(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）複数の細胞から、個別の重鎖可変領域（heavy-chain variable region；ＶＨ）ドメインタンパク質を発現し、そして精製する工程、
（ｂ）工程（ａ）における細胞とは別の複数の細胞から、個別の軽鎖可変領域（light chain variable region；ＶＬ）ドメインタンパク質を発現し、そして精製する工程、及び
（ｃ）精製されたＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質を互いに対にする工程、
を含むＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項２】
前記ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質がヒト由来又は非ヒト由来である、請求項１に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項３】
複数の細胞からの前記個別のＶＨドメインタンパク質は互いに異なるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項４】
複数の細胞からの前記個別のＶＬドメインタンパク質は互いに異なるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項５】
複数の細胞からの前記個別のＶＨドメインタンパク質は互いに異なるアミノ酸配列を含み、そして複数の細胞からの前記個別のＶＬドメインタンパク質は互いに異なるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項６】
前記ＶＨドメインタンパク質はヒト由来又は非ヒト由来であり、そして複数の細胞からの前記個別のＶＨドメインタンパク質は互いに異なるアミノ酸配列を含むか、又はＶＬドメインタンパク質はヒト由来又は非ヒト由来であり、そして複数の細胞からの前記個別のＶＬドメインタンパク質は互いに異なるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項７】
前記ＶＨドメインタンパク質はヒト由来又は非ヒト由来であり、そして複数の細胞からの前記個別のＶＨドメインタンパク質は互いに異なるアミノ酸配列を含み、そしてＶＬドメインタンパク質はヒト由来又は非ヒト由来であり、そして複数の細胞からの前記個別のＶＬドメインタンパク質は互いに異なるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項８】
前記ＶＨドメインタンパク質は複数の相補性決定領域（complementarity determining regions；ＣＤＲｓ）及び複数のフレームワーク領域（ＦＲｓ）を含み、そしてＶＬドメインタンパク質は複数の相補性決定領域（complementarity determining regions；ＣＤＲｓ）及び複数のフレームワーク領域（ＦＲｓ）を含む、請求項１に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項９】
前記ＶＨドメインタンパク質の複数のＣＤＲｓは互いに異なるアミノ酸配列を含むか、前記ＶＬドメインタンパク質の複数のＣＤＲｓは互いに異なるアミノ酸配列を含むか、前記ＶＨドメインタンパク質の複数のＦＲｓは互いに異なるアミノ酸配列を含むか、又は前記ＶＬドメインタンパク質の複数のＦＲｓは互いに異なるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項１０】
前記ＶＨドメインタンパク質の複数のＣＤＲｓは互いに異なるアミノ酸配列を含み、そして前記ＶＬドメインタンパク質の複数のＣＤＲｓは互いに異なるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項１１】
前記ＶＨドメインタンパク質の複数のＦＲｓは互いに異なるアミノ酸配列を含み、そして前記ＶＬドメインタンパク質の複数のＦＲｓは互いに異なるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項１２】
前記ＶＨドメインタンパク質のＦＲｓは互いに異なるアミノ酸配列を含み、そして前記ＶＬドメインタンパク質のＦＲｓは互いに異なるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項１３】
前記工程（ｃ）は、
（ｉ）野生型ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質の間で対にすること、（ii）ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質のそれぞれに導入されたシステイン残基の間のジスルフィド結合により対にすること、
（iii）ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質のそれぞれに導入されたｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインの間の融合により対にすること、又は
（iv）ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質のそれぞれに融合したタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用により対にすること、
によって、ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質を対にすることを含む、請求項１に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項１４】
（ｄ）前記工程（ｃ）の対のＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質を個別の区画に保存する工程、
を更に含む請求項１に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項１５】
前記個別の区画が独特の識別（identification；ＩＤ）番号を割り当てられる、請求項１４に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項１６】
前記区画がプレートウェル、テストチューブ、マイクロ流体チャンネル、又はチップを含む、請求項１４に記載のＦＶライブラリーの製造方法。
【請求項１７】
（ａ）複数の細胞から、個別の重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインタンパク質を発現し、そして精製する工程、
（ｂ）工程（ａ）における細胞とは別の複数の細胞から、個別の軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインタンパク質を発現し、そして精製する工程、
（ｃ）精製されたＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質を互いに対にし、Ｆｖライブラリーを構築する工程、
（ｄ）前記Ｆｖライブラリーの個別のメンバーの機能検査を行う工程、及び
（ｅ）目的の特性、特徴、又は活性を示すＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質対を同定する工程、
を含む目的のＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質対のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質対が、個別の区画に存在する、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
前記個別の区画が独特の識別（identification；ＩＤ）番号を割り当てられる、請求項１８に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
（ｃ）工程（ｂ）において同定されたＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質対の配列を同定する工程、
を更に含む請求項１８に記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
前記機能検査がターゲットへの結合に基づくプレスクリーニング工程を含まない、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記目的の特性、特徴、又は活性が細胞の増殖、分化、又は細胞死である、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーの製造方法、前記製造されたＦＶライブラリーを利用した目的抗体のスクリーニング方法、前記スクリーニング方法によってスクリーニングされたＦＶ抗体及び前記ＦＶライブラリーの製造方法によって製造されたＦＶライブラリーに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、免疫系内の白血球のＢ細胞（Ｂリンパ球）で抗原の刺激によって作られるタンパク質であって、抗原に会うと、細胞にある受容体を介して抗原を認識して受容体を介して結合する。このような抗体は、疾病を治療するためのタンパク質新薬の候補物質と考えられて、目的とする機能的な抗体を探すために種々の抗体ライブラリーを製造して、これからスクリーニングする。このような抗体ライブラリーは、遺伝子組換え技術を利用するもので、ヒト体内に存在するＢ細胞で抗体タンパク質をコードする遺伝子を抽出して、抗体遺伝子ライブラリーを製作して、このライブラリーから所望の抗原結合特異性を持った抗体を選別する。抗体ライブラリー技術は、ヒト抗体など抗体の製作に一大革新をもたらした。抗体免疫反応の最も著しい特徴は、外部からどのような種類、あるいは形の抗原が体内に侵入しても、その抗原が体内の成分と同じでない外来物質であれば、その抗原と特異的に結合する抗体が一週間以内に作られるということである。抗体はＢリンパ球によって作られて、一つのＢリンパ球はただ一種類の抗体だけを生産する。実際に、人体には数多くのＢリンパ球があって、各Ｂリンパ球は、自己だけの独特の抗原結合特異性を持った抗体を細胞膜に発現しているが、一般に約１０８種類程度の抗原結合多様性が人体内に存在すると知られている。抗原が侵入する場合には、この抗原と特異的に結合する抗体を発現しているＢリンパ球だけが速く増殖をしながら抗体を多量生産して、結果的に血清内にこの特定抗体の濃度が急激に上昇して、侵入した抗原の迅速な除去機能を行うことになる。従って、人体内には数億種の抗体多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）が存在して、このような抗体の多様性を抗体レパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）と表現する。従って、人体から十分な数のＢリンパ球を採血で取得した後、この細胞からｍＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）方法で抗体重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを得ると、比較的簡単な方法で人体内の抗体レパートリーを遺伝子形態で試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）に確保することができる。抗体ライブラリー技術の核心は、このようなヒト抗体遺伝子レパートリーをタンパク質で発現する（あるいはディスプレーと表現）と同時に、その抗体タンパク質をコードする遺伝子がある媒体を介して連結される、いわゆる遺伝型−表現型連結（ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）であり、これを介して抗体ライブラリーから特定抗原と結合する抗体を選別して同時にその特定抗体をコードする遺伝子を取得する。この時完ぺきな形態の免疫は不要であり、抗原結合機能を持った抗体のＦａｂ形態で発現するか、あるいは重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨとＶＬ）が約１５アミノ酸の短いペプチド連結子（ｌｉｎｋｅｒ）に連結されたｓｃＦＶ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）と命名された抗体断片で発現する。この時このような抗体の遺伝型−表現型連結（ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）に用いられる媒体をどのような媒体の表面に発現させるのかによって、��ァージディスプレー、リボソームデスプレイ、酵母ディスプレーなどで区別されて、抗原を投与するなどの免疫反応の誘導せず所望の抗原結合性の抗体を得ることができる。しかし、抗体ライブラリー製作及び抗体選別に多くのノウハウが必要で、高親和度の抗体を得るのが容易でないため、抗体選別後親和度成熟など抗体最適化過程を行う場合が多く、特に１次選別時、毒性などの問題から直ちに哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ）で機能分析を行うことができない短所などがある。治療抗体の場合には、単に抗原との結合でなく実際の治療機能がある抗体を選別しなければならないので、このような短所は、治療用抗体開発に障壁となってきた。
