(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト女性が妊娠する可能性を向上させるか、改善するか、または増大させるための、脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントであって、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含み、
ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、20：1〜40：1である、前記サプリメント。
【請求項２】
エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のエイコサペンタエン酸(EPA)をさらに含む、請求項1に記載のサプリメント。
【請求項３】
エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のアラキドン酸をさらに含む、請求項1または2に記載のサプリメント。
【請求項４】
前記DHAが、トリグリセリドの形態である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のサプリメント。
【請求項５】
ビタミンDをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のサプリメント。
【請求項６】
前記ビタミンDが、400〜4000国際単位(IU)の量で存在する、請求項5に記載のサプリメント。
【請求項７】
前記ビタミンDが、1000〜4000IUの量で存在する、請求項5に記載のサプリメント。
【請求項８】
前記ビタミンDが、2000〜4000IUの量で存在する、請求項5に記載のサプリメント。
【請求項９】
ビタミンD以外の少なくとも1種類のビタミンをさらに含む、請求項5に記載のサプリメント。
【請求項１０】
DHA:EPAの重量比が、500:1から1:1までである、請求項2に記載のサプリメント。
【請求項１１】
DHAが、EPAより多い量で存在する、請求項2に記載のサプリメント。
【請求項１２】
DHAが、500mg〜750mgの量で存在し、かつ、EPAが、80mg〜250mgの量で存在する、請求項１１に記載のサプリメント。
【請求項１３】
DHA:EPAが、70:10の重量比で存在する、請求項１２に記載のサプリメント。
【請求項１４】
DHA:EPAが、500:200の重量比で存在する、請求項１２に記載のサプリメント。
【請求項１５】
DHA:EPAが、600〜750:150〜250の重量比で存在する、請求項１２に記載のサプリメント。
【請求項１６】
650mg〜750mgのDHAおよび80mg〜130mgのEPAを含む、請求項2に記載のサプリメント。
【請求項１７】
750mg〜900mgの総ω-3脂肪酸を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載のサプリメント。
【請求項１８】
少なくとも1種類の抗酸化物質をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載のサプリメント。
【請求項１９】
前記少なくとも1種類の抗酸化物質が、α-トコフェロール(ビタミンE)、EDTAカルシウム二ナトリウム、α酢酸トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、アスコルビン酸ならびにその薬学的に許容される塩およびエステル、没食子酸プロピル、クエン酸およびその薬学的に許容される塩、リンゴ酸およびその薬学的に許容される塩、ならびに、それらの亜硫酸塩および混合物より選択される、請求項１８に記載のサプリメント。
【請求項２０】
前記少なくとも1種類の抗酸化物質がBHAを含む、請求項１９に記載のサプリメント。
【請求項２１】
総ω-3脂肪酸が、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも70重量％である、請求項1〜20のいずれか一項に記載のサプリメント。
【請求項２２】
総ω-3脂肪酸が、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも75重量％である、請求項1〜21のいずれか一項に記載のサプリメント。
【請求項２３】
総ω-3脂肪酸が、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも80重量％である、請求項1〜21のいずれか一項に記載のサプリメント。
【請求項２４】
総ω-3脂肪酸が、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも90重量％である、請求項1〜21のいずれか一項に記載のサプリメント。
【請求項２５】
DHAおよびEPAが、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して35重量％〜90重量％存在する、請求項2に記載のサプリメント。
【請求項２６】
DHAおよびEPAが、該サプリメント中の総脂肪酸に対して40重量％〜85重量％存在する、請求項2に記載のサプリメント。
【請求項２７】
DHAおよびEPAが、該サプリメント中の総脂肪酸に対して40重量％〜80重量％存在する、請求項2に記載のサプリメント。
【請求項２８】
DHAおよびEPAが、該サプリメント中の総脂肪酸に対して50重量％〜80重量％存在する、請求項2に記載のサプリメント。
【請求項２９】
ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、20：1である、請求項１に記載のサプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2012年8月31日に出願された米国特許仮出願第61/695,510号および2012年3月7日に出願された米国特許仮出願第61/607,884号に係る優先権を主張する本出願である。これらは全てその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援
本発明は、一部、米国立衛生研究所からの米国政府助成金T32DK007754-12によって行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
高齢出産年齢に近づいた女性は自然妊娠および補助妊娠によるアウトカムが低い場合がある(例えば、Wen et al. Fertility and Sterility 2012を参照されたい)。さらに、染色体異常および先天異常の発生率は年齢と共に増加する。今までのところ、卵巣老化を遅らせるかまたは卵母細胞の質を改善するための有効かつ実用的な戦略はない。
【０００４】
女性の妊孕能は35歳を過ぎると急激に低下することが知られており(Schwartz D, Mayaux MJ (1982), Female fecundity as a function of age: results of artificial insemination in 2193 nulliparous women with azoospermic husbands. Federation CECOS. N Engl J Med. 306, 404-406)、45歳までに生殖能はほとんど失われる(Ventura SJ, Abma JC, Mosher WD, Henshaw S (2004). Estimated pregnancy rates for the United States, 1990-2000: an update. Natl Vital Stat Rep. 52, 1-9)。医療の進歩と共に、女性の平均余命は過去一世紀にわたって30歳と長く延びたが、この同じ期間に閉経年齢はわずか3〜4歳しか変化していない(Soules MR, Bremner WJ (1982), The menopause and climacteric: endocrinologic basis and associated symptomatology. J Am Geriatr Soc. 30, 547-561)。そうして、全寿命と関連して女性の生殖寿命が際だって短くなる不合理変則がもたらされた。この相違は、現在では、これまで以上に顕著である。この長寿命時代において、西洋社会で最も顕著な、出産を先延ばしにする最近の傾向は、年齢関連性の妊孕能低下を生殖医学分野における科学的課題の最前面に押し出している(Martin JA, Hamilton BE, Sutton PD, Ventura SJ, Mathews TJ, Kirmeyer S, Osterman MJ (2010). Births: final data for 2007. Natl Vital Stat Rep. 58, 1-85)。
【０００５】
生物学的に、閉経が起こる年齢は、染色体異常および紡錘体異常ならびにミトコンドリア機能不全の増大により証明される卵母細胞の質の低下(Battaglia DE, Goodwin P, Klein NA, Soules MR (1996). Influence of maternal age on meiotic spindle assembly in oocytes from naturally cycling women. Hum Reprod. 11, 2217-2222; Hunt PA, Hassold TJ (2008). Human female meiosis: what makes a good egg go bad? Trends Genet. 24, 86-93; Selesniemi K, Lee HJ, Muhlhauser A, Tilly JL (2011). Prevention of maternal aging-associated oocyte aneuploidy and meiotic spindle defects in mice by dietary and genetic strategies. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 12319-12324)を伴う、卵母細胞を含む卵胞予備能の進行性の低下および最終的な枯渇によって決定される(Hansen JP (1986). Older maternal age and pregnancy outcome: a review of the literature. Obstet Gynecol Surv. 41, 726-742; Faddy MJ, Gosden RG, Gougeon A, Richardson SJ, Nelson JF (1992). Accelerated disappearance of ovarian follicles in mid-life: implications for forecasting menopause. Hum Reprod. 7, 1342-1346; Tilly JL (2001). Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 838-848)。これらの変化は、生殖可能年齢の終わりに近い(advanced reproductive age)女性の自然妊娠および補助妊娠の試みの低い成功ならびに受胎が成功した場合の染色体異常の高い発生率にかなり寄与する(Navot D, Bergh PA, Williams MA, Garrisi GJ, Guzman I, Sandler B, Grunfeld L (1991b). Poor oocyte quality rather than implantation failure as a cause of age-related decline in female fertility. Lancet. 337, 1375-1377; van Kooij RJ, Looman CW, Habbema JD, Dorland M, te Velde ER (1996). Age-dependent decrease in embryo implantation rate after in vitro fertilization. Fertil Steril. 66, 769-775)。ヒトと同様に、実験用げっ歯類は、実際の寿命のほぼ中盤で自然不妊の状態につながる卵胞予備能の年齢関連性低下を示す(Gosden RG, Laing SC, Felicio LS, Nelson JF, Finch CE (1983). Imminent oocyte exhaustion and reduced follicular recruitment mark the transition to acyclicity in aging C57BL/6J mice. Biol Reprod. 28, 255-260; Perez GI, Robles R, Knudson CM, F1aws JA, Korsmeyer SJ, Tilly JL (1999). Prolongation of ovarian lifespan into advanced chronological age by Bax-deficiency. Nat Genet. 21, 200-203; Wu JM, Zelinski MB, Ingram DK, Ottinger MA (2005). Ovarian aging and menopause: current theories, hypotheses, and research models. Exp Biol Med (Maywood). 230, 818-828)。高齢雌性マウスは、周期的卵巣機能の消失を含む、閉経後女性において観察される生理学的変化の多くを示す。このために、これらの動物は卵巣機能不全研究に理想的なモデルとなっている。残念なことに、関連するげっ歯類モデル系および雌性生殖寿命を延長するための提案された有望な戦略があるのにもかかわらず(Perez GI, Robles R, Knudson CM, F1aws JA, Korsmeyer SJ, Tilly JL (1999). Prolongation of ovarian lifespan into advanced chronological age by Bax-deficiency. Nat Genet. 21, 200-203; Perez GI, Jurisicova A, Wise L, Lipina T, Kanisek M, Bechard A, Takai Y, Hunt P, Roder J, Grynpas M, Tilly JL (2007). Absence of the proapoptotic Bax protein extends fertility and alleviates age-related health complications in female mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 5229-5234; Selesniemi K, Lee HJ, Tilly JL (2008). Moderate caloric restriction initiated in rodents during adulthood sustains function of the female reproductive axis into advanced chronological age. Aging Cell. 7, 622-629; Selesniemi K, Lee HJ, Niikura T, Tilly JL (2009). Young adult donor bone marrow infusions into female mice postpone age-related reproductive failure and improve offspring survival. Aging (Albany NY). 1, 49-57; Niikura Y, Niikura T, Wang N, Satirapod C, Tilly JL (2010). Systemic signals in aged males exert potent rejuvenating effects on the ovarian follicle reserve in mammalian females. Aging (Albany NY). 2, 999-1003; Selesniemi K, Lee HJ, Muhlhauser A, Tilly JL (2011). Prevention of maternal aging-associated oocyte aneuploidy and meiotic spindle defects in mice by dietary and genetic strategies. Proc Natl Acad Sci U SA. 108, 12319-12324)、卵巣老化を大きく遅らせるための、または卵母細胞の質を改善するための有効かつ現実的な戦略はまだ開発されていない。
【０００６】
ヒトの食事パターンを徐々に変えることによって、卵巣老化を遅らせる新規の手段への洞察が得られる可能性がある。人類学的および栄養学的な研究から、過去100年間にわたってヒトの食事、とりわけ、摂取される脂肪のタイプおよび量が顕著に変わったことが証明されている(Eaton SB, Konner M (1985). Paleolithic nutrition. A consideration of its nature and current implications. N Engl J Med. 312, 283-289; Simopoulos AP (1991). Omega-3 fatty acids in health and disease and in growth and development. Am J Clin Nutr. 54, 438-463; Simopoulos AP (2003). Importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids: evolutionary aspects. World Rev Nutr Diet. 92, 1-22; Simopoulos AP (2006). Evolutionary aspects of diet, the omega-6/omega-3 ratio and genetic variation: nutritional implications for chronic diseases. Biomed Pharmacother. 60, 502-507; Simopoulos AP (2009). Evolutionary aspects of the dietary omega-6:omega-3 fatty acid ratio: medical implications. World Rev Nutr Diet. 100, 1-21; Simopoulos AP (2011). Importance of the omega-6/omega-3 balance in health and disease: evolutionary aspects of diet. World Rev Nutr Diet. 102, 10-21)。これらの変化はω-6脂肪酸摂取およびω-3脂肪酸摂取の絶対変化および相対変化によって現れる。現在、西洋型の食事によって、ヒトが歴史的に摂取してきた1:1比とは全く対照的な25:1と高いω-6:ω-3脂肪酸比が供給される(Simopoulos AP (2006). Evolutionary aspects of diet, the omega-6/omega-3 ratio and genetic variation: nutritional implications for chronic diseases. Biomed Pharmacother. 60, 502-507)。これにより、私たちの祖先とは異なり、かつ私たちの遺伝子構成が選択された栄養環境とは異なる栄養環境が作り出される。過去100年間にわたる食習慣の転換が、35歳超の女性の妊娠率の同時に起こる減少傾向に付随しているという状況から、この変化は特に関連性がある(Baird DT, Collins J, Egozcue J, Evers LH, Gianaroli L, Leridon H, Sunde A, Templeton A, Van Steirteghem A, Cohen J, Crosignani PG, Devroey P, Diedrich K, Fauser BC, Fraser L, Glasier A, Liebaers I, Mautone G, Penney G, Tarlatzis B (2005). Fertility and ageing. Hum Reprod Update. 11, 261-276)。
