(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、
ａ．（ｉ）分析物に関する捕捉試薬、および（ｉｉ）アンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬を含む表面；
ｂ．第１の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第１の検出試薬；ならびに
ｃ．第２の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第２の検出試薬
を含む、前記キット。
【請求項２】
捕捉試薬、または第１の検出試薬、または第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
試料中の目的の分析物を検出する方法であって、
ａ．該分析物を、（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬を含む表面上の該捕捉試薬；（ｉｉ）第１の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第１の検出試薬；ならびに（ｉｉｉ）第２の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第２の検出試薬に結合させ；それにより、該捕捉試薬、該分析物ならびに該第１および第２の検出試薬を含み、さらにアンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬を含む該表面上の複合体を形成させること；
ｂ．該第１および第２のプローブが近接されることを必要とする伸長プロセスを用いて、該第２のプローブを伸長して、該アンカー配列に対して相補的であるアンカー配列相補体を含む伸長配列を形成させること；
ｃ．該アンカー配列を該アンカー配列相補体にハイブリダイズさせること；ならびに
ｄ．該表面に結合した伸長配列の量を測定すること
を含み、
ここで前記方法は請求項１に記載のキットを用いて実施される、
前記方法。
【請求項４】
捕捉試薬、または第１の検出試薬、または第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、
受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は分析物に対する抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
アンカーオリゴヌクレオチド配列は１本鎖オリゴヌクレオチド配列、または２本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
伸長配列は１つまたはそれ以上の検出配列をさらに含み、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることをさらに含む、または、
伸長配列は１つまたはそれ以上の標識塩基をさらに含み、測定工程は１つまたはそれ以上の標識塩基の存在を検出することをさらに含む、
請求項３に記載の方法。
【請求項８】
伸長配列は１つまたはそれ以上の修飾塩基をさらに含み、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の修飾塩基と結合することが可能な複数の検出可能な部分と接触させることをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
１つまたはそれ以上の修飾塩基はアプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含み、複数の検出可能な部分は１つまたはそれ以上の修飾塩基および検出可能な標識の結合パートナーを各々含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１つまたはそれ以上の修飾塩基はストレプトアビジンを含み、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む、または、
１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含み、複数の検出可能な部分はストレプトアビジンおよび検出可能な標識を各々含む、または、
１つまたはそれ以上の修飾塩基はアビジンを含み、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む、または、
１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含み、複数の検出可能な部分はアビジンおよび検出可能な標識を各々含む、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）は分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含む、請求項３に記載の方法：
（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する検出試薬、または、
（ｉ）分析物に関する検出試薬；および（ｉｉ）表面上の捕捉試薬。
【請求項１２】
工程（ａ）は分析物を以下の種に同時にまたは実質的に同時に結合させることを含む、請求項３に記載の方法：
（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する検出試薬。
【請求項１３】
伸長工程はプローブを鋳型核酸配列に結合させることおよびプローブをポリメラーゼ連鎖反応法によって伸長させることを含む、または、
伸長工程はプローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること、および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させることを含む、
請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
伸長されるプローブはプローブ伸長後に表面上に局在化したままで残る、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
複合体は伸長工程後に表面に結合したままで残り、
必要に応じて、伸長されるプローブは表面上の複合体の位置の１０〜１００ｎｍ内のポジションでアンカー試薬に結合される、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
伸長工程はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自己持続合成反応）、または等温性の増幅方法を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
伸長工程は等温性の増幅方法を含み、
必要に応じて、等温性の増幅方法はヘリカーゼ依存的な増幅またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
伸長プロセスは、工程（ａ）において形成される複合体を、（ｉ）第２のプローブに対して相補的な内部配列および（ｉｉ）第１のプローブの非オーバーラップ領域に対して相補的な２つの末端配列を含むコネクター配列と接触させることを含み、
必要に応じて、コネクターオリゴヌクレオチドの２つの末端配列をライゲーションして、第１および第２のプローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させることをさらに含む、
請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
伸長プロセスは、工程（ａ）において形成される複合体を、第１のプローブの第１の領域および第２のプローブにおける第１の領域に対して相補的な第１のコネクタープローブ配列を含む第１のコネクターオリゴヌクレオチド配列、および第１のプローブの第２の非オーバーラップ領域および第２のプローブの第２の非オーバーラップ領域に対して相補的な第２のプローブ配列を含む第２のコネクターオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、
必要に応じて、第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチドをライゲーションして、第１および第２のプローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させることをさらに含む、
請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
表面は電極を含み、測定工程は電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンスシグナルを生成することをさらに含み、
必要に応じて、粒子を電極上で採取することおよび電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンスシグナルを生成することをさらに含む、
請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
測定工程は伸長配列を検出可能な標識を有する検出プローブに結合させること、検出可能な標識を測定すること、および測定値を試料中の分析物の量と相関させることをさらに含み、検出プローブは伸長配列の領域に対して相補的である核酸配列を含み、
必要に応じて、検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはその組み合わせの測定によって測定される、または、検出可能な標識はＥＣＬ標識であり、測定工程はＥＣＬシグナルを測定することを含む、
請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
表面は粒子を含む、または、
表面は複数の別個の結合ドメインを含み、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する、または、
表面は複数の別個の結合ドメインを含み、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する、
請求項１に記載のキット。
【請求項２３】
表面はマルチウェルプレートのウェルを含み、
必要に応じて、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含み、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内に２つの別個の結合ドメインに位置する、または、
ウェルは複数の別個の結合ドメインを含み、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内の同じ結合ドメインに位置する、
請求項１に記載のキット。
【請求項２４】
捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上で１０〜１００ｎｍ内にある、請求項１に記載のキット。
【請求項２５】
表面は電極を含む、請求項１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
２０１３年３月１３日出願の米国仮出願第６１／７７９，０５０号、および２０１３年１２月２３日出願の米国仮出願第６１／９１９，８８７号に対する参照がなされ、それぞれ、各々の開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、免疫アッセイを行うための改善された方法を対象とする。その方法を設計して、免疫アッセイにおいてシグナルが増幅されるおよびそこで用いられる免疫アッセイ複合体がアンカーされる。
【背景技術】
【０００３】
文献のかなりの部分が、サンプル中の目的とする分析物の感度の良い測定のための、結合反応、例えば、抗原−抗体反応、核酸ハイブリダイゼーションおよび受容体−リガンド反応を用いる技術について明らかとしている。多くの生化学的な結合システムにおける高度の特異性により、基礎研究、人間および獣医学領域の診断、環境モニタリングおよび産業的な試験を含め種々のマーケットにおいて、価値のある多くのアッセイ方法およびシステムが導かれてきた。目的の分析物の存在は、結合反応における分析物の関与を直接的に測定することによって測定され得る。いくつかのアプローチでは、この関与は、１つまたはそれ以上の結合物質に付着させた観察可能な標識の測定を通して示され得る。
【０００４】
サンドイッチ免疫アッセイ形式は、優れた感度および特異性を多くの適用において提供するが、いくつかの分析物は従来の免疫アッセイ技術による検出に関しては低くすぎる濃度で存在している。サンドイッチ免疫アッセイの性能は、検出抗体の非特異的な結合ならびに高いオフ率（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の抗体を含むサンドイッチ複合体の不安定性によっても制限される可能性がある。しかしながら、従来の免疫アッセイ技術を改変して感度および特異性を改善する取組みは、アッセイの感度および特異性に影響力をおよぼしうる、各工程での非能率性によって妨げられうる、より複雑で人手を要するプロトコールをしばしば生み出す。たとえば、複数の結合事象および／または反応を必要とする複合的なアッセイにおいて、１つの事象または反応が至適未満である場合には、総合的にアッセイの感度および特異性が影響を受けうる。感度を改善し、非特異的な結合を低減させ、サンドイッチ複合体の安定性を改善することによってサンドイッチ免疫アッセイ性能を改善するための新規な技術についての必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、以下の特定の実施形態を企図している。当業者によって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変、付加および修正を、本明細書に記載した実施形態に対してなし得る。このような改変、付加および修正は、特許請求の範囲の範囲内に収まることが意図される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態（１）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、該分析物を、（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬を含む表面上の該捕捉試薬、およびアンカー試薬；ならびに（ｉｉ）核酸プローブに連結された、該分析物に関する検出試薬に結合させ；それにより、該捕捉試薬、該分析物および該検出試薬を含む該表面上に複合体を形成させること；該プローブを伸長させて、該アンカー試薬に結合するアンカー領域を含む伸長配列を形成させること；該伸長配列を該アンカー試薬に結合させること；ならびに該表面に結合した伸長配列の量を測定することを含む方法。
【０００７】
実施形態（１）では、捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ（ｍｉｍｉｔｏｐｅ）、またはアプタマーであってもよい。特定の実施形態では、捕捉試薬は、抗体である。検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよく、特定の実施形態では、検出試薬は、抗体である。実施形態（１）の１つの特定の例では、捕捉および検出試薬は、分析物に対する抗体である。アンカー試薬は、オリゴヌクレオチド配列、アプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含むことができる；場合により、アンカー領域は、アプタマーを含むことができ、アンカー試薬は、アプタマーリガンドを含むことができる。アンカー領域は核酸配列を含むことができ、アンカー試薬はＤＮＡ結合タンパク質を含むことができる。アンカー試薬はオリゴヌクレオチド配列を含むことができ、アンカー試薬は相補的なオリゴヌクレオチド配列を含むことができる。アンカー領域は、１本鎖オリゴヌクレオチド配列または２本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むことができる。
【０００８】
実施形態（１）の結合工程は、アンカー領域とアンカー試薬との間に三重らせんを形成させることをさらに含むことができる。方法は、結合工程の前に、アンカー領域を変性させて、１本鎖配列を曝露させること；結合工程の前にアンカー領域をヘリカーゼ活性に曝露すること；および／または結合工程の前に、アンカー領域をヌクレアーゼ処理に曝露することをさらに含むことができる。この実施形態では、アンカー領域は１つまたはそれ以上のハプテン−修飾塩基を含むことができ、アンカー試薬は１つまたはそれ以上のハプテンに特異的な抗体を含むことができる；および／またはアンカー領域は１つまたはそれ以上のリガンド−修飾塩基を含むことができ、アンカー試薬はリガンドに特異的な１つまたはそれ以上の受容体を含むことができる。伸長配列は１つまたはそれ以上の検出配列をさらに含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることを含むことができる；伸長配列は１つまたはそれ以上の修飾塩基を含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の修飾塩基と結合することが可能な複数の検出可能な部分と接触させることを含むことができる；および／または伸長配列は１つまたはそれ以上の標識塩基を含むことができ、測定工程は１つまたはそれ以上の標識塩基の存在を検出することをさらに含むことができる。この実施形態では、１つまたはそれ以上の修飾塩基はアプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含み、複数の検出可能な部分は１つまたはそれ以上の修飾塩基および検出可能な標識の結合パートナーを各々含む。１つまたはそれ以上の修飾塩基はストレプトアビジンを含むことができ、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；および／または１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含むことができ、複数の検出可能な部分はストレプトアビジンおよび検出可能な標識を各々含む；および／または１つまたはそれ以上の修飾塩基はアビジンを含むことができ、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；および／または１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含むことができ、複数の検出可能な部分はアビジンおよび検出可能な標識を各々含む。
【０００９】
実施形態（１）の第１の工程は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する検出試薬；または実施形態（１）の第１の工程は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）分析物に関する検出試薬；および（ｉｉ）表面上の捕捉試薬；および／または第１の工程は、分析物を以下の種を同時にまたは実質的に同時に結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する検出試薬。
【００１０】
実施形態（１）の伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させることおよびプローブをポリメラーゼ連鎖反応法によって伸長させること；および／またはプローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること；および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させることを含むことができる。この実施形態では、伸長されるプローブは、プローブ伸長後に表面上に局在化したままで残ることができる。したがって、複合体は伸長工程後に表面に結合したままで残ることができ、例えば、伸長されるプローブは、表面上の複合体の位置の１０〜１００ｕｍ内のポジションで、アンカー試薬に結合される。
【００１１】
実施形態（１）の伸長工程は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自己持続合成反応）、または等温性の増幅方法を含むことができる。一実施形態では、伸長工程は、等温性の増幅方法、例えば、ヘリカーゼ依存的な増幅またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含むことができる。
【００１２】
実施形態（１）において参照される表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がプレートのウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する；および／または表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する。一実施形態では、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にあってもよい。表面は電極を含むことができ、測定工程は電位波形（ｖｏｌｔａｇｅ  ｗａｖｅｆｏｒｍ）を適用して、エレクトロケミルミネッセンス（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）シグナルを生成することをさらに含むことができ、場合により、方法は、粒子を電極上で採取することおよび電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンスシグナルを生成することを含む。
【００１３】
実施形態（１）の測定工程は、伸長配列を検出可能な標識を有する検出プローブに結合させること、検出可能な標識を測定すること、および測定値を試料中の分析物の量と相関させることをさらに含むことができ、ここで、検出プローブは、伸長配列の領域に対して相補的である核酸配列を含む。検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定することができる。実施形態（１）の特定の例では、検出可能な標識はＥＣＬ標識であり、測定工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【００１４】
実施形態（２）：試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬、および（ｉｉ）アンカー試薬を含む表面；ならびに（ｂ）核酸プローブに連結された、該分析物に関する検出試薬を含むキット。
【００１５】
実施形態（２）のアンカー試薬は、オリゴヌクレオチド配列、アプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含むことができ、捕捉試薬は抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができる。特定の実施形態では、捕捉試薬は抗体を含むことができ、および／または検出試薬は抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、もしくはアプタマーを含むことができる。キットの特定の実施形態では、検出試薬は、抗体である。
【００１６】
実施形態（２）のキットの表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。キットの表面がプレートのウェルである場合、表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する；および／または表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する。キットの特定の例では、表面はウェルであり、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にあってもよい。さらには、キットの表面は、電極を含むことができる。
【００１７】
実施形態（３）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を、（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬を含む表面上の該捕捉試薬、およびアンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬；ならびに（ｉｉ）核酸プローブに連結された、分析物に関する検出試薬に結合させ；それにより、該捕捉試薬、該分析物および該検出試薬を含む該表面上に複合体を形成させること；（ｂ）該プローブを伸長して、該アンカー配列に対して相補的であるアンカー配列相補体を含む伸長配列を形成させること；（ｃ）該アンカー配列を該アンカー配列相補体にハイブリダイズさせること；ならびに（ｄ）該表面に結合した伸長配列の量を測定することを含む方法。
【００１８】
実施形態（３）では、捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよく、特定の例では、捕捉試薬は、抗体である。同様に、検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであり、実施形態（３）の特定の例では、検出試薬は、抗体である。実施形態（３）の１つの例では、捕捉および検出試薬は、分析物に対する抗体である。アンカーオリゴヌクレオチド配列は、１本鎖オリゴヌクレオチド配列または２本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むことができる。伸長配列は１つまたはそれ以上の検出配列をさらに含んでいてもよく、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることをさらに含むことができる；あるいはまたはさらには、伸長配列は１つまたはそれ以上の修飾塩基をさらに含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の修飾塩基と結合することが可能な複数の検出可能な部分と接触させることをさらに含むことができる。特定の例では、伸長配列は１つまたはそれ以上の標識塩基をさらに含むことができ、測定工程は１つまたはそれ以上の標識塩基の存在を検出することをさらに含むことができる。１つまたはそれ以上の修飾塩基はアプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含み、複数の検出可能な部分は１つまたはそれ以上の修飾塩基および検出可能な標識の結合パートナーを各々含む。１つまたはそれ以上の修飾塩基はストレプトアビジンを含むことができ、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含み、複数の検出可能な部分はストレプトアビジンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はアビジンを含み、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；および／または１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含み、複数の検出可能な部分はアビジンおよび検出可能な標識を各々含む。
【００１９】
実施形態（３）の工程（ａ）は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する検出試薬。あるいは、工程（ａ）は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）分析物に関する検出試薬；および（ｉｉ）表面上の捕捉試薬。さらなる別の例では、工程（ａ）は、分析物を以下の種に同時にまたは実質的に同時に結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する検出試薬。
【００２０】
実施形態（３）の伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させることおよびプローブをポリメラーゼ連鎖反応法によって伸長させることを含むことができる。あるいは、伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること、および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させることを含むことができる。伸長されるプローブは、プローブ伸長後に表面上に局在化したままで残ることができ、例えば、複合体は伸長工程後に表面に結合したままで残る。一例では、伸長されるプローブは、表面上の複合体の位置の１０〜１００ｕｍ内のポジションで、アンカー試薬に結合される。この特定の実施形態では、伸長工程は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自己持続合成反応）、または等温性の増幅方法を含むことができる。たとえば、伸長工程は、等温性の増幅方法、例えば、ヘリカーゼ依存的な増幅またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含むことができる。
【００２１】
実施形態（３）の表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がプレートのウェルである場合、それは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する；表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する。表面がウェルである場合、それは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する；捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にあってもよい。特定の例では、表面は電極を含むことができ、測定工程は電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンス（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）シグナルを生成することをさらに含むことができる。方法は、粒子を電極上で採取することおよび電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンスシグナルを生成することをさらに含むことができる。測定工程は、伸長配列を検出可能な標識を有する検出プローブに結合させること、検出可能な標識を測定すること、および測定値を試料中の分析物の量と相関させることをさらに含むことができ、ここで、検出プローブは、伸長配列の領域に対して相補的である核酸配列を含む。この実施形態では、検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ−ｅｓｃｅｎｃｅ）、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定される。たとえば、検出可能な標識はＥＣＬ標識であり、測定工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【００２２】
実施形態（４）：試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬、および（ｉｉ）アンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬を含む表面；ならびに（ｂ）核酸プローブに連結された、該分析物に関する検出試薬を含むキット。
【００２３】
実施形態（４）のキットは、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含む捕捉試薬を含む。特定の例では、捕捉試薬は、抗体を含むことができる。同様に、検出試薬は抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、特に、検出試薬は抗体を含むことができる。
【００２４】
実施形態（４）のキットは、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる表面を含む。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置し、例えば、表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。たとえば、捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にある。実施形態（４）の表面は、電極を含むことができる。
【００２５】
実施形態（５）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を、（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬を含む表面上の該捕捉試薬、およびアンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬；（ｉｉ）第１の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第１の検出試薬；ならびに（ｉｉｉ）第２の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第２の検出試薬に結合させること；それにより、結合試薬、該分析物ならびに該第１および第２の検出試薬を含む該表面上に複合体を形成させること；（ｂ）該第１および第２のプローブが近接されることを必要とする伸長プロセスを用いて、該第２のプローブを伸長して、該アンカー配列に対して相補的であるアンカー配列相補体を含む伸長配列を形成させること；（ｃ）該アンカー配列を該アンカー配列相補体にハイブリダイズさせること；ならびに（ｄ）該表面に結合した伸長配列の量を測定することを含む方法。
【００２６】
実施形態（５）の捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよい。特定の例では、捕捉試薬は、抗体である。同様に、第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであり、特定の例では、第１の検出試薬は、抗体である。第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよく、特定の例では、第２の検出試薬は、抗体である。より詳細には、捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【００２７】
実施形態（５）では、アンカーオリゴヌクレオチド配列は、１本鎖オリゴヌクレオチド配列または２本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むことができる。この実施形態では、伸長配列は１つまたはそれ以上の検出配列をさらに含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることをさらに含むことができる。伸長配列は１つまたはそれ以上の修飾塩基も含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の修飾塩基と結合することが可能な複数の検出可能な部分と接触させることをさらに含むことができる。伸長配列は１つまたはそれ以上の標識塩基をさらに含むことができ、測定工程は１つまたはそれ以上の標識塩基の存在を検出することをさらに含むことができる。１つまたはそれ以上の修飾塩基はアプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含むことができ、複数の検出可能な部分は１つまたはそれ以上の修飾塩基および検出可能な標識の結合パートナーを各々含む。たとえば、１つまたはそれ以上の修飾塩基はストレプトアビジンを含み、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含み、複数の検出可能な部分はストレプトアビジンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はアビジンを含み、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；および／または１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含み、複数の検出可能な部分はアビジンおよび検出可能な標識を各々含む。
【００２８】
実施形態（５）の工程（ａ）は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する検出試薬。あるいは、工程（ａ）は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）分析物に関する検出試薬；および（ｉｉ）表面上の捕捉試薬；または工程（ａ）は、分析物を以下の種を同時にもしくは実質的に同時に結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する検出試薬。
【００２９】
