(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドサイトーシスを検出する方法であって、
ａ）レポーター要素を細胞表面分析物に係留し、融合要素を作り出すことと、ここで、前記レポーター要素からの検出可能なシグナルが、前記レポーター要素のエンドサイトーシス時に変化する、及び
ｂ）前記レポーター要素からの検出可能なシグナルを監視し、それによってエンドサイトーシスを検出することと、を含み、
前記検出可能なシグナル及び前記変化した検出可能なシグナルが、前記レポーター要素とレポーター基質との相互作用時に放出され、
前記レポーター要素がルシフェラーゼ酵素であり、かつ、
前記レポーター基質が、以下：
【化１】
0006419139.tif 000020
からなる群より選ばれるルシフェラーゼ基質である、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、前記レポーター要素をレポーター基質と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出可能なシグナルを監視し、エンドサイトーシスを検出することは、
ｉ）エンドサイトーシスの前の前記レポーター要素からの前記シグナルを検出することと、
ｉｉ）前記融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることと、
ｉｉｉ）前記レポーター要素からの前記シグナルの検出を繰り返すことと、及び、
ｉｖ）ステップ（ｉ）からの前記シグナルをステップ（ｉｉｉ）からの前記シグナルと比較し、エンドサイトーシスを検出することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞表面分析物が、細胞表面受容体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞表面分析物が、細胞表面の成分と非共有結合的に会合している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記レポーター要素および前記細胞表面分析物が、融合タンパク質として発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ルシフェラーゼ酵素が、甲虫もしくはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素、またはそれらの変異型もしくは変異体であり、
前記変異型もしくは変異体は、配列番号３〜４のうちの１つと９０％を超える配列同一性を有し、かつ、配列番号３〜４のうちの１つの生物学的活性のすべてまたは一部分を保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記検出可能なシグナルが、細胞外空間と比較して細胞内空間内で検出可能に変化する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出可能なシグナルが、細胞外空間と比較してエンドソーム内で検出可能に変化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間に、エンドサイトーシスを誘起するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーター基質が、細胞の形質膜に対して透過性である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記レポーター基質は、前記細胞の細胞内空間から完全にまたは大部分が排除される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記レポーター要素が、複数のレポーター基質を代謝回転することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記レポーター要素が細胞外空間に局在するように、前記融合要素が細胞膜に取り込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記レポーター要素のエンドサイトーシスが、細胞外空間からエンドソーム内への前記レポーター要素の移動をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
エンドサイトーシスを検出する方法であって、
ａ）融合要素を細胞の細胞膜に取り込むことと、ここで、前記融合要素が細胞表面分析物およびレポーター要素を含む、
ｂ）前記レポーター要素をレポーター基質と接触させることと、ここで、前記接触が検出可能なシグナルを生成する、
ｃ）前記検出可能なシグナルを監視し、それによってエンドサイトーシスを検出することと、を含み、
前記検出可能なシグナルが、前記レポーター要素とレポーター基質との相互作用時に放出され、
前記レポーター要素がルシフェラーゼ酵素であり、かつ、
前記レポーター基質が、以下：
【化２】
0006419139.tif 000021
からなる群より選ばれるルシフェラーゼ基質である、方法。
【請求項１７】
エンドサイトーシスを検出する方法であって、
ａ）融合タンパク質を細胞の細胞膜に取り込むことと、ここで、前記融合タンパク質がレポーターポリペプチドおよび細胞表面受容体を含み、前記レポーターポリペプチドがレポーター基質との相互作用時に検出可能なシグナルを放出する、
ｂ）前記レポーターポリペプチドを前記レポーター基質と接触させることと、
ｃ）前記検出可能なシグナルを検出することと、
ｄ）エンドサイトーシスを誘発する、および／またはエンドサイトーシスの発生を可能にすることと、
ｅ）前記検出可能なシグナルの検出を繰り返すことと、
ｆ）ステップ（ｃ）からの前記シグナルをステップ（ｅ）からの前記シグナルと比較することと、ここで、前記シグナルの変化が、エンドサイトーシスが発生したことを示す、
を含み、
前記検出可能なシグナル及び前記変化した検出可能なシグナルが、前記レポーターポリペプチドとレポーター基質との相互作用時に放出され、
前記レポーターポリペプチドがルシフェラーゼ酵素であり、かつ、
前記レポーター基質が、以下：
【化３】
0006419139.tif 000022
からなる群より選ばれるルシフェラーゼ基質である、方法。
【請求項１８】
膜貫通輸送を検出する方法であって、
ａ）融合タンパク質を細胞の膜に取り込むことと、ここで、前記融合タンパク質がレポーター要素および膜会合要素を含み、前記レポーター要素がレポーター基質との相互作用時に検出可能なシグナルを放出する、
ｂ）前記レポーター要素を前記レポーター基質と接触させることと、および、
ｃ）前記検出可能なシグナルを検出することと、を含み、
前記検出可能なシグナルが、前記レポーター要素とレポーター基質との相互作用時に放出され、
前記レポーター要素がルシフェラーゼ酵素であり、かつ、
前記レポーター基質が、以下：
【化４】
0006419139.tif 000023
からなる群より選ばれるルシフェラーゼ基質である、方法。
【請求項１９】
ｄ）膜貫通輸送を誘発し、および／または膜貫通輸送の発生を可能にするステップと、
ｅ）前記検出可能なシグナルの検出を繰り返すステップと、及び、
ｆ）ステップ（ｃ）からの前記シグナルをステップ（ｅ）からの前記シグナルと比較するステップと、ここで、前記シグナルの変化が、膜貫通輸送が発生したことを示す、
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年１１月２３日に出願された仮特許出願第６１／５６３，２９４号に対する優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
生体膜を通過する分析物および／または細胞成分の移動（例えば、細胞表面内部移行）を監視するための組成物および方法が本明細書に提供される。具体的には、レポーター構築物が提供され、その膜貫通移動（例えば、エンドサイトーシスによる）は、本明細書に記載の方法によって監視される。
【背景技術】
【０００３】
エンドサイトーシスは、プロセスの中でも特に受容体脱感作およびシグナル伝達の中心となる極めて重要な機序である。ハイコンテンツ画像に基づくエンドサイトーシスの測定に利用可能な技術は、生物学的な予測であるが、使いやすさの点から制限される。対照的に、酵素断片相補性を用いるものといったハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）互換性技術は、しばしばスクリーニングエラー（例えば、ＨＴＳにおける偽陰性の的中）を引き起こす生物系の過剰な操作を必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）レポーター要素を細胞表面分析物に係留（tethering）し、融合要素を作り出すことと、（ｂ）レポーター要素からの検出可能なシグナルを監視し、それによってエンドサイトーシスを検出することと、を含む、エンドサイトーシスを検出する方法を提供する。一部の実施形態において、レポーター要素は、レポーター基質との相互作用時に検出可能なシグナルを放出する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、レポーター要素をレポーター基質と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、細胞表面分析物、レポーター要素、および／または融合要素のエンドサイトーシスを可能にするステップをさらに含む。一部の実施形態において、レポーター要素からの検出可能なシグナルは、レポーター要素のエンドサイトーシス時に変化する。一部の実施形態において、検出可能なシグナルを監視し、それによってエンドサイトーシスを検出することは、（ｉ）融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることと、（ｉｉ）エンドサイトーシスの誘発後にシグナルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、エンドサイトーシスを検出するために検出可能なシグナルを監視することは、（ｉ）エンドサイトーシスの前のレポーター要素からのシグナルを検出することと、（ｉｉ）融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることと、（ｉｉｉ）レポーター要素からのシグナルの検出を繰り返すことと、（ｉｖ）ステップ（ｉ）からのシグナルとステップ（ｉｉｉ）からのシグナルを比較し、エンドサイトーシスを検出することと、を含む。一部の実施形態において、融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることは、エンドサイトーシスの時間（例えば、十分な時間）を考慮することを含む（例えば、１秒．．．２秒．．．５秒．．．３０秒．．．１分．．．２分．．．５分．．．３０分．．．６０分以上）。一部の実施形態において、細胞表面分析物は、細胞表面成分である。一部の実施形態において、細胞表面成分は、細胞表面受容体を含む。一部の実施形態において、細胞表面分析物は、細胞表面の成分に非共有結合的に会合している。一部の実施形態において、レポーター要素および細胞表面分析物は、融合タンパク質として発現される。一部の実施形態において、レポーター要素および細胞表面分析物は、共有結合的または非共有結合的に共役する（例えば、翻訳後）。一部の実施形態において、レポーター要素および細胞表面分析物は、融合タンパク質として発現される。一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、光学的シグナルを含む。一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、発光を含む。一部の実施形態において、レポーター要素は、ルシフェラーゼ酵素を含む。一部の実施形態において、ルシフェラーゼ酵素は、甲虫またはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素である。一部の実施形態において、ルシフェラーゼ酵素は、野生型ルシフェラーゼ（例えば、甲虫またはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素）またはそれらの変異体（例えば、野生型と７０％超配列同一性）である。一部の実施形態において、エンドサイトーシスは、細胞外空間から細胞内空間へのレポーター要素の移動をもたらす。一部の実施形態において、レポーター要素は、生体膜（例えば、形質膜）を通過して移動する。一部の実施形態において、レポーター要素は、新規膜微小環境に転位置する。一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、細胞外空間と比較して細胞内空間内で、検出可能に変化する（例えば、シグナルの増大、シグナルの減少、放出性質の変化等）。一部の実施形態において、レポーターからの検出可能なシグナルは、細胞外空間と比較して細胞内空間内で減少する。一部の実施形態において、細胞内空間は、エンドソームを含む。一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、細胞外空間と比較してエンドソーム内で検出可能に変化する（例えば、シグナルの増大、シグナルの減少、放出性質の変化等）。一部の実施形態において、レポーターからの検出可能なシグナルは、細胞の外側と比較してエンドソーム内で減少する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間に、エンドサイトーシスを誘起するステップをさらに含む。一部の実施形態において、エンドサイトーシスは、受容体作動薬（例えば、小分子、サイトカイン等）、修飾された成長条件、薬理化合物、細胞シグナル経路の変化、種を誘発する任意のエンドサイトーシスの存在等の１つ以上によって誘起される。一部の実施形態において、レポーター基質は、生細胞の形質膜に対して透過性である。一部の実施形態において、レポーター基質は、細胞膜に対して透過性である。一部の実施形態において、レポーター基質は、細胞の細胞内空間から完全にまたは大部分が排除される。一部の実施形態において、レポーターは、複数のレポーター基質を代謝回転することができる（例えば、複数の基質代謝回転）。一部の実施形態において、レポーター基質は、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、セレンテラジン、またはセレンテラジン誘導体である。
