(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化合物からなる群から選択された少なくとも１つを含む、ヘモグロビンベース系治療剤。
【化１】
0006392855.tif 000002
（上記式中、Ｘはそれぞれクロスリンカーによって結合したヘモグロビン分子を表す。）
【請求項２】
前記クロスリンカーによって結合したヘモグロビン分子が、ウシ、ヒト、イヌ、ブタ、ウマ又は組換えのヘモグロビン分子または前記安定化ヘモグロビンを形成するためにクロスリンカーによって安定化されているそれらのサブユニットを含む、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
さらに、蛍光タンパク質、非タンパク質有機フルオロフォア、蛍光ナノ粒子および金属系発光染料からなる群から選択された少なくとも１種の蛍光標識試薬を含む、請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
前記非タンパク質有機フルオロフォアが、フルオレセイン、ダンシルまたはＴＡＭＲＡを含む、請求項３に記載の治療剤。
【請求項５】
前記がんを患う被検者の必要に応じて投与される組成物であって、治療上有効量の請求項１に記載の治療剤及び医薬的に許容される運搬体、塩、緩衝剤、溶液、またはそれらの組み合わせを含む、医薬組成物。
【請求項６】
癌の治療のために使用される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、静脈注射、腹腔内注射、または皮下注射からなる群から選択された少なくとも１種によって患者に投与される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記がんが膵臓がん、白血病、頭頸部がん、大腸がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、上咽頭がん、食道がん、脳がんからなる群から選択された少なくとも１種を含む、請求項６の組成物。
【請求項９】
前記がんが肝細胞がん、肝臓がん前駆細胞腫瘍、神経膠芽細胞腫、トリプルネガティブ前駆細胞含有腫瘍からなる群から選択された少なくとも１種を含む腫瘍である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の治療剤の調製方法であって：  a) ヘモグロビン分子を由来原料から提供し  b) 安定化ヘモグロビンを形成するために前記ヘモグロビン分子をクロスリンカーによって安定化させ  c) 前記安定化ヘモグロビンと１つまたは複数の官能基に続く前記修飾ヘモグロビンと活性剤のコンジュゲート、または前記コンジュゲートと前記安定化ヘモグロビンを結合させる前にリンカー活性剤とのコンジュゲートを形成するための活性剤と切断可能もしくは切断不可能なリンカーとのコンジュゲート反応によって修飾ヘモグロビンを形成するために前記安定化ヘモグロビンを化学的に修飾し、前記活性剤が5-フルオロウラシルまたはテモゾロマイドである、治療剤の調製方法。
【請求項１１】
ヘモグロビン分子の前記由来原料が、ウシ、ヒト、イヌ、ブタ、ウマおよび組換えのヘモグロビン分子あるいはそれらのサブユニットからなる群から選択された少なくとも１種を含む、請求項１０に記載の治療剤の調製方法。
【請求項１２】
前記活性剤が、１つまたは複数の蛍光タンパク質、非タンパク質有機フルオロフォア、蛍光ナノ粒子または金属系発光染料からなる群から選択された少なくとも１種を含む細胞／蛍光標識試薬と反応させることによって修飾ヘモグロビンを化学的に修飾するステップをさらに含む、請求項１０に記載の治療剤の調製方法。
【請求項１３】
前記非タンパク質有機フルオロフォアが、フルオレセイン、ダンシル、またはＴＡＭＲＡを含む、請求項１２に記載の治療剤の調製方法。
【請求項１４】
前記治療剤の治療上有効量の使用と、がんを標的とし治療するための医薬組成物を調製するために医薬的に許容される運搬体、塩、緩衝剤、溶液、またはそれらの組み合わせとをさらに含み、前記治療剤の前記治療上有効量が前記組成物を投与されている被検者の≦０．０３ｇ／ｋｇである、請求項１０に記載の治療剤の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その開示全体が本明細書に参照によって引用される２０１３年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／８２２，４６３号及び２０１４年５月１３日に出願された米国非仮特許出願第１４／２７５，８８５号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明はがん細胞を標的とする能力を有する物質を生成するために化学修飾されているヘモグロビン系治療剤について記述する。さらに本発明はヘモグロビンベース系治療剤を生成するための化学工業の設計について記述する。さらに本発明はヒトおよび他の動物のがん標的治療、特に肝臓がん、乳がん、膵臓がん、また各々の前駆細胞誘導性あるいは前駆細胞に関連した腫瘍の治療のための医薬組成物を含むヘモグロビンベース系治療剤に関する。また、本発明はライブセルイメージングおよび診断イメージングで使用される蛍光標識された修飾ヘモグロビンを提供する。
【０００３】
化学療法はがん細胞を治療するための抗がん薬の使用法である。化学療法は長年使用されており、最も一般的ながんの治療方法の一つである。多くの場合、化学療法はがん細胞が成長し再生する能力を阻害することによって効果を発揮する。別のグループの薬はがん細胞と闘うために別の方法によって効果を発揮する。化学療法はいくつかのタイプのがんに対しては単独で、あるいは放射能（放射線治療）や手術のような他の治療法との組み合わせにおいて使用することができる。しばしば、化学治療薬の組み合わせは特定のがんと闘うために使用される。５０を超えるがん治療薬が一般的に使用されている。
【０００４】
化学療法は確かにある一定のがんの治療に有効であることができるが、化学治療薬はがん細胞だけでなく身体のすべての部分に行きわたる。このことにより治療中に多くの副作用がある可能性がある。したがって、がん治療中の副作用を緩和し有効性を維持するために治療薬の投与量を低減する方法が必要である。投与量を低減するために、その方法は患者にとっても（副作用がより少ない）化学治療薬の製造者にとっても（製造コストがより低い）利益がある。
【０００５】
ロジウム−１０５複合体、サマリウム−１５３複合体およびその他の関連する複合体を含む一般的な放射線治療剤、これらの治療剤もがん患者にとって多くの副作用がある。
【０００６】
低酸素状態はがんでは一般的である。低酸素状態と（腫瘍の低酸素状態の原因となる）貧血状態はこれらの治療剤の細胞障害活性に必要な酸素を腫瘍細胞から奪うことによって電離放射線治療および化学療法への抵抗性を導く。低酸素状態ではまた、プロテオミクスおよびゲノミクスの変化を含む１つまたは複数の間接的なメカニズムによって放射線治療および化学療法に対する腫瘍の感受性を弱める。
【０００７】
したがって、当業者において非がん性細胞および組織へのがん治療の影響を弱め、がん細胞と組織を標的とするがん治療を改良する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明において、治療薬（例えば化学治療剤、放射線治療剤）によってがん細胞を効率的に死滅させるためにがん細胞を標的としたヘモグロビンベース系治療剤が提供される。一般的な化学治療剤および放射線治療剤が異なる患者に対して広く使用されているが、多くの副作用が見られる。この問題はヘモグロビンを化学修飾し１つまたは複数の治療薬と結合することによって克服することができる。有名ながん治療薬（例えば５−フルオロウラシル含有化学治療薬、テモゾロミド、シスプラチン）と比較したとき、本発明のヘモグロビンベース系治療剤はがん細胞を標的とできるだけでなく、腫瘍の治療においてもより一層効果的である。さらに、がんを標的としたヘモグロビンベース系治療剤は低用量で使用することができるため、治療薬の副作用は大きく低減される。
【０００９】
多くの治療薬は大変高価である。薬用量が低くなれば各患者の治療費を大幅に削減することができる。修飾ヘモグロビンはがん細胞を標的とすることができるため、ヘモグロビンベース系治療剤は薬用量を低減するよい手法である。
【００１０】
本発明の請求の範囲に係るヘモグロビンベース系治療剤はまた、ライブセルイメージングおよび診断イメージングを容易にするために蛍光プローブと結合することができる。すなわち、フルオレセインとコンジュゲートしたヘモグロビンベース系治療剤は肝臓がん細胞および乳がん細胞に取り込まれることができる。新たにフルオレセインとコンジュゲートしたヘモグロビンベース系治療剤の細胞への取り込みは、以下に述べるライブセル取り込みの一連の研究において、フルオレセインとコンジュゲートしたヘモグロビンベース系治療剤の細胞への即時利用によって実証されている。フルオレセインとコンジュゲートしたヘモグロビンベース系治療剤は１５分の曝露後に肝臓がん細胞（例えばＨｅｐＧ２細胞株）および乳がん細胞に取り込まれていることが観察され、曝露１時間後に信号のピークが観察される。
【００１１】
１個または複数のフルオレセイン分子（例えば７個のフルオレセイン分子）がライブセルイメージングと診断イメージングの信号強度を高めるために１個の安定化ヘモグロビン分子と結合することができる。本発明はがん治療のためにがん細胞を標的とする蛍光プローブとコンジュゲートしたおよびコンジュゲートしていないヘモグロビンベース系治療剤にも匹敵する。本発明の比較試験において、治療薬単体と比較したときにヘモグロビンベース系治療剤の投与量を低減することができる。本発明の請求の範囲に係るヘモグロビンベース系治療剤は、治療薬由来の副作用を大きく緩和することができることが試験結果によって裏付けられる。
【００１２】
