前記標的分子がα−シヌクレインまたはα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである、構造（ＶＩ）を有する化合物に関する。特定の実施形態では、構造（ＶＩ）を有する化合物(compoung)内のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスギャップマーである。特に、前記ギャップマーは、４つの２’−Ｏメチル修飾リボヌクレオチドのブロックに隣接する１０個のデオキシヌクレオチドの中央ブロックを含んでなる。
【０２４１】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４４８〜４６５番（配列番号４）、４９９〜５１６番（配列番号５）および５０２〜５１９番（配列番号６）（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置する領域からなる群から選択されるα−シヌクレインｍＲＮＡ内の領域に標的化される。好ましい実施形態では、構造（ＶＩ）を有する化合物内のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３からなる群から選択される配列からなる。
【０２４２】
アミンに対する慣用の保護基としては、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート、ベンジルカルバメート、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート、２−トリメチルシリルエチルカルバメート、９Ｈ−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ）カルバメート、アリルカルバメートまたはニトロフェニルカルバメートなどのカルバメート；ホルムアミド、アセトアミド、トリフルオロアセトアミド、スルホンアミド、トリフルオロメタンスルホニルアミドまたはｔｅｒｔ−ブチルスルホニルアミドなどのアミド；ならびにｐ−メトキシフェニルアミン、ベンジルアミン、ｐ−メトキシベンジルアミン、３，４−ジメトキシベンジルアミン、ジメトキシトリチルアミンまたはモノメトキシトリチルアミンなどのアリールまたはアリールアルキル(arylakylamines)が含まれる。特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）のアシル化剤は、９Ｈ−フルオレニルメトキシカルボニル−６−アミノヘキサン酸である。
【０２４３】
好適な脱保護条件は、例えば、Protecting Groups in Organic Synthesis (Wuts, P.G.M. and Greene T.W., 第4版 Wiley-Interscience)およびProtecting Groups (Kocienski P.J., 第3版Georg Thieme Verlag)において、当業者に公知である。特定の実施形態では、保護基は、ピペリジン、モルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジイソプロピルエチルアミンまたはジメチルアミノピリジンなどのアミンの存在下、好ましくは、ピペリジンの存在下で除去される。
【０２４４】
選択性薬剤に結合されるｓｉＲＮＡ鎖は、M.J. Gait. IRL Press-1985により編集された“Oligonucleotide synthesis, a practical approach.”に開示されている方法に従って固相支持体上での段階的固相合成によって形成される。
【０２４５】
選択性薬剤をコンジュゲートするためには、オリゴヌクレオチドはカルボキシ誘導体化する必要がある。これは５’末端または３’末端で行うことができる。好ましい実施形態では、選択性リガンドは５’末端に結合されている。
【０２４６】
一実施形態によれば、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、上記のような式（Ｖ）の化合物と式（ＶＩ）のカルボキシ修飾オリゴヌクレオチドを反応させることによって調製することができる。
【０２４７】
カルボキシルリンカー修飾因子を用いてオリゴヌクレオチドを活性化するための一般手順は、典型的には下記のスキームに従う。
【化４０】
0006386461.tif 000041
【０２４８】
カルボキシ修飾オリゴヌクレオチドの一般合成法
（ｉ）無水アセトニトリル中に修飾因子分子の溶液を作製し、それを合成装置（Ｙ）の外部リザーバーに入れる、
（ｉｉ）必要なオリゴヌクレオチド配列の合成の開始時に、Ｙ塩基を５’末端に付加する、これによりＹリザーバーからのリンカー／修飾因子分子の、オリゴヌクレオチド配列の末端へのカップリングが可能となる、
（ｉｉｉ）適当なカップリングサイクルを用いて合成を開始する。同じカップリングサイクルを用いて、リンカー／修飾因子分子のカップリングも行う、
（ｉｖ）オリゴヌクレオチド合成の終了時に、支持体を洗浄し、最後に支持体をガスで乾燥させる、
（ｖ）固相支持体をカラムから取り出し、それをねじ口バイアルに移し、２段階の脱保護を完了させる。
【０２４９】
カルボキシ修飾オリゴヌクレオチドは、選択性薬剤とのさらなるコンジュゲーションのために脱保護されなければならない。この目的で、オリゴヌクレオチド中の残存する保護基を総て次のように除去する。２０％ｖ／ｖのメチルアミン（水溶液４０％ｗ／ｖ）および８０％ｖ／ｖの飽和アンモニア溶液（３０〜３２％ｗ／ｖのＮＨ３を含有する）を含有する５００μｌの混合物をオリゴヌクレオチド（２００ｎｍｏｌ規模）の入ったエッペンドルフ管に加えた。この管を密閉して４５分間６５℃の温度に加熱した。この手順によりヌクレオチドのリン原子における保護基（フラノースのアセチル化またはベンゾイル化およびホスホジエステル結合の２−シアノエチル化）および環外アミノ基の保護基（Ｂｚ、Ａｃ、ＩＢｕ）が排除される。次に、この混合物を冷却し、濾過し、上清を乾燥させた。残留ペレットを１Ｍトリエチルアミン−ＨＦと３時間６５℃で反応させて保護基をヌクレオチド（２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ＴＢＤＭＳ）の２’で切断した。最後に、得られた溶液をセファデックスカラムで脱塩すると、カルボキシ修飾５’−オリゴヌクレオチドが残った。
【０２５０】
特定の実施形態では、本発明の方法により合成されたコンジュゲートにより含まれるオリゴヌクレオチドは、アンチセンスギャップマーである。特に、ギャップマーは、４つの２’−Ｏメチル修飾リボヌクレオチドのブロックに隣接する１０個のデオキシヌクレオチドの中央ブロックを含んでなる。
【０２５１】
好ましい実施形態では、本発明の方法により合成されるコンジュゲートにより含まれるオリゴヌクレオチドは、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４４８〜４６５番（配列番号４）、４９９〜５１６番（配列番号５）および５０２〜５１９番（配列番号６）（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置する領域からなる群から選択されるα−シヌクレインｍＲＮＡ内の領域に標的化される。特に、前記核酸は、配列番号１、配列番号２または配列番号３からなる群から選択される配列からなる。
【０２５２】