実施形態（５）の伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させることおよびプローブをポリメラーゼ連鎖反応法によって伸長させることを含むことができる。伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること、および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させることをさらに含むことができる。伸長されるプローブは、プローブ伸長後に表面上に局在化したままで残ることができ、例えば、複合体は伸長工程後に表面に結合したままで残る。伸長されるプローブは、表面上の複合体の位置の１０〜１００ｕｍ内のポジションで、アンカー試薬に結合されてもよい。伸長工程は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自己持続合成反応）、または等温性の増幅方法を含むことができる。特定の例では、伸長工程は、等温性の増幅方法を含むことができ、例えば、ヘリカーゼ依存的な増幅またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。
【００３０】
実施形態（５）の伸長プロセスは、工程（ａ）において形成される複合体を、（ｉ）第２のプローブに対して相補的な内部配列および（ｉｉ）第１のプローブの非オーバーラップ領域に対して相補的な２つの末端配列を含むコネクター配列と接触させることを含むことができる。方法は、コネクターオリゴヌクレオチドの２つの末端配列をライゲーションして、第１および第２のプローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させることをさらに含むことができる。あるいは、伸長プロセスは、実施形態（５）の工程（ａ）において形成される複合体を、第１のプローブの第１の領域および第２のプローブにおける第１の領域に対して相補的な第１のコネクタープローブ配列を含む第１のコネクターオリゴヌクレオチド配列、ならびに第１のプローブの第２の非オーバーラップ領域および第２のプローブの第２の非オーバーラップ領域に対して相補的な第２のプローブ配列を含む第２のコネクターオリゴヌクレオチドと接触させること；ならびに、場合により、第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチドをライゲーションして、第１および第２のプローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させることを含むことができる。
【００３１】
実施形態（５）の表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がプレートのウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。表面は複数の別個の結合ドメインも含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する。表面がプレートのウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にあってもよい。特定の例では、表面は電極を含むことができ、測定工程は電位波形を適用して、エレクトロケミルミネッセンス（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）シグナルを生成することをさらに含むことができ、場合により、実施形態（５）の方法は、粒子を電極上で採取することおよび電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンスシグナルを生成することをさらに含む。
【００３２】
実施形態（５）の測定工程は、伸長配列を検出可能な標識を有する検出プローブに結合させること、検出可能な標識を測定すること、および測定値を試料中の分析物の量と相関させることをさらに含むことができ、ここで、検出プローブは、伸長配列の領域に対して相補的である核酸配列を含む。検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定することができる。特定の例では、検出可能な標識はＥＣＬ標識であり、測定工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【００３３】
実施形態（６）：試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬、および（ｉｉ）アンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬を含む表面；（ｂ）第１の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第１の検出試薬；ならびに（ｃ）第２の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第２の検出試薬を含むキット。
【００３４】
実施形態（６）の捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、特定の例では、捕捉試薬は、抗体を含むことができる。同様に、第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、特定の例では、第１の検出試薬は、抗体を含むことができる。類似して、第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、特定の例では、第２の検出試薬は、抗体を含むことができる。
【００３５】
実施形態（６）の表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する；および／または、表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にあってもよい。特定の例では、表面は、電極を含むことができる。
【００３６】
実施形態（７）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を、（ｉ）捕捉試薬を含む表面上の該分析物に関する該捕捉試薬、およびアンカー試薬；（ｉｉ）第１の近接プローブを含む、該分析物に関する第１の検出試薬、および（ｉｉｉ）第２の近接プローブを含む、該分析物に関する第２の検出試薬に結合させ；それにより、該捕捉試薬、該分析物ならびに該第１および第２の検出試薬を含む該表面上に検出複合体を形成させること；（ｂ）（ｃ）において形成される該検出複合体を、（ｉ）該第２の近接プローブに対して相補的な内部配列および（ｉｉ）該第１の近接プローブの非オーバーラップ領域に対して相補的な２つの末端配列を含むコネクター配列と接触させること；（ｃ）該コネクター配列を該第１および第２の近接プローブにハイブリダイズさせること；（ｄ）コネクターオリゴヌクレオチドの２つの末端配列をライゲーションして、該第１および第２の近接プローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させること；（ｅ）該第２の近接プローブを該標的配列のローリングサークル増幅によって伸長させて、該アンカー試薬に結合する結合ドメインを含むアンプリコンを生成すること；（ｆ）該アンプリコンを該アンカー試薬に結合させること；ならびに（ｇ）該表面上のアンプリコンの量を測定することを含む方法。
【００３７】
実施形態（８）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を：（ｉ）捕捉試薬を含む表面上の該分析物に関する該捕捉試薬、およびアンカー試薬；（ｉｉ）第１の近接プローブを含む、該分析物に関する第１の検出試薬、および（ｉｉｉ）第２の近接プローブを含む、該分析物に関する第２の検出試薬に結合させ；それにより、該捕捉試薬、該分析物ならびに該第１および第２の検出試薬を含む該表面上に検出複合体を形成させること；（ｂ）（ｃ）において形成される検出複合体を、第１のコネクターオリゴヌクレオチドおよび第２のコネクターオリゴヌクレオチドと接触させること、ここで、（ｉ）該第１のコネクターの第１の末端および該第２のコネクターの第１の末端は、該第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に対して相補的であるならびに（ｉｉ）該第１のコネクターの第２の末端および該第２のコネクターの第２の末端は、該第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に対して相補的である；（ｃ）該第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチドを該第１および第２の近接プローブにハイブリダイズさせること；（ｄ）該第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチドをライゲーションして、該第１および第２の近接プローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させること；（ｅ）該第２の近接プローブを該標的配列のローリングサークル増幅によって伸長させて、該アンカー試薬に結合する結合ドメインを含むアンプリコンを生成すること；（ｆ）該アンプリコンを該アンカー試薬に結合させること；ならびに（ｇ）該表面上のアンプリコンの量を測定することを含む方法。
【００３８】
実施形態（７）および（８）の捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよい、特定の例では、捕捉試薬は、抗体である。類似して、第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよく、例えば、第１の検出試薬は、抗体である。さらに、第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、第２の検出試薬は、抗体である。実施形態（７）および（８）の特定の例では、捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【００３９】
実施形態（７）および（８）のアンカー試薬は、オリゴヌクレオチド配列、アプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含むことができる。一例では、結合ドメインはアプタマーを含むことができ、アンカー試薬はアプタマーリガンドを含むことができる。結合ドメインは核酸配列を含むことができ、アンカー試薬はＤＮＡ結合タンパク質を含むことができる；および／またはアンカー試薬はオリゴヌクレオチド配列を含むことができ、アンプリコンは相補的なオリゴヌクレオチド配列を含むことができる。
【００４０】
実施形態（７）および（８）のアンプリコンは１つまたはそれ以上の検出配列をさらに含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることをさらに含むことができる。さらには、アンプリコンは１つまたはそれ以上の修飾塩基をさらに含んでいてもよく、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の修飾塩基と結合することが可能な複数の検出可能な部分と接触させることをさらに含むことができる。さらにまた、アンプリコンは１つまたはそれ以上の標識塩基をさらに含んでいてもよく、測定工程は１つまたはそれ以上の標識塩基の存在を検出することをさらに含むことができる。１つまたはそれ以上の修飾塩基はアプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含むことができ、複数の検出可能な部分は１つまたはそれ以上の修飾塩基および検出可能な標識の結合パートナーを各々含む。１つまたはそれ以上の修飾塩基はストレプトアビジンを含むことができ、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含むことができ、複数の検出可能な部分はストレプトアビジンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はアビジンを含むことができ、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；および／または１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含むことができ、複数の検出可能な部分はアビジンおよび検出可能な標識を各々含む。
【００４１】
実施形態（７）および（８）の工程（ａ）は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；ならびに（ｉｉ）分析物に関する第１および第２の検出試薬。あるいは、工程（ａ）は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）分析物に関する第１および第２の検出試薬；および（ｉｉ）表面上の捕捉試薬。さらにまた、工程（ａ）は、分析物を以下の種に同時にまたは実質的に同時に結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；ならびに（ｉｉ）分析物に関する第１および第２の検出試薬。
【００４２】
実施形態（７）および（８）のアンプリコンは、プローブ伸長後に表面上に局在化したままで残ることができる。複合体は、伸長工程後に表面に結合したままで残ることができる。たとえば、アンプリコンは、表面上の複合体の位置の１０〜１００ｕｍ内のポジションで、アンカー試薬に結合する。
【００４３】
実施形態（７）および（８）の表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がプレートのウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する。表面がプレートのウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。特定の例では、捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にある。
【００４４】
さらにまた、表面は電極を含むことができ、測定工程は電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンス（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）シグナルを生成することを含むことができる。これらの実施形態（（７）および（８））では、方法は、粒子を電極上で採取することおよび電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンスシグナルを生成することをさらに含むことができる。測定工程は、アンプリコンを検出可能な標識を有する検出プローブに結合させること、検出可能な標識を測定すること、および測定値を試料中の分析物の量と相関させることを含むことができ、ここで、検出プローブは、アンプリコンの領域に対して相補的である核酸配列を含む。検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定される。たとえば、検出可能な標識はＥＣＬ標識であり、測定工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【００４５】
実施形態（９）：試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬、および（ｉｉ）アンカー試薬を含む表面；（ｂ）第１の近接プローブを含む該分析物に関する第１の検出試薬；（ｃ）第２の近接プローブを含む該分析物に関する第２の検出試薬；ならびに（ｄ）（ｉ）該第２の近接プローブに対して相補的な内部配列および（ｉｉ）該第１の近接プローブの非オーバーラップ領域に対して相補的な２つの末端配列を含むコネクター配列を含むキット。
【００４６】
実施形態（１０）：試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬、および（ｉｉ）アンカー試薬を含む表面；（ｂ）第１の近接プローブを含む該分析物に関する第１の検出試薬；（ｃ）第２の近接プローブを含む該分析物に関する第２の検出試薬；ならびに（ｄ）（ｉ）第１のコネクターオリゴヌクレオチドおよび（ｉｉ）第２のコネクターオリゴヌクレオチドを含み、ここで、（ｘ）該第１のコネクターの第１の末端および該第２のコネクターの第１の末端は、該第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に対して相補的であるならびに；（ｙ）該第１のコネクターの第２の末端および該第２のコネクターの第２の末端は、該第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に対して相補的である、キット。
【００４７】
実施形態（９）および（１０）の捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができる。特定の例では、捕捉試薬は、抗体を含むことができる。第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、特定の例では、第１の検出試薬は、抗体を含むことができる。第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、特定の例では、第２の検出試薬は、抗体を含むことができる。
【００４８】
実施形態（９）および（１０）の表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がプレートのウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する。表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。特定の例では、捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にある。
【００４９】
実施形態（９）および（１０）の表面は、電極を含むことができる。
【００５０】
実施形態（１１）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を、（ｉ）捕捉試薬を含む表面上の該分析物に関する該捕捉試薬、およびアンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬；（ｉｉ）第１の近接プローブを含む、該分析物に関する第１の検出試薬、および（ｉｉｉ）第２の近接プローブを含む、該分析物に関する第２の検出試薬に結合させ；それにより、該捕捉試薬、該分析物ならびに該第１および第２の検出試薬を含む該表面上に検出複合体を形成させること；（ｂ）（ｃ）において形成される該検出複合体を、（ｉ）該第２の近接プローブに対して相補的な内部配列、（ｉｉ）該第１の近接プローブの非オーバーラップ領域に対して相補的な２つの末端配列および（ｉｉｉ）該アンカー配列とマッチングする配列を含むコネクター配列と接触させること；（ｃ）該コネクター配列を該第１および第２の近接プローブにハイブリダイズさせること；（ｄ）コネクターオリゴヌクレオチドの２つの末端配列をライゲーションして、該第１および第２の近接プローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させること；（ｅ）該第２の近接プローブを該標的配列のローリングサークル増幅によって伸長させて、該アンカー試薬に対して相補的である複数のアンカー配列相補体を含むアンプリコンを生成すること；（ｆ）該アンカー配列を該アンカー配列相補体の１つにハイブリダイズさせること；および（ｇ）該表面上のアンプリコンの量を測定することを含む方法。
【００５１】
実施形態（１２）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を、（ｉ）捕捉試薬を含む表面上の該分析物に関する該捕捉試薬、およびアンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬；（ｉｉ）第１の近接プローブを含む、該分析物に関する第１の検出試薬、および（ｉｉｉ）第２の近接プローブを含む、該分析物に関する第２の検出試薬に結合させ；それにより、該捕捉試薬、該分析物ならびに該第１および第２の検出試薬を含む該表面上に検出複合体を形成させること；（ｂ）（ａ）において形成される検出複合体を、第１のコネクターオリゴヌクレオチドおよび第２のコネクターオリゴヌクレオチドと接触させること、ここで、（ｉ）該第１のコネクターの第１の末端および該第２のコネクターの第１の末端は、該第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に対して相補的である、（ｉｉ）該第１のコネクターの第２の末端および該第２のコネクターの第２の末端は、該第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に対して相補的である；ならびに（ｉｉｉ）該第１および／または第２のコネクターは、該アンカー配列とマッチングする配列も含む；（ｃ）該第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチドを該第１および第２の近接プローブにハイブリダイズさせること；（ｄ）該第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチドをライゲーションして、該第１および第２の近接プローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させること；（ｅ）該第２の近接プローブを該標的配列のローリングサークル増幅によって伸長させて、該アンカー試薬に対して相補的である複数のアンカー配列相補体を含むアンプリコンを生成すること；（ｆ）該アンカー配列を該アンカー配列相補体の１つにハイブリダイズさせること；および（ｇ）該表面上のアンプリコンの量を測定することを含む方法。
【００５２】
実施形態（１１）および（１２）の捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである。特定の例では、捕捉試薬は、抗体である。第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであり、特定の例では、第１の検出試薬は、抗体である。同様に、第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであり、特定の例では、第２の検出試薬は、抗体である。一例では、第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【００５３】
実施形態（１１）および（１２）のアンプリコンは１つまたはそれ以上の検出配列をさらに含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることを含むことができる。さらには、アンプリコンは１つまたはそれ以上の修飾塩基も含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の修飾塩基と結合することが可能な複数の検出可能な部分と接触させることを含むことができる。アンプリコンは１つまたはそれ以上の標識塩基を追加的に含み、測定工程は１つまたはそれ以上の標識塩基の存在を検出することを含むことができる。１つまたはそれ以上の修飾塩基はアプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含み、複数の検出可能な部分は１つまたはそれ以上の修飾塩基および検出可能な標識の結合パートナーを各々含む。１つまたはそれ以上の修飾塩基はストレプトアビジンを含むことができ、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含むことができ、複数の検出可能な部分はストレプトアビジンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はアビジンを含むことができ、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；および／または１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含むことができ、複数の検出可能な部分はアビジンおよび検出可能な標識を各々含む。
【００５４】
実施形態（１１）および（１２）の工程（ａ）は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；ならびに（ｉｉ）分析物に関する第１および第２の検出試薬。あるいは、工程（ａ）は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）分析物に関する第１および第２の検出試薬；および（ｉｉ）表面上の捕捉試薬。さらにまた、工程（ａ）は、分析物を以下の種に同時にまたは実質的に同時に結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；ならびに（ｉｉ）分析物に関する第１および第２の検出試薬。
【００５５】
実施形態（１１）および（１２）におけるアンプリコンは、プローブ伸長後に表面上に局在化したままで残ることができ、ならびに、場合により、複合体は伸長工程後に表面に結合したままで残る。たとえば、アンプリコンは、表面上の複合体の位置の１０〜１００ｕｍ内のポジションで、アンカー試薬に結合する。
【００５６】
実施形態（１１）および（１２）の表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。場合により、表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する。表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にあってもよい。
【００５７】
実施形態（１１）および（１２）の表面は電極を含むことができ、測定工程は電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンス（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）シグナルを生成することを含むことができる。場合により、実施形態（１１）および（１２）は、粒子を電極上で採取することおよび電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンスシグナルを生成することをさらに含む。測定工程は、アンプリコンを検出可能な標識を有する検出プローブに結合させること、検出可能な標識を測定すること、および測定値を試料中の分析物の量と相関させることを含むことができ、ここで、検出プローブは、アンプリコンの領域に対して相補的である核酸配列も含む。検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定することができる。一例では、検出可能な標識はＥＣＬ標識であり、測定工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【００５８】
実施形態（１１）および（１２）の試料は１つまたはそれ以上の分析物分子を含むことができ、表面は表面上に位置する複数の解像可能な結合領域にわたって分布する１つまたはそれ以上の分析物分子に関する複数の捕捉試薬を含むことができ、方法は、（ｘ）１つまたはそれ以上の分析物分子を、表面上の１つまたはそれ以上の捕捉試薬に結合させること；（ｙ）各結合領域における分析物分子の存在または非存在を決定すること；ならびに（ｚ）分析物分子を含有する結合領域の数および／または分析物分子を含有しない分析物ドメインの数を同定することを含むことができる。測定工程は、表面からの光学的なシグナルをイメージングして、複数のピクセルを含むイメージを生成することを含むことができ、各解像可能な結合領域は、イメージにおいて１つまたはそれ以上のピクセルへとマップされる。解像可能な結合領域はアレイの要素であってもよいおよび／または解像可能な結合領域は個々の粒子に単離されるように構成される。各解像可能な結合領域は、＜１００ｎＬの体積を有する個々のナノ−ウェルであってもよい、例えば、ここで、少なくとも９９％の結合領域はゼロまたは１つの分析物分子を含有する、少なくとも約９５％の結合領域はゼロまたは１つの分析物分子を含有する、少なくとも約８０％の結合領域はゼロまたは１つの分析物分子を含有する、および／または少なくとも約５０％の結合領域はゼロまたは１つの分析物分子を含有する。実施形態（１１）および（１２）において試料中の分析物分子の濃度は、少なくとも１つまたは１つの分析物分子を含有する、結合領域の数のキャリブレーション曲線、ポアソン分布分析および／またはガウス分布分析を用いて少なくとも部分的に決定されてもよい。
【００５９】
実施形態（１１）および（１２）では、試料は１つまたはそれ以上の分析物分子を含むことができ、表面は分析物分子に関する複数の結合試薬を各々含む複数の粒子を含むことができ、ここで、複数の粒子は複数の解像可能な結合領域にわたって分布し、方法は、（ｉ）１つまたはそれ以上の分析物分子を、表面上の１つまたはそれ以上の結合試薬に結合させること；ならびに（ｉｉ）複数の粒子を解像可能な結合領域のアレイにわたって分布させること；ならびに（ｉｉｉ）分析物分子を含有する結合領域の数および／または分析物分子を含有しない結合領域の数を同定するために、各解像可能な結合領域における分析物分子の存在または非存在を決定することを含むことができる。
【００６０】
実施形態（１３）：試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬、および（ｉｉ）アンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬を含む表面；（ｂ）第１の近接プローブを含む該分析物に関する第１の検出試薬；（ｃ）第２の近接プローブを含む該分析物に関する第２の検出試薬；ならびに（ｄ）（ｉ）該第２の近接プローブに対して相補的な内部配列および（ｉｉ）該第１の近接プローブの非オーバーラップ領域に対して相補的な２つの末端配列を含むコネクター配列を含むキット。
【００６１】
実施形態（１４）：試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬、および（ｉｉ）アンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬を含む表面；（ｂ）第１の近接プローブを含む該分析物に関する第１の検出試薬；（ｃ）第２の近接プローブを含む該分析物に関する第２の検出試薬；ならびに（ｄ）（ｉ）第１のコネクターオリゴヌクレオチドおよび（ｉｉ）第２のコネクターオリゴヌクレオチドを含み；ここで、（ｘ）該第１のコネクターの第１の末端および該第２のコネクターの第１の末端は、該第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に対して相補的であるならびに；（ｙ）該第１のコネクターの第２の末端および該第２のコネクターの第２の末端は、該第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に対して相補的である、キット。
【００６２】
実施形態（１３）および（１４）の捕捉試薬は抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、例えば、捕捉試薬は抗体を含むことができる。同様に、第１の検出試薬は抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、例えば、第１の検出試薬は抗体を含むことができる。同様に、第２の検出試薬は抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、例えば、第２の検出試薬は抗体を含むことができる。
【００６３】
実施形態（１３）および（１４）の表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。前記は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する。表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上で１０〜１００ｎｍ内にあってもよい、ならびに場合により、表面は電極を含むことができる。
【００６４】
実施形態（１５）：試料中の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を第１および第２の検出試薬に結合させて、各検出複合体が分析物、第１の検出試薬および第２の検出試薬を含む検出複合体を形成させること、ここで、該第１の検出試薬は第１の検出可能な標識を有し、該第２の検出試薬は第２の検出可能な標識を有する、（ｂ）大多数の反応容器が１つまたはそれ以下の分析物を含有するように、該分析物を複数の反応容器にわたって分配すること；ならびに（ｃ）分析物分子の数を、該第１および第２の検出可能な標識を含有する反応容器の数の計数によって検出することを含むことができる方法。実施形態（１５）では、第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよく、例えば、第１の検出試薬は、抗体である。同様に、第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよく、例えば、第２の検出試薬は、抗体である。特定の例では、第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【００６５】
実施形態（１５）の工程（ａ）は前記分析物および前記検出試薬を含む溶液を形成させることをさらに含むことができ、工程（ｂ）は同じ容器中の未結合の第１の検出試薬および未結合の第２の検出試薬が見出される可能性が１０のうち１未満であるように、該溶液を複数の反応容器にわたって分配することを含むことができる。あるいは、実施形態（１５）の工程（ａ）は前記分析物および前記検出試薬を含む溶液を形成させることをさらに含むことができ、工程（ｂ）は同じ容器中の未結合の第１の検出試薬および未結合の第２の検出試薬が見出される可能性が１００のうち１未満であるように、該溶液を複数の反応容器にわたって分配することを含むことができる。さらにまた、実施形態（１５）の工程（ａ）は前記分析物および前記検出試薬を含む溶液を形成させることをさらに含むことができ、工程（ｂ）は同じ容器中の未結合の第１の検出試薬および未結合の第２の検出試薬が見出される可能性が１０００のうち１未満であるように、該溶液を複数の反応容器にわたって分配することを含むことができる。さらには、実施形態（１５）の工程（ａ）は前記分析物および前記検出試薬を含む溶液を形成させることをさらに含むことができ、工程（ｂ）は同じ容器中の未結合の第１の検出試薬および未結合の第２の検出試薬が見出される可能性が１００００のうち１未満であるように、該溶液を複数の反応容器にわたって分配することを含むことができる。
【００６６】
実施形態（１６）：試料中の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬に結合させて、各検出複合体が捕捉試薬、分析物、第１の検出試薬および第２の検出試薬を含む検出複合体を形成させること、ここで、（ｉ）該第１の検出試薬は第１の検出可能な標識を有し、該第２の検出試薬は第２の検出可能な標識を有する、（ｉｉ）該捕捉試薬は表面上にある；（ｂ）大多数の反応容器が１つまたはそれ以下の分析物を含有するように、該分析物を複数の反応容器にわたって分配すること；ならびに（ｃ）分析物分子の数を、該第１および第２の検出可能な標識を含有する反応容器の数の計数によって検出することを含む方法。この実施形態では、捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよく、例えば、捕捉試薬は、抗体である。同様に、第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよく、例えば、第１の検出試薬は、抗体である。さらには、第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよく、例えば、第２の検出試薬は、抗体である。たとえば、捕捉試薬、第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【００６７】
実施形態（１６）の工程（ｂ）は、同じ容器中の未結合の第１の検出試薬および未結合の第２の検出試薬が見出される可能性が１０のうち１未満であるように、該溶液を複数の反応容器にわたって分配することをさらに含むことができる。さらには、実施形態（１６）の工程（ｂ）は、同じ容器中の未結合の第１の検出試薬および未結合の第２の検出試薬が見出される可能性が１００のうち１未満であるように、該溶液を複数の反応容器にわたって分配することをさらに含むことができる。実施形態（１６）の工程（ｂ）は、同じ容器中の未結合の第１の検出試薬および未結合の第２の検出試薬が見出される可能性が１０００のうち１未満であるように、該溶液を複数の反応容器にわたって分配することをさらに含むことができる。さらには、実施形態（１６）の工程（ｂ）は、同じ容器中の未結合の第１の検出試薬および未結合の第２の検出試薬が見出される可能性が１００００のうち１未満であるように、該溶液を複数の反応容器にわたって分配することをさらに含むことができる。
【００６８】
実施形態（１６）の検出複合体中の捕捉試薬は、捕捉試薬を分析物に結合させる前に表面上にあってもよい；または検出複合体中の捕捉試薬は、捕捉試薬を表面上に固定化する前に分析物に結合する。一例では、捕捉試薬はターゲティング部分を含むことができ、表面はターゲティング部分相補体を含むことができる。ターゲティング部分およびターゲティング因子結合パートナー（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒ）は以下の結合対から選択される：アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、受容体−リガンド、抗体−抗原、核酸−核酸相補体。
