(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のポリヌクレオチドを含む植物プロトプラストを単離することを含む、植物細胞の集団から植物を産生する方法であって、
目的のポリヌクレオチドと、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）と、蛍光マーカーとを含む少なくとも１つのプロトプラストを有する植物プロトプラストの集団を用意する工程であって、前記集団には、前記蛍光マーカーを含みかつ前記目的のポリヌクレオチドを含まない植物プロトプラストが実質的になく、前記植物プロトプラストは、アルギン酸ナトリウムによってカプセル化される、工程；
前記目的のポリヌクレオチドと前記蛍光マーカーとを含む前記少なくとも１つのプロトプラストを、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて前記集団内の残りの植物プロトプラストから分離し、それによって前記目的のポリヌクレオチドを含む植物プロトプラストを単離する工程；
前記単離された植物プロトプラストから植物を再生させる工程；および
前記植物を栽培する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記蛍光マーカーが、前記植物プロトプラスト中のポリヌクレオチドから発現される蛍光ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物プロトプラストの集団が、植物組織から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記目的のポリヌクレオチド、および前記蛍光マーカーをコードするポリヌクレオチドが、前記目的のポリヌクレオチドと前記蛍光マーカーとを含む前記少なくとも１つのプロトプラストを形質転換させるために使用される核酸分子内に両方とも存在した、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記目的のポリヌクレオチド、および前記蛍光マーカーをコードするポリヌクレオチドが、前記目的のポリヌクレオチドと前記蛍光マーカーとを含む前記少なくとも１つのプロトプラストのゲノム内に組み込まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記目的のポリヌクレオチド、および前記蛍光マーカーをコードするポリヌクレオチドが、前記少なくとも１つのプロトプラストのゲノム内に部位特異的に組み込まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記目的のポリヌクレオチド、および前記蛍光マーカーをコードするポリヌクレオチドが、ジンクフィンガーヌクレアーゼを利用することによって部位特異的に組み込まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
トランスジェニック植物の生産方法であって、
目的のポリヌクレオチドと蛍光マーカーとを含む少なくとも１つのプロトプラストを有する植物プロトプラストの集団を用意する工程であって、前記少なくとも１つのプロトプラストはジンクフィンガーヌクレアーゼを含むので、前記目的のポリヌクレオチドは、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位で相同組換えによって前記少なくとも１つの植物プロトプラストのゲノム内に組み込まれることが可能であり；および前記植物プロトプラストはアルギン酸ナトリウムによってカプセル化される、工程；
前記目的のポリヌクレオチドと前記蛍光マーカーとを含む前記少なくとも１つのプロトプラストを、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて前記集団内の残りのプロトプラストから分離する工程；
前記少なくとも１つのプロトプラストから前記トランスジェニック植物を再生させる工程；および
前記トランスジェニック植物を栽培する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年９月７日出願の米国特許仮出願第６１／６９７，８９０号の恩典の優先権を主張するものである。
【０００２】
本開示は、植物を産生するための蛍光活性化細胞選別の分野に関する。好ましい実施形態において、本開示は、稔性編集植物を産生するための、編集された再生可能なプロトプラストのＦＡＣＳ濃縮を記載する。
【背景技術】
【０００３】
蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）は、生細胞のフローサイトメトリーおよび細胞選別を行うためにボナー（Bonner）、スウィート（Sweet）、ヒュレット（Hulett）、ハーツェンバーグ（Herzenberg）およびその他によって１９６０年代後半に発明された。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍが、１９７０年代初期にその商用機を売り出した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、専門化されたタイプのフローサイトメトリーである。ＦＡＣＳは、生物細胞の異種混合物を、各細胞の特異的光散乱および蛍光特性に基づいて１度に１細胞ずつ２つまたはそれ以上の容器に選別する方法をもたらす。ＦＡＣＳは、特に興味のある細胞の物理的分離ばかりでなく、個々の細胞からの蛍光シグナルの高速、客観的かつ定量的記録ももたらすので、有用な科学機器である。
【０００４】
細胞浮遊液は、狭い、急速に流れている液体流の中央で飛沫同伴される。その流量は、細胞間にそれらの直径に関して大きな隔たりがあるように計画される。振動メカニズムが細胞の流れを個々の液滴に分断させる。このシステムは、液滴１つに１個より多くの細胞という低い確率になるように調整される。その流れが液滴に分断される直前に、その流動体は蛍光測定ステーションを通過し、そこで各細胞についての目的の蛍光特性が測定される。流れが液滴に分断されるまさにその地点に帯電リングが配置される。直前の蛍光強度測定に基づいてそのリングに電荷がかけられ、液滴が流れから外れるとその液滴上に反対の電荷が捕捉される。その後、それらの荷電した液滴は、静電偏向システムを通って落下し、そのシステムが液滴をそれらの電荷に基づいて容器内に方向転換させる。一部のシステムでは、電荷が流れに直接印加され、外れる液滴はその流れと同じ符号の電荷を保持する。その場合、その流れは、液滴が外れた後、中性に戻される。
【０００５】
広範な発蛍光団をフローサイトメトリーにおいて標識として使用することができる。発蛍光団、または簡単に「蛍光体」は、細胞上または内の標的特徴部を認識する抗体に典型的に連結される。それらは、細胞膜または別の細胞構造に対して親和性を有する化学物質に連結されることもある。各発蛍光団は、特徴的なピーク励起および発光波長を有し、発光スペクトルは、オーバーラップすることが多い。その結果、使用することができる標識の組み合わせは、蛍光色素を励起させるために使用されるランプ（単数もしくは複数）またはレーザー（単数もしくは複数）の波長に、および利用できる検出器に依存する。
【０００６】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、細胞の異種混合物からの蛍光タグが付いた多数の細胞の迅速な単離手段をもたらす。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカー遺伝子の細胞タイプ特異的発現があるトランスジェニック植物のコレクションは、個々の細胞タイプのＦＡＣＳ利用研究にうってつけである。
【０００７】
植物プロトプラストのフローサイトメトリー解析および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が実施可能であることは実証されており、さらに、この技法は、多数の異なる研究分野において価値のある結果をもたらしてきた（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。例えば、組織特異的蛍光タンパク質マーカーを発現するシロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物からのプロトプラストのＦＡＣＳは、特定の細胞タイプにおける基本転写プロファイルと環境刺激転写プロファイルの両方を調査するために使用されており（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）、ならびにフローサイトメトリーは、反応性酸素種生産およびプログラム細胞死タバコプロトプラスト（タバコ（Nicotiana tabacum））を解析するために利用されている（非特許文献８）。蛍光ツールの幅広い選択を植物における過多な生理学的パラメータの解析に利用でき、例えば、蛍光タンパク質に融合したｃｉｓ調節要素（非特許文献９）、遺伝的にコードされた分子センサー（非特許文献１０）または色素ベースのセンサー（非特許文献１１）をサイトメトリーと併用して様々な生物学的過程を測定することができる。しかし、アッセイの感度のためこの方法にはある種の効率の悪さが伴い、改善の余地がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Harkins and Galbraith, 1984
【非特許文献２】Galbraith et al, 1995
【非特許文献３】Sheen et al, 1995
【非特許文献４】Birnbaum et al., 2003
【非特許文献５】Brady et al., 2007
【非特許文献６】Gifford et al., 2008
【非特許文献７】Dinneny et al, 2008
【非特許文献８】Lin et al, 2006
【非特許文献９】Haseloff and Siemering, 2006
【非特許文献１０】Looger et al, 2005
【非特許文献１１】Haugland, 2002
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、以下を提供する。
［１］目的のポリヌクレオチドを含む植物プロトプラストを単離することを含む、植物細胞の集団から植物を産生する方法であって、
目的のポリヌクレオチドと蛍光マーカーとを含む少なくとも１つのプロトプラスト有する植物プロトプラストの集団を用意する工程（ここで、上記集団には、上記蛍光マーカーを含みかつ上記目的のポリヌクレオチドを含まない植物プロトプラストが実質的になく、上記植物プロトプラストは、アルギン酸ナトリウムによってカプセル化される）；
上記目的のポリヌクレオチドと上記蛍光マーカーとを含む上記少なくとも１つのプロトプラストを、上記集団内の残りの植物プロトプラストから分離し、それによって上記目的のポリヌクレオチドを含む植物プロトプラストを単離する工程；
上記単離された植物プロトプラストから植物を再生させる工程；および
上記植物を栽培する工程
を含む方法。
［２］上記少なくとも１つのプロトプラストを分離する工程が、フローサイトメトリーの利用を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］上記少なくとも１つのプロトプラストを分離する工程が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の利用を含む、上記［１］に記載の方法。
［４］上記蛍光マーカーが、上記植物プロトプラスト中のポリヌクレオチドから発現される蛍光ポリペプチドである、上記［１］に記載の方法。
［５］上記目的のポリヌクレオチドが、目的のポリペプチドをコードする、上記［１］に記載の方法。
［６］上記目的のポリペプチドが、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、上記［５］に記載の方法。
［７］上記植物プロトプラストの集団が、植物組織から得られる、上記［１］に記載の方法。
［８］上記目的のポリヌクレオチドと上記蛍光マーカーとを含む複数のプロトプラストを分離する工程を含む、上記［１］に記載の方法。
［９］上記植物が、単子葉植物または双子葉植物である、上記［１］に記載の方法。
［１０］植物プロトプラストを単離することによって再生された植物であって、上記植物プロトプラストが、上記植物プロトプラストのゲノムに組み込まれた目的のポリヌクレオチドを含み、その方法が、
目的のポリヌクレオチドと蛍光マーカーとを含む少なくとも１つのプロトプラストを有する植物プロトプラストの集団を用意する工程（ここで、上記植物プロトプラストはアルギン酸ナトリウムによってカプセル化される）；
上記目的のポリヌクレオチドと上記蛍光マーカーとを含むプロトプラストの上記集団からマイクロカルスを回収する工程（ここで、上記少なくとも１つのプロトプラストは、上記目的のポリヌクレオチドと、上記目的のポリヌクレオチドで形質転換された蛍光マーカーと、上記蛍光マーカーをコードするポリヌクレオチドとを含む）；
上記マイクロカルスから植物を再生させる工程；および
上記植物を栽培する工程
を含む、上記植物。
［１１］上記目的のポリヌクレオチド、および上記蛍光マーカーをコードするポリヌクレオチドが、上記目的のポリヌクレオチドと上記蛍光マーカーとを含む上記少なくとも１つのプロトプラストを形質転換させるために使用される核酸分子内に両方とも存在した、上記［９］に記載の方法。
［１２］上記目的のポリヌクレオチド、および上記蛍光マーカーをコードするポリヌクレオチドが、上記目的のポリヌクレオチドと上記蛍光マーカーとを含む上記少なくとも１つのプロトプラストのゲノム内に組み込まれる、上記［９］に記載の方法。
［１３］上記目的のポリヌクレオチド、および上記蛍光マーカーをコードするポリヌクレオチドが、上記少なくとも１つのプロトプラストのゲノム内に部位特異的に組み込まれる、上記［１２］に記載の方法。
［１４］上記目的のポリヌクレオチド、および上記蛍光マーカーをコードするポリヌクレオチドが、ジンクフィンガーヌクレアーゼを利用することによって部位特異的に組み込まれる、上記［１３］に記載の方法。
［１５］トランスジェニック植物の生産方法であって、
目的のポリヌクレオチドと蛍光マーカーとを含む少なくとも１つのプロトプラストを有する植物プロトプラストの集団を用意する工程（ここで、上記少なくとも１つのプロトプラストは部位特異的ヌクレアーゼを含むので、上記目的のポリヌクレオチドは、上記部位特異的ヌクレアーゼの認識部位で相同組換えによって上記少なくとも１つの植物プロトプラストのゲノム内に組み込まれることが可能であり；および上記植物プロトプラストはアルギン酸ナトリウムによってカプセル化される）；
上記目的のポリヌクレオチドと上記蛍光マーカーとを含む上記少なくとも１つのプロトプラストを、上記集団内の残りのプロトプラストから分離する工程；
上記少なくとも１つのプロトプラストから上記トランスジェニック植物を再生させる工程；および
上記トランスジェニック植物を栽培する工程
を含む方法。
［１６］上記目的のポリヌクレオチドによってコードされる目的のポリペプチドを生産する、上記［１５］に記載の方法によって生産される植物。
［１７］上記目的のポリヌクレオチドによって付与された付加価値形質を含む、上記［１５］に記載の方法によって生産される植物。
［１８］ＦＡＣＳ選別、培養／最適化および再生、植物を栽培する（culture plant）、種子を回収する（recover seed）を含む、種子の生産方法。
本開示の特定の実施形態は、目的のポリヌクレオチドを利用して植物プロトプラストを単離することにより、植物細胞の集団から植物を産生する方法であって、目的のポリヌクレオチドと蛍光マーカーとを含む少なくとも１つのプロトプラスト有する植物プロトプラストの集団を用意する工程（ここで、前記集団には、前記蛍光マーカーを含みかつ前記目的のポリヌクレオチドを含まない植物プロトプラストが実質的になく、前記植物プロトプラストは、アルギン酸ナトリウムによってカプセル化される）；前記目的のポリヌクレオチドと前記蛍光マーカーとを含む前記少なくとも１つのプロトプラストを、前記集団内の残りの植物プロトプラストから分離し、それによって前記目的のポリヌクレオチドを含む植物プロトプラストを単離する工程；前記単離された植物プロトプラストから植物を再生させる工程；および前記植物を栽培する工程による方法に関する。
【００１０】
本発明の別の実施形態には、植物プロトプラストを単離することにより再生された植物であって、前記プロトプラストが、その植物プロトプラストのゲノムに組み込まれた目的のポリヌクレオチドを含むものであり、目的のポリヌクレオチドと蛍光マーカーとを含む少なくとも１つのプロトプラストを有する植物プロトプラストの集団を用意する工程（ここで、前記植物プロトプラストはアルギン酸ナトリウムによってカプセル化される）；前記目的のポリヌクレオチドと前記蛍光マーカーとを含むプロトプラストの前記集団からマイクロカルスを回収する工程（ここで、前記少なくとも１つのプロトプラストは、前記目的のポリヌクレオチドと、前記目的のポリヌクレオチドで形質転換された蛍光マーカーと、前記蛍光マーカーをコードするポリヌクレオチドとを含む）；前記マイクロカルスから植物を再生させる工程；および前記植物を栽培する工程により再生された植物があり得る。
【００１１】
代替実施形態は、トランスジェニック植物の生産方法を含み、前記方法は、目的のポリヌクレオチドと蛍光マーカーとを含む少なくとも１つのプロトプラストを有する植物プロトプラストの集団を用意する工程（ここで、前記少なくとも１つのプロトプラストは部位特異的ヌクレアーゼを含むので、前記目的のポリヌクレオチドは、その部位特異的ヌクレアーゼの認識部位で相同組換えによってその少なくとも１つの植物プロトプラストのゲノム内に組み込まれることが可能であり；および前記植物プロトプラストはアルギン酸ナトリウムによってカプセル化される）；前記目的のポリヌクレオチドと前記蛍光マーカーとを含む前記少なくとも１つのプロトプラストを、前記集団内の残りのプロトプラストから分離する工程；前記少なくとも１つのプロトプラストから前記トランスジェニック植物を再生させる工程；および前記トランスジェニック植物を栽培する工程を含むことができる。
【００１２】
上述の特徴および他の特徴は、添付の図面を参照しながら進める、いくつかの実施形態についての下記の詳細な説明からさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ２遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ２遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ２遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ２遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ２遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、近隣結合距離に基づいてＪＡＬＶＩＥＷ（登録商標）ｖ２．３を使用して生成したＦＡＤ２遺伝子配列の系統樹を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｇ】図３Ｇは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｈ】図３Ｈは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｉ】図３Ｉは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｊ】図３Ｊは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｋ】図３Ｋは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｌ】図３Ｌは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｍ】図３Ｍは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｎ】図３Ｎは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｏ】図３Ｏは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｐ】図３Ｐは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｑ】図３Ｑは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｒ】図３Ｒは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｓ】図３Ｓは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｔ】図３Ｔは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｕ】図３Ｕは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｖ】図３Ｖは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｗ】図３Ｗは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｘ】図３Ｘは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｙ】図３Ｙは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｚ】図３Ｚは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ａ−】図３Ａ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｂ−】図３Ｂ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｃ−】図３Ｃ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｄ−】図３Ｄ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｅ−】図３Ｅ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｆ−】図３Ｆ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｇ−】図３Ｇ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｈ−】図３Ｈ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｉ−】図３Ｉ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｊ−】図３Ｊ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｋ−】図３Ｋ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｌ−】図３Ｌ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図３Ｍ−】図３Ｍ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図４】図４は、近隣結合距離に基づいてＪＡＬＶＩＥＷ（登録商標）ｖ２．３を使用して生成したＦＡＤ３遺伝子配列の系統樹を示す。名づけられた配列は、次のように対応する：本出願を通してＦＡＤ３Ａ’／Ａ’’をＦＡＤ３Ａ’と記載する；本出願を通してハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）２をＦＡＤ３Ｃ’と記載する；本出願を通してハプロタイプ１をＦＡＤ３Ｃ’’と記載する；および本出願を通してハプロタイプ３をＦＡＤ３Ａ’’と記載する。
【図５】図５は、代表的ジンクフィンガーヌクレアーゼ発現カセットであるｐＤＡＢ１０４０１０のプラスミドマップを示す。この構築物のレイアウトは、他のＺＦＮ発現カセットに類似しており、この場合、ジンクフィンガードメイン、２４８２８および２４８２９を上に記載されている代替ジンクフィンガードメインと交換した。
【図６】図６は、１０，０００配列リードあたりの標的ＺＦＮ部位に欠失がある配列リードの数を示す複数ラインの折れ線グラフの例である。グラフ上のＸ軸は、欠失された塩基の数を示し、Ｙ軸は、配列リードの数を示し、およびＺ軸は、グラフの右に記載されているとおりのカラーコード化されたサンプルの正体を示す。示されている具体的なサンプルは、３つの標的ＺＦＮ部位、Ａ、ＢおよびＣと、４つの遺伝子ファミリーメンバー、ならびに対照サンプルＡおよびＢとして評定した２つの対照トランスフェクションを含有する、ＦＡＤ２遺伝子ファミリーの遺伝子座１についてのものである。
【図７Ａ】図７Ａは、図軸の詳細は、図６のとおりである。この図は、ＦＡＤ２遺伝子ファミリーの遺伝子座４を標的にするＺＦＮからのデータを表示するものである。前記遺伝子座は、２つのＺＦＮ部位および２つの必要対照トランスフェクションを含有する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＦＡＤ２ＡおよびＣ遺伝子座のシークエンシングにより単一塩基欠失の観察増加につながる、Ｃ、ＴおよびＧの三塩基リピートを含有するＦＡＤ２ＡおよびＣを同定する、ＺＦＮ標的部位を包囲する特異的配列構成（配列番号４７１−４８０）。
【図８】図８は、ｐＤＡＳ０００１３０のプラスミドマップを示す。
【図９】図９は、ｐＤＡＳ０００２７１のプラスミドマップを示す。
【図１０】図１０は、ｐＤＡＳ０００２７２のプラスミドマップを示す。
【図１１】図１１は、ｐＤＡＳ０００２７３のプラスミドマップを示す。
【図１２】図１２は、ｐＤＡＳ０００２７４のプラスミドマップを示す。
【図１３】図１３は、ｐＤＡＳ０００２７５のプラスミドマップを示す。
【図１４】図１４は、ｐＤＡＳ００００３１のプラスミドマップを示す。
【図１５】図１５は、ｐＤＡＳ００００３６のプラスミドマップを示す。
【図１６】図１６は、ｐＤＡＳ００００３７のプラスミドマップを示す。
【図１７】図１７は、ＥＴＩＰおよびペイロード核酸配置、ならびに植物細胞ゲノムにおけるＥＴＩＰ部位での標的ペイロードの産物を図示する。
【図１８】図１８は、プロトプラストの形質転換、続いて、３’および５’両末端での短縮型スコアリング可能かつ選択可能マーカーの再構築を用いる宿主系統におけるＥＴＩＰでの標的ペイロードＤＮＡのＦＡＣＳ選択を図示する。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｐＤＡＳ００００７４またはｐＤＡＳ００００７５）によるゲノム遺伝子座の二本鎖ＤＮＡ切断およびカノーラ染色体のＥＴＩＰ遺伝子座へのＤｓ−ｒｅｄドナー（ｐＤＡＳ００００６８、ｐＤＡＳ００００７０、またはｐＤＡＳ００００７２）のその後の組み込みの結果として生ずる、ＥＴＩＰカノーラ事象の相同性指向型修復（homology directed repair）を図示する。前記ドナーの前記ゲノム遺伝子座への組み込みは、十分に機能する高発現性のＤｓ−ｒｅｄ導入遺伝子をもたらす。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｐＤＡＳ００００７４またはｐＤＡＳ００００７５）によるゲノム遺伝子座の二本鎖ＤＮＡ切断およびカノーラ染色体のＥＴＩＰ遺伝子座へのＤｓ−ｒｅｄドナー（ｐＤＡＳ００００６８、ｐＤＡＳ００００７０、またはｐＤＡＳ００００７２）のその後の組み込みの結果として生ずる、ＥＴＩＰカノーラ事象の相同性指向型修復（homology directed repair）を図示する。前記ドナーの前記ゲノム遺伝子座への組み込みは、十分に機能する高発現性のＤｓ−ｒｅｄ導入遺伝子をもたらす。
【図２０】図２０は、カノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別と、ｐＤＡＳ００００３１（「ｐＤＡＳ３１」）でトランスフェクトされたカノーラプロトプラストの算出トランスフェクション効率とを示す。加えて、形質転換されていないカノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別結果を陰性対照として提供する。
【図２１】図２１は、カノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別と、ｐＤＡＳ００００６４／ｐＤＡＳ００００７４（上のグラフ）およびｐＤＡＳ００００６４／ｐＤＡＳ００００７５（下のグラフ）でトランスフェクトされたカノーラＥＴＩＰプロトプラスト事象の算出トランスフェクション効率とを示す。
【図２２】図２２は、カノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別と、ｐＤＡＳ００００６８／ｐＤＡＳ００００７４（上のグラフ）およびｐＤＡＳ００００６８／ｐＤＡＳ００００７５（下のグラフ）で形質転換されたカノーラＥＴＩＰプロトプラスト事象の算出トランスフェクション効率とを示す。
【図２３】図２３は、カノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別と、ｐＤＡＳ００００７０／ｐＤＡＳ００００７４（上のグラフ）およびｐＤＡＳ００００７０／ｐＤＡＳ００００７５（下のグラフ）で形質転換されたカノーラＥＴＩＰプロトプラスト事象の算出トランスフェクション効率とを示す。
【図２４】図２４は、カノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別と、ｐＤＡＳ００００７２／ｐＤＡＳ００００７４（上のグラフ）およびｐＤＡＳ００００７２／ｐＤＡＳ００００７５（下のグラフ）で形質転換されたカノーラＥＴＩＰプロトプラスト事象の算出トランスフェクション効率とを示す。
【図２５】図２５は、ｐＤＡＳ００００７４のプラスミドマップを示す。
【図２６】図２６は、ｐＤＡＳ００００７５のプラスミドマップを示す。
【図２７】図２７は、ｐＤＡＳ００００６４のプラスミドマップを示す。
【図２８】図２８は、ｐＤＡＳ００００６８のプラスミドマップを示す。
【図２９】図２９は、ｐＤＡＳ００００７０のプラスミドマップを示す。
【図３０】図３０は、ｐＤＡＳ００００７２のプラスミドマップを示す。
【図３１】図３１は、導入遺伝子コピー数推定アッセイのための導入遺伝子標的プライマーおよびプローブの結合部位を示す概略図である。
