(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色試薬を用いて染色された標本から、特定の生体物質を定量する生体物質定量方法において、
前記染色試薬は、相異なる発光波長の蛍光物質を含む２種類以上の試薬を混合した混合試薬であり、
前記２種類以上の試薬は、前記相異なる発光波長の蛍光物質を用いて同一種類の前記生体物質を染色可能であり、
前記標本における前記生体物質の発現を前記混合試薬に含まれる蛍光物質の蛍光に基づく蛍光輝点で表す蛍光画像を、前記蛍光物質の発光波長ごとに入力する入力工程と、
前記蛍光物質の発光波長ごとに入力された前記蛍光画像における前記蛍光輝点に基づいて、前記生体物質量を定量する定量工程と、
前記蛍光物質の発光波長ごとに定量された前記生体物質量を加算する加算工程と、
を有することを特徴とする生体物質定量方法。
【請求項２】
前記染色試薬は、相異なる発光波長の蛍光物質を含む３種類以上の試薬を混合した混合試薬であり、
前記３種類以上の試薬は、前記相異なる発光波長の蛍光物質を用いて同一種類の前記生体物質を染色可能であることを特徴とする請求項１に記載の生体物質定量方法。
【請求項３】
前記染色試薬は、前記蛍光物質を複数集積したナノ粒子を含み、前記ナノ粒子の平均粒径は、５０ｎｍ以上１００ｎｍ未満であることを特徴とする請求項１又は２に記載の生体物質定量方法。
【請求項４】
前記入力工程において、超解像顕微鏡を用いて前記蛍光画像を入力することを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
【請求項５】
前記生体物質が核タンパク質であることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
【請求項６】
前記核タンパク質がＫｉ６７であることを特徴とする請求項５に記載の生体物質定量方法。
【請求項７】
染色試薬を用いて染色された標本から、特定の生体物質を定量する画像処理装置において、
前記染色試薬は、相異なる発光波長の蛍光物質を含む２種類以上の試薬を混合した混合試薬であり、
前記２種類以上の試薬は、前記相異なる発光波長の蛍光物質を用いて同一種類の前記生体物質を染色可能であり、
前記標本における前記生体物質の発現を前記混合試薬に含まれる蛍光物質の蛍光に基づく蛍光輝点で表す蛍光画像を、前記蛍光物質の発光波長ごとに入力する入力手段と、
前記蛍光物質の発光波長ごとに入力された前記蛍光画像における前記蛍光輝点に基づいて、前記生体物質量を定量する定量手段と、
前記蛍光物質の発光波長ごとに定量された前記生体物質量を加算する加算手段と、
を備えることを特徴とする画像処理装置。
【請求項８】
同一種類の特定の生体物質を染色可能な相異なる発光波長の蛍光物質を各々含む２種類以上の試薬を混合した混合試薬を染色試薬として用いて染色された標本から、前記生体物質を定量するコンピュータを、
前記標本における前記生体物質の発現を前記混合試薬に含まれる蛍光物質の蛍光に基づく蛍光輝点で表す蛍光画像を、前記蛍光物質の発光波長ごとに入力する入力手段、
前記蛍光物質の発光波長ごとに入力された前記蛍光画像における前記蛍光輝点に基づいて、前記生体物質量を定量する定量手段、
前記蛍光物質の発光波長ごとに定量された前記生体物質量を加算する加算手段、
として機能させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光物質の輝度情報を用いた生体物質定量方法、画像処理装置、及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗体医薬を中心とした分子標的薬治療の広がりに伴い、分子標的薬をより効果的に設計するため、観察対象細胞上の生体物質の定量が求められている。生体物質の存在を確認する方法として、蛍光物質を用いて特定の生体物質を特異的に染色することによる、組織分析方法が知られている。
【０００３】
特許文献１には、生体物質に結合する蛍光体を用いて染色された組織標本から、蛍光体の発光を輝点で示す蛍光画像を取得し、蛍光発光輝点の輝点数及び蛍光強度を解析することにより、生体物質の発現量を評価する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−５７６３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、蛍光体１粒子当たりの蛍光強度は、製造上の問題によりある程度のばらつきが生じ得るため、特許文献１に記載される方法では、輝度値に基づいて生体物質を定量する場合には、蛍光体１粒子当たりの蛍光強度のばらつきの影響を受けて誤差が生じやすい。
また、生体物質に結合した蛍光体の密度が低く、１つ１つの蛍光体が発する輝点が分離して観察される場合には、輝点数を数えて正確な定量が容易である。しかし、実際の組織標本では、定量対象である生体物質が高密度に発現して蛍光体の密度が高いことも多く、その場合は、複数の蛍光体を一つの輝点として数えてしまうこととなるため、定量精度が低い。
【０００６】
図１１（ａ）は、生体物質に結合する蛍光体を用いて染色された組織標本を、走査型電子顕微鏡を用いて取得した画像の一例である。図１１（ｂ）は、図１１（ａ）に同一視野範囲の蛍光画像を重ねた図である。図１１（ｂ）の蛍光画像では１つの輝点として観察される領域に、実際には図１１（ｃ）に示されるような複数の蛍光粒子が存在していることも多い。
図１１のように電子顕微鏡を用いて画像を取得すれば、蛍光体の粒子を一つ一つ数えることが可能であるため、粒子数を正確に計測できるが、電子顕微鏡を用いた観察は、標本の処理や画像の取得に手間がかかることから、簡易な光学顕微鏡を用いた生体物質の定量において、精度を高めることが求められている。
【０００７】
本発明の主な目的は、分解能が比較的低い顕微鏡を用いた場合であっても、標本内の生体物質の発現量を定量する精度を向上させることができる生体物質定量方法、画像処理装置、及びプログラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、請求項１に記載の発明によれば、
染色試薬を用いて染色された標本から、特定の生体物質を定量する生体物質定量方法において、
前記染色試薬は、相異なる発光波長の蛍光物質を含む２種類以上の試薬を混合した混合試薬であり、
前記２種類以上の試薬は、前記相異なる発光波長の蛍光物質を用いて同一種類の前記生体物質を染色可能であり、
前記標本における前記生体物質の発現を前記混合試薬に含まれる蛍光物質の蛍光に基づく蛍光輝点で表す蛍光画像を、前記蛍光物質の発光波長ごとに入力する入力工程と、
前記蛍光物質の発光波長ごとに入力された前記蛍光画像における前記蛍光輝点に基づいて、前記生体物質量を定量する定量工程と、
前記蛍光物質の発光波長ごとに定量された前記生体物質量を加算する加算工程と、
を有することを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
【０００９】
請求項２に記載の発明によれば、
前記染色試薬は、相異なる発光波長の蛍光物質を含む３種類以上の試薬を混合した混合試薬であり、
前記３種類以上の試薬は、前記相異なる発光波長の蛍光物質を用いて同一種類の前記生体物質を染色可能であることを特徴とする請求項１に記載の生体物質定量方法が提供される。
【００１０】
請求項３に記載の発明によれば、
前記染色試薬は、前記蛍光物質を複数集積したナノ粒子を含み、前記ナノ粒子の平均粒径は、５０ｎｍ以上１００ｎｍ未満であることを特徴とする請求項１又は２に記載の生体物質定量方法が提供される。
【００１１】
請求項４に記載の発明によれば、
前記入力工程において、超解像顕微鏡を用いて前記蛍光画像を入力することを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の生体物質定量方法が提供される。
【００１２】
請求項５に記載の発明によれば、
前記生体物質が核タンパク質であることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の生体物質定量方法が提供される。
【００１３】
請求項６に記載の発明によれば、
前記核タンパク質がＫｉ６７であることを特徴とする請求項５に記載の生体物質定量方法が提供される。
【００１４】
請求項７に記載の発明によれば、
染色試薬を用いて染色された標本から、特定の生体物質を定量する画像処理装置において、
前記染色試薬は、相異なる発光波長の蛍光物質を含む２種類以上の試薬を混合した混合試薬であり、
前記２種類以上の試薬は、前記相異なる発光波長の蛍光物質を用いて同一種類の前記生体物質を染色可能であり、
前記標本における前記生体物質の発現を前記混合試薬に含まれる蛍光物質の蛍光に基づく蛍光輝点で表す蛍光画像を、前記蛍光物質の発光波長ごとに入力する入力手段と、
前記蛍光物質の発光波長ごとに入力された前記蛍光画像における前記蛍光輝点に基づいて、前記生体物質量を定量する定量手段と、
