(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン疾患を患う患者において、ガン疾患に対する免疫反応を誘導及び／又は刺激することによって前記ガン疾患を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物はＩＬ−７又はその誘導体と併用されるものであり、前記医薬組成物は腫瘍標的化ＩＬ１２を含み、ここで、前記誘導又は刺激が、
（ｉ）ガン細胞の老化又は増殖停止、及び／又は
（ｉｉ）ガン細胞又はガン組織の、起源の細胞又は組織への寛解、
を惹起し、
ここで、前記腫瘍標的化ＩＬ１２が、腫瘍壊死中に曝露されたヒトＤＮＡヒストンＨ１複合体に特異的であり、かつ、ＩＬ１２にそのＣ末端を介して融合された、治療的に有効なモノクローナル抗体又は生物学的に活性があるその一部である、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＩＬ−７又はその誘導体、及び前記医薬組成物が、同時に、別個に、または逐次投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＩＬ−７又はその誘導体が、ネイキッド形態（ｎａｋｅｄ  ｆｏｒｍ）、共有結合形態、又は複合体形態である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＩＬ−７が、免疫グロブリン重鎖又はその一部に共有結合的に融合された、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＩＬ−７又はその誘導体が、免疫グロブリンのＦｃ部分のＣ末端に共有結合的に融合された、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ガン細胞の老化が、前記ＩＬ−７又はその誘導体及び前記腫瘍標的化ＩＬ１２によってトリガされた患者の免疫系の一連の前記刺激又は誘導において、内在性のＩＦＮγ及び／又はＴＮＦを生成することによって引き起こされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ガン細胞の老化が、安定した増殖停止をもたらす、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ガン細胞の老化が、直接的な免疫特異的細胞傷害性効果とは独立している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ガン疾患が、固形腫瘍、又は筋肉、骨、神経、軟骨、腱、血管、及び脂肪若しくは線維組織の腫瘍に関連する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ガンが肉腫である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記治療が、筋形成分化の誘導を惹起する、請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、放射線療法又は放射線−化学療法と併用される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ＩＬ−１２が、そのｐ４０及び／又はｐ３０サブユニットのＮ末端を介して、抗体又は生物学的に有効なその一部のＣ末端へ融合されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
腫瘍標的化ＩＬ１２と、ＩＬ−７又はその誘導体とを有効成分として含む、ガン疾患治療用の医薬組成物であって、
ここで、前記腫瘍標的化ＩＬ１２が、腫瘍壊死中に曝露されたヒトＤＮＡヒストンＨ１複合体に特異的であり、かつ、ＩＬ１２にそのＣ末端を介して融合された、治療的に有効なモノクローナル抗体又は生物学的に活性があるその一部である、医薬組成物。
【請求項１５】
（１）ＩＬ−７又はその誘導体を含む第１製剤；
（２）腫瘍標的化ＩＬ１２を含む第２製剤；
を含み、前記第１製剤と前記第２製剤が、同時に、別個に、または逐次に投与される、医薬キットであって、
ここで、前記腫瘍標的化ＩＬ１２が、腫瘍壊死中に曝露されたヒトＤＮＡヒストンＨ１複合体に特異的であり、かつ、ＩＬ１２にそのＣ末端を介して融合された、治療的に有効なモノクローナル抗体又は生物学的に活性があるその一部である、医薬キット。
【請求項１６】
ＩＬ−７又はその誘導体を投与されたガン疾患を患う患者において、ガン疾患に対する免疫反応を誘導及び／又は刺激することによって前記ガン疾患を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は腫瘍標的化ＩＬ１２を含み、ここで、前記誘導又は刺激が、
（ｉ）ガン細胞の老化又は増殖停止、及び／又は
（ｉｉ）ガン細胞又はガン組織の、起源の細胞又は組織への寛解、
を惹起し、
ここで、前記腫瘍標的化ＩＬ１２が、腫瘍壊死中に曝露されたヒトＤＮＡヒストンＨ１複合体に特異的であり、かつ、ＩＬ１２にそのＣ末端を介して融合された、治療的に有効なモノクローナル抗体又は生物学的に活性があるその一部である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン免疫療法に対するものである。本発明は特に、筋肉、骨、神経、軟骨、腱、血管などのガン、好ましくは肉腫に罹患しているガン患者に対し、好ましくはＩＬ−２及び／又はＩＬ−７と併用した、標的化ＩＬ−１２分子の投与によって引き起こされる自然免疫又は獲得抗腫瘍免疫の誘導に対するものである。
【０００２】
本発明は、特に、好ましくはＩＬ−２及び／又はＩＬ−７の形態と併用する、ＮＨＳ−ＩＬ１２と呼ばれる特異的免疫グロブリン  サイトカイン融合タンパク質の形態のＩＬ−１２の使用に関するものであって、前記ガン疾患、特に肉腫の治療に対し、長期の薬物動態を示す。
【背景技術】
【０００３】
ガン免疫療法は、腫瘍特異的モノクローナル抗体及び他の免疫系成分の「受動的」投与、腫瘍細胞に対する特異的Ｔ細胞介在性免疫応答を誘発又は増強するための「能動的」免疫、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）修飾Ｔ細胞の養子移植（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、及び免疫調節剤を用いた免疫応答の非特異的増強、を含む、多様なバラエティの治療アプローチを包含する。免疫療法はすでに広い範囲のガンの管理に多大な影響を与えているが、これは主にモノクローナル抗体を用いた受動免疫療法に限定されている。ガン免疫療法の分野は複雑で急速に進化している。免疫療法は、従来の化学療法とは、それらの作用機序並びに生じる反応の種類が異なっており、従来の反応基準は、免疫療法剤の疾患を修飾する活性の信頼ある判定（ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）を提供しない可能性がある。多くの受動的免疫療法は、複数の構成要素（例えば、抗原、アジュバント及び送達媒体）を含んでいる。さらに、強固な治療活性は、免疫が、一般的な免疫応答性を高めること、及び、腫瘍が免疫寛容誘発環境を促進する免疫抑制メカニズムを克服することに対する他の免疫調節戦略と組み合わせられることが必要であることが、ますます認識されている。
【０００４】
横紋筋肉腫（ＲＭＳ）は、小児で最も一般的な軟部組織腫瘍であり、進行した段階では非常に好ましくない予後と関連付けられている（Ｏｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：２３８４−２３８９）。外科的切除、化学療法及び放射線療法は、多くの場合、繊細な解剖学的部位に局在する腫瘍であって、拡散傾向にあるために失敗する。従って、代替的な治療戦略に対する高い未充足ニーズが存在する。
【０００５】
最近のデータは、ＲＭＳを含む進行性の固形腫瘍の実現可能な戦略として、同種幹細胞移植（ａｌｌｏＳＣＴ）を示唆している（Ｋｏｓｃｉｅｌｎｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：２４２−２４４）。しかし、この設定における腫瘍制御メカニズムは十分に解明されていない。ＲＭＳに対する細胞傷害性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の応答は、インビトロで生成できるが（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１８１８−１８２３）、免疫エフェクター細胞の抗腫瘍活性は、多くの側面を持っている。死滅させることを超え、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）依存性経路介した複合シグナル伝達は、腫瘍の休止状態（ｄｏｒｍａｎｃｙ）をもたらすことが出来（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ，ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １３：５０７−５１８）、従って誘導されたこれらのサイトカイン分泌は、局所的な腫瘍増殖を制御するために重要な方法と成り得る。実際、いくつかの研究は、ａｌｌｏＳＣＴ後にＩＦＮ−γを産生するＴ細胞の頻度が増加した患者の生存率が改善することを示している（Ｗｉｅｇｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６０．６９３−７０３）。そのため、ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＣＤ８+ＣＴＬと同様に重要であり得る。
【０００６】
このネットワークにおける主要なプレーヤーであるＩＬ−１２は、腫瘍退縮を誘導することができ、自然免疫及び獲得免疫に影響を与える（例えば、Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｇ．２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１３３−１４６）。Ｔ細胞プライミングにおけるその役割に加えて、ＩＬ−１２は、ＴH１７細胞をＴH１表現型へ復帰させ、Ｍ１マクロファージ機能を回復し、ＤＣ−ＮＫの相互作用を媒介する。