したがって、本発明の第一の態様はがん細胞を標的とするために治療薬との結合体として利用されることができる１つまたは複数の官能基で化学的に修飾されたヘモグロビンを作製することである。本発明の第二の態様はがん細胞を死滅させるために修飾ヘモグロビンまたは安定化ヘモグロビンを治療薬（活性剤）に切断可能なもしくは切断不可能な結合またはリンカーを介して化学的に結合させることである。本発明におけるヘモグロビン分子に結合することができる治療薬または活性剤は、がんを標的とし緩和する効果があり本発明のヘモグロビン分子と安定化ヘモグロビン分子もしくは化学的に修飾されたヘモグロビン分子と前記リンカーを介して容易に結合する能力を持つと証明されている例えば５−フルオロウラシル、テモゾロミド、シスプラチン等の化学治療薬、またはロジウム−１０５複合体、サマリウム−１５３複合体およびその他の関連する複合体、または他の任意の治療薬もしくは化合物を含むがこれらに限定されない。治療薬との結合のほかに、本発明の安定化ヘモグロビン分子または修飾ヘモグロビン分子は、細胞もしくは蛍光タンパク質、非タンパク質有機フルオロフォア、蛍光ナノ粒子および金属系発光染料を含むがこれらに限定されない蛍光標識試薬とも結合することができる。
【００１３】
本発明はさらにヒトおよび他の動物のがんの標的治療のための医薬組成物を含むヘモグロビンベース系治療剤に関する。該組成物はがん治療のための治療上有効量の前記治療剤および医薬的に許容される運搬体、塩、緩衝剤、溶液、またはそれらの組み合わせを含む。本発明の第三の態様は前記組成物を様々な腫瘍およびがんを患う被検者に必要な投与を行うことによってがんを治療するための本発明の医薬組成物を含むヘモグロビンベース系治療剤を使用する方法の提供である。前記組成物は被検者に対して静脈注射、腹腔内注射、皮下注射を含むがこれらに限定されない様々な経路で投与することができる。切断可能な形状および切断不可能な形状双方のヘモグロビンベース系治療剤は肝臓がん（肝細胞がん）、大腸がん、非小細胞性肺がん細胞、白血病、神経膠芽細胞腫、乳がん（トリプルネガティブ乳がん）、膵臓がんを含むがんモデルでインビトロとインビボで検査した際にどちらでも有効性があることが明らかになった化学治療剤（例えば５−フルオロウラシル、５ＦＵ）のような活性剤を含む。
【００１４】
本発明のヘモグロビンベース系治療剤はまた、がん細胞を死滅させるためにより効率的であるように治療剤の標的をがん細胞とすることを容易にするために化学的に修飾されている。ヘモグロビン（Ｈｂ）は化学的に修飾されて異なる治療剤（例えば５ＦＵ、テモゾロミド、シスプラチンなど）に結合している。由来を異にするヘモグロビンはがん細胞を標的とするタンパク質である。標的とする、というこの特性ががん細胞、がん幹細胞および／またはがん前駆体細胞を効率的に死滅させることを容易にする。このようにして化学治療剤の投与量を低減することができる。
【００１５】
本発明で使用されるヘモグロビンベース系治療剤は膵臓がん、白血病、頭頸部がん、大腸がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、上咽頭がん、食道がん、脳がんのような様々ながんの治療において使用することができる。本発明はヘモグロビンベース系治療剤に関し、がんの治療法、（肝臓がん前駆細胞誘導性腫瘍異種移植片モデルにおいて例証することができる）肝臓がん、乳がん、特に（トリプルネガティブ前駆細胞誘導性腫瘍異種移植片モデルにおいて例証することができる）トリプルネガティブ乳がんを含むがこれらに限定されないがんの治療法および／またはがん組織の転移とがん組織の再生を阻害する方法に関する。腫瘍内の細胞は本質的に異種起源である。（１）限られた分裂能力を有する大多数のがん細胞、および（２）前駆細胞としても知られており、新規腫瘍細胞を形成することができ本質的に高い転移性を有する希少ながん幹細胞様細胞（ＣＳＣｓ）にまとめるのが一般的な考えである。化学療法抵抗性であり転移性であるという生来の特性のために、ＣＳＣｓはがん患者において再発の要因であると仮定されてきた。本発明の一態様において記されたような腫瘍前駆細胞誘導性マウスモデルは腫瘍の転移と再発の最良の典型的モデルである。
【００１６】
治療剤の部位ががん細胞を死滅させることができる一方でヘモグロビン部位ががん幹細胞を死滅させるために酸素を運搬することができるため、本発明のヘモグロビンベース系治療剤はがん治療において相乗効果を与えることになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図１は、ヘモグロビンベース系治療剤の構成の設計手法を示す。１つまたは複数の治療薬がヘモグロビンベース系治療剤を生成するため修飾されたヘモグロビンと結合することができる。修飾されたヘモグロビンまたは安定化ヘモグロビンは、切断可能な（１Ａ）あるいは切断不可能な結合（１Ｂ）により治療剤に化学結合することができる。
【００１８】
図２は、異種由来のヘモグロビンのアミノ酸配列を示す。
【００１９】
図３Ａは、（１）無水物、（２）ケテン、及び（３）ＮＨＳエステルにより化学修飾されたヘモグロビンを示す。
【００２０】
図３Ｂは、（１）カルビノールアミン、（２）カーボネート、（３）アミナール、（４）尿素、（５）アミド（２本の炭素鎖）、（６）アミド（１本の炭素鎖）、（７）アルキル鎖を有するジスルフィド、（８）カルビノールアミンを有するジスルフィド、（９）ジスルフィドによる化学修飾ヘモグロビンを示す。
【００２１】
図４は、（Ａ）Ｈｂ−５ＦＵ−アルキル（切断不可能）コンジュゲートおよび（Ｂ）Ｈｂ−５ＦＵ−カルビノールアミン（切断可能）コンジュゲートの合成スキームを示す。
【００２２】
図５は、（Ａ）安定型ヘモグロビン、（Ｂ）修飾ヘモグロビンベース系５ＦＵ（切断不可能）またはＨｂ−５ＦＵ−アルキル（切断不可能）コンジュゲート、および（Ｃ）修飾ヘモグロビンベース系５ＦＵ（切断可能なコンジュゲート）またはＨｂ−５ＦＵ−カルビノールアミン（切断可能）コンジュゲートのＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【００２３】
図６は、（Ａ）５ＦＵ−カルビノールアミン（切断可能）モデルおよび５ＦＵ−アルキル（切断不可能）モデル、（Ｂ）ＨＰＬＣ研究におけるヘモグロビンベース系５ＦＵ（Ｈｂ−５ＦＵ−カルビノールアミン（切断可能）コンジュゲート）からの５ＦＵの放出を示す。
【００２４】
図７は、膵臓がんＣａｐａｎ−１動物モデルにおけるヘモグロビンベース系５ＦＵの有効性（腫瘍サイズ）を示す。
【００２５】
図８は、膵臓がんＣａｐａｎ−１動物モデルにおけるヘモグロビンベース系５ＦＵの有
効性（腫瘍量）を示す。
【００２６】
図９は、薬治療後のＣａｐａｎ−１異種移植片を有するマウスの体重増加を示す。
【００２７】
図１０は、肝臓がんＳＭＭＣ７２２１の動物モデルのヘモグロビンベース系５ＦＵの有効性（腫瘍サイズ）を示す。
【００２８】
図１１は、肝臓がんＳＭＭＣ７２２１の動物モデルのヘモグロビンベース系５ＦＵの有効性（腫瘍量）を示す。
【００２９】
図１２は、ＣＤ１３３＋肝臓がん前駆細胞／がん幹細胞の様細胞ＨｅｐＧ２の動物モデルのヘモグロビンベース系５ＦＵの有効性（腫瘍サイズ）を示す。
【００３０】
図１３は、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−乳がん前駆細胞／がん幹細胞様細胞ＭＣＦ７の動物モデルのヘモグロビンベース系５ＦＵの有効性（腫瘍サイズ）を示す。
【００３１】
図１４は、インビトロでのＨＣＴ１１６大腸がんにおけるヘモグロビンベース系５ＦＵの有効性（細胞毒性）を示す。
【００３２】
図１５は、インビトロでのＨＣＴ４６０非小細胞肺がんにおけるヘモグロビンベース系５ＦＵの有効性（細胞毒性）を示す。
【００３３】
図１６は、インビトロでのＨＬ６０急性白血病におけるヘモグロビンベース系５ＦＵの有効性（細胞毒性）を示す。
【００３４】
図１７は、インビトロでのＡ１７２脳がんにおけるヘモグロビンベース系５ＦＵの有効性（細胞毒性）を示す。
【００３５】
図１８は、インビトロでの乳がんにおけるヘモグロビンベース系５ＦＵの有効性（細胞毒性）を示す。
【００３６】
図１９は、インビトロでの乳がんにおけるヘモグロビンベース系５ＦＵの有効性（細胞毒性）を示す。
【００３７】
図２０は、テモゾロミド（ＴＭＺ）と修飾ヘモグロビンのＴＭＺとの結合の構造を示す。
【００３８】
図２１は、ヘモグロビンベース系ＴＭＺのＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【００３９】
図２２は、ヘモグロビンベース系ＴＭＺのＬＣ−ＭＳの結果を示す。１つまたは複数のフルオロフォア分子が１つのヘモグロビン分子に結合できることを示す。
【００４０】
図２３は（Ａ）蛍光標識された修飾ヘモグロビン（Ｂ）１つの蛍光色素で標識されたＨｂ−５ＦＵ−アルキル（切断不可能）−ＦＬコンジュゲート（Ｃ）２つの蛍光色素で標識されたＨｂ−５Ｆｕ−Ｄａｎ−ＴＡＭコンジュゲートが肝臓がん細胞にうまく進入できることを示す。配列は蛍光信号（１つのあるいは２つの蛍光標識）が顕微鏡下で顕微鏡の異なるフィルタを用いて細胞のどこから検知されるかを示す。
【００４１】
図２４は異なるｐＨでの（ｐＨ８．０、８．３、８．５、８．８、９）６−カルボキシサクシンイミジルエステル（Ｆ−６−ＮＨＳ）修飾ヘモグロビンの各ユニットの変性を示す。
【００４２】
図２５はｐＨ８．５でのヘモグロビンに対するＦ−６−ＮＨＳの異なる比率の条件下（３、５、７、９当量）におけるＦ−６−ＮＨＳ修飾ヘモグロビンの各ユニットの変性を示す。
【００４３】
図２６はｐＨ８．５での異なる緩衝剤（酢酸、カーボネート、リン酸）における修飾ヘモグロビンと７当量のＦ−６−ＮＨＳのＦ−６−ＮＨＳ修飾ヘモグロビンの各ユニットの変性を示す。
【００４４】
図２７はケテン修飾ヘモグロビンの異なる条件下における変性を示す。
【００４５】
