(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清又は血漿サンプル中に含まれるエーテルリン脂質を定量する方法であって、
イ．被験体の血清又は血漿を、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）を用いて加水分解処理した後、脂質抽出処理して血清又は血漿の脂質サンプルを得る工程；
並びに、
ロ．前記工程イ．で得られた血清又は血漿の脂質サンプルを、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備える高速液体クロマトグラフィーに付す工程
を含むこと
を特徴とするエーテルリン脂質の定量方法。
【請求項２】
前記高速液体クロマトグラフィーは、
順相カラムと蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備え、
前記高速液体クロマトグラフィーで用いる移動相の組成は、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１、体積比）＋０．０８％トリエチルアミン
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１、体積比）＋０．０８％トリエチルアミン
或いは、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／ギ酸（８２：１７：１、体積比）＋２５％アンモニア水
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／ギ酸（８５：１４：１、体積比）＋２５％アンモニア水
或いは、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／１Ｍギ酸アンモニウム（８２：１７：１）
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／１Ｍギ酸アンモニウム（８２：１７：１）
であること
を特徴とする請求項１に記載のエーテルリン脂質の定量方法。
【請求項３】
前記高速液体クロマトグラフィーは、
下記分析条件で行われること
を特徴とする請求項１に記載のエーテルリン脂質の定量方法。
＜分析条件＞
検出：蒸発光散乱検出器  Ｇａｉｎ  ５，Ｎ２ガス流量  ０．９９ＬＳＭ，エバポレーター温度  ６０℃
カラム：順相カラム（２５０×３ｍｍ，５μｍ）
カラム温度：５０℃
流量：０．４ｍｌ／分
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１，ｖ／ｖ，＋０．０８％トリエチルアミン）
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１，ｖ／ｖ，＋０．０８％トリエチルアミン）
移動相（Ａ）と（Ｂ）の液組成を時間帯に応じて下記のように制御する
0006399294.tif 000009
【請求項４】
前記脂質抽出処理は、
クロロホルム・メタノールによる処理であること
を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のエーテルリン脂質の定量方法。
【請求項５】
エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する、疾患の発症リスクを判定するための検査方法であって、
ハ．請求項１〜４の何れかに記載のエーテルリン脂質の定量方法により、被験体の血清又は血漿サンプル中に含まれるエーテルリン脂質を定量する工程；
ニ．前記工程ハ．で測定した被験体のエーテルリン脂質量と、健常な被験体のエーテルリン脂質量とを比較する工程；
並びに
ホ．前記工程ニ．における比較の結果、前記工程ハ．で測定した被験体のエーテルリン脂質量が、健常な被験体のエーテルリン脂質量よりも少ない場合に、エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する疾患の発症リスクが高いことを示す工程
を含み、
前記疾患は、
認知症、うつ病、脳疲労、不眠症、パーキンソン病、メタボリック症候群、糖尿病、又は動脈硬化であること
を特徴とする検査方法。
【請求項６】
血清又は血漿サンプル中に含まれるエーテルリン脂質の量を定量するための試薬として
ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）と、
脂質抽出用有機溶媒と、
蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備えるＨＰＬＣ分析用の溶媒
を含むこと
を特徴とする、認知症、うつ病、脳疲労、不眠症、パーキンソン病、メタボリック症候群、糖尿病、又は動脈硬化の発症リスクを検査するための検査用キット。
【請求項７】
前記溶媒は、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１、体積比）＋０．０８％トリエチルアミン及び
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１、体積比）＋０．０８％トリエチルアミン
或いは、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／ギ酸（８２：１７：１、体積比）＋２５％アンモニア水及び
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／ギ酸（８５：１４：１、体積比）＋２５％アンモニア水
或いは、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／１Ｍギ酸アンモニウム（８２：１７：１）及び
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／１Ｍギ酸アンモニウム（８２：１７：１）
であること
を特徴とする請求項６に記載の検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、血清又は血漿中のエーテルリン脂質の量を測定する方法、すなわち、エーテルリン脂質の定量方法に関するものである。
より詳しくは、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を用いて、血清又は血漿中のエーテルリン脂質の量を高い精度で簡便に測定する方法、およびこの方法を使用する検査方法、疾患検出用バイオマーカーと、この疾患検出用バイオマーカーの使用方法ならびに検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトなどの哺乳動物の生体内に存在するグリセロリン脂質には、グリセロール骨格のｓｎ−１位にエステル結合を有するリン脂質（ジアシルリン脂質）と、ｓｎ−１位にエーテル結合を有するリン脂質（エーテルリン脂質）が存在する。
さらに、エーテルリン脂質には２つの型が存在し、ｓｎ−１位にエーテル結合を有するもの（アルキルアシルリン脂質）と、ビニルエーテル結合を有するもの（アルケニルアシルリン脂質）が存在する。
