(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
本来のサンプルにおけるナノ粒子の分布状態のTEM観察及び/又は特性評価のための標本キットにおいてナノ粒子含有標本を調製する方法であって、
(a)  (i)各々が上面及び下面を有する上部基板及び下部基板、(ii)第一スペーサー及び第二スペーサー並びに(iii)非密閉チャンバーと、を備える、商用TEMホルダーに適応及び適合する前記標本キットを提供する提供ステップと、
(b)  ナノ粒子含有液体サンプルを前記非密閉チャンバーにロードするロードステップと、
(c)  前記チャンバー中で液体サンプルを乾燥させて、乾燥ナノ粒子含有標本を取得する乾燥ステップと、を有し、
前記ナノ粒子は、前記上部基板の下面と前記下部基板の上面に付着し、
(i)
前記基板の各々は、長さL1、幅W1及び50nmから300nmの範囲の厚さT1を有し、
前記上部基板及び下部基板は、透明であり且つ互いに実質的に並行であり、
(ii)
前記スペーサーの各々は、長さL2、幅W2及び厚さhを有し、並びに前記上部基板の下に位置し且つ前記下部基板の上に位置し、
前記第二スペーサーは、前記第一スペーサーと間隔dだけ間隔を空けて対向するように配置され、
前記スペーサーの幅W2は、前記上部基板の幅W1よりも小さく、
(iii)
前記非密閉チャンバーは、大気に通じる2つの末端を備え、前記上部基板と前記下部基板との間且つ前記第一スペーサーと前記第二スペーサーとの間に形成され、そして、前記スペーサーの厚さによって規定される長さL1、幅d及び高さhを有することによって特徴づけられ、
高さhは、5μm又は5μm未満であり、長さL1は、1cm以下であり、幅dは、1cm未満である、方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子含有液体サンプルは、血液サンプル、体液、ローション、化学的機械研磨/平坦化スラリー及び炭酸カルシウムナノ粒子含有液体又はミルクからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非密閉チャンバーは、前記乾燥ステップの間、ナノ粒子の凝結を防止するために幅が狭くなるように構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
液体サンプル中のナノ粒子のTEM画像を分析する方法であって、
(a)  請求項１の方法に従ってTEMナノ粒子特性評価のための乾燥標本を調製するステップと、
(b)  TEMの下に前記乾燥標本を設置するステップと、
(c)  前記乾燥標本のナノ粒子のTEM画像を観察及び分析して前記液体サンプル中の前記ナノ粒子の凝結、凝集及び/又は濃度に関する情報を得るステップと、を有する、方法。
【請求項５】
前記観察及び分析ステップは、
(i)  前記ナノ粒子のTEM画像を取得してコンピューターに前記TEM画像を保存するステップと、
(ii)  コントラストを高めて、ノイズ及びバックグラウンドを低減するために前記TEM画像を前処理するステップと、
(iii)  前記バックグラウンドから前記画像中の前記ナノ粒子を分けるステップと、
(iv)  ユーザーインターフェースを用いたトレーニングデータベースを構築するステップと、
(v)  前記トレーニングデータベースにおける情報に基づいて個々の粒子を分類するステップと、を更に有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(i)から(v)は、コンピューターソフトウェアによって実行される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記構築するステップは、前記コンピューターをトレーニングしてナノ粒子の特性を認識させるステップを有する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記特性は、凝結粒子及び単一粒子からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
(i)各々が上面及び下面を有する上部基板及び下部基板、(ii)第一スペーサー及び第二スペーサー、(iii)非密閉チャンバー並びに(iv)前記非密閉チャンバー内に配置された乾燥ナノ粒子含有標本を備える標本キットであって、
(i)
前記基板の各々は、長さL1、幅W1及び50nmから300nmの範囲の厚さT1を有し、
前記上部及び下部基板は、透明であり且つ互いに実質的に並行であり、
(ii)
前記スペーサーの各々は、長さL2、幅W2及び厚さhを有し、並びに前記上部基板の下に位置し且つ前記下部基板の上に位置し、
前記第二スペーサーは、前記第一スペーサーと間隔dだけ間隔を空けて対向するように配置され、
前記スペーサーの幅W2は、前記上部基板の幅W1よりも小さく、
(iii)
前記非密閉チャンバーは、大気に通じる2つの末端を備え、前記上部基板と前記下部基板との間且つ前記第一スペーサーと前記第二スペーサーとの間に形成され、そして、前記スペーサーの厚さによって規定される長さL1、幅d及び高さhを有することによって特徴づけられ、
高さhは、5μm又は5μm未満であり、長さL1は、1cm以下であり、幅dは、1cm未満であり、標本キット。
【請求項１０】
(a)  請求項9に記載の標本キットと、
(b)  以下の機能：
(i)  前記ナノ粒子のTEM画像を取得してコンピューターに前記TEM画像を保存するステップと、
(ii)  コントラストを高めて、ノイズ及びバックグラウンドを低減するために前記TEM画像を前処理するステップと、
(iii)  前記バックグラウンドから前記画像中の前記ナノ粒子を分けるステップと、
(iv)  ユーザーインターフェースを用いたトレーニングデータベースを構築するステップと、
(v)  前記トレーニングデータベースにおける情報に基づいて個々の粒子を分類するステップを実行するアルゴリズムを含むコンピューターソフトウェアと、を備える、
組成物中の粒子のTEM画像を分析するためのシステムの使用。
【請求項１１】
前記乾燥ナノ粒子含有標本は、前記非密閉チャンバー内で均一に分配された乾燥形態のナノ粒子を含み、
前記ナノ粒子間の距離は、一様なガウス分布を示し、
乾燥状態の前記ナノ粒子は、ナノ粒子含有液体サンプルに由来し、
乾燥状態の前記ナノ粒子は、前記下部基板の上面と前記上部基板の下面に付着し、
前記乾燥標本は、細胞を含まない、請求項9に記載の標本キット。
【請求項１２】
(a)上面及び下面を有する上部フレーム並びに(b)上面及び下面を有する下部フレームを更に備え、
(a)  前記上部フレームは、上部基板上に設置され、その上面と下面との間に形成された開放ウインドウを備えており、
(b)  前記下部フレームは、下部基板下に設置され、その上面と下面との間に形成された開放ウインドウを備えており、
開放ウインドウの各々は、前記チャンバーに向いて開放している1つの開放ウインドウと、前記チャンバーから離れる方向に向いて開放するもう1つのウインドウと、を備え、
前記チャンバーに向いて開放しているウインドウは、幅が50μm以下であり、長さが800μm以下である、請求項9に記載の標本キット。
【請求項１３】
前記標本キットは、(a)上面及び下面を有する上部フレーム並びに(b)上面及び下面を有する下部フレームを更に備え、
(a)  前記上部フレームは、上部基板上に設置され、その上面と下面との間に形成された開放ウインドウを備えており、
(b)  前記下部フレームは、下部基板下に設置され、その上面と下面との間に形成された開放ウインドウを備えており、
開放ウインドウの各々は、前記チャンバーに向いて開放している1つの開放ウインドウと、前記チャンバーから離れる方向に向いて開放するもう1つのウインドウと、を備え、
前記チャンバーに向いて開放しているウインドウは、幅が50μm以下であり、長さが800μm以下である、請求項1-8のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記上部基板は、複数の穴又はチャネル又はスリットを更に備え、
