(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋタンパク質のみを不活性化させた不活性化タンパク質を有する豚ヘルペスウイルス株である豚ヘルペスウイルス弱毒株であって、
前記豚ヘルペスウイルス株の野生株は、ＨＮ１２０１株（受託番号：ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１３１１）、又は、ＨＮ１２０２株（受託番号：ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１３３５）であることを特徴とする豚ヘルペスウイルス弱毒株。
【請求項２】
ゲノムにおいてｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８ＫのＯＲＦの全長を欠失させた請求項１に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株。
【請求項３】
前記豚ヘルペスウイルス弱毒株は、ｇＥタンパク質配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５であり、或いは、それと９５％以上の配列相同性を有するウイルス株である請求項１に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株。
【請求項４】
ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫタンパク質のみを不活性化させた不活性化タンパク質を有する豚ヘルペスウイルス株である豚ヘルペスウイルス弱毒株であって、
前記豚ヘルペスウイルス株の野生株は、ＨＮ１２０１株(受託番号)：ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１３１１）、又は、ＨＮ１２０２株（受託番号：ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１３５５）であることを特徴とする豚ヘルペスウイルス弱毒株。
【請求項５】
ゲノムにおいて、ＴＫサイトのヌクレオチド配列がＳＥＱ．ＮＯ．４のアミノ酸配列をコードして発現する請求項４に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株。
【請求項６】
免疫量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株の抗原と薬学的に許容される担体を含むワクチン組成物。
【請求項７】
前記豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原の含有量が１０６．０ＴＣＩＤ５０／頭以上である請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原が生きている前記豚ヘルペスウイルス弱毒株であり、更に凍結乾燥保護剤が含まれる請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
更に、不活性化させた病原体或いは抗原組成成分を含む請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記抗原は豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原及び／又はブタパラインフルエンザ菌抗原或いは豚肺炎マイコプラズマ抗原である請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
ワクチン組成物の製造方法であって、（１）請求項１〜５のいずれか一項に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株を増幅培養する工程と、（２）前記増幅培養した豚ヘルペスウイルス弱毒株に凍結乾燥保護剤を混入する工程と、を含むワクチン組成物の製造方法。
【請求項１２】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物の豚オーエスキー病を予防・治療する医薬品の製造への応用。
【請求項１３】
前記の豚オーエスキー病は請求項３に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株による豚オーエスキー病である、請求項１２記載のワクチン組成物の豚オーエスキー病を予防・治療する医薬品の製造への応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は豚ヘルペスウイルス遺伝子欠失株、及びそれから製造したワクチン組成物、並びに製造方法と応用に係り、動物ウイルス学分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】
オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）アルファヘルペスウイルス亜科に属する豚ヘルペスウイルスＩ型（Ｓｕｉｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｓｔｒａｉｎ）感染を原因として、豚、牛、羊等の多種の家畜、家禽と野生動物で引き起こされ、発熱、かゆみ（豚を除く）及び脳脊髄炎を主症状とする急性伝染病である。豚オーエスキー病は、わが国で広く存在しており、被害が深刻化し、大規模養豚場の生産を妨害する主な疫病の一つである。感染すると、妊娠母豚では、流産、死産又はミイラ胎児が発生し、また、子豚では、神経症状、まひが発生し、死亡率が高い。ＰＲＶは強い向汎性、神経向性、潜伏感染特性を有し、末梢神経系に長期にわたって潜伏して感染することができる。潜伏しているウイルスが活性化されて、感染力を持つウイルスになると、潜伏感染されている宿主は発病することになる。
【０００３】
最近の研究により、豚オーエスキー病が新しい特徴を有するとの報告がある。目立つ表現として、どんな年齢の豚でも感染されることがあり、豚群において水平伝播可能であり、潜伏期間が短く（１〜２日）、発病率は１０％〜１００％の範囲であり、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲であり（子豚の死亡率は１００％と高い）、感染した豚は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に消耗により死に至る。また、種雄豚では、精液の質が低下し、妊娠する母豚では、流産（３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚産出（弱い子豚が１４日齢になる前に全例死亡）するなどの生殖障害症状が出る。従来のワクチンを接種した豚は、野生ウイルスの攻撃を完全には抵抗できず、依然として、高熱、意気消沈、食欲不振又は絶食などの症状が出る。感染率は８０％を超え、発病率は３０％を超え、死亡率は１０％〜２０％の範囲である。例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３及び非特許文献４が挙げられる。このように、従来技術において、豚ヘルペスウイルス変異株によるオーエスキー病を解決できるワクチンは未だ存在しない。
【０００４】
また、特許文献１には、豚ヘルペスウイルスのｇＥ／ｇＩ遺伝子欠失株ＰＲＶ−ＺＪ０１１Ｇ（受託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．７９５７）及びそれを使用して製造した不活化前ウイルス含有量が１０６．０ＴＣＩＤ５０であるワクチンが開示される。当該ワクチンにより免疫された５頭の４５日齢の健康な子ブタは１００％保護されたが、豚ヘルペスウイルスワクチンの弱毒化生ワクチンは体内で常に増殖し、細胞性免疫と体液性免疫を引き起こすために、当該特願は新しいヘルペスウイル株の弱毒化ワクチンを提供できなかった。
【０００５】
また、特許文献２には、二重蛍光標識ヘルペスウイルスの遺伝子欠失株の構築が開示される。つまり、ｇＥ遺伝子、ｇＩ遺伝子、ＵＳ９遺伝子、ＴＫ遺伝子、これら四つのヘルペスウイルス遺伝子を欠失させ、相同組換えにより、上記の遺伝子を欠失しようとする箇所に、それぞれＧＦＰ遺伝子とＲＦＰ遺伝子をマーカーとして挿入することが開示される。一方、当該遺伝子欠失株を抗原ベクターとして利用しているものの、遺伝子欠失株そのものが免疫活性作用を有するか否かは開示されていない。さらに、ヘルペスウイルスは合計で７０種類以上の遺伝子断片を有するが、当該遺伝子欠失株の毒性も未知である。
【０００６】
Ｃｈｕｎ−Ｈｕａ  Ｗａｎｇらは、６周齢の子ブタにＰＲＶＴＪ−ｇＥ−株生ワクチンを注射することで子ブタは１００％保護され、且つ発熱の状況が現れないことを開示した（非特許文献５）。しかし、当業者は、豚ヘルペスウイルス生ワクチンの毒性は子ブタの年齢に依存することを知っている。また、本技術分野に一般的な経験から、たとえ６周齢の子ブタに対して安全なワクチンであっても、７日齢の子ブタに対して安全ではない可能性がある。つまり、生ワクチンは豚群内で伝播することがあるため、６周齢子ブタのみに安全なワクチンを、臨床応用することは保証できない。よって、７日齢の子ブタに安全で、かつ新しい豚ヘルペスウイルス変異株を予防できる生ワクチンが従来技術から求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】中国特願ＣＮ１０３７５６９７７Ａ
【特許文献２】中国特願ＣＮ１０３９８１１５３Ａ
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「豚ヘルペスウイルスの新しい流行株の分離・同定及び抗原多様性の解析」、彭金美など、中国予防獣医学報、２０１３，３５（１）：１−４
【非特許文献２】「免疫して発症させる子ブタにおける豚ヘルペスウイルスの分離・同定」、童武など、中国動物伝染病学報、２０１３，２１（３）：１−７
【非特許文献３】「Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  Ｖｉｒｕｓ，Ｃｈｉｎａ，２０１２．」、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２０１４，２０（１）：１０２−１０４
【非特許文献４】「Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｎ  Ｂａｒｔｈａ−Ｋ６１−ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ｐｉｇｓ，Ｃｈｉｎａ，２０１２．」、Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１３．１９（１１）：１７４９−１７５５
