(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト検査被験者から採取した検査試料中のヒト細胞フィブロネクチン（ｃ−Ｆｎ）のレベルを６０分以内で決定する、ヒト検査被験者における出血を予測するための迅速なアッセイであって、
前記検査試料は、全血、血清、および血漿試料からなる群から選択され、
前記アッセイは、以下の工程を含み：
（ａ）ヒト検査被験者から得られた検査試料を抗体および標準エピトープと混合すること、
ここで、前記抗体は、単離したヒトモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合部分、または抗体およびその抗原結合部分の両方であり、前記抗体は、血漿フィブロネクチンに対する親和性よりも少なくとも１００倍を超える親和性を持ってｃ−Ｆｎに結合し、当該抗体は、ｃ−Ｆｎ分子のアミノ酸配列１６３１−１７２１（「ＥＤＡ領域」）に結合する、
ここで、前記標準エピトープは
左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で、
ｉ）ＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＬＲＰＧＳＥＣ（配列番号１）、
ｉｉ）ＥＳＰＱＧＱＶＳＲＹＲＶＴＹＳＳＰＥＤＣ（配列番号２）、
ｉｉｉ）ＨＤＤＭＥＳＱＰＬＩＧＴＱＳＣ（配列番号３）、
および
ｉｖ）ＮＩＤＲＰＫＧＬＡＦＴＤＶＤＶＤＳＩＫＩＡＷＥＳＰＱＧＱＶＳＲＹＲＶＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰＡＰＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＬＲＰＧＳＥＹＴＶＳＶＶＡＬＨＤＤＭＥＳＱＰＬＩＧＴＱＳＴＡ（配列番号４）
からなる群より選択されるアミノ酸配列から成る合成ポリペプチドであり；
ここで、（１）前記抗体もしくはその抗原結合部分は磁性粒子に結合し、かつ前記標準エピトープは標識されている、又は（２）前記標準エピトープは磁性粒子に結合し、かつ前記抗体もしくはその抗原結合部分は標識されており、
ここで、前記アッセイは、前記抗体が、前記検査試料においてｃ−Ｆｎ分子のＥＤＡ領域又は標準エピトープと免疫反応するために固体マトリクスに固定されることを必要とせず、
ここで、前記抗体がＥＤＡ領域及び標準エピトープに結合する場合、前記アッセイは、検査試料のｃ−Ｆｎ抗原のＥＤＡ領域が前記抗体上の結合部位をめぐり標識エピトープと競合する競合アッセイである；
（ｂ）その後、前記抗体と、前記検査試料のｃ−ＦｎのＥＤＡ領域又はｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、もしくはｉｖ）の標準エピトープのいずれかとの複合体を形成し、磁性粒子に結合した標識エピトープもしくは磁性粒子に結合したその標識抗原結合部位の量を測定すること、
ここで、結合した標識抗原または結合した標識エピトープの量が、前記検査試料中のヒト細胞フィブロネクチンの量に逆相関し、前記ヒト検査被験者における出血の予測因子となり、
ここで、前記得る、混合する、形成するおよび測定する工程は、６０分以内に起こる、
前記アッセイ。
【請求項２】
前記検査試料のＥＤＡ領域又はｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、もしくはｉｖ）の標識標準エピトープのいずれかと結合した標識抗体の量を２０分以内で決定する、請求項１に記載の迅速なアッセイ。
【請求項３】
前記被験者は、神経系疾患を有する、請求項１に記載の迅速なアッセイ。
【請求項４】
前記検査被験者はアルツハイマー病又はパーキンソン病を有する、請求項１に記載の迅速なアッセイ。
【請求項５】
前記アッセイは、液体媒体中を自由に流動する常磁性ビーズを用いる流体アッセイである、請求項１に記載の迅速なアッセイ。
【請求項６】
前記単離したヒトモノクローナル抗体はＩＳＴ−９もしくはＩＳＴ−９の抗原結合部分、またはＩＳＴ−９およびその抗原結合部分の両方である、請求項１に記載の迅速なアッセイ。
【請求項７】
前記検査試料中においてｃ−Ｆｎは０〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内にあると決定される、請求項１に記載の迅速なアッセイ。
【請求項８】
ヒト検査被験者から採取した検査試料中のヒト細胞フィブロネクチン（ｃ−Ｆｎ）のレベルを６０分以内で決定する、ヒト検査被験者における出血を予測するための迅速なアッセイであって、
前記検査試料は、全血、血清、および血漿試料からなる群から選択され、
前記アッセイは、以下の工程を含み：
ヒト検査被験者から得られた検査試料を単離したヒトモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合部分、または当該抗体およびその抗原結合部分の両方と混合すること、ここで、当該抗体および／またはその抗原結合部分は、血漿フィブロネクチンに対する親和性よりも少なくとも１００倍を超える親和性を持ってｃ−Ｆｎに結合し、当該抗体および／またはその抗原結合部分（「捕捉抗体」）は、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で、
ｉ）ＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＬＲＰＧＳＥＣ（配列番号１）、
ｉｉ）ＥＳＰＱＧＱＶＳＲＹＲＶＴＹＳＳＰＥＤＣ（配列番号２）、
ｉｉｉ）ＨＤＤＭＥＳＱＰＬＩＧＴＱＳＣ（配列番号３）、
および
ｉｖ）ＮＩＤＲＰＫＧＬＡＦＴＤＶＤＶＤＳＩＫＩＡＷＥＳＰＱＧＱＶＳＲＹＲＶＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰＡＰＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＬＲＰＧＳＥＹＴＶＳＶＶＡＬＨＤＤＭＥＳＱＰＬＩＧＴＱＳＴＡ（配列番号４）
からなる群より選択されるアミノ酸配列に結合し、
その後、前記捕捉抗体と前記検査試料のｃ−Ｆｎとの複合体を形成し、当該複合体を、前記捕捉抗体に結合するコーティングされた常磁性粒子と混合し、そして前記検査試料中における複合体を検出すること；
ここで、前記アッセイは、前記捕捉抗体が、前記検査試料においてｃ−Ｆｎ分子と免疫反応するために固体マトリクスに固定されることを必要とせず、
ここで、前記検査試料中の複合体の量が前記検査試料中のｃ−Ｆｎレベルを示し、これが前記ヒト検査被験者における出血の予測因子となり、
ここで、前記得る、混合する、形成するおよび測定する工程は、６０分以内に起こる、
前記アッセイ。
【請求項９】
前記抗体は標識されている、請求項１に記載の迅速なアッセイ。
【請求項１０】
前記捕捉抗体と前記検査試料のｃ−Ｆｎとの複合体は、当該複合体に結合した標識抗体の量を検出することによりサンドイッチアッセイで検出される、請求項９に記載の迅速なアッセイ。
【請求項１１】
前記標識抗体は前記捕捉抗体またはｃ−Ｆｎに結合する、請求項１０に記載の迅速なアッセイ。
【請求項１２】
ヒト検査被験者から採取した検査試料中のヒト細胞フィブロネクチン（ｃ−Ｆｎ）のレベルを６０分以内で決定する、ヒト検査被験者における出血を予測するための迅速なアッセイであって、
前記検査試料は、全血、血清、および血漿試料からなる群から選択され、
前記アッセイは、以下の工程を含み：
（ａ）ヒト検査被験者から得られた検査試料を抗体および標準エピトープと混合すること、
ここで、前記抗体は、単離したヒトモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合部分、または抗体およびその抗原結合部分の両方であり、前記抗体は、血漿フィブロネクチンに対する親和性よりも少なくとも１００倍を超える親和性を持ってｃ−Ｆｎに結合し、当該抗体は、ｃ−Ｆｎ分子のアミノ酸配列１６３１−１７２１（「ＥＤＡ領域」）に結合し、かつ標準エピトープに結合し、
ここで、前記標準エピトープは
左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で、
ＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰＡＰＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＣ（配列番号５）のアミノ酸配列から成る合成ポリペプチドであり；