【図３２】図３２は、ＦＡＤ２Ａ  ＺＦＮ  ＤＮＡ認識ドメイン（ｂｃ１２０７５＿Ｆａｄ２ａ−ｒ２７２ａ２およびｂｃ１２０７５＿Ｆａｄ２ａ−２７８ａ２）、ならびにＺＦＮ特異的プライマーの結合部位（ＦＡＤ２Ａ．ＵｎＥ．Ｆ１およびＦＡＤ２Ａ．ＵｎＥ．Ｒ１）および内在性プライマーの結合部位（ＦＡＤ２Ａ／２Ｃ．ＲＢ．ＵｎＥ．Ｆ１およびＦＡＤ２Ａ／２Ｃ．ＲＢ．ＵｎＥ．Ｒ１）を示す、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）ファイルを示す。
【図３３】図３３は、完全ＨＤＲによるＦＡＤ２Ａへの導入遺伝子組み込みの検出に使用した内在性および導入遺伝子標的プライマーの結合部位を示す概略図である。
【図３４】図３４は、Ｋｐｎ１制限エンドヌクレアーゼ部位が、完全編集ＦＡＤ２Ａ遺伝子座内のどこに発生するのか、およびＦＡＤ２ａ  ５’、ｈｐｈおよびＦＡＤ２Ａ  ３’サザンプローブがどこに結合するのかを示す略図である。
【図３５】図３５は、Ｋｐｎ１断片、ＦＡＤ２Ａ  ５’、ｈｐｈ、ＦＡＤ２Ａ  ３’プローブの位置およびサイズ、ならびにＨＤＲによるＦＡＤ２Ａ遺伝子座へのＥＴＩＰの組み込みを有する植物について予想されるサザン解析結果を示す。
【図３６】図３６は、コピー数推定ｑＰＣＲからの代表データ出力を示す。左側のカラムは、単一ランダム導入遺伝子インサートを有する公知Ｔ０トランスジェニック植物から得たデータを表し、すべての他のサンプルが「正規化される」キャリブレーターサンプルとして使用される。右側のカラムは、５導入遺伝子組み込みを有する公知Ｔ０トランスジェニック植物である。両方の植物についてのインサートコピー数を、サザン解析を用いて決定した。残りのカラムは、推定上のトランスジェニック植物についてのコピー数推定値を提供する。カラムの下のラベルは、このグラフ中のカラムと符号し、各トランスジェニック植物についての推定コピー数を決定するために使用することができる。コピー数を推定するためにソフトウェアを使用するとき、野生型植物、非形質転換対照植物、およびプラスミドのみの対照は、ｈｐｈおよびＨＭＧ  Ｉ／Ｙ標的両方のためのＣｑを保有しないので、コピー数が得られない。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
プロトプラストの一過性形質転換は、迅速かつ簡単である、植物研究に広く用いられているツールである。この技法を用いて、例えば、プロモーター要素の調節をモニターすることができ、様々な刺激に応じての遺伝子発現もしくは酵素活性を解析することができ、転写因子もしくはシグナル伝達カスケード成分の役割を調査することができ、またはタンパク質の細胞内局在を研究することができる（Sheen, 2001；Yoo et al., 2007）。一般に何カ月もかかり、トランスフェクト剤（通常はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens））の使用を必要とする植物（最も一般的に用いられているプラットフォームであるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））の安定的形質転換とは対照的に、プロトプラストのトランスフェクションは、たった１日で果たすことができ、粗ＤＮＡおよび化学ベースのトランスフェクション法またはエレクトロポレーションベースのトランスフェクション法いずれかしか必要としない。加えて、一過性形質転換解析は、細胞ベースのアッセイが適切であるとき、安定的過発現に伴って遭遇する問題、例えば、多面発現発生効果（pleiotropic developmental effects）または生育不能性を克服することができる。しかし、プロトプラスト形質転換効率は決して１００％ではないことから、結果は、非形質転換細胞が絡んだものになり得る。
【００１５】
形質転換効率は、多くの場合、低く、可変的であり（例えば、Cumminis et al, 2007；＜１０％）、用いられる方法ならびに使用されるプロトプラストおよびＤＮＡの特性に依存する。本発明は、植物生物工学の分野に関するが、すべての生物学的目的に本発明を用いることができる。詳細には、本発明の実施形態は、フローサイトメトリー選別による植物細胞の異種集団からのネイティブまたはトランスジェニック植物細胞系統の産生に関する。かかる植物細胞系統は、単子葉植物であってもよいし、または双子葉植物であってもよい。当業者には明らかであるように、本発明は、稔性植物全体の再生のためにも前記植物細胞系統を使用する。
【００１６】
本発明の実施形態の１つは、首尾よく形質転換された細胞を選択するためのよりよい選択がある、ＦＡＣＳベースの感受性選択に関する。植物浮遊培養などの植物細胞集団の形質転換が、多くの場合、トランスジェニック培養、その不均一で一致性のない発現レベルをもたらすことは以前に報告されている。本発明は、植物ベースのシステムの提供に主として関する。単個細胞を単離して成長させることができることには、非常に多くの潜在的用途がある。例えば、本明細書に概要を示す方法は、植物細胞培養物の生産性に関連したプロセスの向上に役立つ。しかし、本出願は、すべての細胞に広く適用することができる。
【００１７】
本発明の実施形態は、当分野において公知の材料および方法を使用して植物細胞集団から調製される単一の、すなわち個別化されたプロトプラストを分離または単離するための、ＦＡＣＳ技術などのフローサイトメトリー選別の使用を含む。これらのプロトプラストは、形質転換させることができ、ならびに１）蛍光マーカータンパク質もしくはポリペプチドを生産すること；２）所望の産物を生産すること；および／または３）選択剤の存在下で生存することが可能である。ＦＡＣＳについての選別基準は、遺伝的背景（例えば、正倍数性、異数性）、突然変異体、トランスジェニック体、遺伝子交換産物、および蛍光（自家蛍光（葉緑体、代謝産物）、蛍光タンパク質または酵素媒介蛍光）を含む群から選択することができる。いずれの蛍光タンパク質を使用してもよい。選択剤を使用してもよいし、または使用しなくてもよい。
【００１８】
フローサイトメトリー選別による単一プロトプラストの分離または単離後、各々の単一形質転換プロトプラストを共培養によりマイクロコロニー（マイクロカルス）の形成まで再生させる。植物源の起源は限定されないが、マイクロコロニーまたはマイクロカルスの形成まで再生する可能性がプロトプラストにある系統、変種および種に限られる。したがって、本発明は、再生プロトコルが確立されているまたは規定されることとなるすべての植物変種および種に適用することができる。したがって、本発明は、再生部分が確立されているまたは将来提供されることになるすべての品種および種を用いて行うことができる。
【００１９】
マイクロコロニー自体をフィーダー細胞材料から分離または除去し、植物細胞系統の形成まで培養してもよい。
【００２０】
本発明の実施形態は、１）マイクロコロニーまたはマイクロカルスを固体培養培地に移植すること、および２）そのマイクロコロニーまたはマイクロカルスを、少なくとも１つの選択剤の存在下で、トランスジェニックカルス組織の形成まで培養することによるカルス組織の産生も含むことができ、前記トランスジェニックカルス組織から、そのカルス組織を液体培養媒体に移植することによりトランスジェニック植物細胞系統を樹立することができる。マイクロコロニーをフィーダー細胞材料から機械的手段によって、すなわちクローンピッキングによって除去または分離することもできる。この場合、選択剤を必要とせず、マイクロコロニーに含まれる細胞は、いずれの選択剤に対しても耐性を提示する必要がない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、フローサイトメトリー選別に付される前のネイティブまたは非トランスジェニック細胞であって、機能性プロモーターに作動可能に連結させることができる少なくとも１つの異種核酸配列を含む少なくとも１つの発現ベクターで安定的にまたは一過的に形質転換され、前記少なくとも１つの異種核酸配列が所望の産物をコードするネイティブまたは非トランスジェニック細胞である、植物細胞の異種集団を含むことができる。さらなる実施形態において、前記少なくとも１つの異種核酸配列は、少なくとも１つの機能性プロモーターに作動可能に連結され、この場合、前記少なくとも１つの異種核酸配列は、蛍光マーカータンパク質またはポリペプチドと、選択剤に対する耐性のための少なくとも１つの異種核酸配列とをコードするか、または所望の産物をコードする。さらなる実施形態は、細胞が、規定のトランスジェニック植物細胞系統中に蓄積されている所望の産物をコードする異種核酸配列をさらに含むことがある実施形態を含むことができる。
【００２２】
他の実施形態では、組換えタンパク質またはペプチドを組換え、例えば相同組換えまたは非相同組換えによって修飾することができるように、宿主細胞のゲノムを発現させることができる。
【００２３】
樹立された任意の（トランスジェニック）単クローン性または二クローン性（diclonal）植物細胞系統を、組換えタンパク質または代謝産物の生産のために、前記ベクター浮遊液に加えてまたは前記ベクター浮遊液の代わりに、前駆物質、誘導物質、ホルモン、安定剤、阻害剤、ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ分子、シグナル伝達化合物、酵素および／または誘発物の存在下で処理または培養することができる。
【００２４】
異種核酸は、細菌、真菌、植物または非植物由来の遺伝子、例えば、融合タンパク質、および動物由来のタンパク質をコードすることがある。生産されるポリペプチドを、他の場所での使用のためにそれらから精製することができるポリペプチドの生産に利用してもよい。本発明の製法で生産することができるタンパク質としては、ヘテロダイマー、免疫グロブリン、融合抗体および一本鎖抗体が挙げられる。さらに、上記遺伝子を改変して、改変された特徴を有するタンパク質を生産してもよい。
【００２５】
本発明の実施形態は、多種多様なタンパク質およびポリペプチドを生産する能力を含む。これらの実施形態は、異種タンパク質またはポリペプチド、二次代謝産物およびマーカーから成る群より選択される少なくとも１つの所望の産物の生産方法も含むことができる。前記方法は、本発明に従って樹立されるような植物細胞系統を使用して少なくとも１つの所望の産物を生産および蓄積し、その後、その産物を生産細胞からまたは培養培地から得るまたは単離することを含む。
【００２６】
さらなる方法としては、少なくとも細胞外異種タンパク質を産生する方法であって、１）植物細胞の出発集団により含まれる標的細胞に、異種タンパク質または所望の産物をコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸を安定的に導入する工程；２）前記植物浮遊培養から得た植物浮遊細胞からプロトプラストを調製する工程（ここで、前記プロトプラストは、さらに形質転換され、ｉ）蛍光マーカータンパク質もしくはポリペプチドを生産することおよびｉｉ）選択剤の存在下で生存することが可能である）；３）前記プロトプラストの調製物をＦＡＣＳに付すことにより、単一形質転換プロトプラストを分離する工程；４）分離された単一形質転換プロトプラストを、フィーダー細胞材料の存在下での共培養によりマイクロコロニーまたはマイクロカルスの形成まで再生させる工程；５）ｉ）前記マイクロコロニーまたはマイクロカルスを固体培養培地に移植すること、およびｉｉ）前記マイクロコロニーまたはマイクロカルスを、少なくとも１つの選択剤の存在下で、トランスジェニックカルス組織の形成まで培養することにより、カルス組織を産生する工程；および６）前記カルス組織を液体培地に移植することによってトランスジェニック植物細胞系統を樹立する工程；７）適切な培養条件を規定することにより、前記異種タンパク質または所望の産物の核酸からの発現を生じさせるまたは可能にする工程；および８）蓄積された異種タンパク質または所望の産物を生産細胞から回収する工程を含む方法が挙げられる。かかる単離は、もっぱら従来の手段によるものであり得、部分または完全精製を必要とすることもあり、または必要としないこともある。
【００２７】
各構築物において１個より多くの遺伝子を使用してもよい。最適な異種タンパク質をコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を各々が含む複数のベクターを、ここにまたは他の箇所に記載の標的細胞に導入してもよい。これは、酵素の複数のサブユニットの生産にも有用であり得る。
【００２８】
前記蛍光マーカータンパク質またはポリペプチドは、蛍光によって検出可能なタンパク質、例えばＧＵＳ、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ、ルシフェラーゼなどであり得る。好ましくは、報告されるものは、非侵襲性マーカー、例えばＤｓＲｅｄまたはＧＦＰである。
【００２９】
本発明の技法を用いて、成長させることになる一定の植物を選択してもよい。目的の遺伝子の選択を多数の方法で処理してよい。非常に多数の技法が植物宿主細胞へのＤＮＡの挿入に利用可能である。これらの技法としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換剤として使用するＴ−ＤＮＡでの形質転換、融合、注入、微粒子銃（微粒子ボンバードメント）、炭化ケイ素ウイスカー、エアロゾルビーム法、ＰＥＧ、またはエレクトロポレーション法、ならびに他の可能な方法が挙げられる。アグロバクテリアを形質転換に使用する場合、導入することになるＤＮＡを特別なプラスミドに、すなわち、中間ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングしなければならない。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ中の配列に相同である配列のため相同組換えによってＴｉまたはＲｉプラスミドに組み込むことができる。ＴｉまたはＲｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの移入に必要なｖｉｒ領域も含む。中間ベクターは、それら自体をアグロバクテリアにおいて複製することができない。中間ベクターは、ヘルパープラスミド（接合）によってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に移入することができる。バイナリーベクターは、それら自体を大腸菌（E. coli）においてもアグロバクテリアにおいても複製することができる。それらは、左および右Ｔ−ＤＮＡボーダー領域によって囲まれている選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。それらをアグロバクテリアに直接形質転換させることができる（Holsters, 1978）。宿主細胞として使用されるアグロバクテリウムは、ｖｉｒ領域を保有するプラスミドを含まなければならない。ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞への移入に不可欠である。さらなるＴ−ＤＮＡを含有してもよい。そのように形質転換された細菌を植物細胞の形質転換に使用する。ＤＮＡの植物細胞への移入のために、有利にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いて植物外植体を培養することができる。その後、選択のために抗生物質または殺生物剤を含有することもある適する培地において感染植物細胞（例えば、数枚の葉、数片の茎、根、しかしプロトプラストまたは浮遊培養細胞も）から全草を再生させることができる。その後、そのようにして得た植物を、挿入されたＤＮＡの存在について試験することができる。注入およびエレクトロポレーションの場合、プラスミドに対する特別な要求はない。通常のプラスミド、例えば、ｐＵＣ誘導体を使用することが可能である。
【００３０】
形質転換細胞は、植物内で普通に成長する。それらは、胚細胞を形成することができ、形質転換された形質（単数または複数）を後代植物に遺伝させることができる。かかる植物を通常に成長させることができ、同じ形質転換遺伝因子または他の遺伝因子を有する植物と交配することができる。結果として生ずるハイブリッド個体は、対応する表現型特性を有する。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、目的のタンパク質をコードする遺伝子を、植物ゲノムに挿入された転写単位から発現させる。好ましくは、前記転写単位は、植物ゲノムへの安定した組み込みが可能であり、かつ前記タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現する形質転換植物系統の選択を可能にする組換えベクターである。
【００３２】
挿入されたＤＮＡは、いったんゲノムに組み込まれてしまうと、そこで比較的安定している（そして再び出て来ない）。通常、それは、形質転換された植物細胞に殺生物剤または抗生物質、例えば、なかんずく、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する選択マーカーを含有する。典型的に、植物選択可能マーカーは、様々な除草剤、例えば、グルホシネート（例えば、ＰＡＴ／ｂａｒ）、グリホサート（ＥＰＳＰＳ）、ＡＬＳ阻害剤（例えば、イミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホンアニリドなど）、ブロモキシニル、ＨＰＰＤ阻害剤耐性、ＰＰＯ阻害剤、ＡＣＣアーゼ阻害剤および他多数に対する耐性も、もたらすことができる。したがって、個々に用いられるマーカーは、挿入ＤＮＡを含有しない細胞ではなく形質転換細胞の選択を可能にしなければならない。好ましくは、目的の遺伝子（単数または複数）を植物細胞において構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターいずれかにより発現させる。発現されると、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳され、その結果、目的のアミノ酸がタンパク質に組み込まれる。植物細胞において発現されたタンパク質をコードする遺伝子は、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
【００３３】
植物細胞に外来組換えベクターを導入するためのおよび導入された遺伝子を安定的に維持し、発現する植物を得るためのいくつかの技法が存在する。かかる技法としては、微粒子にコーティングされた遺伝物質の細胞への直接導入（Ｃｏｒｎｅｌｌの米国特許第４，９４５，０５０号明細書およびＤｏｗＥｌａｎｃｏ、現Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＬＣの米国特許第５，１４１，１３１号明細書）が挙げられる。加えて、アグロバクテリウム技術を用いて植物を形質転換させてもよい、トレド大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｌｅｄｏ）の米国特許第５，１７７，０１０号明細書；Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍの同第５，１０４，３１０号明細書；欧州特許出願第０１３１６２４号Ｂ１明細書；Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの欧州特許出願第１２０５１６号、同第１５９４１８号Ｂ１および同第１７６，１１２号明細書；Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの米国特許第５，１４９，６４５号、同第５，４６９，９７６号、同第５，４６４，７６３号および同第４，９４０，８３８号および同第４，６９３，９７６号明細書；すべてＭａｘ  Ｐｌａｎｃｋの欧州特許出願第１１６７１８号、同第２９０７９９号、同第３２０５００号明細書；日本たばこ産業株式会社（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ）の欧州特許出願第６０４６６２および同第６２７７５２号明細書、ならびに米国特許第５，５９１，６１６号明細書；すべてＣｉｂａ  Ｇｅｉｇｙ、現Ｓｙｎｇｅｎｔａの欧州特許出願第０２６７１５９号および同第０２９２４３５号明細書、および米国特許第５，２３１，０１９号明細書；両方ともＣａｌｇｅｎｅの米国特許第５，４６３，１７４号および同第４，７６２，７８５号明細書；両方ともＡｇｒａｃｅｔｕｓの米国特許第５，００４，８６３号および同第５，１５９，１３５号明細書を参照されたし。他の形質転換技術としては、ウイスカー技術が挙げられる。両方ともＺｅｎｅｃａ、現Ｓｙｎｇｅｎｔａの米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号明細書を参照されたし。他の直接ＤＮＡ送達形質転換技術としては、エアロゾルビーム技術が挙げられる。米国特許第６，８０９，２３２号明細書を参照されたし。エレクトロポレーション技術も、植物を形質転換させるために使用されている。Ｂｏｙｃｅ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの国際公開第８７／０６６１４号パンフレット；両方ともＤｅｋａｌｂの米国特許第５，４７２，８６９および同第５，３８４，２５３号明細書；ならびに両方ともＰｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓの国際公開第９２／０９６９６号および同第９３／２１３３５号パンフレットを参照されたし。さらに、ウイルスベクターを使用して、目的のタンパク質を発現するトランスジェニック植物を生産することもできる。例えば、Ｍｙｃｏｇｅｎ  Ｐｌａｎｔ  ＳｃｉｅｎｃｅおよびＣｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ（現Ｓｙｎｇｅｎｔａ）の米国特許第５，５６９，５９７号明細書、ならびに両方ともＢｉｏｓｏｕｒｃｅ、現Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙの米国特許第第５，５８９，３６７号および同第５，３１６，９３１号明細書に記載されている方法を用いて、単子葉植物をウイルスベクターで形質転換させることができる。
【００３４】
前に述べたように、ＤＮＡ構築物を植物宿主に導入する手法は、本発明にとって重要ではない。効率的形質転換をもたらすいずれの方法を利用してもよい。例えば、植物細胞形質転換のための様々な方法を本明細書に記載しており、それらにはアグロバクテリウム媒介形質転換を行うためのＴｉまたはＲｉ−プラスミドなどの使用が含まれる。多くの場合、片側または両側がＴ−ＤＮＡボーダー、より具体的には右ボーダーと接している形質転換に使用される構築物を有することが望ましいであろう。これは、構築物が、形質転換モードとしてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用するとき特に有用であるが、Ｔ−ＤＮＡボーダーを他の形質転換モードで使用してもよい。アグロバクテリウムを植物形質転換に使用する場合、ベクターを使用してもよく、そのベクターを、宿主中に存在するＴ−ＤＮＡまたはＴｉもしくはＲｉプラスミドとの相同組換えのために宿主に導入してもよい。前記ベクターの導入をエレクトロポレーションによって行ってもよいし、三親接合によって行ってもよいし、当業者に公知であるグラム陰性菌を形質転換させるための他の技法によって行ってもよい。アグロバクテリウム宿主へのベクター形質転換の手法は、本発明にとって重要ではない。組換えのためのＴ−ＤＮＡを含有するＴｉまたはＲｉプラスミドは、虫えい形成を生じさせることができることもあり、またはできないこともあり、ｖｉｒ遺伝子が前記宿主中に存在する限り前記発明にとって重要ではない。
【００３５】
アグロバクテリウムを形質転換に使用するいくつかの場合、Ｔ−ＤＮＡボーダー内にある発現構築物を、Ditta et al. (1980)およびＥＰＯ特許第０  １２０  ５１５号明細書に記載されているような広域スペクトルベクター、例えばｐＲＫ２またはその誘導体に挿入することになる。形質転換アグロバクテリウムおよび形質転換植物細胞の選択を可能にする本明細書に記載の１つまたはそれ以上のマーカーを前記発現構築物およびＴ−ＤＮＡの中に含めることになる。利用する個々のマーカーは、本発明にとって本質的なものではなく、好ましいマーカーは、使用する宿主および構築法に依存する。
【００３６】
アグロバクテリウムを使用する植物細胞の形質転換のために、外植体を形質転換アグロバクテリウムと併せ、それらの形質転換を可能にするのに十分な時間、形質転換アグロバクテリウムとともに恒温放置する。形質転換後、アグロバクテリアを適切な抗生物質によって死滅させ、適切な選択培地を用いて植物細胞を培養する。カルスが形成されたら、当分野において周知の植物組織培養および植物再生方法に従って適切な植物ホルモンを利用することにより苗条形成を促進することができる。しかし、カルス中間段階は、必ずしも必要であるとは限らない。苗条形成後、前記植物細胞を、根形成を促進する培地に移植し、それによって植物再生を完全なものにすることができる。その後、植物を種子まで成長させ、前記種子を使用して後代を樹立することができる。形質転換法にかかわらす、細菌タンパク質をコードする遺伝子を、植物細胞において前記遺伝子を発現するように構成された遺伝子導入ベクターに、植物プロモーター調節要素はもちろん３’非翻訳転写終結領域、例えばＮｏｓなども前記ベクターに含めることによって好ましくは組み込む。
【００３７】
植物を形質転換させるための非常に多数の技術に加えて、外来遺伝子と接触させる組織のタイプも様々であってよい。かかる組織としては、胚形成組織、カルス組織Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型、胚軸、分裂組織、根組織、篩部における発現のための組織などが挙げられるだろうが、それらに限定されない。本明細書に記載する適切な技法を用いて、ほぼすべての植物組織が退行分化中に形質転換されるだろう。
【００３８】
上で述べたように、様々な選択可能マーカーを必要に応じて使用することができる。個々のマーカーについての選好は当業者の自由裁量であるが、下記の選択可能マーカーのいずれかを、選択可能マーカーとして機能することができるだろう本明細書に収載されていない任意の他の遺伝子とともに使用してもよい。かかる選択可能マーカーとしては、抗生物質カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１に対する耐性、ヒグロマイシン耐性、メトトレキサート耐性をコードするトランスポゾンＴｎ５のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ａｐｈ  ＩＩ）、ならびにグリホサート、ホスフィノトリシン（phosphinothricin）（ビアラホスまたはグルホシネート）、ＡＬＳ阻害性除草剤（イミダゾリノン、スルホニル尿素およびトリアゾロピリミジン除草剤）、ＡＣＣアーゼ阻害剤（例えば、アリールオキシプロピオネート（ayryloxypropionate）またはシクロヘキサンジオン）およびその他、例えば、ブロモキシニルおよびＨＰＰＤ阻害剤（例えば、メソトリオン）などに対する耐性または抵抗性をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３９】
選択可能マーカーに加えて、レポーター遺伝子を使用することを望むことがある。場合によっては、レポーター遺伝子を選択可能マーカーとともに使用してもよく、または選択可能マーカーなしで使用してもよい。レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織内に典型的に存在しない遺伝子であって、何らかの表現型変化または酵素的特性をもたらすタンパク質を典型的にコードしている遺伝子である。かかる遺伝子の例は、Weising et al, 1988に提供されている。好ましいレポーター遺伝子としては、大腸菌（E. coli）のｕｉｄＡ遺伝子座のベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、大腸菌（E. coli）のＴｎ９からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、生物発光クラゲ・オワンクラゲ（Aequorea victoria）からの緑色蛍光タンパク質、およびホタル・フォティナス・ピラリス（Photinus pyralis）からのルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。したがって、前記遺伝子をレシピエント細胞に導入した後、適する時点で、レポーター遺伝子発現を検出するためのアッセイを行ってもよい。好ましいかかるアッセイは、形質転換細胞を同定するために、Jefferson et al. (1987)により記載されているような大腸菌（E. coli）のｕｉｄＡ遺伝子座のベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子の使用を必要とする。
【００４０】
植物プロモーター調節要素に加えて、様々な源からのプロモーター調節要素を植物細胞において効率的に使用して、外来遺伝子を発現させることができる。例えば、細菌由来のプロモーター調節要素、例えば、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター；ウイルス由来のプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓおよび１９Ｓ）、３５Ｔ（これは設計しなおされた３５Ｓプロモーターである、米国特許第６，１６６，３０２号明細書、特に実施例７Ｅを参照されたし）などを使用してもよい。植物プロモーター調節要素としては、リブロース−１，６−ビスホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、ベータ−コングリシニンプロモーター、ベータ−ファセオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ヒートショックプロモーター、および組織特異的プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。他の要素、例えば、マトリックス結合領域、足場結合領域、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列などが存在してもよく、かくして転写効率またはＤＮＡ組み込みを改善してもよい。かかる要素は、ＤＮＡ機能に不可欠であることもあり、または不可欠でないこともあるが、それらは、転写、ｍＲＮＡ安定性などに影響を及ぼすことによってＤＮＡのよりよい発現または機能化をもたらすことができる。植物内での形質転換ＤＮＡの最適な性能を得るために、必要に応じてかかる要素をＤＮＡに含めてもよい。典型的な要素としては、Ａｄｈ−イントロン１、Ａｄｈ−イントロン６、アルファルファモザイクウイルスコートタンパク質リーダー配列、オスモチンＵＴＲ配列、トウモロコシ縞葉枯病ウイルスコートタンパク質リーダー配列、ならびに当業者に利用可能な他のものが挙げられるが、それらに限定されない。構成的プロモーター調節要素を使用してもよく、それによってすべての細胞タイプにおいて常に連続的遺伝子発現を指示する（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ  ３５Ｓなど）。組織特異的プロモーター調節要素は、特異的細胞または組織タイプ、例えば、葉または種子における遺伝子発現に責任を負い（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ、グロブリンなど）、これらも使用してよい。