【０００７】
ω-3脂肪酸の摂取はマウス生殖機能を高齢出産年齢まで延ばす可能性があるに対して、ω-6脂肪酸に富む食餌は高齢出産年齢での低い繁殖成功に関連する可能性があることが本明細書において開示される。さらに、マウス生殖機能が正常に年齢に関連して急低下している場合にω-3脂肪酸の短期摂取を開始しても卵母細胞の質の改善に結び付けられる可能性があるのに対して、ω-6脂肪酸の短期摂取は卵母細胞の悪い質の原因となる可能性がある。従って、ω-3脂肪酸は、卵巣老化を遅らせるための、および高齢出産年齢での卵母細胞の質を改善するための有効かつ実用的な手段を提供する可能性がある。
【発明の概要】
【０００８】
概要
本開示は、ヒト女性が妊娠する可能性を向上させるか、改善するか、または増大させるための方法であって、以下の工程を含む、方法に関する:脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントをヒトに投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
【０００９】
本開示はまた、それを必要とするヒトにおいて卵母細胞および/または卵子の質を維持または改善する方法であって、以下の工程を含む、方法に関する:脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントをヒトに投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。卵母細胞および/または卵子の質は、卵母細胞および/または卵子における少なくとも1つの染色体異常の可能性を低下させることによって維持および改善され得る。少なくとも1つの態様において、ヒトは、少なくとも25歳、少なくとも30歳、または少なくとも35歳であり、かつ、妊娠治療を受けていてもよい。
【００１０】
本開示はまた、それを必要とするヒト女性において不妊を治療する方法であって、以下の工程を含む、方法に関する:脂肪酸の薬学的組成物または医療用食品組成物をヒトに投与する工程であって、該組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも80重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも80重量％のエイコサペンタエン酸(EPA)を含む、工程。
【００１１】
本開示はまた、ヒト女性が妊娠する可能性を向上させるか、改善するか、または増大させるための方法であって、以下の工程を含む、方法に関する:脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントをヒトに投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも80重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも80重量％のエイコサペンタエン酸(EPA)を含む、工程。
【００１２】
本開示はまた、それを必要とするヒト女性または雌性動物において妊孕能および/または生殖機能を向上させかつ/または延長する方法であって、以下の工程を含む、方法に関する:脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントをヒトまたは動物に投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
【００１３】
本開示はまた、それを必要とするヒト女性または雌性動物における閉経期の開始を遅延させる方法であって、以下の工程を含む、方法に関する:脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントをヒトまたは動物に投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
【００１４】
本開示はまた、先天異常の可能性を低下させる方法であって、以下の工程を含む、方法に関する:脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントをヒト女性に投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
【００１５】
本開示はまた、胎児死亡率または乳児死亡率の可能性を低下させる方法であって、以下の工程を含む、方法に関する:脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントをヒト女性に投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、サプリメントの総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
【００１６】
本開示はさらに、ヒト女性が妊娠する可能性を向上させるか、改善するか、または増大させるための、栄養サプリメント、食事サプリメント、食物サプリメント、医薬グレードサプリメント、および医療用食品より選択される組成物の使用であって、以下の工程を含む、使用に関する:エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む組成物をヒトに投与する工程。
【００１７】
本開示はまた、それを必要とするヒト女性において卵母細胞および/または卵子の質を維持または改善するための、栄養サプリメント、食事サプリメント、食物サプリメント、医薬グレードサプリメント、および医療用食品より選択される組成物の使用であって、以下の工程を含む、使用に関する:該組成物をヒトに投与する工程であって、組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
【００１８】
妊孕能を延長するかつ向上させる方法が本明細書において説明される。本明細書に記載の方法は、約1:3〜3:1(例えば、約1:1)の血清比のω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸に達するのに十分なω-3脂肪酸を摂取すると、卵母細胞の質が高まり、マウス生殖機能が高齢出産年齢まで延びるという発見に関する。マウス生殖機能が正常に急低下している場合に、この食餌を実施すると卵母細胞の質が改善される。本明細書に記載の方法は、自然生殖および体外受精などの補助生殖の両方で使用することができる。一部の態様において、本明細書に記載の方法は、高齢出産年齢での(例えば、閉経時の)妊孕能を向上させるかまたは延長することに関する。本開示の、一部の態様において、前記方法は、雌性対象における卵母細胞または卵子の質を改善するのに使用することができる。一部の態様において、前記方法は、発育中の卵母細胞または卵子における紡錘体完全性またはミトコンドリア動態の異常を予防または治療するのに使用することができる。一部の態様において、前記方法は、発育中の卵母細胞または卵子における染色体分離の障害、例えば、ダウン症候群および他のトリソミーを予防するのに使用することができる。
【００１９】
本開示のさらなる利点は、一部が以下の説明において示され、一部が説明から明らかであるか、または本開示の実施によって習得され得る。本開示の利点は、特に、添付の特許請求の範囲において示される要素および組み合わせによって理解されかつ得られるだろう。
【００２０】
前述の全般的な説明および以下の詳細な説明は例示かつ説明にすぎず、特許請求の範囲に記載されたような本開示を限定しないことを理解されなければならない。
【００２１】
添付の図面は本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成し、本開示の1つの(いくつかの)態様を例示し、説明とともに本開示の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図1Aおよび2Bは、実施例2に記載のような、正常マウス出産生殖年齢(3〜6ヶ月)での長期食餌研究における生殖アウトカムおよび妊孕能アウトカムのグラフである。
【図２Ａ】実施例2に記載のような、高齢マウス出産生殖年齢(10〜15ヶ月)での長期食餌研究における生殖アウトカムおよび妊孕能アウトカムのグラフである。
【図２Ｂ】実施例2に記載のような、高齢マウス出産生殖年齢(10〜15ヶ月)での長期食餌研究における生殖アウトカムおよび妊孕能アウトカムのグラフである。
【図２Ｃ】実施例2に記載のような、高齢マウス出産生殖年齢(10〜15ヶ月)での長期食餌研究における生殖アウトカムおよび妊孕能アウトカムのグラフである。
【図３Ａ】実施例2に記載のような、急性的食事療法研究における脂肪酸プロファイル、卵胞数、および卵母細胞の質を示す。
【図３Ｂ】実施例2に記載のような、急性的食事療法研究における脂肪酸プロファイル、卵胞数、および卵母細胞の質を示す。
【図３Ｃ】実施例2に記載のような、急性的食事療法研究における脂肪酸プロファイル、卵胞数、および卵母細胞の質を示す。
【図３Ｄ】実施例2に記載のような、急性的食事療法研究における脂肪酸プロファイル、卵胞数、および卵母細胞の質を示す。特に、図3Dは、それぞれの急性的食事治療群の動物から得られた卵母細胞の代表的なミトコンドリア染色の顕微鏡写真画像を示す。
【図３Ｅ】実施例2に記載のような、急性的食事療法研究における脂肪酸プロファイル、卵胞数、および卵母細胞の質を示す。図3Eは、それぞれの急性的食事治療群の動物から得られた卵母細胞の代表的なチューブリン(紡錘体、緑色)染色およびDNA(青色)染色の顕微鏡写真画像を示す。
【図４Ａ】実施例2に記載のような、脂肪酸プロファイルを有するω-3リッチ食餌の安全性の評価および成長を証明したグラフである。特に、図4Aは、複数世代にわたる血清中脂肪酸プロファイルのグラフである(F1 HCO群、F1 SOY群、F2 SOY群、F1 DHA群、F2 DHA群、およびF5 DHA群については、それぞれ、N=4、5、5、5、4、15)。
【図４Ｂ】実施例2に記載のような、脂肪酸プロファイルを有するω-3リッチ食餌の安全性の評価および成長を証明したグラフである。特に、図4Bは、複数世代にわたる血清中脂肪酸プロファイルのグラフである(F1 HCO群、F1 SOY群、F2 SOY群、F1 DHA群、F2 DHA群、およびF5 DHA群については、それぞれ、N=4、5、5、5、4、15)。
【図４Ｃ】実施例2に記載のような、脂肪酸プロファイルを有するω-3リッチ食餌の安全性の評価および成長を証明したグラフである。特に、図4Cは、複数世代にわたる血清中脂肪酸プロファイルのグラフである(F1 HCO群、F1 SOY群、F2 SOY群、F1 DHA群、F2 DHA群、およびF5 DHA群については、それぞれ、N=4、5、5、5、4、15)。
【図４Ｄ】実施例2に記載のような、脂肪酸プロファイルを有するω-3リッチ食餌の安全性の評価および成長を証明したグラフである。特に、図4Dは、複数世代にわたる血清中脂肪酸プロファイルのグラフである(F1 HCO群、F1 SOY群、F2 SOY群、F1 DHA群、F2 DHA群、およびF5 DHA群については、それぞれ、N=4、5、5、5、4、15)。
【図４Ｅ】実施例2に記載のような、脂肪酸プロファイルを有するω-3リッチ食餌の安全性の評価および成長を証明したグラフである。図4Eは成長データのグラフである。
【図４Ｆ】実施例2に記載のような、脂肪酸プロファイルを有するω-3リッチ食餌の安全性の評価および成長を証明したグラフである。図4Fは成長データのグラフである。
【図４Ｇ】実施例2に記載のような、脂肪酸プロファイルを有するω-3リッチ食餌の安全性の評価および成長を証明したグラフである。図4Gは成長データのグラフである。
【図４Ｈ】実施例2に記載のような、脂肪酸プロファイルを有するω-3リッチ食餌の安全性の評価および成長を証明したグラフである。図4Hは成長データのグラフである。
【図５Ａ】実施例2に記載のような急性的食事療法における動物成長および食餌摂取のグラフである。
【図５Ｂ】実施例2に記載のような急性的食事療法における動物成長および食餌摂取のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
説明
本明細書で使用する「妊孕能」とは、首尾良く受精、移植することができ、出産を乗り切る健常な胎児に発育することができる卵子を雌が生じる能力をいう。従って、妊孕能には、両方とも未受精卵細胞とみなすことができる卵母細胞または卵子の質(例えば、染色体異常の欠如)、その後の卵子または卵母細胞から胎児への分裂および発育、ならびに子孫の正常で健常な発育および分娩に寄与する雌性生殖器系の任意の局面の健康状態および機能が含まれる。本明細書に記載の方法によって治療、抑止、または寛解することができる染色体異常の例には、22q11.2欠失症候群、アンジェルマン症候群、カナバン病、セリアック病、シャルコー・マリー・トゥース病疾患、色覚異常、ネコ鳴き、嚢胞性線維症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ヘモクロマトーシス、血友病、クラインフェルター症候群、神経線維腫症、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎疾患、プラダー・ウィリー症候群、鎌状赤血球症、テイ・サックス病、およびターナー症候群が含まれる。少なくとも1つの態様において、染色体異常はダウン症候群である。
【００２４】
対象は、妊娠を望んでおり、かつ、先天異常および/または乳児死亡率もしくは胎児死亡率を心配している対象でもよい。対象は、妊娠を望んでおり、かつ、このような妊娠合併症の家族歴のために先天異常および/または乳児死亡率もしくは胎児死亡率を心配している対象でもよい。対象は、妊娠を望んでおり、かつ、対象の年齢のために、例えば、対象が30歳またはそれ以上、例えば、35歳、または40歳、またはそれより高齢であるために先天異常および/または乳児死亡率もしくは胎児死亡率を経験する可能性が高い対象でもよい。対象は、妊娠を望んでおり、かつ、このような合併症の家族歴のために先天異常および/または乳児死亡率もしくは胎児死亡率を経験する可能性が高い対象でもよい。対象は、妊娠を望んでおり、かつ、このような合併症の個人歴のために先天異常および/または乳児死亡率もしくは胎児死亡率を経験する可能性が高い対象でもよい。
【００２５】
対象は、妊娠を望んでおり、かつ、妊娠するのに苦労してきた対象でもよい。対象は、妊娠を望んでおり、妊娠するのに苦労しており、かつ予め規定されたプロトコール(例えば、体外受精)によって妊娠治療または人工受胎法を受けることが勧められた対象でもよい。
【００２６】
例えば、一部の態様において、本明細書に記載の方法は、対象における妊孕能を延長させるかまたは向上することに関する。一部の態様において、対象は雌性哺乳動物でもよい。一部の態様において、対象はヒト女性でもよい。一部の態様において、対象は、少なくとも18歳、例えば、18歳、20歳、25歳、30歳、35歳、40歳、その間の任意の年齢、またはそれより高齢のヒト女性である。一部の態様において、対象は少なくとも30歳のヒト女性である。一部の態様において、対象は少なくとも少なくとも35歳のヒト女性である。一部の態様において、対象は少なくとも40歳のヒト女性である。
【００２７】
妊孕能の尺度は、例えば、先天異常の割合、染色体異常の割合、ダウン症候群の割合、卵子の質、卵子のミトコンドリア動態、卵子の紡錘体の構造、ならびに/または子宮内および分娩後の子孫の生存率を含んでもよい。
【００２８】
本明細書に記載の方法の、一部の態様において、少なくとも1:8の血清比のω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸に達するのに十分なω-3脂肪酸に富む食餌を摂取すると卵母細胞または卵子の質が高まる。本明細書に記載の方法は、自然生殖および体外受精などの補助生殖の両方で使用することができる。一部の態様において、本明細書に記載の方法は、高齢出産年齢での妊孕能を向上させるかまたは延長することに関する。一部の態様において、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清比は約1:8〜8:1でもよい。一部の態様において、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清比は、少なくとも2:1、例えば、2:1でもよいもしくはそれを上回ってもよいか、1:1でもよいもしくはそれを上回ってもよいか、または2:1でもよいもしくはそれを上回ってもよいか。一部の態様において、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清比は、少なくとも1:1、例えば、1:1でもよいもしくはそれを上回ってもよいか、2:1でもよいもしくはそれを上回ってもよいか、または3:1でもよいもしくはそれを上回ってもよい。一部の態様において、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清比は2:1である。一部の態様において、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清比は1:0.5である。一部の態様において、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清比は1:2である。一部の態様において、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清比は7:1である。一部の態様において、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清比は8:1である。