前記蛍光物質の発光波長ごとに定量された前記生体物質量を加算する加算手段と、
を備えることを特徴とする画像処理装置が提供される。
【００１５】
請求項８に記載の発明によれば、
同一種類の特定の生体物質を染色可能な相異なる発光波長の蛍光物質を各々含む２種類以上の試薬を混合した混合試薬を染色試薬として用いて染色された標本から、前記生体物質を定量するコンピュータを、
前記標本における前記生体物質の発現を前記混合試薬に含まれる蛍光物質の蛍光に基づく蛍光輝点で表す蛍光画像を、前記蛍光物質の発光波長ごとに入力する入力手段、
前記蛍光物質の発光波長ごとに入力された前記蛍光画像における前記蛍光輝点に基づいて、前記生体物質量を定量する定量手段、
前記蛍光物質の発光波長ごとに定量された前記生体物質量を加算する加算手段、
として機能させるためのプログラムが提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、分解能が比較的低い顕微鏡を用いた場合であっても、標本内の生体物質の発現量を定量する精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の生体物質定量方法を用いた病理診断支援システムのシステム構成を示す図である。
【図２】図１の画像処理装置の機能的構成を示すブロック図である。
【図３】明視野画像の一例を示す図である。
【図４】蛍光画像の一例を示す図である。
【図５】図２の制御部により実行される画像解析処理を示すフローチャートである。
【図６】図５のステップＳ２の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図７】（ａ）明視野画像、（ｂ）細胞核が抽出された画像を示す図である。
【図８】図５のステップＳ４の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図９】（ａ）蛍光画像、（ｂ）輝点領域が抽出された画像を示す図である。
【図１０】顕微鏡の分解能と算出できる輝点数の関係を説明するための模式図である。
【図１１】（ａ）電子顕微鏡画像、（ｂ）電子顕微鏡画像に蛍光画像を重ねた画像、（ｃ）電子顕微鏡画像の拡大画像の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００１９】
＜病理診断支援システム１００の構成＞
図１に、本発明の生体物質定量方法を用いた病理診断支援システム１００の全体構成例を示す。病理診断支援システム１００は、所定の染色試薬で染色された標本の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
【００２０】
図１に示すように、病理診断支援システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａがケーブル３Ａ等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。なお、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはＬＡＮ（Local Area Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
さらに、病理診断支援システム１００は、標本の染色を自動で行う染色装置を備えても良い。
【００２１】
顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き光学顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織標本の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置２Ａに送信するものである。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆ等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織標本に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織標本から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。本実施の形態において、顕微鏡画像取得装置１Ａは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。
【００２２】
なお、顕微鏡画像取得装置１Ａとしては、例えば、国際公開第２０１４／００５１９５号パンフレットに記載された構造化照明法(ＳＩＭ: Structured Illumination Microscopy)を用いて画像を取得する超解像顕微鏡を用いてもよい。構造化照明法を用いた超解像顕微鏡によれば、視野全体を２本のコヒーレントビームで照明して試料上に縞状の光格子を作製し、モアレ効果を利用して従来捕えられなかった回折光を取り込んで解析することにより、分解能の高い顕微鏡画像を取得可能である。従来の光学顕微鏡の分解能（接近している２点を識別できる最小の距離）は、光の回折限界により、およそ２００ｎｍであるが、構造化照明法を用いた超解像顕微鏡によれば、約１００ｎｍの分解能が実現される。
【００２３】
なお、顕微鏡画像取得装置１Ａとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、例えば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織標本全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（例えば、特表２００２−５１４３１９号公報参照）等を用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織標本全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。
【００２４】
画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現量を算出する。
図２に、画像処理装置２Ａの機能構成例を示す。図２に示すように、画像処理装置２Ａは、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５等を備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。
【００２５】
制御部２１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）等を備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。例えば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により画像解析処理（図５参照）を実行し、生体物質の定量手段、及び生体物質量の加算手段としての機能を実現する。
【００２６】
操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。
【００２７】
表示部２３は、例えば、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）やＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等のモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。
【００２８】
通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信Ｉ／Ｆ２４は、明視野画像と蛍光画像の入力手段として機能する。
【００２９】
記憶部２５は、例えばＨＤＤ（Hard Disk Drive）や半導体の不揮発性メモリー等で構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データ等が記憶されている。
その他、画像処理装置２Ａは、ＬＡＮアダプターやルーター等を備え、ＬＡＮ等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
【００３０】
本実施の形態における画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された明視野画像及び蛍光画像を用いて解析を行うことが好ましい。
