(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の停止されたヘリカーゼをポリヌクレオチド中の１個または複数のスペーサーを過ぎて移動させる方法であって、（ａ）１個または複数のスペーサーを含むポリヌクレオチドであって１つまたは複数のヘリカーゼがスペーサーで停止されるポリヌクレオチドを膜貫通ポアと接触させるステップ、ならびに（ｂ）前記ポア全体に電位を印加して、それにより前記１つまたは複数のヘリカーゼを前記ポリヌクレオチド上の前記１個または複数のスペーサーを過ぎて移動させるステップを含む、方法。
【請求項２】
膜貫通ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドに１個または複数のスペーサーを設けるステップ、
（ｂ）１つまたは複数のヘリカーゼが前記１個または複数のスペーサーで停止するように、前記標的ポリヌクレオチドを前記１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップ、
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドおよび前記１つまたは複数の停止されたヘリカーゼを前記ポアと接触させるステップ、ならびに
（ｄ）前記１つまたは複数のヘリカーゼが前記１個または複数のスペーサーを過ぎて移動し、前記ポアを通る前記標的ポリヌクレオチドの前記移動を制御するように、前記ポア全体に電位を印加するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）請求項２に記載の方法を実行するステップ、および
（ｂ）ポアに関して前記ポリヌクレオチドが移動する際に１つまたは複数の測定値を取るステップであって、前記測定値が前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性の指標であり、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特性決定する、ステップ
を含む、方法。
【請求項４】
前記標的ポリヌクレオチドに前記１個または複数のスペーサーを設けるステップが、１個または複数のスペーサーを含むように前記標的ポリヌクレオチドを修飾するステップを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数の特性が、
（ａ）（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記標的ポリヌクレオチドの二次構造、（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、および（ｖｉ）前記標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つもしくは複数のタンパク質でまたは１つもしくは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているか否か、から選択され、
（ｂ）電気的測定および／または光学的測定によって測定され、あるいは
（ｃ）電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定により測定される、
請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数のヘリカーゼが、前記印加された電位から生じる場に沿って前記ポアを通る前記標的ポリヌクレオチドの前記移動を制御する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）前記１個または複数のスペーサーが、前記標的ポリヌクレオチド内に含まれるポリヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを含み、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり、前記１個または複数のスペーサーが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する合成ポリマーを含み、
（ｃ）前記１個または複数のスペーサーが、１つもしくは複数のニトロインドール、１つもしくは複数のイノシン、１つもしくは複数のアクリジン、１つもしくは複数の２−アミノプリン、１つもしくは複数の２−６−ジアミノプリン、１つもしくは複数の５−ブロモ−デオキシウリジン、１つもしくは複数の逆位チミジン（逆位ｄＴ）、１つもしくは複数の逆位ジデオキシ−チミジン（ｄｄＴ）、１つもしくは複数のジデオキシ−シチジン（ｄｄＣ）、１つもしくは複数の５−メチルシチジン、１つもしくは複数の５−ヒドロキシメチルシチジン、１つもしくは複数の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、１つもしくは複数のイソ−デオキシシチジン（イソ−ｄＣ）、１つもしくは複数のイソ−デオキシグアノシン（イソ−ｄＧ）、１つもしくは複数のＣ３基、１つもしくは複数の光開裂（ＰＣ）基、１つもしくは複数のヘキサンジオール基、１つもしくは複数のスペーサー９（ｉＳｐ９）基、１つもしくは複数のスペーサー１８（ｉＳｐ１８）基、ポリマーまたは１つもしくは複数のチオール連結を含み、
（ｄ）前記１個または複数のスペーサーが、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、
（ｅ)前記１個または複数のスペーサーが、塩基を持たない前記１つまたは複数のヌクレオチドを含み、あるいは、
（ｆ）前記１個または複数のスペーサーが、前記１つまたは複数のヘリカーゼが停止する原因となる１つまたは複数の化学基を含み、前記１つまたは複数の化学基が、１つまたは複数のフルオロフォア、ストレプトアビジンおよび／もしくはビオチン、コレステロール、メチレンブルー、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニンおよび／もしくは抗ジゴキシゲニンまたはジベンジルシクロオクチン基である、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）２つ以上の停止されたヘリカーゼが、各スペーサーを過ぎて移動し、（ｉｉ）互いに付着した前記２つ以上のヘリカーゼが、各スペーサーを過ぎて移動し、または（ｉｉｉ）互いに共有結合的に付着している前記２つ以上のヘリカーゼが、各スペーサーを過ぎて移動する、
請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、前記１個または複数のスペーサーが、前記ポリヌクレオチドの１本鎖領域または非ハイブリダイズ領域に含まれ、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、前記１個または複数のスペーサーが、前記ポアに優先的に挿入されるリーダー配列を含む前記１本鎖領域に含まれ、
（ｄ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、前記２本鎖部分の２本の鎖が、架橋成分を使用して連結されており、あるいは、
（ｅ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、前記２本鎖部分の２本の鎖が、架橋成分を使用して連結されており、前記１個または複数のスペーサーが、架橋成分に含まれる、
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つまたは複数のヘリカーゼが、（ａ）１つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼ、１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼ、１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼまたは１つもしくは複数のＤｄａヘリカーゼ、（ｂ）（ａ）におけるヘリカーゼのいずれかに由来の１つもしくは複数のヘリカーゼ、あるいは（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）におけるいずれかのヘリカーゼの組合せである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）前記ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアであり、
（ｂ）前記膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリジン、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、ライセニン（lysenin）、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来であり、
（ｃ）配列番号２に示す８つの同一のサブユニットから形成されている、または前記８つのサブユニットの１つもしくは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有し、ポアを形成する能力を保持しているその変種であり、あるいは、
（ｄ）配列番号４に示す７つの同一サブユニットから形成されている、または前記７つのサブユニットの１つまたは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有し、ポアを形成する能力を保持しているその変種である、
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
１つまたは複数の停止されたヘリカーゼをポリヌクレオチド上の１個または複数のスペーサーを過ぎて移動させるための膜貫通ポアおよび印加された電位の使用。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが膜貫通ポアと接触する前に、前記ポリヌクレオチド上の１つまたは複数のヘリカーゼを停止させるための１個または複数のスペーサーの使用。
【請求項１４】
標的ポリヌクレオチド上の１つまたは複数のヘリカーゼのローディングを制御する方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドに１個または複数のスペーサーを設けるステップ、および
（ｂ）前記１つまたは複数のヘリカーゼが前記標的ポリヌクレオチドに結合し、各スペーサーで停止するように、（ａ）において提供された前記標的ポリヌクレオチドを１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップを含む、方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）が、前記標的ポリヌクレオチドが１個または複数のスペーサーを含むように標的ポリヌクレオチドを修飾するステップを含み、および/または前記標的ポリヌクレオチドに５’から３’方向で（Ｌ−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ）ｎを設ける（式中、Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは整数である）、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）が、前記１つまたは複数のヘリカーゼが前記標的ポリヌクレオチドに結合し、１つのヘリカーゼが各スペーサーで停止するように、（ａ）において提供された前記標的ポリヌクレオチドを前記１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）が、前記標的ポリヌクレオチドに５’から３’方向で（Ｌ１−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ１）ｎを設けるステップを含む（式中、Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは、８〜１５ヌクレオチド長の非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは整数である）、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）が、前記１つまたは複数のヘリカーゼが前記標的ポリヌクレオチドに結合し、２つのヘリカーゼが各スペーサーで停止するように、（ａ）において提供された前記標的ポリヌクレオチドを前記１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）が、前記標的ポリヌクレオチドに５’から３’方向で（Ｌ２−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ２）ｎを設けるステップを含む（式中、Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは、１６〜２２ヌクレオチド長の非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは整数である）、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
各スペーサーに停止された前記２つのヘリカーゼが互いに異なっており、または各スペーサーに停止された前記２つのヘリカーゼが互いに付着しているまたは互いに共有結合的に付着している、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドに５’から３’方向で（Ｌ２−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ２）ｎを設けるステップ（式中、Ｌ２は１本鎖ポリヌクレオチドまたは、１６〜２２ヌクレオチド長の非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは整数である）、
（ｂ）各領域Ｌ２の残りの部分が８〜１５ヌクレオチド長であるように、ブロッキングポリヌクレオチドを各領域Ｌ２の一部にハイブリダイズさせるステップ、
（ｃ）１つのヘリカーゼが各領域Ｌ２の残りの部分に結合するように、（ｂ）において生成された前記標的ポリヌクレオチドを１つまたは複数のヘリカーゼに接触させるステップ、
（ｄ）それらが各ブロッキングポリヌクレオチドを除去し、各スペーサーＳで停止するように、遊離ヌクレオチドおよびヘリカーゼ補因子を（ｃ）における前記１つまたは複数の結合したヘリカーゼに提供するステップ、ならびに
（ｅ）１つの異なるヘリカーゼが各領域Ｌ２に結合し、各スペーサーおよび（ｄ）において停止された各ヘリカーゼによって停止されるように、（ｄ）において生成された前記標的ポリヌクレオチドを（ｃ）において使用されたものとは異なる１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的ポリヌクレオチドに、２つ以上スペーサーが設けられ、および／または前記１つまたは複数の停止されたヘリカーゼが、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法を使用して前記１個または複数のスペーサーを過ぎて移動される、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための複合体であって、（ａ）５’から３’方向の（Ｌ−Ｓ−Ｄ）ｎまたは（Ｄ−Ｓ−Ｌ）ｎ（式中、Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、Ｄは２本鎖ポリヌクレオチドであり、式中ｎは整数である）を含むアダプターと、（ｂ）各アダプターに停止された１つまたは複数のヘリカーゼとを含む、複合体。
【請求項２４】
（ａ）Ｌが、１つのヘリカーゼだけに結合できる（Ｌ１）または２つのヘリカーゼだけに結合できるものであり（Ｌ２）、あるいは
（ｂ）１つのヘリカーゼだけに結合できる（Ｌ１）または２つのヘリカーゼだけに結合できるものであって（Ｌ２）、ｎが１であり、１つまたは２つのヘリカーゼが前記アダプターで停止されている、
請求項２３に記載の複合体。
【請求項２５】
標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのキットであって、（ａ）請求項７に定義される１もしくは複数のスペーサー、または請求項２３もしくは２４に定義される１もしくは複数のアダプター、（ｂ）１つまたは複数のヘリカーゼおよび（ｃ）膜貫通ポアを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリカーゼをポリヌクレオチド上のスペーサーを過ぎて移動させ、ポリヌクレオチド上へのヘリカーゼのローディングを制御する新規方法に関する。本発明は、ヘリカーゼを使用して標的ポリヌクレオチドを特性決定する新規方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
迅速で安価なポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定および同定技術が、幅広い応用にわたって現在必要である。既存の技術は、主にそれらが、大量のポリヌクレオチドを生成するための増幅技術に依存し、シグナル検出のために多量の専門的な蛍光化学物質を必要とするために、遅く高価である。
【０００３】
膜貫通ポア（ナノポア）は、ポリマーおよび種々の小分子のための直接的、電気的バイオセンサーとして大きな将来性を有する。特に、将来性のあるＤＮＡ配列決定技術としてナノポアが近年注目されている。
【０００４】
電位がナノポア全体に印加される場合、ヌクレオチドなどの分析物が一定時間バレルに一過的に存在する場合に電流が変化する。ヌクレオチドのナノポア検出は、既知のサインおよび持続時間での電流変化をもたらす。「鎖配列決定」法では、１本のポリヌクレオチド鎖がポアを通り、ヌクレオチドのアイデンティティが得られる。鎖配列決定は、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためのヘリカーゼなどのヌクレオチドハンドリングタンパク質の使用を含み得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ポリヌクレオチド中のスペーサーは、典型的にはヘリカーゼを停止できる、すなわちヘリカーゼがスペーサーを過ぎてポリヌクレオチドに沿ってさらに移動することを防ぐ。本発明者らは、ヘリカーゼおよびポリヌクレオチドを膜貫通ポアと接触させ、電位を印可することによって、１つまたは複数の停止されたヘリカーゼをポリヌクレオチド中のスペーサーを過ぎて移動させることが可能であることを驚くべきことに実証した。典型的にはヘリカーゼはポアを通り抜けるには大きすぎることから、電位に沿ってポアを通してポリヌクレオチドを移動させる力は、ヘリカーゼをスペーサーを過ぎて移動させる。これは、ポリヌクレオチドの移動を制御するためおよびポリヌクレオチドを、配列決定するなどの特性決定するための重要な用途を有する。本発明者らは、１個または複数のスペーサーを使用してポリヌクレオチド上の１つまたは複数のヘリカーゼのローディングを制御することが可能であることも驚くべきことに実証した。
【０００６】
したがって、本発明は、１つまたは複数の停止されたヘリカーゼを標的ポリヌクレオチド中の１個または複数のスペーサーを過ぎて移動させる方法であって、（ａ）１つまたは複数の停止されたヘリカーゼおよび標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと接触させるステップ、ならびに（ｂ）ポア全体に電位を印加して、それにより１つまたは複数のヘリカーゼを標的ポリヌクレオチド上の１個または複数のスペーサー過ぎて移動させるステップを含む、方法を提供する。
【０００７】
本発明は：
−  膜貫通ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、（ａ）標的ポリヌクレオチドに１個または複数のスペーサーを設けるステップ、（ｂ）１つまたは複数のヘリカーゼが１個または複数のスペーサーで停止するように、標的ポリヌクレオチドを１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップ、（ｃ）標的ポリヌクレオチドおよび１つまたは複数の停止されたヘリカーゼをポアと接触させるステップ、ならびに（ｄ）１つまたは複数のヘリカーゼが１個または複数のスペーサーを過ぎて移動し、ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにポア全体に電位を印加するステップを含む、方法、
−  標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、（ａ）本発明の膜貫通ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を実行するステップ、および（ｂ）ポアに関してポリヌクレオチドが移動する際に１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値がポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性の指標であり、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップを含む、方法、
−  標的ポリヌクレオチド上の１つまたは複数のヘリカーゼのローディングを制御する方法であって、（ａ）ポリヌクレオチドに１個または複数のスペーサーを設けるステップ、および（ｂ）１つまたは複数のヘリカーゼがポリヌクレオチドに結合して各スペーサーで停止するように、（ａ）において提供されたポリヌクレオチドを１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップを含む、方法、
−  標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのアダプターであって、（ａ）５’から３’方向の（Ｌ−Ｓ−Ｄ）ｎまたは（Ｄ−Ｓ−Ｌ）ｎ（式中、Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、Ｄは２本鎖ポリヌクレオチドであり、ｎは整数である）と、（ｂ）各アダプターに停止された１つまたは複数のヘリカーゼとを含む、アダプター、ならびに
−標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのキットであって、（ａ）１個または複数のスペーサー、（ｂ）１つまたは複数のヘリカーゼおよび（ｃ）膜貫通ポアを含む、キット
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１において使用されるラムダＤＮＡ構築物を示す図表である。配列番号９（Ａと標識される）は、その３’末端で４個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ｂと標識される）に付着されている。４個のｉＳｐＣ３スペーサーは、配列番号１０（Ｃと標識される）の５’末端に付着されている。配列番号１０は、配列番号１１（Ｅと標識される）にその５’末端で付着されている４個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ｄと標識される）に付着されている。配列番号１０は、配列番号１２（Ｆと標識される、３’コレステロールテザーを有する）にハイブリダイズされている。
【図２】ヘリカーゼ（Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号８）））がナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通るラムダＤＮＡ構築物（０．２ｎＭ、図１に記載および例示する）の移行を制御する際の例示的電流トレース（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ、２０から１２０）、ｘ軸標識＝時間（秒、３５００から８０００））を示す図である。
【図３】図２に示す電流トレース（上および下の両トレースについてｙ軸標識＝電流（ｐＡ、上トレース２０から８０、下トレース２０から６０）、ｘ軸標識＝時間（秒、上トレース２９９５から３０２０、下トレース８１４０から８１７０））において示されたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の領域の拡大図である。Ａ）はヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の開始を示し、Ｂ）はヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後を示す。１と標識される矢印は、第１の４個のｉＳｐＣ３スペーサー（ナノポアによる捕捉の前に酵素の移動を停止するために使用される）がナノポアを通って移動する場合に対応する。２と標識される矢印は、ナノポアを通って移動する４個のｉＳｐＣ３スペーサーの第２の群に対応する。
【図４】（ａ）は、実施例２において使用されるヘアピンおよびＹ形ＭｕＡ基質設計を示す図である。配列番号１９中のｄＵＭＰは、三角として強調され、ｉＳｐＣ３スペーサーはｘとして示されている。図４（ｂ）は、実施例２に詳述される試料調製手順の際に生成されたラムダＤＮＡ構築物を示している。ラムダＤＮＡの５〜１０ｋＢ断片はＸと標識され、ポリメラーゼによって満たされ、リガーゼによって構築物の残りに連結されたＤＮＡの断片は、ｙと標識され（点線として示される）、ｉＳｐＣ３スペーサーはｘとして示されている。テザー配列（配列番号１６）は、示されるＤＮＡ構築物にハイブリダイズされる。配列番号１６の３’末端に付着するのは、２つのチミン残基および３’コレステロールＴＥＧ（灰色丸として示される）に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーである。
【図５】ヘリカーゼ（Ｔｒｗｃ  Ｃｂａ（配列番号９）がナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通るラムダＤＮＡ構築物（図４ｂに示す）の移行を制御する際の例示的電流トレース（上および下の両トレースについてｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（秒））を示す図である。上トレースは、ナノポアを通るラムダＤＮＡ構築物全体のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示し、Ｘ１と標識される第１のｉＳｐＣ３スペーサーは、電流に１と標識されるスパイクを生じ、Ｘ２と標識される第２のｉＳｐＣ３スペーサーは、電流に２と標識されるスパイクを生じる。下トレースは、ナノポアを通るヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後の領域の拡大を示し、Ｘ３と標識される第３のｉＳｐｃＣ３スペーサーは電流に３と標識されるスパイクを生じる。
【図６】（ａ）実施例３において使用されるヘアピンおよびＹ形ＭｕＡ基質設計を示す図である。５’リン酸は丸で標識され、配列番号１８中のイノシンは四角として強調され、ｉＳｐＣ３スペーサーはｘとして示されている。図６（ｂ）は、実施例３に詳述される試料調製手順の際に生成されたラムダＤＮＡ構築物を示している。ラムダＤＮＡの５〜１０ｋＢ断片はＸと標識され、ｘに付着されたイノシンは四角で標識され、ｉＳｐＣ３スペーサーはｘとして示されている。テザー配列（配列番号１６）は、示されるＤＮＡ構築物にハイブリダイズされる。配列番号１６の３’末端に付着されているのは、２つのチミン残基および３’コレステロールＴＥＧ（灰色丸として示される）に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーである。
【図７】ヘリカーゼ（Ｔｒｗｃ  Ｃｂａ（配列番号１７）がナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通るラムダＤＮＡ構築物（図６ｂに示す）の移行を制御する際の例示的電流トレース（上および下の両トレースについてｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（秒））を示す図である。上トレースは、ナノポアを通るラムダＤＮＡ構築物全体のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示し、Ｘ１と標識される第１のｉＳｐＣ３スペーサーは、電流に１と標識されるスパイクを生じ、Ｘ２と標識される第２のｉＳｐＣ３スペーサーは、電流に２と標識されるスパイクを生じ、Ｘ３と標識される第３のｉＳｐＣ３スペーサーは、電流に３と標識されるスパイクを生じる。下トレースは、ナノポアを通るヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の後半領域の拡大を示し、Ｘ２と標識される第２のｉＳｐＣ３スペーサーは、電流に２と標識されるスパイクを生じ、Ｘ３と標識される第３のｉＳｐＣ３スペーサーは電流に３と標識されるスパイクを生じる。
【図８】酵素活性を検査するための蛍光アッセイを示す図である。通例の蛍光基質がハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼ（ａと標識される）の能力をアッセイするために用いられた。１）蛍光基質鎖（最終４８．７５ｎＭ、配列番号２５および２６）は３’ｓｓＤＮＡオーバーハング（２０塩基）、およびハイブリダイズされたｄｓＤＮＡの４０塩基セクションを有する。上部鎖（ｂ）は、カルボキシフルオレセイン塩基（ｃ）を配列番号２５の５’末端に有し、ハイブリダイズされた相補物（ｄ）はブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基（ｅ）を配列番号２６の３’末端に有する。ハイブリダイズされると、フルオレセイン由来の蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は基本的に非蛍光性である。蛍光基質の下鎖に部分相補的である捕捉鎖（ｆ、配列番号２７）の０．９７５μＭがアッセイに含まれる。２）ＡＴＰ（０．９７５ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）の存在下で、ヘリカーゼＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（１２ｎＭ、配列番号２８）は、蛍光基質の３’オーバーハングに結合し、上部鎖に沿って移動し、示すとおり相補鎖（ｄ）を置換する。３）ＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると、主要な鎖上のフルオレセインが蛍光を発する（星形として示される）。４）置換された下部鎖（ｄ）は、過剰量の捕捉鎖（ｆ）に優先的にアニールして初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ。
