(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩の純度が９９％以上であり、
下記図１に示されるＸ線回折パターンを有し、
0006392330.tif 000005
下記図２に示される赤外線吸収スペクトルを有し、
分子式がＣ50Ｈ78Ｎ10Ｏ11・Ｃ2Ｈ4Ｏ2であるＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩の無定形固体。
0006392330.tif 000006
【請求項２】
（１）Ｆｍｏｃ固相合成方法により、アミノ酸配列（９→１）の順に応じて、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬペプチド樹脂を合成し、次にトリフルオロ酢酸で分解して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品を得るステップと、
（２）ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品を溶解し、濾過し、トリフルオロ酢酸のアセトニトリル／水溶液を流動相として逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製し、精製に使用される固定相はＣ４、Ｃ８又はＣ１８アルキル結合シリカであり、カラム温度は２０−３５℃であり、流動相においてトリフルオロ酢酸濃度は０．０２％−０．５％（ｖ／ｖ）であり、精製後、主ピーク成分を収集し、収集液の純度が９８％より大きい画分を混合して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ精製品溶液を得るＫＩＦＧＳＬＡＦＬ精製ステップと、
（３）ステップ（２）で得た主ピーク成分に対して酢酸のアセトニトリル／水溶液を流動相として逆相高速液体クロマトグラフィーにより塩を形成し、塩形成に使用される固定相はＣ４、Ｃ８又はＣ１８アルキル結合シリカであり、カラム温度は２０−３５℃であり、流動相において酢酸濃度は０．０２％−０．５％（ｖ／ｖ）であり、塩形成後、主ピーク成分を収集して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を得る塩形成のステップと、
（４）減圧濃縮して、乾燥させ、塩形成後のＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を酢酸でｐＨ４に調整し、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩の沈殿が析出されるまで減圧濃縮して、温度を５℃以下に低減させ、遠心分離して沈殿を得て、３０℃未満で真空乾燥させて得るステップとを含む請求項１に記載のＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩の無定形固体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は製薬技術分野に属し、ポリペプチドワクチンの塩及びその製造方法、特にＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩及びその製造方法と該塩を含有する医薬製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
女性の癌の診断のうち、乳癌（ＢＣａ）は最も一般的であり且つ女性の死亡を引き起こす癌に関連する第二の支配的な要因（ＲｉｅｓＬＡＧら、ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ、１９７５−２００３、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）である。過去２０年間にわたり、乳癌治療の発展につれて無病生存率（ＤＦＳ）が著しく向上される。例えば、腫瘍関連抗原に対して反応性を有する抗体療法は既に特定の細胞過程を遮断して疾患の発展を遅延又は疾患の再発を予防することに用いられる。最近、乳癌の治療は発展しているが、相当数の患者は再発疾患で死亡する。従って、再発疾患の発生を予防、遅延又は抑制する治療が求められる。
【０００３】
ワクチンは投与しやすい上に、感染性疾患の治療に用いると成功率が高いためワクチンによる治療や予防が注目を集める。癌ワクチンを調製する基本原理は理論的には直接であるが、実践の場合、成功した有効な固形腫瘍癌ワクチンの例は非常に少ない。
【０００４】
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（アミノ酸配列はＬｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ  −Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕのノナペプチドであり、ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ３６９−３７７とも呼ばれ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ癌原遺伝子ファミリーにおけるペプチド配列である。）は細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答作用を有し、癌を予防及び／又は治療するワクチンに応用でき、現在関連臨床実験研究（Ｚａｋｓ  Ｔなど，  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  （３６９−３７７）  ｆｒｏｍ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｆａｉｌ  ｔｏ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＋ｔｕｍｏｒｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９８，  ５８（２１）：４９０２−８；Ｋｎｕｔｓｏｎ  ＫＬなど，  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ａ２  ｐｅｐｔｉｄｅ、ｐ３６９−３７７、ｆｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｓｈｏｒｔ−ｌｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２，  ８（５）：  １０１４−１０１８）に用いられる。
