(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離タンパク質であって、配列番号２２、２４、又は２６に記載のアミノ酸配列からなる単離タンパク質。
【請求項２】
前記単離タンパク質がヒトに由来する、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の単離タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞、昆虫細胞、及び酵母細胞からなる群より選択される、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の単離タンパク質と、ヒト免疫グロブリンＦｃ断片とを含む融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の単離タンパク質、又は請求項７に記載の融合タンパク質の使用であって、湿疹、座瘡、乾癬、皮膚アレルギー、脂漏性皮膚炎、又は脂漏性脱毛症を治療するための薬剤の調製における使用。
【請求項９】
湿疹、座瘡、乾癬、皮膚アレルギー、脂漏性皮膚炎、又は脂漏性脱毛症を治療するための医薬組成物であって、請求項１又は２に記載のタンパク質、又は請求項７に記載の融合タンパク質と、医薬的に許容可能なベクターとを含む医薬組成物。
【請求項１０】
当該医薬組成物が更にＦＧＦＲ２ｂアンタゴニストを含むと共に、前記ＦＧＦＲ２ｂアンタゴニストが、ＦＧＦ７抗体、ＦＧＦ１０抗体、ＦＧＦＲ２ｂ抗体、ＡＺＤ４５４７、ＡＰ２４５３４、ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＰ６０３、ｓｕ５４０２、ｓｕ６６６８、ＰＤ１６１５７０、ＰＤ１６６８６６、ｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｐｒｙ、ＭＫＰ３、ＤＵＳＰ、ＳＥＦ、及びＸＦＬＲＴ３のうち１又は２以上である、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は中国特許出願番号第２０１３１０７１４１２０.３号（２０１３年１２月２０日出願、発明の名称「ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の遺伝子配列、そのポリペプチド及びその使用」）に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は遺伝子工学の分野に関し、特にＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片、これをコーディングする核酸、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
炎症性皮膚疾患は、皮膚における発赤、腫脹、吹き出物、膿疱等を意味する。前記疾患では、細胞増殖によりケラチノサイトが突出し、しばしば掻痒を伴って患者を大いに悩ますことになる。湿疹は種々の内部及び外部因子によって生じる一般的な上皮及び表皮の炎症性皮膚疾患であり、通常はアレルギー（即ちアレルギー反応）と何らかの関連があると考えられる。座瘡は毛包皮脂腺を伴う慢性の炎症性皮膚疾患であり、通常は青少年期に発症し、一般的には尋常性座瘡と呼ばれる。座瘡は主に顔面、胸部、背部等の皮脂分泌部位に存在し、海外の研究によれば、１２〜２４歳の青少年期における座瘡発生率は８５％にも上る。近年、伝統的な漢方医学から西洋医学まで含めた世界中の研究者が、炎症性皮膚疾患を治療するための種々の薬剤を開発している。現在のところ、臨床で一般に使用されている薬剤は、主にステロールホルモン、抗ヒスタミン剤、及びレチノイン酸等の抗上皮異常角化症剤であるが、副作用が強い上に、これらの疾患の根本的な治療は望めなかった。
【０００４】
ケラチノサイトは人体の細胞群の最外層に存在する細胞であり、人体を外部損傷から守っている。病的状態では、ケラチノサイトは特定の免疫学的に活性な産物を産生すると共に、炎症性サイトカインを放出し、炎症性皮膚疾患において主要な役割を担っている。間葉細胞と上皮細胞との間の相互作用によって、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧ等のシグナル伝達経路が活性化され、その結果として炎症が生じる。しかし、その具体的な機序は未だ不明である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以上に鑑み、本発明の目的の一つは、炎症性皮膚疾患を治療するためのＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片及びそれをコードする核酸、並びにそれらの使用を提供することである。
【０００６】
本発明では以下の技術的解決手段を採用する。
１．単離タンパク質であって、
ｉ）配列番号２、４、６、２２、２４、又は２６に記載のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列
を含む単離タンパク質。
２．単離タンパク質であって、
ii）配列番号２、４、６、２２、２４、又は２６に１又は２以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加を施して得られるアミノ酸配列；
iii）配列番号２、４、６、２２、２４又は２６と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列；或いは
iv）配列番号２、４、６、２２、２４、又は２６のアミノ酸配列をコードする核酸の相補的配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸によってコードされるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むと共に、
ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の機能を有する、単離タンパク質。
３．前記単離タンパク質がヒトに由来する、項２に記載の単離タンパク質。
４．項１〜３の何れか一項に記載の単離タンパク質をコードする単離核酸。
５．項４に記載の核酸を含むベクター。
６．項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
７．前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、大腸菌（E. coli）細胞、昆虫細胞、及び酵母細胞からなる群より選択される、項６に記載の宿主細胞。
８．項１〜３の何れか一項に記載の単離タンパク質と、ヒト免疫グロブリンＦｃ断片とを含む融合タンパク質。
９．項１〜３の何れか一項に記載の単離タンパク質、項４に記載の核酸、項５に記載のベクター、項６に記載の宿主細胞、又は項８に記載の融合タンパク質の使用であって、湿疹、座瘡、乾癬、皮膚アレルギー、脂漏性皮膚炎、又は脂漏性脱毛症を治療するための薬剤の調製における使用。
１０．湿疹、座瘡、乾癬、皮膚アレルギー、脂漏性皮膚炎、又は脂漏性脱毛症を治療するための医薬組成物であって、項１〜３の何れか一項に記載のタンパク質、項４に記載の核酸、項５に記載のベクター、項６に記載の宿主細胞、又は項８に記載の融合タンパク質と、医薬的に許容可能なベクターとを含む医薬組成物。
１１．当該医薬組成物が更にＦＧＦＲ２ｂアンタゴニストを含むと共に、前記ＦＧＦＲ２ｂアンタゴニストが、ＦＧＦ７抗体、ＦＧＦ１０抗体、ＦＧＦＲ２ｂ抗体、ＡＺＤ４５４７、ＡＰ２４５３４、ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＰ６０３、ｓｕ５４０２、ｓｕ６６６８、ＰＤ１６１５７０、ＰＤ１６６８６６、ｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｐｒｙ、ＭＫＰ３、ＤＵＳＰ、ＳＥＦ、及びＸＦＬＲＴ３のうち１又は２以上である、項１０に記載の医薬組成物。
１２．ＦＧＦ７抗体、ＦＧＦ１０抗体、ＦＧＦＲ２ｂ抗体、ＡＺＤ４５４７、ＡＰ２４５３４、ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＰ６０３、ｓｕ５４０２、ｓｕ６６６８、ＰＤ１６１５７０、ＰＤ１６６８６６、ｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｐｒｙ、ＭＫＰ３、ＤＵＳＰ、ＳＥＦ、及びＸＦＬＲＴ３のうち１又は２以上の使用であって、湿疹、座瘡、乾癬、皮膚アレルギー、脂漏性皮膚炎、又は脂漏性脱毛症を治療するための薬剤の調製における使用。
【０００７】
