(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のがん細胞レポーターモジュールと、第２のがん細胞レポーターモジュールと、がん細胞結合性モジュールとを含む組換えレポーターアデノウイルスであって、該第１のがん細胞レポーターモジュールが、第１のレポーター遺伝子表現型を発現する第１のレポーター遺伝子に作動可能に連結された、全ての細胞型において活性なプロモーターを含み、そして、該第２のがん細胞レポーターモジュールが、腫瘍細胞において第２のレポーター遺伝子表現型を発現する第２のレポーター遺伝子に作動可能に連結されたがん応答性プロモーターを含み、そして、該第１のレポーター遺伝子表現型と該第２のレポーター遺伝子表現型が検出可能に異なる、組換えレポーターアデノウイルス。
【請求項２】
免疫回避モジュールをさらに含む、請求項１に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【請求項３】
前記第１のレポーター遺伝子または前記第２のレポーター遺伝子が蛍光レポーター遺伝子である、請求項１または請求項２に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【請求項４】
第３のがん細胞レポーターモジュールをさらに含む、請求項１から請求項３までのうちのいずれか一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスであって、該第３のがん細胞レポーターモジュールが、腫瘍細胞において第３のレポーター遺伝子表現型を発現する第３のレポーター遺伝子に作動可能に連結されたがん応答性プロモーターを含み、前記第１のレポーター遺伝子表現型と前記第２のレポーター遺伝子表現型と該第３のレポーター遺伝子表現型が各々検出可能に異なる、組換えレポーターアデノウイルス。
【請求項５】
前記がん細胞結合性モジュールが、ＣＤ４６に結合するアデノウイルス線維タンパク質を含む、請求項１から請求項４までのうちのいずれか一項に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【請求項６】
前記がん細胞結合性モジュールが、Ａｄ３、Ａｄ１１またはＡｄ３４の線維ノブを含む、請求項１から請求項４までのうちのいずれか一項に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【請求項７】
前記がん応答性プロモーターが、
（ａ）Ｅ２Ｆプロモーター；
（ｂ）血清応答性エレメント（ＳＲＥ）プロモーター；または
（ｃ）トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）により調節されるプロモーター
である、請求項１から請求項４までのうちのいずれか一項に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【請求項８】
前記第１のレポーター遺伝子および／または前記第２のレポーター遺伝子が、融合タンパク質をコードし、該融合タンパク質が、蛍光タンパク質と、該融合タンパク質の細胞質または核のいずれかへの局在化を指向するタンパク質とを含み、該融合タンパク質の局在化を指向する該タンパク質が、ＦＯＸＯ３、ＴＯＲＣ２、ＳＭＡＤまたはＣＲＴＣ２である、請求項１から請求項４までのうちのいずれか一項に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【請求項９】
前記融合タンパク質の局在化を指向する前記タンパク質が、ＦＯＸＯ３またはＣＲＴＣ２を含む、請求項８に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【請求項１０】
前記第１のレポーター遺伝子または前記第２のレポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、または、赤色蛍光タンパク質をコードする、請求項１から請求項４までのうちのいずれか一項に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【請求項１１】
前記蛍光タンパク質がｍＣｈｅｒｒｙまたはｔｄＴｏｍａｔｏを含む、請求項１０に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【請求項１２】
被験体におけるがんを検出するための、請求項１から請求項１１までのうちのいずれか一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスを含む組成物であって、
該組成物が被験体に投与されることを特徴とし；
該組換えレポーターアデノウイルスを、該被験体内のがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成することを特徴とし；
該レポーターが感染したがん細胞が、該被験体からの試料において得られることを特徴とし；
該試料中の該レポーターが感染したがん細胞が検出され、該被験体におけるがんの存在が示されることを特徴とする、
組成物。
【請求項１３】
組換えレポーターアデノウイルスに感染したがん細胞の存在を、被験体におけるがんの指標とする方法であって、
（ｉ）請求項１から請求項１１までのうちの一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスを該被験体から得られた試料中のがん細胞と接触させるステップと、
（ｉｉ）該組換えレポーターアデノウイルスを該がん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成するステップと、
（ｉｉｉ）該レポーターが感染したがん細胞を検出するステップであって、該レポーターが感染したがん細胞の存在が、該被験体におけるがんの存在を示すステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記がんの存在が、前記被験体はがん処置が施され得ることを示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組換えレポーターアデノウイルスに感染したがん細胞の増殖のレベルを、試験化合物により、がん患者由来のがん細胞の増殖が阻害されるかどうかの指標とする方法であって、
（ｉ）請求項１から請求項１１までのうちの一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスを被験体から得られた試料中のがん細胞と接触させるステップと、
（ｉｉ）該組換えレポーターアデノウイルスを該がん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成するステップと、
（ｉｉｉ）該試験化合物の存在下で、該レポーターが感染したがん細胞を十分な時間増殖させるステップと、
（ｉｖ）該レポーターが感染したがん細胞の増殖のレベルを決定するステップと、
（ｖ）該レベルを対照レベルと比較するステップであって、該対照レベルと比較してレベルが低いことにより、該試験化合物によって該患者由来の該がん細胞の増殖が阻害されることが示されるステップと
を含む方法。
【請求項１６】
がんを検出するためのキットであって、請求項１から請求項１１までのうちの一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスを含むキット。
【請求項１７】
制がん剤をスクリーニングするためのキットであって、がん阻害性化合物と、請求項１から請求項１１までのうちの一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスとを含むキット。
【請求項１８】
がん細胞を単離するためのキットであって、発現されたレポーター遺伝子の表現型を検出するためのデバイスと、請求項１から請求項１１までのうちの一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスとを含むキット。
【請求項１９】
前記がんが、肺がん、皮膚がん、または乳がんである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２０】
前記がん細胞が、循環しているがん細胞である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２１】
前記がん細胞が、前悪性細胞である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２２】
前記試料が、体液または組織試料である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２３】
前記体液が血液である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記検出が、レポーター遺伝子表現型の検出を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記レポーター遺伝子表現型が、蛍光レポーター遺伝子表現型である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記被験体はがん処置がさらに施されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年３月１４日に出願された米国仮出願第６１／６１０，９７０号の利益を主張する。米国仮出願第第６１／６１０，９７０号は、その全体が、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
連邦政府の後援による研究または開発の下でなされた発明に対する権利に関する記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）に認定されたＲ０１ＨＧ００４８７６、Ｒ２１ＲＲ０２４４５３およびＲ４３ＲＲ０３１４２４の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
転移として公知のプロセスである、固形腫瘍から体内の離れた部位への細胞の拡散は、がんに関連した全死亡のうちの９０％超の原因になっている。原発腫瘍に由来する細胞は、循環系に侵入して血管遊出（extravagate）して、原発新生物から離れた臓器および組織に浸潤し、そこでコロニー形成し、増殖することができる。したがって、これらの循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出することにより、転移性がん細胞の早期の同定および治療剤ターゲティングの両方に関する貴重な機会がもたらされる（Cristofanilli、２００４年；de  Bono、２００８年）。ＣＴＣを検出するための現行の技法としては、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、フローサイトメトリー、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびより最近ではマイクロフルイディクスが挙げられる。残念ながら、ＲＴ−ＰＣＲでは、生存可能な転移性ＣＴＣと、原発腫瘍に由来する核酸または細胞断片とが区別されない。
【０００４】
抗体に基づく技法は、全てのがんの検出に使用できるわけではなく、最も一般的でかつよく特徴付けられたマーカーを発現するがんの検出にしか使用することができない。現行のシステムのＣＴＣの計数（enumeration）では、がん診断に関する一層の情報しかもたらされない。デバイスの１つであるＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）（Ｖｅｒｉｄｅｘ、Ｒａｒｉｄａｎ  ＮＪ）は、ＣＴＣ分析に関して商業的成功が実証されており、乳房、前立腺、および結腸についてはＦＤＡに認可されているが、卵巣、直腸、および肺については認可を待っているところである。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムの制限としては、（ａ）ＥｐＣＡＭ発現のレベルに依存すること（Punnoose  EAら、PLoS  ONE．２０１０年；５巻（９号）：ｅ１２５１７頁）、（ｂ）間葉系マーカーを使用しないこと（Punnoose  EAら、PLoS  ONE．２０１０年；５巻（９号）：ｅ１２５１７頁）、（ｃ）捕捉するための抗体親和性に対する信頼性（Nagrath  Sら、Nature、２００７年；４５０巻（７１７３号）：１２３５〜９頁、１８０９７４１０）、および最も重要なことに（ｄ）ＣＴＣ表現型の特徴付けが存在しないことが挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Punnoose  EAら、PLoS  ONE．２０１０年；５巻（９号）：ｅ１２５１７頁
【非特許文献２】Nagrath  Sら、Nature、２００７年；４５０巻（７１７３号）：１２３５〜９頁、１８０９７４１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
腫瘍または組織に１００％特異的である抗体は存在せず、抗体は生存可能ＣＴＣにも死んだＣＴＣにも結合する。したがって、血液中の稀なＣＴＣを検出するための、より感度が高く、特異的であり、広範に適用可能な技術が必要とされている。さらに、ＣＴＣを検出し、捕捉するだけでなく、それらの悪性の潜在性を数量化し、個々の患者の腫瘍を取り除くことにおいて最も有効な療法を「先行」して同定する、新しい診断剤およびツールを開発することが切実に必要とされている。
【０００７】
ゲノムスケールにおけるがんの複雑さおよび変動性にもかかわらず、統一的なテーマは、比較的少数の重要な経路における変異によって付与される、いわゆるがんの特質（hallmark）である、それらの増殖（growth）が調節解除された表現型である。出願人らは、数が多く、腫瘍間で非常に変動し得る個々の遺伝子病変を検出することに焦点を合わせるのではなく、複数の転写および分子モジュールをそれらのゲノムに組み入れて、患者の腫瘍に感染し、それを検出し、その分子「特質」および種々の療法に対するその応答を「先行」して報告する診断用ウイルスを創出した。これらの作用物質（agent）を使用すると、任意の所与の腫瘍の分子損傷および悪性特性を迅速に（２４時間以内に）見分け、標準化された自動化プラットフォームによってスコア化することができる。さらに、これらの作用物質は、患者の腫瘍が、特定の療法に応答しそうであるかどうかを迅速かつ直接決定するためのレポーターとして使用することもでき得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の簡単な概要
一態様では、被験体におけるがんを検出する方法が提供される。該方法は、組換えレポーターアデノウイルスを被験体に投与するステップを含む。組換えレポーターアデノウイルスを被験体内のがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成する。被験体から、レポーターが感染したがん細胞を含む試料を得、レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、被験体におけるがんを検出する。
【０００９】
別の態様では、被験体におけるがんを検出する方法が提供される。該方法は、被験体からがん細胞を含む試料を得るステップを含む。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞と接触させる。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成し、レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、前記被験体におけるがんを検出する。
【００１０】
別の態様では、試験化合物により、がん患者由来のがん細胞の増殖が阻害されるかどうかを決定する方法が提供される。該方法は、被験体からがん細胞を含む試料を得るステップを含む。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞と接触させる。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成する。レポーターが感染したがん細胞を十分な時間増殖させる。レポーターが感染したがん細胞の増殖のレベルを決定し、レベルを対照レベルと比較し、対照レベルと比較してレベルが低いことにより、試験化合物によって患者由来のがん細胞の増殖が阻害されることが示される。
【００１１】
別の態様では、被験体由来の試料中のレポーターが感染したがん細胞を単離する方法が提供される。該方法は、レポーターが感染したがん細胞を感染していない細胞と分離するステップを含み、ここで、分離するステップは、少なくとも部分的に、レポーターが感染したがん細胞の発現されたレポーター遺伝子表現型に基づく。
【００１２】
別の態様では、がん細胞レポーターモジュールと、がん細胞結合性モジュールとを含む組換えレポーターアデノウイルスが提供される。
【００１３】
