(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から得られた生物学的試料における大腸癌のインヴィトロ診断補助方法であって、少なくとも一つの核酸の発現を検出し、前記発現が健常人の値と比較して高い場合に癌の罹患の可能性が高いことを決定する工程を有し、前記核酸は、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列から選択され、又は、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列と少なくとも９９％の同一性を示す配列から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２】
少なくとも二つの核酸の発現が検出され、前記少なくとも二つの核酸は配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列から選択され、又は、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列と少なくとも９９％の同一性を示す配列から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二つの核酸の一方は、配列番号２に規定される核酸であり、又は、配列番号２に規定される配列と少なくとも９９％の同一性を示す核酸であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも二つの核酸の発現が検出され、前記少なくとも二つの核酸は配列番号２、３、及び８に規定される配列から選択され、又は、配列番号２、３、及び８に規定される配列と少なくとも９９％の同一性を示す配列から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
発現が検出される核酸に、更に、配列番号６、１４〜１６、１８、２０、２１、２３、２６、２８〜９６、及び９８〜２８５に規定される配列から選択され、又は、配列番号６、１４〜１６、１８、２０、２１、２３、２６、２８〜９６、及び９８〜２８５に規定される配列と少なくとも９９％の同一性を示す配列から選択される核酸を含むことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
検出された発現は、少なくとも一つのRNA転写物又は少なくとも一つのポリペプチドであることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記RNA転写物は少なくとも一つのmRNAであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記RNA転写物はハイブリダイゼーション、増幅、又はシークエンスにより検出されることを特徴とする請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記mRNAは、ハイブリダイゼーション許容な予め定められた条件下で、少なくとも一つのプローブ及び／又は少なくとも一つのプライマーと接触し、前記mRNAへのハイブリダイゼーションの存在又は不存在が検出されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記mRNAのDNA複製物が準備され、前記DNA複製物は、ハイブリダイゼーション許容な予め定められた条件下で、少なくとも一つのプローブ及び／又は少なくとも一つのプライマーと接触し、前記DNA複製物へのハイブリダイゼーションの存在又は不存在が検出されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチド発現が、前記ポリペプチドの少なくとも一つの所定の結合パートナーと接触することにより検出されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
大腸癌のインヴィトロ診断補助に使用される分子マーカーとしての少なくとも一つの核酸の使用であって、核酸の発現が健常人の値と比較して高い場合に癌の罹患の可能性が高いことを決定し、前記核酸は、以下の何れかからなる。
（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列から選択される少なくとも一つのDNA、又は、
（ｉｉ）（ｉ）に規定される一つのDNAと少なくとも９９％の同一性を示す少なくとも一つのDNA
【請求項１３】
少なくとも二つの核酸の使用であって、前記核酸は、以下の何れかからなる、請求項１２記載の核酸の使用。
（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列から選択される少なくとも二つのDNA、又は、
（ｉｉ）（ｉ）に規定される二つのDNAと少なくとも９９％の同一性を示す少なくとも二つのDNA