【０００７】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、食細胞、Ｂ細胞及び活性化樹状細胞を含む、免疫系の種々の細胞による、感染に応答して産生される多面的な炎症誘発性サイトカインである（Ｃｏｌｏｍｂｏ  ａｎｄ  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ（２００２），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１３：１５５−１６８）。ＩＬ−１２は、免疫系の自然及び獲得腕（ａｒｍｓ）の相互作用を媒介し、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に作用し、細胞傷害性リンパ球の増殖及び活性を増強し、及び他の炎症性サイトカイン、特にインターフェロンγの産生に重要な役割を果たしている。ＩＬ−１２は、生物学的に活性な７４ｋＤａのヘテロ二量体を形成するジスルフィド架橋によって共有結合したα鎖（ｐ３５サブユニット、ＩＬ−１２ｐ３５）及びβ鎖（ｐ４０サブユニット、ＩＬ−１２ｐ４０）からなるヘテロ二量体分子である。
【０００８】
内因性ＩＬ−１２の存在は、広範囲の病原体、並びに移植及び化学的に誘導された腫瘍に対する免疫抵抗性に必要であることが示されている（Ｇａｔｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：４９５−５２１）。ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γ及びＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞のようなエフェクター細胞の誘導に基づいた強力な抗腫瘍活性を有することが実証されている（Ｂｒｕｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：１２２３−３０）。高レベルのＩＦＮ−γは、ＩＬ−１２に応答して、Ｔ細胞及びＮＫ細胞によって産生され（Ｋｏｂａｙａｓｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．；１７０：８２７−４５）、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ発現のパラクラインアップレギュレーションを介して増強された抗原提示を導く（Ｗａｌｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２  Ｎａｔｕｒｅ  １９８２；２９９：８３３−６９）。その実証された抗腫瘍活性の結果として、ＩＬ−１２は、腎臓癌、結腸癌、卵巣癌、黒色腫及びＴ細胞リンパ腫を含む広範囲のガンの治療のための免疫療法剤として（Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３：４０９−１７；Ｇｏｌｌｏｂ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６：１６７８−９２；及びＨｕｒｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，８２：７−１０）、及びガンワクチンのアジュバントとして（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９：３８３６−４７）ヒト臨床試験で試験されている。
【０００９】
ＩＬ−１２の全身投与は、主にいくつかの固形腫瘍に有効性を示しているが、治療におけるその使用は、その用量制限毒性のために制限されている（Ｇｏｌｌｏｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：１６７８−１６９２）。１０年にわたる初期の臨床開発の後、ｒＩＬ−１２に対する重篤な毒性及び一般的に低い反応率の文書化された実例が、これまでその臨床開発を妨げてきた。
【００１０】
従って、腫瘍微小環境へのＩＬ−１２の標的化デリバリーは、より効果的かつ毒性が少ないサイトカインを与えることができる可能性があるため、腫瘍免疫療法への非常に有望なアプローチとなる。それゆえ、薬物の効率的な抗腫瘍免疫を用いて、有効かつ上述の全ての行使すべき治療のガン免疫療法アプローチを提供することが本発明の主な対象である。
【発明の概要】
【００１１】
例えば、ＩＬ−２及びＩＬ−１２などの炎症性サイトカインの安全性を改善するための１つの戦略は、腫瘍を標的とする抗体への融合を介して、腫瘍へ直接送達することである。このような抗体−サイトカイン融合タンパク質、又は「免疫サイトカイン」は、以前、前臨床モデルにおいて抗腫瘍免疫を増強する能力を示した（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＳＤ．Ｉｎ  Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ  Ｊ，Ｃｕｉ  Ｙ，Ｌｉ  Ｓ，ｅｄｓ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２００９：２４１−２５６）。免疫サイトカインの耐用性を最大化するために、媒体として選択された抗体は、腫瘍で唯一見出される抗原に特異的に結合するものでなければならない。腫瘍に豊富に存在するが正常組織には存在しない、壊死関連抗原に対する抗体は、魅力的な送達アプローチを提供する（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８８；４８：５８４２−４８）。
【００１２】
選択的に腫瘍壊死の領域を標的とするＤＮＡ／ヒストン結合抗体の能力は、前臨床及び臨床の両方で、十分研究されている。この概念を利用している、ＮＨＳ−ＩＬ１２と呼ばれる壊死標的化ＩＬ−１２免疫サイトカインは、遺伝子的にＮＨＳ７６抗体の重鎖のＣ末端に２つのヒトＩＬ−１２ヘテロ二量体を融合させることによって設計された（国際公開第２０００／００１８２２号）。ＮＨＳ７６は、ＤＮＡ／ヒストンに結合するその特異的な能力で選択したファージディスプレイ由来ＩｇＧ１抗体であり、それによって、インビボで腫瘍を標的とする［Ｓｈａｒｉｆｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｈｙｂｒｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ；２０：３０５−１２］。
【００１３】
上記の特異化した標的化ＩＬ−１２薬剤を投与することによって、ＩＬ−１２誘導ヒト免疫系は、ガン細胞を死滅させるだけでなく、ガンの増殖を減弱させる、すなわち、ガン細胞の老化及び／又は分化を誘導することによる代替メカニズムを利用し、従って、ガン細胞又はガン組織の、起源の細胞又は組織への寛解を導くことが見出された。提案された標的化ＩＬ１２療法は、特に、ガン細胞のＴH１誘導増殖停止及び分化を誘発させる。標的化ＩＬ−１２が、免疫調節剤、例えばインターロイキン、例えばＩＬ−２及びＩＬ−７と共に、又は併用して投与される場合、特に効果が増加する。
【００１４】
本発明によれば、ＩＬ−１２は、結合した標的化形態で、例えばＩＬ１２−融合タンパク質、好ましくは、患者の組織によって発現される抗原又は特異的受容体分子を標的とすることができる免疫グロブリンと、ＩＬ−１２とからなり、該免疫グロブリンのＣ末端は、免疫サイトカインのＮ末端と結合されている融合タンパク質が使用される。本発明によれば、腫瘍標的化ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２に連結された、治療上有効なモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なその部分（例えば、Ｆａｂフラグメント、又はｓｃＦｖなど）である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、治療的に有効な抗体又はその標的化部分は、腫瘍壊死で露出されたＤＮＡ−ヒストンＨ１複合体に対するものである。さらなる特定の実施形態において、標的化ＩＬ−１２分子は、上記及び以下に詳細に記載の、ＩＬ−１２と既知の完全ヒトｌｇＧ１抗体ＮＨＳ７６とからなる、それぞれの融合タンパク質である。
【００１６】
本発明によれば、標的化ＩＬ−１２は、ガン免疫療法において使用することができる。本発明によれば、標的化ＩＬ−１２は、ガン免疫療法において使用することができるものであって、ここで、ガンが、筋肉、骨、神経、軟骨、腱、血管等に関連するものであり、好ましくは肉腫であり、より好ましくは、横紋筋肉腫（ＲＭＳ）である。本発明によれば、標的化ＩＬ−１２は、単独療法で又は免疫調節剤、例えばインターロイキン、インターフェロン、ＣｐＧ、ケモカイン若しくはグルカンと併用して使用することができる。
【００１７】
本発明の特定の実施形態において、免疫調節剤は、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−７、好ましくはＩＬ−２である。さらに、特定の好ましい実施形態において、免疫調節剤はＩＬ−２である。免疫調節剤は、好ましくは、より大きなタンパク質若しくは免疫グロブリン若しくはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｃ）と共有結合又は融合したもの、又は免疫グロブリンとの複合体である。本発明の一実施形態において、ＩＬ−２は、抗体のＦｃ部分に共有結合的に融合される。本発明のさらなる実施形態において、ＩＬ−２は、抗ＩＬ２抗体と複合体の形で結合されている。本発明のさらに別の実施形態では、ＩＬ−７は、抗体のＦｃ部分に共有結合的に融合される。
【００１８】
従って、本発明は、ガン治療にために使用するための腫瘍標的化ＩＬ−１２に対するものであって、ここで、薬剤が、患者における、例えば肉腫だけでなく他の固形腫瘍などのガン疾患に対する免疫応答を誘導及び／又は刺激するものであって、ここで、前記免疫反応の誘導又は刺激が、ガン細胞の老化、及び／又は驚くべき事にガン細胞若しくは細胞に対するガン組織若しくは起源の組織の寛解を惹起し、ここで、腫瘍標的化ＩＬ−１２は、治療上有効なモノクローナル抗体又は生物学的に活性があるその一部であり、腫瘍壊死で曝露されたヒトＤＮＡ−ヒストンＨ１複合体に特異的であり、好ましくはＩＬ−１２へ、好ましくは、ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットへそのＣ末端を介して融合されるものである。
【００１９】
本発明はさらに、前記ガン疾患を患う患者においてガン疾患に対する免疫反応を誘導する又は刺激するために、免疫調節性（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）及び／又は免疫補完的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）薬剤、例えば、インターロイキン、インターフェロン又はケモカイン等を用いた併用療法で使用するための腫瘍標的化ＩＬ−１２に対するものであって、ここで前記誘導又は刺激が、ガン細胞の老化、及びガン細胞又はガン細胞に対するガン組織又は起源の組織の寛解を引き起こし、ここで、前記腫瘍標的化ＩＬ−１２は、治療上有効なモノクローナル抗体又は生物学的に活性があるその一部であり、腫瘍壊死で曝露されたヒトＤＮＡ−ヒストンＨ１複合体に対するものであって、ＩＬ−１２にそのＣ末端を介して融合されたものである。
