(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ植物において、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）又はその前駆体を低減する方法であって、前記タバコ植物内のＬＢＤ（側生器官結合ドメイン）窒素応答性転写因子の活性又は発現を増加させることにより、前記植物を改変するステップを含み、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の濃度又は総含有量が、タバコ葉、収穫された葉、加工されたタバコ葉内で低減している、前記方法。
【請求項２】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように改変されなかったタバコ植物と比較して、改変されたタバコ植物において、少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体を低減するための、活性又は発現が高まっているＬＢＤ窒素応答性転写因子の使用であって、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の濃度又は総含有量が、タバコ葉、収穫された葉、加工されたタバコ葉内で低減している、前記使用。
【請求項３】
少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体が低減しているタバコ植物、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、カットされ収穫されたタバコ葉、加工されたタバコ葉、又はカット及び加工されたタバコ葉を製造する方法であって、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように前記タバコ植物を改変するステップを含み、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の濃度又は総含有量が、タバコ葉、収穫された葉、加工されたタバコ葉内で低減している、前記方法。
【請求項４】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように改変されなかったタバコ植物と比較して、少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体が低減している、請求項１〜３のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項５】
ＴＳＮＡが、ニコチン由来のニトロソアミンケトン（ＮＮＫ）、ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）、又はＮ−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項６】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを、植物内で発現させるステップを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが外来性ポリヌクレオチドである、請求項６に記載の方法又は使用
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、植物内で核酸配列の転写を指示する異種プロモーターと作動可能に連結したＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸配列を含む、請求項６又は７に記載の方法又は使用。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが外来性ポリヌクレオチドである、請求項８に記載の方法又は使用
【請求項１０】
プロモーターが、葉特異的プロモーターである、請求項８又は９に記載の方法又は使用。
【請求項１１】
プロモーターが、構成的プロモーター又は老化プロモーターである、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１２】
ｉ）外来性ＬＢＤ窒素応答性転写因子を含み、
ii）葉特異的プロモーター、葉選好性プロモーター、若しくは老化特異的プロモーターと作動可能に連結したＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸を含むコンストラクト若しくはベクターを含み、及び／又は
iii）請求項１〜１１のいずれかに記載の方法若しくは使用により得られる又は得られた、
タバコ細胞。
【請求項１３】
ｉ）非改変植物との比較において、少なくとも１つのＴＳＮＡ若しくはその前駆体の低減を実現するように改変された植物であって、前記改変が、前記改変された植物におけるＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性若しくは発現の増加であり、
ii）外来性ＬＢＤ窒素応答性転写因子を含み、
iii）請求項１〜１１のいずれかに記載の方法若しくは使用により得られる、
iv）葉特異的プロモーター、葉選好性プロモーター、若しくは老化特異的プロモーターと作動可能に連結したＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸を含むコンストラクト若しくはベクターを含み、及び／又は
ｖ）請求項１２に記載の細胞を含む、
タバコ植物。
【請求項１４】
請求項１３に記載のタバコ植物から得られるタバコ植物繁殖材料。
【請求項１５】
植物の種子である、請求項１４記載のタバコ植物繁殖材料。
【請求項１６】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子ポリペプチド配列が、
ｉ）ＣＸ２ＣＸ６ＣＸ３Ｃ、但しＸは任意のアミノ酸である、
ii）MSCNGCRXLRKGCX（配列番号７）、
iii）QXXATXFXAKFXGR（配列番号８）、
iv）FXSLLXEAXG（配列番号９）、
のモチーフのうちの１又は２以上を含む、
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法若しくは使用。
【請求項１７】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子が、ＬＢＤ３７、ＬＢＤ３８、又はＬＢＤ３９である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法若しくは使用。
【請求項１８】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子が、シロイヌナズナに由来する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法若しくは使用。
【請求項１９】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸配列が、
ｉ）配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号５として本明細書に示すポリヌクレオチド配列、又は
ii）機能的ＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする、ｉ）に示すポリヌクレオチド配列の機能的断片、又は
iii）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６として本明細書に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）高度にストリンジェントな条件下で、上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に教示するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、かつ上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に教示する前記ポリヌクレオチドの機能的活性を保持するポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドと、少なくとも９０％の同一性を有し、かつ上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に教示する前記ポリヌクレオチドの機能的活性を保持するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列、
を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法若しくは使用。
【請求項２０】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子が、
配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６として本明細書に示すポリペプチド配列、又は
少なくとも１つのアミノ酸が保存的に置換した配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６を含むポリペプチド配列、又は
配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６に記載のポリペプチドの機能的活性を保持するポリペプチド
を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法若しくは使用。
【請求項２１】
タバコが、ニコチアナ・タバカム、又はニコチアナ・ルスティカである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法若しくは使用。
【請求項２２】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子ポリペプチド配列が、
ｉ）ＣＸ２ＣＸ６ＣＸ３Ｃ、但しＸは任意のアミノ酸である、
ii）MSCNGCRXLRKGCX（配列番号７）、
iii）QXXATXFXAKFXGR（配列番号８）、
iv）FXSLLXEAXG（配列番号９）、
のモチーフのうちの１又は２以上を含む、
請求項１２に記載のタバコ細胞、請求項１３に記載のタバコ植物、又は請求項１４若しくは１５に記載のタバコ植物繁殖材料。
【請求項２３】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子が、ＬＢＤ３７、ＬＢＤ３８、又はＬＢＤ３９である、請求項１２に記載のタバコ細胞、請求項１３に記載のタバコ植物、又は請求項１４若しくは１５に記載のタバコ植物繁殖材料。
【請求項２４】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子が、シロイヌナズナに由来する、請求項１２に記載のタバコ細胞、請求項１３に記載のタバコ植物、又は請求項１４若しくは１５に記載のタバコ植物繁殖材料。
【請求項２５】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸配列が、
ｉ）配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号５として本明細書に示すポリヌクレオチド配列、又は
ii）機能的ＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする、ｉ）に示すポリヌクレオチド配列の機能的断片、又は
iii）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６として本明細書に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）高度にストリンジェントな条件下で、上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に教示するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、かつ上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に教示する前記ポリヌクレオチドの機能的活性を保持するポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドと、少なくとも９０％の同一性を有し、かつ上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に教示する前記ポリヌクレオチドの機能的活性を保持するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列、
を含む、請求項１２に記載のタバコ細胞、請求項１３に記載のタバコ植物、又は請求項１４若しくは１５に記載のタバコ植物繁殖材料。
【請求項２６】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子が、
配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６として本明細書に示すポリペプチド配列、又は
少なくとも１つのアミノ酸が保存的に置換した配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６を含むポリペプチド配列、又は
配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６に記載のポリペプチドの機能的活性を保持するポリペプチド
を含む、請求項１２に記載のタバコ細胞、請求項１３に記載のタバコ植物、又は請求項１４若しくは１５に記載のタバコ植物繁殖材料。
【請求項２７】
タバコが、ニコチアナ・タバカム、又はニコチアナ・ルスティカである、請求項１２に記載のタバコ細胞、請求項１３に記載のタバコ植物、又は請求項１４若しくは１５に記載のタバコ植物繁殖材料。
【請求項２８】
タバコ製品の製造のための、請求項１２及び２２〜２７のいずれかに記載のタバコ細胞の使用。
【請求項２９】
タバコ植物を育成するための、請求項１３及び２２〜２７のいずれかに記載のタバコ植物の使用。
【請求項３０】
タバコ製品の製造のための、請求項１３及び２２〜２７のいずれかに記載のタバコ植物の使用。
【請求項３１】
作物を成長させるための、請求項１３及び２２〜２７のいずれかに記載のタバコ植物の使用。
【請求項３２】
タバコ葉を製造するための、請求項１３及び２２〜２７のいずれかに記載のタバコ植物の使用。
【請求項３３】
タバコ葉が、加工されたタバコ葉又は乾燥させたタバコ葉である、請求項３２記載のタバコ植物の使用。
【請求項３４】
請求項１３及び２２〜２７のいずれかに記載のタバコ植物の、又は請求項１４、１５、及び２２〜２７のいずれかに記載の繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から得られる、又は請求項２９〜３３のいずれかに記載の使用により得られたタバコ植物から得られる、収穫された葉。
【請求項３５】
カットされ収穫された葉である、請求項３４に記載の収穫されたタバコ植物の葉。
【請求項３６】
ｉ）請求項１２及び２２〜２７のいずれかに記載のタバコ細胞を含み、
ii）請求項２９〜３３のいずれかに記載の使用から得られるタバコ植物から得られる、
iii）請求項１３及び２２〜２７のいずれかに記載のタバコ植物を加工することにより得られる、
iv）請求項１４、１５、及び２２〜２７のいずれかに記載のタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から得られる、又は
ｖ）請求項３４若しくは３５に記載の収穫されたタバコ植物の葉を加工することにより得られる、
加工されたタバコ葉。
【請求項３７】
非生存性である、請求項３６に記載の加工されたタバコ葉。
【請求項３８】
タバコが、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程、又はそれらの組合せにより加工される、請求項３６又は３７に記載の加工されたタバコ葉。
【請求項３９】
カットされ加工されたタバコ葉である、請求項３６〜３８のいずれかに記載の加工されたタバコ葉。
【請求項４０】
ｉ）請求項１３及び２２〜２７のいずれかに記載のタバコ植物又はその一部分、
ii）請求項１４、１５、及び２２〜２７のいずれかに記載のタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物又はその一部分、
iii）請求項３４又は３５に記載の収穫されたタバコ植物の葉、
iv）請求項３６〜３９のいずれかに記載の加工されたタバコ葉、
から調製されるタバコ製品。
【請求項４１】
喫煙物品である、請求項４０に記載のタバコ製品。
【請求項４２】
無煙タバコ製品である、請求項４０に記載のタバコ製品。
【請求項４３】
タバコ加熱デバイスである、請求項４０に記載のタバコ製品。
【請求項４４】
タバコ加熱デバイスがエアゾール発生デバイスである、請求項４３に記載のタバコ製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タバコ植物内のタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の低減に関する。特に、本発明は、側生結合ドメイン（ＬＢＤ，lateral bound domain）窒素応答性転写因子の方法及び使用、並びにタバコ植物及びその下流製品（例えば繁殖材料、収穫された（harvested）葉、加工されたタバコ、及びタバコ製品）に関する。
【背景技術】
【０００２】
タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ，tobacco-specific nitrosamine）は、図１に示すように、ニコチン及び関連化合物から、タバコの乾燥工程及び加工工程期間中に生ずるニトロソ化反応により形成される。空気乾燥されたタバコ内のニトロソ化物質として、乾燥期間中の微生物の作用による葉中硝酸塩の還元に由来する亜硝酸塩が通常挙げられ、またニトロソアミンの生成は、高レベルの硝酸塩／亜硝酸塩及び一酸化窒素と相関することが明らかにされている（Liang S., Yang J., Zhou J., Yu J., Ma Y., Bai R., Xu F., Yang C. Application of exogenous substances reduces tobacco-specific nitrosamines content by regulating biosynthesis of nicotine and nitrite in burley tobacco. Acta Physiol. Plant. (2013) 35: 3027-3036；Shi H., Wang R., Bush L.P., Yang H., Fannin F.F.  The relationships between TSNAs and their precursors in burley tobacco from regions and varieties. Journal of Food, Agriculture & Environment (2012) 10 (3&4): 1048-1052）。ＴＳＮＡの低減を目指すことがタバコ業界にとって望ましい。
【０００３】
