(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ2および２５−ヒドロキシビタミンＤ3の総量を測定する方法であって：
（ａ）（ｉ）２５−ヒドロキシビタミンＤ2および２５−ヒドロキシビタミンＤ3を含むことが疑われる試料、
（ｉｉ）２５−ヒドロキシビタミンＤ2および２５−ヒドロキシビタミンＤ3に対するアッセイを行うための試薬であって、２５−ヒドロキシビタミンＤ2および２５−ヒドロキシビタミンＤ3と結合して複合体を形成することができるアッセイ抗体ならびに２５−ヒドロキシビタミンＤ2および２５−ヒドロキシビタミンＤ3複合体の量と関連してシグナルを生成するシグナル生成系のメンバーを含む、該試薬、ならびに
（ｉｉｉ）２５−ヒドロキシビタミンＤ2に対してより大きな結合親和性を有する非アッセイ抗体であって、その量が、１０μｇ／ｍＬから７５μｇ／ｍＬである、該非アッセイ抗体
を組み合わせてアッセイ媒体中に準備することと、
（ｂ）複合体を形成する条件下においてアッセイ媒体をインキュベートすることと、
（ｃ）複合体からのシグナルの量を測定し、シグナルの量を試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ2および２５−ヒドロキシビタミンＤ3の総量と関連づけることと
を含む、前記方法。
【請求項２】
シグナル生成系のメンバーが、標識を含むビタミンＤ分析物類似体であり、該ビタミンＤ類似体がアッセイ抗体と結合することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アッセイを行うための試薬が粒子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
シグナル生成系のメンバーが光増感剤試薬を含み、アッセイ試薬が化学発光粒子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
光増感剤試薬が粒子を含む、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年４月１２日に出願された米国非仮出願第１３／８６１，４２２号の利益を主張するものである。前述の出願の内容全体を、特に参照によって本明細書に組み入れる。
【０００２】
背景
本発明は、複数の分析物同族体を含むことが疑われる試料中の分析物同族体の総量を正確に測定するための組成物、方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
例えば、薬物およびビタミンなどの多くの小分子化合物またはハプテンは複数の同族体型（ｈｏｍｏｌｏｇｉｃ  ｆｏｒｍ）で存在し、同族体型のそれぞれが、化合物の全体的な生物学的機能に直接または１種もしくはそれ以上のそれらの代謝産物の仲介により寄与する。活性分析物の総量の正確な測定値を得るために、実質的に等モル量の同族体型を測定することが重要である。その理由は、各同族体型の量が等しくないと、アッセイで得られるシグナルがゆがめられ、同族体型の総量を表わさないからである。実質的に等モル量の分析物同族体の測定を取り巻くいくつかの問題としては、例えば、各分析物同族体と等しく結合する抗体を入手することの難しさおよび内在性結合物質が結合した各分析物同族体の遊離が等しくないことが挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
複数の同族体型で存在する分析物であり、そのすべてが活性で、そのような分析物を含むことが疑われる試料中の分析物の総量を正確に高感度で測定するための試薬および方法が必要とされている。例えば、ビタミンＤの複数の同族体型の濃度を正確に高感度で測定するための試薬および方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書に記載される原理による一部の例は、試料中の２つの分析物同族体の総量を測定するために、アッセイで得られるシグナルの量に対する２つの分析物同族体のうちの１つの寄与を調節する方法を対象とする。本方法において、組み合わせは、アッセイ媒体中に準備される。組み合わせは、２つの分析物同族体を含むことが疑われる試料、試料中の２つの分析物同族体の総量を測定するためのアッセイを行うための試薬であって、その試薬は、２つの分析物同族体と結合する少なくとも１種のアッセイ受容体を含む試薬およびシグナルの量に対する寄与が調節されるべき２つの分析物同族体のいずれに対してもより大きな結合親和性を有する非アッセイ受容体を含む。非アッセイ受容体の量は、シグナルに対する分析物同族体の寄与の調節を行うのに十分な量である。２つの分析物同族体の総量を測定するためのアッセイが行われる。
【０００６】
本明細書に記載される原理による一部の例は、試料中の第１の分析物同族体および第２の分析物同族体の量を測定する方法を対象とする。本方法において、組み合わせは、アッセイ媒体中に準備される。この組み合わせは、第１の分析物同族体および第２の分析物同族体を含むことが疑われる試料、第１の分析物同族体および第２の分析物同族体に対するアッセイを行うための試薬ならびにシグナルの量に対する寄与が調節されるべき第１の分析物同族体または第２の分析物同族体のいずれに対してもより大きな結合親和性を有する非アッセイ受容体を含む。アッセイを行うための試薬は、第１の分析物同族体および第２の分析物同族体のそれぞれと結合して複合体を形成することができるアッセイ抗体ならびに複合体中の第１の分析物同族体および第２の分析物同族体の量と関連してシグナルを生成するシグナル生成系のメンバーを含む。非アッセイ受容体の量は、シグナルに対する第１の分析物同族体または第２の分析物同族体の寄与の調節を行うのに十分な量である。アッセイ媒体は、複合体を形成する条件下でインキュベートされる。複合体からのシグナルの量が測定され、試料中の第１の分析物同族体および第２の分析物同族体の総量と関連づけられる。
【０００７】
本明細書に記載される原理による一部の例は、試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の総量を測定する方法を対象とする。組み合わせは、アッセイ媒体中に準備される。この組み合わせは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３を含むことが疑われる試料、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３に対するアッセイを行うための試薬ならびに２５−ヒドロキシビタミンＤ２に対してより大きな結合親和性を有する非アッセイ抗体を含む。アッセイを行うための試薬は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合して複合体を形成することができるアッセイ抗体ならびに２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３複合体の量と関連してシグナルを生成するシグナル生成系のメンバーを含む。非アッセイ抗体の量は、シグナルの量に対する２５−ヒドロキシビタミンＤ２の寄与の調節を行うのに十分な量である。アッセイ媒体は、複合体を形成する条件下でインキュベートされる。複合体からのシグナルの量が測定され、試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の総量と関連づけられる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ビタミンＤの同族体型、すなわち、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の化学式である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
一般的な考察
本明細書に記載される原理による方法は、試料中の分析物同族体の総量を測定するためのアッセイで得られるシグナルの量に対する２つまたはそれ以上の分析物同族体の寄与を調節することを対象とする。アッセイで得られるシグナルに対する分析物同族体の寄与が、試料中の分析物同族体の総量の測定を不正確にする可能性がある理由はいくつかある。こうした理由としては、これらに限定されるものではないが、試料中に存在する異なる分析物同族体に等しく結合しないアッセイ抗体および／または分析物同族体のうちの１つが、置換剤によって他の分析物同族体よりも多く内在性結合物質から外れる場合もあるという事実が挙げられる。上記の両状況により、生成されるシグナルの量が不均等になる。この場合、シグナルの量に対する１つの分析物同族体の寄与により、もとの試料中の分析物同族体の総量を誤って反映させた総シグナル量になる。例えば、説明のためであって、限定するものではないが、２５−ヒドロキシビタミンＤ２のアッセイシグナルを高くするであろう潜在的な要因が２つある。第１の要因は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３よりもビタミンＤ結合タンパク質との結合が弱いため、２５−ヒドロキシビタミンＤ２の方が容易にビタミンＤ結合タンパク質から遊離し、アッセイ抗体が接触可能な遊離型２５−ヒドロキシビタミンＤ２分子の濃度がより高くなることである。第２の要因は、ある場合には、アッセイ抗体が、２５−ヒドロキシビタミンＤ３よりも２５−ヒドロキシビタミンＤ２類似体に対してより大きな親和性を有する。２つの要因が共に働くと、２５−ヒドロキシビタミンＤ３からよりも２５−ヒドロキシビタミンＤ２からより高いシグナルが生じる可能性があり、これが、等モルでない根本的原因である。
【００１０】
医療上の判断範囲の下限における特定のアッセイ方式の性能は、分析物の対象の疑われる濃度範囲にまたがるキャリブレータに対して得られたシグナルの量の差を観察することによって監視することができる。例えば、キャリブレータＬ１とキャリブレータＬ２またはキャリブレータＬ２とキャリブレータＬ３またはキャリブレータＬ１とキャリブレータＬ４などのキャリブレータ間のシグナルの差または分離が大きいことが、例えば望ましい。場合によっては、５つのキャリブレータを利用してもよい、任意にＬ１〜Ｌ５と呼ぶ。シグナル対ノイズ比は、任意にキャリブレータＬ１と呼ぶ、分析物を含まないキャリブレータ（バックグラウンド）を使用したシグナルの量および任意にキャリブレータＬ２と呼ぶ、０を超える第１の既知の量の分析物を含むキャリブレータに対して得られたシグナルの量を測定することによって評価してもよい。この評価は、キャリブレータＬ１および任意にＬ３と呼ぶ、０を超える第２の既知の量の分析物を含むキャリブレータに関するシグナルの量を使用してシグナルの量を測定することも含んでもよい。そのような評価は、キャリブレータＬ４およびＬ５を使用したそのような測定も含むであろう。その場合、キャリブレータのそれぞれは、既知の漸増量の分析物を含む。アッセイの方式に応じて、シグナルの差は、シグナルの増加またはシグナルの減少である場合もある。例えば、競合アッセイに関する大半の例では、分析物の濃度に関連してシグナルが減少することになり；サンドイッチアッセイに関する大半の例では、分析物の濃度に関連してシグナルが増加することになる。
【００１１】
既知の濃度の分析物を使用して形成されたキャリブレータに対するアッセイから得られるシグナルの量を、各キャリブレータの分析物の濃度に関してグラフ化して検量線または標準曲線を作成する。未知の量のシグナルを含む試料に対するアッセイで得られた、結果は、検量線と比較されて、分析物に対するアッセイで得られたシグナルの量に基づいて未知の試料中の分析物の量を確かめる。
【００１２】
本明細書に記載される原理による方法は、分析物同族体またはそれらのそれぞれの代謝産物が有効な２つまたはそれ以上の分析物同族体の総量を測定する。「分析物同族体」または「分析物の同族体型」という語句は、構造および官能基によって関連し、例えば、メチレン基、メチル基、水素、ケト基およびエピマーなどの１つまたはそれ以上の化学的部分が互いに異なる分析物の形態を指す。「有効である」という用語は、例えば、骨代謝などの生物学的機能である場合もある特定の機能に対する分析物の活性の程度を指す。例えば、物質の生物学的活性は、生物学的機能、例えば、対象中の無機物および塩を適切なレベルに維持する細胞の機能などを向上させるか、または抑制する物質の能力に関連する。説明のためであって、限定するものではないが、ビタミンＤは、カルシウム恒常性および骨代謝に関わる対象中のカルシウムおよびリン酸塩を適切なレベルに維持する。
【００１３】
２つまたはそれ以上の同族体型を有する、生物学的試料中の分析物の総量を正確に評価することは、特に２つまたはそれ以上の同族体型が有効な場合に重要である。分析物の存在が、例えば、疾患状態、欠乏症、遺伝子変異または薬理遺伝学に関連する代謝パターンを示す場合もある。例えば、ビタミンＤの欠乏は哺乳動物では多くの障害に関連するため、生物学的試料中のビタミンＤレベルの測定は重要である。乳幼児では、例えば、ビタミンＤの測定が不正確だと、乳幼児のビタミンＤレベルの評価が不正確になり、これが次に、適切な補充がされないことにつながる可能性がある。乳幼児が必要に応じて適切なビタミンＤ療法を受けることができるよう、活性型のビタミンＤの総量を測定することは重要である。
【００１４】
「ビタミンＤ」という用語は、脂溶性セコステロイドのグループを指す。ヒトでは、ビタミンＤは、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）またはエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）として摂取可能であるため、および日光曝露が適切である場合には、体がビタミンＤを（コレステロールから）合成できるため、ビタミンＤは特有なものである。この後者の特性のため、一部の人からは、ビタミンＤが非必須の食物性ビタミンであると考えられているが、大半の人はビタミンＤを必須栄養素であると考えている。ビタミンＤは、カルシウムイオン恒常性の正の調節に重要な生理的役割をもつ。ビタミンＤ３は、動物が合成するビタミンの形態である。ビタミンＤ３は、ビタミンＤ２と同様に、乳製品および特定の食品に添加される一般的なサプリメントでもある。２５−ヒドロキシビタミンＤ３および２５−ヒドロキシビタミンＤ２についての構造を図１に示す。
