(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟卵母細胞の発達を促すインビトロの方法であって、
卵巣組織を、有効な用量のＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）またはＣＮＰ融合タンパク質およびＲ−スポンジンタンパク質またはＲ−スポンジン融合タンパク質の一方または両方と、１時間〜５日の期間インビトロで一時的に接触させて、成熟卵母細胞の発達を促すことを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｒ−スポンジンタンパク質またはＲ−スポンジン融合タンパク質が、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２またはＲ−スポンジン１−Ｆｃである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記卵巣組織を、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）またはＣＮＰまたはＣＮＰ融合タンパク質と接触させて、成熟卵母細胞の発達を促すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
成熟卵母細胞が、排卵前卵胞に含まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
排卵前卵胞が二次卵胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
排卵前卵胞が胞状卵胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
インビトロでの有効量がおよそ０．５ｎｇ／ｍｌ〜およそ１０ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
卵巣組織が、ウマ、イヌ、ウシ、ブタ、マウス、ネコ、バッファロー、ジャイアントパンダ、チンパンジー、ゴリラ、クジラおよびイルカからなる群から選択される哺乳動物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
インビボでの成熟卵母細胞の発達を促すための薬剤であって、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）またはＣＮＰ融合タンパク質およびＲ−スポンジンタンパク質またはＲ−スポンジン融合タンパク質の一方または両方を含有し、
前記薬剤が、有効な用量のＣＮＰまたはＣＮＰ融合タンパク質およびＲ−スポンジンタンパク質またはＲ−スポンジン融合タンパク質の一方または両方と卵巣組織とが１時間〜５日の期間接触して、成熟卵母細胞の発達を促すように、投与される、薬剤。
【請求項１０】
前記Ｒ−スポンジンタンパク質またはＲ−スポンジン融合タンパク質が、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２またはＲ−スポンジン１−Ｆｃである、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１１】
卵巣組織がインタクトな卵巣である、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記接触することがインビボで行われる、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記接触することがインビトロで行われる、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１４】
前記卵巣組織がヒト由来である、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１５】
インビボでの有効量が、およそ０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜およそ５００μｇ／ｋｇ体重／日である、請求項９に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された認可番号ＨＤ０６０８１５８の下、政府の支援によってなされたものである。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の生殖細胞の成長および成熟は、下垂体前葉によって分泌されるゴナドトロピンを含むホルモン、および局所的なパラクリン因子によって複雑に制御されている。成人ヒト卵巣内の卵母細胞の大半は、周囲の卵胞体細胞によって包まれた状態で、第１減数分裂前期という長い期間において維持される。定期的に、一群の原始卵胞が卵胞の成長期に入る。この期間中、卵母細胞の体積は大きく増加し、卵胞顆粒膜細胞の数が増加する。成熟中の卵母細胞は、卵胞細胞を増殖させるパラクリン因子を合成し、卵胞細胞は、血管形成を亢進する成長因子および分化因子（例えば、ＴＧＦ−β２、ＶＥＧＦ、レプチン、およびＦＧＦ２）を分泌して卵母細胞を成長させる。卵母細胞およびそれらの卵胞は、体細胞のアポトーシスを防止する性腺刺激ホルモンに曝露されない限り、ある段階まで進行した後で死滅する。
【０００３】
哺乳類の卵巣は、基本的な機能単位としての卵胞からなる。卵胞の合計数は早い時期に決定され、このプールの枯渇が生殖老化の原因となる。各卵胞は発育して、排卵するか、またはむしろ変性する可能性が高い。個々の卵胞は、最も内側の卵母細胞、それを取り囲む顆粒膜細胞、および外側の層である卵胞膜細胞からなる。各卵胞の運命は、内分泌因子およびパラクリン因子によって支配される。卵胞は、原始卵胞、一次卵胞、および二次卵胞の段階を経て発育した後で卵胞腔を得る。胞状卵胞の段階では、思春期後に発生する周期的なゴナドトロピン刺激下で小数の卵胞が排卵前段階に達し、生殖可能年齢の女性において卵巣エストロゲンの周期的分泌の主な供給源となる。各生殖周期中の排卵前のゴナドトロピンサージに応じて、優勢なグラーフ卵胞が排卵して受精のための成熟卵母細胞を放出する一方で、残りの卵胞細胞および顆粒膜細胞は変化を経て黄体になる。
【０００４】
一旦、成長プールに入ると、卵胞は、損失を最小限に抑えて、一次、二次、および初期胞状卵胞の段階へと進行する。ＦＳＨ治療は、主として初期胞状卵胞のアポトーシスを抑制することにより、不妊症患者において排卵前卵胞を作り出すために広く使用されているが、月経周期３日目の血清ＦＳＨの上昇およびＡＭＨ値の低下に反映されるように、卵巣に含まれる初期胞状卵胞が少ないために、中にはＦＳＨ治療に対する反応性が低い患者もある。
【０００５】
生殖寿命を通して、原始卵胞は、最初のリクルートを経て一次卵胞の成長プールに入る。ヒト卵巣において、一次卵胞が二次卵胞の段階に達するには１２０日超が必要であるのに対し、二次卵胞から初期胞状卵胞の段階まで成長するには７１日を必要とする。一旦、成長プールに入り始めると、卵胞は胞状卵胞の段階に達するまで進行し、初期胞状卵胞の段階まで最小限の卵胞損失が認められた。周期性リクルートメントの間、循環ＦＳＨの増加により、胞状卵胞のコホートはアポトーシス死を免れることができる。このコホートの間に、主席卵胞が、高レベルのエストロゲンおよびインヒビンを分泌することにより優勢となって出現し、下垂体のＦＳＨ放出を抑制する。その結果は、残りのコホートの陰性選択であり、最終的にはその死滅を引き起こす。それと同時に、局所成長因子および脈管構造の増加により優勢卵胞の陽性選択が可能となり、したがって、その最後の成長ならびに最終的な排卵および黄体形成を確実なものとする。周期的リクルートメントの後、胞状卵胞が優勢グラーフ卵胞になるのにわずか２週間しかかからない。ヒト卵胞の原始卵胞から排卵前段階への全体的な発育は、６ヶ月以上を要する。
【０００６】
最も小さな原始卵胞および一次卵胞から最も大きな排卵前卵胞への卵胞の発育は、異なる段階依存性の刺激因子および生存因子を必要とする。ＦＳＨ、アクチビン、神経成長因子、およびＧＤＦ−９は、一次卵胞および／または二次卵胞の成長および分化にとって重要である。胞状卵胞および排卵前卵胞の成長は、ゴナドトロピン刺激に依存し、ＦＳＨは、周期的リクルートメントの間に初期胞状卵胞をアポトーシス死から救う主要な生存因子である。ＦＳＨｃｔｐ（長時間作用型ＦＳＨアゴニスト）による処理は、卵巣重量を増加させ、卵胞発育を増進した。したがって、卵胞の発育は、ゴナドトロピン依存性段階と、ゴナドトロピン応答性段階とに分けることができる。
【０００７】
卵胞のインビトロ成熟のための方法を含む、一次卵胞から二次卵胞、胞状卵胞、および排卵前卵胞の段階まで卵胞を効率的に成熟させる方法についての関心が非常に高い。本発明は、この課題に対応する。
【０００８】
刊行物
Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｄｅｖ  Ｄｙｎ２３７：１０９９−１１１１，Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＷＮＴ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｒｅ  ｗｉｄｅｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｏｖａｒｉｅｓ，ｏｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｔａｇｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ。Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ２４：１５２９−１５４２，Ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ（ＣＴＮＮＢ１）ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｒｅｏｖｕｌａｔｏｒｙ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｕｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ＬＨ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｖｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｕｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ。Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ１９：２５８８−２５９６，Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ。ＭｃＧｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ５７：９９０−９９８，Ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｅａｎｔｒａｌ  ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｒａｔｓ。Ｔａｒｌａｔｚｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ  ９：６１−７６，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｏｖａｒｉａｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＩＶＦ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ。Ｃｈａｓｓｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ１７：１２６４−１２７７，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｒｓｐｏ１  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｏｖａｒｙ。Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ１７：１２７８−１２９１，Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１  ｐｌａｙｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｗｎｔ−４  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ。Ｐａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ３８：１３０４−１３０９Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｓｋｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ。
【０００９】
Ｓｕｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ１６８：８６３−８７０，Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  （ＣＮＰ）：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｂｒａｉｎ。Ｋｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１２０−１２３，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  （ＣＮＰ）。Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ５６：５９−６６，Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｏｖａｒｙ  ａｒｅ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｓｔｒｏｕｓ  ｃｙｃｌｅ。Ｇｕｔｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ６１：１６２−１７０，Ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｓｃｉｅｎｃｅ３３０：３６６−３６９Ｇｒａｎｕｌｏｓａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｇａｎｄ  ＮＰＰＣ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＰＲ２  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｍｅｉｏｔｉｃ  ａｒｒｅｓｔ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｏｏｃｙｔｅｓ。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０７：１０２８０−１０２８４，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｒｍａｎｔ  ｏｖａｒｉａｎ  ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｍａｔｕｒｅ  ｅｇｇｓ。Ｋａｗａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０２：９２０６−９２１１，Ｏｖａｒｉａｎ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｅｍｂｒｙｏｓ。
【発明の概要】
【００１０】