図２８は無水物修飾ヘモグロビンの異なる条件下における変性を示す。
【００４６】
図２９は（Ａ）概要スキームと（Ｂ）切断可能なジスルフィドリンカーを有する５ＦＵ修飾ヘモグロビン（５ＦＵ−アルキル−ジスルフィド（切断可能）ＮＨＳエステル）のＥＳＩ−ＭＳ方法による特性評価を示す。
【００４７】
図３０は（Ａ）概要スキームと（Ｂ）アルキル切断不可能リンカーと結合（コンジュゲート）した蛍光標識された５ＦＵ修飾ヘモグロビン（Ｈｂ−５ＦＵ−アルキル（切断不可能）ＦＬコンジュゲート）のＥＳＩ−ＭＳ方法による特性評価を示す。
【００４８】
図３１は（Ａ）概要スキームと（Ｂ）カルビノールアミン切断可能リンカーと結合（コンジュゲート）している蛍光標識された５ＦＵ修飾ヘモグロビン（Ｈｂ−５ＦＵ−カルビノールアミン（切断可能）ＦＬコンジュゲート）のＥＳＩ−ＭＳ方法による特性評価を示す。
【００４９】
図３２は（Ａ）概要スキームと（Ｂ）標識されている２つの蛍光色素で結合（コンジュゲート）した５ＦＵ修飾ヘモグロビン（Ｈｂ−５ＦＵ−Ｄａｎ−ＴＡＭ）の特性評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
「がん幹細胞」という用語は、生体内で腫瘍の成長を引き起こし維持させることができる腫瘍クローン内で生物学的に区別できる細胞（すなわち発癌性細胞）をいう。
【００５１】
「切断可能なコンジュゲート」という用語は、少なくとも一つの切断可能なリンカーと結合することをいい、それは加水分解または酸化還元反応により結合された治療薬／活性剤を容易に放出することができる。
【００５２】
「切断不可能なコンジュゲート」という用語は、少なくとも一つの切断不可能なリンカーと結合することをいい、それは加水分解または酸化還元反応により結合された治療薬／活性剤を容易に放出することができない。
【００５３】
背景技術にて述べたように、がん性腫瘍などの多くのがん組織は低酸素である。ヘモグロビンは低酸素状態を緩和するために使用されることができる。ヘモグロビンは多くの脊椎動物の脈管系と組織との間のガス交換のために重要な役割を果たしている。ヘモグロビンは、呼吸器系から体細胞へと血液循環によって酸素を運搬することに関与し、また代謝老廃物の二酸化炭素を体細胞から二酸化炭素を排出する呼吸器系へ運搬することに関与している。天然に存在するヘモグロビンは四量体であり、赤血球中に存在するときは通常安定している。しかし、天然に存在するヘモグロビンを赤血球から取り除くと、血漿内では不安定になり２つのα−β二量体に分離する。これらの二量体はそれぞれ分子量がおよそ３２ｋＤａである。これらの二量体は腎臓を通してろ過され排出されるときに重篤な腎損傷の原因となる可能性がある。また、四量体の結合の分離は、循環している機能性ヘモグロビンの持続可能性に悪影響を与える。
【００５４】
本発明の１つの実施態様において、ヘモグロビンは安定化四量体を形成するためにクロスリンカーによって安定化されている。安定化ヘモグロビンは酸素運搬の特性を持ち、ヒトまたは動物の体内のがん細胞またはがん組織を標的にすることができる。ヘモグロビンベース系酸素キャリアは化学的に修飾されて、受容体介在性機構を誘発しヘモグロビンベース系酸素運搬体と化学治療剤双方の有効性を高めるために結合した化学治療剤とともにがん細胞の細胞質中に局在化するよう導いている化学治療剤に結合されている。
【００５５】
ヘモグロビンベース系治療薬の構造設計は図１Ａと図１Ｂに示されている。１つまたは複数の活性剤（またはここでは「治療薬」と同じ意味で使われる）が本発明のヘモグロビンベース系治療剤を形成するために修飾ヘモグロビンまたは安定化ヘモグロビンと結合している。１つまたは複数の特定の活性剤は標的とされるがん組織のタイプおよび結果として生じる化学的に修飾された物質の望ましい分子の大きさによって選択することができる。さらに、複数の活性剤の場合は選択された活性剤が同じであっても異なっていてもよい。結果として生じた分子が有効性を保持しており、また、がん細胞を標的とするために安定化ヘモグロビンと結合することが可能である限り、それが活性剤等というものである。修飾ヘモグロビンまたは安定化ヘモグロビンは切断可能に（図１Ａ）または切断不可能に（図１Ｂ）治療薬／活性剤と化学的に結合することができる。ヘモグロビンの化学的修飾の異なる構造が本発明において調製されることができ、安定化ヘモグロビンは治療薬／活性剤に結合することができる。
【００５６】
いくつかの治療薬（例えば化学治療薬、５ＦＵ）は毒性が高いため高用量で使用することができない。本発明では、化学治療薬、５ＦＵは安定化ヘモグロビン（〜６５ｋＤａ）と化学的に結合している。ヘモグロビンの由来原料はウシ、ヒト、イヌ、ブタ、ウマおよび組換えのヘモグロビンおよび／またはサブユニットであってよいが、これらに限定されない。図２はウシ、ヒト、イヌ、ブタ、ウマのヘモグロビンのアミノ酸配列アライメントを示しており、それぞれＢ、Ｈ、Ｃ、Ｐ、Ｅと付記されている（配列番号１〜５はそれぞれウシ、ヒト、イヌ、ブタ、ウマのアルファヘモグロビン鎖であり、配列番号６〜１０はそれぞれウシ、ヒト、イヌ、ブタ、ウマのベータヘモグロビン鎖である）。由来が異なる異種アミノ酸には影をつけてある。図２はアミノ酸配列を比べたときヒトヘモグロビンがウシ、イヌ、ブタ、ウマのヘモグロビンと高い類似性を共有していることを表している。
【００５７】
ヘモグロビンは治療薬と結合する前に異なる官能基によって化学的に修飾されることができる。ヘモグロビンは（１）無水物、（２）ケテン、（３）ＮＨＳエステル、（４）イソチオシアン酸塩、（５）イソシアン酸塩、（６）活性化エステル（例えばフルオロフェニルエステル、アジ化カルボニル）、（７）塩化スルホニル、（８）カルボニルに続けて還元的アミノ化、（９）エポキシド、（１０）カーボネート、（１１）フルオロベンゼン、（１２）イミドエステル、（１３）ヒドロキシメチルホスフィン誘導体、（１４）マレイミド、（１５）ハロゲン化アルキルもしくはハロアセトアミド、（１６）ジスルフィド、（１７）チオ硫酸塩、（１８）アジリジン含有試薬、（１９）アクリロイル誘導体、（２０）アリール化剤、（２１）ビニルスルホン誘導体、（２２）天然型化学的ライゲーション（例えばチオエステル）、（２３）ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジドと結合しアルデヒドを生成するＮ末端セリンもしくはトレオニンの過ヨウ素酸酸化、（２４）カルボジイミド、（２５）４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェノール、（２６）カルボニルジイミダゾール、（２７）スルホＮＨＳ、（２８）ジアゾアルカンおよびジアゾアセチル化合物、（２９）マンニッヒ縮合物、（３０）ジアゾニウム誘導体、（３１）ジアジリン誘導体、（３２）ベンゾフェノンおよびアントラキノン、（３３）ピリドキサール−５−リン酸塩系のバイオミメティックアミノ基転移によるＮ末端修飾、（３４）バイオ直交性機能（例えばアルキンおよびアジド）とそれに続くバイオ直交性共役反応（例えばアルキンおよびアジドの双極子付加ヒュスゲン１、３−双極子付加、アジドとトリアリルホスフォリンのシュタウディンガーライゲーション、アルケンとテトラジンのディールス‐アルダー反応、アルケンとテトラゾールの光化学反応）、（３５）金属カルベノイド、（３６）パラジウム活性化アリル試薬、（３７）光親和性標識試薬、によって修飾されることができる。図３Ａは（１）無水物、（２）ケテン、（３）ＮＨＳエステルによって化学的に修飾されたヘモグロビンを示す。図３Ｂは（１）カルビノールアミン、（２）カーボネート、（３）アミナール、（４）尿素、（５）アミド（２本の炭素鎖）、（６）アミド（１本の炭素鎖）、（７）アルキル鎖を有するジスルフィド、（８）カルビノールアミンを有するジスルフィド、（９）ジスルフィドによって化学的に修飾されたヘモグロビンを示す。一方で、安定化ヘモグロビンは切断可能または切断不可能なリンカーによって治療薬および／または蛍光剤と直接的に結合することができる。
【００５８】
切断不可能なリンカー（切断不可能なコンジュゲート）を利用して５ＦＵ（Ｈｂ−ＦＵ）と結合している修飾ヘモグロビンが図４Ａに示されており、切断可能なリンカー（切断可能なコンジュゲート）を利用して５ＦＵ（Ｈｂ−ＦＵ）と結合している修飾ヘモグロビンが図４Ｂに示されている。ＬＣ−ＭＳ実験において示されるように修飾ヘモグロビンが５ＦＵと結合していることは成功裏に論証されている。５ＦＵとＨｂ−ＦＵの質量はそれぞれ１３０Ｄａと〜６５ｋＤａである。生理的条件下で切断されることができる切断可能なリンカー（例えばカルビノールアミン、ジスルフィド、カルバミド、アミナール、カーボネート、エステル、カルバマート、リン酸、アミド、アセタール、イミン、オキシム、エーテル、スルホンアミド基）はヘモグロビン部分と治療的部分の間に挿入されることができる。アルキルおよびアリール基のリンカーから成る切断不可能なリンカーもまた加水分解および／または酸化還元反応では容易に切断されないヘモグロビン部分と治療部分の間に挿入されることができる。図５は（Ａ）安定化ヘモグロビン（Ｂ）修飾ヘモグロビンベース系５ＦＵ（切断不可能なコンジュゲート）および（Ｃ）修飾ヘモグロビンベース系５ＦＵ（切断可能なコンジュゲート）のＬＣ−ＭＳの結果を示す。本発明の医薬組成物はがん細胞を標的としがん治療において治療効果を有する本発明のヘモグロビンベース系治療剤を含む。
【００５９】