【００２０】
本発明によれば、前記腫瘍標的化ＩＬ−１２療法は、ガン細胞の老化を引き起こすのに有用であり、それは、好ましくは、前記標的化ＩＬ−１２療法によってトリガされた患者の免疫系の前記刺激又は誘導に続く、内因性のＩＦＮγ及び／又はＴＮＦの産生の増加によって生成される。本発明の前記療法によって、ガン細胞の老化が安定的な増殖停止を引き起こすことが見出された。さらに、ガン細胞の老化及び組織寛解は、ＮＫ細胞及びマクロファージ（これらの細胞はＩＬ−１２によってトリガされるが）の生成及び活性化などのような、直接的な免疫特異的な細胞傷害効果とは独立していることがが見出された。
【００２１】
本発明によれば、腫瘍標的化ＩＬ−１２療法は、ガン免疫療法に有用であって、ここで、ガン疾患は、固形腫瘍、又は筋肉、骨、神経、軟骨、腱、血管、及び脂肪若しくは線維組織の腫瘍に関連している。本発明の特定の実施形態において、療法は、肉腫、好ましくは横紋筋肉腫（ＲＭＳ）を治療するために使用される。
【００２２】
上記及び下記で特定されるＮＨＳ−ＩＬ１２及びＩＬ−２又はＩＬ−７が組み合わせて使用される提案されたガン免疫療法は、ガン細胞の老化を誘発するだけでなく、加えて、筋形成分化の誘導及び起源の組織細胞に対するガン細胞の寛解をも引き起こすことが見出され、それは、ＩＬ−１２に駆動されたヒト免疫系がガン細胞を殺傷するだけでなく、ガンの成長を減弱させるための代替メカニズムも利用することを示している。腫瘍標的化ＩＬ−１２は、少なくとも、完全にヒト化された同種異系の免疫系が再構築されたＮＳＧマウスにおいて腫瘍の成長を有意に抑止する。
【００２３】
本発明において、ＩＬ−２及びＩＬ−７単独では、腫瘍増殖を停止することも、有効な抗腫瘍免疫応答の誘導も行わなかった。ＩＬ−１２を用いた同種ヒト免疫系の刺激が、ヒト化マウスにおける腫瘍増殖を効率的に制御するために必要とされる。この文脈においてより効率的には、ＮＨＳ−ＩＬ１２及びＩＬ−２又はＩＬ−７の組み合わせであり、とりわけ、ＩＬ−２又はＩＬ−７が、体内での半減期が増加するような形態である場合である。一実施形態では、好ましくは、ＩＬ−２又はＩＬ−７は免疫グロブリンに結合されており、好ましくはＩＬ−２又はＩＬ−７は、免疫グロブリンのＦｃフラグメントのＣ末端に融合されている。さらに別の実施形態では、ＩＬ−２は、抗ＩＬ２抗体と、例えばＭＡｂ６０２と複合体化される。
【００２４】
ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬＭＡＢ６０２の組み合わせは、全生存期間及び腫瘍体積減少に関して有意に優位性を示している。組織像（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）は、ＩＬ−１２が、ＮＫ細胞又はＣＤ６８+マクロファージのいずれかによって、ガンの浸潤に必要とされないことを示唆している。明確に対照的に、本発明のＩＬ−１２構築物は、マクロファージを、エフェクター分子及び炎症性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−１β）を効率的に産生するＭＨＣクラス−ＩＩを発現するＭ１型へと駆動するために必要とされる。
【００２５】
本発明に係るデータは、ＩＬ−１２が、少なくとも使用されるこの特定の系において、ガン細胞、例えば、筋肉、骨、神経、軟骨、腱、血管、及び脂肪又は線維組織のガン細胞、好ましくはＲＭＳ細胞を殺傷するために、同種の免疫系を促進したことの示唆を導くことができた。興味深いことに、免疫組織学は、ガン細胞の死滅、アポトーシス又は壊死の証拠が無いことを示し、ＩＬ−２又はＩＬ−７との併用、好ましくは、結合又は複合体形態の、標的化されたＩＬ−１２ガン免疫療法は、殺傷からは独立したガン制御の重要なメカニズムを駆動することを示唆している。最も重要なことに、しかしながら、本発明の標的化ＩＬ１２療法の投与によって増殖停止したガンは、筋特異的タンパク質及び心臓、骨格及び平滑筋における中間径フィラメントの主要なサブユニットである、デスミンのデノボ発現を立体的横紋（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉａｔｅｄ）配置で開始する。とりわけ、線状様式のデスミンの存在が、筋細胞の高度の分化を指している（ｖａｎ，ｄ．，Ｖ，Ｓｃｈａａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２７０：１８９−１９８１）。
【００２６】
要約すると、本発明によって提供されるデータは、ガン細胞のＴH１誘導性増殖停止及び分化についての最初のインビボ証拠である。これは、腫瘍の微小環境及びそれに続くｐ１６INK4a経路の活性化に対し、ＩＬ−１２の標的化デリバリー、好ましくは、ＩＬ−２又はＩＬ−７との併用によって達成され得る。
【００２７】
詳細な説明
【００２８】
用語「老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）」は、本発明において、ガン細胞の寿命を制限し、無制限の細胞増殖を阻止する増殖停止プログラムを意味する。
【００２９】
用語「直接免疫特異的細胞傷害効果（ｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）」とは、本発明において、免疫応答の間に、免疫特異的な細胞傷害性細胞、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞傷害性細胞、又は樹状細胞などの能動的な関与及び作用を意味する。
【００３０】
用語「ガン免疫療法」とは、本発明において、免疫反応を刺激する、増強させる又は抑制することによって、ガンと戦う免疫系の能力を刺激する又は回復させる治療的処置を意味する。ガン免疫療法は、標的の免疫細胞認識を増加させることによって、又は、疾患関連免疫抑制を減少させることのいずれかによって、疾患特異的抗原に対する標的化された免疫活性を引き起こす。
【００３１】
本発明によれば、標的化ＩＬ−１２、例えば、ＮＨＳ−ＩＬ１２の投与と、ＩＬ−２又はＩＬ−７と、好ましくは上記及び下記で詳細に特定される、結合、融合又は複合体形態のＩＬ−２及びＩＬ−７と併用することが好ましい。共投与は、同時又は連続的に実施することができ、ここで、後者の場合、免疫調節剤は、特定の用量及び時間計画（レジメン）に従って、ＮＨＳ−ＩＬ１２のような標的化ＩＬ−１２分子を投与する数時間若しくは数日前又は後に投与することができる。
【００３２】
本発明によれば、標的化ＩＬ−１２、例えばＮＨＳ−ＩＬ１２の投与と、放射線療法及び／又は化学療法とを併用することが原則可能である。
【００３３】
本発明に係る上記の前記標的化ＩＬ−１２融合分子と組み合わせて使用される化学療法剤は、例えば、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、クロロエチルニトロソウレア含有非糖（ｎｏｎ−ｓｕｇａｒ）、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン（ｆｒａｇｙｌｉｎｅ）、メグラミン（Ｍｅｇｌａｍｉｎｅ）ＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタイン（ｃａｒｍｕｓｔａｉｎｅ）、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、ＺＤ９３３１、タキソテール／デセタキセル（Ｄｅｃｅｔａｘｅｌ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、及びこのクラスの他の良い化合物であってもよい。化学療法は、少なくとも２サイクル、好ましくは２〜８サイクル、より好ましくは２〜５サイクル本発明に従って適用される。１サイクルは、２１〜３５日間、好ましくは２１〜２８日間である。化学療法剤の投与レジメンは、様々な可能な患者−及び薬剤−関連の条件及び特性に依存している。
【００３４】
放射線治療（Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）は、標準放射線により本発明に従って実施され、ここで、合計４０〜１２０Ｇｙが、好ましくは少なくとも５０Ｇｙ、より好ましくは５０〜７５Ｇｙで適用される。放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）は一般に分割され、ここで、少なくとも４日間、好ましくは５〜７日間、次々に、一日あたり１．５〜３．５Ｇｙが適用される。総放射線用量が、２１〜３５日以内、好ましくは２８日以内に、本発明に従って適用される。必要又は有利な場合、３．５〜１５Ｇｙ、好ましくは５〜１０Ｇｙの追加用量が、放射線の開始において、又は中間の間隔で適用されうる。放射線治療は、標的化ＩＬ−１２分子及び任意に本発明の免疫調節剤の投与前又は後に、或いは同時に、本発明に従って実施され得る。
【００３５】
化学−放射線治療の処置は、免疫系を調節することができる薬剤の投与によって達成され得る。例えば、１００〜４００ｍｇ／ｍ2、好ましくは２５０ｍｇ／ｍ2の、比較的低用量のシクロホスファミドを適用することによって患者の免疫系が活性化又は増強され得る。通常、ワクチンの開始前に単回用量、原則として１〜５日、好ましくは２〜５日は、有効性に十分であるべきである。
【００３６】
本発明の好ましい標的化ＩＬ−１２は、上記で特定されるような、ＮＨＳ−ＩＬ１２である。上述のように、ＩＬ−１２は、ジスルフィド結合によって共有結合されたα鎖（ｐ３５サブユニット、ＩＬ−１２ｐ３５）及びβ鎖（ｐ４０サブユニット、ＩＬ−１２ｐ４０）からなるヘテロ二量分子である。本発明の融合タンパク質内のｐ３５サブユニットは、（二量体）抗体ＮＨＳ７６の２つの重鎖の各Ｃ末端に連結されている。ｐ４０サブユニットは、共有結合によって、ｐ３５サブユニットに連結されている。実際には、分子は、重鎖と融合タンパク質としてのｐ３５サブユニットと、記載されているように発現されたＮＨＳ−ｐ３５サブユニット融合にｉｎ  ｓｉｔｕで結合する、別々のｐ４０サブユニットを発現するＤＮＡ構築物を用いる組換え方法で製造される。
【００３７】
配列番号１は、成熟（野生型）ヒトＩＬ−１２のα鎖、すなわち、ヒトｐ３５サブユニットの成熟アミノ酸配列を示す：
【００３８】
【表１】
0006416926.tif 000002
【００３９】
配列番号２は、成熟（野生型）ヒトＩＬ−１２のβ鎖、すなわち、ヒトｐ４０サブユニットの成熟アミノ酸配列を示す：
【００４０】
【表２】
0006416926.tif 000003
【００４１】
