(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現するＣＨＯ哺乳動物細胞において前記治療用タンパク質を産生する方法であって、
前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が前記治療用タンパク質の低力価をもたらし、
前記方法が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現を欠損し、前記治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されているＣＨＯ哺乳動物細胞を用いて、
ａ．前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
ｂ．工程ａにおいて培養した前記哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程
を含み、
前記哺乳動物細胞が、前記同族受容体の発現がこのように改変されていない細胞より少なくとも１．５倍多い治療用タンパク質を産生し、
前記治療用タンパク質が、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）タンパク質又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記哺乳動物細胞が機能的インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）の発現を欠損している、方法。
【請求項２】
前記ＣＨＯ哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が、ＲＮＡ干渉又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＨＯ哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が前記ＲＮＡ干渉技術を適用することによって達成され、前記方法が、
（ａ）二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を前記細胞内に導入する工程であって、前記ｄｓＲＮＡ分子が互いに相補的である少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列を含み、前記相補性の領域が３０ヌクレオチド長未満であり、前記ｄｓＲＮＡ分子が、前記細胞内に導入すると、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードする遺伝子の発現を少なくとも１０％阻害する工程、及び
（ｂ）前記組換え治療用タンパク質遺伝子の前記同族受容体をコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程（ａ）において産生された細胞を維持し、それにより前記細胞内の前記同族受容体遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡ干渉がｓｈＲＮＡ分子を使用して達成され、前記方法が、
（ａ）前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であるｓｈＲＮＡを前記細胞内に導入する工程であって、前記ｓｈＲＮＡが、前記細胞内に導入すると、前記同族受容体遺伝子の発現を少なくとも１０％阻害する、工程、及び
（ｂ）前記同族受容体遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程（ａ）において産生された細胞を維持する工程
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＨＯ哺乳動物細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１細胞又はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記同族受容体がＩＧＦ−１Ｒであり、前記治療用タンパク質がＩＧＦ−１又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、ｓｈＲＮＡの配列が、配列番号５、６、７、８、９及び１０からなる群から選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡ干渉が二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を使用して達成され、前記同族受容体が配列番号４４のＩＧＦ−１Ｒであり、前記治療用タンパク質がＩＧＦ−１又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の遺伝子配列が配列番号１及び３からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記同族受容体がＩＧＦ−１Ｒであり、前記治療用タンパク質がＩＧＦ−１又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記ＩＧＦ−１Ｒの発現の欠損がジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によって達成される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記治療用タンパク質が、配列番号１６のヒトインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）タンパク質又はそのバリアントである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ａ．前記インスリン成長因子１受容体の発現を欠損しているＣＨＯ哺乳動物細胞を産生する工程、
ｂ．工程ａ．の細胞を、ＩＧＦ−１又はその生物学的活性を保持するバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
ｃ．形質転換されている工程ｂ．の細胞を選択する工程、
ｄ．工程ｃ．において選択した細胞を、ＩＧＦ−１タンパク質又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で培養する工程、
ｅ．工程ｄにおいて培養した哺乳動物細胞からＩＧＦ−１タンパク質又はそのバリアントを収集する工程
を含み、
前記哺乳動物細胞が、工程ａに記載されているように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも１．５倍多いＩＧＦ−１又はその生物学的活性を保持するバリアントを産生し、工程ａ．及びｂ．の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程を同時に実施することもできる、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療用タンパク質が工業的製造規模で産生される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
組換え治療用タンパク質を産生するための、ＣＨＯ哺乳動物細胞を含む組成物であって、前記細胞が前記治療用タンパク質の内因性同族受容体の発現を欠損しており、前記同族受容体の発現を欠損していない細胞内の前記同族受容体への前記組換え治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び／又は前記組換え治療用タンパク質の低力価をもたらし、
前記組換え治療用タンパク質が、インスリン様成長因子１タンパク質又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記同族受容体がインスリン様成長因子１受容体である、組成物。
【請求項１３】
前記治療用タンパク質が、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８及び２９からなる群から選択されるヒトインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）タンパク質バリアントである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞系において組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質を産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療適用に使用するためのタンパク質様酵素、抗体又はホルモンを産生する必要性は絶えず増加している。現在使用されている最新の異種タンパク質産生系には、大腸菌（E.coli）、酵母、ウイルス、真菌及び昆虫細胞のような原核及び真核細胞系が含まれる。グリコシル化（及び工業的規模の産生が必要とされる場合）などの翻訳後又は翻訳周辺（peri-translational）改変を必要とする組換えタンパク質を産生するために、非常に多くの場合、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）、ミドリザル（Cercopithecus aethiops）、ホモサピエンス（Homo sapiens）、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）、ハツカネズミ（Mus musculus）及びオナガザル種（Chlorocebus species）由来の細胞を含む哺乳動物細胞系が使用される。哺乳動物細胞系は治療用タンパク質及び抗体のための慣用の産生系となっている。前記細胞は、最近、広範囲に特徴付けられており、それらは極めて高い産生レベルに到達することができ、感染性又はウイルス様粒子を含まないようにすることができ、バイオリアクターにおいて非常に高密度まで成長でき、それらは遺伝子操作され得、形質転換され得る。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、適切なグリコシルトランスフェラーゼのトランスフェクションによってヒトグリカンプロファイルに類似するように操作され得る。組換え産生された成長因子は、治療適用において既に広範に使用されているか、又は新規治療の開発のための有望な候補である。しかしながら、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞株における成長ホルモンの発現は細胞成長阻害及び低力価をもたらし得る。
【０００３】
近い将来において、ますます「非抗体」タンパク質型が製薬会社のパイプラインの部分になるであろう。しかしながら、大規模での成長因子、ホルモン、神経伝達物質及びサイトカインのような細胞外シグナル伝達分子の発現は、低い力価をもたらす成長阻害に起因して哺乳動物細胞株において可能であり得ない。従って、工業的規模において成長因子及び他の治療用タンパク質を産生する適切な方法を得ることが明確に望まれる。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の主題は、治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において前記治療用タンパク質を産生する方法であって、前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が治療用タンパク質の低力価をもたらし、その方法が、
ａ．前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で治療用タンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程であって、細胞が前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している、工程、及び
ｂ．前記哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法に関する。
【０００５】
本開示の別の主題は、前記治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において治療用タンパク質を産生する方法であって、前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が治療用タンパク質の低力価をもたらし、その方法が、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損し、治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されている哺乳動物細胞を用いて、
ｃ．治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
ｄ．工程ａにおいて培養した哺乳動物細胞から治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法に関する。
【０００６】
本開示の別の実施形態において、方法は、組換え治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において前記組換え治療用タンパク質を異種産生することに関し、前記同族受容体への前記組換え治療用タンパク質の結合が前記哺乳動物細胞の成長遅延及び組換え治療用タンパク質の低力価をもたらし、その方法は、前記組換え治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損し、構成的又は誘導プロモーターの制御下で異種組換え治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されている哺乳動物細胞を用いて、
ｅ．組換え治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
ｆ．工程ａにおいて培養した哺乳動物細胞から組換え治療用タンパク質を収集する工程
を含む。
【０００７】
特定の実施形態において、上記のように組換え治療用タンパク質であり得る、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞は、同族受容体の発現がこのように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも１．５倍、又は２倍、又は３倍、又は４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は１０倍又はそれより多い治療用タンパク質を産生する。
【０００８】
本開示の別の実施形態において、組換え治療用タンパク質であり得る、上述の治療用タンパク質は成長因子である。
【０００９】
さらに別の実施形態において、成長因子はインスリン様成長因子１タンパク質又はそのバリアントであり、本開示は、哺乳動物細胞におけるインスリン様成長因子１タンパク質又はそのバリアントを産生する方法であって、前記哺乳動物細胞が機能的インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）の発現を欠損し、その方法が、
ａ．ＩＧＦ−１又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
ｂ．工程ａにおいて培養した哺乳動物細胞からＩＧＦ−１又はそのバリアントを収集する工程
を含み、前記哺乳動物細胞が、ＩＧＦ１Ｒの発現がこのように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも１，５倍、又は２倍、又は３倍、又は４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は１０倍又はそれより多いＩＧＦ−１又はそのバリアントを産生する、方法に関する。
【００１０】
本開示の別の実施形態において、組換え治療用タンパク質、例えばインスリン様成長因子１受容体であり得る、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞は遺伝子改変されており、前記同族受容体の発現の欠損は、ＲＮＡ干渉又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される。
【００１１】
本開示の特定の実施形態において、組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質の同族受容体は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によってノックアウトされている。
【００１２】
別の実施形態において、本開示は、哺乳動物細胞において、組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質の同族受容体の発現の欠損が、ＲＮＡ干渉を適用することによって達成され、その方法が、
（ａ）二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を前記細胞内に導入する工程であって、ｄｓＲＮＡが互いに相補的である少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖が、治療用タンパク質の同族受容体をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列を含み、前記相補性の領域が３０ヌクレオチド長未満であり、前記ｄｓＲＮＡが、前記細胞内に導入すると、組換え治療用タンパク質の同族受容体をコードする遺伝子の発現を少なくとも１０％阻害する、工程、及び
（ｂ）組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質の同族受容体をコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程（ａ）において産生された細胞を維持し、それにより細胞内の前記同族受容体遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、上記方法の１つに関する。
【００１３】
本開示の特定の実施形態において、前記治療用タンパク質の同族受容体はインスリン様成長因子１受容体であり、方法は、
（ａ）二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を前記細胞内に導入する工程であって、ｄｓＲＮＡが互いに相補的である少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖が、前記哺乳動物細胞のＩＧＦ−１ＲをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列を含み、前記相補性の領域が３０ヌクレオチド長未満であり、前記ｄｓＲＮＡが、前記細胞内に導入すると、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、工程、及び
（ｂ）ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程（ａ）において産生された細胞を維持し、それにより細胞内のＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の発現を阻害する工程
を含む。
【００１４】
本開示の上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、上記の方法の別の特定の実施形態において、ＲＮＡ干渉はｓｈＲＮＡ分子を使用することによって達成され、方法は、
（ａ）組換え治療用タンパク質の同族受容体をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であるｓｈＲＮＡをコードするベクターを前記細胞内に導入する工程であって、前記ｓｈＲＮＡが、前記細胞内に導入すると、前記同族受容体遺伝子の発現を少なくとも１０％阻害する、工程、及び
（ｂ）前記同族受容体遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程（ａ）において産生された細胞を維持する工程
を含む。
【００１５】
特定の態様において、本開示は、哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）、ミドリザル（Cercopithecus aethiops）、ホモサピエンス（Homo sapiens）、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）、ハツカネズミ（Mus musculus）及びオナガザル種（Chlorocebus species）細胞からなる群から選択される、上記方法に関する。別の態様において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、Ｈｅｌａ、ＢＨＫ、ＨＥＫ、ＮＳ０、Ｃ１２７、ハイブリドーマ、ＰｅｒＣ６（登録商標）、ＣＡＰ及びＳｐ−２／０細胞からなる群から選択される。特定の態様において、上記の開示された方法に使用される哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、前記ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の派生体、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１細胞の派生体、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−ＳＳＦ３細胞又はＣＨＯ−Ｓ細胞の派生体であってもよい。
【００１６】
さらなる実施形態において、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞におけるインスリン様成長因子１受容体の発現の欠損は小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を使用することによって達成され、前記ｓｈＲＮＡ分子の配列は、配列番号５、６、７、８、９及び１０からなる群から選択される。
【００１７】
さらなる実施形態において、上記のインスリン様成長因子１受容体の発現の欠損は、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を使用することによって達成され、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列は配列番号１及び３からなる群から選択される配列を含む。
【００１８】
本開示はさらに、配列番号１及び３からなる群から選択されるｓｉＲＮＡのセンス鎖を含むｄｓＲＮＡ分子に関する。さらなる態様において、本開示は、配列番号５、６、７、８、９及び１０からなる群から選択される配列を含むｓｈＲＮＡ分子に関する。
【００１９】
さらに別の実施形態において、インスリン様成長因子１受容体の発現の欠損は標的遺伝子組換え技術を使用してノックアウト細胞を産生することによって達成される。
【００２０】
従って、本開示はまた、同族受容体がＩＧＦ−１Ｒであり、治療用タンパク質がＩＧＦ−１又はそのバリアントであり、ＩＧＦ−１Ｒの発現の欠損がジンクフィンガーヌクレアーゼを使用することによって達成される、上記方法にも関する。
【００２１】
さらなる実施形態において、本開示は、インスリン様成長因子１タンパク質がヒトインスリン様成長因子１タンパク質（配列番号１６）又はそのバリアントである、上記方法に関する。
【００２２】
別の実施形態において、上記に開示されている方法は、
ａ．前記細胞内で産生されるべき目的の治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
ｂ．工程ａ．の細胞を、目的の治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
ｃ．形質転換されている工程ｂ．の細胞を選択する工程、
ｄ．工程ｃ．において選択した哺乳動物細胞を、目的の前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程、及び
ｅ．工程ｄにおいて培養した哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程
を含み、別法として、工程ａ．及びｂ．の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程は同時に実施することもできる。
【００２３】
さらに特定の実施形態において、上記に開示されている方法は、ＩＧＦ−１、例えばヒトＩＧＦ−１（配列番号１６）又はそのバリアント（例えば配列番号２１〜２９）の産生であって、
ａ．インスリン様成長因子１受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
ｂ．工程ａ．の細胞を、ＩＧＦ−１、例えばヒトＩＧＦ−１又はそのバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
ｃ．形質転換されている工程ｂ．の細胞を選択する工程、
ｄ．工程ｃ．の哺乳動物細胞を、ＩＧＦ−１タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程、及び
ｅ．工程ｄにおいて培養した哺乳動物細胞から前記ＩＧＦ−１タンパク質又はそのバリアントを収集する工程
を含み、別法として、工程ａ．及びｂ．の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程は同時に実施することもでき、
前記哺乳動物細胞は、ＩＧＦ−１Ｒの発現がこのように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも１，５倍、又は２倍、又は３倍、又は４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は１０倍又はそれより多いＩＧＦ−１又はそのバリアントを産生する、産生に関する。
【００２４】
別の態様において、本開示は、成長因子、特にＩＧＦ−１タンパク質又はヒトＩＧＦ−１（配列番号１６）又はそのバリアント（例えば配列番号２１〜２９）であり得る、治療用タンパク質が工業的製造規模で産生される、上記の方法に関する。
【００２５】
本開示はさらに、インスリン様成長因子１タンパク質、例えばヒトＩＧＦ−１（配列番号１６）又はそのバリアント（例えば配列番号２１〜２９）の発現が、このように改変されていない同じ種類の細胞と比較して少なくとも１，５倍、又は２倍、又は３倍、又は４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は１０倍又はそれより多いように遺伝子改変されており、前記遺伝子改変がＩＧＦ−１受容体の発現の欠損をもたらす、哺乳動物細胞を提供する。
