(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物に大腸炎又は大腸癌を自然発症させる方法であって、前記非ヒト動物のＴ細胞特異的にＲＡＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１ａ（Ｒａｐ１ａ）及びＲＡＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１ｂ（Ｒａｐ１ｂ）を欠損させる工程を備える方法。
【請求項２】
Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損させる前記工程が、以下のいずれかの非ヒト動物同士、又は以下のいずれかの非ヒト動物とＲａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物とを交配させてＴ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した非ヒト動物を得る工程である、請求項１に記載の方法：
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物。
【請求項３】
Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞を移植した免疫不全非ヒト動物である、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物。
【請求項４】
Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞を免疫不全非ヒト動物に移植する工程を備える、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物の製造方法。
【請求項５】
被検物質の存在下又は非存在下で、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球の、Ｌ−セレクチンリガンド上、Ｍｕｃｏｓａｌ  Ａｄｄｒｅｓｓｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＭａｄＣＡＭ−１）上又はＰ−セレクチン上におけるローリング活性を測定する工程と、
前記被検物質の存在下における前記ローリング活性が、前記被検物質の非存在下における前記ローリング活性と比較して低下した場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、
を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
被検物質の投与下又は非投与下で、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した非ヒト動物、又はＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞を移植した免疫不全非ヒト動物を飼育する工程と、
前記非ヒト動物の大腸炎又は大腸癌の発症の程度を測定する工程と、
前記被検物質の投与下における大腸炎又は大腸癌の発症の程度が、前記被検物質の非投与下における大腸炎又は大腸癌の発症の程度と比較して低下した場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、
を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
被検物質の存在下又は非存在下で、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球を培養する工程と、
前記リンパ球におけるＥｚｒｉｎ／Ｒａｄｉｘｉｎ／Ｍｏｅｓｉｎ（ＥＲＭ）タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、
前記被検物質の存在下における前記リン酸化レベルが、前記被検物質の非存在下における前記リン酸化レベルと比較して上昇していた場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、
を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
被検物質の存在下又は非存在下で、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球を培養する工程と、
前記リンパ球におけるＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ（ＬＯＫ）タンパク質のキナーゼ活性を測定する工程と、
前記被検物質の存在下における前記キナーゼ活性が、前記被検物質の非存在下における前記キナーゼ活性と比較して上昇していた場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、
を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
潰瘍性大腸炎やクローン病等の炎症性腸疾患は原因が不明の難病である。特に潰瘍性大腸炎では癌が発生しやすく、発癌に至るメカニズムも未解明である。
【０００３】
大腸炎又は大腸癌の治療法を開発するためには、大腸炎及び大腸癌を発症するモデル動物を用いることが有用である。大腸炎を発症するモデル動物として、２％デキストラン硫酸塩を含む水を、マウスに１週間飲ませることにより、潰瘍性大腸炎を誘導するというマウスモデルが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Okayasu I., et al., A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice., Gastroenterology, 98 (3), 694-702, 1990.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１に記載されたマウスモデルでは大腸癌はほとんど発生しない。そこで、本発明は、大腸炎及び大腸癌を自然発症するモデル非ヒト動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
（１）Ｔ細胞特異的にＲＡＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１ａ（Ｒａｐ１ａ）及びＲＡＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１ｂ（Ｒａｐ１ｂ）を欠損した、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物。
（２）以下のいずれかの非ヒト動物：
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物。
（３）Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞。
（４）（１）に記載の大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物から採取した、（３）に記載のＴ細胞。
（５）（３）又は（４）に記載のＴ細胞を移植した免疫不全非ヒト動物である、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物。
（６）（２）に記載の非ヒト動物同士、又は（２）に記載の非ヒト動物とＲａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物とを交配させて、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した非ヒト動物を得る工程を備え、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した前記非ヒト動物が大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物である、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物の製造方法。
（７）（３）又は（４）に記載のＴ細胞を免疫不全非ヒト動物に移植する工程を備える、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物の製造方法。
（８）被検物質の存在下又は非存在下で、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球の、Ｌ−セレクチンリガンド上、Ｍｕｃｏｓａｌ  Ａｄｄｒｅｓｓｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＭａｄＣＡＭ−１）上又はＰ−セレクチン上におけるローリング活性を測定する工程と、前記被検物質の存在下における前記ローリング活性が、前記被検物質の非存在下における前記ローリング活性と比較して低下した場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法。
（９）被検物質の投与下又は非投与下で、（１）又は（５）に記載の大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物を飼育する工程と、前記非ヒト動物の大腸炎又は大腸癌の発症の程度を測定する工程と、前記被検物質の投与下における大腸炎又は大腸癌の発症の程度が、前記被検物質の非投与下における大腸炎又は大腸癌の発症の程度と比較して低下した場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法。
（１０）被検物質の存在下又は非存在下で、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球を培養する工程と、前記リンパ球におけるＥｚｒｉｎ／Ｒａｄｉｘｉｎ／Ｍｏｅｓｉｎ（ＥＲＭ）タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、前記被検物質の存在下における前記リン酸化レベルが、前記被検物質の非存在下における前記リン酸化レベルと比較して上昇していた場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法。
（１１）被検物質の存在下又は非存在下で、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球を培養する工程と、前記リンパ球におけるＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ（ＬＯＫ）タンパク質のキナーゼ活性を測定する工程と、前記被検物質の存在下における前記キナーゼ活性が、前記被検物質の非存在下における前記キナーゼ活性と比較して上昇していた場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、大腸炎及び大腸癌を自然発症するモデル非ヒト動物を提供することができる。当該モデル非ヒト動物は、大腸炎又は大腸癌の発症機構の解明や治療法の開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図２】実験例２のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図３】実験例３のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図４】実験例４のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図５】実験例５のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図７】実験例７のデタッチメントアッセイの結果を示すグラフである。
【図８】（ａ）及び（ｂ）は、実験例８のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図９】実験例９の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１０】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１０のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図１１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１１の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｃ）は、実験例１１においてテザー様の膜の伸長を示す細胞の割合を示すグラフである。
【図１２】実験例１２において、Ｌ−セレクチンの局在を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１３】（ａ）は、実験例１３において、アクチンポリメライゼーションのマーカーである、ＬｉｆｅＡｃｔ−ｍＣｈｅｒｒｙを導入した対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞の顕微鏡写真である。（ｂ）及び（ｃ）は、実験例１３の結果を示すグラフである。
【図１４】実験例１４の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１５】実験例１５の結果を示す共焦点顕微鏡画像である。
【図１６】実験例１６の結果を示すグラフである。
【図１７】実験例１６において、Ｔ細胞が腸間膜リンパ節内の高内皮細静脈に接着した様子を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１８】（ａ）〜（ｃ）は、実験例１７の結果を示すグラフである。
【図１９】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１８の結果を示すグラフである。
【図２０】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１９のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図２１】（ａ）〜（ｄ）は、実験例２０の結果を示すグラフである。
【図２２】（ａ）〜（ｃ）は、実験例２１のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図２３】（ａ）〜（ｃ）は、実験例２２の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２３のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図２５】実験例２４において、Ｒａｐ１−／−マウス及び対照としてのＲａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆマウスの体重の変化を測定したグラフである。
【図２６】実験例２４において、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの代表的な結腸の形態を示す写真である。
【図２７】実験例２４において、Ｒａｐ１−／−マウスの大腸炎によるダメージを光学顕微鏡観察に基づいて評価した結果を示すグラフである。
【図２８】（ａ）〜（ｈ）は、実験例２４において、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの結腸のパラフィン包埋組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色し、光学顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図２９】（ａ）は、実験例２４において、Ｒａｐ１−／−マウスの大腸の炎症部位における陰窩膿瘍を示す顕微鏡写真である（倍率４０倍）。（ｂ）は、実験例２４において、Ｒａｐ１−／−マウスの大腸における類上皮細胞肉芽腫を示す顕微鏡写真である（倍率４０倍）。
【図３０】（ａ）は、実験例２５のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２５において、Ｒａｐ１−／−マウスの結腸粘膜固有層のＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−４産生細胞の割合を示すグラフである。
【図３１】実験例２６において、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウス由来のＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞の［３Ｈ］−チミジン取り込み量を示すグラフである。
【図３２】実験例２７において、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウス由来のＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞のサイトカイン産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図３３】実験例２８の結果を示すグラフである。
【図３４】実験例２９のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図３５】実験例３０のＴｒｅｇ抑制アッセイの結果を示すグラフである。
【図３６】実験例３１のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図３７】実験例３１のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図３８】実験例３２のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図３９】実験例３３のデタッチメントアッセイの結果を示すグラフである。
【図４０】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３４のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図４１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３５のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図４２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３６のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図４３】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３７の結果を示す写真である。
【図４４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３８のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図４５】実験例３９のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図４６】実験例４０の結果を示すグラフである。
【図４７】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４１の結果を示す顕微鏡写真である。
【図４８】実験例４２のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図４９】実験例４３のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図５０】実験例４４のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図５１】実験例４５のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図５２】実験例４６のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図５３】実験例４７のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図５４】実験例４８のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図５５】実験例４９のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図５６】実験例５０のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図５７】実験例５１のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図５８】実験例５２のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図５９】実験例５２において、ローリング活性を測定した結果を示すグラフである。
【図６０】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５２において、フロー接着アッセイを行った結果を示すグラフである。
【図６１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５３におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。（ｃ）は、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４産生細胞の割合を百分率で示したグラフである。
【図６２】実験例５４のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図６３】（ａ）は、実験例５５における共焦点顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例５５において、１分間に１回以上ブレブ形成した細胞の割合を百分率で示したグラフである。
【図６４】実験例５６のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図６５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５７のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図６６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５８のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図６７】実験例５９において、細胞を移植していないマウス、ベクターのみを導入したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を移植したマウス（対照）、及びＥｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を導入したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を移植したマウスの体重の変化を測定したグラフである。
【図６８】実験例６０において、マウスの大腸炎によるダメージを光学顕微鏡観察に基づいて評価した結果を示すグラフである。
【図６９】実験例６０において、細胞を移植したマウスの大腸の顕微鏡写真である。
【図７０】実験例６１の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図７１】実験例６２の結果を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図７２】実験例６２の結果を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図７３】実験例６２の結果を示す共焦点顕微鏡画像である。
【図７４】実験例６３において、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を基礎としたＲａｐ１活性のセンサーを対照細胞に導入し、ＣＸＣＬ１２で刺激した結果を示す画像である。
【図７５】実験例６４の結果を示す図である。