【０００５】
しかしながら、従来技術に開示されている臨床試験に使用されたＫＩＦＧＳＬＡＦＬサンプルはＤＭＳＯ溶液状態であり、室温では安定性が悪いため、−２０℃の低温で保存して、使用前に再解凍しなければならない。これまで、室温で安定した該ポリペプチドの化合物又は混合物は報告されたことがない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は原料の純度、水溶性及び安定性を大幅に改善するＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩を提供することを目的とする。
前記ＫＩＦＧＳＬＡＦＬとは、アミノ酸配列がノナペプチドである：
Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ
１                                ５                              ９
ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ３６９−３７７とも呼ばれ、前記ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩の分子式はＣ50Ｈ78Ｎ10Ｏ11・Ｃ2Ｈ4Ｏ2である。
上記ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩は本発明の好ましい方法で製造されるものであり、非常に高い薬物純度を有し、純度が≧９５％に達し、更に好ましくは≧９８％、特に好ましくは純度≧９９％に達する。薬物の有効性と安全性を確保するのに対して重要な意義があり、商品として開発する価値が期待できる。
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬの合成過程において大量の不純物が発生するため、高純度ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ塩の製造には技術的難問が存在し、高純度単塩の精製品の製造が困難である。
【０００７】
本発明で大量の実験を行って得た好ましいＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩の製造方法は、以下のステップを含む：
（１）、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品の製造
Ｆｍｏｃ固相合成方法により、アミノ酸配列（９→１）の順に応じて、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬペプチド樹脂を製造し、次にトリフルオロ酢酸で分解して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品を得て、具体的には以下のステップを含む：
（１．１）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨを連結した酸感受性樹脂（例えばＷａｎｇ樹脂又は２−クロロ−トリチル−樹脂）を原料として、ピペリジン溶液と反応させて、Ｆｍｏｃ保護基を除去し、溶媒で洗浄してＬｅｕ−樹脂を得る。
（１．２）、固相ポリペプチドの合成方法により、Ｌｅｕ−樹脂とＦｍｏｃで保護したアミノ酸とを順に反応させ、ノナペプチドＫＩＦＧＳＬＡＦＬ−樹脂を得る。その間一般的に使用される縮合剤を使用してペプチド連結反応を行い、溶媒で洗浄した後にピペリジン溶液でＦｍｏｃ保護基を除去し、溶媒で洗浄した後に次のＦｍｏｃで保護したアミノ酸の縮合を行う。
Ｌｅｕ−樹脂と更に縮合反応させるＦｍｏｃで保護したアミノ酸は、順次Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨである。
縮合剤として、好ましくはＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＣ／ＨＯＡｔ等が含まれる。
（１．３）、トリフルオロ酢酸分解溶液でＫＩＦＧＳＬＡＦＬ−樹脂を処理して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬのトリフルオロ酢酸溶液を得る。エチルエーテルを添加して沈殿を析出させ、遠心分離と洗浄をしてＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品を得る。
トリフルオロ酢酸分解溶液とは５０−９５％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸と、残量のジクロロメタンを含み、更に１−１０％（ｖ／ｖ）の水、フェノール、パラメチルフェノール、アニソール、チオアニソール、１，２−エタンジチオール、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）等のカルボカチオン捕捉試薬を添加してもよい。
【０００８】