【００２６】
本開示の上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、本開示の別の態様において、上記の哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞、ミドリザル（Cercopithecus aethiops）細胞、ホモサピエンス（Homo sapiens）細胞、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）細胞、ハツカネズミ（Mus musculus）細胞及びオナガザル種（Chlorocebus species）細胞である。
【００２７】
特定の実施形態において、上記の哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、特にＣＨＯ−Ｋ１細胞の派生体、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１細胞の派生体、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−ＳＳＦ３細胞又はＣＨＯ−Ｓ細胞の派生体であり、前記細胞におけるＩＧＦ−１受容体の発現の欠損はＲＮＡ干渉又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される。
【００２８】
別の態様において、本開示は、組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質を産生するための哺乳動物細胞の使用であって、前記細胞が前記治療用タンパク質の内因性同族受容体の発現を欠損しており、前記同族受容体の発現を欠損していない細胞内の前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び／又は治療用タンパク質の低力価をもたらす、使用に関する。
【００２９】
本開示の別の実施形態は、組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質が成長因子である、上記の使用に関する。
【００３０】
本開示の別の特定の実施形態は、成長因子がインスリン様成長因子１タンパク質又はそのバリアントであり、同族受容体がインスリン様成長因子１受容体である、上記の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】Ａ：細胞成長：バイオリアクターでの実施における組換え抗体を発現するＣＨＯ−Ｋ１派生細胞（太字）及びｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ（配列番号３５）を発現するＣＨＯ−Ｋ１派生細胞（点線）の生存細胞密度（ＶＣＤ）。Ｂ：細胞生存率：バイオリアクターでの実施における生存細胞の百分率（太線、ＣＨＯ−Ｋ１派生クローンを産生する抗体、点線、ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ発現クローン）。
【図２】Ａ：細胞成長：実線はＣＨＯ−Ｋ１派生細胞の生存細胞密度（ＶＣＤ）を示す。ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ又はｈＩＧＦ−１との共培養の間、細胞成長は阻害される（それぞれ破線及び点線）。３回の生物学的反復の平均を示す（ｈＩＧＦ−１急上昇を除く；エラーバー：標準誤差）。ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ／ｈＩＧＦ−１は０日目に急上昇した（急上昇実験）。Ｂ：細胞生存率：実線はＣＨＯ−Ｋ１派生細胞の細胞生存率を示し、破線、点線のそれぞれはｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ／ｈＩＧＦ−１急上昇後の低下した細胞生存率を示す。３回の生物学的反復の平均を示す（ｈＩＧＦ−１急上昇を除く；エラーバー：標準誤差）。細胞生存率は、細胞をｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ／ｈＩＧＦ−１と同時にインキュベートした場合、２日早く下降する。細胞成長又は細胞生存率においてｈＩＧＦ−１とｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔとの差異は検出できなかった。
【図３】ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞の生存細胞密度（ＶＣＤ）（太線）及びｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔとの共培養の間の低下した細胞成長（点線）を示す。ＩＧＦ−１Ｒチロシンキナーゼ阻害剤ＮＶＰＡＥＷ５４１（アスタリスクを有する太線）を加えた後、細胞成長はわずかに低下する。ＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔとの共培養及びＩＧＦ−１Ｒチロシンキナーゼ阻害剤の添加により、さらなる細胞成長阻害は生じなかった（アスタリスクを有する点線）（細胞を、阻害剤を結合させる時間まで、ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔの急上昇前にＮＶＰＡＥＷ５４１と１時間インキュベートした）。
【図４】ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡ発現を、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来親細胞におけるｓｉＲＮＡトランスフェクション後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量した。トランスフェクション後４日目に、スクランブルｓｉＲＮＡ（１００％一致）でトランスフェクトした細胞と比較した、ＩＧＦ−１Ｒに対して２つの異なるｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡレベルの百分率。試料のＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡレベルを正規化した（ＧＡＰＤＨ）。
【図５】ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡ発現を、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来親細胞（プールレベル）における安定なｓｈＲＮＡトランスフェクション及びピューロマイシン選択後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量した。５０ｍｌ細胞培養の培養５日目に、スクランブルｓｈＲＮＡ（１００％一致）でトランスフェクトした細胞と比較した、ＩＧＦ−１Ｒに対して６つの異なるｓｈＲＮＡでトランスフェクトした細胞のＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡレベルの百分率。試料のＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨに正規化した。ｓｈＲＮＡ４は、ＩＧＦ−１Ｒ発現を抑制するのに最適な効果を示した。
【図６】５０ｍｌバッチの培養５日目における、ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔの存在及び非存在下でのＩＧＦ−１Ｒノックダウンクローン及びＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来対照クローン（対照）の生存細胞密度（ＶＣＤ）が強調される。ＩＧＦ−１Ｒノックダウンクローン（ｓｈＲＮＡ；ｎ＝１２の最適ｓｈＲＮＡクローン）は、親ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来対照クローン（ｎ＝７）と比較してｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔの存在下で改善された細胞成長を示す（エラーバー：標準誤差）。
【図７】太線において、親ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞の生存細胞密度（ＶＣＤ）、円を有する太線において、ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔとの共培養の間の低下した細胞成長を示す。破線により、３つのＩＧＦ−１Ｒ  ＫＯクローンの細胞成長平均を示す（エラーバー：標準誤差）。細胞成長は野生型親ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞と比較してわずかに改善した。ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔとの共培養により、少しのみの細胞成長阻害が生じ、細胞成長はｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ共培養をしていない親ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞と同様である。
【図８】太線において、親ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞の細胞成長、円を有する太線において、ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔとの共培養の間の低下した細胞成長を示す。破線により、２つのＩＧＦ−１Ｒ  ＫＯクローンの細胞成長平均を示す（エラーバー：標準誤差）。細胞成長は野生型親ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞と比較して改善する。ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔとの共培養により、１つのＫＯクローンについて細胞成長阻害は生じず、第２のＩＧＦ−１Ｒ  ＫＯクローンについて少しの細胞成長阻害が生じた。
【図９】１４日のバッチ培養のＩＧＦ−１−Ｆｃ融合タンパク質力価を示す（プールレベル）。５つの異なる細胞株における７つの異なるＩＧＦ−１−Ｆｃ融合タンパク質の発現を強調する。ＩＧＦ−１−Ｆｃ融合タンパク質の発現は、ＣＨＯ−Ｋ１又はＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生野生型細胞株と比較して、ＣＨＯ−Ｋ１派生ＩＧＦ−１Ｒ−ＫＯ細胞株、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生ＩＧＦ−１Ｒ−ＫＯ細胞株及びＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生ｓｈＲＮＡ（ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲの発現は低下した）細胞株において５〜２０倍増加した。
【図１０】５０ｍｌバッチ培養の１４日目における、クローンのＩＧＦ−１−Ｆｃ融合タンパク質力価。ＩＧＦ−１−Ｆｃ融合タンパク質の力価：１５個の最適なＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生ＩＧＦ−１Ｒ−ＫＯクローンにおけるｈＩＧＦ−１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ａは、ＩＧＦ−１−Ｆｃ融合タンパク質：ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生野生型細胞クローンにおけるｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Δ１−３、Ｒ３７Ａ、Δ７１−７２、Ｒ７７Ｑ−ｆｃドメインの力価と比較して約６〜７倍高かった。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
一般的定義
本発明をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明を通して記載される。
【００３３】
約：「約」という用語は、近似的、ほぼ、およそ又はその付近を意味するために本明細書に使用される。「約」という用語が、数値範囲と併せて使用される場合、それは、数値より上及び下の境界を拡大することによって範囲を示すという変更である。一般に、「約」という用語は、３０パーセント、好ましくは２０パーセントより上又は下（多い又は少ない）の分散によって、述べられている値より上及び下に数値を変更するために本明細書に使用される。本明細書に使用される場合、「又は」という単語は特定のリストの任意の１つの要素を意味する。
【００３４】
同族受容体：本明細書に使用される場合、例えば異種組換え治療用タンパク質の「同族受容体」という用語は、哺乳動物細胞（前記治療用タンパク質の発現に使用される）の内因性受容体を指し、異種組換え治療用タンパク質は前記受容体のリガンドである。つまり、同族受容体は異種組換え治療用タンパク質に特異的に結合し、その結合は前記細胞内で生理反応を誘発する（例えばシグナル伝達反応を誘導する）。
【００３５】
含む：「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなってもよいか、又は追加のもの、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。
【００３６】
所与の遺伝子の発現の欠損：「所与の遺伝子の発現の欠損」という語句は、遺伝子操作により、細胞内の特定の遺伝子が低下した発現レベルを示す状況を指す。発現レベルは、（ｉ）ｍＲＮＡの量が前記遺伝子から転写される場合又は（ｉｉ）タンパク質の量が前記遺伝子によってコードされる場合又は（ｉｉｉ）遺伝子操作した細胞においてタンパク質の活性が前記遺伝子によってコードされる場合に低下し、遺伝子操作した細胞は、誘導された又は自発的な変異を含み、遺伝子操作していない同じ種類の細胞における前記遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の量／活性より少ない。「欠損」及び「低下」という用語は交換可能に使用され、遺伝子発現のレベルが、遺伝子操作していない同じ種類の細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較して、完全な消滅（例えば同型遺伝子ノックアウト）から１０％、２０％、又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は９０％、又は９５％の低下又はさらにそれより多い低下（例えば異型ノックアウト、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡアプローチ）の範囲である状況を含み、発現レベルはＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルを決定することによって測定される。所与の遺伝子の発現の欠損はまた、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質が、非機能的形態において又は機能障害を有するが、正常なレベルで発現される状況を指す。
【００３７】
異種：本明細書に使用される場合、組換えタンパク質に関連する場合、「異種」という用語は、細胞が由来する種が、ポリペプチドが由来する種と同じではないことを示す。例えば、組換え治療用タンパク質は、タンパク質がヒトアミノ酸配列を有し、前記タンパク質がＣＨＯ細胞において発現される場合、異種組換え治療用タンパク質である。核酸配列に対して「異種」とは、天然でライゲーションされていない、又は天然で異なる位置にライゲーションされている核酸配列（例えばプロモーター）にライゲーションされるヌクレオチド配列も指す。さらに、核酸配列（例えばプロモーター配列）の文脈において、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞に対する「異種」という語句は、前記核酸配列が異なる生物（例えば、非ヒト生物において特定の遺伝子の発現を駆動するために使用されるヒトプロモーター）に由来することを示す。
【００３８】
「阻害」及び「遅延」という用語は、本発明の文脈において交換可能に使用され、哺乳動物細胞成長及び／又は哺乳動物細胞のタンパク質産生が異種タンパク質の発現の結果としてマイナスの影響を及ぼす状況を含む。それ故、細胞成長阻害又は遅延は、例えば、特定の培養時間にわたる細胞培養物中の生存細胞の数、細胞の生存率、全体又は個々のタンパク質の最大到達可能細胞密度及び／又は産生率が、形質転換されていない親細胞株と比較してトランスジェニック細胞において低下している状況を指す。
【００３９】
工業的製造規模：哺乳動物細胞における異種組換えタンパク質産生の文脈において「工業的製造規模」という用語は、バッチ、フェドバッチ又は灌流培養のために使用される従来又はエアリフトバイオリアクターのようなバイオリアクター産生システムを指す。バイオリアクターは、パイロットスケールリアクターについて５０リットル〜２，０００リットル、エアリフトバイオリアクターについて２，０００リットル〜５，０００リットル、従来のステンレス鋼撹拌式バイオリアクターについて最大２５，０００リットルの範囲である。大規模でのポリペプチドの産生は、例えば、ウェーブ、ガラス又はステンレス鋼バイオリアクターにおいて行われてもよい。その目的のために、通常、単一の凍結バイアル、例えばＭａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ製のバイアルから開始して細胞を増殖させる。細胞を解凍し、いくつかの段階で増殖させる。異なる規模のバイオリアクターに適切な量の細胞を接種する。細胞密度は供給溶液及び添加剤をバイオリアクターに加えることによって増加し得る。細胞は長時間高い生存率で維持する。数百ミリグラム／リットルから数グラム／リットルまでの範囲のリアクターにおける産生力価が大規模で達成される。精製は、親和性、イオン交換、疎水性相互作用又はサイズ排除クロマトグラフィー工程を含み得る、標準的なクロマトグラフィー方法論によって行われ得る。バイオリアクターのサイズは最終規模において最大で数千リットル体積であり得る（例えば、F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398も参照のこと）。上記のシステムにおいて産生されるタンパク質の量は、通常、１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの範囲である。工業的製造規模は、（ｉ）培養時間の間、最大２．５×１０７細胞／ｍｌの細胞の成長、（ｉｉ）２００時間超の時間にわたる細胞の培養、それによる維持、（ｉｉｉ）９０％超の細胞生存率を可能にする。
【００４０】
インスリン様成長因子１タンパク質又はそのバリアント：「インスリン様成長因子１タンパク質又はそのバリアント」という語句は、インスリン様成長因子−１遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、特に好ましいものは、ヒトインスリン様成長因子１（ｈＩＧＦ−１）タンパク質及びそのバリアントである。ＩＧＦ−１タンパク質バリアントはＩＧＦ−１野生型配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なるタンパク質であり、「野生型配列」という用語は、少なくとも１つの天然に存在する生物において利用可能なポリペプチド若しくは遺伝子配列又はヒトにより変化、変異若しくは別様で操作されていないポリペプチド若しくは遺伝子配列を指す。
【００４１】
ＩＧＦ−１バリアントはまた、ペプチドリーダー配列を含むＩＧＦ−１前駆タンパク質又はｐｒｏ−ＩＧＦ−１タンパク質である。ＩＧＦ−１バリアントはまた、ＩＧＦ−１タンパク質を含む融合タンパク質、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域に融合したＩＧＦ−１タンパク質を含むタンパク質である。ＩＧＦ−１バリアントの例は、とりわけ、特許出願ＷＯ０５０３３１３４（stabilized IGF-1 protein fused to an immunoglobulin Fc region）及びＷＯ２００７／１４６６８９（stabilized IGF-1 precursor proteins）に開示されている。上記のＩＧＦ−１バリアントは、このようなタンパク質が野生型ＩＧＦ−１の機能的等価物としてみなされ得るという意味でその生物活性を保持する。
【００４２】
ＩＧＦ−１タンパク質に関する機能的等価物は、天然又は人工変異を含むＩＧＦ−１タンパク質として理解されなければならない。変異は、ＩＧＦ−１タンパク質の生物活性を減少しない１つ又は複数の核酸の挿入、欠失又は置換であってもよい。少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％超の同一性、非常に特に好ましくは１００％未満であるが、少なくとも９８％の同一性を有する機能的等価物は、ＩＧＦ−１野生型タンパク質、例えばヒトＩＧＦ−１タンパク質（配列番号１６）と同一である。上記の融合タンパク質の場合、１００％同一性はこのような融合タンパク質のＩＧＦ−１部分に基づいてのみ定義される。インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、細胞がそれらの生理環境で連絡するために使用する複合系の部分である。この複合系（しばしばインスリン様成長因子軸と称される）は、２つの細胞表面受容体（ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＧＦ−２Ｒ）、２つのリガンド（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２）、６つの高親和性ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）のファミリー及び関連するＩＧＦＢＰ分解酵素（プロテアーゼ）からなる。この系は、正常な生理の調節だけでなく、多くの病理学的状態にも重要である（Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003）。ＩＧＦ軸は細胞増殖の促進及び細胞死（アポトーシス）の阻害において役割を果たすことが示されている。ＩＧＦ−１はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）による刺激の結果として肝臓によって主に分泌される。ヒトの身体におけるほとんど全ての細胞、特に筋肉、軟骨、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚及び肺における細胞は、ＩＧＦ−１による影響を受ける。インスリン様効果に加えて、ＩＧＦ−１はまた、細胞成長を調節できる。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２はＩＧＦ結合タンパク質として知られている遺伝子産物のファミリーによって調節される。これらのタンパク質は、ＩＧＦ受容体への結合を阻止することによってＩＧＦ作用を阻害すること、及び受容体への送達を補助し、血流中のＩＧＦ半減期を増加させることによってＩＧＦ作用を促進することの両方を含む複雑な手段でＩＧＦ作用を調節するのに役立つ。少なくとも６つの特性付けされた結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）が存在する。ＩＧＦ−１は広範囲の治療用途に使用される。メカセルミン（商標名Ｉｎｃｒｅｌｅｘ（商標））は成長阻害の治療に承認されているＩＧＦ−１の合成類似体である。いくつかの会社が、１型糖尿病、２型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、重度の熱傷及び筋強直性ジストロフィーを含む、種々のさらなる適応症について臨床試験においてＩＧＦ−１を評価している。
【００４３】
細胞内への導入：核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を指す場合、「細胞内への導入」とは、基本的に形質転換又はトランスフェクションのプロセスを指す。ｄｓＲＮＡを指す場合、「細胞内への導入」はまた、当業者により理解されるように、細胞内へのｄｓＲＮＡの摂取又は吸収を促進することを意味することができる。ｄｓＲＮＡの吸収又は摂取は、補助されていない拡散性又は活性のある細胞プロセスを介して、又は助剤若しくは装置によって行われ得る。
【００４４】
哺乳動物細胞：開示されている方法の文脈において「哺乳動物細胞」という用語は、工業的製造規模でタンパク質産生に適切である細胞を指す。これらの細胞は当業者に周知であり、例えば、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）、ミドリザル（Cercopithecus aethiops）、ホモサピエンス（Homo sapiens）、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）、ハツカネズミ（Mus musculus）及びオナガザル種（Chlorocebus species）に由来する。それぞれの細胞株は、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ細胞（サルの腎臓（アフリカミドリザル）に由来する細胞株、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザルから抽出された腎臓上皮細胞）、Ｈｅｌａ細胞（この株はＨｅｎｒｉｅｔｔａ  Ｌａｃｋｓから得た子宮頸癌細胞に由来した）、ＢＨＫ細胞（ベビーハムスター腎臓細胞、ＨＥＫ細胞（ヒト胎児腎臓）、ＮＳ０細胞（マウス骨髄腫細胞株）、Ｃ１２７細胞（非腫瘍形成性マウス細胞株）、ＰｅｒＣ６（登録商標）細胞（ヒト細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌ）、ＣＡＰ細胞（ＣＥＶＥＣ’ｓ  Ａｍｎｉｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）及びＳｐ−２／０細胞（マウス骨髄腫細胞）として知られている。
【００４５】
