(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試料を、（ｉ）検出対象物と同一な結合特性を有する同一結合物が結合されており、シグナルを発生できる競争者キャリア複合体及び(ｉｉ)検出対象物に特異的に結合するバインダーが結合されているブリッジ複合体と接触させる段階（前記試料内に検出対象物が存在する場合、前記試料内検出対象物は、前記ブリッジ複合体の前記バインダーと結合する）と、
（ｂ）前記段階（ａ）の結果物を、支持体上の試験区域に結合された検出対象物と同一な結合特性を有する同一結合物と接触させる段階（（ｉ）前記検出対象物が前記ブリッジ複合体の前記バインダーに結合しない場合、前記バインダーは、前記支持体上の同一結合物と結合し、前記競争者キャリア複合体は、前記ブリッジ複合体に結合され、前記支持体上でシグナルが発生し、前記試料内検出対象物の濃度が減少すると、前記支持体上に発生するシグナル強度が増加し、（ｉｉ）前記検出対象物が前記ブリッジ複合体の前記バインダーに結合する場合、前記試料内検出対象物が結合された前記バインダーは、前記支持体上の同一結合物及び前記競争者キャリア複合体と結合せず、前記試料内検出対象物の濃度が増加すると、前記支持体上に発生するシグナル強度が減少する）と、
（ｃ）前記段階（ｂ）の結果物において、前記競争者キャリア複合体から発生するシグナルの強度を測定する段階と、を含む、試料内検出対象物の検出方法。
【請求項２】
前記検出対象物及び同一結合物は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、核酸または化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出対象物及び同一結合物は、化合物ホルモンであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出対象物及び同一結合物は、タンパク質に結合された化合物ホルモンであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記検出対象物は、タンパク質に結合された化合物ホルモンであり、前記段階（ａ）は、（ａ−１）前記タンパク質に結合された化合物ホルモンから前記化合物ホルモンを解離させる解離剤で処理された前記試料を前記ブリッジ複合体に接触させる段階と、（ａ−２）前記段階（ａ−１）の結果物を前記競争者キャリア複合体と接触させる段階とを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記競争者キャリア複合体は、粒子またはビーズを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子は、発色性粒子であり、前記発色性粒子から直接シグナルが発生されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記粒子は、シグナル発生標識を追加的に含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ブリッジ複合体にある前記バインダーは、抗体、変形抗体、抗体類似体、アプチド、受容体、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン、アプタマー、レクチン、基質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質またはウイルスタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ブリッジ複合体は、粒子またはビーズを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ブリッジ複合体は、一つの粒子当たり複数個のバインダーを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記段階（ａ）は、前記試料を前記ブリッジ複合体と優先的に接触させた後、前記競争者キャリア複合体と接触させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記競争者キャリア複合体は、前記段階（ａ）を実施する前、前記支持体上の試験区域のアップストリーム側に位置していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記支持体は、（ｉ）試料区域、（ｉｉ）競争者キャリア複合体区域、及び（ｉｉｉ）試験区域を含み、前記三つの区域は、流体流れ的に順番的に前記支持体上に位置していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出対象物は、タンパク質に結合された化合物ホルモンであり、前記段階（ａ）は、前記タンパク質に結合された化合物ホルモンから前記化合物ホルモンを解離させる解離剤で処理された前記試料を、前記ブリッジ複合体に接触させて、試料／ブリッジ複合体反応物を得た後、前記試料区域に前記試料／ブリッジ複合体反応物を適用して実施し、前記段階（ｂ）は、流体流れを通じて、前記試料／ブリッジ複合体反応物と前記競争者キャリア複合体を前記試験区域に移動させ、前記試験区域に結合された同一結合物と接触させて実施することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）試料を収容し、反応がなされるマイクロチャンネルが備えられた支持体と、
（ｂ）（ｉ）前記マイクロチャンネルの一部位に形成されており、（ｉｉ）検出対象物と同一な結合特性を有する同一結合物が結合されており、シグナルを発生できる競争者キャリア複合体が結合されている競争者キャリア複合体区域と、
（ｃ）（ｉ）前記マイクロチャンネルの一部位に形成されており、（ｉｉ）検出対象物と同一な結合特性を有して、検出対象物に特異的に結合するバインダーが結合されているブリッジ複合体と結合可能な同一結合物が結合されている試験区域と、を含み、
（ｉ）前記検出対象物が前記ブリッジ複合体の前記バインダーに結合しない場合、前記バインダーは、前記支持体上の同一結合物と結合し、前記競争者キャリア複合体は、前記ブリッジ複合体に結合され、前記支持体上でシグナルが発生し、前記試料内検出対象物の濃度が減少すると、前記支持体上に発生するシグナル強度が増加し、（ｉｉ）前記検出対象物が前記ブリッジ複合体の前記バインダーに結合する場合、前記試料内検出対象物が結合された前記バインダーは、前記支持体上の同一結合物及び前記競争者キャリア複合体と結合せず、前記試料内検出対象物の濃度が増加すると、前記支持体上に発生するシグナル強度が減少することを特徴とする、試料内検出対象物の検出キット。
【請求項１７】
前記競争者キャリア複合体区域は、前記支持体上の試験区域のアップストリーム側に位置していることを特徴とする、請求項１６に記載の検出キット。
【請求項１８】