次に、カルボキシル活性化オリゴヌクレオチドを、上記で定義されるような式（Ｖ）の選択性薬剤の活性化誘導体と反応させる。一般式（ＩＩＩ）を有する化合物が得られる。
【化４１】
0006386461.tif 000042
【０２５３】
特に、この化合物（ＩＩＩ）は、標的分子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドを含んでなり、前記標的分子はα−シヌクレインまたはα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである。特定の実施形態では、構造（ＩＩＩ）を有する化合物内のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスギャップマーである。特に、前記ギャップマーは、４つの２’−Ｏメチル修飾リボヌクレオチドのブロックに隣接する１０個のデオキシヌクレオチドの中央ブロックを含んでなる。
【０２５４】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトα−シヌクレインｍＲＮＡの４４８〜４６５番（配列番号４）、４９９〜５１６番（配列番号５）および５０２〜５１９番（配列番号６）（前記ナンバリングは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３４５（配列番号７）に定義されるα−シヌクレイン配列の最初のヌクレオチドに対する位置に相当する）に位置する領域からなる群から選択されるα−シヌクレインｍＲＮＡ内の領域に標的化される。好ましい実施形態では、構造（ＩＩＩ）を有する化合物内のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３からなる群から選択される配列からなる。
【０２５５】
Ｆ．診断用のコンジュゲートおよびそれらの使用
神経伝達物質輸送体に高い親和性で結合することができる選択性薬剤を使用することにより治療用化合物を標的細胞に特異的に送達し得るということはまた、診断目的に使用できる化合物の送達にも応用できる。従って、別の実施形態において、本発明は、
ｉ）ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）またはノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）からなる群から選択される１以上の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１つの選択性薬剤と、
ｉｉ）撮像剤と
を含んでなるコンジュゲートを提供する。
【０２５６】
用語「選択性薬剤」および「神経伝達物質輸送体」は上記で詳細に説明されており、本発明の診断用コンジュゲートについても同様に理解することができる。
【０２５７】
用語「撮像剤」および「造影剤」は、本明細書において互換的に使用され、その使用により、その像の異なる領域間の「コントラスト」を増強することにより像の異なる部分の区別が容易になる生体適合性化合物を意味する。従って、用語「造影剤」は、そのような薬剤の不在下でも生成可能な像（例えば、ＭＲＩの場合）の品質を向上させるために使用される薬剤、ならびに像の生成に欠くことのできない薬剤（例えば、核撮像の場合）を包含する。好適な造影剤としては、限定されるものではないが、放射性核種撮像用、コンピューター断層撮影用、ラマン分光法用、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）用および光学的撮像用の造影剤が挙げられる。
【０２５８】
放射性核種撮像用の造影剤として、通常、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、８２Ｒｂ、６２Ｃｕおよび６８Ｇａなどの陽電子放射体で標識された放射性薬剤が挙げられる。ＳＰＥＣＴ放射性薬剤は、通常、９４ｍＴｃ、２０１Ｔｌおよび６７Ｇａなどの陽電子放射体で標識される。放射性核種撮像様式（陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）；単光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ））は、放射性核種で標識された放射性トレーサーの位置および濃度をマッピングする診断用断面撮像技術である。ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴは、代謝活性を測定することにより放射性核種の位置決定および同定を行うために使用することができる。ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴは、細胞生存率などの細胞レベルでの情報に属する情報を提供する。ＰＥＴにおいて、患者は、陽電子を放出する微弱な放射性物質を摂取するかまたは注射され、この物質は身体中を移動するのでモニタリングすることができる。一つの一般的な適用では、例えば、患者は陽電子放射体が結合されたグルコースを与えられ、患者が種々の課題を遂行する際の脳がモニタリングされる。脳はそれが働く際にグルコースを使用するので、ＰＥＴ像はどこで脳活性が高いかを示す。本発明のある実施形態では、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏのＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ撮像のためにｅｘ  ｖｉｖｏで標識する。ＰＥＴと密接に関係するのは単光子放射コンピューター断層撮影法、またはＳＰＥＣＴである。この二者の間の主な違いは、ＳＰＥＣＴが、陽電子放出物質の代わりに低エネルギー光子を放出する放射性トレーサーを使用することである。
【０２５９】
ＣＴ撮像用の造影剤は、例えば、ヨウ素化または臭素化造影媒体を含む。これらの薬剤の例としては、イオタラメート、イオヘキシル、ジアトリゾエート、イオパミドール、エチオドールおよびイオパノエートが挙げられる。ガドリニウム剤もＣＴ造影剤として使用されることが報告されている（例えば、Henson  et  al.,2004参照）。例えば、ガドペンテート剤がＣＴ造影剤として使用されている（Strunk  and  Schild,2004で論述）。コンピューター断層撮影（ＣＴ）が本発明に関して撮像様式として企図される種々の角度から時には千本を超える一連のＸ線を用い、次にそれらをコンピューターと組み合わせることにより、ＣＴは身体の任意の部分の３次元像を構築することを可能にする。コンピューターは任意の角度からおよび任意の深さで２次元断面を表示するようにプログラムされている。ＣＴにおいて、最初のＣＴスキャンで診断がつかないときには、本明細書に記載したものなどの放射線不透過造影剤の静注が、軟組織体の同定および描写の助けとなり得る。
【０２６０】
光学的撮像用の造影剤としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、インドシアニングリーン、オレゴングリーン、オレゴングリーン誘導体の誘導体、ローダミングリーン、ローダミングリーン誘導体、エオシン、エリスロシン、テキサスレッド、テキサスレッド誘導体、マラカイトグリーン，ナノゴールドスルホスクシンイミジルエステル、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン、ピリジルオキサゾール誘導体、カスケードイエロー色素、ダポキシル色素および本明細書に開示されている種々の他の蛍光化合物が挙げられる。