本発明の有利な効果としては、ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片のポリペプチド又はその医薬組成物を使用することで、例えばＥＧＦ／ＦＧＦ／ＶＥＧＦ／ＩＧＦ等の成長因子媒介性シグナル伝達経路を遮断し、炎症の発生を抑制できる点が挙げられる。具体的に、本発明によれば、皮脂の分泌を抑制すると共に、発赤、腫脹、掻痒等の炎症性皮膚疾患に伴う症状を抑制することにより、湿疹、アレルギー皮膚炎、皮膚アレルギー、脂漏性皮膚炎、座瘡等の問題を伴う皮膚の治療改善及び回復に寄与することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施例１に係る６種のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の誘導発言のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。（Ａ）それぞれ配列番号２２、２４、及び２６に示す、野生型、Ｓ２５２Ｗ変異型、及びＰ２５３Ｒ変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の誘導発現プロファイル。（Ｂ）それぞれ配列番号２、４、及び６に示す、野生型、Ｓ２５２Ｗ変異型、及びＰ２５３Ｒ変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の誘導発現プロファイル。レーン１：誘導野生型；レーン２：非誘導野生型；レーン３：誘導Ｓ２５２Ｗ変異型；レーン４：非誘導Ｓ２５２Ｗ変異型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片；レーン５：誘導Ｐ２５３Ｒ変異型；レーン６：非誘導Ｐ２５３Ｒ変異型；及びＭ：分子量標準。
【０００９】
【図２】図２は、実施例１に係る６種のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片のウエスタンブロッティング分析を示す。１〜３：それぞれ配列番号２２、２４、及び２６に示す、野生型、Ｓ２５２Ｗ変異型、及びＰ２５３Ｒ変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片；４〜６：それぞれ配列番号２、４、及び６に示す、野生型、Ｓ２５２Ｗ変異型、及びＰ２５３Ｒ変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片；及びＭ：分子量標準。
【００１０】
【図３】図３は、実施例７に係る６種のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の各々についての、負荷暴露の各段階におけるマウスの耳の腫れの厚さを示す。１〜３：それぞれ配列番号２２、２４、及び２６に示す、野生型、Ｓ２５２Ｗ変異型、及びＰ２５３Ｒ変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片；４〜６：それぞれ配列番号２、４、及び６に示す、野生型、Ｓ２５２Ｗ変異型、及びＰ２５３Ｒ変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片；及びＭ：分子量標準。
【００１１】
【図４】図４は、実施例８に係る等温滴定熱量計（isothermal titration calorimetry：ＩＴＣ）を用いた、ＦＧＦ７と、３種の短縮型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の各々との相互作用の比較結果を示す。試料は、それぞれ配列番号２２、２４、及び２６に示す、野生型、Ｓ２５２Ｗ変異型、及びＰ２５３Ｒ変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片である。
【００１２】
【図５】図５は、リガンドFGF７への結合によりFGFRリン酸化を阻害し、FGFシグナルを遮断する、６種のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片のウエスタンブロッティング分析を示す。試料は、それぞれ配列番号２、４、及び６に示す、野生型、Ｓ２５２Ｗ変異型、及びＰ２５３Ｒ変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片、並びに、それぞれ配列番号２２、２４、及び２６に示す、野生型、Ｓ２５２Ｗ変異型、及びＰ２５３Ｒ変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．単離タンパク質
一側面では、本開示は、単離タンパク質であって、ｉ）配列番号２、４、６、２２、２４、又は２６に記載のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
【００１４】
本明細書において、「含む（comprise）」という用語は、「からなる（consisting of）」の意味を有することが好ましい。配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質は野生型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片である。配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質はＳ２５２Ｗ変異型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片である。配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質はＰ２５３Ｒ変異型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片である。配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質は野生型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の切断型タンパク質である。配列番号２４のアミノ酸配列からなるタンパク質はＳ２５２Ｗ変異型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の切断型タンパク質である。配列番号２６のアミノ酸配列からなるタンパク質はＰ２５３Ｒ変異型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の切断型タンパク質である。
【００１５】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の受容体すなわちＦＧＦＲは膜受容体であり、細胞外断片は特定のリガンドに結合することができ、細胞内部分はチロシンキナーゼ活性を有する。ＦＧＦＲの細胞外断片がリガンドと結合してそのリガンドの二量体化とリン酸化を活性化し、それによって下流のシグナルを活性化することによって標的遺伝子の発現を制御することができる。ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片（ＦＧＦ受容体の２ｂサブタイプの細胞外断片）は、リガンドに結合することによってそのリガンドの有効濃度を減少させ、それによってＦＧＦシグナルを阻害することができる。発明者らは上記単離タンパク質がヒトＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の機能を有することを実証した。本明細書では、「ヒトＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の機能」はＦＧＦＲ受容体に結合することによってＦＧＦシグナルを阻害する能力を意味する。ここで、ＦＧＦＲ受容体はＦＧＦ７又はＦＧＦ１０を指す。「ヒトＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の機能」の有無は、実施例に記載の方法などによって確認できる。
【００１６】
以下に配列番号２２、２４、２６のアミノ酸配列をそれぞれ示す：
配列番号２２
KRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERSPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKHSGINSSNAEVLALFNVTEADAGEYICKVSNYIGQANQSAWLTVLPKQQAPGR
配列番号２４
KRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERWPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKHSGINSSNAEVLALFNVTEADAGEYICKVSNYIGQANQSAWLTVLPKQQAPGR
配列番号２６
KRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERSRHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKHSGINSSNAEVLALFNVTEADAGEYICKVSNYIGQANQSAWLTVLPKQQAPGR
【００１７】
別の側面では、本開示は、単離タンパク質であって、
ｉｉ）配列番号２、４、６、２２、２４、又は２６に１以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加を施して得られるアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号２、４、６、２２、２４又は２６と８０％を超える（８５％を超えることが好ましく、８７．８％を超えることがより好ましく、９０％を超えることがより好ましく、９５％を超えることがより好ましく、９６％を超えることがより好ましく、９７％を超えることがより好ましく、９８％を超えることがより好ましく、９９％を超えることがより好ましく、９９．５％を超えることがより好ましい）配列相同性を有するアミノ酸配列；或いは