ここで、前記アッセイは、前記抗体が、前記検査試料においてｃ−Ｆｎ分子のＥＤＡ領域または標識エピトープと免疫反応するために固体マトリクスに固定されることを必要とせず、
ここで、前記アッセイは、検査試料のｃ−Ｆｎ抗原のＥＤＡ領域が前記抗体上の結合部位をめぐり標識エピトープと競合する競合アッセイである；
（ｂ）前記抗体と、前記ｃ−ＦｎのＥＤＡ領域または標準エピトープのいずれかとの複合体を形成すること;および、
（ｃ）磁性粒子に結合した標識エピトープまたは磁性粒子に結合した標識抗体もしくはその標識抗原結合部位の量を測定すること、
ここで、磁性粒子に結合した標識抗原もしくは標識エピトープの量が、前記検査試料中のヒト細胞フィブロネクチンの量に逆相関し、前記ヒト検査被験者における出血の予測因子となり、
ここで、前記得る、混合する、形成するおよび測定する工程は、６０分以内に起こる、
前記アッセイ。
【請求項１３】
ヒト検査被験者から採取した検査試料中のヒト細胞フィブロネクチン（ｃ−Ｆｎ）のレベルを６０分以内で決定する、ヒト検査被験者における出血を予測するための迅速なアッセイであって、
前記検査試料は、全血、血清、および血漿試料からなる群から選択され、
前記アッセイは、以下の工程を含み：
（ａ）ヒト検査被験者から得られた検査試料を単離したヒトモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合部分、または当該抗体およびその抗原結合部分の両方と混合すること、ここで、当該抗体および／またはその抗原結合部分は、血漿フィブロネクチンに対する親和性よりも少なくとも１００倍を超える親和性を持ってｃ−Ｆｎに結合し、当該抗体および／またはその抗原結合部分（「捕捉抗体」）は、
左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で、
ＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰＡＰＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＣ（配列番号５）から成るアミノ酸配列に結合する：
（ｂ）その後、前記捕捉抗体と前記検査試料のｃ−Ｆｎとの複合体を形成すること；および、
（ｃ）前記検査試料中における複合体を検出すること; 
ここで、前記アッセイは、前記捕捉抗体が、前記検査試料においてｃ−Ｆｎ分子と免疫反応するために固体マトリクスに固定されることを必要とせず、
ここで、前記検査試料中の複合体の量が前記検査試料中のｃ−Ｆｎレベルを示し、これが前記ヒト検査被験者における出血の予測因子となり、
ここで、前記得る、混合する、形成するおよび測定する工程は、６０分以内に起こる、
前記アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国仮特許出願第６０／５０５，６０６号および第６０／５５６，４１１号に基づく米国実用特許第７，６３４，３６０号の一部継続出願である米国実用特許第７，３９２，１４０号の一部継続出願である米国実用特許出願第１１／８９０，１３４号の一部継続出願である。これらの出願の全ての内容は、本明細書の全ての表、図面、および特許請求の範囲を含め、全体が本願に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、ヒトの体内に入る治療薬または装置、特に、心血管系または神経系疾患を治療するために設計された治療薬または装置、による出血事象を予測する迅速な検査に関する。
【０００３】
様々な態様において、本発明は、特に、（１）ヒトの血液または血漿における細胞フィブロネクチンのレベルを検出するための迅速なアッセイの構築方法；（２）治療前に、患者内の出血事象および／または脳内出血（ＩＣＨ）を予測するための、当該迅速なアッセイの使用；（３）当該迅速なアッセイに使用するための抗体；ならびに、（４）細胞フィブロネクチンを検出するための、当該迅速なアッセイについての異なるアッセイ様式に関する。
【背景技術】
【０００４】
以下の背景技術に関する説明は、単に読者が本発明を理解する助けとなるべく提供されており、本発明の先行技術を記述または構成すると認めるわけではない。
【０００５】
診断アッセイは、医療および研究分野において、生体液および組織試料中の様々な構成成分、例えば、薬物、ホルモン、酵素、タンパク質、抗体、および感染因子などを検出するための不可欠な一助となっている。数多くのこれらのアッセイの操作の基礎となる基本原理は、２つ以上の成分の間で起こる特異的な認識および結合反応であり、ここで形成される複合体を後で検出できる。通常は、流体検査試料（例えば、全血、血漿、血清、尿、唾液など）中の対象の標的検体（例えばリガンド）を特異的に認識し結合する捕捉試薬（例えば、受容体）を成分中に含む。また、捕捉試薬と複合体を形成する任意の検体を認識して結合し、視覚により検出可能な指示薬も反応中に含んでおり、この指示薬が、陽性反応が起こったことを示す信号を生成する。特に、免疫学的アッセイは、抗体認識および抗原に対する選択的結合反応に基づいて機能するように設計されており、長年にわたって数多くの疾患状態の検出用の臨床用途において非常に価値あることが証明されている。
【０００６】
フィブロネクチンは、血漿中、細胞表面上、および細胞外マトリックス中に見られる大きな糖タンパク質である。フィブロネクチンは、細胞のみならず他の高分子にも結合するので、細胞を基質に固定するのを促進するのに役立つ。Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１：７５４−６１（１９８３）；Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：３６９−７７（１９８２）。フィブロネクチンは、可変一次構造のサブユニット［平均相対分子量２５０キロダルトン（ｋＤａ）］で構成され、それらサブユニットがジスルフィド結合により二量体または多量体を形成する。Ｈｙｎｅｓ，ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ，Ｈａｙ  ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ  ２９５−３３４（１９８２）；Ｈｙｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９５：３６９−７７（１９８２）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ．８２：８０３−３０（１９８２）；Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４２４−２８；Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，４（７）：１７５５−５９（１９８５）。血漿フィブロネクチン（ｐ−Ｆｎ）は、肝細胞が分泌するのに対し、細胞フィブロネクチン（ｃ−Ｆｎ）は、内皮細胞および線維芽細胞を含む様々な培養細胞が分泌する。Ｔａｍｋｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５８（７）：４６４１−４７；Ｊａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１７７９−９１（１９７８）；Ｂｉｒｄｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９７（２）：５７４−８（１９８０）。
【０００７】
フィブロネクチンは、生体内の傷害および炎症部位に蓄積し［Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ  １１：４２５−４３６（１９７８）；Ｇｒｉｎｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．７６：１８１−１８９（１９８１）；Ｒｅｐｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０（４）：３５１−５８（１９８２）；Ｔｏｒｉｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２（４）：３９９−４０８（１９８５）；Ｃａｒｓｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ  ２４（１０）：１２６１−６７（１９８１）］、これらの部位における血管壁内の細胞によって産生される。Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５６：６４６−５１（１９８２）；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６（２）：７８７−９３（１９８１）；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．７９：２６９−７６（１９８２）；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４：１０１１−１６（１９８４）。