一次卵胞の二次卵胞または前胞状卵胞への発育を刺激するのに十分な期間、一次卵胞を有効用量のＲ−スポンジンアゴニストまたはＣＮＰアゴニストのうちの少なくとも１つと接触させることによって、インビトロおよびインビボでの哺乳類の前胞状卵胞の発育を促進するための方法が提供される。
【００１１】
また、前胞状卵胞の胞状卵胞への発育を刺激するのに十分な期間、前胞状卵胞を有効量のＣＮＰアゴニストと接触させることによる胞状卵胞刺激の方法も提供される。ＣＮＰは、本明細書において、二次／前胞状卵胞の初期胞状卵胞段階への発育を促進し、したがって、ＬＨアゴニストによって、例えば、連続的なｅＣＧ−ｈＣＧ処理によって、排卵の効率的な誘発を可能にすることが示される。いくつかの実施形態において、卵胞発育の最後から２番目の段階から排卵前段階において、ＣＮＰがＦＳＨに取って代わることができ、そのため、ＣＮＰ治療は、従来のＦＳＨ治療に対する反応性が低い患者に利益をもたらし得る。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態において、曝露はインビトロで、例えば、器官または組織培養中で行われ、少なくとも１つの卵胞が、有効用量のＲ−スポンジンアゴニストまたはＣＮＰアゴニストのうちの少なくとも１つに一時的に曝露される。処理された卵胞は、例えば、インビトロ受精、胚性幹細胞の産生等のために、インビトロで用いられてもよいか、またはインビボでの使用を提供するために移植されてもよい。対象となる移植方法として、限定されないが、卵巣の全てまたは断片を含む１つ以上の卵胞の、腎臓カプセル、皮下部位、卵巣部位への移植が挙げられ、その場合、例えば、１つの卵巣が保持され、１つの卵巣はエクスビボ処理のために除去され、１つ以上の処理された卵胞が残りの卵巣の部位に移植されてもよい。
【００１３】
いくつかの実施形態において、インビトロ処理の後に、排卵前卵母細胞を産生するように原始卵胞または一次卵胞を活性化させるための卵巣移植が行われ、その後にインビトロまたはインビボ受精が行われてもよい。
【００１４】
対象となる個体は、絶滅危惧種、経済的に重要な動物、早期卵巣機能不全を罹患している女性、ヒト胚性幹細胞および始原生殖細胞に由来する卵胞等を含む。他の実施形態において、曝露は、局所的に、例えば、卵巣内注射によって、または個体への全身投与によって、インビボで行われる。
【００１５】
Ｒ−スポンジンまたはＣＮＰアゴニストへの曝露後、個体は、卵胞の成長を開始するのに効果的な濃度の、組換えＦＳＨ、インビボ宿主動物において自然に発生するＦＳＨ、ＦＳＨ類似体、例えば、ＦＳＨ−ＣＴＰ、ペグ化ＦＳＨ等を含む卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）またはＦＳＨ類似体で処理されてもよい。
【００１６】
ＣＮＰ、ＦＳＨ、またはそのアゴニストのいずれかで卵胞が刺激されて胞状卵胞の段階になると、個体は、黄体ホルモン（ＬＨ）またはそのアゴニストで処理されてもよく、そのアゴニストは特に、絨毛性ゴナドトロピン、例えば、ウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）等を排卵用量で含む。さらに、卵胞は、ｃ−ｋｉｔリガンド、ニューロトロフィン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−４、ＢＭＰ７、白血病抑制因子、塩基性ＦＧＦ、ケラチノサイト増殖因子等のうちの１つ以上にインビボまたはインビトロで曝露されてもよい。
【００１７】
「Ｒ−スポンジンアゴニスト」という用語は、Ｒ−スポンジンの生物学的活性を提供する抗体および他の模倣物に加えて、特に、Ｒ−スポンジン１タンパク質およびＲ−スポンジン２タンパク質、例えば、天然ヒトタンパク質、または対象となる哺乳動物に由来するタンパク質、天然タンパク質の融合体もしくはキメラ、例えば、免疫グロブリンの一部との融合生成物；天然タンパク質のペグ化形態を含む。
【００１８】
「ＣＮＰアゴニスト」という用語は、ＣＮＰの生物学的活性を提供する抗体および他の模倣物に加えて、特に、ＣＮＰペプチド、例えば、天然ヒトポリペプチド、または対象となる哺乳動物に由来する対応物、天然ポリペプチドの融合体もしくはキメラ；天然ペプチドの安定化形態を含む。
【００１９】
本発明の方法によるＲ−スポンジンまたはＣＮＰアゴニストを用いた刺激に効果的な期間は、通常、少なくとも約１時間、かつ約５日間以内であり、少なくとも約１２時間、かつ約４日間以内、例えば、２、３、４、または５日間であってもよい。
【００２０】
ＦＳＨ治療は、受精のための成熟卵母細胞を形成するように卵胞の発育を刺激するために広く使用されてきた。我々の知見は、ＣＮＰもまた前胞状卵胞および胞状卵胞の両方を刺激することができ、よって、このペプチドホルモンを用いて不妊症の女性の治療に将来的な機会を提供することを証明した。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】異なる卵巣細胞型における、異なるＷｎｔリガンド、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体と、Ｒ−スポンジン２の発現。Ａ）新生仔マウス（３日目、ａおよびｂ）、幼若マウス（１５日目、ｃおよびｄ）、ならびに思春期前マウス（２３日目、ｅおよびｆ）の卵巣におけるＲ−スポンジン２転写物のインサイツハイブリダイゼーション分析を分析した。左パネル：明視野像；右パネル：暗視野像。スケールバー＝１００ｕｍ。矢印：卵母細胞。Ｂ）前胞状卵胞の単離された卵母細胞および体細胞におけるＲ−スポンジン２転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。二次卵胞およびそれよりも小さい卵胞を含む１０日齢の未成熟マウスの卵巣を解離して卵母細胞および体細胞を得た。特異的マーカーを用いてこれらの細胞の純度を確認した（卵母細胞にはＧＤＦ９、体細胞にはＦＳＨ受容体）。Ｕ．Ｄ．：検出不能。Ｃ）卵母細胞および体細胞における異なるＷｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）遺伝子転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｕ．Ｄ．：検出不能。Ｄ）卵母細胞および体細胞における異なるＦｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）遺伝子転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図２】Ｒ−スポンジン２およびＷｎｔ３Ａによる処理は、１０日目の卵巣から得られた体細胞の古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路および増殖を刺激した。Ａ）１０日齢マウスの卵巣から得られた培養体細胞における、Ｒ−スポンジン２およびＷｎｔ３ＡによるＴＣＦ−ルシフェラーゼ受容体活性の相乗的刺激。細胞をＴＣＦ−ルシフェラーゼ受容体プラスミドで６時間トランスフェクトした後、異なる試薬で１８時間処理した。Ｃ：対照、Ｒｓｐｏ２：Ｒ−スポンジン２、ＤＫＫ１：３００ｎｇ／ｍｌ、Ｗｎｔ３ａ：３０ｎｇ／ｍｌ、ＦＳＨ：１００ｎｇ／ｍｌ。Ｂ）Ｒ−スポンジン２およびＷｎｔ３ａが培養体細胞のＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメチルフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）活性に及ぼす刺激作用（細胞数を反映）。ＭＴＳ活性の分析前に、細胞を異なる試薬で２日間処理した。Ｃ；対照、＊Ｐ＜０．０５対対照。
【図３】Ｒ−スポンジン２およびＦＳＨによる処理は、インビトロでの初期卵胞成長および内在性Ｒ−スポンジン２の役割を刺激した。１０日齢マウスの個々の卵巣の外植片培養物を、２日ごとに培地を交換しながら異なる試薬で４日間インキュベートした。いくつかの卵巣をＤＫＫ１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ１、Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニスト）で処理してＷｎｔシグナル伝達経路を抑制した。Ａ）Ｒ−スポンジン２およびＦＳＨによる処理後の卵巣重量の変化。Ｂ）ＤＫＫ１が基礎卵巣およびＲ−スポンジン２で刺激した卵巣の重量に与える拮抗作用。Ｃ）Ｒ−スポンジン２および／またはＦＳＨで処理した卵巣の組織像。矢印：二次卵胞。Ｄ）Ｒ−スポンジン２およびＦＳＨによる処理後の卵胞動態。Ｅ）Ｒ−スポンジン２抗体による処理は、卵巣外植片における内在性Ｒ−スポンジン２の作用を遮断することにより、卵巣重量を減少させた。非免疫ＩｇＧおよび煮沸済Ｒ−スポンジン２抗体（Ａｂ）による共インキュベーションは、対照としての役割を果たした。Ｒ−ｓｐｏ２：Ｒ−スポンジン２。
【図４】Ｒ−スポンジン１−Ｆｃによる処理は、初期卵胞の発育を刺激し、受精および初期胚発生のための成熟卵母細胞の形成を可能にした。Ａ）組換えＲ−スポンジン１−Ｆｃの精製およびその古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の刺激。左パネル：Ｒ−スポンジン１−Ｆｃの免疫染色およびクマシーブルー染色。右パネル：ＴＣＦ−ルシフェラーゼアッセイ。２９３Ｔ細胞をＴＣＦ−ルシフェラーゼ受容体プラスミドでトランスフェクトした後、異なる用量のＲ−スポンジン２またはＲ−スポンジン１−Ｆｃで処理した。Ｂ）Ｒ−スポンジン１−Ｆｃによる処理後のマウスにおける卵巣重量の増加と卵胞発育。１０日齢の思春期前マウスに、Ｒ−スポンジン１−Ｆｃ（１０μｇ／日）または食塩水を５日間毎日腹腔注射し、続いてｅＣＧで２日間処理して卵巣重量を決定した。左パネル：卵巣重量；中央パネル：組織像；右パネル：卵胞動態。Ｃ）Ｒ−スポンジン１−Ｆｃによる処理は、排卵効率を増加させた。Ｒ−スポンジン１−Ｆｃ、続いてｅＣＧで前処理した未成熟マウスに単回用量（７ＩＵ）のｈＣＧを注射して排卵を誘発した。何匹かの成体マウスをＧｎＲＨアンタゴニスト（１μｇ／体重１ｇ）で４日間前処理した後、Ｒ−スポンジン１−Ｆｃまたは食塩水でさらに４日間毎日腹腔内処理した。次いで、動物をｅＣＧで４８時間、続いてｈＣＧで処理し、排卵および卵成熟を誘導した。ｈＣＧ注射から１６時間後、輸卵管内に排卵された成熟卵の数を決定した。成熟卵母細胞も卵巣から穿刺して、各群に総成熟卵母細胞数を決定した。バーの上の数字は、用いられた動物の数を示す。Ｄ）Ｒ−スポンジン１−Ｆｃで処理した成体マウスから得られた成熟卵母細胞のインビトロ受精後の初期胚の発育。輸卵管から得られた排卵された卵母細胞をインビトロで精子と授精させ、初期胚発生を４日間毎日モニタリングした。異なる段階の初期胚に発育した成熟卵母細胞の割合を決定した。
【図５】発育中のＮＰＰＣおよびＮＰＲＢの卵巣発現、ならびに卵巣ＣＮＰペプチド含有量。異なる年齢の未成熟マウスの卵巣を解離して卵母細胞および体細胞を得た。さらに、２日間のｅＣＧ処理の前および後に、２３日齢の未成熟マウスから顆粒膜細胞、卵胞殻、および卵母細胞を単離した。特異的プライマーを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。特異的マーカーを用いて異なる細胞型の純度を確認した（卵母細胞にはＧＤＦ９、顆粒膜細胞にはＦＳＨ受容体、および卵胞膜細胞にはＣＹＰ１７ａ１）。Ａ）ＮＰＰＣの発現、Ｂ）ＮＰＲＢの発現、Ｃ）細胞マーカーの発現。Ｎ．Ｄ．：検出不能。ＯＣ：卵母細胞。Ｄ）異なるサイズの単離卵胞におけるＮＰＰＣおよびＮＰＲＢ転写物のＲＴ−ＰＣＲ。分析のために、異なる直径の卵胞（１〜５卵胞／試料）を、幼若マウス（直径９０〜１４０ｎｍ）およびｅＣＧで処理した未成熟マウス（直径３００〜６００ｕｍ）から単離した。Ｅ）異なる年齢の思春期マウスからの卵巣ＣＮＰ含有量の測定。６〜８個の試料の平均＋／−ＳＥ。
【図６】培養体細胞および顆粒膜細胞によるｃＡＭＰではなくｃＧＭＰの産生のＣＮＰ刺激。Ａ）培養体細胞によるｃＧＭＰ産生のＣＮＰ刺激。１３日齢マウスから単離した体細胞を、ＩＢＭＸを含有する培地中でＣＮＰおよびＡＮＰで処理した。インキュベーションの２時間後、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰの培地中含有量を測定した。Ｂ）２１日齢の思春期前マウスの培養顆粒膜細胞によるｃＧＭＰ産生のＣＮＰ刺激。思春期前マウスの卵巣から顆粒膜細胞を穿刺し、異なる試薬で２時間処理した後、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰの培地中含有量を測定した。８個の試料の平均＋／−ＳＥ。＊Ｐ＜０．０５、対照群とは有意に異なる。
【図７】培養中の前胞状卵胞の成長のＣＮＰによる促進。１３日齢マウスから前胞状卵胞（１２５〜１４５ｕｍ）を単離し、２日ごとに培地を交換しながら４日間培養した。Ａ）増加する用量のＣＮＰ（３〜３００ｎＭ）、１００ｎＭ  ＡＮＰ、または８−ブロモ−ｃＧＭＰ（５ｍＭ）で卵胞を処理し、卵胞の直径を毎日モニタリングした。Ｂ）ＣＮＰおよびＦＳＨの付加的効果。前胞状卵胞をＦＳＨ（２５ｎｇ／ｍｌ）および／またはＣＮＰ（１００ｎＭ）で処理した。用いられた卵胞の数を括弧内に示す。平均＋／−ＳＥ。＊Ｐ＜０．０５、対照群とは有意に異なる。
【図８】卵巣外植片の成長のＣＮＰ刺激およびＮＰＰＣの発現のＦＳＨ刺激。Ａ）１０日齢マウスの個々の卵巣を、増加する用量（０．２５〜３ｕＭ）のＣＮＰ、ＡＮＰ（１ｕＭ）、またはＣＮＰ含むかもしくは含まないＦＳＨ（２５ｎｇ／ｍｌ）で、２日ごとに培地を交換しながら４日間培養した。培養終了時に卵巣重量を測定した。Ｂ）卵巣外植片の組織学的分析。ＣＮＰおよび／またはＦＳＨによる処理の４日後に、組織学的分析のために卵巣外植片を固定した。バー：４００ｕｍ。Ｃ）汎特異性プロテインキナーゼＧ阻害剤であるＲｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ（Ｒｐ−ｃＧＭＰＳ）による処理は、卵巣重量増加のＣＮＰ刺激を遮断した。Ｒｐ−ｃＧＭＰＳによる処理も、高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）ＦＳＨの刺激作用を一部遮断した。Ｄ）培養卵巣外植片において、ＦＳＨはＮＰＰＣを刺激したが、ＮＰＲＢの転写レベルは刺激しなかった。１０日齢マウスの卵巣外植片を２日および４日間培養した後、ＮＰＰＣおよびＮＰＲＢの転写レベルを測定した。用いられた卵巣の数を括弧内に示す。平均＋／−ＳＥ。＊Ｐ＜０．０５、対照群とは有意に異なる。
【図９】ＣＮＰによる幼若マウスのインビボ処理は、前胞状卵胞の発育を促進した。１３日齢マウスをＣＮＰ（２０μｇ／体重１ｋｇ）で４日間毎日腹腔内処理して前胞状卵胞の発育を刺激した。ＣＮＰで前処理した何匹かの動物を、ｅＣＧ（５ＩＵ）で４８時間、続いて排卵用量のｈＣＧ（５ＩＵ）でさらに腹腔内処理した。輸卵管内の排卵された卵母細胞の数を決定した。Ａ）卵巣重量、Ｂ）卵巣組織像、Ｃ）排卵効率。Ｎ＝２０匹の動物。平均＋／−ＳＥ。＊Ｐ＜０．０５、対照群とは有意に異なる。
【図１０】ＣＮＰによるインビボ処理は、未成熟マウスにおいて、初期胞状卵胞の排卵のための排卵前段階への成長を促進した。ＡおよびＢ）２１日齢の思春期前マウスをＣＮＰ（５０ｕｇ／体重１ｋｇ）または食塩水で４日間毎日処理した後、ｈＣＧ（２．５ＩＵ）で排卵を誘発した。ｈＣＧ処理の１８時間後、卵巣重量を決定し、輸卵管内の成熟卵母細胞を数えた。ヒト卵胞平均＋／−ＳＥ。＊Ｐ＜０．０５、対照群とは有意に異なる。
【図１１】排卵前卵胞の発育を促進するためにＣＮＰで前処理した未成熟マウス由来の卵母細胞の初期胚発生。４日間ＣＮＰで前処理し、続いて排卵用量のｈＣＧで処理した未成熟マウス（２１日齢）から成熟卵母細胞を得た。卵母細胞を生精子とインビトロで受精させ、異なる期間培養した。対照群からの卵母細胞は、５ＩＵのｅＣＧで２日間、続いて排卵用量のｈＣＧで１８時間処理した未成熟マウスから誘導した。形態に基づいて初期胚の発育を決定した。左パネル：異なる発育段階に達する胚の割合。ＢＬ：胚盤胞。右パネル：ＣＮＰで前処理した卵母細胞の胚形態。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
