(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)を有効成分として含む、糖代謝又は脂質代謝の異常を原因とする代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記糖代謝又は脂質代謝の異常を原因とする代謝性疾患は、肥満、糖尿、糖尿病の合併症、脂肪肝、脂質異常症、インスリン抵抗性、代謝症候群、及び高血糖症からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)は、肥満や一般の表現型に比べて痩せの表現型で腸内総菌における割合が高いことを特徴とする、糖代謝又は脂質代謝の異常を原因とする請求項１に記載の代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)は、脂肪組織内の脂肪の酸化を活性化させ、腸内のＤＰＰ−４(ｄｉｐｅｐｔｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４)の活性を抑制し、ＧＬＰ−１を増加させるものである、糖代謝又は脂質代謝の異常を原因とする請求項１に記載の代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項５】
バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)を有効成分として含む、脂肪酸化用組成物。
【請求項６】
バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)を有効成分として含む、ＤＰＰ−４(ｄｉｐｅｐｔｉｄａｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４)阻害用組成物。
【請求項７】
バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)を有効成分にする、糖代謝又は脂質代謝の異常を原因とする代謝性疾患の改善または予防用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)を有効成分として含む、代謝性疾患の予防または治療用組成物に関する。
【０００２】
また、本発明は、バクテロイデス・アシジファシエンスを有効成分として含む、脂肪酸化用またはＤＰＰ−４阻害用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
代謝性疾患(Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ)とは、体内の過剰な栄養の蓄積及び運動不足による肥満、糖尿、高血圧及び動脈硬化などのような危険因子が一緒に現われる症候群をいい、最近では、世界保健機関と米国国立保健研究院の心臓、肺、血液研究所が制定した成人の治療プログラムIIIを通して代謝症候群またはインスリン抵抗性(Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ)症候群と公式に命名された。また、２００１年に公表されたアメリカＮＣＥＰ(Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ)のＡＴＰによれば、腰回りが男性４０インチ(１０２ｃｍ)、女性３５インチ(８８ｃｍ)以上の腹部肥満、中性脂肪(ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ)１５０ｍｇ／ｄＬ以上、ＨＤＬコレステロールが男性４０ｍｇ／ｄＬ、女性５０ｍｇ／ｄＬ以下、血圧１３０／８５ｍｍＨｇ以上、空腹血糖(ｆａｓｔｉｎｇ ｇｌｕｃｏｓｅ)が１１０ｍｇ／ｄＬ以上などの５つの危険因子のうち、一人の患者が三つ以上を示す場合、これを代謝性疾患と判定することになり、東洋人の場合においては、腰回りが男性９０、女性８０以上の時、腹部肥満として多少調整されており、このような規定を適用する場合、韓国人は全人口の２５％程度が代謝症候群の症状を示すという最近の研究報告もある
【０００４】
一方、粘膜免疫組織とは、呼吸器、生殖器及び消火器に至る粘膜で覆われている組織をいい、この組織は、外部環境と直接連結されて、外部抗原及び病原体に容易に露出される組織である。人体の粘膜組織には、１００兆個に至る細菌、かび、原生動物等の多様な微生物が群集を成す場合、これらと共存している。全身免疫組織に比べて粘膜免疫組織は、多様な共生微生物と共存するための免疫耐性機序を有し、一方では、病原微生物に対する一次的な防御のために迅速かつ強力な免疫反応を引き起こすことができるシステムを備えている。
【０００５】
腸内微生物の場合、いくつかの機序を介して腸内恒常性維持及び代謝調節に関与して人の健康と疾病に影響を及ぼすことが知られている。腸内微生物は、消化されていない多糖類(Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ)を発酵させて短鎖脂肪酸(Ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ)を作って腸上皮細胞のエネルギー源を供給する。人の腸内微生物叢は、大きく４つの門(Ｐｈｙｌｕｍ)に分けることができるが、グラム陰性菌であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓとＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｉｒａ、グラム陽性菌であるＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓとＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａである。
【０００６】
特に、肥満は心血関係疾患、糖尿病、骨粗鬆症のような疾患に関連されている健康を脅威する危険要素の一つである。最近、肥満が腸内微生物叢の変化及び多様性と深い関連があるという研究結果が多く発表されている。肥満マウス(ｏｂ／ｏｂ ｍｏｕｓｅ)の腸内微生物を正常体重マウスのものと比較してみると、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門が増加し、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ門は減少したことが知られている。これと同様に肥満な人に低炭水化物食あるいは低脂肪食を供給すると、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門が増加して、双子を対象とした研究で肥満な人の腸内微生物を分析してみると、多様性が減少し、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の減少が報告されている。
【０００７】
痩せた人と肥満な人の腸内微生物遺伝子構成について分析した結果、腸内微生物叢の種類及び量で有意な差があることが確認された。すなわち、腸内微生物が豊富でない肥満患者の場合、脂肪過多症、インスリン抵抗症、脂質異常症、そして、炎症反応のような症状を見せ、腸内微生物が豊かな肥満な人に比べて、より容易に体重が増加する結果が報告されている。
【０００８】
腸内微生物と宿主間の相互作用が肥満と代謝症候群の発病に重要な役割をしている。腸内に共生している微生物の役割を究明し、分離／同定してプロバイオティクス(ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ)概念を用いてこれら相互作用に変化を起こすことによって、肥満を予防／治療することができる可能性が高い。 
【０００９】
しかし、特定の腸内微生物が直接的に脂質代謝に関与して体重及び脂肪量に影響を及ぼすことができるということは、まだ明らかにされていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明者らは、痩せの表現型を示す形質転換マウスを確立し、このマウスに特異に増加された腸内微生物を特定し、該当微生物が体内の代謝、特に脂質代謝に効果的に関与することができることを確認して、本発明を完成するに至った。
【００１１】
したがって、本発明の一態様は、前記有用な微生物を含む、代謝性疾患の予防または治療用組成物を提供することである。
【００１２】
もう一つの態様は、前記有用な微生物を代謝性疾患の予防または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、代謝性疾患の予防または治療方法を提供することである。前記方法は、投与する段階以前に、代謝性疾患の予防または治療を必要とする対象を確認(ｉｄｅｎｔｉｆｙ)する段階(例えば、投与対象が代謝性疾患を病んでいるか、病む危険があるかどうかを確認する段階)をさらに含みうる。
【００１３】
もう一つの態様は、前記有用な微生物の代謝性疾患の予防または治療、または代謝性疾患の予防または治療のための薬学組成物の製造に使用するための用途を提供するものである。
【００１４】
また、本発明の一態様は、前記有用な微生物を含む脂肪酸化用またはＤＰＰ−４阻害用組成物またはこれに関連した疾患の予防または治療用組成物に関する。
【００１５】
また、本発明のもう一つの態様は、前記有用な微生物をＤＰＰ−４阻害または脂肪酸化を必要とする対象に投与する段階を含むＤＰＰ−４阻害または脂肪の酸化促進方法、またはこれに関連した疾患の予防または治療方法に関する。前記方法は、投与する段階以前に、ＤＰＰ−４阻害または脂肪の酸化が必要な対象、またはこれに関連した疾患の予防または治療が必要な対象を確認する段階をさらに含みうる。
【００１６】
もう一つの態様は、前記有用な微生物のＤＰＰ−４阻害または脂肪の酸化またはこれに関連した疾患の予防または治療に用いるための用途、またはＤＰＰ−４阻害または脂肪の酸化またはこれに関連した疾患の予防または治療のための薬学組成物の製造に使用するための用途に関する。
【００１７】
本発明のもう一つの態様は、樹状細胞でＡｔｇ７遺伝子が欠損した、痩せの表現型を示す形質転換体に関する。
【００１８】
もう一つの態様は、樹状細胞でＡｔｇ７遺伝子を欠損させる段階を含む、痩せの表現型を示す形質転換体の製造方法に関する。
【００１９】
また、本発明のもう一つの態様は、Ａｔｇ７またはこれをコートする遺伝子の発現阻害剤または活性阻害剤を有効成分として含む代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の一態様は、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)を有効成分として含む、代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。もう一つの態様は、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)を代謝性疾患の予防または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、代謝性疾患の予防または治療方法を提供する。前記方法は、投与する段階以前に、代謝性疾患の予防または治療を必要とする対象を確認(ｉｄｅｎｔｉｆｙ)する段階をさらに含みうる。もう一つの態様は、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)の代謝性疾患の予防または治療、または代謝性疾患の予防または治療のための薬学組成物の製造に使用するための用途を提供することである。
【００２１】
以下、本発明を詳細に 説明する。
【００２２】