【図７６】実験例６５のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図７７】実験例６６のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図７８】実験例６７のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図７９】実験例６８のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図８０】実験例６９のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図８１】実験例７０のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図８２】実験例７１のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図８３】実験例７２の結果を示すグラフである。
【図８４】実験例７２の結果を示すグラフである。
【図８５】実験例７３の結果を示すグラフである。
【図８６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例７４の結果を示すグラフである。
【図８７】実験例７５の結果を示す写真である。
【図８８】実験例７６のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図８９】実験例７７において、対照細胞又はＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞のＬＳ１２細胞上におけるローリングの速度を測定した結果を示すグラフである。
【図９０】実験例７８のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図９１】実験例７９において、対照細胞又はＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞を抗ＬＦＡ−１抗体で前処理し、ＬＳ１２細胞上におけるローリングの速度を測定した結果を示すグラフである。
【図９２】実験例８０のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図９３】実験例８１のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図９４】実験例８２のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図９５】実験例８２において、ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞及びＦＬＮａ−／−Ｔ細胞の、ＣＣＬ２１の非存在下、ＬＳ１２内皮細胞上でのローリングの速度に対する抗ＬＦＡ−１抗体の影響を検討した結果を示すグラフである。
【図９６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例８３のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図９７】（ａ）〜（ｄ）は、実験例８４の結果を示すグラフである。
【図９８】（ａ）及び（ｂ）は、実験例８５のトランスウェルマイグレーションアッセイの結果を示すグラフである。
【図９９】（ａ）〜（ｃ）は、実験例８６のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図１００】実験例８７のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図１０１】実験例８８のフロー接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図１０２】実験例８９の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物を提供する。本実施形態の大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物は、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損している。
【００１０】
実施例において後述するように、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したマウスは、大腸炎及び大腸癌を自然発症する。したがって、本実施形態のモデル非ヒト動物は、大腸炎及び大腸癌を自然発症するモデル非ヒト動物として有用である。
【００１１】
非ヒト動物としては、特に制限されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ニワトリ等が挙げられる。本実施形態のモデル非ヒト動物は、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損している。例えば、マウスＲａｐ１ａ遺伝子のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＭ＿１４５５４１であり、マウスＲａｐ１ｂ遺伝子のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＭ＿０２４４５７である。非ヒト動物がマウス以外の動物である場合には、各動物種におけるＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂが欠損していればよい。
【００１２】
本実施形態のモデル非ヒト動物において、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損しているとは、機能的なＲａｐ１ａタンパク質及びＲａｐ１ｂタンパク質の発現が抑制されているか、又は欠損していることを意味する。例えばゲノム上のＲａｐ１ａアレルの一部又は全部、及びＲａｐ１ｂアレルの一部又は全部が欠失（ノックアウト）していてもよいし、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等の導入によりＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂの発現が抑制（ノックダウン）されていてもよい。
【００１３】
Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損させる方法としては、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ−ＬｏｘＰシステムを用いる方法が挙げられる。例えば、Ｒａｐ１ａアレル及びＲａｐ１ｂアレルのそれぞれを、Ｃｒｅリコンビナーゼの標的配列であるＬｏｘＰ配列で挟んだ非ヒト動物（ｆｌｏｘ非ヒト動物）（以下、「Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物」という場合がある。）と、Ｔ細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードする遺伝子を連結した発現ユニットを導入した非ヒト動物とを交配させる方法が挙げられる。
【００１４】
Ｔ細胞特異的に発現する遺伝子としては、例えば、ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（Ｌｃｋ）、ＣＤ４等が挙げられる。以下、Ｌｃｋ遺伝子のプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードする遺伝子を連結した発現ユニットを有する非ヒト動物を「Ｌｃｋ−Ｃｒｅ非ヒト動物」という場合がある。また、ＣＤ４遺伝子のプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードする遺伝子を連結した発現ユニットを有する非ヒト動物を「ＣＤ４−Ｃｒｅ非ヒト動物」という場合がある。
【００１５】
Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物と、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ非ヒト動物又はＣＤ４−Ｃｒｅ非ヒト動物とを交配させると、子孫の中に、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した非ヒト動物が出現する。
【００１６】
この過程についてより詳細に説明する。例として、Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物とＣＤ４−Ｃｒｅ非ヒト動物とを交配させる場合について説明する。Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物とＣＤ４−Ｃｒｅ非ヒト動物とを交配させて得られた一代雑種（Ｆ１）の遺伝子型はＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔであり、表現型は正常である。
【００１７】
続いて、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物とＲａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物とを交配させると、子孫の中にＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物が出現する。ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物はＴ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損する。
【００１８】
ここで、ＣＤ４−Ｃｒｅ非ヒト動物の代わりにＬｃｋ−Ｃｒｅ非ヒト動物を用いる場合には、上記説明における「ＣＤ４−Ｃｒｅ」を「Ｌｃｋ−Ｃｒｅ」と読み読み替えればよい。また、上記以外の遺伝子型の非ヒト動物を交配させることによってもＴ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した非ヒト動物を得ることができる。詳細については後述する。
【００１９】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞を移植した免疫不全非ヒト動物である、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物を提供する。
【００２０】
Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞については後述する。実施例において後述するように、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞を、放射線照射により免疫系を破壊したマウスに移植すると、自発的な大腸炎及び大腸癌の発症が認められた。
【００２１】
したがって、本実施形態のモデル非ヒト動物は、大腸炎及び大腸癌を自然発症するモデル非ヒト動物として有用である。
【００２２】
免疫不全非ヒト動物としては、例えば、放射線照射マウス、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス）等が挙げられる。
【００２３】
本実施形態のモデル非ヒト動物において、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞の種と、免疫不全非ヒト動物の種とは、同一であってもよく異なっていてもよい。例えば、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞がヒト由来であり、免疫不全非ヒト動物がマウスであってもよい。
【００２４】
［非ヒト動物］
１実施形態において、本発明は、以下のいずれかの非ヒト動物を提供する。
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物。
【００２５】
ここで、「ｗｔ」は遺伝子座が野生型であることを意味する。これらの非ヒト動物は、例えば、Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物と、ＣＤ４−Ｃｒｅ非ヒト動物又はＬｃｋ−Ｃｒｅ非ヒト動物とを交配させることにより、その子孫の中から得ることができる。
【００２６】
上記の非ヒト動物のうち、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物は、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損し、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物となる。
【００２７】
上記の非ヒト動物のうち、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物以外の非ヒト動物の表現型は正常である。表現型が正常である非ヒト動物は、大腸炎又は大腸癌を発症しないため維持が容易である。
【００２８】
必要に応じて上記の非ヒト動物のいずれか同士、又は上記の非ヒト動物のいずれかとＲａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物とを交配させることにより、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物を容易に得ることができる。
【００２９】
より具体的には、上記の非ヒト動物のいずれか同士、又は上記の非ヒト動物のいずれかとＲａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物とを交配させると、子孫の中にＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物が出現する。これらの非ヒト動物は、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損し、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物となる。
【００３０】
したがって、上記の非ヒト動物及びＲａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物は、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物製造用非ヒト動物であるということもできる。
【００３１】
ここで、「これらの非ヒト動物のいずれか同士を交配させる」とは、これらの非ヒト動物から選択される１種同士を交配させること、及びこれらの非ヒト動物から選択される１種と、これらの非ヒト動物から選択される当該１種以外の非ヒト動物とを交配させることを含む。
【００３２】
より詳細には、以下の非ヒト動物から選択されるいずれか１種同士を交配させると、子孫の中にＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物が出現する。なお、以下の非ヒト動物は、上述した非ヒト動物のうち、Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔ又はＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔの遺伝子型を有しないものである。
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物。
【００３３】
また、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、及び
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
からなる群より選択される１種の非ヒト動物と、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、及び
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
からなる群より選択される１種の非ヒト動物とを交配させると、子孫の中に、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した非ヒト動物が出現する。
【００３４】
［Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞］
１実施形態において、本発明は、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞を提供する。実施例において後述するように、本実施形態のＴ細胞を免疫不全非ヒト動物に移植することによっても、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物を作製することができる。
【００３５】
本実施形態のＴ細胞は、例えば、上述した第１実施形態の大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物から採取したＴ細胞であってもよい。非ヒト動物からのＴ細胞の採取は、常法により行うことができる。例えば、ヒト又は非ヒト動物の血液等から採取したリンパ球を、Ｔ細胞を特異的に認識する抗体で染色し、Ｔ細胞をセルソーターで分取してもよいし、磁気ビーズ及びマグネットスタンド等を用いて分取してもよい。
【００３６】
本実施形態のＴ細胞はヒト由来であってもよく、非ヒト動物由来であってもよい。また、本実施形態のＴ細胞は、初代細胞であってもよく、樹立された細胞株であってもよい。
【００３７】
本実施形態のＴ細胞は、例えばゲノム上のＲａｐ１ａアレルの一部又は全部、及びＲａｐ１ｂアレルの一部又は全部が欠失（ノックアウト）したＴ細胞であってもよい。あるいは、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等の導入によりＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂの発現が抑制された（ノックダウンされた）Ｔ細胞であってもよい。
【００３８】
例えば、ヒトＲａｐ１ａ遺伝子のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＭ＿００１０１０９３５であり、ヒトＲａｐ１ｂ遺伝子のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＭ＿００１０１０９４２である。本実施形態のＴ細胞の種がヒト以外の動物である場合には、各動物種におけるＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂが欠損していればよい。
【００３９】
［大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物の製造方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、以下のいずれかの非ヒト動物同士、又は以下のいずれかの非ヒト動物とＲａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物とを交配させて、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した非ヒト動物を得る工程を備え、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した前記非ヒト動物が大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物である、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物の製造方法を提供する。
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／−Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｗｔ／ｗｔＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｗｔＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物、
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋／＋Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｗｔ／ｗｔ非ヒト動物。
【００４０】
大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物は、上記の非ヒト動物、Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ非ヒト動物、ＣＤ４−Ｃｒｅ非ヒト動物等としてそれぞれ維持しておくことができる。特に、表現型が正常である非ヒト動物は、大腸炎又は大腸癌を発症しないため維持が容易である。そして、必要な時にこれらの非ヒト動物を交配させることにより、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物を製造することができる。
【００４１】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、上述した、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞を免疫不全非ヒト動物に移植する工程を備える、大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物の製造方法を提供する。
【００４２】
本実施形態の製造方法によっても大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物を製造することができる。
【００４３】
［大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、被検物質の存在下又は非存在下で、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球の、Ｌ−セレクチンリガンド上、ＭａｄＣＡＭ−１上又はＰ−セレクチン上におけるローリング活性を測定する工程と、前記被検物質の存在下における前記ローリング活性が、前記被検物質の非存在下における前記ローリング活性と比較して低下した場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００４４】
被検物質としては、例えば化合物ライブラリー等を用いることができ、後述する他の実施形態のスクリーニング方法においても同様である。
【００４５】
Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球は、上述した、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したＴ細胞であってもよい。あるいは、初代細胞又は細胞株であるリンパ球細胞において、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂをノックアウト又はノックダウンした細胞であってもよい。ここで、リンパ球細胞はＴ細胞であってもよく、例えばＢ細胞等のＴ細胞以外のリンパ球であってもよい。
【００４６】
本実施形態のスクリーニング方法において、「Ｌ−セレクチンリガンド上」とは、例えばＬ−セレクチンタンパク質のリガンド、すなわち、末梢リンパ節アドレッシン（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｏｄｅ  ａｄｄｒｅｓｓｉｎ、ＰＮＡｄ）分子を発現した血管内皮細胞表面であってもよく、末梢リンパ節アドレッシン分子をコートした支持体表面等であってもよい。
【００４７】
末梢リンパ節アドレッシン分子としては、例えばＧｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＧｌｙＣＡＭ）、Ｎｅｐｍｕｃｉｎ（ＣＤ３００ＬＧ）、６硫酸化シアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）等が挙げられる。
【００４８】