ｉｖ）配列番号２、４、６、２２、２４、又は２６のアミノ酸配列をコードする核酸の相補的配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸によってコードされるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むと共に、
ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の機能を有する、単離タンパク質を提供する。
【００１８】
本明細書のヒトＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質の変異体は、ヒトに由来することが好ましい。
【００１９】
本明細書のヒトＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質の変異体では、アミノ酸置換は保存的置換（特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的性質を有する残基と置換すること）であってもよい。保存的置換としては、脂肪族基含有アミノ酸残基間での置換（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ間での置換など）、極性残基間での置換（ＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、ＧｌｎとＡｓｎの置換など）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。欠失、置換、挿入及び／又は付加によって得られる変異体は、たとえば野生型タンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発（たとえばNucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487-6500, 1982を参照；この文献の全文は参照によって本明細書に組み込まれる）又はタンパク質の人工合成によって生成可能である。本明細書において、「１以上のアミノ酸」は、部位特異的変異誘発又は人工合成の方法による欠失、置換、挿入、及び／又は付加に関与し得る大きさのアミノ酸を意味する。たとえば、１個〜２０個のアミノ酸であり、１個〜１５個のアミノ酸であることが好ましく、１個〜１０個のアミノ酸であることがより好ましく、１個〜８個のアミノ酸であることがより好ましく、１個〜２個のアミノ酸であることがより好ましく、１個のアミノ酸であることがさらに好ましい。
【００２０】
２種類のアミノ酸配列の％相同性は、目視による確認又は数学的計算によって決定可能である。或いは、２種類のペプチド配列の％相同性は、Needleman, S. B.とWunsch, C. D.（J. Mol. Bol., 48: 443-453, 1970）によるアルゴリズムに基づき、University of Wisconsin Genetics Computer Group（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラムを用いた配列アライメント分析によって決定可能である。ＧＡＰプログラムで最適化された初期設定値には以下が含まれる：（１）Henikoff, S.とHenikoff, J. G.の文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992）に記載されているscore/matrix blosum62；（２）１個のギャップに対して１２点減点；（３）連続したギャップに対してさらに４点減点；（４）末端のギャップに対しては減点なし。当業者に利用される配列アライメント分析のためのその他のプログラムを本明細書で用いてもよい。％相同性については、Ａｌｔｓｃｈｕｌらの文献（Nucl. Acid. Res., 25, p. 3389-3402, 1997）に記載されているように、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報を比較することもできる。このプログラムはNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）又はDNA Data Bank of Japan(DDBJ)のウェブサイトで利用可能である。ＢＬＡＳＴプログラムを用いた相同性検索に関する様々な条件（パラメータ）についての詳細な説明もこれらのウェブサイトで見ることができる。必要に応じて設定を部分的に変更することもできるが、検索は一般的には初期設定値を用いて実行される。遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX Ver.7（ＧＥＮＥＴＹＸ）又はＦＡＳＴＡアルゴリズムなどのプログラムを用いて２種類のアミノ酸配列の％相同性を決定することも可能である。これらのプログラムでも初期設定値を用いて検索を実行できる。
【００２１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」という用語は、いわゆる特異的なハイブリダイゼーションは起こるが非特異的なハイブリダイゼーションは起こらない条件を意味する。このような条件下では相同性の高いＤＮＡ同士がハイブリダイズする。たとえば、相同性が８０％以上（９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９７％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることが最も好ましい）のＤＮＡ同士はハイブリダイズするが、上記のパーセンテージよりも相同性の低いＤＮＡ同士はハイブリダイズしない。或いは、「ストリンジェントな条件」は一般的なサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件を意味する場合がある。すなわち、塩濃度と温度を１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃が好ましく、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６８℃がより好ましい）として洗浄を１回（２回か３回が好ましい）行う条件である。
【００２２】
２．単離核酸
別の側面では、本開示は前記ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質又はその変異体をコードする単離核酸を提供する。
【００２３】
単離核酸は一本鎖でも二本鎖でもよく、ＤＮＡでもＲＮＡでもＤＮＡとＲＮＡの複合体であってもよい。
【００２４】
単離核酸は人工合成又はたとえば遺伝子工学などの手段を用いて調製可能である。
【００２５】
一般的に、上記配列番号２、４、６、２２、２４、又は２６のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１、３、５、２１、２３、又は２５の塩基配列によってコードされてもよい。
【００２６】
３．ベクター及び宿主細胞
別の側面では、本開示は前記核酸を含むベクターを提供する。
【００２７】
ベクターの種類については特に限定はなく、当業者によって一般的に用いられているものである。ベクターの例としては、プラスミド、ファージ、動物ウイルスなどが挙げられる。
【００２８】
さらに別の側面では、本開示は前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２９】
宿主細胞の種類については特に限定はなく、当業者によって一般的に用いられているものである。宿主細胞の例としては、ＣＨＯ細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、昆虫細胞、酵母細胞などが挙げられる。
【００３０】
４．融合タンパク質
別の側面では、本開示は前記ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質又はその変異体とヒト免疫グロブリンＦｃ断片との融合タンパク質を提供する。
【００３１】
５．医薬組成物とその製薬における使用
別の側面では、本開示は、有効成分としての前記ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質又はその変異体、前記核酸、前記ベクター、前記宿主細胞、或いは前記融合タンパク質と医薬的に許容可能なベクターとを含む医薬組成物を提供する。本明細書で開示する医薬組成物は、湿疹、座瘡、乾癬、皮膚アレルギー、脂漏性皮膚炎、又は脂漏性脱毛症を治療するために使用可能である。医薬的に許容可能なベクターの例としては、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、香料、賦形剤、溶媒、保存料、結合剤などが挙げられる。
【００３２】
別の側面では、本開示は、前記ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質又はその変異体、前記核酸、前記ベクター、前記宿主細胞、或いは前記融合タンパク質の使用であって、湿疹、座瘡、乾癬、皮膚アレルギー、脂漏性皮膚炎、又は脂漏性脱毛症を治療するための薬剤の調製における使用を提供する。
【００３３】