【０００３】
抗体ライブラリーの中で現在最も多く用いられているのは、ファージディスプレー抗体ライブラリーであり、実際に現在商業化されているリューマチ関節炎治療剤であるヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ、ａｎｔＩ−ＴＮＦ−ａｌｐｈａヒトモノクローナル抗体）がファージディスプレー技術によって製造された治療用抗体である。理想的な抗体ライブラリーは、巨大な抗体多様性を含んでいて、所望の抗原結合特異性を持った高親和度の抗体クローンをいつでも獲得できるライブラリーである。このためには、約１０１０乃至１０１１程度の抗体多様性を持ったライブラリーを製作しなければならないが、抗体遺伝子クローニング作業を介して、このような大きさのライブラリーを製作するのはかなり難しく、まさにこの点がファージディスプレー抗体ライブラリー製作の最も難しい難題といえる。また、ファージ自体が毒性として作用して、すくに機能分析を行うことができない短所がある。リボソームデスプレイの最も大きい長所は、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅシステムデあるため、理論的に１０１３の大きさのライブラリー製作が可能なほど巨大な大きさのライブラリーを簡単に作ることができて、高親和度抗体（ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の獲得に有利で（一般に抗体ライブラリーの大きさが大きいほどライブラリー内に高親和度の抗体が含まれている可能性が高い）、ＰＣＲ増幅過程があるのでｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを利用できて、分子進化（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を人為的に誘導するための突然変異の導入が非常に容易であるが、これも毒性問題及び種々の実験上の問題点によって、実際の場合ｎａｉｖｅ祈願の抗体ライブラリーの製作には、ファージディスプレー技術を主に使っている。酵母ディスプレー技術の場合、組換えベクターをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株に挿入する過程と酵母細胞の大きい大きさによって１０９以上の多様性を持った抗体ライブラリーを作るのに多くの技術的制限があり、従って選別過程での長所を活用してすでに確保されている抗原−特異的抗体の突然変異ライブラリーを製作して、これから高親和度の抗体を選別するのに主に用いる。
【０００４】
しかし、このような抗体ライブラリーは、全ての抗体が個別的に分離保管する形態でなく、全ての抗体が混ざっている形態である。このような抗体ライブラリーが持つ限界は、目標物質抗原に対する抗体を選別する時機能（活性）による選別が現実的に不可能であり、ただ抗原との結合に基づいた抗体選別だけが可能な短所がある。この過程で得られた初期抗体候補は、次の段階で機能の有無を調べて実質的に機能を持つ抗体を選別する。このような選別段階で多くの場合、初期抗体選別段階で結合だけうまくできて機能がない抗体が得られるようになる。従って、このような選別方法の限界を克服できる新しい方法が求められる。即ち、最初から機能による抗体を選別する方法が求められている。しかし、既存のライブラリーは、種々の抗体が共に混ざっている状態で、一度に機能による各々の抗体選別が不可能である。従って、低分子化合物ライブラリーのように全ての抗体を個別的に精製して保管する方法が可能である場合、機能による選別が可能となる。しかし、抗体はタンパク質であるため、発現及び精製過程が必要で、これを介して十万個または百万個の各々異なる抗体のライブラリーを構築するのは現実的に不可能である。即ち、既存の方法は、ライブラリー多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を１，０００，０００と仮定すれば１，０００，０００個のタンパク質精製が必要で、多様性が増加するほど必要なタンパク質精製回数が急激に増える短所がある。これは既存のライブラリー技術は、ベクター内でＤＮＡ水準でＶＨ及びＶＬを組み合わせてライブラリーを製造する技術（ＵＳ８，１７８，３２０）、ＤＮＡ水準で抗体重鎖及び軽鎖ライブラリーを製造する技術（ＵＳ７，８５８，５５９）等多様なライブラリー製造技術があるが、いずれもＤＮＡ水準での組合せで各々満足するｄｉｖｅｒｓｉｔｙのライブラリーを製造するためには、その数だけのタンパク質の精製が必要で、増え過ぎた個数によってライブラリーで製造された抗体を直ぐに機能分析をすることができないので、その数を減らすために抗原との結合を介して選別して機能を分析できる個数を減らす追加ｓｔｅｐが必要で、このような選別中本当に重要な抗体を脱落する重大な短所があった。特に、既存のライブラリー製造方法は、ＤＮＡ水準での組合せでＦＶを発現しなければならないので、多様性だけのタンパク質精製が必要であって、個別的に分離した抗体ライブラリーを放棄した状態であった。
このような背景下、本発明者等は、抗体が機能的に選別することができるように個別的に分離しているライブラリーを開発するために鋭意努力した結果、既存のＤＮＡ水準で組み合わせるライブラリー製造技術とは異なりライブラリーをタンパク質水準で製造することに着目した、ＶＨとＶＬのタンパク質水準での組合せを介してタンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーを製造する可能性があることを確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８，１７８，３２０号明細書
【特許文献２】米国特許第７，８５８，５５９明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の一つの目的は、タンパク質組合せ基盤のＦＶ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリーの製造方法を提供することである。
【０００７】
本発明の他の一つの目的は、前記タンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーの製造方法によって製造されたＦＶライブラリーを利用して、目的抗体をスクリーニングする方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに他の一つの目的は、前記スクリーニングする方法によってスクリーニングされた目的ＦＶ抗体を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の一つの目的は、前記タンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーの製造方法によって製造されたＦＶライブラリーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、ンパク質組合せ基盤のＦＶ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリー及びこれの製造方法を提供する。
【００１１】
具体的に、本発明は、ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質が結合したＦＶを含むタンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーを提供する。
【００１２】
また、本発明は、（ａ）重鎖可変領域（ｈｅａｖｙＣ−Ｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ；ＶＨ）ドメインタンパク質及び軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ；ＶＬ）ドメインタンパク質を製造する工程；及び（ｂ）前記（ａ）工程で製造されたＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質を結合する工程を含む、タンパク質組合せ基盤のＦＶ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリーの製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の標的−ＬＰＥＴＧ−多様な長さのリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ及びＨｉｓタグの融合タンパク質の模式図を簡単に示した図である。（Ａ）は、７個のアミノ酸からなるリンカー、（Ｂ）は１８個のアミノ酸からなるリンカー、（Ｃ）は２０個のアミノ酸からなるリンカーである。
【図２】本発明のタンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーの対結合模式図を示した図である。（Ａ）は野生型結合、（Ｂ）は二硫化結合、（Ｃ）はｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合を示した図である。
【図３】簡単なタンパク質精製過程の模式図を示した図である。
【図４】精製されたＶＬ及びＶＨ突然変異のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示した図である。
【図５】ＦｌａｇタグがないＶＨドメインタンパク質であるＶＨ−Ｇ４４Ｃ、Ｎ−末端にＦｌａｇタグがあるＦｌａｇ−ＶＨ−Ｇ４４Ｃ、Ｎ−末端及びＣ−末端にＦｌａｇタグがあるＦｌａｇ−ＶＨ−Ｇ４４Ｃ−Ｆｌａｇタンパク質の発現がＦｌａｇ存在によって増加することを示した図である。
【図６】ｓｏｒｔａｓｅ融合の有無、Ｆｌａｇ融合の有無による組換えタンパク質の発現及び精製収率を比較して示した図である。
【図７】ＶＨ−ＶＬ対結合のＥＬＩＳＡ実験方法の模式図である。
【図８】ＶＨ−ＶＬ対結合のＥＬＩＳＡ実験結果を示した図である。
【図９】Ｆｌａｇ−ＶＨ及びＦｌａｇ−ＶＬ対結合のＥＬＩＳＡ結果を示した図である。
【図１０】システイン突然変異が導入されたＶＨ及びＶＬ対結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示した図である。
【図１１】Ｆｌａｇ−ＶＨ及びＦｌａｇ−ＶＬ対結合がＶＨ及びＶＬ対結合が増加させることを示したＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示した図である。
【図１２】ＶＬ−ＩＡＡＬＫ３−Ｆｌａｇ−ＶＨ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ及び組み立てられたＦＶのＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果を示した図である。