前記ビニルエーテル結合を有するもの（アルケニルアシルリン脂質）は、プラズマローゲンとも呼ばれている。
以下に、プラズマローゲンの一般式を示す。
【０００３】
【化１】
0006399294.tif 000002
【０００４】
前記式中、Ｒ１  およびＲ２  は脂肪族炭化水素基を示す。
Ｒ１  は、通常、炭素数１〜２０の脂肪族炭化水素基で、例えば、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、イコサニル基などが挙げられる。
Ｒ２  は、通常、脂肪酸残基由来の脂肪族炭化水素基で、例えば、オクタデカジエノイル基、オクタデカトリエノイル基、イコサレトラエノイル基、イコサペンタエノイル基、ドコサテトラエノイル基、ドコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基などが挙げられる。
なお、前記式中、Ｘは極性基を示す。
Ｘは、好ましくは、エタノールアミン、コリン、セリン、イノシトール又はグリセロールである。〕
【０００５】
ヒトなどの哺乳動物においては、エーテルリン脂質は、エタノールアミンを有するものとコリンを有するものが殆どで、セリンやイノシトールを有するものは僅かである。
さらに、生体では、エーテルリン脂質は、他のリン脂質とともに生体膜（細胞膜）の構成成分である。
プラズマローゲンなどのエーテルリン脂質の量は、赤血球サンプルを用いて測定することが多い（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
最近、認知症、アルツハイマー病などの重篤な疾患において、血清中のプラズマローゲ
ンの量が低いことを示唆する報告がなされた（例えば、非特許文献１参照）。
さらに、糖尿病や動脈硬化などの代謝症候群および他の慢性疾患において、血清中のプ
ラズマローゲンの量が低下していることも示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０９０６２５号（請求の範囲）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｏｏｄｅｎｏｗｅ，Ｄ．Ｂ．ら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４    ８巻，２００７年，２４８５〜２４９８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ヒトの血清や血漿中のリン脂質は、リンの量から計算して、主としてコリンリン脂質が約６８％、スフィンゴミエリンが約２０％、およびリゾ型コリンリン脂質が約８％であって、エタノールアミンリン脂質は約２〜３％に過ぎない。
さらに、血清および血漿は細胞膜ではないため、エーテルリン脂質は赤血球や白血球と比べて極めて少ない。
したがって、血清や血漿中のエーテルリン脂質の量を、測定することは困難であった。
【００１０】
最近では、血清や血漿中のエーテルリン脂質の量の測定方法として、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と、マススペクトロメトリーを組み合わせた測定法（ＬＣ／ＭＣ）が使用されている。
さらに、放射性ヨウ素を、ビニルエーテル結合部位に反応させてからＨＰＬＣで各エーテルリン脂質を分画し、ガンマーカウンター（γ−ｃｏｕｎｔｅｒ）で放射性活性を測定する方法がある。
しかしながら、前記マススペクトロメトリー機器およびガンマーカウンター機器は高価であるので、一般の臨床検査などには向かないものである。
【００１１】
この発明はかかる現状に鑑み、血清や血漿中のエーテルリン脂質の量を、簡便に、しかも安価に測定する方法を提供することを目的として検討を行なった。
【００１２】
その結果、特定の処理をした血清や血漿サンプルを用いた場合に、ＨＰＬＣの一般的な検出器である蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）によって、血清や血漿中のエーテルリン脂質の量を、高い精度で簡便に、しかも安価に測定することができることを見出して、この発明を完成させたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、この発明の請求項１に記載の発明は、
血清又は血漿サンプル中に含まれるエーテルリン脂質を定量する方法であって、
イ．被験体の血清又は血漿を、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）を用いて加水分解処理した後、脂質抽出処理して血清又は血漿の脂質サンプルを得る工程；
並びに、
ロ．前記工程イ．で得られた血清又は血漿の脂質サンプルを、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備える高速液体クロマトグラフィーに付す工程
を含むこと
を特徴とするエーテルリン脂質の定量方法である。
【００１４】
この発明の請求項２に記載の発明は、
請求項１に記載のエーテルリン脂質の定量方法において、
前記高速液体クロマトグラフィーは、
順相カラムと蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備え、
前記高速液体クロマトグラフィーで用いる移動相の組成は、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１、体積比）＋０．０８％トリエチルアミン
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１、体積比）＋０．０８％トリエチルアミン
或いは、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／ギ酸（８２：１７：１、体積比）＋２５％アンモニア水
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／ギ酸（８５：１４：１、体積比）＋２５％アンモニア水
或いは、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／１Ｍギ酸アンモニウム（８２：１７：１）
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／１Ｍギ酸アンモニウム（８２：１７：１）
であること
を特徴とするものである。
【００１５】
この発明の請求項３に記載の発明は、
請求項１に記載のエーテルリン脂質の定量方法において、
前記高速液体クロマトグラフィーは、
下記分析条件で行われること
を特徴とするものである。
【００１６】
＜分析条件＞
検出：蒸発光散乱検出器  Ｇａｉｎ  ５，Ｎ２ガス流量  ０．９９ＬＳＭ，エバポレーター温度  ６０℃
カラム：順相カラム（２５０×３ｍｍ，５μｍ）
カラム温度：５０℃
流量：０．４ｍｌ／分
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１，ｖ／ｖ，＋０．０８％トリエチルアミン）