【非特許文献５】「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇＥ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＰＲＶ  ｖａｒｉａｎｔ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｉｎ  Ｂａｒｔｈａ−Ｋ６１−ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ｓｗｉｎｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ」、Ｃｈｕｎ−Ｈｕａ  Ｗａｎｇ，Ｊｉｎ  Ｙｕａｎ，Ｈｕａ−Ｙａｎｇ  Ｑｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３２（２０１４）３３７９-３３８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来技術の問題点を解決するために、本発明は変異した豚ヘルペスウイルスにより引き起こされる豚オーエスキー病を予防・治療するための生きている弱毒化豚ヘルペスウイルス株を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主な目的は、豚ヘルペスウイルス弱毒株を提供することであり、前記豚ヘルペスウイルス弱毒株はｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋタンパク質を不活性化させた豚ヘルペスウイルス株である。好ましくは、前記豚ヘルペスウイルス株が豚ヘルペスウイルス変異株である豚ヘルペスウイルス弱毒株を提供することである。
ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋタンパク質の不活性化は本技術分野の公知の手段を利用することがでる。その遺伝子は上記のタンパク質の機能性断片を発現するヌクレオチド配列を欠失し、その遺伝子はＯＲＦ全体を欠失し、或いはその遺伝子は、一つ或いは複数のヌクレオチドを欠失、除去或いは付加することで、機能性タンパク質を正常に発現できなくなり、或いは発現されたタンパク質が本来の機能を有しておらず、または機能が極めて低いことを含む。
【００１１】
本発明の一実施形態として、本発明はｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失させたヘルペスウイルス遺伝子工学的弱毒株を提供する。
また、本発明の一実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８ＫのＯＲＦの全長を欠失させた。
本発明の一実施形態として、上記のヘルペスウイルス変異株は、ｇＥタンパク質配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５であり、又は、それと９５％以上の配列相同性を有するウイルス株である。好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス変異株は、分離されたものであり、上記の豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現する時に、従来の遺伝子欠失ヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚にも、高熱、意気消沈、食欲不振或いは絶食症状が現れるウイルス株である。より好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス変異株は、上記の豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現する時に、従来のｇＥ、ＴＫ、ｇＩ遺伝子の一つ以上を欠失させたヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚は依然として豚オーエスキー病を感染し、かつ上記の豚ヘルペスウイルス変異株は９〜１０日齢の子ブタに意気消沈と食欲不振をおこすウイルス株である。
【００１２】
最も好ましくは、ヘルペスウイルス変異株は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＨＮ１２０１）（受託番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３１１、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所：中国武漢・武漢大学、寄託日：２０１３年５月２０日）、ＪＳ−２０１２株（童武、張青占、鄭浩等、免疫して発症させる子ブタにおけるヘルペスウイルスの分離・同定［Ｊ］．中国動物伝染病学報、２０１３，２１（３）：１−７）、豚ヘルペスウイルスＨｅＮ１株（中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センタに寄託され、寄託番号：ＣＧＭＣＣＮＯ．６６５６、特願ＣＮ１０２９９４４５８Ａに開示された）、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株（Ｘｉｕｌｉｎｇ  Ｙｕ，Ｚｈｉ  Ｚｈｏｕ，Ｄｏｎｇｍｅｉ  Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ，Ｃｈｉｎａ，２０１２  ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｅｉｄ  ｏｌ．２０，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１４）、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＨＮ１２０２）（受託番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３３５、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所：中国武漢・武漢大学、寄託日：２０１３年８月２６日）、ＰＲＶ  ＴＪ  ｓｔｒａｉｎ（ＰＲＶ  ＴＪ）株（ＣｈｉｎａＣｈｕｎ−Ｈｕａ  Ｗａｎｇ  Ｊｉｎ  Ｙｕａｎ１，Ｈｕａ−Ｙａｎｇ  Ｑｉｎ１，ｅｔ  ａｌ，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇＥ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＰＲＶ  ｖａｒｉａｎｔｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｉｎ  Ｂａｒｔｈａ−Ｋ６１−ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ｓｗｉｎｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ３２（２０１４）３３７９-３３８５に開示された）、豚ヘルペスウイルス変異株ＰＲＶ−ＺＪ０１（受託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．８１７０、ＣＮ１０３６２７６７８Ａに開示された）を含むが、それらに限定されない。
【００１３】
本発明の一実施形態として、上記のヘルペスウイルス株はＨＮ１２０１株、ＨＮ１２０２株、ＪＳ−２０１２株、豚ヘルペスウイルスＨｅＮ１株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ株或いはＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株、ＰＲＶ  ＴＪ株或いはＰＲＶ−ＺＪ０１株である。
また、本発明の一実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株は更にＴＫタンパク質を不活性化させ、好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、ＴＫ部位のヌクレオチド配列がＳＥＱ．ＮＯ．４のアミノ酸配列をコードして発現する。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、ＴＫ部位のヌクレオチド配列がＳＥＱ．ＮＯ．３のヌクレオチド配列である。
また、本発明の好ましい実施形態として、本発明はｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ遺伝子を欠失させるヘルペスウイルス遺伝子工学的弱毒株を提供する。
【００１４】
「豚ヘルペスウイルス変異株」という用語は、高病原性豚ヘルペスウイルス株とも呼ばれ、どんな年齢の豚でも感染されることがあり、豚群において水平伝播可能であり、潜伏期間が短く（１〜２日）、発病率は１０％〜１００％の範囲であり、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲である（子豚の死亡率は１００％と高い）。感染した豚は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に消耗により死に至る。また、種雄豚では精液の質が低下し、妊娠する母豚では流産（３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚産出（弱い子豚が１４日齢になる前に全部死亡）するなどの生殖障害症状が出る。好ましくは、上記のヘルペスウイルス変異株は、分離されたものであり、上記の豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現する時に、従来の遺伝子欠失ヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚に、高熱、意気消沈、食欲不振或いは絶食等症状が現れるウイルス株である。好ましくは、上記のヘルペスウイルス変異株は、ｇＥタンパク質配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５又はそれと９５％以上の配列相同性を有するタンパク質配列であるウイルス株である。より好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス変異株は、上記の豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現する時に、従来のｇＥ、ＴＫ、ｇＩ遺伝子のうち一つ以上を欠失させたヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種したとしても、依然として豚オーエスキー病に感染させ、また、９〜１０日齢の子ブタに意気消沈と食欲不振をおこす。