【００２９】
本明細書に記載の方法は、脂肪酸組成物の投与および/または使用を含む。一部の態様において、本明細書において開示された脂肪酸組成物は、脂肪酸の薬学的組成物または医療用食品組成物を含む。一部の態様において、本明細書において開示された脂肪酸組成物は、脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントを含む。他の態様において、本明細書において開示された脂肪酸組成物は、栄養サプリメント、食事サプリメント、食物サプリメント、医薬グレードサプリメント、および医療用食品を含む。一部の態様において、本明細書において開示された脂肪酸組成物は経口投与されてもよく、静脈内投与されてもよい。他の態様において、本明細書において開示された脂肪酸組成物は、経腸投与されてもよく、非経口投与されてもよい。経腸投与は、例えば、経口投与、胃投与、および直腸投与より選択されてもよい。非経口投与は、例えば、注入、注射、および移植より選択されてもよい。
【００３０】
本明細書で使用する「脂肪酸」という用語には、脂肪酸、例えば、不飽和脂肪酸(例えば、一価不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸)または飽和脂肪酸、ならびにその薬学的に許容されるエステル、遊離酸、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、誘導体、結合体、前駆体、塩、および混合物が含まれる。一部の態様において、ω-3脂肪酸などの脂肪酸は、エチルエステルおよびトリグリセリドより選択される形態である。他の態様において、脂肪酸は遊離酸の形態である。
【００３１】
本明細書で使用する「ω-3脂肪酸」という用語は、天然ω-3脂肪酸および合成ω-3脂肪酸、ならびにその薬学的に許容されるエステル、遊離酸、トリグリセリド、誘導体、結合体(例えば、Zaloga et al.,米国特許出願公開第2004/0254357号およびHorrobin et al., 米国特許第6,245,811号を参照されたい。それぞれが参照により本明細書に組み入れられる)、前駆体、塩、ならびに混合物を含む。ω-3脂肪酸は、ヘキサデカトリエン酸(HTA);α-リノレン酸(ALA);ステアリドン酸(SDA);エイコサトリエン酸(ETE);エイコサテトラエン酸(ETA);エイコサペンタエン酸(EPA);ヘンエイコサペンタエン酸(Heneicosapentaenoic acid)(HPA);ドコサペンタエン酸(DPA);クルパノドン酸;ドコサヘキサエン酸(DHA);テトラコサペンタエン酸;およびテトラコサヘキサエン酸(ニシン酸)を含んでもよいが、これに限定されない。
【００３２】
本開示に従う脂肪酸は動物油および/または非動物油に由来してもよい。本開示の、一部の態様において、脂肪酸は、海洋性油、藻類油、植物ベースの油、および微生物油より選択される少なくとも1種類の油に由来する。海洋性油には、例えば、魚油、例えば、マグロ魚油、オキアミ(krill)油、および魚に由来する脂質組成物が含まれる。植物ベースの油には、例えば、亜麻仁油、キャノーラ油、カラシ油、およびダイズ油が含まれる。微生物油には、例えば、Martekによる製品が含まれる。本開示の少なくとも1つの態様において、脂肪酸は、海洋性油、例えば、魚油に由来する。少なくとも1つの態様において、海洋性油は精製魚油である。
【００３３】
本開示の、一部の態様において、ω-3脂肪酸などの脂肪酸は、アルキルエステル、さらに例えば、エチルエステルなどエステル化される。他の態様において、脂肪酸は、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドより選択される。
【００３４】
一部の態様において、脂肪酸は、脂肪分の多い魚種の体油(body oil)、例えば、カタクチイワシ油またはマグロ油に由来する体油のエステル交換反応を行い、その後に、尿素分別の後に分子蒸留を行うことを含む物理化学的精製プロセスを行うことによって得られる。一部の態様において、エステル交換反応前に環境汚染物質および/またはコレステロールの量を減らすために粗脂肪酸はストリッピングプロセスに供されてもよい。
【００３５】
別の態様において、脂肪酸は、例えば、魚油濃縮物から一次EPAおよびDHAを濃縮(up-concentrate)するために、超臨界CO2抽出またはクロマトグラフィー法を使用することによって得られる。
【００３６】
本開示の脂肪酸は、EPA、DHAなどのω-3脂肪酸、またはその組み合わせを含む。さらに例えば、一部の態様において、脂肪酸は、エチルエステルおよびトリグリセリドより選択される形態のEPAおよびDHAを含む。他の態様において、脂肪酸は遊離酸の形態のEPAおよびDHAを含む。少なくとも1つの態様において、脂肪酸組成物はトリグリセリドの形態のDHAを含む。
【００３７】
本開示の脂肪酸は、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、DHA以外の少なくとも1種類の脂肪酸をさらに含んでもよい。このような脂肪酸の例には、DHA以外のω-3脂肪酸およびω-6脂肪酸が含まれるが、これに限定されない。例えば、本開示の、一部の態様において、脂肪酸組成物は、DHA以外の少なくとも1種類の脂肪酸を含み、該脂肪酸が、EPA、アラキドン酸、α-リノレン酸、ヘンエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、およびオクタデカテトラエン酸より選択される。本開示に含まれる、さらなるω-3脂肪酸およびその混合物の例には、欧州薬局方ω-3トリグリセリド、欧州薬局方ω-3酸エチルエステル60において規定されたω-3脂肪酸、またはω-3酸のモノグラフ(monograph)に富む魚油が含まれる。一部の態様において、EPA以外およびDHA以外の少なくとも1種類の脂肪酸はエチルエステルおよびトリグリセリドより選択される形態である。他の態様において、EPA以外およびDHA以外の少なくとも1種類の脂肪酸は遊離酸の形態である。
【００３８】
本開示に適したω-3脂肪酸の市販例は、Incromega(商標)ω-3海洋性油濃縮物、例えば、Incromega(商標)E1070、Incromega(商標)TG7010 SR、Incromega(商標)E7010 SR、Incromega(商標)TG6015、Incromega(商標)EPA500TG SR、Incromega(商標)E400200 SR、Incromega(商標)E4010、Incromega(商標)DHA700TG SR、Incromega(商標)DHA700E SR、Incromega(商標)DHA500TG SR、Incromega(商標)TG3322 SR、Incromega(商標)E3322 SR、Incromega(商標)TG3322、Incromega(商標)E3322、Incromega(商標)Trio TG/EE(Croda International PLC, Yorkshire, England); EPAX6000FA、EPAX5000TG、EPAX4510TG、EPAX2050TG、EPAX7010EE、EPAX5500EE、EPAX5500TG、EPAX5000EE、EPAX5000TG、EPAX6000EE、EPAX6000TG、EPAX6000FA、EPAX6500EE、EPAX6500TG、EPAX4510TG、EPAX1050TG、EPAX2050TG、EPAX7010TG、EPAX7010EE、EPAX6015TG/EE、EPAX4020TG、およびEPAX4020EE(EPAXはノルウェー企業Austevoll Seafood ASAの全額出資子会社である); MEG-3(登録商標) EPA/DHA魚油濃縮物(Ocean Nutrition Canada); DHA FNO「Functional Nutritional Oil」およびDHA CL「Clear Liquid」(Lonza); Superba(商標)Krill Oil(Aker); Martek製のDHAを含むω-3製品; Neptune オキアミ油(Neptune); Mollers製のタラ肝油製品および抗逆流(anti-reflux)魚油濃縮物(TG); Lysi Omega-3魚油; Seven Seas Triomega(登録商標)Cod Liver Oil Blend (Seven Seas);ならびにFri Flyt Omega-3(Vesteralens)を含むが、これに限定されない様々な脂肪酸混合物(例えば、トリグリセリド(TG)、エチルエステル(EE)、遊離脂肪酸型(FA)の形態であってもよく、かつ/またはリン脂質としてでもよい)を含む。
【００３９】
一部の態様において、脂肪酸組成物は、約10:1のまたはそれを上回るω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比を含む。他の態様において、脂肪酸組成物は、約20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1のまたはそれを上回るω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比を含む。少なくとも1つの態様において、脂肪酸組成物は約750mg〜約900mgの総ω-3脂肪酸を含む。一部の態様において、脂肪酸組成物は、組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも70重量％、少なくとも75重量％、少なくとも80重量％、または少なくとも90重量％のω-3脂肪酸を含む。
【００４０】
一部の態様において、脂肪酸組成物は、DHAを含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のEPAをさらに含む。一部の態様において、脂肪酸組成物は、DHAを含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のアラキドン酸をさらに含む。
【００４１】
少なくとも1つの態様において、脂肪酸組成物は、DHAを含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のEPAをさらに含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のアラキドン酸をさらに含み、DHAはEPAより多い量で存在し、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比は、10:1であるかまたはそれを上回る。このような態様はビタミンDをさらに含んでもよい。
【００４２】
一部の態様において、脂肪酸組成物は、組成物中の総脂肪酸に対して約35重量％〜約90重量％、組成物中の総脂肪酸に対して約40重量％〜約85重量％、組成物中の総脂肪酸に対して約40重量％〜約80重量％、および、組成物中の総脂肪酸に対して約50重量％〜約80重量％より選択される量で存在するDHAおよびEPAを含む。少なくとも1つの態様において、脂肪酸組成物は、エチルエステルの形態のEPAおよびDHAを含み、組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも約84重量％を含む。
【００４３】
本開示の脂肪酸組成物の、一部の態様において、EPA:DHAの重量比は、約1:10〜約10:1、約1:8〜約8:1、約1:6〜約6:1、約1:5〜約5:1、約1:4〜約4:1、約1:3〜約3:1、または約1:2〜約2:1である。少なくとも1つの態様において、EPA:DHA重量比は1:2〜2:1である。他の態様において、DHA:EPAの重量比は、約500:1〜1:500、例えば、500:1、100:1、50:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、または2:1から約1:1までである。
【００４４】
本明細書において開示された脂肪酸組成物の、少なくとも1つの態様において、脂肪酸組成物中の総脂肪酸に対して、DHAの重量による濃度はEPAの重量による濃度より大きい。このような態様では、DHAはEPAより多い量で存在する。
【００４５】
脂肪酸組成物の、一部の態様において、DHAは約500mg〜約750mgの量で存在し、かつ、EPAは約80mg〜約250mgの量で存在する。このような態様において、DHAおよびEPAは、70:10、500:200、および600〜750:150〜250より選択されるDHA:EPA重量比で存在してもよい。少なくとも1つの態様において、脂肪酸組成物は、約650mg〜約750mgのDHAおよび約80mg〜約130mgのEPAを含む。脂肪酸組成物は、少なくとも1つの態様において約750mg〜約900mgの総ω-3脂肪酸を含む。
【００４６】
別の態様において、脂肪酸組成物は、遊離脂肪酸、トリグリセリド、またはエチルエステルの形態の、組成物中の総脂肪酸に対して純粋なDHA、例えば、90％超のDHA、例えば、95％超のDHAを含む。
【００４７】
さらに別の態様において、脂肪酸組成物は、遊離脂肪酸、トリグリセリド、またはエチルエステルの形態の、組成物中の総脂肪酸に対して純粋なEPA、例えば、90％超のEPA、例えば、95％超のEPAを含む。
【００４８】
さらに別の態様において、DHAは、本明細書において開示された脂肪酸組成物中の最も優勢な脂肪酸である。
【００４９】
少なくとも1つの態様において、脂肪酸組成物は、1.2:1(約430〜約495mg/gのEPAエチルエステルおよび約347〜約403mg/gのDHAエチルエステル)のEPA:DHAの重量比、ならびに少なくとも約800mg/g ω-3脂肪酸の総量のω-3脂肪酸エチルエステルを含む。
【００５０】
本明細書において開示された脂肪酸組成物は少なくとも1種類の抗酸化物質をさらに含んでもよい。本開示に適した抗酸化物質の例には、α-トコフェロール(ビタミンE)、EDTAカルシウム二ナトリウム、α酢酸トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、およびブチルヒドロキシアニソール(BHA)が含まれるが、これに限定されない。抗酸化物質の他の例には、アスコルビン酸およびその薬学的に許容される塩、例えば、アスコルビン酸ナトリウム、脂肪酸エステル結合体を含む薬学的に許容されるアスコルビン酸エステル、没食子酸プロピル、クエン酸およびその薬学的に許容される塩、リンゴ酸およびその薬学的に許容される塩、ならびに、亜硫酸ナトリウムなどのそれらの亜硫酸塩、およびそれらの混合物が含まれる。
【００５１】
一部の態様において、本明細書において開示された脂肪酸組成物はビタミンDをさらに含む。ビタミンDすなわちカルシフェロールは、ビタミンD2、エルゴカルシフェロール、およびビタミンD3、コレカルシフェロールを含むステロイド様物質の集まりの一般名である。後者は低用量補給に用いられる天然型である。
【００５２】
本明細書において用いられる「ビタミンD」という用語はビタミンD3を意味する。ビタミンD3はセコステロイドである。IUPAC名は、(3β,5Z,7E)-9,10-セココレスタ-5,7,10(19)-トリエン-3-オールである。別の名称は活性化型7-デヒドロコレステロールである。ビタミンD3の化学構造は以下の通りである。
0006424091.tif 000002
【００５３】
ビタミンD3は肝臓によって25(OH)D3(25ヒドロキシコレカルシフェロール、カルシフェジオール、またはカルシジオールとも知られる)に代謝され、次いで、腎臓によって1,25(OH)2D3(1,25ジヒドロキシコレカルシフェロール、カルシトリオール、または活性型ビタミンDホルモンとも知られる)に変換される。主要な循環型である25(OH)D3はいくらかの代謝活性を有するが、1,25(OH)2D3は最も代謝活性が高い。
【００５４】
25(OH)D3の化学構造は以下の通りである。
0006424091.tif 000003
【００５５】
1,25(OH)2D3の化学構造は以下の通りである。
0006424091.tif 000004
【００５６】
ビタミンD3の一日量は400〜4000国際単位(IU)であり、ω-3脂肪酸組成物の2〜4個のカプセルまたは錠剤または他の任意の製剤に分割されてもよい。例えば、少なくとも1つの態様において、ビタミンD3の一日量は約1000〜約4000IUまたは約2000〜約4000IUである。
【００５７】
本明細書において開示された組成物は、ビタミンD以外の少なくとも1種類の他のビタミンをさらに含んでもよい。本開示に適した他のビタミンの例には、亜鉛およびマグネシウムが含まれるが、これに限定されない。
【００５８】
一部の態様において、脂肪酸組成物は、ω-3-酸エチルエステル、例えば、LOVAZA(商標)(GlaxoSmithKline; Brentford, United Kingdom)を含む。
【００５９】
本明細書に記載の方法に従って精製魚油または高度精製魚油製品を対象に投与することができる。高度精製魚油製品の非限定的な例は、OMEGAVEN(商標)(Fresenius Kabi; Bad Homburg, Germany)であり、経口投与されず、静脈内投与される。一部の態様において、本明細書に記載の方法に従って対象を治療するために、精製魚油または高度精製魚油製品を、約3ヶ月またはそれ未満、例えば、3ヶ月またはそれ未満、2ヶ月またはそれ未満、1ヶ月またはそれ未満、3週間またはそれ未満、2週間またはそれ未満、または1週間またはそれ未満の期間で静脈内投与することができる。一部の態様において、本明細書に記載の方法に従って対象を治療するために、精製魚油または高度精製魚油製品を短期間、例えば、1週間未満、静脈内投与することができる。
【００６０】
一部の態様において、脂肪酸組成物は、カロリーで約2〜60％のC20またはそれより大きなω-3脂肪酸;およびカロリーで約0.05％〜1％のアラキドン酸を含む、経口投与に適した食用油の形態の食事製剤を含む。ここで、前記製剤はリノール酸およびα-リノレン酸から総カロリーの1％未満を提供し、前記脂肪酸は前記食事製剤の総カロリーの5〜60％を提供する。一部の態様において、食事製剤は、カロリーで0.15％〜0.30％のアラキドン酸、またはカロリーで0.15％〜0.6％のアラキドン酸を含む。一部の態様において、C20またはそれより大きなω-3脂肪酸は、エイコサペンタエン酸(EPA)、もしくはドコサヘキサエン酸(DHA)、もしくはエイコサテトラエン酸、もしくは5-ドコサペンタエン酸、またはその組み合わせからなり、アラキドン酸以外のカロリーで約0％のω-6脂肪酸、カロリーで約0％のリノール酸、およびカロリーで約0％のα-リノレン酸を含む。例えば、C20またはそれより大きなω-3脂肪酸とアラキドン酸との比は約10:1〜約40:1である。例えば、比は約10:1、約20:1、約30:1、または約40:1である。一部の態様において、アラキドン酸は、インビボでアラキドン酸に変換されるジホモ-γ-リノレン酸またはγ-リノレン酸として提供される。ここで、ジホモ-γ-リノレン酸またはγ-リノレン酸はカロリーで0.45％〜6.0％の量で提供される。一部の態様において、C20またはそれより大きなω-3脂肪酸は、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)、オクタデカテトラエン酸、エイコサテトラエン酸、α-リノレン酸(ALA)、およびその混合物からなる群より選択される。本明細書に記載の方法において使用することができる、このような組成物および関連組成物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2010/0256235号に記載されている。