【００６９】
実施形態（１６）の表面は粒子である、ならびに、場合により、捕捉試薬は複数の粒子において固定化される、および分析物の分配は分析物を捕捉試薬に結合させることおよび粒子を複数の反応容器に分配することによって達成される。捕捉試薬は複数の粒子において固定化されうる、ならびに分析物の分配は粒子を複数の反応容器に分配することおよび次いで分析物を捕捉試薬に結合させることによって達成される。
【００７０】
実施形態（１６）は、複数の粒子を複数の反応容器に分配することをさらに含むことができ、ここで、複数の粒子はターゲティング部分を含み、捕捉試薬はターゲティング部分相補体を含み、分析物の分配はターゲティング部分相補体をターゲティング部分に結合させることによって達成される。実施形態（１６）は、分配工程前および／または分配工程後に、粒子を洗浄することも含むことができる。
【００７１】
実施形態（１６）の表面は、反応容器の１つ内の位置にあってもよい。この実施形態では、捕捉試薬は複数の反応容器の表面に固定化されうる、および分析物の分配は分析物を捕捉試薬に結合させることによって達成される。場合により、反応容器は、それに固定化されたターゲティング部分を有する表面を有する、捕捉試薬はターゲティング部分相補体を含み、分析物の分配は、ターゲティング部分相補体をターゲティング部分に結合させることによって達成される。この特定の例では、方法は、検出工程の前に、反応容器を洗浄することをさらに含むことができる。
【００７２】
実施形態（１６）の複数の反応容器は、ナノウェルのアレイを含むことができる。複数の反応容器は、少なくとも１０，０００の反応容器を含むことができる。一実施形態では、反応容器は、１００ｎＬ未満の容量を有する。場合により、５０％未満の反応容器が検出時に分析物を含有する、１０％未満の反応容器が検出時に分析物を含有する、１％未満の反応容器が検出時に分析物を含有する、および／または０．１％未満の反応容器が検出時に分析物を含有する。
【００７３】
実施形態（１６）の一態様では、第１の検出可能な標識は、一組の酵素反応系の第１の酵素である、および第２の検出可能な標識は、共役酵素反応系の第２の酵素である、ならびに工程（ｄ）は、１つまたはそれ以上の反応系の基質を添加すること、酵素反応系の産物を産生すること、および産物を含有する反応容器を計数することを含むことができる。この実施形態では、第１および第２の酵素が互いに２００ｎＭ内にある、または第１および第２の酵素が互いに５０ｎＭ内にあるなど、第１の酵素および第２の酵素が近くで近接する場合のみ、産物は産生され得る。たとえば、第１の酵素は酸化酵素であり、第２の酵素はペルオキシダーゼであり、基質は酸化酵素基質および標識Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄまたはルミノール誘導体を含む。この実施形態では、酸化酵素はグルコース酸化酵素であってもよい、および酸化酵素基質はグルコースである。一実施形態では、検出複合体中の第１および第２の酵素によって触媒される反応により、表面上に標識Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄまたはルミノールの固定化がもたらされる、ならびに、場合により、方法は、表面上で標識Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄまたはルミノールを測定することを含むことができる。標識Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄまたはルミノールは、場合により、ビオチン−Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄまたはルミノールである、ならびに、方法は、標識ストレプトアビジンを添加することおよびストレプトアビジンにおける標識を測定することを含むことができる。
【００７４】
実施形態（１６）の工程（ｄ）は、第１および第２の検出可能な標識が同じ分析物分子に結合する場合に生成される近接依存性シグナルを測定すること、ならびに、近接依存性シグナルを産生する反応容器の数を計数することを含んでいてもよく、例えば、近接依存性シグナルはＰＬＡ−ＲＣＡによって生成される。たとえば、第１の検出可能な標識はＦＲＥＴドナーであってもよい、ならびに検出可能な標識はＦＲＥＴアクセプターである、ならびに近接依存性シグナルはＦＲＥＴドナーを励起することおよびＦＲＥＴアクセプターからの放射を測定することによって測定される。一例では、第１および第２の検出可能な標識は、独立に測定されうる。場合により、第１および第２の検出可能な標識は、スペクトル特性に関して互いに異なる発光性標識である。一例では、第１の検出可能な標識は、第１の基質と反応して第１のシグナルを産生する第１の酵素である、ならびに、第２の検出可能な標識は、第２の基質と反応して異なる第２のシグナルを産生する第２の酵素である、ならびに、実施形態（１６）の工程（ｄ）は、第１の酵素基質および第２の酵素基質を添加することならびに第１および第２のシグナルが生成される反応容器の数を計数することを含むことができる。第１および第２のシグナルは、異なるスペクトル特性を有する光学的な吸光度における変化であってもよい。場合により、第１および第２のシグナルは、異なるスペクトル特性を有する発光シグナルである。第１および第２の酵素は、例えば、ホスファターゼ、スルファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される加水分解酵素であってもよい、ならびに第１および第２の基質は、リン酸塩、硫酸塩、ガラクトシドおよびグルクロニド修飾され、安定化されているジオキセタン、４−メチルウンベリフェリル、フルオレセイン、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の例では、第１および第２の酵素は、西洋わさびペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼから選択される。実施形態（１６）の検出工程は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、ルミネセンス、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせを介する検出を含むことができる。
【００７５】
実施形態（１７）：試料中の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）第１の検出可能な標識を含む第１の検出試薬；（ｂ）第２の検出可能な標識を含む第２の検出試薬；（ｃ）１つまたはそれ以下の分析物分子を含有するように構成される複数の反応容器を含むキット。
【００７６】
実施形態（１８）：試料中の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）第１の検出可能な標識を含む第１の検出試薬；（ｂ）第２の検出可能な標識を含む第２の検出試薬；（ｃ）捕捉試薬を含む表面；および（ｄ）１つまたはそれ以下の分析物分子を含有するように構成される複数の反応容器を含むキット。
【００７７】
実施形態（１７）および（１８）の第１および第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、アプタマー、またはそれらの組み合わせを含むことができる。一例では、第１および第２の検出試薬は、抗体を含む。捕捉抗体は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、例えば、捕捉抗体は抗体を含むことができる。一例では、捕捉試薬はターゲティング部分を含むことができ、び表面はターゲティング部分相補体、例えば、ターゲティング部分を含むことができ、ターゲティング因子結合パートナーは以下の結合対から選択される：アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、受容体−リガンド、抗体−抗原、核酸−核酸相補体。
【００７８】
実施形態（１７）および（１８）の表面は粒子であってもよい、および、たとえば、捕捉試薬は複数の粒子に固定化される。あるいは、表面は反応容器の１つ内の位置である、および、例えば、捕捉試薬は複数の反応容器の表面に固定化される。場合により、反応容器はそれに固定化されたターゲティング部分を有する表面を有する、および捕捉試薬はターゲティング部分相補体を含む。複数の反応容器は、ナノウェルのアレイまたは油中水型エマルジョン中に分散される水滴を含むことができる。複数の反応容器は少なくとも１０，０００の反応容器を含むことができ、場合により、複数性の一反応容器は１００ｎＬ未満の容量を有する。
【００７９】
実施形態（１７）および（１８）のキットでは、第１の検出可能な標識は、一組の酵素反応系の第１の酵素であってもよい、ならびに第２の検出可能な標識は、共役酵素反応系の第２の酵素である、ならびにキットは、１つまたはそれ以上の付加的なバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、反応系の１つまたはそれ以上の基質を含むことができる。たとえば、第１の酵素は酸化酵素であり、第２の酵素はペルオキシダーゼであり、基質は酸化酵素基質および標識Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄまたはルミノール誘導体を含む。特定の実施形態では、酸化酵素はグルコース酸化酵素である、および酸化酵素基質はグルコースである。第１および第２の検出可能な標識は近接依存性システムの構成要素であってもよい、例えば、第１の検出可能な標識はＦＲＥＴドナーである、および検出可能な標識はＦＲＥＴアクセプターである。第１および第２の検出可能な標識は、独立に測定されうる。場合により、第１および第２の検出可能な標識は、スペクトル特性に関して互いに異なる発光性標識である。
【００８０】
実施形態（１７）および（１８）のキットでは、第１の検出可能な標識は、第１の基質と反応して第１のシグナルを産生する第１の酵素である、ならびに第２の検出可能な標識は、第２の基質と反応して異なる第２のシグナルを産生する第２の酵素である、ならびにキットは、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、第１の酵素基質および第２の酵素基質を含むことができる。場合により、第１および第２のシグナルは、異なるスペクトル特性を有する光学的な吸光度における変化である。一例では、第１および第２のシグナルは、異なるスペクトル特性を有する発光シグナルである。第１および第２の酵素は、加水分解酵素であってもよい。一例では、第１および第２の酵素は、ホスファターゼ、スルファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される。第１および第２の基質は、リン酸塩、硫酸塩、ガラクトシドおよびグルクロニド修飾され、安定化されているジオキセタン、４−メチルウンベリフェリル、フルオレセイン、またはそれらの組み合わせから選択することができる。場合により、第１および第２の酵素は、西洋わさびペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼから選択される。
【００８１】
実施形態（１９）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を捕捉試薬、第１の検出可能な標識を有する第１の検出試薬および第２の検出可能な標識を有する第２の検出試薬に結合させ、複合体を形成させること、ここで、該複合体中の該捕捉試薬は表面上に固定化される；（ｂ）該第１および第２の検出試薬を架橋して、架橋した産物を形成すること；（ｃ）該架橋した産物を該表面から溶出剤に放出すること；（ｄ）該第１および第２の検出可能な標識の両方を含み、該溶出剤中の個々の架橋した産物を計数することを含む方法。この例（１９）では、捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、特定の例では、捕捉試薬は、抗体である。同様に、第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよい、特定の例では、第１の検出試薬は、抗体である。さらには、第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、詳細には、第２の検出試薬は、抗体であってもよい。１つの特定の例では、捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【００８２】
実施形態（１９）は、架橋剤を添加して、第１および第２の検出試薬を架橋することをさらに含むことができ、例えば、第１および第２の検出試薬は、反応部分を含み、架橋剤は、反応部分に連結する多機能性架橋剤である。たとえば、反応部分は、アミン、チオール、ヒドラジド、アルデヒド、エステル、ヨードアセトアミド、マレイミド、クリック化学試薬、およびそれらの組み合わせを含む。架橋剤は、アミン、チオール、ヒドラジド、アルデヒド、エステル、ヨードアセトアミド、マレイミド、クリック化学試薬、およびそれらの組み合わせを含むことができる。第１および第２の検出試薬は結合部分を含むことができ、架橋剤は結合部分の多価結合パートナーである。一例では、第１および第２の検出試薬は動物種の抗体である、ならびに架橋剤は動物種の多価抗種抗体ターゲティング抗体（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）である。第１および第２の検出試薬はビオチンを含むことができ、架橋剤はストレプトアビジンである；第１および第２の検出試薬はストレプトアビジンを含み、架橋剤はビオチンである；第１および第２の検出試薬はストレプトアビジンに連結され、架橋剤は複数のビオチン分子を含むポリマーである；および／または第１および第２の検出試薬はそれぞれ第１および第２の核酸プローブを含み、架橋剤は、第１の核酸プローブに対して相補的な配列および第２の核酸プローブに対して相補的な別個の配列を含むことができるオリゴヌクレオチドである。
【００８３】
実施形態（１９）の表面は粒子、反応容器、例えば、チューブもしくはアンプルを含むことができ、および／または表面はマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。実施形態（１９）の方法は、粒子を採取することおよび粒子を洗浄して不純物を除去することをさらに含むことができ、場合により、第１および第２の検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定される。特定の例では、第１および第２の検出可能な標識はＥＣＬ標識を含み、計数工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【００８４】
実施形態（２０）：試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）固定化された捕捉試薬を含む表面；（ｂ）第１の検出可能な標識を有する第１の検出試薬；（ｃ）第２の検出可能な標識を有する第２の検出試薬；ならびに（ｄ）該第１および第２の検出試薬と反応性の架橋剤を含むキット。
【００８５】
実施形態（２０）の第１および第２の検出試薬は反応部分を含むことができ、架橋剤は反応部分に連結する多機能性架橋剤である。反応部分は、アミン、チオール、ヒドラジド、アルデヒド、エステル、ヨードアセトアミド、マレイミド、クリック化学試薬、およびそれらの組み合わせを含むことができる；ならびに架橋剤はアミン、チオール、ヒドラジド、アルデヒド、エステル、ヨードアセトアミド、マレイミド、クリック化学試薬、およびそれらの組み合わせを含むことができる。実施形態（２０）の第１および第２の検出試薬は結合部分を含むことができ、架橋剤は結合部分の多価結合パートナーである、例えば、第１および第２の検出試薬は動物種の抗体である、ならびに架橋剤は動物種の多価抗種抗体ターゲティング抗体である；第１および第２の検出試薬はビオチンを含み、架橋剤はストレプトアビジンである；第１および第２の検出試薬はストレプトアビジンを含み、架橋剤はビオチンである；第１および第２の検出試薬はストレプトアビジンに連結され、架橋剤は複数のビオチン分子を含むポリマーである；および／または第１および第２の検出試薬はそれぞれ第１および第２の核酸プローブを含み、架橋剤は、第１の核酸プローブに対して相補的な配列および第２の核酸プローブに対して相補的な別個の配列を含むことができるオリゴヌクレオチドである。
【００８６】
実施形態（２０）の表面は、粒子、マルチウェルプレートのウェル、または反応容器、例えば、チューブまたはアンプルを含むことができる。さらに、表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬は、表面上の別個の結合ドメインに位置する。表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬はウェル内で別個の結合ドメインに位置する。表面は、電極も含むことができる。
【００８７】
実施形態（２１）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を捕捉試薬、第１の検出試薬および第２の検出試薬に結合させて、複合体を形成させること、ここで、該第１の検出試薬は第１の検出可能な標識および第１の核酸プローブを含むことができ、該第２の検出試薬は第２の検出可能な標識および第２の核酸プローブを含むことができ、該複合体中の該捕捉試薬は表面上に固定化される；（ｂ）該第１および第２の検出試薬を、（ｉ）該第１のプローブを該第２のプローブにハイブリダイズさせること、（ｉｉ）該第１および第２のプローブを該第１および第２のプローブに対して相補的な領域を有する第３の核酸にハイブリダイズさせること、または（ｉｉｉ）該第１および第２のプローブをライゲーションすることによって架橋すること；（ｃ）該架橋した産物を該表面から溶出剤に放出すること；（ｄ）該第１および第２の検出可能な標識の両方を含む、該溶出剤中の個々の架橋した産物を計数することを含む方法。
【００８８】
実施形態（２１）の捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよい、例えば、捕捉試薬は、抗体である。同様に、第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、第１の検出試薬は、抗体である；第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよい、例えば、第２の検出試薬は、抗体である。特定の例では、捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【００８９】
実施形態（２１）の表面は、粒子、反応容器、例えば、チューブもしくはアンプル、またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。実施形態（２１）の方法は、粒子を採取することおよび粒子を洗浄して不純物を除去することをさらに含むことができる。第１および第２の検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定することができる。特定の例では、第１および第２の検出可能な標識はＥＣＬ標識を含み、計数工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【００９０】
実施形態（２２）：試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）固定化された捕捉試薬を含む表面；（ｂ）第１の検出可能な標識を有する第１の検出試薬および第１の核酸プローブ；（ｃ）第２の検出可能な標識を有する第２の検出試薬および第２の核酸プローブ；ならびに（ｄ）第１および第２の核酸プローブに対して相補的な領域を有する第３の核酸を含むキット。
【００９１】
実施形態（２２）の表面は、粒子、マルチウェルプレートのウェル、または反応容器、例えば、チューブまたはアンプルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬は表面上の別個の結合ドメインに位置する、ならびに表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬はウェル内で別個の結合ドメインに位置する。表面は、場合により、電極を含むことができる。
【００９２】
実施形態（２３）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を捕捉試薬、第１の検出試薬および第２の検出試薬に結合させて、複合体を形成させること、ここで、該第１の検出試薬は第１の核酸プローブを含むことができ、該第２の検出試薬は第２の核酸プローブを含むことができ、該複合体中の該捕捉試薬は表面上に固定化される；（ｂ）該第２の核酸プローブを伸長して、検出可能な標識を含む伸長配列を形成させること（該伸長は、複合体中の該第１および第２の核酸プローブの共局在に依存的である）；（ｃ）該伸長配列を該表面から溶出剤に放出すること；ならびに（ｄ）該溶出剤中の個々の伸長配列を計数することを含む方法。この実施形態では、捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである。特定の例では、捕捉試薬は、抗体である。同様に、第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであり、特定の例では、第１の検出試薬は、抗体である。第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、詳細には、第２の検出試薬は、抗体である。特定の例では、捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【００９３】
実施形態（２３）の表面は、粒子、反応容器、例えば、チューブもしくはアンプル；またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。実施形態（２３）の方法は、粒子を採取することおよび粒子を洗浄して不純物を除去することをさらに含むことができる。
【００９４】
実施形態（２３）の標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定することができる。特定の例では、標識はＥＣＬ標識を含むことができ、計数工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【００９５】
実施形態（２３）の伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させることおよびプローブをポリメラーゼ連鎖反応法によって伸長させることを含むことができる。伸長工程は、第１のプローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること、および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させることも含むことができる。伸長工程は、第１のプローブを鋳型核酸配列に結合させること、第２のプローブを鋳型配列に結合させること、ならびに第１および第２のプローブをライゲーションすることを含んでいてもよい。場合により、標識は蛍光標識である、および個々の伸長配列の計数は一分子蛍光検出を含むことができ、例えば、蛍光相関分光法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）および／または蛍光相互相関分光法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を含むことができる。一分子蛍光検出は、溶出剤をキャピラリーを通して流すこと、光源をキャピラリー内のある体積に焦点を当ててインタロゲーションゾーン（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｚｏｎｅ）を作ることおよびインタロゲーションゾーンを光検出器で観察して、インタロゲーションゾーンを通した蛍光分子の通過を検出することを含むことができる。一分子蛍光検出は、溶出剤をキャピラリーを通して流すこと、光源をキャピラリー内のある体積に焦点を当ててインタロゲーションゾーンを作ることおよびインタロゲーションゾーンを光検出器で観察して、インタロゲーションゾーンを通した蛍光分子の通過を検出することも含むことができる。
【００９６】
実施形態（２４）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を捕捉試薬、第１の検出可能な標識を有する第１の検出試薬および第２の検出可能な標識を有する第２の検出試薬に結合させ、複合体を形成させること、ここで、該複合体中の該捕捉試薬は表面上に固定化される；（ｂ）形成される複合体を該表面から、固定化された捕捉試薬を表面から溶出剤に解離することによって放出させること；ならびに（ｃ）該第１および第２の検出可能な標識の両方を含む、該溶出剤中の個々の産物を計数することを含む方法。この実施形態では、捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、捕捉試薬は、抗体である；第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、第１の検出試薬は、抗体である；第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、第２の検出試薬は、抗体である；ならびに、特定の例では、捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【００９７】
実施形態（２４）の表面は、粒子、反応容器、例えば、チューブおよび／もしくはアンプル、またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。実施形態（２４）の方法は、粒子を採取することおよび粒子を洗浄して不純物を除去することを含むことができる。第１および第２の検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定されうる、ならびに特定の実施形態では、第１および第２の検出可能な標識はＥＣＬ標識を含み、計数工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【００９８】
実施形態（２５）：試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該分析物を、（ｉ）該分析物に関する捕捉試薬を含む表面上の該捕捉試薬；（ｉｉ）第１の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第１の検出試薬、および（ｉｉｉ）第２の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第２の検出試薬に結合させ；それにより、結合試薬、該分析物ならびに該第１および第２の検出試薬を含む該表面上に複合体を形成させること；（ｂ）該第１および第２のプローブが近接されることを必要とする伸長プロセスを用いて、該第２のプローブを伸長して、伸長配列を形成させること；ならびに（ｃ）該表面に結合した伸長配列の量を測定することを含む方法。この実施形態では、捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、捕捉試薬は、抗体である；第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、第１の検出試薬は、抗体である；第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである；例えば、第２の検出試薬は、抗体である；ならびに、特定の例では、捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【００９９】
実施形態（２５）の伸長配列は１つまたはそれ以上の検出配列を含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることを含むことができる；伸長配列は１つまたはそれ以上の修飾塩基を含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の修飾塩基と結合することが可能な複数の検出可能な部分と接触させることを含むことができる；および／または伸長配列は１つまたはそれ以上の標識塩基を含むことができ、測定工程は１つまたはそれ以上の標識塩基の存在を検出することを含むことができる。１つまたはそれ以上の修飾塩基はアプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含み、複数の検出可能な部分は１つまたはそれ以上の修飾塩基および検出可能な標識の結合パートナーを各々含む。１つまたはそれ以上の修飾塩基はストレプトアビジンを含むことができ、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含み、複数の検出可能な部分はストレプトアビジンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はアビジンを含み、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；および／または１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含み、複数の検出可能な部分はアビジンおよび検出可能な標識を各々含む。
【０１００】
実施形態（２５）の工程（ａ）は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する検出試薬；分析物を以下の種に以下の順序で結合させること：（ｉ）分析物に関する検出試薬；および（ｉｉ）表面上の捕捉試薬；または分析物を以下の種を同時にもしくは実質的に同時に結合させること：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する検出試薬。伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させることおよびプローブをポリメラーゼ連鎖反応法によって伸長させることを含むことができる；またはプローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること、および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させること。この実施形態では、伸長されるプローブは、プローブ伸長後に表面上に局在化したままで残ることができ、例えば、複合体は伸長工程後に表面に結合したままで残る。伸長工程は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自己持続合成反応）、または等温性の増幅方法を含むことができる。特定の例では、伸長工程は、等温性の増幅方法、例えば、ヘリカーゼ依存的な増幅またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含むことができる。
【０１０１】
実施形態（２５）の伸長プロセスは、工程（ａ）において形成される複合体を、（ｉ）第２のプローブに対して相補的な内部配列および（ｉｉ）第１のプローブの非オーバーラップ領域に対して相補的な２つの末端配列を含むコネクター配列と接触させることを含むことができる。プロセスは、コネクターオリゴヌクレオチドの２つの末端配列をライゲーションして、第１および第２のプローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させることをさらに含むことができる。実施形態（２５）の伸長プロセスは、工程（ａ）において形成される複合体を、第１のプローブの第１の領域および第２のプローブにおける第１の領域に対して相補的な第１のコネクタープローブ配列を含む第１のコネクターオリゴヌクレオチド配列、ならびに第１のプローブの第２の非オーバーラップ領域および第２のプローブの第２の非オーバーラップ領域に対して相補的な第２のプローブ配列を含む第２のコネクターオリゴヌクレオチドと接触させることも含むことができる。プロセスは、第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチドをライゲーションして、第１および第２のプローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させることも含むことができる。
【０１０２】
実施形態（２５）の表面は、粒子またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する、表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。表面は電極を含むことができ、測定工程は電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンス（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）シグナルを生成することを含むことができる。方法は、場合により、粒子を電極上で採取することおよび電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンスシグナルを生成することを含む。測定工程は、伸長配列を検出可能な標識を有する検出プローブに結合させること、検出可能な標識を測定すること、および測定値を試料中の分析物の量と相関させることをさらに含んでいてもよく、ここで、検出プローブは、伸長配列の領域に対して相補的である核酸配列を含む。検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定することができる。特定の例では、検出可能な標識はＥＣＬ標識であり、測定工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【０１０３】
実施形態（２６）：試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）該分析物に関する捕捉試薬を含む表面；（ｂ）第１の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第１の検出試薬；ならびに（ｃ）第２の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第２の検出試薬を含むキット。
【０１０４】
実施形態（２６）の捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、例えば、捕捉試薬は、抗体を含むことができる；第１の検出試薬は抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、例えば、第１の検出試薬は抗体を含むことができる；第２の検出試薬は抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、例えば、第２の検出試薬は抗体を含むことができる；ならびに表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する；ならびに表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。場合により、表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する、表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。表面は、電極を含むことができる。
【０１０５】
実施形態１〜２６の表面は、アッセイ容器、例えば、試験管、キュベット、フローセル、ＦＡＣＳセルソーター、カートリッジ、またはマルチウェルプレートのウェルの内部表面を含むことができる。表面は、スライド、アッセイチップ、またはアッセイアレイ；ピン、プローブ、ビーズ、または濾過培地；ラテラルフローメディア（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｍｅｄｉａ）、例えば、濾過膜も含むことができる。
【０１０６】
実施形態（２７）：１つまたはそれ以上の分析物分子を含む試料中の目的の分析物を検出する方法であって、（ａ）該試料を、表面上に位置する複数の解像可能な結合領域を含む該表面と接触させること（各解像可能な結合領域は該試料中の１つまたはそれ以上の分析物分子に関する複数の捕捉試薬を含む）；（ｂ）１つまたはそれ以上の分析物分子を、（ｉ）該表面上の１つまたはそれ以上の捕捉試薬に結合させること；（ｉｉ）第１の検出可能な標識を含む該分析物に関する第１の検出試薬、および（ｉｉｉ）第２の検出可能な標識を含む該分析物に関する第２の検出試薬；それにより、該捕捉試薬、該分析物ならびに該第１および第２の検出試薬を含む該表面上の解像可能な結合ドメインにおいて検出複合体を形成させること、ここで、該第１および第２の検出可能な標識は異なる標識化合物である；（ｃ）各結合領域における該分析物分子の存在または非存在を決定すること；ならびに（ｄ）該分析物分子を含有する結合領域の数および／または該分析物分子を含有しない結合領域の数を同定することを含む方法。同定工程は、表面からの光学的なシグナルをイメージングして、複数のピクセルを含むイメージを生成することを含むことができ、各解像可能な結合領域は、イメージにおいて１つまたはそれ以上のピクセルへとマップされる。解像可能な結合領域は、アレイの要素であってもよいおよび／または個々の粒子に単離されるように構成されてもよい。各解像可能な結合領域は＜１００ｎＬの体積を有する個々のナノ−ウェルであってもよいおよび／または少なくとも９９％の結合領域はゼロまたは１つの分析物分子を含有する；少なくとも約９５％の結合領域は、ゼロまたは１つの分析物分子を含有する；少なくとも約８０％の結合領域は、ゼロまたは１つの分析物分子を含有する；あるいは、少なくとも約５０％の結合領域は、ゼロまたは１つの分析物分子を含有する。試料中の分析物分子の濃度は、少なくとも１つまたは１つの分析物分子を含有する、結合領域の数のキャリブレーション曲線、ポアソン分布分析および／またはガウス分布分析を用いて少なくとも部分的に決定されてもよい。