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１，ｖ／ｖ，＋０．０８％トリエチルアミン）
移動相（Ａ）と（Ｂ）の液組成を時間帯に応じて下記のように制御する
0006399294.tif 000003
【００１７】
この発明の請求項４に記載の発明は、
請求項１〜３のいずれかに記載のエーテルリン脂質の定量方法において、
前記脂質抽出処理は、
クロロホルム・メタノールによる処理であること
を特徴とするものである。
【００１８】
この発明の請求項５に記載の発明は、
エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する、疾患の発症リスクを判定するための検査方法であって、
ハ．請求項１〜４の何れかに記載のエーテルリン脂質の定量方法により、被験体の血清又は血漿サンプル中に含まれるエーテルリン脂質を定量する工程；
ニ．前記工程ハ．で測定した被験体のエーテルリン脂質量と、健常な被験体のエーテルリン脂質量とを比較する工程；
並びに
ホ．前記工程ニ．における比較の結果、前記工程ハ．で測定した被験体のエーテルリン脂質量が、健常な被験体のエーテルリン脂質量よりも少ない場合に、エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する疾患の発症リスクが高いことを示す工程
を含み、
前記疾患は、
認知症、うつ病、脳疲労、不眠症、パーキンソン病、メタボリック症候群、糖尿病、又は動脈硬化であること
を特徴とする検査方法である。
【００１９】
この発明の請求項６に記載の発明は、
血清又は血漿サンプル中に含まれるエーテルリン脂質の量を定量するための試薬として
ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）と、
脂質抽出用有機溶媒と、
蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備えるＨＰＬＣ分析用の溶媒
を含むこと
を特徴とする、認知症、うつ病、脳疲労、不眠症、パーキンソン病、メタボリック症候群、糖尿病、又は動脈硬化の発症リスクを検査するための検査用キットである。
【００２０】
この発明の請求項７に記載の発明は、
請求項６に記載の検査用キットにおいて、
前記溶媒は、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１、体積比）＋０．０８％トリエチルアミン及び
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１、体積比）＋０．０８％トリエチルアミン
或いは、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／ギ酸（８２：１７：１、体積比）＋２５％アンモニア水及び
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／ギ酸（８５：１４：１、体積比）＋２５％アンモニア水
或いは、
移動相Ａ：ヘキサン／イソプロパノール／１Ｍギ酸アンモニウム（８２：１７：１）及び
移動相Ｂ：イソプロパノール／水／１Ｍギ酸アンモニウム（８２：１７：１）
であること
を特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２１】
この発明のエーテルリン質の定量方法は、血清や血漿中に少量しか含まれていないエーテルリン脂質、特にエタノールアミンエーテルリン脂質又はコリンエーテルリン脂質を、高い精度で簡便に、しかも安価に定量することができる。
【００２２】
さらに、このような定量方法を用いて、認知症、うつ病、脳疲労、不眠症、パーキンソン病、メタボリック症候群、糖尿病又は動脈硬化などのエーテルリン脂質量の減少と密接に関連する疾患の、発症リスクを判定ないし予測するための検査方法を提供することができる。
さらにまた、この発明の前記疾患検出用バイオマーカーによって、前記疾患の検査や判定を簡便、安全かつ低コストに行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ホスホリパーゼＡ１処理した血漿の総リン脂質を示すＨＰＬＣチャートであ    る。
【図２】血漿中の総リン脂質を示すＨＰＬＣチャートである。
【図３】ホスホリパーゼＡ１処理及び塩酸処理した血漿の総リン脂質を示すＨＰＬＣ    チャートである。
【図４】ホスホリパーゼＡ１処理したヒト血漿の総リン脂質を示すマススペクトロメ    トリーチャート（トータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ））である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、この発明の実施の形態について説明する。
この実施例は、この発明の好ましい代表例を示すものであるが、この発明がこのような代表例に限定されるものではない。
【００２５】
この発明のエーテルリン脂質の定量方法は、血清又は血漿サンプル中に含まれるエーテルリン脂質を定量するものであって、以下の工程を含むものである。
イ．被験体の血清又は血漿を加水分解処理した後、脂質抽出処理して血清又は血漿の脂質サンプルを得る工程；
並びに
ロ．前記工程イ．で得られた血清又は血漿の脂質サンプルを高速液体クロマトグラフィーに付す工程
【００２６】
前記工程イ．は、前記被験体の血清又は血漿を加水分解処理することを含む。
前記加水分解処理によって、血清又は血漿中のジアシル型リン脂質は全て除去されるので、その後に脂質抽出処理をすれば、各リン脂質の相互分離が可能なＨＰＬＣ法、特にＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法によって、血清又は血漿中に少量しか含まれていないエーテルリン脂質を、高い精度で簡便に、しかも安価に定量することが可能となる。
【００２７】
前記被験体としては、哺乳動物、すなわち、ヒト及び非ヒト哺乳動物が挙げられる。
前記非ヒト哺乳動物としては、例えば、ペット、実験動物、家畜等が挙げられる。
具体的には、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどが例示できる。
【００２８】
この発明において、血清および血漿は、被験体から通常の採血方法（例えば、シリンジ採血又は真空採血）で得られる血液を、公知の方法により処理することによって得ることができる。
例えば、血液サンプルを、遠心（例えば、１０００×ｇ，５分間）して、上清を回収することによって得られる。
【００２９】
前記加水分解処理としては、リン脂質のｓｎ−１のアシル結合を、特異的に加水分解する処理、例えば、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）による処理が挙げられる。
【００３０】
前記ＰＬＡ１は、血清ないし血漿中のエーテルリン脂質においてｓｎ−１位のアシル結合のみに作用し、エーテル結合には作用しない。