【００６１】
一部の態様において、対象には、対象の総脂肪酸摂取量が約10:1〜40:1の総ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の比を含むようなω-3脂肪酸含有組成物の用量が与えられる。一部の態様において、対象には、対象の総脂肪酸摂取量が20:1であるかまたはそれを上回り、例えば、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1であるかまたはそれを上回る総ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の比を含むようなω-3脂肪酸含有組成物の用量が与えられる。
【００６２】
一部の態様において、対象は、本明細書に記載の方法に従って、少なくとも1日、少なくとも1週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、またはそれより長く治療される。一部の態様において、対象の妊孕能を向上させるための、または対象を妊娠させるためのプロトコール、処置、または治療で治療される前に少なくとも1日、少なくとも1週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、またはそれより長く、対象にω-3脂肪酸含有組成物が投与される。一部の態様において、プロトコール、治療、または処置の前に少なくとも1週間、対象にω-3脂肪酸含有組成物が投与される。一部の態様において、プロトコール、治療、または処置の前に少なくとも1ヶ月間、対象にω-3脂肪酸含有組成物が投与される。一部の態様において、プロトコール、治療、または処置の前に少なくとも2ヶ月間、対象にω-3脂肪酸含有組成物が投与される。一部の態様において、プロトコール、治療、または処置の前に少なくとも3ヶ月間、対象にω-3脂肪酸含有組成物が投与される。
【００６３】
一部の態様において、脂肪酸組成物が、脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントである場合、サプリメント中の総脂肪酸の一日量は、例えば、約1〜約8グラム、例えば、約2〜約4グラムでもよい。他の態様において、サプリメント中の総脂肪酸の一日量は、例えば、約2〜約8グラムでもよい。
【００６４】
さらに他の態様では、脂肪酸組成物が、脂肪酸の薬学的組成物または医療用食品組成物である場合、脂肪酸の薬学的組成物中または医療用食品組成物中の総脂肪酸の一日量は約2g〜約8gでもよい。
【００６５】
本明細書に記載の方法の、一部の態様において、体外受精(IVF)プロトコールが強化される。一部の態様において、IVFプロトコールは、(1)複数の卵胞を刺激して複数の未受精卵細胞を発育させる工程、(2)雌から未受精卵細胞を取り出す工程、(3)卵細胞を体外受精する工程、および(4)受精した胚を子宮に移す工程を含む。当業者であれば、高品質の卵母細胞または卵子が、使用されている方法またはプロトコールの高い成功率をもたらすので、卵母細胞または卵子の質(他の場合では卵細胞の質として知られる)の改善は任意の受精方法または受精プロトコールに容易に組み込むことができることが理解されるだろう。本明細書に記載の方法の、一部の態様において、卵母細胞、卵子、または受精卵は凍結保存される。
【００６６】
さらに、本明細書に記載の方法は閉経期の開始または進行を遅らせることができる。すなわち、妊孕能を維持することができ、かつ/または妊孕能の自然減少を弱めることができる。本明細書に記載の方法のいずれの態様も閉経期の開始および進行を遅らせる方法に関し得る。対象がすぐではないが(例えば、IVFによって)子供をつくりたいと望んだ時に、本明細書に記載の方法に従って対象を治療できることが意図される。すなわち、対象が生殖的に成熟しているが(例えば、月経開始後)、対象が閉経になるまで、ならびに/または妊孕能の維持、向上、および/もしくは改善をもはや望まなくなるまで、本明細書に記載の任意の方法に従って対象を治療することができるか、または対象に投与することができる。一部の態様において、対象が、妊孕能が低下する年齢、および/または閉経期が妥当に始まる可能性のある年齢、例えば、少なくとも25歳、少なくとも30歳、少なくとも35歳、またはそれより高齢に達した際に、本明細書に記載の任意の方法に従って対象を治療することができる。一部の態様において、本明細書に記載の任意の方法による治療が開始した際に、対象は少なくとも25歳でもよい。一部の態様において、本明細書に記載の任意の方法による治療が開始した際に、対象は少なくとも30歳でもよい。一部の態様において、本明細書に記載の任意の方法による治療が開始した際に、対象は少なくとも35歳でもよい。一部の態様において、本明細書に記載のように対象に経口組成物を投与することができる。
【００６７】
本開示の他の態様は、本明細書の検討および本明細書における開示の実施から当業者に明らかであろう。本明細書および実施例は例示にすぎないとみなされ、本開示の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【００６８】
本明細書に記載される技術に関する一部の態様は、番号が付けられた以下の項目のいずれかによって定義されうる。
1. ヒト女性が妊娠する可能性を向上させるか、改善するか、または増大させるための方法であって、以下の工程を含む、方法:
脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントを該ヒトに投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
2. 前記サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のエイコサペンタエン酸(EPA)をさらに含む、項目1に記載の方法。
3. 前記サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のアラキドン酸をさらに含む、項目1または2に記載の方法。
4. 前記DHAが、トリグリセリドの形態である、項目1に記載の方法。
5. 前記サプリメントがビタミンDをさらに含む、項目1に記載の方法。
6. 前記ビタミンDが、約400〜約4000国際単位(IU)、約1000〜約4000IU、または約2000〜約4000IUの量で存在する、項目5に記載の方法。
7. 前記サプリメントが、ビタミンD以外の少なくとも1種類のビタミンをさらに含む、項目5に記載の方法。
8. DHA:EPAの重量比が、約500:1、100:1、50:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1から1:1までである、項目2に記載の方法。
9. ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、約10:1であるかまたはそれを上回る、項目3に記載の方法。
10. 前記ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、約20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1であるかまたはそれを上回る、項目9に記載の方法。
11. DHAが、EPAより多い量で存在する、項目2に記載の方法。
12. DHAが、約500mg〜約750mgの量で存在し、かつ、EPAが、約80mg〜約250mgの量で存在する、項目11に記載の方法。
13. DHA:EPAが、約70:10、500:200、および600〜750:150〜250より選択される重量比で存在する、項目12に記載の方法。
14. 前記サプリメントが、約650mg〜約750mgのDHAおよび約80mg〜約130mgのEPAを含む、項目2に記載の方法。
15. 前記サプリメントが、約750mg〜約900mgの総ω-3脂肪酸を含む、項目1に記載の方法。
16. 前記サプリメントが、少なくとも1種類の抗酸化物質をさらに含む、項目1に記載の方法。
17. 前記少なくとも1種類の抗酸化物質が、α-トコフェロール(ビタミンE)、EDTAカルシウム二ナトリウム、α酢酸トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、アスコルビン酸ならびにその薬学的に許容される塩およびエステル、没食子酸プロピル、クエン酸およびその薬学的に許容される塩、リンゴ酸およびその薬学的に許容される塩、ならびに、それらの亜硫酸塩および混合物より選択される、項目16に記載の方法。
18. 前記少なくとも1種類の抗酸化物質がBHAを含む、項目17に記載の方法。
19. 前記脂肪酸が、海洋性油、藻類油、植物ベースの油、および微生物油より選択される少なくとも1種類の油に由来する、項目1、2、または3に記載の方法。
20. 前記油がマグロ魚油である、項目19に記載の方法。
21. 総ω-3脂肪酸が、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも70重量％、少なくとも75重量％、少なくとも80重量％、または少なくとも90重量％である、項目1に記載の方法。
22. DHAおよびEPAが、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して約35重量％〜約90重量％、該サプリメント中の総脂肪酸に対して約40重量％〜約85重量％、該サプリメント中の総脂肪酸に対して約40重量％〜約80重量％、および、該サプリメント中の総脂肪酸に対して約50重量％〜約80重量％より選択される量で存在する、項目2に記載の方法。
23. 前記サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、DHA以外の少なくとも1種類の他の脂肪酸を含む、項目1に記載の方法。
24. 前記サプリメントが、DHA以外の少なくとも1種類のω-3脂肪酸を含み、該ω-3脂肪酸が、欧州薬局方ω-3トリグリセリドおよび欧州薬局方ω-3酸エチルエステル60において規定されたω-3脂肪酸より選択される、項目1に記載の方法。
25. 前記サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のエイコサペンタエン酸(EPA)をさらに含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のアラキドン酸をさらに含み、DHAが、EPAより多い量で存在し、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、10:1であるかまたはそれを上回る、項目2に記載の方法。
26. 前記サプリメントがビタミンDをさらに含む、項目25に記載の方法。
27. 前記サプリメント中の総脂肪酸の一日量が1〜8グラムである、項目1に記載の方法。
28. 前記サプリメント中の総脂肪酸の一日量が2〜4グラムである、項目27に記載の方法。
29. DHAが、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも90重量％の量で存在する、項目1に記載の方法。
30. 前記DHAが、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも95重量％の量で存在する、項目29に記載の方法。
31. それを必要とするヒトにおいて卵母細胞および/または卵子の質を維持または改善する方法であって、以下の工程を含む、方法:
脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントを該ヒトに投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
32. 前記サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のエイコサペンタエン酸(EPA)をさらに含む、項目31に記載の方法。
33. 前記サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のアラキドン酸をさらに含む、項目31または32に記載の方法。
34. 前記DHAが、トリグリセリドの形態である、項目31に記載の方法。
35. 前記サプリメントがビタミンDをさらに含む、項目31に記載の方法。
36. 前記ビタミンDが、約400〜約4000国際単位(IU)、約1000〜約4000IU、または約2000〜約4000IUの量で存在する、項目35に記載の方法。
37. 前記サプリメントが、前記ビタミンD以外の少なくとも1種類のビタミンをさらに含む、項目35に記載の方法。
38. DHA:EPAの重量比が、約500:1、100:1、50:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1から1:1までである、項目32に記載の方法。
39. ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、約10:1であるかまたはそれを上回る、項目33に記載の方法。
40. 前記ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、約20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1であるかまたはそれを上回る、項目39に記載の方法。
41. DHAが、EPAより多い量で存在する、項目32に記載の方法。
42. DHAが、約500mg〜約750mgの量で存在し、かつ、EPAが、約80mg〜約250mgの量で存在する、項目41に記載の方法。
43. DHA:EPAが、約70:10、約500:200、および約600〜750:150〜250より選択される重量比で存在する、項目41に記載の方法。
44. 前記サプリメントが、約80mg/g〜約130mg/gのEPAエチルエステル、EPA遊離脂肪酸、またはEPAトリグリセリド、および、約650mg/g〜約750mg/gのDHAエチルエステル、DHA遊離脂肪酸、またはDHAトリグリセリドを含む、項目41に記載の方法。
45. 前記サプリメントが、約750mg/g〜約900mg/gの総ω-3脂肪酸を含む、項目31に記載の方法。
46. 前記サプリメントが、少なくとも1種類の抗酸化物質をさらに含む、項目31に記載の方法。
47. 前記少なくとも1種類の抗酸化物質が、α-トコフェロール(ビタミンE)、EDTAカルシウム二ナトリウム、α酢酸トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、アスコルビン酸ならびにその薬学的に許容される塩およびエステル、没食子酸プロピル、クエン酸およびその薬学的に許容される塩、リンゴ酸およびその薬学的に許容される塩、ならびに、それらの亜硫酸塩および混合物より選択される、項目46に記載の方法。
48. 前記少なくとも1種類の抗酸化物質がBHAを含む、項目47に記載の方法。
49. 前記脂肪酸が、海洋性油、藻類油、植物ベースの油、および微生物油より選択される少なくとも1種類の油に由来する、項目31、32、または33に記載の方法。
50. 前記油がマグロ魚油である、項目49に記載の方法。
51. 総ω-3脂肪酸が、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも70重量％、少なくとも75重量％、少なくとも80重量％、または少なくとも90重量％である、項目31に記載の方法。
52. 前記DHAおよび前記EPAが、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して約35重量％〜約90重量％、該サプリメント中の総脂肪酸に対して約40重量％〜約85重量％、該サプリメント中の総脂肪酸に対して約40重量％〜約80重量％、および、該サプリメント中の総脂肪酸に対して約50重量％〜約80重量％より選択される量で存在する、項目32に記載の方法。
53. 前記サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、DHA以外の少なくとも1種類の他の脂肪酸を含む、項目31に記載の方法。
54. 前記サプリメントが、欧州薬局方ω-3トリグリセリドおよび欧州薬局方ω-3酸エチルエステル60において規定されたω-3脂肪酸より選択される少なくとも1種類のω-3脂肪酸を含む、項目31に記載の方法。
55. 前記サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のエイコサペンタエン酸(EPA)をさらに含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のアラキドン酸をさらに含み、DHAが、EPAより多い量で存在し、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、10:1であるかまたはそれを上回る、項目31に記載の方法。
56. 前記サプリメントがビタミンDをさらに含む、項目55に記載の方法。
57. 前記サプリメント中の総脂肪酸の一日量が1〜8グラムである、項目31に記載の方法。
58. 前記サプリメント中の総脂肪酸の一日量が2〜4グラムである、項目57に記載の方法。
59. DHAが、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも90重量％の量で存在する、項目31に記載の方法。
60. 前記DHAが、前記サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも95重量％の量で存在する、項目59に記載の方法。
61. 前記卵母細胞および/または前記卵子における紡錘体完全性およびミトコンドリア動態の少なくとも1つにおける異常の可能性を低下させることによって、該卵母細胞および/または該卵子の質が維持または改善される、項目31に記載の方法。
62. 前記卵母細胞および/または前記卵子における少なくとも1つの染色体異常の可能性を低下させることによって、該卵母細胞および/または該卵子の質が維持または改善される、項目31に記載の方法。