ＲＮＡ干渉：「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」という用語は当該分野において周知であり、標的遺伝子に相補的な領域を有する「ｓｉＲＮＡ」又は「低分子干渉リボ核酸」による細胞内の１つ又は複数の標的遺伝子の阻害を意味すると一般に理解される。ＲＮＡｉを媒介するその能力についてｓｉＲＮＡを試験するために種々のアッセイが当該分野において知られている（例えば、Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213を参照のこと）。遺伝子発現に対する本発明に係るｓｉＲＮＡの効果は、典型的に、例えば本明細書に記載されているｓｉＲＮＡ分子で処理されていない細胞と比較して少なくとも１０％、３０％、５０％、９０％、９５％又は９９％阻害される標的遺伝子の発現を生じる。
【００４６】
本発明に係る「ｓｉＲＮＡ」又は「低分子干渉リボ核酸」は、以下の態様を含む、当該分野において知られている意味を有する：ｓｉＲＮＡは生理的条件下で相補領域と一緒にハイブリダイズするリボヌクレオチドの二本鎖からなる。鎖は分離しているが、特定の実施形態においてそれらは分子リンカーによって結合されてもよい。個々のリボヌクレオチドは、改変されていない天然に存在するリボヌクレオチド、改変されていない天然に存在するデオキシリボヌクレオチドであってもよく、又はそれらは本明細書のいずれかの場所に記載されているように化学的に改変若しくは合成されてもよい。
【００４７】
本発明に係るｓｉＲＮＡ分子は標的遺伝子のｍＲＮＡの領域と実質的に同一である二本鎖領域を含む。標的遺伝子の対応する配列と１００％同一性を有する領域が適切である。この状態は「完全に相補的」と称される。しかしながら、領域はまた、標的化されるｍＲＮＡの領域の長さに応じて、標的遺伝子の対応する領域と比較して１つ、２つ又は３つのミスマッチを含有してもよく、それ自体が完全に相補的でなくてもよい。一実施形態において、開示されている方法に使用されるＲＮＡ分子は１つの所与の遺伝子を特異的に標的化する。所望のｍＲＮＡのみを標的化するために、ｓｉＲＮＡ試薬は、標的ｍＲＮＡと１００％相同性及び細胞又は生物に存在する全ての他の遺伝子に対して少なくとも２つのミスマッチしたヌクレオチドを有し得る。特異的標的配列の発現を効果的に阻害するために十分な配列同一性を有するｓｉＲＮＡを分析し、識別する方法は当該分野において知られている。配列同一性は当該分野において知られている配列比較及びアラインメントアルゴリズム（Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991及び本明細書に引用されている参考文献を参照のこと）及び例えば、デフォルトパラメータを使用してＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムに実装されているＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）によってヌクレオチド配列間の相違の百分率を計算することによって最適化され得る。
【００４８】
ＲＮＡｉ試薬の効果に影響を与える別の要因は標的遺伝子の標的領域である。ＲＮＡｉ試薬による阻害に効果的な標的遺伝子の領域は実験によって決定され得る。適切なｍＲＮＡ標的領域はコード領域である。また、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ及びスプライス部位などの非翻訳領域も適切である。例えば、Elbashir S.M. et al, 2001 EMBO J., 20, 6877-6888に記載されているトランスフェクションアッセイがこの目的のために実施されてもよい。多くの他の適切なアッセイ及び方法が当該分野において存在し、それらは当業者に周知である。
【００４９】
標的と相補的なｓｉＲＮＡの領域の長さは、本発明によれば、１８〜１００ヌクレオチド、１８〜２５ヌクレオチド、１８〜２２ヌクレオチド又は１９ヌクレオチドであってもよい。対応する標的領域に対してミスマッチが存在する場合、相補領域の長さはいくらか長いことが一般に必要とされる。
【００５０】
ｓｉＲＮＡは、オーバーハング末端（標的に相補的であってもよく、又はなくてもよい）又は標的遺伝子ではないが、それ自体に相補的なさらなるヌクレオチドを有してもよいので、ｓｉＲＮＡの各々の分離鎖の全長は、１８〜１００ヌクレオチド、１８〜４９ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド又は１８〜２５ヌクレオチドであってもよい。
【００５１】
小ヘアピンＲＮＡ又は短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用され得る密接なヘアピンターンを生じるＲＮＡの配列である。小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）はインビボで転写され得、ｓｉＲＮＡと同様の対応するｍＲＮＡの分解を引き起こし得る（Shi, 2003）。これらの開発は、ｓｉＲＮＡ二本鎖又はｓｈＲＮＡを発現するベクター（小ヘアピンＲＮＡ）が、例えば受容体をコードする遺伝子の発現を遮断するために使用され得るという可能性を高める。小ヘアピンＲＮＡを合成するための調節可能なプロモーターは記載されており、当業者に周知である（例えば、ＷＯ０５００７８７７Ａ）。
【００５２】
標的遺伝子組換え：本明細書に使用される場合、「標的遺伝子組換え」という用語は、組換えが宿主細胞又は宿主生物内に存在するＤＮＡ標的遺伝子座内で発生するプロセスを指す。組換えは相同又は非相同ＤＮＡのいずれかを含み得る。標的遺伝子組換えを達成するために、操作したヌクレアーゼによるゲノム編集（ＧＥＥＮ）が適用され得る方法である。広く使用されている操作したヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、再操作したホーミングエンドヌクレアーゼのような操作したメガヌクレアーゼである。相同標的遺伝子組換えの一例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）による宿主ＤＮＡの選択した遺伝子座の切断（ＷＯ０３０８７３４１に開示されている）、その後の外因性又は内因性起源のいずれかの相同ＤＮＡによる切断したＤＮＡの相同組換えである。非相同標的遺伝子組換えの一例は、ＺＦＮによる宿主ＤＮＡの選択した遺伝子座の切断、その後の切断したＤＮＡの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）である。本明細書に使用される場合、「宿主細胞」又は「宿主生物」又は単に「標的宿主」という用語は、本発明の方法に使用される機能を発現するために１つ又は複数の遺伝子を保有するように遺伝的に形質転換されるように選択されている細胞又は生物を指す。宿主はさらに本発明の標的遺伝子組換え又は変異法によって形質転換されている生物又は細胞であってもよい。
【００５３】
治療用タンパク質：「治療用タンパク質」という用語は、ヒト又は獣医学的治療のためのタンパク質を指し、急性又は慢性投与を意図し得る。特に、「治療用タンパク質」は、疾患又は病的状態を有する哺乳動物の治療に使用されるタンパク質である。
【００５４】
形質転換：哺乳動物細胞「の形質転換」／「を形質転換する」又は「形質転換された」という用語は、組換えＤＮＡ構築物、例えばタンパク質発現構築物又はｓｈＲＮＡ発現構築物の前記哺乳動物細胞内への導入を指す。形質転換は、細胞、例えばＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞のゲノム内の組換えＤＮＡを組み込み、安定に維持するプロセスを示す。組換えＤＮＡ構築物を安定に維持することは、宿主生物のゲノム内への前記ＤＮＡ構築物の組込み及び例えば一過性発現ベクターの場合、宿主生物内のベクターの染色体外の存在を含む。「形質転換」という用語は、「トランスフェクション」又は「形質導入」という用語と本明細書において交換可能に使用される。
【００５５】
センス鎖：「センス鎖」という用語は、本明細書に使用される場合、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
【００５６】
発明の詳細な説明
哺乳動物細胞の成長遅延及び／又は治療用タンパク質の低力価をもたらし得る、前記治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する前記哺乳動物細胞において、組換え治療用タンパク質であり得る、前記治療用タンパク質を産生する問題についての解決策が開示される（実施例の段落を参照のこと）。
【００５７】
従って、一態様において、本発明は、治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において、組換えタンパク質であり得る、前記治療用タンパク質を産生する方法であって、前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び／又は治療用タンパク質の低力価をもたらし、その方法が、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損し、前記治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されている哺乳動物細胞を用いて、
ａ．治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
ｂ．工程ａにおいて培養した哺乳動物細胞から治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法を提供する。
【００５８】
特定の実施形態において、上記方法は、単離した治療用タンパク質を処理する工程を含む。
【００５９】
別の実施形態において、本開示は、哺乳動物細胞の成長遅延及び／又は組換え治療用タンパク質の低力価をもたらし得る、前記治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する前記哺乳動物細胞における構成的又は誘導異種プロモーターの制御下で前記治療用タンパク質を産生する問題についての解決策を提供する（実施例の段落を参照のこと）。
【００６０】
従って、一態様において、本発明は、組換え治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において前記組換え治療用タンパク質を異種産生する方法であって、前記同族受容体への前記組換え治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び／又は組換え治療用タンパク質の低力価をもたらし、その方法が、前記組換え治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損し、前記哺乳動物細胞に対して異種である構成的又は誘導プロモーターの制御下で異種組換え治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されている哺乳動物細胞を用いて、
ｃ．組換え治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
ｄ．工程ａにおいて培養した哺乳動物細胞から組換え治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法を提供する。
【００６１】
特定の実施形態において、上記方法は、単離した治療用タンパク質を処理する工程を含む。
【００６２】
トランスフェクトした哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞を用いたポリペプチドの大規模産生は、例えば、ウェーブ、ガラス又はステンレス鋼バイオリアクターにおいて行われてもよい。その目的のために、通常、単一の凍結バイアル、例えばＭａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ製のバイアルから開始して細胞を増殖させる。細胞を解凍し、いくつかの段階で増殖させる。異なる規模のバイオリアクターに適切な量の細胞を接種する。細胞密度は供給溶液及び添加剤をバイオリアクターに加えることによって増加し得る。細胞は長時間高い生存率で維持する。数百ミリグラム／リットルから数グラム／リットルまでの範囲のリアクターにおける産生濃度は大規模で達成される。精製は、親和性、イオン交換、疎水性相互作用又はサイズ排除クロマトグラフィー工程を含み得る、標準的なクロマトグラフィー方法論によって行われ得る。バイオリアクターのサイズは最終規模において最大で数千リットル体積であり得る（例えば、F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398も参照のこと）。
【００６３】
特定の実施形態において、目的の前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞は、治療用タンパク質の同族受容体の発現がこのように改変されていない細胞より少なくとも１，５倍、又は２倍、又は３倍、又は４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は１０倍又はそれより多い治療用タンパク質を産生する。
【００６４】
本開示のさらに別の実施形態において、上記のように改変された細胞は、対照集団と比較して、少なくとも５パーセント、又は１０パーセント又は１５パーセント又は２０パーセント又は３０パーセント又は４０パーセント、又は５０パーセント又はそれより多い生存細胞を有する。代替として、又はさらに、改変された細胞は、改変されていない細胞と比較して長時間、細胞生存率を維持する。例えば、改変された細胞は、対照細胞と比較して長時間、特定の百分率の細胞生存率（例えば９５パーセント）を維持できる。
【００６５】
別の特定の実施形態において、目的の前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞は、培養時間の間、０．５〜１×１０７細胞／ｍｌ又は１〜１．５×１０７細胞／ｍｌ又は１．５〜２×１０７細胞／ｍｌ又は２〜２．５×１０７細胞／ｍｌ又は３〜３．５×１０７細胞／ｍｌ又はそれより多い細胞密度まで成長する。前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞の生存率は、最初の８０〜１１０時間又は１１０〜１４０時間又は１４０〜１７０時間又は１７０〜２００時間又は２００〜２３０時間又は２３０〜２６０時間又はそれより長い時間の培養時間の間、９０％超である。
【００６６】
さらなる実施形態において、目的の前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損し、図１０に記載されている条件下で培養した哺乳動物細胞の培養物は、少なくとも０．４ｇ／Ｌ又は０．６ｇ／Ｌ又は０．８ｇ／Ｌ又は１．０ｇ／Ｌ又は１．２ｇ／Ｌ又は１．４ｇ／Ｌ又は１．６ｇ／Ｌ又は１．８ｇ／Ｌ又は２．０ｇ／Ｌ又は２．２ｇ／ｌ又はそれより多い治療用タンパク質を産生する。
【００６７】
別の実施形態において、上述の治療用タンパク質は成長因子である。成長因子は、当該分野において知られており、限定されないが、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、オートクリン運動因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長分化因子−９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、肝癌由来成長因子（ＨＤＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）及び他のニューロトロフィン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、Ｗｎｔシグナル伝達経路胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ウシ胎児成長ホルモン（ＦＢＳ）、インターロイキン２−（ＩＬ２）、ＩＬ３−、ＩＬ４−、ＩＬ５−、ＩＬ６−、ＩＬ７−成長因子が含まれる。
【００６８】
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、さらに別の実施形態において、本開示はインスリン様成長因子１又はそのバリアントの産生に関する。その成熟形態において、ソマトメジンとも呼ばれるヒトＩＧＦ−１は、培養物中の広範囲の細胞の成長を刺激することが示されている７０アミノ酸の小タンパク質である。成熟タンパク質は３つの公知のスプライスバリアントｍＲＮＡによって最初にコードされる。各ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームは、７０アミノ酸ＩＧＦ−１（配列番号１６）及び特定のＩＧＦ−１  ｍＲＮＡに応じて、Ｃ末端における特定のＥ−ペプチドを含有する前駆タンパク質をコードする。これらのＥ−ペプチドは、Ｅａ（配列番号１７）、Ｅｂ（配列番号１８）及びＥｃ（配列番号１９）ペプチドと呼ばれており、３５〜８７アミノ酸長の範囲であり、Ｎ末端において共通配列領域及びＣ末端において可変配列領域を包含する。生理学的発現状況において、Ｅ−ペプチドは内因性プロテアーゼによって前駆体から切断されて、生物活性があることが知られている成熟７０アミノ酸ＩＧＦ−１を生じる。ＩＧＦ−１タンパク質は、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、インスリン様成長因子２受容体（ＩＧＦ−２Ｒ）及びインスリン受容体（ＩＮＳＲ）に結合する。ＩＧＦ−１は酵母及び大腸菌（E.coli）の両方を使用して大規模で組換えにより製造されている。ＩＧＦ−１は、このタンパク質が患者の血清中の内因性プロテアーゼによって迅速に分解されるので、不十分な薬物候補である。前記不都合な点を克服するために異なる戦略が適用されている。ＷＯ０５０３３１３４は、免疫グロブリンＦｃ領域に融合した安定化されたＩＧＦ−１タンパク質を開示している。ＷＯ２００７／１４６６８９は、プロテアーゼによるＩＧＦ−１由来のＥ−ペプチドの切断が低下している、安定化されたＩＧＦ−１前駆タンパク質を開示している。ＷＯ２００５０３３１３４及びＷＯ２００７／１４６６８９に開示されている教示はインビボでＩＧＦ−１バリアントを安定化するために使用され得るが、それらは、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞株における組換えＩＧＦ−１又はそのバリアントの発現が、細胞成長阻害及び低力価をもたらすという問題を解決していない（実施例の段落を参照のこと）。
【００６９】
本発明の教示は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞において組換えＩＧＦ−１又はそのバリアントを産生する方法であって、前記哺乳動物細胞は機能的インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）の発現を欠損しており、その方法が、
ａ．インスリン様成長因子１受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
ｂ．ＩＧＦ−１又はそのバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで工程ａ．の細胞を形質転換する工程、
ｃ．形質転換されている工程ｂ．の細胞を選択する工程、
ｄ．ＩＧＦ−１又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で工程ｃ．において選択した細胞を培養する工程、及び
ｅ．工程ｄにおいて培養した哺乳動物細胞からＩＧＦ−１又はそのバリアントを収集する工程
を含み、別法として、工程ａ．及びｂ．の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程は同時に実施することもできる、方法を提供する。
【００７０】
特定の実施形態において、上記方法は、単離した治療用タンパク質を処理する工程を含む。
【００７１】
特定の実施形態において、工程ａ．からｅ．において上記のように産生し、培養した場合、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）の発現を欠損している哺乳動物細胞は、工程ａ．に記載されているように改変されていない（ＩＧＦ−１Ｒの発現を欠損していない）が、上記の工程ｂ．に記載されているように形質転換されている細胞より、少なくとも１．５倍、又は２倍、又は３倍、又は４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は１０倍又はそれより多いＩＧＦ−１又はそのバリアントを産生する。別の特定の実施形態において、上記のようにＩＧＦ−１Ｒの発現を欠損している哺乳動物細胞は、培養時間の間、０．５〜１×１０７細胞／ｍｌ又は１〜１．５×１０７細胞／ｍｌ又は１．５〜２×１０７細胞／ｍｌ又は２〜２．５×１０７又は３〜３．５×１０７細胞／ｍｌ又はそれより多くまで成長する。ＩＧＦ−１Ｒの発現を欠損している哺乳動物細胞の生存率は、最初の８０〜１１０時間又は１１０〜１４０時間又は１４０〜１７０時間又は１７０〜２００時間又は２００〜２３０時間又は２３０〜２６０時間の培養時間の間、９７％超である。
【００７２】
さらなる実施形態において、本明細書に記載されており、開示されているように培養したＩＧＦ−１Ｒの発現を欠損している哺乳動物細胞の培養物は、少なくとも１ｇ／Ｌ又は１．２ｇ／Ｌ又は１．４ｇ／Ｌ又は１．６ｇ／Ｌ又は１．８ｇ／Ｌ又は２ｇ／Ｌ又は２．２ｇ／Ｌ又は２．４ｇ／Ｌ又は２．６ｇ／Ｌ又は２．８ｇ／Ｌ又は３ｇ／ｌ又はそれより多いＩＧＦ−１又はそのバリアントを産生する。
【００７３】
遺伝子改変細胞の形質転換、選択及び培養を含む、特定の遺伝子、例えばインスリン様成長因子１受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞の産生は、微生物及び哺乳動物系について開発された古典的分子生物学の周知の全般的なパラダイムに従い、確立された技術であり、当業者に周知である。ＣＨＯノックアウト細胞は今世紀の初めに先行技術において既に記載されている（Kramer et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 88:425-436を参照のこと）。以下の方法は特定の遺伝子の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生するために使用され得る：
【００７４】
相同組換えによる遺伝子標的
相同組換えは、特定の遺伝子の発現を欠損している（例えば遺伝子ノックアウト）哺乳動物細胞を得るための１つの手段である。この技術は、原則として、非標的法より特異的であるが、相同組換えの頻度は非常に低く、工業的な細胞株操作に適用できない（Vasquez KM, Marburger K, Intody Z, Wilson JH (2001) Manipulating the mammalian genome by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci USA 98(15): 8403-8410）。結果として、多くのクローンのスクリーニング及び分析がノックアウト細胞を識別するために必要とされる。この手順の成功例はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞におけるα１，６−フコシルトランスフェラーゼのノックアウトである（Yamane-Ohnuki N, Kinoshita S, Inoue-Urakubo M, Kusunoki M, Iida S, Nakano R, Wakitani M, Niwa R, Sakurada M, Uchida K, Shitara K, Satoh M (2004) Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng 87(5):614-622）。
【００７５】
二本鎖切断が相同組換えの発生を高めるためにメガヌクレアーゼによって導入され得る。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）は、１２〜４５ｂｐの長いＤＮＡ配列を認識する（Paques F, Duchateau P (2007) Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Curr Gene Ther 7(1):49-66）。Ｉ−ＳｃｅＩ及びＩ−ＣｒｅＩが集中的に研究されているメガヌクレアーゼである（Epinat JC, Arnould S, Chames P, Rochaix P, Desfontaines D, Puzin C, Patin A, Zanghellini A, Paques F, Lacroix E (2003) A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Res 31(11):2952-2962）。
【００７６】
操作されたメガヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断
メガヌクレアーゼは大きな認識部位（１２〜４０塩基対）によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、結果として、この部位は、一般的に、任意の所与のゲノムにおいて１回のみ発生する。メガヌクレアーゼは、高度に標的化された手段で配列を置換、除去又は改変するために使用され得る「分子ＤＮＡハサミ」である。タンパク質操作を介してそれらの認識配列を改変することによって、標的配列は変化され得る。研究及びゲノム操作に最も広範に使用されている最適な特徴付けられたエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ及びＩ−ＤｍｏＩが含まれる。大部分のメガヌクレアーゼは、ホモダイマー又は内部対称モノマーである。触媒ドメインを含有するＤＮＡ結合部位は切断点のいずれかの側における２つの部分から構成される。
【００７７】
これまで、種々の単細胞生物由来の約６００個のメガヌクレアーゼが識別され、配列決定されている。これは、認識可能なＤＮＡ配列の数がゲノムカスタマイズ適用について非常に制限されていることを示す。この制限を克服するために、例えば、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓのような会社は、目的の各遺伝子についての標的部位に特異的であるようにメガヌクレアーゼを操作している。メガヌクレアーゼの高度の特異性により、それらは高度の正確性及び低い細胞毒性を与えられる。
【００７８】