【０００５】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）融合要素を細胞の細胞膜に取り込むことであって、融合要素が細胞表面分析物およびレポーター要素を含む、取り込むことと、（ｂ）レポーターをレポーター基質と接触させることであって、その接触が検出可能なシグナルを生成する、接触することと、（ｃ）検出可能なシグナルを監視し、それによってエンドサイトーシスを検出することと、を含む、エンドサイトーシスを検出する方法を提供する。一部の実施形態において、検出可能なシグナルの監視は、（ｉ）融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることと、（ｉｉ）エンドサイトーシスの誘発後にシグナルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、検出可能なシグナルを監視することは、（ｉ）エンドサイトーシスの前のシグナルを検出することと、（ｉｉ）融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることと、（ｉｉｉ）エンドサイトーシス後のシグナルを検出することと、（ｉｖ）ステップ（ｉ）からのシグナルとステップ（ｉｉｉ）からのシグナルを比較し、エンドサイトーシスを検出することと、を含む。一部の実施形態において、融合要素は、融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、エンドサイトーシスを可能にすることは、エンドサイトーシスの時間（例えば、十分な時間）を考慮することを含む（例えば、１秒．．．２秒．．．５秒．．．３０秒．．．１分．．．２分．．．５分．．．３０分．．．６０分以上）。一部の実施形態において、細胞表面分析物は、細胞表面成分を含む。一部の実施形態において、細胞表面成分は、細胞表面受容体を含む。一部の実施形態において、細胞表面分析物は、細胞表面の成分に非共有結合的に会合している。一部の実施形態において、レポーター要素は、ルシフェラーゼ酵素を含む。一部の実施形態において、ルシフェラーゼ酵素は、甲虫またはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素である。一部の実施形態において、ルシフェラーゼ酵素は、野生型酵素（例えば、甲虫またはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素）またはそれらの変異体（例えば、７０％超配列同一性）である。一部の実施形態において、融合要素は、レポーター要素が細胞外空間内に局在（例えば、細胞に隣接）するように、細胞膜に取り込まれる。一部の実施形態において、レポーター要素のエンドサイトーシスは、細胞外空間からエンドソーム内へのレポーター要素の移動をもたらす。一部の実施形態において、シグナルは、細胞外空間と比較してエンドソーム内で検出可能に変化する。一部の実施形態において、シグナルは、細胞外空間と比較してエンドソーム内で減少する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間に、エンドサイトーシスを誘起するステップをさらに含む。一部の実施形態において、エンドサイトーシスは、受容体作動薬（例えば、小分子、サイトカイン等）、修飾された成長条件、薬理化合物、細胞シグナル経路の変化、種を誘発する任意のエンドサイトーシスの存在等の１つ以上によって誘起される。一部の実施形態において、レポーター基質は、生細胞の形質膜に対して透過性であることが知られている。一部の実施形態において、レポーター基質は、細胞膜に対して透過性であるか、または実験の条件下で細胞の位相的内側から完全にもしくは大部分が排除される。一部の実施形態において、レポーター基質は、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、セレンテラジン、またはセレンテラジン誘導体である。
【０００６】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）融合タンパク質を細胞の細胞膜に取り込むステップであって、融合タンパク質がレポーターポリペプチドおよび細胞表面受容体を含み、レポーターポリペプチドがレポーター基質との相互作用時に検出可能なシグナルを放出する、取り込むステップ、（ｂ）レポーターポリペプチドをレポーター基質と接触させるステップ、（ｃ）検出可能なシグナルを検出するステップ、（ｄ）エンドサイトーシスを誘発し、かつ／またはエンドサイトーシスの発生を可能にするステップ、（ｅ）検出可能なシグナルの検出を繰り返すステップ、および（ｆ）ステップ（ｃ）からのシグナルをステップ（ｅ）からのシグナルと比較するステップであって、シグナルの変化が、エンドサイトーシスが発生したことを示す、比較するステップのうちの１つ以上（例えば、すべてのステップ、順序通りのすべてのステップ）を含むエンドサイトーシスを検出する方法を提供する。一部の実施形態において、融合タンパク質は、融合構築物から発現される。一部の実施形態において、融合タンパク質は、抗体抗原会合に基づいて生成される。一部の実施形態において、融合タンパク質は、細胞内で発現される。一部の実施形態において、細胞表面分析物は、外因的に生成され、細胞の培地に添加される。一部の実施形態において、レポーター基質は、細胞膜透過性である。一部の実施形態において、レポーターポリペプチドは、レポーター基質の複数の代謝回転能力を有する。一部の実施形態において、レポーターポリペプチドは、ルシフェラーゼ酵素を含む。一部の実施形態において、ルシフェラーゼ酵素は、甲虫またはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素である。一部の実施形態において、ルシフェラーゼ酵素は、野生型酵素（例えば、甲虫またはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素）またはそれらの変異体（例えば、７０％超配列同一性）である。一部の実施形態において、融合タンパク質は、レポーター要素が細胞の外側に局在するように、細胞膜に取り込まれる。一部の実施形態において、レポーターポリペプチドのエンドサイトーシスは、細胞外空間から細胞内空間へのレポーターポリペプチドの移動をもたらす。一部の実施形態において、シグナルは、細胞外空間と比較して細胞内空間内で検出可能に変化する。一部の実施形態において、細胞内空間は、エンドソーム内にある。一部の実施形態において、シグナルは、細胞外空間と比較してエンドソーム内で検出可能に変化する。一部の実施形態において、シグナルは、細胞外空間と比較して細胞内空間内で減少する。一部の実施形態において、シグナルは、細胞外空間と比較してエンドソーム内で減少する。一部の実施形態において、レポーター基質は、生細胞の形質膜に対して透過性であることが知られている。一部の実施形態において、レポーター基質は、細胞膜に対して透過性であるか、または実験の条件下で細胞の位相的内側から完全にもしくは大部分が排除される。一部の実施形態において、レポーター基質は、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、セレンテラジン、またはセレンテラジン誘導体である。
【０００７】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）レポーター要素を細胞表面分析物に係留することと、（ｂ）レポーター要素からの検出可能なシグナルを監視し、それによってエンドサイトーシスを検出することと、を含む、エンドサイトーシスを検出する組成物および方法を提供する。一部の実施形態において、レポーター要素は、レポーター基質との相互作用時に検出可能なシグナルを放出する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、レポーター要素をレポーター基質と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、細胞表面分析物および／またはレポーター要素のエンドサイトーシスの時間を考慮するステップをさらに含む。一部の実施形態において、レポーター要素からの検出可能なシグナルは、レポーター要素のエンドサイトーシス時に変化する。一部の実施形態において、検出可能なシグナルを監視し、エンドサイトーシスを検出することは、（ｉ）融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることと、（ｉｉ）エンドサイトーシスのシグナル誘発を検出することと、を含む。一部の実施形態において、検出可能なシグナルを監視し、エンドサイトーシスを検出することは、（ｉ）エンドサイトーシスの前のシグナルを検出することと、（ｉｉ）融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることと、（ｉｉｉ）エンドサイトーシス後のシグナルを検出することと、（ｉｖ）ステップ（ｉ）からのシグナルとステップ（ｉｉｉ）からのシグナルを比較し、それによってエンドサイトーシスを検出することと、を含む。一部の実施形態において、レポーター要素は、細胞表面成分に係留される。一部の実施形態において、細胞表面成分は、細胞表面受容体を含む。一部の実施形態において、細胞表面受容体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０の配列を含む。一部の実施形態において、細胞表面受容体は、配列番号５〜１０のうちの１つと７０％超える配列同一性（例えば、７５％．．．８０％．．．９０％．．．９５％．．．９８％．．．９９％）を含む。一部の実施形態において、細胞表面受容体は、配列番号５〜１０のうちの１つの生物学的活性のすべてまたは一部分を保持する。一部の実施形態において、レポーター要素および細胞表面成分は、融合タンパク質として発現される。一部の実施形態において、融合タンパク質は、レポーター要素および細胞表面成分に加えて１つ以上のペプチド要素を含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上のシグナルペプチド（例えば、ＩＬ６シグナルペプチド）を含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１と７０％以上配列同一性（例えば、７０％．．．８０％．．．９０％．．．９５％．．．９８％．．．９９％）のシグナルペプチドを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上のリンカーセグメント（例えば、ＧＳＳＧリンカー）を含む。一部の実施形態において、リンカーセグメントは、融合タンパク質の２つのポリペプチド部分を含むペプチドまたは非ペプチド（例えば、核酸、ＰＥＧ、アルキル鎖）セグメントである。一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２と７０％以上（例えば、７０％．．．８０％．．．９０％．．．９５％．．．９８％．．．９９％）配列同一性のリンカーを含む。一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、光学的シグナルを含む。一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、発光を含む。一部の実施形態において、レポーター要素は、ルシフェラーゼ酵素を含む。一部の実施形態において、ルシフェラーゼ酵素は、配列番号３または配列番号４の配列を含む。一部の実施形態において、ルシフェラーゼ酵素は、配列番号３〜４のうちの１つと７０％を超える配列同一性（例えば、７５％．．．８０％．．．９０％．．．９５％．．．９８％．．．９９％）を含む。一部の実施形態において、ルシフェラーゼ酵素は、配列番号３〜４のうちの１つの生物学的活性のすべてまたは一部分を保持する。一部の実施形態において、エンドサイトーシスは、細胞の外側からエンドソーム内へのレポーター要素の移動をもたらす。一部の実施形態において、エンドサイトーシスは、細胞外空間から細胞内空間（例えば、エンドソーム）内へのレポーター要素の移動をもたらす。一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、細胞の外側と比較してエンドソーム内で検出可能に変化する。一部の実施形態において、レポーター要素からの検出可能なシグナルは、細胞の外側と比較してエンドソーム内で減少する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間に、エンドサイトーシスを誘起するステップ（例えば、化学物質を用いて（例えば、医薬品を用いて））をさらに含む。一部の実施形態において、レポーター基質は、細胞培地に添加される。一部の実施形態において、レポーター基質は、生細胞の形質膜に対して透過性であるか、細胞膜に対して透過性であるか、または細胞の位相的内側から完全にもしくは大部分が排除される。