（Ａ）５ＦＵ−カルバノールアミン（切断可能）モデルと５ＦＵ−アルキル（切断不可能）モデルおよび（Ｂ）切断可能なリンカーを有するヘモグロビンベース系５ＦＵ（Ｈｂ−５ＦＵカルバノールアミンコンジュゲート）からの５ＦＵの放出が図６Ａと図６Ｂにそれぞれ示されている。５ＦＵ−カルバノールアミン（切断可能）モデルと５ＦＵ−アルキル（切断不可能）モデルからの５ＦＵの放出（図６Ａ）は５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）と５０％ヒト血漿中で行われる。９００μＬの５０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）または５０％ヒト血漿のいずれかが入っている１．５ｍＬエッペンチューブにサンプル１００μＬ（１０μｍｏｌ／ｍＬ  ＤＭＳＯ）を入れ、室温（２５℃）または３７℃に置く。１００μＬのアリコートをＨＰＬＣ分析の様々な時点で引き出す。５０％ヒト血漿のサンプルの溶液からは、アリコートを引き出し、その後同量のＴＨＦで冷却して１分間撹拌する。３２００ｒ．ｐ．ｍ．で２分間遠心分離した後、上澄みのアリコートをピペットで採取しＨＰＬＣによって分析する。切断可能なリンカーを有するヘモグロビンベース系５ＦＵ（Ｈｂ−５ＦＵカルバノールアミン（切断可能）コンジュゲート）からの５ＦＵの放出（図６Ｂ）はＤＢ緩衝液（ｐＨ７．４）と５０％ヒト血漿中で行われ、ＨＰＬＣによって分析される。
【００６０】
５ＦＵ−カルバノールアミン（切断可能）モデルの分解は降順に以下の条件と比率で観察される。３７℃で５０％ヒト血漿＞３７℃でＰＢＳ（ｐＨ７．４）＞室温（室温、２５℃）でＰＢＳ（ｐＨ７．４）。５ＦＵ−アルキル（切断不可能）モデルはこれらのいずれの条件下においても安定している。
【００６１】
切断可能なリンカーを有するヘモグロビンベース系５ＦＵ（Ｈｂ−５ＦＵカルバノールアミン（切断可能）コンジュゲート）の分解は降順に以下の条件と比率で観察される：３７℃で５０％ヒト血漿＞３７℃でＤＢ緩衝液（ｐＨ７．４）。
【００６２】
本発明の医薬組成物はがん細胞を標的としがん治療に治療効果を有するヘモグロビンベース系治療剤を含む。我々の動物研究において、ヘモグロビンベース系５ＦＵで処理した２０〜２２％腫瘍容積（図７）でおよび１３０％腫瘍量（図８）で膵臓がんを異種移植したマウス（Ｃａｐａｎ−１）の腫瘍の成長が抑制されたことが判明した。２８日の処理期間後に著しい体重の減少は観察されず（図９）、ヘモグロビンベース系５ＦＵが細胞毒性を有さないことを示唆している。同じような傾向がヘモグロビンベース系５ＦＵで処理した３８％腫瘍容積（図１０）でおよび３３％腫瘍量（図１１）で肝臓がんを異種移植したマウス（ＳＭＭＣ７２２１）における腫瘍成長の抑制において観察することができる。我々の動物研究において、ヘモグロビンベース系５ＦＵで処理した肝臓がんＣＤ１３３＋幹細胞様細胞または乳がんＣＤ４４＋／ＣＤ２４−幹細胞様細胞を移植したマウスの腫瘍の成長が著しく抑制されたことが判明した。腫瘍成長の抑制はそれぞれＣＤ１３３＋ＬＣＳＣ異種移植で１８８％（図１２）、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−ＢＣＳＣ異種移植で２００％（図１３）検知された。
【００６３】
上記のヘモグロビンベース系５ＦＵの他のがん細胞を標的とする能力が様々なインビトロのモデルにおいて認められる。ＭＴＴ測定法を採用することにより、様々ながん細胞のヘモグロビンベース系５ＦＵの細胞毒性が測定された。すなわち：ＨＣＴ１１６結腸直腸がんにおいて２０％の細胞死（図１４）、Ｈ４６０非小細胞性肺がん細胞において６０％（図１５）、Ｊｕｒｋａｔ白血病細胞において２８％（図１６）、Ａ１７２神経膠芽細胞腫脳がんにおいて５７％（図１７）、ＭＣＦ７乳がん細胞において３５％（図１８）、Ｈｕｈ７肝臓がん細胞において２０％（図１９）。
【００６４】
テモゾロミド（ＴＭＺ）の構造とＴＭＺと結合した修飾ヘモグロビンが図２０に示される。ＬＣ−ＭＳ実験において示される通り、修飾ヘモグロビンがＴＭＺに結合していていることは成功裏に論証されている。図２１は本発明のヘモグロビンベース系ＴＭＺのＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【００６５】
図２２は１つまたは複数のフルオレセイン（例えばフルオレセイン６−カルボキシサクシンイミジルエステル、Ｆ−６−ＮＨＳ）が１つのヘモグロビン分子と結合していることを示す。蛍光標識ヘモグロビンもまたがん細胞（例えば肝臓がん細胞）に入り、その結果は図２３Ａに示される。修飾ヘモグロビンベース系治療剤もまたがん細胞を効果的に死滅させることが期待されている。いかにさまざまな形態の修飾ヘモグロビンベース系５ＦＵががん細胞に取り込まれることができるかを明確に記するために、ライブセルイメージングが本発明において採用されている（図２３Ａ、２３Ｂ）。肝臓がん細胞、ＨｅｐＧ２およびＣＤ１３３＋肝臓がん幹細胞様細胞が肝臓がん細胞への取り込み前に０．０１２５ｇ／ｄＬに１５分間曝露される。１５分間の曝露の後、修飾ヘモグロビンベース系５ＦＵががん細胞の細胞質に取り込まれる様子が観察される。曝露１時間後に取り込みのピークがまた観察される。
【００６６】
Ｆ−６−ＮＨＳによる修飾ヘモグロビンの条件はｐＨ、モル比、緩衝剤を含む異なるパラメータで最適化される。図２４は異なるｐＨでの（ｐＨ８．０、８．３、８．５、８．８、９．０）Ｆ−６−ＮＨＳ修飾ヘモグロビンの各ユニットの変性を示す。安定化ヘモグロビンの化学修飾に望ましい条件はｐＨ８．５である。図２５はｐＨ８．５でのヘモグロビン１当量に対する（３、５、７、９当量）Ｆ−６−ＮＨＳの異なる比率の条件下におけるＦ−６−ＮＨＳ修飾ヘモグロビンの各ユニットの変性を示す。Ｆ−６−ＮＨＳと安定化ヘモグロビンの望ましい比率は７：１である。図２６はｐＨ８．５での異なる緩衝剤（酢酸、炭酸、リン酸）におけるＦ−６−ＮＨＳとヘモグロビン（７：１当量）のＦ−６−ＮＨＳ修飾ヘモグロビンの各ユニットの変性を示す。異なる緩衝剤の条件下で転換の著しい差は無い。
【００６７】
ケテンによるヘモグロビンの修飾の条件はｐＨ、温度、モル比を含む異なるパラメータで最適化される。図２７はケテン修飾ヘモグロビンの異なる条件下における変性を示す。望ましい条件はｐＨ９、３７℃で３０当量である。
【００６８】
無水物によるヘモグロビン修飾の条件もまたｐＨとモル比を含む異なるパラメータで最適化される。図２８は無水物修飾ヘモグロビンの異なる条件下における変性を示す。望ましい条件はｐＨ９で３０当量である。
【００６９】
切断可能なリンカーとしてジスルフィドを含む５ＦＵと共役結合した修飾ヘモグロビン（Ｈｂ−５ＦＵ−ジスルフィド（切断可能）コンジュゲート）の構造が図２９Ａに示されている。ＬＣ−ＭＳ実験において示されるように、修飾ヘモグロビンが切断可能なジスルフィドリンカーを介して５ＦＵに結合していることは成功裏に論証されている。図２９ＢはＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【００７０】
ライブセルイメージングまたは診断イメージングの目的で、ヘモグロビンベース系５ＦＵコンジュゲートは蛍光色素、例えばフルオロセイン−６で標識化されている。図３０は（Ａ）概要の図解と（Ｂ）アルキル切断不可能リンカーと共役結合している蛍光標識化された５ＦＵ修飾ヘモグロビン（Ｈｂ−５ＦＵ−アルキル（切断不可能）ＦＬコンジュゲート）のＥＳＩ−ＭＳ方法による特性評価を示す。図３１は（Ａ）概要の図解と（Ｂ）カルビノールアミン切断可能リンカーと共役結合している蛍光標識化された５ＦＵ修飾ヘモグロビン（Ｈｂ−５ＦＵ−カルビノールアミン（切断可能）ＦＬコンジュゲート）のＥＳＩ−ＭＳ方法による特性評価を示す。
【００７１】
イメージングの目的で、ヘモグロビンベース系５ＦＵコンジュゲートもまた２つの蛍光色素で標識されている（図３２Ａに示される）。５ＦＵ−ダンシルの約２つの分子とＴＡＭＲＡの２つの分子が修飾ヘモグロビンの一つの分子上で共役結合している。修飾ヘモグロビン溶液（１ｍＬ、１０ｇ／ｄＬ、１．５６ｍＭ、ＤＢ緩衝剤、ｐＨ８．５）のある溶液をＤＭＳＯ中の５５μＬのＴＡＭＲＡ  ＮＨＳ（１００ｍＭ、３．５当量）と、ＤＭＳＯ中の５５μＬの５ＦＵ−ダンシルＮＨＳ（１００ｍＭ、３．５当量）に加える。反応液を室温で４時間撹拌し、次にバイオゲルＰ−３０ゲルで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特性評価をする（図３２Ｂに示される）。２つの蛍光標識された５ＦＵ修飾ヘモグロビンコンジュゲート（Ｈｂ−５ＦＵ−Ｄａｎ−ＴＡＭ）もまたダンシルー５ＦＵ（４８８ｎｍで励起）とＴＡＭヘモグロビンベース系剤（５５５ｎｍで励起）の双方ががん細胞の細胞質において検知されている（図２３Ｃ）ヘモグロビンベース系５ＦＵと同様の方法で取り込まれることができる。
【００７２】
市場ではヘモグロビンベース系治療剤は入手できない。本発明で調製された医薬組成物を含む修飾ヘモグロビンベース系治療剤は治療効果を有しがん細胞を標的とすることができる。がん治療に使用するために、本発明の医薬組成物を含む修飾ヘモグロビンベース系治療剤はがん細胞を死滅させる抗がん剤として提供される。修飾ヘモグロビンベース系治療剤は低用量で使用でき他の分子を標的とした薬剤または細胞毒性剤と併用できるよい候補である。
【実施例】
【００７３】
次の例は、如何なる意味でも本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の特定の態様を説明するものとして提供される。
【００７４】
実施例１ａ
ケテンの合成
ジクロロメタン（ＤＣＭ）（１００ｍＬ）中で十分撹拌された５−ヘキシン−１−オール（４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（４．５ｍｍｏｌ）を０℃でメチルスルホニルクロリド（ＭｓＣｌ）（ＤＣＭ中４．１ｍｍｏｌ）に滴下した。混合液を一晩撹拌し室温まで温めた。重炭酸ナトリウム（液体）を反応混合液に注ぐと有機相が分離した。水層がＤＣＭで抽出され、混合した有機抽出物を水と塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥し溶媒を蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン中２０％酢酸エチル）によって粗メシレートを精製し無色の油を得た。