63. 前記少なくとも1つの染色体異常が、22q11.2欠失症候群、アンジェルマン症候群、カナバン病、セリアック病、シャルコー・マリー・トゥース病、色覚異常、ネコ鳴き、嚢胞性線維症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ヘモクロマトーシス、血友病、クラインフェルター症候群、神経線維腫症、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎疾患、プラダー・ウィリー症候群、鎌状赤血球症、テイ・サックス病、およびターナー症候群より選択される、項目62に記載の方法。
64. 前記少なくとも1つの染色体異常がダウン症候群である、項目63に記載の方法。
65. 前記サプリメントが経腸投与または非経口投与される、項目31に記載の方法。
66. 前記サプリメントが経腸投与され、かつ、該経腸投与が、経口投与、胃投与、および直腸投与より選択される、項目65に記載の方法。
67. 前記サプリメントが非経口投与され、かつ、該非経口投与が、注入、注射、および移植より選択される、項目65に記載の方法。
68. 前記ヒトが少なくとも25歳、少なくとも30歳、または少なくとも35歳である、項目31に記載の方法。
69. 前記ヒトが不妊治療を受けている、項目31に記載の方法。
70. それを必要とするヒト女性において不妊を治療する方法であって、以下の工程を含む、方法:
脂肪酸の薬学的組成物または医療用食品組成物を該ヒトに投与する工程であって、該組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも80重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも80重量％のエイコサペンタエン酸(EPA)を含む、工程。
71. 前記薬学的組成物中または前記医療用食品組成物中の総脂肪酸の一日量が約2g〜約8gである、項目70に記載の方法。
72. ヒト女性が妊娠する可能性を向上させるか、改善するか、または増大させる方法であって、以下の工程を含む、方法:
脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントを該ヒトに投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも80重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも80重量％のエイコサペンタエン酸(EPA)を含む、工程。
73. 前記総脂肪酸の一日量が約2g〜約8gである、項目72に記載の方法。
74. EPA:DHA比が1:2〜2:1である、項目70または72に記載の方法。
75. 前記EPAおよび前記DHAが、エチルエステルの形態であり、かつ、前記組成物中または前記サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも約84重量％を構成する、項目70または72に記載の方法。
76. 前記組成物または前記サプリメントが、約430〜495mg/gのEPAエチルエステル、約347〜403mg/gのDHAエチルエステル、および、少なくとも約800mg/gのω-3脂肪酸を含む、項目70または72に記載の方法。
77. それを必要とするヒト女性または雌性動物において妊孕能および/または生殖機能を向上させかつ/または延長する方法であって、以下の工程を含む、方法:
脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントを該ヒトまたは該動物に投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
78. それを必要とするヒト女性または雌性動物における閉経期の開始を遅延させる方法であって、以下の工程を含む、方法:
脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントを該ヒトまたは該動物に投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
79. 先天異常の可能性を低下させる方法であって、以下の工程を含む、方法:
脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントをヒト女性に投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
80. 胎児死亡率または乳児死亡率の可能性を低下させる方法であって、以下の工程を含む、方法:
脂肪酸の栄養サプリメント、食事サプリメント、または食物サプリメントをヒト女性に投与する工程であって、該サプリメントが、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該サプリメント中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
81. ヒト女性が妊娠する可能性を向上させるか、改善するか、または増大させるための、栄養サプリメント、食事サプリメント、食物サプリメント、医薬グレードサプリメント、および医療用食品より選択される組成物の使用であって、以下の工程を含む、使用:
該組成物を該ヒトに投与する工程であって、該組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
82. 前記組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のエイコサペンタエン酸(EPA)をさらに含む、項目81に記載の使用。
83. 前記組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のアラキドン酸をさらに含む、項目81または82に記載の使用。
84. 前記DHAが、トリグリセリドの形態である、項目81に記載の使用。
85. 前記組成物がビタミンDをさらに含む、項目81に記載の使用。
86. 前記ビタミンDが、約400〜約4000国際単位(IU)、約1000〜約4000IU、または約2000〜約4000IUの量で存在する、項目85に記載の使用。
87. 前記組成物が、ビタミンD以外の少なくとも1種類のビタミンをさらに含む、項目85に記載の使用。
88. DHA:EPAの重量比が、約500:1、100:1、50:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1から1:1までである、項目82に記載の使用。
89. ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、約10:1であるかまたはそれを上回る、項目83に記載の使用。
90. 前記ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、約20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1であるかまたはそれを上回る、項目89に記載の使用。
91. DHAが、EPAより多い量で存在する、項目82に記載の使用。
92. DHAが、約500mg〜約750mgの量で存在し、かつ、EPAが、約80mg〜約250mgの量で存在する、項目91に記載の使用。
93. DHA:EPAが、約70:10、500:200、および600〜750:150〜250より選択される重量比で存在する、項目92に記載の使用。
94. 前記組成物が、約650mg〜約750mgのDHAおよび約80mg〜約130mgのEPAを含む、項目82に記載の使用。
95. 前記組成物が、約750mg〜約900mgの総ω-3脂肪酸を含む、項目81に記載の使用。
96. 前記組成物が、少なくとも1種類の抗酸化物質をさらに含む、項目81に記載の使用。
97. 前記少なくとも1種類の抗酸化物質が、α-トコフェロール(ビタミンE)、EDTAカルシウム二ナトリウム、α酢酸トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、アスコルビン酸ならびにその薬学的に許容される塩およびエステル、没食子酸プロピル、クエン酸およびその薬学的に許容される塩、リンゴ酸およびその薬学的に許容される塩、ならびに、それらの亜硫酸塩および混合物より選択される、項目96に記載の使用。
98. 前記少なくとも1種類の抗酸化物質がBHAを含む、項目97に記載の使用。
99. 前記脂肪酸が、海洋性油、藻類油、植物ベースの油、および微生物油より選択される少なくとも1種類の油に由来する、項目81、82、または83に記載の使用。
100. 前記油がマグロ魚油である、項目99に記載の使用。
101. 総ω-3脂肪酸が、前記組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも70重量％、少なくとも75重量％、少なくとも80重量％、または少なくとも90重量％である、項目81に記載の使用。
102. DHAおよびEPAが、前記組成物中の総脂肪酸に対して約35重量％〜約90重量％、該組成物中の総脂肪酸に対して約40重量％〜約85重量％、該組成物中の総脂肪酸に対して約40重量％〜約80重量％、および、該組成物中の総脂肪酸に対して約50重量％〜約80重量％より選択される量で存在する、項目82に記載の使用。
103. 前記組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、DHA以外の少なくとも1種類の他の脂肪酸を含む、項目81に記載の使用。
104. 前記組成物が、DHA以外の少なくとも1種類のω-3脂肪酸を含み、該ω-3脂肪酸が、欧州薬局方ω-3トリグリセリドおよび欧州薬局方ω-3酸エチルエステル60において規定されたω-3脂肪酸より選択される、項目81に記載の使用。
105. 前記組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のエイコサペンタエン酸(EPA)をさらに含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のアラキドン酸をさらに含み、DHAが、EPAより多い量で存在し、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、10:1であるかまたはそれを上回る、項目81に記載の使用。
106. 前記組成物がビタミンDをさらに含む、項目105に記載の使用。
107. 前記組成物中の総脂肪酸の一日量が1〜8グラムである、項目81に記載の使用。
108. 前記組成物中の総脂肪酸の一日量が2〜4グラムである、項目107に記載の使用。
109. DHAが、前記組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも90重量％の量で存在する、項目81に記載の使用。
110. 前記DHAが、前記組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも95重量％の量で存在する、項目109に記載の使用。
111. それを必要とするヒト女性において卵母細胞および/または卵子の質を維持または改善するための、栄養サプリメント、食事サプリメント、食物サプリメント、医薬グレードサプリメント、および医療用食品より選択される組成物の使用であって、以下の工程を含む、使用:
該組成物を該ヒトに投与する工程であって、該組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
112. 前記組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のエイコサペンタエン酸(EPA)をさらに含む、項目111に記載の使用。
113. 前記組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のアラキドン酸をさらに含む、項目111または112に記載の使用。
114. 前記DHAが、トリグリセリドの形態である、項目111に記載の使用。
115. 前記組成物がビタミンDをさらに含む、項目111に記載の使用。
116. 前記ビタミンDが、約400〜約4000国際単位(IU)、約1000〜約4000IU、または約2000〜約4000IUの量で存在する、項目115に記載の使用。
117. 前記組成物が、ビタミンD以外の少なくとも1種類のビタミンをさらに含む、項目115に記載の使用。
118. DHA:EPAの重量比が、約500:1、100:1、50:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1から1:1までである、項目112に記載の使用。
119. ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、約10:1であるかまたはそれを上回る、項目113に記載の使用。
120. 前記ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、約20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1であるかまたはそれを上回る、項目119に記載の使用。
121. DHAが、EPAより多い量で存在する、項目112に記載の使用。
122. DHAが、約500mg〜約750mgの量で存在し、かつ、EPAが、約80mg〜約250mgの量で存在する、項目121に記載の使用。
123. DHA:EPAが、約70:10、500:200、および600〜750:150〜250より選択される重量比で存在する、項目122に記載の使用。
124. 前記組成物が、約650mg〜約750mgのDHAおよび約80mg〜約130mgのEPAを含む、項目112に記載の使用。
125. 前記組成物が、約750mg〜約900mgの総ω-3脂肪酸を含む、項目111に記載の使用。
126. 前記組成物が、少なくとも1種類の抗酸化物質をさらに含む、項目111に記載の使用。
127. 前記少なくとも1種類の抗酸化物質が、α-トコフェロール(ビタミンE)、EDTAカルシウム二ナトリウム、α酢酸トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、アスコルビン酸ならびにその薬学的に許容される塩およびエステル、没食子酸プロピル、クエン酸およびその薬学的に許容される塩、リンゴ酸およびその薬学的に許容される塩、ならびに、それらの亜硫酸塩および混合物より選択される、項目126に記載の使用。
128. 前記少なくとも1種類の抗酸化物質がBHAを含む、項目127に記載の使用。
129. 前記脂肪酸が、海洋性油、藻類油、植物ベースの油、および微生物油より選択される少なくとも1種類の油に由来する、項目111、112、または113に記載の使用。
130. 前記油がマグロ魚油である、項目129に記載の使用。
131. 総ω-3脂肪酸が、前記組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも70重量％、少なくとも75重量％、少なくとも80重量％、または少なくとも90重量％である、項目111に記載の使用。
132. DHAおよびEPAが、前記組成物中の総脂肪酸に対して約35重量％〜約90重量％、該組成物中の総脂肪酸に対して約40重量％〜約85重量％、該組成物中の総脂肪酸に対して約40重量％〜約80重量％、および、該組成物中の総脂肪酸に対して約50重量％〜約80重量％より選択される量で存在する、項目112に記載の使用。
133. 前記組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、DHA以外の少なくとも1種類の他の脂肪酸を含む、項目111に記載の使用。
134. 前記組成物が、DHA以外の少なくとも1種類のω-3脂肪酸を含み、該ω-3脂肪酸が、欧州薬局方ω-3トリグリセリドおよび欧州薬局方ω-3酸エチルエステル60において規定されたω-3脂肪酸より選択される、項目111に記載の使用。
135. 前記組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のエイコサペンタエン酸(EPA)をさらに含み、かつ、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態のアラキドン酸をさらに含み、DHAが、EPAより多い量で存在し、ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の重量比が、10:1であるかまたはそれを上回る、項目111に記載の使用。
136. 前記組成物がビタミンDをさらに含む、項目135に記載の使用。
137. 前記組成物中の総脂肪酸の一日量が1〜8グラムである、項目111に記載の使用。
138. 前記組成物中の総脂肪酸の一日量が2〜4グラムである、項目137に記載の使用。
139. DHAが、前記組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも90重量％の量で存在する、項目111に記載の使用。
140. 前記DHAが、前記組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも95重量％の量で存在する、項目139に記載の使用。
141. 対象における妊孕能を向上させるかまたは延長する方法であって、以下の工程を含む、方法:
1:1またはそれ未満のω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清中濃度比を有している該対象にω-3脂肪酸含有組成物を投与する工程。
142. 前記組成物を投与する工程の後に、前記ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清中濃度比を決定する工程;および
1:1またはそれ未満のω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清中濃度比を前記対象が有していると判定された場合に、前記ω-3脂肪酸含有組成物の追加用量を投与する工程
をさらに含む、項目141に記載の方法。
143. 前記ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清中濃度比を決定する工程;および
1:1を上回るω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清中濃度比を前記対象が有していると判定されるまで、前記ω-3脂肪酸含有組成物の用量を投与する工程
をさらに含む、項目141に記載の方法。
144. 対象における妊孕能を向上させるかまたは延長する方法であって、以下の工程を含む、方法:
ω-3脂肪酸含有組成物を対象に投与する工程であって、該対象の総脂肪酸摂取量が、20:1のまたはそれを上回る総ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の比を含む、工程。
145. 前記対象の妊孕能を向上させるかまたは該対象を妊娠させるための治療または処置を開始または継続する工程をさらに含む、項目141〜144のいずれかに記載の方法。
146. 前記対象がヒト女性である、項目141〜145のいずれかに記載の方法。
147. 前記対象が少なくとも30歳である、項目146に記載の方法。
