(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経疾患または神経障害を対象において処置するために有用である星状膠細胞の集団をエクスビボで作製する方法であって、外因性ｍｉＲ−１０１をＭＳＣの集団において発現させ、かつ、ｍｉＲ−１３８のＭＳＣの前記集団における発現をダウンレギュレーションし、それにより、前記星状膠細胞の集団を作製することを含む方法。
【請求項２】
前記ＭＳＣが、骨髄、脂肪組織、胎盤、臍帯血および臍帯からなる群から選択される組織から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＳＣは前記対象に対して自己である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＳＣは前記対象に対して非自己である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＳＣは前記対象に対して半同種である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記発現することが、前記ＭＳＣを、前記ｍｉＲ−１０１をコードするかまたは前記ｍｉＲ−１０１のプレ−ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターによりトランスフェクションすることによって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ダウンレギュレーションすることが、前記ＭＳＣを、前記ｍｉＲ−１３８にハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害するポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターによりトランスフェクションすることによって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲ−１３８にハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害するポリヌクレオチド配列が、ｍｉＲ−１３８に対するａｎｔａｇｏｍｉＲである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＧＦＡＰ、ＥＡＡＴ１およびＥＡＡＴ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの増大した発現を前記作製することの後において確認することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現の後、前、または前記接触と同時に、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ニューレグリン、ＦＧＦ−ｂおよびｃ−ＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される少なくとも１つの作用因子を含む分化培地において前記ＭＳＣをインキュベーションすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
外因性ｍｉＲ−１０１を含み、およびｍｉＲ−１３８にハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害するポリヌクレオチド作用因子を含む、間葉系幹細胞の遺伝子改変され単離された集団であって、前記細胞が星状膠細胞の表現型を有する、遺伝子改変され単離された細胞集団。
【請求項１２】
前記細胞集団の細胞の少なくとも５０％が、ＧＦＡＰ、ＥＡＡＴ１およびＥＡＡＴ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、請求項１１に記載の単離された細胞集団。
【請求項１３】
脳疾患または脳障害を処置するための医薬の製造における、請求項１１に記載の単離された細胞集団の使用。
【請求項１４】
前記脳疾患または脳障害が神経変性障害である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記神経変性障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レット症候群、自己免疫性脳脊髄炎、卒中、アルツハイマー病、骨髄および脳の傷害、およびハンチントン病からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１１または１２に記載される単離された細胞集団と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１７】
神経疾患または神経障害の処置において使用するためのものである、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記神経疾患または神経障害は神経変性障害である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記神経変性障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レット症候群、自己免疫性脳脊髄炎、卒中、アルツハイマー病、骨髄および脳の傷害、およびハンチントン病からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１２年２月２２日に出願した米国特許仮出願第６１／６０１６２４号（参照として本明細書中にそれらの全体が援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、間葉系幹細胞を、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を使用して星状膠細胞に向かってエクスビボ分化させる方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪、臍帯、胎盤および血管周囲の組織を含むほとんどの結合組織に存在する、多数の種から単離することができる間質細胞の不均一な集団である。ＭＳＣはまた、胎盤および臍帯ワルトンゼリーからも単離することができる。
【０００４】
骨髄および脂肪組織を含むすべての組織におけるＭＳＣの濃度は非常に低いが、ＭＳＣの数をインビトロで拡大させることができる。典型的には、１５回までの継代培養を使用するＭＳＣの拡大では、遺伝的安定性を示す変異が生じていない。ＭＳＣは間葉系譜の細胞（例えば、骨、軟骨および脂肪など）に分化することができ、しかし、ある種の条件のもとでは、内胚葉系譜および神経外胚葉系譜の細胞の表現型を獲得することが報告されており、このことは「分化転換」のための何らかの潜在的能力を示唆している。
【０００５】
骨髄区画内において、これらの細胞はしっかりと混じり合い、造血および造血幹細胞の生存を黙従的状態において支援する（７）。加えて、培養における拡大の後において、ＭＳＣは、自然免疫および適応免疫を調節するその能力を保持する（８）。さらに、ＭＳＣは炎症部位に能動的に遊走し、ＣＮＳを含む損傷を受けた組織を保護する。これらは、自己免疫障害を含む炎症性疾患および免疫媒介疾患を処置するための、免疫抑制性の、正確に言えば、免疫調節性または抗炎症性の新しい作用因としてのその使用を裏付けた性質である（９）。ＭＳＣのこれらの特徴は、同種骨髄移植の後における命を脅かす移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を抑制するためのその使用、したがって、同種骨髄移植の非常に重篤な合併症の１つを抑制し、これにより、多臓器傷害を伴う移植関連の毒性および死亡を低下させることを助けるに値した（１０）。
【０００６】
いくつかの研究では、種々の因子にインビトロでさらされた後のＭＳＣがその表現型を変化させ、ニューロンおよびグリアのマーカーを明らかにすることが示されている［Ｋｏｐｅｎ，Ｇ．Ｃ．他，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＵＳＡ．９６（１９）：１０７１１−６，１９９９；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．１６４（２）：２４７−５６．２０００；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．６１（４）：３６４−７０，２０００；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．他，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．６９（６）：９０８−１７，２００２；Ｂｌａｃｋ，Ｉ．Ｂ．，Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ．２７（３）：６３２−６，２００１；Ｋｏｈｙａｍａ，Ｊ．他  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．６８（４−５）：２３５−４４，２００１；Ｌｅｖｙ，Ｙ．Ｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１（２）：１２１−３２，２００３］。
【０００７】
したがって、ＭＳＣ（エクスビボ分化ＭＳＣおよび非分化の両方）が、多発性硬化症、パーキンソン病、ＡＬＳ、アルツハイマー病、脊髄傷害および卒中を含む様々な神経学的障害を処置するための細胞置換療法のための候補物として提案されている。
【０００８】
ニューロン細胞置換戦略に代わるものとして、存在する機能的かつ形態学的に正常な細胞の生存を増大させるために、細胞治療は、疾患組織または損傷組織の正常な解剖学（例えば、結合性）および生理学（例えば、適切なシナプス接合ならびに機能する神経伝達物質および神経調節因子）を回復するか、または再建することを目的とする場合がある。
【０００９】
星状膠細胞は、中枢神経系に最も豊富に存在するタイプのグリア細胞であり、大きな役割を脳の発達および正常な生理学的機能において果たしている。成熟型星状膠細胞は、線維性星状膠細胞および原形質性星状膠細胞の２つのタイプに分けられる。線維性星状膠細胞は白質に存在しており、典型的には、中間径フィラメントマーカーのグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）により染色することができる密集したグリアフィラメントを伴う「星様」外観を有する。原形質性星状膠細胞は灰白質に見出され、より不規則な「モジャモジャ状」突起を有し、典型的にはグリアフィラメントをほとんど有していない。これらの細胞は互いに接触し合い、薄い突起を鞘で覆い、一部は血管と接触する。
【００１０】
星状膠細胞はまた、水分平衡、酸化還元電位、ならびに、イオンおよび神経伝達物質の濃度を調節し、神経栄養因子を分泌し、毒素および残骸を脳脊髄液（ＣＳＦ）から除き、かつ、血液脳関門を維持する。星状膠細胞はまた、カルシウム流を調節し、ｄ−セリンを放出し、神経ペプチドを産生し、かつ、シナプス伝達を調節することによって細胞−細胞のシグナル伝達に関与する。
【００１１】
星状膠細胞は構造的および生理学的な支援を中枢神経系において提供するので、ＭＳＣを星状膠細胞系譜に向かって分化させることが、神経学的障害を処置するために提案されている。
【００１２】
グリア細胞（乏突起膠細胞および星状膠細胞）、神経芽細胞腫細胞株および神経膠芽細胞腫細胞株を含む様々な細胞タイプがＧＤＮＦを産生する。２０％ウシ胎児血清が補充されるＤＭＥＭで培養されるラットＢＭＳＣが６回目の継代において、ＧＤＮＦおよびＮＧＦを発現することが示されている［Ｇａｒｃｉａ  Ｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、３１６（３）：７５３〜４、２００４］。
【００１３】
国際特許出願公開ＷＯ２００６／１３４６０２および同ＷＯ２００９／１４４７１８は、神経栄養因子を産生する細胞への間葉系幹細胞の分化を教示する。
【００１４】
国際特許出願公開ＷＯ２０１０／１１１５２２は、疾患を処置するためにミクロＲＮＡを分泌し、また送達する間葉系幹細胞を教示する。
【００１５】
国際特許出願公開ＷＯ２０１０／１４４６９８は、そのニューロン分化を誘導するための間葉系幹細胞におけるｍｉＲＮＡの発現を教示する。
【００１６】
国際特許出願番号ＩＬ２０１１／０００６６０は、その乏突起膠細胞分化を誘導するための間葉系幹細胞におけるｍｉＲＮＡの発現を教示する。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経疾患または神経障害を対象において処置するために有用である細胞の集団を作製する方法であって、ｍｉＲ−１２９３，ｍｉＲ−１８，ｍｉＲ−１１８２，ｍｉＲ−１１８５，ｍｉＲ−１２７６，ｍｉＲ−１７−５ｐ，ｍｉＲ−１４１，ｍｉＲ−３０２ｂ，ｍｉＲ−２０ｂ，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１４６ａ，ｍｉＲ−１４６ｂ，ｍｉＲ−３ａ，ｍｉＲ−２９，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−８９１，ｍｉＲ−８７４およびｍｉＲ−１３２からなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるレベルをアップレギュレーションし、それにより、前記神経疾患または神経障害を処置するために有用である前記細胞集団を作製することを含む方法が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経疾患または神経障害を対象において処置するために有用である細胞の集団を作製する方法であって、ｍｉ−Ｒ−１９３ｂ，ｍｉ−Ｒ−１２３８，ｍｉＲ−８８９，ｍｉ−Ｒ−３７０，ｍｉ−Ｒ−５４８−ｄ１，ｍｉ−Ｒ−２２１，ｍｉ−Ｒ−１３５ａ，ｍｉ−Ｒ−１４９，ｍｉ−Ｒ−２２２，ｍｉ−Ｒ−１９９ａ，ｍｉ−Ｒ−３０２ａ，ｍｉＲ−３０２ｂ，ｍｉ−Ｒ−３０２ｃ，ｍｉ−Ｒ−３０２ｄ，ｍｉ−Ｒ−３６９−３ｐ，ｍｉ−Ｒ−ｌｅｔ７ａ，ｍｉ−Ｒ−ｌｅｔ７ｂ，ｍｉ−Ｒ−１０ｂ，ｍｉ−Ｒ−２３ａ，ｍｉ−Ｒ−２３ｂ，ｍｉ−Ｒ−１３８，ｍｉ−Ｒ−１８２，ｍｉ−Ｒ−４８７，ｍｉ−Ｒ−２１４，ｍｉ−Ｒ−４０９，ｍｉＲ−１３３，ｍｉＲ−１４５およびｍｉ−Ｒ−３２からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現をダウンレギュレーションし、それにより、前記神経疾患または神経障害を処置するために有用である前記細胞集団を作製することを含む方法であって、前記ダウンレギュレーションすることが、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡにハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因のレベルをアップレギュレーションすることによって実行される方法が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経疾患または神経障害を対象において処置するために有用である細胞の集団を作製する方法であって、外因性ｍｉＲ−９および外因性ｍｉＲ−２０ｂのＭＳＣの集団におけるレベルをアップレギュレーションし、それにより、前記細胞集団を作製することを含む方法が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経疾患または神経障害を対象において処置するために有用である細胞の集団を作製する方法であって、外因性ｍｉＲ−９、外因性ｍｉＲ−１４６および外因性ｍｉＲ−１０１のＭＳＣの集団におけるレベルをアップレギュレーションし、かつ、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−３０２のＭＳＣの前記集団における発現をダウンレギュレーションし、それにより、前記細胞集団を作製することを含む方法が提供される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経疾患または神経障害を対象において処置するために有用である細胞の集団を作製する方法であって、外因性ｍｉＲ−１０１のＭＳＣの集団におけるレベルをアップレギュレーションし、かつ、ｍｉＲ−１３８のＭＳＣの前記集団における発現をダウンレギュレーションし、それにより、前記細胞集団を作製することを含む方法が提供される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１８，ｍｉＲ−１７−５ｐ，ｍｉＲ−１４１，ｍｉＲ−３０２ｂ，ｍｉＲ−２０ｂ，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１４６ａ，ｍｉＲ−１４６ｂ，ｍｉＲ−９，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−８９１，ｍｉＲ−８７４，ｍｉＲ−１１８２，ｍｉＲ−１１８５，ｍｉＲ−１２７６，ｍｉＲ−１２９３およびｍｉＲ−１３２からなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡを含み、および／または、ｍｉ−Ｒ−１９３ｂ，ｍｉ−Ｒ−２２１，ｍｉ−Ｒ−１３５ａ，ｍｉ−Ｒ−１４９，ｍｉ−Ｒ−２２２，ｍｉ−Ｒ−１９９ａ，ｍｉ−Ｒ−３０２ａ，ｍｉ−Ｒ−３０２ｃ，ｍｉ−Ｒ−３０２ｄ，ｍｉ−Ｒ−３６９−３ｐ，ｍｉ−Ｒ−３７０，ｍｉ−Ｒ−ｌｅｔ７ａ，ｍｉ−Ｒ−ｌｅｔ７ｂ，ｍｉ−Ｒ−１０ｂ，ｍｉ−Ｒ−２３ａ，ｍｉ−Ｒ−２３ｂ，ｍｉ−Ｒ−１３８，ｍｉ−Ｒ−１８２，ｍｉ−Ｒ−４８７，ｍｉ−Ｒ−２１４，ｍｉ−Ｒ−４０９，ｍｉ−Ｒ−５４８−ｄ１，ｍｉ−Ｒ−８８９，ｍｉ−Ｒ−１２３８およびｍｉ−Ｒ−３２からなる群から選択されるｍｉＲＮＡにハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因を含む、細胞の遺伝子改変され単離された集団であって、前記細胞が星状膠細胞の表現型を有する、遺伝子改変され単離された細胞集団が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経疾患または神経障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、本明細書中に記載される単離された細胞集団の治療効果的な量を前記対象に投与し、それにより、前記神経疾患または神経障害を処置することを含む方法が提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に記載される単離された細胞集団と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経疾患または神経障害の処置のために調節され得るｍｉＲＮＡを選択する方法であって、
