(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド、TRISおよびリン酸塩を含む液体医薬組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含み、前記組成物が、
前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜3.0mg/mlの濃度で含有すること、
100mMのTRISおよび50mMのリン酸塩を含有すること、
そのpHが約6.0であること、ならびに
0.04％のポリソルベート80を含有すること
を特徴とする液体医薬組成物。
【請求項２】
リオプロテクタント（lyoprotectant）をさらに含有することを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
2％〜10％のリオプロテクタントを含有することを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記リオプロテクタントがトレハロースまたはトレハロース二水和物であることを特徴とする、請求項2または3に記載の組成物。
【請求項５】
約4％のトレハロース二水和物をさらに含有することを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドを2mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
請求項1から6のいずれか一項に記載の液体医薬組成物を凍結乾燥する工程を含む固体混合物の製造方法。
【請求項８】
請求項7に記載の方法により製造された凍結乾燥された固体混合物を好適な液体媒体に溶解することによって再構成されることを特徴とする液体医薬組成物。
【請求項９】
前記組成物の皮下投与の後における前記ポリペプチドの生物学的利用能が60％超であることを特徴とする、請求項1から６および8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
治療方法において使用するための請求項1から６、８および9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物の非経口投与を含む治療方法において使用するための請求項1から６、および８から10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前立腺の過剰増殖性疾患を治療的に処置するための方法において使用するための請求項1から６、および８から11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前立腺の過剰増殖性疾患を治療的に処置するための方法において使用するための請求項1から６、および８から12のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法が前記組成物の皮下投与を含むものである、組成物。
【請求項１４】
請求項1から６、および８から13のいずれか一項に記載の組成物を含有するシリンジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも2つの抗原結合ドメインを有するポリペプチドを含有し、かつ、皮下投与のためにとりわけ適する安定な医薬組成物に関する。本発明は、望まれていないポリペプチド凝集物（二量体および／または多量体）の形成を最小限に抑える液体組成物を提供する。本発明はさらに、抗原結合ドメインを有するポリペプチドの凝集を液体組成物において最小限に抑えるための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
治療効力を一定に保つために、抗体を溶液中で安定化しなければならないこと、すなわち、二量体および多量体（これらは高分子量凝集物またはHMW凝集物として知られている）の形成を防止しなければならないことが、先行技術分野において知られている。国際公開第2011061712号は、25mg/ml〜250mg/mlの抗体に加えて、10mM〜30mMの緩衝液（好ましくは、酢酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジンまたはそれらの組合せ）、1％〜15％のポリオール、および、同様に、0.001％〜0.05％の湿潤化剤を含有する安定化された抗体配合物を開示する。組成物のpHが5〜7.5の間である。
【０００３】