【０００８】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）融合要素を細胞の細胞膜に取り込むことであって、融合要素が細胞表面分析物およびレポーター要素を含む、取り込むことと、（ｂ）レポーター要素をレポーター基質と接触させることであって、その接触は、レポーター要素からシグナルを生成する、接触することと、（ｃ）シグナルを監視し、それによってエンドサイトーシスを検出することと、を含む、エンドサイトーシスを検出する方法を提供する。一部の実施形態において、シグナルを監視し、エンドサイトーシスを検出することは、（ｉ）エンドサイトーシスの前のシグナルを検出することと、（ｉｉ）融合要素および細胞表面分析物のエンドサイトーシスを可能にすることと、（ｉｉｉ）エンドサイトーシス後のシグナルを検出することと、（ｉｖ）ステップ（ｉ）からのシグナルとステップ（ｉｉｉ）からのシグナルを比較し、それによってエンドサイトーシスを検出することと、を含む。一部の実施形態において、融合要素は、融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、細胞表面分析物は、細胞表面成分を含む。一つの実施形態において、細胞表面成分は、細胞表面受容体を含む。一部の実施形態において、レポーター要素は、ルシフェラーゼ酵素（例えば、甲虫またはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素）を含む。一部の実施形態において、ルシフェラーゼ酵素は、野生型酵素（例えば、甲虫またはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素）またはそれらの変異体（例えば、７０％超配列同一性）である。一部の実施形態において、融合要素は、レポーター要素が細胞の外側に局在するように細胞膜に取り込まれる。一部の実施形態において、レポーター要素のエンドサイトーシスは、細胞の外側からエンドソーム内へのレポーター要素の移動をもたらす。一部の実施形態において、シグナルは、エンドソーム内で細胞の外側と比較して検出可能に変化する。一部の実施形態において、シグナルは、細胞の外側と比較してエンドソーム内で減少する。一部の実施形態において、放出性質、例えば、シグナルの波長は、細胞の外側と比較してエンドソーム内で変化する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間に、エンドサイトーシスを誘起するステップをさらに含む。一部の実施形態において、レポーター基質は、生細胞の形質膜に対して透過性であるか、細胞膜に対して透過性であるか、または細胞の位相的内側から完全にもしくは大部分が排除される。一部の実施形態において、レポーター基質は、膜透過性基質である。
【０００９】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）融合要素を細胞の細胞膜に取り込むことであって、融合要素が細胞表面分析物およびレポーター要素を含む、取り込むことと、（ｂ）エンドサイトーシスの発生を可能にする、および／またはエンドサイトーシスを誘発することと、（ｃ）レポーター要素をレポーター基質と接触させることであって、その接触は、レポーター要素からのシグナルを生成する、接触することと、（ｄ）シグナルを監視し、それによってエンドサイトーシスを検出することと、を含む、エンドサイトーシスを検出する方法を提供する。
【００１０】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）融合タンパク質を細胞の細胞膜に取り込むことであって、融合タンパク質がレポーターポリペプチドおよび細胞表面受容体を含み、レポーターポリペプチドがレポーター基質との相互作用時に検出可能なシグナルを放出する、取り込むことと、（ｂ）レポーターポリペプチドをレポーター基質と接触させることと、（ｃ）レポーターポリペプチドから検出可能なシグナルを検出することと、（ｄ）エンドサイトーシスを誘発する、および／またはエンドサイトーシスの発生を可能にすることと、（ｅ）検出可能なシグナルの検出を繰り返すことと、（ｆ）ステップ（ｃ）からのシグナルをステップ（ｅ）からのシグナルと比較することであって、シグナルの変化が、エンドサイトーシスが発生したことを示す、比較することと、を含む、エンドサイトーシスを検出する方法を提供する。一部の実施形態において、融合タンパク質は、融合構築物から発現される。一部の実施形態において、融合タンパク質は、細胞内で内因的に発現される。一部の実施形態において、融合タンパク質は、外因的に発現され、細胞培地に添加される。
【００１１】
一部の実施形態において、本発明は、レポータータンパク質および細胞表面成分を含む融合タンパク質、ならびにそれらを使用する、例えば、エンドサイトーシスを検出するための方法を提供する。一部の実施形態において、レポータータンパク質は、レポーター酵素である。一部の実施形態において、レポーター酵素は、ルシフェラーゼである。一部の実施形態において、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、オプロフォーラスルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、それらの変異型もしくは変異体、または他の好適なルシフェラーゼである。一部の実施形態において、ルシフェラーゼは、配列番号３または配列番号４のすべてまたは一部分に対して７０％以上の配列同一性を有する。一部の実施形態において、ルシフェラーゼは、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のルシフェラーゼの生物学的活性を有する。一部の実施形態において、ルシフェラーゼは、配列番号３または配列番号４のルシフェラーゼの生物学的活性を有する。一部の実施形態において、細胞表面成分は、細胞表面タンパク質である。一部の実施形態において、細胞表面タンパク質は、細胞表面受容体である。一部の実施形態において、細胞表面受容体は、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のすべてまたは一部分に対して７０％以上の配列同一性を有する。一部の実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上のシグナルペプチド（例えば、細胞表面シグナル、分泌シグナル等）を含む。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１のすべてまたは一部分に対して７０％以上の配列同一性を有する。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１のシグナルペプチドの生物学的活性を有する。一部の実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上のリンカーセグメントを含む。一部の実施形態において、リンカーセグメントは、ペプチドまたは非ペプチドである。一部の実施形態において、リンカーセグメントは、ポリマーである。一部の実施形態において、リンカーセグメントは、炭素含有鎖である。一部の実施形態において、リンカーは、ＧＳＳＧリンカーである。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号２のすべてまたは一部分に対して７０％以上の配列同一性を有する。一部の実施形態において、リンカーは、細胞表面成分、レポーター、および／またはシグナルペプチドを細胞表面成分、レポーター要素、および／またはシグナルペプチドの１つ以上に共有結合的に連結する。一部の実施形態において、分泌タグ（例えば、ＩＬ６分泌タグ（例えば、配列番号１））およびリンカー（例えば、ＧＳＳＧリンカー（例えば、配列番号２））は、融合タンパク質のＮ末端にある。一部の実施形態において、分泌タグは、リンカーによってルシフェラーゼレポーター酵素のＮ末端に付着される。一部の実施形態において、ルシフェラーゼレポーター酵素のＣ末端は、直接またはリンカーによってのいずれかで、細胞表面成分、例えば、細胞表面タンパク質または受容体のＮ末端に付着される。
【００１２】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、以下の式、
Ｎ−シグナルペプチド−Ｌ1−レポーター−Ｌ2−細胞表面タンパク質−Ｃ、
を構成し、式中、Ｌ1は、任意のリンカーセグメントであり、Ｌ2は、第２の任意のリンカーセグメントである。
【００１３】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、以下の式、
Ｎ−レポーター−Ｌ−細胞表面タンパク質−Ｃ、
を構成し、式中Ｌは、任意のリンカーセグメントである。
【００１４】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、以下の式、
Ｎ−シグナルペプチド−レポーター−細胞表面タンパク質−Ｃ、を構成する。
【００１５】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、以下の式、
Ｎ−レポーター−細胞表面タンパク質−Ｃ、を構成する。
【００１６】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、以下の式、
Ｎ−シグナルペプチド−Ｌ1−細胞表面タンパク質−Ｌ2−レポーター−Ｃ、
を構成し、Ｌ1は、任意のリンカーセグメントであり、Ｌ2は、第２の任意のリンカーセグメントである。
【００１７】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、以下の式、
Ｎ−細胞表面タンパク質−Ｌ−レポーター−Ｃ、
を構成し、式中Ｌは、任意のリンカーセグメントである。
【００１８】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、以下の式、
Ｎ−シグナルペプチド−細胞表面タンパク質−レポーター−Ｃ、
を構成し、Ｌ1は、任意のリンカーセグメントであり、Ｌ2は、第２の任意のリンカーセグメントである。
【００１９】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、以下の式、
Ｎ−細胞表面タンパク質−レポーター−Ｃ、を構成する。
【００２０】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のアッセイを実施するための成分、試薬（例えば、融合構築物、レポータータンパク質、基質等）、材料（例えば、固体支持体（例えば、マルチウェルプレート）、細胞）、および／またはシステム／機器（例えば、蛍光光度計、細胞造影、データ解析等）を含むキットを提供する。一部の実施形態において、例えば、本発明のキットは、レポータータンパク質を含む融合構築物、例えばルシフェラーゼ酵素、およびレポータータンパク質の基質、例えばルシフェリンもしくはセレンテラジンまたはそれらの誘導体を含み得る。
【００２１】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）融合タンパク質を細胞膜に取り込むことであって、融合タンパク質がレポーター要素および膜会合要素を含み、レポーター要素がレポーター基質との相互作用時に検出可能なシグナルを放出する、取り込むことと、（ｂ）レポーター要素をレポーター基質と接触させることと、（ｃ）検出可能なシグナルを検出することと、を含む、膜貫通輸送を検出する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、（ｄ）膜貫通輸送を誘発し、かつ／または膜貫通輸送の発生を可能にするステップと、（ｅ）検出可能なシグナルの検出を繰り返すステップと、（ｆ）ステップ（ｃ）からのシグナルをステップ（ｅ）からのシグナルと比較するステップであって、シグナルの変化が、膜貫通輸送が発生したことを示す、比較するステップと、をさらに含む。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、エンドサイトーシスを誘発し、かつ／または膜貫通輸送の発生を可能にするステップをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、（ｆ）ステップ（ｃ）からのシグナルを対照シグナルと比較するステップであって、シグナルの変化が、膜貫通輸送が発生したことを示す、比較するステップをさらに含む。一部の実施形態において、レポーター要素は、酵素である。一部の実施形態において、シグナルは、光学的シグナルである。一部の実施形態において、レポーター基質は、膜透過性である。一部の実施形態において、膜会合要素は、膜会合ポリペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】作動薬または媒介物のみに応答してホタルルシフェラーゼに融合したＧＰＣＲの融合タンパク質のエンドサイトーシスの動力学的測定を示すグラフを示す。（ａ）ホタル−Ｌｕｃ／ＡＴ１Ｒ内部移行、（ｂ）ホタル−Ｌｕｃ／ＯＰＲＤ１内部移行、（ｃ）ホタル−Ｌｕｃ／Ｂ２ＡＲ内部移行、および（ｄ）ホタル−Ｌｕｃ／Ｖ２Ｒ内部移行。