配列番号３は、シグナル配列（イタリック、最初の１９アミノ酸）、可変ドメイン（下線）、及び脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ）Ｌ１０３Ｖ変異（太字）を含む、本発明に従って使用される及び修飾されるＭａｂ  ＮＨＳのλ軽鎖のアミノ酸配列を示す。シグナル配列は、成熟ポリペプチド鎖の一部ではない：
【００４２】
【表３】
0006416926.tif 000004
【００４３】
配列番号４は、シグナル配列（イタリック、最初の１９アミノ酸）、可変ドメイン（下線）、及び、ｈｕ  ｐ３５の最初のアミノ酸のＲからＡへの置換（太字）、ｈｕ  ｐ３５（下線及びイタリック体）を含む、重鎖／ヒトｐ３５融合のアミノ酸配列を示している。シグナル配列は、成熟ポリペプチド鎖の一部ではない：
【００４４】
【表４】
0006416926.tif 000005
【００４５】
配列番号５は、シグナル配列（イタリック体）及び太字で示される変異体配列（ＫＤＮＴＥＧＲＶへ変異したＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶ）を有する、ヒトｐ４０のアミノ酸配列を示す。シグナル配列は、成熟ポリペプチド鎖の一部ではない：
【００４６】
【表５】
0006416926.tif 000006
【００４７】
ＮＳＧマウスにおける完全に機能する免疫系の確立
【００４８】
インビボのヒトのシステムにおいて、ＮＨＳ−ＩＬ１２構築物の毒性及び潜在的な治療効果を試験するために、ＮＳＧマウスにｈｕＣＤ３４+幹細胞を移植し、ＦｃＩＬ−７で移植を刺激した（図１Ａ）。＞９９．９％純粋なｈｕＣＤ３４+細胞のＮＳＧマウスへの移植は、１２週間以内にすべての造血系統を確立した。また、複雑なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーが、骨髄、胸腺、脾臓及び胸腺に同等に見出された。合わせると、データは、移植されたマウスが、インビボでの状況において厳密にヒトに似たヒトＴ細胞免疫系を発達させたことを示している。マウスは、ドナーのＮＫレパートリーを反映したＮＫｐ受容体及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）で示される正常なＮＫ細胞もまた発達させた。
【００４９】
腫瘍の播種
【００５０】
１×１０6の同種Ａ２０４細胞の皮下播種は、幹細胞移植１２週間後、３週間以内に全てのマウスにおいて積極的な腫瘍増殖をもたらした。ＲＭＳの患者の幹細胞移植（ＳＣＴ）に沿って、免疫系は、同種異系Ａ２０４の拒絶に失敗した。腫瘍は、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）１−４は完全に欠いていたが、表面のＨＬＡクラスＩ及びＩＩ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ネクチン−２（ＣＤ１１２）及びポリオウイルス受容体（ＰＶＲ、ＣＤ１５５）の実質的な発現が有するにも関わらず、急速に成長した。
【００５１】
ヒストン標的化ＩＬ−１２融合タンパク質を用いた肉腫療法
【００５２】
腫瘍播種後、固形Ａ２０４ＲＭＳ腫瘍が３週間後に構築された。その後、マウスは、ＦｃＩＬ−７単独（コントロール）、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７又はＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２を用いて５週間処置した（図１Ａ）。構築物の静脈内注入は、急性でも経時的のいずれも、目に見える全身毒性を引き起こさなかった（図１Ｂ：４匹のマウス／コホート、１００日）。ＦｃＩＬ−７のみで処置したマウスでは、肉腫は、指数関数的な成長を示した。４／７のマウスは５週前に死亡し、３匹のマウスは５２日目に肉腫負担に起因するエンドポイント基準に達した（図１Ｃ）。Ｆｃ−ＩＬ７群では、６．５倍の腫瘍の成長が、２５日目から５２日目で観察され、一方で、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２では、成長が１．８倍に減少した（Ｐ＜０．０５、片側ｔ検定）。従って、肉腫はＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２を受けたマウスにおいて有意に増殖停止したままであり（ｎ＝１１）（図１Ｃ）、全てのマウスの生存が得られた（図１Ｂ及び１Ｄ）。ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７は、より短い期間、２／１１のマウスのみを保護し（図１Ｂ及び１Ｃ）、それらは、それぞれ４３日目及び４９日目に死亡した。３群全てからの分析を取得するために、生存させたままで１００日まで治療を受けた（長期間治療）ＮＨＳ−ＩＬ１２処置群のうちの４匹のマウスを除いて、マウスは５２日目で屠殺した（短期間治療）。ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７の長期治療は、順調に腫瘍増殖を１／４で停止させ、２／４で腫瘍増殖を遅延し、１匹のマウスで腫瘍を除去した。ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２長期治療は、３／４のマウスで腫瘍を除去し、残りのマウスで腫瘍増殖を停止した（図１Ｄ）。
【００５３】
ＮＨＳ−ＩＬ１２構築物の生体内分布
【００５４】
モノクローナル抗体ＮＨＳ７６は、壊死性ガン領域における細胞内抗原を認識する。従って、ＮＨＳ−ＩＬ１２が、肉腫の部位に優先的に結合するかどうかを分析した。123Ｉ標識ＮＨＳ−ＩＬ１２を用いたＳＰＥＣＴ／ＣＴの生体内分布研究は、肉腫の微小環境の内部において、有意なＮＨＳ−ＩＬ１２のインビボ濃縮を明らかにした（図２Ａ）。123Ｉ標識ＮＨＳ−ＩＬ１２の定量は、反対側の筋肉と比較した場合に、腫瘍中の４〜６倍放射性核種の濃縮を示した。123Ｉカウントは、時間が経過しても安定したままであり（図２Ｂ）、ＮＨＳ−ＩＬ１２が優先的にヒト肉腫へ結合することを確認した。
【００５５】
腫瘍特異的免疫応答
【００５６】
異なる治療プロトコルの治療効果の基礎となる違いを理解するために、本発明者らは、Ａ２０４肉腫浸潤ヒト免疫細胞の組織学、免疫組織化学（ＩＨＣ）並びに詳細な分子及び機能的特徴付けを行った。
【００５７】
驚くべきことに、ＦｃＩＬ−７で処置したマウスの肉腫は、マクロファージ（ＣＤ６８+）及びＮＫ細胞（ＣＤ５６+）を独占的に含む、わずかな浸潤のみをを有していた。対照的に、ＮＨＳ−ＩＬ１２レジメンで処理したマウスの肉腫は、ＮＫ細胞、マクロファージ並びに多数のＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞を伴う高密度の単核の浸潤を示した。全ての処置群のＮＫ細胞は、ＮＫＧ２ＤのｍＲＮＡとＤＮＡＭ−１（図３Ａ）、肉腫関連表面分子ネクチン２（ＣＤ１１２）及びＰＶＲ（ＣＤ１５５）に対するリガンドを発現した。ＮＫ細胞の分化及び活性化を操縦する表面分子のｍＲＮＡ発現は、厳密にＮＨＳ−ＩＬ１２構築を必要とした。ＦｃＩＬ−７又はＩＬ−２ＭＡＢ６０２は、その後、浸潤しているＮＫ細胞集団上で、ＮＨＳ−ＩＬ１２構築物の効果を調節した。ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６は、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７で処置したマウスの腫瘍中でのみ見出され、一方でＮＫｐ３０発現はＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２処置及びＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７長期間処置したマウスの肉腫に限定された（図３Ａ）。ＦｃＩＬ−７で処置したマウスの肉腫は、強力にＣＤ１６１（図３Ｂ）及びＴH１７−マスター転写因子ＲＯＲＣ（図４Ａ）を発現し、ＩＬ−１７を産生する表現型に特徴づけられる（Ｂｉｌｌｅｒｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０７：３００６−１１）。対照的に、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７で処置したマウスは、強力なＣＤ１６１発現を有しているが（図４Ｂ）、有意にＲＯＲＣ発現は低く（図４Ａ）、高レベルのＩＦＮ−γ及びＴＮＦを分泌するが、溶解活性を欠いているエフェクター及びセントラルメモリーＴ細胞を特徴付けている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：２１１−２１６）。ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２で処置したマウスは、ＣＤ１６１のｍＲＮＡ（図３Ｂ）とＲＯＲＣ  ｍＲＮＡ（図４Ａ）を欠いており、ＩＬ−１７を産生するＮＫ−又はＴ細胞の表現型が、これらのマウスにおいて抑制されたことを強く示唆している（Ｌａｕｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２６：３７１−３８１；Ｇｈｏｒｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６７：９６７−９７１）。
【００５８】
ＫＩＲ分子は、ＭＨＣ−Ｉ欠損環境でさえもＮＫ細胞の機能を損なうため（２７）、ＦｃｌＬ−７−又はＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７で処置したマウスのいずれかの肉腫のＫＩＲの発現を分析した。全部の肉腫の定量ＲＴ−ＰＣＲが、両群において同様のレベルであることを明らかにした。予想されたように、ＮＫ細胞をホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）する正常なマウス筋肉組織及び、ヒト肉腫異種移植の腫瘍浸潤リンパ球のＫＩＲ発現は、マウス筋肉がＫＩＲ２ＤＬ３及びＫＩＲ２ＤＬ４を示したように異なっており、一方で、ヒト肉腫は、ＫＩＲ２ＤＬ１に加えてＫＩＲ３ＤＬ１を示した。様々なＫＩＲの発現にも関わらず、ＮＨＳ−ＩＬ１２でインビトロ刺激した後にＩＦＮ−γを放出する肉腫組織から新鮮に単離されたＮＫ細胞のように、ＮＫ細胞は機能を残したままであった。ＮＫ細胞に加えて、ｍＲＮＡ発現が、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７で処置したマウスの肉腫のほぼ独占するＴＣＲＶα２４を発現するｉＮＫＴ細胞、ＮＫｐ４６+ＮＫ又はγδＴ細胞のように、ＴH１７先天性リンパ球集団であることを特徴づけていることを見出した（図３Ａ、３Ｃ、３Ｄ）。