【図９】酵素活性を検査するための蛍光アッセイを示す図である。２つの可能性がある蛍光基質がハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼ（ａと標識される）の能力をアッセイするために使用され、これらは図９に示されている、（ａ）（１Ｃ〜３Ｃと標識される）は、配列番号２７の３’末端を配列番号２９の３’末端に繋いでいる４個のＳｐ９スペーサー（黒三角として示される）を有し、（ｂ）（１Ｂ〜３Ｂと標識される）は、は配列番号２７の３’末端を配列番号２９の３’末端に繋いでいる１個のＳｐ９スペーサー（黒三角として示される）を有する。蛍光基質鎖（既に記載のとおりａ）またはｂ）のいずれでも最終４８．７５ｎＭ）は、３’ｓｓＤＮＡオーバーハング（２０塩基）およびハイブリダイズされたｄｓＤＮＡの４０塩基セクションを有する。上部鎖（ｂ）は、配列番号２７の５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基（ｃ）を有し、ハイブリダイズされた相補物（ｄ）は、配列番号２６の３’末端にブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基（ｅ）を有する。ハイブリダイズされると、フルオレセイン由来の蛍光は、局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は基本的に非蛍光性である。蛍光基質の下部鎖に部分相補的である捕捉鎖（ｆ、配列番号２７）１μＭがアッセイに含まれる。２ａおよびｂ）  ＡＴＰ（０．９７５ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）の存在下でヘリカーゼＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号２８）は、蛍光基質の３’オーバーハングに結合し、上部鎖に沿ってＳｐ９基（複数可）まで移動する。ｓｐ９基（Ｂにおいて１およびＣにおいて４）は、それを通り過ぎて移動するヘリカーゼを停め、ヘリカーゼは、相補鎖（配列番号２６）を置換しない。したがってフルオレセインおよびブラックホールクエンチャーは、互いに近接近のままであり、蛍光は観察されない。
【図１０】Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ａと標識、配列番号２８）について４００ｍＭのＫＣｌでの、緩衝溶液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、０．９７５ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、４８．７５ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（Ａ＝配列番号２５および２６、Ｂ＝その３’末端で１個のＳｐ９スペーサーによって配列番号２９の５’末端に付着しており、配列番号２６にハイブリダイズされている配列番号２７、Ｃ＝その３’末端で４個のＳｐ９スペーサーによって配列番号２９の５’末端に付着しており、配列番号２６にハイブリダイズされている配列番号２７）、０．９７５μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号２７））中の相対ｄｓＤＮＡ代謝回転速度のグラフ（ｙ軸＝相対ｄｓＤＮＡ代謝回転、ｘ軸＝蛍光基質）である。
【図１１】Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ａと標識、配列番号２８）について４００ｍＭのＫＣｌでの、緩衝溶液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、０．９７５ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、４８．７５ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（Ｄ＝配列番号３２および２６、Ｅ＝その３’末端で１つのｉｄＳｐ基によって配列番号３０の５’末端に付着しており、配列番号２６にハイブリダイズされている配列番号２７、Ｆ＝その３’末端で４つのｉｄＳｐ基によって配列番号３１の５’末端に付着しており、配列番号２６にハイブリダイズされている配列番号２７ならびにＧ＝配列番号２６にハイブリダイズされている配列番号３３）、０．９７５μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号２７））中の相対ｄｓＤＮＡ代謝回転速度のグラフ（ｙ軸＝相対ｄｓＤＮＡ代謝回転、ｘ軸＝蛍光基質）である。
【図１２】ヘリカーゼ（１と標識される）を停止するｉＳｐＣ３またはｉＳｐ１８スペーサーを含有しない対照鎖についての実験ステップを示す図である。対照鎖（配列番号３４）は、スペーサーまたはブロッキング基を含有せず、ＤＮＡ（配列番号３５、その５’末端に付着しているカルボキシフルオレセインを有する、灰色丸として示される）の短い相補鎖にハイブリダイズされる。これは、５０ヌクレオチドオーバーハングを有する部分的に２本鎖の構築物を生成する。構築物（配列番号３５にハイブリダイズした配列番号３４）は、酵素をオーバーハングに結合させるためにＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃと予備インキュベートされる。示すとおり、オーバーハングの長さのために１つより多い酵素がそれに結合できる。次いで、酵素に、ヘリカーゼ移動を促進するために必要な構成成分（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２）を設ける。追加的捕捉鎖（配列番号３７）もＡＴＰおよびＭｇＣｌ２と共に加えられる。次いでヘリカーゼは、対照鎖に沿って移行し、短い相補鎖を置換し、対照鎖をヘリカーゼまたは相補鎖結合を含まないままにする（Ａと標識される）。次いで相補鎖はヘアピンを形成し、そのため対照鎖に再アニールできない（Ｂと標識される）。溶液中で遊離であるまたは対照ＤＮＡに沿って移動し、末端で離れたヘリカーゼは、次いで示されるとおり過剰量の捕捉鎖（配列番号３７、Ｃと標識される複合体）によって結合される。ヘリカーゼに結合していない任意のＤＮＡは、インタクトなままである（化学種Ｆのままである）。次いで試料混合物は、ゲルにかけられ、分離された化学種はゲル上にそれらが生成するバンドによって同定される。
【図１３】ヘリカーゼ（１と標識される）を停止するためにｉＳｐＣ３またはｉＳｐ１８スペーサー（図中でＸとして示される）を含有する鎖についての実験ステップを示す図である。図１２に示されたのと同じ手順が実行され、酵素は、ＤＮＡ構築物（短い相補鎖はその５’末端に付着しているカルボキシフルオレセインを有する）と予備インキュベートされた。スペーサー基は、２本鎖領域の前に位置付けられ、示されるとおりヘリカーゼはＤＮＡに結合できる。ＡＴＰ、ＭｇＣｌ２および捕捉ＤＮＡ（２と標識される）の添加により、次いで、ヘリカーゼに、ヘリカーゼ移動を促進するために必要な構成成分が設けられる。スペーサーがヘリカーゼを停止できる場合、それはＤＮＡ構築物に結合したままであり、短い相補鎖（Ｄと標識される）をまだ含有する。スペーサーがヘリカーゼを停止できない場合、それはスペーサーを過ぎて移動し、相補鎖（Ｂと標識される）を置換し、化学種Ａをヘリカーゼ結合を有さないようにする。次いで遊離酵素は、過剰量の捕捉鎖（Ｃと標識される）に結合し、置換された相補鎖はヘアピン（Ｂと標識される）を形成する。スペーサーが１つのヘリカーゼを停止できるが、２つのヘリカーゼは停止できない場合、それにより第１のヘリカーゼは、後ろのヘリカーゼによってスペーサーを過ぎて押され、相補鎖を置換する。しかし第２のヘリカーゼは、スペーサーを過ぎて移動することができず、Ｅと標識される複合体を生じる。ヘリカーゼに結合しない任意のＤＮＡは、ヘリカーゼと結合していないインタクトなままである（化学種Ｆ）。次いで試料混合物をゲルにかけ、分離された化学種はゲル上にそれらが生成したバンドによって同定される。
【図１４】対照鎖（表１１中１）について実行されたゲルアッセイを示す図である。Ｍと標識されるレーンは、参照のためのＤＮＡラダー（バンドは、最も低い質量（ゲルの最下部）から最も高い質量（ゲルの最上部）２００ｂｐ（塩基対）、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００／５１７ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１２００ｂｐおよび１５１７ｂｐに対応する）を示す。レーン１は、アニールされたＤＮＡ（配列番号３５にハイブリダイズした配列番号３４）だけを含有する。レーン２は、対照鎖（燃料を加えていない）に予め結合したヘリカーゼ（Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ）を含有する。レーン３は、燃料（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２）が緩衝液１に添加された後の対照鎖を示す。レーン４は、燃料（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２）が緩衝液２に添加された後の対照鎖を示す。バンドＸは、配列番号３４だけに対応し、バンドＹは、配列番号３５にハイブリダイズした配列番号３４に対応する。１Ｙと標識される領域は、配列番号３５にハイブリダイズした配列番号３４に結合した１つのヘリカーゼに対応する。２Ｙと標識される領域は、配列番号３５にハイブリダイズした配列番号３４に結合した２つのヘリカーゼに対応する。３Ｙと標識される領域は、配列番号３５にハイブリダイズした配列番号３４に結合した３つのヘリカーゼに対応する。４Ｙと標識される領域は、配列番号３５にハイブリダイズした配列番号３４に結合した４つのヘリカーゼに対応する。５Ｙと標識される領域は、配列番号３５にハイブリダイズした配列番号３４に結合した５つのヘリカーゼに対応する。
【図１５】ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡとの間の接合部に３つ（表１１における７、対応するレーン＝１〜４）、４個（表１１における８、対応するレーン＝５〜８）および５個のｉＳｐ１８スペーサー（表１１における９、対応するレーン＝９〜１２）を含有するＤＮＡ構築物について実行されたゲルアッセイを示す図である。Ｍと標識されるレーンは、参照のためのＤＮＡラダー（バンドは、最も低い質量（ゲルの最下部）から最も高い質量（ゲルの最上部）２００ｂｐ（塩基対）、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００／５１７ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１２００ｂｐおよび１５１７ｂｐに対応する）を示す。レーン１は、アニールされたＤＮＡ（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている３個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）だけを含有する。レーン２は、燃料を加えていないＤＮＡ構築物に予め結合したヘリカーゼ（Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ）を含有する（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている３個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）。レーン３は、燃料（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２）が緩衝液１に添加された後のＤＮＡ構築物（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている３個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）を示す。レーン４は、燃料（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２）が緩衝液２に添加された後のＤＮＡ構築物（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている３個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）を示す。レーン５は、アニールされたＤＮＡ（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている４個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）だけを含有する。レーン６は、燃料を加えていないＤＮＡ構築物に予め結合したヘリカーゼ（Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ）を含有する（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている４個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）。レーン７は、燃料（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２）が緩衝液１に添加された後のＤＮＡ構築物（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている４個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）を示す。レーン８は、燃料（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２）が緩衝液２に添加された後のＤＮＡ構築物（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている４個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）を示す。レーン９は、アニールされたＤＮＡ（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）だけを含有する。レーン１０は、燃料を加えていないＤＮＡ構築物に予め結合したヘリカーゼ（Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ）を含有する（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）。レーン１１は、燃料（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２）が緩衝液１に添加された後のＤＮＡ構築物（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）を示す。レーン１２は、燃料（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２）が緩衝液２に添加された後のＤＮＡ構築物（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）を示す。バンドＸはｓｓＤＮＡ構築物（例えば、配列番号３６の５’末端に付着されている３個、４個または５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）だけに対応し、バンドＹはｄｓＤＮＡ構築物（配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６の５’末端に付着されている３個、４個または５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９）だけに対応する。１Ｘと標識される領域は、配列番号３６に付着されている３個、４個または５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９に結合した１つのヘリカーゼに対応する。１Ｙと標識される領域は、配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６に付着されている３個、４個または５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９に結合した１つのヘリカーゼに対応する。２Ｙと標識される領域は、配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６に付着されている３個、４個または５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９に結合した２つのヘリカーゼに対応する。３Ｙと標識される領域は、配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６に付着されている３個、４個または５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９に結合した３つのヘリカーゼに対応する。４Ｙと標識される領域は、配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６に付着されている３個、４個または５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９に結合した４つのヘリカーゼに対応する。５Ｙと標識される領域は、配列番号３５にハイブリダイズする配列番号３６に付着されている３個、４個または５個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着している配列番号９に結合した５つのヘリカーゼに対応する。
【図１６】実施例９において使用される標準ＤＮＡ構築物を示す図である。ｘは、ヘリカーゼが結合できないスペーサー基を表す。１と標識される領域の長さは、その領域に結合できるヘリカーゼの数を制御するために変更できる。図は、領域１中の１つまたは２つのヘリカーゼの結合を例として示す。
【図１７】表１２において３と標識されるＤＮＡ構築物の例示的ゲルアッセイを示す図である（配列番号３５にハイブリダイズされる配列番号３６の５’末端に付着されている４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端で付着されている配列番号９の５’末端に付着している５個のｉＳｐＣ３スペーサー）。Ｍと標識されるレーンは、参照のためのＤＮＡラダー（バンドは、最も低い質量（ゲルの最下部）から最も高い質量（ゲルの最上部）２００ｂｐ（塩基対）、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００／５１７ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１２００ｂｐおよび１５１７ｂｐに対応する）を示す。レーン１〜６は、さまざまな濃度のＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ−１＝５０００ｎＭ、２＝２５００ｎＭ、３＝１２５０ｎＭ、４＝６２５ｎＭ、５＝３１２．５ｎＭおよび６＝０ｎＭ）に対応する。レベルＸで観察されたバンドは、未結合ｄｓＤＮＡ構築物に対応する。ゲルの左側の数は、ＤＮＡに結合した酵素の数に関する。このＤＮＡ構築物について添加した酵素の最高濃度で６つまでのヘリカーゼが結合できた。ゲルの上に示した数は、添加したＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃの濃度に対応する）。
【図１８】実施例９において使用されるＤＮＡ構築物を示す図である。ＡおよびＢと標識される領域は、１つのヘリカーゼが各領域（右側に示すとおり）に結合できるように設計されたＤＮＡの短い鎖（配列番号３７）である。領域１は２５個のＳｐＣ３スペーサーに対応し、領域２は２個のｉＳｐ１８スペーサーに対応し、領域３は２個のｉＳｐ１８スペーサーに対応し、領域４は、分岐（forked）ＤＮＡ（例えば配列番号４２＝非分岐（７と標識される断片を欠失している）および、６個のｉＳｐ１８スペーサーに付着している配列番号１２（７と標識される断片として示される）＝分岐）でできている場合とできていない場合とがあるＤＮＡの別の鎖にハイブリダイズするＤＮＡ（配列番号１０）のセクションであり、領域５は４つの５−ニトロインドールに対応し、領域６はその相補物にハイブリダイズされるＤＮＡ（配列番号４１）の別の領域に対応する（配列番号４３）。
【図１９】図１８に記載および示すＤＮＡ構築物のゲルアッセイを示す図である。レベルＸで観察されたバンドは、未結合ｄｓＤＮＡ構築物に対応する。Ｍと標識されるレーンは、参照のためのＤＮＡラダー（バンドは、最も低い質量（ゲルの最下部）から最も高い質量（ゲルの最上部）２００ｂｐ（塩基対）、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００／５１７ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１２００ｂｐおよび１５１７ｂｐに対応する）を示す。ゲルの左側の数は、ＤＮＡに結合した酵素の数に関する。このＤＮＡ構築物について、酵素４７５ｎＭ以上の濃度で２つのヘリカーゼの結合を観察できた（図１８に示すとおり１つは領域Ａ、２つ目は領域Ｂ）。ゲルの上に示す数は、加えたＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃの濃度に対応する）。
【図２０】実施例１０において使用されるＤＮＡ構築物（ＤＮＡ構築物Ｘ１と称される）を示す図である。その３’末端で４個のｉＳｐ１８スペーサー（黒四角として示される）に付着されている配列番号３８の５’末端に付着している２５個のＳｐＣ３スペーサー（ｘとして示される）がある。４個のｉＳｐ１８スペーサーは、その３’末端で４つの５−ニトロインドール（灰色三角として示される）に付着されている配列番号１０の５’末端に付着されている。４つのニトロインドールは、次いで配列番号４１の５’末端に付着されている。配列番号４１にハイブリダイズする相補的ＤＮＡ鎖は、配列番号４３である。配列番号１０にハイブリダイズする相補的ＤＮＡ鎖は、配列番号１２（配列番号１２の３’末端に付着しているのは、２つのチミン残基および３’コレステロールＴＥＧ（灰色丸として示される）に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーである）である。Ａと標識される領域は、Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃが結合できる構築物の領域に対応する。
【図２１】ヘリカーゼ（Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ）がナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）を通るＤＮＡ構築物（０．１ｎＭ、図２０の記載を参照されたい）の移行を制御する際の例示的電流トレース（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ、５０から２５０）、ｘ軸標識＝時間（秒、２３８から２５２））を示す図である。１と標識される領域は、ナノポアを通るポリＴ領域（配列番号３８、酵素が結合する）のヘリカーゼ制御移行を示す。２と標識される領域は、ナノポアを通るｉＳｐ１８スペーサーのヘリカーゼ制御移行に対応する。
【図２２】実施例４において使用されるＤＮＡ構築物を示す図表である。２つのチミンは３’末端で２８個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ａと標識される）に付着されている。２８個のｉＳｐＣ３スペーサーは、配列番号２３（領域Ｂに対応する配列＝ポリＴセクションおよび領域Ｃ＝テザー配列（配列番号１２）に相補的な配列）の５’末端に他方の末端で付着されている。配列番号２３の３’末端は、４個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ｄと標識される）に付着されている。４個のｉＳｐＣ３スペーサーの他方の末端は、配列番号２４の５’末端に付着されている。テザー配列（配列番号１２）は、２つのチミン残基および３’コレステロールＴＥＧに付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着されている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
配列表の記載
配列番号１は、ＭＳ−Ｂ１変異ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレチド配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
【００１０】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、以下の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
【００１１】
配列番号３は、α−ヘモリジン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddartら、PNAS、2009;106(19):7702-7707）の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１２】
配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００１３】
配列番号５から７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。
【００１４】
配列番号８は、腸内細菌（Enterobacteria）ファージＴ４由来ヘリカーゼＤｄａ１９９３のアミノ酸配列を示す。
【００１５】
配列番号９は、実施例１、２、３、７および８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００１６】
配列番号１０は、実施例１および９において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００１７】
配列番号１１は、実施例１において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。配列番号１１は、配列番号１０の３’末端に付着されている３個のｉＳｐＣ３スペーサーにその５’末端で付着されている。
【００１８】
配列番号１２は、実施例１および９において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。実施例１では配列番号１２は、２つのチミン残基および３’コレステロールＴＥＧに付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーにその３’末端で付着されている。実施例９では配列番号１２はその３’末端で６個のｉＳｐ１８スペーサーだけに付着されている。
【００１９】
配列番号１３は、腸内細菌（Enterobacteria）ファージλのポリヌクレオチド配列を示す。配列は、センス鎖の５’末端に付着している追加的な１２塩基オーバーハングを含有する。本明細書に示す配列は、センス鎖のものだけである。
【００２０】
配列番号１４は、実施例２および３において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。配列番号１４は、４個のｉＳｐＣ３スペーサー単位によって配列番号１５の５’末端にその３’末端で付着されている。
【００２１】
配列番号１５は、実施例２および３において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。配列番号１５は、４個のｉＳｐＣ３スペーサー単位によって配列番号１４の３’末端にその５’末端で付着されている。
【００２２】
配列番号１６は、実施例２および３において使用される、２つのチミン残基および３’コレステロールＴＥＧに付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーを配列の３’末端に有するポリヌクレオチド配列を示す。
【００２３】
配列番号１７は、Ｔｒｗｃ  Ｃｂａヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
【００２４】
配列番号１８は、実施例３において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。配列番号１８は、４個のｉＳｐＣ３スペーサー単位によって配列番号９の５’末端にその３’末端で付着されている。この配列は、その５’末端に付着しているリン酸および位置１から５に５つのデオキシイノシンを有する。
【００２５】
配列番号１９は、実施例２において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００２６】
配列番号２０は、実施例２において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００２７】
配列番号２１および２２は、続く配列の番号付けを維持するためのプレースホルダーである。
【００２８】
配列番号２３は、実施例４において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。この配列の５’末端に付着しているのは、２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー基の５’末端に付着している追加的な２つのＴを有する。この配列の３’末端に付着しているのは、配列番号２４の５’末端に付着されている４個のｉＳｐＣ３スペーサー単位である。
【００２９】
配列番号２４は、実施例９において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。この配列の５’末端に付着しているのは、４個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後は配列番号２３に付着されている。配列番号２３の５’末端に付着しているのは、２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー基の５’末端に付着している追加的な２つのＴを有する。
【００３０】
配列番号２５は、実施例５において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。それは、その５’末端にカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）塩基を有する。
【００３１】
配列番号２６は、実施例５および６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。それは、その３’末端にブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基を有する。
【００３２】
配列番号２７は、実施例５および６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００３３】