【０１０７】
実施形態（２７）の表面は分析物分子に関する複数の結合試薬を各々含む複数の粒子を含むことができ、ここで、複数の粒子は複数の解像可能な結合領域にわたって分布する、方法は、（ｉ）１つまたはそれ以上の分析物分子を、表面上の１つまたはそれ以上の捕捉試薬、ならびに１つまたはそれ以上の分析物分子の各々に関する第１および第２の検出試薬に結合させること、ここで、第１および第２の検出試薬はそれぞれ第１および第２の検出可能な標識を含む；（ｉｉ）複数の粒子を解像可能な結合領域のアレイにわたって分布させること；ならびに（ｉｉｉ）分析物分子を含有する結合領域の数および／または分析物分子を含有しない結合領域の数を同定するために、各解像可能な結合領域における分析物分子の存在または非存在を決定することを含むことができ、ここで、場合により、各解像可能な結合領域は＜１００ｎＬの体積を有する個々のナノ−ウェルであるおよび／または少なくとも９９％の結合領域はゼロまたは１つの分析物分子を含有する；少なくとも約９５％の結合領域は、ゼロまたは１つの分析物分子を含有する；少なくとも約８０％の結合領域は、ゼロまたは１つの分析物分子を含有する；および／または少なくとも約５０％の結合領域は、ゼロまたは１つの分析物分子を含有する。
【０１０８】
実施形態（２７）における捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、捕捉試薬は、抗体である。第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、第１の検出試薬は、抗体である；第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、第２の検出試薬は、抗体である。特定の例では、捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【０１０９】
実施形態（２７）の工程（ａ）は、分析物を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する第１および第２の検出試薬；分析物を以下の種に以下の順序で結合させること：（ｉ）分析物に関する第１および第２の検出試薬；および（ｉｉ）表面上の捕捉試薬；または分析物を以下の種を同時にもしくは実質的に同時に結合させること：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）分析物に関する第１および第２の検出試薬。
【０１１０】
実施形態（２７）の表面は、粒子またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。特定の例では、表面は電極を含むことができ、同定工程は電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンス（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）シグナルを生成することを含むことができる。実施形態（２７）の方法は、粒子を電極上で採取することおよび電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンスシグナルを生成することをさらに含むことができる。第１の検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定される；および／または第２の検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定される。第１および第２の検出可能な標識は独立に測定することができ、一例では、第１および第２の検出可能な標識はスペクトル特性に関して互いに異なる発光性標識である。
【０１１１】
実施形態（２７）の表面は、アッセイ容器、例えば、試験管、キュベット、フローセル、ＦＡＣＳセルソーター、カートリッジ、またはマルチウェルプレートのウェルの内部表面を含むことができる。表面は、スライド、アッセイチップ、またはアッセイアレイ；ピン、プローブ、ビーズ、または濾過培地；ラテラルフローメディア、例えば、濾過膜も含むことができる。
【０１１２】
実施形態（２８）：１つまたはそれ以上の分析物分子を含む試料中の目的の分析物を検出するためのキットであって、（ａ）表面上に位置する複数の解像可能な結合領域を含む表面（各解像可能な結合領域は該試料中の１つまたはそれ以上の分析物分子に関する複数の捕捉試薬を含む）；（ｂ）第１の検出可能な標識を含む該分析物に関する第１の検出試薬；ならびに（ｃ）第２の検出可能な標識を含む該分析物に関する第２の検出試薬を含み；ここで、該第１および第２の検出可能な標識は、異なる標識化合物である、キット。
【０１１３】
実施形態（２８）の解像可能な結合領域は、アレイの要素であってもよいおよび／または個々の粒子に単離されるように構成されてもよい。各解像可能な結合領域は、場合により、＜１００ｎＬの体積を有する個々のナノ−ウェルである。表面は分析物分子に関する複数の結合試薬を各々含む複数の粒子を含むことができ、ここで、複数の粒子は複数の解像可能な結合領域にわたって分布する、キットは、１つまたはそれ以上の分析物分子の各々に関する第１および第２の検出試薬を含むことができ、ここで、第１および第２の検出試薬はそれぞれ第１および第２の検出可能な標識を含む。
【０１１４】
実施形態（２８）における捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、捕捉試薬は、抗体である。第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、第１の検出試薬は、抗体である；第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、第２の検出試薬は、抗体である。特定の例では、捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、分析物に対する抗体である。
【０１１５】
実施形態（２８）の表面は、粒子またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。特定の例では、表面は電極を含むことができ、同定工程は電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンス（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）シグナルを生成することを含むことができる。第１の検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定される；および／または第２の検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定される。第１および第２の検出可能な標識は独立に測定することができ、一例では、第１および第２の検出可能な標識はスペクトル特性に関して互いに異なる発光性標識である。
【０１１６】
実施形態（２８）の表面は、アッセイ容器、例えば、試験管、キュベット、フローセル、ＦＡＣＳセルソーター、カートリッジ、またはマルチウェルプレートのウェルの内部表面を含むことができる。表面は、スライド、アッセイチップ、またはアッセイアレイ；ピン、プローブ、ビーズ、または濾過培地；ラテラルフローメディア、例えば、濾過膜も含むことができる。
【０１１７】
実施形態（２９）：試料中のＨＩＶ  ｐ２４を検出する方法であって、（ａ）ＨＩＶ  ｐ２４を、（ｉ）ＨＩＶ  ｐ２４に関する捕捉試薬を含む表面上の該捕捉試薬、およびアンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬；（ｉｉ）第１の核酸プローブに連結された、ＨＩＶ  ｐ２４に関する第１の検出試薬；ならびに（ｉｉｉ）第２の核酸プローブに連結された、ＨＩＶ  ｐ２４に関する第２の検出試薬に結合させ；それにより、結合試薬、ＨＩＶ  ｐ２４ならびに該第１および第２の検出試薬を含む該表面上に複合体を形成させること；（ｂ）該第１および第２のプローブが近接されることを必要とする伸長プロセスを用いて、該第２のプローブを伸長して、該アンカー配列に対して相補的であるアンカー配列相補体を含む伸長配列を形成させること；（ｃ）該アンカー配列を該アンカー配列相補体にハイブリダイズさせること；ならびに（ｄ）該表面に結合した伸長配列の量を測定することを含む方法。
【０１１８】
実施形態（２９）の捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよい。特定の例では、捕捉試薬は、抗体である。同様に、第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであり、特定の例では、第１の検出試薬は、抗体である。第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーであってもよく、特定の例では、第２の検出試薬は、抗体である。より詳細には、捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、ＨＩＶ  ｐ２４に対する抗体である。
【０１１９】
実施形態（２９）では、アンカーオリゴヌクレオチド配列は、１本鎖オリゴヌクレオチド配列または２本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むことができる。この実施形態では、伸長配列は１つまたはそれ以上の検出配列を含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることを含むことができる。伸長配列は１つまたはそれ以上の修飾塩基も含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の修飾塩基と結合することが可能な複数の検出可能な部分と接触させることを含むことができる。伸長配列は１つまたはそれ以上の標識塩基をさらに含むことができ、測定工程は１つまたはそれ以上の標識塩基の存在を検出することを含むことができる。１つまたはそれ以上の修飾塩基はアプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含むことができ、複数の検出可能な部分は１つまたはそれ以上の修飾塩基および検出可能な標識の結合パートナーを各々含む。たとえば、１つまたはそれ以上の修飾塩基はストレプトアビジンを含み、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含み、複数の検出可能な部分はストレプトアビジンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はアビジンを含み、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；および／または１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含み、複数の検出可能な部分はアビジンおよび検出可能な標識を各々含む。
【０１２０】
実施形態（２９）の工程（ａ）は、ＨＩＶ  ｐ２４を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）ＨＩＶ  ｐ２４に関する検出試薬。あるいは、工程（ａ）は、ＨＩＶ  ｐ２４を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）ＨＩＶ  ｐ２４に関する検出試薬；および（ｉｉ）表面上の捕捉試薬；または工程（ａ）は、ＨＩＶ  ｐ２４を以下の種を同時にもしくは実質的に同時に結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）ＨＩＶ  ｐ２４に関する検出試薬。
【０１２１】
実施形態（２９）の伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させることおよびプローブをポリメラーゼ連鎖反応法によって伸長させることを含むことができる。伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること、および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させることをさらに含むことができる。伸長されるプローブは、プローブ伸長後に表面上に局在化したままで残ることができ、例えば、複合体は伸長工程後に表面に結合したままで残る。伸長されるプローブは、表面上の複合体の位置の１０〜１００ｕｍ内のポジションで、アンカー試薬に結合されてもよい。伸長工程は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自己持続合成反応）、または等温性の増幅方法を含むことができる。特定の例では、伸長工程は、等温性の増幅方法を含むことができ、例えば、ヘリカーゼ依存的な増幅またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。
【０１２２】
実施形態（２９）の伸長プロセスは、工程（ａ）において形成される複合体を、（ｉ）第２のプローブに対して相補的な内部配列および（ｉｉ）第１のプローブの非オーバーラップ領域に対して相補的な２つの末端配列を含むコネクター配列と接触させることを含むことができる。方法は、コネクターオリゴヌクレオチドの２つの末端配列をライゲーションして、第１および第２のプローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させることをさらに含むことができる。あるいは、伸長プロセスは、実施形態（２９）の工程（ａ）において形成される複合体を、第１のプローブの第１の領域および第２のプローブにおける第１の領域に対して相補的な第１のコネクタープローブ配列を含む第１のコネクターオリゴヌクレオチド配列、ならびに第１のプローブの第２の非オーバーラップ領域および第２のプローブの第２の非オーバーラップ領域に対して相補的な第２のプローブ配列を含む第２のコネクターオリゴヌクレオチドと接触させること；ならびに、場合により、第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチドをライゲーションして、第１および第２のプローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させることを含むことができる。
【０１２３】
実施形態（２９）の表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がプレートのウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。表面は複数の別個の結合ドメインも含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する。表面がプレートのウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にあってもよい。特定の例では、表面は電極を含むことができ、測定工程は電位波形を適用して、エレクトロケミルミネッセンス（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）シグナルを生成することを含むことができ、場合により、実施形態（２９）の方法は、粒子を電極上で採取することおよび電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンスシグナルを生成することをさらに含む。
【０１２４】
実施形態（２９）の測定工程は、伸長配列を検出可能な標識を有する検出プローブに結合させること、検出可能な標識を測定すること、および測定値を試料中のｐ２４の量と相関させることを含むことができ、ここで、検出プローブは、伸長配列の領域に対して相補的である核酸配列を含む。検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定することができる。特定の例では、検出可能な標識はＥＣＬ標識であり、測定工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【０１２５】
実施形態（３０）：試料中のＨＩＶ  ｐ２４の検出のためのキットであって、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、（ａ）（ｉ）ＨＩＶ  ｐ２４に関する捕捉試薬、および（ｉｉ）アンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬を含む表面；（ｂ）第１の核酸プローブに連結された、ＨＩＶ  ｐ２４に関する第１の検出試薬；ならびに（ｃ）第２の核酸プローブに連結された、ＨＩＶ  ｐ２４に関する第２の検出試薬を含むキット。
【０１２６】
実施形態（３０）の捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、特定の例では、捕捉試薬は、抗体を含むことができる。同様に、第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、特定の例では、第１の検出試薬は、抗体を含むことができる。類似して、第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含むことができ、特定の例では、第２の検出試薬は、抗体を含むことができる。
【０１２７】
実施形態（３０）の表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する；および／または、表面がウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にあってもよい。特定の例では、表面は、電極を含むことができる。
【０１２８】
実施形態（３１）：試料中のＨＩＶ  ｐ２４を検出する方法であって、（ａ）ＨＩＶ  ｐ２４を、（ｉ）捕捉試薬を含む表面上のＨＩＶ  ｐ２４に関する該捕捉試薬、およびアンカー試薬；（ｉｉ）第１の近接プローブを含む、ＨＩＶ  ｐ２４に関する第１の検出試薬、および（ｉｉｉ）第２の近接プローブを含む、ＨＩＶ  ｐ２４に関する第２の検出試薬に結合させ；それにより、該捕捉試薬、ＨＩＶ  ｐ２４ならびに該第１および第２の検出試薬を含む該表面上に検出複合体を形成させること；（ｂ）（ｃ）において形成される該検出複合体を、（ｉ）該第２の近接プローブに対して相補的な内部配列および（ｉｉ）該第１の近接プローブの非オーバーラップ領域に対して相補的な２つの末端配列を含むコネクター配列と接触させること；（ｃ）該コネクター配列を該第１および第２の近接プローブにハイブリダイズさせること；（ｄ）コネクターオリゴヌクレオチドの２つの末端配列をライゲーションして、該第１および第２の近接プローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させること；（ｅ）該第２の近接プローブを該標的配列のローリングサークル増幅によって伸長させて、該アンカー試薬に結合する結合ドメインを含むアンプリコンを生成すること；（ｆ）該アンプリコンを該アンカー試薬に結合させること；ならびに（ｇ）該表面上のアンプリコンの量を測定することを含む方法。
【０１２９】
実施形態（３２）：試料中のＨＩＶ  ｐ２４を検出する方法であって、（ａ）ＨＩＶ  ｐ２４を：（ｉ）捕捉試薬を含む表面上のＨＩＶ  ｐ２４に関する該捕捉試薬、およびアンカー試薬；（ｉｉ）第１の近接プローブを含む、ＨＩＶ  ｐ２４に関する第１の検出試薬、および（ｉｉｉ）第２の近接プローブを含む、ＨＩＶ  ｐ２４に関する第２の検出試薬に結合させ；それにより、該捕捉試薬、ＨＩＶ  ｐ２４ならびに該第１および第２の検出試薬を含む該表面上に検出複合体を形成させること；（ｂ）（ｃ）において形成される検出複合体を、第１のコネクターオリゴヌクレオチドおよび第２のコネクターオリゴヌクレオチドと接触させること、ここで、（ｉ）該第１のコネクターの第１の末端および該第２のコネクターの第１の末端は、該第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に対して相補的であるならびに（ｉｉ）該第１のコネクターの第２の末端および該第２のコネクターの第２の末端は、該第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に対して相補的である；（ｃ）該第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチドを該第１および第２の近接プローブにハイブリダイズさせること；（ｄ）該第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチドをライゲーションして、該第１および第２の近接プローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させること；（ｅ）該第２の近接プローブを該標的配列のローリングサークル増幅によって伸長させて、該アンカー試薬に結合する結合ドメインを含むアンプリコンを生成すること；（ｆ）該アンプリコンを該アンカー試薬に結合させること；ならびに（ｇ）該表面上のアンプリコンの量を測定することを含む方法。
【０１３０】
実施形態（３１）および（３２）の捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、特定の例では、捕捉試薬は、抗体である。類似して、第１の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、第１の検出試薬は、抗体である。さらに、第２の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、例えば、第２の検出試薬は、抗体である。実施形態（３１）および（３２）の特定の例では、捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、ＨＩＶ  ｐ２４に対する抗体である。
【０１３１】
実施形態（３１）および（３２）のアンカー試薬は、オリゴヌクレオチド配列、アプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含むことができる。一例では、結合ドメインはアプタマーを含むことができ、アンカー試薬はアプタマーリガンドを含むことができる。結合ドメインは核酸配列を含むことができ、アンカー試薬はＤＮＡ結合タンパク質を含むことができる；および／またはアンカー試薬はオリゴヌクレオチド配列を含むことができ、アンプリコンは相補的なオリゴヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１３２】
実施形態（３１）および（３２）のアンプリコンは１つまたはそれ以上の検出配列を含むことができ、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることを含むことができる。さらには、アンプリコンは１つまたはそれ以上の修飾塩基をさらに含んでいてもよく、測定工程は伸長配列を１つまたはそれ以上の修飾塩基と結合することが可能な複数の検出可能な部分と接触させることを含むことができる。さらにまた、アンプリコンは１つまたはそれ以上の標識塩基をさらに含んでいてもよく、測定工程は１つまたはそれ以上の標識塩基の存在を検出することを含むことができる。１つまたはそれ以上の修飾塩基はアプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープを含むことができ、複数の検出可能な部分は１つまたはそれ以上の修飾塩基および検出可能な標識の結合パートナーを各々含む。１つまたはそれ以上の修飾塩基はストレプトアビジンを含むことができ、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含むことができ、複数の検出可能な部分はストレプトアビジンおよび検出可能な標識を各々含む；１つまたはそれ以上の修飾塩基はアビジンを含むことができ、複数の検出可能な部分はビオチンおよび検出可能な標識を各々含む；および／または１つまたはそれ以上の修飾塩基はビオチンを含むことができ、複数の検出可能な部分はアビジンおよび検出可能な標識を各々含む。
【０１３３】
実施形態（３１）および（３２）の工程（ａ）は、ＨＩＶ  ｐ２４を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）ＨＩＶ  ｐ２４に関する第１および第２の検出試薬。あるいは、工程（ａ）は、ＨＩＶ  ｐ２４を以下の種に以下の順序で結合させることを含むことができる：（ｉ）ＨＩＶ  ｐ２４に関する第１および第２の検出試薬；および（ｉｉ）表面上の捕捉試薬。さらにまた、工程（ａ）は、ＨＩＶ  ｐ２４を以下の種を同時にもしくは実質的に同時に結合させることを含むことができる：（ｉ）表面上の捕捉試薬；および（ｉｉ）ＨＩＶ  ｐ２４に関する第１および第２の検出試薬。
【０１３４】
実施形態（３１）および（３２）のアンプリコンは、プローブ伸長後に表面上に局在化したままで残る。複合体は、伸長工程後に表面に結合したままで残ることができる。たとえば、アンプリコンは、表面上の複合体の位置の１０〜１００ｕｍ内のポジションで、アンカー試薬に結合する。
【０１３５】
実施形態（３１）および（３２）の表面は、粒子および／またはマルチウェルプレートのウェルを含むことができる。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の２つの別個の結合ドメインに位置する。表面がプレートのウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で２つの別個の結合ドメインに位置する。表面は複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに位置する。表面がプレートのウェルである場合、ウェルは複数の別個の結合ドメインを含むことができ、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内で同じ結合ドメインに位置する。特定の例では、捕捉試薬およびアンカー試薬は、表面上で１０〜１００ｎｍ内にある。
【０１３６】
さらにまた、表面は電極を含むことができ、測定工程は電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンス（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）シグナルを生成することを含むことができる。これらの実施形態（（３１）および（３２））では、方法は、粒子を電極上で採取することおよび電位波形を電極に適用して、エレクトロケミルミネッセンスシグナルを生成することをさらに含むことができる。測定工程は、アンプリコンを検出可能な標識を有する検出プローブに結合させること、検出可能な標識を測定すること、および測定値を試料中の分析物の量と相関させることを含むことができ、ここで、検出プローブは、アンプリコンの領域に対して相補的である核酸配列を含む。検出可能な標識は、光散乱、光学的な吸光度、蛍光、化学発光、エレクトロケミルミネッセンス、バイオルミネセンス、リン光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせの測定によって測定される。たとえば、検出可能な標識はＥＣＬ標識であり、測定工程はＥＣＬシグナルを測定することを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１ａ】免疫アッセイにおける固定試薬の使用を説明する図である。図１（ａ）は、捕捉試薬、目的の分析物、および核酸プローブを含む検出試薬を含む検出複合体に結合し安定化させるための固定試薬の使用を示す。核酸プローブは伸長して固定試薬に結合される。
【図１ｂ】免疫アッセイにおける固定試薬の使用を説明する図である。図１（ｂ）では、固定試薬は、検出試薬上に形成される伸長された配列の一部分に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチド配列を含んでいる。
【図１ｃ】免疫アッセイにおける固定試薬の使用を説明する図である。図１（ｃ）は、それぞれに核酸プローブを含む２つの検出試薬を使用して分析物に結合する、特定の実施形態を示す図である。検出試薬上のプローブには増幅プロセスが適用され、伸長したプローブの１つがアンカーオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能となる。
【図２ａ】図２（ａ）は、固定試薬を有する表面上で形成された免疫複合体にＰＬＡ−ＲＣＡプロセスを適用し、免疫複合体に結合した伸長配列内に複数の検出可能な種を組み入れる、特定の実施形態を示す図である。
【図２ｂ】図２（ｂ）は連結オリゴヌクレオチドの２つの代替構成の図である。
【図２ｃ】図２（ｃ）は連結オリゴヌクレオチドの２つの代替構成の図である。
【図３】タンパク質にオリゴヌクレオチドを取り付ける一方法を示す図である。
【図４ａ】図４（ａ）は、表面の境界複合体が、捕捉試薬、分析物、および２つの検出試薬の間で形成されており、検出試薬各々には、第１および第２近接プローブにそれぞれ結合しており、これら近接プローブはコネクタープローブにライゲートして、ローリングサークル増幅により増幅される環状ＤＮＡ鋳型を形成する、本発明の好ましい実施形態を示す図である。Ｃｉｒｃ−１（配列番号４）；Ｃｉｒｃ−２（配列番号５）；ＰＰ１（配列番号１（ポリＡ末端切断））；ＰＰ２（配列番号２）。図４（ａ）は、さらにアッセイが進行するにつれ生じるアンプリコンの配列に相補的な固定オリゴヌクレオチド配列を有する増幅試薬を含んでいる。
【図４ｂ】図４（ｂ）は環状ＤＮＡ鋳型Ｃｉｒｃ−１の例示的な配列（配列番号４）を示す。この配列は検出オリゴヌクレオチド配列、アンプリコンの不活性領域および、および第２近接プローブにハイブリダイズするＰＰ２部分を有する。
【図４ｃ】図４（ｃ）は、Ｃｉｒｃ−１（配列番号４）およびＣｉｒｃ−２（配列番号５）が、Ｐ１ｂ＋Ｐ１ａ（配列番号１）およびＰ２ａ＋Ｐ２ｂ（配列番号２）にハイブリダイズする実施形態を示す図である。
【図５】ローリングサークル増幅により増幅できるアンプリコンを生成する代替方法を説明する図である。
【図６ａ】ローリングサークル増幅により増幅できるアンプリコンを生成する代替方法を説明する図である。
【図６ｂ】ローリングサークル増幅により増幅できるアンプリコンを生成する代替方法を説明する図である。
【図７】サンドイッチ複合体において、近接プローブの各々の一部分が、各セグメントにハイブリダイズさせたＲＮＡの短鎖により一時的に保護される、別の実施形態を説明する図である。これら鎖は、近接プローブが互いにハイブリダイズできるよう、また鎖が伸長できるよう酵素で除去される。
【図８】捕捉試薬および検出試薬に近接プローブが結合され、図７で記述したように各近接プローブの一部分が、そこへハイブリダイズしたＲＮＡの短鎖により一時的に保護される、さらなる実施形態を示す図である。
【図９】実施例１に記述した方法を使用して導出したＩＬ−１０アッセイの検量線を示す図である。
【図１０】（ａ）〜（ｂ）は、固定試薬を使用した場合（ａ）と使用しない場合（ｂ）の蛍光顕微鏡画像を示す写真である。
【図１１ａ】図１１（ａ）は、ライゲーション部位１または２を含む単一の線状コネクターオリゴヌクレオチド配列の構成と、アッセイにおけるこれらコネクターの使用を示す図である。Ｃｉｒｃ−１（配列番号４）；Ｃｉｒｃ−２（配列番号５）；近接プローブ１（配列番号１）；近接プローブ２（配列番号２）。
【図１１ｂ】図１１（ｂ）は、Ｃｉｒｃ−１およびＣｉｒｃ−２の組み合わせを使用したアッセイと、ライゲーション部位１を有する単一の線状コネクターオリゴヌクレオチド配列、またはライゲーション部位２を有する単一の線状コネクターオリゴヌクレオチド配列のいずれかを使用したアッセイの比較である。
【図１２】実施例１および６に記述した方法を使用して導出したＨＩＶ  ｐ２４アッセイの検量線である。
【図１３】実施例１および６に記述した方法を使用した、セロコンバージョンパネルの分析の結果を示すである。
【発明を実施するための形態】
【０１３８】
本明細書において他に定義しない限り、本発明に関連する科学的および技術的な用語は、当業者により広く理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含むものとする。本明細書において使用される冠詞の「ａ」および「ａｎ」はその冠詞の文法上の目的格の１つまたは複数（つまり少なくとも１つ）について言及する。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
【０１３９】
本発明は（ｉ）アッセイにおいて使用される標的分析物および１つまたはそれ以上の分析物結合試薬間で形成される検出複合体をアンカーすること；および／または（ｉｉ）標識した検出複合体からのシグナルを増幅することを含む、改良された免疫アッセイを含む。アンカーは、低結合親和性の相互作用および／または高分子量標識もしくは標識部位を含む複合体を安定させるために使用してもよい。シグナルの増幅は、伸長プローブを複数の標識または検出標識部位を含む結合複合体に付着させることによって実現でき、そのことによって個々の検出複合体の各々についての検出可能なシグナルを増幅する。好ましい実施形態において、複数の標識または検出標識部位を含む伸長プローブを検出複合体に付着させること、および複合体が表面に確実に保持されるように、複合体を表面にアンカーすることが方法に含まれる。この改変アッセイは、非常に低い数の結合事象を検出するために使用することができ、個々の分析物結合試薬複合体であってもそれが可能である。基本的なアプローチは免疫アッセイに限られることはなく、結合試薬の他のクラスを用いた結合アッセイを行うことにも使用することができる。
【０１４０】
結合アッセイを改善するために使用できる１つの方法は、表面に結合させたアンカー試薬を使用して目的の分析物を含む検出複合体を表面に接着させることおよび検出複合体を安定化させることである。このアプローチは検出複合体を形成する試薬間の低結合親和性を克服するためおよび／または複合体がその後のプロセスの前に表面から解離することを防ぐために使用してもよい。結合アッセイにおけるアンカー試薬の使用について、図１（ａ）に図示した。表面（１０１）には、分析物Ａに結合する捕捉試薬（１０２）、およびアンカー試薬（１０３）が含まれる。１つまたはそれ以上の工程において、分析物は捕捉試薬およびさらに分析物に結合する検出試薬（１０４）に結合する。ここで、検出試薬は核酸プローブ（１０５）に連結している。分析物は捕捉試薬および検出試薬に同時にまたは実質的に同時に結合することができるか、あるいは分析物は捕捉試薬および検出試薬に（いずれかの順序において）順次に結合することができる。したがって、複合体（１０６）は、捕捉試薬、分析物、および検出試薬を含む表面上に形成される。プローブは伸長され、アンカー試薬に結合するアンカー領域を含む伸長配列（１０７）を形成する。伸長配列はアンカー試薬に結合し、表面に結合した伸長配列の量が測定される。
【０１４１】
結合アッセイの分野の当業者は、本方法において使用してもよい捕捉試薬および対応する結合パートナーの範囲を容易に理解する。そのような対の非限定的なリストとして、（いずれかの順序において）受容体／リガンドの対、抗体／抗原、天然または合成受容体／リガンドの対、ハプテン／抗体の対、抗原／抗体の対、エピトープ／抗体の対、ミミトープ（ｍｉｍｉｔｏｐｅ）／抗体の対、アプタマー／標的分子の対、ハイブリダイゼーションパートナーおよびインターカレーター／標的分子の対が挙げられる。１つの実施形態において、結合アッセイは、抗体または他の受容体タンパク質を目的の分析物の捕捉試薬および／または検出試薬として使用する。用語「抗体」は、インタクトな抗体分子（インビトロで抗体サブユニットの再会合によって構築されたハイブリッド抗体を含む）、抗体断片および抗体の抗原結合ドメインを含む組み換えタンパク質コンストラクト（例えばＰｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．およびＷｅｉｒ，Ｒ．Ｃ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６７（補足）；５１〜６４頁（１９６６）ならびにＨｏｃｈｍａｎ，１．Ｉｎｂａｒ，Ｄ．およびＧｉｖｏｌ，Ｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：１１３０頁（１９７３）に記載のような）、ならびに、例えば検出可能な標識の導入による、化学的に修飾した抗体コンストラクトを含む。
【０１４２】