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌のインヴィトロ診断又は予後予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
内在性レトロウイルスは、生殖細胞へのプロウイルス形態で集積され、且つホストの子孫のゲノムへこの手段により伝達された伝染性レトロウイルスの子孫を構成する。
【０００３】
ヒトゲノム配列により、転位性因子又はその派生物が非常に豊富であることが明らかになった。実際、繰返し配列はヒトゲノムと内在性レトロウイルスの半分に近いことを示し、現在では、エレメントの数で、前記ゲノムの８％を構成するレトロトランスポゾンは４０００００以上になろうとしている。
【０００４】
ヒトゲノムにおいて現在示される内在性レトロウイルスエレメント（ERVs）の個体数は、ヒト株の進化過程において成功発生する約１００の内在化の結果である。
【０００５】
内在化の種々の波が、我々の時代にいたるまでの２００万から９０００万年の間の期間にわたり拡散し、続いて失敗の可能性を有した“コピー／ペースト”現象による多数のコピーが行われ、先駆者たるプロウイルスから始まって結果としてHERVのファミリー即ち、配列相同性を示すエレメントセット、が形成された。哺乳類の出現前では、最古のエレメントであるHERV-Lが出現したと推定される。最初の霊長類が出現した時期に、HERV-F及びHERV-Hという二つのファミリーが出現した。４０００万から５５００万年前において、HERV-FRD及びHERV-K(HML-5)ファミリーは、より高度な霊長類に特異的であった。一方で、その後の５００万から１０００万年前に、新世界猿類の分離後、例えばHERV-W及びHERV-Eファミリーが出現し、それらは狭鼻下目（ヒト上科及びオナガザル科）に特異的であった。
【０００６】
ERV配列はファミリーに従った種々の密度にて全ての染色体に表れ、ERVの物理的近接性とその系統発生上の近接性との間に相関はない。
【０００７】
長い間ERVはパラサイト又は単にDVA老廃物と考えられていた。にもかかわらず、ERVの生物学における衝撃は、ゲノムモデリングにおける参画や、依然支持を続ける有害な再結合に限定されない。
【０００８】
ERVの多彩さ及び構造上の複雑さのため、その発現解析は極めて複雑で困難なものとなる。HERV発現を検知することにより、同一ファミリーにおいて1以上の部位の転写活性が理解される。付加された活性部位は、組織及び／又は事情により変更される。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者は、内在性レトロウイルスエレメントの正確に同定された部位に対応する核酸配列が大腸癌と関連しており、これらの配列が病理学的状態の分子マーカーであることを発見し立証した。同定された配列は、プロウイルス、即ち、長い末端反復(LTRs)における５’及び３’位置でのgag、pol、及びenv遺伝子の全て又は一部、又は、LTRｓの全て又は一部を含む配列である。同定されたDNA配列は、配列表において各々配列番号１から２８５に規定されるものとして参照され、それらの染色体位置は、癌試料と正常試料との間の“発現比”により発現、過剰発現、又は低発現として、下記表(NCBI 36/hg18)において規定されている。拡散発現又は拡散発現における変化が大腸癌組織に特異的である場合、標的組織コラムにおいてシンボル“ｘ”にてこの情報は示される。大腸組織以外の生物学的部分にて、発現又は関連する拡散の発現が決定される場合、このことは間接的に大腸癌の兆候を示す。大腸組織に特異的であると同定されたDNA配列は、配列表において配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列である。大腸組織に特異的でないと同定されたDNA配列は、配列表において配列番号6, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 23, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 10 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 15 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 20 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284及び285に規定される配列である。
【００１０】
【表１】
0006357420.tif 000002
【００１１】
【表２】
0006357420.tif 000003
【００１２】
【表３】
0006357420.tif 000004
【００１３】
【表４】
0006357420.tif 000005
【００１４】
【表５】
0006357420.tif 000006
【００１５】
【表６】