【００４１】
プロモーター調節要素はまた、植物の発育のある一定の時期の間、活性（または不活性）であることがあり、ならびに植物組織および器官内で活性であることがある。かかるものの例としては、花粉特異的、胚特異的、トウモロコシの毛特異的、綿繊維特異的、根特異的、種子胚乳特異的または栄養相特異的プロモーター調節要素などが挙げられるが、それらに限定されない。ある一定の状況下では、特異的シグナル、例えば、物理的刺激（ヒートショック遺伝子）、光（ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）、ホルモン（Ｅｍ）、代謝産物、化学薬品（テトラサイクリン応答性）およびストレスに応答しての遺伝子の発現に責任を負う誘導性プロモーター調製要素を使用することが望ましいこともある。植物において機能する他の望ましい転写および翻訳要素を使用してもよい。非常に多数の植物特異的遺伝子導入ベクターが当分野において公知である。
【００４２】
植物ＲＮＡウイルスベースの系を使用して細菌タンパク質を発現させることもできる。そうする場合、タンパク質をコードする遺伝子を、適する植物ウイルスのコートプロモーター領域に挿入することができ、そのウイルスに目的の宿主植物を感染させることになる。その後、そのタンパク質を発現させることができ、かくしてその植物を除草剤による損傷から防護する。植物ＲＮＡウイルスベースの系は、Ｍｙｃｏｇｅｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．の米国特許第５，５００，３６０号明細書、ならびにＢｉｏｓｏｕｒｃｅの米国特許第５，３１６，９３１号および同第５，５８９，３６７号明細書に記載されている。
【００４３】
抵抗性または耐性レベルをさらに増加させる手段。収量を含む表現型に対する観察可能な悪影響なしに新規除草剤耐性形質を本主題発明の植物に付与することができることを本明細書において証明する。かかる植物は、本主題発明の範囲内である。本明細書において例示および提案する植物は、例えば、少なくとも１つの対象除草剤の、２ｘ、３ｘ、４ｘおよび５ｘ典型的塗布レベルに耐えることができる。これらの抵抗性レベルの改善は、本発明の範囲内である。例えば、様々な技法が当分野において公知であり、ならびに予見できることとして、所与の遺伝子の発現を増加させるためにそれらの技法を最適化することおよびさらに開発することができる。
【００４４】
１つのかかる方法は、（発現カセットなどの中の）対象遺伝子のコピー数を増加させることを含む。形質転換事象を、遺伝子の複数のコピーを有するものについて選択することもできる。
【００４５】
強力なプロモーターおよびエンハンサーを使用して発現を「スーパーチャージ」することができる。かかるプロモーターの例としては、３５Ｓエンハンサーを使用する好ましい３５Ｔプロモーターが挙げられる。かかる使用には、３５Ｓ、トウモロコシユビキチン、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）ユビキチン、Ａ．ｔ．アクチンおよびＣＳＭＶプロモーターが含まれる。他の強力なウイルスプロモーターも好ましい。エンハンサーとしては、４  ＯＣＳおよび３５Ｓダブルエンハンサーが挙げられる。マトリックス結合領域（ＭＡＲ）を使用して、例えば、形質転換効率および導入遺伝子発現を増加させることもできる。
【００４６】
シャフリング（指向進化）および転写因子を本主題発明による実施形態に使用することもできる。
【００４７】
配列レベルは異なるが、同じまたは同様の総合的本質的三次元構造、表面電荷分布などを保持する、変異体タンパク質を設計することもできる。例えば、米国特許第７，０５８，５１５号明細書；Larson et al., Protein Sci. 2002 11: 2804-2813, 「Thoroughly sampling sequence space: Large-scale protein design of structural ensembles」；Crameri et al., Nature Biotechnology 15, 436-438 (1997), 「Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling」；Stemmer, W. P. C. 1994, DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751；Stemmer, W. P. C. 1994, Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370: 389-391；Stemmer, W. P. C. 1995, Searching sequence space. Bio/Technology 13: 549-553；Crameri, A., Cwirla, S, and Stemmer, W. P. C. 1996, Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling, Nature Medicine 2: 100-103；およびCrameri, A., Whitehorn, E. A., Tate, E. and Stemmer, W. P. C., 1996, Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling, Nature Biotechnology 14: 315-319を参照されたし。
【００４８】
植物細胞に挿入された組換えポリヌクレオチドの活性は、そのインサートに隣接した内在性植物ＤＮＡの影響に依存し得る。したがって、別の選択肢は、挿入のための植物ゲノム内の優れた位置であることが公知である事象の利用である。例えば、ｃｒｙ１Ｆおよびｃｒｙ１Ａｃ綿事象；遺伝子、例えばＡＡＤ１またはＡＡＤ１２またはその他をかかるインサートの代わりにそれらのゲノム遺伝子座において代用する、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３に関する、国際公開第２００５／１０３２６６号Ａ１パンフレットを参照されたし。したがって、例えば、標的相同組換えを本主題発明に従って用いることができる。このタイプの技術は、例えば、標的組換えへのためのジンクフィンガーの使用に関する、国際公開第０３／０８０８０９号Ａ２パンフレットおよび対応公開米国出願（米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書）の主題である。リコンビナーゼ（例えば、ｃｒｅ−１０ｘおよびｆｌｐ−ｆｒｔ）の使用も当分野において公知である。
【００４９】
合成ヘアピンに最も適する５’または３’ＵＴＲのコンピュータによる設計も本主題発明の範囲内で行うことができる。一般にはコンピュータモデリング、ならびに遺伝子シャフリングおよび指向進化も、本明細書中の他の場所で論ずる。コンピュータモデリングおよびＵＴＲに関してより具体的に言えば、本発明の５’および３’ＵＴＲ誘導体の予測／評価に用いるためのコンピュータモデリング法としては、ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐから入手できるＭＦｏｌｄバージョン３．１（Zucker et al., Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. In RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, J. Barciszewski & B. F. C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, (1999)；Zucker et al., Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999)；Zucker et al., RNA Secondary Structure Prediction. In Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, S. Beaucage, D. E. Bergstrom, G. D. Glick, and R. A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, (2000)を参照されたし）；ソースコードとして無料配布されており、ウェブサイトgenetics.wust1.edu/eddy/software/にアクセスすることによりダウンロードすることができるＣＯＶＥ（共分散モデル（確率文脈自由文法法）を用いるＲＮＡ構造解析）ｖ．２．４．２（Eddy & Durbin, Nucl. Acids Res. 1994, 22: 2079-2088）；および同じく無料配布されており、ウェブサイトbioinf.au.dk. FOLDALIGN/でダウンロードできるＦＯＬＤＡＬＩＧＮ（Finding the most significant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences. J. Gorodkin, L. J. Heyer and G. D. Stormo. Nucleic Acids Research, Vol. 25, no. 18 pp 3724-3732, 1997；Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences. J. Gorodkin, L. J. Heyer, and G. D. Stormo. ISMB 5;120-123, 1997を参照されたし）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５０】
本主題発明の実施形態を自然進化または化学誘導突然変異体とともに用いることができる（突然変異体をスクリーニング法によって選択し、その後、他の遺伝子で形質転換させることができる）。本主題発明の植物を様々な耐性遺伝子および／または進化耐性遺伝子と併用することができる。旧来の育種法を本主題発明と併用して、強力に組み合わせること、遺伝子移入すること、および形質の選択を改善することもできる。
【００５１】
本明細書において引用し、論ずる、出版物、特許および特許出願を含む、すべての参考文献は、本出願の出願日より前のそれらの開示について単に提供するものである。先行発明のためかかる開示に先行する権利が本発明者らにはないと解釈すべきものは、本明細書にはない。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例を、ある特定の特徴および／または態様を例証するために提供する。これらの実施例を、記載する特定の特徴または態様に本開示を限定するものと解釈すべきではない。
【００５３】
実施例１：細菌人工染色体ライブラリーからのパラロガスＦＡＤ２およびＦＡＤ３標的配列の同定
ＢＡＣ構築
細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーは、商業ベンダー（Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、ワシントン州プルマン）からのものであった。前記ＢＡＣライブラリーは、セイヨウアブラナ変種（Brassica napus L.var.）ＤＨ１０２７５から単離された高分子量ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）断片を含有する１１０，５９２のＢＡＣクローンから成った。ｇＤＮＡをＢａｍＨＩまたはＨｉｎＤＩＩＩ制限酵素いずれかで消化した。約１３５Ｋｂｐの単離されたｇＤＮＡをｐＣＣ１ＢＡＣベクター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州マディソン）にライゲートし、大腸菌株（Escherichia coli str.）ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させた。前記ＢＡＣライブラリーは、２つの異なる制限酵素を使用して構築された偶数のＢＡＣクローンから成った。したがって、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ構築ＢＡＣライブラリーは、１４４の個別の３８４ウェルプレートから成った。同様に、ＢａｍＨＩ構築ＢＡＣライブラリーは、１４４の別々の３８４ウェルプレートから成った。合計１１０，５９２のＢＡＣクローンを単離し、２８８の個別の３８４ウェルプレートに配列した。２８８の個別の３８４ウェルプレートの各々を、迅速なＰＣＲベースのスクリーニングのために単一ＤＮＡ抽出物として前記ベンダーから得た。結果として生じたＢＡＣライブラリーは、おおよそ１５ＧｂｐのｇＤＮＡをカバーし、これは、セイヨウアブラナ変種（Brassica napus L.var.）ＤＨ１０２７５ゲノムの１２倍ゲノムカバー率に相当する（前記セイヨウアブラナ（Brassica napus L.）ゲノムの推定値は、Johnston et al. (2005) Annals of Botany 95:229-235に記載されているように約１．１３２Ｇｂｐである）。
【００５４】
ＢＡＣライブラリーから単離されたＦＡＤ２コード配列の配列解析
構築されたＢＡＣライブラリーを使用して、ＦＡＤ２遺伝子コード配列を単離した。シークエンシング実験を行って、セイヨウアブラナ変種（Brassica napus L.var.）ＤＨ１０２７５から４つのＦＡＤ２遺伝子パラログの特異的遺伝子配列を同定した。
【００５５】
ＦＡＤ２遺伝子配列は、最初、モデル種シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において同定された。その遺伝子配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにローカスタグ：Ａｔ３ｇ１２１２０として収載されている。モデル植物種シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）と、４倍体セイヨウアブラナ（Brassica napus）の祖先の１つである２倍体ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）との間の比較ゲノム関係は、以前に記載されている。（Schranz et al. (2006) Trends in Plant Science 11(11):535-542）。ＦＡＤ２遺伝子に特に関して、比較解析は、その遺伝子の３〜４コピーが前記２倍体アブラナ属（Brassica）ゲノム中に出現することがあることを予測した。さらなる遺伝子マッピング研究がScheffler et al. (1997) Theoretical and Applied Genetics 94; 583-591によって完了された。これらの遺伝子マッピング研究の結果は、ＦＡＤ２遺伝子の４つのコピーがセイヨウアブラナ（Brassica napus）中に存在することを示した。
【００５６】
セイヨウアブラナ変種（B. napus L.var.）ＤＨ１２０７５から構築されたＢＡＣライブラリーのシークエンシング解析により、結果として、４つのＢＡＣ配列（配列番号（SEQ ID NO:）１、配列番号２、配列番号３および配列番号４）を単離し、それらからＦＡＤ２Ａ（配列番号５）、ＦＡＤ２−１（配列番号６）、ＦＡＤ２−２（配列番号７）およびＦＡＤ２−３（配列番号８）遺伝子についてのコード配列を決定した。ＦＡＤ２Ａ、ＦＡＤ２−１、ＦＡＤ２−２およびＦＡＤ２−３遺伝子配列を同定し、遺伝子マップを作成した。配列アラインメントプラグラムを用いて、および同一率を用いる近隣結合樹を用いて、それら４つのＦＡＤ２遺伝子の配列解析を行った。配列アラインメントをＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  １１．０コンピュータプログラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）からのＡＬＩＧＮＸ（登録商標）プログラムによって行い、図１に示す。ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）は、修正Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用して、類似性比較のためのおよび注釈付けのためのタンパク質または核酸いずれかの複数の配列アラインメントを生じさせる。近隣結合樹をＪＡＬＶＩＥＷ  ｖ２．３（登録商標）ソフトウェアで作成し、図２に示す。（Waterhouse et al. (2009) Bioinformatics 25 (9) 1189-1191）。図２に示すように、単離された配列の解析は、ＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ２−３配列が高レベルの配列類似性を共有すること、および同様に、ＦＡＤ２−１およびＦＡＤ２−２が高レベルの配列類似性を共有することを示した。前記４配列を２つのクレードにカテゴリー分けすることができ、ＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ２−３は第一クレードを構成し、ＦＡＤ２−１およびＦＡＤ２−２は第二クレードを構成する。
【００５７】
次に、セイヨウアブラナ（Brassica napus）からの新たに単離されたＦＡＤ２配列を、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）ゲノムＢＡＣライブラリーから単離されたＢＬＡＳＴゲノムライブラリーおよびブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）ショットガンゲノム配列リードに使用した。ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）およびブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）は両方とも、複２倍体種（ＡＣゲノム、ｎ＝１９）である、セイヨウアブラナ（Brassica napus）の２倍体祖先である。セイヨウアブラナ（Brassica napus）は、さらにブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）（Ａサブゲノム、ｎ＝１０）とブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）（Ｃサブゲノム、ｎ＝９）間の最近の交配事象から得られたものであった。ＢＬＡＳＴｎ解析を用いて、２倍体祖先配列を、セイヨウアブラナ（Brassica napus）から単離された４つの異なるＦＡＤ２コード配列と比較した。この配列解析により、新たに発見されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＦＡＤ２配列と最高の配列類似性を共有する、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）およびブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）からの特異的、注釈付き遺伝子配列を同定した。表１は、新たに同定されたＦＡＤ２コード配列および対応する祖先参照配列アクセッション番号および由来生物を収載するものである。
【表１】
0006362600.tif 000002
【００５８】
ＦＡＤ２遺伝子は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ゲノム中に、サブゲノム１つにつき各遺伝子の２つのコピーとして存在する。各遺伝子の１つのコピーはＡサブゲノム上に位置し、同様に各ゲノムの１つのコピーはＣサブゲノム上に存在する。各遺伝子が位置するのがどちらのサブゲノムであるのかを示すための新たな命名規則を記載する。セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＢＡＣゲノムＤＮＡライブラリーから単離された４つの異なるＦＡＤ２コード配列と祖先配列データとの高レベルの配列類似性は、ＦＡＤ２−３が、ＣサブゲノムからのＦＡＤ２配列の複製であり、ＦＡＤ２Ｃと改称される可能性があること；ＦＡＤ２−１が、ＡサブゲノムからのＦＡＤ２配列の複製であり、したがってＦＡＤ２Ａ’と名づけられる可能性があること；および最後に、ＦＡＤ２−２が、ＣサブゲノムのＦＡＤ２配列から複製された二次コピーであり、ＦＡＤ２Ｃ’と名づけられる可能性があることを示唆する。
【００５９】
ＢＡＣライブラリーから単離されたＦＡＤ３コード配列の配列解析
構築されたＢＡＣライブラリーを使用して、ＦＡＤ３遺伝子コード配列を単離した。シークエンシング実験を行って、セイヨウアブラナ変種（Brassica napus L.var.）ＤＨ１０２７５から５つのＦＡＤ３遺伝子パラログの特異的遺伝子配列を同定した。
【００６０】
ＦＡＤ３遺伝子配列は、最初、モデル種シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において同定された。その遺伝子配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにローカスタグ：Ａｔ２ｇ２９９８０として収載されている。モデル植物種シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）と、４倍体セイヨウアブラナ（Brassica napus）の祖先の１つである２倍体ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）との間の比較ゲノム関係は、以前に記載されている。（Schranz et al. (2006) Trends in Plant Science 11(11):535-542）。そのＦＡＤ遺伝子に特に関して、比較解析は、その遺伝子の３〜４コピーが２倍体アブラナ属（Brassica）ゲノム中に出現することがあることを予測した。さらなる遺伝子マッピング研究がScheffler et al. (1997) Theoretical and Applied Genetics 94; 583-591によって完了された。これらの遺伝子マッピング研究の結果は、ＦＡＤ３遺伝子の６つのコピーがセイヨウアブラナ（Brassica napus）中に存在することを示した。
【００６１】
セイヨウアブラナ（Brassica napus）からのＦＡＤ３遺伝子に焦点を合わせた以前のシークエンシング努力により、Ａゲノム特異的コピーとＣゲノム特異的コピーの両方が同定され、遺伝子マップが作成された（Hu et al., (2006) Theoretical and Applied Genetics, 113(3): 497-507）。種子特異的ｃＤＮＡライブラリーからのＥＳＴ配列のコレクションは、以前に、サスカチュワン州、サスカトゥーン、１０７サイエンスプレイス、カナダ農務・農産食品省（Agriculture and Agri-food Canada）のアンドリュー・シャープ（Andrew Sharpe） によって植物系統ＤＨ１２０７５から構築され、シークエンシングされていた。二重半数体カノーラ植物ＤＨ１２０７５完全長遺伝子配列からのＥＳＴのコレクションを入手できなかったので、さらに、正しくコールされるヌクレオチドの配列量および信頼性の表示も入手できなかった。したがって、異なるＦＡＤ遺伝子配列リード間の配列変異が、ＦＡＤ３遺伝子ファミリーの様々なパラログの異なる遺伝子コピーに起因すると無条件に考えることはできず、ゲノム配列を入手することもできなかった。しかし、ＥＳＴならびにHu et al., (2006)に記載されている２つのＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ完全長遺伝子配列を用いて統合配列解析を行ったときに、両方の遺伝子にマッチしたＥＳＴを追加の３つのハプロタイプとともに同定した。結果として、ＦＡＤ３の合計６つの特有のハプロタイプを同定した。それらの様々なＦＡＤ３ハプロタイプについてのすべての入手可能なデータの組み立て後、エクソン１において高レベルのエクソン配列多様性を同定した。エクソン１におけるＦＡＤ３配列のその多様性を、遺伝子／対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの設計に利用できる機会として認定した。加えて、ハプロタイプ間に最小の差が認められたエクソン（例えば、エクソン５、６、７および８はＦＡＤ３ＡとＦＡＤ３Ｃ間で異なる１〜３ｂｐを有した）または配列変異が全くないエクソン（例えば、エクソン２および３）を同定した。
【００６２】
セイヨウアブラナ変種（B.napus L.var.）ＤＨ１２０７５から構築されたＢＡＣライブラリーのシークエンシング解析により、結果として６つのＢＡＣ配列（配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４）を単離し、それらからＦＡＤ３Ａ（配列番号１５）、ＦＡＤ３Ａ’（配列番号１６）、ＦＡＤ３Ａ”（配列番号１７）、ＦＡＤ３Ｃ（配列番号１８）、ＦＡＤ３Ｃ”（配列番号１９）およびＦＡＤ３Ｃ’（配列番号２０）遺伝子についてのコード配列を決定した。ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ａ’、ＦＡＤ３Ａ”、ＦＡＤ３Ｃ、ＦＡＤ３Ｃ”およびＦＡＤ３Ｃ’遺伝子配列を同定し、遺伝子マップを作成した。
【００６３】
配列アラインメントプラグラムを用いて、および同一率を用いる近隣結合樹を用いて、それら６つのＦＡＤ３遺伝子の配列解析を行った。配列アラインメントをＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  １１．０コンピュータプログラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）からのＡＬＩＧＮＸ（登録商標）プログラムによって行い、図３に示す。ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）は、修正Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用して、類似性比較のためのおよび注釈付けのためのタンパク質または核酸いずれかの複数の配列アラインメントを生じさせる。近隣結合樹をＪＡＬＶＩＥＷ  ｖ２．３（登録商標）ソフトウェアで作成し、図４に示す。（Waterhouse et al. (2009) Bioinformatics 25 (9) 1189-1191）。ＦＡＤ３遺伝子を含有すると同定されたコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）を、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）遺伝子のデータベースに対するＢＬＡＳＴｎクエリーとして使用した。ＦＡＤ３遺伝子を含有する６つのコンティグの各々についての領域をシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＦＡＤ３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ａｔ２ｇ２９９８０）への比較により同定した。その後、ＦＡＤ３コンティグを、すべてのＦＡＤ３遺伝子が５’から３’への配向になるように配向させた。可能な場合には、上流（５’）２つおよび下流（３’）１つほどのシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）遺伝子を含有するようにＦＡＤ３コンティグをトリミングした。配向させたら、ＦＡＤ３遺伝子の完全コード領域を各コンティグから抽出し、異なるＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバー間の関係を表示するための近隣結合樹を生成するために使用した。６つのＦＡＤ３ファミリーメンバーを、３対のＦＡＤ３遺伝子にアラインした（図４）。
【００６４】
ＰＣＲベースのスクリーニング
ＰＣＲプライマーのコホートを、上述のＢＡＣライブラリーをスクリーニングするために設計した。前記プライマーを、遺伝子ファミリーのすべてのメンバーを増幅することになる万能プライマーとして、または標的対立遺伝子増幅のための遺伝子特異的プライマーとして設計した。前記ＰＣＲプライマーを２０ｂｐ長（＋／−１ｂｐ）であるように設計した。そして前記プライマーは、５０％（＋／−８％）のＧ／Ｃ含量を有する。表２および表３は、設計し、合成したプライマーを収載するものである。ＢＡＣライブラリーのクローンをプールし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってスクリーニングした。
【表２】
0006362600.tif 000003
【表３】
0006362600.tif 000004
【００６５】
２つの異なる条件セットをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いた。第一の一連のＰＣＲ反応は、１Ｘ ＰＣＲ緩衝液（ｄＮＴＰを含有）；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；２００μＭの０．２５Ｕ ＩＭＭＯＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、英国ロンドン）；２５０ｎＭの各プライマー；および約５〜１０ｎｇ テンプレートＤＮＡを含有した。第二の一連のＰＣＲ反応は、ゲノムＤＮＡの増幅のために開発したものであり、５〜１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１Ｘ ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭ フォワードおよびリバースプライマー、ならびに０．２５Ｕ ＩＭＭＯＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、英国ロンドン）を含有した。増幅物をプールして１３μＬの最終体積にし、ＭＪ  ＰＴＣ２００（登録商標）サーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）またはＡＢＩ  ９７００  ＧＥＮＥ  ＡＭＰ  ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して増幅した。ブライアンら（Scottish Crops Research Institute annual report: 2001-2002）によって記載されたスクリーニングシステムに基づく４次元スクリーニングと上記ＰＣＲ条件を用いて、特定のプレートのＰＣＲベースのスクリーニングを行った。プールされたＢＡＣライブラリーのＰＣＲベースのスクリーニング後、直接サンガーシークエンシング法を用いて、増幅ＰＣＲ産物をシークエンシングした。ＢＩＧＤＹＥ（登録商標）ｖ３．１プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってエタノール、酢酸ナトリウムおよびＥＤＴＡで増幅産物を精製し、電気泳動をＡＢＩ３７３０ｘｌ（登録商標）自動キャピラリー電気泳動プラットフォームで行った。