別の態様では、被験体におけるがんを検出する方法が提供される。該方法は、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスを被験体に投与するステップを含む。組換えレポーターアデノウイルスを被験体内のがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成する。被験体から、レポーターが感染したがん細胞を含む試料を得、レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、被験体におけるがんを検出する。
【００１４】
別の態様では、被験体におけるがんを検出する方法が提供される。該方法は、被験体からがん細胞を含む試料を得るステップを含む。その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞と接触させる。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成し、レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、被験体におけるがんを検出する。
【００１５】
別の態様では、試験化合物により、がん患者由来のがん細胞の増殖が阻害されるかどうかを決定する方法が提供される。該方法は、被験体からがん細胞を含む試料を得るステップと、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞と接触させるステップとを含む。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成する。レポーターが感染したがん細胞を十分な時間増殖させ、レポーターが感染したがん細胞の増殖のレベルを決定する。このレベルを対照レベルと比較し、ここで、対照レベルと比較してレベルが低いことにより、試験化合物によって患者由来のがん細胞の増殖が阻害されることが示される。
【００１６】
別の態様では、がんを検出するためのキットが提供される。キットは、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスを含む。
【００１７】
別の態様では、制がん剤（cancer  drug）をスクリーニングするためのキットが提供される。キットは、がん阻害性化合物と、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスとを含む。
【００１８】
別の態様では、がん細胞を単離するためのキットが提供される。キットは、発現されたレポーター遺伝子表現型を検出するためのデバイスと、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】がんの特質。
【００２０】
【図２】迅速なｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応において、Ａｄｓｅｍｂｌｙにより、モジュラー部分からＡｄゲノムが組み立てられる。図２の上のパネル：ゲノムが転写モジュールと機能モジュールとに分けられ、プラスミドにクローニングされている。図２の中央のパネル：ＣＴＣを強調するために、Ｅ１モジュール、Ｅ３モジュール、およびＥ４モジュールが蛍光タンパク質を駆動する腫瘍特異的プロモーターを用いて改変されている。図２の下のパネル：ウイルスの体系的な複数部位特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再組立ておよび再構成を示す。
【００２１】
【図３】ｐ１６がサイレンシングされた場合にＥ２Ｆ応答性プロモーターは活性である。
【００２２】
【図４】空間フィルター（マスク）はデバイスの特徴の拡大画像に置かれる。染色された細胞からのインプット蛍光パルスシグナルが、異なる空間フィルターによって調節された後に、ＰＭＴによって登録され、それにより、それらがマイクロフルイディクスチャネルを通って伝わるに従い、時間ドメインにおける細胞の異なる位置に対応する光電流の異なる波形、例えば、（１１１）、（１１０１）または（１０１１）などがもたらされる。この時空符号化（ｓｐａｃｅ−ｔｉｍｅ  ｃｏｄｉｎｇ）技術により、３つのシグナル、または、さらにそれより多くを弁別するために使用するＰＭＴが１つのみであることによって、システムのサイズおよび費用が低下する。
【００２３】
【図５】図５（ａ）：デバイス構造。２５０μｍの広い主要な流体チャネル（ｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｈａｎｎｅｌ）が３つのサブチャネルに分割されている。中央のチャネルは廃棄物を収集するためのものであり、左側のチャネルおよび右側のチャネルは、試料を収集するためのものである。照明光（４８８ｎｍのレーザー）が光ファイバーによってデバイスに送達され、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）  ＡＦでコーティングした光流体（optofluidic）導波管によってガイドされる。ＰＺＴアクチュエータがデバイスに組み込まれている。四角内は、ＰＤＭＳで構成されるデバイスの選別接合部である。図５（ｂ）：ＰＺＴアクチュエータが下に曲がるにつれ、目的の細胞が右側の選別チャネルに押され、一方、非標的細胞は、ＰＺＴのトリガーとならずに中央の廃棄物チャネルに直接移動する。図５（ｃ）：フローパターンの観察。左：高速ＣＭＯＳカメラを使用して０．３ｍｓ毎に撮った写真を重ね合せることによる、右側のチャネルに選別された蛍光ビーズのトレース。右：ＰＺＴアクチュエータに対する種々の電圧の大きさの下でのビーズについてのビーズ軌道プロット。これは、十分な偏向のための閾値電圧を設定することに役立つ。
【００２４】
【図６】ＮａｎｏＳｏｒｔ−ＵＣＳＤ  μＦＡＣＳシステムを使用して、フルオレセイン染色された赤白血病（Ｋ５６２）細胞を染色されなかった細胞から選別することについての実証。２３０倍の濃縮係数が達成された（４０）。
【００２５】
【図７】ワークフローおよび形質導入されたＣＴＣからの予測される蛍光読み取り。
【００２６】
【図８】ウイルスベクターによるＣＴＣ表現型解析。
【００２７】
【図９】選択された腫瘍診断経路についての蛍光読み取り。この図には、４つの診断用発現カセットの最初のパネル（左側）および細胞におけるそれらの予測される表現型（右側）が列挙されている。ＣＭＶ−［Ｆｏｘｏ３−ＧＦＰ］カセットは構成的に活性であり、したがって、ＧＦＰは、ＣＭＶプロモーターが活性である全ての細胞型において発現される。非腫瘍組織などのＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性が低い細胞では、Ｆｏｘｏ３−ＧＦＰ融合物は核に局在化する。しかし、例えば腫瘍細胞においてなど、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性が高い細胞では、Ｆｏｘｏ３−ＧＦＰ融合物は細胞質に局在化する。Ｅ２Ｆ−［ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＲＴＣ２］カセットは、例えばほぼ全ての腫瘍においてなど、不活性ｐＲＢを有する細胞においてのみ活性である。これらの細胞では、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＲＴＣ２融合物は、腫瘍抑制因子Ｌｋｂ１がインタクトである場合には細胞質性である。しかし、Ｌｋｂ１機能が失われた腫瘍細胞では、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＲＴＣ２融合物は核内に位置する。血清応答エレメント（ＳＲＥ）プロモーターは、腫瘍などの迅速に分裂している細胞を示す、活性化された増殖因子シグナル伝達またはマイトジェン刺激を有する細胞においてのみＹＦＰを発現させる。最後に、ＳＭＡＤ応答性プロモーターカセットは、ＴＧＦβシグナル伝達が活性である細胞におけるｔｄＴｏｍａｔｏの発現を駆動し、これは、特定のがんにおける転移性の表現型に関連付けられている。組み合わせた場合、これらの４つの発現カセットにより、５つの異なるがん関連経路に関する情報がもたらされる。
【００２８】
【図１０】腫瘍診断用ウイルスを創出するためのアデノウイルスＡｄｓｅｍｂｌｙモジュールの操作。Ａｄｓｅｍｂｌｙゲノム組立て方法を使用してウイルスを創出した。この図には、最初の４つのがん診断用発現カセットのそれぞれが設置されたＡｄｓｅｍｂｌｙモジュールが示されている。以前の実験において、二重の発現カセットが許容されることが示されているので、２つのカセットをＥ１モジュールにクローニングした。Ｅ３モジュールのＥ３Ａ／Ｅ３Ｂ部分を欠失させ、単一のカセットで置き換えた。Ｅ３モジュール内でも生ずる、表１に列挙されている繊維の操作は示されていない。最後に、Ｅ４領域を欠失させ、単一のモジュールで置き換えた。欠失および挿入に関するより詳細な情報は、材料および方法において見いだすことができる。これらのＡｄｓｅｍｂｌｙベクターを改変した後、これらを標準のＡｄｓｅｍｂｌｙ反応において使用して、腫瘍診断用発現カセットの１つまたは複数を含有するウイルスを創出した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそのポリマー、ならびにその相補物を指す。この用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を含有する核酸、合成核酸、天然に存在する核酸、天然に存在しない核酸、参照核酸と同様の結合特性を有する核酸、および参照ヌクレオチドと同様に代謝される核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【００３０】
別段の指定のない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列だけでなく、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列も暗黙のうちに包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる（Batzerら、Nucleic  Acid  Res.  １９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ohtsukaら、J.  Biol.  Chem.  ２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；Rossoliniら、Mol.  Cell.  Probes  ８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【００３１】
特定の核酸配列は、「スプライスバリアント」も暗黙のうちに包含する。同様に、核酸にコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライスバリアントにコードされる任
意のタンパク質を暗黙のうちに包含する。「スプライスバリアント」は、その名称が示すように、遺伝子の代替スプライシングの産物である。転写後に、最初の核酸転写物は、異なる（代替の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライシングされ得る。スプライスバリアントが産生される機構は変動するが、エキソンの代替スプライシングを含む。その同じ核酸から、読み通し（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写によって生じる代替のポリペプチドもこの定義に包含される。この定義には、上記スプライス産物の組換え型を含めたスプライシング反応の任意の産物が含まれる。カリウムチャネルスプライスバリアントの例がLeicherら、J.  Biol.  Chem.  ２７３巻（５２号）：３５０９５〜３５１０１頁（１９９８年）において考察されている。
【００３２】
所望の治療的な遺伝子のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築には、当技術分野においてよく理解されている標準のライゲーション技法および制限技法を用いることができる（Maniatisら、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、New  York（１９８２年）を参照されたい）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは、所望の形態に切断すること、調整すること、および再ライゲーションすることができる。
【００３３】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に作動可能に連結している；またはリボソーム結合部位は、それが、翻訳が容易になるように位置している場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結している」とは、連結しているＤＮＡ配列が互いに近くにあり、また、分泌リーダーの場合では、近接しており、読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位におけるライゲーションによって実現される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実施に従って使用する。
【００３４】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して、「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下記の初期状態のパラメータで用いて、または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトなどを参照されたい）によって測定したところ、同じである２つ以上の配列またはサブシーケンス、または同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の百分率（すなわち、比較ウィンドウまたは示された領域にわたり最大の対応について比較しアラインメントした場合、特定の領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性）を有する２つ以上の配列またはサブシーケンスを指す。そのような配列はそこで「実質的に同一」といわれる。この定義は、試験配列の相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）も指す、またはそれに適用することができる。この定義は、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も包含する。下記の通り、好ましいアルゴリズムはギャップなどを説明することができる。少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって同一性が存在することが好ましい、または５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって同一性が存在することがより好ましい。
【００３５】
配列比較のために、一般には、１つの配列が、試験配列を比較するための参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であればサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期状態のプログラムパラメータを使用することができる、あるいは、代替のパラメータを指定することができることが好ましい。次いで上記配列比較アルゴリズムにより、上記プログラムパラメータに基づいて、上記参照配列と比較した上記試験配列についてのパーセント配列同一性が算出される。
【００３６】
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、配列を、同じ数の連続した位置の参照配列と、その２つの配列を最適にアラインメントした後に比較することができる、２０から６００まで、通常約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続した位置の数のうちの任意の１つのセグメントを参照することを含む。比較するために配列をアラインメントする方法は当技術分野で周知である。比較するための最適な配列のアラインメントは、例えば、Smith  &  Waterman、Adv.  Appl.  Math.  ２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、Needleman  &  Wunsch、J.  Mol.  Biol.  ４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson  &  Lipman、Proc.  Nat'l.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（Ausubelら編、１９９５年、追補）を参照されたい）によって行うことができる。