（２）、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬの精製
方法（１）で製造されたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品をアセトニトリルと水の混合溶液に溶解して濾過し、濾液を逆相高速液体クロマトグラフィーで精製し、精製品のアセトニトリル／水溶液を得る。
逆相高速液体クロマトグラフィーの精製条件について、好ましくはＣ４、Ｃ８、Ｃ１８アルキル結合シリカ、更に好ましくはＣ１８アルキル結合シリカを固定相とし、カラム温度は好ましくは２０−３５℃、更に好ましくは２５−３０℃とし、流動相としてトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水溶液とし、そのうちトリフルオロ酢酸の濃度は０．０２％−０．５％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．０５％−０．２％（ｖ／ｖ）である。流動相におけるアセトニトリルの体積百分率は１０％−８０％が好ましく、低濃度から高濃度へ勾配溶離を行い、更に好ましくは２０％−５０％である。
【０００９】
（３）、塩形成（酢酸塩形成）
上記方法（２）で製造されたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ精製品溶液を酢酸のアセトニトリル／水溶液を流動相とする逆相高速液体クロマトグラフィーで処理して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を得る。
塩形成条件について、使用される逆相高速液体クロマトグラフィーは好ましくはＣ４、Ｃ８、Ｃ１８アルキル結合シリカ、更に好ましくはＣ１８アルキル結合シリカを固定相とし、カラム温度として好ましくは２０−３５℃、更に好ましくは２５−３０℃とし、流動相は酢酸を含むアセトニトリル／水溶液であり、そのうち酢酸濃度は０．０２％−０．５％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．０５％−０．２％（ｖ／ｖ）である。流動相において、アセトニトリルの体積百分率は２％−８０％が好ましく、低濃度から高濃度へ勾配溶離を行い、更に好ましくは先ず２％−４％アイソクラチック溶離又は勾配溶離を少なくとも１カラム体積で行い、更に２０％−５０％で低濃度から高濃度へ勾配溶離を行う。
【００１０】
（４）、溶媒を除去してＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩固体を得る。
一つの方法は上記方法（３）で製造されたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を減圧濃縮して乾燥させ、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩固体を得ることである。
もう一つの方法は上記方法（３）で製造されたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を減圧濃縮して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩沈殿を析出させ、遠心分離して沈殿を得て、沈殿を真空乾燥させてＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩固体を得ることである。
【００１１】
本発明の提供するＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩を無定形固体とし、そのＸ線回折パターンにおいて結晶の特徴的吸収ピークがないようにすることを第二目的とする。無定形固体であるＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩は水溶性と安定性が著しく向上し、薬物製剤、特に注射投与製剤の使用が更に容易になる。
本発明で大量の実験を行って得る好ましい無定形固体ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩の製造方法は、
上記方法（３）で製造されたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を、酢酸でｐＨ４程度に調整し、減圧濃縮してＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩沈殿を析出させ、温度を５℃以下に低減し、遠心分離して沈殿を得て、＜３０℃で真空乾燥させて均一なＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩無定形固体を得るステップを含む。
【００１２】
Ｘ線回折パターンは、装置型番としてエンピリアン（Ｅｍｐｙｒｅａｎ）Ｘ線回折装置を使用して、測定条件としてＣｕターゲットＫα１線、電圧４０ｋｖ、電流４０ｍＡ、２θ範囲３°−５０°、発散スリット１／３２°、散乱防止スリット１／１６°、散乱防止スリット７．５ｍｍ、ステップサイズ０．０２°、各ステップの滞在時間４０秒にするように検出して得る。
【００１３】
前記無定形固体であるＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩について、ＫＢｒ錠剤法を使用してＩＲスペクトル検出条件で検出した結果、３２８８ｃｍ-1、３０６５ｃｍ-1、２９５８ｃｍ-1、１６３２ｃｍ-1、１５２７ｃｍ-1、１４０４ｃｍ-1及び６９８ｃｍ-1において赤外線吸収ピークを有する。
【００１４】