哺乳類の卵胞の生存および成熟を調節するための組成物および方法が提供される。卵胞を有効用量のＲ−スポンジンアゴニストまたはＣＮＰアゴニストのうちの少なくとも１つに選択的に曝露することにより、卵胞の成長およびそれに続く卵成熟を操作することができる。
【００２３】
本発明の方法は、特に哺乳動物種を含む多種多様な動物種において使用される。動物モデル、特に小さな哺乳動物、例えば、ネズミ科、ウサギ目等が、実験的研究の対象となる。例えば、ウマ、ウシ、希少な動物園動物、例えば、パンダ、大型ネコ科動物等の他の動物種は、インビトロ受精における改善の恩恵を受けることができる。ヒトは特に、インビトロ受精の方法を含む卵成熟の増強の対象となる。本発明の方法を用いた治療の対象となる個体として、限定されないが、早期卵巣機能不全、閉経周辺期、ＦＳＨに対する低反応性等を被る個体を含む。
【００２４】
本発明の実施形態は、哺乳動物の多くの種の卵胞を含むことができる。本発明は、本特許出願内の特定の例によって引用される哺乳動物の種に限定されるものではないことを理解されたい。本発明の実施形態は、例えば、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、バッファロー等の、食肉または酪農生産のための商業的価値を有する動物の新鮮なまたは凍結解凍した卵胞を含み得る（当然、食肉または酪農生産に用いられる哺乳動物は、文化によって異なり得る）。それはまた、希少なまたは珍しい属性（複数可）、例えば、重量、サイズ、もしくは構造を含む形態学的特徴、または速度、敏捷性、知性等の他の所望の特徴を有する個体からの卵胞を含んでもよい。それはまた、死亡したドナー、または希少なもしくは外来性の哺乳動物、例えば、動物標本または絶滅危惧種等からの卵胞を含んでもよい。本発明の実施形態はまた、限定されないが、チンパンジー、ゴリラ等を含む霊長類から回収された、新鮮なまたは凍結解凍した卵胞を含んでもよく、また、例えば、クジラまたはネズミイルカ等の海洋哺乳類からの卵胞を含むこともできる。
【００２５】
主題の発明をさらに説明する前に、特定の実施形態の変形例が作製されてもよく、なおも添付の特許請求の範囲内に属するため、本発明は、以下に記載される本発明の特定の実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。また、用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためであって、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。その代わりに、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって確立される。
【００２６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に指示されない限り、複数形の指示対象を含む。別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２７】
卵胞。    卵胞は、メスの生殖生物学の基本単位であり、卵巣内に見られる細胞の略楕円形の集合体から構成される。１つの卵胞は、単一の卵母細胞を含む。卵胞は、定期的に成長および発育を開始し、通常は単一のコンピテントな卵母細胞が最終的に排卵される。卵胞の細胞は、卵母細胞、顆粒膜細胞、ならびに内卵胞膜層および外卵胞膜層の細胞である。卵胞内の卵母細胞は、一次卵母細胞の段階にある。そのような卵母細胞の核は、胚胞と呼ばれる。卵胞内の顆粒膜細胞は卵母細胞を取り囲み、それらの数はゴナドトロピンに応じて増加する。それらはまた、卵巣ホルモン合成の調節に関与するペプチドを産生する。卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、細胞表面上で黄体ホルモン（ＬＨ）受容体を発現するように顆粒膜細胞に作用する。一方、顆粒膜細胞は、細胞外マトリクスの薄層である卵胞基底膜または基底層（写真の線維血管膜）内に封入される。基底層の外側には、内卵胞膜および外卵胞膜の層が見られる。
【００２８】
卵巣のインビトロ培養。    哺乳類の卵巣またはその断片を培養するための方法は、当該技術分野で既知であり、本発明の目的のための断片は、少なくとも１つの卵胞を含む。典型的には、卵巣の全部または一部が組織培養培地に配置され、培地は、卵胞細胞の成長または維持に有用な因子を含んでもよく、また本明細書に記載されるように、有効量のＰＴＥＮ阻害剤をさらに含んでもよい。本明細書に提供される実施例を参照のこと。さらなる記載は、とりわけ、Ｈｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓ  Ｂ  Ｄｅｖ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．８０（２）：１１３−２５に見出だされ得る（これらの参考文献の各々は、参照により、本明細書に具体的に組み込まれる）。イヌ卵巣のインビトロ培養は、Ｌｕｖｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．；６３（１）：４１−５９によって記載されている。ウシ卵胞の培養は、Ｈａｎｓｅｌ（２００３）Ａｎｉｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｓｃｉ．；７９（３−４）：１９１−２０１によって記載されている。Ｆｏｒｔｕｎｅ（２００２）Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．（４１）：１１−２１は、ヒヨコの胚のＣＡＭの下に卵巣皮質の小片または卵巣の移植片を使用する器官培養について記載している。
【００２９】
インビトロでの卵巣組織および器官培養についての考察は、Ｄｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．７：ｄ１９７９−８９；およびＳｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．１２３（２）：１８５−２０２に見出だすことができる。胎仔または新生仔げっ歯類の全卵巣が、器官培養系においてインキュベートされている。これは、卵胞形成の順序およびそのホルモン必要量、静止状態にある卵胞の活性化、卵胞の成長および発育、ならびにステロイド産生能の獲得について理解するために利用されてきた。この技術の適応は、培地で連続的に灌流されたチャンバ内でのインキュベーション、またはインタクトな脈管構造を通る培地の灌流を含む。卵胞発育、排卵、およびステロイド産生の遅延についても、このシステムにおいて調べることができる。別のアプローチは、酵素または機械的解離によって単離された個々の卵胞を培養することであった。ヒト原始卵胞および一次卵胞の凍結保存については、Ｈｏｖａｔｔａ  （２０００）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６９（１−２）：９５−７によって記載されている。
【００３０】
卵巣移植。    １９５０年代に始まった卵巣の腎臓への移植は、動物実験において十分に確立された手技である。後に、酵素消化によって乳仔マウスの卵巣から単離された原始卵胞が、Ｘ線照射または卵巣摘出によって生殖不能にした成体宿主の卵嚢に移植された。移植片から形成された卵巣は、自然に排卵することができ、それらを有する動物の大半がオスを受容した。交尾の結果、多くの場合、妊娠して健康な子孫が産まれた。さらに、原始卵胞は、移植前に凍結保存することができる。女性において、早期卵巣機能不全に関して不一致な一卵性双生児間での卵巣移植の成功が報告されている。卵子提供治療に失敗した後、生殖不能な双生児は、彼女の姉／妹から卵巣皮質組織の移植を受けた。移植後、患者は妊娠し、健常児を出産した。この卵巣移植の症例に加えて、不妊化を引き起こす癌治療または手術を受けている女性において、内分泌機能の保存によって証明されるように、前腕への卵巣皮質片の自家移植が成功裡に行われてきている。この場合、卵巣移植の手法は、休止状態にある原始卵胞を活性化するために用いられてもよい。
【００３１】
Ｒ−スポンジン２（ＲＳＰＯ２）。    ＲＳＰＯ２等のＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８およびＬＲＰ６受容体への結合を介してβカテニンを調節する分泌タンパク質である。ＲＳＰＯファミリーの他のメンバーと同様に、アミノ酸２４３ヒトＲＳＰＯ２タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、２つのフューリン様ドメイン、トロンボスポンジン１型ドメイン、および正電荷を帯びたアミノ酸に富んだＣ末端低複雑性領域を含有する。ＲＳＰＯ２の発現は、結腸、直腸、小腸、および肺を含む内胚葉起源の器官において検出されており、対応する腫瘍において発現が低い。ＲＳＰＯ２は、ＷＮＴ／βカテニンカスケードを刺激するように正のフィードバックループにおいて機能する。ヒトＲＳＰＯ２遺伝子は、６つのコーディングエクソンと、染色体８ｑ２３．１のマップとを含有する。
【００３２】
Ｒ−スポンジン２の遺伝子参照配列は、Ｇｅｎｂａｎｋの遺伝子座ＮＭ＿１７８５６５で、またＣｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３（１０），２２６５−２２７０（参照により本明細書に具体的に組み込まれる）によって記載されるようにアクセスされてもよい。
【００３３】
「Ｒ−スポンジン１」タンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０３３７２２に記載されている。Ｒ−スポンジン１（Ｒ−ｓｐｏ１）は、Ｒ−スポンジンタンパク質ファミリーの４つのタンパク質のうちの１つである（Ｒ−スポンジンの４つのヒトパラログは、Ｒ−スポンジン１〜４を含む）。Ｒ−ｓｐｏ１は、主要なシグナルペプチド、システインに富んだ２つのフューリン様ドメイン、および１つのトロンボスポンジン１型ドメインを含有する分泌糖タンパク質である。Ｒ−Ｓｐｏ１は、Ｗｎｔとの相同性を有しないが、Ｗｎｔと相乗作用してβカテニン依存性シグナルを活性化する。
【００３４】
対象となるＲ−スポンジン分子、例えば、Ｒ−スポンジン１およびＲ−スポンジン２に含まれるのは、異種ポリペプチドに融合または結合したＲ−スポンジンポリペプチドまたはその一部（例えば、１つ以上のドメイン）を含む「キメラ」ポリペプチドである。キメラポリペプチドは、一般に、天然Ｒ−スポンジンポリペプチドと共通する少なくとも１つの生物学的特性を共有する。キメラポリペプチドの例として、天然ポリペプチドの一部を、免疫グロブリン配列、具体的には、当該技術分野において、その分子が改善された薬物動態学的特性を提供することが分かっている免疫グロブリンのＦｃ領域と組み合わせるイムノアドヘシンが挙げられる。例えば、市販の製品は、そのＣ末端でヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合された完全長ヒトＲ−スポンジン−１である。この融合体は、タンパク質の生物学的活性を損なうことなく、その安定性をインビトロおよびインビボで高める。ｄｅ  Ｌａｕ，ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ４７６：２９３、Ｃａｒｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＮＡＳ１０８：１１４５２（参照により、各々が具体的に本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００３５】
活性化剤がＲ−スポンジンタンパク質またはその融合体、例えば、Ｒ−スポンジン１−Ｆｃである場合、インビボでの使用に有効な用量は、少なくとも約０．１μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約０．５μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約１μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約２．５μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約５μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約１０μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約２０μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約２５μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約５０μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約８５μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約１００μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約２５０μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約５００μｇ／体重１ｋｇ／日であってもよい。インビトロでの使用の場合、Ｒ−スポンジンの濃度は、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２．５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７．５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、またはそれ以上であってもよい。
【００３６】
ＣＮＰ。    ナトリウム利尿ペプチドは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、およびＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の３つの構造的に関連する分子のファミリーを含む。ＣＮＰは、前駆体ＮＰＰＣタンパク質が２２個のアミノ酸ペプチドＣＮＰに切断される多様な細胞型において発現されるＮＰＰＣ（ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ）遺伝子によってコードされる。ＣＮＰが、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲＢ）としても知られるその同族の受容体であるグアニリルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）を活性化するのに対し、ＡＮＰおよびＢＮＰは、ナトリウム利尿ペプチド受容体−Ａ（ＮＰＲＡ）としても知られるグアニリルシクラーゼ（ＧＣ）−Ａを刺激する。ＧＣ−ＡおよびＧＣ−Ｂは、第２のメッセンジャーｃＧＭＰの産生を介してシグナルを送り、キナーゼ相同ドメイン内の特異的部位の脱リン酸化に反映される同種脱感作および異種脱感作の両方を受ける、膜アンカー型グアニリルシクラーゼ酵素である。ＡＮＰおよびＢＮＰは、内分泌ホルモンとして作用し、血圧および血液量を調節し、心臓肥大を阻止する。対照的に、ＣＮＰは、オートクリン／パラクリン様式で作用して血管緊張低下および血管リモデリングを誘導し、また骨成長を調節する。
【００３７】
以前の研究によって、ＮＰＰＣおよびＮＰＲＢの卵巣での発現ならびにゴナドトロピンによるそれらの調節が報告されている。最近の研究により、顆粒膜細胞におけるＮＰＰＣのメッセンジャーＲＮＡの発現、ならびにＣＮＰが卵丘細胞におけるｃＧＭＰ産生を刺激して卵母細胞の減数分裂再開を阻害する能力が証明され、卵胞液および顆粒膜細胞抽出物における低分子量卵成熟阻害剤（ＯＭＩ）の初期同定と一致した。その後の研究により、排卵性ＬＨサージが、成熟卵巣およびヒト卵胞液においてＣＮＰレベルを低下させたことが示された。