0006357420.tif 000007
【００１６】
【表７】
0006357420.tif 000008
【００１７】
【表８】
0006357420.tif 000009
【００１８】
従って、本願発明の概要は、患者から得られた生物学的試料における大腸癌のインヴィトロ診断又は予後予測方法であって、少なくとも一つの拡散配列の少なくとも一つの発現を検出する工程を有し、前記核酸配列は、配列番号１から２８５に規定される配列から選択され、又は、配列番号１から２８５に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは９９．５％の同一性、より好ましくは９９．６％の同一性、更に好ましくは９９．７％の同一性、を示す配列から選択されることを特徴とする方法である。
【００１９】
前記診断方法により、個々人が病気であるか否かを決定することが可能である。この診断方法により、個々人の生存性及び／又はクオリティオブライフに影響を与える病態の深刻度（グレード及び／又はステージ）を算定することが可能となる。本願発明において診断は迅速である。
【００２０】
ゲノムにおけるヌクレオチド多様性が考慮にいれられて、上述の割合同定が決定される。ヌクレオチド多様性は、繰返し配列を包含していない領域よりも繰返し配列を豊富に包含しているゲノム領域において、上昇することが知られている。例えば、繰返し配列を包含する領域において、ニッカーソンD.A.(1)は、約０．３％(0.32％)の多様性を示した。上記に規定された各々の配列の癌ステージの識別能力は、SAM装置(5)を用い、偽陽性(6)の割合により校正し、２６以下の値を除去する統計学的解析手段により示される。結果として上記同定された各々の配列は、癌症状と通常症状との間の発現において重要な情報を示しますこの結果として、上述した配列の一つについて観察された発現の差は、病態の特徴を意味する。もちろん、参照された配列のいくつか、例えば配列表の配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に示される配列において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２８５までの１以上の組み合わせ、好ましくは配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１８までの１以上の組み合わせ、に示される発現の差を組み合わせることも可能である。
【００２１】
特に、配列番号２、３、及び８に規定される配列を単独で又は組み合わされて（ペアで又は全部で３つにて）、１以上の特徴を好ましく構成される。
【００２２】
このように本発明においては、少なくとも二つの拡散配列の各々の少なくとも二つの発現が検出され、前記核酸配列は、配列番号１から２８５に規定される配列から選択され、又は、配列番号１から２８５に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性、を示す配列から選択される。
【００２３】
本発明にかかる方法の一実施形態では、少なくとも二つの拡散配列の発現が検出され、前記少なくとも二つの拡散配列は大腸組織に特異的であると同定された配列から選択され、即ち、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列から選択され、又は、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列から選択される。
【００２４】
本発明にかかる方法の別の実施形態では、大腸組織に特異的であると同定された配列、即ち、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列から選択され、又は、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列から選択される少なくとも一つの配列の発現が検出され、且つ、大腸組織に特異的でないと同定された配列、即ち、配列番号6, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 23, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 15 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 20 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 25 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284及び285に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列から選択される少なくとも一つの配列の発現が検出される。
【００２５】