【図１３】ＶＬ、ＶＨ及び組み立てられたＦＶ野生型のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示した図である。
【図１４】ＶＬ−Ｑ１００Ｃ−Ｆｌａｇ−ＶＨ−Ｇ４４Ｃ−Ｆｌａｇ、及び組み立てられたＦＶのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示した図である。
【図１５】ＶＬ−ＩＡＡＬＫ３−Ｆｌａｇ−ＶＨ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ、及び組み立てられたＦＶのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示した図である。
【図１６】ＢＴ−４７４細胞増殖に対する結合４Ｄ５  ＦＶ抗体の効果をＣＣＫ８  ａｓｓａｙ（Ｄｏｊｊｉｎｄｏ）を介して確認した結果を示した図である。
【図１７】ＢＴ−４７４細胞で４Ｄ５  ＩｇＧ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン及び結合ＦＶ抗体のＨｅｒ２発現細胞表面への結合プロフィールをＦＡＣＳを介してモニタリングした結果を示した図である。
【図１８】ＣＤＲデザインのためのＶＨ  ＣＤＲ３及びＶＬ  ＣＤＲ３の選択を示した図である。
【図１９】ＶＨ  ＣＤＲ及びＶＬ  ＣＤＲ多様性を導入するための、高頻度の有無を分析を示した図である。
【図２０】本発明の一実施例に係る多様性を持つライブラリーをデザインした結果を示した図である。
【図２１】５ＶＨｓと５ＶＬｓの組合せで構築された２５ＦＶｓをＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認した結果を示した図である。
【図２２】４Ｄ５  ＶＨと５個の合成ＶＬｓによって製造された結合ＦＶをＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認した結果を示した図である。
【図２３】ライブラリースクリーニング過程を示した図である。
【図２４】アルファアッセイを介して個別ＦＶと１０個の混合抗原の相互結合をスクリーニングした結果を示した図である。
【図２５】混合された抗原に結合するＦＶと個別抗原の相互結合を２次的にスクリーニングした結果を示した図である。
【図２６】ＣＳＦ１Ｒに主に結合するＦＶのアルファアッセイの結果を示した図である。
【図２７】アルファアッセイの結果、ＣＳＦ１Ｒと主に結合するＦＶに対する相互結合をＥＬＩＳＡで確認した結果を示した図である。
【図２８】アルファアッセイの結果、ＣＳＦ１Ｒと主に結合するＦＶに対する相互結合をウエスタンブロットを介して確認した結果を示した図である。
【図２９】ｃ−ＭＥＴに結合するＦＶのアルファアッセイの結果を示した図である。
【図３０】アルファアッセイの結果、ｃ−ＭＥＴと主に結合するＦＶに対する相互結合をＥＬＩＳＡで確認した結果を示した図である。
【図３１】アルファアッセイの結果、ｃ−ＭＥＴと主に結合するＦＶに対する相互結合をウエスタンブロットで確認した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の用語「ＦＶ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリー」とは、多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を持つ各々の複数のＦＶが集まっているＦＶの総集合体を意味する。本発明の用語「ＦＶ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、抗体のＦａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）領域の一部分で重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ；ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔＣ−Ｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ；ＶＬ）からなる部分で、最小抗体断片を意味する。本発明の目的上、前記ＦＶ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリーは、タンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーであってもよい。
【００１５】
既存のライブラリーは、抗体の多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）の抗体遺伝子レパートリー（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ）を満足するために、ＤＮＡ水準で組合せが行われた。一般に、抗体はＢリンパ球によって作られて、一つのＢリンパ球はただ一種類の抗体だけを生産する。そこで、人体内には数多くのＢリンパ球が存在して、各々のＢリンパ球は、自己だけの独特の抗原結合特異性を持った抗体を細胞膜に発現していて、一般に約１０８種類程度の抗原結合多様性が人体内に存在すると知られている。従って、人体内には数億種の抗体多様性が存在して、このような抗体多様性であるレパートリーを形成するためには、数億個の組合せのＤＮＡを製造して、これから抗体を形成しなければならない。例えば、１０８の多様性を持つライブラリーを製造するためには、１００，０００，０００個のＤＮＡを合成して、１００，０００，０００度のタンパク質精製を行ってこそ分離したタンパク質発現抗体ライブラリーを製造するもので、これは現実的に不可能に近い。しかし、本発明のタンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーの場合には、ＶＨドメイン１０，０００個とＶＬドメイン１０，０００個の発現及び精製、即ち、ただ２０，０００個の発現及び精製を介して分離したＦＶライブラリーを製造することができる。このような本発明のタンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリー製造方法は、本発明者等によって最初に開発された。本発明のタンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリー製造方法は、各々分離精製されたＶＨドメイン及びＶＬドメインを細胞内でなく細胞外で結合させて所望のタンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーを製造できることを特徴とする。
【００１６】
好ましくは、前記ＦＶライブラリーは、個別的機能検査が可能であることを特徴とする。
【００１７】
好ましくは、前記個別的機能検査は、目標物質結合に伴う目的に応じて、前−選別工程を行って、さらに好ましくは目標物質結合に伴う前−選別工程を行わなくても良い。
【００１８】
前記で説明したように、既存のライブラリーは、ＤＮＡ基盤のライブラリーであって、各々の抗体をＤＮＡからタンパク質に発現して分離するには、数多くの発現及び精製過程が必要で、各々の抗体が、ライブラリー内に個別的に分離されておらず、各々の抗体が、ライブラリー内に混在して存在する。そこで、タンパク質である抗体の機能検査を行うためには、抗体をタンパク質に精製分離する工程が必要で、これは先に説明したように実質的には不可能で、抗原と同じ目標物質との結合を介して１次選別する工程を介して、目標物質と結合した抗体に対してのみ機能検査を行って２次選別をした。しかし、このような目標物質との結合による選別時には、実際機能をする抗体を逃す危険がある。そこで、本発明のＦＶライブラリーは、個別的分離が可能で、１次選別、即ち目標物質結合による前−選別工程なしに、個別的機能検査を行って実質的に機能をするＦＶ抗体を逃さないで製造することができる。
【００１９】
本発明の目的上、前記ＦＶライブラリーはＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むＦＶライブラリーであってもよいが、ＶＨドメインタンパク質及び軽鎖可変領域ＶＬドメインタンパク質の組合せによって製造されるライブラリー基盤で、抗原結合能力を持つ断片であるＣＨ領域が結合したＦａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦＶ及びｒＩｇＧを含む、抗体の抗原結合形態及び全体抗体を含んでもよい。また、前記抗体は、組換え一本鎖ＦＶ断片（ｓｃＦＶ）、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）または、両特異性分子、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディを含んでもよい。二価または両特異性分子は、例えば、Kostelnyなど（１９９２，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４８：１５４７），  Ｐａｃｋ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  （１９９２，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３１：１５７９），  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  など  （１９９３，  Ｓｕｐｒａ），  Ｇｒｕｂｅｒ  など（１９９４，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ５３６８），  Ｚｈｕなど（１９９７，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，  ６：７８１など），  Ｈｕなど（１９９６，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５６：３０５５），  Ａｄａｍｓなど（１９９３，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５３：４０２６）及びＭｃＣａｒｔｎｅｙなど（１９９５，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，  ８：３０１）に記載される。前記全体抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧを含み、ＩｇＧは亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を持つ構造で、１個の抗原結合部位を持つ。Ｆａｂ‘は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を持つ点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基が二硫化結合から生成される。
【００２０】