【００３８】
ＣＮＰは、２２アミノ酸残基長であり、５３個のアミノ酸残基でＮ末端が伸長された形態も記載されている。ＡＮＰ、ＢＮＰ、およびＣＮＰは、分子内ジスルフィド結合によって形成される１７残基の環状構造内で高度に相同である。ＣＮＰの遺伝子配列は、Ｇｅｎｂａｎｋの遺伝子座ＮＭ＿０２４４０９でアクセスすることができる。ＡＮＰおよびＢＮＰは、主として、それぞれ心房および心室によって主に産生される心臓ホルモンとして作用する。ＣＮＰは、主に脳内で発現されると考えられていたが、他の研究により、培養内皮細胞および血管によるインビボでのＣＮＰの産生は、種々のサイトカインおよび増殖因子によりＣＮＰの産生を増強すると、卵胞壁を裏打ちするマウス顆粒膜細胞がＮｐｐｃ  ｍＲＮＡを発現する一方で、卵母細胞を取り囲む卵丘細胞がＮｐｐｃ受容体Ｎｐｒ２グアニリルシクラーゼのｍＲＮＡを発現することを示したことが証明された。Ｎｐｐｃは、卵丘細胞および卵母細胞におけるｃＧＭＰレベルを増加させ、インビトロでの減数分裂再開を阻害した。減数分裂停止は、ＮｐｐｃまたはＮｐｒ２突然変異マウスのほとんどのグラーフ卵胞において持続されず、早期に減数分裂が再開した。卵母細胞由来パラクリン因子は、卵丘細胞によるＮｐｒ２  ｍＲＮＡの発現を促進した。
【００３９】
活性化剤がＣＮＰである場合、インビボでの使用に有効な用量は、少なくとも約０．１μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約０．５μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約１μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約２．５μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約５μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約１０μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約２０μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約２５μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約５０μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約８５μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約１００μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約２５０μｇ／体重１ｋｇ／日、少なくとも約５００μｇ／体重１ｋｇ／日である。インビトロでの使用の場合、ＣＮＰの濃度は、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２．５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７．５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、またはそれ以上であってもよい。
【００４０】
Ｒ−スポンジンまたはＣＮＰまたはそのエピトープ断片に特異的な抗体、具体的にはアゴニスト抗体が、本発明の方法において使用されてもよい。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、任意のアイソタイプの抗体、抗原に対する特異的結合を保持するＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄ断片を含むがこれらに限定されない抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに抗体および非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含む。抗体は、例えば、放射性同位元素、検出可能な生成物を形成する酵素、緑色蛍光タンパク質等によって検出可能に標識されてもよい。抗体は、他の部分、例えば、特異的結合対のメンバー等、例えば、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）等にさらにコンジュゲートされてもよい。抗体はまた、ポリスチレンプレートまたはビーズ等を含むがこれらに限定されない個体支持体に結合されてもよい。
【００４１】
抗体−抗原の相互作用に関連して、「抗体特異性」とは、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、所与の抗体が所与の抗原に結合することを意味し、結合は、抗体によって認識され、かつ無関係の抗原には本質的に結合しない、抗原またはそのエピトープによって阻害され得る。特異的抗体の結合を決定する方法は、当業者に既知であり、本発明の抗体のポリペプチドに対する特異性を決定するために使用することができる。
【００４２】
抗体は、従来の方法に従って調製され、発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、それ自体で、または既知の免疫原性担体、例えば、ＫＬＨ、Ｐｒｅ−Ｓ  ＨＢｓＡｇ、他のウイルスもしくは真核生物のタンパク質等にコンジュゲートして、免疫原として使用される。必要に応じて、一連の注射とともに種々のアジュバントが用いられてもよい。モノクローナル抗体の場合、１回以上の追加免疫注射の後、脾臓が単離され、細胞融合によりリンパ球が不死化され、次いで、高親和性抗体結合についてスクリーニングされる。不死化細胞、すなわち、所望の抗体を産生するハイブリドーマが増殖されてもよい。さらなる詳細については、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８を参照のこと。所望の場合、重鎖および軽鎖をコードするｍＲＮＡを単離し、大腸菌中でクローニングすることにより突然変異を誘発してもよく、また重鎖および軽鎖を混合して抗体の親和性をさらに増強してもよい。抗体を産生させる方法としてのインビボ免疫化の代替手段は、通常、インビトロでの親和性成熟と併せたファージディスプレイライブラリーへの結合を含む。
【００４３】
ＦＳＨ。    卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、脳下垂体前葉の性腺刺激ホルモン産生細胞によって合成よび分泌されるホルモンである。ＦＳＨは、人体の発育、成長、思春期成熟、および生殖過程を調節する。ＦＳＨおよび黄体ホルモン（ＬＨ）は、生殖において相乗的に作用する。メスにおいて、卵巣のＦＳＨが、未成熟なグラーフ卵胞の成長を刺激して成熟させる。グラーフ卵胞は、成熟した排卵前卵胞である。一次卵胞は、成熟してグラーフ卵胞になる。卵胞が成長すると、インヒビンを分泌してＦＳＨ産生を遮断する。
【００４４】
ＦＳＨは、二量体糖タンパク質である。ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、およびｈＣＧのαサブユニットは、同一であり、９２個のアミノ酸を含有する。ＦＳＨは、特定の生物学的作用を付与し、かつＦＳＨ受容体との相互作用に寄与する、１１８個のアミノ酸のβサブユニット（ＦＳＨＢ）を有する。天然ＦＳＨの半減期は３〜４時間である。その分子量は３００００である。
【００４５】
種々のＦＳＨ製剤が臨床用途に利用可能である。この製剤は、卵胞の発育を刺激するための不妊症治療、特にＩＶＦ治療および子宮内人工授精（ＩＵＩ）において一般的に使用される。ＦＳＨは、ＬＨと混合されたＰｅｒｇｏｎａｌまたはＭｅｎｏｐｕｒの形態で、また尿中ゴナドトロピンの他のさらに精製された形態で、組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ、Ｆｏｌｌｉｓｔｉｍ）としての純粋な形態で、ならびにＦｏｌｌｉｓｔｉｍ  ＡＱ、Ｇｏｎａｌ−Ｆ、Ｇｏｎａｌ−ｆ  ＲＦＦ、Ｇｏｎａｌ−ｆ  ＲＦＦ  Ｐｅｎとして入手可能である。
【００４６】
ＦＳＨの類似体もまた臨床的に使用され、該類似体は、例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸が天然形態から変更された全ての生物学的に活性な変異形態、ＰＥＧ化ＦＳＨ、単鎖二機能性の変異体、ＦＳＨ−ＣＴＰ等を含む。卵巣の反応性を強化する試みにおいて、ＦＳＨサブユニットがヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）部分によって結合されたＦＳＨ−ＣＴＰ（コリフォリトロピンアルファ）；および単鎖二機能性ＶＥＧＦ−ＦＳＨ−ＣＴＰ（ＶＦＣ）類似体を含む、いくつかの長時間作用型のＦＳＨ治療薬が開発されてきた。ＦＳＨ−ＣＴＰは、より長いインビボ半減期を有し、例えば、１〜４週間の投与間の間隔で投与されてもよい。例えば、Ｌａｐｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３１：２５１４−２５２０；およびＤｅｖｒｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．５  ２０６２−２０７０（参照により、各々が具体的に本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００４７】
ＬＨおよびアゴニスト。    ＬＨは、ヘテロ二量体糖タンパク質である。その構造は、他の糖タンパク質ホルモン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の構造と類似する。タンパク質二量体は、非共有的に会合したαおよびβサブユニットと称される２つの糖タンパク質のサブユニットを含有する。ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、およびｈＣＧのαサブユニットは、同一であり、ヒトにおいて９２個のアミノ酸を含有するが、ほぼ全ての他の脊椎動物種では９６個のアミノ酸を含有する。βサブユニットは、様々である。ＬＨは、特定の生物学的作用を付与し、かつＬＨ受容体との相互作用の特異性に寄与する、１２０個のアミノ酸を有する（ＬＨＢ）。このβサブユニットは、ｈＣＧのβサブユニットと高度に相同であり、どちらも同じ受容体を刺激する。
【００４８】
ＬＨは、ＦＳＨと混合されたＰｅｒｇｏｎａｌの形態で、また尿中ゴナドトロピン他の形態で入手可能である。組換えＬＨは、ルトロピンアルファ（Ｌｕｖｅｒｉｓ）として入手可能である。全てのこれらの薬物は、非経口的に投与される。
【００４９】
ｈＣＧ薬は、同じ受容体を活性化し、より安価であり、ＬＨよりも長い半減期を有するため、しばしばＬＨの代替品として用いられる。ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、２４４個のアミノ酸の糖タンパク質である。ｈＣＧゴナドトロピンのβサブユニットは、１４５個のアミノ酸を含有する。他のゴナドトロピンと同様に、ｈＣＧは、尿から抽出するか、または遺伝子組換えによって抽出することができる。Ｐｒｅｇｎｙｌ、Ｆｏｌｌｕｔｅｉｎ、Ｐｒｏｆａｓｉ、Ｃｈｏｒａｇｏｎ、およびＮｏｖａｒｅｌは、前者の方法を使用し、妊娠した女性の尿に由来する。Ｏｖｉｄｒｅｌは、組換えＤＮＡの産物である。代替品として、ウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）は、妊娠した雌馬の絨毛膜で産生される性腺刺激ホルモンである。
【００５０】
治療の候補。    生卵胞を保有するいずれの女性ヒト対象も、本発明の方法を用いた治療の候補である。典型的には、対象は、早期卵巣機能不全を含む何らかの形態の不妊症に罹患する。例えば、対象は、正常な卵母細胞の産生を経験するが、例えば、ＰＣＯＳまたはＰＣＯＳ様卵巣におけるように受精の障害を有する可能性がある。本発明の方法は、卵巣刺激プロトコルを含む従来のインビトロ受精法の好適な候補ではない女性において特に有用であり得る。従来のＦＳＨ治療に対する反応性の低い患者が含まれる。
【００５１】
上述のように、本発明の方法は、通常、哺乳類、例えば、ウマ、イヌ、ウシ等の種々の非ヒト動物の不妊の治療においても有用である。
【００５２】
早期卵巣機能不全（ＰＯＦ）は、女性の１％に発症する。ＰＯＦの既知の原因は、Ｘ染色体または常染色体に関与する遺伝性異常、および自己免疫性卵巣疾患を含む。現在、ＰＯＦ患者における不妊治療のための立証された唯一の手段は、提供された卵母細胞を用いた補助受胎を含む。胚凍結保存、卵巣凍結保存、および卵母細胞凍結保存は、癌治療を受けている女性において卵巣機能不全が予見可能である場合には期待できるが、他の選択肢はほとんど存在しない。ＰＯＦの病因の遺伝的多様性のために、様々な量の残存原始卵胞が、活性化のために患者の卵巣内に依然として存在する。
【００５３】
卵巣の疲弊の程度は、ＰＯＦ患者間で様々である。本発明の方法は、ＰＴＥＮ阻害剤を使用してＰＯＦ患者の残りの原始卵母細胞を活性化し、その後の卵巣移植およびＲ−スポンジンまたはＣＮＰアゴニストによる治療により、初期卵胞の排卵前段階への発育を促進することができる。この後に、ＩＶＦのための成熟卵母細胞の回収、および胚移植後の妊娠が続く可能性がある。現代社会における出産年齢が遅いことに起因して、多くの閉経期前後の女性も、卵巣予備能の低下の結果として不妊を経験している。ゴナドトロピン治療は、初期胞状卵胞の排卵前段階への発育を促進させるために広く用いられているが、多くの閉経期前後の患者はゴナドトロピン療法に反応を示さない。これらの女性は、以前として様々な数の原始卵胞を有するため、彼女達も本発明の方法の恩恵を受ける。
【００５４】
卵成熟を増強する方法
前胞状卵胞の胞状卵胞および排卵前卵胞への発育を刺激するのに十分な期間、前胞状卵胞を有効用量のＲ−スポンジンアゴニストまたはＣＮＰアゴニストのうちの少なくとも１つと接触させることによって、インビトロおよびインビボでの哺乳類の前胞状卵胞の発育を促進するための方法が提供される。
【００５５】
また、前胞状卵胞の胞状卵胞への発育を刺激するのに十分な期間、前胞状卵胞を有効量のＣＮＰアゴニストと接触させることによる前胞状卵胞刺激の方法も提供される。ＣＮＰは、本明細書において、二次／前胞状卵胞の初期胞状卵胞段階への発育を促進し、したがって、ＬＨアゴニストによって、例えば、連続的なｅＣＧ−ｈＣＧ処理によって、排卵の効率的な誘発を可能にすることが示される。いくつかの実施形態において、卵胞発育の最後から２番目の段階から排卵前段階において、ＣＮＰがＦＳＨに取って代わることができ、そのため、ＣＮＰ治療は、従来のＦＳＨ治療に対する反応性が低い患者に利益をもたらし得る。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態において、曝露はインビトロで、例えば、器官または組織培養中で行われ、少なくとも１つの卵胞が、有効用量のＲ−スポンジンアゴニストまたはＣＮＰアゴニストのうちの少なくとも１つに一時的に曝露される。処理された卵胞は、例えば、インビトロ受精、胚性幹細胞の作製等のためにインビトロで用いられてもよいか、またはインビボでの使用を提供するために移植されてもよい。対象となる移植方法として、限定されないが、卵巣の全てまたは断片を含む１つ以上の卵胞の、腎臓カプセル、皮下部位、卵巣部位への移植が挙げられ、その場合、例えば、１つの卵巣が保持され、１つの卵巣はエクスビボ処理のために除去され、１つ以上の処理された卵胞が残りの卵巣の部位に移植されてもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態において、インビトロ処理の後に、排卵前卵母細胞を形成するように原始卵胞または一次卵胞を活性化させるための卵巣移植が行われ、その後にインビトロまたはインビボ受精が行われてもよい。
【００５８】
対象となる個体は、絶滅危惧種、経済的に重要な動物、早期卵巣機能不全に罹患する女性、ヒト胚性幹細胞および始原生殖細胞に由来する卵胞等を含む。他の実施形態において、曝露は、局所的に、例えば、卵巣内注射によって、または個体への全身投与によって、インビボで行われる。