ＤＮＡ二本鎖切断が（例えばメガヌクレアーゼを使用することによって）行われた後、「非相同末端結合」が生じる。「非相同末端結合」はＤＮＡにおける二本鎖切断を修復する細胞の自然なプロセスである。切断したＤＮＡ末端は、相同組換えと対照的に、相同鋳型を必要とせずに、直接、再ライゲーションされる。「非相同末端結合」のエラープローン性質に起因して、一部の割合の二本鎖切断はヌクレオチドの付加及び／又は欠失によって修復過誤になる。ゲノム配列内のこれらの変異は二本鎖切断の部位において生じ、遺伝子機能の喪失をもたらし、従って、遺伝子ノックアウトを達成する。
【００７９】
ジンクフィンガーヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断
ジンクフィンガーヌクレアーゼは哺乳動物ノックアウト細胞を産生するための非常に有用な手段である。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、操作されたジンクフィンガードメイン、短いリンカー及び配列特異的ＤＮＡ二本鎖切断を導入している改変されたＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインから構成される。ジンクフィンガードメイン内の残基を変化させることによって、異なるＤＮＡ結合特異性を有する新たなジンクフィンガーヌクレアーゼが産生され得る（Bibikova M, Beumer K, Trautman JK, Carroll D (2003) Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science 300 (5620):764; Cathomen T, Joung JK (2008) Zinc-finger nucleases: the next generation emerges. Mol Ther 16(7):1200-1207）。ジンクフィンガーヌクレアーゼは任意の所望のゲノム部位を標的化するように設計され得るので、ジンクフィンガードメインは切断位置を誘導し、他の遺伝子標的プロセスより有益である。当業者は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び遺伝子標的化におけるそれらの適用を扱っている多数の科学出版物を知っている（Remy S, Tesson L, Menoret S, Usal C, Scharenberg AM, Anegon I (2010) Zinc-finger nucleases: a powerful tool for genetic engineering of animals. Transgenic Res 19(3):363-371; Kramer et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 88:425-436; Kandavelou K, Ramalingam S, London V, Mani M, Wu J, Alexeev V, Civin CI, Chandrasegaran S (2009) Targeted manipulation of mammalian genomes using designed zinc finger nucleases. Biochem Biophys Res Commun 388(1):56-61; Urnov FD, Miller JC, Lee YL, Beausejour CM, Rock JM, Augustus S, Jamieson AC, Porteus MH, Gregory PD, Holmes MC (2005) Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature 435(7042):646-651;）。
【００８０】
ジンクフィンガーヌクレアーゼによって触媒されるＤＮＡ二本鎖切断は、２つの異なるＤＮＡ修復経路、すなわち、相同組換え又は非相同末端結合を活性化できる。相同組換えは、好ましくは、多量の適切なドナーＤＮＡが利用可能であり、ゲノム内への新たなＤＮＡの導入を可能にする場合、活性化される（Bibikova M, Beumer K, Trautman JK, Carroll D (2003) Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science 300 (5620):764））。
【００８１】
ＤＮＡ修復の非相同末端結合は、切断したＤＮＡ末端の再ライゲーションを単純に利用している。いくつかの場合、ヌクレオチドの挿入又は欠失が行われてもよく、その後、元のセグメントと比較して異なる配列を導く。その結果、フレームシフト又はナンセンスコドンが起こり、転写の間、切断した又は異常なｍＲＮＡを生じる。カスタマイズされたジンクフィンガーヌクレアーゼはいくつかの手段において産生され得る（Beerli RR, Barbas CF 3rd (2002) Engineering polydactyl zinc-finger transcription factors. Nat Biotechnol 20(2):135-141); Foley JE, Yeh JR, Maeder ML, Reyon D, Sander JD, Peterson RT, Joung JK (2009) Rapid mutation of endogenous zebrafish genes using zinc finger nucleases made by Oligomerized Pool ENgineering (OPEN). PLoS ONE 4(2):e4348）。カスタマイズされたジンクフィンガーヌクレアーゼは、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入できる。ジンクフィンガーヌクレアーゼを生成する原理は、Cathomen T, Joung JK (2008) Zinc-finger nucleases: the next generation emerges. Mol Ther 16(7):1200-12078）に開示されている。別のアプローチは、「Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ」（www.zincfingers.org）によって提供されている自由にアクセス可能なオリゴマー化プール操作（ＯＰＥＮ）プラットフォームを使用する。このプラットフォームは標的ＤＮＡ配列に基づいて組換えられているジンクフィンガープールアーカイブを使用する。その後、組換えられたジンクフィンガーは細菌２ハイブリッドシステムを介してスクリーニングされる。成功した結合はレポーター遺伝子の発現によって測定される（Maeder ML, Thibodeau-Beganny S, Osiak A, Wright DA, Anthony RM, Eichtinger M, Jiang T, Foley JE, Winfrey RJ, Townsend JA, Unger-Wallace E, Sander JD, Muller-Lerch F, Fu F, Pearlberg J, Gobel C, Dassie JP, Pruett-Miller SM, Porteus MH, Sgroi DC, Iafrate AJ, Dobbs D, McCray PB Jr, Cathomen T, Voytas DF, Joung JK (2008) Rapid “open-source” engineering of customized zinc-finger nucleases for highly efficient gene modification. Mol Cell 31(2):294-301 Foley et al. 2009; Maeder et al. 2008）。ジンクフィンガー技術は、Kramer et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 88:425-436の表１に示されているように操作している細胞株において既に首尾良く適用されている。
【００８２】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工の制限酵素である。ＴＡＬエフェクターはキサントモナス（Xanthomonas）細菌によって分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは第１２及び第１３アミノ酸を除いて高度に保存された３３〜３４アミノ酸配列を含有する。これらの２つの位置は非常に変わりやすく、特異的ヌクレオチド認識と強い相関関係を示す。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間のこの簡単な関係は、適切な反復可変２残基（Repeat Variable Diresidue）（ＲＶＤ）を含有する反復セグメントの組合せを選択することによって特異的ＤＮＡ結合ドメインの操作を可能にする。従って、ＴＡＬＥのＤＮＡ認識の機構は簡単なコードに基づき、それにより１つのＲＶＤはＤＮＡ配列の１つのヌクレオチドを認識し、各ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが、高精度で大きな認識部位（１５〜３０ｎｔ）を標的化できることを確実にする。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼの第２の成分は、ＤＮＡ二本鎖切断を導入し、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＦｏｋＩ）に融合しているエンドヌクレアーゼの触媒ドメインである。ＴＡＬＥＮは対で機能するので、２つの高度に配列特異的なＴＡＬＥＮ単位から構成されるヘテロダイマーである。これらの単位は標的ＤＮＡ配列に結合し、エンドヌクレアーゼドメインをダイマー化できるスペーサー領域を生じ、ＤＮＡ二本鎖切断を生じる。ＤＮＡ切断後、ＤＮＡ二本鎖切断は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される。ＮＨＥＪは、２つの端部を一緒に結合し、いくつかの例において、塩基対の欠失又は挿入を導き、フレームシフトを産生し、タンパク質の産生を阻止することによって修復する。
【００８３】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に基づいたゲノム操作は、哺乳動物細胞のゲノム内へのＤＮＡ配列の挿入、欠失又は置換を可能にするｒＡＡＶベクターの使用についての中心となるゲノム編集プラットフォームである。相同組換え、天然ＤＮＡが機構を修復するという発見に基づく技術が、正確なゲノム変更を実施するために利用され得る。この技術は、タンパク質の生物製造のための生物産生細胞株を最適化するために細胞株を操作する際の使用として採用されている。
【００８４】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７キロベース長である一本鎖デオキシリボ核酸から構築される。これらの一本鎖ＤＮＡウイルスベクターは、高い形質導入率を有し、例えば、ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮ技術のようにゲノム内の二本鎖ＤＮＡを切断せずに内因性ＨＲを刺激する特異的性質を有する。ｒＡＡＶベクターは任意の標的ゲノム遺伝子座に設計され得、例えば遺伝子ノックアウトを実施できる。ｒＡＡＶは単一の対立遺伝子を一度に標的化する。
【００８５】
遺伝子を抑制するための別の選択肢は、例えば、ＫＲＡＢ又はＳＩＤ転写抑制ドメインと融合したＴＡＬエフェクターを作製した、Garg A, Lohmueller JJ, Silver PA, Armel TZ. (Nucleic Acids Res. 2012 Aug;40(15):7584-95. Engineering synthetic TAL effectors with orthogonal target sites)及びZhang F, Cong L, Lodato S, Kosuri S, Church GM, Arlotta P (Nat Biotechnol. 2011 Feb;29(2):149-53. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription)によって報告されているＴＡＬリプレッサーである。ＴＡＬ  ＤＮＡ結合ドメインの両方の末端又はＮ−若しくはＣ−末端に位置しているＫＲＡＢは、レポータープラスミドの９０％超の抑制を表したことが示された。
【００８６】
それ故、本開示の別の態様は、上記に開示されている、治療用タンパク質を産生する方法であって、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している細胞が、標的遺伝子組換え技術を適用することによって産生されている、方法に関する。
【００８７】
ＲＮＡ干渉
ＲＮＡｉプロセスは極めて詳細に従来技術において記載されている：
Carthew RW, Sontheimer EJ (2009) Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136(4):642-655; 
Dykxhoorn DM, Novina CD, Sharp PA (2003) Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol 4(6):457-467;
Kim DH, Rossi JJ (2007) Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet 8(3):173-184;
Siomi H, Siomi MC (2009) On the road to reading the RNAinterference code. Nature 457(7228):396-404;
Wu SC (2009) RNA interference technology to improve recombinant protein production in Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Adv 27(4):417-422.
Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411(6836):494-498.
Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296(5567):550-553.
【００８８】
例えば、ｓｉＲＮＡが、ＣＨＯ細胞において、アポトーシスカスケードに関連するタンパク質である、タンパク質Ｒｅｑｕｉｅｍ（Wong DC, Wong KT, Nissom PM, Heng CK, Yap MG (2006b) Targeting early apoptotic genes in batch and fed-batch CHO cell cultures. Biotechnol Bioeng 95(3):350-361）並びにカスパーゼ３及び７（Sung YH, Lee JS, Park SH, Koo J, Lee GM (2007) Influence of co-down-regulation of caspase-3 and caspase-7 by siRNAs on sodium butyrate-induced apoptotic cell death of Chinese hamster ovary cells producing thrombopoietin. Metab Eng 9(5-6):452-464）をサイレンシングするために使用された。
【００８９】
特定の実施形態において、本開示は、哺乳動物細胞において、組換え治療用タンパク質、例えば、目的の治療用タンパク質がＩＧＦ−１タンパク質又はそのバリアントである場合、インスリン様成長因子１受容体であり得る、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現の欠損が、ＲＮＡ干渉を適用することによって達成される、上記の方法の１つであって、その方法が、
（ａ）二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を前記細胞内に導入する工程であって、ｄｓＲＮＡが互いに相補的である少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖が、治療用タンパク質の同族受容体、例えばＩＧＦ−１ＲをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列を含み、前記相補性の領域が３０ヌクレオチド長未満であり、前記ｄｓＲＮＡが、前記細胞内に導入すると、治療用タンパク質の同族受容体、例えばＩＧＦ−１Ｒ遺伝子をコードする遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、工程、及び
（ｂ）治療用タンパク質の同族受容体をコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程（ａ）において産生された細胞を維持し、それにより細胞内の前記受容体、例えばＩＧＦ−１Ｒの発現を阻害する工程
を含む、方法に関する。
【００９０】
「サイレンス」及び「の発現を阻害する」という用語は、それらがＩＧＦ−１Ｒ遺伝子を指す限り、正常（未処理）細胞と比較して、転写された又は利用可能であるｍＲＮＡの量の低下によって現れる、ＩＧＦ−１Ｒを標的とするｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡで処理した細胞内のＩＧＦ−１Ｒの発現の少なくとも部分的な抑制を指す。この尺度は、このように処理されていないが、第１の細胞又は細胞の群と実質的に同一である第２の細胞又は細胞の群（対照細胞）に対して、処理細胞（ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の発現が阻害されるように処理されている最初の細胞又は細胞の群から単離され得る）内のｍＲＮＡレベルを比較することによって決定され得る。阻害の程度は通常
【００９１】
【数１】
0006392245.tif 000002
の観点から表される。
【００９２】
或いは、阻害の程度は、遺伝子転写に機能的に関連しているパラメータ、例えば、ポリペプチドの量、又はＩＧＦ−１Ｒに関連する特定の表現型を示す細胞の数の低下の観点から与えられ得る。例えば、特定の例において、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の発現は、それが、ＩＧＦ−１Ｒ特異的ｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与によって少なくとも約２０％、２５％、３５％、又は５０％抑制される場合、阻害される。いくつかの実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子は、ＩＧＦ−１Ｒ特異的ｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与によって少なくとも約６０％、７０％、又は８０％抑制される。いくつかの実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子は、ＩＧＦ−１Ｒ特異的ｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与によって少なくとも約８５％、９０％、又は９５％抑制される。
【００９３】
ｄｓＲＮＡは二本鎖構造を形成するためにハイブリダイズするのに十分に相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の遺伝子産物の配列に由来する標的配列に対して、実質的に相補的、及びほぼ完全に相補的である相補性の領域を含み、他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせた場合、２つの鎖がハイブリダイズし、二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的である領域を含む。一般的には、二本鎖構造は１５から３０の間、より一般的には１８から２５の間、さらにより一般的には１９から２４の間、最も一般的には１９から２１の間の塩基対長である。同様に、標的配列に対する相補性の領域は、１５から３０の間、より一般的には１８から２５の間、さらにより一般的には１９から２４の間、最も一般的には１９から２１の間のヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡは平滑末端されてもよく（例えば、いずれかの鎖における各ヌクレオチドが、他方の鎖における塩基対に適したヌクレオチドを有する場合）、又はそれは、一般的に３’末端に１つ若しくは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含んでもよい。ｄｓＲＮＡは、以下にさらに説明されている当該分野において公知の標準的な方法によって、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから市販されているような自動ＤＮＡ合成装置の使用によって合成され得る。
【００９４】
さらなる実施形態において、上記のインスリン様成長因子１受容体の発現の欠損は、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を使用することによって達成され、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列は配列番号１及び３からなる群から選択される配列を含む。
【００９５】
さらなる実施形態において、インスリン様成長因子１受容体の発現の欠損は、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を使用することによって達成され、前記ｓｈＲＮＡ分子の配列は、配列番号５、６、７、８、９及び１０からなる群から選択される。
【００９６】
本明細書に開示されている標的遺伝子組換え技術若しくはＲＮＡ干渉アプローチ又は上述の先行技術に記載されているものが、目的の組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質の同族受容体、例えば、インスリン様成長因子１受容体のような成長因子の発現を欠損している、組換え哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞を産生するために適用され得る（実施例の段落を参照のこと）。
【００９７】
トランスジェニック哺乳動物細胞の産生
当業者は、遺伝子改変された哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１派生体、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生体又はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞のようなＣＨＯ細胞を形質転換し、選択し、培養する方法を知っている。選択プロトコルが、成長因子、例えばＩＧＦ−１のような所望の治療タンパク質をコードする組換えＤＮＡを組み込んでいる可能性のある細胞の選択を容易にするために通常使用されている。形質転換ベクターに同時に組み込まれた遺伝子によって付与される抗生物質耐性又は栄養選択培地中で成長する能力が通常使用される（Weber, W. and Fussenegger, M. (2003) Inducible gene expression in mammalian cells, in Gene transfer and expression in mammalian cells, (Makrides, S.C., Ed.), Elsevier: Amsterdam, pp. 589-604を参照のこと）（Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector: Niwa Hitoshi, Yamamura Ken-ichi, Miyazaki Jun-ichi）。組換えタンパク質産生のための２つの最も一般的なＣＨＯ発現系は、シヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）系メトトレキサート（ＭＴＸ）選択又はグルタミン合成酵素（ＧＳ）系メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）選択を利用する（Rita Costa A, Elisa Rodrigues M, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Eur J Pharm Biopharm. 2010 Feb; 74(2):127-38. Epub 2009 Oct 22. Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production）。
【００９８】
外来ＤＮＡの組込み部位は発現のレベルに明確に影響を与える。Ｃｒｅｗ／ｌｏｘＰシステムを使用したゲノムの高度に転写活性のある領域内への外来遺伝子の組込みが記載されている（Kwaks, T. and Otte, A. (2006) Employing epigenetics to augment the expression of therapeutic proteins in mammalian cells. Trends Biotechnol., 24(3), 137-142.）。この特異的部位への任意の外来導入遺伝子の組込みが高産生クローンを生じると仮定すると、標的組込みは相互の部位特異的組込みにより達成され得る（Baer, A. and Bode, J. (2001) Coping with kinetic and thermodynamic barriers: RMCE, an efficient strategy for the targeted integration of transgenes. Curr. Opin. Biotechnol., 12, 473-480.）。
【００９９】