前記（ａ）工程である重鎖可変領域（ｈｅａｖｙＣ−Ｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ；ＶＨ）ドメインタンパク質及び軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ；ＶＬ）ドメインタンパク質を製造する工程は、好ましくはＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質に目的する多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を導入して製造されることができる。多様性導入は、公示の突然変異方法によって実行されることができる。また、ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質は、公示の方法によって製造されることができる。前記ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質からなるＦＶライブラリーの製造は、ＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）、ＳＣＯＰ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）といったヒトタンパク質の３次構造を全部含むデータベースを使って配列が選択できて、これに制限されるのではないが公示の多様なヒトまたは、非ヒトタンパク質の配列が知られた多様なデータベスを介してライブラリー製造のためのタンパク質配列を選択することができる。また、Ｋａｂａｔ抗体データベス（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｉｍｋａｂ．ｈｔｍｌ）とＮＣＢＩデータベス（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｋＨ−Ｇｏｖ）から入手可能な公示された可変部位配列及びＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）とＰＲＦ／ＳＥＱＤＢ（ｗｗｗ．ｐｒｆ．ｏｒ．ｊｐ）のようなタンパク質データベスからＶＨ及びＶＬ配列を選択してＶＨ及びＶＬ配列のライブラリーを設計することができる。また、一つ以上の個別提供者等（ｄｏｎｏｒｓ）から増幅されたＶＨ及びＶＬ  ｍＲＮＡの直接配列決定（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によってヒトＶＨ及びＶＬ配列の収集によって、このようなものなどを補充することができる。ドメインの多様な組合せをＶＨ及びＶＬドメインタンパク質の設計のために考慮してもよい。配列選択においては、Ｔ細胞受容体または他のＩｇ配列を除いて、抗体ドメイン配列だけを公示の方法によって選別してもよい。本発明の一実施例では、ＰＩＳＥＣサーバーでＨＭＭＥＲプログラムを利用して選択した（実施例６）。
【００２１】
前記ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質は、ヒトまたは非ヒト由来であってもよい。
【００２２】
好ましくは、前記ＶＨドメインタンパク質またはＶＬドメインタンパク質内のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）に突然変異が導入される。前記ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３で選択された１種以上であってもよく、これに制限されないが、１種、２種、または、３種であってもよい。さらに好ましくはＣＤＲ３であってもよいが、目的する抗体の種類によって制限されず突然変異が導入されてもよい。本発明の一実施例では、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は固定して、ＣＤＲ３に突然変異を導入して多様性を変化させた（実施例８）。
【００２３】
好ましくは、前記ＶＨドメインタンパク質またはＶＬドメインタンパク質内のフレームワーク（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に突然変異が導入される。
【００２４】
好ましくは、前記（ａ）工程で製造されたＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質を無作為的に結合する工程である（ｂ）工程のタンパク質結合は、（ｉ）野生型ドメイン間の結合、（ｉｉ）システイン導入による二硫化結合、（ｉｉｉ）ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメイン融合によるｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合、（ｉｖ）タンパク質間相互作用による結合、及び（ｖ）これらの組合せからなる群で選択された結合であってもよい。前記（ｉ）乃至（ｉｖ）は、公示の結合方法を制限することがく含み、その例として（ｉ）乃至（ｉｖ）各々、または１種以上の組合せによって実行されることができる。
【００２５】
好ましくは、前記（ｉ）野生型ドメイン間の結合は、野生型ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質間の公示された対結合によって実行されることができる。本発明の一実施例では、野生型結合（対結合）を確認した（実験例２）。
【００２６】
好ましくは、前記（ｉｉ）システイン導入による二硫化結合は、公示の方法によってＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質にシステインを導入して、ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質各々に導入されたシステイン間に二硫化結合をなして対結合をなすことができる。本発明の一実施例では、二硫化結合（対結合）を確認した（実験例１乃至４）。
【００２７】
好ましくは、前記（ｉｉｉ）ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメイン融合によるｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合は、公示されたｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインをＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質に導入して、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合でＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質間に対結合をなすことができる。このようなｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインは、公示されたデータベスなどから得ることができて、Ｋａｔｊａ  Ｍ．Ａｒｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）  ３１２、２２１−２２８）が開示した方法を応用して製造することができる。また、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．ＢｉｏｌＣ−Ｈｅｍ．（２００２）２７７，３７２７２−３７２７９）、Ｊ．Ｒ．Ｌｉｔｏｗｓｋｉ（Ｊ．ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．（２００１）５８，４７７−４９２）、Ｊｅｓｕｓ  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）  ２１，５１１−５９１）、Ｋａｔｊａ  Ｍ．Ａｒｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００２）１０，１２３５−１２４８）、Ｋａｔｊａ  Ｍ．Ａｒｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ.（Ｊ．ＢｉｏｌＣ−Ｈｅｍ．（２０００）２９５，６２７−６３９）等に記載された配列などを参照することができるが、一定の規則を持つｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインは、いずれも含まれることで、前記論文の配列に制限されない。本発明の一実施例では、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合による対結合を確認した（実験例１乃至４）。
【００２８】
好ましくは、前記（ｉｖ）タンパク質間相互作用による結合は公示されたタンパク質間相互作用による結合は、制限されずに含まれるか、その例としてＪＵＮドメイン及びＦＯＳドメインのようなロイシン−ジッパーのようなタンパク質結合を利用することができる。また、非共有相互作用、操作されたＣＨドメイン、操作された相互結合面など公示の多様な相互作用を含んでもよい。
【００２９】
好ましくは、前記（ｂ）工程の結合は、無作為的な対結合または目的する対結合によるものであってもよい。
【００３０】
好ましくは、前記タンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリー製造方法は、（ｃ）結合したＦＶを各々指定されたＩＤ（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）番号が付与された個別区画に静置する工程をさらに含む。前記結合したＦＶは、無作為的な対結合または目的する対結合によるものであってもよい。目的する対結合の場合、各々の情報を知っているＶＨドメイン及びＶＬドメインが重複しい一程の規則でライブラリーを製造することを含んでもよい。好ましくは、このように目的する対結合の場合、既知のＶＨ及びＶＬの対結合を行って、前記結合したＦＶを分離して、これを区別して各々指定されたＩＤ番号が付与された個別区画に静置して、各々指定されたＩＤ番号が付与された個別区画のＶＨ及びＶＬドメインの情報をＩＤ番号で確認することができる。
【００３１】
本発明のＦＶライブラリーは、個別的分離が可能であるため、個別区画に静置されたライブラリーを製造することができる。プレート、テストチューブ、ａｒｒａｙなど公示の多様な装置に指定されたＩＤ番号が付与された個別区画を持つことができるが、これに制限されない。また、前記区画内には、緩衝溶液、タンパク質安定化剤などがさらに含まれてもよい。
【００３２】
もう一つの様態として、本発明は、（ａ）前記ＦＶライブラリー製造方法で製造されたタンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーを準備する工程；及び（ｂ）前記ＦＶライブラリーを使って目的する特性、特徴または活性に対して、個別的機能検査する工程を含む、目的するＦＶ抗体をスクリーニングする方法を提供する。
【００３３】
ＦＶライブラリー製造方法は前記で説明したとおりである。
【００３４】
好ましくは、前記目的する特性、特徴または活性は、細胞の増殖、分化または細胞死でってもよい。また、目的する特性、特徴または活性が、タンパク質−タンパク質凝集、タンパク質安定性の向上、増加したタンパク質可溶性、グリコシル化部位の導入、接合部位の導入、免疫原性の減少、タンパク質発現の向上、抗原親和性における増加、抗原親和性における減少、結合親和性における変化、免疫原性における変化、または、特異性の向上などであってもよいが、スクリーニングする者の自己の意志目的に応じてその特性、特徴または活性が選択されて、これに制限されない。
【００３５】
好ましくは、前記スクリーニングする方法は、（ｃ）目的するＦＶ抗体が静置された区画のＩＤ番号を確認する工程をさらに含んでもよい。
【００３６】
好ましくは、前記スクリーニングする方法は、（ｃ）目的するＦＶ抗体が静置された区画のＩＤ番号を確認する工程；及び（ｄ）確認したＩＤ番号の区画のＦＶ抗体の組合せの前にＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインタンパク質を確認する工程をさらに含んでもよい。
【００３７】
このように確認した区画のＦＶ抗体の組合せの前に、ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインを確認して、前記ＶＨドメインタンパク質及びＶＬドメインが組合された目的するＦＶ抗体だけを増幅することができる。
【００３８】
好ましくは、前記スクリーニングする方法は、（ｃ）目的するＦＶ抗体が静置された区画のＩＤ番号を確認する工程；及び（ｄ）確認したＩＤ番号の区画のＦＶ抗体を分離してＤＮＡ配列を確認する工程をさらに含んでもよい。
【００３９】
このように確認した区画のＦＶ抗体を分離して、ＤＮＡ配列を確認して、前記目的するＦＶ抗体だけを増幅することができる。
もう一つの様態として、本発明は、前記スクリーニング方法によってスクリーニングされた目的ＦＶ抗体を提供する。
【００４０】