【００５９】
Ｒ−スポンジンまたはＣＮＰアゴニストへの曝露後、個体は、卵胞の成長を開始するのに効果的な濃度の、組換えＦＳＨ、インビボ宿主動物において自然に発生するＦＳＨ、ＦＳＨ類似体、例えば、ＦＳＨ−ＣＴＰ、ペグ化ＦＳＨ等を含む卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）またはＦＳＨ類似体で処理されてもよい。
【００６０】
ＣＮＰ、ＦＳＨ、またはそのアゴニストのいずれかで卵胞が刺激されて胞状卵胞の段階になると、個体は、黄体ホルモン（ＬＨ）またはそのアゴニストで処理されてもよく、そのアゴニストは特に、絨毛性ゴナドトロピン、例えば、ウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）等を排卵用量で含む。さらに、卵胞は、ｃ−ｋｉｔリガンド、ニューロトロフィン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−４、ＢＭＰ７、白血病抑制因子、塩基性ＦＧＦ、ケラチノサイト増殖因子等のうちの１つ以上にインビボまたはインビトロで曝露されてもよい。
【００６１】
Ｒ−スポンジンまたはＣＮＰアゴニストの用量は、前胞状卵胞を刺激して上述のように胞状卵胞への発育を誘導するのに十分であり、そのため、それが使用される特異的な薬剤、培養中にそれが提供される時間の長さ、卵胞の状態等に応じて変化する。濃度を経験的に決定するための当該技術分野で既知の方法を使用することができる。活性成分の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）の決定を含む、細胞培養および／または実験動物における標準的な薬学的手順に従って決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、それは比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
【００６２】
一例として、卵胞培養物は、以前に示した濃度のＣＮＰアゴニストおよびＲ−スポンジンアゴニストの一方または両方と、少なくとも約１時間〜約２４時間の一時的な期間接触させてもよいが、約６〜約１２時間であってもよい。濃度は、他の阻害剤の効力を反映するように調節されてもよい。
【００６３】
休止状態からの卵胞の放出後、卵胞内に存在する卵母細胞がインビトロ目的に用いられてもよい。いくつかの実施形態において、卵母細胞が直接用いられ、また他の実施形態において、卵胞が、卵成熟を調節するために１つ以上の因子と接触させられ、例えば、培養物が、インビトロで卵成熟を誘導するのに十分な濃度のＦＳＨまたはＦＳＨ類似体と接触させられてもよく、ＦＳＨまたはＦＳＨ類似体は、組換え、修飾、天然等であってもよい。代替として、ＣＮＰは、卵成熟を誘導するために使用されてもよい。インビトロ成熟後、卵母細胞は、例えば、移植のためにインビトロで受精させてもよく、幹細胞株の作製のためにインビトロで受精させてもよく、種々の研究目的のために受精せずに用いられてもよい。
【００６４】
卵胞は、ｃ−ｋｉｔリガンド（Ｈｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｐａｒｒｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎｎｅｒ，１９９９）、ニューロトロフィン（Ｏｊｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、血管内皮増殖因子（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−４（Ｔａｎｗａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、ＢＭＰ７（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、白血病抑制因子（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、塩基性ＦＧＦ（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ケラチノサイト増殖因子（Ｋｅｚｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）等のうちの１つ以上の存在下でさらに培養されてもよく、因子（複数可）は、ＣＮＰアゴニストおよびＲ−スポンジンアゴニストの一方もしくは両方と一緒に、またはＣＮＰアゴニストおよびＲ−スポンジンアゴニストの一方もしくは両方への曝露の後で加えられてもよい。例えば、ｅＣＧおよび／またはＨＣＧを含むＬＨアゴニストは、卵成熟の後にＦＳＨまたはＣＮＰによって投与されてもよい。
【００６５】
他の実施形態において、卵胞は、成熟のために動物レシピエントに移植されてもよい。上述のように、卵巣部位、腎臓部位、皮下部位等における卵巣またはその断片の移植のための方法が当該技術分野で既知である。卵巣組織が卵巣以外の部位に移植される場合、さらなるインビトロ操作を行わずに受精を進めてもよい。卵巣組織が卵巣以外の部位、例えば、皮下部位に移植される場合、卵母細胞は、インビトロ受精のためにその後除去されてもよい。レシピエントは、卵母細胞の成熟のために内在性ＦＳＨを提供してもよいか、またはその目的のために外来性ＣＮＰもしくはＦＳＨもしくはＦＳＨ類似体（組換え、長時間作用型ＦＳＨ−ＣＴＰ等を含む）を提供されてもよい。
【００６６】
他の実施形態において、曝露は、インビボで行われ、個体に局所的または全身的に施される。細胞培養および／または動物実験から得られたデータは、ヒトの投薬量の範囲を処方する際に使用することができる。活性成分の投薬量は、典型的には、ＥＤ５０を含むが、毒性はほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内である。投薬量は、用いられる投薬形態および用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。個体は、少なくとも約６時間、通常、少なくとも約１２時間、有効濃度で接触させられるが、少なくとも約１日であってもよく、また約１週間以内、通常、約３日以内であってもよい。
【００６７】
組成物はまた、所望の製剤に応じて、動物またはヒトへの投与のための薬学的組成物を処方するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容された、非毒性の希釈剤の担体を含むこともできる。希釈剤は、配合剤の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例として、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル液、ブドウ糖溶液、およびハンクス液が挙げられる。さらに、薬学的組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療性、非免疫原性の安定剤、賦形剤等を含むことができる。組成物はまた、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤および界面活性剤等の、生理的条件に近づくためのさらなる物質も含むことができる。
【００６８】
組成物はまた、様々な安定剤のうちのいずれか、例えば抗酸化剤等を含むことができる。薬学的組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボでの安定性を高めるか、またはさもなければその薬理学的特性を強化する（例えば、ポリペプチドの半減期を延長する、その毒性を低下させる、溶解度または取り込みを増強する）種々の周知の化合物と複合体を形成することができる。そのような修飾または錯化剤の例として、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩が挙げられる。組成物のポリペプチドはまた、それらのインビボでの属性を強化する分子と複合体形成することもできる。そのような分子は、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質を含む。
【００６９】
種々の種類の投与に好適な製剤に関するさらなる指針は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に見出すことができる。薬物送達のための簡潔な考察については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照のこと。
【００７０】
ＣＮＰアゴニストおよびＲ−スポンジンアゴニストの一方または両方は、様々な異なる方法で投与することができる。例として、経口的、局所的、腹腔内、静脈内、動脈内、皮下的、真皮下、経皮的、卵巣内の方法によって組成物を投与することが挙げられる。薬学的剤形において、化合物は、それらの薬学的に許容される塩の形態で投与されてもよいか、またはそれらは単独で、もしくは他の薬学的に活性な化合物と適切に会合させて、および組み合わせて使用されてもよい。
【００７１】
「単位剤形」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒトおよび動物対象向けの単一投与量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、薬剤的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルと共に所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された、所定量の本発明の化合物を含有する。本発明の新規単位剤形の詳細は、用いられる特定の化合物、および達成されるべき効果、および宿主における各化合物と関連した薬物動力学に依存する。
【００７２】
全身投与の典型的な投薬量は、０．１μｇ〜１００ミリグラム／対象の体重１ｋｇ／投与の範囲である。典型的な投薬量は、１日２〜６回服用される錠剤１個、または１日１回服用される、比例的に高い含有量の活性成分を含有する徐放性カプセルもしくは錠剤１個であってもよい。徐放性効果は、異なるｐＨ値で溶解するカプセル材料により、浸透圧によって徐々に放出するカプセルにより、または任意の他の既知の制御放出手段により得ることができる。
【００７３】
当業者は、特定の化合物、症状の重篤度、副作用に対する対象の感受性の関数として、用量レベルが変化し得ることを容易に理解するであろう。特定の化合物の中には、他の化合物よりも強力なものもある。所与の化合物の好ましい投薬量は、様々な手段を用いて当業者によって決定される。好ましい手段は、所与の化合物の生理学的効果を測定することである。
【００７４】
このような曝露の後、個体は、成熟卵母細胞を放出するのに効果的な濃度のＣＮＰでまたは組換えＦＳＨもしくはＦＳＨ類似体（限定されないが、インビボ宿主動物において自然に発生するＦＳＨ、ＦＳＨ類似体、例えば、ＦＳＨ−ＣＴＰ、単鎖類似体、ペグ化ＦＳＨ等を含む）で処理されてもよい。個体はまた、上述のようにＬＨアゴニストで処理されてもよい。代替として、卵母細胞は、上述のように卵巣から除去され、インビトロ成熟に用いられてもよい。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は、当業者に、主題の発明の作製方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するために記載されるのであって、本発明と見なされるものの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度、濃度等）に関して正確性を確保する努力がなされたが、ある程度の実験誤差および偏差が許容されるべきである。別途指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
【００７６】
実施例１
卵母細胞由来Ｒ−スポンジン２は、卵胞の発育を促進する
Ｒ−スポンジンタンパク質は、ＬＧＲ４／５／６受容体を活性化して古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化することにより腸管の発達を刺激することができる成体幹細胞因子である。複数のＷｎｔリガンドおよび同族のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体が卵巣で発現されるが、それらの生理的役割は未知のままである。生物情報学、ＲＴ−ＰＣＲ、およびインサイツハイブリダイゼーション分析に基づいて、我々は、一次卵胞から排卵前段階の卵胞の卵母細胞におけるＲ−スポンジン２の発現を証明した。Ｒ−スポンジン２およびＷｎｔ３ａによる前胞状卵胞の培養体細胞の処理は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路および細胞増殖を相乗的に刺激した。Ｒ−スポンジン２の刺激作用は、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤であるＤｉｃｋｋｏｐｆ１によって遮断された。ＦＳＨも細胞増殖を刺激したが、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路は活性化しなかった。小さい卵胞を含有する思春期前卵巣の器官培養において、Ｒ−スポンジン２による処理が、ＦＳＨと同様に、一次卵胞から二次卵胞への発育を促進した。基礎卵胞およびＲ−スポンジン２で刺激した卵胞の成長は、ＤＫＫ１および特異的Ｒ−スポンジン２抗体によって遮断された。さらに、組換えＲ−スポンジンアゴニストのインビボ投与は、未成熟マウスおよびＧｎＲＨアンタゴニストで処理した成体マウスの両方において、一次卵胞の第二卵胞段階への発育を刺激した。その後のゴナドトロピンによる処理は、インビトロ受精後に初期胚発生を経ることができる成熟卵母細胞の形成を可能にした。したがって、卵母細胞由来Ｒ−スポンジン２は、初期卵胞発育に必要不可欠なパラクリン因子であり、Ｒ−スポンジンアゴニストは、従来のゴナドトロピン療法に対する反応性が低い不妊症の女性に対する新たな治療計画を提供する。
【００７７】
我々は、発育中の卵胞の卵母細胞におけるＲ−スポンジン２の排他的な発現、ならびに卵巣体細胞における古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の刺激において、この卵母細胞因子が、Ｗｎｔリガンドと相乗作用して細胞増殖および卵胞成長をもたらす能力を証明した。インビボ投与後、Ｒ−スポンジンアゴニストは、ＦＳＨと同様に、一次および二次卵胞の胞状卵胞段階への発育を促進した。ＦＳＨに加えて、Ｒ−スポンジン２も、別の卵胞刺激因子を意味する。
【００７８】
方法および材料
動物：異なる年齢のメスＩＣＲマウスをＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手してＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設にて飼育し、１２時間の暗期／明期、ならびに食餌および水の自由摂取とした。マウスは、地域の動物研究委員会のガイドラインに従って処理した。
【００７９】