国際公開第2010148337(A1)号（「小モジュール免疫薬のための凍結乾燥製剤」）は、小さい免疫医薬タンパク質（Small Immunopharmaceutical Protein）（SMIP）として知られているものの組成物を開示する。SMIPは、多数の融合されたドメインから構成される構築物であり、例えば、抗原結合ドメイン、免疫グロブリンのヒンジ領域、および、Ig分子のCH2領域もしくはCH3領域またはそれらに由来する領域から構成される構築物である。SMIPのドメインは、ヒト起源、非ヒト起源または（遺伝子技術方法を使用して作製される）人工物起源のものである場合がある遺伝子配列の産物であるポリペプチドからなる。SMIPタンパク質は好ましくは単一特異性であるにもかかわらず、その適用はまた、多特異性のバリアント、例えば、Scorpion分子を開示する。Scorpion分子は、C末端のさらなる結合ドメインを有するSMIPタンパク質を含有する。Scorpion分子の結合ドメインは好ましくは異なる標的構造に結合し、したがって、免疫特異的治療剤として好適である。国際公開第2010148337(A1)号は、SMIPを含有する凍結乾燥された組成物の安定な配合物を開示しており、しかし、SMIPの7％未満が凝集形態で存在する。前記配合物はさらに、緩衝液薬剤、安定剤、増量剤、湿潤化剤およびさらには賦形剤を含むことができる。国際公開第2009070642(A1)号は、BiTE分子MT103（その第1の結合ドメインがT細胞受容体抗原のCD3に特異的に結合し、これに対して、第2の結合ドメインがB細胞抗原のCD19に特異的に結合する）の様々な配合物を開示する。このBiTE分子は、7.0のpHにおいて、300μg/mlの最大濃度に至るまで、開示された組成物において安定である。使用される緩衝液がクエン酸塩である。配合物は静脈内投与および皮下投与のために好適である。皮下投与後の生物学的利用能が10％〜50％である。
【０００４】
IgG抗体は、大きい定常領域（CH1-3領域/CL領域）を有しており、これらの領域がその物理化学的性質の大部分に関わっている。様々な特異性を有するIgG抗体は、主にVL領域およびVH領域の中の超可変性の抗体結合部位（CDR1〜CDR3）の領域において構造的に異なる。個々のIgGバリアントの間における構造的および物理化学的な違いは、大きい定常領域のために比較的小さい。IgG抗体のように、国際公開第2010148337(A1)号に記載されるSMIP分子は、定常性の抗体領域の一部を含有する。
【０００５】
対照的に、様々な特異性を有するBiTE分子はそれらの物理化学的性質が著しく異なる。一般には異なる免疫グロブリンの2つの単鎖可変フラグメント（scFv）から構成される融合タンパク質として、それらは定常性のCH1-3領域/CL領域を欠いており、したがって、抗原結合ドメインにおける違いは、IgG抗体またはSMIP抗体についての場合よりもはるかに大きいBiTE分子のいくつかの部分に関係する。同様に、BiTE分子MT103と、本発明において使用されるBiTE分子とは、主としてそれらの分子構造において異なる。MT103におけるドメインはVL-VH-VH-VLの配列で配置されるが、本発明において好ましく使用されるBiTE分子についての配置はVH-VL-VH-VLの形態のものである。さらには、両方の分子の配列は多数の位置において異なる。
【０００６】
BiTE分子のこれらの性質およびそれらの小さいサイズは、種々のBiTE分子の物理化学的挙動における明確な違いを生じさせる。このことは、（物理化学的安定性を増大させるための）個々の配合物をそれぞれの個々の適用のために開発する必要があることをもたらす。なぜならば、個々のBiTEまたは類似する分子の配合物は代わりの適用のために使用することができず、または、代わりの適用のためには様々な制限を伴って使用され得るだけであるからである。
【０００７】
1つの実施形態において、組成物に存在するポリペプチドは、二重特異性T細胞エンゲージャー（Bispecific T-cell engager engager BiTE）として知られているものである。具体的な実施形態において、BiTEは、T細胞受容体−CD3複合体のε鎖に特異的に結合する第1の結合ドメインと、前立腺特異的膜抗原（PSMA）に特異的に結合する第2の結合ドメインとを有する。PSMAは、高い特異性を伴って前立腺の上皮細胞の表面に、また、前立腺癌の場合に、増大した強度で発現する内在性のII型膜タンパク質である。さらには、PSMAが、固形腫瘍の新たに形成された血管によって発現される。したがって、PSMA-BiTEは、細胞傷害性T細胞とこれらの標的細胞との直接的な接触を媒介する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第2011061712号
【特許文献２】国際公開第2010148337(A1)号
【特許文献３】国際公開第2009070642(A1)号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
タンパク質における凝集物形成、例えば、BiTE分子における凝集物形成は、薬学適用において望ましくなく、例えば、生物学的有効成分の効力または利用能が凝集物形成によって変化する可能性がある。
【００１０】
このことから、望まれていない凝集物形成が抑制されるような方法でBiTE分子を安定化させることを可能にする配合物を提供するという目的がもたらされる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