もう一つの様態として、本発明は、前記タンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーの製造方法によって製造されたタンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーを提供する。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４２】
実施例１：発現ベクターの製造
１−１：ＢＡＰ−ｓｏｒｔａｓｅ−ＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）製造
本発明の実施例１で使われたＰＣＲ条件は下記のとおりである。
ＰＣＲ混合物は、３１．５ｕｌの蒸溜水、１０ｕｌの５Ｘ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ｂｕｆｆｅｒ、５ｕｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）、１ｕｌのフォワードプライマー（１００μＭ）、１ｕｌのリバースプライマー（１００μＭ）、１ｕｌの鋳型（１００ｎｇ／ｕｌ）、０．５ｕｌのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕ／ｕｌ）で構成した。ＰＣＲ条件は、９８℃で１０秒、６８℃で１分を３０サイクル行って、産物を４℃に保管した。
【００４３】
各鋳型は、ＢＡＰ、ｓｏｒｔａｓｅ、標的配列を合成して使った。
【００４４】
具体的に使われたプライマーは下記のとおりである。
【００４５】
先ず、プライマー１_ｓｆｉ(5'−ccgt  ggcccaggcggcc  GCA  AGCAGC  GGC  CTG  AAC  GAC  ATC  TTC  GAG  GCC−3':配列番号1)または、プライマー１(5'−ATGT  CATATG  GCA  AGCAGC  GGC  CTG  AAC  GAC  ATC  TTC  GAG  GCC−3':配列番号2)、及びプライマー２(5'−CTGCATTTCGTGCCACTCGATCTTCTGGGCCTCGAAGATGTCGTT−3':配列番号3)を利用してＢＡＰ（ｂｉｏｔｉｎ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。
【００４６】
プライマー３(5'−ATC  GAG  TGG  CAC  GAA  ATG  CAG  GCT  AAG  CCG  CAG  ATT  CCG−3':配列番号4)及びプライマー４(5'−GCCGGTCTCGGGAAGCTTCTTGACCTCGGTAGCGACAAA−3':配列番号5)を利用して、ＳｒｔＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１６２６８７）の６０乃至２０６回目アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。
【００４７】
プライマー５(5'−CAG  TAA  GCT  TCC  CGA  GAC  CGG  CGAT  ATC  CAG  ATG  ACT  CAG  AGC−3':配列番号6)、プライマー６(5'−ACTCGAACCCGCCGTACGTTTTATCTCTACCTTTGT−3':配列番号7)及び鋳型標的（ＶＬ）を利用してＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）をコードする２次ＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。
【００４８】
その後、前記三つのＰＣＲ産物を共に混合した後、プライマー１_ｓｆｉまたはプライマー１及びプライマー７(5'−taat  ggccggcctggcc  GC  GGC  CGC  TTAAAGATCTTCTTCACTAATTAACTT−3':配列番号8)を使って、ＳｒｔＡｃ−ＬＰＥＴＧ及び標的（ｔａｒｇｅｔ）をコードする配列の間にＨｉｎｄＩＩＩ  ｓｉｔｅがある融合タンパク質であるＢＡＰ−ＳｒｔＡ−ｋＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。
【００４９】
結果として出てきたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで切断して、ｐＥＴ２３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションして、ＳｆｉＩで切断した後、融合タンパク質であるＢＡＰ−ｓｏｒｔａｓｅ−ＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔを発現するベクターであるｐＣｏｍ３ｘでライゲーションした。
【００５０】
１−２：Ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ｋＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０製造
プライマー８(5'−ATGT  CATATG  GAC  ATT  CAG  ATG  ACA  CAG  AGT−3':配列番号12)及びプライマー９(5'−ggaaccaccgccggtctcgggaagAAGATCTTCTTCACTAATTAAC−3':配列番号13)を利用して、ｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）(GGSSRSS:配列番号9)が連結されたｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。
【００５１】
プライマー８及びプライマー１０(5'−GGA  AGA  TCT  AGA  GGA  ACC  ACC  CCC  ACC  ACC  GCC  CGA  GCC  ACC  GCC  ACC  GGA  TGA  GCC  GGT  CTC  GGG  AAG  AAG  AT−3':配列番号14)及び前記ＰＣＲ産物であるｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧＬ−Ｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）を利用してｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）(SSGGGGSGGGGGGSSRSS:配列番号10)が連結されたｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。
【００５２】
プライマー１１(5'−gag  acc  ggc  ggt  ggt  tcc  tct  aga  tct  tcc  cag  gct  aag  ccg  cag  att−3':配列番号15)及びプライマー１２(5'−taat  GC  GGC  CGC  tta  atgatggtgATGGTGATGATGATGATGGC−3':配列番号16)を利用してｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。
【００５３】
プライマー１３(5'−gtggttcctctagatcttcc  TCG  AAG  GTC  GCG  GGA  TAT  ATT−3':配列番号17)及びプライマー１４(5'−taat  ggccggcctggcc  tta  atgatggtgATGGTGATGATGATGATGGC−3':配列番号18)を利用してｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。
【００５４】
プライマー１５(5'−GGT  TCC  TCT  AGA  TCT  TCC  GGA  AGC  cag  gct  aag  ccg  cag  att−3':配列番号19)及びプライマー１４を利用してｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）(SSGGGGSGGGGGGSSRSSGS:配列番号11)が連結されたｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。
【００５５】
最後に、ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−Ｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０（図１Ａ）をプライマー８、プライマー１２及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）及びｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ）の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲで増幅した。
【００５６】
ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−Ｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０（図１Ｂ）をコードする遺伝子をプライマー８、プライマー１４及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）及びｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ）の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲで増幅した。
【００５７】
ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−Ｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０（図１Ｃ）をコードする遺伝子をプライマー８、プライマー１４及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）及びｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ）の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲで増幅した。
【００５８】
結果として出てきたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで切断して、融合タンパク質であるｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０を発現するベクターであるｐＥＴ２３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）でライゲーションした。
【００５９】
融合タンパク質であるｔａｒｇｅｔ−ｋＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０は標的及びｋＬＰＥＴＧＬ−Ｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０をコードする配列の間にＨｉｎｄＩＩＩ  ｓｉｔｅがある。その後、発現のために、すべての遺伝作製物をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ｐＥＴ２３ａ−ｋＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０にライゲーションした。
【００６０】
実施例２：水溶性発現確認