本発明者らは、具体例として、樹状細胞においてＡｔｇ７遺伝子を欠損させたとき、マウスにおいて痩せの表現型が発揮されることを確認した後、対照群との腸内微生物を比較して、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)が痩せの表現型を発揮するＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスにおいて高いレベルで存在することを確認した。また、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)がマウスの体重及び体脂肪を減少させ、血中グルコースレベルを減少させ、血中インスリンの生産を増加させることを確認した。
【００２３】
また、本発明によるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)は、脂肪組織内の胆汁酸−ＴＧＲ５−ＰＰＡＲα軸による脂肪の酸化の活性を引き起こし、これは、高エネルギー消費を引き起こした。これと同時に、ＢＡは、内臓のＤＰＰ−４を活性化し、次に、ＧＬＰ−１を増加させ、これによってグルコース恒常性に寄与する。胆汁酸、コーレート(cholate)及びタウリンもやはりＴＧＲ５受容体を介してＧＬＰ−１活性に寄与してインスリン感受性を改善した。
【００２４】
これによって本発明のバクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)は、代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いることができる。
【００２５】
前記バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)は、微生物細胞そのものだけでなく、前記菌体の培養物、例えば、微生物細胞が含まれている培養物または微生物細胞が除外された培養物、前記培養物の乾燥物、破砕物、分画物などを含む概念である。
【００２６】
本明細書において、「代謝性疾患(ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ)」とは、肥満、糖尿、糖尿病の合併症、脂肪肝、高血圧、末梢血管疾患、脂質異常症、インスリン抵抗性、心血管疾患、動脈硬化症、代謝症候群、高血唐症、高脂血症及び炭水化物代謝異常などからなる群より選択された疾患を意味する。
【００２７】
前記代謝性疾患の一例として、肥満がある。本発明において、用語の「肥満(ｏｂｅｓｉｔｙ)」は、脂肪細胞数の増加及び細胞体積の拡張として定義されている疾病であって、糖尿、高中性脂肪血症、高血圧、心血管疾患、血液凝固異常、腎臓疾患、眼疾患及び足部感染など代謝性疾患の主な原因となりうる。
【００２８】
また、代謝性疾患の他の例として、「糖尿病(ｄｉａｂｅｔｅｓ)」とは、インスリンが不足したり、インスリンに対する感受性が低下して炭水貨物代謝に異常が生じる疾患であって、膵腸でのインスリン分泌量が少なくて発生する第１型糖尿病(インスリン依存型糖尿病:Ｉｎｓｕｌｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ:ＩＤＤＳ)とインスリンに対する組織の拒絶反応による第２型糖尿病(インスリン非依存型糖尿病:Ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｌｌｉｔｕｓ:ＮＩＤＤＭ)に分けることができる。全糖尿病の９０％以上が第２型糖尿病である。第２型糖尿病は、遺伝および肥満、その中でも特に腹部肥満(胴回り:尻回りの割合が８５:１００以上の状態)に関連性が高いことが知られている。したがって、本発明の糖尿病とは、好ましくは、第２型糖尿病を意味する。前記代謝性疾患は、糖尿の合併症を含みうる。糖尿病の急性合併症(低血糖症、ケトサン症または非ケトン性高滲透性昏睡状態)は、糖尿病が適切に調節されていない場合に発生することができる。長期間の深刻な合併症は、心血管疾患(二重リスク)、慢性腎不全、失明につながることができる網膜損傷、いくつかの種類の神経の損傷および微小血管の損傷を含み、これらは、勃起不全及び 治癒遅延(ｐｏｏｒ ｈｅａｌｉｎｇ)を引き起こすことができる。傷(特に、足)の治癒遅延は、壊疽(ｇａｎｇｒｅｎｅ)を引き起こすおそれがあり、切断に至ることもある。
【００２９】
本明細書において、脂肪肝は、正常細胞内には存在しない中性脂肪が肝細胞内に非正常的に沈着して見える現象が現れたことを言う。
【００３０】
本明細書において、高血圧は、動脈の血圧が慢性的に高い状態で、１８歳以上の成人で収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上の場合をいい、肥満などにより発生することもある。
【００３１】
末梢血管疾患は、末梢血管疾患(ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＶＤ)という用語は、末梢動脈と静脈の損傷、機能障害などを指す。
【００３２】
本発明の脂質異常症は、低い高密度リポタンパク質コレステロール(ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＨＤＬc)、高い中性脂肪濃度及び少し高いかまたは正常である低密度リポタンパク質コレステロール(ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＬＤＬｃ)濃度の組み合せを意味する。
【００３３】
また、本発明のインスリン抵抗性は、生理的インスリン濃度で糖質、脂質、及びタンパク質などのエネルギー代謝を総体的に調節するための最も重要な生体ホルモンであるインスリンの作用が正常よりも低下した代謝性状態を意味する。
【００３４】
本発明の動脈硬化症とは、コレステロール、リン脂質、カルシウムなどを含む脂肪性物質(ｐｌａｑｕｅ)が血管内膜に蓄積され、動脈は硬くなり弾力性を失って狭くなり、血液の供給が阻害されたり、圧力が高くなり、動脈が破裂、剥離などが起こる状態を言う。
【００３５】
本発明の高血糖症とは、血液中の血糖値(血糖値)が非正常的に上昇した状態であって、インスリンの生産の異常またはインスリン機能異常によるものともいえる。
【００３６】
本願の高脂血症は、血中コレステロールのような脂質成分が増加し、血液の流れが円滑でなくなり動脈壁に脂質成分が付着することにより、慢性的な炎症反応を起こし、動脈の内壁が狭くなり、血管が固まる動脈硬化が誘発され、長期的には、これから生成された血栓が心臓冠状動脈や脳血管などを塞がれ、心筋梗塞、脳卒中や脳梗塞などを引き起こす原因となる。
【００３７】
高インスリン血症は、血液中のインスリン数値が正常よりも高い状態を意味し、器質的高インスリン血症及び機能的高インスリン血症がある。器質的高インスリン血症は、ランゲルハンス島の増殖(腺腫、肥大)により、膵腸からのインスリンが過剰に分泌されるために発生し、自発性低血糖症となる。機能性高インスリン血症は、ランゲルハンス島腺腫などがなく、自律神経、消化器系の機能障害により、胃切除後に脳卒中、肝炎などの原因によって、主に食後のインスリン値が高くなり、食後２〜４時間後に低血糖を起こすことを意味する。
【００３８】
本発明の炭水化物代謝異常は、ピルビン酸からブドウ糖を作り出すブドウ糖生合成の過程に問題があるか、ピルビン酸から二酸化炭素と水を作り出すＴＣＡ回路及び酸化的リン酸化の過程に問題が生じて発病する代謝異常疾患であって、第Ｉ型グリコーゲン蓄積疾患、欠損症フルトース−１，６−ビスホスファターゼ欠損症、ピルビン酸脱水素酵素複合体欠損症、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、糖原病、ガラクトース血症などをその例として挙げられ、これに制限されるものではない。
【００３９】
また、代謝性疾患の一例としては、代謝症候群がある。代謝症候群は、当業者において以下を含む一群の代謝性危険因子(ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ)によって特徴化される:腹部肥満(腹部内及び周囲に過度な脂肪組織);アテローム性動脈硬化性脂質異常症(血液の脂肪疾患−高トリグリセライド、低ＨＤＬコレステロール及び高ＬＤＬコレステロール−動脈血管壁にプラーク形成を増加させる);増加された血圧;インスリン抵抗性またはグルコース過敏症;全血栓性状態(ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｓｔａｔｅ;例えば、血液中の高いフィブリノーゲンまたはＰＡＩ−１(ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１)の存在);及び親−炎症性状態(例えば、血液のＣ−反応性タンパク質の増加)。代謝症候群を病む人々は、冠状動脈心臓疾患及び動脈血管壁でプラーク形成の増加(ｐｌａｑｕｅ ｂｕｉｌｄｕｐｓ)に関連した他の疾患(例えば、脳卒中及び末梢血管疾患)、そして第II型糖尿病の危険度が増加する。
【００４０】
代謝性疾患のもう一つの例として、心血関係疾患や心臓性疾患がある。
【００４１】
心臓性疾患(ｃａｒｄｉａｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ)は、心臓疾患(ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ)及び心血管疾患(ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ)という用語と相互混用して用いられることができる一般的な用語である。本明細書において、心臓性疾患は、心臓の正常な機能を抑制するすべてのタイプの疾患を意味する。より特異的には、本明細書において、心臓性疾患に含まれる疾患は、冠状動脈性心臓疾患、心筋症、心血管疾患、虚血性心臓疾患、心臓麻痺、高血圧性心臓疾患、炎症性心臓疾患及び心臓弁膜症(ｖａｌｖｕｌａｒｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ)を含むが、ここに限定されるものではない。
【００４２】
また、本発明の一態様は、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)を有効成分として含む、脂肪酸化用組成物、またはこれに関連した疾患の予防または治療用組成物を提供する。もう一つの態様は、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)を脂肪の酸化促進またはこれに関連した疾患の予防または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、脂肪の酸化促進またはこれに関連した疾患の予防または治療方法を提供する。前記方法は、投与する段階以前に、脂肪の酸化促進またはこれに関連した疾患の予防または治療を必要とする対象を確認(ｉｄｅｎｔｉｆｙ)する段階をさらに含みうる。もう一つの態様は、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)の脂肪の酸化促進またはこれに関連した疾患の予防または治療、または脂肪の酸化促進またはこれに関連した疾患の予防または治療のための薬学組成物の製造に使用するための用途を提供する。
【００４３】
前記脂肪酸化用組成物は、酸化ストレスから誘導される生理学的または病理学的状態の予防または治療用薬学組成物であってもよい。また、前記組成物は、物理的または精神的ストレスの予防または治療用薬学的組成物であってもよい。前記組成物は、老化、癌、複合性動脈硬化、関節炎、パーキンソン病、脳卒中、脳震蕩、アルツハイマー病、血管障害、高脂血症、心筋梗塞、及び脳梗塞からなる群より選択された１種以上の疾病の予防または治療用薬学的組成物であってもよい。
【００４４】
前記脂肪酸化用組成物は、また前記代謝性疾患だけでなく、筋肉疾患、及び筋肉減少症、悪液質、筋肉損傷、筋ジストロフィー及び筋肉疲労などの関連疾患を治療、筋肉機能、及び持久力の改善、身体遂行力の向上、持久力の能力の増大、筋肉量の増加、筋肉の損失防止、筋肉回復の増大、筋肉疲労の減少、エネルギーバランスの改善、筋肉遂行力及び／又は筋肉強度及び／又は筋肉量及び／又は筋肉機能の維持、体型の改善、または筋肉:脂肪比の改善などに用いられることができる。
【００４５】