したがって、前記ＰＬＡ１処理によって、ジアシル型のリン脂質は分解されるが、エーテル型のリン脂質は分解されない。
【００３１】
前記ＰＬＡ１については、前記効果が得られるものであれば、その由来などは特に制限されない。
前記ＰＬＡ１として、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｉｚａｅ由来のＰＬＡ１が挙げられる。
かかるＰＬＡ１は、例えば、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、あるいは三菱化学フーズ株式会社などから購入可能である。
シグマ社製のものは液体のＰＬＡ１で、三菱化学フーズ（株）社製のものは、ＰＬＡ１を２５％含有した粉末のものである
【００３２】
前記ＰＬＡ１の使用量については、血清ないし血漿の量に応じて適宜選択され得る。
シグマ社製の液体ＰＬＡ１の場合には、好ましくは血清ないし血漿１０μＬに対して、０．０１〜０．５０μＬ、より好ましくは０．０４〜０．２０μＬである。
【００３３】
前記ＰＬＡ１による加水分解反応を適当な溶媒、特にバッファー中で行うことができるが、このような溶媒は、使用するＰＬＡ１に応じて適宜選択され得る。
例えば、０．１Ｍクエン酸緩衝溶液（クエン酸−ＨＣｌバッファー；ｐＨ４．５）を用いることができる。
この場合、前記ＰＬＡ１を前記溶液に加えて溶解させて適当な濃度（例えば、三菱化学フーズ（株）社製の粉末のものの場合には、１０〜３００ｍｇ／ｍＬ）のＰＬＡ１溶液を調製してから、３０〜５０μＬの血清ないし血漿にＰＬＡ１溶液を加えればよい。
前記溶媒の使用量については、加水分解反応が進行するものであればよく、特に制限はないが、好ましくは、血清ないし血漿１０μＬ当たり、１〜２００μＬ、より好ましくは５〜２００μＬである。
【００３４】
前記反応条件については、適宜選択できる。
好ましくは温度３０〜７０℃、より好ましくは温度４５〜５５℃、さらに好ましくは温度５０℃で撹拌しながら好ましくは１〜５時間、より好ましくは１〜２時間反応させる。
その際のｐＨは、好ましくはｐＨ３．５〜５．５、より好ましくはｐＨ４〜５である。
【００３５】
なお、前記加水分解反応を、冷却により止めてもよい。
【００３６】
血清又は血漿を加水分解処理した後、脂質を抽出して、血清又は血漿の脂質サンプルを得る方法としては、公知の脂質抽出法を用いることができる。
例えば、メタノール及びクロロホルムを、加水分解処理した血清又は血漿に加えて混和し、クロロホルム層を回収する方法が例示できる。
より具体的には、加水分解処理した血清又は血漿溶液（血清又は血漿サンプル）に１〜３倍容量のメタノール、および前記メタノールと同容量又は２倍容量のクロロホルムを加えて混和し、室温で１０分〜２時間程度静置した後に遠心して（例えば、１，３０００ｒｐｍ、１０分間）、クロロホルム層を回収する方法が挙げられる。
回収したクロロホルム層は、窒素ガスなどを用いて乾燥させた後、温度−２０℃〜−４０℃程度で保存することができる。
【００３７】
前記工程ロ．は、前記工程イ．で得られた血清又は血漿の脂質サンプルを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付して、解析する工程である。
【００３８】
上記のように、ＰＬＡ１で処理した後に抽出して得られる血清又は血漿の脂質サンプルを、一般的な検出器である蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ：Evaporative Light Scattering Detector）を備える高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析することで、血清又は血漿中に存在する、エーテルリン脂質のそれぞれ完全な独立したピークが現われたクロマトグラムを得ることができる。
具体的には、血清又は血漿の脂質サンプルを、例えば、ヘキサン／イソプロパノール（３：２）、あるいはクロロホルム／メタノール（１：１乃至２：１）に溶解させてＨＰＬＣに注入し、検出をＥＬＳＤにより行うことで、血清又は血漿中に存在するエーテルリン脂質を検出できる。
【００３９】
その際、
ＨＰＬＣカラムとして、例えば、
Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ １００ ＤＩＯＬ （２５０×３ｍｍ，５μｍ）などの順相カラムを用い、
ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１、体積比）＋０．０８％トリエチルアミン（移動相Ａ）、
イソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１、体積比）＋０．０８％トリエチルアミン（移動相Ｂ）
あるいは、
ヘキサン／イソプロパノール／ギ酸（８２：１７：１、体積比）＋２５％アンモニア水（移動相Ａ）、
イソプロパノール／水／ギ酸（８５：１４：１、体積比）＋２５％アンモニア水（移動相Ｂ）
あるいは、
ヘキサン／イソプロパノール／１Ｍギ酸アンモニウム（８２：１７：１）（移動相Ａ）、
イソプロパノール／水／１Ｍギ酸アンモニウム（８２：１７：１）（移動相Ｂ）
などを用いることができる。
なお、この発明においては、前記ＰＬＡ１の作用によって、血清又は血漿中のジアシル型リン脂質は完全に分解されているので、各リン脂質の相互分離が可能なＨＰＬＣ法であれば、上記特定のカラムや、上記移動相に限定されず利用できる。
図４において、この一例が示されている。
【００４０】
得られるクロマトグラムの各ピークの面積が、各脂質成分の含有量を表す。
精製されたエーテルリン脂質は入手困難であることが多い。
したがって、精製されたコリン脂質及びエタノールアミンリン脂質を用いて、それぞれの検量線を作成して、エタノールアミンエーテルリン脂質及びコリンエーテルリン脂質の定量ができる。
ＥＬＳＤでは、類似した構造を有する物質であれば、同様のエリアレスポンスを示すからである。
【００４１】
この発明において、前記ＨＰＬＣに他の適当な分析装置と連結させて、分析を行うことができる。
前記分析装置としては、例えば、質量分析計（ＭＳ）や、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）などが挙げられる。
【００４２】
この発明においては、前記エーテルリン脂質の定量方法を用いて測定したエーテルリン脂質の量を、健常な被験体のエーテルリン脂質量と比較することによって、エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する、疾患の発症リスクを判定することができる。
【００４３】
この発明の検査方法は、エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する疾患の、発症リスクを判定するための検査方法であって、下記工程を含む。
ハ．請求項１〜３の何れかに記載のエーテルリン脂質の定量方法によって、被験体の血清又は血漿サンプル中に含まれるエーテルリン脂質を定量する工程；
