(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満および／または２型糖尿病を治療または予防するための、対象の口および／または咽頭に送達用の剤形である医薬組成物であって、体重および／または血糖値の正常化を誘導するのに有効な量の、分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドを含み、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、水溶性であり、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １〜３の配列の３つのペプチド全てを含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４〜９から選択される配列の１つ以上のペプチドをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４〜９の配列の６つのペプチド全てをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドがブレビバシラス・テクサスポルスから分離された混合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドが合成物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
量が単回または分割投与において１日あたり食物消費の乾燥重量１ｋｇあたり１００〜１０，０００ｍｇの範囲である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
剤形が、チューインガム、トローチ、及び口腔スプレー剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
肥満、２型糖尿病および／または肥満と関連する他の疾患を治療または予防する方法であって、ブレビバシラス・テクサスポルスから分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドを効果的な量でそれを必要とする対象（ヒトを除く）の口および／または咽頭に送達することを含み、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、水溶性であり、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １〜３の配列の３つのペプチド全てを含む、方法。
【請求項９】
体重または体重増加を低下する方法であって、ブレビバシラス・テクサスポルスから分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドを効果的な量でそれを必要とする対象（ヒトを除く）の口および／または咽頭に送達することを含み、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、水溶性であり、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １〜３の配列の３つのペプチド全てを含む、方法。
【請求項１０】
食物摂取量を低下する方法であって、ブレビバシラス・テクサスポルスから分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドを効果的な量でそれを必要とする対象（ヒトを除く）の口および／または咽頭に送達することを含み、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、水溶性であり、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １〜３の配列の３つのペプチド全てを含む、方法。
【請求項１１】
２型糖尿病を治療または予防する方法であって、ブレビバシラス・テクサスポルスから分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドを、血糖量をコントロールしてインスリン感受性を増加するのに効果的な量で、それを必要とする対象（ヒトを除く）の口および／または咽頭に送達することを含み、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、水溶性であり、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １〜３の配列の３つのペプチド全てを含む、方法。
【請求項１２】
複合型脂質異常症を治療または予防する方法であって、ブレビバシラス・テクサスポルスから分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドを、血中ＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリド量をコントロールするのに効果的な量で、それを必要とする対象（ヒトを除く）の口および／または咽頭に送達することを含み、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、水溶性であり、
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １〜３の配列の３つのペプチド全てを含む、方法。
【請求項１３】
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４〜２１から選択される配列の１つ以上のペプチドをさらに含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４〜９から選択される配列の１つ以上のペプチドをさらに含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４〜９の配列の６つのペプチド全てをさらに含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離され、精製されてなるＢＴリポペプチドがブレビバシラス・テクサスポルスから分離された混合物である、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象（ヒトを除く）が肥満または過体重である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１２年１２月１７日出願した米国特許仮出願第６１／７３８、１６６号の優先権を主張し、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、一般的にバイオテクノロジーの分野、より具体的には、肥満および２型糖尿病を含む肥満関連疾患を治療または予防するリポペプチドファミリーの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