また、「ＭａｄＣＡＭ−１上」とは、例えばＭａｄＣＡＭ−１タンパク質を発現した血管内皮細胞表面であってもよく、ＭａｄＣＡＭ−１タンパク質をコートした支持体表面等であってもよい。例えばマウスＭａｄＣＡＭ−１タンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿０３８６１９であり、ヒトＭａｄＣＡＭ−１タンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿５７０１１６である。
【００４９】
また、「Ｐ−セレクチン上」とは、例えばＰ−セレクチンタンパク質を発現した血管内皮細胞表面であってもよく、Ｐ−セレクチンタンパク質をコートした支持体表面等であってもよい。例えばマウスＰ−セレクチンタンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿０３５４７７であり、ヒトＰ−セレクチンタンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿００２９９６である。
【００５０】
ローリングとは、リンパ球がＬ−セレクチンリガンド上、ＭａｄＣＡＭ−１上又はＰ−セレクチン上等の表面を転がる現象である。ローリング活性が上昇するとは、ローリングが発生する頻度が上昇することを意味し、ローリング活性が低下するとは、ローリングが発生する頻度が低下することを意味する。ローリングが発生する頻度は、例えば、単位時間あたりにリンパ球がローリングを起こした回数を測定すること等により測定することができる。
【００５１】
より具体的には、例えば、上記のＬ−セレクチンリガンド、ＭａｄＣＡＭ−１又はＰ−セレクチンを有する表面を備えたチャンバー内にリンパ球を入れて培地を灌流させ、リンパ球のローリングを計測する、フロー接着アッセイにより、ローリング活性を測定することができる。培地の灌流は、例えばシリンジポンプを用いて約２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下を発生させること等により行うことができる。
【００５２】
リンパ球が内皮細胞に接着する過程は、例えば、ローリング、一時的な接着（０．５〜１０秒の滞留時間）及び安定な接着（１０秒を超える滞留時間）に分けることができる。本実施形態のスクリーニング方法において、ローリングの発生頻度を測定する場合には、一時的な接着の発生頻度及び安定な接着の発生頻度を含めてもよいし、これらを除外してローリングのみの発生頻度を測定してもよい。
【００５３】
実施例において後述するように、発明者らは、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球は、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損していないリンパ球と比較して、Ｌ−セレクチンリガンド上、ＭａｄＣＡＭ−１上又はＰ−セレクチン上におけるローリング活性が有意に上昇することを明らかにした。したがって、当該ローリング活性の上昇を抑制する被検物質は、大腸炎又は大腸癌の治療剤となり得る。
【００５４】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、被検物質の投与下又は非投与下で、上述した大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物を飼育する工程と、前記非ヒト動物の大腸炎又は大腸癌の発症の程度を測定する工程と、前記被検物質の投与下における大腸炎又は大腸癌の発症の程度が、前記被検物質の非投与下における大腸炎又は大腸癌の発症の程度と比較して低下した場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５５】
大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物としては、上述した第１実施形態の非ヒト動物であってもよいし、上述した第２実施形態の非ヒト動物であってもよい。
【００５６】
被検物質の投与は、例えば飲水中への添加、食餌中への添加、直接飲ませる等の方法により経口的に行ってもよいし、例えば静脈注射等により非経口的に行ってもよい。
【００５７】
大腸炎又は大腸癌の発症の程度を測定する方法は、特に制限されず、例えば、体重の変化を測定する方法、大腸の組織切片の顕微鏡観察により評価する方法、癌マーカーの量を測定する方法等が挙げられる。
【００５８】
大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物に投与した場合に、大腸炎又は大腸癌の発症の程度を低下させる被検物質は、大腸炎又は大腸癌の治療剤となり得る。
【００５９】
（第３実施形態）
１実施形態において、本発明は、被検物質の存在下又は非存在下で、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球を培養する工程と、前記リンパ球におけるＥＲＭタンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、前記被検物質の存在下における前記リン酸化レベルが、前記被検物質の非存在下における前記リン酸化レベルと比較して上昇していた場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００６０】
Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球としては、上述した第１実施形態のスクリーニング方法におけるものと同様のものを用いることができる。
【００６１】
ＥＲＭタンパク質としては、Ｅｚｒｉｎタンパク質、Ｒａｄｉｘｉｎタンパク質、Ｍｏｅｓｉｎタンパク質等が挙げられる。例えば、マウスＥｚｒｉｎタンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿０３３５３６であり、ヒトＥｚｒｉｎタンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿００１１０４５４７である。また、例えばマウスＲａｄｉｘｉｎタンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿００１０９８０８６であり、ヒトＲａｄｉｘｉｎタンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿００１２４７４２１である。また、例えばマウスＭｏｅｓｉｎタンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿０３４９６３であり、ヒトＭｏｅｓｉｎタンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿００２４３５である。
【００６２】
実施例において後述するように、発明者らは、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球では、ＥＲＭタンパク質のリン酸化レベルが低下することを明らかにした。したがって、被検物質の存在下でＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球を培養した場合に、上記のＥＲＭタンパク質のリン酸化レベルの低下を抑制する被検物質は、大腸炎又は大腸癌の治療剤となり得る。
【００６３】
（第４実施形態）
１実施形態において、本発明は、被検物質の存在下又は非存在下で、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球を培養する工程と、前記リンパ球におけるＬＯＫタンパク質のキナーゼ活性を測定する工程と、前記被検物質の存在下における前記キナーゼ活性が、前記被検物質の非存在下における前記キナーゼ活性と比較して上昇していた場合に、前記被検物質は大腸炎又は大腸癌の治療剤であると判定する工程と、を備える、大腸炎又は大腸癌の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００６４】
Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球としては、上述した第１実施形態のスクリーニング方法におけるものと同様のものを用いることができる。
【００６５】
例えば、マウスＬＯＫタンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿０３３３１４であり、ヒトＬＯＫタンパク質のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿００５９８１である。
【００６６】
実施例において後述するように、発明者らは、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球では、ＬＯＫタンパク質のキナーゼ活性が低下することを見出した。したがって、被検物質の存在下でＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したリンパ球を培養した場合に、上記のキナーゼ活性の低下を抑制する被検物質は、大腸炎又は大腸癌の治療剤となり得る。
【００６７】
ＬＯＫタンパク質のキナーゼ活性は、例えば、リンパ球の破砕物を［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含有するバッファー中で、ＬＯＫタンパク質の基質であるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）と反応させ、ＭＢＰに取り込まれた３２Ｐの放射活性を測定すること等により測定することができる。
【実施例】
【００６８】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６９】
［細胞及びマウス］
ＣＤ３陽性Ｔ細胞又はＣＤ４陽性Ｔ細胞は、Ｒａｐ１欠損マウス又はフィラミン（ＦＬＮ）欠損マウスのリンパ節又は脾臓から、ＭｉｄｉＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）又はセルソーター（型式「ｍｏＦｌｏＸＤＰ」、ベックマンコールター社）を用いて分離した。Ｒａｐ１ａのエクソン２〜３がＬｏｘＰ配列で挟まれたＲａｐ１ａｆ／ｆマウス、Ｒａｐ１ｂのエクソン１がＬｏｘＰ配列で挟まれたＲａｐ１ｂｆ／ｆマウス、ＦＬＮａのエクソン２〜７がＬｏｘＰ配列で挟まれたＦＬＮａｆ／ｆマウスは、特定病原体除去環境下で維持した。これらのマウスはＬｃｋ−Ｃｒｅマウス又はＣＤ４−Ｃｒｅマウスと交配し、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ、Ｒａｐ１ｂ又はＦＬＮａを欠損したマウスを得た。全ての動物実験は、北里大学動物実験委員会に承認されたプロトコールにしたがって行った。
【００７０】
［抗体及び試薬］
蛍光標識された抗マウスＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４，ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７、α４β７、Ｆｏｘｐ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、抗マウスＬＦＡ−１抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社）、抗ヒトＬＦＡ−１抗体（ＴＳ２／４、ＴＳ１／１８；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、抗Ｔ７抗体（ノバジェン社）、抗ＲＦＰ抗体（ＭＢＬ社）、抗Ｓｐａ−１、ＦＬＮａ、ＦＬＮｂ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社）、抗Ｒａｐ１抗体（ＢＤバイオサイエンス社）、抗ＥＲＭ、抗リン酸化ＥＲＭ抗体（セルシグナリング社）、ＬＦＡ−１の活性化エピトープに対する抗体（ＭＥＭ１４８、アブカム社）、抗ＦＬＡＧ抗体（インビトロジェン社）、抗β−アクチン抗体（シグマ社）、抗Ｈａｌｏ抗体及びＨａｌｏＬｉｎｋ（商標）レジン（プロメガ社）、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（セルシグナリング社）を、フローサイトメトリー、免疫沈降、イムノブロッティングに使用した。ＬＦＡ−１の活性化エピトープに対する抗体（ＫＩＭ１２７）は、Ｔ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ博士（ハーバード大学医学大学院、ボストン）より提供された。マウスＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１０はＲ＆Ｄシステムズ社より購入した。サイトカイン産生はＢＤ（商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて測定した。
【００７１】
［ＤＮＡ構築物］
Ｒａｐ１のドミナントネガティブ変異体であるＲａｐ１Ｎ１７、及びＲａｐ１のドミナントアクティブ変異体であるＲａｐ１Ｖ１２は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ライフテクノロジーズ社）又はレンチウイルスベクター（ＣＳＩＩ−ＥＦ−ＭＣＳ、理化学研究所、三好浩之博士より提供された。）に導入して発現させた。
【００７２】
フィラミンａ（ＦＬＮａ）のリピート１〜３、４〜７、８〜１１及び２１をコードするｃＤＮＡ、又はβ２の細胞質領域をコードするｃＤＮＡをｐＧＥＸベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にサブクローニングし、大腸菌ＢＬ２１株内でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現させた。Ｈａｌｏタグを結合したＦＬＮａ  ｃＤＮＡは、かずさＤＮＡ研究所より購入した。また、ＦＬＮａのリピート３をＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（東洋紡社）を用いて削除し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ライフテクノロジーズ社）にサブクローニングした。
【００７３】
リン酸化状態を模倣したヒトＥｚｒｉｎは、ｃＤＮＡ（ｐＦＮ２１ＡＥ１４１７、かずさＤＮＡ研究所）の第５６７位のスレオニンを、ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔを使用してグルタミン酸にシングルポイント置換し、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを有するＥｚｒｉｎ変異体として、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ライフテクノロジーズ社）のＮｏｔＩサイトにサブクローニングした。
【００７４】
ＦＬＡＧタグを結合したＬＯＫの発現ベクターは、ヒトＬＯＫのｃＤＮＡ及びＦＬＡＧのｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ライフテクノロジーズ社）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ及びＸｈｏＩ／ＸｂａＩサイトにそれぞれサブクローニングして作製した。
【００７５】
ＥＧＦＰタグを結合したＲａｌ−ＧＤＳ−ＲＢＤの発現ベクターは、ＥＧＦＰをコードするｃＤＮＡとヒトＲａｌ−ＧＤＳのＲＢＤ（アミノ酸第７７２〜８６８）をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ライフテクノロジーズ社）のＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトにそれぞれ導入することにより作製した。
【００７６】
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を基礎としたＲａｐ１活性のセンサーは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）タグを結合したＲａｐ１がモノマーの蛍光タンパク質である（ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ）タグを結合したＲＡＰＬ−ＲＢＤに結合されたものであり、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター上で作製した。全ての構築物は塩基配列のシークエンスにより確認した。
【００７７】
［ＲＮＡ干渉］
Ｒａｐ１ａ、Ｒａｐ１ｂ、ＦＬＮａ、ＦＬＮｂを標的とするｓｈＲＮＡ又は対照のスクランブルｓｈＲＮＡをＧＦＰを含む又は含まないレンチウイルスベクター（理化学研究所、三好浩之博士より提供された。）を用いてＢＡＦ／ＬＦＡ−１細胞に導入した。ｓｈＲＮＡはレンチウイルスベクターのＨ１プロモーターカセットの下流に導入した。レンチウイルス粒子の調製及び濃縮は常法により行った。遺伝子導入効率は９０％以上であった。
【００７８】
Ｒａｐ１ａのｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１に示す。また、Ｒａｐ１ｂのｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号２に示す。また、ＦＬＮａのｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号３に示す。また、ＦＬＮｂのｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号４に示す。
【００７９】
［フロー接着アッセイ］
フロー接着アッセイは、ヒト内皮細胞株ＬＳ１２上、又はＮｅｐｍｕｃｉｎ、ＧｌｙＣＡＭ−１若しくはＭａｄＣＡＭ−１−ＩｇＧ（リン酸バッファー（ＰＢＳ）中５μｇ／ｍＬ）でコートしたプレート上で行った。ここで、ＭａｄＣＡＭ−１−ＩｇＧとは、ＭａｄＣＡＭ−１タンパク質とＩｇＧタンパク質の定常領域との融合タンパク質を意味する。
【００８０】
マウスＩＣＡＭ−１を発現した又は発現していない、ヒト内皮細胞株ＬＳ１２を、実験の１日前にフィブロネクチンコートされたディスク上で培養した。ＬＳ１２の単層は、ＴＮＦαで最後の６時間処理した。さらに、単層は、フローチャンバー（型式「ＦＣＳ２」、Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ社）に設置する前に、場合によりケモカイン（ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２１又はＣＸＣＬ１０、０．５μＭ）で処理した。層流は、自動シリンジポンプ（ハーバードアパレイタス社）を用いて発生させた。リンパ球（１×１０６個／ｍＬ）又はＢＡＦ／Ｌ−セレクチン／ＬＦＡ−１細胞（１×１０５個／ｍＬ）を予め温めた１０％ウシ血清及び１ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁し、３７℃、２ｄｙｎ／ｃｍ２で注入した。いくつかの実験においては、細胞は記載した抗体で処理した。０．３２ｍｍ２の顕微鏡視野下の位相差イメージをオリンパス社  Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ  ＤＬ１０×／０．３ＮＡ対物レンズを用いて３．３ｍ秒間隔で記録した。リンパ球のフレーム毎の移動及び速度は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウエア（モレキュラーデバイス社）を用いて自動的に個々の細胞を追跡することにより計算した。ＬＳ１２細胞、ＰＮＡｄ又はＭａｄＣＡＭ−１との相互作用は、ローリング、一時的な接着（０．５〜１０秒の滞留時間）及び安定な接着（１０秒を超える滞留時間）に基づいて分類した。１分間あたりにローリング、一時的な接着及び安定な接着を示した細胞の頻度を示した。
【００８１】
［Ｔｒｅｇ抑制アッセイ］
ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ２５−）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ；ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗＣＤ２５＋）を、脾細胞及びリンパ節由来の単細胞懸濁液からＦＡＣＳソーティングにより分取した。ソーティング後、ナイーブＴ細胞は５，６−カルボキシフルオレセイン二酢酸（ＣＦＳＥ、インビトロジェン社）で標識し、完全ＲＰＭＩ培地中で５×１０５個／ｍＬに調製した。非標識のＴｒｅｇ細胞は２．５×１０５個／ｍＬに調製した。続いて、これらの細胞をラウンドボトム９６ウェルプレート上でＴｒｅｇ細胞：ナイーブＴ細胞の比が１：２及び１：４となるように共培養した。続いて、細胞を１μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ３抗体及び２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体で刺激した。４８時間後に、細胞を回収し、ナイーブＴ細胞の増殖をＣＦＳＥの希釈及びフローサイトメトリー解析により決定した。
【００８２】
［細胞内サイトカイン染色］
ＣＤ４陽性Ｔ細胞を培地から回収し、ブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ、５０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で３７℃、４時間刺激した。ＰＥＣｙ７標識抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５）で染色した後、細胞を４％パラホルムアルデヒド−リン酸バッファー（ＰＢＳ）で１０分間固定し、０．５％サポニン及び１％ウシ血清を含むＨＢＳＳバッファーで透過処理し、ＦＩＴＣ標識抗インターフェロン（ＩＦＮ）−γ抗体（ＸＭＧ１．１）、ＰＥ標識抗インターロイキン（ＩＬ）−１７Ａ抗体（ＴＣ１１−１８Ｈ１０）、及びＡＰＣ標識抗ＩＬ−４抗体（１１Ｂ１１）で３０分間染色した。続いて、細胞を、０．５％サポニン及び１％ウシ血清を含むＨＢＳＳバッファーで２回洗浄し、１％ウシ血清を含むＨＢＳＳバッファーに懸濁し、フローサイトメトリー解析を行った。
【００８３】
［統計解析］
実験群を多重比較する場合には、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った後にボンフェローニ補正した両側多重ｔ検定を行い、二群間で比較する場合には、スチューデントの両側ｔ検定を行った。いずれの場合においても、５％未満のＰ値を有意であると判断した。
【００８４】
＜Ｉ．Ｒａｐ１の欠損はＬ−セレクチン依存性のローリングを促進した＞
［実験例１］
発明者らは、以前に、ｐｒｏ−Ｂ細胞株であるＢＡＦにヒトＬ−セレクチン及びＬＦＡ−１を発現させた細胞株（ＢＡＦ／ＬＦＡ−１／Ｌ−セレクチン）及び内皮細胞であるＬＳ１２を用いて、Ｌ−セレクチン及びＬＦＡ−１に媒介されるリンパ球の接着カスケードを再構成した実験系を確立した。
【００８５】
上記の実験系におけるＲａｐ１の役割を検討するため、発明者らは、ＢＡＦ／ＬＦＡ−１／Ｌ−セレクチン細胞におけるＲａｐ１を、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを標的としたｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスの導入によりノックダウンした。
【００８６】
Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂに対するｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスを導入したＢＡＦ／ＬＦＡ−１／Ｌ−セレクチン細胞（以下、「Ｒａｐ１ＫＤ」細胞という場合がある。）を作製した。対照として、スクランブルｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスを導入したＢＡＦ／ＬＦＡ−１／Ｌ−セレクチン細胞を用いた。これらの細胞の細胞破砕物をイムノブロッティングに供し、抗Ｒａｐ１抗体を用いてＲａｐ１タンパク質を検出した。
【００８７】
図１は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。３回の実験の代表的な結果を示す。アクチンはローディングコントロールとして検出した。その結果、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂのノックダウン細胞（Ｒａｐ１ＫＤ細胞）におけるＲａｐ１タンパク質の発現レベルは対照細胞であるＢＡＦ／ＬＦＡ−１／Ｌ−セレクチン細胞の約２０％に減少したことが確認された。