【００６６】
ＰＣＲベースのスクリーニングおよび高次構造サンガーシークエンシング（conformational Sanger sequencing）後、様々な異なるＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーを含有するプレートのコレクションを同定した。合計４つの特有のＦＡＤ２およびＦＡＤ３パラロガス遺伝子配列を同定した（表４および表５）。各ＦＡＤ２およびＦＡＤ３パラロガス遺伝子配列につき合計２枚のプレートを選択してプレートスクリーニングに付して、ＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子を含有するプレート内の特定のウェルおよびクローンを同定した（表４および表５）。両方のプレートについての特定のウェルを同定し、ＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーの各々について個々のクローンを選択した。
【表４】
0006362600.tif 000005
【表５】
0006362600.tif 000006
【００６７】
同定されたＦＡＤ遺伝子ファミリーメンバー各々について単一のＢＡＣクローンをシークエンシングによってさらに解析した。ＢＡＣクローンのＤＮＡを単離し、ＬＡＲＧＥ  ＣＯＮＳＴＲＵＣＴ  ＫＩＴ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を製造業者の説明書に従って使用してシークエンシングのために調製した。抽出されたＢＡＣ  ＤＮＡを、ＧＳ−ＦＬＸ（登録商標）Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を製造業者の説明書に従って使用してシークエンシングのために調製した。シークエンシング反応は、物理的にセクター分けされたＧＳ−ＦＬＸ  ＴＩ（登録商標）ピコタイタープレートを、最適なデータ出力のために対でプールされたＢＡＣとともに使用して行った。ＢＡＣを対で組み合わせ、この場合、ＦＡＤ２遺伝子をＦＡＤ３遺伝子と対にした。すべての生成配列データをＮＥＷＢＬＥＲ  ｖ２．０．０１．１４（登録商標）（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、コネチカット州ブランフォード）によって組み立てた。組み立てられたコンティグを、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ  ｖ３．７（登録商標）（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、ミシガン州アナーバー）を使用して対応するＦＡＤ遺伝子の存在について手作業で評定した。
【００６８】
４つのＦＡＤ２および６つのＦＡＤ３遺伝子すべての完全ゲノム配列を同定し、十分に特性評価した後、ジンクフィンガーヌクレアーゼを、各々の特異的遺伝子ファミリーメンバーの配列に結合するように設計した。
【００６９】
実施例２：ＦＡＤ２遺伝子に特異的なジンクフィンガー結合ドメインの設計
ＦＡＤ２遺伝子座の様々な機能的配列をコードするＤＮＡ配列に対して指向されたジンクフィンガータンパク質を以前に記載されたように設計した。例えば、Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651を参照されたし。例示的標的配列および認識ヘリックスを表６および表８（認識ヘリックス領域設計）ならびに表７および表９（標的部位）に示す。表８および表９では、ＺＦＰ認識ヘリックスが接触する標的部位のヌクレオチドを大文字で示し、非接触ヌクレオチドを小文字で示す。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）標的部位を、ＦＡＤ２Ａの５つの標的部位およびＦＡＤ３の７つの標的部位を結合するように設計した。ＦＡＤ２およびＦＡＤ３ジンクフィンガー設計を、ＣＣＨＣ構造を伴う少なくとも１つのフィンガーを有するタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクターに組み込んだ。米国特許出願公開第２００８／０１８２３３２号明細書を参照されたし。詳細には、各タンパク質の最後のフィンガーは、認識ヘリックスのためのＣＣＨＣ主鎖を有した。非カノニカルジンクフィンガーコード配列を、４アミノ酸ＺＣリンカーおよびトウモロコシ（Zea mays）に由来するｏｐａｑｕｅ−２核移行シグナルによってＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569の配列のアミノ酸３８４−５７９）に融合させて、ＦＡＤ２Ａジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成した。融合タンパク質の発現を、比較的強い構成的プロモーター、例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーターに由来するプロモーターであって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＯＲＦ２３  ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１）が隣接するプロモーターによって駆動した。ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルスからのヌクレオチド配列をコードする自己加水分解性２Ａ（Szymczak et al., 2004）を、その構築物にクローニングされた２つのジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質の間に付加させた。例示的ベクターを下に記載する。
【００７０】
活性ヌクレアーゼを識別することが以前に証明されている発芽酵母ベースの系を使用して、最適なジンクフィンガーを切断活性について検証した。例えば、米国特許出願公開第２００９０１１１１１９号明細書；Doyon et al. (2008) Nat Biotechnol. 26:702-708；Geurts et al. (2009) Science 325:433を参照されたし。様々な機能性ドメインのためのジンクフィンガーをインビボ用に選択した。設計し、生産し、試験して推定ＦＡＤゲノムポリヌクレオチド標的部位に結合させた非常に多数のＺＦＮのうち、ある一定のＺＦＮを高レベルのインビボ活性を有すると同定し、さらなる実験のために選択した。これらのＺＦＮは、特有のＦＡＤ２ゲノムポリヌクレオチド標的部位のインプランタでの効率的結合および切断が可能であることを特徴とした。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表７】
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【表８−１】
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【表８−２】
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【表９】
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【００７１】
実施例３：ＦＡＤ２遺伝子のジンクフィンガーヌクレアーゼ切断の評価
構築物組み立て
実施例２において説明したような酵母アッセイを用いて同定した、例示的ジンクフィンガーヌクレアーゼのＺＦＮ発現構築物を含有するプラスミドベクターを、当分野において一般に公知の技術および技法を用いて設計し、完成させた。各ジンクフィンガーコード配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流に位置する、ｏｐａｑｕｅ−２核移行シグナルをコードする配列（Maddaloni et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17(18):7532）に融合させた。
【００７２】
次に、ｏｐａｑｕｅ−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列を、相補的ｏｐａｑｕｅ−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列と対合させた。したがって、各構築物は、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-8127）からの２Ａ配列によって隔てられた２つのｏｐａｑｕｅ−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列で構成されている単一のオープンリーディングフレームから成った。前記融合タンパク質の発現を、比較的強い構成的プロモーター、例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーターに由来するプロモーターであって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＯＲＦ２３  ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ）が隣接するプロモーターによって駆動した。
【００７３】
ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いてベクターを組み立てた。制限エンドヌクレアーゼをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；マサチューセッツ州イプスウィッチ）から得、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡライゲーションに使用した。プラスミド調製は、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ベツレヘム）またはＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を供給業者の説明書に従って使用して行った。アガロースＴｒｉｓ−酢酸塩ゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ断片を単離した。すべての組み立てたプラスミドのコロニーを、最初にｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、商業シークエンシングベンダー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、アラバマ州ハンツヴィル）がシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。セイヨウアブラナ（B. napus）プロトプラストへの送達前に、Ｐｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  ＰＬＡＳＭＩＤ  ＭＡＸＩＰＲＥＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）またはＰｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を供給業者の説明書に従って使用して、大腸菌（E. coli）の培養物からプラスミドＤＮＡを調製した。
【００７４】
得られた１１のプラスミド構築物：ｐＤＡＢ１０４００８（ＺＦＮ２４８４５およびＺＦＮ２４８４４構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００９（ＺＦＮ２４８２０およびＺＦＮ２４８２１構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４０１０（ＺＦＮ２４８２８およびＺＦＮ２４８２９構築物を含有）（図５）、ｐＤＡＢ１０４００３（ＺＦＮ２４８１０およびＺＦＮ２４８１１構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４０１１（ＺＦＮ２４８３２およびＺＦＮ２４８３３構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００２（ＺＦＮ２４７９４およびＺＦＮ２４７９５構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００６（ＺＦＮ２４７９６およびＺＦＮ２４７９７構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００４（ＺＦＮ２４８１４およびＺＦＮ２４８１５構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００１（ＺＦＮ２４８００およびＺＦＮ２４８０１構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００５（ＺＦＮ２４８１８およびＺＦＮ２４８１９構築物を含有）、およびｐＤＡＢ１０４００７（ＺＦＮ２４８３６およびＺＦＮ２４８３７構築物を含有）を、制限酵素消化によっておよびＤＮＡシークエンシングによって確認した。表１０は、切断および結合するように各ＺＦＮを設計した、異なる構築物および特異的ＦＡＤ配列を収載するものである。
【００７５】
得られたプラスミド構築物；ｐＤＡＢ１０７８２４（ＺＦＮｓ  ２８０２５−２Ａ−２８０２６）、ｐＤＡＢ１０７８１５（ＺＦＮｓ  ２７９６１−２Ａ−２７９６２）、ｐＤＡＢ１０７８１６（ＺＦＮｓ  ２７９６９−２Ａ−２７９７０）、ｐＤＡＢ１０７８１７（ＺＦＮｓ  ２７９７３−２Ａ−２７９７４）、ｐＤＡＢ１０７８２５（ＺＦＮｓ  ２８０３５−２Ａ−２８０３６）、ｐＤＡＢ１０７８２６（ＺＦＮｓ  ２８０３９−２Ａ−２８０４０）、ｐＤＡＢ１０７８１８（ＺＦＮｓ  ２７９８７−２Ａ−２７９８８）、ｐＤＡＢ１０７８２７（ＺＦＮｓ  ２８０５１−２Ａ−２８０５２）、ｐＤＡＢ１０７８２１（ＺＦＮｓ  ２８００４−２Ａ−２８００５）、ｐＤＡＢ１０７８１９（ＺＦＮｓ  ２７９８９−２Ａ−２７９９０）、ｐＤＡＢ１０７８２８（ＺＦＮｓ  ２８０５３−２Ａ−２８０５４）、ｐＤＡＢ１０７８２９（ＺＦＮｓ  ２８０５５−２Ａ−２８０５６）、ｐＤＡＢ１０７８２０（ＺＦＮｓ  ２７９９１−２Ａ−２７９９２）、ｐＤＡＢ１０７８２２（ＺＦＮｓ  ２８０２１−２Ａ−２８０２２）およびｐＤＡＢ１０７８２３（ＺＦＮｓ  ２８０２３−２Ａ−２８０２４）を、制限酵素消化によっておよびＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【表１０】
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【００７６】
トランスフェクションのためのＤＮＡの調製
上記ベクターのプラスミドＤＮＡを、１００％（ｖ／ｖ）エタノールでの沈殿および洗浄によって滅菌し、層流フード内で乾燥させた。そのＤＮＡペレットを、下で説明するようなプロトプラスト細胞へのトランスフェクションのために、３０μＬの滅菌二重蒸留水に０．７μｇ／μｌの最終濃度で浮遊させた。一過性トランスフェクションのためにスーパーコイルプラスミドＤＮＡにおよび安定したトランスフェクションのために線形化プラスミドＤＮＡに結果としてなるようにプラスミドＤＮＡの調製を企てた。キャリアＤＮＡ（例えば、魚精子ＤＮＡ）の形質転換用プラスミドへの付加は、プロトプラスト細胞の一過性トランスフェクションには必要でなかった。一過性研究のために、１０６プロトプラストにつき約３０μｇのプラスミドＤＮＡを形質転換ごとに使用した。
【００７７】
トランスフェクション
セイヨウアブラナ変種（Brassica napus L.var.）ＤＨ１０２７５のトランスフェクションを、Spangenberg et al., (1986) Plant Physiology 66: 1-8に記載されているように完了した。培地配合は、Spangenberg G. and Protrykus I. (1995) Polyethylene Glycol-Mediated Direct Gene Transfer in Tobacco Protoplasts. In: Gene Transfer to Plants. (Protrykus I. and Spangenberg G. Eds.) Springer-Verlag, Berlinに記載されている。セイヨウアブラナ（Brassica napus）種子を７０％エタノールで表面滅菌した。種子を１２ｍＬの７０％エタノール溶液に浸漬し、１０分間、そのカクテルを穏やかに揺動させることによって混合した。その溶液をデカントすることによって７０％エタノール溶液を除去し、１％ ｗ／ｖ 次亜塩素酸カルシウムおよび０．１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０から成る種子滅菌溶液と交換した。種子を種子滅菌溶液に浸漬し、２５分間、そのカクテルを穏やかに揺動させることによって混合した。その種子滅菌溶液をデカントし、滅菌された種子を５０ｍＬの滅菌水で３回すすいだ。最後に、種子を、ペトリ皿の中に置かれた滅菌８０ｍｍ ＷＨＡＴＭＡＮ（登録商標）濾紙ディスク（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ミズーリ州セントルイス）に移し、種子に滅菌水を軽く浸み込ませた。そのペトリ皿をＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ミズーリ州セントルイス）で密封し、プレートを２５℃で、完全暗所下で、１から２日間、恒温放置した。種子から実生出芽の形跡が観察された後、固体ＧＥＭ培地が入っているペトリ皿に実生を移して、さらなる種子発芽を助長した。実生をＧＥＭ培地上で、２５℃で、４から５日間、恒温放置した。
【００７８】
ある体積の液体ＰＳ培地（約１０ｍＬ）を滅菌ペトリ皿にデカントした。滅菌ピンセットおよびメスを使用して、４葉成長および発育期の４から５日齢実生の地上部分を除去し、廃棄した。２０〜４０ｍｍの長さの胚軸セグメントにより、小さい、原形質リッチなプロトプラストの最高集団を生産することにした。胚軸セグメントを無菌切除し、液体ＰＳ培地に移植した。切除した胚軸セグメントを集め、横方向に切断して５〜１０ｍｍセグメントにした。次に、それらの胚軸セグメントを新たなＰＳ培地に移植し、室温で１時間、恒温放置した。原形質分離した胚軸を、酵素溶液が入っているペトリ皿に移した。胚軸セグメントのすべてをその溶液に浸漬するように気を付けた。ペトリ皿をＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）で密封し、一晩、１６から１８時間、２０〜２２℃で、穏やかに揺動しながら恒温放置した。
【００７９】
プロトプラスト細胞を胚軸セグメントから放出させた。一晩胚軸消化物を穏やかに撹拌して、プロトプラストを酵素溶液に放出させた。ペトリ皿をわずかに傾けて、酵素溶液および植物破片から成る消化浮遊液を移すのを補助した。１０ｍＬピペットを使用して、消化浮遊液を滅菌プロトプラスト濾過（１００マイクロメートルメッシュのフィルター）ユニットに移して、プロトプラストを植物破片からさらに分離した。濾過ユニットを穏やかにタッピングして、篩に捕らわれていた過剰な液体を放出させた。そのプロトプラスト浮遊液、約８から９ｍＬを穏やかに混合し、１４ｍＬ滅菌プラスチック丸底遠心チューブに分配した。各浮遊液の上に１．５ｍＬのＷ５溶液をかぶせた。Ｗ５溶液を注意深く斜めにプロトプラスト浮遊液一面に分注し、最小限の撹拌で１滴ずつ分注した。プロトプラスト浮遊液へのＷ５溶液への添加により、結果としてプロトプラストリッチ界面が生成された。ピペットを使用してこの界面を回収した。次に、回収したプロトプラストを新たな１４ｍＬ遠心チューブに移し、穏やかに混合した。血球計数計を使用して、収量および得られたプロトプラストを測定して、１ミリリットルあたりのプロトプラストの数を決定した。葉組織を消化して葉肉プロトプラストを生成する前記方法を繰り返した。
【００８０】
次に、Ｗ５溶液を１０ｍＬの体積に添加し、それらのプロトプラストを７０ｇのペレットにし、その後、Ｗ５溶液を除去した。残存するプロトプラスト浮遊液を穏やかな振盪により再浮遊させた。プロトプラストが入っている各チューブに５ｍＬのＷ５溶液を満たし、室温で１から４時間、恒温放置した。それらのプロトプラスト浮遊液を７０ｇのペレットにし、すべてのＷ５溶液を除去した。次に、３００μＬの形質転換緩衝液を、単離されたプロトプラストを含有するペレット化プロトプラスト浮遊液の各々に添加した。各々のチューブのプロトプラスト浮遊液に１０μｇのプラスミドＤＮＡを添加した。プラスミドＤＮＡは、上で説明したジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物（例えば、ｐＤＡＢ１０４０１０）から成った。次に、３００μＬの予熱したＰＥＧ４０００溶液をプロトプラスト浮遊液に添加し、それらのチューブを穏やかにタッピングした。プロトプラスト浮遊液および形質転換混合物を一切撹拌せずに１５分間、室温で恒温放置しておいた。さらなる１０ｍＬのＷ５溶液を１ｍＬ、１ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、２ｍＬおよび３ｍＬの一連のアリコートで各チューブに添加し、Ｗ５溶液の各添加間にチューブを穏やかに反転させた。遠心分離機において７０ｇで回転させることによってプロトプラストをペレットにした。すべてのＷ５溶液を除去して、純粋なプロトプラスト浮遊液を残した。
【００８１】
次に、０．５ｍＬのＫ３培地をペレット化プロトプラスト細胞に添加し、それらの細胞を再浮遊させた。それらの再浮遊させたプロトプラスト細胞を、１：１濃度の５ｍＬのＫ３および０．６ｍＬのＳｅａ  Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロース（Ｃａｍｂｒｅｘ、ニュージャージー州イーストラザフォード）が入っているペトリ皿の中央に置いた。それらのペトリ皿を１回の穏やかな渦運動で振盪し、２０〜３０分間、室温で恒温放置しておいた。ペトリ皿をＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）で密封し、プロトプラストを２４時間、完全暗所で培養した。暗所での恒温放置後、それらのペトリ皿を６日間、薄明かり（５μＭｏｌ ｍ−２ｓ−１のＯｓｒａｍ  Ｌ３６  Ｗ／２１  Ｌｕｍｉｌｕｘホワイトチューブ）で培養した。培養工程後、滅菌スパチュラを使用して、プロトプラストを含有するアガロースを四分円に分割した。分離した四分円を、２０ｍＬのＡ培地が入っている２５０ｍＬ プラスチック培養容器内に置き、回転振盪機を用いて８０ｒｐｍおよび１．２５ｃｍ 偏心距離で、２４℃で、継続的に薄明かりで１４日間、恒温放置し、その後、各ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物の活性レベルを判定した。
【００８２】
カノーラプロトプラストからのゲノムＤＮＡ単離
トランスフェクトされたプロトプラストを個別の１．５または２．０ｍＬ遠心チューブに供給した。それらの細胞を緩衝溶液中、チューブの底部でペレット化した。液体窒素で細胞を瞬間冷凍し、続いてそれらの細胞を４８時間、ＬＡＢＣＯＮＣＯ  ＦＲＥＥＺＯＮＥ  ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、ミズーリ州カンザスシティー）において−４０℃および約１３３ｘ１０−３  ｍＢａｒ圧で冷凍乾燥させることによって、ＤＮＡ抽出を行った。組織破壊を必要としなかったことおよびプロトプラスト細胞を直接溶解緩衝液に添加したことを除き、ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ、カリフォルニア州カールズバッド）植物キットを製造業者の説明書に従って使用して、それらの凍結乾燥細胞をＤＮＡ抽出に付した。
【００８３】
カノーラプロトプラストにおけるゲノムＤＮＡ配列切断についてのＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３  ＺＦＮの試験
複数のＺＦＮ対を標的部位とオーバーラップするように設計するために、ＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３遺伝子座についてのＺＦＮ標的部位の設計をクラスター化した。ＺＦＮ標的部位のクラスター化は、オーバーラップしているＺＦＮ標的部位のすべてをカプセル化するような１００ｂｐウインドウの中のすべてのＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーから周囲ゲノム配列を増幅するＰＣＲプライマーを設計することを可能にした。したがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード配列技術を用いて、トランスフェクトされたプロトプラストの標的ＺＦＮ部位の完全性を評定することができた。加えて、設計したＰＣＲプライマーは、配列リードをＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３ファミリーの特定の遺伝子メンバーに帰属させることになる特定のヌクレオチド塩基を含む必要があった。したがって、すべてのＰＣＲプライマーには、いずれのＺＦＮ標的切断部位からも５〜１０ヌクレオチド離れて結合することが求められることになる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性が、プライミング部位を除去し得る、増幅を阻害し得る、およびしたがってＮＨＥＪ活性の評定を歪め得る小規模な欠失の原因となることは公知であるからである。
【００８４】
ＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３遺伝子ファミリーのＺＦＮ標的遺伝子座のすべてに結合するようにプライマーを設計し（表１１）、ＰＣＲ増幅産物のサンガーベースのシークエンシングによってすべての遺伝子ファミリーメンバーの増幅について実験的に試験した。いくつかの場合、すべての遺伝子ファミリーメンバーを区別するプライマーを開発できなかった（表１２および表１３）が、すべての場合、ＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３の標的遺伝子配列を区別することができた。ＰＣＲプライマー設計後、カスタムＤＮＡバーコード配列をＰＣＲプライマーに組み込み、それらのプライマーを使用して、異なるＺＦＮ標的遺伝子座を区別し、トランスフェクションおよびＺＦＮに対する特異的配列リードを同定した（表１１、１２および１３）。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１２】
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【表１３】
0006362600.tif 000020
【００８５】
ＺＦＮでトランスフェクトされたカノーラプロトプラストのＤＮＡ抽出後、標的ＺＦＮ遺伝子座のＰＣＲ増幅を行って、Ｉｌｌｕｍｉｎａベースの合成によるシークエンシング技術のために正しい形式で必要遺伝子座特異的ＤＮＡ分子を生成した。各アッセイを、２５ｎｇ 出発ＤＮＡ（セイヨウアブラナ（Brassica napus）ゲノムの約１２，５００細胞相当量）で作業するために最適化した。適切なレベルでのＮＨＥＪ効率および特異性の評定に必要なカバー率を生じさせるためにサンプルごとに複数の反応、個々のプロトプラストから得たセイヨウアブラナ（Brassica napus）ゲノムの２００，０００コピーに相当する約１６ ＰＣＲ反応を行った。３回ずつ行う同じアッセイおよび１反応で試験することになるすべてのサンプルのためにＰＣＲ増幅マスターミックスを調製し、標的組織に関して行うための最適なサイクル数を決定するために用いられる定量的ＰＣＲ法を用いてアッセイして、ＰＣＲ増幅が試薬制限されておらず、まだ指数増幅段階にあることを確実なものにした。必要な陰性対照反応での実験を、ＭＸ３０００Ｐ  ＴＨＥＲＭＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して９６ウェル形式で行った。定量的ＰＣＲプラットフォームから収集した出力データから蛍光の相対的増加をサイクルごとにプロットし、そして過剰なサイクリングおよび共通転写産物または分子の増幅を低減させるために、十分な増幅をもたらすが反応に試薬制限を被らせないアッセイあたりのサイクル数を決定した。未使用のマスターミックスが、定量的ＰＣＲ解析を終え、サイクル数を決定するまで氷上にあり、そしてその後、そのマスターミックスを所望の反応チューブ数（ＺＦＮアッセイあたり約１６）に等分し、ＰＣＲ反応を行った。増幅後、単一ＺＦＮ遺伝子座についてのサンプルを一緒にプールし、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用してＺＦＮあたり２００μＬのプールされた産物を清浄化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード技術を用いてサンプルをシークエンシングできるようにするために、さらなる対の末端プライマーを生成された断片上に増幅によって結合させることが必要であった。これを、第一増幅ラウンドにおいて付加された配列に一部は相補的であるが必要とされる対の末端配列も含有するプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅によって果たした。共通断片を過増幅することなく対の末端配列をテンプレートに付加させる、実施するＰＣＲサイクルの最適な数を、前に説明したような定量的ＰＣＲサイクル解析のサンプル通過を用いて再び決定した。ＰＣＲ増幅後、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用して生成された産物を清浄化し、２．５％アガロースゲルで分割した。ＳＹＢＥＲ  ＳＡＦＥ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して正しいサイズのバンドとして可視化されたＤＮＡ断片をゲル抽出して、一切の残留ＰＣＲ生成プライマー−ダイマーまたは他の偽断片を除去し、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用してそのゲル���ライスからＤＮＡを抽出した。ゲル抽出の完了後、ＡＭＰＵＲＥ（登録商標）磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州ブレア）を１：１．７のＤＮＡ対ビーズ比で使用してＤＮＡのさらなる清浄化を行った。その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用の定量的ＰＣＲベースのライブラリー定量キット（ＫＡＰＡ）を使用して、１／４０，０００および１／８０，０００希釈で、および反応を３回ずつ行って、ＤＮＡを濃度について評定した。定量的ＰＣＲ結果に基づき、ＤＮＡを２ｎＭの標準濃度に希釈し、ＤＮＡシークエンシングのためにすべてのライブラリーを併せた。ＣＢＯＴ  ＣＬＵＳＴＥＲ（登録商標）生成キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用してシークエンシングのためにサンプルを調製し、製造業者の説明書に従ってＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＧＡ２ｘ（登録商標）を１００ｂｐペアエンドシークエンシングリードで用いてシークエンシングした。