全ての発現実験は、Ｅ.ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）を利用して行った。１００ｍｇ／ｌのアンピシリン及び０.５％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むｄＹＴ培地（３０ｍｌ）に単一バクテリアコロニーを接種して、３７℃で夜中培養した。ｄＹＴ  ｍｅｄｉｕｍ（１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４）０．３ｌに前培養（ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ）を接種して３７℃で培養した（バッフル付１ｌフラスコ（１ｌ  ｆｌａｓｋ  ｗｉｔｈ  ｂａｆｆｌｅｓ、２００ｒｐｍ）。ＯＤ６００値が０．６である時ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるべく添加して発現を誘導した。培養を１８時間１８℃で維持した。細胞を遠心分離で収集して（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、３０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌで懸濁して、超音波（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）で破砕した。粗抽出を遠心分離して（１０，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）、上澄み液を０．２ｍｍフィルターでろ過して、下記の実施例３のＮｉＦＦクロマトグラフィーに直接適用した。
【００６１】
実施例３：Ｎｉ−ＮＴＡ精製
溶解物の上澄み液を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ（ＧＥ）コラムにロードして、２０倍コラム体積のバッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、及び５ｍＭ  ＢＭＥ）で洗浄後、５倍コラム体積のバッファーＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄した。洗浄後、タンパク質−結合レジンのａｌｉｑｕｏｔｅを切断バッファー（５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び５ｍＭ  ｔｒｉ−Ｇｌｙを含むバッファーＢ）で平衡化させた後、２５℃で１時間反応させた。
【００６２】
タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析して、タンパク質の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）で分析した。タンパク質の収率は、計算された計算値を持つＵＶ分析（＠２８０ｎｍ）で定量した。
【００６３】
実施例４：ＶＨ及びＶＬドメイン抗体の対結合
ＶＨ及びＶＬのＦＶヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）へのドメイン結合反応を同じ体積のＶＨ及びＶＬを混合して行った。対結合条件（ｐａｉｒｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）バッファー内に１００μｇ／ｍｌのＶＨ及び１００μｇ／ｍｌのＶＬタンパク質を混合して１時間室温で反応させた。
【００６４】
本発明のＶＨ及びＶＬドメインの結合方法は、野生型間の結合、二硫化結合による結合、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる結合であり、各結合方法に対する模式図を図２に示した。
【００６５】
組み立てられたＦＶ（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ＦＶ）をＥＬＩＳＡ、サイズ排除クロマトグラフィーで分析して、タンパク質の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析した。また、二硫化結合で組み立てられたＦＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＥＬＩＳＡで分析した。
【００６６】
マイクロプレート（Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を一夜中ｃａｒｂｏｎａｔｅ／ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅバッファー（ｐＨ９．６）内の３００ｎｇの抗原（Ｅｒｂｂ２）及び捕獲抗体で４℃で一夜中コーティングした。ＰＢＳ−Ｔ  ０．０５％で洗浄後、プレートを３％スキムミルク（ｓｋｉｍｍｅｄ  ｍｉｌｋ）を含むＰＢＳ−Ｔで１時間３７℃でブロッキングした。組み立てられたＦＶ（１〜０．５μｇ）を添加して、１時間３７℃で反応させた。プレートを洗浄して、３％スキムミルク（ｓｋｉｍｍｅｄ  ｍｉｌｋ）を含むＰＢＳ−Ｔ内のｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＨＡまたはｍｙｃ抗体を１：２５００希釈して反応させた。プレートを１時間３７℃で反応させて、洗浄後ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）／ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ気質溶液で発色させた。前記反応を２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止して、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【００６７】
実施例５：ＨＰＬＣ分析    
ダイオードアレイ検出器を持つＡｇｌｉｅｎｔ  １２６０シリーズＨＰＬＣシステムでサイズ排除ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。コラム（７．８０  Ｘ  ３００ｍｍ  ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−ｓ２０００）はＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘから購入した。５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ６．５）を移動相として使った。
【００６８】
実施例６：抗体配列の収集
ＰＤＢ  ｅｎｔｒｙ  １Ｑ９Ｒ内の抗体構造の可変ドメイン領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ）を利用して、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴでＰＤＢ（本発明者等のＰＩＳＣＥＳ  Ｗｅｂ  ｓｉｔｅ上で利用可能な非−リダンダンシー配列ファイルｐｄｂａａｎｒ）の全ての配列データを検索した。３５％同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）以上及びＥ−ｖａｌｕｅが１．０×１０−２０より良い配列だけ維持して、抗体ドメインのみ残した（例えば、Ｔ細胞受容体及び他のＩｇ配列を除く）。結果的に重鎖及び軽鎖配列をＰＩＳＣＥＳサーバーを利用して９０％同一性で選んで集めた。重鎖配列及び軽鎖配列のｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔを個別的にＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗで決めて、マニュアルとおり選んで集めて、編集した。前記ａｌｉｇｎｍｅｎｔは、その後、ＨＭＭＥＲプログラムを利用して、重鎖−特異的及び軽鎖−特異的ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデル（ＨＭＭ）を作るのに使った。ＨＭＭプロファイルは位置−特異的挿入確率を含むタンパク質ファミリーのｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔの統計的モデルである。これは可変ドメイン配列内によく決定された位置にあって、長さが様々なＣＤＲの位置を決めるのに適合するようにさせる。前記ＨＭＭは、本発明者等のＰＩＳＣＥＳサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｄｕｎｂｒａｃｋ．ｆｃｃｃ．ｅｄｕ／ＰＩＳＣＥＳ−Ｐｈｐ）で利用可能なｐｄｂａａ（リダンダンシー（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を含む、ＰＤＢ内の全てのタンパク質配列のセット）を検索するのに使った。ＨＭＭＥＲスコアのｃｕｔｏｆｆ値及びＥ−ｖａｌｕｅはｐｄｂａａタンパク質配列を検索する時、単に抗体の重鎖及び軽鎖配列スコアがｃｕｔｏｆｆが良いように選択した。両ＨＭＭによって探した配列をさらに高いスコア及びさらに低いＥ−ｖａｌｕｅである一つに割り当てた。κ及びλ軽鎖スコアは、軽鎖ＨＭＭのｃｕｔｏｆｆより良い。このようなＨＭＭプロファイル（一つは重鎖及び一つはλ軽鎖である）は、各ＣＤＲの前後に特異的な保存フレームワーク（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）の位置を確認するのに使った。
【００６９】
実施例７：ＣＤＲ分析
再配列された抗体ＶＨ及びＶＬ配列の整列した収集は、ＣＤＲの長さ及び組成の分析に使った。各ａｌｉｇｎｍｅｎｔ内のＣＤＲは、ＣＤＲの長さに応じてグループで分類した。個別的なグループは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ.（Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７−８８３）に記載された規則に従って、標準構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）で分類した。全ての分析はエクセルを利用して行った。
【００７０】
実施例８：タンパク質組合せによる効果的なＦＶ抗体形成及び活性検証
広く知られたＨＥＲＣＥＰＴＩＮをモデルとして、ＶＨ及びＶＬタンパク質を利用して様々な変移体を導入して、タンパク質組合せによる効率的なＦＶ抗体形成及び活性検証を確認した。
【００７１】
実験例１：融合タンパク質の自己切断による簡単精製確認
前記実施例１乃至３の方法によって簡単に融合タンパク質で標的タンパク質であるＶＨドメインまたはＶＬドメインを分離する可能性があることを確認した。
【００７２】
具体的に、Ｆｌａｇ−ＶＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ−ＨＡ−Ｆｌａｇ−ＬＰＥＴＧＬ−Ｉｎｋｅｒ（７、１８、２０ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ−Ｈｉｓ１０の場合、下記のような配列を使った。
【００７３】
Flag(DYKD:配列番号20),VH(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS:配列番号21),Linker(SLEGTGGTSGSTSGTGGSSRSSST:配列番号22),HA(YPYDVPDYAK:配列番号23)を使って、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌは下記の表１に記載された配列を使った。
【００７４】
【表１】
0006368322.tif 000002
【００７５】
具体的に、ＶＬ−ｌｉｎｋｅｒ−ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ−ｍｙｃ−ＬＰＥＴＧ−Ｌｉｎｋｅｒ（７、１８、２０ａ.ａ．）−ＳｒｔＡ−Ｈｉｓ１０の場合、下記のような配列を使った。
【００７６】
VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK:配列番号32),linker(ALEGTGSSTGSSTGPGGSSRSSST:配列番号33)、myc(EQKLISEEDLKLPET:配列番号34)を使って、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌは、下記の表２に記載された配列を使った。
