(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光（４）の生成のためのパルス光源およびスイッチング光（５）の生成のためのパルス光源または連続光源を用いるＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法における照明および検出のための方法であって、
励起光（４）のための前記パルス光源が、１５０ピコ秒より長いパルス期間でかつ励起状態の寿命より短いか１０ナノ秒より短いパルス期間で前記励起光（４）を生成し、
前記スイッチング光（５）がパルスで照射される場合に、スイッチング光（５）が、前記励起光（４）のパルス中にサンプルに送出されず、かつ前記励起光（４）のパルス中に前記サンプルから来る全ての光子が、検出および解析から拒絶され、刺激パルス（２）の活性化時か、その直後に、前記サンプルから来る前記光子が検出および解析され、あるいは
前記スイッチング光（５）が連続的に照射される場合に、スイッチング光（５）が、前記励起光（４）のパルス中に既にサンプルに送出され、かつ励起光（４）のパルス中に前記サンプルから来る全ての光子が、前記励起光（４）が照射されている限り拒絶され、前記励起光（４）のパルスの終了時か、その直後に、前記サンプルから来る前記光子が検出および解析される、
方法。
【請求項２】
前記励起光（４）の前記パルスが、４００ピコ秒〜１０ナノ秒の範囲の長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記励起光（４）の前記パルスの長さが、前記励起光（４）によって放出されるまで励起される、サンプルの染料分子における蛍光状態の寿命に対応する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記励起光（４）の前記パルスが、前記スイッチング光（５）の前記パルスに時間的に先行する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記励起光（４）の前記パルスが、非対称時間プロファイルを有し、そのプロファイルでは、光パルス強度の降下エッジが、前記光パルス強度の立ち上がりエッジよりも急勾配である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法を実行するためのＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法における照明および検出用の装置であって、励起光（４）の生成のための少なくとも１つのパルス光源と、スイッチング光（５）の生成のための少なくとも１つのパルス光源または少なくとも１つの連続光源と、を有し、
励起光（４）のための前記パルス光源が、１５０ピコ秒より長いパルス期間でかつ励起状態の寿命より短いか１０ナノ秒より短いパルス期間のパルスを有する励起光（４）を生成し、
前記スイッチング光（５）がパルスで照射される場合に、スイッチング光（５）が、前記励起光（４）のパルス中にサンプルに送出されず、かつ前記励起光（４）のパルス中に前記サンプルから来る全ての光子が、検出および解析から拒絶され、刺激パルス（２）の活性化時か、その直後に、前記サンプルから来る前記光子が検出および解析され、あるいは
前記スイッチング光（５）が連続的に照射される場合に、スイッチング光（５）が、前記励起光（４）のパルス中に既にサンプルに送出され、かつ励起光（４）のパルス中に前記サンプルから来る全ての光子が、前記励起光（４）が照射されている限り拒絶され、前記励起光（４）のパルスの終了時か、その直後に、前記サンプルから来る前記光子が検出および解析される、
装置。
【請求項７】
前記励起光（４）の前記パルスの期間が、前記励起光（４）によって放出されるまで励起される、サンプルの染料分子における蛍光状態の寿命に対応するように、励起光（４）のための前記パルス光源が設けられ、設計される、請求項６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、励起光およびスイッチング光用のパルス光源または連続光源を用いるＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法における照明および検出用の方法に関する。本発明はまた、本発明の方法を実行するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＥＳＯＬＦＴ（可逆的飽和性光学（蛍光）遷移）顕微鏡法には、高倍率で特に鮮明な画像を生成できる一群の光顕微鏡方法が含まれる。従来の対物レンズおよび回折ビームの使用にもかかわらず、回折限界をはるかに超えて、分子レベルにまで至る解像度を達成することが可能である（この点では、非特許文献１、非特許文献２を参照されたい）。