【００３７】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれAltschulら、Nuc.  Acids  Res.  ２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）およびAltschulら、J.  Mol.  Biol.  ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されている。本発明の核酸およびタンパク質についてのパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載のパラメータを用いてＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を使用する。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、当技術分野で公知の通り、National  Center  for  Biotechnology  Informationを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインメントした際にいくらかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすかのいずれかの、クエリ配列内の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Altschulら、上記）。これらの最初の近傍ワードヒット（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｈｉｔ）は、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための種としての機能を果たす。累積アラインメントスコアが増加し得る限りは上記ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（残基の一致する対についてのリワード（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して上記累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸長は、上記累積アラインメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘまで低下するとき；上記累積スコアが、１つまたは複数のネガティブスコアリング（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ）残基アラインメントが蓄積したことによってゼロ以下になるとき；または、いずれかの配列の末端に到達するときに停止する。上記ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸにより、上記アラインメントの感度およびスピードが決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）では、初期状態としてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムで、初期状態としてワード長３、および期待値（Ｅ）１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff  &  Henikoff、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。
【００３８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然に存在するアミノ酸に対応する人工的な化学的模倣物であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸のポリマーにあてはまる。
【００３９】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに上記天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号にコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化合物を指す。
【００４０】
アミノ酸は、本明細書ではそれらの一般に公知の３文字記号によってまたはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字記号のいずれかによって称することができる。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に認められている１文字コードによって称することができる。
【００４１】
「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントとは、同一または基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または上記核酸が基本的に同一の配列に対するアミノ酸配列をコードしない場合の核酸を指す。遺伝暗号の縮重が原因で、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが特定される全ての位置で、コードされるポリペプチドを変化させることなく、上記コドンを、記載されているその対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント変異」である。本明細書におけるポリペプチドをコードする核酸配列の全ても同様に、上記核酸の可能性のあるサイレント変異の全てを説明する。核酸の各コドン（普通はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および普通はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）を改変して機能的に同一の分子をもたらすことができることは、当業者には理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異のそれぞれは、記載されている配列のそれぞれに、発現産物に関しては、潜在的に含まれるが、実際のプローブ配列に関しては、そうではない。
【００４２】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列における単一のアミノ酸または低百分率のアミノ酸を変化させる、付加するまたは欠失させる核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、その変更によりアミノ酸が化学的に同様のアミノ酸で置換される「保存的に改変されたバリアント」であることが当業者には理解される。機能的に同様のアミノ酸をもたらす保存置換の表は当技術分野で周知である。そのような保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加され、それを排除するものではない。
【００４３】
以下の８群はそれぞれ、互いに保存置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton、Proteins（１９８４年）を参照されたい）。
【００４４】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、ウイルス、核酸、タンパク質、またはベクターを参照して使用される場合、その細胞、ウイルス、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入またはネイティブな核酸またはタンパク質の変更によって改変されていること、またはその細胞が、そのように改変された細胞に由来する細胞であることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、ネイティブな（非組換え）形態の細胞においては見いだされない遺伝子を発現する、または別の方法で異常に発現される、低発現である、もしくは全く発現されないネイティブな遺伝子を発現する。
【００４５】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、プローブが、一般には核酸の複合混合物（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅ）中のその標的サブシーケンスとハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なる。より長い配列は、特により高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な手引きは、Tijssen、Techniques  in  Biochemistry  and  Molecular  Biology--Hybridization  with  Nucleic  Probes、「Overview  of  principles  of  hybridization  and  the  strategy  of  nucleic  acid  assays」（１９９３年）に見いだされる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義済みのイオン強度、ｐＨにおける特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択する。上記Ｔｍは、上記標的と相補的な上記プローブの５０％が平衡状態（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、上記プローブの５０％が平衡状態で占有される）でその標的配列とハイブリダイズする温度（定義済みのイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度において）である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって実現することもできる。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍であり、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍であることが好ましい。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下の通りであってよい：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳ、４２℃でインキュベートすること、または、５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳ中、６５℃で洗浄すること。
【００４６】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、それでも実質的に同一である。これは、例えば、上記遺伝暗号により許容される最大のコドンの縮重を用いて核酸のコピーを創製する場合に生じる。そのような場合では、上記核酸は、一般には中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、４０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳの緩衝液中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ中、４５℃での洗浄が挙げられる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。同様のストリンジェンシーの条件をもたらすために代替のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用することができることは、当業者には容易に理解される。ハイブリダイゼーションのパラメータを決定するための追加の手引きは多数の参照、例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Ausubelら編、John  Wiley  &  Sonsにおいて提供される。
【００４７】
ＰＣＲに関して、低ストリンジェンシーの増幅のためには約３６℃の温度が典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて約３２℃から４８℃の間で変動し得る。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅のためには、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、上記プライマーの長さおよび特異性に応じて約５０℃から約６５℃までの範囲であり得る。高ストリンジェンシーの増幅および低ストリンジェンシーの増幅の両方に対する典型的なサイクル条件は、９０℃〜９５℃で３０秒間〜２分間の変性相、３０秒間〜２分間続くアニーリング相、および約７２℃で１〜２分間にわたる伸長相を含む。低ストリンジェンシーの増幅反応および高ストリンジェンシーの増幅反応についてのプロトコールおよび手引きは、例えば、Innisら（１９９０年）PCR  Protocols、A  Guide  to  Methods  and  Applications、Academic  Press,  Inc.  N.Y.）において提供される。
【００４８】
「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」、「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」、「トランスフェクトすること（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）」または「形質導入すること（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）」という用語は、互換的に使用することができ、核酸分子またはタンパク質を細胞に導入するプロセスと定義される。核酸は、ウイルスに基づかない方法またはウイルスに基づく方法を使用して細胞に導入される。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能部分をコードする配列であってよい。一般には、核酸ベクターは、タンパク質の発現に必要なエレメント（例えば、プロモーター、転写開始部位など）を含む。ウイルスによらないトランスフェクションの方法は、核酸分子を細胞に導入するための送達系としてウイルスＤＮＡもウイルス粒子も使用しない任意の適切な方法を含む。ウイルスによらないトランスフェクションの例示的な方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、熱ショックによるトランスフェクション、マグネティフェクション（ｍａｇｎｅｔｉｆｅｃｔｉｏｎ）および電気穿孔が挙げられる。ウイルスに基づく方法については、任意の有用なウイルスベクターを本明細書に記載の方法において使用することができる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、当技術分野で周知の標準の手順に従って、アデノウイルスベクターを使用して核酸分子を細胞に導入する。「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」または「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語は、外部環境からタンパク質を細胞に導入することも指す。一般には、タンパク質の形質導入またはトランスフェクションは、細胞膜を横断することができるペプチドまたはタンパク質を目的のタンパク質に付着させることに依拠する。例えば、Fordら（２００１年）Gene  Therapy  ８巻：１〜４頁およびProchiantz（２００７年）Nat.  Methods  ４巻：１１９〜２０頁を参照されたい。
【００４９】
トランスフェクトされた遺伝子の発現は、宿主細胞において一過性または安定に起こり得る。「一過性の発現」の間、トランスフェクトされた核酸は、宿主細胞のゲノムには組み込まれず、また、細胞分裂の間に娘細胞に移されない。その発現はトランスフェクトされた細胞に限られているので、遺伝子の発現は時間と共に失われる。対照的に、トランスフェクトされた遺伝子の安定発現は、遺伝子を、トランスフェクトされた細胞に選択有意性を付与する別の遺伝子とコトランスフェクトした場合に起こり得る。そのような選択有意性は、細胞が直面する特定の毒素に対する抵抗性であってよい。トランスフェクトされた遺伝子の発現は、さらに、宿主ゲノムへのトランスポゾン媒介性挿入によって達成することができる。トランスポゾン媒介性挿入の間、遺伝子は、宿主ゲノムへの挿入ならびにその後の切り出しを可能にする２つのトランスポゾンリンカー配列の間に、予測可能な様式で配置される。
【００５０】
「培養する（ｃｕｌｔｕｒｅ）」「培養すること（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」、「増殖させる（ｇｒｏｗ）」、「増殖させること（ｇｒｏｗｉｎｇ）」、「維持する（ｍａｉｎｔａｉｎ）」、「維持すること（ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「増大させる（ｅｘｐａｎｄ）」、「増大させること（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」などの用語は、細胞培養自体または培養のプロセスについて言及する場合、互換的に使用することができ、身体外（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ）で、生存に適した条件下で細胞を維持することを意味する。培養細胞を生存させ、培養することにより、細胞の増殖、分化、または分裂をもたらすことができる。この用語は、いくつかは、自然に老化する可能性があることなどにより、培養物中の全ての細胞が生存または増殖または分裂することを意味するものではない。細胞は、一般には、培地中で培養され、培地は培養の過程中に交換され得る。