【００７７】
【表２】
0006368322.tif 000003
【００７８】
システイン突然変異を導入した、Ｆｌａｇ−ＶＨ（Ｈ−Ｇ４４ＣまたはＨ−Ｑ１０５Ｃ）−ＨＡ−Ｆｌａｇ−ＬＰＥＴＧ−Ｌｉｎｋｅｒ（７、１８、２０ａ．ａ．）−ＳｔｒＡＨ−Ｉｓ１０の配列は、下記の表３に記載したＶＨ以外には前記と同じ配列を使った。
【００７９】
【表３】
0006368322.tif 000004
【００８０】
システイン突然変異を導入した、ＶＬ（Ｌ−Ａ４３ＣまたはＬ−Ｑ１００Ｃ）−ＭＹＣ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（７、１８、２０ａ．ａ．）−ＳｔｒＡ−Ｈｉｓ１０の配列は、下記の表４に記載したＶＬ以外には前記と同じ配列を使った。
【００８１】
【表４】
0006368322.tif 000005
【００８２】
このような簡単精製方法は図３に簡単に模式化した。
図３の方法によって精製されたＶＬ及びＶＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図４に示した。また、図５にＦｌａｇタグによる精製収率を示した。このような結果を図６にまとめた。
【００８３】
前記図４に記載された配列は、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉＨ−Ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）から配列情報を収得した。図３と４の配列は、ヘテロダイマー形成のために、４Ｄ５（HERCEPTIN(R)）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のｉｎｔｅｒｆａｃｅにシステインを導入して任意に突然変異を行った。
【００８４】
その結果、前記非−融合システム（ｎｏｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）でのＶＬの精製収率は１０ｍｇ／ｌで、ＶＨは０．２ｍｇ／ｌであった。これに対して、精製方法の単純化のために本発明者等が考案したＳｏｒｔａｓｅ融合方法による結果、精製収率が概略３〜６．５倍が増加したことを確認した（図６）。また、Ｆｌａｇタグを付けた場合に、発現率が約２〜５５倍増加したことを確認した（図６）。
【００８５】
実験例２：ＥＬＩＳＡ分析を介したタンパク質水準でＶＨ−ＶＬ対結合確認
前記実施例４の方法でＶＨ及びＶＬのＦＶ対結合をＥＬＩＳＡで確認した。このようなＥＬＩＳＡ方法の簡単な模式図を図７に示した。
【００８６】
具体的にＶＨ−ＨＡ  ｔａｇ及びＶＬ−ｍｙｃ  ｔａｇでデザインして、１対の野生型結合（ｗｔ）、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる１１対の結合、二硫化結合による４対の結合の計１６対の結合をＥＬＩＳＡ方法で分析した。ＶＨ−ＶＬ対結合のＥＬＩＳＡ結果を図８に示した。その結果、抗原と共に対結合時、全部対結合が似た水準で観察されることが確認された。抗原なしでａｎｔｉ−ＨＡ−ｐａｉｒｓ−ａｎｔｉ−ｍｙＣ−ＨＲＰで進めた時、野生型はシグナルがなく、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる１１対の結合中ＶＨ  ｗｉｎｚｉｐＡ１／ＶＬ  ｗｉｎｚｉｐＢ２はシグナルが低く、ＶＨ  ｗｉｎｚｉｐＡ２／ＶＬ  ｗｉｎｚｉｐＢ２はシグナルがなかった。二硫化結合による４対の結合中にはＶＨ  Ｇ４４Ｃ/ＶＬ  Ｑ１００Ｃでだけシグナルを確認した（図８、左側棒：ａｎｔｉ−ＨＡ/ＦＶ／ａｎｔｉ−ｍｙＣ−ＨＲＰ、右側棒：Ｅｒｂｂ２／ＦＶ／ａｎｔｉ−ｍｙＣ−ＨＲＰ表示）。
【００８７】
また、ＦｌａｇでタグされたＶＨ及びＶＬをデザインして、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる８対の結合、二硫化結合による４対の結合の計１２対の結合をＥＬＩＳＡ方法で分析した。その結果、抗原と共に対結合時、全部対結合が似た水準で観察されることが確認された。抗原なしでａｎｔｉ−ＨＡ−ｐａｉｒｓ−ａｎｔｉ−ｍｙＣ  ＨＲＰで進めた時、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる８対の結合中ＶＨ  ｗｉｎｚｉｐＡ１／ＶＬ  ｗｉｎｚｉｐＢ１とＶＨ  ＩＡＡＬ  Ｅ３／ＶＬ−ＩＡＡＬ  Ｋ３のシグナルが高く、二硫化結合による４対の結合中には他の分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなど）では対結合が観察されたが、低い親和度でＥＬＩＳＡでシグナルがなかった（図９）。
【００８８】
前記のような結果は、本発明のタンパク質ＶＨ及びＶＬドメインが無作為的に対結合を介して多様な多様性を付与するＦＶライブラリーを製造する可能性があることを裏付けるものとなる。
【００８９】
実験例３：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を介したタンパク質水準でＶＨ−ＶＬ対結合確認
前記実施例４の方法でＶＨ及びＶＬのＦＶ対結合をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。ＶＬ及びＶＨにシステインを導入する突然変異を介して形成された二硫化結合によるＶＨ−ＶＬ対結合を図１０に示した。その結果、ＶＬ−Ｑ１００Ｃ／ＶＨ−Ｇ４４Ｃ、ＶＬ−Ａ４３Ｃ／ＶＨ−Ｑ１００Ｃ、及びＶＬ−Ａ４３Ｃ／ＶＨ−Ｇ４４Ｃが二硫化結合による対結合でヘテロダイマーを形成することを確認した（図１０）。
【００９０】
また、ＶＬ及びＶＨにシステインを導入する突然変異を介して形成された二硫化結合中、各々Ｆｌａｇタグを付けた、Ｆｌａｇ−ＶＨ及びＶＬの二硫化結合によるＶＨ−ＶＬ対結合を図１１に示した。その結果、ＶＬｋ１−Ｑ１００Ｃ／Ｆ−ＶＨ−Ｇ４４Ｃ−Ｆ、ＶＬｋ１−Ｑ１００Ｃ／Ｆ−ＶＨ−Ｇ４４Ｃ、及びＶＬｋ１−Ｑ１００Ｃ／ＶＨ−Ｇ４４Ｃが二硫化結合による対結合でヘテロダイマーを形成して、生産率が増加するのを確認した（図１１）。
【００９１】
前記のような結果は、本発明のタンパク質ＶＨ及びＶＬドメインが無作為的に対結合を介して多様な多様性を付与するＦＶライブラリーを製造する可能性があることを裏付けるものである。
【００９２】
実験例４：ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を介したタンパク質水準でＶＨ−ＶＬ対結合確認
前記実施例４及び５の方法でＶＨ及びＶＬのＦＶ対結合をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）で確認した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの条件は下記のとおりである：
【００９３】
コラム:7.80×300mm  BioSep-SEC-s2000
移動相：ＰＢＳ、ＰＨ７．４
コラムflow  rate:0.5ｍｌ/min
コラム温度:25℃
UV吸光度検出器:280nm,210nm
注入体積（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）：１００ｕｌ
【００９４】
ＶＬ−ＩＡＡＬＫ３、Ｆｌａｇ−ＶＨ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ及び組み立てられたＦＶのサイズ排除クロマトグラフィー結果を図１２に示した。
【００９５】
具体的に、ＦｌａｇでタグされたＶＨ−ＨＡ  ｔａｇ及びＶＬ−ｍｙｃ  ｔａｇでデザインして、１対の野生型結合（ｗｔ）、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる１１対の結合、二硫化結合による４対の結合の計１６対の結合をサイズ排除クロマトグラフィー方法で分析した。ＶＬ−ＩＡＡＬＫ３−Ｆｌａｇ−ＶＨ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ及び組み立てられたＦＶ結合のサイズ排除クロマトグラフィー結果を図１２に示した。その結果、分子量が大きい順で組み立てられたＦＶ、Ｆｌａｇ−ＶＨ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ、ＶＬ−ＩＡＡＬＫ３の順に検出されることを確認した。
【００９６】
野生型を含んでＶＬ−ＩＡＡＬＫ３、Ｆｌａｇ−ＶＨ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ及び組み立てられたＦＶ結合以外の結果では、ＶＨあるいはＶＬが検出されなく、組み立てられたＦＶはＶＨあるいはＶＬに比較して分子量のサイズ移動を見せて、計算される初期時間に検出されることを確認した。これは、抗体の特徴として知られている高い疏水性によりＶＨあるいはＶＬ単一ドメイン抗体は、サイズ排除クロマトグラフィー分析が困難で、多くの組み立てられたＦＶは、各単一ドメイン抗体の表面に露出した疏水性が高い残基が組み立てられたＦＶによって隠されながら親水性に変わって検出となった。
【００９７】
前記のような結果は、本発明のタンパク質ＶＨ及びＶＬドメインが対結合を介して多様な多様性を付与するＦＶライブラリーを製造する可能性があることを裏付けるものである。
【００９８】
実験例５：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を介したＶＨ−ＶＬ対結合分子量分析
前記実施例４及び５の方法でＶＨ及びＶＬのＦＶ対結合の分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析した。
【００９９】
ＶＬ、ＶＨ及びＦＶ  ｗｔの分析結果を図１３に、ＶＬ−Ｑ１００Ｃ、Ｆｌａｇ−ＶＨ−Ｇ４４Ｃ−Ｆｌａｇ及びＦＶの分析結果を図１４に、ＶＬ−ＩＡＡＬＫ３、Ｆｌａｇ−ＶＨ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ及びＦＶの分析結果を図１５に示した。
【０１００】
その結果ｗｔに対して各々ＶＬ及びＶＨの分子量を正確に確認できて、結合したＦＶの分子量は確認されなかった（図１３）。ＶＬ−Ｑ１００Ｃ（１３．６ｋＤａ）、Ｆｌａｇ−ＶＨ−Ｇ４４Ｃ−Ｆｌａｇ（１６．２ｋＤａ）、ＦＶ（２９．８ｋＤａ）の分子量を確認して結合を確認することができた（図１４）。ＶＬ−ＩＡＡＬＫ３（１８．６ｋＤａ）、Ｆｌａｇ−ＶＨ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ（２１．２ｋＤａ）、ＦＶ（３９．８ｋＤａ）の分子量が確認して結合を確認することができた（図１５）。
【０１０１】
実験例６：細胞水準で組み立てられたＦＶの活性検証
ＢＴ−４７４細胞増殖に対する結合４Ｄ５  ＦＶ抗体の効果をＣＣＫ８アッセイの（Ｄｏｊｊｉｎｄｏ）を介して確認して、その結果を図１６に示した。図１６を参照すると、ヒト乳癌細胞ＢＴ−４７４は、細胞表面でＨＥＲ−２を過発現して、結合した４Ｄ５  ＦＶによって４Ｄ５  ＩｇＧ抗体によって減少したのと似た程度でＢＴ−４７４の成長が減少したことを確認することができる。
【０１０２】
間接免疫蛍光体ラベリング後に４Ｄ５  ＩｇＧとＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ−Ｆｃを順に使って、ＦＡＣＳを介して、細胞表面でＨｅｒ２発現水準を確認した。ＶＨドメイン、ＶＬドメイン及び結合ＦＶ抗体のＢＴ−４７４細胞に対する結合は、１ｕｇ  ａｎｔｉ−ｃ−Ｍｙｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙで細胞を１時間ラベリングして、ＦＡＣＳ前Ａｌｅｘａ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙで２次ラベリングして確認した。
【０１０３】