【０００３】
従来の光顕微鏡において、近接して配置された特徴間を区別する能力は、約２００ｎｍである。これは、光の波動性ゆえである。例えば、従来の光顕微鏡において、解像限界は、主として、使用される光の波長および開口数によって決定される。ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法において、この限界は、克服される。この目的のために、染料は、それらが照明に応えて（蛍光）信号を発することができない状態に一時的にスイッチングされる。
【０００４】
上記の説明によれば、ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法は、回折限界を克服する光顕微鏡法の変形である。したがって、ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法を用いれば、実際には近過ぎて全く解像できない標本の特徴を検出および結像することが可能である。
【０００５】
ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法において、ＳＴＥＤ顕微鏡法（非特許文献３、非特許文献４を参照されたい）およびＧＳＤ顕微鏡法（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７を参照されたい）の原理が、最も広い意味で、２つの区別可能な状態間で可逆的にスイッチングできる任意の種類の分子に一般化される。２つの可能な状態の少なくとも１つへの、染料分子の「スイッチング」は、光の影響によって達成することができる。これに関連して、用語「スイッチング」は、最も広い意味で理解されるべきである。
【０００６】
ＲＥＳＯＬＴ顕微鏡法において、検査される標本は、特別な分子、通常は蛍光染料で標識付けされる。染料分子における光学的に駆動された区別可能な状態を用いる。具体的には、染料分子は、少なくとも２つの状態間を行ったり来たり、または行きつ戻りつしてスイッチングされる。これらの状態は、信号を発生する明状態および信号を発生しない暗状態であってもよい。２つの状態の少なくとも１つへの染料分子のスイッチングは、光の作用によって達成される。
【０００７】
用語「ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法」は、総称、すなわち、その下に、類似の原理に従って動作する異なる方法が包摂されることになる総称として理解されるべきである。ＳＴＥＤ（誘導放出抑制）顕微鏡法は、例えば、ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法に属する。その方法において、蛍光染料は、電子基底状態および励起状態間で行ったり来たりして変化し、そのプロセスで蛍光発光する。暗状態において、染料は、誘導放出を通して、その基底状態に永続的に維持される。したがって、蛍光染料の２つの構成が存在し、それらに従って、蛍光染料は、信号発生状態で蛍光発光し、一方で暗状態において、放出は、知覚できない。
【０００８】
ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法に属する別の方法は、ＧＳＤ（基底状態抑制）顕微鏡法である。ここで、蛍光染料が、マーカとして用いられる。明状態において、染料は、基底状態および励起状態間で行ったり来たりして変化し、そのプロセスで蛍光発光する。暗状態に対して、分子の基底状態は、激減される。これは、蛍光発光が生じない長寿命状態へと分子が励起されることを意味する。分子が長寿命暗状態にある限り、分子は、基底状態において利用可能でなく、したがって、蛍光発光するために励起され得ない。明状態への戻りは、自然に発生する。
【０００９】
ＳＰＥＭ（飽和パターン励起顕微鏡法）およびＳＳＩＭ（飽和構造化照明顕微鏡法）がまた、代表的なＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法である。これらの方法において、最初に陰画が生成され、次に数学的な画像再構成が実行される。基底状態は、上記で提示した説明に従って暗状態に取って代わる。第１の励起状態は、明状態に対応する。
【００１０】
ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法の文脈で言及される別の方法は、アップコンバージョン顕微鏡法（非特許文献８を参照されたい）である。ＳＴＡＱ顕微鏡法もまた、ＲＥＳＯＬＦＴの下に包摂されることになる。
【００１１】
本発明が、一般に、用いられる特定の方法にかかわらず、ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法における照明および検出用に使用可能な方法および装置に関することに、この時点で留意されたい。重要なことは、ＲＥＳＯＬＦＴの基本原理の利用であり、その適用は、この基本原理の全ての考えられる典型に関係する。