【００８８】
［実験例２］
対照細胞、Ｒａｐ１ＫＤ細胞、Ｓｐａ−１発現細胞、Ｒａｐ１ＫＤ細胞にＲａｐ１Ｎ１７を発現させた細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞にＲａｐ１Ｖ１２を発現させた細胞をＬＳ１２細胞上で、１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２の存在下又は非存在下、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。ここで、Ｒａｐ１Ｎ１７はＲａｐ１のドミナントネガティブ変異体であり、Ｒａｐ１Ｖ１２はＲａｐ１のドミナントアクティブ変異体である。また、Ｓｐａ−１は、Ｒａｐ１特異的なＧＴＰアーゼ活性化タンパク質である。
【００８９】
続いて、各細胞と内皮細胞ＬＳ１２との相互作用を示すデジタルイメージを３０フレーム／秒で撮影した。１００個以上の細胞の接着イベントを測定し、図２に示すように、ローリング、一時的接着、安定な接着に分類した。図２において、データは３回の独立した実験における平均値±標準誤差を表す。図２中、「＊１」は、対照細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、Ｒａｐ１ＫＤ細胞と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。
【００９０】
ＣＸＣＬ１２により誘導される、ＬＦＡ−１に媒介される細胞の接着は、Ｒａｐ１の欠損により阻害されることが知られている。これに対し、意外なことに、Ｒａｐ１ＫＤ細胞の内皮細胞上でのローリングの頻度は、ＣＸＣＬ１２の非存在下において有意に上昇した。
【００９１】
また、Ｓｐａ−１の発現は、ＣＸＣＬ１２により誘導される細胞の接着を阻害したが、ローリングイベントの発生頻度を上昇させなかった。この結果は、Ｒａｐ１−ＧＤＰの減少がローリングを促進することを示す。
【００９２】
この結果と一致して、ドミナントアクティブ変異体であるＲａｐ１Ｖ１２をＲａｐ１ＫＤ細胞で発現させてもローリング頻度を低下させなかったが、ドミナントネガティブ変異体であるＲａｐ１Ｎ１７をＲａｐ１ＫＤ細胞で発現させるとローリング頻度が低下した。この結果は、ＧＤＰからＧＴＰへの変換が、キャプチャー及びそれに続くローリングを促進することを示す。
【００９３】
［実験例３］
続いて、発明者らは、初代マウスＴ細胞を用いて、リンパ球接着カスケードにおけるＲａｐ１の機能を解析した。
【００９４】
Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂのコンディショナルダブルノックアウトマウス（Ｒａｐ１ＣＫＯ）を作製するために、Ｒａｐ１ａアレル及びＲａｐ１ｂアレルがそれぞれｌｏｘＰ配列で挟まれたマウス（以下、「Ｒａｐ１ｆ／ｆ」マウスという場合がある。）と、Ｔ細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するＬｃｋ−Ｃｒｅマウス又はＣＤ４−Ｃｒｅマウスとを交配させた。得られた子孫の中に、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１を欠損したマウス（以下、「Ｒａｐ１−／−」マウスという場合がある。）が得られた。
【００９５】
Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス由来のＴ細胞と、Ｒａｐ１−／−マウス由来のＴ細胞の細胞破砕物を、抗Ｒａｐ１抗体を用いたイムノブロッティングに供した。図３はイムノブロッティングの結果を示す写真である。３回の実験の代表的な結果を示す。アクチンタンパク質は、ローディングコントロールとして検出した。
【００９６】
その結果、Ｒａｐ１−／−マウス由来のＴ細胞はＲａｐ１タンパク質を欠損していることが確認された。
【００９７】
［実験例４］
続いて、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス由来のＴ細胞（以下、「Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞」という場合がある。）及びＲａｐ１−／−マウス由来のＴ細胞（以下、「Ｒａｐ１−／−Ｔ細胞」という場合がある。）を、マウスＩＣＡＭ−１を発現させたＬＳ１２細胞上で、１００ｎＭ  ＣＣＬ２１の存在下又は非存在下、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。
【００９８】
層流下で、Ｔ細胞と内皮細胞との相互作用を示すデジタルイメージを３０フレーム／秒で撮影した。１００個以上の細胞の接着イベントを測定し、図４に示すように、ローリング、一時的接着、安定な接着に分類した。図４において、データは３回の独立した実験における平均値±標準誤差を表す。図４中、「＊」は、対照のＲａｐ１ｆ／ｆＴ細胞における合計頻度と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【００９９】
その結果、Ｒａｐ１−／−Ｔ細胞は、内皮細胞上への、ケモカインに誘導される安定な接着イベントを欠損していた。しかしながら、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞と比較して、ＣＣＬ２１の非存在下において、有意に上昇したローリングの頻度を示した。
【０１００】
［実験例５］
図５は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの腸間膜リンパ節由来のナイーブＴ細胞におけるＣＣＲ７の発現特性を示すフローサイトメトリーの代表的な結果を示すグラフである。また、図２４（ａ）は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの腸間膜リンパ節由来のナイーブＴ細胞及びエフェクターメモリー（Ｅ／Ｍ）Ｔ細胞の、ＬＦＡ−１の発現特性を示すフローサイトメトリー解析の代表的な結果を示すグラフである。図５及び図２４（ａ）に示すように、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞及びＲａｐ１−／−Ｔ細胞におけるＬＦＡ−１及びＣＣＲ７の発現量は同程度であった。
【０１０１】
［実験例６］
続いて、発明者らは、ＣＣＬ２１の非存在下における、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞及びＲａｐ１−／−Ｔ細胞のＬＳ１２細胞との相互作用に対する、抗ＬＦＡ−１抗体又は抗Ｌ−セレクチン抗体の影響を検討した。
【０１０２】
Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞及びＲａｐ１−／−Ｔ細胞を抗ＬＦＡ−１抗体又は抗Ｌ−セレクチン抗体の存在下又は非存在下で前処理し、各細胞の接着イベントを上記と同様にして検討した。図６（ａ）は、各細胞の、ローリング、一時的接着、安定な接着の頻度を示すグラフである。
【０１０３】
その結果、抗ＬＦＡ−１抗体処理は、Ｒａｐ１−／−Ｔ細胞のローリングの発生に影響を与えなかったが、抗Ｌ−セレクチン抗体処理は、いずれの細胞においてもローリングの発生を完全に阻害した。この結果は、Ｒａｐ１の欠損が、内皮細胞上におけるＬ−セレクチン依存性のローリングを促進することを示す。
【０１０４】
図６（ｂ）は、ＣＣＬ２１の非存在下における、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞又はＲａｐ１−／−Ｔ細胞のＬＳ１２内皮細胞上でのローリングの速度を示すグラフである。各細胞は、抗ＬＦＡ−１抗体の存在下又は非存在下で前処理した。図６（ｂ）において、データは３回の実験における平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝１００）。図６（ｂ）中、「＊」は、対照のＲａｐ１ｆ／ｆＴ細胞と比較して、危険率０．３％未満で有意差があることを表す。
【０１０５】
ローリングの速度は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞と比較して、Ｒａｐ１−／−Ｔ細胞において低下した。また、この結果は、細胞の抗ＬＦＡ−１抗体による前処理の影響を受けなかった。
【０１０６】
［実験例７］
続いて、Ｒａｐ１ＫＤ細胞を用いて内皮細胞上の接着イベントについて検討した。まず、対照細胞であるＢＡＦ／ＬＦＡ−１／Ｌ−セレクチン細胞又はＲａｐ１ＫＤ細胞でＲａｐ１のドミナントアクティブ変異体であるＲａｐ１Ｖ１２を発現させた。続いて、デタッチメントアッセイにより、各細胞の、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１依存性の結合を静止状態に置いた後に測定した。
【０１０７】
各細胞をＩＣＡＭ−１上で１０分間インキュベートした後、層流下（２ｄｙｎ／ｃｍ２）に置き、層流に耐性を示した、強く接着した細胞を数えた。結果を図７に示す。データは３回の実験における平均値±標準誤差を表す（各群に付きｎ＝５０）。その結果、Ｒａｐ１Ｖ１２を発現させた細胞は、ＩＣＡＭ−１に対する結合活性を示すことが明らかとなった。
【０１０８】
［実験例８］
続いて、ＣＸＣＬ１２の非存在下における、対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞（ＢＡＦ／ＬＦＡ−１／Ｌ−セレクチン細胞）のＬＳ１２細胞との相互作用に対する、抗ＬＦＡ−１抗体又は抗Ｌ−セレクチン抗体の影響を検討した。対照細胞には、スクランブルｓｈＲＮＡを導入した細胞を使用した。
【０１０９】
対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞を抗ＬＦＡ−１抗体又は抗Ｌ−セレクチン抗体の存在下又は非存在下で前処理し、ＬＳ１２細胞上で、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。続いて、各細胞の接着イベントを上記と同様にして検討した。
【０１１０】
図８（ａ）は、各細胞の、ローリング、一時的接着、安定な接着の頻度を示すグラフである。図８（ａ）において、データは３回の実験における平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝１５０）。
【０１１１】
その結果、抗ＬＦＡ−１抗体処理は、対照細胞のローリングの発生に影響を与えなかったが、抗Ｌ−セレクチン抗体処理は、いずれの細胞においてもローリングの発生を完全に阻害した。
【０１１２】
この結果は、Ｒａｐ１の欠損が、内皮細胞上におけるＬ−セレクチン依存性のローリングを促進することを更に支持するものである。
【０１１３】
図８（ｂ）は、ＣＸＣＬ１２の非存在下における、対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞のＬＳ１２内皮細胞上でのローリングの速度を示すグラフである。各細胞は、抗ＬＦＡ−１抗体の存在下又は非存在下で前処理した。図８（ｂ）において、データは３回の実験における平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝１５０）。図８（ｂ）中、「＊」は、対照細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【０１１４】
［実験例９］
対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞で（緑色蛍光タンパク質）ＧＦＰを発現させ、各細胞のローリングの様子を層流下で倍率６３倍の対物レンズを用いて観察した。図９は、観察結果を示す蛍光顕微鏡写真である。内皮細胞と相互作用しない対照細胞、内皮細胞上で速くローリングする（＞４００μｍ／秒）対照細胞、及び遅くローリングする（＜１００μｍ／秒）Ｒａｐ１ＫＤ細胞の連続的な画像を示す。スケールバーは５μｍを示す。
【０１１５】
［実験例１０］
Ｌ−セレクチンへの依存性を更に検証するために、発明者らは、対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞の、精製されたＧｌｙＣＡＭ−１又はＮｅｐｍｕｃｉｎ（ＣＤ３００ＬＧ）が固定されたプレート上への接着イベントを検討した。
【０１１６】
対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞を、精製されたＧｌｙＣＡＭ−１又はＮｅｐｍｕｃｉｎ（ＣＤ３００ＬＧ）が固定されたプレート上で、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。続いて、細胞の接着イベントを上記と同様にして測定した。
【０１１７】
図１０（ａ）は、結果を示すグラフである。データは３回の実験における平均値±標準誤差を表す（各群に付きｎ＝５０）。図１０（ａ）中、「＊１」は、対照細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【０１１８】
図１０（ｂ）は、対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞の、ＧｌｙＣＡＭ−１又はＮｅｐｍｕｃｉｎ（ＣＤ３００ＬＧ）が固定されたプレート上でのローリングの速度を示すグラフである。図１０（ｂ）中、「＊２」は、対照細胞と比較して、危険率５％未満で有意差があることを表す。
【０１１９】
その結果、Ｒａｐ１ＫＤ細胞では、対照細胞と比較して、ローリングの頻度が１０倍以上に増加した。また、ＧｌｙＣＡＭ−１又はＮｅｐｍｕｃｉｎ（ＣＤ３００ＬＧ）が固定されたプレート上におけるローリングの速度は有意に減少した。
【０１２０】
［実験例１１］
対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞のローリング中の形態を検討するために、対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞でＧＦＰを発現させ、フローチャンバーに導入し、層流下で倍率６３倍の対物レンズを用いてＧＦＰの蛍光を観察した。図１１（ａ）は、ＧＦＰの蛍光の観察結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５μｍを示す。
【０１２１】
その結果、ゆっくりとローリングする（＜１００μｍ／秒）Ｒａｐ１ＫＤ細胞は、いくつかのテザー様の膜の伸長を示した。また、テザーが内皮細胞に接着し、流れの上流側に向かって伸長している場合、その瞬間的な速度は５０μｍ／秒以下に減少した。対照的に、速くローリングする（＞４００μｍ／秒）対照細胞は、内皮細胞上に明確な突出を示さなかった。
【０１２２】
図１１（ｂ）は、ゆっくりとローリングするＲａｐ１ＫＤ細胞の連続的な画像を示す。スケールバーは５μｍを示す。図１１（ｃ）は、テザー様の膜の伸長を示す細胞の割合を示すグラフである。データは３回の独立した実験結果の平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝５０）。図１１（ｃ）中、「＊」は、対照細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【０１２３】
［実験例１２］
図１２は、対照細胞及びＲａｐ１をノックダウンしたＢＡＦ／ＬＦＡ−１細胞（Ｒａｐ１ＫＤ）におけるＬ−セレクチンの局在を示す蛍光顕微鏡写真である。代表的な２個ずつの細胞の写真を示す。「ＤＩＣ」は、微分干渉顕微鏡画像であることを示す。スケールバーは５μｍであることを示す。図中の矢印は、ブレブ様の突出を示す。
【０１２４】
その結果、対照細胞とＲａｐ１ＫＤ細胞において、Ｌ−セレクチンの局在には違いは認められなかった。しかしながら、Ｒａｐ１ＫＤ細胞は、Ｌ−セレクチンを含む複数のブレブを形成することが示された。
【０１２５】
［実験例１３］
対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞を共焦点顕微鏡で観察した。図１３（ａ）は、アクチンポリメライゼーションのマーカーである、ＬｉｆｅＡｃｔ−ｍＣｈｅｒｒｙを導入した対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞の顕微鏡写真である。少なくとも３回の独立した実験における代表的な２つずつの細胞の写真を示す。スケールバーは５μｍを示す。
【０１２６】
図１３（ｂ）は、対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞が１分間あたりに形成するブレブの数を示すグラフであり、図１３（ｃ）は、Ｒａｐ１ＫＤ細胞におけるブレブの維持時間を示すグラフである（各群についてｎ＝５０）。その結果、ブレブの数及び維持時間は、Ｒａｐ１ＫＤ細胞において、対照細胞と比較して有意に高かった。
【０１２７】
［実験例１４］
続いて、発明者らは、対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞をケモカインの非存在下で３７℃でインキュベートした。図１４はこれらの細胞の顕微鏡画像を示す写真である。その結果、Ｒａｐ１ＫＤ細胞は、ケモカイン刺激の非存在下において、活発なブレブ形成を示すことが明らかとなった。また、後述するように、対照細胞は、ケモカインによる刺激の後に、一時的にブレブ形成を示した。
【０１２８】
［実験例１５］
図１５は、アクチンバイオセンサーであるＬｉｆｅＡｃｔ−ｍＣｈｅｒｒｙを導入したＲａｐ１ＫＤ細胞のブレブの伸長及び後退を示す代表的な共焦点顕微鏡画像である。デジタルイメージは、５秒ごとに撮影した。図中の矢印はブレブを示す。スケールバーは５μｍである。ブレブの伸長は、既知の他の細胞突出と異なり、アクチンポリメライゼーションを伴わないことが知られているため、これを指標としてブレブ形成を確認することができる。
【０１２９】
以上の結果は、Ｒａｐ１−ＧＤＰが、テザー形成を制限することによって、内皮細胞上におけるＬ−セレクチン依存性キャプチャー及びローリングを抑制することを示す。
【０１３０】
＜ＩＩ．  Ｒａｐ１の欠損によりＴ細胞の恒常性が損なわれた＞
［実験例１６］
Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞又はＲａｐ１−／−Ｔ細胞に、マウスの腸間膜リンパ節内の高内皮細静脈を通過させ、ローリング又は接着の頻度を測定した。図１６は結果を示すグラフである。データは４回の独立した実験結果の平均値±標準誤差を表す。図１６中、「＊」は、対応するＲａｐ１ｆ／ｆＴ細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【０１３１】
図１７は、Ｔ細胞が腸間膜リンパ節内の高内皮細静脈に接着した様子を示す蛍光顕微鏡写真である。リンパ球の接着を示す生体内イメージは、異なる標識を施したＲａｐ１ｆ／ｆＴ細胞又はＲａｐ１−／−Ｔ細胞を静脈投与してから３０分後に撮影した。３回の独立した実験における代表的な結果を示す。
【０１３２】
その結果、Ｒａｐ１−／−Ｔ細胞の高内皮細静脈上におけるローリングの頻度は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞のそれよりも有意に高かった。しかしながら、Ｒａｐ１−／−Ｔ細胞は、同程度の細胞数のＲａｐ１ｆ／ｆＴ細胞と混合してマウスに移植して３０分後には、腸間膜リンパ節内の高内皮細静脈上に集積しなかった。
【０１３３】
［実験例１７］
Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞及びＲａｐ１−／−Ｔ細胞を５，６−カルボキシフルオレセイン二酢酸（ＣＦＳＥ、インビトロジェン社）、及び、５−（及び−６）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン（ＣＭＴＭＲ、インビトロジェン社）でそれぞれ標識し、同細胞数ずつ混合し、通常のマウスに静脈投与した。１時間後、レシピエントマウスの血液及び腸間膜リンパ節中のリンパ球をフローサイトメトリーで解析した。図１８（ａ）及び（ｂ）は実験結果を示すグラフである。４回の実験の代表的な結果を示す。四角の上の数字は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞に対するＲａｐ１−／−Ｔ細胞の割合を示す。図１８中、「Ｂｌｏｏｄ」は血液を表し、「ＬＮ」はリンパ節を表す（以下、同様である。）。
【０１３４】
図１８（ｃ）は、腸間膜リンパ節中のＲａｐ１ｆ／ｆＴ細胞に対するＲａｐ１−／−Ｔ細胞の割合を示すグラフである（ｎ＝４回の実験）。図１８（ｃ）中の「＊」は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。その結果、Ｒａｐ１−／−Ｔ細胞は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞の１０％未満の効率で腸間膜リンパ節にホーミングすることが明らかとなった。
【０１３５】
［実験例１８］
４〜５週齢のＲａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの血液中及び腸間膜リンパ節中のＴ細胞数を計測した。図１９（ａ）及び（ｂ）は、結果を示すグラフである（ｎ＝１０）。データは平均値±標準誤差を表す。
【０１３６】
図１９（ａ）は血液の結果を示し、図１９（ｂ）は腸間膜リンパ節の結果を示す。図１９（ｂ）中、「＊」は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウスと比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。図１９中、「ｍＬＮ」は腸間膜リンパ節を表す（以下、同様である。）。
【０１３７】
その結果、４〜５週齢において、Ｒａｐ１−／−マウスの腸間膜リンパ節におけるＴ細胞の数は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウスの腸間膜リンパ節におけるＴ細胞の数の約１０％に減少することが明らかとなった。また、同時に、Ｒａｐ１−／−マウスの血液中のＴ細胞の数は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウスの血液中のＴ細胞の数と比較して増加することが明らかとなった。
【０１３８】
［実験例１９］
図２０（ａ）及び（ｂ）は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの腸間膜リンパ節由来のリンパ球の代表的なフローサイトメトリー特性を示すグラフである。図２０（ａ）はＲａｐ１ｆ／ｆマウスの結果を示し、図２０（ｂ）はＲａｐ１−／−マウスの結果を示す。横軸はＣＤ３陽性細胞にゲートをかけた細胞集団におけるＣＤ６２Ｌの発現強度を示し、縦軸は、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけた細胞集団におけるＣＤ４４の発現強度を示す。
【０１３９】
その結果、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの腸間膜リンパ節由来のＴ細胞は、９０％以上がナイーブＴ細胞の表現型を有することが明らかとなった。
【０１４０】
［実験例２０］
図２１（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、９週齢のＲａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの、血液、腸間膜リンパ節、パイエル板（ＰＰ）、結腸粘膜固有層（Ｃｏｌｏｎ  ＬＰ）中のナイーブＴ細胞及びＣＤ４陽性エフェクターメモリーＴ細胞（以下、「ＴＥＭ」細胞という場合がある。）の数を示すグラフである。データは平均値±標準誤差を表す。
【０１４１】
図２１（ｂ）〜（ｃ）中、「＊１」は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウスと比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウスと比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。また、「＊３」は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウスと比較して、危険率０．５％未満で有意差があることを表す。また、「＊４」は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウスと比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【０１４２】