前記支持体は、（ｉ）試料区域、（ｉｉ）競争者キャリア複合体区域、及び（ｉｉｉ）試験区域を含み、前記三つの区域は、流体流れ的に順番的に前記支持体上に位置していることを特徴とする、請求項１６に記載の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１４年５月２３日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−００６２１４３号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。
【０００２】
本発明は、新規な試料内検出対象物の検出方法及びこれを利用した検出キットに関する。
【背景技術】
【０００３】
テストステロンは、２次性徴を示す男性ホルモンであって、アンドロゲングループのステロイドホルモンに属し、主に生殖腺から分泌される。テストステロンは、男性更年期の（１）性欲減少、及び勃起能力及び頻度減少、（２）知的活動、認知機能、空間知覚力の減少、疲労、気分低下及び不安の気分変化、（３）睡眠障害、（４）筋肉量及び筋肉強度の減少に係る諸脂肪量の減少、（５）内蔵脂肪の増加、（６）体毛の減少及び皮膚疾患、及び（７）骨密度減少による骨減少症及び骨折危険増加に係る。
【０００４】
主に血液内に存在するテストステロンの量を分析して診断し、増加されたテストステロンは、アンドロゲン抵抗性、卵巣がん、睾丸がん、先天性副腎過形成（ｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｄｒｅｎａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）または思春期早発症（Ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ  ｐｕｂｅｒｔｙ）に係り、減少されたテストステロンは、慢性疾患、脳下垂体異常、思春期遅延（Ｄｅｌａｙｅｄ  ｐｕｂｅｒｔｙ）、睾丸異常、またはプロラクチンを過生産する脳下垂体細胞からなる、がん化していない腫瘍に係る。
【０００５】
一方、生体内に存在するテストステロンは、遊離された状態として存在するものではなく、大部分がタンパク質と結合された状態として存在する。即ち、遊離された（ｆｒｅｅ）状態のテストステロンは、約２〜３％に過ぎず、４４〜６５％が性ホルモン結合グロブリン（Ｓｅｘ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＳＨＢＧ）と結合された状態として存在し、３３〜５４％がアルブミンと結合された状態として存在する。このような理由で、血液内に存在するテストステロンを検出することが難しい。
【０００６】
一般に、テストステロンに結合したタンパク質を除去するために、タンパク質変性を起こす酸溶液を利用するか、テストステロンと類似した構造を有するホルモンである２−メトキシエストラジオール（２−ＭＥ）を使用することが必要である。場合によって、十分なシグナルを得るための遊離（ｆｒｅｅ）状態のテストステロンを得るために、反応条件及び反応試薬を調節することも可能である。
【０００７】
一方、テストステロン（分子量２８８．４２）などのホルモンを既存検出方法に適用する場合、小さい分子量により、サンドウィッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ａｓｓａｙ）の使用が不可能であった。
【０００８】
本発明で利用する検出方法は、競争反応（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ）を利用したもので、金ナノ粒子を媒介体として使用し、従来競争反応を利用した分析法より反応感度を高めて、測定シグナルを増幅させることにより、テストステロンのような微小分子をより正確に検出できる方法を確立する。
【０００９】
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容をより明確に説明する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、新規な試料内検出対象物の検出方法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、試料内に検出対象物が存在する場合、試料内検出対象物が‘ブリッジ複合体’と結合し、これにより、検出対象物が結合された‘ブリッジ複合体’及びシグナルを発生させる‘競争者キャリア複合体’は、支持体上の同一結合物と結合せず、結果的に前記支持体上でシグナルが発生しないため、試料内検出対象物を正確に検出することができる方法を開発した。本発明の方法は、酸性化または検出対象物の類似体（ａｎａｌｏｇ）などを利用して、検出対象物に結合された非ターゲット（ｎｏｎｔａｒｇｅｔ）物質を分離した後、直ちに分析に適用していた従来流体流動検出方法（ｌｉｑｕｉｄ  ｆｌｏｗ  ａｓｓａｙ）と違って、前記結合タンパク質から分離された試料内検出対象物を、検出対象物に特異的なバインダー（例えば、抗体）を結合させた粒子と接触させることにより、検出対象物、バインダー及び粒子の複合体が流動分析に適用されるようにした。前記過程を行うことにより、検出対象物とバインダーの十分な反応を誘導し、本発明の検出方法に好適な状態のローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）試料を完成し、これにより、より精密な定性及び定量分析が可能であることを確認した。また、別途の洗浄過程を必要としないため、外部要因による影響を最小化し、データの安全を向上させて、既存の方法と比較し、精密な分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を提供して、試料内検出対象物の正確な濃度測定を可能にし、測定シグナルを増幅させることができるという長所がある。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、新規な試料内検出対象物の検出方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、新規な試料内検出対象物の検出キットを提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一様態によると、本発明は、
（ａ）試料を、（ｉ）検出対象物と同一な結合特性を有する同一結合物（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）が結合されており、シグナルを発生できる競争者キャリア複合体（ａ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｈａｖｉｎｇ  ａｎ  ａｎａｌｙｔｅ  ａｎｄ  ｂｅｉｎｇ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）及び（ｉｉ）検出対象物に特異的に結合するバインダーが結合されているブリッジ複合体と接触させる段階（前記試料内に検出対象物が存在する場合、前記試料内検出対象物は、前記ブリッジ複合体と結合する）と、