肥満は代謝症候群として総称的に知られる重大な疾患群を引き起こす。これらの肥満関連疾患には、インスリン耐性（２型糖尿病）、アテローム性異常脂質血症（心臓血管疾患を引き起こす）、高血圧（脳卒中、心臓発作および慢性腎不全のリスクがある）および脂肪肝が含まれる。２型糖尿病と肥満の強い関連性によって「糖尿肥満」という造語が作られている。肥満は最も重大で蔓延している健康問題の１つであり、世界中で４億を超える人に影響を及ぼしている。発展途上国における肥満率は最近２０年で３倍に増加しており、一方、米国人の肥満率は世界で最も高い。米国成人の６４％が太り過ぎまたは肥満であり、米国の小児および青年の約３分の１は過体重または肥満である。処方薬と市販薬、減量プログラム、ダイエットおよび運動プラグラムを含め、肥満の「治療」には事欠かない。これらの解決策のいくつかは効果があるが、それらは体重または総体的な健康における長期的な改善を伴わず、医師と患者の両者にとってほとんど全面的に期待が満たされない結果となる。数種類の処方薬は中枢作用で食欲を抑制または（抗栄養剤として）脂肪吸収をブロックするのに効果的に作用する。しかしこれらの治療法は限られた効果および／または様々な有害事象の問題がある。これらの治療法を用いるほとんどの患者はリバウンドして体重が増え続ける。
【０００４】
肥満は、消費を超える不均衡なエネルギー摂取だけの結果ではない。対象者の遺伝的特質、食生活および運動に加えて、腸内微生物叢が肥満および代謝症候群の進行（すなわち、遺伝的肥満マウスｏｂ／ｏｂマウスにおいて）における主要な環境因子として、２種類の優勢な細菌門(バクテロイデスおよびファーミキューテス)の相対的な量における腸内微生物叢の変化(Ley et al., 2005)および食事からのエネルギーの収集能力の増加によって、明らかになってきた。肥満形質は伝染性または感染性でもあり：「肥満微生物叢」を定着させた無菌マウスは、「痩身微生物叢」を定着させたマウスよりも全体脂肪において有意に大きな増加を生じ(Turnbaugh et al., 2006)、一方、無菌マウスは高脂肪誘発性糖尿肥満に耐性である(Backhed et al., 2004; Backhed et al., 2007; Rabot et al., 2010)。さらに重要なことに、腸内微生物叢のグラム陰性菌によって産生されるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）は、「代謝性エンドトキシン血症」により糖尿肥満において誘発的な役割を演じ：高脂肪食はＬＰＳ含有細菌の比率だけでなくＬＰＳの腸透過性も高める(Cani et al., 2007)。従って、プロバイオティックス(Lee et al., 2006; Ma et al., 2008; Aronsson et al., 2010; Kadooka et al., 2010; Kang et al., 2010; Kondo et al., 2010; Chen et al., 2011; Delzenne et al., 2011; Mozaffarian et al., 2011; Fak and Backhed, 2012; Ji et al., 2012; Teixeira et al., 2012)およびプレバイオティックス(Keenan et al., 2006; Zhou et al., 2008; Zhou et al., 2009)などの、ホスト動物に全般的な健康上の利益を付与する既知の微生物叢調節物質／腸障壁増強物質は、肥満および代謝症候群のこの特定の治療領域における新しい臨床的手段として有望である。だが、ヒトにとって望ましくない食事の変化などの問題（すなわち、食事中の８％超の難消化性デンプンプレバイオティックス）がこれらの方法の利用を制限する可能性がある。しかし、腸免疫耐性の長年の概念を維持して以前の理論(Vijay-Kumar et al., 2010)が弱まる中で、病原体パターン感知性ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって制御される抗感染性先天免疫は、寛容性に打ち勝って「肥満微生物叢」中の肥満原因となる片利共生微生物を外来感染性微生物として標的にし痩身微生物叢を誘発して肥満および代謝症候群を予防することができないようであり、抗感染性の先天免疫調節物質の抗糖尿肥満としての利用を推測する土台が奪われていることが最近見出された(Ubeda et al., 2012)。
【０００５】
現在、肥満に効果的であることが証明されている唯一の治療は胃バイパス手術である。正常な消化では、食物は胃を通って小腸に入り、そこで栄養物およびカロリーのほとんどが吸収される；それから大腸（結腸）へと移行して残った廃物が最終的に排泄される。典型的なルーワイ胃手術では、外科用ステープルまたはプラスチック製バンドを用いて胃の最上部に小袋を造って胃を小さくし；小さくした胃を小腸の中間部分（空腸）に直接繋いで、胃の残りの部分および小腸の上部（十二指腸）をバイパスさせる。１０年間まで維持できる食欲抑制および２０〜３０ｋｇの典型的な体重減少に加えて(Maggard et al., 2005)、胃バイパスは術後の数日以内に、有意な体重減少のかなり前に２型糖尿病を完全に回復させる。しかし胃バイパス手術は、高い手術費、合併症による約１％の著しく高い死亡率、約１５％の不成功率、不可逆性、胆石、吸収不良により痩せるほどの体重減少および栄養補充の要求のため、極めて重篤な者に制限される。胃バイパスの基本的な抗糖尿肥満メカニズムは、未消化栄養物を中間および低部の胃腸経路に迂回させ、栄養感知性腸内分泌細胞によるペプチドＹＹＹ（ＰＹＹ）、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、オキシントモジュリン（ＯＸＭ）、およびコレシストキニン（ＣＣＫ）などの食欲抑制抗糖尿肥満ＧＩペプチドホルモンの分泌を刺激するものと考えられる(Geraedts et al., 2009; Geraedts et al., 2010; Laferrere et al., 2010; Peterli et al., 2012)。肥満を治療するためにこれらの抗糖尿肥満ホルモンを注射可能な単一治療剤として使用する試みは、おそらく１種類以上のホルモンを同時に投与することが必要なため成功していない(Field et al., 2010)。 興味深いことに、口腔味覚受容体細胞はＧＩ腸内分泌細胞と（受容体発現およびＧＩホルモン産生において）高い機能的類似を示し(Wu et al., 2002; Dyer et al., 2005; Bogunovic et al., 2007; Palazzo et al., 2007; Wang et al., 2009)、またＤＩＯマウスの口腔に送達されたＰＹＹが、おそらく口腔内の求心性味覚神経の線維上の特異的Ｙ２受容体との相互作用を介して、食物摂取および体重の非常に優れた低下を誘発したことが示された(Acosta et al., 2011)(US 13/145,660も参照)。今までのところ、口腔味覚受容体細胞における複数のＧＩホルモンの産生を刺激して抗糖尿肥満効果を付与できる既知の薬剤または方法はない。
【０００６】
胃バイパス手術および（有害事象の傾向がある）抗栄養法は、抗栄養剤（ジルロタピドなど）が栄養吸収を阻害してＧＩホルモンの分泌を誘発するように、ＧＩホルモンの上方調節において機構的にかなり重複している(Wren et al., 2007)。
【０００７】