前記穴又はチャネル又はスリットのサイズは、前記チャンバー内の前記液体サンプルが前記穴又はチャネル又はスリットからしみ出るのを制限するように構成されている、請求項9に記載の標本キット。
【請求項１５】
前記上部基板及び下部基板は、それぞれが100nmから200nmの範囲の厚さを有する、請求項9に記載の標本キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、均一に分配されたナノ粒子を含む標本の調製方法に関する。かかる均一に分配された標本は、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いた、画像に基づく観察及び定量的特性評価に適している。本発明は、液体サンプルにおけるナノ粒子の形態、サイズ及び分布のリアルタイム調査を容易にするが、標本キットの幾何的制約に起因するナノ粒子の凝集を引き起こすことはない。
【０００２】
発明の背景
ナノ粒子又はナノ粒子を主成分とする製剤には、高度な治療又は診断目的のために標的組織へ効果的にデリバリーされるというメリットがある。このことは、通常、それらのサイズ、形状、表面特性及び凝結/凝集状態に関連している。液性環境又は生理的環境でのそれらのサイズ、分布、凝結/凝集状態及び形状に関連する、ナノ粒子の総合的な物理化学的特性評価は、それらの生物医学的用途での使用及び安全規程の順守に重要であるが、困難な課題でもある。生物流体におけるナノ粒子の凝結/凝集は、生物学的認識に重要な物理的寸法、形状及び表面特性を決定するのに重要な役割を果たすが、かかる凝結/凝集に関する画像に基づく観察は、固相では達成するのが困難である。透過型電子顕微鏡(TEM)は、ナノ粒子を観察するための特有且つ強力な道具である。しかしながら、(ナノ粒子の溶液を銅グリッド上で乾燥させること又はそれをクライオステージホルダー上で凍結させることによって調製される)従来型のTEM標本中におけるナノ粒子の空間分布が不均一なため、TEMは、水溶液におけるナノ粒子の空間分布の評価のためには滅多に使用されない。
【０００３】
発明の概要
本発明は、ナノ粒子を液体サンプル(例えば血液サンプル又は乳相液体)から選別して、乾燥プロセスの間に粒子が凝結するのを防止するための、チャンバー幅を制御できるマイクロチップナノピペットの製作に関する。これによって、それらの凝結/凝集状態及び水溶液中の粒子濃度の定量分析が可能になる。このマイクロチップは、全ての種類の商用TEMホルダーに適応及び適合する。かかるナノピペットは、TEM画像に基づく定量的特性評価のための単純且つ簡便なサンプリングデバイスであることがわかる。
【０００４】
一つの態様では、本発明は、TEMナノ粒子特性評価のための標本を調製する方法に関する。
上記方法は、
(a)  (i)各々が上面及び下面を有する上部基板及び下部基板、(ii)第一スペーサー及び第二スペーサー並びに(iii)非密閉チャンバーを備える標本キットを提供するステップと、
(b)  ナノ粒子含有液体サンプルを上記チャンバーにロードするステップと、
(c)  上記チャンバー中で液体サンプルを乾燥させて、上記上部基板の下面と上記下部基板の上面に付着した、乾燥ナノ粒子含有標本を取得するステップと、を有し、
(i)
上記基板の各々は、長さL1、幅W1及び厚さT1を有し、
上記上部基板及び下部基板は、透明であり且つ互いに実質的に並行であり、
(ii)
上記スペーサーの各々は、長さL2、幅W2及び厚さhを有し、並びに上記上部基板の下に位置し且つ上記下部基板の上に位置し、
上記第二スペーサーは、上記第一スペーサーと間隔dだけ間隔を空けて対向するように配置され、
上記スペーサーの幅W2は、上記上部基板の幅W1よりも小さく、
(iii)
上記非密閉チャンバーは、大気に通じる2つの末端を備え、上記上部基板と上記下部基板との間且つ上記第一スペーサーと上記第二スペーサーとの間に形成され、そして、上記スペーサーの厚さによって規定される長さL1、幅d及び高さhを有することによって特徴づけられ、
高さhは、赤血球の直径よりも小さい。
【０００５】
別の態様においては、本発明は、上述の標本キットに関する。
【０００６】
別の態様においては、本発明は、液体サンプル中のナノ粒子のTEM画像を分析する方法に関する。
上記方法は、
(a)  上述の方法に従ってTEMナノ粒子特性評価のための乾燥標本を調製するステップと、
(b)  TEM下に上記乾燥標本を設置するステップと、
(c)  上記乾燥標本のナノ粒子のTEM画像を観察及び分析して上記液体サンプル中の上記ナノ粒子の凝結、凝集及び/又は濃度に関する情報を得るステップと、を有する。
【０００７】
更に別の態様においては、本発明は、組成物中の粒子のTEM画像を分析するシステムに関する。
上記システムは、
(a)  上述の標本キットと、
(b)  コンピューターソフトウェアと、を備え、
上記コンピューターソフトウェアは、
(i)  上記ナノ粒子のTEM画像を取得してコンピューターに上記画像を保存する機能と、
(ii)  コントラストを高めて、ノイズ及びバックグラウンドを低減するために上記TEM画像を前処理する機能と、
(iii)  上記バックグラウンドから上記画像中の上記ナノ粒子を分ける機能と、
(iv)  ユーザーインターフェースを用いたトレーニングデータベースを構築する機能と、
(v)  上記トレーニングデータベースにおける情報に基づいて個々の粒子を分類する機能と、を実行するアルゴリズムを有する。
【０００８】
別の態様においては、本発明は、上述の標本キットの非密閉チャンバー内で均一に分配された乾燥形態のナノ粒子を含んでいる乾燥ナノ粒子含有標本に関する。ナノ粒子は、液体サンプル中に懸濁した非乾燥粒子形態としてチャンバーにロードされる。チャンバー内で均一に分配された乾燥形態のナノ粒子は、上記下部基板の上面と上記上部基板の下面に付着する。非密閉チャンバー内のナノ粒子の均一な分布は、液体サンプル中に懸濁した非乾燥ナノ粒子の状態を反映する。更に、乾燥標本は、細胞を含まない。上記下部基板の上面及び上記上部基板の下面は、チャンバーの内表面(上部及び下部内表面)の一部を形成する。
【０００９】
これらの態様及び他の態様は、以下の図面に関連する好適な実施形態に関する以下の記述から明らかになるだろう。但し、その中の変更形態及び修正形態は、開示する新規の概念の精神と範囲から逸脱することなく作用し得るものである。
【００１０】
添付の図面は、本発明の1又は複数の実施形態を例示して、明細書と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。可能限り、同じ参照番号を図面の全体にわたって使用して、実施形態における同一又は類似の構成要素を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−２】図1AからEは、顕微鏡標本の調製に関する従来法を示している模式的な側面図(図1A-D)及び平面図(図1E)である。図2AからEは、他の顕微鏡標本の調製に関する従来法を示している模式的な側面図(図2A-D)及び平面図(図2E)である。
【図３−４】図3A-Eは、本発明による、乾燥顕微鏡標本の調製を示している模式的な側面図(図3A-D)及び平面図(図3E)である。図4Aから4Eは、本発明による、顕微鏡標本の調製を示している模式的な側面図(図4A-D)及び平面図(図4E)である。
【図５−６】図5は、本発明の一実施形態による、標本キット(又は、マイクロチップナノピペット)の模式的な斜視図である。図6は、標本キット(マイクロチップナノピペット)の模式的な断面図である。
【図７−９】図7Aから7Bは、本発明の一実施形態による、ライン702に沿った標本キットの模式的な平面図(図7A)及び断面図(図7B)である。図8Aから8Bは、本発明の他の実施形態による、ライン702に沿った標本キットの模式的な平面図(図8A)及び断面図(図8B)である。図9Aから9Bは、本発明の他の実施形態による、ライン702に沿った標本キットの模式的な平面図(図9A)及び断面図(図9B)である。