さらに、その組込み部位に関係なく、外来ＤＮＡをより転写活性にするのに役立つ短いヌクレオチド配列が導入遺伝子に連結している。ＳＴＡＲエレメント（安定化及び抗リプレッサーエレメント）は、ヒストン脱アセチル化パターンの範囲及び挿入された導入遺伝子に近接するメチル化の広がりを減少させる（Kwaks, T.; Barnett, P.; Hemrika, W.; Siersma, T.; Sewalt, R. Satijn, D.; Brons, J.; van Blokland, R.; Kruckeberg, A.; Kelder, A. and Otte, W. (2003) Identification of anti-repressor elements that confer high and stable protein production in mammalian cells. Nat.Biotechnol., 21, 553-558.）。骨格／マトリクス関連領域は核マトリクスと相互作用し、遺伝子発現が調整され、抑制から保護されるループを生じ（Girod, P.; Zahn-Zabal, M.and Mermod, N. (2005) MAR elements as tools to increase protein production by CHO cells, in Animal cell technology meets genomics; Godia, M.F. and Fussenegges, M., Ed., Springer: Amsterdam, pp. 411-415; Girod, P.; Zahn-Zabal, M. and Mermod, N. (2005) Use of the chicken lysozyme 5' matrix attachment region to generate high producer CHO cell lines. Biotechnol. Bioeng., 91(1), 1-11.）、一方、ＵＣＯＥエレメント（遍在性クロマチンオープニングエレメント）は高度に転写活性のある環境を生じる［（Benton, T.; Chen, T.; McEntree, M.; Fox, B.; King, D.; Crombie, R.; Thomas, T. and Bebbington, C. (2002) The use of UCOE vectors in combination with a preadapted serum free, suspension cell line allows for rapid production of large quantities of protein. Cytotechnology, 38, 43-46.）。
【０１００】
哺乳動物細胞、特にＣＨＯ及びＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞などの齧歯動物細胞においてポリペプチドを産生するのに特に適しているベクターは特許出願ＷＯ０９０８０７２０Ａに開示されている。哺乳動物宿主細胞内に発現ベクターを導入するための従来技術において知られているいくつかの適切な方法が存在する。それぞれの方法は、限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃により及びポリマーにより媒介される遺伝子導入を含む。適切な宿主細胞は上記されている。宿主細胞内への発現ベクター核酸の導入後、得られた形質転換体を、発現カセット（ＭＳＭ）内に含まれる哺乳動物選択可能マーカー遺伝子の発現をアッセイするのに適した選択的条件下で培養する。これは、例えば哺乳動物選択可能マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合、形質転換体が、哺乳動物細胞内で対応する抗生物質活性を含有する培地中で培養され、このような条件下で生存する形質転換体が選択され、それによりマーカー遺伝子を発現する形質転換体の取得を可能にし、それによりベクターが組み込まれていることを意味する。さらに、第２の選択工程は、発現カセット（ＭＡＳＭ）に含まれる増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を選択するのに適合された選択培地中で形質転換体を培養することによって実施され得る。例えばＤＨＦＲが増幅可能な選択可能マーカー遺伝子として使用される場合、形質転換体はＤＨＦＲ阻害剤の存在下でヌクレオチド又はプリンを含まない培地中で培養され得る。誘導プロモーターが少なくとも１つの発現カセットに使用される場合、対応する誘導シグナルはポリペプチドの発現を開始するために提供されるべきである。ＤＨＦＲ選択／増幅系を使用するために、前記宿主細胞は、ＤＨＦＲ阻害剤の存在下で培養され得る。適切なＤＨＦＲ阻害剤は例えばＭＴＸなどの抗葉酸剤である。使用される抗葉酸剤／ＭＴＸの濃度は宿主細胞及びベクター内に組み込まれたＤＨＦＲバリアントに依存する。濃度範囲は、例えば約５ｎＭ〜２０ｎＭの範囲の値から５００ｎＭ〜１０００ｎＭの値又は二次若しくはさらなる増幅工程のためにさらに高い値にてＤＨＦＲ”宿主細胞において多工程の増幅手順のために選択され得る。ＤＨＦＲ＋について、細胞開始濃度は、最初の工程において１００ｎＭ〜７５０ｎＭ、好ましくは５００ｎＭ、さらなる増幅工程について５００ｎＭ〜１０００ｎＭ及びそれ以上の範囲で通常高い。適切なＤＨＦＲバリアントは上記されている。
【０１０１】
ＧＳ選択／増幅系を使用するために、前記宿主細胞は例えばＭＳＸの存在下で培養され得る。使用されるＭＳＸの濃度は宿主細胞に依存する。濃度範囲は、約１５〜１５０マイクロモル、２０〜１００マイクロモル及び２５〜５０マイクロモルの間で選択され得る。これらの範囲はＮＳＯ及びＣＨＯ細胞に特に適している。
【０１０２】
次の工程において、治療用タンパク質は細胞培養物から単離／収集され得る。治療用タンパク質は宿主細胞を破壊することによって得られ得る。治療用タンパク質はまた、発現され得、例えば、培養培地中に分泌され得、そこから得られ得る。また、それぞれの方法の組合せも可能である。それによって、産物、特にポリペプチドが産生され得、高収率で効果的に得られ／単離され得る。得られた治療用タンパク質はまた、所望の質で目的の産物を産生するために、例えば精製及び／又は改変工程などのさらなる処理工程に供されてもよい。
【０１０３】
１つの代替によれば、目的の前記ポリペプチドは細胞培養培地中に分泌され、その後、細胞培養培地から単離される。
【０１０４】
ＣＨＯ細胞は当業者に公知の標準的な方法に従って培養され、収集される（例えば、Curr. Protoc. Protein Sci. 2001 May;Chapter 5: Unit5.10. Production of recombinant proteins in mammalian cells. Chen S, Gray D, Ma J, Subramanian S.; CHO cultivation media are furthermore described in Journal of Biotechnology, Volume 108, Issue 3, 18 March 2004, Pages 279-292: Serum- and protein-free media formulations for the Chinese hamster ovary cell line DUKXB11. Martin Schroder, Kathrin Matischak, Peter Friedl。
【０１０５】
さらなる実施形態において、本開示は、インスリン様成長因子１タンパク質がヒトインスリン様成長因子１タンパク質（配列番号１６）又はそのバリアントである、上記の方法に関する。例えば、このような配列には、限定されないが、以下の配列が含まれる：
【０１０６】
このような分子の例には、限定されないが、以下のポリペプチドが含まれる：
【０１０７】
アミノ酸Ｇ４２がアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸が以下である、ヒトＩＧＦ−１  Ｅａ−ペプチド前駆タンパク質を含むポリペプチド。
（１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（９）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（１０）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１９）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２０）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異している。
（２２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異している。
（２５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２９）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（２ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（３ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（４ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（５ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（６ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（７ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（８ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（９ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（１０ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１１ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１２ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１３ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１４ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１５ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１６ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１７ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１８ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１９ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２０ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２１ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異している。
（２２ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２３ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２  ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２４ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異している。
（２５ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２６ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２７ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２８ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２９ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
【０１０８】
さらに、開示されている方法に従って産生され得るＩＧＦ−１バリアントは、上記ポリペプチド（１）〜（２９ａ）の１つであって、１〜３位にて変異している代わりに前記分子が、アミノ酸Ｅ３のみが欠失している、タンパク質に関する（例えば、分子（２８ａ）はまた、ヒトＩＧＦ−１  Ｅａ−ペプチド前駆タンパク質を含むポリペプチドであって、アミノ酸Ｇ４２がアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している、ポリペプチドを指すことができる）。
【０１０９】
さらに、開示されている方法に従って産生され得るＩＧＦ−１バリアントは、ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を含有する、すなわち、免疫グロブリンＦｃ領域に融合しているヒトＩＧＦ−１由来のＥａ−ペプチドを含む、ポリペプチドであって、４２位におけるアミノ酸グリシンが別のアミノ酸によって置換されており、アミノ酸の番号付けが配列番号１６に対応する、ポリペプチドである。Ｅ−ペプチドは、Ｅａ、Ｅｂ又はＥｃペプチド（配列番号１７〜１９）であってもよく、４２位におけるグリシンが置換されているアミノ酸はセリンである。
【０１１０】
従って、一実施形態において、開示されている方法に従って産生され得るＩＧＦ−１バリアントは、ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を含むポリペプチドであって、（ａ）アミノ酸Ｇ４２がアミノ酸セリンによって置換されており、（ｂ）免疫グロブリンＦｃ領域、特に改変されたＦｃ領域、特にＦｃ受容体へのその結合を調節するように改変されているＦｃ領域に連結している、ポリペプチドに関する。例えば、１つ又は複数のアミノ酸は、Ｆｃ領域がＦｃ受容体又は相補体のＣ１成分に対して変化した親和性を有するように、異なるアミノ酸残基と置き換えてもよい。いわゆる発現停止した免疫グロブリンＦｃ領域が当該分野において記載されている：ＬＡＬＡ及びＮ２９７Ａ（Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691）;及びD265A（Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69; Strohl, W.,上記）。サイレントＦｃ  ＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列におけるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を含む、いわゆるＬＡＬＡ変異体を含む。サイレントＩｇＧ１抗体の別の例はＤ２６５Ａ変異を含む。別のサイレントＩｇＧ１抗体はＮ２９７Ａ変異を含み、これにより、無グルコシル化（aglycosylated）／非グリコシル化（non-glycosylated）抗体が得られる。
【０１１１】
上述のＬＡＬＡアプローチは、両方、Ｗｉｎｔｅｒらによる、ＵＳ５，６２４，８２１及びＵＳ５，６４８，２６０にさらに詳細に記載されている。従って、一実施形態において、開示されているｈＩＧＦ−１前駆タンパク質は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異又はＤ２６５Ａ変異又はＮ２９７Ａ変異を含むＦｃ領域に融合している。このようなＦｃ  ＬＡＬＡ、Ｄ２６５Ａ又はＮ２９７Ａ構築物はＡＤＣＣ活性を低下させる。
【０１１２】
従って、一実施形態において、開示されている方法に従って産生され得るＩＧＦ−１バリアントは、免疫グロブリンＦｃ領域に融合したヒトＩＧＦ−１  Ｅａ−ペプチド前駆タンパク質を含有するポリペプチドであって、４２位におけるアミノ酸グリシンがセリンに置換され、バリアントが、アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１、Ｓ７２、Ｒ７４、Ｒ７７、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４及び／又はＭ１０５にてさらなる欠失及び／又は変異をさらに含み、アミノ酸の番号付けが配列番号２０に対応する、ポリペプチドである。
【０１１３】
このような分子の例には、限定されないが、以下のポリペプチドが含まれる：
【０１１４】
免疫グロブリンＦｃ領域に融合したヒトＩＧＦ−１  Ｅａ−ペプチド前駆タンパク質を含有するポリペプチドであって、４２位におけるアミノ酸グリシンがアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸の番号付けが配列番号２０に対応し、アミノ酸が以下である、ポリペプチド
（１ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（２ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（３ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（４ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（５ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（６ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（７ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（８ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（９ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（１０ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１１ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１２ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１３ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１４ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１５ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１６ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１７ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１８ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１９ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２０ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２１ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２２ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２３ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２４ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２５ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２６ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２７ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２８ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２９ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（２ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（３ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（４ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（５ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（６ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（７ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（８ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（９ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（１０ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１１ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１２ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１３ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１４ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１５ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１６ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１７ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１８ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。（１９ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２０ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２１ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異している。
（２２ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２３ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２  ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２４ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２５ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２６ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
２７ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２８ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２９ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
【０１１５】
別の実施形態において、開示されている方法に従って産生され得るＩＧＦ−１バリアントは、上記のポリペプチド（１ｂ）〜（２９ｃ）を含むタンパク質であって、１〜３位にて変異している代わりに、前記分子が、アミノ酸Ｅ３のみが欠失している、タンパク質に関する（例えば、分子（２８ｃ）はまた、免疫グロブリンＦｃ領域に融合したヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を含む、ポリペプチドであって、アミノ酸Ｇ４２がアミノ酸のアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している、ポリペプチドを指すことができる）。
【０１１６】
別の実施形態において、開示されている方法に従って産生され得るＩＧＦ−１バリアントは、アミノ酸
ａ）VQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASG（配列番号３３）、又は
ｂ）VQAQQHTDMPKTQKYQPPATNKNTKSQRRKGS（配列番号３４）
からなる変異したＥａ−ペプチドを含む、上記のポリペプチド１〜２９ｃに関する。
【０１１７】
さらなる実施形態において、開示されている方法に従って産生され得るＩＧＦ−１バリアントはＦｃ領域に融合している上記のＩＧＦ−１前駆タンパク質であり、Ｆｃ領域は改変されたＩＧＦ−１前駆ポリペプチドに直接融合し得るか、又は当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術を使用してヒンジ領域によって結合され得る。ＤＮＡヒンジ領域が使用される場合、Ｆｃ領域は改変されたＩＧＦ−１前駆ポリペプチドの任意の部分に結合していてもよい。一実施形態において、Ｆｃ領域は改変されたＩＧＦ−１前駆ポリペプチドのＣ末端に直接融合している。別の実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（−ＧＳ−）リンカーによって改変されたＩＧＦ−１前駆ポリペプチドのＣ末端に連結している。
【０１１８】
ＤＮＡリンカーは、操作を容易にするように成分の間に制限部位を提供するために使用してもよい。リンカーはまた、宿主細胞からポリペプチドの発現を向上させるため、成分がその最適な三次又は四次構造を推測でき、且つ／又はその標的分子と適切に相互作用できるように立体障害を減少させるために提供してもよい。所望のスペーサーを識別するリンカー及び方法に関しては、例えば、George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879を参照のこと。
【０１１９】
