(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）流路と、
（ｂ）レーザ光源と、
（ｃ）（１）音響光学偏向器、及び、
（２）前記レーザ光源から第１の周波数シフトされた光ビームを発生させるために前記音響光学偏向器に作動的に結合された無線周波数コム発生器
を備えた第１のビーム発生器と、
（ｄ）（１）音響光学周波数シフタ、及び、
（２）前記レーザ光源から第２の周波数シフトされた光ビームを発生させるために前記音響光学周波数シフタに作動的に結合された無線周波数トーン発生器
を備えた第２のビーム発生器と、
（ｅ）前記流路内を通って移動する前記試料を前記第１及び第２のビーム発生器からのビームに露光させるように構成された対物レンズシステムであって、前記流路の隣りに配置された対物レンズシステムと、
（ｆ）光検出器であって、前記第１及び第２のビーム発生器からのビームへの露光による試料からの光放射が、前記光検出器によって検出される、光検出器と、
（ｇ）コムライン周波数を識別するために、前記無線周波数コム発生器により発生させられた参照コムに高速フーリエ変換を適用し、
受信された信号をフレームに分割し、
分割された前記信号に高速フーリエ変換を適用し、
コムライン周波数において変換された信号の値を記録し、
記録された前記値から画像を形成する
ように構成されたプログラムを備えたプロセッサと
を備えている、試料の光学問い合わせのための装置。
【請求項２】
前記対物レンズシステムが、
走査ミラーと、
走査レンズと、
チューブレンズと、
対物レンズと
を備えている、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記光検出器が、
蛍光放射フィルタと、
スリット開口と、
光電子増倍管と
を備えている、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記対物レンズシステムを通じて試料へと導かれる結合ビームを生成するために前記第１のビーム発生器からのビームを前記第２のビーム発生器からのビームと結合させるように構成された非偏光ビームスプリッタをさらに備えている、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記無線周波数コム発生器が直接デジタル合成（ＤＤＳ）無線周波数コム発生器を備えており、前記無線周波数トーン発生器が直接デジタル合成（ＤＤＳ）無線周波数トーン発生器を備えている、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記対物レンズシステム及び前記光検出器を制御するように構成される制御器をさらに備えている、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
レーザ励起源からの光を第１及び第２の周波数シフトされたビームへと分割するための音響光学干渉計であって、
（ａ）レーザ励起源と、
（ｂ）（１）音響光学偏向器、及び、
（２）前記レーザ励起源から第１の周波数シフトされた光ビームを発生させるために前記音響光学偏向器に作動的に結合された無線周波数コム発生器
を備えた第１のビーム発生器と、
（ｃ）（１）音響光学周波数シフタ、及び、
（２）前記レーザ励起源から第２の周波数シフトされた光ビームを発生させるために前記音響光学周波数シフタに作動的に結合された無線周波数トーン発生器
を備えた第２のビーム発生器と、
（ｄ）前記周波数シフトされたビームを結合し、結合された前記ビームを試料に集束させるためのビームスプリッタ及びレンズシステムと、
（ｅ）前記試料上の全ての点からの蛍光放射を同時に検出するための光検出器と
を備えている、音響光学干渉計と、
前記光検出器に結合されたコンピュータであって、
コムライン周波数を識別するために、前記無線周波数コム発生器により発生させられた参照コムに高速フーリエ変換を適用し、
受信された信号をフレームに分割し、
分割された前記信号に高速フーリエ変換を適用し、
コムライン周波数において変換された信号の値を記録し、
記録された前記値から画像を形成する
ように構成されたプログラムを備えた、コンピュータと
を備えている、蛍光イメージングのための装置。
【請求項８】
前記音響光学干渉計の第１の周波数にシフトされたビームが、直接デジタル合成（ＤＤＳ）無線周波数コム発生器及び音響光学偏向器により生成される、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記音響光学干渉計の第２の周波数にシフトされたビームが、直接デジタル合成（ＤＤＳ）無線周波数トーン発生器及び音響光学周波数シフタにより生成される、請求項７に記載の装置。
【請求項１０】
前記光検出器が、
ダイクロイックミラーと、
蛍光放射フィルタと、
スリット開口と、
光電子増倍管と
を備えている、請求項７に記載の装置。
【請求項１１】
（ａ）（１）音響光学偏向器、及び、
（２）前記音響光学偏向器に作動的に結合された無線周波数コム発生器
を備えた第１のビーム発生器を用いて、周波数シフトされた光の第１のビームを作成する工程と、
（ｂ）（１）音響光学周波数シフタ、及び、
（２）前記音響光学周波数シフタに作動的に結合された無線周波数トーン発生器
を備えた第２のビーム発生器を用いて、周波数シフトされた光の第２のビームを作成する工程と、
（ｃ）前記第１及び第２のビームにより試料に問い合わせる工程と、
（ｄ）試料における前記周波数シフトされた光のビームへの露光に基づく応答を検出する工程と、
（ｅ）コムライン周波数を識別するために参照コムに高速フーリエ変換を適用する工程と、
（ｆ）受信した信号をフレームに分割する工程と、
（ｇ）分割された前記信号に高速フーリエ変換を適用する工程と、
（ｈ）コムライン周波数において変換された信号の値を記録する工程と、
（ｉ）記録された前記値から画像を形成する工程と
を備えている、蛍光イメージングの方法。
【請求項１２】
結合されたビームを生成するために前記第１のビームと前記第２のビームとを結合する工程と、
前記結合されたビームにより試料に問い合わせる工程と
をさらに備えている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のビームが無線周波数コム及び励起レーザビームにより駆動された音響光学偏向器により作成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のビームが無線周波数トーン及び励起レーザビームにより駆動された音響光学周波数シフタにより作成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
画素の列における各画素ごとに別個の無線周波数を割り当てる工程をさらに備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）（１）音響光学偏向器、及び、
（２）前記音響光学偏向器に作動的に結合された無線周波数コム発生器
を備えた第１のビーム発生器を用いて、周波数シフトされた光の第１のビームを作成する工程と、
（ｂ）（１）音響光学周波数シフタ、及び、
（２）前記音響光学周波数シフタに作動的に結合された無線周波数トーン発生器
を備えた第２のビーム発生器を用いて、周波数シフトされた光の第２のビームを作成する工程と、
（ｃ）前記第１及び第２のビームにより試料に問い合わせる工程と、
（ｄ）試料における前記周波数シフトされた光のビームへの露光に基づく応答を検出する工程と、
（ｅ）前記検出器からの信号を得る工程と、
（ｆ）コムトーンを計算する工程と、
（ｇ）混合信号を生成するために前記信号を各コムトーンと混合する工程と、
（ｈ）時間分解能を決定するために信号をローパスフィルタに通す工程と、
（ｉ）フィルタに通された前記信号をアンダーサンプリングする工程と、
（ｊ）画像を形成する工程と
を備えている、蛍光イメージングの方法。
【請求項１７】
結合されたビームを生成するために前記第１のビームと前記第２のビームとを結合する工程と、
前記結合されたビームにより試料に問い合わせる工程と