148. 前記対象が少なくとも35歳である、項目147に記載の方法。
149. 前記対象のω-6脂肪酸食事摂取量を減らすさらなる工程を含む、項目141〜148のいずれかに記載の方法。
150. 前記対象のω-6脂肪酸食事摂取量を減らすように該対象を指導するさらなる工程を含む、項目141〜149のいずれかに記載の方法。
151. 前記ω-3脂肪酸含有組成物が、
ヘキサデカトリエン酸(HTA);α-リノレン酸(ALA);ステアリドン酸(SDA);エイコサトリエン酸(ETE);エイコサテトラエン酸(ETA);エイコサペンタエン酸(EPA);ヘンエイコサペンタエン酸 (Heneicosapentaenoic acid)(HPA);ドコサペンタエン酸(DPA);クルパノドン酸;ドコサヘキサエン酸(DHA);テトラコサペンタエン酸;およびテトラコサヘキサエン酸(ニシン酸)
からなる群より選択されるω-3脂肪酸を含む、項目141〜150のいずれかに記載の方法。
152. 前記ω-3脂肪酸含有組成物が食事サプリメントではない、項目141〜151のいずれかに記載の方法。
153. 前記ω-3脂肪酸含有組成物が経口投与される、項目141〜152のいずれかに記載の方法。
154. 前記ω-3脂肪酸含有組成物が静脈内投与される、項目141〜153のいずれかに記載の方法。
155. 前記対象の妊孕能を向上させるかまたは該対象を妊娠させるための前記治療または前記処置が、
卵胞を刺激して未受精卵細胞を発育させること;該対象から未受精卵細胞を取り出すこと;妊娠促進剤を投与すること;体外受精;凍結保存妊娠治療;および人工授精
からなる群より選択される、項目145〜154のいずれかに記載の方法。
156. 先天異常の可能性が低下する、項目141〜155のいずれかに記載の方法。
157. 前記先天異常がダウン症候群である、項目156に記載の方法。
158. 胎児死亡率または乳児死亡率の可能性が低下する、項目141〜157のいずれかに記載の方法。
159. 前記治療または前記処置の前に少なくとも1週間、前記対象に前記ω-3脂肪酸含有組成物が投与される、項目141〜158のいずれかに記載の方法。
160. 前記治療または前記処置の前に少なくとも1ヶ月間、前記対象に前記ω-3脂肪酸含有組成物が投与される、項目141〜159のいずれかに記載の方法。
161. 前記治療または前記処置の前に少なくとも3ヶ月、前記対象に前記ω-3脂肪酸含有組成物が投与される、項目141〜160のいずれかに記載の方法。
162. 閉経期の開始が遅延される、項目141〜161のいずれかに記載の方法。
163. 対象における閉経期の開始を遅延させる方法であって、以下の工程を含む、方法:
ω-3脂肪酸含有組成物を、1:1またはそれ未満のω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清中濃度比を有している対象に投与する工程。
164. 前記対象が少なくとも25歳である、項目163に記載の方法。
165. 前記対象が少なくとも30歳である、項目163に記載の方法。
166. 前記対象が少なくとも35歳である、項目163に記載の方法。
167. 前記ω-3脂肪酸含有組成物が経口投与される、項目163〜166のいずれかに記載の方法。
168. 前記組成物を投与する工程の後に、前記ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清中濃度比を決定する工程;および
1:1またはそれ未満のω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清中濃度比を前記対象が有していると判定された場合に、前記ω-3脂肪酸含有組成物の追加用量を投与する工程
をさらに含む、項目163〜167のいずれかに記載の方法。
169. 前記ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清中濃度比を決定する工程;および
1:1を上回るω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の血清中濃度比を前記対象が有していると判定されるまで、前記ω-3脂肪酸含有組成物の用量を投与する工程
をさらに含む、項目163〜168のいずれかに記載の方法。
170. 前記対象の総脂肪酸摂取量が、20:1のまたはそれを上回る総ω-3脂肪酸:ω-6脂肪酸の比を含む、項目163〜169のいずれかに記載の方法。
171. 前記対象の妊孕能を向上させるかまたは該対象を妊娠させるための治療または処置を開始または継続する工程をさらに含む、項目163〜170のいずれかに記載の方法。
172. 前記対象がヒト女性である、項目163〜171のいずれかに記載の方法。
173. 前記対象のω-6脂肪酸食事摂取量を減らすさらなる工程を含む、項目163〜172のいずれかに記載の方法。
174. 前記対象のω-6脂肪酸食事摂取量を減らすように該対象を指導するさらなる工程を含む、項目163〜172のいずれかに記載の方法。
175. 前記ω-3脂肪酸含有組成物が、
ヘキサデカトリエン酸(HTA);α-リノレン酸(ALA);ステアリドン酸(SDA);エイコサトリエン酸(ETE);エイコサテトラエン酸(ETA);エイコサペンタエン酸(EPA);ヘンエイコサペンタエン酸(HPA);ドコサペンタエン酸(DPA);クルパノドン酸;ドコサヘキサエン酸(DHA);テトラコサペンタエン酸;およびテトラコサヘキサエン酸(ニシン酸)
からなる群より選択されるω-3脂肪酸を含む、項目163〜174のいずれかに記載の方法。
176. 前記対象の妊孕能を向上させるかまたは該対象を妊娠させるための前記治療または前記処置が、
卵胞を刺激して未受精卵細胞を発育させること;該対象から未受精卵細胞を取り出すこと;妊娠促進剤を投与すること;体外受精;凍結保存妊娠治療;および人工授精
からなる群より選択される、項目163〜175のいずれかに記載の方法。
177. 先天異常の可能性が低下する、項目163〜176のいずれかに記載の方法。
178. 前記先天異常がダウン症候群である、項目176に記載の方法。
179. 胎児死亡率または乳児死亡率の可能性が低下する、項目163〜178のいずれかに記載の方法。
180. それを必要とするヒト女性または雌性動物において妊孕能および/または生殖機能を向上させかつ/または延長するための、栄養サプリメント、食事サプリメント、食物サプリメント、医薬グレードサプリメント、および医療用食品より選択される組成物の使用であって、以下の工程を含む、使用:
該組成物を該ヒトまたは該動物に投与する工程であって、該組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
181. それを必要とするヒト女性または雌性動物における閉経期の開始を遅延させるための、栄養サプリメント、食事サプリメント、食物サプリメント、医薬グレードサプリメント、および医療用食品より選択される組成物の使用であって、以下の工程を含む、使用:
該組成物を該ヒトまたは該動物に投与する工程であって、該組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
182. 先天異常の可能性を低下させるための、栄養サプリメント、食事サプリメント、食物サプリメント、医薬グレードサプリメント、および医療用食品より選択される組成物の使用であって、以下の工程を含む、使用:
該組成物をヒト女性に投与する工程であって、該組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
183. 胎児死亡率または乳児死亡率の可能性を低下させるための、栄養サプリメント、食事サプリメント、食物サプリメント、医薬グレードサプリメント、および医療用食品より選択される組成物の使用であって、以下の工程を含む、使用:
該組成物をヒト女性に投与する工程であって、該組成物が、エチルエステル、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドより選択される形態の、該組成物中の総脂肪酸に対して少なくとも30重量％のドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、工程。
【実施例】
【００６９】
実施例1:混合脂肪酸組成物
ある研究では、以下の混合脂肪酸油組成物が2000または4000(IU)のビタミンDとともに試験される。
0006424091.tif 000005
EE=エチルエステル;TG=トリグリセリド。
【００７０】
実施例2:脂肪酸の摂取
本明細書に記載の実験の目的は、(1)マウス生殖機能および卵子の質に対するω-3脂肪酸に富む食餌の効果を評価すること、および(2)ω-3脂肪酸に富む食餌が長期摂取に安全かどうかを判定することの2つの部分からなる。本明細書に記載のように、ω-3脂肪酸を一生を通して摂取すると高齢出産年齢でのマウス生殖機能が維持され、マウス生殖機能が正常に急低下する時期にω-3脂肪酸を摂取すると卵母細胞の質が大幅に改善されることが見出された。さらに、ω-3脂肪酸は、必須脂肪酸欠乏症の証拠が全くなく複数世代にわたる長期摂取に安全であることが見出された。これらの知見は、高齢出産年齢での首尾良い自然生殖および補助生殖に重要な意味を有する。
【００７１】
結果
長期研究における生殖アウトカムおよび妊孕能アウトカム
最初に、生殖機能に対するω-3脂肪酸またはω-6脂肪酸の長期摂取の効果を評価することが求められた。このために、ω-3脂肪酸に富む食餌は冷水性魚類の脂肪酸組成を模倣するように設計され(Le HD, Meisel JA, de Meijer VE, Fallon EM, Gura KM, Nose V, Bistrian BR, Puder M (2011). Docosahexaenoic Acid and Arachidonic Acid Prevent Essential Fatty Acid Deficiency and Hepatic Steatosis. JPEΝ J Parenter Enteral Nutr.)、20:1のω-3:ω-6脂肪酸比がドコサヘキサエン酸(DHA; 22:6n-3; ω-3脂肪酸)およびアラキドン酸(AA; 20:4n-6;ω-6脂肪酸)として供給される。対照的に、ω-6脂肪酸に富む食餌は標準的な西洋型の食事を模倣するように設計され、脂肪がダイズ油として供給され、従って、約8:1のω-6:ω-3脂肪酸比がリノール酸(LA;18:2n-6;ω-6脂肪酸)およびα-リノレン酸(ALA;18:3n-3;ω-3脂肪酸)として供給される。全ての脂肪が硬化ヤシ油(HCO)として供給される第3の食餌は必須脂肪酸が欠損しており、必須脂肪酸欠乏症用に対照として使用した。これらの3つの等カロリー食餌に関するさらなる詳細を表1に示した。
【００７２】
（表１）実験食餌の組成
0006424091.tif 000006
全ての値をkcal/kg食餌として報告した。
【００７３】
高齢出産年齢での生殖能力を評価する前に、正常なマウス雌性生殖寿命の間に、これらの食餌を与えた動物の生殖能力を特徴付けるために繁殖試験を行った。これを行うために、成獣雌性マウスを3つの異なる等カロリー食餌(HCO、SOY、DHA)の1つに無作為化した。4週間の食事療法後に、このF0世代に対して繁殖試験を開始した。次世代の動物に同じ食餌を与えて飼育し、雌が生殖成熟に達した際にそれぞれの次世代を用いて繁殖試験を続けた。それぞれの実験食餌群のF1世代動物(F0雌親に生まれた)の一腹子数および生存率は異なった(各食餌群のF0世代動物間で差が無かった一腹子数および生存率のグラフを示す図1Aを参照されたい(SOY群、HCO群、およびDHA群については、それぞれ、N=3、6、3一腹子;子孫の生存率を3週間で評価した)。SOY食餌を与えた動物をF3世代まで繁殖させ、DHA食餌を与えた動物をF6世代まで繁殖させ、この時点で、さらなる繁殖の試みを終結した。注目すべきことに、繁殖における継続した試みにもかかわらず、HCO食餌を与えた動物はF1世代を超えて首尾良く繁殖することができなかった。これは、血清中脂肪酸プロファイル(表2)において＞0.2のトリエン:テトラエン(T:T)比として定義された重篤な必須脂肪酸欠乏症に二次的なものである可能性が高い。DHA食餌を与えた動物の連続した世代は予想範囲内で一腹子数を有し続けた。後の世代の子孫の生存率はF1世代の75％からF5世代の95％およびF6世代の100％まで顕著に改善された(DHA食餌を与えた動物の6つの連続した世代にわたって維持される生殖機能のグラフを示す図1Bを参照されたい。連続した世代にわたって生存率が改善された(F0、F4、およびF5世代について、それぞれ、N=3、13、3一腹子);子孫の生存率を3週間で評価した)。
【００７４】
（表２）HCO食餌、SOY食餌、およびDHA食餌におけるF1世代動物の血清中脂肪酸プロファイル
0006424091.tif 000007
値は全てパーセント±SDを表す。
【００７５】
ω-3に富む食餌を与えた動物およびω-6に富む食餌を与えた動物が通常の雌性生殖寿命の範囲内で首尾良く繁殖する能力が確認されたら、次いで、これらの食餌を与えた動物が高齢出産年齢(＞10ヶ月齢)で繁殖する能力を試験した。ω-3に富む食餌を与えた動物(N=7)は全て10〜15ヶ月齢の間に平均3.3±0.3一腹子/動物で全て首尾良く繁殖することができた(DHA食餌を与えた高齢出産年齢の雌において維持された生殖機能のグラフを示す図2Aを参照されたい。子孫の生存率を2週間で評価した。それぞれの動物をx軸上にある数字で示した。それぞれの棒は1一腹子を表す。白色の棒は子孫の総数を表し、黒色の棒は生存可能な子孫を表す。x印は、死亡した動物、または研究期間中に安楽死させなければならなかった動物を示す)。高齢出産年齢(＞10ヶ月)雌親の平均一腹子(4.4±1.9匹の子孫/一腹子)は、同じ食餌を与えた若齢動物コホート(6.0±2.7匹の子孫/一腹子)と比較して少なかったが(P=0.10)、高齢の雌親に生まれた子孫の全生存率は89％で非常に高かった。全く対照的に、ω-6に富む食餌を与えて飼育された10匹の老齢動物にはいずれも生存可能な一腹子がなかった(SOY食餌を与えた動物は高齢出産年齢での繁殖成功が非常に低いことを証明する図2Bを参照されたい;子孫の生存率を2週間で評価した)。別の比較点として、標準実験用げっ歯類固形飼料を与えた動物(N=7)も対象にして10ヶ月齢での繁殖試験を開始した。これらの動物の繁殖成功もω-3に富む食餌を与えた動物と著しい対照をなした。2匹の動物のみにそれぞれ、生存可能な1一腹子があった(CHOW食餌を与えた動物は高齢出産年齢での繁殖成功が非常に低いことを証明する図2Cを参照されたい;子孫の生存率を2週間で評価した)。これらの知見から、過去100年間にわたってヒト食事に食事性ω-6脂肪酸が著しく増えたことは、実際には、高齢出産年齢の女性の繁殖成功に有害であり得ることが示唆される(Eaton SB, Konner M (1985). Paleolithic nutrition. A consideration of its nature and current implications. N Engl J Med. 312, 283-289; Simopoulos AP (2003). Importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids: evolutionary aspects. World Rev Nutr Diet. 92, 1-22; Simopoulos AP (2006). Evolutionary aspects of diet, the omega-6/omega-3 ratio and genetic variation: nutritional implications for chronic diseases. Biomed Pharmacother. 60, 502-507; Simopoulos AP (2009). Evolutionary aspects of the dietary omega-6:omega-3 fatty acid ratio: medical implications. World Rev Nutr Diet. 100, 1-21; Simopoulos AP (2011). Importance of the omega-6/omega-3 balance in health and disease: evolutionary aspects of diet. World Rev Nutr Diet. 102, 10-21)。
【００７６】
急性的食事療法研究における卵母細胞の質
次に、急性的食事療法モデルを調べた。卵子の質は、生殖可能年齢の終わりに近い女性の妊娠の成功を決定する最も重要な1つの要因であると認識されているので(Navot D, Bergh PA, Williams M, Garrisi GJ, Guzman I, Sandler B, Fox J, Schreiner-Engel P, Hofmann GE, Grunfeld L (1991a). An insight into early reproductive processes through the in vivo model of ovum donation. J Clin Endocrinol Metab. 72, 408-414; Navot D, Bergh PA, Williams MA, Garrisi GJ, Guzman I, Sandler B, Grunfeld L (1991b). Poor oocyte quality rather than implantation failure as a cause of age-related decline in female fertility. Lancet. 337, 1375-1377)、この目標は、高齢出産年齢での卵母細胞の質に対する急性的食事療法の効果を判定することであった。
【００７７】
10ヶ月齢まで標準実験用げっ歯類固形飼料(CHOW)を与えた36匹の10ヶ月齢未交尾雌性マウスを3つの異なる食餌群のそれぞれに無作為に割り当てた(N=12 CHOW、N=12 SOY、N=12 DHA)。SOY食餌を与えた1匹の動物が、重篤な皮膚炎のために10週目の食事療法の間に安楽死を必要とした。残り35匹の動物は12週間の食事療法を完了するまで生き延び、13ヶ月齢で安楽死させた。群間で摂取カロリーの平均または週ごとの動物体重の平均には差がなかった(11週間研究にわたるどの時点においても(図5A)体重または(図5B)摂取kcalに差がないことを示す図5Aおよび5Bを参照されたい;全てのデータを平均±SDとして表した)。急性的食事療法は、どの食餌群においても生化学的必須脂肪酸欠乏症の発症をもたらさなかった(表3)。しかしながら、この比較的短い期間の食事療法でさえも、DHA食餌群における血清中ω-6/ω-3脂肪酸比はCHOW食餌群およびSOY食餌群と比較して有意に高かった(それぞれの急性的食事治療群における動物の血清中ω-6/ω-3脂肪酸およびトリエン:テトラエン比のグラフを示す図3Aを参照されたい。DHA群における血清中ω-6/ω-3脂肪酸比はCHOW群(P=0.008)およびSOY群(P=0.008)と比較して1/7より小さかった。どの食餌群の動物にも生化学的必須脂肪酸欠乏症(トリエン:テトラエン比＞0.2)の証拠はなかった(CHOW群、SOY群、およびDHA群について、それぞれ、N=5、5、5匹の動物)。全てのバーは平均±SDを示す。
