(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験物質と微生物（６）との反応を測定する方法であって、前記方法は、
流体デバイス（１）の培養室（１０）に配置される三次元（３Ｄ）培養マトリックス（２）中で前記微生物（６）の培養を提供するステップ（Ｓ１）であって、
前記流体デバイス（１）が、前記培養室（１０）の第１の端部（１２）と隣接する第１の流体チャネル（２０）と、及び前記培養室（１０）の第２の異なる端部（１４）と隣接する第２の流体チャネル（３０）と、を有する、
ステップ（Ｓ１）と、
第１の濃度で前記試験物質を含有する第１の流体の流れに、前記第１の流体チャネル（２０）の入力（２２）を接続するステップ（Ｓ２）と、
前記試験物質を欠くか、或いは前記第１の濃度よりも低濃度の第２の濃度で前記試験物質を含有する第２の流体の流れに、前記第２の流体チャネル（３０）の入力（３２）を接続して、前記３Ｄ培養マトリックス（２）の少なくとも一部に渡って前記試験物質の濃度勾配を形成するステップ（Ｓ３）と、及び
前記３Ｄ培養マトリックスにおける任意の境界領域（５）のうち、前記第１の端部（１２）及び／又は前記第２の異なる端部（１４）に関連する位置に基づき、且つ、前記境界領域（５）の幅に基づき、前記試験物質と前記微生物（６）との反応を測定するステップ（Ｓ４）であって、
前記境界領域（５）が、前記微生物（６）が前記試験物質と第１の反応を示す第１の反応領域（３）と、前記微生物（６）が前記試験物質と第２の異なる反応を示す第２の反応領域（４）と、の間に存在する、ステップ（Ｓ４）と、
を備える、方法。
【請求項２】
前記反応を測定するステップ（Ｓ４）は、
前記３Ｄ培養マトリックス（２）における前記任意の境界領域（５）のうち、前記第１の端部（１２）及び／又は前記第２の異なる端部（１４）に関連する前記位置に基づき、前記境界領域（５）の前記幅に基づき且つ前記境界領域（５）の形状に基づき、前記物質に対する前記微生物（６）の前記応答を測定すること、を更に含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（Ｓ２）が、
前記第１の濃度の前記試験物質を含有する第１の流体を含む第１の流体貯蔵部（２６）に対し、前記第１の流体チャネル（２０）の前記入力（２２）を接続するステップ（Ｓ１０）と、及び
前記第１の流体貯蔵部（２６）から前記第１の流体チャネル（２０）の前記入力（２２）へ前記第１の流体をポンピングし、前記第１の流体チャネル（２０）の出力（２４）を通して出力するステップ（Ｓ１１）と、を含み、並びに
前記ステップ（Ｓ３）が、
前記試験物質を欠くか、或いは前記第２の濃度で前記試験物質を含有する第２の流体を含む、第２の流体貯蔵部（３６）に対し、前記第２の流体チャネル（３０）の前記入力（３２）を接続するステップ（Ｓ１２）と、及び
前記第２の流体貯蔵部（３６）から前記第２の流体チャネル（３０）の前記入力（３２）へ前記第２の流体をポンピングし、前記第２の流体チャネル（３０）の出力（３４）を通して出力するステップ（Ｓ１３）と、を含む、
請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、
前記３Ｄ培養マトリックス（２）の少なくとも１つの画像を撮像するステップ（Ｓ２１）と、及び
前記少なくとも１つの画像において前記境界領域（５）を識別するステップ（Ｓ２２）であって、
前記ステップ（Ｓ４）が、前記少なくとも１つの画像において識別された前記境界領域（５）のうち、前記第１の端部（１２）及び／又は前記第２の異なる端部（１４）に関連する前記位置に基づき、且つ前記境界領域（５）の前記幅に基づき、前記試験物質に対する前記微生物（６）の前記反応を測定することを含む、ステップ（Ｓ２２）と、
を更に備える、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（Ｓ２１）が、明視野顕微鏡または位相差顕微鏡（６８）を使用して、前記３Ｄ培養マトリックス（２）の前記少なくとも１つの画像を撮像することを含み、且つ
前記ステップ（Ｓ２２）が、前記少なくとも１つの画像において検出された光強度に基づき、前記境界領域（５）を識別するように構成されたコンピュータ（６２）によって前記少なくとも１つの画像を処理すること、を含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、
前記微生物（６）に結合するように、または前記微生物（６）によって吸収されるように構成された少なくとも１つの蛍光性のラベルを前記３Ｄ培養マトリックス（２）に加えるステップ（Ｓ２０）を更に含み、
前記ステップ（Ｓ２１）が、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡（６８）を使用して、前記３Ｄ培養マトリックス（２）の前記少なくとも１つの画像を撮像すること、を含み、且つ、
前記ステップ（Ｓ２２）が、前記少なくとも１つの画像において検出された蛍光に基づいて、前記境界領域（５）を識別するように構成されたコンピュータ（６２）によって前記少なくとも１つの画像を処理すること、を含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（Ｓ２１）が、前記３Ｄ培養マトリックス（２）の少なくとも一部の上の前記試験物質の定常状態の濃度勾配の少なくとも形成後に、前記微生物（６）の前記培養物を有する前記３Ｄ培養マトリックス（２）の前記少なくとも１つ画像を撮像すること、を含む、
請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、前記第１の流体の流れから前記３Ｄ培養マトリックス（２）を通過する前記第１の流体または第２の流体の流れを実質的に含んでいない前記３Ｄ培養マトリックス（２）の中への前記試験物質の拡散によって、前記３Ｄ培養マトリックス（２）の前記少なくとも一部の上に前記濃度勾配を設定するステップ（Ｓ３０）を更に含む、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（Ｓ２）が、前記第１の濃度の第１の試験物質を含み、且つ、第２の試験物質を含まないかまたは第３の濃度の前記第２の試験物質を含む前記第１の流体の流れに、前記第１の流体チャネル（２０）の前記入力（２２）を接続すること、を含み、
前記ステップ（Ｓ３）が、前記第１の試験物質の第１の濃度勾配及び前記第２の試験物質の第２の濃度勾配を前記３Ｄ培養マトリックス（２）の前記少なくとも一部の上に形成するために、前記第１の試験物質を含まないかまたは前記第２の濃度の前記第１の試験物質を含み、且つ、前記第３の濃度より高い第４の濃度の前記第２の試験物質を含む前記第２の流体の流れに、前記第２の流体チャネル（３０）の前記入力（３２）を接続すること、を含み、且つ
前記ステップ（Ｓ４）が、前記微生物（６）が前記第１の試験物質及び前記第２の試験物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域（３）と、前記微生物（６）が前記第１の試験物質及び前記第２の試験物質に対して第２の異なる反応を示すそれぞれの第２の反応領域（４）との間の前記３Ｄ培養マトリックス（２）における任意の境界領域（５）のうち、前記第１の端部（１２）及び／または前記第２の異なる端部（１４）に関連するそれぞれの位置に基づき、且つ、前記境界領域（５）の前記幅に基づき、前記第１の試験物質及び前記第２の試験物質に対する前記微生物（６）の反応を測定すること、を含む、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（Ｓ２）が、前記第１の濃度の第１の試験物質を含み、且つ、第３の濃度の第２の試験物質を含む前記第１の流体の流れに、前記第１の流体チャネル（２０）の前記入力（２２）を接続すること、を含み、
前記ステップ（Ｓ３）が、前記３Ｄ培養マトリックス（２）の前記少なくとも一部の上に前記第１の試験物質の第１の濃度勾配及び前記第２の試験物質の第２の濃度勾配を形成するために、前記第１の試験物質を含まないかまたは前記第２の濃度の前記第１の試験物質を含み、且つ、前記第２の試験物質を含まないかまたは前記第３の濃度よりも低い第４の濃度の前記第２の試験物質を含む前記第２の流体の流れに、前記第２の流体チャネル（３０）の前記入力（３２）を接続すること、を含み、且つ
前記ステップ（Ｓ４）が、前記微生物（６）が前記混合物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域（３）と、前記微生物（６）が前記混合物質に対して第２の異なる反応を示す第２の反応領域（４）との間の前記３Ｄ培養マトリックス（２）における任意の境界領域（５）のうち、前記第１の端部（１２）及び／または前記第２の異なる端部（１４）に関連する位置に基づき、且つ前記境界領域（５）の前記幅に基づき、前記第１の試験物質及び前記第２の試験物質の混合物質に対する前記微生物（６）の反応を測定すること、を含む、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法において、
前記培養室（１０）は、前記培養室（１０）の第３の端部（１６）に隣接する第３の流体チャネル（４０）及び前記培養室（１０）の第４の異なる端部（１８）に隣接する第４の流体チャネル（５０）を備え、前記試験物質は第１の試験物質であり、
前記方法は、
第３の濃度の第２の試験物質を含む第３の流体の流れに、前記第３の流体チャネル（４０）の入力を接続することと、
前記３Ｄ培養マトリックス（２）の少なくとも一部の上に前記第２の試験物質の濃度勾配を形成するために、前記第２の試験物質を含まないかまたは前記第３の濃度より低い第４の濃度の前記第２の試験物質を含む第４の流体の流れに、前記第４の流体チャネル（５０）の入力を接続することと、及び
前記微生物（６）が前記第２の試験物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域（３）と、前記微生物（６）が前記第２の試験物質に対して第２の異なる反応を示す第２の反応領域（４）との間の前記３Ｄ培養マトリックス（２）における任意の境界領域（５）のうち、第３の端部及び／または第４の異なる端部に関連する位置に基づき、且つ前記境界領域（５）の前記幅に基づき、前記第２の試験物質に対する前記微生物（６）の反応を測定することと、
を更に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（４）が、微生物（６）を成長させる成長領域（４）と前記微生物（６）の成長を欠いている非成長領域（３）との間の前記３Ｄ培養マトリックス（２）における任意の境界領域（５）のうち、前記第１の端部（１２）及び／または前記第２の異なる端部（１４）に関連する位置に基づき、前記試験物質に対する前記微生物（６）の感受性を測定すること、を含み、 前記方法が、
前記境界領域（５）の幅に基づき、前記試験物質に対する前記微生物（６）の耐性を測定するステップ（Ｓ４０）を更に含む、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、
前記３Ｄ培養マトリックスの少なくとも１つの画像を撮像するステップ（Ｓ２１）と、
前記少なくとも１つの画像において検出された光強度に基づいて、前記境界領域（５）を識別するように構成されたコンピュータ（６２）によって前記少なくとも１つの画像を処理することにより、前記少なくとも１つの画像における前記境界領域（５）を識別するステップ（Ｓ２２）と、
前記３Ｄ培養マトリックス（２）において、前記第１の端部（１２）と前記第２の異なる端部（１４）との間の位置に対する前記検出光強度の関係を測定するステップ（Ｓ５０）と、及び
前記関係に基づいて、前記微生物（６）に対する前記試験物質の最小抑制濃度、ＭＩＣを測定するステップ（Ｓ５１）と、
を更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試験物質に対する微生物（６）の反応を測定するシステム（６０）であって、前記システム（６０）は、