【０００８】
本発明は、新規な合成ポリペプチドの細胞フィブロネクチン（ｃ−Ｆｎ）の迅速な検出への使用に関する。Ｐｅｔｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．は、米国特許第４，９８０，２７９号において、ポリペプチド配列が、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で、ＥＬＦＰＡＰＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＣおよびＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰＡＰＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＣである合成ポリペプチド、抗体、そしてこれらを細胞フィブロネクチンに使用する方法について記載している。同著者らはさらに、正常なヒト血液に含まれるｃ−ＦＮは微量だが、血管炎を伴う膠原病の患者の血液ではｃ−Ｆｎレベルが著しく上昇していることを実証した［Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１３８，１６７−１７４（１９８８）；Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１１３（５），５８６−５９７（１９８９）］。
【０００９】
この研究に続き、幾人かの著者が、さらに、様々な疾患過程におけるｃ−Ｆｎの役割を示唆している。Ｓｅｎｙｅｉ，ｅｔ  ａｌ．は、米国特許第５，０７９，１７１号において子癇前症におけるｃ−Ｆｎの役割について記載している。Ｋａｎｔｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．は、糖尿病におけるｃ−Ｆｎの役割について記載している［Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００１  ｖｏｌ．２４  ｎｏ．２  ３２３−３２７］。Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．は、出血性変化の予測におけるｃ−Ｆｎの役割について記載している［Ｓｔｒｏｋｅ．２００４；３５：１６７１−１６７６］。最後に、米国特許出願第１１／８９０，１３４号において、本発明の発明者であるＤｉａｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．は、心筋梗塞後の心血管系の大出血の予測におけるｃ−Ｆｎの役割を実証した。
【００１０】
ＥＬＩＳＡベースのアッセイが、細胞の生体液を検出および測定するために開発されてきたが、これらの方法では実用的な臨床診断で使用するのに時間がかかりすぎる。したがって、ｃ−Ｆｎを検出および測定するより良い方法が必要である。
【００１１】
疾病管理を決定するためにｃ−Ｆｎの使用を示唆する従前からのデータにもかかわらず、本発明までは、ヘルスケアにおけるｃ−Ｆｎの役割は研究用のみに限定されていた。というのは、迅速、効率的、かつ正確に、ヒト試料中のｃ−Ｆｎのレベルを測定するためのアッセイが作成されなかったからである。ＢｉｏＨｉｔ  ＯｙｊのＥＬＩＳＡキットのような従来から作成されているアッセイは、（１）ヒト血漿試料においてｃ−Ｆｎが変動する全範囲（０〜２０ｍｇ／ｍｌ）と比較して狭い範囲（１〜３ｍｇ／ｍｌ）での反応についてのみ直線的である、（２）実施するのに特別な訓練を要する、そして（３）結果を得るのに数時間が必要である。狭い範囲で直線的であるということは、単に準最適であるのみならず、出血の予測におけるｃ−Ｆｎ変動の測定に全く不適切であるということである。というのは、アッセイが不適切となるこのような高濃度の血漿ｃ−Ｆｎの範囲それこそが将来の出血リスクが高いことを示唆するからである。簡単に言えば、従来のアッセイは、（１）脳卒中発症後のように、今すぐにでも起こりかねない出血リスクを迅速に決定することが今後の医療介入計画に欠かせないとき、許容できないほど遅い；そして（２）高いｃ−Ｆｎ濃度、つまり出血を予測するのに医学的に一番重要なｃ−Ｆｎ濃度の範囲において効果がない、という２つの問題がある。
【００１２】
対照的に、本発明は、（１）特に、高ｃ−Ｆｎ濃度を含む、対象の全範囲にわたる血漿ｃ−Ｆｎ濃度について、定量的な尺度を与える抗体および方法を提供し、そして、（２）治療上の意思決定を迅速にしなければならない（さもなくば、負の結果が避けられない）脳卒中などの多くの場合において迅速な検査の実施が必須である、患者のポイントオブケアが、２０分未満で特別な訓練なしに臨床医によって実施可能になるものとして理解されるであろう。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ヒト被験者における出血を予測するための装置に関する。この装置は、ヒト細胞フィブロネクチンを迅速に検出するためのアッセイである。好ましいアッセイは、例えば２０分未満といった迅速なアッセイを実施できるものである。また、当該装置またはアッセイは、先に記載のような将来の出血を予測するために重要なｃ−Ｆｎ濃度の全範囲にわたって有効である。
【００１４】
本発明の別の態様は、そのような迅速なアッセイの存在を可能にする合成ポリペプチドから誘導される抗体に関する。これらの抗体は、本発明の合成ポリペプチドおよび変性ヒト細胞フィブロネクチンと免疫反応する、そして、好ましくは、天然非変性ヒト細胞フィブロネクチンとも免疫反応するが、変性または天然のいずれの状態のヒト血漿フィブロネクチンとは実質的に免疫反応しない。抗体は、宿主動物の血清中に存在可能で、また、宿主の血清タンパク質、ポリペプチド、および細胞破片を実質的に含まない、実質的に純粋な形態であり得る。特に好ましい合成ポリペプチドは、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で、サブ配列：ａ）ＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＬＲＰＧＳＥＣ；ｂ）ＥＳＰＱＧＱＶＳＲＹＲＶＴＹＳＳＰＥＤＣ；およびｃ）ＨＤＤＭＥＳＱＰＬＩＧＴＱＳＣ；ならびに配列：ＮＩＤＲＰＫＧＬＡＦＴＤＶＤＶＤＳＩＫＩＡＷＥＳＰＱＧＱＶＳＲＹＲＶＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰＡＰＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＬＲＰＧＳＥＹＴＶＳＶＶＡＬＨＤＤＭＥＳＱＰＬＩＧＴＱＳＴＡからなる群のうち１つまたは複数の配列を有する。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、本発明の抗ポリペプチド抗体が、血液、血漿、または他の体液試料と免疫反応するために固体マトリクスに固定されることを必要としないアッセイ方法に関する。このアッセイ方法の一つの変形では、濃度が未知の細胞フィブロネクチンを有する試料を、過剰量の捕捉抗体および標識抗体と混合する。混合物を指定時間インキュベートして、両方の抗体をサンドイッチ様式で細胞フィブロネクチンに結合させる。次いで、混合物をコーティングされた常磁性粒子と接触させる。常磁性粒子は、捕捉抗体（したがって細胞フィブロネクチン）に結合する。結合していない抗体を除去するための洗浄において、常磁性粒子は、磁場のため、結合しサンドイッチされあた細胞フィブロネクチンとともに、固定された位置で保持される。最後に、標識抗体と反応し、試料中の細胞フィブロネクチン濃度と正比例する光を放出する基質溶液を加える。
【００１６】
このアッセイ方法の別の変形では、患者試料中の抗原は、磁性粒子に結合した抗体上の結合部位をめぐり、標識抗原と競合する。前記試料中の抗原は、細胞フィブロネクチンの標識抗体上の結合部位をめぐり、磁性粒子に結合した抗原と競合する。この方法では、細胞フィブロネクチンレベルが、患者試料中の抗原の量に逆相関する。抗原の量は、標識抗体を調べることにより決定される。