並びに
ニ．前記工程ハ．で測定した被験体のエーテルリン脂質量と、健常な被験体のエーテルリン脂質量とを比較する工程。
【００４４】
前記エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する疾患としては、認知症、うつ病、脳疲労、不眠症、パーキンソン病、メタボリック症候群、糖尿病又は動脈硬化などが挙げられる。
好ましくは、認知症、うつ病、脳疲労、不眠症、パーキンソン病、メタボリック症候群、糖尿病又は動脈硬化である。
前記認知症としては、変性性認知症が挙げられる。
具体的には、パーキンソン病に伴う認知症、前頭側頭型認知症、ピック病、びまん性レビー小体病、アルツハイマー型認知症等が例示できる。
【００４５】
前記工程ハ．は、前記したエーテルリン脂質の定量方法によって、被験体の血清又は血漿サンプル中に含まれるエーテルリン脂質の量を測定する工程であって、その詳細については前記の通りである。
【００４６】
前記工程ニ．は、前記工程ハ．で測定した被験体のエーテルリン脂質量と、健常な被験体のエーテルリン脂質量とを比較する工程である。
すなわち、この工程では、
（ａ）被験体から採取した、血液中の血清ないし血漿に含まれるエーテルリン脂質量と、
（ｂ）健常な被験体から採取した、血液中の血清ないし血漿に含まれるエーテルリン脂質量とを比較する。
【００４７】
なお、前記「健常な被験体のエーテルリン脂質量」は、通常、対象となる被験体（例えば、哺乳動物）と同一種であって、少なくとも前記疾患を患っていない、好ましくは健康な被験体から採取した、血液中の血漿に含まれるエーテルリン脂質量である。
【００４８】
前記比較については、
前記（ａ）被験体の血清又は血漿量中に存在するエーテルリン脂質量および、
前記（ｂ）健常な被験体の血清又は血漿量中に存在するエーテルリン脂質量
が、ともに絶対量値（例えば、質量値又はモル値など）として得られている場合には、測定に用いる血清又は血漿の量を、揃えることによって行うことができる。
このように、一定の血清又は血漿量中に存在する被験体のエーテルリン脂質量と、これと同量の血清又は血漿量中に存在する、健常な被験体のエーテルリン脂質量とを比較することにより、被験体のエーテルリン脂質量の、健常な被験体のエーテルリン脂質量に対する多少を決めることができる。
【００４９】
なお、前記比較に際しては、必ずしも質量値などの絶対量を求める必要はなく、健常な被験体の血清ないし血漿に含まれる、エーテルリン脂質の量と比較することができるデータが得られればよい。
【００５０】
例えば、蒸発光散乱検出器を備える高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤともいう）により、被験体の血清ないし血漿に含まれる脂質、および健常な被験体の血清ないし血漿に含まれる、脂質を分析して得られるデータ、例えば、それぞれのクロマトグラムにおける、エーテルリン脂質を示すピークの面積を互いに比較することができる。
この場合、ＨＰＬＣの測定に用いる脂質を得る血清ないし血漿量を揃えることにより、被験体の血清ないし血漿に含まれるエーテルリン脂質の量の、健常な被験体の血清ないし血漿に含まれるエーテルリン脂質の量に対する多少を決めることができる。
【００５１】
さらにまた、ＨＰＬＣの測定に用いる脂質を得る血清ないし血漿量を揃えなくとも、あるいは揃えた上で、エーテルリン脂質を示すピーク面積を、他の特定の脂質成分を示すピーク面積と比べた場合の割合で表し、当該割合を比較することで、被験体の血清ないし血漿に含まれるエーテルリン脂質の量の、健常な被験体の血清ないし血漿に含まれるエーテルリン脂質の量に対する多少を決めることもできる。
すなわち、被験体の血清ないし血漿および健常な被験体の血清ないし血漿のそれぞれについて、ＨＰＬＣ分析を行ってクロマトグラムを得、それぞれのクロマトグラムにおいてある特定の脂質成分量に対するエーテルリン脂質量の割合（比）を求め、当該比の大小を比べることによって、エーテルリン脂質量を比較することができる。
当該比が大きい方が、エーテルリン脂質量が多いことになり、当該比が小さい方が、エーテルリン脂質量が少ないことになる。
【００５２】
なお、当該比は、「エーテルリン脂質量／特定の脂質成分量」と記載することができ、「エーテルリン脂質を示すピークの面積／特定の脂質成分を示すピークの面積」で求めることができる。
この比較方法では、当該比の分母に用いられる「特定の脂質成分」として、被験体の血清ないし血漿、及び健常な被験体の血清ないし血漿に含まれ、かつその含有量が、個人差が少ない特定の脂質成分を選択することが好ましい。
【００５３】
このような脂質成分としては、
ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、コレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールなどが挙げられ、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、コレステロールが好ましく、ホスファチジルエタノールアミン
がより好ましい。
なお、ＨＰＬＣの測定に用いる脂質を得る血清ないし血漿量を揃えた上、かつ特定の脂質成分量に対するエーテルリン脂質量の割合（比）を求めることが、より精度の高い比較結果を得ることができる点から好ましい。
【００５４】
この発明の検査方法においては、
前記（ａ）被験体の血清又は血漿量中に存在するエーテルリン脂質量と、
前記（ｂ）健常な被験体の血清又は血漿量中に存在するエーテルリン脂質量
との比較結果を用いて、被験体の血清ないし血漿がエーテルリン脂質量の減少と密接に関連する、疾患の発症リスクが高いか低いかを判定することができる。
この判定では、前記（ａ）が前記（ｂ）より少ない場合に、被験体は前記疾患の発症リスクが高いと判定される。
すなわち、この発明の検査方法には、さらに下記工程を含めることができる。
ホ．前記工程ニ．における比較の結果、前記工程ハ．で測定した被験体のエーテルリン脂質量が、健常な被験体のエーテルリン脂質量よりも少ない場合に、エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する疾患の発症リスクが高いと判定する工程。
【００５５】
特に、前記のＨＰＬＣ分析で得たクロマトグラムから「エーテルリン脂質量／特定の脂質成分量」の比を算出し、この比を用いてエーテルリン脂質量を比較する場合、「エタノールアミンエーテルリン脂質量／ホスファチジルエタノールアミン量」を比較することが好ましい。
なお、「エタノールアミンエーテルリン脂質量／ホスファチジルエタノールアミン量」比は、健常な被験体（特に健常ヒト）では０．８５〜０．９程度であるのに対し、前記疾患の発症リスクが高い被験体（特に発症患者）では０．７以下程度（０．７〜０．５程度）となる。
発症患者の「エタノールアミンエーテルリン脂質量／ホスファチジルエタノールアミン量」比値は、健常者の当該比値の９０％以下（好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下）ともいえる。