解決策が、本特許出願において、また、請求項において示されており、解決策は、TRISおよびリン酸塩を含むBiTE配合物を包含する。その好ましい実施形態において、配合物は、50mMのリン酸塩、100mMのTRIS、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロース二水和物を6.0のpHで含み、かつ、PSMA-BiTE1分子を含む配合物を凝集物の形成に関して安定化することができる。このことが、μg/ml未満の範囲での低い濃度および2mg/mlを超える高い濃度の両方に当てはまる。この安定化効果は当業者には驚くべきものである。なぜならば、例えば、国際公開第2009070642(A1)号において使用されるクエン酸塩は、50mMのクエン酸塩と100mMのTRISとのpH6.0における組合せとしてでさえも、この効果を示さないからである。例えば、リン酸塩の代わりにクエン酸塩のみを含有した比較可能な組成物における測定された二量体割合が7.0％であった。対照的に、本発明による組成物は二量体割合を0.8％に制限した（表6および表7を比較のこと）。TRISおよびリン酸塩の併用使用が組成物の安定化効果に関与している。BiTE分子を剪断力に関しても同様に安定化させるためには、少なくとも0.04％の濃度での湿潤化剤（例えば、ポリソルベート80など）が要求される。なぜならば、二量体割合が他の場合には大きすぎることになるからである（およそ7.5％、表15を参照のこと）。注射用シリンジ、輸液バッグなどの容器壁におけるPSMA-BiTE1分子の吸着を防止するためには、ただ0.002％のポリソルベート80を有することで十分である。
【００１２】
<定義>
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、ジスルフィド結合により互いに連結される2つの重鎖（H）ポリペプチド鎖および2つの軽鎖（L）ポリペプチド鎖をそれぞれが含む様々な免疫グロブリン分子を示す。それぞれの重鎖が、可変領域（VH）と、定常領域とからなり、そしてまた、定常領域は3つのドメイン（CH1、CH2およびCH3）からなる。軽鎖のそれぞれが可変領域（VL）および定常領域（CL）から構成される。軽鎖および重鎖の両方の可変領域（VHおよびVL）はさらに、それぞれの場合において、3つの超可変性の抗体結合部位（CDR1〜CDR3）と、これらのCDRの間における合計で4つの保存された領域（FR1〜FR4）とに細かく分けられる。
【００１３】
用語「モノクローナル抗体」は、比較的小さい、天然に存在する変異または翻訳後修飾を除いて同一である抗体の集団が起源である抗体を表す。ポリクローナル抗体とは対照的に、免疫応答の一部として現れるように、モノクローナル抗体は、特異的なエピトープに対するものである。
【００１４】
「二重特異性抗体」または「二機能性抗体」は、重鎖および軽鎖の2つの異なる対と、同様に2つの異なる抗原結合部位とを有する人工的なハイブリッド抗体である。
【００１５】
パパインによる抗体の処理により、2つの同一の抗原結合Fabフラグメントと、結晶化可能なFcフラグメントとがもたらされる。「Fabフラグメント」は、完全なVL鎖と、重鎖の一部、すなわち、可変領域および最初の定常ドメインCH1を含有するVHドメインとからなる。したがって、それぞれのFabフラグメントが個々の抗原結合部位を有する。「Fcフラグメント」は、ジスルフィド結合により連結されている両方の重鎖のカルボキシ末端部を含む。Fcフラグメントの一部分が他の細胞のFc受容体によって認識され、これを介して抗体のエフェクター機能を決定する。
【００１６】
ペプシンは抗体をジスルフィド結合の下流側で切断し、したがって、2つのFabフラグメントはヒンジ領域を介して連結されたままであり、ただ1つの「F(ab')2フラグメント」が形成される。F(ab')2フラグメントは両方の抗原結合部位を有しており、したがって、完全な抗体のように、抗原を架橋することができる。
【００１７】
用語「ドメイン」は、規定され、かつ、独立して折り畳まれた構造を有するタンパク質の球状領域を表す。IgG抗体の各軽鎖が2つのドメイン（それぞれの場合において、定常ドメインおよび可変ドメイン）から構成される；各重鎖が4つのドメイン（それぞれの場合において、3つの定常ドメインおよび1つの可変ドメイン）から構成される。これら2つの可変領域がそれぞれ、重鎖の1つのドメインと、軽鎖の1つのドメインとから構成される。
【００１８】
用語「エピトープ」または用語「抗原決定基」は、抗体（またはその抗原結合フラグメント）が特異的に結合する抗原の領域を表す。エピトープは、連続するアミノ酸からなることができ、または、三次のタンパク質折り畳みの結果として互いに非常に接近している不連続なアミノ酸からなることができる。
【００１９】
「抗原」は、抗体が結合することができる「抗原決定基」を有する分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物）である。