窒素（Ｎ）及び硝酸塩（ＮＯ３−）の利用能は、植物の代謝、成長、及び発育に関する多くの側面を制御する。植物特異的側生器官境界ドメイン（ＬＢＤ，lateral organ boundaries domain）遺伝子ファミリーは、植物の側生器官の発達を制御するのに不可欠であり、また窒素代謝制御にも関与している。転写因子のＬＢＤ遺伝子ファミリーのうち、３つのＮ／ＮＯ３−誘発性メンバー（LBD37、LBD8、及びLBD39）が、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）においてアントシアニン生合成の負の制御因子として作用する（Rubin G., Tohge T., Matsuda F., Saito K., Scheible W-R.  Members of the LBD Family of transcription factors repress anthocyanin synthesis and affect additional nitrogen responses in Arabidopsis. Plant Cell (2009) 21 (11): 3567-3584)。LBD37〜39は、Ｎの利用能について植物系に対してシグナルを伝達し、特異的Ｎ欠乏応答、例えばアントシアニン合成等の抑制を引き起こすと考えられている。また、ＬＢＤ遺伝子は、ＮＯ３−の取込み及び同化に必要とされる重要な遺伝子を含むその他の多くのすでに知られているＮ応答性遺伝子についても抑制し、その結果、ＮＯ３−含有量、硝酸レダクターゼ活性／活性化、タンパク質、アミノ酸、及びスターチのレベル、アントシアニン生合成、並びにＮ関連の成長表現型に変化をもたらす(Rubin et al.2009)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Liang S., Yang J., Zhou J., Yu J., Ma Y., Bai R., Xu F., Yang C. Application of exogenous substances reduces tobacco-specific nitrosamines content by regulating biosynthesis of nicotine and nitrite in burley tobacco. Acta Physiol. Plant. (2013) 35: 3027-3036
【非特許文献２】Shi H., Wang R., Bush L.P., Yang H., Fannin F.F.  The relationships between TSNAs and their precursors in burley tobacco from regions and varieties. Journal of Food, Agriculture & Environment (2012) 10 (3&4): 1048-1052
【非特許文献３】Rubin G., Tohge T., Matsuda F., Saito K., Scheible W-R.  Members of the LBD Family of transcription factors repress anthocyanin synthesis and affect additional nitrogen responses in Arabidopsis. Plant Cell (2009) 21 (11): 3567-3584
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様によれば、本発明は、タバコ植物において、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ，tobacco-specific nitrosamine）又はその前駆体を低減する方法であって、前記タバコ植物内のＬＢＤ（側生器官結合ドメイン）窒素応答性転写因子の活性又は発現を増加させることにより、植物を改変するステップを含む方法を提供する。
【０００６】
別の態様では、少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体を低減するための、タバコ植物内ＬＢＤ窒素応答性転写因子の使用が提供される。
【０００７】
本発明は、さらなる態様では、少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体が低減しているタバコ植物、タバコ植物繁殖材料（tobacco plant propagation material）、タバコ葉、カットされ収穫されたタバコ葉、加工されたタバコ葉、又はカット及び加工されたタバコ葉を製造する方法であって、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように前記タバコ植物を改変するステップを含む、方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、葉特異的プロモーター又は葉選好性プロモーター（leaf-preferred promoter）と作動可能に連結したＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸を含むコンストラクト又はベクターが提供される。本発明は、老化特異的プロモーターと作動可能に連結したＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸を含むコンストラクト又はベクターも提供する。
【０００９】
さらなる態様では、
ｉ）外来性ＬＢＤ窒素応答性転写因子を含み、
ii）本発明のコンストラクト若しくはベクターを含み、及び／又は
iii）本発明の方法若しくは使用により得られる（例えば得られた）、
タバコ細胞が提供される。
【００１０】
本発明は、別の態様において、
ｉ）非改変植物との比較において、少なくとも１つのＴＳＮＡ若しくはその前駆体の減少を実現するように改変された植物であって、前記改変が、前記改変された植物におけるＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性若しくは発現の増加であり、
ii）外来性ＬＢＤ窒素応答性転写因子を含み、
iii）本発明による方法若しくは使用により得られ、
iv）本発明によるコンストラクト若しくはベクターを含み、及び／又は
ｖ）本発明による細胞を含む、
タバコ植物を提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明のタバコ植物から得られるタバコ植物繁殖材料（例えば、植物の種子）が提供される。
【００１２】
本発明は、
・タバコ製品の製造のための本発明のタバコ細胞の使用、
・タバコ植物の育成のための本発明のタバコ植物の使用、
・タバコ製品の製造のための本発明のタバコ植物の使用、
・作物を成長させるための本発明のタバコ植物の使用、及び
・タバコ葉（例えば、加工された（好ましくは乾燥させた［cured］）タバコ葉）の製造のための本発明のタバコ植物の使用、
をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、本発明のタバコ植物の、又は本発明の繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から得られる、又は本発明による使用により得られるタバコ植物から得られる収穫された葉も提供する。
【００１４】
さらに本発明は、
ｉ）本発明のタバコ細胞を含み、
ii）本発明の使用から得られるタバコ植物から得られ、
iii）本発明のタバコ植物を加工することにより得られる、
iv）本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から得られる、又は
ｖ）本発明の収穫されたタバコ植物の葉を加工することにより得られる、
加工されたタバコ葉を提供する。
【００１５】
本発明は、
ｉ）本発明によるタバコ植物若しくはその一部分、
ii）本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物若しくはその一部分、
iii）本発明による収穫されたタバコ植物の葉、又は
iv）本発明による加工されたタバコ葉、
から調製されるタバコ製品をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の実施形態を、例示目的に限定して、下記の添付図面を参照しながらここに記載する。
【図１】タバコの煙における、ニトロソ化反応による、ニコチン及びノルニコチン等の前駆体からタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の形成を示す図である。
【図２】024-0147コンストラクト（LBD37、構成的プロモーター）、024-0148コンストラクト（LBD38、構成的プロモーター）、0138-0148コンストラクト（LBD38、老化特異的プロモーター）、及び024-0149コンストラクト（LBD39、構成的プロモーター）のアミノ酸レベルを示す図である。
【図３】024-0147（構成的プロモーターにおけるLBD37）、0138-0148（老化特異的プロモーターにおけるLBD38）、及び0138-0149（老化特異的プロモーターにおけるLBD39）コンストラクトで形質転換した植物から製造された乾燥タバコ内のＮＮＫ及びＮＮＮのレベルを示す図である。
【図４】024-0147（構成的プロモーターにおけるLBD37）、0138-0148（老化特異的プロモーターにおけるLBD38）、及び0138-0149（老化特異的プロモーターにおけるLBD39）コンストラクトで形質転換した植物から製造された微細化タバコ内のニコチンレベルを示す図である。
【図５】0138-0149（老化特異的プロモーターにおけるLBD39）、0138-0148（老化特異的プロモーターにおけるLBD38）、及び024-0147（構成的プロモーターにおけるLBD37）コンストラクトで形質転換したタバコ植物の収率を示す図である。
【図６】シロイヌナズナに由来するLBD37（配列番号１及び２）、LBD38（配列番号３及び４）、並びにLBD39（配列番号５及び６）に関するヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【図７】異なる植物種に由来するオーソロガスタンパク質に対するシロイヌナズナのLBD37（AtLBD37）、LBD38（AtLBD38）、及びLBD39（AtLBD39）のアラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことに、タバコ植物内のＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現を増加させることにより、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）又はその前駆体を低減し得ることを初めて示した。
【００１８】
図１に示すように、タバコ葉内の残留窒素が、ニトロソ化反応を通じて、ニトロソアミンの形成に寄与することは周知されている。特に、硝酸塩及び亜硝酸塩及び一酸化窒素（ＮＯ）は、乾燥葉内で、タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）形成に対する前駆体として作用する。理論に束縛されるものではないが、ＬＢＤ遺伝子発現を調節することにより硝酸同化を変化させれば、亜硝酸塩及び一酸化窒素（ＮＯ）の生成、したがってタバコ葉の乾燥工程及び加工工程期間中に生成するＴＳＮＡのレベルを調節することができると考えられている。それにもかかわらず、本発明の所見は極めて意外である。
【００１９】
本発明は、タバコ植物において、少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の低減のための、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の使用も提供する。
【００２０】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が高まっているタバコ植物から調製されるタバコ製品中のＴＳＮＡ含有量又は濃度を低減することは、極めて有利な技術的効果となる。
【００２１】
１つの実施形態では、少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体が低減しているタバコ植物、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、加工されたタバコ葉、カットされたタバコ葉又はカット及び加工されたタバコ葉を製造する方法が提供され、該方法は、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように、前記タバコ植物を改変するステップを含む。
【００２２】
用語「タバコ特異的ニトロソアミン」又は「ＴＳＮＡ」は、本明細書で用いる場合、当技術分野におけるその通常の意味を有する、すなわちタバコ製品又はその他のニコチン含有製品にのみ見出されるニトロソアミンを指す。好適には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンは、４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ，4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone）、Ｎ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ，N'-nitrosonornicotine）、Ｎ’−ニトロソアナタビン（ＮＡＴ，N'-nitrosoanatabine）、又はＮ−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ，N-nitrosoanabasine）であり得る。
【００２３】
より好適には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンは、ＮＮＫ又はＮＮＮであり得る。
【００２４】
用語「その前駆体」とは、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンと関連して使用される場合、タバコ特異的ニトロソアミンの形成を誘発する、又はニトロソ化反応に関与し、タバコ特異的ニトロソアミンの生成を引き起こすタバコ植物の１又は２以上の化学物質又は化合物を意味する。好適には、用語「その前駆体」とは、硝酸塩、亜硝酸塩、又は一酸化窒素を指し得る。
【００２５】
１つの実施形態では、本発明の方法及び／又は使用を実行すれば、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように改変されなかったタバコ植物と比較して、改変されたタバコ植物において少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の低減が引き起こされる。
【００２６】
用語「少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体を低減する」又は「少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の低減」は、本発明の製品、方法、又は使用における少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の濃度及び／又は総含有量が、同等の製品、方法、又は使用に関連して低いことを意味するように、本明細書では使用される。例えば、同等のタバコ製品は、本発明により改変されていないが、すべてのその他の関連する特性（例えば植物種、成長条件、タバコ加工方法等）は同一であったタバコ植物に由来する。
【００２７】
少なくとも１つのＴＳＮＡ若しくはその前駆体の濃度及び／又はレベルを決定するための、当技術分野において公知のあらゆる方法が利用可能である。特に、本明細書の実施例４に詳記するような方法が利用可能である。例えば、タバコ特異的ニトロソアミンの前駆体の濃度及び／又はレベルを決定する際には、例えば国際公開第２００９／０２２１８３号パンフレット、Morot-Gaudry-Talarmain et al., 2002, Planta, 215:708-715、又はMur et al., Plant Science 181 (2011) 509-519に詳記する方法等（本明細書に参照として組み込まれる）が利用可能である。
【００２８】
好適には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体の濃度及び／又は総含有量は、本発明の方法及び／又は使用を実施することにより低減され得る。好適には、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように改変されなかったタバコ植物内の少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（複数可）若しくはその前駆体の濃度及び／又はレベルと比較して、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体の濃度及び／又はレベルは、本発明のタバコ植物（例えば、本発明の方法及び／又は使用により得られる若しくは得られた）において低減され得る。
【００２９】
少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（複数可）若しくはその前駆体の濃度及び／又は総含有量は、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように改変されなかったタバコ植物から得られる若しくは得られたタバコ葉、収穫された葉、加工されたタバコ葉、タバコ製品、若しくはそれらの組合せと比較して、本発明のタバコ植物から得られる若しくは得られたタバコ葉、収穫された葉、加工されたタバコ葉、タバコ製品、若しくはそれらの組合せにおいて低減され得る。
【００３０】
好適には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体の濃度及び／又は総含有量は、加工されたタバコ葉において低減され得る。
【００３１】
好適には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体の濃度及び／又はレベルは、タバコ製品において低減され得る。
【００３２】
１つの実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体は、少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低減され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体は、約５％〜約９５％、約１０％〜約９０％、２０％〜約８０％、３０％〜約７０％、又は約４０％〜６０％低減され得る。
【００３３】
加工された（例えば、乾燥させた）タバコ葉に関連して、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体は、約５０００ｎｇ／ｇ〜約５０ｎｇ／ｇ、約４０００ｎｇ／ｇ〜約１００ｎｇ／ｇ、約３０００ｎｇ／ｇ〜５００ｎｇ／ｇ、又は２０００ｎｇ／ｇ〜１０００ｎｇ／ｇ低減され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体は、少なくとも約５０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約５００ｎｇ／ｇ、少なくとも約１００ｎｇ／ｇ、又は少なくとも約５０ｎｇ／ｇ低減され得る。
【００３４】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子
ＬＢＤ（側生器官境界ドメイン）遺伝子は、アシンメトリックリーフ２（ＡＳ２，ASYMMETRIC LEAVES2）様（ＡＳＬ，ASYMMETRIC LEAVES2-like）としても公知であり、植物特異的転写因子のファミリーをコードする。ＬＢＤタンパク質は、ＤＮＡ結合及びタンパク質−タンパク質相互作用に関係することが公知である特徴的なＮ末端ＬＯＢドメインにより定義される。ＬＯＢドメインは、ＤＮＡ結合に必要とされるＣ−モチーフを含み、ＣＸ２ＣＸ６ＣＸ３Ｃモチーフ内に４つの完全に保存されたシステイン（Ｃ）残基が含まれるが、但しＸは非保存性の残基である。また、ＬＯＢドメインは、保存性のグリシン残基及びタンパク質−タンパク質相互作用に必要とされるＣ末端ロイシン−ジッパー様の配列も含有する（Majer C., Hochholdinger F. Defining the boundaries: structure and function of LOB domain proteins. Trends in Plant Science (2011) 16 (1): 47-52）。ファウンダー遺伝子ＬＯＢは、６−ｂｐ  GCGGCG  ＤＮＡコンセンサスモチーフを認識すること、及び酵母菌における転写を活性化させることが明らかにされている（Husbands A., Bell E. M., Shuai B., Smith H.M.S., Springer P.S. Lateral organ boundaries defines a new family of DNA-binding transcription factors and can interact with specific bHLH proteins. Nucleic Acids Research (2007) 35 (19): 6663-6671）。
