(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＰＳ  Ｏ抗原を欠く非侵入性ラフ（ｒｏｕｇｈ）赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）株であって、内因性侵入プラスミド上に存在する遺伝子（単数または複数）の突然変異によって非侵入性である前記株を含む生弱毒化赤痢菌属ワクチン。
【請求項２】
ｒｆｂオペロンのクラスター中の遺伝子、あるいはＯ抗原合成をコードするｒｆｂ/ｗｂｂ遺伝子クラスター内の１またはそれより多い遺伝子、Ｏ抗原リガーゼをコードするｗａａＬ、Ｏ抗原輸送に関与するＯ抗原フリッパーゼをコードするｗｚｘ、Ｏ抗原重合に関与するｗｚｙ/ｒｆｃ、ＬＰＳ−コア合成をコードするｒｆａ／ｗａａ遺伝子クラスター内の遺伝子、Ｏ抗原発現に影響を及ぼす制御遺伝子、例えばｒｆａＨ、あるいはＯ抗原発現の少なくとも９０％の減少を生じる機能喪失型（単数または複数）からなる群より選択される、ＬＰＳ合成、輸送および発現に関与する１またはそれより多い遺伝子の突然変異を含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
前記赤痢菌属株が、Ｓ．フレックスネリ（Ｓ．  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、Ｓ．ソネイ（Ｓ．  ｓｏｎｎｅｉ）、Ｓ．ディセンテリエ（Ｓ．  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）およびＳ．ボイディー（Ｓ．  ｂｏｙｄｉｉ）からなる群より選択される、請求項１または２記載のワクチン。
【請求項４】
赤痢菌属の異なる血清型および種に対して交差防御性である、請求項１〜３のいずれか記載のワクチン。
【請求項５】
種が、Ｓ．フレックスネリ２ａ、Ｓ．フレックスネリ６およびＳ．ソネイからなる群より選択される、請求項４記載のワクチン。
【請求項６】
突然変異が、１またはそれより多いｉｐａ遺伝子の欠失を含む、請求項１〜５のいずれか記載のワクチン。
【請求項７】
１またはそれより多いｉｐａ遺伝子が、ｉｐａＢおよび／またはｉｐａＣである、請求項６記載のワクチン。
【請求項８】
ｒｆｂＦ遺伝子の欠失である、ＬＰＳ合成、輸送および発現に関与する１またはそれより多い遺伝子の突然変異、並びにｉｐａＢおよびｉｐａＣ遺伝子の欠失である、侵入プラスミドの突然変異を含む、請求項１〜７のいずれか記載のワクチン。
【請求項９】
前記侵入プラスミドが、異種抗原をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、前記抗原を分泌するかまたは前記抗原を細菌細胞表面上に発現する、組換え内因性侵入プラスミドである、請求項１〜８のいずれか記載のワクチン。
【請求項１０】
前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、および寄生虫抗原からなる群より選択される、請求項９記載のワクチン。
【請求項１１】
細菌抗原が、熱不安定性毒素のＢサブユニット（ＬＴＢ）、熱安定性毒素（ＳＴ）、あるいはそのサブユニットまたは融合体を含む、腸内毒素原性大腸菌のエンテロトキシン（ＥＴＥＣ）、好ましくは、配列番号１に示すようなアミノ酸配列を含むＳＴｍを含むＬＴＢ／ＳＴｍである、請求項１０記載のワクチン。
【請求項１２】
前記赤痢菌属が、必須染色体遺伝子の欠失および侵入プラスミド内への前記遺伝子の挿入をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか記載のワクチン。
【請求項１３】
被験体を予防して、感染性疾患、好ましくは経腸疾患を防止するのための医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれか記載のワクチンの使用。
【請求項１４】
医薬が経口または鼻内投与されるためのものである、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
ワクチンが、
−赤痢菌属および赤痢菌属以外の種の少なくとも１つの病原体の防御抗原を発現している多価ワクチンであり、そして
−前記感染性疾患が、任意の赤痢菌属血清型または種および／または前記病原体によって引き起こされる
請求項１３または１４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清型独立性交差防御を誘導し、そして異種（非赤痢菌属）抗原を発現するため、特異的ターゲティング化突然変異を用いて生成された、生弱毒化赤痢菌属ワクチン株に関する。
【背景技術】
【０００２】
赤痢菌属は、細菌性赤痢を引き起こす、ヒトに非常に適応した（ａｄｏｐｔｅｄ）グラム陰性腸内細菌である。疾患はもっぱら、直接人的接触または食物および水のヒト糞便汚染によって拡散する。その結果、細菌性赤痢は、最適以下の衛生状態の地域に固有のものである。世界中で１億６５００万の症例があると概算され、死亡数は１００万もの多さであり、大部分が５歳未満の小児の間のものである。赤痢菌属は、東南アジアおよびサハラ以南のアフリカにおいて、１〜５歳の小児の間の急性下痢エピソードの症例において単離される、最も蔓延した細菌性病原体の１つであることが見出された（Ｋｏｔｌｏｆｆら，  Ｂｕｌｌ．  Ｗ．Ｈ．Ｏ．  ７７：６５１−６６６，  １９９９）。細菌性赤痢はまた、流行国に入った旅行者および軍人の間でも一般的である。赤痢を管理するには、ワクチンが決定的であることは長く認められてきたが、赤痢菌属に対するワクチン開発は、血清型特異的免疫反応によって妨害されており、すなわち、赤痢菌属への曝露（天然またはワクチン仲介性）に際して、免疫防御は通常、所定の血清型に限定される。赤痢菌属の４つの種は、総計５０の血清型および下位血清型を含み、これらは、ＬＰＳ  Ｏ抗原によって区別される。
【０００３】
Ｈｏｎｇら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２４：７７９−９１，  １９９７）は、染色体およびプラスミドにコードされるリポ多糖遺伝子における突然変異の、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の侵入および血清耐性に対する影響を記載した。ｒｆｂおよびｒｆａＬ遺伝子における突然変異は、全Ｏ抗原側鎖を除去するかまたは非常に減少した長さの鎖を生じるかのいずれかであった。
【０００４】
Ｎａｇｙら（Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９８：１６９９−７０６，  ２００８）は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）制御性リポ多糖突然変異体のワクチン潜在能力を記載した。転写アンチターミネーターＲｆａＨの喪失は、ＬＰＳ鎖の不均一な長さ、「穏やかにラフな（ｇｅｎｔｌｙ  ｒｏｕｇｈ）」表現型を生じた。
【０００５】
制御タンパク質ＲｆａＨは、Ｓ．フレックスネリの長い鎖の（すなわち多数のＯ抗原反復の）ＬＰＳ分子の増殖期依存性上方制御に関与することが示されている（Ｃａｒｔｅｒら  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００７  Ｏｃｔ；１５３（Ｐｔ  １０）：３４９９−５０７）。
【０００６】
ＬＰＳ  Ｏ抗原以外の赤痢菌属の主要な病原性因子は、驚くほど保存されている。これは、これらの抗原に対する免疫仲介性進化圧の欠如を暗示し、Ｏ抗原が単一の防御抗原であるという認識されている見方を立証する。にもかかわらず、特に反復曝露の後には、いわゆる「侵入プラスミド抗原」（Ｉｐａ）に対する顕著な抗体反応がある。巨大病原性プラスミド上にコードされるこれらの抗原は、侵入およびしたがって病原性には不可欠の３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）の構成要素を形成する。
【０００７】
赤痢菌属病原性因子侵入プラスミド抗原Ｂ（ｉｐａＢ）の構造−機能分析が、Ｇｕｉｃｈｏｎら（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３：１２６９−７６，  ２００１）によって開示された。タンパク質サブドメインと機能を相関させるため、ｉｐａＢ突然変異体が生成された。
【０００８】
Ｍｅｎａｒｄら（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７５１８：５８９９−５９０６，  １９９３）は、シゲラ・フレックスネリのｉｐａ遺伝子、ｉｐａＢ、ｉｐａＣおよびｉｐａＤの突然変異誘発が、赤痢菌属の侵入能の喪失を生じることを記載した。
【０００９】
Ｉｐａタンパク質に対する抗体（マイナー保存抗原に対するものなど）は、非防御性であると見なされ、これは、そうでなければ血清型間での交差防御が誘発されうるためである。現在のワクチンアプローチは、ほぼもっぱら、Ｏ抗原仲介性免疫に頼っており、これは５つまたは６つの血清型が、風土性のおよび流行性の赤痢症例の大部分に対して、高い防御を提供するという事実を利用している。にもかかわらず、示唆される多価ワクチンの大部分は、精製サブユニット（Ｏ抗原）または異なるＬＰＳ  Ｏ抗原型を持ついくつかの生弱毒化細菌のいずれかに基づくという事実を考慮すると、これらは、おそらく、あまりにも複雑であり、そしてしたがって高価である可能性が高い。さらに、他の多血清型病原体、例えば肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関して立証されるように、部分的血清型カバーが、集団免疫に基づくワクチン血清型に対する免疫圧のため、血清型置換を、そして非ワクチン血清型のエスケープおよび蔓延増加を誘導することが予期される。したがって、理想的な赤痢菌属ワクチンは、すべての循環血清型に対して実質的な交差防御を提供することが期待される。
【００１０】
赤痢菌属に加えて、腸内毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）は、旅行者の下痢の原因となる主な細菌性病原体であり、そして流行国における小児の死亡の主因の１つを代表する。したがって、これら２つの病原体に同時に取り組むワクチンを開発する努力がなされている。
【００１１】
旅行者の下痢は、現在、抗生物質によって治療される；しかし、赤痢菌属株の間では耐性率が増加しており、これにより、この疾患の管理はますます困難になってきている。さらに、ＥＴＥＣ感染は、過敏性結腸症候群に関連する長期の結果をもたらしうる。ワクチン接種は、この非常に対処不十分な医学的必要性に取り組む最も有効な方法であることが広く認められている；しかし、これらの状態の防止に現在利用可能なワクチンはない。
【００１２】
ＥＴＥＣ株において、２つのタイプのエンテロトキシン、熱不安定性毒素（ＬＴ）、およびブタ疾患に関連するＳＴ（ＳＴｐ）またはヒト疾患に関連するＳＴ（ＳＴａ）のいずれかとしての熱安定性毒素（ＳＴ）が同定されてきている。ＬＴは、コレラ毒素に構造が非常に相同である。Ａサブユニットは毒素の活性構成要素であり、これは、アデニル酸シクラーゼの活性を増加させるよう機能する。これは、細胞表面上のガングリオシドに結合するＢサブユニットによって宿主細胞内に送達される。ＳＴａは、小分子（１９アミノ酸）非免疫原性ポリペプチドであり、グアニル酸シクラーゼ刺激活性を有する。ＳＴｍは、ＳＴの突然変異型であり、非毒性であるが、なお免疫原性である。こうしたＳＴｍは、ワクチン抗原として安全に使用されるはずであると見なされる（Ｔａｘｔら  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７８：１８２４−３１，  ２０１０）。
【００１３】
ＥＴＥＣ株はまた、腸管凝集性大腸菌株で最初に同定された、ＳＴとサイズおよび作用様式が類似であるが配列が異なる熱安定性毒素、ＥＡＳＴ１も産生することが立証されてきている（ＮａｔａｒｏおよびＫａｐｅｒ，  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  １１：１４２−２０１，  １９９８；  Ｚｈａｎｇら，  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １２３：１４５−１５２，  ２００７）。
【００１４】
Ｚｈｅｎｇら（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｅｔｅｒｏｌ．  １１：３４１１−１８，  ２００５）は、腸内毒素原性大腸菌のＣＳ３およびＬＴＢ／ＳＴｍを同時発現するａｓｄ突然変異体赤痢菌株を構築した。経口経路によってマウスを免疫した後、ＣＳ３、ＬＴＢ、ＳＴ、および赤痢菌属リポ多糖に対する抗体が生じた。
【００１５】
Ｘｕら（Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：６６４−６４８，  ２００３）は、ＤＮＡに基づくＨＩＶ  ｇａｇワクチンのキャリアーとしての生弱毒化侵入性シゲラ・フレックスネリ血清型２ａ  ｒｆｂＦ突然変異体を記載した。
【００１６】
Ｎｏｒｉｅｇａら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６７（２）：７８２−７８８，  １９９９）は、２つの血清型２ａおよび３ａの使用を伴う、１４のシゲラ・フレックスネリ血清型に対する交差防御のための戦略を記載した。記載される弱毒化株は、Ｓ．フレックスネリ２ａ株ＣＶＤ１２０７（ΔｇｕａＢ−Ａ  Δｓｅｔ１  Δｓｅｎ）およびＳ．フレックスネリ３ａ株ＣＶＤ  １２１１（ΔｇｕａＢ−Ａ  ΔｖｉｒＧ  Δｓｅｎ）である。
【００１７】
Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９（２）：１０７２−１０８３，  ２００１）は、ａｒｏＣ突然変異体、および二重ｐｕｒＥ  ａｒｏＣ突然変異体である、シゲラ・フレックスネリ５の突然変異体を記載する。
【００１８】
Ｌｅｖｉｎｅら（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇｅｎ  ９８：１２０−１２３，  １９９７）は、染色体遺伝子ａｒｏＡおよびプラスミド遺伝子ｖｉｒＧにおいて突然変異を宿する弱毒化Ｓ．フレックスネリ２ａ株ＣＶＤ  １２０３、ならびに核酸合成に欠損を生じるｇｕａＢ−Ａにおける欠失突然変異、およびｖｉｒＧにおける欠失突然変異を宿するＳ．フレックスネリ２ａワクチン候補ＣＶＤ１２０５を記載した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｋｏｔｌｏｆｆら，  Ｂｕｌｌ．  Ｗ．Ｈ．Ｏ．  ７７：６５１−６６６，  １９９９
【非特許文献２】Ｈｏｎｇら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２４：７７９−９１，  １９９７）
【非特許文献３】Ｎａｇｙら（Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９８：１６９９−７０６，  ２００８）
【非特許文献４】Ｃａｒｔｅｒら  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００７  Ｏｃｔ；１５３（Ｐｔ  １０）：３４９９−５０７
【非特許文献５】Ｇｕｉｃｈｏｎら（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３：１２６９−７６，  ２００１）
【非特許文献６】Ｍｅｎａｒｄら（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７５１８：５８９９−５９０６，  １９９３）