［実験例２１］
図２２（ａ）〜（ｃ）は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの、血液、腸間膜リンパ節、結腸粘膜固有層中のリンパ球の代表的なフローサイトメトリー特性を示すグラフである。
【０１４３】
図２２（ａ）は血液の結果を示し、図２２（ｂ）は腸間膜リンパ節の結果を示し、図２２（ｃ）は結腸粘膜固有層の結果を示す。横軸はＣＤ４陽性細胞にゲートをかけた細胞集団におけるＣＤ６２Ｌの発現強度を示し、縦軸は、ＣＤ４陽性細胞にゲートをかけた細胞集団におけるＣＤ４４の発現強度を示す。
【０１４４】
８週齢以上の週齢では、Ｒａｐ１−／−マウスの腸間膜リンパ節及びパイエル板におけるＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋ＴＥＭ細胞の割合は、６２．５±４．３％及び８４．２％±６．４％に増加した。これに対し、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウスにおいては、それぞれ５．８±１．８％及び３９．３±３．２％であった。
【０１４５】
血液及び腸間膜リンパ節におけるＴＥＭ細胞の数には、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの間で有意な差はなかった。また、パイエル板におけるＴＥＭ細胞の数は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウスと比較してＲａｐ１−／−マウスにおいて低かった。それにもかかわらず、結腸粘膜固有層におけるＴＥＭ細胞の数は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウスと比較してＲａｐ１−／−マウスにおいて４倍以上に増加していた。この結果は、Ｒａｐ１−／−ナイーブＴ細胞が腸間膜リンパ節にホーミングできなかった結果と対照的である。
【０１４６】
［実験例２２］
Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの結腸の凍結切片を抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１４７】
図２３（ａ）〜（ｃ）は、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図２３（ａ）はＲａｐ１ｆ／ｆマウスの結果を示す（倍率４０倍）。図２３（ｂ）はＲａｐ１−／−マウスの結果を示す（倍率４０倍）。図２３（ｃ）は図２３（ｂ）の領域ｃを拡大した蛍光顕微鏡写真である（倍率２００倍）。
【０１４８】
その結果、ＣＤ８陽性Ｔ細胞ではなく、ＣＤ４陽性Ｔ細胞がＲａｐ１−／−マウスの結腸粘膜固有層に浸潤したことが明らかとなった。
【０１４９】
［実験例２３］
図２４（ａ）及び（ｂ）は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの腸間膜リンパ節由来のナイーブＴ細胞及びエフェクターメモリー（Ｅ／Ｍ）Ｔ細胞の、ＬＦＡ−１（図２４（ａ））及びα４β７（図２４（ｂ））の発現特性を示すフローサイトメトリー解析の代表的な結果である。その結果、α４β７を高発現する、腸指向性のＴＥＭ細胞の数は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの腸間膜リンパ節において全く同数であった。
【０１５０】
これらの結果は、Ｒａｐ１の欠損はＴＥＭ細胞の結腸へのホーミングを促進することを示す。
【０１５１】
＜ＩＩＩ．  Ｒａｐ１コンディショナルノックアウトマウスは１２週齢で大腸癌を伴う大腸炎を自然発症した＞
［実験例２４］
発明者らは、Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆマウス（以下、「Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス」という場合がある。）と、Ｌｃｋ−Ｃｒｅマウス又はＣＤ４−Ｃｒｅマウスとを交配させることにより、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したマウス（以下、「Ｒａｐ１−／−マウス」という場合がある。）を作製した。
【０１５２】
Ｒａｐ１−／−マウスを解析した結果、９週齢で消耗性疾患を発症し、体重の減少や下痢が認められることが明らかとなった。
【０１５３】
図２５は、Ｒａｐ１−／−マウス（以下、「−／−」と表す場合がある。）及び対照としてのＲａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆマウス（以下、「ｆ／ｆ」と表す場合がある。）の体重の変化を測定したグラフである（ｎ＝１０）。体重は毎日測定し、測定開始時の体重を基準とした百分率で示した。データは平均値±標準誤差を表す。
【０１５４】
図２５中、「＊１」は、対応するＲａｐ１ｆ／ｆマウスと比較して、危険率２％未満で有意差があることを表し、「＊２」は危険率１％未満で有意差があることを表し、「＊３」は危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【０１５５】
Ｒａｐ１−／−マウスは、１２週齢において、腸重積症の発症及び脱肛が観察された。組織学的な解析の結果、全てのＲａｐ１−／−マウスが重篤な大腸炎を発症していることが明らかとなった。
【０１５６】
図２６は、８〜１２週齢のＲａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの代表的な結腸の形態を示す写真である。「＃１」は、Ｒａｐ１−／−マウスの結腸における腸重積症を示す。「＃２」は、Ｒａｐ１−／−マウスの盲腸と結腸の間に発症した腺腫（癌）を示す。図２６中のバーは１ｃｍを表す。
【０１５７】
図２７は、Ｒａｐ１−／−マウスの大腸炎によるダメージを光学顕微鏡観察に基づいて評価した結果を示すグラフである。縦軸は、組織学的スコアを表す。組織学的スコアは以下の基準に基づいて評価した。データは平均値±標準誤差を表す。図２７中、「＊」は、対応するＲａｐ１ｆ／ｆマウスと比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
グレード０：変化は認められない。
グレード１：上皮の最小限の肥厚化を伴うか又は伴わない、粘膜への炎症性細胞の最小限の孤立散在性の浸潤。
グレード２：軽度の孤立散在性から散在性の炎症性細胞の浸潤、しばしば粘膜下層にまで拡張し、びらんを伴い、軽度から中度の上皮の肥厚化及びゴブレット細胞からの軽度から中度のムチンの欠失を伴う。
グレード３：しばしば経壁的である、中度の炎症性細胞の浸潤、中度から重度の上皮の肥厚化及びムチンの欠失を伴う。
グレード４：しばしば経壁的であり、陰窩膿瘍及び時々潰瘍を伴う顕著な炎症性細胞の浸潤、顕著な上皮の肥厚化及びムチンの欠失を伴う。
グレート５：重度の潰瘍及び腸腺の消失を伴う顕著で経壁的な炎症。
【０１５８】
続いて、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの結腸のパラフィン包埋組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色し、光学顕微鏡で組織構造を観察した。図２８（ａ）はＲａｐ１ｆ／ｆマウスの盲腸の組織構造を示す顕微鏡写真である（倍率４０倍）。図２８（ｂ）はＲａｐ１ｆ／ｆマウスの結腸の組織構造を示す顕微鏡写真である（倍率４０倍）。図２８（ｃ）はＲａｐ１−／−マウスの大腸の炎症部位の組織構造を示す顕微鏡写真である（倍率４０倍）。図２８（ｄ）は、図２８（ｂ）の領域（ｄ）を拡大した顕微鏡写真である（倍率２００倍）。図２８（ｅ）は、図２８（ｂ）の領域（ｅ）を拡大した顕微鏡写真である（倍率２００倍）。バーは２００μｍを表す。図２８（ｄ）及び（ｅ）は、Ｒａｐ１−／−マウスの結腸の炎症部位において、リンパ球が浸潤しており、腸腺が消失していることを示す。図２８（ｆ）はＲａｐ１−／−マウスに発症した腺腫の組織構造を示す顕微鏡写真である。図２８（ｇ）は図２８（ｆ）の領域（ｇ）を拡大した顕微鏡写真である（倍率２００倍）。図２８（ｈ）は図２８（ｆ）の領域（ｈ）を拡大した顕微鏡写真である（倍率２００倍）。
【０１５９】
図２９（ａ）はＲａｐ１−／−マウスの大腸の炎症部位における陰窩膿瘍を示す顕微鏡写真である（倍率４０倍）。図２９（ａ）の右下の領域は、図２９（ａ）の四角で囲まれた領域を拡大した顕微鏡写真である（倍率２００倍）。
【０１６０】
図２９（ｂ）はＲａｐ１−／−マウスの大腸における類上皮細胞肉芽腫を示す顕微鏡写真である（倍率４０倍）。図２９（ｂ）の右下の領域は、図２９（ｂ）の四角で囲まれた領域を拡大した顕微鏡写真である（倍率２００倍）。
【０１６１】
図２９（ｃ）はＲａｐ１−／−マウスの腸腺が消失した領域の組織構造を示す顕微鏡写真である（倍率４０倍）。図２９（ｄ）は、図２９（ｃ）の領域（ｄ）を拡大した顕微鏡写真である（倍率２００倍）。図２９（ｅ）は、図２９（ｄ）と同一の領域を抗ＣＤ３抗体及び抗Ｂ２２０抗体で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である（倍率２００倍）。なお、ＣＤ３はＴ細胞のマーカーであり、Ｂ２２０はＢ細胞のマーカーである。
【０１６２】
図２８〜２９に示すように、Ｒａｐ１−／−マウスはしばしば陰窩膿瘍及び類上皮細胞肉芽腫を示した。これらはクローン病の特徴である。しかしながら、デキストラン硫酸ナトリウムにより誘導されるＴ細胞非依存的な大腸炎等に認められる、大腸損傷依存的な炎症と対照的に、Ｒａｐ１−／−マウスでは重篤な潰瘍も好中球の浸潤も認められなかった。さらに、Ｒａｐ１−／−マウスにおけるこれらの症状は、常に、軽度の異型性を伴う、大腸炎に関連した管状腺腫の発症を伴っていた。
【０１６３】
［実験例２５］
続いて、Ｒａｐ１−／−マウスの結腸粘膜固有層のＣＤ４＋エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）細胞のサイトカイン分泌特性を検討した（ｎ＝５）。具体的には、Ｒａｐ１−／−マウスの結腸粘膜固有層のＴ細胞を、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンで刺激した。続いて、フローサイトメトリーを用いて、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、インターロイキン（ＩＬ）−１７及びＩＬ−４の産生に基づいて、ＣＤ４陽性細胞中のＴＨ１細胞及びＴＨ１７細胞、又はＴＨ１細胞及びＴＨ２細胞の割合を測定した。
【０１６４】
図３０（ａ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図３０（ｂ）は、Ｒａｐ１−／−マウスの結腸粘膜固有層のＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−４産生細胞の割合を示すグラフである。データは平均値±標準誤差を表す。
【０１６５】
その結果、Ｒａｐ１−／−マウスでは、腸間膜リンパ節及びパイエル板で形成された病原性ＴＨ１７エフェクター細胞及びＴＨ１エフェクター細胞が、結腸にホーミングし、大腸炎を引き起こしていることが明らかとなった。
【０１６６】
［実験例２６］
続いて、発明者らは、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウス由来のＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞（以下、「ＴＮ細胞」という場合がある。）を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で刺激し、増殖及びサイトカイン産生に対するＲａｐ１欠損の影響を検討した。
【０１６７】
図３１は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウス由来のＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞の［３Ｈ］−チミジン取り込み量を示すグラフである。Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスのリンパ節及び脾臓に由来する初代ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞を、無刺激（図３１中、「Ｎｏｎｅ」と示す。）、抗ＣＤ３抗体のみ（図３１中、「ＣＤ３」と示す。）又は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体（図３１中、「ＣＤ３／ＣＤ２８」と示す。）で刺激し、刺激開始から４８時間後の３［Ｈ］−チミジン取り込み量を測定した（ｎ＝３）。データは３回の独立した実験結果の平均値±標準誤差を表す。図３１中、「＊１」は、対応するＲａｐ１ｆ／ｆマウス由来のＴ細胞と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表し、「＊２」は危険率２％未満で有意差があることを表す。
【０１６８】
その結果、Ｒａｐ１を欠損したＴ細胞は、対照のＴ細胞と比較して、抗ＣＤ２８抗体の存在下及び非存在下でのＴ細胞受容体複合体の架橋に対する抑制された増殖を示した。
【０１６９】
［実験例２７］
図３２は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウス由来のＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞のサイトカイン産生量を測定した結果を示すグラフである。Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスのリンパ節及び脾臓に由来する初代ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞を、無刺激（図３２中、「−」と示す。）又は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体（図３２中、「＋」と示す。）で刺激した。刺激開始から３日後に、各細胞の培養上清中のサイトカインの量を測定した（ｎ＝３）。データは３回の独立した実験結果の平均値±標準誤差を表す。図３２中、「＊１」は、対応するＲａｐ１ｆ／ｆマウス由来のＴ細胞と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表し、「＊２」は危険率５％未満で有意差があることを表す。
【０１７０】
Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞及びＲａｐ１−／−Ｔ細胞において、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＴＮＦ及びＩＬ−６の産生量には違いが認められなかった。一方、Ｒａｐ１−／−Ｔ細胞のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７の産生は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞と比較して減少又はわずかに増加した。
【０１７１】
［実験例２８］
図３３は、９週齢のＲａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの腸間膜リンパ節、パイエル板及び結腸粘膜固有層における全ＣＤ４陽性Ｔ細胞を基準としたＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を百分率で示すグラフである（ｎ＝１０）。データは平均値±標準誤差を表す。
【０１７２】
［実験例２９］
図３４は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウスの結腸粘膜固有層の細胞のフローサイトメトリー解析の代表的な結果を示すグラフである。図３４の結果は、ＣＤ４陽性細胞にゲートをかけたリンパ球がＦｏｘｐ３を発現していることを示す。
【０１７３】
［実験例３０］
図３５は、Ｔｒｅｇ抑制アッセイを行った結果を示すグラフである。具体的な実験手順は上述した通りである。対照のＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞（図３５中、「Ｔｃｏｎ」と表す。）をＲａｐ１ｆ／ｆＴｒｅｇ細胞又はＲａｐ１−／−Ｔｒｅｇ細胞と図３５に示す割合で混合し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で４８時間刺激し、Ｔｒｅｇ細胞によるナイーブＴ細胞の増殖抑制効果を検討した。
【０１７４】
以上の結果から、Ｒａｐ１−／−マウスの腸間膜リンパ節、パイエル板又は結腸粘膜固有層におけるＦｏｘｐ３陽性細胞の割合及び抑制作用は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス由来の同様の細胞と比較して減少していないことが明らかとなった。
【０１７５】
以上の結果は、Ｒａｐ１−／−マウスの大腸におけるＴＨ１７エフェクター細胞又はＴＨ１エフェクター細胞の増加は、Ｒａｐ１欠損Ｔ細胞の増大した増殖又はサイトカイン産生に依存するものではないことを示す。
【０１７６】
＜ＩＶ．  Ｒａｐ１の欠損はＴＥＭ細胞のローリングを促進した＞
［実験例３１］
Ｒａｐ１欠損ＴＥＭ細胞のホーミング活性を検討するために、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウス由来のＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞を、ＴＨ１７誘導条件下で培養した。図３６及び図３７は、Ｒａｐ１ｆ／ｆマウス及びＲａｐ１−／−マウス由来のＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞を、ＴＨ１７誘導条件下で培養したときのＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、α４β７、ＣＸＣＲ３、ＰＳＧＬ−１及びＬＦＡ−１の発現特性を示す代表的な結果を示すグラフである。
【０１７７】
その結果、Ｒａｐ１の欠損はＴＨ１７細胞及びＴＨ１細胞への分化に顕著な影響を与えなかった。また、Ｒａｐ１の欠損はα４β７、ＰＳＧＬ−１、ＬＦＡ−１及びＣＸＣＲ３の発現にも顕著な影響を与えなかった。
【０１７８】
［実験例３２］
続いて、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞を１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１０の存在下又は非存在下において３７℃１５秒間インキュベートし破砕した。細胞破砕物をＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ融合タンパクを用いたプルダウンアッセイに供し、抗Ｒａｐ１抗体を用いたイムノブロッティングにより解析した。
【０１７９】
図３８は、独立した３回の実験における代表的な結果を示す写真である。その結果、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞は、ＣＸＣＬ１０による刺激により活性化することが明らかとなった。
【０１８０】
［実験例３３］
図３９は、ケモカインの存在下又は非存在下で、デタッチメントアッセイにより測定した、Ｒａｐ１ｆ／ｆＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞、Ｒａｐ１−／−ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞、Ｒａｐ１ｆ／ｆＣＤ４陽性エフェクターＴ細胞、Ｒａｐ１−／−ＣＤ４陽性エフェクター細胞の、ＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ−１結合又はα４β７−ＭａｄＣＡＭ−１結合を静止状態に置いた後に測定した結果を示すグラフである。
【０１８１】
各細胞をＩＣＡＭ−１又はＭａｄＣＡＭ−１上で１０分間インキュベートした後、層流（２ｄｙｎ／ｃｍ２）下に置き、層流に耐性を示した、強く接着した細胞を数えた。データは３回の実験における平均値±標準誤差を表す（各群に付きｎ＝５０）。図３９中、「＊１」は、対照のナイーブＴ細胞と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、対照のＴＥＭ細胞と比較して、危険率２％未満で有意差があることを表す。
【０１８２】
その結果、Ｒａｐ１−／−ナイーブＴ細胞又はＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞のＬＦＡ−１又はα４β７の、ＩＣＡＭ−１又はＭａｄＣＡＭ−１に対する結合活性は、対照細胞と比較して顕著に低かった。一方、ＴＥＭ細胞がＩＣＡＭ−１又はＭａｄＣＡＭ−１に結合する基礎的な結合は上昇していた。これは、ＬＦＡ−１又はα４β７の発現の上昇によると考えられた。
【０１８３】
［実験例３４］
発明者らは、層流下で、Ｒａｐ１の欠損が、Ｐ−セレクチン及びＬＦＡ−１を発現した内皮細胞へのＴＥＭ細胞の接着カスケードに与える影響を検討した。
【０１８４】
ＴＨ１７誘導条件下で分化させたＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞又はＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を、Ｐ−セレクチン及びマウスＩＣＡＭ−１を発現させたＬＳ１２細胞上で、１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１０の存在下又は非存在下、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。
【０１８５】
層流下で、ＴＥＭ細胞と内皮細胞との相互作用を示すデジタルイメージを３０フレーム／秒で撮影した。１００個以上の細胞の接着イベントを測定し、図４０（ａ）に示すように、ローリング、一時的接着、安定な接着に分類した。図４０（ａ）において、データは３回の独立した実験における平均値±標準誤差を表す。図４０（ａ）中、「＊１」は、対照のＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、危険率２％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、対照のＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、危険率５％未満で有意差があることを表す。
【０１８６】
図４０（ｂ）は、ＣＸＣＬ１０の非存在下における、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞又はＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞の内皮細胞上でのローリングの速度を示すグラフである。図４０（ｂ）中、「＊」は、対照のＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、危険率５％未満で有意差があることを表す。
【０１８７】
その結果、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、ＣＸＣＬ１０の存在下及び非存在下で、有意に、より高頻度のローリング及び接着を示した。また、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞のローリングの速度は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞のローリングの速度と比較して有意に遅かった。
【０１８８】
以上の結果は、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞において、ＰＳＧＬ−１／Ｐ−セレクチン依存性のローリングが上昇していることを示す。