明視野画像は、Ｈ（ヘマトキシリン）染色試薬、ＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色試薬を用いて染色された組織標本を、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像であって、当該組織標本における細胞の形態を表す細胞形態画像である。ヘマトキシリンは青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など（好塩基性の組織等）を染色する。エオジンは赤〜ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など（好酸性の組織等）を染色する。図３に、ＨＥ染色を行った組織標本を撮影した明視野画像の一例を示す。
【００３１】
蛍光画像は、特定の生体物質を特異的に標識する蛍光物質を内包したナノ粒子（蛍光粒子）を含む染色試薬を用いて染色された組織標本に対し、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光粒子を発光（蛍光）させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。即ち、蛍光画像に現れる蛍光は、組織標本における、特定の生体物質の発現を示すものである。図４に、蛍光画像の一例を示す。
【００３２】
＜蛍光画像の取得＞
ここで、蛍光画像の取得方法について、この蛍光画像の取得に際して用いられる染色試薬、染色試薬による組織標本の染色方法等も含めて詳細に説明する。
【００３３】
〔蛍光物質〕
蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット（半導体粒子）を挙げることができる。２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜１１００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。
【００３４】
蛍光有機色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Alexa Fluor（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Texas Red系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
【００３５】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びAlexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、BODIPY FL、BODIPY TMR、BODIPY 493／503、BODIPY 530／550、BODIPY 558／568、BODIPY 564／570、BODIPY 576／589、BODIPY 581／591、BODIPY 630／650、BODIPY 650／665（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Cy5、Cy5.5、Cy7等を挙げることができる。
【００３６】
量子ドットとしては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。
具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
〔蛍光物質内包ナノ粒子〕
本実施の形態において、蛍光物質は、複数の蛍光物質を内包したナノ粒子（蛍光粒子）を形成していることが好ましい。蛍光粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、結合していなくてもよい。ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ、メラミン等を挙げることができる。
【００３８】
また、量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを蛍光粒子として用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ2、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ2、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【００３９】
本実施の形態で用いられる蛍光粒子は、公知の方法により作製することが可能であり、蛍光色素の内包には、原料であるモノマーに蛍光色素の分子を結合させて粒子を合成する方法、樹脂に蛍光色素を吸着させて導入する方法など、樹脂中への蛍光色素の導入はいかなる方法を用いても構わない。
【００４０】
蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
【００４１】
量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
【００４２】
本実施の形態で用いられる蛍光粒子の粒径は特に限定されないが、粒径が大きいものは、生体物質との結合が妨げられて定量結果が不正確となることがあり、また、粒径が小さいものは、１つの蛍光粒子に含まれる蛍光物質が少ないため蛍光粒子の信号がバックグラウンドノイズ（カメラのノイズや細胞の自家蛍光）に埋もれて定量が困難であることなどから、蛍光粒子の平均粒径は５０〜２５０ｎｍ程度のものが好適である。また、粒径のばらつきを示す変動係数（＝（標準偏差／平均値）×１００％）は特に限定されないが、２０％以下のものを用いることが好ましい。
なお、蛍光粒子の平均粒径の算出においては、まず、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて撮影した電子顕微鏡写真から蛍光粒子の断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径とする。本願においては、１０００個の蛍光粒子の粒径を計測し、その算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
【００４３】
〔蛍光粒子の表面修飾〕
蛍光粒子は、目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応するために表面修飾を施される。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質（ペプチド）および核酸（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞核に存在するタンパク質であるＫｉ６７に特異的に結合する抗Ｋｉ６７抗体、細胞膜に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗Ｋｉ６７抗体及び抗ＨＥＲ２抗体を蛍光粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
【００４４】
表面修飾された蛍光粒子と、目的とする生体物質は、直接結合されても良いが、別の物質を介して間接的に結合されても良い。例えば、生体物質に特異的に結合する一次抗体及び、一次抗体に特異的に結合するビオチン化二次抗体を介して、ビオチンに特異的に結合するストレプトアビジンにより修飾された蛍光粒子と生体物質が結合することとしても良い。
一次抗体及び二次抗体は、蛍光粒子が特定の生体物質に特異的に結合できる組み合わせの抗体を任意に用いることができ、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いても良い。
【００４５】
特定抗原としては以下を例示することができ、各抗原を認識する抗体はさまざまな抗体メーカーから入手可能であるとともに一般的な知識に基づいて作成可能である。例示としてM.アクチン、M.S.アクチン、S.M.アクチン、ACTH、Alk-1、α1-アンチキモトリプシン、α1-アンチトリプシン、AFP、bcl-2、bcl-6、β-カテニン、BCA 225、CA19-9、CA125、カルシトニン、カルレチニン、CD1a、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD15、CD20、CD21、CD23、CD30、CD31、CD34、CD43、CD45、CD45R、CD56、CD57、CD61、CD68、CD79a、"CD99、MIC2"、CD138、クロモグラニン、c-KIT、c-MET、コラーゲン タイプIV、Cox-2、サイクリンD1、ケラチン、サイトケラチン（高分子量）、パンケラチン、パンケラチン、サイトケラチン5/6、サイトケラチン 7、サイトケラチン 8、サイトケラチン8/18、サイトケラチン 14、サイトケラチン 19、サイトケラチン 20、CMV、E-カドヘリン、EGFR、ER、EMA、EBV、第VIII因子関連抗原、ファッシン、FSH、ガレクチン-3、ガストリン、GFAP、グルカゴン、グリコフォリン A、グランザイムB、hCG、hGH、ヘリコバクターピロリ、HBc 抗原、HBs 抗原、ヘパトサイト特異抗原、HER2、HSV -I、HSV -II、HHV-8、IgA、IgG、IgM、IGF-1R、インヒビン、インスリン、カッパ L鎖、Ki67、ラムダ L鎖、LH、リゾチーム、マクロファージ、メランA、MLH-1、MSH-2、ミエロパーオキシダーゼ、ミオゲニン、ミオグロビン、ミオシン、ニューロフィラメント、NSE、p27 (Kip1)、p53、p53、P63、PAX 5、PLAP、ニューモシスティス  カリニ、ポドプラニン（D2-40）、PGR、プロラクチン、PSA、前立腺酸性フォスファターゼ、Renal Cell Carcinoma、S100、ソマトスタチン、スペクトリン、シナプトフィジン、TAG-72、TdT、サイログロブリン、TSH、TTF-1、TRAcP、トリプターゼ、ビリン、ビメンチン、WT1、Zap-70が挙げられる。
