(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の方法工程：
（ａ）プロモーターとタンパク質をコードする核酸とを含む発現構築体を、微生物中に導入する工程；
（ｂ）この微生物中でタンパク質を発現させる工程
を含む、微生物によるタンパク質の製造法において、微生物がバチルス・プミルス種に属しており、
遺伝子ｓｐｏＩＶ（ｙｑｆＤ）もしくはその一部の欠損により微生物の胞子形成が抑制されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
プロモーターが、以下：
（ａ）配列番号１において示される核酸配列に対して、少なくとも９５％同一である核酸配列；
（ｂ）配列番号２において示される核酸配列に対して、少なくとも９５％同一である核酸配列；
（ｃ）配列番号３において示される核酸配列に対して、少なくとも９５％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号４において示される核酸配列に対して、少なくとも９５％同一である核酸配列
から選択された核酸配列を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質が微生物中に自然に存在するものではない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質が酵素である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質が、酸性セルラーゼ、α−アミラーゼ、α−アセトデカルボキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラバナーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−マンノシダーゼ、カラゲナーゼ、カルボヒドラーゼ、カタラーゼ、セロビオースオキシダーゼ、セルラーゼ、キモシン、エンド−１，３−β−グルカナーゼ、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンドペプチダーゼ、エステラーゼ、エキソペプチダーゼ、Ｇ４アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコリパーゼ、ヘミセルラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾホスホリパーゼ、マルトース産生アミラーゼ、マンナナーゼ、中性プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、プルラナーゼ、レンネット酵素、ラムノガラクツロナーゼ、スブチリシン、タンナーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、キサンタナーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、又はこれらの混合物である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
微生物がバチルス・プミルスＤＳＭ １４３９５である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
以下の方法工程：
（ａ）プロモーターとタンパク質をコードする核酸とを含む発現構築体を、微生物中に導入する工程；
（ｂ）この微生物中でタンパク質を発現させる工程
を含み、その際、微生物がバチルス・プミルス種に属しており、遺伝子ｓｐｏＩＶ（ｙｑｆＤ）もしくはその一部の欠損により微生物の胞子形成が抑制されている方法により得られる微生物。
【請求項８】
プロモーターが、以下：
（ｉ）配列番号１において示される核酸配列に対して、少なくとも９５％同一である核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２において示される核酸配列に対して、少なくとも９５％同一である核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号３において示される核酸配列に対して、少なくとも９５％同一である核酸配列；
（ｉｖ）配列番号４において示される核酸配列に対して、少なくとも９５％同一である核酸配列
から選択された核酸配列を含んでいる、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
タンパク質が微生物中に自然に存在するものではない、請求項７又は８に記載の微生物。
【請求項１０】
タンパク質が酵素である、請求項７から９までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１１】
タンパク質が、酸性セルラーゼ、α−アミラーゼ、α−アセトデカルボキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラバナーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−マンノシダーゼ、カラゲナーゼ、カルボヒドラーゼ、カタラーゼ、セロビオースオキシダーゼ、セルラーゼ、キモシン、エンド−１，３−β−グルカナーゼ、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンドペプチダーゼ、エステラーゼ、エキソペプチダーゼ、Ｇ４アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコリパーゼ、ヘミセルラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾホスホリパーゼ、マルトース産生アミラーゼ、マンナナーゼ、中性プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、プルラナーゼ、レンネット酵素、ラムノガラクツロナーゼ、スブチリシン、タンナーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、キサンタナーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、又はこれらの混合物である、請求項７から１０までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１２】
微生物がバチルス・プミルスＤＳＭ １４３９５である、請求項７から１１までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１３】
タンパク質を製造するための、請求項７から１２までのいずれか１項に記載の微生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野、特に微生物によるタンパク質合成の分野に関する。本発明は、特に遺伝子改変微生物によるタンパク質の製造法に関し、さらにこのような方法において使用される微生物を提案する。さらに本発明は、タンパク質製造へのこのような微生物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
有用物質の製造のために、微生物が使用されることがある。有用物質とは、例えば低分子量化合物、例えば栄養補助食品、又は製薬的に有効な化合物、又はタンパク質であり、これらに関しては、その多様性に基づいて大工業的な用途が存在する。第一のケースでは、有用物質の製造のために、当該微生物の代謝特性が利用され、かつ／又は変化され；第二のケースでは、好ましくは、興味の対象となるタンパク質の遺伝子を発現する微生物が用いられる。
【０００３】
大工業的なバイオテクノロジーによる産生のために、当該微生物は、微生物の代謝特性に相応して構成されている発酵槽中で培養される。培養の間、微生物は提供された基質を代謝し、所望の生成物を形成し、この生成物は、発酵の終了後に通常は産生生物から分離されて、発酵スラリー及び／又は発酵培地から清浄化及び／又は濃縮される。発酵によるタンパク質産生の際に、典型的には、基質として、炭素源（典型的にはグルコース）に加えて、タンパク質に富む複合的な原料が使用される。従って、タンパク質産生は基質タンパク質から目的タンパク質への生体内変化に相応する。これにより、基質タンパク質から個々のアミノ酸への完全な加水分解が促進され、その後、このアミノ酸は目的タンパク質の生合成に利用可能である。
【０００４】