【０１８９】
［実験例３５］
続いて、発明者らは、層流下で、Ｒａｐ１の欠損が、ＭａｄＣＡＭ−１を発現した内皮細胞へのＴＥＭ細胞の接着カスケードに与える影響を検討した。
【０１９０】
ＴＨ１７誘導条件下で分化させたＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞又はＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を、ＭａｄＣＡＭ−１を発現させたＬＳ１２細胞上で、１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１０の存在下又は非存在下、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。
【０１９１】
層流下で、ＴＥＭ細胞と内皮細胞との相互作用を示すデジタルイメージを３０フレーム／秒で撮影した。１００個以上の細胞の接着イベントを測定し、図４１（ａ）に示すように、ローリング、一時的接着、安定な接着に分類した。図４１（ａ）において、データは３回の独立した実験における平均値±標準誤差を表す。図４１（ａ）中、「＊１」は、対照のＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、対照のＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、危険率２％未満で有意差があることを表す。
【０１９２】
図４１（ｂ）は、ＣＸＣＬ１０の非存在下における、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞又はＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞の内皮細胞上でのローリングの速度を示すグラフである。図４１（ｂ）中、「＊」は、対照のＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、危険率０．３％未満で有意差があることを表す。
【０１９３】
その結果、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、有意に、より高頻度のローリング及び接着を示した。また、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞のローリングの速度は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞のローリングの速度と比較して有意に遅かった。
【０１９４】
［実験例３６］
発明者らはまた、層流下における、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞の、精製されたＭａｄＣＡＭ−１上へのローリング及び接着を検討した。
【０１９５】
ＴＨ１７誘導条件下で分化させたＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞又はＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を、精製したＭａｄＣＡＭ−１を固定化したプレート上で、１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１０の存在下又は非存在下、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。
【０１９６】
Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞には、予め、Ｒａｐ１のドミナントネガティブ変異体であるＲａｐ１Ｎ１７を発現可能に保持するレンチウイルスベクターを導入した。対照としては、空のレンチウイルスベクターを導入した細胞を使用した。
【０１９７】
層流下で、ＴＥＭ細胞とＭａｄＣＡＭ−１との相互作用を示すデジタルイメージを３０フレーム／秒で撮影した。１００個以上の細胞の接着イベントを測定し、図４２（ａ）に示すように、ローリング、一時的接着、安定な接着に分類した。図４２（ａ）において、データは３回の独立した実験における平均値±標準誤差を表す。図４２（ａ）中、「＊１」は、刺激していない対照のＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、危険率２％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、対応するＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。
【０１９８】
図４２（ｂ）は、ＣＸＣＬ１０の非存在下における、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞又はＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞の内皮細胞上でのローリングの速度を示すグラフである。図４２（ｂ）中、「＊」は、対照のＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、危険率０．５％未満で有意差があることを表す。
【０１９９】
その結果、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞は、ＣＸＣＬ１０の存在下又は非存在下において、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、有意に、より高頻度のローリング及び接着を示した。また、ＭａｄＣＡＭ上でのＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞のローリングの速度は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞のローリングの速度と比較して有意に遅かった。また、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞における、Ｒａｐ１のドミナントネガティブ変異体であるＲａｐ１Ｎ１７の発現は、ＭａｄＣＡＭ上への接着イベントの頻度を有意に抑制した。
【０２００】
［実験例３７］
図４３（ａ）及び（ｂ）は、１μＭ  ５，６−カルボキシフルオレセイン二酢酸（ＣＦＳＥ、インビトロジェン社）で標識したＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞（図４３（ａ））及びＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞（図４３（ｂ））のＭａｄＣＡＭ上でのローリングの様子を層流下で倍率６３倍の対物レンズを用いて観察した結果を示す図である。図４３（ａ）及び（ｂ）に示す時間におけるＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞及びＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞の代表的なイメージを示す。
【０２０１】
１００μｍ／秒未満で遅くローリングするＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞は、いくつかのテザー様の膜の伸長を示した。これは、Ｌ−セレクチン依存性のローリングと同様である。しかしながら、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞は、ＭａｄＣＡＭ上に明確な突起を示さなかった。
【０２０２】
［実験例３８］
続いて、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞及びＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞の結腸へのホーミングの能力を比較するために、これらの細胞を別々に標識して通常のマウスに注射した。具体的には、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を１μＭ  ５，６−カルボキシフルオレセイン二酢酸（ＣＦＳＥ、インビトロジェン社）で標識した。また、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞を１０μＭ  ５−（及び−６）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン（ＣＭＴＭＲ、インビトロジェン社）で標識した。各細胞５×１０６個ずつを混合してＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈注射した。１０時間後に結腸粘膜固有層由来の細胞をフローサイトメトリーで解析した。
【０２０３】
図４４（ａ）及び（ｂ）はフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図４４（ａ）は、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞とＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞の割合を示す、３回の実験の代表的な結果である。図４４（ｂ）中の四角の上の数字は、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞とＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞の割合を示す。
【０２０４】
ＭａｄＣＡＭ−１上への増強したローリング及び接着と一致して、結腸にホーミングしたＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞の数は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞の数の約４倍多かった。
【０２０５】
以上の結果は、Ｒａｐ１の欠損が、病原性ＴＥＭ細胞の大腸へのホーミングを促進することを示す。その結果、自発的な大腸炎が誘導されると考えられる。
【０２０６】
＜Ｖ．  Ｒａｐ１欠損により、Ｅｚｒｉｎタンパク質及びＭｏｅｓｉｎタンパク質のリン酸化が減少した＞
［実験例３９］
発明者らは、Ｒａｐ−１ＧＤＰによって、Ｅｚｒｉｎ／Ｒａｄｉｘｉｎ／Ｍｏｅｓｉｎ（ＥＲＭ）タンパク質が制御されているか否かを検討した。ＥＲＭタンパク質としては、Ｅｚｒｉｎタンパク質及びＭｏｅｓｉｎタンパク質を検討した。
【０２０７】
ｐｒｏ−Ｂ細胞株であるＢＡＦ細胞のＲａｐ１をノックダウンした細胞（Ｒａｐ１ＫＤ）を１００ｎＭのＣＸＣＬ１２で図４５に示す時間刺激した。対照として、通常のＢＡＦ細胞を使用した。細胞破砕物を、第５６７番目のスレオニン残基がリン酸化されたＥｚｒｉｎタンパク質に対する抗体、第５５８番目のスレオニン残基がリン酸化されたＭｏｅｓｉｎタンパク質に対する抗体、抗Ｅｚｒｉｎ抗体及び抗Ｍｏｅｓｉｎ抗体を用いてイムノブロッティングにより検出した。図４５は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。
【０２０８】
図４５に示すように、リンパ球は、Ｅｚｒｉｎタンパク質及びＭｏｅｓｉｎタンパク質を発現した。対照のＢＡＦ細胞において、Ｅｚｒｉｎタンパク質及びＭｏｅｓｉｎタンパク質は高度にリン酸化されていた。しかしながら、ＣＸＣＬ１２で刺激を行うと、リン酸化レベルは半分以下に減少した。
【０２０９】
これに対し、刺激されていないＲａｐ１ＫＤ細胞における、ＥＲＭタンパク質の基礎的なリン酸化量は、対照の細胞の１／３であった。この結果は、Ｒａｐ１−ＧＤＰが刺激されていない細胞におけるＥＲＭタンパク質の最大限のリン酸化に必須であることを示す。
【０２１０】
［実験例４０］
続いて、発明者らは、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂに特異的なセンスｉＲＮＡを、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを用いてＢＡＦ細胞に導入し、Ｒａｐ１ＫＤ細胞とした。対照細胞としては、スクランブルされた対照ｉＲＮＡを、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを用いてＢＡＦ細胞に導入した細胞を使用した。
【０２１１】
Ｒａｐ１ＫＤ細胞及び対照細胞を、１００ｎＭのＣＸＣＬ１２の存在下及び非存在下で３７℃、１０分間インキュベートした。続いて、各細胞をリン酸化Ｅｚｒｉｎタンパク質に対する抗体及びリン酸化Ｍｏｅｓｉｎタンパク質に対する抗体で染色した。
【０２１２】
続いて、各細胞を蛍光顕微鏡観察し、細胞の側部及び後部と比較して、ウロポッド（ｕｒｏｐｏｄ）において５倍以上のリン酸化Ｅｚｒｉｎタンパク質又はリン酸化Ｍｏｅｓｉｎタンパク質を有する細胞の存在割合を測定した。図４６は測定結果を示すグラフである。
【０２１３】
データは３回の独立した実験結果の平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝４０）。図４６中、「＊」は、対照細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【０２１４】
ＣＸＣＬ１２に誘導されるウロポッド形成はＥＲＭタンパク質のリン酸化に依存することが知られている。図４６に示すように、ＣＸＣＬ１２に誘導されるウロポッド形成は、Ｒａｐ１ＫＤ細胞においても減少することが明らかとなった。
【０２１５】
［実験例４１］
図４７（ａ）及び（ｂ）は、対照細胞（図４７（ａ））及びＲａｐ１ＫＤ細胞（図４７（ｂ））の蛍光顕微鏡写真（「ｐＥＲＭ」は、リン酸化Ｅｚｒｉｎタンパク質に対する抗体及びリン酸化Ｍｏｅｓｉｎタンパク質に対する抗体の染色結果を示し、「ＧＦＰ」は、ＧＦＰの蛍光の検出結果を示す。）及び微分干渉顕微鏡写真（ＤＩＣ）である。代表的な結果を示す。スケールバーは５μｍである。
【０２１６】
［実験例４２］
続いて、発明者らは、Ｒａｐ１のＧＴＰアーゼ活性化因子であるＳｐａ−１を強制発現させてその影響を検討した。まず、ＢＡＦ細胞にＳｐａ−１の発現ベクターを導入した。対照として、ＢＡＦ細胞にベクターのみを導入した細胞を使用した。続いて、これらの細胞の破砕物をイムノブロッティングに供し、抗Ｓｐａ−１抗体で検出した。
【０２１７】
図４８は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。その結果、Ｓｐａ−１が強制発現できていることが確認された。
【０２１８】
［実験例４３］
続いて、対照細胞及びＳｐａ−１を強制発現させた細胞を、図４９に示した時間、３７℃で１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２の存在下でインキュベートし破砕した。続いて、細胞破砕物を、ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ融合タンパク質を用いたプルダウンアッセイに供し、抗Ｒａｐ１抗体を用いたイムノブロッティングにより解析した。
【０２１９】
その結果、Ｓｐａ−１の発現は、ＣＸＣＬ２刺激によるＲａｐ１の活性化を阻害することが示された。この阻害はＣＸＣＬ２刺激１５秒後に最大に達した。
【０２２０】
［実験例４４］
続いて、対照細胞及びＳｐａ−１を強制発現させた細胞を、図５０に示した時間、３７℃で１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２の存在下でインキュベートし破砕した。続いて、細胞破砕物を、リン酸化Ｅｚｒｉｎタンパク質に対する抗体、リン酸化Ｍｏｅｓｉｎタンパク質に対する抗体、抗Ｅｚｒｉｎ抗体及び抗Ｍｏｅｓｉｎ抗体を用いたイムノブロッティングに供した。
【０２２１】
図５０は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。その結果、ＣＸＣＬ２で刺激後の全ての時点で、ＥＲＭタンパク質のリン酸化は、対照細胞におけるリン酸化レベルの約１．６倍高かった。
【０２２２】
［実験例４５］
ナイーブＴ細胞において、ＥＲＭタンパク質はリン酸化された活性化状態で存在しており、ＣＣＬ２１で刺激すると１５秒でＥＲＭタンパク質のリン酸化が消失することが知られている。
【０２２３】
そこで、発明者らは、Ｒａｐ−１ｆ／ｆナイーブＴ細胞及びＲａｐ−１−／−ナイーブＴ細胞におけるＥｚｒｉｎタンパク質及びＭｏｅｓｉｎタンパク質のリン酸化を検討した。まず、ナイーブＴ細胞を１００ｎＭ  ＣＣＬ２１で図５１に示す時間刺激した。続いて、各細胞の破砕物を、リン酸化Ｅｚｒｉｎタンパク質に対する抗体、リン酸化Ｍｏｅｓｉｎタンパク質に対する抗体、抗Ｅｚｒｉｎ抗体及び抗Ｍｏｅｓｉｎ抗体を用いたイムノブロッティングに供した。
【０２２４】
図５１は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。アクチンタンパク質は、ローディングコントロールとして検出した。
【０２２５】
その結果、Ｒａｐ−１−／−ナイーブＴ細胞におけるＥＲＭタンパク質のリン酸化の基礎的なレベルは、Ｒａｐ−１ｆ／ｆナイーブＴ細胞のそれの約半分（５２％）に減少することが明らかとなった。
【０２２６】
［実験例４６］
ＴＨ１７誘導条件下で培養したＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞又はＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を、１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１０で１５秒間刺激した。各細胞の破砕物を、リン酸化Ｅｚｒｉｎタンパク質に対する抗体、リン酸化Ｍｏｅｓｉｎタンパク質に対する抗体、抗Ｅｚｒｉｎ抗体及び抗Ｍｏｅｓｉｎ抗体を用いたイムノブロッティングに供した。
図５２はイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【０２２７】
その結果、ＴＥＭ細胞におけるＥＲＭタンパク質は高度にリン酸化されており、ＣＸＣＬ１０刺激によりリン酸化レベルが急激に減少することが明らかとなった。ＣＸＣＬ１０刺激の非存在下において、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞のＥＲＭタンパク質のリン酸化レベルは、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞のそれの１／３未満であった。
【０２２８】
［実験例４７］
Ｒｈｏ関連キナーゼ（Ｒｏｃｋ）がＥＲＭタンパク質をリン酸化することが知られている。そこで、発明者らは、Ｒａｐ１の欠損によってＲｈｏタンパク質の活性が影響を受けるか否かについて検討した。
【０２２９】
具体的には、Ｒｈｏｔｅｋｉｎタンパク質のＲｈｏ結合領域（ＲＢＤ）とＧＳＴタンパク質との融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｒｈｏｔｅｋｉｎ  ＲＢＤ）を用いたプルダウンアッセイにより、ＧＴＰに結合したＲｈｏタンパク質を回収した。
【０２３０】
対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞を１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２で図５３に示す時間刺激後、破砕し、ＧＳＴ−Ｒｈｏｔｅｋｉｎ  ＲＢＤタンパク質を用いたプルダウンアッセイを行った。続いて、ＧＴＰに結合したＲｈｏタンパク質及び総Ｒｈｏタンパク質を、抗Ｒｈｏ抗体を用いたイムノブロッティングにより検出した。図５３はイムノブロッティングの結果を示す写真である。独立した４回の実験の代表的な結果である。
【０２３１】
図５３に示すように、対照細胞において、Ｒｈｏタンパク質は、ＣＸＣＬ１２刺激の３分後に活性化した。また、Ｒａｐ１ＫＤ細胞において、Ｒｈｏタンパク質の活性化の減少は認められなかった。
【０２３２】
この結果は、Ｒｈｏタンパク質の活性が、Ｒａｐ１ＫＤ細胞におけるＥＲＭタンパク質のリン酸化の減少には関与していないことを示す。
【０２３３】
［実験例４８］
ＬＯＫタンパク質がリンパ球のＥＲＭタンパク質をリン酸化することが知られている。そこで、発明者らは、Ｒａｐ１の欠損によってＬＯＫタンパク質の活性が影響を受けるか否かについて検討した。
【０２３４】
アフリカミドリザル腎細胞株であるＣＯＳ細胞に、ＦＬＡＧタグを結合したＬＯＫタンパク質（ＦＬＡＧ−ＬＯＫ）を発現させた。同時に、Ｔ７タグを結合したＲａｐ１Ｖ１２又はＲａｐ１Ｎ１７も発現させた。Ｒａｐ１Ｎ１７はＲａｐ１のドミナントネガティブ変異体である。
【０２３５】
続いて、細胞破砕物をＨａｌｏ−ｌｉｎｋｅｄレジンで免疫沈降し、抗Ｔ７抗体でイムノブロットした。
【０２３６】
図５４は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。独立した４回の実験の代表的な結果を示す。その結果、Ｒａｐ１−ＧＴＰではなく、Ｒａｐ１−ＧＤＰがＬＯＫタンパク質と結合することが明らかとなった。
【０２３７】
［実験例４９］
続いて、Ｒａｐ１Ｎ１７発現ＣＯＳ細胞又はＲａｐ１Ｖ１２発現ＣＯＳ細胞におけるＬＯＫタンパク質のキナーゼ活性を測定した。図５５は、キナーゼ活性を測定した結果を示す写真である。３回の実験の代表的な結果を示す。
【０２３８】
その結果、ＬＯＫタンパク質とＲａｐ１−ＧＤＰとの結合はＬＯＫタンパク質のキナーゼ活性を増加させることが明らかとなった。
【０２３９】
［実験例５０］
続いて、対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞にＦＬＡＧ−ＬＯＫを発現させ、図５６に示す時間、１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２で刺激した。続いて、ＬＯＫタンパク質のキナーゼ活性を測定した。図５６は、キナーゼ活性を測定した結果を示す写真である。３回の実験の代表的な結果を示す。
【０２４０】
その結果、Ｒａｐ１ＫＤ細胞におけるＬＯＫタンパク質のキナーゼ活性は対照細胞の１８±２．６％に減少したことが明らかとなった。ＣＸＣＬ１２刺激は、迅速に、ＬＯＫタンパク質のキナーゼ活性を１／３に減少させた。この結果は、上述したＥＲＭタンパク質のリン酸化の減少の速度論と一致した。
【０２４１】
［実験例５１］
続いて、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞又はＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を、１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１０で図５７に示す時間刺激した。続いて、各細胞中のＬＯＫタンパク質のキナーゼ活性を測定した。図５７は、キナーゼ活性を測定した結果を示す写真である。３回の実験の代表的な結果を示す。
【０２４２】
その結果、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞中のＬＯＫタンパク質のキナーゼ活性は、ＣＸＣＬ１０刺激の非存在下において対照細胞の３２％に減少したことが明らかとなった。
【０２４３】
以上の結果は、Ｒａｐ１−ＧＤＰがＬＯＫタンパク質の活性化に必要であり、ナイーブＴ細胞及びＴＥＭ細胞のＥＲＭタンパク質のリン酸化に重要な役割を担っていることを示す。
【０２４４】
＜ＶＩ．  Ｒａｐ１欠損Ｔ細胞における、リン酸化状態を模倣したＥｚｒｉｎタンパク質の発現がローリングを減少させた＞
［実験例５２］
Ｒａｐ１ＫＤ細胞における、Ｅｚｒｉｎタンパク質及びＭｏｅｓｉｎタンパク質の減少したリン酸化が、Ｌ−セレクチン依存性ローリングを促進しているのか否かについて検討した。具体的には、Ｅｚｒｉｎタンパク質のリン酸化状態を模倣した変異体（Ｔ５６７Ｅ）を、対照細胞及びＲａｐ１ＫＤ細胞に導入した。
【０２４５】
まず、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂに特異的なセンスｉＲＮＡを、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを用いてＢＡＦ細胞に導入し、Ｒａｐ１ＫＤ細胞とした。対照細胞としては、スクランブルされた対照ｉＲＮＡを、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを用いてＢＡＦ細胞に導入した細胞を使用した。