【００５９】
ＮＨＳ−ＩＬ１２で処置した全てのコホートの腫瘍は、先天性リンパ球集団に加え、広範囲のＣＤ３+Ｔ細胞を示した（図４Ｂ及び４Ｃ）。これらは、ＦｃＩＬ−７で処置されたマウスの肉腫中には存在せず、Ｖβスペクトラタイプ（ｓｐｅｃｔｒａｔｙｐｅ）分析中で乏しいシグナルを示し（図４Ｂ及び４Ｃ）、浸潤ＣＤ８+Ｔ細胞は存在しないことを示した。ＮＨＳ−ＩＬ１２処置された肉腫は、制限されたＴ細胞クローンの優先的な増殖が起こる間に生じるような、様々なＶβ−ファミリー内のオリゴクローナル又はモノクローナルのピークによって実証された、広範なＴＣＲレパートリーを示した（図４Ｃ）。ＣＤＲ３領域のクローニング及びシークエンシングは、ピークには、２つの治療群において強力に増幅されたＴＲＢＶセグメント、例えば、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７コホートの全ての個体のＴＲＢＶ２９−１、又は、ＮＨＳ−ＩＬ１／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２コホートのＴＲＢＶ５−５及びＴＲＢＶ１８を有する異なったＴ細胞クローンの限定数を含んでいることを確認した（図４Ｂ及び４Ｃ）。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７をそれぞれ調節する転写因子Ｔ−ｂｅｔ及びＲＯＲＣの相対的な発現は、各コホートのリンパ球浸潤性腫瘍におけるＴH１バイアスの程度を反映した。Ｔ−ｂｅｔ／ＲＯＲＣ比は、ＦｃＩＬ−７のみのコホートにおいて＜０．０５であって、一方でＦｃ−ＩＬ７又はＩＬ−２ＭＡＢ６０２のいずれかとＮＨＳ−ＩＬ１２を受けたマウスでは、１９倍（０．８）及び４４倍（２．２）高かった（図４Ｄ）。Ｔ−ｂｅｔ／ＲＯＲＣ発現に沿って、Ｆｏｘｐ３は、ＦｃＩＬ−７のみのコホートに比べて、両方のＮＨＳ−ＩＬ１２群で約１０倍低かった（図４Ａ）。従って、低Ｆｏｘｐ３発現は、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ４０Ｌの強い発現と逆相関した（図４Ａ及び図４Ｄ）。
【００６０】
ＮＨＳ−ＩＬ１２で処置した肉腫における老化誘導
【００６１】
ＮＨＳ−ＩＬ１２構築物は、全ての処置マウスで肉腫発生を強力に抑制した（図１）。驚くべきことに、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２群の肉腫のみ、大量のパーフォリンタンパク質及びグランザイムＫのｍＲＮＡを含むでいるが（図４Ａ）、一方でＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７で処置したマウスは、パーフォリンのタンパク質を実質的に欠いており、グランザイムＫのｍＲＮＡのレベルが低発現であった（図４Ａ）。これは、肉腫を制御する免疫応答が、細胞溶解とは異なるメカニズムを誘導したことを強く示唆している。また、肉腫には、死滅させる又はアポトーシスによるガンの制御を説明する、ＣＤ４+又はＣＤ８+細胞の十分な数を含んでいなかった。
【００６２】
従って、増殖マーカーの増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）及びＫｉ６７を定量して、肉腫細胞増殖に対する免疫応答の影響を分析した。急速に増殖しているＦｃｌＬ−７−コントロール腫瘍においては、５０％の肉腫細胞がＰＣＮＡ又はＫｉ６７陽性に染色され、細胞の大部分が増殖していることを示している（図５Ａ及び５Ｂ）。ＮＨＳ−ＩＬ１２処置群では、ＰＣＮＡ−（図５Ａ）及びＫｉ６７−両方が染色された肉腫細胞は、ＦｃＩＬ−７−コントロールよりも有意に低かった（図５Ａ及び５Ｂ）。免疫応答が単に細胞周期を停止したかどうか、又はサイトカイン誘導性の老化で見られるような安定した増殖停止を誘発したかどうかを確かめるために、肉腫は、１つの増殖マーカー、及び、老化関連リン酸化ヘテロクロマチンタンパク質１（ρ−ΗΡ１γ）又は細胞周期調節サイクリン依存性キナーゼインヒビター２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）としても知られるｐ１６INK4aのいずれかを二重染色した。ＦｃＩＬ−７−のみで処置した肉腫は、高いＰＣＮＡ／Ｋｉ６７発現を示し、同時に非常に低発現のｐ１６INK4a／核ｐ−ＨＰ−１γを示し、これら肉腫細胞が急速に増殖していることを確認した（図５Ａ及び５Ｂ）。著しく対照的に、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２又はＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７のいずれかで処置したマウス由来の肉腫細胞の最大７０％が、老化マーカー  ρ−ΗΡ１γ又はｐ１６INK4aを発現し（図５Ａ及び５Ｂ）、ＰＣＮＡ（ＰＣＮＡ-／ρ−ΗΡ１γ+）（図５Ａ、上の列の挿入）及びＫｉ６７（Ｋｉ６７-／ｐ１６INK4a）（図５Ａ、下の列の挿入）は存在しなかった。
【００６３】
データは、ヒト免疫系のＩＬ−１２駆動型刺激は、ガンの成長を抑制するための重要なメカニズムとして、ガン細胞の老化を利用できることを明確に示している。
【００６４】
ＩＦＮ−γ及びＴＮＦは、ＩＬ−１２駆動型ＴH１免疫の二つの主要なエフェクターサイトカインであるので、これら２つのサイトカインが老化を誘導することができるように、ごく初期継代の様々な患者由来ヒトＲＭＳ細胞株は、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦの用量を増加しながらインキュベートした。単独のサイトカインは、増殖阻害がない又は緩やかな増殖阻害を引き起こした。しかし、組み合わせた場合、それらは、３つの肉腫中の２つで持続性があり、老化を定義する増殖阻害を引き起こした（図５Ｃ）。重要なことは、老化耐性肉腫は、細胞周期調節ｐ１６INK4aを発現せず（示されない（ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ））、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ誘導老化は、ｐ１６INK4aの活性化を厳密に必要とすることを確認した。
【００６５】
Ａ２０４横紋筋肉腫における分化誘導
【００６６】
ＩＦＮ−γ−及びＴＮＦ−が支配する免疫応答は、ＲＭＳの持続的細胞周期の停止を引き起こし、骨格筋分化は、筋特異的遺伝子の発現を許容し、細胞融合して多核筋管へとなることを許容する初期の細胞周期からの筋芽細胞の中止（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）に依存するので、この増殖停止が、Ａ２０４肉腫の分化に影響を与える可能性があるかが課題事項である。デスミンは、未分化又は低分化型ＲＭＳに存在しない横紋筋芽細胞の（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｂｌａｓｔｉｃ）分化の信頼できるマーカーである。従って、Ａ２０４肉腫は、筋細胞を特徴付ける横紋（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒｉａｔｉｏｎ）を示すことがなく、それらは移植前にデスミンも発現もしない（示されない）。ヒト化マウスへの移植に続き、ＦｃＩＬ−７で処置した増殖性肉腫には横紋はないが、腫瘍中に拡散して分布したわずかな単一デスミン+細胞を伴い、分化状態は低いままである（図６Ａ及び６Ｂ）。著しく対照的に、ＮＨＳ−ＩＬ１２治療は、腫瘍の増殖の抑制及び老化誘導だけでなく、Ａ２０４肉腫において筋原構造やマーカー発現を徐々に回復した。ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７は、明らかにデスミンを発現した成熟ＲＭＳ細胞がランダムに分布し、線形領域と横紋を有する領域とを誘導した。機能的な筋肉組織へのこの分化は、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２で処置したマウス由来の肉腫でより顕著であった。このような増殖停止した肉腫は、広範囲に腫瘍を貫通する、多孔（ｃｒｉｂｒｉｆｏｒｍ）／チューブ様構造を有する分化ゾーンの索状（ｒｅｓｔｉｆｏｒｍ）／ロープ状の増殖を示した（図６Ａ及び６Ｂ）。従って、インビボでの肉腫の増殖停止は、老化を誘導し、Ａ２０４ＲＭＳ起源の、筋細胞の細胞運命特異的なマーカーの回復と関連していた。
【００６７】
インビトロでは、ＩＦＮ−γ／ＴＮＦの組み合わせの単一の適用は、Ａ２０４肉腫細胞に変更できない増殖停止を起こし、即座にサイクリン依存性キナーゼインヒビターＰ２１CIP1/WAF1のｍＲＮＡを上昇させ（Ｄａｙ＋１では７倍、未処置コントロールのＤａｙ５の１０倍）、それは、骨格筋に本質的に（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃｌｙ）に細胞周期から細胞を撤回させている（図７）。驚くべきことに、５日以内に、ＩＦＮ−γ／ＴＮＦはまた、肉腫培養において、後期分裂後期（ｌａｔｅ  ａｎａｐｈａｓｅ）で見られるような近位の核を有する二核及び多核細胞を大規模に誘導し（＞８０％の細胞が多核）（図７Ｃ及び７Ｄ）、ｐ１６INK4aが介在する不可逆の細胞質分裂阻害を示唆している。また、肉腫細胞は、さらに２つの筋細胞分化調節マーカー（Ｍｙｆ−６及びミオシン重鎖（ＭｙｏｓｉｎＨｅａｖｙＣｈａｉｎ）−ＩＩ）をｄｅ  ｎｏｖｏに発現し（図７Ｅ）、進行した筋細胞分化のステップである、ＳＡ−β−ガラクトシダーゼ+、細長い多核細胞、筋原形成する巨細胞へと変形した（図７Ｃ及び７Ｄ）。インビトロでのＩＦＮ−γ／ＴＮＦの単回投与は、ＲＭＳ細胞株ＲＨ３０及び患者由来ＲＭＳ株ＳＲＨ（継代１４）も不可逆的な増殖停止を起こしたが（図８）、ＺＣＲＨ（ｐ１６欠損、継代９）は停止しなかった。
【００６８】
三胚葉（ｔｈｒｅｅ  ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒｓ）の組織を代表する腫瘍細胞株のパネルにおける分化誘導
【００６９】
ＩＦＮ−γ／ＴＮＦによって誘導される増殖停止及び分化が広範な関連性を有しているかどうかを試験するために、２つのＴH１サイトカインの組合せのＩＦＮ−γ／ＴＮＦを、インビトロにて三胚葉の組織を代表する腫瘍細胞株のパネルで試験した。３／３の神経膠芽腫細胞株（Ｔ９８Ｇ、Ｌｎ２２９、Ａ１７２）、２／２の神経芽細胞腫細胞株（ＬＳ及びＬＡＮ−１）、及びガン細胞株ＭＣＦ−７（乳房）、ＨＣＴ−１１６（結腸直腸）、及びＨｅｐ３ｂ細胞（肝細胞ガン）は増殖を停止し、一斉にＳＡ−β−Ｇａｌを発現し、変性タイプの細胞及び核の異型を示した（図８）。病理組織学的特性は、細胞損傷によって引き起こされる骨格筋における反応性／非腫瘍性の多核筋原巨細胞に似た大型の過剰染色体（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍａｔｉｃ）多型（ｐｌｅｏｍｏｒｐｈ）核及び形態を含んでいた。膠芽腫では、核の異型性は、末梢神経の良性の「古代の神経鞘腫（ａｎｃｉｅｎｔ  ｓｃｈｗａｎｎｏｍａｓ）」に見られるタイプに似ていた（図８）。多核巨細胞の発達は、多くの臓器で報告されており、感染症、傷害、自己免疫及び腫瘍と連動している。