【非特許文献７】Ｔａｘｔら  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７８：１８２４−３１，  ２０１０
【非特許文献８】ＮａｔａｒｏおよびＫａｐｅｒ，  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  １１：１４２−２０１，  １９９８
【非特許文献９】Ｚｈａｎｇら，  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １２３：１４５−１５２，  ２００７
【非特許文献１０】Ｚｈｅｎｇら（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｅｔｅｒｏｌ．  １１：３４１１−１８，  ２００５）
【非特許文献１１】Ｘｕら（Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：６６４−６４８，  ２００３）
【非特許文献１２】Ｎｏｒｉｅｇａら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６７（２）：７８２−７８８，  １９９９）
【非特許文献１３】Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９（２）：１０７２−１０８３，  ２００１）
【非特許文献１４】Ｌｅｖｉｎｅら（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇｅｎ  ９８：１２０−１２３，  １９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、改善された赤痢菌属ワクチン、特に、流行国に向かう旅行者および発展途上国で生活する幼い小児に非常に関連する下痢性疾患の防止のためのワクチンを提供することである。こうしたワクチンは、異なる病原体に由来する抗原を異種性に発現し、そして細菌性病原体、および特に細菌性赤痢に対する広域防御を誘導することが可能な、生弱毒化シゲラ・フレックスネリ・ワクチンに基づくことも可能である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明の概要
目的は、請求されるような主題によって解決される。
【００２２】
本発明にしたがって、ＬＰＳ  Ｏ抗原を欠くラフ赤痢菌属株に基づく、生弱毒化赤痢菌属ワクチンを提供する。
【００２３】
特に、赤痢菌属株は、突然変異誘発によって、特に侵入プラスミドの突然変異によって非侵入性である。
【００２４】
特に、本発明記載のワクチンは、好ましくは、例えばシゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ株（Ｗｅｉら  シゲラ・フレックスネリ血清型２ａ株２４５７Ｔの完全ゲノム配列および比較ゲノミクス。  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００３  Ｍａｙ；７１（５）：２７７５−８６．）のＧｎｄ（６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、２０８９１５５−２０９０５６１）およびＧａｌＦ（ＵＴＰ−グルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、２１０１９２８−２１０２８２１）遺伝子の間の染色体上に位置する、または病原性プラスミド（シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ））上に位置する、ｒｆｂオペロンのクラスター中の遺伝子からなる群より選択される、ＬＰＳ合成、輸送および発現に関与する１またはそれより多い遺伝子の突然変異誘発によって弱毒化されている。特に好ましいのは、Ｏ抗原合成をコードするｒｆｂ/ｗｂｂ遺伝子クラスター内の１またはそれより多い遺伝子、Ｏ抗原リガーゼをコードするｗａａＬ、Ｏ抗原輸送に関与するＯ抗原フリッパーゼをコードするｗｚｘ、Ｏ抗原重合に関与するｗｚｙ/ｒｆｃ、ＬＰＳ−コア合成をコードするｒｆａ／ｗａａ遺伝子クラスター内の遺伝子、Ｏ抗原発現に影響を及ぼす制御遺伝子、例えばｒｆａＨ、あるいはＯ抗原発現の少なくとも９０％の減少を生じる機能喪失型（単数または複数）の突然変異誘発である。
【００２５】
特定の態様にしたがって、前記突然変異誘発は、ｒｆｂ  Ｆ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｊおよび／またはＩ遺伝子の１またはそれより多くの欠失、あるいはその一部の欠失、あるいは多様な赤痢菌属血清型における対応する遺伝子の欠失による。あるいは、不活性化、例えば一過性、条件的または恒常的不活性化による突然変異誘発を使用してもよい。
【００２６】
前記赤痢菌属株は、好ましくは、例えば任意の赤痢菌属血清型または種由来の、赤痢菌属、特にＳ．フレックスネリ、Ｓ．ソネイ、Ｓ．ディセンテリエ（Ｓ．  ｄｙｓｅｎｔｈｅｒｉａｅ）およびＳ．ボイディー（Ｓ．  ｂｏｙｄｉｉ）より選択される。
【００２７】
特に、前記赤痢菌属株は、交差反応性抗体を誘導可能な外膜タンパク質、特に、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＡおよびＯｍｐＸ、または侵入プラスミド上にコードされるものを含む、保存されたタンパク質を発現する。
【００２８】
本発明記載のワクチンは、特に、赤痢菌属の異なる血清型および種に対して、特にＳ．フレックスネリ２ａ、Ｓ．フレックスネリ６およびＳ．ソネイ、または腸管侵入性大腸菌のいずれかに対して交差防御性である。
【００２９】
特定の側面にしたがって、前記赤痢菌属は、侵入プラスミドのさらなる突然変異誘発、特にｉｐａＢおよび／またはｉｐａＣおよび／または他のｉｐａ遺伝子の欠失を含む侵入プラスミドの突然変異によって、非侵入性である。
【００３０】
特に、前記赤痢菌属は、異種抗原をコードする少なくとも１つの遺伝子を取り込み、前記抗原を分泌するかまたは前記抗原を細菌細胞表面上に発現する、組換え内因性侵入プラスミドを含む。
【００３１】
好ましい態様は、前記抗原が、病原体由来の防御抗原、例えば
−細菌抗原、好ましくは毒素またはコロニー形成因子、
−ウイルス抗原、好ましくは経腸または粘膜感染を引き起こす病原体由来のもの、
−真菌抗原、好ましくは経腸または粘膜感染を引き起こす病原体由来のもの、および
−寄生虫抗原、好ましくは経腸感染を引き起こす病原体由来のもの
からなる群より選択されるものである、ワクチンを指す。
【００３２】
特に、細菌性抗原は、好ましくは
ａ．  大腸菌抗原、特に、ＥＴＥＣのＬＴＢ、突然変異ＬＴＡおよびＳＴ、そのサブユニットまたは融合体からなる群より選択されるエンテロトキシン、腸管凝集性大腸菌（ＥＡＥＣ）由来の抗原、あるいは志賀毒素様毒素１または２
ｂ．カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）抗原
ｃ．クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原、特に毒素ＡおよびＢ
ｄ．コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）抗原、特にＣＴ−Ｂ抗原、ならびに
ｅ．ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の突然変異体または融合タンパク質
からなる群より選択される、腸管病原性細菌から生じる。
【００３３】
特に、細菌抗原は、熱不安定性毒素のＢサブユニット（ＬＴＢ）、熱安定性毒素（ＳＴ）、あるいはそのサブユニットまたは融合体を含むエンテロトキシン（ＥＴＥＣ）であり、好ましくは、配列番号１に示すようなアミノ酸配列を含むＳＴｍを含むＬＴＢ／ＳＴｍであって、場合によってヒトＳＴの野生型配列は排除される。
【００３４】
特に、前記ＥＴＥＣ抗原は、ＬＴのＢサブユニットおよび突然変異体ＳＴの融合タンパク質、好ましくは融合タンパク質ＬＴＢ／ＳＴｍであり、図７の配列番号１１〜１８から得られるようなアミノ酸配列（４つの構築物に関するＬＴＡ−プロモーター−ＬＴＢ−ＳＴ−ＬＴＢターミネーターヌクレオチドおよびＬＴＢ−ＳＴアミノ酸配列）、例えば１３位および／または１２位にＳＴ突然変異を含むもの、例えばＰ１３ＦまたはＰ１３Ｇ、および／またはＮ１２ＲまたはＮ１２Ｋである。
【００３５】
特に、ウイルス抗原は、下痢性ウイルスから生じ、好ましくはロタウイルスおよびノーウォークウイルス（カルシウイルス）からなる群より選択される。
【００３６】
特に、寄生虫抗原は、好ましくは、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種および赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）からなる群より選択される、下痢誘発原生動物から生じる。
【００３７】
特に、真菌抗原は、好ましくは、ブラストミセス・デルマティディティス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｄｉｔｉｓ）およびヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種からなる群より選択される、下痢誘発真菌から生じる。
【００３８】
本発明の特定の側面にしたがって、赤痢菌属ワクチン株は、必須染色体遺伝子、特にｐｐａ遺伝子、またはａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｄａｐＥ、ｅｒａ、ｆｒｒ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＺ、ｉｎｆＡ、ｌｇｔ、ｌｐｘＣ、ｍｓｂＡ、ｍｕｒＡ、ｍｕｒＩ、ｎａｄＥ、ｐａｒＣ、ｐｒｏＳ、ｐｙｒＢ、ｒｐｓＢ、ｔｒｍＡ、ｒｈｏおよびｒｈｏＬのいずれかの欠失および侵入プラスミド内への前記遺伝子の挿入をさらに含む。
【００３９】
さらに、本発明の特定の態様にしたがって、感染性疾患、特に経腸疾患、例えば下痢性疾患を防止するため、被験体の予防または免疫予防において使用するための、ワクチンを提供する。特に、疾患は、細菌性赤痢、赤痢および下痢からなる群より選択される。
【００４０】
本発明にしたがって、被験体における感染性疾患、特に経腸疾患を、特にそれぞれ前記被験体のワクチン接種および免疫によって、防止する方法をさらに提供する。
【００４１】
特に、前記経腸疾患は、任意の赤痢菌属血清型または種によって引き起こされる。
【００４２】
好ましくは、前記（免疫）予防は、粘膜または経口配合物中のワクチンの投与を含む。
【００４３】
特に、ワクチンは、経口または鼻内投与される。
【００４４】
特定の態様は、
−赤痢菌属および赤痢菌属以外の種の少なくとも１つの他の病原体の防御抗原を、前記病原体の防御抗原を内因性修飾組換え侵入プラスミドに取り込むことによって発現している多価ワクチンを用い、そして
−前記感染性疾患が、任意の赤痢菌属血清型または種および／または前記病原体によって引き起こされる
本発明にしたがって使用するためのワクチンを指す。
【００４５】
本発明のさらなる側面にしたがって、ｒｆｂＦならびにｉｐａＢおよび／またはｉｐａＣ遺伝子の少なくとも１つの欠失、あるいはその必須部分の欠失を含む、Ｓ．フレックスネリ２ａ株、例えばＳ．フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔである、赤痢菌属株を提供する。
【００４６】
特に、前記赤痢菌属株は、必須染色体遺伝子の欠失および侵入プラスミド内への前記遺伝子の挿入をさらに含んでもよい。
【００４７】
好ましくは、前記赤痢菌属株は、異種抗原をコードする少なくとも１つの遺伝子を取り込み、前記抗原を発現しそして／または分泌する組換え侵入プラスミドを含む。
【００４８】
さらに、本発明のさらなる側面にしたがって、少なくとも１つの異種抗原をコードするヌクレオチド配列を含む突然変異赤痢菌属侵入プラスミドに基づく組換えプラスミドベクターであって、プラスミドがｉｐａＢおよび／またはｉｐａＣ遺伝子の少なくとも１つにおいて突然変異している、前記プラスミドベクターを提供する。これは特に、非コードまたはコード領域、例えばそれぞれ、遺伝子に機能可能であるように連結されている制御配列および遺伝子の欠失および／または不活性化、好ましくは細菌宿主細胞を非侵入性にする遺伝子の欠失、特にｉｐａＢおよび／またはｉｐａＣ遺伝子の欠失、あるいはその（実質的な）部分の欠失のための突然変異を指す。
【００４９】
本発明のさらなる特定の側面は、本発明記載のベクターを含む細菌宿主細胞に関し、ここで前記宿主細胞は、赤痢菌属、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター属またはエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）より特に選択される。
【００５０】
前記宿主細胞は、特に、内因性侵入プラスミドにおける突然変異を含む。特に、本発明記載のベクターは、内因性侵入プラスミド、すなわち宿主細胞に対して内因性または相同性であるプラスミドである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＬＰＳ  Ｏ抗原合成を欠くＳ．フレックスネリおよびＳ．ソネイの生弱毒化非侵入性株の交差防御能。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの群をＳ．フレックスネリ２ａ（ａおよびｂ）突然変異体のＣＲＰ（１０６ＣＦＵ）およびＣＲＮ（１０８ＣＦＵ）変異体、あるいはＳ．ソネイ（ｃ）の第Ｉ期（１０５．５ＣＦＵ）および第ＩＩ期（１０７．５ＣＦＵ）変異体で、２週間間隔で２回、鼻内免疫した。対照群を生理食塩水で偽ワクチン接種した。続いて、マウスを同じ経路で１０６ＣＦＵの野生型Ｓ．フレックスネリ６（ａおよびｃ）または１０６．５ＣＦＵの野生型Ｓ．ソネイ（ｂ）のいずれかに曝露した。続いて生存を１４日間監視した。図は、各群５匹のマウスでの３回（ｂ）または２回（ａおよびｃ）の独立の実験および反復の組み合わせデータを示す。ログ−ランク（マンテル−コックス）検定によって生存曲線の統計分析を行った。生存が偽ワクチン接種マウスのものと有意に異なる場合、ｐ値をグラフ上に示す。
【図２】用いた多様な突然変異体の抗原性表現型の模式図、ならびにこれらが誘導しうる抗体レベルの提唱される相違  Ｏ抗原、その遺伝的決定因子、およびこれらによって誘発される抗体を示す。Ｉｐａおよびマイナー保存表面抗原を示す。ＩｐａおよびＯ抗原の両方を発現する突然変異体（Ｓ．フレックスネリ  ΔａｒｏＣ  ＣＲＰおよびＳ．ソネイ第Ｉ期）は、主にこれらの主要抗原に対して抗体反応を誘発する。対照的に、ワクチン株におけるこれらの抗原の喪失は、マイナー保存抗原に対する、より高い反応を可能にする。ｉｐ：侵入プラスミド、ｃｈｒ．：染色体、Ｔ３ＳＳ：３型分泌系、ＬＰＳ：リポ多糖。
【図３】生弱毒化Ｓ．フレックスネリ２ａ株でワクチン接種したマウスから得られる広域反応性粘膜ＩｇＡ。スムース（ｓｍｏｏｔｈ）ｉｐａ陽性株（ΔａｒｏＣ  ＣＲＰ）および二重突然変異体（ΔｒｆｂＦ  ＣＲＮ）での２回の免疫後に収集したＢＡＬ試料におけるｓＩｇＡの免疫反応性を、異なるターゲット細菌細胞上のＥＬＩＳＡにおいて決定した。反復実験を比較可能にするため、同じ希釈での比（ΔａｒｏＣ  ＣＲＰ試料の反応性をΔｒｆｂＦ  ＣＲＮ試料の反応性で割る）として反応性を表す。グラフは、独立のワクチン接種から得たＢＡＬ試料で行った４回の実験の平均＋平均の標準誤差を示す。マン−ホイットニー・ノンパラメトリック検定によって、データを、二重（ｉｐａおよびＯ抗原）陽性ターゲット上で得た値（ΔａｒｏＣ  ＣＲＰ；黒いカラム）に統計的に比較した。