【図１０】図10は、ウインドウ型TEMマイクロチップナノピペットのジオメトリー及び標本調製のためのサンプリングプロセスを示す：(A)寸法及び素材を明示している、デバイスの概略図；(B)ナノピペットは、単純且つ簡便にナノ粒子を選別して血液中のより大きな物質を防ぐフィルターとして作用する；(C)乾燥プロセスを制御するための特定のチャンバー幅を有するチャンバーの拡大概略図。
【図１１】図11は、銅グリッド及びナノピペット上のcPEG5k-GNPの乾燥プロセス及び分布を示している：(A)(炭素及びSiOxフィルムを用いた)銅グリッド上、及び、(SixNy-フィルムを用いた)ナノピペットにおいて乾燥させた、5%グルコース溶液中のcPEG5k-GNPのTEM画像；(B)4つの個々の画像ゾーン(2.0μm×2.7μm)においてカウントした粒子数；(C)粒子数パーセンテージ対TEM画像(4つの画像ゾーンの合計)における隣接する粒子までの距離。スケールバーは、50nmである。
【図１２】図12は、TEMナノピペットを使用して、50%希釈の血液中におけるcPEG5k-GNPの観察を示している：(A)ナノピペットにおける、5%グルコース溶液、50%希釈の血液及び50%希釈の血液中のcPEG5k-GNPのTEM画像；(B)TEM画像ゾーン(2.0μm×2.7μm)における4つのナノピペットの粒子数；(C)ナノピペットにおいて4回繰り返した血液サンプルにおける粒子数パーセンテージ対隣接する粒子までの距離；(D)粒子数パーセンテージ対50%血液及び5%グルコース中のcPEG5k-GNPの隣接する粒子までの距離の比較。スケールバーは、20nmである。
【図１３】図13は、TEMナノピペットを使用した血液サンプル中のcPEG5k-GNP濃度の定量化と、誘導結合プラズママススペクトロメトリー(ICPMS)分析を示している:(A)ナノピペットを使用したナノ粒子の濃度を定量化するためのコンセプト；(B)ICPMS及びナノピペット(n = 3)を使用した、50%希釈の血液におけるcPEG5k-GNP濃度の測定。青線は、傾斜= 1.03(CICPMS = Cナノピペット)及びr2 = 0.997を有する線形フィッティング結果である。(C)ICPMS(n = 1)及びナノピペット(n = 3)分析法を使用した、t = 0.1、1、3、7、24、及び48hにおける一匹のラット由来の全血サンプル中のcPEG5k-GNP濃度の測定。有意差は、t検定(p = 0.05)を使用した2つの方法の間では見られなかった。(D)ラットの全血中のcPEG5k-GNPのTEM画像。スケールバーは、20nmである。
【図１４】図14A-Bは、ラインに沿った標本キットの模式的な平面図(図14A)及び断面図(図14B)であり、ウインドウの幅対フィルム(即ち、上部基板及び下部基板)の厚さを示している。
【図１５Ａ−Ｂ】図15A-Bは、前処理前後の画像を示している。
【図１５Ｃ−Ｄ】図15C-Dは、前処理前後の画像を示している。
【図１５Ｅ−Ｆ】図15E-Fは、仕分けの画像を示している。
【図１５Ｇ−Ｈ】図15G-Hは、仕分けの画像を示している。
【図１５Ｉ−Ｊ】図15I-Jは、データベースを構築するための粒子選択(図15I)及び画像の分類(図15J)の画像を示している。
【図１６】図16A-Bは、日焼け止めローション中のZnO及びTiO2粒子のTEM画像の分析の結果を示している。
【図１７】図17A-Cは、ミルク中のCaCO3粒子のTEM画像の分析の結果を示している。
【図１８】図18A-Bは、CMPスラリーのTEM画像の分析の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
定義
この明細書において使用する用語は、本発明が属する技術分野、及び、それぞれの用語が使われる特定の文脈内での通常の意味を一般に有する。本発明を説明するために用いるある種の用語は、以下に記述し、そうでなければ本明細書に記述して、本発明の記述に関係する実践者に助言を更に提供する。便宜上、ある種の用語は、例えばイタリック及び/又は引用符を使用して強調されているかもしれない。強調の使用は、用語の範囲及び意味に対して影響を及ぼすものではない。用語の範囲及び意味は、同じ文脈において、それが強調されていようがいまいが同じである。同じことを複数の方法で言うことができることはいうまでもない。その結果、代わりの言葉及び同義語を、本明細書に記述した任意の1以上の用語に用いることができるが、用語が詳しく述べられていようが本明細書に述べられていようが任意の特別な意味を持たない。ある種の用語については、同義語が用いられている。1又は複数の同義語の記述は、他の同義語の使用を除外するものではない。この明細書の任意の場所における例(本明細書に記述した任意の用語例を含む)の使用は、説明のためだけに使用するものであり、本発明又は任意の例示用語の範囲及び意味を制限するものではない。同様に、本発明は、この明細書が与える様々な実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
別途規定されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、本発明に関係する当業者が理解するものと同じ意味を一般的には有する。不一致の場合は、定義を含む本書によって規定される。
【００１４】
本明細書で用いられる「だいたい」、「約」又は「およそ」は、所定の値又は範囲の20パーセント以内、好ましくは10パーセント以内、より好ましくは5パーセント以内を一般的には意味する。本明細書が与える数値量は、およそであり、用語「だいたい」、「約」又は「およそ」は、はっきりと明言しない限り推定され得ることを意味する。
【００１５】
用語「標本キット」及び「マイクロチップナノピペット」は、互いに置換可能である。
【００１６】
粒子凝結は、コロイド懸濁液中でのクラスターの形成を指し、コロイド系の不安定化を引き起こす最も頻度が高いメカニズムを表す。
【００１７】
凝集は、互いに又は固体表面に対する粒子のくっつきを指す。凝結は、強い結合力を含み、不可逆的である。凝集は、凝結ほど強くなく、より容易な可逆性を有する。即ち、コロイドの粒子は、より小さな凝集体又は個々の粒子にバラバラに分解するのが容易である。コートされていない粒子は、強く凝結する。表面コート粒子は、最終的には凝集するが、容易に分解し得るものである。
【００１８】
本明細書で用いられ「ナノ粒子」は、1000nm又はそれ未満を指し、粒子の少なくとも1つの寸法は、100nm未満でなければならない。
【００１９】
本明細書で用いるように、数又は範囲が記載されている場合、当業者は、それが本発明に関連する特定の分野において適切で且つ合理的な範囲を含むことを意図するものであることを理解している。
【００２０】
0.5μm超5μm未満に関しては、範囲内の全ての小数第一位と整数の単位量の範囲が本発明の一部として具体的に開示されていることを意味している。従って、0.6、0.7、0.8及び1、2、3及び4μm単位量が、本発明の実施形態として含まれる。
【００２１】
50nmから300nmの範囲に関しては、範囲内の全ての整数の単位量が本発明の一部として具体的に開示されていることを意味している。従って、50、51、52、...、298、299及び300nm単位量が、本発明の実施形態として含まれる。
【００２２】
5μmから30μmの範囲に関しては、範囲内の全ての整数の単位量が本発明の一部として具体的に開示されていることを意味している。従って、5、6、7、...、28、29及び30μmが、本発明の実施形態として含まれる。
【００２３】
EDS又はEDAXと呼ばれるエネルギー分散X線分析(EDX)は、素材の元素組成を同定するために用いるX線技術である。
【００２４】
サポートベクターマシン(SVM又はサポートベクターネットワーク[1])は、分類及び回帰分析に使用する、データを分析してパターンを認識する学習アルゴリズムに関する教師付学習モデルである。
【００２５】
用語「ナノ粒子の均一な分布」は、隣接ナノ粒子間の距離が、図11C(ナノピペットを使用してのサンプル調製)に示す通り、一様なガウス分布を示すことを意味する。図11A-B(銅グリッドを使用してのサンプル調製)は、互いに異なる2つのピークを示すものであり、隣接ナノ粒子間の距離における偏差が大きいことを表している。
【００２６】