【００７８】
（表３）CHOW食餌、SOY食餌、またはDHA食餌を用いた急性的食事療法後の老齢動物の血清中脂肪酸プロファイル
0006424091.tif 000008
値は全てパーセント±SDを表す。
【００７９】
13ヶ月齢まで生き残った35匹の雌性マウスを対象にして、卵母細胞の成熟状態および質に加えてホルモン刺激後の卵母細胞収量を評価した。CHOWを与えた動物から合計53個の卵母細胞を収集した。これに対して、SOY食餌群およびDHA食餌群からそれぞれ23個および25個の卵母細胞を収集した。卵母細胞の成熟状態を評価した際に、CHOW食餌(13％)およびSOY食餌(35％)を与えた動物に由来する卵母細胞と比較して、DHA食餌を与えた動物から採取した卵母細胞の高い割合(44％)が、受精能力のある卵子プールに相当する、完全に成熟している(MII期)ことが見出された(P=0.01)。さらに、SOY食餌を与えた動物に由来する卵母細胞の39％およびCHOW食餌を与えた動物に由来する卵母細胞の35％と比較して、DHA食餌を与えた動物に由来する卵母細胞の12％しか閉鎖性でなかった(P=0.09)(CHOW群およびSOY群と比較して、DHA群の動物に由来する卵母細胞の大きな割合が完全に成熟しており、かつ、少ない割合が閉鎖性であったことを証明する卵母細胞の特徴付けのグラフを示す図3Bを参照されたい(CHOW群、SOY群、およびDHA群については、それぞれ、N=53個、23個、および25個の卵母細胞)。全てのバーは平均±SDを示す)。同様に、卵胞数から、SOY食餌を与えた動物由来の卵巣内にある原始卵胞および全非閉鎖卵胞の数はDHA食餌を与えた動物と比較して有意に少ないことが証明された(DHA食餌による急性的治療後の動物に由来する卵巣における全卵胞(P=0.04)および原始卵胞(P=0.04)の数はSOY食餌と比較して多いことを証明する卵胞数のグラフを示す図3Cを参照されたい(CHOW群、SOY群、およびDHA群について、それぞれ、N=6、6、および7匹の動物)。全てのバーは平均±SD.を示す)。
【００８０】
3つの食餌群それぞれの動物から収集した完全成熟(MII期)卵母細胞の質を評価した。この分析のために完全成熟卵母細胞を選択した。この成熟期に卵母細胞における年齢関連性欠陥がはっきりと分かり、これらの卵母細胞は受精能力のある卵子プールに相当するからである。ミトコンドリア染色パターンおよび紡錘体完全性を評価することによって卵母細胞の質を評価した。個々の卵母細胞を、これらのエンドポイントのそれぞれに無作為に割り当てた。ミトコンドリア凝集は高齢出産による卵母細胞の質の低下と結び付けられており、凝集のないミトコンドリアの均一な細胞質分布は良質の卵母細胞を表している(Tarin JJ, Perez-Albala S, Cano A (2001). Cellular and morphological traits of oocytes retrieved from aging mice after exogenous ovarian stimulation. Biol Reprod. 65, 141-150)。ミトコンドリアの共焦点分析から、DHA食餌を与えた動物に由来する6/6(100％)MII卵母細胞においてミトコンドリアに均一な細胞質分布があるが、他の食餌群の動物に由来する卵母細胞には大規模なミトコンドリア凝集があることが明らかになった。SOY食餌を与えた動物に由来する1/3(33％)MII卵母細胞およびCHOW食餌を与えた動物に由来する0/4(0％)MII卵母細胞は正常と分類された(P=0.006)(それぞれの急性的食事治療群の動物から得られた卵母細胞の代表的なミトコンドリア染色の顕微鏡写真画像を示す図3Dを参照されたい。DHA群の動物に由来する6/6(100％)成熟卵母細胞においてミトコンドリアは正常であるように見えたのに対して、CHOW食餌群の0/4(0％)成熟卵母細胞およびSOY食餌群の1/3(33％)成熟卵母細胞においてミトコンドリアは正常であるように見えた(P=0.006))。同様に、α-チューブリンおよびDNA分布の共焦点分析から、DHA動物から収集した4/5(80％)MII卵母細胞における減数分裂紡錘体は形状およびサイズが普通であり、微小管形態ははっきり認識できることが明らかになった。対照的に、SOYを与えた動物に由来する0/5(0％)MII卵母細胞およびCHOWを与えた動物に由来する2/3(66％)MII卵母細胞に正常な減数分裂紡錘体があった(P=0.03)(それぞれの急性的食事治療群の動物から得られた卵母細胞の代表的なチューブリン(紡錘体、緑色)およびDNA(青色)染色の顕微鏡写真画像を示す図3Eを参照されたい。CHOW群の動物に由来する2/3(66％)成熟卵母細胞およびSOY群の動物に由来する0/5(0％)成熟卵母細胞と比較して、DHA群の動物に由来する4/5(80％)成熟卵母細胞において減数分裂紡錘体は正常であるように見えた(P=0.03))。
【００８１】
安全性評価
本研究における有益な生殖効果に関連するω-3脂肪酸に富む食餌はω-3脂肪酸DHAの形態で総カロリーの2％を供給した。この食餌は従来の必須脂肪酸、ALA、およびLAを全く含有せず(Burr GO, Burr MM (1973). Nutrition classics from The Journal of Biological Chemistry 82:345-67, 1929. A new deficiency disease produced by the rigid exclusion of fat from the diet. Nutr Rev. 31, 248-249)、ω-3脂肪酸経路およびω-6脂肪酸経路の下流分子(DHAおよびAA)を含有する。従って、この目標は、ω-3に富む食餌を与えて飼育された動物が必須脂肪酸欠乏症の生化学的証拠または臨床的証拠を発症するかどうか判定することであった。臨床的に必須な脂肪酸の欠乏症があると成長、生殖、および授乳が損なわれる(Burr GO, Burr MM (1973). Nutrition classics from The Journal of Biological Chemistry 82:345-67, 1929. A new deficiency disease produced by the rigid exclusion of fat from the diet. Nutr Rev. 31, 248-249)。ω-3に富む食餌を与えた動物が首尾良く複数世代にわたって繁殖および泌乳する能力は既に確認されているので、生化学的必須脂肪酸欠乏症を評価するために、必須脂肪酸欠乏症のさらなる臨床指標として成長パターンおよび血清中脂肪酸プロファイルを使用した。最後に、全ての主要な臓器系の組織学的評価を行った。
【００８２】
脂肪酸プロファイル
SOY(F1世代もしくはF2世代) 食餌群またはDHA(F1世代、F2世代、もしくはF5世代) 食餌群の動物には生化学的必須脂肪酸欠乏症の証拠はなかった。対照的に、HCO食餌を与えた動物の全てに、生化学的必須脂肪酸欠乏症の証拠と、一貫して高い血清中T:T比があった(血清中トリエン:テトラエン比から、SOY食餌またはDHA食餌を与えた動物には生化学的必須脂肪酸欠乏症の証拠(トリエン:テトラエン比＞0.2、水平破線)がなかったことが証明される図4Aを参照されたい。全てのデータを平均±SDとして表した)。必須脂肪酸欠乏症の場ではミード酸が相対的に過剰産生されるので、これらの知見はミード酸(20:3n-9;ω-9脂肪酸)によって確認することができる。ミード酸は、F1 HCO群における総脂肪酸含有量の9.37±1.00％を占め、これと比較して、F1 SOY群では0.12±0.04％およびF1 DHA群では0.02±0.04％しか占めない。
【００８３】
食事療法は血清の脂肪酸プロファイルを有意に変えた。その結果、DHA群のω-6/ω-3脂肪酸比はSOY群およびHCO群と比較して低くなった(血清中ω-6/ω-3脂肪酸比(図4B)ならびに(図4C)ω-6脂肪酸および(図4D)ω-3脂肪酸に起因する脂肪酸の全パーセントは群間で有意差があったことを証明する図4B〜4Dを参照されたい。全てのデータを平均±SDとして表した)。興味深いことに、SOY食餌群の血清中ω-6/ω-3脂肪酸比(F1については3.98±0.48およびF2については3.62±0.12)は、典型的な西洋型の食事を摂取しているヒトについて報告された比(4.72±0.19)に非常に似ていた(Ambring A, Johansson M, Axelsen M, Gan L, Strandvik B, Friberg P (2006). Mediterranean-inspired diet lowers the ratio of serum phospholipid n-6 to n-3 fatty acids, the number of leukocytes and platelets, and vascular endothelial growth factor in healthy subjects. Am J Clin Nutr. 83, 575-581)。このことから、この実験食餌は西洋社会において見られる血清中ω-6脂肪酸およびω-3脂肪酸の分布を効果的に模倣することが分かる。
【００８４】
成長
それぞれの実験食餌(HCO、SOY、およびDHA)を与えたF1世代動物について動物体重をモニタリングし、判断基準を得るために、標準実験用げっ歯類固形飼料を与えた同年齢動物と比較した。標準実験用げっ歯類固形飼料を与えた動物と比較した場合に、離乳から成獣期までSOY動物およびDHA動物の成長パターンには差は無かった。HCO食餌を与えた動物は、他の食餌を与えた動物より一貫して少ない週ごとの体重によって証明されたように成長を遅らせた。この差は雌より雄の方が顕著であった。(生まれて3週目(離乳)〜8週目の代表的なF1世代(図4E)雄および(図4F)雌の週ごとの平均体重を証明する図4E〜4Fを参照されたい。CHOW食餌、SOY食餌、およびDHA食餌を与えた動物間で週ごとの体重には差がなかったが、HCO食餌を与えた動物については一貫して少なかった(CHOW食餌群、HCO食餌群、SOY食餌群、およびDHA食餌群については、それぞれ、N=5、11、7、5匹の雄性動物およびN=5、6、9、5匹の雌性動物)。全てのデータを平均±SDとして表した)。動物の後の世代における正常成長パターンを保証するために、次世代のDHA食餌を与えた動物の連続世代をモニタリングした。これらの間でF2世代動物およびF5世代動物の成長には差は認められなかった(生まれて3週目(離乳)〜8週目の代表的なF1世代、F2世代、およびF5世代(図4G)雄ならびに(図4H)雌の週ごとの平均体重を証明する図4G〜4Hを参照されたい)。F1世代と比較して、DHA食餌を与えた動物は、この食餌による、一生続く治療にもかかわらず複数世代にわたって正常成長を証明し続けた(F1、F2、およびF5 DHA群については、それぞれ、N=5、8、6匹の雄性動物およびN=5、5、6匹の雌性動物。全てのデータを平均±SDとして表した)。このことから、複数世代にわたって、このω-3脂肪酸に富む食餌を一生涯摂取しても、成長の有害作用と結び付けられないことが分かる。
【００８５】
組織学
合計15匹の成獣F5世代動物由来の脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、および大腿のヘマトキシリン・エオシン染色スライドを、げっ歯類病理学者が詳しく調べた。これらを、標準げっ歯類固形飼料を与えた5匹の同年齢動物に由来する同じ臓器のヘマトキシリン・エオシン染色スライドと比較した。脳標本、心臓標本、肝臓標本、腎臓標本、および大腿標本の検査時に異常は認められなかった。DHA食餌を与えた動物に由来する15個の肺試料のうち3個に軽度の気腫性変化があった。これは、おそらく、採取中および保存中の外傷の結果である。さらに、DHA食餌を与えた4匹の動物に、実験用マウスでは非特異的な所見である、脾臓において軽度の骨髄外造血があった。
【００８６】
考察
ω-3脂肪酸の投与(例えば、食事摂取による)はマウスモデルにおいて生殖寿命を延ばすだけでなく、卵子の質の著しい改善ももたらすという証拠が本明細書において説明される。これらの知見は高齢出産年齢での首尾良い自然生殖および補助生殖に関連する。
【００８７】
ω-3脂肪酸に富む食餌を与えたマウスは、これらの動物の予想される正常な生殖寿命を過ぎても首尾良く繁殖できることが本明細書において証明されている。ω-3に富む食餌を与えた、高齢出産年齢の雌親(＞10ヶ月)の平均一腹子(4.4±1.9匹の子孫/一腹子)は、同じ食餌を与えた若齢動物コホート(6.0±2.7匹の子孫/一腹子)と比較してわずかに少なかったが、高齢出産年齢の雌親に生まれた子孫の生存率は89％で非常に高かった。全く対照的に、標準実験用げっ歯類固形飼料またはω-6に富む食餌(典型的な西洋型の食事を模倣するように設計された)を与えて飼育された老齢動物(＞10ヶ月)の繁殖成功は極めて低かった。これらは、過去100年間にわたってヒト食事に食事性ω-6脂肪酸が著しく増えたことが、実際には、高齢出産年齢の女性の繁殖成功に有害であり得ることを示している可能性がある。
【００８８】
しかしながら、一部の対象は、自然生殖寿命を延長するための実行可能な戦略として、非常に高いω-3:ω-6脂肪酸比を含有する食餌の一生続く摂取に変更できない可能性がある。代替アプローチには、出産を遅らせることを望んでいる女性が、生殖妊孕能が自然低下する時点に、または生殖妊孕能が自然低下すると推定される時機の直前に開始することができる食事の変更が含まれる。本明細書に記載のデータから、自然妊孕能が急低下すると予想される時機の前後にω-3脂肪酸に富む食餌を開始すると、ミトコンドリア動態および紡錘体構造により測定されるように卵母細胞の質が著しく改善されることが分かった。卵子の質は、生殖可能年齢の終わりに近い女性の妊娠の成功を決定する最も重要な1つの要因であると認識されている(Navot D, Bergh PA, Williams M, Garrisi GJ, Guzman I, Sandler B, Fox J, Schreiner-Engel P, Hofmann GE, Grunfeld L (1991a). An insight into early reproductive processes through the in vivo model of ovum donation. J Clin Endocrinol Metab. 72, 408-414; Navot D, Bergh PA, Williams MA, Garrisi GJ, Guzman I, Sandler B, Grunfeld L (1991b). Poor oocyte quality rather than implantation failure as a cause of age-related decline in female fertility. Lancet. 337, 1375-1377)。年齢が進むにつれて、卵子の減数分裂細胞周期は染色体分離の誤りを起こしやすくなる。この結果、高齢女性が排卵する卵母細胞において異数性が起こる割合が非常に高くなる(Hunt PA (1998). The control of mammalian female meiosis: factors that influence chromosome segregation. J Assist Reprod Genet. 15, 246-252; Hassold T, Hunt P (2009). Maternal age and chromosomally abnormal pregnancies: what we know and what we wish we knew. Curr Opin Pediatr. 21, 703-708)。老齢動物モデルにおいて卵母細胞の質を改善する戦略は限られている。長期抗酸化物質治療は卵母細胞の質に及ぼす雌加齢の悪影響を打ち消すことが示されてきた(Tarin JJ, Perez-Albala S, Cano A (2002a). Oral antioxidants counteract the negative effects of female aging on oocyte quantity and quality in the mouse. Mol Reprod Dev. 61, 385-397)。しかしながら、この治療は繁殖成功を改善することが示されておらず、卵巣機能および子宮機能に非常に大きな悪影響があるために臨床用途は実現不可能である(Tarin JJ, Perez-Albala S, Pertusa JF, Cano A (2002b). Oral administration of pharmacological doses of vitamins C and E reduces reproductive fitness and impairs the ovarian and uterine functions of female mice. Theriogenology. 57, 1539-1550)。成人で開始するカロリー制限はマウス雌性生殖軸(reproductive axis)の機能を高齢の暦年齢まで維持し、カロリー制限された動物の二分の一は、対照動物が妊孕能の消失を経験する時期を過ぎて6ヶ月間、妊娠可能であり、高齢出産年齢のこれらの雌親に生まれた子の生存率は73％であることが示されている(Selesniemi K, Lee HJ, Tilly JL (2008). Moderate caloric restriction initiated in rodents during adulthood sustains function of the female reproductive axis into advanced chronological age. Aging Cell. 7, 622-629)。このカロリー制限戦略も卵母細胞の質を改善することが示されているが(Simopoulos AP (2011). Importance of the omega-6/omega-3 balance in health and disease: evolutionary aspects of diet. World Rev Nutr Diet. 102, 10-21)。これらの有益な効果を得るのに必要な非常に厳しいカロリー制限に関連する、予想される有害な健康上の影響のために臨床用途は限定的なままである。本明細書に記載のデータから、食事性ω-3脂肪酸は卵母細胞の質の年齢関連性低下を防ぐことができ、従って、生殖可能年齢の終��りに近い女性が、生存可能な子孫を首尾良く妊娠および出産する手段を提供することが分かる。さらに、卵母細胞の質を改善し、従って、生殖可能年齢の終わりに近い女性において異数性の割合を低下させる可能性から、本明細書に記載の方法がダウン症候群などの染色体障害の発生を減少させることができることが分かる。