【００１２】
本発明の教示における説明を単純化するために、一般的なＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法に関する教示は、ＳＴＥＤ顕微鏡法の例を用いて説明するが、ＳＴＥＤ顕微鏡法は、励起光および刺激光（スイッチング光に対応する）用にパルス光源または連続光源を用いる。
【００１３】
前述のタイプの対応する装置が、特に、走査型共焦点蛍光顕微鏡法に関連して、特許文献１に説明されている。この装置において、横方向解像度を向上させるために、標本点が励起ビームで照明され、その結果、励起光によって作用された蛍光分子は、励起状態に変換される。さらに、標本点は、適切な波長の刺激ビームで照明され、その結果、励起状態の蛍光分子は、誘導放出プロセスによって基底状態に戻すことができる。励起ビームおよび刺激ビーム（スイッチングビーム）は、それらの強度分布または照明パターンが、対象物領域において少なくとも部分的に互いに重複するような方法で配置される。重複領域にある蛍光分子は、励起ビームによる励起直後に誘導放出によって基底状態に変換され、その結果、励起ビームの照明パターンにはあるが刺激ビームの照明パターンにも２つの照明パターンの重複領域にもない蛍光分子からの光だけが検出される。
【００１４】
誘導放出光および／または反射刺激光は、光学フィルタによって、走査顕微鏡の検出ビーム経路から除去することができ、その結果、励起ビームの照明パターン領域からの蛍光光から２つの照明パターンの重複領域を引いたものだけが検出される。この削減は、蛍光放出に寄与する対象物領域を回折限界の結像範囲より下に低減できるようにし、したがって解像度における改善を表す。
【００１５】
ＳＴＥＤ顕微鏡法における対象物の照明および検出用の装置が、既に特許文献２から周知であり、そこでは、メインビームスプリッタが、スイッチング可能ビームスプリッタ、すなわち、刺激光の照射パワーに依存し、刺激光分布の領域における励起準位が無視できるほどになった場合に伝達用にスイッチングできるスイッチング可能ビームスプリッタの形態を取る。ここでは、非常に一般的にゲーティングのことを言う。
【００１６】
ＳＴＥＤ顕微鏡法において、前述のように、サンプルは、最初に、例えばパルス緑色レーザ光の励起ビームによって光学的に励起される。次に、いわゆるケンチングが、はっきり言うと刺激光を用いた照射によって実行され、その結果、サンプルの誘導放出が、励起された染料の蛍光スペクトルと重複する波長において、励起された焦点領域の一部で発生する。典型的には、誘導放出は、７００〜８００ｍｍの範囲である。ＳＴＥＤ照明の外側の領域は、「通常の」蛍光プロセスで放出する。
【００１７】
典型的な顕微鏡において、解像度が、回折ゆえに、光の波長によって制限される一方で、ＳＴＥＤ顕微鏡法は、古典的回折限界を超えた解像度を達成できるようにする技術である。
【００１８】
共焦点顕微鏡において、走査レーザスポットは、あるサイズ、典型的には約２００ｎｍより小さくすることはできない。したがって、この値より小さな、サンプルにおける構造は、結像することができない。
【００１９】
共焦点顕微鏡の解像限界を克服するために、ＳＴＥＤ顕微鏡法において、対象物における染料を励起させるために用いられる走査焦点光分布（「励起光」）は、別の光分布と重ね合わされるが、この別の光分布は、典型的にはリング形状であり、その中央に強度最小値を有する。この光分布の波長は、励起光によって励起された染料から誘導放出（「ＳＴＥＤ光」）を引き起こすように選択される。このように、励起光分布に当てられたエリアのうち、実際には蛍光光が、ＳＴＥＤ光分布の中央における領域からのみ放出されることが達成可能である。なぜなら、そこは、ＳＴＥＤ光分布がその最小値を有し、したがって、誘導放出を引き起こさない場所だからである。励起光によって照明される他の全ての領域では、蛍光光は放出されない。なぜなら、速やかな誘導放出によって蛍光が即座に抑制されるからである。
【００２０】
誘導放出を介して放出された光は、適切なフィルタによって除去可能であり、その結果、励起光分布の中央からのあの光だけが残る。このようにして得られた新しい効果的な光分布は、元の光分布よりはるかに小さい。それによって、サンプルにおけるはるかに小さな構造を見ることが可能になる。
【００２１】
ＳＴＥＤ顕微鏡法の基本原理に関して、非特許文献９および非特許文献１０がまた参照される。ＳＴＥＤ顕微鏡法に関するこれらの出版物の内容は、当業者に周知であると考えられる。
【００２２】
ＳＴＥＤ顕微鏡法において、励起光および刺激光（ＳＴＥＤ光）の時間整合は、重要な役割を果たす。
