(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の免疫細胞に結合する可溶性β-グルカンを同定する方法であって、
前記対象から得られた免疫細胞を含む血液試料の少なくとも一部に酵母に由来する可溶性β-グルカンを添加し、可溶性β-グルカンが免疫細胞に結合することが可能な条件下で、混合物をインキュベートする工程、及び
前記免疫細胞に結合された可溶性β-グルカンを検出する工程、ならびに
前記対象から得られた免疫細胞を含む第二の血液試料の少なくとも一部に酵母に由来する可溶性β-グルカンを添加し、可溶性β-グルカンが免疫細胞に結合することが可能な条件下で、混合物をインキュベートする工程、及び
前記免疫細胞に結合された可溶性β-グルカンを検出する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記可溶性β-グルカンがβ-1,3/1,6グルカンを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記可溶性β-グルカンが、β（1,6）-［ポリ-（1,3）-D-グルコピラノシル］-ポリ-β（1,3）-D-グルコピラノースを含んでなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫細胞に結合された可溶性β-グルカンを検出する工程が、特異的にβ-グルカンに結合するモノクローナル抗体に試料を接触させる工程を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、BfD I、BfD II、BfD III又はBfD IVを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年5月1日付けで出願された米国仮出願第61/640,834号、及び2012年4月30日付けで出願された米国仮出願第61/640,397号の優先権を主張する。前記仮出願は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本願は、一態様において、対象の免疫細胞に結合するβ-グルカンを同定する方法を記載する。通常、斯かる方法は、免疫細胞を含んでなる血液試料を対象から得ること、β-グルカンを少なくとも血液試料の一部に添加し、β-グルカンが免疫細胞に結合することが可能な条件下で混合物をインキュベートすること、並びに免疫細胞に結合されたβ-グルカンを検出することを含む。
【発明の概要】
【０００３】
一部の実施形態において、β-グルカンは、酵母に由来してよい。一部の実施形態において、β-グルカンはβ-1,3／1,6グルカン、例えば、β（1,6）-［ポリ-（1,3）-D-グルコピラノシル］-ポリ-β（1,3）-D-グルコピラノースを含むことができる。
【０００４】
一部の実施形態において、免疫細胞に結合されたβ-グルカンを検出することは、β-グルカンに特異的に結合するモノクローナル抗体と試料を接触させることを含むことができる。これらの実施形態の一部において、モノクローナル抗体はBfD I、BfD II、BfD III又はBfD IVを含んでなる。
【０００５】
一部の実施形態において、本願の方法は、対象由来の免疫細胞を含んでなる第二の血液試料を得ること、β-グルカンを第二の血液試料の少なくとも一部に添加すること、β-グルカンが免疫細胞に結合することが可能な条件下で斯かる混合物をインキュベートすること、及び免疫細胞に結合されたβ-グルカンを検出することをさらに含むことができる。
【０００６】
他の態様において、本願は、対象のためのβ-グルカン免疫療法を改善する方法を記載する。通常、斯かる方法は、対象を低バインダーとして同定すること、及びβ-グルカンと、対象を低バインダーから高バインダーへ変換可能な抗体調製物とを対象へ同時投与することを含む。一部の実施形態において、対象を低バインダーとして同定することは、抗β-グルカン抗体価を含んでなる血液試料を対象から得る工程、少なくとも血液試料の一部の抗β-グルカン抗体価を測定する工程、及び抗β-グルカン抗体価が所定のレベル未満の場合に、対象を低バインダーとして同定する工程を含むことができる。他の実施形態において、対象を低バインダーとして同定することは、免疫細胞を含んでなる血液試料を対象から得る工程、少なくとも血液試料の一部にβ-グルカンを添加し、β-グルカンが免疫細胞に結合することが可能な条件下で混合物をインキュベートする工程、免疫細胞に結合されたβ-グルカンを検出する工程、並びにβ-グルカンが10%以下の免疫細胞に結合される場合に、対象を低バインダーとして同定する工程を含むことができる。
【０００７】
一部の実施形態において、抗体調製物は、高バインダー由来の血清を含むことができる。一部の実施形態において、抗体調製物が、β-グルカンを特異的に結合するモノクローナル抗体、例えば、BfD I、BfD II、BfD III又はBfD IVを含むことができる。一部の実施形態において、抗体調製物は、静注用免疫グロブリンを含むことができる。一部の実施形態において、抗体調製物は、抗体又は抗体断片、例えば、Fc部分に結合されたβ-グルカン部分を含むことができる。
【０００８】
一部の実施形態において、β-グルカン及び抗体調製物は、同時間に同時投与される。他の実施形態において、β-グルカン及び抗体調製物は異なる時間に同時投与される。一部の実施形態において、β-グルカン及び抗体調製物は、異なる部位に同時投与される。
【０００９】
一部の実施形態において、β-グルカンは、酵母に由来してよい。一部の実施形態において、β-グルカンは、β-1,3／1,6グルカン、例えば、β（1,6）-［ポリ-（1,3）-D-グルコピラノシル］-ポリ-β（1,3）-D-グルコピラノースを含むことができる。
【００１０】
本願発明の上記要約は、全実施形態又は本願発明の全実施を記載することを目的とするものではない。以下により詳細に説明する記載は、実施形態を示す。本願の各箇所において、様々な組合せで使用可能な例のリストを介してガイダンスが提供される。各例示において示されるリストは代表群としてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、健康な人の全血中の多形核白血球に結合した特異的なβ-グルカン（PGG）を示すフローサイトメトリーデータを表す。