【００４６】
目的とする生体物質が核酸の場合、病気との関連が指摘されている特定核酸遺伝子としては以下を例示することができ、各特定核酸遺伝子を認識するプローブは、BACプローブとして入手可能であるとともに一般的な知識に基づいて作成可能である。具体的な特定核酸遺伝子の例示は以下の通り。癌の増殖や分子標的薬の奏効率に関係する遺伝子として、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、Ｐ５３、ＭＥＴなどが挙げられ、さらに、各種癌関連遺伝子として知られている遺伝子として、以下のものが挙げられる。チロシンキナーゼ関連遺伝子として、ＡＬＫ、ＦＬＴ３、ＡＸＬ、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ３、ＤＤＲ１、ＦＭＳ（ＣＳＦ１Ｒ）、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ４（ＥＲＢＢ４）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ１、ＩＮＳＲ、ＥＰＨＡ２、ＩＲＲ（ＩＮＳＲＲ）、ＥＰＨＡ３、ＫＩＴ、ＥＰＨＡ４、ＬＴＫ、ＥＰＨＡ５、ＭＥＲ（ＭＥＲＴＫ）、ＥＰＨＡ６、ＭＥＴ、ＥＰＨＡ７、ＭＵＳＫ、ＥＰＨＡ８、ＮＰＭ１−ＡＬＫ、ＥＰＨＢ１、ＰＤＧＦＲα（ＰＤＧＦＲＡ）、ＥＰＨＢ２、ＰＤＧＦＲβ（ＰＤＧＦＲＢ）ＥＰＨＢ３、ＲＥＴ、ＥＰＨＢ４、ＲＯＮ（ＭＳＴ１Ｒ）、ＦＧＦＲ１、ＲＯＳ（ＲＯＳ１）、ＦＧＦＲ２、ＴＩＥ２（ＴＥＫ）、ＦＧＦＲ３、ＴＲＫＡ（ＮＴＲＫ１）、ＦＧＦＲ４、ＴＲＫＢ（ＮＴＲＫ２）、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）、ＴＲＫＣ（ＮＴＲＫ３） が挙げられる。また、乳がん関連の遺伝子としてＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＣＡ３、ＣＣＮＤ１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＲＢＢ２、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ｐ５３、ＰＴＥＮが挙げられる。カルチノイド腫瘍に関連する遺伝子として、ＢＣＬ２、ＢＲＤ４、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＨＥＳ１、ＭＡＰ２、ＭＥＮ１、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＵＴ、ＲＡＦ、ＳＤＨＤ、ＶＥＧＦＡが挙げられる。大腸がん関連遺伝子として、ＡＰＣ、ＭＳＨ６、ＡＸＩＮ２、ＭＹＨ、ＢＭＰＲ１Ａ、ｐ５３、ＤＣＣ、ＰＭＳ２、ＫＲＡＳ２ （ｏｒ Ｋｉ−ｒａｓ）、ＰＴＥＮ、ＭＬＨ１、ＳＭＡＤ４、ＭＳＨ２、ＳＴＫ１１、ＭＳＨ６が挙げられる。肺がん関連の遺伝子としては、ＡＬＫ、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢ１、ＥＧＦＲ、ＲＥＴ、ＥＭＬ４、ＲＯＳ１、ＫＲＡＳ２、ＴＰ５３、ＭＹＣが挙げられる。肝臓がん関連の遺伝子としては、Ａｘｉｎ１、ＭＡＬＡＴ１、ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ、ｐ１６  ＩＮＫ４Ａ、ｃ−ＥＲＢＢ−２、ｐ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＲＢ１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ＳＭＡＤ２、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＤ４、ＩＧＦＲ２、ＴＣＦ１、ＫＲＡＳが挙げられる。腎臓がん関連遺伝子として、Ａｌｐｈａ、ＰＲＣＣ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＰＳＦ、ＣＬＴＣ、ＴＦＥ３、ｐ５４ｎｒｂ／ＮＯＮＯ、ＴＦＥＢが挙げられる。甲状腺がん関連遺伝子として、ＡＫＡＰ１０、ＮＴＲＫ１、ＡＫＡＰ９、ＲＥＴ、ＢＲＡＦ、ＴＦＧ、ＥＬＥ１、ＴＰＭ３、Ｈ４／Ｄ１０Ｓ１７０、ＴＰＲが挙げられる。卵巣がん関連遺伝子として、ＡＫＴ２、ＭＤＭ２、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＢＲＣＡ１、ＮＣＯＡ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ｐ５３、ＥＲＢＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＧＡＴＡ４、ＲＢ、ＨＲＡＳ、ＲＥＴ���ＫＲＡＳ、ＲＮＡＳＥＴ２が挙げられる。前立腺がん関連遺伝子として、ＡＲ、ＫＬＫ３、ＢＲＣＡ２、ＭＹＣ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＮＫＸ３．１、ＥＺＨ２、ｐ５３、ＧＳＴＰ１、ＰＴＥＮが挙げられる。骨腫瘍関連遺伝子として、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＮＢＰ、ＯＭＤ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＨＲＡＰ３、ＣＯＬ４Ａ５、ＵＳＰ６が挙げられる。
【００４７】
蛍光粒子を修飾する物質と蛍光粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。
【００４８】
また、蛍光粒子を修飾する物質と蛍光粒子の間を連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、Thermo Scientific社製ＳＭ（ＰＥＧ）１２を用いることができる。
【００４９】
蛍光物質内包シリカナノ粒子を表面修飾する場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Gelest社製PEG-silane no．SIM6492.7）等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。
【００５０】
蛍光有機色素内包ナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光有機色素内包ナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光有機色素内包ナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光有機色素内包ナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、EDC（1-Ethyl-3-［3-Dimethylaminopropyl］carbodiimide Hydrochloride：Pierce（登録商標）社製）のような縮合剤を用いることもできる。
【００５１】
必要により、有機分子で修飾された蛍光有機色素内包ナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつsulfo-SMCC（Sulfosuccinimidyl ４［N-maleimidomethyl］-cyclohexane-1-carboxylate：Pierce社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光有機色素内包ナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光有機色素内包ナノ粒子ができる。
【００５２】
蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基等の官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素、量子ドットを含浸することにより、官能基をもつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降EDC又はsulfo-SMCCを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。