をさらに備えている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のビームが無線周波数コム及び励起レーザビームにより駆動された音響光学偏向器により作成される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のビームが無線周波数トーン及び励起レーザビームにより駆動された音響光学周波数シフタにより作成される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
画素の列における各画素ごとに別個の無線周波数を割り当てる工程をさらに備える、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）（１）音響光学偏向器、及び、
（２）前記音響光学偏向器に作動的に結合された無線周波数コム発生器
を備えた第１のビーム発生器を用いて、周波数シフトされた光の第１のビームを作成する工程と、
（ｂ）（１）音響光学周波数シフタ、及び、
（２）前記音響光学周波数シフタに作動的に結合された無線周波数トーン発生器
を備えた第２のビーム発生器を用いて、周波数シフトされた光の第２のビームを作成する工程と、
（ｃ）前記第１及び第２のビームにより試料に問い合わせる工程と、
（ｄ）試料における前記周波数シフトされた光のビームへの露光に基づく応答を検出する工程と、
（ｅ）前記検出器からの信号を得る工程と、
（ｆ）コムトーンを計算する工程と、
（ｇ）混合信号を生成するために前記信号を各コムトーンと混合する工程と、
（ｈ）前記信号の各コムトーンをデジタルローパスフィルタに並列に通す工程と、
（ｉ）フィルタに通された前記信号をオーバーサンプリングする工程と、
（ｊ）画像を形成する工程と
を備えている、蛍光イメージングの方法。
【請求項２２】
結合されたビームを生成するために前記第１のビームと前記第２のビームとを結合する工程と、
前記結合されたビームにより試料に問い合わせる工程と
をさらに備えている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のビームが無線周波数コム及び励起レーザビームにより駆動された音響光学偏向器により作成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のビームが無線周波数トーン及び励起レーザビームにより駆動された音響光学周波数シフタにより作成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
画素の列における各画素ごとに別個の無線周波数を割り当てる工程をさらに備える、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１月９日出願の米国仮特許出願第６１／７５０，５９９号の優先権及びその利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
適用なし
【０００３】
コンピュータプログラム付属物による提出材料の参照による組み込み
適用なし
【０００４】
本発明は、概して光学イメージングデバイスまたは方法に関し、より詳細には、ビート周波数多重化により可能となる高速１次元及び２次元蛍光イメージングのための装置または方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
蛍光顕微鏡検査は、生物医学研究における最も重要かつ普及している強力なイメージング様式の１つである。近年の蛍光顕微鏡検査の空間分解能は、サブ回折限界の分解能でさえ当然のように得られるところまで改良されている。しかしながら、蛍光顕微鏡検査における時間分解能は、空間分解能の進歩についていけていない。
【０００６】
蛍光顕微鏡検査にはいくつかの様式が存在しているが、該技術の時間分解能は、比較的弱い蛍光サンプルの光放出により根本的に制限されている。その結果、従来のシングルポイントレーザー走査蛍光顕微鏡検査における最大フルフレーム（５１２×５１２ピクセル）レートは、およそ３０フレーム毎秒のビデオレートに制限されており、これは１０ＭＨｚ未満のピクセルレートに相当する。ライン走査及びスピニングディスク共焦点顕微鏡は、蛍光励起及び検出を多重化することによって、より高いフレームレートを得ることができるが、該フレームレートは、それぞれ、低い電子ゲインや、スピニングディスクの光スループット及び検出器の読み出し時間の両方によって、結局は制限される。
【０００７】
蛍光顕微鏡検査におけるサブミリ秒分解能の要求は、電子増倍電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）カメラ、科学用相補型金属酸化膜半導体（ｓＣＭＯＳ）カメラ、ニポースピニングディスク共焦点顕微鏡及びライン走査共焦点顕微鏡のような多くの先進的イメージング技術の開発の背景にある主要な原動力となっている。これらの各デバイスには、感度、速度、分解能及び共焦点性の間で異なる利点及びトレードオフがあり、生細胞内及び生体内におけるサブミリ秒の生化学的動態をイメージングするためのデバイスは、未解決の技術的課題となったままである。
【０００８】
高スループットイメージングフローサイトメトリーは、高速蛍光イメージングが要求される他の用途である。流体流中の個々の細胞のイメージングは、散乱及びシングルポイント蛍光振幅のみの測定に比べて、短期間での大量の細胞の形態、転座及び細胞シグナル伝達の分析に加え、高スループットの希少細胞検出に利用され得る情報を提供する。フローサイトメトリーに関するフローレートが高いと、高ＳＮＲの画像をブレなく生成するためには、高感度な光検出及び高速なカメラシャッタースピードが求められる。
【０００９】
従来のイメージングフローサイトメーターは、この問題を回避するために時間遅延及び積分ＣＣＤ技術を使用しているが、この手法におけるシリアル読み出し方式では、デバイスは毎秒５，０００細胞のスループットにまで制限される。このレートにおいて、フローサイトメトリーを用いて血液中の循環腫瘍細胞のような希少細胞を高効率で検出することは、臨床用途には実用的でない。
【００１０】
速度と感度とのトレードオフは、高速蛍光顕微鏡システムにおける重要な制限要因である。短期間（サブミリ秒）中に蛍光試料から放出される少数の光子から信号対雑音比（ＳＮＲ）の高い画像を生成する能力は、従来、検出された信号がその熱雑音レベルより大きく増幅されるように電子ゲインを提供する光検出デバイスの能力に依存している。このため、高ゲインの光電子増倍管（ＰＭＴ）及びＥＭＣＣＤｓは、高速蛍光イメージング用途に最も頻繁に使用される。近年のＥＭＣＣＤｓが高い量子効率及びゲインを示す一方で、ゲインレジスタ及びピクセル読み出し方式はシリアルであり、その全体のフルフレームレートを毎秒１００フレーム未満にまで制限している。ＰＭＴは、高いゲイン、低いダークノイズ及びＥＭＣＣＤｓよりも高い読み出し速度を提供するが、通常は大規模なアレイ形式では製造されず、シングルポイント走査用途への利用が制限される。ＰＭＴ検出器を使用することにより、レーザ走査蛍光顕微鏡は、ＥＭＣＣＤｓに類似したフレームレートで高い感度を得ることができるが、ビーム走査のシリアルな性質は、結局は画像取得の速度を制限する。
【００１１】
今日まで、これらの技術の欠点は、生物学におけるサブミリ秒の現象についてのフルフレームの蛍光イメージング分析を妨げている。生細胞内のカルシウム波及び代謝波、ニューロンの大集団内の活動電位配列、または心筋細胞内のカルシウム放出相関及びシグナル伝達のような生化学的現象の細かな動態を分解することが可能なイメージングデバイスが求められている。
【００１２】
従って、細胞内の動的プロセスを捕捉するためのサブミリ秒の時間分解能による高速な蛍光検出及びイメージング、並びに、大量の細胞の高スループット形態、転座及び細胞シグナル伝達の分析を迅速に実行可能なフローイメージングのための装置及び方法が求められている。本発明は、これら及び他の要求を満足する技術改良である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、無線周波数多重励起（ＦＩＲＥ）レーザ走査顕微鏡検査を用いた蛍光刺激、検出及びイメージングへの新規なアプローチを提供する。該ＦＩＲＥシステムは、直交周波数ドメイン多重化技術を採用しており、それによって並列ピクセル励起及び約８０ＭＨｚの基準ピクセル読み出し速度の両方を提供する。しかしながら、０．１〜１，０００ＭＨｚの範囲のピクセル周波数も可能である。