【００１５】
食物由来および本質的に合成されたビタミンＤ３およびビタミンＤ２の両方とも、代謝活性化を受けて生理活性代謝産物を形成しなければならない。ヒトでは、ビタミンＤ３活性化の最初の工程は、主に肝臓で起こり、中間代謝産物である２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（カルシジオール、カルシフェジオール、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールまたは２５−ヒドロキシビタミンＤ３とも称される）を形成するためのヒドロキシル化を伴う。カルシジオールが循環器系におけるビタミンＤ３の主な形態である。ビタミンＤ２も、類似の代謝活性化を受けて２５−ヒドロキシビタミンＤ２を形成する。一括して、これらの化合物は２５−ヒドロキシビタミンＤと呼ばれ（省略して２５（ＯＨ）Ｄ）、これらは、主要な代謝産物であり、ビタミンＤの状態を確認するために血清中で測定され；２５（ＯＨ）Ｄは前駆ホルモンであり、生物学的機能を発揮するために１，２５（ＯＨ）Ｄに変換される必要がある。
【００１６】
本明細書に記載される原理による方法は、特に、試料中の分析物同族体のすべてと結合する抗体などの１つの受容体または特異的に結合する対メンバーが利用される場合に、試料中の２つの分析物同族体の総量を測定するためにアッセイで得られるシグナルの量に対する２つの分析物同族体のうちの１つの寄与を調節することを提供する。一部の例において、試料中の実質的に等モル量の複数の分析物同族体を反映して測定されたシグナルの総量を得るために、別の同族体よりも高い１つの同族体からのシグナルの量を調節することが重要である。上述のとおり、実質的に等モル量の複数の分析物同族体の測定を取り巻くいくつかの問題としては、例えば、分析物同族体と等しく結合する抗体などの受容体を入手することの難しさおよび内在性結合物質が結合した分析物同族体の遊離が等しくないことが挙げられる。「実質的に等モル量」という語句は、アッセイ媒体中の各分析物同族体の量が同等であるか、または例えば、互いが約１０％、もしくは約９％、もしくは約８％、もしくは約７％、もしくは約６％、もしくは約５％、もしくは約４％、もしくは約３％、もしくは約２％、もしくは約１％、もしくは０％以下の差で異なることを意味する。
【００１７】
２つまたはそれ以上の分析物同族体に対するアッセイに関して、２つまたはそれ以上の分析物同族体に等しく結合する抗体などの１種の受容体が利用されるのが理想的である。しかしながら、多くの場合に、そのような受容体を得ることは難しく、２つまたはそれ以上の分析物同族体に不均等に結合する受容体を使用せざるをえない。各分析物同族体に不均等に結合する受容体が利用される状況では、アッセイは、試料中の分析物同族体の合計濃度が不正確な結果になる可能性もある。そのような状況では、分析物同族体の１つのみを使用したキャリブレータが一般に形成される。アッセイに使用される受容体が分析物同族体のうちの１つとより力強く結合すると、その分析物同族体からより高いシグナルが生成され、シグナルの総量が増加する。総シグナルのこの量が検量線と比較されると、検量線から得られる対応する分析物同族体の総量が試料中の分析物同族体の実際の総量よりも多くなることになる。本明細書に記載される原理による方法は、シグナルが試料中の分析物同族体の実際の総量と正確に関連づけられるよう、得られるシグナルの量を調節する手段を提供する。
【００１８】
上述のとおり、複数の分析物同族体に対するアッセイで得られるシグナルが不正確になる別の理由は、内在性結合物質が結合した各分析物同族体の遊離が等しくないことである。多くの分析物同族体には、内在性結合物質が結合する。そのような内在性結合物質は、採取元から採取された試料中に存在するものである。内在性結合物質の性質は、例えば、試料の性質、試料の採取元の性質、分析物の性質および分析物を含む分子複合体の性質の１つまたはそれ以上によって決まる。
【００１９】
内在性結合物質が結合した分析物同族体は、本明細書中で考察するような置換剤によってそのような物質から遊離することができる。内在性結合物質としては、内在性特異的結合物質および内在性非特異的結合物質の両方が挙げられる。特異的結合物質は、表面もしくは空洞に分析物の特定の空間および極性機構（ｐｏｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）と特異的に結合する領域を有し、それにより分析物と相補的であると定義される物質であり、または逆もまた同様である。特異的結合は、非特異的結合と区別される。その理由は、特異的結合は、認識が実質的に低い他の分子と比較して、２つの異なる分子の他方に対して一方を特異的に認識するためである。非特異的結合物質は、一般に、特異的な表面構造とは比較的無関係である分子間の非共有結合によって分析物と結合する物質である。分析物に対する内在性結合物質としては、これらに限定されるものではないが、例えば、抗分析物抗体および受容体などの分析物と特異的に結合するタンパク質、ならびに分析物に非特異的に結合する結合タンパク質が挙げられる。特定の例では、説明のためであって、限定するものではないが、分析物がビタミンＤであり、内在性結合物質がビタミンＤ結合タンパク質である。
【００２０】
内在性結合物質を含む場合には、内在性結合物質から分析物を遊離させるために置換剤を利用してもよい。置換剤を使用した場合の問題の１つは、多くの場合、置換剤が内在性結合物質から各分析物同族体を等しい量で外さないことである。むしろ、１つの分析物同族体の方が、その同じ分析物の別の同族体が外れるのと比較して多く外れる場合もある。この現象は、アッセイに利用される分析物同族体に対する受容体が、アッセイにおける検出のための各分析物同族体と実質的に等しく結合した場合でも、アッセイで得られるシグナルが実質的に等モル量でない問題をもたらす。本明細書に記載される原理による方法は、シグナルが試料中の分析物同族体の実際の総量と正確に関連づけられるよう得られたシグナルの量を調節する手段を提供する。
【００２１】
上述のとおり、分析物同族体の測定は、置換剤で処理した試料に対して行うことができる。試料に添加される置換剤の量は、実質的にすべての分析物同族体を内在性結合物質から外すのに十分な量である。「実質的にすべての分析物同族体を内在性結合物質から外す」という語句は、分析物同族体が少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％または１００％内在性結合物質から外れ、アッセイの間に検出のために利用できることを意味する。
【００２２】
置換剤の添加後、試料は、実質的にすべての分析物同族体を内在性結合物質から外すための時間、条件下においてインキュベートされる。インキュベーションの長さおよび条件は、例えば、置換剤の性質、分析物同族体の性質および分析物同族体の可能性のある濃度の１つまたはそれ以上により決まる。一部の実施形態において、この工程に対するインキュベーション温度は、例えば、約５℃から約９９℃、または約１５℃から約７０℃、または約２０℃から約４５℃であってもよい。インキュベーションの時間は、例えば、約０．２秒から約２４時間、または約１秒から約６時間、または約２秒から約１時間、または約１から約１５分間である。インキュベーションは、本明細書中で考察するとおり、都合上、アッセイ媒体でもよい媒体中で行われてもよいが、その必要はない。
【００２３】
本明細書に記載される原理によるアッセイ法において、組み合わせは、アッセイ媒体中に準備される。この組み合わせは、２つの分析物同族体を含む可能性のある試料、試料中の２つの分析物同族体の総量を測定するためのアッセイを行うための試薬であって、２つの分析物同族体と結合する少なくとも１種のアッセイ受容体を含む試薬およびシグナルの量に対する寄与が調節されるべき２つの分析物同族体のいずれに対してもより大きな結合親和性を有する非アッセイ受容体を含む。非アッセイ受容体の量は、シグナルに対する分析物同族体の寄与に対して所定量の調節を行うのに十分な量である。２つの分析物同族体の総量を測定するためのアッセイが行われる。
【００２４】
非アッセイ受容体は、別の分析物同族体よりも１つの分析物同族体に対して選択的に結合し、試料中の分析物同族体の存在または量に関連する複合体の形成に関与しない物質である。説明のためであって、限定するものではないが、非アッセイ受容体は、例えば、抗体、分子インプリントポリマー、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡであってもよい。
【００２５】
説明のためであって、限定するものではないが、本明細書に記載される原理により抗体を作製する方法の例を記載する。本明細書に記載される原理に従った特性をもつ少なくとも２つの異なる抗体、アッセイ抗体および非アッセイ抗体が必要とされる。アッセイ抗体は、試料中に存在することが疑われる複数の分析物同族体に対して十分なアッセイ結合親和性を示す。非アッセイ抗体は、過剰でない分析物同族体に対する結合親和性よりも大きな結合親和性で過剰な分析物同族体と結合する。一部の例において、非アッセイ抗体は、過剰な分析物同族体に対して十分な結合親和性を示すが、過剰でない分析物同族体に対しては十分な結合親和性を示さないか、または実質的に結合親和性を示さない。
【００２６】
「アッセイ結合親和性」という語句は、分析物同族体と結合したアッセイ抗体の複合体を生成するためにアッセイ抗体が対応する分析物同族体と結合する強さを指す。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。抗体としては、完全な免疫グロブリンまたはそのフラグメントが挙げられ、その免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭなどのさまざまなクラスならびにアイソタイプが含まれる。そのフラグメントとしては、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ‘）２、Ｆａｂ‘ならびに同種のものが挙げられる。さらに、必要に応じて特定の分子に対する結合親和性が維持されるならば、免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントの凝集体、重合体および複合物が使用できる。
【００２７】
モノクローナル抗体は、連続的に雑種細胞株を作製し、分泌されたタンパク質を収集する（体細胞雑種形成技術）などの当該技術分野において周知の技術によって作製することができる。モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２６５：４９５〜４９７ページ、１９７５年の標準的な技術により生成してもよい。モノクローナル抗体技術の総説は、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｍｅｌｃｈｅｒｓら編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７８）、Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：４９５ページ（１９７７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８：６９２ページ（１９８０年）およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ７３（Ｐａｒｔ  Ｂ）：３〜４６ページ（１９８１年）に見出される。
【００２８】
抗体の作製に関する別のアプローチでは、抗体結合部位をコードする配列を、染色体ＤＮＡから切り取り、クローニングベクターに挿入することができ、この配列が細菌中で発現して、対応する抗体結合部位を有する組換え型タンパク質を産生することができる。このアプローチには、天然の抗体の特異的結合のために必要とされるアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列またはその突然変異版のクローニングおよび発現が含まれる。
【００２９】
モノクローナル抗体の産生に関するアプローチの１つでは、第１の工程は、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジまたは雌ウシなどの抗体産生動物の、抗原、例えば、免疫源による免疫化を含む。免疫化は、完全フロイントアジュバントもしくはモノホスホリルリピドＡおよび合成トレハロースジコリノミコラートアジュバントなどのその他のアジュバントなどのアジュバントを用いて、または用いずに行うことができる。次の工程は、抗体産生動物から脾細胞を単離すること、およびポリエチレングリコールの使用またはその他の技術によってなど抗体産生脾細胞を適切な融合パートナー、一般に骨髄腫細胞と融合することを含む。一般に、使用される骨髄腫細胞は、通常、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）培地においては増殖するが、融合細胞の選択のために使用されるヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地においては増殖できないものである。次の工程は、一般にＨＡＴ培地における選択による融合細胞の選択を含む。次の工程は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイまたはスクリーニングに適したその他のイムノアッセイを使用した適切な抗体産生のためのクローン化雑種のスクリーニングを含む。