従って、微生物の発酵に関しては豊富な先行技術が存在しており、これらは、例えば形成速度及び栄養利用に関する当該菌種の最適化から、発酵槽の技術的な構成を経て、当該微生物及び／又は発酵培地からの有用物質の取得にまで及んでいる。
【０００５】
微生物による発酵における細菌の使用は、基本的には望ましい。細菌は、世代時間が短く、かつ培養条件に関する要求がわずかであることを特徴としている。それにより、低コストの培養法ないし製造法の確立が可能となる。さらに、当業者は発酵技術における細菌について豊富な経験を有している。好ましくは、グラム陽性菌が使用される。なぜならば、グラム陽性菌は自身を包囲する培地に、製造すべきタンパク質（目的タンパク質）を分泌するためである。
【０００６】
一般に、微生物による発酵において可能な限り高い産生収率が望まれる。例えば、国際特許出願ＷＯ９１／０２７９２号には、バチルス・リチェニフォルミスからの遺伝子調節配列、特にバチルス・リチェニフォルミスプロモーターの制御下での最適化されたバチルス・リチェニフォルミス菌種におけるバチルス・レンタスからのアルカリプロテアーゼの発酵による改善された産生が開示されている。
【０００７】
バチルス・リチェニフォルミスに代わり同等に高いかもしくは改善された産生収率を達成し得る産生生物の利用可能性は、従来技術では満足のいくものではない。さらに、高い産生収率を可能にする微生物による発酵法に関しては、高い要求が課せられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、微生物による発酵において特にタンパク質の高い産生収率を達成することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の対象は、以下の方法工程：
（ａ）プロモーターとタンパク質をコードする核酸とを含む発現構築体を、微生物中に導入する工程；
（ｂ）この微生物中でタンパク質を発現させる工程
を含む、微生物によるタンパク質の製造法において、微生物がバチルス・プミルス種に属していることを特徴とする方法である。
【００１０】
本発明による方法は、任意にさらに、さらなる方法工程：
（ｃ）微生物を培養する工程
を含む。
【００１１】
従って、本発明による好ましい一実施態様において、本発明による方法は発酵法である。
【００１２】
意想外にも、このような方法においてバチルス・プミルス種の細菌を使用することにより高い産生収率が可能となるため、好ましいことが判明した。産生生物としてのバチルス・プミルスの使用により、好ましい産生収率、特に産生収率の向上を達成することができる。これに関連して、対照として、従来技術において確立された産生生物であり、微生物による数多くの発酵において工業的に利用されているバチルス・リチェニフォルミスが用いられる。
【００１３】
従って、好ましい一実施態様において、本発明による方法は、微生物におけるタンパク質の発現を向上させるための方法である。本発明による方法によって、本発明による方法との相違点が好ましくは野生型のバチルス・リチェニフォルミス種の細菌を使用する点のみである同様の方法と比較して、より多量のタンパク質が得られた場合に、タンパク質の発現が向上する。これに関連して、比較すべき二つの方法とも、微生物に対して可能な限り最適な同一の条件下で、同一の期間にわたって実施される。
【００１４】
発現構築体とは、微生物におけるタンパク質の発現を生じさせる核酸配列である。これは、遺伝情報、即ち、タンパク質をコードする核酸配列（遺伝子）を含む。核酸配列の発現は、翻訳による、遺伝子産生物、ないしこの配列によりコードされた遺伝子産生物、即ち、一つないし複数のポリペプチド（タンパク質）の生成である。ポリペプチド及びタンパク質という概念は、本願において同義で用いられている。従って、本発明の意味において、発現とは、遺伝情報からのリボ核酸（ＲＮＡ）及びタンパク質の生合成を意味する。一般に、発現には、転写、即ち、遺伝子のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）配列をもとにしたメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の合成、並びにこのｍＲＮＡから相応するポリペプチドへの翻訳が含まれ、このポリペプチドは、場合によりさらに翻訳後改変され得る。従って、タンパク質の発現とは、本発明によれば微生物中に存在する遺伝情報からの、タンパク質の生合成を表す。
【００１５】
発現構築体は、さらに、タンパク質ないし補助プロテアーゼをコードする核酸配列（いわゆる遺伝子調節配列）の発現に関する制御機能を有する、少なくとも１つの核酸配列、好ましくはＤＮＡを含む。ここで、遺伝子調節配列とは、微生物中に存在することによって、タンパク質をコードする核酸配列の転写頻度が好ましくは高まるような核酸配列である。好ましくは、これはプロモーター配列であり、それというのも、このような配列は核酸配列の発現にとって重要であるためである。しかしながら、本発明による発現構築体は、さらに他の遺伝子調節配列、例えば１つ以上のエンハンサー配列を含むことができる。従って、本発明の範囲内での発現構築体には、遺伝子とプロモーターとからの少なくとも１つの機能単位が含まれる。しかしながら、この機能単位は、必ずしもフィジカルな単位として存在していなくてもよい。
【００１６】
本発明による発現構築体にとって、少なくとも１つのプロモーターの存在は重要である。従って、プロモーターとは、遺伝子発現の調節を可能にするＤＮＡ配列と解釈される。当然のことながら、プロモーター配列は遺伝子の一成分であり、しばしばその５’末端上、従ってＲＮＡコード領域前に存在している。好ましくは、本発明による発現構築体におけるプロモーター配列は、タンパク質をコードする核酸配列の５’側に存在している。プロモーターの重要な特徴は、ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写の開始を仲介し、かつ転写因子と称される、ＤＮＡに結合する少なくとも１つのタンパク質ないしポリペプチドとの特異的な相互作用である。多くの場合、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始時には、多くの転写因子及び／又は他のタンパク質が関与する。従って、プロモーターとは、好ましくは、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列、即ち、遺伝子の転写の開始時に少なくとも１つの転写因子と少なくとも一時的に結合するようなＤＮＡ配列である。プロモーターの強さは、発現した遺伝子の転写頻度により、即ち、単位時間当たりに生成されたＲＮＡ分子、特にｍＲＮＡ分子の数により測定可能である。本発明による発現構築体のプロモーターは、微生物の固有のプロモーターであることができる。従って、このようなプロモーター配列は、当然のことながら微生物中に存在している。また、本発明による発現構築体のプロモーターは、組換えにより微生物中に導入されていてもよい。本発明による発現構築体を有し得る他の全ての遺伝子調節配列についても同様のことが言える。本発明による方法において用いられるような発現構築体におけるプロモーターによって、この発現構築体において、タンパク質（目的タンパク質）をコードする核酸配列の発現が生じる。
【００１７】
好ましい一実施態様において、本発明による方法は、プロモーターが、以下：
（ａ）配列番号１において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列；
（ｂ）配列番号２において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列；
（ｃ）配列番号３において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号４において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列
から選択されている核酸配列を含んでいることを特徴とする。
【００１８】
もう一つの実施態様において、プロモーターは上記の通りの核酸配列を有している。
【００１９】
このようなプロモーター配列が、本発明による方法において、特に高いタンパク質産生収率を達成し得ることが判明した。
【００２０】
好ましくは、プロモーターは、該プロモーターが、配列番号１において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列を含んでおり、かつ、該プロモーターによって、該プロモーターにより発現する遺伝子の転写頻度が、少なくとも配列番号１によるプロモーターの転写頻度に相応するようになることを特徴としている。
【００２１】