【図２】定時点の濃度応答曲線を示す。（ａ）耐熱性ホタルルシフェラーゼ（ＦＦｌｕｃ）を使用する４つの異なるＧＰＣＲの正規化された濃度応答曲線。２０分間の各試料（作動薬濃度）からの発光を、刺激の前に同じ試料の発光に正規化した、（ｂ）ＥＧＦＲ／ＦＦｌｕｃ融合物のエンドサイトーシスに対するＥＧＦ濃度応答曲線、（ｃ）ＨｅＬａ細胞中のＦＦＬｕｃ／Ｂ２ＡＲ融合物のエンドサイトーシスに対するイソプロテレノール濃度応答曲線、（ｄ）Ｂ２ＡＲに対するＦＦＬｕｃ（ｌｕｃ２）融合物の交代性の変異型のエンドサイトーシスに対するイソプロテレノール濃度応答曲線、（ｅ）Ｄ−ルシフェリン構造（ＰＢＩ−３１０２）に基づく交代性のルシフェリン基質を使用したＦＦＬｕｃ／Ｂ２ＡＲ融合物のエンドサイトーシスに対するイソプロテレノール濃度応答曲線。（ｆ）ルシフェラーゼ活性のためのＭｇ／ＡＴＰの細胞内貯蔵に依存することによるＦＦＬｕｃ／Ｖ２Ｒ融合物のエンドサイトーシスに対する「シグナルの増大」アルギニンバソプレシン濃度応答曲線。
【図３】実時間における様々なＯｇＬｕｃ／ＧＰＣＲ融合物のエンドサイトーシスに対する単一用量の正規化された動力学的応答。
【図４】様々なＯｇＬｕｃ／ＧＰＣＲ融合物のエンドサイトーシスに対する正規化されたＧＰＣＲ濃度応答曲線を示す。ここで、３０分間の発光を同じ試料の発光に刺激の前に正規化した。正規化された発光を作動薬濃度に対してプロットした。
【図５】（ａ〜ｂ）上述の方法を使用するＯｇＬｕｃレポータータンパク質を使用してＢ２ＡＲおよびＶ２Ｒのエンドサイトーシス誘発の作動薬特異度を示すグラフを示す、（ｃ〜ｄ）上述のように基質（ＰＢＩ−４５２５およびＰＢＩ−４３７７）として交代性のセレンテラジン誘導体を使用する、ＯｇＬｕｃＢ２ＡＲ融合物のエンドサイトーシスに対する濃度応答曲線を示す、（ｅ〜ｆ）エンドサイトーシスが発生した後にルシフェラーゼ基質を添加することによるＯｇＬｕｃ−Ｂ２ＡＲまたはＯｇＬｕｃ−Ｖ２Ｒのエンドサイトーシスを測定する能力を示す（非動力学的、エンドポイント測定）。
【図６】Ｂ２ＡＲエンドサイトーシス遮断薬、アルペレネロール（ａｌｐｅｒｅｎｅｒｏｌ）の存在または不在下における、ＯｇＬｕｃ／Ｂ２ＡＲエンドサイトーシスに対するイソプロテレノール濃度応答曲線を示す。
【図７】本アッセイ読み出しに関する機能性ダイナミンタンパク質上の依存を示す共発現ドミナントネガティブダイナミンの存在下における、ＦＦＬｕｃ／Ｂ２ＡＲエンドサイトーシスに対する濃度応答曲線を示す。
【図８】アンジオテンシン−１Ａ型受容体／ホタルルシフェラーゼ融合物と既知のβ−アレスチン偏向作動薬ＴＲＶ１２００２７を使用するＧタンパク質非依存性シグナル伝達現象を示すグラフを示す。
【図９−１】ルシフェラーゼ基質の例の化学構造を示す。
【図９−２】ルシフェラーゼ基質の例の化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
本明細書で使用される場合、「膜貫通輸送」という用語は、任意の好適な機序による、生体膜または脂質二重層を通過する分析物、細胞表面成分、タンパク質等の移動を指す。「膜貫通輸送」という用語は、細胞膜、細胞内膜、小胞膜、核膜、細胞内小器官膜（例えば、葉緑体、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ複合体、エンドソーム、空胞等）を通過する移動に適用される。「膜貫通輸送」という用語は、任意の好適な機序（例えば、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、自己貪食性流動、膜転位、エキソサイトーシス、自己貪食、膜貫通移動等）による膜を通過する移動に適用される。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「細胞外」、「細胞外空間」、および「細胞外領域」という用語は、細胞内、細胞の外側、細胞膜の外側に含まれず、かつ／または細胞膜内に含まれない物理的空間を指す。例えば、細胞に直接隣接するが形質膜内ではない領域は、細胞外であると定義される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「細胞内」、「細胞内空間」、および「細胞内領域」という用語は、細胞内に含まれ、かつ／または細胞膜内に包まれる物理的空間を指す。「細胞質の」、「核の」、「エンドソームの」、および細胞内の他の区画または細胞小器官は、「細胞内空間」である。
【００２６】
詳細な説明
生体膜を通過する分析物および／または細胞成分の移動（例えば、細胞表面内部移行）を監視するための組成物および方法が本明細書に提供される。特に、レポーター構築物が提供され、その膜貫通移動（例えば、エンドサイトーシスによる）は、本明細書に記載の方法によって監視される。本明細書に記載の組成物および方法は、様々な種類の膜貫通輸送の検出および監視に好適である。しかし、本明細書に記載のほとんどの実施形態は、細胞表面内部移行および／またはエンドサイトーシスに特に着目する。一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法が、他の細胞膜（例えば、細胞内膜、小胞膜、核膜、細胞内小器官膜等）を通過する他の種類の輸送（例えば、ファゴサイトーシス、自己貪食性流動、膜転位、エキソサイトーシス）の検出および／または監視に好適であることに留意されたい。本明細書に記載の実施形態は、任意の一種類の膜輸送または任意の一種類のクラスの膜に限定されない。具体的にエンドサイトーシスを取り上げる本明細書の実施形態は、同様に他の種類の膜貫通輸送にもより広範に適用されるものと見なされるべきである。
【００２７】
細胞による細胞表面内部移行および／またはエンドサイトーシスを監視するための組成物および方法が本明細書に提供される。特に、レポーター構築物（例えば、細胞表面成分およびレポータータンパク質の融合物）が、提供され、その内部移行（例えば、エンドサイトーシスによる）は、本明細書に記載の方法によって監視される。一部の実施形態において、生細胞中においてリアルタイムでエンドサイトーシスを監視する単純な方法を提供するおよび／または既存の方法の不利益を伴わない、組成物（例えば、細胞表面成分／レポーター融合タンパク質）およびそれらを使用する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、固体支持体、例えば、マイクロプレート上で実施される。一部の実施形態において、細胞表面成分、例えば、細胞表面受容体またはタンパク質のエンドサイトーシスの量、速度、持続期間、タイミング、誘因、および／または阻害物質を判定するための方法および組成物が提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載の内部移行アッセイ法は、最小限に浸潤性であり、一過性にトランスフェクトされた細胞に適合し、および／または他の機能アッセイのエンドポイント、例えば、二次メッセンジャーシグナル伝達、生存率、細胞毒性の測定、または同様の表現型アッセイとともに、エンドサイトーシスのマルチプレックスな分析に非破壊的エンドポイントを利用する。
【００２８】
一部の実施形態では、細胞表面タンパク質、例えば、細胞表面受容体、細胞表面分析物等の内部移行および／またはエンドサイトーシスを監視および／または検出するための組成物および方法。一部の実施形態において、検出可能なシグナルを生成する（例えば、基質との相互作用を通して、検出可能な標識を介して、別の分子との相互作用を通して等）レポーター要素、例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）は、非細胞質内空間の細胞表面に（例えば、細胞外空間、例えば、細胞表面受容体に）係留される。一部の実施形態において、そこにレポーター要素が付着される細胞膜または特定の細胞膜成分の領域の内部移行またはエンドサイトーシスは、レポーター要素の内部移行またはエンドサイトーシスをもたらす。一部の実施形態において、放出されるシグナル中の検出可能な変化（例えば、シグナルの損失、シグナルの減少、頻度の変化、シグナルの増加、シグナルの増大、波長の変化等）は、レポーター分子の内部移行時に（例えば、エンドサイトーシスを通して）生じる。一部の実施形態において、放出されるシグナルを監視すること（例えば、エンドポイント検出によって、リアルタイムの監視によって等）は、レポーター要素の内部移行を検出する方法を提供する。一部の実施形態において、放出されるシグナルの監視および／またはレポーター分子の内部移行は、エンドサイトーシス（例えば、速度、タイミング、持続期間、量等）ならびにそれらの様々な細胞内条件、細胞外条件、分子成分、および医薬品の影響を研究または監視するための方法を提供する。一部の実施形態において、レポーター要素（複数可）を細胞表面に係留する、（例えば、細胞表面上または細胞もしくはエンドソーム内で）放出されるシグナルを検出する、レポーターシグナルを監視する（例えば、リアルタイムで、エンドポイント検出を介して等）、エンドサイトーシス上の条件的な変化の影響（例えば、薬物様分子の導入）を評価する等のための組成物および方法が提供される。
【００２９】
一部の実施形態において、レポータータンパク質、例えば、酵素（例えば、ルシフェラーゼ）は、細胞表面受容体に付着され、それによりレポータータンパク質を細胞表面に係留し、細胞表面受容体の内部移行および／またはエンドサイトーシスを監視する。一部の実施形態において、レポータータンパク質および細胞表面受容体タンパク質は、例えば、融合構築物（例えば、遺伝的構築物）からの単一融合タンパク質として発現される。一部の実施形態において、レポータータンパク質および細胞表面受容体タンパク質は、（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に）安定して会合し、融合物を形成する。一部の実施形態において、レポータータンパク質および細胞表面受容体タンパク質は、非遺伝的に共役し、融合タンパク質を形成する。一部の実施形態において、細胞表面受容体の例えばエンドサイトーシスを介する内部移行は、レポータータンパク質の内部移行をもたらす。一部の実施形態において、レポータータンパク質からのシグナルは、細胞表面受容体（およびレポーター）のエンドサイトーシス時に変化する。一部の実施形態において、経時的にレポーター分子からのシグナルを監視することは、細胞表面受容体の内部移行および／またはエンドサイトーシスを検出するための手段を提供する（例えば、シグナルが内部移行時に変化するように）。
【００３０】
一部の実施形態において、例えば、レポーターおよび隣接する細胞膜の内部移行を監視するために、レポーター要素を細胞膜に付着する、接着する、固着する、会合する、係留する等の手段が提供される。一部の実施形態において、細胞表面成分は、レポーター要素を細胞表面に付着する、接着する、固着する、会合する、係留する等のために用いられる。一部の実施形態において、レポーター要素および細胞表面成分を含む融合要素が提供される。一部の実施形態において、細胞表面成分は、融合要素を細胞表面に付着する、接着する、固着する、会合する、係留する等が可能な任意の要素、例えばタンパク質である。一部の実施形態において、細胞表面成分は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、ウイルス粒子、巨大分子複合体等を含む。一部の実施形態において、細胞表面成分は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。一部の実施形態において、細胞表面成分は、膜会合タンパク質、膜会合タンパク質、細胞表面受容体、膜貫通受容体等である。一部の実施形態において、受容体は、イオンチャネル連結受容体（例えば、アセチルコリン受容体）、酵素連結受容体（例えば、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ結合受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ結合受容体）、および／またはＧタンパク質共役受容体／７−膜貫通受容体である。本明細書に記載の実施形態において使用される具体的な膜貫通受容体には、アンジオテンシン２型ｌａ受容体（ＡＴ１Ｒ）、バソプレシン２受容体（Ｖ２Ｒ）、δオピオイド受容体（ＯＰＲＤ１）および上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）δオピオイド受容体、バソプレシン２受容体、ＥＤＧ１受容体、β２アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ２）、アルギニンバソプレシン受容体２（ＡＶＰＲ２）、セロトニン受容体１ａ（ＨＴＲ１Ａ）、ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体（ＣＨＲＭ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）、ドーパミンＤ２受容体（ＤＲＤ２）、κオピオイド受容体（ＯＰＲＫ）、またはα１ａ−ａｄｒｅｇｅｎｉｃ受容体（ＡＤＲＡ１Ａ）、インスリン成長因子−１受容体（ＩＧＦ−Ｒ）等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法および組成物が、本明細書に記載される細胞表面成分（例えば、細胞膜タンパク質）に限定されないことをまた理解されたい。