特に、本発明にかかる方法では、少なくとも一つの拡散配列、好ましくは二つの拡散配列又は三つの拡散配列、の発現が検出され、前記拡散配列は配列番号２、３、及び８に規定される配列から選択され、又は、配列番号２、３、及び８に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列から選択される。
【００２６】
検出された発現は、少なくとも一つのRNA転写物、特に少なくとも一つのmRNA又は少なくとも一つのポリペプチドである。
【００２７】
発現産物がmRNA転写物の場合、それはハイブリダイゼーション、シークエンス、又は増幅のような好ましい手法により検出される。mRNAは、予め定められた実験条件下でmRNA転写物にハイブリダイズするように設計された少なくとも一つのプローブ及び／又は少なくとも一つのプライマーと接触することにより検出され、これによりmRNAへのハイブリダイゼーションの存在又は不存在が検出され、mRNAの定量化が明確になる。好ましい手法としては、増幅（例えば、RT-PCR、NASBA等）、チップ又は配列へのハイブリダイゼーションがあげられる。mRNAは、cDNAコピーのような転写物から得られる核酸を使用して検出することも可能である。
【００２８】
一般に、本発明にかかる方法は、分析試料からmRNAを抽出する初期工程を包含する。ここでこの方法は以下を包含する。
（i）分析試料からmRNAを抽出する工程、
（ｉｉ）分析試料からmRNAを検出し定量化する工程、
（ｉｉｉ）同一個体における健康体試料である参照試料におけるmRNAを抽出する工程、又は、
（ｉｖ）健康体試料からmRNAを検出し定量化する工程、
（ｖ）参照試料及び分析試料において発現しているmRNAの量を比較する工程、大腸癌の深刻さの診断又は予後予測と相関する健康体参照試料で発現するmRNAの量と異なる分析試料におけるmRNA発現の量の決定が可能である（健康体大腸組織におけるmRNAの量と比較した癌性大腸組織におけるmRNAの量の差は、発現、過剰発現、又は低発現とされる。）。
【００２９】
そして、特には、
（i）試料から分析されるmRNAの抽出、
（ｉｉ）分析されるRNAにおいて、試料中の少なくとも一つのRNA配列、好ましくは試料中の少なくとも二つのRNA配列、の発現レベルの決定、ここでRNA配列は、配列番号１から２８５に規定される配列から選択され、又は、配列番号１から２８５に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性、を示す配列から選択される少なくとも一つの核酸配列及び少なくとも二つの核酸配列の転写物である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において規定されたRNA配列の発現レベルと参照発現レベルとの比較、大腸癌の診断又は予後予測と相関する参照発現レベルと比較して差を示す分析RNAの発現レベルの決定が可能、又は、
（i）分析試料からmRNAを抽出する工程、
（ｉｉ）分析試料からmRNAを検出し定量化する工程、
（ｉｉｉ）参照mRNAの量と比較される分析試料において発現しているmRNAの量を比較する工程、大腸癌の診断又は予後予測と相関する参照mRNAの量と異なる分析試料におけるmRNA発現の量の決定が可能である（参照mRNAの量と比較した分析試料におけるmRNAの量の差は、発現、過剰発現、又は低発現とされる。）。
【００３０】
本発明にかかる方法の一実施形態では、mRNAのDNAコピーが繰り返され、DNAコピーは、ハイブリダイゼーションを許容する所定条件下で、少なくとも一つのプローブ及び／又は少なくとも一つのプライマーと接触し、DNA複製物へのハイブリダイゼーションの存在又は不存在が検出される。
【００３１】
検出される発現産物が、上述した転写物の少なくとも一つの転写産物であるポリペプチドであることも可能である。この場合、発現したポリペプチドは、前記ポリペプチドの少なくとも一つの所定の結合パートナー、特に抗体又は抗体アナログ又はアプタマー、と接触して検出される。結合パートナーは、例えば競合的性質の親和性タンパク（nanofitin（登録商標））である精製された又は抗体アナログである抗体であり、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
【００３２】
ポリクローナル抗体は、適切な免疫原による動物への免疫を行い、続いて精製形態での所定の抗体を復活させ、前記動物の血清を取り出し、抗体により認識される抗原のコラムでの親和性クロマトグラフィにてその他の血清構成物から前記抗体が分離される。
【００３３】
モノクローナル抗体は、概要が下記されるハイブリドーマ技術により得られる。
【００３４】