（ａ）ＭＳＣの集団を星状膠細胞の表現型に向かって分化させること；および
（ｂ）ＭＳＣの集団におけるｍｉＲＮＡの発現における変化を、前記ＭＳＣを星状膠細胞の表現型に向かって分化させる前および分化させた後において分析すること（ただし、所定のレベルを越えるか、または下回るｍｉＲＮＡの発現の変化により、前記ｍｉＲＮＡが前記神経疾患または神経障害の処置のために調節され得ることが示される）
を含む方法が提供される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経疾患または神経障害を対象において処置するために有用である細胞の集団を作製する方法であって、表１に示される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるレベルをアップレギュレーションし、それにより、前記神経疾患または神経障害を処置するために有用である前記細胞集団を作製することを含む方法が提供される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経疾患または神経障害を対象において処置するために有用である細胞の集団を作製する方法であって、表２に示される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるレベルをダウンレギュレーションし、それにより、前記神経疾患または神経障害を処置するために有用である前記細胞集団を作製することを含む方法が提供される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、パーキンソン病をその必要性のある対象において処置する方法であって、外因性ｍｉＲ５０４を発現するように改変されたＭＳＣの治療効果的な量を前記対象に投与し、それにより、前記パーキンソン病を処置することを含む方法が提供される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１８，ｍｉＲ−１２９３，ｍｉＲ−１１８２，ｍｉＲ−１１８５およびｍｉＲ−１２７６からなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡを含み、および／または、ｍｉ−Ｒ−１９３ｂ，ｍｉ−Ｒ−１２３８，ｍｉＲ−８８９，ｍｉ−Ｒ−３７０およびｍｉ−Ｒ−５４８−ｄ１からなる群から選択されるｍｉＲＮＡにハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因を含む、細胞の遺伝子改変され単離された集団であって、前記細胞が星状膠細胞の表現型を有する、遺伝子改変され単離された細胞集団が提供される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１２９３、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１１８５およびｍｉＲ−１２７６からなる群から選択される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１０１およびｍｉＲ−１４１からなる群から選択される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−３０２ａおよびｍｉＲ−３０２ｂからなる群から選択される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉ−Ｒ−１９３ｂ、ｍｉ−Ｒ−１２３８、ｍｉＲ−８８９、ｍｉ−Ｒ−３７０およびｍｉ−Ｒ−５４８−ｄ１からなる群から選択される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−１０１およびｍｉＲ−１４６ａのそれぞれを含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＭＳＣが、骨髄、脂肪組織、胎盤、臍帯血および臍帯からなる群から選択される組織から単離される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＭＳＣは上記対象に対して自己である。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＭＳＣは上記対象に対して非自己である。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＭＳＣは上記対象に対して半同種である。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記アップレギュレーションすることは、上記ＭＳＣに上記ｍｉＲＮＡを導入することを含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記アップレギュレーションすることが、上記ＭＳＣを、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡのプレ−ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターによりトランスフェクションすることによって実行される。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記アップレギュレーションすることが、上記ＭＳＣを、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターによりトランスフェクションすることによって実行される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、Ｓ１００，ＧＦＡＰ、グルタミンシンセターゼ、ＥＡＡＴ１およびＥＡＡＴ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を上記作製することの後において分析することを含む。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はインビボで実行される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はエクスビボで実行される。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記接触の後、前、または接触と同時に、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ニューレグリン、ＦＧＦ−ｂおよびｃ−ＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される少なくとも１つの作用因を含む分化培地において上記ＭＳＣをインキュベーションすることを含む。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞集団の少なくとも５０％が、Ｓ１００，ＧＦＡＰ、グルタミンシンセターゼ、ＥＡＡＴ１およびＥＡＡＴ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された細胞集団は、脳疾患または脳障害を処置することにおいて使用するためのものである。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患または脳障害は、神経変性障害である。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経変性障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、レット症候群、自己免疫性脳脊髄炎、卒中、アルツハイマー病およびハンチントン病からなる群から選択される。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経疾患または神経障害は神経変性障害である。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経変性障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、レット症候群、自己免疫性脳脊髄炎、卒中、アルツハイマー病およびハンチントン病からなる群から選択される。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、工程（ａ）の後、工程（ｂ）に先立って、星状膠細胞特異的遺伝子の発現を分析することを含む。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記星状膠細胞特異的遺伝子はＧＦＡＰである。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経変性障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、レット症候群、自己免疫性脳脊髄炎、卒中、アルツハイマー病およびハンチントン病からなる群から選択される。
【００５５】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００５７】
【図１Ａ−１Ｆ】図１Ａ−１Ｆは、ＭＳＣが星状膠細胞様細胞に分化し得ることを例示する写真である。ＢＭ−ＭＳＣを分化培地とインキュベーションし、その後、位相差顕微鏡法を使用して細胞形態学について分析し、また、坑ＧＦＡＰ抗体により染色した。類似する結果が、ＡＤ−ＭＳＣに関して、また、臍帯および胎盤に由来するＭＳＣに関して得られた（データは示されず）。
【００５８】
【図２】図２は、分化ＭＳＣが星状膠細胞のマーカーを発現することを例示する棒グラフである。対照ＭＳＣおよび分化ＭＳＣを方法において記載されるように処理した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを、ＧＦＡＰ、グルタミンシンセターゼおよびＳ１００のためのプライマーを使用して行った。
【００５９】
【図３】図３は、分化ＭＳＣがグルタミン酸輸送体を発現することを例示する棒グラフである。対照ＭＳＣおよび分化ＭＳＣを方法において記載されるように処理した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを、グルタミン酸輸送体のためのプライマーを使用して行った。
【００６０】
【図４】図４は、ｍｉＲＮＡの幹細胞セットのｍｉＲＮＡシグナチャーの分析の結果を表す棒グラフである。このセットは、幹細胞シグナチャーおよび自己再生に関連するｍｉＲＮＡからなる。
【００６１】
【図５】図５は、ｍｉＲＮＡの神経セットのｍｉＲＮＡシグナチャーの分析の結果を表す棒グラフである。このセットは、神経の発達に関連するｍｉＲＮＡからなる。
【００６２】
【図６】図６は、ｍｉＲＮＡの造血セットのｍｉＲＮＡシグナチャーの分析の結果を表す棒グラフである。このセットは、造血に関連するｍｉＲＮＡからなる。
【００６３】
【図７】図７は、ｍｉＲＮＡの器官セットのｍｉＲＮＡシグナチャーの分析を表す棒グラフである。このセットは、分化組織特定に関連するｍｉＲＮＡからなる。
【００６４】
【図８】図８は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってした場合の、ＭＳＣの星状膠細胞分化の期間中における例示的ｍｉＲＮＡの発現における変化を例示する棒グラフである。
【００６５】
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ−９Ｂは、ＧＦＡＰ−ＧＦＰレポーターにより形質導入されるＢＭ−ＭＳＣの写真である。図９Ｂでは、ＭＳＣをａｎｔａｇｏｍｉＲ−１３８およびｍｉＲ−１０１の両方によりトランスフェクションした。細胞を１０日後に蛍光顕微鏡で観察した。
【００６６】
【図１０】図１０は、ｍｉＲＮＡ５０４がαシヌクレインをＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてダウンレギュレーションすることを例示する、ウエスタンブロット分析の結果の写真である（レーン１＝対照；レーン２＋３＝ｍｉＲＮＡ５０４）。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、間葉系幹細胞を、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を使用して神経幹細胞および運動ニューロンに向かってエクスビボ分化させる方法に関連する。
【００６８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
【００６９】
星状膠細胞は、中枢神経系における最も豊富に存在するタイプのグリア細胞であり、大きな役割を脳の発達および正常な生理学的機能において果たしている。成熟型星状膠細胞は、線維性星状膠細胞および原形質性星状膠細胞の２つのタイプに分けられる。線維性星状膠細胞は白質に存在しており、典型的には、中間径フィラメントマーカーのグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）により染色することができる密集したグリアフィラメントを伴う「星様」外観を有する。原形質性星状膠細胞は灰白質に見出され、より不規則な「モジャモジャ状」突起を有し、典型的にはグリアフィラメントをほとんど有していない。これらの細胞は互いに接触し合い、薄い突起を鞘で覆い、一部は血管と接触する。
【００７０】
星状膠細胞はまた、水分平衡、酸化還元電位、ならびに、イオンおよび神経伝達物質の濃度を調節し、神経栄養因子を分泌し、毒素および残骸を脳脊髄液（ＣＳＦ）から除き、かつ、血液脳関門を維持する。星状膠細胞はまた、カルシウム流を調節し、ｄ−セリンを放出し、神経ペプチドを産生し、かつ、シナプス伝達を調節することによって細胞−細胞のシグナル伝達に関与する。
【００７１】
星状膠細胞は構造的および生理学的な支援を中枢神経系において提供するので、星状膠細胞表現型を有する細胞を作製することが、神経学的障害を処置するために提案されている。
【００７２】
本発明を実施に移している間に、本発明者らは、膨大な数の潜在的なミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の中から、ｍｉＲ−１８，ｍｉＲ−１７−５ｐ，ｍｉＲ−１４１，ｍｉＲ−３０２ｂ，ｍｉＲ−２０ｂ，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１４６ａ，ｍｉＲ−１４６ｂ，ｍｉＲ−３ａ，ｍｉＲ−２６，ｍｉＲ−２９，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−８９１，ｍｉＲ−８７４，ｍｉＲ−１１８２，ｍｉＲ−１１８５，ｍｉＲ−１２７６，ｍｉＲ−１２９３およびｍｉＲ−１３２を含む特定のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションのみが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の星状膠細胞分化を誘導することを見出しており、そのような分化ＭＳＣは、脳の疾患または障害を有する患者を処置するために使用され得ることを提案する。
【００７３】
具体的には、本発明者らは、上記で列挙されるｍｉＲＮＡの特定の組合せ（例えば、ｍｉＲ−９およびｍｉＲ−２０ｂの組合せ、同様にまた、ｍｉＲ−２０ｂ、１０１および１４６ａの組合せ）によるＭＳＣのトランスフェクションが当該細胞の形態学的外観を変化させ、さらには、様々な星状膠細胞マーカーのそれらにおける発現（例えば、ＧＦＡＰ発現）を増大させたことを示している。
【００７４】
加えて、本発明者らは、ＭＳＣの星状膠細胞分化にそのダウンレギュレーションが関連するいくつかのｍｉＲＮＡを特定している。このリストには、ｍｉ−Ｒ−１９３ｂ，ｍｉ−Ｒ−２２１，ｍｉ−Ｒ−１３５ａ，ｍｉ−Ｒ−１４９，ｍｉ−Ｒ−２２２，ｍｉ−Ｒ−１９９ａ，ｍｉ−Ｒ−３０２ａ，ｍｉ−Ｒ−３０２ｃ，ｍｉ−Ｒ−３０２ｄ，ｍｉ−Ｒ−３６９−３ｐ，ｍｉ−Ｒ−３７０，ｍｉ−Ｒ−ｌｅｔ７ａ，ｍｉ−Ｒ−ｌｅｔ７ｂ，ｍｉ−Ｒ−１０ｂ，ｍｉ−Ｒ−２３ａ，ｍｉ−Ｒ−２３ｂ，ｍｉ−Ｒ−３２，ｍｉＲ−１３３，ｍｉ−Ｒ−１４５，ｍｉ−Ｒ−１３８，ｍｉ−Ｒ−１８２，ｍｉ−Ｒ−４８７，ｍｉ−Ｒ−２１４，ｍｉ−Ｒ−４０９，ｍｉ−Ｒ−５４８−ｄ１，ｍｉ−Ｒ−８８９およびｍｉ−Ｒ−１２３８が含まれる。さらに、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−３０２を阻害し、一方で、同時に、ｍｉＲ−９、１４６および１０１を過剰発現させることにより、ＧＦＡＰ発現によって測定すると、星状膠細胞表現型に向かう分化が高められたことが見出された。加えて、ｍｉＲ−１３８を阻害し、一方で、同時に、ｍｉＲ−１０１を過剰発現させることにより、ＧＦＡＰ発現によって測定すると、星状膠細胞表現型に向かう分化が高められたことが見出された。
【００７５】