【００３５】
シロイヌナズナＬＢＤ遺伝子ファミリーは、ＬＯＢドメインにおけるアミノ酸の保存に基づき２つのクラスに分割される４３のメンバーから構成される。クラスＩは、ＬＯＢとLBD1〜LBD36から構成され、またクラスIIは、LBD37〜LBD43から構成される。シロイヌナズナでは、クラスII内の３つのＬＢＤ遺伝子、すなわちLBD37（ASL39）、LBD38（ASL40）、及びLBD39（ASL41）は、窒素又は硝酸塩により上方制御され、またアントシアニン合成に対する負の制御因子として作用することが公知である。また、ＬＢＤ遺伝子は、ＮＯ３−の取込み及び同化に必要とされる重要な遺伝子を含むその他の多くの公知のＮ応答性遺伝子についても抑制し、その結果、ＮＯ３−含有量、硝酸レダクターゼ活性／活性化、及びその他のＮ関連の成長表現型に変化をもたらす（Rubin et al.、2009）。
【００３６】
用語「側生器官境界ドメイン（ＬＢＤ）窒素応答性転写因子」とは、本明細書で用いる場合、ＬＯＢドメインを含有し、また窒素又は硝酸塩の利用能によって影響を受け得るように転写因子として作用するタンパク質を意味する。
【００３７】
１つの実施形態では、ＬＢＤ窒素応答性転写因子ポリペプチド配列は、
ｉ）ＣＸ２ＣＸ６ＣＸ３Ｃ、但しＸは任意のアミノ酸である、
ii）MSCNGCRXLRKGCX（配列番号７）、
iii）QXXATXFXAKFXGR（配列番号８）、
iv）FXSLLXEAXG（配列番号９）、
のモチーフのうち１又は２以上を含む。
【００３８】
さらなる実施形態では、ＬＢＤ窒素応答性転写因子は、LBD37、LBD38、又はLBD39である。
【００３９】
用語「ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性を増加させる」とは、植物内のＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性が全体として、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように改変されなかった植物と比較して改変された植物において増加することを意味する。
【００４０】
１つの実施形態では、改変された植物内のＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性増加は、非改変植物と比較して約５％を超え得る。好適には、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性増加は、約１０％を超え、好適には約１５％を超え得る。いくつかの実施形態では、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性増加は、約２０％を超え、より好適には約３０％を超え得る。いくつかの実施形態では、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性増加は、約４０％、例えば約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％等を超え得る。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性を増加させる植物の改変は、遺伝子編集を用いて実施され得る。
【００４２】
遺伝子編集は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて実施され得る。いくつかの非限定的な例を、CRISPR-Cas9システムの使用を含め、ここに提示する。CRISPR/Cas9ゲノム編集ツール、例えばClontech社製（Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye、France）の「Guide-it」等が市販されている。遺伝子編集の別の方法として、市販キット（例えば、Addgene社製、1Kendall Sq. Ste. B7102、Cambridge、MA 02139、USA）によるTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）技術の使用が挙げられる。さらなる方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、例えばSigma-Aldrich社から入手可能なCompoZr（登録商標）ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術等の使用を含む。別の方法は、Silva et al Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11-27（その教示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されているメガヌクレアーゼの使用（又はさらなる方法）を含む。なおもさらなる方法として、オリゴヌクレオチド指定突然変異（ＯＤＭ，oligonucleotide-directed mutagenesis）、例えばKeygene社 (Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, The Netherlands)から入手可能なKeyBase（登録商標）等が挙げられる。
【００４３】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、タバコ植物に対して内在性であり得る。
【００４４】
本明細書で「内在性」遺伝子と呼ぶ場合、それは、その天然の形態（すなわち、何らかのヒトによる介入が存在しない）で植物に見出される対象遺伝子を意味するだけでなく、単離された形態の同一遺伝子（又は実質的に相同的な核酸／遺伝子）であって、その後、植物に（再）導入された遺伝子（導入遺伝子）をも意味する。例えば、そのような導入遺伝子を含有する遺伝子導入植物では、導入遺伝子発現が実質的に低減する、及び／又は内在性遺伝子の発現が実質的に低減することとなり得る。単離される遺伝子は、生物から単離され得る、又は例えば化学合成による人工物であり得る。
【００４５】
別の実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、タバコ植物に対して外来性であり得る。
【００４６】
１つの実施形態では、ＬＢＤ窒素応答性転写因子は、下記の属、すなわちシロイヌナズナ属、アブラナ属、イネ属、インゲンマメ属、ナス属、ホウレンソウ属のうちの１又は２以上から選択される植物から得ることができる。
【００４７】
好適には、シロイヌナズナＬＢＤ窒素応答性転写因子は、シロイヌナズナＬＢＤ窒素応答性転写因子であり得る。
【００４８】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）から選択され得る。
【００４９】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）から選択され得る。
【００５０】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、トウガラシ（Capsicum annuum）から選択され得る。
【００５１】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、レタス（Lactuca sativa）から選択され得る。
【００５２】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、イネ（Oryza sativa）、好適にはジャポニカ種（Oryza sativa subsp. japonica）から選択され得る。
【００５３】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）から選択され得る。
【００５４】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、トマト（Solanum lycopersicum）から選択され得る。
【００５５】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、ジャガイモ（Solanum tuberosum）から選択され得る。
【００５６】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）から選択され得る。
【００５７】
１つの実施形態では、本発明で用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、ナス科（Solanaceae）、より好ましくはヤコウカ（Cestoideae）亜科、より好ましくはニコチアナ属、及び最も好ましくはニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、又はニコチアナ・ルスティカ（N. rustica）に由来し得る。
【００５８】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、ニコチアナ属に由来する。
【００５９】
ＬＢＤ窒素応答性転写因子は、ニコチアナ・ルスティカ及びニコチアナ・タバカム（例えば、ＬＡ  Ｂ２１、ＬＮ  ＫＹ１７１、ＴＩ  １４０６、バスマ（Basma）、ガルパオ（Galpao）、ペリケ（Perique）、ベインハルト（Beinhart）１０００−１、及びペチコ（Petico））を含むニコチアナ属の任意の種に由来し得る。その他の種としてＮ．アカウリス（N. acaulis）、Ｎ．アクミナタ（N. acuminata）、Ｎ．アクミナタ・変種マルチフロラ（N. acuminata var. multiflora）、Ｎ．アフリカナ（N. africana）、Ｎ．アラタ（N. alata）、Ｎ．アムプレキシカウリス（N. amplexicaulis）、Ｎ．アレントシ（N. arentsii）、Ｎ．アテヌアタ（N. attenuata）、Ｎ．ベナビデシ（N. benavidesii）、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）、Ｎ．ビゲロビ（N. bigelovii）、Ｎ．ボナリエンシス（N. bonariensis）、Ｎ．カビコラ（N. cavicola）、Ｎ．クレベランジ（N. clevelandii）、Ｎ．コルジフォリア（N. cordifolia）、Ｎ．コリンボサ（N. corymbosa）、Ｎ．デブネイ（N. debneyi）、Ｎ．エクセルシオル（N. excelsior）、Ｎ．フォルゲチアナ（N. forgetiana）、Ｎ．フラグランス（N. fragrans）、Ｎ．グラウカ（N. glauca）、Ｎ．グルチノサ（N. glutinosa）、Ｎ．グッドスピーディ（N. goodspeedii）、Ｎ．ゴセイ（N. gossei）、Ｎ．ハイブリッド（N. hybrid）、Ｎ．イングルバ（N. ingulba）、Ｎ．カワカミ（N. kawakamii）、Ｎ．ナイチアナ（N. knightiana）、Ｎ．ラングスドルフィ（N. langsdorffii）、Ｎ．リネアリス（N. linearis）、Ｎ．ロンギフロラ（N. longiflora）、Ｎ．マリチマ（N. maritima）、Ｎ．メガロシホン（N. megalosiphon）、Ｎ．ミエルシ（N. miersii）、Ｎ．ノクチフロラ（N. noctiflora）、Ｎ．ヌジカウリス（N. nudicaulis）、Ｎ．オブツシフォリア（N. obtusifolia）、Ｎ．オシデンタリス（N. occidentalis）、Ｎ．オシデンタリス・亜種ヘスペリス（N. occidentalis subsp. hesperis）、Ｎ．オトホラ（N. otophora）、Ｎ．パニクラータ（N. paniculata）、Ｎ．パウシフロラ（N. pauciflora）、Ｎ．ペツニオイデス（N. petunioides）、Ｎ．プルムバギニフォリア（N. plumbaginifolia）、Ｎ．クアドリバルビス（N. quadrivalvis）、Ｎ．ライモンジ（N. raimondii）、Ｎ．レパンダ（N. repanda）、Ｎ．ロスラタ（N. rosulata）、Ｎ．ロスラタ・亜種イングルバ（N. rosulata subsp. ingulba）、Ｎ．ロツンジホリア（N. rotundifolia）、Ｎ．セトケリ（N. setchellii）、Ｎ．シムランス（N. simulans）、Ｎ．ソラニフォリア（N. solanifolia）、Ｎ．スペガジニ（N. spegazzinii）、Ｎ．ストクトニ（N. stocktonii）、Ｎ．スアベオレンス（N. suaveolens）、Ｎ．シルベストリス（N. sylvestris）、Ｎ．チルシフロラ（N. thyrsiflora）、Ｎ．トメントサ（N. tomentosa）、Ｎ．トメントシホルミス（N. tomentosiformis）、Ｎ．トリゴノフィラ（N. trigonophylla）、Ｎ．アンブラチカ（N. umbratica）、Ｎ．アンドゥラタ（N. undulata）、Ｎ．ベルチナ（N. velutina）、Ｎ．ウィガンジオイデス（N. wigandioides）、及びＮ．ｘサンデラエ（N. x sanderae）が挙げられる。
【００６０】
１つの実施形態では、ＬＢＤ窒素応答性転写因子は、ＬＢＤ遺伝子ファミリーのクラスIIに由来する。好適には、ＬＢＤ窒素応答性転写因子は、LBD37、LBD38、又はLBD39である。１つの特定の実施形態では、LBD37、LBD38、又はLBD39は、シロイヌナズナに由来する。別の実施形態では、LBD37、LBD38、又はLBD39は別の種に由来し、好適には、図７に記載されているタンパク質のうちの１つである（すなわち、SlLBD37、ObLBD37、BrLBD37、SlLBD38、BrLBD38、又はBrLBD39）。
【００６１】
別の実施形態では、ＬＢＤ窒素応答性転写因子ポリペプチド配列は、
ｉ）ＣＸ２ＣＸ６ＣＸ３Ｃ、但しＸは任意のアミノ酸である、
ii）MSCNGCRXLRKGCX（配列番号７）、
iii）QXXATXFXAKFXGR（配列番号８）、
iv）FXSLLXEAXG（配列番号９）、
のモチーフのうちの１又は２以上を含む。
【００６２】
さらなる実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、
ｉ）配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号５として本明細書に示すポリヌクレオチド配列、
ii）機能的ＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする、ｉ）に示すポリヌクレオチド配列の機能的断片、又は
iii）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６として本明細書に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）高度にストリンジェントな条件下で、上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に教示するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドと、少なくとも７０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列、
を含むポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００６３】
用語「機能的断片」とは、本明細書で用いる場合、ＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする能力を有し、その活性を保持するポリヌクレオチドの一部分を意味する。１つの実施形態では、機能的断片は、本発明のポリヌクレオチドのうち、少なくとも５０個のヌクレオチド、少なくとも７５個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチド、少なくとも１５０個のヌクレオチド、少なくとも２００個のヌクレオチド、少なくとも３００個のヌクレオチド、少なくとも４００個のヌクレオチド、又は少なくとも５００個のヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチドの一部分であり得る。
【００６４】
用語「遺伝子コードの縮重」とは、本明細書で用いる場合、ポリペプチド配列をコードするコドンにおける冗長性を意味し、アミノ酸を規定する３コドンの組合せの多様性として顕在化する。例えば、イソロイシンアミノ酸を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子では、イソロイシンは、ＡＵＵ、ＡＵＣ、又はＡＵＡによりコードされ得る。これは、得られたポリペプチドは同一の配列を有するものの、ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は複数の配列を有し得ることを意味する。換言すれば、ヌクレオチド配列が多型であっても、同一のポリペプチド生成物をコードすることができる。これは、同一のポリペプチド配列をコードするにもかかわらず、１つの核酸配列は、第２の配列に対して配列の同一性が非常に低い配列を含み得ることを意味する。
【００６５】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、又は配列番号５と、少なくとも８０％の同一性を有し得る。
【００６６】
好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、又は配列番号５と、少なくとも９０％の同一性を有し得る。
【００６７】
好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、又は配列番号５と、少なくとも９５％の同一性（より好適には、少なくとも９９％の同一性）を有し得る。
【００６８】
より好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、又は配列番号５と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【００６９】
別の実施形態では、本発明に基づき用いられるＬＢＤ窒素応答性転写因子は、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６として本明細書に示すポリペプチド配列、又は少なくとも１つのアミノ酸が保存的に置換された配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６を含むポリペプチド配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み得る。
【００７０】
好適には、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有し得る。
【００７１】
より好適には、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有し得る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有し得る。
【００７２】
より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【００７３】
発現の増加
本発明の方法及び使用は、少なくとも１つのＬＢＤ窒素応答性転写因子について、その発現の増加を含む。発現の増加は、当業者にとって公知の任意の手段により達成され得る。
【００７４】
用語「発現の増加」又は「過剰発現」とは、本明細書で用いる場合、オリジナルの野生型発現レベルに付加する任意の発現形態を意味する。
【００７５】