【００２３】
ＳＴＥＤ方法の特別な変形が、パルスＳＴＥＤ方法である。ここで、励起光は、典型的には１５０ピコ秒未満の非常に短いパルスでサンプルの方へ照射される。その直後、染料分子の励起状態の典型的な寿命よりはるかに短い期間に、刺激光が、同様にパルスで照射される。このパルスは、通常、励起光パルスより長く、例えば数百ピコ秒〜数ナノ秒のパルス長を有してもよい。励起状態の「寿命」は、典型的には数ナノ秒である。脱励起および関連光子の放出は、この平均寿命を有する確率過程である。したがって、分子集合が短い励起パルスによって照明された場合に、特に数ナノ秒の特有の減衰定数で、指数関数的に減衰する蛍光を検出することが可能である。したがって、蛍光パルスの直後に刺激光を照射することが重要である。なぜなら、これは、ＳＴＥＤ光によって蛍光ができる限り抑制されることを保証する唯一の方法であるからである。長すぎる時間の経過が許された場合には、励起光分布の中央からの光子だけでなく、他の領域からの光子もまた、記録されることになろう。これらの光子は、貧弱な解像度に帰着するので、望ましくない。
【００２４】
励起状態の寿命と比較して励起パルスが短いこともまた重要である。それが長い場合に、ＳＴＥＤパルスは、励起パルスの最初に既に励起されている分子用には遅すぎることになろう。次に、かかる分子は、それらの蛍光光が抑制される前に光を放出する可能性があり、したがって貧弱な解像度に寄与することになろう。ＳＴＥＤパルスが、通常、励起パルスより数桁強いことにもまた留意されたい。したがって、高パルスエネルギを備えた強力なレーザが必要とされる。
【００２５】
ＳＴＥＤ方法の別の周知の変形は、連続刺激光が用いられる方法である（ＣＷ ＳＴＥＤ＝連続波ＳＴＥＤ）。ここで、刺激光は、パルス化されるのではなく、より正確には励起用に連続的に放出される。したがって、刺激光は、連続的に照射される。
【００２６】
連続刺激光を用いるＳＴＥＤ方法は、実際に著しい利点を有する。例えば、パルスの不可欠な時間系列を考慮する必要がない。パルス刺激光の場合には、パルス長と同様にパルス間隔が、極めて重要なパラメータである。特に、十分に短い励起パルスを生成することは簡単ではない。これができる光源は、通常、非常に高価である。刺激光用の適切なパルス光源もまた、高価であり、限られた数から選択するしかない。これは、ＣＷレーザが光源として用いられる場合には異なる。連続的に光を放出する、コスト効率がよく、しかも信頼できるＣＷレーザ光源の多くの選択肢が、励起光源およびＳＴＥＤ光源の両方に利用可能である。
【００２７】
しかしながら、ＣＷ ＳＴＥＤ方法にはまた、極めて重大な欠点がある。解像度は、決してパルスＳＴＥＤ方法におけるほど優れてはいない。これは、染料が、いつでも励起され得るからである。今度は、刺激光は、励起直後にパルス形態における最大強度で照射されるのではなく、連続的に照射される。したがって、瞬間ｔ０に励起され、かつ非常に短い励起期間を有する染料分子は、刺激光をほとんど「見ず」、したがって、誘導放出によって脱励起される見込みがほとんどない。より長い寿命を有する染料分子は、より多くの刺激光を「見る」ので、したがって、より効果的に脱励起される。したがって、ＣＷ ＳＴＥＤ方法はまた、解像度の改善に寄与するが、最初に言及した染料分子は、解像度における劣化を引き起こす。
【００２８】
励起光が連続的に照射されるので、前述の２つの場合の混合が常に存在する。したがって、解像度は、確かに向上されるが、しかし理想的な方法においてではなく、最適からは程遠い。
【００２９】
けれども別のＳＴＥＤ方法があり、それは「ゲートＳＴＥＤ」として知られている。これに関して、非特許文献１１および非特許文献１２が参照される。ゲートＳＴＥＤ方法は、最初に言及した２つのＳＴＥＤ方法の組み合わせである。励起光が、短パルスで照射されるのに対して、刺激光は、連続的に照射される。
【００３０】
「悪い」光子、すなわち励起パルスの直後に放出される光子の検出を防ぐために、これらの光子の全てが拒絶される。これは、例えば、短期間にわたって検出器を作動させないことによってか、またはこの期間中に検出器の信号を処理しないことによって達成してもよい。ある時間が励起パルス後に経過した後で放出された光子だけを検出することによって、これらの光子が、実際に、解析用の望ましい光子、すなわち励起光分布の中央から来る（この場合に、刺激光は全く照射されない）光子であって、さらに高解像度に寄与する光子であることを保証することができる。したがって、全ての他の分子、すなわち励起光分布のまさに中央の外の分子は、ＳＴＥＤ光を十分に長く「見て」おり、その結果、それらは、脱励起されている可能性が高く、光子を放出しない。
【００３１】