同様に、アンカー試薬および対応するアンカーメンバーまたは領域には、任意の適切な結合の対、例えば、受容体／リガンドの対、抗体／抗原、天然または合成受容体／リガンドの対、ハプテン／抗体の対、抗原／抗体の対、エピトープ／抗体の対、ミミトープ／抗体の対、アプタマー／標的分子の対、ハイブリダイゼーションパートナーおよびインターカレーター／標的分子の対、ならびに静電気帯電により結合した表面およびアンカー試薬の使用が含まれてもよい。例えば、アンカー試薬は、オリゴヌクレオチド配列、アプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、またはミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）であってよく、および対応するアンカー領域にはそれぞれ、相補オリゴヌクレオチド配列、アプタマーリガンド、アプタマー、抗原、抗体、受容体、リガンド、または抗体を含む。１つの特定の実施形態として、アンカー領域はオリゴヌクレオチド配列であって、アンカー試薬はＤＮＡ結合タンパク質を含む。代替的には、アンカー領域が二重鎖オリゴヌクレオチド配列であるならば、アンカー試薬はインターカレーターを含んでもよい。さらなる実施形態として、アンカー領域は１つまたはそれ以上の修飾オリゴヌクレオチド塩基を含み、対応するアンカー試薬はアンカー領域上の修飾塩基に結合する１つまたはそれ以上の部分を含む。例えば、修飾塩基にはハプテンまたはリガンドを含んでもよく、対応するアンカー試薬にはそれぞれ、ハプテンまたはリガンドに特異的な１つまたはそれ以上の抗体またはリガンドを含んでもよい。さらに、アンカー領域は、検出複合体を検出するために使用することができる多数の標識ヌクレオチド塩基を含んでもよい。
【０１４３】
図１（ｂ）において示した特定の実施形態において、表面に結合したアンカー試薬には、検出複合体を表面にアンカーするために使用されるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。アンカーオリゴヌクレオチド配列は、検出複合体に付着した相補的なオリゴヌクレオチド配列に結合する。この実施形態において、表面（１０８）は、分析物、Ａに結合する捕捉試薬（１０９）、およびアンカーオリゴヌクレオチド配列（１１１）を含むアンカー試薬（１１０）を含む。１つまたはそれ以上の工程において、分析物は捕捉試薬およびさらに分析物に結合する検出試薬（１１２）に結合する。ここで、検出試薬は核酸プローブ（１１３）に連結している。図１（ａ）において前に記載したように、分析物は捕捉試薬および検出試薬に同時にもしくは実質的に同時に結合することができるか、または分析物は各々の捕捉試薬および検出試薬に（いずれかの順序において）順次に結合することができる。したがって、複合体（１１４）は、結合試薬、分析物、および検出試薬を含む表面上において形成される。プローブは伸長され、アンカー配列に相補的であるアンカー配列相補体を含む伸長配列（１１５）を形成する。アンカー配列はアンカー配列相補体にハイブリダイズし、表面に結合した伸長配列の量が測定される。
【０１４４】
検出複合体は１つまたはそれ以上の検出試薬を、例えば分析物に対するアッセイの特異性を増強させるために含ませることができる。例えば、各々の検出試薬が分析物に接近している場合に検出可能なシグナルを発信するようにアッセイが設計されているか、または分析物に結合した単体の検出試薬からのシグナルが、分析物に結合した複数の検出試薬から発信したシグナルと区別できるのであれば、複数の検出試薬を使用することにより、アッセイの特異性を増強させることができる。そのようなアッセイの１つの実施形態を図１（ｃ）に示す。表面（１１６）は、分析物Ａに結合する捕捉試薬（１１７）、およびアンカーオリゴヌクレオチド配列（１１９）を含むアンカー試薬（１１８）を含む。１つまたはそれ以上の工程において、分析物は捕捉試薬および分析物に結合する２つの（またはそれ以上の）検出試薬（それぞれ、１２０および１２１）の各々に結合し、各々の第１および第２の検出試薬は核酸プローブ（１２２および１２３、それぞれ第１および第２の核酸プローブ）に連結される。分析物は捕捉試薬および検出試薬に同時にもしくは実質的に同時に、または順次的に、段階的に結合することができる。したがって、複合体（１２４）は捕捉試薬、分析物、ならびに第１および第２の検出試薬を含む表面上に形成される。第１および第２のプローブが互いに近接していることを必要とする伸長プロセスを用いて、第１のプローブは、アンカー配列に相補的なアンカー配列相補体を含む伸長配列（１２５）を形成するように伸長される。最後から二番目の工程において、アンカー配列はアンカー配列相補体にハイブリダイズされ、表面上に結合した伸長配列の量が測定される。
【０１４５】
図１（ｃ）に示した方法の特定の実施形態を図２（ａ）に示すが、ここで、アンカー試薬は検出複合体を表面に接着させるために使用し、検出複合体に付着したプローブはアンカー試薬に結合する伸長領域を生成するように伸長される。この実施形態において、複合体は近接プローブに結合する２つの検出試薬を使用して検出される。本方法は検出試薬をコネクター配列に接合させることを含み、その後、コネクター配列はライゲーションさせることにより環状標的配列を形成し、ローリングサークル増幅法によりアンカー試薬に結合したアンプリコンを生成させる。表面（２０１）は、捕捉試薬（２０２）およびアンカー試薬（２０３）を含む。１つまたはそれ以上の工程において、分析物は捕捉試薬、第１の近接プローブ（２０５）を含む第１の検出試薬（２０４）、第２の近接プローブ（２０７）を含む第２の検出試薬（２０６）に結合し、それにより、表面上に検出複合体（２０８）を形成する。検出複合体を、各々が第１の近接プローブの非重複領域と相補的な末端配列および第２の近接プローブの非重複領域と相補的な末端配列を含む２つのコネクター配列（２０９ａおよび２０９ｂ）と接触させる。コネクター配列は第１および第２の近接プローブとハイブリダイズさせ、コネクターオリゴヌクレオチドの末端配列はライゲーションさせることにより、第１および第２の近接プローブの両方にハイブリダイズさせた環状標的配列（２１０）を形成する。第２の近接プローブはローリングサークルハイブリダイゼーションにより伸長され、アンカー試薬に結合する結合試薬を含むアンプリコンを生成し、表面に結合したアンプリコンの量が測定される。第１の近接プローブは、第１のプローブの伸長を防ぐためにキャップされ、またはさもなければ修飾されてもよい。（代替的な実施形態においては、第１の近接プローブは伸長され、第２の近接プローブは伸長を防ぐためにキャップされ、またはさもなければ修飾されてもよい。）図２（ａ）に示した実施形態において、アンプリコンは、アンプリコンにハイブリダイズさせ、表面に結合したアンプリコンの量を測定するために使用する標識した検出プローブに相補的な２つまたはそれ以上の検出配列もまた含む。（図２（ａ）に示されていない）代替的な実施形態において、伸長プロセスは、アンプリコンに相補的な１つまたはそれ以上の標識プローブを添加することなく表面上で直接アンプリコンを検出するために使用する標識されたヌクレオチド塩基をアンプリコンに取り込む。図２（ｂ）は、第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチド（それぞれ２０９ａおよび２０９ｂ）を示すコネクター配列の構成要素の模式的な説明図である。ここで、第１のコネクターの第１の末端（Ｃ１（Ｅ１））および第２のコネクターの第１の末端（Ｃ２（Ｅ１））は第１の近接プローブの２つの非重複領域と相補的であり、第１のコネクターの第２の末端（Ｃ１（Ｅ２））および第２のコネクターの第２の末端（Ｃ２（Ｅ２））は第２の近接プローブの２つの非重複領域と相補的である。第１および第２のコネクターは第１および第２の近接プローブとハイブリダイズし、第１および第２のコネクターがライゲーションされることにより第１および第２の近接プローブの両方にハイブリダイズする環状標的配列を形成する。
【０１４６】
図２（ｃ）はコネクターの代替的な実施形態を示す。コネクター配列２１１は、第２の近接プローブと相補的な内部配列（ＣＩＳ）および第１の近接プローブの非重複領域に相補的な２つの末端配列（それぞれＣＥ１およびＣＥ２）を含む。この実施形態において、ローリングサークル増幅法のための環状標的配列を形成するために１つのライゲーション事象だけが必要である（すなわち、第１の近接プローブにハイブリダイズした末端ＣＥ１およびＣＥ２のライゲーション）が、プライミング／伸長が第２の近接プローブからのものであるため、２つの近接プローブの近接の必要性が保たれる。好ましくは、第１の近接プローブは、第１のプローブの伸長を防ぐためにキャップされ、またはさもなければ修飾される。
【０１４７】
その後、第２の近接プローブが環状標的配列のローリングサークル増幅法により伸長され、アンカー試薬に結合する結合領域を含むアンプリコンを生成し、表面に結合したアンプリコンの量が測定される。
【０１４８】
第１および第２の近接プローブの配列は当業者に知られている方法により設計することができる。例えば、各々のプローブは長さ約２０〜５０塩基、好ましくは長さ２５〜４０塩基の間、最も好ましくは長さ約３０〜３５塩基の間である。第１および第２の近接プローブはまた、本明細書に記載のプロセスにおいて使用される１つまたはそれ以上のコネクター配列またはその部分に相補的な配列を含む。１つの実施形態において、検出複合体は、各々が第１の近接プローブの非重複領域に相補的な末端配列および第２の近接プローブの非重複領域に相補的な末端配列を含む２つのコネクター配列（２０９ａおよび２０９ｂ）に接触する。したがって、この実施形態において、第１および第２の近接プローブは、各々がコネクターの末端配列に相補的な非重複領域を含む。代替的には、１つだけのコネクターを使用してよく、コネクター配列（２１１）は、第２の近接プローブと相補的な内部配列（ＣＩＳ）および第１の近接プローブの非重複領域に相補的な２つの末端配列（それぞれＣＥ１およびＣＥ２）を含む。したがって、この実施形態において、第１の近接プローブは、それぞれコネクター、ＣＥ１およびＣＥ２の２つの末端配列に相補的な非重複領域を含み、第２の近接プローブは、コネクターの内部配列（ＣＩＳ）に相補的な配列を含む。第１の近接プローブは、第１のプローブの伸長を防ぐためにキャップされ、またはさもなければ修飾されてもよい。（代替的な実施形態においては、第１の近接プローブは伸長され、第２の近接プローブは、伸長を防ぐためにキャップされ、またはさもなければ修飾されてもよい。）
【０１４９】
したがって、図１〜２に図示した実施形態は、アンカー試薬を取り込むように結合アッセイを改変できること、および／または検出複合体からのシグナルが増幅できることを示している。好ましい実施形態において、アンカー試薬およびシグナル増幅法を結合アッセイにおいて使用する。代替的には、増強した結合アッセイを達成するため、１つまたは他の方法のみを使用してもよい。したがって、本発明は、アンカー試薬を省略した、図１〜２に記載したようなシグナル増幅法を有するアッセイを含む。
【０１５０】
アンカー試薬が直接または間接的に表面に（例えば、結合反応により）結合したアンカー配列を含むこれらの実施形態において、アンカー試薬を生成するために、当該技術分野において確立した、共有結合によるおよび非共有結合による付着方法を含むオリゴヌクレオチドを固定するための方法を使用することができる。１つの実施形態において、アンカー試薬はアンカー配列に連結またはさもなければ結合したタンパク質を含む。この実施形態において、（共有結合によりまたは非共有結合により）表面に固定することができ、アンカーオリゴヌクレオチドにより修飾できる、任意のタンパク質を使用することができる。非限定的な例として、ストレプトアビジン、アビジン、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。好ましい実施形態として、アンカー試薬はＢＳＡを含む。タンパク質は、既知の方法を用いて、例えば、図３に図示したように、よく確立されたヘテロ二官能性架橋剤である、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を用いて、アンカーオリゴヌクレオチドで修飾し、表面に付着させることができる。ＳＭＣＣのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が反応することにより、チオール反応性マレイミド基を有するＢＳＡが標識される。変わって、マレイミド基は、チオール修飾オリゴヌクレオチドと反応して、安定なチオエーテル結合を介して連結したＢＳＡ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを形成する。１つの特定の例として、一連のＢＳＡ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを黒鉛炭素表面、好ましくはスクリーン印刷カーボンインク電極にプリントして、アレイを形成する。代替的には、タンパク質がアビジンまたはストレプトアビジンであるならば、アンカー配列はビオチンに連結することができ、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン相互作用により固定化したアビジンまたはストレプトアビジンに結合させることができる。
【０１５１】
アンカー試薬に付着したアンカーオリゴヌクレオチドは、伸長プロセスの間に展開する伸長配列（またはアンプリコン）にハイブリダイズする任意の配列であってよい。アンカーオリゴヌクレオチドはまた、相補性領域を表面から離れて伸長させるために、表面と相補的（ハイブリダイズしている）領域と間のリンカー配列として使用される非相補的な領域（例えばポリ（Ａ）配列）を含んでいてもよい。１つの実施形態として、ハイブリダイゼーション配列は、近接または検出プローブへの結合とは関連しないアンプリコンの領域（「内部」領域）として選択される。より特定の実施形態として、ハイブリダイゼーション配列は、アンプリコンの内部領域全長と相補的であり、（好ましくは長さ約２５ヌクレオチド）、単独としてまたは、例えば長さ３０ヌクレオチドまでのポリ（Ａ）アーム（ｐｏｌｙ（Ａ）ａｒｍ）との組み合わせとして含まれる。好ましくは、アンカーオリゴヌクレオチドは：（ｉ）（アンプリコンの内部領域についての全長相補体、長さ２５ヌクレオチド）−（２０ヌクレオチドのポリ（Ａ）アーム）；または（ｉｉ）（アンプリコンの内部領域の一部についての相補体、長さ１５ヌクレオチド）−（３０ヌクレオチドのポリ（Ａ）アーム）から選択される。
【０１５２】
１つの実施形態において、第２の近接プローブを伸長させるために、近接ライゲーション増幅（ＰＬＡ）が行われる。図２（ａ）〜（ｃ）を参照して上述したように、２つの近接プローブを含む複合体は１つまたはそれ以上のコネクターオリゴヌクレオチド（２０９ａ〜２０９ｂまたは２１１）と接触させ、ハイブリダイズしたコネクター配列のライゲーションにより環状オリゴヌクレオチドが形成され、それはその後、環のローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）により第２の近接プローブを伸長するために使用される。近接ライゲーション増幅のための適切なプローブ設計および増幅条件は、当該技術分野においてよく確立されている。本発明の独特な態様は、アンカー試薬において使用されるものと同じ配列のコネクターの１つに包含されるものである。第２の近接プローブの伸長の間、伸長した領域はそれによりアンカー試薬にハイブリダイズするアンカー配列の相補体を含み、それによりサンドイッチ複合体を安定化させ、第２の近接プローブの解離を防ぐ。伸長した第２の近接プローブは、（例えば、ＲＣＡ伸長反応の間の標識ヌクレオチドの包含により）表面上の分析物の量を決定するために測定できる検出可能な標識を含んでいてもよい。代替的には、多数の検出可能な標識を含む標識プローブが加えられ、伸長した第２の近接プローブにハイブリダイズされ、表面に結合した分析物の量が測定される。
【０１５３】
任意の適切な増幅技術を伸長配列（またはアンプリコン）の生成のために使用することができ、それには、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ連鎖反応法）、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；リガーゼ連鎖反応法）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；鎖置換増幅法）、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；自家持続配列複製法）および等温核酸増幅法（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、例えば、ヘリカーゼ依存増幅法（ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）およびローリングサークル増幅法（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＲＣＡ）を含むがそれらに限定されない。好ましい実施形態として、感度、多重化、ダイナミックレンジおよび拡張性の点で顕著な利点を有するため、ＲＣＡが使用される。ＲＣＡについての技術は当該技術分野において知られている（例えば、Ｂａｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２６：５０７３〜５０７８頁、１９９８；Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２２６頁、１９９８；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０１１３〜１０１１９頁、２０００；Ｆａｒｕｑｉら、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２：４頁、２０００；Ｎａｌｌｕｒら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：ｅ１１８頁、２００１；Ｄｅａｎら  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：１０９５〜１０９９頁、２００１；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：３５９〜３６５頁、２００２；米国特許第６，０５４，２７４号、６，２９１，１８７号、６，３２３，００９号、６，３４４，３２９号および６，３６８，８０１号を参照のこと）。ＲＣＡのいくつかの異なる変形が知られており、線形ＲＣＡ（ＬＲＣＡ）および指数関数的ＲＣＡ（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ＲＣＡ；ＥＲＣＡ）が含まれる。ＲＣＡはオリジナル標的ＤＮＡに付着したコピーの鎖とともに何千もの環状テンプレートのコピーを生成し、標的の空間的分解能およびシグナルの迅速的増幅をもたらす。ＲＣＡは（ｉ）単一標的分子の検出；（ｉｉ）ＤＮＡおよびＲＮＡと同様にタンパク質からのシグナルの増幅；（ｉｉｉ）固体表面上において増幅した分子の位置の同定；（ｉｖ）多くの異なる標的の同時測定；ならびに（ｖ）溶液中または固相における１つまたはそれ以上の標的の解析を容易にする。検出複合体を有するＲＣＡ生産物の空間位置局在性は、アレイまたは粒子に基づくフォーマットにおける多重結合アッセイの遂行の際に、特に有利となる。
【０１５４】
アンカー試薬およびシグナル増幅プロセスの両方を使用した本発明の特定の実施形態を図４（ａ）に示した。図４（ａ）は、捕捉試薬（４０２）、分析物（４０３）ならびに、各々がそれぞれ第１の近接プローブ（４０６）（ＰＰ１、配列番号１）および第２の近接プローブ（４０７）（ＰＰ２、配列番号２）を含む２つの検出試薬（３０４および３０５）の間において、表面上（４０１）に形成された複合体を示す。第１および第２のコネクターオリゴヌクレオチドＣｉｒｃ−１（４０８）（配列番号４）およびＣｉｒｃ−２（４０９）（配列番号５）が加えられ、両者の近接プローブが複合体に存在すると、各々がＣｉｒｃ−１およびＣｉｒｃ−２にハイブリダイズし、２つの近接プローブの間に架橋を作製する。結合したコネクタープローブはそれぞれライゲーション部位１および２（４１０および４１１）でライゲーションされ、環状ＤＮＡテンプレート（４１２）を形成する。環状ＤＮＡテンプレートはローリングサークル増幅法により増幅され、第２の近接プローブを伸長し、それにより、１つまたはそれ以上の検出配列（４１３）および（部分的なアンカー配列相補体（４１５）を含む）アンカーオリゴヌクレオチド配列相補体（４１４）を含むアンプリコンを生成する。（捕捉部分（４１７）に付着した）アンカーオリゴヌクレオチド配列（４１６）およびその相補体はハイブリダイズし、多数の検出プローブは多数の検出プローブ配列にハイブリダイズし、表面に結合した分析物の量が測定される（示されていないが図１（ａ）に図示してある）。図４（ｂ）は、第１の近接プローブ（ＰＰ１）にハイブリダイズするように設計された一部分、検出オリゴヌクレオチド配列、（アンカーオリゴヌクレオチド配列に結合するように全体または部分的に使用することができる）アンプリコンの内部領域、および（第２の近接プローブにハイブリダイズするように設計された）ＰＰ２の一部分を有する、第１の環状ＤＮＡテンプレートＣｉｒｃ−１（４０８）（配列番号４）の例示的な配列を示している。（配列番号４および配列番号５の配列を含む）環状ＤＮＡテンプレートがローリングサークル増幅法により増幅され、多数の検出配列（それぞれ４１８および４１９）を含むアンプリコンを生成することを示す、さらなる実施形態を図４（ｃ）に示した。本明細書に記載の配列を変えることを意図しなくとも、図４（ｃ）のような図に開示されたような近接プローブＰＰ１およびＰＰ２のポリ−Ａテイルは、開示したＰＰ１および／またはＰＰ２配列と比較して、図に具体的に示されたアラニン反復の数がばらついていてもよいことは、理解されるべきである。
【０１５５】
図４（ａ）に示された本発明のさらなる実施形態において、捕捉部分４１７に付着したアンカーオリゴヌクレオチド配列（４１６）は、３’の自由末端を有し、プライマーとして作用することができる。この実施形態において、第２の近接プローブは検出配列（４１３）と相補的な配列を含む。
【０１５６】
ＲＣＡまたは任意の適切な増幅方法により増幅される標的配列を生成する別のアプローチを図５に図示した。この実施形態において、各々の近接プローブはループしたヘアピン構造に折りたたまれ得る。これらのヘアピン構造の形成により、単鎖ループおよび組み換えシグナルを含む二重鎖部分が生成される。リコンビナーゼを加えて、２つのヘアピン構造の組み換えを推進し、環状ＤＮＡテンプレートを形成する。その後、上述のようなＲＣＡに供する。アンプリコンは標識され、場合によってアンカー試薬にアンカーされ、分析物が検出される。この実施形態の重要な要素は、リコンビナーゼが配列特異的組み換え部位を含むＤＮＡの部位特異的組み換えを触媒することができる能力である。例えば、バクテリオファージＰ１からのＣｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位を含む部位において組み換えを触媒し、他の非限定的な例としてＦｌｉｐｐａｓｅ（ｆｌｐ、酵母由来）、Ｈｉｎ（サルモネラ菌）、およびＣｒｅの遺伝子操作（進化）バージョンであるＴｒｅが含まれるが、それらに限定されない。この代替的なアプローチはオリゴヌクレオチドテンプレート、ＡＴＰおよびｄＮＴＰのような付加的な構成要素の添加が必要ではない。この実施形態において、ｌｏｘＰ（組み換え）部位が、非対称的であるように修飾されることが好ましく、通常の平衡が望ましい組み換え生産物の形成の方向にシフトするように得られる。これは、組み換え部位の明暗の濃淡により、図５に図示される。
【０１５７】
さらに、ＲＣＡまたは任意の適切な増幅方法により増幅された標的配列を生成するための、なお別の方法を図６（ａ）に図示する。検出試薬に付着した各々の近接プローブは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる２つのオリゴヌクレオチド間の部位特異的組み換えが可能なｌｏｘＰ部位を含み、ｌｏｘＰ部位に隣接する、１つの近接プローブの５’部分および他の近接プローブの３’部分が含まれる新しいオリゴヌクレオチド配列の形成をもたらす。新しく作製された標的配列は、その後、上述のように、任意の適切な方法により増幅させ、標識させ、場合によってアンカーさせ、検出させることができる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを増幅のための操作可能な要素として使用する、この実施形態を図６（ａ）に図示する。近接プローブの３または５’部分のいずれかに連結したＴ３およびＳＰ６のような他のＲＮＡポリメラーゼ部位が本方法における使用に同じく適切であることもまた理解される。この実施形態において、ｌｏｘＰ（組み換え）部位が、非対称的であるように修飾されることが好ましく、通常の平衡が望ましい組み換え生産物の形成の方向にシフトするように得られる。図６（ｂ）に示すように、この方法はＲＣＡにおいて使用することができる環状ＤＮＡテンプレートを生成するために使用することもできる。
【０１５８】
本発明は、分析物を表面上の捕捉試薬および２つの検出試薬に結合させ、検出複合体を形成することを含む分析物の検出方法を含む。本方法は、２つの検出試薬の１つのみを含む複合体と比較して、両方の検出試薬を含む複合体を優先的に測定する、検出複合体の測定を含む。１つの実施形態として、本方法は複合体を形成すること、その後、検出試薬を架橋すること、および架橋した試薬を検出することを含む。検出複合体の構成要素を連結するために、任意の適切な架橋化学が使用できる。例えば、第１および第２の検出試薬は、反応性部分とリンクする多機能性架橋剤の添加により反応し、連結する反応性部分を含むことができる。この実施形態において、反応性部分および架橋剤はアミン、チオール、ヒドラジド、アルデヒド、エステル、ヨードアセトアミド、マレイミド、クリックケミストリー試薬、およびそれらの組み合わせを含むことができる。別の実施形態において、第１および第２の検出試薬は結合部分を含んでもよく、架橋剤は結合部分の多価の結合パートナーである。この実施形態のいくつかの非限定的な例として：（ａ）第１および第２の検出試薬は動物種の抗体であって、架橋剤は動物種の抗体をターゲティングする多価の抗−種抗体である；（ｂ）第１および第２の検出試薬はビオチンを含み、架橋剤はストレプトアビジンである（もしくは逆もまた同じ）；（ｃ）第１および第２の検出試薬はストレプトアビジンに連結しており、架橋剤は多数のビオチン分子を含むポリマーである（もしくは逆もまた同じ）；または（ｄ）第１および第２の検出試薬はそれぞれ第１および第２の核酸プローブを含み、架橋剤は、第１の核酸プローブに相補的な配列と第２の核酸プローブに相補的な別途の配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【０１５９】
特定の実施形態において、サンプル中の目的の分析物は、固定化した捕捉試薬、第１の検出試薬および第２の検出試薬に分析物を結合させ、複合体を形成することにより検出することができる。ここで、第１の検出試薬は第１の検出可能な標識および第１の核酸プローブを含み、ならびに第２の検出試薬は第２の検出可能な標識および第２の核酸プローブを含む。この実施形態において、第１および第２の検出試薬は（ｉ）第１のプローブを第２のプローブにハイブリダイズさせる、（ｉｉ）第１および第２のプローブを第１および第２のプローブに相補的な領域を有する第３の核酸にハイブリダイズさせる、または（ｉｉｉ）第１および第２のプローブをライゲーションすることにより、架橋される。
【０１６０】
架橋された生産物は表面に結合されることにより検出することができるか、または場合によって、架橋された生産物は表面から溶出剤の中へ放出され、検出されることができる。この点において、第１および第２の検出可能な標識の両方を含む、溶出剤中のこれらの個々の架橋された生産物のみがカウントされる。溶出剤中の標識の存在を検出するために、任意の適切な検出方法が使用される。好ましい実施形態において、標識は蛍光分子であって、溶出剤中に存在する標識された架橋された生産物は、１分子蛍光検出、例えば、蛍光相関分光法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、および／または蛍光相互相関分光法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によってカウントされる。この実施形態において、１分子蛍光検出は、キャピラリーを通じて溶出剤を流すこと、光源をキャピラリーの中の容積に焦点をあわせ、照合ゾーン（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｚｏｎｅ）を作製することおよび照合ゾーンを通る蛍光分子の通過を検出するために照合ゾーンを光検出器で観測することを含む。検出方法は第１の標識に関連する第１の蛍光シグナルおよび第２の標識に関連する第２の蛍光シグナルを検出すること、および両方のシグナルが照合ゾーンから検出される検出事象をカウントすることをさらに含んでいてもよい。代替的には、１つの標識は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーであり、他のラベルはＦＲＥＴアクセプターであり、検出方法は照合ゾーンのＦＲＥＴドナーを励起すること、ＦＲＥＴアクセプターからの蛍光シグナルを検出することをさらに含んでもよい。
【０１６１】
特定の実施形態において、サンプル中の分析物は、分析物を固定化した捕捉試薬、第１の核酸プローブを含む第１の検出試薬および第２の核酸プローブを含む第２の検出試薬に結合させ、複合体を形成させること；検出可能な標識を含む伸長配列を形成するために、第２の核酸プローブを伸長させることであって、伸長は複合体中の第１および第２の核酸プローブの共局在に依存していること；伸長配列を表面から溶出剤中へ放出すること；ならびに溶出剤中の個々の伸長配列をカウントすることにより検出することができる。伸長工程は、プローブをテンプレート核酸配列に結合させることおよびプローブをポリメラーゼ連鎖反応法により伸長させることを含んでいてもよい。代替的には、伸長工程は、第１のプローブをテンプレート核酸配列に結合させること、環状核酸テンプレートを形成させること、および環状テンプレートをローリングサークル増幅法により伸長させることを含む。伸長工程は、第１のプローブをテンプレート核酸配列に結合させること、第２のプローブをテンプレート配列に結合させること、ならびに第１および第２のプローブをライゲーションさせることを含んでいてもよい。
【０１６２】
捕捉試薬を使用する本発明の方法において、捕捉試薬は直接的に固相に固定化することができ、または例えば下に述べるターゲッティング試薬のような、第２の結合試薬によって間接的に固定化することができる。例えば、捕捉試薬は固相上に固定化したターゲッティング試薬相補体に結合するターゲッティング試薬に連結してもよいし、含んでもよい。ターゲッティング試薬のその相補体への結合は直接的であってもよいし（例えば、ターゲッティング試薬はストレプトアビジンであって相補体はビオチンであってもよい）、または架橋剤を介して間接的であってもよい（例えば、ターゲッティング試薬および相補体はビオチンであって、架橋剤はストレプトアビジンのような多価のビオチン結合受容体であってもよい）。１つの実施形態において、ターゲッティング剤およびその相補体は第１のオリゴヌクレオチドおよび相補性オリゴヌクレオチド、受容体−リガンドの対、抗原−抗体の対、ハプテン−抗体の対、エピトープ−抗体の対、ミメトープ−抗体の対、アプタマー−標的分子の対、ハイブリダイゼーションパートナーまたはインターカレーター標的分子の対を含む。アッセイにおいて使用されるターゲッティング剤および相補体は、アッセイによって測定される分析物についての捕捉試薬または検出試薬と関連するターゲッティング剤および相補体がアッセイによって測定される他の分析物についての捕捉試薬または検出試薬に関連するターゲッティング剤および相補体について実質的に非交差反応性であるように選択される。例えば、結合試薬のその関連結合ドメインへの（その関連ターゲッティング剤およびターゲッティング剤相補体による）結合は、実質的に他の分析物（および存在する異なるターゲッティング剤相補体）に関連する結合ドメインへのその結合よりも実質的に強力であるべきである。好ましくは、分析物についての捕捉試薬または検出試薬の他の分析物に関連する結合ドメインへの結合の正しい結合ドメインへの結合に対する交差反応性は、＜１％、より好ましくは＜０．１％およびより好ましくは＜０．０１％である。好ましい実施形態において、ターゲッティング剤／ターゲッティング剤相補体は相補性配列を含むオリゴヌクレオチドの対を含み、ターゲッティング剤およびその相補体はターゲッティング剤がその相補体にハイブリダイズするために十分な条件下で接触される。
【０１６３】
ターゲッティング剤が使用される際は、アッセイ法に使用される捕捉試薬がいつ固相上に固定化されるかについて、ある程度柔軟性がある。１つの実施形態において、捕捉試薬は、ターゲッティング剤−ターゲッティング剤相補体相互作用により固相上に事前に固定化して、ユーザーに提供される。別の実施形態において、ターゲッティング剤および固定化したターゲッティング剤相補体を支持する固相に連結した捕捉試薬は、別々の構成要素として提供される。アッセイ方法は、したがって、ターゲッティング剤をその相補体に（直接または架橋剤の使用により）結合することにより捕捉試薬を固相上に固定化する工程をさらに含む。この工程は、検出複合体の形成に関連する工程の前、同時に、または後に行われてもよい。
【０１６４】
本発明の方法においては、結合アッセイの技術分野からの従来の表面を含む広く多様な表面が使用に適切である。表面はポリマー（例えば、ポリスチレンおよびポリプロピレン）、セラミックス、ガラス、複合材料（例えば、カーボンベースのインクのようなカーボン−ポリマー複合体）を含む様々な異なる材料から作られてもよい。適切な表面としては、アッセイ容器の内部表面（例えば、試験管、キュベット、フローセル、ＦＡＣＳセルソーター、カートリッジ、マルチウェルプレートのウェルなど）、スライド、（遺伝子またはタンパク質チップ測定において使用されるような）アッセイチップ、ピンまたはプローブ、ビーズ、ろ過メディア、側方流動メディア（例えば、側方流動試験紙において使用されるろ過膜）などのような巨視的な物体の表面が挙げられる。
【０１６５】
適切な表面としてはまた、他のタイプの粒子ベースのアッセイにおいて通常使用される粒子（コロイドまたはビーズが含まれるがそれらに限定されない）、例えば、マグネティック、ポリプロピレン、およびラテックス粒子、固相合成において典型的に使用される材料、例えば、ポリスチレンおよびポリアクリルアミド粒子、ならびにクロマトグラフィーの応用において典型的に使用される材料、例えば、シリカ、アルミナ、ポリアクリルアミド、ポリスチレンが、挙げられる。材料はまたカーボン小繊維のような繊維であってもよい。微小粒子は無生物であってもよいし、または代替的には、細胞、ウイルス、バクテリアなどの生命の生物学的実態を含んでいてもよい。本方法において使用される粒子には、１つまたはそれ以上の捕捉試薬または検出試薬に付着させるために適切な任意の材料が含まれてもよく、それは例えば、遠心分離、重力、ろ過、またはマグネティック収集を介して収集してもよい。捕捉試薬または検出試薬に付着させてもよい広く多様な異なるタイプの粒子が結合アッセイにおける使用のために市販されている。これらには、粒子を磁場によって収集できるように磁化可能な材料を含む粒子とともに非マグネティック粒子が含まれる。１つの実施形態において、粒子は、コロイド状金粒子のような伝導性および／または半導体材料を含む。微小粒子は広く多様なサイズおよび形状を有していてもよい。限定されない例としては、微小粒子は５ナノメートルから１００マイクロメートルの間であってよい。好ましくは、微小粒子は２０ｎｍから１０マイクロメートルの間のサイズを有する。粒子は球状、長方形、ロッド状などであってよいか、または形状として不規則であってもよい。
【０１６６】
本方法において使用される粒子は、粒子の混合物の中から特定の粒子または粒子の亜集団を同定するようにコードされてもよい。そのようにコードされた粒子の使用は、結合アッセイについて固相支持体として粒子を利用するアッセイの多重化を可能にするように使用されてきた。１つのアプローチとして、粒子は１つまたはそれ以上の蛍光色素を含むように製造され、１つまたはそれ以上の波長における蛍光発光の強度および／または相対的強度に基づいて粒子の特定の集団が同定される。このアプローチはルミネックスｘＭＡＰシステムズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ  ｓｙｓｔｅｍｓ）（例えば、米国特許第６，９３９，７２０号を参照のこと）およびベクトンディッキンソン  サイトメトリックビーズアレイシステムズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ）において使用されてきた。代替的には、粒子はサイズ、形状、包埋した光学的パターンなどのような他の物性の差異によりコードされてもよい。混合物中または粒子のセット中に提供された１つまたはそれ以上の粒子は、粒子の光学的特性、サイズ、形状、包埋した光学的パターンなどに基づいて、混合物中の他の粒子と区別されるようにコードされてもよい。
【０１６７】
特定の実施形態において、本発明の方法は多数の異なる分析物をこれらの分析物についての多数の捕捉試薬に結合させることにより、多重化されたフォーマットにおいて使用することができる。捕捉分析物は、コードすることにより特定のビーズについての捕捉試薬（および分析物標的）が同定されるように、コードされたビーズに固定化される。本方法は、（本明細書に記載した検出アプローチを使用して）結合した分析物を有するビーズの数をカウントすることをさらに含んでもよい。
【０１６８】