発明者らの研究から、前記の各ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質が効果的にＦＧＦＲリガンドと結合してＦＧＦＲのリン酸化を阻害できることがわかった。一方、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の受容体すなわちＦＧＦＲは膜受容体であり、細胞外断片は特定のリガンドに結合することができ、細胞内部分はチロシンキナーゼ活性を有することが知られている。ＦＧＦＲの細胞外断片がリガンドと結合してそのリガンドの二量体化とリン酸化を活性化し、それによって下流のシグナルを活性化することによってＦＧＦＲは標的遺伝子の発現を制御することができる。したがって、上記の各ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片は、ＦＧＦＲリガンドと結合してＦＧＦＲリガンドが膜ＦＧＦＲと結合するのを阻害することによって、炎症性皮膚疾患の発生に関連すると考えられる下流のシグナルの活性化を阻害できると推測できる。
【００３４】
したがって、発明者らの研究結果によれば、ＦＧＦＲ２ｂの任意のアンタゴニストが炎症性皮膚疾患の治療に使用可能であると結論付けることができる。本明細書において、ＦＧＦＲ２ｂのアンタゴニストとしては、ＦＧＦ７抗体、ＦＧＦ１０抗体、ＦＧＦＲ２ｂ抗体、ＡＺＤ４５４７、ＡＰ２４５３４、ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＰ６０３、ｓｕ５４０２、ｓｕ６６６８、ＰＤ１６１５７０、ＰＤ１６６８６６、ｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｐｒｙ、ＭＫＰ３、ＤＵＳＰ、ＳＥＦ、ＸＦＬＲＴ３のうちの１以上が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本明細書の炎症性皮膚疾患の例としては、湿疹、座瘡、乾癬、皮膚アレルギー、脂漏性皮膚炎、又は脂漏性脱毛症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
本開示の技術を明確に理解するため、例示を目的とし、以下の実施態様の例について図面を参照しながら説明する。これらの実施例は本開示の例示のみを目的とし、いかなる場合もその範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。以下の実施例に明記しない場合、具体的な実験条件は一般的に従来の条件（SambrookらがMolecular cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載した条件など）、又は製造業者の推奨する条件に従う。実施例に使用する様々な化学物質はすべて市販のものである。
【００３７】
実施例１：野生型及び変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片ポリペプチドをコードする遺伝子の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での発現
本実施例では、野生型及び変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片をコードする遺伝子（配列番号１と２１、配列番号３と２３、配列番号５と２５）を調製する方法と、これらの遺伝子を大腸菌内で発現させることによってＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片（配列番号２と２２、配列番号４と２４、配列番号６と２６）を調製する方法について記載する。
【００３８】
Ｉ．ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片をコードする遺伝子の調製：
１．野生型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の全長ｍＲＮＡを、トリゾール法でヒトの胎盤組織（中華人民共和国、広東省にある病院から産婦の同意を得て入手した新鮮な胎盤組織）から抽出し、これに基づきｃＤＮＡライブラリを構築した。
【００３９】
（１）トリゾール法によるｍＲＮＡの抽出：
細胞の密集度が９０％になるまで細胞をインキュベートした後、トリゾール溶液を添加して細胞を溶解した。得られた細胞溶解液をＥＰ管に移し、１／５の量のクロロホルムを添加した。上層の無色の水相を新しいＥＰ管に移し、トリゾールの１／２の量のイソプロパノールを添加した；
遠心分離を行った後、白色の乳濁液状の沈殿物をＥＰ管の底に確認した。次いで７５％エタノールを添加し、沈殿物を洗浄した；
風乾後、ＲＮＡ分解酵素を含まない水を添加し、ピペッティングを繰り返すことによって混合し、ＲＮＡを完全に溶解させた後、ＲＮＡの濃度と純度を確認した。
【００４０】
（２）ＰＣＲを利用したｍＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡの調製：
ｍＲＮＡサンプルをＰＣＲ管に添加し、６５℃で１０分かけてＰＣＲ装置で予備変性した。予備変性したｍＲＮＡサンプルを直ちに氷上に置いた。
【００４１】
逆転写反応系：全量を２０μＬとし、以下に示す量のものをさらに添加した。
【表０１】
0006408603.tif 000002
【００４２】
逆転写ＰＣＲプログラム：３０℃、１０分；４２℃、１時間；７０℃、１０分とした。
【００４３】
２．プライマーの設計：
本明細書に記載の設計されたプライマーはすべてBeijing Liuhe Huada Gene Technology Co., Ltd.から入手可能である。
野生型プライマー配列：
F1：CG CATATG GCACCATACTGGACCAAC;
R1：AT GGATCC CTATTA CAGGATGACTGTTACCAC（制限酵素切断部位Nde I及びBamH Iを含む）
F1'：CG CATATG aagagagcaccatactgg;
R1'：AT GGATCC CTATTA TCTTCCAGGCGCTTGCTG（制限酵素切断部位Nde I 及びBamH Iを含む）
【００４４】
Ｓ２５２Ｗ変異型及びＰ２５３Ｒ変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片ポリペプチドの遺伝子を得るため、部位特異的変異誘発のための２組のプライマーを設計した。
Ｓ２５２Ｗ変異型のプライマー配列は以下のとおりである：
F2：TTGT      GGAGCG  ATGGCCTCACCGGCCCAT；
R2：ATGG      GCCGGT  GAGGCCATCGCTCCACAA。
Ｐ２５３Ｒ変異型のプライマー配列は以下のとおりである：
F3：TTGTGGAGCGATCGCGTCACCGCCCAT;
R3：ATGGGCGGTGACGCGATCGCTCCACAA
【００４５】
３．ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の遺伝子配列の増幅：
野生型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の遺伝子を増幅するため、野生型ＰＣＲプライマーを用いて、ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片をコードするＤＮＡ配列の予備増幅を行った。
【００４６】
変異型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の２種類の遺伝子を増幅するため、野生型ＦＧＦＲ２ｂ遺伝子を鋳型とし、それぞれの変異型ＰＣＲプライマーを用いて重複伸長ＰＣＲ方法を行い、Ｓ２５２Ｗ変異を有する変異型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片遺伝子とＰ２５３Ｒ変異を有する変異型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片遺伝子を得た。
【００４７】
ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の遺伝子配列の増幅系及び反応条件は以下のとおりである（PrimerSTAR max, TaKaRa）。
【００４８】
【表０２】
0006408603.tif 000003
【００４９】
４．回収、精製及び同定：
アガロースゲル電気泳動及びゲル抽出を行った。回収したＤＮＡ断片の濃度と純度をアガロースゲル電気泳動及びＵＶ分光光度計によって測定できた。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比は１．７〜１．９とした。
【００５０】
ＩＩ．野生型及び変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質遺伝子の組み換えベクターの構築
１．二重消化・連結反応による組み換えプラスミドの構築
ＰＣＲ増幅した配列をｐＥＴ３ｃベクター(Invitrogen, USA)と共にNde I及びBamH Iで二重消化した（消化条件：３７℃の水浴で４時間）；
Nde I及びBamH Iで二重消化した後、ｐＥＴ３ｃプラスミドとＦＧＦＲ２ｂ遺伝子配列を連結した（連結条件：１６℃の水浴で１２時間）。
【００５１】
２．組み換えプラスミドの発現と同定