【００１７】
本発明は、いくつかの利益および利点を提供する。
【００１８】
一つの利点は、患者のヒト細胞フィブロネクチンのレベルが、迅速な時間規模、しばしば２０分未満、で評価できるということであり、これにより臨床医が急性の神経系または心血管系の事象に対する治療についての判断ができるようになる。
【００１９】
別の利点は、細胞フィブロネクチンのレベルを患者のポイントオブケアで決定できることである。
【００２０】
さらに別の利点は、細胞フィブロネクチンのレベルを、「ワンタッチ」のポイントオブケア装置により自動化された方法で測定できることであり；このような装置は、最小限の技術訓練を受けた者でも使用可能である。必要なのは、患者試料を抽出し、事前に組み立てたポーチまたはカートリッジに小分けして配置することのみである。
【００２１】
さらにまた別の利点は、患者が将来心血管系または神経系疾患に対する治療または外科的処置を受ける場合に、当該心血管系または神経系疾患の治療または外科的処置を行う前に患者の出血を予測することである。
【００２２】
本発明のさらなる利益および利点は、以下の発明の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
以下、図面について説明する。
【００２４】
【図１】図１は、競合方法およびサンドイッチ方法の２つのアッセイ様式のイラストである。これら両者を、迅速なアッセイの開発において検討した。
【００２５】
【図２】図２は、本発明の実施に使用した原材料を示す。
【００２６】
【図３】図３は、実施例Ｉで参照した表１〜２を示す。
【００２７】
【図４】図４は、実施例Ｉで参照した表３〜４を示す。
【００２８】
【図５】図５は、実施例Ｉで参照した表５〜６を示す。
【００２９】
【図６】図６は、実施例Ｉで参照した表７を示す。
【００３０】
【図７】図７は、実施例Ｉで参照した表８〜１０を示す。
【００３１】
【図８】図８は、実施例Ｉで参照した表１１〜１３を示す。
【００３２】
【図９】図９は、実施例Ｉで参照した置換曲線（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｃｕｒｖｅ）のグラフを示す。
【００３３】
【図１０】図１０は、実施例ＩＩで参照したシグナルインキュベーション時間のグラフであり、血漿中ｃ−Ｆｎの測定可能値が１５分未満で得られることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
１．定義
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、特に明記しない限り、抗体の断片または部分（これらの断片または部分が特定されているか否かにかかわらず）、そして一本鎖形態を含む。あるタンパク質が特異的または優先的にｃ−Ｆｎ分子のＥＤＡ領域と結合する能力を保持し、かつ本明細書に開示の１つまたは複数の配列を含む限り、そのタンパク質は、用語「抗体」に含まれる。抗体は、例えば、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローン等の単一コピー又はクローン由来であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、均一または実質的に均一な集団内に存在する。抗体は、Ｆｃ領域を含むインタクトで完全または完全長の定常領域を含んでいてもよく、あるいは任意の短縮形態が抗原結合部分を含みかつ抗原結合能力を保持するように設けられた抗体の部分または断片を含むものであってもよい。このような短縮形態としては、例えば、開示された抗ｃ−Ｆｎの抗体のＣＤＲまたは可変領域を含むＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。さらに、そのような短縮抗体の形態は、ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲをコードするＤＮＡをリンカー配列でつなげることにより作成できる一本鎖Ｆｖ断片であってもよい（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ  ２６９−３１５，１９９４参照）。本発明の抗体は、当該技術分野において周知の技術、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、またはこれらの技術と当該技術分野において容易に思いつく他の技術の組み合わせ、を用いて製造することができる。
【００３５】
本発明で使用する場合、用語「抗原」は、天然か合成にかかわらず、検体抗体が特異的に反応する対象である抗原決定基を指す。合成抗原には、従来の化学合成によって構築されたもの、ならびに組換えＤＮＡ技術によって構築されたものが含まれる。抗原材料はまた、本発明に従い、コロイド粒子、蛍光マーカー、または化学発光粒子で標識してもよく、抗体検体を検出するためのサンドイッチ型アッセイ、または抗原検体を検出するための競合アッセイで用いてもよい。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「標識」は、特定の結合物質に結合または結合体を形成して信号を生成可能な任意の分子、粒子、あるいは一般的なマーカータンパク質を指す。また、標識は、一般的なマーカータンパク質と結合した酵素と反応すると、視覚により検出可能なシグナルを生成できる基質をも含み得る。一実施形態では、標識は好ましくは補助試薬を添加することなく検出可能なシグナルを自発的に生成可能であり、かつ機器の助けを借りずに視覚的手段によって容易に検出される「直接」標識である。例えば、コロイド金粒子が、標識として使用できる。他の適切な標識としては、他の種類のコロイド金属粒子、染料ゾルなどの微小着色粒子、着色ラテックス粒子が挙げられる。多くのこのような物質が、当業者に周知であろう。
【００３７】
用語「ヒト改変抗体」は、ヒトゲノム配列に由来するフレームワーク領域および定常領域と同一であるか又は実質的に同一（実質的にヒト由来）のフレームワーク領域、ヒンジ領域、および定常領域を有する抗体を指す。完全なヒトのフレームワーク領域、ヒンジ領域、および定常領域は、ヒト生殖細胞系列の配列ならびに自然発生的な体細胞変異を有する配列の領域のことである。ヒト改変抗体は、完全なヒトのフレームワーク領域、ヒンジ領域、または定常領域由来であって、その中に１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を含むフレームワーク領域、ヒンジ領域、または定常領域を含むものでもよい。しばしば、ヒト改変抗体は、好ましくは、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。
【００３８】
用語「予測」は、本明細書では、投与または外科的手技による治療後、患者が１つの薬物または複数の薬物のセットに対し有利又は不利のいずれに作用する可能性があるのか、そしてその作用はどの程度なのか、あるいは患者が生存する可能性を示すために使用する。本発明の予測方法は、患者が治療レジメンまたは外科的介入に対し出血の副作用を被る可能性があるか否かを予測するのに貴重なツールである。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「迅速なアッセイ」は、６０分未満、好ましくは２０分未満で実施可能なアッセイを指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「治療」は、医学的または外科的手段を介して患者を管理することと定義する。治療は、医学的状態または疾患の少なくとも１つの症状を改善または軽減するものであり、治癒をもたらすことが必要というわけではない。本明細書で使用する場合、用語「治療転帰」とは、治療した患者に対する物理的な効果のことである。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「試料」は、ヒト患者由来の体液、最も好ましくは、全血、血漿、または血清、を含む患者試料を指す。
【００４２】
２．詳細な説明
２．１  抗体（ａｂ）の開発および評価
我々は、いくつかの抗体開発方法を使用した。我々が試みた最初の２つの方法では、スクリーニング対象の抗原を認識可能な抗体が得られたが、しかしこれらの抗体のｃ−Ｆｎ分子全体に対する親和性は弱く、ｃ−Ｆｎ分子全体を認識することはできなかった。追加として３つの方法を試みた。５つの異なる抗体開発手法を、抗体を生成するのに使用した抗原と共に、以下記載する。