【００３０】
上記のとおり分析物同族体に対して必要な結合親和性を有するアッセイ抗体は、周知のスクリーニング手法によって選択でき、これらとしては、説明のためであって、限定するものではないが、例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、ウエスタン分析および表面プラズモン共鳴が挙げられる。
【００３１】
上述のとおり、非アッセイ受容体の機能は、試料中の２つの分析物同族体の総量を測定するためのアッセイで得られるシグナルの量に対する２つの分析物同族体のうちの１つの寄与を調節することを提供することである。本明細書に記載される原理による一部の例において、非アッセイ受容体は、アッセイにおいて実質的に等モル量のシグナルを提供する。非アッセイ抗体などの非アッセイ受容体は、この目的のために選択される。例えば、非アッセイ抗体は、別の分析物同族体と比較して１つの分析物同族体に対して結合する能力（その結合親和性）に関して選択される。非アッセイ抗体は、上記のとおりアッセイ媒体中に過剰にあることがわかっている分析物同族体に対して選択的な結合親和性を示さなければならない。
【００３２】
したがって、非アッセイ抗体は作製され、各分析物同族体に対するアッセイ受容体の結合親和性の不均衡および内在性結合物質からの分析物同族体のうちの１つの不均等な遊離の一方または両方に関して、分析物同族体に対するアッセイで得られるシグナルが調節されるように、非アッセイ抗体が、別の分析物同族体と比較して１つの分析物同族体に対して十分な結合親和性を示すよう適切なスクリーニング法によって選択される。この説明の目的に対して、アッセイ受容体がより大きな結合親和性を有するか、または内在性結合物質からより多く遊離する分析物同族体を、本明細書中では「過剰な分析物同族体」と呼び、他方の分析物同族体を、本明細書中では「過剰でない分析物同族体」と呼ぶ。
【００３３】
本明細書に記載される原理による一部の例において、非アッセイ受容体は、非アッセイ抗体である。上記のとおり分析物同族体に対して必要な結合親和性を有する非アッセイ抗体は、周知のスクリーニング手法により選択することができ、これらとしては、説明のためであって、限定するものではないが、例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、ウエスタン分析および表面プラズモン共鳴が挙げられる。
【００３４】
「選択的な結合親和性」という語句は、過剰な分析物同族体に対する非アッセイ抗体の結合親和性が、過剰でない分析物同族体に対する非アッセイ抗体の結合親和性よりも大きいことを意味する。本明細書に記載される原理による一部の例において、非アッセイ抗体は、過剰な分析物同族体に対して、過剰でない分析物同族体に対する結合親和性よりも、例えば、約１０、または約１０２、または約１０３、または約１０４、または約１０５倍だけ大きい結合親和性を有する。例えば、過剰な分析物同族体に対する非アッセイ抗体の結合親和性が約１０９リットル／モルである場合、過剰でない分析物同族体に対する非アッセイ抗体の結合親和性は、例えば、約１０７リットル／モル未満、または約１０６リットル／モル未満であってもよい。本明細書に記載される原理による一部の例において、非アッセイ抗体は、過剰でない分析物同族体に対して実質的に結合親和性を示さない。「実質的に結合親和性を示さない」という語句は、非アッセイ抗体と過剰でない分析物同族体との間では実質的に検出可能な複合体が形成されないことを意味する。
【００３５】
本明細書に記載される原理による一部の例において、過剰な分析物同族体に対する非アッセイ抗体の結合親和性は、例えば、少なくとも約１０７リットル／モル、または少なくとも約１０８リットル／モル、または少なくとも約１０９リットル／モル、または少なくとも約１０１０リットル／モル、または少なくとも約１０１１リットル／モル、または少なくとも約１０１２リットル／モル、または少なくとも約１０１３リットル／モル、または少なくとも約１０１４リットル／モルである。本明細書に記載される原理による一部の例において、過剰な分析物同族体に対する非アッセイ抗体の結合親和性は、例えば、約１０７から約１０１４リットル／モル、または約１０７から約１０１１リットル／モル、または約１０７から約１０１２リットル／モル、または約１０８から約１０１４リットル／モル、または約１０８から約１０１１リットル／モル、または約１０８から約１０１２リットル／モルである。
【００３６】
本明細書に記載される原理による一部の例において、過剰でない分析物同族体に対する非アッセイ抗体の結合親和性は、例えば、約１０７リットル／モル未満、または約１０６リットル／モル未満、または約１０５リットル／モル未満、または約１０４リットル／モル未満、または約１０３リットル／モル未満、または約１０２リットル／モル未満、または約１０リットル／モル未満である。本明細書に記載される原理による一部の例において、過剰でない分析物同族体に対する非アッセイ抗体の結合親和性は、例えば、約１０から約１０６リットル／モル、または約１０から約１０５リットル／モル、または約１０から約１０４リットル／モル、または約１０から約１０３リットル／モル、または約１０から約１０２リットル／モル、または約１０２から約１０６リットル／モルである。
【００３７】
利用される非アッセイ受容体の量は、分析物同族体の総量に関するアッセイで得られるシグナルに対する過剰な分析物同族体の寄与の調節を行うのに十分な量である。一部の例において、アッセイ媒体中の非アッセイ受容体の量は、アッセイ媒体中の過剰な分析物同族体および過剰でない分析物同族体に関して実質的に等しいシグナルの量を達成するのに十分な量である。非アッセイ受容体の量は多くの要因により決まり、要因としては、説明のためであって、限定するものではないが、例えば、異なる分析物同族体に対する非アッセイ受容体の性質および結合親和性、異なる分析物同族体に対するアッセイ受容体の性質および結合親和性、遊離する過剰でない分析物同族体の量と比較した置換剤によって遊離する過剰な分析物同族体の量、分析物同族体の性質、アッセイの性質、アッセイ試薬の性質ならびに臨床試料の性質が挙げられる。一部の例において、利用される非アッセイ受容体の量は経験的に決定され、上述の要因の１つまたはそれ以上に基づく。本明細書に記載される原理による一部の例において、非アッセイ受容体の量は、例えば、約１μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬから約７５μｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬから約２５μｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬから約１０μｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬから約７５μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬから約２５μｇ／ｍＬである。
【００３８】
分析物同族体を含む媒体の処理は、分析物同族体に対するアッセイと別の工程としてまたはそれと同時に行われてもよい。本明細書中で考察されるとおり、過剰な分析物同族体の量が、放出剤（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）による試料の処理により生じる場合、非アッセイ受容体による媒体の処理は、放出剤による処理に引き続いて行われる。過剰な分析物同族体の量が、各分析物同族体に対するアッセイ抗体のアッセイ結合親和性の不均衡により生じる場合、非アッセイ受容体による媒体の処理は、分析物同族体に対するアッセイ中に行われる。
【００３９】
本明細書に記載される原理により分析物同族体を含む媒体を処理する条件は、分析物同族体に対するアッセイに利用されるものと同じであってもよい。一部の例において、処理は水性の緩衝媒体中において中程度のｐＨで行われ、一般に、これにより、過剰な分析物同族体に対する非アッセイ受容体の最適な結合がもたらされる。水性媒体は水のみでもよく、または０．１から約４０体積パーセントの共溶媒を含んでもよい。媒体のｐＨは、例えば、約４から約１１の範囲、または約５から約１０範囲、または約６．５から約９．５の範囲になる。ｐＨは、一般には、任意の特異的な結合対の結合メンバーの最適な結合、シグナル生成系のメンバーなどのアッセイの他の試薬に最適なｐＨなどの間で折り合いをつけることになる。所望のｐＨにし、アッセイの間、そのｐＨに維持するためにさまざまなバッファーを使用してもよい。実例となるバッファーとしては、説明のためであって、限定するものではないが、例えば、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ＴＲＩＳ、バルビタール、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳおよびＢＩＣＩＮＥが挙げられる。利用される特定のバッファーは重要ではないが、個々のアッセイでは、何らかのバッファーが好ましい場合もある。非アッセイ受容体による処理に、さまざまな補助材料を利用してもよい。例えば、バッファーに加えて、媒体は、利用される媒体および試薬のための安定剤を含んでもよい。
【００４０】
非アッセイ受容体による処理に利用される各種試薬の添加の間の任意の間隔を含む１つまたはそれ以上の間隔で１つまたはそれ以上のインキュベーション期間を媒体に適用してもよい。媒体は、一般に非アッセイ受容体が過剰な分析物同族体と結合するのに十分な温度、時間でインキュベートされる。本方法を行うために中程度の温度が通常利用され、一般には、測定の期間中、一定温度、好ましくは室温である。一部の例において、インキュベーション温度は、例えば、約５℃から約９９℃、または約１５℃から約７０℃、または約２０℃から約４５℃の範囲に及ぶ。インキュベーションの時間は、一部の例において、例えば、約０．２秒から約２４時間、または約１秒から約６時間、または約２秒から約１時間、または約１分から約１５分間である。時間は多くの要因に左右され、要因としては、これらに限定されるものではないが、例えば、媒体の温度ならびに必要に応じて過剰な分析物同族体および過剰でない分析物同族体に対する非アッセイ受容体の結合親和性が挙げられる。
【００４１】
その後、試料中の第１の分析物同族体および第２の分析物同族体の量を測定するために、第１の分析物同族体および第２の分析物同族体に対してアッセイが行われる。アッセイを行うための試薬は、例えば、分析物同族体のそれぞれと結合して複合体を形成することができるアッセイ抗体などのアッセイ受容体および複合体中の分析物同族体の量と関連してシグナルを生成するシグナル生成系のメンバーを含む。非アッセイ受容体の量は、シグナルに対する第１の分析物同族体または第２の分析物同族体の寄与の調節を行うのに十分な量である。アッセイ媒体は、複合体を形成する条件下でインキュベートされる。複合体からのシグナルの量が測定され、試料中の分析物同族体の総量と関連づけられる。アッセイは、下でより詳細に考察するとおり任意の数のアッセイから選択することができる。
【００４２】
アッセイの概括的な説明
以下の解説は、説明のためであって、限定するものではない。抗体を利用する任意の適切なアッセイ（イムノアッセイ）が本明細書に記載される原理が関与する測定に利用できる。アッセイは、任意のアッセイ成分または生成物の分離を伴わず（均一）または分離を伴って（不均一）行うことができる。不均一アッセイは、一般に１つまたはそれ以上の分離工程を含み、競合または非競合の場合がある。アッセイは、手動または自動であってもよい。
【００４３】
分析対象の試料は、２つまたはそれ以上の分析物同族体を含むことが疑われるものである。試料は、生物学的試料または非生物学的試料であってもよい。生物学的試料は、哺乳動物対象または非哺乳動物対象からのものでもよい。哺乳動物対象は、例えば、ヒトまたはその他の動物種であってもよい。生物学的試料としては、全血、血清、血漿、痰、リンパ液、精液、膣粘液、糞、尿、脊髄液、唾液、大便、脳脊髄液、涙、粘液および同種のものなどの生体液；毛、皮膚、臓器の切片もしくは切除された組織またはその他の体の一部などの生物学的組織；などが挙げられる。多くの場合、試料は、全血、血漿または血清である。以下に限定されるものではないが、例えば、排水流を含む非生物学的試料も、本明細書に記載される原理による化合物を使用して分析することができる。
【００４４】
都合がよい任意の媒体中で試料を準備してもよく、それは、下でより完全に考察するとおり、例えば、アッセイ媒体であってもよい。ある場合には、例えば、内在性結合物質から分析物同族体を遊離させるため、または血液細胞を溶解させるためなど、試料に前処理を施してもよい。一部の例において、そのような前処理は、それに続くアッセイの妨げにならない媒体中で行われる。
【００４５】
多くの実施形態において、イムノアッセイは、標識試薬を伴う。標識試薬を伴うイムノアッセイとしては、例えば、化学発光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、蛍光偏光イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、阻害アッセイ、励起発光アッセイ（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ）および蛍光酸素チャネリングアッセイ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）が挙げられる。
【００４６】
イムノアッセイの一般的なグループの１つとしては、限定された濃度の１つのアッセイ試薬を使用したイムノアッセイが挙げられる。イムノアッセイの別のグループは、過剰な１つまたはそれ以上の主要な試薬の使用を伴う。イムノアッセイの別のグループは、分離のいらない均一アッセイであり、この場合、試料中の分析物同族体にアッセイ抗体が結合したときに標識試薬が標識シグナルを変化させる。