第一に、動物、概ねマウスが適切な抗原により免疫され、このマウスのBリンパ球が抗原に対して抗体を産生可能となる。これらの抗体-産生リンパ球は“不死”ミエローマ細胞（試料ではネズミ科）と融合してハイブリドーマを産出する。所定の抗体を産生可能で有り且つ無限複製可能な細胞が、得られた細胞の不均一混合物から選択される。各々のハイブリドーマはクローンの形態で複製され、例えばELIZA、一次元又は二次元ウエスタンブロット、免疫蛍光法、又はバイオセンサーといったタンパク質認識試験に使用されるモノクローナル抗体の生産として生じる。このようにして選択されたモノクローナル抗体は、続いて上述した親和性クロマトグラフィ技術により精製される。
【００３５】
モノクローナル抗体は、当業者に公知の技術を用いて遺伝子工学により得られるリコンビナント抗体である。
【００３６】
Nanofitin（登録商標）は、抗体のような生物学的標的に結合可能な小さなタンパク質であり、これにより生体内での標的への結合が探知可能となる。
【００３７】
アプタマーは、所定のリガンドに結合可能な合成オリゴヌクレオチドである。
【００３８】
本発明は、単離された、大腸癌のインヴィトロでの診断又は予後予測のための分子マーカーとしての少なくとも一つの核酸配列の使用にも関し、この核酸配列は下記からなる。
（ｉ）配列番号１から２８５に規定される配列から選択される少なくとも一つのDNA配列、又は、
（ｉｉ）配列番号１から２８５に規定される配列と相補的な少なくとも一つのDNA配列、又は、
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す少なくとも一つのDNA配列、又は、
（ｉｖ）（ｉ）に規定される配列から選択される配列の転写物である少なくとも一つのRNA配列、又は、
（ｖ）（ｉ）に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列から選択される配列の転写物である少なくとも一つのRNA配列
ある実施形態において、下記からなる少なくとも二つの核酸配列が使用される。
（ｉ）配列番号１から２８５に規定される配列から選択され、好ましくは配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７、特に配列番号２、３、及び８、に規定される配列から選択される少なくとも二つのDNA配列、又は、
（ｉｉ）配列番号１から２８５に規定される配列から選択され、好ましくは配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７、特に配列番号２、３、及び８、に規定される配列から選択される少なくとも二つの配列と各々相補的な少なくとも二つのDNA配列、又は、
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）に規定される二つの配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す少なくとも二つのDNA配列、又は、
（ｉｖ）各々が（ｉ）に規定される配列から選択される二つの配列の転写物である少なくとも二つのRNA配列、又は、
（ｖ）（ｉ）に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列から選択される少なくとも二つの配列の転写物である少なくとも二つのRNA配列
本願発明は、患者から得られた生物学的試料における大腸癌のインヴィトロ診断又は予後予測キットにも関し、配列番号１から２８５に規定される配列から、又は、配列番号１から２８５に規定される拡散配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列から、選択される少なくとも一つの拡散配列の少なくとも一つの発現産物に対する少なくとも一つの所定の結合パートナーと、配列番号１から２８５に規定される拡散配列の、又は、配列番号１から２８５に規定される拡散配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す核酸配列の、発現産物の２８５未満の所定の結合パートナーと、を有することを特徴とする。
【００３９】
一つの実施形態においては、キットは、配列番号１から２８５に規定される配列から、又は、配列番号１から２８５に規定される拡散配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列から、選択される少なくとも二つの拡散配列の少なくとも二つの発現産物に対する少なくとも二つの所定の結合パートナーと、配列番号１から２８５に規定される拡散配列の、又は、配列番号１から２８５に規定される拡散配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す核酸配列の、発現産物の２８５未満の所定の結合パートナーと、を有することを特徴とする。
【００４０】
例えば、キットは、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される配列から、又は、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１９、２２、２４、２５、２７、及び９７に規定される拡散配列と少なくとも９９％の同一性を示す配列から、選択される少なくとも二つの拡散配列の発現産物に対する少なくとも二つの所定の結合パートナーを有する。