【００４３】
使用した方法は以下の通りである：
−ペプチドＡ１を使用したＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＨＵＣＡＬライブラリのパニング
−ｐ−Ｆｎ分子全体への結合に対してネガティブスクリーニングした、ｃ−Ｆｎ分子全体に対するマウスの標準的な免疫法
−完全ＥＤ−Ａ領域を使用したＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＨＵＣＡＬライブラリのパニング
−３種ペプチド混合物（Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３）に対するマウスの標準的な免疫法
−ペプチドＡ２および完全ＥＤ−Ａ領域に対するマウスの標準的な免疫法
【００４４】
Ａｂ陽性だと、ｃ−Ｆｎ分子全体へは強い正の結合を示し、ｐ−Ｆｎへの結合はゼロということになろう。最終的に４個のクローンがこの基準を満たしたので選択し、市販のＩＳＴ−９Ａｂと共に、精製および継続的な検査に用いた。
【００４５】
抗ｃ−ＦＮ抗体の通過スクリーニング（ｐａｓｓｉｎｇ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は、以下を用いた：
−Ｐ４Ｆ６
−Ｐ３Ａ３
−Ｐ１Ｈ１１
−１９Ｂ１２−３Ｈ５
−市販のＩＳＴ−９
【００４６】
広範な親和性検査の後、３つの捕捉抗体：ａ）抗ペプチドＰ３Ａ３；ｂ）抗ペプチドＰ４Ｆ６；および、ｃ）市販の抗ｃ−ＦＮクローンＩＳＴ−９（マイクロプレート上にさまざまな条件でコーティングした）について、捕捉抗体としての評価を、ウサギ抗フィブロネクチン検出システムを用いて行った。現在、ＢＩＯＦＩＩＴ製の市販ｃ−Ｆｎ  ＥＬＩＳＡキットが１つ存在するが、そのアッセイ結果は、直線範囲、正確性、対照、および試料培地について多くの制限事項があった。よって、正確なＥＬＩＳＡキットの開発は、最終的に迅速な免疫アッセイに関し重要度が高い。
【００４７】
全体的な検査の結果により、Ｐ４Ｆ６捕捉抗体は、ウサギ抗フィブロネクチンを捕捉したことが実証され、最適な組み合わせとしての二次抗体は、１）ｃ−Ｆｎに特異性があり、かつフィブロネクチンと交差反応性がないこと、２）ゼロ標準で低いバックグラウンドを有すること、並びに３）適切なスパイクおよび回復値を有することがわかった。
【００４８】
最初の検査により、記載の抗体ペアは、我々の基準範囲である０、０．１０〜２０．０ｕｇ／ｍＬにおいて許容できる結果；１）ゼロと低基準との間を許容可能な程度に識別できること（感度）；２）ｃ−Ｆｎを認識するが、フィブロネクチンと交差反応性がないこと；そして、３）Ｐ４Ｆ６が、血清および血漿の両方におけるｃ−Ｆｎを認識できること、をもたらしたことを実証した。
【００４９】
我々は、かなり多くの検査をして、条件およびバッファーを最適化し、様々な血液、血清、血漿マトリックスにおいて許容範囲以上のスパイクおよび回収率について、標準及び試料の両方で一貫した％ＣＶを得ることができた。このプロセスの結果として、我々は対照を標準化し、直線性と正確性の両方で現在市販のＢｉｏｈｉｔ製のキットよりも優れたｃ−Ｆｎ  ＥＬＩＳＡキットを作成することができた。
【００５０】
ＰＯＣプラットフォーム特有の性質および構成成分の適合性検査
２つの重要な理由のため、ｃ−Ｆｎに対して質の高い抗体を得るのは非常に困難である。ｃ−Ｆｎには存在するがｐ−Ｆｎには存在しないＥＤ−Ａ領域は、抗体結合にとって非常にありふれた領域というわけではない。加えて、このように結合のための領域が小さいので、ｃ−Ｆｎのみに特異的に高い親和性を有する抗体ペアを取得することが不可能である。よって、ＥＬＩＳＡシステムにおける抗体の一つは、非特異的であろうと思われる。さらに、我々は、凍結融解サイクルで、ｃ−ｆｎが急速に劣化し、および／または、急速にＥＤ−Ａ抗原性を失うことを発見した。
【００５１】
ぺアとして結合する２つの独立したｃ−Ｆｎ特異的モノクローナル抗体を取得することができないと、血液中のｐ−ＦＮの存在量が多いために重大な問題となる。ｐ−ＦＮの存在量は１００倍多いので、二次抗体を排除してしまい、このシステムでの検出の妨害となるだろう。これは、非特異的な抗体を用いる前に全ての未結合のｐ−Ｆｎを取り除く洗浄工程によるものであり、ＥＬＩＳＡの問題ではない。したがって、これらの理由から、我々は本発明を実証する際のプラットフォームとしてＱｕａｌｉｇｅｎ社のＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）ＩＰシステムを選択した。
【００５２】
「競合」および「サンドイッチ」型の化学発光アッセイは、両者とも、ＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）ＩＰシステムで実行できる。このシステムは、注入ポートに取り付けられたフラットパッケージ内に６つの独立したチャンバーを有する。注入ポート内の血液／血清／血漿試料は、チャンバー１内に挿入される。サンドイッチアッセイでは、未知の検体濃度を有する試料を、過剰量の捕捉抗体および標識抗体と混合する。（チャンバー２において）混合物を指定時間インキュベートして、両方の抗体をサンドイッチ様式で検体に結合させる。次いで、混合物を、コーティング済みの常磁性粒子と接触させる。常磁性粒子が捕捉抗体（加えて、つまり検体）に結合する。この分析装置は、（チャンバー４から）繰り返しの洗浄中に、サンドイッチされた検体を付けたまま常磁性粒子を保持するため小さな磁石を使用する。洗浄により、全ての未結合の抗体を廃棄チャンバー（チャンバー５）に除去する（全てチャンバー３で行う）。最後に、（チャンバー６から出る）基質溶液を加え、この溶液が標識抗体と反応して発光し、この光が試料中の検体濃度に正比例する（全てチャンバー３で行う）。
【００５３】
ＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）ＩＰシステムは流体用の検査であるため、我々の抗体を検査するのに物理的な媒体（すなわち試料パッド、結合パッド、および側方流動ストリップ）は用いず、用いたのはプラスチック袋および化学発光試薬のみであった。
【００５４】
ｃ−Ｆｎ分子の安定性の問題を克服するために、我々はｃ−Ｆｎ対照および標準物質を凍結乾燥させた。次に、広範な安定性試験および溶液中においてそれらを比較検査したところ、凍結乾燥した対照は安定であったという結論になった。最終的に我々のＥＬＩＳＡおよび迅速なアッセイの流通および利用に際し、これらは新鮮な状態で再構成されることだろう。
【００５５】
３．実施例
本発明は、以下の実施例に記載された特定の実施形態を参照してより良く理解されるであろう。
【００５６】
３．１  実施例Ｉ
本実施例において、我々は、ｃ−Ｆｎの迅速な検査用に競合アッセイ様式を実施した。開発において、２つの基本的な競合アッセイ様式を用いた。１つの形式（図１の画像ｄ）では、「試料」中の抗原は、磁性粒子に結合した抗体上の結合部位をめぐり、標識抗原と競合する。類似の様式（図１の画像ｃ）では、「試料」中の抗原は、標識抗体上の結合部位をめぐり、磁性粒子に結合した抗原と競合する。両方の様式において、アッセイ応答は、試料中の抗原の量に逆相関する。
【００５７】
材料および方法
原材料
材料を、図２ａおよび図２ｂに示す。プライマーペプチドは、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から入手した。
【００５８】
ビオチンおよび結合方法
表１は、実施したビオチン化およびアルカリホスファターゼ結合をまとめたものである。ｃＦｎ抗原のビオチン化は、ＰＥＧ４ビオチンを用い、抗原：ビオチンのモル比を１：５、１：１０、１：２０、および１：５０にして実施した。Ｐ４Ｆ６抗体のビオチン化は、ＰＥＧ４ビオチンを用い、抗体：ビオチン比を１：５および１：２０にして実施した。Ｐ１Ｈ１およびＰ３Ａ３のビオチン化は、抗体でＰＥＧ４ビオチンを用い、抗体：ビオチン比を１：２０にして実施した。アルカリホスファターゼ結合は、ＳＭＣＣおよびＳＰＤＰヘテロ二官能性試薬を利用した酵素−抗体結合についてＱｕａｌｉｇｅｎプロトコルに従い酵素アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を用いて実施した。
【００５９】
ＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）試薬およびアッセイプロトコル
ＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）システムで使用する試薬パックを、フィラーＩＩに充填した。開発に際し、ビオチン化およびＡＬＰ結合した試薬について複数の組み合わせを検査した。構成成分の概要は以下の通りである：
・ バッファー溶液中にＡＬＰ結合体（抗原、ペプチドまたは抗体）を含む抗体溶液（１００μＬ／ｐａｃｋ）
・常磁性粒子（１５０μＬ／ｐａｃｋ）：バッファー溶液中に、ビオチン化抗原、ビオチン化ペプチド、またはビオチン化抗体のいずれかを含む、ストレプトアビジンに結合（カップリング）した０．５ｍｇ／ｍＬのＳｐｅｅｄｂｅａｄ  ＰＭＰ（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）
・洗浄液（２．１ｍＬ／ｐａｃｋ）：洗浄剤入りトリスバッファー
・基質（１４０μＬ／ｐａｃｋ）：Ｉｍｍｕｇｌｏｗ  Ｐｌｕｓ
【００６０】
表２は、基本的なＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）アッセイプロトコルをまとめたものである。見てわかるように、合計時間は完了まで約１８分である。
【００６１】
開発および最適化試験
スクリーニング試験
抗原、ペプチド、および抗体スクリーニング
ビオチン化抗原、ペプチド、および抗体を、対応する抗体、抗原およびペプチドアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）結合体とペアにして、最適なアッセイ性能を生みだすペアの組み合わせを決定した。表３は、開発において検査した、ビオチンと結合体のペアについて詳しく説明するものである。ペアは、最大アッセイ応答および既知のｃＦｎ濃度を有するスパイクした試料の％相対置換（％  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）について検査した。これらの分析の結果を、本報告に添付の付記１に詳述する。これらのスクリーニング評価から、以下の２組のペアを最終的な継続評価用に選択した：
１）ＥＤＡ−Ｆｃビオチン／Ｐ４Ｆ６抗体結合体
２）ｃＦｎビオチン／Ｐ４Ｆ６抗体結合体
【００６２】
ａ）バッファー試験
安定性、応答、およびｃＦｎ抗原の％相対置換を最適化するために、様々なｐＨバッファー、洗浄剤、タンパク質、および他の添加剤を、ｃＦｎ  ＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）アッセイで検査した。ビオチン溶液を常磁性粒子（ＰＭＰ）にカップリングするのにカップリングバッファーを使用し、ＡＬＰ結合体を希釈するのに結合体バッファーを使用した。
【００６３】
カップリングバッファーおよび結合体バッファーの組成を、以下に詳述する：
カップリングバッファー：
＃１）０．１Ｍ  ＴＢＳ  ｐＨ８＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０
＃２）２５ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ６＋１％ＢＳＡ＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０
＃３）２５ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ６＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０
＃４）ＢＢＣ  ｐＨ８（トリス＋３％ＢＳＡ）＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０
＃５）ＢＢＣ  ｐＨ８（トリス＋３％ＢＳＡ）＋０．２５ｍｇ／ｍＬ  α−シクロデキストリン＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０
＃６）ＢＢＣ  ｐＨ８（トリス＋３％ＢＳＡ）＋５％トレハロース＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０
結合体バッファー；
＃１）ＰＢＳ  ｐＨ６＋１％ＢＳＡ
＃２）ＰＢＳ  ｐＨ６＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ
【００６４】
カップリングバッファーおよび結合体バッファーの各組み合わせは、６日間にわたる安定性を実証するために、２０１１年１１月２２日および２０１１年１１月２８日に検査した。表４は、バッファーブランクのＲＬＵおよび１０μｇ／ｍＬのｃ−Ｆｎフィブロネクチンを含む試験のデータを示す。
【００６５】
カップリング／結合体バッファー試験の結果は、バッファー中にＢＳＡを添加すると不安定にあることを示した。この不安定性のため、３％ＢＳＡを含有するカップリングバッファーを用いた６日間の応答では劇的な減少が起こった。ｃ−Ｆｎの％置換は、いかなるバッファーの組み合わせを用いても有意ではなかったので、最適なバッファーの組み合わせを、最大の応答性と安定性に基づいて選択した。以下、最適な応答性と安定性を生みだすために決定したバッファーの組成ついて詳述する：
カップリングバッファー＝２５ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ６＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０
結合体バッファー＝ＰＢＳ  ｐＨ６＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ
【００６６】
アッセイにおける細胞フィブロネクチン（ｃＦｎ）抗原の置換を最適化する試みでは、様々なｐＨバッファー、タンパク質、洗浄剤、還元剤および他の添加剤についての検査を含む試料の前処理試験をいくつか実施した。
【００６７】
ｉ）試料バッファー添加剤についての実験
既知の濃度の細胞フィブロネクチン（ｃＦｎ）試料を様々なバッファー添加剤で処理し、ｃＦｎを含有しないブランクバッファーにより生じた応答と比較するアッセイで検査した。添加剤の２×ストック溶液を、ＰＢＳ  ｐＨ６バッファーで調製した。検査の直前に、試料（ブランクまたはｃＦｎ）を適切な２×ストックバッファーで１：２に希釈した。表５は、バッファー添加物および生じた応答を詳述するものである。
【００６８】
ＳＤＳ試料の前処理
この試験は、試料の前処理としてＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を使用する効果を詳述するものである。ＳＤＳは、ｃＦｎ結合の機会を増やすようにタンパク質の構造を変化させる能力があるため選択した。ＳＤＳ２×ストックバッファーを、ＰＢＳ  ｐＨ６、０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０バッファーで調製した。検査の直前に、試料を各ＳＤＳバッファーで１：２に希釈した。表６は、初期のＳＤＳ力価スクリーニングのデータを示す。表７は、狭いＳＤＳ力価でのスクリーニングのデータを示す。
【００６９】
試料の前処理として使用したＳＤＳは、前処理をしない試料と比較して、ｃＦｎの置換が良くなったように思われる。応答対置換比を比較すると、０．０５％のＳＤＳ（ＳＤＳ０．１％ストック）が、試料の前処理として使用するのに最適な濃度であるように思われる。
【００７０】
ｐＨバッファー
アッセイおよび試料（対照）バッファーのｐＨを比較するため、２つの試験を詳述する。１つの試験では、ＰＭＰカップリング、結合体、および試料バッファーで使用したｐＨ６および８のバッファーを比較した（表８）。もう１つの試験では、ＳＤＳを添加したｐＨ４、５、および６の試料バッファーを比較した（表９）。
【００７１】
結果データに基づくと、このアッセイは、ｐＨおよび／またはバッファーに依存するようだ。ＴＢＳ  ｐＨ８を使用すると非常に低いアッセイ応答が生じたが、一方、ｐＨ６以下で検査したバッファーだと許容されるアッセイ応答が生じた。表９のデータは、バッファーｐＨを下げるとアッセイ応答が増加したことを示す。置換比は、アッセイおよび対照（試料）バッファーとしてリン酸ｐＨ６を用いると最適である。
【００７２】
ＡＬＰ標識および非標識のＰ４Ｆ６抗体の比較