よって、当該比値を比較する場合、被験体の血清ないし血漿の当該比値が、健常な被験体の血清ないし血漿の当該比の９０％以下（好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下）になったときに、被験体は前記疾患の発症リスクが高いと判定することができると考えられる。
【００５６】
さらに、この発明においては、前記被験体の血清又は血漿を加水分解処理することによって得られた加水分解処理血清又は血漿を用いて、これに含まれているエーテルリン脂質を、酵素法（発色法）によって定量することができる。
【００５７】
具体的には、前記被験体の血清又は血漿を加水分解処理、好ましくはＰＬＡ１で処理すると、血清又は血漿中のエーテルリン脂質とリゾリン脂質とスフィンゴミエリンは分解されずに残り、これら以外のリン脂質は分解される。
この処理液を、さらにホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）で処理すると、ＰＬＤは処理液中のリゾリン脂質とスフィンゴミエリンには作用しないが、エーテルリン脂質（ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリン）には作用するので、エタノールアミン及びコリンが放出される。
前記処理液を、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）に代えて、ホスファチジルコリン特異性ＰＬＤ（phosphatidylcholine specific PLD）で処理すると、ホスファチジルコリン特異性ＰＬＤは、処理液中のリゾリン脂質とスフィンゴミエリンには作用しないが、ホスファチジルコリンには作用するので、コリンが放出される。
【００５８】
得られたエタノールアミンについては、アミンオキシダーゼを用いて、コリンについては、コリンオキシダーゼを用いて処理を行った後、ペルオキシダーゼで処理すると発色が得られるので、分光光度計（例えば、プレートリーダーや、自動分析装置）を用いて測定を行うことができる。
なお、前記分光光度計による測定の際の波長については、一定の波長であればよいが、例えば、４５０〜６００ｎｍの範囲が選択される。
【００５９】
これにより得られる一定の波長における発色度が、脂質成分の量を表す。
精製されたエーテルリン脂質は、入手困難であることが多い。
したがって、精製されたコリン脂質およびエタノールアミンリン脂質を用いて、それぞれの検量線を作成して、エタノールアミンエーテルリン脂質およびコリンエーテルリン脂質の定量ができる。
【００６０】
すなわち、この発明においては、
血清又は血漿サンプル中に含まれるエタノールアミンエーテルリン脂質又はコリンエーテルリン脂質を定量する方法であって、
ヘ．被験体の血清又は血漿を加水分解処理した後、ホスホリパーゼＤ又はホスファチジルコリン特異性ＰＬＤによる処理をする工程；
並びに
ト．前記工程ヘ．で得られた処理液を、アミンオキシダーゼ若しくはコリンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼによる処理をした後、分光光度計による測定に付す工程
を含むこと
を特徴とするエタノールアミンエーテルリン脂質又はコリンエーテルリン脂質の定量方法
を提供できる。
【００６１】
なお、ＰＬＤもしくはホスファチジルコリン特異性ＰＬＤによる処理の前に血清又は血漿中に存在している遊離アミンを除去してもよい。
【００６２】
また、前記ＰＬＤもしくはホスファチジルコリン特異性ＰＬＤによる処理、ならびにアミンオキシダーゼ若しくはコリンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼによる処理を、適当な界面活性剤の存在下で行うことができる。
前記界面活性剤としては、好ましくは非イオン系界面活性剤、より好ましくはポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルが選択される。
例えば、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を使用することができる。
前記界面活性剤の使用量については、例えば、０．０１〜１０質量％である。
【００６３】
さらに、前記ＰＬＤもしくはホスファチジルコリン特異性ＰＬＤによる処理、ならびにアミンオキシダーゼ若しくはコリンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼによる処理を、適当なバッファーで調整して行うことができる。
前記バッファーとしては、例えばトリス−塩酸緩衝液、具体的には５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）が選択される。
【００６４】
なお、この発明においては、前記と同様にして、前記エタノールアミンエーテルリン脂質又はコリンエーテルリン脂質の定量方法を用いて測定した、エタノールアミンエーテルリン脂質又はコリンエーテルリン脂質の量を、健常な被験体のエタノールアミンエーテルリン脂質又はコリンエーテルリン脂質の量と比較することによって、エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する、疾患の発症リスクを判定することができる。
【００６５】
すなわち、この発明においては、エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する疾患の、発症リスクを判定するための検査方法であって、下記工程を含む検査方法を提供することができる。
チ．請求項６に記載のエタノールアミンエーテルリン脂質又はコリンエーテルリン脂質の定量方法により、被験体の血清又は血漿サンプル中に含まれるエタノールアミンエーテルリン脂質又はコリンエーテルリン脂質を定量する工程
並びに
リ．前記工程チ．で測定した被験体のエタノールアミンエーテルリン脂質量又はコリンエーテルリン脂質量と、健常な被験体のエタノールアミンエーテルリン脂質量又はコリンエーテルリン脂質量とを比較する工程。
なお、この検査方法は、前記説明に基づいて容易に実施することができる。
【００６６】
この発明は、血清又は血漿中に含まれるエーテルリン脂質からなる、エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する、疾患の検出用バイオマーカーも包含する。
前記疾患の検出用バイオマーカーとは、前記疾患の発症を判定又は診断する指標となる生体分子をいう。
なお、生体中に存在するエーテルリン脂質ではなく、生体から単離された血清又は血漿に含有されるエーテルリン脂質が、前記疾患検出用バイオマーカーとして使用される。
よって、この発明のバイオマーカーは、血清又は血漿から抽出されたエーテルリン脂質からなる前記疾患の検出用バイオマーカーともいえる。
【００６７】
この発明のバイオマーカーは、前記疾患を患った被験体において、健常な被験体に比べエーテルリン脂質の量が減少するという特徴を有する。