三次元の３Ｄ培養マトリックス（２）において前記微生物（６）の培養物を収容するように構成された培養室（１０）、
前記培養室（１０）の第１の端部（１２）に隣接する第１の流体チャネル（２０）、及び、
前記培養室（１０）の第２の異なる端部（１４）に隣接する第２の流体チャネル（３０）、
を備えた流体デバイス（１）と、
第１の濃度の前記試験物質を含む第１の流体を有するとともに、前記第１の流体チャネル（２０）の入力（２２）に接続されるように構成された第１の流体貯蔵部（２６）と、
前記３Ｄ培養マトリックス（２）の少なくとも一部の上に前記試験物質の濃度勾配を形成するために、前記試験物質を含まないかまたは前記第１の濃度より低い第２の濃度の前記試験物質を含む第２の流体を有するとともに、前記第２の流体チャネル（３０）の入力（３２）に接続されるように構成された第２の流体貯蔵部（３６）と、及び、
ｉ）前記３Ｄ培養マトリックス（２）の少なくとも１つの画像を撮像するように構成され、ｉｉ）前記微生物（６）が前記試験物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域（３）と、前記微生物（６）が前記試験物質に対して第２の異なる反応を示す第２の反応領域（４）との間の前記３Ｄ培養マトリックス（２）における任意の境界領域（５）のうち、前記第１の端部（１２）及び／または前記第２の異なる端部（１４）に関連する位置を識別するために前記少なくとも１つの画像を処理するように構成され、且つ、ｉｉｉ）前記任意の境界領域（５）の前記位置に基づき、且つ前記境界領域（５）の前記幅に基づき、前記試験物質に対する前記微生物（６）の反応を測定するように構成されたコンピュータ・ベースのシステム（６２、６６）と、
を備える、システム。
【請求項１５】
試験物質に対する微生物（６）の反応を測定する流体デバイス（１）の使用であって、前記流体デバイス（１）は、
三次元の３Ｄ培養マトリックス（２）において前記微生物（６）の培養物を収容するように構成された培養室（１０）と、
前記培養室（１０）の第１の端部（１２）に隣接するとともに、第１の濃度の前記試験物質を含む第１の流体の流れを運ぶように構成された第１の流体チャネル（２０）と、及び、
前記３Ｄ培養マトリックス（２）の少なくとも一部の上に前記試験物質の濃度勾配を形成するために、前記培養室（１０）の第２の異なる端部（１４）に隣接するとともに、前記試験物質を含まないかまたは前記第１の濃度より低い第２の濃度の前記試験物質を含む第２の流体の流れを運ぶように構成された第２の流体チャネル（３０）と、
を備え、
前記使用は、前記微生物（６）が前記試験物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域（３）と、前記微生物（６）が前記試験物質に対して第２の異なる反応を示す第２の反応領域（４）との間の前記３Ｄ培養マトリックス（２）における任意の境界領域（５）のうち、前記第１の端部（１２）及び／または前記第２の異なる端部（１４）に関連する位置に基づき、且つ前記境界領域（５）の前記幅に基づき前記試験物質に対する前記微生物（６）の前記反応を測定すること、
を含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
実施形態は、一般的には流体デバイスに関し、特に、試験物質に対する微生物の反応を測定する際に、そのような流体デバイスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質に対する耐性菌は、抗生物質によってこれらの細菌が死滅されまたは分裂を停止することができないので、地球規模の問題が増大していることを表している。細菌の世代交代時間は多くの場合非常に速くなることがあり（約２０分）、細菌の短い世代交代時間及び相対的な遺伝的不安定性のために、細菌は迅速に抗生物質への耐性を得る。抗生物質に対する耐性菌の感染の罹患率は人間母集団の中で増加しており、これらの細菌のうちのいくつかは多重耐性にさえなってきており、ときには、それらの成長を停止させることができる効率的な抗生物質がないことを意味している。
【０００３】
細菌、菌類、寄生虫及びウィルスを含むがこれらに限定されない微生物の識別及び研究のための従来のアプローチ、及び、その微生物の成長を殺すかまたは抑制する抗生物質に対するそれらの耐性のための従来のアプローチは、主に細菌の例において、ルリア培養液（ＬＢ）寒天プレートに制限されていた。その後、これらのＬＢ寒天プレートは確定濃度の殺菌性及び静菌性の抗生物質を含むように作成された。抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）及び微生物に対する抗生物質あるいは他の試験物質の効果を評価するためのそのような二次元の（２Ｄ）培養方法には、様々な制限がある。例えば、特定の細菌株が所定の抗生物質に対して耐性を有するかどうかを示すことを読み取れる明確な結果を見込むために、微生物、例えば細菌は夜間を通じて培養されることが、通常これらの準備に要求される。さらに、一般的には、ＬＢ寒天プレートごとには単一の抗生物質の濃度だけしか試験することができない。
【０００４】
別の先行技術のＡＳＴアプローチはいわゆるＥ試験を使用する。Ｅ試験は、基本的には寒天拡散法であり、抗生物質としてその効果について評価される試験物質の異なる濃度がしみ込んだ長方形のストリップを使用する。典型的なアプローチでは、Ｅ試験ストリップが寒天プレートの上に置かれた後、細菌は寒天プレートの上で２Ｄ培養の中で拡散され且つ成長される。Ｅ試験ストリップは、拡散によって試験物質を放出し、放出された試験物質の成長抑制効果は２４時間の定温培養の後に多くの場合検査される。このアプローチの制限は、非常に長い定温培養時間に加えて、試験物質の抑制濃度の読み出しが、別個のディジタルステップ及びＥ試験ストリップにおいて使用される選択された濃度の中ででしか可能でないことである。
【０００５】
さらに従来のＡＳＴアプローチは、異なるウェルの中で試験物質の異なる濃度を有するマイクロタイタプレート分析を使用する。追加細菌を備えたマイクロタイタプレートは、通常、夜間を通じて培養され、細菌に対する抑制効果は異なるウェルの中で光学的な濁り度を測定することにより評価される。このアプローチは、基本的にはＥ試験ストリップを使用した場合と同様の欠点を有する。
【０００６】
ＡＳＴ時間を短縮するために、迅速なＡＳＴ（ＲＡＳＴ）のためのミクロ流体チャネルシステムが開発されている。そのようなＲＡＳＴアプローチは、細菌が抗生物質を含んでいる小滴の中で取得される小滴ベースのミクロ流体チャネルシステムを有する［非特許文献１〜３］。小滴ベース・システムの制限は、単一の抗生物質の濃度だけしか試験できないことである。他のＲＡＳＴアプローチには、ガス浸透性のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）微小チャネルを使用すること［非特許文献４］、ミクロ流体の電極構造における細菌の誘電泳動で取得すること［非特許文献５〜６］、抗生物質を有するＰＤＭＳ層をプレロードすること［非特許文献７］、ミクロ流体チャネルに細菌を共有結合すること及びそれらを機械的な剪断応力にかけること［非特許文献８］、または、非同期磁気ビード回転（ＡＭＢＲ）バイオセンサを使用すること［非特許文献９］、またはミクロ流体のアガロースチャネルシステムにおける単細胞成長を追跡すること［非特許文献１０］が含まれる。これらの様々なＲＡＳＴアプローチの主な制限は、それらが単一抗生物質の濃度あるいは１組の少数の選択された抗生物質の濃度だけしか試験できないことである。
【０００７】
さらに、細菌のバイオフィルムの抗生物質の感受性の分析のためにミクロ流体のシステムを使用することが提案された［非特許文献１１］。しかしながら、それらミクロ流体のシステムは、２４時間の定温培養及び試験される細菌が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を表現できるプラスミドを含んでいることが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ  ２０１０／０５６１８６
【特許文献２】ＷＯ  ２０１２／０３３４３９
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｏｅｄｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，  ２００８，  ８：１２６５−１２７２
【非特許文献２】Ｃｈｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，  ２０１２，  １２：１６２９−１６３７
【非特許文献３】Ｅｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１０，  ６：２６０−２６６
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１０，  ８２：１０１２−１０１９
【非特許文献５】Ｐｅｉｔｚ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ，  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，  ２０１０，  １０：２９４４−２９５１
【非特許文献６】Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍｉｃｒｏｌｕｉｄｉｃｓ，  ２０１１  ，  ５：０２１１０２
【非特許文献７】Ｃｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，  ２０１２，  １２：１０５２−１０５９
【非特許文献８】Ｋａｌａｓｈｎｉｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，  ２０１２，  １２：４５２３−４５３２
【非特許文献９】Ｋｉｎｎｕｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｍａｌｌ，  ２０１２，  ８：２４７７−２４８２
【非特許文献１０】Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，  ２０１３，  １３：２８０−２８７
【非特許文献１１】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，  ２０１０，  １０：３２９６−３２９９
【非特許文献１２】Ｈａｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，  ２００９，  １１  ：８２７−８３５
【非特許文献１３】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，  ２０１２，  １２：２２５５−２２６４
【非特許文献１４】Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ２０１３，  １１０：６７１２−６７１７
【非特許文献１５】Ｆｒｉｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２００７，  ２８：４７０５−４７１２
【非特許文献１６】Ｈｕｍｐｈｒｅｊｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｒｃｒｏｂｉｏｌ，  １９５２，  ７：２９−１４３