【図４】補足表１：欠失突然変異体の生成および確認のために用いたオリゴヌクレオチド（配列番号３〜１０）。
【図５】弱毒化シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ株の模式図。  Ａ．シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ完全配列決定株。Ｏ抗原は、赤痢菌属の血清型決定因子である。赤痢菌属染色体上のｒｆｂＦ遺伝子は、ＬＰＳのＯ抗原構成要素の合成に必須な因子をコードする。すべての病原性赤痢菌属株に存在する侵入プラスミドは、ＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）の重要な分子構成要素である侵入プラスミド抗原（ＩｐａＡ〜Ｄ）をコードする。Ｔ３ＳＳは、ターゲット細胞−赤痢菌属相互作用の重要なプロセスを仲介し、そして最終的に、赤痢菌属因子のターゲット細胞への伝播を導き、病原体が侵入し、そして拡散するのを可能にする。ＩｐａＢおよびＩｐａＣは、この系の重要でそして必須の構成要素である。  Ｂ．シゲラ・フレックスネリ２ａ  Ｔ２４５７  ｒｆｂＦ−ｉｐａＢ／Ｃ−突然変異体において、２つの欠失が導入されている。染色体からのｒｆｂＦ遺伝子の欠失は、Ｏ抗原合成を排除し、そして弱毒化された「ラフ」株を生じ、そしてワクチン接種に際して、血清型独立性免疫を誘導する。侵入プラスミド上のｉｐａＢおよびＣ遺伝子の欠失は、Ｔ３ＳＳを破壊し、したがって赤痢菌属突然変異体を非侵入性に（そしてコンゴーレッド陰性に）する。  Ｃ．突然変異体赤痢菌属株の侵入プラスミドを安定化させるため、必須染色体遺伝子（無機ピロホスファターゼ、ｐｐａ（図７、配列番号２４））を染色体から欠失させ、そして合成構築物の一部として、侵入プラスミド内に再導入する。
【図６】シゲラ・フレックスネリ２ａの侵入プラスミドｐＣＰ３０１の模式図。ｉｐａクラスター、ｉｐａＢ／Ｃ欠失のためのプライマーの位置（ｐＫＤ１、２）、およびｉｐａＢ／Ｃの欠失を監視するための対照プライマー（ｋｏ１、２）を伴う３０１株。ｉｐａＪおよびＩＳ１００要素の間の合成遺伝子の挿入部位の位置もまた示す。
【図７−１】配列  アミノ酸１３位に突然変異（ＰｒｏからＰｈｅ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＰ−Ｐ１３Ｆ（ヌクレオチド配列、配列番号１１）、  アミノ酸１３位でＳＴ中に突然変異（ＰｒｏからＰｈｅ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＰ−Ｐ１３Ｆ（アミノ酸配列、配列番号１２）、  アミノ酸１３位に突然変異（ＰｒｏからＧｌｙ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｐ１３Ｇ（ヌクレオチド配列、配列番号１３）、  アミノ酸１３位でＳＴ中に突然変異（ＰｒｏからＧｌｙ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｐ１３Ｇ（アミノ酸配列、配列番号１４）、  アミノ酸１２位に突然変異（ＡｓｎからＡｒｇ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｎ１２Ｒ（ヌクレオチド配列、配列番号１５）、  アミノ酸１２位でＳＴ中に突然変異（ＡｓｎからＡｒｇ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｎ１２Ｒ（アミノ酸配列、配列番号１６）、  アミノ酸１２位に突然変異（ＡｓｎからＬｙｓ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｎ１２Ｋ（ヌクレオチド配列、配列番号１７）、  アミノ酸１２位でＳＴ中に突然変異（ＡｓｎからＬｙｓ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｎ１２Ｋ（アミノ酸配列、配列番号１８）、ｉｐａ欠失突然変異体株を確認するための順方向対照ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｃｏ１（配列番号１９）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を確認するための逆方向対照ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｃｏ２（配列番号２０）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｐＫＤ１（配列番号２１）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｐＫＤ２（配列番号２２）、  侵入プラスミドから除去されるｉｐａＢおよびｉｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列  ｉｐａＢＣ（配列番号２３）。染色体から侵入プラスミドに移植されるｐｐａ遺伝子のヌクレオチド配列  赤痢菌属ｐｐａ遺伝子（配列番号２４）。  ｐｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｐＫＤ−Ｆ（配列番号２５）  ｐｐａ欠失突然変異体株を生成するための逆方向ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｐＫＤ−Ｒ（配列番号２６）  ｐｐａ欠失突然変異体株を確認するための順方向対照ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｋｏ１（配列番号２７）  ｐｐａ欠失突然変異体株を確認するための逆方向対照ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｋｏ２（配列番号２８）  柔軟なフォールディングのため、ＬＴ−ＢおよびｍＳＴの間に挿入されるリンカーペプチド  ＧＧＧＧＳ（配列番号２９）
【図７−２】配列  アミノ酸１３位に突然変異（ＰｒｏからＰｈｅ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＰ−Ｐ１３Ｆ（ヌクレオチド配列、配列番号１１）、  アミノ酸１３位でＳＴ中に突然変異（ＰｒｏからＰｈｅ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＰ−Ｐ１３Ｆ（アミノ酸配列、配列番号１２）、  アミノ酸１３位に突然変異（ＰｒｏからＧｌｙ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｐ１３Ｇ（ヌクレオチド配列、配列番号１３）、  アミノ酸１３位でＳＴ中に突然変異（ＰｒｏからＧｌｙ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｐ１３Ｇ（アミノ酸配列、配列番号１４）、  アミノ酸１２位に突然変異（ＡｓｎからＡｒｇ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｎ１２Ｒ（ヌクレオチド配列、配列番号１５）、  アミノ酸１２位でＳＴ中に突然変異（ＡｓｎからＡｒｇ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｎ１２Ｒ（アミノ酸配列、配列番号１６）、  アミノ酸１２位に突然変異（ＡｓｎからＬｙｓ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｎ１２Ｋ（ヌクレオチド配列、配列番号１７）、  アミノ酸１２位でＳＴ中に突然変異（ＡｓｎからＬｙｓ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｎ１２Ｋ（アミノ酸配列、配列番号１８）、ｉｐａ欠失突然変異体株を確認するための順方向対照ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｃｏ１（配列番号１９）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を確認するための逆方向対照ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｃｏ２（配列番号２０）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｐＫＤ１（配列番号２１）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｐＫＤ２（配列番号２２）、  侵入プラスミドから除去されるｉｐａＢおよびｉｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列  ｉｐａＢＣ（配列番号２３）。染色体から侵入プラスミドに移植されるｐｐａ遺伝子のヌクレオチド配列  赤痢菌属ｐｐａ遺伝子（配列番号２４）。  ｐｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｐＫＤ−Ｆ（配列番号２５）  ｐｐａ欠失突然変異体株を生成するための逆方向ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｐＫＤ−Ｒ（配列番号２６）  ｐｐａ欠失突然変異体株を確認するための順方向対照ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｋｏ１（配列番号２７）  ｐｐａ欠失突然変異体株を確認するための逆方向対照ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｋｏ２（配列番号２８）  柔軟なフォールディングのため、ＬＴ−ＢおよびｍＳＴの間に挿入されるリンカーペプチド  ＧＧＧＧＳ（配列番号２９）
【図７−３】配列  アミノ酸１３位に突然変異（ＰｒｏからＰｈｅ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＰ−Ｐ１３Ｆ（ヌクレオチド配列、配列番号１１）、  アミノ酸１３位でＳＴ中に突然変異（ＰｒｏからＰｈｅ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＰ−Ｐ１３Ｆ（アミノ酸配列、配列番号１２）、  アミノ酸１３位に突然変異（ＰｒｏからＧｌｙ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｐ１３Ｇ（ヌクレオチド配列、配列番号１３）、  アミノ酸１３位でＳＴ中に突然変異（ＰｒｏからＧｌｙ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｐ１３Ｇ（アミノ酸配列、配列番号１４）、  アミノ酸１２位に突然変異（ＡｓｎからＡｒｇ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｎ１２Ｒ（ヌクレオチド配列、配列番号１５）、  アミノ酸１２位でＳＴ中に突然変異（ＡｓｎからＡｒｇ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｎ１２Ｒ（アミノ酸配列、配列番号１６）、  アミノ酸１２位に突然変異（ＡｓｎからＬｙｓ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｎ１２Ｋ（ヌクレオチド配列、配列番号１７）、  アミノ酸１２位でＳＴ中に突然変異（ＡｓｎからＬｙｓ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｎ１２Ｋ（アミノ酸配列、配列番号１８）、ｉｐａ欠失突然変異体株を確認するための順方向対照ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｃｏ１（配列番号１９）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を確認するための逆方向対照ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｃｏ２（配列番号２０）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｐＫＤ１（配列番号２１）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｐＫＤ２（配列番号２２）、  侵入プラスミドから除去されるｉｐａＢおよびｉｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列  ｉｐａＢＣ（配列番号２３）。染色体から侵入プラスミドに移植されるｐｐａ遺伝子のヌクレオチド配列  赤痢菌属ｐｐａ遺伝子（配列番号２４）。  ｐｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｐＫＤ−Ｆ（配列番号２５）  ｐｐａ欠失突然変異体株を生成するための逆方向ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｐＫＤ−Ｒ（配列番号２６）  ｐｐａ欠失突然変異体株を確認するための順方向対照ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｋｏ１（配列番号２７）  ｐｐａ欠失突然変異体株を確認するための逆方向対照ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｋｏ２（配列番号２８）  柔軟なフォールディングのため、ＬＴ−ＢおよびｍＳＴの間に挿入されるリンカーペプチド  ＧＧＧＧＳ（配列番号２９）
【図７−４】配列  アミノ酸１３位に突然変異（ＰｒｏからＰｈｅ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＰ−Ｐ１３Ｆ（ヌクレオチド配列、配列番号１１）、  アミノ酸１３位でＳＴ中に突然変異（ＰｒｏからＰｈｅ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＰ−Ｐ１３Ｆ（アミノ酸配列、配列番号１２）、  アミノ酸１３位に突然変異（ＰｒｏからＧｌｙ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｐ１３Ｇ（ヌクレオチド配列、配列番号１３）、  アミノ酸１３位でＳＴ中に突然変異（ＰｒｏからＧｌｙ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｐ１３Ｇ（アミノ酸配列、配列番号１４）、  アミノ酸１２位に突然変異（ＡｓｎからＡｒｇ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｎ１２Ｒ（ヌクレオチド配列、配列番号１５）、  アミノ酸１２位でＳＴ中に突然変異（ＡｓｎからＡｒｇ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｎ１２Ｒ（アミノ酸配列、配列番号１６）、  アミノ酸１２位に突然変異（ＡｓｎからＬｙｓ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｎ１２Ｋ（ヌクレオチド配列、配列番号１７）、  アミノ酸１２位でＳＴ中に突然変異（ＡｓｎからＬｙｓ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｎ１２Ｋ（アミノ酸配列、配列番号１８）、ｉｐａ欠失突然変異体株を確認するための順方向対照ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｃｏ１（配列番号１９）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を確認するための逆方向対照ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｃｏ２（配列番号２０）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｐＫＤ１（配列番号２１）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｐＫＤ２（配列番号２２）、  侵入プラスミドから除去されるｉｐａＢおよびｉｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列  ｉｐａＢＣ（配列番号２３）。染色体から侵入プラスミドに移植されるｐｐａ遺伝子のヌクレオチド配列  赤痢菌属ｐｐａ遺伝子（配列番号２４）。  ｐｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｐＫＤ−Ｆ（配列番号２５）  ｐｐａ欠失突然変異体株を生成するための逆方向ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｐＫＤ−Ｒ（配列番号２６）  ｐｐａ欠失突然変異体株を確認するための順方向対照ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｋｏ１（配列番号２７）  ｐｐａ欠失突然変異体株を確認するための逆方向対照ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｋｏ２（配列番号２８）  柔軟なフォールディングのため、ＬＴ−ＢおよびｍＳＴの間に挿入されるリンカーペプチド  ＧＧＧＧＳ（配列番号２９）