【００７０】
医薬組成物
【００７１】
本発明の標的化ＩＬ−１２融合タンパク質は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、抗体可変領域及び医薬的に許容される担体を含む。本明細書で使用される用語「医薬的に許容される担体」は、医薬投与と適合する、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことが意図される。医薬的に活性がある物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は当技術分野において周知である。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように製剤化（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が含まれる。非経口、皮内、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は二亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝液及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの浸透圧調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器又はガラス若しくはプラスチック製の複数用量バイアル中に封入することができる。
【００７３】
本発明の標的化ＩＬ−１２融合タンパク質及びＩＬ−７／ＩＬ−２分子を含む薬物は、量は剤形に応じて異なるが、０．０１から１００％（ｗ／ｗ）の濃度を有しうる。
【００７４】
投与は、好ましくは２週間に１回又は月に一回であるが、与えられた個体における薬物動態挙動に応じて、より多い又は少ない頻度であってもよい。約７０ｋｇの成人に対して、本出願で特定されるような抗体融合タンパク質の投薬は、用量あたり約５０〜１０００ｍｇの範囲、好ましくは、用量当たり約１００〜５００ｍｇの範囲である。最も好ましい用量は、１ヶ月あたり一度処置される７０ｋｇ成人に対して、約２００〜４００ｍｇである。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１Ａ】試験デザイン、ＲＭＳ曝露と治療後の腫瘍増殖及び生存。（Ａ）４〜６週齢のＮＳＧマウスは、致死以下の（ｓｕｂ−ｌｅｔｈａｌｌｙ）放射線量を照射し、ＣＤ３４+ＣＤ３-移植片でヒト化した。完全移植したマウスは、１×１０6のＡ２０４細胞１２週で播種した。腫瘍体積が５０〜２００ｍｍ3である１８日後に免疫療法を開始した。ＦｃＩＬ−７コホートの腫瘍が体重の２０％に達した時、５週間治療後にマウスを屠殺した。ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７及びＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２コホートの４匹のマウスは生存したままであり、腫瘍播種後少なくとも９５日まで治療を行った。
【図１Ｂ】（Ｂ）ＦｃＩＬ−７、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７及びＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２の生存に対する影響。生存曲線はログランク検定を用いて比較した。生存率は、ＦｃＩＬ−７コホートと比較して、ＮＨＳ−ＩＬ１２コホートが非常に有意に良好であった。ＦｃＩＬ−７コントロール群では、４匹の動物が５２日前に死亡し、３匹は過剰な腫瘍増殖があるために５２日目に屠殺した。ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃｌＬ−７治療コホートでは、２匹のマウスが５２日前、長期治療群では１匹が５６日、１匹が７４日に死亡した。
【図１Ｃ】（Ｃ）ＦｃＩＬ−７、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７及びＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２の腫瘍増殖に対する影響。ヒトＲＭＳ  Ａ２０４を有するマウスは、ＦｃＩＬ−７（２０μｇ）（丸）、ＮＨＳ−ＩＬ１２（２０μｇ）／ＦｃＩＬ−７（２０μｇ）（三角形）、又はＮＨＳ−ＩＬ１２（２０μｇ）及びＭＡＢ６０２（１５μｇ）と複合化されたＩＬ−２（１．５μｇ）で毎週、静脈注射した（四角）。腫瘍サイズはｍｍ3で、７匹のマウス／短期間（５週間）処置した群、の平均±ＳＤとして示した。
【図１Ｄ】（Ｄ）長期間治療中（１４週間、＞９５日間）のＮＨＳ−ＩＬ１２群あたり４匹のマウスの個別の腫瘍サイズ（ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７：四角；  ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２：丸）。
【図２Ａ】123Ｉ標識ＮＨＳ−ＩＬ１２は、ヒトＡ２０４腫瘍異種移植片の病変部に蓄積する。（Ａ）123Ｉ標識ＮＨＳ−ＩＬ１２の治療用量（３０μｇ）の注射後２、２６、４６時間後に実施したインビボＳＰＥＣＴスキャンが、筋組織と比較して（点線の丸）腫瘍中にＮＨＳ−ＩＬ１２の特異的な蓄積を示す（黒丸）。
【図２Ｂ】（Ｂ）123Ｉ−ＮＨＳ−ＩＬ１２の取り込みは、投与２６時間後、腫瘍病変部でその最大値に達し、一方で筋肉においては、特定の信号が全体のスキャン時間にわたって検出されなかった。カウントは、測定時点間の123Ｉの放射性崩壊を調整するために減衰補正した（ｎ＝２）。＊Ｐ＜０．０５。
【図３Ａ】ＦｃＩＬ−７、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７及びＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２の先天性免疫に対する影響。（Ａ）各コホート中の個体の腫瘍ホモジネートを、主要なトリガ受容体ＮＫＧ２Ｃ、−Ｄ及び−Ｅ、ＤＮＡＭ−１並びにナチュラルキラー受容体のＮＫｐ３０、−４４及び−４６のＲＴ−ＰＣＲベースのフラグメント長分析（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて試験した。コホート内での高適合（ｈｉｇｈ  ｃｏｎｇｒｕｉｔｙ）に留意すること。
【図３Ｂ】（Ｂ）腫瘍及び筋肉のホモジネート中のＣＤ１６１の発現。量は、平均蛍光強度（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｔｓｉｔｙ）として与えられる。各ドットは１個の各腫瘍を表す。**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、片側スチューデントｔ検定で評価。
【図３Ｃ】（Ｃ）５２日目のｉＮＫＴ細胞（不変Ｖａ２４及びＶβ１１）、Ｖδ１及び−２鎖、並びにＮＫｐ４６の指標となるＴＣＲ転写物。Ｔ＝腫瘍組織、Ｍ＝筋肉組織、ＬＴ＝１００日間長期処置したマウス、Ｓ＝単一のピーク、Ｇ＝Ｖａ２４鎖発現のガウス分布。
【図３Ｄ】（Ｄ）単一ピークとして又はガウス分布として検出される、Ａ２０４腫瘍におけるＴＣＲＶα２４  ｍＲＮＡ発現。ヒトｉＮＫＴにおいて、ＴＣＲＶα２４がＴＣＲＶβ１１鎖に優先的に関連付けられている。
【図４Ａ】ＦｃＩＬ−７、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７及びＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２の影響下のαβＴ細胞のクローン分析。（Ａ）腫瘍ホモジネートにおける種々の免疫マーカーのリアルタイムＰＣＲベースの検出。
【図４Ｂ】（Ｂ）標的遺伝子の発現は、ヒトＣＤ４５の発現に対して正規化された。２５のＴＲＢＶセグメントの発現はＣＤＲ３サイズのスペクトラタイピング（ｓｐｅｃｔｒａｔｙｐｉｎｇ）により決定した。満たされた正方形（ｆｉｌｌｅｄ  ｓｑｕａｒｅ）は、最大１２のフラグメントの発現を示している。各垂直レーンは一つのマウスを表し、暗い正方形（ｄａｒｋ  ｓｑｕａｒｅ）は、ＣＤＲ３の配列分析のために選択されたＴＲＢＶセグメントを示す。
【図４Ｃ】（Ｃ）選択されたＴＲＢＶセグメントのＣＤＲ３領域のタンパク質配列、太字のアミノ酸コードは、相同配列をマークする。（配列番号６：ＬＤＫＶＧＱＥＴＱＹＦ；  配列番号７：ＶＤＲＴＧＥＰＦＹＧＹＴＦ；  配列番号８：ＳＴＲＴＧＳＹＮＹＰＬＨＦ；  配列番号９：ＬＡＥＧＶＴＥＡＦＦ；  配列番号１０：ＬＡＫＧＶＴＥＡＦＦ；  配列番号１１：ＳＬＮＬＶＬＰＧＧＡＥＡＦＦ；  配列番号１２：ＰＲＦＳＭＮＴＥＡＦＦ；  配列番号１３：ＳＲＧＳＦＥＳＹＮＥＡＶＬＲＡＱ；  配列番号１４：ＳＲＧＳＦＥＳＹＮＥＱＦＦ；  配列番号１５：ＳＲＧＳＦＥＳＹＮＥＱＶＬＲ；  配列番号１６：ＲＴＶＡＮＧＦＳＰＬＨＦ）
【図４Ｄ】（Ｄ）腫瘍ホモジネート中のＴ−ｂｅｔ／ＲＯＲＣ−及びＦｏｘｐ３／ＣＤ４０Ｌ−発現比（ｎ＝４）。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。
【図５Ａ】ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７及びＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２処理による老化マーカーの誘導及び増殖抑制効果。（Ａ）腫瘍切片内の細胞老化及び増殖を、ＰＣＮＡと組み合わせた核ρ−ΗΡ１γ（上のパネル）又はＫｉ６７と組み合わせたｐ１６INK4a（下のパネル）の免疫蛍光二重染色によって決定した（１：１００）。インサートは、ρ−ΗΡ１γ又はｐ１６INK4a染色の核ドットを可視化する写真の高倍率を示す（１：３００）。