【００８９】
本研究における有益な生殖効果に関連するω-3脂肪酸に富む食餌はω-3脂肪酸DHAの形態で総カロリーの2％を供給した。以前の研究から、非常に高用量のω-3脂肪酸DHAおよびエイコサペンタエン酸(EPA;20:5n-3)でも忍容性が高く、かつ小児患者および成人患者の両方に安全に投与できることが示唆されている(Lloyd-Still JD, Powers CA, Hoffman DR, Boyd-Trull K, Lester LA, Benisek DC, Arterburn LM (2006). Bioavailability and safety of a high dose of docosahexaenoic acid triacylglycerol of algal origin in cystic fibrosis patients: a randomized, controlled study. Nutrition. 22, 36-46; Sorgi PJ, Hallowell EM, Hutchins HL, Sears B (2007). Effects of an open-label pilot study with high-dose EPA/DHA concentrates on plasma phospholipids and behavior in children with attention deficit hyperactivity disorder. Nutr J. 6, 16; Gura KM, Lee S, Valim C, Zhou J, Kim S, Modi BP, Arsenault DA, Strijbosch RA, Lopes S, Duggan C, Puder M (2008). Safety and efficacy of a fish-oil-based fat emulsion in the treatment of parenteral nutrition-associated liver disease. Pediatrics. 121, e678-686)。さらに、食事ω-3脂肪酸の有益な効果は食餌中のω-3:ω-6脂肪酸の比およびこれらの脂肪酸の絶対用量によって決定されることがよく認識されている(Simopoulos AP (2002). The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids. Biomed Pharmacother. 56, 365-379)。従って、一部の態様において、本明細書に記載の方法は、食餌中のω-6脂肪酸含有量を限定することに加えて、例えば、ω-3脂肪酸の薬理学的用量に関連し得る。
【００９０】
マウス生殖機能に対するω-3脂肪酸の有益な効果に加えて、少なくともDHAおよびAAは生命の維持および必須脂肪酸欠乏症の予防に十分な脂肪源であり得るという証拠が本明細書において説明される。約80年前に、ALAおよびLAは、BurrおよびBurrによって、健常な皮膚ならびに首尾良い成長、生殖、および授乳に必要な必須脂肪酸であることが確かめられた(Burr GO, Burr MM (1973). Nutrition classics from The Journal of Biological Chemistry 82:345-67, 1929. A new deficiency disease produced by the rigid exclusion of fat from the diet. Nutr Rev. 31, 248-249)。DHAおよびAAは、それぞれ、非常に多くの生理学的プロセスおよび生化学的プロセスにおいて役割を有すると特定されている、ω-3脂肪酸経路およびω-6脂肪酸経路の下流分子である。本明細書に記載のデータから、20:1比のDHA:AAを含有する食餌は長期摂取に安全であり、マウスモデルにおいて、容易に判断できる有害な健康上の影響は無いことが証明された。6世代にわたって、この食餌を与えた動物のT:T比およびミード酸レベルは一貫して非常に低かった。このことは生化学的必須脂肪酸欠乏症が存在しないことを示唆している。これらの動物には臨床的必須脂肪酸欠乏症の証拠がなく、皮膚の健康、ならびに正常な成長、生殖、および授乳が維持された。
【００９１】
本明細書に記載のデータから、ω-3脂肪酸を摂取すると、高齢出産年齢での繁殖成功が改善されることが証明される。ω-3に富む食餌を摂取した動物において卵母細胞の質が改善されたという証拠も提供される。高齢出産年齢であるとみなされた女性における生殖能力の維持を含んでもよい。
【００９２】
本研究から、低い生殖パラメータに通常関連する年齢でのマウス繁殖成功および卵母細胞の質に対するω-3脂肪酸に富む食餌の有益な効果が発見された。ω-3脂肪酸に富む食餌、例えば、20:1比のDHA:AAとして供給される総カロリーの2.1％を構成するω-3脂肪酸に富む食餌は数世代にわたる摂取に安全であり、高齢での自然妊孕能が改善されることが見出された。生殖能力が自然に急低下する間に動物に急性的食事療法を行うと、紡錘体構造およびミトコンドリア動態によって測定されるように卵母細胞の質が改善される。
【００９３】
実験手順
全ての動物飼育および実験手順はChildren's Hospital Bostonの実験動物委員会(institutional animal care and use committee)による検査および認可を受けた。全ての動物を、調節された温度(21℃±1.6℃)、湿度(45％±10％)、および12時間で入れ替わる明暗周期でバリアルーム(barrier room)の中で紙チップ床敷を敷いて収容した。水および研究食餌を自由に利用できるようにした。
【００９４】
長期食餌研究(生殖および妊孕能)
動物。未交尾C57BL/6成獣雌性マウスおよび成獣雄性C57BL/6マウスをJackson Laboratories(#000664; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA)から入手した。繁殖試験の前に雄の受精能を確認した。どの繁殖試験にも6ヶ月齢を超えた雄を使用しなかった。
【００９５】
給餌レジメン。成獣雌性動物を3つの異なる食餌群の1つに無作為化した。各食餌群は、総カロリーの10％を、ダイズ油(SOY; #110990, Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA)、硬化ヤシ油(HCO; #102328, Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA)、または20:1比のDHA:AA (DHA; #102536, Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA)として供給される脂肪の形態で含有する。各食餌の詳細な組成を表1に示した。
【００９６】
最初の動物をF0世代と名付けた。繁殖試験を開始する前に4週間、これらの動物にそれぞれの食餌を与え続けた。次世代の動物には一生涯にわたって母親と同じ食餌を与えて飼育した。雄が1週間を超えて特定の食餌を摂取しないように、雄をケージ間で循環させた。
【００９７】
繁殖試験。4週間の食事療法後に各食餌群のF0動物を用いて繁殖試験を開始した。この子孫をF1世代と名付けた。生殖成熟に達した後、F1動物を繁殖させてF2世代を作製した。その後の繁殖試験をSOY動物についてはF3世代まで、DHA動物についてはF6世代まで続けた。HCO食餌を与えた動物は、F1世代を超えて首尾良く繁殖することができなかった。一腹子当たりの生まれた子孫の総数、および生存可能な(離乳まで生存した)生まれた子孫の数を妊娠ごとに別々に記録した。生き残らなかった子孫は出生時に死んでいるのが発見されたか、または出生直後に死んだ。生存可能な子孫を全て離乳(産後21日目)まで雌親と一緒に残した。産後21日目に、後で雌親との交配を試みるために子孫をケージから取り出した。全ての雄性子孫を安楽死させ、各世代から無作為に選択した雌の一部をさらなる繁殖のためにとっておいた。
【００９８】
SOY(N=10) 食餌群およびDHA(N=7) 食餌群のF2雌性動物およびF3雌性動物の一部に対して、＞10ヶ月齢と定義された、マウス生殖可能年齢の終わりで繁殖試験を続けた。比較のために、付随して、標準実験用げっ歯類固形飼料(CHOW; National Institute on Aging, Bethesda, MD, USA)を与えた同年齢雌性動物に対して繁殖試験を開始した。生存可能な子孫を産後14日目まで雌親と一緒に残した以外は前記のように正確に繁殖試験を行った。産後14日目に子孫を安楽死させ、その後の雌親との交配の試みを続けた。雌親が15ヶ月齢になるまで繁殖試験をこのやり方で続けた。
【００９９】
急性的食事療法研究(卵母細胞の質)
動物。10ヶ月齢の未交尾雌性C57BL/6マウスをNational Institute on Aging (NIA, Bethesda, MD, USA)から入手した。これらの動物には出生から購入時までNIH-31標準実験用げっ歯類固形飼料を与えた。
【０１００】
給餌レジメン。雌性動物を3つの異なる食餌群(N=12/群):CHOW、SOY、およびDHAの1つに無作為化した。各動物の消費した食餌の量および成長を毎週モニタリングした。12週間の食事療法に相当する13ヶ月齢時の安楽死まで全ての動物に実験食餌を与えた。
【０１０１】
脂肪酸プロファイル。血清中脂肪酸プロファイルを、各食餌群の動物に由来する5個の代表的な血清試料に対して行った。改良フォルチ(Folch)法(Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH (1957). A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509)に従って総脂肪酸を抽出した。脂肪酸分析は、Supelcowax SP-10キャピラリーカラム(GMI Inc., Ramsey, MN, USA)を搭載したHP-5975B質量分析計に連結したHewlett-Packard 6890Nガスクロマトグラフ(GMI Inc., Ramsey, MN, USA)において行った。脂肪酸濃度(nmol/mL血清)は、ピーク面積と17:0内部標準の面積を比例比較することによって計算した。
【０１０２】
卵母細胞の取り出し。妊馬血清性ゴナドトロピン(PMSG, 10IU; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)を腹腔内注射し、48時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG, 10IU; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)を腹腔内注射することによってマウス(N=12 CHOW, N=11 SOY, N=12 DHA)を過排卵した。hCG注射の15〜16時間後に、卵管をインシュリン注射器で穿刺することによって卵母細胞を卵管から収集した。80IU/mLのヒアルロニダーゼ(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)中で短時間インキュベートし、その後に、0.4％BSA(フラクションV、脂肪酸フリー; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)を添加したヒトチューバルフルイド(human tubal fluid)(HTF)(Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA)で3回洗浄することによって、取り出された卵母細胞から卵丘細胞をはいだ。Hoffman光学顕微鏡を用いて、卵母細胞を成熟中期II細胞(MII;囲卵腔の中にある第一極体の存在)、成熟停止細胞(極体の突出のない卵核胞の崩壊、もしくは卵核胞が損なわれていない)、または死細胞(凝縮し、断片化した細胞質)として計数および分類した。3つの食餌群からの卵母細胞を同時に分析した。
【０１０３】
ミトコンドリア分析。各食餌群から収集した成熟(MII)卵母細胞の一部から、付着している体細胞(卵丘細胞)をはぎ、0.4％BSAおよび200nM MitoTracker Red CMRox(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)を添加したHTF培地中で37℃で60分間インキュベートした。卵母細胞を酸性化タイロード液(Irvine-Scientific, Santa Ana, CA, USA)で洗浄およびインキュベートし、洗浄し、固定し、再洗浄した後に、0.5％BSA、0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)、および0.1％Triton X-100(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)を含有するリン酸緩衝食塩水(PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)で1時間インキュベートした。次いで、卵母細胞をVectashield(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)を用いてマウントし、2人の無関係の熟練観察者が共焦点顕微鏡観察で分析した。活性のあるミトコンドリアが均一に細胞質分布している卵母細胞を正常とスコア付けした。
【０１０４】
DNAおよび紡錘体分析。各食餌群から収集した成熟(MII)卵母細胞の一部を0.5％BSA含有PBSで洗浄し、透明帯を軟らかくし、除去するために酸性化タイロード液中で短時間インキュベートした。次いで、卵母細胞を、0.5％BSAを含有する2.0％中性緩衝パラホルムアルデヒドで洗浄および固定した。卵母細胞を、0.5％BSA、0.1％Triton-X、0.05％Tween-20、および5％正常ヤギ血清(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)を添加したマウスブロッキング溶液(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)中でインキュベートすることによって、透過処理およびブロッキングを行った。卵母細胞を、0.5％BSA含有PBSで1:200に希釈したマウス抗αチューブリン抗体(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)で一晩、洗浄およびインキュベートし、1:250に希釈したAlexa Fluor-488結合ヤギ抗マウスIgG(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)で洗浄およびインキュベートした。洗浄後、卵母細胞をヨウ化プロピジウム含有Vectashield(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)を用いてマウントし、共焦点顕微鏡観察によって分析した。紡錘体分析のために、明瞭な、かつきちんと整理された微小管繊維のある円筒形の双極紡錘体と、中期板にきっちりと並べられた染色体を有する卵母細胞を正常とスコア付けした。3つの群からの卵母細胞を同時に分析した。
【０１０５】
卵胞数。卵巣を固定し、パラフィン包埋し、連続切片(8μm)を作製し、顕微鏡ガラススライド上に順序正しく並べた。次いで、切片をヘマトキシリンおよびピクリックメチルブルー(picric methyl blue)で染色し、以前に述べられたように(Morita Y, Perez GI, Maravei DV, Tilly KI, Tilly JL (1999). Targeted expression of Bcl-2 in mouse oocytes inhibits ovarian follicle atresia and prevents spontaneous and chemotherapy-induced oocyte apoptosis in vitro. Mol Endocrinol. 13, 841-850)、無作為出発で切片1枚おきに非閉鎖原始卵胞、一次卵胞、および小さな前胞状卵胞の数について分析した。はっきりと目に見える核のある卵母細胞を含有する卵胞のみをスコア付けした。次いで、この処置によって卵巣全量の2分の1がサンプリングされたと仮定して、各卵巣について累積数に補正率2を掛けることによって、卵巣1個当たりの卵胞の総数を概算した。計数は全て盲検試験の試験責任者によって行われた。
【０１０６】
安全性の評価
脂肪酸プロファイル。血清中脂肪酸プロファイルを、無作為に選択された動物から収集した血清試料に対して行った。HCO食餌、SOY食餌、およびDHA食餌を与えた異なる世代の動物を代表するように代表的な試料を選択した。以下の代表的な動物:F1 HCO(n=4)、F1 SOY(n=5)、F2 SOY(N=5)、F1 DHA(N=5)、F2 DHA(N=4)、F5 DHA(N=15)から血清を収集した。脂肪酸の抽出および分析を前記のように行った。
【０１０７】
成長。研究の長期食餌アーム(arm)において各食餌を与えた雌親に生まれた代表的な一腹子の成長をモニタリングし、離乳から成獣期まで連続体重を入手した。SOY群およびHCO群の代表的な、かつ無作為に選択したF1一腹子ならびにDHA群のF1、F2、およびF5一腹子をモニタリングした。同様に、さらなる判断基準を得るために、標準実験用固形飼料(CHOW)を与えた雌親に生まれた一腹子の体重もモニタリングした。
【０１０８】
組織学的分析。臓器系を組織学的分析するために、DHA食餌を与えたF5世代からの15匹の成獣を安楽死させた。これらの動物のそれぞれから脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、および長骨(大腿)を採取し、10％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリン・エオシン染色した。比較試料を、標準的な実験用げっ歯類固形飼料を与えた5匹の同年齢C57BL/6マウスから入手した。全てのスライドを、げっ歯類病理学者が詳しく調べ、組織学的外観に基づいて正常または異常と分類した。全ての顕著な異常に関する詳細を記録した。
【０１０９】
統計解析。全ての連続変数を平均±標準偏差(SD)として表した。連続変数はスチューデントt検定を用いて、またはデータが正規分布していない時にはマンホイットニーU検定を用いて解析した。3つ超の独立した群からの連続変数は、クラスカル・ウォリス一元配置分散分析を用いて解析した。カテゴリー変数はカイ二乗検定を用いて解析した。有意性は両側5％α水準を用いて評価した。全ての統計解析を、GraphPad Prismソフトウェア(バージョン4.0; San Diego, CA, USA)を用いて行った。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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