【非特許文献１７】Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，  ２０１４，  Ａｃｃｅｐｔｅｄ  ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ，  ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ４ＬＣ００４５１Ｅ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、先行技術の欠点を解消する微生物の反応試験のための迅速な方法及びシステムがなおも必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
試験物質に対する微生物の反応の効率的で迅速な測定を可能にすることが一般的な目的である。
【００１２】
この目的及び他の目的は、この明細書に定義されるような実施形態によって達成される。
【００１３】
実施形態のある態様は、試験物質に対する微生物の反応を測定する方法に関する。その方法は、培養室の第１の端部に隣接する第１の流体チャネル及び培養室の第２の異なる端部に隣接する第２の流体チャネルを有する流体デバイスの培養室に配置された三次元（３Ｄ）培養マトリックスにおける微生物の培養を実現することを含む。その方法はまた、第１の濃度の試験物質を含む第１の流体の流れに第１の流体チャネルの入力を接続することを含む。その方法はさらに、試験物質を含まないかまたは３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に試験物質の濃度勾配を形成するために第１の濃度よりも低い第２の濃度の試験物質を含む第２の流体の流れに第２の流体チャネルの入力を接続することを含む。その方法はさらにまた、第１の端部及び／または第２の異なる端部に関連する３Ｄ培養マトリックスにおける任意の境界領域の位置に基づいて、試験物質に対する微生物の反応を測定することを含む。境界領域は、微生物が試験物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域と、微生物が試験物質に対して第２の異なる反応を示す第２の反応領域の間に存在する。
【００１４】
実施形態の他の態様は、試験物質に対する微生物の反応を測定するシステムに関する。そのシステムは、３Ｄ培養マトリックスにおける微生物の培養物を収容するように構成された培養室を有する流体デバイスを備えている。流体デバイスはまた、培養室の第１の端部に隣接する第１の流体チャネル及び培養室の第２の異なる端部に隣接する第２の流体チャネルを備えている。システムはさらに、第１の濃度の試験物質を含む第１の流体を有する第１の流体貯蔵部を備えている。第１の流体貯蔵部は、第１の流体チャネルの入力に接続されるように構成されている。システムはさらに、試験物質を含まないかまたは第１の濃度より低い第２の濃度の試験物質を含む第２の流体を有する第２の流体貯蔵部を備えている。第２の流体貯蔵部は、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に試験物質の濃度勾配を形成するために第２の流体チャネルの入力に接続されるように構成されている。システムはさらに、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも１つの画像を撮像するように構成され、且つ３Ｄ培養マトリックスにおける任意の境界領域のうち、第１の端部及び／または第２の異なる端部に関連する位置を識別するために少なくとも１つの画像を処理するように構成されたコンピュータ・ベースのシステムを備えている。境界領域は、微生物が試験物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域と微生物が試験物質に対して第２の異なる反応を示す第２の反応領域との間に存在する。コンピュータ・ベースのシステムはまた、境界領域の位置に基づいて試験物質に対する微生物の反応を測定するように構成されている。
【００１５】
実施形態のさらなる態様は、試験物質に対する微生物の反応を測定するための流体デバイスの使用に関する。流体デバイスは、３Ｄ培養マトリックスにおける微生物の培養物を収容するように構成された培養室を備えている。流体デバイスはまた、培養室の第１の端部に隣接し、且つ、第１の濃度の試験物質を含む第１の流体の流れを運ぶように構成された第１の流体チャネルを備えている。流体デバイスはさらに、培養室の第２の異なる端部に隣接し、且つ、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に試験物質の濃度勾配を形成するために、試験物質を含まないかまたは第１の濃度より低い第２の濃度の試験物質を含む第２の流体の流れを運ぶように構成された第２の流体チャネルを備えている。使用は、第１の端部及び／または第２の異なる端部に関連する３Ｄ培養マトリックスにおける任意の境界領域の位置に基づく試験物質に対する微生物の反応を測定することを含む。境界領域は、微生物が試験物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域と微生物が試験物質に対して第２の異なる反応を示す第２の反応領域との間に存在する。
【００１６】
実施形態の態様は、様々な試験物質に対する微生物の反応に関して非常に迅速で効率的な測定を可能にする。濃度の連続的な範囲に対する微生物の反応は、実施形態によって試験することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
さらなる目的及び利点を有する実施形態は、下記の添付図面とともに以下の説明を参照することによって非常によく理解される。
【００１８】
【図１】実施形態による試験物質に対する微生物の反応の測定方法を説明するフロー図である。
【図２】図１のステップに接続する実施形態を示すフロー図である。
【図３】実施形態による図１の方法の追加のオプションのステップを示すフロー図である。
【図４】実施形態による図１の方法の追加のオプションのステップを示すフロー図である。
【図５】実施形態による図１の方法の追加のオプションのステップを示すフロー図である。
【図６】実施形態による図３の方法の追加のオプションのステップを示すフロー図である。
【図７】図６のＭＩＣステップの測定の実施形態を示すフロー図である。
【図８】実施形態によるミクロ流体デバイス及び微生物を有する３Ｄ培養マトリックスの概要を示す概略図である。
【図９】実施形態による培養室及びミクロ流体デバイスの流体チャネルの概略図である。
【図１０】他の実施形態による培養室及びミクロ流体デバイスの流体チャネルの概略図である。
【図１１】さらなる実施形態による培養室及びミクロ流体デバイスの流体チャネルの概略図である。
【図１２】また別の実施形態による培養室及びミクロ流体デバイスの流体チャネルの概略図である。
【図１３】さらなる実施形態による培養室及びミクロ流体デバイスの流体チャネルの概略図である。
【図１４】さらに別の実施形態による培養室及びミクロ流体デバイスの流体チャネルの概略図である。
【図１５】また別の実施形態による培養室及びミクロ流体デバイスの流体チャネルの概略図である。
【図１６】３Ｄ培養マトリックスにおける濃度勾配の形成を示す時系列とともに実施形態による試験物質に対する微生物の反応を測定するシステムを概略的に示す図である。
【図１７Ａ】Ｅ、大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５（ブラックボックスは強度測定用の選択されたエリアを示す）を含む３Ｄ培養マトリックスによるアンピシリン（左から右の２０−０μｇ／ｍｌ）の線形勾配の形成後の３Ｄ培養マトリックスを撮像した画像を示す図である。
【図１７Ｂ】アンピシリン用のＥ、大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５の最小抑制濃度を示す５μｇ／ｍｌにおいて強度増加を有する図１７Ａの選択されたエリアの強度プロフィールを示す図である。
【図１７Ｃ】図１７Ａの３Ｄ培養マトリックスよるアンピシリン（２０−０μｇ／ｍｌ）の線形勾配を概略的に示す図である。
【図１８Ａ】Ｅ、大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５（ブラックボックスは強度測定用の選択されたエリアを示す）を含む３Ｄマトリックスによるスペクチノマイシン（左から右の５０−０のμｇ／ｍｌ）の線形勾配の形成後の３Ｄ培養マトリックスを撮像した画像を示す図である。
【図１８Ｂ】図１８Ａにおける選択されたエリアの強度プロフィールを示す図である。
【図１８Ｃ】、図１８Ａの３Ｄ培養マトリックスによるスペクチノマイシン（５０−０μｇ／ｍｌ）の線形勾配を概略的に示す図である。
【図１９】スペクチノマイシンの様々な濃度に晒されたＥ、大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５における経時的な成長曲線を示す図である。
【図２０】安定して継続する勾配の抗菌剤を有するミクロ流体デバイスの中で細胞を培養した結果を概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図面の全体を通じて、同じ参照番号は同様のまたは対応する要素について使用される。
【００２０】
本実施形態は、一般的には流体デバイスに関し、特には試験物質に対する微生物の反応を測定する際のそのような流体デバイスの使用に関する。ミクロ流体デバイスのような流体デバイスは、様々な試験物質に対する微生物の反応を監視するためにまたは測定するために特に最適に設計することができる。適切な微生物の培養物を有する三次元の（３Ｄ）培養マトリックスを含む培養室を備えたそのような流体デバイスは、より詳細には、試験物質または実際に多数の試験物質の任意の組合せに対する微生物の反応を迅速に測定するための効率的なツールを提供する。
【００２１】
そのような流体デバイスは、それらを非常に効率的なツールにする重要な機能を有する。第１に、適切な試験物質の定常状態の勾配は、迅速且つ正確に３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に形成することができる。このことは、試験物質の濃度の連続的な範囲が、３Ｄ培養マトリックスの端部若しくは側部のうちの１つにおける高濃度から下がって３Ｄ培養マトリックスの別の端部若しくは側部における低い濃度若しくはゼロ濃度で形成されることを意味する。したがって、試験物質の濃度の連続的な範囲は、単一の流体デバイスで試験することができる。このことは、１つまたはせいぜい少数の事前定義の濃度は試験できるが、任意の連続的な濃度の範囲は試験できない従来技術とは明確に異なっている。したがって、例えば、抗生物質の最小抑制濃度のより正確な測定を行うことができる。
【００２２】
第２に、微生物は３Ｄ培養マトリックスにおいて培養される。したがって、微生物は、三次元の中で成長することができる。このことは、その結果として、生存して成長する微生物が存在する３Ｄ培養マトリックスのエリアと死滅したまたは低成長の細胞を有するエリアとの間ではるかにより有意な違いを提供する。したがって、実施形態は強化された信号対雑音比を実現する。したがって、微生物が小さい成長しかできず、このため、より低い検出信号しか生成されない二次元（２Ｄ）表面上のバイオフィルムで微生物を育てることと比較して、３Ｄ培養マトリックスの中の異なるエリアまたは領域で微生物を育てることとの間を区別することははるかに容易である。
【００２３】
試験物質の勾配は、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に迅速に形成することができる。三次元において微生物成長の可能性を伴うこのことは、非常に短い時間、通常は、１時間またはせいぜい数時間の間に試験物質に対する微生物の反応を読み取ることを可能にする。このことは、典型的には夜通しの培養を必要とする種々の従来技術と比較されるべきである。
【００２４】
流体デバイスは、小規模なデバイスとして、すなわち、ミクロ流体デバイスまたはナノ流体デバイスさえ有利に実現される。したがって、成功裡に試験を実行するためには、少量の試験物質及び微生物が必要なだけである。
【００２５】