【図５Ｂ−５Ｃ】（Ｂ）ＦｃＩＬ−７、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７又はＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２で処理後のρ−ΗΡ１γ陽性細胞（すなわち、５つ以上の核ドットを有する細胞）、ｐ１６INK4a陽性細胞（高倍率で決定されるような（１：３００））又はＫｉ６７陽性細胞の平均パーセンテージ（ｎ＝３）。**Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、片側スチューデントｔ検定で評価。（Ｃ）プライマリーのヒトＲＭＳガン細胞調製物中のサイトカイン誘導増殖停止。ＣＣＡ細胞（ｅＲＭＳ、継代７）、ＳＲＨ（ｅＲＭＳ、継代８）、又はＺＣＲＨ細胞（ａＲＭＳ、継代＞９）は、２×１０4細胞／９．６ｃｍ2の密度で播種した。３日目及び４日目、細胞は、１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ又は培地のみ（コントロール）で処理した。７日目にはサイトカインを除去し、細胞をトリプシン処理し、カウントして、２×１０4細胞／９．６ｃｍ2の密度で再播種した。さらに４日間（ＺＣＲＨ及びＳＲＨ）又は１０日間（ＣＣＡ）インキュベートした後、生細胞をカウントした。ＩＦＮ−γプラスＴＮＦの非存在（Ｃｏ．）又は存在下のレスポンダー細胞ＣＣＡ及びＳＲＨ及び非レスポンダー細胞ＺＣＲＨの増殖曲線。平均細胞数±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。
【図６Ａ】Ａ２０４ＲＭＳにおける筋原性分化のマーカーとしてデスミンのインビボ発現及び組織化。（Ａ）すべてのコホート（ＦｃＩＬ−７、ＮＨＳ−ＩＬ１２／ＦｃＩＬ−７、又はＮＨＳ−ＩＬ１２／ＩＬ−２ＭＡＢ６０２処置）の腫瘍（ｎ＝３／コホート）の組織学的スライドは、デスミンで染色された。
【図６Ｂ】（Ｂ）は盲検病理学者によって解析された。ＬＴ：長期間治療；  ＳＴ：短期間治療。
【図７Ａ】多核性の老化Ａ２０４細胞並びにネイティブ及びサイトカイン処理したＡ２０４細胞におけるｐ２１及び筋原性マーカーの発現。（Ａ）定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦにて（＋＋）又はコントロールとして培地にて（−）処理前及び後の、ｐ２１の相対発現量（ｎ＝３）。
【図７Ｂ】（Ｂ）ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ処理（逆三角形）は、ガン細胞の増殖を停止させるが、肉腫細胞を殺さない（ｎ＝３）。比較では、正常細胞培養（丸）は、無妨害で増殖を示した（ｎ＝３）。
【図７Ｃ】（Ｃ）上部レーン：サイトカイン処理したＡ２０４ガン細胞は老化している（黒矢印：グレー染色）及び多核である（白矢印、ＤＡＰＩ染色）。下部レーン：ネガティブコントロールとしての培地処理Ａ２０４肉腫細胞は、ＳＡ−β−Ｇａｌ及び単核（ＤＡＰＩ染色）に陰性である。
【図７Ｄ】（Ｄ）透過型顕微鏡より描かれる標準的な培養のＡ２０４細胞（左）と比較して、Ａ２０４細胞におけるサイトカイン誘導性の細長い、多核及び合胞体形態（中及び右）。
【図７Ｅ】（Ｅ）Ａ２０４及びＲＨ３０肉腫細胞株における筋原性の転写因子の相対的発現。３日間の、培地（−）と比較した、１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ（＋＋）によるＡ２０４細胞のＭＨＣＩＩとＭＹＦ−６  ｍＲＮＡ発現の誘導（ｎ＝３）。
【図８】中胚葉、内胚葉及び外胚葉起源を代表する細胞株は、培地コントロール（未処理）と比較して、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦと併用した１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γの単回投与で処理した（ｄａｙｌ）後、多核表現型及び増殖停止を示した。神経膠芽腫の写真は、処置後３７日目に撮影し、他全ては６日目に撮影した。細胞が最終的に試験された４３日目の時点では、すべて処理された細胞株の細胞は生存していた。ＲＭＳ：横紋筋肉腫、ＧＢＭ：神経膠芽腫、ＢＣ：乳癌、ＣＲＣ：結腸直腸癌、ＨＣＣ：肝細胞癌、ＮＢ：神経芽細胞腫
【実施例】
【００７６】
（１）ＮＳＧマウスのヒト化。ＨｕＣＤ３４+幹細胞は、親ドナー由来の、過剰のＧ−ＣＳＦで誘導した末梢血幹細胞に由来したものであって、ＣＤ３４+セレクションでＴ細胞を除去されている（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、ドイツ）。細胞を、２０％ＤＭＳＯ／８０％  ５％−ＨＳＡ溶液で１：２に懸濁し、続いて、Ｓｙｌａｂアイスキューブデバイスで制御した凍結速度にて凍結保存した。解凍後、細胞をトリパンブルーで染色し、ノイバウアー細胞計数チャンバで計数した。余剰細胞の科学的使用に関するインフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に従って全てのドナーから得た。ＣＤ３４+集団純度は、さらに、解凍した後のＣＤ３+の第２ラウンドの除去のによって＞９９．９９％に増加した（ＬＳ  ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、ドイツ）。幹細胞のドナーは、ＲＭＳ  Ａ２０４細胞株に対してすべてＨＬＡミスマッチであった。予め温めておいた１００μＬ  ＰＢＳ中の１×１０6ｈｕＣＤ３４+細胞を、致死量以下に放射線照射した（２５０ｃＧｙ）ＮＳＧマウスの尾静脈に注射した。移植は、２０μｇのＦｃＩＬ−７（メルク、ドイツ）の毎週適用によってサポートされた。ＮＨＳ−ＩＬ１２の治療群それぞれにおいて、４匹の動物が、最大１５週間（１００日）、Ｆｃ−ＩＬ７又はＩＬ−２ＭＡＢ６０２とともに、長期間ＮＨＳ−ＩＬ１２サイトカイン治療を受けた。
【００７７】
（２）腫瘍の注入及び測定。胎児の（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ）小児ＲＭＳのＡ２０４細胞は、ＡＴＣＣ（ＨＴＢ８２）から得られ、融解し、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中で１継代サブ培養し、滅菌生理食塩水で３回洗浄し、ＰＣＲマイコプラズマテストキットＡｐｐｌｉＣｈｅｍ（ドイツ）でマイコプラズマを試験し、ＮＳＧマウスに移植した。マウス当たり、１×１０6腫瘍細胞を皮下注射により右脇腹に移植した。腫瘍体積は以下の式を用いて決定した：ＶＴ＝ａ×ｂ×ｄ×π／６（ａ、ｂ及びｄは腫瘍の長さ、幅及び深さを示す）  マウスは、ＦｃＩＬ−７コホートにおける動物の腫瘍が体重の＞２０％達した時点の、腫瘍播種５２日目に屠殺した。ＮＨＳ−ＩＬ１２群あたり４匹のマウスは、さらに長期間治療のために生かし続けた。
【００７８】
（３）抗ヒトヒストン／ヒトIＬ−１２融合タンパク質及びＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体複合体の投与。１週間に１回、２０μｇのＦｃＩＬ−７と共に２０μｇのＮＨＳ−ＩＬ１２融合タンパク質（両方メルク、ドイツ製）を、腫瘍が＞１５０μＬに成長した後の移植ヒト化ＮＧＳマウスの尾静脈に穿刺を介して投与した。上記で述べたように、マウス追加群は、一週間ごとに、１．５μｇのＩＬ−２及び１５μｇの抗ＩＬ−２ｍＡｂ  ＭＡＢ６０２の混合物を受けた。組換えヒトＩＬ−２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、アルデスロイキン、カイロン、ＵＳＡ）及びＭＡＢ６０２（抗−ｈｌＬ−２  ｍＡＢＣＤ１２２、クローン５３５５、Ｒ＆Ｄシステムズ）を注入する前に室温で１５分間共培養した。
【００７９】
（４）インビボＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング。播種したマウスのインビボイメージングは、Ｉｎｖｅｏｎ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ＳＰＥＣＴ／ＣＴ（シーメンスヘルスケア、ノックスビル、ＴＮ、米国）を用いて行った。担体フリーヨウ化ナトリウム（123Ｉ）はＧＥヘルスケアから購入し、ＮＨＳ−ＩＬ１２の放射性ヨウ素化はＰｉｅｒｃｅ（登録商標）ヨウ素化試薬（サーモサイエンティフィック社）を用いて行った。マウスを１８ＭＢｑの123Ｉを用いて標識した３０μｇのＮＨＳ−ＩＬ１２を尾静脈から注射し、トレーサー投与２時間後、２６時間後及び４６時間後にインビボＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージを得た。注入及び測定中に、酸素中の１．５％イソフルランを用いてマウスを麻酔した（０．５Ｌ／分）。対象領域（ＲＯＩ）は、腫瘍全体をカバーするために、いくつかのスライスの上でＣＴ情報に基づいた再構成ＳＰＥＣＴ画像の輪郭を示した。参考のために、同等の大きさの対象領域は、同じ動物の左後肢に影響を受けない筋組織上に置いた。123Ｉ−ＮＨＳ−ＩＬ１２取り込み評価のために、減衰補正されたカウントを使用した。
【００８０】
（５）６色フローサイトメトリー。免疫再構築は、移植１０〜１２週後の複数の個体で評価し、末梢血、末梢血、脾臓、骨髄及び胸腺は、マウスとは非交差反応であり、ヒトエピトープに特異的な以下のマウスｍＡｂを用いて解析した：ＣＤ６２Ｌ（Ｄｒｅｇ５６）−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５（２Ａ３）−ＡＰＣ、ＣＤ３（ＳＫ７）−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ８（ＳＫ１）−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ８（ＳＫ１）−ＡＰＣ−Ｈ７、ＣＤ４（ＳＫ３）−ＦＩＴＣ、ＣＤ４（ＳＫ３）−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ１４（Ｍ５Ｅ２）−ＰＥ、ＣＤ５６（Ｍｙ３１）−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）−ＰｅｒＣｐ、ＮＫｐ３０（Ｐ３０−１５）−ＰＥ、ＮＫｐ４４（Ｐ４４−８）−ＡＰＣ、ＮＫｐ４６（９Ｅ２）−ＰＥ並びにそれらの対応するＩｇＧアイソタイプ（全てＢＤファーミンジェン、ドイツ）。ＣＤ４５（ＭＥＭ−２８）−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＣＤ１９（ＨｌＢ１９）−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ３（ＭＥＭ−５７）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、ＣＤ４（ＭＥＭ−２４１）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００  （エクスバイオ、チェコスロバキア）。ＣＤ４５（Ｈｌ３０）−ＰＥ  及びそれぞれのアイソタイプＩｇＧ（バイオレジェンド、ドイツ）。生着は、移植１２〜１４週後、日常的に眼窩採血し、ＦＡＣＳ染色により確認した。Ａ２０４細胞株は、ＵＬＢＰ−１（Ｚ−９）、ＵＬＢＰ−２（２Ｆ９）、ＵＬＢＰ−３（Ｆ１６）、ＵＬＢＰ−４（６Ｅ６）ＰＥ（全てサンタクルス、米国）、ＭＩＣＡ／Ｂ（６Ｄ４）ＡＰＣ  ＣＤ１１２（Ｒ２．５２５）ＰＥ、ＣＤ１５５（ＳＫＩＩ．４）ＰＥ（全てバイオレジェンド、ドイツ）、ＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｗ６／３２）ＰＥ（ＤＡＫＯサイトメーション（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、ドイツ）、二次抗体ＲＡＭ−ＰＥ（Ｘ５６）（ＢＤファーミンジェン、ドイツ）及びアイソタイプコントロール（ベックマンコールター及びＲ＆Ｄシステムズ、ドイツ）。フローサイトメトリーは、Ｄｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを使用してＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）で行った。