【００５３】
〔染色方法〕
以下、表面修飾された蛍光粒子を用いて、パラフィン包埋された組織切片である組織標本の染色方法について述べるが、本発明はこれに限定されるものではなく、基板上に固定した細胞等の標本にも適用可能である。
また、以下に説明する染色方法が適用できる標本の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。
【００５４】
１）脱パラフィン工程
キシレンを入れた容器に組織標本を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に組織標本を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に組織標本を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
【００５５】
２）賦活化処理
公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％  尿素、０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０−１３０℃、時間は５−３０分で行うことができる。
次いで、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を入れた容器に、賦活化処理後の標本を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
【００５６】
３）表面修飾された蛍光粒子を用いた染色
染色試薬として、表面修飾された蛍光粒子を複数種類混合したＰＢＳ分散液（混合試薬）を準備する。混合する蛍光粒子は、内包する蛍光物質が発する蛍光を分離して撮像できる組み合わせのものを任意に選択可能であり、任意の種類数を選択して良いが、特に、蛍光物質の励起光の波長差及び発光の波長差が、共にできるだけ大きくなるように選択することが好ましい。
また、１分子の生体物質に対しては、蛍光粒子が１粒子のみ結合して、蛍光粒子が２粒子以上結合しないようにするために、蛍光粒子に内包される蛍光物質の種類のみが異なり、その他の構成（例えば、表面修飾の構造、ナノ粒子の素材、平均粒径、粒径の変動係数など）は同じとなるように作製された蛍光粒子を混合することが好ましい。
【００５７】
表面修飾された蛍光粒子のＰＢＳ分散液を複数種類混合した染色試薬を、組織標本に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光粒子の表面修飾を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
蛍光粒子による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
【００５８】
次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を浸漬させ、未反応蛍光粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。カバーガラスを組織標本に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
なお、ＨＥ染色試薬を用いて染色を行う場合、カバーガラスによる封入前にＨＥ染色を行う。
【００５９】
〔蛍光画像の取得〕
染色した組織標本に対し顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、広視野の顕微鏡画像（蛍光画像）を取得する。顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、蛍光染色に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
【００６０】
＜病理診断支援システム１００の動作（画像処理方法を含む。）＞
以下、病理診断支援システム１００において、上記説明した蛍光画像及び明視野画像を取得して解析を行う動作について説明する。ここでは、ＨＥ染色試薬及び細胞核に発現する特定のタンパク質（以下、特定タンパクと呼ぶ。）を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光粒子を含む２種類の染色試薬（以下、染色試薬Ａ及びＢとする）を同量ずつ混合した混合試薬を用いて染色された組織標本を観察対象とする場合を例にとり説明する。特定タンパクの１分子に対しては、混合試薬に含まれる蛍光粒子のうち１粒子のみが結合可能であるように、混合する染色試薬Ａ及びＢの種類を選択する。
【００６１】
まず、操作者は、ＨＥ染色試薬及び混合試薬を用いて組織標本を染色する。その後、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、（ａ１）〜（ａ６）の手順により明視野画像及び蛍光画像が取得される。
（ａ１）操作者は、ＨＥ染色試薬と、混合試薬とにより染色された組織標本をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置１Ａのスライド固定ステージに設置する。
（ａ２）明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
（ａ３）撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ４）ユニットを蛍光ユニットに変更する。
（ａ５）視野及び撮影倍率を変えずに、励起光及びフィルターを適宜選択して、染色試薬Ａに含まれる蛍光粒子を励起させた状態で撮像手段により撮影を行って、染色試薬Ａが発する蛍光を撮影した第一の蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ６）視野及び撮影倍率を変えずに、励起光及びフィルターを適宜選択して、染色試薬Ｂに含まれる蛍光粒子を励起させた状態で撮像手段により撮影を行って、染色試薬Ｂが発する蛍光を撮影した第二の蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
【００６２】
画像処理装置２Ａにおいては、（ａ３）、（ａ５）、及び（ａ６）で撮影された明視野画像、第一の蛍光画像、及び第二の蛍光画像に基づき画像解析処理が実行される。
図５に、画像処理装置２Ａにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図５に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【００６３】
まず、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの明視野画像が入力されると（ステップＳ１）、制御部２１は、明視野画像から細胞核の領域を抽出する（ステップＳ２）。
図６に、ステップＳ２における処理の詳細フローを示す。ステップＳ２の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【００６４】
ステップＳ２においては、ＨＥ染色により青色に染色された細胞核の領域を抽出するため、明視野画像を色分解して青色の成分を抽出し、モノクロ画像へ変換する（ステップＳ２０１）。なお、青色の成分のみを抽出するのではなく、青色を強調するような色相変換を行っても良い。図７（ａ）に、モノクロ画像に変換された明視野画像の一例を示す。
次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて閾値処理を施し、各画素の値を二値化した二値画像を生成する（ステップＳ２０２）。
【００６５】
次いで、ノイズ処理を行う（ステップＳ２０３）。ノイズ処理は、具体的には、二値画像にクロージング処理を施すことにより行うことができる。クロージング処理は、膨張処理を行ってから同じ回数分だけ収縮処理を行う処理である。膨張処理は、注目画素からｎ×ｎ画素（ｎは２以上の整数）の範囲内にある画素に１つでも白が含まれている場合に注目画素を白に置き換える処理である。収縮処理は、注目画素からｎ×ｎ画素の範囲内にある画素に１つでも黒が含まれている場合に注目画素を黒に置き換える処理である。クロージング処理により、ノイズ等の小さい領域を除去することができる。図７（ｂ）に示されように、ノイズ処理後には、細胞核が抽出された画像（細胞核画像）が生成される。
【００６６】
次いで、ノイズ処理後の画像にラベリング処理を施し、抽出された細胞核のそれぞれにラベルを付与する（ステップＳ２０４）。ラベリング処理とは、連結している画素に同じラベル（番号）を付与していくことで画像内のオブジェクトを識別する処理である。ラベリング処理により、ノイズ処理後の画像から各細胞核を識別してラベルを付与することができる。