試験物質に対する微生物の反応の測定若しくは監視は、通常の顕微鏡検査を使用して行うことができ、または実に人間の目によってさえ行うことができる。したがって、一般に、複雑ではなく専用に設計された検出機器は、試験物質に対する微生物の反応を測定するためには必要でない。
【００２６】
実施形態は、様々な試験物質に対する微生物の反応の監視及び測定において流体デバイスを使用する。流体デバイスは、この明細書において流体培養デバイスとしても称され、試験物質を培養室に、したがってさらに培養室に存在する３Ｄ培養マトリックスの中に輸送するために、流体の流れが流体デバイスのチャネルに存在することを示唆する。
【００２７】
流体デバイスは、有利には、いわゆるミクロ流体デバイスまたはミクロ流体培養デバイスである。ミクロ流体は、ミクロ流体デバイスの流体チャネルが微小化されたチャネルであることを示唆する。一般に、サブミクロン範囲の寸法を有するそのような流体チャネルについては、表出ナノ流体工学がしばしば使用される。したがって、実施形態の流体デバイスは、そのようなナノ流体デバイスまたはナノ流体培養デバイスである。
【００２８】
流体培養デバイスの流体チャネルは、それぞれの流体の流れを運ぶように構成されている。流体の流れは、むしろ流体チャネルにおける液体の液体流れである。しかしながら、流体チャネルにおいてガスの流れまたは実に流動化された固体若しくは粒子の流れを有する可能性もある。油溶性ガスをその中に有する液体の流れも、実施形態において使用することができる。
【００２９】
一般的な実施形態では、図８に示すように、流体デバイス１が３Ｄ培養マトリックス２における微生物６の培養物を収容するように構成された培養室１０を備えている。流体デバイス１はまた、培養室１０の第１の端部または側部１２に隣接する第１の流体チャネル２０及び培養室１０の第２の異なる端部または側部１４に隣接する第２の流体チャネル３０を備えている。そのため、第１の流体チャネル２０は、第１の濃度の試験物質を含む第１の流体の流れを運ぶように構成されている。第２の流体チャネル３０は、同様に、３Ｄ培養マトリックス２の少なくとも一部の上に試験物質の濃度勾配を形成するために、試験物質を含まないかまたは第１の濃度より低い第２の濃度の試験物質を含む第２の流体の流れを運ぶように構成されている。
【００３０】
３Ｄ培養マトリックス２の少なくとも一部の上に試験物質の濃度勾配を形成するために、２つの流体の流れは異なる濃度で試験物質を含むことになる。この明細書においては、第１の流体の流れは、最も高い濃度の試験物質を含む流体の流れとして定義される。このことは、第２の流体の流れが、試験物質を含まないかまたは第１の流体の流れと比べて異なるすなわち低い濃度の試験物質を含むことを意味する。
【００３１】
２つの流体の流れは、試験される１つまたは複数以上の試験物質を除いては同じ成分または要素を有することが好ましい。したがって、流体の流れが液体流れである場合には、第１及び第２の流体の流れは、選択された第１の濃度または選択された第１及び第２の濃度の試験物質が添加される同じ液体または液体混合を含むことが望ましい。同様に、２つの流体の流れがガスの流れである場合には、第１及び第２の流体の流れは、選択された濃度の試験物質が添加される同じガスまたはガス混合を含むことが望ましい。
【００３２】
実施形態は、一般的には、３Ｄ培養マトリックスを収容するように構成され、且つそれぞれの流体チャネルを備えた異なる端部に隣接する培養室を備えた任意の流体デバイスを使用することができる。本発明の技術分野において利用できるそのような流体チャネルがいくつか存在する。例えば、実施形態において優れて作動するミクロ流体デバイスがＧｒａｄｉｅｎｔｅｃｈ  ＡＢ（ウプサラ、スウェーデン）によってＣＥＬＬＤＩＲＥＣＴＯＲ（登録商標）  Ｒｕｂｙとして販売されている。実施形態によって使用することができる流体デバイスも、例えば以下の文献［非特許文献１２〜１７、１9及び特許文献１、２］に開示され、ミクロ流体デバイスに関するそれらの教示は参照によってこの明細書に組込まれている。
【００３３】
図２０は、ミクロ流体デバイスの培養室にゲルと細胞の混合物を注入することを概略的に示す。細胞は、形成された３Ｄ培養マトリックスにおいて最初に均等に分散される。例示的な実施例において、安定して連続的な勾配は、抗菌剤を含む第１の流体の流れ及び抗菌剤を含まない第２の流体の流れの提供により形成された。これにより勾配は、培養室及び３Ｄ培養マトリックスの上に形成される。下の図は、３Ｄ培養マトリックス中の細胞を培養し、且つ抗菌剤の勾配にそれらを晒した結果を示す。
【００３４】
図１は、実施形態による試験物質に対する微生物の反応を測定する方法のフロー図である。その方法は、ステップＳ１において、流体デバイスの培養室の中に配置された３Ｄ培養マトリックスにおける微生物の培養を実現することを含む。この流体デバイスは、培養室の第１の端部または側部に隣接する第１の流体チャネル及び培養室の第２の異なる端部または側部に隣接する第２の流体チャネルを備えている。次のステップＳ２は、第１の濃度の試験物質を含む第１の流体の流れに第１の流体チャネルの入力を接続することを含む。ステップＳ３は、同様に、試験物質を含まないかまたは第１の濃度より低い第２の濃度の試験物質を含む第２の流体の流れに第２の流体チャネルの入力を接続することを含む。したがって、その結果、試験物質の濃度勾配は、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に形成される。次のステップＳ４は、第１の端部若しくは側部に関係する及び／または第２の異なる端部若しくは側部に関係する３Ｄ培養マトリックスにおける任意の境界領域の位置に基づいて、試験物質に対する微生物の反応を測定する。この境界領域は、微生物が試験物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域と微生物が試験物質に対して第２の異なる反応を示す第２反応領域との間に存在する。
【００３５】
２つのステップＳ２及びＳ３は、任意の順序で連続的に実行することができ、すなわちステップＳ２はステップＳ３の前または後に実行することができる。あるいは、２つのステップのＳ２及びＳ３は、少なくとも部分的には並列して実行することができる。
【００３６】
試験物質に対する３Ｄ培養マトリックスにおける微生物の反応は、少なくとも３つのはっきりと目に見える領域が一般に存在することを示唆する。これらの領域は、微生物が試験物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域を含む。この第１の反応領域は、第１の端部または側部及び第１の流体チャネルに最も近い領域である。したがって、第１の反応領域は、試験物質のより高い濃度に晒された３Ｄ培養マトリックスの一部に対応する。領域はまた、微生物が試験物質に対して第２の反応を示し、且つこの第２の反応が第１の反応とは異なる第２の反応領域を含む。第２の反応領域は、第２の端部または側部及び第２の流体チャネルに最も近い領域である。したがって、第２の反応領域は、試験物質のより低い濃度に晒された３Ｄ培養マトリックスの一部に対応する。
【００３７】
境界領域は、その結果、第１の反応領域と第２の反応領域との間に存在する３Ｄ培養マトリックスの一部を構成する。この境界領域５は、図１７Ａに示すように、第１の反応領域３と第２の反応領域４との間の基本的には多分に非常に薄い境目または境界である。あるいは、境界領域５は、図１８Ａに示すように、第１及び第２の端部または側部の間の３Ｄ培養マトリックスにおいてより広い範囲を有する。
【００３８】
境界領域は、その結果、試験物質の部分的な濃度が第１の反応領域における第１の反応から第２の反応領域における第２の反応までの試験物質に応じてシフトまたは変化を達成する３Ｄ培養マトリックスの一部を構成する。
【００３９】
例えば、試験物質が抗生物質または別の殺菌剤若しくは静菌剤である場合には、第２の反応領域は、実質的には生存または成長する細菌を有する３Ｄ培養マトリックスの一部の可能性があり、その中で、この明細書では細菌によって代表される微生物が試験物質の比較的低い濃度に晒される。その一方、第１の反応領域は、生存または成長する細菌が存在しない３Ｄ培養マトリックスの一部であることが望ましく、したがって、第１の反応領域は、（細胞の死滅または細胞の成長がないことにより）細菌の相対的な欠如によって特徴づけられる。その結果、境界領域は、成長／生存の一部と無成長／細胞死滅の一部との間の境界または部分を構成する。
【００４０】
図１７Ａは、はっきりと成長している細菌を有する第２の反応領域４（図では白信号として見える）を示す。３Ｄ培養マトリックスのこの一部において、試験物質、この明細書ではアンピシリンの濃度は低すぎて、Ｅ、大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５細菌中の細胞成長を防ぐことまたは細胞死を引き起こすことができない。しかしながら、第１の反応領域３においては、アンピシリンの濃度は十分に高く、細胞成長を防ぐかまたは細胞死を引き起こす。したがって、Ｅ、大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５は、３Ｄ培養マトリックスのこの一部では実質的に見られない。示された実験においては、境界領域５は、基本的には、特にこのＥ、大腸菌株用のアンピシリンの最小抑制濃度（ＭＩＣ）を定義する明確な境目または境界である。
【００４１】
図１８Ａにおいては、生存し且つ成長するＥ、大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５を有する第２の反応領域４と試験物質としてのスペクチノマイシンの濃度が細菌を殺すかまたは少なくとも任意の細菌の成長を防ぐのに十分に高かった第１の反応領域３との間のより広い境界領域５では状況が多少異なる。この実験では、境界領域５においていくらか生存し且つ成長する細菌によって示されるように、Ｅ、大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５のいくらかは抗生物質スペクチノマイシンに対して耐性が見られる。しかしながら、この境界領域５における細菌の量は十分に小さく、図１８Ａに明瞭に示されるように、第２の反応領域４における細菌の量とは異なる。
【００４２】
微生物の運動性反応が試験される設定に対応して、第２の反応領域は、（試験物質が微生物の中に運動性を引き起こしたかさもなければ運動性を持たない微生物の場合に）微生物の運動性が小さいか若しくは無い３Ｄ培養マトリックスの一部か、または、（微生物が運動性を持ち且つ試験物質がこの運動性を抑制する場合に）微生物の運動性が大きい３Ｄ培養マトリックスの一部であり得る。そして、第１の反応領域は、微生物の中に運動性を引き起こすかまたは微生物の運動性を抑制する試験物質の十分に高い濃度を有する３Ｄ培養マトリックスの一部であり得る。境界領域はまた、第１及び第２の反応領域の間の３Ｄ培養マトリックスの一部であり、且つ、境界領域の一方の側の上の非運動性／低い運動性の部分から境界領域の他方の側の上の運動性／高い運動性の部分まで運動性の切り替えまたは変化によって特徴づけられている。境界領域は、したがって、図１７Ａに類似する明瞭な境目若しくは境界か、または微生物のある中間的な運動性を持つより広い部分であり得る。
【００４３】
運動性及び細胞死滅は、実施形態によって監視され且つ測定することができる微生物の反応の実施例に過ぎない。他の実施例は、限定はされないが、細胞の成長、増殖、引き起こされたストレスの様々な形態に対する反応行動、マトリックス付着、変異性などを含んでいる。
【００４４】
反応が測定されるべき微生物は、流体デバイスの３Ｄ培養マトリックスの中で育てられ培養することができる任意の微生物であり得る。そのような微生物の限定されない実施例は、細菌、菌類、寄生虫、ウィルス、及びさらにヒト細胞あるいは他の哺乳類の細胞のような細胞を含んでいる。微生物の単一の種または菌株は試験することができ、そのため、３Ｄ培養マトリックスの中で培養することができる。あるいは、組み合わされた多数の反応、すなわち、少なくとも２つの微生物が測定されることがあり得る。そのようなアプローチにおいては、多数の異なる微生物は３Ｄ培養マトリックスにおいて共培養される。