インサイツハイブリダイゼーション分析：Ｒ−スポンジン２を発現する卵巣細胞型を同定するために、インサイツハイブリダイゼーション分析を行った。端的に述べると、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ  Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、マウスＲ−スポンジン２ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＣ１５６６１７．１、ヌクレオチド５４２〜７２６）の［３５Ｓ］−ウリジン三リン酸（３５Ｓ−ＵＴＰ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で標識したアンチセンスおよびセンスプローブを作製した。卵巣の凍結切片を８μｍに切断し、標識プローブ（約５×１０６ｃｐｍ／ｍｌ）とともに５６℃で一晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、３７℃で３０分間、スライドをＲＮＡｓｅ  Ａで処理し、ハイブリダイズしなかったプローブを不活性化し、続いて、下降系列のＳＳＣ緩衝液（２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ、および０．１×ＳＳＣ）で、６５℃で３０分間洗浄してから脱水した。放射標識を可視化するために、ＮＴＢ−２オートラジオグラフィー写真用乳剤（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）にスライドを浸漬し、４℃で１０日間保存した。Ｄ−１９現像液および定着液（Ｋｏｄａｋを使用してシグナルを現像し、ヘマトキシリンによる対比染色を行った。
【００８０】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析および免疫組織化学：卵母細胞および体細胞におけるＲ−スポンジン２ならびに多様なＷｎｔおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ遺伝子の転写レベルを、異なる細胞マーカーの転写レベルと一緒に分析した。１０日齢マウスの卵巣を、０．２５％トリプシン、０．１％コラゲナーゼＩ、０．０２％  ＤＮａｓｅＩで、３７℃で１５分間処理した。１ｍＭ  ＥＤＴＡを加えた後、３７℃で３０分間卵巣をインキュベートし、卵母細胞および残りの体細胞を回収した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、製造者のプロトコルに従ってＳｅｎｓｉｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してｃＤＮＡを合成した。Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＴＤ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上でｉＴａｑ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、次のようにリアルタイムＰＣＲを行った：９５℃で１５分間、次いで、９５℃で１５秒間および６０℃で６０秒間を４５サイクル。特定の遺伝子の絶対的存在量を、βアクチンレベルの絶対的存在量に対して正規化した。
【００８１】
細胞増殖アッセイ：１０日齢マウスから得た卵巣を、コラゲナーゼＩ、ＤＮａｓｅ、およびトリプシンで消化した。２７０ｘｇで１０分間遠心分離した後、細胞ペレットを洗浄し、４ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、およびビルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＭｃＣｏｙ５ａ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中の９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に３７℃で３時間プレーティングした。ＰＢＳで２回洗浄して浮遊する卵母細胞を除去した後、異なる因子を含有するＭｃＣｏｙ５ａ無血清培地中で４８時間細胞を培養した。４９０ｎｍで吸光度を測定する２時間前に基質を加えることによって、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを行った。
【００８２】
ＴＣＦ−ルシフェラーゼアッセイ：１０日齢マウスの卵巣体細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；  Ｇｉｂｃｏ）を含有するＭｃＣｏｙ‘ｓ５ａ培地中３７℃で一晩培養した後、ＴＣＦ−ルシフェラーゼアッセイに基づいてＷｎｔシグナル伝達を評価した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、０．１μｇのｐＲＬ−ＴＫプラスミドと一緒に１μｇのｐＴＯＰ  ＦＬＡＳＨまたはｐＦＯＰ  ＦＬＡＳＨプラスミドで６時間細胞をトランスフェクトした。１０％ＦＢＳを含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地中で一晩培養した後、無血清培地中で細胞を８時間培養し、Ｒ−スポンジン２、Ｗｎｔ３ａ、および／またはＦＳＨで１８時間処理した。ルミノメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とともにＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、相対発光量として表されるルシフェラーゼ活性を決定した。
【００８３】
卵巣外植片培養：１０日齢マウスの卵巣を培養プレートインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に載せ、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、０．１％Ａｌｂｕｍａｘ  ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ）、インスリン−トランスフェリン−セレン（Ｇｉｂｃｏ）、０．０５ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有する４００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中、培地の薄い層で卵巣を覆うためにメンブレンインサートの下で培養した。２日ごとに培地を交換しながら、Ｒ−スポンジン２および／またはＦＳＨで卵巣を４日間処理した。いくつかのグループでは、外植片をＤＫＫ１またはＲ−スポンジン２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）でも処理し、Ｒ−スポンジンの活性を遮断した。非免疫ＩｇＧまたは煮沸済み（１００℃、１５分）Ｒ−スポンジン２抗体で処理した外植片は、陰性対照としての役割を果たした。培養終了時に、卵巣をブアン固定液中で固定し、パラフィン包埋し、連続的な切片に切断してからヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。同じ卵胞を再度数えることを回避するために、明瞭に染色された卵母細胞核を有する卵胞のみを数えた。
【００８４】
Ｒ−スポンジン１−Ｆｃによるインビボ処理、インビトロ受精、および初期胚培養：
プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（２０）を使用して、Ｃ末端マウス抗体ＩｇＧ２のＦｃ断片を含有するマウスＲ−スポンジン１−Ｆｃ融合タンパク質を、安定にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の順化培地から精製した。クマシーブルー染色、およびＲ−スポンジン１抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した免疫ブロットにより、組換えタンパク質のレベルを決定した。２９３Ｔ細胞におけるＴＣＦルシフェラーゼアッセイに基づいて、Ｗｎｔシグナル伝達活性を推測した。Ｒ−スポンジン１−Ｆｃを１０日齢マウスの腹腔内に５日間毎日注射し（１０ｕｇ／日）、その後ｅＣＧ（７ＩＵ）を１回注射し、４８時間後には排卵用量（７ＩＵ）のｈＣＧを注射した。１６時間後、輸卵管内の排卵された卵母細胞の数と、卵巣内に残った成熟卵母細胞の数を決定した。成体の試験では、９〜１０週齢のマウスに、ＧｎＲＨアンタゴニスト（ＯＲＧ３７４６２、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｉｎｃ．、１ｕｇ／ｇ  ＢＷ）を４日間毎日腹腔内に前処理し、その後、ＧｎＲＨアンタゴニストと一緒にＲ−スポンジン１−Ｆｃ（２０ｕｇ／日）を用いてさらに４日間処理した。次いで、ｅＣＧ（７ＩＵ）の単回投与と、４８時間後のｈＣＧ（７ＩＵ）で動物を処理した。１６時間後、排卵された卵母細胞の数を決定した。インビトロ受精のために、ＩＣＲオスマウス（１０〜１２週齢）の精子をヒト卵管液培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に採集し、３７℃で１時間インキュベートした。卵母細胞を精子（２〜３×１０５／ｍｌ）と６時間受精させ、授精卵母細胞をＫＳＯＭ−ＡＡ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移して胚盤胞まで発育させた。
【００８５】
結果
一次卵胞およびより大きな卵胞の卵母細胞におけるＲ−スポンジン２の発現
図１Ａに示すように、３日齢の新生仔マウスの卵巣は、卵巣皮質に複数の原始卵胞を含有し、いくつかの一次卵胞は髄質領域に移動した（図１Ａａ）。インサイツハイブリダイゼーション分析に基づくと、陽性Ｒ−スポンジン２のｍＲＮＡシグナルが一次卵胞の卵母細胞のみに認められたが、皮質の原始卵胞には認められなかった（図１Ａｂ）。１５日齢の幼若マウスの卵巣において、一次、二次、および初期胞状卵胞の段階にある卵胞が顕著であり（図１Ａｃ）、Ｒ−スポンジン２シグナルが、一次卵胞およびより大きな卵胞の卵母細胞に認められた（図１Ａｄ）。思春期前マウス（２３日齢）の卵巣において、最も大きな卵胞が胞状卵胞の段階に達した（図１Ａｅ）。ここでも同様に、一次卵胞およびより大きな卵胞の卵母細胞にＲ−スポンジン２の発現が認められた（図１Ａｆ）。センスプローブを用いた切片にはシグナルが認められなかった。
【００８６】
我々は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行って、１０日齢マウスから得た卵母細胞および体細胞におけるＲ−スポンジン２の発現レベルを、多様なＷｎｔおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ遺伝子と一緒に調べた。図１Ｂに示すように、体細胞において、最低レベルのＲ−スポンジン２が卵母細胞に認められた。卵母細胞マーカーであるＧＤＦ９は、卵母細胞に検出されたのみであったのに対し、ＦＳＨ受容体は体細胞に認められた。図１Ｃに示すように、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３Ａ、およびＷｎｔ５ｂの転写レベルが体細胞に認められたが、卵母細胞中では検出不能であった。対照的に、Ｗｎｔ４およびＷｎｔ５ａの転写物は、体細胞および卵母細胞の両方に認められた。Ｆｉｚｚｌｅｄ受容体（図１Ｄ）に関しては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ６、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ９の転写物が体細胞にのみ認められたのに対し、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ８は、卵母細胞および体細胞の両方で、体細胞におけるよりも高いレベルで認められた。
【００８７】
Ｒ−スポンジン２による治療は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路および卵巣体細胞の増殖を刺激した。    古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化をモニタリングするために、１０日齢マウスの卵巣から体細胞を得て、ＴＣＦ−ルシフェラーゼ受容体プラスミドでトランスフェクトした後、Ｒ−スポンジン２、Ｗｎｔ３ａ、および／またはＦＳＨで１８時間処理した。Ｗｎｔシグナル伝達の指標としてルシフェラーゼ活性を測定した。図２Ａに示すように、Ｗｎｔ３ａまたはＲ−スポンジン２単独の処理がＴＣＦ−ルシフェラーゼ活性の最小限の刺激をもたらしたのに対し、ＦＳＨによる処理は効果がなかった。Ｗｎｔ３ａおよびＲ−スポンジン２の両方の存在下で、ＴＣＦ−ルシフェラーゼ活性における相乗的増加が顕著であった。さらに、Ｗｎｔシグナル伝達のアンタゴニストであるＤＫＫ１による処理は、Ｒ−スポンジン２およびＷｎｔ３ａの刺激作用を遮断した。生細胞の数を推定するために、増加する用量のＷｎｔ３ａを含むかまたは含まないＲ−スポンジン２でも細胞を培養し、ミトコンドリア還元酵素（ＭＴＳ）の活性を測定した。図２Ｂに示すように、Ｒ−スポンジン２またはＷｎｔ３ａ単独の処理は、ＭＴＳ活性を用量依存的に刺激した。Ｗｎｔ３ａおよびＲ−スポンジン２の両方による処理は、ＭＴＳ活性のさらなる増加をもたらした。同様に、ＦＳＨ処理もまた生細胞数を増加させた。
【００８８】
Ｒ−スポンジン２は、器官外植片における初期卵胞発育を刺激した。    １０日齢マウスの卵巣を、異なる因子とともに、培養２日目に培地を交換して４日間培養した。図３Ａに示すように、Ｒ−スポンジン２による処理は、卵巣の重量を用量依存的に増加させ、Ｒ−スポンジン２およびＦＳＨの両方を一緒に加えるとさらなる増加が認められた。さらに、アンタゴニストＤＫＫ１との同時処理は、基礎卵巣およびＲ−スポンジン２で刺激した卵巣の重量の増加を阻害した。形態学的分析から、Ｒ−スポンジン２またはＦＳＨのいずれかによる処理後の卵胞発育の促進が示唆された（図３Ｃ）。異なる発育段階における卵胞の割合は、各段階で卵胞の数を数えることによって評価した。原始および変性卵胞の割合に無視できる程度の変化が認められたものの、Ｒ−スポンジン２および／またはＦＳＨによる処理は、二次卵胞の割合の増加を伴って一次卵胞の比率を減少させたことから（図３Ｄ）、Ｒ−スポンジン２およびＦＳＨによる初期卵胞発育の促進が示唆される。
【００８９】
卵母細胞によって分泌される内在性Ｒ−スポンジン２の卵胞成長に対する役割を調査するために、我々は、特異的Ｒ−スポンジン２抗体とともに卵巣をインキュベートした。図３Ｅに示すように、親和性精製Ｒ−スポンジン２抗体による処理は、基礎卵巣およびＲ−スポンジン２で刺激した卵巣の重量を抑制したが、非免疫ＩｇＧは抑制しなかった。さらに、非免疫ＩｇＧまたは予め煮沸したＲ−スポンジン２抗体による処理は、卵巣重量に影響を及ぼさなかったことから、卵胞の成長における内在性Ｒ−スポンジン２の重要な役割が示唆される。
【００９０】
Ｒ−スポンジン１−Ｆｃによるインビボ処理は卵胞発育を促進し、排卵のゴナドトロピン刺激および初期胚発生を可能にする。    我々は、分泌を促進させるために、ヒトＲ−スポンジン１ｃＤＮＡのＣ末端をヒトＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによりキメラＲ−スポンジン１−Ｆｃタンパク質を作製した。２９３Ｔ細胞における発現プラスミドのトランスフェクション後、分泌したＲ−スポンジン１−Ｆｃタンパク質を精製し、Ｗｎｔシグナル伝達経路を刺激する能力について調べた。図４Ａに示すように、免疫ブロットにおいて精製Ｒ−スポンジン１−Ｆｃの１本のバンドを検出することができ、増加する用量のＲスポンジン１−Ｆｃによる処理は、Ｗｎｔ３ａと一緒に加えられると、ＴＣＦ−ルシフェラーゼ活性を用量依存的に刺激した。キメラＲ−スポンジン１の効力は、組換えヒトＲ−スポンジン２の効力に類似する。
【００９１】