配列番号２８は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００３４】
配列番号２９は、実施例５において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、１個または４個のいずれかのｉＳｐ９スペーサー基によってその５’末端で配列番号２７に繋がれている。
【００３５】
配列番号３０は、実施例６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、その５’末端で１つのｉｄＳｐ基によって配列番号２７に繋がれている。
【００３６】
配列番号３１は、実施例６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、４つのｉｄＳｐ基によってその５’末端で配列番号２７に繋がれている。
【００３７】
配列番号３２は、実施例６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。それは、その５’末端にカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）塩基を有する。
【００３８】
配列番号３３は、実施例６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。それは、その５’末端にカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）塩基を有する。
【００３９】
配列番号３４は、実施例７において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４０】
配列番号３５は、実施例７および８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。それは、その５’末端にカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）塩基を有する。
【００４１】
配列番号３６は、実施例７および８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４２】
配列番号３７は、実施例７、８および９において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４３】
配列番号３８は、実施例８および１０において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４４】
配列番号３９は、実施例８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４５】
配列番号４０は、実施例８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４６】
配列番号４１は、実施例９において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４７】
配列番号４２は、実施例９において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４８】
配列番号４３は、実施例９において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４９】
発明の詳細な記載
本開示の生成物および方法のさまざまな応用が当技術分野における具体的な必要性に適合され得ることは理解される。本明細書で用いられる用語は本発明の詳細な実施形態を記載する目的のためのみであり、限定されることを意図しないことも理解される。
【００５０】
付加的に、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他を明確に記す場合を除いて複数の参照物を含む。したがって、例えば「１つのポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は２つ以上のポリヌクレオチドを含み、「１つのスペーサー（ａ  ｓｐａｃｅｒ）」を参照することは２つ以上のスペーサーを含み、「１つのヘリカーゼ（ａ  ｈｅｌｉｃａｓｅ）」を参照することは２つ以上のヘリカーゼを含み、「１つの膜貫通ポア（ａ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｒｅ）」を参照することは２つ以上のポアを含むなど。
【００５１】
本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は、上記または下記に関わらず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５２】
スペーサーを過ぎてヘリカーゼを移動する方法
本発明は、標的ポリヌクレオチド中の１個または複数のスペーサーを過ぎて１つまたは複数の停止されたヘリカーゼを移動させる方法を提供する。ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドに沿った移動が止められた場合に停止される。各スペーサーは、典型的には１つまたは複数のヘリカーゼを停止する。１つまたは複数のヘリカーゼが停止されるかどうかを決定するための方法は下に考察される。１つまたは複数のヘリカーゼは、スペーサーの前で停止されてよい。１つまたは複数のヘリカーゼは、スペーサーによって停止されてよい。１つまたは複数のヘリカーゼは、スペーサー上で停止されてよい。本発明は、１個または複数のスペーサーを過ぎて、すなわち越えて１つまたは複数の停止されたヘリカーゼを移動させることに関する。
【００５３】
１つまたは複数の停止されたヘリカーゼおよび標的ポリヌクレオチドは、膜貫通ポアと接触され、電位が印加される。下により詳細に記載するとおり、標的ポリヌクレオチドは、印加された電位から生じる場に沿ってポアを通って移動する。１つまたは複数のヘリカーゼは、典型的にはポアを通って移動するには大きすぎる。標的ポリヌクレオチドの一部がポアに入り、印加された電位から生じる場に沿ってポアを通って移動する際に、標的ポリヌクレオチドがポアを通って移動することから、１つまたは複数のヘリカーゼはポアによってスペーサーを過ぎて移動される。これは、標的ポリヌクレオチド（１個または複数のスペーサーを含む）がポアを通って移動し、１つまたは複数のヘリカーゼがポアの最上部に残るためである。
【００５４】
これは、標的ポリヌクレオチド上の１つまたは複数のヘリカーゼの位置を制御できるようにする。１つまたは複数の停止されたヘリカーゼおよび標的ポリヌクレオチドが膜貫通ポアと接触し、電位が印加される前は、１つまたは複数のヘリカーゼはそれらが停止された位置のままである。ヘリカーゼ移動を促進するために必要な構成成分（例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋）の存在下でさえ、１つまたは複数のヘリカーゼは標的ポリヌクレオチド上のスペーサーを過ぎて移動せず、それらが膜貫通ポアの存在下になり、電位が印加されるまで、スペーサーの他の側の標的ポリヌクレオチドの部分に沿って移動しない。
【００５５】
１つまたは複数のヘリカーゼは、膜貫通ポアの存在下だが印加された電位の非存在下ではそれらが停止された位置のままでもある。この場合電位の印加は、スペーサーを過ぎて１つまたは複数のヘリカーゼを移動させる。電位の印加は、したがって１つまたは複数のヘリカーゼのスペーサーを過ぎて、スペーサーの他の側の標的ポリヌクレオチドの部分に沿った移動を引き起こすために使用され得る。例えば電圧の増大は、１つまたは複数のヘリカーゼをスペーサーを過ぎて移動するために使用され得る。
【００５６】
本発明は、膜貫通ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法も提供する。標的ポリヌクレオチドに、１個または複数のスペーサーを設ける。標的ポリヌクレオチドは１つまたは複数のヘリカーゼと接触され、１つまたは複数のヘリカーゼは１個または複数のスペーサーで停止する。これは、１つまたは複数のヘリカーゼがポリヌクレオチド上の１つまたは複数の特定の位置に残ることを確実にする。これは下でより詳細に考察される。標的ポリヌクレオチドおよび１つまたは複数の停止されたヘリカーゼは、膜貫通ポアと接触される。電位が印加されると、１つまたは複数のヘリカーゼは１個または複数のスペーサーを過ぎて、スペーサー（複数可）の他の側のポリヌクレオチドの部分に沿って移動する。これは、１つまたは複数のヘリカーゼがポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御できるようにする。電位は、ポア中にポリヌクレオチドを挿入するためにも典型的には使用される。
【００５７】
ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を少なくとも２つの活性モードの操作（ヘリカーゼに、移動を促進するために必要な全ての構成成分、例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋が提供される場合）および１つの不活性モードの操作（ヘリカーゼに、移動を促進するために必要な構成成分が提供されない場合）で制御できる。移動を促進するために必要な全ての構成成分が提供される場合、ヘリカーゼはポリヌクレオチドに沿って５’から３’または３’から５’方向（ヘリカーゼに依存する）で移動するが、ポア中のポリヌクレオチドの方向（ポリヌクレオチドのどちらの末端がポアによって捕捉されたかに依存する）は、ヘリカーゼが印加された場とは反対にポアの外にポリヌクレオチドを移動させる、または印加された場に沿ってポアの中にポリヌクレオチドを移動させる、のいずれかのために使用され得ることを意味する。ヘリカーゼが向かって移動するポリヌクレオチドの末端がポアによって捕捉される場合、ヘリカーゼは印加された電位から生じる場の方向とは反対に作動し、挿入されたポリヌクレオチドをポアの外にｃｉｓチャンバーへ引く。しかし、ヘリカーゼが移動するところから離れた末端がポア中に捕捉される場合、ヘリカーゼは印加された電位から生じる場の方向に沿って作動し、挿入されたポリヌクレオチドをポアの中にｔｒａｎｓチャンバーへ押す。
【００５８】
ヘリカーゼに、移動を促進するために必要な構成成分が提供されない場合、ヘリカーゼはポリヌクレオチドに結合でき、印加された電位から生じる場によってポア中に引かれる場合に、ポリヌクレオチドの移動を遅くするブレーキとして作用する。不活性モードでは、ポリヌクレオチドのどちらの末端が捕捉されるかは問題とならず、それはヘリカーゼがブレーキとして作用してポリヌクレオチドをポア中にｔｒａｎｓ側に向けて引く印加された場である。不活性モードでは、ヘリカーゼによるポリヌクレオチドの移動制御は、ラチェッティング（ratcheting）、スライディングおよびブレーキングを含む多数の方法で記載され得る。
【００５９】
本発明の方法では、１つまたは複数のヘリカーゼは、印加された電位から生じる場に沿ってポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を好ましくは制御する。好ましい一実施形態では、１つまたは複数のヘリカーゼは、活性モードで使用され、１つまたは複数のヘリカーゼが移動するところから離れた末端は、１つまたは複数のヘリカーゼが印加された電位から生じる場に沿って作動し、ポリヌクレオチドをポアを通して押すようにポアによって捕捉される。１つまたは複数のヘリカーゼが５’から３’方向で移動する場合、標的ポリヌクレオチドの５’末端は、ポアによって好ましくは捕捉される。そのような実施形態では、１つまたは複数のヘリカーゼは、１個または複数のスペーサーを過ぎて５’から３’方向に移動される。１つまたは複数のヘリカーゼが３’から５’方向に移動する場合、標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ポアによって好ましくは捕捉される。そのような実施形態では、１つまたは複数のヘリカーゼは、３’から５’方向で１個または複数のスペーサーを過ぎて移動される。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、１つまたは複数のヘリカーゼは、印加された場が標的ポリヌクレオチドをポアを通して引き、１つまたは複数のヘリカーゼがブレーキとして作用するように不活性モードにおいて使用される。本発明の方法では、１つまたは複数のヘリカーゼは、印加された電位から生じる場に沿ってポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を好ましくは遅くするまたはブレーキをかける。いずれの場合でも１つまたは複数のヘリカーゼは、ポアを通って移動するためには典型的には大きすぎ、ポアは、ポリヌクレオチドが印加された電位から生じる場に沿ってポアを通って移動する際に、ポリヌクレオチド上の１個または複数のスペーサーを過ぎて１つまたは複数のヘリカーゼを押す。
【００６１】
膜貫通ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法は、ポアを使用するポリヌクレオチドの特性決定の際、例えば鎖配列決定の際に有用であり得る。本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法も提供する。標的ポリヌクレオチドに、１個または複数のスペーサーを設ける。標的ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のヘリカーゼと接触され、１つまたは複数のヘリカーゼは１個または複数のスペーサーで停止する。これは、１つまたは複数のヘリカーゼがポリヌクレオチド上の１つまたは複数の特定の位置に残ることを確実にする。これは下でより詳細に考察される。標的ポリヌクレオチドおよび１つまたは複数の停止されたヘリカーゼは、膜貫通ポアと接触される。電位が印加されると、１つまたは複数のヘリカーゼは１個または複数のスペーサーを過ぎて、スペーサー（複数可）の反対側のポリヌクレオチドの部分に沿って移動する。これは、１つまたは複数のヘリカーゼがポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御できるようにする。方法は、ポアに関してポリヌクレオチドが移動する際に１つまたは複数の測定値を取ることも含む。測定値はポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性の指標である。
【００６２】
標的ポリヌクレオチド上に１つまたは複数のヘリカーゼを停止し、膜貫通ポアおよび印加された電位を使用して１個または複数のスペーサーを過ぎて１つまたは複数のヘリカーゼを移動する能力は、それが標的ポリヌクレオチドの配列決定などの効果的な特性決定を可能にすることから有利である。例えば、１つまたは複数のヘリカーゼは、ポアによって捕捉されるように設計されており、特性決定される必要がないリーダー配列中の標的ポリヌクレオチドの一方の末端に向けて停止され得る（下に記載のとおり）。リーダー配列中の１つまたは複数のヘリカーゼの停止は、１つまたは複数のヘリカーゼが、それが／それらがポアと接触し、電位が印加されるまで特性決定されるポリヌクレオチドの部分に沿ってリーダー配列から離れて移動しないことを意味する。１つまたは複数のヘリカーゼおよびポリヌクレオチドがポアと接触し、電位が印加されると、リーダー配列は典型的にはポアによって捕捉され、ポアを通って移動する。この移動は、１つまたは複数のヘリカーゼをスペーサー（複数可）を過ぎて、特性決定されるポリヌクレオチドの部分に沿って移動させる（上に記載のとおり）。これにより１つまたは複数のヘリカーゼは、特性決定されるポリヌクレオチドの部分の移動を制御できる。
【００６３】
１つまたは複数のヘリカーゼがリーダー配列中で停止されない場合、それ／それらはリーダー配列から離れてポリヌクレオチドに沿っておよび特性決定されるポリヌクレオチドの部分に沿って移動するであろう。１つまたは複数のヘリカーゼおよびポリヌクレオチドがこれらの環境下でポアに接触し、電位が印加される場合、リーダー配列および、全てではないがいくつかの特性決定されるポリヌクレオチドは、印加された電位から生じる場に沿ってポアを通って未制御な様式で移動する。１つまたは複数のヘリカーゼがポアに一度接触しただけで、それ／それらは、上に考察したとおり、特性決定されるポリヌクレオチドの部分の移動を制御し始める。未制御な様式でポアを通って移動するポリヌクレオチドのいかなる部分も、下に記載したとおり、特性決定できない。１つまたは複数のヘリカーゼがリーダー配列から離れて、標的ポリヌクレオチドの残りの大部分に沿って移動する場合、もしあれば、わずかなポリヌクレオチドは特性決定される。
【００６４】
本発明による１個または複数のスペーサーの使用は、下により詳細に考察されるとおり、標的ポリヌクレオチド上の１つまたは複数のヘリカーゼの数および位置も制御できるようにする。例えば、特性決定の前に標的ポリヌクレオチドにライゲーションされていてよいアダプター上の特定の位置で特定の数のヘリカーゼが停止され得る。そのようなアダプターは、本発明によって提供され、特性決定のためのキットにおいて提供され得る。１個または複数のスペーサーの使用は、アダプターおよび／または特性決定前の標的ポリヌクレオチドがヘリカーゼ移動を促進するために必要な構成成分（例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋）の存在下にあっても、特性決定が始まるまでヘリカーゼがあると考えられる所にそれらが残ることを確実にする。
【００６５】
ポリヌクレオチド
核酸などのポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含み得る。ヌクレオチドは、天然に存在するものまたは人工的であってよい。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷をうけ得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジン二量体を含む場合がある。そのような二量体は、典型的には紫外線による損傷に関連し、皮膚メラノーマの主原因である。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば標識またはタグで修飾される場合がある。好適な標識は、下に記載されている。
【００６６】
ヌクレオチドは、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を典型的には含有する。核酸塩基および糖は、ヌクレオシドを形成する。
【００６７】
核酸塩基は、典型的には複素環である。核酸塩基は、これだけに限らないがプリンおよびピリミジンならびにより具体的にはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）およびシトシン（Ｃ）を含む。
【００６８】
糖は、典型的には五炭糖である。ヌクレオチド糖は、これだけに限らないがリボースおよびデオキシリボースを含む。糖は、好ましくはデオキシリボースである。
【００６９】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、次のヌクレオシド：アデノシン、ウリジン、グアノシンおよびシチジンを含む場合がある。ヌクレオチドは、好ましくはデオキシリボヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、次のヌクレオシド：デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシウリジン（ｄＵ）および／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）ならびにデオキシシチジン（ｄＣ）を好ましくは含む。
【００７０】
ヌクレオチドは典型的には一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着できる。
【００７１】
好適なヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）およびデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を含む。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。ヌクレオチドは、最も好ましくはｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。ポリヌクレオチドは、次のヌクレオチド：ｄＡＭＰ、ｄＵＭＰおよび／またはｄＴＭＰ、ｄＧＭＰならびにｄＣＭＰを好ましくは含む。
【００７２】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で互いに付着されていてよい。ヌクレオチドは、核酸中でのようにそれらの糖およびリン酸基によって典型的には付着されている。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体中と同様にそれらの核酸塩基を介して繋がれてよい。
【００７３】
ポリヌクレオチドは、核酸であってよい。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当技術分野において公知の任意の合成核酸であってよい。ＰＮＡ骨格は、ペプチド結合によって連結された反復するＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からなる。ＧＮＡ骨格は、リン酸ジエステル結合によって連結された反復するグリコール単位からなる。ＴＮＡ骨格は、リン酸ジエステル結合によって互いに連結された反復するトレオース糖からなる。ＬＮＡは、上に考察したとおりリボヌクレオチドから形成され、リボース成分中の２’酸素と４’炭素とを繋ぐ追加の架橋を有する。
【００７４】
ポリヌクレオチドは、最も好ましくはリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【００７５】
ポリヌクレオチドは、好ましくは、１個または複数のスペーサー中を除いていかなる、塩基を持たないヌクレオチド（すなわち核酸塩基を欠失しているヌクレオチド）も含まない。ポリヌクレオチドは、好ましくは、１個または複数のスペーサー中を除いていかなるＣ３スペーサー（すなわち核酸塩基および糖を欠失しているヌクレオチド）も含まない。
【００７６】
ポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。例えばポリヌクレオチドは、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド以上、長さ５０００ヌクレオチド以上または長さ１０００００ヌクレオチド以上であってよい。
【００７７】
ヘリカーゼは、本発明の方法において標的ポリヌクレオチドの全体または一部のみに沿って移動してよい。標的ポリヌクレオチドの全体または一部のみは、本発明の方法を使用して特性決定され得る。
【００７８】
標的ポリヌクレオチドは、１本鎖であってよい。標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部は好ましくは２本鎖である。ヘリカーゼは、典型的には１本鎖ポリヌクレオチドに結合する。標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖である場合、標的ポリヌクレオチドは、１本鎖領域または非ハイブリダイズ領域を好ましくは含む。１つまたは複数のヘリカーゼは、１本鎖領域または非ハイブリダイズ領域の１つの鎖に結合できる。標的ポリヌクレオチドは、１つもしくは複数の１本鎖領域または１つもしくは複数の非ハイブリダイズ領域を好ましくは含む。
【００７９】
１個または複数のスペーサーは、標的ポリヌクレオチドの１本鎖領域または非ハイブリダイズ領域に好ましくは含まれる。標的ポリヌクレオチドは、１つより多い１本鎖領域または１つより多い非ハイブリダイズ領域を含み得る。標的ポリヌクレオチドは、１本鎖領域または非ハイブリダイズ領域をその配列および／または一方もしくは両方の末端に含み得る。１個または複数のスペーサーは、標的ポリヌクレオチドの２本鎖領域中に含まれ得る。
【００８０】
方法において使用される１つまたは複数のヘリカーゼが、５’から３’方向で移動する場合、標的ポリヌクレオチドは、１本鎖領域または非ハイブリダイズ領域をその５’末端に好ましくは含む。方法において使用される１つまたは複数のヘリカーゼが、３’から５’方向で移動する場合、標的ポリヌクレオチドは、１本鎖領域または非ハイブリダイズ領域をその３’末端に好ましくは含む。１つまたは複数のヘリカーゼが不活性モードで（すなわちブレーキとして）使用される場合、１本鎖領域または非ハイブリダイズ領域がどこに位置付けられるかは問題にならない。
【００８１】
１本鎖領域は、ポアに優先的に挿入されるリーダー配列を好ましくは含む。リーダー配列は、本発明の方法を促進する。リーダー配列は、膜貫通ポアを優先的に通るように設計され、それによりポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を促進する。リーダー配列は、ポリマーを典型的には含む。ポリマーは、好ましくは負に荷電している。ポリマーは、好ましくはＤＮＡもしくはＲＮＡなどのポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド（塩基を持たないＤＮＡなど）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリペプチドである。リーダーは、ポリヌクレオチドを好ましくは含み、１本鎖ポリヌクレオチドをより好ましくは含む。リーダー配列は、上に考察の任意のポリヌクレオチドを含み得る。１本鎖リーダー配列は、ポリｄＴセクションなどのＤＮＡの１本鎖を最も好ましくは含む。リーダー配列は、１個または複数のスペーサーを好ましくは含む。
【００８２】
リーダー配列は、任意の長さであってよいが、典型的には長さ２０から１５０ヌクレオチドなどの長さ１０から１５０ヌクレオチドである。リーダーの長さは、方法において使用される膜貫通ポアに典型的には依存する。
【００８３】
標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖である場合、２本鎖部分の２本の鎖は、ヘアピンなどの架橋成分を使用して好ましくは連結されている。これは、本発明の特性決定法を促進する。標的ポリヌクレオチドの２本の鎖を架橋成分によって連結することは、ポリヌクレオチドの両方の鎖が膜貫通ポアによって、配列決定されるなど特性決定されるようにする。２本の鎖は、ポリヌクレオチドが１本鎖ポリヌクレオチドとしてポアを通って移動する際に脱ハイブリダイズする。この方法は、単一の２本鎖標的ポリヌクレオチドから得られる情報の量を二倍にすることから有利である。さらに相補性「アンチセンス」鎖中の配列が、「センス」鎖の配列に必然的に直交性であることから、２本の鎖からの情報は、情報として（informatically）組み合わされ得る。したがって、この機構は、さらに確実な観察を提供する直交較正能力（orthogonal proof-reading capability）を提供する。
【００８４】
国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１７８６号（ＷＯ２０１３／０１４４５１として公開）に開示の任意の実施形態は、使用できる。架橋成分は、ポリヌクレオチドの２本の鎖を典型的には共有結合で連結する。架橋成分は、架橋成分が膜貫通ポアを通るポリヌクレオチドの移動を干渉しない限り、標的ポリヌクレオチドの２本の鎖を連結できる任意のものであってもよい。好適な架橋成分は、これだけに限らないがポリマー性リンカー、化学的リンカー、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。好ましくは架橋成分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（塩基を持たないＤＮＡなど）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。架橋成分は、より好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである。架橋成分は、１個または複数のスペーサーを含み得る。
【００８５】
架橋成分は、最も好ましくはヘアピンループである。ヘアピンループは、上に開示の任意のポリヌクレオチドから形成され得る。ヘアピンループまたはヘアピンループのループは、典型的には長さ約４から約１００ヌクレオチド、好ましくは長さ約４から約８ヌクレオチドである。
【００８６】
架橋成分は、当技術分野において公知の任意の好適な手段によって標的ポリヌクレオチドの２本の鎖に連結されている。架橋成分は、別々に合成され、標的ポリヌクレオチドに化学的に付着または酵素的にライゲーションされ得る。代替的に架橋成分は、標的ポリヌクレオチドのプロセシングにおいて生成され得る。
【００８７】
架橋成分は、標的ポリヌクレオチドの一方の末端またはその近くで標的ポリヌクレオチドに連結される。架橋成分は、ポリヌクレオチドの末端の１０ヌクレオチド以内で好ましくは標的ポリヌクレオチドに連結される。
【００８８】
１個または複数のスペーサーは、それ／それらが１つまたは複数のヘリカーゼを停止し、制御されるまたは特性決定される標的ポリヌクレオチドに沿った移動を防ぐように好ましくは位置付けられる。例えば１個または複数のスペーサーは、好ましくはリーダー配列と制御されるまたは特性決定される標的ポリヌクレオチドとの間、例えばポリヌクレオチドの一方の末端のリーダー配列中に位置付けられる。リーダー配列は、典型的には印加された電位から生じる場に沿ってポアに進入し、ポリヌクレオチドがポアを通って移動する際に１つまたは複数のヘリカーゼは１個または複数のスペーサーを過ぎて移動する。次いで１つまたは複数のヘリカーゼは、ポアを通して標的ポリヌクレオチドの残り部分の移動を制御でき、その特性決定を促進できる。
【００８９】
最も好ましい実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ヘアピンループなどの架橋成分によって一方の末端で連結された２本鎖部分、および架橋成分とは反対の末端にリーダー配列を含む１本鎖部分を含む。１個または複数のスペーサーは、リーダー配列および／または架橋成分に存在してよい。
【００９０】
標的ポリヌクレオチドは、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、標的ポリヌクレオチドを含有することが公知であるまたは含有すると考えられる試料について典型的には実行される。本発明は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの同一性を確認するために試料中でのその存在が公知であるまたは期待される試料について実行され得る。
【００９１】