また、プロモーターは、該プロモーターが、配列番号２において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列を含んでおり、かつ、該プロモーターによって、該プロモーターにより発現する遺伝子の転写頻度が、少なくとも配列番号２によるプロモーターの転写頻度に相応するようになることを特徴としている。
【００２２】
もう一つの他の実施態様によれば、プロモーターは、該プロモーターが、配列番号３において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列を含んでおり、かつ、該プロモーターによって、該プロモーターにより発現する遺伝子の転写頻度が、少なくとも配列番号３によるプロモーターの転写頻度に相応するようになることを特徴としている。
【００２３】
もう一つの他の実施態様によれば、プロモーターは、該プロモーターが、配列番号４において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列を含んでおり、かつ、該プロモーターによって、該プロモーターにより発現する遺伝子の転写頻度が、少なくとも配列番号４によるプロモーターの転写頻度に相応するようになることを特徴としている。
【００２４】
もう一つの他の実施態様において、プロモーターは上記の通りの核酸配列を有している。
【００２５】
核酸配列又はアミノ酸配列の同一性の測定は、配列比較により行われる。そのような比較は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列中の類似の一連部分を互いに分類することにより行われる。この配列比較は、好ましくは従来技術において確立されている常用のBLASTアルゴリズム（例えばAltschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410, 及び、Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, p.3389-3402を参照のこと）に基づいて行われ、かつ原則的に、核酸配列又はアミノ酸配列中のヌクレオチド又はアミノ酸の類似の一連部分を互いに分類することより行われる。表による該当位置の分類をアライメントと称する。従来技術において利用可能なもう一つのアルゴリズムは、FASTAアルゴリズムである。配列比較（アライメント）、特に多重配列比較は、通常はコンピュータプログラムにより作成される。多くの場合、例えばClustal系（例えば、Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500を参照のこと）、T-Coffee（例えばNotredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217を参照のこと）、又は、これらのプログラムないしアルゴリズムに基づくプログラムが用いられている。本発明の範囲内では、配列比較及びアライメントを、好ましくはコンピュータプログラムVector NTI(R) Suite 10.3(Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, USA)で、所定の標準（デフォルト）パラメータを用いて作成する。
【００２６】
そのような比較により、互いに比較された配列の類似性に関する断定が可能となる。通常は、この類似性はパーセンテージでの同一性で示され、即ち、同一の、ないしアライメントにおいて互いに相応する位置での、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の割合で示される。ホモロジーのさらなる包括的概念では、アミノ酸配列において、保持されたアミノ酸交換、即ち、類似の特性を有するアミノ酸が考慮される。なぜならば、このようなアミノ酸は、タンパク質内部で多くの場合類似の活性ないし機能を発揮するためである。従って、比較された配列の類似性を、パーセントホモロジー又はパーセント類似度と表記することもできる。同一性及び／又はホモロジーのデータは、全てのポリペプチド又は遺伝子に関する場合もあるし、若干の範囲に関してのみの場合もある。
【００２７】
従って、種々の核酸配列ないしアミノ酸配列の相同的ないし同一の範囲は、配列における一致により定義される。これらはしばしば同一又は類似の機能を有する。これらは微小であり、わずかなヌクレオチドないしアミノ酸を含むに過ぎない。しばしば、そのような微小な範囲が、タンパク質の活性全体にとって重要な機能を果たす。従って、配列の一致が、若干の、場合により微小な範囲のみに関するものであることは、有意義であり得る。しかしながら、他に記載がない限り、本願における同一性ないしホモロジーのデータは、それぞれ示された核酸配列又はアミノ酸配列の全長に関するものである。タンパク質、特に酵素、以下で特にプロテアーゼの場合、他に記載がない限り、このデータはさらに、それぞれ成熟タンパク質に関するものである。従って、異なる内容の記載がない限り、タンパク質についての配列の考察は、属する遺伝子によりコードされるものが非成熟型であって、これが翻訳後にさらに成熟型へと処理される場合であっても、常に、処理の完了した成熟タンパク質に関するものである。
【００２８】
本発明による方法において微生物中に導入すべき発現構築体は、さらに、タンパク質をコードする。従ってこの発現構築体は、このタンパク質をコードする核酸を含んでいる。このために、基本的には、タンパク質へと翻訳され得る任意の核酸配列を用いることができる。これは、本発明による方法により製造すべきタンパク質（目的タンパク質）である。これは、好ましくは酵素であり、さらに好ましくは下記の酵素である。
【００２９】
本発明による核酸及び発現構築体は、核酸を変化させるための自体公知の方法により作製されてよい。そのようなものは、例えばFritsch、Sambrook及びManiatisによる関連のハンドブック "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989に記載されており、バイオテクノロジー分野の当業者に公知である。そのような方法の例は、化学合成又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、任意に他の分子生物学的及び／又は化学的ないし生化学的な標準的方法と組み合わせられる。
【００３０】
本発明による方法は、特に、タンパク質、特に酵素の組換えによる製造に適している。このために、発現構築体が、好ましくは形質転換により微生物中に導入される。これに関連して、それぞれの発現構築体又はその一部が、ベクター、特に発現ベクターを介して送り込まれる。しかしながら、発現構築体の一部のみ、好ましくは、少なくともタンパク質をコードする核酸のみを、完成発現構築体が微生物中で初めて生じるような様式で、微生物中に導入することも可能である。これは、例えばベクターにより行うことができ、このベクターによって、宿主細胞におけるタンパク質のための遺伝子を、例えば染色体、染色体ＤＮＡ又は他のベクターといったすでに存在している遺伝子要素中に導入することができ、それによって、例えば内在性プロモーターがタンパク質のための遺伝子の発現に利用される。従って、導入という概念には、発現構築体が完全に微生物中に導入され、好ましくは形質転換されるという可能性と、発現構築体の一部のみ、特に好ましくは、タンパク質をコードする核酸のみが微生物中に導入され、好ましくは形質転換され、完全な発現構築体が微生物中で初めて生じるという可能性が含まれる。本発明の範囲内では、発現構築体の少なくとも一部が常に微生物中に導入される。
【００３１】
ベクターは、バイオテクノロジー分野の当業者に公知である。これは、特に細菌において使用される場合には、特定のプラスミド、即ち環状の遺伝子要素である。本発明の範囲内では、発現構築体は、好ましくはベクターへクローニングされている。ベクターには、例えば、細菌のプラスミドから、ウイルスから、又はバクテリオファージから誘導されたもの、又は、極めて多様な由来の要素を有する主に合成のベクター又はプラスミドが含まれる。その都度存在するさらなる遺伝子要素と共に、ベクターは、数世代にわたって安定な単位として微生物中で定住し得る。その際、本発明の意味において、ベクターが染色体外で固有の単位として生存するか、又は染色体DNAに組み入れられるかは、さしたる問題ではない。多数の系のうちいずれが選択されるかは、個々のケースに依存する。重要となり得るものは、例えば、達成可能なコピー数、利用可能な選択形、そのうち特に抗生物質耐性、又はベクターの取り込みが可能な微生物の培養可能性である。
【００３２】