【０２６１】
好ましい実施形態では、造影剤は、磁気共鳴撮像装置により撮像可能な化合物である。磁気共鳴撮像装置により撮像可能な造影剤は、他の撮像技術で使用されるものと異なる。それらの目的は、同一のシグナル特性を有する組織コンパートメント間を識別するのに役立つこと、および緩和時間を短縮すること（Ｔｌ強調スピンエコーＭＲ像により強いシグナルを、そしてＴ２強調像に低強度のシグナルを生ずることになる）である。ＭＲＩ造影剤の例としては、ガドリニウムキレート、マンガンキレート、クロムキレート、および鉄粒子が挙げられる。特定の一実施形態では、ＭＲＩ造影剤は１９Ｆである。ＣＴおよびＭＲＩは両方とも組織境界を識別するのに役立つ解剖学的情報を提供する。ＣＴに比較したＭＲＩの欠点として、患者の忍容性が低いこと、ペースメーカーおよびある種の他の金属インプラントデバイスの禁忌、ならびに複数の原因（それらの少なからずが運動である）が関係するアーチファクトが挙げられる。他方、ＣＴは迅速で、十分な忍容性があり、かつ容易に利用できるが、ＭＲＩよりコントラスト解像度が低く、ヨウ素化造影剤およびイオン化性放射線が必要になる。ＣＴおよびＭＲＩの両方の欠点は、いずれの撮像様式も細胞レベルにおける機能的情報を提供しないことである。例えば、いずれの様式も細胞生存率に関する情報を提供しない。磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）は、ＣＴより新しく、高強度磁石およびラジオ波周波数シグナルを使用して像を生成する撮像様式である。生物組織中に最も豊富な分子種は水である。撮像検査で最終的にシグナルを生じさせるのは、水のプロトン核の量子力学的「スピン」である。ＭＲＩにおいては、撮像される試料が強い静的磁場（１〜１２テスラ）に置かれ、スピンがラジオ波周波数（ＲＦ）の放射線のパルスで励起されて試料中に正味の磁化を生じさせる。次に、種々の磁場勾配および他のＲＦパルスがスピンに作用して、記録されるシグナル中に空間的情報をコードする。これらのシグナルを収集して解析することにより、ＣＴ像同様に、通常２次元断面で表示される３次元画像を計算することが可能である。
【０２６２】
ＭＲＩ造影剤としては、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）からなる群から選択される金属の錯体が挙げられる。好ましい実施形態では、磁気共鳴撮像装置により撮像することができる化合物は、ガドリニウム系化合物である。
【０２６３】
用語「ガドリニウム系化合物」は、本明細書で使用する場合、撮像に関して使用される場合には、対象に投与可能で静脈内増強が生ずる任意のガドリニウム含有物質を意味するものとする。別の実施形態では、ガドリニウム含有造影剤は、ガドリニウム、ガドリニウムペンテート、およびガドジアミドからなる群から選択される。
【０２６４】
ガドリニウム含有造影剤の投与量は、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇの量で可変である。別の実施形態では、第２の磁気共鳴像がガドリニウム含有造影剤を投与した約４５分後に取得される。本発明はまた、工程（ｃ）または工程（ｄ）のいずれかに続いて対象に生理食塩水（例えば、リンゲル溶液）を腹腔内投与する工程をさらに含んでなる上記の方法も提供する。
【０２６５】
本発明はまた、診断剤として上記に定義されたコンジュゲートの使用および神経伝達物質輸送体をそれらの表面上に発現する細胞の検出方法も提供する。
【０２６６】
本発明による診断用コンジュゲートは、ＤＡＴ、ＳＥＲＴまたはＮＥＴからなる群から選択される１以上の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１つの選択性薬剤と撮像剤を含んでなる。特定の実施形態では、選択性薬剤は、三重遮断薬、より詳しくは、構造（Ｉ）：
【化４２】
0006386461.tif 000043
［式中、
ｎまたはｍは、それぞれ０以上６以下の値を有する整数であり；
ｐは、０以上４以下の値を有する整数であり；
Ｒ１は、水素；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ；−ＣＯ２ＲＡ；−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２または−Ｃ（ＲＡ）３であり；ここで、ＲＡの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ２は、水素；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＢ；−ＣＯ２ＲＢ；−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２または−Ｃ（ＲＢ）３であり；ここで、ＲＢの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ３は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＣ；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＣＯ２ＲＣ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＣ；−ＳＯＲＣ；ＳＯ２ＲＣ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＣ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＣ）２；−ＮＲＣＣ（＝Ｏ）ＯＲＣ；または−Ｃ（ＲＣ）３であり：ここで、ＲＣの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分であり；
Ｒ４は、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；または置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリールであり；
Ｒ５は、水素；ハロゲン；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロ脂肪族；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アシル；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型アリール；置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐型ヘテロアリール；−ＯＲＥ；−Ｃ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＣＯ２ＲＥ；−ＣＮ；−ＳＣＮ；−ＳＲＥ；−ＳＯＲＥ；ＳＯ２ＲＥ；−ＮＯ２；−Ｎ３；−Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＥ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＥ）２；−ＮＲＥＣ（＝Ｏ）ＯＲＥ；または−Ｃ（ＲＥ）３であり、ここで、ＲＥの各存在は独立に、水素、保護基、脂肪族部分、ヘテロ脂肪族部分、アシル部分；アリール部分；ヘテロアリール部分；アルコキシ；アリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ；またはヘテロアリールチオ部分である。］