したがって、本発明の１つの局面によれば、神経疾患または神経障害を対象において処置するために有用である細胞の集団を作製する方法であって、ｍｉＲ−１８，ｍｉＲ−１７−５ｐ，ｍｉＲ−１４１，ｍｉＲ−３０２ｂ，ｍｉＲ−２０ｂ，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１４６ａ，ｍｉＲ−１４６ｂ，ｍｉＲ−３ａ，ｍｉＲ−２６，ｍｉＲ−２９，ｍｉＲ−１３２，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−８９１，ｍｉＲ−８７４，ｍｉＲ−１１８２，ｍｉＲ−１１８５，ｍｉＲ−１２７６およびｍｉＲ−１２９３からなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるレベルをアップレギュレーションし、それにより、前記神経疾患または神経障害を処置するために有用である前記細胞集団を作製することを含む方法が提供される。
【００７６】
アップレギュレーションのために意図されるさらなるｍｉＲＮＡが本明細書中下記に提供される。ｍｉＲ−９２ａｐ，ｍｉＲ−２１，ｍｉＲ−２６ａ，ｍｉＲ−１８ａ，ｍｉＲ−１２４，ｍｉＲ−９９ａ，ｍｉＲ−３０ｃ，ｍｉＲ−３０１ａ，ｍｉＲ−１４５−５０，ｍｉＲ−１４３−３ｐ，ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−２０ｂ，ｍｉＲ−２９ｃ，ｍｉＲ−２９ｂ，ｍｉＲ−１４３，ｌｅｔ−７ｇ，ｌｅｔ−７ａ，ｌｅｔ−７ｂ，ｍｉＲ−９８，ｍｉＲ−３０ａ＊，ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−１，ｍｉＲ−１９２，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−５１６−ａｐ，ｍｉＲ−３１，ｍｉＲ−１８１ａ，ｍｉＲ−１８１ｂ，ｍｉＲ−１８１ｃ，ｍｉＲ−３４−ｃ，ｍｉＲ−３４ｂ＊，ｍｉＲ−１０３ａ，ｍｉＲ−２１０，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−３０ａ，ｍｉＲ−３１，ｍｉＲ−２２２，ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−１７＊，ｍｉＲ−２００ｂ，ｍｉＲ−２００ｃ，ｍｉＲ−１２８，ｍｉＲ−５０３，ｍｉＲ−４２４，ｍｉＲ−１９５，ｍｉＲ−１２５６，ｍｉＲ−２０３ａ，ｍｉＲ−１９９，ｍｉＲ−９３，ｍｉＲ−９８，ｍｉＲ−１２５−ａ，ｍｉＲ−１３３ａ，ｍｉＲ−１３３ｂ，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１９４，ｍｉＲ−３４６，ｍｉＲ−１５ｂ，ｍｉＲ−３３８−３ｐ，ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−２０５，ｍｉＲ−２１０，ｍｉＲ−１２５，ｍｉＲ−１２２６，ｍｉＲ−７０８，ｍｉＲ−４４９，ｍｉＲ−４２２，ｍｉＲ−３４０，ｍｉＲ−６０５，ｍｉＲ−５２２，ｍｉＲ−６６３，ｍｉＲ−１３０ａ，ｍｉＲ−１３０ｂ，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−５２０，ｍｉＲ−６３９，ｍｉＲ−６５４，ｍｉＲ−５１９，ｍｉｒ−２０２，ｍｉｒ−７６７−５ｐ，ｍｉｒ−２９ａ，ｍｉｒ−２９ｂ，ｍｉｒ−２９ｃ，ｌｅｔ−７ａ，ｌｅｔ−７ｂ，ｌｅｔ−７ｃ，ｌｅｔ−７ｄ，ｌｅｔ−７ｅ，ｌｅｔ−７ｆ，ｌｅｔ−７ｇ，ｌｅｔ−７ｉ，ｍｉｒ−４４５８，ｍｉｒ−４５００，ｍｉｒ−９８，ｍｉｒ−１４８ａ，ｍｉｒ−１４８ｂ，ｍｉｒ−１５２，ｍｉｒ−４６５８，ｍｉｒ−３６６２，ｍｉｒ−２５，ｍｉｒ−３２，ｍｉｒ−３６３，ｍｉｒ−３６７，ｍｉｒ−９２ａ，ｍｉｒ−９２ｂ，ｍｉｒ−５２０ｄ−５ｐ，ｍｉｒ−５２４−５ｐ，ｍｉｒ−４７２４−３ｐ，ｍｉｒ−１２９４，ｍｉｒ−１４３，ｍｉｒ−４７７０，ｍｉｒ−３６５９，ｍｉｒ−１４５，ｍｉｒ−３１６３，ｍｉｒ−１８１ａ，ｍｉｒ−１８１ｂ，ｍｉｒ−１８１ｃ，ｍｉｒ−１８１ｄ，ｍｉｒ−４２６２，ｍｉｒ−４２７９，ｍｉｒ−１４４，ｍｉｒ−６４２ｂ，ｍｉｒ−４７４２−３ｐ，ｍｉｒ−３１７７−５ｐ，ｍｉｒ−６５６，ｍｉｒ−３１２１−３ｐ，ｍｉｒ−１０６ａ，ｍｉｒ−１０６ｂ，ｍｉｒ−１７，ｍｉｒ−２０ａ，ｍｉｒ−２０ｂ，ｍｉｒ−５１９ｄ，ｍｉｒ−９３，ｍｉｒ−１２９７，ｍｉｒ−２６ａ，ｍｉｒ−２６ｂ，ｍｉｒ−４４６５，ｍｉｒ−３２６，ｍｉｒ−３３０−５ｐ，ｍｉｒ−３９２７およびｍｉｒ−２１１３。
【００７７】
アップレギュレーションのために意図されるさらなるｍｉＲＮＡは、ｍｉｒ−３７２，ｍｉｒ−３７３，ｍｉｒ−５２０ａ−３ｐ，ｍｉｒ−５２０ｂ，ｍｉｒ−５２０ｃ−３ｐ，ｍｉｒ−５２０ｄ−３ｐ，ｍｉｒ−５２０ｅ，ｍｉｒ−１９９ａ−３ｐ，ｍｉｒ−１９９ｂ−３ｐ，ｍｉｒ−３１２９−５ｐを含む。
【００７８】
アップレギュレーションがインビボまたはエクスビボで実行される場合がある。
【００７９】
間葉系幹細胞は、生物活性因子（例えば、サイトカインなど）からの様々な影響に依存して、１種以上の間葉系組織（例えば、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性結合組織および繊維性結合組織、筋芽細胞）および胚の中胚葉に起源を有する組織とは異なる組織（例えば、神経系細胞）を生じさせる。そのような細胞は、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児および思春期の皮膚、血液および他の組織から単離することができるにもかかわらず、容易に利用可能な脂肪組織およびＢＭにおけるそれらの存在量は他の組織におけるそれらの存在量をはるかに超えており、したがって、ＢＭおよび脂肪組織からの単離が現時点では好ましい。
【００８０】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離し、精製し、拡大する様々な方法が当技術分野では知られており、これらには、例えば、ＣａｐｌａｎおよびＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈによって米国特許第５４８６３５９号に開示される方法、ならびに、Ｊｏｎｅｓ  Ｅ．Ａ．他、２００２、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、４６（１２）：３３４９〜６０に開示される方法が含まれる。
【００８１】
間葉系幹細胞は、骨髄、末梢血、血液、胎盤（例えば絨毛膜および／または羊膜）、臍帯血、臍帯、羊水、および脂肪組織から単離される場合がある。
【００８２】
間葉系幹細胞を末梢血から単離する方法が、Ｋａｓｓｉｓ他［Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００６  Ｍａｙ；３７（１０）：９６７〜７６］によって記載される。間葉系幹細胞を胎盤組織から単離する方法が、Ｚｈａｎｇ他［Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００４、１１７（６）：８８２〜８８７］によって記載される。脂肪組織、胎盤および臍帯血の間葉系幹細胞を単離し、培養する方法が、Ｋｅｒｎ他［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００６；２４：１２９４〜１３０１］によって記載される。
【００８３】
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞はヒト由来である。
【００８４】
本発明のこの局面の別の実施形態によれば、間葉系幹細胞はヒトの新生児の胎盤および臍帯から単離される。
【００８５】
骨髄を吸引によって個体の腸骨稜から単離することができる。低密度ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）が、ＦＩＣＯＬ−ＰＡＱＵＥ密度勾配によって、またはＨｅｔａｓｔａｒｃｈ（ヒドロキシエチルデンプン）を使用する赤血球の除去によって分離される場合がある。好ましくは、間葉系幹細胞の培養物が、ＢＭ吸引物（通常的には２０ｍｌ）を等体積のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎａｄ、ＮＹ、米国）により希釈し、希釈された細胞を約１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌカラム（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）の上に重層することによって作製される。２５００×ｇでの遠心分離を３０分間行った後、単核細胞層が境界から取り出され、ＨＢＳＳに懸濁される。その後、細胞が１５００×ｇで１５分間遠心分離され、完全培地（ＭＥＭ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含まないα培地；ＧＩＢＣＯ）、ＭＳＣの迅速成長のために選択されたロットに由来する２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン（ＧＩＢＣＯ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、および２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）に再懸濁される。再懸濁された細胞が１０ｃｍの培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）において約２５ｍｌの培地に置床され、５％の加湿ＣＯ２とともに３７℃でインキュベーションされる。培養で２４時間の後、非接着性細胞が捨てられ、接着性細胞がリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）により２回徹底的に洗浄される。培地が、３日毎または４日毎に約１４日間、新鮮な完全培地により取り換えられる。その後、接着性細胞が、０．２５％のトリプシンおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（トリプシン／ＥＤＴＡ、ＧＩＢＣＯ）を３７℃で５分間用いて集められ、６ｃｍのプレートに再置床され、さらに１４日間培養される。その後、細胞がトリプシン処理され、細胞計数デバイス、例えば、血球計（Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）などを使用して計数される。培養細胞が遠心分離によって回収され、５％ＤＭＳＯおよび３０％ＦＣＳとともに、１ｍｌあたり１〜２×１０６細胞の濃度で再懸濁される。それぞれが約１ｍｌのアリコートが緩速凍結され、液体窒素において貯蔵される。
【００８６】
脂肪組織由来のＭＳＣを脂肪吸引によって得ることができ、また、単核細胞を、脂肪および脂肪細胞を除くことによって手作業で、またはＣｅｌｕｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏｒｉ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）をＭＳＣの調製のために上記で記載されるのと同じ手順に従って使用して単離することができる。
【００８７】
１つの実施形態によれば、集団が（例えば、フラスコにおいて）ポリスチレンプラスチック表面に置床され、間葉系幹細胞が、非接着性細胞を除くことによって単離される。代替では、間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞のマーカーを使用してＦＡＣＳによって単離される場合がある。
【００８８】
好ましくは、ＭＳＣは少なくとも５０％精製され、より好ましくは少なくとも７５％精製され、一層より好ましくは少なくとも９０％精製される。
【００８９】
間葉系幹細胞画分を拡大するために、凍結された細胞が３７℃で解凍され、完全培地により希釈され、ＤＭＳＯを除くために遠心分離によって回収される。細胞が完全培地に再懸濁され、約５０００細胞／ｃｍ２の濃度で置床される。培養で２４時間の後、非接着性細胞が除かれ、接着性細胞が、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して集められ、狭くしたパスツールピペットに通すことによって解離させられ、好ましくは、約１．５〜約３．０細胞／ｃｍ２の密度で再置床される。これらの条件のもとで、ＭＳＣ培養物は約５０回の集団倍加にわたって成長することができ、約２０００倍にわたって拡大させることができる［Ｃｏｌｔｅｒ  ＤＣ他、Ｒａｐｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｔｉｃ−ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９７：３２１３〜３２１８、２０００］。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態によって利用されるＭＳＣ培養物には好ましくは、それらの形態学的特徴によって定義される３つの群の細胞、すなわち、小さい無顆粒細胞（これらは本明細書中下記ではＲＳ−１として示される）、小さい顆粒細胞（これらは本明細書中下記ではＲＳ−２として示される）、および大きい適度な顆粒細胞（これらは本明細書中下記では成熟ＭＳＣとして示される）が含まれる。培養におけるそのような細胞の存在および濃度を、例えば、免疫蛍光、インサイチューハイブリダイゼーションおよび活性アッセイを使用することにより、様々な細胞表面マーカーの存在の有無を特定することによってアッセイすることができる。
【００９１】
ＭＳＣが本発明のいくつかの実施形態の培養条件のもとで培養されるとき、ＭＳＣは、造血幹細胞マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ４３およびＣＤ４５については陰性の染色を示す。小さい割合の細胞（１０％未満）がＣＤ３１および／またはＣＤ３８のマーカーについてかすかに陽性である。加えて、成熟ＭＳＣは、造血幹細胞マーカーであるＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）についてかすかに陽性であり、骨形成ＭＳＣのマーカーであるＳｔｒｏ−１について中程度に陽性であり［Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．＆Ｔｏｒｏｋ−Ｓｔｏｒｂ，Ｂ．（１９９１）、Ｂｌｏｏｄ、７８、５５６２］、かつ、胸腺細胞および末梢Ｔリンパ球のマーカーであるＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）について陽性である。他方で、ＲＳ−１細胞はＣＤ１１７およびＳｔｒｏ１のマーカーについて陰性であり、かつ、ＣＤ９０のマーカーについてかすかに陽性であり、ＲＳ−２細胞はこれらのマーカーのすべてについて陰性である。
【００９２】
本発明の間葉系幹細胞は、本明細書中下記でさらに記載されるように、自己、同系または同種の血縁者の供給源（一致した兄弟姉妹またはハプロタイプ一致の家族の一員）あるいは非血縁者の全く一致していない供給源のものである場合がある。
【００９３】
間葉系幹細胞の培養を、米国特許第６，５２８，２４５号およびＳａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｕｒｒｙ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｕｒｒｙ他（Ｊ．Ｎｅｕｒｉｓｃｉ．Ｒｅｓ．９６：９０８−９１７，２００１）；ＢｌａｃｋおよびＷｏｏｄｂｕｒｙ（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．２７：６３２−６３５，２００１）；Ｄｅｎｇ他（２００１），Ｋｏｈｙａｍａ他（２００１），ＲｅｙｅｓおよびＶｅｒｆａｔｉｌｅ（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３８：２３１−２３５，２００１）およびＪｉａｎｇ他（Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：４７−４９，２００２）に記載されたもののような星状膠細胞に向かう細胞の分化を支援する（または、少なくとも妨げない）任意の培地において行うことができる。
【００９４】
培地は、Ｇ５、神経基礎培地、ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）、あるいは、ニューロンもしくは星状膠細胞の成長を支援する任意の他の培地である場合がある。
【００９５】
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１０１およびｍｉＲ−１４１の少なくとも１つを含む。
【００９６】
本発明者らによって意図される特定の組合せには、外因性ｍｉＲ−９および外因性ｍｉＲ−２０ｂのＭＳＣ集団におけるレベルをアップレギュレーションすることが含まれる。
【００９７】
本発明者らによって意図される別の組合せには、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−１０１およびｍｉＲ−１４６ａのそれぞれをＭＳＣ集団においてアップレギュレーションすることが含まれる。
【００９８】
用語「ミクロＲＮＡ」、用語「ｍｉＲＮＡ」および用語「ｍｉＲ」は同義的であり、遺伝子発現を調節する、長さが約１９〜２８ヌクレオチドである非コードの一本鎖ＲＮＡ分子の集まりを示す。様々なｍｉＲＮＡが広範囲の生物において見出され、発達、恒常性および疾患原因において役割を果たすことが示されている。
【００９９】
下記はｍｉＲＮＡ活性の機構の簡単な記載である。
【０１００】