【００４７】
上述のとおり、アッセイは、任意のアッセイ成分または生成物の分離を伴わず（均一）または分離を伴って（不均一）行うことができる。均一イムノアッセイは、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎらの米国特許第３，８１７，８３７号、第３欄、６行目から第６欄、６４行目に開示されているＥＭＩＴ（登録商標）アッセイ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ディアフィールド、イリノイ州）；米国特許第５，３４０，７１６号（Ｕｌｌｍａｎら）に開示されている励起発光イムノアッセイ（「ＬＯＣＩ（登録商標）技術」）；Ｕｌｌｍａｎらの米国特許第３，９９６，３４５号、第１７欄、５９行目から第２３欄、２５行目に開示されているものなどの免疫蛍光法；Ｍａｇｇｉｏらの米国特許第４，２３３，４０２号、第６欄、２５行目から第９欄、６３行目に開示されているものなどの酵素チャネリングイムノアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（「ＥＣＩＡ」）；例えば、とりわけ、米国特許第５，３５４，６９３号に開示されているとおりの蛍光偏光イムノアッセイ（「ＦＰＩＡ」）；酵素結合免疫吸着測定法などの酵素イムノアッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）によって例証される。例となる不均一アッセイは、Ｙａｌｏｗら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ３９：１１５７ページ（１９６０年）に開示されているラジオイムノアッセイである。上記開示をすべて、参照によって本明細書に組み入れる。
【００４８】
その他の酵素イムノアッセイは、例えば、ＮｇｏおよびＬｅｎｈｏｆｆ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  （１９８０年）１１６：２８５〜２８８ページに考察されている酵素調節媒介イムノアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（「ＥＭＭＩＡ」）；Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４年）  ２２：８９５〜９０４ページに開示されている基質標識蛍光イムノアッセイ（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（「ＳＬＦＩＡ」）；Ｋｈａｎｎａら、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ａｃｔａ  （１９８９年）  １８５：２３１〜２４０ページに開示されている組み合わせ酵素ドナーイムノアッセイ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｄｏｎｏｒ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（「ＣＥＤＩＡ」）；粒子増強比濁阻害イムノアッセイ（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（「ＰＥＴＩＮＩＡ」）および粒子増強比濁イムノアッセイ（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（「ＰＥＴＩＡ」）などの均一粒子標識イムノアッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などである。
【００４９】
その他のアッセイとしては、ゾル粒子イムノアッセイ（ｓｏｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（「ＳＰＩＡ」）、分散色素イムノアッセイ（ｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｄｙｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（「ＤＩＡ」）；メタロイムノアッセイ（「ＭＩＡ」）；酵素膜イムノアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（「ＥＭＩＡ」）；発光イムノアッセイ（ｌｕｍｉｎｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（「ＬＩＡ」）；などが挙げられる。他の種類のアッセイとしては、分析物の結合時に試薬の光学的、音響的および電気的特性の変化を観察することを含む免疫センサーアッセイが挙げられる。そのようなアッセイとしては、例えば、光学的免疫センサーアッセイ、音響的免疫センサーアッセイ、半導体免疫センサーアッセイ、電気化学的変換器免疫センサーアッセイ、電位差測定免疫センサーアッセイおよび電流測定電極アッセイ（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ａｓｓａｙ）が挙げられる。
【００５０】
不均一アッセイは、一般に１つまたはそれ以上の分離工程を含み、競合または非競合の場合がある。参照によって本明細書に組み入れるＤａｖａｌｉａｎらの米国特許第５，０８９，３９０号、第１４欄、２５行目から第１５欄、９行目にさまざまな競合および非競合不均一アッセイの方式が開示されている。競合不均一アッセイの例において、分析物を結合させるための抗体を有する支持体が、複数の分析物同族体を含むことが疑われる試料および標識を含む分析物類似体を含む媒体と接触させられる。本明細書に記載される原理による非アッセイ抗体は、支持体上のアッセイ抗体の前またはそれと同時に試料とともにインキュベートされる。試料中の分析物同族体は、アッセイ抗体との結合に関して標識された分析物類似体と競合する。支持体と媒体を分離した後、支持体または媒体の標識活性が従来の技術によって測定され、試料中の分析物の量と関連づけられる。上記競合不均一アッセイの変形では、支持体は分析物類似体を含み、それは、本明細書に記載される原理によるアッセイ抗体試薬との結合に関して試料の分析物同族体と競合する。
【００５１】
一部の例において、分析対象の試料は、分析物と結合する、例えば、血漿または血清タンパク質などの内在性結合物質から分析物を遊離させるために前処理される。内在性結合物質からの分析物の遊離は、例えば、消化剤もしくは放出剤の添加によって、または連続的に使用される消化剤および放出剤の組み合わせによって行ってもよい。消化剤とは、内在性結合物質を分解するものであり、その結果、内在性結合物質が分析物と結合できなくなる。そのような薬剤としては、これらに限定されるものではないが、プロテイナーゼＫおよび、例えば、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）などのタンパク質変性剤が挙げられる。内在性結合物質から分析物を遊離させるための放出剤としては、説明のためであって、限定するものではないが、例えば、サリチル酸、ワルファリン、スルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）（例えば、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）および８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸（８−ＡＮＳ）を含む）、サリチル酸ならびに上記のものの誘導体などの酸性変性剤が挙げられる。
【００５２】
消化および／または遊離操作を行うための、例えば、持続時間、温度、ｐＨおよび媒体中の放出剤の濃度などの条件は、例えば、分析物の性質、内在性結合物質の性質、試料の性質および放出剤の性質によって決まる。一般に、条件は、所望の効果または機能を達成するのに十分なものである。本明細書に記載される原理による一部の例において、放出剤の有効な濃度は、約０．０１から約２０ｍｇ／ｍＬ、または約０．０１から約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．０１から約５ｍｇ／ｍＬ、または約０．１から約２０ｍｇ／ｍＬ、または約０．１から約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．１から約５ｍｇ／ｍＬ、または約０．１から約１ｍｇ／ｍＬである。内在性結合物質から分析物を遊離させるための試料の前処理は、アッセイを行う前の個別の工程として、またはアッセイの第１の工程として行われてもよい。いずれの場合でも、消化剤および／または放出剤の作用を止めるために１つまたはそれ以上の試薬が必要とされこともある。
【００５３】
本明細書に記載される原理に従って試料に対してアッセイを行う条件には、一般に、最適なアッセイ感度をもたらす中程度のｐＨの水性の緩衝媒体中でアッセイを行うことが含まれる。水性媒体は、水のみでもよく、または０．１から約４０体積パーセントの共溶媒を含んでもよい。媒体のｐＨは、例えば、約４から約１１の範囲、または約５から約１０の範囲、または約６．５から約９．５の範囲になる。ｐＨは、通常、任意の特異的な結合対の結合メンバーの最適な結合、シグナル生成系のメンバーなどのアッセイの他の試薬に最適なｐＨなどの間で折り合いをつけることになる。所望のｐＨにし、アッセイの間、そのｐＨに維持するためにさまざまなバッファーを使用してもよい。実例となるバッファーとしては、説明のためであって、限定するものではないが、例えば、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ＴＲＩＳ、バルビタール、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、およびＢＩＣＩＮＥが挙げられる。利用される特定のバッファーは重要ではないが、個々のアッセイでは、何らかのバッファーが好ましい場合もある。
【００５４】
本アッセイ法に、さまざまな補助材料を利用してもよい。例えば、バッファーに加えて、媒体は、利用される媒体および試薬のための安定剤を含んでもよい。一部の実施形態において、こうした添加剤に加えて、例えば、アルブミンなどのタンパク質；例えば、ホルムアミドなどの有機溶媒；第４級アンモニウム塩；例えば、デキストラン硫酸などのポリアニオン；例えば、ポリアルキレングリコールなどの結合促進剤；例えば、デキストランまたはトレハロースなどのポリサッカライドを含んでもよい。媒体はまた、血餅の形成を防ぐための薬剤を含んでもよい。そのような薬剤は、当該技術分野において周知であり、これらに限定されるものではないが、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸塩、ヘパリンが挙げられる。媒体はまた、以下に限定されるものではないが、例えば、アジ化ナトリウム、硫酸ネオマイシン、ＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００、ストレプトマイシンなどの１つまたはそれ以上の保存料を含んでもよい。媒体は、１つまたはそれ以上の界面活性剤をさらに含んでもよい。上記の任意の材料は、利用される場合、所望の効果または機能を達成するのに十分な濃度または量で存在する。
【００５５】
アッセイに利用される上記のものを含む各種試薬の添加の間の任意の間隔を含む１つまたはそれ以上の間隔で１つまたはそれ以上のインキュベーション期間を媒体に適用してもよい。媒体は、試料中の試薬の各種成分の結合および分析物の結合のために十分な温度および時間で通常インキュベートされ、例えば、非アッセイ抗体の１つの分析物同族体との結合またはアッセイ抗体の複数の分析物同族体との結合などが生じる。本方法を行うために中程度の温度が通常利用され、一般に、測定の期間中は、一定温度、好ましくは室温である。一部の例において、インキュベーション温度は、例えば、約５℃から約９９℃、または約１５℃から約７０℃、または約２０℃から約４５℃の範囲に及ぶ。インキュベーションの時間は、一部の例において、例えば、約０．２秒から約２４時間、または約１秒から約６時間、または約２秒から約１時間、または約１分から約１５分間である。この時間は、媒体の温度および各種試薬の結合速度により左右され、結合速度は、会合速度定数、濃度、結合定数および解離速度定数によって決定される。
【００５６】
本明細書中で考察される多くのアッセイは、シグナル生成系を使用し、これは、１つまたはそれ以上の成分を有してもよく、少なくとも１つの成分は標識である。シグナル生成系は、試料中の分析物同族体の存在に関連するシグナルを生成する。シグナル生成系は、測定可能なシグナルを生成するために必要とされる試薬をすべて含む。シグナル生成系の他の成分は展開液（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に含まれ、シグナル生成系の他の成分としては、これらに限定されるものではないが、例えば、基質、促進剤、活性化物質、化学発光化合物、補酵素、阻害物質、捕捉剤、金属イオン、およびシグナル生成物質の結合に必要とされる特異的結合物質が挙げられる。シグナル生成系の他の成分は、例えば、補酵素、酵素的生成物と反応する物質、その他の酵素および触媒であってもよい。シグナル生成系は、外部手段によって、電磁放射の使用によって、望ましくは、視覚による調査によって検出可能なシグナルをもたらす。例となるシグナル生成系は、米国特許第５，５０８，１７８号に記載されており、この関連した開示を参照によって本明細書に組み入れる。
【００５７】