【００３１】
一部の実施形態において、細胞の内部移行および／またはレポーターのエンドサイトーシス時に変化する（例えば、減少する）検出可能なシグナルを放出するレポーター要素または複合体が提供される。一部の実施形態において、細胞表面成分およびレポーター要素を含む融合要素が提供される。一部の実施形態において、レポーター要素は、例えば、基質との相互作用時にまたは（例えば、ｐＨの変化による、光への曝露による）刺激される際に、検出可能なシグナルを生成する任意の分子、巨大分子（例えば、タンパク質）、または複合体である。一部の実施形態において、レポーター要素は、タンパク質である。一部の実施形態において、レポーター要素は、酵素である。一部の実施形態において、レポーター、レポーター基質、および／またはレポーター／基質複合体は、光学的な、分光学的な、光化学的な、生化学的な、免疫学的な、化学的な、および／または磁気的な手段で検出可能である。一部の実施形態において、レポーター、レポーター基質、および／またはレポーター／基質複合体は、標識を含む。好適な標識には、着色性、放射性、蛍光性、紫外線の、および／または磁気分子もしくは粒子が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、レポーター、レポーター基質、および／またはレポーター／基質複合体は、抗体、遺伝子プローブ、色素、蛍光色素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖質、ポリヌクレオチド、酵素、補酵素、補助因子、抗生物質、ステロイド、ホルモン、またはビタミンのうちの１つ以上によって標識される。一部の実施形態において、レポーター、レポーター基質、および／またはレポーター／基質複合体、および／またはそれらの標識は、刺激性の現象を伴って、または伴わずに検出される測定可能なシグナルを生成する。一部の実施形態において、検出可能な基質（例えば、蛍光性、放射性、光学的に検出可能な造影剤等）は、レポーターと接触させる、相互作用する、会合する、および／または結合する。一部の実施形態において、レポーターの基質は、検出可能である。一部の実施形態において、レポーターは、検出可能である。一部の実施形態において、レポーターは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。一部の実施形態において、レポータータンパク質は、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、またはβ−ガラクトシダーゼ等の酵素を含む。一部の実施形態において、レポーターは、発光性、蛍光性、および／または化学発光性である。一部の実施形態において、レポーターは、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、およびアルカリホスファターゼ等のタンパク質を含む。一部の実施形態において、レポーターは、ルシフェラーゼ、例えば、甲虫ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ（例えば、フォティヌスピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）またはフォティヌスピペンシルヴァニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ））、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ、オプロフォーラスルシフェラーゼ、ルシフェリン利用ルシフェラーゼ、セレンテラジン利用ルシフェラーゼ、およびそれらの任意の好適な��異型もしくは変異体を含む。一部の実施形態において、レポータータンパク質は、複数の基質代謝回転が可能な酵素を含む。一部の実施形態において、レポータータンパク質は、従来の酵素に限定されない。一部の実施形態において、レポータータンパク質は、野生型タンパク質または変異型、例えば、レポーターアッセイにおける使用に野生型より優れた利点を提供する耐熱性および／または化学安定性（ｃｈｅｍｏｓｔａｂｌｅ）の形態である。
【００３２】
一部の実施形態において、レポーター要素の基質、リガンド、結合パートナー、標識等が提供される。一部の実施形態において、レポーター要素の任意の好適な相互作用パートナー（例えば、基質、リガンド、抗体、標識等）が提供される。一部の実施形態において、レポーター要素は、酵素であり、酵素基質が提供される。一部の実施形態において、酵素基質は、セレンテラジン、ルシフェリン、他の好適なルシフェラーゼ基質、またはそれらの誘導体である。一部の実施形態において、レポーター酵素および酵素基質の相互作用は、検出可能なシグナル、例えば、酵素基質と相互作用する酵素からの発光を提供する。一部の実施形態において、レポーター要素の相互作用パートナーは、相互作用パートナーとの相互作用時にレポーターと会合している検出可能な標識を含む。一部の実施形態において、基質、リガンド、結合パートナー等は、膜透過性である。一部の実施形態において、基質、リガンド、結合パートナー等は、細胞膜、エンドソーム膜、空胞膜、核膜、および／または他の細胞内膜を通して通過可能であるかまたは透過的に通過する。一部の実施形態において、基質、リガンド、結合パートナー等は、膜不透過性である。一部の実施形態において、基質、リガンド、結合パートナー等は、細胞内、細胞外、および／または水性環境において可溶性である。一部の実施形態において、レポーター要素（例えば、酵素）の基質が提供される。一部の実施形態において、レポーター要素（例えば、酵素）は、複数の基質代謝回転能力を有する。
【００３３】
一部の実施形態において、本発明は、直接、リンカーによって、または別の要素を通してのいずれかで細胞表面成分または複合細胞膜タンパク質に付着される１つ以上のレポーター要素、例えば、レポータータンパク質または酵素（例えば、ルシフェラーゼ）を含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態において、融合タンパク質は、機能性、例えば、細胞輸送、分泌、もしくは表面局在化を提供するかまたは融合タンパク質の性能を強化する１つ以上の追加のペプチドセグメントを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、分泌ペプチド、例えば、ＩＬ−６シグナルペプチド（例えば、配列番号１）を含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端分泌ペプチド、例えば、ＩＬ−６シグナルペプチド（例えば、配列番号１）を含む。
【００３４】
一部の実施形態において、細胞表面分析物（例えば、細胞表面タンパク質）と共役するレポーター要素（例えば、レポーター酵素）が提供される。一部の実施形態において、レポーター要素および細胞表面分析物は、融合物として遺伝的に発現される。一部の実施形態において、レポーター要素および細胞表面分析物は、融合物を形成するように（例えば、翻訳後的に）反応する。一部の実施形態において、レポーター要素および細胞表面分析物は、共有結合的または非共有結合的に、共役する、連結する、および／または付着される。一部の実施形態において、本発明は、リンカー、例えば、ＧＳＳＧリンカー（例えば、配列番号２）によって細胞表面成分または複合細胞膜タンパク質に共有結合的に連結される１つ以上のレポータータンパク質、例えば、レポーター酵素（例えば、ルシフェラーゼ）を含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態において、融合タンパク質は、レポータータンパク質および／またはリンカー、例えば、ＧＳＳＧリンカー（例えば、配列番号２）を介して細胞表面成分もしくは複合細胞膜タンパク質に付着される１つ以上の追加のペプチドセグメントを含む。一部の実施形態において、リンカーは、ペプチドである。一部の実施形態において、好適なリンカーは、要素の構造および／または生物学的活性に干渉しない要素間の十分な間隔を提供する。一部の実施形態において、リンカーは、非ペプチドリンカー、例えば、ポリマー、アルキル鎖等である。一部の実施形態において、好適なリンカーが当分野において知られている。本発明は、ペプチドリンカー配列の配列によって限定されない。
【００３５】
一部の実施形態において、レポーター要素、例えば、レポータータンパク質または酵素は、細胞表面成分、例えば、細胞表面受容体もしくは他の細胞表面タンパク質のＮ末端および／または内部部分に付着される。一部の実施形態において、レポーター要素、例えば、レポータータンパク質または酵素は、細胞表面成分、例えば、細胞表面受容体もしくは他の細胞表面タンパク質のＮ末端に付着される。一部の実施形態において、レポーター要素は、細胞表面成分の全体構造および／または機能に干渉しないように、細胞表面成分の一部分に付着される。一部の実施形態において、細胞表面受容体は、レポーター要素、例えば、レポータータンパク質もしくは酵素のＮ末端および／または内部部分に付着される。一部の実施形態において、レポーター要素は、レポーター要素の全体構造および／または機能に干渉しないように、細胞表面成分の部分に付着される。一部の実施形態において、レポーター要素は、細胞表面受容体、例えば、ＧＰＣＲ、非ＧＰＣＲ受容体（例えば、チロシンキナーゼ受容体等）のＮ末端に付着される。
【００３６】
一部の実施形態において、エンドサイトーシスおよび試薬、例えば、融合タンパク質、レポーター要素、細胞表面成分（例えば、細胞表面受容体）、基質、発現構築物、試験試薬等の検出のためのアッセイ、それらの実行のための材料（例えば、マイクロプレート）および機器（例えば、ルミノメーター）が提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載のアッセイは、エンドサイトーシス時に放出される検出可能なシグナルの変化を利用する。本発明の実施形態の開発中に行われた様々なレポーター要素を用いた実験は、レポーター要素のエンドサイトーシス時に放出されるシグナルが変化することを示した。本発明は、レポーター分子の検出可能なシグナルを変化させる任意の特定の機序に限定されない。作用の機序の理解は、本発明を実施するために必須ではない。一部の実施形態において、（例えば、細胞表面タンパク質への付着によって）細胞の表面に係留され、続くエンドサイトーシスのときに検出可能に異なるシグナルを放出する任意のレポーター要素、例えば、レポータータンパク質または酵素（例えば、ルシフェラーゼ））は、本明細書の実施形態における使用を発見する。一部の実施形態において、レポーター要素のエンドサイトーシスに応じるレポーターシグナルにおける検出可能な変化は、シグナルの損失、シグナルの減少、シグナルの強化、シグナルの増大、シグナルの変化（例えば、放出される波長の変化等）等を含む。一部の実施形態において、シグナルの変化は、エンドサイトーシスの環境（例えば、ｐＨ、塩濃度、立体障害等）、レポーター要素の分解、レポーター要素の細胞表面への再循環、基質有効性の損失、またはレポーター要素のエンドサイトーシス時に検出可能に異なるシグナルをもたらす任意の他の機序によって起こる。本発明は、レポーター分子の検出可能なシグナルを変化させる任意の特定の機序に限定されず、作用の機序の理解は、本発明を実施するために必須ではない。
【００３７】
一部の実施形態において、リアルタイム（例えば、時間経過中を通して迅速な／繰り返される検出）のエンドサイトーシスの検出および／または監視が提供される。一部の実施形態において、エンドポイント（例えば、エンドサイトーシスの検出および／または監視が提供される。一部の実施形態において、エンドポイント（例えば、エンドサイトーシスの検出および／または監視は、エンドサイトーシスの存在、不在、速度、量等を確認するために対照または標準と比較される。一部の実施形態において、検出および／または監視は、１つ以上の時点（例えば、時間＝０秒、１秒、２秒、５秒、１０秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、５時間、またはそれらの内の任意の好適な時点）にて実施される。一部の実施形態において、レポーターシグナルは、基質の添加の前に検出される。一部の実施形態において、レポーターシグナルは、基質の添加時（例えば、時間＝０）に検出される。一部の実施形態において、レポーターシグナルは、基質の添加後に検出される。一部の実施形態において、レポーター基質は、エンドサイトーシスを誘起する前に細胞に添加される。一部の実施形態において、レポーター基質は、エンドサイトーシスを誘起した後に細胞に添加される。一部の実施形態において、レポーター基質は、エンドサイトーシスの発生を可能にする前に細胞に添加される。一部の実施形態において、レポーター基質は、エンドサイトーシスの発生を可能にした後に細胞に添加される。一部の実施形態において、レポーターシグナルおよび／またはレポーター／基質シグナルは、例えば、バックグラウンド、ベースライン、エンドサイトーシス前のレベルシグナル）を確立するために、エンドサイトーシスの前に検出される。一部の実施形態において、時間は、エンドサイトーシスの発生を可能にする。一部の実施形態において、エンドサイトーシスは、好適な方法、例えば、受容体作動薬（例えば、小分子、サイトカイン等）、修飾された成長条件、薬理化合物、細胞シグナル経路の変化、種を誘発する任意のエンドサイトーシスの存在等によって誘起される。一部の実施形態において、エンドサイトーシスをもたらすことで知られている生物学的過程は、任意の好適な方法によって誘発される。一部の実施形態において、レポーターシグナルおよび／またはレポーター／基質シグナルは、最初の検出後に連続的または定期的に（例えば、１秒、２秒、５秒、１０秒、３０秒、１分、２分、５、１０分等の間隔で）監視される。一部の実施形態において、レポーターシグナルおよび／またはレポーター／基質シグナルは、レポーター基質の添加後に連続的または定期的に監視される。一部の実施形態において、レポーターシグナルおよび／またはレポーター／基質シグナルは、例えば、受容体作動薬の添加によるエンドサイトーシスの誘起後に連続的または定期的に監視される。一部の実施形態において、エンドサイトーシスのリアルタイムの監視は、例えば、（例えば、１秒、２秒、５秒、１０秒、３０秒、１分、２分等密接して空けられる間隔で経時的にレポーターシグナルを検出することによって提供される。一部の実施形態において、エンドサイトーシスの検出は、１つ以上の定時点、例えば、１５分、２０分、３０分等でレポーターシグナルを検出することによって提供される。一部の実施形態において、速度、量、持続期間等の測定は、リアルタイムアッセイによって提供される。一部の実施形態において、エンドサイトーシスの測定は、エンドポイントを介するエンドサイトーシスの刺激後にレポーターシグナルを検出することによって提供される。