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子が転写され、これにより、プリ−ｍｉＲＮＡとして公知のｍｉＲＮＡ前駆体の産生がもたらされる。プリ−ｍｉＲＮＡは典型的には、多数のプリ−ｍｉＲＮＡを含む多シストロン性ＲＮＡの一部である。プリ−ｍｉＲＮＡは、ステム／ループを有するヘアピンを形成する場合がある。ステムはミスマッチの塩基を含む場合がある。
【０１０１】
プリ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造が、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａによって認識される。Ｄｒｏｓｈａは典型的には、プリ−ｍｉＲＮＡにおける末端のループを認識し、およそ２回のらせん状ターンをステムに切断して、プレ−ｍｉＲＮＡとして公知の６０〜７０ｎｔの前駆体を生じさせる。Ｄｒｏｓｈａは、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼに典型的な互い違いの切れ目を伴ってプリ−ｍｉＲＮＡを切断し、これにより、５’ホスファートおよび約２ヌクレオチドの３’突出を有するプレ−ｍｉＲＮＡのステム・ループをもたらす。ステムのおよそ１回のらせん状ターン（約１０ヌクレオチド）がＤｒｏｓｈａ切断部位を越えて伸びることが、効率的なプロセシングのために必須であることが推定されている。その後、プレ−ｍｉＲＮＡが、Ｒａｎ−ＧＴＰおよび輸出受容体エクスポーチン−５によって核から細胞質に能動輸送される。
【０１０２】
その後、プレ−ｍｉＲＮＡの二本鎖ステムがＤｉｃｅｒによって認識される（Ｄｉｃｅｒもまた、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼである）。Ｄｉｃｅｒはまた、ステム・ループの塩基において５’ホスファートおよび３’突出を認識する場合がある。その場合、Ｄｉｃｅｒは末端ループをステム・ループの塩基から２回のらせん状ターン離れて切断し、これにより、さらなる５’ホスファートおよび約２ヌクレオチドの３’突出を残す。生じたｓｉＲＮＡ様二重鎖はミスマッチを含む場合があり、成熟ｍｉＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ＊として公知の類似サイズの断片とを含む。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊が、プリ−ｍｉＲＮＡおよびプレ−ｍｉＲＮＡの相対するアームに由来する場合がある。ｍｉＲＮＡ＊配列が、典型的にはｍｉＲＮＡよりも低い頻度ではあるが、クローン化されたｍｉＲＮＡのライブラリーにおいて見出される場合がある。
【０１０３】
最初はｍｉＲＮＡ＊との二本鎖の種として存在するにもかかわらず、ｍｉＲＮＡは最終的には、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知のリボ核タンパク質複合体の中に一本鎖ＲＮＡとして取り込まれる。様々なタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、このことは、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖に対する特異性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制するか、または活性化する）、およびｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のどの鎖がＲＩＳＣに入るかにおける変動性をもたらすことができる。
【０１０４】
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣに入るとき、ｍｉＲＮＡ＊は除かれ、分解される。ＲＩＳＣに入るｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖の鎖は、５’末端がそれほど強固に対形成しない方の鎖である。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の両末端がほぼ同等な５’対形成を有する場合には、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の両方が遺伝子サイレンシング活性を有する場合がある。
【０１０５】
ＲＩＳＣは、標的核酸を、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間における大きいレベルの相補性に基づいて、とりわけ、ｍｉＲＮＡの２〜７番目のヌクレオチドによる相補性に基づいて特定する。
【０１０６】
数多くの研究が、翻訳の効率的な阻害を達成するための、ｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間における塩基対形成要件を調べている（これらがＢａｒｔｅｌ（２００４、Ｃｅｌｌ、１１６−２８１）によって総説される）。哺乳動物細胞では、ｍｉＲＮＡの最初の８ヌクレオチドが重要であり得る（Ｄｏｅｎｃｈ＆Ｓｈａｒｐ、２００４、ＧｅｎｅｓＤｅｖ、２００４−５０４）。しかしながら、ミクロＲＮＡの他の部分もまた、ｍＲＮＡ結合に関与する場合がある。そのうえ、３’における十分な塩基対形成は５’における不十分な対形成を補うことができる（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ他、２００５、ＰＬｏＳ、３−ｅ８５）。コンピューター計算研究では、ゲノム全体に対するｍｉＲＮＡ結合が分析された場合、標的結合におけるｍｉＲＮＡの５’での２〜７番目の塩基に特異的な役割が示唆されており、しかし、通常では「Ａ」であることが見出される最初のヌクレオチドの役割もまた認められた（Ｌｅｗｉｓ他、２００５、Ｃｅｌｌ、１２０−１５）。同様に、１〜７番目のヌクレオチドまたは２〜８番目のヌクレオチドが、Ｋｒｅｋ他（２００５、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、３７−４９５）によって、標的を特定し、検証するために使用された。
【０１０７】
ｍＲＮＡにおける標的部位が、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはコード領域に存在する場合がある。興味深いことに、多数のｍｉＲＮＡが、同じ部位または多数の部位を認識することによって同じｍＲＮＡ標的を調節する場合がある。多数のｍｉＲＮＡ結合部位がほとんどの遺伝子的に特定された標的に存在することは、多数のＲＩＳＣの協同作用により、最も効率的な翻訳阻害がもたらされることを示し得る。
【０１０８】
ｍｉＲＮＡが、ＲＩＳＣに、遺伝子発現を２つの機構、すなわち、ｍＲＮＡ切断または翻訳抑制のどちらかによってダウンレギュレーションさせる場合がある。ｍＲＮＡが、ある特定の程度の相補性をｍｉＲＮＡに対して有するならば、ｍｉＲＮＡにより、ｍＲＮＡの切断が規定される場合がある。ｍｉＲＮＡが切断を導くとき、切れ目は典型的には、ｍｉＲＮＡの１０番目および１１番目の残基に対するヌクレオチド対形成の間である。代替では、ｍｉＲＮＡが、必要な程度の相補性をｍｉＲＮＡに対して有していないならば、ｍｉＲＮＡにより、翻訳が抑制される場合がある。翻訳抑制が動物においてより多く見られる場合がある。これは、動物は、より低い程度の相補性をｍｉＲＮＡと結合部位との間に有する場合があるからである。
【０１０９】
どのｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の対の５’末端および３’末端にも、変動性が存在し得ることに留意しなければならない。この変動性は、切断部位に関するＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒの酵素プロセシングにおける変動性に起因する場合がある。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の５’末端および３’末端における変動性はまた、プリ−ｍｉＲＮＡおよびプレ−ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因する場合がある。ステム鎖のミスマッチにより、異なるヘアピン構造の集団がもたらされる場合がある。ステム構造における変動性はまた、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒによる切断の生成物における変動性をもたらす場合がある。
【０１１０】
用語「ミクロＲＮＡ模倣体」は、ＲＮＡｉ経路に入り、遺伝子発現を調節することができる合成された非コードＲＮＡを示す。ｍｉＲＮＡ模倣体は内因性ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を模倣しており、成熟型二本鎖分子または模倣体前駆体（例えば、またはプレ−ｍｉＲＮＡ）として設計することができる。ｍｉＲＮＡ模倣体は、修飾された、または修飾されていないＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたは代替となり得る核酸化学（例えば、ＬＮＡまたは２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ））から構成され得る。他の修飾体が本明細書中下記に記載される。成熟型二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣体については、二重鎖領域の長さが、１３〜３３ヌクレオチドの間、１８２４ヌクレオチドの間、または２１〜２３ヌクレオチドの間で変化し得る。ｍｉＲＮＡはまた、合計で少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のヌクレオチドを含む場合がある。ｍｉＲＮＡの配列はプレ−ｍｉＲＮＡの最初の１３〜３３ヌクレオチドである場合がある。ｍｉＲＮＡの配列はまた、プレ−ｍｉＲＮＡの最後の１３ヌクレオチド〜３３ヌクレオチドである場合がある。ｍｉＲＮＡの配列は本明細書中に記載されたｍｉＲＮＡの配列のいずれか、またはその変化体を含む場合がある。
【０１１１】
間葉系幹細胞を接触することが下記のいくつかの方法で実行される場合があることが、本明細書中に提供される説明から理解されるであろう：
１．間葉系幹細胞を成熟型ｍｉＲＮＡ（または本明細書中下記で記載されるように改変形態）により一過性にトランスフェクションすること。本発明の教示に従って設計されるｍｉＲＮＡは、酵素的合成および固相合成の両方を含めて、当技術分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド合成法に従って作製することができる。固相合成を実行するための様々な設備および試薬が、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。そのような合成のための任意の他の手段もまた用いることができる；オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内であり、固相化学（例えば、シアノエチルホスホルアミダイト）、その後、脱保護、脱塩および精製（例えば、自動トリチル・オン法またはＨＰＬＣによる精製）を利用して、例えば、下記において詳しく記載されるような確立された方法論により達成することができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．他編（１９９４、１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８８）、“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＧａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”。
２．間葉系幹細胞を、成熟型ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。
３．間葉系幹細胞を、プレ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。プレ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜９０ヌクレオチド、６０〜８０ヌクレオチド、または６０〜７０ヌクレオチドを含む場合がある。プレ−ｍｉＲＮＡの配列は、本明細書中に示されるようなｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊を含む場合がある。プレ−ｍｉＲＮＡの配列はまた、プリ−ｍｉＲＮＡの５’末端および３’末端から０〜１６０個のヌクレオチドを除外するプリ−ｍｉＲＮＡの配列である場合がある。プレ−ｍｉＲＮＡの配列はｍｉＲＮＡの配列を含む場合がある。
４．間葉系幹細胞を、プリ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。プリ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜３００００ヌクレオチド、５０〜２５０００ヌクレオチド、１００〜２００００ヌクレオチド、１０００〜１５００ヌクレオチド、または８０〜１００ヌクレオチドを含む場合がある。プリ−ｍｉＲＮＡの配列は、本明細書中に示されるようにプレ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊、ならびに、それらの変化体を含む場合がある。ｍｉＲＮＡ模倣体の調製を化学的合成法によって、または、組換え法によって行うことができる。
【０１１２】
述べられたように、本発明ではまた、間葉系幹細胞を特定のｍｉＲＮＡ（つまり、ｍｉ−Ｒ−１９３ｂ，ｍｉ−Ｒ−２２１，ｍｉ−Ｒ−１３５ａ，ｍｉ−Ｒ−１４９，  ｍｉ−Ｒ−２２２，ｍｉ−Ｒ−１９９ａ，ｍｉ−Ｒ−３０２，ｍｉ−Ｒ−３０２ｃ，ｍｉ−Ｒ−３０２ｄ，ｍｉ−Ｒ−３６９−３ｐ，ｍｉ−Ｒ−３７０，ｍｉ−Ｒ−ｌｅｔ７ａ，ｍｉ−Ｒ−ｌｅｔ７ｂ，ｍｉ−Ｒ−１０ｂ，ｍｉ−Ｒ−２３ａ，ｍｉ−Ｒ−２３ｂ，ｍｉ−Ｒ−３２，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１３３，ｍｉ−Ｒ−１３８，ｍｉ−Ｒ−１８２，ｍｉ−Ｒ−４８７，ｍｉ−Ｒ−２１４，ｍｉ−Ｒ−４０９，ｍｉ−Ｒ−５４８−ｄ１，ｍｉ−Ｒ−８８９並びにｍｉ−Ｒ−１２３８）のダウンレギュレーションによって星状膠細胞表現型に向けて分化させることが意図される。
【０１１３】
ダウンレギュレーションのために意図されるさらなるｍｉＲＮＡが下記に示される。
ｍｉＲ−２０４，ｍｉＲ−２２４，ｍｉＲ−６１６，ｍｉＲ−１２２，ｍｉＲ−２９９，ｍｉＲ−１００，ｍｉＲ−１３８，ｍｉＲ−１４０，ｍｉＲ−３７５，ｍｉＲ−２１７，ｍｉＲ−３０２，ｍｉＲ−３７２，ｍｉＲ−９６，ｍｉＲ−１２７−３ｐ，ｍｉＲ−４４９，ｍｉＲ−１３５ｂ，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−３２６，ｍｉＲ−３２４，ｍｉＲ−３３５，ｍｉＲ−１４，ｍｉＲ−１６。
【０１１４】
ダウンレギュレーションのために意図されるさらなるｍｉＲＮＡが下記に示される。
ｍｉｒ−４１０，ｍｉｒ−３１６３，ｍｉｒ−１４８ａ，ｍｉｒ−１４８ｂ，ｍｉｒ−１５２，ｍｉｒ−３１２１−３ｐ，ｍｉｒ−４９５，ｍｉｒ−２０３，ｍｉｒ−４６８０−３ｐ。
【０１１５】
特定の実施形態によれば、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−３０２ａ、ｍｉＲ−１３８およびｍｉＲ−３０２ｂの少なくとも１つが、本発明の星状膠細胞様細胞を生じさせるためにダウンレギュレーションされる。
【０１１６】
ｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションすることを、当該ｍｉＲＮＡに対して生理学的条件下での細胞においてハイブリダイゼーション可能であるポリヌクレオチドを使用して実行させることができる。
【０１１７】
特定の実施形態によれば、細胞集団が、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１４６およびｍｉＲ−１０１のＭＳＣの集団における発現をアップレギュレーションし、かつ、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−３０２のＭＳＣの当該集団における発現をダウンレギュレーションすることによって作製される。
【０１１８】
別の実施形態によれば、細胞集団が、ｍｉＲ−１０１の発現をアップレギュレーションし、かつ、ｍｉＲ−１３８の発現をダウンレギュレーションすることによって作製される。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション可能（な）」は、ハイブリダイゼーションすることができること、すなわち、二本鎖分子（例えば、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡおよび／またはＤＮＡ：ＤＮＡ分子など）を形成できることを示す。「生理学的条件」は、細胞、組織あるいは完全な生物体または細胞体に存在する条件を示す。好ましくは、本発明によって使用される生理学的条件には、３４℃〜４０℃の間の温度、より好ましくは３５℃〜３８℃の間の温度、より好ましくは３６℃〜３７．５℃の間の温度、最も好ましくは３７℃〜３７．５℃の間の温度；０．８％〜１％の間、より好ましくは約０．９％の塩濃度（例えば、塩化ナトリウムＮａＣｌ）；および／または、６．５〜８の範囲でのｐＨ値、より好ましくは６．５〜７．５、最も好ましくは７〜７．５の範囲でのｐＨ値が含まれる。
【０１２０】
本明細書中上記で述べられたように、上記リストのｍｉＲＮＡおよび本明細書中に記載されるｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションするポリヌクレオチドが、当技術分野で公知の様々な方法を使用して、修飾ポリヌクレオチドとして提供される場合がある。