【図７−５】配列  アミノ酸１３位に突然変異（ＰｒｏからＰｈｅ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＰ−Ｐ１３Ｆ（ヌクレオチド配列、配列番号１１）、  アミノ酸１３位でＳＴ中に突然変異（ＰｒｏからＰｈｅ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＰ−Ｐ１３Ｆ（アミノ酸配列、配列番号１２）、  アミノ酸１３位に突然変異（ＰｒｏからＧｌｙ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｐ１３Ｇ（ヌクレオチド配列、配列番号１３）、  アミノ酸１３位でＳＴ中に突然変異（ＰｒｏからＧｌｙ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｐ１３Ｇ（アミノ酸配列、配列番号１４）、  アミノ酸１２位に突然変異（ＡｓｎからＡｒｇ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｎ１２Ｒ（ヌクレオチド配列、配列番号１５）、  アミノ酸１２位でＳＴ中に突然変異（ＡｓｎからＡｒｇ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｎ１２Ｒ（アミノ酸配列、配列番号１６）、  アミノ酸１２位に突然変異（ＡｓｎからＬｙｓ）を含み、それとともにｅｌｔＡＢプロモーターおよび終結配列を含む、ＳＴをコードするＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質の遺伝子  ＧＳ−Ｎ１２Ｋ（ヌクレオチド配列、配列番号１７）、  アミノ酸１２位でＳＴ中に突然変異（ＡｓｎからＬｙｓ）を含む、ＬＴ−Ｂ／ｍＳＴ融合タンパク質  ＧＳ−Ｎ１２Ｋ（アミノ酸配列、配列番号１８）、ｉｐａ欠失突然変異体株を確認するための順方向対照ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｃｏ１（配列番号１９）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を確認するための逆方向対照ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｃｏ２（配列番号２０）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｐＫＤ１（配列番号２１）、  ｉｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｉｐａ  ｐＫＤ２（配列番号２２）、  侵入プラスミドから除去されるｉｐａＢおよびｉｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列  ｉｐａＢＣ（配列番号２３）。染色体から侵入プラスミドに移植されるｐｐａ遺伝子のヌクレオチド配列  赤痢菌属ｐｐａ遺伝子（配列番号２４）。  ｐｐａ欠失突然変異体株を生成するための順方向ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｐＫＤ−Ｆ（配列番号２５）  ｐｐａ欠失突然変異体株を生成するための逆方向ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｐＫＤ−Ｒ（配列番号２６）  ｐｐａ欠失突然変異体株を確認するための順方向対照ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｋｏ１（配列番号２７）  ｐｐａ欠失突然変異体株を確認するための逆方向対照ＰＣＲプライマー  ｐｐａ  ｋｏ２（配列番号２８）  柔軟なフォールディングのため、ＬＴ−ＢおよびｍＳＴの間に挿入されるリンカーペプチド  ＧＧＧＧＳ（配列番号２９）
【図８】ｒｆｂＦ遺伝子が欠失される染色体領域のＰＣＲ増幅。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＷＴ：野生型シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ、隣接領域を含むｒｆｂＦ遺伝子、１１００ｂｐ断片；ｍｔ：ΔｒｆｂＦ突然変異体、クロラムフェニコール遺伝子での遺伝子置換、１３００ｂｐ。
【図９】ｉｐａＣおよびｉｐａＢ遺伝子を欠失させた侵入プラスミド領域のＰＣＲ増幅。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＷＴ：野生型シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ、隣接領域を含むｉｐａＢおよびｉｐａＣ遺伝子、１６００ｂｐ断片；ｍｔ：ΔｉｐａＢＣ突然変異体侵入プラスミド、カナマイシン遺伝子での遺伝子置換、２５７０ｂｐ。
【図１０−１】Ａ．必須遺伝子Ｐｐａ、ＬＴＢ−ｍＳＴ融合タンパク質およびカナマイシン耐性タンパク質をコードする多遺伝子構築物の構造。ＬＴＢ−ｍＳＴ融合タンパク質の発現は、ＬＴＡプロモーターによって駆動され、そして転写はＬＴＢターミネーターで終結する。解毒性ＳＴ突然変異（Ｐ１３Ｆ、Ｐ１３Ｇ、Ｎ１２Ｒ、Ｎ１２Ｋ）を含む４つの構築物のＬＴＢ−ＳＴアミノ酸配列を示す（突然変異コドンを下線で示す）。略語：ＣＳ：クローニング部位；Ｈ１およびＨ２：相同組換えを補助する侵入プラスミド上の相同領域１および２；ｐｐａ：無機ピロホスファターゼ遺伝子；ｐｒｏ：プロモーター；ｔｅｒｍ：ターミネーター；ＧＧＧＧＳ：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２９）ＬＴＢおよびｍＳＴの間の５アミノ酸リンカー；ｋａｎ：カナマイシン耐性遺伝子。
【図１０−２】Ｂ．赤痢菌属侵入プラスミド内へのＥＴＥＣ遺伝子の挿入。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＷＴ：野生型シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ、侵入プラスミド遺伝子間領域、４５０ｂｐ断片；ｍｔ：ＬＴ−Ｂ＋ＳＴｍ遺伝子突然変異体侵入プラスミド、カナマイシン遺伝子での遺伝子置換、２８００ｂｐ。  Ｃ．ＬＴＢを検出するためのイムノブロット分析。組換え体ＬＴ−Ｂ、ならびに大腸菌および赤痢菌属培養上清分画（分泌されたタンパク質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、タンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーし、そして抗ＬＴＢモノクローナル抗体で検出した。レーン１：野生型シゲラ・フレックスネリ（陰性対照）；レーン２：侵入プラスミド中に融合遺伝子を所持するシゲラ・フレックスネリ；レーン３：図１０Ａに示すような合成構築物を含有するｐＧＥＴベクターで形質転換されたＤＨ５α大腸菌；レーン４：ＬＴを発現するＥＴＥＣ株（陽性対照）。
【図１１】操作されたｒｆｂＦおよびｉｐａＣ／ｉｐａＢ組み合わせ突然変異を含むシゲラ・フレックスネリ２ａワクチン株によって誘導される異種防御。５匹のマウスの群を、致死量未満の用量の野生型株シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ（５ｘ１０５ｃｆｕ／マウス）またはその同質遺伝子的欠失突然変異体２４５７ＴΔｒｆｂ、２４５７ＴΔｉｐａＢＣ、２４５７ＴΔｒｆｂΔｉｐａＢＣ（すべて１０８ｃｆｕ／マウス）のいずれかで鼻内免疫するか、あるいはＰＢＳ緩衝液で偽免疫した。２週間間隔で、３回の同一の免疫を行った。最後の追加免疫の１週間後、マウスを致死用量のＳ．ソネイ株（２ｘ１０６ｃｆｕ／マウス）に曝露した。動物の生存を毎日監視した。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本明細書全体で用いられる特定の用語は、以下の意味を有する。
【００５３】
用語「弱毒化」は、本明細書において、もはや疾患を引き起こすことが可能ではない、すなわち修飾された株が非病原性であるように、修飾されている、赤痢菌属の病原性株を記載する。弱毒化赤痢菌属に関する用語「生」は、本明細書において、増殖し、そして再生することが可能な赤痢菌属を記載する。したがって、本発明の生存赤痢菌属株は、弱毒化生ワクチン中で用いられ、そして特に、被験体の結腸にコロニー形成することが可能であるが、経腸または下痢性病原体によって引き起こされる経腸疾患に関連する臨床的症状を引き起こさない。さらに、本発明の生株は、特に、ワクチン接種された被験体において、限定された複製、および赤痢菌属の病原性株に対して防御性である防御免疫反応の誘導が可能である。本発明の弱毒化細菌を遺伝子操作して、天然細菌によっては発現されない異種抗原を発現させることも可能であり、したがって、弱毒化細菌は、異種抗原のキャリアーとして働く。
【００５４】
本発明にしたがって用いる用語「抗原」は、特に、任意の抗原決定基を指すものとし、これは、おそらく、抗体の結合部位によって認識されうる。特に好ましい抗原は、免疫学的にまたは療法的に適切であることがすでに証明されているかまたは適切であることが可能である分子または構造、特に臨床的有効性が試験されているものである。該用語は、本明細書において、特に、免疫的にアクセス可能であり、そして免疫的に適切なエピトープを含む抗原、特に１またはそれより多い種または血清型に見られる保存抗原より選択される分子または構造を含むものとする。免疫的にアクセス可能なエピトープは、典型的には、細胞表面上に発現される抗原によって提示されるかまたはこうした抗原中に含まれる。用語「防御抗原」は、本明細書において、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫反応を誘発し、したがって抗原に対する中和抗体を誘導する抗原を指すものとする。これは、抗原での能動免疫に際して、有効な防御を提供する。細胞性および体液性免疫反応の両方を誘発する本質的な能力のため、タンパク質抗原が好ましい抗原である。
【００５５】
用語「異種性」は、本明細書において、抗原に関して特に用いられ、そして前記異種抗原を発現する細胞に対して外来性である（ｆｏｒｅｉｇｎ）抗原と理解される。赤痢菌属細胞または株に関して、該用語は、特に、赤痢菌属細胞または株のそれぞれに外来性である抗原を指す。したがって、こうした異種性または外来性抗原は、野生型細胞または株において発現されないが、前記抗原をコードする異種遺伝子を含む組換え型によって発現されるであろう。それによって、前記組換え細胞または株は、前記異種抗原を、例えば細胞表面上に発現するであろう。本発明の細胞を遺伝子操作して、異種抗原、例えば非毒性構成要素あるいはＬＴおよび／またはＳＴまたはＳＴｍの型を発現させることも可能である。こうした細胞は、異種抗原ならびに天然抗原に対する免疫反応を誘導し、そしてしたがって、ワクチンによって提供される防御を改善する。
【００５６】
抗原に関する用語「交差反応性」は、本明細書において、例えば同じ種の異なる血清型または異なる細菌種を含む、異なる病原体間で共有されるエピトープを持つ抗原を意味するものとする。交差反応性抗原は、典型的には保存された構造である。交差反応性エピトープは、異なる病原体によって発現される同じ抗原から、またはそうでなければ類似の構造を持つ異なる抗原から生じうる。
【００５７】
特定の交差反応性抗原は、交差反応性抗体、例えば抗血清の抗体、単離抗体または組換え抗体によって認識される。こうした交差反応性抗体は、異なる病原体の交差反応性抗原を認識しうる。特定の交差反応性抗体は中和抗体である。
【００５８】
「交差防御性」ワクチンまたは免疫反応は、反応を誘発するために用いたものとは同一でない、少なくとも１つの異なる病原体、例えば異なる種または血清型による感染に対して防御するものと理解される。交差防御有効性は、典型的には、異なる病原体に曝露されている被験体由来の異なる抗血清を用いて試験可能である。
【００５９】
交差反応性抗原が交差防御免疫を誘導するように設計する際、例えば免疫反応を誘発する１つの病原体に由来する交差反応性抗原で動物を免疫し、そして反応を誘発するために用いたものとは異なる少なくとも１つの病原体に動物を曝露することによって、該交差反応性抗原を動物モデルにおいて試験することも可能である。例えば、交差反応性抗原を持つ１より多い赤痢菌属血清型または他の腸管侵入性細菌、例えば大腸菌に対するこうした交差防御免疫は、異なる個体の細菌の種内の別個の変動、例えば亜種レベルの変動に対する防御を指す。共通の抗原を持つ血清型（ｓｅｒｏｖａｒ）群は血清群または血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）とも呼ばれる。
【００６０】
広域、例えば多株および／または多血清型および／または多種赤痢菌属ワクチンの開発の基礎は、赤痢菌属血清型に普及している交差反応性抗原の同定である。これには特に、ヒト感染に関連する単離体が含まれる。
【００６１】
多価ワクチンが、異なる病原体に対する交差防御免疫を誘導するように設計する際、典型的には、いくつかの抗原、例えば異なる病原体由来の個々の抗原によって、免疫反応を誘発する。例えば、こうした多価ワクチンは、異なる種由来の、例えば赤痢菌属およびエシェリキア属由来の少なくとも２つの異なる防御抗原に基づいてもよいが、また、他の細菌、ウイルス、真菌または寄生虫抗原に基づいてもよい。例えば、免疫反応を誘発する少なくとも２つの異なる病原体由来の異なる防御抗原を含むワクチンで動物を免疫し、そして病原体の１つ、２つまたはそれより多くに動物を曝露することによって、動物モデルにおいて交差防御性多価ワクチンを試験してもよい。
【００６２】
本発明にしたがって用いられる、特定の弱毒化赤痢菌属細菌に基づく多種ワクチン候補の開発の基礎は、防御抗原が、防御が求められる異なる病原性種において広く行き渡っている、一連の異なる血清型に取り組むように交差反応性であるかまたはないかいずれかを同定することである。