「標識」という用語は、ポリ（アミノ酸）標識および非ポリ（アミノ酸）標識を含む。「ポリ（アミノ酸）標識部分」という用語は、例えば、以下に限定されるものではないが、酵素、抗体、ペプチドおよび免疫源などのタンパク質である標識を含む。例えば、酵素などの標識タンパク質に関して、分子量の範囲は、約１０，０００から約６００，０００、または約１０，０００から約３００，０００の分子量になる。一般に、例えば、タンパク質の本明細書に記載される原理による少なくとも１つの化合物（類似体群）あたり約２００，０００分子量、または少なくとも約１つあたり約１５０，０００分子量、または少なくとも約１つあたり約１００，０００分子量、または少なくとも約１つあたり約５０，０００分子量ある。酵素の場合には、類似体群の数は、一般に、１から約２０個、約２から約１５個、約３から約１２個、または約６から約１０個である。
【００５８】
酵素としては、説明のためであって、限定するものではないが、例えば、デヒドロゲナーゼ、例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼなどの酸化還元酵素；過酸化水素の生成および色素前駆体を酸化させて色素にするための過酸化水素の使用を伴う、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼおよびミクロペルオキシダーゼなどの酵素；例えば、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼなどの加水分解酵素；例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼ；トランスフェラーゼ；以下に限定されるものではないが、色素前駆体を酸化させるために過酸化水素を利用する酵素、すなわち、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼもしくはミクロペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼと結合した、例えば、グルコースおよびガラクトースオキシダーゼなどの糖酸化酵素またはウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環酸化酵素などの酵素の組み合わせが挙げられる。
【００５９】
「非ポリ（アミノ酸）標識」という用語は、タンパク質ではない標識を含む。非ポリ（アミノ酸）標識は、直接検出することができるか、または検出可能なシグナルを生成する反応により検出可能である。非ポリ（アミノ酸）標識は、同位体または非同位体のものが可能であり、説明のためであって、限定するものではないが、例えば、放射性同位体、（以下に限定されるものではないが、例えば、蛍光化合物および化学発光化合物を含む）発光化合物、触媒をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、色素、補酵素、酵素基質、放射性基、および増幅可能なポリヌクレオチド配列でもよい。
【００６０】
一部の例において、シグナル生成系の１つのメンバー一は有機小分子であり、有機小分子とは、分子量が約２００から約２，０００、または約２００から約１，５００、または約２００から約１，０００、または約２００から約５００の分子を指す。そのような有機小分子としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ビオチン、蛍光分子（例えば、フルオレセインおよびローダミンなど）、化学発光分子およびジニトロフェノールが挙げられる。有機小分子の結合パートナーは、この小分子を特異的に認識し、それと結合する分子である。小分子の結合パートナーは、小分子の性質によって定義され、そのようなものとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、有機小分子に対する抗体（これらに限定されるものではないが、蛍光分子に対する抗体（例えば、フルオレセインに対する抗体およびローダミンに対する抗体など）、化学発光分子に対する抗体、ジニトロフェノールに対する抗体を含む）が挙げられる。
【００６１】
アッセイの一部の例では、支持体が利用される。支持体は、有機または無機の、固体または液体の不水溶性材料から構成され、これは、透明または部分的に透明であってもよい。支持体は、以下に限定されるものではないが、例えば、ビーズを含む粒子（粒状の支持体）、薄膜、膜、チューブ、ウェル、細片、棒、繊維、または、例えば、プレートもしくは紙などの平面など多くの任意の形状を有してもよい。支持体は、利用される媒体に懸濁可能であっても、または可能でなくてもよい。懸濁可能な支持体の例は、例えば、ラテックスなどの高分子材料、脂質二重層すなわちリポソーム、油滴、細胞およびハイドロゲルならびに磁性粒子である。その他の支持体組成物としては、説明のためであって、限定するものではないが、例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニルクロリド）、ポリアクリルアミド、ポリアクリラート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリラート、ポリ（エチレンテレフタラート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチラート）などのポリマーが挙げられ、単独でまたは他の材料とともに使用される。支持体を、例えば、色素、触媒またはその他の検出可能な基によりさらに標識してもよいし、しなくてもよい。
【００６２】
一部の例において、支持体は、粒子であってもよい。粒子の平均直径は、少なくとも約０．０２マイクロメートルであり、約１００マイクロメートル以下である。一部の例において、粒子の平均直径は、約０．０５マイクロメートルから約２０マイクロメートル、または約０．３マイクロメートルから約１０マイクロメートルである。粒子は、有機または無機の膨潤性または非膨潤性で多孔質または非多孔質であり、好ましくは、水に近い密度、一般に約０．７ｇ／ｍＬから約１．５ｇ／ｍＬであってもよく、透明、部分的に透明または不透明であってもよい材料から成る。粒子は、例えば、細胞ならびに微生物、例えば、赤血球、白血球、リンパ球、ハイブリドーマ、連鎖球菌、黄色ブドウ球菌および大腸菌、ウイルスなどの生物学的材料が可能である。粒子は、有機および無機ポリマー、リポソーム、ラテックス粒子、磁性または非磁性粒子、リン脂質ベシクル、カイロミクロン、リポタンパク質ならびに同種のものからなる粒子でもよい。一部の例において、粒子は、二酸化クロム（クロム）粒子またはラテックス粒子である。
【００６３】
化学発光粒子は、それと化学発光化合物が結合した粒子である。「それと結合した」という語句は、本明細書中で使用される場合、例えば、化学発光化合物などの化合物と粒子が直接的または間接的な接着、吸着、吸収、組み込みまたは溶解によって結合できることを意味する。利用できる化学発光化合物の例は、米国特許第５，３４０，７１６号および同第６，２５１，５８１号に記載されているものであり、この関連する開示を参照によって本明細書に組み入れる。本明細書に記載される原理による一部の例において、化学発光化合物は、光活性化可能な物質であり、これは、光によって直接もしくは増感励起時または一重項酸素との反応時に、化学反応を受けて一般に２５０から１２００ｎｍの波長範囲内である発光と同時またはその後に分解される準安定の反応生成物を形成する。「光活性化可能な」という用語は、「光化学的に活性化可能な」を含む。一部の例において、化学発光化合物は、一重項酸素と反応してジオキセタンまたはジオキセタノンを形成するものである。後者は、一般に電子豊富なオレフィンである。例となるそのような電子豊富なオレフィンは、エノールエーテル、エナミン、９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、９−アルキリデン−キサンタンおよびルシゲニンである。その他の化合物としては、ルミノールおよびその他のフタルヒドラジドならびに光化学的に不安定な保護基により保護されていることにより化学発光反応を受けることから保護された化学発光化合物が挙げられ、そのような化合物には、例えば、ホタルルシフェリン、アクアフォリン（ａｑｕａｐｈｏｒｉｎ）、ならびにルミノールが含まれる。利用できるそのような化学発光化合物の例は、米国特許第５，７０９，９９４号に記載されているものであり、この関連する開示を参照によって本明細書に組み入れる。
【００６４】
増感剤粒子は、それと結合した増感剤化合物を有する粒子であり、そのようなものとしては、以下に限定されるものではないが、光増感剤化合物が挙げられる。利用できる増感剤化合物の例は、米国特許第５，３４０，７１６号および同第６，２５１，５８１号に記載されているものであり、この関連する開示を参照によって本明細書に組み入れる。
【００６５】
光増感剤は、一般に光による励起によって一重項酸素を形成するための増感剤である。一部の例において、光増感剤は、化学発光化合物よりも長い波長で吸収し、化学発光化合物よりも低いエネルギーの三重項を有する。光増感剤は、光活性化可能なものであってもよい（例えば、色素および芳香族化合物）。光増感剤は、一般に共有結合した原子から構成される化合物であり、通常、複数の共役二重または三重結合を含む。化合物は、２００〜１１００ｎｍ、一般には３００〜１０００ｎｍ、好ましくは４５０〜９５０ｎｍの波長範囲の光を吸収しなければならない。一般的な光増感剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、アセトン、ベンゾフェノン、９−チオキサントン、エオシン、９，１０−ジブロモアントラセン、メチレンブルー、メタロポルフィリン（例えば、ヘマトポルフィリン）、フタロシアニン、クロロフィル、ローズベンガル、バックミンスターフラーレン、およびこれらの化合物の誘導体が挙げられる。その他の光増感剤の例は、Ｎ．Ｊ．  Ｔｕｒｒｏ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１３２ページ、Ｗ．  Ａ．  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．  １９６５年に列挙されている。光増感剤は、光活性化を補助し、この場合、活性化は一重項酸素による。一般には、光増感剤は、光を吸収し、それにより形成される励起された光増感剤が酸素を活性化して一重項酸素を生成し、これが、化学発光化合物と反応して準安定の発光中間体をもたらす。
【００６６】
一部の既知のアッセイは、シグナル生成系（ｓｐｓ）を利用し、これは、第１および第２のｓｐｓメンバーを使用する。ｓｐｓメンバーは、ｓｐｓの一方のメンバーの活性化が、例えば、光または活性化生成物などの生成物を生成することに関連する場合もあり、これがｓｐｓの別のメンバーを活性化する。
【００６７】
そのようなアッセイの例において、ｓｐｓメンバーは、例えば、光増感剤などの増感剤と、増感剤の活性化が化学発光組成物を活性化する生成物をもたらす化学発光化合物を含む化学発光組成物とを含む。第２のｓｐｓメンバーは、通常、結合および／または非結合ｓｐｓメンバーの量、すなわち、検出している分析物と結合した、または、結合していないｓｐｓメンバーの量に関連した検出可能なシグナルを生成する。本明細書に記載される原理による一部の例において、増感剤試薬または化学発光試薬のいずれか一方は、本明細書に記載される原理に従った抗体試薬を含む。
【００６８】
アッセイ可能な試料中の分析物同族体の濃度は、一般に、例えば、約１０−５から約１０−１７Ｍ、または約１０−６から約１０−１４Ｍまで変動する。アッセイが（試料中に存在する分析物の量に対して）質的、半定量的または定量的なものであるかどうかなどの
要件、特定の検出技術および分析物の予測される濃度が、通常、各種試薬の濃度を決定する。
【００６９】
アッセイ媒体中の各種試薬の濃度は、一般に、例えば、分析物同族体の対象の濃度範囲およびアッセイの性質によって決定される。しかしながら、それぞれの試薬の最終濃度は、通常、対象の範囲にわたってアッセイの感度を最適化するために経験的に決定される。すなわち、重要な分析物の濃度の変化が正確に測定可能なシグナルの差をもたらさなければならない。シグナル生成系の性質および分析物同族体の性質などの要件が、通常、各種試薬の濃度を決める。
【００７０】
上述のとおり、試料および試薬は、媒体中に組み合わせが準備される。媒体への添加の順序は変更することができるが、本明細書に記載されるアッセイ方式の一部の実施形態については特定の優先度がある。添加の最も単純な順序は、当然、すべての材料を同時に添加することであり、均一アッセイにおける場合、シグナルに対するアッセイ媒体の影響を決定する。あるいは、試薬のそれぞれまたは試薬の群は、連続的に混ぜ合わせることができる。一部の実施形態において、上記のとおりのそれぞれの添加に続いて、インキュベーション工程を伴ってもよい。不均一アッセイでは、１つまたはそれ以上のインキュベーション工程の後に洗浄工程を用いることもできる。
【００７１】
本明細書に記載される原理による方法の特定の例
上記のとおり、本明細書に記載される原理による方法は、複数の分析物同族体を含むことが疑われる試料中の２つまたはそれ以上の分析物同族体の総量を測定することを対象とする。分析物同族体の総量は、例えば、アッセイ抗体などのアッセイ受容体を使用して試料に対してアッセイを行うことによって測定される。より詳細に上述したとおり、それに先立って、またはそれと同時に試料は非アッセイ抗体とともにインキュベートされる。下記の実施例において、アッセイ抗体および非アッセイ抗体の両方は、１つまたはそれ以上の上記の手順によって作製および選別されるモノクローナル抗体である。
【００７２】