【００１５】
本発明における「相同性」という用語は、本出願中では、二本のアミノ酸配列或いは二本のヌクレオチド配列の類似度を意味する。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の相同性は、本分野で既知の適当な方法のいずれかによって算出される。たとえば、目標となるアミノ酸（或いはヌクレオチド）配列と参照アミノ酸（或いはヌクレオチド）配列について、配列照合を行って、必要な場合には、照合する二本の配列の間に同じアミノ酸（或いはヌクレオチド）の数を最適化するように欠失を入れ、それを基にして二本のアミノ酸（或いはヌクレオチド）配列の間に同じアミノ酸（或いはヌクレオチド）の百分率を算出する。アミノ酸（或いはヌクレオチド）配列の照合と相同性の計算は、本分野で既知のソフトウェア、たとえば、ＢＬＡＳＴソフトウェア（アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）から入手可能、或いは、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ソフトウェア（ヨーロッパバイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｊｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）から入手可能である。或いは、たとえば、Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３−４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７−８（２００７）を参照）；及びＴＣｏｆｆｅｅソフトウェア等（スイスバイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｔｃｏｆｆｅｅ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｔｃｏｆｆｅｅ／ｔｃｏｆｆｅｅ＿ｃｇｉ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ）から入手可能、或いは、たとえば、Ｐｏｉｒｏｔ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１（１３）：３５０３−６（２００３）；Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．，３０２（１）：２０５−１７（２０００）を参照）によって実現できるが、それらに限定されない。ソフトウェアを使って配列を照合するときに、ソフトウェアの既定パラメーターを使用してもよく、或いは実際の状況によってソフトウェアのパラメーターを調整してもよく、それらが当業者の知識範囲内で行うことができる。
【００１６】
「ｇＩタンパク質」という用語は、ＵＳ７によってコードされ、３６６個のアミノ酸を含み、ＯＲＦが１２２２９８〜１２３３９８の間に位置することを意味する。
「ｇＥタンパク質」という用語は、ＵＳ８によってコードされ、５７７個のアミノ酸を含み、ＯＲＦが１２３５０２〜１２５２３５の間に位置することを意味する。
「１１Ｋ」という用語は、ＵＳ９によってコードされ、９８個のアミノ酸を含み、ＯＲＦが１２５２９３〜１２５５８９の間に位置することを意味する。
「２８Ｋ」という用語は、ＵＳ２によってコードされ、２５６個のアミノ酸を含み、ＯＲＦが１２５８１１〜１２６５８１の間に位置することを意味する。
「ＴＫ」という用語は、「チミジンキナーゼ」とも呼ばれ、ＵＬ２３によってコードされ、３２０個のアミノ酸を含み、ＯＲＦが５９５１２〜６０４７４の間に位置することを意味する。
本発明の「ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ」及び「ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ」という用語は、それぞれ「ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ及び２８Ｋ」および「ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ、２８ＫおよびＴＫ」を意味し、その記号「／」は本発明において「及び」という意味であり、たとえば「ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋタンパク質を不活性化させる」とは、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ、２８Ｋの四つのタンパク質を全て失活させることを意味する。
特に記載しない限り、本発明の「ＰＲＶ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ＴＫ−」という用語は、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ、２８ＫおよびＴＫ遺伝子を欠失させることを意味する。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態として、上記のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失させるヘルペスウイルス遺伝子工学的弱毒株は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失させる遺伝子工学的弱毒株である。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋを欠失させたＨＮ１２０１株、ＨＮ１２０２株、ＪＳ−２０１２株、豚ヘルペスウイルスＨｅＮ１株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ株或いはＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株を含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のヘルペスウイルス弱毒株は、遺伝子工学によってｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失させる豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＨＮ１２０１）であり、当該豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株の受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は２０１３年５月２０日である。
【００１８】
本発明で用いられる「弱毒化」という用語は、遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルスが、修飾しない親株より毒性が低下することを意味する。形態として、豚の死亡頭数と発熱頭数の減少及び発熱持続時間の短縮が現れる。ウイルス株の疾患重症度を確定するための一つ以上のパラメーターの統計的有意差が低下すると、その「毒性がより低い」ということを意味する。
本発明の他の一態様は、免疫量の上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原とベクターを含み、好ましくは、豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原の含有量＞１０６．０ＴＣＩＤ５０／頭であるワクチン組成物に関する。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原が生きている上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株であり、上記のワクチン組成物は更に凍結乾燥保護剤を含む。
本発明の実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株ＨＮ１２０１株、ＨＮ１２０２株、ＪＳ−２０１２株、豚ヘルペスウイルスＨｅＮ１株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ株或いはＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株、ＰＲＶ  ＴＪ株或いはＰＲＶ−ＺＪ０１株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株ＨＮ１２０１株、ＨＮ１２０２株、ＪＳ−２０１２株、豚ヘルペスウイルスＨｅＮ１株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ株或いはＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株、ＰＲＶ  ＴＪ株或いはＰＲＶ−ＺＪ０１株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原が生きている豚ヘルペスウイルス弱毒株であり、上記のワクチン組成物は更に凍結乾燥保護剤を含む。
本発明の一実施形態として、上記のワクチン組成物は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株の生きている弱毒化ワクチンである。
【００２０】
ワクチンに、アジュバント活性を有する１種以上の化合物を添加しても良い。本発明に係る生きている弱毒化豚ヘルペスウイルスは必ずしもこのようなアジュバントで効果を実現するものではないが、特に本発明に係る生きている弱毒化豚ヘルペスウイルスと他の病原ウイルス或いは病原微生物（詳しくは後述する）の抗原性物質との組み合わせワクチンには、アジュバントを添加する意味がある。アジュバントは免疫系の非特異的刺激剤であり、宿主のワクチンに対する免疫応答を向上させる。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全アジュバント及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭｓ（免疫刺激複合体、ヨーロッパ特許ＥＰ１０９９４２を参照すること）、サポニン、鉱油、植物油、Ｃａｒｂｏｐｏｌが挙げられる。