【図２】図２は、健康な人の全血中の好中球に結合した特異的なβ-グルカンを示すデータを表す。
【図３】図３は、健康な人の全血中の単球に結合した特異的なβ-グルカンを示すデータを表す。
【図４】図４は、低バインダーと高バインダーの抗β-グルカン抗体価を比較したデータを表す。
【図５】図５は、two-armed、open-label、無作為化、多施設共同研究の対照及び試験群における、患者の平均治療日数の比較を表す。
【図６】図６は、高バインダー血清が、低バインダーから得られたPMNに結合したβ-グルカンを増加できることを示すデータを表す。
【図７】図７は、抗β-グルカン抗体が、低バインダー由来のPMNに結合したβ-グルカンを増加できることを示すデータを表す。
【図８】図８は、静注用免疫グロブリンが、低バインダー由来のPMNに結合したβ-グルカンを増加できることを示すデータを表す。
【図９】図９は、PGG-抗体の結合がPMNに結合することを示すデータを表す。
【図１０】図１０は、PGG-IVIGの結合がPMNに結合することを示すデータを表す。
【００１２】
代表的な実施形態の詳細な記載
本願は、免疫療法の成分としての可溶性β-グルカンの使用に関する方法を記載する。本明細書に記載の方法は、健常者の異なる群における免疫細胞によるβ-グルカンの特異的な結合の観察を利用する。驚いたことに、β-グルカンの「高バインダー」は、抗β-グルカン抗体の「低バインダー」より高い力価を示す。よって、本明細書は、個体をスクリーニングし、「高バインダー」及び「低バインダー」を同定する方法を記載する。本明細書はまた、「低バインダー」を「高バインダー」へ変換することを通常含む方法を記載し、β-グルカン-ベースの免疫療法が有効となり得る群を増大する。本明細書はまた、現在の「高バインダー」又は「低バインダー」状態に関して対象を定期的にモニタリングし、対象への治療を調整し、必要ならば、「高バインダー」状態の達成又は維持を促進することを含む治療計画を記載する。
【００１３】
β-グルカンは、様々な微生物、並びに例えば、酵母、細菌、藻類、海藻、キノコ、オート麦、及び大麦を含む植物源に由来するグルコースのポリマーである。これらの内、酵母β-グルカンは、その免疫調節特性が広範囲に調査されている。酵母β-グルカンは、様々な形態、例えば、インタクト酵母、ザイモサン、精製全グルカン粒子、可溶化ザイモサン多糖、又は異なる分子量の高精製可溶性β-グルカンで存在し得る。構造的に、酵母β-グルカンは、β-（1,6）グリコシド結合を介して骨格に結合された過β-（1,3）グルコピラノース分枝を有する、β-（1,3）-結合グルコピラノース骨格として構成されるグルコースモノマーから成る。酵母β-グルカンの異なる形態は、互いに異なって機能し得る。酵母β-グルカンがその免疫調節効果を発揮するメカニズムは、β-グルカンの異なる形態間の構造差、例えば、その粒子性又は可溶性特性、三次元構造、主鎖の長さ、側鎖の長さ、及び側鎖の頻度によって影響される。酵母β-グルカンの免疫刺激機能は、異なる種の異なる細胞型に関与する受容体にも依存し、これは再度、β-グルカンの構造特性に依存し得る。
【００１４】
一般的に、β-グルカン免疫療法は、対象へ任意の適した形態のβ-グルカン又はβ-グルカンの２又は３以上の形態の任意の組合せを投与することを含むことができる。適したβ-グルカン及び自然源の適したβ-グルカンの調製物は、例えば、米国特許出願第2008/0103112 A1号に記載される。場合により、β-グルカンは酵母、例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）に由来してよい。場合により、β-グルカンは、本願明細書において、可溶性酵母由来のβ-グルカンの高精製及び特徴がはっきりした形態である、PGG（IMPRIME PGG, Biothera, Eagan, MN）とも呼ぶ、β（1,6）-［ポリ-（1,3）-D-グルコピラノシル］-ポリ-β（1,3）-D-グルコピラノースである又はそれに由来してよい。さらに、β-グルカン-ベースの免疫療法は、例えば、修飾及び／又は誘導体化β-グルカン、例えば、国際特許出願第PCT/US12/36795号に記載されるものの使用を含むことができる。他の場合、β-グルカン免疫療法は、例えば、米国特許第7,981,447号に記載の粒子性可溶性β-グルカン又は粒子性可溶性β-グルカン調製物を投与することを含むことができる。
【００１５】
上述の通り、酵母β-グルカンは、免疫調節特性に関して広範囲で調査されてきた。特に、PGG β-グルカンは、腫瘍関連モノクローナル抗体（mAbs）と組合せて投与される場合の、様々な癌型に対する前臨床活性が証明された。癌の典型的な型及びその関連した腫瘍関連mAbsは、例えば、T細胞リンパ腫（抗MUC1、抗GD2）、肺癌（抗MUC1）、乳腺癌（抗MMTV）卵巣癌（ベバシズマブ）、非小細胞肺癌（ベバシズマブ、セツキシマブ）、結腸直腸癌（セツキシマブ）、慢性リンパ性白血病及び非ホジキンリンパ腫（リツキシマブ）、及び膵臓癌（セツキシマブ、抗MUC1）を含む。β-グルカンは、好中球を刺激することができ、続いて、腫瘍関連抗体を特徴とする腫瘍に好中球は補充される。補充された好中球は、mAb-標識腫瘍細胞の表面で、補体 受容体3（CR3）の二重連結、iC3b/C3b、及び注入β-グルカンによって活性化され、腫瘍細胞を死滅させる。
【００１６】
しかしながら、今回我々は、異なる個体群が存在することを発見した。１群は、全血中の自然免疫細胞に結合するβ-グルカンの相対的に高い能力を示し、他の群は、全血中の自然免疫細胞に結合するβ-グルカンの相対的に低い能力を示す。この観察は、免疫のマウスモデル及び単離ヒト免疫細胞を含む試験由来のデータに基づき、全く想定外であった。多くの個体は、天然由来のβ-グルカンへの低レベルの曝露から、免疫細胞に結合したβ-グルカンのある程度のレベルを示す（例えば、図1、「デノボ」）。外因性β-グルカンが投与される場合、「低バインダー」は、β-グルカンを結合する免疫細胞の割合において中程度の増大を示し、一方、「高バインダー」は、自然β-グルカンを結合する免疫細胞の割合において、標識の増加を示す（図1、「+外因性PGG」）。図1及び図2は、多形核白血球（PMNs）に結合したβ-グルカンを反映したデータを示し、図3（単球）は同じく、特異的な結合が他の自然免疫細胞群にあてはまることを示す。さらに、「高バインダー」はまた、より化学誘引物質サイトカイン及びケモカイン、例えば、、IL-8、MCP、MIP-1等を生成する傾向がある。