【００６７】
次いで、図５の画像解析処理に戻り、通信Ｉ／Ｆ２４により、顕微鏡画像取得装置１Ａにより取得された蛍光画像（本実施の形態では、第一の蛍光画像及び第二の蛍光画像）が入力されると（ステップＳ３）、制御部２１は、入力された各蛍光画像から、輝点領域を抽出する（ステップＳ４）。
図８に、ステップＳ４における処理の詳細フローを示す。ステップＳ４の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【００６８】
ステップＳ４においては、まず、細胞自家蛍光や他の不要信号成分等のノイズ除去処理が施される（ステップＳ４０１）。ノイズ除去処理には、ガウシアンフィルター等のローパスフィルターや二次微分等のハイパスフィルターが好ましく用いられる。図９（ａ）に、ノイズ除去処理後の蛍光画像の一例を示す。
【００６９】
次いで、蛍光画像に閾値処理を施し、二値画像を生成して輝点領域を抽出する（ステップＳ４０２）。図９（ｂ）に、輝点領域が抽出された画像（輝点領域画像）の一例を示す。
次いで、抽出された輝点領域のそれぞれにラベルを付与するラベリング処理を施す（ステップＳ４０３）。
【００７０】
ステップＳ４０３の処理の終了後、図５の画像解析処理に戻り、輝点領域画像（図９（ｂ））と細胞核画像（図７（ｂ））を重ね合わせる加算処理が行われ、細胞核における輝点領域の分布が画像処理装置２Ａの表示部２３に表示されて（ステップＳ５）、ステップＳ２０４でラベリングされた各細胞核上に存在する輝点領域の数（輝点数）が算出される（ステップＳ６）。
【００７１】
次いで、制御部２１は、ステップＳ３で入力された全ての蛍光画像に基づいて輝点数を算出したか否かを判定する（ステップＳ７）。
全ての蛍光画像に基づいて輝点数を算出していない場合には（ステップＳ７：Ｎｏ）、ステップＳ４の処理に戻り、輝点数を算出していない蛍光画像に対してステップＳ４〜Ｓ６の画像処理を実行して、輝点数を算出する。
【００７２】
制御部２１が、全ての蛍光画像に基づいて輝点数が算出されたと判定すると（ステップＳ７：Ｙｅｓ）、ステップＳ６において蛍光画像ごとに算出された各細胞核上に存在する輝点数を加算して（ステップＳ８）、細胞核当りの総輝点数を算出する。
【００７３】
以上の本実施形態によれば、相異なる蛍光波長の蛍光物質を含む蛍光粒子を混合して染色された組織標本から、ステップＳ１〜Ｓ２の処理により細胞核の領域が抽出され、ステップＳ３〜Ｓ７の処理により、蛍光物質の波長毎に細胞核当りの輝点数が算出され、ステップＳ８の処理により、細胞核当たりの総輝点数が算出される。
【００７４】
本実施形態により算出される輝点数と、画像取得に用いる顕微鏡の分解能の関係を、図１０の模式図を用いて説明する。
図１０（ａ）は、同一種類の複数の特定タンパク３０Ａ及び３０Ｂの発現を示す顕微鏡画像の模式図であり、点線で示される円３１の直径Ｒは、蛍光画像の取得に用いる光学顕微鏡の分解能である。
【００７５】
図１０（ａ）のように分布している特定タンパク３０Ａ及び３０Ｂのそれぞれに、同一波長の蛍光を発する蛍光粒子３２Ａが結合すると、２つの蛍光粒子３２Ａによる蛍光輝点は、図１０（ｂ）に示されるように顕微鏡の分解能よりも近接しているため、２つの蛍光輝点を蛍光画像上で分離して観察することができない。従って、本実施形態の画像解析処理を実行すると、輝点数は１と算出される。
【００７６】
一方、図１０（ａ）のように分布している特定タンパク３０Ａ及び３０Ｂのそれぞれに、図１０（ｃ）に示されるように相異なる波長の蛍光を発する２種類の蛍光粒子３２Ａ及び３２Ｂが結合すると、特定タンパク３０Ａ及び３０Ｂは、異なる蛍光波長の蛍光粒子で染め分けられることとなる本実施形態の画像解析処理を実行すると、蛍光粒子３２Ａ及び３２Ｂの蛍光は別の蛍光画像上の蛍光輝点として撮影されることとなるため、蛍光粒子３２Ａ及び３２Ｂに基づく輝点が分離されて、輝点数は２と算出される。
【００７７】
混合する蛍光粒子の色数が多いほど、隣接する特定タンパクが異なる蛍光粒子により染め分けられる確率が増加するため、高密度に分布した蛍光物質を分離して算出される確率が高まり、正確な定量が可能となる。
【００７８】
なお、上記実施形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。
例えば、蛍光染色粒子を含む染色試薬は、３種類以上混合しても良い。また、特定タンパクの種類に応じて、特定タンパクが発現する領域を染色可能なＨＥ染色以外の染色方法を用いて、染色を行っても良い。
【００７９】
また、本実施の形態において、蛍光染色に用いられる蛍光物質は、蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を例として説明したが、これに限定されるものではなく、生体物質１分子に結合する蛍光物質の蛍光が顕微鏡画像上でドット状に観察される場合であれば、本発明の定量方法を適用することができる。
しかし、例えば生体物質１分子を有機蛍光色素１分子で蛍光染色したような場合には、有機蛍光色素１分子のわずかな蛍光を撮影できるように画像取得条件（露光時間、コントラスト等）を調整すると、細胞全体が蛍光を発するような画像となって蛍光輝点がドット状に得られないことが多い。一方、蛍光粒子は１粒子当たりの輝度値が高く、蛍光粒子１粒子に相当する蛍光輝点をドット状に観察することが容易であるという利点がある。また、蛍光粒子は、褪色を起こしにくいという観点からも、蛍光画像取得が容易である。以上のような観点から、本発明においては、蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いることが好ましい。
【００８０】
また、複数の蛍光粒子を混合する割合は任意であるが、隣接する特定タンパクが発光波長の異なる蛍光粒子で染色される確率を高めるためには、相異なる発光波長の蛍光粒子が同一濃度となるように混合することが好ましい。
しかし、例えば特定タンパクが非常に高密度に発現している場合や、画像取得に用いる顕微鏡の分解能が低い場合には、相異なる発光波長の蛍光粒子の濃度を異ならせて混合して用いることも有効である。例えば、図１０の円３１内に生体物質３０が１０個以上存在するような場合には、全ての生体物質３０を異なる発光波長の蛍光粒子で染色して識別することは事実上非常に困難であるが、２種類の染色試薬（染色試薬Ａ及びＢとする）の混合比率をＡ：Ｂ＝１：９として、染色試薬Ａの発する蛍光を撮影した蛍光画像から計測した輝点数の１０倍を、１細胞核当りの総輝点数とみなすという解析が可能である。
【００８１】
また、ステップＳ４において、輝点領域に含まれる蛍光粒子数を解析する画像処理を実行して、ステップＳ５〜Ｓ７において、細胞核当りの輝点数の代わりに、細胞核当りの蛍光粒子数を算出することとしても良い。輝点領域に含まれる蛍光粒子数の算出方法は任意である。
【００８２】
また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピュータ読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピュータ読み取り可能な媒体として、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬型記録媒体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ(搬送波)も適用される。
【００８３】
その他、病理診断支援システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
【実施例】
【００８４】
（Ａ）蛍光物質内包ナノ粒子の作製及び表面修飾
以下の（Ａ−１）〜（Ａ−３）の工程により、蛍光波長が異なる３種の蛍光物質をそれぞれ内包する蛍光物質内包ナノ粒子を作製し、ストレプトアビジンと結合させる表面修飾を行った。
【００８５】
（Ａ−１）Ａｌｅｘａ４８８内包ナノ粒子
蛍光物質としてＡｌｅｘａ４８８（ライフテクノロジーズ社製、励起波長４９０ｎｍ／蛍光波長５２５ｎｍ）２．５ｍｇを水２２．５ｍＬに加えた後、ホットスターラー上で70℃で20分間加熱し、メラミン樹脂ニカラックＭＸ−０３５(日本カーバイド工業社製、重量平均重合度：１．５)１．５ｇを加え、さらに５分間加熱撹拌した。ギ酸１００μLを加え、６０℃で２０分間加熱撹拌した後、室温で放冷した。冷却後、反応混合物を遠心用チューブに入れて遠心分離機に１２，０００ｒｐｍで２０分間かけ、上澄みを除去した。この粒子を１ｍＬの純水中に再分散して、Ａｌｅｘａ４８８内包ナノ粒子としてブチルヒドロキシトルエン・色素内包メラミン樹脂ナノ粒子を得た。
得られたＡｌｅｘａ４８８内包ナノ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製  Ｓ−８００型）で観察したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。