リンカー配列は、受容体成分に天然に結合した１つ又は複数のアミノ酸を含んでもよく、又は融合タンパク質の発現を向上させるために使用される付加配列であってもよく、目的の特に望まれる部位を提供し、成分ドメインが最適な三次構造を形成でき、且つ／又はその標的分子との成分の相互作用を向上させることができる。一実施形態において、リンカーは、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜２５アミノ酸長の間にある１つ又は複数のペプチド配列を含む。一実施形態において、リンカーは１〜５アミノ酸長である。一実施形態において、リンカーは３アミノ酸配列であり、より具体的には、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙの３アミノ酸配列である。別の実施形態において、リンカーはＧｌｙ−Ｓｅｒである。
【０１２０】
このようなヒンジ分子の例は、限定されないが、以下のポリペプチドが含まれる：
ヒンジ１：CPPCPA（配列番号３０）
ヒンジ２：DKTHTCPPCPA（配列番号３１）
ヒンジ３：EPKSCDKTHTCPPCPA（配列番号３２）
【０１２１】
従って、本開示は、好ましくは、上記のようにアミノ酸２３４及び２３５の一方又は両方をアラニンに置換することによって、免疫グロブリンＦｃ領域、特に改変されたＦｃ領域、特にＦｃ受容体へのその結合を調節するために改変されているＦｃ領域に融合しているヒトＩＧＦ−１  Ｅａ−ペプチド前駆タンパク質を含有するＩＧＦ−１バリアントが産生される方法であって、４２位におけるアミノ酸グリシンが欠失し又はセリンに置換されており、アミノ酸の番号付けが配列番号２０に対応し、免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域を介してＩＧＦ−１前駆タンパク質に融合している、方法に関する。
【０１２２】
このような分子の例には、限定されないが、以下のポリペプチド：
ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｅ（配列番号２３）
ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ａ（配列番号２４）
ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｃ（配列番号２５）
ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｆ（配列番号２６）
ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ａ（配列番号２８）
ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ｅ（配列番号２７）
ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ｆ（配列番号２９）
が含まれる。
【０１２３】
特定の態様において、本開示は、哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）、ミドリザル（Cercopithecus aethiops）、ホモサピエンス（Homo sapiens）、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）、ハツカネズミ（Mus musculus）及びオナガザル種（Chlorocebus species）由来の細胞からなる群から選択される、上記の方法に関する。上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい他の実施形態において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ細胞（サルの腎臓（アフリカミドリザル）に由来する細胞株、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザルから抽出された腎臓上皮細胞）、Ｈｅｌａ細胞（この株はＨｅｎｒｉｅｔｔａ  Ｌａｃｋｓから得た子宮頸癌細胞に由来した）、ＢＨＫ細胞（ベビーハムスター腎臓細胞、ＨＥＫ細胞（ヒト胎児腎臓）、ＮＳ０細胞（マウス骨髄腫細胞株）、Ｃ１２７細胞（非腫瘍形成性マウス細胞株）、ＰｅｒＣ６（登録商標）細胞（ヒト細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌ）、ＣＡＰ細胞（ＣＥＶＥＣ’ｓ  Ａｍｎｉｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）及びＳｐ−２／０細胞（マウス骨髄腫細胞）からなる群から選択される。
【０１２４】
ＣＨＯ細胞は１９５７年に初めて首尾良く単離された（Tjio JH, Puck TT (1958) Genetics of somatic mammalian cells. II. Chromosomal constitution of cells in tissue culture. J Exp Med 108(2):259-268）。元の不死化ＣＨＯ細胞株に基づいて、いくつかの異なるクローンが開発されている。元の細胞株に由来するＣＨＯ−Ｋ１株はグリシン補充に依存する（Kao FT, Puck TT (1968) Genetics of somatic mammalian cells, VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells. Proc Natl Acad Sci USA 60(4):1275-1281）。その後の遺伝子変異により、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の両方の対立遺伝子が欠失したＣＨＯ−ＤＧ４４株が導かれた（Urlaub G, Chasin LA (1980) Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc Natl Acad Sci USA 77(7):4216-4220）。この細胞株は成長のためにグリシン及びヒポキサンチン並びにチミジンを必要とする。ＤＧ４４細胞株は研究を意図したが、この株は最も一般的に使用されるＣＨＯ発現系の１つになった。特定の態様において、上記に開示されている方法に使用される哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、前記ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞又はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞であってもよい。ＣＨＯ  Ｋ１細胞は１９５７年に成体チャイニーズハムスターの卵巣生検から開始した親ＣＨＯ細胞株（ＤＳＭＺ番号：ＡＣＣ１１０）のサブクローンである。それらは適切な合成装置の不在のためにプロリンを必要とする。翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特性機構を有する異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３及びＷＩ３８）はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能である。
【０１２５】
本発明の特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞はＣＨＯ−Ｋ１派生細胞であり、前記細胞のＩＧＦＲ１は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用することによってノックアウトされているか、又はＲＮＡ干渉技術を使用することによってノックダウンされており、本発明の方法に係る前記細胞内で産生される治療用タンパク質は、配列番号２３、又は配列番号２４、又は配列番号２５、又は配列番号２６、又は配列番号２７、又は配列番号２８、又は配列番号２９のＩＧＦ−１タンパク質である。
【０１２６】
さらなる態様において、本開示は、このように改変されていない同じ種類の細胞と比較して前記細胞内の異種組換え治療用タンパク質のより高い発現を可能にするように改変されている遺伝子改変哺乳動物細胞であって、異種組換え治療用タンパク質は前記細胞内で発現された内因性同族受容体のリガンドであり、前記遺伝子改変により、前記同族受容体の発現の欠損がもたらされ、組換え治療用タンパク質の発現は、治療用タンパク質の同族受容体の発現がこのように改変されていない細胞におけるより、少なくとも１．５倍、又は２倍、又は３倍、又は４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は１０倍又はそれより多い、哺乳動物細胞に関する。
【０１２７】
別の特定の実施形態において、本開示は、改変されていない同じ種類の細胞と比較して、前記細胞内の異種組換え治療用タンパク質のより高い発現を可能にするように改変されている遺伝子改変哺乳動物細胞であって、異種組換え治療用タンパク質は前記細胞内で発現された内因性同族受容体のリガンドであり、前記遺伝子改変により、前記同族受容体の発現の欠損がもたらされ、治療用タンパク質を発現する場合、前記遺伝子改変哺乳動物細胞は、培養時間の間、０．５〜１×１０７細胞／ｍｌ又は１〜１．５×１０７細胞／ｍｌ又は１．５〜２×１０７細胞／ｍｌ又は２〜２．５×１０７又は３〜３．５×１０７細胞／ｍｌ又はそれより多くまで成長できる、哺乳動物細胞に関する。
【０１２８】
さらなる実施形態において、本開示は、このように改変されていない同じ種類の細胞と比較して、前記細胞内で異種組換え治療用タンパク質のより高い発現を可能にするように改変されている遺伝子改変哺乳動物細胞であって、異種組換え治療用タンパク質は前記細胞内で発現された内因性同族受容体のリガンドであり、遺伝子改変により、前記同族受容体の発現の欠損がもたらされ、治療用タンパク質を発現する場合、前記遺伝子改変哺乳動物細胞の生存率が、最初の８０〜１１０時間又は１１０〜１４０時間又は１４０〜１７０時間又は１７０〜２００時間又は２００〜２３０時間又は２３０〜２６０時間の培養時間の間、９７％超である、哺乳動物細胞に関する。
【０１２９】
別の態様において、本開示は、このように改変されていない同じ種類の細胞と比較して、前記細胞内で異種組換え治療用タンパク質のより高い発現を可能にするように改変されている遺伝子改変哺乳動物細胞であって、異種組換え治療用タンパク質は前記細胞内で発現された内因性同族受容体のリガンドであり、遺伝子改変により、前記同族受容体の発現の欠損がもたらされ、（ｉ）組換え治療用タンパク質の発現が、このように改変されていない細胞におけるより、少なくとも１．５倍、又は２倍、又は３倍、又は４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は１０倍又はそれより多く、（ｉｉ）前記遺伝子改変哺乳動物細胞は、培養時間の間、０．５〜１×１０７細胞／ｍｌ又は１〜１．５×１０７細胞／ｍｌ又は１．５〜２×１０７細胞／ｍｌ又は２〜２．５×１０７又は３〜３．５×１０７細胞／ｍｌ又はそれより多くまで成長でき、（ｉｉｉ）前記遺伝子改変哺乳動物細胞の生存率は、最初の８０〜１１０時間又は１１０〜１４０時間又は１４０〜１７０時間又は１７０〜２００時間又は２００〜２３０時間又は２３０〜２６０時間の培養時間の間、９０％超である、哺乳動物細胞に関する。
【０１３０】
さらに別の態様において、本開示は、このように改変されていない同じ種類の細胞と比較して、前記細胞内の異種組換え治療用タンパク質のより高い発現を可能にするように改変されている上記の遺伝子改変哺乳動物細胞であって、哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）、ミドリザル（Cercopithecus aethiops）、ホモサピエンス（Homo sapiens）、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）、ハツカネズミ（Mus musculus）及びオナガザル種（Chlorocebus sp.）細胞からなる群から選択される、遺伝子改変哺乳動物細胞に関する。
【０１３１】
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、他の実施形態において、上記の哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ細胞（サルの腎臓（アフリカミドリザル）に由来する細胞株、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザルから抽出された腎臓上皮細胞）、Ｈｅｌａ細胞（この株はＨｅｎｒｉｅｔｔａ  Ｌａｃｋｓから得た子宮頸癌細胞に由来した）、ＢＨＫ細胞（ベビーハムスター腎臓細胞、ＨＥＫ細胞（ヒト胎児腎臓）、ＮＳ０細胞（マウス骨髄腫細胞株）、Ｃ１２７細胞（非腫瘍形成性マウス細胞株）、ＰｅｒＣ６（登録商標）細胞（ヒト細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌ）、ＣＡＰ細胞（ＣＥＶＥＣ’ｓ  Ａｍｎｉｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）及びＳｐ−２／０−細胞（マウス骨髄腫細胞）からなる群から選択される。特定の態様において、上記の哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、前記ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞又はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞であってもよい。
【０１３２】
本開示のさらに別の態様は、インスリン様成長因子１受容体の発現を欠損している、遺伝子改変ＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１派生又はＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞を含む。
【０１３３】
さらなる実施形態において、インスリン様成長因子１受容体の発現を欠損している上記のＣＨＯ細胞は、異種プロモーターの制御下で、ヒトインスリン様成長因子１遺伝子又はそのバリアントの染色体又は染色体外の少なくとも１つのコピーを有する。
【０１３４】
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、さらに別の実施形態において、インスリン様成長因子１受容体の発現を欠損している上記ＣＨＯ細胞は、異種プロモーターの制御下で、ヒトインスリン様成長因子１遺伝子又はそのバリアントの少なくとも１つの染色体又は染色体外のコピーを含み、ＩＧＦ−１Ｒの発現がこのように改変されていない同じ種類の細胞と比較して、少なくとも１．５倍、又は２倍、又は３倍、又は４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は１０倍多いヒトインスリン様成長因子１タンパク質又はそのバリアントの発現を可能にする。
【０１３５】
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、他の実施形態において、インスリン様成長因子１受容体の発現を欠損している上記のＣＨＯ細胞は、異種プロモーターの制御下で、ヒトインスリン様成長因子１遺伝子又はそのバリアントの少なくとも１つの染色体又は染色体外のコピー及び標的遺伝子組換え技術によってノックアウトされている唯一の非機能的インスリン様成長因子１受容体遺伝子を含む。
【０１３６】
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、さらなる実施形態において、インスリン様成長因子１受容体の発現を欠損している上記のＣＨＯ細胞は、（ｉ）異種プロモーターの制御下で、ヒトインスリン様成長因子１遺伝子又はそのバリアントの１つの染色体又は染色体外のコピー及び（ｉｉ）互いに相補的である少なくとも２つの配列を含む二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を少なくとも含み、センス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖はＩＧＦ−１ＲをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列を含み、ｓｉＲＮＡの各々の分離鎖の全長は、１５〜４９ヌクレオチド、１７〜３０ヌクレオチド又は１９〜２５ヌクレオチドであってもよく、インスリン様成長因子１受容体の発現は、本開示に係る上述のｄｓＲＮＡ分子で処理されていない細胞と比較して少なくとも１０％、３０％、５０％、９０％、９５％又は９９％阻害される。一実施形態において、上記の細胞は少なくとも１つの二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含み、前記分子のセンス鎖の配列は配列番号１又は３からなる群から選択される。
【０１３７】
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、さらなる実施形態において、インスリン様成長因子１受容体の発現を欠損している上記のＣＨＯ細胞は、（ｉ）異種プロモーターの制御下で、ヒトインスリン様成長因子１遺伝子又はそのバリアントの１つの染色体又は染色体外のコピー及び（ｉｉ）ＩＧＦ−１ＲをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部との相補性の領域を含むｓｈＲＮＡ分子を少なくとも含み、インスリン様成長因子１受容体の発現は、本発明に係る上述のｓｈＲＮＡ分子で処理されていない細胞と比較して、少なくとも１０％、３０％、５０％、９０％、９５％又は９９％阻害される。一実施形態において、上記の細胞は配列番号５、６、７、８、９及び１０からなる群から選択されるｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１種類を含む。
【０１３８】
配列
【０１３９】
【表１】
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【実施例】
【０１４０】
ＣＨＯ細胞株における組換えＩＧＦ−１の発現は細胞成長阻害（図１、２）及び低力価をもたらす。ｓｈＲＮＡ技術又は「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」技術を使用したＣＨＯ細胞内のＩＧＦ１−Ｒの安定なノックダウン／ノックアウトにより、驚くべきことに、改善された細胞成長及びより高いＩＧＦ−１タンパク質力価がもたらされた（図６、７、８、９及び１０）。ＩＧＦ−１をコードするプラスミドで安定にトランスフェクトされたＩＧＦ−１−Ｒ（ノックダウン）の低下した発現を有するＣＨＯ細胞は、安定にトランスフェクトした野生型ＣＨＯ細胞と比較して約５倍高いプール力価を生じた。さらに高いプール力価がＩＧＦ−１Ｒノックアウト細胞株の安定なトランスフェクション後に測定され得る。組換えＩＧＦ−１の５〜２０倍の力価増加が野生型ＣＨＯ細胞株と比較して検出され得る（図９）。要約すると、これらのデータは、哺乳動物細胞株における受容体遺伝子のノックダウン又はノックアウトが、治療用タンパク質を発現することが困難である産生を著しく改善できることを示す。
【０１４１】
パートＡ：一般的方法
本発明を、ここで、非限定的な実施例によって記載するが、それらは本発明の好ましい実施形態を構成する。
【０１４２】
Ｉ．細胞培養方法及びトランスフェクション
目的の治療用タンパク質を発現するための本発明に係る宿主細胞をトランスフェクトし、培養するための適切な方法は当業者に知られている。以下を実施例により開示する。
【０１４３】
実施例１：  細胞培養
ＣＨＯ細胞を成長させている懸濁液を、例えば米国特許第６，０４８，７２８号に開示されているように振盪フラスコ内の標準培地中で培養する。細胞を新鮮な培地中で１週間に２回継代し、この研究の間にわたって対数増殖期に維持する。
【０１４４】
実施例２：  トランスフェクション
トランスフェクションのために、９５パーセント超の生存率を有する対数増殖期における親ＣＨＯ細胞を使用した。製造業者（Ｌｏｎｚａ）の指示書に従ってＡｍａｘａ（商標）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）技術を使用して、エレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）によるトランスフェクションを行った。５×１０６細胞を９０ｇにて１０分、遠心分離し、１００μｌトランスフェクション試薬（「溶液Ｖ」）（Ｌｏｎｚａ）中で再懸濁した。細胞に何も加えないか（トランスフェクションの陰性対照）、又は３０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ若しくは３μｇの線形ＤＮＡベクター（ｓｈＲＮＡベクター若しくは（例えば配列番号２３〜２９の）ＩＧＦ−１バリアントをコードするベクター又はジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする両方のベクター（ｐＺＦＮ１及び２（配列番号３６／３７））の６μｇ若しくは１０μｇの均一混合物を加え、全混合物をエレクトロポレーションキュベットに移した。ヌクレオフェクション（プログラム：Ｕ−２３）後、キュベットを１ｍｌの予め温めておいた（セ氏３７度）培養培地ですすぎ、細胞を１２５ｍｌの振盪フラスコ内の２０ｍｌの予め温めておいた培地に加え、セ氏３７度及び１０パーセントＣＯ２にて２日間、インキュベートした。
【０１４５】
実施例３：  ピューロマイシン／ジェネティシン選択
選択をトランスフェクションの４８時間後に開始した。発現ベクター核酸に位置するピューロマイシン／ジェネティシン選択マーカーはピューロマイシン／Ｇ４１８耐性についての選択を可能にする。トランスフェクタントの選択のために、細胞が８０％超の生存率に回復するまで、５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＰＡＡ）／０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で細胞を培養した。トランスフェクション及びピューロマイシン／Ｇ４１８選択の約４／２週後、大部分がピューロマイシン／Ｇ４１８耐性細胞からなるプール集団が出現する。プールを回収した後、細胞を凍結させた。
【０１４６】
実施例４：  Ｇ４１８耐性細胞の遺伝子増幅
Ｇ４１８耐性細胞のさらによりストリンジェントな選択を、Ｇ４１８を含まないＭＴＸ含有培養培地（１μＭ）に細胞を通すことによって開始した。培養の３週後、ＭＴＸ耐性及び高産生細胞プールを生成した。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）選択マーカーは、葉酸類似体メトトレキサート（ＭＴＸ）を培養培地に加えることによって高産生細胞のストリンジェントな選択を可能にし、トランスフェクションプールについての増加した力価を生じる。ＭＴＸ選択から細胞を回収した後、細胞を凍結させ、ＦＡＣＳクローニング及びスクリーニングの間にわたって培養をＭＴＸ含有培地中で継続した。
【０１４７】
実施例５：  蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によるクローン細胞株の確立
クローン細胞株（すなわち、単一細胞に由来する細胞株）を得るために、トランスフェクトした細胞のプールを９６ウェルプレート中に播種した。トランスフェクトしたプール又は「スーパープール（superpool）」（いくつかのプールを調和した混合物）につき１×１０７細胞を遠心分離し、５ｍｌの冷やしたＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、１ｍｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁した。ｓｈＲＮＡ及びｐＺＦＮでトランスフェクトした細胞について、適切な量のＣｙ５で標識したｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔを加えた。細胞を暗所で３０分間、氷上でインキュベートし、続いて、５ｍｌの冷やしたＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁した。細胞を濾過し、保存又は／及びクローニングのためにＦＡＣＳチューブ中に分配した。細胞クローニングをＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で実施した。ｓｈＲＮＡ及びｐＺＦＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞は分類された単一細胞であった。ほとんど又は全く機能的でないＩＧＦ−１Ｒ発現を有する細胞のみを選択するために、５％の最も低いＣｙ５蛍光細胞のみを選択した。標準的な手順を使用して細胞をスケールアップした。個々のクローンを、ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡ発現又はＩＧＦ−１Ｒエクソン３における変異のいずれかについて評価し、培養及び分析後に最も低いＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡ発現又はＩＧＦ−１Ｒノックアウトクローンが保持されている。これらの候補から、ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ又はｒｈＩＧＦ−１の存在下で適切に成長する細胞株を、ベクターをコードする配列番号２３〜２９のＩＧＦ−１バリアントでのトランスフェクションのために選択した。最も高い産生力を有するクローンを、組換えタンパク質の産生のために選択した。産生力は、通常、培養条件を確立／適合することによって、すなわちバイオプロセスパラメータ（例えば、温度、供給、酸素及び温度変化）によって又はそれを適合することによってさらに改善され得る。
【０１４８】
実施例６：  環状ベクターの細菌クローニング
１つのＳｈｏｔ  Ｓｔｂｌ３細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＣ７３７３−０３）を製造業者の指示書に従ってクローニングされるベクターで形質転換し、適切な濃度の抗生物質を含有するアガロースプレート上に塗布した。使用した抗生物質は、２５μｇ／ｍｌのカナマイシン又は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンであった。一晩のインキュベーション後、明確な成長した細菌コロニーを採取し、２ｍｌの抗生物質を含有するＬＢ培養液中で８時間増殖させ、さらに１００ｍｌ中で１５時間増殖させた。製造業者の指示書に従って、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ１２３６２）を使用してＤＮＡベクターを精製した。ゲノム編集を必要とするベクター配列を、ベクター特異的フォワード及びリバースプライマーを使用してサンガーシークエンシングによって検証した。正確な配列を有するベクターをさらに使用した。