大腸菌ＤＨ５α株をＣａＣｌ２法で形質転換した。
【００５２】
（１）プラスミドを含まないＤＨ５α株を活性化した後、そのうち５０μＬを５ｍｌのＬＢ管に播種し、抗生剤の非存在下、振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって細胞を１．５ｍｌ回収した。
【００５３】
（２）上清を捨て、氷浴した８００μＬのＣａＣｌ２に細胞を再懸濁した。６０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行った後、再び上清を捨てた。
【００５４】
（３）氷浴した５０μＬのＣａＣｌ２に細胞を再懸濁し、ＬＢ管壁に付着した細胞をそっとピペッティングして取った。
【００５５】
（４）上記の連結後のプラスミド１０μＬを形質転換受容性細胞５０μＬと混合し、３０分間氷浴した。
【００５６】
（５）この混合物に４２℃で９０秒間熱ショックを与え、素早く氷上に移し２〜３分間置いた。
【００５７】
（６）２００μＬのＬＢ培地を添加し、十分に混合した後、１３０〜１５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートした。
【００５８】
３．二重酵素消化による組み換えプラスミドの同定：
０．１％Ａｍｐを含むＬＢ培地に複数の単一コロニーを白金耳で移し、ラベルを付け、振盪しながら３７℃で１２時間インキュベートした。次いでプラスミドを抽出し（Omega Plasmid Mini Kitの作業プロトコルに従った）、二重酵素消化によって同定した（実施例１と同様）。二重酵素消化によって同定した単クローンをSango Biotech Co., Ltdに送り配列決定した。配列決定で正しい配列が確認された６個の組み換えプラスミドが得られ、これらをｐＥＴ３ｃ−ＦＧＦＲ２ｂ、ｐＥＴ３ｃ−Ｓ２５２Ｗ−ＦＧＦＲ２ｂ、ｐＥＴ３ｃ−Ｐ２５３Ｒ−ＦＧＦＲ２ｂと命名した。
【００５９】
ＩＩＩ．ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質遺伝子の大腸菌内での発現
【００６０】
（１）上記のＣａＣｌ２法による大腸菌ＤＨ５α株の形質転換に従い、６個の組み換えプラスミドをそれぞれＢＬ２１（＋）遺伝子改変株に形質転換して発現株を得た。
【００６１】
（２）ＢＬ２１（＋）遺伝子改変株を、０．１％Ａｍｐを含む滅菌済みＬＢ液体培地に１：５０の播種割合で播種し、震盪しながら（２００ｒｐｍ）３７℃でインキュベートした；
細胞がＯＤ６００＝０．６〜０．８に達したら対照群と誘導群を確立した：
誘導群：０．８４ＭのＩＰＴＧを終濃度が０．８４ｍＭになるように添加し、３７℃で３時間インキュベートし、発現を誘導した；
対照群：何の処置も行わなかった。
標的タンパク質の発現状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で確認した（図１参照）。
【００６２】
ＩＶ．ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片ポリペプチドの回収と精製：
【００６３】
（１）５時間インキュベートした後、遠心分離によって細胞を回収した。
【００６４】
（２）細胞を超音波処理した。細胞塊と破砕緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＰＢ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．５）の割合は１：８〜１：１０とした。
【００６５】
（３）原核生物（大腸菌）発現株の一部ではＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質は封入体として発現された。このような場合、封入体の洗浄と変性・再生技術によって活性型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質を得た（詳細な方法については特許出願ZL200710029286.6号を参照）。
【００６６】
（４）Ｂｅｋ抗体（ｃ−１７）（Santa Cruz Blotechnology）を一次抗体、抗ウサギ二次抗体（ＣＡＴ番号ＡＳ００６、Ａｓｂｉｏ）を二次抗体として用い、ウェスタンブロット法によって検出を行った。結果を図２に示す。この結果から、ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の類似体がＦＧＦＲ抗体によって特異的に認識可能であることがわかった。
【００６７】
実施例２：ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の哺乳類細胞内での発現
本実施例では、ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の野生型の遺伝子及び変異型の遺伝子（配列番号１と２１、配列番号３と２３、配列番号５と２５）を哺乳類細胞内で組み換え発現することによって、グリコシル化する可能性のあるＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片ポリペプチドを調製する方法について記載する。
【００６８】
１．プライマー設計：
F4：ATAT GGATCC GCCGCCACC ATG gcaccatactggaccaac；
R4：GCGCAAGCTT TCATTA CAGGATGACTGTTACCAC（酵素切断部位BamH I及びHind IIIを含む）
F4'：ATAT GGATCC GCCGCCACC ATG aagagagcaccatactgg；
R4'：GCGCAAGCTT TCATTA TCTTCCAGGCGCTTGCTG（酵素切断部位BamH I及びHind IIIを含む）
【００６９】
２．ベクターの構築：
ベクターｐＣＤＮＡ３．１（−）（Invitrogenより購入）を発現ベクターとして使用した；
ＦＧＦＲ２ｂ遺伝子配列（配列番号１と２１、配列番号３と２３、配列番号５と２５）をそれぞれｐＣＤＮＡ３．１に連結し（実施例１と同様の方法を用いた）、ベクターｐＣＤＮＡ３．１−ＦＧＦＲ２ｂを得た。
【００７０】
３．２９３細胞へのｐＣＤＮＡ３．１−ＦＧＦＲ２ｂの形質移入
【００７１】
（１）６種類の組み換えプラスミドｐＣＤＮＡ３．１−ＦＧＦＲ２ｂをEndoFree Mini Plasmid Kit（ＯＭＥＧＡより購入）のプロトコルに従って抽出した。
【００７２】
（２）ヒト２９３細胞（ATCC CCL1573）を宿主細胞として選択し、ウシ胎児血清を添加し必要に応じて栄養素及び／又は抗生剤を添加したＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）中、インキュベータ（飽和湿度、３７℃、５％ＣＯ２）内で密集状態になるまでインキュベートした。
【００７３】
（３）形質移入の２４時間前、対数増殖期にある２９３細胞を０．２５％トリプシン分解酵素で消化し、抗体を含まないＤＭＥＭ培地に細胞をピペッティングすることによって懸濁させ、６ウェルプレートに移した（２×１０５細胞／ウェル）。細胞を完全に接着させ細胞密度を５０％〜６０％に到達させた。
（４）Lipofectamine（商標）2000 Liposomal Transfection Kit（Invitrogen（ＵＳＡ）より購入）を用いて形質移入を行った。具体的な工程は以下のとおりである。Lipofectamine（商標）2000の希釈：６ウェルプレートに入れた２５０μＬ／ウェルのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）に５μＬ／ウェルのLipofectamine（商標）2000を添加し、５分間静置した；
形質移入するプラスミドの希釈：６ウェルプレートに入れた２５０μＬ／ウェルのＯｐｔｉ−ＭＥＭに対し、形質移入するプラスミド４μｇを添加することによって希釈を行った；
同量の上記２種類の希釈液を混合し、２０分間静置した。この混合物５００μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ１．５ｍｌを各ウェルに添加した；インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で４〜６時間インキュベートした後、培地を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地と交換した；形質移入の２４時間後に古い培地を慎重に除去し、新鮮なＤＭＥＭ完全培地と交換してインキュベーションを継続した。
【００７４】
４．ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質の精製と同定：
培養液を４℃、１８０００ｒｐｍで遠心分離し上清を回収した。タンパク質の精製工程は以下を含む：
ヘパリン親和性（アフィニティー）カラム(GE 17-0998-01 50ml)を用いた。カラムをカラム容量の３倍の再蒸留水で洗浄し、次いでアフィニティークロマトグラフィー用の平衡化液で調整した；流速は５ｍｌ／分とした；少なくともカラム容量の３倍の量を調整した後、工程２で得た上清を充填し、カラム容量の３倍量のアフィニティークロマトグラフィー用平衡化液でさらに洗浄し、ヘパリン溶出液で溶出し；２８０ｎｍの波長で単一の溶出ピークを回収し、野生型ＦＧＦＲ２ｂ、Ｓ２５２Ｗ変異型ＦＧＦＲ２ｂ、及びＰ２５３Ｒ変異型ＦＧＦＲ２ｂのポリペプチドを得た。これらを−７０℃で保存した後、さらに分析した。