【００８６】
得られたＡｌｅｘａ４８８内包ナノ粒子０．１ｍｇをＥｔＯＨ１．５ｍＬ中に分散し、アミンプロピルトリメトキシシランＬＳ−３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。
次いで、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-［（N-maleomidopropionamid）-dodecaethyleneglycol］ester）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付いたＡｌｅｘａ４８８内包ナノ粒子を得た。
【００８７】
一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をN-succinimidyl S-acetylthioacetate（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、Ａｌｅｘａ４８８内包ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
上記のＡｌｅｘａ４８８内包ナノ粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、平均粒径１５０ｎｍのストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ４８８内包ナノ粒子を得た。
【００８８】
また、以上の平均粒径１５０ｎｍのストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ４８８内包ナノ粒子の作製及び表面修飾の工程において、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．４ｇとした他は同様にして、平均粒径５０ｎｍのストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ４８８内包ナノ粒子を得た。
【００８９】
（Ａ−２）Ａｌｅｘａ５９４内包ナノ粒子
（Ａ−１）の工程において、Ａｌｅｘａ４８８をＡｌｅｘａ５９４（ライフテクノロジーズ社製、最大励起波長５９４ｎｍ／最大蛍光波長５８０ｎｍ）に変更した他は同様にして、平均粒径１５０ｎｍ及び５０ｎｍの、ストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ５９４内包ナノ粒子を得た。
【００９０】
（Ａ−３）Ａｌｅｘａ６４７内包ナノ粒子
（Ａ−１）の工程において、Ａｌｅｘａ４８８をＡｌｅｘａ６４７（ライフテクノロジーズ社製、最大励起波長６５０ｎｍ／最大蛍光波長６６５ｎｍ）に変更した他は同様にして、平均粒径１５０ｎｍ及び５０ｎｍの、ストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ６４７内包ナノ粒子を得た。
【００９１】
（Ｂ）蛍光染色
＜実施例１＞
ホルマリン固定及びパラフィン包埋したヒト乳房組織から作製した病理切片を組織標本として用いた。組織標本を、キシレンを用いて脱パラフィン処理した後、オートクレーブ内で１２５℃で５分間賦活化及び、ＢＳＡ１％溶液でブロッキングした後、市販のＨＥ染色試薬を用いてＨＥ染色を施した。
【００９２】
ＨＥ染色後の組織標本に、１次抗体として抗ＨＥＲ２抗体（ベンタナ  パスウェーＨＥＲ２（４Ｂ５））３μｇ／ｍｌを室温で４０分反応させた後、マウス  ビオチン化２次抗体（ベンタナＤＡＢユニバーサルキット）６μｇ／ｍｌを室温で３０分反応させた。
１次抗体及び２次抗体と反応させた組織標本を、（Ａ）で作製したストレプトアビジン結合蛍光物質内包ナノ粒子のうち、平均粒径が１５０ｎｍの任意の蛍光波長のものを２種類選択して同量ずつ混合し、混合した合計濃度が０．２ｎＭとなるように調整したものを組織標本に反応させて、細胞膜に発現するタンパク質であるＨＥＲ２の蛍光染色を実施した。こののち、脱水操作及びエンテランニューによる封入を行った。
【００９３】
＜実施例２＞
実施例１において、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包ナノ粒子のうち、平均粒径が１５０ｎｍのもの３種類を同量ずつ混合し、混合した合計濃度が０．２ｎＭとなるように調整したものを組織標本に反応させて蛍光染色を実施した他は同様にして、ＨＥＲ２を蛍光染色した組織標本を作製した。
【００９４】
＜実施例３＞
実施例１において、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包ナノ粒子のうち、平均粒径が５０ｎｍの任意の蛍光波長のものを２種類選択して同量ずつ混合し、混合した合計濃度が０．２ｎＭとなるように調整したものを組織標本に反応させて蛍光染色を実施した他は同様にして、ＨＥＲ２を蛍光染色した組織標本を作製した。
【００９５】
＜実施例４＞
実施例３において、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包ナノ粒子のうち、平均粒径が５０ｎｍのもの３種類を同量ずつ混合し、混合した合計濃度が０．２ｎＭとなるように調整したものを組織標本に反応させて蛍光染色を実施した他は同様にして、ＨＥＲ２を蛍光染色した組織標本を作製した。
【００９６】
＜実施例５＞
実施例１において、１次抗体としてＫｉ６７（クローンＭＩＢ１、ＤＡＫＯ社製）３μｇ／ｍｌ、２次抗体としてマウス  ビオチン化２次抗体（ニチレイヒストファイン社製）６μｇ／ｍｌを用いた以外は同様にして、細胞核に発現するタンパク質であるＫｉ６７の蛍光染色を実施した。
【００９７】
＜実施例６＞
実施例５において、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包ナノ粒子のうち、平均粒径が５０ｎｍの任意の蛍光波長のものを２種類選択して同量ずつ混合し、混合した合計濃度が０．２ｎＭとなるように調整したものを組織標本に反応させて蛍光染色を実施した他は同様にして、Ｋｉ６７を蛍光染色した組織標本を作製した。
【００９８】
＜実施例７＞
実施例３において、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包ナノ粒子のうち、平均粒径が５０ｎｍのもの３種類を同量ずつ混合し、混合した合計濃度が０．２ｎＭとなるように調整したものを組織標本に反応させて蛍光染色を実施した他は同様にして、Ｋｉ６７を蛍光染色した組織標本を作製した。
【００９９】
＜比較例１＞
実施例１において、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包ナノ粒子のうち、平均粒径が１５０ｎｍの任意の蛍光波長のものを１種類用いて濃度が０．２ｎＭとなるように調整したものを組織標本に反応させて蛍光染色を実施した他は同様にして、ＨＥＲ２を蛍光染色した組織標本を作製した。
【０１００】
＜比較例２＞
比較例１において、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包ナノ粒子のうち、平均粒径が５０ｎｍの任意の蛍光波長のものを１種類用いて濃度が０．２ｎＭとなるように調整したものを組織標本に反応させて蛍光染色を実施した他は同様にして、ＨＥＲ２を蛍光染色した組織標本を作製した。
【０１０１】
＜比較例３＞
実施例５において、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包ナノ粒子のうち、平均粒径が１５０ｎｍの任意の蛍光波長のものを１種類用いて濃度が０．２ｎＭとなるように調整したものを組織標本に反応させて蛍光染色を実施した他は同様にして、Ｋｉ６７を蛍光染色した組織標本を作製した。
【０１０２】
＜比較例４＞
比較例３において、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包ナノ粒子のうち、平均粒径が５０ｎｍの任意の蛍光波長のものを１種類用いて濃度が０．２ｎＭとなるように調整したものを組織標本に反応させて蛍光染色を実施した他は同様にして、Ｋｉ６７を蛍光染色した組織標本を作製した。
【０１０３】
（Ｃ）画像の取得及び画像解析処理
＜画像の取得＞
蛍光染色を施した実施例１〜７及び比較例１〜４の組織標本の蛍光画像及び明視野画像を、蛍光顕微鏡（カールツァイス社製、Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ２）及び超解像顕微鏡（ニコン社製、Ｎ−ＳＩＭ）を用いて、それぞれ取得した。
なお、本実施例で用いた蛍光顕微鏡の分解能は約２００ｎｍ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光を観察する場合のＲｅｙｌｅｉｇｈの分解能は３３４ｎｍ）、超解像顕微鏡の分解能は約１００ｎｍ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光を観察する場合のＲｅｙｌｅｉｇｈの分解能は８５ｎｍ）であった。