小さなチャンバーを備える標本キットは、TEM用標本の調製用に開示されている。チャンバーの高さは、血液細胞の寸法よりも小さいため、血液細胞からナノ粒子を選別するのに適している。本発明によって調製される標本は、液体サンプル(例えば血液)におけるナノ粒子の分布状態のTEM観察に適している。チャンバーの高さが小さいと、乾燥の間にナノ粒子が凝結又は凝集する可能性がなくなる。従って、本発明の下で調製される標本は、液体サンプル中のナノ粒子の分散及び/又は凝集のTEM観察に適している。
【００２７】
一つの態様では、本発明は、(a)各々が上面及び下面を有する上部基板及び下部基板、(b)第一スペーサー及び第二スペーサー並びに(c)チャンバーを備える標本キット(図5、6、10、14)に関するものであり、
(a)
上記基板の各々は、長さL1、幅W1及び厚さT1を有し、
上記上部及び下部基板は、透明であり且つ互いに並行であり、
(b)
上記スペーサーの各々は、長さL2、幅W2及び厚さhを有し、並びに上記上部基板の下に位置し且つ上記下部基板の上に位置し、
上記第二スペーサーは、上記第一スペーサーと間隔dだけ間隔を空けて対向するように配置され、
上記スペーサーの幅W2は、上記上部基板の幅W1よりも小さく、
(c)
上記チャンバーは、上記上部基板と下部基板との間且つ第一スペーサーと第二スペーサーとの間に形成され、
上記チャンバーは、大気に通じる2つの末端を備え、そして、上記スペーサーの厚さによって規定される長さL1、幅d及び高さhを有することによって特徴づけられ、
高さhは、赤血球の直径よりも小さい。
【００２８】
本発明の一実施形態において、上部基板は、複数の穴又はチャネル又はスリットを更に備え、上記穴又はチャネル又はスリットのサイズは、上記チャンバー内の上記液体サンプルが上部基板の上記穴又はチャネル又はスリットから漏れる/しみ出るのを制限するように充分に狭くなるように構成されている。
【００２９】
本発明の別の実施形態において、上記上部基板は、隙間構造(例えば穴又はスリット又はチャネル)を備えていない。
【００３０】
上記標本キットの上記下部基板は、上記下部基板に任意の隙間構造が形成されることなく平坦且つ連続している。上記チャンバーは、全ての側面が囲まれず閉鎖もされない。
【００３１】
チャンバーの長さ、幅及び高さは、それぞれ、上部基板及び下部基板の長さ、2つのスペーサー間の距離及びスペーサーの厚さによって規定される。従って、チャネルの容積は、固定であり、算出又は測定することができる。本発明の一実施形態によるチャンバーの長さは1cm以下であり、チャンバーの高さは赤血球の直径よりも小さい。
【００３２】
本発明の別の実施形態において、上述した標本キットは、上面及び下面を有する上部フレーム並びに上面及び下面を有する下部フレームを更に備え、
(a)  上記上部フレームは、上部基板上に設置され、その上面と下面との間に形成された開放ウインドウを備えており、
(b)  上記下部フレームは、下部基板下に設置され、その上面と下面との間に形成された開放ウインドウを備えており、
開放ウインドウの各々は、上記チャンバーに向いて開放している1つの開放ウインドウと、上記チャンバーから離れる方向に向いて開放するもう1つのウインドウと、を備え、
上記チャンバーに向いて開放しているウインドウは、幅が50μm以下であり、長さが800μm以下である。
【００３３】
上部及び下部フレームは、基板に力を与えることによって上部及び下部基板をサポートしている。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、上部基板及び下部基板は、それぞれが50nmから300nm又は50nmから200nm、好ましくは100nmから200nmの範囲の厚さを有する。2枚の基板のそれぞれが50nm以上の厚さを有し、液体サンプルのロード及び乾燥の間、変形を最小限にして上部基板及び下部基板(又は、フィルム)を並行に維持することは、重要である。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、チャンバーの高さは、0.1μm超から5μm未満である。あるいは、チャンバーの高さは、5μm又は5μm未満である。本発明の別の実施形態において、チャンバーの高さは、10μm未満、5nmから2μm、5nmから0.5μm及び5nmから150nmからなる群より選択される。本発明の別の実施形態において、チャンバーは、長さが1cm以下であり幅が1cm未満である。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、上部基板及び下部基板は、それぞれ、窒化ケイ素(SixNy)フィルムを備える。
【００３７】
別の態様においては、本発明は、透過型電子顕微鏡(TEM)ナノ粒子特性評価のための乾燥標本を調製するのに用いられる上述の標本キットに関する。
【００３８】
別の態様においては、本発明は、TEMナノ粒子特性評価のための標本を調製する方法に関する。上記方法は、
(a)  上述の標本キットを提供するステップと、
(b)  ナノ粒子含有液体サンプルを非密閉チャンバーにロードするステップと、を有する。
この場合、上記方法は、乾燥プロセスを有さないため、液体サンプル中のナノ粒子がTEM下で観察される。
【００３９】
更に別の態様においては、本発明は、TEMナノ粒子特性評価のための標本を調製する方法に関する。上記方法は、
(a)  上述の標本キットを提供するステップと、
(b)  ナノ粒子含有液体サンプルを非密閉チャンバーにロードするステップと、
(c)  非密閉チャンバー内の液体サンプルを乾燥させて、上部基板の下面及び下部基板の上面に付着した、乾燥ナノ粒子含有標本を得るステップと、を有する。
【００４０】
本発明の一実施形態において、上記ロードするステップは、チャンバーの一端を下方に位置させて、液体サンプルと接触させることによって実行される。
【００４１】
本発明の別の実施形態において、ナノ粒子含有液体サンプルは、血液サンプル、体液、ローション、化学的機械研磨/平坦化スラリー及び炭酸カルシウムナノ粒子含有液体又はミルクからなる群より選択される少なくとも1つである。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、液体サンプルの乾燥の間、ナノ粒子は、移動並びに凝結及び/又は凝集が制限される。
【００４３】
更に別の態様においては、本発明は、液体サンプル中のナノ粒子のTEM画像を分析する方法に関する。上記方法は、
(a)  上述の方法に従ってTEMナノ粒子特性評価のための乾燥標本を調製するステップと、
(b)  TEMの下に上記乾燥標本を設置するステップと、
(c)  乾燥標本のナノ粒子のTEM画像を観察及び分析して液体サンプル中の上記ナノ粒子の凝結、凝集及び/又は濃度に関する情報を得るステップと、を有する。
【００４４】
本発明の一実施形態において、観察及び分析ステップは、
(i)  上記ナノ粒子のTEM画像を取得してコンピューターに上記TEM画像を保存するステップと、
(ii)  コントラストを高めて、ノイズ及びバックグラウンドを低減するために上記TEM画像を前処理するステップと、
(iii)  上記バックグラウンドから上記画像中の上記ナノ粒子を分けるステップと、
(iv)  ユーザーインターフェースを用いたトレーニングデータベースを構築するステップと、
(v)  上記トレーニングデータベースにおける情報に基づいて個々の粒子を分類するステップと、を更に有する。
【００４５】
本発明の別の実施形態において、ステップ(i)から(v)は、コンピューターソフトウェアによって実行される。
【００４６】
本発明の別の実施形態において、上記構築するステップは、上記コンピューターをトレーニングしてナノ粒子の特性を認識させるステップを有する。上記特性は、凝結粒子及び単一粒子からなる群より選択される少なくとも1つであってもよい。
【００４７】
別の態様においては、本発明は、組成物中の粒子のTEM画像を分析するのに使用するためのシステムに関するものであり、上記システムは、
(a)  上述の標本キットと、
(b)  コンピューターソフトウェアと、を備え、
上記コンピューターソフトウェアは、