【０１２１】
例えば、本発明のオリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ）またはポリヌクレオチドは、３’から５’へのホスホジエステル連結で結合する、プリン塩基およびピリミジン塩基からなる複素環式ヌクレオシドを含む場合がある。
【０１２２】
好ましく使用されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書中下記で幅広く記載されるように、骨格、ヌクレオシド間連結または塩基のいずれにおいても改変されるものである。
【０１２３】
本発明のこの局面に従って有用である好ましいオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの具体的な例には、修飾された骨格または非天然型のヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドには、米国特許第４，４６９，８６３号；米国特許第４，４７６，３０１号；米国特許第５，０２３，２４３号；米国特許第５，１７７，１９６号；米国特許第５，１８８，８９７号；米国特許第５，２６４，４２３号；米国特許第５，２７６，０１９号；米国特許第５，２７８，３０２号；米国特許第５，２８６，７１７号；米国特許第５，３２１，１３１号；米国特許第５，３９９，６７６号；米国特許第５，４０５，９３９号；米国特許第５，４５３，４９６号；米国特許第５，４５５，２３３号；米国特許第５，４６６，６７７号；米国特許第５，４７６，９２５号；米国特許第５，５１９，１２６号；米国特許第５，５３６，８２１号；米国特許第５，５４１，３０６号；米国特許第５，５５０，１１１号；米国特許第５，５６３，２５３号；米国特許第５，５７１，７９９号；米国特許第５，５８７，３６１号；および米国特許第５，６２５，０５０号に開示されるように、リン原子を骨格に保持するものが含まれる。
【０１２４】
好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格または修飾ポリヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオアート；キラルなホスホロチオアート；ホスホロジチオアート；ホスホトリエステル；アミノアルキルホスホトリエステル；メチルホスホナートおよび他のアルキルホスホナート（３’−アルキレンホスホナートおよびキラルなホスホナートを含む）；ホスフィナート；ホスホルアミダート（３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含む）；チオノホスホルアミダート；チオノアルキルホスホナート；チオノアルキルホスホトリエステル；ならびに、通常の３’−５’連結を有するボラノホスファート、これらの２’−５’連結アナログ、および、逆の極性を有するもの（この場合、ヌクレオシドユニットの隣接する対が、３’−５’から５’−３’に、または、２’−５’から５’−２’に連結される）が含まれる。上記修飾体の様々な塩、混合塩および遊離酸形態もまた使用することができる。
【０１２５】
代替において、リン原子を骨格に含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格または修飾ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルの混合型ヌクレオシド間連結、あるいは、１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間連結または複素環ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらには、米国特許第５，０３４，５０６号；米国特許第５，１６６，３１５号；米国特許第５，１８５，４４４号；米国特許第５，２１４，１３４号；米国特許第５，２１６，１４１号；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，２６４，５６２号；米国特許第５，２６４，５６４号；米国特許第５，４０５，９３８号；米国特許第５，４３４，２５７号；米国特許第５，４６６，６７７号；米国特許第５，４７０，９６７号；米国特許第５，４８９，６７７号；米国特許第５，５４１，３０７号；米国特許第５，５６１，２２５号；米国特許第５，５９６，０８６号；米国特許第５，６０２，２４０号；米国特許第５，６１０，２８９号；米国特許第５，６０２，２４０号；米国特許第５，６０８，０４６号；米国特許第５，６１０，２８９号；米国特許第５，６１８，７０４号；米国特許第５，６２３，０７０号；米国特許第５，６６３，３１２号；米国特許第５，６３３，３６０号；米国特許第５，６７７，４３７号；および米国特許第５，６７７，４３９号に開示されるように、（部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成される）モルホリノ連結；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびメチレンチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；ならびに、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合成分部分を有する他のものが含まれる。
【０１２６】
本発明に従って使用されることがある他のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、糖およびヌクレオシド間連結の両方において修飾されるものであり、すなわち、ヌクレオチドユニットの骨格が新規な基により置き換えられる。塩基ユニットは、適切なポリヌクレオチド標的との相補のために維持される。そのようなオリゴヌクレオチド模倣体の一例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、糖−骨格がアミド含有骨格（特に、アミノエチルグリシン骨格）により置き換えられるオリゴヌクレオチドを示す。塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する米国特許には、米国特許第５５３９０８２号、同第５７１４３３１号および同第５７１９２６２号が含まれるが、これらに限定されない（これらのそれぞれが参照によって本明細書中に組み込まれる）。本発明において使用されることがある他の骨格修飾が米国特許第６３０３３７４号に開示される。
【０１２７】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはまた、塩基修飾または塩基置換を含む場合がある。本明細書中で使用される場合、「非修飾」塩基または「天然型」塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびに、ピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。「修飾（された）」塩基には、他の合成塩基および天然型塩基、例えば、下記の塩基が含まれるが、それらに限定されない：５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プセウドウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換されたアデニンおよびグアニン；５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換されたウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン；８−アザグアニンおよび８−アザアデニン；７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン；ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン。さらなる修飾塩基には、下記において開示される修飾塩基が含まれる：米国特許第３６８７８０８号；Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．他（１９９０）、“Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”、８５８頁〜８５９頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ他（１９９１）、“Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ”、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、３０、６１３；および、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、第１５章、２８９頁〜３０２頁、Ｓ．Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢ．Ｌｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３。そのような修飾塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン類、ならびに、Ｎ−２−置換プリン、Ｎ−６−置換プリンおよびＯ−６−置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）が含まれる。５−メチルシトシン置換体は、核酸二重鎖の安定性を０．６℃〜１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．他（１９９３）、“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、２７６頁〜２７８頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）、現時点では好ましい塩基置換体であり、一層より具体的には、２’−Ｏ−メトキシエチルによる糖修飾と組み合わされるときには好ましい塩基置換体である。
【０１２８】
ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを調節するポリヌクレオチド作用因を間葉系幹細胞において発現させるために、ｍｉＲＮＡ（またはプレ−ｍｉＲＮＡ、またはプリ−ｍｉＲＮＡ、または、ｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションするポリヌクレオチド）をコードするポリヌクレオチド配列が好ましくは、間葉系幹細胞での発現のために好適である核酸構築物に連結される。そのような核酸構築物は、細胞におけるポリヌクレオチド配列の転写を構成的様式または誘導可能な様式で行わせるためのプロモーター配列を含む。
【０１２９】
本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物ではまた、所望される活性（例えば、星状膠細胞分化能など）を示すｍｉＲＮＡホモログが利用され得ることが理解されるであろう。そのようなホモログは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して求められる場合（ただし、この場合、ギャップ重みが５０に等しく、長さ重みが３に等しく、平均マッチが１０に等しく、平均ミスマッチが−９に等しい）、例えば、与えられる配列のいずれかに対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％であることが可能である。
【０１３０】
加えて、ホモログは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して求められる場合（ただし、この場合、ギャップ重みが５０に等しく、長さ重みが３に等しく、平均マッチが１０に等しく、平均ミスマッチが−９に等しい）、例えば、本明細書中で与えられる配列に対する同一性が少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％であることが可能である。
【０１３１】
本発明のいくつかの実施形態との使用のために好適である構成的プロモーターが、ほとんどの環境条件およびほとんどのタイプの細胞のもとで活性であるプロモーター配列であり、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などである。本発明のいくつかの実施形態との使用のために好適である誘導可能なプロモーターには、例えば、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｚａｂａｌａ  Ｍ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００４、６４（８）：２７９９〜８０４）が含まれる。
【０１３２】
真核生物プロモーターは典型的には、２つのタイプの認識配列、すなわち、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含有する。ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位から２５塩基対〜３０塩基対上流に位置しており、ＲＮＡポリメラーゼにＲＮＡ合成を開始させることに関与すると考えられている。もう一方の上流プロモーターエレメントにより、転写が開始される速度が決定される。
【０１３３】
好ましくは、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物によって利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において、すなわち、間葉系幹細胞において活性である。
【０１３４】
エンハンサーエレメントは、連結されている同種または異種プロモーターから転写を１０００倍にまで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたときに活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは幅広い宿主範囲を有しており、様々な組織において活性である。例えば、ＳＶ４０の初期遺伝子エンハンサーが多くの細胞タイプのために好適である。本発明のいくつかの実施形態のために好適である他のエンハンサー／プロモーター組合せには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルス、およびＨＩＶなど）から得られる長末端反復に由来する組合せが含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８３）を参照のこと（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１３５】
発現ベクターの構築において、プロモーターは好ましくは、異種の転写開始部位からの距離がその天然の環境における転写開始部位からの距離とおよそ同じで配置される。しかしながら、当技術分野では公知のように、この距離におけるいくらかの変動が、プロモーター機能を失うことなく受け入れられ得る。
【０１３６】
既に記載されたエレメントに加えて、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または組換えＤＮＡを有する細胞の特定を容易にするために意図される他の特化したエレメントを含有する場合がある。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外での複製を促進させるＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドで運ばれる遺伝子または宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子のどちらかによって提供される限り、エピソームとして複製される。
【０１３７】
ベクターは真核生物レプリコンを含む場合があり、または含まない場合がある。真核生物レプリコンが存在するならば、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まないならば、エピソーム増幅を行うことができない。代わりに、組換えＤＮＡが、操作された細胞のゲノムに一体化し、この場合、その細胞において、プロモーターにより、所望される核酸の発現が導かれる。
【０１３８】
哺乳動物発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびに、それらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）から得られる調節エレメントを含有する発現ベクターもまた使用することができる。ＳＶ４０系ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および任意の、真核生物細胞における発現のために効果的であることが示されるＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳ガンウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは他のプロモーターの指示のもとでのタンパク質の発現を可能にする他のベクターが含まれる。
【０１４０】