【０１０４】
蛍光画像は、蛍光染色に用いたストレプトアビジン結合蛍光物質内包ナノ粒子の種類ごとに蛍光画像を取得した。蛍光画像の取得において用いる励起光及び蛍光検出用光学フィルターは、以下のように選択した。
Ａｌｅｘａ４８８内包ナノ粒子の蛍光を撮影した蛍光画像は、励起波長４８８ｎｍの励起光下、中心波長４８２ｎｍ、平均透過率９０％以上の波長幅３２ｎｍの励起フィルター、エッジ波長５０６ｎｍのダイクロイックミラー、中心波長５４０ｎｍ、平均透過率９３％以上の波長幅５０ｎｍの吸収フィルターを用いて取得した。
Ａｌｅｘａ５９４内包ナノ粒子の蛍光を撮影した蛍光画像は、励起波長５９０ｎｍの励起光下、中心波長５８６ｎｍ、平均透過率９０％以上の波長幅１５ｎｍの励起フィルター、エッジ波長５９９．５ｎｍのダイクロイックミラー、中心波長６２４ｎｍ、平均透過率９３％以上の波長幅４０ｎｍの吸収フィルターを用いて取得した。
Ａｌｅｘａ６４７内包ナノ粒子の蛍光を撮影した蛍光画像は、励起波長６３３ｎｍの励起光下、中心波長６２８ｎｍ、平均透過率９３％以上の波長幅４０ｎｍの励起フィルター、エッジ波長６６０ｎｍのダイクロイックミラー、中心波長６９２ｎｍ、平均透過率９３％以上の波長幅４０ｎｍの吸収フィルターを用いて取得した。
【０１０５】
蛍光顕微鏡および超解像顕微鏡を用いて画像を取得した後、組織標本を真空乾燥及びカーボン蒸着し、蛍光画像及び明視野画像を取得したのとほぼ同一の領域から、走査型電子顕微鏡（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、ＦＥ−ＳＥＭ、ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｓ−４５００）を用いてＳＥＭ画像を取得した。
【０１０６】
＜画像解析処理＞
取得した蛍光画像及び明視野画像に対して、図５の画像解析処理を実行した。
具体的には、まず、ＨＥＲ２を蛍光染色した実施例１〜４及び比較例１〜２においては、明視野画像からエオジンによる染色に基づいて細胞の領域を抽出し、Ｋｉ６７を染色した実施例５〜７及び比較例３〜４においては、明視野画像からヘマトキシリンによる染色に基づいて細胞核の領域を抽出した。
また、輝点数の計測（図５、ステップＳ３〜６）では、予め設定された上限閾値および下限閾値に基づいて、取得した蛍光画像から輝点領域が抽出された２値化画像を作成した。作成された２値化画像に、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフト「Ｇ−ｃｏｕｎｔ」を用いて、細胞１０００個について１細胞当たりの輝点数を算出し、平均値を算出した。
【０１０７】
（Ｄ）実験結果
電子顕微鏡で観察された細胞又は細胞核１個当たりの蛍光粒子数の絶対値及び、電子顕微鏡で観察された細胞又は細胞核１個当たりの蛍光粒子数の絶対値を１００（％）とした場合の、同一標本において蛍光顕微鏡及び超解像顕微鏡で観察された細胞又は細胞核１個当たりの輝点数（輝点抽出率：％）を、表１に示す。なお、電子顕微鏡で観察された蛍光粒子数の絶対値は、蛍光粒子数の真値であると見做すことができ、輝点抽出率が１００（％）に近いほど、蛍光粒子数の絶対値に近い輝点数が算出されて定量精度が高いと考えられる。
【０１０８】
【表１】
0006372370.tif 000002
【０１０９】
蛍光染色に用いた蛍光粒子の色数が１つである比較例１〜４においては、通常の光学顕微鏡（分解能２００ｎｍ）を用いて取得された蛍光画像から算出される輝点抽出率は、最大でも比較例１の７５％であった。また、分解能が約１００ｎｍである超解像顕微鏡を用いて取得された蛍光画像から算出される輝点抽出率は、蛍光粒子の平均粒径が１５０ｎｍである場合（比較例１及び３）には９５％、蛍光粒子の平均粒径が５０ｎｍの場合（比較例２及び４）には４６〜６３％であり、蛍光画像の取得に用いた顕微鏡の分解能よりも蛍光粒子の平均粒径が小さい場合には、近接した複数の粒子が分離して観察できない確率が高く、複数の蛍光粒子が発する蛍光が１つの輝点として計測されていることが示唆される。
一方、蛍光粒子の色数が２〜３である実施例１〜７によれば、汎用顕微鏡及び超解像顕微鏡を用いて取得された蛍光画像から算出される輝点抽出率はいずれも増加し、電子顕微鏡で観察された細胞又は細胞核１個当たりの蛍光粒子数の絶対値に近い数の輝点数が算出された。
【０１１０】
また、実施例１と２、実施例３と４、実施例６と７をそれぞれ比較することにより、用いる蛍光粒子の色数が増えるほど、汎用顕微鏡及び超解像顕微鏡を用いて取得された蛍光画像から算出される輝点抽出率が増加し、定量精度が高い。
【０１１１】
また、蛍光粒子の平均粒径が５０ｎｍである場合には、平均粒径が１５０ｎｍである場合と比較して、電子顕微鏡で観察される細胞又は細胞核１個当たりの蛍光粒子数の絶対値が増加することから、蛍光粒子数は生体物質の発現をより正確に反映すると考えられる。
【０１１２】
蛍光染色に用いる蛍光粒子の色数が１つである場合には、蛍光粒子が高密度に分布するほど、近接した蛍光粒子の１つ１つを分離した輝点として観察できない可能性が高まる。そのため、生体物質に結合している蛍光粒子数が増加する一方で、輝点抽出率は減少し、結果として、検出できる輝点数には限界があるため定量精度が高まるとは限らなかった。しかし、本発明の方法によれば、顕微鏡の分解能の範囲内に複数の蛍光粒子が存在する場合であっても、分離した輝点として観察できる可能性が高く、輝点抽出率が高いため、平均粒径が超解像顕微鏡の分解能（１００ｎｍ）以下の蛍光粒子を用いた染色であっても高精度の定量が可能である。
【０１１３】
また、構造化照明法を用いた超解像顕微鏡により取得された蛍光画像から算出された輝点抽出率は、実施例においては常に８０％以上と高い値であり、定量精度が高い。
【０１１４】
また、比較例１〜４によれば、染色対象がＫｉ６７である場合には、ＨＥＲ２である場合と比較して、特に輝点抽出率が少ない。これは、染色対象がＫｉ６７のように高密度に発現する核タンパクの場合には、蛍光粒子の間隔が狭い場合が多いため、複数の蛍光粒子が発する蛍光が１つの輝点として計測される確率が特に高いことによると推測される。
しかし、比較例３と実施例５、及び、比較例４と実施例６〜７をそれぞれ比較すると、本発明の方法によれば、染色対象がＫｉ６７であっても輝点抽出率が高い。
【０１１５】
また、染色に用いる蛍光粒子の色数が増加した場合の輝点抽出率の変化を検討すると、染色対象がＫｉ６７である場合には特に輝点抽出率が増加した。  具体的には、例えば、平均粒径が１５０ｎｍの蛍光粒子を用いて、色数を１つから２つに増加した場合の汎用顕微鏡を用いた輝点抽出率は、染色対象がＨＥＲ２である場合には１．１倍（７５％（比較例１）から８２％（実施例１）に増加）であったのに対し、染色対象がＫｉ６７である場合には２．７倍（２３％（比較例３）から６２％（実施例４）に増加）であった。
つまり、本発明の生体物質定量方法は、特に高密度に発現する生体物質（例えば、Ｋｉ６７）の定量において特に効果が高い。Ｋｉ６７の他に、例えば、ＥＲなどの核タンパクの定量においても、同様に高い効果が得られると考えられる。
【０１１６】
以上のように、本発明の生体物質定量方法によれば、蛍光画像の取得に用いる顕微鏡の分解能が蛍光粒子の平均粒径よりも小さい場合であっても、近接した複数の蛍光粒子を分離して計測できる確率が高いため、蛍光粒子の輝点数に基づく生体物質の発現量の定量精度を高めることができる。
【０１１７】
また、本発明の方法で定量される生体物質の種類は、実施例で示されたＨＥＲ２、Ｋｉ６７に限定されるものではない。また、診断対象となる病変（がん）種に応じて、蛍光画像を取得する際の生体物質認識部位を異なるものとすれば、病変種に応じた生体物質の発現量を定量的に示す特徴量を医師に提供することが可能となる。
【符号の説明】
【０１１８】
１Ａ    顕微鏡画像取得装置
２Ａ    画像処理装置
３Ａ    ケーブル
２１    制御部（入力手段、定量手段、加算手段）
２２    操作部
２３    表示部
２４    通信Ｉ／Ｆ
２５    記憶部
２６    バス
３０Ａ、３０Ｂ  特定タンパク
３２Ａ、３２Ｂ  蛍光粒子
１００  病理診断支援システム
【図１】
0006372370.tif 000003
【図２】
0006372370.tif 000004
【図３】
0006372370.tif 000005
【図４】
0006372370.tif 000006
【図５】
0006372370.tif 000007
【図６】
0006372370.tif 000008
【図７】
0006372370.tif 000009
【図８】
0006372370.tif 000010
【図９】
0006372370.tif 000011
【図１０】
0006372370.tif 000012
【図１１】
0006372370.tif 000013