「発現の増加」とは、ある植物が、同一品種の親植物の発現レベルと比較して、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルにおいて増加していることを意味する。発現レベルは、同一条件下で培養される同一品種の親植物内の対応する部分と比較される。発現レベルが、親植物の発現レベルを少なくとも１．１倍上回り増加するケースが、発現レベルが増加するケースとして好ましくはみなされる。この場合、発現レベルの増加が認められるとみなされるためには、植物の発現レベルが、親植物の発現レベルと比較して、ｔ−検定により５％の有意差を有するのがより好ましい。植物及び親植物の発現レベルが、同一の方法により同時に測定されるのが好ましい。但し、バックグラウンドデータとして保管されたデータも利用可能である。
【００７６】
遺伝子の発現又は遺伝子産物を増加させる方法は、当技術分野において十分に実証されており、また、例えば適するプロモーターにより駆動される過剰発現、転写エンハンサー又は翻訳エンハンサーの使用を含む。プロモーター又はエンハンサーエレメントとして機能する単離された核酸は、所望のポリペプチドをコードする核酸の発現を上方制御するために、異種ではない形態（non-heterologous form）のポリヌクレオチドのしかるべき位置（一般的に上流）に導入され得る。例えば、内在性プロモーターが、インビボでの突然変異、欠損、及び／若しくは置換により変更され得る（米国特許第５，５６５，３５０号明細書；国際公開第９３２２４４３号パンフレットを参照）、又は遺伝子の発現を制御するために、単離されたプロモーターが、適切な向きで、本発明の遺伝子から距離を置いて植物細胞に導入され得る。
【００７７】
ポリペプチドの発現が望ましい場合には、ポリヌクレオチドコード領域の３’末端に、ポリアデニル化領域を含むのが一般的に望ましい。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、その他の様々な植物遺伝子、又はＴ−ＤＮＡに由来し得る。付加される３１末端配列は、例えばノパリンシンターゼ又はオクトピンシンターゼ遺伝子に、又は代替的に別の植物遺伝子に、又はそれほど好ましくないが任意のその他の真核生物遺伝子に由来し得る。
【００７８】
サイトゾル内に蓄積する成熟したメッセージの量を増やすために、イントロン配列も、コーディング配列又は部分的コーディング配列の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に付加され得る。転写ユニット内にスプライス可能なイントロンを組み込むと、植物発現コンストラクト及び動物発現コンストラクトのいずれにおいても、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方において、最大１０００倍、遺伝子発現が増加することが明らかにされている（Buchman and Berg (1988) MoI. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 :1183-1200）。そのようなイントロンによる遺伝子発現の増強は、転写ユニットの５’末端近傍に配置したときに、一般的に最大となる。トウモロコシのイントロンＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２、及び６、Ｂｒｏｎｚｅ−１イントロンの使用は、当技術分野において公知である。一般情報については、The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994)を参照。
【００７９】
１つの実施形態では、発現の増加は、遺伝子編集又は標的を定めた突然変異誘発の使用により達成され得る。
【００８０】
遺伝子編集は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて実施され得る。いくつかの非限定的な例を、CRISPR-Cas9システムの使用を含め、ここに提示する。CRISPR/Cas9ゲノム編集ツール、例えばClontech社製（Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye, France）の「Guide-it」等が市販されている。遺伝子編集の別の方法として、市販キット（例えば、Addgene社製, 1Kendall Sq. Ste. B7102, Cambridge, MA 02139, USA）によるTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）技術の使用が挙げられる。さらなる方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、例えばSigma-Aldrich社から入手可能なCompoZr（登録商標）ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術等の使用を含む。別の方法は、Silva et al Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11-27（その教示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されているメガヌクレアーゼの使用（又はさらなる方法）を含む。なおもさらなる方法として、オリゴヌクレオチド指定突然変異（ＯＤＭ）、例えばKeygene社（Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, The Netherlands）から入手可能なKeyBase（登録商標）等が挙げられる。
【００８１】
好適には、遺伝子編集は、ＬＢＤ窒素応答性転写因子プロモーターの配列をインビボで変化させるのに利用可能である。
【００８２】
本発明の別の実施形態では、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の発現増加は、ＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、外来性ポリヌクレオチド）を、植物内で発現させることにより達成され得る。１つの実施形態では、前記ポリヌクレオチド（例えば、外来性ポリヌクレオチド）は、前記植物内で前記核酸配列の転写を指示するために、異種プロモーターと作動可能に連結したＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸配列を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、老化特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生制御型プロモーター（developmentally-regulated promoter）、及び誘導性プロモーターからなる群から選択され得る。
【００８４】
１つの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。
【００８５】
遺伝子はすべての細胞型において同一レベルで発現されない可能性はあるものの、構成的プロモーターは、植物の発育期間中に植物の様々な部分全体にわたり、連続的に遺伝子の発現を指示する。公知の構成的プロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物（Odell JT, Nagy F, Chua NH. (1985). Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature. 313 810-2）、ライスアクチン１遺伝子（Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991). Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3 1155-65）、及びトウモロコシユビキチン１遺伝子（Cornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE. (1993). Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice. Plant Molec. Biol. 23 567-81）と関連したものが挙げられる。構成的プロモーター、例えばカーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ，carnation etched ring virus）プロモーター等（Hull R, Sadler J, LongstaffM (1986) The sequence of carnation etched ring virus DNA: comparison with cauliflower mosaic virus and retroviruses. EMBO Journal, 5(2):3083-3090）。
【００８６】
構成的プロモーターは、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）、ライスアクチン１遺伝子又はトウモロコシユビキチン１遺伝子に由来のプロモーターから選択され得る。
【００８７】
好適には、プロモーターは、ＣＥＲＶプロモーターであり得る。
【００８８】
１つの実施形態では、プロモーターは、老化特異的プロモーターであり得る。
【００８９】
「老化特異的プロモーター」（ＳＡＧ，senescence-specific promoter）は、老化関連遺伝子の発現制御と関連するプロモーターであり得る。したがって、プロモーターはコーディング配列（すなわち、遺伝子）の発現を制限し得るが、該プロモーターは、実質的にもっぱら老化組織においてコーディング配列と作動可能に連結している。したがって、老化特異的プロモーターは、実質的に植物組織が老化を経た場合に限り、３’タンパク質コード領域の発現が生ずるように発生学的に制御された様式で、植物組織内において遺伝子発現を選択的に促進する能力を有するプロモーターであり得る。老化は、植物のより古い部分、例えばより古い葉等で生ずる傾向を有し、一方植物のより若い部分、例えば種子等では生じないものと認識される。
【００９０】
非常に多くの老化関連遺伝子を発現することが公知である植物の一例として、シロイヌナズナが挙げられる。したがって、老化特異的プロモーターは、シロイヌナズナの老化関連遺伝子から単離され得る。Gepsteinら（The Plant Journal, 2003, 36, 629-642）は、シロイヌナズナをモデルとして用いて、ＳＡＧ及びそのプロモーターについて詳細な試験を実施した。遺伝的コンストラクトは、本書に開示するＳＡＧのいずれかに由来するプロモーターを含み得る。例えば、適するプロモーターは、ＳＡＧ１２、ＳＡＧ１３、ＳＡＧ１０１、ＳＡＧ２１、若しくはＳＡＧ１８、及びその機能的バリアント若しくは機能的断片からなる群から選択され得る。
【００９１】
１つの実施形態では、プロモーターは、当業者にとって公知のＳＡＧ１２プロモーター又はその機能的バリアント若しくは断片であり得る（Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319）。
【００９２】
適するプロモーター及びその配列は、本明細書に参照として組み込まれる国際公開第２０１０／０９７６２３号パンフレットに見出され得る。
【００９３】
別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。
【００９４】
組織特異的プロモーターは、植物の１つの（又はいくつかの）部分内にある遺伝子の発現を、通常そのような植物の部分の寿命全体にわたり指示するプロモーターである。組織特異的プロモーターのカテゴリーには、特異性が絶対的ではないプロモーターも一般的に含まれる、すなわち、該プロモーターは、好ましい組織以外の組織内においても低レベルの発現を指示し得る。
【００９５】
いくつかの組織特異的プロモーターは、当技術分野において公知であり、またジャガイモの塊茎内で発現するパタチン遺伝子、及び小麦、大麦、又はトウモロコシの胚乳内で発現する高分子量グルテニン遺伝子と関連するプロモーターを含む。これらのプロモーターのいずれも、本発明で利用可能である。
【００９６】
好適には、組織特異的プロモーターは、葉特異的プロモーターであり得る。適する葉特異的プロモーターは、アシンメトリックリーフ１（ＡＳ１，ASYMMETRIC LEAVES 1）を含み得る。
【００９７】
別の実施形態では、プロモーターは、発生制御型プロモーターであり得る。
【００９８】
発生制御型プロモーターは、植物の発育期間中の特定の時期において、１又は２以上の植物の部分に存在する遺伝子の発現変化を指示する。遺伝子は、その他の時期に、異なる（通常より低い）レベルで当該植物の部分内で発現し得るが、またその他の植物の部分においても発現し得る。
【００９９】
１つの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
【０１００】
誘導性プロモーターは、インデューサーに反応して遺伝子の発現を指示する能力を有する。インデューサーが存在しない場合には、遺伝子は発現しない。インデューサーは、プロモーター配列に直接作用し得る、又はリプレッサー分子の効果を和らげることにより作用し得る。インデューサーは、化学物質、例えば代謝物、タンパク質、増殖制御因子、又は毒性元素等、生理学的ストレス、例えば熱、傷害、若しくは浸透圧等、又は病原体若しくは害虫がもたらす作用の間接的結果であり得る。発生制御型プロモーターは、植物の生活環の特定の時点において、植物により産生される内在性インデューサー、又は環境上の刺激に応答する誘導性プロモーターの特定のタイプとして記載される場合もある。誘導性プロモーターの公知の例として、例えばWarner SA、Scott R、Draper J.（1993）が記載する傷害応答と関連するプロモーター（Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPR1) wound-responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its characterization in transgenic tobacco. Plant J. 3 191-201.）、Benfey及びChua (1989)が開示する温度応答と関連するプロモーター（Benfey, P.N., and Chua, N-H. (1989) Regulated genes in transgenic plants. Science 244 174-181）、及びGatz (1995)が記載するような化学的に誘発されたプロモーター（Gatz, C. (1995) Novel inducible/repressible gene expression systems. Methods in Cell Biol. 50 411-424）等が挙げられる。
【０１０１】
したがって、１つの実施形態では、プロモーターは、ＣＥＲＶプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（完全型又はトランケーション型）、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモーター、エンドウマメプラストシアニンプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、クロロフィルｒ／ｂ結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α、β−グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター、及びパタチンプロモーターからなる群から選択され得る。
【０１０２】
本発明は、葉特異的プロモーターと作動可能に連結したＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸を含むコンストラクト又はベクターをさらに提供する。
【０１０３】
本発明は、老化特異的プロモーターと作動可能に連結したＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする核酸を含むコンストラクト又はベクターも提供する。
【０１０４】
コンストラクトは、ベクター内に含まれ得る。好適には、ベクターは、プラスミドであり得る。
【０１０５】
タバコ植物
本発明は、タバコ植物、並びにタバコ細胞、タバコ植物及び植物繁殖材料と関連する方法、使用を提供する。
【０１０６】
用語「タバコ植物」とは、本明細書で用いる場合、タバコ製品の製造で使用されるニコチアナ属内の植物を意味する。適するタバコ植物の非限定的な例として、Ｎ．タバカム及びＮ．ルスチカ（例えば、ＬＡ  Ｂ２１、ＬＮ  ＫＹ１７１、Ｔｌ  １４０６、バスマ、ガルパオ、ペリケ、ベインハルト１０００−１、及びペチコ）が挙げられる。用語「タバコ」を、タバコ製品の製造に役立たないニコチアナ種にまで拡張する意図はない。
【０１０７】
したがって、１つの実施形態では、タバコ植物には、ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）が含まれる。
【０１０８】
タバコ材料は、バーレイ品種として一般的に知られているニコチアナ・タバカム種の品種、フルー又はブライト品種、ダーク品種、及びオリエンタル／トルコ品種に由来し得る。いくつかの実施形態では、タバコ材料は、バーレイ、バージニア、熱風乾燥式、空気乾燥式、火力乾燥式、オリエンタル、又はダークタバコ植物に由来する。タバコ植物は、メリーランドタバコ、レアタバコ、スペシャリティタバコ、膨化タバコ等から選択され得る。
【０１０９】
タバコ栽培品種及びエリートタバコ栽培品種の使用も、本明細書において検討される。本明細書で使用されるタバコ植物は、したがってタバコ品種又はエリートタバコ栽培品種であり得る。
【０１１０】
特に有用なニコチアナ・タバカム品種として、バーレイタイプ、ダークタイプ、熱風乾燥タイプ、及びオリエンタルタイプのタバコが挙げられる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、タバコ植物は、例えば下記の品種のうちの１又は２以上から選択され得る：Ｎ．タバカムＡＡ３７−１、Ｎ．タバカムＢ１３Ｐ、Ｎ．タバカム・クサンシ（N.tabacum Xanthi）（ミッチェル-モール(Mitchell-Mor))、Ｎ．タバカムＫＴ  Ｄ＃３ハイブリッド１０７、Ｎ．タバカムＢｅｌ−Ｗ３、Ｎ．タバカム７９−６１５、Ｎ．タバカム・サムスンホルムズ（Samsun Holmes）ＮＮ、Ｎ．タバカムＢＵ２１×Ｎ．タバカム・ホジャパラド（Hoja Parado）の交配に由来するＦ４、ライン９７、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃２ハイブリッド４９、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃４ハイブリッド１  １０、Ｎ．タバカム・バーレイ２１、Ｎ．タバカムＰＭ０１６、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃５ＫＹ１６０ＳＩ、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃７ＦＣＡ、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃６ＴＮ８６ＳＩ、Ｎ．タバカムＰＭ０２１、Ｎ．タバカムＫ１４９、Ｎ．タバカムＫ３２６、Ｎ．タバカムＫ３４６、Ｎ．タバカムＫ３５８、Ｎ．タバカムＫ３９４、Ｎ．タバカムＫ３９９、Ｎ．タバカムＫ７３０、Ｎ．タバカムＫＹ１０、Ｎ．タバカムＫＹ１４、Ｎ．タバカムＫＹ１６０、Ｎ．タバカムＫＹ１７、Ｎ．タバカムＫＹ８９５９、Ｎ．タバカムＫＹ９、Ｎ．タバカムＫＹ９０７、Ｎ．タバカムＭＤ６０９、Ｎ．タバカム・マクネイル（McNair）３７３、Ｎ．タバカムＮＣ２０００、Ｎ．タバカムＰＧ０１、Ｎ．タバカムＰＧ０４、Ｎ．タバカムＰ０１、Ｎ．タバカムＰ０２、Ｎ．タバカムＰ０３、Ｎ．タバカムＲＧ１  １、Ｎ．タバカムＲＧ１７、Ｎ．タバカムＲＧ８、Ｎ．タバカム・スペイト（Speight）Ｇ−２８、Ｎ．タバカムＴＮ８６、Ｎ．タバカムＴＮ９０、Ｎ．タバカムＶＡ５０９、Ｎ．タバカムＡＳ４４、Ｎ．タバカム・バンケット（Banket）Ａ１、Ｎ．タバカム・バスマドラマ（Basma Drama）Ｂ８４／３１、Ｎ．タバカム・バスマＩジクナ（Basma I Zichna）ＺＰ４／Ｂ、Ｎ．タバカム・バスマクサンシ（Basma Xanthi）ＢＸ２Ａ、Ｎ．タバカム・バテク（Batek）、Ｎ．タバカム・ベスキジェンバー（Besuki Jember）、Ｎ．タバカムＣ１０４、Ｎ．タバカム・コーカー（Coker）３１９、Ｎ．タバカム・コーカー３４７、Ｎ．タバカム・クリオロミシオネロ（Criollo Misionero）、Ｎ．タバカムＰＭ０９２、Ｎ．タバカム・デルクレスト（Delcrest）、Ｎ．タバカム・ジェベル（Djebel）８１、Ｎ．タバカムＤＶＨ４０５、Ｎ．タバカム・ガルパオコマム（Galpao Comum）、Ｎ．タバカムＨＢ０４Ｐ、Ｎ．タバカム・ヒックスブロードリーフ（Hicks Broadleaf）、Ｎ．タバカム・カバクラクエラッソナ（Kabakulak Elassona）、Ｎ．タバカムＰＭ１０２、Ｎ．タバカム・クツァゲ（Kutsage）Ｅ１、Ｎ．タバカムＫＹ１４×Ｌ８、Ｎ．タバカムＫＹ１７１、Ｎ．タバカムＬＡ  ＢＵ２１、Ｎ．タバカム・マクネイル９４４、Ｎ．タバカムＮＣ２３２６、Ｎ．タバカムＮＣ７１、Ｎ．タバカムＮＣ２９７、Ｎ．タバカムＮＣ３、Ｎ．タバカムＰＶＨ０３、Ｎ．タバカムＰＶＨ０９、Ｎ．タバカムＰＶＨ１９、Ｎ．タバカムＰＶＨ２１  １０、Ｎ．タバカム・レッドロシアン（Red Russian）、Ｎ．タバカム・サムスン（Samsun）、N.タバカム・サプラク（Saplak）、Ｎ．タバカム・シンマバ（Simmaba）、Ｎ．タバカム・タルガー（Talgar）２８、Ｎ．タバカムＰＭ１３２、Ｎ．タバカム・ウィスリカ（Wislica）、Ｎ．��バカム・ヤヤルダグ（Yayaldag）、Ｎ．タバカムＮＣ４、Ｎ．タバカムＴＲマドーレ（Madole）、Ｎ．タバカム・プリレップ（Prilep）ＨＣ−７２、Ｎ．タバカム・プリレップＰ２３、Ｎ．タバカム・プリレップＰＢ１５６／１、Ｎ．タバカム・プリレップＰ１２−２／１、Ｎ．タバカム・ヤカ（Yaka）ＪＫ−４８、Ｎ．タバカム・ヤカＪＢ１２５／３、Ｎ．タバカムＴＩ−１０６８、Ｎ．タバカムＫＤＨ−９６０、Ｎ．タバカムＴＩ−１０７０、Ｎ．タバカムＴＷ１３６、Ｎ．タバカムＰＭ２０４、Ｎ．タバカムＰＭ２０５、Ｎ．タバカム・バスマ（Basma）、Ｎ．タバカムＴＫＦ４０２８、Ｎ．タバカムＬ８、Ｎ．タバカムＴＫＦ２００２、Ｎ．タバカムＴＮ９０、Ｎ．タバカムＧＲ１４１、Ｎ．タバカム・バスマクサンシ、Ｎ．タバカムＧＲ１４９、Ｎ．タバカムＧＲ１５３、及びＮ．タバカム・ペティットハバナ（Petit Havana）。