およびその薬学上許容される形態を有する三重再取り込み阻害剤である。
【０２６７】
本発明はまた、多モードの撮像法も提供する。本発明のある特定の実施形態は、複数のシグナルを測定することを含む複数の撮像様式を使用して対象または対象内の部位を撮像する方法に関する。ある特定の実施形態では、細胞上または細胞中の単一の標識から複数のシグナルが生ずる。上記で示されるように、当業者に知られたいずれの撮像様式も、本発明の撮像法のこれらの実施形態で適用可能である。
【０２６８】
撮像様式は、標識された組成物、例えば、標識された細胞の投与中または投与後の任意の時点で実施される。例えば、撮像試験は、本発明の標識された細胞の投与中に、すなわち、特定の位置へ送達を導く補助とするために、またはその後の任意の時点に実施することができる。
【０２６９】
第１の撮像様式と同時に、または第１の撮像様式後の任意の時点で、付加的撮像様式を実施することができる。例えば、付加的撮像様式は、第１の撮像様式の完了の約１秒、約１時間、約１日、もしくはそれより長い任意の時間の後に、またはこれらの示した時間の間の任意の時点で実施することができる。本発明のある特定の実施形態では、複数の撮像様式が並行して実施され、従って、それらは標識された細胞または薬剤の投与に続いて同時に開始される。当業者ならば、本発明によって企図される種々の撮像様式の実行に精通しているであろう。
【０２７０】
本撮像方法のいくつかの実施形態では、同じ撮像デバイスが第１の撮像様式および第２の撮像様式を実施するために使用される。他の実施形態では、異なる撮像デバイスが異なる撮像様式を実施するために使用される。当業者ならば、本明細書に記載の撮像様式を実行するために利用可能な撮像デバイスに精通しているであろう。
【０２７１】
本発明は、１以上の撮像様式を用いて細胞を撮像するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は複数種の撮像剤で標識され、他の態様では、細胞は単一の標識剤で標識される。ある特定の実施形態では、単一の標識剤は多モード検出可能な薬剤である。
【０２７２】
Ｇ．リポソームおよびデンドリマーを含んでなるコンジュゲート
別の実施形態(enmbodiment)では、本発明は、リポソームが、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）またはノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）からなる群から選択される１以上の神経伝達物質輸送体とカップリングされている、コンジュゲートを提供する。
【０２７３】
別の実施形態(enmbodiment)では、本発明は、デンドリマーが、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）またはノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）からなる群から選択される１以上の神経伝達物質輸送体とカップリングされている、コンジュゲートを提供する。
【０２７４】
デンドリマーまたはリポソーム内に治療化合物をカプセル化することにより、コンジュゲートは、前記神経伝達物質輸送体を発現する細胞に対する前記化合物の選択的送達が可能となる。
【０２７５】
好ましい実施形態では、選択性薬剤は、三重再取り込み阻害剤、ノルアドレナリン・ドーパミン二重再取り込み阻害剤、セロトニン単独再取り込み阻害剤、ノルアドレナリン単独再取り込み阻害剤およびドーパミン単独再取り込み阻害剤からなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、選択性薬剤は、一般式：
【化４３】
0006386461.tif 000044
を有する化合物としてのインダトラリン、またはその薬学上活性な塩であり、式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は上記で定義される通りである。
【０２７６】
リポソームおよびナノ粒子は、薬物のカプセル化に慣用されるナノコンテナの例示的形態である。リポソームは好ましくは、２００ナノメートルの直径を有する。５０〜１５０ナノメートルの間の直径を有するリポソームが好ましい。特に好ましいのは、約８０ナノメートルの外径を有するリポソームまたは他ナノコンテナである。好適なタイプのリポソームは、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジホスファチジルホスホコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、またはコレステロールなどの天然リン脂質を、リポソーム内のＤＮＡを安定化させるための少量（１パーセント）のジドデシルジメチル臭化アンモニウム（ＤＤＡＢ）などの陽イオン脂質とともに用いて製造される。
【０２７７】
リポソームは、ＤＮＡを封入し、処方物が血液中に留まっているかまたは血液から標的細胞の細胞内コンパートメントに移行中に核酸をヌクレアーゼから保護することができる、直径２００ｎｍ未満のナノ粒子または任意の他の分子ナノコンテナで置き換えることができる。また、ＰＥＧ鎖などのコンジュゲーション剤を使用する代わりに、スフィンゴミエリンなどの１以上の他のポリマー物質をリポソームまたはナノコンテナの表面に結合させて、「輸送可能ペプチド」のコンジュゲーションのため、および処方物の血液からの除去を遅延させて血漿薬物動態を最適化するための足場を提供するという二重の目的を果たすこともできる。さらに、本発明は、特定の標的受容体を有する任意の細胞群または臓器群へのＤＮＡの送達を企図する。リポソームは、肝臓、肺および脾臓などの臓器へＤＮＡを送達するために使用可能である。
【０２７８】
本発明のコンジュゲートの送達のために好適な他のコンテナとして、デンドリマーが含まれる。用語「デンドリマー」は、コアとそのコアから発散する分岐構造の複数のシェルを有する高分子を意味する。樹枝状担体の形状は様々であり得る。場合によっては、樹枝状担体はほぼ球状または球形の形状であってもよい。さらに、樹枝状担体は、例えば、約５００ダルトン〜約２００万ダルトンの分子量範囲に相当する、約１５オングストローム（Ａ）〜約２５０Ａの範囲の直径を有し得る。デンドリマーは、種々の供給先（例えば、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ、ミッドランド、ミシガン）から商業的に入手可能であり、または当業者に公知の方法により合成することもできる。樹枝状分子は、低分子量種と高分子量種に大別できる。第１のカテゴリーにはデンドリマーおよびデンドロンが含まれ、第２のカテゴリーはデンドロナイズドポリマー、高分岐ポリマー、およびブラシポリマー（ボトルブラシとも呼ばれる）を包含する。デンドリマーおよびデンドロンは、繰り返し分岐した、単分散、かつ、通常は高対称性の化合物である。デンドリマーおよびデンドロンの定義に明白な違いはない。デンドロンは通常、フォーカルポイントと呼ばれる、単一の化学介入可能な基を含む。モル質量分布の欠如のために、高分子質量デンドリマーおよびデンドロンは高分子ではあるがポリマーではない。デンドリマーの特性は、分子表面上の官能基により支配される。樹枝状足場は内部機能と外部機能を分離することから、機能性分子のデンドリマー封入により、生体材料中の活性部位の構造を模倣する構造である活性部位の孤立化が可能となる。例えば、デンドリマーは、その末端基がカルボキシル基などの親水基である場合には水溶性となり得る。