胃バイパス手術および微生物叢調節／腸障壁増強抗糖尿肥満治療剤（プレバイオティックスおよびプロバイオティックス）もまた、ＧＩホルモンの上方調節において機構的にかなり重複している。抗糖尿肥満プレバイオティックスである非消化性耐性デンプンの腸内発酵は、短鎖脂肪酸を遊離させてＰＹＹおよびＧＬＰ−１の終日持続された分泌を生じる(Keenan et al., 2006; Zhou et al., 2008; Zhou et al., 2009)。ＴＬＲ２作動剤リポタンパク質／リポペプチド(Sturm et al., 2005)、ＴＬＲ５作動剤フラゲリン(Schlee et al., 2007; Troge et al., 2012)およびＴＬＲ９作動剤ＣｐＧ  ＤＮＡ (Lammers et al., 2003; Menard et al., 2010; Zhong et al., 2012)などのＴＬＲ作動剤は、プロバイオティックスの有効な効果に対する重要な寄与因子である。ＴＬＲ作動剤はまたＧＩホルモンの腸内分泌を直接的に誘発する非免疫調節機能も有している（病原体負荷に対する抗感染性の先天免疫を高める活性は報告されていない）。ＳＴＣ−１細胞のような腸内分泌細胞は、ＴＬＲ２を含む機能的ＴＬＲを発現する(Bogunovic et al., 2007)。ＴＬＲ４、ＴＬＲ５またはＴＬＲ９の活性化（それぞれ作動剤ＬＰＳ、フラゲリン、またはＣｐＧオリゴＤＮＡによる）は、ＳＴＣ−１腸内分泌細胞からの、ならびにＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＧＩホルモンＣＣＫの分泌を誘発し(Palazzo et al., 2007)、プロバイオティックスのためのＴＬＲ仲介抗糖尿肥満腸内分泌機構を示唆している。さらに、飽和脂肪酸はＴＬＲ４およびＴＬＲ２の両方の作動剤であり(Lee et al., 2001; Lee et al., 2004)、そのためこれらの両ＴＬＲは腸内分泌細胞において最も糖尿肥満関連栄養物に関し直接的に栄養感知する役割を演じる。しかし、この免疫非依存性ＴＬＲ−ＧＩホルモン経路の可能性については、新しい非吸収性の非炎症性ＴＬＲ作動剤の非存在下では検討されておらず、これは前述の伝統的な炎症性ＴＬＲ作動剤は、有害なＴＬＲ仲介による全身炎症性反応の可能性を防止するために、抗糖尿肥満剤としての使用が除外されなければならないためである（前述のように、ＬＰＳは実際に代謝症候群を誘発し得る）。従って、当分野において肥満および代謝症候群のための新規治療剤が必要である。
【０００８】
ブレビバシラス・テクサスポルス(例、ATCC PTA-5854)は既に同定されている土壌細菌であり、非リボソームペプチドシンターゼ(ＮＲＰＳ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ９５３３７１のオペロンによってコードされている) を発現してアミノ酸残基１３個の関連カチオン性ＮＲＰ変異体のファミリー／混合物（それらの新たに解明されたＮ端構造を踏まえた「ＢＴペプチド」または「ＢＴリポペプチド」、本開示では両用語は置き換え可能である）を産生し、それらの中でＢＴ１５８３が最も豊富な変異体である (WO/2005/074626)。カチオン性ペプチド（Ｂ．テクサスポルスから分離される混合または個別ペプチド）はインビトロで広範囲スペクトルの抗菌活性を示す（ＢＴ機能Ｎｏ．１）。ＰＴＡ−５８５４とブレビバシラス・ラテロスポラス型株との間の高い１６ＳｒＤＮＡ配列の同一性（９８．５％）によって、ブレビバシラス・テクサスポルスはブレビバシラス・ラテロスポラスの亜種として分類され、ブレビバシラス・ラテロスポラス亜種テクサスポルスはＢＴ  ＮＲＰＳ由来の非リボソームペプチド（またはＢＴペプチド）を産生するブレビバシラス・ラテロスポラス株として定義されている。少なくとも２種類のＢ．ラテロスポラス株（ＬＭＧ１５４４１およびＧＩ−９）のゲノムシークエンシングによってこの分類が確認されている。両ゲノム（それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦＲＶ００００００００およびＥＭＢＬ登録番号ＣＡＧＤ０１０００００１〜ＣＡＧＤ０１００００６１で公開されている)にはＡＹ９５３３７１と９９％のＤＮＡ配列同一性を有する完全なＢＴ  ＮＲＰＳオペロンが含まれるが、これらのＢ．ラテロスポラス株はＢＴペプチドの産生株として知られていない。「ブレビバシラス・テクサスポルス」、「ブレビバシラス・ラテロスポラス亜種テクサスポルス」および「Ｂ．ラテロスポラス」は、したがって同義的である。
【０００９】
ＢＴペプチドのＮ末端残基の正確な同一性（その改変を含む）は知られておらず、ＷＯ／２００５／０７４６２６は二重メチル化Ｂｍｔの暫定的Ｎ末端割り当てである（４Ｒ）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メチル−Ｌ−トレオニン、およびＢＴ１５８３の全体構造であるＭｅ２−Ｂｍｔ−Ｌｅｕ−ＤＯｒｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＤＬｙｓ−Ｖａｌ−ＤＬｅｕ−Ｌｙｓ−ＤＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖｏｌを示した。ここでＯｒｎはオルニチン、Ｖｏｌはバリノールを表す。ＢＴペプチドは、インビトロにおけるそれらの抗菌活性に基づき抗生物質として発見されたが(WO/2005/074626および(Wu et al., 2005))、経口によって送達されたＢＴペプチド（Ｂ．テクサスポルスから分離された混合物として）はインビボにおける抗菌活性を欠如している。例えば、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）はインビトロでＢＴペプチドに対する感受性が高いが、最小阻害濃度よりも十分高い濃度で経口送達されたＢＴペプチドは、マウスＧＩ経路におけるＶＲＥのコロニー破壊ができない(Kogut et al., 2007)。重要なことには、経口送達されたＢＴペプチドはＧＩ経路で消化も吸収もされず、これはおそらくそれぞれ、Ｄ型アミノ酸残基の存在および約１，６００ダルトンというそれらの比較的大きい分子量によると考えられる。しかし、経口送達されたＢＴペプチド（またＢ．テクサスポルスから分離された混合物として）は動物に多くの効果的な全身性作用を生じさせることができる。経口送達されたＢＴペプチドは、呼吸性大腸菌症（気嚢大腸菌感染）の予防、ならびに若いニワトリにおける成長の促進および飼料効率の増大に効果的である(Jiang et al., 2005)。おそらくさらに重要なことには、ＢＴペプチドのインビボ抗感染効果はインビトロ抗生物質活性とは独立していると考えられ、なぜなら経口送達されたＢＴペプチドはインビトロ最小阻害濃度以下の濃度で、大腸菌およびサルモネラによるニワトリにおける感染の予防に効果的なためである(Jiang et al., 2005; Kogut et al., 2007; Kogut et al., 2009)。ＢＴ摂取したニワトリにおいて循環性好異球および単球が（活性化よりもむしろ）プライミングされることも発見され、これらのインビボ抗感染効果の作用の考えうるメカニズムとして先天免疫調節が示されている。経口送達されたＢＴペプチドが消化または吸収されずにＧＩ経路を通過するという事実を考慮すると、ＢＴペプチドは腸上皮細胞を刺激して因子を血液に分泌させ、それが今度は白血球をプライミングして抗感染性免疫を高めているのかもしれない（ＢＴ機能Ｎｏ．２）。
【００１０】