【００６３】
用語「経腸（ｅｎｔｅｒａｌ）」はまた「腸内（ｅｎｔｅｒｉｃ）」としても知られ、本明細書において、特に疾患または病原体に関連付けられる際、腸に関連するかまたは腸に影響を及ぼす疾患状態または病原体、例えば赤痢または下痢性疾患を指すものとする。特に、こうした経腸疾患は、結腸の感染性疾患を指す。特定の症状には、血性粘膜充填性下痢；腹痛；発熱および体液喪失が含まれる。下痢性疾患は、１日３回またはそれを越える軟便または液状便、あるいはその人にとって正常であるより多い排便を生じる状態を指す。経腸病原体は、前記病原体に罹患した際、または毒素、特にエンテロトキシンでの被験体の中毒に際してのいずれかで、被験体において経腸疾患を引き起こすと理解される。
【００６４】
感染性経腸疾患、例えば赤痢または下痢には多くの原因があり、これにはウイルス、細菌、真菌および寄生虫が含まれる。例は以下のように提供される：ノロウイルスは、成人におけるウイルス性下痢の最も一般的な原因であるが、ロタウイルスは、５歳未満の小児において最も一般的な原因である。アデノウイルス４０および４１型、ならびにアストロウイルスは、かなりの数の感染を引き起こす。細菌、カンピロバクター属は、細菌性赤痢または下痢の一般的な原因であるが、サルモネラ属、赤痢菌属、および大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のいくつかの株による感染は、ある地方において頻繁である。高齢者において、特に関連しない感染に対して抗生物質で治療されている高齢者においては、クロストリジウム・ディフィシレによって産生される毒素はしばしば、重度の下痢を引き起こす。寄生虫の例には、慢性感染を引き起こしうるランブル鞭毛虫、および赤痢アメーバが含まれる。本発明のワクチンが取り組む可能性がある例示的な経腸疾患は、細菌性赤痢およびＥＴＥＣ関連下痢である。
【００６５】
用語「内因性」は、本明細書において、プラスミドに関して、特定の宿主細胞で生じるプラスミドを意味するものとする。内因性プラスミドを遺伝子操作して、組換え内因性プラスミドを得ることも可能であり、例えば組換え技術によって、プラスミドをｉｎ  ｓｉｔｕで、すなわち天然内因性プラスミドを宿する宿主細胞内で操作することも可能であるし、あるいは宿主細胞から除去した際、該プラスミドを実験室操作に供し、そして次いで同じタイプの宿主細胞内に再導入してもよい。赤痢菌属の侵入性表現型は、侵入プラスミド、あるいは天然または内因性侵入プラスミドとも呼ばれる内因性２２０ｋｂ病原性プラスミドによって特に与えられる。赤痢菌属の内因性侵入プラスミドは、特に、組換え目的のため、単離された侵入プラスミドとして、またはｉｎ  ｓｉｔｕ組換えのため、本発明にしたがって提供される。
【００６６】
用語「必須の」は、本明細書において、遺伝子に関して、生物が生存するために、例えば細菌細胞が複製するために必要な遺伝子を指すと理解される。必須遺伝子の突然変異、例えば欠失および／または不活性化は、致死表現型または複製不能細胞を生じるであろう。赤痢菌属の必須遺伝子を突然変異させて、赤痢菌属染色体の遺伝子（単数または複数）を欠失させ、そしてさらに、該遺伝子（単数または複数）を侵入プラスミド内に取り込んで、侵入プラスミドを安定化させることも可能である。これによって、安定した組換え内因性侵入プラスミドを含む赤痢菌属の培養が提供される。赤痢菌属の必須遺伝子の中には、ｐｐａ、ａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｄａｐＥ、ｅｒａ、ｆｒｒ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＺ、ｉｎｆＡ、ｌｇｔ、ｌｐｘＣ、ｍｓｂＡ、ｍｕｒＡ、ｍｕｒＩ、ｎａｄＥ、ｐａｒＣ、ｐｒｏＳ、ｐｙｒＢ、ｒｐｓＢ、ｔｒｍＡ、ｒｈｏおよびｒｈｏＬ遺伝子が含まれる。
【００６７】
本明細書において、遺伝子の「不活性化」は、常に、遺伝子の一過性、誘導性または恒常的下方調節を指し、したがって、遺伝子産物の発現を減少させるかまたは阻害するものを指すと理解される。これは、特に、遺伝子または該遺伝子に機能可能であるように連結されている制御配列、例えば遺伝子の発現を制御するプロモーター、エンハンサー等の突然変異によって行われてもよい。不活性化突然変異の中には、ポリヌクレオチドまたは遺伝子、例えば病原性因子をコードする遺伝子の発現の減少または抑制を生じるか、あるいはそれぞれの非機能性タンパク質、例えば非機能性病原性因子の発現を導くものがある。
【００６８】
用語「侵入性」または「非侵入性」は、本明細書において、遺伝子に関して、以下のように理解される。侵入性病原性細菌は、真核細胞に侵入可能である。例えば、侵入後、赤痢菌属は細胞内で増殖し、そして隣接する上皮細胞に拡散し、組織破壊および細菌性赤痢に特徴的な病態を生じる。赤痢菌属の侵入性を仲介する遺伝子の中には、例えば侵入プラスミド抗原をコードするｉｐａ遺伝子がある。こうした遺伝子の少なくとも１つの欠失および／または不活性化は、非侵入性赤痢菌属を導きうる。
【００６９】
Ｓｅｒｅｎｙ試験は、赤痢菌属または大腸菌などの生物の侵入性を決定するための標準的な試験である（Ｗｏｏｄら  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２４：４９８−５００，  １９８６）。これは、細菌懸濁物をモルモットの目に接種することによって行われる。重度の粘液膿性結膜炎および重度の角膜炎が陽性試験を示す。
【００７０】
用語「単離された」または「単離」は、本明細書において、核酸に関して、そして特にベクター、プラスミドおよび特に赤痢菌属の侵入プラスミドに関して、「実質的に純粋な」形で存在するように、天然に関連している環境から十分に分離されている化合物を指すものとする。用語「実質的に純粋な」または「精製された」は、本明細書において、化合物、例えば核酸分子またはプラスミドの少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を含む調製物を指すものとする。純度は、その化合物に適した方法（例えばクロマトグラフィ法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析等）によって測定される。
【００７１】
「単離された」は、必ずしも他の化合物または物質との人工的または合成混合物、あるいは原理的活性に干渉せず、そして例えば不完全な精製のために存在しうる不純物の存在の排除を意味しない。特に、本発明の単離された核酸分子はまた、化学的に合成されたものが含まれると意味される。
【００７２】
本発明の単離された侵入プラスミドに関して、この用語は、生じた細胞質から分離されたプラスミドを指す。「単離されたプラスミド」は、生物学的または合成手段によって直接産生され、そして産生中に存在する他の構成要素から分離されたプラスミドをさらに示すことも可能である。
【００７３】
用語「突然変異誘発」は、本明細書において、遺伝子に関して、突然変異遺伝子を得るための、遺伝配列の突然変異、特に少なくとも１つのヌクレオチドの任意の欠失、置換、挿入、あるいはこれらの任意の組み合わせを意味するものとする。これは、特に、遺伝子全体（単数または複数）またはその有意な部分、例えば遺伝子の少なくとも５０％の欠失を指すものとする。用語「突然変異誘発」および「突然変異」は、本明細書において、交換可能に用いられる。
【００７４】
用語「ラフ」は、グラム陰性細菌、例えば赤痢菌属に関して、スムースでないものを意味し、そして特に、「穏やかにラフ」（すなわちＯ抗原合成下方制御）または「極度に（ｄｅｅｐ−）ラフ」な細菌も含むものとする。用語「ラフ」には、本明細書において、不規則なコロニー形態などの特徴が含まれてもよく、そして例えば波状のおよび／または多葉状の形態が含まれてもよい。該用語は、特に、株がＯ多糖を産生不能であり、そして／または実質的に産生不能であることを意味する。ＬＰＳ内に含まれる反復グリカンポリマーは、Ｏ抗原、Ｏ多糖、または細菌のＯ鎖（Ｏ側鎖）と称される。Ｏ抗原は、コアオリゴ糖に付着し、そしてＬＰＳ分子の最外部のドメインを含む。Ｏ鎖の存在または非存在は、ＬＰＳがラフまたはスムースと見なされるかを決定する。改変されたＯ抗原構造を有する細菌株は、寒天プレート上で増殖した際、その外見をスムースからダル（ｄｕｌｌ）に変化させる。全長Ｏ鎖は、ＬＰＳをスムースにし、一方、Ｏ鎖の非存在または減少はＬＰＳをラフにする。「スムース」細菌には、完全コアおよびＯ抗原が含まれる。「ラフ」細菌には、ＬＰＳ  Ｏ抗原の欠如が含まれ、これは、Ｏ抗原がないかまたはＯ抗原の鎖の長さが減少しているか、またはスムースＬＰＳ鎖の数が減少していることを意味する。用語「穏やかにラフ」は、Ｏ抗原の鎖の長さが減少しているかまたはスムースＬＰＳ鎖の数が減少しているラフ細菌の下位群を指す。「極度にラフ」な細菌は、ＬＰＳコアの一部を失い、その結果、やはりＯ抗原を欠いている。
【００７５】
用語「ＬＰＳ  Ｏ抗原の欠如」は、本明細書において、ラフ赤痢菌属に関して、標準アッセイにおいて決定した際、ＬＰＳ  Ｏ抗原が５０％未満、または４０％未満、または３０％未満、または２０％未満、または１０％未満であるか、あるいはＬＰＳ  Ｏ抗原が本質的にないかまたはないことを特に指すものとする。
【００７６】
標準試験を用いて、株のラフ特性を決定することも可能である。
【００７７】
例えば、ＬＰＳ突然変異体の表現型を、例えばＬＰＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離および銀染色または血清型特異的免疫血清を用いた凝集試験によって決定してもよい。
【００７８】
ラフ赤痢菌属を、弱毒化によって、例えば少なくとも１つの遺伝子またはその有意な部分の突然変異によって、例えば欠失および／または不活性化によって、産生してもよく、こうした遺伝子はＬＰＳ合成、輸送および／または発現に関与するものであり、好ましくは、ｒｆｂオペロンのクラスター中の遺伝子、あるいはＯ抗原合成をコードするｒｆｂ/ｗｂｂ遺伝子クラスター内の１またはそれより多い遺伝子、Ｏ抗原リガーゼをコードするｗａａＬ、Ｏ抗原輸送に関与するＯ抗原フリッパーゼをコードするｗｚｘ、Ｏ抗原重合に関与するｗｚｙ/ｒｆｃ、ＬＰＳ−コア合成をコードするｒｆａ／ｗａａ遺伝子クラスター内の遺伝子、Ｏ抗原発現に影響を及ぼす制御遺伝子、例えばｒｆａＨ、あるいはＯ抗原発現の少なくとも９０％の減少を生じる機能喪失型（単数または複数）からなる群より選択される。
【００７９】
ＬＰＳ糖合成に関与する遺伝子の特定の例は、ｒｆｂＡ、Ｂ、ＤおよびＣである。
【００８０】
ＬＰＳ糖トランスフェラーゼに関与する遺伝子の特定の例は、ｒｆｂＦおよびＧである。
【００８１】
ＬＰＳ  Ｏ抗原ポリメラーゼに関与する遺伝子の特定の例は、ｒｆｃ／ｗｚｙである。
【００８２】
ｒｆｂオペロンのクラスターは、染色体上または侵入プラスミド（シゲラ・ソネイ）上のいずれかに位置する。このクラスター中の特定の遺伝子はｒｆｂＦ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｊおよび／またはＩ遺伝子である。
【００８３】
本明細書において、用語「組換え体」は、宿主細胞に天然には存在しない分子または構築物を指す。いくつかの態様において、組換え核酸分子は、天然には存在しない方式でともに連結される、２またはそれより多い天然存在配列を含有する。組換えタンパク質は、組換え核酸によってコードされ、そして／または発現されるタンパク質を指す。いくつかの態様において、「組換え細胞」は、細胞の天然（すなわち非組換え）型内の同一の型には見られない遺伝子を発現し、そして／またはそうでなければ意図的なヒト介入のために、異常に過剰発現され、過少発現され、そして／またはまったく発現されていない天然遺伝子を発現する。組換え細胞は、少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。「組換え」、「組み換える」そして「組み換えられた」核酸の生成は、一般的に、少なくとも２つの核酸断片の組み立てを含む。特定の態様において、組換えタンパク質および組換え核酸は、機能するままであり、すなわち宿主細胞において、その活性を保持するかまたは増進した活性を示す。いかなる場合も、弱毒化細菌、例えば本発明の弱毒化赤痢菌属は組換え細胞と見なされる。本明細書において、核酸構築物、例えばプラスミドまたはベクター、核酸（例えばポリヌクレオチド）、ポリペプチド、または宿主細胞は、非天然存在、人工的または操作されている場合、「組換え体」と呼ばれる。赤痢菌属の組換え侵入プラスミドは、特に、１つ、２つまたはそれより多いポリヌクレオチドまたは遺伝子の特定の欠失および／または不活性化、例えば侵入プラスミド抗原をコードする遺伝子の少なくとも１つの欠失を取り込み、そして／または１またはそれより多い異種遺伝子、例えば防御抗原をコードする遺伝子をさらに含むよう操作されている。
【００８４】
赤痢菌属の「安定な」組換え侵入プラスミドは、細胞培養において、プラスミドを維持するよう選択された条件下で、赤痢菌属細胞培養中、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９０％より多い保持を示す赤痢菌属プラスミドである。赤痢菌属の安定な組換え侵入プラスミドの特定の例は、染色体遺伝子座に位置する必須遺伝子を欠失させ、そして／または不活性化させるように突然変異され、そして該遺伝子が侵入プラスミドの遺伝子座に組み込まれている、組換え赤痢菌属宿主細胞を指す。侵入プラスミドを含まない赤痢菌属は増殖せずまたは複製しないであろうが、内因性侵入プラスミドを所持する赤痢菌属は、ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖し、そして複製することが可能であろう。
【００８５】
本明細書において、用語「ベクター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、例えば外来（異種）遺伝子を宿主細胞内に導入し、宿主を形質転換して、そして導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進することが可能であるビヒクルを指す。プラスミドは、本発明の好ましいベクターであり、特に赤痢菌属の侵入プラスミドが好ましく、これには特に、内因性侵入プラスミドが含まれる。
【００８６】
ベクターは、典型的には、伝達性作用因子のＤＮＡを含み、このベクター内に外来ＤＮＡが挿入される。ＤＮＡの別のセグメント内にＤＮＡの１つのセグメントを挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（ヌクレオチドの特定の群）でＤＮＡを切断する、制限酵素と呼ばれる酵素の使用を伴う。「カセット」は、定義された制限部位でベクター内に挿入可能な発現産物をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡのセグメントを指す。カセット制限部位は、適切な読み枠でのカセットの挿入を確実にするよう設計される。一般的に、外来ＤＮＡをベクターＤＮＡの１またはそれより多い制限部位で挿入し、そして次いで、外来ＤＮＡは、伝達性ベクターＤＮＡとともに、宿主細胞内に運ばれる。挿入または付加ＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列、例えば発現ベクターはまた、「ＤＮＡ構築物」とも称されうる。ベクターの一般的なタイプは、「プラスミド」であり、これは一般的に、通常は細菌起源の、二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子であり；さらなる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れ可能であり、そして適切な宿主細胞内に容易に導入可能である。