従って、好ましい実施形態においては、本発明に係る生きている弱毒化ワクチンはアジュバントを含む。
本発明に用いられる薬学的に許容される担体又は希釈剤の他の具体例には、ＳＰＧＡ、糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質及びバッファー（例えば、リン酸バッファー）などの安定化剤を含む。
特にこのような安定化剤をワクチンに混入する時に、ワクチンは冷凍乾燥に非常に適する。従って、より好ましい実施形態において、生きている弱毒化ワクチンは冷凍乾燥品である。
【００２１】
また、本発明の豚ヘルペスウイルスワクチンを他の不活性化させた病原体或いは抗原を組み合わせて使用することで、豚オーエスキー病をはじめとする各種類の疾病に抵抗する混合ワクチン或いは複合ワクチンを製造できる。本発明における「混合ワクチン」という用語は、本発明の豚ヘルペスウイルスと少なくとも１種の異なるウイルスとのウイルス混合物から製造したワクチンである。「複合ワクチン」という用語は、ウイルスと細菌から製造したワクチンである。たとえば、本発明の豚ヘルペスウイルスを豚コレラウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、豚サーコウイルス及び／又はブタパラインフルエンザ菌、マイコプラズマと、混合し又は組み合わせることができる。
本発明の一実施形態として、上記のワクチンは、更に、不活性化させた病原体或いは抗原組成成分を含み、好ましくは、上記の抗原は豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原及び／又はブタパラインフルエンザ菌抗原或いは豚肺炎マイコプラズマ抗原である。
【００２２】
本発明の一実施形態として、本発明の弱毒株に外来遺伝子を挿入でき、上記の外来遺伝子は、豚に感染するいろいろな病原体の１種以上の抗原をコードするものであり、上記の病原体は、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、豚インフルエンザウイルス、豚パルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、豚サーコウイルス１型又は２型、大腸菌、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉ  ｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ），ブタパラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、豚肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、豚レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）からなる。
好ましくは、上記のワクチン組成物は更に、媒体、アジュバント、賦形剤を含有する。
本発明に係わるワクチン組成物は、媒体、アジュバント及び／又は賦形剤をさらに含有してもよい。生理食塩水或いは蒸留水を媒体として使用できる。
【００２３】
本発明の他の形態は、（１）上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株を増幅培養する工程と、（２）上記の増幅培養した豚ヘルペスウイルス弱毒株に凍結乾燥保護剤を混入する工程と、を含む上記のワクチン組成物を製造する方法に関する。
本発明の他の一形態は、豚オーエスキー病を予防・治療する、上記のワクチン組成物の医薬品の製造への応用に関する。
本発明の一実施形態として、上記の豚オーエスキー病は豚ヘルペスウイルス変異株による豚オーエスキー病である。
本文に用いられる「豚ヘルペスウイルスに起因する疾病」という用語は、以下の症状を示す意味として用いられることがあり、即ち、どんな年齢の豚でも感染することがある。豚群において水平伝播可能であり、潜伏期間が短く（１〜２日）、発病率は１０％〜１００％の範囲であり、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲であり（子豚の死亡率は１００％と高い）、感染した豚は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に消耗により死に至る。また、種雄豚では精液の質が低下し、妊娠する母豚では流産（３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚産出（弱い子豚が１４日齢になる前に全部死亡）するなどの生殖障害症状が出るが、それに限定されない。
【００２４】
上記の症状と従来技術において普通の豚ヘルペスウイルスを感染して生じた症状との相違点として、感染された成熟豚（体重が５０ｋｇ以上の豚である）は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に消耗により死に至ることがあり、初生豚及び４週齢以下の子豚は突然に発病し、多量に死亡し、死亡率が９０％以上となり、発病した子豚の主な症状は、体温が４１℃以上に上昇し、食欲がなくなると伴い、明らかな神経症状と下痢があることであり、離乳前後の子豚の主な症状は呼吸困難、咳、鼻水などの呼吸系症状である。
本文に用いられる用語「予防」とは本発明のワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルスの感染を抑制し、又は発病を遅延させるいずれの行為である。「治療」という用語とは、本発明に係るワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルス感染による症状を緩和し又は良くするいずれの行為である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係るウイルス株は、毒性が低く、より良い免疫保護が得られ、早期に抗体を誘導させ、かつ免疫後再び攻撃してもｇＥ抗体が陽性へ変化しない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ｐＵＣｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８ＫＡ−ＧＦＰ−Ｂプラスミドの構築を示す概略図である。
【図２】ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子欠失位置及びゲノム上のＵＳＡとＵＳＢホモロジーアームの位置を示す概略図である。
【図３】ＰＣＲ法によって確認した豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子欠失前後でのＰＣＲ断片電気泳動の対比図である。
【図４】ＴＫ遺伝子欠失位置及びゲノム上のＴＫＡとＴＫＢホモロジーアームの位置を示す概略図である。
【図５】ＰＣＲ法によって確認した豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株のＴＫ遺伝子欠失前後でのＰＣＲ断片電気泳動の対比図である。  配列表において：  配列１は豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子ヌクレオチド配列である。  配列２は豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株のＴＫ遺伝子ヌクレオチド配列である。  配列３は豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株のＴＫ遺伝子を欠失させた位置のヌクレオチド配列である。  配列４は豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株のＴＫ遺伝子を欠失させた位置のアミノ酸配列である。  配列５は豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株のｇＥアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の利点と特徴がより明らかになるように、具体的な実施例を組み合わせて、本発明を更に説明する。ただし、それらの実施例は単なる実例であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、本発明の主旨と範囲から逸脱しない限り、本発明の技術方案の詳細や形式に対して修正又は変更を行うことができ、それらの修正と変更はいずれも本発明の保護範囲に入る。
本発明における用語「頭分」とは、豚に対して１頭当たりのワクチン注射量である。
本発明に記載されている「ＴＣＩＤ５０」（５０％ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）は、細胞培養物の５０％を感染させることができるウイルス量であり、ウイルス感染力を表す方式の一つである。
ＭＥＭ液体培地（液）はアメリカＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ会社から購入したＭＥＭ乾燥粉末培地を用いて、明細書により調製したものである。
本発明のＤＭＥＭ培地は、ＧＢ／Ｔ１８６４１−２００２付録Ａの調製方法により調製したものである。
本発明に記載される「ＰＢＳ」とはリン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）の英語イニシャルであり、本発明では、０．０１ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）を用い、《分子クローン》第三版により調製された。
【００２８】
本実施例に用いられる豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＨＮ１２０１）は、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が２０１３年５月２０日である。
本実施例に用いられる豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＨＮ１２０２）は、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３３５であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が２０１３年８月２６日である。
ＰＲＶは豚ヘルペスウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）の英語の略語である。