【００２０】
用語「立体配座」は、タンパク質またはポリペプチドの三次構造、例えば、抗体、抗体鎖、そのドメインまたは一部分の三次構造を示す。
【００２１】
特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドにおけるエピトープと「特異的に結合する」、あるいは、この構造「に対して特異的」である抗体は、代わりの構造にはそれほど効果的に結合しない。
【００２２】
用語「scFv抗体」は本特許出願においては、抗体の共有結合により結合したVHドメインおよびVLドメインからなる人為的に作製された抗体フラグメントを示す。両方のドメインが1つのポリペプチド鎖に存在しており、多数のアミノ酸から構成されるポリペプチドリンカーを介して互いに連結される。Fc媒介のエフェクター機能を除いて、scFv抗体は、抗体のすべての機能、より具体的には、その選択性および親和性を保持している。
【００２３】
「二重特異性T細胞エンゲージャー」（BiTE）分子は、2つの柔軟に連結された単鎖抗体（scFv）から構成される組換えタンパク質構築物である。前記scFv抗体の一方が、標的細胞により発現される選択された腫瘍抗原に特異的に結合し、第2のscFv抗体が、CD3、すなわち、T細胞上のT細胞受容体複合体のサブユニットに特異的に結合する。BiTE抗体はT細胞を一時的に標的細胞に結合させることができ、同時に、T細胞の細胞溶解活性を活性化することができる。T細胞のBiTE媒介活性化は、T細胞上の特異的なT細胞受容体、または、標的細胞上のMHC I分子、ペプチド抗原もしくは共刺激分子のどちらも必要としない。
【００２４】
用語「安定性」および用語「安定（的）な」はBiTE分子含有化合物類との関連において、その製造、調製、貯蔵、使用または輸送に関連する所与の条件のもとでの凝集、分解またはフラグメント化に関しての抗体またはそのフラグメントの抵抗性を表す。本発明による「安定な」配合物は、その生物学的活性を、製造、調製、輸送、使用および貯蔵の所与の条件のもとで保持する。
【００２５】
溶液中に存在するタンパク質（例えば、BiTE分子）は、製造時、容器充填時および輸送時に生じるような機械的動きに対して敏感である。動きがある特定の強度を越えると、分子には、凝集および／または変性が引き起こされる。したがって、液体のタンパク質含有組成物は機械的動きの期間中は、撹拌ストレス（agitation stress）として知られているものにさらされる。「撹拌ストレス試験」において、液体のタンパク質含有組成物に対する機械的（撹拌）力の制御された使用が、種々の組成物における溶解されたタンパク質の凝集挙動および変性挙動を分析するために使用される。
【００２６】
撹拌ストレス試験におけるタンパク質の挙動は、例えば、カニューレを用いた溶液の吸引時および注入時に生じるような剪断力に関してのその物理的安定性を示すものである。
【００２７】
「凍結乾燥」は、昇華の原理に基づく乾燥方法を表す。乾燥される物質は最初、約−45℃にまで冷却され、その後、真空が続いて加えられ、物質が約−20℃に加熱される。結果として、氷の結晶が、液体の中間段階を通ることなく気体状態に直接に昇華する。この様式で乾燥される物質は、約25℃での（依然として真空下にある）二次乾燥工程の後ではその最初の水分の5％未満を含有しており、「凍結乾燥物」と呼ばれる。
【００２８】
患者への投与に先立って、凍結乾燥物は「再構成され」、すなわち、医薬的に許容される希釈剤に溶解される。「再構成された配合物」は本発明との関連では、凍結乾燥された抗体配合物をそのような希釈剤に溶解することによって形成される。この抗体はその後は溶解された形態であり、患者に投与することができる。
【００２９】
「ポリオール」は、多数のヒドロキシル基（-OH）を含有する一群の有機化合物（ポリアルコール、多価アルコール）を表す。スクロースまたはトレハロースなどのポリオールは、抗体を安定化することができ、かつ／または、組成物の浸透圧(オスモル濃度)に影響を与えることができる糖である。
【００３０】
凍結乾燥時におけるタンパク質の望まれていない分解または凝集を防止するために、いわゆる「リオプロテクタント（lyoprotectant）」が加えられる。これらは、例えば、糖または糖アルコールであり、例えば、スクロース、マンノース、トレハロース、グルコース、ソルビトール、マンニトールなどである。本発明との関連において、トレハロースが、好ましく使用されるリオプロテクタントである。
【００３１】
用語「湿潤化剤」は本明細書中では、親水性領域および疎水性領域を有するどのような界面活性剤をも示し、これには、非イオン性、カチオン性、アニオン性および両性イオン性の界面活性剤が含まれる。使用可能な界面活性剤には、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（これはまた、ポリソルベート80またはTWEEN 80として知られている）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（これはまた、ポリソルベート20またはTWEEN 20として知られている）、または、N-ラウリルサルコシンが包含される。本明細書中に開示される組成物のためには、好ましいものが、非イオン性の湿潤化剤である。特に好ましいことが、本発明の組成物のためのポリソルベート80の使用である。湿潤化剤は0.002％〜0.1％の濃度で使用することができる。