試料は生物学的試料であってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたまたは抽出された試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。生物または微生物は典型的には古細菌のもの、原核性または真核性であり、典型的には五界：植物界、動物界、菌界、モネラ界および原生生物界の１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られたまたは抽出された試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。試料は、好ましくは液体試料である。試料は典型的には、患者の体液を含む。試料は尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。典型的には試料は、ヒト由来であるが、代替的に、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育される動物由来などの別の哺乳動物由来であってもよく、代替的にネコまたはイヌなどの愛玩動物であってもよい。代替的に植物由来の試料は、穀類、マメ、果実または野菜などの商品作物（例えばコムギ、キノア、オオムギ、カラスムギ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマメ、サトウキビ、ココア、ワタ）から典型的には得られる。
【００９２】
試料は、非生物学的試料であってよい。非生物学的試料は、好ましくは液体試料である。非生物学的試料の例は、手術用液（surgical fluids）、水（飲料水、海水または河川水など）および検査室検査のための試薬を含む。
【００９３】
試料は、典型的にはアッセイされる前に例えば遠心分離によってまたは、不要の分子または細胞（赤血球細胞など）をろ過して除く膜を通すことによって処理される。試料は採取されてから直ちに測定されてよい。試料は、典型的にはアッセイの前に好ましくは−７０℃より低くで、保存されてもよい。
【００９４】
スペーサー（複数可）
１個または複数のスペーサーは、標的ポリヌクレオチドに含まれる。１個または複数のスペーサーは、標的ポリヌクレオチドの好ましくは一部であり、例えばそれ／それらはポリヌクレオチド配列を中断する。１個または複数のスペーサーは、好ましくは、スピードバンプなど標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１つまたは複数のブロッキング分子の一部ではない。
【００９５】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のスペーサーなどの任意の数のスペーサーが標的ポリヌクレオチド中にあってよい。好ましくは２個、４個または６個のスペーサーが標的ポリヌクレオチド中にある。リーダー配列中のスペーサーおよびヘアピンループ中のスペーサーなどの標的ポリヌクレオチドの異なる領域中にスペーサーがあってよい。
【００９６】
１個または複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼが活性モードにおいてでさえ克服できないエネルギー障壁をそれぞれ提供する。１個または複数のスペーサーは、ヘリカーゼの牽引を低減すること（例えば、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドから塩基を除去すること）または１つもしく複数のヘリカーゼの移動を物理的にブロッキングすること（例えばかさ高い化学基を使用すること）によって１つまたは複数のヘリカーゼを停止できる。
【００９７】
１個または複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼを停止する任意の分子または分子の組合せを含み得る。１個または複数のスペーサーは、標的ポリヌクレオチドに沿って１つまたは複数のヘリカーゼが移動することを防ぐ任意の分子または分子の組合せを含み得る。１つまたは複数のヘリカーゼが膜貫通ポアおよび印加された電位の非存在下で１個または複数のスペーサーで停止されるかどうかを決定することは容易である。例えばこれは、実施例において示されるとおりアッセイでき、例えばスペーサーを過ぎて移動し、ＤＮＡの相補鎖を置換するヘリカーゼの能力は、ＰＡＧＥによって測定され得る。
【００９８】
１個または複数のスペーサーは、ポリマーなどの直鎖状分子典型的には含む。１個または複数のスペーサーは、標的ポリヌクレオチドとは異なる構造を典型的には有する。例えば、標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、１個または複数のスペーサーは典型的にはＤＮＡではない。特に、標的ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、１個または複数のスペーサーは好ましくはペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する合成ポリマーを含む。
【００９９】
１個または複数のスペーサーは、好ましくは１つもしくは複数の５−ニトロインドールなどの１つもしくは複数のニトロインドール、１つもしくは複数のイノシン、１つもしくは複数のアクリジン、１つもしくは複数の２−アミノプリン、１つもしくは複数の２−６−ジアミノプリン、１つもしくは複数の５−ブロモ−デオキシウリジン、１つもしくは複数の逆位（inverted）チミジン（逆位ｄＴ）、１つもしくは複数の逆位ジデオキシ−チミジン（ｄｄＴ）、１つもしくは複数のジデオキシ−シチジン（ｄｄｃ）、１つもしくは複数の５−メチルシチジン、１つもしくは複数の５−ヒドロキシメチルシチジン、１つもしくは複数の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、１つもしくは複数のイソ−デオキシシチジン（イソ−ｄＣ）、１つもしくは複数のイソ−デオキシグアノシン（イソ−ｄＧ）、１つもしくは複数のｉＳｐＣ３基（すなわち糖および塩基を欠失しているヌクレオチド）、１つもしくは複数の光開裂（photo-cleavable）（ＰＣ）基、１つもしくは複数のヘキサンジオール基、１つもしくは複数のスペーサー９（ｉＳｐ９）基、１つもしくは複数のスペーサー１８（ｉＳｐ１８）基、ポリマーまたは１つもしくは複数のチオール連結（thiol connection）を含む。１個または複数のスペーサーは、これらの基の任意の組合せを含み得る。これらの基の多くは、ＩＤＴ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））から商業的に入手できる。
【０１００】
１個または複数のスペーサーは、任意の数のこれらの基を含有できる。例えば、２−アミノプリン、２−６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、逆位ｄＴ、ｄｄＴ、ｄｄＣ、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ−ｄＣ、イソ−ｄＧ、ｉＳｐＣ３基、ＰＣ基、ヘキサンジオール基およびチオール連結について、１個または複数のスペーサーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上を好ましくは含む。１個または複数のスペーサーは、２、３、４、５、６、７、８個以上のｉＳｐ９基を好ましくは含む。１個または複数のスペーサーは、２、３、４、５または６個以上のｉＳｐ１８基を好ましくは含む。最も好ましいスペーサーは、４つのｉＳｐ１８基である。
【０１０１】
ポリマーは、好ましくはポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上のアミノ酸を好ましくは含む。ＰＥＧは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上のモノマー単位を好ましくは含む。
【０１０２】
１個または複数のスペーサーは、塩基を持たない１つまたは複数のヌクレオチド（すなわち核酸塩基を欠失しているヌクレオチド）、塩基を持たない２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上などのヌクレオチドを好ましくは含む。核酸塩基は、塩基を持たないヌクレオチドにおいて−Ｈ（ｉｄＳｐ）または−ＯＨによって置き換えられ得る。塩基を持たないスペーサーは、１つまたは複数の隣接するヌクレオチドから核酸塩基を除去することによって標的ポリヌクレオチドに挿入され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、３−メチルアデニン、７−メチルグアニン、１，Ｎ６−エテノアデニンイノシンまたはヒポキサンチンを含むように修飾でき、核酸塩基は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）を使用してこれらのヌクレオチドから除去され得る。代替的に、ポリヌクレオチドは、ウラシルおよびウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で除去された核酸塩基を含むように修飾され得る。一実施形態では、１個または複数のスペーサーは、いかなる塩基を持たないヌクレオチドも含まない。
【０１０３】
１つまたは複数のヘリカーゼは、各直鎖状分子スペーサーまで（すなわち前）または上で停止され得る。直鎖状分子スペーサーが使用される場合、標的ポリヌクレオチドに、好ましくは、それを過ぎて１つまたは複数のヘリカーゼが移動される各スペーサーの末端に隣接するポリヌクレオチドの２本鎖領域を設ける。２本鎖領域は、隣接するスペーサー上で１つまたは複数のヘリカーゼを停止することを典型的には補助する。二本鎖領域（複数可）の存在は、方法が約１００ｍＭ以下の塩濃度で実行される場合は、特に好ましい。各２本鎖領域は、典型的には、少なくとも１２などの、長さ少なくとも１０ヌクレオチドである。本発明において使用される標的ポリヌクレオチドが１本鎖である場合、２本鎖領域は、スペーサーに隣接する領域への短いポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって形成され得る。短いポリヌクレオチドは、典型的には標的ポリヌクレオチドと同じヌクレオチドから形成されるが、異なるヌクレオチドから形成されてもよい。例えば短いポリヌクレオチドはＬＮＡから形成されてよい。
【０１０４】
直鎖状分子スペーサーが使用される場合、標的ポリヌクレオチドは、それを過ぎて１つまたは複数のヘリカーゼが移動される末端とは反対の各スペーサーの末端にブロッキング分子を有して好ましくは提供される。これは、１つまたは複数のヘリカーゼが各スペーサー上で停止されたままであることを確実にすることを補助できる。それは、それ／それらが溶液中に拡散する場合に、標的ポリヌクレオチド上の１つまたは複数のヘリカーゼを保持することも補助できる。ブロッキング分子は、物理的に１つまたは複数のヘリカーゼを停止させる、下に考察の任意の化学基であってよい。ブロッキング分子は、ポリヌクレオチドの２本鎖領域であってよい。
【０１０５】
１個または複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼを物理的に停止させる１つまたは複数の化学基を好ましくは含む。１つまたは複数の化学基は、好ましくは１つまたは複数のペンダント化学基である。１つまたは複数の化学基は、標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数の核酸塩基に付着され得る。１つまたは複数の化学基は、標的ポリヌクレオチド骨格に付着され得る。任意の数のこれらの化学基は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上などで存在し得る。好適な基は、これだけに限らないがフルオロフォア、ストレプトアビジンおよび／もしくはビオチン、コレステロール、メチレンブルー、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニンならびに／または抗ジゴキシゲニンおよびジベンジルシクロオクチン（dibenzylcyclooctyne）基を含む。
【０１０６】
標的ポリヌクレオチド中のさまざまなスペーサーは、さまざまな停止分子を含んでよい。例えば１つのスペーサーは、上に考察の１つの直鎖状分子を含む場合があり、別のスペーサーは１つまたは複数のヘリカーゼを物理的に停止させる１つまたは複数の化学基を含む場合がある。スペーサーは、上に考察の任意の直鎖状分子ならびに、１つまたは複数の塩基を持たないものおよびフルオロフォアなどの、１つまたは複数のヘリカーゼを物理的に停止させる１つまたは複数の化学基を含む場合がある。
【０１０７】
好適なスペーサーは、標的ポリヌクレオチドの種類および本発明の方法が実行される条件に応じて設計されてよい。大部分のヘリカーゼは、結合し、ＤＮＡに沿って移動し、ＤＮＡでなはい何かを使用して停止されてよい。好適な分子は上に考察されている。
【０１０８】
本発明の方法は、遊離ヌクレオチドの存在下および／またはヘリカーゼ補因子の存在下で好ましくは実行される。これは下でより詳細に考察される。膜貫通ポアおよび印加された電位の非存在下で、１個または複数のスペーサーは遊離ヌクレオチドの存在下および／またはヘリカーゼ補因子の存在下で１つまたは複数のヘリカーゼを好ましくは停止できる。
【０１０９】
本発明の方法が下に考察の遊離ヌクレオチドおよびヘリカーゼ補因子の存在下（１つまたは複数のヘリカーゼが活性モードであるように）で実行される場合、１つまたは複数の長いスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼが、それらが膜貫通ポアと接触し、電位が印加される前に、標的ポリヌクレオチド上で停止されることを確実にするために典型的には使用される。１つまたは複数の短いスペーサーは、遊離ヌクレオチドおよびヘリカーゼ補因子の非存在下で（１つまたは複数のヘリカーゼが不活性モードであるように）使用され得る。
【０１１０】
塩濃度も１つまたは複数のヘリカーゼを停止する１個または複数のスペーサーの能力に影響を与える。膜貫通ポアおよび印加された電位の非存在下では、１個または複数のスペーサーは、約１００ｍＭ以下の塩濃度で１つまたは複数のヘリカーゼを好ましくは停止できる。より高い塩濃度が本発明の方法において使用されると、より短い１個または複数のスペーサーが典型的には使用され、逆も同様である。
【０１１１】
特質の好ましい組合せは下の表１に示される。
【０１１２】
【表１】
0006408494.tif 000002
【０１１３】
下により詳細に考察されるとおり、方法は、スペーサーを過ぎて２つ以上のヘリカーゼを移動することに関する場合がある。そのような場合、スペーサーの長さは、ポアおよび印加された電位の非存在下でスペーサーを過ぎてトレイリングヘリカーゼがリーディングヘリカーゼを押すことを防ぐために典型的には増大される。方法が、１個または複数のスペーサーを過ぎて２つ以上のヘリカーゼを移動することに関する場合、上に考察のスペーサー長は、２倍、２．５倍または３倍などの少なくとも１．５倍に増大される場合がある。例えば、方法が１個または複数のスペーサーを過ぎて２つ以上のヘリカーゼを移動することに関する場合、上の表１の第３カラムにおけるスペーサー長は、１．５倍、２倍、２．５倍または３倍に増大される場合がある。
【０１１４】
２つ以上のヘリカーゼは、それぞれがそれ自体の１個または複数のスペーサーを有するように分離されてもよい。これは下でより詳細に考察される。
【０１１５】
ヘリカーゼ（複数可）
任意のヘリカーゼが本発明において使用され得る。ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼもしくはＴｒｗＣヘリカーゼなどのＲｅｃＤヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはＤｄａヘリカーゼであってよく、またはそれに由来してよい。ヘリカーゼは、任意のヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼまたは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号（ＷＯ２０１３／０５７４９５として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１３／０９８５６２として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１３０９８５６１として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号、第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号および第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号ならびに英国出願第１３１８４６４．３号２０１３年１０月１８日出願）において開示のヘリカーゼ構築物であってよい。
【０１１６】
ヘリカーゼは、配列番号１７（Ｔｒｗｃ  Ｃｂａ）に示す配列もしくはその変種、配列番号２８（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ）に示す配列もしくはその変種または配列番号８（Ｄｄａ）に示す配列もしくはその変種を好ましくは含む。変種は、膜貫通ポアについて下に考察の任意の方法において元の配列から異なっていてよい。配列番号８の好ましい変種は、Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃならびに次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失ならびにＧ１およびＧ２の付加）を含む。
【０１１７】
任意の数のヘリカーゼが本発明による１個または複数のスペーサーを過ぎて移動され得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のヘリカーゼは、１個または複数のスペーサーを過ぎて移動され得る。いくつかの実施形態では、異なる数のヘリカーゼが各スペーサーを過ぎて移動され得る。例えば、２つのヘリカーゼが２つの別々のスペーサーを使用して停止される場合、１つのヘリカーゼ（第１のヘリカーゼ）が第１のスペーサーを過ぎて移動される場合があるが、２つのヘリカーゼ（第１および第２のヘリカーゼ）が第２のスペーサーを過ぎて移動される場合もある。
【０１１８】
本発明の方法は、３つ以上または４つ以上などの２つ以上の停止されたヘリカーゼを１個または複数のスペーサーを過ぎて移動させるステップを好ましくは含む。２つ以上のヘリカーゼは、典型的には同じヘリカーゼである。２つ以上のヘリカーゼは、異なるヘリカーゼであってよい。
【０１１９】
２つ以上のヘリカーゼは、上に述べたヘリカーゼの任意の組合せであってよい。２つ以上のヘリカーゼは、２つ以上のＤｄａヘリカーゼであってよい。２つ以上のヘリカーゼは、１つまたは複数のＤｄａヘリカーゼおよび１つまたは複数のＴｒｗＣヘリカーゼであってよい。２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼの異なる変種であってよい。
【０１２０】
２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは互いに付着している。２つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは互いに共有結合的に付着している。ヘリカーゼは、任意の順序で任意の方法を使用して付着され得る。本発明における使用のための好ましいヘリカーゼ構築物は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号、第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号および第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号、ならびに英国出願第１３１８４６４．３号２０１３年１０月１８日出願に記載されている。
【０１２１】
条件および膜貫通ポア
方法は、ポア全体に電位を印加するステップを含む。印加された電位は、電圧電位であってよい。方法は、ポア全体に電圧電位を印可するステップを含み得る。方法は、ポア全体に印加される電圧を増加するステップを含み得る。本実施形態では、初期電圧電位は１個または複数のスペーサーを過ぎて１つまたは複数のヘリカーゼを移動するためには典型的には不十分であり、増加した電圧電位は１個または複数のスペーサーを過ぎて１つまたは複数のヘリカーゼを移動するために典型的には十分である。代替的に、印加された電位は、化学電位であってもよい。この例は、両親媒性層全体の塩勾配を使用することである。塩勾配はHolden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5に開示されている。いくつかの場合では、標的ポリヌクレオチドがポアに関して移動する際にポアを通過する電流は、標的ポリヌクレオチドの配列を決定するために使用される。これは、鎖配列決定である。
【０１２２】
膜貫通ポアは、膜をある程度越える構造である。それは、印加された電位によって駆動された水和イオンを膜全体または中に流れるようにする。膜貫通ポアは、典型的には膜全体を越え、それにより水和イオンは膜の一方の側から膜の他方の側へ流れ得る。しかし膜貫通ポアは、膜を越える必要はない。それは、一方の末端で閉じていてもよい。例えばポアは、それに沿ってまたは中に水和イオンが流れ得る膜中のウエルであってよい。
【０１２３】
任意の膜貫通ポアが本発明において使用され得る。ポアは、生物学的または人工であってよい。好適なポアは、これだけに限らないがタンパク質ポア、ポリヌクレオチドポアおよびソリッドステートポアを含む。
【０１２４】
任意の膜が本発明により用いられ得る。好適な膜は、当技術分野において周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、少なくとも１つの親水性部分および少なくとも１つの親油性または疎水性部分の両方を有するリン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は、合成または天然に存在してよい。天然に存在しない両親媒性物質および単層を形成する両親媒性物質は、当技術分野において公知であり、例えばブロック共重合体（Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450）を含む。ブロック共重合体は、２つ以上のモノマーサブユニットが１本鎖ポリマーを作成するために一緒に重合されているポリマー性材料である。ブロック共重合体は、各モノマーサブユニットによって寄与される特性を典型的には有する。しかし、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成されたポリマーが有していない特有の特性を有する場合がある。ブロック共重合体は、モノマーサブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）である一方で、他のサブユニット（複数可）が水性媒体中で親水性であるように操作され得る。この場合ブロック共重合体は、両親媒性特性を有する場合があり、生物学的膜を模倣する構造を形成できる。ブロック共重合体は、ジブロック（２つのモノマーサブユニットからなる）である場合があるが、両親媒性物質として挙動するさらに複雑な配置を形成するために２つより多いモノマーサブユニットから構築されてもよい。共重合体は、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロック共重合体であってよい。
【０１２５】
両親媒性層は、単層または二重層であってよい。両親媒性層は、典型的には平面状脂質二重層または支持された二重層である。
【０１２６】
両親媒性層は、典型的には脂質二重層である。脂質二重層は細胞膜のモデルであり、さまざまな実験研究のための優れたプラットフォームとして役立つ。例えば、脂質二重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査のために用いられ得る。代替的に脂質二重層は、さまざまな物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして用いられ得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。好適な脂質二重層は、これだけに限らないが平面状脂質二重層、支持された二重層またはリポソームを含む。脂質二重層は好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に開示されている。
【０１２７】
脂質二重層を形成するための方法は、当技術分野において公知である。好適な方法は実施例に開示する。脂質二重層は、脂質単層が水溶液／空気界面にその界面に垂直である開口部のいずれかの端を通って運ばれる、モンタルおよびミューラーの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1972;69:3561-3566）によって一般的には形成される。
【０１２８】
モンタルおよびミューラーの方法は、タンパク質ポア挿入のために好適である良質な脂質二重層を形成する対費用効果が高くて比較的簡単な方法であることから一般的である。二重層形成の他の一般的方法は、チップディッピング、ペインティング二重層およびリポソーム二重層のパッチクランピングを含む。
【０１２９】
好ましい実施形態では、脂質二重層は国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載のとおり形成される。
【０１３０】
別の好ましい実施形態では、膜は、ソリッドステート層である。ソリッドステート層は生物由来ではない。換言すると、ソリッドステート層は、生物または細胞などの生物学的環境由来でなく、またはそれから単離されず、生物学的に入手可能な構造の合成的に製造されたバージョンでもない。ソリッドステート層は、これだけに限らないがミクロ電子材料、Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２Ｏ３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチックまたは２要素添加硬化シリコンゴム（two-component addition-cure silicone rubber）などのエラストマーならびにガラスを含む有機材料ならびに無機材料の両方から形成され得る。ソリッドステート層は、グラフェン（graphene）などの一原子層からまたは数原子厚だけである層から形成され得る。好適なグラフェン（graphene）層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。
【０１３１】
方法は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）挿入されたポアを有する細胞を用いて典型的には実行される。方法は、人工脂質二重層などの人工両親媒性層を使用して典型的に実行される。層は、ポアに加えて他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質ならびに他の分子を含んでもよい。好適な装置および条件は、下に考察される。本発明の方法は、典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される。
【０１３２】
標的ポリヌクレオチドは、好ましくは膜にカップリングされ得る。これは、任意の公知の方法を用いてされ得る。膜が脂質二重層などの両親媒性層である場合は（下に詳細に考察されるとおり）、標的ポリヌクレオチドは、膜に存在するポリペプチドまたは膜に存在する疎水性アンカーを介して膜に好ましくはカップリングされる。疎水性アンカーは、好ましくは脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブまたはアミノ酸である。
【０１３３】
標的ポリヌクレオチドは膜に直接カップリングされ得る。それは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１１９１号（ＷＯ２０１２／１６４２７０として公開）に開示の方法のいずれかを使用して膜にカップリングされ得る。標的ポリヌクレオチドは好ましくは膜にリンカーを介してカップリングされる。好ましいリンカーは、これだけに限らないがポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどのポリマーを含む。標的ポリヌクレオチドが膜に直接カップリングされる場合、膜とポアおよび／またはヘリカーゼとの間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。リンカーが用いられる場合、標的ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。リンカーが用いられる場合、リンカーは標的ポリヌクレオチドの任意の位置に付着され得る。リンカーは、テールポリマーで標的ポリヌクレオチドに典型的には付着される。
【０１３４】
カップリングは、安定または一過的であってよい。ある種の応用に関してカップリングの一過的な性質は好ましい。安定カップリング分子がポリヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかに直接付着された場合、膜とポアおよび／またはヘリカーゼとの間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。カップリングが一過的である場合、カップリングされた端は無作為に膜から遊離し、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。安定なまたは一過的連結を膜と形成する化学基は、下により詳細に考察される。ポリヌクレオチドは、コレステロール（cholesterol）または脂肪酸アシル鎖を用いて脂質二重層などの両親媒性層に一過的にカップリングされ得る。ヘキサデカン酸などの長さ６から３０までの炭素原子を有する任意の脂肪酸アシル鎖は用いられ得る。
【０１３５】
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、両親媒性層にカップリングされる。合成脂質二重層へのポリヌクレオチドのカップリングは、種々の異なるテザーリング戦略で既に実行されている。これらを下の表２に要約する。
【０１３６】
【表２】
0006408494.tif 000003
【０１３７】
ポリヌクレオチドは、合成反応において修飾ホスホラミダイトを用いて官能基化されることができ、チオール、コレステロール（cholesterol）、脂質およびビオチン基などの反応基の付加に容易に適合される。これらのさまざまな付着化学物質は、ポリヌクレオチドに一連の付着選択肢をもたらす。さまざまな各修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌクレオチドを繋ぎ止め、カップリングは常に永久的ではなく、膜へのさまざまな残存時間をポリヌクレオチドにもたらす。一過的カップリングの有利点は、上に考察される。