１０日齢の思春期前マウスにＲ−スポンジン１−Ｆｃ（１０ｕｇ／日）を５日間毎日腹腔内注射し、その後、ｅＣＧで４８時間処理して卵胞成熟の最終段階を刺激した。図４Ｂに示すように、Ｒ−スポンジン１−Ｆｃに続いてｅＣＧで処理した後に、卵巣重量の増加が認められた。これらの動物のうちの何匹かを排卵用量（７ＩＵ）のｈＣＧでさらに処理し、ｈＣＧ注射の１６時間後に輸卵管内の排卵された卵の数を評価した。卵巣内に残った成熟卵母細胞の数を推定するために、針穿刺を用いて成熟卵母細胞も卵巣から回収した。図５Ａに示すように、回収した排卵された成熟卵の合計数は、対照と比較してＲ−スポンジン１−Ｆｃ処理群においてより多かった。これらのデータは、Ｒ−スポンジン１−Ｆｃが、一次／二次卵胞の発育を促進し、ゴナドトロピンに反応して成熟卵母細胞を形成することが可能な排卵前卵胞の形成をもたらす能力を証明するものである。成体マウスにおけるＲ−スポンジンアゴニストの刺激作用をさらに証明するために、９〜１０週齢のマウスをＧｎＲＨアンタゴニストで処理して内在性ゴナドトロピンレベルを低下させた後、ｅＣＧによる処理の４日前にＲ−スポンジン１−Ｆｃまたは食塩水で４日間処理し、卵胞成熟の最終段階を誘導した。２日後、動物に単回用量のｈＣＧを注射して排卵を誘発した。図５Ｂに示すように、輸卵管から回収して卵巣から穿刺により取り出した成熟卵母細胞は、対照と比較してＲ−スポンジン１−Ｆｃ処理動物においてより多かった。その後のインビトロ受精および胚培養により、対照およびＲ−スポンジン１−Ｆｃ処理動物から得られた相当な割合の卵母細胞が胚盤胞の段階に進行したことが示された（図４Ｃ）。
【００９２】
我々のデータは、Ｒ−スポンジン２が、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を介して顆粒膜細胞の増殖を促進することができる、卵母細胞に発現される遺伝子であることを示した。古典的βカテニン経路の刺激において、卵母細胞由来Ｒ−スポンジン２および顆粒膜細胞由来Ｗｎｔリガンドの強力な相乗作用が認められ、初期卵胞発育の促進がもたらされた。これらのデータは、卵母細胞が所与の卵胞の運命を支配する上での重要な役割を強調している。卵胞の発育は、下垂体前葉によって産生されるゴナドトロピンと、卵母細胞によって分泌される局所因子の両方に依存していることは明らかである。
【００９３】
卵母細胞におけるＲ−スポンジン２の排他的局在は、インサイツハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲ分析によって支持される。Ｒ−スポンジン２の転写物は、原始卵胞には認められないが、一次卵胞および大きな卵胞の卵母細胞において排卵前段階まで発現される。ＲＴ−ＰＣＲ分析はさらに、体細胞において無視できる程度のＲ−スポンジン２の発現を示した。休止状態にある卵胞が一旦成長し始めると、成長する卵胞の卵母細胞がＲ−スポンジン２を産生して周囲の体細胞の増殖を促進する。体細胞における複数のＷｎｔリガンドおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に関する我々の知見と一致して、以前の研究によって、卵胞の発育を通して顆粒膜細胞におけるＷｎｔ２およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４の発現が証明されている。我々はまた、卵巣顆粒膜細胞におけるＬＧＲ４の発現も証明したが、それは、Ｒ−スポンジンタンパク質がＬＧＲ４のリガンドであることを示す最近の知見、およびＬＧＲ４の卵巣での発現を示す以前の研究と一致している。
【００９４】
体細胞における古典的Ｗｎｔシグナル伝達の最適な活性化は、卵母細胞由来Ｒ−スポンジン２および体細胞由来Ｗｎｔタンパク質による相乗的な刺激を必要とする。ＷｎｔアンタゴニストであるＤＫＫ１は、共受容体ＬＲＰ６およびＫｒｅｍｅｎ１に結合して、それらの内部移行を引き起こすことにより、Ｗｎｔシグナル伝達を妨げる。外植片培養におけるＤＫＫ１の抑制効果に関する我々の知見は、Ｒ−スポンジン２による卵胞成長の促進が古典的Ｗｎｔ経路を介して媒介されることを示した。インビボのＦＳＨ治療も前胞状卵胞の発育を刺激するが、ＦＳＨはＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーターを刺激せず、また卵巣発育に対するＦＳＨの刺激作用はＤＫＫ１によって遮断されなかったことから、Ｒ−スポンジンおよびＦＳＨは、独立した経路を介して作用する可能性が高い。ここで観察された卵巣体細胞の増殖および卵胞の成長におけるＷｎｔシグナル伝達の重要な役割は、顆粒膜細胞に優勢な安定したβカテニン突然変異を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて認められた、ＦＳＨによって誘導された卵胞成長の亢進および卵胞閉鎖の抑制の観察と一致する。同様に、トランスフェクトしたｓｉＲＮＡを用いたげっ歯類顆粒膜細胞におけるＷＮＴ２発現のノックダウンは、ＤＮＡの合成を低下させたのに対し、ウイルスベクターを用いたＷＮＴ２の過剰発現はそれを増強した。特異的抗体を用いた内在性Ｒ−スポンジン２の中和により、内在性卵母細胞由来Ｒ−スポンジン２の卵胞発育における重要な役割が強調された。各生殖周期の間に複数の原始卵胞が成長を開始するが、ほんのわずかな卵胞のみが排卵前段階まで発育して成熟卵母細胞を放出する。全ての卵胞は、局所的なＷｎｔの発現を刺激することができる循環ＦＳＨの影響下にあるため、それらの卵母細胞における最適なＲ−スポンジン２の発現を伴う卵胞が優勢となり、コンピテントな卵を放出するのに成功する。
【００９５】
ＦＳＨ治療は不妊症治療に広く使用されているが、患者のサブグループ（ＦＳＨ低反応者）は、ゴナドトロピンによる治療に最小限の反応を示した。これらの患者は、月経周期の３日目に、少ない胞状卵胞数と、血清ＦＳＨおよびＡＭＨ（抗ミュラー管ホルモン）レベルの上昇を示した。高用量のゴナドトロピン療法、または成長ホルモンもしくは成長ホルモン放出ホルモンを用いた補助療法が使用されてきたが、その利益が最小限であることは明らかである。ＦＳＨ低反応者の病因が不明であり、この臨床状態のげっ歯類モデルが存在しないため、我々は、内在性ゴナドトロピンレベルを減少させるようにＧｎＲＨアンタゴニストで処理した未成熟マウスおよび成体マウスにおいて、Ｒ−スポンジンが卵胞発育を促進させる能力について調査した。１０日齢マウスでは、最も発育の進んだ卵胞が第二卵胞および前胞状卵胞の段階に達し、Ｒ−スポンジンアゴニストの外因性投与は、これらの卵胞の排卵前段階への進行を促進した。ゴナドトロピン刺激の後で、より多くの成熟卵母細胞が形成された。ＧＮＲＨアンタゴニストで処理した成体マウスにおいて、Ｒ−スポンジンアゴニストによる処理は、同様に、受精および胚発生を経ることが可能な成熟卵母細胞の数を増加させた。Ｒ−スポンジン１（１００μｇ／成体マウス）によるインビボ処理が腸管幹細胞の増殖および腸管の発達を刺激することが示されているが、恐らくは、より低用量の（５倍）化合物を使用したために、本発明の処理プロトコル下では、腸管の長さおよびＰＣＮＡ染色における変化は観察されなかった。
【００９６】
本発明の知見は、初期卵胞の発育を促進するＲ−スポンジンの能力が、卵胞形成の初期段階を刺激することによる新たな治療アプローチの基盤としての役割を果たし得ることを証明した。
【００９７】
実施例２
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドは卵胞発育を刺激する
卵巣の顆粒膜細胞に発現されるＮＰＰＣ遺伝子によってコードされたＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）は、卵丘細胞内のナトリウム利尿ペプチド受容体−Ｂ（ＮＰＲＢ）を活性化することにより卵成熟を阻害する。ＲＴ−ＰＣＲは、マウスにおいて、卵巣ＣＮＰペプチドの増加と関連した、卵巣発育および卵胞成長中のＮＰＰＣおよびＮＰＲＢの発現の増加を示した。乳仔卵巣の培養体細胞および思春期前動物の顆粒膜細胞において、ＣＮＰによる処理はｃＧＭＰの産生を刺激した。また、ＣＮＰによる培養前胞状卵胞の処理が卵胞の成長を刺激した一方で、ＣＮＰによる乳仔マウスの卵巣外植片の処理は、ＦＳＨと同様に、卵巣重量を増加させた。ＣＮＰおよびＦＳＨの両方の刺激作用は、プロテインキナーゼＧ阻害剤によって一部遮断され、観察されたＦＳＨによるＮＰＰＣ転写物の刺激と一致していた。インビボ試験によって、乳仔マウスにＣＮＰを４日間毎日注射することにより、卵巣の成長を促進させ、ゴナドトロピンによる排卵誘発に成功することがさらに示された。思春期前マウスにおいて、ＣＮＰ処理もまた、初期胞状卵胞の排卵前段階への成長を促進し、ＬＨ／ｈＣＧによる効率的な排卵誘発をもたらした。ＣＮＰ処理後に回収された成熟卵母細胞は、インビトロで受精して胚盤胞まで発育することができ、生存能力のある子孫を分娩することができた。ヒト卵巣皮質断片の異種移植片においても、ＣＮＰ処理はまた、卵胞数から明らかであるように卵胞の成長を刺激した。よって、成長中の卵胞によって分泌されるＣＮＰは、前胞状卵胞および胞状卵胞の成長に必要不可欠である。ＦＳＨに加えて、ＣＮＰによる処理も、女性の不妊症に新たな治療を提供することができる。
【００９８】
結果
卵胞発育中のＣＮＰおよびその受容体ＮＰＲＢの発現：リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により、思春期前発育中のマウス（７〜１９日齢）から得た体細胞において、ＮＰＰＣおよびＮＰＲＢ転写物の発現の年齢依存性増加が示されたが、卵母細胞におけるレベルは無視できる程度であった（図５Ａおよび５Ｂ）。顆粒膜細胞および卵胞殻も、２３日齢の思春期前マウスの初期胞状卵胞から、およびｅＣＧで２日間処理したマウスの排卵前卵胞から得た。図５ＡおよびＢに示すように、ＮＰＰＣおよびＮＰＲＢの両方の転写物の発現は、卵胞膜細胞および卵母細胞よりも顆粒膜細胞においてより高かった。異なる細胞マーカーを用いて異なる細胞型の純度を確認した（図５Ｃ、卵母細胞にはＧＤＦ９、顆粒膜細胞にはＦＳＨ受容体、および卵胞膜細胞にはＣＹＰ１７ａ１）。我々はさらに、異なるサイズの卵胞を単離した（１３日齢マウスからは直径９０〜１４０ｕｍ、思春期前マウスからは直径３００〜４００ｕｍ、ｅＣＧ処理マウスからは直径５００〜６００ｕｍ）。図５Ｄに示すように、卵胞の発育中にＮＰＰＣおよびＮＰＲＢの両方の転写レベルの増加が検出され、排卵前卵胞（直径５００〜６００）において最も高いレベルに達した。卵巣内のプロＣＮＰからの成熟ＣＮＰペプチドのプロセシングを証明するために、特異的ＥＩＡを用いて思春期前発育中のマウスからの卵巣抽出物を分析した。図５Ｅに示すように、卵巣のＣＮＰ含有量は、最初の卵胞発育の波の間に年齢依存的に増加し、１９日齢の動物において最高レベルに達した。
【００９９】
培養卵巣体細胞による、ｃＡＭＰではなくｃＧＭＰ産生の刺激：ＮＰＲＢ受容体が、ＣＮＰリガンドによって刺激されるｃＧＭＰの産生を媒介したため、我々は、１３日齢マウスの卵巣から体細胞を、また２１日齢マウスから顆粒膜細胞を単離して、増加する用量のＣＮＰまたは高用量（３０ｎＭ）のＡＮＰで２時間処理した。ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰの両方の培地中含有量をＲＩＡにより決定した。図６ＡおよびＢに示すように、ＡＮＰではなく、ＣＮＰによる処理が、両方の細胞調製物にｃＧＭＰの培地中含有量における用量依存性の増加をもたらした。対照的に、ＣＮＰ処理後のｃＡＭＰ産生における変化は、どちらの種類の細胞にも検出されなかった。
【０１００】
ＣＮＰ処理は前胞状卵胞および培養卵巣外植片の成長を促進した：１３日齢マウスの卵巣から前胞状卵胞（直径１２５〜１３５ｕｍ）を単離し、異なるホルモンで４日間処理し、卵胞の直径を毎日モニタリングした。図７Ａに示すように、ＣＮＰによる処理は、卵胞サイズの用量依存性および時間依存性の増加をもたらし、ｃＧＭＰ類似体である８−ブロモ−ｃＧＭＰによって誘発されるものに相当するレベルに達した。対照的に、ＡＮＰによる処理は効果がなかった。さらに、ＣＮＰおよびＦＳＨを組み合わせた処理（２５ｎｇ／ｍｌ）は、さらなる卵胞成長の増加をもたらした（図７Ｂ）。これらの知見は、ＣＮＰが前胞状卵胞の成長を促進する能力を証明した。
【０１０１】
我々はさらに、卵巣の外植片培養物を用いてＣＮＰの作用を調査した。１０日齢マウスの個々の卵巣を、２日ごとに培地を交換しながら、ＣＮＰ、ＡＮＰ、および／またはＦＳＨとともに４日間培養した。図８Ａに示すように、ＡＮＰではなく、ＣＮＰによる処理が、卵巣重量の用量依存性増加をもたらした。ＣＮＰと同様に、ＦＳＨによる処理もまた卵巣重量を増加させ、ＣＮＰおよびＦＳＨの両方を含めるとさらに増加した。組織学的分析は、ＣＮＰによる処理も、ＦＳＨと同様に、前胞状卵胞の発育を促進したことを示した（図８Ｂ）。さらに、代謝的に安定な、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼＧの競合阻害剤であるＲｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ（Ｒｐ−ｃＧＭＰＳ）による処理が、ＣＮＰの刺激作用を遮断し、高用量ＦＳＨの効果を一部抑制した。この阻害剤が、ｃＧＭＰの産生を増加することができないＦＳＨの刺激作用を一部遮断することができたため、我々はさらに、ＦＳＨ処理が卵巣培養中にＮＰＰＣの発現を増加させるかどうかを調べた。図８Ｄに示すように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＦＳＨ処理の２日後および４日後の両方にＮＰＰＣ転写レベルの増加を示したことから、ＦＳＨの刺激作用は、刺激性ＣＮＰの発現によって一部媒介されることが示唆される。対照的に、ＮＰＲＢの転写レベルにおける変化は検出されなかった。
【０１０２】
ＣＮＰによるインビボ処理は、幼若、思春期前、および成体マウスにおいて、排卵のための卵胞発育、ならびにその後の妊娠を促進した：ＣＮＰが前胞状卵胞のインビボでの発育を刺激する能力を調べるために、１３日齢の幼若マウスをＣＮＰで４日間毎日腹腔内処理した。この後にｅＣＧの単回腹腔内注射をさらに２日間行い、卵巣重量を決定した。図９Ａに示すように、ＣＮＰ処理は卵巣重量に５６％の増加をもたらした。組織学的分析は、ＣＮＰ処理後に胞状卵胞の発育における増加を示した（図９Ｂ）。これらの動物のうちの何匹かを排卵用量のｈＣＧでさらに処理し、排卵効率を確認した。図９Ｃに示すように、ＣＮＰで処理した動物の輸卵管に、対象と比較して、より多数の排卵された卵母細胞が認められた。これらの知見は、ＣＮＰが二次／前胞状卵胞の初期胞状卵胞段階への発育を促進させ、したがって、連続的なｅＣＧ−ｈＣＧ処理によって効率的な排卵の誘発を可能にする能力を実証するものである。
【０１０３】
ＣＮＰが初期胞状卵胞の排卵前段階への発育を刺激する能力をさらに調べるために、２１日齢の思春期前マウスをＣＮＰで４日間毎日腹腔内処理し、その後で排卵用量のｈＣＧの単回注射を行った。ｈＣＧ処理の１８時間後、排卵された成熟卵母細胞の数を決定した。図１０Ａに示すように、ＣＮＰによる前処理は卵巣重量を増加させた。食塩水で前処理した動物と比較して、ＣＮＰによる前処理は、ｈＣＧによって誘導される、排卵された卵母細胞の数の増加をもたらした（図１０Ｂ）。
【０１０４】
我々はさらに、ＣＮＰによる前処理後に回収された排卵された卵母細胞が受精することが可能かどうかを調べた。ＣＮＰで前処理した思春期前マウスの輸卵管からｈＣＧ処理後に卵母細胞を得て、インビトロ受精に用いた。我々は、ｅＣＧ（２日）およびｈＣＧ（１６時間）で連続的に処理した思春期前マウスから得た卵母細胞を対照として用いた。図７に示すように、ＣＮＰで前処理した動物からの受精卵母細胞は、対照卵母細胞と比較して同じ効率で胚盤胞の段階まで発育した。排卵を誘発するためにＣＮＰ、続いてｈＣＧで前処理した何匹かの思春期前メスを繁殖性のオスと交配した。妊娠の成功が証明され、続いて健康な仔マウスが産まれた。
【０１０５】
ＣＮＰの卵成熟阻害剤としての役割に加えて、我々の試験は、ＣＮＰが前胞状卵胞および胞状卵胞の発育を促進する能力を証明した。ＮＰＰＣ遺伝子は、前胞状卵胞および胞状卵胞の体細胞／顆粒膜細胞に発現され、外来性ＣＮＰは、ＮＰＲＢ受容体を介して媒介されるｃＧＭＰの産生を刺激することにより、卵胞の成長を促進することができる。さらに、ＦＳＨが、卵巣外植片培養物においてＮＰＰＣの発現を増加させ、ＦＳＨの卵巣発育に対する刺激作用の一部が、プロテインキナーゼＧの阻害剤によって遮断されたことから、ｃＧＭＰ経路を介して作用するパラクリンホルモンＣＮＰは、前胞状卵胞発育の促進において内分泌ホルモンＦＳＨの効果のうちのいくつかを媒介する可能性が高い。幼若ラットにおけるＦＳＨの前胞状卵胞に対する既知の卵胞刺激作用と同様に、幼若マウスのＣＮＰ処理は、前胞状卵胞の初期胞状卵胞段階への発育を刺激し、ゴナドトロピンによる最後から２番目の刺激を可能にした。さらに、未成熟マウスのＣＮＰ処理は、排卵前ＬＨ／ｈＣＧ刺激に反応することが可能である排卵前卵胞の形成を引き起こし、結果として、排卵、受精、および妊娠の成功をもたらした。これらの知見は、卵胞発育の最後から２番目の段階から排卵前段階において、ＣＮＰがＦＳＨに取って代わることができることを示唆するものである。