【００４１】
特に、キットは、配列番号２、３、及び８に規定される核酸配列の、又は、配列番号２、３、及び８に規定される拡散配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列の、発現産物の２又は３の所定の結合パートナーを有する。
【００４２】
発現産物の所定の結合パートナー上記に規定されている。
【００４３】
本願発明は、大腸癌の治療及び／又は予後予測の有効性評価方法にも関し、この方法は、生物学的試料を得る工程と、前記生物学的試料の少なくとも一つの拡散配列の少なくとも一つの発現を検出する工程と、を有し、前記核酸配列は、配列番号１から２８５に規定される配列から選択され、又は、配列番号１から２８５に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列から選択される。
【００４４】
一つの実施形態において、少なくとも二つの拡散配列の発現が検出され、前記二つの拡散配列は配列番号１から２８５に規定される配列から選択され、又は、配列番号１から２８５に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列から選択される。
【００４５】
別の実施形態において、少なくとも一つの核酸配列、好ましくは少なくとも二つの拡散配列又は三つの核酸配列の発現産物が検出され、前記拡散配列は配列番号２、３、及び８に規定される配列から選択され、又は、配列番号２、３、及び８に規定される配列と少なくとも９９％の同一性、好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．６％の同一性、少なくとも９９．７％の同一性を示す配列から選択される。
【００４６】
用語“生物学的試料”は、組織、液体、細胞やアポトーシス体のような前記組織及び液体の組み合わせ、及び、所定のエクソソーム及び微小胞を有する老廃小胞を意味する。実験例では、生物学的試料は、大腸癌に罹患した疑いのある患者の大腸からのバイオプシー、又は、転位を示す患者の大腸以外の組織からのバイオプシーにより得られる。第２のケースでは、核酸（分子マーカー）の発現変化が大腸組織に特異的である場合、原発性癌、即ち大腸癌であると判断することが可能である。生物学的試料は、血液、血液画分（血清、血漿）、尿、唾液、脳脊髄液、リンパ、母乳、精液、及びこれらの混合物、特に上記で規定された老廃小胞、のような生物学的液体である。例えば、上皮細胞から由来する、エクソソーム又は微小胞における大腸組織に特異的な転写物の検出により、組織レベルでの試料の検出を行うこと無しに、原発性癌又は転位癌の存在を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図1及び図２は、HERV配列に対する大腸癌での発現差を示す。より詳細には、図１（クラスタリング）は調査手法による全てのコントロール組織と比較した大腸癌に関連する発現指向を有するHERVエレメントのまとめ図である。
【図２】図２は正常大腸と腫瘍大腸との間のHERVエレメントの発現の差を示す統計図を示す。
【図３】図３は、二つの生物学的液体：尿及び血清におけるHERV配列の検出を示す。
【図４】図４は、二つの生物学的液体：尿及び血清におけるHERV配列の検出を示す。
【図５】図５は、２８の大腸腫瘍及び１８の健康大腸組織において、配列番号２、３、及び８における定量的RT-PCRにより観察された発現結果を示し、特に、大腸腫瘍試料無しでの検出を増大させるこれらの結合による利点を示す。
【実施例】
【００４８】
実施例１：大腸癌の発現差を示すHERV配列の同定
方法：
大腸癌において発現差をHERV配列の同定は、本件発明者によって設計され、Affymetrix会社によって製造されたHERV-V2と呼ばれるGeneChipフォーマットでの高密度DNAチップの設計及び使用に基づく。このチップは、ヒトゲノムの中で識別されるHERV配列に対応するプローブを含有する。これらの配列は、機能的領域（LTR,gag,pol,及びenv）に切断された原型的参照を使用することにより同定され、次に、ヒトゲノム全体(NCBI 36/hg18)のスケールにて同様の調査により、10035の識別性のあるHERV部位が同定され、HERVgDB3と呼ばれるデータバンクにて注釈と共にグループ化された。チップを構成する一部であり、不要な標的とのハイブリダイゼーションの危険性を有しているプローブは、HERVgDB3の基礎として規定され、ハイブリダイゼーションの所定基準の適用の際に創造過程から選択された。このため、HERVgDB3配列は、最初は２５のオーバーラップする核酸（25-mers）のセットして分断され、候補プローブのセットとなった。