【００７５】
アフィニティークロマトグラフィー用平衡化液：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５；
ヘパリン溶出液：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５；
流量：５ｍｌ／分
ウェスタンブロットによる同定から、ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質がＦＧＦＲ抗体によって特異的に認識可能であることがわかる。
【００７６】
実施例３：ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片のＣＨＯ細胞内での発現
本実施例では、野生型及び変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の遺伝子（配列番号１と２１、配列番号３と２３、配列番号５と２５）をＣＨＯ細胞内で発現させることによってＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片（配列番号２と２２、配列番号４と２４、配列番号６と２６）の遺伝子を調製する方法について記載する。ここで用いる遺伝子配列の調製については実施例１を参照のこと。
【００７７】
１．プライマー設計：
F5：ATAT GAATTC GCCGCCACC ATG gcaccatactggaccaac；
R5：GCGC GGATCC TCATTA CAGGATGACTGTTACCAC（酵素切断部位BamH I及びEcoRIを含む）；
F5'：ATAT GAATTC GCCGCCACC ATG aagagagcaccatactgg；
R5'：GCGC GGATCC TCATTA TCTTCCAGGCGCTTGCTG（酵素切断部位BamH I及びEcoRIを含む）
【００７８】
２．ベクターの構築：
ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ３（Clontechより購入）を発現ベクターとして用いた；
ＦＧＦＲ２ｂの遺伝子配列（配列番号１と２１、配列番号３と２３、配列番号５と２５）をｐＣＤＮＡ３．１にそれぞれ連結し（実施例１と同じ方法を用いた）、６種類のベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ３−ＦＧＦＲ２ｂを得た。
【００７９】
３．ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞へのｐＩＲＥＳｎｅｏ３−ＦＧＦＲ２の形質移入
【００８０】
（１）EndoFree Maxiprep Plasmid Kit（Invitrogen）のプロトコルに従い、プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ３−ＦＧＦＲ２ｂを抽出した。
【００８１】
（２）工程（１）で得た各プラスミドを実施例２と同じ形質移入工程でチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−ＤＧ４（Invitrogen）に形質移入し、ピューロマイシン（４００ｎｇ／ｍｌ）を用いて高圧下でスクリーニングすることにより、安定にクローン化された組み換えＣＨＯ細胞を選別した。
【００８２】
（３）組み換えＣＨＯ細胞をｐｒｏＣＨＯ５培地（４ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、０．６８ｍｇ／Ｌヒポキサンチン、０．１９４ｍｇ／Ｌチミジン）に播種し（５×１０５細胞／ｍｌ）、そのうち１．５Ｌを５Ｌの振盪フラスコに入れて１１０ｒ／分、３７℃で７２時間インキュベートし、その後３１℃で２１６時間さらにインキュベートした。
【００８３】
（４）細胞培養液１．５Ｌの上清を回収し、そのうち５００ｍｌを次いで０．４５μｍフィルターで濾過し、ヘパリンアフィニティーカラムで精製して標的タンパク質を得た。
【００８４】
実施例４：ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の酵母細胞内での発現
本実施例では、野生型及び変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片遺伝子（配列番号１と２１、配列番号３と２３、配列番号５と２５）を調製する方法と、これらを酵母細胞内で発現することによってＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片のポリペプチド（配列番号２と２２、配列番号４と２４、配列番号６と２６）を調製する方法について記載する。
【００８５】
１．プライマー設計：
上流プライマーF6：5'-ATAT CTCGAG GCCGCCACC ATG gcaccatactggaccaac -3'（下線部はXho I酵素切断部位である）；
下流プライマーR6：5'-GCGC TCTAGA TCATTA CAGGATGACTGTTACCAC C -3'（下線部はXba I酵素切断部位である）；
上流プライマーF6'：5'-ATAT CTCGAG GCCGCCACC ATG aagagagcaccatactgg -3'（下線部はXho I酵素切断部位である）；
下流プライマーR6'：5'-GCGC TCTAGA TCATTA TCTTCCAGGCGCTTGCTG -3'（下線部はXba I酵素切断部位である）
【００８６】
２．ベクターの構築：
ピキア（Pichia）の発現ベクターｐＰＩＣＺαＡ（Invitrogen）を使用した。
操作手順は実施例１と同様であり、Ｆ６とＲ６をプライマーとし、Xho IとXba Iを酵素とした。このようにして得たベクターをｐＰＩＣＺαＡ−ＦＧＦＲ２ｂと命名した。
【００８７】
３．大腸菌細胞の形質転換と同定：
実施例１と同様、ＣａＣｌ２法で大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換し、ｐＰＩＣＺαＡ−ＦＧＦＲ２ｂを大腸菌ＤＨ５α細胞にそれぞれ導入した。形質転換したＤＨ５α細胞を、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）（１００μｇ／ｍｌ）抗生剤を含むＬＢプレートを用いて予備スクリーニングした。プレート上で増殖させた単一コロニーを選択し、３７℃下２２０ｒｐｍで振盪しながら培養した後、少量のプラスミドを抽出し、制限酵素分析（Xho IとXba Iを用いた二重酵素消化による同定）によって同定した。この同定で陽性のクローンを選出し、配列決定のために送った。
【００８８】
４．酵母Ｘ３３細胞の形質転換：
精製したプラスミド（ｐＰＩＣＺαＡ−ＦＧＦＲ２ｂの各々）をSac I酵素で消化（消化系：１０倍緩衝液２μｌ、プラスミド１０μｌ、Sac I酵素１μｌ；〜２０μｌのｄｄＨ２Ｏを充填）することによって直線化した。形質転換受容性のピキアＸ３３細胞をそれぞれ以下のように電気形質転換した：形質転換受容性Ｘ３３細胞８０μｌと直線プラスミド２０μｌを均一に混合し、予冷した０．２ｃｍギャップの電気穿孔キュベットに移して５分間氷浴中に維持し、１８００Ｖの電気パルスエネルギーの形質転換電圧を４．３ミリ秒かけて電気形質転換した；予冷した１Ｍのソルビトール１ｍｌを直ちにキュベットに添加し、静かにピペッティングすることによって混合した後、１．５ｍＬのＥＰ管に移し、プレートに入ったＺｅｏｃｉｎ１００μｇ／ｍｌを含むHypertonic Complete Medium （ＹＰＤＳ）に播種し；この混合物を２８℃で２〜３日インキュベートした。
【００８９】
５．組み換え株の同定と発現誘導：
具体的な手順はＷａｎｇらによる融合抗体ＳｃＦｖ−Ｆｃの発現に関する説明(Construction of a general expression vector for fused antibody ScFv-Fc, China Biotechnology. 2011,31(8):110-117)に記載されている。
【００９０】
６．ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質の精製と同定：
【００９１】
（１）遠心分離によって酵母細胞を発酵培地から除去した。
【００９２】
（２）組み換えＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質を８０００ＫＤカラム限外濾過フィルターで予備分離精製し、培地を濃縮した。
【００９３】
（３）ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質を含む濃縮物をヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィー（実施例２と同じ）によってさらに精製し、ウェスタンブロットによって同定した。結果から、各ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片類似体がＦＧＦＲ抗体によって特異的に認識可能であることがわかる。
【００９４】
実施例５：バキュロウイルスと感染昆虫細胞内でのＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の発現