【００５１】
「培地」および「培養液」という用語は、細胞培養環境を指す。培地は、一般には等張性溶液であり、例えば、細胞の接着または支持のためのマトリックスをもたらすために、液体、ゼラチン質、または半固体であってよい。培地は、本明細書で使用される場合、細胞を培養するために必要な栄養的支持、化学的支持、および構造的支持の成分を含んでよい。
【００５２】
「対照」試料または値とは、試験試料と比較するための参照、通常は既知の参照としての機能を果たす試料を指す。例えば、試験試料は、試験条件から、例えば、試験化合物の存在下で取得され、既知の条件（例えば、試験化合物の不在下（陰性対照）または既知の化合物の存在下（陽性対照））からの試料と比較されることができる。対照は、いくつもの試験または結果から集められた平均値も示し得る。当業者は、任意の数のパラメータを評価するために対照を設計することができることを理解されよう。例えば、対照を、薬理学的データ（例えば、半減期）または治療上の尺度（例えば、副作用の比較）に基づいて治療利益を比較するために考案することができる。当業者は、所与の状況においてどの対照が有益であるかを理解し、対照値との比較に基づいてデータを解析することができる。対照は、データの有意性を決定するためにも有益である。例えば、所与のパラメータの値が対照において広範に変動する場合、試験試料における変動は有意であるとはみなされない。
【００５３】
「追加的な」、「さらなる」または「第２の」成分（例えば、がん細胞レポーターモジュール、レポーター遺伝子表現型）を含む組成物において、第２の成分は、本明細書で使用される場合、他の成分または第１の成分とは異なる。「第３の」成分は、他の成分、第１の成分、および第２の成分とは異なり、さらに列挙されたまたは「追加的な」成分は同様に異なる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、白血病、癌腫および肉腫を含めた、哺乳動物に見いだされる全種類のがん、新生物、または悪性腫瘍を指す。例示的ながんとしては、脳がん、乳がん、子宮頸部がん、結腸がん、頭頸部がん、肝がん、腎がん、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、肉腫、胃がん、子宮がんおよび髄芽腫が挙げられる。さらなる例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマ（insulanoma）、悪性カルチノイド、膀胱がん、前癌皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、泌尿生殖器がん、悪性高カルシウム血症、子宮体がん、副腎皮質がん、膵内分泌腺および膵外分泌腺の新生物、ならびに前立腺がんが挙げられる。
【００５５】
「白血病」という用語は、広範には造血臓器の進行性の悪性疾患を指し、一般に、血液および骨髄における白血球およびそれらの前駆体の増殖および発生の変形を特徴とする。白血病は、一般に、（１）疾患の持続時間および特性−急性または慢性；（２）関与する細胞の種類；骨髄系（ｍｙｅｌｏｉｄ）（骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ））、リンパ系（リンパ性）、または単球性；および（３）血液中の異常な細胞の数が増加するか増加しないか−白血病性または無白血病性（亜白血病性）に基づいて臨床的に分類される。Ｐ３８８白血病モデルは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗白血病活性を予測するものとして広範に認められている。Ｐ３８８アッセイにおいて試験陽性の化合物は、一般に、処置されている白血病の種類にかかわらずｉｎ  ｖｉｖｏでいくらかのレベルの抗白血病活性を示すと考えられている。したがって、本発明は、白血病を処置する方法、および好ましくは、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好酸球性白血病、グロス白血病（Ｇｒｏｓｓ’  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、有毛細胞白血病、血球母細胞性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、組織球性白血病（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病（Ｎａｅｇｅｌｉ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ’ｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞性白血病（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）を処置する方法を包含する。
【００５６】
「肉腫」という用語は、概して、胚の結合組織のような物質でできている腫瘍を指し、一般に、線維状物質または均一な物質に埋め込まれた密に固まった（ｐａｃｋｅｄ）細胞で構成される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバーネシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫（ｃｈｌｏｒｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａ）、絨毛癌、胎生期肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫（Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ  ｓａｒｃｏｍａ）、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫（ｆａｓｃｉａｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、線維芽細胞肉腫（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、Ｂ細胞の免疫芽球肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球肉腫、イエンセン肉腫（Ｊｅｎｓｅｎ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫（Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａ）、傍骨性肉腫（ｐａｒｏｓｔｅａｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、網状赤血球肉腫（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、ラウス肉腫、漿液嚢腫性肉腫（ｓｅｒｏｃｙｓｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性肉腫（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｌｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）が挙げられる。
【００５７】
「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味すると解釈される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる黒色腫としては、例えば、末端部黒子黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫（Ｃｌｏｕｄｍａｎ’ｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、Ｓ９１黒色腫、ハーディングパッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫（subungal  melanoma）、および表在拡大型黒色腫が挙げられる。
【００５８】
「癌腫」という用語は、周囲の組織に浸潤し、転移を生じさせる傾向がある、上皮細胞でできている悪性の新しい成長物を指す。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる例示的な癌腫としては、例えば、細葉癌腫（ａｃｉｎａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、細葉状癌腫（ａｃｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌腫、腺腫様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞癌腫（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌腫、基底有棘細胞癌腫、細気管支肺胞癌腫、細気管支癌腫、気管支原性癌腫、大脳様癌腫（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管細胞癌腫、絨毛癌腫、膠様癌腫、面皰癌腫、体癌腫（ｃｏｒｐｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、篩状癌腫（ｃｒｉｂｒｉｆｏｒｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、鎧状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｎ  ｃｕｉｒａｓｓｅ）、皮膚癌腫、円柱状癌腫（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、円柱細胞癌腫、腺管癌腫、緻密癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｄｕｒｕｍ）、胎生期癌腫、脳様癌腫、類表皮癌腫（ｅｐｉｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮腺様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ  ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外方増殖性癌腫（ｅｘｏｐｈｙｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、潰瘍癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｘ  ｕｌｃｅｒｅ）、線維性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｆｉｂｒｏｓｕｍ）、ゼラチン状癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｎｉ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌腫（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌腫（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫（ｈａｉｒ−ｍａｔｒｉｘ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血液様癌腫（ｈｅｍａｔｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、ヒアリン癌腫（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎様癌腫（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳児胎生期癌腫（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮内癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、表皮内癌腫、上皮内癌腫（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペシェール癌腫（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチツキー細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ状癌腫（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫性癌腫（ｌｉｐｏｍａｔｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ上皮癌（ｌｙｍｐｈｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、髄様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌腫（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌腫、モール癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌腫、粘液分泌性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘液性類表皮癌腫、粘液癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌腫、粘液腫性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽腔癌腫、燕麦細胞癌腫、骨化性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）、類骨癌腫（ｏｓｔｅｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭状癌腫、門脈周囲性癌腫（ｐｅｒｉｐｏｒｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前浸潤癌、有棘細胞癌（ｐｒｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粥状癌腫（ｐｕｌｔａｃｅｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎臓の腎細胞癌腫、予備細胞癌腫（ｒｅｓｅｒｖｅ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａｔｏｄｅｓ）、シュナイダー癌（ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、小細胞癌腫、ソラノイド癌腫（ｓｏｌａｎｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞癌腫（ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、紡錘体細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ストリング癌腫（ｓｔｒｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、毛細血管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌腫（ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌腫、および絨毛癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｖｉｌｌｏｓｕｍ）が挙げられる。
【００５９】
「治療有効用量または量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ  ｏｒ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、本明細書では、それが投与されるものに効果を生じる用量を意味する。その正確な用量および処方は処置の目的に依存し、当業者は公知の技法を使用して確かめることができる（例えば、Lieberman、Pharmaceutical  Dosage  Forms（１〜３巻、１９９２年）；Lloyd、The  Art,  Science  and  Technology  of  Pharmaceutical  Compounding（１９９９年）；Remington：The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、第２０版、Gennaro編（２００３年）、およびPickar、Dosage  Calculations（１９９９年）を参照されたい）。