【０１１２】
品種又は栽培品種の非限定的な例は、ＢＤ６４、ＣＣ１０１、ＣＣ２００、ＣＣ２７、ＣＣ３０１、ＣＣ４００、ＣＣ５００、ＣＣ６００、ＣＣ７００、ＣＣ８００、ＣＣ９００、コーカー１７６、コーカー３１９、コーカー３７１ゴールド、コーカー４８、ＣＤ２６３、ＤＦ９１  １、ＤＴ５３８ＬＣガルパオタバコ、ＧＬ２６Ｈ、ＧＬ３５０、ＧＬ６００、ＧＬ７３７、ＧＬ９３９、ＧＬ９７３、ＨＢ０４Ｐ、ＨＢ０４Ｐ  ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ハイブリッド４０３ＬＣ、ハイブリッド４０４ＬＣ、ハイブリッド５０１ＬＣ、Ｋ１４９、Ｋ３２６、Ｋ３４６、Ｋ３５８、Ｋ３９４、Ｋ３９９、Ｋ７３０、ＫＤＨ９５９、ＫＴ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ１６０、ＫＹ１７、ＫＹ１７１、ＫＹ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４×Ｌ８ＬＣ、リトルクリッテンデン（Little Crittenden）、マクネイル３７３、マクネイル９４４、ｍｓＫＹ１４×Ｌ８、ナロウリーフマドーレ（Narrow Leaf Madole）、ナロウリーフマドーレＬＣ、ＮＢＨ９８、Ｎ−１２６、Ｎ−７７７ＬＣ、Ｎ−７３７１ＬＣ、ＮＣ１００、ＮＣ１０２、ＮＣ２０００、ＮＣ２９１、ＮＣ２９７、ＮＣ２９９、ＮＣ３、ＮＣ４、ＮＣ５、ＮＣ６、ＮＣ７、ＮＣ６０６、ＮＣ７１、ＮＣ７２、ＮＣ８１０、ＮＣ  ＢＨ１２９、ＮＣ２００２、ニールスミスマドーレ（Neal Smith Madole）、ＯＸＦＯＲＤ２０７、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ’Periq’e’タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ６１０、Ｒ６３０、Ｒ７−１１、Ｒ７−１２、ＲＧ１７、ＲＧ８１、ＲＧ  Ｈ５１、ＲＧＨ４、ＲＧＨ５１、ＲＳ１４１０、スペイト１６８、スペイト１７２、スペイト１７９、スペイト２１０、スペイト２２０、スペイト２２５、スペイト２２７、スペイト２３４、スペイトＧ−２８、スペイトＧ−７０、スペイトＨ−６、スペイトＨ２０、スペイトＮＦ３、ＴＩ１４０６、ＴＩ１２６９、ＴＮ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ９０、ＴＮ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、ＴＲ（トムロッソン（Tom Rosson））マドーレ、ＶＡ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、クサンシ（ミッチェル-モール）、Ｂｅｌ−Ｗ３、７９−６１５、サムスンホルムズＮＮ、ＫＴＲＤＣナンバー２ハイブリッド４９、バーレイ２１、ＫＹ８９５９、ＫＹ９、ＭＤ６０９、ＰＧ０１、ＰＧ０４、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、ＲＧ１  １、ＲＧ８、ＶＡ５０９、ＡＳ４４、バンケットＡ１、バスマドラマＢ８４／３１、バスマＩジクナＺＰ４／Ｂ、バスマクサンシＢＸ２Ａ、バテク、ベスキジェンバー（Besuki Jember）、Ｃ１０４、コーカー３４７、クリオロミシオネロ、デルクレスト、ジェベル８１、ＤＶＨ４０５、ガルパオコマム、ＨＢ０４Ｐ、ヒックスブロードリーフ、カバクラクエラッソナ、クツァゲＥ１、ＬＡ  ＢＵ２１、ＮＣ２３２６、ＮＣ２９７、ＰＶＨ２１  １０、レッドロシアン、サムスン、サプラク、シンマバ、タルガー２８、ウィスリカ、ヤヤルダグ、プリレップＨＣ−７２、プリレップＰ２３、プリレップＰＢ１５６／１、プリレップＰ１２−２／１、ヤカＪＫ−４８、ヤカＪＢ１２５／３、ＴＩ−１０６８、ＫＤＨ−９６０、ＴＩ−１０７０、ＴＷ１３６、バスマ、ＴＫＦ４０２８、���８、ＴＫＦ２００２、ＧＲ１４１、バスマクサンシ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、ペティットハバナである。上記これらの低コンバーター亜品種も、たとえ本明細書で特に特定されないとしても検討される。
【０１１３】
１つの実施形態では、タバコ植物は、バーレイタイプのタバコ植物、好適にはバーレイＰＨ２５１７である。
【０１１４】
１つの実施形態では、植物繁殖材料は、本発明のタバコ植物から得ることができる。
【０１１５】
「植物繁殖材料」とは、本明細書で用いる場合、さらなる植物を生み出し得る、植物から得られるあらゆる植物由来物質を意味する。
【０１１６】
好適には、植物繁殖材料は、種子であり得る。
【０１１７】
１つの実施形態では、本発明のタバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、外来性ＬＢＤ窒素応答性転写因子を含み得る。別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、本発明によるコンストラクト又はベクターを含み得る。別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、本発明による方法により得ることができる（例えば、得られた）。
【０１１８】
好適には、本発明によるタバコ植物は、非改変タバコ植物と比較して、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（複数可）について低減した量を含み得るが、その場合、改変は、前記改変された植物におけるＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現の増加である。
【０１１９】
１つの実施形態では、本発明に基づくタバコ植物は、本発明のタバコ細胞を含む。
【０１２０】
別の実施形態では、植物繁殖材料は、本発明のタバコ植物から得ることができる（例えば、得られた）。
【０１２１】
別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、
ｉ）配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号５として本明細書に示すポリヌクレオチド配列、又は
ii）ｉ）に示すポリヌクレオチド配列の断片であって、その機能的断片が、タバコ内の硝酸レダクターゼが一般的にその制御下に置かれる１若しくは２以上の翻訳後制御機構（複数可）による制御から離脱した硝酸レダクターゼをコードする断片、又は
iii）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６として本明細書に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）高度にストリンジェントな条件下で、上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に教示するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドと、少なくとも７０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列、
を含み得る。
【０１２２】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、又は配列番号５と、少なくとも８０％の同一性を有し得る。
【０１２３】
好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、又は配列番号５と、少なくとも９０％の同一性を有し得る。
【０１２４】
好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、又は配列番号５と、少なくとも９５％の同一性（より好適には、少なくとも９９％の同一性）を有し得る。
【０１２５】
別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６として本明細書に示すポリペプチド配列、又は少なくとも１つのアミノ酸が保存的に置換された配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６を含むポリペプチド配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含むＬＢＤ窒素応答性転写因子を含み得る。
【０１２６】
好適には、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有し得る。より好適には、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有し得る。特に、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有し得る。
【０１２７】
最も好適には、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【０１２８】
１つの実施形態では、タバコ製品の製造のための上記実施形態において提供されるようなタバコ細胞の使用が提供される。
【０１２９】
さらに、タバコ植物を育成するための、本明細書に記載するタバコ植物の使用が提供される。
【０１３０】
本発明は、別の実施形態では、タバコ製品の製造のための、上記実施形態のタバコ植物の使用も提供する。
【０１３１】
別の実施形態では、作物を成長させるための、本発明のタバコ植物の使用が提供される。
【０１３２】
アミノ酸
１つの実施形態では、本発明による、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現を増加させる植物の改変は、非改変植物と比較して、植物内のアミノ酸濃度変化を引き起こし得る。
【０１３３】
１つの実施形態では、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現を増加させる植物の改変は、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、トレオニン、及びプロリンからなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸（複数可）の濃度変化を引き起こし得る。
【０１３４】
好適には、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現を増加させる植物の改変は、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、及びトレオニンからなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸（複数可）の濃度低減を引き起こし得る。
【０１３５】
好適には、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現を増加させる植物の改変は、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びプロリンからなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸（複数可）の濃度増加を引き起こし得る。
【０１３６】
製品
本発明は、本発明によるタバコから得られる、又は得られた製品も提供する。
【０１３７】
１つの実施形態では、タバコ葉を製造するための、本発明のタバコ植物の使用が提供される。
【０１３８】
好適には、タバコ葉は、加工工程等の下流の用途に供され得る。したがって、１つの実施形態では、上記実施形態の使用は、加工されたタバコ葉を提供し得る。好適には、タバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程、又はそれらの組合せの対象となり得る。
【０１３９】
別の実施形態では、タバコ葉はカットされ得る。いくつかの実施形態では、タバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程、又はそれらの組合せに供される前又は後においてカットされ得る。
【０１４０】
１つの実施形態では、本発明は収穫された本発明のタバコ植物の葉を提供する。
【０１４１】
さらなる実施形態では、収穫された葉は、本発明の繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から得ることができる（例えば、得られた）。
【０１４２】
別の実施形態では、本発明の方法又は使用から得られる収穫された葉が提供される。
【０１４３】
好適には、収穫された葉は、カットされ収穫された葉であり得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、収穫された葉は生存タバコ細胞を含み得る。その他の実施形態では、収穫された葉はさらなる加工の対象となり得る。
【０１４５】
加工されたタバコ葉も提供される。
【０１４６】
加工されたタバコ葉は、本発明のタバコ植物から得ることができる。好適には、加工されたタバコ葉は、本発明の方法及び／又は使用のいずれかに基づき得られたタバコ植物から得ることができる。
【０１４７】
別の実施形態では、加工されたタバコ葉は、本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から得ることができる。
【０１４８】
本発明の加工されたタバコ葉は、収穫された本発明の葉を加工することにより得ることができる。
【０１４９】
用語「加工されたタバコ葉」とは、本明細書で用いる場合、当技術分野においてタバコが供される１又は２以上の加工ステップを経たタバコ葉を意味する。「加工されたタバコ葉」は、生存細胞を含まない又は実質的に含まない。
【０１５０】
用語「生存細胞」とは、増殖することができ、及び／又は代謝的に活性である細胞を意味する。したがって、細胞が生存していないと言われる場合には、「非生存」とも呼ばれ、その場合、細胞は生存細胞の特徴を示さない。
【０１５１】
用語「実質的に生存しない細胞」とは、全細胞のうち約５％未満が生存していることを意味する。全細胞のうち、好ましくは約３％未満、より好ましくは約１％未満、なおいっそうより好ましくは約０．１％未満が生存している。
【０１５２】
１つの実施形態では、加工されたタバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程のうちの１又は２以上により加工され得る。
【０１５３】
好適には、加工されたタバコ葉は乾燥工程により加工され得る。
【０１５４】
タバコ葉は、当技術分野において公知の任意の方法により乾燥され得る。１つの実施形態では、タバコ葉は、空気乾燥、火力乾燥、熱風乾燥、及び天日乾燥からなる群から選択される乾燥法のうちの１又は２以上により乾燥され得る。
【０１５５】
好適には、タバコ葉は空気乾燥され得る。
【０１５６】
一般的に、空気乾燥は、十分に換気された収蔵室内でタバコ葉を吊り下げ、そして放置乾燥することにより達成される。これは、４〜８週間にわたり通常実施される。空気乾燥は、バーレイ種のタバコに特に適する。
【０１５７】
好適には、タバコ葉は火力乾燥され得る。火力乾燥は、大型の収蔵室内でタバコ葉を吊り下げ、その収蔵室内で、連続的又は間欠的に弱く煙らせながら広葉樹の炎を継続することにより一般的に達成され、その乾燥は、プロセス及びタバコに応じて３日間〜１０週間を通常要する。
【０１５８】
別の実施形態では、タバコ葉は熱風乾燥され得る。熱風乾燥は、タバコ葉をタバコスティック上に糸で吊るし、そしてそれを乾燥収蔵室内のタイアーポールから吊り下げる工程を含み得る。収蔵室は、外部供給式の火室から通ずる煙道を通常有する。これにより、一般的に、煙に曝露されないで加熱乾燥させたタバコが得られる。通常、温度は乾燥工程の過程全体にわたりゆっくりと上昇し、全プロセスに約１週間を要する。
【０１５９】
好適には、タバコ葉は天日乾燥され得る。この方法は、むき出しのタバコの天日への曝露を一般的に含む。
【０１６０】
好適には、加工されたタバコ葉は発酵工程により加工され得る。
【０１６１】
発酵は、当技術分野において公知の任意の方式で実施可能である。一般的に、発酵期間中に、タバコ葉は、湿気を保持するために、例えば黄麻布でくるまれたスタック状（バルク状）の乾燥タバコに積層される。葉内に残留する水とタバコの重量が組み合わさって自然の熱が生成し、タバコを熟成させる。バルク中心部の温度は毎日モニタリングされる。いくつかの方法では、毎週、バルク全体が開放される。次に葉を取り出して振動及び湿度を与え、そして内側の葉が外側に来るように、また底部にあった葉がバルクの最上部に配置されるようにバルクを回転させる。これにより、バルク全体を通じて均等な発酵が保証される。葉の上のさらなる湿気に加え、葉それ自体が実際に回転することで熱が生成し、タバコに本来含まれるアンモニアが放出され、そしてニコチンが低減する一方、色の深みも増し、またタバコのアロマも良化する。一般的に、発酵プロセスは、タバコの品種、葉上の葉柄の位置、厚さ、及び葉の使用目的に応じて最長６カ月継続する。
【０１６２】
好適には、加工されたタバコ葉は、加熱殺菌により加工され得る。加熱殺菌工程は、タバコ葉が、無煙タバコ製品、最も好ましくはスヌースを製造するのに用いられる場合、特に好ましい可能性がある。
【０１６３】
タバコ葉の加熱殺菌は、当技術分野において公知の任意の方法により実施され得る。例えば、加熱殺菌は、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、J Fould, L Ramstrom, M Burke, K Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public health in Sweden. Tobacco Control (2003) 12: 349-359に詳記するように実施され得る。
【０１６４】
スヌースの製造期間中、加熱殺菌は、タバコが蒸気で２４〜３６時間加熱処理されるプロセス（約１００℃の温度に達する）により一般的に実施される。これにより、ほぼ無菌の製品がもたらされ、また理論に束縛されるものではないが、この結果のひとつとして、さらなるＴＳＮＡ形成が制限されるものと考えられている。