本実施例では、野生型及び変異型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片遺伝子（配列番号１と２１、配列番号３と２３、配列番号５と２５）を調製する方法と、これらを酵母細胞内で発現させることによってＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片ポリペプチド（配列番号２と２２、配列番号４と２４、配列番号６と２６）を調製する方法について記載する。
【００９５】
１．実施例２に記載の方法により、ベクターｐＦａｓｔＢａｃ−ＦＧＦＲ２ｂ、ｐＦａｓｔＢａｃ−ＦＧＦＲ２ｂ−Ｓ２５２Ｗ、及びｐＦａｓｔＢａｃ−ＦＧＦＲ２ｂ−Ｐ２５３Ｒを得た（実施例２と同じプライマーを用い、ベクターｐＦａｓｔＢａｃはInvitrogenより入手した）。
【００９６】
２．形質転換受容性の大腸菌ＤＨ１０ＢＡｃ細胞の形質転換
−８０℃で保存した形質転換受容性の大腸菌ＤＨ１０ＢＡｃ細胞（Invitrogenより入手）を氷上で解凍した；無菌状態の形質転換受容性大腸菌ＤＨ１０ＢＡｃ細胞に５μＬのプラスミドを添加し、３０分間氷上に維持し、４２℃で４５秒間熱ショックを与え、直ちに氷上に戻して２分間静置した；細胞に室温のＳ．Ｏ．Ｃ．培地（Ｃａｔ番号１５５４４−０３４）０．９ｍｌを添加し、２２５ｒｐｍ（３７℃）で４５分間振盪した；培養液をＳ．Ｏ．Ｃ．培地で希釈し（１：１０）、希釈した培養液１００μＬを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン７μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ２００ｍｇ／ｍｌ、Ｘ−ｇａｌ２０ｍｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに置き、次いでこれを３７℃で２４時間インキュベートした；翌日、白色の点を採取し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で培養し、培養液をＰＣＲ分析によって同定した；同定した培養液を５ｍｌの培地に播種し、３７℃で一晩インキュベートした；陽性のバクミドを抽出した。Bac-to-bac HT Vector kit（Invitrogenより購入、Ｃａｔ．１０５８−０２７）を用いて組み換えプラスミドＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動を行い、形質転換結果を検出した。
【００９７】
３．組み換えバキュロウイルスｐＦａｓｔＢａｃベクターでの形質移入の具体的な手順は、Ｘｉｅらによる"Expression of recombinant human soluble PDGFRβ/Fc in Sf9 insect cells, Entomological Journal. July 2009, 52(7):743-748"に記載されている。
【００９８】
４．ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の発現
上清と細胞を回収し、１６０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。次いで上清と細胞ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供し、ウェスタンブロットにより同定した。結果から、ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の類似体がＦＧＦＲ２ｂ抗体によって特異的に認識可能であることがわかる。
【００９９】
実施例６：６種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片による湿疹の治療効果
本実施例では、実施例１に従って調製した配列番号２と２２、配列番号４と２４（Ｓ２５２Ｗ変異型）、及び配列番号６と２６（Ｐ２５３Ｒ変異型）に示す６種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片による湿疹の治療効果について、マウスに対する実験を通じて記載する。図３に実験結果を示す。
【０１００】
Ｉ．実験手順
１．クリーングレードの雄ＩＣＲマウス８０匹（Laboratory animal center of SUN YAT-SEN University）を体重に基づいて無作為に８群（正常群、モデル群、６種のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質それぞれに対応する群）に分けた。各群１０匹とした。
【０１０１】
２．正常群のマウス以外のマウスの腹部の毛を剃り、１００μＬの１％２，４−ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）エタノール溶液を腹部に塗布し、アレルギーを誘発した。５日後、マウスの左耳介に一様に２５μＬの０．５％ＤＮＣＢエタノール溶液を３日ごとに１回、合計４回塗布することによって負荷を与えた。各負荷の後、マウスの耳介腫脹の程度をノギスで測定した。
【０１０２】
３．３種類の全長ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質のそれぞれに対応する群のマウスに対して１匹あたり２５μＬの用量（濃度１００μｇ／ｍｌ）を、３種類の切断型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質のそれぞれに対応する群のマウスに対して１匹につき２５μＬ（濃度５０μｇ／ｍｌ）の用量を、それぞれ１日１回投与した（負荷を与える日の場合は負荷の１時間前に投与した）；
正常群とモデル群には同量の蒸留水を１４日間継続的に与えた。
【０１０３】
ＩＩ．実験結果
図３に示すように、正常群と比較してモデル群のマウスの左耳の痂皮の数は有意に増加した。モデル群と比較して６種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片タンパク質に対応するマウスの左耳の痂皮の数は有意に減少し、切断型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片は全長ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片よりも高い効果を有した。
【０１０４】
実施例７：６種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片による座瘡の治療効果
本実施例では、実施例１に従って調製した配列番号２と２２、配列番号４と２４（Ｓ２５２Ｗ変異型）、及び配列番号６と２６（Ｐ２５３Ｒ変異型）に示す６種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片による座瘡の治療効果について記載し、角化の抑制に関する実験と脂腺性の発疹（sebaceous gland spot）の抑制に関する実験が含まれる。表１及び表２にこれらの実験の結果を示す。
【０１０５】
Ｉ．ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片による角化抑制に関する実験
１．実験手順
【０１０６】
（１）雄の日本白色種ウサギ４８匹（体重２〜３ｋｇ、Laboratory animal center of SUN YAT-SEN Universityより入手）を以下の群に分けた：正常対照群、生理食塩水群、６種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片それぞれに対応する群（各群６匹、合計８群）。
【０１０７】
（２）第１群のウサギ６匹はコールタールを塗布しない正常対照群とした。それ以外の７群、計４２匹には、両耳内部の外耳道の開口部にコールタール０．５ｍｌを２ｃｍ×２ｃｍの範囲で１日１回、２週間継続して塗布し、ウサギの耳の実験角化モデルを確立した。
【０１０８】
（３）投与段階：
第２群を生理食塩水群とし、１日あたり０．１ｍｌの生理食塩水を両耳の角化部位に塗布した；
第３群〜第５群を３種類の切断型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片投与群とし、１日あたり０．１ｍｌ（５０μｇ／ｍｌ）を両耳の角化部位に塗布した；
第６群〜第８群を３種類の全長ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片投与群とし、１日あたり０．１ｍｌ（１００μｇ／ｍｌ）を両耳の角化部位に塗布した；
上記の各群に対し、１日２回の投与を１週間継続して行った。
【０１０９】
（４）実験効果の測定指標
表皮の厚みの増大、毛包開口部の拡張の程度、及び角化物質の量によって検体の病理組織変化を４段階に分類した：０は座瘡が見られない場合；＋は厚くなった角化物質が毛包漏斗部にわずかに見られる場合；＋＋は中等量の角化物質が毛包漏斗部から皮脂腺に向かって広がっている場合；＋＋＋は拡張した毛包に多量の角化物質が見られる場合である。
【０１１０】
２．結果
実験結果を表１に示す。第２群と比較して第３群〜第８群では角化が有意に抑制され、切断型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片は全長ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片よりも高い効果を示した。