（ｂ）前記段階（ａ）の結果物を、支持体上の試験区域（ｔｅｓｔ  ｚｏｎｅ）に結合された検出対象物と同一な結合特性を有する同一結合物と接触させる段階（前記試料内に検出対象物が存在する場合、前記試料内検出対象物が結合された前記ブリッジ複合体は、前記支持体上の同一結合物と結合せず、前記支持体上でシグナルが発生することがなく、前記試料内に検出対象物が存在しない場合、前記ブリッジ複合体は、前記支持体上の同一結合物と結合し、前記競争者キャリア複合体は、前記ブリッジ複合体に結合され、前記支持体上でシグナルが発生する）と、
（ｃ）前記段階（ｂ）の結果物において、前記競争者キャリア複合体から発生するシグナルの強度を測定する段階と、を含む、試料内検出対象物の検出方法を提供する。
【００１５】
本発明者らは、新規な試料内検出対象物の検出方法を開発するために鋭意研究した結果、試料内に検出対象物が存在する場合、試料内検出対象物が‘シグナルを発生させる競争者キャリア複合体’に対して競争的に‘ブリッジ複合体’と結合し、これにより、検出対象物が結合されたブリッジ複合体は、支持体上の同一結合物と結合せず、結果的に前記支持体上でシグナルが発生しないため、試料内検出対象物を正確に検出することができる方法を開発した。本発明の方法は、酸性化または検出対象物の類似体（ａｎａｌｏｇ）などを利用して、検出対象物に結合された非ターゲット（ｎｏｎｔａｒｇｅｔ）物質を分離した後、直ちに分析に適用していた従来流体流動検出方法（ｌｉｑｕｉｄ  ｆｌｏｗ  ａｓｓａｙ）と違って、前記結合タンパク質から分離された試料内検出対象物を、検出対象物に特異的なバインダー（例えば、抗体）を結合させた粒子と接触させることにより、検出対象物、バインダー及び粒子の複合体が流動分析に適用されるようにした。前記過程を行うことにより、検出対象物とバインダーの十分な反応を誘導し、本発明の検出方法に好適な状態のローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）試料を完成し、これにより、より精密な定性及び定量分析が可能であることを確認した。また、別途の洗浄過程を必要としないため、外部要因による影響を最小化し、データの安全を向上させて、既存の方法と比較し、精密な分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を提供して、試料内検出対象物の正確な濃度測定を可能にし、測定シグナルを増幅させることができる。
【００１６】
本発明の検出方法は、競争反応（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用して分析試料内に存在する検出対象物を検出する方法であって、本発明者らは、従来の競争分析方法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ）において、(ｉ)流体流動中の反応(内部反応)で支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）に固定された抗体に検出対象物を結合させる場合、試料内検出対象物と抗体との反応時間が十分ではなく、正確な定量分析が難しく、（ｉｉ）流体流動適用前の試験管内反応（外部反応）で検出対象物と抗体を反応させる場合、検出シグナルが発生しないか、あるいは抗体をビーズに結合させて外部反応を進行する場合、シグナル測定時、ビーズに結合された抗体を除去する洗浄過程をさらに要求するという点に着目し、これを改善するための試料内検出対象物の検出方法を開発するために鋭意研究し、その結果、本発明の方法が設計された。
【００１７】
本発明の実施例によると、検出対象物であるテストステロンに結合されているタンパク質（例えば、グロブリンまたはアルブミン）を分離するために、競争者ホルモン（例えば、２−メトキシエストラジオール）を使用しているが、その他にも、検出対象物を非ターゲット物質から分離するための多様な公知の方法を使用することができる。
【００１８】
本発明の方法は、（１）金ナノ粒子と検出対象物に特異的な抗体を結合させた‘ブリッジ複合体’を使用して、抗体と検出対象物間の十分な結合反応を誘導することにより、反応性を向上させることができて、（２）優れた分解能または分離能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）により、検出対象物を細密な濃度範囲で分離することができ、これにより、試料内検出対象物の正確な濃度測定が可能である。（３）また、本発明の方法は、ホルモン、ビタミンなど、分子量の小さい微小分子（Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を効果的に検出することができる。
【００１９】
本明細書において、用語‘試料’は、検出対象物を含む物質であって、あらゆる哺乳動物由来の有機物質（ｏｒｇａｎｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）及び人為的に合成された有機分子（ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を含み、これに限定されるものではない。例えば、前記試料は、ウイルス、バクテリア、細胞または組織由来の抽出物、破砕物（ｌｙｓａｔｅ）または精製物、血液、血漿、血清、リンパ、骨髄液、唾液、眼球液、精液、脳抽出物、脊髄液、関節液、胸腺液、腹水または羊膜液などの生物学的試料、汚染物質、毒素、有毒化学物質、法医学的物質またはこれに類似した物質を含む。前記有機分子は、炭素、窒素、酸素及び／または硫黄原子間に共有結合を有する分子を意味する。有機分子は、一酸化炭素のような小さいサイズの分子からポリマーのような複雑で大きいサイズの分子から選択できる。
【００２０】
本明細書において、用語‘同一結合物（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）’は、検出対象物と同一な結合特性を有するあらゆる生化学的化合物を意味する。本発明において、検出対象物及び同一結合物は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、核酸または化合物である。前記検出対象物及び同一結合物は、公知の多様な化合物ホルモン及びこれらの類似体（ａｎａｌｏｇ）を含み、例えば、テストステロン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ヒト成長ホルモン、プロゲステロン、絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）及びこれらの類似体ホルモンを含む。本発明の一実施例によると、前記同一結合物は、テストステロン−３−カルボキシメチルオキシム−ＢＳＡである。
【００２１】
本発明によると、前記検出対象物及び同一結合物は、化合物ホルモン及びタンパク質に結合された化合物ホルモンであり、より詳細には、テストステロン、性ホルモン結合グロブリン（Ｓｅｘ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｌｕｏｂｕｌｉｎ、ＳＨＢＧ）に結合されたテストステロン、またはアルブミンに結合されたテストステロンである。一方、本発明の方法は、テストステロンだけではなく、ビタミンＤのような微小分子を検出するに幅広く利用できる。