【００７５】
アセトン（６０ｍＬ）中のメシレート（２ｍｍｏｌ）溶液に反応混合液中でヨウ化カリウム（２．５ｍｍｏｌ）を加え還流するまで２０時間熱した。室温まで冷却した後、ろ過して沈殿物を取り出した。ろ過ケークをアセトン溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、溶媒を蒸発させた。残留油分をエーテル（１００ｍＬ）で希釈しチオ硫酸ナトリウム（飽和、１０ｍＬ）で洗浄した。水溶液をエーテルで抽出し混合有機抽出物を塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し溶媒を蒸発させた。残留物を真空で分留しヨウ化化合物５−ヘキシン−１−アイオダイドを得た。
【００７６】
リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ヘキサン中１Ｍ、２０ｍＬ）を−７８℃で乾燥したテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）中フェニル酢酸メチル（２．７３ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）溶液に滴下した。1時間後、反応混合液を０℃まで温め、溶液に乾燥したテトラヒドロフラン（５ｍＬ）の中の５−ヘキシン−１−アイオダイド（４．１６ｇ、２０ｍｍｏｌ）を滴下した。０℃で１．５時間撹拌した後、反応混合液を水洗浄および飽和塩化アンモニウム溶液で急冷しジエチルエーテルで抽出した。有機層と無水硫酸マグネシウムを混合し乾燥させて４．１７ｇのアルキン官能基化エステルを得た。
【００７７】
アルキン官能基化エステルのメタノール（１００ｍＬ）および水（２ｍＬ）溶液（４．１７ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）を水酸化カリウムパレット（１．５ｇ、２７ｍｍｏｌ）で処理し、還流するまで一晩熱した。反応混合液を真空で濃縮した。反応混合液に水を加え、次にジメチルエーテルで洗浄した。液体の層を収集し塩酸で酸性化しエーテルで抽出した。有機層と無水硫酸マグネシウムを混合し乾燥させ、真空で濃縮してアルキン官能基化カルボン酸を無色の油として得た。
【００７８】
室温の乾燥したジクロロメタン（５ｍＬ）中のアルキン官能基化カルボン酸（１．０８ｇ、５ｍｍｏｌ）を塩化オキサリル（ジクロロメタン中２Ｍ、５ｍＬ）に加え、反応混合液を２時間撹拌した。溶液を窒素雰囲気下で蒸留し淡黄色の油を得た。淡黄色の油は乾燥したテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中で溶解し、乾燥したトリエチルアミン（６ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に滴下した。得られた混合液を０℃で２時間撹拌した。生成した塩を窒素雰囲気下でろ過しろ液を１１０℃（１ｍｍＨｇ）で蒸留し淡黄色の油としてケテンを得た。
【００７９】
実施例１ｂ
ケテンを使用したペプチドとヘモグロビンの修飾
１．０ｍＬエッペンチューブ中でペプチドＹＴＳＳＳＫＮＶＶＲ水溶液（１ｍＭ、１０μＬ）、ケテン（１０当量、乾燥テトラヒドロフラン中１００ｍＭケテン原液の１μＬ）およびリン酸緩衝剤（ｐＨ６．３およびｐＨ７．４、８０μＬ）を混合した。反応混合液を室温で２時間置いた。ペプチドの転換は反応混合液のＬＳ−ＭＳ分析の全イオン数から測定した。ＭＳ／ＭＳ（タンデム質量分析）を使用し、Ｎ−末端の選択率を測定した。
【００８０】
１．０ｍＬエッペンチューブ中で、緩衝剤中の安定化ヘモグロビン溶液（１．５６ｍＭ、４０μＬ）、ケテン（１０、２０、３０、４０、５０当量、乾燥テトラヒドロフラン中１００ｍＭケテン原液）、およびリン酸緩衝剤（ｐＨ６．３、７．４、９、１６０μＬ）を混合した。混合反応液を室温で一晩置いた（１セット３７℃でｐＨ９）。タンパク質の転換は反応混合液のＬＣ―ＭＳ分析の全イオン数から測定した。図２７は異なる条件下（ｐＨ、温度、モル比）のケテン修飾ヘモグロビンの変性を示す。好ましい条件はｐＨ９、３７℃で３０当量である。
【００８１】
実施例２ａ
無水物の合成
アルキンで官能化されたカルボン酸（１００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１８０．５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のトリエチルアミン（０．５ｍｍｏｌ）を室温で一晩撹拌した。反応混合液を水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し真空で濃縮し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン中４％エチルアセテートで溶出）によって精製し無水物を得た。
【００８２】
実施例２ｂ
無水物を使用したペプチドとヘモグロビンの修飾
１．０ｍＬエッペンチューブ中で、ペプチドＹＴＳＳＳＫＮＶＶＲ水溶液（１ｍＭ、１０μＬ）、無水物（１０当量、乾燥テトラヒドロフラン中１００ｍＭ無水物原液の１μＬ）およびリン酸緩衝剤（ｐＨ６．３およびｐＨ７．４、８０μＬ）を混合した。反応混合液を室温で２時間置いた。ペプチドの転換は反応混合液のＬＣ−ＭＳ分析の全イオン数から測定した。ＭＳ／ＭＳ分析を使用し、Ｎ−末端の選択率を測定した。
【００８３】
１．０ｍＬエッペンチューブ中で、緩衝剤中の安定化ヘモグロビン溶液（１．５６ｍＭ、４０μＬ）、無水物（１０、２０、３０、４０、５０当量、乾燥テトラヒドロフラン中１００ｍＭ無水物原液）、およびリン酸緩衝剤（ｐＨ６．３、７．４、９、１６０μＬ）を混合した。混合反応液を室温で一晩置いた（１セット３７℃でｐＨ９）。タンパク質の変性は反応混合液のＬＣ―ＭＳ分析の全イオン数から測定した。図２８は異なる条件下（ｐＨ、温度、モル比）の無水物修飾ヘモグロビンの変性を示す。好ましい条件はｐＨ９、３０当量である。
【００８４】
実施例３ａ
ＮＨＳエステルの合成
アルキン官能基を持つカルボン酸（１００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）（６４．４ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１８０．５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン中の４−ジ（メチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）（触媒量０．５ｍｇ）（２０ｍＬ）を室温で一晩撹拌した。反応混合液を水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し真空で濃縮し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン中５０％エチルアセテートで溶出）によって精製しＮＨＳエステルを得た。
【００８５】
実施例３ｂ
ＮＨＳエステルを使用したペプチドと安定化ヘモグロビンの修飾
６．８μＬ（１０ｎｍｏｌ）の安定化ヘモグロビン溶液（１００ｍｇ／ｍＬ、１．５６ｍＭ）あるいは１０μＬのＹＴＳＳＳＫＮＶＶＲ原液（１ｍＭ）を１．５ｍＬのエッペンチューブ中の１８０μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４、１０ｍＭ）緩衝剤と５μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の混合液に加えた（安定化ヘモグロビン／ＹＴＳＳＳＫＮＶＶＲ最終濃度：０．０５ｍＭ）。乾燥テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中にＮＨＳエステル（０．８ｍｇ）溶液（２ｍＭ）を０．５μＬ（０．１当量／滴、１０、２０、４０滴）滴下し、２分毎に一滴１０μＬ（０．２当量／滴、５、１０、２０滴）ずつ滴下し、即座にボルテックスミキサーにかけた。滴下は９０分で終え反応液をさらに２．５時間室温に置いた。次にＰＢＳ（ｐＨ７．４、１０ｍＭ）緩衝剤中のエタノールアミン溶液（２０ｍＭ）を反応液に加え、残存するフリーＮＨＳエステルを室温で３時間急冷した。
【００８６】
実施例４ａ
フルオレセイン６−ＮＨＳエステルを有する安定化ヘモグロビンの修飾
安定化ヘモグロビン溶液（９．９ｇ／ｄＬ）をフルオレセイン６−カルボキシルサクシンイミジルエステル（Ｆ−６−ＮＨＳ）で修飾した。反応条件（ｐＨ、比率、時間、緩衝剤）が最適化され、反応混合液はＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳによって特性評価した。安定化ヘモグロビン溶液を窒素下で酢酸（０．２Ｍ）と水酸化ナトリウム（０．１Ｍ）で異なるｐＨ（それぞれｐＨ８．０、８．３、８．５、８．８、９．０）に調節した。異なる当量（それぞれ３、５、７、９当量）のＤＭＳＯ中のＦ−６−ＮＨＳを安定化ヘモグロビン溶液に滴下し、異なる反応時間（それぞれ２、３、４、５時間）暗所で窒素下で撹拌した。過剰なＦ−６−ＮＨＳはバイオスピントリス３０カラム（１０ｋ）（あるいはウルトラアミコン４ｍＬ、３ｋ）で取り除かれた。修飾ヘモグロビン溶液をＲＡ緩衝剤（ｐＨ７．５）中で保存し、ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳで特性評価した。
【００８７】
実施例４ｂ
異なるｐＨでのＦ−６−ＮＨＳ修飾ヘモグロビンの変性