【０２７９】
デンドリマーは一般に下記の特徴によって特性決定が可能である：（ｉ）１以上の反応性部位を有することができ、デンドリマーの最終トポロジーを左右するような点様または有意なサイズであり得る開始コア（Ｉ）；（ｉｉ）開始コアに結合した分岐状の繰り返し単位の１以上の層；（ｉｉｉ）デンドリマーの表面に、場合により架橋基を介して結合された陰イオン基または陽イオン基などの官能性末端基。
【０２８０】
本明細書において企図されるデンドリマーは、リジン、またはリジン類似体構成単位含んでなり得る。用語「リジン類似体」は、構成単位の前層に結合するための単一の頂点カルボキシル基と、さらなる構成単位、遮断基、リンカーまたはアリール酸基と結合することができる２個または３個の第一アミン基を有する分子を意味する。本明細書において企図される「リジン類似体」の例はＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００３５２に記載され、例えば、グリシル−ｌｙｓである。いくつかの特定の例では、デンドリマーは、構成単位としてリジンのみかまたはリジン類似体の一タイプを含んでなる。
【０２８１】
本明細書において企図される他のデンドリマーには、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エーテルヒドロキシルアミン）（ＰＥＨＡＭ）またはポリプロピレンイミン構成単位を含んでなるものが含まれる。その特定の例では、デンドリマーは、構成単位としてポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エーテルヒドロキシルアミン）（ＰＥＨＡＭ）またはポリプロピレンイミンのみを有する。
【０２８２】
コア部分は、一構成単位に対して結合点を１つだけ含んでもよいし、または２、３もしくはそれを超える結合点を含んでいてもよく、これらは構成単位の結合のためにさらに使用されてもされなくてもよい。一般に、結合点は遊離アミノ基である。コア部分は、構成単位からなり得るか、構成単位を含んでなり得るか、構成単位から誘導され得るか、または構成単位とは異なる分子であり得る。例示的なコア部分は本発明に示され、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００３５２に記載されている。
【０２８３】
リポソームおよびデンドリマーは、静脈内投与に好適な任意の医薬担体と組み合わせることができる。組成物の静脈内投与は、最小の侵襲性であるので好ましい経路である。必要であれば、他の投与経路も可能である。好適な薬学上許容される担体としては、生理食塩水、Ｔｒｉｓバッファー、リン酸バッファー、または任意の他の水溶液が含まれる。適当な用量は、当業者に周知の手順によって確定することができる。
【０２８４】
本発明によるコンジュゲート(cojungates)のリポソームおよびデンドリマーは、α−シヌクレインを特異的に(specificially)標的とすることができる上記の核酸をいずれも封入することができる。さらに、リポソームおよびデンドリマーはまた、パーキンソン病の治療に適切であり、かつ、神経伝達物質受容体を発現するニューロンにおいてそれらの作用を発揮する化合物も含有し得る。本発明によるデンドリマーまたはリポソームに組み込むことができる好適な薬物としては、レボドパ、ドーパミンアゴニスト、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、アマンタジンおよび抗コリン作動薬が含まれる。
【０２８５】
以下の実施例および図面は例示として示され、本発明を限定することは意図されない。
【実施例】
【０２８６】
実施例１  標的化のバリデーション：機能
実験計画
本発明による分子の標的化を機能的に判定するために、インダトラリンとカップリングされた５ＨＴ１Ａ受容体に標的化されたアンチセンス分子を含んでなるコンジュゲートを使用した。インダトラリンは、ドーパミン、ノルエピネフリン(norepinephrinee)、およびセロトニンの再取り込みを遮断する非選択性モノアミン輸送体阻害剤である。この分子を、インダトラリンが縫線核を標的とすることを確認するために鼻腔内投与した。２種類の異なる濃度を試験し（３０および１００μｇ／マウス）、縫線内の５−ＨＴ１Ａ受容体が標的化されたことを機能的に判定するために、８−ＯＨ−ＤＰＡＴ投与後の低体温を評価した。分子の鼻腔内投与の２４時間後に基礎体温を測定した。
【０２８７】
８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）テトラリン（８−ＯＨ−ＤＰＡＴ）は、正中縫線内の細胞体樹状突起５−ＨＴ１Ａ自己受容体を活性化することによりマウスに低体温を誘導する選択的５−ＨＴ１Ａアゴニストである。このアッセイにより、縫線、および５−ＨＴ１Ａ特異的アンチセンスを標的化できれば、８−ＯＨ−ＤＰＡＴにより誘導される低体温がインダトラリン(indrataline)によって遮断され得るかどうかが判定された。
【０２８８】
３０〜１００μｇ／マウスの本発明による分子を鼻腔内投与し、２４時間後に基礎体温を測定した。８−ＯＨ−ＤＰＡＴ  １ｍｇ／ｋｇを腹膜内（ｉ．ｐ．）投与し、５分、１５分、３０分、６０〜１２０分後に体温を測定した。
【０２８９】
結果
インダトラリンで標的化されたオリゴが、単回適用の２４時間後に、鼻腔経由で縫線に到達し、５−ＨＴ１Ａの発現をノックダウンできることが見出された（図１参照）。両濃度とも、単回用量で８−ＯＨ−ＤＰＡＴにより引き起こされる体温変化を遮断することができたが、４日間の標準的な投与のための以下の実験で３０μｇ／マウスを選択し、経時的にオリゴを蓄積させた。
【０２９０】
実施例２  標的化のバリデーション：局在
実験計画
黒質、青斑核および縫線が標的化されたかどうかを可視化するために、蛍光団Ａｌｅｘａ４８８で標識したインダトラリン−アンチセンスの脳室内投与を使用した。
【０２９１】
ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）の発現は、黒質緻密部（ＳＮＣ）のドーパミンニューロンに局在した。
【０２９２】
ノルエピネフリン(norepinephrinee)輸送体（ＮＥＴは、溶質輸送担体ファミリー６メンバー２、ＳＬＣ６Ａ２としても知られる）の発現は、青斑核（ＬＣ）のノルアドレナリン作動性ニューロンに限定され、ドーパミンまたはエピネフリンを放出するニューロン上には存在しない。
【０２９３】
セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）の発現は、主として、縫線核に局在するセロトニン作動性ニューロンに局在し、背側縫線核（ＤＲ）に高レベルである。
【０２９４】
共局在のために、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）とトリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）を選択した。ＴＨは、カテコールアミンの合成の律速段階を触媒し、ＳＮおよびＬＣで高い発現を示す。ＴＰＨは、セロトニンの合成に関与し、縫線で発現される。
【０２９５】
結果