【００１４】
音響光学偏向器は、ピクセル列全体の同時励起を周波数エンコードするように用いられ、それにより、単一の光電子増倍管とデジタル位相コヒーレント信号回復技術を用いた蛍光画像の検出及び多重分離（de-multiplexing）が可能になる。
【００１５】
具体的には、ＦＩＲＥ顕微鏡検査は、蛍光試料の励起を周波数ドメインへと符号化する無線周波数−空間マッピングを使用しており、そのため、上記画像は単一のＰＭＴを用いて検出され得ると共に、デジタルロックイン検出を用いて復調され得る。
【００１６】
一実施形態では、ＦＩＲＥシステムは、高速イメージングへの計測可能なアプローチを提供するように適合させられ、その際、無線周波数（ＲＦ）電子機器及び音響光学デバイスに利用可能なＭＨｚ帯域を活用することにより、単一のデータストリーム中において数百のピクセルを同時に読み取る、ＭＨｚ相当のピクセルクロック読み取りを可能にする。加えて、ＦＩＲＥ顕微鏡検査は、各々独立したピクセル励起周波数の振幅及び位相を操作する直接デジタル合成（ＤＤＳ）を使用しており、それにより、画像ノイズ及びピクセルクロストークを低減するために、画像多重分離プロセスの位相コヒーレントデジタルロックインアンプ及び直交周波数分割多重化（ＯＦＤＭ）アルゴリズムが適用できるようになる。直接デジタル合成を使用することにより得られる該システムの柔軟性によって、ピクセル数、読み出しレート及び視界の全体的な調整が可能になる。
【００１７】
上記装置は、試料の各個別の点が別々の無線周波数にあたるように該試料上の複数の点を同時に問い合わせる（interrogate）ために使用され得る周波数シフトされたビームを生成するように構成される。上記装置は、試料の各個々の点が異なる無線周波数であるように、該試料上の複数の点を調べるために使用され得る周波数シフトされた光を生成するように構成されている。このことを達成するために、励起レーザビームは、まず、マッハツェンダ干渉計の２つのアームに分割される。第１のアームの光は、音響光学偏向器によって周波数シフトされ、該音響光学偏向器は、信号のピーク出力に対する平均出力の比を最小にするように設計されている位相操作された無線周波数コムによって駆動される。該ＲＦコムは、出力角及び周波数シフトの両方の範囲を有する複数の偏向光ビームを発生させる。該干渉計の第２のアームは、音響光学周波数シフタを使用して周波数をシフトされ、局部発振器（ＬＯ）ビームを生成する。シリンドリカルレンズは、該ＬＯアームの発散角を該ＲＦコムビームの発散角に合わせるために使用されてもよい。第２のビームスプリッタで結合した後、該２つのビームは、従来のレーザ走査型顕微鏡レンズシステムを使用して、試料上の線に集束される。該サンプルの高速ライン走査は、共振走査ミラーを横方向に用いて達成される。
【００１８】
上記試料中の蛍光分子は２乗検波器として機能し、それらの励起は電場全体の２乗に応じる。その結果生じる蛍光は、上記干渉計の２つのアームの周波数の差によって規定される様々なビートにおいて放出される。そのため、蛍光放射は、明らかな変調を伴った励起周波数において振動し、１／τ以下の励起周波数となる。ここで、τは試料の蛍光寿命である。１ナノ秒域の寿命を伴う蛍光体に対し、ＦＩＲＥの使用可能なＲＦ帯域幅はおよそ１ＧＨｚである。音響光学デバイスは本質的に共振するので、該干渉計の第２のアームにおける周波数シフタは、所与の蛍光体に使用可能な帯域幅を最大化する目的で、ビート周波数を基底帯域にヘテロダインするように選択される。
【００１９】
上記試料からの蛍光放射は、好ましくは対物レンズにより集められ、そして他のサンプル面からの蛍光放射を拒むスリット開口を使用し、脱走査（de-scan）共焦点構成においてＰＭＴにより検出される。
【００２０】
本技術のデモンストレーションとして、４．４ｋＨｚのフレームレートにて静止細胞の回折限界の共焦点蛍光イメージングを、流速１ｍｓ-1（毎秒約５０，０００細胞のスループットに相当する）にて蛍光顕微鏡検査を行った。
【００２１】
高速蛍光指示薬及び電位感受性色素と組み合わせることにより、この高速イメージング様式は、生物学において従来は時間的に未解決だったサブミリ秒の動態を観察することのできる可能性を有しており、神経機能、自己免疫疾患、不整脈及びその他のミリ秒タイムスケールの生物学的現象のより完全な理解につながり得る。
【００２２】
ビート周波数多重化は、２光子励起蛍光顕微鏡検査を含む他タイプのレーザ走査顕微鏡検査にも適用され得る。おそらく最も顕著なことに、各ピクセルからの放射が別個の無線周波数に紐付けられているので、ＦＩＲＥは、上記試料中の蛍光放射の散乱に起因するピクセルクロストーク（多焦点多光子顕微鏡検査において典型的にイメージング深度を制限する効果）に対して本質的に影響を受けない。高速蛍光体との組み合わせによって、ＦＩＲＥ顕微鏡検査は、蛍光顕微鏡検査を用いたナノ秒〜マイクロ秒タイムスケールの現象の観察が可能となる。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、明細書の以下に示す部分において明らかにされる。詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を十分に開示することを目的としており、それらを限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本発明は、以下の図面を参照することによって、さらに十分に理解される。該図面は、例示のみを目的とするものである。
【００２５】
【図１】図１は、本発明による蛍光イメージング装置の一実施形態の概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、各無線周波数コムの周波数に対して１回回折させられた一次ビームを生成する、図１の音響光学偏向素子の概略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、周波数シフトされたビームを混合することによりビート周波数を生成することを示すビームスプリッタの概略図である。
【図３】図３は、本発明に係る周波数シフトされたビームを用いて試料からの蛍光を誘導及び検出する一つの方法のフロー図である。
【図４】図４は、本発明に係る蛍光顕微鏡検査のための一つの方法のフロー図である。
【図５】図５は、本発明に係る一つの画像再構成アルゴリズムのフロー図である。
【図６】図６は、本発明に係る第２の画像再構成アルゴリズムのフロー図である。
【図７】図７は、本発明に係る第３の画像再構成アルゴリズムのフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
図面をより具体的に参照すると、例示の目的で、本発明並びに関連する蛍光励起及び検出のための方法におけるシステムスキームのいくつかの実施形態が、概して図１〜図７に示されている。本明細書に開示される基本的な概念から逸脱することなく、該方法は特定の工程及び順序において異なっていてもよく、該装置の構成は構造の詳細において異なっていてもよいことが理解される。方法における工程は、これらの工程が起こり得る順序の単なる例示である。該工程は、なお特許請求に係る発明の目標を果たすような所望の任意の順序で起こってもよい。
【００２７】
図１、図２Ａ及び図２Ｂを参照すると、無線周波数多重化された励起を用いた蛍光イメージングのための装置１０の一実施形態は、本発明を例示するために示されている。異なる無線周波数における試料上の個々の点の励起は、ＦＩＲＥ装置及び処理手順の重要な特徴である。図１に示される実施例では、ビート周波数励起多重化は、マッハツェンダ干渉計（ＭＺＩ）構成にて音響光学デバイスを用いて行われる。
【００２８】