【００４５】
３Ｄ培養マトリックスは、適切な微生物用の培養マトリックスのように適切な任意の材料で作ることができる。そのような材料は、細胞培養用に従来から使用されている材料の中から選択することができる。好ましいが限定されない材料の例には、天草、アガロース、コラーゲンＩ、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）のような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ゲル、Ｎ終端上のフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護グループで固相合成法によって形成されたフェニルアラニン（Ｐｈｅ）ジペプチドの混合物のようなヒドロゲル、及びＦｍｏｃに保護されたリシン（Ｌｙｓ）または単独でフェニルアラニンが含まれる。
【００４６】
特定の実施形態においては、微生物は１つの菌株であり、試験物質は抗生物質であり、抗生物質のＭＩＣは流体デバイスによって測定される。
【００４７】
試験物質に対する３Ｄ培養マトリックスにおける微生物の反応は、培養室の第１及び／または第２の端部若しくは側部に関連する境界領域の位置に基づいて、図１のステップＳ４において測定される。培養室の端部若しくは側部に関連する境界領域のこの位置は、濃度または少なくとも試験物質の濃度範囲に相関する。したがって、境界領域の位置または境界領域と第１の端部若しくは側部との間の距離、及び／または、境界領域と第２の異なる端部若しくは側部との間の距離は、試験物質の濃度または濃度の範囲に対応する。このように、微生物の反応が変化するかまたは第１の反応領域における第１の反応から第２の反応領域における第２の反応まで切り替わる濃度若しくは濃度範囲を正確に測定することが可能である。
このことはさらに、境界領域の位置が、それによって、例えば、抗生物質のＭＩＣ、微生物の運動性を抑制し／引き起こす試験物質の運動性の抑制／濃度促進、微生物のマトリックス付着を禁止し／引き起こす試験物質の付着抑制／濃度促進などに変形または変換できることを意味する。
【００４８】
特定の実施形態においては、ステップＳ４は、３Ｄ培養マトリックスにおける境界領域の第１の端部及び／または第２の異なる端部に関連する位置に基づいて、及び、境界領域の幅に基づいて、試験物質に対する微生物の反応を測定することを含む。したがって、この特定の実施形態においては、反応を測定する場合に、境界領域の位置、すなわち境界領域と培養室の第１及び／または第２の端部との間の距離のみならず、境界領域の幅も使用される。例えば、境界領域の幅が実質的にゼロ（図１７Ａを参照）である場合、すなわち、基本的には第１及び第２の反応領域の境目すなわち境界がゼロである場合には、微生物の反応の変化は試験物質の特定の濃度で発生する。しかしながら、境界領域がゼロでない幅（図１８Ａを参照）を持っている場合には、微生物の反応の変化は境界領域のそれぞれの端部に対応する濃度範囲で発生する。
【００４９】
ゼロでない幅を有する境界領域はさらに、試験物質に対する微生物の任意の耐性に関する情報を提供する。したがって、拡張された境界領域は、微生物のいくつかに試験物質に対する耐性が存在することを示唆する。なぜならば、例えば、微生物は試験物質の濃度で成長することができるか、さもなければ試験物質の濃度が微生物を殺すかまたは耐性を持たない微生物の成長を防止するからである。このことは、試験物質に対する微生物の所定の時間における任意の耐性を測定するかまたは検出するために、境界領域の幅を使用できることを意味する。
【００５０】
事実、試験物質に対する耐性を引き起こしまたは試験物質に対する耐性の喪失を確かに生じさせる微生物内の任意の変異を検出することは、実施形態の流体デバイス及び方法によって実際に可能である。したがって、３Ｄ培養マトリックスにおける微生物の培養によって及び第１及び第２の流体チャネルを通る第１及び第２の流体の流れによって流体デバイスを作動させる場合に、境界領域の幅を時間の経過とともに監視することが可能である。境界領域の幅の時間の経過とともに生じる増加は、したがって多くの場合、微生物の少なくともいくつかの中での試験物質に対する耐性の利得を示唆する。これに対して、境界領域の幅の減少は、多くの場合、以前に試験物質に対する耐性を示した微生物の中で試験物質に対する耐性の喪失を示唆する。
【００５１】
このように、特定の実施形態においては、試験物質に対する微生物の反応を測定する場合に、境界領域の位置のみならず、その幅も使用することが望ましい。
【００５２】
多数の試験物質及び勾配を使用した流体デバイスのより複雑な設定及び配置においては、関連するものであればよいのは境界領域の幅あるいは複数の境界領域の幅だけではない。これらの場合には、追加または代替で、境界領域の実際の形状を試験物質に対する微生物の反応として記述することができる。境界領域の形状は、その結果、面積、曲率、異なる方角の幅などのようなパラメータを包含することができる。したがって、特定の実施形態においては、試験物質に対する微生物の反応を測定する場合、境界領域の位置及び境界領域の形状が使用される。
【００５３】
図２は、特定の実施形態による図１の中のステップＳ２及びＳ３を示すフロー図である。この図は、図８をさらに参照して且つこの明細書に示される流体デバイス１とともに以下さらに説明する。その方法は、図１のステップＳ１から続く。次のステップＳ１０は、第１の濃度の試験物質を有する第１の流体を含む第１の流体貯蔵部２６に第１の流体チャネル２０の入力２２を接続することを含む。次のステップＳ１１は、第１の流体貯蔵部２６から第１の流体チャネル２０の入力２２の中に第１の流体をポンピングすることさもなければ供給すること、及び第１の流体チャネル２０の出力２４を通じて出力することを含む。
【００５４】
ステップＳ１２は、試験物質を有しないかまたは第２の濃度で試験物質を有する第２の流体を含む第２の流体貯蔵部３６に第２の流体チャネル３０の入力３２を接続することを含む。続くステップＳ１３は、第２の流体貯蔵部３６から第２の流体チャネル３０の入力３２の中に第２の流体をポンピングすることさもなければ供給すること、及び第２の流体チャネル３０の出力３４を通じて出力することを含む。方法は、その後、図１のステップＳ４に続く。
【００５５】
したがって、特定の実施形態においては、各流体チャネル２０及び３０は、流体を有する流体貯蔵部２６及び３６に接続されて、流体チャネル２０、３０を通じて流体を流し、且つ、培養室１０における３Ｄ培養マトリックス２に試験物質を輸送する。流体は、流体チャネル２０及び３０を通じて流体の流れを形成することができる任意の機器（図示せず）を使用して、流体貯蔵部２６、３６から流体チャネル２０、３０の中に引き出すことができる。多くの場合、流体ポンプまたは推進機は、流体貯蔵部２６、３６及び流体チャネル２０、３０の入力２２、３２からの流体経路の中に配列され、及び／または、流体チャネル２０、３０の出力２４、３４に接続される。両方の流体経路上で作動する単一のポンプまたは推進機を使用することが可能である。
【００５６】
図８において、流体チャネル２０、３０は共通の出力２４、３４を備えている。したがって、第１の流体チャネル２０及び第２の流体チャネル３０は、培養室１０のポイント下流で一緒になる。代替のアプローチでは、流体チャネル２０、３０の各々はそれぞれの出力２４、３４を備えている。
【００５７】
貯蔵部２６、３６から流体チャネル２０、３０の入力２２、３２の中への流体のポンピングは、反応を測定する流体デバイス１の使用法または動作を通じて実行されることが望ましい。したがって、流体のポンピングは、少なくとも試験物質に対する微生物６の反応が測定されるまで実行されることが望ましい。
【００５８】
２つの流体貯蔵部２６、３６の中に存在する流体は、試験物質のそれぞれの濃度以外は同じ流体であることが望ましい。
【００５９】
流体チャネル２０、３０を通る流体の流れを均一で変動しないようにすることは、３Ｄ細胞マトリックス２の少なくとも一部の上に試験物質の勾配が形成されることを意味する。このことは、流体チャネル２０、３０が流体貯蔵部２６、３６に接続されて、チャネルを通る流体のポンピングがたった今開始したばかりのときは、試験物質の濃度勾配が３Ｄ培養マトリックス１０の上にまだ形成されていないことを意味する。これとは明確に異なり、培養室１０の第１の端部若しくは側部１２は試験物質の第１の濃度に晒され、且つ培養室２０の第２の端部若しくは側部１４は試験物質の第２の濃度に晒されるかまたは試験物質には全く晒されない。この点において、実質的に、試験物質は３Ｄ培養マトリックス２の中に拡散せず、そのことは、一般的には試験物質のゼロの濃度を有することになる。時間とともに、試験物質は、第１の流体チャネル２０における第１の流体から３Ｄ培養マトリックス２の中に拡散していく。結局、試験物質の定常状態の濃度勾配は、試験物質の第１の濃度を有する第１の流体チャネル２０に面している３Ｄ培養マトリックス２の第１の端部と、試験物質のゼロの濃度若しくは第２の濃度を有する第２の流体チャネル２０に面している３Ｄ培養マトリックス２の第２の端部とを備えた３Ｄ培養マトリックス２の少なくとも一部の上に形成される。
【００６０】
図２では、２つの流体チャネル２０、３０を備えた流体デバイス１が仮定されている。３つ以上の流体チャネル２０、３０が培養室１０のそれぞれの端部に隣接する場合には、それぞれの接続及びポンピングのステップは、このような流体チャネルの各々に対して実行されることが望ましい。
【００６１】
図２では、ステップは連続する順で表されている。ステップＳ１０及びＳ１２は、任意の順でまたは少なくとも部分的には並行して実行することができる。ステップＳ１１及びＳ１３のポンピングは、一般的には、流体デバイス１の全体の使用法または動作にわたって並列して実行される。
【００６２】
したがって、特定の実施形態では、方法は図４に示されるような追加のステップＳ３０を含む。方法は、図１のステップＳ３からまたは実に図２の中のステップＳ１３から継続する。この付加のステップＳ３０は、試験物質が第１の流体の流れから３Ｄ培養マトリックス２の中に拡散することによって、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上の濃度勾配を形成することを含む。試験物質のこの拡散は、３Ｄ培養マトリックスを通過する第１または第２の流体の流れが実質的に無い状態で達成されることが望ましい。
【００６３】
したがって、拡散はいわゆる供給側の流体チャネル２０からであり、それは他の流体チャネル、表示された吸収側の流体チャネル３０と比較して流体において試験物質のより高い濃度を含んでいる。好ましい実施形態では、２つの流体チャネル２０、３０における流体の流速は、培養室１０における３Ｄ培養マトリックス２を通過する流体の流れが存在しないので、実質的には同様に維持されることが望ましい。実質的に類似していることは、２つの流れが同一であることが望ましいが、ポンプシステムの流速における固有の変化のせいでわずかに異なることがあり得ることを示している。したがって、２つの流体チャネル２０、３０における流速の差は、１０％未満が望ましく、２．５％未満のように、５％未満であることがさらに望ましく、１％未満であることが最も望ましい。
【００６４】
３Ｄ培養マトリックス２の上及び長方形または正方形の底面を備えた培養室１０に隣接する流体チャネル２０、３０の一部の上に流体の有効な流れがない場合には、３Ｄ培養マトリックス２の上の濃度勾配は線形になる。
【００６５】
試験物質の濃度勾配は、培養室及び培養室の形状に関連する流体チャネルの位置及びその中に配置された３Ｄ培養マトリックスに依存して、３Ｄ培養マトリックスの全体の上または３Ｄ培養マトリックスの一部の上に形成することができる。
【００６６】