【００８７】
本発明の赤痢菌属は、好ましくは、１またはそれより多い異種遺伝子を発現するベクターとして用いられる、組換え内因性侵入プラスミドを含む。したがって、好ましい態様にしたがって、赤痢菌属は、「非人工的ベクター」株であり、これは、この株が、任意の（組換え）内因性プラスミドに加えて、人工的なプラスミドを含まない株であることを意味する。
【００８８】
プラスミドベクターは、しばしば、コードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有し、そして外来ＤＮＡを挿入するのに適した１またはそれより多い制限部位を有する。コードＤＮＡは、特定のタンパク質または酵素の特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始するか、制御するか、あるいはそうでなければ仲介するかまたは調節するＤＮＡの配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来であってもまたは異なる遺伝子由来であってもよく、そして同じまたは異なる生物に由来してもよい。組換えクローニングベクターには、しばしば、クローニングまたは発現のため、１またはそれより多い複製系、宿主における選択、例えば抗生物質耐性のため、１またはそれより多いマーカー、および１またはそれより多い発現カセットが含まれる。用語「発現系」は、例えばベクターに所持され、そして宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のため、適切な条件下での、宿主細胞および適合するベクターを意味する。
【００８９】
したがって、本発明にしたがった弱毒化赤痢菌属は、特に、生ワクチンの開発に用いられる。
【００９０】
弱毒化赤痢菌属は、特に、赤痢菌属種および血清群（血清型）のいずれかの病原性株に由来する。例えば、任意の以下の群である：
・血清群Ａ：Ｓ．ディセンテリエ（１２血清型）
・血清群Ｂ：Ｓ．フレックスネリ（１５血清型および下位血清型）
・血清群Ｃ：Ｓ．ボイディー（１８血清型）
・血清群Ｄ：Ｓ．ソネイ（１血清型）
病原性赤痢菌属株は、本明細書において、弱毒化の目的のため、臨床的に知られる病原性株または病原性因子を含有すると同定される株であることも可能である。特に、株は、Ｓ．フレックスネリ、Ｓ．ソネイ、Ｓ．ディセンテリエおよびＳ．ボイディー、特にＳ．フレックスネリ２ａ、例えばＳ．フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ（ＡＴＣＣ  ７００９３０、ＤＮＡ＝７００９３０Ｄ−５）、またはＣＩＰ  １０７６５９（パスツール研究所、フランス）のいずれかより選択される。
【００９１】
病原性赤痢菌属株は、当該技術分野に知られる方法によって修飾可能であり、これには、生じた株が弱毒化され、特に非病原性であり、被験体において疾患を引き起こすことが不可能であるような、多数回の連続継代、温度感受性弱毒化、突然変異等が含まれる。
【００９２】
いくつかの態様において、病原性株に対する修飾は、病原性因子をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現の減少または抑制を含む遺伝子の欠失および／または不活性化を生じるか、あるいは非機能性病原性因子の発現を導く。
【００９３】
弱毒化突然変異を得るため、例えばポリヌクレオチド発現を減少させるかまたは無効にするため、当該技術分野に周知の多くの技術がある。例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて、あらかじめ決定した部位、例えばプロモーター領域に、またはナンセンス突然変異を生じるためにコード配列内に突然変異を導入してもよい。組換えＤＮＡ技術は、関心対象の遺伝子のクローニング、部位特異的突然変異誘発による遺伝子配列の修飾、制限酵素消化後、再連結、およびそれに続く突然変異遺伝子での野生型遺伝子の置換を含む。
【００９４】
適切な標準組換えＤＮＡ技術が当該技術分野に知られ、そしてとりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（１９８９），  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）に記載される。
【００９５】
野生型遺伝子のＤＮＡ配列を、ベクター、例えばプラスミド内にクローニングし、場合によってクローニングしたＤＮＡ配列内に選択可能マーカー遺伝子を挿入するか、またはＤＮＡ配列の一部を欠失させて不活性化を生じる工程を含む、当該技術分野に周知の方法を使用して、弱毒化突然変異を実行してもよい。欠失は、例えば、コード配列中またはコード配列のすぐ外の２点で切断する制限酵素を用いてＤＮＡ配列を切断し、そして残りの配列中で、２つの端をともに連結することによって、欠失を導入することも可能である。あるいは、ターゲット遺伝子の隣接領域を別個に増幅し、そして別個の重複ＰＣＲ反応において、直接一緒に連結して、介在するターゲット配列を省いた突然変異体アレルを構築することも可能である。エレクトロポレーション化学形質転換またはコンジュゲート化などの既知の技術によって、突然変異ＤＮＡ配列を所持するプラスミドを細菌内に形質転換してもよい。次いで、適切な選択によって、突然変異体を同定することも可能であり、ここで不活性化ＤＮＡ配列は細菌の染色体内に組換えられ、そして野生型ＤＮＡ配列は相同組換えによって機能しなくなる。
【００９６】
さらに、抗生物質耐性遺伝子を用いる場合、該遺伝子は、一般的に、ワクチンにおいて細菌が用いられる前に、細菌から除去される。Ｄａｔｓｅｎｋｏら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ  ９７，  ６６４０−６６４５（２０００））の方法によると、突然変異誘発は、ラムダバクテリオファージＲｅｄ組換え酵素系に基づき、該系は、コードされるプラスミドおよび染色体遺伝子の両方の特異的破壊を可能にする。戦略は、こうした遺伝子を、例えば選択可能抗生物質耐性遺伝子で置換することであり、これは、ターゲットとされる遺伝子に対する４０〜６０ｎｔの相同性伸長を含むプライマーを用いたＰＣＲによって生成される、選択可能抗生物質耐性遺伝子と置換することである。Ｒｅｄに基づく組換えは、これらの相同配列中で仲介される。選択後、抗生物質耐性遺伝子はまた、ＦＬＰ組換え酵素を発現するヘルパーベクターを用いて除去可能であり、該酵素は、抗生物質耐性遺伝子に隣接するＦＲＴ直接反復（ＦＬＰ認識ターゲット）を用いる。
【００９７】
いくつかの態様において、染色体または染色体外ＤＮＡ，例えばプラスミド中のあらかじめ決定した部位に、発現が減少しているかまたは発現がない突然変異遺伝子を生じる、挿入、欠失、または別のものによる１ヌクレオチドの置換、例えば点突然変異を通じて、突然変異を導入することも可能である。突然変異は、赤痢を引き起こす能力が減少している赤痢菌属株を生じるはずである。好ましくは、突然変異は、遺伝子の破壊が核酸の切除によって引き起こされる欠失突然変異である。こうした突然変異は、例えば、塩基対の隣接スパンの欠失によって作製されうる。非常に小さい欠失、例えば１０塩基対ストレッチであっても、遺伝子がタンパク質をコードしないかまたは非機能性タンパク質をコードするようにすることも可能である。１つの単一の塩基対の欠失であっても、こうした突然変異の結果、他の塩基対がもはや正しい読み枠でなくなるか、あるいは転写が阻害されるかまたは減少するため、タンパク質を生じないかまたは非機能性タンパク質を導きうる。より好ましくは、より長いストレッチ、例えば１００塩基対または遺伝子の少なくとも有意な部分、例えば遺伝子の少なくとも５０％が除去される。さらにより好ましくは、遺伝子全体が欠失される。
【００９８】
断片または遺伝子全体の欠失、あるいはその組み合わせを伴う、よく定義され、そして意図的に作製された突然変異は、古典的に誘導された突然変異に比較して、野生型に復帰しないという利点を有する。したがって、本発明のいくつかの態様において、ワクチン株は、生弱毒化赤痢菌株を含み、ここで、病原性因子をコードする遺伝子中の突然変異は、対応するタンパク質が産生されないかまたはタンパク質が非機能性であるように、病原性因子をコードするポリヌクレオチド配列を破壊する欠失または挿入を含む。
【００９９】
弱毒化された赤痢菌属株を操作するために選択される例示的な病原性因子は、ｒｆｂ、ｉｐａＢ、ｉｐａＣまたはａｒｏＣである。
【０１００】
弱毒化は、例えば、１またはそれより多い以下の遺伝子を欠失させ、そして／または不活性化させること、あるいはその（有意な）部分、あるいは前記遺伝子の弱毒化を達成する前記遺伝子の調節因子のいずれかによって引き起こされうる：ｒｆｂ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ｖｉｒＧおよびｉｐａＡ−Ｄ。本発明の好ましい弱毒化赤痢菌属株は、少なくとも３またはそれより多い弱毒化突然変異を含む二重突然変異体または多重突然変異体株である。弱毒化突然変異のためのターゲット遺伝子の好ましい組み合わせには、少なくとも１つのｒｆｂ遺伝子（例えばｒｆｂＦ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｊおよび／またはＩ遺伝子）および少なくとも１つのｉｐａ遺伝子（例えばｉｐａＢ、ｉｐａＣ）が含まれる。
【０１０１】
遺伝子操作から生じる弱毒化突然変異の代替物として、非病原性であるか、あるいは病原性因子をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子中に１またはそれより多いあらかじめ存在する突然変異を含む、赤痢菌属の天然存在株であって、生ワクチン株として使用可能な前記株を同定することもまた可能であろう。これらの天然存在赤痢菌属株は、標準的技術によってひとたび単離されたならば、二重または多重突然変異体株を構築するため、さらなる突然変異誘発または組換えＤＮＡ技術に供されることも可能である。
【０１０２】
病原性因子をコードする遺伝子中に１またはそれより多い突然変異を有する細菌を同定するための技術は、当業者に知られる。したがって、上述の技術によって突然変異している赤痢菌属株の検出のためのルーチンの技術には、本明細書の別の箇所に記載するような、ノーザンおよびウェスタンブロッティング、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよび細胞傷害性アッセイが含まれる。特定の病原性因子をコードする機能性遺伝子をまったく含まない突然変異体株は、標準的技術を使用して、容易に選択可能である。
【０１０３】
弱毒化すべき病原性因子をコードする遺伝子は、プラスミド媒介性であってもよい。したがって、いくつかの態様において、病原性赤痢菌属株に対する修飾は、１またはそれより多い内因性赤痢菌属プラスミドを突然変異させる工程を含む。用語「プラスミド」は、特に、細菌染色体と独立に複製する細胞質ＤＮＡを指す。赤痢菌属病原性または侵入プラスミドの一部の突然変異、あるいはさらにプラスミドの除去もまた想定されうる。しかし、弱毒化赤痢菌株は、なお、内因性侵入プラスミド、より好ましくは安定な侵入プラスミドを含むことが好ましい。これは、不安定株または不安定侵入プラスミドで起こりうる、特に弱毒化細胞による侵入プラスミドの潜在的な喪失、または野生型赤痢菌属由来の（天然）侵入プラスミドの潜在的な取り込みに関して、弱毒化株の安定性を確実にする。
【０１０４】
赤痢菌属侵入プラスミドは、赤痢菌属の大部分の株において内因性である。侵入プラスミドは赤痢菌属株の培養に際して失われうるが、抗原、特に防御抗原をコードする異種遺伝子を取り込むために有用なベクターとして発展させるための魅力的なターゲットにする、高レベルの安定性を示す組換え体を得るように操作することも可能である。
【０１０５】
本明細書で後述する実施例において得られる本発明の組換え侵入プラスミドは、図５および１０Ａに示すような特徴を有する。
【０１０６】
本発明のプラスミドには、赤痢菌属において自律性に複製可能なその誘導体が含まれる。こうした誘導体は、侵入に関与する領域以外の部分が除去されている侵入プラスミドに対応するもの、あるいは一部に別の（異種性）ＤＮＡ配列が挿入されている侵入プラスミドに対応するものであることも可能である。それによって、赤痢菌属中で自律性に複製可能な適切なシャトルベクターが得られうる。こうしたベクターは、本発明にしたがった弱毒化赤痢菌属生ワクチン株のいずれにおいても、あるいは腸管侵入性エシェリキア属を含む、侵入プラスミドを取り込むことが可能な他の細菌いずれにおいても使用可能である。
【０１０７】
内因性赤痢菌属侵入プラスミドは、当該技術分野においてよく性質決定されており、そしてこうした知識は、こうしたプラスミドにおける組換えのための部位、ならびに適切な増殖条件の選択、例えばＩＳ１００およびｉｐａＪ遺伝子の間のヌクレオチド１０３１８７−１０３３２８の間の位（これらの位は、シゲラ・フレックスネリ２ａ  ３０１株のｐＣＰ３０１侵入プラスミドに関して決定される）を知らせる。
【０１０８】
プラスミドは、好ましくは単一コピープラスミドとして使用される。
【０１０９】
本発明のプラスミドは、単離型で、例えばプラスミドＤＮＡを細胞から調製するための一般的な方法によって、赤痢菌属細胞から細胞質のＤＮＡ分画を調製することによって、提供されうる。さらに、密度勾配遠心分離法、アガロースゲル電気泳動等によって、ＤＮＡ分画を精製してもよい。
【０１１０】
シャトルベクターの構築のため、配列全体またはその一部を用いてもよい。その一部を用いる際、こうした部分は、典型的には、プラスミドの複製に関与する領域を含有するが、複製に不要な領域は排除されてもよい。例えば、制限酵素でプラスミドを消化することによって得た部分を、赤痢菌属において自律性に複製可能なプラスミドに連結し、別の細菌、例えば別の赤痢菌属株またはエシェリキア属株を、得た組換えプラスミドで形質転換し、そして組換えプラスミドに形質転換体が宿するかどうかを決定することによって、複製に必要な領域を決定してもよい。
【０１１１】
弱毒化細菌ワクチンを配合するための既知の技術を用いて、本発明記載のワクチンを配合してもよい。ワクチンは、経口投与のため、例えば水溶液または投与前に適切な緩衝液中で再構成するための乾燥粉末として、好適に提示される。再構成は、好適には細菌の生存性を確実にするため、適切なｐＨの緩衝液中で好適に達成される。弱毒化細菌およびワクチンを胃の酸性から保護するため、重炭酸ナトリウムなどの保護剤が、ワクチンの各投与とともに好適に投与される。あるいは、ワクチンは、凍結乾燥被包型で提示される。
【０１１２】
薬学的に許容されうるビヒクル中で、例えばスプレーとして、ワクチン株を投与してもよいし、あるいは食物および／または水と混合するか、あるいは適切なキャリアー、希釈剤、アジュバントまたは賦形剤、例えば無菌水、生理学的生理食塩水、グルコース等と混合して送達してもよい。ワクチン株は、望ましい投与経路および調製物に応じて、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化剤または粘性増進添加剤、保存剤、フレーバー剤、着色剤等を含有しうる。薬学的組成物および薬剤の調製のための薬学的キャリアーは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（１９９０），  第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）などの教科書に示されるように、当該技術分野に周知である。
【０１１３】