また、本発明の一態様は、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)を有効成分として含む、ＤＰＰ−４阻害用組成物または血糖低下用組成物を提供する。もう一つの態様は、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)をＤＰＰ−４阻害または血糖低下を必要とする対象に投与する段階を含む、ＤＰＰ−４阻害または血糖低下方法を提供する。前記方法は、投与する段階以前に、ＤＰＰ−４阻害または血糖低下を必要とする対象を確認(ｉｄｅｎｔｉｆｙ)する段階をさらに含みうる。もう一つの態様は、バクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)のＤＰＰ−４阻害または血糖低下、またはＤＰＰ−４阻害、または血糖低下のための薬学組成物の製造に使用するための用途を提供する。
【００４６】
Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４(ＤＰＰ−４)阻害剤は、血糖調節のための新機序の薬剤である。食べ物の摂取時、消化管では、ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１(ＧＬＰ−１)とｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ(ＧＩＰ)が分泌される。これはインクレチンと呼ばれ、腸のＫ、Ｌ細胞から分泌した後、血中でＤＰＰ−４という酵素によって非常に短い時間内に分解される。ＤＰＰ−４阻害剤は、インクレチン分解を担当するＤＰＰ−４酵素を阻害することにより、インクレチン血中濃度を高めることになる。この他にもＤＰＰ−４阻害剤の使用は、インスリン合成と分泌促進、ｇｌｕｃａｇｏｎの抑制および肝におけるブドウ糖合成抑制を介して血糖を調節することが知られている。
【００４７】
前記組成物が、代謝性疾患または脂肪の酸化関連疾患の予防用、または治療用薬学的組成物で製造される場合、前記組成物は、薬学的に許容される担体を含みうる。前記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。前記薬学的組成物は、前記成分に加えて潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。
【００４８】
前記代謝性疾患または脂肪の酸化関連疾患の予防用または治療用薬学的組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与することができる。経口投与の時、タンパク質またはペプチドは、消化されるために経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃からの分解から保護されるように剤形化されるべきである。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。
【００４９】
前記薬学組成物の投与対象は、動物、例えば、ヒトなどの哺乳類、またはこれらから分離した細胞、組織、またはこれらの培養物であってもよい。
【００５０】
前記代謝性疾患または脂肪の酸化関連疾患の予防用または治療用薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの要因によって多様に処方されることができる。前記組成物の好ましい投与量は、成人の基準で１００−１００,０００,０００(１０２−１０８)ｃｅｌｌ／ｋｇの範囲内である。用語の「薬学的有効量」は、代謝性疾患または脂肪の酸化関連疾患を予防または治療するのに十分な量を意味する。
【００５１】
前記組成物は，当該当業者が容易に実施することができる方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより単位容量の形態で製造され、または多容量の容器内に入れて製造されうる。このとき、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤、または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。また、前記組成物は、個々の治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療薬とは、順次的または同時に投与することができる。また、単回または必要に応じて追加投与することができる。
【００５２】
本発明によるバクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ)は、食品組成物として活用されることができる。本発明の食品用組成物は、代謝性疾患の症状を予防及び改善または脂肪の酸化に効果がある食品、例えば、食品の主原料、副原料、食品添加剤、機能性食品または飲料として容易に活用することができる。
【００５３】
本願で前記「食品」とは、栄養素を一つまたはそれ以上含有している天然物または加工品を意味し、好ましくは、ある程度の加工工程を経て直接食べることができる状態になったものを意味し、通常の意味として、食品、食品添加剤、機能性食品及び飲料をすべて含むものをいう。
【００５４】
本発明による代謝性疾患の症状の予防及び改善用または脂肪酸化用組成物を添加することができる食品としては、例えば、各種の食品類、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、機能性食品などがある。さらに、本願発明において、食品には、特殊栄養食品(例えば、調剤乳類、乳幼児食など)、食肉加工品、魚肉製品、豆腐類、コンニャク類、麺類(例えば、ラーメン類、麺類など)、パン類、健康補助食品、調味食品(例えば、醤油、味噌、唐辛子味噌、合わせ味噌など)、ソース類、菓子類(例えば、スナック類)、キャンデー類、チョコレート類、ガム類、アイスクリーム類、乳加工品(例えば、発酵乳、チーズなど)、その他の加工食品、キムチ、漬物食品(各種のキムチ類、ジャンアチなど)、飲料(例えば、果実飲料、野菜類飲料、豆乳類、発酵飲料類など)、天然調味料(例えば、ラーメンスープなど)を含むが、これらに限定されるものではない。前記食品、飲料または食品添加剤は、通常の製造方法で製造されることができる。
【００５５】
また、前記「機能性食品」とは、食品に物理的、生化学的、生物工学的手法などを用いて該当食品の機能を特定の目的に作用、発現するように付加価値を付与した食品群や食品組成が持つ生体防御リズムの調節、疾病防止と回復などに関する体内調節機能を生体に対して十分に発現するように設計して加工した食品を意味し、具体的には、健康機能性食品であってもよい。前記機能性食品には、食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含むことができ、機能性食品の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含みうる。
【００５６】
また、本発明において、前記「飲料」とは、喉の渇きを解消したり、味を楽しむために飲むことの総称を意味し、機能性飲料を含む。前記飲料は、指示された割合で必須成分として、前記代謝性疾患の症状の予防及び改善用組成物を含むこと以外に他の成分には特別な制限はなく、通常の飲料のようにいくつかの香味剤または天然炭水化物などをさらに成分として含みうる。
【００５７】
また、前記記述したこと以外に、本発明の代謝性疾患症状の予防及び改善用または脂肪酸化用組成物を含む食品は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物(電解質)、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤(チーズ、チョコレートなど)、ペクト酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができ、前記成分は、独立してまたは組み合わせて用いることができる。
【００５８】
本発明の代謝性疾患の症状の予防及び改善用または脂肪酸化用組成物を含む食品において、前記本発明による組成物の量は、全体の食品の重量の０.００１重量％ないし９０重量％で含むことができ、好ましくは、０.１重量％ないし４０重量％で含むことができ、飲料の場合には、１００ｍｌを基準に０.００１ｇないし２ｇ、好ましくは、０.０１ｇないし０.１ｇの割合で含みうるが、健康及び衛生を目的としたり、健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記範囲以下であってもよく、有効成分は、安全性の面で何らの問題がないので、前記範囲以上の量で使用されることができ、 前記範囲に限定されるものではない。
【００５９】
また、本発明のもう一つの態様は、樹状細胞でＡｔｇ７遺伝子が欠損した、痩せの表現型を示す形質転換体を提供する。また、本発明のもう一つの態様は、樹状細胞でＡｔｇ７遺伝子を欠損させる段階を含む、痩せの表現型を示す形質転換体の製造方法を提供する。
【００６０】
また、本発明のもう一つの態様は、Ａｔｇ７またはこれをコートする遺伝子の発現阻害剤または活性阻害剤を有効成分として含む代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００６１】
前記Ａｔｇ７をコートする遺伝子の発現阻害剤は、前記遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ)、ｓｈＲＮＡ(ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ)、ｍｉＲＮＡ(ｍｉｃｒｏＲＮＡ)、リボザイム(ｒｉｂｏｚｙｍｅ)、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＮＡ(ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ)、アンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００６２】
前記Ａｔｇ７の活性阻害剤は、Ａｔｇ７に特異的な抗体、アプタマー、天然抽出物及び化学物質であってもよい。前記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクロナル抗体であってもよい。
【００６３】
本発明において、用語の「形質転換」は、外部から与えられたＤＮＡによって生物の遺伝的な性質が変わることで、すなわち，生物のある系統の細胞から抽出された核酸の一種であるＤＮＡを他の系統の生きている細胞に与えたとき、ＤＮＡがその細胞に入って遺伝形質が変化する現象を意味する。
【００６４】
本発明において、用語の「形質転換体」は、形質転換によって生成された個体を意味し、その個体に制限はないが、好ましくは、形質転換動物を意味する。
【００６５】
また、本発明のもう一つの態様は、Ａｔｇ７またはこれをコートする遺伝子の発現阻害剤または活性阻害剤を有効成分として含む代謝性疾患の予防または改善用食品組成物を提供することができる。
【００６６】
また、本発明の一態様は、前記形質転換体と肥満または一般的な表現型の個体の腸内微生物を比較する段階を含む、有用な腸内微生物のスクリーニング方法を提供する。前記スクリーニング方法は、前記比較する段階以後に、肥満または一般の表現型の個体の腸内微生物と比較して前記形質転換体に個体数が多い微生物を有用な腸内微生物として選択(決定)する段階をさらに含みうる。
【００６７】
前記有用な腸内微生物は、代謝性疾患または脂肪酸化に有用な微生物であってもよく、好ましくは、脂質代謝性疾患に有用な微生物であってもよい。
【発明の効果】
【００６８】