アッセイ応答を最適化し、結合体の不安定性による影響を低減するために、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’特異的）（ＧＡＭ）ＡＬＰを検出酵素として用いて、ＡＬＰ標識Ｐ４Ｆ６抗体（結合体）を非標識Ｐ４Ｆ６抗体と比較した。ＡＬＰが結合したＰ４Ｆ６抗体の安定性は決定されなかったが、日々変動することは観察された。表１０は、この比較による詳細なデータを示す。
【００７３】
ヤギ抗マウスＡＬＰを検出酵素として用いる非標識Ｐ４Ｆ６抗体の使用により、アッセイ応答が大幅に改善し置換比がわずかに改善した。ＧＡＭ  ＡＬＰ検出酵素とＰ４Ｆ６非標識抗体を用いてさらに試験を実施した（結果は記載せず）。
【００７４】
モノクローナル抗細胞フィブロネクチンクローンＦＮ−３Ｅ２
細胞フィブロネクチンに対するモノクローナル抗体を、Ｓｉｇｍａから購入し、アッセイで検査し、現在の抗ｃＦｎクローンＰ４Ｆ６抗体と比較した。両方の抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）ＡＬＰを用いて検出した。アッセイ応答およびｃＦｎの置換を比較した。表１１は、この試験の結果を詳述するものである。
【００７５】
購入したモノクローナル抗ｃＦｎ抗体の使用により、許容可能なアッセイ応答が生じたが、ｃＦｎの置換は全く見られなかった。従って、現在のＰ４Ｆ６抗体に比べ、明らかな改善は見られない。
【００７６】
アッセイインキュベーション試験
アッセイ応答及びｃＦｎの置換を最適化するために、様々なアッセイインキュベーション時間を検査した。ＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）アッセイシステムは、２種類のインキュベーションを含む；１つ目は、試料／抗体インキュベーションであり、２つ目は、試料／抗体およびビオチンにカップリングさせたストレプトアビジンＰＭＰ免疫複合体の混合中に起こるインキュベーションである。表１２は、検査したインキュベーションの組み合わせについてのアッセイ応答および置換比を示す。
【００７７】
１．５分の試料／抗体のインキュベーションと、５回の混合（約４分）によるＰＭＰ／抗体複合体のインキュベーションの採用により、最適な応答および置換が生じているようだ。
【００７８】
最適化アッセイ
以下は、最適化されたｃＦｎ競合様式のＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）アッセイの概要である：
・抗体溶液（１００μＬ／ｐａｃｋ）：Ｐ４Ｆ６抗ｃＦｎモノクローナル抗体（０．５μｇ／ｍＬ）およびヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’特異的）ＡＬＰ（１：２０００希釈）を含む、０．１％ｐｒｉｏｎｅｘおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ  ｐＨ６
・常磁性粒子（１５０μＬ／ｐａｃｋ）：０．１％ｐｒｉｏｎｅｘおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ  ｐＨ６中に、ｃＦｎビオチン（２μｇ／ｍＬ）をカップリングさせた０．５ｍｇ／ｍＬのＳｐｅｅｄｂｅａｄストレプトアビジンＰＭＰ（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）
・基質（１４０μＬ／ｐａｃｋ）：Ｉｍｍｕｇｌｏｗ  Ｐｌｕｓ
・洗浄液（２．１ｍＬ／ｐａｃｋ）：洗浄剤入りのトリスバッファー
【００７９】
合計時間が約７分のアッセイプロトコルを用いた。このプロトコルは、抗体溶液を用いて試料（１００μＬ、ＳＤＳを含むバッファー中で前処理済み）を１．５分インキュベーションした後に、ストレプトアビジンＰＭＰにカップリングしたｃＦｎビオチンに免疫複合体を混合する（５回混合／約４分）ことから構成される。最後の工程には、３回の洗浄および基質の読み取りが含まれる。試料の前処理は、検査の直前に行う。試料およびブランクをＳＤＳ０．１％バッファー中で１：２に希釈したらすぐにパックに装填する。
【００８０】
ｃ−Ｆｎの力価を、上記で詳述したアッセイ条件を用いて二重に検査した。平均、標準偏差、％ＣＶ、および置換比を計算した。表１３は、この試験の結果を詳述するものである。視覚的な表現については、図９を参照のこと。この図より、ｃ−Ｆｎの迅速な検査が、このアッセイ様式で実現できることがわかる。
【００８１】
４．結論
Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓからＱｕａｌｉｇｅｎに供給された材料ならびに購入された試薬を用いたところ、競合アッセイ様式でのｃＦｎの免疫アッセイは、ＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）システム上で最適化され、その合計インキュベーション時間は約７分であった。
【００８２】
ＥＤＡ−Ｆｃペプチドでもアッセイで許容可能な応答が生じたが、「試料」中のｃＦｎの標識ｃＦｎ分子全体を置換させる能力は標識ＥＤＡ−Ｆｃペプチドを置換させる能力より高かったので、天然ｃＦｎ分子全体を最終アッセイ構成用に選択した。
【００８３】
ｃＦｎ置換を起こすために、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いる試料の前処理工程を採用すべきである。競合アッセイ様式では、アッセイ応答は、「試料」におけるｃ−Ｆｎの量に逆相関する。ｃ−Ｆｎを含まない「試料」と比較して、ｃ−Ｆｎの「試料」で生じた応答の低下が、「置換」によるものであると考えられる。
【００８４】
実施例ＩＩ
本実施例において、我々は、液体媒体中を自由に流動する常磁性ビーズを用いてｃ−Ｆｎの迅速な検査のためのサンドイッチアッセイを実施した。実施した実験は、ビオチン−モノクローナル抗体、酵素アルカリホスファターゼにカップリングしたポリクローナル抗体の調製、アッセイの最適化、およびマスター検量線の作成である。また、アッセイの性能特性を、直線性、感度および不正確性について評価した。Ｐ４Ｆ６抗体が、ＥＬＩＳＡシステムにおいて最良であることが証明されているが、これは、全ての迅速な流体免疫測定システムについて当てはまるわけではないので、３ｃ−Ｆｎモノクローナル抗体についても検査した。ヒト包皮線維芽細胞由来のフィブロネクチンを、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ／Ｎ  Ｆ２５１８  Ｌ／Ｎ  ０３１Ｍ４０６５Ｖから購入した。
【００８５】
抗ｃＦｎモノクローナル抗体を、ＰＥＧ４−ビオチンを用いてビオチン化し（ビオチン：抗体比は５：１）、ＳＭＣＣおよびＳＰＤＰヘテロ二官能性試薬を利用した酵素−抗体結合についてのＱｕａｌｉｇｅｎの内部プロトコルに従い、抗ｃＦｎウサギ抗体を酵素アルカリホスファターゼに結合させた（ＲＩｇＧ−ＡＬＰ）。
【００８６】
フィラーＩＩＩに充填した試薬パックは、以下の構成成分を含む：
・抗体溶液（１００μＬ／ｐａｃｋ）：ＩｇＧ−ビオチン（２．５μｇ／ｍＬ）およびＲＩｇＧ−ＡＬＰ（１．５μｇ／ｍＬ）を含む、安定剤および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りのＰＢＳを含有するＱｕａｌｉｇｅｎ抗体溶液
・常磁性粒子（１５０μＬ／ｐａｃｋ）：３％ＢＳＡおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０入りのトリスバッファー中に、０．５ｍｇ／ｍＬのＳｐｅｅｄビーズＰＭＰ（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）
・基質（１４０μＬ／ｐａｃｋ）：Ｉｍｍｕｇｌｏｗ  Ｐｌｕｓ
・洗浄液（２．１ｍＬ／ｐａｃｋ）：洗浄剤入りトリスバッファー
【００８７】
合計時間が約１１分のアッセイプロトコルを、ＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）システムにおけるｃＦｎの評価に用いた。このプロトコルは、抗体溶液を用いて試料（２５μＬ）を５分インキュベーションした後に、免疫複合体をＰＭＰ−ストレプトアビジンと混合し（５回混合／合計時間〜約２分）、そして３回洗浄することから構成される。最後に、基質を反応物に添加し、１分間読み取りを行う。表２の概略プロトコルを参照のこと。
【００８８】
標準液：標準液は、ｃＦｎ抗原をＢＳＡベースのマトリックス（Ｑｕａｌｉｇｅｎ多検体安定化溶液）で希釈することにより調製した。標準液は、次の濃度で調製した：０，０．２５，０．５，１．０，２．５，５．０，６．０，７．５および１０μｇ／ｍＬ。標準液は、使用するまで約−２０℃で保存した。