代替的にはまたは付加的には、検出複合体および／または捕捉試薬は、例えば、結合ドメインが個々のアレイ要素である結合アレイにおいて、または結合ドメインが個々のビーズであるビーズのセットにおいて、別々のアッセイシグナルが各々の結合ドメイン上に生成され、測定されるようにして、直接的または間接的に１つまたはそれ以上の固相上の異なる別々の結合ドメインに結合することができる。もし異なる分析物についての捕捉試薬が異なる結合ドメインに固定化された場合には、それらのドメインに結合した異なる分析物は独立に測定することができる。そのような実施形態の１つの例としては、結合ドメインは１つまたはそれ以上の表面上に、目的の分析物を結合する捕捉試薬の別々のドメインを固定化させるように調製される。場合によって、表面は、部分的に、サンプルを保持するかまたはサンプルが通過する（例えば、フローセル、ウェル、キュベットなどの）容器の１つまたはそれ以上の境界を定義してもよい。好ましい実施形態については、個々の結合ドメインは電気化学または電気化学発光アッセイにおいて使用される電極上に形成される。電気化学発光を用いた多数の結合ドメインを含む表面上の分析物の多重化測定は、メソスケールダイアグノスティックス、ＬＬＣ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）、ＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ（登録商標）およびＳＥＣＴＯＲ（登録商標）イメージャー（Ｉｍａｇｅｒ）製品系統において使用されてきた（例えば、米国特許第７，８４２，２４６号および６，９７７，７２２号、その記載は参照によって本明細書にその全体を組み入れる）。
【０１６９】
なおさらに、検出複合体および／または捕捉試薬は、上述したように場合によって異なる別々の結合ドメインを含む電極表面に、直接的または間接的に結合することができる。電極表面はマルチウェルプレートおよび／またはフローセルの構成要素であってよい。電極は、伝導性物質、例えば、金、銀、プラチナ、ニッケル、スチール、イリジウム、銅、アルミニウム、伝導性アロー（ａ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ａｌｌｏｗ）などのような金属を含むことができる。それらにはまた、例えば、酸化アルミニウム被覆アルミニウムのような酸化物被覆金属を含んでいてもよい。電極は、例えば、金属対電極およびカーボン作用電極のような、同じまたは異なる材料から作られ得る作用および対電極を含むことができる。１つの特定の実施形態において、電極には、カーボン、カーボンブラック、黒鉛カーボン、カーボンナノチューブ、カーボン小繊維、黒鉛、グラフェン、カーボンファイバーおよびそれらの混合物のようなカーボンベースの材料が含まれる。１つの実施形態において、電極には、例えば、黒鉛、カーボンブラック、カーボンナノチューブなどのような、元素状炭素が含まれる。それらは、伝導性カーボンポリマー複合材料、マトリックス中に分散された伝導性粒子（例えば、カーボンインク、カーボンペースト、金属インク、グラフェンインク）、および／または伝導性ポリマーが含まれ得ることが有利である。本発明の１つの特定の実施形態は、カーボン、例えばカーボン層、および／またはカーボンインクのスクリーン印刷層を含む電極（例えば、作用および／または対電極）を有するアッセイモジュール、好ましくはマルチ−ウェルプレートである。
【０１７０】
本発明は、個々の検出複合体の検出およびカウントについての方法を含む。特定の実施形態において、表面は、サンプル中に存在する１つまたはそれ以上の分析物分子について多数の捕捉試薬を含み、多数の捕捉試薬は表面に位置する多数の分離できる結合領域にわたって分散される。測定を実施し、解析するために使用される条件下において、「分離できる結合領域」とは、分離可能で、さらなる個々の結合事象が起きているもう１つのエリアと区別できる個々の結合事象に関連する最小の表面エリアである。したがって、本方法は１つまたはそれ以上の分析物分子を１つまたはそれ以上の捕捉試薬に表面上で結合させること、表面上の多数の分離できる結合領域における分析物分子の存在または不在を決定すること、ならびに、分析物分子を含む分離できる結合領域の数および／または分析物分子を含まない分析物ドメインの数を同定することを含む。
【０１７１】
分離できる結合領域は、全体的にまたは部分的に、光学的に照合することができる。すなわち、各々の個々の分離できる結合領域は個々に光学的に照合され、および／または、多数の分離できる結合領域を含む表面全体は画像化されることができ、その画像の１つまたはそれ以上のピクセルまたはピクセルのグループ分けは個々の分離できる結合領域にマップされることができる。分離できる結合領域は多数の微小粒子中の微小粒子であってもよい。光学サインについての変化を示す分離できる結合領域は、従来の光学的検出システムにより同定されることができる。検出した種（例えば、蛍光実態のタイプなど）および操作的な波長に依存して、特定の波長について設計した光学フィルターは、分離できる結合領域の光学照合について使用することができる。光学照合が使用される場合の実施形態において、システムは、光源の波長および／または強度を調整するために複数の光源および／または多数のフィルターを含むことができる。いくつかの実施形態において、多数の分離できる結合領域からの光学シグナルはＣＣＤカメラを用いて捕捉される。画像を捕捉するために使用することができるカメラ画像化システムの他の非限定的な例としては、当業者には知られている、電荷注入装置（ｃｈａｒｇｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅｓ  （ＣＩＤｓ））、相補型金属酸化物半導体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｍｅｔａｌ  ｏｘｉｄｅ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒｓ（ＣＭＯＳｓ））装置、科学的ＣＭＯＳ（ｓＣＭＯＳ）装置、および時間遅延積分（ｔｉｍｅ  ｄｅｌａｙ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ＴＤＩ））装置が挙げられる。いくつかの実施形態においては、光ダイオードまたは光電子増倍管（ＰＭＴ）を連結したスキャニングミラーシステムが画像化に使用されてもよい。
【０１７２】
本方法の測定工程には、多数のピクセルからなる画像を生成するために表面（またはその一部）からの光学シグナルを画像化することを含むことができる。ここで、各々の分離できる結合領域は画像中の１つまたはそれ以上のピクセルまたはピクセルの群にマップする。結合事象（検出複合体）を示すシグナルを有するピクセルまたはピクセルのセットを同定するための画像解析は、例えば、蛍光顕微鏡像における標識された生物学的構造を同定およびカウントするために利用できる豊富な画像解析アルゴリズムおよびソフトウェアのような、技術分野に認識された方法を用いて達成することができる。１つの実施形態において、大規模のシグナル勾配を除去するため画像をフィルタリングした後に、画像は区分けしきい値を用いてバイナリ画像に変換される。分離できる結合領域は上述のしきい値強度の隣接領域を同定することにより、見つけられる。結合ドメインは、サイズおよび強度の要求を満たせば、結合事象として分類される。
【０１７３】
１つの実施形態において、分離できる結合領域はアレイの要素である。好ましい実施形態において、アレイは、マイクロ−ウェルまたはナノウェル、例えば単位基板の個々のくぼみまたはウェルのアレイである。好ましくは、ウェルの容量は１００ｎＬ未満、好ましくは５０ｎＬ未満である。１つの実施形態において、ウェルの容量は約１０ａＬ〜１００ｐＬの範囲である。場合において、ウェルは微小粒子を保持するように形状が決められていてもよい。
【０１７４】
１つの実施形態において、基板に位置し、アッセイの間に対象となる分離できる結合領域の少なくとも５０％は、ゼロまたは１つの分析物分子を含んでいる。好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９９％の分離できる結合領域は、ゼロまたは１つ以上の分析物分子を含んでいる。サンプル中の分析物分子の濃度は少なくとも部分的に、少なくとも１つまたは１つの分析物分子を含む結合領域の数の較正曲線、ポアソン分布解析および／またはガウシアン分布解析を用いて決定される。特定の実施形態において、表面は、各々が分析物分子についての多数の捕捉試薬を含む多数の粒子を含み、多数の粒子は多数の分離できる結合領域（例えば、マイクロ−またはナノ−ウェルのアレイ）にわたって分布される。したがって、本方法は：（ｉ）１つまたはそれ以上の分析物分子を表面上の１つまたはそれ以上の捕捉試薬に結合させること、（ｉｉ）分離できる結合領域のアレイにわたって多数の粒子を分布させること、ならびに（ｉｉｉ）分析物分子を含む結合ドメインの数および／または分析物分子を含まない結合ドメインの数を同定するために、各々の分離できる結合領域において分析物分子が存在するか不在であるかを決定することを含む。
【０１７５】
本発明の１つまたはそれ以上の方法を用いて閉じ込められた容量の分析物を検出することもまた有利である。これらの実施形態において、サンプル中の分析物分子は、各々が区別できる標識を有する検出試薬の対に結合しており、分析物は、基板、例えばプレート、ディッシュ、チップ、光学ファイバーなど、の上で、多数の場所、例えばウェルまたは反応容器（本明細書ににおいては「反応容器」と呼ぶ）、にわたって、反応容器の大部分が１つまたはより少ない分析物を含むように区分化されている。この方法によりユーザーは、分析物に付着した各々の区別できる標識を含む反応容器の数をカウントすることにより分析物分子を検出することができる。いくつかの場合において、課題対象となる多数の反応容器は、少なくとも１つの分析物分子を含む可能性がある全量の反応容器の一部または本質的に全てである（例えば、少なくとも１つの分析物分子に関連しているかまたはいずれの分析物分子にも関連していない）。以下の出版された米国特許出願を引用する：米国特許出願第２００７０２５９４４８号；米国特許出願第２００７０２５９３８５号；米国特許出願第２００７０２５９３８１号；および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／０１９１８４号。これらの出版物の各々の開示は、参照によって本明細書に組み入れる。反応容器の少なくとも一部を課題対象としてよく、少なくとも１つの分析物分子または粒子を含む反応容器の数／パーセンテージを示す測定がされてもよい。いくつかの場合において、数／パーセンテージに基づいて、流体サンプル中の分析物分子の濃度の測定が決定されてもよい。
【０１７６】
閉じ込められた容量の中での分析物分子の検出を可能とする特定の実施形態において、サンプル中の分析物は、分析物を第１および第２の検出試薬に結合させ、検出複合体を形成することにより検出することができる。各々の検出複合体には、分析物、第１の検出試薬、および第２の検出試薬が含まれ、ならびに第１の検出試薬および第２の検出試薬はそれぞれ第１および第２の検出可能な標識を有する。検出複合体は同時に、実質的に同時に、または順次的に形成されることができる。検出複合体は、反応容器の大部分が１つまたはより少ない検出複合体を含むように多数の反応容器にわたって区分化され、第１および第２の検出可能な標識の各々を含む反応容器の数をカウントすることにより、分析物分子の数が検出される。好ましくは、検出複合体は、結合していない第１の検出試薬および結合していない第２の検出試薬を同じ容器中に検出する可能性が約１０に１つ未満、好ましくは約１００に１つ未満、より好ましくは約１０００に１つ未満、および最も好ましくは約１０，０００に１つ未満であるように、多数の反応容器にわたって区分化される。検出複合体は、例えば、多数の反応容器にわたって検出複合体の一部を手動で等分する、および／または検出複合体が支持体上の個々の反応容器の中へ分離するようにして、多数の反応容器にわたって検出複合体を含む溶液を流すことによって、多数の反応容器にわたって区分化、すなわち、部分または一部に分割または分離される。
【０１７７】
さらなる実施形態において、サンプル中の分析物は、（ａ）分析物を表面に結合した捕捉試薬ならびに第１および第２の検出試薬に結合させ、検出複合体を形成させることによって検出することができる。ここで、（ｉ）各々の検出複合体は捕捉試薬、分析物、第１の検出試薬および第２の検出試薬を含み、（ｉｉ）第１の検出試薬は第１の検出可能な標識を有し、および第２の検出試薬は第２の検出可能な標識を有する。任意の順序で構成要素を添加することにより、例えば、同時に、または実質的に同時に構成要素をまとめることによって、または順次に各々の構成要素を加えて、検出複合体を段階的に形成することによって、検出複合体を形成することができる。大部分の反応容器が１つまたはより少ない分析物を含むようにして、検出複合体は、多数の反応容器にわたって区分化され、第１および第２の検出可能な標識を含む反応容器の数をカウントすることによって、分析物分子の数が検出される。本方法は、各々の工程の後、および検出工程の前に洗浄してまたは洗浄せずに実行され得る。
【０１７８】
表面は粒子であることができ、場合によって、多数の捕捉試薬が粒子または多数の粒子の上に固定化される。この実施形態において、区分化工程は多くの方法により実行することができる：（ｉ）捕捉試薬は多数の粒子の上に固定化され、分析物の区分化は分析物を捕捉試薬に結合させることおよび粒子を多数の反応容器中に区分化することによって達成される；（ｉｉ）捕捉試薬は多数の粒子上に固定化され、分析物の区分化は粒子を多数の反応容器中に区分化し、その後分析物を捕捉試薬に結合させることによって達成される。
【０１７９】
多数の反応容器には、油中水滴型エマルション中に分散させた水ドロップレットも含む。エマルションは１００ｕｍまでの直径およびほぼ１ｎＬの容量のドロップレットとして作ることができる。高容量、すなわち、エマルション１ｍＬ中に１０１０ドロップレットを超える量、エマルション調製の容易さ、および広い範囲の条件にわたるそれらの高い安定性により、区画化生化学的アッセイの理想的手段が提供される。各々の水ドロップレットは、独立した反応容器として機能し、検出複合体は、場合によって粒子に付着して、多数の水ドロップレットにわたって区分化されることができる。
【０１８０】
代替的には、表面は、反応容器の１つの中の場所である。例えば、反応容器がプレートのウェルであるならば、表面はそのプレートのウェルの中のドメインまたは領域であることができる。この実施形態において、捕捉試薬は多数の反応容器のドメインまたは領域に固定化されることができ、区分化工程は分析物分子を捕捉試薬に結合させることによって達成される。別の実施形態において、多数の反応容器は、そこに固定化したターゲッティング部分を持つ領域を含み、捕捉試薬はターゲッティング部分相補体を含み、区分化工程はターゲッティング部分相補体を多数の反応容器に位置するターゲット部分に結合させることによって達成される。さらなる実施形態において、本明細書に記載の結合アッセイは、例えば、サンプル中の分析物の濃度を上昇させることおよび／またはアッセイ性能を妨げるかもしれないサンプル中に存在し得る異物の濃度を減少させることによって、アッセイ性能を改善させるための前濃縮工程も含むことができる。これは（ａ）目的の分析物を含むサンプルを分析物に結合する第１の結合試薬に連結した粒子に接触させ、それにより前記第１の結合試薬に結合した分析物を含む複合体を形成すること；（ｂ）複合体を収集すること；（ｃ）複合体からサンプルの結合していない構成要素を分離すること；（ｄ）および複合体を放出することによって行うことができる。この前濃縮方法は、アッセイ性能を妨げるかもしれない不純物を取り除くために本明細書に記載の結合アッセイが行われる前に行うことができる。この点において、米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／０２６１２９２号が引用され、その記載は参照によって本明細書に組み入れる。
【０１８１】
本発明の方法により解析されてもよいサンプルの例には、食料サンプル（食料抽出物、食料破砕物、飲料などを含む）、環境サンプル（例えば、土壌サンプル、環境スラッジ、収集した環境エアロゾル、環境ワイプ、ろ過水など）、工業サンプル（例えば、工業生産プロセスからの出発原料、生成物または中間体）、ヒトの医療サンプル、獣医学サンプルおよび他の生物学的起源のサンプルが含まれるが、それらに限定されない。解析されてもよい生物学的サンプルには、便、粘膜スワブ、生理学的試料、および／または細胞の懸濁液を含むサンプルが含まれるがそれらに限定されない。生物学的サンプルの具体例としては、血液、血清、血漿、便、粘膜スワブ、組織吸引物、組織破砕物、細胞培養物および細胞培養上清（真核生物および原核生物の細胞培養物を含む）、尿、唾液、たん、および脳脊髄サンプルが含まれる。
【０１８２】
本発明の方法を使用して測定されてもよい分析物としては、タンパク質、毒素、核酸、微生物、ウイルス、細胞、菌類、胞子、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、薬、ホルモン、ステロイド、栄養素、代謝産物および上記の分子の任意の修飾された誘導体、または１つもしくはそれ以上の上記の分子を含む任意の複合体またはそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。サンプル中の目的の分析物のレベルは疾患または病状を示すものであってよく、またはそれは単に患者がその分析物に曝されているか否かについて示すものであってもよい。
【０１８３】
本発明のアッセイはサンプル中の１つまたはそれ以上の、例えば２つまたはそれ以上の分析物の濃度を決定することに使用してもよい。したがって、２つまたはそれ以上の分析物は同じサンプル中で測定されてもよい。同じサンプル中で測定することができる分析物のパネルとしては、例えば、分析物についてのアッセイのパネルまたは病状または生理的条件に関連した活性が挙げられる。特定のこのようなパネルには、サイトカインおよび／またはそれらの受容体（例えば、１つまたはそれ以上のＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬＬ−α、ＩＬＬ−β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ−１０、ＩＬ−Ｌ２、ＩＦＮ−ｙ、など）、増殖因子および／またはそれらの受容体（例えば、１つまたはそれ以上のＥＧＦ、ＶＧＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、など）、乱用薬物、治療薬、ビタミン、病原体特異的抗体、自己抗体（例えば、Ｓｍ、ＲＮＰ、ＳＳ−Ａ、ＳＳ−α、Ｊ０−１、およびＳｃｌ−７０抗原に対して向けられた１つまたはそれ以上の抗体）、アレルゲン特異的抗体、腫瘍マーカー（例えば、１つまたはそれ以上のＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５  ＩＩ、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＹＦＲＡ  ２１−１、ＮＳＥ、ＡＦＰ、など）、うっ血性心臓疾患および／または急性心筋梗塞を含む心疾患のマーカー（例えば、１つまたはそれ以上のトロポニンＴ、トロポニンＩ、トロポニンＣ、ミオグロビン、ＣＫＭＢ、ミエロペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、β−ナトリウム利尿タンパク質（ＢＮＰ）、α−ナトリウム利尿タンパク質（ＡＮＰ）、エンドセリン、アルドステロン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、など）、止血に関連するマーカー（例えば、１つまたはそれ以上のフィブリンモノマー、Ｄ−ダイマー、トロンビン−アンチトロンビン複合体、プロトロンビン断片１＆２、抗Ｘａ因子など）、急性ウイルス性肝炎感染のマーカー（例えば、１つまたはそれ以上のＡ型肝炎ウイルスに対するＩｇＭ抗体、Ｂ型肝炎コア抗原に対するＩｇＭ抗体、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体等）、アルツハイマー病のマーカー（アルファ−アミロイド、ベータアミロイド、Ａβ  ４２、Ａβ  ４０、Ａβ  ３８、Ａβ  ３９、Ａβ  ３７、Ａβ  ３４、タウタンパク質、など）骨粗鬆症のマーカー（例えば、１つまたはそれ以上の架橋したＮｏｒ  Ｃテロペプチド、総デオキシピリジノリン、遊離のデオキシピリジノリン、オステオカルシン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲンのＣ末端プロペプチド、骨特異的アルカリホスファターゼなど）、妊孕能状態や妊孕能に関連する障害のマーカー（例えば、１つまたはそれ以上のエストラジオール、プロゲステロン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロラクチン、ｈＣＧ、テストステロンなど）、甲状腺障害のマーカー（例えば、１つまたはそれ以上の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、トータルＴ３、遊離Ｔ３、トータルＴ４、遊離Ｔ４、およびリバースＴ３）、および前立腺癌のマーカー（例えば、１つまたはそれ以上のトータルＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、複合体化ＰＳＡ、前立腺酸性ホスファターゼ、クレアチンキナーゼなど）のパネルが含まれる。本発明のある実施形態には、例えば、特定の病状または生理的条���に関連した１つもしくはそれ以上の、２つもしくはそれ以上の、４つもしくはそれ以上の、または１０もしくはそれ以上の分析物の測定が含まれる（例えば、パネルにおいて上述のようにリストに挙げたような、まとめてグループ化された分析物；例えば、甲状腺障害の診断に有用なパネルとして、例えば、１つまたはそれ以上の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、トータルＴ３、遊離Ｔ３、トータルＴ４、遊離Ｔ４、およびリバースＴ３が含まれてもよい）。
【０１８４】
好ましい実施形態において、パネルは、従来のサンプルマトリックス中に１つまたはそれ以上の低存在量の分析物、例えば、約１００ｆｇ／ｍＬ未満、好ましくは約１０ｆｇ／ｍＬ未満の濃度の分析物を含む。パネル中に含むことができる分析物の非限定的なリストには、例えば、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−３１、Ａｂ−３８、Ａｂ−４０、Ａｂ−４２、Ａｂ−３９、Ａｂ−４３、Ａｂ−１５、Ａｂ−１６、Ａｂ−１７、βアミロイドオリゴマー、Ｃ−ペプチド、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＮＦ−ｇ、ＰＳＡ、タウ、フォスフォ−タウ、ＴＮＦａ、トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、トロポニンＣ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＥＰＯ、ＬＣ３Ｂ、アルブミン、ＣＨＯ−Ｐ、大腸菌ＨＣＰ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＮＳＯ−Ｐ、Ｐｅｒ−Ｃ６、残余プロテインＡ（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、カスパーゼ−３アクティブ（Ｃａｓｐａｓｅ−３  ａｃｔｉｖｅ）、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＨＧＦＲ／ｏ−ＭＥＴ、ＩＦＮ−β、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、β−ＮＧＦ、ＴＦＦ３、ＴＩＭＰ１、Ｋｉｍ−１、α−２マクログロブリン、Ｄ−ダイマー、ＩＣＡＭ−１、ミエロペルオキシダーゼ、ミオグロビン、ＰＡＩ−１、ＰＣＳＫ９、プラスミノゲン、レニン／プロレニン、ｔＰＡ、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ−α、ＣＣＬ２／ＭＣＰ１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／Ｒａｎｔｅｓ、ＣＲＰ、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＬ−１０、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１α、ＩＬ−１β、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ１２（ｐ７０）、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−３３、ｃ−ＭＥＴ、アディポネクチン、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１、成長ホルモン、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、インシュリン、レプチン、乳汁分泌ホルモン、ＨＩＶ  ｐ２４、ＨＢ−ＥＧＦ、ＡＫＴ、フォスフォ−ＡＫＴおよびそれらの組み合わせを含む。
【０１８５】
特定の実施形態において、パネルは、従来のサンプルマトリックス中に１つまたはそれ以上の低存在量の分析物、例えば、約１００ｆｇ／ｍＬ未満、好ましくは約１０ｆｇ／ｍＬ未満の濃度の分析物を含む。好ましくはパネルには、１つまたはそれ以上の下記の分析物が含まれる：ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−３１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−３３、心筋トロポニンＴ、およびそれらの組み合わせ。特定の実施形態において、サンプル中に検出される分析物の濃度は、０．０１ｆＭから１００ｆＭ、０．０３ｆＭ〜５０ｆＭ、または０．０３ｆＭ〜１０ｆＭの範囲内である。いくつかの実施形態において、実質的に正確に決定され得るサンプル中の分析物分子の濃度は、約１００ｆＭ未満、約１０ｆＭ未満、約３ｆＭ未満、約１ｆＭ未満、約０．３ｆＭ未満、約０．１ｆＭ未満、約０．０３ｆＭ未満、またはそれ未満である。サンプル中の分析物分子の濃度は、サンプル中の分析物分子の測定濃度が、サンプル中の分析物分子の実際の濃度の約２０％以内であるならば、実質的に正確に決定されるとみなされてもよい。ある実施形態においては、サンプル中の分析物分子の測定濃度は、サンプル中の分析物分子の実際の濃度の約１０％以内、約３％以内または約１％以内である。アッセイの検出限界は、バックグラウンドシグナルより少なくとも２．５の標準偏差であるシグナルを与える濃度であり、好ましくは、アッセイは、サンプル中の約１０〜１０，０００の分子、またはサンプル中の１００〜５，０００分子またはサンプル中の１００〜１０００の分子を検出することができる。
【０１８６】
さらなる実施形態において、本明細書に記載される方法は、直近の暴露および／または感染に起因する低存在量の分析物を検出するために使用されることができる。様々な疾患または状態、例えば、癌、細菌感染、例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ；炭疽）、ウイルス感染症、例えば、ＨＩＶ、肝炎、ＨＰＶなど、毒素曝露、例えば、リシン、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、またはＥなどの早期診断が、ＥＬＩＳＡのような利用可能な技術の検出限界（ＬＯＤ）は、疾患の発症を示す可能性がある低存在量タンパク質の循環濃度よりも高いという事実によって制限されている。パネルには、１つまたはそれ以上の従来サンプルマトリックス中の低存在量の分析物、例えば、約１００ｆｇ／ｍＬ未満、または約１０ｆｇ／ｍＬ未満の濃度の分析物を含むことができる。パネルに含むことができる分析物の非限定的なリストには、例えば、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶｇｐ１６０、ＨＩＶｐ２４、ＨＩＶｐ６６、ＨＩＶｐ５１、ＨＩＶｐ１７、ＨＩＶｐ３１、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、Ｖｉｖ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥ型肝炎抗原、ＨＰＶタイプ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３、および／または８２、ＨＰＶ−Ｅ６およびＥ７タンパク質、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−３１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−３３、心筋トロポニンＴ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。なおさらには、パネルには直近の疾患の発症、暴露および／または感染に起因して低存在量であり得る１つまたはそれ以上の下記の分析物を含むことができる：Ａｂ−３８、Ａｂ−４０、Ａｂ−４２、Ａｂ−３９、Ａｂ−４３、Ａｂ−１５、Ａｂ−１６、Ａｂ−１７、βアミロイドオリゴマー、Ｃ−ペプチド、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＮＦ−ｇ、ＰＳＡ、Ｔａｕ、フォスフォ−Ｔａｕ、ＴＮＦａ、トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、トロポニンＣ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＥＰＯ、ＬＣ３Ｂ、アルブミン、ＣＨＯ−Ｐ、大腸菌ＨＣＰ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＮＳＯ−Ｐ、Ｐｅｒ−Ｃ６、残余プロテインＡ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、カスパーゼ−３アクティブ、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＨＧＦＲ／ｏ−ＭＥＴ、ＩＦＮ−β、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、β−ＮＧＦ、ＴＦＦ３、ＴＩＭＰ１、Ｋｉｍ−１、α−２マクログロブリン、Ｄ−ダイマー、ＩＣＡＭ−１、ミエロペルオキシダーゼ、ミオグロビン、ＰＡＩ−１、ＰＣＳＫ９、プラスミノゲン、レニン／プロレニン、ｔＰＡ、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ−α、ＣＣＬ２／ＭＣＰ１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／Ｒａｎｔｅｓ、ＣＲＰ、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＬ−１０、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ｃ−ＭＥＴ、アディポネクチン、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１、成長ホルモン、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、インシュリン、レプチン、乳汁分泌ホルモン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＡＫＴ、フォスフォ−ＡＫＴ、およびそれらの組み合わせ。
【０１８７】
本発明の方法は、上述したように、広い種類の生物学用および生化学用薬剤の検出を許容するように設計されている。１つの実施形態において、本方法は病原体および／または潜在的な病原体ウイルス、生物兵器剤（「ＢＷＡ」）を含むバクテリアおよび毒素を、血液、たん、大便、フィルター、綿棒などを制限されることなく含む、さまざまな関連する臨床および環境マトリックスにおいて検出するように使用してもよい。本発明の方法を用いて、（単独で、または組み合わせて）分析することができる病原体および毒素の非限定的なリストは、炭疽菌（炭疽）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ；ペスト）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ；コレラ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ；野兎病）、ブルセラ属菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．；ブルセラ症）、Ｑ熱リケッチア（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ；Ｑ熱）、リステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ）、サルモネラ菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖ．  ｃｈｏｌｅｒａ）、クラミジア  トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、バークホルデリア疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、天然痘ウイルス（ｖａｒｉｏｌａ  ｖｉｒｕｓ；天然痘）を含むオルソポックスウイルス（ｏｒｔｈｏｐｏｘ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、ウイルス性脳炎、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＶＥＥ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＷＥＥ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ｅａｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＥＥＥ）、アルファウイルス、ウイルス性出血熱、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、エボラウイルス、ブドウ球菌エンテロトキシン、リシン、ボツリヌス毒素（Ａ、Ｂ、Ｅ）、ボツリヌス菌、マイコトキシン、フザリウム、マイロテシウム（Ｍｙｒｏｔｅｃｉｕｍ）、セファロスポリウム、トリコデルマ、ベルチシモノスポリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｍｏｎｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スタキボトリス、鼻疽、小麦菌、バチルス  グロビジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、セラチア  マルセセンス、黄色の雨（ｙｅｌｌｏｗ  ｒａｉｎ）、トリコテセン系マイコトキシン、ネズミチフス菌、アフラトキシン、インドネズミノミ、ディアマヌス  モンタヌス（Ｄｉａｍａｎｕｓ  ｍｏｎｔａｎｕｓ）、痘瘡、サル痘ウイルス、アレナウイルス、ハンタウイルス、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱、ボリビア出血熱、リフトバレー熱ウイルス、クリミア−コンゴウイルス、ハンタウイルス、マールブルグ出血熱、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザ、インフルエンザＡ、インフルエンザＡ、Ｈ１特異的、インフルエンザＡ、Ｈ３特異的、インフルエンザＡ、Ｈ５特異的、インフルエンザＡ、２００９−Ｈ１Ｎ１特異的、インフルエンザＢなどのヒトおよび動物の株を含む）、ＲＳＶ、ヒト免疫不全ウイルスＩおよびＩＩ（ＨＩＶ  ＩおよびＩＩ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝炎（非Ａ、ＢまたはＣ）、エンテロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、クラミジア  トラコマチス、ナイセリア  ゴノレア、膣トリコモナス、ヒトパピローマウイルス、梅毒トレポネーマ、肺炎連鎖球菌、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ヘモフィルス  インフルエンザエ、肺炎マイコプラズマ、クラミドフィラ  ニューモニエ、レジオネラ  ニューモフィラ、黄色ブドウ球菌、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、アブリン、志賀毒素１、志賀毒素２、モラクセラ  カタラーリス、化膿連鎖球菌、クロストリジウム  ディフィシル、髄膜炎菌、肺炎桿菌、結核菌、Ａ群連鎖球菌、大腸菌Ｏ１５７、コロナウイルス、コクサッキーＡウイルス、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、メタニューモウイルス、ワクシニア、ならびにアデノウイルスである。
【０１８８】