本発明によるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)は、脂肪組織内の胆汁酸−ＴＧＲ５−ＰＰＡＲα軸による脂肪酸化の活性を引き起こしており、これは、高エネルギー消費を引き起こす。これと同時に、ＢＡは、内臓のＤＰＰ−４を活性化し、次にＧＬＰ−１を増加し、これにより、グルコース恒常性に寄与する。胆汁酸、コーレート及びタウリンもＴＧＲ５受容体を介してＧＬＰ−１活性に寄与してインスリン感受性を改善する。これにより、代謝性疾患の非常に効果的な治療及び予防剤として用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスで痩せの表現型を確認した図である。  (Ａ) Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスにおける体重変化を２３週間モニタリングした(左側パネル)。ＮＣＤ食餌した２４週齢の雄Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの体重及び脂肪量(右側パネル)。(ｎ＝８)。  (Ｂ) ２４週齢のＡｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの写真。  (Ｃ) ＮＣＤ食餌した２４週齢の雄Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの腹部脂肪組織のＭＲＩ。  (Ｄ) Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの脂肪組織の組織学的変化(左側パネル)及び脂肪細胞のサイズ(右側パネル)。Ｓｃａｌｅ ｂａｒｓ＝５０ μｍ 。  (Ｅ) 非絶食条件下でのＮＣＤ−食餌Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの血清におけるグルコース及びインスリンのレベル。  (Ｆ) 雄Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスのＧＴＴ(Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ)及びＩＴＴ(ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ)の結果。  すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍ.で示した。＊はＰ<０.０５、＊＊はＰ<０.０１、＊＊＊はＰ<０.００１を示す。
【図２】痩せの表現型が内臓共生バクテリアからの起源であることを示す図である。  (Ａ) コハウジング(ＣＨ;中間)及び分離(左右端)された２４週齢雄Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの写真。  (Ｂ) コハウジング及び分離されたケージでの２４週齢雄Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスにおける体重及び脂肪量(ｎ＝３又は４)。  (Ｃ) ＣＨ後、各マウスの体重を追加的に１０週間モニタリングした結果(ｎ＝３〜９)。  (Ｄ) Ａｔｇ７f／fまたはＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便の移動１８週間後に未処理されたＢ６マウスの体重及び脂肪量(ｎ＝５)。  (Ｅ) 非絶食条件下で、Ａｔｇ７f／fまたはＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便抽出物を移動させた後、血清でのインスリン及びグルコースレベル(ｎ＝５)。すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍ値である。＊はＰ<０.０５、＊＊はＰ<０.０１、＊＊＊はＰ<０.００１、ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図３】内臓共生バクテリアでＢ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)が、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便から拡張されることを示す図である。  門(ｐｈｙｌｕｍ)レベル(Ａ)及び綱から属までの(Ｂ)パイロシーケンシングデータ(ｎ＝６)。  (Ｃ) パイロシーケンシングによって検出された糞便内のＢＡの分布を示す種(ｓｐｅｃｉｅｓ)の代表的な円グラフ。赤色の矢印＝ＢＡ。  (Ｄ) ＢＡに特異的なＦＩＳＨ(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ)プローブによって決定されたＡｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスのＩＥＣｓ(ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ)及び結腸のルーメンでの増加したＢＡの数(ｎ＝３)。Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ 。すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍ値である。＊はＰ<０.０５、ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図４】Ｂ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)が食餌誘導されたＢ６マウスの肥満の体重及び脂肪量を調節することを示す図である。  (Ａ) 高脂肪食(ＨＦＤ;左側パネル)及びＰＢＳ−及びＢＡ−食餌マウスの写真である。各群の体重を１０週間モニタリングした(右側パネル)。ＢＡは、毎日経口投与した(５×１０９ＣＦＵ／１００μl)(ｎ＝５)。  (Ｂ) ＰＢＳまたはＢＡ(ｎ＝５)とともに経口食餌摂取。  (Ｃ) ＰＢＳ−及びＢＡ−食餌マウスのＭＲＩ。  (Ｄ) ＨＦＤ中のＰＢＳ−及びＢＡ−食餌マウスの脂肪組織(左側パネル)及び脂肪細胞サイズ(右側パネル)の組織的変化。  すべてのデータは、≧２独立した実験の平均±ｓ.ｅ.ｍ.で示す。  (Ｅ) グルコースまたはインスリンの腹腔内の注射後の一定の時点で測定されたＰＢＳ−及びＢＡ−食餌マウスの血清を用いたＧＴＴ(Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ;左側パネル、ｎ＝８または９)及びＩＴＴ(ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ;右側パネル、ｎ＝７−１２)の結果。  (Ｆ) ＰＢＳ−またはＢＡ−食餌マウスのエネルギー消費、総活性、及びＲＥＲ(ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒａｔｉｏ)(ｎ＝５)。すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍ.で示す。＊はＰ<０.０５、＊＊はＰ<０.０１、＊＊＊はＰ<０.００１、ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図５】ＢＡがＰＰＡＲα活性を介して脂肪組織内の脂肪の酸化を誘発することを示す図である。  各実験の最後の時点で脂肪酸合成(ＦａｓＮ、ＨＳＬ、ＰＥＰＣＫ、ＳＣＤ１、及びＰＰＡＲγ)、β−酸化(ＰＰＡＲα)、熱発生((ＰＲＤＭ１６、ＰＧＣ１ａ、Ｃｉｄｅａ、及びＧＬＵＴ４)に関連した遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルをＡｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウス(Ａ;ｎ＝５)、糞便微生物移植されたマウス(Ｂ;ｎ＝５)、及びＢＡ−食餌マウス(Ｃ;ｎ＝５)の精巣上体脂肪組織を用いてリアルタイムＰＣＲを介して決定した。  毎日ＢＡ投与１日、７日及び１４日後に脂肪組織でのＰＰＡＲα(Ｄ)及びＴＧＲ５(Ｅ)の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲを介して分析した。  すべてのデータは、≧２独立した実験の平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。＊はＰ<０.０５、＊＊はＰ<０.０１、＊＊＊はＰ<０.００１、ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図６】Ｂ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)が腸内のＤＰＰ−４(ｄｉｐｅｐｔｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｌ−４)分泌を調節してＧＬＰ−１の生成を誘発するということを示す図である。  ＰＢＳ−及びＢＡ−食餌マウスの血清におけるグルコース及びインスリンレベル(Ａ)及び活性化ＧＬＰ−１(Ｂ)(ｎｏｒｍａｌ ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ、ＮＣＤ;ｈｉｇｈ−ｆａｔ ｄｉｅｔ、ＨＦＤ;ｎ＝５)。  (Ｃ) 未処理のＢ６マウスにＢＡまたはＢＡの培養上層液または培地単独を投与した１時間後、発光分析を介して小腸のＤＰＰ−４のレベルを確認した。  (Ｄ) ＣＥ−ＭＳ(Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ)を用いたＰＢＳ−及びＢＡ−食餌マウス(ｎ＝５)の糞便でコーレート及びタウリンの定量。  すべてのデータは、≧２独立した実験の平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。＊はＰ<０.０５、＊＊はＰ<０.０１、＊＊＊はＰ<０.００１、ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図７】Ｂ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)がインスリン感受性及び肥満を予防または治療することができるメカニズムを示す図である。  痩せの表現型であるＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスで拡張された特異的腸内共生バクテリア(すなわち、ＢＡ)を確認した。ＢＡの投与は、脂肪組織内の胆汁酸−ＴＧＲ５−ＰＰＡＲα軸による脂肪の酸化の活性を引き起こしており、これは、高エネルギー消費を引き起こす。同時に、ＢＡは、内臓のＤＰＰ−４を活性化し、次にＧＬＰ−１を増加し、これによってグルコース恒常性に寄与する。胆汁酸、コーレート及びタウリンもＴＧＲ５受容体を介してＧＬＰ−１活性に寄与してインスリン感受性を改善する。  ＰＰＡＲαはｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α、ＳＣＦＡｓはｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓを示す。
【図８】Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスが性別を問わず痩せの表現型を示すことを確認した図である。  ＮＣＤ食餌７ないし２３週齢の雄(左側)及び雌(右側)Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの体重。