【００８６】
標的ジンクフィンガー部位での非相同末端結合の検出のためのデータ解析法
シークエンシング反応、およびベースコーリングのためにＩｌｌｕｍｉｎａバイオインフォマティックパイプラインを使用して行った一次データコーリングの完了後、各場合、完全解析を行って標的ＺＦＮ部位における欠失塩基を同定した。入力配列のリストに従ってコンピュータによりＤＮＡ配列からバーコードを抽出し、選別するようにカスタムＰＥＲＬスクリプトを設計した。バーコードは、誤帰属配列リードを低減させるために、許容される３０より大きいＰｈｒｅｄスコアで基準配列とマッチしなければならなかった。使用した異なるバーコード群に配列リードをビニングした後、すべての配列にわたってクオリティフィルターを通した。このクオリティフィルターは、第二のカスタム開発ＰＥＲＬスクリプトであった。「Ｎ」とコールされる塩基が３つより多かった場合、または中央値Ｐｈｒｅｄスコアが２０未満であった場合、または２０未満のＰｈｒｅｄスコアを有する３連続塩基があった場合、または配列リードが４０ｂｐの長さより短かった場合、配列リードを除外した。対の配列リードの両方が入手可能である場合、ＮＥＸＴＧＥＮＥ（登録商標）（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、ペンシルバニア州ステートカレッジ）パッケージを使用して残りの配列をマージした。その後、それらの残りのマージされた配列リードを、第三のカスタムＰＥＲＬスクリプトと、その残りの配列識別子の最後に記録された、同定された重複配列の数のカウントを使用して、特有の配列リードのコレクションに縮小した。その後、ＮＥＸＴＧＥＮＥ（登録商標）ソフトウェアを使用してそれらの特有の配列リードをＦＡＤ２およびＦＡＤ３参照配列にアラインし、ギャップ付きＦＡＳＴＡアラインメントファイルを作成した。
【００８７】
そのギャップ付きＦＡＳＴＡファイルを使用し、４つのカスタムＰＥＲＬスクリプトを使用してギャップ付き塩基位置番号の入力基準への変換を行った。これは、異なる遺伝子ファミリーメンバー（異なる遺伝子ファミリーメンバー間の同祖またはパラロガス配列変異のいずれか）を区別する塩基を、組み立てたデータの中で同定することを可能にした。塩基ナンバリングの変換を実行し次第、各々の特有の配列リードについてハプロタイプレポートを生成することおよびリードを特定の遺伝子ファミリーメンバーに割り当てることが可能であった。リードを遺伝子によりグループ分けし次第、ＺＦＮ標的部位を包囲する１０ｂｐウインドウを同定し、評定した。欠失を有する配列の数を失われた塩基の数とともに遺伝子ごとに記録した。
【００８８】
その後、データを、１０，０００配列リードあたり１から１０塩基が標的ＺＦＮ部位において欠失されている配列の数とともに、複数ライン折れ線グラフとしてグラフ表示した（図６）。この解析を、すべてのＺＦＮトランスフェクションとともに対照トランスフェクションについて行った。いくつかの場合、天然ＤＮＡ配列中のリピートは、標的ＺＦＮ部位におけるシークエンシングエラー、例えば、単一塩基欠失の出現率の増加として一般に見られるエラーをもたらし、これは、すべてのサンプルにおいて、ＺＦＮでトランスフェクトしたサンプルにおいても、対照においても、報告された（図７）。
【００８９】
これらの結果から、ＮＨＥＪのより大きな活性によって判定して、ＦＡＤ２標的部位での最高レベルのＺＦＮ活性を遺伝子座Ｅにおいて同定した。プラスミドｐＤＡＢ１０４０１０上にコードされたＺＦＮ（すなわち、ＺＦＮ２４８２８および２４８２９）を、有意なゲノムＤＮＡ切断活性および最小の非標的活性というその特徴を考えて、特別設計の導入遺伝子組み込みプラットフォーム（Engineered Transgene Integration Platform）（ＥＴＩＰ）のインプランタ標的化のために選択した。
【００９０】
実施例４：特別設計の導入遺伝子組み込みプラットフォーム（ＥＴＩＰ）カノーラ植物系統のための遺伝子構築物
下で説明するプラスミドベクター構築物は、当業者に一般に公知の方法および技法を用いて造った。この段落の中で説明する特定の試薬および技法の応用は、当業者には容易に分かり、プラスミドベクター構築物を造るという所望の目的を達成するために他の試薬および技法と容易に交換することができよう。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；マサチューセッツ州イプスウィッチ）から得た。ライゲーションは、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で完了した。１つのエントリーベクターをシングルディスティネーションベクターに組み立てるためにＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＧａｔｅｗａｙ反応を行った。１つのエントリーベクターをシングルディスティネーションベクターに組み立てるためにＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用してＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）反応を行った。プラスミド調製は、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｉｎｃ．，ペンシルバニア州ベツレヘム）またはＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を供給業者の説明書に従って使用して行った。アガロースＴｒｉｓ−酢酸塩ゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ断片を単離した。すべての組み立てたプラスミドのコロニーを、最初にｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、商業シークエンシングベンダー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、アラバマ州ハンツヴィル）がシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。
【００９１】
カノーラのＦＡＤ２Ａ遺伝子座内へのＥＴＩＰの正確な組み込みのための直接−送達ベクター
セイヨウアブラナ（B. napus）のＦＡＤ２Ａ遺伝子への特異的組み込みのためのＥＴＩＰ含有ベクターｐＤＡＳ０００１３０（図８、配列番号１４１のようなＴ鎖インサート）の構築に標準クローニング法を用いた。この構築物を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物ｐＤＡＢ１００４０１０でカノーラプロトプラストに送達されるように設計した。ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物は、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座を切断することになり、そしてその後、ｐＤＡＳ０００１３０構築物が相同性指向型修復メカニズムによってカノーラゲノム内に組み込まれることになる。このＥＴＩＰは、追加のＺＦＮ認識配列によって隔てられた４つの発現カセット（２つは不完全）と、別のＺＦＮ認識配列を含有する特別設計のランディングパッド（Engineered Landing Pad）（ＥＬＰ）とから成る。前記追加のＺＦＮ認識配列は特有のものであり、ＥＴＩＰおよびＥＬＰ導入遺伝子挿入物内へのポリヌクレオチド配列の導入のために標的化されるようにそれらを設計した。同様に、前記ＺＦＮ認識配列は、ポリヌクレオチド配列の切除に利用することができる。第一の遺伝子発現カセットは、不完全なｄｓＲＥＤ発現カセットであり、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ポリユビキチン１０（ＡｔＵｂｉプロモーター）遺伝子からのプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン（Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、造礁サンゴ・イソギンチャクモドキ属の１種（Discosoma sp.）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）からの２１０ｂｐのｄｓＲｅｄ遺伝子（ｄｓ  ＲＥＤ（双子葉植物最適化）エクソン１）、続いてシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）チオレダクターゼ様遺伝子からのイントロン（Ａｔチオレダクターゼからのイントロン１：アクセッション番号：ＮＣ＿００３７４）、そしてトウモロコシ（Zea mays）Ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ−１（Ｖｐ１）遺伝子の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（Ｚｍｌｉｐターミネーター：Paek et al., (1998) Molecules and Cells, 8(3): 336-342）を含有した。第二の発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルスからの５’ＵＴＲを含む１９Ｓプロモーター（ＣａＭＶ  １９Ｓ：Cook and Penon (1990) Plant Molecular  Biology 14(3):391-405）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、大腸菌（E. coli）からのｈｐｈ遺伝子（ｈｐｈ（ＨｙｇＲ）：Kaster et al., (1983) Nucleic Acids Research 11(19):6895-6911）、そしてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム１の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（Ａｔ−ＯＲＦ１ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を含有した。第三の発現カセットは、不完全ＰＡＴ発現カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）４−クマリル−ＣｏＡシンターゼからの第一イントロン（イントロン＃２  ４−クマリルＣｏＡシンターゼｖ：アクセッション番号：Ａｔ３ｇ２１３２０／ＮＣ００３０７４）、続いて、ホフィノトリシン（phophinothricin）、グルホシネートおよびビアラホスを含むグルタミンシンセターゼの阻害剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離された、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の合成、植物最適化バージョンの最後の２５６ｂｐ（ＰＡＴ（ｖ６）３’末端：Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1): 25-37）を含有した。このカセットは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム２３の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（ＡｔｕＯＲＦ２３ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を末端に有した。第四の発現カセットは、ｉｐｔ遺伝子カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）ＤＮＡ結合タンパク質ＭＹＢ３２遺伝子（Ｕ２６９３３）からのプロモーターおよび５’ＵＴＲの５８８ｂｐ 短縮バージョン（ＡｔＭＹＢ３２（Ｔ）プロモーター：Li et al., (1999) Plant Physiology 121:313）、続いてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）からのイソペンチルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子、そしてカリフラワーモザイクウイルスからの転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３５ｓターミネーター（ＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーター：Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101(4): 1395-1396）を含有した。ＦＡＤ２Ａへの送達のために、ＥＴＩＰ配列の各末端を、セイヨウアブラナ（B. napus）のＦＡＤ２Ａ遺伝子へのｐＤＡＢ１０４０１０にコードされているＺＦＮの送達によって誘導される２本鎖破断の位置のいずれかの側からの１ｋｂのＦＡＤ２Ａゲノム配列に隣接させた。
【００９２】
ＥＴＩＰ配列は、商業遺伝子合成ベンダー（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が合成した。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）植物ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）を、製造業者により供給された説明書に従って使用して、セイヨウアブラナ（B. napus）ＤＨ１２０７５の葉組織から精製したゲノムＤＮＡからＦＡＤ２Ａゲノム配列の１ｋｂセグメントを増幅した。Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用して、それらの１ｋｂ ＦＡＤ２Ａ配列をＥＴＩＰベクターにライゲートした。すべての組み立てたプラスミドのコロニーを、最初にｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）から得た。プラスミド調製は、ＱＩＡＰＲＥＰ  ＳＰＩＮ  ＭＩＮＩＰＲＥＰ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭＡＸＩＰＲＥＰ（登録商標）システム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）を供給業者の説明書に従って使用して行った。ＡＢＩ  Ｓａｎｇｅｒ  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢＩＧ  ＤＹＥ  ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）ｖ３．１サイクルシークエンシングプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡをシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。
【００９３】
カノーラのＦＡＤ３遺伝子座へのＥＴＩＰの正確な組み込みのための直接−送達ベクター
セイヨウアブラナ（B. napus）のＦＡＤ３ＡまたはＦＡＤ３Ｃ遺伝子への特異的組み込みのためのＥＴＩＰ含有ベクターｐＤＡＳ０００２７１（図９、配列番号１４２のようなＴ鎖インサート）、ｐＤＡＳ０００２７２（図１０、配列番号１４３のようなＴ鎖インサート）、ｐＤＡＳ０００２７３（図１１、配列番号１４４のようなＴ鎖インサート）、ｐＤＡＳ０００２７４（図１２、配列番号１４５のようなＴ鎖インサート）およびｐＤＡＳ０００２７５（図１３、配列番号１４６のようなＴ鎖インサート）の構築に標準クローニング法を用いた。この構築物を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物ｐＤＡＢ１０７８２８またはｐＤＡＢ１０７８２９でカノーラプロトプラストに送達されるように設計した。特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物がＦＡＤ３Ａ遺伝子座を切断することになり、そしてその後、ｐＤＡＳ０００２７３またはｐＤＡＳ２７５構築物が相同性指向型修復メカニズムによってカノーラゲノム内に組み込まれることになる。同様に、特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物がＦＡＤ３Ｃ遺伝子座を切断することになり、そしてその後、ｐＤＡＳ０００２７１、ｐＤＡＳ０００２７２またはｐＤＡＳ０００２７４構築物が相同性指向型修復メカニズムによってカノーラゲノム内に組み込まれることになる。ＥＴＩＰは、追加のＺＦＮ認識配列によって隔てられた４つの発現カセット（２つは不完全）と、別のＺＦＮ認識配列を含有する特別設計のランディングパッド（ＥＬＰ）とから成る。前記追加のＺＦＮ認識配列は特有のものであり、ＥＴＩＰおよびＥＬＰ導入遺伝子挿入物内へのポリヌクレオチド配列の導入のために標的化されるようにそれらを設計した。同様に、前記ＺＦＮ認識配列は、ポリヌクレオチド配列の切除に利用することができる。第一の遺伝子発現カセットは、不完全なｄｓＲＥＤ発現カセットであり、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ポリユビキチン１０（ＡｔＵｂｉプロモーター）遺伝子からのプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン（Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、造礁サンゴ・イソギンチャクモドキ属の１種（Discosoma sp.）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）からの２１０ｂｐのｄｓＲｅｄ遺伝子（ｄｓ  ＲＥＤ（双子葉植物最適化）エクソン１）、続いてシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）チオレダクターゼ様遺伝子からのイントロン（Ａｔチオレダクターゼからのイントロン１：アクセッション番号：ＮＣ＿００３７４）、そしてトウモロコシ（Zea mays）Ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ−１（Ｖｐ１）遺伝子の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（Ｚｍｌｉｐターミネーター：Paek et al., (1998) Molecules and Cells, 8(3): 336-342）を含有した。第二の発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルスからの５’ＵＴＲを含む１９Ｓプロモーター（ＣａＭＶ  １９Ｓ：Cook and Penon (1990) Plant Molecular  Biology 14(3): 391-405）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、大腸菌（E. coli）からのｈｐｈ遺伝子（ｈｐｈ（ＨｙｇＲ）：Kaster et al., (1983) Nucleic Acids Research  11(19): 6895-6911）、そしてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム１の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（ＡｔＯＲＦ１ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を含有した。第三の発現カセットは、不完全ＰＡＴ発現カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）４−クマリル−ＣｏＡシンターゼからの第一イントロン（イントロン＃２  ４−クマリルＣｏＡシンターゼｖ：アクセッション番号：Ａｔ３ｇ２１３２０／ＮＣ００３０７４）、続いて、ホフィノトリシン（phophinothricin）、グルホシネートおよびビアラホスを含むグルタミンシンセターゼの阻害剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離された、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の合成、植物最適化バージョンの最後の２５６ｂｐ（ＰＡＴ（ｖ６）３’末端：Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1): 25-37）を含有した。このカセットは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム２３の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（ＡｔＯＲＦ２３ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を末端に有した。第四の発現カセットは、ｉｐｔ遺伝子カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）ＤＮＡ結合タンパク質ＭＹＢ３２遺伝子（Ｕ２６９３３）からのプロモーターおよび５’ＵＴＲの５８８ｂｐ 短縮バージョン（ＡｔＭＹＢ３２（Ｔ）プロモーター：Li et al., (1999) Plant Physiology 121:313）、続いてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）からのイソペンチルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子、そしてカリフラワーモザイクウイルスからの転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３５ｓターミネーター（ＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーター：Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101(4): 1395-1396）を含有した。ＦＡＤ３ＡまたはＦＡＤ３Ｃへの送達のために、ＥＴＩＰ配列の各末端を、セイヨウアブラナ（B. napus）のＦＡＤ３ＡまたはＦＡＤ３Ｃ遺伝子内へのコードされているＺＦＮの送達によって誘導される２本鎖破断の位置のいずれかの側からの１ｋｂのＦＡＤ３ＡまたはＦＡＤ３ｃゲノム配列に隣接させた。
【００９４】
ＥＴＩＰ配列は、商業遺伝子合成ベンダー（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が合成した。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）植物ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）を、製造業者により供給された説明書に従って使用して、セイヨウアブラナ（B. napus）ＤＨ１２０７５の葉組織から精製したゲノムＤＮＡからＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃゲノム配列の１ｋｂセグメントを増幅した。Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用して、それらの１ｋｂ ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ配列をＥＴＩＰベクターにライゲートした。すべての組み立てたプラスミドのコロニーを、最初にｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）から得た。プラスミド調製は、ＱＩＡＰＲＥＰ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭＡＸＩＰＲＥＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）を供給業者の説明書に従って使用して行った。ＡＢＩ  Ｓａｎｇｅｒ  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢＩＧ  ＤＹＥ  ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）ｖ３．１サイクルシークエンシングプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡをシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。
【００９５】
対照ベクター
対照ベクターを使用して、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）細胞ベースの選別法を開発した。２つの遺伝子発現カセットから成る対照ベクター、ｐＤＡＳ００００３１（図１４：配列番号１４７のようなＴ鎖インサート）の構築に標準クローニング法を用いた。第一の遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス１９ｓプロモーター（ＣａＭＶ  １９Ｓプロモーター；Shillito, et al., (1985) Bio/Technology 3; 1099-1103）：：ヒグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ（ＨｙｇＲ）；米国特許第４，７２７，０２８号明細書）：：およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オープンリーディングフレーム１  ３’非翻訳領域（ＡｔＯＲＦ１ターミネーター：Huang et al., (1990) J. Bacteriol. 1990 172:1814-1822）を含有した。第二の遺伝子発現カセットは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター；Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493)：：ｄｓＲＥＤ（ｄｓＲＥＤ（Ｄ）；米国特許第６，８５２，８４９号明細書）、およびシロイヌナズナ属（Arabidopsis）からのイントロン（イントロン＃１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０２５６３９．１）：：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オープンリーディングフレーム２３  ３’非翻訳領域（ＡｔＯＲＦ２３ターミネーター；米国特許第５，４２８，１４７号明細書）をトランス配向（例えば、ヘッドトゥーヘッド配向）でのインフレーム融合体として含有した。ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いてこのプラスミドベクターを組み立てた。
【００９６】
カノーラへのＥＴＩＰのランダム組み込みのためのバイナリーベクターの構築