前記無定形固体であるＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩についてＥＳＩ質量スペクトルを行った結果、分子イオンピークは９９５．９であり、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬによる分子量計算値とほぼ一致する。
【００１５】
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩無定形固体をアセトニトリルと水（体積比＝５：９５）混合溶液で溶解し、高速液体クロマトグラフィーを使用して、検出条件として、Ｃ１８結合シリカ（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を固定相、アセトニトリルを流動相Ａ、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム（リン酸でｐＨ３．０に調整する）水溶液を流動相Ｂとして、勾配溶離（流動相Ａ５％−４５％、溶離時間２０分、次に流動相Ａ４５％でアイソクラチック溶離）を流速１ｍＬ／分で行い、検出波長を１９５ｎｍ（０−８分間）と２３０ｎｍ（８−５０分間）にするようにして、分析した結果、酢酸と目的ペプチドＫＩＦＧＳＬＡＦＬのピークが現れる時間はそれぞれ約４．６分間と２１分間である。
【００１６】
本発明は上記ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩を含むポリペプチドワクチンの医薬製品を提供することを更なる目的とし、該医薬製品は薬学的に受容可能な溶媒で注射可能な薬用製品に調製して、患者に注射投与することに適する。前記薬学的に受容可能な溶媒は注射用水、無菌水等を含む。
【００１７】
本発明のＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩、特にその無定形固体は高純度と優れた安定性、及び優れた水溶性を有するため、該医薬製品の薬物有効性と安全性を向上させる。
【００１８】
前記医薬製品は１種以上の薬学的に受容可能な賦形剤を含んでもよい。本発明の医薬製品は非経口投与する任意の粉末剤形、例えば凍結乾燥粉末、懸濁形、乳剤注射剤等であってもよい。
前記医薬製品は好ましくは乳癌及び乳癌再発の治療に応用できる。
【００１９】
本発明では、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩は、断わらない限り、分子式がＣ50Ｈ78Ｎ10Ｏ11・Ｃ2Ｈ4Ｏ2のＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩を意味する。
【００２０】
本発明の各試薬の略語は下記の通りに定義される：
【００２１】
【表１】
0006392330.tif 000002
【００２２】
従来技術に比べて本発明は下記顕著な利点及び有益な効果を有する：
１、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ硫酸塩に比べて、本発明が提供するＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩は薬物の純度、安定性及び水溶性を大幅に向上させ、薬物の安全性や有効性を十分に確保する。
２、本発明が提供する無定形固体であるＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩は、優れた水溶性と安定性を有し、注射投与等の手段に使用される場合は薬物が迅速に再溶解しやすく、注射溶媒（例えばジメチルスルホキシド）に溶解したＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液に比べて更に優れた安定性を有し、溶解特性や安定性のために、薬剤の製造に有利であり、薬物製剤の使用し易さを十分に確保し、安全且つ効果的に使用することができる。
３、本発明は高純度ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩の製造方法を提供し、従来技術では塩形成及び純度向上についての技術的難問を克服し、該方法は条件が温和であり、再現しやすく、そのため産業化コストを大幅に低減させる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１はＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩無定形固体のＸ−ｒａｙ回折スペクトルである。
【図２】図２はＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩無定形固体のＩＲスペクトルである。
【図３】図３はＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩無定形固体のＥＳＩ質量スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、実施例と図面により本発明を説明するが、本発明を制限するものではない。
【００２５】
実施例１、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品の製造
１、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（置換度０．８ｍｍｏｌ／ｇ）４０ｇを秤量して、ＤＭＦ３００ｍＬ膨潤性樹脂を３０分間かけて添加する。吸引濾過してＤＭＦを除去し、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を３００ｍＬ添加して３０分間反応させる。吸引濾過して、ＤＭＦ６×１５０ｍＬで樹脂を洗浄する。