【００１７】
本願明細書において、「高バインダー」状態は、外因的に供されたβ-グルカンを結合する特定の免疫細胞群の所定の割合を示す個体を意味する。個体が「高バインダー」又は「低バインダー」であるかを決定するために使用される免疫細胞群は、例えば、多形核リンパ球（PMNs）又は単球とすることができる。個体は、個体由来の血液試料の少なくとも10%のPMNs又は単球が、外因的に供されたβ-グルカンに結合する場合、「高バインダー」と考えられる。よって、個体は、個体由来の血液試料中の少なくとも10%、少なくとも12%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも15%又は少なくとも40%のPMNs又は単球が、外因的に供されたβ-グルカンに結合する場合に、「高バインダー」とすることができる（例えば、図2及び図3）。場合により、外因的に供されたβ-グルカンは、最終濃度10 μg/mL〜100 μg/mLに供されたPGGを含むことができる。「低バインダー」の状態は、「高バインダー」状態を示すことができない個体を意味する。
【００１８】
さらに、「高バインダー」は、抗β-グルカン抗体の「低バインダー」より高い力価を示すことができる（図4）。「高バインダー」に関する典型的な抗β-グルカン抗体価は、少なくとも25,000、例えば、少なくとも30,000、少なくとも35,000、少なくとも40,000、少なくとも45,000、少なくとも50,000、少なくとも55,000又は少なくとも60,000力価とすることができる（例えば、図4）。抗β-グルカン抗体価は、典型的にIgGを意味する。しかしながら、場合により、IgMの存在は、低IgG力価を補足し、「高バインダー」状態の確立を補助することができる。以下により詳細に記載するように、「高バインダー」状態は、β-グルカンの治療への個体の応答に影響しうる。個々の抗β-グルカン抗体をβ-グルカン治療の一部として供することによって、β-グルカン治療へ「高バインダー」様応答を示す自然の「低バインダー」を人工的に誘発できる。
【００１９】
よって、一態様において、本願は、個体をスクリーニングし、個体が、その時点で「高バインダー」又は「低バインダー」状態を示すかを同定することを記載する。通常斯かる方法は、対象から血液試料を得る工程、少なくとも試料の一部にβ-グルカンを添加し、β-グルカンが免疫細胞に結合することが可能な条件下で、混合物をインキュベートする工程、並びに免疫細胞に結合されたβ-グルカンを検出する工程を含む。
【００２０】
血液試料は、免疫細胞を含むための血液の十分な量を含む。よって、一部の実施形態において、血液試料は全血とすることができる。他の実施形態において、血液試料は、スクリーニングアッセイに必須でない１又は２以上の全血成分、例えば、赤血球を除去するために少なくとも部分的に加工されてよい。よって、一部の実施形態において、血液試料は、血液産物、例えば、バフィーコートの少なくとも一部を含む任意の血液画分を含むことができる。
【００２１】
一部の実施形態において、β-グルカンは、酵母、例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）に由来してよい。一部の実施形態において、β-グルカンは、β-1,3/1,6グルカン、例えば、、β（1,6）-［ポリ-（1,3）-D-グルコピラノシル］-ポリ-β（1,3）-D-グルコピラノースを含むことができる。
【００２２】
一部の実施形態において、免疫細胞に結合されたβ-グルカンは、β-グルカンに特異的に結合するモノクローナル抗体と試料を接触させることによって検出できる。モノクローナル抗体は、特異的にβ-グルカンに結合する任意のモノクローナル抗体としてよい。本願明細書において、「特異的」及びその変形は、特定の標的に関して特異的な又は非一般的（すなわち、非特異的）結合性をある程度有することを意味する。β-グルカンを特異的に結合する代表的なモノクローナル抗体は、例えば、米国特許第6,294,321号に記載の、BfD I、BfD II、BfD III及び／又はBfD IV（Biothera, Eagan, MN）として特定されるモノクローナル抗体を含む。
【００２３】
免疫細胞結合β-グルカンに結合する抗β-グルカン抗体の検出を補助するために、抗β-グルカン抗体は、検出可能な標識を含むことができる。或いは、結合抗β-グルカン抗体は、標識された第二の抗体を使用して検出できる。いずれの場合にも、適した標識は、例えば、蛍光標識、酵素標識、比色標識又は放射標識を含む。
【００２４】
本願の方法は、基質にβ-グルカン結合免疫細胞を固定化することをさらに含むことができる。場合により、免疫細胞は、β-グルカンと接触させる前に、例えば、血液試料をβ-グルカンと接触させる前に、少なくとも血液試料の一部を基質と接触させることによって固定化できる。他の実施形態において、免疫細胞は、β-グルカンと接触させた後に固定化できる。いずれの場合にも、免疫細胞は、任意の適した材料、例えば、特異的に所望の免疫細胞群に結合する固定化された抗体を使用して固定化できる。
【００２５】
一部の実施形態において、本願の方法は、非結合アッセイ成分を除去するために洗浄工程を含むことができる。例えば、一部の実施形態は、β-グルカン結合免疫細胞由来の非結合β-グルカン及び／又は非結合血液試料成分を洗浄する工程を含むことができる。他の例として、一部の実施形態は、存在する場合、基質由来の非結合免疫細胞を洗浄する工程を含むことができる。さらに他の例として、一部の実施形態は、免疫細胞に結合されたβ-グルカン由来の非結合β-グルカン特異的抗体の洗浄を含むことができる。
【００２６】
一部の実施形態において、本願の方法は、対象の状態を長期的に「高バインダー」又は「低バインダー」として時間と共にモニターする、対象の反復スクリーニングを含むことができる。β-グルカン免疫療法を受けている一部の癌患者は、反復β-グルカン投薬で抗β-グルカン抗体価の低下を時間と共に示す。これらの患者はまた、β-グルカン結合免疫細胞（例えば、末梢PMNs）の長期の低下を示し得る。斯かる観察は、少なくとも一部において、β-グルカン結合免疫細胞の循環外へ及び腫瘍微小環境への補充に起因し得る。或いは、少なくとも一部において、循環免疫細胞に結合するβ-グルカンに影響する血漿因子の変化（例えば、時間と共に低下された抗β-グルカン抗体）に起因し得る。