上記で記載されるように、ウイルスは、多くの場合には宿主の防御機構を逃れるために進化してきた非常に特殊化された感染性作用因である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプにおいて感染し、伝播する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その天然の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的とし、かつ、それにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入するために利用される。したがって、本発明のいくつかの実施形態によって使用されるベクターのタイプは、形質転換された細胞タイプに依存するであろう。好適なベクターを形質転換された細胞タイプに従って選択できることは、十分に当業者の能力の範囲内であり、そのようなものとして、選択での考慮の一般的記載は本明細書中には提供されない。例えば、骨髄細胞を、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を使用して標的化することができ、また、腎臓細胞が、Ｌｉａｎｇ  ＣＹ他（２００４）（Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ、１４９：５１〜６０）に記載されるようなバキュロウイルスのオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に存在する異種プロモーターを使用して標的化される場合がある。
【０１４１】
１つの実施形態によれば、レンチウイルスベクターが、間葉系幹細胞をトランスフェクションするために使用される。
【０１４２】
様々な方法を、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターを間葉系幹細胞に導入するために使用することができる。そのような方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）、およびＧｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４（６）：５０４〜５１２、１９８６］において一般的に記載されており、また、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、陽性−陰性の選抜方法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０１４３】
ウイルス感染による核酸の導入は、より大きいトランスフェクション効率をウイルスの感染性のために得ることができるので、他の方法（例えば、リポフェクションおよびエレクトロポレーションなど）を上回るいくつかの利点を提供する。
【０１４４】
非ウイルス性である他のベクター、例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなどを使用することができる。
【０１４５】
ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣体およびプレ−ｍｉＲは、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子など）を使用して、または、酸化第二鉄磁性ＮＰによってもまた、細胞にトランスフェクションすることができる。例えば、Ｇｈｏｓｈ他、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１３（Ｊａｎ）、３４（３）：８０７〜１６；Ｃｒｅｗ  Ｅ他、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、２０１２（Ｊａｎ）、３、８４（１）：２６〜９を参照のこと。本明細書中上記で述べられたように、本明細書中に記載されるｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションするポリヌクレオチドが、当技術分野で公知の様々な方法を使用して、修飾ポリヌクレオチドとして提供される場合がある。
【０１４６】
組込みを伴わないトランスフェクションの他の様式には、小環状ＤＮＡベクターの使用、またはゲノムから後で除くことができる遺伝子のトランスフェクションを可能にするＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの使用が含まれる。
【０１４７】
本明細書中上記で述べられたように、様々な原核生物細胞または真核生物細胞を、本発明のいくつかの実施形態のｍｉＲＮＡまたは当該ｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションすることができるポリヌクレオチド作用因を発現させるための宿主発現系として使用することができる。これらには、微生物、例えば、コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、組換えプラスミドＤＮＡ発現ベクターまたは組換えコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換される細菌、コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換される酵母；コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）が感染させられる植物細胞系、または、コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換される植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現系もまた、本発明のいくつかの実施形態のｍｉＲＮＡを発現させるために使用することができる。
【０１４８】
細菌用構築物の例には、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターのｐＥＴシリーズが含まれる［Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１８５：６０〜８９）。
【０１４９】
酵母においては、米国特許第５９３２４４７号に開示されるように、構成的または誘導可能なプロモーターを含有する数多くのベクターを使用することができる。代替では、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への組み込みを促進するベクターを使用することができる。
【０１５０】
間葉系幹細胞を接触させるために使用される条件が、ｍｉＲＮＡ（またはその阻害剤）がその分化を誘導することを可能にする期間／細胞濃度／ｍｉＲＮＡ濃度／細胞とｍｉＲＮＡとの間の比率について選択される。本発明者らはさらに、星状膠細胞系譜に向かう分化を促進させる分化因子との間葉系幹細胞のインキュベーションを意図する。そのような分化因子とのインキュベーションが、ｍｉＲＮＡと接触させることの前に、ｍｉＲＮＡと接触させることと同時に、または、ｍｉＲＮＡと接触させることの後で実行される場合がある。この実施形態によれば、培地は、ＳＨＨ（例えば、約２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦｂ（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）、ｃＡＭＰインデューサ（例えば、ＩＢＭＸまたはｄｂｃｙｃＡＭＰ）、ＰＤＧＦ（例えば、約５ｎｇ／ｍｌ）、ニューレギュリン（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＧＦｂ（例えば、約２０ｎｇ／ｍｌ）のうちの少なくとも１つを補充されることができる。
【０１５１】
代替において、または、加えて、間葉系幹細胞は、発現構築物を使用して、例えば、本明細書中上記で記載される発現構築物などを使用して、そのような分化因子を発現するように遺伝子改変される場合がある。
【０１５２】
分化工程の期間中またはその後において、間葉系幹細胞はそれらの分化状態についてモニターされる場合がある。細胞分化を、分化を示すことが公知の細胞特異的マーカーまたは組織特異的マーカーを調べたときに明らかにすることができる。例えば、分化細胞が下記のマーカーを発現する場合がある：Ｓ１００ｂｅｔａ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＴ−１、興奮性アミノ酸輸送体１（ＥＡＡＴ１）および興奮性アミノ酸輸送体２（ＥＡＡＴ２）。さらに、分化細胞は神経栄養因子を分泌する場合があり、そのような神経栄養因子には、例えば、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｌ１９０６３、同Ｌ１５３０６；神経成長因子（ＮＧＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＣＡＡ３７７０３；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＣＡＡ６２６３２；ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ３７７６３；ニューロトロフィン−４／５；ニュールツリン（ＮＴＮ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００４５４９；ニューロトロフィン−４、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ８６５２８；パーセフィン、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＣ３９６４０；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＣＡＡ４２７６１；アルテミン（ＡＲＴ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＤ１３１１０；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００６０５；インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００６０９；および／またはニューブラスチン（Ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＤ２１０７５が含まれる。
【０１５３】
分化時間が、星状膠細胞の初期始原体またはより成熟した星状膠細胞を得るように選択され得ることが理解されるであろう。特定の初期の星状膠細胞性細胞または成熟した星状膠細胞性細胞について富化することもまた意図される。ＣＤ４４、Ａ２Ｂ５およびＳ１００などのマーカーを発現する細胞について選択することは、始原体タイプの星状膠細胞の富化を可能にし、これに対して、ＧＦＡＰおよびグルタミンシンターゼなどのマーカーを発現する細胞について選択することは、成熟型星状膠細胞の富化を可能にする。
【０１５４】
組織／細胞特異的なマーカーを、当技術分野で周知の免疫学的技術を使用して検出することができる［Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ他（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５〜７］。例には、膜結合マーカーのためのフローサイトメトリー、細胞外および細胞内マーカーのための免疫組織化学、ならびに、分泌された分子マーカーのための酵素免疫アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
加えて、細胞分化の後には、ＧＦＰまたはＲＦＰによりタグ化され、増大した蛍光を分化時に示す特異的レポーターを伴うことができる。
【０１５６】
本明細書中に記載される方法に従って得られる単離された細胞集団は典型的には不均一であり、だが、均一な細胞集団もまた意図される。
【０１５７】
特定の実施形態によれば、細胞集団は、ｍｉＲＮＡまたは当該ｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションすることができるポリヌクレオチド作用因を発現するように遺伝子改変される。
【０１５８】
用語「単離された」は、本明細書中で使用される場合、その生体内場所（例えば、骨髄、神経組織）から取り出されている細胞の集団を示す。好ましくは、単離された細胞集団は、その生体内場所に存在する他の物質（例えば、他の細胞）を実質的に含んでいない。
【０１５９】
細胞集団は、細胞の約５０％超が、以下のマーカーの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは全てを発現するように選択される場合がある：Ｓ１００ｂｅｔａ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＴ−１、ＧＤＮＦ，ＢＤＮＦ，ＩＧＦ−１およびＧＬＡＳＴ。
【０１６０】
細胞集団は、細胞の約６０％超が、以下のマーカーの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは全てを発現するように選択される場合がある：Ｓ１００ｂｅｔａ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＴ−１、ＧＤＮＦ，ＢＤＮＦ，ＩＧＦ−１およびＧＬＡＳＴ。
【０１６１】
細胞集団は、細胞の約７０％超が、以下のマーカーの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは全てを発現するように選択される場合がある：Ｓ１００ｂｅｔａ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＴ−１、ＧＤＮＦ，ＢＤＮＦ，ＩＧＦ−１およびＧＬＡＳＴ。
【０１６２】
細胞集団は、細胞の約８０％超が、以下のマーカーの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは全てを発現するように選択される場合がある：Ｓ１００ｂｅｔａ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＴ−１、ＧＤＮＦ，ＢＤＮＦ，ＩＧＦ−１およびＧＬＡＳＴ。
【０１６３】
細胞集団は、細胞の約９０％超が、以下のマーカーの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは全てを発現するように選択される場合がある：Ｓ１００ｂｅｔａ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＴ−１、ＧＤＮＦ，ＢＤＮＦ，ＩＧＦ−１およびＧＬＡＳＴ。
【０１６４】
細胞集団は、細胞の約９５％超が、以下のマーカーの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは全てを発現するように選択される場合がある：Ｓ１００ｂｅｔａ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＴ−１、ＧＤＮＦ，ＢＤＮＦ，ＩＧＦ−１およびＧＬＡＳＴ。
【０１６５】
細胞の特定の亜集団の単離が、細胞の蛍光活性化細胞分取および／または磁気分離を含む当技術分野で公知の技術を使用して実行される場合がある。
【０１６６】
本発明のこの局面の集団の細胞は、細胞サイズ、細胞形状、オルガネラサイズおよびオルガネラ数を含む構造的な星状膠細胞表現型を含む場合がある。したがって、成熟星状膠細胞の構造的な表現型は、丸い核、「星形」の本体、およびＣＮＳの小血管上で血管基底膜として終わる多くの長い突起を含む。
【０１６７】
これらの構造的表現型が、顕微鏡技術（例えば、走査型電子顕微鏡法）を使用して分析される場合がある。抗体または色素が、分析を助けるための識別特徴を強調するために使用される場合がある。
【０１６８】
本発明者らはさらに、ＭＳＣを星状膠細胞表現型に向かって分化させたときにアップレギュレーションされる特定のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ５０４）がα−シヌクレインを標的とすることを示している（図１０を参照のこと）。α−シヌクレイン遺伝子内の変異が常染色体優性家族性ＰＤに伴う。
【０１６９】
したがって、本発明者らはさらに、ｍｉＲＮＡ５０４を脳に輸送するためのカーゴ細胞としてのＭＳＣの使用を提案する。この場合、脳において、このｍｉＲＮＡがその後、パーキンソン病のための処置としてα−シヌクレインを標的とする。
【０１７０】
ＭＳＣを星状膠細胞表現型に向かって分化させたときにアップレギュレーションされる別のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ１５２）がハンチントン（ＨＴＴ）遺伝子を標的とする。この遺伝子内の変異がハンチントン病（ＨＤ）に伴う。
【０１７１】
したがって、本発明者らはさらに、ｍｉＲＮＡ１５２を脳に輸送するためのカーゴ細胞としてのＭＳＣの使用を提案する。この場合、脳において、このｍｉＲＮＡがその後、ハンチントン病のための処置としてα−シヌクレインを標的とする。
【０１７２】
ＭＳＣを星状膠細胞表現型に向かって分化させたときにアップレギュレーションされる別のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ６６５）がプリオン遺伝子（ＰＲＮＰ）を標的とする。したがって、本発明者らはさらに、ｍｉＲＮＡ６６５を脳に輸送するためのカーゴ細胞としてのＭＳＣの使用を提案する。この場合、脳において、このｍｉＲＮＡがその後、ＰＲＮＰを標的とする。
【０１７３】
ＭＳＣを星状膠細胞表現型に向かって分化させたときにアップレギュレーションされる別のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ３４０）がＳＯＤ１遺伝子を標的とする。この遺伝子内の変異がＡＬＳに伴う。
【０１７４】
したがって、本発明者らはさらに、ｍｉＲＮＡ３４０を脳に輸送するためのカーゴ細胞としてのＭＳＣの使用を提案する。この場合、脳において、このｍｉＲＮＡがその後、ＡＬＳのための処置としてＳＯＤ１遺伝子を標的とする。
【０１７５】