(i)  ナノ粒子のTEM画像を取得してコンピューターに画像を保存する機能と、
(ii)  コントラストを高めて、ノイズ及びバックグラウンドを低減するためにTEM画像を前処理する機能と、
(iii)  バックグラウンドから画像中のナノ粒子を分ける機能と、
(iv)  ユーザーインターフェースを用いたトレーニングデータベースを構築する機能と、
(v)  トレーニングデータベースにおける情報に基づいて個々の粒子を分類する機能と、を実行するアルゴリズムを有する。
【００４８】
サポートベクターマシン(SVM)は、前処理、仕分け、トレーニングデータベース-構築及び粒子-分類を実行するのに適しているであろうアルゴリズムである。前処理ステップは、以下のヒストグラム等化アルゴリズムを使用する:
【数１】
0006297551.tif 000002
【００４９】
更に別の態様においては、本発明は、上述の標本キットの非密閉(又は、非閉)チャンバー内でのナノ粒子の均一な分布によって特徴づけられる乾燥ナノ粒子含有標本に関するものである。上記乾燥標本は、ナノ粒子含有液体サンプルの乾燥によって生じる。上記非密閉チャンバー内でのナノ粒子の均一な分布は、液体サンプル中のナノ粒子の状態を反映している。上記ナノ粒子含有標本は、囲まれておらず非閉でもない。上記ナノ粒子含有液体サンプルは、血液サンプル、体液、ローション、化学的機械研磨/平坦化スラリー及び炭酸カルシウムナノ粒子含有液体又はミルクからなる群より選択される少なくとも1つであってもよい。
【実施例】
【００５０】
本発明の範囲を制限する意図はないが、本発明の実施形態による例示的な機器、装置、方法及びそれらの関連した結果物を以下に示す。なお、表題又は副題は、読み手の便宜のための例として用いてもよいものであり、本発明の範囲を決して制限すべきものではない。更に、ある種の理論が、本明細書において提唱及び開示されているが、それらが当たっていようがいまいが、動作に関する任意の特定の理論又はスキームに関係なく本発明に従って実施される限り、決して本発明の範囲を制限すべきものではない。
【００５１】
従来法によって調製された顕微鏡標本
図1A-Eは、顕微鏡標本の調製のための従来法を示す模式的な図である。血液サンプル等の生物流体サンプル102(血液細胞104及び粒子106(例：ナノ粒子)を含む)を1滴、基板100片(例えば銅グリッド)に置く(図1A-B、側面図)。ナノ粒子の直径は、通常1マイクロメートル以下であるため、血液細胞の直径よりも小さい。赤血球(RBC)は、平均直径が6から8μmであり、白血球(WBC)は、平均直径が10から12μmである。生物流体又は血液サンプル102中の液体が乾燥プロセスの間に蒸発して、水滴が小さくなり、より小さい複数の液滴が形成される(図1C、側面図)。各液滴の表面張力108が成分(例えば、ナノ粒子)を互いに近づくように引き込む結果、液滴内のナノ粒子が凝結する。図1D(側面図)は、サンプル内の液体を完全に蒸発させた後に形成される2つの凝結群110a及び110bを示している。上記調製された標本中に生じるナノ粒子110a及び110bの凝結は、ナノ粒子-凝集と類似の外観を示す。これが、ナノ粒子凝結とナノ粒子凝集との間で観察混乱を引き起こし、TEM観察者に不正確で誤った情報を与える。図1Eは、図1Dの平面図であり、形成された2つの凝結群110a及び110bを示している。図1Eの顕微鏡標本は、本来のサンプル102中のナノ粒子106の本当の状態を反映しない。本来のサンプル102中のナノ粒子106は、任意の凝結(図1B)なしに均一に分散するためである。これによって、対象由来の血液サンプル中のナノ粒子の状態、分散及び/又は凝集に関する情報を得るためにTEMを使用する意義が失われる。
【００５２】
図2は、従来法に従って調製される顕微鏡標本の別の図である。血液サンプル等の生物流体サンプル102(血液細胞104、分散したナノ粒子106及びナノ粒子凝集210を含む)を1滴、基板100片(例えば銅グリッド)に置く(図2A-B)。血液サンプル102中の液体が乾燥プロセスの間に蒸発して、水滴が小さくなり、より小さい複数の液滴が形成される(図2C)。各液滴の表面張力108が成分(例えば、ナノ粒子)を互いに近づくように引き込む結果、液滴内のナノ粒子の凝結110a及び110bが形成される(図2D)。図2Eは、図2Dの平面図であり、2つの凝結グループ110a及び110bを示しており、それらは新しく形成された凝結といえる。理由は、それらは、本来の血液サンプル102(図2B)に存在していないためである。従って、図2に従って調製される顕微鏡標本は、TEM観察者に誤った情報を与える。
【００５３】
図2D-Eに示される顕微鏡標本は、ナノ粒子凝集210、及び、ナノ粒子凝集210と類似の外観を有する新しく形成されたナノ粒子凝結110a及び110bを示している。新しく形成されたナノ粒子凝結110a及び110bは、乾燥プロセスの間に液滴内の表面張力108によって引き起こされる。これによって、本来の血液サンプルがナノ粒子凝集を含むか否かに関する情報を得るためにTEMを使用する目的が妨げられる。理由は、従来法によって調製される顕微鏡標本がナノ粒子凝集の正確な数を反映していないためである。
【００５４】
マイクロチップナノピペット(即ち、標本キット)によって調製される顕微鏡標本
本発明は、小さなチャンバーを備えるマイクロチップナノピペットによって調製される顕微鏡(microcopy)標本に関する。チャンバーの高さは、赤血球(RBC)の直径よりも非常に小さく構成されている。RBCは、WBCよりも小さい。従って、全ての血液細胞は、遮断/選別されマイクロチップナノピペットのチャンバーに入ることができない。標本中に血液細胞がないことは、ナノ粒子の観察に対する干渉が低減されるため、標本検査の質及び量が高まる。マイクロチップナノピペットの小さなチャンバーは、血液サンプルをその中に保持して、乾燥プロセス中に表面張力の効果を失わせる。本発明によって調製される顕微鏡標本は、本来の血液サンプル中のナノ粒子の本当の分布状態(例えば分散及び/又は凝集)を検出することを可能にする。
【００５５】
図3は、本発明による顕微鏡標本の調製を示している。血液サンプル102は、マイクロチップナノピペットの上部基板302と下部基板304(図3A)の間に形成されたチャンバー300の一端と接触している。血液サンプル102には、ナノ粒子106及び血液細胞104が含まれている。上部基板302と下部基板304との間の高さhは、全てのRBC及びWBCがチャンバー300に入らないように、赤血球104の直径よりも小さくなるように作られている。上部基板302は、上面306及び下面307を備える。下部基板304も、上面310及び下面312を備える。チャンバー300の10μmの高さhは、血液サンプル中のナノ粒子の分布状態、分散及び/又は凝集のTEM観察に充分である。
【００５６】
ナノ粒子106は、血液流体と共にチャンバー300に入る(図3B)。血液細胞104は、細胞のサイズがチャンバーの高さよりも大きいため、チャンバー300に入れない。チャンバー内部の液体は、乾燥プロセスを受ける。これによって、小さな複数の液滴が形成される。各液滴は、単一のナノ粒子106を包んでおり、液滴の凝着力308に起因して、チャンバー300の内表面(即ち、上部基板の下面及び下部基板の上面)上に付着する(図3C)。図3Dは、血液サンプルの液体が乾燥した後の顕微鏡標本の側面図である。この図は、上部基板302の下面307に付着したいくつかのナノ粒子106と、下部基板304の上面310に付着したいくつかのナノ粒子106を示している。2枚の基板302、304間の小さなスペース又は小さな高さhに起因して、薄いサンプル層(H)に分配するナノ粒子106の数は制限される。これによって、薄いサンプル層(H)におけるナノ粒子106が凝結する可能性がなくなる。図3Eは、図3Dの平面図であり、分散したナノ粒子106が図3Bに示す本来の血液サンプル102中のナノ粒子106の真の分散状態を正確に反映していることを示している。
【００５７】