励起レーザ１２はビームを生成し、該ビームは非偏光ビームスプリッタ１４によって分割され、その結果生じた第１のビーム１６は音響光学偏向器（ＡＯＤ）２２に導かれ、スプリッタ１４からの第２のビーム１８は、音響光学周波数シフタ（ＡＯＦＳ）２８に導かれる。
【００２９】
図１に示されるように、ＭＺＩの一方のアームにおける励起光ビーム１６は、１００ＭＨｚ帯域幅のＡＯＤ２２によって周波数シフトさせることができ、該ＡＯＤ２２は、例えば、ＤＤＳ  ＲＦコム発生器２０によって生成される無線周波数のコムにより駆動させられる。ＤＤＳ  ＲＦコム発生器２０からの無線周波数のコムは、好ましくは、そのピーク出力に対する平均電力の比を最小にするように位相操作される。図２Ａに見られるように、ＡＯＤ２２は、出力角及び周波数シフトの両方の範囲を有する複数の偏向光ビーム２４を生成する。ＡＯＤ２２は、各無線周波数コムの周波数に対して１回回折させられた一次ビームを生成する。
【００３０】
干渉計の第２のアームにおける光ビーム１８は、音響光学周波数シフタ２８を通過し、局部発振器（ＬＯ）ビーム３０を提供する。該音響光学周波数シフタ２８は、好ましくは、ＤＤＳ  ＲＦトーン発生器２６によって生成された単一の無線周波数トーンにより駆動させられる。シリンドリカルレンズ（図示しない）は、該局部発振器（ＬＯ）ビーム３０の発散角と上記無線周波数ビームの発散角とを合わせるために、ＡＯＦＳ２８の後に配置してもよい。
【００３１】
上記ＭＺＩ出力では、２つのビーム２４、３０は、第２のビームスプリッタ３２によって結合される。図２Ｂはまた、該ＭＺＩ出力及びビームスプリッタ３２におけるビート周波数の生成も示す。結合ビーム３４は、従来のレーザ走査型顕微鏡レンズシステムを使用して、最後には上記試料上の水平線へと集束され、周波数シフトを空間にマッピングする。
【００３２】
図１の装置では、結合ビーム３４は、ダイクロイックミラー３６から共振走査検流計３８へと反射され、走査レンズ４０、結像レンズ４２及び対物レンズ４４を通って上記試料へと反射される。試料細胞４６は通路４８内にあり、この図では結合ビーム３４を通ってもたらされる。
【００３３】
露光された試料４６からの蛍光放射５０は、共焦点構成における光電子増倍管（ＰＭＴ）５８によって検出され、このとき、平面外の蛍光放射を拒むためにスリット開口５６を使用する。共振走査ミラー３８は、二次元イメージングのため、横方向に高速走査する。水平方向の点は、異なる無線周波数において並列に励起される。検流計を用いて垂直方向にこのライン走査励起を走査することにより、二次元画像が生成される。
【００３４】
図１の実施形態では、対物レンズ４４、結像レンズ４２、走査レンズ４０及び共振走査ミラー３８からの放出ビーム５０は、ダイクロイックミラー３６、蛍光放射フィルタ５２，５４及び開口５６を通って、少なくとも１つの光電子増倍管５８に導かれる。光電子増倍管５８は、デジタル記録オシロスコープのような演算及び記録デバイス６０に結合される。
【００３５】
一実施形態では、演算デバイス６０は、共振走査ミラー３８、レーザ１２、ＲＦコム２０及びＲＦトーン２６発生器のような他の構成要素並びに光学的性質（optics）を制御すると共にＰＭＴ信号を処理するように構成されている。上記演算デバイスは、ディスプレイを有していてもよい。
【００３６】
したがって、周波数シフトされた光を利用する蛍光励起及び検出のための方法が提供され、該方法は、試料上の複数の点を同時に問い合わせるために使用され得る。蛍光励起及び検出のための一つの方法７０は、図３に概略的に示される。図３のブロック７２では、周波数シフトされた光のビームが作成される。周波数シフトされた光のビームは、種々の方法で作成され得る。各無線周波数コム周波数について１回回折された一次ビームは、図２Ａに示されるように、音響光学偏向器を用いて生成され得る。
【００３７】
試料４６の蛍光分子が光学場全体の２乗検波器として機能するので、蛍光は、干渉計の二つのアームの周波数の差によって規定される様々なビートで励起される。蛍光体の有限の周波数応答を考えると、ＬＯビーム周波数シフトは、使用可能な変調帯域幅を最大化するようにビート周波数励起スペクトルを基底帯域にヘテロダインするよう選択される。このことは、ＡＯＤが高調波干渉を避けるために典型的にはアップシフトされたサブオクターブ通過帯域で動作するため、必要である。
【００３８】
ＡＯＤ２２を駆動するために使用される無線周波数コム２０の直接デジタル合成（ＤＤＳ）は、特定の無線周波数及び位相により各ピクセルの励起を規定し、その結果、該無線周波数コムと検出信号との位相コヒーレンスが得られる。この位相コヒーレンスにより、コンピュータ６０に実装された位相感応性デジタルロックインアンプの並列アレイを用いた画像多重分離が可能となる。ＦＩＲＥの並列読み出しの結果、ＡＯＤの帯域幅に等しい最大ピクセルレートが得られる。
【００３９】
各ピクセルの励起が、直接デジタル合成器（ＤＤＳ）を使用して特定の無線周波数及び位相により規定されるため、検出された蛍光は位相シフトされ、駆動信号に応じてスケーリングされる。この位相コヒーレント放射により、公知の超高感度検出技術であるデジタルロックインアンプの信号回復が可能となる。
【００４０】
図３のブロック７４では、該試料は、周波数シフトされたビームにより各点に別個の無線周波数で問い合わせられ、それによって試料中の蛍光が励起される。周波数シフトされたビームへの露光に対する該試料の応答は、図３のブロック７６において検出される。
【００４１】
ＦＩＲＥ装置及び方法の重要な特徴は、試料の個々の点において異なる無線周波数で蛍光を励起する能力である。各ピクセルの蛍光放射のデジタル合成された無線周波数の「紐付け」は、２つの干渉している周波数シフトされたレーザビーム間におけるビート周波数において生じる。周波数ドメイン多重化により、ＦＩＲＥ画像の列における各ピクセルには、独自の無線周波数が割り当てられる。二次元ＦＩＲＥ画像では、ピクセルは、時間−周波数のガボール格子上の点に類似している。単一素子の光検出器は、複数のピクセルからの蛍光を同時に検出し、画像は、上記検出器の出力の周波数成分から再構成され、デジタルドメイン内にて並列ロックインアンプを使用して分解される。周波数シフトされたビームへの露光に対する試料の応答は、図３のブロック７６において検出される。検出された信号の解析は、単に試料の多点測定であってもよく、被写体の画像の生成を含んでいてもよい。
【００４２】
蛍光顕微鏡検査のための方法８０の一つの応用は、図４に概略的に示される。ブロック８２では、第１の光ビームの周波数シフトは、無線周波数のコムにより駆動される音響光学偏向器を用いて行われ、好ましくは、そのピーク対平均電力比を最小化するように位相操作される。音響光学偏向器（ＡＯＤ）は、出力角及び周波数シフトの両方の範囲を有する複数の偏向光ビームを生成する。
【００４３】
第２のビームからの光は、無線周波数トーンにより駆動される音響光学周波数シフタを通過して、図４のブロック８４において、単一の局部発振器（ＬＯ）ビームを提供する。ＬＯビームの発散角を上記無線周波数コムビームの発散角に一致させるために、シリンドリカルレンズが任意に使用されてもよい。
【００４４】
ブロック８６におけるビームによる試料の問い合わせは、好ましくは、ビート周波数変調を用いたピクセル多重化アプローチを使用する。一実施形態では、周波数シフトされたビームは、従来のライン走査顕微鏡レンズシステムを使用して試料に導かれる。該試料の高速ライン走査は、共振走査ミラーを横方向に用いて達成され得る。
【００４５】
上記試料における蛍光分子の励起は電場全体の２乗に応じるため、結果として生じる蛍光は、第１及び第２の問い合わせビームの周波数の差によって規定される様々なビートで放出される。
【数１】
0006338597.tif 000002
【００４６】
２つの周波数シフトされた波の干渉により、生じたビート周波数の強度における振幅変調が生じる：
【数２】
0006338597.tif 000003
【００４７】
そのため、上記蛍光放射は、明らかな変調を伴った励起周波数において振動し、１／τ以下の励起周波数となる。ここで、τは試料の蛍光寿命である。
【００４８】
最大変調周波数は、本質的に上記試料の蛍光寿命によって制限され、そのため、最大ピクセル読み出しレートも、本質的に上記試料の蛍光寿命によって制限される。