【００３２】
用語「緩衝液」は本明細書中では、酸性物質またはアルカリ性物質を加えた後でそのpHがほんのわずかに変化する緩衝化された溶液を表す。緩衝化された溶液は、弱酸およびその対応する塩基の混合物、または、弱塩基およびその対応する酸の混合物を含有する。
【００３３】
用語「患者」は、予防的または治療的な処置を受ける（ヒトまたは動物の）個体を示す。
【００３４】
用語「処置」は本明細書中では、患者に対する／患者への治療物質の使用または投与、あるいは、疾患に罹患しているか、または、疾患の症状を示しているか、または、疾患に対する素因を有する患者の単離された組織またはその細胞株に対する／への治療物質の使用または投与で、疾患、その症状または疾患に対する素因を治すか、改善するか、それらに影響を与えるか、停止させるか、または、緩和するという目標を伴うそのような使用または投与を示す。
【００３５】
「効果的な用量」は本明細書中では、所望される効果を少なくとも部分的に達成することができる有効成分の量を表す。したがって、「治療効果的な用量」は、疾患を少なくとも部分的に治すために、または、疾患によって引き起こされる患者における有害な影響を少なくとも部分的に除くために十分である有効成分の量として定義される。この目的のために実際に要求される量は疾患の重篤度および患者の全体的な免疫状態に依存している。
【００３６】
用語「生物学的利用能」は、本明細書中で使用される場合、全身循環において変化せずに利用可能である有効成分または医薬品の用量の割合を表す。したがって、生物学的利用能は、有効成分がどのくらい迅速に、また、どの程度、作用部位において吸収され、利用可能であるかを示す測定された値である。定義により、静脈内投与された医薬品は100％の生物学的利用能を有する。
【００３７】
絶対的な生物学的利用能は、どのような様式であれ、静脈内投与と比較される所望される（静脈内以外の）様式で投与される物質の生物学的利用能を表し、これに対して、相対的な生物学的利用能は、特定の投薬形態についての生物学的利用能の比較（例えば、経口対皮下）からもたらされる。
【００３８】
「等張性化合物」は、ヒト血液と実質的に同じ浸透圧を有する。したがって、等張性化合物は一般に、約250mOsm〜350mOsmの浸透圧を有する。用語「低張性（の）」は、ヒト血液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する組成物を表し、これに対して、用語「高張性(の)」組成物は、ヒト血液の浸透圧を超える浸透圧を有する。
【００３９】
用語「高分子量凝集物」（同義語：「HMW」）は、少なくとも2つのタンパク質単量体から構成される凝集物を表す。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「リン酸塩」は、三塩基性オルトリン酸（H3PO4）の水溶性の薬理学的に安全な塩を示し、好ましいものが第一（水素）リン酸塩および第二（二水素）リン酸塩である。本発明による組成物は好ましくはナトリウムリン酸塩を含有し、特に好ましくはリン酸水素二ナトリウム（Na2HPO4）を含有する。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）およびリン酸塩を含むことを特徴とする、二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）分子の医薬配合物に関する。
【００４２】
様々なBiTE分子が先行技術において知られている。様々なBiTE分子が、特定の標的細胞を溶解するために細胞傷害性T細胞の協力を一時的に得るような方法で設計される（Bauerle他、Curr Opin Mol Ther、2009 Feb、11(1):22-30を参照のこと）。それらはがん治療のためにとりわけ好適である。
【００４３】
BiTE分子は、2つのscFv抗体結合ドメインを含むポリペプチドであり、この場合、第1のscFv結合ドメインはヒトCD3イプシロンに結合することができ、第2のscFv結合ドメインは第2のさらなる表面抗原と結合する。好ましいものががん細胞のヒト表面抗原である。特に好ましい表面抗原ががん細胞のヒト表面タンパク質である。これらのscFv結合ドメインは、キメラな抗体フラグメント、ヒト化抗体フラグメントまたはヒト抗体フラグメントを含むことができる。好ましくは、scFv結合ドメインはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメントを含む。
【００４４】