図4は、本発明による他の顕微鏡標本の調製を示している。血液サンプル102は、マイクロチップナノピペットの上部基板302と下部基板304との間に形成されたチャンバー300の一端と接触している(図4A)。血液サンプル102には、ナノ粒子凝集210、分散したナノ粒子106及び血液細胞104が含まれている。上部基板302と下部基板304との間の高さhは、全てのRBC及びWBCがチャンバー300に入らないように、赤血球104の直径よりも小さくなるように作られている。ナノ粒子106もナノ粒子-凝集210も、血液サンプル102の流体と共にチャンバー300に入る。血液細胞104は、その寸法がチャンバーの高さよりも大きいため、チャンバー300に入ることができない(図4B)。チャンバー内部の液体は、乾燥プロセスを受ける。これによって、小さな複数の液滴が形成される。各液滴は、単一のナノ粒子106又は一群の凝集ナノ粒子210を包んでおり、液滴の凝着力308に起因して、チャンバー300の内表面(即ち、上部基板の下面及び下部基板の上面)上に付着する(図4C)。チャンバー300中の液体が完全に乾燥した後、いくつかの分散したナノ粒子106及びナノ粒子-凝集210は、上部基板302の下面及び下部基板304の上面に付着する。小さなスペース又は小さな高さhは、薄いサンプル層(H)に分配するナノ粒子106及びナノ粒子-凝集210の数を制限するため、薄いサンプル層(H)におけるナノ粒子106及びナノ粒子-凝集210が凝結する可能性がなくなる(図4D)。図4Eは、図4Dの平面図であり、 顕微鏡標本の分散したナノ粒子106及びナノ粒子-凝集210は、図4Bに示す本来の血液サンプル102内で分配されたナノ粒子106及びナノ粒子-凝集210の真の状態を正確に反映している。
【００５８】
図5は、TEM下での観察のための顕微鏡標本を調製するのに用いるマイクロチップナノピペット500を示している。マイクロチップナノピペット500は、上部基板302と下部基板304との間に形成されたチャンバー300を備え、チャンバー300の高さhは、RBCの直径よりも小さく、上部基板302は、電子を透過する素材でできている。10μm未満のチャンバー高さで、血液サンプル102中のナノ粒子の分布状態及びナノ粒子の分散又は凝集のTEM観察は充分可能である。第一スペーサー502a及び第二スペーサー502bは、上部基板302と下部基板304との間に挿入してチャンバー300の高さを制御する。チャンバー300は、第一末端301a及び第二末端301bを備え、各末端は、入口504を備える。入口504は、サンプル注入のための構成としてもよい。
【００５９】
上部フレーム506は、上部基板302上に設置され、下部フレーム508(これは、上部フレームと同じサイズであってもよい)は下部基板304下に設置され、上部フレーム506及び下部フレーム508は、それぞれが上面510及び下面511を備え、開放ウインドウ512は、上面510と下面511との間に形成され、開放ウインドウ512は、上部フレーム506又は下部フレーム508の厚さに等しい高さhwと、上部又は下部フレームの長さ及び幅よりも小さい長さ及び幅を有する。開放ウインドウ512は、TEM電子ビーム518を受ける(図5から6)。
【００６０】
上部フレーム506の開放ウインドウ512と下部フレーム508の開放ウインドウ512は、それぞれが、チャンバーに向いている開口部512cとチャンバーから離れる方向に向いている他の開口部を有する(図10A)。上部フレームの開放ウインドウの開口部512c(これは、チャンバーに向いている)は、上部フレームの下面で形成され、上部基板302、従ってチャンバー300の方へ向いている。下部フレームの開放ウインドウの開口部512cは、下部フレームの上面で形成され、下部基板304及びチャンバー300の方へ向いている。チャンバーに向いている開口部512cは、50μm以下の幅516及び800μm以下の長さ514を有する。従って、チャンバー300内の粒子標本は、マイクロチップナノピペット500の上部から、TEM下のウインドウ開口部512c(これは、上部フレームの下面に設置され、上部基板302及びチャンバー300に向いている)を通じて観察することができる。
【００６１】
上部基板及び下部基板の厚さは、50nmから300nm又は50nmから200nm、好ましくは100nmから200nmの範囲である。
【００６２】
基板の厚さ及びウインドウの幅は、本発明によるナノ粒子のTEM画像解析における標本キットの使用においてかなり重要である。2枚の基板は、それぞれ、50nm以上の厚さを有する必要があり、チャンバーに向いているウインドウ幅516c(即ち、チャンバーに向いているウインドウの開口部)は、50μm又は50μm未満である必要がある。これらの要件は、上部基板及び下部基板の変形を最小限にして、上部基板及び下部基板(又は、フィルム)を並行に保つのに必要である。基板(又は、フィルム)が変形すると、乾燥プロセスの間に粒子が凝結してナノ粒子のTEM画像解析が不正確となる。
【００６３】
図14A-Bは、チャンバーに向いている開放ウインドウ512cの幅(w)とフィルム(上部基板及び下部基板)の厚さの寸法を示している。上記寸法は、開放ウインドウ512cと隣接している(又は、暴露している)部分の2つのフィルム(即ち、上部及び下部基板)が互いに並行したままとなるようにある種の範囲内にある必要がある。チャンバーに向いている開放ウインドウ512cの幅は、≦50μm、好ましくは5-30μmであり、長さは、≦800μm、好ましくは50-500μmである。フィルム(又は、基板)の厚さは、≦300nm、好ましくは50-200nmである。
【００６４】
図6は、上部基板302と下部基板304との間に形成されたチャンバー300を示している。観測ウインドウ512は、マイクロチップナノピペット500の上部フレーム506の中央に作成される。チャンバー300の一部は、マイクロチップナノピペット500の上部から、TEM下のウインドウ512を通じて観察することができる。チャンバー300の一端は、液体サンプルのための入口504として役割を果す。
【００６５】
図7Aは、チャンバー300上の平面図を示す。上部基板302は、平面パネルでできており、電子を透過する。図7Bは、図7Aの断面図であり、上部基板302も下部基板304も示しており、液体サンプル(例えば、血液102)が基板302と304との間のチャンバー300に満たされている。
【００６６】
図8は、本発明の他の実施形態によるマイクロチップナノピペットを示している。図8Aは、別のマイクロチップナノピペットにおける、穴803を備える上部基板802の平面図であり、上部基板802を貫通する複数の穴803を示している。標本の観察は、チャンバー中の血液又は液体にて行なうことができる。より質が良好な、TEMを用いた標本観察は、上部基板802が妨害しない穴803によって行なうことができる。図8Bは、図8Aの断面図であり、上部基板802及び下部基板804を示しており、サンプル血液102が基板802と804との間のチャンバーに満たされている。各穴は、表面張力808によってチャンバー内に血液サンプル102が保持されるように充分小さく構成されている。そのため、血液サンプル液体102が穴803を通じてしみ出ることはない。
【００６７】
図9は、本発明の別の実施形態によるマイクロチップナノピペットを示している。図9Aは、別のマイクロチップナノピペットにおける、スリット又はチャネル903を有する上部基板902の平面図であり、上部基板902を貫通する複数のスリット又はチャネル(又は、貫通溝)903を示している。標本の観察は、チャンバー中の血液又は液体にて行なうことができる。より質が良好な、TEMを用いた標本観察は、上部基板902が妨害しないスリット903によって行なうことができる。図9Bは、図9Aの断面図であり、上部基板902及び下部基板904を示しており、サンプル血液102が基板902と904との間のチャンバーに満たされている。各スリット又はチャネルは、表面張力908によってチャンバー内に血液サンプル102が保持されるように充分小さい又は狭い幅を有するように構成されている。そのため、血液サンプル液体102がスリット903を通じてしみ出ることはない。
【００６８】