【００２２】
本明細書において、用語‘競争者キャリア複合体（ａ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ）’は、同一結合物及び粒子またはビーズ（ｂｅａｄ）を含む複合体であって、前記粒子またはビーズには、検出対象物と同一な結合特性を有する同一結合物（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）が結合されている。前記粒子またはビーズは、シグナルを発生させることができ、例えば、前記粒子またはビーズは、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノビーズまたはマイクロビーズを含む。前記粒子またはビーズは、２００ｎｍ乃至１，０００ｎｍの直径を有し、本発明によると、前記粒子またはビーズの直径は、２００ｎｍ乃至５００ｎｍである。本発明によると、前記競争者キャリア複合体は、同一結合物とビーズが結合された複合体として機能し、より詳細には、前記競争者キャリア複合体のビーズに結合された同一結合物がブリッジ複合体に結合された抗体と結合できる。
【００２３】
本明細書において、用語‘バインダー（ｂｉｎｄｅｒ）’は、検出対象物に特異的に結合する物質であって、例えば、検出対象物に特異的なタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、核酸及び化合物を含む。例えば、前記バインダーは、抗体、変形抗体、抗体類似体、アプチド、収容体、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン、アプタマー、レクチン、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質またはウイルスタンパク質である。本発明によると、前記バインダーは、抗体である。
【００２４】
本明細書において、用語‘ブリッジ複合体’は、バインダー及び粒子またはビーズを含む複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）であって、前記粒子またはビーズには、検出対象物に特異的に結合するバインダーが結合されており、前記ブリッジ複合体に結合されたバインダーは、試料内検出対象物または同一結合物と結合できる。前記粒子またはビーズは、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノビーズまたはマイクロビーズを含む。前記粒子またはビーズは、２０ｎｍ乃至８０ｎｍの直径を有し、本発明によると、前記粒子またはビーズの直径は、４０ｎｍ乃至５０ｎｍである。
【００２５】
本発明によると、前記ブリッジ複合体は、‘金ナノ粒子及び検出対象物に特異的な抗体’の複合体である。一方、前記ブリッジ複合体は、一つの粒子当たり複数個のバインダーを含むことができる。
【００２６】
以下、上述のような本発明の方法による試料内検出対象物の検出方法について具体的に説明する。
【００２７】
＜段階（ａ）：試料、競争者キャリア複合体及びブリッジ複合体の接触＞
まず、試料を（ｉ）検出対象物と同一な結合特性を有する同一結合物（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）が結合されている競争者キャリア複合体（ａ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ）及び(ｉｉ)検出対象物に特異的に結合するバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）が結合されているブリッジ複合体と接触（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）させる。
【００２８】
前記試料内に検出対象物が存在する場合、前記試料内検出対象物は、前記ブリッジ複合体と結合する。
【００２９】
ブリッジ複合体と結合する試料内検出対象物と競争者キャリア複合体は、同時に競争的に反応するか、あるいはそれぞれ選択的、順番的に反応する。例えば、（ｉ）試料、競争者キャリア複合体及びブリッジ複合体を同時に接触させる場合、前記ブリッジ複合体は、前記競争者キャリア複合体に対して競争的に前記試料内検出対象物と結合して、（ｉｉ）選択的、順番的に接触させる場合、ブリッジ複合体は、検出対象物（試料）または同一結合物（競争者キャリア複合体）と結合して、同時に接触する時とはちがって、競争反応はほとんど起こらない。
【００３０】
本発明によると、試料内検出対象物とブリッジ複合体結合の複合体が先に形成された後、ブリッジ複合体の残余バインダーに競争者キャリア複合体が結合できる。例えば、試料とブリッジ複合体を反応させて、検出対象物−ブリッジ複合体の複合体を形成した後、本発明の検出キットに適用した場合、前記複合体が試験区域の同一結合体に結合した後、競争者キャリア複合体がブリッジ複合体の非結合抗体と結合する。
【００３１】
本発明によると、前記競争者キャリア複合体は、粒子として発色性（ｃｏｌｏｒｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）を含み、前記発色性粒子からシグナルが直接発生する。例えば、前記発色性粒子は、蛍光分子の粒子、発色性金属粒子、発色性リポソーム、ブラックカーボン粒子、発色性ポリマー粒子、リン光分子の粒子またはダイ分子の粒子である。
【００３２】
本発明によると、前記競争者キャリア複合体の粒子またはビーズは、検出可能なシグナル発生標識を追加的に含み、前記シグナルは、前記シグナル発生標識から発生できる。用語‘シグナル’は、検出可能なパラメーター（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を意味し、光学的、電気的または磁気的パラメーターの流れ、蛍光放射、赤外線放射、紫外線放射、化学発光、光反射または前記シグナルの吸収程度を含む。検出可能なシグナルを発生させる標識は、化学物質（例えば、ビオチン）、酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びシトクロムＰ４５０）、放射能物質（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン）、発光物質、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）及びＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含むが、これらに限定されるものではない。多様なラベル及びラベリング方法は、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９に記載されている。
【００３３】