【０１６５】
１つの実施形態では、加熱殺菌は蒸気式加熱殺菌であり得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、加工されたタバコ葉はカットされ得る。加工されたタバコ葉は、加工前又は後でカットされ得る。好適には、加工されたタバコ葉は、加工後にカットされ得る。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、タバコ植物、収穫されたタバコ植物の葉、及び／又は加工されたタバコ葉は、ニコチンを抽出するのに利用可能である。ニコチンの抽出は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて実現され得る。例えば、タバコからニコチンを抽出する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２，１６２，７３８号明細書に教示されている。
【０１６８】
別の態様では、本発明はタバコ製品を提供する。
【０１６９】
１つの実施形態では、タバコ製品は、本発明のタバコ植物又はその一部分から調製され得る。
【０１７０】
好適には、タバコ植物又はその一部分は、本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖され得る。
【０１７１】
用語「その一部分」とは、タバコ植物の文脈において本明細書で用いる場合、タバコ植物の一部分を意味する。好ましくは、「その一部分」とはタバコ植物の葉である。
【０１７２】
別の実施形態では、タバコ製品は、収穫された本発明の葉から調製され得る。
【０１７３】
さらなる実施形態では、タバコ製品は、加工された本発明のタバコ葉から調製され得る。
【０１７４】
好適には、タバコ製品は、乾燥工程、発酵工程、及び／又は加熱殺菌工程のうちの１又は２以上により加工されたタバコ葉から調製され得る。
【０１７５】
好適には、タバコ製品はカットされたタバコ葉を含み得るが、上記実施形態にしたがって加工されてもよい。
【０１７６】
１つの実施形態では、タバコ製品は喫煙物品であり得る。
【０１７７】
本明細書で用いる場合、用語「喫煙物品」は、タバコ、タバコ派生品、膨化タバコ、再構成タバコ、又はタバコ代用品に基づき、喫煙可能な製品、例えば巻きタバコ、シガレット、シガー、及びシガリロ等を含み得る。
【０１７８】
別の実施形態では、タバコ製品は無煙タバコ製品であり得る。
【０１７９】
用語「無煙タバコ製品」とは、本明細書で用いる場合、喫煙する及び／又は燃焼させるように意図されないタバコ製品を意味する。１つの実施形態では、無煙タバコ製品として、スヌース、嗅ぎ煙草、噛みタバコ等を挙げることができる。
【０１８０】
さらなる実施形態では、タバコ製品はタバコ加熱デバイスであり得る。
【０１８１】
一般的に、加熱式喫煙物品では、熱源から、熱源の内部、近傍、又は下流に位置し得る物理的に分離したエアゾール形成基材又は材料に熱を移動させることにより、エアゾールが生成する。喫煙期間中、熱源からの熱移動により揮発性化合物がエアゾール形成基材から放出され、そして喫煙物品を通じて吸引された空気中に取り込まれる。放出された化合物が冷やされると、凝縮してエアゾールを形成し、ユーザーにより吸入される。
【０１８２】
消費用のエアゾール発生物品及びデバイス、又はタバコ喫煙用の加熱デバイスは、当技術分野において公知である。そのようなデバイスとして、例えば、電気加熱式エアゾール発生デバイスを挙げることができ、同デバイス内では、エアゾール発生デバイスの１又は２以上の電気発熱要素からタバコ加熱デバイスのエアゾール形成基材に熱を移動させることにより、エアゾールが発生する。
【０１８３】
好適には、タバコ加熱デバイスは、エアゾール発生デバイスであり得る。
【０１８４】
好ましくは、タバコ加熱デバイスは、非燃焼加熱式デバイスであり得る。非燃焼加熱式デバイスは、当技術分野において公知であり、またタバコを燃焼させるのではなく、加熱することにより化合物を放出させる。
【０１８５】
非燃焼加熱式デバイスの適する例として、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０３４４５９号パンフレット、又は英国特許第２５１５５０２号明細書に教示するものが該当し得る。
【０１８６】
１つの実施形態では、タバコ加熱デバイスのエアゾール形成基材は、本発明に基づくタバコ製品であり得る。
【０１８７】
ポリヌクレオチド／ポリペプチド／コンストラクト／方法
本発明の特定の実施形態では、所望のタンパク質（例えば、ＬＢＤ窒素応答性転写因子）をコードするキメラ遺伝子は、植物細胞に形質転換可能であり、プロモーターの指示に基づき、所望のタンパク質について制御された発現を実現する。プロモーターは、動物、植物、菌類、細菌、及びウイルスを含む異なるソースから取得され得る。また、プロモーターは合成によっても構築され得る。
【０１８８】
外来性遺伝子は、適するベクター、例えば植物形質転換ベクターによって、本発明による植物に導入され得る。植物形質転換ベクターは、５’→３’の転写方向で、プロモーター配列、所望の遺伝子（例えば、調節解除された硝酸レダクターゼ）コーディング配列を含む発現カセットを含み得るが、但しイントロンを含んでもよく、並びにＲＮＡポリメラーゼに対する終止シグナル、及びポリアデニラーゼに対するポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳、転写終結コドン配列を含んでもよい。プロモーター配列は、１又は２以上のコピー内に存在し得るが、またそのようなコピーは、上述のように当該プロモーター配列と同一、又はそのバリアントであり得る。転写終結コドン配列は、植物、細菌、又はウイルスの遺伝子から取得され得る。適する転写終結コドン配列は、例えば、エンドウマメｒｂｃＳ  Ｅ９転写終結コドン配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンターゼ遺伝子に由来するｎｏｓ転写終結コドン配列、及びカリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓ転写終結コドン配列である。当業者は、その他の適する転写終結コドン配列を容易に認識する。
【０１８９】
発現カセットは、プロモーターの強度を高める遺伝子発現強化機構も含み得る。そのようなエンハンサーエレメントの例として、エンドウマメプラストシアニン遺伝子のプロモーターの一部分に由来するものが挙げられ、それは、国際特許出願番号ＷＯ第９７／２００５６号の主題である。適するエンハンサーエレメントは、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子に由来するｎｏｓエンハンサーエレメント、及びカリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓエンハンサーエレメントであり得る。このような制御領域は、プロモーターＤＮＡ配列と同一の遺伝子に由来し得る、或いはニコチアナ・タバカム、又はその他の生物、例えばナス科の植物若しくはヤコウカ亜科から得られる異なる遺伝子に由来し得る。すべての制御領域は、形質転換される組織の細胞で作動する能力を有するべきである。
【０１９０】
プロモーターＤＮＡ配列は、本発明で使用される配列をコーディングする所望の遺伝子（例えば、プロモーターが指示する遺伝子、例えばＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように植物の改変をコードする遺伝子）と同一の遺伝子に由来し得る、或いはニコチアナ・タバカム、又は別の生物、例えばナス科の植物から若しくはヤコウカ亜科から得られる異なる遺伝子に由来し得る。「キメラ遺伝子」と呼ぶ場合、それは、所望の遺伝子をコードする核酸配列（例えば、調節解除された硝酸レダクターゼをコードする遺伝子）は、その発現を指示するプロモーター配列とは異なる起源に由来する（例えば、異なる遺伝子に由来、又は異なる種に由来する）ことを意味する。
【０１９１】
発現カセットは、基本的植物形質転換ベクター、例えばpBIN19プラス、pBI101等、又は当技術分野において公知のその他の適する植物形質転換ベクターに組み込まれ得る。発現カセットに付加して、植物形質転換ベクターは、形質転換プロセスに必要な配列を含む。そのような配列は、アグロバクテリウム属ｖｉｒ遺伝子、１若しくは２以上のＴ−ＤＮＡ境界配列、及び選択マーカー、又は遺伝子導入植物細胞を確認するその他の手段を含み得る。
【０１９２】
用語「植物形質転換ベクター」とは、インビボ又はインビトロで発現する能力を有するコンストラクトを意味する。好ましくは、発現ベクターは、生物のゲノムに組み込まれる。用語「組み込まれる」は、好ましくはゲノムへの安定な組込みを含む。
【０１９３】
植物を形質転換する技術は当技術分野において周知されており、また例えば、アグロバクテリウム媒介型の形質転換を含む。遺伝子改変植物の構築における基本原則は、挿入された遺伝物質の安定的維持が得られるように、植物ゲノム内に遺伝情報を挿入することである。一般的技術のレビューは、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）、及びChriston（AgroFood-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）による文献に見出され得る。
【０１９４】
一般的に、アグロバクテリウム媒介型形質転換では、外来の所望のＤＮＡ、すなわちキメラ遺伝子を担持するバイナリーベクターを、アグロバクテリウムと標的植物から得た外植片との同時培養により、適するアグロバクテリウム系統から標的植物に移動させる。形質転換植物の組織は、次に選択培地上で再生されるが、同選択培地は、選択マーカー及び植物成長ホルモンを含む。代替法として、フローラルディップ法（Clough & Bent, 1998）が挙げられ、同法により、インタクトな植物の花芽がキメラ遺伝子を含有するアグロバクテリウム系統の懸濁液と接触することとなり、結実後、形質転換された個々の植物を発芽させ、そして選択的培地上で成長させることにより確認される。アグロバクテリウムによる植物組織の直接感染は単純な技法であり、幅広く採用されているが、同法は、Butcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208.に記載されている。
【０１９５】
さらに適する形質転換方法として、例えばポリエチレングリコール、又はエレクトロポレーション技術、粒子衝突（particle bombardment）、マイクロインジェクション、及びシリコンカーバイドファイバーの使用等を用いたプロトプラストへの直接遺伝子移入法が挙げられる。
【０１９６】
シリコンカーバイドホイスカー技術を含むバリスティック形質転換法を用いた植物の形質転換は、Frame B R, Drayton P R, Bagnaall S V, Lewnau C J, Bullock W P, Wilson H M, Dunwell J M, Thompson J A & Wang K (1994)で教示されている。シリコンカーバイドホイスカー媒介式形質転換による、結実能力のある遺伝子導入トウモロコシ植物の製造は、The Plant Journal 6: 941-948に教示されており、またウイルス形質転換技術は、例えばMeyer P, Heidmmm I & Niedenhof I (1992)に教示されている。植物用のベクター系としてのキャッサバモザイクウイルスの使用は、Gene 110: 213-217.に教示されている。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許第Ａ−０４４９３７５号明細書に見出され得る。
【０１９７】
さらなる態様では、本発明は、所望の遺伝子（例えば、調節解除された硝酸レダクターゼをコードする遺伝子）をコードするヌクレオチド配列を担持するベクター系、及び植物等の生物のゲノムに該ベクター系を導入するステップに関する。ベクター系は、１つのベクターを含み得るが、２つのベクターを含んでもよい。２ベクターの場合、ベクター系は、バイナリーベクター系と通常呼ばれる。バイナリーベクター系は、Gynheung Anetal, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.においてさらに詳細に記載されている。
【０１９８】
植物細胞を形質転換するために広範に採用されている１つの系は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するＴｉプラスミド、又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）に由来するＲｉプラスミドを使用する（Anetal., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 and Butcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208.）。植物を対象とした本発明による望ましい外来性遺伝子導入法をそれぞれ実施した後、さらなるＤＮＡ配列の存在及び／又は挿入が必要となり得る。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用について集中的に試験されており、欧州特許第Ａ−１２０５１６号明細書、Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Amsterdam, 1985, Chapter V; Fraley, etal., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46; and Anetal., EMBO J (1985) 4:277-284.に記載されている。
【０１９９】
所望のタンパク質（例えば、ＬＢＤ窒素応答性転写因子）をコードする外来性遺伝子で形質転換された植物細胞は、周知された組織培養法に基づき、例えばアミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等の必要な成長因子が供給された好適な培養培地内で細胞を培養すること等により成長及び維持可能である。
【０２００】
本発明に関連する用語「遺伝子導入植物」には、所望の遺伝子をコードする外来性遺伝子、例えば本発明によるＬＢＤ窒素応答性転写因子をコードする遺伝子を含むあらゆる植物が含まれる。好ましくは、外来性遺伝子は、植物のゲノムに組み込まれる。
【０２０１】
「遺伝子導入植物」及び「キメラ遺伝子」が、その本来のプロモーターの制御下に置かれており、該プロモーターもその天然の環境にあるとき、用語「遺伝子導入植物」及び「キメラ遺伝子」は、その天然の環境内に天然のヌクレオチドコーディング配列を含まない。
【０２０２】
１つの態様では、核酸配列、キメラ遺伝子、植物形質転換ベクター、又は本発明による植物細胞は、単離された状態にある。用語「単離された」とは、自然状態において配列が本質的に関連し、また自然において見出されるようなその他の構成要素について、配列は、その少なくとも１つを少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【０２０３】
１つの態様では、核酸配列、キメラ遺伝子、植物形質転換ベクター、又は本発明による植物細胞は、精製された状態にある。用語「精製された」とは、比較的純粋な状態、例えば少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９８％純粋を意味する。
【０２０４】
用語「ヌクレオチド配列」とは、本明細書で用いる場合、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びにそのバリアント、ホモログ、断片及び誘導体（例えば、その一部分等）を意味する。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来、又は合成由来、又は組換え体由来であり得るが、二本鎖であっても、また一本鎖であってもよく、センスストランド又はアンチセンスストランドのいずれを示すかを問わない。
【０２０５】
本発明に関連する用語「ヌクレオチド配列」には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。好ましくは、該用語は、ＤＮＡ、より好ましくは本発明を目的としてコーディングするｃＤＮＡ配列を意味する。
【０２０６】
好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列が本発明に関係し、そして本発明の範囲そのものに含まれるとき、当該ヌクレオチド配列は、その天然の環境に置かれたときの本発明による天然のヌクレオチド配列、及び同様にその天然の環境に置かれた天然において関連する配列（複数可）と連結したときの本発明による天然のヌクレオチド配列を含まない。呼びやすくするために、この好ましい実施形態を「非天然のヌクレオチド配列」と呼ぶこととする。こうしたことから、用語「天然のヌクレオチド配列」とは、その天然の環境に置かれているヌクレオチド配列全体、及び同様にその天然の環境に置かれた天然において関連するプロモーター全体と作動的に連結しているヌクレオチド配列全体を意味する。但し、本発明の範囲に含まれるアミノ酸配列は、その天然の生物内でヌクレオチド配列により発現した後に単離及び／又は精製され得る。但し、好ましくは、本発明の範囲に含まれるアミノ酸配列は、その天然の生物内でヌクレオチド配列により発現し得るが、但しその場合、ヌクレオチド配列は、当該生物内において、上記ヌクレオチド配列が本質的に関連するプロモーターの制御を受けない。
【０２０７】
一般的に、本発明の範囲に含まれるヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（すなわち、組換えＤＮＡ）を用いて調製される。但し、本発明の代替的実施形態では、ヌクレオチド配列は、当技術分野において周知の化学的方法を用いて、その全部又は一部において合成され得る（Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232を参照）。
【０２０８】
本明細書で定義するような特別な特性を有するタンパク質、又は改変に適するタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、前記タンパク質を産生する任意の細胞若しくは生物から同定及び／又は単離及び／又は精製され得る。様々な方法が、ヌクレオチド配列の同定及び／又は単離及び／又は精製について、当技術分野において周知されている。例として、適する配列が同定及び／又は単離及び／又は精製されたら、より多くの配列を調製するために、ＰＣＲ増幅技術が利用可能である。
【０２０９】
さらなる例として、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーが、酵素を産生する生物に由来する染色体ＤＮＡ、又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築され得る。酵素のアミノ酸配列が公知の場合には、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成することが可能であり、そして生物から調製されるゲノムライブラリーから、酵素をコードするクローンを同定するのに利用可能である。或いは、別の公知の酵素遺伝子と相同の配列を含有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、酵素をコードするクローンを同定するのに利用可能である。後者の場合では、ストリンジェンシーが低いハイブリダイゼーション及び洗浄条件が使用される。
【０２１０】
なおもさらなる代替法では、酵素をコードするヌクレオチド配列が、確立された標準法、例えばBeucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869.に記載されているホスホロアミダイト法、又はMatthes et al.,  (1984) EMBO J. 3, p 801-805に記載されている方法により合成的に調製され得る。ホスホロアミダイト法では、オリゴヌクレオチドが、例えば自動ＤＮＡ合成装置内で合成され、精製、アニーリング、ライゲートされ、及びしかるべきベクター内にクローン化される。