【図９】２４週齢のＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの痩せの表現型が炎症に関連していないことを示す図である。  (Ａ) ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ ｍｏｕｓｅ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｋｉｔ(ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ)を用いて測定したＡｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウス(ｎ＝７)の血清における炎症前サイトカインのレベル。  (Ｂ) リアルタイムＰＣＲによるＦ４／８０(左側)及びＴＮＦα(右側)ｍＲＮＡ発現レベル。  (Ｃ) 小腸及び大腸のヘマトキシリン−エオシン染色(ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ)結果。Ｓｃａｌｅ Ｂａｒ＝１００μｍ。  すべてのデータは、≧２の独立した実験での平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。＊はＰ<０.０５、ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図１０】Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便代謝物のＯＰＬＳ−ＤＡ(Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ)を示す図である。  (Ａ) Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウス(ｎ＝７)の糞便での１Ｈ−ＮＭＲ(ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ)のＯＰＬＳ−ＤＡからの交差−確認値プロット(Ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｓｃｏｒｅ ｐｌｏｔｓ)。  (Ｂ) Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウス(ｎ＝７)の糞便での１Ｈ−ＮＭＲデータのＯＰＬＳ−ＤＡからの予想構成要素のためのＳ−プロット。  (Ｃ) ガスクロマトグラフィ−質量分析法を用いたＡｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウス(ｎ＝１３５)の糞便での短鎖脂肪酸(例えば、アセテート、ブチレート及びプロピオネート(propionate))及び乳酸(lactate)の定量。すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。＊はＰ<０.０５、＊＊はＰ<０.０１を示す。
【図１１】コ−ハウジング(ｃｏ−ｈｏｕｓｉｎｇ、ＣＨ)ケージ及び糞便微生物の桐油でのマウスの補償的体重の変化を示す図である。  ＣＨケージ内のＡｔｇ７f／f(ｎ＝５)及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃ(ｎ＝４)マウスの体重、分離して飼育されたＡｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウス(Ｓ)の体重をそれぞれ灰色及び青色の円に基づいて線グラフで示した。
【図１２】図３Ｃに示したＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便での種レベルのパイロシーケンシングデータは、色の凡例を示す。
【図１３】ＤＮＡメタゲノム内のバクテロイデスコンティックの生物学的配置を示す図である。  Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便でのコンティック数の相対的な存在度を比較したものである。すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍ.で示す。＊はＰ<０.０５、＊＊＊はＰ<０.００１、ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図１４】経口投与されたＢ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)が一時的に結腸に残っていることを示す図である。  結腸及び糞便を零時、及びＢＡ(５×１０９ＣＦＵ／１００μl)経口投与１日ないし５日後に得て、ＢＡ−特異的ＦＩＳＨ(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ)プローブを介して染色した。  (Ａ) ＢＡの共焦点画像(黄色の矢印)。  (Ｂ) 特定時点で糞便でのＢＡの定量。スライドあたりに≧２０部位で個数を数えた。すべてのデータは、３つの独立した実験の平均±ｓ.ｅ.ｍ.で示す。＊＊＊はＰ<０.００１、Ｎ.Ｄ. はｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄを示す。
【図１５】ＢＡまたはＰＢＳが提供されたＮＣＤ食餌Ｂ６マウスにおけるＢ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)の体重及び脂肪量に対する効果的な機能を示す図である。  (Ａ)１０週間後の写真及び体重(それぞれ左、右のパネル)。ＢＡは、毎日経口投与された(５×１０９ＣＦＵ／１００μl)。  (Ｂ) ＰＢＳまたはＢＡと経口食餌摂取。  (Ｃ) ＭＲＩ分析。  (Ｄ) 脂肪組織の組織学的変化(左側パネル)及び脂肪細胞のサイズの変化(右側パネル)。  (Ｅ) グルコース及びインスリンの腹腔内注射後に特定時点でのＧＴＴ(Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ)(左側パネル、ｎ＝８−９)及びＩＴＴ(ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ)(右側パネル、ｎ＝７−１２)の結果。  (Ｆ) ＰＢＳ−またはＢＡ−食餌マウス(ｎ＝５)におけるエネルギー消費、総活性及びＲＥＲ(ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒａｔｉｏ)。  すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍ.で示す。＊はＰ<０.０５、＊＊はＰ<０.０１、＊＊＊はＰ<０.００１、ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図１６】ＮＣＤまたはＨＦＤ及びＢ.ｓａｒｔｏｒｉｉ(ＢＳ)の食餌されたマウスが、類似した体重及び食餌摂取を有することを確認した図である。  (Ａ) ＢＳ(ｎ＝５)(５×１０９ＣＦＵ／１００μl)の経口投与の１０週間に伴う体重。  (Ｂ)食餌摂取。  データは、２回の独立的実験の平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図１７】Ｂ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)の投与が肝及び末梢インスリン感受性を改善することを示す図である。  ６週間、ＢＡ−、加熱不活性化した(heat-inactivated)ＢＡ−食餌マウス及びＮＣＤ食餌された対照群マウス(ｎ＝３)の高インスリン血症正常血糖グルコースクランプ(ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉｃ−ｅｕｇｌｙｃｅｍｉｃ ｃｌａｍｐ)を行った結果である。  クランプ実験の中でインスリンの水液量を一次実験に基づいて３ｍＵと決めた。全身グルコース吸収(末梢インスリン感受性、Ａ)及びインスリン−媒介の肝グルコース生成率の抑制(肝インスリン感受性、Ｂ)が加熱不活性化したＢＡ食餌群に比べてＢＡ−食餌マウスで有意に増加した。すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍ.で示す。＊はＰ<０.０５、ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図１８】１０週間、経口Ｂ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)投与後、糞便におけるＳＣＦＡｓ(ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ)のレベル及び乳酸のレベルを示す図である。ＮＣＤ(Ａ;ｎ＝５)及びＨＦＤ(Ｂ;ｎ＝６)食餌マウスで糞便内のアセテート、ブチレート、プロピオネート、及び乳酸のレベルをガスクロマトグラフィー− 質量分析計を通じて測定した。  すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。＊＊はＰ<０.０１、ｎｓはｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図１９】Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスで肝および小腸での脂質代謝の類似レベルを示す図である。  脂肪酸合成(ＦａｓＮ、ＨＳＬ、ＰＥＰＣＫ、ＳＣＤ１、及びＰＰＡＲγ)、β−酸化(ＰＰＡＲα)、熱発生((ＰＲＤＭ１６、ＰＧＣ１ａ、Ｃｉｄｅａ、及びＧＬＵＴ４)に関連した遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルをＡｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウス(Ａ;ｎ＝５)の肝(Ａ)及び小腸(Ｂ)を用いてリアルタイムＰＣＲを介して決定した。  すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。
【図２０】Ｂ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)がβ−細胞過刺激を誘発しないことを示す図である。  ＢＡ(５×１０９ＣＦＵ／１００μl)を１０週間投与したマウス(ｎ＝５)から膵腸組織を得た。  (Ａ) 膵腸島(ｉｓｌｅｔ)の共焦点画像(α−細胞は赤色、β−細胞は緑色)。Ｓｃａｌｅ Ｂａｒ＝５０μｍ。セクションを連続してマウス抗−グルカゴンＩｇＧ Ａｂ(Ｋ７９ｂＢ１０;Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ)及びウサギポリクローナル抗−インスリンＡｂ(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ)と反応させた後、PE−接合された抗−マウスＩｇＧ(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)及びＦＩＴＣ−接合された抗−ウサギＩｇＧ(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)のそれぞれと反応させた。  (Ｂ) β−細胞部位のサイズをＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍを用いて定量した。膵腸島をスライドあたり１０個の部位で任意に選択した。すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍである。＊＊＊はＰ<０.００１、ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔを示す。
【図２１】Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃ、糞便微生物移植(ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＦＭＴ)、及びＢ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)−食餌マウスの血漿におけるトリグリセリド及びコレステロールレベルを示す図である。  血漿トリグリセリド及び総コレステロールの濃度は、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウス(Ａ;ｎ＝３)、ＦＭＴマウス(Ｂ;ｎ＝５)、及びＢＡ−食餌マウス(Ｃ;ｎ＝５)内で酵素的アッセイキットを用いて分析した。すべてのデータは、平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。ｎｓはｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ、ＮＣＤはｎｏｒｍａｌ ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ、ＨＦＤはｈｉｇｈ−ｆａｔ ｄｉｅｔを示す。