【００４９】
励起周波数が１／τ（τは試料の蛍光寿命）である場合には、放出された蛍光は明らかな変調を伴った励起周波数で振動する。
【００５０】
さらに、ビート周波数の変調は、ＦＩＲＥの速度の基本である。２つのコヒーレントな周波数シフトされた光の波のビートは、ピクセルのクロストークを導入して使用可能な帯域幅を減らし得る高調波を何ら用いずに、単一の無線周波数の音を生成する。全てのピクセルが回折限界において空間的に分解されるようにＦＩＲＥシステムが設計されているため、隣接する２つのピクセルからの励起光のビートは、コム間隔周波数において蛍光信号を生成する。
【００５１】
しかしなら、上記周波数は、画像帯域の外にあり、ピクセルのクロストークを生成しない。生細胞のような試料における高速な現象のブレのないイメージングに関し、イメージングされ得る最速の動的事象の速度は、最大許容側波帯周波数（コム間隔の半分）により決定される。
【００５２】
空間分解能、ピクセル数及び視野もまた設計され得る。ＦＩＲＥ顕微鏡は、回折限界の技術である。他のレーザ走査顕微鏡検査技術と同様に、最小の横方向空間分解能は、対物レンズの開口数とレーザ励起波長によって決定される回折限界スポットサイズである。
【００５３】
本システムの好ましいピクセルレートは、基準ラインレートとラインあたりのピクセルの数との積に等しい。コム間隔に制限される基準ラインレートにより、ＦＩＲＥの最大ピクセルレートはＡＯＤの帯域幅（ＢAOD）に等しく、ＢAOD＝ｐx×ｒlineとなる。ここで、ｐxはライン内のピクセル数であり、ｒlineはラインレートである。ｘ軸は、ＡＯＤの偏向方向として選択された。
【００５４】
ラインあたりの分解可能な点の数は、ＡＯＤの時間−帯域幅の積（ＴＢＰAOD）に等しい。ナイキスト空間サンプリング基準を満たすためには、ラインあたりのピクセル数は、少なくともこの値の２倍である必要があり、Ｐx＝２×ＴＢＰAODとなる。
【００５５】
ｘ方向における視野（ＦＯＶｘ）は、分解可能な点の数を回折限界スポットサイズｄと掛けたものであり、ＦＯＶx＝ｄ×ＴＢＰAOD＝ｄ×ｐx／２となる。
【００５６】
ｙ方向におけるナイキストオーバーサンプリングも満たされる必要がある。走査ミラーを伴う２次元イメージングの場合、フレームレート、視野及びｙ方向におけるピクセルの数は、ｐy×ｒflame＝ｒline及びＦＯＶy＝ｄ×ｐy／２の関係を満たしている必要がある。ここで、ｒflameは２次元フレームレートである。該走査ミラーの範囲は、上記ＦＯＶyに一致するように選択される必要がある。
【００５７】
ｙ方向におけるオーバーサンプリングのためのこれらの基準はＦＩＲＥに固有のものではなく、任意のイメージングシステムにとっても満足され得る。しかしながら、ｙ方向におけるナイキスト基準を満たしていることは、ＦＩＲＥにとって特に好ましい。ｙ方向におけるアンダーサンプリングによれば、静的な試料に対しても、ラインレートの半分より大きい蛍光の変化率を得ることができる。この周波数ドメインでは、生成された側波帯は半分の周波数コム間隔を超えて拡張されることとなり、その結果、ピクセル間のクロストークが生じて、ｘ軸方向にブレることとなる。
【００５８】
試料の各回折限界スポットのオーバーサンプリングにより、このブレ効果を回避し得る。生細胞のような動的な試料に対しては、フレームレートとピクセル周波数間隔は、該試料の動態に応じて、側波帯のブレを回避するように適切に選択される必要がある。周波数空間におけるピクセル間隔は、蛍光信号の最大変化率の少なくとも２倍大きい必要がある。光学システムの倍率は、個々のピクセルが該試料において空間的に分解されるように調整される必要がある。
【００５９】
上述のＦＩＲＥシステムでは、最速のライン走査のシャッター速度は１．２５ミリ秒（コム間隔８００ｋＨｚ）であって、これにより最大４００ｋＨｚの周波数成分を有するピクセル動態を取り込むことが可能になる。
【００６０】
問い合わせられた試料からの蛍光は、ブロック８８において時間をかけて検出され、図４のブロック９０において画像が生成され得る。検出は、好ましくは、少なくとも１つの光電子増倍管（ＰＭＴ）によって行われる。しかしながら、他の検出方式を適合させてもよい。
【００６１】
蛍光イメージングは、試料の励起された各ピクセルから放射された光子の数を推定することにより、試料の暗視野画像を生成する。従来の蛍光イメージングでは、光子の数は、光信号を統合することより推定される。ＦＩＲＥでは、各ピクセルから放射された光は、特定の無線周波数で変調され、各ピクセルからの信号の強度は、例えば、短時間フーリエ変換を実行することにより、または、並列デジタルロックインを用いて各画素からの信号を復調することにより、識別される。その結果、ＦＩＲＥは複数の画素を並列に読み出し、それによってイメージング速度を増加させると共に、所定のフレームレートでの積分時間を増加させる。
【００６２】
デジタルビューの画素数、リアルタイム制御を提供する無線周波数スペクトルの振幅及び位相をデジタル合成することによりもたらされる柔軟性により、ピクセルの数、ピクセルの周波数間隔、ピクセルの不均一性及び視野は完全かつリアルタイムに制御される。ＰＭＴは、ＣＣＤやＣＭＯＳ技術よりも小さいダイナミックレンジを本質的に有しているため、画素ごとにこの量を最大化することがＦＩＲＥ処理のパフォーマンスにとって重要となる。具体的には、励起周波数コムを位相操作することにより、各ピクセルのダイナミックレンジをＤ／√Ｍとしてスケーリングすることができる。ここで、ＤはＰＭＴのダイナミックレンジであり、Ｍはピクセル多重化因数である。これは、励起周波数の全ての初期位相がロックされてＤ／Ｍのダイナミックレンジを有する画像が得られる場合とは対照的である。
【００６３】
ＦＩＲＥは、根本的に速度に対するダイナミックレンジのトレードオフを示すが、試料励起をＭ倍に多重化することによって各ピクセルの滞留時間がＭ倍の増加されるため、一点走査型の蛍光顕微鏡検査と比較した場合には、感度は向上している。しかしながら、検出の並列性のため、ＦＩＲＥは、列中の全ピクセルにわたってショットノイズを有する。このことは、スケーリングされる各ピクセルについて、ライン走査の全ピクセルから収集された光子の総数の平方根のショットノイズ制限による不確実性の原因となる。この効果が各ピクセルについてＳＮＲを劣化させる程度は、該試料のスパース性に逆依存する。
【００６４】
前述のように、局部発振器（ＬＯ）及び無線周波数（ＲＦ）コムビームの直接デジタル合成は、５ＧＳ／ｓの任意の波形発生器の２つの出力を使用して達成されることが可能であって、例えば、音響光学偏向器（ＡＯＤ）及び音響光学周波数シフタ（ＡＯＦＳ）を駆動するために増幅される。光検出及びデジタル化の後、２つのデジタル逆多重化アルゴリズムは、周波数多重化されたデータから蛍光画像を回復するために使用され得る。蛍光信号を回復する第１の方法では、短時間フーリエ変換（ＳＴＦＴ）を採用する。第２の方法では、各コムラインを個別にヘテロダイン及び多重分離するデジタルロックインアンプのアレイを使用する。
【００６５】
第１の方法の画像再構成アルゴリズム１００を、図５に概略的に示す。ＳＴＦＴ法は、データ列をフレームに分割し、各フレームに離散フーリエ変換（ＤＦＴ）を実行することにより行われ、それによって周波数多重信号を回復する。各フレームは、１次元ライン走査に対応している。周波数ビンにわたって広がっている電力からのピクセル−ピクセルクロストークを回避するために、各フレームの持続時間は、周波数コム間隔の逆数の整数倍に設定される。この場合、周波数チャネルは直交であるとされ、ＤＦＴビンは周波数コムライン上に正確に位置する。この状況における最大ラインレートは周波数コム間隔に等しく、３００ｋＨｚ、４００ｋＨｚ及び８００ｋＨｚのラインレートに対応している。
【００６６】
したがって、図５に見られるように、入力信号１０２は、フレーム１０６に分割され、高速フーリエ変換１０８の対象となる。これと同時に、参照コム１０４は、高速フーリエ変換１１０の対象となり、コムライン周波数が１１２にて識別及び記録される。該コムライン周波数での信号値は、ブロック１１４で記録され、カラーマッピングされた画像が１１６にて生成される。