以下の具体的な実施形態において、それぞれ、豚ヘルペスウイルス変異株ＰＲＶ  ＨＮ１２０１株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ株とＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株、ＨＮ１２０２株を例として本発明を説明する。
【実施例１】
【００２９】
（ＰＲＶ  ＨＮ１２０１株ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ欠失ウイルス株の製造）
１．１ＰＲＶ  ＨＮ１２０１ＧＦＰ組換えウイルス導入ベクターの構築
欠失しようとするＵＳセグメント（ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ）の配列によって、その両端にそれぞれホモロジーアーム、即ちＵＳＡとＵＳＢを設計した。ＵＳＡとＵＳＢをｐＵＣ１９ベクターにクローンして、ｐＵＣＵＳＡＢと名づけた。次に、ＧＦＰ遺伝子をｐＵＣＵＳＡＢにクローンして、組換えウイルス導入ベクターを獲得して、ｐＵＣＵＳＡ−ＧＦＰ−Ｂと名づけた。導入ベクターにおいて、ホモロジーアームはＵＳ両側の配列であるため、組換えて得られた組換えウイルスはｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８ＫのＵＳセグメントを欠失した。組換え導入ベクター構築の概略図を図１に示し、図２はゲノム上のＵＳＡとＵＳＢホモロジーアームの位置を示す。
【００３０】
１．１．１、相同組換えアームの増幅及びクローン
１．１．１．１プライマーの設計とテンプレートの制作
ＨＮ１２０１ウイルスの遺伝子配列によって、二対のプライマーを設計し、欠失セグメントの両側のホモロジーアームを増幅した。
左側のホモロジーアームＵＳＡの上下流のプライマーは、それぞれ
ＵＳＡＦ：ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＴＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴ（下線がＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素切断サイトである）、
ＵＳＡＲ：ＣＴＡＴＣＴＡＧＡａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔｇｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＣＧＧＴＡＣＴＧＣＧＧＡＧＧＣＴＡＣＧＧＡＣ（下線がＸｂａ  Ｉ制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがｌｏｘｐサイトである）である。
右側のホモロジーアームＵＳＢの上下流のプライマーは、それぞれ
ＵＳＢＦ：ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＡＣＧＧＣＡＧＧＡＴＣＴＣＴＣＣＧＣＧＴＣＣＣ（下線がＳｐｈＩ制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがｌｏｘｐサイトである）、
ＵＳＢＲ：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣ（下線がＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素切断サイトである）である。
ＰＲＶ  ＨＮ１２０１でｖｅｒｏ細胞を感染し、細胞の８０％以上が病変を認められた後、上澄みの一部を取り、Ｇｅｎｅａｉｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを利用して、ウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、ホモロジーアームを増幅するためのテンプレートとする。
【００３１】
１．１．１．２  ホモロジーアームＵＳＡ、ＵＳＢの増幅及びクローン
ＴＡＫＡＲＡのＰｒｉｍｅＳＴＡＲを利用して、ＰＣＲを行って、以下の体系及び条件でＵＳＡ、ＵＳＢを増幅させた。
0006368725.tif 000002
ＰＣＲにより増幅されたＵＳＡとＵＳＢ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した後、ゲル回収キット（天根社製）を使用して目的断片を回収した。ＵＳＡ断片とｐＵＣ１９ベクターをそれぞれＥｃｏＲ  ＩとＸｂａＩで二重消化（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した後、目的断片を回収し、Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ結合した後、ＤＨ５αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、３７℃で一晩培養する。モノクローナルを選別し、酵素消化によって正確であると勘定したプラスミドをｐＵＣＵＳＡと名づけた。ｐＵＣＵＳＡとＵＳＢをそれぞれ  ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化した後、目的断片を回収し、Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ結合した後、ＤＨ５αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、３７℃で一晩培養した。モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをｐＵＣＵＳＡＢと名づけた。
【００３２】
１．１．２  標識遺伝子ＧＦＰの増幅
１．１．２．１  ＧＦＰベクターｐＡｃＧＦＰ−Ｃ１マルチプルクローニングサイトの除去
ｐＡｃＧＦＰ−Ｃ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入し、型番６３２４７０）をＢｇｌ  ＩＩとＳｍａ  Ｉで二重消化した後、線状化されたベクターを回収し、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化し、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ結合した後、ＤＨ５αコンピテントセルの形質転換を行い、ＭＣＳを除去したＧＦＰプラスミドを獲得し、ｐＡｃＧＦＰΔＭＣＳと名づけた。
１．１．２．２  ＧＦＰ遺伝子の増幅
ｐＡｃＧＦＰ−Ｃ１ベクター配列に基づき、ＧＦＰを増幅するためのプライマーを設計した。
＜上流プライマー＞
ＣＭＶＵ：ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ（下線がＳａｌＩ制限酵素切断サイトである）
＜下流プライマー＞
ＳＶ４０Ｒ：ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣ（下線がＳｐｈ  Ｉ制限酵素切断サイトである）
プラスミドｐＡｃＧＦＰΔＭＣＳをテンプレートとして、以下の体系及び条件でＧＦＰ遺伝子を増幅した。
0006368725.tif 000003
電気泳動によって目的バンドを回収し、次の結合を行った。
【００３３】
１．１．３  ＧＦＰ標識遺伝子とｐＵＣＵＳＡＢの結合
ＧＦＰをＳａｌ  ＩとＳｐｈ  Ｉで二重消化した後、目的断片を回収し、同様に二重消化したｐＵＣＲＲＡＢプラスミドと結合し、ＤＨ５αコンピテントセルの形質転換を行い、モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをｐＵＣＵＳＡ−ＧＦＰ−Ｂと名づけた。
１．２  ＧＦＰを含む組換えウイルスの獲得
１．２．１  導入ベクターとＨＮ１２０１  ＤＮＡでＶｅｒｏ細胞を共トランスフェクションして組換えウイルスを獲得する
リポソーム法でＶｅｒｏ細胞を共トランスフェクションし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、型番１１６６８０３０）に付属する明細書の工程によって、３ｕｇ  ＰＲＶ−ＨＮ１２０１ウイルスゲノムＤＮＡと５ｕｇ導入ベクターｐＵＣＵＳＡ−ＧＦＰ−Ｂをトランスフェクションした。３７℃で５％ＣＯ２を含む培養箱に培養した。トランスフェクションしてから３６〜４８時間後に、細胞病変が生じて、且つ病変部に蛍光が認められたら、細胞の上澄みをＰ０世代組換えウイルスとして回収し、ｒＰＲＶ−ＧＦＰ−ＵＳ−と名づけた。
１．２．２  組換えウイルスのプラークの精製
得られたＰ０世代組換えウイルスｒＰＲＶ−ＧＦＰ−ＵＳ−でＶｅｒｏ細胞を感染した後、２％の低融点アガロースを敷き、４８時間後、細胞に明らかな病変と蛍光が認められた後、緑色蛍光のプラークを選別して、−７０℃で３回凍結融解した後、１０倍段階希釈してＶｅｒｏ細胞を敷いておいた６ウェルプレートに接種し、引き続いて緑色蛍光プラークを選別して精製し、プラーク精製を８循環で行って、精製された野生型ウイルスＨＮ１２０１を含まないｇＩ／ｇＥ／ＵＳ９／ＵＳ２（すなわち、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ）欠失の組換えウイルスｒＰＲＶ−ＧＦＰ−ＵＳ−を得た。
【００３４】
１．３  ｇＩ／ｇＥ／ＵＳ９／ＵＳ２（すなわち、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ）セグメント欠失組換えウイルスにおけるＧＦＰ標識遺伝子の除去
Ｃｒｅ酵素を発現するｐＢＳ１８５プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅから購入し、Ｃｒｅ酵素はホモロジーアームＵＳＡ下流とＵＳＢ上流のｌｏｘＰサイトを認識し、二つのｌｏｘｐサイトの間の配列を除去する）と組換えウイルスｒＰＲＶ−ＧＦＰ−ＵＳ−ゲノムＤＮＡにより、ｖｅｒｏ細胞の共トランスフェクションを行った結果、トランスフェクションしてから２４時間後、比較的に明らかな病変が現れ、しかも単独な蛍光がより多かった。獲得したＰ０世代ウイルスを段階希釈した後、接種して、プラークを選別し、蛍光を発しないプラークを選別して、次の精製を行った。２回選別・精製して、蛍光を発しないウイルスを獲得して、ｖＰＲＶ−ＵＳ−と名づけた。精製ウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ同定によって、ｇＩ／ｇＥ／ＵＳ９／ＵＳ２（すなわち、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ）セグメントが欠失され、且つＧＦＰ標識遺伝子もすでに除去されたことが分かった。ＧＦＰ標識遺伝子を含まないｇＩ／ｇＥ／ＵＳ９／ＵＳ２（すなわち、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ）セグメント欠失ウイルスの精製が成功したことを明らかにした。