本明細書に記載の結合アッセイの改良法は、結合アッセイのダイナミックレンジ、すなわち、希釈することなくシステムもしくは方法によって定量化され得る流体サンプル中の分析物分子の濃度またはサンプルの濃度の範囲、を拡大するかまたは同様の結果を生ずるアッセイ条件の変更（例えば、使用する試薬の濃度など）するために使用することができ、ここで、分析物分子の測定濃度は実質的に正確に決定され得る。流体サンプル中の分析物分子の濃度は、流体サンプル中の分析物分子の測定濃度が、流体サンプル中の分析物分子の実際の（例えば、真の）濃度の約１０％以内であれば、実質的に正確に決定されたものとみなされてもよい。ある実施形態において、流体サンプル中の分析物分子の測定濃度は測定濃度が流体サンプル中の分析物分子の実際の濃度の約５％以内、約４％以内、約３％以内、約２％以内、約１％以内、約０．５％以内、約０．４％以内、約０．３％以内、約０．２％以内、約０．１％以内である実施形態において実質的に正確に決定される。いくつかの場合において、決定した濃度の測定値は、真の（例えば、実際の）濃度とは、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下異なる。アッセイ方法の精度は、いくつかの実施形態において、選択したアッセイ方法を用い、測定濃度を実際の濃度と比較して、既知の濃度の流体サンプル中の分析物分子の濃度を決定することにより、決定されてもよい。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、システムまたは方法は、約１０００（３  ｌｏｇ）、約１０，０００（４  ｌｏｇ）、約１００，０００（５  ｌｏｇ）、約３５０，０００（５．５  ｌｏｇ）、１，０００，０００（６  ｌｏｇ）、約３，５００，０００（６．５  ｌｏｇ）、約１０，０００，０００（７  ｌｏｇ）、約３５，０００，０００（７．５  ｌｏｇ）、約１００，０００，０００（８  ｌｏｇ）以上のダイナミックレンジにわたって流体サンプル中の分析物分子の濃度を測定することができるものであってよい。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、実質的に正確に決定され得る流体サンプル中の分析物分子の濃度（例えば未知の濃度）は、約５０００ｆＭ（フェムトモル）未満、約３０００ｆＭ未満、約２０００ｆＭ未満、約１０００ｆＭ未満、約５００ｆＭ未満、約３００ｆＭ未満、約２００ｆＭ未満、約１００ｆＭ未満、約５０ｆＭ未満、約２５ｆＭ未満、約１０ｆＭ未満、約５ｆＭ未満、約２ｆＭ未満、約１ｆＭ未満、約５００ａＭ（アトモル）未満、約１００ａＭ未満、約１０ａＭ未満、約５ａＭ未満、約１ａＭ未満、約０．１ａＭ未満、約５００ｚＭ（ゼプトモル）未満、約１００ｚＭ未満、約１０ｚＭ未満、約５ｚＭ未満、約１ｚＭ未満、約０．１ｚＭ未満、またはそれ以下である。いくつかの場合において、検出限界値（例えば、溶液中で決定され得る分析物分子の最も低い濃度）は約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、約１ｆＭ、約５００ａＭ（アトモル）、約１００ａＭ、約５０ａＭ、約１０ａＭ、約５ａＭ、約１ａＭ、約０．１ａＭ、約５００ｚＭ（ゼプトモル）、約１００ｚＭ、約５０ｚＭ、約１０ｚＭ、約５ｚＭ、約１ｚＭ、約０．１ｚＭ以下である。いくつかの実施形態において、実質的に正確に決定され得る流体サンプル中の分析物分子または粒子の濃度は、約５０００ｆＭと約０．１ｆＭの間、約３０００ｆＭと約０．１ｆＭの間、約１０００ｆＭと約０．１ｆＭの間、約１０００ｆＭと約０．１ｚＭの間、約１００ｆＭと約１ｚＭの間、約１００ａＭと約０．１ｚＭの間、またはそれ以下である。検出の上限（例えば、溶液中で決定され得る分析物分子の上限濃度）は少なくとも約１００ｆＭ、少なくとも約１０００ｆＭ、少なくとも約１０ｐＭ（ピコモル）、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１０ｎＭ（ナノモル）、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約１０００ｎＭ、少なくとも約１０ｕＭ、少なくとも約１００ｕＭ、少なくとも約１０００ｕＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１０００ｍＭ、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、決定される流体サンプル中の分析物分子または粒子の濃度は、約５０ｘ１０−１５Ｍ未満、または約４０ｘ１０−１５Ｍ未満、または約３０ｘ１０−１５Ｍ未満、または約２０ｘ１０−１５Ｍ未満、または約１０ｘ１０−１５Ｍ未満、または約未満、または約１ｘ１０−１５Ｍ未満である。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、実質的に正確に決定され得るサンプル中の分析物分子の濃度は、約１００ｆＭ未満、約１０ｆＭ未満、約３ｆＭ未満、約１ｆＭ未満、約０．３ｆＭ未満、約０．１ｆＭ未満、約０．０３ｆＭ未満、またはそれ以下である。いくつかの実施形態において、実質的に正確に決定され得るサンプル中の分析物分子の濃度は、約５０００ｆＭと約０．１ｆＭの間、約３０００ｆＭと約０．１ｆＭの間、約１０００ｆＭと約０．１ｆＭの間、約１０００ｆＭと約１ｆＭの間、約１００ｆＭと約１ｆＭの間、約１００ｆＭと約０．１ｆＭの間である。サンプル中の分析物分子の濃度は、サンプル中の分析物分子の測定濃度が、サンプル中の分析物分子の実際の濃度の約２０％以内であれば、実質的に正確に決定されたものとみなされてもよい。ある実施形態において、サンプル中の分析物分子の測定濃度は、サンプル中の分析物分子の実際の濃度の約１０％以内、約３％以内、または約１％以内であってよい。アッセイ方法の精度は、いくつかの実施形態において、選択したアッセイ方法を用い、既知の濃度のサンプル中の分析物分子の濃度を決定することにより、決定されてもよい。好ましくは、アッセイは、サンプル中に約１０〜１０，０００分子、好ましくは、サンプル中に１００〜５，０００分子、およびより好ましくは、サンプル中に１００〜１０００分子を検出することができる。
【０１９２】
例えば、同一の捕捉抗体、および２つの検出抗体のいずれか一方、ならびに同一標識および同一検出技術を使用して測定した従来のサンドイッチ免疫アッセイ技術と比較すると、本明細書に記述したアッセイフォーマットの使用は、検出信号およびアッセイ感度を１０倍も、好ましくは５０倍、１００倍または１０００倍も向上させ得る。本明細書に記述したアッセイフォーマットの使用が、標準的なサンドイッチ免疫アッセイと比較して、検出信号およびアッセイ感度を１００倍向上させるのが好ましい。
【０１９３】
本発明の方法の有利な態様の１つは、特に高感度の光検出技術と組み合わせた場合、信号増幅によって個々の結合イベントを光の輝点として検出できるようになることである。信号の定量化は、個々のイベントの計数により（バックグラウンドノイズから結合イベントを識別する能力の改善により、低濃度の分析物に対して感度を上昇できる）または、全結合イベントの信号を積分することにより（高濃度の分析物測定に対して、より良いダイナミックレンジを提供できる）、実行できる。
【０１９４】
本発明の方法は様々なアッセイ装置および／またはフォーマットにおいて使用され得る。アッセイ装置には、例えばアッセイプレート、カートリッジ、マルチウェルアッセイプレート、反応容器、テストチューブ、キュベット、フローセル、アッセイチップ、ラテラルフロー装置等のアッセイモジュールを含み、これら装置はアッセイ試薬（標的化剤または他の結合試薬を含み得る）を有するが、アッセイ試薬はアッセイの進行とともに追加されるか、またはアッセイモジュールのウェル、チャンバまたはアッセイ領域にあらかじめロードされる。これらの装置では特異的結合アッセイ、例えば免疫アッセイ、免疫クロマトグラフィーアッセイに対して様々なアッセイフォーマットを用い得る。例示のアッセイ装置およびフォーマットを本明細書で後に記述する。ある種の実施形態において、本発明の方法は、乾燥状態で保存されたアッセイ試薬を用いてもよく、アッセイ装置／キットはさらに、アッセイ試薬を乾燥状態に維持するための乾燥剤を含んでもよく、また乾燥剤が供給されてもよい。アッセイ試薬をあらかじめロードしたアッセイ装置により、保存中の優れた安定性を維持しつつ、アッセイ測定の速度を大幅に向上させ、かつアッセイ測定を単純化できる。乾燥アッセイ試薬は、乾燥でき、後にアッセイでの使用に先立って再構成できる任意のアッセイ試薬であってよい。このような試薬には、目的の分析物を検出するために使用され得る結合アッセイに有益な結合試薬、酵素、酵素基質、指示染料および他の反応化合物が含まれるがこれらに限定するものではない。アッセイ試薬はさらに、検出のメカニズムに直接関与しないが、アッセイで補助的な役割を果たす物質を含んでいてもよく、例えば遮断薬、安定化剤、界面活性剤、塩、ｐＨ緩衝液、保存剤などを含むが、これらに限定するものではない。試薬は遊離状態で存在してもよく、またはアッセイモジュールにおけるコンパートメント（例えばチャンバ、チャンネル、フローセル、ウェル等）の表面、もしくはコロイド、ビーズまたは他の粒子の支持物の表面を含む固相上で支持されていてもよい。
【０１９５】
本発明の方法は分析物の量を測定するための様々な方法と一緒に使用でき、特に、固相に結合した分析物の量を測定するための方法とともに使用できる。使用可能な技術には、細胞培養ベースアッセイ、結合アッセイ（凝集検査、免疫アッセイ、核酸ハイブリッド形成アッセイ等を含む）、酵素アッセイ、比色分析等、当業界で知られた技術があるがこれらに限定されない。他の適切な技術は当技術分野において平均的なスキルを有する当業者には容易に明らかとなろう。なんらかの測定技術により、測定は目視検査可能なものとなり、測定を実施するための装置の使用が必要となる場合があるが、それが利点となる場合もある。
【０１９６】
分析物の量を測定する方法は非標識技術を含み、ｉ）表面に分析物が結合した後、表面での質量または屈折率の変化を測定する技術（例えば表面超音波技術、表面プラズモン共鳴センサー、偏光解析技術等）、ｉｉ）質量分析技術（表面上の分析物を測定できるＭＡＬＤＩ、ＳＥＬＤＩ等の技術を含む）、ｉｉｉ）クロマトグラフィー技術または電気泳動技術、ｉｖ）蛍光技術（分析物固有の蛍光に基づく）等があるがこれらに限定されない。
【０１９７】
分析物の量を測定するための方法はさらに、分析物に直接または間接的に結合し得る標識の検出を通して（例えば標識された分析物の結合パートナーの使用を通じて）分析物を測定する技術を含む。適切な標識には、直接視覚化できる標識を含む（例えば、視覚的に確認できる粒子および測定可能な信号を生成する標識、例えば光散乱、光学的吸収、蛍光、化学発光、電気化学発光、放射線、磁場等）。使用し得る標識はまた、光散乱、吸収、蛍光等の測定可能な信号をもたらす化学的活性を有する酵素または他の化学反応種を含む。標識としての酵素の使用は、ＥＬＩＳＡ、酵素免疫アッセイ法またはＥＩＡと呼ばれる酵素結合免疫吸着検査法において確立されている。ＥＬＩＳＡフォーマットでは、未知の量の抗原を表面に固定し、次に特異抗体を表面に流して、特異抗体を抗原に結合さ得る。この抗体は酵素に結合し、最終工程で、ある物質が追加され、酵素は検出可能な信号に変化をもたらす産物に変わる。産物の形成は、例えば、吸収、蛍光、化学発光、光散乱等の測定可能な特徴における基質との差異によって検出可能である。本発明による固相結合法と一緒に使用し得るある測定方法は（すべてではないが）、非結合成分（例えば標識）を固相から除去する洗浄工程から利益を得る場合もあり、この工程が必要となる場合もある。したがって、本発明の方法はそのような洗浄工程を含み得る。
【０１９８】
一対の検出可能な標識を用いるこれら実施形態において、一対の標識が互いに近くにある、つまり、検出複合体内の目的の分析物にそれぞれに直接または間接的に結合する場合、これら標識物質はそれぞれ独立して検出できる能力、および／または検出可能な信号を生成するよう連携する能力に基づいて選択される。一実施形態において、第１の検出可能な標識は共役酵素反応系の第１の酵素であり、第２の検出可能な標識は共役酵素反応系の第２の酵素であり、本方法はさらに、反応系の１つまたはそれ以上の基質を追加して、それにより酵素反応系の検出可能な産物を生成する工程を含む。検出可能な産物を含む反応容器と含まない反応容器は識別可能である。好ましい実施形態では、第１の酵素と第２の酵素が近接している、例えば２００ｎｍ未満、理想的には５０ｎｍ未満の場合にのみ、検出可能な産物が生成される。一実施形態において、第１の酵素はオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼであり、第２の酵素はペルオキシダーゼであり、基質はオキシダーゼ基質、例えばグルコース、と標識チラミド、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）、またはルミノール誘導体（本明細書ではまとめて、標識した反応性誘導体と呼び、好ましい実施形態では、標識した反応性誘導体はＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄまたはルミノールを含む）を含む。この実施形態では、第１の酵素が基質と反応して第２の酵素と反応する産物を生成し、この産物は標識した反応性誘導体と反応する第２の産物を生成し、検出可能な種を生成する。好ましくは、この反応は検出複合体の第１および第２の酵素により触媒され、表面上に標識した反応性誘導体を固定する。この誘導体は表面上に存在する分析物分子の数を決定するために測定され得る。一実施形態において、標識した反応性誘導体はビオチン−チラミドであり、本方法はさらに、標識ストレプトアビジンを追加し、ストレプトアビジン上の標識を測定することを含む。
【０１９９】
さらに本方法で使用できる別の近接依存性の標識化システムはＦＲＥＴペアであり、例えば第１の検出可能な標識はＦＲＥＴドナーであり、検出可能な標識はＦＲＥＴアクセプターである。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、２つの色素分子の電子的励起状態の間の距離に依存した相互作用であり、励起がドナー分子からアクセプター分子へ、発光せず転移する。ＦＲＥＴの効率は分子間の距離の６乗に反比例し、これは生体高分子の大きさに比肩する距離であるため、有用なシステムである。この標識化システムでは、近接依存性の信号は、ＦＲＥＴドナーを励起させてＦＲＥＴアクセプターからの放出を測定することで測定される。ドナーおよびアクセプター分子は、例えば約１０〜１００オングストローム等の近接距離にあるのが好ましく、アクセプターの吸収スペクトルはドナーの蛍光発光スペクトルと重なり合うことが好ましく、ドナーおよびアクセプターの転移双極子配向はほぼ並行でなくてはならない。ＦＲＥＴペアのリストを表１に示すがこれに限定しない。
【０２００】
【表１】
0006408552.tif 000002
【０２０１】
実施形態において使用可能な、一対の検出標識を用いる別の適切な標識化システムは、第１および第２の検出可能な標識を独立して測定できるシステムである。例えば、第１および第２の検出可能な標識は、分光特性に対して互いに異なる発光標識であってもよい。あるいは、第１の検出可能な標識は、第１の基質と反応して第１の信号を生成する第１の酵素であり、第２の検出可能な標識は、第２の基質と反応して異なる第２の信号を生成する第２の酵素であり、本方法はさらに、第１の酵素基質および第２の酵素基質を追加し、第１および第２の信号が生成される反応容器の数を計数することを含む。第１および第２の信号は異なる分光特性により、光学的吸収および／または発光信号が異なる可能性がある。
【０２０２】
第１および第２の検出可能な標識が第１および第２の酵素を含む場合、これら酵素はそれぞれ加水分解酵素、例えばホスファターゼ、スルファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、またはそれらの組合せであってもよく、したがって、第１および第２の基質はリン酸塩、硫酸塩、ガラクトシドおよびグルクロニド修飾安定化ジオキセタン、４−メチルウンベリフェリル、フルオレセインまたはそれらの組合せから選択される。あるいは、第１および第２の酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼから選択される。
【０２０３】
あるいは、分析物分子を検出するために使用する標識は単一分子の蛍光検出、例えば蛍光相関分光法、および／または蛍光交差相関分光法において使用できる蛍光種であってもよい。単一分子蛍光検出は、キャピラリーに検出可能な種を含む溶出液を流し、キャピラリー内の内容物に光源を集中させて監視領域を設定し、光検知器で監視領域を観察し、監視領域を通過する蛍光分子を検出することを含む。
【０２０４】
一実施形態では、試料内の目的の分析物は電気化学発光に基づいたアッセイフォーマット、例えば電気化学発光（ＥＣＬ）に基づく免疫アッセイを使用して測定してもよい。ＥＣＬの感度の高さ、幅広いダイナミックレンジおよび選択性は医学的診断における重要な特質である。市販のＥＣＬ器具は並はずれた性能を示し、感度、ダイナミックレンジ、精度に優れ、複雑なサンプル基材を許容することを含め、複数の理由から広く使用されてきた。ＥＣＬの放出を誘起できる種（ＥＣＬ活性種）がＥＣＬ標識として使用されてきており、例えば、ｉ）金属が例えば第ＶＩＩＩ族の貴金属からのものである有機金属化合物（Ｒｕ含有およびＯｓ含有有機金属化合物、例えばトリス−ビピリジル−ルテニウム（ＲｕＢｐｙ）部分を含む）ならびにｉｉ）ルミノールおよび関連化合物がある。ＥＣＬプロセスのＥＣＬ標識関与する種を本明細書においてＥＣＬ共反応物（ｃｏｒｅａｃｔａｎｔｓ）と呼ぶ。一般に使用される共反応物としては、ＲｕＢｐｙ由来のＥＣＬに対する第三級アミン（例えば米国特許第５，８４６，４８５号を参照）、オキザレートおよびパーサルフェート、ならびにルミノール由来のＥＣＬに対する過酸化水素（例えば米国特許第５，２４０，８６３号を参照）などがある。ＥＣＬ標識が発生する光を、レポーター信号として診断手続に使用できる（Ｂａｒｄら、米国特許第５，２３８，８０８号、参照によって本明細書に組み入れる）。例えば、ＥＣＬ標識は、抗体、核酸プローブ、レセプターまたはリガンド等の結合剤に共有結合でき；結合相互作用での結合試薬の関与はＥＣＬ標識から放出されたＥＣＬの測定によりモニターできる。あるいは、ＥＣＬ活性化合物からのＥＣＬ信号は化学的環境の指標になり得る（例えば、米国特許第５，６４１，６２３号を参照。これはＥＣＬ共反応物の形成または分解をモニターするＥＣＬアッセイを記載している）。ＥＣＬ、ＥＣＬ標識、ＥＣＬアッセイおよびＥＣＬアッセイを実施するための器具についてのさらなる背景については、米国特許第５，０９３，２６８号、同第５，１４７，８０６号、同第５，３２４，４５７号、同第５，５９１，５８１号、同第５，５９７，９１０号、同第５，６４１，６２３号、同第５，６４３，７１３号、同第５，６７９，５１９号、同第５，７０５，４０２号、同第５，８４６，４８５号、同第５，８６６，４３４号、同第５，７８６，１４１号、同第５，７３１，１４７号、同第６，０６６，４４８号、同第６，１３６，２６８号、同第５，７７６，６７２号、同第５，３０８，７５４号、同第５，２４０，８６３号、同第６，２０７，３６９号、同第６，２１４，５５２号および同第５，５８９，１３６号、ならびに国際公開第９９／６３３４７号、ＷＯ００／０３２３３、ＷＯ９９／５８９６２、ＷＯ９９／３２６６２、ＷＯ９９／１４５９９、ＷＯ９８／１２５３９、ＷＯ９７／３６９３１およびＷＯ９８／５７１５４を参照されたい。これらはすべて参照によって本明細書に組み入れる。
【０２０５】
複数のアッセイ測定を単一の試料上で実行する場合、本発明の方法はシングルプレックスまたはマルチプレックスのフォーマットに適用し得る。本発明で使用できるマルチプレックス測定は、これらに限定するものではないが、ｉ）多数のセンサーの使用を含み；ｉｉ）ある表面（例えばアレイ）上の位置によって識別可能な、表面上の別個のアッセイ領域を使用し；ｉｉｉ）粒子性状、例えば、大きさ、形、色等により識別可能な粒子にコーティングした試薬の使用を含み；ｉｖ）光学的性質（例えば吸収度または発光スペクトル）に基づいて識別可能なアッセイ信号を生成する、または、ｖ）アッセイ信号の時間的特性（例えば時間、信号の周波数または位相）に基づく、マルチプレックス測定を含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、試料内の分析物分子の濃度測定は、少なくとも一部分で、測定したパラメーターと検量基準との比較により決定してもよい。例えば、分析物分子を含む結合表面の分画を検量線と比較して、試料内の分析物分子の濃度測定を求めてもよい。検量線は、既知の濃度の複数の標準化試料のアッセイを、テスト試料の分析に使用する条件下で完了することで作成し得る。各標準化試料において分析物分子の検出／定量化に関係する信号を読むことで、分析物分子の既知濃度に分析物分子の検出を関連づける検量線を作成し得る。その後、アッセイを未知濃度の分析物分子を含む試料で完了させ、このアッセイでの分析物分子の検出を検量線上にプロットし、試料内の分析物分子の濃度測定を決定し得る。
【０２０７】
光学信号（蛍光、化学発光または電気化学発光等）の測定に映像化技術を使用する特定のケースでは、結合イベントは光源の輝点として検出できる。点源の表面密度が低い場合（例えば、ＲｘＲ領域に点源を見つける可能性、−Ｒは検出システムにおける空間分解能である−が１０％未満である場合）、任意の観察された点源は単一の結合イベントによるものである可能性が高い。これらの条件下では、イベントの計数が最も高感度な測定となり得る。表面密度が増加するにつれ、個々の結合イベントを分解し計数することが徐々に困難となる。これらの条件下では、結合表面の光学信号の積分により正確な測定が可能となる。
【０２０８】
本明細書に記述された方法が、当業者に既知の免疫アッセイの多くのプラットフォームに適用できることは、当業者には明らかであろう。免疫アッセイプラットフォームの様々な特徴は、特定のプラットフォームに適合するよう調整し得るが、この調整は通常のスキルを有する当業者に十分可能なものである。例えば、本明細書に記述された方法は、コード化粒子を使用するビーズベースのフォーマットに適用できる。このようなシステムでは、使用するビーズは磁性または非磁性であってよく、ビーズの表面は捕捉試薬の１つまたはそれ以上の複製を有するよう修飾される。本システムで用いる検出試薬は一対の検出試薬である。一実施形態では、２つの検出試薬は識別可能な蛍光標識を含む。あるいは、２つの検出試薬は、本明細書に記載したように核酸プローブで修飾され、この場合、免疫アッセイ法は伸長プロセス、例えばＲＣＡ−ＰＬＡを含み、検出可能な各検出試薬の存在を示す増幅産物を生成する。検出試薬が識別可能な蛍光標識を２つ含む場合、測定工程にはフローセルへのビーズの導入を含み、ビーズが磁性である場合、フローセルにおいてビーズを捕捉することを含む。検出試薬が核酸プローブで修飾される場合、測定工程にはビーズ上にサンドイッチ複合体を形成すること、ＲＣＡ−ＰＬＡを実行すること、および蛍光標識した検出プローブでアンプリコンを標識することを含む。その後、標識されたビーズをフローセルへ導入し、ビーズが磁性である場合は、ビーズをフローセル内で捕捉する。各実施形態では、アッセイは蛍光標識したコード化ビーズの同定をベースにしたスペクトルによって多重化できる。多色検出における励起光源および放出光検出器は、各実施形態の結合イベントの検出に使用でき、定量化は検出可能な両標識を有するビーズ、または検出できるよう標識された伸長産物を含むこれらビーズを計数することで実現でき、定量化はまた、積分強度、例えばすべての結合イベントの信号に対する積分による検出によって実現できる。したがって、あるキットが上述した方法で使用するために提供されるが、このキットは１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、下記の１つまたはそれ以上を含む：（ａ）捕捉試薬を有する磁性または非磁性ビーズ；（ｂ）識別可能な蛍光標識を有する検出試薬２つ；および（ｃ）アッセイプロトコル用の任意のバッファーおよび／または賦形剤。別のキットが上述した方法で使用できるが、このキットは１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、下記の１つまたはそれ以上を含む：（ａ）捕捉試薬を有する磁性または非磁性ビーズ；（ｂ）核酸プローブで修飾される検出試薬２つ（場合により、検出試薬は別々に提供され、近接プローブ（１および２）は、プローブによる検出試薬を修飾するための命令と一緒に提供される）；および（ｃ）蛍光標識プローブ；近接プローブによる検出試薬の修飾に必要な任意の試薬；アッセイ希釈剤、キャリブレーター、環状化オリゴヌクレオチド、ライゲーション混合物またはその成分、例えばライゲーションバッファー、ＡＴＰ、ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ；ＲＣＡ混合物またはその成分、例えばＢＳＡ、バッファー、ｄＮＴＰ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ。
【０２０９】
別の実施形態では、本明細書に記述した方法は、フローセル分析、ビーズベースのフォーマットに適用できる。そのようなシステムでは、使用するビーズは磁性であり得、ビーズの表面は捕捉試薬の１つまたはそれ以上の複製を含むよう修飾される。本システムで用いる検出試薬は、本明細書に記載したような核酸プローブで修飾される一対の検出試薬であり、この場合、免疫アッセイ法は伸長プロセス、例えばＲＣＡ−ＰＬＡを含み、検出可能な各検出試薬の存在を示す増幅産物を生成する。測定工程はビーズ上にサンドイッチ複合体を形成すること、ＲＣＡ−ＰＬＡを実行すること、およびＥＣＬ標識した検出プローブでアンプリコンを標識することを含む。その後、標識されたビーズをフローセルへ導入し、ビーズをフローセル内で捕捉する。特に、磁場を磁粉、例えばビーズを引きつけるために電極表面に印加するが、これは様々な金属、例えば白金を含み得る。電圧源は電極に電圧を印加するために使用され、放出光検出器は結合イベントを検出するために使用でき；定量化は検出できるよう標識された伸長産物を有するビーズを計数することで実現でき、定量化はまた、積分強度、例えばすべての結合イベントの信号に対する積分による検出によって実現できる。上述した方法で使用可能なキットは、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、下記の１つまたはそれ以上を含むことができる：（ａ）捕捉試薬を有する磁性ビーズ；（ｂ）核酸プローブで修飾される検出試薬２つ（場合により、検出試薬は別々に提供され、近接プローブ（１および２）は、プローブによる検出試薬を修飾するための命令と一緒に提供される）；および（ｃ）ＥＣＬ標識プローブ；近接プローブによる検出試薬の修飾に必要な任意の試薬；アッセイ希釈剤、キャリブレーター、環状化オリゴヌクレオチド、ライゲーション混合物またはその成分、例えばライゲーションバッファー、ＡＴＰ、ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ；ＲＣＡ混合物またはその成分、例えばＢＳＡ、バッファー、ｄＮＴＰ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ。
【０２１０】
フローセル分析のビーズベースのフォーマットの特定の実施形態では、試料を、ビオチン化モノクローナル分析物特異的捕捉抗体、および各々、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートさせたモノクローナル分析物特異抗体の混合物とインキュベートし、反応させてサンドイッチ複合体を形成する。ストレプトアビジンコート微粒子の追加後、この複合体は、ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用によって固相に結合する。ライゲーション混合物をこの混合物に追加し、混合物とライゲーション混合物とを一緒にインキュベートし、洗浄して、過剰な環状化オリゴヌクレオチドを除去し、ＲＣＡ混合物と一緒にインキュベートする。混合物を洗浄し、ビオチン標識検出プローブの混合物を追加する。適切な標識、例えば発光標識、化学発光標識、またはＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ等の電気化学発光標識を組み込むため、検出プローブを、末端のビオチン標識と合成し、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識ストレプトアビジンにあらかじめ結合させる。反応混合物を測定セルへ吸引し、微粒子を、例えば、白金電極などの金属電極の電極の表面上に磁気的に捕捉する。その後、非結合物質を適切な洗浄バッファー、例えばＰｒｏＣｅｌｌ（ＴＰＡ含有バッファー）で除去する。その後、電極に電圧を印加して化学発光の放出を誘発し、発光を光電子増倍管により測定する。電圧の印加と結果としての発光の測定は、例えばＣｏｂａｓおよび／またはＥｌｅｃｓｙｓ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＬＴＤ．から入手可能）など任意の適切なフローセルにおいて行うことができる。
【０２１１】
また別の実施形態において、本明細書に記述した方法は、ビーズベースのフォーマットに適用でき、キャピラリーの流動によりデジタル的に個々の分子を計数できる。そのようなシステムでは、使用するビーズは磁性であり得、ビーズの表面は捕捉試薬の１つまたはそれ以上の複製を含むよう修飾される。本システムで用いる検出試薬は、識別可能な蛍光標識を含む一対の検出試薬である。この測定工程は、捕捉試薬、分析物および検出試薬を含むサンドイッチ複合体を形成すること、検出試薬を架橋すること、検出試薬を溶出すること、ならびにフローセルにビーズを導入することを含む。多色検出における励起光源および放出光検出器は、結合イベントの検出に使用でき、定量化はフローセル内の２つの蛍光体の検出を関連させることにより実現でき、定量化はまた、積分強度、例えばすべての結合イベントの信号に対する積分による検出によって実現できる。上述した方法で使用可能なキットは、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、下記の１つまたはそれ以上を含むことができる：（ａ）捕捉試薬を有する磁性ビーズ；（ｂ）識別可能な蛍光標識を有する２つの架橋可能な検出試薬；および（ｃ）アッセイプロトコル用の任意のバッファーおよび／または賦形剤。
【０２１２】
さらに、本明細書に記述した方法はビーズベースのフォーマットに適用できるが、このフォーマットは個々のナノウェル中へビーズを分離させることを含む。そのようなシステムでは、使用するビーズは磁性であり得、ビーズの表面は捕捉試薬の１つまたはそれ以上の複製を含むよう修飾される。本システムで用いる検出試薬は、識別可能な酵素標識を含む一対の検出試薬である。測定工程は捕捉試薬、分析物および検出試薬を含むサンドイッチ複合体を形成すること、ならびに２つの酵素標識のための基質を追加することを含む。その後、ビーズは個々のナノウェル内で捕捉される。アッセイは、異なる分光特性を有する酵素産物の同定をベースにしたスペクトルによって多重化できる。多色検出における励起光源および放出光検出器は、結合イベントの検出に使用でき、定量化は両酵素産物を含むナノウェルを計数することで実現でき、定量化はまた、積分強度、例えば全ナノウェルの信号に対する積分による検出によって実現できる。上述した方法で使用できるあるキットは、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、下記の１つまたはそれ以上を含むことができる：（ａ）捕捉試薬を有する磁性ビーズ；（ｂ）識別可能な酵素標識でそれぞれ修飾した２つの検出試薬、例えばビオチン化検出試薬およびハプテンコンジュゲート検出試薬；（ｃ）ストレプトアビジ−β−ガラクトシダーゼ、抗ハプテンコンジュゲート酵素、レソルフィンβ‐ｄ‐ガラクトピラノシド；（ｄ）アレイ、例えばＱｕａｎｔｅｒｉｘ  ＤＶＤフォーマットアレイ；（ｅ）フルオロカーボン油；ならびに（ｆ）アッセイプロトコル用の任意のバッファーおよび／または賦形剤。この特定の実施形態では、検出可能な信号は、ナノウェル高感度システムの使用と近接性に基づいた検出システムとを組み合わせることにより増強される。特定の近接性に基づいた検出システムを使用してこの特定の実施形態を説明するが、本明細書に記述された他の近接性に基づいた検出システム、例えばＦＲＥＴドナー／アクセプターシステム；分光特性が互いに異なる発光標識；または上述したような加水分解酵素である第１および第２の酵素および適切な付随する基質の使用、をアッセイでの検出可能な信号を増強するために使用できるという事実を当業者は理解するであろう。
【０２１３】
さらに、本明細書に記述された方法は、ビーズアレイベースのプラットフォームに適用できる。そのようなシステムでは、使用するビーズは非磁性であってよく、ビーズの表面は捕捉試薬の１つまたはそれ以上の複製を含むよう修飾される。本システムで用いる検出試薬は、第１および第２核酸プローブを含む一対の検出試薬である。この測定工程は、捕捉試薬、分析物および検出試薬を含むサンドイッチ複合体を形成すること、プローブのうちの１つを伸長して、伸長配列を形成すること（ここで伸長は、サンドイッチ複合体における第１および第２プローブの共局在化に依存する）、蛍光プローブで伸長配列を標識すること、および表面から溶出液中へ伸長配列を放出することを含む。多色検出における励起光源および放出光検出器は、結合イベントの検出に使用でき、定量化は検出できるよう標識された個々の伸長産物を計数することで実現でき、定量化はまた、積分強度、例えばすべての結合イベントの信号に対する積分による検出によって実現できる。上述した方法で使用可能なキットは、１つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、下記の１つまたはそれ以上を含むことができる：（ａ）捕捉試薬を有する非磁性ビーズ；（ｂ）核酸プローブで修飾された検出試薬２つ（場合により、検出試薬は別々に提供され、近接プローブ（１および２）は、プローブによる検出試薬を修飾するための命令と一緒に提供される）；および（ｃ）蛍光標識したプローブ；近接プローブによる検出試薬の修飾に必要な任意の試薬；アッセイ希釈剤、キャリブレーター、環状化オリゴヌクレオチド、ライゲーション混合物またはその成分、例えばライゲーションバッファー、ＡＴＰ、ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ；ＲＣＡ混合物またはその成分、例えばＢＳＡ、バッファー、ｄＮＴＰ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ。
【０２１４】
本明細書に記述した、性能を改善した結合アッセイは、アッセイで用いる構成部分のセットを含む１つまたはそれ以上のキットを使用して実行できる。例えば、試料内の分析物の検出に使用されるキットは、１つまたはそれ以上のバイアル、容器またはコンパートメントにおいて、分析物用の捕捉試薬および固定試薬を含む表面；および核酸プローブに連結される、分析物用の検出試薬を含む。そのようなキットは、固定オリゴヌクレオチド配列を含む固定試薬を含んでいてもよい。
【０２１５】
本明細書に記述した方法の実行に使用できる別のキットは、１つまたはそれ以上のバイアル、容器またはコンパートメントおいて、分析物用の捕捉試薬および固定オリゴヌクレオチド配列を含む固定試薬を含む表面；第１の核酸プローブに結合する第１の検出試薬；ならびに、第２の核酸プローブに結合する第２の検出試薬を含む。
【０２１６】
さらに、本明細書に記述した結合アッセイの実行に使用できる別のキットは、１つまたはそれ以上のバイアル、容器またはコンパートメントおいて、分析物用の捕捉試薬および固定試薬を含む表面；第１の近接プローブを含む分析物用の第１の検出試薬；第２の近接プローブを含む分析物用の第２の検出試薬；ならびに、（ｉ）第２の近接プローブに相補的な内部配列および（ｉｉ）第１の近接プローブの非オーバーラップ領域に相補的な２つの末端配列を含むコネクター配列を含む。あるいは、キットは上記に代えて、分析物用の捕捉試薬および固定試薬を含む表面；第１の近接プローブを含む分析物用の第１の検出試薬；第２の近接プローブを含む分析物用の第２の検出試薬ならびに（ｉ）第１コネクターオリゴヌクレオチド、および（ｉｉ）第２コネクターオリゴヌクレオチド、を含んでもよく、（ｘ）第１コネクターの第１末端および第２コネクターの第１末端が、第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に相補的であり、（ｙ）第１コネクターの第２末端および第２コネクターの第２末端が、第１の近接プローブの２つの非オーバーラップ領域に相補的である。さらに、これらのいずれかの、または両キットにおける固定試薬には、固定オリゴヌクレオチド配列を含むことができる。
【０２１７】
さらに、本明細書に記述された方法は、１つまたはそれ以上のバイアル、容器またはコンパートメントにおいて、第１の検出可能な標識を含む第１の検出試薬；第２の検出可能な標識を含む第２の検出試薬；分析物分子を１個含む、または含まないよう構成された複数の反応容器；および場合により捕捉試薬を含む表面を含むキットを使用して実施できる。
【０２１８】
最後に、本明細書に記述した方法を使用する分析物検出のためのキットは、１つまたはそれ以上のバイアル、容器または区画おいて、固定化した捕捉試薬；第１の検出可能な標識を有する第１の検出試薬；第２の検出可能な標識を有する第２の検出試薬；および第１および第２の検出試薬と反応する架橋剤を含む表面、を含む。架橋剤は、検出試薬に結合した反応部分を連結する多機能性架橋剤、または検出試薬に結合した結合部分の多価の結合パートナーを含めることができる。適切な多機能性架橋剤はアミン、チオール類、ヒドラジド、アルデヒド、エステル、ヨードアセトアミド、マレイミド類、クリックケミストリー試薬およびそれらの組合せ含むが、これらに限定するものではない。同様に、多価の結合パートナーの一例は、検出試薬を標的とする多価の抗種（ａｎｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）抗体であるが、これはその動物種の抗体である。架橋剤はまたストレプトアビジン、検出試薬に結合する結合パートナーの一方とペアになった場合の、アビジンまたはビオチンを含むことができる。架橋剤はまたキットの構成部分に直接的または間接的に結合された核酸プローブに相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。特定の実施形態において、本明細書に記述した方法で使用するキットは、１つまたはそれ以上のバイアル、容器またはコンパートメントおいて、固定化した捕捉試薬；第１の検出可能な標識および第１の核酸プローブを有する第１の検出試薬；第２の検出可能な標識および第２の核酸プローブを有する第２の検出試薬；ならびに第１および第２核酸プローブに相補的な領域を有する第３の核酸を含む表面、を含む。