【００６７】
第２の画像再構成法では、図６及び図７に示された２つのデジタルロックインアンプのアプローチが使用されてもよい。全体として、第２の画像再構成では、ロックインアンプの復調技術は、データ信号を各周波数コムラインのコピーとデジタル混合することによって実現される。該コムラインと該信号との混合により、基底帯域に対応するコムラインがダウンシフトされる。ローパスフィルタ（ＬＰＦ）は、対象のコムラインからの変調蛍光信号のみを残して、他のすべてのコムラインを消すために使用され得る。参照と該信号との位相ロックを防ぐため、同位相（Ｉ）及び直角位相（Ｑ）混合項の両方が計算されてもよい。ＩチャネルとＱチャネルとの大きさの合計は、該信号の振幅に等しい。周波数空間におけるピクセルクロストークを防止するため、ＬＰＦの帯域幅はコム間隔の半分より小さい。フィルタリング後のアナログ帯域幅の減少により、各ピクセルの信号は、少なくとも周波数コム間隔に等しいナイキスト周波数まで移動平均（boxcar-average）及びアンダーサンプリングされ得る。アンダーサンプリングされたデータレートは、本システムのラインレートに対応する。
【００６８】
したがって、図６の画像再構成１２０、信号１２２及び参照コム１２４は、入力として提供される。参照コム１２４は、高速フーリエ変換１２６の対象となり、コムライン周波数は１２８にて記録され、個々のコムラインは１３０にてフィルタリングされる。フィルタリングされたコムライン１３０は、逆高速フーリエ変換１３２の対象となり、信号１２２は、１３４にて各コムトーンと混合される。混合された該信号は、時間分解能を決定するためにローパスフィルタ１３６でフィルタリングされ、ライン速度を決定するために１３８にてアンダーサンプリングされる。その後、カラーマッピングされた画像が得られた信号から１４０にて形成される。
【００６９】
ロックインアンプの復調画像再構成についての別の実施形態を図７に示す。ここでは、図６に示すものと同じ参照コム処理及び初期信号処理が行われる。しかしながら、混合信号／コムトーン出力の各コムは、デジタルローパスフィルタ１５２によって並列にフィルタリングされる。フィルタリングされた信号は、ブロック１５４にてオーバーサンプリング及び平均化され、カラーマッピングされた画像は、ブロック１５６にて形成される。
【００７０】
蛍光画像を多重分離するためには、ＤＦＴ及びロックイン技術の両方が使用され得るが、ロックイン技術は以下のいくつかの利点がある：（ａ）コムライン構成の柔軟性を残しつつ、直交性を必要としない。（ｂ）基準ラインレートがアンダーサンプリング係数によって決定され、それによって最小ナイキスト周波数以上のラインレートが可能になる。（ｃ）参照及び信号は、信号位相の先天的な推定、またはＩチャネルとＱチャネルとの比率からの推定のいずれかにより、位相ロックされ得る。位相ロック動作は位相ノイズを取り除き、それによって信号対雑音比（ＳＮＲ）が３ｄＢ改善される。
【００７１】
本発明は、添付の実施例を参照して理解され得るが、該実施例は、例示のみを目的とするものであって、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲を限定するいかなる意味としても解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７２】
実施例１
ＦＩＲＥ顕微鏡の動作原理を実証するため、固定された直径１５μｍの蛍光ポリスチレンビーズの試料を、３００ｋＨｚ間隔で２５６の励起周波数（７６．８  ＭＨｚでの総帯域幅）を用いて画像化した。該画像は、４．２ｋＨｚでのフレームレートで収集した。検出された時間ドメインのＰＭＴ信号は、該ビーズの水平位置を示さなかった。各ビーズの位置に関連する異なる周波数成分を示すため、該信号の３つのウィンドウの高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を使用した。
【００７３】
これは、試料の励起及び放射についての周波数−空間マッピングを示した。画像中のビーズの垂直位置は、共振走査ミラーの参照出力から回収した。垂直方向における共振走査ミラーの非線形な空間−時間マッピングを回避するため、中間画像面には走査野の直線部に該試料の励起を制限するように開口が配置され、画像には画像中の任意の残留歪みを補償するように正弦補正アルゴリズムが適用される。
【００７４】
このＦＩＲＥシステムの軸方向の分解能は、４８８ｎｍの励起と共に５００ｎｍの蛍光ビーズを励起させることにより測定し、４８８ｎｍの励起を使用して、１μｍ間隔での焦点を通じて試料を走査した。１００ｘ、１．４−ＮＡの油浸対物レンズは、ＰＭＴの前に配された２００ｍｍの焦点距離のチューブレンズ及び１００μｍの背の高いスリット開口と組み合わせて使用した。該データに適用されたガウシアンは、５．９μｍのＦＷＨＭを示した。１００μｍのスリットはこの倍率におけるエアリディスクよりも大きいため、この軸方向の分解能は、より小さなスリットを使用することによってさらに向上させることが可能であった。
【００７５】
蛍光動的現象を記録する二次元ＦＩＲＥの能力を実証するため、マイクロ流体チャネルの内部を２．３ｍｍ  ｓ-1の速度で流れる蛍光ビーズをイメージングした。ＦＩＲＥの二次元実装では、脱走査設定で２．２ｋＨｚの共振走査ミラーを用いた倒立顕微鏡で画像を取得した。垂直方向における共振スキャナの非線形な空間−時間マッピングを回避するため、該イメージングシステムの中間画像面には走査領域の略直線部に該試料の励起を制限するように開口が配置された。画像には、該ミラーの正弦波偏向パターンから生じる画像中の任意の残留歪みを補償するように、Ｍａｔｌａｂにおいて正弦補正アルゴリズムがさらに適用された。明るさ及びコントラストの調整、閾値処理及び二次元ローパスフィルタリングは、全ての画像に対して実行した。
【００７６】
ダイクロイックミラーとバンドパスフィルタを通過した後のバイアルカリ光電子増倍管（ＰＭＴ）（Ｒ３８９６、浜松社製）により、蛍光放射を検出した。ＰＭＴからの電流信号は、５ｋＶ／Ａのトランスインピーダンスゲインを有する４００  ＭＨｚの帯域幅電流アンプにより増幅させた。この電圧信号は、２５０ＭＳ／ｓ、８ビット分解能のオシロスコープを使用してデジタル化させた。二次元スキャンされた画像のために、共振走査ミラーからの参照出力を、トリガリングに使用すると共に、画像再構成のためにデジタル化して保存した。フローサイトメトリー実験のために、画像信号自体のデジタイザをトリガした。デジタル化されたデータは、信号処理のためにＰＣに移した。
【００７７】
実施例２
生物学的試料におけるＦＩＲＥ顕微鏡検査を実証するために、様々な蛍光体で染色された接着細胞を、４．４ｋＨｚでのフレームレートでイメージングした。ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、Ｃ６星状細胞のラット神経膠線維芽細胞及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母は、蛍光細胞質基質染色（Calcein AM）または核酸染色（Syto16）により染色した。ＮＩＨ  ３Ｔ３及びＭＣＦ−７細胞及びＣ６星状細胞は、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリンストレプトマイシンを用いて、ダルベッコ改変イーグル培地中において３７℃及び５％ＣＯ２で増殖させた。サッカロマイセス・セレビシエの液体培養物は、トリプシン大豆ブロス中において２４０ｒｐｍ及び３７℃にて増殖させた。
【００７８】
染色する前に、培養された哺乳動物細胞を培養フラスコから取り出し、ガラススライド上に播種して、２４時間広げさせた。哺乳動物細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて４μΜのSyto16緑色蛍光核酸染色で３０分間、培養培地中にて１μΜのCalcein Red-Orange AMで４５分間または培養培地中にて１μΜのCalcein AMで４５分間のいずれかにより染色させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドを用いて１０分間固定した。固定の後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、静止イメージングまたはフロースルー微量流体イメージングのいずれか用に調製した。