【０１０６】
ＣＮＰは、ＮＰＲＢ受容体を介してのみ作用し、下流のｃＧＭＰシグナル伝達を刺激する。我々の知見は、ＮＰＲＢ／ＧＣ−Ｂヌルマウスを使用した以前の研究と一致している。椎骨または四肢骨の縦方向の成長の減衰に加えて、メスＮＰＲＢヌルマウスは、不妊および非周期的であり、原始卵胞から二次卵胞までのみを含む小さな卵巣を有していた。ＣＮＰがＮＰＲＢ受容体を介してのみ作用するため、ＮＰＲＢヌルマウスに見られた二次卵胞の段階における卵胞発育停止は、卵胞発育の最終段階におけるＣＮＰの必要不可欠な役割と、ＦＳＨの作用を媒介するＣＮＰの重要な役割を強調するものである。
【０１０７】
マウスにおける異なる発育段階の卵胞内のＮＰＰＣ転写物およびＣＮＰペプチドの検出は、ラットの発情周期の異なる段階において卵巣抽出物中の免疫反応性ＣＮＰの存在を示す以前の研究と一致している。我々は、卵丘細胞を含まない穿刺顆粒膜細胞においてのみ遺伝子発現を調べたが、最近の研究により、卵丘細胞が壁顆粒膜細胞よりも高いレベルのＮＰＲＢ受容体を発現することと、エストラジオールによるＮＰＲＢ発現の刺激が示されている。我々のデータはさらに、卵胞の成長中にＮＰＰＣおよびＮＰＲＢの両方の受容体の発現が増加し、排卵前卵胞が最も高いレベルのこれらの遺伝子を発現することを証明した。排卵前ＬＨサージの後、卵成熟と関連した減数分裂阻害活性レベルの低下と同時に、ＮＰＰＣの発現および卵巣内のＣＮＰ含有量が時間依存的に減少した。我々の、ＣＮＰが卵胞の成長を促進する能力の証明と合わせて、卵胞内のＣＮＰおよびその受容体が、卵胞の発育中、排卵前ＬＨサージまで、卵胞体細胞の増殖および卵成熟の抑制の両方において重要な役割を果たすことが示されている。患者において、排卵前ＬＨサージの開始はまた、卵胞の成長休止および卵母細胞の減数分裂成熟の再開と同時に、顆粒膜細胞におけるＮＰＰＣ発現の低下および卵胞液中のＣＮＰ分泌の減少も伴う。
【０１０８】
ラットの培養前胞状卵胞の成長に対するブロモ−ｃＧＭＰ（膜可溶性ｃＧＭＰ類似体）の促進作用と同様に、培養前胞状卵胞および卵巣外植片を用いた本発明の試験は、ＣＮＰが卵胞発育を促進する能力を証明した。卵巣外植片培養物において、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの強力かつ選択的な阻害剤であるＲｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ（Ｒｐ−８Ｂｒ−ｃＧＭＰ）による同時処理は、ＣＮＰの作用を遮断した。この知見は、ＣＮＰが、ｃＡＭＰではなく、幼若マウスの卵巣からの培養体細胞および初期胞状卵胞からの培養顆粒膜細胞によって産生されるｃＧＭＰを刺激する能力と一致している。したがって、ｃＧＭＰ経路によって媒介されるＣＮＰの卵胞刺激作用は、ＦＳＨによって誘導されるｃＡＭＰシグナル伝達経路とは異なる。前胞状卵胞およびより小さな卵胞を含む培養卵巣外植片において、ＦＳＨによる処理は、ＮＰＲＢ転写物の発現ではなく、ＮＰＰＣの発現を増加させた。また、高用量ＦＳＨの卵巣外植片の成長に対する刺激作用は、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ阻害剤によって一部遮断された。これらのデータは、前胞状卵胞においてＦＳＨによって誘導される卵巣内ＣＮＰが、ＦＳＨの卵巣作用を一部媒介し得ることを示唆するものであった。興味深いことに、ＮＰＣＣの転写レベルは、胞状卵胞から排卵前卵胞にかけても増加したが、顆粒膜細胞のように発現された時には一定のままであり、顆粒膜細胞数に対する刺激を反映していた。卵胞発育に関する正確なクロストーク、ならびにＣＮＰによって誘導されるｃＧＭＰおよびＦＳＨによって刺激されるｃＡＭＰ経路の重複作用については、さらなる分析を要する。
【０１０９】
１３日齢の幼若マウスを用いたインビボ処理により、ＣＮＰ処理が、前胞状卵胞の発育を促進し、その後、ｈＣＧの排卵性サージに応じて排卵を引き起こすことができる排卵前卵胞がｅＣＧで誘導可能であったことが証明された。さらに、２１日齢の思春期前マウスのＣＮＰ処理は、初期胞状卵胞の排卵前段階への発育を促進し、したがってＬＨ／ｈＣＧによる排卵の誘発を可能にし、受精可能な卵母細胞を生み出し、妊娠を成功させた。また、ＣＮＰ処理後に回収された成熟卵母細胞は、従来のｅＣＧ−ｈＣＧによる未成熟マウスの連続プライミング後に得られるものに匹敵する、同様の発生能を有する。ＮＰＲＢ受容体は、顆粒膜細胞に発現されるが卵胞膜細胞にはあまり発現されず、また、排卵前卵胞による最適なエストロゲン産生のためには、顆粒膜細胞および卵胞膜細胞の両方が必要であるため、ＣＮＰによるインビボ処理は、顆粒膜細胞の機能を刺激することができ、十分な内在性ＬＨは、卵胞膜細胞の機能を促進し、卵胞の排卵前段階への最終的な成熟の刺激を可能にすることができた。また、外来性ＣＮＰは、卵胞膜細胞に発現されたＮＰＲＢ受容体を介して作用することができた。ＦＳＨと同様に、ＣＮＰが思春期前マウスにおける排卵前卵胞の発育を刺激する能力も、排卵前卵胞の形成においてＣＮＰがＦＳＨに取って代わることができることを示唆しており、卵胞刺激性パラクリンホルモンとしてのＣＮＰの重要性を強調するものであり、ＮＰＲＢヌルマウスに見られた二次卵胞の段階における卵胞停止の報告と一致していた。
【０１１０】
ＣＮＰがＮＰＲＢを介してのみ作用するのに対し、ＡＮＰおよびＢＮＰは、ＮＰＲＡを介して作用する。ＣＮＰは、血管拡張性、降圧性、およびナトリウム利尿活性を有することが示されているが、本発明のＣＮＰ投与量および注射プロトコルを使用した４日間のＣＮＰ処理の後で異常は観察されなかった。本発明の低用量ＣＮＰの使用に伴う明らかな副作用の欠如は、生理濃度のＣＮＰを使用して最小限の心臓および腎臓作用が示された以前の報告と一致している。実際、超生理学的血漿レベルに達するヒトにおけるＣＮＰの短期注入は、血管降圧薬またはナトリウム利尿薬ではない。
【０１１１】
ＦＳＨ治療は、卵胞の発育を刺激して、受精のための成熟卵母細胞を形成するために広く使用されてきた。我々の知見は、ＣＮＰもまた前胞状卵胞および胞状卵胞の両方を刺激することができ、よって、このペプチドホルモンを用いて、不妊症の女性の治療に将来的な機会を提供することを証明した。ＣＮＰによる治療は、従来のＦＳＨ治療に対する反応性が低い患者に利益をもたらし得る。
【０１１２】
方法および材料：
動物：異なる年齢のメスＣＤ１マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手してＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設にて飼育し、１２時間の暗期／明期、ならびに食餌および水の自由摂取とした。マウスは、地域の動物研究委員会のガイドラインに従って処理した。
【０１１３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析：卵巣および異なる卵巣細胞型におけるＮＰＰＣおよびＮＰＲＢの転写レベルを、異なる細胞マーカーの転写レベルと一緒に分析した。１０日齢マウスの卵巣を、０．２５％トリプシン、０．１％コラゲナーゼＩ、０．０２％ＤＮａｓｅＩで、３７℃で１５分間処理した。１ｍＭ  ＥＤＴＡを加えた後、３７℃で３０分間卵巣をインキュベートし、卵母細胞および残りの体細胞を回収した。さらに、２３日齢の思春期前マウスから初期胞状卵胞を単離し、穿刺して顆粒膜細胞および卵母細胞を回収し、卵胞殻を得た。同様の手順を用いて、ｅＣＧ（５ＩＵ）による思春期前マウスの処理から４８時間後に、顆粒膜細胞、卵母細胞、および卵胞殻を排卵前卵胞から単離した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、製造者のプロトコルに従ってＳｅｎｓｉｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してｃＤＮＡを合成した。Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＴＤ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上でｉＴａｑ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を使用して、次のようにリアルタイムＰＣＲを行った：９５℃で１５分間、次いで、９５℃で１５秒間および６０℃で６０秒間を４５サイクル。サイクル閾値法によりデータを分析し、発現の倍変化を測定した。特定の遺伝子の絶対的存在量を、βアクチンレベルの絶対的存在量に対して正規化した。
【０１１４】
卵巣ＣＮＰレベルの測定：ＣＮＰペプチドレベルのＥＩＡによる測定のために、異なる年齢のマウスから卵巣を得て、５体積の水で５分間煮沸して内在性プロテアーゼを不活性化した。次いで、溶液を１Ｍ  ＡｃＯＨおよび２０ｍＭ  ＨＣｌに調整した。Ｐｏｌｙｔｒｏｎ混合機（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）で卵巣をホモジナイズし、４℃で３０分間、２０，０００×ｇで遠心分離した。抽出物の上清を濃度６６％のアセトンで沈殿させた。３，０００×ｇで３０分間遠心分離することにより沈殿物を除去した後、上清中のアセトンを蒸発させ、抽出したペプチドを水に溶解し、製造者の指示に従ってＣＮＰ  ＥＩＡキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用してＥＩＡ分析を行った。
【０１１５】
異なるサイズの卵胞の切開および前胞状卵胞の培養：ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、１３日齢マウスから直径９０〜１４０ｕｍの初期二次卵胞を単離し、２３日齢の思春期前マウスから胞状卵胞（直径３００〜４００ｕｍ）を単離した。ｅＣＧ（５ＩＵ）で処理した思春期前マウスから排卵前卵胞（直径５００〜６００ｕｍ）を単離した。卵胞培養のために、１３日齢マウスから前胞状卵胞（直径１２５〜１４５ｕｍ）を単離し、インスリン、トランスフェリン、およびセレンと一緒にペニシリンおよびストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭ（１００ｕｌ／ウェル）を含んだ９６ウェルプレートにおいて個々に培養した。ＣＮＰ、ＡＮＰ、８−ブロモ−ｃＧＭＰ、および／またはＦＳＨを用いてまたは用いずに、外植片を処理した。培地を２日ごとに交換し、卵胞の直径を測定することにより卵胞の成長を毎日モニタリングした。
【０１１６】
卵巣外植片培養：１０日齢マウスの卵巣を培養プレートインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に載せ、０．１％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、０．１％  Ａｌｂｕｍａｘ  ＩＩ、インスリン−トランスフェリン−セレン、０．０５ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−アスコルビン酸、およびペニシリン−ストレプトマイシンを含有する４００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２中、培地の薄い層で卵巣を覆うようにメンブレンインサートの下で培養した。２日ごとに培地を交換しながら、ＣＮＰおよび／またはＦＳＨで卵巣を４日間処理した。また、いくつかの外植片は、汎特異性プロテインキナーゼＧ阻害剤であるＲｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ（ＢｉｏＬｏｇ、Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でも処理した。培養終了時に、卵巣をブアン固定液中で固定し、パラフィン包埋し、連続的な切片に切断した後、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。
【０１１７】
ＣＮＰによるインビボ処理、排卵、および妊娠：１３日齢の乳仔マウスをＣＮＰ（２０ｕｇ／体重１ｋｇ）で４日間毎日腹腔内処理した。この後にｅＣＧ（５ＩＵ）の単回注射を２日間行い、最後から２番目の卵胞の成熟を刺激した後、重量測定および組織学的分析のために卵巣を回収した。何匹かの動物を（５ＩＵ）ｈＣＧでさらに処理し、１６時間後に輸卵管内の卵母細胞をモニタリングし、排卵効率を評価した。ＣＮＰが初期胞状卵胞の成長に及ぼす影響を調べるために、２１日齢の思春期前マウスをＣＮＰ（５０ｕｇ／体重１ｋｇ）で４日間毎日腹腔内処理して排卵前卵胞の発育を刺激し、続いて排卵用量の（２．５ＩＵ）のｈＣＧの注射を行った。１６時間後、排卵された卵母細胞の数を測定した。ＣＮＰ処理動物から得た成熟卵母細胞をインビトロ受精に用いた。ＣＤ１オスマウス（１０〜１２週齢）の精子をヒト卵管液培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に回収し、３７℃で１時間インキュベートした。卵母細胞を精子（２〜３×１０５／ｍｌ）と６時間受精させ、授精卵母細胞をＫＳＯＭ−ＡＡ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移して胚盤胞まで発育させた。妊娠および仔マウスの誕生をモニタリングするために、ＣＮＰ処理したメスのうちの何匹かを生殖能力のあるオスと交配した。
【０１１８】
統計分析：結果は、３つ以上の独立測定の平均±ＳＥとして表される。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡ検定を用い、続いて、Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとしたＦｉｓｈｅｒの保護最小有意差により決定した。
【０１１９】
使用される略称は次の通りである：ＣＮＰ：Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド、ＡＮＰ：心房性ナトリウム利尿ペプチド、ＢＮＰ：脳ナトリウム利尿ペプチド：ｅＣＧ：ウマ絨毛性ゴナドトロピン、ｈＣＧ：ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＮＰＲＢ：ナトリウム利尿ペプチド受容体−Ｂ、ＮＰＲＡ：ナトリウム利尿ペプチド受容体−Ａ、ＥＩＡ：酵素結合免疫測定法、ＲＩＡ：ラジオイムノアッセイ。
【０１２０】
本明細書に引用される全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれると示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において論じされる刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書における如何なるものも、先行発明を理由として、本発明がそのような開示に先行する権利を有しないことを求めるものと解釈されるべきではない。
【０１２１】
上述の発明は、理解を明確にする目的で例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲の主旨および範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正がそれに対して行われ得ることは、本発明の教示を考慮すれば、当業者には明らかである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図５Ｄ−Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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