ボゴロールはパプアニューギニアのチューブワームで発見された海洋細菌ブレビバシラス・ラテロスポラスＰＮＧ２７６から分離された５種類のリポペプチド抗生物質からなるファミリーであり(US 6,784,283)、これはまたリポペプチド抗生物質タウラムアミドを含む多数の他の抗生物質を産生する(Gerard et al., 1999; Desjardine et al., 2007)。最も豊富な変異体であるボゴロールＡは報告されている分子量１，５８４および報告されている構造（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）であるＨｍｐ−ＥＤｈｂ−Ｌｅｕ−ＤＯｒｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＤＬｙｓ−Ｖａｌ−ＤＬｅｕ−Ｌｙｓ−ＤＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖｏｌを有している(Barsby et al., 2001; Barsby et al., 2006)。ここでＨｍｐは２−ヒドロキシ−３−メチルペンタン酸、Ｄｈｂは２，３−デヒドロ−２−アミノブチル酸を表す。本発明の前段階として、本発明人はＢＴペプチドがリポペプチドであることを発見した：ＢＴ１５８３はボゴロールＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と同じ構造を有し、ＢＴとボゴロールファミリーは４種類の共通ＮＲＰメンバーを共有し、このためブレビバシラス・ラテロスポラスＰＮＧ２７６もＢ．テクサスポルス株である（実施例１および２）。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、プロテアーゼ耐性ＢＴペプチドが栄養感知腸内分泌／味覚受容体細胞によって典型的に仲介される生理学的変化を誘発でき、従って経口抗糖尿肥満偽栄養物として使用できる（ＢＴ機能Ｎｏ．３）という本発明人の発見に一部基づいている。経口送達されたＢＴペプチドは、食事誘発された遺伝性肥満およびインスリン耐性を、一方向性の体重減少よりもむしろ体重の正常化と調和したパターンで完全に回復することが示されている。
【００１２】
一実施形態では、本発明は肥満および肥満と関連する疾患を治療または予防するための、1種類以上のＢＴリポペプチドを効果的な量で含む医薬組成物を提供する。例として、本発明のＢＴリポペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １〜２１から選択される配列を有する。ＢＴリポペプチドはＢ．テクサスポルス株を用いて天然に（混合物またはさらに精製された個別ペプチドとして）または化学合成によって作製できる。本発明のＢＴリポペプチドは、分離された水溶性リポペプチド、すなわち実質的に精製された形態として提供される。「実質的に精製された形態」は、本発明の１種類以上のペプチドが組成物の少なくとも約１重量％、好ましくは少なくとも約１０重量％、より好ましくは約２５重量％、さらにより好ましくは少なくとも約５０重量％、さらにより一層好ましくは約７５重量％、さらにより一層好ましくは約９５重量％、および最も好ましくは約９９重量％を構成する。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、Ｂ．テクサスポルスから分離された混合物として効果的な量のＢＴペプチドを含むことができる。本発明のペプチドは塩として提供でき、これらの塩には塩と結合するペプチドの一部（例、アミノ酸側基）が塩基性部または酸性部であるかどうかに依存して酸または塩基付加塩が含まれる。好ましくは、塩は医薬品目的として許容可能である。また本発明は、本発明のペプチドおよび医薬品として許容可能なそれらの塩を医薬組成物中に提供する。本発明の医薬組成物は、組成物に基剤、希釈剤または医薬組成物の使用に適した他の材料をペプチドまたは複数ペプチドとともに含むことがあるため、本発明のＢＴペプチドまたは複数ペプチドを実質的に精製された形態で必ずしも含まなくてもよい。
【００１３】
一実施形態では、肥満および肥満と関連した疾患を治療または予防するための本発明の医薬組成物は経口投与剤型であり、効果的な量の水溶性ＢＴリポペプチドおよび対象の口腔とのペプチドの接触および／または暴露を促進する原料を含む。特定の実施形態では、経口投与剤型は１種類以上のＢＴリポペプチドを含む水性溶液である。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は対象における飽食を誘動する方法と関連し、水溶性剤型中に１種類以上のＢＴリポペプチドを含む組成物を対象の口の少なくとも一部に、食事の前の期間（食前）に適用することを含む。期間は５秒以上であってよい。特定の実施形態では、期間は食事前５〜３６０分である。さらに特定の実施形態では、期間は食事前３０〜１２０分である。
【００１５】
別の実施形態は、水溶性形態である１種類以上のＢＴリポペプチドおよび医薬品として許容可能な基剤を含む固体（例、粉末）、液体または半液体組成物を含む容器と関連する。特定の実施形態では、容器は組成物を対象の口の中に放出するノズルを含む。容器は圧力下にあり、および／またはポンプノズルを備えていてよい。
【００１６】
別の実施形態は、水溶性形態である１種類以上のＢＴリポペプチドを加えた、口に適用可能な物品と関連する。物品は、１種類以上のＢＴリポペプチドを加えたチューインガム、１種類以上のＢＴリポペプチドを加えたトローチ（例、口の中である期間保持することが意図された可溶性の固体または半固体物質）、または１種類以上のＢＴリポペプチドを加えた透過性ポーチまたはスポンジであってよい。物品は１種類以上のＢＴリポペプチドを口および／または咽頭に長期送達するように設計され、経口投与として従来理解されているようなピル、錠剤またはカプセル組成物の即時嚥下を含む従来の経口投与とは反する。特に、物品は舌に送達するために設計される。
【００１７】
特定の実施形態では、１種類以上のＢＴリポペプチドは少なくとも５、１０、１５秒以上の一般的な継続時間に従って対象の口および／または咽頭に送達される。別の実施形態では、送達は０．１〜１２０分間であり、そのような範囲における０．１分ずつの任意な特定の増加を含む。
【００１８】
ある実施形態では、組成物は口の中に噴霧するために調製される。医薬組成物はスプレーノズルを備えた容器中に配置し、ポンプ作動または圧力放出のいずれかによって放出できる。
【００１９】
別の実施形態では、医薬組成物は組み合わされてチューインガムの剤型で提供される。
【００２０】
別の態様では、本発明は１種類以上のＢＴリポペプチドの効果的な量の経口投与によって肥満および肥満関連疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明の一つの代表的な実施形態には、肥満または過体重の患者を選択し、体重または体重増加を低下するのに効果的な量の１種類以上のＢＴリポペプチドを患者に経口投与することが含まれる。本発明の別の代表的な実施形態は、２型糖尿病を治療または予防する方法であり、血糖量を制御してインスリン感受性を増加するのに効果的な量の１種類以上のＢＴリポペプチドを患者に経口投与することが含まれる。本発明の別の実施形態は、複合型脂質異常症を治療または予防する方法であり、血中ＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリド量を制御するのに効果的な量の１種類以上のＢＴリポペプチドを患者に経口投与することが含まれる。本発明の別の代表的な実施形態は、非アルコール性脂肪肝を治療または予防する方法であり、肝臓中の脂肪蓄積およびそれに続く肝不全を治療または予防するのに効果的な量の１種類以上のＢＴリポペプチドを患者に経口投与することが含まれる。本発明のさらに別の代表的な実施形態は、高血圧を治療または予防する方法であり、高血圧を治療または予防するのに効果的な量の１種類以上のＢＴリポペプチドを患者に経口投与することが含まれる。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は食物摂取を低下する方法を提供し、肥満または過体重の患者を選択し、食物摂取を低下するのに効果的な量のＢＴリポペプチドを患者に経口投与することが含まれる。