ついで各々の候補プローブに対して、KASHアルゴリズム(2)を使用してヒトゲノム全体の配列につき実行して、非特異的ハイブリダイゼーションの危険性が評価された。実験スコアにより、数のインパクトに付加して、アライメントにおけるエラー位置及びタイプのハイブリダイゼーションの結果が作成された。このスコア値は標的／プローブハイブリダイゼーションポテンシャルと相関する。ヒトゲノム全体についての候補プローブの全てのハイブリダイゼーションポテンシャルについての知識により、その捕捉特性を評価することが可能となる。良好な捕捉親和性を示す候補プローブが保持され、ついで“プローブセット”とともにグループ分けされ、最終的にHERV-V2チップにて合成された。HERV-V2高密度チップを用いる分析試料は、腫瘍から抽出されたRNAに対応し、これらの腫瘍に隣接する健康体組織から抽出されたRNAにも対応する。分析された組織は、胸部、卵巣、子宮、前立腺、肺、睾丸、及びコントロールとしての胎盤とともに、大腸である。胎盤のケースでは、健康体組織のみが使用された。各々の試料において、WTOに公知の増幅プロトコールを使用して、cDNAの合成に50ngのRNAが使用された。WTO増幅の原理は以下に示すものである。即ち、線形一重螺旋増幅表示SPIAによりリバース転写工程の前に、ランダムプライマー、及びRNA転写物の３’末を標的とするプライマー、が加えられた。ついでcDNAがアッセイされ、キャラクタライズされ、精製され、２μｇが分画され、ターミナルトランスフェラーゼ酵素の作用により３’末にビオチンがラベルされる。このように準備された標的産物は、コントロールオリゴヌクレオチドと混合され、ついでAffymetrix社により推奨されるプロトコルに従って、ハイブリダイゼーションが実行される。ついで蛍光可視化されるために、チップが標識化され読み込まれる。標準コントロールに基づく定量コントロールが実行され、一連のインジケータ（MAD、MAD-Medプロット、RLE）が統計分析に従わないチップを排除する。
【００４９】
チップの分析は、トリプトファンプローブのシグナル強度に基づくバックグランドノイズの校正を通してのデータの前処理、ついで変位置に基づくRNA規格化(3)からなるついで実験のバッチにリンクした効果の二重校正が、観察される発現の差異が生物学的であり技術由来のものではないことを示すため、COMBAT法(4)により実行される。この段階では、ユークリッド分割（クラスタリング）によるデータをグルーピングするツールを用いてデータの調査分析が行われ、最終的に、組織の正常状態と腫瘍状態との間の発現差を示す配列を求めるため、偽陽性比による校正(6)の後にSAM過程を用いる統計分析及び２６以下の値の排除がなされる。
【００５０】
結果：
この手法を用いるHERV-V2DNAチップの分析により産生されるデータ処理により、正常大腸と腫瘍大腸との間の重大な発現差を統計的に示す一連の“プローブセット”を同定することが可能となった。クラスタリングの結果とコントロール試料内の発現差の探索により、腫瘍大腸と関連した発現差を有するHERVエレメントを証明した。
【００５１】
腫瘍大腸における発現差を示すHERVエレメントのヌクレオチド配列は、配列番号１から２８５に示す配列により同定され、各々の配列の染色体位置はNCBI文献36/hg18により与えられ、“標的組織”情報（クロス）は、正常大腸と腫瘍大腸との間の比較（コントロール組織内の比較と比べて）においてのみ観察される差異ある発現が観察されるエレメントを示す。正常状態と腫瘍状態との間の発現比を表示する値が与えられる。
【００５２】
実施例２：生物学的液体におけるHERV配列の検出
方法：
本発明者は、HERV配列が生物学的液体中に検出されることを示したが、これにより、とりわけ、原発組織の離隔検出へのリコースによる大腸癌を特徴付けることが可能となった。研究は、異なる個々人から提供された２０の尿試料及び３８の血清試料にて実行された。
【００５３】
血清及び尿は下記の条件にて遠心分離された。
【００５４】
血清：４℃にて10分間500ｇ。上清が回復され４℃にて20分間16500ｇにて再度遠心分離された。細胞を欠損しているが、エクソソーム、微小胞、核酸、及びタンパク質を含有するこの２回目の遠心分離の上清がチップにて分析された。チップは、前述したモードに従って使用されたHERV-V2DNAチップである。
【００５５】
尿：収集後、４℃にて４分間800ｇ。ペレットがRNA protect cell reagent(登録商標)にてリカバーされた。ついで、ペレットへの溶解バッファーの添加の前に、５分間5000ｇにて遠心分離が行われた。チップは、前述したモードに従って使用されたHERV-V2DNAチップである。
【００５６】
結果：
上記表に記載されている配列に対応する発現シグナルを含む、多数の陽性シグナルが、図３及び図４に示されるように、血清上清及び尿由来の細胞ペレットにおいて検出された。このことにより、特に血清や尿といった生物学的液体が、HERV配列の検出にとっての生物学的材料として有益なソースであることが確認される。