【０１３８】
ポリヌクレオチドのカップリングは、反応基がポリヌクレオチドに付加され得る限り多数の他の手段によっても達成され得る。ＤＮＡのいずれかの端への反応基の付加は既に報告されている。チオール基はポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いてｓｓＤＮＡの５’に付加され得る(Grant,G.P.およびP.Z.Qin (2007) "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10):e77)。ビオチン、チオールおよびフルオロフォア（fluorophore）などの化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むためにターミナルトランスフェラーゼを用いて付加され得る(Kumar,A.,P.Tchenら、(1988)."Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2):376-82)。
【０１３９】
代替的に反応基は、既に膜にカップリングしているポリヌクレオチド中の短い領域であると考えられ、それにより付着はハイブリダイゼーションを介して達成され得る。領域は、ポリヌクレオチドの一部であってよくまたはそれにライゲーションされてよい。ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている(Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williamsら、(1992)."Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20):9823-5)。
【０１４０】
最も好ましくは、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズするコレステロールタグ化ポリヌクレオチドを使用して膜にカップリングされる。
【０１４１】
膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、分析物などの水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側へ流れるようにするポリペプチドまたはポリペプチドの集積物である。本発明では膜貫通タンパク質ポアは、水和イオンが印加された電位によって膜の一方の側から他方へ流れるように駆動されるようにするポアを形成できる。膜貫通タンパク質ポアは、ヌクレオチドなどの分析物が膜（脂質二重層など）の一方の側から他方へ流れるように好ましくはする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドまたは核酸がポアを通って移動されることを可能にする。
【０１４２】
膜貫通タンパク質ポアは、モノマーまたはオリゴマーであってよい。ポアは、６、７、８または９つのサブユニットなどのいくつかの反復サブユニットから好ましくは作られる。ポアは、好ましくは六量体、七量体、八量体または九量体ポアである。
【０１４３】
膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレルまたはチャネルを典型的には含む。ポアのサブユニットは、典型的には中央軸を取り囲み、膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束もしくはチャネルに鎖を供する。
【０１４４】
膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に好ましくは位置する。膜貫通タンパク質ポアは、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との間の相互作用を典型的には促進する。
【０１４５】
本発明による使用のための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポアまたはα−ヘリックス束ポアから生じ得る。β−バレルポアは、β−鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なβ−バレルポアは、これだけに限らないが、α−ヘモリジン（hemolysin）、炭疽毒素およびロイコシジン（leukocidin）などのβ−毒素、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤ、ライセニン、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリン（porin）を含む。α−ヘリックス束ポアは、α−ヘリックスから形成されたバレルまたはチャネルを含む。好適なα−ヘリックス束ポアは、これだけに限らないが内膜タンパク質ならびに、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通ポアは、ライセニン由来である場合がある。ライセニン（lysenin）由来の好適なポアは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５０６６７号（ＷＯ２０１３／１５３３５９として公開）に開示されている。膜貫通ポアは、Ｍｓｐ由来またはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来であってよい。
【０１４６】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに由来し、好ましくはＭｓｐＡに由来する。そのようなポアはオリゴマーであり、典型的にはＭｓｐ由来の７、８、９または１０個の単量体を含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐ由来のホモオリゴマーポアであってよい。代替的にポアは、少なくとも１個の他とは異なる単量体を含むＭｓｐ由来のヘテロオリゴマーポアであってもよい。好ましくはポアは、ＭｓｐＡまたはその相同体もしくはパラログ由来である。
【０１４７】
Ｍｓｐ由来の単量体は、配列番号２に示す配列またはその変種を典型的には含む。配列番号２はＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。それは次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変種は、配列番号２のものから変化し、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は測定され得る。サブユニットを両親媒性層などの膜に挿入するための方法は、当技術分野において公知である。例えばサブユニットは、脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合するステップおよび機能的状態に会合するステップによって挿入されるように脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁され得る。代替的にサブユニットは、M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005、127、6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックアンドプレース」法を用いて膜に直接挿入され得る。
【０１４８】
配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種は、配列全体にわたって配列番号２のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が１００以上（例えば１２５、１５０、１７５もしくは２００またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。
【０１４９】
相同性を決定するために当技術分野における標準的方法が用いられ得る。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えばその初期設定で用いられる）を提供する（Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Research 12、387-395頁）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を算出するためまたは配列を列挙するために（等価残基または対応する配列を同定するステップなど（典型的にはその初期設定で））用いられ得る、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S.Fら、(1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開で入手可能である。
【０１５０】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。変種は、ＭｓｐＡと比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体中の任意の変異を含み得る。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態は配列番号５から７に示される。詳細には変種は、ＭｓｐＢに存在する次の置換：Ａ１３８Ｐを含む場合がある。変種は、ＭｓｐＣに存在する次の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐの１つまたは複数を含む場合がある。変種はＭｓｐＤに存在する次の置換：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの１つまたは複数を含む場合がある。変種は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤ由来の１つまたは複数の変異および置換の組合せを含み得る。変種は、好ましくは変異Ｌ８８Ｎを含む。配列番号２の変種は、ＭＳ−（Ｂ１）８の全変異に加えて変異Ｌ８８Ｎを有し、ＭＳ−（Ｂ２）８と称される。本発明において用いられるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８である。さらに好ましい変種は、変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む。配列番号２の変種は、ＭＳ−（Ｂ１）８の全ての変異に加えて変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有し、ＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８と称される。本発明において使用されるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８またはＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８である。
【０１５１】
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号２のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、アミノ酸を同様の化学構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積を有する他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有してよい。代替的に保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入する場合がある。保存的アミノ酸変更は、当技術分野において周知であり、下の表３に定義のとおり２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が同様の極性を有する場合、これは表４におけるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参照することによっても決定され得る。
【０１５２】
【表３】
0006408494.tif 000004
【０１５３】
【表４】
0006408494.tif 000005
【０１５４】
配列番号２の配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
【０１５５】
変種は、配列番号２の断片を含み得る。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。そのような断片は、ポアを生成するために用いられ得る。断片は、配列番号２のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の１つを含まなければならない。典型的には断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の全てを含む。
【０１５６】
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的または追加的に付加され得る。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長はより長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）よい。担体タンパク質は、本発明によるアミノ酸配列に融合され得る。他の融合タンパク質は、下により詳細に考察される。
【０１５７】
上に考察したとおり変種は、配列番号２から変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与する配列番号２の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するＭｓｐのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号２の変種は、β−シートを形成する配列番号２中の領域を典型的には含む。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に作出され得る。配列番号２の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。
【０１５８】
Ｍｓｐ由来の単量体は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラッグタグの付加によって、または（細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によってポリペプチドが天然でそのような配列を含有しない場合に）修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポア上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側に操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている(Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505)。
【０１５９】
Ｍｓｐ由来の単量体は、明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、下に記載されている。
【０１６０】
Ｍｓｐ由来の単量体は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成され得る。例えばＭｓｐ由来の単量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
【０１６１】
Ｍｓｐ由来の単量体は、ヌクレオチド識別を促進するために１つまたは複数の特異的修飾を含有する。Ｍｓｐ由来の単量体は、他の非特異的な修飾をそれらがポア形成を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、Ｍｓｐ由来の単量体の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
【０１６２】
Ｍｓｐ由来の単量体は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。Ｍｓｐ由来の単量体は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばポアはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアを生成するための好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に考察されている。ポアを膜に挿入するための方法は考察されている。
【０１６３】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来でもある。野生型α−ＨＬポアは、７個の同一単量体またはサブユニットから形成される（すなわち七量体である）。α−ヘモリジン−ＮＮの１個の単量体またはサブユニットの配列は配列番号４に示されている。膜貫通タンパク質ポアは、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個の単量体を好ましくは含む。配列番号４のアミノ酸１、７から２１、３１から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７２から２７４、２８７から２９０および２９４はループ領域を形成する。配列番号４の残基１１３および１４７はα−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄の一部を形成する。
【０１６４】
そのような実施形態では、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個のタンパク質または単量体を含むポアは、本発明の方法において好ましくは用いられる。７個のタンパク質は、同じ（ホモ−七量体）または異なっていて（ヘテロ−七量体）よい。
【０１６５】
配列番号４の変種は、配列番号４のものから変化したアミノ酸配列を有し、ポア形成能力を保持しているタンパク質である。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に脂質二重層などの両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は決定され得る。サブユニットを脂質二重層などの両親媒性層に挿入するための方法は当技術分野において公知である。好適な方法は上に考察されている。
【０１６６】
変種は、ヘリカーゼへの共有結合付着または相互作用を促進する修飾を含み得る。変種は、ヘリカーゼへの付着を促進する１つまたは複数の反応性システイン残基を好ましくは含む。例えば変種は、配列番号４の位置８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の１つまたは複数にシステインを含み得る。好ましい変種は、配列番号４の位置８、９、１７、２３７、２３９および２８７の残基のシステインでの置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。変種は、好ましくは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載の変種のいずれか１つである。
【０１６７】
変種は、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促進する修飾も含み得る。
【０１６８】
変種は、生物（例えば細菌ブドウ球菌（Staphylococcus））によって天然で発現される天然に存在する変種であってよい。代替的に変種は、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは組換え的に発現されてもよい。変種は、組換え技術によって生成される天然に存在しない変種も含む。配列番号４のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号４のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上（例えば２３０、２５０、２７０もしくは２８０またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。相同性は上に考察のとおり決定され得る。
【０１６９】
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号４のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、上に考察の通り作出され得る。
【０１７０】
配列番号４のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
【０１７１】
変種は、配列番号４の断片であり得る。そのような断片はポア形成能力を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。断片は、配列番号４のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は典型的には配列番号４の残基１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を含む。
【０１７２】
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的にまたは追加的に付加され得る。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはその変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長は、より長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）良い。担体タンパク質は、ポアまたは変種に融合されてもよい。
【０１７３】
上に考察したとおり、配列番号４の変種は、配列番号４のものから変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するサブユニットである。変種は、ポア形成に関与する配列番号４の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するα−ＨＬのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号４の変種は、β鎖を形成する配列番号４の領域を典型的には含む。β鎖を形成する配列番号４のアミノ酸は上に考察されている。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限りβ−鎖を形成する配列番号４の領域に作出され得る。配列番号４のβ鎖領域に作られ得る具体的な修飾は、上に考察されている。
【０１７４】
配列番号４の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。α−ヘリックスおよびループを形成するアミノ酸は、上に考察されている。
【０１７５】
変種は、上に考察のとおり、その同定または精製を支援するために修飾され得る。
【０１７６】
α−ＨＬ由来のポアは、Ｍｓｐ由来のポアに関連して上に考察のとおり作出され得る。
【０１７７】
いくつかの実施形態では膜貫通タンパク質ポアは、化学的に修飾される。ポアは、任意の方法および任意の部位で化学的に修飾され得る。膜貫通タンパク質ポアは、１つもしくは複数のシステインへの分子の付着（システイン連結）、１つもしくは複数のリシンへの分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって好ましくは化学的に修飾される。そのような修飾を実行するための好適な方法は、当技術分野において周知である。膜貫通タンパク質ポアは、任意の分子の付着によって化学的に修飾され得る。例えばポアは、色素またはフルオロフォアの付着によって化学的に修飾され得る。
【０１７８】
ポア中の任意の数の単量体は、化学的に修飾され得る。１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）の単量体は、上に考察のとおり好ましくは化学的に修飾される。
【０１７９】
システイン残基の反応性は、隣接残基の修飾によって増強され得る。例えば近接アルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより反応性のＳ−基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが付着する前にポアの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。
【０１８０】
（ポアが化学的に修飾される）分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のとおりポアに直接付着され得るか、またはリンカーを介して付着され得る。
【０１８１】
ヘリカーゼは、ポアに共有結合的に付着されていてもよい。ヘリカーゼは、好ましくはポアに共有結合的に付着されていない。
【０１８２】
本明細書に記載の任意のタンパク質は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラッグタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または、それらの細胞からの分泌を促進するために（ポリペプチドが天然でそのような配列を含有していない場合に）シグナル配列の付加によって修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ヘリカーゼまたはポア上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側の操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている（Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505）。
【０１８３】
標的ポリヌクレオチド、ヘリカーゼまたはポアは明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、検出され得る任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、これだけに限らないが蛍光分子、放射性同位元素（例えば125I、35S）、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド（ビオチンなど）を含む。
【０１８４】
タンパク質は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。タンパク質のアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むようにまたはタンパク質の安定性を増大させるように修飾され得る。タンパク質が合成的手段によって生成される場合、そのようなアミノ酸は、生成の際に導入され得る。タンパク質は、合成的にまたは組換え生成のいずれかに続いて変更され得る。
【０１８５】
タンパク質は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成し得る。例えばポアまたはヘリカーゼは、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
【０１８６】
本発明において用いられるタンパク質は、他の非特異的修飾もそれらがタンパク質機能を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、タンパク質（複数可）の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
【０１８７】
タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を用いて得られ、複製され得る。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的技術を用いて細菌宿主細胞において発現され得る。タンパク質は、組換え発現ベクターからのポリペプチドの原位置での発現によって細胞において生成され得る。場合により発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを保持する。これらの方法は、Sambrook,J.and Russell,D.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual、3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYに記載されている。
【０１８８】
目的の配列をコードする遺伝子は、特異的プライマーを含むＰＣＲを使用して増幅され得る。増幅された配列は、次いでクローニングベクターなどの組換え複製可能ベクターに組み込まれ得る。ベクターは、適合性宿主細胞においてポリヌクレオチドを複製するために使用され得る。したがってポリヌクレオチド配列は、目的の配列をコードするポリヌクレオチドを複製可能ベクターに導入すること、ベクターを適合性宿主細胞に導入すること、およびベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって作られ得る。ベクターは、宿主細胞から回収され得る。ポリヌクレオチドのクローニングのために好適な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、下により詳細に記載される。
【０１８９】
ポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターにクローン化され得る。発現ベクターでは、ポリヌクレオチド配列は、典型的には、宿主細胞によるコード配列の発現を提供できる制御配列に作動可能に連結される。そのような発現ベクターは、構築物を発現するために使用され得る。
【０１９０】
用語「作動可能に連結」は、記載の構成成分がそれらが目的の様式で機能することを可能にする関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に連結」した制御配列は、制御配列と適合性である条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲーションされる。同じまたは異なるポリヌクレオチドの複数のコピーがベクターに導入され得る。
【０１９１】
次いで発現ベクターは、好適な宿主細胞に導入され得る。それにより構築物は、構築物をコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入すること、ベクターを適合性細菌宿主細胞に導入すること、およびポリヌクレオチド配列の発現をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって生成され得る。