２、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ  ２４．８ｇ、ＨＯＢｔ  ８．６ｇ及びＤＭＦ  １５０ｍＬを添加して、均一に撹拌し、更にＤＩＣ  ９．５ｍＬを添加し、２８−３０℃の水浴において４〜５時間撹拌する。Ｋａｉｓｅｒ法で検出した結果樹脂が無色になった後、吸引濾過して、ＤＭＦ２×２００ｍＬで樹脂を洗浄する。２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を３００ｍＬ添加して３０分間反応させ、吸引濾過して、ＤＭＦ６×２００  ｍＬで樹脂を洗浄する。
３、ステップ２を参照して、次のアミノ酸を順次結合する。後続アミノ酸の順番及び使用量は、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ  １９．９ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ  ２２．６ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ  ２４．５ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ  １９．０ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ  ２４．８ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ  ２２．６ｇ及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ  ３０．０ｇである。
４、順にジクロロメタンとメタノールで樹脂を洗浄し、真空乾燥させて、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬペプチド樹脂を得る。
５、ペプチド樹脂を１０ｇ秤量して、１００ｍＬの分解溶液（ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ2Ｏ＝９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ）を添加し、室温で２時間撹拌する。樹脂を濾過して、適量の分解溶液で樹脂を洗浄する。洗浄液と濾液を混合して、撹拌しながらエチルエーテル１Ｌを添加し、沈殿を析出する。遠心分離とエチルエーテル洗浄を複数回行った後、真空乾燥させてＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品を得る。
【００２６】
実施例２、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬの精製
実施例１で得られた５ｇのＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品を、１００ｍＬの１０体積％のアセトニトリルを含む水に溶解して濾過する。充填材の高さを２５０ｍｍ、直径を１５０ｍｍ、流動相Ａをトリフルオロ酢酸を０．１体積％含む水、流動相Ｂをトリフルオロ酢酸を０．１体積％含むアセトニトリルとして、勾配溶離（Ｂ  ２０−５０％、溶離時間６０分）を６００ｍＬ／分の流速で行い、検出波長を２３０ｎｍとするように、濾液をＣ１８カラムで精製する。主ピーク成分を収集する。分析型高速液体クロマトグラフィーで収集液の純度を検出する。純度が９８％より大きい画分を混合して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ精製品溶液を得る。分析型高速液体クロマトグラフィーで収集液の純度を検出した結果、純度は９８．６％、収率は４５％であった。
分析高速液体クロマトグラフィーでトリフルオロ酢酸と目的ペプチドの含有量を検出する条件について、創新通恒製ＬＣ３００高速液体クロマトグラフを使用して、Ｃ１８結合シリカ（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を固定相、アセトニトリルを流動相Ａ、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム（リン酸でｐＨ３．０に調整する）水溶液を流動相Ｂとする。勾配溶離（流動相Ａ  ５％−４５％、溶離時間２０分、次に流動相Ａに変更して４５％アイソクラチック溶離）、流速１ｍＬ／分、検出波長１９５ｎｍ（０−８分間）及び２３０ｎｍ（８−５０分間）である。トリフルオロ酢酸と目的ペプチドのピークが現れる時間はそれぞれ約４．９と２１分間である。
分析高速液体クロマトグラフィーで目的ペプチドの純度を検出する条件については、創新通恒製ＬＣ３００高速液体クロマトグラフを使用して、Ｃ１８結合シリカ（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を固定相、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム（リン酸でｐＨ３．０に調整する）水溶液とアセトニトリルとの混合液（体積比７：３）を流動相として、流速を１ｍＬ／分、検出波長を２３０ｎｍとする。目的ペプチドのピークが現れる時間は約１０分間である。
【００２７】
実施例３、遊離ＫＩＦＧＳＬＡＦＬペプチドの製造
実施例２で得られたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ溶液を０−５℃に冷却し、撹拌しながら５％ＮａＯＨ水溶液をｐＨが１０になるまで滴下する。大量のコロイド状沈殿が析出されるまで減圧濃縮する。遠心分離して、少量の氷水で洗浄する。沈殿を真空乾燥させて純度９８．１％の白色固体を得る。
【００２８】
実施例４、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液の製造