【００２７】
他の態様において、本願は、「低バインダー」を「高バインダー」へ変換させる方法を記載する。two-armed、open-label、無作為化、多施設共同試験において、少なくとも２つの以前の化学治療後の再発性／進行性結腸直腸癌を有する795人の対象を、対照群及び 試験群に分類した。対照群の対象は、セツキシマブでの治療を受けた。試験群の対象は、セツキシマブ+ 4 mg/kg PGG β-グルカンでの治療を受けた。図5は、免疫療法の一部としてβ-グルカンを受けている対象は、セツキシマブのみ受けている対象より平均して長期間治療状態であったが、効果は「高バインダー」であった対象において最も偉大であったことを示す。ここで、治療の長さは治療の成功を示し、よってより長期の治療時間は正の治療結果を示し、一方、短い治療の長さは不十分な結果を示す。よって、「低バインダー」状態に対する「高バインダー」状態の臨床的結果が存在する。
【００２８】
「低バインダー」状態に対する「高バインダー」状態の斯かる臨床的結果は、個体を「低バインダー」から「高バインダー」へ変換することが個人に対して臨床的結果を有しうることを意味する。図6は、「高バインダー」血清が、「低バインダー」の免疫細胞に結合したβ-グルカン（例えば、PMNs）を増加できることを示す。抗β-グルカンモノクローナル抗体の増加量はまた、「低バインダー」由来の血清中で免疫細胞に結合したβ-グルカン（例えば、PMNs）を増加できる（図7）。また、静注用免疫グロブリン（IVIG）、多くのドナー（典型的に数百、さらに数千のドナー、よって、自然に抗β-グルカン抗体を含有する）由来のプールされた多価IgGを含有する血液産物はまた、「低バインダー」由来の血清中で免疫細胞に結合したβ-グルカン（例えば、PMNs）を増加できる（図8）。その結果、個体に、免疫療法の成分として、β-グルカンと抗β-グルカン抗体を含む調製物の組合せを供することによって、個体を「低バインダー」状態から「高バインダー」状態へ変換することができる。顕著に、個体の「低バインダー」状態から「高バインダー」状態への変換は、免疫療法の臨床結果を改善できる。
【００２９】
よって、本願の方法は、β-グルカンと、対象を低バインダーから高バインダーへ変換が可能な抗体調製物の同時投与を含む。本願明細書において、「同時投与」は、投与される組合せの２又は３以上の成分を意味し、組合せの治療又は予防効果は、単独投与の成分各々の治療又は予防効果より増大し得る。２つの成分は、同時間に同時投与されても、連続して同時投与されてもよい。同時に投与される成分は、１又は２以上の医薬組成物中に供されてよい。２又は３以上の成分の連続同時投与は、両成分が投与された後に両成分が同時に生体利用可能なように成分が投与される場合を含む。成分が同時に同時投与される又は連続して同時投与されるかにかかわらず、成分は単一部位又は異なる部位に同時投与されてよい。
【００３０】
「低バインダー」から「高バインダー」への同様の状態変換は、任意の抗体又は抗体の一部に結合されたβ-グルカン部分を含む組成物を対象へ投与することによって生じうる。図9は、全血中のPMNsによる相対的に低いPGG結合から（Imp Ref,第二のパネル）、PGGをBTH1704（抗MUC1, 米国特許第6,204,366号, Biothera, Inc, Eagan, MN, 第３パネル）又はアービタックス（Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN, 第４パネル）抗腫瘍抗体に結合することによる高結合状態への変化を説明しているデータを示す。図10はまた、全血中のPMNsによる相対的に低いPGG結合（Imp Ref,第二のパネル）から、PGGを静注用免疫グロブリンへ結合することによる高結合状態（IVIG, Biolegend, San Diego, CA）への変化を説明する。
【００３１】
よって、他の態様において、本願の方法は、対象へ、抗体、治療抗体、抗腫瘍抗体又は抗体断片、例えば、抗体のFc部分に結合されたβ-グルカン部分を含む組成物を投与することを含む。PGG部分と抗体のPGG複合物を含む修飾及び／又は誘導体化PGGは、国際特許出願PCT/US12/36795に記載され、抗体断片の複合物に適用されても良い。PGG部分は、β-1,3/1,6グルカンであってもそれに由来してもよい。ここで、「由来する」とは、複合物が必ずPGG β-グルカンの１又は２以上の原子を取り換える共有結合を創造するによって調製されることを意味する。本願明細書において、「β-1,3/1,6グルカンに由来」とは、PGGの１又は２以上の原子を取り換え複合物の共有結合を創生した後に、複合物の一部として残存するPGG β-グルカンの一部を意味する。
【００３２】
本願明細書において、「低バインダーを高バインダーへ変換することが可能」とは、「低バインダー」（例えば、所定の閾値以下）から「高バインダー」（例えば、所定の閾値以上）への、個体のバインダー状態の変更特性を意味する。「低バインダー」又は「高バインダー」としての対象の状態は、対象から得られた少なくとも血液試料の一部においてβ-グルカンが免疫細胞に結合する程度を参照して決定されて良い。或いは、対象のバインダー状態は、対象から得られた少なくとも血液試料の一部中において測定された抗β-グルカン抗体価に関して決定されて良い。
【００３３】
一部の実施形態において、抗体調製物は高バインダー由来の血清を含むことができる。
【００３４】
他の実施形態において、抗体調製物は、静注用免疫グロブリンを含むことができる。さらに他の実施形態において、抗体調製物は、β-グルカンを特異的に結合するモノクローナル抗体を含むことができる。β-グルカンに特異的に結合する代表的なモノクローナル抗体は、例えば、BfD I、BfD II、BfD III又はBfD IVを含む。
【００３５】