【０２１９】
本明細書に記述したキットの表面は、１つまたはそれ以上の分析物分子に対する複数の捕捉試薬を含むことができ、捕捉試薬は、例えばアレイ、マルチウェルプレート、またはマイクロもしくはナノウェルプレートにおいて、表面上に位置する複数の解像可能な結合領域または反応容器にわたって分布している。加えてこの表面には、分析物分子用の複数の捕捉試薬をそれぞれ含む複数の粒子をさらに含むことができる。
【０２２０】
上述のキットは、さらに下記の１つまたはそれ以上を含むことができる：１つまたはそれ以上の追加試薬、バッファー、ポリメラーゼ、リガーゼ、および／またはｄＮＴＰ（標識、または非標識）。さらに１つまたはそれ以上の検出試薬が検出可能な標識を含む場合、キットにはまた、キットで用いる検出可能な標識に対する共反応物を含むことができる。あるいは、１つまたはそれ以上の検出試薬が共役酵素反応系の構成要素である場合、検出試薬の各々は第１および第２の酵素を含み、キットはさらに、１つまたはそれ以上の容器、バイアルまたはコンパートメントにおいて、共役酵素反応系のための１つまたはそれ以上の基質、および、場合により共役酵素反応系の産物に結合するよう構成された標識成分を含む。例えば、第１の酵素はオキシダーゼであってもよく、第２の酵素はペルオキシダーゼであってもよく、キットはさらにオキシダーゼ基質および標識チラミド誘導体を含む。別の実施形態において、第１および第２の検出可能な試薬は、近接依存性検出システムの成分、例えばＦＲＥＴドナー、ＦＲＥＴアクセプター、またはそれらの分光特性に関して互いに異なる発光標識を含むことができる。
【０２２１】
付加的な代替的実施形態
さらなる実施形態を図７に図示する。パネル（ａ）のサンドイッチ免疫アッセイ複合体における各近接プローブの一部分が、各セグメントにハイブリダイズしたＲＮＡの短鎖により一時的に保護される。ＲＮＡ鎖は酵素で除去され、近接プローブの各々が互いにハイブリダイズし、鎖はビオチン化ｄＮＴＰを使用して、ポリメラーゼ伸長により伸長する（パネル（ｂ））。鎖に組み込まれた各ビオチン化塩基はそれぞれ、検出可能な標識で標識したストレプトアビジンに結合する（パネル（ｃ））。
【０２２２】
また別のアプローチを図８に図示する。近接プローブは、（パネル（ａ）で示すように）固定試薬および検出試薬に結合でき、または各近接プローブは上述のように２つの検出試薬に結合できる（図示せず）。図７で図示したのと類似した方法で、各々近接プローブの一部分が、各セグメントにハイブリダイズしたＲＮＡの短鎖により一時的に保護される。ＲＮＡ鎖は酵素で除去され、近接プローブの各々が互いにハイブリダイズし、鎖はビオチン化ｄＮＴＰを使用して、ポリメラーゼ伸長により伸長する（パネル（ｂ））。鎖に組み込まれた各ビオチン化塩基はそれぞれ、検出可能な標識で標識したストレプトアビジンに結合する（パネル（ｃ））。
【実施例１】
【０２２３】
近接ライゲーションおよびローリングサークル増幅の一般的なプロトコル
標的分析物に対する一対の検出抗体を、近接プローブ１および２を追加して以下のように修飾した：１００ｕＬバッファー中２００ｕｇの第１の検出抗体に、１．７４ｕＬ、２３ｍＭのｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを追加し、１５０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、３０分間室温でインキュベートした。遊離したｓｕｌｆｏ  ＳＭＣＣはサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。検出抗体の最終濃度は２ｍｇ／ｍＬまたはこれよりわずかに低かった。３００ｕＭのチオール修飾オリゴヌクレオチド（近接プローブ１および２）９５ｕＬを、１００ｍＭリン酸緩衝液中１ｍＭ  ＤＴＴの５ｕＬ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．４で室温で１時間還元した。近接プローブ１および２の配列は次の通りである：
【０２２４】
チオール修飾近接プローブ１：ＳＨ−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＣＧＣ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＣＧＣ  ＴＴＵ  ＵＵ（配列番号１；３つのＵ残基は２’Ｏ−メチルＲＮＡである）。
【０２２５】
チオール修飾近接プローブ２：ＳＨ−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＴＴ（配列番号２）。
【０２２６】
過剰なＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣおよびＤＴＴを例えば、スピンカラム分離器を３つ使用して除去し、抗体およびＤＮＡを共有結合によるコンジュゲーション用にプールした。この溶液を室温で１時間、混合しながらインキュベートした。抗体−近接プローブコンジュゲートを、例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、コンジュゲートしなかった抗体およびオリゴヌクレオチドを除去した。
【０２２７】
ＭＳＤ  ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）プレートを適切なＭＳＤ（登録商標）遮断溶液と一緒に１時間ブロッキングし洗浄した。プレート上の各結合領域はそれぞれ捕捉抗体および固定部分（ＢＳＡ−オリゴヌクレオチド複合体として固定化され、オリゴヌクレオチドはローリングサークルのアンプリコンに特異的であるよう選択された）含む。この実施例において使用される固定オリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−／３ＴｈｉｏＭＣ３−Ｄ／−３’（配列番号３）であった。アッセイ希釈剤およびキャリブレーター、または試料（適切に希釈した）各２５μｌ（全容積５０ｕｌとなる）を各ウェルに追加した。プレートを１〜３時間、振とうさせながらインキュベートし、各ウェルを洗浄した。上述の通り調整した、近接プローブ１および２で標識した検出抗体の溶液を各ウェル（ウェル当たり２５ｕＬ）に追加し、１〜２時間振とうさせながらインキュベートした（あるいは、それぞれ個々の検出抗体を連続して追加し、個々の抗体追加後は１時間インキュベーションした）。下記成分を含むライゲーション混合物を各ウェルに追加した：（ｉ）環状化オリゴヌクレオチド１（４ｎＭ）、環状化オリゴヌクレオチド２（４ｎＭ）、ライゲーションバッファー、ＡＴＰ（１ｍＭ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（０．１５Ｕ／ｕＬ）。各々の環状化オリゴヌクレオチドは：
【０２２８】
Ｃｉｒｃ−１：リン酸−ＣＴＡ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＣ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＴＧＣ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＴＡＡ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＴＡ（配列番号４）。
【０２２９】
Ｃｉｒｃ−２：リン酸−ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＡＧＣ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  Ａ（配列番号５）であった。
【０２３０】
このプレートを室温で３０分間ライゲーション混合物と一緒にインキュベートし、洗浄して過剰な環状化オリゴヌクレオチドを除去し、３７℃で１．５時間ＲＣＡ混合物と一緒にインキュベートした。ＲＣＡ混合物はＲＣＡバッファー、ｄＮＴＰ（各２５０ｕＭ）、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（０．１２５Ｕ／ｍｌ）を包含していた。プレートを洗浄し、検出プローブの混合物を追加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ここで検出プローブ混合物は次のものを含んでいた：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（１ｍＭ  ＳＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％トリトン、ＢＳＡ（２００ｕｇ／ｍｌ）、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）、検出プローブ（６．２５ｎＭ））。検出プローブは、配列ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＣＧＡ  ＧＴＣ  ＣＧＴ  ＣＴ（配列番号６）であった。電気化学発光標識ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を組み込むために、検出プローブを、末端のビオチン標識と合成し、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識ストレプトアビジンにあらかじめ結合した。プレートを洗浄し、ＭＳＤ読み取りバッファー１５０μｌを添加し、ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）６０００リーダーで直ちに読んだ（プレートとリーダーはＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤより提供）。
【０２３１】
一般的な手順を以下の分析物を検出するために使用した：トロポニンＩ、Ａｋｔ（ｔｏｔａｌ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（４７３）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（３０８）、インフルエンザＡ核タンパク質（ＮＰ）、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、Ａｂｅｔａ１−４２、ＴＮＦアルファモデル系を使用するｂｒｉｄｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｉｇアッセイ、Ｂ型肝炎表面抗原を使用するｂｒｉｄｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｉｇアッセイ、および、Ｌｙｍｅ  Ｃ６を使用するｂｒｉｄｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｉｇアッセイ。標準的なサンドイッチ免疫アッセイに対するＥＣＬ信号およびアッセイ感度の増加は、アッセイ間で変動したが、１００倍もの向上が観察された。テストしたあるアッセイ、例えばトロポニンＩ、Ａｋｔ（ｔｏｔａｌ）、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、Ａｂｅｔａ１−４２では、固定部分があることで増幅工程中の検出複合体の分離を防止することにより、信号および／または希釈直線性が向上した。上述の手順によるＩＬ−１０アッセイの検量線を図９に示す。さらに表２（下）は、上述の手順により導出された、代表的なアッセイのあるセットのＬＯＤを示す（列２、「３−ＡＢ  ＲＣＡ／ＰＬＡアッセイ」）。Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓウェブサイトで入手可能であるＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤの標準２抗体免疫アッセイプロトコルのＬＯＤ（列３「ＭＳＤ  Ｖ−Ｐｌｅｘ  ２−ＡＢ免疫アッセイプロトコル」）と比較している。
【０２３２】
【表２】
0006408552.tif 000003
【実施例２】
【０２３３】
固定試薬がある場合、および無い場合のアッセイプロトコル  ＭＳＤ  ７−ｓｐｏｔ  ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴプレートを、実施例１で上述したようにトロポニンＩ捕捉抗体（２２０ｕｇ／ｍＬ）で各々コートした。捕捉抗体を固定部分、つまりアンプリコンに特異的なオリゴヌクレオチドを共有結合したＢＳＡ（存在する場合は、固定部分５ｕｇ／ｍＬ）と一緒に、または固定部分なしでスポットした。アッセイ希釈剤、キャリブレーター、または試料（適切に希釈した）各２５μｌ（全部で５０ｕｌ）を各ウェルに追加した。プレートを、２時間振とうさせながらインキュベートし各ウェルを洗浄した。上述の通り調整した、近接プローブ１および２で標識した検出抗体の溶液を各ウェルに追加し（ウェル当たり２５ｕＬ）、１時間振とうさせながらインキュベートした。実施例１で上述したように、ライゲーション混合物を各ウェルに追加した。実施例１で上述したように、このプレートを室温で３０分間ライゲーション混合物と一緒にインキュベートし、洗浄して過剰な環状化オリゴヌクレオチドを除去し、ＲＣＡ混合物と一緒に３７℃で１．５時間インキュベートした。実施例１で記述したように、プレートを洗浄し、検出プローブの混合物を加えて３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＭＳＤ読み取りバッファー１５０μｌを添加し、ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）６０００リーダーで直ちに読んだ。蛍光イメージングのためＭＳＤ電極をプレートの上部から除去し、ＰＢＳおよびカバースリップで湿潤状態とした。表面を、顕微鏡でＺｙｌａカメラ、対物レンズ２０ｘ、２ｘ２ビニング、カスタマーフィルタセットを用いて、２秒間暴露して観察した。
【０２３４】
表３（下）に示すように、ＥＣＬ値は固定試薬が存在する状態で４〜５倍高く、また、検出限界は３分の１低かった（より高感度である）。
【０２３５】
【表３】
0006408552.tif 000004
【０２３６】
図１０（ａ）および（ｂ）は、固定試薬５ｕｇ／ｍＬ有りのプレート表面（パネル（ａ））および固定試薬無しのプレート表面（パネル（ｂ））の蛍光顕微鏡画像を示す。画像には、個々の結合イベントに関連した明るい蛍光スポットが示され、固定試薬が存在下でのＲＣＡ増幅は、観察可能な結合イベントの生成においてより効果的であったことが確認できる。
【実施例３】
【０２３７】
コネクターオリゴヌクレオチドが１つの場合と２つの場合との比較
実施例２に記述したアッセイを繰り返したが、ここでは環状テンプレートを形成するために２つの別個のライゲーション部位を有する２つのコネクターオリゴヌクレオチドを使用する代わりに、ライゲーション部位を１つ有する単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドを使用した。図１１（ａ）に示すように、ライゲーション部位１またはライゲーション部位２で開いた単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドを準備した。単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドを両方とも、実施例１と２で使用したオリゴヌクレオチド、Ｃｉｒｃ−１とＣｉｒｃ−２との組合せと並行してテストした。実施例２に記述したプロトコルを用いて、さらに、単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドを３種類の濃度、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび３１ｎＭでテストし、一方、Ｃｉｒｃ−１とＣｉｒｃ−２のオリゴヌクレオチドの組合せを使用する標準アッセイを１２５ｎＭでテストした。図１１（ｂ）に示すように、２つの単一線状コネクターオリゴヌクレオチドは、２種のコネクターオリゴヌクレオチド混合物（Ｃｉｒｃ−１とＣｉｒｃ−２）とおよそ同一の効率でＲＣＡ増幅産物に成功裡に組み込まれた。ライゲーション部位１で開いていた単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドは、信号強度、非特異的バックグラウンドおよび総合的な感度に基づいて、２種のコネクター混合物に匹敵する性能を有していた。予想した通り、ライゲーション部位２で開いていた単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドは、非特異的なバックグラウンドがより高く、感度はより低かった。この後者のケースでは、ライゲーションとプライミングの両方が、近接プローブ＃１の存在にのみ依存しており；したがって、近接増幅アプローチの特定の利点のうちのいくつかが損なわれた。
【実施例４】
【０２３８】
代替近接プローブ、固定オリゴヌクレオチドおよびコネクター配列を使用して実施した３つの抗体アッセイ
以下の試薬の代替セットを用いて、実施例１で概説したプロトコルを使用してアッセイを実施した：
【０２３９】
【表４】
0006408552.tif 000005
【０２４０】
下記の表５の結果はトロポニンアッセイのものであり、トロポニンの濃度は５００ｐｇ／ｍＬで、ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴプレートのウェルはそれぞれ、表４で挙げたセットの１つからの固定オリゴヌクレオチドを有する捕捉スポット１つを含んでいた。実施例１で記述したように、アッセイは近接プローブ（１）の１つおよび近接プローブ（２）の１つを同濃度で使用した。セット（ａ）〜（ｃ）の非特異的結合がより多かったが、これは、実施例１での記述と比較して検出オリゴヌクレオチド−ＳＡ−ＳＴＡＧの濃度が９倍高かったためである。検出オリゴヌクレオチド−ＳＡ−ＳＴＡＧの濃度がより高くなったのは、実施例１のようなＳＡ−ＳＴＡＧ単独の滴定でなく、あらかじめ結合した複合体を共に滴定したことによる。
【０２４１】
【表５】
0006408552.tif 000006
【実施例５】
【０２４２】
付加的な免疫アッセイプラットフォームで実施した３つの抗体アッセイ
（ａ）コード化粒子を使用する、ビーズベースの免疫アッセイフォーマット
アッセイ工程はすべて９６ウェルフィルタプレートで実施した。真空マニホールドでプレートから液体を除去した（Ｈｇ１０インチを超過せず）。プレートは反転させない。目詰まりが生じた場合、コニカルチューブ１５ｍｌの先端を使用して目詰まりしたウェルの下の区域をやさしく押し、次に、１ｍｌのパスツールピペットのゴム球を使用するか、目詰まりしたウェルを親指でやさしく押して、詰まりを取り除く。最終の吸引工程後、ペーパータオルを重ねた上でプレートの底を軽く叩き、次に、フィルタプレートの底面をＫｉｍｗｉｐｅで拭いて残留液／液滴を除去した。
【０２４３】
洗浄溶液の調整：脱イオン水２８５ｍｌで２０ｘ洗浄溶液ボトルの全容量を希釈して１ｘ洗浄溶液を調整した。
【０２４４】
アッセイ標準の用意：凍結乾燥した標準試料を１００％のアッセイ希釈剤（血清および血漿試料）、または５０％アッセイ希釈剤／５０％組織培養メディア（組織培養上清）で再構成した；再構成容積：（ｉ）バイアル１個：１ｍｌ；（ｉｉ）バイアル２個：１バイアル当たり０．５ｍｌ。８〜１０分間室温で再水和した。バイアルを数回ゆっくり逆さにし、完全に水和させるためさらに３〜５分静置した。標準試料を２つ以上使用する場合は、各標準試料を同容積合わせて、穏やかに混合する。再構成した標準試料の３倍の系列希釈を行い７ポイントの検量線を調製した。
【０２４５】
分析物捕捉：
（１）１０ｘキャプチャービーズストックをボルテックス（３０秒）および超音波分解（３０秒）する。ホイルにくるんだチューブで、１０ｘキャプチャービーズストック（ウェル当たり２．５μｌ）を洗浄溶液に希釈する（ウェル当たり２５μｌ  約２，０００〜５，０００ビーズ／アッセイ）。より高度な多重化には、保持した１０ｘキャプチャービーズストックの追加分の容積を調製できるよう洗浄溶液の容積を調整する。
【０２４６】
（２）２００μｌ洗浄溶液で標準ウェルおよび試料ウェルをあらかじめ湿潤させる。
【０２４７】
（３）希釈したキャプチャービーズ溶液をボルテックス（３０秒）および超音波分解（３０秒）する。直ちに２５μｌを各アッセイウェルに追加し、続いて１ｘ洗浄溶液を２００μＬ追加する。吸引し洗浄溶液２００μＬで洗浄を繰り返す。必要ならばフィルタプレートの底を軽く叩いて拭く。
【０２４８】
（４）インキュベーションバッファー５０μｌを全アッセイウェルに追加した。
【０２４９】
（５）指定のウェルへ標準試料を１００μｌ追加した。試料として指定したウェルには、５０μｌアッセイ希釈剤、続いて５０μｌ試料を追加した。振とう機上で（５００〜６００ｒｐｍ）、室温で２時間プレートをカバーしインキュベートした。全インキュベーションにおいて、不透明な蓋でアッセイプレートを覆い遮光した。速度は振とう機の半径により調整される必要がある場合がある。
【０２５０】
分析物検出
（６）蛍光標識した検出抗体の１ｘ混合物の調整：希釈剤（ウェル当たり１００μｌ）で１０ｘ検出抗体混合物（ウェル当たり１０μｌ）を希釈した。混合物は目的の分析物に特異的な一対の検出抗体を含み、１つはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０（青色蛍光標識）で標識し、もう１つはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（赤色蛍光標識）で標識した（これらの各々の蛍光標識はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍから入手可能）。より高度な多重化は、必要な１０ｘ抗体混合物の追加の容積を調製できるよう希釈剤の容積を調整する。吸引し洗浄溶液２００μＬで２回アッセイウェルを洗浄した。１００μｌの希釈検出抗体混合物を各アッセイウェルに追加した。プレートをカバーし、プレート振とう機で１時間インキュベートした（５００〜６００ｒｐｍ）。
【０２５１】
アッセイの読み取り
（８）吸引し洗浄溶液２００μＬで３回アッセイウェルを洗浄した。清潔なペーパータオルでフィルタプレートの底を乾かし、完全に全残留液滴を除去した。１００μｌ洗浄溶液を各アッセイウェルに追加し、２〜３分間プレート振とう機（５００〜６００ｒｐｍ）上にプレートを載せた。
【０２５２】
（９）個々の蛍光標識に対するカラーチャンネルを含む多色蛍光パーティクルアナライザー（ＦＡＣＳシステムまたは修正したｘＭＡＰ装置等）でビーズ懸濁を分析する。感度を最大にするために、任意の粒子は、ある１つの分析物に結合するか、または全く結合しない可能性があり、分析物の量は、（粒子のコード化に基づいて）所与の分析物に特異的であり、両蛍光標識を含む粒子の数を計数することにより定量するという条件でアッセイを実行する。場合により、アッセイはコード化されたビーズを使用したマルチプレックスフォーマットで実行できるが、ここで、コードは、ビーズ上の捕捉抗体および各分析物に対する追加の検出抗体ペアが分析物に特異的であることを示す。ｘＭＡＰ等でビーズに組み込む蛍光色の追加を使用してコード化を決定した場合、分析器は追加した色の測定およびビーズコードの識別に対応する追加の検出チャネルを有さなくてはいけない。
【０２５３】
（ｂ）固定部分を含むコード化粒子、核酸プローブで修飾した２つの検出試薬を使用したビーズベースの免疫アッセイフォーマット
実施例５（ａ）で概説したように、アッセイ工程はすべて９６−ウェルフィルタプレートで実施した。実施例５（ａ）で記述したように、洗浄溶液およびアッセイの標準試料を調製し、実施例１で記述したように、標的分析物に対する一対の検出抗体を、近接プローブ１および２を追加して修飾した。分析物を実施例５（ａ）で記述したように捕捉ビーズ上で捕捉した。捕捉ビーズは固定部分を含むが、この固定部分は、ＢＳＡ−オリゴヌクレオチド複合体としてビーズ表面に固定化され、オリゴヌクレオチドはローリングサークルのアンプリコンに特異的であるよう選択される。使用した固定オリゴヌクレオチドの配列は配列番号３である。
【０２５４】
アッセイ希釈剤２５μｌ、キャリブレーター、または試料（適切に希釈した）を捕捉ビーズの混合物と混合した。混合物を、１〜３時間振とうさせながらインキュベートし、洗浄した。上述にように調製した、近接プローブ１および２で標識した検出抗体の溶液を混合物に追加し、１〜２時間振とうさせながらインキュベートした（あるいは、それぞれ個々の検出抗体を連続して追加し、個々の追加後は１時間インキュベーションした）。実施例１で記述したライゲーション混合物を追加した。この混合物を３７℃で３０分間ライゲーション混合物と一緒にインキュベートし、洗浄して過剰な環状化オリゴヌクレオチドを除去し、３７℃で１．５時間、実施例１に上述したＲＣＡ混合物と一緒にインキュベートした。混合物を洗浄し、上述のフルオレセイン標識検出プローブの混合物を加えて３７℃で３０分間インキュベートした。混合物を洗浄し、粒子をマルチチャンネル蛍光パーティクルアナライザーに吸引した。
【０２５５】
（ｃ）ビーズベースのフォーマットおよび個々のナノウェルへの捕捉分析物分子の分離
試料を２５％ウシ血清（２〜４倍希釈）１００ｕｌで調製し、捕捉抗体でコートした５００Ｋビーズ（常磁性２．７μｍ、場合によって蛍光コード化）を、試料に追加した。試料を２３℃で約２時間インキュベートした。試料をＰＢＳ（５Ｘ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、標識した検出抗体の混合物を追加した（第１ビオチン化検出抗体およびハプテンコンジュゲート抗体を含む混合物）。混合物を２３℃で約１時間インキュベートした。混合物をＰＢＳ（５Ｘ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、酵素標識を追加し、ストレプトアビジン−β‐ガラクトシダーゼ（４０ｐＭ）、抗ハプテンコンジュゲート酵素も追加し、混合物を２３℃で約３０分間インキュベートした（またはＳｉｍｏａアナライザーに３分間かけた）。この混合物を、ＰＢＳ（５Ｘ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で７回洗浄し、酵素基質、レゾルフィン−ベータ−ｄ−ガラクトピラノシド  １５ｕｌ（ローディングバッファー内１００ｕＭ）を追加した。
【０２５６】
混合物をナノウェルのアレイ上に引き出し（ＤＶＤフォーマットでＱｕａｎｔｅｒｉｘから提供、環状オレフィンポリマーから作製、１ディスク当たり２４試料）、約２分を静置した。アレイをバッファーと一緒に洗い流し、アレイをフルオロカーボン油と一緒に密閉し、２３℃で２〜５分間インキュベートし、結果をマルチカラーの蛍光イメージャー上で読んだ。画像分析を使用して両蛍光酵素産物を包むナノウェルの数を計数し、それにより試料中の分析物の濃度と関連する値を得た。
【０２５７】
（ｄ）フローセル分析を用いたビーズベースの免疫アッセイフォーマット
第１のインキュベーション：試料１０ｕｌ、ビオチン化モノクローナル分析物特異的捕捉抗体（希釈標準溶液２．６ｍｇ／ｌ）、およびそれぞれオリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせたモノクローナル分析物特異抗体の混合物（０．３ｍｇ／ｌの希釈標準溶液）を反応させてサンドイッチ複合体を形成した。モノクローナル分析物特異抗体の混合物は実施例１の記述通りに調製し、混合物には、実施例１で上述したように、近接プローブ１および２にコンジュゲートした一対の抗体が挙げられる。
【０２５８】
第２インキュベーション：ストレプトアビジンコート微粒子の追加後に（Ｄｙｎａｌ  Ｍ２８０、２．８ｕｍ、０．７２ｍｇ／ｍｌ、ビオチン結合能４７０ｎｇ／ｍｇ）、複合体をビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用により固相に結合させた。実施例１に記述したプロトコルによって調製したライゲーション混合物をこの混合物に追加した。
混合物を３７℃で３０分間ライゲーション混合物と一緒にインキュベートし、洗浄して過剰な環状化オリゴヌクレオチドを除去し、実施例１で記述したＲＣＡ混合物と一緒にインキュベートした。混合物を洗浄し、ビオチン標識した検出プローブの混合物を追加し、３７℃で３０分間インキュベートした。検出プローブ混合物は実施例１で記述したように調製した。電気化学発光標識ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を組み込むために、検出プローブを、末端のビオチン標識と合成し、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識ストレプトアビジンにあらかじめ結合した。
【０２５９】
反応混合物を測定セルへ吸引し、測定セルで微粒子を電極の表面上へ磁気によって捕捉した。その後、未結合の物質をＰｒｏＣｅｌｌ（ＴＰＡを含むバッファー）で除去した。その後、電極に電圧をかけ、化学発光を誘発し、光電子増倍管により測定した。結果は検量線によって決定した。検量線は２ポイント較正および試薬バー・コードにより提供されたマスタ曲線により装置の固有差を考慮して生成した。
【実施例６】
【０２６０】
ＨＩＶ−１  Ｐ２４の検出
材料、方法および結果：
実施例１に記述した手順をＨＩＶ−１  ｐ２４を検出するために使用した。ＨＩＶ−１  ｍｉｘｅｄ  ｔｉｔｅｒ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｐａｎｅｌ（Ｓｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｗｗｗ．ｓｅｒａｃａｒｅｃａｔａｌｏｇ．ｃｏｍから入手可能）、ＨＩＶ−１セロコンバージョンパネル（これもＳｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）、ＨＩＶ抗体陽性試料（ＰｒｏＭｅｄＤｘ、ＬＬＣ、ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｄｄｘ．ｃｏｍから入手可能）および正常な対応試料（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、ｗｗｗ．ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ．ｃｏｍから入手可能）から入手した約６４の血清または血漿試料を試験した。上述の手順に従って導出されたＨＩＶ−１  ｐ２４アッセイの検量線を図１２に示す。アッセイのＬＯＤは、１．３ｆｇ／ｍＬであることが見出され、ＬＬＯＱは３．０ｆｇ／ｍＬ、ＵＬＯＱは３７、５００ｆｇ／ｍＬだった。２５ｕＬ試料の検出限界１．３ｆｇ／ｍＬはｐ２４分子約６５０個に相当し、ウィルス粒子（分子）はそれぞれ、ｐ２４タンパク質の複製を約２０００個生成する。
【０２６１】
Ｍｉｘｅｄ  ｔｉｔｅｒ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｐａｎｅｌ、ＰＲＡ２０４（Ｂ）は、市販のアッセイ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ａｎｄ  Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ）においてＨＩＶ  ｐ２４抗原に対する陽性反応が弱から強までの範囲の１０の標本１セットから成る。陰性標本を２つパネルに含めた。アッセイの結果を下の表６に示す：
【０２６２】
【表６】
0006408552.tif 000007
【０２６３】
ＨＩＶ  ｐ２４レベルは高く、ほとんどの試料のＵＬＯＱを超えていた。１０個の陽性試料はすべて検出可能で、市販のｐ２４キットに匹敵し、一方、陰性試料（それぞれ市販のアッセイ、ＰＲＡ２０４（Ｂ）−１０および−２０基づく）は、それぞれ約３ｆｇ／ｍＬおよび約２ｆｇ／ｍＬであり、極めて低かった。
【０２６４】
セロコンバージョンパネルの分析結果を図１３に示す。３抗体アッセイフォーマットはＰＣＲと同程度に高感度であり、第１の陽性試料の検出にかかる推定遅延時間およびＰＲＢ９４８〜ＰＲＢ９６２パネルの両試料におけるｐ２４レベルは、ＰＣＲキットに匹敵し、他の市販のｐ２４アッセイより優れていることが見出された。データを表７に示す。
【０２６５】
【表７】
0006408552.tif 000008
【０２６６】
結論：
ＨＩＶに感染して間もない患者は、この疾病の伝播の一因となる傾向がある。ウィルス負荷は感染後最初の数週間高く、新たに感染した患者は、自らの感染とともに、他者へ感染を拡大し得ることを自覚していない可能性が高い。したがって、急性ＨＩＶ感染の早期発見は、公衆衛生上非常に重要である。ＰＣＲ法は確立された感受性を有し；血清または血漿ｍＬ当たりわずか６０のＨＩＶ  ＲＮＡ複製を検出できる（ｍＬ当たりウィルス粒子３０個）。しかしながら、ＰＣＲ法は複雑で費用が高く、したがって、すべての状況で適切とはならない。免疫アッセイはより単純でより安価であるが、現行の検出限界は、第四世代のｐ２４免疫アッセイにおいてわずか約１０ｐｇ／ｍＬ、または１ｍＬ当たり約２億５０００万個のカプシドタンパク質となっている。ウィルス当たり約２，０００個のｐ２４カプシドタンパク質が存在するという事実にもかかわらず、これらの免疫アッセイは、ウイルスベースでＰＣＲ検査の数千倍分の一の感度である。
【０２６７】
本明細書の記述にあるような、ＭＳＤのＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ（登録商標）テクノロジーに基づいた次世代電気化学発光アッセイフォーマットが開発され、その性能には特色がある。この新規のｐ２４免疫アッセイの検出限界は約１ｆｇ／ｍＬ（現在のｐ２４免疫アッセイより１０，０００倍高感度）であった。１ｆｇ／ｍＬの感度は、２５ｕＬの我々のサンプル容積において１未満のウィルス粒子に相当する。定量化の下限および上限はそれぞれ３ｆｇ／ｍＬおよび３８，０００ｆｇ／ｍＬであった。プレート内ＣＶは７％、全ＣＶは１５％であった。添加回収率および希釈の直線性は８０％〜１２０％であった。ｐ２４は、明らかに健常なドナー３２人の血清または血漿において検出できなかった。ｐ２４混合タイターパネルは、３−ＡＢ  ＨＩＶｐ２４アッセイと市販のｐ２４免疫アッセイ間の優れた相関を示した。２つのセロコンバージョンパネルを検査した：ＳｅｒａＣａｒｅ  ＰＲＢ９４８（０および１８日目、ＰＣＲ陰性；２２および２３日目、ＰＣＲ陽性）およびＰＲＢ９６２（０および２日目、ＰＣＲ陰性；７、９、１４および１７日目、ＰＣＲ陽性）。両ケースで、３ＡＢ  ＨＩＶｐ２４アッセイの結果は、すべてのＰＣＲ陰性試料で陰性であり、すべてのＰＣＲ陽性試料では陽性であり、感染は従来のｐ２４免疫アッセイの前に良く検出された。
【０２６８】
結論として、本明細書に記述された３−ＡＢ  ＨＩＶｐ２４免疫アッセイは、ｐ２４  ＥＬＩＳＡの現行の範囲より１０，０００倍高感度であり、ＰＣＲアッセイにおける感度に匹敵する。本アッセイは専用の設備を必要とせず、ＭＥＳＯ（商標）ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ  １２０およびＳＥＣＴＯＲ（登録商標）イメージャー上で実行できる。
【０２６９】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態よって範囲を限定されない。実際、本明細書に開示したものに加えて、本方法の様々な改変は、これまでの記述と添付の図から当業者には明らかとなろう。このような改変は特許請求の範囲内にあることが意図される。様々な文献が本明細書に引用されているが、これらの開示全体を参照によって組み入れる。
【０２７０】
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【図１ａ】
0006408552.tif 000009
【図１ｂ】
0006408552.tif 000010
【図１ｃ】
0006408552.tif 000011
【図２ａ】
0006408552.tif 000012
【図２ｂ】
0006408552.tif 000013
【図２ｃ】
0006408552.tif 000014
【図３】
0006408552.tif 000015
【図４ａ】
0006408552.tif 000016
【図４ｂ】
0006408552.tif 000017
【図４ｃ】
0006408552.tif 000018
【図５】
0006408552.tif 000019
【図６ａ】
0006408552.tif 000020
【図６ｂ】
0006408552.tif 000021
【図７】
0006408552.tif 000022
【図８】
0006408552.tif 000023
【図９】
0006408552.tif 000024
【図１０】
0006408552.tif 000025
【図１１ａ】
0006408552.tif 000026
【図１１ｂ】
0006408552.tif 000027
【図１２】
0006408552.tif 000028
【図１３】
0006408552.tif 000029
【配列表】
0006408552000001.app