【０２４６】
これらの細胞に、ＦＬＡＧタグを結合したＥｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現するレンチウイルスベクターを導入した。対照として、ベクターのみを導入した細胞を使用した。続いて、これらの細胞の破砕物をイムノブロッティングに供し、抗ＦＬＡＧ抗体で検出した。アクチンタンパク質は、ローディングコントロールとして検出した。
【０２４７】
図５８は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。４回の独立した実験の代表的な結果を示す。その結果、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）が強制発現できていることが確認された。
【０２４８】
続いて、これらの細胞のＮｅｐｍｕｃｉｎ（ＣＤ３００ＬＧ）上でのローリングを上記と同様にして測定した。図５９はローリング活性を測定した結果を示すグラフである。データは３回の独立した実験における平均値±標準誤差を表す。図５９中、「＊」は、対照のＲａｐ１ＫＤ細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【０２４９】
続いて、上記の細胞のＬＳ１２細胞上でのローリングを上記と同様にして測定した。図６０（ａ）はローリング活性を測定した結果を示すグラフである。データは３回の独立した実験における平均値±標準誤差を表す。図６０（ａ）中、「＊１」は、スクランブルされた対照ｉＲＮＡを導入した対照細胞と比較して、危険率０．５％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、スクランブルされた対照ｉＲＮＡを導入した対照細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【０２５０】
また、「＊３」は、対照のＲａｐ１ＫＤ細胞と比較して、危険率０．２％未満で有意差があることを表す。また、「＊４」は、対照のＲａｐ１ＫＤ細胞と比較して、危険率０．５％未満で有意差があることを表す。
【０２５１】
図６０（ｂ）は、各細胞のローリングの速度を示すグラフである。データは３回の実験における平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝１５０）。図６０（ｂ）中、「＊」は、Ｒａｐ１ＫＤ細胞にベクターのみを導入した細胞と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。
【０２５２】
その結果、図６０（ａ）に示すように、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現させることにより、ケモカインの非存在下における、Ｎｅｐｍｕｃｉｎ上又は内皮細胞上でのＲａｐ１ＫＤ細胞のローリングの頻度が、対照細胞と比較して有意に減少した。
【０２５３】
また、対照細胞におけるＥｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）の発現は、Ｒａｐ１ＫＤ細胞におけるＥｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）の発現と同様に、内皮細胞上におけるローリングの頻度をケモカインの存在下及び非存在下において減少させた。
【０２５４】
また、図６０（ｂ）に示すように、Ｒａｐ１ＫＤ細胞のローリングの速度は、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現させることにより有意に上昇した。
【０２５５】
［実験例５３］
フローサイトメトリー解析により、大腸炎を自発的に発症したＲａｐ１−／−マウスの腸間膜リンパ節由来のＴ細胞のサイトカイン分泌特性を測定した（ｎ＝５）。大腸炎を発症したマウスのリンパ節由来のＣＤ４陽性ＴＥＭ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の存在下で３日間培養した。続いて、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンで刺激し、サイトカイン分泌特性を解析した。図６１（ａ）及び（ｂ）は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図６１（ｃ）は、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４産生細胞の割合を百分率で示したグラフである。データは平均値±標準誤差を表す。
【０２５６】
［実験例５４］
続いて、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞にＥｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現するレンチウイルスベクターを導入し、ＴＨ１７誘導条件下で培養した。対照には、ベクターのみを導入した細胞を用いた。続いて、これらの細胞の破砕物をイムノブロッティングに供し、抗ＦＬＡＧ抗体で検出した。
【０２５７】
図６２は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。アクチンタンパク質は、ローディングコントロールとして検出した。その結果、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）が強制発現できていることが確認された。
【０２５８】
［実験例５５］
続いて、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を強制発現したＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞及びＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞の形態を共焦点顕微鏡で観察した。図６３（ａ）は、代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。
【０２５９】
図６３（ｂ）は、１分間に１回以上ブレブ形成した細胞の割合を百分率で示したグラフである（ｎ＝５０）。図６３中、「＊１」は、対照のＲａｐ１ｆ／ｆＴＥＭ細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、対照のＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞にベクターのみを導入した細胞と比較して、危険率０．２％未満で有意差があることを表す。
【０２６０】
［実験例５６］
図６４は、対照細胞及びＥｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞における、ＣＸＣＲ３及びα４β７の発現プロファイルを示すグラフである。
【０２６１】
その結果、対照細胞及びＥｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現したＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞は、ＣＸＣＲ３及びα４β７の同程度の発現を示した。一方、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現したＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞は、対照細胞と比較して有意に減少したブレブ形成を示した。
【０２６２】
［実験例５７］
ベクターのみ又はＥｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を、ＴＨ１７誘導条件下、精製したＭａｄＣＡＭ−１を固定化したプレート上で、１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１０の存在下又は非存在下、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。
【０２６３】
層流下で、ＴＥＭ細胞とＭａｄＣＡＭ−１との相互作用を示すデジタルイメージを３０フレーム／秒で撮影した。１００個以上の細胞の接着イベントを測定し、図６５（ａ）に示すように、ローリング、一時的接着、安定な接着に分類した。
【０２６４】
図６５（ａ）において、データは３回の独立した実験における平均値±標準誤差を表す。図６５（ａ）中、「＊１」は、対照のＴＥＭ細胞と比較して、危険率２％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、対応するＴＥＭ細胞と比較して、危険率０．２％未満で有意差があることを表す。
【０２６５】
図６５（ｂ）は、ＣＸＣＬ１０の非存在下における、ＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞のＭａｄＣＡＭ−１上でのローリングの速度を示すグラフである。図６５（ｂ）中、「＊」は、対照のＴＥＭ細胞と比較して、危険率０．５％未満で有意差があることを表す。
【０２６６】
図６５（ａ）及び（ｂ）に示すように、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）の発現は、ＣＸＣＬ１０の存在下又は非存在下において、Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞のローリング及び接着を有意に抑制し、ローリング速度を上昇させた。
【０２６７】
［実験例５８］
続いて、発明者らは、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞の結腸へのホーミングの検討を行った。対照細胞としては、ベクターのみを導入したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を使用した。
【０２６８】
ＣＦＳＥ又はＣＭＴＭＲでそれぞれ染色した各細胞５×１０６個ずつを混合してＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈注射した。１０時間後に結腸粘膜固有層由来の細胞をフローサイトメトリーで解析した。
【０２６９】
図６６（ａ）は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図６６（ａ）中の四角の上の数字は、対照細胞とＥｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現したＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞の割合を示す。図６６（ｂ）は、結腸粘膜固有層における、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現したＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞の対照細胞に対する割合を示すグラフである（ｎ＝３）。図６６（ｂ）中、「＊」は、対照細胞と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【０２７０】
その結果、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現したＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞の、結腸にホーミングする能力は対照細胞の３６．５±５．３％に減少した。Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を発現したＲａｐ１−／−ＴＥＭ細胞及び対照細胞は、血液中では同数存在していた。
【０２７１】
［実験例５９］
続いて、発明者らは、ＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−病原性Ｔ細胞を、放射線照射した通常のマウスに移植し、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）の発現が大腸炎の発症を抑制するか否かを検討した。
【０２７２】
図６７は、細胞を移植していないマウス、ベクターのみを導入したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を移植したマウス（対照）、及びＥｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を導入したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を移植したマウスの体重を毎日測定し、測定開始時の体重を基準とした百分率で示したグラフである（各群についてｎ＝３）。データは平均値±標準誤差を表す。図６７中、「＊」は、対照細胞と比較して、危険率２％未満で有意差があることを表す。
【０２７３】
［実験例６０］
図６８は、各マウスの大腸炎によるダメージを光学顕微鏡観察に基づいて評価した結果を示すグラフである。縦軸は、組織学的スコアを表す。組織学的スコアは上述した基準に基づいて評価した。データは平均値±標準誤差を表す。図６８中、「＊」は、ベクターのみを導入したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を移植したマウスと比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。
【０２７４】
図６９は、細胞を移植したマウスにおける大腸の代表的な組織構造を示す顕微鏡写真である。各マウスの結腸のパラフィン包埋組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色し、光学顕微鏡で観察した代表的な組織学的構造を示す（倍率４０倍）。スケールバーは２００μｍを示す。
【０２７５】
その結果、ＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を移植したマウスは、３週間で、体重の減少、下痢を特徴とする消耗性疾患を発症した。しかしながら、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を導入したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を移植したマウスは、少なくとも移植後３週間、上記のような症状を示さなかった。
【０２７６】
［実験例６１］
図７０は、ＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を移植したマウス及びＥｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を導入したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を移植したマウスの結腸の凍結切片を抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体で染色した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。
【０２７７】
その結果、Ｅｚｒｉｎ変異体（Ｔ５６７Ｅ）を導入したＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を移植したマウスの結腸では、ＣＤ４陽性Ｒａｐ１−／−ＴＥＭ細胞を移植したマウスの結腸と比較して、ＣＤ４陽性ＴＥＭ細胞の浸潤が減少していることが明らかとなった。
【０２７８】
以上の結果は、Ｒａｐ１−ＧＤＰが、ＥＲＭタンパク質のリン酸化を介したＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン又はα４β７依存性のローリングを抑制し、ＣＤ４陽性病原性Ｔ細胞の結腸への移動を抑制することにより、大腸炎の発症を阻害していることを示す。
【０２７９】
＜ＶＩＩ．  フィラミンはＬＦＡ−１の活性化を抑制した＞
［実験例６２］
ケモカイン刺激後のＲａｐ１−ＧＴＰの細胞内局在を検討した。以下の実験では、Ｒａｌグアニンヌクレオチド解離阻害因子（ＧＤＳ）−ＲＢＤ（Ｒａｓ結合ドメイン）−ｍＣｈｅｒｒｙ（ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ）をレポーターとして使用した。
【０２８０】
ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ及びｍＣｈｅｒｒｙの融合タンパク質を発現させた対照細胞を１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２で図７１に示す時間刺激した。図７１は、上記の細胞を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは５μｍを表す。
【０２８１】
図７２は、ＣＸＣＬ１２による刺激の３秒後にＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙが細胞膜に局在する様子を示す共焦点顕微鏡写真である。ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ及びｍＣｈｅｒｒｙの融合タンパク質を野生型の細胞で発現させ、ＣＸＣＬ１２刺激によるその局在の変化を検討した。図７２は、５回の実験の代表的な結果を示す。スケールバーは５μｍを示す。図７２の各写真の下のグラフは、各写真におけるＸ−Ｙ直線に沿ったＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度のラインプロファイルを示す。
【０２８２】
その結果、ＣＸＣＬ１２刺激の前は、ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質は細胞全体に拡散して存在していた。そして、ＣＸＣＬ１２刺激の５秒後に細胞膜に集積した。
【０２８３】
図７１に示すように、Ｒａｐ１活性化の数秒後にブレブが出現し、続いて膜のひだが出現した。図７３は、ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度の疑似カラーイメージを示す共焦点顕微鏡画像である。ＣＸＣＬ１２刺激の７０秒後に、ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙは核周囲領域に局在した。スケールバーは５μｍを表す。最終的に、ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙは、極性化した細胞の前縁に局在した。
【０２８４】
［実験例６３］
図７４は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を基礎としたＲａｐ１活性のセンサーを対照細胞に導入し、図７４に示す時間１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２で刺激した結果を示す画像である。ＦＲＥＴ効率に対応するｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ／ＣＦＰの蛍光強度比イメージを示す。５回の実験の代表的な結果を示す。スケールバーは５μｍを示す。
【０２８５】
図７４に示すように、Ｒａｐ１の活性化は、ＣＸＣＬ１２刺激から５秒以内に細胞膜で起こり、続いて核周囲領域で起こった。最終的に、Ｒａｐ１の活性化は細胞の前縁に限定された。
【０２８６】
［実験例６４］
発明者らは、更に、ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙを用いて、Ｒａｐ１活性化と層流下でのリンパ球の内皮細胞への接着との関連を検討した。ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙを発現させた対照細胞を、１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２の存在下、ＬＳ１２細胞上で２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。層流下で倍率６３倍の対物レンズを用いて、細胞の接着領域のデジタルイメージを毎秒１フレームで撮影した。図７５は、３回の実験の代表的な結果を示す図である。
【０２８７】
その結果、ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙが対照細胞及び内皮細胞の接触領域の一部に明確に集積したときに、当該Ｒａｐ１の活性化部位を通じて細胞が停止することが明らかとなった。
【０２８８】
これらの結果は、Ｒａｐ１の活性化は細胞膜においてケモカイン刺激の数秒以内に起こり、内皮細胞上におけるＬＦＡ−１依存性の細胞接着が誘導されることを示す。
【０２８９】
［実験例６５］
続いて、発明者らは、ＬＦＡ−１の細胞質ドメインにアクチン結合タンパク質であるフィラミン（ＦＬＮ）が結合しているか否かを検討した。具体的には、Ｒａｐ１Ｖ１２又はＲａｐ１Ｎ１７とＦＬＮａとの結合をプルダウンアッセイにより検討した。
【０２９０】
Ｔ７タグを結合したＲａｐ１Ｖ１２、Ｒａｐ１Ｎ１７、αＬ及びβ２をＣＯＳ細胞に導入した。遺伝子導入から４８時間後に細胞を破砕し、ＦＬＮａリピートの１〜３、４〜７、８〜１１及び２１とＧＳＴとの融合タンパク質を用いたプルダウンアッセイを行い、抗Ｔ７抗体又は抗β２抗体を用いたイムノブロッティングにより検出した。図７６は３回の実験の代表的な結果を示す。
【０２９１】
その結果、Ｒａｐ１Ｎ１７ではなくＲａｐ１Ｖ１２がＦＬＮａリピートの１〜３とＧＳＴとの融合タンパク質に結合した。しかしながら、検討した他の領域については、非常に弱く結合したか、全く結合しなかった。また、ＬＦＡ−１のβ２は、ＦＬＮａのリピート２１と結合した。
【０２９２】
［実験例６６］
Ｔ７タグを結合したＲａｐ１Ｖ１２、Ｒａｐ１Ｎ１７、αＬ及びβ２をＣＯＳ細胞に導入した。遺伝子導入から４８時間後に細胞を破砕し、細胞破砕物を抗ＦＬＮａ抗体を用いた免疫沈降に供し、沈降物を抗Ｔ７抗体を用いたイムノブロッティングにより検出した。図７７は、免疫沈降の結果を示す写真である。４回の実験の代表的な結果を示す。図７７に示すように、Ｒａｐ１−ＧＤＰではなくＲａｐ１−ＧＴＰが細胞中のＦＬＮａと結合した。
【０２９３】
［実験例６７］
続いて、発明者らは、リピート１〜３をそれぞれ欠失したＦＬＮａとＲａｐ１Ｖ１２との結合を検討した。
【０２９４】
具体的には、Ｈａｌｏ−野生型ＦＬＮａ、Ｈａｌｏ−ＦＬＮａ（Δ１）、Ｈａｌｏ−ＦＬＮａ（Δ２）、Ｈａｌｏ−ＦＬＮａ（Δ３）をＣＯＳ細胞に導入した。ここで、ＦＬＮａ（Δ１）はＦＬＮａのリピート１欠失変異体を表す。また、ＦＬＮａ（Δ２）はＦＬＮａのリピート２欠失変異体を表す。また、ＦＬＮａ（Δ３）はＦＬＮａのリピート３欠失変異体を表す。
【０２９５】
続いて、遺伝子導入から４８時間後に細胞を破砕し、細胞破砕物をＨａｌｏｌｉｎｋ（商標）レジンを用いた免疫沈降に供し、沈降物を抗Ｔ７抗体又は抗ＦＬＮａ抗体を用いたイムノブロッティングにより検出した。図７８は、免疫沈降の結果を示す写真である。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。
【０２９６】
その結果、Ｒａｐ１Ｖ１２は、ＦＬＮａ（Δ１）及びＦＬＮａ（Δ２）と結合したが、ＦＬＮａ（Δ３）とは結合しなかった。この結果は、ＦＬＮａのリピート３がＲａｐ１−ＧＴＰとの結合に最も重要な領域であることを示す。
【０２９７】
［実験例６８］
続いて発明者らは、ＦＬＮａとＲａｐ１−ＧＴＰとの結合が、ＦＬＮａとβ２の細胞質領域との結合に影響しているか否かを検討した。具体的には、Ｈａｌｏ−ＦＬＮａ、Ｔ７タグを結合したＲａｐ１Ｖ１２及びＲａｐ１Ｎ１７、αＬ、並びにｍＲＦＰタグを結合したβ２をＣＯＳ細胞に導入した。遺伝子導入から４８時間後に細胞を破砕し、細胞破砕物をＨａｌｏｌｉｎｋ（商標）レジンを用いた免疫沈降に供し、沈降物を抗ｍＲＦＰ抗体、抗Ｔ７抗体、抗Ｈａｌｏ抗体及び抗αＬ抗体を用いたイムノブロッティングにより検出した。図７９は、免疫沈降の結果を示す写真である。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。
【０２９８】
その結果、ＦＬＮａはＲａｐ１Ｖ１２と結合することが明らかとなった。この結果、ＦＬＮａとβ２との結合が、Ｒａｐ１Ｎ１７を発現させた細胞におけるＦＬＮａとβ２との結合と比較して減少した。