【０１９２】
ベクターは、複製開始点、場合により前記ポリヌクレオチド配列の発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターと共に提供される、例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってよい。ベクターは、１つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含有できる。プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計される宿主細胞に適合性であるように選択されてよい。Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλＬプロモーターは、典型的には使用される。
【０１９３】
宿主細胞は、構築物を典型的には高レベルで発現する。ポリヌクレオチド配列で形質転換される宿主細胞は、細胞を形質転換するために使用される発現ベクターと適合性であるように選ばれる。宿主細胞は、典型的には細菌性であり、好ましくは大腸菌（E.coli）である。λＤＥ３溶原菌を含む任意の細胞、例えばＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓ、Ｃ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、ＯｒｉｇａｍｉおよびＯｒｉｇａｍｉ  Ｂは、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現できる。
【０１９４】
タンパク質は、大規模に生成されることができ、タンパク質生成生物または組換え発現からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィー系による精製が続く。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィー系は、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏ−Ｃａｄ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ｓｙｓｔｅｍおよびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを含む。
【０１９５】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定するステップを含む。方法は、標的ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つまたは５つ以上の特性を測定するステップを含み得る。１つまたは複数の特性は、好ましくは（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される。（ｉ）から（ｖ）の任意の組合せは本発明により測定され得る。
【０１９６】
（ｉ）に関して、ポリヌクレオチドの長さは、例えば標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の数、または標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の持続時間を決定することによって測定され得る。
【０１９７】
（ｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの同一性は、多数の方法において測定され得る。ポリヌクレオチドの同一性は、標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴ってまたは標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は、簡単であり、ポリヌクレオチドは配列決定され、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行われ得る。例えばポリヌクレオチド中の具体的なモチーフの存在は（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定するステップを伴わずに）測定され得る。代替的に、方法における具体的な電気的および／または光学的シグナルの測定は、標的ポリヌクレオチドを具体的な供給源由来であるとして同定できる。
【０１９８】
（ｉｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの配列は、以前記載されたとおり決定され得る。好適な配列決定方法、詳細には電気的測定を用いるものは、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。
【０１９９】
（ｉｖ）に関して、二次構造は、種々の方法において測定され得る。例えば方法が電気的測定を含む場合、二次構造は残存時間における変化またはポアを通って流れる電流における変化を用いて測定され得る。これは、１本鎖と２本鎖のポリヌクレオチドの領域を区別できるようにする。
【０２００】
（ｖ）に関して、任意の修飾の存在または非存在は、測定され得る。方法は、好ましくは標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているかどうかを決定するステップを含む。具体的な修飾は、下に記載の方法を用いて測定され得るポアとの特異的な相互作用を生じる。例えばメチルシトシンは、各ヌクレオチドとのその相互作用の際にポアを通って流れる電流に基づいてシトシンから区別され得る。
【０２０１】
種々の異なる種類の測定が作出されてよい。これは、非限定的に:電気的測定および光学的測定を含む。可能性のある電気的測定は、電流測定：インピーダンス測定、トンネル測定（Ivanov APら、Nano Lett.2011 Jan 12;11(1):279-85）およびＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）を含む。光学的測定は、電気的測定(Soni GVら、Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301)と組み合わされ得る。測定は、ポアを通って流れるイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってよい。
【０２０２】
電気的測定は、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ−２０００／２８３１２号に記載の標準的単一チャネル記録機器を用いて作出され得る。代替的に電気的測定は、例えば国際出願第ＷＯ−２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ−２０１１／０６７５５９号に記載のマルチチャネル系を用いても作出され得る。
【０２０３】
方法は、ポアが膜中に存在する膜／ポア系を調べるのに好適である任意の装置を用いて実行され得る。方法は、膜貫通ポアセンシングに好適である任意の装置を用いて実行され得る。例えば装置は、水性溶液および、チャンバーを２つのセクションに分離する障壁を含むチャンバーを含む。障壁はポアを含有する膜が形成される開口部を典型的には有する。代替的に障壁は、その中にポアが存在する膜を形成する。
【０２０４】
方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ２００８／１０２１２０）に記載の装置を用いて実行され得る。
【０２０５】
方法は、ポアに関してポリヌクレオチドが移動する際に、ポアを通過する電流を測定するステップを含み得る。したがって装置は、電位を印加でき、膜およびポアを通る電気シグナルを測定できる電気回路も含む。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いても実行され得る。方法は、電圧クランプの使用を好ましくは含む。
【０２０６】
本発明の方法は、ポアに関してポリヌクレオチドが移動する際に、ポアを通過する電流の測定を含み得る。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するための好適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例で開示される。方法は、膜およびポア全体に印加される電圧と共に典型的には実行される。用いられる電圧は典型的には、＋２Ｖから−２Ｖまで、典型的には−４００ｍＶから＋４００ｍＶまでである。好ましくは用いられる電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値および＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限値を含む範囲内である。用いられる電圧は、より好ましくは１００ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍＶまでの範囲内である。印加される電位を増加させることによってポアによるさまざまなヌクレオチド間の識別を向上させることは可能である。
【０２０７】
方法は、金属塩（例えばアルカリ金属塩）、ハロゲン化塩（例えばアルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩）などの任意の電荷担体の存在下で典型的には実行される。電荷担体は、イオン液体または有機塩、例えばテトラメチル塩化アンモニウム、トリメチルフェニル塩化アンモニウム、フェニルトリメチル塩化アンモニウムもしくは１−エチル−３メチルイミダゾリウムクロリド（1-ethyl-3-methyl imidazolium chloride）を含み得る。上に考察した例示的装置では、塩はチャンバー中の水性溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が典型的には使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌおよびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物は、好ましい。塩濃度は飽和であってよい。塩濃度は、３Ｍ以下があり得、典型的には０．１から２．５Ｍまで、０．３から１．９Ｍまで、０．５から１．８Ｍまで、０．７から１．７Ｍまで、０．９から１．６Ｍまでまたは１Ｍから１．４Ｍまでである。塩濃度は、好ましくは１５０ｍＭから１Ｍまでである。Ｈｅｌ３０８、ＸＰＤ、ＲｅｃＤ、ＴｒａＩ、およびＤｄａヘリカーゼは、高塩濃度下で驚くべきことに作用する。方法は、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍなどの少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて好ましくは実行される。高塩濃度は、高い信号対雑音比を提供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流が同定されることを可能にする。
【０２０８】
方法は、緩衝剤の存在下で典型的には実行される。上に考察した例示的装置では、緩衝剤はチャンバー中の水性溶液に存在する。任意の緩衝剤が本発明の方法において用いられ得る。典型的には緩衝液は、リン酸緩衝液である。他の好適な緩衝液は、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。方法は、４．０から１２．０まで、４．５から１０．０まで、５．０から９．０まで、５．５から８．８まで、６．０から８．７までまたは７．０から８．８までまたは７．５から８．５までのｐＨで典型的には実行される。用いられるｐＨは好ましくは約７．５である。
【０２０９】
方法は、０ｏＣから１００ｏＣまで、１５ｏＣから９５ｏＣまで、１６ｏＣから９０ｏＣまで、１７ｏＣから８５ｏＣまで、１８ｏＣから８０ｏＣまで、１９ｏＣから７０ｏＣまでまたは２０ｏＣから６０ｏＣまでで実行され得る。方法は典型的には室温で実行される。方法は、約３７℃などのヘリカーゼ機能を支持する温度で場合により実行される。
【０２１０】
方法は、遊離ヌクレオチドもしくは遊離ヌクレオチド類似物および／またはヘリカーゼの作用を促進するヘリカーゼ補因子の存在下で実行され得る。方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物の非存在下およびヘリカーゼ補因子の非存在下でも実行され得る。遊離ヌクレオチドは、上に考察した個々のヌクレオチドの任意の１つまたは複数であってよい。遊離ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含む。遊離ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。ヘリカーゼ補因子は、ヘリカーゼまたは構築物を機能させる因子である。ヘリカーゼ補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオンは好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＣｏ２＋である。ヘリカーゼ補因子は、最も好ましくはＭｇ２＋である。
【０２１１】
標的ポリヌクレオチド上への１つまたは複数のヘリカーゼのローディングを制御する方法
本発明は、標的ポリヌクレオチド上への１つまたは複数のヘリカーゼのローディングを制御する方法も提供する。方法は、１個または複数のスペーサーを有する標的ポリヌクレオチドを提供するステップを含む。方法は、１個または複数のスペーサーを含むように標的ポリヌクレオチドを修飾するステップを好ましくは含む。上に考察した全てのスペーサー実施形態は、本方法に等しく適用される。
【０２１２】
方法は、１つまたは複数のヘリカーゼが標的ポリヌクレオチドに結合し、１つまたは複数のヘリカーゼが各スペーサーで停止するように、標的ポリヌクレオチドを１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップも含む。スペーサーでのヘリカーゼの停止は、上に考察したとおりアッセイされ得る。
【０２１３】
標的ポリヌクレオチドは、上に考察したとおり任意の数のスペーサーを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のスペーサーなどの２個以上のスペーサーを好ましくは含む。任意の数のヘリカーゼは、上に考察のとおり各スペーサーで停止され得る。このように、多数のヘリカーゼが標的ポリヌクレオチド上のどこにどのようにロードされるかを制御することは可能であり、それにより標的ポリヌクレオチドの特性決定を促進する。１つまたは複数のヘリカーゼは、上に考察した方法のいずれかを使用して１個または複数のスペーサーを過ぎて移動され得る。
【０２１４】
標的ポリヌクレオチドは、１個または複数のスペーサーＳおよび１つもしくは複数の１本鎖領域または１つもしくは複数の非ハイブリダイズ領域Ｌ（Ｌはローディング部位である）を含んで好ましくは提供される。各領域Ｌの長さは、各Ｌに結合し、各スペーサーＳで停止されるべきヘリカーゼの数に依存する。１個または複数のスペーサーＳおよび１つまたは複数の領域Ｌは、互いに隣接して（すなわち隣り合って）よくまたは標的ポリヌクレオチドの一部によって分離されていてもよい。各スペーサーは、それに向かってヘリカーゼが移動する各領域Ｌの末端に、または近くに典型的には位置付けられる。例えば、ヘリカーゼが５’から３’へのヘリカーゼである場合、各スペーサーは典型的には各領域の３’末端にまたは近くに位置付けられる、すなわち５’−Ｌ−Ｓ−３’。ヘリカーゼが３’から５’へのヘリカーゼである場合、各スペーサーは、各領域の５’末端にまたは近くに典型的には位置付けられる、すなわち５’−Ｓ−Ｌ−３’。
【０２１５】
標的ポリヌクレオチドは、（Ｌ−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ）ｎを５’から３’方向で含んで好ましくは提供され、式中Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの整数である。ｎは好ましくは１、２、３または４である。５’から３’方向は、標的ポリヌクレオチドを指す。
【０２１６】
標的ポリヌクレオチドは、１つもしくは複数の１本鎖領域または１つもしくは複数の非ハイブリダイズ領域Ｌを含んで好ましくは提供され、そのそれぞれはスペーサーＳをいずれかの末端にまたは近くに有する、すなわち（Ｓ−Ｌ−Ｓ）ｎを含んで提供される。
【０２１７】
好ましい実施形態では、スペーサーは、上に考察したとおり２本鎖領域Ｄに隣接する、すなわち５’から３’へのヘリカーゼもしくは不活性モードにおいて使用されるヘリカーゼのために５’−Ｌ−Ｓ−Ｄ−３’、または３’から５’へのヘリカーゼもしくは不活性モードにおいて使用されるヘリカーゼのために５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ−３’。標的ポリヌクレオチドは、５’から３’方向で（Ｌ−Ｓ−Ｄ）ｎまたは（Ｄ−Ｓ−Ｌ）ｎを含んで好ましくは提供され、式中Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドもしくは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、Ｄは２本鎖ポリヌクレオチドであり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの整数である。ｎは好ましくは１、２、３または４である。Ｌは、Ｄと同じ種類のポリヌクレオチドであってよく、またはＤとは異なる種類のポリヌクレオチドであってもよい。Ｌおよび／またはＤは、標的ポリヌクレオチドと同じ種類のポリヌクレオチドであってよく、または標的ポリヌクレオチドとは異なる種類のポリヌクレオチドであってもよい。
【０２１８】
好ましい実施形態では、ブロッキング分子Ｂは、それを過ぎて１つまたは複数のヘリカーゼが移動される末端とは反対の各スペーサーの末端に提供される。すなわち５’から３’へのヘリカーゼもしくは不活性モードにおいて使用されるヘリカーゼのために５’−Ｂ−Ｌ−Ｓ−３’、または３’から５’へのヘリカーゼのために５’−Ｓ−Ｌ−Ｂ−３’。標的ポリヌクレオチドは、好ましくは５’から３’方向で（Ｂ−Ｌ−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ−Ｂ）ｎを含んで提供され、式中Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、Ｂはブロッキング分子であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの整数である。ｎは好ましくは１、２、３または４である。
【０２１９】
最も好ましい実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤおよびＢの両方、すなわち５’から３’へのヘリカーゼもしくは不活性モードにおいて使用されるヘリカーゼのために５’−Ｂ−Ｌ−Ｓ−Ｄ−３’、または３’から５’へのヘリカーゼのために５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ−Ｂ−３’を含んで提供される。標的ポリヌクレオチドは、最も好ましくは５’から３’方向で（Ｂ−Ｌ−Ｓ−Ｄ）ｎまたは（Ｄ−Ｓ−Ｌ−Ｂ）ｎを含んで提供され、式中Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、Ｂはブロッキング分子であり、Ｄは２本鎖ポリヌクレオチドであり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの整数である。ｎは好ましくは１、２、３または４である。
【０２２０】
標的ポリヌクレオチドは、任意の数のこれらのスペーサー含有単位を含んで提供され得る。例えば標的ポリヌクレオチドは、（５’−Ｌ−Ｓ−３’）ｎ、（５’−Ｓ−Ｌ−３’）ｎ、（Ｓ−Ｌ−Ｓ）ｎ、（５’−Ｌ−Ｓ−Ｄ−３’）ｎ、（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ−３’）ｎ、（５’−Ｂ−Ｌ−Ｓ−３’）ｎ、（５’−Ｓ−Ｌ−Ｂ−３’）ｎ、（５’−Ｂ−Ｌ−Ｓ−Ｄ−３’）ｎまたは（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ−Ｂ−３’）ｎを含んで提供されてよく、式中ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの２以上である。そのような実施形態は、複数のヘリカーゼが標的ポリヌクレオチド上で停止されるようにする。
【０２２１】
標的ポリヌクレオチドは、本発明のアダプターを標的ポリヌクレオチドにライゲーションすることによってＬ、Ｓ、ＤおよびＢを参照して上に考察する全ての実施形態と共に提供され得る。
【０２２２】
好ましい実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、１つのヘリカーゼ（すなわち１つだけのヘリカーゼ）が各スペーサーで停止するように１つまたは複数のヘリカーゼと接触される。これは、１個または複数のスペーサーＳおよび、それぞれが１つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけである１つもしくは複数の１本鎖領域または１つもしくは複数の非ハイブリダイズ領域Ｌ１を標的ポリヌクレオチドに設けることによって達成され得る。標的ポリヌクレオチドに、好ましくは５’から３’方向で（Ｌ１−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ１）ｎを設ける（式中、Ｌ１は、１つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけである１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの整数である）。ｎは好ましくは１、２、３または４である。
【０２２３】
領域Ｌ１の長さは、ヘリカーゼのフットプリントに依存し、容易なやり方で算出され得る。領域Ｌ１は、標的ポリヌクレオチドの一部であってよく、例えば本発明のアダプターの一部として標的ポリヌクレオチドに加えられてもよい。領域Ｌ１は、典型的には長さ８、９、１０、１２、１３、１４または１５ヌクレオチドである。１個または複数のスペーサーＳおよび１つまたは複数のＬ１領域は、互いに隣接して（すなわち隣り合って）よくまたは標的ポリヌクレオチドの一部によって分離されていてもよい。各スペーサーＳは、典型的にはそれに向けてヘリカーゼが移動する各領域Ｌ１の末端にまたは近くに位置付けられる。例えば、ヘリカーゼが５’から３’へのヘリカーゼである場合、各スペーサーＳは典型的には各領域Ｌ１の３’末端にまたは近くに位置付けられる、すなわち５’−Ｌ１−Ｓ−３’。ヘリカーゼが３’から５’へのヘリカーゼである場合、各スペーサーＳは典型的には各領域Ｌ１の５’末端にまたは近くに位置付けられる、すなわち５’−Ｓ−Ｌ１−３’。標的ポリヌクレオチドに、好ましくは、それぞれが１つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけであり、それぞれがいずれかの末端にもしくは近くにスペーサーＳを有する、１つもしくは複数の１本鎖領域または１つもしくは複数の非ハイブリダイズ領域Ｌ１、すなわち（Ｓ−Ｌ１−Ｓ）ｎを設ける。
【０２２４】
標的ポリヌクレオチドに、（５’−Ｌ１−Ｓ−３’）ｎ、（５’−Ｓ−Ｌ１−３’）ｎ、（Ｓ−Ｌ１−Ｓ）ｎ、（５’−Ｌ１−Ｓ−Ｄ−３’）ｎ、（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ１−３’）ｎ、（５’−Ｂ−Ｌ１−Ｓ−３’）ｎ、（５’−Ｓ−Ｌ１−Ｂ−３’）ｎ、（５’−Ｂ−Ｌ１−Ｓ−Ｄ−３’）ｎまたは（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ１−Ｂ−３’）ｎを設けることができ、式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの整数である。ｎは好ましくは１、２、３または４である。そのような実施形態は、ｎ個のヘリカーゼが標的ポリヌクレオチド上で停止されるようにする。１つのヘリカーゼは、各スペーサーによって停止される。
【０２２５】
別の好ましい実施形態では、標的ポリヌクレオチドに、２つのヘリカーゼ（すなわち２つだけのヘリカーゼ）が各スペーサーで停止するように、１つまたは複数のヘリカーゼと接触される。これは、それぞれが２つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけである、１個または複数のスペーサーＳおよび１つもしくは複数の１本鎖領域または１つもしくは複数の非ハイブリダイズ領域Ｌ２を含む標的ポリヌクレオチドを提供することによって達成され得る。標的ポリヌクレオチドに、好ましくは、５’から３’方向で（Ｌ２−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ２）ｎを設けてもよい（式中、Ｌは、２つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけである１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの整数である）。ｎは好ましくは１、２、３または４である。
【０２２６】
領域Ｌ２の長さは、ヘリカーゼのフットプリントに依存し、容易なやり方で算出され得る。領域Ｌ２は、標的ポリヌクレオチドの一部であってよく、例えば本発明のアダプターの一部として標的ポリヌクレオチドに加えられてもよい。領域Ｌ２は、典型的には長さ１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドである。１個または複数のスペーサーＳおよび１つまたは複数の領域Ｌ２は、互いに隣接して（すなわち隣り合って）よくまたはポリヌクレオチドの一部によって分離されていてもよい。各スペーサーは、それに向かってヘリカーゼが移動する各領域の末端にまたは近くに典型的には位置付けられる。例えば、ヘリカーゼが５’から３’へのヘリカーゼである場合、各スペーサーは典型的には各領域の３’末端にまたは近くに位置付けられる。ポリヌクレオチドに、好ましくは、それぞれが２つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけであり、それぞれがスペーサーＳをいずれかの末端にもしくは近くに有する、１つもしくは複数の１本鎖領域または１つもしくは複数の非ハイブリダイズ領域Ｌ２、すなわち（Ｓ−Ｌ２−Ｓ）ｎを設ける。
【０２２７】
標的ポリヌクレオチドに、（５’−Ｌ２−Ｓ−３’）ｎ、（５’−Ｓ−Ｌ２−３’）ｎ、（Ｓ−Ｌ２−Ｓ）ｎ、（５’−Ｌ２−Ｓ−Ｄ−３’）ｎ、（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ２−３’）ｎ、（５’−Ｂ−Ｌ２−Ｓ−３’）ｎ、（５’−Ｓ−Ｌ２−Ｂ−３’）ｎ、（５’−Ｂ−Ｌ２−Ｓ−Ｄ−３’）ｎまたは（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ２−Ｂ−３’）ｎを設けてもよく、式中ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの整数である。ｎは好ましくは１、２、３または４である。そのような実施形態は、２ｎヘリカーゼが標的ポリヌクレオチド上で停止されるようにする。２つのヘリカーゼは各スペーサーによって停止される。
【０２２８】
各スペーサーで停止される２つのヘリカーゼは、好ましくは互いに異なっている。これは、いくつかの方法で制御され得る。例えば、２つの異なるヘリカーゼは、互いに共有結合で付着しているなど、互いに付着されていてよく、それにより各スペーサーで停止される。好適な構築物は上に考察されている。代替的に、ブロッキングポリヌクレオチドは、異なるヘリカーゼが各スペーサーによって停止されることを確実にするために使用され得る。方法が、それぞれが２つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけである１個または複数のスペーサーＳおよび１つもしくは複数の１本鎖領域または１つもしくは複数の非ハイブリダイズ領域Ｌ２を含むポリヌクレオチドを提供するステップを含む場合、方法は各領域の残りの（すなわち非ブロック）部分が１つのヘリカーゼが結合するのに十分な長さだけであるように、ブロッキングポリヌクレオチドを各領域Ｌ２の一部にハイブリダイズするステップを好ましくは含む。ブロッキングポリヌクレオチドは、典型的には長さ２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドである。ブロッキングポリヌクレオチドは、２つのヘリカーゼが同じ領域に同時に結合することを防ぐ。ブロッキングポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、好ましくは１つのヘリカーゼが各領域Ｌ２の残りの（すなわち非ブロック）部分に結合するように、１つまたは複数のヘリカーゼと接触される。各ヘリカーゼは、次いで各ブロッキングポリヌクレオチドを除去するために使用され得る。１つまたは複数の結合したヘリカーゼは、それらが各ブロッキングポリヌクレオチドを除去し、各スペーサーＳで停止するように、遊離ヌクレオチドおよびヘリカーゼ補因子を含んで好ましくは提供される。この方法で生成されたポリヌクレオチドは、次いで方法において先に使用されたヘリカーゼとは異なる１つまたは複数のヘリカーゼと、１つの異なるヘリカーゼが各領域に結合し、スペーサーおよび他の停止されたヘリカーゼによって停止されるように、好ましくは接触される。
【０２２９】
方法は、（ａ）５’から３’方向で（Ｌ２−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ２）ｎを標的ポリヌクレオチドに設けるステップ（式中、Ｌは、２つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけである１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの整数である）、（ｂ）各領域Ｌ２の残りの部分が１つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけであるように、ブロッキングポリヌクレオチドを各領域Ｌ２の一部にハイブリダイズするステップ、（ｃ）１つのヘリカーゼが各領域Ｌ２の残りの部分に結合するように、（ｂ）において生成された標的ポリヌクレオチドを１つまたは複数のヘリカーゼに接触させるステップ、（ｄ）それらが各ブロッキングポリヌクレオチドを除去し、各スペーサーＳで停止するように、遊離ヌクレオチドおよびヘリカーゼ補因子を（ｃ）における１つまたは複数の結合したヘリカーゼに提供するステップ、ならびに（ｅ）１つの異なるヘリカーゼが各領域Ｌ２に結合し、各スペーサーによって停止され、各ヘリカーゼが（ｄ）において停止されるように、（ｄ）において生成された標的ポリヌクレオチドを（ｃ）において使用されたものとは異なる１つまたは複数のヘリカーゼに接触させるステップを好ましくは含む。ｎは好ましくは１、２、３または４である。上に考察したとおり（Ｓ−Ｌ２−Ｓ）ｎ、（５’−Ｌ２−Ｓ−Ｄ−３’）ｎ、（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ２−３’）ｎ、（５’−Ｂ−Ｌ２−Ｓ−３’）ｎ、（５’−Ｓ−Ｌ２−Ｂ−３’）ｎ、（５’−Ｂ−Ｌ２−Ｓ−Ｄ−３’）ｎおよび（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ２−Ｂ−３’）ｎなどのＳおよびＬ２の他の配置も、本実施形態において使用され得る。