発現ベクターは、さらに、例えば細胞密度、又は所定の化合物の添加といった培養条件の変更によって調整可能である。そのような化合物の一例は、ガラクトース誘導体イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(IPTG)であり、これは細菌のラクトースオペロン(lac-Operon)のアクチベーターとして用いられる。
【００３３】
本発明のもう一つの実施態様において、本発明による方法は、タンパク質が微生物中に自然に存在するものではないことを特徴とする。
【００３４】
自然に存在するものではないとは、この文脈において、タンパク質が微生物の固有のタンパク質ないし酵素ではないことを意味する。従って、タンパク質は、微生物中で、その野生型の微生物の染色体ＤＮＡの一部である核酸配列により発現されることができない。従って、タンパク質及び／又はその都度これをコードする核酸配列は、微生物の野生型中には存在せず、かつ／又は、微生物の野生型からこれを単離することができない。好ましくは、微生物中に自然に存在するものではないタンパク質ないしこれをコードする核酸配列は、遺伝子工学的な方法で微生物中に意図的に導入されたものであり、そのため、微生物は、タンパク質ないしこれをコードする核酸配列が富化されている。しかしながら、タンパク質は、他の微生物中に完全に自然に存在するものであってもよい−この考えに関しては、本方法において使用される微生物が排除される。
【００３５】
本発明のもう一つの実施態様において、本方法は、タンパク質が酵素であり、特に、酸性セルラーゼ、α−アミラーゼ、α−アセトデカルボキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラバナーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−マンノシダーゼ、カラゲナーゼ、カルボヒドラーゼ、カタラーゼ、セロビオースオキシダーゼ、セルラーゼ、キモシン、エンド−１，３−β−グルカナーゼ、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンドペプチダーゼ、エステラーゼ、エキソペプチダーゼ、Ｇ４アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコリパーゼ、ヘミセルラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾホスホリパーゼ、マルトース産生アミラーゼ、マンナナーゼ、中性プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクトリアーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンステラーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、プルラナーゼ、レンネット酵素、ラムノガラクツロナーゼ、スブチリシン、タンナーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、キサンタナーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、又はこれからの混合物であることを特徴とする。極めて特に好ましくは、タンパク質はプロテアーゼである。本発明による方法の特に好ましい実施態様において、産生すべきプロテアーゼ（＝目的プロテアーゼ）は、同時に、微生物のためのタンパク質基質の加水分解にも関与しており、好ましくは、基質タンパク質のさらに改善された分解を引き起こし得る。従ってその場合には、微生物に、改善された培養条件がもたらされる。
【００３６】
例えば、本発明による方法により、以下に挙げた酵素を好ましく製造することができる。
【００３７】
プロテアーゼのうち、スブチリシンが好ましい。これについての例は、スブチリシンBPN'及びスブチリシン・カールスバーグ、プロテアーゼPB92、スブチリシン147及び309、バチルス・レンタスからのアルカリプロテアーゼ、スブチリシンDY、及び、スブチラーゼであるがしかしより狭義ではもはやスブチリシンに分類できない酵素テルミターゼ、プロテイナーゼＫ及びプロテアーゼTW3及びTW7である。スブチリシン・カールスバーグは、発展形で、デンマーク、Bagsvaerd在のNovozymes A/S社より商品名Alcalase(R)で入手可能である。スブチリシン147及び309は、Novozymes社より商品名Esperase(R)ないしSavinase(R)で販売されている。バチルス・レンタスDSM 5483からのプロテアーゼから、BLAP(R)の商品名で販売されているプロテアーゼ変異体が誘導される。好ましい他のプロテアーゼは、さらに、例えばPURの商品名で販売されている酵素である。さらに、他のプロテアーゼは、Novozymes社よりDurazym(R)、Relase(R)、Everlase(R)、Nafizym(R)、Natalase(R)、Kannase(R)及びOvozyme(R)の商品名で、Genencor/Danisco社よりPurafect(R)、Purafect(R) OxP、Purafect(R)Prime、Excellase(R)及びProperase(R)の商品名で、インド、Thane在のAdvanced Biochemicals Ltd.社よりProtosol(R)の商品名で、中国在のWuxi Snyder Bioproducts Ltd.社よりWuxi(R)の商品名で、日本、名古屋在のAmano Pharmaceuticals Ltd.社よりProleather(R)及びProtease P(R)の商品名で、及び、日本、東京在のKao Corp.社よりProteinase K-16の商品名で入手される酵素である。さらに、国際特許出願ＷＯ２００８／０８６９１６号及びＷＯ２００７／１３１６５６号に開示されている、バチルス・ギブソニ及びバチルス・プミルスからのプロテアーゼも好ましい。
【００３８】
α−アミラーゼの例は、バチルス・リチェニフォルミスから、バチルス・アミロリクエファシエンスから、又はバチルス・ステアロテルモフィルスからのα−アミラーゼであり、さらに、その、特に洗浄剤又は清浄化剤において使用するために改善された発展形である。バチルス・リチェニフォルミスからの酵素は、Novozymes社よりTermamyl(R)の商品名で、さらにDanisco/Genencor社よりPurastar(R)STの商品名で入手可能である。このα−アミラーゼの発展製品は、Novozymes社よりDuramyl(R)及びTermamyl(R)ultraの商品名で、Danisco/Genencor社よりPurastar(R)OxAmの商品名で、そして、日本、東京在のDaiwa Seiko Inc.社よりKeistase(R)として入手可能である。バチルス・アミロリクエファシエンスからのα−アミラーゼは、Novozymes社よりBAN(R)の商品名で販売されており、バチルス・ステアロテルモフィルスからのα−アミラーゼの誘導された変異体は、同様にNovozymes社よりBSG(R)及びNovamyl(R)の商品名で販売されている。さらに、バチルス種A7-7（DSM 12368）からのα−アミラーゼ及びバチルス・アガラドヘレンス（DSM 9948）からのシクロデキストリン−グルカノトランスフェラーゼ（CGTアーゼ）が挙げられる。同様に、全ての前述の分子の融合生成物が使用可能である。さらに、Novozymes社よりFungamyl(R)の商品名で入手可能な、アスペルギルス・ニゲル及びＡ．オリゼーからのα−アミラーゼの発展形が適している。さらなる好ましい市販製品は、例えば、Danisco/Genencor社のアミラーゼPowerase(R)、並びにアミラーゼAmylase-LT(R)、Stainzyme(R)及びStainzyme plus(R)（Novozymes社）である。点突然変異によっても得られるこれらの酵素の変異体もまた本発明により製造されることができる。さらなる好ましいアミラーゼは、国際公開公報ＷＯ００／６００６０号、ＷＯ０３／００２７１１号、ＷＯ０３／０５４１７７号及びＷＯ０７／０７９９３８号に開示されており、従ってその開示内容を引用により本願明細書に援用する。本発明により製造可能なアミラーゼは、さらに好ましくはα−アミラーゼである。
【００３９】