【０２９９】
［実験例６９］
ベクターのみ又はＴ７タグを結合したＲａｐ１Ｖ１２（Ｔ７−Ｒａｐ１Ｖ１２）を発現したＢＡＦ／ＬＦＡ−１細胞の膜画分をβ２の細胞質領域とＧＳＴとの融合タンパク質（β２ｃｙｔ−ＧＳＴ）を用いてプルダウンした。
【０３００】
β２ｃｙｔ−ＧＳＴに結合したＦＬＮａ、全ＦＬＮａ及びＴ７−Ｒａｐ１Ｖ１２を、抗ＦＬＮａ抗体及び抗Ｔ７抗体を用いたイムノブロッティングにより解析した。図８０は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。
【０３０１】
その結果、Ｒａｐ１Ｖ１２発現細胞の膜画分からβ２ｃｙｔ−ＧＳＴによりプルダウンされたＦＬＮａの量は、対照細胞の３２％であった。
【０３０２】
［実験例７０］
Ｒａｐ１はケモカイン刺激によって活性化されるため、発明者らは、ＣＸＣＬ１２刺激がＲａｐ１−ＧＴＰに依存してＦＬＮとβ２との結合を減少させるか否かを検討した。ベクターのみ又はＳｐａ−１を発現させた細胞を１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２で１分間刺激し、破砕した。細胞破砕物を、抗β２抗体を用いて免疫沈降し、沈降物を抗ＦＬＮａ抗体を用いたイムノブロッティングにより検出した。
【０３０３】
図８１は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。その結果、ＣＸＣＬ１２刺激後の対照細胞において、抗β２抗体により免疫沈降したＦＬＮａの量は、ＣＸＣＬ１２刺激なしの対照細胞において、抗β２抗体により免疫沈降したＦＬＮａの量の２８％であった。
【０３０４】
一方、ＣＸＣＬ１２刺激後のＳｐａ−１発現細胞において、抗β２抗体により免疫沈降したＦＬＮａの量は、ＣＸＣＬ１２刺激なしのＳｐａ−１発現細胞において、抗β２抗体により免疫沈降したＦＬＮａの量の６８％であった。
【０３０５】
この結果は、ＣＸＣＬ１２刺激が対照細胞におけるβ２とＬＦＮａとの結合を減少させるが、Ｓｐａ−１発現細胞におけるβ２とＬＦＮａとの結合は減少させないことを示す。すなわち、Ｓｐａ−１の発現によるＲａｐ１活性化の阻害が、ＣＸＣＬ１２刺激後のＬＦＡ−１とβ２の細胞質領域との解離を抑制した。
【０３０６】
［実験例７１］
続いて、発明者らは、接着カスケードにおける、ＦＬＮとβ２とのＲａｐ依存性の解離について検討した。まず、ＦＬＮａ及びＦＬＮｂをｓｈＲＮＡによりノックダウン（ＫＤ）した。スクランブルｓｈＲＮＡ（対照）、ＦＬＮａに対するｓｈＲＮＡ又はＦＬＮｂに対するｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスをＢＡＦ／ＬＦＡ−１／Ｌ−セレクチン細胞に導入し、細胞破砕物をイムノブロッティングにより解析した。図８２はイムノブロッティングの結果を示す写真である。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。アクチンタンパク質をローディングコントロールとして検出した。その結果、ＦＬＮａ及びＦＬＮｂの８５％以上がノックダウンできていることが確認された。
【０３０７】
［実験例７２］
ＬＦＡ−１の活性化エピトープに対する抗体（ＫＩＭ１２７）を用いたフローサイトメトリー解析により、対照細胞、ＦＬＮａＫＤ細胞、ＦＬＮｂＫＤ細胞、ＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞におけるＬＦＡ−１の活性化を検討した。
【０３０８】
図８３は、結果を示すグラフである。データは、抗ＬＦＡ−１抗体（ＴＳ１／１８）を用いたＬＦＡ−１の発現量に基づいて正規化した。データは３回の実験結果の平均値±標準誤差を表す。図８３中、「＊」は、対照細胞と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。
【０３０９】
続いて、同様の実験をＬＦＡ−１の活性化エピトープに対する別の抗体（ＭＥＭ１４８）を用いたフローサイトメトリー解析により行い、対照細胞、ＦＬＮａＫＤ細胞、ＦＬＮｂＫＤ細胞、ＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞におけるＬＦＡ−１の活性化を検討した。
【０３１０】
図８４は、結果を示すグラフである。データは、抗ＬＦＡ−１抗体（ＴＳ１／１８）を用いたＬＦＡ−１の発現量に基づいて正規化した。データは３回の実験結果の平均値±標準誤差を表す。図８４中、「＊」は、対照細胞と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。
【０３１１】
その結果、抗体ＫＩＭ１２７及びＭＥＭ１４８により認識される、ＬＦＡ−１の活性化を示すエピトープの発現は、ＦＬＮのノックダウンにより有意に上昇した。この結果は、ＦＬＮがＬＦＡ−１の活性化を制限していることを示す。
【０３１２】
［実験例７３］
続いて、発明者らは、ＦＲＡＰ（光褪色後蛍光回復法）により、ＦＬＮのノックダウンがＬＦＡ−１の可動性を高めているか否かを検討した。図８５は、赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）標識したＬＦＡ−１を発現した対照細胞及びＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞における、フォトブリーチングから１分後の回復割合の百分率を示すグラフである。データは３回の実験結果の平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝２０）。図８５中、「＊」は、対照細胞と比較して、危険率０．５％未満で有意差があることを表す。
【０３１３】
その結果、対照細胞と比較して、ＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞におけるＬＦＡ−１の可動性は有意に高かった。
【０３１４】
［実験例７４］
図８６（ａ）及び（ｂ）は、αＬ−ｍＲＦＰ及びβ２を共発現させた対照細胞（図８６（ａ））及びＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞（図８６（ｂ））を、波長５６７ｎｍのレーザーを用いてフォトブリーチングし、定量的なＦＲＡＰ解析を行った代表的な結果を示すグラフである。
【０３１５】
［実験例７５］
図８７は、αＬ−ｍＲＦＰ及びβ２を共発現させたＢＡＦ細胞を用いたＦＲＡＰ解析の代表的な結果を示す写真である。四角はフォトブリーチングを行った領域を示す。スケールバーは５μｍを表す。
【０３１６】
［実験例７６］
対照細胞、ＦＬＮａＫＤ細胞、ＦＬＮｂＫＤ細胞及びＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞をＬＳ１２細胞上で、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。各細胞の相互作用を示すデジタルイメージを３０フレーム／秒で撮影し、ローリング、一時的接着、安定な接着に分類した（各群についてｎ＝１５０）。
【０３１７】
図８８は、結果を示すグラフである。図８８中、「＊１」は、対照細胞における合計頻度と比較して、危険率２％未満で有意差があることを表す。「＊２」は、対照細胞における合計頻度と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。
【０３１８】
その結果、ＢＡＦ／ＬＦＡ−１／Ｌ−セレクチン細胞におけるＦＬＮａ又はＦＬＮｂの欠損は、ローリング及び接着の頻度を上昇させ、ＦＬＮａ及びｂのダブルノックダウンはこれらの頻度を相加的に上昇させることが明らかとなった。
【０３１９】
［実験例７７］
図８９は、対照細胞又はＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞のＬＳ１２細胞上におけるローリングの速度を示すグラフである。データは３回の実験結果の平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝１５０）。図８９中、「＊」は、対照細胞と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。
【０３２０】
その結果、ＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞のローリングの速度は、対照細胞と比較して有意に遅かった。
【０３２１】
［実験例７８］
対照細胞及びＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞を抗Ｌ−セレクチン抗体若しくは抗ＬＦＡ−１抗体の存在下又は非存在下で前処理し、ＬＳ１２細胞上で、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。各細胞の相互作用を示すデジタルイメージを３０フレーム／秒で撮影し、ローリング、一時的接着、安定な接着に分類した。
【０３２２】
図９０は、結果を示すグラフである。データは３回の実験結果の平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝１５０）。図９０中、「＊」は、対照細胞における合計頻度と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。
【０３２３】
その結果、細胞の相互作用イベントの頻度は、細胞を抗ＬＦＡ−１抗体で前処理することにより有意に減少することが明らかとなった。
【０３２４】
［実験例７９］
対照細胞又はＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞を抗ＬＦＡ−１抗体で前処理し、ＬＳ１２細胞上におけるローリングの速度を検討した。図９１は、対照細胞又はＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞のローリングの速度に対する抗ＬＦＡ−１抗体の影響を示すグラフである。
【０３２５】
図９１中、「＊１」は、対照細胞と比較して、危険率２％未満で有意差があることを表す。「＊２」は、抗ＬＦＡ−１抗体で前処理していないＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞と比較して、危険率５％未満で有意差があることを表す。
【０３２６】
その結果、ＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞のローリングの速度は、抗ＬＦＡ−１抗体処理により有意に速くなることが明らかとなった。
【０３２７】
［実験例８０］
対照細胞及びＦＬＮａ／ｂＫＤ細胞を、１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２の存在下又は非存在下、抗Ｌ−セレクチン抗体若しくは抗ＬＦＡ−１抗体の存在下又は非存在下、ＬＳ１２細胞上で、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。
【０３２８】
図９２は、実験結果を示すグラフである。データは３回の実験結果の平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝１５０）。図９２中、「＊１」は、ＣＸＣＬ１２で刺激し、抗ＬＦＡ−１抗体で処理しなかった対照細胞における合計頻度と比較して、危険率２％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、ＣＸＣＬ１２で刺激し、抗ＬＦＡ−１抗体で処理しなかった対照細胞における合計頻度と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。
【０３２９】
以上の結果から、ＦＬＮの欠損は、主にＬＦＡ−１依存性のローリング及び接着を誘導することが明らかとなった。
【０３３０】
＜ＶＩＩＩ．  ＦＬＮａ欠損Ｔ細胞は、ＬＦＡ−１に媒介される機能の増強を示した＞
［実験例８１］
続いて、発明者らは、初代Ｔ細胞の接着カスケードにおけるＦＬＮａの機能について検討した。ＦＬＮａのコンディショナルノックアウトマウスを作製するために、ＦＬＮａアレルがｌｏｘＰ配列で挟まれたマウス（以下、「ＦＬＮａｆ／ｆ」マウスという場合がある。）と、Ｔ細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するＬｃｋ−Ｃｒｅマウスとを交配させた。得られた子孫の中に、Ｔ細胞特異的にＦＬＮａを欠損したマウス（以下、「ＦＬＮａ−／−」マウスという場合がある。）が得られた。
【０３３１】
ＦＬＮａｆ／ｆマウス及びＦＬＮａ−／−マウス由来のＴ細胞を抗ＦＬＮａ抗体又は抗ＦＬＮｂ抗体を用いたイムノブロッティングにより解析した。アクチンタンパク質をローディングコントロールとして検出した。図９３は、３回の独立した実験の代表的な結果を示す写真である。
【０３３２】
その結果、ＦＬＮａ−／−マウス由来のＴ細胞（以下、「ＦＬＮａ−／−Ｔ細胞」という場合がある。）では、ＦＬＮａタンパク質が発現していないことが確認された。しかしながらＦＬＮｂの発現はわずかに補償的に上昇した。
【０３３３】
［実験例８２］
ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞及びＦＬＮａ−／−Ｔ細胞のＬＳ１２細胞上での接着イベントを、上記と同様にして層流下で測定した。図９４は、結果を示すグラフである。データは３回の独立した実験結果の平均値±標準誤差を表す。図９４中、「＊１」は、対応するＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞における合計頻度と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、抗ＬＦＡ−１抗体で処理しなかったＦＬＮａ−／−Ｔ細胞における合計頻度と比較して、危険率０．１％未満で有意差があることを表す。また、「＊３」は、抗ＬＦＡ−１抗体で処理しなかったＦＬＮａ−／−Ｔ細胞における合計頻度と比較して、危険率３％未満で有意差があることを表す。
【０３３４】
図９５は、ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞及びＦＬＮａ−／−Ｔ細胞の、ＣＣＬ２１の非存在下、ＬＳ１２内皮細胞上でのローリングの速度に対する抗ＬＦＡ−１抗体の影響を示すグラフである。データは３回の独立した実験結果の平均値±標準誤差を表す。図９５中、「＊１」は、ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、抗ＬＦＡ−１抗体で処理しなかったＦＬＮａ−／−Ｔ細胞と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。
【０３３５】
その結果、ＦＬＮａ−／−Ｔ細胞は、ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞と比較して、ＬＦＡ−１依存性ローリングの頻度の有意な上昇及びローリングの速度の有意な低下を示すことが明らかとなった。また、抗ＬＦＡ−１抗体による前処理により、ＦＬＮａ−／−Ｔ細胞の相互作用イベントの頻度が有意に低下し、ローリングの速度が有意に上昇した。
【０３３６】
［実験例８３］
ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞及びＦＬＮａ−／−Ｔ細胞を、ＣＣＬ２１の非存在下、ＭａｄＣＡＭ−１上で、２ｄｙｎ／ｃｍ２の層流下で灌流させた。図９６（ａ）は上記と同様にして細胞の接着イベントを測定した結果を示すグラフである。データは３回の実験における平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝１００）。
【０３３７】
図９６（ｂ）は、ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞及びＦＬＮａ−／−Ｔ細胞のローリングの速度を示すグラフである。データは３回の実験における平均値±標準誤差を表す（各群についてｎ＝１００）。
【０３３８】
その結果、ＦＬＮａ−／−Ｔ細胞及びＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞との間には、α４β７依存性のローリングであるＭａｄＣＡＭ−１上のローリングの頻度及びローリングの速度には有意な差は認められなかった。
【０３３９】
［実験例８４］
図９７（ａ）及び（ｂ）は、ＣＣＬ２１の存在下又は非存在下におけるＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞及びＦＬＮａ−／−Ｔ細胞のＩＣＡＭ−１上での移動（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（図９７（ａ））及び速度（図９７（ｂ））を示すグラフである（各群についてｎ＝５０）。図９７中、「＊１」は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞と比較して、危険率２％未満で有意差があることを表す。また、「＊２」は、Ｒａｐ１ｆ／ｆＴ細胞と比較して、危険率５％未満で有意差があることを表す。
【０３４０】
図９７（ｃ）及び（ｄ）は、ＣＣＬ２１の存在下、ＩＣＡＭ−１上におけるＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞及びＦＬＮａ−／−Ｔ細胞の軌跡を示す代表的な図である。各線は１個の細胞の軌跡を示す。
【０３４１】
その結果、ＩＣＡＭ−１上での移動及び速度は、ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞と比較して、ＦＬＮａ−／−Ｔ細胞において、有意に上昇した。
【０３４２】
［実験例８５］
発明者らは、トランスウェルマイグレーションアッセイにより、ＦＬＮａ−／−Ｔ細胞のＣＣＬ２１に対する走化性について検討した。まず、精製されたＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞及びＦＬＮａ−／−Ｔ細胞を、直径３μｍのポアを有するコートされていないトランスウェルインサート上に、５００μＬの１％ウシ胎児血清−ＲＰＭＩ培地中、２×１０６個／ｍＬの濃度で播種した。
【０３４３】
続いて、下部チャンバーの培地（５００μＬ）に、図９８（ａ）に示す濃度のＣＣＬ２１を添加した。続いて、細胞の遊走を３７℃で１時間行った。続いて、トランスウェルインサートを除去し、下部チャンバーに移動した細胞の数を計測した。
【０３４４】
図９８（ａ）は結果を示すグラフである。全細胞数に対する、下部チャンバーに移動した細胞の数を百分率で示す。データは３回の独立した実験における平均値±標準誤差を表す。図９８（ｂ）は、同様の実験をＩＣＡＭ−１でコートされたトランスウェルインサートを用いて行った結果を示すグラフである。データは３回の独立した実験における平均値±標準誤差を表す。「＊」は、対応するＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞と比較して、危険率０．２％未満で有意差があることを表す。
【０３４５】
その結果、コートされていないトランスウェルインサートを用いた実験では、ＣＣＬ２１によって誘引され、下部チャンバーに移動した細胞数は、ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞及びＦＬＮａ−／−Ｔ細胞の間で差が認められなかった。一方、ＩＣＡＭ−１コートされたトランスウェルインサートを通過したＦＬＮａ−／−Ｔ細胞の数は、低濃度のＣＣＬ２１において、ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞と比較して有意に増加した。
【０３４６】
［実験例８６］
ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞及びＦＬＮａ−／−Ｔ細胞をＣＦＳＥ又はＣＭＴＭＲでそれぞれ標識し、同細胞数ずつ混合し通常のマウスに静脈注射した。１時間後、血液及び末梢リンパ節中のリンパ球をフローサイトメトリーにより解析した。図９９（ａ）及び（ｂ）は、血液中（図９９（ａ））及びリンパ節中（図９９（ｂ））におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。グラフ中の四角の上の数字は、ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞に対するＦＬＮａ−／−Ｔ細胞の比率を示す。
【０３４７】
図９９（ｃ）はリンパ節中のＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞に対するＦＬＮａ−／−Ｔ細胞の比率を示すグラフである（ｎ＝４）。「＊」は、ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞と比較して、危険率２％未満で有意差があることを表す。その結果、リンパ節にホーミングしたＦＬＮａ−／−Ｔ細胞は、ＦＬＮａｆ／ｆＴ細胞と比較して有意に多いことが明らかとなった。
【０３４８】
これらの結果は、ＦＬＮａが、ＬＦＡ−１依存性の初代Ｔ細胞の接着及び移動の抑制因子であることを支持する。
【０３４９】
［実験例８７］
Ｒａｐ１依存性のβ２からのＦＬＮの解離が、ケモカインに誘導される接着と関連しているか否かを検討するために、以下の実験を行った。まず、Ｈａｌｏタグを結合した野生型（ＷＴ）ＦＬＮａ又はＦＬＮａ（Δ３）をＢＡＦ／ＬＦＡ−１／Ｌ−セレクチン細胞に導入した。続いてこれらの細胞の破砕物を、抗Ｈａｌｏ抗体を用いたイムノブロッティングに供した。
【０３５０】
図１００は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。３回の実験の代表的な結果を示す。その結果、野生型ＦＬＮａ及びＦＬＮａ（Δ３）が発現したことが確認された。
【０３５１】
［実験例８８］
続いて、野生型ＦＬＮａ又はＦＬＮａ（Δ３）を発現した細胞のＬＳ１２細胞上での接着イベントを層流下で上記と同様にして測定した。図１０１は結果を示すグラフである。データは３回の独立した実験における平均値±標準誤差を表す。「＊１」は、抗ＬＦＡ−１抗体処理をしなかった対照細胞における頻度の合計と比較して、危険率３％未満で有意差があることを表す。「＊２」は、対応する対照細胞における頻度の合計と比較して、危険率１％未満で有意差があることを表す。
【０３５２】
［実験例８９］
図１０２は、ベクターのみ、野生型ＦＬＮａ又はＦＬＮａ（Δ３）を発現した細胞の、ＣＸＣＬ１２の存在下又は非存在下におけるＫＩＭ１２７エピトープの発現を検討した結果を示すグラフである（各群についてｎ＝５）。「＊」は、野生型のＦＬＮａを発現した細胞と比較して、危険率５％未満で有意差があることを表す。
【０３５３】
その結果、ＢＡＦ／ＬＦＡ−１／Ｌ−セレクチン細胞におけるＦＬＮａ（Δ３）の発現は、野生型ＦＬＮａを発現した細胞と比較して、ＣＸＣＬ１２刺激による細胞接着の頻度を有意に低下させ、ＫＩＭ１２７抗体により認識されるＬＦＡ−１の拡張した高次構造の形成を有意に阻害した。
【０３５４】
以上の結果は、Ｒａｐ１−ＧＴＰのＦＬＮｓへの結合が、ＬＦＡ−１の活性化に重要であり、ＬＦＡ−１の活性化がケモカイン刺激による細胞接着に必須であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０３５５】
本発明によれば、大腸炎及び大腸癌を自然発症するモデル非ヒト動物を提供することができる。当該モデル非ヒト動物は、大腸炎又は大腸癌の発症機構の解明や治療法の開発に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４７】
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【図４９】
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【図５０】
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【図６８】
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【図７０】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【配列表】
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