【００６０】
「薬学的に許容される塩」または「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、本明細書に記載の化合物に見いだされる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むことを意味するする。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を有する場合、中性の形態のそのような化合物を十分な量の所望の塩基と、そのままで、または適切な不活性溶媒中で接触させることによって塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、またはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を有する場合、中性の形態のそのような化合物を、十分な量の所望の酸と、そのままで、または適切な不活性溶媒中で接触させることによって酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎｉｃ）、リン酸、一水素リン酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、二水素リン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、硫酸、一水素硫酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｕｒｉｃ）、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸に由来する酸付加塩、ならびに、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸（ｐ−ｔｏｌｙｌｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、クエン酸、酒石酸、およびメタンスルホン酸などのような比較的非毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。アルギン酸塩（arginate）などのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸（galactunoric）のような有機酸の塩も包含される（例えば、Bergeら、Journal  of  Pharmaceutical  Science  ６６巻：１〜１９頁（１９７７年）を参照されたい）。ある特定の本発明の化合物は、その化合物を塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性および酸性の官能基を含有する。当業者に公知の他の薬学的に許容されるキャリアは、本発明に適している。
【００６１】
ＩＩ．方法
一態様では、被験体におけるがんを検出する方法が提供される。該方法は、組換えレポーターアデノウイルスを被験体に投与するステップを含む。組換えレポーターアデノウイルスを被験体内のがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成する。レポーターが感染したがん細胞を含む試料を被験体から得、レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、被験体におけるがんを検出する。本明細書で提供される組換えレポーターアデノウイルスは、レポータータンパク質をコードする配列を少なくとも１つ（例えば１つ）含む組換えアデノウイルスである。組換えレポーターアデノウイルスの非限定的な例が表２および図９に示されている。実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスは、その全体があらゆる目的について本明細書に組み込まれる公開出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４８００６に記載の方法に従って形成される。レポータータンパク質は、蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）であってもよく、または蛍光標識することにより容易に検出可能になり得るタンパク質であってもよい。蛍光標識は、蛍光標識された抗体をレポータータンパク質と結合させることによって達成することができる。いくつかの実施形態では、組換えレポーターアデノウイルスは、蛍光タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結しているサイトメガロウイルスプロモーターを含む。いくつかの別の実施形態では、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えレポーターアデノウイルスは、蛍光タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結しているＥ２Ｆプロモーターを含む。いくつかの別の実施形態では、蛍光タンパク質は赤色蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えレポーターアデノウイルスは、蛍光タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結しているＳＲＥプロモーターを含む。いくつかの別の実施形態では、蛍光タンパク質は黄色蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えレポーターアデノウイルスは、蛍光タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結しているＳＭＡＤ応答性プロモーターを含む。いくつかの別の実施形態では、蛍光タンパク質は赤色蛍光タンパク質である。
【００６２】
別の態様では、被験体におけるがんを検出する方法が提供される。該方法は、被験体からがん細胞を含む試料を得るステップを含む。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞と接触させる。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成し、レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、前記被験体におけるがんを検出する。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法による検出は、レポーター遺伝子表現型を検出することを含む。いくつかの別の実施形態では、レポーター遺伝子表現型は、蛍光レポーター遺伝子表現型である。細胞（例えば、がん細胞）に本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスを感染させる場合、細胞に、あるレポーター表現型を発現させるために十分な量の組換えレポーターアデノウイルスを感染させる。
【００６３】
別の態様では、試験化合物により、がん患者由来のがん細胞の増殖が阻害されるかどうかを決定する方法が提供される。該方法は、被験体からがん細胞を含む試料を得るステップを含む。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞と接触させる。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成する。レポーターが感染したがん細胞を十分な時間増殖させる。レポーターが感染したがん細胞の増殖のレベルを決定し、レベルを対照レベルと比較し、対照レベルと比較してレベルが低いことにより、試験化合物によって患者由来のがん細胞の増殖が阻害されることが示される。本明細書で提供される対照レベルは、試験化合物の不在下でのがん細胞の増殖のレベルである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法によるがんは、肺がん、皮膚がんまたは乳がんである。他の実施形態では、本明細書において提供される方法によるがん細胞は、循環しているがん細胞である。いくつかの実施形態では、がん細胞は、前がん（premalignant）細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法による試料は、体液である。いくつかの別の実施形態では、体液は血液である。他の実施形態では、体液は血清または血漿である。他の実施形態では、体液は尿、唾液、肺組織、気管支肺胞洗浄試料、または呼気凝縮液である。
【００６５】
別の態様では、被験体由来の試料中のレポーターが感染したがん細胞を単離する方法が提供される。該方法は、レポーターが感染したがん細胞を、感染していない細胞から分離するステップを含み、ここで、分離するステップは、少なくとも部分的に、レポーターが感染したがん細胞の発現されたレポーター遺伝子の表現型に基づく。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子の表現型は、蛍光活性のレベルである。他の実施形態では、レポーター遺伝子の表現型は、細胞の増殖のレベルである。他の実施形態では、レポーター遺伝子の表現型は、異常な細胞形態のレベルである。いくつかの実施形態では、該方法は、レポーターが感染したがん細胞を十分な時間増殖させ、それにより、発現されたレポーター遺伝子の表現型を発現させるステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、感染していない細胞は非がん細胞である。他の実施形態では、試料は血液試料である。
【００６６】
別の態様では、被験体におけるがんを検出する方法が提供される。該方法は、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスを被験体に投与するステップを含む。組換えレポーターアデノウイルスを被験体内のがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成する。レポーターが感染したがん細胞を含む被験体から試料を得、レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、被験体におけるがんを検出する。
【００６７】
別の態様では、被験体におけるがんを検出する方法が提供される。該方法は、被験体からがん細胞を含む試料を得るステップを含む。その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞と接触させる。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成し、レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、被験体におけるがんを検出する。いくつかの実施形態では、該方法は、被験体にがん治療を施すステップをさらに含む。
【００６８】
試験化合物により、がん患者由来のがん細胞の増殖が阻害されるかどうかを決定する方法が提供される。該方法は、被験体からがん細胞を含む試料を得るステップと、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞と接触させるステップとを含む。組換えレポーターアデノウイルスをがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成する。レポーターが感染したがん細胞を十分な時間増殖させ、レポーターが感染したがん細胞の増殖のレベルを決定する。レベルを対照レベルと比較し、対照レベルと比較してレベルが低いことにより、試験化合物によって患者由来のがん細胞の増殖が阻害されることが示される。
【００６９】
ＩＩＩ．組成物
本明細書では、とりわけ、がん細胞の診断および検出のために有用な組換えレポーターアデノウイルスが提供される。一態様では、がん細胞レポーターモジュールと、がん細胞結合性モジュールとを含む組換えレポーターアデノウイルスが提供される。本明細書において提供されるがん細胞レポーターモジュールは、レポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子を含む。レポータータンパク質は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）であってもよく、または蛍光標識することにより容易に検出可能になり得るタンパク質であってもよい。蛍光標識は、蛍光標識された抗体をレポータータンパク質と結合させることによって達成することができる。本明細書で提供されるがん細胞結合性分子は、がん細胞によって発現される分子（例えば、細胞受容体）に結合することができる分子である。細胞結合性分子は、低分子であってもタンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、がん細胞レポーターモジュールは、レポーター遺伝子に作動可能に連結しているがん応答性プロモーターを含む。本明細書で提供されるがん応答性プロモーターは、がん細胞において活性を有するプロモーターであり、この活性は、非がん細胞におけるプロモーターの活性とは検出可能に異なる。いくつかの実施形態では、活性は、非がん細胞におけるプロモーターの活性と比較して減少する。他の実施形態では、活性は、非がん細胞におけるプロモーターの活性と比較して増加する。いくつかの別の実施形態では、レポーター遺伝子は蛍光レポーター遺伝子である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスは、免疫回避モジュールをさらに含む。本明細書で提供される免疫回避モジュールは、組換えレポーターアデノウイルスによって発現されると、組換えレポーターアデノウイルスががん患者の免疫系によって検出されることを防止するタンパク質またはポリペプチドである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、がん細胞レポーターモジュールは、第１のがん細胞レポーターモジュールであり、組換えレポーターアデノウイルスは、第２のがん細胞レポーターモジュールおよび第３のがん細胞レポーターモジュールをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のがん細胞レポーターモジュールは、第１のレポーター遺伝子の表現型を発現させることができ、第２のがん細胞レポーターモジュールは、第２のレポーター遺伝子の表現型を発現させることができ、第３のがん細胞レポーターモジュールは、第３のレポーター遺伝子の表現型を発現させることができる。いくつかの別の実施形態では、第１のレポーター遺伝子の表現型、第２のレポーター遺伝子の表現型、および第３のレポーター遺伝子の表現型はそれぞれ検出可能に異なる。いくつかの実施形態では、第１のレポーター遺伝子の表現型は第１のがんを示し、第２のレポーター遺伝子の表現型は第２のがんを示し、第３のレポーター遺伝子の表現型は第３のがんを示す。いくつかの別の実施形態では、第１のがん、第２のがんおよび第３のがんはそれぞれ独立に異なる。いくつかの実施形態では、第１のレポーター遺伝子の表現型、第２のレポーター遺伝子の表現型および第３のレポーター遺伝子の表現型は単一のがんを示す。
【００７２】
ＩＶ．キット
別の態様では、がんを検出するためのキットが提供される。キットは、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のものなどの、細胞（例えば、潜在的ながん細胞）を被験体由来の組織試料または細胞試料から分離するための試薬（例えば、磁気ビーズまたは他の親和性に基づく分離用材料、ストック緩衝液など）を含む。したがって、キットは、少なくとも１つの細胞特異的マーカーに特異的に結合することができる抗体または他の試薬を含んでよい。キットは、試料を処理および検出の間保持するためのチューブまたは他の容器も含んでよい。キットは、組換えレポーターアデノウイルスを、細胞に感染させ、細胞を検出するために適した条件下で患者に投与するための説明書をさらに含む。
【００７３】
別の態様では、制がん剤をスクリーニングするためのキットが提供される。キットは、がん阻害性化合物と、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスとを含む。いくつかの実施形態では、キットは、がん阻害性化合物を投与するための試薬（例えば、ストック緩衝液）と、レポーター遺伝子の表現型を検出するための卓上検出デバイスとを含む。
【００７４】
別の態様では、がん細胞を単離するためのキットが提供される。キットは、発現されたレポーター遺伝子の表現型を検出するためのデバイスと、その実施形態を含めた本明細書において提供される組換えレポーターアデノウイルスとを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のものなどの、がん細胞を被験体由来の組織試料または細胞試料から分離（単離）するための試薬（例えば、磁気ビーズまたは他の親和性に基づく分離用材料、ストック緩衝液など）を含む。したがって、キットは、少なくとも１つのがん細胞特異的マーカー特異的に結合することができる抗体または他の試薬を含んでよい。キットは、試料を処理および検出の間保持するためのチューブまたは他の容器も含んでよい。キットは、組換えレポーターアデノウイルスを、がん細胞に感染させ、がん細胞を検出するために適した条件下で患者に投与するための説明書をさらに含む。