ここで、狭いチャンバー幅を有するマイクロチップナノピペットを構築して乾燥プロセスの間に粒子が凝結するのを防止させたところ、血液中のそれらの凝結/凝集状態及び粒子濃度の定量分析が可能になった(図10)。ナノピペットの上側の基板がサンプル液滴の表面張力を破壊するため、液滴を従来通りに銅グリッド上で乾燥させると、水の蒸発及び物質の凝結を伴う毛細管流動が抑制される。このナノピペットは、全血、50%希釈の血液及び5%グルコース溶液中のPEG化金ナノ粒子の単純且つ簡便な選別のためのフィルターとして作用する。50%希釈の血液サンプル中のカルボキシルPEG5k改変金ナノ粒子は、わずかな凝結(〜18%)が観察された一方で、5%グルコース溶液中では充分に分散されていた。更に、インビトロの50%希釈の血液及びインビボの全血に関して、一定のcPEG5k-GNP濃度が、ナノピペット及び誘導結合プラズマ分光分析法(ICPMS)分析を用いて得られた。
【００６９】
我々は、水溶液中の粒子の凝結/凝集状態を得るためにナノピペットの使用の可能性を検討した。カルボキシルPEG5k改変金ナノ粒子(cPEG5k-GNP)は、血中で長く循環し且つ充分に分散するコロイド形態であることが知られており、5%グルコース溶液に溶解して、(SixNy-フィルムを備える)ナノピペット及び(カーボンフィルム又はSiOx-フィルムを備える)銅グリッド上で乾燥させたTEM標本中の粒子の空間分布を検討及び比較するためのモデル粒子として用いた。粒子の均一な空間分布が、SixNy-フィルム(水接触角:〜32度)を備えるナノピペットにおいて観察され、ランダムに4つ選択した2.0μm×2.7μm画像ゾーン中の粒子数が478、467、502及び504と測定された(図11A-B)。最も近接する粒子に対する各cPEG5k-GNPの距離(図11D)も、4つの2.0μm×2.7μm画像ゾーン全てにおいて測定した。そして、粒子数パーセンテージ(n/N)を、隣接した粒子までの距離に対してプロットした(図11D)。69.4±21.6nmの平均距離を有する単一の幅広い分布ピークが観察された(図11C)。これは、cPEG5k-GNPの直径(TEMによる観察で〜39.6 nm、DLSによる測定で〜39.3nm)よりも大きく、大部分の粒子が隣接粒子から分かれていることを示すものである。粒径よりも大きいd値で分配された粒子のパーセンテージがより高いことは、大部分の粒子が接触することなく分配され、凝結することなく分けられていることを示唆する。これらの結果は、5%グルコース溶液においては充分に分散されるcPEG5k-GNPから分かる通りであり、ナノピペットが粒子の本来の空間分布を保存してサンプル溶液中の凝結/凝集を回避することができることを示している。しかしながら、同じサンプル溶液を、疎水性カーボンフィルム(水接触角:〜70度)を備える銅グリッド上、及び更に親水性SiOx-フィルム(水接触角:〜30度)を備えるグリッド上で乾燥させると、明らかに不均一な粒子の空間分布が観察された(図11A-B)。粒子数パーセンテージ対隣接した粒子までの距離のプロット(図11D)から、3つのピークが、カーボンフィルム及びSiOx-フィルム銅グリッド(図11C)に関して得られた。cPEG5k-GNPの直径よりも小さい距離を有する2つのピークの存在は、粒子が乾燥プロセス(バルク溶媒の漸進的な蒸発)の間に銅グリッド上に垂直に積み重なっているか自己凝結していること示唆し、SiOx-フィルムを備える親水性表面修飾でさえも凝結を防止することができないことを示唆している。他の例では、300nmポリスチレンビーズを、ナノピペット及び銅グリッド中で乾燥させた。ビーズは、ナノピペットにおいてはよく分かれていたが、銅グリッド(カーボンフィルム及びSiOxフィルム)上では非常に凝結していた。ナノピペットは、粒子の本来の凝結/凝集状態を保持し且つ定量化する単純且つ簡便なサンプリングデバイスを明確に提供する。サンプリングデバイスに起因して導入される任意の人工物は混在していない。
【００７０】
更に、我々は、血液からある種の大きさの粒子を区別する特定のチャンバー幅を有するナノピペットの使用の可能性を検討した。血液は、ナノ粒子を観察して特性を評価しがいのある興味深い生理的環境である。粒子の本来の空間分布を保持することに加えて、ナノピペットの規定された狭いチャンバー構造は、ナノサイズの素材を単純且つ簡便に選別するためのフィルターとして作用させることもできることから、血液中に見られるより大きな物質の侵入が防止される。この場合、血液細胞及び血小板は、サンプルのロードプロセスで除外することができる(図10B)。従って、ナノピペットのチャンバー幅よりも小さく、血漿中においてサイズがμm未満の粒子だけをサンプリングしてTEMによって観察した。50%希釈の血液サンプルは、この方法を使用して研究し、いくつかの不規則な形状のナノスケールの物質(5-20nm)が観察されたが、おそらく、血清タンパク質(例えば血清アルブミン)であろう(図12A)。cPEG5k-GNPを50%希釈の血液に混ぜると、金ナノ粒子(紫色の矢で明示)及び推定血液タンパク質(白色の矢で明示)が容易に視覚化されて認識され、画像に基づく定量分析に用いられる(図12A)。4つのナノピペットを用いて同じ50%希釈の血液サンプル由来の粒子をロードした。類似の粒子数がそれぞれについて観察された(図12B)。粒子の均一な空間分布及び再現可能な定量結果は、ナノピペットが血液から粒子を選別する有望なサンプリングデバイスであることを明らかにしている。更に、50%希釈の血液中のcPEG5k-GNPの凝結/凝集状態は、粒子数パーセンテージ対隣接粒子までの距離をプロットすることによって評価した(図12D)。図12Cにおける4回の反復実験から、cPEG5k-GNPは、cPEG5k-GNPの直径よりも大きい、隣の粒子までの距離を有する幅広いピーク(〜80%粒子)を表すことが示された。このことから、大部分の粒子が血液中で充分に分散されていることが示された。21.7%、18.4%、15.4%及び15.6%の粒子数パーセンテージを有するcPEG5k-GNP(〜39.6nm)の直径付近に見られる小さい追加のピークが、全4回の反復ナノピペットに対しても観察された。同じ濃度のcPEG5k-GNPを5%グルコース溶液に混ぜた時には単一のピークだけが観察されたため、〜18%の粒子数を有する追加の凝結ピークから、50%希釈の血液がわずかな粒子凝結を誘導することが明らかである(図12D)。この結果から、ナノピペットは、ナノ粒子を選別して血液中のナノ粒子の凝結/凝集状態を評価し、結果が再現可能であり且つ定量的である単純且つ簡便なサンプリングデバイスを提供するものであり、関心のある別の生物流体の分析に用いることもできることが確認された。更に、意図的に凝結させたクエン酸塩改変金ナノ粒子(クエン酸塩-GNP)を検討した。5%グルコースにおけるクエン酸塩-GNPは、〜70%凝結(各凝結体中に2-10ナノ粒子を有する)を示した一方で、50%希釈の血液においては、粒子の凝結度が〜87%へ増加し、〜40%の凝結体には、各凝結体中に11-100粒子が含まれていた。従って、ナノピペットは、種々の液性環境において意図的に凝結されたナノ粒子の凝結度を潜在的に区別することが可能である。
【００７１】
生物学的マトリックス中のナノ粒子の濃度を定量化することは、それらの吸収、分布、代謝及び排出のインビボ分析と、特に身体の生物流体において豊富であるが未だ一般的な課題である元素(例えば、C、H、O、N、P、Fe、Zn及びCa)から構成されるナノ粒子に関する薬物動態学的及び毒性研究にとって重要である。粒子の本来の空間分布を保持することに加えて、均一な標本を調製して血液から粒子を選別するフィルターとして作用するために、ナノピペットの固定及び特定の狭いチャンバー体積は、TEM画像面積とナノピペットのチャンバー幅とを掛けた値に等しい画像体積(V)(V = L×W×H)を有する。従って、各TEM画像中の粒子数(N)をカウントして合計画像体積で割り、各サンプル溶液中の粒子濃度(C)(C =N/V)を決定した(図13A)。次に、TEM画像でカウントした、ナノピペット中のcPEG5k-GNPの数を、金属(例えばAu、Ag、Fe等)の濃度を定量化する金標準法であるICPMS分析と比較した。ナノピペット(n = 3)においてカウントしてICPMSによって算出されたcPEG5k-GNPの粒子濃度は、50%希釈の血液中において5×1010から5×1013粒子/mLの粒子濃度範囲と一致する(図13B)。更に、5%グルコース中のcPEG5k-GNP(400μL、3×1014粒子/mL)をラットの静脈内に注射して、血液サンプルを注射後に取得した(t = 0.1、1、3、7、24、48 h)。各全血サンプルは、ナノピペット(n = 3)を用いて選別され、ICPMSによって分析された。図13Cは、ナノピペットにおいてカウントしてICPMSで測定したcPEG5k-GNPの数に関して得られた比較結果を示している。この実験から、ナノピペットは、TEMを用いたナノ粒子の濃度を評価するための単純且つ簡便なサンプリングデバイスであることが確認された。この成功は、必要とされるサンプル体積が非常に小さい(<1μL)ことに起因するものである。このツールは、関心のある局所体液における粒子濃度を分析するために用いることができる。