本発明において使用されるBiTE分子は、第1の結合ドメインが、ヒト、および、マーモセット（Callithrix jacchus）、ワタボウシタマリン（Saguinus oedipus）またはリスザル（Saimiri sciureus）のCD3イプシロン鎖のエピトープに結合することができ、前記エピトープが、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4からなる群から選択されるアミノ酸配列の一部であり、かつ、前記エピトープがアミノ酸配列Gln-Asp-Gly-Asn-Gluを少なくとも含むという点で、例えば、国際公開第2009070642(A1)号に記載されるようなBiTE分子（例えば、MT103）とは異なる。このことは、前臨床研究が促進されるという利点を有する。なぜならば、例えば、薬物動態学的研究または毒物学的研究を、免疫系がヒトの免疫系と類似している前述の試験動物において行うことができるからである。これらの特徴を有するBiTE分子が、例えば、国際公開第2008119566(A2)号または同第2008119567(A2)号に開示される。
【００４５】
したがって、1つの実施形態において、本発明による組成物は、第1の結合ドメインが、ヒト、および、マーモセット、ワタボウシタマリンまたはリスザルのCD3イプシロン鎖のエピトープに結合することができるBiTE分子であって、前記エピトープが、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4からなる群から選択されるアミノ酸配列の一部であり、かつ、前記エピトープがアミノ酸配列Gln-Asp-Gly-Asn-Gluを少なくとも含む、BiTE分子を含む。
【００４６】
配列番号5は、上記の基準を満たすscFv結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００４７】
好ましい実施形態において、ポリペプチドの第1の結合ドメインは、配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
scFvは、可変軽鎖（VL）抗体鎖および可変重鎖（VH）抗体鎖のアミノ酸を含む。様々なBiTE分子を様々な配向で組み立てることができる。BiTE分子MT103は、例えば、scFvの（VL-VH）結合ドメイン2−（VH-VL）結合ドメイン1配置を有する。
【００４９】
他の配向もまた可能であり、例えば、（VH-VL）結合ドメイン2−（VH-VL）結合ドメイン1もまた可能である。
【００５０】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは（VH-VL）結合ドメイン2−（VH-VL）結合ドメイン1の配置を有する。
【００５１】
特に好ましい実施形態において、ポリペプチドは（VH-VL）結合ドメイン2−（VH-VL）結合ドメイン1の配置を有し、ただし、（VH-VL）結合ドメイン1は、配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む。
【００５２】
本発明の1つの実施形態が、第2の結合ドメインが細胞表面抗原に結合することができることを特徴とする液体医薬組成物である。細胞表面抗原は、結合性タンパク質（例えば、抗体またはscFv）が結合することができる抗原であり、ただし、この場合、細胞は溶解される必要はない。
【００５３】
本発明の1つの実施形態が、ポリペプチドの第2の結合ドメインががん細胞の表面抗原に結合することができることを特徴とする液体医薬組成物である。
【００５４】
さらなる実施形態において、ポリペプチドの第2の結合ドメインは、ヒト表面抗原の前立腺特異的膜抗原（PSMA、SWISS-PROT：FOLH1_HUMAN、アクセション番号：Q04609）に結合する。そのようなBiTE分子が、例えば、国際公開第2010037836(A2)号に記載される。
【００５５】
配列番号6は、PSMAに結合する結合ドメインを表す。
【００５６】
好ましい実施形態において、ポリペプチドの第2の結合ドメインは、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む。
【００５７】
本発明の1つの実施形態が、第1および第2のscFv結合ドメインを含み、第1の結合ドメインが、配列番号5に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む液体医薬組成物であって、TRISおよびリン酸塩をさらに含むことを特徴とする液体医薬組成物である。
【００５８】
本発明の1つの実施形態が、ポリペプチドの結合ドメインがヒトscFv抗体フラグメントまたはヒト化scFv抗体フラグメントを含むことを特徴とする液体医薬組成物である。
【００５９】
本発明の1つの実施形態が、第2のPSMA結合性の結合ドメインが、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする液体医薬組成物である。
【００６０】