実際に、ゲートＳＴＥＤ方法は、有利であると分かった。なぜなら、それは、刺激光を生成するために、比較的安価で信頼できるＣＷレーザの使用を可能にするからである。しかしながら、この方法でもまた、励起光用に高価な短パルスレーザを使用しなければならない。これは、特に費用圧力の増加を考慮すると不利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】ＤＥ ４４ １６ ５５８ Ｃ２
【特許文献２】ＤＥ １０３ １３ １３８ Ｂ４
【非特許文献】
【００３３】
【非特許文献１】Stefan W．Hell，Marcus Dyba and Stefan Jakobs：Concepts for nanoscale resolution in fluorescence microscopy．Current Opinion in Neurobiology ２００４，１４：ｐｐ．５９９−６０９
【非特許文献２】Stefan W．Hell：Microscopy and its focal switch．Special Features Perspective，Vol．６ Ｎｏ．１，January ２００９，Nature Methods
【非特許文献３】Stefan W．Hell，Jan Wichmann：Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission：stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy．In：Optics Letters．１９，Ｎｏ．１１，１９９４，ｐｐ．７８０−７８２
【非特許文献４】Thomas A．Klar，Stefan W．Hell：Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy．In：Optics Letters．Vol．２４，Ｎｏ.１４，１９９９，ｐｐ．９５４−９５６
【非特許文献５】Volker Dose：Peer review．In：EPL，A Letters Journal Exploring the Frontiers of Physics．Vol．８９，２００９
【非特許文献６】Stefan W．Hell M．Kroug：Ground-state-depletion fluorescence microscopy：a concept for breaking the diffraction resolution limit．In：Applied Physics B：Lasers and Optics．Vol．６０，Ｎｏ．５，１９９５，ｐｐ．４９５−４９７
【非特許文献７】Stefan Bretschneider，Christian Eggeling，Stefan W．Hell：Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving．In：Physical Review Letters．Vol．９８，Ｎｏ．５，２００７，ｐ．２１８１０３
【非特許文献８】D．H．Kim and J．U．Kang：Upconversion microscopy for biological applications，Microscopy：Science，Technology，Applications and Education，pp．５７１−５８２
【非特許文献９】Hell，S．W．，“Far-Field Optical Nanoscopy”，Science，３１６，２００７
【非特許文献１０】Hell，S．W．，“Far-Field Optical Nanoscopy”，Single Molecule Spectroscopy in Chemistry，Physics and Biology，Springer Verlag，２０１０
【非特許文献１１】Vicidomini，G．，et．al．，Nature Methods，８（７），２０１１
【非特許文献１２】Moffitt，Ｊ Ｒ，et．al．，Optics Express，１９（５），２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
したがって、本発明の目的は、十分な高解像度で確実にＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法を実行できるようにする、ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法における照明および検出用の方法および装置の両方を提供することである。コストは、特に、必要とされる光源に関して、可能な限り低く保つべきである。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
前述の目的は、独立請求項１および６の特徴構成によって達成される。
【００３６】