【００２２】
好ましくは、本発明における患者はヒトの患者である。
【００２３】
本発明による非吸収性偽栄養物としてのＢＴリポペプチドの投与量は、一日あたりの食物消費の乾燥重量ｋｇあたりのＢＴリポペプチドのｍｇとして計量される（一日あたりの体重ｋｇあたりのｍｇ数に反するものとして）。本発明は、ＢＴリポペプチド偽栄養物の効果的な量が単回投与または分割投与において、一日あたりの食物消費乾燥重量ｋｇあたり１００〜１０，０００ｍｇの範囲であることを提供する。
【００２４】
また、本発明では、新規の経口抗糖尿肥満剤を特定する方法を提供し、先天免疫細胞を用いたインビトロでのスクリーニングによって非炎症性ＴＬＲ作動剤を特定し、ついで経口送達によって糖尿肥満動物モデル（すなわち、ＤＩＯ、ｄｂ／ｄｂ、またはｏｂ／ｏｂマウス）における不消化、非吸収および抗糖尿肥満効果を試験することを含む。また本発明は、このような新規の経口抗糖尿肥満剤を用いて肥満および肥満関連疾患を治療する方法を提供する。
【００２５】
さらに本発明は、微生物（結核菌、大腸菌、サルモネラ、カンピロバクター、黄色ブドウ球菌、エンテロコッカス・フェシウム、肺炎連鎖球菌、淋病、緑膿菌、クロストリジウム・ディフィシル、アシネトバクター・バウマンニ、ＨＩＶ、インフルエンザ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ヘルペスウイルス、フィロウイルス、エプスタインバーウイルス、ＨＰＶ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス）、寄生虫感染、癌およびこれらの組合せに対するワクチンなどの、ワクチンに対する免疫反応を高める経口アジュバントとしてＢＴリポペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】１Ｈ−１Ｈ  ＮＯＥを破線で示すＢＴ１５８３の補正した構造
【図２】４０ｐｐｍの飲用水による経口ＢＴ治療は、ＤＩＯマウスにおける体重増加、食物または水分の摂取に差を生じなかった。
【図３】ＤＩＯマウスにおける経口ブドウ糖負荷（ｏＧＴＴ）およびグルコース誘発性ンスリン分泌は、４０ｐｐｍでの飲用水による３０日の経口ＢＴ治療によって変化しなかった。
【図４】４００ｐｐｍでの飲用水による経口ＢＴ治療は、ＤＩＯマウスにおける体重、食物と水分の摂取を有意に低下した。
【図５】ＤＩＯマウスにおける経口ブドウ糖負荷（ｏＧＴＴ）およびグルコース誘発性ンスリン分泌は、４００ｐｐｍでの飲用水による３０日の経口ＢＴ治療によって有意に改善された。
【図６】身体組成および水分補給は、４００ｐｐｍでの飲用水による３０日の経口ＢＴ治療によって有意に改善された。
【００２７】
本発明の理解を容易にするため、多数の用語を下に定義する。ここで定義された用語は、本発明に関連する分野における通常の技術者によって一般的に理解される意味を有する。不特定的（「ａ」、「ａｎ」など）および特定的（「the」など）であるような用語は、ただ一つの要素を意味すると意図されておらず、説明に使用できる特定の例の一般的な部類を含む。ここに示す用語は、本発明の特定な実施形態を記載するのに使用されるが、これらの使用は請求項で記載される以外、本発明の範囲を定めるものではない。
【００２８】
「ＮＲＰ変異体」は同一ＮＲＰＳから微生物によって産生される非リボソームペプチドを意味する。ＮＲＰ変異体は、ＮＲＰＳにおけるＮＲＰＳコドン縮退の範囲によって１つ以上の残基でアミノ酸配列 が互いに異なっていてよい。
【００２９】
「非炎症性ＴＬＲ作動剤」は、先天免疫細胞においてそれ自身では反応を誘発できないが、別の刺激物質によって誘発された細胞の反応を増大できるＴＬＲ作動剤を意味する。言い換えると、炎症反応を直接的に誘発する伝統的なＴＬＲ作動剤（ＴＬＲ４作動剤ＬＰＳなど）とは異なり、非炎症性ＴＬＲ作動剤の効果はプライミングのみである。
【００３０】
「偽栄養物」は、ＧＩホルモンの分泌、抗糖尿肥満効果、および栄養物吸収増強などの栄養感知腸内分泌／味覚受容体細胞によって典型的に仲介される生理学的変化を誘動できる、非消化性および非吸収性の天然または合成化合物を意味する。偽栄養物は、ＧＩホルモンの分泌を誘動する栄養物の吸収を妨害する天然または合成化合物である抗栄養物（ジルロタピドなど）とは区別される(Wren et al., 2007)。
【００３１】
腸内分泌細胞におけるＴＬＲ仲介以外の免疫非依存栄養感知の経路によって、腸内分泌／味覚受容体細胞からの抗糖尿肥満ＧＩホルモンの分泌を誘動できる新規の偽栄養物を特定するための効果的な二段階法が可能となる。第一段階は、分離した白血球などの先天免疫細胞によってインビトロで化合物をスクリーニングすることにより非炎症性（プライミングするが活性化しない）ＴＬＲ作動剤を特定することを含む。第二段階は、ＴＬＲ作動剤の経口送達によってＤＩＯ，ｄｂ／ｄｂまたはｏｂ／ｏｂマウスにおける不消化、非吸収および抗糖尿肥満効果についてＴＬＲ作動剤を試験することを含む。起こり得る有害な全身性炎症を避けるため、ＬＰＳなどの炎症性ＴＬＲ作動剤を除外することが必須である。ＢＴリポペプチド偽栄養物の発見は、このスクリーニング法の概念実証を提供する。
【００３２】
「肥満度指数」（ＢＭＩ）は個人の体重と身長に基づいた数値であり、健康への体重の影響を評価する方法を提供する。個人の体重のｋｇ値および伸長のｍ値：ＢＭＩ＝ｋｇ／ｍ２。健康な「正常体重」は、ＢＭＩが１９〜２４．９であることを意味する。「過体重」はＢＭＩ２５〜２９．９を意味する。「肥満」はＢＭＩ３０以上を意味する。
【００３３】
「投与」は自己投与を含む。「経口送達」または「経口投与」は口腔への送達または投与および／または口腔を通した送達または投与を含む。
【００３４】
実施例３〜７の試験で使用されたＢＴペプチドまたはＢＴリポペプチドは、ＢＴ  ＮＲＰ変異体を分析する逆相ＨＰＬＣ段階は使用せずに、ＷＯ／２００５／０７４６２６および(Wu et al., 2005)で公開された分離および検出方法を用いて、Ｂ．テクサスポルスから分離した天然ＢＴ  ＮＲＰ変異体の混合物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １〜９を含む）であった。当該技術に精通している人はこれらの参照文献に記載された方法を用いてＢＴペプチドまたはＢＴリポペプチドを簡単に調製できる。ＢＴペプチドまたはＢＴリポペプドを特徴付けして、アミノ酸配列を下の表１に示した。表１は、９種類の（検出レベルを超える）ＢＴ  ＮＲＰ変異体の構造およびそのような混合物中のそれらの典型的な相対量を示す（非ＢＴ−ＮＲＰＳ由来ペプチドは質量分析によって検出されなかった）。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
実施例１
質量分析
【００３７】
ＷＯ／２００５／０７４６２６および(Wu et al., 2005)において、ＢＴの非リボソームペプチドシンターゼの第一モジュールのＮＲＰＳコドンはトレオニンまたはジヒドロトレオニン（Ｄｈｔ）のコドンであることが予測された。ＢＴ１５８３の標準的なアミノ酸組成測定では、第一アミノ酸残基としてＴｈｒまたはＤｈｔのどちらかが存在するというエビデンスは得られなかった。そのためＢｍｔの残基は、その二重Ｎ−メチル化型が、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）で１９８のｂシリーズｍ／ｚシグナルにおおよそ「一致」する１９７の質量を有するフラグメントを与え得たことによってのみ暫定的に割り当てられた。