【００７２】
結論として、我々は、均一な標本の調製のため及び血液由来のナノ粒子の選別のためのマイクロチップに基づくナノピペットを構築した。形態学に基づく情報に加えて、TEM画像に基づく定量方法を、関心のある液性環境中の粒子の形状、サイズ/サイズ分布、凝結/凝集状態及び濃度を分析するために開発した。更に、このナノピペットは、全てのTEMホルダーに適応可能であり、大量生産可能で、使い捨てで、サンプルのロード及び観察に便利である。PEG化金ナノ粒子の総合的な生理的特性評価(血液サンプル中のそれらの凝結/凝集状態及び粒子の数を含む)から、生物流体中のナノ粒子特性評価に関するこのナノピペットデバイスのポテンシャルが証明される。この特性評価は、個々の粒子の観察に基づく。このため、この方法は、特に生物流体において豊富な元素(例えば、C、H、O、N、P、Fe、Zn及びCa)から構成されるナノ粒子を定量化するための、他の粒子に基づく素材に容易に応用することができる。乾燥条件下での観察に加えて、選別された薄いサンプル溶液を、ナノピペットに封入して本来の液性環境において画像化することができる。従って、我々は、この研究において、単純且つ簡便な(conventional)サンプリングデバイスである我々のナノピペットが、関心のある様々な本来の環境中のナノ材料のサイズ/サイズ分布、形状、凝結/凝集状態及び粒子濃度を定量的に特徴づけるTEMの使用の可能性を提供することを証明した。
【００７３】
コンピューターソフトウェアを用いてナノ粒子画像を分析した。ナノ粒子のTEM画像を取得してコンピューターに保存し、次に、コントラスト(図15A-B)を高めて、ノイズ及びバックグラウンド(図15C-D)低減するために前処理を行った。次に、画像中のナノ粒子をバックグラウンドから分けた(閾値画像カット)。次に、ユーザー又は観察者は、ユーザーインターフェース(一次粒子及び二次粒子を選択する粒子選択)を用いてトレーニングデータベースを構築する(図15G)。最後に、ソフトウェアを実行し、トレーニングデータベースの情報に基づいて個々のナノ粒子を一次又は二次粒子に分類した(図15J)。
【００７４】
図15A-Jは、TEMデータベースからダウンロードされた本来の画像(A)と、ヒストグラム等化アルゴリズムによる画像コントラスト増強(B)と、画像コントラストを高める手法によるバックグラウンドノイズ増大(C)と、粒子の信号強度を保持すると共に移動平均フィルターによるバックグラウンドノイズレベルの減少(D)と、TEMデータベースからダウンロードした本来の画像(E)と、インタラクティブ選択方法を使用することによる、画像からの粒子シグナルの単離(F)と、本来の画像の拡大画像(G)と、画像処理後の単離された粒子の明らかに特徴的なひずみがない画像(H)と、個々の粒子をクリックすることによってトレーニングデータベースを構築するためにユーザーが使用したプログラムのスナップショット(I)及び(J)と、を示している。一次粒子は、赤い点(ここでは「p」と示す)にて標識されているが、二次粒子は緑の点(ここでは「s」と示す)にて標識されている(I)。コンピューターソフトウェアは、あらゆる粒子を区別することが可能であった(J)。
【００７５】
図16Aは、日焼け止めローション中のZnOナノ粒子のTEM画像、サイズ分布及びEDX分析を示している。日焼け止めローションを標本キットに直接ロードして、TEM観察のために乾燥させた。図16Bは、日焼け止めローション中のTiO2ナノ粒子のTEM画像、サイズ分布及びEDX分析を示している。
【００７６】
図17Aは、ミルク中のCaCO3粒子のTEM画像を示している。ミルクを標本キットに直接ロードして、TEM観察のために乾燥させた。図17Bは、ミルク中の一次及び凝結/凝集化CaCO3粒子のTEM画像を示している。図17Cは、ミルク中の一次及び凝結/凝集化CaCO3粒子並びにその合計のサイズ分布を示している。ミルクを標本キットに直接ロードして、TEM観察のために乾燥させた。
【００７７】
図16-17に記載のTEM標本キットのチャンバーの高さは、2μmである。ローション、ミルク等のサンプルを標本キットに直接ロードして、TEM観察のために乾燥させた。
【００７８】
図18Aは、TEM/FEI/200keV、TEM/日立/100keV及びSTEM/FEI/30keVによって観察した、液性環境のCMPスラリー中の研磨材のTEM画像を示している。図18Bは、CMPスラリー中の一次及び凝結/凝集化SiO2研磨材並びにその合計のTEM画像及びサイズ分布を示している。図18A-BのCMPスラリーを、0.2μmのチャンバー幅を有するTEM標本キットに直接ロードして、TEM観察のためにエポキシ樹脂によって封止した。
【００７９】
本発明の例示的な実施形態に関する前述の説明は、図示及び説明の目的のためだけに示しており、網羅的であったり開示される厳密な形態に本発明を制限したりすることを意図するものではない。上記説明の観点から多くの修正形態及び変更形態が可能である。
【００８０】
実施形態及び実施例は、本発明及びそれらの実用的な応用の原理を説明する目的で選択し記載しており、他の当業者が本発明及び各種実施形態を、予想される特定の用途に適している各種変更形態を伴って利用することができるようにしている。代わり実施形態は、その趣旨及び範囲を逸脱しない範囲内で、関係する当業者にとって明らかになるだろう。従って、本発明の範囲は、ここで記載されている前述の記述及び例示的な実施形態よりは、むしろ添付の特許請求の範囲によって規定される。
【００８１】
特許、特許出願及び様々な刊行物を含み得るいくつかの参考文献は、本発明の記述に引用され論じられている参考文献の引用又は議論は、単に本発明の記述を明確にするためだけに提供されているものであり、かかる任意の参考文献が本明細書に記載の本発明に対する「先行技術」であるという自認でない。この明細書中で引用され議論されている全ての文献は、それらの全体が本明細書に引用によって組み込まれており、各文献が引用によって個々に組み込まれているのと同程度に組込まれている。
【図１−２】
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【図３−４】
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【図５−６】
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【図７−９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ−Ｄ】
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【図１５Ｅ−Ｆ】
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【図１５Ｇ−Ｈ】
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【図１５Ｉ−Ｊ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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