異なるｐＨ（ｐＨ８．０、８．３、８．５、８．８、９．０）でのＦ−６−ＮＨＳ修飾ヘモグロビンの各ユニットの変性が最適化された。変性は反応混合液のＬＣ−ＭＳ分析の全イオン数から測定した。Ｆ−６−ＮＨＳの安定化ヘモグロビンに対する比率３：１で１ｍＬＲＡ緩衝剤で４時間、暗所にて変性を行った。結果を図２４に示す。好ましいｐＨの条件は８．５であった。図２４において、ａ=α鎖、ａ１=モノ−フルオレセインで修飾したα鎖、ａ２=ジ−フルオレセインで修飾したα鎖、ａ３=トリ−フルオレセインで修飾したα鎖、２ａ=α−α鎖、２ａ１=モノ−フルオレセインで修飾したα−α鎖、２ａ２=ジ−フルオレセインで修飾したα−α鎖、２ａ３=トリ−フルオレセインで修飾したα−α鎖、２β=β−β鎖、２β１=モノ−フルオレセインで修飾したβ−β鎖、２β２=ジ−フルオレセインで修飾したβ−β鎖、２β３=トリ−フルオレセインで修飾したβ−β鎖、２β４=テトラ−フルオレセインで修飾したβ−β鎖、２β’=β’−β’鎖、２β’１=モノ−フルオレセインで修飾したβ’−β’鎖、２β’２=ジ−フルオレセインで修飾したβ’−β’鎖、２β’３=トリ−フルオレセインで修飾したβ’−β’鎖、２β’４=テトラ−フルオレセインで修飾したβ’−β’鎖である。
【００８８】
実施例４ｃ
安定化ヘモグロビンに対するＦ−６−ＮＨＳの異なる比率におけるＦ−６−ＮＨＳ−修飾ヘモグロビンの変性
暗所で４時間、ｐＨ８．５、１ｍＬのＲＡ緩衝剤中における安定化ヘモグロビンに対するＦ−６−ＮＨＳの異なる比率（３、５、７、９当量）のＦ−６−ＮＨＳ−修飾ヘモグロビン各ユニットの変性を行った。安定化ヘモグロビンの濃度は９．９ｇ／ｄＬである。転換は反応混合液のＬＣ−ＭＳ分析の全イオン数から測定した。結果を図２５に示す。安定化ヘモグロビンに対するＦ−６−ＮＨＳの好ましい比率は７：１であった。
【００８９】
実施例４ｄ
異なる飯能時間におけるＦ−６−ＮＨＳ−修飾ヘモグロビンの変性
暗所で異なる反応時間（２、３、４、５時間）ｐＨ８．５、１ｍＬのＲＡ緩衝剤中における７当量のＦ−６−ＮＨＳ−修飾ヘモグロビン各ユニットの変性を行った。安定化ヘモグロビンの濃度は９．９ｇ／ｄＬであった。転換は反応混合液のＬＣ−ＭＳ分析の全イオン数から測定した。好ましい反応時間は４時間であった。
【００９０】
実施例４ｅ
異なる緩衝剤中におけるＦ−６−ＮＨＳ−修飾ヘモグロビンの変性
暗所で４時間、ｐＨ８．５、安定化ヘモグロビンに対するＦ−６−ＮＨＳが７当量の異なる緩衝剤（酢酸、カーボネート、リン酸緩衝剤）中におけるＦ−６−ＮＨＳ−修飾ヘモグロビン各ユニットの変性を行った。安定化ヘモグロビンの濃度は９．９ｇ／ｄＬであった。修飾ユニットの質量と強度と相応するユニットの質量と強度の合計との比率から変性体を得た。結果を図２６に示す。異なる緩衝剤の使用によって変性に大きな差はなかった。
【００９１】
実施例５ａ
５ＦＵ−カルビノールアミン（切断可能）ＮＨＳエステルの合成
５ＦＵカルビノールアミンコハク酸（３７５ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２９９ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、４９９ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、３０ｍｇ、触媒）溶液をジクロロメタン（２０ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１ｍＬ）中で窒素雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。沈殿物をろ過し５ＦＵ−カルビノールアミン（切断可能）ＮＨＳエステルを得た。
【００９２】
実施例５ｂ
５ＦＵ−カルビノールアミン（切断可能）ＮＨＳエステルによるヘモグロビンの修飾
１ｍＬの修飾ヘモグロビン溶液（１０ｇ／ｄＬ、１．５６ｍＭ、ＤＢ緩衝剤、ｐＨ８．５）を１１０μＬの５ＦＵ−カルビノールアミン（切断可能）ＮＨＳエステル（１００ｍＭ、７当量）と共にＤＭＳＯに加えた。反応液を室温で４時間撹拌し、バイオゲルＰ−３０ゲルを用いて精製しＥＳＩ−ＭＳによって特性評価した。推定変性収率は９５％であった。切断可能な５−ＦＵの約６個の分子が修飾ヘモグロビンの１個の分子とコンジュゲートした。
【００９３】
実施例６ａ
５ＦＵ切断不可能ＮＨＳエステルの合成
ＤＭＦ（６ｍＬ）中５ＦＵ溶液（１．００ｇ、７．６９ｍｍｏｌ）にトリエチルアミン（１．０８ｍＬ、７．６９ｍｍｏｌ）を滴下した。１０分間撹拌した後、メチルアクリレート（１．３８ｍＬ、１５．４ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合液を室温で２０時間撹拌し続けた。粗混合液を真空で濃縮しシリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィー（５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）によって精製し、メチルエステルを物質として得た。メチルエステル溶液（６５０ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）を５％塩酸（３５ｍＬ）に溶解した。反応混合液を３時間還流しながら加熱した。混合液が冷めたらＨ２Ｏ（２０ｍＬ）を加え有機層をエチルアセテート（６×２０ｍＬ）で抽出した。複合有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、ろ過して真空で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製した。
【００９４】
得られた物質の溶液（３７５ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２９９ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、４９９ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ（２０ｍＬ）中の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、３０ｍｇ、触媒）とＤＭＦ（１ｍＬ）を室温、窒素雰囲気下で１８時間撹拌した。沈殿物をろ過し５ＦＵ−アルキル（切断不可能）ＮＨＳエステルを得た。
【００９５】
実施例６ｂ
５ＦＵ切断不可能ＮＨＳエステルを有するヘモグロビンの修飾
１ｍＬの修飾ヘモグロビン溶液（１０ｇ／ｄＬ、１．５６ｍＭ、ＤＢ緩衝剤、ｐＨ８．５）をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中の１１０μＬの５ＦＵ切断不可能ＮＨＳ（１００ｍＭ、７当量）に加えた。反応液を室温で４時間撹拌した後、バイオゲルＰ−３０ゲルを用いて精製しＥＳＩ−ＭＳによって特性評価した。推定変性収率は９５％であった。切断不可能５ＦＵの約６個の分子が修飾ヘモグロビンの１個の分子と結合（コンジュゲート）した。
【００９６】
実施例７ａ
切断可能な５ＦＵジスルフィドＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成
５ＦＵ−１−プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１７９ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）溶液、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の４−[[２−[（２−アミノエチル）ジチオ]エチル]アミノ]−４−オキソ−ブタン酸（１２６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）にトリエチルアミン（０．２５ｍＬ、０．７５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合液を室温（２５℃）で４時間撹拌し続けた。粗混合液を真空で濃縮しフラッシュクロマトグラフィー（５％ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出）で精製し、物質５ＦＵ−ジスルフィド（切断可能）コハク酸を得た。
【００９７】
５ＦＵジスルフィドコハク酸溶液（１０９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、９６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（５ｍＬ）中の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１ｍｇ、触媒）を室温（２５℃）、窒素雰囲気下で１２時間撹拌した。粗反応混合液を真空で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（５％ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出）で精製し、白色固体として物質５ＦＵ−ジルスフィド（切断可能）ＮＨＳエステルを得た。
【００９８】
実施例７ｂ
５ＦＵ−ジスルフィド（切断可能）−ＮＨＳを有するヘモグロビンの修飾
１ｍＬの修飾ヘモグロビン溶液（１０ｇ／ｄＬ、１．５６ｍＭ、ＤＢ緩衝剤、ｐＨ８．５）をＤＭＳＯ中の１１０μＬの５ＦＵ−ジルスフィド（切断可能）ＮＨＳエステル（１００ｍＭ、７当量）に加えた。反応液を室温で４時間撹拌した後、バイオゲルＰ−３０ゲルを用いて精製し、ＥＳＩ−ＭＳによって特性評価した。５ＦＵジスルフィドの約４個の分子が修飾ヘモグロビンの１個の分子と結合（コンジュゲート）した。
【００９９】
実施例８
テモゾロミドジスルフィドＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成
テモゾロミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを撹拌した溶液（１４６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）および氷水浴中の乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）中の４−[[２−[（２−アミノエチル）ジチオ]エチル]アミノ]−４−オキソ−ブタン酸（１２６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）にトリエチルアミン（０．３ｍＬ、０．５５ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を室温（２５℃）まで温め、４時間撹拌した。粗反応混合液を真空で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製し（４０％ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出）、白色固体として物質テモゾロミドジスルフィドコハク酸を得た。
【０１００】
テモゾロミドジスルフィドコハク酸（７８．５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３１ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、５２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を室温（２５℃）、窒素雰囲気下で１２時間撹拌した。粗反応混合液を真空で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製（５％ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出）し、白色固体として物質テモゾロミドジスルフィドＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを得た。
【０１０１】
実施例９
フルオレセイン６−ＮＨＳおよび５ＦＵ切断可能ＮＨＳエステルを有するヘモグロビンの修飾
１ｍＬの修飾ヘモグロビン溶液（１０ｇ／ｄＬ、１．５６ｍＭ、ＤＢ緩衝剤、ｐＨ８．５）をＤＭＳＯ中の５５μＬのフルオレセイン−６ＮＨＳ（１００ｍＭ、３．５当量）とＤＭＳＯ中の５５μＬの５ＦＵ切断可能ＮＨＳ（１００ｍＭ、３．５当量）に加えた。反応液を室温で４時間撹拌し、バイオゲルＰ−３０ゲルを用いて精製し、ＥＳＩ−ＭＳによって特性評価した。切断可能な５ＦＵの約２．５個の分子とフルオレセインの２．５個の分子が修飾ヘモグロビンの１個の分子とコンジュゲートした。
【０１０２】
実施例１０
フルオレセイン６−ＮＨＳおよび（１つの蛍光色素で標識された）５ＦＵ切断不可能ＮＨＳエステルを有するヘモグロビンの修飾
１ｍＬの修飾ヘモグロビン溶液（１０ｇ／ｄＬ、１．５６ｍＭ、ＤＢ緩衝剤、ｐＨ８．５）をＤＭＳＯ中の５５μＬのフルオレセイン６−ＮＨＳ（１００ｍＭ、３．５当量）とＤＭＳＯ中の５５μＬの５ＦＵ切断不可能ＮＨＳ（１００ｍＭ、３．５当量）に加えた。反応液を室温で４時間撹拌し、バイオゲルＰ−３０ゲルを用いて精製し、ＥＳＩ−ＭＳによって特性評価した。切断不可能５ＦＵの約２．５個の分子とフルオレセインの２．５個の分子が修飾ヘモグロビンの１個の分子とコンジュゲートした。
【０１０３】
実施例１１
ライブセルイメージングのために（２つの蛍光色素で標識された）ヘモグロビン−５ＦＵ−２染料コンジュゲートのための異なる化合物の合成
ライブセルイメージングのためのヘモグロビン−５ＦＵ−２染料コンジュゲートの合成のために、前駆体はリジン−銅錯体、５ＦＵリジン、５ＦＵダンシルリジン、５ＦＵダンシルリジンＮＨＳエステル、５ＦＵダンシルリジンエタノールアミン、５ＦＵダンシルリジンコハク酸、５ＦＵダンシルリジンＮＨＳエステルを含む。
【０１０４】
実施例１１ａ
リジン−銅錯体の組成
炭酸水素ナトリウム溶液（１Ｍ、４０ｍＬ）溶液中のＬ−リジン溶液（３．１４ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）に硫酸銅（II）（５水和物、２．１５ｇ、８．６０ｍｍｏｌ）を一滴加えた。暗青色の懸濁液を３時間撹拌しメタノール（１５ｍＬ）を加えた。反応液を室温で２４時間放置した。残存した青色の懸濁体をろ過し、真空で乾燥し、リジン−銅錯体（青色粉末）を得た。
【０１０５】
実施例１１ｂ
５ＦＵリジンの組成
リジン銅錯体（７２．４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（３４．４ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（５ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、５ＦＵ−アルキル（切断不可能）ＮＨＳエステル（１２３ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を濁った青色の懸濁液に加えた。室温で１６時間撹拌を続けるうちに、色が澄明な明青色（沈殿物は無い）に変わる時点が観測された。次に硫化ナトリウム（１６．４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を反応混合液に加えると灰茶色に変わった。粗混合液を希塩酸でｐＨ４に中性化した。沈殿物をろ過し残留したろ液を真空で濃縮し冷メタノール（２０ｍＬ）で洗浄した。粗澄明な残留物を得て、精製せずに次の段階で使用した。
【０１０６】
実施例１１ｃ
５ＦＵダンシルリジンの組成
ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）中の５ＦＵリジン（２７１ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）溶液に０℃でトリエチルアミン（２ｍＬ）を滴下した。１５分間撹拌した後、５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−塩化スルホニル（２７０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を加えると、途中で澄明から緑茶色への色の変化が観察された。暗所、室温で２４時間撹拌した後、反応混合液を真空で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（２０％メタノール／ジクロロメタンで溶出）によって精製し、黄色固体として５ＦＵダンシルリジンを得た。
【０１０７】
実施例１１ｄ  ５ＦＵダンシルリジンＮＨＳエステルの組成
ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中の５ＦＵダンシルリジン（９８．０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５０．４ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（３０．０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（４ｍｇ、触媒）を加えた。反応混合液を暗所室温で１８時間撹拌した。その後、反応混合液を真空で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（２０％メタノール／ジクロロメタンで溶出）を使って精製し、黄色固体として５ＦＵダンシルリジンＮＨＳエステルを得た。
【０１０８】
実施例１１ｅ  
５ＦＵダンシルリジンエタノールアミンの組成
室温でジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）中の５ＦＵダンシルリジンＮＨＳエステル（１０３ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）溶液にエタノールアミン（５００μＬ）を滴下した。反応混合液を暗所で１２時間撹拌した。その後、反応混合液を真空で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（２０％メタノール／ジクロロメタンで溶出）を使って精製し、黄色固体として５ＦＵダンシルリジンエタノールアミンを得た。
【０１０９】
実施例１１ｆ
５ＦＵダンシルリジンコハク酸の組成
テトラハイドロフラン（２ｍＬ）中の５ＦＵダンシルリジンエタノールアミン（２８．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）にトリエチルアミン（０．５０ｍＬ）および無水コハク酸（４０．０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液を加熱し３時間還流した。一度冷却し、反応混合液を真空で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（２０％メタノール／ジクロロメタンで溶出）を使って精製し、黄色固体として５ＦＵダンシルリジンコハク酸を得た。
【０１１０】
実施例１１ｇ
５ＦＵダンシルリジンＮＨＳエステルの組成
ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中の５ＦＵダンシルリジンコハク酸（２６．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１８．０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（２２．０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２ｍｇ、触媒）を加えた。反応混合液を室温で２０時間撹拌した。溶媒を真空で取り除き、粗残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２０％メタノール／ジクロロメタンで溶出）を使って精製し、黄色膜として５ＦＵダンシルリジンＮＨＳエステルを得た。