以下の特定の例において、各分析物同族体は、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３であるが、説明のためであって、限定するものではない。本明細書に記載される原理による一部の例は、ビタミンＤの複数の同族体を含むことが疑われる試料中のビタミンＤ２およびビタミンＤ３の総量を測定する方法を対象とし、本明細書中では、「ビタミンＤに対するアッセイ」と呼ぶ場合もある。下記の特定のアッセイに関して本明細書中で使用される場合、「ビタミンＤ同族体」という用語は、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３を指す。
【００７３】
一例では、励起発光イムノアッセイを利用してもよい。励起発光イムノアッセイについて、米国特許第５，３４０，７１６号（Ｕｌｌｍａｎ）に言及されており、この開示を参照によって本明細書に組み入れる。アプローチの１つでは、アッセイは、光増感剤と結合した粒子を使用し、この場合、ビタミンＤ類似体が粒子と結合している（粒子類似体試薬）。化学発光試薬は、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体のそれぞれに対して十分なアッセイ結合親和性を示すアッセイ抗体を含む。この例において、アッセイ抗体は、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体に対して実質的に同等の結合親和性を示す。ただし、試料は、放出剤により前処理され、ビタミンＤ２同族体は、ビタミンＤ３同族体の量よりも多く内在性結合物質から遊離している。本明細書に記載される原理によると、上記のとおり作製された非アッセイ抗体は、遊離した同族体を含む媒体とともにインキュベートされる。非アッセイ抗体は、放出剤によって過剰に遊離するビタミンＤ２同族体に対して選択的な結合親和性を示す。非アッセイ抗体の量は、アッセイで得られるシグナルの量を調節して、ビタミンＤ３同族体の量を上回って遊離するビタミンＤ２同族体の量を打ち消すのに十分な量である。ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体を含む媒体の処理は、個別の工程において行うことができ、またはアッセイ抗体を使用したアッセイと同時に行うこともできる。
【００７４】
上の例において、アッセイ抗体は、小分子と連結され、この小分子は、化学発光粒子上の小分子に対する結合パートナーと結合する。この化学発光試薬は、予め形成するか、またはその場で形成することができる。ビタミンＤ分析物同族体は、ビタミンＤに対するアッセイ抗体との結合に関して粒子類似体試薬と競合する。ビタミンＤ分析物同族体が存在すると、化学発光試薬と近接近する粒子類似体試薬の分子の数が少なくなる。したがって、アッセイのシグナルが減少することになる。光増感剤は一重項酸素を形成し、２つの標識が近接近すると化学発光試薬を活性化させる。活性化した化学発光試薬は、その後、光を生成する。この場合、分析物の存在下ではシグナルの減少が観察される。生成された光の量は、形成された複合体の量と関連づけられ、これば次に、試料中に存在するビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体の総量と関連づけられる。
【００７５】
例としてビタミンＤを使用した励起発光イムノアッセイの別の特定の例において、説明のためであって、限定するものではないが、アッセイは、化学発光化合物と結合した粒子を使用し、この場合、ビタミンＤ類似体が粒子と結合している（粒子類似体試薬）。ビタミンＤ２同族体に対して、ビタミンＤ３同族体に対する結合親和性よりも大きな結合親和性を示すアッセイ抗体を含む光増感剤試薬が利用される。アッセイ抗体は、その後、化学発光粒子上の小分子に対する結合パートナーと結合することになる小分子と連結される。
【００７６】
この例において、アッセイ抗体は、ビタミンＤ２同族体に対して、ビタミンＤ３同族体に対する結合親和性よりも大きな結合親和性を示す。試料は、放出剤により前処理され、これにより、内在性結合物質から実質的に等しい量の各ビタミンＤ同族体の遊離がもたらされる。本明細書に記載される原理によると、上記のとおりに作製された非アッセイ抗体は、遊離した同族体を含む媒体とともにインキュベートされる。非アッセイ抗体は、アッセイ抗体がより大きな結合親和性を有するビタミンＤ２同族体に対して選択的な結合親和性を示す。非アッセイ抗体の量は、アッセイで得られるシグナルの量を調節して、ビタミンＤ３同族体の量に対してよりも多くアッセイ抗体が結合するビタミンＤ２同族体の量を打ち消すのに十分な量である。ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体を含む媒体の処理は、アッセイ抗体を使用したアッセイと同時に行われる。
【００７７】
ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体の両方が、ビタミンＤに対するアッセイ抗体との結合に関して粒子類似体試薬と競合する。ビタミンＤ分析物同族体が存在すると、光増感剤試薬と近接近する粒子類似体試薬の分子の数が少なくなる。したがって、アッセイのシグナルが減少することになる。光増感剤は、一重項酸素を形成し、２つの標識が近接近すると、粒子類似体試薬の化学発光化合物を活性化する。活性化した化学発光化合物は、その後、光を生成する。この場合、分析物の存在下ではシグナルの減少が観察される。生成された光の量は、形成された複合体の量と関連づけられ、これが次に、試料中に存在するビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体の両方の量に関連づけられる。
【００７８】
説明のためであって、限定するものではないがビタミンＤを使用した励起発光アッセイの別の特定の例において小分子に対する、（ビオチンに対する結合パートナーである）、例えば、アビジンまたはストレプトアビジンなどの結合パートナーと結合した光増感剤粒子が利用される。アッセイ抗体試薬は、利用される各ビタミンＤ分析物同族体の両方と結合するアッセイ抗体と連結されたビオチンを含む。化学発光試薬は、検出系の一部として利用される。
【００７９】
この例において、アッセイ抗体は、ビタミンＤ２同族体に対して、ビタミンＤ３同族体に対する結合親和性よりも大きな結合親和性を示す。さらに、試料は、放出剤により前処理され、ビタミンＤ２同族体は、ビタミンＤ３同族体の量よりも多く内在性結合物質から
遊離する。本明細書に記載される原理によると、上記のとおりに作製された非アッセイ抗体は、遊離した同族体を含む媒体とともにインキュベートされる。非アッセイ抗体は、アッセイ抗体がより大きな結合親和性を有するビタミンＤ２同族体に対して選択的な結合親和性を示し、ビタミンＤ２同族体は、ビタミンＤ３同族体についてよりも多く内在性結合物質から遊離する。非アッセイ抗体の量は、アッセイで得られるシグナルの量を調節して、ビタミンＤ３同族体の量に対するよりも多い量でアッセイ抗体が結合するビタミンＤ２同族体の量および遊離するビタミンＤ３同族体の量を上回って遊離するビタミンＤ２同族体の量を打ち消すのに十分な量である。ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体を含む媒体の処理は、アッセイ抗体を使用したアッセイと同時に行われる。
【００８０】
上記試薬を含む反応媒体はインキュベートして、アビジンとビオチンの間の結合により光増感剤粒子のアビジンまたはストレプトアビジンをアッセイ抗体試薬のビオチンと結合させ、そしてまた光増感剤粒子に付着しているアッセイ抗体試薬のアッセイ抗体と試料の分析物同族体や化学発光試薬の一部である分析物の間を特異的に結合させる。インキュベーションは、非アッセイ抗体とビタミンＤ２分析物同族体の間も結合させる。その後、媒体は、励起状態で酸素を一重項状態に活性化することができる光増感剤を励起するために光が照射される。ここで、分析物同族体の存在により、光増感剤に近接近する化学発光試薬が少なくなるため、一重項酸素による化学発光試薬の活性化が減り、発光が減る。その後、媒体は発光もしくは放射される光の存在および／または量について確認され、その存在は、分析物同族体の存在および／または量に関連づけられる。この場合、分析物の存在下ではシグナルの減少が観察される。生成された光の量は、形成された複合体の量と関連づけられ、これが次に、試料中に存在するビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体の両方の量と関連づけられる。
【００８１】
説明のためであって、限定するものではないが、試料中のビタミンＤの検出に関するアッセイ方式の別の例は、ＡＣＭＩＡアッセイ方式である。ＡＣＭＩＡアッセイ方式については、ビタミンＤまたはビタミンＤ類似体によりコーティングされたクロム粒子（クロム粒子試薬）が第１の成分として利用される。第２の成分は、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体に対する第１のアッセイ抗体を含むアッセイ抗体試薬である。抗体試薬中で、第１のアッセイ抗体は、連結基によってレポーター酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）と連結されてアッセイ抗体−酵素複合物を形成する。
【００８２】
この例において、アッセイ抗体は、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体に対して実質的に同等の結合親和性を示す。ただし、試料は、放出剤により前処理され、ビタミンＤ２同族体は、ビタミンＤ３同族体の量よりも多く内在性結合物質から遊離する。本明細書に記載される原理によると、上記のとおりに作製された非アッセイ抗体は、遊離した同族体を含む媒体とともにインキュベートされる。非アッセイ抗体は、放出剤によって過剰に遊離するビタミンＤ２同族体に対して選択的な結合親和性を示す。非アッセイ抗体の量は、アッセイで得られるシグナルの量を調節して、ビタミンＤ３同族体の量を超えて遊離するビタミンＤ２同族体の量を打ち消すのに十分な量である。ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体を含む媒体の処理は、個別の工程において行うことができ、またはアッセイ抗体を使用したアッセイと同時に行うこともできる。
【００８３】
試料を含む媒体は、第２のアッセイ抗体試薬により処理され、これは、ビタミンＤ分析物同族体のそれぞれに対して実質的に同等のアッセイ結合親和性を示す第２のアッセイ抗体を含み；第２のアッセイ抗体は、試料中のビタミンＤ同族体と結合する。媒体は、上記のとおりの非アッセイ抗体も含む。ビタミンＤ分析物同族体を第１のアッセイ抗体と結合させるために、抗体−酵素複合物が、媒体中の試料と混合される。次に、クロム粒子試薬が添加されて、あらゆる過剰な抗体−酵素複合物と結合する。その後、磁石が利用され、この磁石は、懸濁液からクロム粒子および過剰な抗体−酵素複合物のすべてを引き寄せ、上清が最終的な反応容器に移される。レポーター酵素の基質が最終的な反応容器に添加され、酵素活性が、経時的な吸光度の変化として分光光度的に測定される。このシグナルの量は、試料中のビタミンＤの両同族体型の量と関連づけられる。
【００８４】
（説明のためであって、限定するものではないが）試料中のビタミンＤの同族体型に対するアッセイの別の例は、固相として常磁性粒子を使用したアクリジニウムエステル標識イムノアッセイである（ＡＤＶＩＡイムノアッセイ）。ビタミンＤアッセイのこの例に利用される検出系は、小分子複合物または捕捉複合物（ｃａｐｔｕｒｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）としての小分子標識化ビタミンＤ（捕捉部分）、固相（ＳＰ）としての小分子被覆常磁性ラテックス粒子に対する結合パートナーならびにビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体に対するアクリジニウムエステル標識化アッセイ抗体（検出抗体）を含む。小分子は、例えば、ビオチンまたはフルオレセインであってもよく、それぞれの結合パートナーは、ストレプトアビジンであるか、またはフルオレセインに対する抗体であってもよい。ビタミンＤ類似体は、小分子と直接連結されるか、または例えば、タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの連結基を介して連結される。患者試料中のビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体は、アクリジニウムエステル標識化抗ビタミンＤアッセイ検出抗体との結合に関して捕捉部分のビタミンＤ類似体と競合する。
【００８５】
ビタミンＤの複数の同族体を含むことが疑われる試料は、１，８−ＡＮＳにより前処理される。この例において、アッセイ抗体は、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体に対して実質的に同等の結合親和性を示す。ただし、１，８−ＡＮＳによる前処理の結果として、ビタミンＤ２同族体は、ビタミンＤ３同族体の量よりも多く内在性結合物質から遊離する。本明細書に記載される原理によると、上記のとおりに作製された非アッセイ抗体は、遊離した同族体を含む媒体とともにインキュベートされる。非アッセイ抗体は、放出剤によって過剰に遊離するビタミンＤ２同族体に対して選択的な結合親和性を示す。非アッセイ抗体の量は、アッセイで得られるシグナルの量を調節して、ビタミンＤ３同族体の量を上回って遊離するビタミンＤ２同族体の量を打ち消すのに十分な量である。非アッセイ抗体によるビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体を含む媒体の処理は、個別の工程として行ってもよく、またはアッセイ抗体を使用したアッセイと同時に行ってもよい。アッセイは、ともに提供される製造業者の説明書に従ってＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）、ＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＸＰまたはＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＣＰ装置（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ニューアーク、デラウェア州）を使用して行うことができる。