対象とする３領域（ＳＮ、ＬＣおよびＤＲ）の単一平面共焦点画像を採取した。緑のインダトラリン−オリゴ−Ａｌｅｘａ４８８の直接蛍光染色を行い、ＬＣおよびＳＮの場合には抗ＴＨ（チロキシンヒドロキシラーゼ）で、ＤＲには抗ＴＰＨ（トリプトファンヒドロキシラーゼ）で、核染色にはＤＡＰＩで共染色した。動物を手術の１時間後および２４時間後に屠殺したところ、１時間でオリゴの鮮明な染色が見られた。他の脳領域には、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光は検出されなかった。
【０２９６】
これらの３領域の高倍率での単一平面共焦点画像は、ニューロンＴＨ（ＳＮおよびＬＣ）およびＴＰＨ（ＤＲ）に共局在する分子の細胞質(cytoplasmic)染色および核内染色が陽性であったことを示した。
【０２９７】
よって、インダトラリンとコンジュゲートされたオリゴの脳室内投与によって、動物の目的の領域、すなわち、ＳＮ、ＬＣおよびＤＲだけに投与１時間後に分子の特異的標的化が見られ、標的化されたオリゴが目的領域に到達し、ニューロン中へのインターナリゼーションを受け、細胞質(cytoplasm)および核に達したという証拠が得られた。
【０２９８】
実施例３  候補選択
実験計画
合計７つの前候補分子をＲＮアーゼＨアッセイにより選択した。このアッセイの目的は、これらの７つのオリゴヌクレオチドのいずれがｍＲＮＡの切断を触媒するこの非特異的エンドヌクレアーゼの活性を促進するかを判定することであった。
【０２９９】
ｍＲＮＡのノックダウンをｉｎ  ｖｉｖｏで判定するために、各分析分子につき合計５個体の動物でｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。これら７つの前候補分子は、連続何週間か投与を受ける２群に分けた。合計３０μｇ／マウス／日を連続４日間投与した。最後の投与から２４時間後に動物を屠殺した。
【０３００】
黒質（ＳＮｃ／ＶＴＡ）および線条体のα−シヌクレインタンパク質レベルをウエスタンブロットによって分析した。マウスを１ｍｇ／ｋｇ／日のＰＤ−１２３３およびＰＤ−１２３３と同じリガンドを有するナンセンス配列で連続４日間鼻腔内処置した。最後の投与から２４時間後、３日後および７日後に動物を屠殺した。
【０３０１】
結果
図２は、ＲＮアーゼＨアッセイの結果を示す。
【０３０２】
選択の際には下記の判定基準を用いた：図２に示される選択候補、５種（マウス、ラット、イヌ、サルおよびヒト）間で９４〜１００％の相同性、他のシヌクレイン（γおよびβ）との相同性が無い、およびＲＮアーゼＨ活性の誘導。
【０３０３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行うため、オリゴヌクレオチドの最終化学を図３に示されるスキームに記載のように選択した。
【０３０４】
前候補として選択された群１の特徴を表１に示す。
【０３０５】
【表１】
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【０３０６】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションデータは、ビヒクルに比べて候補１２３４による効果的なノックダウンを示す黒質のα−ｓｙｎレベルの低下、ならびに候補１２３３および１２３４による背側縫線核のα−ｓｙｎレベルの低下を示した。
【０３０７】
図４は、ビヒクルに対するパーセンテージとして計算される、嗅球（ＢＯ）、黒質（ＳＮｃ／ＶＴＡ）、背側縫線核（ＤＲ）および正中縫線（ＭｎＲ）のα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）のｍＲＮＡレベルの定量を示す。π  ナンセンス（ＩＮＤ−ｎｓ−ＡＳＯ）に対してｐ＜０．０５、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１  ｖｓ  ビヒクル（二元配置ＡＮＯＶＡ）。
【０３０８】
候補１２３２、１２３３および１２３４は、連続４日間３０μｇ／マウス／日の用量で、他の脳領域でのレベルに影響を及ぼさずに、標的領域でα−シヌクレインのｍＲＮＡレベルを低下させることができたことが見出された。最大の低下は、前候補１２３４ではＳＮ（黒質）に、前候補１２３３では縫線に見られた。他の脳領域は影響を受けていなかった。
【０３０９】
図８は、β−アクチンおよびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対して標準化したα−シヌクレインの黒質ＳＮｃ／ＶＴＡレベル、ならびにβ−アクチンに対して標準化したＴＨのレベルを示す。１２３３は、最後の投与から２４時間後のα−シヌクレインレベル、および３日後に回復されたレベルに有意な低下（ｐ＜０．０５）をもたらした。
【０３１０】
図９は、β−アクチンおよびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対して標準化したα−シヌクレインの線条体レベル、ならびにβ−アクチンに対して標準化したＴＨのレベルを示す。１２３３は、最後の投与から２４時間後のα−シヌクレインレベル、および３日後に回復されたレベルに有意な低下（ｐ＜０．０５）をもたらした。
【０３１１】
実施例４：毒性
実験計画
また、従前にアッセイした分子が、ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）においてＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−α、ＩＦＮγ、およびＴＮＦα分泌を誘導できたかどうかも分析した。化合物を片対数６点希釈液（１０、３．１６、１．０、０．３２、０．１、および０．０３μＭ濃度）として試験した。ＰＢＭＣに及ぼす化合物の効果は、アラマーブルー細胞傷害性プレートランで並行して３反復で試験した。
【０３１２】
結果
表２は、ＰＢＭＣにおいて免疫応答を誘導することができた分子は無かったことを示す。
【０３１３】
【表２】
0006386461.tif 000046
【０３１４】
実施例５：さらなる候補選択
実験計画
最後の選択は、候補配列のヒトを含む数種との相補性を評価することにより行った。さらなる特性評価のために考慮した種はマウス、サルおよびヒトであった。ＢＬＡＳＴ分析は、ヒトおよびマウスのゲノムおよびトランスクリプトームデータベースを使用することにより、また、サルのｒｅｆ．ｓｅｑ．ＲＮＡデータベースを使用することにより行った。
【０３１５】
結果
３つの前候補は総て、ヒトおよびサルα−シヌクレインと１００％相同であることが見出された。
【０３１６】
特に、前候補分子１２３４は、マウスα−シヌクレイン配列に関してｎｔ２にミスマッチがあったが、これはその活性に影響を及ぼさなかった。前候補分子１２３２および１２３３は、他のいずれのヒト遺伝子とも相同性は無かった。前候補１２３４は、２以上の遺伝子と若干の相同性があった。シンタフィリンに対する推定されるオフターゲット効果には特に注意する必要があった。この遺伝子はヒトの脳およびまたＳＮで発現が高い。
【０３１７】
図５は、孤発性パーキンソン病（ＰＤ）患者から得られた死後脳サンプルからの中央および外側黒質(substantin nigras)（ＳＮ）の分析を示す。ＰＤにおいて、ＳＮは広範囲の組織損傷を呈する。
【０３１８】
図６は、３つの種のシンタフィリン配列のアラインメントを示す。ヒトのα−シヌクレインｍＲＮＡと共通の候補１２３４の１５ｎｔを四角で示す）。このアラインメントは、マウス配列との相同性がないこと、およびサル配列にはｎｔ１０に内部ミスマッチがあり、サルではＲＮアーゼＨ活性がおそらく低下していることを示した。