【００５７】
実施例３：大腸癌検出において、２又は３のHERV配列の組み合わせの利点の実証
方法：
２８の大腸癌(CT1, CT2, CT3, CT65, CT94, CC1, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9, CC10, 549T, 551T, 553T, 556T, 558T, 559T, 560T, 561T, 601T, 602T, 604T, 607T及び615T)由来のRNAと、１８の健康な大腸組織(CN1, CN2, CN3, CN64, CN93, 549N, 551N, 553N, 556N, 558N, 559N, 560N, 561N, 601N, 602N, 604N, 607N及び615N)とが抽出され、２又は３のHERV配列の発現結果の組み合わせにより大腸癌試料における検出の増加が可能となることが実証された。
【００５８】
配列番号２の領域1723-1824、配列番号３の領域1540-1665、及び配列番号８の領域1684-1923に対応する定量的RT-PCR増幅が、研究対象の４６試料の全てにつき実行された。HERV配列発現の結果がデルタCt方法を用いて処理され、GAPDHハウスキーピング遺伝子の発現結果により規格化された。その結果が図５に示された。
【００５９】
結果：
配列番号２の領域1723-1824の定量的RT-PCR増幅は、１１の大腸癌試料(CT3, CT94, CC1, CC2, 558T, 559T, 560T, 561T, 602T, 604T及び607T)にて陽性である。この領域の検出は、健康な大腸組織試料では観察されなかった。
【００６０】
配列番号３の領域1540-1665の定量的RT-PCR増幅は、６の大腸癌試料(CT1, CT3, CT94, CC5, CC8及びCC10)にて陽性である。この領域の検出は、健康な大腸組織試料では観察されなかった。
【００６１】
配列番号８の領域1684-1923の定量的RT-PCR増幅は、４の大腸癌試料(CT3, CC2, CC6及びCC10)にて陽性である。この領域の検出は、健康な大腸組織試料では観察されなかった。
【００６２】
加えて、配列番号２の領域1723-1824の検出及び配列番号３の領域1540-1665の検出を考慮に入れることにより、１５の大腸癌試料(CT1, CT3,CT94, CC1, CC2, CC5, CC8, CC10, 558T, 559T, 560T, 561T, 602T, 604T and 607T)のカバレッジが許容され、これにより三つを使用する場合と比較して二つのHERV配列の組み合わせの感度が示された。
【００６３】
配列番号２の領域1723-1824の検出及び配列番号８の領域1684-1923の検出を考慮に入れることにより、１３の大腸癌試料(CT3, CT94, CC1, CC2, CC6, CC10, 558T, 559T, 560T, 561T, 602T, 604T及び607T)のカバレッジが許容され、これによりこれらのHERV配列を使用する場合と比較して二つのHERV配列の組み合わせの感度が示された。
【００６４】
配列番号３の領域1540-1665の検出及び配列番号８の領域1684-1923の検出を考慮に入れることにより、８の大腸癌試料(CT1, CT3, CT93, CC2, CC5, CC6, CC8及びCC10)のカバレッジが許容され、これによりこれらのHERV配列を使用する場合と比較して二つのHERV配列の組み合わせの感度が示された。
【００６５】
最後に、配列番号２の領域1723-1824の検出、配列番号３の領域1540-1665の検出及び配列番号８の領域1684-1923の検出を考慮に入れることにより、１６の大腸癌試料(CT1, CT3, CT94, CC1, CC2, CC5, CC6, CC8, CC10, 558T, 559T, 560T, 561T, 602T, 604T及び607T)のカバレッジが許容され、これによりこれらのHERV配列を使用する場合と比較して三つのHERV配列の組み合わせの感度が示された。
【００６６】
参考文献
1. Nickerson,D.A., Taylor,S.L., Weiss,K.M., Clark,A.G., Hutchinson,R.G., Stengard,J., Salomaa,V., Vartiainen,E., Boerwinkle,E. and Sing,C.F. (1998) DNA sequence diversity in a 9.7-kb region of the human lipoprotein lipase gene. Nat. Genet., 19, 233-240.
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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