本発明のこの局面によれば、ＭＳＣが、ｍｉＲＮＡ（またはその模倣体）を発現するように操作され、ＭＳＣが本明細書中上記で記載されるような星状膠細胞表現型に向かって分化するように培養される場合がある。代替では、ＭＳＣが、ｍｉＲＮＡ（またはその模倣体）を発現するように操作され、星状膠細胞分化を考慮することなく患者（例えば、パーキンソン病患者）に投与される場合がある。
【０１７６】
本発明の細胞および細胞集団は様々な治療目的のために有用でありうる。本明細書で記載される細胞で有益に治療しうるＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害の代表的な例には、疼痛性障害、運動障害、解離性障害、気分障害、情動障害、神経変性疾患または神経変性障害、および痙攣性障害が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
そのような状態のより具体的な例には、パーキンソン病、ＡＬＳ、多発性硬化症、ハンチントン病、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性（ｇｌａｕｃａｔｏｍｕｓ）神経障害、黄斑変性、動作時振戦および遅発性ジスキネジー、パニック、不安、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病的行動、アルツハイマー病ならびにてんかんが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
分化ＭＳＣの使用はまた、脊髄傷害を含む神経系の外傷性病変を処置するために、また、出血または血栓症または塞栓症によって引き起こされる卒中を処置するためにも適応される場合がある。これは、神経形成を誘導し、かつ、損傷ニューロンに対する傷害を最小限に抑えるための生存因子を提供することが必要であるからである。
【０１７９】
本明細書中に記載される方法のどれにおいても、細胞が、自己、半自己または非自己（すなわち、同種または異種）のヒトのドナーまたは胚または臍帯／胎盤から得られる場合がある。例えば、細胞がヒト死体またはドナー対象から単離される場合がある。
【０１８０】
半自己の用語は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩまたはクラスＩＩの遺伝子座においてレシピエント細胞に対して部分的に一致していないドナー細胞を示す。
【０１８１】
本発明の細胞は、埋め込み部位にその性質が依存する様々な移植取り組みを使用して、処置された個体に投与することができる。
【０１８２】
「移植」、「細胞置換」または「移植する」の用語または表現は本明細書中では交換可能に使用され、本発明の細胞を標的組織に導入することを示す。上述のように、細胞はレシピエントに、あるいは、同種ドナー、半同種ドナーまたは異種ドナーに由来することができる。
【０１８３】
細胞は全身的には循環に注入するか、クモ膜下腔内に投与するかまたは中枢神経系、脊髄もしくは脳室腔の中に移植するか、あるいは、硬膜下において宿主の脳の表面に移植することができる。成功する移植のための条件には、（ｉ）埋め込み物の生存性、（ｉｉ）移植部位における移植片の保持、および（ｉｉｉ）移植部位における最少量の病理学的反応が含まれる。様々な神経組織（例えば、胚性脳組織）を宿主の脳に移植するための様々な方法が、“Ｎｅｕｒａｌ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＣＮＳ”、ＢｊｏｒｋｌｕｎｄおよびＳｔｅｎｅｖｉ編（１９８５）；Ｆｒｅｅｄ他（２００１）；Ｏｌａｎｏｗ他（２００３）に記載されている。これらの手順には、実質内移植、すなわち、組織を移植時に脳の実質に注入するか、または置くことによって達成される、（脳外または実質外移植と比較されるような）宿主の脳の内部における実質内移植が含まれる。
【０１８４】
実質内移植を、２つの取り組みを使用して行うことができる：（ｉ）細胞を宿主の脳の実質に注入すること、または（ｉｉ）宿主の脳の実質を露出させるために外科的手段によって腔を準備し、その後、移植片をこの腔の中に置くこと。両方の方法が、移植片と宿主脳組織との間における実質での設置を移植時にもたらし、また、ともに、移植片と宿主脳組織との間における解剖学的一体化を容易にする。移植片が宿主の脳の不可欠な部分となり、かつ、宿主の生涯にわたって生存することが要求されるならば、このことは重要である。
【０１８５】
代替では、移植片が、室（例えば、脳室）に、あるいは、硬膜下に、すなわち、介在する軟膜またはクモ膜および軟膜によって宿主の脳の実質から隔てられる宿主の脳の表面に置かれる場合がある。脳室に移植することが、ドナー細胞の注入によって、または細胞を基体（例えば、３％コラーゲンなど）において成長させて、その後、移植片のずれを防止するために脳室内に埋め込まれることがある充実組織のプラグを形成することによって達成される場合がある。硬膜下移植のために、細胞が、隙間を硬膜に作製した後で脳の表面の周りに注入される場合がある。宿主の脳の選択された領域への注入が、ドリルで穴を開け、硬膜を突き通して、マイクロシリンジの針が挿入されることを可能にすることによって行われる場合がある。マイクロシリンジは好ましくは、定位フレームに取り付けられ、三次元定位座標が、針を脳または脊髄の所望される場所に設置するために選択される。細胞はまた、脳の被殻、基底核、海馬皮質、線条体、黒質または尾状領域に、同様にまた、脊髄に導入される場合がある。
【０１８６】
細胞はまた、組織の健康な領域に移植される場合がある。場合により、損傷した組織区域の正確な場所が不明である場合があり、細胞が、健康な領域に気付かずに移植される場合がある。他の場合には、細胞を健康な領域に投与して、それにより、その領域に対する何らかのさらなる損傷を回避することが好ましい場合がある。どのような場合であれ、移植後、細胞は好ましくは、損傷区域に遊走する。
【０１８７】
移植のために、細胞懸濁物がシリンジに引き入れられ、麻酔された移植レシピエントに投与される。複数の注入が、この手順を使用して行われる場合がある。
【０１８８】
細胞を、脳または脊髄における任意の所定の部位に移植することをこのように可能にする細胞懸濁物手順は、比較的非外傷性であり、複数の移植を、同じ細胞懸濁物を使用していくつかの異なる部位または同じ部位において同時に可能にし、また、異なる解剖学的領域から得られる細胞の混合物を可能にする。複数の移植片が、細胞タイプの混合物、および／または細胞に挿入される導入遺伝子の混合物からなる場合がある。好ましくは、およそ１０４〜およそ１０９個の細胞が移植片あたり導入される。細胞は、冒された区域への標的化の機会を最大にするために、異なる場所に同時に投与することができる（例えば、クモ膜下腔内および静脈内の組み合わされた投与など）。
【０１８９】
脊髄移植に好ましい場合がある腔内への移植のために、組織が中枢神経系（ＣＮＳ）の外側表面に近い領域から取り出され、例えば、Ｓｔｅｎｅｖｉ他（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、１１４：１〜２０、１９７６）によって記載されるように、脳の上にある骨を除き、出血をゲルフォームなどの材料により止めることによって移植腔を形成する。吸引が、腔を作り出すために使用される場合がある。その後、移植片が腔に置かれる。２つ以上の移植片が、細胞または充実組織埋め込み物の注入を使用して同じ腔に置かれる場合がある。好ましくは、埋め込み部位が、処置されるＣＮＳ障害によって決定される。脱髄したＭＳ病変が、ＭＳの効果的な処置が適切な標的部位への細胞の遊走能により依拠し得るように、ＣＮＳの至るところ、多数の場所にわたって分布する。
【０１９０】
本明細書中に記載される細胞の鼻腔内投与もまた意図される。
【０１９１】
ＭＳＣは典型的には、ＭＨＣクラス２をダウンレギュレーションし、したがって、免疫原性がそれほど大きくない。臍帯血、臍帯ワルトンゼリーまたは胎盤から得られる胚性細胞または新生児細胞は、特にそのような細胞は最初は免疫抑制的かつ免疫調節性であるので、強い免疫原性である可能性がさらにより少なく、したがって、拒絶される可能性がそれほど大きくない。
【０１９２】
それにもかかわらず、非自己細胞は、身体に投与されたときには免疫反応を誘導することがあるので、いくつかの取り組みが、非自己細胞の拒絶の可能性を軽減するために開発されている。さらに、多発性硬化症などの疾患は、炎症に基づく疾患であるので、免疫反応の問題が悪化する。これらには、細胞を免疫学的寛容部位に投与すること、あるいは、代替では、最初は自己免疫障害を抑えるために適応されることがある抗炎症性処置を提供して、および／または、非自己／半自己の細胞を移植前に免疫隔離性の半透過性膜でカプセル封入して、レシピエントの免疫系を抑制することのどちらもが含まれる。
【０１９３】
本明細書中上記で述べられたように、本発明者らはまた、免疫反応を制限するための新生児間葉系幹細胞の使用を提案する。
【０１９４】
下記の実験が、神経学的障害を処置するための、臍帯／胎盤から単離される新生児ＭＳＣの潜在的な使用を確認するために行われる場合がある。
１）分化ＭＳＣ（様々な神経細胞または神経始原体細胞に至るもの）が、同種Ｔ細胞との一方向混合リンパ球培養において刺激因子として役立つ場合があり、同じドナーから単離される同種リンパ球に対して応答するＴ細胞との比較での増殖応答が、低応答性を実証するために３Ｈ−チミジン取り込みによって評価される場合がある。
２）分化ＭＳＣが、Ｔ細胞により媒介される増殖応答に対する免疫抑制影響を確認するために、一方向混合リンパ球培養に対して、また、Ｔ細胞マイトジェン（フィトヘマグルチニンおよびコンカナバリンＡ）との細胞培養に対して添加／共培養される場合がある。
３）Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットから培養される臍帯細胞および胎盤細胞（非改変細胞および分化細胞）がＭＳＣについて富化される場合があり、これらの細胞が、誘導された実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を有するＬｅｗｉｓラットに注入される場合がある。代替では、ＢＡＬＢ／ｃマウスの（ＢＡＬＢ／ｃｘＣ５７ＢＬ／６）Ｆ１から培養される臍帯細胞および胎盤細胞、または、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットから得られる異種細胞（非改変細胞および分化細胞）がＭＳＣについて富化される場合があり、これらの細胞が、誘導された実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を有するＣ５７ＢＬ／６またはＳＪＬ／ｊレシピエントに注入される場合がある。麻痺に対する臨床効果が、異種のＭＨＣ、完全不一致ＭＳＣまたはハプロタイプ一致した不一致ＭＳＣの治療効果を評価するために調べられる場合がある。そのような実験は、遺伝的障害または遺伝的傾向のある障害を有する患者を家族の一員のハプロタイプ一致したＭＳＣにより処置するための基礎を提供する場合がある。
４）臍帯および胎盤から培養されるＢＡＬＢ／ｃのＭＳＣが、ＧＦＰまたはＲＦＰにより標識されるプレ−ｍｉＲとともに輸注される場合がある（この場合、ＧＦＰまたはＲＦＰは、本発明者らが、誘導されたＥＡＥを有するＣ５７ＢＬ／６レシピエントの脳におけるこれらの細胞の遊走および持続を追跡することを可能にするであろう）。標識されたＭＨＣ不一致の分化ＭＳＣの臨床効果が、疾患、麻痺および組織病理学の兆候をモニターすることによって評価される場合がある。そのような細胞の遊走および局在化もまた、遺伝的に形質導入されたＧＦＰ「緑色」ドナーまたはＲｅｄ２「赤色」ドナーに由来する蛍光性細胞を使用することによってモニターされる場合がある。
【０１９５】
述べられたように、本発明ではまた、免疫応答を最小限に抑えるためのカプセル化技術も意図される。
【０１９６】
カプセル化技術は一般には、小さい球状ビヒクルを伴うマイクロカプセル化として、また、より大きい平坦シートおよび中空繊維膜を伴うマクロカプセル化として分類される（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．他、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２０００、４２：２９〜６４）。
【０１９７】
マイクロカプセルを調製する様々な方法が当技術分野で公知であり、これらには、例えば、下記によって開示される方法が含まれる：Ｌｕ  Ｍ  Ｚ他、Ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｏｘｙｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０００、７０：４７９〜８３；Ｃｈａｎｇ  Ｔ  ＭおよびＰｒａｋａｓｈ  Ｓ、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ，ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００１、１７：２４９〜６０、ならびに、Ｌｕ  Ｍ  Ｚ他、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔａｔｅ）、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ、２０００、１７：２４５〜５１。
【０１９８】
例えば、マイクロカプセルが、修飾コラーゲンを、メチルアタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のターポリマー殻と複合体化することによって調製され、これは２〜５．ｍｕ．ｍのカプセル厚さを生じさせる。そのようなマイクロカプセルはさらに、負荷電の滑らかな表面を与えるために、また、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、さらなる２〜５．ｍｕ．ｍのターポリマー殻によりカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．他、Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００２、２３：８４９〜５６）。
【０１９９】
他のマイクロカプセルが、海洋多糖であるアルギン酸塩（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ．、Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００３、５：６６５〜８）またはその誘導体に基づく。例えば、マイクロカプセルを、ポリアニオンのアルギン酸ナトリウムおよびセルロース硫酸ナトリウムと、ポリカチオンのポリ（メチレン−ｃｏ−グアニジン）塩酸塩との間における塩化カルシウム存在下での高分子電解質複合体化によって調製することができる。
【０２００】
細胞のカプセル化が、より小さいカプセルが使用されるときには改善されることが理解されるであろう。したがって、カプセル化された細胞の品質管理、機械的安定性、拡散特性およびインビトロ活性が、カプセルサイズが１ｍｍから４００．ｍｕ．ｍに縮小されたときに改善した（Ｃａｎａｐｌｅ  Ｌ．他、Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｉｚｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ、２００２、１３：７８３〜９６）。そのうえ、７ｎｍもの小さい十分に制御された細孔サイズ、調整された表面化学、および、精密な微細構造様式を有するナノ多孔性バイオカプセルが、細胞のための微小環境を首尾良く免疫隔離することが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ、Ｓｍａｌｌ  ｉｓ  ｂｅａｕｔｉｆｕｌ：ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９、１０：６〜９；およびＤｅｓａｉ，Ｔ．Ａ．、Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００２、２：６３３〜４６）。
【０２０１】
免疫抑制剤の例には、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、エタネルセプト、ＴＮＦアルファ遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物学的作用因、および、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が含まれるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナマート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤およびトラマドールが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０２】
本明細書中に記載される方法のどれにおいても、細胞は、それ自体で、または、好ましくは、医薬的に許容される担体をさらに含む医薬組成物の一部としてそのどちらでも投与することができる。
【０２０３】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される細胞組成物の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、医薬的に好適な担体および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、対象に対する細胞の投与を容易にすることである。
【０２０４】