1つの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号5および配列番号6に示される配列によってコードされる第1および第2の結合ドメインのアミノ酸配列を含む。
【００６１】
配列番号5および配列番号6に示される配列を含むポリペプチドが、配列番号7または配列番号8に示される。
【００６２】
好ましいポリペプチドは、配列番号7に示されるアミノ酸配列を含む。
【００６３】
特に好ましいポリペプチドが、配列番号8に示されるアミノ酸配列によってコードされるPSMA-BiTE1分子である。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態が、ポリペプチド、TRISおよびリン酸塩を含む液体医薬組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号7に示されるアミノ酸配列を含む、液体医薬組成物である。
【００６５】
本発明の特に好ましい実施形態が、ポリペプチド、TRISおよびリン酸塩を含む液体医薬組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む、液体医薬組成物である。
【００６６】
1つの実施形態において、本発明による組成物は、約0.5μg/ml、約0.7μg/ml、約1μg/ml、約2μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約10μg/ml、約15μg/ml、約18μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml、約30μg/ml、約30μg/ml、約35μg/ml、約40μg/ml、約45μg/ml、約50μg/ml、約55μg/ml、約60μg/ml、約70μg/ml、約80μg/ml、約90μg/ml、約100μg/ml、約110μg/ml、約120μg/ml、約130μg/ml、約140μg/ml、約150μg/ml、約160μg/ml、約170μg/ml、約180μg/ml、約190μg/ml、約200μg/ml、約225μg/ml、約275μg/ml、約300μg/ml、約325μg/ml、約350μg/ml、約375μg/ml、約400μg/ml、約500μg/ml、約700μg/ml、約900μg/mlまたは約1000μg/mlの上記ポリペプチドを含む。
【００６７】
1つの実施形態において、本発明による組成物は、0.5μg/ml、0.7μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、18μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、150μg/ml、160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml、225μg/ml、275μg/ml、300μg/ml、325μg/ml、350μg/ml、375μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、700μg/ml、900μg/mlまたは1000μg/mlの上記BiTE分子を含む。
【００６８】
さらなる実施形態において、本発明による組成物は、約1mg/ml、約1.3mg/ml、約1.5mg/ml、約1.8mg/ml、約2mg/ml、約2.3mg/ml、約2.5mg/ml、約2.8mg/ml、約3mg/ml、約3.5mg/ml、約4mg/ml、約5mg/ml、約6mg/ml、約7mg/ml、約8mg/ml、約9mg/mlまたは約10mg/mlの上記BiTE分子を含む。
【００６９】
さらなる実施形態において、本発明による組成物は、1mg/ml、1.3mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml、2.3mg/ml、2.5mg/ml、2.8mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/mlまたは10mg/mlの上記BiTE分子を含む。
【００７０】
さらなる実施形態において、本発明による組成物は、約0.5μg/ml〜約1μg/ml、約1μg/ml〜約5μg/ml、約5μg/ml〜約10μg/ml、約10μg/ml〜約20μg/ml、約20μg/ml〜約50μg/ml、約50μg/ml〜約90μg/ml、約90μg/ml〜約120μg/ml、約120μg/ml〜約150μg/ml、約150μg/ml〜約180μg/ml、約180μg/ml〜約200μg/ml、約200μg/ml〜約250μg/ml、約250μg/ml〜約280μg/ml、約280μg/ml〜約300μg/ml、または、約300μg/ml〜約350μg/mlの上記BiTE分子を含む。
【００７１】