【０３１９】
これらのデータを総て考慮して、本発明の発明者らは、最良の候補として、図７に示されるように配列：ｃｕｃｃＣＴＣＣＡＣＴＧＴＣｕｕｃｕを有する分子＃１２３３（以下、ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３またはＰＤ−１２３３とも呼ぶ）を選択した。
【０３２０】
実施例６：副次的薬力学  ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３によるサイトカイン誘導能
実験計画
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３（１２３３）の、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの分泌を誘導する能力を検討した。
【０３２１】
ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３は、０．０３、０．１、０．３、１、３および１０μＭの濃度で試験した。サイトカイン分泌は、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスキットを用いて測定した。コンカナバリンＡ（３０ｍｇ／ｍｌ）を増殖参照化合物として使用した。
【０３２２】
結果
ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３は最大１０μＭの濃度で、ヒトＰＢＭＣからのＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮγまたはＴＮＦα放出を誘導しなかった。
【０３２３】
実施例７：安全性薬理学  ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の中枢神経系（ＣＮＳ）に及ぼす潜在的影響
実験計画
ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３のＣＮＳに及ぼす潜在的影響は、マウスにおいてＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ  Ｂａｔｔｅｒｙ（ＦＯＢ）（Ｉｒｗｉｎテスト）（非ＧＬＰ）で評価した。
【０３２４】
６個体の雄ＣＤ−１マウスの群に、単回用量０．３、１．０または３．０ｍｇ／ｋｇのＮＬＦ−ＰＤ−１２３３またはビヒクルを、目盛り付きピペットを用いて各鼻孔に１０μｌを投与することにより、総量２０μｌ／動物で鼻腔内に与えた。
【０３２５】
動物を、Ｉｒｗｉｎの方法(Irwin S 1968 Psychopharmacologia (Berl.) 13: 222-257)に基づき、一般行動、自律神経および運動への影響に関して観察した。体温も測定した。
【０３２６】
観察は投与の３０、６０、１２０、２４０〜３６０分後に行った。さらに、各マウスの直腸温度を投与前と各観察の直後に測定した。動物を投与後さらに７日維持し、その間、毎日、毒性の総体的徴候および死亡率を観察した。
【０３２７】
結果
０．３、１および３ｍｇ／ｋｇの用量レベルでのＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の鼻腔内投与は、ビヒクル対照群に比べて、雄マウスに顕著な行動的、生理学的または体温の変化をもたらさなかった。
【０３２８】
従って、ＮＯＥＬ（無影響量(no observed effect level)）は＞３ｍｇ／ｋｇであると考えられた。
【０３２９】
実施例８：薬物動態
実験計画
ハイブリダイゼーションアッセイ：  ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３を検出するために、蛍光標識ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを用いた競合的ハイブリダイゼーションアッセイを開発した。
【０３３０】
蛍光検出を用いたＨＰＬＣ：  蛍光検出を用いた陰イオン交換（ＡＥＸ）−ＨＰＬＣ法を使用し、ＨＰＬＣに注入する前に蛍光(florescence)標識ＰＮＡプローブ（５’−Ａｔｔｏ４２５−ＯＯ−ＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＡ−３’、配列番号１９）とのハイブリダイゼーションにより血液および組織中のＮＬＦ−ＰＤ−１２３３を検出した。ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３のＯＤＮは、血漿中で不安定であることが知られている非修飾ＤＮＡであるので、このＯＤＮを、その配列の３’末端に反転ｄＴを導入することにより修飾した。ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の定量下限(lower limit of quantification)（ＬＬＯＱ）は、血漿中では０．６ｎｇ／ｍｌ、組織中では１．５ｎｇ／ｇであることが示された。
【０３３１】
結果
マウスへのＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の静脈内投与後の血漿濃度の測定
非修飾ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３および３’保護誘導体をマウスに静脈内投与した。血漿濃度をハイブリダイゼーションアッセイにより測定した。
【０３３２】
非修飾ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の血漿濃度は、マウスへの静脈内投与後に１時間検出能できた（図１０参照）。３’保護ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３は、静脈内投与後に少なくとも２４時間、マウスの循環中に検出できた。
【０３３３】
これらのデータは、非修飾ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３は、３’保護誘導体とは対照的に、血中でヌクレアーゼにより急速に分解されることを示す。
【０３３４】
カニクイザルへのＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の静脈内投与後の血中濃度の測定
ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３を、サルに０．３および１ｍｇ／ｋｇで静脈内投与し、血中濃度をハイブリダイゼーションアッセイにより測定した。
【０３３５】
ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３濃度の急速な低下が見られ、投与１時間後には親化合物は検出できなかった（図１１参照）。いくつかの代謝産物のピークが検出され、そのパターンは３’−エキソヌクレアーゼ消化に典型的なものであった。
【０３３６】
カニクイザルへのＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の鼻腔内投与後のＣＳＦ濃度の測定
ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３をサルに、０．３および３ｍｇ／ｋｇの単回用量ならびに１４日間にわたって毎日１ｍｇ／ｋｇを鼻腔内投与した。ＣＳＦおよび血中濃度をハイブリダイゼーションアッセイにより測定した。
【０３３７】