【０２１１】
ヌクレオチド配列は、標準技法に基づき、合成由来、ゲノム由来、又はｃＤＮＡ由来（適宜）の断片をライゲートすることにより調製されたゲノム由来と合成由来の混合物、及び合成由来とｃＤＮＡ由来の混合物、又はゲノム由来とｃＤＮＡ由来の混合物であり得る。各ライゲートされた断片は、ヌクレオチド配列全体のうちの様々な部分に対応する。また、ＤＮＡ配列は、例えば米国特許第４，６８３，２０２号明細書、又はSaiki R K et al., (Science (1988) 239, pp 487-491)の記載に従い、特異的プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，polymerase chain reaction）によっても調製され得る。
【０２１２】
本発明の範囲には、本明細書で定義するような特別な特性を有する酵素のアミノ酸配列も含まれる。
【０２１３】
本明細書で用いる場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。いくつかの事例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。いくつかの事例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【０２１４】
アミノ酸配列は、適するソースから調製及び／若しくは単離され得る、又はアミノ酸配列は合成により作製され得る、又はアミノ酸配列は組換えＤＮＡ技術の使用により調製され得る。
【０２１５】
好ましくは、アミノ酸配列が、本発明に関係するとき、及び本発明の範囲そのものに含まれるとき、当該アミノ酸配列は、天然型酵素ではない。こうしたことから、用語「天然型酵素」とは、その天然の環境に置かれた酵素全体を意味し、その場合、当該天然型酵素は、その天然のヌクレオチド配列により発現される。
【０２１６】
本発明は、本明細書で定義する特別な特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列（複数可）、又はそのようなポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列とある程度の配列同一性若しくは配列相同性を有する配列（以後、「相同的配列（複数可）」と呼ぶ）の使用も含む。ここで、用語「ホモログ」とは、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列と所定の相同性を有する実体を意味する。ここで、用語「相同性」は「同一性」に等しいとみなすことができる。
【０２１７】
相同的アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列及び／又は断片は、機能的活性を保持する及び／又は酵素の活性を増強するポリペプチドを提供及び／又はコードすべきである。
【０２１８】
一般的に、相同的配列は、例えば対象アミノ酸配列と同一の活性部位等を含む、又は同一の活性部位をコードする。また相同性は、類似性（すなわち、類似した化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）についても検討され得るが、本発明の文脈において、配列同一性に関して相同性と表現するのが好ましい。
【０２１９】
１つの実施形態では、相同的配列は、対象配列と比較して１又は複数の付加、欠損、及び／又は置換を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を含むものと理解される。
【０２２０】
１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が本明細書で提示されるタンパク質に関する、或いはこの（親）タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸、例えば２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸等、又はそれより多くのアミノ酸、例えば１０若しくは１０個を超えるアミノ酸等が置換、欠損、若しくは付加することにより、親タンパク質に由来するタンパク質であって、かつ親タンパク質の活性を有するタンパク質に関する。
【０２２１】
１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が本明細書で提示されるタンパク質をコードする、又はこの（親）タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸、例えば２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸等、若しくはそれより多くのアミノ酸、例えば１０若しくは１０個を超えるアミノ酸等が置換、欠損、若しくは付加することにより、親タンパク質に由来し、また親タンパク質の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（又は遺伝子）に関する。
【０２２２】
相同性、又は同一性の比較は、目視により、又はより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施され得る。このような市販のコンピュータープログラムは、２又は３以上の配列の間の相同性の割合（％）を計算することができる。
【０２２３】
相同性の割合（％）、又は同一性の割合（％）は、連続した配列について計算され得る、すなわち一方の配列が他方の配列と位置合わせされ、そして一方の配列内の各アミノ酸が他方の配列内の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較される。これは「非ギャップ」アラインメントと呼ばれる。一般的に、そのような非ギャップアラインメントは、残基数が比較的短い場合にのみ実施される。
【０２２４】
これは、非常に単純で一貫性のある方法であるが、例えば１つの挿入又は欠損以外は同一である配列の対において、それ以降のアミノ酸残基がアラインメントから排除される原因となり、したがってグローバルアラインメントを実施したときに、相同性の割合（％）の著しい低減を引き起こす可能性があるという点が考慮されない。したがって、ほとんどの配列比較法は、挿入及び欠損の可能性を考慮して、全体的な相同性スコアに対して不当にペナルティーを科さない最適なアラインメントを生成するように設計される。これは、局所的相同性を最大化させるように、配列アラインメント内に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０２２５】
但し、このようなより複雑な方法は、同数の同一のアミノ酸について、ギャップができる限り少なくなるように配列アラインメントを行い、２つの比較される配列間においてより高い関連性を反映させることにより、多くのギャップを有するスコアよりも高いスコアを実現するように、アラインメント内に生ずる各ギャップに対して「ギャップペナルティー」を割り振る。ギャップの存在に対して比較的高いコスト、及びギャップ内の後続する各残基に対してより小さいペナルティーを科す「アフィンギャップコスト」が一般的に用いられる。これは、最も一般的に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーにより、もちろん、ギャップがより少ない最適化されたアラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーの修正を可能にする。但し、配列比較にそのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を使用するのが好ましい。
【０２２６】
相同性の割合（％）が最大となる計算法は、したがってギャップペナルティーを考慮しつつ、最適なアラインメントの生成を最初に必要とする。そのようなアラインメントを実施するのに適するコンピュータープログラムは、Vector NTI（Invitrogen Corp.社）である。配列比較を実施することができるソフトウェアの例として、例えばBLASTパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18を参照）、BLAST2（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8、及びtatiana@ncbi.nlm.nih.govを参照）、FASTA（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）、及びAlignXが挙げられるが、但しこれらに限定されない。少なくともBLAST、BLAST2、及びFASTAが、オフライン及びオンラインサーチに利用可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58〜7-60を参照）。
【０２２７】
最終的な相同性の割合（％）は、同一性に関して測定可能であるが、アラインメントプロセスそのものは、一般的にオールオアナッシングの対比較に基づかない。むしろ、化学的類似性、又は進化距離に基づき各ペアワイズ比較に対してスコアを割り振る、スケール化類似性スコアマトリックスが一般的に用いられる。一般的に用いられるそのようなマトリックスの例は、BLOSUM62マトリックス−BLASTパッケージプログラムのデフォルトマトリックスである。Vector NTIプログラムは、パブリックデフォルト値、又は供給される場合にはカスタムシンボル比較表のいずれかを一般的に使用する（さらに詳しくは、ユーザーマニュアルを参照）。いくつかの用途では、Vector NTIパッケージ用のデフォルト値を使用するのが好ましい。
【０２２８】
或いは、相同性の割合（％）は、CLUSTALに類似したアルゴリズムに基づき、Vector NTI（Invitrogen Corp.社）内の複数のアラインメント特性を用いて計算され得る（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）。
【０２２９】
ソフトウェアが最適なアラインメントを生成したら、相同性の割合（％）、好ましくは配列同一性の割合（％）を計算することが可能である。ソフトウェアは、一般的に配列比較の一環としてこれを行い、そして数値結果を生成する。
【０２３０】
配列同一性を決定するときに、ギャップペナルティーを使用する場合、好ましくはペアワイズアラインメント用として、下記のパラメーターが使用される：
【０２３１】
【表１】
0006368863.tif 000002
【０２３２】
１つの実施形態では、CLUSTALは、上記で定義されたギャップペナルティー及びギャップエクステンションセットと共に利用可能である。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、BLAST又はCLUSTALアラインメントで用いられるギャップペナルティーは、これまでに詳記したギャップペナルティーとは異なる可能性がある。当業者は、BLAST及びCLUSTALアラインメントを実施するための標準パラメーターは定期的に変化し得るが、またBLAST又はCLUSTALアラインメントアルゴリズムについて詳記された標準パラメーターに基づきしかるべきパラメーターを、その時に選択することができるものと認識する。
【０２３４】
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも３０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも４０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも５０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも６０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも１００個の連続したヌクレオチドについて決定される。
【０２３５】
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、配列全体にわたり決定され得る。
【０２３６】
配列は、サイレント変化を引き起こし、機能的に同等の物質を生み出すアミノ酸残基の欠損、挿入、又は置換も有し得る。計画的なアミノ酸置換は、物質の二次結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいてなし得る。例えば、負電荷を有するアミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる；正電荷を有するアミノ酸として、リジン及びアルギニンが挙げられる；並びに類似した親水性値を有する無荷電極性頭部基を備えたアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが挙げられる。
【０２３７】
保存的置換は、例えば下記の表に基づきなし得る。第２の列の同一ブロック内、及び好ましくは第３の列の同一行内のアミノ酸は、相互に置換され得る：
【０２３８】
【表２】
0006368863.tif 000003
【０２３９】
本発明は、生じる可能性がある相同的置換（置換及び交換は、いずれも既存のアミノ酸残基と代替残基とが相互に交換することを意味するために本明細書で用いられる）、すなわち似た者同士の置換、例えば塩基性には塩基性、酸性には酸性、極性には極性等の置換も含む。１つのクラスの残基から別のクラスに、また或いは非天然のアミノ酸、例えばオルニチン（以後Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以後Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシン等の組込みを含め、相同的ではない置換も生じる可能性がある。
【０２４０】
交換は、非天然のアミノ酸によってもなされる可能性があり、アルファ＊及びアルファ−二置換型＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン化合物誘導体、例えばトリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊等、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊等、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃、及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊が含まれる。＊の表記は、上記考察のために（相同的又は相同的ではない置換に関連して）利用されており、誘導体の疎水的性質を表し、一方＃は、誘導体の親水的性質を表し、＃＊は両親媒性の特徴を表すのに利用されている。
【０２４１】
バリアントのアミノ酸配列は、アミノ酸スペーサー、例えばグリシン又はβ−アラニン残基等に付加して、アルキル基、例えば、メチル、エチル、又はプロピル基等を含む、配列内の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。さらなる変化形態は、ペプトイド形態内の１又は２以上のアミノ酸残基の存在と関係し、当業者には十分に理解される。誤解を回避するために、α炭素置換基がα炭素ではなく残基の窒素原子上にあるようなバリアントのアミノ酸残基を指すのに、「ペプトイド形態」が用いられる。ペプトイド形態のペプチドを調製する方法は、当技術分野、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371、及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.において公知である。
【０２４２】
本発明で用いられるヌクレオチド配列は、その中に合成又は修飾されたヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の修飾が、当技術分野において公知である。これには、メチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格、並びに／或いは分子の３’及び／又は５’末端部におけるアクリジン若しくはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的に照らせば、本明細書に記載するヌクレオチド配列は、当技術分野において利用可能な任意の方法により修飾され得るものと理解される。そのような修飾は、本発明のヌクレオチド配列のインビボでの活性又は寿命を増強するために実施され得る。
【０２４３】
本発明は、本発明の核酸配列に対して相補的な配列、又は本発明の配列若しくはそれと相補的な配列とハイブリダイズする能力を有する配列も含む。
【０２４４】
用語「ハイブリダイゼーション」には、本明細書で用いる場合、「核酸のストランドが、塩基対形成を通じて、相補鎖と結合するプロセス」、並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施されるような増幅プロセスが含まれるものとする。
【０２４５】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列とも関連する（本明細書に提示する配列の相補的な配列を含む）。
【０２４６】
好ましくは、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で決定される（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）。
【０２４７】
より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、高度にストリンジェントな条件下で決定される（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）。
【０２４８】
１つの態様では、本発明で用いられる配列は、合成配列−すなわち、インビトロでの化学合成、又は酵素的合成により調製された配列である。そのような配列として、宿主生物にとってコドン利用が最適となるように作製された配列が挙げられるが、但しこれに限定されない。用語「発現ベクター」とは、インビボ又はインビトロでの発現能力を有するコンストラクトを意味する。
【０２４９】
好ましくは、発現ベクターは、適する宿主生物のゲノムに組み込まれる。用語「組み込まれる」には、好ましくはゲノムへの安定な組込みが含まれる。
【０２５０】
本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が、適する宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を実現する能力を有する制御配列と作動可能に連結したベクター内に存在し得る。
【０２５１】
本発明で用いられるベクターは、本発明のポリペプチドの発現を実現するために、本明細書に記載するような好適な宿主細胞に形質転換され得る。
【０２５２】
ベクター、例えばプラスミド、コスミド、又はファージベクターの選択は、多くの場合、ベクターが導入される宿主細胞に依存する。
【０２５３】
ベクターは、例えばＲＮＡを生成するために、インビトロで利用可能である、又は宿主細胞に対してトランスフェクト、形質転換、形質導入し、又は感染させるのに利用可能である。
【０２５４】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を複製可能なベクターに導入し、該ベクターを適合性のある宿主細胞に導入し、そして該ベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を増殖させることにより本発明のヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
【０２５５】
ベクターは、ベクターが対象とする宿主細胞内で複製するのを可能にするヌクレオチド配列をさらに含み得る。そのような配列の例として、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、及びpIJ702の複製起点が挙げられる。
【０２５６】