【０１４９】
実施例７：  急上昇実験
細胞培養を標準培地（５０ｍｌ培養物）中で２×１０５生存細胞／ｍｌの密度で継代した。適切な量の濾過滅菌した（０．２２μｍフィルタ）ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ又はｒｈＩＧＦ−１を５０ｍｇ／ｌの最終濃度のために加えた。両方は、ＣＨＯ−Ｋ１及びＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生親細胞の細胞成長阻害を誘発した。細胞を標準的な条件下で培養し、細胞生存率及び密度を２４時間に基づいて定期的に測定した。
【０１５０】
実施例８：  バイオリアクターにおいてＩＧＦ−１を発現する形質転換したＣＨＯ細胞の培養。
バイオリアクターにおいてＩＧＦ−１を発現する形質転換した細胞を培養するために、フェドバッチプロセスを適用した。細胞成長を補助し、生存率を維持することによって産生期を延ばすように供給開始及び温度変化などのプロセス事象の時間を決めた（Niraj Kumar, Patrick Gammell, Martin Clynes (2007) Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture; Cytotechnology (2007) 53:33-46）。
【０１５１】
実施例９：  ＣＨＯ細胞からのＩＧＦ−１の収集。
収集手段として、深層濾過、続いて濾過滅菌を用いる標準的な細胞分離技術を適用した。ＣＨＯ細胞を培養し、当業者に知られている標準的な方法に従って収集した（例えば、Curr. Protoc. Protein Sci. 2001 May;Chapter 5: Unit 5.10. Production of recombinant proteins in mammalian cells. Chen S, Gray D, Ma J, Subramanian S; (Mahesh Prashada, Klaus Tarrach (2006) Depth filtration: Cell clarification of bioreactor offloads, Filtration & Separation Volume 43, Issue 7, September 2006, Pages 28-30）。
【０１５２】
ＩＩ  ベクター構築
本発明の教示に係るいくつかのベクター構築物は実現可能である。ベクターの個々のエレメントは従来技術において知られているので、適切なベクターが、例えば、基本的な遺伝エレメントのシークエンシング又は増幅及び適切なクローニング並びに所望の方向における発現カセットによって構築され得る。それぞれのクローニング法は従来技術の水準であり、また、上記の遺伝エレメントの配列も従来技術に記載されている。続いて、ベクター構築物の生成は例として記載されている。しかしながら、それぞれのベクターを得るためのいくつかの他の実施形態及び手段が適しており、容易に利用できることは当業者により理解される。この段落に記載されている全てのプラスミド構築物（例えばｐＢＷ６７９）は、ＷＯ２００９０８０７２０に記載されている哺乳動物発現ベクターに基づく。ＷＯ２００９０８０７２０の実施例の段落、特に図１、表１及び実施例の段落ＩＩ：ベクター構築物（２１〜３１ページ）は本明細書に参照として組み込まれる。
【０１５３】
実施例１０：  ｓｈＲＮＡベクター構築物：
６個のセンス（配列番号５〜１０）及び６個の対応するアンチセンスヘアピンｓｉＲＮＡ鋳型オリゴヌクレオチドを合成し、アニールし、製造業者の指示書に従ってｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１−Ｕ６  ｐｕｒｏ発現ベクター（Ａｍｂｉｏｎ、品番ＡＭ５７６２）内でライゲーションした。これらのライゲーション産物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを使用して実施例６に記載されているように大腸菌（E.Coli）内でクローニングした。６個のｓｈＲＮＡベクターの各々について３個のコロニーを採取し、増殖させた。精製したＤＮＡベクターの配列を、カスタムフォワードプライマー（配列番号４６）及びＴ７リバースプライマー（配列番号４７）を使用して検証した。正確なフォワード及びリバース配列を有するＤＮＡベクターを、ＳｓｐＩ（ＮＥＢ、カタログＲ０１３２Ｓ）で線形化し、イソプロパノール及びエタノール沈殿で精製し、トランスフェクションの前にヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。２つのトランスフェクション複製を、これらの６個のｓｈＲＮＡベクターの各々について実施し（従って１２個のプールを生成した）、１つのトランスフェクションをスクランブルｓｈＲＮＡ対照（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１−Ｕ６  ｐｕｒｏ発現ベクターキットに含まれた）について行った。ピューロマイシンを用いてトランスフェクト細胞を選択した（実施例３）。ｓｈＲＮＡ１、４又は６（配列番号５、８、９）のいずれかに対応する２つのプールをそれぞれスーパープールし、ｓｈＲＮＡ２、３及び５（配列番号６、７、９）でトランスフェクトした６個全てのプールを、Ｃｙ５で標識したｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔで染色し、ＦＡＣＳを使用した単一細胞クローニングをする前に、スーパープール中で均一に合わせた（実施例５）。
【０１５４】
実施例１１：  ＩＧＦ−１Ｒのエクソン３に特異的であるＺＦＮの設計／産生及び使用：
ＩＧＦ−１Ｒのエクソン３及び隣接イントロンをＣＨＯ−Ｋ１及びＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生親細胞株（配列番号１４／１５）中で配列決定した。最初に、エクソン３を、エクソン３及びＩＧＦ−１Ｒ遺伝子のマウス配列を覆う所有のハムスターｃＤＮＡ配列に基づいて配列決定した。ＰＣＲプライマーを保存部分において設計し、得られたＰＣＲ産物を配列決定した。エクソン３配列に基づいて、Ｓｉｇｍａはエクソン３隣接イントロンを配列決定し、２つのＺＦＮ標的化ＩＧＦ−１Ｒエクソン３を操作した。各ＺＦＮは、それぞれリバース（５’上）、フォワード（３’上）ＤＮＡ鎖における１８ヌクレオチドを標的とし、結合する。２つの結合部位は切断部位の５つのヌクレオチド（配列番号１１）によって分離している。産物の詳細及び方法はＳｉｇｍａから入手可能である（「７４１８８  ＣｏｍｐｏＺｒ  Ｃｕｓｔｏｍ  ＺＦＮ  Ｔｅｃｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ」に記載されている）。Ｓｉｇｍａはまた、周囲のイントロン配列（配列番号１２及び１３）においてフォワード及びリバースＰＣＲプライマーを設計して、ｇＤＮＡレベルにおいてＩＧＦ−１Ｒエクソン３を増幅して、５０１ｂｐのＰＣＲ産物を得た。Ｓｉｇｍａは、それぞれリバース（ｐＺＦＮ１）、フォワード（ｐＺＦＮ２）鎖認識操作したＺＦＮをコードする、２０〜２５μｇの２つのＤＮＡベクターを含む、ＣｏｍｐｏＺｒ（商標）（カスタムジンクフィンガーヌクレアーゼ、製品番号ＣＳＴＺＦＮ−１ＫＴ、ロット番号０８０２１０１９ＭＮ）を提供した。
【０１５５】
いずれかのベクターを用いて周知の形質転換プロトコル（実施例６を参照のこと）に従って大腸菌（E.coli）を形質転換し、アガロースプレートを含有する２５μｇ／ｍｌのカナマイシン上に播いた。各ベクターについて、４つの細菌コロニーを選択し、増殖した。各ｐＺＦＮの４つの精製したＤＮＡプラスミド試料のＺＦＮ配列を、Ｔ７フォワード及びＢＨＧリバースプライマーを使用して検証し、プールした。環状ｐＺＦＮ１及びｐＺＦＮ２ベクターの６μｇ又は１０μｇの均一混合物を、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ）を使用してＣＨＯ−Ｋ１派生細胞及びＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生親細胞内でトランスフェクトした。３つの複製トランスフェクションを各量について実施し、各親細胞株について６つのプールを得た。プールにおけるＺＦＮの切断効率を測定するために、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎアッセイ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ、カタログ７０６０２５）を、トランスフェクション（ゼロ日と数える）の３日及び１０日後に使用した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ、カタログＧ１Ｎ７０−１ＫＴ）を使用してプールのゲノムＤＮＡを単離し、ＩＧＦ−１Ｒ（配列番号１２及び１３）のフォワード及びリバースシークエンシングプライマーを使用したＰＣＲ反応においてエクソン３を増幅した。次いでＰＣＲ産物を９５℃で変性させた。温度を徐々に低下させて、いくつかの野生型及び変異産物をハイブリダイズして、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）酵素によって切断された切断部位周囲にミスマッチを有する二本鎖ＤＮＡを形成させた。ｌａｂ９０１と呼ばれる毛管ゲル電気泳動系（ＬＡＢ９０１）を使用して最終産物を分析した。６つ全ての形質転換したプールについて、予想される５０１ｂｐの完全一致ＰＣＲ産物に加えて、切断部位のいずれかの側における断片に対応する、約２７７ｂｐ及び２２４ｂｐの２つのより小さなバンドを両方の細胞株の６つ全てのプールにおいて検出し、従って、ＣＨＯ−Ｋ１及びＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生親細胞においてＺＦＮ活性を証明した。トランスフェクションの７日後、プールは１０×９６ウェルプレートにおいて（実施例５に記載されているように）クローニングした単一細胞であった。
【０１５６】
ｐＺＦＮでトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１派生細胞株の全部で５０７個のクローンを、上記のＳｕｒｖｅｙｏｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎアッセイを使用して変異について評価した（クローンのゲノムＤＮＡを、Ｓｉｇｍａ製のＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ  Ｂｌｏｏｄ  ＰＣＲキット、カタログＸＮＡＢ２を使用して９６ウェルプレート中で抽出する）。４２個のクローンにおいて、２つのより小さなバンドを検出し、これらのゲノムがエクソン３の少なくとも１つの変異コピーを含有することが示された。続いて、これらのクローンのＩＧＦ−１Ｒエクソン３を配列決定した。ＤＮＡシークエンシングクロマトグラムは、標的配列の２つのコピーを示す、２つの重複する同じ強度のシグナルを示した。４２個のクローンのうちの６つは両方のコピーにおいてＩＧＦ−１Ｒ変異を有し、そのうちの２つのクローンは両方のコピー（クローン１及び２、配列番号３８、３９、４１及び４２）においてフレームシフト変異を有し、１つのクローン（３）は一方のコピーにおいてフレームシフト変異及び他方において１１４ｂｐ欠失（配列番号４０及び４３）を有した。これらの３つのクローンにおけるＩＧＦ−１Ｒ配列をＴＯＰＯクローニング（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．Ｋ４５７５−４０；６つの細菌コロニーを選択した）によって確認した。３つ全てのＫ．Ｏ．クローンを親細胞より顕著に高い生存細胞密度まで成長させた。５０ｍｇ／Ｌの「ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ」（配列番号３５）の急上昇は標準培地中で親細胞と同様の細胞成長挙動を生じた（図８）。遺伝子型Δ５／Δ２２（配列番号３９／４１）を有するクローンを、インスリン様成長因子１タンパク質、例えばヒトＩＧＦ−１（配列番号１６又は２０）又はそのバリアント（例えば配列番号２１〜２９）でのトランスフェクションのために選択した。
【０１５７】
ｐＺＦＮでトランスフェクトしたＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞株の単一細胞クローニングは１１７個のクローンを生じ、それらを上記のようにＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いて変異について評価した。全部で２８個のクローンは、ＩＧＦ−１Ｒエクソン３の少なくとも１つの変異コピー（２つのより小さなバンドが検出された）を有したが、シークエンシングにより、全てのこれらのクローンは依然として野生型コピーを含有することが示された。変異配列が検出された２つのクローン（Δ２２又はΔ１６）をｐＺＦＮで２回トランスフェクトし、１０μｇの混合ｐＺＦＮを使用して６つのプールを生成した。トランスフェクションの７日後、これらのプールは（実施例５に記載されているように）６×９６ウェルプレートにおいて分類された単一細胞であった。全部で２１１個のクローンをＩＧＦ−１Ｒエクソン３について配列決定し（既に変異した配列が存在するのでＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイはもはや可能ではない）、重複配列をクロマトグラムで分析した。クローンの全体の約２０％は野生型及び２つの変異配列（大部分は切断部位周囲で欠失している）を有した。遺伝子型Δ２２／Δ７／野生型、Δ１６／Δ７／野生型及びΔ１６／Δ２２／野生型を有する３つのクローンを、ｐＺＦＮでの第３ラウンドのトランスフェクションのために選択した（これらの配列はＴＯＰＯクローニングによって確認した）。８μｇの混合ｐＺＦＮでの２つのトランスフェクションを３つのクローンの各々について実施した。７〜９日後、クローンに対応する２つのプールを混合した。非機能的ＩＧＦ−１Ｒを有する細胞を濃縮するために、３つの得られたプールを、５０ｍｇ／ｌのｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔの存在下で６〜８週共培養した。単一細胞クローニングの２日前に、（Ｃｙ５で標識したｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔの結合を可能にし、５％の最も低い蛍光細胞を選択するために）ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔを有さない細胞を培養した。３つのプールは９×９６ウェルプレートにおいて分類された単一細胞であった。
【０１５８】
ＩＧＦ−１Ｒエクソン３における野生型切断部位配列に結合するＰＣＲプライマーを設計し、変異クローンの効果的なスクリーニングを可能にした。ＩＧＦ−１Ｒについてのフォワードシークエンシングプライマーと一緒にＰＣＲを実施した（細胞が野生型ＩＧＦ−１Ｒ配列を含有する場合、ＰＣＲはＰＣＲ産物を生じると仮定する）。全部で３８９個のクローンをスクリーニングし、５８個のＰＣＲ陰性クローンを配列決定した。これらのクローンの３０個において、野生型配列は検出できず、そのうちの２２個のクローンはフレームシフト変異を含有した（配列Δ２２／Δ７を有する１３個のクローン）。５０ｍｇ／ｌのｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔと共培養した及び共培養していないこれらの細胞成長を評価し、ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔの存在下で遺伝子型Δ２２／Δ７（配列番号４４／４５）を有する最適な成長クローンを、配列番号２１〜２９のタンパク質をコードするＤＮＡ構築物でのトランスフェクションのために選択した。
【０１５９】
実施例１２：
（ベクターｐＢＷ８０６（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ａ）のクローニング戦略（図１１））
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿ＡをコードするベクターｐＢＷ８０６を２つの連続したクローニング工程に従って調製した。第１の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＳＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｅ  ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したＦｃ領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行して、ｐＢＷ６７９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターｐＢＷ８０５を得た。第２の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ａ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ａ融合タンパク質のｎ末端領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＳｓｅ２３２Ｉを用いて消化した。並行して中間体ベクターｐＢＷ８０５を続いて、Ｓｓｅ２３２Ｉ及びＸｂａＩを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ａ＿ｐＭＡ−Ｔ断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ８０６を得た。
【０１６０】
（ベクターｐＢＷ８０７（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｃ）のクローニング戦略（図１２））
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿ＣをコードするベクターｐＢＷ８０７を２つの連続したクローニング工程に従って調製した。第１の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＳＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したＦｃ領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行して、ｐＢＷ６７９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターｐＢＷ８０５を得た。第２の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＷＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｃ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｃ融合タンパク質のｎ末端領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＳｓｅ２３２Ｉを用いて消化した。並行して中間体ベクターｐＢＷ８０５を続いて、Ｓｓｅ２３２Ｉ及びＸｂａＩを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｃ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ８０７を得た。
【０１６１】
（ベクターｐＢＷ８０８（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｆ）のクローニング戦略（図１３））
ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｆ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）をコードするベクターｐＢＷ８０８を２つの連続したクローニング工程に従って調製した。第１の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＳＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したＦｃ領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行して、ｐＢＷ６７９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターｐＢＷ８０５を得た。第２の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＹＣ＿ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｆ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｆｃ融合タンパク質のｎ末端領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＳｓｅ２３２Ｉを用いて消化した。並行して中間体ベクターｐＢＷ８０５を続いて、Ｓｓｅ２３２Ｉ及びＸｂａＩを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｆ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ８０８を得た。
【０１６２】
（ベクターｐＢＷ８０９（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ｅ）のクローニング戦略（図１４））
ＨＩＧＦ１−ＥＡ−ＦＣ＿ＭＵＴ  ０４／２＿Ｅ  Ｆｃ融合配列をコードする、ベクターｐＢＷ８０９を２つの連続したクローニング工程に従って調製した。第１の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＳＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したＦｃ領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行して、ｐＢＷ６７９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターｐＢＷ８０５を得た。第２の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮ２Ｃ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ｅ融合タンパク質のｎ末端領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＳｓｅ２３２Ｉを用いて消化した。並行して中間体ベクターｐＢＷ８０５を続いて、Ｓｓｅ２３２Ｉ及びＸｂａＩを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ８０９を得た。
【０１６３】
（ベクターｐＢＷ８１０（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ａ）のクローニング戦略（図１５））
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿ＡをコードするベクターｐＢＷ８１０を２つの連続したクローニング工程に従って調製した。第１の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＳＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したＦｃ領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行して、ｐＢＷ６７９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターｐＢＷ８０５を得た。第２の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮ２Ｃ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ａ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ａ融合タンパク質のｎ末端領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＳｓｅ２３２Ｉを用いて消化した。並行して中間体ベクターｐＢＷ８０５を続いて、Ｓｓｅ２３２Ｉ及びＸｂａＩを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ａ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ８１０を得た。
【０１６４】
（ベクターｐＢＷ４１０（ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ）のクローニング戦略（図１６））
ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ配列をコードする、ベクター０６１０９００ｐＧＡ４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したコードＩＧＦ配列を抽出するためにＸｂａＩ及びＭｌｕＩを用いて消化した。並行してｐＢＷ１６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＭｌｕＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ４１０を得た。
【０１６５】
（ベクターｐＢＷ６６４（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Δ１−３、Ｒ３７Ａ、Δ７１−７２、７７−ｆｃドメイン）のクローニング戦略（図１７））