本発明のワクチン株を、投薬型で、そして医学または獣医学業の当業者に周知の技術によって、レシピエント被験体の年齢、性別、体重、種および状態、ならびに投与経路などの要因を考慮して、投与することも可能である。投与経路は、経皮経路、粘膜投与を通じて（例えば経口、鼻、肛門、膣）または非経口経路を通じて（皮内、筋内、皮下、静脈内、または腹腔内）であってもよい。ワクチン株を単独で投与してもよいし、あるいは他の治療または療法と同時投与または連続投与してもよい。投与の型には、非経口、皮下、皮内、筋内または静脈内投与（例えば注射可能投与）のための懸濁物、シロップまたはエリキシル、および調製物、例えば無菌懸濁物またはエマルジョンが含まれてもよい。
【０１１４】
ワクチンを、被験体、特にヒト、あるいは温血哺乳動物、特にブタを含む動物のワクチン接種に用いてもよい。
【０１１５】
ひとたび産生したら、本発明のワクチン株を能動的免疫療法の経過に、特にワクチン接種によって、被験体に投与して、経腸疾患、特に赤痢菌属によって引き起こされる赤痢、および場合によって異種経腸または下痢性病原体を防止してもよい。これは、交差防御性および／または多価である、本発明にしたがった任意のワクチンによって達成可能である。
【０１１６】
赤痢菌属および場合によって他の微生物、例えば本発明の交差防御性および／または多価ワクチンによってターゲットとされる下痢性微生物によって引き起こされる感染は、したがって、有効用量の本発明記載のワクチンを投与することによって、防止または治療可能である。使用する投薬型は、最終的に、医師の自由裁量によるが、被験体のサイズおよび体重、ならびに配合されるワクチンのタイプを含む、多様な要因に応じるであろう。しかし、用量あたり１０７〜１０１１、例えば１０８〜１０１０の細菌の経口投与を含む投薬型が、７０ｋｇの成人宿主には好適でありうる。
【０１１７】
赤痢菌属および場合によって他の微生物、特に病原体によって引き起こされる感染は、したがって、本発明記載のワクチンの有効用量を投与することによって、防止または治療可能である。使用する投薬型は、最終的に、医師の自由裁量によるが、被験体のサイズおよび体重、ならびに配合されるワクチンのタイプを含む、多様な要因に応じるであろう。しかし、用量あたり１０７〜１０１１、例えば１０８〜１０１０の細菌の経口投与を含む投薬型が、７０ｋｇの成人宿主には好適でありうる。
【０１１８】
特定の例にしたがって、プロトタイプＳ．フレックスネリ２ａ株の同質遺伝子的弱毒化突然変異体を構築した。突然変異体は、Ｏ抗原の合成が不可能である（Δｒｆｂ）か、またはよく証明されたワクチンアプローチを代表して、栄養要求性（ΔａｒｏＣ）であった。マウス肺モデルにおけるこれらの突然変異体の病原性は、匹敵するレベルの弱毒化を示した。続いて、本発明者らは、Ｉｐａをコードする侵入プラスミドを欠く両突然変異体の誘導体を単離した（コンゴーレッド陰性／ＣＲＮ／突然変異体）。これらの後者の突然変異体における侵入性表現型の喪失は、弱毒化をさらに進めて検出不能レベルにする。Ｏ抗原（ΔｒｆｂＦ  ＣＲＰ）、またはｉｐａタンパク質（ΔａｒｏＣ  ＣＲＮ）のいずれかを欠くか、または両方を欠く（ΔｒｆｂＦ  ＣＲＮ）、あるいはこれらの抗原のいずれも欠いていない（ΔａｒｏＣ  ＣＲＰ）Ｓ．フレックスネリ２ａ突然変異体のこのシリーズを用いて、致死量未満の用量でマウスを鼻内免疫した。続いて、マウスを致死用量の異種Ｓ．フレックスネリ６（図１ａ）またはＳ．ソネイ（図１ｂ）野生型株に曝露した。ｉｐａおよびＯ抗原の両方を発現している弱毒化突然変異体（Δａｒｏ  ＣＲＰ）は、偽ワクチン接種マウスで観察されるレベルを超えた防御を提供しえなかった。対照的に、抗原の主要免疫原性基を両方とも欠く二重突然変異体は、異種曝露株両方に対して高い防御を誘発した。病原性プラスミド単独の喪失（ΔａｒｏＣ  ＣＲＮ）であっても、交差防御を改善するようであった。これらの結果を確証するため、また、マウス群を、Ｓ．ソネイ単離体の第Ｉ期（ＩｐａおよびＯ抗原陽性）および第ＩＩ期（ＩｐａおよびＯ抗原陰性）変異体でも免疫した。第ＩＩ期ワクチン株はＳ．フレックスネリ６による曝露に対する高い防御を提供する一方、完全病原性第Ｉ期株での免疫は、生理食塩水によって提供されるものとは有意に異なる生存をまったく提供しなかった（図１ｃ）。
【０１１９】
改善された交差防御が、この突然変異体バックグラウンドでの（すなわち優性抗原の喪失に際して−図２を参照されたい）マイナー抗原の免疫原性増加から生じるという概念を支持するため、免疫マウスから得た血清および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）試料の免疫反応性を、主要抗原性基の両方を発現するかまたはどちらも発現しない全細菌細胞に対するＥＬＩＳＡにおいて比較した（図３）。
【０１２０】
ΔａｒｏＣ  ＣＲＰ（ｉｐａおよびＯ抗原の両方が陽性）突然変異体でワクチン接種したマウスから得たＢＡＬは、侵入性スムース相同ターゲットに対してより反応原性であり、これらの抗原が実際に免疫反応を支配することが検証された。対照的に、ワクチン株上の免疫優性抗原の喪失（ΔｒｆｂＦ  ＣＲＮ）は、ＯおよびＩｐａ抗原両方を回避する相同ターゲット株に対する改善された反応原性を生じた。
【０１２１】
さらに、異種Ｓ．ソネイ株は、二重突然変異体によってワクチン接種されたマウスから得たＢＡＬによってより容易に認識された。これらの結果は、これらのターゲット上でアクセス可能な共有されるマイナー抗原に対するより高い力価の粘膜抗体があることを裏付ける。興味深いことに、この現象は、血清ＩｇＧの場合は明らかではなく（データ未提示）、血清ＩｇＧよりもむしろｓＩｇＡがこのモデルにおける防御を仲介することを示す先の知見を支持する。
【０１２２】
現在のワクチンアプローチ（一般的に、ならびに特に赤痢菌属に対するもの）は、主要免疫原性抗原の利用に頼る。しかし、免疫反応を逃れるには、進化圧は、これらの抗原の多数の免疫学的に別個の変異体を選択してきており、これが血清型において病原体を分類する基礎を形作る。血清型決定主要抗原の利用は、したがって、すべての血清型がワクチン中に含まれることが可能でない限り（例えばポリオウイルスワクチンの場合）、病原体に対する部分的な防御しか与えない可能性がある。最も蔓延している血清型の組み合わせは、比較的広い防御を生じうるが、これは血清型置換（すなわちより一般的でない血清型が出現して、ワクチン血清型の根絶によって開いたギャップを埋める）のため、一過性でありうる。このため、ときどき、例えば多価ワクチン中にさらなる血清型を含めることによる、ワクチン最適化が必要となる。しかし、抗原性競合および干渉のような現象、ならびに財政的な考慮のため、含まれる血清型の最大数は限定される。
【０１２３】
他方で、所定の細菌病原体の多様な血清型は、その表面上に莫大な数の保存抗原を共有する。これらが保存されたままであることが可能であったという事実は、表面上でアクセス可能ではなく（防御抗原ではなく）、そして／またはその機能が非常に必要であるため、その抗原性構造において、修飾が許されないか、いずれかであることを暗示する。これは、非常に保存され（侵入における洗練された機能のため）、そして非常に免疫原性であり、にもかかわらず、おそらく、ターゲット細胞への接触に際してのみ発現され、したがって、おそらく抗体仲介性防御機構に対してアクセス可能ではないため、交差防御を誘発不能である、赤痢菌属ｉｐａタンパク質によって例示される。
【０１２４】
特に、本発明者らは、免疫優性抗原、例えばｉｐａおよびＯ抗原が、マイナー抗原に対してより少ない抗体の作製しか許さないように、免疫反応をハイジャックすることを示す（図２）。Ｉｐａが防御性でなく、そしてＯ抗原が非常に多様であることを考慮すると、赤痢菌属は、免疫反応を効率的に回避可能である。本発明者らはしかし、これらの抗原クラスの欠失が、生ワクチン株の交差防御能を非常に改善したことを示す。
【０１２５】
侵入プラスミド突然変異に関して、コンゴーレッド陽性の喪失に基づいて侵入プラスミドの自発的欠失突然変異体を選択する代わりに、残りのプラスミドは損なわれない（ｉｎｔａｃｔ）まま、ｉｐａＢおよびＣ遺伝子を除去することも可能である。
【０１２６】
さらに、染色体から侵入プラスミドへ、ｐｐａなどの必須遺伝子を移植することによって、プラスミドを安定化させることも可能である。
【０１２７】
さらに、外来（異種）抗原、例えばＥＴＥＣ  ＬＴＢおよび突然変異ＳＴａ（ＳＴｍ）毒素の発現が実行可能である。ＳＴｍは、好ましくは、１またはそれより多い点突然変異を含有する。特に好ましいＳＴｍは、
ＮＳＳＮＹＣＣＥＬＣＣＸＸＡＣＴＧＣＹ（配列番号１）
であり、式中
１２位のＸは、Ｎ、ＫまたはＲであり、そして／または
１３位のＸは、Ｐ、Ｇ、ＬまたはＦであり、
ここで、ＳＴｍは、野生型配列：
ＮＳＳＮＹＣＣＥＬＣＣＮＰＡＣＴＧＣＹ（配列番号２）
を排除する。
【０１２８】
点突然変異の好ましい組み合わせは、Ｐ１３Ｆと組み合わせたＮ１２ＫまたはＮ１２Ｒである。
【０１２９】
さらに、実施例は、共有される保存抗原の相対免疫原性が、ワクチン株における主要抗原の非存在下で増加したことを示す。これらの欠失は、防御の範囲を改善するだけでなく、ワクチン株を非常に非病原性にするため、二重突然変異体は、極度に高用量であっても、非常に安全であると見なされる。さらに、生経口ワクチンは、製造が比較的安価であり、そして投与のために訓練された医療従事者を必要とせず、このことは流行国におけるターゲット集団を考慮した際、重要な要因である。
【０１３０】
以下の定義の主題は、本発明の態様と見なされる：
１．  ＬＰＳ  Ｏ抗原を欠くラフ赤痢菌属株、好ましくは非侵入性株に基づく、生弱毒化赤痢菌属ワクチン。
【０１３１】
２．  好ましくは、ｒｆｂのクラスター中の遺伝子、あるいはＯ抗原合成をコードするｒｆｂ/ｗｂｂ遺伝子クラスター内の１またはそれより多い遺伝子、Ｏ抗原リガーゼをコードするｗａａＬ、Ｏ抗原輸送に関与するＯ抗原フリッパーゼをコードするｗｚｘ、Ｏ抗原重合に関与するｗｚｙ/ｒｆｃ、ＬＰＳ−コア合成をコードするｒｆａ／ｗａａ遺伝子クラスター内の遺伝子、Ｏ抗原発現に影響を及ぼす制御遺伝子、例えばｒｆａＨ、あるいはＯ抗原発現の少なくとも９０％の減少を生じる機能喪失型（単数または複数）からなる群より選択される、ＬＰＳ合成、輸送および発現に関与する１またはそれより多い遺伝子の突然変異誘発によって弱毒化されている、定義１記載のワクチン。
【０１３２】
３．  前記突然変異誘発が、ｒｆｂ  Ｆ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｊおよび／またはＩ遺伝子の１またはそれより多くの欠失、あるいはその一部の欠失、あるいは多様な赤痢菌属血清型における対応する遺伝子の欠失による、定義１または２記載のワクチン。
【０１３３】
４．  前記赤痢菌属株が、赤痢菌属より、例えば任意の赤痢菌属血清型または種、特にＳ．フレックスネリ、Ｓ．ソネイ、Ｓ．ディセンテリエおよびＳ．ボイディーより選択される、定義１から３のいずれか記載のワクチン。
【０１３４】
５．  前記赤痢菌属が交差反応性外膜タンパク質を発現する、定義１〜４のいずれか記載のワクチン。
【０１３５】
６．  赤痢菌属の異なる血清型および種に対して、特にＳ．フレックスネリ２ａ、Ｓ．フレックスネリ６およびＳ．ソネイ、または腸管侵入性大腸菌のいずれかに対して交差防御性である、定義１〜５のいずれか記載のワクチン。
【０１３６】
７．  前記赤痢菌属が、侵入プラスミドのさらなる突然変異誘発、特にｉｐａＢおよび／またはｉｐａＣ遺伝子および／または他のｉｐａ遺伝子の欠失によって、非侵入性である、定義１〜６のいずれか記載のワクチン。
【０１３７】
８．  前記赤痢菌属が、異種抗原をコードする少なくとも１つの遺伝子を取り込み、前記抗原を分泌するかまたは前記抗原を例えば細菌細胞表面上に発現する、組換え内因性侵入プラスミドを含む、定義１〜７のいずれか記載のワクチン。
【０１３８】
９．  前記抗原が
−細菌抗原、好ましくは毒素またはコロニー形成因子、
−ウイルス抗原、好ましくは経腸または粘膜感染を引き起こす病原体由来のもの、
−真菌抗原、好ましくは経腸または粘膜感染を引き起こす病原体由来のもの、および
−寄生虫抗原、好ましくは経腸感染を引き起こす病原体由来のもの
からなる群より選択される、定義８記載のワクチン。
【０１３９】
１０．  細菌性抗原が、好ましくは
ａ．大腸菌抗原、特に、ＥＴＥＣのＬＴＢ、突然変異ＬＴＡおよびＳＴ、そのサブユニットまたは融合体からなる群より選択されるエンテロトキシン、腸管凝集性大腸菌（ＥＡＥＣ）由来の抗原、または志賀毒素様毒素１または２
ｂ．カンピロバクター・ジェジュニ抗原
ｃ．クロストリジウム・ディフィシレ抗原、特に毒素ＡおよびＢ
ｄ．コレラ菌抗原、特にＣＴ−Ｂ抗原、ならびに
ｅ．ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の突然変異体または融合タンパク質
からなる群より選択される、腸管病原性細菌から生じる、定義９記載のワクチン。
【０１４０】
１１．  前記ＥＴＥＣが、ＬＴＢおよび突然変異体ＳＴ（ＳＴｍ）の融合エンテロトキシン、特に配列番号１に示すようなアミノ酸配列を含むＳＴｍを含む融合タンパク質である、定義１０記載のワクチン。
【０１４１】
１２．  ウイルス抗原が、好ましくは、ロタウイルスおよびカルシウイルス、例えばノーウォークウイルスからなる群より選択される、下痢性ウイルスから生じる、定義１０記載のワクチン。
【０１４２】
１３．  寄生虫抗原が、好ましくは、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム属種および赤痢アメーバからなる群より選択される、下痢誘発原生動物から生じる、定義１０記載のワクチン。
【０１４３】
１４．  真菌抗原が、好ましくは、ブラストミセス・デルマティディティスおよびヒストプラズマ属種からなる群より選択される、下痢誘発真菌から生じる、定義１０記載のワクチン。
【０１４４】
１５．  前記赤痢菌属が、必須染色体遺伝子、特にｐｐａ遺伝子、またはａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｄａｐＥ、ｅｒａ、ｆｒｒ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＺ、ｉｎｆＡ、ｌｇｔ、ｌｐｘＣ、ｍｓｂＡ、ｍｕｒＡ、ｍｕｒＩ、ｎａｄＥ、ｐａｒＣ、ｐｒｏＳ、ｐｙｒＢ、ｒｐｓＢ、ｔｒｍＡ、ｒｈｏおよびｒｈｏＬのいずれかの欠失および侵入プラスミド内への前記遺伝子の挿入をさらに含む、定義１〜１４のいずれか記載のワクチン。
【０１４５】
１６．  感染性疾患、特に経腸疾患、例えば下痢性または赤痢疾患を防止するため、被験体の能動的免疫療法において使用するための、定義１〜１５のいずれか記載のワクチン。
【０１４６】
１７．  前記経腸疾患が、任意の赤痢菌属血清型または種によって引き起こされる、定義１６記載の使用のためのワクチン。
【０１４７】
１８．  免疫療法が、粘膜または経口配合物中のワクチンの投与を含む、定義１６または１７記載の使用のためのワクチン。
【０１４８】
１９．  ワクチンが経口または鼻内投与される、定義１６〜１８のいずれか記載の使用のためのワクチン。
【０１４９】
２０．  −赤痢菌属および赤痢菌属以外の種の少なくとも１つの病原体の防御抗原を、前記病原体の防御抗原を内因性侵入プラスミド内に取り込むことによって発現している多価ワクチンを用い、そして
−前記感染性疾患が、任意の赤痢菌属血清型または種および／または前記病原体によって引き起こされる
定義１６〜１９のいずれか記載の使用のためのワクチン。
【０１５０】
２１．  ｒｆｂＦ、ｉｐａＢおよび／またはｉｐａＣ遺伝子の１つの欠失、あるいはその必須部分の欠失を含む、Ｓ．フレックスネリ２ａ株である、赤痢菌属株。
【０１５１】
２２．  異種抗原をコードする少なくとも１つの遺伝子を取り込み、前記抗原を発現するかまたは前記抗原を分泌する組換え侵入プラスミドを含む、定義２１記載の赤痢菌属株。