【００７９】
静止イメージングの場合には、１．５番カバーガラスをスライド上に置いて封止した。フロースルーマイクロ流体実験用の接着した哺乳動物細胞の形状を維持するため、セルスクレーパーは、染色され固定された細胞をガラススライドから除去及び拡散するために使用された。該細胞を、ＰＢＳで希釈した。
【００８０】
Ｓ．セレビシエを、同じ濃度のCalcein AMを４５分間用いて懸濁液中で染色し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて固定して、ＰＢＳで２回洗浄した。静止イメージングのため、該細胞をガラススライド上に播種し、１．５番カバースリップ下に封止した。
【００８１】
広視野蛍光イメージングによるＦＩＲＥ顕微鏡検査と比較するため、４８８ｎｍでのレーザ励起をＦＩＲＥイメージング（８．５ｍＷｐｅｒピクセル、対物レンズの前に測定）に使用し、水銀ランプ励起を広視野イメージングのために使用した。生成された全てのＦＩＲＥ画像は、４００ｋＨｚでの無線周波数コム周波数間隔を使用しており、２００×９２ピクセルで構成されていた。ＬＯビームとフラットトップ高周波コムビームとのガウシアンプロファイルの不一致が原因となる若干の口径食が、ＦＩＲＥ画像に観察された。この不一致及びその結果である口径食は、直接デジタル合成発生器において、無線周波数コムのデジタル予等化を使用して削除され得る。
【００８２】
細胞の画像は、１，２８０×１，０２４ピクセルのＣＭＯＳカメラに基づいて、ＦＩＲＥ顕微及び従来の広視野蛍光顕微鏡の両方を用いて撮影した。振幅のほぼ３桁のフレームレート差は、デジタルロックインアンプ画像復調と組み合わせたＰＭＴ検出器のゲインによって軽減される。単１フレームの比較により、ＦＩＲＥ励起のピクセルあたりの強度は広視野励起の約１０倍であることが示された。しかしながら、ＦＩＲＥ画像の場合のフレーム毎のピクセルあたりの試料に対する総励起エネルギー入射は、広視野画像の場合に比べて１００倍小さかった。
【００８３】
実施例３
フローサイトメトリーは、高速蛍光測定を必要とする用途である。一点フローサイトメトリーに比べて、イメージングフローサイトメトリーは、高スループットの希少細胞検出のために特に有用であり得る情報を提供する。フローサイトメトリーに係る高速な流速には、高ＳＮＲでブレのない画像を生成するために、高速なイメージングシャッタ速度及び高感度な光検出が求められる。従来のイメージングフローサイトメーターは、この問題を回避するために時間遅延積分ＣＣＤ技術を使用するが、この技術のシリアルなピクセル読み出し方式では、現在では、デバイスが毎秒約５，０００個の細胞のスループットに制限される。
【００８４】
ＦＩＲＥを使用した高速イメージングフローサイトメトリーを実証するため、８００ｋＨｚ間隔で１２５ピクセルの単一の固定ラインスキャン（ピクセル読み出しレート１００ＭＨｚ、ラインスキャンレート８００ｋＨｚ）を、マイクロ流体チャネルに１ｍｓ-1の速度で流れるSyto16で染色されたＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞のイメージングに使用した。細胞直径を２０ｍｍと仮定すると、この速度は毎秒５０，０００細胞のスループットに相当する。
【００８５】
イメージングフローサイトメトリー用に、ＭＣＦ−７乳癌細胞をSyto16で染色した後、ホルムアルデヒドで固定した。次に、該細胞をリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、シリンジポンプを用いて、固定体積速度で、ポリジメチルシロキサンから作製された直線状の矩形断面１１０μｍ×６０μｍであるマイクロ流体チャネルに通流させた。該流体の流速は、式Ｖ＝Ｑ／Ａを使用して計算される。ここで、Ｑは体積流量であり、Ａはチャネルの断面積である。該画像の垂直スケーリング較正は、同じ体積のフローレートで流れる１０μｍ球状ビーズのイメージングの後に実行した。
【００８６】
比較のために、Syto16で染色されたＭＣＦ−７細胞もまた、同じ速度の流体流中において、単一露光モード（５１２×５１２ピクセル）でのフレーム転送ＥＭＣＣＤを使用してイメージングした。ＥＭＣＣＤの高い感度及びゲインの両方により適度なＳＮＲの画像が得られるが、１０ｍｓの最小露光時間とそのフレーム転送の性質により、これらのフロー速度において有意なブレが生じる。これとは対照的に、１．２５ｍｓのＦＩＲＥラインスキャンシャッター速度では、同等のＳＮＲでブレのない画像が得られる。ＦＩＲＥシステムのこの構成は、１００ＭＨｚ範囲内におけるピクセルの読み出しレートを特徴とし、このレートは、より広帯域の音響光学偏向器を使用することにより、１ＧＨｚを超えるまで直接的に拡張され得る。ＦＩＲＥの最大変調周波数、ひいては最大ピクセル読出しレートは、該試料の蛍光寿命によって本質的に制限される。
【００８７】
本方法の無線周波数多重励起アプローチは、多くの異なる診断デバイスに適合させられ得ることがわかる。例えば、本方法は、神経学、生理学、免疫学または研究に使用される高速レーザ走査型蛍光顕微鏡検査に適合させられ得る。本方法は、多光子励起蛍光顕微鏡検査や、誘導ラマン、ＣＡＲＳ、第２次高調波及び第３次高調波顕微鏡検査等での使用に適合させられ得る。高速蛍光寿命イメージング顕微鏡検査（周波数ドメインＦＬＩＭ）、蛍光を使用したイメージングフローサイトメトリー、及び、マルチフローチャネル同時シングルポイント蛍光ベースのフローサイトメトリーのような他の画像診断法もまた、本方法から利益を得ることができる。
【００８８】
本明細書の説明には多くの詳細が含まれるが、これらは本発明の範囲を限定するものではなく、単に本発明の現在好ましい実施形態のいくつかの例示を提供するものとして解釈されるべきである。従って、本発明の範囲が当業者にとって明らかになり得る他の実施形態を完全に包含することが理解されるものである。
【００８９】
本発明の実施形態は、本発明の実施の形態に係る方法及びシステムのフローチャートの例示、及び／または、アルゴリズム、式もしくは他の演算記述を参照して説明されてもよく、該アルゴリズム、式または他の演算記述は、コンピュータプログラム製品として実装されていてもよい。この点について、フローチャートの各ブロックまたはステップ、及びフローチャートのブロック（及び／またはステップ）の組み合わせ、アルゴリズム、式もしくは演算記述は、コンピュータ可読プログラムコードロジックにおいて具現化される１つ以上のコンピュータプログラム命令を含むハードウェア、ファームウェア及び／またはソフトウェアのような種々の手段により実装され得る。理解されるように、あらゆるそのようなコンピュータプログラム命令はコンピュータにロードされてもよく、該コンピュータは、汎用コンピュータまたは専用コンピュータ、またはマシンを生成するための他のプログラム可能な処理装置を制限なく含む。その際、コンピュータまたは他のプログラム可能な処理装置で実行されるコンピュータプログラム命令は、（１つまたは複数の）フローチャートの（１つまたは複数の）ブロックで指定された機能を実装する手段を生成する。
【００９０】
したがって、フローチャート、アルゴリズム、式または演算記述のブロックは、指定された機能を実行するための手段の組み合わせ、指定された機能を実行するためのステップの組合せ、及び、コンピュータ可読プログラムコードロジック手段で具現化されるような指定された機能を実行するためのコンピュータプログラム命令をサポートする。また、本明細書に記載のフローチャートの例示、アルゴリズム、式または演算記述の各ブロック及びそれらの組み合わせは、指定された機能またはステップを実行する特殊な目的のハードウェアベースのコンピュータシステム、または、特殊な目的のハードウェアとコンピュータ可読プログラムコードロジック手段との組み合わせによって実施し得ることが理解される。