【００３８】
本明細書の一部の実施形態において、エンドサイトーシスを監視する、検出する、または定量化するための組成物および方法が提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法は、任意の種類のエンドサイトーシス、例えば、クラスリン媒介、カベオレ（ｃａｖｅｏｌｅ）、マクロピノサイトーシス、またはファゴサイトーシスの監視に有用である。一部の実施形態において、エンドサイトーシスは、プロセスに関与するエンドサイトーシス経路および／またはエンドサイトーシス成分に関わりなく監視される。一部の実施形態において、組成物および方法は、すべての種類のエンドサイトーシスを検出するように構成される。一部の実施形態において、ダイナミン依存エンドサイトーシスを検出する組成物および方法が提供される。一部の実施形態において、組成物および方法は、１つ以上の種類のエンドサイトーシス、例えば、クラスリン媒介、カベオレ、マクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、および／またはダイナミン依存を検出するように提供される。一部の実施形態において、組成物および方法は、一種類のエンドサイトーシス、例えば、クラスリン媒介、カベオレ、マクロピノサイトーシス、ダイナミン依存、またはファゴサイトーシスを検出するように提供される。
【００３９】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法およびアッセイの１つ以上のタンパク質成分（例えば、レポーター、受容体、融合等）をコードする、および／または発現することが可能な核酸構築物およびベクターが提供される。一部の実施形態において、ベクターおよび／または構築物は、コードされたタンパク質が細胞の転写および翻訳機構によって発現されることを可能にする配列および調節要素を含む。一部の実施形態において、ベクターおよび／または構築物は、エンハンサー領域、プロモーター領域、開始コドン、終止コドン、転写終止配列、ポータブル（ｐｏｒｔａｂｌｅ）翻訳開始配列、遺伝子コード領域、遺伝子挿入領域等のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態において、細胞表面受容体をコードする核酸を挿入するためのクローニング部位またはレポーター要素と融合するための他の細胞表面タンパク質を提供する構築物が提供される。一部の実施形態において、細胞内のレポーター要素および／または融合タンパク質の安定したまたは一過性の発現のためのベクターが提供される。一部の実施形態において、好適なベクター、送達系（例えば、ウイルス遺伝子送達）、プラスミド（例えば、ｐＦ５Ａプラスミドおよびそこから送達されるプラスミド等）、および構築物が、タンパク質組成物を生成するために提供され、本明細書に記載の方法の実施が提供される。
【００４０】
一部の実施形態において、成分、試薬、例えば、融合構築物、レポータータンパク質、基質等、および／または材料（例えば、マルチウェルプレート、細胞）を含むキットが提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法またはアッセイを実施するためのキットが提供される。一部の実施形態において、本発明の方法を実施するために構築物、融合タンパク質等を生成する、発現する、および／または操作する材料および試薬がキット内に提供される。
【００４１】
一部の実施形態において、マルチプレックスな型式で実施される方法およびアッセイが提供される。一部の実施形態において、方法およびアッセイは、例えば、エンドサイトーシスの阻害物質またはエンハンサーを選別するように高処理量の手法で実施される。一部の実施形態において、本明細書に提供されるアッセイは、マルチウェルプレート、例えば、９６−ウェル、３８４−ウェル等において迅速に実施される。一部の実施形態において、アッセイは、混合および読み取り型式（例えば、非画像ベース、フローベース等）の両立する高処理量スクリーニングにおいてエンドサイトーシスを測定する。
【００４２】
一部の実施形態において、組成物、方法、および／またはアッセイを評価する、定量化する、検出する、および／または監視するためのシステム、機器、または装置が提供される。一部の実施形態において、細胞の外部上のレポーター要素の量、飲食されたレポーター要素の量、および／またはレポーター要素のエンドサイトーシスを検出する、を定量化する、または監視するシステム、機器、および／または装置が提供される。一部の実施形態において、検出、定量化、および／または監視が、分光光度計、蛍光光度計、ルミノメーター、光電子増倍管、光ダイオード、ネフロメーター（ｎｅｐｈｌｏｍｅｔｅｒ）、光量子カウンター、電極、電流計、シンチレーションカウンター、ガイガー計数管、電圧計、容量センサ、高周波トランスミッター、磁気抵抗器メーター（ｍａｇｎｅｔｏｒｅｓｉｓｔｏｍｅｔｅｒ）、フローサイトメーター、ＣＣＤ、ホール効果機器等のうちの１つ以上を含む機器、システム、または装置によって提供される。一部の実施形態において、所与のレポーター要素、例えば、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、または放射標識の検出に好適な機器が選択される、および／または提供される。一部の実施形態において、比較的安価な検出システム、例えば、高性能の蛍光光度計とは対照的な低〜中価格のルミノメーターと互換性のあるアッセイ、方法、および組成物が提供される。
【００４３】
一部の実施形態において、エンドサイトーシスならびに受容体内部移行および／もしくはエンドサイトーシスにおける細胞内もしくは細胞外プロセス、成分（例えば、クラスリン、ダイナミン等）、および他の要素（例えば、細胞型、細胞ストレス、細胞外環境等）の役割を研究する、または分析する方法が提供される。一部の実施形態において、受容体内部移行および／またはエンドサイトーシスの速度、量、持続期間、および／またはタイミング上の様々な要素の効果を監視するためのアッセイが提供される。一部の実施形態において、受容体内部移行および／またはエンドサイトーシスの速度、量、持続期間、および／またはタイミング上の特異的分子、例えば、細胞成分（例えば、クラスリン、ダイナミン等）、薬物等の効果を監視するためのアッセイが提供される。一部の実施形態において、特異的受容体の内部移行および／またはエンドサイトーシス上の所望の効果に対する化合物を選別するためのアッセイが提供される（例えば、高処理量、マルチプレックス等）。一部の実施形態において、細胞表面受容体のエンドサイトーシス、受容体内部移行、または機能不全に関与する１つ以上の症状、疾患、または障害を治療または予防するための化合物を選別するためのアッセイが提供される。一部の実施形態において、特異的受容体の内部移行または通常のエンドサイトーシスの速度、量、持続期間、および／またはタイミングを誘起する、強化する、阻害する、またはさもなければそれに影響する分子を同定するためのアッセイが提供される。
【００４４】
実験
実施例１
作動薬誘発受容体エンドサイトーシスを監視するホタルルシフェラーゼ受容体融合物および細胞透過性基質
エンドサイトーシスの動力学的測定またはエンドポイント測定を提供する実験を本発明の実施形態の開発中に行った。Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、アンジオテンシン２型１ａ受容体（ＡＴ１Ｒ）、β２アドレナリン受容体（Ｂ２ＡＲ）、バソプレシン２受容体（Ｖ２Ｒ）、δオピオイド受容体（ＯＰＲＤ１）、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）をホタルルシフェラーゼに融合し、ｐＦ５ａベクター（プロメガ社）にクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。ルシフェラーゼレポーターの効率的な細胞表面発現を実現するために、ＦＦｌｕｃ−ＧＰＣＲ融合タンパク質は、Ｎ末端ＩＬ−６分泌ペプチドをさらにコードした。ＨＥＫ２９３細胞を、製造者の説明書に従ってＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（プロメガ社）を用いて、ＦＦｌｕｃ−ＧＰＣＲ融合物をコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。適切な発現レベルを実現するために、１部のプラスミドＤＮＡ（質量比）を１００部のキャリアＤＮＡ（ｐＧＥＭ−３Ｚ、プロメガ社）に希釈し、約０．５ｎｇ／ウェルのレポーターＤＮＡを得た。ＦＦｌｕｃ−Ｖ２ＲおよびＦＦｌｕｃ−ＡＴ１Ｒについて、プラスミドＤＮＡを、それぞれ、５ｎｇ／ウェルおよび０．１６ｎｇ／ウェルでトランスフェクトした。ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトするために、プラスミドＤＮＡを１：１０でキャリアＤＮＡに希釈し、５ｎｇ／ウェルのプラスミドＤＮＡを得た。トランスフェクションおよび３７℃で２４時間のインキュベーション後、細胞培地を無血清培地（１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ、インビトロゲン）に置き換え、細胞血清を４時間（ＧＰＣＲ研究用）または２４時間（ＥＧＦＲ研究用）のいずれかで欠乏させた。ウェルあたり５０μＬのルシフェラーゼ基質、Ｄ−ルシフェリンを次いで、最終濃度０．２ｍＭのＤ−ルシフェリン、２ｍＭのＭｇＣｌ2、および２ｍＭのＡＴＰに添加し、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。ＡＴ１ＲおよびＶ２Ｒに対して、０．０２ｍＭのＤ−ルシフェリンを使用した。ｌｕｃ２−Ｂ２ＡＲ実験のため、０．０１ｍＭのＤ−ルシフェリンを使用した。Ｄ−ルシフェリン誘導体ＰＢＩ−３１０２を使用するＦＦＬｕｃ実験のため、０．０２ｍＭの基質を使用した。刺激する直前に、０．５秒の積分時間に設定されたＧＬＯＭＡＸマルチプラスプレートリーダー上で発光を測定した。細胞を次いで、以下に示される作動薬で刺激し（１／１０体積添加）、発光を実時間の２分毎に測定した。最大レベルの受容体内部移行を実現するために、各受容体に対して以下の濃度の作動薬を使用した。Ｂ２ＡＲに対して１０ｕＭのイソプロテレノール（ＩＳＯ）、Ｖ２Ｒに対して１ｕＭのアルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）、ＡＴ１Ｒに対して５００ｎＭのアンジオテンシン２（Ａｎｇ２）、またはＯＰＲＤ１に対して１０ｕＭのＳＮＣ−８０。対照として、細胞を媒介物（ＤＭＳＯまたは水のいずれかを含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ）で処理した。正規化された発光は、各試料の発光量（ＲＬＵ）を刺激する前の同じ試料からの発光で割ることによって判定された（図１Ａ〜Ｄを参照）。
【００４５】
ＧＰＣＲ濃度応答曲線のために、２０分間の各試料（作動薬濃度）からの発光を刺激する前の同じ試料からの発光に正規化した（図２Ａを参照）。これらのデータを活性化率に正規化した（０％に割り当てた最低値および１００％に割り当てた最高値）。受容体チロシンキナーゼのエンドサイトーシスを、ルシフェラーゼ融合物を使用して測定できるかどうかを判定するために、上述の配置でＦＦＬｕｃ−上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）融合物を試験した（図２Ｂ）。様々な濃度の上皮性成長因子（ＥＧＦ）で処理した際の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）エンドサイトーシスのＣＲＣは、刺激する前の同じ試料の発光量に正規化された２時間の各試料（作動薬濃度）の発光から判定された（図２Ｂを参照）。ＨｅＬａ細胞中のβ２アドレナリン受容体エンドサイトーシスのイソプロテレノール濃度応答曲線（ＣＲＣ）は、刺激する前の同じ試料の発光に正規化された２０分間の各試料（作動薬濃度）の発光から判定された（図２Ｃを参照）。Ｄ−ルシフェリン誘導体ＰＢＩ３１０２を使用してβ２アドレナリン受容体エンドサイトーシスのイソプロテレノール濃度応答曲線（ＣＲＣ）は、刺激する前の同じ試料の発光に正規化された２０分間の各試料（作動薬濃度）の発光から判定された（図２Ｄを参照）。ＦＦＬｕｃ変異型ｌｕｃ２を使用してβ２アドレナリン受容体エンドサイトーシスのイソプロテレノール濃度応答曲線（ＣＲＣ）は、刺激する前の同じ試料の発光に正規化された３０分間の各試料（作動薬濃度）の発光から判定された（図２Ｅを参照）。