リパーゼ又はクチナーゼについての例は、もともとフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）（Thermomyces lanuginosus）から得られるか、あるいはさらに発展したリパーゼ、特にアミノ酸交換体D96Lを備えるものである。それらは、例えば、Novozymes社より商品名Lipolase(R)、Lipolase(R)Ultra、LipoPrime(R)、Lipozyme(R)及びLipex(R)の商品名で販売されている。さらに、例えば、もとはフザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）及びフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）から単離されたクチナーゼが製造可能である。Danisco/Genencor社より、例えばその出発酵素がもともとシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）及びフザリウム・ソラニ（Fusarium solanii）から単離されたものであるリパーゼ又はクチナーゼが製造可能である。さらなる重要な市販製品として、当初Gist-Brocades社（現在はDanisco/Genencor社）から販売されていた調製物M1 Lipase(R)及びLipomax(R)、並びに、日本在のMeito Sangyo KK社よりLipase MY-30(R)、Lipase OF(R)及びLipase PL(R)の商品名で販売されている酵素、さらに、Danisco/Genencor社の製品Lumafast(R)が挙げられる。
【００４０】
セルラーゼ（エンドグルカナーゼ、EG）についての例には、真菌のエンドグルカナーゼ（EG）リッチなセルラーゼ調製物又はその発展形の系列が含まれ、これはNovozymes社よりCelluzyme(R)の商品名で販売されている。同様に、Novozymes社より入手可能な製品Endolase(R)及びCarezyme(R)は、フミコラ・インソレンスDSM 1800からの50 kD-EG又は43 kD-EGをベースとしている。これらの企業のさらなる製造可能な市販製品は、Cellusoft(R)、Renozyme(R)及びCelluclean(R)である。さらに製造可能であるのは、例えばフィンランド在のAB Enzymes社よりEcostone(R)及びBiotouch(R)の商品名で入手可能なセルラーゼであり、この少なくとも一部はメラノカルプス（Melanocarpus）からの20 kD-EGをベースとしている。AB Enzymes社のさらなるセルラーゼは、Econase(R)及びEcopulp(R)である。適したさらなるセルラーゼは、バチルス種CBS 670.93及びCBS 669.93からのものであり、ここでバチルス種CBS 670.93は、Danisco/Genencor社よりPuradax(R)の商品名で入手可能である。Danisco/Genencor社のさらなる製造可能な市販製品は、"Genencor detergent cellulase L" 及びIndiAge(R)Neutraである。
【００４１】
点突然変異によって得られるこれらの酵素の変異体もまた、本発明により製造可能である。特に好ましいセルラーゼは、国際公開公報ＷＯ９８／１２３０７号に開示されているチェラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）セルラーゼ誘導体、国際公開公報ＷＯ９７／１４８０４号に開示されている、メラノカルプス、特にメラノカルプス・アルボミセス（Melanocarpus albomyces）からのセルラーゼ、欧州特許出願ＥＰ１３０５４３２号に開示されている、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）からのEGIII型のセルラーゼ、又はそれから得られる誘導体、特に欧州特許出願ＥＰ１２４０５２５号及びＥＰ１３０５４３２に開示されているもの、並びに、国際公開公報ＷＯ１９９２００６１６５号、ＷＯ９６／２９３９７号及びＷＯ０２／０９９０９１号に開示されているセルラーゼである。従って、それぞれの開示内容を引用により本願明細書に援用する。
【００４２】
さらに、ヘミセルラーゼの概念にまとめられるさらなる酵素を製造することができる。これには、例えば、マンナナーゼ、キサンタンリアーゼ、キサンタナーゼ、ペクチンリアーゼ（＝ペクチナーゼ）、ペクチンエステラーゼ、ペクテートリアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ及びβ−グルカナーゼが含まれる。これに関連して適した酵素は、例えばNovozymes社よりGamanase(R)、Pektinex AR(R)及びPectaway(R)の商品名で、AB Enzymes社よりRohapec(R) B1 Lの商品名で、さらに米国、San Diego CA在のDiversa Corp.社よりPyrolase(R)の商品名で入手可能である。バチルス・スブチルスから取得されたβ−グルカナーゼは、Novozymes社よりCereflo(R)の商品名で入手可能である。本発明によれば特に好ましいヘミセルラーゼはマンナナーゼであり、これは例えばNovozymes社よりMannaway(R)の商品名で、又はGenencor社よりPurabrite(R)の商品名で販売されている。
【００４３】
さらに、オキシドレダクターゼ、例えばオキシダーゼ、オキシゲナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばハロペルオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼ、ブロモペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、グルコースペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ジオキシゲナーゼ、又はラッカーゼ（フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ）も製造可能である。好適な市販製品として、Novozymes社のDenilite(R)1及び2が挙げられる。さらなる酵素は、国際特許出願ＷＯ９８／４５３９８号、ＷＯ２００５／０５６７８２号、ＷＯ２００４／０５８９６１号、並びにＷＯ２００５／１２４０１２号に開示されている。
【００４４】
本発明のさらなる一実施態様において、本方法は、微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であることを特徴とする。この菌種は、２００１年３月１日に、DSMZ（DSMZ：ドイツ微生物細胞培養コレクション、Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, ドイツ在）に寄託され、DSMZによりバチルス・プミルス菌種（DSM ID 01-197）として同定されたものである。本特許出願の実施例において実証されている通り、この菌種により、微生物による発酵において極めて良好な産生収率が達成される。
【００４５】
本発明のもう一つの実施態様において、本発明による方法において使用可能な菌種は遺伝子改変されている。遺伝子改変により、産生収率が好ましくはさらに向上するか、又は産生物の特性が好ましく変化する。ここで、産生物とは、発酵培地中に存在する発現したタンパク質と解釈されるべきである。例えば、その臭気が少なくなり、その色調が弱くなり、かつ／又は、生成物が澄明になり（即ち、混濁がわずかになり）、又はその密度が低くなる。これに関連して、遺伝子改変とは、方法工程（ａ）による発現構築体の導入を指すのではない。そうではなくて、本発明による方法において使用可能な微生物種であるバチルス・プミルスは、発現構築体が方法工程（ａ）によりこの微生物中に導入される前にすでに遺伝子改変されている。好ましくは、遺伝子改変体の存在が、野生型バチルス・プミルス、特にバチルス・プミルスDSM 14395と比較して調べられる。これに関連して、遺伝子改変として、置換、挿入及び／又は欠損が該当する。好ましくは、遺伝子改変によって、微生物中の遺伝子の機能の変化、例えば機能の失活が生じる。遺伝子の機能の変化、例えば機能の失活により、タンパク質の製造が向上及び／又は改善され、ひいては産生収率が改善され、かつ／又は、１つ以上の改善された特性を有する産生物が得られる。機能の失活とは、遺伝子によりコードされた遺伝子生成物がもはや形成されないか、又は生物学的に失活した形で形成されるため、その機能が微生物中でもはや発揮され得ないことと解釈されるべきである。これに関連して、遺伝子の機能の失活は、特に、遺伝子が代替遺伝子と完全又は部分的に置き換えられることにより生じ得る。この代替遺伝子は、もとから存在している遺伝子の代わりに発現され得る。従って、もとから存在している遺伝子は機能が失活され、その代わりに代替遺伝子が発現され、これにより機能の変化が生じる。この代替遺伝子はもとの遺伝子と類似している（もとの遺伝子に対して同一性が５０％を上回る）遺伝子であってもよいし、もとの遺伝子と類似していない（もとの遺伝子に対して同一性が５０％以下である）遺伝子であってもよい。例えば、代替遺伝子は、挿入によって、もとの遺伝子のコード配列へと導入される。これにより、もとの遺伝子は機能失活し、その代わりに代替遺伝子が発現する。遺伝子改変は、遺伝子生成物をコードする配列においてのみならず、遺伝子に属する遺伝子調節配列においても存在してよい。