【０１１１】
実施例１２
ライブセルイメージングのためのＴＡＭＲＡ−ＮＨＳおよび５ＦＵ−ダンシルＮＨＳエステルを有するヘモグロビンの修飾
１ｍＬの修飾ヘモグロビン溶液（１０ｇ／ｄＬ、１．５６ｍＭ、ＤＢ緩衝剤、ｐＨ８．５）をＤＭＳＯ中の５５μＬのＴＡＭＲＡ  ＮＨＳ（１００ｍＭ、３．５当量）とＤＭＳＯ中の５５μＬの５ＦＵ−ダンシルＮＨＳ（１００ｍＭ、３．５当量）に加えた。反応液を室温で４時間撹拌し、バイオゲルＰ−３０ゲルを用いて精製し、ＥＳＩ−ＭＳによって特性評価した。５ＦＵ−Ｄａｎｓの約２個の分子とＴＡＭＲＡの２個の分子が修飾ヘモグロビンの１個の分子とコンジュゲートした。
【０１１２】
実施例１３
異なるがん細胞株のための培養と試薬
がん細胞をＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンと共に３７℃で培養した。正常酸素圧の条件下で細胞を周囲のＯ２濃度および５％のＣＯ２で定温放置し、低酸素条件下で細胞を０．１〜０．５％のＯ２（クオラムＦＣ−７自動ＣＯ２／Ｏ２／Ｎ２ガスミキサー）と５％のＣＯ２で定温放置した。肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、ＳＭＭＣ７２２１、乳がん細胞４Ｔ１、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、神経膠芽細胞腫脳がん細胞Ａ１７２およびＵ８７ＭＧ、結腸直腸がん細胞ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９、白血病細胞Ｈ６０およびＪｕｒｋａｔ、非小細胞性肺がん細胞Ａ５４９およびＨ４６０、膵臓がん細胞ＪＦ３０５およびＣａｐａｎ−１を含む使用した付着性がん細胞株と非付着性がん細胞株双方の培養条件は同程度である。
【０１１３】
実施例１４
がん幹細胞様／前駆細胞の分離、培養および試薬
推定肝臓がんおよび乳がん幹細胞様／前駆細胞（ＣＤ１３３＋ＬＣＳＣｓおよびＣＤ４４＋／ＣＤ２４−ＢＣＳＣｓ）をフローサイトメトリー解析によってヒト肝臓がん細胞から分取あるいは分離した。これらの分取された細胞は自己再生能を持ち、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの少数のみに注射したときに腫瘍を形成することができ、インビトロで球状体を形成することができ、および本質的に化学療法抵抗性が高いという特性を有していた。ＰＥ−コンジュゲートされた単クローン性マウス抗ヒトＣＤ１３３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したＨｅｐＧ２肝臓がん細胞、およびＰＥ−コンジュゲートされた単クローン性マウス抗ヒトＣＤ２４およびＡＰＣ−コンジュゲートされた単クローン性マウス抗ヒトＣＤ４４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したＭＣＦ７乳がん細胞を蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）にかけた。アイソタイプＩｇＧ１ｋ−ＰＥ、ＩｇＧ２Ｂ−ＰＥ、ＩｇＧ２Ａカッパ−ＡＰＣ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｌｔｄ．）をコントロールとして用いた。サンプルを分析しＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて分取した。最も明るく染色された２５％の細胞あるいは最もかすかに染色された２５％の細胞を陽性集団と陰性集団として選択した。分取した細胞の幹細胞性は次に行うウエスタンブロッティングとＣＤ１３３、Ｏｃｔ  ４の染色およびＳｏｘ２多能性マーカーによって検証した。
【０１１４】
分取したＬＣＳＣｓを次にヒトＭａｍｍｏｃｕｌｔ増殖補填剤（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）、０．４８μｇ／ｍＬの溶解したばかりのヒドロコルチゾン、４μｇ／ｍＬの未使用ヘパリンを補給したヒトＭａｍｍｏｃｕｌｔ基本培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）における非付着性培養条件下に移した。抗生物質は培地に加えなかった。調製したばかりの培地を０．２μｍの低タンパク結合フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌｔｄ．）を用いてろ過した。ＬＣＳＣ球状体は懸濁液中で直径が約７０μｍの大きさに達するまで成長することができた。７０μｍの大きさを越えたＬＣＳＣ球状体は１０００ｒｐｍで３分間遠心分離によって継代培養し、次にトリプシン−ＥＤＴＡで１分間物理的に解離し、続いて新しい培地で再懸濁した。
【０１１５】
実施例１５
がん細胞のライブセル経時的顕微鏡検査法
がん細胞（例えばＨｅｐＧ２肝臓がん細胞）をガラス底マイクロウェル皿（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上に播種する。大気／温度調節室およびマルチポジション画像取得の電動ステージを備えたＺｅｉｓｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１広角顕微鏡を用いて規定のズーム（６３ｘ、２０ｘ）でのライブセルを取得した。（あらかじめ混合した）０．１％Ｏ２および０．５％ＣＯ２によりパージされた密閉型ライブセルイメージングシステムにおいて定温放置した。細胞は（１）１つの蛍光色素で標識されたＨｂ−５ＦＵ−アルキル（切断不可能）−ＦＬコンジュゲート（２）２つの蛍光色素で標識されたＨｂ−５ＦＵ−Ｄａｎ−ＴＡＭコンジュゲートに１５分間曝露した後、３分毎に２時間画像を取得した。画像は畳み込みを解き、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を利用して低速度撮影動画に圧縮した。画像を図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃに示す。
【０１１６】
実施例１６
がん細胞株の細胞毒性アッセイ
３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２、５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）増殖アッセイを利用して細胞生存能力を測定した。簡単に述べると、がん細胞株（例えばＨｅｐＧ２あるいはＨｕｈ７肝臓がん細胞）を９６孔フラット底マイクロプレート（６０００細胞／孔）に播種し１００μＬの増殖培地で３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。各孔の細胞培地を薬物無し、５ＦＵ単独、修飾ヘモグロビンベース系５ＦＵ（Ｈｂ−ＦＵ）とＩＣ５０濃度の別の化学療法剤をそれぞれ含む１００μＬの細胞増殖培地に交換した。５ＦＵあるいはＨｂ−ＦＵを２４時間定温放置し、２０μＬのＭＴＴ標識試薬（ＰＢＳ溶液中５ｍｇ／ｍＬ）を各孔に加えてさらに４時間３７℃で定温放置した。増殖培地をゆっくりと取り除き、ホルマザン結晶を完全に溶解するための可溶化剤として２００μＬのＤＭＳＯを各孔に加えた。波長５７０ｎｍの吸光度をＭｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって測定し、各データポイントは孔数の３倍の平均±標準偏差を表す。
【０１１７】
実施例１７
免疫不全ヌードおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける様々な腫瘍異種移植片モデルの確立と投与計画
２つの皮下腫瘍モデルを確立するためにヒトがん細胞をｂａｌｂ／ｃヌードマウスに接種した。処置前に実験動物を無作為に９つの異なるグループ（１グループあたり４〜８匹のマウス）に振り分けた。実験動物にはそれぞれ（１）ＲＡ−緩衝剤（２）０．４ｇ／ｋｇ（ヒトに対しては０．０３ｇ／ｋｇ）の安定化ヘモグロビン単体（週に１回、４回投与）（静注、ｉ．ｖ．）、（３）８０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵ（週に１回、４回投与）（ｉ．ｖ．）、（４）５ＦＵおよび安定化ヘモグロビンの同時投与（５ＦＵの処置１時間前に安定化ヘモグロビンを処す）、（５）安定化ヘモグロビンの複数回投与（安定化ヘモグロビンを１日目と４日目に投与、４週間）、（６）０．４ｇ／ｋｇの５ＦＵとコンジュゲートした切断不可能型安定化ヘモグロビン（週に１回、４回投与）（ｉ．ｖ．）、（７）０．４ｇ／ｋｇの５ＦＵとコンジュゲートした切断可能型安定化ヘモグロビン（週に１回、４回投与）（ｉ．ｖ．）を与えた。
【０１１８】
がん細胞の腫瘍形成性は生後５週のｂａｌｂ／ｃヌードマウスの側腹部へ１〜５×１０６のがん細胞を皮下注射することより測定した。がん前駆細胞については、１×１０5の成功裡に単離した前駆細胞を異種移植片を確立するためのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。各グループは４匹から８匹の実験動物を含む。約０．３〜０．５ｃｍ３の腫瘍が検知された後３日毎にカリパスで腫瘍の大きさを測定し、腫瘍容積を容積（ｃｍ３）＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２にて計算した。屠殺する日にマウスの重量を測定し、屠殺直後に採取した腫瘍の重量を測定し画像を撮影した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【配列表】
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