【０２３０】
上に考察したとおり、スペーサーの長さは、停止されるヘリカーゼの数および／またはスペーサーを過ぎて移動され得るヘリカーゼの数を制御するために使用され得る。より長いスペーサーは、より多いヘリカーゼを停止するために使用され得る。トレイリングヘリカーゼがスペーサーを過ぎてリーディングヘリカーゼを押し得ることから、３、４または５つのヘリカーゼなどの２つ以上のヘリカーゼの行列（train）は、より長いスペーサーを過ぎても移動できる。上のＬ１およびＬ２に関連する実施形態は、３、４または５つのヘリカーゼが各スペーサーで停止されるように修飾され得る。例えばポリヌクレオチドに、１個または複数のスペーサーＳおよび、それぞれが３つの（Ｌ３）、４つの（Ｌ４）もしくは５つの（Ｌ５）ヘリカーゼが結合するために十分な長さだけである１つもしくは複数の１本鎖領域または１つもしくは複数の非ハイブリダイズ領域を設けることができる。
【０２３１】
アダプター
本発明は、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのアダプターも提供する。アダプターは、好ましくは標的ポリヌクレオチドを特性決定するためである。アダプターは、（ａ）５’から３’方向で（Ｌ−Ｓ−Ｄ）ｎまたは（Ｄ−Ｓ−Ｌ）ｎ、式中Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、Ｄは２本鎖ポリヌクレオチドであり、式中ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの整数である、および（ｂ）各アダプターで停止された１つまたは複数のヘリカーゼを含む。ｎは好ましくは１、２、３または４である。５’から３’方向は、アダプター中のＬおよびＤポリヌクレオチドの方向を指す。
【０２３２】
１つまたは複数のヘリカーゼは、スペーサーＳの前で、スペーサーＳまでにまたはスペーサーＳ上で停止され得る。
【０２３３】
アダプターは、標的ポリヌクレオチドが上に考察の方法のいずれかにおいて使用され得るように標的ポリヌクレオチドにライゲーションされてよい。
【０２３４】
Ｌは、上に考察したとおりＬ１またはＬ２であってよい。アダプターは、Ｌ１とＬ２との組合せを含んでよい。
【０２３５】
上で考察した全てのスペーサー実施形態は、本方法に等しく適用される。
【０２３６】
Ｌ、ＳおよびＤを参照して上で考察したいずれの実施形態も、本発明のアダプターに等しく適用される。アダプターは、（５’−Ｌ１−Ｓ−Ｄ−３’）ｎ、（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ１−３’）ｎ、（５’−Ｂ−Ｌ１−Ｓ−Ｄ−３’）ｎもしくは（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ１−Ｂ−３’）ｎ、（５’−Ｌ２−Ｓ−Ｄ−３’）ｎ、（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ２−３’）ｎ、（５’−Ｂ−Ｌ２−Ｓ−Ｄ−３’）ｎまたは（５’−Ｄ−Ｓ−Ｌ２−Ｂ−３’）ｎを５’から３’方向で含み得る、式中ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上などの整数である。ｎは好ましくは１、２、３または４である。Ｌ１またはＬ２は、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５で置き換えられる場合がある。
【０２３７】
最も好ましくはｎは１であり、１つまたは２つのヘリカーゼはアダプター上で停止される。
【０２３８】
キット
本発明は、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのキットも提供する。キットは、好ましくは標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのものである。キットは、（ａ）１個または複数のスペーサー、（ｂ）１つまたは複数のヘリカーゼおよび（ｃ）膜貫通ポアを含む。本発明の方法を参照して上で考察した全てのスペーサー実施形態は、本発明のキットに等しく適用される。例えば１個または複数のスペーサーは、標的ポリヌクレオチドにライゲーションでき、ポアに優先的に挿入されるリーダー配列を含むポリヌクレオチドアダプター、好ましくは１本鎖ポリヌクレオチドアダプターの一部であってよい。キットは、上に考察のヘリカーゼおよびポアのいずれかを含んでよい。
【０２３９】
１個または複数のスペーサーおよび１つまたは複数のヘリカーゼは、本発明のアダプターの一部であってよい。
【０２４０】
キットは、脂質二重層などの両親媒性層を形成するために必要なリン脂質などの膜の構成成分をさらに含んでよい。
【０２４１】
本発明のキットは、上に述べた任意の実施形態が実行されるようにする１つまたは複数の他の試薬または器具を追加的に含んでよい。そのような試薬または器具は、次の：好適な緩衝剤（複数可）（水性溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは、針を含む器具など）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現するための手段、上に定義の膜または電圧もしくはパッチクランプ装置、の１つまたは複数を含む。試薬は、液体試料が試薬を再懸濁するように乾燥状態でキット中に存在する場合がある。キットは、キットが本発明の方法において用いられ得るようにする説明書、またはいずれの患者に方法が用いられ得るかに関する詳細も場合により含む場合がある。キットは、ヘリカーゼ移動を促進するために必要な構成成分（例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋）を場合により含んでよい。以下の実施例は、本発明を例示する。
実施例
【実施例１】
【０２４２】
本実施例は、どのようにＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号８）ヘリカーゼが単一のＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るインタクトなＤＮＡ鎖の移動を制御できるかを記載する。ラムダＤＮＡ構築物（配列番号１１にその３’末端に付着されている３個のｉＳｐＣ３スペーサーに付着されている配列番号１０の５’末端に付着されている４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端によって付着している配列番号９、この構築物の配列番号１０領域は配列番号１２（その３’末端に付着した、２つのチミン残基および３’コレステロールＴＥＧに付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーを有する）にハイブリダイズされる）中のｉＳｐＣ３スペーサーをナノポアによって構築物が捕捉されるまで酵素を停止するために使用する。捕捉されると、印加された電位の力が酵素Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを停止スペーサーを過ぎて移動させ、ナノポアを通るラムダ構築物の酵素制御ＤＮＡ移動を可能にする。
【０２４３】
材料および方法
実験を設定する前に、ラムダＤＮＡ構築物（配列番号１１にその３’末端で付着されている配列番号１０の５’末端に付着されている４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端によって付着している配列番号９、この構築物の配列番号１０領域は配列番号１２（３’コレステロールテザーを有する）にハイブリダイズされる）およびＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを緩衝液（２０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ  ＤＴＴ）中１５分間、２３℃で合わせて予備インキュベートした。
【０２４４】
電気測定値を緩衝液（６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）中のブロック共重合体に挿入した単一のＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）から２０℃（実験系を冷却プレートに置くことによって）で得た。ブロック共重合体に挿入された単一ポアを達成した後、緩衝液（１ｍＬ、６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）をいかなる過剰のＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）も除去するために系に流し、最終的に実験用緩衝液を系に流した（２ｍＬ  ９６０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）。ＭｇＣｌ２（最終濃度１０ｍＭ）およびＡＴＰ（最終濃度１ｍＭ）を緩衝液（９６０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）と合わせて混合し、次いでラムダＤＮＡ構築物（最終濃度０．２ｎＭ）、Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（最終濃度１０ｎＭ）緩衝液（２０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ  ＤＴＴ）予備混合物に添加した。次いで予備混合物を単一ナノポア実験系に添加した。実験を電位フリップ（potential flip）工程（＋１００ｍＶを２秒間、次いで０Ｖを２秒間、次いで−１２０ｍＶを１４５００秒間をｃｉｓ側に印加する）の後、４時間実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０２４５】
結果および考察
ＤＮＡ構築物を図１に示す。Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃは、ＤＮＡ構築物と予備インキュベートされる場合、Ａと標識される構築物の領域（配列番号９）に結合できる。しかし酵素は、自由溶液中の場合、停止基を過ぎて運搬（motor）できない（図１においてＢおよびＤと標識される）。したがって、酵素は、ＤＮＡ構築物がナノポアによって捕捉されるまで、ｉＳｐＣ３スペーサー（図１においてＢと標識される）で停止される。ナノポアによって捕捉されると、印加された電位の力が酵素Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを停止スペーサーを過ぎて移動させ、ナノポアを通るラムダ構築物の酵素制御ＤＮＡ移動を可能にする。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の例を図２に示す。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、長さ５１７０秒間であり、ナノポアを通るおよそ３０ｋＢのラムダ構築物の移行に対応する。図３は、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の開始（ａ）および最後（ｂ）領域の拡大を示し、１および２はｉＳｐＣ３スペーサーがヘリカーゼの制御下でナノポアを通って移行する場合を示す。
【実施例２】
【０２４６】
本実施例において使用されるＤＮＡ構築物は、ＭｕＡを使用するラムダＤＮＡの約５〜１０ｋＢ断片への断片化によって生成した。試料調製によって生成した断片を、次いでそれらの移動をヘリカーゼ酵素によって制御して、ナノポアに通した。ヘリカーゼをナノポア全体に印加された電位の力でｄｓＤＮＡ領域（テザーが構築物にハイブリダイズしている）およびスペーサーを過ぎて移動させた。ナノポアを通るマーカーのヘリカーゼ制御移動によって生成された特徴的な遮断の観察は、試料調製手順が成功し、酵素が図４（ｂ）に示すとおり停止されたことを示した。これは、酵素が規定の出発点を有し、ナノポアによって捕捉されるまでｄｓＤＮＡ領域（テザーが構築物にハイブリダイズしている）およびスペーサーを過ぎて移動できなかったことを意味した。
【０２４７】
材料および方法
２．１  Ｙ形およびヘアピンＭｕＡ基質を形成するためのＤＮＡ鎖のアニール
Ｙ形およびヘアピンＭｕＡ基質を下の表５に示すとおり調製した。Ｙ形およびヘアピンＭｕＡ基質を形成するためにＤＮＡを含有する試料混合物を次いで９５℃に、２分間加熱し、次いで１分間あたり２℃の速度で１６℃に冷却した。これは、配列番号１４および１５（配列番号１４はその３’末端で４個のｉＳｐＣ３スペーサー単位によって配列番号１５の５’末端に付着されている）をＹ形ＭｕＡ基質を形成するように配列番号１９および９（配列番号１９はその３’末端で４個のｉＳｐＣ３スペーサー単位によって配列番号９の５’末端に付着されている）にアニールさせ、配列番号１９および２０（配列番号１９はその３’末端で４個のｉＳｐＣ３スペーサー単位によって配列番号１５の５’末端に付着されている）についてはヘアピンループＭｕＡ基質を形成した。形成された２つのＭｕＡ基質のＤＮＡ基質設計を図４（ａ）に示す。
【０２４８】
【表５】
0006408494.tif 000006
【０２４９】
２．２  ＭｕＡトランスポサーゼを使用するＤＮＡテンプレートの断片化
２本鎖ラムダＤＮＡ（配列番号１３はセンス鎖の配列に対応する）をＭｕＡトランスポサーゼを使用して長さおよそ５〜１０ｋＢ鎖に断片化した。ＭｕＡトランスポサーゼはセクション３．１においてアニールしたＭｕＡ基質（Ｙ形およびヘアピンＭｕＡ基質）を挿入した。試料を下の表６に示すとおり調製した。次いで試料を３０℃で、１時間インキュベートし、７５℃で、１０分間熱不活性化した。次いで試料をＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してさらに精製し、２６μＬで溶出した。
【０２５０】
【表６】
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【０２５１】
２．３  挿入されたＭｕＡ基質を含む断片化ラムダＤＮＡのＵＳＥＲ消化
ステップ３．２からの精製試料容積１を次いで配列番号１９からｄＵＭＰを除去するためにＵＳＥＲ（商標）消化で処置した。適切な容積および濃度について下の表７を参照されたい。次いで試料を氷塊で冷却する前に３７℃で、３０分間インキュベートした。
【０２５２】
【表７】
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【０２５３】
２．４  ２本鎖ラムダＤＮＡ構築物断片中の１本鎖ギャップの修復
ＵＳＥＲ（商標）での処置後に生成された試料容積２を次いで１本鎖ギャップを閉じるためにＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼで処置した。試料容積３（適切な容積および濃度について下の表８を参照されたい）を３０分間、１６℃でインキュベートし、次いでＥＤＴＡ（０．５Ｍ、１０μＬ）を試料容積３に添加した。次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キットを水５０μＬで溶出された各試料を精製するために使用した。精製試料のアリコート（１μＬ）を試料を定量するためにＡｇｉｌｅｎｔ１２０００チップにかけ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を残りの試料に濃度がそれぞれ１０ｍＭおよび５０ｍＭになるまで添加した。最後に、配列番号１６（配列の３’末端は２つのチミン残基および３’コレステロールＴＥＧに付着した６個のｉＳｐ１８スペーサーを有する、０．５μＭ）を精製試料にアニールした。
【０２５４】
【表８】
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【０２５５】
２．５  精製および断片化したラムダＤＮＡ構築物のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す電気生理学実験
実験を設定する前に、ラムダＤＮＡ構築物（０．２ｎＭ、断片のいずれかの末端にＭｕＡトランスポサーゼによって付着したＹ形ＭｕＡ基質およびヘアピンＭｕＡ基質を有するラムダＤＮＡの５〜１０ｋＢ断片（例示的構築物については図４（ｂ）を参照されたい））ならびにＴｒｗｃ  Ｃｂａ（配列番号９、１μＭ）を合わせて緩衝液（５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０（ＮａＯＨの添加によってｐＨをｐＨ１０．０に変更した）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で１時間予備インキュベートした。
【０２５６】
電気測定値を緩衝液（６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）中のブロック共重合体に挿入した単一のＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）から得た。二重層中での単一ポアを達成した後、緩衝液（１ｍＬ、６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）をいかなる過剰のＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）も除去するために系を通して流し、実験系を系の温度を約１５℃にする８℃に設定した冷却プレートに置いた。ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびｄＴＴＰ（５ｍＭ）を緩衝液（６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）と合わせて混合し、次いでラムダＤＮＡ構築物（０．２ｎＭ）、Ｔｒｗ  ｃＣｂａ（配列番号９、１μＭ）緩衝液（５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０（ＮａＯＨの添加によってｐＨをｐＨ１０．０に変更した）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）予備混合物に添加した。予備混合物を次いで単一ナノポア実験系に添加した。実験を電位フリップ工程（＋１２０ｍＶを３０分間、次いで−１００ｍＶを２秒間、次いで０ｍＶを２秒間）の後、２時間実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０２５７】
２．６  結果および考察
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をラムダＤＮＡ構築物について観察し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の例を図５に示す。ラムダＤＮＡ構築物中に存在するｉＳｐＣ３スペーサーは、図５において数字１、２および３によって強調される特徴的な遮断レベルを生成した。Ｙ形ＭｕＡ基質は、４個のｉＳｐＣ３スペーサーをいずれかの鎖に有し、ヘアピンＭｕＡ基質も４個のｉＳｐＣ３スペーサーを有し、各ｉＳｐＣ３スペーサーはラムダＤＮＡ構築物のその領域がナノポアを通って移行する際に、より多い電流が流れるようにする。試料調製が成功すると、次いでｉＳｐＣ３スペーサー事象が、ラムダＤＮＡ構築物の開始時、途中（センスとアンチセンス配列との間の移行を示す）および最後に観察される。図５は、ｉＳｐＣ３スペーサー領域に対応する電流の増加の３つの場合を明らかに示す。したがって試料調製手順は、図４（ｂ）に示すラムダＤＮＡ構築物を生成するためにＭｕＡ基質をラムダＤＮＡに効率的に導入した。ナノポアによるＤＮＡの捕捉で、酵素（Ａと標識される）はナノポア全体に印加された電位の力でｄｓＤＮＡ領域（テザーが構築物にハイブリダイズしている）およびスペーサーを過ぎて移動される。
【実施例３】
【０２５８】
本実施例において使用されるＤＮＡ構築物をＭｕＡを使用するラムダＤＮＡの約５〜１０ｋＢ断片への断片化によって生成した。本実施例は、実施例２に記載のものに類似しているが、本実施例ではトランスポサーゼ配列がイノシンを含有するため、試料調製手順が異なる（上に記載のステップ２．３および２．４は必要ない）。酵素は、ナノポア全体に印加された電位の力でｄｓＤＮＡ領域およびスペーサーを過ぎて移動された。
【０２５９】
材料および方法
３．１  Ｙ形およびヘアピンＭｕＡ基質を形成するためのＤＮＡ鎖のアニール
Ｙ形２およびヘアピン２ＭｕＡ基質を上の実施例２．１に記載のとおり調製した。本実施例において使用した容積、濃度および配列を下の表９に詳述する。形成した２つの構築物のＤＮＡ基質設計を図６（ａ）に示す。
【０２６０】
【表９】
0006408494.tif 000010
【０２６１】
３．２  ＭｕＡトランスポサーゼを使用するＤＮＡテンプレートの断片化
２本鎖ラムダＤＮＡ（配列番号１３はセンス鎖だけの配列を示す）をＭｕＡトランスポサーゼを使用して長さおよそ５〜１０ｋＢ鎖に断片化した。ＭｕＡトランスポサーゼをセクション３．１においてアニールしたＭｕＡ基質（Ｙ形２およびヘアピン２ＭｕＡ基質）に挿入した。使用したＭｕＡ基質がＹ形２およびヘアピン２ＭｕＡ基質であることを除いて上のセクション２．２および表６に記載のものに類似の手順によって試料を調製した。この場合精製試料Ｘは、２０μＬの容積で溶出された。
【０２６２】
３．３  ２本鎖ラムダＤＮＡ構築物断片におけるニック修復
Ｙ形２およびヘアピン２ＭｕＡ基質が断片化ラムダＤＮＡに挿入されると、完全な２本鎖ラムダＤＮＡ断片を生成するために鎖中のニックを修復し、イノシンをラムダＤＮＡ断片に連結する必要がある。下の表１０に記載のとおり１つの反応を氷上で構築した。ＥＤＴＡ（１０μＬ、０．５Ｍ）を試料に添加する前に試料を１６℃で、６０分間インキュベートした。得られた試料混合物をＱｉａＱｕｉｃｋ（商標）精製を使用して精製し、水５０μＬ中に溶出した。精製試料のアリコート（１μＬ）を試料を定量するためにＡｇｉｌｅｎｔ１２０００チップにかけ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を残りの試料に濃度がそれぞれ１０ｍＭおよび５０ｍＭになるまで添加した。最後に配列番号１６（配列の３’末端は２つのチミン残基および３’コレステロールＴＥＧに付着した６個のｉＳｐ１８スペーサーを有する、０．５μＭ）を精製ラムダＤＮＡ構築物にアニールした。
【０２６３】
【表１０】
0006408494.tif 000011
【０２６４】
３．４  精製および断片化したラムダＤＮＡ構築物のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す電気生理学実験
実験を設定する前に、ラムダＤＮＡ構築物（０．２ｎＭ、断片のいずれかの末端にＭｕＡトランスポサーゼによって付着したＹ形２およびヘアピン２ＭｕＡ基質を有するラムダＤＮＡの５〜１０ｋＢ断片（例示的構築物については図６（ｂ）を参照されたい））ならびにＴｒｗｃ  Ｃｂａ（配列番号１７、１μＭ）を合わせて緩衝液（５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０（ＮａＯＨの添加によってｐＨをｐＨ１０．０に変更した）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で１時間予備インキュベートした。
【０２６５】
電気測定値を緩衝液（６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）中のブロック共重合体に挿入した単一のＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）から得た。二重層中での単一ポアを達成した後、緩衝液（３ｍＬ、６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）をいかなる過剰のＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）も除去するために系を通して流し、実験系を系の温度を約１５℃にする８℃に設定した冷却プレートに置いた。ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびｄＴＴＰ（５ｍＭ）を緩衝液（６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）と合わせて混合し、次いでラムダＤＮＡ構築物（０．２ｎＭ）、Ｔｒｗｃ  Ｃｂａ（配列番号１７、１μＭ）緩衝液（５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０（ＮａＯＨの添加によってｐＨをｐＨ１０．０に変更した）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）予備混合物に添加した。予備混合物を次いで単一ナノポア実験系に添加した。実験を電位フリップ工程（＋１２０ｍＶを３０分間、次いで−１００ｍＶを２秒間、次いで０ｍＶを２秒間）の後、２時間実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０２６６】
３．５  結果および考察
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をラムダＤＮＡ構築物について観察し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の例を図７に示す。ラムダＤＮＡ構築物に存在するｉＳｐＣ３スペーサーは、図７において数字１〜３によって強調される特徴的な遮断レベルを生成した。Ｙ形２ＭｕＡ基質は、いずれかの鎖に４個のｉＳｐＣ３スペーサーを有し、ヘアピン２ＭｕＡ基質も４個のｉＳｐＣ３スペーサーを有し、各ｉＳｐＣ３スペーサーはラムダＤＮＡ構築物のその領域がナノポアを通って移行する際により多い電流を流れるようにする。試料調製が成功すると、次いでｉＳｐＣ３スペーサー事象が、ラムダＤＮＡ構築物の開始時、途中（センスとアンチセンス配列との間の移行を示す）および最後に観察される。図７は、ｉＳｐＣ３スペーサー領域に対応する電流の増加の３つの場合を明らかに示す。したがって試料調製手順は図６（ｂ）に示すラムダＤＮＡ構築物を生成するためにＭｕＡ基質をラムダＤＮＡに効率的に導入した。ナノポアによるＤＮＡの捕捉で、酵素（Ａと標識される）はナノポア全体に印加された電位の力でｄｓＤＮＡ領域（テザーが構築物にハイブリダイズしている）およびスペーサーを過ぎる。Ｙ形２およびヘアピン２ＭｕＡ基質中のイノシンの使用により、試料調製手順におけるステップは、ＭｕＡ基質が挿入されると必要なことは２本鎖ＤＮＡ構築物中のニックを閉じるだけであることから低減された。
【実施例４】
【０２６７】
本実施例は、インタクトなＤＮＡ鎖（配列番号２３の５’末端に付着しているのは２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー基の５’末端に付着している追加的な２つのＴ’を有する、配列番号２３の３’末端に付着しているのは配列番号２４の５’末端に付着されているさらなる４個のｉＳｐＣ３スペーサーであり、ここで配列番号１２は配列番号２３の領域にハイブリダイズされる）のナノポアを通る移動を制御するＴｒｗＣ  Ｃｂａモノマー（配列番号１７）の能力を、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（各モノマー単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号１７を含み、１つのモノマー単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各モノマー単位の位置２７６を介して他に連結されている）のものと比較する。本実施例において使用されるＤＮＡ構築物を図２２に示す（ヘリカーゼは、Ｂと標識される領域に結合できる）。ＤＮＡ構築物がナノポアによって捕捉されると、ナノポア全体に印加された電位がｄｓＤＮＡ領域（テザーが構築物にハイブリダイズしている）およびスペーサーを過ぎて酵素を移動し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動が観察される。
【０２６８】
二量体を有するモノマーのヘリカーゼ制御移動の比較において、モノマーよりも二量体が長い残存（dwell）ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動（長い残存移動は、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の大部分の平均から３標準偏差より多く離れたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動である）の大きな百分率を生じたことが観察された。
【０２６９】
材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ（１ｎＭ、配列番号２３の５’末端に付着しているのは２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー基の５’末端に付着した追加的な２つのＴを有する、配列番号２３の３’末端に付着しているのは配列番号２４の５’末端に付着されているさらなる４個のｉＳｐＣ３スペーサーであり、ここで配列番号１２は配列番号２３の領域にハイブリダイズされる）および酵素（ＴｒｗＣ  Ｃｂａモノマー（１ｎＭ、配列番号１７）またはＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（０．３ｎＭ、ここで各モノマー単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号１７を含み、１つのモノマー単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各モノマー単位の位置２７６を介して他に連結されている）のいずれか）を合わせて＞１６時間、予備インキュベートした。
【０２７０】