【００４６】
本発明により使用可能な微生物は、例えば発酵の間の劣悪な臭気の形成を阻止するために、例えばその培養条件の要求に関して、その移動特性に関して、その胞子形成性に関して、所定の代謝経路に関して、変えられていてよく、また、他の、もしくは付加的な選択マーカーを有していてもよい。
【００４７】
これに関連して、本発明による方法において使用可能なバチルス・プミルス種中の全ての遺伝子は遺伝子改変が可能であり、これに対して、刊行物Gioia et al., PLoS ONE, 9: e928 (2007)において開示されているバチルス・プミルスゲノム中に相応部が存在している。この刊行物には、初めて完全に配列決定されたバチルス・プミルスゲノムが記載されている。その開示内容を引用により本願明細書に援用する。
【００４８】
さらに、発明による方法において使用可能なバチルス・プミルス菌種中の全ての遺伝子は遺伝子改変が可能であり、これに対して、以下に示す微生物の１つ以上のゲノム中に相応部が存在している：
【化１】
0006335793.tif 000002
【００４９】
【化２】
0006335793.tif 000003
【００５０】
上記の刊行物に加えて、遺伝子改変可能な遺伝子、特にその配列は、公的にアクセス可能なデータバンクにおいても入手可能であり、例えばKEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes：京都遺伝子ゲノム百科事典）データバンクにおいて、http://www.genome.jp/keggで、又は、NCBI(National Center for Biotechnology Information：国立生物工学情報センター、アメリカ国立医学図書館、8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894, USA)のデータバンクにおいて、http://www.ncbi.nlm.nih.govで入手可能である。KEGGデータバンクは、１９９５年以来、「京都大学バイオインフォマティクスセンター」及び「東京大学ヒトゲノムセンター」の金久氏らの研究室により開発されているものである。個々の遺伝子に加えて、これらのデータバンクは、種々の微生物の、ゲノムの全体又はゲノムの大部分の情報及び配列をも有している。
【００５１】
本特許出願の意味での遺伝子の相応は、一方では、本発明により使用可能なバチルス・プミルス菌種の遺伝子と、Gioiaらにより開示されたバチルス・プミルス菌種の遺伝子及び／又は前記の微生物の遺伝子との間で、配列相同性が可能な限り高いことを特徴とする。他方で、遺伝子の相応は、機能が同様であること、即ち、本発明により使用可能なバチルス・プミルス菌種の、及びGioiaらにより開示されたバチルス・プミルス菌種の、及び／又は前記の微生物の、互いに相応する遺伝子が、それぞれの微生物において同様の機能を有していることを特徴とする。
【００５２】
この遺伝子情報及び／又はゲノム情報により、本発明による方法において使用可能なバチルス・プミルス菌種中のそれぞれの遺伝子を、配列比較をもとに同定することが可能となる。Gioiaらにより開示されたバチルス・プミルス菌種からの、及び／又は前記の微生物のゲノムからの、遺伝子情報、特に配列情報に基づき、当業者は、配列比較及び／又は分子生物学上の標準的な研究方法により、遺伝子改変し、次いで本発明による方法において使用すべきであるバチルス・プミルス菌種のゲノムにおいて、配列一致度の極めて高い核酸配列を求めることができる。機能が同様であること、即ち機能が相応していることの確認は、それぞれの微生物を用いた比較試験により可能であり、その際、その都度、配列比較に基づいて比較された遺伝子が同じ方法で変化（好ましくは機能失活）され、双方の微生物において同様の変化、特に形質変化が生じるかどうかが確認される。例えば、Gioiaらにより開示されたバチルス・プミルス菌種において、かつ／又は、前記の微生物において、問題となる遺伝子の変化、特に機能の失活に伴って、代謝活性、移動性又は胞子形成特性の変化が生じる場合には、本発明において改変及び使用が可能なバチルス・プミルス菌種において相応する変化が認められ、ここで、正しい分類を確認することができる。相応する方法は、遺伝子学、特に微生物の遺伝子学の分野の標準的なものであり、この分野の当業者には広く知られている。
【００５３】
特に好ましい実施態様において、微生物は胞子形成が抑制されている。これは、好ましくは、その遺伝子spoIV(yqfD)ないしその遺伝子の相応部が、特に遺伝子spoIV(yqfD)ないしその遺伝子の相応部又はその一部の欠損により機能失活されることにより達成される。このような胞子形成が抑制されたバチルス・プミルス菌種により、本発明による方法において特に高い産生収率が達成されることが判明した。
【００５４】
本発明による方法において使用される微生物は、通常の様式で、例えば非連続的又は連続的な系において培養及び発酵されてよい。第一のケースでは、適した培地に微生物が接種され、そしてタンパク質は実験により求められる期間の後に培地から回収される。連続的な発酵は、比較的長期間にわたり細胞は部分的に死ぬが、しかし成長もし、そして同時に、形成されたタンパク質を培地から取り出することのできる流動平衡（Fliessgleichgewicht）の達成を特徴とする。
【００５５】
本発明による方法は、好ましくは発酵法である。発酵法は、従来技術から自体公知であり、かつ、本来の大工業的な生産工程であり、通常は、製造されたタンパク質の好適な精製法がその後に続く。本発明によるタンパク質の製造法の基礎をなす全ての発酵方法は、本発明による方法の実施態様である。
【００５６】
発酵が供給ストラテジーによって実施されることを特徴とする発酵方法が、特に考慮される。この場合、進行する培養によって消費される培地成分が供給される。それによって、細胞密度においても細胞材料又は乾燥材料においても、少なからぬ増加が達成できる。さらに、発酵は、不所望な代謝生成物がフィルター除去されるか、又は、バッファーもしくはその都度適当な対イオンの添加によって中和されるように構成されることもできる。
【００５７】
製造されたタンパク質を、発酵培地から回収することができる。そのような発酵方法は、微生物からのタンパク質の単離、即ち、細胞材料（乾燥材料）からの生成物後処理よりも好ましい。このことは、例えば、適した分泌マーカー又は−機構及び／又は輸送系の提供によって達成されることができ、それによって微生物はタンパク質を発酵培地へと分泌する。分泌がない場合には、代わりに、宿主細胞からのタンパク質の単離、即ち、細胞材料からのその精製は、例えば硫酸アンモニウム又はエタノールを用いた沈殿、又はクロマトグラフィーによる精製によって行われることができる。
【００５８】
本発明のもう一つの対象は、以下の方法工程：
（ａ）プロモーターとタンパク質をコードする核酸とを含む発現構築体を、微生物中に導入する工程；
（ｂ）この微生物中でタンパク質を発現させる工程
を含み、その際、微生物がバチルス・プミルス種に属している方法により得られる微生物である。
【００５９】
従ってこれは、本発明による方法の対象であり得る全ての微生物である。本発明による方法のために記載されている全ての事柄、対象及び実施態様は、この本発明による対象にも適用可能である。従って、相応する箇所の開示を、この開示が本発明による微生物にも該当するという指摘をもってここに援用する。
【００６０】
本発明による微生物の特に好ましい実施態様は、
（ａ）プロモーターが、以下：
（ｉ）配列番号１において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号３において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列；
（ｉｖ）配列番号４において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列