【表１】
0006408603.tif 000004
【０１１１】
ＩＩ．ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片による脂腺性の発疹の抑制実験
１．実験手順：
【０１１２】
（１）雄の成体ゴールデンハムスター５６匹に約２０℃の環境下で標準的な食餌を与え、２週間後、実験に使用した。
【０１１３】
（２）ゴールデンハムスターの背側の毛を脱毛剤で脱毛し、両側の脂腺性の発疹が見えるようにし、生理食塩水群と６種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片それぞれに対応する群を含む７群に無作為に分けた。各群８匹とした。
【０１１４】
（３）投与段階：
第１群は生理食塩水群（陰性対照群）とし、生理食塩水０．１ｍｌを両側の脂腺性の発疹に塗布した；
第２群〜第４群は、実施例２に記載の方法と同じ方法で調製した３種類の切断型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片それぞれを投与する群とし、０．１ｍｌ（５０μｇ／ｍｌ）を両側の脂腺性の発疹に塗布した；
第５群〜第７群は実施例２に記載の方法と同じ方法で調製した３種類の全長ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片それぞれを投与する群とし、０．１ｍｌ（１００μｇ／ｍｌ）を両側の脂腺性の発疹に塗布した；
上記の各群に対し、１日２回の投与を３０日間継続して行った。
【０１１５】
（４）実験効果の測定
最後の投与から２４時間後、各群のゴールデンハムスターをジエチルエーテルで麻酔し、両側の脂腺性の発疹を除去し、組織学的変化を光学顕微鏡で観察した。
【０１１６】
４０倍で観察し、各視野を１ｍｍ×１ｍｍの格子状に均等に分割した。視野のうち皮脂腺で占められた格子の数と面積を計算し、群間で比較した（重複している視野は計算中に除外した）。皮脂腺の厚みの測定：重複した脂腺葉の数が４以上の場合は「厚い」；重複する脂腺葉の数が２か３の場合、「中程度」；脂腺葉の数が１の場合「薄い」とした。
【０１１７】
２．実験結果
実験結果を表２に示す。第２群と比較して、第３群〜第７群では脂腺性の発疹が有意に阻害され、切断型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片は全長ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片よりも高い効果を示した。各治療群を対照群と比較してＰ値を求めた。
【０１１８】
【表２】
0006408603.tif 000005
【０１１９】
実施例８：等温滴定熱量測定（ｉＴＣ）による３種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片とＦＧＦ７の相互作用の測定
本実験では、実施例１の方法に従って調製した配列番号２２、配列番号２４（Ｓ２５２Ｗ変異型）、及び配列番号２６（Ｐ２５３Ｒ変異型）に示す３種類の切断型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片のＦＧＦ７（又はＫＧＦ）との結合について実証する。図４に結果を示す。
【０１２０】
３種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片とＦＧＦ７（Milliporeより購入）をそれぞれｉＴＣ緩衝液（０．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ及び５％グリセリンを含む２０ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４−クエン酸緩衝液、ｐＨ７．２）で透析し、透析後のタンパク質を４℃、１８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、ｉＴＣ実験を行った。
【０１２１】
３５μｍｏｌ／Ｌの３種類の各ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片（４００μｌ）を検体プールにそれぞれ添加し、９３μｍｏｌ／ＬのＦＧＦ７（２００μｌ）を１回につき２μｌずつ、２．５分の間隔をあけて合計２０滴、滴定した。
【０１２２】
結果から、Ｓ２５２Ｗ変異型とＰ２５３Ｒ変異型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片の結合親和性がいずれも野生型のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片よりも高いことがわかった。
【０１２３】
実施例９：６種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片のリガンドとの結合によるＦＧＦシグナル阻害試験
本実験では、実施例１の方法に従って調製した配列番号２と２２、配列番号４と２４（Ｓ２５２Ｗ変異型）、及び配列番号６と２６（Ｐ２５３Ｒ変異型）に示す６種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片がリガンドと結合してＦＧＦＲのリン酸化を阻害することを実証する。図５に結果を示す。
【０１２４】
１．細胞培養液
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地を入れた５０ｃｍ２細胞培養瓶（Ｔｈｅｒｍｏより購入）内でヒトケラチノサイトＨａｃａｔ（ＡＴＣＣより入手）を継代し、細胞インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）でインキュベートした。
【０１２５】
２．ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片のリガンドとの結合によるＦＧＦＲリン酸化の阻害のウェスタンブロットによる検出
細胞を２４時間インキュベートした後１×ＰＢＳで洗浄して残った培地を除去し、これを０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＭＥＭ飢餓培地と交換した。１２時間後、誘導を行った。具体的な手順は以下のとおりである：５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７（ＫＧＦともいう）又は１μｇ／ｍｌの６種類のＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片を含む３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ／ＭＥＭ培地を６ウェルプレートに移した（２ｍｌ／ウェル）：
ウェル♯１には３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ／ＭＥＭ培地を添加し；
ウェル♯２には３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ／ＭＥＭ培地＋ＦＧＦ７を添加し；
ウェル＃３〜５には３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ／ＭＥＭ培地＋３種類の全長ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片＋ＦＧＦ７を添加し；
ウェル♯６〜８には３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ／ＭＥＭ培地＋３種類の切断型ＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片＋ＦＧＦ７を添加した。
【０１２６】
誘導の１時間後にウェスタンブロット分析を行った。使用した抗体はすべてＣＳＴから購入し、ＦＧＦ７はMilliporeから購入した。
【０１２７】
ＦＧＦ７はＦＧＦＲ２ｂの自己リン酸化を誘導することによってＦＧＦシグナルを活性化する。ウェスタンブロット分析では抗リン酸化ＦＧＦＲ抗体を用い、リン酸化したＦＧＦＲの量はＦＧＦシグナルの活性化に十分であった。ＦＧＦ７の効果によってリン酸化ＦＧＦＲが豊富に存在した（左から２番目のレーン）が、リン酸化ＦＧＦＲが有意に減少したことから、ＦＧＦ７による活性化効果がＦＧＦＲ２ｂ細胞外断片によって阻害されたことがわかった（左から３〜８番目のレーン）。
【０１２８】
本明細書に記載の態様はあくまでも本発明を説明することのみを目的とするものである。いかなる意味でも本発明の範囲を限定することを意味するものではない。当業者であれば理解するように、本明細書に記載の態様には、本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく、種々の変更及び修飾を加えることが可能である。斯かる変更や修飾は本発明の企図するところであり、その範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ定められるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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