β-グルカン、抗体調製物、及び／又は両成分の組合せは、「担体」と共に組成物中で調製されてよい。本願明細書において、「担体」は、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤及び／又は抗真菌薬、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、サスペンション、コロイド等の任意の溶媒を含む。斯かる医薬活性物質のための媒体及び／又は剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤がβ-グルカン又は抗体と適合しない場合を除き、治療 組成物中でのその使用が検討される。補足の活性成分はまた、組成物中に組み込むことが出来る。
【００３６】
「医薬的に許容」は、生物学的に望ましくない又はその他の望ましくない物質でないことを意味し、すなわち、含有される医薬組成物の任意の他の成分と共に、任意の望ましくない生物学的効果を生じることなく又は有害態様で相互作用することなくβ-グルカン及び／又は抗体と共に個体に投与されてよい。
【００３７】
β-グルカン、抗体調製物、及び／又は両成分の組合せは、医薬組成物中に調製されてよい。一部の実施形態において、β-グルカン及び抗体調製物は単一製剤中に供されてよい。他の実施形態において、β-グルカン及び抗体調製物は、別々の製剤中に供されてよい。医薬組成物は、１又は２以上の好ましい投与経路に適合される様々な及び／又は多数の 形態中に調製されてよい。よって、例えば、経口、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内等）又は局所（例えば、鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、経皮、直腸性等）を含む１又は２以上の周知の経路を介して医薬組成物は投与できる。医薬組成物又はその一部は、例えば、経鼻又は呼吸粘膜への投与によって（例えば、スプレー又はエアロゾルによって）粘膜面に投与できる。医薬組成物又はその一部はまた、徐放又は 遅延放出を介して投与できる。
【００３８】
製剤は、好都合に単位剤形に表すことができ、薬学分野の周知の方法によって調製されてよい。医薬的に許容される担体での組成物の調製方法は、β-グルカン及び／又は抗体調製物を１又は２以上の 補足的な成分を構成する担体と結合させる工程を含む。一般的に、製剤は、均一に及び／又は密に活性化合物を液体担体、微粉化した固体担体又は双方と結合させ、続いて必要ならば、産物を所望の製剤に整形化することによって調製されてよい。
【００３９】
β-グルカン、抗体調製物、及び／又は両成分の組合せは、溶液、懸濁液、エマルジョン、スプレー、エアロゾル又は任意の混合物の形態を含むがそれらに限定されない任意の適した形態中に供されてよい。組成物は、任意の医薬的に許容される賦形剤、担体又はビヒクルと共に製剤中に送達されてよい。例えば、製剤は、従来の局所剤形、例えば、クリーム、軟膏、エアロゾル製剤、非エアゾールスプレー、ゲル、ローション等の中に送達されてよい。製剤は、例えば、アジュバント、皮膚浸透促進剤、着色剤、香料、風味剤、保湿剤、増粘剤等を含む１又は２以上の添加物をさらに含んでよい。
【００４０】
一部の実施形態において、β-グルカンは、酵母、例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）に由来してよい。一部の実施形態において、β-グルカンは、β-1,3/1,6グルカン、例えば、β（1,6）-［ポリ-（1,3）-D-グルコピラノシル］-ポリ-β（1,3）-D-グルコピラノースを含むことができる。
【００４１】
一部の実施形態において、本願の方法は、例えば、約100 ng/kg〜約50 mg/kgの用量を供する十分なβ-グルカンを対象へ投与することを含むことができるが、一方一部の実施形態において、本願の方法は、斯かる範囲外の用量でβ-グルカンを投与することによって実施できる。一部の実施形態において、本願の方法は、約10 μg/kg〜約10 mg/kgの用量、例えば、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg又は約10 mg/kgの用量を対象へ供するために、十分なβ-グルカンを投与することを含む。特定の一実施形態において、本願の方法は、約4 mg/kgの用量を供する十分なβ-グルカンを投与することを含む。
【００４２】
或いは、用量は、治療過程の開始の直前に得られる実際の体重を使用して算出されてよい。このように算出される投与量に関して、体表面積（m2）は、Dubois方法: m2 =（wt kg0.425 x 高さ cm0.725）x 0.007184を使用して治療過程の開始の前に算出される。一部の実施形態において、よって、本願の方法は、例えば、約0.01 mg/m2〜約10 mg/m2の用量を供するために、十分なβ-グルカンを投与することを含むことができる。
【００４３】
一部の実施形態において、本願の方法は、例えば、約100 ng/kg〜約50 mg/kgの用量を供するために、β-グルカンを特異的に結合する十分な抗体を対象へ投与することを含むことができるが、一方一部の実施形態で、本願の方法は斯かる範囲外の用量で抗体を投与することによって実施できる。一部の実施形態において、本願の方法は、約10 μg/kg〜約5 mg/kgの用量、例えば、約100 μg/kg〜約1 mg/kgの用量を供するための十分な抗体を対象へ投与することを含む。一部の実施形態において、β-グルカンを特異的に結合する抗体は、静注用免疫グロブリン（IVIG）、プールされた多価IgGを含有する、多くのドナー由来（典型的には数百、さらに数千のドナー由来、よって、自然に抗β-グルカン抗体を含有）の血液産物の形態で投与できる。斯かる実施形態において、IVIGは、約0.1 g/kg〜約2.0 g/kg 例えば、0.1 g/kg、0.2 g/kg、0.3 g/kg、0.4 g/kg、0.5 g/kg、0.6 g/kg、0.7 g/kg、0.8 g/kg、0.9 g/kg、1.0 g/kg、1.1 g/kg、1.2 g/kg、1.3 g/kg、1.4 g/kg、1.5 g/kg、1.6 g/kg、1.7 g/kg、1.8 g/kg、1.9 g/kg又は2.0 g/kgの用量で投与されてよい。特定の実施形態において、IVIGは、約0.4 g/kg〜約1.0 g/kgの用量を供するために投与されてよい。
【００４４】