セイヨウアブラナ（Brassica napus）のゲノム内へのＥＴＩＰ  Ｔ鎖配列のランダム組み込みのために２つのバイナリーベクターを構築した。ＥＴＩＰ含有ベクターｐＤＡＳ００００３６（図１５、配列番号１４８のようなＴ鎖インサート）およびｐＤＡＳ００００３７（図１６、配列番号１４９のようなＴ鎖インサート）の構築に標準クローニング法を用いた。これらのＥＴＩＰベクターは、ＺＦＮ認識配列によって隔てられた４つの発現カセット（２つは不完全）と、さらなるＺＦＮ認識配列を含有する特別設計のランディングパッド（ＥＬＰ）とから成る。第一の遺伝子発現カセットは、不完全なｄｓＲＥＤ発現カセットであり、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ポリユビキチン１０（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター）遺伝子からのプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン（Norris et al., (1993) Plant Molecular Biology, 21(5): 895-906）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、造礁サンゴ・イソギンチャクモドキ属の１種（Discosoma sp.）からの２１０ｂｐのｄｓＲｅｄ遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）、続いてシロイヌナズナ属（Arabidopsis）チオレダクターゼ様遺伝子からのイントロン（アクセッション番号：ＮＣ＿００３７４）、そしてトウモロコシ（Zea mays）Ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ−１（Ｖｐ１）遺伝子の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）（Ｚｍ  Ｌｉｐターミネーター：Paek et al., (1998) Molecules and Cells , 8(3): 336-342）を含有した。第二の発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルスからの５’ＵＴＲを含む１９Ｓプロモーター（ＣｓＶＭＶ  １９プロモーター：Cook and Penon (1990) Plant Molecular  Biology 14(3): 391-405）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、大腸菌（E. coli）からのｈｐｈ遺伝子（ｈｐｈ（Ｄ）：Kaster et al., (1983) Nucleic Acids Research  11(19): 6895-6911）、そしてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（Ａｔ−ＯＲＦ１ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を含有した。第三の発現カセットは、不完全ＰＡＴ発現カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）４−クマリル−ＣｏＡシンターゼからの第一イントロン（アクセッション番号：Ａｔ３ｇ２１３２０（ＮＣ００３０７４））、続いて、ホフィノトリシン（phophinothricin）、グルホシネートおよびビアラホスを含むグルタミンシンセターゼの阻害剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離された、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子の合成、植物最適化バージョンの最後の２５６ｂｐ（ＰＡＴｖ６（エクソン２）；Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1): 25-37）を含有した。このカセットは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム２３（ＯＲＦ２３）の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（ＡｔｕＯＲＦ２３ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を末端に有した。第四の発現カセットは、ｉｐｔ遺伝子カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）ＤＮＡ結合タンパク質ＭＹＢ３２遺伝子（Ｕ２６９３３）からのプロモーターおよび５’ＵＴＲの５８８ｂｐ 短縮バージョン（ＡｔＭＹＢ３２（Ｔ）プロモーター：Li et al., (1999) Plant Physiology 121:313）、続いてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）からのイソペンチルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子、そしてカリフラワーモザイクウイルスからの転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３５ｓターミネーター（ＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーター：Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101(4): 1395-1396）を含有した。
【００９７】
発現カセットおよびＥＬＰは、商業遺伝子合成ベンダー（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）がＭｕｌｔｉ−Ｇａｔｅｗａｙ  ｓｉｔｅを用いて合成した。エントリークローンは、ＢＰ  ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｐＤＯＮＲ２２１  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｕｉｔｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して各発現カセットおよびＥＬＰで構築した。その後、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  Ｐｌｕｓ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＧａｔｅｗａｙ可能なバイナリーベクターとのＭｕｌｔｉ−Ｇａｔｅｗａｙ反応にそれらのエントリークローンを使用した。すべての組み立てたプラスミドのコロニーを、最初にｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）から得た。プラスミド調製は、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）またはＰｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）を供給業者の説明書に従って使用して行った。ＡＢＩ  Ｓａｎｇｅｒ  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡをシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。
【００９８】
実施例５：ＥＴＩＰカノーラ植物系統の産生
セイヨウアブラナ（Brassica napus）の形質転換
実施例４において説明した、ＥＴＩＰ構築物（ｐＤＡＳ００００３６、ｐＤＡＳ００００３７）、ＤＳ−Ｒｅｄ対照構築物（ｐＤＡＳ００００３１）、ならびにＦＡＤ２Ａ、ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ部位特異的構築物（ｐＤＡＳ０００１３０、およびｐＤＡＳ０００２７１〜ｐＤＡＳ０００２７５）ならびに付随ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｐＤＡＢ１０４０１０、ｐＤＡＢ１０７２８およびｐＤＡＢ１０７２９）。バイナリーベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＧＶ３１０１：ＰＭ９０に形質転換した。実施例３において説明したトランスフェクションプロトコルを、多少の変更を加えて用いて、セイヨウアブラナ（Brassica napus）プロトプラスト細胞の形質転換を完了した。
【００９９】
前記プロトコルの変更は、Ｓｅａ  Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロースの代わりのアルギン酸ナトリウムの使用を含んだ。ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物とＥＴＩＰ構築物の両方をセイヨウアブラナ（Brassica napus）プロトプラスト細胞に共送達するトランスフェクション実験を、５：１モル比のプラスミドＤＮＡを含むＤＮＡ濃度で完了した。他のＥＴＩＰおよび対照プラスミド構築物は、３０μｇのプラスミドＤＮＡの濃度で形質転換させた。したがって、ｐＤＡＳ０００１３０は、２７．８μｇのプラスミドＤＮＡの濃度から成り、およびｐＤＡＢ１０４０１０は、２．２μｇのプラスミドＤＮＡの濃度から成った。他のＥＴＩＰおよび対照プラスミド構築物は、３０μｇのプラスミド濃度で形質転換した。
【０１００】
前記プロトコルのさらなる変更は、１．５ｍｇ／ｍＬのヒグロマイシンを含有する培地中の形質転換プロトプラストからの全草の繁殖を含んだ。全草の繁殖には、Ａ培地を２週間ごとに取り換えることおよびプロトプラスト由来のコロニーをモニターすることを必要とした。プロトプラスト由来のコロニーが直径おおよそ２〜３ｍｍに成長した後、固体ＭＳ  ｍｏｒｐｈｏ培地が入っている１２−ｗｅｌｌ  ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）プレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ミズーリ州セントルイス）の個々のウェルにコロニーを移した。プレートを１から２週間、２４℃で、連続的薄明かりのもとで、カルスが直径８〜１０ｍｍのサイズに増殖するまで、恒温放置した。プロトプラスト細胞が直径１〜２ｃｍの直径に達した後、ＭＳ  ｍｏｒｐｈｏ培地が入っている個々の２５０ｍＬ培養容器にプロトプラスト細胞を移した。それらの容器を、２４℃で、１６時間昼（２０μＭｏｌ ｍ−２ｓ−１のＯｓｒａｍ  Ｌ３６  Ｗ／２１  Ｌｕｍｉｌｕｘホワイトチューブ）および８時間夜の条件下で恒温放置した。１から２週間以内に、複数の苗条が見られた。それらの苗条が３〜４ｃｍの長さに達した後、ＭＳ培地が入っている２５０ｍＬ培養容器に苗条を移した。それらの２５０ｍＬ培養容器を、２４℃で、１６時間昼（２０μＭｏｌ ｍ−２ｓ−１のＯｓｒａｍ  Ｌ３６  Ｗ／２１  Ｌｕｍｉｌｕｘホワイトチューブ）および８時間夜の条件下で恒温放置した。それらの苗条が小植物に発育するまで苗条を培養容器内で維持し、小植物に発育した時点で温室に移して成熟するまで成長させた。
【０１０１】
実施例６：カノーラへのＴ−ＤＮＡ含有ＥＴＩＰの組み込みについての分子確認
ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）９６  Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商標）またはＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、すべての推定トランスジェニック植物の葉組織からゲノムＤＮＡを抽出した。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）の残存率について試験するためにｐＴｉＣ５８フォワード（配列番号１５０  ＣＧＡＧＡＡＣＴＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣ）およびｐＴｉＣ５８リバース（配列番号１５１  ＴＧＧＣＧＡＴＴＣＴＧＡＧＡＴＴＣＣ）からｖｉｒＣを増幅するために設計したプライマー、セイヨウアブラナ（B. napus）からアクチンを増幅するために設計したプライマー；アクチンフォワード（配列番号１５２  ＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧ）およびアクチンリバース（配列番号１５３  ＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧ）を使用して、ＰＣＲにより各植物からのゲノムＤＮＡを解析して、それらのゲノムＤＮＡの質を確認した。ｈｐｈ遺伝子を増幅するためにプライマーを設計した；ＥＴＩＰによってコードされたＨＰＨフォワード（配列番号１５４  ＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＣＧ）およびＨＰＨリバース（配列番号１５５  ＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣ）。ｖｉｒＣプライマーから産物をもたらさなかったが、正しいサイズの産物がアクチンおよびｈｐｈへのプライマーで増幅された植物を、トランスジェニックとして分類した。
【０１０２】
第二のスクリーニングを完了し、このスクリーニングでは、Ｔ−ＤＮＡ領域の外側でバイナリーベクターを増幅するために設計した５セットのプライマー［［（１Ｆ  配列番号１５６  ＡＴＧＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＣ；１Ｒ  配列番号１５７  ＧＡＡＧＧＧＡＡＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＣＣ）（２Ｆ  配列番号１５８  ＴＧＣＧＣＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＣＡＡＡＴ；２Ｒ  ＳＥ  ＩＤ  ＮＯ：１５９  ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣ）（３Ｆ  配列番号１６０  ＣＣＴＧＣＡＴＴＣＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣ；３Ｒ  配列番号１６１  ＣＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＧＣ）（４Ｆ  配列番号１６２  ＡＴＴＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴ；４Ｒ  配列番号１６３  ＧＣＣＡＡＣＧＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＣＴ）（５Ｆ  配列番号１６４  ＧＣＣＣＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＡＡＧＴ；５Ｒ  配列番号１６５  ＧＴＡＡＣＴＴＡＧＧＡＣＴＴＧＴＧＣＧＡ）］を使用してＰＣＲにより各トランスジェニック植物からのｇＤＮＡを増幅した。正しいおよび予想されたサイズのＰＣＲ産物がプライマーセット３および４から増幅された植物は、主鎖組み込み（backbone integration）を有するとみなした。
【０１０３】
主鎖組み込みのない植物からのＤＮＡを、修正ＣＴＡＢ法（Maguire et al,. (1994) Plant Molecular Biology Reporter, 12(2): 106-109）を用いて２０ｇの葉組織から精製した。単離されたｇＤＮＡをいくつかの制限酵素で消化し、１０μｇのｇＤＮＡをアガロースゲルでの電気泳動によって分離し、標準サザンブロット法プロトコルを用いて膜に転写した。ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）を製造業者の説明書に従って使用して膜をプローブした。各発現カセットへの、ＥＬＰへのおよび内在性対照遺伝子、アクチンへのプローブは、ＥＴＩＰ構築物から、次のプライマーを使用して増幅した：（ＩＰＴ−Ｆ  配列番号１６６  ＴＣＴＣＴＡＣＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＧ；ＩＰＴ−Ｒ  配列番号１６７  ＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＣ；ｄｓＲＥＤ−Ｆ  配列番号１６８  ＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＧＡＧＡＡＣＧ；ｄｓＲＥＤ−Ｒ  配列番号１６９  ＴＴＣＣＧＴＡＴＴＧＧＡＡＴＴＧＡＧＧ；ＰＡＴ−Ｆ  配列番号１７０  ＴＴＧＣＴＴＡＡＧＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＣＧ；ＰＡＴ−Ｒ  配列番号１７１  ＴＧＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＧＧ；ＥＬＰ−Ｆ  配列番号１７２  ＡＴＧＡＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＴＡＧＴＧＧＧ；ＥＬＰ−Ｒ  配列番号１７３  ＡＧＧＧＴＧＴＡＡＧＧＴＡＣＴＡＧＣＣ；Ｈｐｈ−Ｆ  配列番号１７４  ＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＣＧ；Ｈｐｈ−Ｒ  配列番号１７５  ＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣ；アクチン−Ｆ  配列番号１７６  ＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴＡＣＣＣ；アクチン−Ｒ  配列番号１７７  ＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧ）。
【０１０４】
ＥＴＩＰの単一コピーしか含有しないすべての植物からＥＴＩＰ配列を増幅し、シークエンシングした。ＡＢＩ３７３０ｘＩ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅａｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＰＣＲ産物の直接シークエンシングによって各Ｔ−ＤＮＡインサートの配列を解析した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ゲノムＤＮＡからＴ−ＤＮＡインサートを増幅した。Ｔ−ＤＮＡの増幅反応を複数のプライマー対で完了させて、長さおおよそ２Ｋｂｐのオーバーラップ配列を増幅した。各ＰＣＲ産物を複数のプライマーでシークエンシングして、完全カバー率を確保した。シークエンシングＰＣＲ反応の前に、ＰＣＲ反応物をエビ・アルカリホスファターゼおよびエンドヌクレアーゼＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理して過剰なプライマーを不活性化した。各単一コピーＥＴＩＰ系統のＴ−ＤＮＡインサートに隣接する配列を、８つの制限エンドヌクレアーゼでの精製ゲノムＤＮＡの消化、続いて、それらの制限エンドヌクレアーゼによって生成されたオーバーハングに特異的な二本鎖アダプターのライゲーションによって同定した。このライゲーション工程の後、ＥＴＩＰの３’または５’末端いずれかへのビオチン化プライマーおよび各アダプターへのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）ｂｅａｄｓ（商標）（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で捕捉し、清浄化した。ネストＰＣＲを行い、ＡＢＩ  Ｓａｎｇｅｒ  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ（商標）シークエンシングプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてすべての産物をシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。
【０１０５】
サザンブロット解析
サザンプロ−ビングの前にｇＤＮＡサンプルを消化するために特定の制限酵素を選択した。ＥｃｏＲＩおよびＳｗａＩでゲノムＤＮＡを消化することによって推定トランスジェニック植物を解析した。次に、消化されたｇＤＮＡおよび未切断のｇＤＮＡを、ＰＡＴｖ６を含むポリヌクレオチド断片、ＩＰＴを含むポリヌクレオチド断片またはＥＬＰ遺伝子要素を含むポリヌクレオチド断片いずれかでプローブした。これらのポリヌクレオチドプローブ断片は、ＥｃｏＲＩ消化物中およびＳｗａＩ消化物中の複数のインサートの区別を可能にするからであった。その後、同定された単一コピートランスジェニック植物系統を６つすべてのプローブでさらに解析して、挿入されたベクターのすべての不可欠要素の存在を同定した。
【０１０６】
したがって、ＥＴＩＰ−ｐＤＡＳ００００３６で形質転換された６７の独立事象をサンプリングし、導入遺伝子（ｈｐｈ）の存在、およびベクター主鎖の存在について試験した。試験した６７植物のうち、４７は、ゲノム内に組み込まれた導入遺伝子を有することが判明した。それらの４７のトランスジェニック植物からの１７の植物は、ベクター主鎖を含有することが判明した（表１４）。ベクター主鎖の有意な部分を含有しなかった（ＯｒｉまたはＳｐｅｃＲ不在）残りの３０植物をサザン解析のためにサンプリングした。一般則として、植物を最初にＩＰＴプローブでスクリーニングし、推定単一コピー系統と同定された植物系統を、ｄｓＲＥＤ、ＰＡＴ、ＥＬＰおよびｈｐｈ遺伝子要素を含むプローブでさらに試験して、カセット全体の存在を確認した。
【０１０７】
同様に、ＥＴＩＰ−ｐＤＡＳ００００３７で形質転換されたおよび土壌で生存している５２の独立事象をサンプリングし、導入遺伝子（ｈｐｈ）の存在、およびベクター主鎖の存在について試験した。試験した５２植物のうち、４８は、ゲノム内に組み込まれた導入遺伝子を有することが判明した。それらの４８のトランスジェニック植物からの２３の植物は、ベクター主鎖も含有することが判明し、３植物は、試験しなかった（表１４）。ベクター主鎖の有意な部分を含有しなかった（ＯｒｉまたはＳｐｅｃＲ不在）残りの２２植物をサザン解析のためにサンプリングした。これらのトランスジェニック植物を最初にＩＰＴプローブでスクリーニングし、推定単一コピー系統と同定された植物系統を、ｄｓＲＥＤ、ＰＡＴ、ＥＬＰ、ｈｐｈおよびアクチンプローブでさらに試験して結果を確認した。５つの独立した単一コピー系統の同定を達成し次第、残りの植物に関するサザン解析を終了させた。合計で１１のＥＴＩＰ−ｐＤＡＳ００００３７系統をサザン解析に付した。
【表１４】
0006362600.tif 000021
【０１０８】
ｐＤＡＳ００００３６およびｐＤＡＳ００００３７で形質転換されたＥＴＩＰトランスジェニックカノーラの結果
ｐＤＡＳ００００３６およびｐＤＡＳ００００３７の形質転換により生じさせたトランスジェニックセイヨウアブラナ（Brassica napus）事象は、単一コピー、完全長Ｔ鎖挿入物を生じさせる結果となった。各植物についての４事象のうちの３事象を十分に特性評価し、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ゲノム内の特定の染色体に推定的にマッピングした。少数の単一塩基対再配列がＴ鎖組み込み中に発生したが、選択された事象は、導入遺伝子の頑強な発現を駆動することができる完全長発現カセットを含有した。選択されたＴ０事象をＴ１発育期に成長させた。上記ＰＣＲアッセイを用いてそのＴ１をｒｅｓスクリーニングして（res-screened）、組み込まれたＴ鎖の接合状態を判定した。スクリーニングした事象を、ホモ接合性、ヘミ接合性またはヌルとカテゴリー分けした。
【０１０９】
組み込まれたＥＴＩＰ配列の単一コピーしか含有しないすべてのトランスジェニック事象からＥＴＩＰ配列を増幅し、シークエンシングした。各Ｔ−ＤＮＡインサートの配列を、ＰＣＲ産物の直接シークエンシングによって解析した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ゲノムＤＮＡからＴ−ＤＮＡインサートを増幅した。次に、Ｔ−ＤＮＡを複数のプライマー対で増幅して、長さおおよそ２Ｋｂｐのオーバーラップ配列を増幅した。各ＰＣＲ産物を複数のプライマーでシークエンシングして、完全カバー率を確保した。シークエンシングＰＣＲ反応の前に、ＰＣＲ反応物をエビ・アルカリホスファターゼおよびエンドヌクレアーゼＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理して過剰なプライマーを不活性化した。
【０１１０】
各単一コピーＥＴＩＰ系統のＴ−ＤＮＡインサートに隣接する配列を、８つの制限エンドヌクレアーゼでの精製ゲノムＤＮＡの消化、続いて、それらの制限エンドヌクレアーゼによって生成されたオーバーハングに特異的な二本鎖アダプターのライゲーションによって同定した。この工程の後、ＥＴＩＰの３’または５’末端いずれかへのビオチン化プライマーおよび各アダプターへのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（商標）（ＳＰＲＩ）ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で捕捉し、清浄化した。ネストＰＣＲを行い、ＡＢＩ  Ｓａｎｇｅｒ  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１サイクルシークエンシングプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてすべての産物をシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。８のＥＴＩＰ系統を同定し、隣接配列解析のために選択した（表１５）。左および右の隣接配列（ボーダーまたはジャンクション配列とも記載する）を配列番号４３１〜配列番号４４６として提供する。下線付きの配列は、プラスミドベクターを示した。下線のない配列は、ゲノム隣接配列を示す。
【表１５】
0006362600.tif 000022
ｐＤＡＳ００００３６事象詳細：ｅｍ０２−５７８８−１−１  左ボーダー隣接（配列番号４３１）
TCGAGATTGTGCTGAAGTAAACCATTTTACTTCAAATCTATTTTTAACTATTTACTTTTATTAAGGAGAGAAACTTTGCTGATTAATTCAAATTAGTGATCATTAAGATTCCAAAGATTCCGATTTAGAAAAGTCAAAGATTCAAAGAACAAGTCTAGGTCCTCATGGCTCATGTTGCATCCGATTCACCATCCACTCATCTTTCATATCTTCCTCCACTGTCTCTCTAGAAACAACTCATTTAATTTAGAAAACTCCTTTTTCAATTTAGAAATATTAAAGTTTATCACAATGTATCAATTAAATATTATCCGATGACTCATTCATAGTCAGGACCTTGCTGTCTGTGTCGTCCGTAATTATTATTTCAATACAAAACAAATATATGTTCACTCAGAAAATTACGGCGCAATCATCTAATTTTGTGGACCAAAATAAATAGCGTAGCTTCGAGATTTCAAAGTTGTGTTCAAATTTAATTTTGATTTCCGTTCCTCGTATACTCTTTTATGTATAGAAAATAATAATATCCACTACTAGTAGTTGATAACTACATTACATATATTAAAATTATGATGTCACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATC
ｅｍ０２−５７８８−１−１  左ボーダー隣接（配列番号４３２）
CATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACACATAGCGACCGAGCTCGAGCCGAAGTTCGGTCGCTGTTTCACTGTTTGGGAAAGCATCAGTAACGCAGAAGACATAATTAAAAATTAATTATATATGGTAGTTTTTCTAGATTCTCCACTATACCTCATTGTGATTGAAAAACAACTATATATATATATATATATGTATTTAAAATTAAGAAATCATTAAATCGTACCATAATGCAGAAAACTTTATAAGTTCCTATTCTTTTGTCAAGATGAGTAGATGACACATCATGTACCACATAACATAACCATAATGGTGCGATACCATACCAAAACTTAATTTAGAAACTAATTAAAATTTTGGTAGTTTAAGATTCCTCCTAATGGTTGTCAAAAAAAAAAAAAGATTCCTCCTAATACATGGTAGAATATATTTTTGAGTTAAAATGAAAGTAAAATCTTCAAATTAGTCATAAGGAAATTCTAAAAAACATCGACTTTCTTTATAAAGATCCCATTGTAATTTTAGATGATTAATTTTATCCCAATCCAATTAAGAATTGTACACATCGGCCTCTATATATATCAAACACCTAAAA
ｐＤＡＳ００００３６事象詳細：ａｄ５８−５７８４−２−１  左ボーダー隣接（配列番号４３３）
CGATTTGCAGCTATAATCAATCACACCTTATCGTTCTTTCAAAGAAAAATCGAAAGTTGTAAACTTTATCAGCCTGTGTAGTGATTATTTCAATTTGATAAAGAAAAAAAAAGGCTTAGCTTTATTTGGTTTTTTGTTACAATCTTGATTAATTTTAGATTAGCACTCTGATTCTAGCGGAACATGAGAGTGGTTCCATCAAACCTCAGACAGTGAGCACAGTGGTTGCAGCAAACCATTTGGGTGAGAGCTCTTCAGTTTCTTTGCTATTAGCTGGTTCTGGCTCTTCTCTTCAAGAAGCTGCTTCTCAAGCTGCCTCTTGTCATCCTTCTGTTTCCGAGGTAACTAACTACATTCTTCATTTGTCCTTTTTTCTTGTGGGTCTTAAATGTTYGTGCTTTTCTTTATAGGTACTTGTTGCTGATTCAGATAGATTTGAGTACCCTTTAGCTGAACCTTGGGCTAAACTGGTTGACTTTGTTCGCCAACAAAGAGATTACTCTCACATCCTTGCCTTCCTCTAGCTCATTTGGCAAGAACATACTTCCTCTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTC
ａｄ５８−５７８４−２−１  右ボーダー隣接（配列番号４３４）
CCTGTCATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCGCCGGCCTACCTCGCGTTGCTGCTCTTTTAGATGTCTCTCCTGTTACTGATGTTGTCAAAATCTTAGGATCCAATGAGTTTATCAGGTATACTTCTATCATGTATTGCTTGAGATTTTGGAGTGTTAGTAAAGATTTCAATAAAAGAATTTTTTCAAACAAAATTTTGGGGGCTTGAAGCTAATGTTTGGAAATATGTAACGGAGTTTAAATCTTTTGGCAGGCCTATATATGCGGGAAACGCCTTGTGTAGAGTTCGCTATACTGGTGCTGGTCCTTGTGTGTTGACTATTAGAACTACATCTTTTCCTGTTACCCCAATAACTGAGTCAAAGAAAGCTACTATCTCTCAGATTGATCTCTCGAAATTCAAAGAAGGTTTGTTTAGTATTATTCTCTTGTGCATAGCCTTTTTGCTTTTTTTTTTTTTATAAAAAAAGTTGAGTATGCTTATTGCCCATTGCA
ｐＤＡＳ００００３６事象詳細：ａｄ５８−５８９８−１０−１  左ボーダー隣接（配列番号４３５）