ある実施形態においては、２つの流体の流れの中の試験物質のそれぞれの濃度は、手順の全体にわたって固定される。したがって、そのような場合においては、第１の濃度及び第２の濃度（ゼロでない場合）は固定されることが望ましい。別の実施形態では、手順の期間中に流体の流れのうちの少なくとも１つにおいて、試験物質の濃度を変更しまたは調整することが可能である。そのような変更は、濃度における１つ以上のステップの観点から可能であり、すなわち、試験物質の最初の濃度から新たな濃度に切り替えることが可能である。あるいは、濃度の変更は徐々に且つ時間にわたってすることができる。
【００６７】
例えば、流体の流れの中の試験物質の最初の濃度が検出可能ないかなる効果をも得られなかった場合には、濃度の変更が行われる。例えば、両方の流体の流れの中の抗生物質の濃度が低すぎると、そのため３Ｄ培養マトリックスの全体にわたって微生物の成長を得ているときには、少なくとも第１の流体チャネルにおける抗生物質の濃度を増加することが適切な場合があり得る。
【００６８】
流体の流れの少なくとも１つにおける試験物質の濃度の変更も、様々な負荷試験の中で使用することができる。
【００６９】
図３は、様々な実施形態による方法の追加手順を示すフロー図である。ある実施形態においては、方法は、図１のステップＳ３から（または図２のステップＳ１３若しくは図４のステップＳ３０から）継続する。次のステップＳ２１は、この実施形態において、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも１つの画像又は写真を撮像することを含む。その後、境界領域はステップＳ２２における少なくとも１つの画像の中で識別される。その後、方法は図１のステップＳ４に継続し、そこでは、３Ｄ培養マトリックスの第１及び／または第２の端部若しくは側部に関連する境界領域の位置に基づいて試験物質に対する微生物の反応が測定され、またそこでは、少なくとも１つの画像の中で位置が識別される。
【００７０】
したがって、３Ｄ培養マトリックスの１つ以上の画像が撮像され、その後、これらの画像の少なくとも１つの中で境界領域が識別される。その後、境界領域の位置及びさらにオプションによる境界領域の幅及び／または形状が、画像から手作業で、または、この明細書においてさらに説明する適切な機器を使用した画像処理によって、測定され得る。
【００７１】
特定の実施形態では、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも１つの画像は、明視野顕微鏡を使用して、または位相差顕微鏡を使用して、ステップＳ２１において撮像される。そのような場合、境界領域の位置及びオプションによる幅及び／または形状は、少なくとも１つの画像の中で検出された光強度に基づいて識別することができる。ある実施形態においては、ステップＳ２２は、したがって、少なくとも１つの画像の中で検出された光強度に基づいて、境界領域を識別するように構成されたコンピュータによって少なくとも１つの画像を処理することを含む。
【００７２】
したがって、ほとんどの実施形態では、３Ｄ培養マトリックスに関して明視野顕微鏡または位相差顕微鏡を使用して撮像された画像の中の第１の反応領域と第２の反応との間に明瞭な目に見える差異が存在することになる。結果として、画像の中で検出された光強度は、手作業で、または適切な画像処理プログラム若しくはソフトウェアを備えたコンピュータを使用して、画像の中の境界領域の位置、及びオプションによる幅及び／または形状を識別するために使用することができる。このことは、最も実用的な実施形態では、微生物の染色またはラベリングが必要ではないことを意味する。
【００７３】
しかしながら、追加のオプションのステップＳ２０を有することは可能であり、それは少なくとも１つの蛍光性のラベルを３Ｄ培養マトリックスに加えることを含む。その結果、この蛍光性のラベルは、微生物に結合するように構成されるかまたは微生物によって取り込まれるように構成される。そのような場合には、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも１つの画像は、ステップＳ２１において蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して撮像することが望ましい。その後、境界領域は、少なくとも１つの画像の中で検出された蛍光に基づいて、境界領域を識別するように構成されたコンピュータによって少なくとも１つの画像を処理することによりステップＳ２２において識別することができる。あるいは、少なくとも画像の中の蛍光に基づいて、境界領域（位置及びオプションの幅及び／または形状）を識別するために少なくとも１つの画像の手作業の検査を使用することができる。
【００７４】
上記説明した実施形態では、少なくとも１つの蛍光性のラベルが３Ｄ培養マトリックスに加えられた。代替のアプローチでは、微生物は、蛍光性の物質のような、少なくとも１つの物質で自身を表すことができ、それは蛍光顕微鏡若しくは共焦点顕微鏡または実に任意の他の画像技法を使用して撮像された画像の中で検出することができる。あるいは、微生物は、例えば、そのような物質をコード化する設計された表現ベクトルの形質移入によって、そのような物質を表せさせることができる。したがって、そのようなアプローチでは、ステップＳ２０における蛍光性のラベルの追加を省略することができる。
【００７５】
ある好ましい実施形態では、ステップＳ２１は３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上の試験物質の定常状態の濃度勾配の形成の少なくとも後に、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも１つの画像を撮像することを含む。したがって、特定のアプローチでは、試験物質に対する微生物の反応を測定する前に、定常状態の濃度勾配をまず形成することが望ましい。したがって、境界領域を識別するために撮像され且つ分析されまたは処理される少なくとも１つの画像は、そのような定常状態の濃度勾配の形成の後に撮像されることが望ましい。
【００７６】
さらに、定常状態に達する前に、勾配の形成は予測可能で、いくつかの場合においては、例えば、蛍光合成物を使用して直接に映像化することができ、したがって定常状態の勾配を達成する前に試験物質の既に知られている濃度に関する微生物の反応の読み出しを可能にする。
【００７７】
ステップＳ２１において３Ｄ培養マトリックスの単一の画像を撮像することができる。あるいは、３Ｄ培養マトリックスの複数の画像は、流体チャネルの入力をそれぞれの流体の流れに接続することから、例えば０〜１２時間の間隔内で周期的に撮像される。ある特定の実施形態では、画像が周期的に撮像される時間間隔は、０〜６時間、０〜４時間、若しくは０〜３時間が望ましく、または０〜２時間若しくは０〜１時間がさらに望ましく、その後に、それぞれの流体の流れに流体チャネルを接続することによる監視が開始する。
【００７８】
前の説明では、主に、流体デバイスの中の単一の試験物質に対する反応を測定することに対して検討がなされた。しかしながら、さらに、多数の試験物質の混合物に対する反応を測定するときには、または、実に多数の試験物質若しくはその混合物に対する異なる反応を測定するときには、多数の試験物質に対する反応を同時に測定することが可能である。
【００７９】
ある実施形態では、図１のステップＳ２は、それによって、第１の濃度の第１の試験物質を含み、且つ第２の試験物質を含まずまたは第３の濃度の第２の試験物質を含む第１の流体の流れに第１の流体チャネルの入力を接続することを含む。一方、ステップＳ３は、第１の試験物質を含まずまたは第２の濃度（それは第１の濃度より低い）の第１の試験物質を含み、且つ第３の濃度よりも高い第４の濃度の第２の試験物質を含む第２の流体の流れに第２の流体チャネルの入力を接続することを含む。第１の試験物質の第１の濃度勾配及び第２の試験物質の第２の濃度勾配は、その結果、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に形成される。
【００８０】
ステップＳ４は、この実施形態において、培養室の第１及び／または第２の端部若しくは側部に関する３Ｄ培養マトリックスの中の任意の境界領域の位置に基づいて、第１の試験物質及び第２の試験物質に対する微生物の反応を測定することを含む。境界領域は、微生物が第１の試験物質及び第２の試験物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域と、微生物が第１の試験物質及び第２の試験物質に対して第２の異なる反応を示すそれぞれの第２の反応領域との間に存在する。
【００８１】
したがって、この実施形態では、第１の試験物質の濃度勾配は、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上の第１の流体チャネル（第１の試験物質の高濃度）から第２の流体チャネル（第１の試験物質の低濃度）に向かって形成される。これに対応して、第２の試験物質の濃度勾配は、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上の第２の流体チャネル（第２の試験物質の高濃度）から第１の流体チャネル（第２の試験物質の低濃度）に向かって形成される。
【００８２】
試験物質が、例えば、異なる抗生物質である場合には、２つの境界領域が存在する可能性がある。１つの場合では第１の流体チャネルから第２の流体チャネルに向かって移動する場合には、３Ｄ培養マトリックスは以下に示す領域、すなわち、微生物が生存しないまたは成長の無い微生物を有する第１の「死滅」領域、第１の境界領域、生存し且つ成長する微生物を有する成長領域、第２の境界領域、及び第２の「死滅」領域の中に急降下することがある。それぞれの領域の位置及び幅（形状）は、特定の抗生物質、抗生物質の濃度（第１及び第４の濃度並びにオプションの第２及び第３の濃度）及び特定の微生物に依存する。
【００８３】
別のアプローチでは、ステップＳ２は、第１の濃度の第１の試験物質を含み且つ第３の濃度の第２の試験物質を含む第１の流体の流れに第１の流体チャネルの入力を接続することを含む。次に、ステップＳ３は、第１の試験物質を含まないかまたは（第１の濃度より低い）第２の濃度の第１の試験物質を含み、且つ、第２の試験物質を含まないかまたは第３の濃度より低い第４の濃度の第２の試験物質を含む第２の流体の流れに第２の流体チャネルの入力を接続することを含む。第１の試験物質の第１の濃度勾配及び第２の試験物質の第２の濃度勾配は、その結果、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に形成される。
【００８４】
ステップＳ４は、この実施形態において、培養室の第１及び／または第２の端部若しくは側部に関連する３Ｄ培養マトリックスにおける任意の境界領域の位置に基づいて、第１及び第２の試験物質の混合物に対する微生物の反応を測定することを含む。境界領域は、微生物が混合物に対して第１の反応を示す第１の反応領域と、微生物が混合物に対して第２の異なる反応を示す第２の反応領域との間に存在する。
【００８５】
したがって、この実施形態では、第１の試験物質の濃度勾配は、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に第１の流体チャネル（第１の試験物質の高濃度）から第２の流体チャネル（第１の試験物質の低濃度）に向かって形成される。これに対応して、第２の試験物質の濃度勾配は、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に第１の流体チャネル（第２の試験物質の高濃度）から第２の流体チャネル（第２の試験物質の低濃度）に向かって形成される。
【００８６】
この実施形態は、第１の流体の流れが両方の試験物質の最も高い濃度を含むのに対して、従来の実施形態では、第１の流体の流れが第１の試験物質の最も高い濃度を含む点で、また第２の流体の流れが第２の試験物質の最も高い濃度を含む点で、従来の実施形態とは異なる。
【００８７】