或いは、用量は、治療過程の開始直前に得られる実際の体重を使用して算出されてよい。このように算出される用量に関して、体表面積（m2）は、Dubois方法: m2 =（wt kg0.425 x 高さ cm0.725）x 0.007184を使用して、治療過程の開始の前に算出される。一部の実施形態において、よって、本願の方法は、例えば、約0.01 mg/m2〜約10 mg/m2の用量を供するために、十分な抗体を投与することを含むことができる。
【００４５】
一部の実施形態において、β-グルカン及び抗体調製物は、例えば、１週間に単一用量〜複数回用量で同時投与されてよいが、一方一部の実施形態にいおいて、本願の方法は、斯かる範囲外の頻度でβ-グルカン及び抗体の同時投与によって実施されてよい。特定の実施形態において、β-グルカン及び抗体は、約１年に１回〜１週間に１回投与されてよい。
【００４６】
一部の実施形態において、本願の方法は、対象に免疫療法を供することをさらにを含む。免疫療法は、１又は２以上の腫瘍関連抗体（例えば、セツキシマブ、ベバシズマブ、抗MUC1）を投与することを含むことができる。ここで、β-グルカン及び抗体調製物の同時投与は、免疫療法の有効性を増加できる。
【００４７】
本願明細書において、用語「及び／又は」は、１又は全リストされたエレメント又はリストされたエレメントの任意の２又は３以上の組合せを意味し；用語「含んでなる」及びその変形は、これらの用語が明細書の記載及び請求項に現れる場合に限定的な意味を有さず；他に特定されない限り、「a」「an」「the」及び「少なくとも１つ」は、互換的に使用され、１又は２以上を意味し；エンドポイントによる数値範囲の列挙は、斯かる範囲内に含まれる全数値を含む（例えば、1〜5は、1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等を含む）。
【００４８】
上記記載において、特定の実施形態は、明確化のため分離して記載されてよい。特定の実施形態の特徴が他の実施形態の特徴と適合しないと他に明確に特定されない限り、特定の実施形態は、１又は２以上の実施形態に関連して本明細書に記載の適合する特徴の組合せを含むことができる。
【００４９】
別々の工程を含む本明細書に開示される任意の方法に関して、斯かる工程は任意の実行可能な順で行われて良い。また、必要に応じて、２又は３以上の工程の任意の組合せが同時に行われて良い。
【００５０】
本願発明は、以下の実施例によって説明される。特定の実施例、材料、量、及び手順は、実施例は本願で説明されるように発明の趣旨及び範囲に従って広く解釈されるべきである、と 理解されるべきである。
【実施例】
【００５１】
実施例１
材料
Imprime PGG（Biothera, Eagan, MN）を、0.8% 塩化ナトリウム及び0.2% クエン酸一ナトリウム（sodium citrate monobasic）中の1 mg/mLの濃度でpH of 6.4で調製された防腐剤の入っていない可溶性β-グルカン製剤中に供した。斯かる化合物を使用まで4-8°Cで保存した。
【００５２】
試料の調製
全血。フレッシュな全血を、提供の前にインフォームドコンセントに供した健常なボランティアから得た（New England In stitutional Review Board, May 2007）。血液を、158 USP Units Freeze-Driedヘパリンナトリウム（BD Biosciences; San Jose, CA）含有のバキュテナー（登録商標）中に回収した。
【００５３】
血清及び血漿。血清セパレーター（red top）又はヘパリンナトリウム（green top）チューブを使用した、バキュテナー（登録商標）チューブ（BD Biosciences; San Jose, CA）回収によって、全血を血清又は血漿に加工した。チューブを十分に混合し、室温で30分間インキュベートし、続いて2000 rpm（〜1150 ×g）で10分間遠心分離した。上清（血清又は血漿）を続いてフレッシュなポリカーボネート保存円錐チューブに移した。
【００５４】
抗BG ELISA方法
サル抗β-グルカン方法から改良した予備のELIS方法（Noss et al., 2012 Int. Arch. Allergy Immunol., 157:98-108）を、ヒト血清試料を試験するために使用した。Costar universal結合プレートを精製水中に希釈した1 μg/mLの精製β-グルカン濃度で50 μLのβ-グルカンでコーティングし、37°Cで30分間インキュベートした。コーティングしたプレートを、続いて高強度の>1500 μW/cm2 の紫外線に5分間室温で曝露し、50°Cの強制空気オーブン中に静置し乾燥させ、第二の紫外線曝露を>1500 μW/cm2 で５分間室温で行った。プレートを続いてウシ血清アルブミンの0.5%溶液で> 30分間ブロックし、洗浄緩衝剤で洗浄した（0.05% Tween-20のリン酸緩衝食塩水［PBS］）。ヒト血清試料を洗浄緩衝剤中に希釈し、プレートに添加し、続いて連続的にプレート上で洗浄緩衝剤中に希釈した。1:400に希釈した試験試料を７回のさらなる段階1:2希釈で試験プレートにピペットで採取した（1:400〜1:12,800の血清希釈）。試料を室温で30分間インキュベートし、ヒトIgGをプレート結合β-グルカン抗原に結合させた。インキュベーションに続いて、ウェルを洗浄緩衝剤で洗浄し、酵素標識された第二の抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼが結合されたアフィニティー精製ヤギ抗ヒトIgG、Fcガンマ特異的）を、ウェル中でインキュベートし、β-グルカン抗原に結合されたヒトIgGと結合させた。第二の抗体を30分間インキュベーションし、洗浄緩衝剤で洗浄した。全洗浄緩衝剤をウェルから除去した後、ペルオキシダーゼ基質をウェル中でインキュベートし、５分発色現像において発色現像を~1 Mリン酸でクエンチした。マイクロタイタープレートリーダーを使用して、450 nmでの光学密度（OD）を測定した。
【００５５】
抗β-グルカンAb力価の測定
反復試験ウェルから得られるODの平均値を求め、平均アッセイバックグラウンドを減算した。0.100以上のバックグラウンド調整ODを供する最大希釈を試料力価と見なし、斯かる希釈の逆数として表した。アッセイパフォーマンスの決定に関して、値を標準基準血清に割り当て、基準曲線を各アッセイプレート上に作成した。実施例に関して、1:12,800の希釈で0.100のバックグラウンド調整ODを供する試験試料を、12,800の力価を有すると見なした。試料を複数回試験し、それらの力価の平均が1:400から段階1:2力価レベルに位置する場合、次の最低力価レベルをその力価として表した。例えば、４つの提供から１人のドナーの血清を、５つの別個のアッセイ中で試験し28,160の平均力価を生じ；その力価を25,600と表した。