TAATTTCATTTTCGTCATTTTGGTAAAGTAACAAAAGACAGAATATTGGTTAGTCGTGTTGGTTAGGAATAAAATAAAGAACGTGGACATCGTGGAATAAAAATATTCAGACAAGGAAACTAACAATAAAACAGTAATGAACATGGTTCTGAATCTCATCTTTGTGTATCTCCAATGGAATCCACCGCCACGAATCAGACTCCTTCTCCAAGCTCCACCGTCGACGATGACAATGGCGACGGTGTCTATACCGACGAATTTACCAAACTACCCCCGGACCCGGGGATCCTCTAGAGTCAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTC
ａｄ５８−５８９８−１０−１  右ボーダー隣接（配列番号４３６）
CGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGATTAAAGATAAAATTTGATTTTTCATTACATAATAATCCATTAATTTTCACGCACGTGGAACCCATTTGGTGTACTTCCACGTCCTCTAAGAGAGCACTGACCCACTCATCAAAAAGATACATCTTTATAAGCCCCTTCATCGTCACACAGACACACACTTCCCTCTCAATTATTCCATATTCTCCTAATTTCTAATTGTTACACCTCAACACATTAGATTCGTACCAAACAAAAACGATTAGCTCCCAAGCCTAAGCTTTTATTTCCTTATAATTTTTCTTGGGTTTCTCTCTATAAAGAATGCAAATGACTGAGAGAGGCCGAGCCATGTGGCACACGTCCCTAGCCTCGGCATTCCGCACAGCTCTAGCTTGCACAATCGTTGGTGCGGCTACGCTCTACGGACCCGAGTGGATCCTCCGTTTTGTGGCATTCCCGGCGTTTTCTTACGTCACGGTCATTCTCATCATTACGGACGCCACGCTAGGCGACACACTACGTGGCTGCTGGCTAGCCCTTTACGCCACATGTCAGAGCGTTGCACCGGCTATCATTACACTAAGGCTTATAGGACCAGCTCGGCTCACGGCCGG
ｐＤＡＳ００００３７事象詳細：ｌｆ３１−６１３９−２−３  左ボーダー隣接（配列番号４３７）
TTTCTTTCCATCAGTTCTTCGGCACCTTCCTGGCTCTGCGTCTATCTTTCTTTCCATCCCGGCCCATCTCGTACACATTCCACCCAACTACACAAACACGTTATAGTCTTTTACATTATGACCAAATCAACCCTAAAGATACAGCCTTTATAAAAAATATAGGGGTCAAAGCAAAGAAGAGAAAGTTTGCTTACAGTGTGGAGAAAAGAAGTTGGAAGATGAGGAGTAAGAAGAAGAAGAGAAGAGAAAGGGTCTTCTGATGAGGAATAGGAGATAAGGTGGAACTGGAATGTTTGCCGCTAAATACTTGAAGACAAGAGCTTGATTTTCAAGCTCTTCCCATTGTGACTCAGTGAAAGGGATCCTAGTCGTCATGAAGAGATAGAGAAAATTGATGATGAAGGAGGTCTGATGAAGAGAAGAGAGAGAGAGAGATATTACACAAAGAGGGTTGTATTGCAAAATTGAAAGTGTAGAGAGAGTAGTAGGTAAGTTTTTATTAATAATGTTGTTCACACCTGCAGTCTGCAGAATATTGTGGTGTGAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTA
ｌｆ３１−６１３９−２−３  右ボーダー隣接（配列番号４３８）
TTCAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGAACATATATATACGCATAATATTCTCAGAACCCGACCCATTGGTTGACTCGGATCAAGATCGACCCGATCCGACCCGGTTAAAAGCACGTCGTCTCCTTTGGTTCGCCCCTTATATTCGACGAGTGAGTTCGATTGGATCGCTGTTTGTCATTTCTCACTACCTTAAGAAAAAAAAAAAGGTGCGTCTCTCTCTCACCTTTACCGCTCACTTACCTCTCAGATCTGACATCGATTTTCCAAATCTTC:TCCAGGTACTCTCTCTCCTGGCCGTTGACGGTCCCGTCCCGGCCGTGGATCTGATTTCGCCGCGATCTGAGGTCAAGCATGGCGGCAGCTAACGCCCCCATCACGATGAAGGAGGTCCTAACGGTGAGTCCCGCCTCCATTTTTAGTAACATA
ｐＤＡＳ００００３７事象詳細：ｂｍ５６−６３１５−１−１  左ボーダー隣接（配列番号４３９）
TACATCGCGATTCATCCTGGTTTGATTAGAATGACGAGGAAGTTGTCATATTCCCAAACAGGAAAATTGGGATCGCCTTATTTGAAAGTGGGATAACTTCTTCATCTTAATTCTTATGAGAATTATTCCACTTCCTGGTGATTCTCCACTACTTTTTGTATATAAATACAGCTTCTTACATCGCGATTCATCCTGATTTGATTAGAATGACGAGAAAGTTGTCATATTCCCAAACAGGAAAACTGGGATCACCTGATTTGAAAGTGGGATAACTTCTTCATCCTAATTCTTATGAGATTTATTCCACTTCCTGGTGATTCTCCACTTCTTTATGTATCCAAATACATCTTCTTACATCGCGATTCATCCTGGTTTGATTAGAATGACGAGGAAGTTGTCATATTCCCAAACATGAAAACTGGGAAAGTGGGATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGAT
ｂｍ５６−６３１５−１−１  右ボーダー隣接（配列番号４４０）
CCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGACGATAAACTATCAGTCTTTCAAAGCGCATCTATGGCTAGTCATCACGGTTTTTAACTGTTTTACGAAGTCGCGGAGAGGCTCGTCTTCTCCCTAGGATAAACTGCAGAGGTCGACATCGGAGGTTTCTCGATCTATGAACATAGAGTACTGTTTGAGAAACTCCGAGGCGAGTTGGCGGAAACTCCCTATAGAGTTTTTCTTTAGACAAGAGAACCACTCAAGCGCTGCTTCGCGGAGGTTCTCGACGAAGAGGCGGCATTCGCCGGCATCTCTTTCTCTATCTTTAAACTTGGCTCTTCCCATCGCGATCTGGAAAGCCTGCAAGTGTGCCTTAGGATCGGTTGTACCATCGTAAGGAGCCACTTTGACTTTATCAGGATCCGAAACCGTAGTTTCGGTGATGCGGGTGGTGAAGGGCGTTTTTCGAGACTCCTCGAGGAGTAGGGTGATATCGAGTGCAGTACTAGTAGCGTGATGATTTGGGATTTCACCGCTCTAACCTCCGCAGCCGTTTTCA
ｐＤＡＳ００００３７事象詳細：ａｄ５８−６３７２−１−１  左ボーダー隣接（配列番号４４１）
TTTTACAGTGTTAGAAGAAGTGGATGAAGCTGAAATTGAATTTTCAAACTCGTTCAGCTTGACTAGAGGTGGGAGAGAGTCAAAGCCTCCCATCAAGTACCAAAACATGGAATAGAAGACAGTCCGAGGGAGAGGAAACCGTGGCCGACGAGGCCGTGGCTCCTATCATTAACTAGTGTCTTTCTTACTATTAATGGTTTATTAAGTCTCAGCCTTTGTTGTTTCATTGGTTTGAGATTCACTCATACATGAAACTTGTTTCATTCCAGCTTTTCCAAACTATAAGAATATTTCCAATCTTATCTTGTAATAGTTTAAGTTTTAAATTGAAAGCCCTTAGTTCAAAAAACAAAAAAAAAAAATTAGCCCTTGAATTTATATATAATCACGACGGCCATATTTGGCAGCTACACTGATATGTTTTCAATTGGCTGACAGGCCTTGAGCAGGGTTTGCTGGGTATATTGGTAGGAAGATGTGTTGCGAGGTTGAAGCCTCATTTAGGCAATATAAACATGATCATTAGCGTTATGTCATTAGTTATACTTATACGTAGACTAAGTAACCCACTAAAGGTTGCTGATTCCTTTTGTATCGACTAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGC
ａｄ５８−６３７２−１−１  右ボーダー隣接（配列番号４４２）
CATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGACTGAATTTTAATTTCTAATTTTTGTAAAAAATTTGTATAACCTCAAATTATTAAAAGGCGGATTTTATTAGAATTATAACTAAATTATCTATAACTCCAAAATTTTGACAATCAATCATGTCTATATCTTTATTTTTTTGCTAAATTATCATGTCTATATCTTTTCTTTCTTCCAAACTTACTTGAGACTAAAAGTCTTTATAAATTTTGATAGGAGTTCCACACACAAACAAAAACAAAACAAATATTTTTCATCAAGGGATACTTATTTAACATCACGGATTCACAGTTTATTAACAAAAATCCAAACAAAGACTGAAAGACAGAAGATTCAATCTAACAATAGTCGGCAAACACCAGTGATTAACTAACGAAATAAATTAACAAGTGGTCAGATCTTCGGGAAA
ｐＤＡＳ００００３７事象詳細：ａｄ５８−６６２０−４−１  左ボーダー隣接（配列番号４４３）
TAATTTCATTTTCGTCATTTTGGTAAAGTAACAAAAGACAGAATATTGGTTAGTCGTGTTGGTTAGGAATAAAATAAAGAACGTGGACATCGTGGAATAAAAATATTCAGACAAGGAAACTAACAATAAAACAGTAATGAACATGGTTCTGAATCTCATCTTTGTGTATCTCCAATGGAATCCACCGCCACGAATCAGACTCCTTCTCCAAGCTCCACCGTCGACGATGACAATGGCGACGGTGTCTATACCGACGAATTTACCAAACTACCCCCGGACCCGGGGATCCTCTAGAGTCAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTC
ａｄ５８−６６２０−４−１  右ボーダー隣接（配列番号４４４）
CATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGAAATAATCGGATATTTAATTTTCTTAGACAGTTCATTAGTAGTTGATCTTAAACATTCACGTTTTATTTTCTTTTCTTTTCGAATGCTAGACTCTAGTTTGGTACCCATAGGATTCGAGTTACATGAAGCTATTGACACTGGGAGTGCTTCAAGATCTGTAAGAGGCAAAGATTCACAAACAGAACGTGATTTCTTGGATAGTGATGTGGAGATTGTGATAAGAACCAGCATGAGTATTACTTTTACTGCCCCTGCTGTGGTGAAGACATCACCAAAACAGTCAAGCTCGTGAAGAAATCAGATATTCAACCCGCAAAAAAATCTGACAATGCAAATAAACCTATTGACACTAAGAATGGTTCAAGATCCGAAGACAAGAAGACAAAAAATTTGTCCTGGCTCCCTGCTTATCTCCAGAAGCTGTTTCTTTCTGTTTATGGCCACATCAAAGACAAAGGTACCCTTTCTTTTGGTGCCTTTGGTGTGGACAGGTGTGATTGACTTTGGTTTCTTGGCAGATTCAGGCAAGATAGAGGTTGATTCAAAGTCAACTAACAATGATCTTGGTACCAATAGTGAGGA
ｐＤＡＳ００００３７事象詳細：ａｄ５８−６６２０−１７−１  左ボーダー隣接（配列番号４４５）
CCGCCTTGAACAACCGCTCCGCCGTTGCTCAGTACATTATCGAGGTTACCAAAAAGTTCAATCCTTTATGCTTGTTTTGGCGTGTGATTCGTTACGAATGAGTAAAATTGATTTGGTTTTTTTCTTTGAACAGCATGGTGGAGATGTGAATGCGACGGATCATACGGGGCAGACTGCGTTGCATTGGAGTGCGGTTCGTGGTGCGGTGCAAGTTGCGGAGCTTTTGCTTCAAGAGGGTGCAAGGGTTGATGCTACGGATATGTATGGATATCAGGTTCTAACCACTTCCTCTTTCTTTGTGGAGATTGTCTTTTTGTTTCAATGCTAGTCAACTTCTTTCTTTCTTTCACAAAACTAAGTAGTATTGCTTGTTTTGTTGTCGTTGCATTTTTTCTTATGGCTGTGTTCTGAGGTTCATGTAGGTATATAAGCACTTCGTACTTTGCCACTTGTTTCATTTAGGCAACATTGTGCACATATCTAAGTAGTTGGTCTTTGTAAAATTAGTTTGTTTGTCTTCAAAGTATATTGAGCAGTTTCATGACTCATTATTCAAAGGTTTGTCTAAATTAGAGAGAACTTTCATTTTGCCTGGATTTAATCAGCATTTAGAATGTTTATAGCGATATCATTTTTAGTTGAAAAAATCTCAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTC
ａｄ５８−６６２０−１７−１  右ボーダー隣接（配列番号４４６）
GTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTAGATCCCCGACCGACCGCCCATCCTGGACGGCCTCGTGCATGCTGATGTTGTCAAAATCTTAGGATCCAATGAGTTTATCAGGTATACTTCTATCATGTATTGCTTGAGATTTTGGAGTGTTAGTAAAGATTTCAATAAAAGAATTTTTTCAAACAAAATTTTGGGGGCTTGAAGCTAATGTTTGGAAATATGTAACGGAGTTTAAATCTTTTGGCAGGCCTATATATGCGGGAAACGCCTTGTGTAGAGTTCGCTATACTGGTGCTGGTCCTTGTGTGTTGACTATTAGAACTACATCTTTTCCTGTTACCCCAATAACTGAGTCAAAGAAAGCTACTATCTCTCAGATTGATCTCTCGAAATTCAAAGAAGGTTTGTTTAGTATTATTCTCTTGTGCATAGCCTTTTTGSTTTTTTTTTTTTTATAAAAAAAGTTGAGTATGCTTATTGCCCATTGC
【０１１１】
ＥＴＩＰのマッピング
ＥＴＩＰの単一コピー挿入物を含有する各トランスジェニック事象について、手作業での組み立て後に隣接配列を獲得し、ローカルＢＬＡＳＴ解析においてクエリーとして使用した。単一コピー組み込みを有する合計８植物がこのプロセスによって同定された（表１６および表１７）。ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）からの５９５，４７８のゲノム由来ショットガン配列のコレクションをＮＣＢＩ  ＧＳＳデータベースからダウンロードし、ヌクレオチドＢＬＡＳＴデータベースとしてフォーマットした。その後、隣接ＥＴＩＰ配列をそのデータベースとＢＬＡＳＴｎ比較し、すべてのマッチを手作業で調査した。その後、Ｂ．オレラセア（B. oleracea）データベースから隣接ＥＴＩＰ配列への最も有意な配列マッチを獲得し、オンラインブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）ゲノム配列（http://brassicadb.org/brad/blastPage.php）に対してアラインし、そこで最も有意な配列マッチを有するゲノム内の位置も検索した。５’または３’隣接配列のみがＢ．オレラセア（B. oleracea）ゲノム配列との有意なマッチを提供した場合、アラインされないまたはマッチしない配列は、データベースにない配列同定を有したか、またはＥＴＩＰの組み込み中に有意なゲノム再配列が生じたと仮定した。解析から有意なＢＬＡＳＴｎマッチを生じさせたサンプルについては、その後、隣接ＥＴＩＰ配列、最も有意なＢ．オレラセア（B. oleracea）ＧＳＳマッチング配列とともにＢ．ラパ（B. rapa）ゲノムからの最も有意なマッチング配列をＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ｖ５．０ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、ミシガン州アナーバー）で８つの単一コピーＥＴＩＰ植物の各々について手作業でアラインした。その後、それらの３配列を比較し、隣接ＥＴＩＰと比較して２倍体アブラナ属（Brassica）種のいずれかからの最も類似した配列を、ＥＴＩＰが位置するゲノムに指定した。大多数のサンプルについて、２つの２倍体アブラナ属（Brassica）ゲノム配列間に有意な変異は存在せず、セイヨウアブラナ（B. napus）由来の隣接ＥＴＩＰ配列は、前記２倍体配列の一方または他方と卓越した関連性を示した。しかし、前記２倍体間の配列変異は不十分であり、連鎖群割り当ては可能であることもあったが、サブゲノム割り当ては可能でなかった。そこで、特異的ゲノム位置をブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）ゲノム配列からの位置から予測した。ＥＴＩＰがＢ．オレラセア（B. oleracea）Ｃゲノムに組み込まれていると同定された場合、Parkin et al. (Genetics 2005, 171: 765-781)に記載されている２倍体アブラナ属（Brassica）ゲノム間の比較シンテニーを用いて、そのゲノム位置をセイヨウアブラナ（Brassica napus）Ｃサブゲノムに外挿した。加えて、Schranz et al. (Trend in Plant Science 2006, 11,11: 535-542)に記載されているシロイヌナズナ属（Arabidopsis）アブラナ属（Brassica）シンテニーによるゲノム位置の確認ばかりでなく、同定された配列をシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ゲノムコード配列（http://arabidopsis.org/index.jspからダウンロードしたＴＡＩＲ  ９  ＣＤＳ）とＢＬＡＳＴｎ比較し、破壊された一切の遺伝子配列の正体も同定した。
【表１６】
0006362600.tif 000023
【表１７】
0006362600.tif 000024
【０１１２】
ホモ接合事象を用いて、前に説明した方法によりプロトプラストを生産する。その後、それらのプロトプラストを、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれているジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されているジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＥＴＩＰの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミドで共形質転換する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＥＴＩＰ遺伝子座を切断し、ドナープラスミドは、相同性指向型修復によってセイヨウアブラナ（Brassica napus）細胞のゲノム内に組み込まれる。ドナープラスミドの組み込みの結果として、部分ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子が完全長ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子に修復される。今や十分に作動可能なＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子の発現を用いて、ＦＡＣＳ法でプロトプラスト細胞を選別する。推定トランスジェニック植物を、実施例７において説明するＦＡＣＳ法を用いて選別し、単離されたプロトプラストを成熟植物へと再生させる。分子確認法を用いて、ＥＴＩＰ標的化植物内のドナープラスミドの組み込みを確認する。したがって、ＥＴＩＰ遺伝子座は、ドナーポリヌクレオチド配列の遺伝子標的組み込みのための部位特異的遺伝子座としての役割を果たす。
【０１１３】
ゲノム標的化位置は、植物の正常な表現型を改変しないゲノム位置を提供する。ＥＴＩＰ内の導入遺伝子を標的にする場合、結果として生ずる事象は、それらのＥＴＩＰ事象を対照植物と比較したときに耕種学的に意味のある意図されない差をもたらさない。加えて、ＥＴＩＰ遺伝子座内に組み込まれた導入遺伝子のタンパク質発現レベルは、頑強に発現され、複数のゲノム遺伝子座にわたって一致しており、安定している。配列番号４３１から配列番号４４６の開示するゲノム配列は、導入遺伝子を含む遺伝子発現カセットの組み込みのための標的になり得るアブラナ属（brassica）ゲノム内のゲノム位置を提供する。
【０１１４】
カノーラへのＥＴＩＰのＦＡＤ２Ａ組み込みの分子確認
組織を８０μｌのＡＥ緩衝液で溶離したことを除き、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用して、すべての推定トランスジェニック植物の葉組織からゲノムＤＮＡを抽出した。再生植物からの３０ミリグラムの若葉組織を液体窒素で瞬間冷凍した後、粉末に粉砕した。
【０１１５】
ＦＡＤ２Ａ遺伝子座の分子特性評価を、３つの独立したアッセイを用いて行った。アッセイを設計し、以下の対照を用いて最適化した：単一のランダムに組み込まれた導入遺伝子を含む特性評価されたトランスジェニック事象、５つのランダムの組み込まれた導入遺伝子を有する特性評価されたトランスジェニック事象、野生型カノーラ園芸品種ＤＨ１２０７５植物および無テンプレート対照反応。ＨＤＲによるＦＡＤ２ＡへのＥＴＩＰの組み込みの証拠を提供するために、以下の３つの分子解析からの結果をともに考慮する。
【０１１６】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による導入遺伝子組み込みの同定
ｈｐｈ（ｈｐｔとも記載する）標的遺伝子に特異的なプライマー（配列番号４４７、ｈｐｔ  Ｆ７９１  ５’ＣＴＴＡＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴＣＧＧＡＣＴＴＧ  ３’；配列番号：４４８、ｈｐｔ  Ｒ９０９  ５’ＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡＡＣＧ  ３’；配列番号４４９、ｈｐｔ  Ｔａｑｍａｎ  ８７２  ５’ＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧ  ３’ＦＡＭ）（図３１）、および高移動度群タンパク質Ｉ／Ｙ（ＨＭＧ  Ｉ／Ｙ）をコードする参照遺伝子（配列番号４５０、Ｆ  ５’ＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＧ  ３’；配列番号４５１、Ｒ  ５’ＴＴＣＧＡＴＴＴＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＣ  ３’；配列番号４５２、プローブ  ５’ＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＣＴ  ３’ＨＥＸ）を使用して、各植物の４つの複製を解析した。次の条件：１０分間９５℃、続いて４０サイクルの３０秒間９５℃、１分間６０℃を用いて反応を増幅し、各アニール工程終了時に増幅データを収集した。ΔＣｑ＝Ｃｑ（標的遺伝子）−Ｃｑ（参照遺伝子）のΔＣｐ法を用いて、コピー数を算出した。Livak, K.J. and T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001. 25(4): p. 402-8。ｈｐｈおよびＨＭＧ  Ｉ／Ｙの増幅ならびに０．５またはそれ以上のコピー数を有する植物をトランスジェニックとみなし、その一方で０．５以上かつ１．２以下のコピー数を有する植物を推定単一コピーとしてスコアリングした。増幅は、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システムとＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（ＲＯＸ）、（Ｒｏｃｈｅ、スイス国バーゼル）で行った。
【０１１７】
破壊されたＦＡＤ２Ａ  ＺＦＮ部位の検出
主要アッセイである破壊遺伝子座試験で、各植物を内在性標的の増幅の存在または不在について解析した。このアッセイは、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｑＰＣＲアッセイであり、シングルプレックスでのものであるが、各反応が同じＰＣＲプレートで同時に進み、内在性遺伝子座（ＦＡＤ２Ａ／２Ｃ．ＲＢ．ＵｎＥ．Ｆ１、配列番号４５３、５’ＣＴＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴ＊Ｃ  ３’およびＦＡＤ２Ａ／２Ｃ．ＲＢ．ＵｎＥ．Ｒ１、５’配列番号４５４、ＧＣＧＴＣＣＣＡＡＡＧＧＧＴＴＧＴＴＧＡ＊Ｇ  ３’）およびＺＦＮ遺伝子座（ＺＦＮ  ｐＤＡＢ１０４０１０がゲノムに結合し、切断する遺伝子座）（ＦＡＤ２Ａ．ＵｎＥ．Ｆ１、配列番号４５５、５’ＴＣＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧ＊Ｃ  ３’およびＦＡＤ２Ａ．ＵｎＥ．Ｒ１、配列番号４５６、５’ＣＣＣＣＧＡＧＡＣＧＴＴＧＡＡＧＧＣＴＡＡＧＴＡＣＡＡ＊Ａ  ３’）を標的にする（図３２）。次の条件を用いて両方のプライマー対を増幅した：３０秒間９８℃、続いて３５サイクルの（１０秒間９８℃、２０秒間６５℃、９０秒間７２℃）、それから続いて１０秒間９５℃、その後、５０℃から９５℃まで０．０５秒に０．５℃の増加で、各増加時にプレートを読み取って溶融解析。反応条件を表１８に収載する。
【表１８】
0006362600.tif 000025
【０１１８】
内在性標的の増幅を有するがＺＦＮ標的の増幅を有さない植物を、破壊遺伝子座試験について陽性とスコアリングし、破壊ＺＦＮ遺伝子座を有すると判断した。ＦＡＤ２Ａ遺伝子座における両方の対立遺伝子のＺＦＮ結合部位が破壊されているとき、このアッセイを陽性であると判断した。
【０１１９】
相同性指向型修復によるＦＡＤ２Ａへの導入遺伝子組み込みのＰＣＲ検出
導入遺伝子標的ｈｐｈ（ｈｐｈ＿ＥｘｏＤｉｇＰＣ＿Ｆ１、配列番号４５７、５’ＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧＡ  ３’およびｈｐｈ＿ＥｘｏＤｉｇＰＣ＿Ｒ１、配列番号４５８、５’ＴＣＣＡＴＣＡＧＴＣＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡ  ３’）と、ＦＡＤ２Ａ内在性遺伝子座（ＦＡＤ２Ａ．Ｏｕｔ．Ｆ１、配列番号４５９、５’ＣＡＴＡＧＣＡＧＴＣＴＣＡＣＧＴＣＣＴＧＧＴ＊Ｃ  ３’およびＦＡＤ２Ａ．Ｏｕｔ．Ｒｖｓ３、配列番号４６０、５’ＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＴＴＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡ＊Ｇ  ３’）と、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座への導入遺伝子の上流の、ＨＤＲによりＦＡＤ２Ａ遺伝子座に挿入された任意の導入遺伝子の５’末端に及ぶ領域（ＦＡＤ２Ａ．Ｏｕｔ．Ｆ１、配列番号４６１、５’ＣＡＴＡＧＣＡＧＴＣＴＣＡＣＧＴＣＣＴＧＧＴ＊Ｃ  ３’およびＱＡ５２０、配列番号４６２、５’ＣＣＴＧＡＴＣＣＧＴＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧ  ３’）と、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座への導入遺伝子の下流の、ＨＤＲによりＦＡＤ２Ａ遺伝子座に挿入された任意の導入遺伝子の３’末端に及ぶ領域（ＱＡ５５８、配列番号４６３、５’ＧＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＣＴＡＧＧＣＡＴＣ  ３’およびＦＡＤ２Ａ．Ｏｕｔ．Ｒｖｓ３、配列番号４６４、５’ＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＴＴＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡ＊Ｇ  ３’）とを増幅するために設計したＰＣＲプライマーでのエンドポイントを用いて、各推定植物形質転換体を解析した（図３３）。すべてのプライマー対を、次の条件を用いて増幅した：３０秒間９８℃、続いて３５サイクルの（１０秒間９８℃、２０秒間６５℃、９０秒間７２℃）。反応試薬条件は、表１９に記載のとおりである。
【表１９】
0006362600.tif 000026
【０１２０】
５’導入遺伝子−ゲノム隣接標的の増幅および／または３’ 導入遺伝子−ゲノム隣接標的の増幅は、推定挿入事象を示した。（ＺＦＮ切断部位の直ぐ上流および下流のＦＡＤ２Ａ領域と１００％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む）ｐＤＡＳ０００１３０カセット内のおおよそ１，０００ｂｐ ＦＡＤ２Ａ相同性アームのため、オフターゲットＥＴＩＰ組み込み事象の増幅から生ずるＰＣＲキメリズムのためにＰＣＲ反応を偽陽性ＰＣＲ産物増幅を被りやすいことに注意しなければならない。ｈｐｈ標的の増幅は、導入遺伝子組み込みが起こったことを確証した。ＦＡＤ２Ａ標的の増幅は、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座がインタクトであるか、または部分的挿入物しか含有しないことを示唆する。ＥＴＩＰのサイズ（ＥＴＩＰカセットについての１１，４６２ｂｐ、またはＦＡＤ２Ａ相同アームおよびＥＴＩＰカセットを含む１３，４７２ｂｐ）のため、ＦＡＤ２Ａプライマーは、インタクトＥＴＩＰがＦＡＤ２Ａ遺伝子座に組み込まれているときには産物を増幅しないと予想される。