実施例２で得られたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ溶液を適当に濃縮させた後に充填材の高さが２５０ｍｍ、直径が１５０ｍｍのＣ１８カラムで精製する。先ず０．１体積％の酢酸と３体積％のアセトニトリルを含む水溶液で１５分間かけて８００ｍＬ／分の流速で溶離する。次に０．１体積％の酢酸を含む水を流動相Ａ、０．１体積％の酢酸を含むアセトニトリルを流動相Ｂとして、勾配溶離（Ｂ：２０％−４０％、溶離時間５０  分）を行い、検出波長を２３０ｎｍとする。主ピーク成分を収集して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を得て、純度は９９．６％、収率は９０％であった。
【００２９】
実施例５、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩無定形固体の製造
実施例４で得られたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を酢酸でｐＨ４に調整し、大量のコロイド状沈殿が析出されるまで減圧濃縮し、温度を０−５℃に低減し、遠心分離して沈殿を得て、沈殿を＜３０℃で真空乾燥させて白色固体を得る。
実施例２の分析高速液体クロマトグラフィーで検出した結果、酢酸のピークが現れる時間は約４．６分間である。測定した結果として、サンプルにおける酢酸は５．７重量％であり、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬの純度は９９．５％であった。
Ｘ−ｒａｙ回折スペクトル検出条件：装置型番：エンピリアン（Ｅｍｐｙｒｅａｎ）Ｘ線回折装置；テスト条件：ＣｕターゲットＫα１線、電圧４０ｋｖ、電流４０ｍＡ、２θ範囲３°−５０°、発散スリット１／３２°、散乱防止スリット１／１６°、散乱防止スリット７．５ｍｍ、ステップサイズ０．０２°、各ステップの滞在時間４０秒である。Ｘ−ｒａｙ回折スペクトルは図面１に示される。
ＫＢｒ錠剤法で得られたＩＲスペクトルは図面２に示される。
ＥＳＩ質量スペクトル結果は図３に示され、そのうち９９５．９ｍ／ｚピークはＭ＋Ｈ+であり、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬの分子量計算値とほぼ一致する。
【００３０】
実施例６、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ・Ｈ2ＳＯ4の製造
実施例２で得られたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ溶液を０−５℃に冷却し、撹拌しながら５重量％のＮａＯＨ水溶液を滴下してｐＨを１０にする。大量のコロイド状沈殿が析出されるまで減圧濃縮する。遠心分離して、少量の氷水で洗浄する。固体を５０体積％のアセトニトリル溶液で溶解し、１ｍｏｌのＥ７５を含むのに対して０．５ｍｏｌ添加する比率でＨ2ＳＯ4を添加し、均一撹拌し（ｐＨ＝６）、３０℃の水浴下で減圧して回転蒸発濃縮を２〜３時間行う。冷凍乾燥させて固体製品を得る。
【００３１】
実施例７、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬとＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩の安定性測定
無菌環境において２５℃且つＲＨ５０％下で、以下のサンプルの安定性を観察する：
サンプル１は実施例５の無定形固体製品である。サンプル２は実施例４の溶液をジメチルスルホキシドで約１ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．２ミクロンの穴径を有する濾過膜で濾過するものである。サンプル３は実施例３の固体製品である。サンプル４は実施例３の固体製品をジメチルスルホキシドで溶解し、約１ｍｇ／ｍＬに希釈して、０．２ミクロンの穴径を有する濾過膜で濾過するものである。サンプル５は実施例６の固体製品である。高速液体クロマトグラフィーで各サンプルの純度を検出した結果は下記表に示される。
【００３２】
【表２】
0006392330.tif 000003
【００３３】
上記表における実験結果に基づいて、従来技術によるＫＩＦＧＳＬＡＦＬ固体（サンプル３）及びそのＤＭＳＯ溶液（サンプル４）は安定性がＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩無定形固体（サンプル１）及びそのＤＭＳＯ溶液（サンプル２）より遥かに悪く、且つＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩無定形固体（サンプル１）の安定性もそのＤＭＳＯ溶液（サンプル２）、及びＫＩＦＧＳＬＡＦＬ・Ｈ2ＳＯ4（サンプル５）より著しく優れる。
【００３４】
実施例８、溶解性測定
小試験管において、それぞれ実施例３、実施例５及び実施例６の固体製品を一定質量の２５℃注射用水に添加し、恒温シェーカーに入れて振とうし、固体の溶解状況を観察する。溶解状況は以下のとおりである：
【００３５】
【表３】
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【００３６】
上記表における実験結果に基づいて、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩無定形固体（実施例５サンプル）の水溶性は従来技術によるＫＩＦＧＳＬＡＦＬ固体、及びＫＩＦＧＳＬＡＦＬ・Ｈ2ＳＯ4に比べて大幅に向上し、製剤や使用が更に容易になる。
【００３７】
実施例９、ポリペプチドワクチン製品の製造
無菌環境において、実施例５のように操作してＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩を製造する。精密に秤量（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ換算で１ｍｇ／部）して、ガラス瓶に分包して、密閉包装して、ポリペプチドワクチン製品を得る。