このため、本実施形態は、試験物質の混合物またはカクテルに対する微生物の反応を測定するためにより適切である。明瞭な差異における従来の実施形態は、単一の流体デバイス及び単一の培養室を使用して、２つの試験物質の並列試験を可能にする。
【００８８】
ある実施形態では、流体デバイスの培養室は、それぞれの流体の流れに接続することができる少なくとも４つの端部または側部を備えている。したがって、培養室は、その結果として追加的に、培養室の第３の端部または側部に隣接する第３の流体チャネル及び培養室の第４の異なる端部または側部に隣接する第４の流体チャネルを備えている。この実施形態では、試験物質は第１の試験物質である。
【００８９】
その後、方法は、第３の濃度の第２の試験物質を含む第３の流体の流れに第３の流体チャネルの入力を接続し、且つ第２の試験物質を含まないかまたは第３の濃度より低い第４の濃度の第２の試験物質を含む第４の流体の流れに第４の流体チャネルの入力を接続する追加のステップを含む。したがって、第２の試験物質の濃度勾配は、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に形成される。この実施形態では、方法はさらに、３Ｄ培養マトリックスにおける任意の境界領域のうち、第３及び／または第４の端部若しくは側部に関連する位置に基づいて、第２の試験物質に対する微生物の反応を測定することを含む。この境界領域は、微生物が第２の試験物質に対して第１の反応を示す第１の反応領域と、微生物が第２の試験物質に対して第２の異なる反応を示す第２の反応領域との間に存在する。
【００９０】
この実施形態では、２つの試験物質は並列して試験することができる。例えば、培養室及び３Ｄ培養マトリックスが長方形または正方形の断面を有する場合には、第１の試験物質の濃度勾配は第１及び第２の流体チャネルの間のＸ方向に沿って形成することができるのに対して、第２試験物質の濃度勾配は今度は第３及び第４の流体チャネルの間のＹ方向に沿って形成される。
【００９１】
以下、方法の特定の使用について、試験物質が抗生物質である場合、または殺菌剤及び／または静菌剤の他の形態である場合についてさらに説明する。この実施形態では、図１のステップＳ４は、培養室の第１及び／または第２の端部若しくは側部に関連する３Ｄ培養マトリックスにおける境界領域の位置に基づいて、試験物質に対する微生物の感受性を測定することを含む。この境界領域は、その結果、微生物を育てる成長領域と、微生物を育てない非成長領域の間に存在する。
【００９２】
この実施形態では、図５に示されるような付加ステップを実行することができる。その方法は、図１のステップＳ４から継続する。これに続くステップＳ４０は、境界領域の幅に基づいて試験物質に対する微生物の耐性を測定する。したがって、境界領域がゼロでない幅を持っている場合には、試験物質に対して耐性がある微生物は境界領域に対応する濃度範囲の中で成長することができる。ステップＳ４０の変形は、境界領域の形状に基づいて試験物質に対する微生物の耐性を測定することを含む。
【００９３】
図６は、例えば明視野顕微鏡または位相差顕微鏡を使用して、図３のステップＳ２１において３Ｄ培養マトリックスを撮像した画像から試験物質のＭＩＣを測定するために使用することができる図１のステップＳ４の実施形態を示すフロー図である。方法はこのように、図３のステップＳ２２から継続し、ステップＳ５０に継続する。このステップＳ５０は、培養室の第１の端部若しくは側部と第２の異なる端部若しくは側部との間の３Ｄ培養マトリックスにおける位置に対する検出された光強度の関係を測定することを含む。したがって、基本的には、このステップＳ５０は、第１の端部または側部と側部の第２の端部との間の異なる距離で検出された光強度を測定することに対応する。この関係は、例えば、グラフの形式であってもよいし、または、図１７Ｂ及び１８Ｂを参照すると、培養室の第１及び第２の端部の間の距離に対する検出された光強度の方法を示すプロットであってもよい。
【００９４】
例えば、３Ｄ培養マトリックスは、検出された光強度の値を持つ行及び列のマトリックスと見なすことができる。そのような場合においては、長方形または正方形の３Ｄ培養マトリックスの場合において、３Ｄ培養マトリックスの第１の側部から３Ｄ培養マトリックスの第２の反対の側部に向かって移動する場合には、行は検出された光強度の値を表すことができる。したがって、そのような行は濃度勾配の方向と並行である。ある実施形態では、検出された光強度の平均値を持つ平均の行は、すべての行の検出された光強度の値を合計し、且つ行の数でそれぞれの合計値を除算することによって得られる。あるいは、合計行は、濃度勾配の方向と垂直な方向におけるすべての行の検出された光強度の値を合計することによって計算される。その後、異なる距離で検出された光強度の測定は、平均の行または合計の行の上で実行することができる。
【００９５】
その後、次のステップＳ５１は、その関係に基づいて微生物用の試験物質のＭＩＣを測定することを含む。
【００９６】
図７は、このＭＩＣの測定を実行することができる方法をより詳細に示すフロー図である。その方法は、ステップＳ５０から継続する。次のステップＳ６０は、検出された光強度と位置との間の関係を表す信号にキンクが存在する位置を識別することを含む。この信号は、したがって、図１７Ｂ及び１８Ｂに示されるように、グラフで表現することができる。ステップＳ６０は、このように、信号を調査して、信号にキンクが存在する位置を識別する。
【００９７】
次のステップＳ６１は、３Ｄ培養マトリックスにおける位置に対する濃度を定義する事前定義の勾配情報に基づいて、ステップＳ６０において識別され且つキンクに相当する位置を試験物質の濃度に変換することを含む。したがって、このアプローチでは、３Ｄ培養マトリックスの中の試験物質の濃度と端部の１つに関連する位置との間に事前定義の関係がある。
【００９８】
一般的に、濃度勾配は、定常状態における線形の濃度勾配であり、すなわち、第１の端部若しくは側部の第１の濃度から第２の端部若しくは側部の第２の濃度またはゼロ濃度まで拡がる。そのような場合においては、試験物質の濃度と端部位置の１つに関係する距離または位置との間には単純な関係がある。
【００９９】
さらに、例えば放射性のラベルを使用して試験物質にラベルを付けること、または、実質的に同様の拡散特性を持ち、主に分子のサイズによって指示され、試験物質としての３Ｄ培養マトリックスを通過する蛍光性のように容易に検出できる検出物質を使用することは可能である。そのような場合には、放射能でラベル付けられた試験物質の濃度勾配または検出物質を容易に測定することが可能であり、また、３Ｄ培養マトリックスにおける位置に対する濃度を定義する事前定義の勾配情報をそのような実験から簡単に測定することができる。
【０１００】
いずれの場合も、事前定義済の勾配情報は、ステップＳ６０において測定された位置をステップＳ６１において試験物質のＭＩＣに対応する濃度の値に変換することを可能にする。
【０１０１】
３Ｄ培養マトリックス内で定常状態の勾配を形成するために必要な時間は、２つの流体チャネルの間の３Ｄ培養マトリックスの幅及び試験物質の拡散定数に依存する。その一方、拡散定数は、温度、３Ｄ培養マトリックスの粘性、及び試験物質の分子の半径に依存する。例えば、アガロースマトリックスにおけるアンピシリンは、Ｄ＝０．０１６ｃｍ２／ｈの拡散定数を持っている［１８］。
【０１０２】
図９〜１５は、流体チャネルの様々な数及び位置並びに培養室の異なる形状を示す異なる実施形態による流体デバイスの一部を示す。しかしながら、示された図は、単に実施形態の少数の例示的な例として見なされるべきであり、さらなる変形及び修正は可能で且つ実施形態の範囲内にある。
【０１０３】
図９は、第１の側部１２に隣接する第１の流体チャネル２０及び第２の反対側の側部１４に隣接する第２の流体チャネル３０を有する長方形または正方形の培養室１０を備えた流体デバイスの実施形態を示す。この実施形態では、線形の濃度勾配は、定常状態の期間に培養室１０に存在する３Ｄ培養マトリックス全体の上に形成される。
【０１０４】
２つの流体チャネルは、必ずしも図９に示されるような培養室の対面する側部に隣接する必要はない。図１０は、培養室１０の２つの近傍の側部１２、１６に隣接する第１の流体チャネル２０及び第２の流体チャネル３０を備えた培養室１０を示す。この実施形態では、濃度勾配はこれらの２つの近傍の側部１２、１６の間に形成される。
【０１０５】
前に説明したように、２つを超える流体チャネルを使用することが可能である。図１１は、培養室１０の各側部１２、１４、１６、１８がそれぞれの流体チャネル２０、３０、４０、５０によって隣接されている実施形態を示す。このアプローチでは、第１の流体チャネル２０から第２の反対側の流体チャネル３０まで（Ｘの方向）の３Ｄ培養マトリックス上の第１の試験物質の第１の線形の濃度勾配を形成するために、２つの異なる試験物質を試験することができる。一方、３Ｄ培養マトリックス上の第２の試験物質の第２の線形の濃度勾配は、第３の流体チャネル４０から第４の反対側の流体チャネル５０まで（Ｙ方向）形成することができる。
【０１０６】
図９〜１１において、長方形または正方形の培養室１０が開示されている。しかしながら、実施形態はそれに限定されない。図１２は、培養室１０の第１の側部１２に隣接する第１の流体チャネル２０、第２の近傍の側部１４に隣接する第２の流体チャネル３０、及び第３の近傍の側部１６にさらに隣接するオプションとして第３の流体チャネル４０を備えた三角形の形状を有する培養室１０を示す。
【０１０７】
さらに、５、６、７または多くの側部までも備えたより複雑な培養室の形状が可能である。図１３は、６個の側部１２、１４及び６個までの流体チャネル２０、３０を備えた六角形の培養室１０を示し、そのうち２個だけが図の中に引用符号で標示されている。したがって、この実施形態では、単一の流体デバイスにおいて、３つの異なる線形の濃度勾配を形成することが可能であり、且つ、そのために３つの異なる試験物質を試験する。
【０１０８】
流体デバイスはさらに、図１４に概略的に示されるような円形または楕円形の培養室１０を備えることができる。そのような場合には、流体チャネル２０、３０は、培養室１０のそれぞれの端部１２、１４に隣接する。これらの端部１２、１４は、培養室１０の円周の異なる一部に対応し、したがって培養室１０の中に配列される３Ｄ培養マトリックスの横方向表面の異なる部分に対応する。
【０１０９】
図９〜１４において、流体チャネルは培養室の側部の形式の端部または周囲の部分に隣接している。また他の例として、図１５に示されるように、培養室１０の上端または上側または天井１２及び底または下側１４で表される端部１２、１４に隣接する流体チャネル２０、３０を備えることが可能である。
【０１１０】
本実施形態は、様々な微生物、試験物質、及び反応の識別を測定するため及び監視するために使用することができる。したがって、実施形態は、病院の診療室、研究室、診断の実験室、健康管理施設などにおいて多くの異なる用途を発見する。
【０１１１】
例えば、実施形態は、ＭＩＣを識別するため、または、微生物の成長、増殖、死滅若しくは生存性に関する任意の所定の微生物に対して効果を有する生物活性合成物の最小の濃度を識別するために、生物活性合成物の効果の有無を有する他の濃度の閾値を識別するために使用することができる。
【０１１２】
さらに、１セットの異なる試験物質用のＭＩＣの形成によって、試験された微生物の表現型の同一性は、例えば診断試験で確立することができる。表現型の分析は、微生物株の十分な識別に帰着するか、または様々な試験物質に対する反応に関する微生物の一般的な分類に帰着する。
【０１１３】
実施形態はまた、成長、増殖、生存性または微生物の他の行動の態様に対する試験合成物用のＭＩＣの変化を、時間をかけて追跡するために使用することができる。このアプローチは、いくつかの世代を通じて時間をかけて、微生物の中で、抗生物質の耐性のような、耐性の発育または喪失を監視することを可能にし、それによって、試験物質の効果を代謝しまたは抵抗する微生物の能力を変質させることを可能にする。この種の実験は、試験物質の適切な臨床用量の表示及び／または管理の回数を実現するために使用することができる。したがって、実施形態は、薬力学及び任意の所定のタイプの微生物における任意の試験物質若しくは試験物質の組合せの薬物動態学の両方を研究するために使用することができる。