よって、被験体および健常な被験体から当該バイオマーカーをそれぞれ単離して、その量を測定し、比較して、被験体の方が少ない場合には、被験体が前記疾患を患っていると診断することができる。
【００６８】
なお、前記疾患の検出用バイオマーカーとしては、エーテルリン脂質の中でも、エタノールアミンエーテルリン脂質又はコリンエーテルリン脂質が好ましい。
したがって、この発明には、血清又は血漿に含有されるエタノールアミンエーテルリン脂質又はコリンエーテルリン脂質からなる、前記疾患の検出用バイオマーカーが好ましく包含される。
この発明のバイオマーカーは、前記説明に基づいて容易に実施することができる。
【００６９】
この発明は、エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する疾患の発症リスクを検査するための検査用キットも包含する。
【００７０】
この発明のキットには、血清ないし血漿に含まれるエーテルリン脂質量を測定するために有用な試薬と、脂質抽出用有機溶媒（血清又は血漿を加水分解処理した後、脂質を抽出するために有用な有機溶媒）が備えられる。
【００７１】
前記試薬としては、血清又は血漿の加水分解処理に使用する試薬、具体的には、血清又は血漿に含まれる脂質の加水分解のための試薬や、血清又は血漿を加水分解処理した後、エタノールアミン又はコリンを生成するために有用な試薬が例示される。
より具体的には、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）や、その溶媒（例えば０．１Ｍクエン酸緩衝溶液）、ホスホリパーゼＤもしくはホスファチジルコリン特異性ＰＬＤなどが挙げられる。
前記脂質抽出用有機溶媒としては、メタノール、クロロホルム、クロロホルム／メタノール（好ましくは２：１）液などが例示される。
【００７２】
前記キットには、採血用シリンジや採血用チューブなどの採血用器具、さらに、ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１）、イソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１）、トリエチルアミンなどのＨＰＬＣ分析用の溶媒や、アミンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼなどの分光光度計による分析およびそのための発色用の試薬が備えられていてもよい。
【００７３】
なお、この発明のキットは、前記説明に基づいて容易に実施することができる。
【実施例】
【００７４】
以下に、実施例を挙げてこの発明を詳細に説明するが、この発明はこれら実施例により制限されることはない。
【００７５】
実施例１；血漿中のエーテルリン脂質の定量
１）血液採取
注射器を用いて静脈血を採取した。
採取した血液には、抗凝固剤としてＥＤＴＡ−Ｎａ（エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム塩）を加えた。これをヒト血液サンプルとした。
【００７６】
２）血漿の調製
得られた血液サンプルを１０００×ｇ，５分間遠心して、上清（すなわち血漿）を回収した。
【００７７】
３）血漿サンプルの調製
ａ．血漿５０μＬをエッペンドルフチューブに入れた。
ｂ．ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａｅ由来，三菱化学フーズ（株）製）を２５％含有した粉末を、０．１Ｍ  クエン酸（ｐＨ４．５）に濃度２００ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解させて、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）溶液を得た。
ｃ．得られたホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）溶液１５０μＬを、血漿に加えて、よく混和し、温度５０℃で１時間反応させた。
ｄ．さらに、クロロホルム／メタノール（２：１）０．５ｍＬを加え、１分間激しく混和した後、１０分間室温に置いた。
ｅ．これを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。
ｆ．クロロホルム層を、別のガラススピッツに回収した。
ｇ．回収したクロロホルム層を、窒素ガスで乾燥して血漿サンプルとし、これを温度−３０℃に保存した。
【００７８】
４）血漿サンプルの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）解析
得られた血漿サンプルを、ヘキサン／イソプロパノール（３：２）２００μＬに再溶解した。
得られた血漿サンプル１０μＬをＨＰＬＣに注入し、下記条件でＨＰＬＣ解析を行った。
その結果を図１に示す。
【００７９】
＜高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の条件＞
使用機器：ＨＰＬＣ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ）
カラム  ：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ  １００  ＤＩＯＬ  （２５０×３ｍｍ，５μｍ）
（メルク，Ｔｏｋｙｏ）
流  量  ：０．４ｍｌ／分
カラム温度：５０℃
検  出  ：蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）（１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＥＬＳＤ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）  Ｇａｉｎ  ５，Ｎ２ガス流量  ０．９９ＬＳＭ，エバポレーター温度  ６０℃
移動相  ：
（Ａ）ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１，ｖ／ｖ，＋０．０８％トリエチルアミン）
（Ｂ）イソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１，ｖ／ｖ，＋０．０８％トリエチルアミン）
なお、時間帯と移動相（Ａ）と（Ｂ）の液組成を、表１に示す。
【００８０】
【表１】
0006399294.tif 000004
【００８１】
図１から、ヒト血漿をＰＬＡ１で直接処理すると、ジアシルリン脂質（ａｃｙｌ  ＰＥ，ａｃｙｌ  ＰＣ，ａｃｙｌ  ＰＩ）が完全に分解されることが分かった。
したがって、ＰＬＡ１処理後、ＨＰＬＣ解析においては、エーテルリン脂質はいずれも独立したピークとして認められ、定量が明確になる。
一方、図２は、血漿中の総リン脂質を示すＨＰＬＣチャートである。
ヒト血漿中に含まれるエタノールアミンリン脂質及びエーテル型コリン脂質は微量である。
図２から、総脂質（未処理のもの）を上記同様のＨＰＬＣ法で分析した場合、ジアシル型リン脂質とエーテル型リン脂質の分離は、不完全であることが分かる。