【図２２】Ｂ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＢＡ)がＣＤ１１ｃ＋細胞の自己消化を調節できることを示す図である。  ＢＡとの共培養６及び２４時間後、骨髄−由来ＣＤ１１ｃ＋細胞内のＢＡの数をＥＧアガープレート上で決めた(ＭＯＩ＝１０)。Ａｔｇ７f／fまたはＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスから骨髄を得た。すべてのデータは、独立した３回の実験の平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。＊はＰ<０.０５、Ｎ.Ｄ. はｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７１】
実施例１:動物実験
すべての動物実験は、牙山動物実験倫理委員会の承認を得た(許可番号:ＰＮ２０１４−１３−０６９)。すべての実験は、ケタミン(１００ｍｇ／ｋｇ)及びキシラジン(２０ｍｇ／ｋｇ)による麻酔下で行った。
【００７２】
実施例２:マウス及びバクテリア株
Ｃ５７ＢＬ／６(Ｂ６)、及びＣＤ１１ｃ−Ｃｒｅ、Ｖｉｌｌｉｎｅ−Ｃｒｅ,及びＬｙｓＭ−ＣｒｅマウスをそれぞれＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ(Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ.,Ｓｕｎｇｎａｍ,Ｋｏｒｅａ)、及びＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ(Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ)から購入した。ＡＴＧ７ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスは、Ｄｒ.Ｍａｓａａｋｉ Ｋｏｍａｔｓｕ(Ｔｏｋｙｏ Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊａｐａｎ)から提供された。Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスは、ＣＤ１１ｃｃｒｅマウス及びＡＴＧ７f／fマウスをソウル牙山病院の動物室で交配することにより製造した。すべてのマウスに無病原菌条件の下で滅菌された飼料と食水を提供した。Ｂ.ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ(ＪＣＭ１０５５６)及びＢ.ｓａｒｔｏｒｉｉ(ＪＣＭ１７１３６)は、ＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ ＣｅｎｔｅｒのＪａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ(ＪＣＭ)から購入した。
【００７３】
実施例３:４５４パイロシーケンシング分析
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｓｔｏｏｌ ｍｉｎｉ ｋｉｔs(Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ)を用いて糞便からｃＤＮＡを抽出した。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ１ないしＶ３部位を標的するプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。バクテリアの増幅のために、バーコードが付着したプライマー９Ｆ(５'−ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣ−ＴＣＡＧ−ＡＣ−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３';下線を引いた配列は、標的部位のプライマーを意味)及び５４１Ｒ(５'−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣ−ＴＣＡＧ−Ｘ−ＡＣ−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３';'Ｘ'は、各対象の特異的バーコードを意味)(ｈｔｔｐ:／／ｏｋｌｂｂ.ｅｚｂｉｏｃｌｏｕｄ.ｎｅｔ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１００1)を用いた。
【００７４】
増幅は、下記の条件の下で行った:９５℃で５分間変性開始、９５℃で３０秒間３０サイクル変性、５５℃で３０秒間プライマーアニーリング、及び７２℃で３０秒間増幅、及び７２℃で５分間最終延長。前提された産物の同一濃度を一緒に集めて、短い部分(非標的物)は、ＡＭＰｕｒｅ ｂｅａｄ ｋｉｔ(Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ,Ｂｅｖｅｒｌｙ,ＭＡ)を用いて除去した。産物の質及びサイズをＤＮＡ７５００１チップを用いたＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００(Ａｇｉｌｅｎｔ,Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ,ＣＡ)上で測定した。混合した増幅物のシーケンシングは、エマルジョンＰＣＲを介して行った後、ピコタイター(ｐｉｃｏｔｉｔｅｒ)プレート上に置いた。シーケンシングは、ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ(Ｒｏｃｈｅ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ)上でＣｈｕｎｌａｂ(Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ)で行った。パイロシーケンシングデータ分析は、従来技術に基づいて行った(Ｌｉｍ Ｙ.Ｗ.ｅｔ ａｌ.)
【００７５】
実施例４:ＣＥ−ＴＯＦ−ＭＳ(Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ(ＣＥ)ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ)測定
ＣＥ−ＴＯＦ−ＭＳを用いた荷電した代謝産物の量的分析を下記のように行った。１０ｍｇの凍結乾燥された糞便サンプルを３−ｍｍジルコニア−シリカビーズ(ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ)を用いて粉砕し、内部標準としてカチオンとしてメチオニンスルホン(Ｗａｋｏ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ)、アニオンとしてＭＥＳ(Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ)、及びＣＳＡ(Ｄ−Ｃａｍｐｈｏｌ−１０−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ;Ｗａｋｏ)をそれぞれ２０μｍ含むＭｅＯＨの４００μlを用いて均質化した。次に、２００μlの脱−イオン水及び５００μlのクロロホルムを追加した。Ｓｈａｋｅｍａｓｔｅｒ ｎｅｏ(Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ)を用いて１０分間１,５００ｒ.ｐ.ｍ.で撹拌し、溶液を４℃で1５分間４,６００ｇに遠心分離し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ５,０００−Ｄａカットオフフィルター(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ)を用いてフィルタリングしてタンパク質を除去した。濾液を凍結乾燥し、参照化合物として３−アミノピロリジン(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ)及びトリメサート(ｔｒｉｍｅｓａｔｅ)(Ｗａｋｏ)をそれぞれ２００μｍを含む２５μl水に溶解させた。すべてのＣＥ−ＴＯＦ−ＭＳ実験は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ:ＣＥキャピラリー電気泳動システム、Ｇ３２５０ＡＡＬＣ／ＭＳＤ ＴＯＦシステム、１１００シリーズｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣポンプ、Ｇ１６０３ＡＣＥ−ＭＳアダプター、及びＧ１６０７Ａ ＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳｓｐｒａｙｅｒキットを用いて行った。ピーク注釈(ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ)及び定量を決めるために、データを内部のソフトウェア(Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｍ ｅｔ al.)を用いて(ＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ)処理した。
【００７６】
実施例５:ＧＣ−ＭＳ(Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍａｓｓ ｓ
ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ)測定
糞便の有機物濃度をガスクロマトグラフィー−質量分析計で決めた。糞便のエーテル抽出物の部分標本(８０ｍｌ)をＮ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−Ｎメチルトリフルオロアセトアミドと混合した。バイアルを密封し、８０℃で２０分間湯煎で加熱し、４８時間室温に置いて誘導体化(ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ)した。誘導体化されたサンプルをＨＰ−５ＭＳコラム(０.２５ｍｍ×３０ｍｍ×０.２５ｍｍ)及び５９７３Ｎｅｔｗｏｒｋ ｍａｓｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ(Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を備えた６８９０Ｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ ＧＣ Ｓｙｓｔｅｍ(Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)で処理した。
【００７７】
純粋なヘリウム(９９.９９９９％)をキャリアガスとして用いて、１.２ｍｌ ｍｉｎ−１の速度で運搬した。
【００７８】
出口圧力を２０:１で分割して９７ｋＰａに設定した。注入口及び移動線の温度は、それぞれ２５０及び２６０℃であった。温度プログラムを下記のように使用した:６０℃(３分)、６０−１２０℃(５℃／分)、１２０−３００℃(２０℃／分)。次に、各サンプルの１μlを３０分の反応時間の間に注入した。有機酸の濃度をピーク領域と標準を比較して定量した。
【００７９】
実施例６:ＧＬＰ−１(ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１)の測定