【００４６】
実施例２
作動薬誘発受容体エンドサイトーシスを監視するオプロフォーラスＬｕｃ受容体融合および細胞透過性基質
２つのオプロフォーラスルシフェラーゼ（ＯｇＬｕｃ）変異型である９Ｂ８  ＯｇＬｕｃおよびＬ２７Ｖ  ＯｇＬｕｃを用いて、実施例１に記載された５つのＧＰＣＲの融合物のエンドサイトーシスを調査する実験を本発明の実施形態の開発中に行った。ＨＥＫ２９３細胞を、製造者の説明書に従ってＦｕｇｅｎｅ  ＨＤを用いて、ＯｇＬｕｃ受容体融合物をコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。適切な発現レベルを実現するために、１部のプラスミドＤＮＡを、１０００部のキャリアＤＮＡ（ｐＧＥＭ−３Ｚ）に希釈し、５０ｐｇ／ウェルのプラスミドＤＮＡを得た。２４時間のインキュベーション後、細胞培地を無血清培地（１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ）に置き換え、細胞血清を４時間欠乏させた。ウェルあたり５０μＬのＰＢＩ−３９３９（セレンテラジン誘導体、図９を参照）の溶液を次いで、２０μＭの最終濃度に添加し、続いて３７℃で５分間のインキュベーションをした。刺激する直前に、０．５秒の積分時間に設定されたＧＬＯＭＡＸマルチプラスプレートリーダー上で発光を測定した。細胞を次いで、実施例１に示される作動薬で刺激し、発光を実時間の２分毎に測定した。正規化された発光を、様々な融合タンパク質に関する内部移行の速度を観察するために時間に対してプロットした（図３を参照）。
【００４７】
ＯｇＬｕｃ  ＧＰＣＲ融合物は、作動薬用量応答の測定も可能にする（図４）。ＦＦＬｕｃエンドサイトーシスと同様に、ＯｇＬｕｃ−ＧＰＣＲエンドサイトーシスを各種濃度の作動薬（ＥＤＧ１に対するスフィンゴシン−１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）を含む）で誘発した。正規化された発光は、各試料の発光量を刺激する前の同じ試料からの発光で割ることによって判定された。様々なＧＰＣＲのＣＲＣのために、３０分間の刺激の正規化された発光を使用した。データを次いで、活性化率に正規化した（０％に割り当てた最低値および１００％に割り当てた最高値）（図４を参照）。
【００４８】
アッセイ応答の特異度を判定するために、ＨＥＫ２９３細胞を、ＯｇＬｕｃ−Ｂ２ＡＲまたはＯｇＬｕｃ−Ｖ２Ｒ融合タンパク質でトランスフェクトし、前述のように処理した（図５Ａ〜Ｂ）。既知のＢ２ＡＲ受容体作動薬は、ＯｇＬｕｃ−Ｖ２Ｒ融合タンパク質のエンドサイトーシスを促進しない（図５Ｂを参照）。反対に、既知のＶ２Ｒ作動薬は、ＯｇＬｕｃ−Ｂ２ＡＲ融合タンパク質のエンドサイトーシスを促進しない（図５Ａを参照）。
【００４９】
ＰＢＩ−３９３９以外のセレンテラジン基質が、ＯｇＬｕｃ受容体融合を使用してエンドサイトーシス測定ができるかどうかを判定するために、セレンテラジン誘導体、ＰＢＩ−４５２５およびＰＢＩ−４３７７（図９を参照）を使用してＯｇＬｕｃ（９Ｂ８）−Ｂ２ＡＲのエンドサイトーシスを測定した（図５Ｃ〜Ｄ）。ＰＢＩ−４３７７またはＰＢＩ−４５２５の存在下で定常状態のルシフェラーゼ活性を実現するために、細胞を、刺激する前に３７℃でそれぞれ２時間または５分間、基質で事前にインキュベートした。発光測定およびデータ処理を前述のように行った。
【００５０】
エンドサイトーシスの刺激後の基質の添加によってエンドサイトーシス測定が実施され得るかどうかを判定するために、前述のようにＯｇＬｕｃ−Ｂ２ＡＲ（図５Ｆ）またはＯｇＬｕｃ  Ｖ２Ｒ（図５Ｅ）融合物を発現する細胞を、前述のようであるが、ルシフェラーゼ基質の不在下で刺激した。インキュベーションの３０分間後、ＰＢＩ−３９３９を２０μＭの最終濃度に添加し、エンドポイント分析を介して発光をすぐに測定した。未加工の発光量をｙ軸上にプロットした。
【００５１】
実施例３
受容体エンドサイトーシスの阻害を監視するためのルシフェラーゼ受容体融合物および細胞透過性基質。
受容体エンドサイトーシスの阻害を検出する実験を本発明の実施形態の開発中に行った。ＯｇＬｕｃ−Ｂ２ＡＲ融合物のイソプロテレノール誘発エンドサイトーシスのＣＲＣを１００μＭのアルプレネロール（ａｌｐｒｅｎｅｒｏｌ）遮断薬（イソプロテレノールでの処理の１５分前に添加される）の存在下／不在下であることを除いて、実施例２に記載されるように実施した（図６を参照）。ＦＦｌｕｃ−Ｂ２ＡＲ融合物のイソプロテレノール誘発エンドサイトーシスのＣＲＣを細胞がドミナントネガティブダイナミン（Ｋ４４Ａ）を過剰発現することを除いて、実施例１に記載されるように実施した。ダイナミン（Ｋ４４Ａ）およびＦＦｌｕｃ−Ｂ２ＡＲを共発現するために、キャリアＤＮＡをＣＭＶプロモーターの制御下でダイナミン（Ｋ４４Ａ）をコードするプラスミドＤＮＡに置き換えた（図７を参照）。
【００５２】
実施例４
ルシフェラーゼシグナルの減少
ＴＲＶ１２００２７、Ｇ−タンパク質活性化を促進しない作動薬（別名、β−アレスチン−偏向作動薬）に応答してＡＴ１Ｒ／ＦＦｌｕｃ融合物のエンドサイトーシスを調査する実験を本発明の実施形態の開発中に行った。細胞を、ＡＴ１Ｒ／ＦＦｌｕｃ融合物をコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ルシフェリン基質を添加し、先に記載されたように細胞をインキュベートした。刺激する直前に発光を測定した。細胞を次いで、各種濃度のＴＲＶ１２００２７で１５分間刺激し、発光を検出した。融合タンパク質の内部移行を観察するために正規化された発光を作動薬濃度に対してプロットした（図８を参照）。これらのデータは、二次メッセンジャー応答における内部移行の独立性を示す。アッセイは、他のアッセイ形式で一般的に測定されるように、作動薬が二次メッセンジャー応答を生成できないにもかかわらず内部移行を検出した（図８を参照）。
【００５３】
実施例５
受容体再循環
本明細書に記載の実験は、受容体再循環、例えば、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスを検出する、および／または測定する技術および方法を提供する。例えば、受容体再循環は、レポーターエンドサイトーシスを誘発した後、誘発作動薬が除去されるパルスチェイス実験によって測定され得る。発光の増加は、受容体の細胞表面への再循環／エキソサイトーシスを示すことになる。
【００５４】
実施例６
ルシフェラーゼシグナルの増加
エンドサイトーシスのエンドポイント測定を提供する実験を本発明の実施形態の開発中に行った。Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）バソプレシン２受容体（Ｖ２Ｒ）または負の対照のβ２アドレナリン受容体（Ｂ２ＡＲ）を、ホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ２）に融合し、ｐＦ５ａベクター（プロメガ社）にクローン化し、ＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。ルシフェラーゼレポーターの効率的な細胞表面発現を実現するために、ＦＦｌｕｃ−ＧＰＣＲ融合タンパク質は、Ｎ末端ＩＬ−６分泌ペプチドをさらにコードした。ＨＥＫ２９３細胞を、製造者の説明書に従ってＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（プロメガ社）を用いて、ＦＦｌｕｃ−ＧＰＣＲ融合物をコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。適切な発現レベルを実現するために、１部のプラスミドＤＮＡ（質量比）を１００部のキャリアＤＮＡ（ｐＧＥＭ−３Ｚ、プロメガ社）に希釈し、約０．５ｎｇ／ウェルのレポーターＤＮＡを得た。３７℃で２４時間のインキュベーション後、細胞培地を無血清培地（１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ、インビトロゲン）に置き換え、細胞血清を１時間欠乏させた。血清欠乏後、細胞を連続的に希釈されたアルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）で３０分間刺激した。細胞外ルシフェラーゼを次いで、０．０８％のトリプシンの最終濃度のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）の溶液（５０μＬ／ウェル）の添加を介して阻害した。
細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。５０μＬ／ウェルのＤ−ルシフェリンの溶液（Ｍｇ／ＡＴＰを伴わない）を次いで、（２ｍＭの最終濃度に）添加し、細胞をさらに５時間インキュベートした。未加工の発光シグナルにおける用量依存性の増加がＶ２Ｒ融合タンパク質に対して観察される一方、負の対照（Ｂ２ＡＲ）融合タンパク質（図２Ｆを参照）に対して増加は観察されない。
【００５５】
本明細書に提供されるすべての刊行物および特許は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本発明の範囲および趣旨を逸脱することのない本発明の記載の組成物および方法の様々な修正および変更が、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されたが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、関連分野の技術者に明らかである本発明を実施するための記載の手法の様々な修正は、本発明の範囲内であると意図される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕    エンドサイトーシスを検出する方法であって、
ａ）レポーター要素を細胞表面分析物に係留し、融合要素を作り出すことと、
ｂ）前記レポーター要素からの検出可能なシグナルを監視し、それによってエンドサイトーシスを検出することと、を含む、方法。
〔２〕前記レポーター要素が、レポーター基質との相互作用時に前記検出可能なシグナルを放出する、前記〔１〕に記載のエンドサイトーシスを検出する方法。
〔３〕ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、前記レポーター要素をレポーター基質と接触させるステップをさらに含む、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、前記細胞表面分析物、前記レポーター要素、および／または前記融合要素のエンドサイトーシスを可能にするステップをさらに含む、前記〔２〕に記載の方法。
〔５〕前記レポーター要素からの前記検出可能なシグナルが、前記レポーター要素のエンドサイトーシス時に変化する、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕    前記検出可能なシグナルを監視し、それによってエンドサイトーシスを検出することは、
ｉ）前記融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることと、
ｉｉ）エンドサイトーシスの誘発後に前記シグナルを検出することと、を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔７〕    前記検出可能なシグナルを監視し、エンドサイトーシスを検出することは、
ｉ）エンドサイトーシスの前の前記レポーター要素からの前記シグナルを検出することと、
ｉｉ）前記融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることと、
ｉｉｉ）前記レポーター要素からの前記シグナルの検出を繰り返すことと、
ｉｖ）ステップ（ｉ）からの前記シグナルをステップ（ｉｉｉ）からの前記シグナルと比較し、エンドサイトーシスを検出することと、を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔８〕前記細胞表面分析物が、細胞表面成分である、前記〔１〕に記載の方法。
〔９〕前記細胞表面成分が、細胞表面受容体を含む、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記細胞表面分析物が、前記細胞表面の成分と非共有結合的に会合している、前記〔１〕に記載の方法。
〔１１〕前記レポーター要素および前記細胞表面分析物が、融合タンパク質として発現される、前記〔１〕に記載の方法。
〔１２〕前記検出可能なシグナルが、光学的シグナルを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１３〕前記検出可能なシグナルが、発光を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１４〕前記レポーター要素が、ルシフェラーゼ酵素を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１５〕前記ルシフェラーゼ酵素が、カブトムシもしくはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素、またはそれらの変異型もしくは変異体である、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕エンドサイトーシスが、細胞外空間から細胞内空間への前記レポーター要素の移動をもたらす、前記〔１〕に記載の方法。