【００８９】
対照：３つのレベルのｃＦｎ対照を、Ｑｕａｌｉｇｅｎ多検体安定化溶液で調製し、不正確性の試験に使用した。
【００９０】
直線性試料は、脱脂ヒト血清（Ｇｏｌｄｅｎｗｅｓｔカタログ番号４２０−１Ｌ  ＬＮ  ０８Ｅ１２０６）をｃＦｎでスパイクさせ、その後スパイクしていない血清で希釈することにより調製した。
【００９１】
感度：  ０．０、０．２５、０．５、および１．０μｇ／ｍＬのｃＦｎ濃度を調製した。３台のＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）アナライザを用いて各レベルにつき２０回繰り返して検査を行い、合計６０回測定した。
【００９２】
Ｐｒｅｄｉｃａｔｉｏｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓから入手した全ての抗体をビオチン化および酵素結合した。スクリーニング実験により、全てのモノクローナル抗体がウサギ抗体と対になったことが示された。どのペアも、評価に用いるのに十分なシグナルを出さなかったので、この実行可能性試験はＲＩｇＧ−ＡＬＰに結合したモノクローナルＰ４Ｆ６ビオチンの使用に基づく。
【００９３】
合計時間が約１１分のアッセイを本試験で用いた。最初のインキュベーション工程は、抗体（ｍＩｇＧ−ビオチンおよびＲＩｇＧ−ＡＬＰ）を試料と混合することから構成される。図１０ａ）は、抗体を用いた試料のインキュベーションが５分で十分であることを示す。
【００９４】
検量線は、６台の異なるＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）アナライザで、各ｃＦｎ標準液を５回繰り返して検査することにより作成した。標準レベル当たり合計３０回反復することになる。次に、５μｇ／ｍＬの濃度の標準レベルを用いてＲＬＵ値を正規化し、トリム平均をそれぞれの標準レベルについて算出した。図１０ｂ）は、６台のアナライザでの正規化ＲＬＵを用いて作成した典型的な検量線を示す。この図より、ｃ−Ｆｎの迅速な検査は、このアッセイ様式で実現されることがわかる。
【００９５】
我々は、合計約１１分のインキュベーション時間でＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）システムを用いたｃ−Ｆｎの化学発光免疫アッセイが実行可能であることを実証した。検査したアッセイのダイナミックレンジは０．３１μｇ／ｍＬの検出限界で、０．０〜１０．０μｇ／ｍＬであった。
【００９６】
複数台のＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）アナライザを用い、我々が調製した対照を分析することによってアッセイの不正確性について検査した。アナライザ１台当たりおよび全体の合計としての不正確性は、それぞれ、約４．７％および約１４．９％であった。アッセイの直線性は、患者血清試料を高標準物質でスパイクし、これを希釈することによって検査した。
【００９７】
当業者にとって、数多くの変更が可能であることが理解されるだろう。したがって、上記の説明および添付の図面は、本発明の例示に過ぎず非限定的なものとして解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、ならびに本発明が関与する技術分野で公知または慣行の範囲内の本開示から逸脱しない原理に従い、本明細書で既に記載しそして添付の特許請求の範囲において記載される本質的な特徴が当てはまるような本発明のいかなる変形、使用、または用途も、一般に包含する意図であることが理解されるだろう。
【００９８】
本発明から導かれる結論の概要
本発明は、血液中の二量体糖タンパク質細胞フィブロネクチンについて１５分未満の迅速な検査を可能にする。本発明の一態様では、細胞フィブロネクチンのＥＤＡ領域と結合する抗体が提供され、当該抗体は、細胞フィブロネクチンのＥＤＡ領域に対する親和性は高いが、血漿フィブロネクチンに対する親和性は少なくとも２桁少ない。本発明は、さらに、細胞性フィブロネクチンのＥＤＡ領域に対して生じる抗体を含む診断アッセイおよびキットを包含する。
【００９９】
本実施形態の別の態様では、ｃ−Ｆｎに対する抗体を、常磁性ビーズとともに競合アッセイ様式で使用することにより、血液試料中のｃ−Ｆｎの定量的測定を可能にする。
【０１００】
本態様の好ましい実施形態は、Ｑｕａｌｉｇｅｎ，ＩｎｃのＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）ＩＰシステムを用いた競合アッセイ様式である。
【０１０１】
本実施形態の別の態様では、ｃ−Ｆｎに対する抗体を、常磁性ビーズとともにサンドイッチアッセイ様式で使用することにより、血液試料中のｃ−Ｆｎの定量的測定を可能にする。
【０１０２】
本態様の好ましい実施形態は、Ｑｕａｌｉｇｅｎ，ＩｎｃのＦＡＳＴＰＡＣＫ（登録商標）ＩＰシステムを用いたサンドイッチアッセイ様式である。
【０１０３】
本発明の特別の実施形態では、迅速なアッセイにより、特定の患者のポイントオブケアにおける出血の予測が可能になる。
【０１０４】
本実施形態の好ましい態様では、迅速なアッセイにより、ヒト被験者における内部神経系または心血管系の出血、あるいはヒト被験者に治療薬を投与した後に起こる神経系または心血管系の出血の可能性の予測が可能になる。
【０１０５】
本実施形態の別の好ましい態様では、迅速なアッセイにより、ヒト被験者に血栓溶解治療薬を投与した後に起こる大出血の予測が可能になる。
【０１０６】
本実施形態の別の好ましい態様では、迅速なアッセイにより、ヒト被験者に抗凝固治療薬を投与した後に起こる大出血の予測が可能になる。
【０１０７】
本実施形態の別の好ましい態様では、迅速なアッセイにより、ヒト被験者に第Ｘａ因子阻害剤を投与した後に起こる大出血の予測が可能になる。
【０１０８】
本実施形態の更に別の好ましい態様では、迅速なアッセイにより、ヒト被験者にアルツハイマー病またはパーキンソン病に対する治療薬を投与した後に起こる大出血の予測が可能になる。
【０１０９】
本実施形態の更に別の好ましい態様では、迅速なアッセイにより、外科的処置を施す前に大出血の予測が可能になる。
【０１１０】
５．本発明の要約
本発明は、ヒト細胞フィブロネクチンを検出するための迅速なアッセイに関し、生体液中の細胞フィブロネクチンを検出および測定するために従来から開発されてきたＥＬＩＳＡベースのアッセイでは実用的な臨床診断で使用するのに時間がかかりすぎていたという背景がある。このアッセイは、迅速な時間規模で、出血事象の予想を可能にする。また、高い親和性を有するヒトモノクローナル抗体、特に細胞フィブロネクチン（ｃ−Ｆｎ）の同位体決定基に対する抗体、ならびにこれらの抗体の均等物および誘導体についても記載する。これらの抗体は、血漿フィブロネクチンに対する親和性よりも少なくとも１００倍を超える親和性を持ってこれらの標的にそれぞれ結合し、そして様々な検出様式において３０分未満で、いくつかの検出様式では１５分未満で、ｃ−Ｆｎを検出するアッセイの作成を可能にする。これらの抗体は、診断、特に、出血事象の予測，疾患の予防および治療に有用である。
【０１１１】
同時に、開示された迅速なアッセイおよび使用方法は、オペレータによる使用の簡便性、細胞フィブロネクチンについてその場での迅速な決定、ならびにオペレータおよび患者の両者の汚染リスクを最小限にする使い捨て方法を含め、従来技術よりも実質的な利益を享受する。開示された発明は、事故現場、緊急治療室、手術、介護施設、集中治療室、および非医療環境での使用を含め、ポイントオブケア臨床診断分野に適応可能である。
【０１１２】
本発明により、実施が簡単で、２０分未満しかかからず、そして卓上機器によって実行できる、ヒト体液試料の細胞フィブロネクチンについて定量的で正確な測定が初めて可能になった。これにより、大出血が分子レベルで初めて予測可能となるので、時間が極めて重要となることが多い治療薬の投与または外科的手順における出血を予測するためのポイントオブケアの検査が可能になるだろう。これにより、医師は、ヒト患者の心血管系および神経血管系に影響を与えかねない治療や処置について「実施する」または「実施しない」決定を、致命的な出血の副作用が起こるかもしれないという不確実性に直面することなく、行うことができるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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