請求項１の特徴構成によれば、本発明の方法は、励起光がパルスで照射され、励起光のパルスが、１５０ピコ秒より長く、励起状態の寿命より短いか１０ナノ秒より短く、スイッチング光がパルスで照射される場合に、スイッチング光が、励起光のパルス中にサンプルに送出されず、かつ励起光のパルス中にサンプルから来る全ての光子が、検出および解析から拒絶され、刺激パルスの活性化時か、その直後に、サンプルから来る光子が検出および解析され、あるいはスイッチング光が連続的に照射される場合に、スイッチング光が、励起光のパルス中に既にサンプルに送出され、かつ励起光のパルス中にサンプルから来る全ての光子が、励起光（４）が照射されている限り拒絶され、励起光（４）のパルスの終了時か、その直後に、サンプルから来る光子が検出および解析されること、を特徴とする。
【００３７】
本発明による装置に関して、目的は、独立請求項６の特徴構成によって達成される。これらの特徴構成によれば、本発明の装置は、励起光のためのパルス光源が、１５０ピコ秒より長いパルス期間でかつ励起状態の寿命より短いか１０ナノ秒より短いパルス期間のパルスを有する励起光を生成し、スイッチング光（５）がパルスで照射される場合に、スイッチング光（５）が、励起光（４）のパルス中にサンプルに送出されず、かつ励起光のパルス中にサンプルから来る全ての光子が、検出および解析から拒絶され、刺激パルスの活性化時か、その直後に、サンプルから来る光子が検出および解析され、あるいはスイッチング光が連続的に照射される場合に、スイッチング光が、励起光のパルス中に既にサンプルに送出され、かつ励起光（４）のパルス中にサンプルから来る全ての光子が、励起光が照射されている限り拒絶され、励起光のパルスの終了時か、その直後に、サンプルから来る光子が検出および解析されること、を特徴とする。
【００３８】
本発明によれば、改善された方法で励起光をパルスで照射することと、これに関連して、励起光パルスを有利な時間範囲内に維持すること、すなわち１５０ピコ秒より長く、最大数ナノ秒のパルスを画定することと、が可能であることが分かった。これによって、安価なレーザ光源の使用が可能になる。
【００３９】
驚いたことに、信号フィルタの適切な実行を仮定すると、非常に高価な光源によってのみ生成できる短い励起パルスを用いる必要性がないことが分かった。それとは全く反対に、かかる短い励起パルスは、不利である。したがって、先行技術において普通に用いられるような、通常は１５０ピコ秒未満の短いパルス長よりも長いパルスを照射することが適切であり、特に有利である。有利なことに、励起パルスの期間は、数百ピコ秒〜数ナノ秒の範囲であってもよい。特に、励起パルスの長さは、励起光によって放出へ励起される、サンプルの染料分子における蛍光状態の寿命（半減期）にほぼ対応してもよい。非常に驚いたことに、この特徴は、信号の増加およびまた解像度の改善につながる。
【００４０】
本発明によって実現されるように、励起光におけるパルス長の差は、信号の改善だけでなく、励起光源に関する著しい技術的単純化につながる。例えば、数ナノ秒〜数ピコ秒の範囲におけるパルス長は、安価な手段を用いて、すなわち、１５０ピコ秒未満のパルス長のための光源よりもはるかに安価な適切な光源によって実現することができる。
【００４１】
さらに、本発明の教示によれば、励起パルスの光強度は、先行技術から周知の短パルス励起に要求されるようには、鋭い立ち上がりエッジを示す必要はない。有利なことに適度に急勾配であるべきなのは励起パルスの降下エッジだけである。したがって、非対称パルスが可能かつ適切であり、それによって、励起光パルスを生成するための光源に関するさらなる技術的単純化が可能になる。
【００４２】
その理由は、光の高速遮断、すなわち、光パルスの鋭い降下エッジの生成が、例えば電力供給の極性を急速に反転させることによってなど、単純な手段で達成できるのに対して、光強度における急勾配の立ち上がりは、多くのレーザにおいて問題が多いからである。本発明の教示によれば、光強度におけるかかる急勾配の立ち上がりの必要はない。これは、光源に関してコスト削減に寄与する別の点である。
【００４３】
この時点で、本発明が、パルス刺激光源（ＳＴＥＤ光源）およびＣＷ刺激光源（ＣＷ ＳＴＥＤ光源）の両方に適していることに留意されたい。
【００４４】
刺激光（ＳＴＥＤ光）がパルスで照射される場合に、刺激光が、励起光パルス中にサンプルに送出されないことが特に有利である。この段階において、サンプルから来る全ての光子は、検出および解析から拒絶される。刺激パルスの活性化時に、またはその直後に、サンプルから来る光子は、検出および解析される。
【００４５】