【００７５】
Ｖ．特定の実施形態
出願人らの意図は、他の検出システム、バイオマーカーまたは相関する遺伝子の発現サインのいずれを用いても不可能である分子複雑化（molecular  sophistication）および予後判定力のレベルで臨床決定を通知するためのポイントオブケア診断を提供する標準化された自動プラットフォームを開発することである。血液から生存可能なＣＴＣを検出し、計数し、特徴付け、単離する非侵襲的検査が開発されてきた。これは、臨床医に、がんが存在すること、またはがんが原発性病変から進行していることを警告し、また、循環性腫瘍細胞の数性質および遺伝子異常によって調節解除されている腫瘍経路に応じて、どのくらい侵襲的に患者を処置するべきかに関する臨床決定を通知するものである。さらに、これにより、技師が作動させる迅速な実用的自動プラットフォームを使用して、ロバストな転写性レポーターおよび分子特質に基づいて、重要ながん経路のいずれが調節解除されているかを決定することができる。ＣＴＣを単離し、捕捉し、種々の潜在的な処置レジメンに応答するそれらの能力について直接試験し、どの処置の選択肢が、最大の有効性を実現する可能性が最も高いかに関する臨床医の決定を通知することができる。
【００７６】
蛍光タンパク質の読み取りを通じて腫瘍経路に関する定量的データおよび定性的データをもたらすウイルスベクター
【００７７】
現在腫瘍ゲノムにおいて１００，０００を超える変異が同定されており（Stratton  MR、Campbell  PJ、Futreal  PA、Nature．２００９年；４５８巻（７２３９号）：７１９〜２４頁、１９３６００７９）、そのうち少なくとも３５０種の遺伝子が反復変異（recurrent  mutation）を示す（Futreal  PAら、Nat  Rev  Cancer、２００４年；４巻（３号）：１７７〜８３頁、１４９９３８９９）。この新しい遺伝学的知見にもかかわらず、がん患者の診断、予後判定および処置はなお、主観的な組織病理、形質転換の代理バイオマーカー、変動し得る表面マーカーまたは相関する遺伝子発現サインに大きく依拠している。ＤＮＡ配列決定が進歩するとともに、あらゆるがん患者の腫瘍のゲノムを配列決定することが近いうちに可能になるであろう。しかし、たとえこれが可能であっても、これらのデータでは、腫瘍の表現型を決定するか、またはこれらの因子がどのように相互作用するかを先験的に予測して、患者の臨床転帰を、もしくは種々の療法に対するそれらの腫瘍の応答を決定することを可能にする腫瘍微小環境内のエピジェネティックな改変および重要な相互作用は示されない。
【００７８】
がんの複雑さおよび遺伝学的変動性にもかかわらず、全ての腫瘍が、比較的少数の重要な経路における変異の結果であるそれらの悪性度、いわゆる「がんの特質」を決定する表現型を共有する（図１、（Hanahan  D、Weinberg  RA、Cell、２０００年；１００巻（１号）：５７〜７０頁、１０６４７９３１））。個々の腫瘍において、これらの経路を調節解除する変異は変動するが、重要な転写エレメントおよびエフェクターにおいて下流で収束する。例えば、増殖因子シグナル伝達についての腫瘍の自己充足性は、ＲＴＫ、ＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＰＩ−３Ｋ、またはＲＡＦにおける変異からもたらされることができ、一方ＲＢ腫瘍抑制因子経路は、ＲＢ自体の変異、ｐ１６の喪失（点変異およびエピジェネティックなサイレンシング）またはサイクリンの過剰発現によって不活性されることができる（Du  W、Searle  JS、Curr  Drug  Targets、２００９年；１０巻（７号）：５８１〜９頁、１９６０１７６２；Sherr  CJ、Cel、２００４年；１１６巻（２号）：２３５〜４６頁、１４７４４４３４；Rossi  DJ、Weissman  IL、Cell、２００６年；１２５巻（２号）：２２９〜３１頁、１６６３０８１１；Gazdar  AF、Oncogene、２００９；２８  Suppl  １：S２４−３１．１９６８０２９３；Yuan  TL、Cantley  LC、Oncogene．２００８年；２７巻（４１号）：５４９７〜５１０頁、１８７９４８８４）。これらの変異の獲得およびそれらの結果として生じる表現形形質は同時には起こらないが、長期にわたり、かつ進行期を通して、度々起こる。これらの重要な分子活性の調節解除は、診断用転写性レポーターおよび細胞に基づくアッセイを使用して機能的に決定することができる。例えば、Ｒｂまたはｐ１６における変異により、Ｅ２Ｆ駆動プロモーターが活性化される（Du  W、Searle  JS、Curr  Drug  Targets、２００９年；１０巻（７号）：５８１〜９頁、１９６０１７６２；Sherr  CJ、Cel、２００４年；１１６巻（２号）：２３５〜４６頁、１４７４４４３４）。同様に、ＳＭＡＤの細胞質内への局在化と比較した核内への局在化は、ＴＧＦβ経路シグナル伝達および転移の指標である（Shi  Y、Massague  J.、Cell、２００３年；１１３巻（６号）：６８５〜７００頁、１２８０９６００）。これらの転写性の細胞に基づく蛍光局在化読み取りは、基礎研究および薬物スクリーニング適用において腫瘍経路活性のレポーターとして個別に使用されている。
【００７９】
出願人らは、数が多く、腫瘍間で非常に変動し得る個々の遺伝子病変を検出することに焦点を合わせるのではなく、複数の転写モジュールおよび分子モジュールをそれらのゲノムに組み入れて、患者の腫瘍を検出し、その分子「特質」および種々の療法に対する「先行」する応答を報告する、ウイルス性の診断用ドローンを創出した。出願人らはこれを達成するために、次世代の腫瘍選択的複製性アデノウイルスを創出するために出願人らが最近開発した変形力のある新しい科学技術的プラットフォームを活用する（O'Shea  CC、Oncogene、２００５年；２４巻（５２号）：７６３６〜９頁、１６２９９５２５；O'Shea  CC.、Oncogene、２００５年；２４巻（５２号）：７６４０〜５５頁、１６２９９５２６）。アデノウイルスは、感染後１時間以内に核に到達する天然の多重遺伝子発現ビヒクルである（O'Shea  CC、Oncogene、２００５年；２４巻（５２号）：７６３６〜９頁、１６２９９５２５；O'Shea  CC.、Oncogene、２００５年；２４巻（５２号）：７６４０〜５５頁、１６２９９５２６；Leopold  PL、Crystal  RG、Adv  Drug  Deliv  Rev.、２００７年；５９巻（８号）：８１０〜２１頁、１７７０７５４６）。出願人らの「Ａｄｓｅｍｂｌｙ」により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ゲノムの構成要素のライブラリー（Ａｄ２／５とは異なるトロピズムおよび性質を有するか、または変更された機能性が付与されるように遺伝子改変された、６０種を超えるヒトアデノウイルスおよび動物アデノウイルスから創出された）および異種エレメントからカスタムアデノウイルスゲノムを迅速に新規に組み立てることが可能になる（図２）（O'Shea  CC、Oncogene、２００５年；２４巻（５２号）：７６３６〜９頁、１６２９９５２５）。出願人らは、さまざまな変異および導入遺伝子の発現カセットを有する６０種を超える新しいウイルスを創出するために、この技術をすでに使用しており、この方法を使用して創出したウイルスは、高い力価で増殖することができることを示した。
【００８０】
Ｅ１領域、Ｅ３領域、およびＥ４領域はいずれも培養物中での複製に必要ではないか、または利用可能な細胞株を用いて補完することができる（Goncalves  MA、de  Vries  AA、Rev  Med  Virol.、２００６年；１６巻（３号）：１６７〜８６頁、１６７１０８３７）。これらの領域のそれぞれが、代替スプライシングを使用して複数の遺伝子産物（１６種の遺伝子）の発現を駆動する独立したプロモーターエレメントを有する。出願人らは、これを、種々の腫瘍試料において調節解除されている経路活性のマルチプレックス定量的測定を組み入れる単一の有力な診断剤を操作して作製するためのシステムとして活用する（表１）。天然のウイルスプロモーターを、重要な変異／表現型を伴う腫瘍において活性化されているプロモーターで置き換える。これらのプロモーターは、患者の腫瘍において調節解除されている重要な経路に関する追加的な情報をもたらす４種の異なる蛍光レポーター遺伝子融合物の発現を駆動する。例えば、細胞質内と比較した核内での、ＮＦ−κＢ（炎症）、ＴＯＲＣ２（ＬＫＢ１変異および代謝）、ＦＯＸＯ（ＰＩ３−Ｋ／ＡＫＴ変異）またはＳＭＡＤ４（ＴＧＦβ経路変異）など（Shi  Y、Massague  J.、Cell、２００３年；１１３巻（６号）：６８５〜７００頁、１２８０９６００；Oeckinghaus  A、Ghosh  S.、Cold  Spring  Harb  Perspect  Biol.、２００９年；１巻（４号）：ａ００００３４頁、２００６６０９２；Wullschleger  S、Loewith  R、Hall  MN、Cell、２００６年；１２４巻（３号）：４７１〜８４頁、１６４６９６９５；Weidinger  Cら、Endocr  Relat  Cancer、２００８年；１５巻（４号）：９１７〜２９頁、１８７７５９７５）。これらの作用物質を使用すると、任意の所与の腫瘍の分子損傷および悪性特性を迅速に（２４時間以内に）見分け、ＮａｎｏＳｏｒｔラボオンチップμＦＡＣＳによってスコア化することができる。さらに、これらの作用物質は、患者の腫瘍が、特定の療法に応答するようであるかどうかを迅速にかつ直接決定するためのレポーターとして使用され得る。出願人らの技術により、以前に記載されたＣＴＣ検出のウイルスに基づく方法が、いくつかの重要な手段で改善される（Fong  SMら、Surgery、２００９年；１４６巻（３号）：４９８〜５０５頁、１９７１５８０７；Kojima  Tら、J  Clin  Invest.、２００９年；１１９巻（１０号）：３１７２〜８１頁、１９７２９８３７）。Ａｄｓｅｍｂｌｙの使用を通じて、腫瘍応答性蛍光エレメントのライブラリーを創出することができる。これにより、特定の型の腫瘍および経路変異を検出するために調整した複数のアデノウイルスを迅速に創出することが可能になる。Ａｄｓｅｍｂｌｙにより、アデノウイルスの再標的化を容易にし、したがって、ＣＴＣへの形質導入の機会を最大にすることも可能になる。最後に、Ａｄｓｅｍｂｌｙにより、種々のゲノムモジュールからの多重遺伝子発現を容易にすることが可能になり、これにより、ＣＴＣ検出の間に得ることができる情報の量が増加する。
【００８１】
ラボオンチップ技術（Lab-On-A-Chip  Technology）
【００８２】
ＣＴＣの計数および捕捉を改善するためのいくつかの方法が提唱されており、フローサイトメトリーの成功がすでに証明されている（Allan  AL、Keeney  M.、J  Oncol.、２０１０年；２０１０巻：４２６２１８頁、２００４９１６８）。フローサイトメトリーにより、複数のパラメータの下での、迅速であり、それでも非常に特異的であり、定量的な細胞ごとの分析が可能になるだけでなく、ＣＴＣをさらなる分子キャラクタリゼーションのために選別することも可能にする。さらに、フローサイトメトリーは、成熟し、よく認識され、商業的に実行可能な技術である。しかし、複数の障害により、現行のフローサイトメーターは、ＣＴＣのポイントオブケア分析のためには非実用的なものとなっている。第１に、手動のピペット操作で個々の抗体を細胞試料に入れることによって細胞を標識しなければならない。この手順により、抗体の取扱いにおける差異、ピペット操作の不正確さ、保管の不一致、および抗体ロットの変動性に起因して、データに大きな変動が生じる可能性がある。第２に、現行のフローサイトメーターは、非常に費用がかかり、設置面積が大きい（すなわち動かすことができない）。最後に、現行のフローサイトメーターは、作動させるのが技術的かつ分析的に難しい。
【００８３】
出願人らは、これらの技術的な問題に取り組むために、マイクロフルイディクス、フォトニクス、およびマイクロアコースティックス（ｍｉｃｒｏａｃｏｕｓｔｉｃｓ）を革新的な分析技法と組み合わせたラボオンチップ技術を開発した。これらの、ＮａｎｏＳｏｒｔ，Ｉｎｃが排他的にライセンスを持つ特許を受けた技術により、ポイントオブケアで、費用および空間の部分で現行の業界のリーダーの性能に見合うまたはそれを超えるロバストな携帯型の安価なデバイスを介してフローサイトメトリーを利用することが可能になる（Cho  SH、Chen  CH、Tsai  FS、Godin  JM、Lo  YH、Lab  Chip.、２０１０年；１０巻（１２号）：１５６７〜７３頁、２０３７９６０４；Cho  SHら、Conf  Proc  IEEE  Eng  Med  Biol  Soc.、２００９年；２００９巻：１０７５〜８頁、１９９６５１４１；Chen  CHら、Biomed  Microdevices、２００９年；１１巻（６号）：１２２３〜３１頁、１９６４９７１０；Chen  CHら、Hawkins  AR編、Handbook  of  Optofluidics：CDC  Press；２０１０年、６６４頁；Godin  J、Lo  YH、Biomed  Opt  Express、２０１０年；１巻（５号）：１４７２〜９頁、２１２５８５６３）。
【００８４】
ウイルスに基づく検出器および診断法に媒介されるＣＴＣの蛍光強調
【００８５】
出願人らは、ウイルスのＥ１転写単位、Ｅ３転写単位およびＥ４転写単位と置き換える、ウイルスの骨格における追加的な修飾を用いて再組立てして新規の組織トロピズムおよび他の活性を付与した一連の腫瘍経路活性モジュールを創出した。これらのウイルス性診断剤を、ヒト腫瘍細胞株（既知の表現型／変異を有する）ならびに初代細胞において検証し、培養物中、およびヒト血液試料の状況の両方でもそれを行った。
【００８６】
診断用アデノウイルスの最初のセットを操作して、ＲＢ／ｐ１６経路、ＴＧＦβ経路、増殖因子／ＰＩ−３Ｋ／Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路、ＬＫＢ１／ＡＭＰＫ経路における変異を有する腫瘍細胞に関して診断的である４種の異なる蛍光バイオマーカーを発現させ、検出および収集のためにそれらに標識を付けただけでなく、それらの悪性度および療法に対する応答を定義した。Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｉｃデータベースからの最新のデータにより、ＥＧＦＲが腫瘍の２８％で増幅／変異されていること、ＲＢ（１２％）、ｐ１６（１３％）、Ｒａｓ（１７％）、ＬＫＢ１（９％）、ＳＭＡＤ４（２％）が示されている。そのような手法の実現可能性は、がんにおけるウイルス遺伝子の発現を選択的に誘導し、それにより、腫瘍選択的なウイルス複製を確実にするために、腫瘍溶解性ウイルスを開発するためのそのような腫瘍特異的プロモーターの使用によりすでに実証されている（O'Shea  CC、Oncogene、２００５年；２４巻（５２号）：７６３６〜９頁、１６２９９５２５；O'Shea  CC.、Oncogene、２００５年；２４巻（５２号）：７６４０〜５５頁、１６２９９５２６；Huang  TGら、Gene  Ther.、２００３年；１０巻（１５号）：１２４１〜７頁、１２８５８１８９；McCormick  F.、Cancer  Biol  Ther.、２００３年；２（４  Suppl  １）：S１５７−６０．１４５０８０９４；Ries  SJ、Brandts  CH、Drug  Discov  Today、２００４年；９巻（１７号）：７５９〜６８頁、１５４５０２４２；Chiocca  EA、Nat  Rev  Cancer、２００２年；２巻（１２号）：９３８〜５０頁、１２４５９７３２）。
【００８７】
例えば、健康な女性由来の乳房組織は、ヒト乳房上皮細胞のバリアント（ｖＨＭＥＣ）の亜集団を含有し、このバリアントでは、ｐ１６INK４aがエピジェネティックにサイレンシングされており（Holst  CR、Cancer  Res.、２００３年；６３巻（７号）：１５９６〜６０１頁、１２６７０９１０）、このバリアントは、乳がんの前悪性前駆体を示すと考えられている（Tlsty  TD、J  Mammary  Gland  Biol  Neoplasia、２００４年；９巻（３号）：２６３〜７４頁、１５５５７７９９；Crawford  YGら、Cancer  Cell、２００４年；５巻（３号）：２６３〜７３頁、１５０５０９１８；Romanov  SRら、Nature、２００１年；４０９巻（６８２０号）：６３３〜７頁、１１２１４３２４）。出願人らは、図３において、天然のＥ１プロモーターが細胞性Ｅ２Ｆプロモーター（Johnson  Lら、Cancer  Cell、２００２年；１巻（４号）：３２５〜３７頁、１２０８６８４８）で置き換えられているウイルスが、ＨＭＥＣと比較して、ｖＨＭＥＣにおいて下流のウイルスタンパク質の発現を特異的に駆動することを示す。出願人らは、組み込まれたラボオンチップμＦＡＣＳを使用して検出、定量および選別を可能にする蛍光マーカーで今やウイルス遺伝子が置き換えられている複製能力のないウイルスを使用すること以外は、ＣＴＣを検出し、単離するために、同様の戦略を使用する。