前記標識は、発散する波長によってそれぞれ異なる蛍光シグナルが観察される。前記標識は、公知の多様な蛍光物質を含むことができ、例えば、フルオレセインとその誘導体、ロダミンとその誘導体、ピコエリトリン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアナトスチルベン−２,２’−ジスルホン酸、7-ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル−ピレンブチレート、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２,２’−ジスルホン酸誘導体、ＬＣＴＭ−Ｒｅｄ  ６４０、ＬＣＴＭ−Ｒｅｄ  ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミン、イソチオシアネート、エリトロシンイソチオシアネート、ジエチレントリアミンペンタアセテート、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホン酸、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸、２−ｐ−トーイジニル−６−ナフタレンスルホン酸、３−フェニル−７−イソシアネートクマリン、９−イソチオシアネートアクリジン、アクリジンオレンジ、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾクサゾイリル）フェニル）メレイミド、ベンゾクサジアゾル、スチルベン及びファイレンを含むが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の方法において、前記検出対象物がタンパク質に結合された化合物ホルモンである場合、前記段階（ａ）は、（ａ−１）前記タンパク質に結合された化合物ホルモンから前記化合物ホルモンを解離させる解離剤（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｇｅｎｔ）で処理された前記試料を前記ブリッジ複合体に接触させる段階と、（ａ−２）前記段階（ａ−１）の結果物を前記競争者キャリア複合体と接触させる段階とを含むことができる。
【００３５】
前記解離剤（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｇｅｎｔ）は、化合物ホルモンとタンパク質を分離させるための試薬であって、酸、アルカリ、重金属または有機溶剤及び競争者ホルモンなどを使用することができる。本発明によると、前記解離剤は、競争者ホルモン（例えば、２−メトキシエストラジオール）であり、前記競争者ホルモンは、前記化合物ホルモン（例えば、テストステロン）に対して競争的に作用し、前記化合物ホルモンに結合されたタンパク質（性ホルモン結合グロブリンまたはアルブミン）を分離させる。
【００３６】
一方、前記競争者キャリア複合体は、前記段階（ａ）を実施する前、前記支持体上の試験区域のアップストリーム側に位置している。この場合、試料は、競争者キャリア複合体と共に同一化合物が結合された試験区域を通過するようになる。
【００３７】
本発明によると、検出対象物を含む試料は、前記支持体上の（ｉ）試料が投入される‘試料区域’、（ｉｉ）前記試料と競争者キャリア複合体を接触させる‘競争者キャリア複合体区域’、及び（ｉｉｉ）ブリッジ複合体及び／または競争者キャリア複合体が結合可能な‘試験区域’を含み、前記三つの区域は、流体流れ的に順番的に前記支持体上に位置する。例えば、前記検出対象物がタンパク質に結合された化合物ホルモンである場合、前記段階（ａ）は、前記タンパク質に結合された化合物ホルモンから前記化合物ホルモンを解離させる解離剤で処理された前記試料を、前記ブリッジ複合体に接触させて、試料／ブリッジ複合体反応物を得た後、前記試料区域に前記試料／ブリッジ複合体反応物を適用して実施し、前記段階（ｂ）は、流体流れを通じて、前記試料／ブリッジ複合体反応物と前記競争者キャリア複合体を前記試験区域に移動させ、前記試験区域に結合された同一結合物と接触させて実施することができる。
【００３８】
＜段階（ｂ）：試験区域の同一結合物及び前記段階（ａ）の結果物の接触＞
次いで、前記段階（ａ）の結果物を、支持体上の試験区域に結合された検出対象物と同一な結合特性を有する同一結合物と接触させる。
【００３９】
前記試料内に検出対象物が存在する場合、前記試料内検出対象物が結合された前記ブリッジ複合体は、前記支持体上の同一結合物と結合せず、前記支持体上でシグナルが発生することがなく、前記試料内に検出対象物が存在しない場合、前記ブリッジ複合体は、前記支持体上の同一結合物と結合し、前記競争者キャリア複合体は、前記ブリッジ複合体に結合され、前記支持体上でシグナルが発生する。
【００４０】
本発明によると、支持体には同一結合物が結合されており、前記同一結合物は、反応物の連続的な流れがなされる一つの反応容器の基質表面上に存在し、前記反応容器は、マイクロチャンネルを有するマイクロチップである。
【００４１】
本明細書において、用語‘支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）’は、‘固体状基質（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、固体状支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）または固相（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ）’と同一な意味として使用でき、非液状物質を意味する。前記支持体は、内部にマイクロチャンネルが形成でき、例えば、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）、毛細管の一部またはマイクロチャンネル内を流動/接着された小径ビーズ（ｓｍａｌｌ  ｄｉａｍｅｔｅｒ  ｂｅａｄｓ）として存在できる。このような形態の公知の物質は、ポリスチレン及びポリプロピレン、ガラス、金属、及びゲルのような炭化水素重合体を含む。前記支持体は、ディップスティック、マイクロタイタープレート、粒子（例えば、ビーズ）、親和性カラム及びイムノブロットメンブレイン（例えば、ポリフッ化ビニリデンメンブレイン）形態である（参照：米国特許第５１４３８２５号、第５３７４５３０号、第４９０８３０５号及び第５４９８５５１号)。
【００４２】
＜段階（ｃ）：シグナル測定＞
次いで、シグナル測定装置を使用し、前記段階（ｂ）の結果物において、前記競争者キャリア複合体から発生されるシグナルの強度を測定する。
【００４３】
本発明の方法によると、競争者キャリア複合体に含まれた標識が放出するシグナルは、蛍光シグナルとして測定されるため、試験区域の蛍光シグナルを測定して検出対象物の存在を確認することができ、試験区域を通過した試料は、一連の過程を通じて定量分析が可能である。本発明によると、検出対象物の定量分析は、大韓民国特許第１０−１３５３９３０号に記載の方法により実施する。
【００４４】
本発明によると、前記支持体上のマイクロチャンネルは、試験区域及び標準区域（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｚｏｎｅ）を含み、前記試験区域の表面に同一結合物が結合されており、前記標準領域に、動物由来のペプチドまたはこれと結合可能な物質として選定される検出抗体が結合できる。場合によって、同一結合物または検出対象物に特異的な検出抗体が結合できる。