〔１７〕前記検出可能なシグナルが、前記細胞外空間と比較して前記細胞内空間内で検出可能に変化する、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕前記レポーターからの前記検出可能なシグナルが、前記細胞外空間と比較して前記細胞内空間内で減少する、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕前記細胞内空間が、エンドソームを含む、前記〔１６〕に記載の方法。
〔２０〕前記検出可能なシグナルが、前記細胞外空間と比較して前記エンドソーム内で検出可能に変化する、前記〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕前記レポーターからの前記検出可能なシグナルが、前記細胞の外側と比較して前記エンドソーム内で減少する、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕ステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間に、エンドサイトーシスを誘起するステップをさらに含む、前記〔６〕または〔７〕に記載の方法。
〔２３〕前記レポーター基質が、生細胞の形質膜に対して透過性である、前記〔３〕に記載の方法。
〔２４〕前記レポーター基質が、細胞膜に対して透過性である、前記〔３〕に記載の方法。
〔２５〕前記レポーター基質は、前記細胞の前記細胞内空間から完全にまたは大部分が排除される、前記〔３〕に記載の方法。
〔２６〕前記レポーターが、複数のレポーター基質を代謝回転することができる、前記〔３〕に記載の方法。
〔２７〕前記レポーター基質が、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、セレンテラジン、またはセレンテラジン誘導体である、前記〔３〕に記載の方法。
〔２８〕    エンドサイトーシスを検出する方法であって、
ａ）融合要素を細胞の細胞膜に取り込むことであって、前記融合要素が細胞表面分析物およびレポーター要素を含む、取り込むことと、
ｂ）前記レポーターをレポーター基質と接触させることであって、前記接触が検出可能なシグナルを生成する、接触させることと、
ｃ）前記検出可能なシグナルを監視し、それによってエンドサイトーシスを検出することと、を含む、方法。
〔２９〕    前記検出可能なシグナルを監視することは、
ｉ）前記融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることと、
ｉｉ）エンドサイトーシスの誘発後に前記シグナルを検出することと、を含む、前記〔２８〕に記載のエンドサイトーシスを検出する方法。
〔３０〕    前記検出可能なシグナルを監視することは、
ｉ）エンドサイトーシスの前の前記シグナルを検出することと、
ｉｉ）前記融合要素のエンドサイトーシスを可能にすることと、
ｉｉｉ）エンドサイトーシス後の前記シグナルを検出することと、
ｉｖ）ステップ（ｉ）からの前記シグナルをステップ（ｉｉｉ）からの前記シグナルと比較し、エンドサイトーシスを検出することと、を含む、前記〔２８〕に記載のエンドサイトーシスを検出する方法。
〔３１〕前記融合要素が、融合タンパク質を含む、前記〔２８〕に記載の方法。
〔３２〕前記細胞表面分析物が、細胞表面成分を含む、前記〔２８〕に記載の方法。
〔３３〕前記細胞表面成分が、細胞表面受容体を含む、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕前記細胞表面分析物が、細胞表面の成分と非共有結合的に会合している、前記〔２８〕に記載の方法。
〔３５〕前記レポーター要素が、ルシフェラーゼ酵素を含む、前記〔２８〕に記載の方法。
〔３６〕前記ルシフェラーゼ酵素が、カブトムシもしくはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素、またはそれらの変異体もしくは変異型である、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３７〕前記レポーター要素が前記細胞外空間に局在するように、前記融合要素が前記細胞膜に取り込まれる、前記〔２８〕に記載の方法。
〔３８〕前記レポーター要素のエンドサイトーシスが、細胞外空間からエンドソーム内への前記レポーター要素の移動をもたらす、前記〔２８〕に記載の方法。
〔３９〕前記シグナルが、前記細胞外空間と比較して前記エンドソーム内で検出可能に変化する、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４０〕前記シグナルが、前記細胞外空間と比較して前記エンドソーム内で減少する、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４１〕ステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間にエンドサイトーシスを誘起するステップをさらに含む、前記〔２９〕または〔３０〕に記載の方法。
〔４２〕前記レポーター基質が、生細胞の前記形質膜に対して透過性であることが知られている、前記〔２８〕に記載の方法。
〔４３〕前記レポーター基質が、細胞膜に対して透過性であるか、または実験の条件下で前記細胞の位相的内側から完全にもしくは大部分が排除される、前記〔２８〕に記載の方法。
〔４４〕前記レポーター基質が、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、セレンテラジン、またはセレンテラジン誘導体である、前記〔２８〕に記載の方法。
〔４５〕    エンドサイトーシスを検出する方法であって、
ａ）融合タンパク質を細胞の細胞膜に取り込むことであって、前記融合タンパク質がレポーターポリペプチドおよび細胞表面受容体を含み、前記レポーターポリペプチドがレポーター基質との相互作用時に検出可能なシグナルを放出する、取り込むことと、
ｂ）前記レポーターポリペプチドを前記レポーター基質と接触させることと、
ｃ）前記検出可能なシグナルを検出することと、
ｄ）エンドサイトーシスを誘発する、および／またはエンドサイトーシスの発生を可能にすることと、
ｅ）前記検出可能なシグナルの検出を繰り返すことと、
ｆ）ステップ（ｃ）からの前記シグナルをステップ（ｅ）からの前記シグナルと比較することであって、前記シグナルの変化が、エンドサイトーシスが発生したことを示す、比較することと、を含む、方法。
〔４６〕前記融合タンパク質が、融合構築物から発現される、前記〔４５〕に記載の方法。
〔４７〕前記融合タンパク質が、抗体抗原会合に基づいて生成される、前記〔４５〕に記載の方法。
〔４８〕前記融合タンパク質が、前記細胞内で発現される、前記〔４５〕に記載の方法。
〔４９〕前記細胞表面分析物が、外因的に生成され、前記細胞の培地に添加される、前記〔４５〕に記載の方法。
〔５０〕前記レポーター基質が、細胞膜透過性である、前記〔４５〕に記載の方法。
〔５１〕前記レポーターポリペプチドが、前記レポーター基質の複数の代謝回転能力を有する、前記〔４５〕に記載の方法。
〔５２〕前記レポーターポリペプチドが、ルシフェラーゼ酵素を含む、前記〔４５〕に記載の方法。
〔５３〕前記ルシフェラーゼ酵素が、カブトムシもしくはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素、またはそれらの変異体もしくは変異型である、前記〔５２〕に記載の方法。
〔５４〕前記レポーター要素が前記細胞の外側に局在するように、前記融合タンパク質が前記細胞膜に取り込まれる、前記〔４５〕に記載の方法。
〔５５〕前記レポーターポリペプチドのエンドサイトーシスが、細胞外空間から細胞内空間への前記レポーターポリペプチドの移動をもたらす、前記〔４５〕に記載の方法。
〔５６〕前記シグナルが、前記細胞外空間と比較して前記細胞内空間内で検出可能に変化する、前記〔５５〕に記載の方法。
〔５７〕前記細胞内空間が、エンドソーム内にある、前記〔５５〕に記載の方法。
〔５８〕前記シグナルが、前記細胞外空間と比較して前記エンドソーム内で検出可能に変化する、前記〔５７〕に記載の方法。
〔５９〕前記シグナルが、前記細胞外空間と比較して前記細胞内空間内で減少する、前記〔５５〕に記載の方法。
〔６０〕前記シグナルが、前記細胞外空間と比較して前記エンドソーム内で減少する、前記〔５７〕に記載の方法。
〔６１〕前記レポーター基質が、生細胞の前記形質膜に対して透過性であることが知られている、前記〔４５〕に記載の方法。
〔６２〕前記レポーター基質が、細胞膜に対して透過性であるか、または実験の条件下で前記細胞の位相的内側から完全にもしくは大部分が排除される、前記〔４５〕に記載の方法。
〔６３〕前記レポーター基質が、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、セレンテラジン、またはセレンテラジン誘導体である、前記〔４５〕に記載の方法。
〔６４〕    膜貫通輸送を検出する方法であって、
ａ）融合タンパク質を細胞膜に取り込むことであって、前記融合タンパク質がレポーター要素および膜会合要素を含み、前記レポーター要素がレポーター基質との相互作用時に検出可能なシグナルを放出する、取り込むことと、
ｂ）前記レポーター要素を前記レポーター基質と接触させることと、
ｃ）前記検出可能なシグナルを検出することと、を含む、方法。
〔６５〕    
ｄ）膜貫通輸送を誘発し、かつ／または膜貫通輸送の発生を可能にするステップと、
ｅ）前記検出可能なシグナルの検出を繰り返すステップと、
ｆ）ステップ（ｃ）からの前記シグナルをステップ（ｅ）からの前記シグナルと比較するステップであって、前記シグナルの変化が、膜貫通輸送が発生したことを示す、比較するステップと、をさらに含む、前記〔６４〕に記載の方法。
〔６６〕ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、エンドサイトーシスを誘発し、かつ／または膜貫通輸送の発生を可能にするステップをさらに含む、前記〔６４〕に記載の方法。
〔６７〕    ｆ）ステップ（ｃ）からの前記シグナルを対照シグナルと比較することであって、前記シグナルの変化が、膜貫通輸送が発生したことを示す、比較することをさらに含む、前記〔６６〕に記載の方法。
〔６８〕前記レポーター要素が、酵素である、前記〔６４〕に記載の方法。
〔６９〕前記酵素が、ルシフェラーゼ酵素を含む、前記〔６８〕に記載の方法。
〔７０〕前記ルシフェラーゼ酵素が、カブトムシもしくはオプロフォーラスルシフェラーゼ酵素、またはそれらの変異体もしくは変異型である、前記〔６９〕に記載の方法。
〔７１〕前記シグナルが、光学的シグナルである、前記〔６４〕に記載の方法。
〔７２〕前記レポーター基質が、膜透過性である、前記〔６４〕に記載の方法。
〔７３〕膜会合要素が、膜会合ポリペプチドである、前記〔６４〕に記載の方法。
【００５６】
配列
配列番号１−ＩＬ６シグナルペプチド
【化１】
0006419139.tif 000002
配列番号２−ＧＳＳＧリンカー
【化２】
0006419139.tif 000003
配列番号３−ＯｇＬｕｃＬ２７Ｖ
【化３】
0006419139.tif 000004
配列番号４−ＵｌｔｒａＧｌｏ  ＦＦｌｕｃ
【化４−１】
0006419139.tif 000005
【化４−２】
0006419139.tif 000006
配列番号５−ＡＴ１Ｒ
【化５】
0006419139.tif 000007
配列番号６−ＯＰＲＤ１
【化６−１】
0006419139.tif 000008
【化６−２】
0006419139.tif 000009
配列番号７−ＥＧＦＲ
【化７−１】
0006419139.tif 000010
【化７−２】
0006419139.tif 000011
配列番号８−ＥＤＧ１
【化８−１】
0006419139.tif 000012
【化８−２】
0006419139.tif 000013
配列番号９−ＡＶＰＲ２
【化９】
0006419139.tif 000014
配列番号１０−ＡＤＲＢ２
【化１０−１】
0006419139.tif 000015
【化１０−２】
0006419139.tif 000016
配列番号１１−ｌｕｃ２  ＦＦｌｕｃ
【化１１−１】
0006419139.tif 000017
【化１１−２】
0006419139.tif 000018
配列番号：１２−ＯｇＬｕｃ  ９Ｂ８
【化１２】
0006419139.tif 000019
【図１】
0006419139.tif 000024
【図２】
0006419139.tif 000025
【図３】
0006419139.tif 000026
【図４】
0006419139.tif 000027
【図５】
0006419139.tif 000028
【図６】
0006419139.tif 000029
【図７】
0006419139.tif 000030
【図８】
0006419139.tif 000031
【図９−１】
0006419139.tif 000032
【図９−２】
0006419139.tif 000033
【配列表】
0006419139000001.app