本発明の教示によれば、先行技術とは異なり、励起光は、励起された蛍光状態の寿命のほぼ半減期に対応する、より長いパルスで照射される。励起光がパルスシステムからの光なので、刺激光源は、この時点では活性でない。すなわち、刺激光は、照射されない。先行技術と異なり、励起期間中に放射される全ての光子は、拒絶される。それらは、いわゆる「ゲーティング期間」内に入る。その理由は、これらの光子が、中央からだけではなく、全励起領域から来るからである。ゲーティング期間が不活性化され、かつ光子を検出できるのは、刺激光パルスが活性である場合か、または刺激光パルスの活性化の直後だけである。その場合には、これらの光子は、希望通りに、もっぱら励起光分布の中央から来る可能性が高い。
【００４６】
本発明の方法は、先行技術に勝る、次のような利点を有する。すなわち、製造が簡単で安価な長パルス励起光源を使用することが、その非常に単純化された制御エレクトロニクスおよび非常にコスト効率の良いレーザ光源を使用できる可能性ゆえに、本発明の方法によって可能になるという利点を有する。
【００４７】
先行技術に勝る別の利点は、励起期間がより長く、したがって、より多くの光子が検出器に達するということに存在する。励起パルスが、染料分子の励起状態における寿命のほぼ半減期に対応し得るので、励起パルスのまさに最初に励起された著しい数の分子が、ゲーティング段階の終了後に放出し、かつ使用可能である。多数の使用可能な光子が、ゲーティング段階の終了後まで放出されず、その結果、それらもまた検出することができる。励起光の中央部で励起される分子から、さらに多数の光子を検出することができる。励起パルスのまさに終わりに放出される光子もまた、使用可能である。
【００４８】
先行技術では多くの光子が拒絶されることになるが、本発明により、多くの追加の光子を用いて、よりよい信号を生成することが可能になる。
【００４９】
前述のように、本発明による方法はまた、刺激光が連続的に照射される場合、すなわち、いわゆるＣＷ ＳＴＥＤ方法に従って用いることができる。ここでは、刺激光が、励起光のパルス中に既にサンプルに送出されることが重要である。この段階において、サンプルから来る全ての光子は、励起光が照射されている限りは拒絶される。励起パルスの終了時に、またはその直後に、サンプルから来る光子は、検出および解析される。
【００５０】
ＣＷ  ＳＴＥＤ方法の場合に、光子が検出されない期間は、励起光が、励起パルスの終了後のある期間まで照射される期間を超えて延びる。このように、励起パルスの終了まで励起されない分子もまた、それらが刺激光を十分に長く「見る」ので、長い時間にわたって用いることができる。
【００５１】
有利なことに、本発明の教示は、様々な方法で具体化および改善することが可能である。この点において、一方では請求項１に従属する請求項が参照され、他方では先行技術、および図面を参照する本発明の２つの好ましい例示的な実施形態の以下の説明が参照される。図面に関連する本発明の好ましい例示的な実施形態の説明と共に、教示の一般的に好ましい実施形態および改善の説明がまた提示される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】先行技術によるパルスＳＴＥＤ方法における励起光パルスおよび刺激光パルスの強度時間プロファイルを概略的に示す図である。
【図２】先行技術によるＣＷ ＳＴＥＤ方法における励起光および刺激光の強度時間プロファイルを概略的に示す図である。
【図３】先行技術によるゲートＳＴＥＤ方法における励起光パルスおよび刺激光の強度時間プロファイルを概略的に示す図である。
【図４】本発明の方法が、パルス励起光およびパルス刺激光を使用するパルスＳＴＥＤ方法において用いられる場合のための励起光パルスおよび刺激光パルスの強度時間プロファイルを概略的に示す図である。
【図５】本発明の方法が、パルス励起光および連続刺激光を使用するＣＷ ＳＴＥＤ方法において用いられる場合のための励起光パルスおよび刺激光の強度時間プロファイルを概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
図１は、先行技術から周知のパルスＳＴＥＤ方法、ならびに特に励起光パルス１およびＳＴＥＤパルス（刺激光パルス）２の時間プロファイルを簡略図で示す。
【００５４】
励起光パルス１に関しては、それが、染料分子の励起状態の寿命と比較して短いことが不可欠である。このパルスがより長い場合に、刺激光パルス２のパルスは、励起光パルスの最初に既に励起されている分子にとって遅すぎることになろう。その場合には、かかる分子は、それらの蛍光発光が刺激光パルス２によって抑制される前に、光を放出ことになり、それは、貧弱な解像度に帰着することになろう。
【００５５】
参照数字３によって示す曲線は、刺激光が照射されない場合には発生するであろう蛍光減衰を示す。
【００５６】
図２の図は、別の先行技術の変形、すなわちＣＷ ＳＴＥＤ方法を示す。ここでは、励起光４も刺激光５（ＳＴＥＤ光）もパルス化されない。もっと正確に言えば、ここでは、励起は、連続的に実行される。すなわち、光は、連続的に照射される。