【０１１４】
実施形態はさらに、抗生物質のように、個々の物質よりも総合的に効率的である試験物質の組合せを評価し且つ識別するために使用することができ、または試験物質が相乗効果を持つかどうか、若しくはそれらが例えば成長、増殖、生存性、若しくは微生物の他の行動の態様に対する効果を総合的に持たないかどうかを評価するために使用することができる。
【０１１５】
実施形態は、微生物の成長、増殖、生存性、死滅、拡散能力若しくは微生物の他の行動の態様に対する効果のための新規薬剤または化合物をスクリーニングするために使用することができる。
【０１１６】
実施形態はまた、臨床実践の中で使用される物質に対する任意の所定の微生物の反応の最初のプロフィールを迅速に取得するために使用することができる。その狙いは、したがって、微生物感染に苦しむ患者の反微生物治療に適している物質を識別できることである。このことは、適切な治療を計画するために、患者の寿命が感染を引き起こす微生物の速い識別に左右される場合であっても使用することができる。
【０１１７】
実施形態はさらに、細胞の行動、細胞の生存性、細胞の増殖、細胞の死滅及び／または宿主細胞上のウィルス及び試験物質の量及び効果のための読み出し情報として使用される細胞分化に対する効果と共に、ウィルスに感染した宿主細胞に対する薬または試験物質の効果を研究するために使用することができる。このアプリケーションでは、ウィルスは、それらが感染させることができることが知られている細胞と一緒に置かれることが望ましい。したがって、細胞変性効果のような感染した宿主細胞に対するのと同様に、ウィルス粒子に対する両者の直接の効果は、異なる濃度の試験物質の効果を研究するために使用することができる。
【０１１８】
寄生虫に対する薬の効果に関する研究の例として、寄生虫に感染し、且つ流体デバイスの３Ｄ培養マトリックスの中で培養された人間またはマウスの赤血球を使用して、マラリア原虫を研究することができる。次に、薬の１つ以上の勾配に対する寄生虫と赤血球の反応は試験することができる。
【０１１９】
流体デバイスの培養室における３Ｄ培養マトリックスの中の微生物の培養は、少なくとも部分的に閉じられた培養室の内部の微生物を飼育することを可能にする。このことは、潜在的に有害な微生物に対する職員の保護を実現するだけでなく、３Ｄ培養マトリックスの中の試験サンプルの汚染に対しても保護する。
【０１２０】
実施形態の別の態様は、図１６に示すように、試験物質に対する微生物の反応を測定するためのシステム６０に関する。システム６０は、培養室１０によって表され、且つ図の中のチャネルに隣接する流体デバイスを備えている。流体デバイスは、３Ｄ培養マトリックスの中の微生物の培養物を収容するように構成された培養室１０を備えている。流体デバイスはまた、培養室１０の第１の端部または側部に隣接する第１の流体チャネル及び培養室１０の第２の異なる端部または側部に隣接する第２の流体チャネルを備えている。システム６０は、第１の濃度の試験物質を含む第１の流体を有する第１の流体貯蔵部（図８を参照）をさらに備えている。第１の流体貯蔵部は、第１の流体チャネルの入力に接続されるように構成されている。システム６０はまた、試験物質を含まないかまたは第１の濃度より低い第２の濃度の試験物質を含む第２の流体を有する第２の流体貯蔵部を備えている。第２の流体貯蔵部は、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上の試験物質の濃度勾配を形成するために第２の流体チャネルの入力に接続されるように構成されている。
【０１２１】
システム６０はまた、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも１つの画像を撮像するように構成され、且つ、３Ｄ培養マトリックスにおいて、第１の端部及び／または第２の異なる端部に関連する任意の境界領域の位置を識別するために少なくとも１つの画像を処理するように構成されたコンピュータ・ベースのシステム６２、６６を備えている。この境界領域は、微生物が試験物質に対する第１の反応を示す第１の反応領域と微生物が試験物質に対する第２の異なる反応を示す第２の反応領域の間に存在する。コンピュータ・ベースのシステム６２、６６も、境界領域の位置に基づいて試験物質に対する微生物の反応を測定するように構成されている。
【０１２２】
図１６では、コンピュータ・ベースのシステム６２、６６は、カメラまたは他の画像若しくは信号取り込み機器すなわち検出器６６によって例示されている。このカメラまたは検出器６６は、３Ｄ培養マトリックスの写真を撮像するために、図の中に示されるような顕微鏡６８に接続されるかまたは関連して配置されていることが望ましいが、必須のことではない。カメラ６６は、画像データ及びコンピュータ６２の演算処理装置によって実行される符号化手段を含むコンピュータプログラムを格納するように構成されたメモリを備えたコンピュータ６２に接続されることが望ましい。コンピュータプログラムは、そのため、例えば検出された光強度または検出された蛍光に基づいて、画像の中の境界領域の位置及びオプションとして幅及び／または形状を識別するように構成されている。コンピュータプログラムはまた、この明細書で前述したように、境界領域の位置を試験物質に関する濃度の値または濃度の値の範囲に変換するように構成されていることが望ましい。
【０１２３】
システム６０のオプションの画面６４は、取り込まれた画像（図１７Ａまたは１８Ａ）、３Ｄ培養マトリックスにおける位置に対する若しくは濃度勾配に沿った試験物質の濃度に対する検出された光強度若しくは検出された蛍光を示す処理されたグラフ（図１７Ｂまたは１８Ｂ）、及び／または測定の濃度若しくは濃度範囲を表示するためにコンピュータ６２に接続することができる。
【０１２４】
実施形態の別の態様は、試験物質に対する微生物の反応を測定する流体デバイスの使用に関する。流体デバイスは、３Ｄ培養マトリックスの中の微生物の培養物を収容するように構成された培養室を備えている。流体デバイスはまた、培養室の第１の端部に隣接し、且つ、第１の濃度の試験物質を含む第１の流体の流れを運ぶように構成された第１の流体チャネルを備えている。流体デバイスは、培養室の第２の異なる端部に隣接し、且つ、３Ｄ培養マトリックスの少なくとも一部の上に試験物質の濃度勾配を形成するために、試験物質を含まないかまたは第１の濃度より低い第２の濃度の試験物質を含む第２の流体を運ぶように構成された第２の流体チャネルをさらに備えている。その使用は、第１の端部及び／または第２の異なる端部に関連する３Ｄ培養マトリックスにおける任意の境界領域の位置に基づいて、試験物質に対する微生物の反応を測定することを含む。境界領域は、微生物が試験物質に対する第１の反応を示す第１の反応領域と微生物が試験物質に対する第２の異なる反応を示す第２の反応領域の間に存在する。
【０１２５】
実験
実験１−アンピシリン
細菌負荷Ｅ、大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５は、ルリア煮出し汁（ＬＢ）プレート上で培養された。Ｅ、大腸菌細胞は、ＭＵＬＴＩＳＫＡＮＲ（登録商標）  ＦＣマイクロプレート測光器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定されたように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によってＯＤ６００＝０．１に希釈された。ＯＤ６００＝０．１細胞を持つＰＢＳ及び低い溶解温度アガロースの同じ量はともに混合された。白い先端を備えたピペットは、混合物の８μΙを吸い上げるため、且つミクロ流体デバイスＣＥＬＬＤＩＲＥＣＴＯＲ（登録商標）  Ｒｕｂｙ（Ｇｒａｄｉｅｎｔｅｃｈ  ＡＢ）の培養室に混合物を注入するために使用された。図２０の上パネルを参照されたい。ミクロ流体デバイスの流体チャネル入力は、Ｍｕｅｌｌｅ−Ｈｉｎｔｏｎ培養液及びそこに２０μｇ／ｍｌのアンピシリンをも含む貯蔵部の１つを備えた流体貯蔵部に接続された。流体チャネルに培養液を引き込むために使用される推進機の速度は、３０分の間は５μｌ／分にセットされ、残りの時間は２μｌ／分にセットされた。
【０１２６】
ミクロ流体デバイスは、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラに接続されたＥｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００ニコン倒立顕微鏡システムに装着された。実験期間中３７°Ｃに３Ｄ培養マトリックスの中の温度を維持するために、ミクロ流体デバイスは、サーマルスタットに接続された。本実験では、培養室全体が顕微鏡の視野に入るように、２ｘ対物レンズが使用された。明るさ及び焦点距離の調節に続いて、ソフトウェア支援のＣＣＤカメラのコマ撮り写真（１写真／３０秒）がオンされた。
【０１２７】
写真は、培養室の選択された中央の部分と整合させるためにカットされた。図１７Ａ及び１８Ａのブラックボックスを参照されたい。写真から検出された光強度データを抽出するために画像処理ソフトウェアが使用された。Ｘ軸として濃度勾配を備えＹ軸として勾配の方向に垂直なすべての線のグレースケールの値、すなわち検出された光強度の値を合計するために、空間の成長状況分散図が使用された。
【０１２８】
アンピシリンのＭＩＣを表す特異点は、このチャートで見つけることができる。図１７Ｂに示されるように、光学的強度によって表される細胞成長率の図も描画された。
【０１２９】
図１７Ａは、アンピシリンの濃度が低い吸引の流体チャネルに近い大きな細胞成長を示す。Ｅ、大腸菌細胞は、図で見られる白い帯域に対応する。図１７Ｂは、アンピシリンの濃度勾配に対する細胞成長を示す。ＭＩＣは、この実験においては５μｇ／ｍｌであると測定された。図１７Ｃは、３Ｄ培養マトリックス中で形成されたアンピシリンの濃度勾配を示す。
【０１３０】
図１７Ｂにおいて１０μｇ／ｍｌの近傍で見られる頂点は３Ｄ培養マトリックスにおける断裂のせいであることに留意されたい。
【０１３１】
実験２−スペクチノマイシン
この実験は、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンがアンピシリンの代わりに流体貯蔵部のうちの１つに加えられたことを除き、実験１と同様に行なわれた。結果は図１８Ａ〜１８Ｃに示されている。
【０１３２】
実験１（図１７Ａ及び１７Ｂ）と比較して、図１８Ａ及び１８Ｂは明らかに、はるかに広い境界を示している。このように、この実験は、Ｅ、大腸菌細胞中のスペクチノマイシンの耐性の存在を示したが、その一方、実験１においてはこれに対応するアンピシリンの耐性は検出されなかった。
【０１３３】
図１９は、時間経過による３Ｄ培養マトリックス中の異なる位置における、平均グレースケールの値、すなわち検出された強度、これによる細胞密度を示す。これらの異なる位置は、０、１２．５、２５、３７．５及び５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンの濃度に対応する。
【０１３４】
前述された実施形態は、本発明の少数の例示的な例として理解されたい。様々な修正、組合せ及び変更が本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態になされることは、当業者によって理解されるはずである。特に、異なる実施形態における異なる部分の解決策は、他の構成において組み合わせることができ、技術的に可能である。しかしながら、本発明の範囲は添付された特許請求の範囲によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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