ＣＳＦ（図１２Ａ）および血液（図１２Ｂ）におけるＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の濃度は用量依存的であったが、用量に比例しなかった。ＣＳＦ（脳脊髄液）のＣｍａｘはおよそ１００ｐｇ／ｍＬ（０．３ｍｇ／ｋｇ）および４００ｐｇ／ｍＬ（３ｍｇ／ｋｇ）であり、血中のＣｍａｘはおよそ６０ｐｇ／ｍＬ（０．３ｍｇ／ｋｇ）およびおよそ３８００ｐｇ／ｍＬ（３ｍｇ／ｋｇ）であった。血中のＮＬＦ−ＰＤ−１２３３濃度の増大は、ＣＳＦ中の増大よりも強かった（図１２参照）。
【０３３８】
１４日間にわたって１ｍｇ／ｋｇを複数回鼻腔内投与した後には、ＣＳＦの投与前サンプルにすでに低濃度が見られた。ＣＳＦのＣｍａｘはおよそ４００ｐｇ／ｍＬであった。このＣｍａｘは３ｍｇ／ｋｇの単回投与に匹敵するものであり、多回投与期間の蓄積効果により説明でき、投与後４８時間の時点で最低濃度はなおおよそ１５０ｐｇ／ｍＬであった。血中では、Ｃｍａｘはおよそ３００ｐｇ／ｍＬであったが、蓄積効果は見られなかった（図１２）。
【０３３９】
分布
１ｍｇ／ｋｇの単回鼻腔内投与後のＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の組織分布をマウスで調べた（各時点につき３個体の動物）。
【０３４０】
脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、胃および血漿のサンプルを投与１５分、１時間、１、６時間および２４時間後に採取した。
【０３４１】
ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の血漿および組織濃度は、蛍光検出を用いるＡＥＸ−ＨＰＬＣを用いて測定した。
【０３４２】
ＮＬＦ−１２３３の最高濃度は投与１時間および６時間後に胃で見られたが、各動物間で変動が大きかった（表３）。
【０３４３】
投与２４時間後、分析した総ての組織中での濃度は、このアッセイの検出限界に近いか下回った。胃と肝臓のみに（１個体のみ）有意な量のＮＬＦ−ＰＤ−１２３３が検出できた（表３）。
【０３４４】
【表３】
0006386461.tif 000047
【０３４５】
外れ値は計算から除かなかった。標準偏差（ＳＤ）は適用無し(not applicable)（ｎ．ａ．）に設定し、値は、検出限界を超える値の数が少なかったために計算できなかった。
【０３４６】
親化合物の濃度が高かった総ての組織サンプルで、ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の代謝産物が見られた。親化合物が低濃度の組織でも代謝産物は存在するが、検出限界を下回ると推測することができる。見られたピークパターンは、ＮＦＬ−１２３３の分解が主として３’−エキソヌクレアーゼにより誘導されることを示していた。
【０３４７】
１５分の時点で、１個体の動物を除き、ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３に対する有意な血漿暴露は見られなかった。
【０３４８】
ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３は、投与１時間および６時間後におよそ１ｎｇ／ｇの濃度で脳に検出された。脳組織は完全にホモジナイズしたので、空間分布に関する結論は下すことができなかった。
【０３４９】
鼻腔内送達後の動物間の全体的な変動は極めて大きいことが判明した。
【０３５０】
マウスにおいて（各時点につき３個体の動物）、１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後の非修飾ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３および３’保護誘導体の組織分布を調べた。投与１５分、１時間、６時間および２４時間後に、脳、肝臓、脾臓、腎臓および血漿のサンプルを採取し手分析した。
【０３５１】
マウスの静脈内投与１５分後に、低組織濃度の親化合物である非修飾ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３が測定された。最高濃度の非修飾ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３は、肝臓で見られた。ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３はまた脳にも低濃度で存在した（図１３）。
【０３５２】
非修飾ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３と代謝産物を合わせた組織濃度は、親化合物単独よりもやや高く、最高濃度は肝臓および腎臓で測定された（図１４）。
【０３５３】
３’修飾ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の組織濃度は、非修飾ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の場合よりも高く、３’エキソヌクレアーゼに対する安定化が親化合物の分解を低減することを示している（図１５）。
【０３５４】
ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３の３’保護誘導体と代謝産物を合わせた組織濃度は、親化合物単独に比べてやや高いに過ぎなかった（図１６）。
【０３５５】
実施例９  機能アッセイ
本発明によるコンジュゲートが中枢神経系においてドーパミン放出を増大させ得るかどうかを判定するために、ベラトリジン（ナトリウムチャネルアクチベーター）に応答するドーパミンのレベルまたはノミフェンシン（ドーパミン再取り込み阻害剤）に応答する細胞外ドーパミンのレベルを、コンジュゲート１２３３で処置したマウスまたは対照マウスにおいて測定した。
【０３５６】
実験計画
微小透析ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを行った。動物をビヒクル（ＰＢＳ）または１２３３で処置した（連続４日、１ｍｇ／ｋｇ／日）。ベラトリジンにより誘発されるドーパミン放出および細胞外ドーパミンをＨＰＬＣにより測定した。
【０３５７】
結果
ビヒクル（ＰＢＳ）または１２３３で処置した動物における、ＨＰＬＣにより測定されるベラトリジン誘発ドーパミン放出の微小透析ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、ＮＬＦ−ＰＤ−１２３３処置によるα−シヌクレインレベルの低下の後の薬理学的刺激後にドーパミン放出が有意に増加することを示した（図１７参照）。
【０３５８】
ビヒクル（ＰＢＳ）または１２３３で処置された動物においてＨＰＬＣにより測定された細胞外ドーパミンの微小透析ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、薬理学的刺激（ノミフェンシン、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤）後の放出増加、およびＮＬＦ−ＰＤ−１２３３による処置後のドーパミンレベルの有意な増加を示した（図１８参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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