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Δ１−３、Ｒ３７Ａ、Δ７１−７２、７７−ｆｃドメイン配列をコードする、ベクター０９０５９１５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したコードＩＧＦ配列を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行してｐＢＷ５９６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ６６４を得た。
【０１６６】
（ベクターｐＢＷ６６６（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Δ１−３、Ｒ３７Ａ、Δ７１−７２、Ｒ７７Ｑ−ｆｃドメイン）のクローニング戦略（図１８））
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Δ１−３、Ｒ３７Ａ、Δ７１−７２、Ｒ７７Ｑ−ｆｃドメイン配列をコードする、ベクター０９５０９１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したコードＩＧＦ配列を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行してｐＢＷ５９６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ６６６を得た。
【０１６７】
結果：
ＣＨＯ細胞株における組換えＩＧＦ−１の発現により、細胞成長阻害及び低力価が生じた。ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔの最大力価測定は８ｕｇ／ｍｌであり、これは１００ｍｇ／Ｌの抗体力価（モル質量に基づく）に対応する。バイオリアクタープロセスにおける組換え抗体の平均力価測定は約３ｇ／Ｌである。ＩＧＦ−１の低力価の１つの原因はＩＧＦ−１発現細胞の低下した細胞成長及び低い細胞生存率である。抗体発現プロセスの間、ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞は２×１０７細胞／ｍｌまで成長し、細胞生存率は、最初の２３０〜２６０時間の培養時間の間、９７％超である。対照的に、ＩＧＦ−１を発現するＣＨＯ−Ｋ１派生細胞は０．５×１０７細胞／ｍｌまでしか成長せず、細胞生存率は２日後で既に９７％未満に低下する（図１を参照のこと）。
【０１６８】
低下した細胞成長はまた、ＩＧＦ−１と非トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１派生細胞の共培養の間に検出され得る。図２は、親ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞が２．５×１０７細胞／ｍｌまで成長することを示す。ｒｈＩＧＦ１又はｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ（５０ｍｇ／Ｌ）とＣＨＯ−Ｋ１派生細胞の共培養の間、細胞成長はまた顕著に阻害された（０．９×１０７細胞／ｍｌ）（図２を参照のこと）。
【０１６９】
次の工程において、特異的ＩＧＦ−ＩＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＮＶＰＡＥＷ５４１）（ＮＶＰＡＥＷ５４１−ＩＧＦ−ＩＲキナーゼの新規で有効な選択的阻害剤のインビボ抗腫瘍活性；Carlos Garcia-Echeverria et al.; Cancer Cell;２００４年２月２６日にオンラインで公開されたDOI:10.1016/S1535610804000510）を、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞におけるｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔ共培養実験の間に加えた。細胞成長阻害は阻止することができた（図３を参照のこと）。これにより、ＩＧＦ−１Ｒが、細胞成長阻害を生じる細胞内にシグナルを誘発することが検証される。
【０１７０】
これらの結果を確認するために、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡベクターでのＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞のトランスフェクションを実施した（ＩＧＦ−１Ｒに対するｓｉ−及びｓｈＲＮＡ）。ＩＧＦ−１Ｒに対する２つの異なるｓｉＲＮＡ（配列番号１〜４）及び対照ｓｉＲＮＡ（スクランブル）を使用した。スクランブル配列は、ｓｉＲＮＡ送達法に起因し得る遺伝子発現プロファイルに対する任意の変化を差し引くために含んだ。このｓｉＲＮＡはチャイニーズハムスターにおける任意の既知の遺伝子と相補的ではない。試験した両方のｓｉＲＮＡは８０％超のＩＧＦ−１ＲのｍＲＮＡレベルを低下させた（図４を参照のこと）。
【０１７１】
ＩＧＦ−１Ｒの永続的に低下した発現を有する細胞株を生成するために、親ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞を、ＩＧＦ−１Ｒに対してｓｈＲＮＡを発現するベクター（配列番号５〜１０）でトランスフェクトした。ＩＧＦ−１Ｒに対して全部で６つの異なるｓｈＲＮＡ配列を評価した（図５を参照のこと）。ＩＧＦ−１Ｒの９４％までの低下した遺伝子発現が、プールレベルでこのアプローチ（ｓｈＲＮＡ４）により達成できた。
【０１７２】
図５に示されるｓｈＲＮＡプールはＦＡＣＳ技術を使用してクローニングした単一細胞であった。この技術は、トランスフェクト細胞の不均一集団からの特定の性質（例えば高抗体産生体）を有するクローンの迅速な識別及び単離を可能にし、標準的な限界希釈クローニング法に関連する労力及び時間を減少させる（Borth N, Zeyda M, Kunert R, Katinger H.Efficient selection of high-producing subclones during gene amplification of recombinant Chinese hamster ovary cells by flow cytometry and cell sorting. Biotechnol Bioeng. 2000-2001;71(4):266-73.; Carroll, S.; Al-Rubeai, M. The selection of high-producing cell lines using flow cytometry and cell sorting. Expert Opin. Biol. Ther. 2004, 4, 1821-1829.; Yoshikawa, T.; Nakanishi, F.; Ogura, Y.; Oi, D.; Omasa, T.; Katakura, Y.; Kishimoto, M.; Suga, K. Flow cytometry: An improved method for the selection of highly productive geneamplified CHO cells using flow cytometry. Biotechnol. Bioeng. 2001, 74, 435-442.; Meng, Y. G.; Liang, J.; Wong, W. L.; Chisholm, V. Green fluorescent protein as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells. Gene 2000, 242, 201-207）。この特定の場合、細胞をＣｙ５で標識したｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔで染色し、最も低い５％染色細胞を分類した。これらのクローンは、ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔとの共培養の間、親細胞株と比較してＩＧＦ−１Ｒの発現の劇的な低下及び生存細胞数の増加を示した（図５及び６を参照のこと）。それにも関らず、細胞成長阻害が依然として存在した（ｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔの存在下及び非存在下で培養したクローンの直接比較）。依然として少量のＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡが存在する（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検出された）ので、ＩＧＦ−１Ｒが細胞表面上で、より少ない量で依然として発現することが想定でき、これによりＩＧＦ−１に対する感受性が残っていることが説明される。
【０１７３】
次の工程において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術（ＺＦＮ）を使用したＩＧＦ−１Ｒのノックアウトを、ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞及びＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞株において実施した。ＩＧＦ−１Ｒのエクソン３の領域において特異的に結合するＺＦＮを設計した。２つのプラスミド（それらの各々はＩＧＦ−１Ｒ特異的ＺＦＮの１つのサブユニットをコードする）をＣＨＯ−Ｋ１派生細胞又はＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞において共トランスフェクトした。各ＺＦＮサブユニットは特異的な１８塩基対長の配列に結合し、従って全体で３６ｂｐ配列が特異的に認識される（ゲノムの他の位置におけるランダム切断を回避する）。ＦｏｋＩのエンドヌクレアーゼドメインを、ＤＮＡを切断するためにヘテロダイマーとしてのみ機能するように再操作する。ＺＦＮダイマーはＩＧＦ−１Ｒのエクソン３において標的化した二本鎖切断を生じる。非相同末端結合のエラープローン細胞プロセスによって、この二本鎖切断はＤＮＡ配列の改変を生じることができ、そのために標的遺伝子の機能的ノックアウトを生成する。ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞について、３つのノックアウトクローンを生成した（両方の対立遺伝子でのノックアウト）：クローン１：Δ２（配列番号３８）、クローン２：Δ５（配列番号３９）及びクローン３：Δ２（配列番号４０）、クローン１：＋１８（及び１４ｂｐｓ置換）（配列番号４２）、クローン２：Δ２２（配列番号４１）及びクローン３：Δ１１４（配列番号４３）。
【０１７４】
ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞ポリクローナル及びＩＧＦ−１Ｒチャレンジングのノックアウトを生じた倍数性と対照的である（２つより多いＩＧＦ−１Ｒコピー／ゲノムがノックアウトされなければならない）。本発明者らはフレームシフト変異を有するいくつかの特有のノックアウトクローンを生成し、ＴＯＰＯクローニング及びシークエンシングを用いてそれらの２つを検証した。クローン１２：Δ７（５０％）（配列番号４５）／Δ２２（５０％）（配列番号４４）、クローン１９：Δ７（１４．５％）／Δ１６（４４％）／Δ２２（１８％）／Δ２２ｍｕｔ（１５％）。括弧内の百分率は、この変異が３２個の配列決定した細菌コロニーからどれくらいの頻度で発生するかに基づく。クローン１９について、６つのＩＧＦ−１Ｒ対立遺伝子（３×Δ１６、１×Δ７、１×Δ２２、１×Δ２２ｍｕｔ）が存在すると想定され得る。
【０１７５】
３つの生成したＣＨＯ−Ｋ１派生細胞ＩＧＦ−１Ｒ  ＫＯクローンをｈＩＧＦ−１Ｅａ  ３ｍｕｔと共培養し、細胞成長阻害は検出できなかった（図７を参照のこと）。２つの生成したＩＧＦ−１Ｒ  ＫＯ  ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来のクローンもまた、ＩＧＦ−１の存在／非存在下で培養した。ＣＨＯ−Ｋ１  ＩＧＦ−１Ｒ  ＫＯクローンと同様に、改善された細胞成長を、野生型ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞と比較してＫＯクローンについて検出することができた（図８を参照のこと）。ＫＯクローンの１つは、ＩＧＦ−１の存在下で細胞成長阻害が存在せず、他のＫＯクローンは、ＩＧＦ−１の存在下で、ＩＧＦ−１と共培養していないＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞と同様の最大の生存細胞数を有したことを示した。
【０１７６】
Δ５／Δ２２  ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞ＩＧＦ−１Ｒ  ＫＯクローン及びΔ７／Δ２２  ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１細胞由来ＩＧＦ−１Ｒ  ＫＯクローンを、５つの異なるＩＧＦ−１−ＦＣ融合物候補でトランスフェクトした（図９を参照のこと）。組換えＩＧＦ−１−ＦＣタンパク質の５〜１７倍の力価の増加を、異なるＩＧＦ−１−ＦＣ融合物候補でトランスフェクトした野生型ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞／ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１細胞由来細胞株と比較してプールレベルで検出することができた。
【０１７７】
ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞ＩＧＦ−１Ｒ−ＫＯ又はＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来ＩＧＦ−１Ｒ−ＫＯ細胞株において発現したＩＧＦ−１−ＦＣ融合物候補（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ａ及びｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  ０４／２＿Ｅ）の２つを、１００Ｌのウェーブバイオリアクター（フェドバッチプロセス及び温度変化）において培養した。ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ａ／４を発現するＣＨＯ−Ｋ１派生細胞ＩＧＦ−１ＲＫＯプールを３×１０７細胞／ｍｌの最大生存細胞密度まで成長させ、これは平均ＡＢプロセスより高い（平均細胞密度は２．２×１０７細胞／ｍｌである。ＩＧＦ−１を発現するＣＨＯ−Ｋ１由来野生型細胞と比較して、これは生存細胞数において３〜６倍高い（図１を参照のこと）。ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ａ／４を発現するＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来ＩＧＦ−１ＲＫＯ細胞を１．５〜２×１０７細胞／ｍｌの最大細胞密度まで成長させ、これは野生型ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞株と比較してより高い最大細胞密度である。
【０１７８】
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ  １３／２＿Ａを発現するＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来ＩＧＦ−１Ｒ  ＫＯ細胞が分類した単一細胞であり、２４ウェル及び５０ｍｌのバッチ培養物中のバッチ力価を決定した。図９において、各群由来の１５個の最適なクローンの振盪フラスコ力価。ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１細胞由来ＩＧＦ−１Ｒ  ＫＯクローンの全ては８倍高い２４ウェル力価及び７倍高い振盪フラスコ力価を有する。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
組換え治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において前記治療用タンパク質を産生する方法であって、前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が前記治療用タンパク質の低力価をもたらし、前記方法が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現を欠損し、前記治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されている哺乳動物細胞を用いて、
ａ．前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
ｂ．工程ａにおいて培養した前記哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程を含み、前記哺乳動物細胞が、前記同族受容体の発現がこのように改変されていない細胞より少なくとも１．５倍多い治療用タンパク質を産生する、方法。
［２］
前記治療用タンパク質が成長因子である、請求項１に記載の方法。
［３］
前記成長因子がインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）タンパク質又はそのバリアントであり、前記哺乳動物細胞が機能的インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）の発現を欠損している、請求項２に記載の方法。
［４］
前記哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が、ＲＮＡ干渉又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
［５］
前記哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が前記ＲＮＡ干渉技術を適用することによって達成され、前記方法が、
（ａ）二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を前記細胞内に導入する工程であって、前記ｄｓＲＮＡ分子が互いに相補的である少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列を含み、前記相補性の領域が３０ヌクレオチド長未満であり、前記ｄｓＲＮＡ分子が、前記細胞内に導入すると、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードする遺伝子の発現を少なくとも１０％阻害する工程、及び
（ｂ）前記組換え治療用タンパク質遺伝子の前記同族受容体をコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程（ａ）において産生された細胞を維持し、それにより前記細胞内の前記同族受容体遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、請求項４に記載の方法。
［６］
前記ＲＮＡ干渉がｓｈＲＮＡ分子を使用して達成され、前記方法が、
（ａ）前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であるｓｈＲＮＡを前記細胞内に導入する工程であって、前記ｓｈＲＮＡが、前記細胞内に導入すると、前記同族受容体遺伝子の発現を少なくとも１０％阻害する、工程、及び
（ｂ）前記同族受容体遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程（ａ）において産生された細胞を維持する工程
を含む、請求項５に記載の方法。
［７］
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、Ｈｅｌａ、ＢＨＫ、ＨＥＫ、ＮＳ０、Ｃ１２７、ハイブリドーマ、ＰｅｒＣ６、ＣＡＰ及びＳｐ−２／０細胞からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
［８］
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ−Ｋ１派生細胞、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞又はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である、請求項７に記載の方法。
［９］
前記同族受容体がＩＧＦ−１Ｒであり、前記治療用タンパク質がＩＧＦ−１又はそのバリアントであり、ｓｈＲＮＡの配列が、配列番号５、６、７、８、９及び１０からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
［１０］
前記ＲＮＡ干渉が二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を使用して達成され、前記同族受容体が配列番号４４のＩＧＦ−１Ｒであり、前記治療用タンパク質がＩＧＦ−１又はそのバリアントであり、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の遺伝子配列が配列番号１及び３からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
［１１］
配列番号１及び３からなる群から選択されるｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む、ｄｓＲＮＡ分子。
［１２］
配列番号５、６、７、８、９及び１０からなる群から選択される配列を含む、ｓｈＲＮＡ分子。
［１３］
前記同族受容体がＩＧＦ−１Ｒであり、前記治療用タンパク質がＩＧＦ−１又はそのバリアントであり、前記ＩＧＦ−１Ｒの発現の欠損がジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によって達成される、請求項４に記載の方法。
［１４］
前記成長因子が、配列番号１６のヒトインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）タンパク質又はそのバリアントである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
ａ．前記インスリン成長因子１受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
ｂ．工程ａ．の細胞を、ＩＧＦ−１又はそのバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
ｃ．形質転換されている工程ｂ．の細胞を選択する工程、
ｄ．工程ｃ．において選択した細胞を、ＩＧＦ−１タンパク質又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で培養する工程、
ｅ．工程ｄにおいて培養した哺乳動物細胞からＩＧＦ−１タンパク質又はそのバリアントを収集する工程
を含み、前記哺乳動物細胞が、工程ａに記載されているように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも１．５倍多いＩＧＦ−１又はそのバリアントを産生し、工程ａ．及びｂ．の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程を同時に実施することもできる、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
前記治療用タンパク質が工業的製造規模で産生される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
インスリン様成長因子１タンパク質又はそのバリアントの発現が、このように改変されていない細胞と比較して少なくとも１．５倍高いように遺伝子改変されている哺乳動物細胞であって、前記遺伝子改変により、ＩＧＦ−１受容体の発現の欠損がもたらされる、哺乳動物細胞。
［１８］
前記細胞が、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞、ミドリザル（Cercopithecus aethiops）細胞、ホモサピエンス（Homo sapiens）細胞、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）細胞、ハツカネズミ（Mus musculus）細胞及びオナガザル種（Chlorocebus sp.）細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。
［１９］
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１８に記載の細胞。
［２０］
ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞又はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である、請求項１９に記載の細胞。
［２１］
ＩＧＦ−１受容体の発現の欠損を導く前記遺伝子改変が、ＲＮＡ干渉技術又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される、請求項１７〜２０に記載の細胞。
［２２］
組換え治療用タンパク質を産生するための哺乳動物細胞の使用であって、前記細胞が前記治療用タンパク質の内因性同族受容体の発現を欠損しており、前記同族受容体の発現を欠損していない細胞内の前記同族受容体への前記組換え治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び／又は前記組換え治療用タンパク質の低力価をもたらす、使用。
［２３］
前記組換え治療用タンパク質が成長因子である、請求項２２に記載の使用。
［２４］
前記成長因子がインスリン様成長因子１タンパク質又はそのバリアントであり、前記同族受容体がインスリン様成長因子１受容体である、請求項２３に記載の使用。
［２５］
請求項１〜１０、１１、１４又は１５のいずれか一項に記載の方法における、請求項１７〜２１に記載の細胞の使用。
［２６］
前記成長因子が、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８及び２９からなる群から選択されるヒトインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）タンパク質バリアントである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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