１．４  ＰＲＶ  ＨＮ１２０１株ＵＳセグメント欠失ウイルス株の確認
ｇＩ／ｇＥ／ＵＳ９／ＵＳ２（すなわち、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ）セグメント欠失ウイルスと野生型ウイルスのウイルスゲノムを抽出し、ＰＣＲ同定を行い、プライマーは下記の通りであった。
ＵＳＤＣＦ：ＴＡＣＡＴＣＧＴＣＧＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＴＧＧＣ
ＵＳＤＣＲ：ＡＧＣＴＣＧＴＧＣＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧ
野生型ウイルスで増幅したＰＣＲ産物のサイズが６２８６ｂｐであり、ｇＩ／ｇＥ／Ｕ  Ｓ９／ＵＳ２（すなわち、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ）セグメント欠失ウイルスで増幅したＰＣＲ断片のサイズが１９６０ｂｐであった。
ＰＣＲ実験の結果から、ｇＩ／ｇＥ／ＵＳ９／ＵＳ２（すなわち、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ）セグメントＯＲＦをすでに完全に欠失させたことを証明した。
【実施例２】
【００３５】
（ＰＲＶ  ＨＮ１２０１株ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失ウイルス株の製造）
２．１  ＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ＧＦＰ組換えウイルス導入ベクターの構築
欠失しようとするＴＫ遺伝子の配列によって、その両端にそれぞれホモロジーアーム、即ちＴＫＡとＴＫＢを設計した。ＴＫＡとＴＫＢをｐＵＣ１９ベクターにクローンして、ｐＵＣＴＫＡＢと名づけた。次に、ＧＦＰ遺伝子をｐＵＣＴＫＡＢにクローンして、組換えウイルス導入ベクターを獲得し、ｐＵＣＴＫＡ−ＧＦＰ−Ｂと名づけた。導入ベクターにおいて、ホモロジーアームはＴＫ両側の配列であるため、組換えて得られた組換えウイルスはＴＫ遺伝子を欠失した。図４はゲノム上のＴＫＡとＴＫＢホモロジーアームの位置を示す。
【００３６】
２．１．１  相同組換えアームの増幅及びクローン
２．１．１．１  プライマーの設計とテンプレートの製造
ＨＮ１２０１ウイルスの遺伝子配列によって、二対のプライマーを設計し、ＴＫ遺伝子の両側のホモロジーアームを増幅した。
左側のホモロジーアームＴＫＡの上下流のプライマーは、それぞれ
ＴＫＡＦ：  ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＡＧＴＧＣＣＧＧＴＴＧＣＣＣＡＣＧＴＡＣＡ（下線がＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素切断サイトである）
ＴＫＡＲ：ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｔａｃａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＣＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＣＧＴＴＣＴＧＣ（下線がＸｂａ  Ｉ制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがｌｏｘｐサイトである）である。
右側のホモロジーアームＴＫＢの上下流のプライマーは、それぞれ
ＴＫＢＦ：ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔｇｔａｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＡＡＣＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＧＡＧＧ（下線がＳｐｈ  Ｉ制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがｌｏｘｐサイトである）
ＴＫＢＲ：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣ（下線がＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素切断サイトである）である。
ＰＲＶ  ＨＮ１２０１でｖｅｒｏ細胞を感染し、細胞の８０％以上が病変を認められた後、上澄みの一部を取り、Ｇｅｎｅａｉｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを利用して、ウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、ホモロジーアームを増幅するためのテンプレートとする。
【００３７】
２．１．１．２  ホモロジーアームＴＫＡ、ＴＫＢの増幅及びクローン
ＴＡＫＡＲＡのＰｒｉｍｅＳＴＡＲを利用して、ＰＣＲを行って、以下の体系及び条件でＴＫＡ、ＴＫＢを増幅させた。
0006368725.tif 000004
ＰＣＲにより増幅されたＴＫＡとＴＫＢ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した後、ゲル回収キット（天根社製）を使用して目的断片を回収する。ＴＫＡ断片とｐＵＣ１９ベクターをそれぞれＥｃｏＲ  ＩとＸｂａＩで二重消化した後、目的断片を回収し、Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ結合した後、ＤＨ５αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、３７℃で一晩培養した。モノクローナルを選別し、酵素消化によって正確であると勘定したプラスミドをｐＵＣＴＫＡと名づけた。ｐＵＣＴＫＡとＴＫＢをそれぞれ  ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化した後、目的断片を回収し、Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ結合した後、ＤＨ５αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、３７℃で一晩培養した。モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをｐＵＣＴＫＡＢと名づけた。
【００３８】
２．１．２  標識遺伝子ＧＦＰの増幅
２．１．２．１  ＧＦＰベクターｐＡｃＧＦＰ−Ｃ１マルチプルクローニングサイトの除去
ｐＡｃＧＦＰ−Ｃ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入し、型番６３２４７０）をＢｇｌ  ＩＩとＳｍａ  Ｉで二重消化した後、線状化されたベクターを回収し、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化し、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ結合した後、ＤＨ５αコンピテントセルの形質転換を行い、ＭＣＳを除去したＧＦＰプラスミドを獲得し、ｐＡｃＧＦＰΔＭＣＳと名づけた。
２．１．２．２  ＧＦＰ遺伝子の増幅
ｐＡｃＧＦＰ−Ｃ１ベクター配列に基づき、ＧＦＰを増幅するためのプライマーを設計した。
＜上流プライマー＞
ＣＭＶＵ：ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ（下線がＳａｌＩ制限酵素切断サイトである）
＜下流プライマー＞
ＳＶ４０Ｒ：ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣ（下線がＳｐｈ  Ｉ制限酵素切断サイトである）
プラスミドｐＡｃＧＦＰΔＭＣＳをテンプレートとして、以下の体系及び条件でＧＦＰ遺伝子を増幅した。
0006368725.tif 000005
電気泳動によって目的バンドを回収し、次の結合を行った。
【００３９】
２．１．３  ＧＦＰ標識遺伝子とｐＵＣＴＫＡＢの結合
ＧＦＰをＳａｌ  ＩとＳｐｈ  Ｉで二重消化した後、目的断片を回収し、同様に二重消化したｐＵＣＴＫＡＢプラスミドと結合し、ＤＨ５αコンピテントセルの形質転換を行い、モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをｐＵＣＴＫＡ−ＧＦＰ−Ｂと名づけた。
２．２  ＧＦＰを含む組換えウイルスの獲得
２．２．１  導入ベクターとｖＰＲＶ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−  ＤＮＡでＶｅｒｏ細胞を共トランスフェクションして組換えウイルスを獲得する
リポソーム法でＶｅｒｏ細胞を共トランスフェクションし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、型番１１６６８０３０）に付属する明細書の工程によって、３μｇ  ｖＰＲＶ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ウイルスゲノムＤＮＡと５μｇ導入ベクターｐＵＣＴＫＡ−ＧＦＰ−Ｂをトランスフェクションした。３７℃で５％ＣＯ２を含む培養箱に培養した。トランスフェクションしてから３６〜４８時間後に、細胞病変が生じて、且つ病変部に蛍光が認められたら、細胞の上澄みをＰ０世代組換えウイルスとして回収し、ｒＰＲＶ−ＧＦＰ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ＴＫ−と名づけた。
２．２．２  組換えウイルスｒＰＲＶ−ＧＦＰ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ＴＫ−のプラークの精製
得られたＰ０世代組換えウイルスｒＰＲＶ−ＧＦＰ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ＴＫ−でＶｅｒｏ細胞を感染した後、２％の低融点アガロースを敷き、４８時間後、細胞に明らかな病変と蛍光が認められた後、緑色蛍光のプラークを選別して、−７０℃で３回凍結融解した後、１０倍段階希釈してＶｅｒｏ細胞を敷いておいた６ウェルプレートに接種し、引き続いて緑色蛍光プラークを選別して精製し、プラーク精製を１１循環で行って、精製された、ＰＲＶ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ＴＫ−ウイルスを含んでおらず、五つの遺伝子を欠失させた組換えウイルスｒＰＲＶ−ＧＦＰ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ＴＫ−を得た。