【００５７】
図３の図は、先行技術によるいわゆるゲートＳＴＥＤ方法を示す。ここでは、刺激光５が、連続的に照射されるのに対して、励起光４は、励起光パルス１と呼ばれる短パルスで照射される。参照数字６は、それぞれの拒絶期間、すなわち拒絶された光子を示す。曲線３は、刺激光が照射されない場合に発生するであろう蛍光減衰を示す。
【００５８】
図４の図は、本発明によるパルス刺激光５用の関係を示す。
【００５９】
図１に示す先行技術とは対照的に、励起光４は、励起された蛍光状態における寿命のほぼ半減期に対応する、より長い励起光パルス１で照射される。図４に示すシステムがパルスシステムなので、励起光４が活性化された時点では、刺激光またはＳＴＥＤ光５は活性ではない。励起期間中に照射された全ての光子は、斜線エリア６によって示されるように拒絶される。それらは、拒絶された「ゲーティング期間」内に入る。その理由は、これらの光子が、励起光スポットの中央からだけではなく、全励起領域から来るからである。ゲーティング期間６が不活性化され、かつ光子が検出され得るのは、刺激光パルス２が活性である場合かまたは刺激光パルス２の活性化の直後だけである。そのとき、これらの光子は、希望通りに、もっぱら励起光分布の中央から来る可能性が高い。
【００６０】
長パルス励起光源を用いて励起光４または励起光パルス１を生成することができ、長パルス励起光源が、その非常に単純な制御エレクトロニクス、およびコスト効率の良いレーザ光源を使用できる可能性ゆえに安価であることは、先行技術に勝る利点である。
【００６１】
図１に示す先行技術に勝る別の利点は、励起期間がより長く、したがって、先行技術において可能であるより多くの光子が検出器に達するということに存在する。励起光パルス１が、染料分子の励起状態における寿命の半減期に対応し得るので、励起光パルスのまさに最初においてさえ励起される著しい数の分子が、ゲーティング期間６の終了後に、やはり光子を放出する。これは、曲線７によって示されているが、曲線７は、励起光パルス１の最初に励起される分子からの光子放出の可能性を表す。多数の光子が、ゲーティング期間６の終了後まで放出されず、その結果、それらもまた検出される。一層多数の光子を、励起光パルス１の中央部において励起された分子から検出することができる。これは、曲線８によって示されている。曲線９は、励起光パルス１のまさに終了まで励起されない染料分子の放出期間を表す。これは、先行技術において励起されることになる全ての分子に対応する。したがって、先行技術は、本発明が教示するような、よりよい信号用に使用可能な多くの光子を拒絶する。
【００６２】
図５の図は、ＣＷ ＳＴＥＤ方法用に用いられる本発明の方法の別の例示的な実施形態を示す。ここでは、励起光は、図４の例示的な実施形態におけるようにパルス化される。ＳＴＥＤ光または刺激光５は、連続的に照射される。
【００６３】
曲線７、８および９は、刺激光が照射されない場合に発生するであろう蛍光減衰を示す。
【００６４】
また、図５において、斜線エリアは、光子が検出されない拒絶期間６を表す。この期間は、励起光４が、励起光パルス１の終了後のある期間まで照射される期間を超えて延びる。これが必要なのは、励起光パルスの終了まで励起されない分子がまた、ＳＴＥＤ光または刺激光５を十分に長く「見なければならない」からである。
【００６５】
用語「ＲＥＳＯＬＦＴ」の下に包摂される特定の方法にかかわらず、本発明による方法および装置の両方が、一般的なＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法に関することにもう一度特に留意されたい。ここで重要なことは、方法が、光顕微鏡法、すなわち解像限界が克服される、言い換えれば染料分子の写真光学的にスイッチング可能または制御可能な状態を用いる光顕微鏡法であるということである。
【００６６】
本発明による方法および装置のさらなる有利な実施形態に関して、かつ反復を避けるために、説明の一般的部分および添付の特許請求の範囲が参照される。
【００６７】
最後に、上記の例示的な実施形態が、単に、特許請求される教示を示すように意図され、その教示をかかる実施形態に限定するようには意図されていないことに特に留意されたい。
【符号の説明】
【００６８】
１  励起光パルス
２  刺激光パルス、ＳＴＥＤパルス
３  曲線
４  励起光
５  スイッチング光
６  拒絶期間、ゲーティング期間、斜線エリア
７  曲線
８  曲線
９  曲線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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