【００５６】
アッセイ検量線。１mLあたりの160の任意単位の値（AU/mL）を、標準ヒト抗β-グルカンに割り当てた。よって、アッセイ方法における1:400 希釈は、標準希釈曲線の最高点として400 mAU/mLの値をもたらし、さらなる段階1:2 希釈をアッセイプレート上で調製した。アッセイ対照をELISA洗浄緩衝剤中に試験のために1:100に希釈した。各対照レベルのさらなる２つの希釈を、各プレート上での同時の試験のために各々調製した。
【００５７】
統計分析。平均バックグラウンド補正光学密度に対する単位mAU/mLのプロッティング標準濃度から、標準基準曲線が得られた。ELISAソフトウェアを使用して、4-parameter fitを標準用量応答曲線から算出し、試料、対照及び試験血清に関して未知値を決定した。検量線の上下の屈曲点に位置するアッセイ応答値（直線部）を、使用し、試料試験値を決定した。変動係数（%CV）を算出するために、一連の値の標準偏差を同一の一連の値の平均で割り、結果に100をかけた。
【００５８】
PGGの全血（WB）細胞への結合
健常ドナー由来のWBの１００マイクロリットルを、5 mLのポリスチレン蛍光標示式細胞分取器（FACS）チューブ中に分注した。これらのWB試料を、Imprime PGG（10 μg/mL若しくは100 μg/mL）又はクエン酸緩衝液、ビヒクル対照で刺激した。試料含有FACSチューブを、緩く対応のキャップでカバーし、30分間又は2時間、37°Cで加湿インキュベーター（5% CO2）中でインキュベートした。
【００５９】
表1. 全血試料の染色のために使用した抗体混合物
【００６０】
【表１】
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【００６１】
インキュベーション後に、全試料を2 mLの1×Dulbeccoのリン酸緩衝食塩水（DPBS）を添加することによって洗浄し、1500-1700 rpmで4°Cで５分間遠心分離した。洗浄及び吸引の２ラウンド後に、5 μLの抗β-グルカン抗体BfD IV（〜100 μg/mL）を、各チューブ中に混合させ、室温で30分間インキュベートした。上記のように斯かる一次抗体を1×DPBSで２度洗い落とし、第二の抗体及び特異的細胞表面標識含有の抗体の混合物（表1）を添加し、30分間室温で暗室でインキュベートした。赤血球を溶解するために、2 mLの1×BD溶解溶液（BD Biosciences; San Jose, CA）を各試料に添加し、穏やかにボルテックスした。室温での1時間のインキュベーション期間の後に、試料を1500-1700 rpmで4°Cで5分間遠心分離した。BD溶解溶液を吸引し、細胞を1×DPBSで一度洗浄し、上記の通り吸引した。固定のため、300-400 μLの1% パラホルムアルデヒドを各試料に添加した。固定20時間内にLSR II（BD Biosciences; San Jose, CA）上で試料を得た。データをFlowJoソフトウェア（Tree Star, Ashland, OR）を使用して分析した。
【００６２】
実施例2
材料
Imprime PGG（Biothera, Eagan, MN）を、0.8% 塩化ナトリウム及び0.2% クエン酸一ナトリウム（sodium citrate monobasic）中にpH6.4で1 mg/mLの濃度で調製された防腐剤の入っていない、可溶性β-グルカン製剤中に供した。4-8°Cで使用まで斯かる化合物を保存した。
【００６３】
全血（WB）結合アッセイ
フレッシュなWBを、提供の前にインフォームドコンセント供された健常なボランティアから得た（New England Institutional Review Board。Blood Donation Protocol No. 07-124）。血液を、158 USP Units Freeze-Driedヘパリンナトリウム（BD Biosciences; San Jose, CA）含有のバキュテナー（登録商標）中に回収した。血清を、トロンビンベースの血餅アクチベーター（BD Biosciences; San Jose, CA）含有のバキュテナー（登録商標）中に回収した。回収の約20分後に、バイアルを2000rpmで10分間室温で遠心分離した。血清を斯かるバイアルから回収し、8時間以内の使用のために4°Cで又は8時間後の使用のために-80°Cで保存した。
【００６４】
全血結合アッセイを、全血試料を30分間又は2時間37°Cで加湿インキュベーター中でImprime PGGでインキュベートすることによって実施した。1×Dulbeccoのリン酸緩衝食塩水（DPBS）で洗浄後、BfDIV、マウス抗β-グルカン抗体を添加しWBで30分間室温でインキュベートした。洗浄のさらなるラウンド後に、ヤギ抗マウス検出抗体及び表面分子への抗体を含む抗体混合物を添加し、室温で暗室で30分間インキュベートした。赤血球をBD Lyseで溶解し、1% パラホルムアルデヒド中に試料を再懸濁した。試料をフローサイトメーター上で得て、FlowJoソフトウェア（Ashland, OR）を使用して分析した。
【００６５】
WB及び血清クロスオーバー研究
血清クロスオーバー研究のために、1200 rpmで10分間全血を沈降させ、血漿を除去した。血液細胞を1-2回1×DPBSで洗浄し、残存血漿を除去した。50 μLの血清を添加し、混合し、Imprimeを添加した。
【００６６】
抗β-グルカンIgG（BioSupplies, Australia）でのインキュベーションのために、凍結乾燥抗体を1×DPBSで1 mg/mLに再懸濁し、-80°C又は4°Cで保存溶液として保存した。血液試料へ添加する前に、斯かる保存溶液を1:10〜100 μg/mLに希釈し、10 μLの斯かる溶液を100 μLの血液に添加した。IVIGでのインキュベーションのために、10% IVIG（100 mg/mL）（PRIVIGEN, CSL Behrling, King of Prussia, PA）を全血試料に指示最終濃度で添加した。
【００６７】
代表的な実施形態
実施形態1.