本明細書中以降、表現「医薬的に許容される担体」は、対象に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。担体の非限定的な例としては、ポリプロピレングリコール、生理食塩水、乳剤、および有機溶媒と水の混合物が挙げられる。
【０２０５】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２０６】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０２０７】
好適な投与経路には、血液循環（静脈または動脈内）内へ、髄液内へ、または関心のある組織もしくは器官内への直接投与を含む。したがって、例えば細胞は脳内へ直接投与されることができる。
【０２０８】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外および細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。好ましくは、投与量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定される。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０２０９】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。例えば、脱髄性疾患の動物モデルには、シバラー（ｓｈｉ／ｓｈｉ、ＭＢＰ欠失）マウス、ＭＤラット（ＰＬＰ欠損）、Ｊｉｍｐｙマウス（ＰＬＰ変異）、イヌの身震いする子犬（ＰＬＰ変異）、単収縮体マウス（ガラクトシルセラミダーゼ欠如、ヒトのグラッベ病の場合のように）、振せん体マウス（ＰＭＰ−２２欠損）が含まれる。ウイルス誘導の脱髄モデルは、タイラーウイルスおよびマウス肝炎ウイルスの使用を含む。自己免疫性ＥＡＥが多発性硬化症のための可能なモデルである。
【０２１０】
これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。例えば、多発性硬化症患者を、処置に対する陽性の応答を示している改善された運動機能について症候的にモニターすることができる。
【０２１１】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。
【０２１２】
投薬量および投薬間隔は、脳疾患／障害を効果的に処置するために十分である有効成分のレベルに個々に調節され得る。所望される効果を達成するために必要である投薬量は、個体の特徴および投与経路に依存するであろう。様々な検出アッセイを、血漿中濃度を求めるために使用することができる。
【０２１３】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０２１４】
投与されるための組成物の量は当然のことながら、処置されている個体、病気の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存しているであろう。投与量および投与時期が、個体の変化する状態の注意深い連続したモニターリングに応じて変わるであろう。例えば、処置された多発性硬化症患者には、モニターしている徴候に基づいて、疾患の症状を軽減するために十分である量の細胞が投与されるであろう。
【０２１５】
本発明の細胞は、神経変性障害を処置することにおいて有用である治療剤、例えば、ガングリオシド；抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、トキシン、神経突起促進分子；ならびに、神経伝達物質分子（例えば、Ｌ−ＤＯＰＡなど）の代謝拮抗剤および前駆体などとともに共投与され得る。
【０２１６】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２１７】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０２１８】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０２１９】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０２２０】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０２２１】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【０２２２】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２２３】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２２４】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２２５】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０２２６】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０２２７】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０２２８】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０２２９】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０２３０】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０２３１】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０２３２】
本明細書で記載される各ｍｉＲについて対応する配列（成熟およびプレ）が本明細書の部分として見なされるべきである配列表に与えられる。
【０２３３】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０２３４】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０２３５】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ他編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ���Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２３６】
実施例１
ＭＳＣを星状膠細胞表現型に向かって分化させるための可溶性因子
材料および方法
星状膠細胞表現型を発現する細胞へのＭＳＣの分化：４つの異なる供給源から得られるＭＳＣ（骨髄（ＢＭ−ＭＳＣ）、脂肪細胞由来（ＡＤ−ＭＳＣ）、臍帯由来細胞および胎盤由来細胞）をこれらの研究において用いた。細胞を最初、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに１日間置床し、その後、ＳＨＨ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＮＭ培地に５日間にわたって移した。細胞を、ＩＢＭＸ（０．５ｍＭ）、ｄｂｃｙｃＡＭＰ（１ｍＭ）、ＰＤＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ニューレグリン（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦｂ（２０ｎｇ／ｍｌ）とさらに１０日間インキュベーションした。最後の段階で、細胞を、同じ因子が補充されるＧ５培地において５日間インキュベーションした。
【０２３７】
分化細胞を下記のマーカーについて分析した：
ネスチン、Ｏｌｉｇ２、β−ＩＩＩチューブリン、ＧＦＡＰ、グルタミンシンターゼ。
【０２３８】
結果
上記の分化プロトコルを使用した場合、ＢＭ−ＭＳＣ（図１）およびそれ以外のＭＳＣタイプ（データは示されず）の両方が星状膠細胞性の形態学を示し、星状膠細胞のマーカーであるＧＦＡＰについて陽性で染色された（図１）。
【０２３９】
本発明者らは分化細胞をさらに分析し、分化細胞が、図２および図３に示されるように、グルタミン酸輸送体と同様に、ＧＦＡＰおよびＳ１００のｍＲＮＡを発現することを見出した。
【０２４０】
実施例２
ＭＳＣを星状膠細胞に分化させるためのｍｉＲＮＡ
材料および方法
ｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析：対照ＭＳＣおよび分化ＭＳＣにおける特異的ｍｉＲＮＡの示差的発現を分析するために、幹細胞ミクロＲＮＡのｑＰＣＲアレイを、ＳＢＩ社から得られるｑｕａｎｔｉＭｉＲ（カタログ＃ＲＡ６２０Ａ−１）とともに用いた。
【０２４１】
このシステムは、２つの別個の実験用ＲＮＡサンプルの間における９５個の別々のミクロＲＮＡの倍数差を定量化することを可能にする。アレイプレートはまた、Ｕ６転写物を正規化シグナルとして含む。アレイのために選ばれる９５個すべてのミクロＲＮＡは、幹細胞自己再生、造血、ニューロン発達および分化組織特定における可能性のある役割に関して、公表された意味付けを有する。
【０２４２】
総ＲＮＡを、サイズが２００ｂｐ未満であるＲＮＡ画分を単離するＱｉａｇｅｎから得られるｍｉＲｎｅａｓｙ総ＲＮＡ単離キット（カタログ＃２１７００４）を使用して、対照ＭＳＣおよび分化ＭＳＣの１０５個〜１０６個の細胞から単離した。
【０２４３】
５００ｎｇの総ＲＮＡを、“ＳＢＩ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｑＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  ｗｉｔｈ  ＱｕａｎｔｉＭｉｒ（商標）”（Ｃａｔ．＃  ＲＡ６２０Ａ−１）の使用者プロトコル（その内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）に従って処理した。ｑＰＣＲのために、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲマスターミックス（ｃａｔ＃４３６７６５９）を使用した。
【０２４４】
妥当性確認のために、目的とする特異的ｍｉＲＮＡのｓｙｂｒ−ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲを、ＱＩＡＧＥＮ社のｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｓｙｓｔｅｍのハンドブック（ｃａｔ．＃２１８０６１＆２１８０７３）に従って処理される同じＲＮＡサンプルに対して行った。
【０２４５】
９６個のｍｉＲＮＡの発現を検出するＨｕ  ｈｓａ−ｍｉＲミクロＲＮＡプロファイリングキット（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）“ＳＢＩ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｑＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  ｗｉｔｈ  ＱｕａｎｔｉＭｉｒ（商標）”（Ｃａｔ．＃  ＲＡ６２０Ａ−１）を使用して、星状膠細胞に分化させられるＭＳＣと比較される非改変のＢＭ−ＭＳＣにおけるｍｉＲＮＡのプロファイリングを行った。５００ｎｇの総ＲＮＡをポリＡポリメラーゼによってその３’末端に対してポリ（Ａ）によりタグ化し、ＱｕａｎｔｉＭｉｒ  ＲＴ技術によってオリゴｄＴアダプターとともに逆転写した。ｍｉＲＮＡの発現レベルを、ＳＹＢＲグリーン試薬およびＶＩＩＡ７を使用する定量的ＰＣＲによって、すなわち、リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。すべてのｍｉＲＮＡをｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーおよび万能的逆方向プライマー（ＳＢＩ）により測定することができた。ｍｉＲＮＡの発現レベルを、下記の式により計算されるような相対的定量化のための比較ＣＴ法を使用して、Ｕ６  ｓｎＲＮＡに対して正規化した：２−［（ＣＴ星状膠細胞ｄｉｆｆ  ｍｉＲＮＡ−ＣＴ星状膠細胞内因性対照）−（ＣＴ  ＤＭＥＭ  ｍｉＲＮＡ−ＣＴ  ＤＭＥＭ内因性対照）］。
【０２４６】
結果
ＭＳＣの星状膠細胞への分化に関与している可能性のあるｍｉＲＮＡを特定するために、対照の非改変ＭＳＣのｍｉＲＮＡシグナチャーを星状膠細胞に分化させられるＭＳＣに対して比較した。
【０２４７】
幹細胞にすべてが関連づけられ、幹細胞とのそれらの公知の関連に基づいてサブグループ（神経関連ｍｉＲＮＡ、造血ｍｉＲＮＡおよび器官関連ｍｉＲＮＡ）に分けられた９６個のｍｉＲＮＡを含有するｑＲＴ−ＰＣＲマイクロアレイを分析した。
【０２４８】
図４〜図７に示されるように、各グループの特異的ｍｉＲＮＡの発現における有意な変化が対照ＭＳＣと分化ＭＳＣとの間に存在した。
【０２４９】
ｑＲＴ−ＰＣＲ研究を、対照細胞と分化細胞との間で認められたｍｉＲＮＡ発現における差を検証するために行った。
【０２５０】
マイクロアレイのデータに関して得られた結果と類似して、ｑＲＴ−ＰＣＲでは、分化させられたＭＳＣは、ｍｉＲ３２，１３３，２２１，１４５，３０２ａおよび３０２ｂにおける低下、並びにｍｉＲ９，２０ｂ，１０１，１４１，１４６ａおよび１４６ｂにおける増大を示すことが見出された。
【０２５１】
上記細胞の星状膠細胞分化における特異的ｍｉＲＮＡの役割をさらに調べた。ｍｉＲ−９およびｍｉＲ−２０ｂの組合せ、同様にまた、ｍｉＲ−２０ｂ、１０１および１４６ａの組合せもまた、ＧＦＡＰ発現を増大させたことが見出された。同様に、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−３０２を阻害し、かつ、ｍｉＲ−９、１４６および１０１を発現させることもまた、ＧＦＡＰ発現を増大させたことが見出された（データは示されず）。
【０２５２】
実施例３
ＭＳＣを星状膠細胞表現型に分化させるためのさらなるｍｉＲＮＡの特定
材料および方法
骨髄の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）をＧＦＡＰ−ＧＦＰレポーターにより形質導入した。その後、細胞をａｎｔａｇｏｍｉＲ−１３８およびｍｉＲ−１０１の両方によりトランスフェクションした。細胞を１０日後に蛍光顕微鏡で観察した。さらなる遺伝子アレイおよびｍｉＲアレイを使用して、分化細胞を特徴づけた。
【０２５３】
結果
図９Ａ〜図９Ｂに例示されるように、ｍｉＲ−１３８のサイレンシングをｍｉＲ−１０１の過剰発現と一緒に行うことにより、ＧＦＡＰ陽性細胞へのＭＳＣの分化が引き起こされる。加えて、これらの細胞はまた、高レベルのグルタミン酸輸送体を発現した（データは示されず）。
【０２５４】
ｍｉＲアレイ分析により、分化細胞において増大した下記のｍｉＲ、すなわち、ｍｉＲ−５０４、ｍｉＲ−８９１およびｍｉＲ−８７４が特定され、また、分化細胞において低下した下記のｍｉＲ、すなわち、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−４８７、ｍｉＲ−２１４およびｍｉＲ−４０９が特定された。分化した星状膠細胞の遺伝子アレイ分析により、骨形成分化、脂肪生成分化および軟骨形成分化に関係づけられる様々な遺伝子における低下、ならびに、神経マーカーの増大した発現が明らかにされた。同様に、分化した星状膠細胞は高レベルのＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦを発現したことが見出された。加えて、分化した星状膠細胞は、細胞遊走において役割を果たすＣＸＣＲ４、ケモカインおよびＩＬ−８の高いレベルを発現した。
【０２５５】
さらなるｍｉＲアレイ結果が本明細書中下記の表１および表２に提供される。表１は、非分化ＭＳＣと比較した場合、実施例１（材料および方法）に記載されるような、ＭＳＣの星状膠細胞への分化のときに（３倍を超えて）アップレギュレーションされるさらなるｍｉＲＮＡの列挙である。表２は、非分化ＭＳＣと比較した場合、実施例１（材料および方法）に記載されるような、ＭＳＣの星状膠細胞への分化のときに（３倍を超えて）ダウンレギュレーションされるさらなるｍｉＲＮＡの列挙である。
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【０２５６】
実施例４
ｍｉＲＮＡを使用するＭＳＣにおけるαシヌクレインのダウンレギュレーション
α−シヌクレインが成体の脳において広範囲に発現される。α−シヌクレイン遺伝子内の変異は常染色体優性家族性ＰＤに伴う。ヒト野生型形態の過剰発現およびα−シヌクレイン変異型形態の発現は、不溶性凝集物を形成し、酸化ストレスに対するニューロンの増大した感受性を生じさせるレビー小体の主要構造を構成するより大きい傾向を示す。
【０２５７】
いくつかの標的予測ソフトウエアツールを使用して、ｍｉＲ−５０４を、推定される候補物として特定し、α−シヌクレインの３’ＵＴＲ領域における可能性のあるｍｉＲ−５０４結合部位を特定した。ウエスタンブロット分析を使用して、ＭＳＣの星状膠細胞への分化を誘導するｍｉＲ−５０４はまた、α−シヌクレインの発現を低下させることが見出された（図１０）。
【０２５８】
実施例５
配列
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【０２５９】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０２６０】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図１Ａ−１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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