【００３８】
Ｎ端構造をよりよく理解するため、ＢＴ１５８３ペプチドをさらに包括的ＭＳ／ＭＳ分析にかけ、それにより８３．０ダルトンのΔＭと解釈される過去に検出されなかった１１５．１のより小さなｂシリーズｍ／ｚシグナルが、第一アミノ酸残基の質量として示された（表２）。８３．０ダルトンの質量を有する唯一の既知のアミノ酸残基はまさにジヒドロトレオニン（Ｄｈｔ）であり、文献ではより一般的に２，３−デヒドロ−２−アミノブチル酸（Ｄｈｂ）として知られている。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
ＢＴ１５８３の第一アミノ酸残基がＤｈｂと同定されたことによって、ＢＴ１５８３とリポペプチドボゴロールＡが同一分子構造を有するという可能性が生じた。この仮説の最初の試験として、ＢＴ１５８３をＨＣｌで１１０℃、一昼夜処理して遊離アミノ酸に加水分解し、ついでＭＡＬＤＩ−ＴＤＦ質量分析にかけＢＴ１５８３にもＤｈｂおよびＨｍｐ残基が含まれるかどうかを調べた。検出のポジティブモードでは、Ｔｙｒ（Ｍ＋Ｈ＋／ｚ＝１８２．１）、Ｌｙｓ（１４７．１）、Ｏｒｎ（１３３．１）、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ（１３２．１）、Ｖａｌ（１１８．１）およびＶｏｌ（１０４．１）が明確に検出されたが、Ｄｈｂ／Ｄｈｔ（１０２．１）あるいはＴｈｒ（１２０．１）は検出されないままであった。しかし検出のネガティブモードでは、１３１．１のＭ−Ｈ＋／ｚシグナルが明確に検出され、ＢＴ１５８３におけるＨｍｐ残基の存在が裏付けられた。
【００４１】
ＨＰＬＣ精製によって８種類のさらなるＢＲ  ＮＲＰ変異体が分離され、これらも同じ包括的ＭＳ／ＭＳ分析に供した。これらのＮＲＰ変異体はすべて１９８．１に加えて１１５．１のｂシリーズｍ／ｚシグナルを生じた（表２）ため、それらはＢＴ１５８３と同じＮ端（Ｈｍｐ−Ｄｈｂ−）構造を含むと考えられた。
【００４２】
従って、質量分析結果によってＢＴペプチドのボゴロールリポペプチドとのさらなる構造的類似性が明らかとなり、ペプチドの２つのファミリー間の正確な関係を決定するための更なる研究が求められた。
【００４３】
実施例２
２Ｄ  ＮＭＲ
【００４４】
ボゴロールＡのアセチル化誘導体の二次元ＮＭＲスペクトル分析が、ボゴロールＡの構造解析において重要な役割を演じた(US 6,784,283)。天然ＢＴ１５８３の構造を包括的に解明するため、非誘導体化ＢＴ１５８３の二次元ＮＭＲスペクトル解析を実施するのに成功した。ＮＭＲデータによって、１３個のアミノ酸残基（１つのＤｈｂ、３つのＬｅｕ、１つのＯｒｎ、１つのＩｌｅ、３つのＶａｌ、２つのＬｙｓ、および１つのＴｙｒ、１つのＶｏｌ）およびＨｍｐの１つの脂肪酸残基に相当する１４スピン系が明らかになった。完全な共鳴帰属を、アミノ酸、ＨｍｐおよびＶｏｌに関して報告されている化学シフト値に基づき、ならびに１Ｈ−１Ｈ全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、１Ｈ−１Ｈ相関分光法（ＣＯＳＹ）、１Ｈ−１５Ｎ異核種間一量子コヒーレンス分光法（ＨＳＱＣ）およびに１Ｈ−１３Ｃ異核種間多量子コヒーレンス分光法（ＨＭＱＣ）実験から行い（表３）、これにより１４スピン系すべてが同定できた。核オーバーハウザー強化分光法（ＮＯＥＳＹ）マップスペクトルは、双極子結合性に起因したクロスピークを示した。ＮＨｉ／ＮＨ（ｉ＋１）および／またはＣαＨｉ／ＮＨ（ｉ＋１）クロスピーク、ここでｉはアミノ酸の位置番号を表している、によってアミノ酸配列およびＮ末端におけるＨｍｐ０のＤｈｂ１への連結が決定できた（図１）。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
特に、オレフィンスペクトル領域では、強度１：３：３：１の四重シグナル（約１Ｈδ＝５．５８ｐｐｍ）がそのままＤｈｂ１  Ｃβプロトンに帰属された。Ｄｈｂ１の（Ｅ）配置帰属はＬｅｕ２  ＮＨプロトンと結合したＤｈｂ１  ＣγプロトンのＮＯＥに基づいて決められた。
【００４７】
Ｈｍｐ０の主な特徴は、ＴＯＣＳＹ、ＣＯＳＹおよびＨＭＱＣ実験によって確認された。プロトン（１Ｈδ＝５．３８ｐｐｍ）は、それが炭素（１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣにおける) または窒素(δが比較的低いため)のいずれとも結合していないことに基づいて、ヒドロキシルプロトンとして同定された。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹおよび１Ｈ−１Ｈ  ＴＯＣＳＹの両方において、ヒドロキシプロトンはＨｍｐ  Ｃ２プロトン（１Ｈδ＝３．５９ｐｐｍ）とのみ相互作用していることが認められた。ＨｍｐのＣ３での側基としての性質は、Ｃ６メチルプロトンのＣ３との排他的なＣＯＳＹ相互作用によって実証され、またＣ２およびＣ４プロトンとのさらなるＣＯＳＹ相互作用を示した。最後にＣ２とＣ６プロトンの間のＮＯＥ結合はＬ−Ｈｍｐ残基と完全に一致した。
【００４８】
従って、ＢＴ１５８３とブロゴールＡは、Ｈｍｐ−ＥＤｈｂ−Ｌｅｕ−ＤＯｒｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＤＬｙｓ−Ｖａｌ−ＤＬｅｕ−Ｌｙｓ−ＤＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖｏｌの同一構造を有している。言い換えると、Ｂ．テクサスポルス由来のＢＴ１５８３およびその天然ＮＲＰ変異体は、ＷＯ／２００５／０７４６２６で記載され請求されているようにＮ末端メチル化されていない。この結論は表１の天然ＢＴ  ＮＲＰ変異体の記載に取り入れられている（明らかにボゴロールＤの酸化誘導体であるボゴロールＥを除いたボゴロールとの相関関係について）。
【００４９】
従って、自然の生息地が大きく異なるにも関わらず、ブレビバシラス・ラテロスポラスＰＮＧ２７６も、そのＢＴペプチドファミリーの産生に基づき、Ｂ．テクサスポルス亜種の株である。
【００５０】
実施例３
ＢＴおよびＴＬＲ２
【００５１】
経口投与されたＢＴリポペプチドは、好異球および単球のニワトリ血液先天免疫細胞を（直接的に活性化するよりもむしろ）プライミングし(Kogut et al., 2007; Kogut et al., 2009)、またＢＴリポペプチドは分離されたニワトリの好異球および単球をインビトロでも（直接的に活性化するよりもむしろ）プライミングする(Kogut et al., 2012)。経口送達されたＢＴリポペプチドは血液に吸収されずにこれらの先天免疫細胞と直接接触するため、インビトロにおけるＢＴによる白血球のプライミングは、ＢＴリポペプチドがインビボにおいて同様にふるまうことを決して示唆しない。しかしインビトロにおけるプライミング測定は、ＢＴ仲介される先天免疫調節に含まれる可能なシグナル化経路を探索する有効なツールである。ＴＬＲは先天免疫において重要な役割を演じる保存された受容体であり(Farnell et al., 2003)またＴＲＬ２はリポペプチド作動剤を有する唯一のＴＬＲであるため、同じインビトロＢＴプライミング測定(Kogut et al., 2012)を実施して、ＴＬＲ２がＢＴリポペプチドに対する受容体として機能できるかどうか調べた。
【００５２】