【００８６】
本明細書に記載される原理に従った分析物に対するアッセイの別の例は、固相として常磁性粒子を使用したアクリジニウムエステル標識イムノアッセイである（ＡＤＶＩＡイムノアッセイ）。ビタミンＤ同族体に対するアッセイのこの例に利用される検出系は、捕捉複合物としてアッセイ抗体およびアッセイ抗体と連結された小分子を含むアッセイ抗体試薬（捕捉抗体）、アッセイ抗体試薬の小分子に対する結合パートナーにより被覆された固相（ＳＰ）として常磁性ラテックス粒子ならびにアクリジニウムエステル標識化ビタミンＤ分析物類似体（検出ハプテン）を含む。アクリジニウムエステル標識は、分析物類似体と直接結合して検出ハプテンを形成することもでき、または例えば、ＢＳＡなどの例えば、タンパク質を含む連結基を利用してもよい。試料のビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体は、アッセイ抗体との結合に関してアクリジニウムエステル標識化検出ハプテンと競合する。
【００８７】
この例において、アッセイ抗体は、ビタミンＤ２同族体に対して、ビタミンＤ３同族体に対する結合親和性よりも大きな結合親和性を示す。ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体を含むことが疑われる試料は、１つまたはそれ以上の放出剤および消化剤により前処理され、これらは、内在性結合物質から実質的に等しい量の各ビタミンＤ同族体の遊離をもたらす。本明細書に記載される原理によると、上記のとおりに作製された非アッセイ抗体は、遊離した同族体を含む媒体とともにインキュベートされる。非アッセイ抗体は、アッセイ抗体がより大きな結合親和性を有するビタミンＤ２同族体に対して選択的な結合親和性を示す。非アッセイ抗体の量は、アッセイで得られるシグナルの量を調節して、ビタミンＤ３同族体の量よりも多くアッセイ抗体が結合するビタミンＤ２同族体の量を打ち消すのに十分な量である。ビタミンＤ２およびビタミンＤ３同族体を含む媒体の処理は、アッセイ抗体試薬を使用したアッセイと同時に行われる。
【００８８】
上記アッセイは、ともに提供される製造業者の説明書に従ってＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）、ＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＸＰまたはＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＣＰ装置（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ニューアーク  デラウェア州）を使用して行うことができる。上記アクリジニウムエステルアッセイの変形では、小分子は、例えば、ビオチンまたはフルオレセインであってもよく、小分子に対する結合パートナーは、それぞれ、例えば、アビジンもしくはストレプトアビジンであってもよく、またはフルオレセインに対する抗体であってもよい。
【００８９】
検査工程
アッセイ法の一工程において、媒体は、本明細書に記載される原理に従って、分析物の同族体型および分析物に対する抗体を含む複合体の存在について検査される。複合体の量は、試料中の分析物の同族体型の量を示す。
【００９０】
「分析物の量を測定すること」という語句は、分析物の同族体型の定量的、半定量的および質的な測定を指す。定量的、半定量的および質的な方法ならびに分析物を測定するための他のすべての方法が分析物の量を測定する方法であると見なされる。例えば、単に分析物を含むことが疑われる試料中の分析物の有無を検出する方法は、本発明の範囲内に含まれると考えられる。「検出すること」および「測定すること」という用語ならびに測定に関するその他の一般的な同義語は、本発明の範囲内であると考えられる。
【００９１】
多くの実施形態において、媒体の検査は、媒体からのシグナルの検出を伴う。シグナルの存在および／または量は、試料中の分析物の同族体型の存在および／または量と関連づけられる。検出の詳細な方式は、シグナル生成系の性質によって決まる。上記のとおり、シグナル生成系の標識が、外部手段によって検出可能なシグナルを生成することができる多数の方法がある。シグナル生成系の活性化は、シグナル生成系メンバーの性質によって決まる。
【００９２】
測定中の温度は、一般に、例えば、約１０℃から約７０℃、または約２０℃から約４５℃、または約２０℃から約２５℃の範囲に及ぶ。アプローチの１つでは、上記のとおり既知の濃度のビタミンＤ分析物を使用して標準曲線が形成される。キャリブレータおよびその他の対照も使用することもできる。
【００９３】
任意の標識からの発光または生成された光は、光電子増倍管もしくはフォトダイオードを使用することによって、またはその量を測定するのに都合のよいその他の任意の手段によってなど、視覚により、写真により、光量計により、分光光度的に測定することができ、その量は、媒体中の分析物同族体の量と関連づけられる。シグナルの存在および／または量についての検査は、一般には、単にシグナルが読み取られる工程であるシグナルの検出も含む。シグナルは、通常、計器を使用して読み取られ、その計器の性質は、シグナルの性質により決まる。計器は、以下に限定されるものではないが、例えば、分光光度計、蛍光光度計、吸光度計、ルミノメーターおよびケミルミノメーター（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）であってもよい。
【００９４】
アッセイを行うための試薬を含むキット
分析物の同族体型を複数含むことが疑われる試料の１回分に対してアッセイを行うためのキットを製造してもよい。キットは、試料中の分析物同族体に対する少なくとも１種のアッセイ抗体を含む抗体試薬を含む。キットは、本明細書に記載される原理による非アッセイ受容体をさらに含む。非アッセイ受容体の量は、シグナルに対する２つの分析物同族体のうちの１つの寄与の調節を行うのに十分な量である。キットは、アッセイを実施するためのその他の試薬をさらに含んでもよく、その性質は、特定のアッセイ方式によって決まる。
【００９５】
試薬の交差反応性および安定性に応じて、試薬をそれぞれ個別の容器に入れてもよく、またはさまざまな試薬を、１つもしくはそれ以上の容器中に組み合わせてもよい。キットは、例えば、追加の特異的に結合する対メンバー、シグナル生成系メンバーおよび補助試薬など、別々に包装されたアッセイを行うためのその他の試薬をさらに含んでもよい。
【００９６】
キットの各種試薬の相対量は、本方法の間に生じる必要のある反応を実質的に最適化する試薬の濃度を提供するため、さらに実質的にアッセイの感度を最適化するために大きく変化する可能性がある。適切な状況下において、キットの１つまたはそれ以上の試薬は、通常、賦形剤を含む凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができ、溶解時に本明細書に記載される原理による化合物試薬を使用した方法またはアッセイを実施するために適した濃度の試薬溶液をもたらす。キットは、本明細書に記載される原理による化合物試薬を含む試薬を利用した方法の書面による説明をさらに含んでもよい。
【００９７】
「第１の」および「第２の」の呼称は、本明細書中で使用される場合、完全に任意のものであり、本方法の言及される部分のいかなる順序もしくは順位付けまたは部分の付加のいかなる順序を示すことも意味するものではない。
【００９８】
「少なくとも」という語句は、本明細書中で使用される場合、特定の要素の数が、挙げた数以上であってもよいことを意味する。「約」という語句は、本明細書中で使用される場合、挙げた数がプラスマイナス１０％だけ異なってもよいことを意味し；例えば、「約５」は、４．５から５．５の範囲を意味する。
【００９９】
以下の考察は、限定するものではなく説明のための、本明細書に記載される原理による特定の実施例を対象とし；特定の実施例は、本開示の範囲および添付の特許請求の範囲を限定する意図はない。本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、多数の改変物および代替的組成物、方法および系を考え出すことができる。
【実施例】
【０１００】
別に指示がある場合を除いて、以下の実験における材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（セントルイス、ミズーリ州）またはＦｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から購入できる。本明細書中で開示される部および百分率は、別に指示がある場合を除いて重量対体積による。
【０１０１】
定義：
ｍｇ＝ミリグラム
ｇ＝グラム
ｎｇ＝ナノグラム
ｍＬ＝ミリリットル
μＬ＝マイクロリットル
μｍｏｌ＝マイクロモル
℃＝摂氏度
ｍｉｎ＝分
ｓｅｃ＝秒
ｈｒ＝時間
ｗ／ｖ＝重量／体積
ｖ／ｖ＝体積／体積
ＥＤＡ＝エチレンジアミン
ＥＤＡＣ＝Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩
スルホＮＨＳまたはＳＮＨＳ＝スルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラアセタート
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール
ＥｔＯＡｃ＝エチルアセタート
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＭｅＯＰ＝１−メトキシ−２−プロパノール
ＭＥＳ＝２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＤＩ＝蒸留
ＵＰＡ＝微粒子分析器（Ｕｌｔｒａ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）
ＬＯＣＩ＝発光酸素チャネリングイムノアッセイ（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）
Ａｂ＝抗体
【０１０２】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方に対して実質的に等モルのアッセイ結合親和性を示すビオチン化アッセイ抗体の作製
１０ｍＭのＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）中のビタミンＤ抗体５Ｈ１０（Ｂｉｏｖｅｎｔｉｘ、ファーンハム、サリー、英国のヒツジモノクローナル抗体）の溶液（２．６３ｍｇ／ｍＬで０．８ｍＬ）を、ＮＨＳ−ｄＰＥＧ（登録商標）４−ビオチン（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．、パウエル、オハイオ州、品番１０２００）の水溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）４３．２μＬと混合した。添加したビオチン化試薬の量は、抗体に対するビオチン化剤の１０倍モルの曝露に相当する。この反応混合物を室温で３ｈｒインキュベートし、その後、０．５ＭのＴＲＩＳ  ８０μＬを添加することによって反応をクエンチした。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）（ＹＭ１０）デバイス中で、この反応混合物を、２６０ｎｍにおける廃液の吸収が≦０．０３になるまで１０ｍＭのＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いてバッファー交換した。抗体溶液（２．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質１．０４ｍＬ）を、ＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００  １０μＬおよび０．２ｕｍ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してろ過した硫酸ネオマイシンの水溶液１０μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、２〜８℃で保存した。
【０１０３】
ＥＰＲＭ−ＥＤＡビーズの作製
ＥＰＲＭビーズ（２０００ｍｇ、２０．０ｍＬ）を４０ｍＬのバイアルに加えた。米国特許第７，１７９，６６０号に記載されているのと類似の手順でＥＰＲＭビーズを作製し、化学発光化合物は、ユウロピウムキレートを伴う２−（４−（Ｎ，Ｎ，ジ−テトラデシル）−アニリノ−３−フェニルチオキセンとした。ＥＤＡ（８００ｍｇ、８９０μＬ）を、ｐＨ６のＭＥＳバッファー（「バッファー」）１０ｍＬおよび６Ｎ  ＨＣｌ約４．２ｍＬと混合した。この混合物のｐＨは、約６．９であるか、または約６．９に調節した。そのＥＤＡ溶液を、ボルテックスしながらＥＰＲＭビーズに添加し、その混合物を、室温で１５分間振動させた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４００ｍｇ）を、１５ｍＬのバイアル中で蒸留水１０ｍＬと混合し、その組み合わせを、上記のビーズの混合物に添加した。その混合物を、３７℃で１８〜２０時間振盪した。そのビーズを６本の４０ｍＬの遠心沈殿管に移した。ＭＥＳバッファーを添加して体積を３５ｍＬにし、その混合物を、１９，０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ間遠心分離した。その上清をデカントし、そのビーズを、撹拌棒によりバッファー２ｍＬに再懸濁させ、追加のバッファーを添加して３５ｍＬにした。その混合物を、氷を使用して混合物を低温に維持し、１８ワットの力で３０ｓｅｃ間超音波処理した。あらゆる活性化学物質を除去するために洗浄／超音波処理工程を４回行った。最後のＭＥＳバッファー遠心分離の後、５％のＭｅＯＰおよび０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むバッファー（「第２のバッファー」）２ｍＬを、再懸濁工程のために遠心沈殿管に添加した。超音波処理の前に追加の第２のバッファーを添加して、３５ｍＬにした。そのビーズ懸濁液を、１９，０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ間遠心分離した。その上清を捨てた。最後の超音波処理は、各遠心沈殿管中の第２のバッファー１２ｍＬを使用して、２５ｍｇ／ｍＬの希釈液を得た。ＵＰＡ計器により測定すると粒子径は２７７ｎｍであった。