【０１５２】
２３．  必須染色体遺伝子の欠失および前記遺伝子の侵入プラスミド内への挿入をさらに含む、定義２１または２２記載の赤痢菌属。
【０１５３】
２４．  少なくとも１つの異種抗原をコードするヌクレオチド配列を含む突然変異赤痢菌属侵入プラスミドに基づく組換えプラスミドベクターであって、プラスミドがｉｐａＢおよび／またはｉｐａＣ遺伝子の少なくとも１つにおいて突然変異している、前記プラスミドベクター。
【０１５４】
２５．  前記宿主細胞が、赤痢菌属、エシェリキア属、サルモネラ属、カンピロバクター属またはエルシニア属より選択される、定義２４記載のベクターを含む細菌宿主細胞。
【０１５５】
２６．  ベクターが内因性侵入プラスミドである、定義２５記載の宿主細胞。
【０１５６】
前述の説明は、以下の実施例を参照するとより完全に理解されるであろう。こうした実施例は、しかし、単に、本発明の１またはそれより多い態様を実施する方法の代表であり、そして本発明の範囲を限定するとして読んではならない。
【実施例】
【０１５７】
実施例１：弱毒化赤痢菌属株の調製
方法
細菌株および培養条件
細菌をルーチンに、ルリア・ベルタニ（ＬＢ）ブロス中、または寒天プレート上で増殖させた。ｉｐａタンパク質を発現する、損なわれていない侵入プラスミドの検出のため、０．０１％コンゴーレッド色素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したトリプチックソイ寒天（ＴＳＡ）プレートを用いた。新鮮培養は常に、コンゴーレッド陽性（ＣＲＰ）コロニーで開始し、プラスミド所持を確実にした。適切な場合、以下の濃度の抗生物質を培地に補った：アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン１００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ。
【０１５８】
配列決定したプロトタイプ、シゲラ・フレックスネリ２ａ株２（株２４５７Ｔ、ＡＴＣＣ７００９３０）を突然変異誘発の親株として用いた。先に記載される（Ｌｅｖｉｎｅ，  Ｍ．Ｍ．，ら  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５，  ５４０−５５３（２００７））Ｒｅｄ組換え酵素技術によって、ａｒｏＣおよびｒｆｂＦ遺伝子の不活性化を実行した。ａｒｏＣの欠失は、芳香族化合物を合成不能な、栄養要求性突然変異体を生じる。ＲｆｂＦは、Ｏ抗原サブユニットの合成に関与し、ＲｆｂＦがなくなると、ラフＬＰＳ表現型が生じる。突然変異の生成および確認に用いたオリゴヌクレオチドを、図４中の補足表１として提供する（配列番号３〜１０）。突然変異体２４５７ＴΔａｒｏＣ：：ｋａｎおよび２４５７ＴΔｒｆｂＦ：：ｃａｔを、続いて、コンゴーレッド（ＣＲ）寒天プレート上で培養して、ＣＲ陽性（ＣＲＰ）およびＣＲ陰性（ＣＲＮ）コロニーを選択した。侵入プラスミド上にコードされる病原性決定基の喪失をＰＣＲによって確認した。同様に、Ｓ．ソネイの第Ｉ期および第ＩＩ期変異体をＣＲプレート上で区別した。第Ｉ期は、侵入プラスミド所持野生型Ｓ．ソネイ株の伝統的な命名であり、一方、第ＩＩ期は、プラスミドを失った株を指す。Ｏ抗原合成はまた、この種の病原性プラスミド上にコードされるため、第ＩＩ期変異体は、非侵入性であり、そしてまたラフでもある。曝露研究に用いた野生型シゲラ・フレックスネリ６およびＳ．ソネイ株は、細菌性赤痢の臨床症例から単離されてきている。商業的タイピング血清を用いたスライド凝集によって、その血清型を決定した（Ｍａｓｔ  ＡｓｓｕｒｅＴＭ；Ｍａｓｔ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ.、英国マーシーサイド）。
【０１５９】
動物実験
以前記載されたマウス肺モデル（ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｒｇら，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３：１９４７−１９５４，  １９９５）において、すべてのｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行った。６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、５ｍｇ／ｍｌケタミン（Ｃａｌｉｐｓｏｌ、Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｇｅｄｅｏｎ、ハンガリー）および０．３ｍｇ／ｍｌキシラジン（Ｐｒｉｍａｓｉｎｅ、Ａｌｆａｓａｎ）の混合物で腹腔内麻酔した。
【０１６０】
必要なＣＦＵの細菌を含有する接種物（生理食塩水中で希釈）５０μｌで、鼻内感染を行った。接種物から連続希釈をプレーティングすることによって、細菌数を正当化した。ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ（Ｏａｋｓ，  ＥＶ，ら  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ５３：５７−６３，  １９８６）にしたがって、０．５対数連続希釈（１０５〜１０８ＣＦＵ）による感染から、５０パーセント致死用量（ＬＤ５０値）を計算した。致死量未満の用量の細菌（株２４５７Ｔ由来の１０６ＣＦＵのＣＲＰ突然変異体および１０８ｃｆｕのＣＲＮ突然変異体；１０５．５ＣＦＵの第Ｉ期および１０７．５ＣＦＵの第ＩＩ期Ｓ．ソネイ）で、２週間間隔で２回、ワクチン接種を行った。対照群には生理食塩水を投与した。パイロット研究において、すべてのワクチン株は、ｐ．ｉ．３日以内に一掃されていることが示された。追加免疫から２週間後、マウスを致死用量のＳ．フレックスネリ６またはＳ．ソネイ野生型株のいずれかに曝露した。
【０１６１】
続いて、致死性を１４日間監視した。あるいは、免疫したマウスを追加免疫の２週間後に屠殺し、そして気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）および血液試料を収集した。ＢＡＬの収集のため、安楽死させたマウスの気管に、鈍化させた針でカニューレ挿入するように用意し、そして２００μｌの生理食塩水を注射し、そして各マウスの気管支から回収した（ｒｅｔｒａｃｔ）。
【０１６２】
ＥＬＩＳＡ
新鮮なＣＲプレートから接種した細菌を、ＬＢブロス中で一晩増殖させた。９６ウェルプレート（Ｃ．Ｅ．Ｂ．、フランス）を、炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中、４℃で、０．１ｍｌの洗浄細菌懸濁物（５ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ）で一晩コーティングした。翌日、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄し、そして次いで、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳで、室温で１時間、ブロッキングした。ＢＡＬおよび血清試料を、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈し、そして抗原コーティングプレートと３７℃で１時間インキュベーションした。プレートに渡って、連続希釈を行った。３回の洗浄後、プレートを、ＨＲＰＯ（Ｄａｋｏ  Ａ／Ｓ、デンマーク）とコンジュゲート化した抗マウスＩｇＧ（血清ＩｇＧに関して）または抗マウスＩｇＡ（ＢＡＬ試料に関して）免疫グロブリンで探査した。ＥＬＩＳＡ基質は、Ｈ２Ｏ２を含有するクエン酸緩衝液中に溶解したｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。慣用的なＥＬＩＳＡプレート読み取り装置上、４９２ｎｍで、ＯＤを測定した。同じ希釈（１：１０）のΔａｒｏ  ＣＲＰ  ＢＡＬ試料の反応性に関連して、免疫反応性を表した。４回の独立のアッセイから、平均＋ＳＥＭを計算した。
【０１６３】
統計分析
ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ６の統計法で、５０％致死用量を計算した。Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．００を用いたログ−ランク（マンテル−コックス）検定で、生存曲線の統計分析を行った。ＢＡＬのＩｇＡ力価を、マン−ホイットニー・ノンパラメトリック分析で比較した。０．０５より低い場合、ｐ値を有意と見なした。
【０１６４】
結果
弱毒化シゲラ・フレックスネリ２４５７Ｔ（血清型２ａ）ワクチン株で免疫し、そして野生型赤痢菌属株に曝露した動物の生存曲線に基づいて、ｒｆｂＦ遺伝子欠失と、侵入プラスミド喪失を、異種曝露設定において組み合わせることによって、相乗的防御効果が観察された。コンゴーレッド陰性（ＣＮＲ、侵入プラスミド欠失を伴う）シゲラ・フレックスネリ２４５７Ｔ（２ａ）ΔｒｆｂＦ株での免疫により、コンゴーレッド陽性（ＣＮＰ、損なわれていない侵入プラスミド）シゲラ・フレックスネリ２ａΔｒｆｂＦ株のものに比較して、動物を異種シゲラ・フレックスネリ６株に曝露した際に、有意により優れた防御が達成された（図１ｂ）。野生型シゲラ・フレックスネリ５４４株（２ａ）での相同曝露の場合、両方のワクチン株は等しく防御性であり、相同曝露に関して、ｒｆｂＦ遺伝子の欠失であっても十分であることが示唆される（図１ａ）。ワクチン接種有効性の相違は、より高い許容されうるΔｒｆｂＦ−侵入プラスミド二重突然変異体での致死量未満の曝露用量に部分的に関連するようであるが、二重突然変異体と匹敵する曝露用量で用いたＣＲＮ  Δａｒｏ（対照）株が、相同および異種曝露実験の両方において、部分的な防御を誘導したため（図１ａ、ｂ）、完全に説明できるわけではない。
【０１６５】
異種曝露に対する有意な防御を達成する、ｒｆｂＦ遺伝子および侵入プラスミドを不活性化させる突然変異の有益な効果のさらなる証拠は、シゲラ・ソネイ・ワクチン株を用いることによって提供される。シゲラ・ソネイ第ＩＩ期変異体（侵入複合体およびｒｆｂＦ遺伝子の両方の発現に関与する侵入プラスミド欠失）での免疫は、野生型シゲラ・フレックスネリ５４２株（血清型６）での致死性曝露に対して高レベルの防御を提供する一方、野生型Ｓ．ソネイ株第Ｉ期変異体（侵入複合体およびｒｆｂＦ遺伝子を所持する、損なわれていない侵入プラスミド）は、低い（統計的に有意でない）防御効果を示した（図１ｃ）。
【０１６６】
実施例２：侵入プラスミド上に合成遺伝子構築物を含むシゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７突然変異体の調製
突然変異体構築のための供給源物質は、上述のようなＡＴＣＣ株シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔである。Ｒｅｄ組換え酵素技術を用いて、ｒｆｂＦおよびｉｐａＢおよびｉｐａＣ遺伝子、ならびにｐｐａ遺伝子の欠失を行う（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．  ＆  Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．  ＰＣＲ産物を用いた、大腸菌Ｋ−１２における染色体遺伝子の一工程不活性化。  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ  ９７，  ６６４０−６６４５（２０００））。
【０１６７】
工程１：ｒｆｂＦ遺伝子を染色体から除去した。ＲｆｂＦの欠如は、表現型変化と関連する：該赤痢菌属株は、「ラフ」になり、これは寒天プレート上で裸眼によって検出可能な典型的な形態学的変化である。この表現型変化は観察されたが、ｒｆｂＦ遺伝子除去の成功はまた、ＰＣＲ分析によっても確認された。これは、野生型または突然変異赤痢菌属由来のゲノムＤＮＡを用いて得られるＰＣＲ産物の異なる長さに基づいた（図８）。
【０１６８】
工程２：ｉｐａＢおよびｉｐａＣ遺伝子を侵入プラスミドから除去した。これらの遺伝子は隣接しており、そしてｒｆｂＦ遺伝子欠失に適用される同じＲｅｄ組換え酵素技術で、一緒に欠失された。この遺伝子欠失もまた、表現型を生じる：該赤痢菌属は、色素コンゴーレッドを取り込む能力を喪失し、そしてしたがって、コンゴーレッド含有寒天プレート上に、野生型プラスミドを所持する赤い赤痢菌属とは対照的に白色コロニーを形成する。赤痢菌属は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中に自発的にプラスミドを喪失しうるため、ｉｐａＢおよびｉｐａＣ遺伝子の欠失は、突然変異体のＰＣＲ分析によって確認され、そしてこれは、野生型プラスミドに比較して、突然変異体で得られるより短いＰＣＲ断片に基づいた（図９）。
【０１６９】
工程３：ＥＴＥＣ毒素ＬＴ−ＢおよびＳＴの発現を駆動するとともに、染色体から侵入プラスミド内へ必須遺伝子（ｐｐａ）を移植する、合成遺伝子の挿入（図１０Ａを参照されたい）。遺伝子操作領域の部位特異的ＰＣＲ増幅によって、ＬＴＢ−ｍＳＴ融合遺伝子の導入成功を証明した（図１０Ｂ）。赤痢菌属由来の毒素融合遺伝子の発現をイムノブロッティングによって試験した（図１０Ｃ）。最終ワクチン株由来の単位複製配列がより短い長さであることに基づいて、ＰＣＲによって、染色体からのｐｐａ遺伝子（赤痢菌属の増殖に必須）の除去を証明した。
【０１７０】
すべての遺伝子操作は、抗生物質耐性遺伝子の挿入を伴った。各工程後、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ  ９７，  ６６４０−６６４５（２０００））によって記載されるように、抗生物質耐性の原因である遺伝子を除去した。
【０１７１】
実施例３：実施例２の突然変異体株を試験するための動物防御研究
細菌性赤痢のマウス肺モデルにおいて、同質遺伝子的突然変異体株対その親野生型株の病原性弱毒化を示した。各株に関する最低致死用量を決定するため、異なる細菌株の１０倍連続希釈（１０６〜１０８ｃｆｕの間）で、マウス群を鼻内感染させた。野生型株の場合、それぞれ１０６、１０７および１０８ｃｆｕ／マウス用量で、３０、５０、および１００％致死性が見られた。対照的に、同質遺伝子的突然変異体２４５７ＴΔｒｆｂ、２４５７ＴΔｉｐａＢＣ、または二重突然変異体２４５７ＴΔｒｆｂΔｉｐａＢＣのいずれでも、いかなる試験用量でも、マウスは死ななかった。これらの結果は、対応する遺伝子の欠失に際して、すべての突然変異体において高い病原性減弱があることを示唆する。
【０１７２】
続いて、マウス群を、同じモデルにおいて、野生型株２４５７Ｔ（５ｘ１０５ｃｆｕ／マウス）またはその同質遺伝子的欠失突然変異体２４５７Δｒｆｂ、２４５７ＴΔｉｐａＢＣ、２４５７ＴΔｒｆｂΔｉｐａＢＣ（すべて１０８ｃｆｕ／マウス）のいずれかの致死量未満の用量で免疫するか、あるいはＰＢＳのみで偽免疫した。２週間間隔で３回、同一の免疫を行った。最後の追加免疫の１週間後、マウスを（先に最適化された）致死用量（２ｘ１０６ｃｆｕ／マウス）のＳ．ソネイ株に曝露した。図１１に示すように、野生型株での免疫は防御を提供不能である一方、単一遺伝子座突然変異体各々（２４５７ＴΔｒｆｂまたは２４５７ＴΔｉｐａＢＣのいずれか）は、部分的防御しか誘発しなかった。対照的に、二重突然変異体（２４５７ＴΔｒｆｂΔｉｐａＢＣ）は、異種赤痢菌属種による感染に対する完全防御を提供可能であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【配列表】
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