ヒトＴＬＲ２に対するヤギポリクローナル抗体をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂ  （Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）から入手した。ＴＬＲ２ブロッキングのため、分離したニワトリ好異球と抗体（２．０μｇ／ｍｌ）を、ＢＴおよび／またはＰＭＡで処理する前に、３９℃で３０分間インキュベーションした。
【００５３】
【表４】
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【００５４】
既に報告されているように、ＢＴリポペプチド（１２ｐｐｍ）による好異球の処理は、ＰＭＡの非存在下では酸化的破壊を刺激しなかったが（表４、第３群対第４群）、ＰＭＡ刺激した酸化的破壊を約３倍有意に増加させた（第４群対第２群）。
【００５５】
好異球の抗ヒトＴＬＲ２ヤギ抗体（２．０μｇ／ｍＬ）での前処理によりＢＴプライム化した酸化的破壊は４３％低下し（第６群対第４群）、これはニワトリＴＬＲ２に対するこれらのヒト抗体による阻害の報告されている最大レベル(Farnell et al., 2003)である。これらの結果は、ヒトＴＬＲ２に対する抗体がＢＴによる好異球のプライミングを少なくとも部分的に阻害し、ＴＬＲ２が精製ＢＴリポペプチドのインビトロでのプライミングに対する受容体として機能しており、かつＢＴリポペプチドが（プライミングのみの）非炎症性ＴＬＲ２作動剤であることを実証した。
【００５６】
実施例４
経口アジュバントとしてのＢＴリポペプチド
【００５７】
伝統的な炎症性ＴＬＲ２作動剤は様々なワクチン用のアジュバントとして使用されているため、ＢＴリポペプチドの非炎症性ＴＬＲ２作動剤としての発見は、それらのマウスＴＢワクチンモデルにおけるインビボ免疫調節活性に関する伝統的なアジュバント有効性の試験を促した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを最初に経口ＢＴリポペプチドで処理し、ついで２種類のＴＢワクチン（比較的弱いＥＳＡＴ−６／ＭＰＬ／ＤＤＡサブユニットワクチンおよび強いＢＣＧ生ワクチン）の１つで処理し、それからワクチン処理に対する反応の改善を試験した。試験群は下記を含んだ。
【００５８】
１．経口ＢＴリポペプチド処理、飲用水中４０ｐｐｍで３日間の投与のみ。 
【００５９】
２．経口ＢＴリポペプチド処理（飲用水中４０ｐｐｍ）を３日間、続いて３日目に１×濃度でＥＳＡＴ−６／ＭＰＬ／ＤＤＡ注射。
【００６０】
３．１×濃度でＥＳＡＴ−６／ＭＰＬ／ＤＤＡ注射のみ。
【００６１】
４．経口ＢＴリポペプチド処理（飲用水中４０ｐｐｍ）を３日間、続いて３日目に１×濃度でＭＰＬ／ＤＤＡ注射。
【００６２】
５．経口ＢＴリポペプチド処理（飲用水中４０ｐｐｍ）を３日間、続いて３日目にＢＣＧワクチンの注射。
【００６３】
６．ＢＣＧワクチン注射のみ。
【００６４】
７．ＭＰＬ／ＤＤＡ注射のみ。
【００６５】
８．生理食塩水注射のみ。
【００６６】
マウスを前述のように接種して４週間休息させた後、毒性ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖの低投与量エアゾール（５０〜１００ＣＦＵ）を負荷した。そして負荷３０日後に生菌数を評価した。感染後３０日目にマウスの肺および脾臓について、器官をホモジナイズして７Ｈ１１寒天平板上に１０倍ずつ連続希釈して接種することにより、生菌数の計測を実施した。
【００６７】
【表５】
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【００６８】
表５に示す結果は、飲用水中４０ｐｐｍで３日間経口送達されたＢＴリポペプチドが、ＥＳＡＴ−６サブユニットワクチンの効果を（特に標的器官である肺において）ＢＣＧ生ワクチンのレベルまで有意に増加させた（ＢＴアジュバントがワクチンと別々に送達されたときにでさえ）ことを実証し、飲用水中４０ｐｐｍのこの投与量での経口ＢＴリポペプチドのＣ５７ＢＬ／６マウスにおける強い抗感染性免疫調節活性が確認された。
【００６９】
実施例５
ＢＴ仲介免疫調節は抗糖尿肥満活性の付与に十分でない
【００７０】
ＢＴリポペプチドがＴＬＲ２作動剤であるという前述の発見は、ＢＴペプチドが肥満の原因であるという考えを強化すると考えられ、なぜならＴＬＲ２シグナリングはマウスモデルにおける食事誘発性肥満（ＤＩＯ）および代謝症候群を仲介するからある(Ehses et al., 2010; Himes and Smith, 2010; Kuo et al., 2011)。ＤＩＯマウス試験を実施して、高い免疫調節量で経口送達したＢＴリポペプチド（実施例４の伝統的アジュバント試験によって確立されたように、飲用水中４０ｐｐｍで）の肥満および代謝症候群に対する効果を調べた。
【００７１】
高脂肪食誘発した肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＢＴペプチド効果の評価のために使用した。マウスは１８週齢であり、処理前１２週間は高脂肪食を不断給餌された。マウスの肥満度は中程度（体重約４０ｇ）であり、体重／肥満に対するリポペプチドの効果を両方向で評価可能であった。マウスにＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．から入手した高脂肪食Ｄ１２４９２（６０％ｋｃａｌ％脂肪）を与えた。天然ＢＴペプチドで処理する前にベースライン計測 (一週間の食物および水分の摂取量、体重、血糖値、インスリン、経口的ブドウ糖負荷試験)を実施した。無作為に２群に分けた[対照(非ペプチド処理)および実験(ＢＴペプチド処理)群]。ＢＴペプチドは飲用水中４０ｐｐｍまたは４０ｍｇ／Ｌで送達した。ＢＴリポペプチドの効果(食物および水分の摂取量、体重、血糖値、インスリン、経口的ブドウ糖負荷に対する)を評価した。
【００７２】
図２に示すように、４０ｐｐｍでの飲用水による５週間の経口ＢＴ処理は、ＤＩＯマウスの体重増加、食物摂取量、または水分摂取量に差を生じなかった。食物中の等量ＢＴ送達濃度は、試験全期間にわたって約４０ｐｐｍ（または食物１ｋｇあたりのｍｇ）で一定に維持した。
【００７３】
図３に示すように、４０ｐｐｍでの飲用水による５週間の経口ＢＴ処理は、ＤＩＯマウスの血糖量コントロールまたはインスリン感受性に差を生じなかった。
【００７４】
抗感染性先天免疫の効果的なインビボ調節に十分な量での経口送達ＢＴリポペプチドは、食事誘発された肥満またはインスリン耐性をどちらの方向にも変化させることができず、腸免疫耐性を裏付けられなかった（片利共生生物仲介された糖尿肥満のコントロールにおけるＴＬＲ仲介による抗感染先天免疫の役割の欠如）。
【００７５】
実施例６
ＤＩＯマウスにおいて経口投与されたＢＴリポペプチドの偽栄養物としての抗糖尿肥満効果
【００７６】
ＢＴリポペプチドの非炎症性ＴＬＲ２作動剤としての発見は、腸内分泌／味覚受容体細胞におけるＴＬＲ介在栄養感知による抗糖尿肥満偽栄養物としてのこれらの利用という、予期しなかった全く正反対の予想となった（「ＢＴ−腸内分泌仮説)。ＧＩホルモン反応を誘発する閾値は、食事において最小限８％（または８０，０００ｐｐｍ、このとき試験したどのＢＴ濃度よりも３桁多い）の耐性デンプンが血漿ＧＬＰ−１およびＰＹＹを増加させるために必要とされるように、高いと考えられるため(Belobrajdic et al., 2012)、ＤＩＯマウスにおける抗糖尿肥満効果の可能性の新たな試験では、ＢＴ濃度（飲用水中）を４０ｐｐｍから４００ｐｐｍへと１桁引き上げた。