【００８１】
（６）免疫組織染色。凍結組織スライド（５μｍ厚）は、４％緩衝ホルマリン（２分間）でインキュベートし、蒸留水（ａｑｕａ  ｄｅｓｔ．）で洗浄し、圧力チャンバ内にてクエン酸緩衝液ｐＨ６．０中で沸騰させ（４分間）、トリスＮａＣｌ−Ｔｗｅｅｎ中で洗浄した。サンプルスライドを湿潤チャンバに移し、ＺｙｔｏｃｈｅｍプラスＡＰポリマーキット（ザイトメッドシステムズ社（Ｚｙｔｏｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ドイツ）で染色した。一次抗体は：ＣＤ３（ＳＰ７、１：５０；  ＤＣＳ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｅ  ＧｍＢＨ、ドイツ）、モノクローナルウサギ抗ヒトＣＤ４（ＳＰ３５、１：５０、ザイトメッドシステムズ社）、ＣＤ８（Ｃ８／１４４Ｂ、１：１００）、ＣＤ５６（１２３Ｃ３−Ｄ５、１：２０）、ＣＤ６８（ＰＧ−Ｍ１、１：１５０）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＴＡＬ．１Ｂ５、１：２００）、デスミン（Ｄ３３、１：１００、全てＤＡＫＯ、ドイツ）、パーフォリン（５８１０、１：２００、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社／ライカ社、ドイツ）。最終的な染色は、パーマネントＡＰレッドキット（Ｚｙｔｏｍｅｄシステムズ、ドイツ）を用いて実施した。単盲検定は、免疫組織学的スライドの分析を行った。
【００８２】
（７）免疫蛍光。ヒト異種移植したＡ２０４腫瘍の新鮮凍結クライオスタット切片を前述のように染色した（Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ａｄａｍｓ（２００７）  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ６：７８４−７８９）。簡潔には、クライオスタット切片を過ヨウ素酸−リシン−パラホルムアルデヒドで固定し、ロバ血清（１：２０）を用いて室温（ＲＴ）で３０分間ブロックした。次いで、スライドをウサギ抗Ｐ−ＨＰ１γ（１：８０；  アバカム社、英国）、マウス抗ＰＣＮＡ（１：５０；セルシグナリングテクノロジー社、米国）、マウス抗ｐ１６INK4a（１：５０；  サンタクルーズバイオテクノロジー社、ドイツ）、又はウサギ抗Ｋｉ６７（１：１００；  アバカム社、米国）を用いて１時間、室温でインキュベートした。３回の洗浄後、切片をＣｙ３−又はＣｙ５共役ロバ抗ウサギ抗体及びＣｙ３−又はＣｙ５共役ロバ抗マウス抗体（全てディアノバ社、ドイツ）と共にインキュベートした。Ｍｏｗｉｏｌ（登録商標）（ヘキスト、ドイツ）を用いてスライドをマウントする前に、核をＹｏｐｒｏ（１：２０００；  インビトロジェン社、ドイツ）で染色し（５分）、切片をライカＴＣＳ−Ｓｐ／ライカＤＭ  ＲＢ共焦点レーザー走査顕微鏡（ライカマイクロシステムズ、ドイツ）で分析した。画像は、ライカ共焦点ソフトウェアＬＣＳ（バージョン２．６１）で処理した。
【００８３】
（８）ＴＮＦ及びＩＦＮ−γを用いた患者由来のプライマリーＲＭＳ及びガン細胞株の治療。異なるガン細胞株の持続的な増殖停止（横紋筋肉腫ＲＨ３０、ＳＲＨ；  膠芽細胞腫Ｔ９８Ｇ、ＬＮ２２９、Ａ１７２；  乳癌ＭＣＦ−７；  大腸癌ＨＣＴ−１１６；肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ及び神経芽細胞種（ｎｅｕｒｂｌａｓｔｏｍａｓ）ＬＡＮ−１、ＬＳ）をサイトカイン処置後、正確に、以前の手順（Ｂｒａｕｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  ４９４：３６１−３６５）を使用して決定した。ＲＭＳの初期分化事象を研究するための短期培養は、低い数の腫瘍細胞を播種し（４．０００又は８．０００細胞／ｃｍ2）、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ  ＋  １００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを含む及び含まない培地でインキュベートすることによって達成された。
【００８４】
（８）ＫＩＲ発現分析。発現解析は、以前記載されたもの（７７）のように実施された。ＮＫｐ３０、−４４、−４６、ＤＮＡＭ−１、ＣＤ１６１転写物は、５’ＦＡＭ標識リバースプライマーを用い、エンドポイントＰＣＲで特異的なプライマーを用いて決定した。ＰＣＲ産物は、長さ標準に対してジーンスキャン−６００  ＬＩＺ及びＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを用いてＡＢＩシーケンサー中でフラグメント長を分析した；ＭＦＩは、半定量的分析を使用した。
【００８５】
（９）Ｔ−ｂｅｔ、ＲＯＲＣ、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ４０Ｌ、グランザイムＢ、グランザイムＫの発現。腫瘍内の遺伝子発現は、ｃＤＮＡを特異的プライマー（リクエストに応じてすべて利用可能な配列）及びｉＱ  ＳＹＢＲグリーンスーパーミックスバイオラッド（ミュンヘン、ドイツ）を使用して、バイオラッドＣ１０００サーマルサイクラー／ＣＦＸ９６リアルタイムシステム（ミュンヘン、ドイツ）を用いて決定した。発現は、ヒトＣＤ４５の発現に対して正規化した。ＲＯＲＣ発現は、特異的なプライマーセット（サーチＬＣ、ドイツ）及びファストスタートＤＮＡ  ＳＹＢＲグリーンＩ（ロッシュ社、ドイツ）を用いて検出した。
【００８６】
（１０）Ｖα−２４鎖の同定。これに対し、Ｈａｎらによって発表されたプロトコル（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：３０ｌ−３１）を使用した。
【００８７】
（１１）Ｖβスペクトラタイピング分析。ＴＣＲ  Ｖβ鎖発現の多様性及びＴＣＲレパートリーの複雑さは、Ｇｏｒｓｋｉら（Ｇｏｒｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５１０９−５１１）に軽微な変更を加えたもので分析した。５’ＦＡＭ標識Ｃβ−プライマーは、ジーンスキャン−６００  ＬＩＺ及びＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを用いたＡＢＩシーケンサー（いずれもアプライドバイオシステムズ社、ドイツ）を使用してアンプリコン検出に使用された。
【００８８】
（１２）γδ免疫スコープ（ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ）。免疫スコープ（ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ）は、以前公開されたように（Ｄｅｃｈａｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．，１９９９，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １０３：ｌ４３７−１４４９）決定した。
【００８９】
（１３）ＴＣＲ−ＣＤＲ３領域のの同定。Ｖβ  ＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭＴｅａｓｙ（プロメガ社、ドイツ）にクローニングし、標準的な手順を用いてＸＬ１ブルーコンピテント細胞（ストラタジーン社、米国）中で増幅した。挿入−陽性クローンを、再増幅Ｖβ  ＰＣＲに直接運んだ。５μＬのＰＣＲのアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）を２．５％アガロースゲル上で分析し、関連する長さのＰＣＲ産物は、配列解析するためにＳｅｑｌａｂ、ドイツへ送付した。ｃＤＮＡのタンパク質配列への翻訳は、ＥＭＢＯＳＳ  Ｔｒａｎｓｅｑフリーソフトウェアを用いて行った。
【図１Ａ】
0006416926.tif 000007
【図１Ｂ】
0006416926.tif 000008
【図１Ｃ】
0006416926.tif 000009
【図１Ｄ】
0006416926.tif 000010
【図２Ａ】
0006416926.tif 000011
【図２Ｂ】
0006416926.tif 000012
【図３Ａ】
0006416926.tif 000013
【図３Ｂ】
0006416926.tif 000014
【図３Ｃ】
0006416926.tif 000015
【図３Ｄ】
0006416926.tif 000016
【図４Ａ】
0006416926.tif 000017
【図４Ｂ】
0006416926.tif 000018
【図４Ｃ】
0006416926.tif 000019
【図４Ｄ】
0006416926.tif 000020
【図５Ａ】
0006416926.tif 000021
【図５Ｂ−５Ｃ】
0006416926.tif 000022
【図６Ａ】
0006416926.tif 000023
【図６Ｂ】
0006416926.tif 000024
【図７Ａ】
0006416926.tif 000025
【図７Ｂ】
0006416926.tif 000026
【図７Ｃ】
0006416926.tif 000027
【図７Ｄ】
0006416926.tif 000028
【図７Ｅ】
0006416926.tif 000029
【図８】
0006416926.tif 000030
【配列表】
0006416926000001.app