【００４５】
本明細書において、用語‘試験区域（ｔｅｓｔ  ｚｏｎｅ）’は、流体流動分析のために前記支持体のマイクロチャンネル内に含まれた区画であって、試験領域の表面には、検出対象物と同一な結合特性を有する同一結合物が結合されている。
【００４６】
本明細書において、用語‘標準区域（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｚｏｎｅ）’は、前記支持体のマイクロチャンネル内に含まれた区画であって、動物由来のペプチドまたはこれと結合可能な物質として選定される検出抗体が結合できる。場合によって、標準区域の表面には、同一結合物または検出対象物に特異的な抗体が結合されており、試験区域を通過した同一結合物または検出対象物が結合できる。
【００４７】
前記同一結合物または抗体は、物理的な吸着または化学的な接着により、固体状基質に付着可能である。物理的吸着は、適切な緩衝液に存在する抗体または抗原と固体状の材料間で反応により行われる。緩衝液としては、リン酸塩緩衝液、トリス−ヒドロクロライド緩衝液、炭酸塩緩衝液などである。反応は、４〜３７℃、特に、室温で特定時間前記緩衝液を混合して維持することにより行われる。化学的付着は、ペプチド付着方法のうち、カルボジイミド法を使用することにより実行可能である。また他の化学法は、グルタルアルデヒドまたはシアヌリッククロライド（‘ペプチド合成法’、Ｍａｒｕｚｅｎ、１９７５または‘酵素免疫測定法’共立出版、‘プロテイン核酸酵素’、特別号３１、１９８７)などのような２価横連結試薬で実行される方法である。
【００４８】
本発明によると、前記試料は、前記マイクロチップに適用されて、前記試料は、前記マイクロチャンネルに形成された流れを通じて、前記試験領域及び標準領域と接触する。
【００４９】
前記シグナル測定方法に対する詳細な説明は、大韓民国特許第１０−１３５３９３０号に記載されている。
【００５０】
本発明の他の様態によると、本発明は、（ａ）試料を収容し、反応がなされるマイクロチャンネル（ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ）が備えられた支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）と、
（ｂ）（ｉ）前記マイクロチャンネルの一部位に形成されており、（ｉｉ）検出対象物と同一な結合特性を有する同一結合物が結合されており、シグナルを発生できる競争者キャリア複合体（ａ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｈａｖｉｎｇ  ａｎ  ａｎａｌｙｔｅ  ａｎｄ  ｂｅｉｎｇ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）が結合されている競争者キャリア複合体区域（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｚｏｎｅ）と、
（ｃ）（ｉ）前記マイクロチャンネルの一部位に形成されており、（ｉｉ）検出対象物と同一な結合特性を有して、検出対象物に特異的に結合するバインダーが結合されているブリッジ複合体と結合可能な同一結合物（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）が結合されている試験区域（ｔｅｓｔ  ｚｏｎｅ）と、を含み、
前記試料内に検出対象物が存在する場合、前記試料内検出対象物は、前記ブリッジ複合体と結合し、前記試料内検出対象物が結合された前記ブリッジ複合体は、前記支持体上の同一結合物と結合せず、前記支持体上でシグナルが発生することがなく、前記試料内に検出対象物が存在しない場合、前記ブリッジ複合体は、前記支持体上の同一結合物と結合し、前記競争者キャリア複合体は、前記ブリッジ複合体に結合され、前記支持体上でシグナルが発生することを特徴とする、試料内検出対象物の検出キットを提供する。
【００５１】
本発明の検出装置は、上述の本発明の試料内検出対象物の検出方法を利用したものであって、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【００５２】
本発明の装置をそれぞれの構成別に詳細に説明すると、下記のようである。
【００５３】
＜構成（ａ）：マイクロチャンネルが備えられた支持体＞
本発明の検出装置には、試料を収容して、反応がなされる支持体が含まれる。前記支持体内には、分析試料を収容するためのマイクロチャンネルが備えられており、前記マイクロチャンネルは、多様な深さ（ｄｅｐｔｈ）を有することができる。
【００５４】
分析試料を収容できる前記マイクロチップは、１以上のマイクロチャンネルを含むことができ、前記マイクロチャンネルには、それぞれ異なる検出対象物を検出する同一化合物及び検出抗体が結合できる。前記マイクロチャンネルには、試料区域、反応開始区域、競争者キャリア複合体区域、試験区域、標準区域及び反応終了区域が含まれて、例えば、前記各領域は、試料区域、反応開始区域、競争者キャリア複合体区域、試験区域、標準区域及び反応終了区域の順番に位置できる。
【００５５】
前記マイクロチャンネルは、試料が注入できる試料注入口を含むことができ、試料が前記注入口を通じてマイクロチャンネル内部に流入されると、マイクロチャンネルを通過しつつ、試験区域に位置した同一結合物（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）に結合または非結合される。
【００５６】
一方、検出対象物の探知のために、蛍光物質などを利用した分析試料のラベリング（ｌａｂｅｌｉｎｇ）反応または抗原-抗体反応などを利用した分析試料の特異反応（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などを利用し、後でセンサーなどの多様な探知手段を利用して所望の対象のみを選別的に確認することができる。標識された分析試料は、マイクロチャンネル内部を通過するようになるが、この際、マイクロチャンネルの一断面が光学センサーに露出され、これを利用して蛍光シグナルを探知することもできる。
【００５７】
＜構成（ｂ）：競争者キャリア複合体区域（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｚｏｎｅ）＞
本発明の検出装置において、前記競争者キャリア複合体区域は、前記マイクロチャンネルの一部位に形成されており、検出対象物と同一な結合特性を有する同一結合物が結合されていて、シグナルを発生できる競争者キャリア複合体が結合されるように設計される。
【００５８】
本発明によると、前記競争者キャリア複合体区域は、前記支持体上の試験区域のアップストリーム側に位置する。
【００５９】
＜構成（ｃ）：試験領域（ｔｅｓｔ  ｚｏｎｅ）＞