いくつかの用途では、本発明で用いられるヌクレオチド配列は、例えば選択された宿主細胞等によりヌクレオチド配列の発現を実現する能力を有する制御配列と作動可能に連結している。例として、本発明には、そのような制御配列と作動可能に連結した本発明のヌクレオチド配列を含むベクターが含まれる、すなわちベクターは発現ベクターである。
【０２５７】
用語「作動可能に連結している」とは、記載する構成要素が、その意図した方式で機能するのを可能にする関係にある並列配置を意味する。コーディング配列に「作動可能に連結している」制御配列は、制御配列に適合する条件下でコーディング配列の発現が実現するようにライゲートされる。
【０２５８】
用語「制御配列」には、プロモーター、及びエンハンサー、及びその他の発現制御シグナルが含まれる。
【０２５９】
用語「プロモーター」は、当技術分野の通常の意味で用いられ、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０２６０】
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の発現強化は、異種制御領域、例えばプロモーター、分泌リーダー、及び転写終結コドン領域の選択によっても達成され得る。
【０２６１】
好ましくは、本発明によるヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターと作動可能に連結している。
【０２６２】
用語「コンストラクト」は、用語「コンジュゲート」、「カセット」、及び「ハイブリッド」等と同義であるが、プロモーターに直接又は間接的に結合した、本発明に基づき使用されるヌクレオチド配列を含む。
【０２６３】
間接的な結合の例は、適するスペーサー群、例えばＳｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロン等のイントロン配列、中間のプロモーター、及び本発明のヌクレオチド配列等の提供である。同じことは、本発明に関連して、用語「融合した」にも当てはまり、同用語には直接又は間接的な結合が含まれる。場合によっては、野生型遺伝子プロモーターと通常関連したタンパク質をコーディングするヌクレオチド配列の天然の組合せが、いずれもその天然の環境に置かれている場合、これらの用語には当該組合せは含まれない。
【０２６４】
コンストラクトは、遺伝的コンストラクトの選択を可能にするマーカーを含み得る、又は発現し得る。
【０２６５】
植物の形質転換で用いられる一般的技術のレビューは、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)、及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)の文献に見出され得る。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許第Ａ−０４４９３７５号明細書に見出され得る。
【０２６６】
別途規定しない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、本開示で使用される用語の多くについて、当業者に一般的なディクショナリーを提供する。
【０２６７】
本開示は、本明細書に開示する例示的な方法及び材料に限定されず、また本明細書に記載するものと類似した又は同等のあらゆる方法及び材料は、本開示の実施形態を実践又は試験するのに利用可能である。数値の範囲には、範囲を規定する数字も含まれる。別途明示しない限り、核酸配列はいずれも、左から右に５’→３’の向きで記載されており、アミノ酸配列は、左から右にアミノ基→カルボキシ基の向きでそれぞれ記載されている。
【０２６８】
本明細書に提示される表題は、本明細書を全体的に参照することにより理解され得る本開示の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、直下で定義する用語は、本明細書を全体的に参照することにより、さらに完全に定義される。
【０２６９】
アミノ酸は、本明細書ではアミノ酸の名称、３文字略号、又は１文字略号を用いて表される。
【０２７０】
用語「タンパク質」には、本明細書で用いる場合、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドが含まれる。
【０２７１】
本明細書で用いる場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。いくつかの事例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。いくつかの事例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【０２７２】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では交換可能に用いられる。本開示及び特許請求の範囲では、アミノ酸残基について、従来方式の１文字及び３文字コードが使用され得る。アミノ酸の３文字コードは、ＩＵＰＡＣＩＵＢ生化学命名法に関する合同委員会（ＪＣＢＮ，Joint Commission on Biochemical Nomenclature）に準拠して規定される通りである。またポリペプチドは、遺伝子コードの縮重に起因して、１を超えるヌクレオチド配列によりコードされ得るものとやはり理解される。
【０２７３】
用語のその他の定義も、本明細書全体を通じて提示され得る。例示的な実施形態がより詳細に記載する前に、本開示は、記載されている特定の実施形態に限定されない、したがって、当然ながら変化する可能性もあると理解される。また、本明細書で用いる用語は、特定の実施形態を記載する目的に限定され、そして本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、制限するようには意図されないものとやはり理解される。
【０２７４】
ある範囲の値が提示される場合、その内容について別途明確な指示がない限り、下限の単位の１０分の１まで、当該範囲の上限及び下限の間の中間的な値それぞれも特に開示されるものと理解される。記載された任意の値の間のより狭い範囲のそれぞれ、又は記載された範囲内の中間的な値、及び当該記載された範囲内の任意のその他の記載された値、又は中間的な値は本開示に含まれる。これらのより狭い範囲の上限及び下限は、該範囲に独立して含まれる又はそれから除外され得る、並びにいずれか一方若しくは両方の限界がより狭い範囲に含まれる、又はそのいずれも含まれない場合の各範囲も本開示に含まれ、記載された範囲内において、特に除外された任意の限界が設けられる。一方又は両方の限界が、記載された範囲に含まれる場合、そのような含まれる限界の一方又は両方を除いた範囲も本開示に含まれる。
【０２７５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、その内容について別途明確な指示がない限り、複数形の指示物が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「an enzyme（酵素）」、又は「a nitrate reductase（硝酸レダクターゼ）」と記載する場合、それには複数のそのような候補薬剤及び当業者にとって公知のその同等物等が含まれる。
【０２７６】
本明細書で議論される公開資料は、本出願の出願日に先立つそれらの開示のためにもっぱら提供される。本明細書内のいずれも、そのような公開資料が、本明細書に添付される特許請求の範囲に対する先行技術に該当するとした承認として解釈されない。
【０２７７】
長所
本発明と関連した重要な長所は、ＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように改変されなかったタバコ植物から調製されたタバコ製品内のタバコ特異的ニトロソアミン濃度（例えば、ＮＮＫ）の低減である。
【０２７８】
本発明は、下記の図及び実施例を参照しながら、例示目的に限定して以下に記載される。
［実施例］
【実施例１】
【０２７９】
ＬＢＤクローニング
ＬＢＤ遺伝子、LBD37（At5g67420.1）、LBD38（At3g49940.1）、及びLBD39（At4g37540.1）を、シロイヌナズナｃＤＮＡから単離した。これらを、TOPO（登録商標）シャトルベクター（Life Ｔechnologies社から入手可能）に予備的にクローン化し、その後、構成的なカーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター、ＳＡＧ１２老化特異的プロモーター、及びノパリンシンターゼ（ｎｏｓ，nopaline synthase）転写終結コドンを含有するｐＢＮＰバイナリーベクターに形質転換した。いずれの配列分析においても、コンストラクトが正しいと判定されたら、その後、該コンストラクトをアグロバクテリウムLBA4404（Clontech Laboratories, Inc.社から入手可能）に形質転換し、そしてバーレイPH2517に形質転換した。
【実施例２】
【０２８０】
タバコの形質転換
バーレイPH2517植物を、Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985)の記載に従い、リーフディスクの同時培養法を用いて形質転換した。
【０２８１】
形質転換したアグロバクテリウムのオーバーナイト培養物を、ＬＢブロス、５０ｍｌプラス関連する抗生物質を含む１ｇ／Ｌのグルコース内に準備した。これを、ＯＤ６００が０．６〜０．９９に達するまで、２７℃で増殖させた。
【０２８２】
最も若い２つの十分に増殖した葉を７週齢のタバコ植物から採取し、そして８％Domestos（商標）内で１０分間表面滅菌し、そして滅菌蒸留水で４回洗浄した。リーフディスクを、次に１１ｍｍのコルクボーラーを用いてカットし、そしてアグロバクテリウム懸濁液内に２分間播種した。ディスクを、次に無菌フィルターペーパーからなるシートの間でブロッティングし、そして１０ディスク／プレートをＭＳ３％スクロース＋２．２μＭのＢＡＰ＋０．２７μＭのＮＡＡプレート上に配置した。プレートを、次に２日間インキュベーションした。ディスクを、次に同一の、５００ｇ／ｌのセフォタキシム及び１００ｇ／ｌのカナマイシンが補充されたＭＳ  ＢＮ培地のプレートに移した。シュートの形成開始まで、ディスクを上記培地の新鮮なプレート上に２週間毎に移した。シュートが現れたら、それを切除し、そして５００ｍｇ／ｌのセフォタキシム及び１００ｍｇ／ｌのカナマイシンが補充されたＬＳ培地＋３％スクロース＋０．５μＭのＢＡＰを含有するプレートに移した。十分な大きさとなったら（約２週間）、これらを、５００ｍｇ／ｌのセフォタキシムが補充されたＬＳ培地＋３％スクロース＋０．５μＭのＢＡＰのジャーに移した。約３週間後、ジャー内のシュートを、ＬＳ培地＋３％スクロース＋２５０ｍｇ／ｌのセフォタキシムに移した。さらに３〜４週間後、植物を最終的にＬＳ培地＋３％スクロース（抗生物質無添加）に移し、発根させた。植物が発根したら、該植物を温室内の土壌に移した。組織培養における成長条件は、２４℃±１℃、日照１６時間であった。
【実施例３】
【０２８３】
ＴＳＮＡレベル測定
ＴＳＮＡ分析は、Labstat（登録商標）International ULC社（62 Manitou Drive, Kitchener, Ontario, N2C 1L3）に外注委託した。Labstat社が用いた方法は下記の文献に基づく：
・Wu, W.; Ashley, D. L.; Watson, C. H. Anal. Chem. (2003) 75: 4827-4832.
・Wagner, K. A.; Finkel, N. H.; Fossett, J. E.; Gillman, I. G. Anal. Chem. (2005) 77: 1001-1006.
・Lee, J-M.; Shin J-W.; Oh, I_H.; Lee U-C.; Rhee M-S. (2004) Coresta Congress Kyoto. Paper SS20; See http://www.coresta.org/Past_abstracts/Kyoto2004-SmokeTech.pdf
・Chwojdak, C. A.; Self, D. A.; Wheeler, H. R. A collaborative, Harmonized LC-MS/MS Method for the determination of Tobacco Specific Nitrosamines (TSNA) in Tobacco and Tobacco Related Materials. 61st Tobacco Science Research Conference, Charlotte, NC. USA. September 24, 2007.
【０２８４】
方法の概要：
試験では、乾燥タバコにつき、最低試料サイズ、１００ｇを必要とした。タバコ製品を微細化し、４ｍｍ未満の粒子サイズを保証するために篩分けし、ラボ複合物の調製後、できる限り速やかに分析を開始した。
【０２８５】
４つの重水素で標識されたＴＳＮＡ類似体（すなわち、ＮＮＮ−ｄ４、ＮＡＴ−ｄ４、ＮＡＢ−ｄ４、ＮＮＫ−ｄ４）を含有する所定量の内部標準溶液をタバコ製品（０．７５ｇ）上にスパイクし、次にリストアクションシェイカー上で、ＴＳＮＡ化合物を酢酸アンモニウム水溶液中に抽出した。抽出物を次に濾過し、そしてポジティブエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ，electrospray ionization）を用いたＬＣ−ＭＳＭＳ分析に供した。アナライト毎に、２つの質量変化の対が、アナライトの確認及び定量に役立てるために利用可能である。最も強度の高い対を定量に用いた；それほど強度が高くない変化の対は、さらなる化合物確認のためのクォリファイアーとして用いた。
【０２８６】
結果：
図３は、構成的プロモーター（024-0147）におけるLBD37のコンストラクトを発現する植物から製造された乾燥タバコ中のＮＮＫ及びＮＮＮのレベルは、野生型植物と比較して有意に低減したことを示す。老化特異的プロモーター（138-0148）におけるLBD38のコンストラクトを発現する植物から製造された乾燥タバコも、ＮＮＫの顕著な低減を示した。
【０２８７】
LBD38及び39の過剰発現は、植物に対する適応コストの懸念があるので、LBD38及び39を老化プロモーターの制御下で発現させた。但し、導入遺伝子の効果は減じてしまうので、ＴＳＮＡの低減に対する効果も同様である。
【０２８８】
対照と比較したときの遺伝子導入物内のＮＮＫ含有量低減の程度は、構成的プロモーター（024-0147）と比較したときの老化プロモーター（0138-0148及び0138-0149）による遺伝子発現において、明らかに低い。但し、LBD37により生み出されるＮＮＫレベルに対する効果はラインの８０％に達し、平均１／３〜１／６に低減することを示している。ＮＮＮの低減も、LBD37遺伝子を担持する植物について統計的に有意である。ＮＮＮにつき、野生型の対照と比較して１／２〜１／４の低減が認められた。
【実施例４】
【０２８９】
タバコ葉アミノ酸含有量分析（Ｔ１）
野生型及び遺伝子導入バーレイPH2517植物のアミノ酸含有量を、Phenomenex社が販売するEZ:Faast LC/MSキットを用いて測定した。ＨＰＬＣカラムを含むすべての試薬及び供給品は、キットの構成要素である。手順のステップはいずれも、プロトコールとして用いられるユーザーマニュアルKH0-7338に記載されている。
【０２９０】
方法は、分析対象試料の固相抽出を含み、その後に誘導体化及び液体／液体抽出が続く。誘導体化された試料を、液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ，liquid chromatography-mass spectrometry）により迅速に分析した。
【０２９１】
妨害化合物を通過させる一方、アミノ酸には結合する吸着剤がパックされたチップにより、固相抽出を実施した。吸着剤に結合したアミノ酸を、次に試料バイアル中に押し出し、そして試薬を用いて、水溶液中、室温で迅速に誘導体化した。誘導体化されたアミノ酸を、妨害化合物からさらに分離するために、有機層に同時に移動させた。有機層を、次に除去、蒸発、及び水性移動相中に再溶解し、そしてＬＣ−ＭＳシステム上で分析した。
【０２９２】
各コンストラクトに由来する４つの独立した植物を温室内で成長させた。植物を１４週間成長させ、葉番号１０（中間の位置）を試料採取し、そして液体窒素中で急速冷凍した。下記に示す結果は、主要アミノ酸含有量の平均から得られる。１２個の野生型植物を同一条件で成長させ、そして対照について提示した結果は、中央部の葉、１２枚の平均アミノ酸含有量を表す。
【０２９３】
結果及び考察
乾燥タバコ葉中のＴＳＮＡ含有量は、収穫時に葉内に存在する窒素化合物種と関連することが周知されている。老化時の窒素同化、窒素輸送、中央窒素代謝、及びリサイクリングは、植物の窒素状態に関係するすべての事象である。非常に複雑ではあるが、アミノ酸含有量は、植物の窒素状態の反映であり、またＴＳＮＡ前駆体レベルを示唆する可能性があるとも認識される。
【０２９４】
図２に提示する結果は、植物のアミノ酸の分布を示しており、したがって窒素状態は、コンストラクトにより影響を受ける。グルタミン酸、グルタミン、及びアスパラギンは、野生型植物及び遺伝子導入植物の両方において、明らかに最も豊富なアミノ酸、３種である。但し、遺伝子LBD37、38、又は39を担持する多くの遺伝子導入ラインにおいて、総アミノ酸の存在量は、野生型と比較して増加している。また、アミノ酸の総量に対するグルタミン酸及びプロリンの割合は、遺伝子導入物内のその他のアミノ酸と比較して増加していることを示す。これは、３つのＬＢＤ遺伝子が過剰発現している植物において、窒素種分布の変化を示している。
【実施例５】
【０２９５】
タバコニコチンレベルの分析
ニコチン分析は、Labstat社に外注委託した。Labstat社が用いた方法は下記の文献に基づく：
・Imperial Tobacco Canada Limited, Procedures analytical Services, Procedure 11; “Simultaneous Determination of  Sugars and Total Alkaloids in Tobacco”.
・Bran & Luebbe, Auto Analyser 3 (AA3) Reference Manual.
【０２９６】
方法の概要：
微細化したタバコをタイプ１の水で抽出し、次に濾過した。抽出物を、次にBran & Luebbe Auto Analyser 3（ＡＡ３，Auto Analyser 3）上で分析した。各試料を緩衝化した水酸化ナトリウム溶液でオンライン稀釈し、そしてスルファニル酸流体中に透析した。溶離液を塩化シアノゲンと反応させて、黄色がかった緑色の色素を形成し、比色計で４６０ｎｍにおいて吸収を読み取った。
【０２９７】
結果：
図４に提示するニコチンレベル分析結果は、植物内でLBD37、LBD38、及びLBD39遺伝子が発現すると、野生型と比較して、得られたタバコのニコチン含有量が若干増加することを示す。ニコチンは窒素に富んだ代謝物であるので、この結果は、遺伝子導入植物における窒素分布／代謝の変化について、別の示唆をもたらす。図５は、老化プロモーター（0138-0148及び0138-0149）の下でLBD38及びLBD39を発現する植物について、収率は野生型と実質的に同一であるが、構成的プロモーター（024-0147）によりLBD37を発現する植物ではわずかに低減したことを示す。
【０２９８】
上記明細書に記載するすべての公開資料は、本明細書に参照として組み込まれる。記載されている本発明の方法及びシステムについて、本発明の範囲及び精神から逸脱しないその様々な修飾形態及び変更形態は、当業者にとって明白である。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、主張されるような本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと理解すべきである。確かに、本発明を実施するに当たり、生化学及びバイオテクノロジー、又は関連分野の当業者にとって、記載するモードの様々な改変は明らかであるが、そのような改変も下記の特許請求の範囲内であるように意図される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【配列表】
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