【００９１】
さらに、コンピュータ可読プログラムコードロジックで具現化されるようなこれらのコンピュータプログラム命令は、コンピュータまたは他のプログラム可能な処理装置を特定の方法で機能するように指示し得るコンピュータ可読メモリ内に格納されてもよく、それによって、該コンピュータ可読メモリに記憶された命令は、（１つまたは複数の）フローチャートの（１つまたは複数の）ブロックにおいて指定された機能を実装する命令手段を含む製品を生じさせる。該コンピュータプログラム命令はまた、コンピュータまたはその他のプログラム可能な処理装置上にロードされて、該コンピュータまたはその他のプログラム可能な処理装置上で実行されてコンピュータに実装されるプロセスを生成する一連の動作ステップを生成してもよく、それによって、該コンピュータまたは他のプログラム可能な処理装置上で実行される該命令は、（１つまたは複数の）フローチャート、アルゴリズム、式または演算記述の（１つまたは複数の）ブロックにおいて指定された機能を実装するためのステップを提供する。
【００９２】
上述の説明から、本発明は、以下を含む様々な方法で実施され得ることが理解されるであろう。
１．（ａ）（１）レーザ光源、（２）音響光学偏向器、及び、（３）無線周波数コム発生器を備えた第１のビーム発生器と、（ｂ）（１）レーザ光源、（２）音響光学周波数シフタ、及び、（３）無線周波数トーン発生器を備えた第２のビーム発生器と、（ｃ）前記第１及び第２のビーム発生器からのビームに試料を経時的に露光させるように構成された対物レンズシステムと、（ｄ）光検出器とを備えており、前記第１及び第２のビーム発生器からのビームへの露光による試料からの光放射が、前記光検出器によって検出される、試料の光学問い合わせのための装置。
２．前記対物レンズシステムが、走査ミラーと、走査レンズと、チューブレンズと、対物レンズとを備えている、先の任意の実施形態に引用される装置。
３．前記光検出器が、蛍光放射フィルタと、スリット開口と、光電子増倍管とを備えている、先の任意の実施形態に引用される装置。
４．前記光検出器が、検出された蛍光放射から前記試料の画像を生成するためのプログラム作成を備えたコンピュータをさらに備えている、先の任意の実施形態に引用される装置。
５．前記対物レンズシステムを通じて試料へと導かれる結合ビームを生成するために前記第１のビーム発生器からのビームを前記第２のビーム発生器からのビームと結合させるように構成された非偏光ビームスプリッタをさらに備えている、先の任意の実施形態に引用される装置。
６．前記無線周波数コム発生器が直接デジタル合成（ＤＤＳ）無線周波数コム発生器を備えており、前記無線周波数トーン発生器が直接デジタル合成（ＤＤＳ）無線周波数トーン発生器を備えている、先の任意の実施形態に引用される装置。
７．前記対物レンズシステム及び前記光検出器を制御するように構成される制御器をさらに備えている、先の任意の実施形態に引用される装置。
８．（ａ）レーザ励起源と、（ｂ）前記レーザ励起源からの光を第１及び第２の周波数にシフトされたビームへと分割するための音響光学干渉計と、（ｃ）前記周波数シフトされたビームを結合し、結合された前記ビームを試料に集束させるためのビームスプリッタ及びレンズシステムと、（ｄ）前記試料上の全ての点からの蛍光放射を検出するための光検出器と、（ｅ）検出された前記蛍光放射から前記試料の画像を生成するためのプログラム作成を備えた、前記光検出器に結合されたコンピュータとを備えている、蛍光イメージングのための装置。
９．前記音響光学干渉計の第１の周波数にシフトされたビームが、直接デジタル合成（ＤＤＳ）無線周波数コム発生器及び音響光学偏向器により生成される、先の任意の実施形態に引用される装置。
１０．前記音響光学干渉計の第２の周波数にシフトされたビームが、直接デジタル合成（ＤＤＳ）無線周波数トーン発生器及び音響光学周波数シフタにより生成される、先の任意の実施形態に引用される装置。
１１．前記光検出器が、ダイクロイックミラーと、蛍光放射フィルタと、スリット開口と、光電子増倍管とを備えている、先の任意の実施形態に引用される装置。
１２．（ａ）第１の周波数シフトされた光のビームを作成する工程と、（ｂ）第２の周波数シフトされた光のビームを作成する工程と、（ｃ）前記第１及び第２のビームにより試料に問い合わせる工程と、（ｄ）試料における前記周波数シフトされた光のビームへの露光に基づく応答を検出する工程とを備えている、蛍光イメージングの方法。
１３．結合されたビームを生成するために前記第１のビームと前記第２のビームとを結合する工程と、前記結合されたビームにより試料に問い合わせる工程とをさらに備えている、先の任意の実施形態に引用される方法。
１４．前記第１のビームが無線周波数コム及び励起レーザビームにより駆動された音響光学偏向器により作成される、先の任意の実施形態に引用される方法。
１５．前記第２のビームが無線周波数トーン及び励起レーザビームにより駆動された音響光学周波数シフタにより作成される、先の任意の実施形態に引用される方法。
１６．画素の列における各画素ごとに別個の無線周波数を割り当てる工程をさらに備える、先の任意の実施形態に引用される方法。
１７．前記検出された蛍光放出から前記試料の画像を生成する工程をさらに備える、先の任意の実施形態に引用される方法。
１８．前記画像の生成が、コムライン周波数を識別するために参照コムに高速フーリエ変換を適用する工程と、受信した信号をフレームに分割する工程と、分割された前記信号に高速フーリエ変換を適用する工程と、コムライン周波数において変換された信号の値を記録する工程と、記録された前記値から画像を形成する工程とを備えている、先の任意の実施形態に引用される方法。
１９．前記画像の生成が、前記検出器からの信号を得る工程と、コムトーンを計算する工程と、混合信号を生成するために前記信号を各コムトーンと混合する工程と、時間分解能を決定するために信号をローパスフィルタに通す工程と、フィルタに通された前記信号をアンダーサンプリングする工程と、画像を形成する工程とを備えている、先の任意の実施形態に引用される方法。
２０．前記画像の生成が、前記検出器からの信号を得る工程と、コムトーンを計算する工程と、混合信号を生成するために前記信号を各コムトーンと混合する工程と、前記信号の各コムトーンをデジタルローパスフィルタに並列に通す工程と、フィルタに通された前記信号をオーバーサンプリングする工程と、画像を形成する工程とを備えている、先の任意の実施形態に引用される方法。
【００９３】
上述の説明には多くの詳細が含まれるが、これらは本発明の範囲を限定するものではなく、単に本発明の現在好ましい実施形態のいくつかの例示を提供するものとして解釈されるべきである。したがって、本発明の範囲が当業者にとって明らかになり得る他の実施形態を完全に包含し、該本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲以外の何によっても限定されないことが理解されるものであり、単数形の要素の参照は、明示的に述べられない限り「ただ１つ」であることを意図されず、むしろ「１つまたは複数」であることが意図される。当業者に既知である上述の好適な実施形態の要素についての全ての構造的、化学的、及び機能的な等価物は、参照により本明細書に組み込まれ、本特許請求の範囲に包含されることが意図される。さらに、装置または方法は、本発明によって解決されることが求められる各々全ての問題に対処する必要はなく、本特許請求の範囲に包含される必要はない。さらに、本開示におけるいかなる要素、構成品または方法ステップも、これらの要素、構成品、または方法ステップが特許請求の範囲に明示的に記載されているか否かに関わらず、公衆に開放されることは意図されていない。本明細書のいかなる請求項も、その要素が「〜するための手段」という語句で明確に表現されてない限り、米国特許法第１１２条第６パラグラフの規定に基づいて解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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