【００８８】
これを達成するために、ウイルスの「Ｅ１」モジュールプロモーターおよびｏｒｆを、ＴＯＲＣ２−ｅＹＦＰ融合物を駆動するＥ２Ｆプロモーターで置き換える。これにより、ｐＲｂ／ｐ１６経路およびＬＫＢ１において変異を有する細胞が同定される。ウイルスの「Ｅ３」モジュールプロモーターおよびｏｒｆを２つのカセットで置き換える。血清応答エレメント（ＳＲＥ）によって調節されるＣＭＶプロモーターは、ｍＣｈｅｒｒｙを駆動し、それにより、ＥＧＦＲ／ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ経路の過剰活性化が同定され、また、ＴＧＦβにより調節されるプロモーターはｍＯｒａｎｇｅを駆動し、それにより、転移能を有する細胞が同定される。ウイルスの「Ｅ４」モジュールプロモーターおよびｏｒｆを、ｅＧＦＰ−ＦＯＸＯを駆動するＣＭＶ主要ＩＥプロモーターで置き換える。これらは、ほぼ全ての細胞において発現され、蛍光を正規化する手段およびＰＴＥＮ／ＰＩ−３Ｋ／ＡＫＴ経路における変異を有する細胞を同定する手段の両方として役立つ。
【００８９】
出願人らは、ＣＴＣへの感染を確実にするために、新規の革新も組み入れる。最初に発見されたＡｄ５が、基礎研究および臨床研究において使用される最も優勢なアデノウイルスである。Ａｄ５の細胞受容体はＣＡＲであり、これはＥ−カドヘリンと一緒に上皮細胞を特色付ける。しかし、ＣＡＲの発現は、例えば転移において起こり得る、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を受けている細胞ではしばしば下方制御される。これらの細胞を感染させ、検出するために、出願人らは、ＣＤ４６などの種々の細胞受容体に結合するいくつかの繊維シュードタイピングしたウイルスを創出し、検証し、それにより、ＣＴＣへの形質導入の機会を最大にした（表２）。
【００９０】
それぞれが代替の受容体を標的とするが、全てが同じ発現カセットを含有するこの最初の一連の５種のウイルスを、既知の分子損傷を伴う肺がん細胞株および乳がん細胞株のパネルと比較して、初代肺上皮細胞および乳房上皮細胞において検証する（Neve  RMら、Cancer  Cell、２００６年；１０巻（６号）：５１５〜２７頁、１７１５７７９１）。細胞に、５種のウイルスのそれぞれをＭＯＩ＝３０で２４時間にわたって形質導入し、その後、ＦＡＣＳおよび顕微鏡法を使用して蛍光検出する。培養物において腫瘍選択的な遺伝子発現が確認されたら、出願人らは、ヒト血液試料の状況でウイルスによる形質導入を最適化する。複製能力のあるアデノウイルスベクター（Kojima  Tら、J  Clin  Invest.、２００９年；１１９巻（１０号）：３１７２〜８１頁、１９７２９８３７）および複製欠損アデノウイルスベクター（Lyons  Mら、Mol  Ther.、２００６年；１４巻（１号）：１１８〜２８頁、１６５８０８８３）のどちらによっても、腫瘍細胞を用いてスパイクした試料を含めた全血試料中の細胞に形質導入することができることが以前実証されている。血液バンクから得た期限切れの全血７．５ｍＬを、塩化アンモニウムを含有する赤血球溶解緩衝液を用いて処理する。次いで、試料を、肺がん細胞または乳がん細胞を血液１ｍＬ当たり細胞１個、１０個、１００個、または１０００個で用いてスパイクする（Punnoose  EAら、PLoS  ONE.  ２０１０年；５巻（９号）：ｅ１２５１７頁）。初代肺上皮細胞または初代乳房上皮細胞を陰性対照としてスパイクする。２つの形質導入シナリオについて調べる。その１つでは、細胞をペレットにし、５種のウイルスの混合物を試料に各ウイルス１０４ＰＦＵ、１０５ＰＦＵ、および１０６ＰＦＵの濃度で加える。２つめでは、ウイルスを、細胞をペレットせずに全血に加える。ウイルスを加えた後、細胞を３７℃で１６時間または２４時間、揺らしながらインキュベートし、遠心分離によって収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、μＦＡＣＳによって選別する。
【００９１】
ＣＴＣ単離用のＮａｎｏＳｏｒｔ−ＵＣＳＤベンチトップ型μＦＡＣＳ
【００９２】
ＮａｎｏＳｏｒｔにより、いくつかのＮＩＨ  ＮＣＲＲ助成金によって部分的に援助されたＹｕｈｗａ  Ｌｏ’ｓ  ＵＣＳＤ研究所からの技術を使用する唯一の十分に機能的なラボオンチップマイクロ蛍光活性化細胞選別機（μＦＡＣＳ）プロトタイプが開発中である（Cho  SH、Chen  CH、Tsai  FS、Godin  JM、Lo  YH、Lab  Chip.、２０１０年；１０巻（１２号）：１５６７〜７３頁、２０３７９６０４；Cho  SHら、Conf  Proc  IEEE  Eng  Med  Biol  Soc.、２００９年；２００９巻：１０７５〜８頁、１９９６５１４１；Chen  CHら、Biomed  Microdevices、２００９年；１１巻（６号）：１２２３〜３１頁、１９６４９７１０；Chen  CHら、Hawkins  AR編、Handbook  of  Optofluidics：CDC  Press；２０１０年、６６４頁）。ラボオンチップμＦＡＣＳでは、蛍光および散乱を検出するためにオンチップの光導波路および独特の時空符号化アーキテクチャの設計を使用する。光学インタロゲーション後に、このデバイスでは、組み込まれた圧電ディスクアクチュエータを使用して、有限体積（１００ｐＬから１ｎＬ）の流体を移動させることによって単一細胞を選別する。図４には、選別に成功したことが検証される、検出スポットにある光電子増倍管（ＰＭＴ）検出器からの典型的な時空符号化された蛍光シグナル（１１１０）、それに続く、短時間後の別の時空符号化されたシグナル（１０１１）が示されている（Cho  SHら、Conf  Proc  IEEE  Eng  Med  Biol  Soc.、２００９年；２００９巻：１０７５〜８頁、１９９６５１４１；Godin  J、J  Biophotonics.、２００８年；１巻（５号）：３５５〜７６頁、１９３４３６６０）。これにより、個々の選別事象の成功を検証し、あらゆるＣＴＣが保持されたことを保証する独特の特徴がもたらされる。検出シグナル（１１１０と符号化される）が登録されたが、その後の（１０１１）シグナルが登録されなかったときは、システムにより、ＣＴＣが選別機を免れたことがすぐに検出される。この事象では、使用者は、ＣＴＣを捕捉するために、試料に２回目の処理を行うことを選択することができる。
【００９３】
図５には、圧電選別機の原理、およびオンチップ選別機によりどのように有効にフローを切り換えることができるかが概略的に示されている。そこで示されているフローの切り換えスピードは、出願人らのＣＣＤカメラのスピードによって限定され、実際のフローの切り換えスピード、したがって選別スピードは、実際には数回速い。図６に細胞選別の結果が示されており、表１にＮａｎｏＳｏｒｔ−ＵＣＳＤのμＦＡＣＳとＢＤのＭｏ−Ｆｌｏｗシステムとの比較が要約されている。出願人らは、μＦＡＣＳシステムを使用して、ＣＴＣの計数および単離の両方を完了する。
【００９４】
ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）を基本モデルとして使用し、ＣＴＣを計数および単離するためにラボオンチップ設計を改変および最適化する。これらの改変は、圧電選別機の設計およびマイクロ流体のフローの限局を含む。最適化された選別では、特異性よりもスピードを優先して最適化する現行の設計とは対照的に、収集効率を最大にする設計を使用して、個々のＣＴＣが選別されることを保証する。フローの限局に関して、現行の設計では、側方フローを限局させるためにシースフローを使用し、横断方向のフローの限局を達成するためにＮａｖａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより発明された「シェブロンパターン」を使用する（Howell  PB、Jr.、Lab  Chip、２００８年；８巻（７号）：１０９７〜１０３頁、１８５８４０８４）。しかし、「シェブロン」設計は、大きな浮遊細胞（例えば、ＣＴＣ）に対しては、強力な揚力が原因であまり有効ではない（Godin  J.  Optical  Systems  for  Integration  with  Microfluidics.  La  Jolla：University  of  California、San  Diego；２０１０年）。出願人らは、ＣＴＣの限局およびフローの流れへの集中を改善するために、代替のフローの限局設計を調査し、最適化する（例えば、曲がったチャネルにおいて慣性力および偏心力（ｅｃｃｅｎｔｒｉｃ  ｆｏｒｃｅ）を利用する（Bhagat  Aら、Microfluidics  and  Nanofluidics、２００９年；７巻（２号）：２１７〜２６頁；Bhagat  AASら、Physics  of  Fluids、２００８年；２０巻（１０号）：１０１７０２〜４頁；Di  Carlo  Dら、Anal  Chem、２００８年；８０巻（６号）：２２０４〜１１頁、１８２７５２２２；Di  Carlo  Dら、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、２００７年；１０４巻（４８号）：１８８９２〜７頁、１８０２５４７７）。フローの流れにおけるＣＴＣの限局の改善により、蛍光および散乱シグナルの変動係数（ＣＶ）が低下し、これにより、計数の誤差が減少することができる。
【００９５】
ＮａｎｏＳｏｒｔデバイスを使用して試料を試験する。次いで、出願人らは、市販のフローサイトメーター（例えば、ＦＡＣＳＡｒｉａ、ＢＤ）を使用して、「収集された試料」および「廃棄物」中の細胞濃度を測定する。収集された試料と廃棄物との間の細胞の比率により、計数の正確度および選別効率が生じる。
【００９６】
臨床血液試料からＣＴＣを検出し、単離する腫瘍選択的な蛍光ウイルスベクターとμＦＡＣＳとの併用
【００９７】
出願人らは、臨床試料において腫瘍特異的な蛍光ウイルスベクターとμＦＡＣＳ技術との両方を使用することについて検証するために、ＵＣＳＤ  Ｍｏｏｒｅ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒからＩＶ期の非小細胞肺がん患者由来の末梢血試料を得る。この特定の腫瘍は、上皮起源（ＣＤ４５−、ＥｐＣＡＭ＋およびサイトケラチン８および１８＋、および／またはサイトケラチン１９＋）のものであり、また、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  ＣＴＣプラットフォーム（Ｖｅｒｉｄｅｘ）を使用して検証することができるので、出願人らのウイルスに適している。さらに、この腫瘍は、いくつかの異なるヒトアデノウイルスの天然の一次標的であるので、出願人らのウイルスに特に適している。全血７．５ｍＬをヘパリン添加チューブ中に収集し、塩化アンモニウムを含有する赤血球溶解緩衝液を用いて処理する。次いで、５種のウイルスのプールを試料に加え、３７℃で２４時間、揺らしながらインキュベートする。形質導入後、細胞を１０００×ｇでペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄し、μＦＡＣＳによって選別する。バックグラウンドを超える蛍光を発する細胞を顕微鏡法によってさらに処理するために収集する。出願人らは、がんの特質に対して診断的な細胞質染色または核染色を決定する（図７および図８）。
【００９８】
ＮａｎｏＳｏｒｔ実験プロトコールを、検証のために最良の市販のシステムであるＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（Ｖｅｒｉｄｅｘ）と比較する。どちらの方法によっても血液７．５ｍＬを分析する。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈは、臨床検査室（ＡｐｏＣｅｌｌ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）によって行われる。そのチームにより結果が分析され、考察され、査読付き刊行物に発表するために準備される。
【００９９】
ＶＩ．実験手順
全てのベクターをＡｄ５  Ａｄｓｅｍｂｌｙベクターから操作した。
【０１００】
ΔＥ１｛ＳＲＥｐ−ＹＦＰ｝−｛ＣＭＶｐ−［Ｆｏｘｏ３−ＧＦＰ］｝プラスミドの創出
【０１０１】
プラスミドｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  ΔＥ１  ＣＭＶ−ＧＦＰの骨格をＰＣＲによって得た。この断片は、Ａｄ５ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＣ＿０００００８／ＧＩ：５６１６０５２９Ｆ）の３７６〜３５１４位が欠失しており、ｅＧＦＰを駆動するＣＭＶプロモーターが挿入されている。ＳＲＥプロモーターをプラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃからＰＣＲによって得、ＢＧＨポリアデニル化シグナルをプラスミドｐＣＤＮＡ３からＰＣＲによって得た。配列およびライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）を使用してＳＲＥプロモーターおよびＢＧＨポリＡを組み合わせてｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  ΔＥ１  ＣＭＶ−ＧＦＰ骨格に入れて、プラスミドｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  ΔＥ１  ＳＲＥｐ−ＣＭＶ−ＧＦＰを創出した。これにより、ＳＲＥプロモーターとＢＧＨポリＡシグナルの間にＰａｃＩ制限酵素部位も生成した。Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＯＲＦ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、Ｆｏｘｏ３  ｃＤＮＡを、そのｃＤＮＡを含有するプラスミドからＰＣＲによって得た。これをＳＬＩＣにより、ＰＣＲによって得たプラスミドｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  ΔＥ１  ＳＲＥｐ−ＣＭＶ−ＧＦＰの骨格内のＧＦＰのＮ末端と直接融合した。これにより、プラスミドｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  ΔＥ１  ＳＲＥｐ−ＣＭＶ−［Ｆｏｘｏ３−ＧＦＰ］が生成した。最後に、ｌａｎ−ＹＦＰのｃＤＮＡをプラスミドｐＬａｎＹＦＰ−ＮＴからＰＣＲによって得、ＳＬＩＣによってＰａｃＩ−ｃｕｔプラスミドｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  ΔＥ１  ＳＲＥｐ−ＣＭＶ−［Ｆｏｘｏ３−ＧＦＰ］にクローニングした。これによりプラスミドｐＥＮＴＲ  ΔＥ１｛ＳＲＥｐ−ＹＦＰ｝−｛ＣＭＶｐ−［Ｆｏｘｏ３−ＧＦＰ］｝が生成した。
【０１０２】
一連のΔＥ３｛ＳＭＡＤｒｐ−ｔｄＴｏｍａｔｏ｝プラスミドの創出
【０１０３】
これらの５種のプラスミドのそれぞれについて、以下の一連の変化を生じさせた：ｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  Ｅ３、ｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  Ｅ３  Ａｄ５／３繊維、ｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  Ｅ３  Ａｄ５／１１繊維、ｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  Ｅ３  Ａｄ５／３４繊維、およびｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  Ｅ３  Ａｄ５−ＲＧＤ繊維。まず、Ｅ３プロモーターの２７５３９〜２７５４２位のＴＡＴＡボックス配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＣ＿０００００８）を、部位特異的変異誘発によってＣＡＴＣへと変異させた。同様に、２７５０９〜２７５１４位のＡＴＦ結合部位をＴＣＧＴＣＡからＴＡＧＧＣＡに変異させた。偽陽性の読み取りを減少させるために、これらの２つの変化によりＥ３プロモーターの基底の活性を低下させる。次いで、これらのベクターの骨格をＰＣＲによって得て、Ｅ３Ａ領域およびＥ３Ｂ領域（２８１３０〜３０８０７位）を欠失させ、ＳＬＩＣを使用して、ＰａｃＩ制限部位が後ろに続くＳＭＡＤ応答性プロモーター（ＳＭＡＤｒｐ）をこの骨格に挿入した。最後に、ｔｄＴｏｍａｔｏをＰＣＲによって得、ＳＬＩＣを使用して、ＰａｃＩで消化したベクターに挿入した。
【０１０４】
ΔＥ４｛Ｅ２Ｆ１ｐ−［ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＲＴＣ２］｝プラスミドの創出
【０１０５】
ｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  Ｅ４のプラスミド骨格をＰＣＲによって得て、Ａｄ５ゲノムの３２９２７〜３５８１５位を欠失させ、ＳＬＩＣを使用して、後ろにＰａｃＩ制限部位が続くＥ２Ｆ１プロモーターと組み合わせた。Ｅ２Ｆ１プロモーターをウイルスＯＮＹＸ−４１１のＤＮＡからＰＣＲによって得た。これにより、プラスミドｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  ΔＥ４  Ｅ２Ｆ１ｐが生成した。Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＯＲＦ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにおいて、ＣＲＴＣ２  ｃＤＮＡを、そのｃＤＮＡを含有するプラスミドからＰＣＲによって得、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡをプラスミドｐｍｃｈｅｒｒｙ−Ｃ１から得た。ＣＲＴＣ２を、アミノ酸リンカーＳＧＬＲＳを用いてｍＣｈｅｒｒｙのＣ末端と融合し、ＳＬＩＣを使用して、ＰａｃＩで消化したベクターｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  ΔＥ４  Ｅ２Ｆ１ｐにクローニングした。これにより、プラスミドｐＥＮＴＲ  Ａｄ５  ΔＥ４  ｛Ｅ２Ｆ１ｐ−［ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＲＴＣ２］｝が創出された。
【０１０６】
ＰＣＲに関しては、全てのＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ酵素（ＮＥＢ）を使用して実施した。全てのＰＣＲを、１×ＨＦ緩衝液、各ｄＮＴＰ  ２００μＭ、各プライマー０．５μＭ、および鋳型１０ｎｇを用いて実施した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９８℃で３０秒−９８℃で１０秒、６５℃で３０秒（２サイクル毎に温度を１℃下げる）、ＰＣＲ産物の長さ１ｋｂ毎に７２℃で３０秒を１０サイクル、７２℃で５分、４℃で保持。
【０１０７】
ＳＬＩＣに関しては、直鎖状断片を、以下の反応物２０μｌ中、室温で１２分エキソヌクレアーゼ処理する：５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、２００ｍＭの尿素、５ｍＭのＤＴＴ、および０．５μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ。反応を、０．５ＭのＥＤＴＡ  １μｌを加え、その後７５℃で２０分インキュベートすることによって停止させる。次いで、等量のＴ４処理したＤＮＡを新しいチューブ中で混合して体積を約２０μｌにした。２断片を組み合わせたＳＬＩＣについては、各反応物１０μｌを使用する。３断片を組み合わせたＳＬＩＣについては、各反応物７μｌを使用する。断片を、６５℃まで１０分加熱し、次いで温度を２５℃に至るまで５秒毎に０．５℃低下するようにゆっくりと冷却することによってアニーリングする。アニーリング後、反応物５μｌを形質転換し、クローンをスクリーニングする。
【０１０８】
変更されたエントリーベクタープラスミドからのウイルスの創出に関しては、Ａｄｓｅｍｂｌｙゲノム組立て方法を使用してこのウイルスを創出した。二重ＤＥＳＴベクター  ２０ｆｍｏｌをＡｄ５  Ｅ１エントリーベクター  ５０ｆｍｏｌおよびＡｄ５  Ｅ３エントリーベクターおよびＡｄ５  Ｅ４エントリーベクターのそれぞれ１０ｆｍｏｌと組み合わせる。これらのベクターを、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２μｌと組み合わせ、最終的な体積を１０μｌにする。反応物を２５℃で一晩（１２〜１６時間）インキュベートする。反応を、プロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌを加え、３７℃で１０分インキュベートすることによって停止させる。次いで、反応物５μｌを、ｃｃｄＢ遺伝子産物に対して感受性である高コンピテントな細菌（＞１×１０９ｃｆｕ／μｇ）に導入してそれを形質転換する。その後、コロニーを単離し、完全なゲノムについてスクリーニングする。陽性クローンを、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の説明書に従って使用して２９３−Ｅ４細胞にトランスフェクトし、５日後にウイルスを回収した。
【０１０９】
ウイルスからの蛍光読み取りを調べるための初代細胞および腫瘍細胞の形質導入。正常な非腫瘍細胞および種々の腫瘍細胞を顕微鏡チャンバースライド上にプレーティングする。次の日に、培地を除去し、ウイルス接種物を加える。ウイルス接種物の総感染多重度は３０と等しい。２時間後に、接種物を除去し、新鮮な培地を加える。２４時間後に、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中に３０分固定する。固定後、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、蛍光イメージングを実施する。
【０１１０】
ＶＩＩ．表
【表１】
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【０１１１】
表２．がん診断のために創出されたウイルス
【０１１２】
がん診断のために創出されたアデノウイルスの最初のパネル。省略したウイルス名が１列目に列挙されている。その後の４つの列には、これらのウイルスによりコードされるがん診断用発現カセットの各部分が列挙されている。これは、使用したプロモーター、そのプロモーターについての蛍光タンパク質読み取り、該当する場合にはその蛍光タンパク質と融合したタンパク質（蛍光融合体）、および使用したポリアデニル化シグナル（ポリＡシグナル）を含む。６列目には、そのウイルスの繊維ノブ（ｋｎｏｂ）タンパク質を得た血清型が示されている。Ａｄ−ＲＧＤとは、繊維のＨＩ−ループにＲＧＤペプチドモチーフが挿入されたＡｄ５繊維を指す。最後の列には、該当する場合、どの表現型がプロモーターを活性化するか、および細胞内のどこに蛍光融合体が局在するかが説明されている。この一覧には、１つまたは２つの発現カセットを有するウイルスのみが含まれているが、任意の所与のウイルスからのカセットを他のカセットと組み合わせることができ、単一のウイルスから４つ以上の発現カセットが可能とされる。
【表２】
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【０１１３】
ＶＩＩＩ．実施形態
【０１１４】
実施形態１。被験体におけるがんを検出する方法であって、（ｉ）組換えレポーターアデノウイルスを被験体に投与するステップと、（ｉｉ）該組換えレポーターアデノウイルスを該被験体内のがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成するステップと、（ｉｉｉ）該被験体から、該レポーターが感染したがん細胞を含む試料を得るステップと、（ｉｖ）該レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、該被験体におけるがんを検出するステップとを含む方法。
【０１１５】
実施形態２。被験体におけるがんを検出する方法であって、（ｉ）被験体からがん細胞を含む試料を得るステップと、（ｉｉ）組換えレポーターアデノウイルスを該がん細胞と接触させるステップと、（ｉｉｉ）該組換えレポーターアデノウイルスを該がん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成するステップと、（ｉｖ）該レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、該被験体におけるがんを検出するステップとを含む方法。
【０１１６】
実施形態３。試験化合物により、がん患者由来のがん細胞の増殖が阻害されるかどうかを決定する方法であって、（ｉ）被験体からがん細胞を含む試料を得るステップと、（ｉｉ）組換えレポーターアデノウイルスを該がん細胞と接触させるステップと、（ｉｉｉ）該組換えレポーターアデノウイルスを該がん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成するステップと、（ｉｖ）該レポーターが感染したがん細胞を十分な時間増殖させるステップと、（ｖ）該レポーターが感染したがん細胞の増殖のレベルを決定するステップと、（ｖｉ）該レベルを対照レベルと比較するステップであって、該対照レベルと比較してレベルが低いことにより、該試験化合物によって該患者由来の該がん細胞の増殖が阻害されることが示されるステップとを含む方法。
【０１１７】
実施形態４。前記がんが、肺がん、皮膚がんまたは乳がんである、実施形態１、実施形態２または実施形態３のうちの一項に記載の方法。
【０１１８】
実施形態５。前記がん細胞が、循環しているがん細胞である、実施形態１、実施形態２または実施形態３のうちの一項に記載の方法。
【０１１９】
実施形態６。前記がん細胞が、前がん細胞である、実施形態１、実施形態２または実施形態３のうちの一項に記載の方法。
【０１２０】
実施形態７。前記試料が、体液または組織試料である、実施形態１、実施形態２または実施形態３のうちの一項に記載の方法。
【０１２１】
実施形態８。前記体液が、血液である、実施形態７に記載の方法。
【０１２２】
実施形態９。前記検出するステップが、レポーター遺伝子の表現型を検出することを含む、実施形態１または実施形態２のうちの一項に記載の方法。
【０１２３】
実施形態１０。前記レポーター遺伝子の表現型が蛍光レポーター遺伝子の表現型である、実施形態９に記載の方法。
【０１２４】
実施形態１１。被験体由来の試料中のレポーターが感染したがん細胞を単離する方法であって、該レポーターが感染したがん細胞を感染していない細胞と分離するステップを含み、該分離するステップが、少なくとも部分的に、該レポーターが感染したがん細胞の発現されたレポーター遺伝子の表現型に基づく方法。
【０１２５】
実施形態１２。前記レポーターが感染したがん細胞を十分な時間増殖させ、それにより、前記発現されたレポーター遺伝子の表現型を発現させるステップをさらに含む、実施形態１１に記載の方法。
【０１２６】
実施形態１３。前記感染していない細胞が非がん細胞である、実施形態１１に記載の方法。
【０１２７】
実施形態１４。前記試料が血液試料である、実施形態１１に記載の方法。
【０１２８】
実施形態１５。がん細胞レポーターモジュールと、がん細胞結合性モジュールとを含む組換えレポーターアデノウイルス。
【０１２９】
実施形態１６。免疫回避モジュールをさらに含む、実施形態１５に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【０１３０】
実施形態１７。前記がん細胞レポーターモジュールが、レポーター遺伝子に作動可能に連結しているがん応答性プロモーターを含む、実施形態１５に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【０１３１】
実施形態１８。前記レポーター遺伝子が蛍光レポーター遺伝子である、実施形態１７に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【０１３２】
実施形態１９。前記がん細胞レポーターモジュールが第１のがん細胞レポーターモジュールであり、前記組換えレポーターアデノウイルスが、第２のがん細胞レポーターモジュールおよび第３のがん細胞レポーターモジュールをさらに含む、実施形態１５に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【０１３３】
実施形態２０。前記第１のがん細胞レポーターモジュールが、第１のレポーター遺伝子の表現型を発現させることができ、前記第２のがん細胞レポーターモジュールが、第２のレポーター遺伝子の表現型を発現させることができ、前記第３のがん細胞レポーターモジュールが、第３のレポーター遺伝子の表現型を発現させることができる、実施形態１９に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【０１３４】
実施形態２１。前記第１のレポーター遺伝子の表現型、前記第２のレポーター遺伝子の表現型、および前記第３のレポーター遺伝子の表現型がそれぞれ検出可能に異なる、実施形態２０に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【０１３５】
実施形態２２。前記第１のレポーター遺伝子の表現型が第１のがんを示し、前記第２のレポーター遺伝子の表現型が第２のがんを示し、前記第３のレポーター遺伝子の表現型が第３のがんを示す、実施形態２０に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【０１３６】
実施形態２３。前記第１のがん、前記第２のがんおよび前記第３のがんがそれぞれ独立に異なる、実施形態２２に記載の組換えアデノウイルス。
【０１３７】
実施形態２４。前記第１のレポーター遺伝子の表現型、前記第２のレポーター遺伝子の表現型および前記第３のレポーター遺伝子の表現型が単一のがんを示す、実施形態２０に記載の組換えレポーターアデノウイルス。
【０１３８】
実施形態２５。被験体におけるがんを検出する方法であって、
（ｉ）実施形態１５から実施形態２４までのうちの一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスを被験体に投与するステップと、
（ｉｉ）該組換えレポーターアデノウイルスを該被験体内のがん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成するステップと、
（ｉｉｉ）該被験体から、該レポーターが感染したがん細胞を含む試料を得るステップと、
（ｉｖ）該レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、該被験体におけるがんを検出するステップと
を含む方法。
【０１３９】
実施形態２６。被験体におけるがんを検出する方法であって、（ｉ）被験体からがん細胞を含む試料を得るステップと、（ｉｉ）実施形態１５から実施形態２４までのうちの一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスを該がん細胞と接触させるステップと、（ｉｉｉ）該組換えレポーターアデノウイルスを該がん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成するステップと、（ｉｖ）該レポーターが感染したがん細胞を検出し、それにより、該被験体におけるがんを検出するステップと
を含む方法。
【０１４０】
実施形態２７。前記被験体にがん処置を施すステップをさらに含む、実施形態２５または２６のうちの一項に記載の方法。
【０１４１】
実施形態２８。試験化合物により、がん患者由来のがん細胞の増殖が阻害されるかどうかを決定する方法であって、（ｉ）被験体からがん細胞を含む試料を得るステップと、（ｉｉ）実施形態１５から実施形態２４までのうちの一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスを該がん細胞と接触させるステップと、（ｉｉｉ）該組換えレポーターアデノウイルスを該がん細胞に感染させ、それにより、レポーターが感染したがん細胞を形成するステップと、（ｉｖ）該レポーターが感染したがん細胞を十分な時間増殖させるステップと、（ｖ）該レポーターが感染したがん細胞の増殖のレベルを決定するステップと、（ｖｉ）該レベルを対照レベルと比較するステップであって、該対照レベルと比較してレベルが低いことにより、該試験化合物によって該患者由来の該がん細胞の増殖が阻害されることが示されるステップとを含む方法。
【０１４２】
実施形態２９。がんを検出するためのキットであって、実施形態１５から実施形態２４までのうちの一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスを含むキット。
【０１４３】
実施形態３０。制がん剤をスクリーニングするためのキットであって、がん阻害性化合物と、実施形態１５から実施形態２４までのうちの一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスとを含むキット。
【０１４４】
実施形態３１。がん細胞を単離するためのキットであって、発現されたレポーター遺伝子の表現型を検出するためのデバイスと、実施形態１５から実施形態２４までのうちの一項に記載の組換えレポーターアデノウイルスとを含むキット。
【図１】
0006329936.tif 000004
【図２】
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【図３】
0006329936.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006329936.tif 000010
【図８】
0006329936.tif 000011
【図９】
0006329936.tif 000012
【図１０】
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