【００７７】
Ｃ５７ＢＬＫ／６  ＤＩＯマウスは２４週齢であり、処理前の１８週間はＤ１２４９２を不断給餌され、これらのマウスは試験開始時には極度に肥満して体重が約５０ｇだった。処理の前にベースライン計測 (一週間の食物および水分の摂取量、体重、血糖値、インスリン、経口的ブドウ糖負荷試験)を実施した。対照群（１０匹）およびＢＴ群（５匹）を設定した。ＢＴペプチドを飲用水中４００ｐｐｍまたは４００ｍｇ／Ｌで３０日間送達した。ＢＴリポペプチドの効果(食物および水分の摂取量、体重、血糖値、インスリン、経口的ブドウ糖負荷に対する)を評価した。
【００７８】
図４に示すように、４００ｐｐｍでの飲用水による経口ＢＴ処理はＤＩＯマウスにおける有意な体重減少を生じた。一定の体重低下はＢＴ投与により始まり、第２２日頃に約１５ｇまたは対照と比べて全体重の３０％の最大に達した。第２２日〜第３０日で、ＢＴ群の平均体重は、低脂肪食を継続して与えた２７週齢の健康なマウスの典型的な体重（または正常な体重）である約３５ｇで安定したままであった。従って、ＢＴは完全にこれらのマウスにおけるＤＩＯを回復させた。またＢＴで誘発された体重減少は、正常体重に到達した正にその時点で止まった（そして低下し過ぎない）ことも認められ、ＢＴの生物学的機能が一方向性の体重減少よりもむしろ体重の正常化（理想の正常体重に向けた最適化）であることを示唆した。
【００７９】
ＢＴで仲介される体重正常化の考えはまた、食物摂取量の変化によっても裏付けられた。最初に経口ＢＴ処理によって食物摂取量の安定した低下が起こり第７日に最大４０％の減少に達した。その後（および第２２日頃の完全なＤＩＯ回復前の２週間にわたって）、食物摂取量は戻り始め第２２日までに対照群の量に達した。食欲低下と体重減少が正常な体重の時点で同時に止まったことによって、食欲抑制が体重減少の主な推進役であり、（正常体重からの逸脱に応じた）食欲の微調整が体重正常化の主なメカニズムであることが明確に示された。
【００８０】
水分摂取量は試験全体を通して約３分の２低下し、その結果同等なＢＴの食物中送達濃度は第２、７、１４、２２および３０日でそれぞれ約１６８、２１８、２００、１８６、１８７および１７７ｐｐｍ（または食物１ｋｇあたりのｍｇ）であった。言い換えると、この試験における実際の投与量は実施例５の約５倍だった。経口送達したＢＴリポペプチドによる食物および水の摂取の同時抑制は、ＢＴ−腸内分泌仮説によって予測された結果だった。なぜならＧＬＰ−１(Haak, 1999; Gutzwiller et al., 2004; Gutzwiller et al., 2006; McKay et al., 2011; Chan et al., 2013)、ＰＹＹ(Sloth et al., 2007)およびＣＣＫ(Koopmans et al., 1972; Guzek and Morawska, 1986; Verbalis et al., 1987; Bondy et al., 1989; Ebenezer, 1996; Menani and Johnson, 1998)は食物摂取に加えて水分摂取を抑制することが知られているからである。興味深いことに、「条件付け味覚嫌悪」を、水分および食物摂取の両方のＢＴによる抑制に関する代わりの説明として思い起こすことは、ＢＴ−腸内分泌仮説を実際に支持することになるであろう。なぜなら条件付け味覚嫌悪はＧＩホルモン(Bojanowska, 2005; Chelikani et al., 2006; Schier et al., 2011)および口腔味覚細胞（それらは条件付け味覚嫌悪を仲介する）によって仲介されるからである。
【００８１】
図５に示すように、飲用水中４００ｐｐｍで３０日間の経口ＢＴ処理は、血糖量コントロールにおける有意な改善およびインスリン感受性の優れた増強（４倍超）を引き起こした。
【００８２】
図６に示すように、経口ＢＴ処理は、全脂肪量の約４０％低下および除脂肪体重の最小限の低下を伴う身体組成の有意な改善を引き起こした。
【００８３】
重要なことに、経口ＢＴ処理は身体水分含量（全水分および自由水の両方）を維持し、かつ水分摂取の低下した正常な体水分補給は、増加した内部水分供給（脂肪分解からの「代謝水」）およびＣＣＫによる抗利尿ホルモンバソプレシンの誘動によって増加した腎臓水分保持(Guzek and Morawska, 1986; Verbalis et al., 1987)の両方に向かった。身体水分補給を維持しながら低下した水分摂取は、糖尿病患者にとって喜ばしい利点であるため、経口送達ＢＴは糖尿病と関連した過度な喉の渇き、水分摂取および排尿の治療に使用できる。経口ＢＴを投与される非糖尿患者において起こり得る水分摂取低下による有害事象は、毎日水を何杯か追加するという医師の指示によって容易に避けることができる。
【００８４】
さらに、３０日間の経口ＢＴ処理は、ＤＩＯマウスにおける内臓型肥満の目に見える低下および脂肪肝の改善を引き起こした。重要なことには、生理学的または行動的な有害事象は試験全体を通して観察されなかった。
【００８５】
従って、単剤としてのＢＴリポペプチドの効果的な量（「栄養感知」量）の経口送達は、栄養物模倣を目的とした試験でのＤＩＯマウスにおいて優れた抗糖尿肥満効果を引き起こした。
【００８６】
実施例７
ｄｂ／ｄｂマウスにおいて経口送達されたＢＴリポペプチドの偽栄養物としての抗糖尿肥満効果
【００８７】
ＢＴリポペプチドが遺伝的に肥満および糖尿病であるｄｂ／ｄｂマウスに経口投与されたとき、ペプチドは同様な抗糖尿肥満効果をもたらした。４００ｐｐｍでの飲用水によるＢＴリポペプチドの経口送達（一日平均の投与量は体重１ｋｇあたり１５ｍｇ）は、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて劇的に体重を減少させて血糖コントロールを改善した。
【００８８】
しかし、ｄｂ／ｄｂマウスへの一日一回の胃内強制投与（体重１ｋｇあたりＢＴリポペプチドを１５ｍｇ）ではこのような効果がもたらされず、ＢＴリポペプチドが、ＧＩホルモン産生味覚受容体細胞が存在する口腔と直接接触するまたは口腔に暴露されることが重要であると示唆された。それらのカチオン性および両親媒性の特性によって、ＢＴリポペプチドは生体材料に粘着性があると知られており、インビボで水相から容易に捕捉できる(US 61/447,703)。精製したＢＴペプチドを水溶液として経口送達したとき、食物または他の消化管物質によるペプチドの捕捉効果によって遊離の水性ＢＴリポペプチド濃度を、腸内分泌細胞からＧＩホルモンの分泌を誘動する閾値より低くできると考えられる。
【００８９】
本発明はいくつかの実施形態で記載されているが、本発明は本公開の趣旨および範囲内でさらに変更できる。従って、本出願は本発明の一般的原理を使用したいかなる変化、利用、または適応も含むことが意図されている。さらに本出願は、本発明が関連し、添付された請求項の制限内にある当該技術における既知または慣例的な履行内にあるような本開示からの逸脱も含むことが意図されている。
【００９０】
ここに引用されている公開、特許、および特許出願を含むすべての参考文献は、それぞれの参考文献が参考として組み込まれると個別および特定的に示されそのすべてが本明細書で説明されているかのように本明細書に同じ範囲で参考として組み込まれ、下記の文献を含む。 
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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