本発明の抗原検出装置において、前記試験領域は、前記マイクロチャンネルの一部位に形成されており、検出対象物と同一な結合特性を有して、検出対象物に特異的に結合するバインダーが結合されているブリッジ複合体と結合可能な同一結合物（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）が結合されるように設計される。
【００６０】
前記試料内に検出対象物が存在する場合、前記試料内検出対象物は、前記ブリッジ複合体と結合し、前記試料内検出対象物が結合された前記ブリッジ複合体は、前記支持体上の同一結合物と結合せず、前記支持体上でシグナルが発生することがなく、前記試料内に検出対象物が存在しない場合、前記ブリッジ複合体は、前記支持体上の同一結合物と結合し、前記競争者キャリア複合体は、前記ブリッジ複合体に結合され、前記支持体上でシグナルが発生する。
【００６１】
本発明によると、本発明の検出装置に含まれる支持体は、（ｉ）試料区域、（ｉｉ）競争者キャリア複合体区域、及び（ｉｉｉ）試験区域を含み、前記三つの区域は、流体流れ的に順番的に前記支持体上に位置する。
【００６２】
本発明の検出装置は、前記マイクロチャンネルの一部位に形成されており、検出対象物または同一結合物が特異的に結合する標準物質（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）が表面に結合された標準区域（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｚｏｎｅ）をさらに含むことができる。
【００６３】
本発明によると、前記装置は、検出可能なシグナルを発生させる標識が結合されており、前記検出対象物または同一結合物に特異的に結合する検出抗体を標準物質として含むことができる。
【００６４】
本発明によると、前記装置は、前記標識から発生するシグナルを測定する測定手段をさらに含むことができ、または前記装置は、前記試験領域及び標準領域で測定されたシグナルの強度の比率を計算する分析手段をさらに含むことができる。
【００６５】
本発明の方法及び装置は、多様な方式で利用でき、例えば、微小分子のホルモンを検出する場合、試料内非ターゲットタンパク質と結合ホルモンを自由（ｆｒｅｅ）ホルモン状態に効果的に解離させ、優れた分解能または分離能を提供することにより、試料内の検出対象物を細密な濃度範囲で分離できる。
【発明の効果】
【００６６】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである。
（ａ）本発明は、新規な試料内検出対象物の検出方法及びこれを利用した検出装置に関する。
（ｂ）本発明の検出方法は、金ナノ粒子と検出対象物に特異的な抗体を結合させた‘ブリッジ複合体’を使用して、抗体と検出対象物間の十分な結合反応を誘導することにより、反応性を向上させることができる。
（ｃ）これにより、優れた分解能または分離能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を提供し、試料内検出対象物の正確な濃度測定を可能にし、測定シグナルを増幅させることができる。
（ｄ）また、本発明の方法は、ホルモン、ビタミンなど、分子量の小さい微小分子（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を効果的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の検出方法を模式的に示す。
【図２】テストステロンの濃度による解離（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）程度を測定したものである。図２ａは、金ナノ粒子を使用していない従来検出方法１及び２による検量線（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）を示し、図２ｂは、金ナノ粒子を使用した本発明の方法による検量線（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）を示す。横軸は、標準区域シグナル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）に対する試験区域シグナル（ｔｅｓｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の比率（ｒａｔｉｏ）を示し、縦軸は、テストステロンの濃度を意味する。本発明の方法を利用した場合、測定されたシグナルの平均値の範囲及び解離程度（Ｄｉｓ.％）がさらに広いことを確認することができて、これにより、本発明の方法が高い分離能を提供することを確認した。
【図３】検出方法による相関関係を示す。図３ａは、従来検出方法１及び２（図６ａ及び図６ｂ）による相関図を示し、図３ｂは、従来検出方法３（図６ｃ）による相関図を示して、図３ｃは、本発明の方法による相関図を示す。図３ａの場合、相関性が０．７４１４と低く、図３ｂの場合、相関性は高かったが、別途の洗浄過程が必要であるという短所がある。本発明の場合、洗浄過程が必要なく、相関性も高かった。
【図４】金ナノ粒子を含む媒介体を使用した場合及び使用しなかった場合の分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を比較するためのＥＬＩＳＡ結果である。金ナノ粒子を使用した場合、Ｏ．Ｄ．値の範囲が広く測定されることを確認した。
【図５】図５ａ及び図５ｂは、ビタミンＤの濃度による解離（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）程度を測定したものである。図５ａは、金ナノ粒子を使用していない従来検出方法１及び２による検量線（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）を示し、図５ｂは、金ナノ粒子を使用した本発明の方法にいよる検量線を示す。
【図６】図６ａ乃至図６ｃは、本発明の検出装置を利用するが、既存のテストステロン検出方法を使用してテストステロンを検出する方法を示す（それぞれ既存反応１、２及び３）。試料（ｓａｍｐｌｅ）は、血液を示す（ａ：試料注入口、ｂ：競争者キャリア複合体区域、ｃ：試験区域、ｄ：標準区域）。＊略語Ａｎｔｉ−Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  Ｆ.Ｂ.：Ａｎｔｉ−Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｂｅａｄＴｅｓｔｏ−３ＣＭＯ：ＢＳＡ−（ｂ）：Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｏｘｉｍｅ−ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ−ＢｉｏｔｉｎＡｎｔｉ−Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ−（ｂ）：Ａｎｔｉ−Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ−Ｂｉｏｔｉｎ２−ＭＥ：２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ
【発明を実施するための形態】
【００６８】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００６９】
＜実施例１：金ナノ粒子と抗体のカップリング（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）＞
直径約４０ｎｍの金ナノ粒子（Ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）と抗体（抗−テストステロンまたは抗−Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ）をテストチューブ内で一定な比率で混ぜた後、常温で１時間反応した。前記抗体は、最終濃度が５μｇ／ｍＬになるように添加した。
【００７０】
以後、前記反応混合物にリン酸バッファー（ＰＢ  ｂｕｆｆｅｒ）内１０％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を１．１％になるように添加した後、常温で１時間反応した。
【００７１】
前記反応物を１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。
【００７２】
上澄み液を除去したチューブに貯蔵バッファー（Ｓｔｏｒａｇｅ  ｂｕｆｆｅｒ、２ｍＭホウ酸塩内０．１％カゼイン）を入れて懸濁した。前記遠心分離及び再懸濁過程をさらに２回繰り返した後、４℃で保管した。
【００７３】
＜実施例２：蛍光マイクロビーズと抗原のカップリング（Ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）＞
１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）を利用して、直径約５００ｎｍの蛍光マイクロ粒子（またはマイクロビーズ）を活性化させた。次いで、活性化された蛍光マイクロ粒子と抗原［テストステロン−３−カルボシキメチルオキシム−ＢＳＡ（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｏｘｉｍｅ−ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ−３−ＣＭＯ−ＢＳＡ）またはビタミンＤ］をテストチューブ内で一定な比率で混ぜた後（２％蛍光マイクロ粒子１００μＬ及び抗原２５０μｇ）、常温で２時間反応した。
【００７４】
以後、前記反応混合物に蒸留水内１０％ＢＳＡを、最終濃度１％になるように添加した後、常温で１時間反応した。
【００７５】
前記反応物に１Ｍグリシンを最終濃度５０ｍＭになるように添加した後、常温で３０分間反応した。次いで、前記実施例１の遠心分離と再懸濁過程を反復実施した後、４℃で保管した。
【００７６】
＜実施例３：テストステロン３ＣＭＯ  ＢＳＡのビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）反応＞
テストステロン３ＣＭＯ  ＢＳＡとビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を一定比率で混ぜた後、常温で１時間反応した（２０ｍｏｌ  ビオチン／１ｍｏｌ抗体）。
【００７７】
以後、残っている未反応ビオチンを除去するために、ＰＢＳ内で透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）を進行した。前記透析過程の間、未反応ビオチンが十分除去できるように、３回乃至４回程度新しいＰＢＳに入れ替えた。ビオチンの除去された抗体は、ＵＶ−分光器を利用して濃度を確認した後、４℃で保管した。
【００７８】
＜実施例４：チップ（Ｃｈｉｐ）準備＞
ビオチニル化されたテストステロンまたはビオチニル化されたビタミンＤ（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ−Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ）を、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）が結合されているチップの下部基板に点滴（ｄｏｔｔｉｎｇ）した後、常温で１時間反応した。
【００７９】
次いで、洗浄溶液（Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）でチップを洗浄し、３７℃で十分乾燥した後、サンプルバッファー（２−メトキシエストラジオール、２−ＭＥ）とテストステロン−蛍光マイクロ粒子を下部基板に点滴した後、３７℃で十分乾燥した。準備された下部基板と上部基板とを結合した後、使用前まで乾燥機で保管した。
【００８０】
＜実施例５：テストステロン測定＞
２−ＭＥ、実施例１の金ナノ粒子溶液及び血液を混合した後、常温で５分間反応した。前記混合反応物３５μＬを実施例４のチップ上に落とした後、反応物がチップの反応経路を全て通過すると、ＦＲＥＮＤ（ナノエンテック、大韓民国）を利用して蛍光シグナルを測定した。
【００８１】
本発明の方法及び既存の検出方法を利用してテストステロンの解離（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）程度を比較した時、本発明の検出方法の場合、測定されたシグナルの平均値の範囲及び解離程度（Ｄｉｓ.％）がさらに広いことを確認することができ、これにより、本発明の方法が高い分離能を提供できることを確認した。
【００８２】
【表１】
0006386591.tif 000002
【００８３】
【表２】
0006386591.tif 000003
【００８４】
＜実施例６：ビタミンＤ測定＞
放出試薬（Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）の含まれた金ナノ粒子溶液と血液を混合した後、４９℃で１０分間反応した。前記混合反応物３５μＬを実施例４のチップ上に落とした後、反応物がチップの反応経路を全て通過すると、ＦＲＥＮＤを利用して蛍光シグナルを測定した。
【００８５】
前記実施例５と同様に、本発明の検出方法の場合、測定されたシグナルの平均値の範囲及び解離程度（Ｄｉｓ.％）がさらに広いことを確認することができた。
【００８６】
【表３】
0006386591.tif 000004
【００８７】
【表４】
0006386591.tif 000005
【００８８】
以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１】
0006386591.tif 000006
【図２ａ】
0006386591.tif 000007
【図２ｂ】
0006386591.tif 000008
【図３ａ】
0006386591.tif 000009
【図３ｂ】
0006386591.tif 000010
【図３ｃ】
0006386591.tif 000011
【図４】
0006386591.tif 000012