から選択された核酸配列を含んでおり、
かつ／又は、
（ｂ）タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ／又は、
（ｃ）タンパク質が酵素であり、特に、酸性セルラーゼ、α−アミラーゼ、α−アセトデカルボキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラバナーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−マンノシダーゼ、カラゲナーゼ、カルボヒドラーゼ、カタラーゼ、セロビオースオキシダーゼ、セルラーゼ、キモシン、エンド−１，３−β−グルカナーゼ、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンドペプチダーゼ、エステラーゼ、エキソペプチダーゼ、Ｇ４アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコリパーゼ、ヘミセルラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾホスホリパーゼ、マルトース産生アミラーゼ、マンナナーゼ、中性プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、プルラナーゼ、レンネット酵素、ラムノガラクツロナーゼ、スブチリシン、タンナーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、キサンタナーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、好ましくはプロテアーゼ、又はα−アミラーゼ、又はこれからの混合物であり、
かつ／又は、
（ｄ）微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ／又は、
（ｅ）好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ／又は、
（ｆ）微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
【００６１】
本発明による微生物の極めて特に好ましい一実施態様は、
（ａ）プロモーターが、以下：
（ｉ）配列番号１において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列
から選択された核酸配列を含んでおり、
かつ／又は、
（ｂ）タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ／又は、
（ｃ）タンパク質がプロテアーゼであり、好ましくはスブチリシン、又はα−アミラーゼであり、
かつ／又は、
（ｄ）微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ／又は、
（ｅ）好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ／又は、
（ｆ）微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
【００６２】
本発明による微生物のさらに極めて特に好ましい一実施態様は、
（ａ）プロモーターが、以下：
（ｉ）配列番号１において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号３において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列；
（ｉｖ）配列番号４において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列
から選択された核酸配列を含んでおり、
かつ／又は、
（ｂ）タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ／又は、
（ｃ）タンパク質がα−アミラーゼであり、
かつ／又は、
（ｄ）微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ／又は、
（ｅ）好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ／又は、
（ｆ）微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
【００６３】
本発明による微生物の極めて特に好ましい実施態様は、
（ａ）プロモーターが、配列番号３において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列を含んでおり、
かつ／又は、
（ｂ）タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ／又は、
（ｃ）タンパク質がα−アミラーゼであり、
かつ／又は、
（ｄ）微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ／又は、
（ｅ）好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ／又は、
（ｆ）微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
【００６４】
本発明による微生物のもう一つの極めて特に好ましい実施態様は、
（ａ）プロモーターが、配列番号１において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列を含んでおり、
かつ／又は、
（ｂ）タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ／又は、
（ｃ）タンパク質がα−アミラーゼであり、
かつ／又は、
（ｄ）微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ／又は、
（ｅ）好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ／又は、
（ｆ）微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
【００６５】
本発明による微生物のもう一つの極めて特に好ましい実施態様は、
（ａ）プロモーターが、配列番号２において示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、極めて特に好ましくは１００％同一である核酸配列を含んでおり、
かつ／又は、
（ｂ）タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ／又は、
（ｃ）タンパク質がα−アミラーゼであり、
かつ／又は、
（ｄ）微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ／又は、
（ｅ）好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ／又は、
（ｆ）微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
【００６６】
本発明による微生物は、好ましくは本発明による方法において、タンパク質の製造のために使用される。従って、首尾一貫して、本発明のもう一つの対象は、タンパク質、特に酵素を製造するための、本発明による微生物の使用である。
【００６７】
本発明による方法ないし微生物のために記載されている全ての事柄、対象及び実施態様は、この本発明による対象にも適用可能である。従って、相応する箇所の開示を、この開示が本発明による使用にも該当するという指摘をもってここに援用する。
【実施例】
【００６８】
全ての分子生物学的な作業工程は、例えばFritsch、Sambrook及びManiatisによるハンドブック "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989又は同等の関連する文献に記載されているような標準的な方法に従う。酵素、キット及び機器を、それぞれのメーカーの指示に従って使用した。
【００６９】
実施例１：
バチルス・プミルスを用いた発酵によるプロテアーゼ（目的タンパク質）の産生と、バチルス・リチェニフォルミスを用いた発酵によるプロテアーゼ（目的タンパク質）の産生との比較