よって、この発明によれば、血清や血漿中に微量に含まれているエーテルリン脂質を、高い精度で簡便に、しかも安価に定量することができることは明らかである。
【００８２】
なお、図３は、ホスホリパーゼＡ１処理および塩酸処理した血漿の、総リン脂質を示すＨＰＬＣチャートである。
リン脂質を塩酸処理すると、アルケニルリン脂質（プラズマローゲン）は分解されるが、アシルリン脂質とアルキルリン脂質は分解されない。
図３から、ヒト血漿のコリンを持つエーテルリン脂質には、アルキルアシルリン脂質（ａｌｋｙｌ  ＰＣ）が約５０％含まれていることが示された。
さらに、図１及び３の結果を考慮すると、ヒト血漿ないし血清におけるリン脂質の構成は、ジアシルコリンリン脂質（ａｃｙｌ  ＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ−1，ＳＭ−2）リゾコリンリン脂質（ＬＰＣ）、ジアシルエタノールアミンリン脂質（ａｃｙｌ  ＰＥ）、ジアシルイノシトールリン脂質（ａｃｙｌ  ＰＩ）、並びにエーテルリン脂質である、アルケニルアシルエタノールアミンリン脂質（ａｌｋｅｎｙｌ  ＰＥ）、アルケニルアシル及びアルキルアシルコリンリン脂質（ａｌｋｅｎｙｌ  ＰＣ，ａｌｋｙｌ  ＰＣ）であ
ることが分かった（図２）。
【００８３】
実施例２；ヒト血漿のＨＰＬＣ−ＭＳ解析
ヒト血漿を、前記同様、ＰＬＡ１で処理した後、脂質を抽出し、ＨＰＬＣに注入し、そのまま直接マススペクトロメーター（ＭＳ）に連結して、エーテルリン脂質を測定した。
その際、ＨＰＬＣとしては、前記同様、ＨＰＬＣ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ）を用いた。
また、ＨＰＬＣの条件については、カラムとしてＡｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＨＩＬＬＩＣ  １５０×２．１ｍｍ（２．７μｍ）（Ｓｉｇｍａ，Ｔｏｋｙｏ）を用い、移動相（Ａ）；アセトニトリル、移動相（Ｂ）１．０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３（ギ酸で調整））、流量０．２ｍＬ／分としたことを除いて、前記同様とした。
ＭＳとしては、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６１３０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ）を用いた。
その結果を、図４に示す。
【００８４】
図４においては、ＰＬＡ１の作用によって、ジアシル型リン脂質は完全に分解されていることが分かる。
したがって、各リン脂質の相互分離が可能なＨＰＬＣであれば、特定のカラムや移動相に限定されず利用できることは明らかである。
しかも、ＨＰＬＣをマススペクトロメトリーに直接連結して、マススペクトロメトリーによる血清ないし血漿中のエーテルリン脂質の分析を行うことができることも明らかである。
【００８５】
実施例３；血漿中のエタノールアミンエーテルリン脂質の定量
１）血液採取
注射器を用いて静脈血を採取した。
採取した血液には、抗凝固剤としてＥＤＴＡ−Ｎａ（エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム塩）を加えた。これをヒト血液サンプルとした。
【００８６】
２）血漿の調製
得られた血液サンプルを１，０００×ｇ，５分間遠心して、上清（すなわち血漿）を回収した。
【００８７】
３）各反応液の調製
３−１）反応液１の調製
下記表２に示される成分を混合し、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で調整して、反応液１を得た。
【００８８】
【表２】
0006399294.tif 000005
【００８９】
３−２）反応液２の調製
下記表３に示される成分を混合し、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で調整して、反応液２を得た。
【００９０】
【表３】
0006399294.tif 000006
【００９１】
４）血漿サンプルの分光光度計（プレートリーダー）による解析
ａ．血漿３０μＬをプレートリーダーのウェル（ｗｅｌｌ）に入れた。
ｂ．５０％ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）溶液（シグマ社製）１０μＬを、血漿に加えた。
ｃ．温度５０℃で１時間反応させた。
ｄ．室温に冷却後、反応液１を１００μＬ加えて、温度３７℃で１０分間置き、血漿中に存在している遊離アミンを除いた。
ｅ．さらに、反応液２を５０μＬ加えて、温度３７℃で５分間置いた。
ｆ．波長５４０〜６００ｎｍで測定した。
【００９２】
実施例４；血漿中のコリンエーテルリン脂質の定量
１）血液採取及び血漿の調製
実施例３と同様の方法によって血液採取及び血漿の調製を行った。
【００９３】
２）各反応液の調製
２−１）反応液１の調製
下記表４に示される成分を混合し、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で調整して、反応液１を得た。
【００９４】
【表４】
0006399294.tif 000007
【００９５】
２−２）反応液２の調製
下記表５に示される成分を混合し、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で調整して、反応液２を得た。
【００９６】
【表５】
0006399294.tif 000008
【００９７】
３）血漿サンプルの分光光度計（プレートリーダー）による解析
ａ．血漿３０μＬをプレートリーダーのウェル（ｗｅｌｌ）に入れた。
ｂ．５０％ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）溶液（シグマ社製）１０μＬを、血漿に加えた。
ｃ．温度５０℃で１時間反応させた。
ｄ．室温に冷却後、反応液１を１００μＬ加えて、温度３７℃で１０分間置き、血漿中に存在している遊離アミンを除いた。
ｅ．さらに、反応液２を５０μＬ加えて、温度３７℃で５分間置いた。
ｆ．波長５４０〜６００ｎｍで測定した。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
この発明によれば、血清や血漿中に少量しか含まれていないエーテルリン脂質を、高い精度で簡便に、しかも安価に定量することが可能となる。
さらに、このような定量方法を用いて、認知症、うつ病、脳疲労、不眠症、パーキンソン病、メタボリック症候群、糖尿病又は動脈硬化などの、エーテルリン脂質量の減少と密接に関連する疾患の発症リスクを、判定ないし予測することが可能となるので、医薬業界において幅広く利用されるものである。
【図１】
0006399294.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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