【００４０】
２．３  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失組換えウイルスにおけるＧＦＰ標識遺伝子の除去
Ｃｒｅ酵素を発現するｐＢＳ１８５プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅから購入し、Ｃｒｅ酵素はホモロジーアームＴＫＡの下流とＴＫＢの上流の変異型ｌｏｘＰサイトを認識し、二つのｌｏｘｐサイトの間の配列を除去する）と組換えウイルスｒＰＲＶ−ＧＦＰ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ＴＫ−ゲノムＤＮＡにより、ｖｅｒｏ細胞の共トランスフェクションを行った結果、トランスフェクションしてから２４時間後、比較的に明らかな病変が現れ、しかも単独な蛍光がより多かった。獲得したＰ０世代ウイルスを段階希釈した後、接種して、プラークを選別し、蛍光を発しないプラークを選別して、次の精製を行った。２回選別・精製して、蛍光を発しないウイルスを獲得して、ＰＲＶ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ＴＫ−と名づけた。精製ウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ同定によって、ＴＫ遺伝子が欠失され、且つＧＦＰ標識遺伝子もすでに除去されたことが分かった。ＧＦＰ標識遺伝子を含まないｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ＴＫ−欠失ウイルスの精製が成功したことを表明した。
２．４  ＰＲＶ  ＨＮ１２０１株ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失ウイルス株の確認
ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子欠失の同定プライマーは上記と同じである。
ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失ウイルスと野生型ウイルスのウイルスゲノムを抽出し、ＰＣＲ同定を行い、プライマーは下記の通りであった。
ＴＫＤＣＦ：ｃｃｔａｃｇｇｃａｃｃｇｇｃａａｇａｇｃａ
ＴＫＤＣＲ：ｃｇｃｃｃａｇｃｇｔｃａｃｇｔｔｇａａｇａｃ
図５に示すように、野生型ウイルスで増幅したＰＣＲ産物のサイズが１５６６ｂｐであり、ＴＫ欠失ウイルスで増幅したＰＣＲ断片のサイズが７４２ｂｐである。
【実施例３】
【００４１】
（ＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ欠失ウイルス株の製造）
ＣＮ１０３７５６９７７Ａの実施例１の方法を参照して、ＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ欠失株を製造した。
【実施例４】
【００４２】
（ヘルペスウイルス遺伝子欠失株の病原性試験）
豚ヘルペスウイルス抗原抗体が陰性である７日齢の子ブタ２５頭を５頭／群でランダムに５群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄと空白対照群）に分け、群分けと攻撃（ウィルスチャレンジ）状況を表１に示す。
【表１】
0006368725.tif 000006
【００４３】
ウイルスを接種した後、毎日、子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察し、具体的な結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
0006368725.tif 000007
0006368725.tif 000008
【００４５】
上記結果から、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株は７日齢子ブタを死亡させる（１００％、５／５）が、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失させたＰＲＶ  ＨＮ１２０１は毒性が大幅に低減し、２頭のみの豚が体温上昇するだけであり、臨床症状は現れなかった。ｇＩ／ｇＥ遺伝子を欠失させたＰＲＶ  ＨＮ１２０１の毒性で、７日齢の子ブタは、ほとんど体温上昇、意気消沈等の臨床症状が現れ、残存毒性があることを証明しているが、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ遺伝子を欠失させたＰＲＶ  ＨＮ１２０１株は全く毒性がない。
【実施例５】
【００４６】
（豚ヘルペスウイルス遺伝子欠失生ワクチンの製造）
５．１、ワクチンウイルスの増殖
実施例１で製造したＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ欠失株、実施例２で製造したＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株、実施例３で製造したＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ欠失株のウイルス種を５×１０４倍で希釈した後、単層に成長したＳＴ細胞へ接種し、１時間吸着した後、２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液１０００ｍｌを混入し、３７℃の温室に６回転／時間の回転速度で回転培養した。８０％の細胞が病変した後、２回凍結融解し、ウイルスを獲得し、ウイルス力価を測定した。ウイルス液を低温で保存した。
５．２、保護剤の調製
１００ｍｌ脱イオン水に対して、ショ糖４０ｇ、ゼラチン８ｇを添加し、充分に溶解した後、高圧蒸気滅菌（１２１℃、３０ｍｉｎ）を行った。
５．３、ワクチンウイルス混濁液の配合
５．１で製造して保存していたウイルス液と５．２で製造した保護剤を１：１（体積比）で混合し、２．６  ｍｌ／ボットルで、滅菌したアンプールに分注し、凍結乾燥した。ワクチンは細菌や外来ウイルスにより汚染されるかどうかとチェックした結果、凍結乾燥前のウイルス含有量にほぼ一致する。実施例１で製造したＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ欠失株のバッチ番号は、２０１４０５０１であり、実施例２で製造したＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株のバッチ番号は２０１４０５０２であり、実施例３で製造したＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ欠失株バッチ番号は、２０１４０５０３である。
【実施例６】
【００４７】
（豚ヘルペスウイルス遺伝子欠失生ワクチンの免疫原性実験）
９日齢のＰＲＶ抗原抗体が陰性である子ブタ２５頭を５頭／群でランダムに５群に分け、表３に従って、実施例５で製造したワクチンを接種し、対照ワクチン群は、スペインＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＯＳ  ＨＩＰＲＡ，  Ｓ．Ａ．製の豚ヘルペスウイルス生ワクチン（Ｂａｒｔｈａ  Ｋ−６１株、バッチ番号：４２ＲＨ）を明細書の使用量に従って使用し、空白対照群は、１ｍｌ／頭でＤＭＥＭ培地を接種した。免疫してから２８日後攻撃し、攻撃量がＨＮ１２０１株豚ヘルペスウイルス１×１０７．０  ＴＣＩＤ５０／頭であり、攻撃後、毎日、子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察し（結果を表３に示す）、攻撃前、それぞれ試験群と対照群の子ブタを採血した。
【表３】
0006368725.tif 000009
【００４８】
免疫してから２８日後攻撃し、攻撃量が豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株１×１０７．０  ＴＣＩＤ５０／頭、１ｍｌ／頭であり、臨床症状と死亡状況を観察し、表５に示し、攻撃後、毎日、子ブタの体温を測定し、且つ臨床症状を観察した。
【００４９】
【表５】
0006368725.tif 000010
【００５０】
表５の結果から、実施例５により豚ヘルペスウイルス遺伝子欠失ワクチンを製造して子ブタを免疫した後、ウイルス感染（臨床症状が現れること）を防ぐことができ、子ブタを１００％（５／５）保護できたが、空白対照群の子ブタは攻撃してから５日後、全部死亡したので、三つの試験群で豚ヘルペスウイルス生ワクチンは優れた保護力を有し、優れた免疫保護と安全性を示すとともに、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋを欠失させたヘルペスウイルス株及びｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫを欠失させたヘルペスウイルス株はいずれも免疫原性に影響しないことを証明した。ｇＩ／ｇＥのみを欠失させたワクチンで免疫した後、体温上昇等の臨床症状が依然として現れるが、依然として優れた免疫原性を有する。一方、従来の商品化したワクチンは豚を完全には保護できない。
【実施例７】
【００５１】
（ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ株とＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株、ＨＮ１２０２株ヘルペスウイルス変異株の遺伝子欠失株の構築）