【０１２１】
ＦＡＤ２Ａ編集のサザン検出
５’ゲノム−導入遺伝子隣接標的産物の増幅および／もしくは３’導入遺伝子−ゲノム隣接標的の増幅のいずれかを有する、またはＺＦＮ遺伝子標的の増幅を有さない、または両方を有する植物を、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座への導入遺伝子組み込みの検出のためにサザン解析に付した。修正ＣＴＡＢ法（Maguire, T.L., G.G. Collins, and M. Sedgley A modified CTAB DNA extraction procedure for plants belonging to the family proteaceae. Plant Molecular Biology Reporter, 1994. 12(2): p. 106-109）を用いて５ｇの葉組織からゲノムＤＮＡを精製した。次に、１２μｇのゲノムＤＮＡをＫｐｎ１−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で消化し、消化断片を０．８％アガロースゲルでの電気泳動により分離した後、標準サザンブロット法プロトコルを用いて膜に転写した。ＦＡＤ２Ａ  ５’標的領域へのプライマー（Ｆ、配列番号４６５、５’ＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴ  ３’およびＲ、配列番号４６６、５’ＡＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡ  ３’）、ＦＡＤ２Ａ  ３’標的領域へのプライマー（Ｆ、配列番号４６７、５’ＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＴＡＧ  ３’およびＲ、配列番号４６８、５’ＧＴＴＣＣＣＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＧＧ  ３’）およびｈｐｈへのプライマー（Ｆ、配列番号４６９、５’ＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＣＧ  ３’およびＲ、配列番号４７０、  ５’ＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣ  ３’）を使用してプローブを生成して、ＤＩＧ  ＥＡＳＹ  ＨＹＢ  ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）を製造業者の説明書に従って使用してＦＡＤ２Ａ遺伝子座内のＥＴＩＰの存在を検出した（図３４）。ＦＡＤ２Ａ  ５’領域のために４２℃で、ＦＡＤ２Ａ  ３’領域のために４５℃で、およびｈｐｈの検出のために４２℃でハイブリダイゼーションを行った。
【０１２２】
膜結合ゲノムＤＮＡを特定の順序でプローブした；先ず、ＦＡＤ２Ａ  ５’配列をプローブし、次いでＦＡＤ２Ａ  ３’配列をプローブし、そして最後にｈｐｈ配列をプローブした（図３５）。この理論的根拠（rational）は、次のとおりである。第一のプローブ（ＦＡＤ２Ａ  ５’）は、診断プローブであり、ＥＴＩＰが完全ＨＤＲによりＦＡＤ２Ａに組み込まれた場合、５，３２１ｂｐ断片が膜上に見えることになる。結果として生ずるバンドサイズは、電気泳動中に容易に区別され、ＤＩＧ標識Ｒｏｃｈｅ  ＤＮＡ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＷＥＩＧＨＴ  ＭＡＲＫＥＲ  ＩＩＩ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）では５，１４８ｂｐの近くに位置することになる。膜の第二のプローブは、ＦＡＤ２Ａ  ３’プローブとともにあり、編集された植物は、２２，４３３ｂｐ断片を有することになるが、未編集の植物は、１６，４６８ｂｐ断片を有することになる。ＦＡＤ２Ａ  ３’プローブで同定された同じ２２，４３３ｂｐ断片はまた、ｈｐｈプローブによって結合され、ｈｐｈプローブで同定されるはずである。これらの断片は、非常に大きいのでゲルで区別することが困難であり、およびＤＩＧ標識Ｒｏｃｈｅ  ＤＮＡ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＷＥＩＧＨＴ  ＭＡＲＫＥＲ  ＩＩＩ（登録商標）では最大の２１，２２６ｂｐ断片より上または下で出現する断片間のいずれの差も判定することが困難だろう。したがって、これらのプローブは、ＦＡＤ２Ａ  ５’プローブを使用する５ｋｂ断片の可視化により、相同性指向型修復（ＨＤＲ）によるＦＡＤ２ＡへのＥＴＩＰ組み込みの同定を強化し得る証拠を提供する。制限酵素、ＫｐｎＩは、ＫｐｎＩ部位が単一の切断遺伝子座、単一遺伝子座におけるＥＴＩＰカセット、内に出現するので、このアッセイでの使用に唯一適している制限エンドヌクレアーゼであり、ＦＡＤ２Ａ  ＺＦＮ遺伝子座の２つの部位に存在した。１つの部位は、ＦＡＤ２Ａ相同性アームの上流に、およびもう１つの部位は下流に位置した。加えて、ＫｐｎＩは、メチル化感受性でなく、忠実度が増された組換え酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）として入手可能である。
【０１２３】
分子およびサザン解析の結果
トランスフェクション、培養および選択の後、トランスジェニック植物を土壌に移植した。このプロセスを１３９の植物が生き残り、それらをｇＤＮＡ抽出および解析のために組織サンプリングした。１３９すべての植物をコピー数推定のために解析した。これら１３９の植物のうちの５６は、ＥＴＩＰについて陽性であり、それら５６の陽性植物のうちの１１は、推定単一コピー組み込みを有した（図３６）（表２０）。ＥＴＩＰ組み込みについて陽性であった５６の植物のうちの７植物においてＦＡＤ２Ａ  ５’−ゲノム−導入遺伝子隣接配列の増幅を起こった。ＥＴＩＰ組み込みについて陽性であった５６の植物のいずれにおいてもＦＡＤ２Ａ  ３’−導入遺伝子−ゲノム隣接配列の増幅は起こらなかった。加えて、導入遺伝子組み込みについて陽性であった５６の植物のうちの１１植物は、破壊遺伝子座ｑＰＣＲ試験について陽性であった。ＦＡＤ２Ａ  ５’−ゲノム−導入遺伝子隣接配列の増幅につい陽性および／または破壊遺伝子座ｑＰＣＲ試験について陽性であった１４の植物を、上で説明した３つのプローブでサザン解析に付した。サザン解析に進めた１４植物のすべての植物が、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座内への部分的組み込みを示したが、これらの植物はいずれも、ＦＡＤ２Ａ  ５’プローブ、ＦＡＤ２Ａ  ３’およびｈｐｈプローブでプローブしたとき、ＨＤＲによるＦＡＤ２Ａ遺伝子座へＥＴＩＰの完全な完全長組み込みの証拠を示さなかった。ＦＡＤ２Ａ  ３’プローブでプローブしたとき、ｉ）ＷＴより大きく見えるおよびｉｉ）これらのサンプルについて観察されたバンドと同一に見えるバンドはなかった（表２０）。
【表２０】
0006362600.tif 000027
【０１２４】
ｐＤＡＳ０００１３０およびｐＤＡＢ１０４０１０で形質転換したＥＴＩＰトランスジェニックカノーラの結果
ｐＤＡＳ０００１３０およびｐＤＡＢ１０４０１０の形質転換によって生じるトランスジェニックセイヨウアブラナ（Brassica napus）事象は、ｐＤＡＳ０００１３０からのＥＴＩＰポリヌクレオチド配列のＦＡＤ２Ａ遺伝子座内へ単一コピー、完全長Ｔ鎖挿入物の組み込みをもたらす。４事象のうちの３事象を十分に特性評価し、組み込まれたＥＴＩＰを含有することを確認する。その確認を、イン−アウトＰＣＲ（in-out PCR）増幅法を用いて完了し、サザンブロットによってさらに検証する。選択されたＴ０事象をＴ１生育期に成長させる。Ｔ１植物を再スクリーニングして、組み込まれたＴ鎖の接合状態を判定する。スクリーングした事象をホモ接合性、ヘミ接合性またはヌルとカテゴリー分けする。
【０１２５】
ホモ接合事象を用いて、前に説明した方法によりプロトプラストを生産する。その後、プロトプラストを、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれているジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されているジンクフィンガーヌクレアーゼと、ドナーがＨＤＲメカニズムによってＥＴＩＰ内に組み込まれているＥＴＩＰの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミドとで共形質転換させる。同様に、その後、プロトプラストを、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれているジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されているジンクフィンガーヌクレアーゼと、ドナーが非相同末端結合メカニズムによってＥＴＩＰ内に組み込まれているＥＴＩＰの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミドとで共形質転換させる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＥＴＩＰ遺伝子座を切断し、ドナープラスミドは、相同性指向型修復または非相同末端結合によってセイヨウアブラナ（Brassica napus）細胞のゲノム内に組み込まれる。ドナープラスミドの組み込みの結果として、部分ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子が完全長ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子に修復される。今や十分に作動可能なＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子の発現を用いて、ＦＡＣＳ法でプロトプラスト細胞を選別する。推定トランスジェニック植物を、実施例７において説明するＦＡＣＳ法を用いて選別し、単離されたプロトプラストを成熟植物へと再生させる。分子確認法を用いて、ＥＴＩＰ標的化植物内へのドナープラスミドの組み込みを確認する。したがって、ＥＴＩＰ遺伝子座は、ドナーポリヌクレオチド配列の遺伝子標的組み込みのための部位特異的遺伝子座としての役割を果たす。
【０１２６】
ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびｐＤＡＳ０００２７１〜ｐＤＡＳ０００２７５  ＥＴＩＰ構築物で形質転換させたＥＴＩＰトランスジェニックカノーラの結果
ＥＴＩＰおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物の形質転換によって生じるトランスジェニックセイヨウアブラナ（Brassica napus）事象は、ＦＡＤ３Ａ遺伝子座内へのｐＤＡＳ０００２７３またはｐＤＡＳ２７５からの、およびＦＡＤ３Ｃ遺伝子座へのｐＤＡＳ０００２７１、ｐＤＡＳ０００２７２またはｐＤＡＳ０００２７４からのＥＴＩＰポリヌクレオチド配列の単一コピー、完全長Ｔ鎖挿入物の組み込みをもたらす。４事象のうちの３事象を十分に特性評価し、組み込まれたＥＴＩＰを含有することを確認する。その確認を、イン−アウトＰＣＲ増幅法を用いて完了し、サザンブロットによってさらに検証する。選択されたＴ０事象をＴ１生育期に成長させる。Ｔ１植物を再スクリーニングして、組み込まれたＴ鎖の接合状態を判定する。スクリーングした事象をホモ接合性、ヘミ接合性またはヌルとカテゴリー分けする。
【０１２７】
ホモ接合事象を用いて、前に説明した方法によりプロトプラストを生産する。その後、プロトプラストを、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれているジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されているジンクフィンガーヌクレアーゼと、ＥＴＩＰの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミドとで共形質転換させる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＥＴＩＰ遺伝子座を切断し、ドナープラスミドは、相同性指向型修復によってセイヨウアブラナ（Brassica napus）細胞のゲノム内に組み込まれる。ドナープラスミドの組み込みの結果として、部分ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子が完全長ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子に修復される。今や十分に作動可能なＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子の発現を用いて、ＦＡＣＳ法でプロトプラスト細胞を選別する。推定トランスジェニック植物を、実施例７において説明するＦＡＣＳ法を用いて選別し、単離されたプロトプラストを成熟植物へと再生させる。分子確認法を用いて、ＥＴＩＰ標的化植物内へのドナープラスミドの組み込みを確認する。したがって、ＥＴＩＰ遺伝子座は、ドナーポリヌクレオチド配列の遺伝子標的組み込みのための部位特異的遺伝子座としての役割を果たす。
【０１２８】
実施例７：プロトプラスト細胞のＦＡＣＳベースの選別
ＤＳ−Ｒｅｄ対照構築物、ｐＤＡＳ００００３１でトランスフェクトしたセイヨウアブラナ（Brassica napus）プロトプラストを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｆｌｕｘ−Ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ（商標）（カリフォルニア州サンノゼ）を使用してＦＡＣＳ媒介細胞選別により選別した。実施例３において説明したように、プロトプラスト細胞を単離し、トランスフェクトした。細胞をｐＤＡＳ００００３１でトランスフェクトした後、表２１に記載する条件で前記ＦＡＣＳ選別装置を使用して細胞を選別した。
【表２１】
0006362600.tif 000028
【０１２９】
ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子を発現するプロトプラストを選別し、単離した。ＦＡＣＳ単離プロトプラストを、前記選別装置を使用してカウントした。約１ｘ１０５から１．８ｘ１０５個の細胞をＦＡＣＳ単離後第１日に２４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れた。それらの細胞を５から２０日間、ビーズ培地に移植した。約１ｘ１０４個の細胞をＦＡＣＳ単離後第２日に２または４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れる類似の条件を試験した。試験した様々な条件は、単離した全プロトプラスト細胞の生存率または９５〜９８％での細胞の回収をもたらした。ＦＡＣＳ選別プロトプラスト細胞を３〜２０日間、ビーズ培地に移植した。ＦＡＣＳ選別プロトプラスト細胞を、１．５ｍｇ／ｍＬのヒグロマイシンを含有する培地で、上記プロトコルを用いて植物に再生させた。それらの推定トランスジェニック植物がｐＤＡＳ００００３１からのインタクトＴ鎖インサートを含有することを分子確認プロトコルによって確認した。
【０１３０】
ＤＳ−ＲＥＤのＺＦＮ媒介相同組換えでのＥＴＩＰ系統の標的化
ｐＤＡＳ００００３６からのＴ鎖インサートを含有するカノーラ系統を得、Ｔ鎖の完全長、単一コピーを含有することを分子特性評価によって確認した。このカノーラ事象をｐＤＡＳ００００３６−８８と名づけ、前に説明した方法によってプロトプラストを生産するために用いた。それらのプロトプラストを単離し、その後、約５０，０００のカノーラプロトプラスト細胞を、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれたジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４（図２５）またはｐＤＡＳ００００７５（図２６）いずれかと、ＥＴＩＰの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミドｐＤＡＳ００００６４、ｐＤＡＳ００００６８、ｐＤＡＳ００００７０またはｐＤＡＳ００００７２（それぞれ図２７、図２８、図２９および図３０）とで共形質転換させた。図１９および図２０は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介相同組換えによりＤｓ−ｒｅｄ導入遺伝子の部位特異的組み込みをもたらす相同性指向型修復の実例を提供する。前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを、ＥＴＩＰ遺伝子座を被定義ジンクフィンガー結合配列で切断し、それによってそのゲノム内に二本鎖破断を生じさせるように設計した。次に、ドナープラスミドをセイヨウアブラナ（Brassica napus）プロトプラスト細胞のゲノム内に相同性指向型修復によって組み込んだ。ドナープラスミドのイントロン−１およびイントロン−２領域は、ＥＴＩＰ遺伝子座の対応するイントロン−１およびイントロン−２領域と相同性を共有する。ドナープラスミドの組み込みの結果として、部分ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子は、完全長、高発現性ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子に修復された。その十分に作動可能なＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子を使用して、上記ＦＡＣＳ法でプロトプラスト細胞を選別した。したがって、ＥＴＩＰ遺伝子座は、ドナーポリヌクレオチド配列の標的組み込みのための特異的遺伝子座としての役割を果たす。最後に、単離されたプロトプラストを選別し、成熟植物へと再生させることができる。分子確認法を用いてＥＴＩＰ標的化植物内へのドナープラスミドの組み込みを確認することができる。
【０１３１】
ドナープラスミドＤＮＡとＺＦＮプラスミドＤＮＡを様々な濃度で混合し、それらを使用して事象ｐＤＡＳ００００３６−８８を有するカノーラプロトプラスト細胞をトランスフェクトし、前に説明したＦＡＣＳトランスフェクションを用いてトランスジェニックプロトプラスト細胞を選別した。表２２は、様々なトランスフェクション実験、および事象ｐＤＡＳ００００３６−８８を有するカノーラプロトプラストのトランスフェクションに使用したＤＮＡ濃度を記載するものである。ＺＦＮおよびドナープラスミドＤＮＡを単離し、前に説明した方法によってトランスフェクションのために調製した。
【表２２】
0006362600.tif 000029
【０１３２】
トランスフェクション実験を完了した後、プロトプラストを室温で４８時間、恒温放置し、上記ＦＡＣＳプロトコルを用いて選別した。各実験を独立して選別し、導入遺伝子のジンクフィンガー媒介遺伝子移入を、ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子を発現する個々の事象の同定によって確認した。図２１〜２４は、ＦＡＣＳ選別の結果を示す。グラフに図示する結果が示すように、インタクトな十分に組み込まれたＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子を含有する複数の事象が生じた。これらの複数のＤｓ−Ｒｅｄ事象は、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みの結果であった。この部位特異的組み込みは、Ｄｓ−Ｒｅｄ導入遺伝子の高発現性、完全コピーをもたらした。Ｄｓ−Ｒｅｄ導入遺伝子発現の頻度は、全カノーラプロトプラスト細胞（約５０，０００）の約０．０３〜０．０７％の範囲であった。しかし、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みについてのトランスフェクション効率の頻度のほうがはるかに高く、約０．０７〜０．６４％の範囲であった。
【０１３３】
図２１は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００６４およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２６μｇ対４μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０３％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．２２〜０．０７％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００６４およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２６μｇ対４μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０３％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．２６〜０．０８％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
【０１３４】
図２２は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００６８およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０３％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．２２〜０．０７％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００６８およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０４％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．３８〜０．１２％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
【０１３５】
図２３は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００７０およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０７％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．６４〜０．２１％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００７０およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０４％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．３４〜０．１１％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
【０１３６】
図２４は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００７２およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０７％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．６２〜０．２０％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００７２およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０５％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．４４〜０．１４％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
【０１３７】
選択された外植体を、ホスホトリノシン（phosphothrinocin）を含有する再生培地に移植し、培養した。その培養期間後、生存している外植体を培養および植物発育のために伸長培地および根誘導培地に移植した。発育した根および苗条構造から成る全草を土壌に移植し、温室でさらに繁殖させた。組織培養プロセスは、前に上で説明した培地および培養条件を用いた。組織培養プロセスから生産された植物の結果を下の表２３に示す。
【表２３−１】
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【表２３−２】
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【表２３−３】
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【０１３８】
ＦＡＣＳ選別法を任意の蛍光導入遺伝子配列のスクリーニングに直接利用することができ、ＦＡＣＳ選別法を用いて、任意のプロトプラスト、本明細書ではゲノム遺伝子座内のＥＴＩＰ領域の特定の部位内で相同性媒介修復により蛍光導入遺伝子で標的化されるセイヨウアブラナ（Brassica napus）プロトプラスト細胞のある一定の割合を単離する。
【０１３９】
ある一定の例示的実施形態を本明細書において説明したが、後続のクレームの範囲を逸脱することなくそれらの例示的実施形態に多くの追加、削除および変更を加えてもよいことは、通常の当量者には認められ、理解されるであろう。加えて、１つの実施形態の特徴を別の実施形態の特徴と組み合わせてもよい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ−】
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【図３Ａ−】
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【図３Ｂ−】
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【図３Ｂ−】
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【図３Ｃ−】
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【図３Ｃ−】
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【図３Ｄ−】
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【図３Ｄ−】
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【図３Ｅ−】
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【図３Ｅ−】
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【図３Ｆ−】
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【図３Ｆ−】
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【図３Ｇ−】
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【図３Ｇ−】
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【図３Ｈ−】
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【図３Ｈ−】
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【図３Ｉ−】
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【図３Ｉ−】
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【図３Ｊ−】
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【図３Ｊ−】
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【図３Ｋ−】
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【図３Ｋ−】
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【図３Ｌ−】
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【図３Ｌ−】
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【図３Ｍ−】
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【図３Ｍ−】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図３Ｑ】
0006362600.tif 000068
【図３Ｒ】
0006362600.tif 000069
【図３Ｓ】
0006362600.tif 000070
【図３Ｔ】
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【図３Ｕ】
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【図３Ｖ】
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【図３Ｗ】
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【図３Ｘ】
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【図３Ｙ】
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【図３Ｚ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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