ＢＴ−４７４細胞で４Ｄ５  ＩｇＧ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン及び結合ＦＶ抗体のＨｅｒ２発現細胞表面への結合プロフィールをＦＡＣＳを介してモニタリングして、その結果を図１７に示した。市販中の４Ｄ５  ＩｇＧ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ）で分析した結果、ＢＴ−４７４細胞でＨＥＲ−２の過発現が確認された。
【０１０４】
実験例７：ライブラリーデザイン
ＶＨ及びＶＬタンパク質の対結合によって製造された機能的組合せタンパク質ライブラリーを既知の抗原−抗体結合体でデザインした。自然免疫レパートリー（ｎａｔｕｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）は、高い特異性及び親和度を持つ任意の抗原を根本的に認識する抗体を生成することができる。抗原認識は、抗原と接触する広い表面に存在する６個のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）により媒介される。ＣＤＲ配列は、超可変的（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）であるが、機能的ＣＤＲの全体組成が特定アミノ酸タイプに対し友好的な偏見を持つようにさせる。本発明者等のライブラリーは、分子認識を媒介するのに特に適合した機能的グループの小さいサブセットに機能的多様性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を制限した。本発明者などのライブラリーは信頼できるフォールディング及び高発現収率を与える選択されたフレームワーク各々のｋｅｙ抗体内の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３に抗原−抗体複合体形成に重要な高頻度配列を導入して製造した。全てのＣＤＲの長さは、収集された抗体から高頻度で固定した。ＣＤＲ１及び２の組成は、収集された抗体中最も多い残基でデザインした。本発明者等のライブラリーは、ＶＨ（１００）及びＶＬ（１００）の対結合によって１０４抗体の組合せわせた複雑性（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）を持っている。ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのＶＨ３、ＶＬｋ３及びＶＬｋ１切片は、非常に高い頻度で再配列された抗体内で確認されて、よく発現して、対をなす。
【０１０５】
本発明者等は、ＶＨ３−６６及びＶＬｋ１フレームウィーク内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３  ＤＮＡ配列を合成して、抗原−抗体複合体形成に重要な高頻度配列を利用して、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３に多様性を導入した。
【０１０６】
前記実施例６乃至８の方法でライブラリーデザインを行った。フレームワークとしてＶＨ３−６６及びＶＬＫ３を使った。ヘテロダイマーの多くは、ＨＶ３、ＨＶ１、ＨＶ４とＫＶ３及びＫＶ１である。
【０１０７】
ＣＤＲは高頻度で出てくるＣＤＲの長さを固定した。具体的に、ＣＤＲ  Ｈ１は長さを１０、ＣＤＲ  Ｈ２は１０、ＣＤＲ  Ｈ３は１１、ＣＤＲ  Ｌ１は１１、ＣＤＲ  Ｌ２は７、ＣＤＲ  Ｌ３は９個のアミノ酸で固定した。高頻度で出てくるＣＤＲ  Ｈ３及びＣＤＲ  Ｌ３の代表的な内容を図１８に示した。
【０１０８】
実験例８：ライブラリー構築
多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）デザインは、ＣＤＲ１及び２は最も高頻度の残基で固定して、ＣＤＲ３は高頻度の残基でデザインした。その例を図１９に示した。ＶＨドメイン１００個及びＶＬドメイン１００個を組み合わせて、１００×１００=１００００個の多様性を持つライブラリーをデザインした。その結果は図２０に表示したとおりである。タンパク質組合せによって構築された１０，０００ＦＶｓ中５ＶＨｓと５ＶＬｓの組合せで構築された２５ＦＶｓをＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認して、その結果を図２１に示した。
【０１０９】
４Ｄ５  ＶＨと５個の合成ＶＬｓに対する組合せをＦＡＣＳとＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認して、その結果を図２２に示した。４Ｄ５  ＶＨと５個の合成ＶＬｓによって製造された結合ＦＶをＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認した。しかし、ＢＴ−４７４細胞には結合していないことを確認した。
【０１１０】
実験例９：ライブラリースクリーニング
ライブラリースクリーニングのために、Ｆｃがコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）されたＣＴＬＡ４、４１ＢＢ、ＴＲＡＬ  Ｒ１、ｃＭＥＴ、ＴＲＡＬＩ  Ｒ２、ＣＤ４０、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７、ＣＤ３０、ＩＬ−１７Ｒ、ＣＳＦ１−Ｒを含む１０個の抗原を選定して、１次スクリーニングで１０個の混合された抗原と個別ＦＶとの相互結合をアルファアッセイ（ａｌｐｈａ  ａｓｓａｙ、Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ）で確認して、選別された抗体に対する個別抗原の相互結合を２次的にスクリーニングした。ライブラリースクリーニング過程を図２３に図示した。
【０１１１】
アルファアッセイはドナービーズ（ｄｏｎｏｒ  ｂｅａｄ）とアクセプタービーズ（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｂｅａｄ）のビーズ基盤近接性アッセイ（ｂｅａｄ  ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ）で、ビオチン化された抗原は、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）がコーティングされたビーズでキャプチャーできて、ｍｙｃ−ｔａｇがあるＦＶはａｎｔｉ−ｍｙｃがコンジュゲーションされたアクセプタービーズに結合することができる。ドナービーズとアクセプタービーズは、抗原−ＦＶ相互結合によって近接性を持つことになる。ドナービーズは一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ）放出の結果で６８０ｎｍで励起され、一重項酸素によって増幅された蛍光シグナルがアクセプタービーズで発光されて、アルファシグナルを検出することになる。
【０１１２】
アルファアッセイを介して個別ＦＶと１０個の混合抗原の相互結合をスクリーニングした結果を図２４に示した。図２４を参照すると、Ｙ軸は、アルファシグナルを、Ｘ軸は、スクリーニングした１００００個のＦＶを示した。ｈｉｇｈシグナルからｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに近いｌｏｗシグナルまで種々の抗体がスクリーニングされたことを確認することができる。
【０１１３】
混合された抗原に結合するＦＶと個別抗原の相互結合を２次的にスクリーニングして、その結果を図２５に示した。ＣＳＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＣＤ３０、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１に特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を見せる抗体を探すことができ、種々の抗原の組合せに多重特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を持つ抗体を確認することができた。
【０１１４】
ＣＳＦ１Ｒに主に結合するＦＶのアルファアッセイの結果を図２６に示した。図２６を介して、アルファシグナルの差を見せる種々の抗体を確認することができる。
【０１１５】
アルファアッセイの結果、ＣＳＦ１Ｒと主に結合するＦＶに対する相互結合をＥＬＩＳＡで同時に確認して、その結果を図２７に示した。確認したＦＶｓが概してＣＳＦ１Ｒとｃ−ＭＥＴ（ＨＧＦＲ）に同時に結合する結果を示すことを確認した。ＦＶ#７１９７と#７１９５等一部は多重特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を見せた。
【０１１６】
アルファアッセイの結果、ＣＳＦ１Ｒと主に結合するＦＶに対する相互結合をウエスタンブロットで確認して、その結果を図２８に示した。ＦＶｓが概してＣＳＦ１Ｒとｃ−ＭＥＴ（ＨＧＦＲ）に同時に結合する結果を示すことを確認した。
【０１１７】
ｃ−ＭＥＴに結合するＦＶのアルファアッセイの結果を図２９に示した。図２９を介してアルファシグナルの差を見せる種々の抗体を確認した。
【０１１８】
アルファアッセイの結果、ｃ−ＭＥＴと主に結合するＦＶに対する相互結合をＥＬＩＳＡで同時に確認して、その結果を図３０に示した。確認したＦＶｓが概してＣＳＦ１Ｒとｃ−ＭＥＴ（ＨＧＦＲ）に同時に結合する結果を確認した。ＦＶ#７２４と#６９００等一部は多重特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を見せた。
【０１１９】
アルファアッセイの結果、ｃ−ＭＥＴと主に結合するＦＶに対する相互結合をウエスタンブロットで確認して、その結果を図３１に示した。図３１を参照すると、ＦＶｓが概してＣＳＦ１Ｒとｃ−ＭＥＴ（ＨＧＦＲ）に同時に結合する結果を示すことを確認した。
【０１２０】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施可能であることが理解できるはずである。これと関連して、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるいずれの変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明は、今まで存在しなかった新しいＦＶライブラリー製造のプラットホーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）で、特に既存のＤＮＡ水準でライブラリーの組合せではなくＶＨとＶＬのタンパク質水準での組合せを介して精製及びスクリーニングにかかる時間及び費用を大幅に減少できる新規なン抗体製造のプラットホームを提供できる技術である。このような技術的特徴によって、実質的に機能をする治療抗体を既存の時間及び費用を画期的に削減させて選別できるだけでなく、目標物質に制限されることなく、阻害剤、調節剤などを開発することができる。
【０１２２】
また、既存ライブラリーが持つ毒性問題がないので、機能分析が直ぐできて、様々な目的に応じた抗体を選別することができて、細胞増殖、分化、細胞死などに関与する機能に伴う抗体を選別したり、正常及び異常（目的疾病、現象、状態）細胞または個体間において抗体を利用した区分が可能になる。即ち、抗体医薬品の生産に適用できて、その他に様々な疾病の診断、幹細胞分化能の確認及び分化促進、疾病のメカニズム研究、抗体スクリーニング、阻害剤と調節剤の同時開発可能、各種状態（分化及び未分化、疾病群と正常群）に対して抗体ｍａｐｐｉｎｇ（ｆｉｎｇｅｒ−ｐｒｉｎｔｉｎｇ）可能性などの多様な分野に適用可能になる。
【０１２３】
本発明は、走光性を利用して改良された単細胞生物体を微細流体システムを利用して効果的に選別できるもので、細胞単位で容易なモニタリングが可能で、収集した結果の統計的分析を含んだ様々な分析を介して、変化した光反応性及び/または光敏感性を持つ突然変異菌株を容易にまたは高速で選別できて、走光性及び光転換効率の相関解明、光転換効率が向上した改良された単細胞生物体選別に有用に活用できる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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