それぞれ、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ株とＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株（Ｘｉｕｌｉｎｇ  Ｙｕ，Ｚｈｉ  Ｚｈｏｕ，Ｄｏｎｇｍｅｉ  Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ，Ｃｈｉｎａ，２０１２  ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｅｉｄ  ｏｌ．２０，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１４）（出願者は、特許審査指南の規定により、特許出願日から公衆に２０年配布することを承諾する）、ＨＮ１２０２株（寄託番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３３５、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が２０１３年８月２６日である）をウイルス親株として、実施例１、２の方法を参照して、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ及びｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ遺伝子を欠失させて製造した弱毒株をそれぞれＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株、ＰＲＶＨＮ１２０２  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株と名づけ、ＰＣＲでウイルス親株と照合することにより、遺伝子欠失を証明した。
【実施例８】
【００５２】
（ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ株とＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株、ＨＮ１２０２株ヘルペスウイルス変異株弱毒株ワクチン組成物の製造）
実施例５．１の方法により、実施例７で製造した各弱毒ワクチン株を増殖し、体積比１：１で保護剤（１００ｍｌ脱イオン水に対してショ糖４０ｇ、ゼラチン８ｇを混入し、十分に溶解した後、高圧蒸気滅菌（１２１℃で３０ｍｉｎ）を行って得られるもの）を混入し、凍結乾燥させた。ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株のバッチ番号がＱ０１であり、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株のバッチ番号がＱ０２であり、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株のバッチ番号がＱ０３であり、ＰＲＶＨＮ１２０２  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株のバッチ番号がＱ０４である。
【実施例９】
【００５３】
（実施例７で製造したウイルス株の病原性試験）
実施例４の方法により病原性試験を行い、実験豚を５頭／群で５群に分け、それぞれ、実施例７で製造したＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤＴＫ  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株、ＰＲＶＨＮ１２０２  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株を１ｍｌ（１０７．０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）で点鼻接種した結果、各群の豚は何れも生存し、体温が正常し、臨床症状が出なかった。これは、ＴＫ／ｇＥ／ｇＩ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失させことにより、変異ヘルペスウイルス株の毒性が低減したことを証明する。
【実施例１０】
【００５４】
（実施例８で製造したワクチンの免疫原性試験）
実施例６の試験方法及び接種量により、実施例８で製造したワクチンに対して免疫原性試験を行い、同時に対照ワクチンである豚ヘルペスウイルス生ワクチンＨＢ−９８株（バッチ番号：１３０８０１１−１、中牧実業株式会社成都薬械厂）を接種し、免疫２８日後攻撃し、攻撃量が豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株１×１０７．０  ＴＣＩＤ５０／頭であり、臨床症状と死亡状況を観察し、攻撃した後、毎日、子ブタの体温を測定して臨床症状を観察し、その結果を表６に示す。
【００５５】
【表６】
0006368725.tif 000011
【００５６】
表６の結果から、実施例８により豚ヘルペスウイルスワクチンを製造して子ブタを免疫した後、ウイルス感染（臨床症状が現れること）を防ぐことができ、子ブタを１００％（５／５）保護できたが、ワクチン対照群でただ８０％（４／５）を保護し、空白対照群の子ブタは攻撃してから５日後、全部死亡したので、豚ヘルペスウイルス生ワクチンは優れた保護力を有することが分かった。また、従来の生ワクチンに対して、臨床症状がほとんどなく、優れた免疫保護を示す。
【実施例１１】
【００５７】
（異なるウイルス株ワクチンを免疫した後ｇＢ抗体をモニタする）
約１３日齢のＰＲＶ抗原抗体が陰性である豚１５頭を使用し、体重によって、５頭／群でランダムに３群に分けた。第１群〜第３群は、それぞれ、実施例５で製造したＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株（バッチ番号２０１４０５０２）のワクチン、スペインＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＯＳ  ＨＩＰＲＡ，  Ｓ．Ａ．製の豚オーエスキー病生ワクチン（Ｂａｒｔｈａ  Ｋ−６１、バッチ番号６６ＫＲ）とベーリンガーインゲルハイム動物保健（アメリカ）有限公司製の豚オーエスキー病生ワクチン（Ｋ−６１、バッチ番号１９５−Ｂ５９Ｂ）を、１ｍｌ／頭の免疫量（商品化ワクチンは明細書の剤量により免疫し、１頭分／頭であり；ＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株は１０６．０  ＴＣＩＤ５０／頭である）で免疫した。免疫後８日目、１０日目、１２日目、１４日目、２１日目に採血し、血清を分離した後、ｇＢ  ＥＬＩＳＡ抗体検出キットの明細書（Ｂｉｏｃｈｅｋ会社、バッチ番号ＦＳ５７６３、有効期限：２０１５．０１．０７）に基づき、ｇＢ抗体測定を行い、詳しい検出結果を下記表７に示す。
【００５８】
【表７】
0006368725.tif 000012
註１．ＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株（バッ
チ番号２０１４０５０２）のワクチン
0006368725.tif 000013
註２．ＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株（バッ
チ番号２０１４０５０２）のワクチン
0006368725.tif 000014
注：判定基準：陰性Ｓ／Ｐ値≦０．４９９、陽性Ｓ／Ｐ値≧０．５００
（結論）：
抗体検出結果から分かるように、ＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株で免疫してから１２日後、ｇＢ抗体は全部陽性に変わったが、比較例のワクチンで免疫してから２１日に、抗体はまだ全部陽性に変わっていなかった。ＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株は早めに免疫保護を生じることが可能なことが証明された。
【実施例１２】
【００５９】
（四つの遺伝子を欠失させた株のワクチンで免疫して攻撃した後ｇＥ抗体をモニタする）
約１３日齢のＰＲＶ抗原抗体が陰性である豚１５頭を使用し、体重によって、５頭／群でランダムに３群に分けた。第１群〜第３群は、それぞれ、実施例５で製造したＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株（バッチ番号２０１４０５０２）のワクチン、スペインＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＯＳ  ＨＩＰＲＡ，  Ｓ．Ａ．製の豚オーエスキー病生ワクチン（Ｂａｒｔｈａ  Ｋ−６１、バッチ番号６６ＫＲ）とベーリンガーインゲルハイム動物保健（アメリカ）有限公司製の豚オーエスキー病生ワクチン（Ｋ−６１、バッチ番号１９５−Ｂ５９Ｂ）を、１ｍｌ／頭の免疫量（商品化ワクチンは明細書の剤量により免疫し、１頭分／頭であり；本発明のＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株の免疫量は１０６．０  ＴＣＩＤ５０／頭である）で免疫した。免疫後２１日目に攻撃し、ＰＲＶ  ＨＮ１２０１を使用して攻撃し、攻撃量が１０７．０  ＴＣＩＤ５０／頭、１ｍｌ／頭であり、攻撃後の７日目〜１４日目毎日採血し、血清を分離した後、ｇＥ  ＥＬＩＳＡ抗体検出キットの明細書（ＩＤＥＸＸ会社、バッチ番号ＡＫ６５０、有効期限：２０１５．０６．１３）に基づき、ｇＥ抗体測定を行った結果、実施例５で製造したＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株（バッチ番号２０１４０５０２）のワクチン免疫群の豚は攻撃後１４日目にｇＥ抗体が依然として陰性である（Ｓ／Ｎ値が０．６０以下であれば、サンプルをＰＲＶ  ｇＥ抗体陽性と判定すべきである）が、商品化ワクチンで免疫した免疫群の豚は、攻撃後ｇＥ抗体が異なる程度で陽性に変わった。詳しい検出結果を下記表８に示す。
【００６０】
【表８】
0006368725.tif 000015
註１．ＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇｉ／ｇｅ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株（バッチ番号２０１４０５０２）のワクチン
0006368725.tif 000016
0006368725.tif 000017
註２．ＰＲＶ  ＨＮ１２０１  ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ／ＴＫ欠失株（バッチ番号２０１４０５０２）のワクチン
【００６１】
上記の実験結果から、本発明のワクチン株は従来の商用ワクチン株より優れた免疫原性を有し、免疫後より迅速に抗体を生じさせ、且つウイルスが豚体内での有効な増幅を抑制し、ｇＥ抗体が陰性を示すことがわかった。
【００６２】
以上の記載は単に本発明の好ましい実施例であり、本発明を限定するものではない。本発明の主旨と原則の範囲に行われる変更、等価置換、改良などはいずれも本発明の保護範囲に含まれる。
【図１】
0006368725.tif 000018
【図２】
0006368725.tif 000019
【図３】
0006368725.tif 000020
【図４】
0006368725.tif 000021
【図５】
0006368725.tif 000022
【配列表】
0006368725000001.app