【０１０４】
ＥＰＲＭケミビーズ（ｃｈｅｍｉｂｅａｄ）を、米国特許第６，１５３，４４２号および米国特許出願公開第２００５０１１８７２７Ａ号に記載されている方法と類似の手法で作製し、この関連する開示を参照によって本明細書に組み入れる。ＥＰＲＭケミビーズは、アミノデキストラン内層および遊離アルデヒド官能基を有するデキストランアルデヒド外層を含む。例えば、米国特許第５，９２９，０４９号、同７，１７９，６６０号および同７，１７２，９０６号を参照のこと。この関連する開示を参照によって本明細書に組み入れる。この反応を、例えば、ＭＥＳなどの適したバッファーを用いた緩衝水性媒体中で約０から約４０℃の温度で約１６から約６４時間、約５．５から約７．０または約６のｐＨにおいて行った。この反応を、例えば、カルボキシメトキシルアミン０．５塩酸塩（ＣＭＯ）などの適したクエンチ剤を添加することによってクエンチし、続いて粒子を洗浄した。
【０１０５】
外側デキストランアルデヒド層にあるアルデヒド基を、還元的アミノ化条件下でエチレンジアミンと反応させてエチレン鎖および末端アミン基を含むペンダント部分を有する試薬ＥＰＲＭ−ＥＤＡを形成した。還元的アミノ化条件としては、例えば、金属水素化物などの還元剤の使用が挙げられる。その反応を、反応中、約２０℃から約１００℃の温度で約１時間から約４８時間、水性媒体中で行った。
【０１０６】
２５−ＯＨ  ビタミンＤ３  ３−カルバマート（２５−ＯＨ  ビタミンＤ２  ３−カルバマート）の合成
（ホイルで覆った）５ｍｌのフラスコにおいて無水アセトニトリル１ｍｌ中のＣｈｅｍＲｅａｇｅｎｔｓ．ｃｏｍ、シュガーランド、テキサス州から購入した２５−ＯＨ  ＶＤ３  ２２ｍｇ（５５μｍｏｌ）、ジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）１００ｍｇ（４２０μｍｏｌ）、トリエチルアミン１００μＬの混合物を、室温で窒素下において１８ｈｒ撹拌して活性化２５−ＯＨ  ＶＤ３を調製した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝２：１）は、出発材料が残っていなかったことを示した。１０ｍｌのフラスコにカルボキシメトキシルアミン０．５塩酸塩（ＣＭＯ）１５０ｍｇ、トリエチルアミン０．３ｍｌおよびＤＭＦ  １ｍｌを添加することによって懸濁液を調製した。活性化２５−ＯＨ  ＶＤ３を含む溶液を、撹拌しながらＣＭＯ懸濁液に滴加した、これを、さらに１８ｈｒ続けた。可能な限り溶媒を除去するために減圧を利用した（熱浴温度は、５０℃を超えるべきでない）。ＥｔＯＡｃ（２５ｍｌ）を残留物に添加し、これを、塩水２ｍｌにより３回洗浄した。その有機相を、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過した；ロータリーエバポレータを使用して溶媒を除去した。乾燥後に粗生成物（４２ｍｇ）が得られ、ＨＰＬＣにより精製した。高真空下で乾燥した後、純粋な生成物（２４ｍｇ）が得られた。その生成物を無水ＤＭＳＯ  １．２ｍｌに溶解させた。アリコートをバイアルに移し、−７０℃に維持した。
【０１０７】
ケミビーズ試薬を得るためのＥＰＲＭ−ＥＤＡと２５−ＯＨ  ビタミンＤ３  ３−カルバマートのカップリング
２５−ＯＨ  ビタミンＤ３  ３−カルバマート（上記のとおりに調製したＤＭＳＯ中のアリコート１０μＬ）（０．２ｍｇ）を、２ｍＬのバイアルに添加した。ＥＤＡＣ（６．８ｍｇ）およびＳＮＨＳ（９．４ｍｇ）プラス無水ＤＭＳＯ  ２．２７ｍＬ（３ｍｇ／ｍＬ）を、５ｍＬのバイアルに添加した。ＥＤＡＣ／ＳＮＨＳ溶液（１９０μＬ）を上記の２ｍＬのバイアルの中身（１ｍｇ／ｍＬ）と混合して活性化２５−ＯＨ  ビタミンＤ３  ３−カルバマートを調製した。その混合物を、室温で１８ｈｒ回転させた。１６％のＧＡＦＡＣ（登録商標）界面活性剤溶液（ＧＡＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウェイン、ニュージャージー州）のアリコート０．４ｍＬ（０．１５％）を、蒸留水３．６ｍＬにより１．６％に希釈した。
【０１０８】
ビタミンＤ３（８．５ｍｇ）およびＤＭＳＯ  ８５０μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）を混合した。撹拌子を備えた１０ｍＬの丸底フラスコ（標識化３３２３−０６４Ｂ）に、ＥＰＲＭ−ＥＤＡ  ２．０ｍＬ（２００ＭＧ）を添加し、続いて上記のビタミンＤ３溶液４００μＬ（４ｍｇ）を添加した。その混合物を室温で一晩撹拌した。
【０１０９】
撹拌子を備えた１０ｍＬの丸底フラスコに、穏やかに撹拌しながら、（上記のとおりに作製した）ＥＰＲＭ−ＥＤＡ  ２．０ｍＬ（２００ｍｇ）を添加し、続いて１．６％のＧＡＦＡＣ（登録商標）界面活性剤溶液２６０μＬ（０．１５％）を添加した。小さな試験管に、無水ＤＭＳＯ  ５０４μＬを添加し、続いて上記のとおりに調製した活性化ビタミンＤ３−３−カルバマート６０μＬ（０．０６ｍｇ）を添加し；その混合物をＥＰＲＭ−ＥＤＡビーズ混合物に添加した。ビーズ懸濁液の総ＤＭＳＯ含有量を２０％とした。反応容器を室温で一晩撹拌した。その後、そのビーズをダイアフィルトレーションにより洗浄した。
【０１１０】
１０％のＭｅＯＰ／１％のＧＡＦＡＣ（登録商標）／ｐＨ６のＭＥＳバッファーを含むそれぞれのビーズロットを、最大２０ｍＬの使用体積（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）とした。その混合物に５体積のバッファーを用いてダイアフィルトレーションを行い、その後、混合物を低温に維持するために氷を使用して、プローブ型超音波処理器（ｐｒｏｂｅ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）により１８〜２１ワットで超音波処理をした。ダイアフィルトレーション／超音波処理を５０体積まで継続し、流出液試料を３５、４０、４５および５０体積において採取した。バッファーを、ＬＯＣＩハプテン洗浄バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％の硫酸ネオマイシン、０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）４０５Ｘおよび０．１５％のＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００、ｐＨ７．２）に変え、１０体積を使用した。その混合物を約７ｍＬに減らし、ＵＰＡを行った。粒子径は、３３２３−０６４Ａ＝２８９ｎｍおよび３３２３−０６４Ｂ＝２９８ｎｍであった。パーセント固体を測定し、そのビーズロットをｐＨ７．２のＬＯＣＩハプテン洗浄バッファーにより最大で１０ｍｇ／ｍＬにした。生成量は１６０．４ｍｇであった。
【０１１１】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の総量についてのアッセイ
ＬＯＣＩアッセイのプロトコールに従って、さまざまな量の２５−ヒドロキシビタミンＤ３を含むキャリブレータ溶液を使用して、ＤＩＭＥＮＳＩＯＮ（登録商標）ＶＩＳＴＡ（登録商標）分析器（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ディアフィールド、イリノイ州）によりアッセイを行った。この実施例において、このアッセイには、化学発光試薬として、上記のとおりに調製したケミビーズ試薬を使用した。ビタミンＤを含むことが疑われる試料を、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳバッファー（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、４．９ｍＭのナトリウムＨＥＰＥＳ、３００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエチレングリコール、１２．２６ｍＭのコール酸ナトリウムおよび０．２０％のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）２５Ｒ２）中で５％のトリクロロ酢酸ナトリウムおよび６％のサリチル酸ナトリウムを用いて前処理した。
【０１１２】
前処理に関する条件は以下のとおりとした：約４５ｎｇ／ｍＬの２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３を含む血清試料８μＬを、上記の前処理試薬およびビオチン化アッセイ抗体試薬とともに約１８分間インキュベートした。その後、未反応の（結合していない）ビオチン化アッセイ抗体を除去するために、２５ＯＨ  Ｄ３被覆ケミビーズ試薬を添加した。次に、ストレプトアビジン被覆センシビーズ（ｓｅｎｓｉｂｅａｄ）試薬を、その後、添加して、結合していないアッセイ抗体のＬＯＣＩシグナルを生成した。２５−ヒドロキシビタミンＤ濃度は、ＬＯＣＩシグナルに反比例する。前処理の結果として、内在性結合物質から遊離し、アッセイ抗体と結合した２５−ヒドロキシビタミンＤ２の量は６３ｎｇ／ｍＬであり、内在性結合物質から遊離した２５−ヒドロキシビタミンＤ３の量は４２ｎｇ／ｍＬであった。明らかなように、遊離した２５−ヒドロキシビタミンＤ２の量が遊離した２５−ヒドロキシビタミンＤ３の量よりも多かった。
【０１１３】
試料を上記のとおりに調製したビオチン化アッセイ抗体試薬と反応させ、その後、ケミビーズ試薬と反応させた。溶液としての非アッセイ抗体として、ビタミンＤ抗体３Ａ１０（Ｂｉｏｖｅｎｔｉｘ  Ｉｎｃ．、ファーンハム、サリー、英国のマウスモノクローナル抗体）を利用し、非アッセイ抗体は、遊離した２５−ヒドロキシビタミンＤ３の量よりも多く遊離した２５−ヒドロキシビタミンＤ２の過剰な量を打ち消すために４０μｇ／ｍＬ（または５Ｈ１０抗体の量の５３倍）の量で存在するものとした。ケミビーズは、試料の分析物によってふさがったモノクローナル抗体結合部位の部分と結合する。その後、ストレプトアビジン結合増感剤ビーズを、反応混合物に添加した。これにより、ケミビーズ／センシビーズ対が形成され、その濃度は、ビタミンＤの両方の型（第１の試料部分）またはビタミンＤのエピ体（第２の試料部分）のいずれかの濃度と逆相関した。６８０ｎｍでの照射時、増感剤ビーズは、一重項酸素を形成し、一重項酸素はケミビーズ中に拡散し、そのケミビーズは、センシビーズと対になり、オレフィン系色素と反応し、およそ６１２ｎｍで化学発光シグナルを誘発し、これは、分析物濃度と逆相関する。
【０１１４】
ストレプトアビジン−増感剤ビーズ（「センシビーズ」）を、米国特許第６，１５３，４４２号、同第７，０２２，５２９号、同第７，２２９，８４２号および米国特許出願公開第２００５０１１８７２７Ａ号に記載されているのと類似の方法を使用して作製した。光増感剤は、ビス−（トリヘキシル）−シリコン−ｔ−ブチル−フタロシアニンとした。１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ８．０のＨＥＰＥＳバッファー中のセンシビーズ試薬の濃度を２００μｇ／ｍＬとした。上記のとおりに調製されたＥＰＲＭ−ＥＤＡ−２５−ＯＨビタミンＤ３粒子試薬を、「ケミビーズ試薬」として１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％の界面活性剤を含むｐＨ７．２のＨＥＰＥＳバッファー中において２００μｇ／ｍＬの濃度で利用した。
【０１１５】
時間ｔ＝０ｓｅｃに、ビオチン化抗体試薬２０μＬおよび水２０μＬを反応容器に添加した。試料１２μＬを２１．６秒後に添加し、続いて水８μＬを添加した。ｔ＝４１４．０秒に、ケミビーズ試薬４０μＬを添加し、続いて水２０ｍＬを添加した。センシビーズ試薬を、その後、４５７．２秒の時点で分注した。反応シーケンスの開始６０１．２秒後に測定を行った。
【０１１６】
上記のアッセイ方式を使用して、さまざまな量の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３を含む血清試料に対してアッセイを行った。モノクローナル抗体１０Ｈ９の代わりに、それぞれモノクローナル抗体５Ｆ６および６Ｆ１１（共にＢｉｏｖｅｎｔｉｘ、ファーンハム、サリー、英国のヒツジモノクローナル）を使用して上記アッセイを繰り返した。その結果を、以下のとおり表にし、説明する：
【０１１７】
個々の出版物または特許出願のそれぞれを、参照により組み入れることを具体的に個々に示したかのように、本明細書中に挙げられた出版物および特許出願のすべてを参照によって本明細書に組み入れる。
【０１１８】
当然のことながら、上記の例は、本明細書に記載される原理を示す多くの特定の例のうちの一部の例に過ぎない。明らかに、当業者は、添付の特許請求の範囲によって規定される範囲から逸脱することなく、数々のその他の組み合わせを容易に考え出すことができる。
【図１】
0006419161.tif 000002