電気測定値を緩衝液（６２５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）中のブロック共重合体に挿入した単一のＭｓｐＡナノポアＭＳ（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む配列番号２）から得た。ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびｄＴＴＰ（５ｍＭ）を緩衝液（６２５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）と合わせて混合し、次いでＤＮＡ（既に記載の構築物）、酵素予備混合物（ＴｒｗＣ  Ｃｂａモノマー（１ｎＭ、配列番号１７）またはＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（１ｎＭ、ここで各モノマー単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号１７を含み、１つのモノマー単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各モノマー単位の位置２７６を介して他に連結されている）のいずれか）に添加した。二重層中での単一ポアを達成した後、予備混合物を単一ナノポア実験系に添加した。実験を＋１２０ｍＶの一定電位で実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０２７１】
結果および考察
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をヘリカーゼＴｒｗＣ  Ｃｂａモノマー（配列番号１７）およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各モノマー単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号１７を含み、１つのモノマー単位は３．４ｋＤａ  ＰＥＧリンカーを使用して各モノマー単位の位置２７６を介して他に連結されている）について観察した。ナノポアによるＤＮＡ構築物の捕捉で、ヘリカーゼは、ｄｓＤＮＡ領域（テザーが構築物にハイブリダイズしている）およびスペーサーを過ぎて移動され、ヘリカーゼ制御移動を観察した。
【０２７２】
観察されたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に、検出された移動のおよそ約９５％を占める主な集団があるが、少数の百分率の残存時間が顕著に長い（ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の大部分の平均から３標準偏差より多く離れている）移動がある。これらのより長い移動は、データ分析の改善を可能にする。ＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（１ｎＭ）をＤＮＡ移動を制御するために使用した場合、これらのより長い残存時間移動（ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の大部分の平均から３標準偏差より多く離れている）のずっとより高い百分率（ＴｒｗＣ  Ｃｂａモノマーについての５％と比較してＴｒｗＣ  Ｃｂａ  Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体について２０％）が観察された。二量体ヘリカーゼの使用は、それがナノポア配列決定系においてデータ分析の改善を可能にすることから、モノマーを越える利益を提供する。
【実施例５】
【０２７３】
本実施例は、Ｓｐ９スペーサー単位が酵素活性を検査するための蛍光に基づくアッセイにおいてＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号２８）（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２の両方と提供される場合に）の移動を停止するために使用できることを例示する。
【０２７４】
材料および方法
３種の異なる通例の蛍光基質（Ａ＝（スペーサーを含有しない対照鎖）配列番号２５および２６、Ｂ＝（単一のＳｐ９スペーサーを含有する鎖）その３’末端で１個のＳｐ９スペーサーによって配列番号２９の５’末端に付着し、配列番号２６にハイブリダイズされる配列番号２７、Ｃ＝（４つのＳｐ９を含有する鎖）その３’末端で４個のＳｐ９スペーサーによって配列番号２９の５’末端に付着し、配列番号２６にハイブリダイズする配列番号２７）をハイブリダイズしたｄｓＤＮＡを置換するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号２８）の能力をアッセイするために使用した。ＦＡＭ標識ＤＮＡ（蛍光基質についてＡ＝配列番号２５、Ｂ＝その３’末端で配列番号２９の３’末端に付着された１個のｓｐ９スペーサーに付着された配列番号２７、Ｃ＝その３’末端で配列番号２９の３’末端に付着された４個のｓｐ９スペーサーに付着した配列番号２７）をその３’末端（配列番号２６）に付着したブラックホールクエンチャーを有する部分相補鎖に、４００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中で１対１の比で（各鎖１ｕＭ）アニールする。鎖を室温で、３０分間アニールした。アニールされたＤＮＡ（Ａ＝配列番２５および２６、Ｂ＝その３’末端で１個のＳｐ９スペーサーによって配列番号２９の５’末端に付着し、配列番号２６にハイブリダイズする配列番号２７、Ｃ＝その３’末端で４個のＳｐ９スペーサーによって配列番号２９の５’末端に付着し、配列番号２６にハイブリダイズする配列番号２７）を４００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＡＴＰ（１ｕＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号２７も存在する）中で５０ｎＭに希釈した。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号２８）の試料を４００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中で４７５ｎＭに希釈した。次いでＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（１２ｎＭ）を４００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．９７５ｍＭ  ＡＴＰ（０．９７５ｕＭ捕捉ＤＮＡも存在する）中で４８．７５ｎＭアニールしたＤＮＡに対してアッセイした（下に記載し、図８および９に示すとおり）。
【０２７５】
対照鎖Ａを図８に示す、１Ａ）において蛍光基質鎖（最終４８．７５ｎＭ）は、３’ｓｓＤＮＡオーバーハング、およびハイブリダイズしたｄｓＤＮＡの４０塩基セクションを有する。３’ｓｓＤＮＡオーバーハングを含有する上部鎖は、配列番号２５の５’末端に付着したカルボキシフルオレセイン塩基を有し、ハイブリダイズした相補物は、配列番号２６の３’末端に付着したブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基を有する。ハイブリダイズされると、フルオレセイン由来の蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は基本的に非蛍光性である。蛍光基質の下部鎖に部分相補的である捕捉鎖（配列番号２７）１μＭがアッセイに含まれる。２Ａ）に示されるとおりＡＴＰ（０．９７５ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）の存在下で基質に添加されたヘリカーゼ（１２ｎＭ）は、蛍光基質の３’テールに結合し、上部鎖に沿って移動し、相補鎖を置換する。３Ａ）に示すとおり、ＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると、主要な鎖上のフルオレセインは蛍光を発する。４Ａ）に示すとおり、置換された鎖は過剰量の捕捉鎖に優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ。図９は、鎖Ｂ（１Ｂ〜３Ｂ）およびＣ（１Ｃ〜３Ｃ）についてのアッセイのステップを示し、これらの鎖についてＳｐ９スペーサーはヘリカーゼを停止し、フルオレセインを有する鎖が付着したブラックホールクエンチャーを有する鎖から分離されることを防ぐ。
【０２７６】
結果および考察
図１０中のグラフは、緩衝溶液（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、０．９７５ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、４８．７５ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（上に考察したとおり基質Ａ、ＢおよびＣ）、０．９７５μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号２７））中、４００ｍＭ  ＫＣｌでのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（図８および９においてＡと標識、配列番号２８）についての活性の初期速度を示す。調査した塩濃度では、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号２８）は、対照鎖ＡのｄｓＤＮＡ代謝回転を示した。しかし図１０は、配列（Ｂ（１個のＳｐ９スペーサー）およびＣ（４個のＳｐ９スペーサー））中にＳｐ９スペーサーを有する両方の構築物について、ｄｓＤＮＡ代謝回転が無効にされたことを明らかに示している。これは、ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２の存在下でＳｐ９スペーサーが自由溶液中でＨｅｌ３０８Ｍｂｕ酵素を停止することを示す。
【実施例６】
【０２７７】
本実施例は、ｉｄＳｐ基を酵素活性を検査するための蛍光に基づくアッセイにおいてＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号２８）（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２の両方と提供される場合に）の移動を停止するために使用できることを例示する。
【０２７８】
材料および方法
４種の異なる通例の蛍光基質（Ｄ＝（スペーサーを含有しない対照鎖）配列番号３２および２６、Ｅ＝（単一のｉｄＳｐスペーサーを含有する鎖）その３’末端で１つのｉｄＳｐ基によって配列番号３０の５’末端に付着し、配列番号２６にハイブリダイズする配列番号２７、Ｆ＝（４つのｉｄＳｐを含有する鎖）その３’末端で４つのｉｄＳｐ基によって配列番号３１の５’末端に付着し、配列番号２６にハイブリダイズする配列番号２７およびＧ＝（スペーサーを含有しない第２の対照鎖）配列番号３３および２６）をハイブリダイズしたｄｓＤＮＡを置換するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号２８）の能力をアッセイするために使用した。ＦＡＭ標識ＤＮＡ（蛍光基質についてＤ＝配列番号３２、Ｅ＝その３’末端で配列番号３０の３’末端に付着された１つのｉｄＳｐ基に付着した配列番号２７、Ｆ＝その３’末端で配列番号３１の３’末端に付着された４つのｉｄＳｐ基に付着した配列番号２７およびＧ＝配列番号３３）をその３’末端（配列番号２６）に付着したブラックホールクエンチャーを有する部分相補鎖に、４００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中で１対１．２の比で（１：１．２μＭ）アニールする。鎖を室温で、１５分間アニールした。アニールされたＤＮＡ（Ｄ＝配列番号３２および２６、Ｅ＝その３’末端で１つのｉｄＳｐ基によって配列番号３０の５’末端に付着し、配列番号２６にハイブリダイズする配列番号２７、Ｆ＝その３’末端で４つのｉｄＳｐ基によって配列番号３１の５’末端に付着し、配列番号２６にハイブリダイズする配列番号２７ならびにＧ＝配列番号３３および２６）を４００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＡＴＰ（１ｕＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号２７も存在する）中で５０ｎＭに希釈した。次いでＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（１２ｎＭ）を４００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．９７５ｍＭ  ＡＴＰ（０．９７５ｕＭ捕捉ＤＮＡも存在する）中で４８．７５ｎＭアニールしたＤＮＡに対してアッセイした（（ＤＮＡ構築物が異なり、Ｓｐ９スペーサーの代わりにｉｄＳｐ基を含有することを除いて）実施例５において既に記載ならびに図８および９に示すとおり（再びこれらの図においてＳｐ９基はｉｄＳｐ基によって置き換えられている））。
【０２７９】
結果および考察
図１１中のグラフは、緩衝溶液（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、０．９７５ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、４８．７５ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（上に考察したとおり基質Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）、０．９７５μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号２７））中、４００ｍＭ  ＫＣｌでのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（図８および９においてＡと標識、配列番号２８）についての活性の初期速度を示す。調査した塩濃度では、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号２８）は、対照鎖ＤおよびＧのｄｓＤＮＡ代謝回転を示した。しかし図１１は、配列（Ｆ）中に４個のｉｄＳｐスペーサーを有する構築物について、ｄｓＤＮＡ代謝回転が無効にされたことを明らかに示している。これは、ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２の存在下で４つのｉｄＳｐ基が自由溶液中でＨｅｌ３０８Ｍｂｕ酵素を停止することを示す。
【実施例７】
【０２８０】
本実施例は、Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃの移動を停止するｉＳｐＣ３スペーサーおよびｉＳｐ１８スペーサーの能力を測定するために使用されたゲルに基づくアッセイを例示する。
【０２８１】
材料および方法
アニールされたＤＮＡ複合体（検査した配列は下の表１１に示す）をＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（２０００ｎＭ）およびＤＮＡ（１００ｎＭ）の最終濃度をもたらすようにＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃと（１：１、ｖ／ｖ）の比で２５ｍＭリン酸ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＫＣｌ中で混合した。ヘリカーゼは、２時間、周囲温度でＤＮＡに結合させた。捕捉鎖（配列番号３７、２０μＭ）を各試料に任意の未結合酵素に結合するように添加し、試料を周囲温度で、３０分間インキュベートした。緩衝液を試料（表１１からのＤＮＡ構築物＝５０ｎＭ、捕捉ＤＮＡ（配列番号３７）＝１０μＭおよびＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ＝１０００ｎＭ）に添加し、周囲温度で１時間インキュベートした（緩衝液１＝２５ｍＭリン酸ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＡＴＰまたは緩衝液２＝２５ｍＭリン酸ｐＨ８．０、１Ｍ  ＫＣｌ、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、７５ｍＭフェロシアン化カリウム、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＡＴＰのいずれか）。ローディング緩衝液（２５ｍＭリン酸ｐＨ８．０、１５１．５ｍＭ  ＫＣｌ、２５％グリセロール、１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ）をヘリカーゼ活性を消光するために各試料に添加する。試料を４〜２０％ＴＢＥゲルにロードし、ゲルを１６０Ｖ、１．５時間実行した。次いでゲルをＤＮＡバンドを観察するためにＳＹＢＲゴールドで染色した。
【０２８２】
【表１１】
0006408494.tif 000012
【０２８３】
結果および考察
図１２は、ＤＮＡ構築物がヘリカーゼ（Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ）を停止するためのスペーサーを含有しない陽性対照実験のゲルを示す。図１４のレーン２は、５つまでのヘリカーゼ酵素が配列番号３４の１本鎖セクションに結合できることを示している。ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２の添加で、複数の酵素に結合しているｄｓＤＮＡ構築物に対応するさらに高いバンドは消え、ｓｓＤＮＡ構築物（Ｘと標識され、配列番号３４だけに対応する）に対応するバンドは強度が増加している。これは、ヘリカーゼが燃料と共に提供される場合、それはＤＮＡに沿って移動し、ハイブリダイズされた相補鎖（配列番号３５）を置換することを示す。
【０２８４】
図１５は、表１１のＤＮＡ構築物７〜９についての（例えばｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡ接合部の直前に３個、４個または５個のｉＳｐ１８スペーサーを有するＤＮＡ）酵素活性実験を示すゲルの例を示す。レーン１〜４は３個のｉＳｐ１８スペーサーに対応し、レーン５〜７は４個のｉＳｐ１８スペーサーに対応し、レーン９〜１２は５個のｉＳｐ１８スペーサーに対応する。レーン２、６および１０は、対照と同様に、５つまでのヘリカーゼ酵素が表１１のＤＮＡ構築物７〜９の１本鎖セクションに結合できることを示している。ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２の添加でヘリカーゼは、ＤＮＡ鎖に沿って移動するために必要な構成成分と共に提供される、レーン３〜４、７〜８および１１〜１２は、ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２の添加後の２つの異なる緩衝液条件下（緩衝液１および２）での種々のＤＮＡ構築物を示す。２つのバンドが１Ｙおよび１Ｘと標識される領域に明らかに見られる。１Ｙは、停止され、結合した１つのヘリカーゼを含むｄｓＤＮＡ構築物に対応する。これは、検査した条件下で３個、４個および５個のｉＳＰ１８スペーサーがヘリカーゼを停止できることを示す。１Ｘは、停止され、結合した１つのヘリカーゼを含むｓｓＤＮＡ構築物に対応する。このバンドは、ＤＮＡ構築物に結合している複数のヘリカーゼから生じ、ヘリカーゼは停止基を過ぎて先頭のヘリカーゼを押し、それにより短い相補鎖（配列番号３５）を置換する。しかしこのバンドは、単一のヘリカーゼがｉＳｐ１８スペーサー（例えば図１３結果における化学種Ｅ）を過ぎて移動できないことから、１つのヘリカーゼ結合をまだ有する。ヘリカーゼを停止するために４個および５個のｉＳｐ１８スペーサーが使用される場合、レベル２Ｙにかすかなバンドがある。これは検査した条件下では、４／５個のｉＳｐ１８スペーサーが使用される場合、２つまでのヘリカーゼの移動を停止できることを示している。
【０２８５】
検査した緩衝液条件の少なくとも１つにおいて調査した他のスペーサー組合せ（表１１の登録２〜６）で、ｉＳｐＣ３およびｉＳｐ１８スペーサーの両方は、１つのヘリカーゼを停止できた。検査した２つの緩衝液条件で、一般に緩衝液１よりも緩衝液２についてさらに効率的な停止が観察された。検査した条件下では含まれるスペーサーの数が多いほど、ヘリカーゼの停止はより効率的になる。
【実施例８】
【０２８６】
本実施例は、具体的な領域において１つまたは２つだけのＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼの結合を制御するために必要な塩基の数を調査する。
【０２８７】
材料および方法
下の表１２に詳述するＤＮＡ構築物（最終濃度１μＭまたは１００ｎＭ）を、系列希釈したＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを含む適切な緩衝液中でインキュベートした。次いで試料を４〜２０％ＴＢＥゲルにロードし、１６０Ｖ、９０分間で実行した。次いで登録１〜６を含有するゲルをＳＹＢＲを使用して染色した。図１６は、本実験において使用したＤＮＡ構築物の種類を示す。１と標識される領域の長さは、条件を最適化するために２から５０に変更し、それによりＤＮＡに結合できるＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼの数を制御できる。
【０２８８】
【表１２】
0006408494.tif 000013
0006408494.tif 000014
【０２８９】
結果および考察
表１２に列挙するＤＮＡ構築物それぞれを、２塩基から５０塩基で変化した領域１（図１６に示す）にいくつの酵素が結合できるかを決定するために調査した。検査したそれぞれのＤＮＡ構築物について、ヘリカーゼを添加しない場合に未結合ＤＮＡに対する単一のバンドだけが観察された。調査した条件下では、構築物４（２つのチミン塩基の結合領域を有する）および構築物５（４つのチミン塩基の結合領域を有する）は、いずれの濃度でもいずれのヘリカーゼも結合させることが観察されなかった（表１４を参照されたい）。構築物６（８つのチミン塩基の結合領域を有する、表１４を参照されたい）および構築物１（１０個のチミン塩基の結合領域を有した）は、１つのヘリカーゼだけが結合することが観察された（表１３を参照されたい）。２０個のチミン塩基の結合領域を有する構築物２は、検査したより高い濃度で２つの酵素を結合させ、５０個のチミン塩基の結合領域を有する構築物３は、検査した最も高い濃度で６つまでの酵素を結合させた（本実験を示すゲルについて図１７を参照されたい、表１３を参照されたい）。構築物１〜６は、ｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡ領域の接合部でのヘリカーゼの結合を防ぐためにｉＳｐＣ３スペーサーを使用した。構築物７および８は、ｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡ領域の接合部でのヘリカーゼの結合を防ぐためにｉＳｐ１８スペーサーを使用した。構築物７（１６個のチミンの結合領域を有する）および構築物８（１８個のチミンの結合領域を有する）両方は、検査した条件下で２つまでのヘリカーゼの結合を可能にした（表１５を参照されたい）。したがって８つのチミン塩基長より大きい結合領域は、少なくとも１つの酵素をＤＮＡ構築物に結合させる。
【０２９０】
【表１３】
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【０２９１】
【表１４】
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【０２９２】
【表１５】
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【実施例９】
【０２９３】
本実施例は、ＤＮＡ構築物Ｘ（図１８に記載し、示す）に添加した場合に２つのヘリカーゼの結合を生じるＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼの濃度を調査する。
【０２９４】
材料および方法
２つのＤＮＡ構築物を分岐していないＤＮＡの相補鎖を有するもの（配列番号４２は図１８に示すＤＮＡ構築物にハイブリダイズされる）、および分岐しているもの（配列番号１２（３’末端に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーを有する）は図１８に示すＤＮＡ構築物にハイブリダイズされる）について検査した。表１６に示すＤＮＡ鎖を２５ｍＭリン酸ｐＨ８．０、１５１５．５ｍＭ  ＫＣｌ中１μＭでアニールした（配列番号４３（下の登録では９および１０）ならびに配列番号１２（下の登録１０）または配列番号４２（下の登録９）の相補鎖の１０％過剰を使用した）。
【０２９５】
【表１６】
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【０２９６】
Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを２５ｍＭリン酸ｐＨ８．０、１５１．５ｍＭ  ＫＣｌに緩衝液交換し、系列希釈した。次いでヘリカーゼおよびＤＮＡを上に記載のＤＮＡ構築物試料９および１０と混合した（１：１、ｖ／ｖ）（最終濃度ＤＮＡ＝１００ｎＭ、調査したヘリカーゼ濃度＝３８００ｎＭ、１９００ｎＭ、９５０ｎＭ、４７５ｎＭ、２３８ｎＭ、０ｎＭ）。次いでＤＮＡおよび酵素容積を周囲温度で、１．５時間インキュベートした。色素不含有ローディング緩衝液（５×、７．５μＬ）を各試料（３０μＬ）に添加した。次いで各試料（３７．５μＬ）を４〜２０％ＴＢＥゲルにロードし、１６０Ｖ、９０分間で実行した。次いでゲルをＳＹＢＲを使用して染色した。
【０２９７】
結果および考察
表１６に列挙した２つのＤＮＡ構築物を、２つのヘリカーゼの結合を促進するためにＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼのどのような濃度が必要であるかを決定するために調査した。検査したそれぞれのＤＮＡ構築物について、ヘリカーゼを添加しない場合に未結合ＤＮＡについての単一のバンドだけが観察された。調査した条件下では、両方の構築物９（非分岐構築物）および１０（分岐）は、２３８ｎＭヘリカーゼからはヘリカーゼ１つ、および４７５ｎＭ以上からは酵素２つの結合を観察した。酵素の濃度が増大すると酵素２つの結合に対応するバンドの強度が増加した。図１８に示すＤＮＡ構築物の設計は、３８００ｎＭの高い濃度で酵素２つの結合だけを可能にする。したがって調査したスペーサーは、構築物が予備インキュベートされる場合、ヘリカーゼをそれらに結合させない。
【実施例１０】
【０２９８】
本実施例は、構築物（ＤＮＡ構築物Ｘ１）がナノポアによって捕捉されるまで、自由溶液中でＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃが４個のｉＳｐ１８スペーサーによってどのように停止されるかを示す。捕捉されると、印加された電位の力は酵素Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを停止スペーサーを過ぎて移動させ、ナノポアを通るラムダ構築物の酵素制御ＤＮＡ移動を可能にする。
【０２９９】
材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ構築物Ｘ１（０．１３μＬ、１００ｎＭ）およびＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（１５．６μＬ、２５０ｎＭ）を合わせて緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、２５３ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０）中で１時間、室温で予備インキュベートした。
【０３００】
電気測定値を緩衝液（６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）中のブロック共重合体に挿入した単一のＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）から３０℃で（実験系を冷却プレートに置くことによって）得た。ブロック共重合体に挿入された単一ポアを達成した後、緩衝液（１ｍＬ、６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）をいかなる過剰のＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）も除去するために系に流した。フェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）（最終濃度２００μＭ）をＤＮＡ（最終濃度０，１ｎＭ）酵素（最終濃度３ｎＭ）予備混合物に添加し、ＭｇＣｌ２（最終濃度１０ｍＭ）およびＡＴＰ（最終濃度１ｍＭ）を緩衝液（１２６０μＬ、６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）と合わせて混合する前に１分間インキュベートした。この実験混合物を次いで単一ナノポア実験系に添加した。実験を電位フリップ工程（＋１８０ｍＶを２秒間、次いで０Ｖを２秒間、次いで−１２０ｍＶを３６００秒間（×６回反復）をｃｉｓ側に印加する）の後、６時間実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０３０１】
結果および考察
ＤＮＡ構築物を図２０に示す。Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃは、ＤＮＡ構築物と予備インキュベートした場合、Ａと標識される構築物の領域（配列番号９）に結合できる。しかし酵素は、自由溶液中での場合、停止基（４個のｉＳｐ１８スペーサー）を過ぎて運搬できない（黒四角と標識される）。したがって酵素は、ＤＮＡ構築物がナノポアによって捕捉されるまで、ｉＳｐ１８スペーサー（図１においてＢと標識される）で停止される。ナノポアによって捕捉されると、印加された電位の力が酵素Ｔ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを停止スペーサー（４個のｉＳｐ１８スペーサー）を過ぎて移動させ、ナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｘ１構築物の酵素制御ＤＮＡ移動を可能にする。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の例を図２１に示す。１と標識されるセクションは、ヘリカーゼの制御下で配列番号３８のｐＴ領域がナノポアを通って移行する場合を示した。２と標識されるセクションは、ｉＳｐ１８スペーサーがヘリカーゼの制御下でナノポアを通って移行する場合を示した。観察されたヘリカーゼ事象がｐＴ領域およびヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の開始時にｉＳｐ１８シグナルを示したことから、ヘリカーゼは、規定の出発点（ｉＳｐ１８スペーサーによるヘリカーゼの停止から生じる）を有することが観察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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