血液サンプルを対照群及びＢＡ−食餌マウスから得て、３０分間、４℃で１８００ｇで遠心分離した。ＤＰＰ−４(ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｌ−４)阻害剤を追加し、ＧＬＰ−１濃度をＧＬＰ−１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ(Ｓｈｉｂａｙａｇｉ)を用いて決めた。
【００８０】
実施例７:ＤＰＰ−４の測定
ＤＰＰ−４レベルを測定した。野生型Ｂ６マウスに６時間の絶食後、ＢＡ(５×１０９ＣＦＵ／１００μl)またはこれの培養上層液(１００μl／ｈｅａｄ)または培養培地単独をＤＰＰ−４阻害剤シタグリプチン(４０ｍｇ／ｍｏｕｓｅ;Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ Ｄｏｈｍｅ ａｎｄ Ｃｈｉｂｒｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,Ｒａｈｗａｙ,ＮＪ)とともに投与し、次にグルコースを３０分後に提供した。１５分後、回腸の腸内上皮細胞を前処理マウスから回収し、ＰＢＳで洗滌してルミナール物質を除去した。粘液を掻き出し、上皮を１〜２ｍｍの長さに切り取り、１ｍｌＰＢＳ内に位置させた。スライス組織を遠心分離(６,０００ｇ、４ｏＣ、５ｍｉｎ)でスピンダウンし、５０μlの上層液をキット試薬とともに２時間の間、３７℃でＤＰＰ−４Ｇｌｏ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｓｓａｙ(Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ)を用いてインキュベーションした。ＤＰＰ−４活性をシタグリプチンの不在下の対照群サンプルの値で計算した。
【００８１】
実施例８:統計
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ(ＧｒａｐｈＰａｄ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ)を統計的分析に用いた。両群間の有意的な差をｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｐａｉｒｅｄ t−ｔｅｓｔまたはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ t−ｔｅｓｔで分析した。多数群の場合、ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔを用いて分析した(＊はＰ<０.０５、＊＊はＰ<０.０１、＊＊＊はＰ<０.００１を示す)。
【００８２】
実施例９:Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスで減少した体重と脂肪量を確認
代謝性疾患の発病における兔疫細胞の自己消化作用の役割を確認するために、Ａｔｇ７コンディショナルノックアウトマウスの樹状細胞(Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃ)、消化管上皮細胞(Ａｔｇ７Δｖｉｌｌｉｎ)、及びマクロファージ(Ａｔｇ７ΔＬｙｓＭ)で体重及び行動を観察した。マウスにＮＣＤ(ｎｏｒｍａｌ ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ)を供給した。
以後、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスとそれの同産子の対照群マウス(Ａｔｇ７ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ(f／f))の間の体重の差が増加することを確認した(図1Ａ)。
【００８３】
重要なことに、２４週齢Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスは、Ａｔｇ７f／fマウスに比べて非常に低い体重および脂肪量を有することが確認された(図１、Ａ及びＢ)。雌および雄の両方で痩せの表現型(Ａｔｇ７ΔＣＤ１１Ｃ;図８)が現れた。
【００８４】
ＭＲＩ(Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ)分析では、同産子のＡｔｇ７f／fマウスに比べて、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスで著しく減少した腹部の脂肪組織を軸方向および冠状方向のいずれの方向から確認された(図１Ｃ)。また、Ａｔｇ７f／fマウスに比べて、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスから得た内臓脂肪組織の単一脂肪細胞のサイズが有意に小さかった(図１Ｄ)。
【００８５】
痩せの表現型のＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスにおける全身性または粘膜性炎症の関与を確認するために、血清での炎症前サイトカイン(ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ)のレベル及び内臓脂肪組織内のＦ４／８０及びＴＮＦαのｍＲＮＡ発現を確認し、小腸及び大腸の組織を分析した。Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスで全身性及び粘膜性炎症の多数の標識子が類似したり、減少したレベルを確認し、これはＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの痩せの表現型が炎症に関連していないことを示す(図９)。
【００８６】
重要なことに、非絶食条件の下でＡｔｇ７f／fマウスよりも高いインスリン及び続けて低いグルコースレベルをＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの血清で確認した(図１Ｅ)。同産子Ａｔｇ７f／fマウスに比べてＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスは、ＧＴＴ(ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ)及びＩＴＴ(ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ)によって決定されたインスリン抵抗性は、同産子Ａｔｇ７f／fマウスと比べてＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスで向上したことを確認した(図１Ｆ)。総合して、これらのデータは、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスが減少した脂肪量及び向上したグルコース恒常性を有することを示す。
【００８７】
実施例１０:Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便における低ＳＣＦＡｓレベルの確認
老齢のＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスが低い体重及び脂肪量を持つため、糞便から実施例４のＣＥ−ＴＯＦ−ＭＳ(ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ)及び実施例５のＧＣ−ＭＳ(ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ)を用いて痩せの表現型とエネルギーの利用との間の関連性を確認した。
【００８８】
ＯＰＬＳ−ＤＡ(ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ)におけるＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの個別的プロットは、Ａｔｇ７f／fマウスと明らかに分離される(図１０Ａ)。
【００８９】
さらに、一部のＳＣＦＡｓ、例えば、アセテート、ブチレート、プロピオネート及び乳酸は、軸からリモートスポットに位置し(図１０Ｂ)、これは、このような因子がＡｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスを区別するのに寄与することを示す。実際に、Ａｔｇ７f／fマウスに比べてＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスでアセテート、ブチレート、及びプロピオネートの量は、著しく減少され、これに比べて乳酸の量は、より高かった(図１０Ｃ)。
【００９０】
実施例１１:共生バクテリアが老齢のＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの痩せの表現型に関連したことを確認
Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの痩せの表現型が共生バクテリアに関連するかどうかを確認するために、コハウジング(ｃｏ−ｈｏｕｓｉｎｇ、ＣＨ)及びＦＭＴ(ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ)実験を行った。生まれた時からＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃ及びＡｔｇ７f／fマウスは、ケージを共有して糞便に露出させた。
【００９１】
その結果、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃとケージを共有したＡｔｇ７f／fマウスは、Ａｔｇ７f／fマウスに比べて、より多くの重量と脂肪を損失した(図２、Ａ及びＢ;図１１)。また、Ａｔｇ７f／fマウスとケージを共有したＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスは、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスに比べて体重と脂肪が増加した(図２、Ａ及びＢ;図１１)。ＣＨマウスの表現型が共生微生物によるかどうかを確認するために、コハウジング実験後、マウスを各自のケージに移動させた。図２Ｃに示すように、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスが単独飼育されている場合に体重を失っており、Ａｔｇ７f／fマウスは、そうではなかった。また、野生型Ｂ６マウスにＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便抽出物を１２週間経口投与した結果、野生型Ｂ６またはＡｔｇ７f／fマウスの糞便に比べて有意に低い体重および脂肪量を示した(図２Ｄ)。また、重要なことに、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便抽出物を投与した野生型Ｂ６マウスは、Ａｔｇ７f／fマウスの抽出物を投与したマウスに比べて高いインスリンレベルとそれに続く低血清グルコースレベルを示した(図２Ｅ)。
【００９２】
総合してみると、これらの結果は、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの痩せの表現型に必須な役割を果たすことを示す。
【００９３】
実施例１２:Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便からバクテロイデス・アシジファシエンス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ，ＢＡ)の拡張