それぞれ、プロテアーゼ（目的タンパク質）をコードする遺伝子と機能性プロモーターとを含む、以下に示す３つの異なる発現プラスミドを、バチルス・リチェニフォルミス菌種及びバチルス・プミルス菌種に形質転換させた。形質転換されたこれらの菌種を発酵によるプロテアーゼ産生に使用した。使用したバチルス・リチェニフォルミス菌種は、国際特許出願ＷＯ９１／０２７９２号に開示されている。バチルス・プミルス菌種として、遺伝子spoIV(yqfD)を欠損により機能失活させたバチルス・プミルスDSM 14395を使用した。プロモーターとして、配列番号１及び配列番号２による核酸配列を利用した。このプロモーターは、それぞれの発現プラスミドにおいて、それぞれ、プロテアーゼをコードする核酸配列の５’側に配置されている。以下のプラスミドを使用した（第１表）：
【表１】
0006335793.tif 000004
【００７０】
それぞれの微生物への発現プラスミドの形質転換の後に、生じた産生菌種を、標準的な発酵法で、２Ｌの研究室用発酵槽（４８時間培養）に入れ、得られたプロテアーゼ活性を、基質suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-ニトロアニリド（AAPF）からの発色団パラニトロアニリン（pNA）の遊離により測定する。プロテアーゼは基質を分解し、pNAを遊離する。pNAの遊離により４１０ｍｍでの吸光度の増加が生じ、その経時変化が酵素活性に関する尺度である（Del Mar et al., 1979を参照のこと）。測定を温度２５℃、ｐＨ８．６、波長４１０ｎｍで行う。測定時間は５分間であり、測定間隔は２０ｓ〜６０ｓである。
【００７１】
バチルス・リチェニフォルミスと比較して、産生生物としてバチルス・プミルスを用いた場合の収率は明らかに増加している（第２表を参照のこと）。バチルス・リチェニフォルミスに関してその都度得られたプロテアーゼ活性を１００％と定義し、これに対するバチルス・プミルスに関して測定された相対的なプロテアーゼ活性を示す。
【００７２】
【表２】
0006335793.tif 000005
【００７３】
実施例２：
この実施例において、種々のプロモーターを含む発現構築体を用いた、バチルス・プミルスにおける発酵によるプロテアーゼ（目的タンパク質）の産生を試験した。実施例１において記載した通り、配列番号１及び配列番号２によるプロモーターを有する発現プラスミド１及び３を使用した。他の発現プラスミド（対照）として、バチルス・プミルスからのプロモーターの代わりに、国際特許出願ＷＯ９１／０２７９２号に開示されている(「ATCC 53926アルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター」；ＷＯ９１／０２７９２号の実施例５、６、及び図２７を参照のこと)バチルス・リチェニフォルミスプロモーターを使用するという点で発現プラスミド１及び３と相違する発現プラスミドを使用した。バチルス・プミルス菌種として、実施例１の通り、遺伝子spoIV(yqfD)を欠損により機能失活させたバチルス・プミルスDSM 14395を使用した。
【００７４】
この菌種を、上記の発現プラスミドで形質転換させた。生じた産生菌種を、標準的な発酵法で、２Ｌの研究室用発酵槽に入れ、得られたプロテアーゼ活性を、実施例１に記載の通り、基質suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-ニトロアニリド（AAPF）からの発色団パラニトロアニリン（pNA）の遊離により測定する。対照菌種と比較して、プラスミド１及び３を用いた場合の収率は明らかに増加している（第３表を参照のこと）。対照菌種に関するプロテアーゼ活性を１００％と定義し、これに対するプラスミド１及び３を含む菌種に関して測定された相対的なプロテアーゼ活性を示す。
【００７５】
【表３】
0006335793.tif 000006
【００７６】
実施例３：
それぞれ、アミラーゼ（目的タンパク質）をコードする遺伝子と機能性プロモーターとを含む、以下に示す２つの異なる発現プラスミドを、バチルス・リチェニフォルミス菌種及びバチルス・プミルス菌種に形質転換させた。形質転換されたこれらの菌種を発酵によるアミラーゼ産生に使用した。使用したバチルス・リチェニフォルミス菌種は、国際特許出願ＷＯ９１／０２７９２号に開示されている。バチルス・プミルス菌種として、遺伝子spoIV(yqfD)を欠損により機能失活させたバチルス・プミルスDSM 14395を使用した。プロモーターとして、配列番号３及び配列番号４による核酸配列を利用した（Palva,l., Pettersson,R.F., Kalkkinen,N., Lehtovaara,P., Sarvas,M., Soderlund,H., Takkinen,K. and Kaariainen,L. "Nucleotide sequence of the promoter and NH2-terminal Signal peptide region of the alpha-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens"; Gene 15(1), 43-51(1981)に開示されているような、バチルス・アミロリクエファシエンスからのアミラーゼプロモーター）。このプロモーターは、それぞれの発現プラスミドにおいて、それぞれアミラーゼをコードする核酸配列の５’側に配置されている。以下のプラスミドを使用した（第４表）：
【表４】
0006335793.tif 000007
【００７７】
それぞれの微生物への発現プラスミドの形質転換の後に、生じた産生菌種を、標準的な発酵法で、２Ｌの研究室用発酵槽（４８時間培養）に入れ、得られたアミラーゼ活性を測定した。ＴＡＵでのアミラーゼ活性の測定のために、改変ニトロフェニルマルトヘプタオシドを使用した。この改変ニトロフェニルマルトヘプタオシドの末端グルコース単位はベンジリデン基によりブロックされており、これはアミラーゼにより分解されて遊離ｐ−ニトロフェニルオリゴ糖となり、これはその側で補助酵素グルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼにより反応して、グルコース及びｐ−ニトロフェノールとなる。従って、遊離ｐ−ニトロフェノールの量がアミラーゼ活性に比例する。測定を、例えば米国、イリノイ、Abott Park在のAbbott社製の試験キットQuick-Start(R)を用いて行う。試験バッチにおける吸光値の増加（４０５ｎｍ）を、３７℃で３分間、ブランク値に対して光度計により検出する。キャリブレーションを、公知の活性の酵素標準物質（例えば、２９００ＴＡＵ／ｇを有するGenencor社製のMaxamyl(R)/Purastar(R) 2900）により行う。標準物質の酵素濃度に対する１分間あたりの吸光値偏差ｄＥ（４０５ｎｍ）のプロットにより評価を行う。
【００７８】
第５表に、バチルス・リチェニフォルミスに関してプラスミド４（配列番号３によるプロモーター）を用いて得られたアミラーゼ活性を１００％と定義し、これに対するバチルス・プミルスに関して測定された相対的なアミラーゼ活性を示す。
【００７９】
【表５】
0006335793.tif 000008
【００８０】
意想外にも、（当然のことながら固有のアミラーゼを産生しない）バチルス・プミルスにおける配列番号３によるプロモーターが、異種発現アミラーゼの極めて高い収率を達成するのに特に適していることが判明した。
【００８１】
実施例４：
この実施例において、種々のプロモーターを含む発現構築体を用いた、バチルス・プミルスにおける発酵によるアミラーゼ（目的タンパク質）の産生を試験した。実施例３において記載した通り、配列番号３、１及び２によるプロモーターを有する発現プラスミド４、６及び７を使用した。バチルス・プミルス菌種として、実施例１の通り、遺伝子spoIV(yqfD)を欠損により機能失活させたバチルス・プミルスDSM 14395を使用した。この菌種を上記の発現プラスミドを用いて形質転換させた。生じた産生菌種を、標準的な発酵法で、２Ｌの研究室用発酵槽に入れ、得られたアミラーゼ活性を実施例３に記載した通りに測定した。
【００８２】
第６表に、プラスミド４を含むＢ・プミルス菌種に関するアミラーゼ活性を１００％と定義し、これに対するプラスミド４、６及び７を含む上記のＢ・プミルス菌種に関して測定された相対的なアミラーゼ活性を示す。すでにＢ・プミルスにおける異種アミラーゼ発現に特に適ししているプラスミド４（第５表を参照のこと）と比較して、プラスミド７を用いた場合には同様に高い収率を達成することができ、プラスミド６を用いた場合にはさらに改善されたアミラーゼ収率を達成することができる（第６表を参照のこと）。
【００８３】
【表６】
0006335793.tif 000009
【配列表】
0006335793000001.app