【００３８】
実施例１０
実施例２で得られたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ溶液を適当に濃縮した後に充填材の高さが２５０ｍｍ、直径が１５０ｍｍのＣ１８カラムで精製する。０．１体積％の酢酸を含む水を流動相Ａ、アセトニトリルを流動相Ｂとして、勾配溶離（Ｂ：２０％−４０％、溶離時間５０分）を８００ｍＬ／分の流速で行い、検出波長を２３０ｎｍとする。主ピーク成分を収集して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬの溶液を得て減圧濃縮して凍結乾燥させて白色固体を得る。実施例２のＨＰＬＣで検出した結果、酢酸は４．８重量％、トリフルオロ酢酸は１．９重量％である。
【００３９】
実施例１１
実施例１で得られたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品を実施例２の方法のようにクロマトグラフィーにより精製して、主ピーク成分を収集する。分析型高速液体クロマトグラフィーで収集液の純度を検出する。純度が９２％より大きい画分を収集して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ溶液を得る。分析型高速液体クロマトグラフィーで収集液の純度を検出した結果、純度は９５．１％である。次に実施例４のクロマトグラフィー方法により塩形成し、主ピーク成分を収集して、純度９５．３％のＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を得る。得られたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を乾固するまで減圧濃縮して、４０℃で真空乾燥させて白色固体を得て、全収率は６０％であった。実施例２のＨＰＬＣで検出した結果、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬの純度は９４．１％であった。
【００４０】
実施例１２
実施例１で得られたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品を実施例２の方法のようにクロマトグラフィーにより精製して、主ピーク成分を収集する。分析型高速液体クロマトグラフィーで収集液の純度を検出する。純度が９２％より大きい画分を収集して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ溶液を得る。分析型高速液体クロマトグラフィーで収集液の純度を検出した結果、純度は９５．１％であった。次に実施例４のクロマトグラフィー方法により塩形成し、主ピーク成分を収集して、純度９５．３％のＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を得て、全収率は６０％であった。次に実施例５の方法で処理して白色固体、即ち無定形ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩を得て、純度は９５．３％であった。
【００４１】
実施例１３
実施例１で得られたＫＩＦＧＳＬＡＦＬ粗製品を実施例２の方法のようにクロマトグラフィーにより精製して、主ピーク成分を収集する。分析型高速液体クロマトグラフィーで収集液の純度を検出する。純度が９６％より大きい画分を収集して、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ溶液を得る。分析型高速液体クロマトグラフィーで収集液の純度を検出した結果、純度は９７．５％であった。次に実施例４のクロマトグラフィー方法により塩形成し、主ピーク成分を収集して、純度９８．１％のＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩溶液を得て、全収率は４５％であった。次に実施例５の方法で処理して白色固体、即ち無定形ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ酢酸塩を得て、純度は９８．０％であった。
【００４２】
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬを合成過程において大量の不純物が発生するため、高純度ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ塩の産業化製造を実現するのに技術的難問が存在し、高純度単塩の精製品が製造しにくく、且つ上記実施例１０のように、合成製品は例えば酢酸やトリフルオロ酢酸等の混合塩を生成しやすく、単塩精製品の分離精製が困難である。
発明者は本分野における通常の分離精製手段の好ましい実施形態、例えば実施例１１の形態を使用して、純度９５％以下の製品だけを得、製品の医薬分野への応用には不利である。しかし、大量の実験を行って得る好ましい精製形態、例えば実施例１２及び１３は、製品の純度を９５％以上、更に９８％以上に達成させ、それにより高純度ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ塩の製造に存在する難問を克服し、該製品の産業化及び医薬応用を可能にする。
【００４３】
上記実施例は本発明の好ましい実施形態であるが、本発明の実施形態が上記実施例に制限されず、本発明の主旨や原理を脱逸しない限り、全ての変化、修飾、置換、組合せ、簡略化が、同等置換方式であり、本発明の保護範囲内に属すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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