対象の免疫細胞に結合する可溶性β-グルカンを同定する方法であって、
上記対象から免疫細胞を含んでなる血液試料を得る工程、
少なくとも血液試料の一部に可溶性β-グルカンを添加し、可溶性β-グルカンが免疫細胞に結合することが可能な条件下で、混合物をインキュベートする工程、並びに
免疫細胞に結合された可溶性β-グルカンを検出する工程、
を含んでなる方法。
【００６８】
実施形態2. 前記可溶性β-グルカンが酵母に由来する、実施形態１に記載の方法。
【００６９】
実施形態3. 前記可溶性β-グルカンがβ-1,3/1,6グルカンを含んでなる、実施形態１又は２に記載の方法。
【００７０】
実施形態4. 前記可溶性β-グルカンが、β（1,6）-［ポリ-（1,3）-D-グルコピラノシル］-ポリ-β（1,3）-D-グルコピラノースを含んでなる、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【００７１】
実施形態5. 免疫細胞に結合された可溶性β-グルカンを検出する工程が、試料をβ-グルカンに特異的に結合するモノクローナル抗体に接触させる工程を含んでなる、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
【００７２】
実施形態6. 前記モノクローナル抗体が、BfD I、BfD II、BfD III又はBfD IVを含んでなる、実施形態５に記載の方法。
【００７３】
実施形態7. 前記対象由来の免疫細胞を含んでなる第二の血液試料を得る工程、
可溶性β-グルカンを第二の血液試料の少なくとも一部に添加し、可溶性β-グルカンが免疫細胞に結合することが可能な条件下で混合物をインキュベートする工程、並びに
免疫細胞に結合された可溶性β-グルカンを検出する工程、
をさらに含んでなる、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
【００７４】
実施形態8. 対象のためのβ-グルカン免疫療法を改善する方法であって、
対象を低バインダーとして同定する工程、並びに
可溶性β-グルカンと、対象を低バインダーから高バインダーへ変換可能な抗体調製物を対象へ同時投与する工程、
を含んでなる、方法。
【００７５】
実施形態9. 対象を低バインダーとして同定することが、
抗β-グルカン抗体価を含んでなる血液試料を対象から得る工程、
少なくとも血液試料の一部の抗β-グルカン抗体価を測定す工程、並びに
抗β-グルカンIgG抗体価が20,000未満の場合に、対象を低バインダーとして同定する工程、
を含んでなる、実施形態８に記載の方法。
【００７６】
実施形態10. 前記対象を低バインダーとして同定する工程が、
免疫細胞を含んでなる血液試料を対象から得る工程、
少なくとも血液試料の一部に可溶性β-グルカンを添加し、可溶性β-グルカンが免疫細胞に結合することが可能な条件下で、混合物をインキュベートする工程、
免疫細胞に結合された可溶性β-グルカンを検出する工程、並びに
β-グルカンが10%以下の免疫細胞に結合される場合に、対象を低バインダーとして同定する工程、
を含んでなる、実施形態８に記載の方法。
【００７７】
実施形態11. 前記抗体調製物が、高バインダー由来の血清を含んでなる、実施形態８〜１０のいずれかに記載の方法。
【００７８】
実施形態12. 前記抗体調製物が、可溶性β-グルカンを特異的に結合するモノクローナル抗体を含んでなる、実施形態８〜１０のいずれかに記載の方法。
【００７９】
実施形態13. 前記モノクローナル抗体が、BfD I、BfD II、BfD III又はBfD IVを含んでなる、実施形態１２に記載の方法。
【００８０】
実施形態14. 前記抗体調製物が、静注用免疫グロブリンを含んでなる、実施形態８〜１３のいずれかに記載の方法。
【００８１】
実施形態15. 前記可溶性β-グルカン及び抗体調製物が、同時に同時投与される、実施形態８〜１４のいずれかに記載の方法。
【００８２】
実施形態16. 前記可溶性β-グルカン及び抗体調製物が、異なる時間に同時投与される、実施形態８〜１４のいずれかに記載の方法。
【００８３】
実施形態17. 前記可溶性β-グルカン及び抗体調製物が、異なる部位に同時投与される、実施形態８〜１４のいずれかに記載の方法。
【００８４】
実施形態18. 前記可溶性β-グルカンが酵母に由来する、実施形態８〜１６のいずれかに記載の方法。
【００８５】
実施形態19. 前記可溶性β-グルカンが、β-1,3/1,6グルカンを含んでなる、実施形態８〜１８のいずれかに記載の方法。
【００８６】
実施形態20. 前記可溶性β-グルカンが、β（1,6）-［ポリ-（1,3）-D-グルコピラノシル］-ポリ-β（1,3）-D-グルコピラノースを含んでなる、実施形態９〜１９のいずれかに記載の方法。
【００８７】
本明細書中に記載される、全特許、特許出願、及び公表、及び電子的に利用可能な材料（例えば、GenBank及びRefSeq中のヌクレオチド配列寄託、及び例えば、SwissProt、PIR、PRF、PDB中のアミノ酸配列寄託、並びにGenBank及びRefSeq中の注釈コード領域からの翻訳を含む）の全開示は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。本願の開示と参照により本明細書に組み込まれる任意の文献の開示との間に矛盾が存在する場合には、本願の開示が優先される。上述の詳細な説明及び実施例は、理解の明確化のためにのみ供される。それらに限定される必要性はない。本願発明は、請求項によって定義される発明に含まれるであろう当業者に明らかな変形のために示され記載される正確な１つ１つに限定されない。
【００８８】
他に表示しない限り、成分量、分子量を表している全ての数値、及び明細書及び請求項で使用されるそれらは、用語「約」によって全ての例において変更されると理解されるべきである。従って、他に逆に表示しない限り、明細書及び請求項に記載の数値パラメータは、本願発明によって得ようとする所望の特性に非常に依存的となり得る近似である。少なくとも、請求項の範囲への均等論の限定を試みるものではなく、各数値パラメータは、表される重要な数字の数を考慮して且つ通常の四捨五入技術の適用によって少なくとも解釈されるべきである。
【００８９】
本願発明の広範な範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるに関わらず、具体的な実施例に記載の数値は可能な限り正確に表される。しかしながら、全数値は本質的に、各々の試験測定において見られる標準偏差から必ず得られる範囲を含む。
【００９０】
全ての見出しは、読者の利便性のためであり、特定されない限り、見出しに続く文書の意味を限定するために使用されるべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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