腸内共生バクテリアの多様性と組成を確認するために、メタジェノミクス分析を用いた。パイロシーケンシング分析において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、及びＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの割合、門(ｐｈｙｌｕｍ)レベルの腸内微生物の一次分布において、Ａｔｇ７f／f及びＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便が相互に類似することを確認した(図３Ａ)。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｉａ(綱)、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ(目)、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ(科)、及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ(属)の分布も類似、または有意的な差がなかった(図３Ｂ)。しかし、種のレベルで、ＢＡの割合がＡｔｇ７f／fマウスに比べてＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便で有意に拡張されたことを確認した(５.４８±１.７６％ｖｓ.０.７７±０.１８％)(図３Ｃ、ｒｅｄ ａｒｒｏｗ;図１２及び１３)。
【００９４】
一方、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃまたはＡｔｇ７f／fマウスの糞便からＢ.ｓａｒｔｏｒｉｉを含む他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種の割合は、差がなかった(図１３)。
【００９５】
アルファの多様性で、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの糞便微生物の種豊富度(Ｃｈａｏ １ ｉｎｄｅｘ)が著しく減少された反面、群集多様性(Ｓｈａｎｎｏｎ／Ｓｉｍｐｓｏｎ ｉｎｄｅｘ)は、Ａｔｇ７f／fマウスの糞便微生物と類似した(下記表１)。
【００９６】
【表１】
0006393425.tif 000002
【００９７】
痩せの表現型のＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスのＢＡの拡張を確認するために、ＦＩＳＨ(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ)分析を行った。図３Ｄに示すように、増加されたＢＡの数を結腸のルーメンで検出し、少ないＢＡがＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの結腸上皮細胞に内在化されたことを確認した。
【００９８】
総合してみると、これらの結果は、共生バクテリアでは、ＢＡが痩せの表現型内臓で拡張されたことを示す。
【００９９】
実施例１３:高脂肪食(ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ、ＨＦＤ)−提供Ｂ６マウスへのＢＡの経口投与が痩せの表現型を誘導することを確認
拡張されたＢＡが脂質代謝を調節するかどうかを確認するために、ＢＡ(ＪＣＭ１０５５６)を得て、多量の微生物を確保するために培養し、これを非処理Ｂ６マウスに提供した。
【０１００】
投与の最適の条件を決めるために、ＢＡ(５×１０９ＣＦＵ／１００μl)を食餌したマウスの結腸組織及び内のＢＡをＦＩＳＨ分析で定量した。経口投与１日後、結腸上皮細胞のルーメンで多数のＢＡを検出した(図１４Ａ)。
【０１０１】
経口投与２日後にピークされた糞便内のＢＡの数は、続いてすぐに消えて回復された(図１４Ｂ)。ＢＡの経口投与は、食餌の影響なく、ＮＣＤ及びＨＦＤが提供された野生型Ｂ６マウスの体重及び脂肪量を減少させることを確認した(図４、Ａ−Ｃ;図１５、Ａ−Ｃ)。対照的に、対照群に使用したＢ.ｓａｒｔｏｒｉｉ−提供マウスでは、体重減少が確認されなかった(図１６)。また、ＰＢＳ−およびＨＦＤ−提供のマウスに比べてＢＡ−及びＨＦＤ−提供Ｂ６マウスで精巣上体(ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ)の脂肪組織での単一脂肪細胞のサイズが有意により小さかった(図４Ｄ)。また、ＧＴＴ及びＩＴＴにより決定されたインスリン抵抗性は、ＰＢＳ−及びＨＦＤ−提供のマウスに比べてＢＡ−及びＨＦＤ−提供のマウスで著しく改善された(図４Ｅ)。
【０１０２】
ＢＡ食餌による肝及び末梢(ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ)のインスリン感受性に対する効果を確認するために、加熱不活性化したＢＡを対照群として用いた高インスリン血症正常血糖グルコースクランプ(ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉｃ−ｅｕｇｌｙｃｅｍｉｃ ｃｌａｍｐ)技術を用いた。
【０１０３】
興味深いことに、ＢＡ食餌は、肝及び末梢(ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ)のインスリン感受性を改善した(図１７)。ＢＡの経口投与の時、ＮＣＤ−食餌マウスの糞便でブチレートが減少することを確認したが、アセテート、プロピオネート、及び乳酸のレベルは、変わらないことを確認した(図１８Ａ)。類似した傾向をＨＦＤ−食餌群で確認した(図１８Ｂ)。エネルギー消費、活性及び基質利用を測定するために、５日間ＣＬＡＭＳ(ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ)ケージで個別的に飼育した後、ＢＡが供給されたマウスをモニタリングした。ＰＢＳまたはＢＡが供給されたマウスの群が類似した運動活性(ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ)及び呼吸交換率(ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒａｔｉｏ)を示す一方、ＢＡ−及びＨＦＤ−食餌マウスは、ＰＢＳ−及びＨＦＤ−食餌マウスに比べてより多いエネルギーを消費することを確認した(図４Ｆ)。経口ＢＡが投与されたＮＣＤ−食餌マウスで類似した効果を示した(図１５)。
【０１０４】
総合して、ＢＡの長期間投与は、エネルギー消費を誘導し、これによって食餌−誘導された肥満マウスで優性の痩せの表現型を誘発する。
【０１０５】
実施例１４:痩せの表現型のマウスが脂肪組織でＰＰＡＲ(ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ)α発現の増加を示すことを確認
Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃ、ＦＭＴＢ６、及びＢＡ−食餌Ｂ６マウスで減少した体重および脂肪量を検出したことに基づいて脂肪組織、肝、及び小腸での脂質代謝に関連した遺伝子の発現レベルを分析した。重要なことに、脂質β−酸化、特にＰＰＡＲαに関連した遺伝子の発現がＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスの精巣上体の脂肪組織に限って増加した(図５Ａ)。小腸及び肝では、有意的な差を確認することができなかった(図１９Ａ及びＢ)。これらの結果と一貫して、ＰＰＡＲαの発現は、Ａｔｇ７ΔＣＤ１１ｃの排泄抽出物を食餌したＢ６マウス、及びＨＦＤ並びにＢＡを１０週間の食餌したマウスの精巣上体の脂肪組織から有意的に上向き調節されたことを確認した(図５、Ｂ及びＣ)。
【０１０６】
向上されたβ−酸化レベルがバクテリア単独によって活性化されるか、または痩せの表現型の産物によって活性化されていないのかにツイ確認するために、時間依存性の方法によるＢＡ投与によるＢ６マウスにおけるＰＰＡＲα発現レベルを測定した。
【０１０７】
興味深いことに、Ｂ６マウスの精巣上体脂肪組織におけるＰＰＡＲαのｍＲＮＡレベルは、ＢＡ投与２週後に有意に増加した(図５Ｄ)。
【０１０８】
また、ＰＰＡＲα活性によるエネルギー消費を刺激することができるＴＧＲ５、ＧＰＢＡＲ１(Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ)の発現レベルを測定した。
【０１０９】
その結果、ＢＡ投与によって脂肪組織におけるＴＧＲ５発現レベルが増加することを確認した(図５Ｅ)。これらの結果は、ＢＡによる痩せの表現型がＴＧＲ５−ＰＰＡＲα活性による脂肪組織内の脂肪の酸化を開始することを示す。
【０１１０】
実施例１５:ＢＡがＤＰＰ４(ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４)の調節及び胆汁酸の生成によってＧＬＰ−１(ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ−１)の生成を媒介することを確認
【０１１１】
グルコース恒常性の調節でＢＡの役割を確認した。予想したように、ＢＡ−食餌Ｂ６マウスにおいてＰＢＳ−食餌Ｂ６マウスよりも血清でより高いインスリン及び低グルコースレベルを示した(図６Ａ)。
【０１１２】
これらの血漿インスリンレベルの増加がβ−細胞の過剰な刺激によるものかを確認するために、ＢＡ食餌1０週後、膵腸組織内のα−及びβ−細胞の染色を行った。
【０１１３】
その結果、ＢＡ食餌は、β−細胞の過刺激を誘発するものではないことを確認した(図２０)。
【０１１４】
ＢＡ−食餌痩せマウスにおけるインスリン分泌の高いレベルのメカニズムを確認するために、血液へのインスリン放出を刺激するＧＬＰ−１レベルを測定した。
【０１１５】
血清のＧＬＰ−１レベルは、ＮＣＤ−及びＨＦＤ−食餌マウスで著しく増加することを確認した(図６Ｂ)。
【０１１６】
ＧＬＰ−１の阻害活性を持つよく知られている酵素であるＤＰＰ−４のレベルがＢＡまたはこれの培養上層液の経口投与後、小腸回腸で減少することを確認した(図６Ｃ)。
【０１１７】
さらに、タンパク質の量を反映したＤＰＰ−４活性を測定した。従来の研究では、胆汁液がＴＧＲ５活性を介したＧＬＰ−１分泌の刺激を介してグルコース恒常性に重要な役割を果たしていることを示した。
【０１１８】
その結果、ＢＡを１０週間食餌したＢ６マウスの糞便内の一次胆汁酸から脱結合された(ｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ)コーレート、ＣＡ(ｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ)の塩、及びタウリンの有意的に増加されたレベルを確認したが、コレステロールの有意的な損失は、確認できなかった(図６Ｄ;図２１)。これらの結果は、ＢＡまたはこの代謝産物がＤＰＰ−４酵素の活性を下げ、これによりＧＬＰ−１活性を引き起こし、インスリン感受性およびグルコース抵抗性を改善することを示す。
【０１１９】
総合してみると、本発明者は、特異的腸内の共生バクテリア(すなわち、ＢＡ)が痩せの表現型のＡｔｇ７ΔＣＤ１１ｃマウスで拡張されることを確認した。ＢＡの投与は、脂肪組織内の胆汁酸−ＴＧＲ５−ＰＰＡＲα軸による脂肪の酸化の活性を引き起こしており、これは高エネルギー消費を引き起こす。
【０１２０】
同時に、ＢＡは、内臓のＤＰＰ−４を活性化し、次にＧＬＰ−１を増加し、これによってグルコース恒常性に寄与する。胆汁酸、コーレート及びタウリンもＴＧＲ５受容体を介してＧＬＰ−１活性に寄与してインスリン感受性を改善する。
【０１２１】
したがって、ＢＡは、糖尿、肥満のような代謝性疾患の予防または治療に重要な役割を果たすことが分かる(図７)。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１５ｆ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２２】
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【配列表】
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