さらなる実施形態において、本発明による組成物は、0.5μg/ml〜1μg/ml、1μg/ml〜5μg/ml、5μg/ml〜10μg/ml、10μg/ml〜20μg/ml、20μg/ml〜50μg/ml、50μg/ml〜90μg/ml、90μg/ml〜120μg/ml、120μg/ml〜150μg/ml、150μg/ml〜180μg/ml、180μg/ml〜200μg/ml、200μg/ml〜250μg/ml、250μg/ml〜280μg/ml、280μg/ml〜300μg/ml、または、300μg/ml〜350μg/mlの上記BiTE分子を含む。
【００７２】
さらなる実施形態において、本発明による組成物は、約350μg/ml〜約1mg/ml、約350μg/ml〜約1.3mg/ml、約350μg/ml〜約1.5mg/ml、約350μg/ml〜約1.8mg/ml、約350μg/ml〜約2mg/ml、約350μg/ml〜約2.3mg/ml、約350μg/ml〜約2.5mg/ml、約350μg/ml〜約2.8mg/ml、約350μg/ml〜約3.0mg/ml、約350μg/ml〜約3.5mg/ml、約350μg/ml〜約5mg/ml、または、約350μg/ml〜約10mg/mlの上記BiTE分子を含む。
【００７３】
さらなる実施形態において、本発明による組成物は、350μg/ml〜1mg/ml、350μg/ml〜1.3mg/ml、350μg/ml〜1.5mg/ml、350μg/ml〜1.8mg/ml、350μg/ml〜2mg/ml、350μg/ml〜2.3mg/ml、350μg/ml〜2.5mg/ml、350μg/ml〜2.8mg/ml、350μg/ml〜3.0mg/ml、350μg/ml〜3.5mg/ml、350μg/ml〜5mg/ml、または、350μg/ml〜10mg/mlの上記BiTE分子を含む。
【００７４】
さらなる実施形態において、本発明による組成物は、0.5μg/ml〜10mg/ml、0.5μg/ml〜5mg/ml、0.5μg/ml〜3.5mg/ml、0.5μg/ml〜3.0mg/ml、0.5μg/ml〜2.8mg/ml、0.5μg/ml〜2.5mg/ml、0.5μg/ml〜2.3mg/ml、0.5μg/ml〜2.0mg/ml、0.5μg/ml〜1.8mg/ml、0.5μg/ml〜1.5mg/ml、0.5μg/ml〜1.3mg/ml、0.5μg/ml〜1.0mg/ml、0.5μg/ml〜350μg/ml、0.5μg/ml〜300μg/ml、0.5μg/ml〜250μg/mlの上記BiTE分子を含む。
【００７５】
さらなる実施形態において、本発明による組成物は、約0.5μg/ml〜約10mg/ml、約0.5μg/ml〜約5mg/ml、約0.5μg/ml〜約3.5mg/ml、約0.5μg/ml〜約3.0mg/ml、約0.5μg/ml〜約2.8mg/ml、約0.5μg/ml〜約2.5mg/ml、約0.5μg/ml〜約2.3mg/ml、約0.5μg/ml〜約2.0mg/ml、約0.5μg/ml〜約1.8mg/ml、約0.5μg/ml〜約1.5mg/ml、約0.5μg/ml〜約1.3mg/ml、約0.5μg/ml〜約1.0mg/ml、約0.5μg/ml〜約350μg/ml、約0.5μg/ml〜約300μg/ml、約0.5μg/ml〜約250μg/mlの上記BiTE分子を含む。
【００７６】
特に好ましい実施形態において、本発明による組成物は約2mg/mlの本発明によるポリペプチドを含む。
【００７７】
さらなる実施形態において、本発明による組成物はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）およびリン酸塩の組合せを緩衝化用のpH影響性薬剤として含む。
【００７８】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は、TRISを約10mMの濃度で、または、約20mMの濃度で、または、約30mMの濃度で、または、約40mMの濃度で、または、約50mMの濃度で、または、約60mMの濃度で、または、約70mMの濃度で、または、約80mMの濃度で、または、約90mMの濃度で、または、約100mMの濃度で、または、約150mMの濃度で、または、約200mMの濃度で、または、約250mMの濃度で、または、約300mMの濃度で含み、かつ、リン酸塩を約10mMの濃度で、または、約20mMの濃度で、または、約30mMの濃度で、または、約40mMの濃度で、または、約50mMの濃度で、または、約60mMの濃度で、または、約70mMの濃度で、または、約80mMの濃度で、または、約90mMの濃度で、または、約100mMの濃度で、または、約150mMの濃度で、または、約200mMの濃度で含む。
【００７９】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は、TRISを10mMの濃度で、または、20mMの濃度で、または、30mMの濃度で、または、40mMの濃度で、または、50mMの濃度で、または、60mMの濃度で、または、70mMの濃度で、または、80mMの濃度で、または、90mMの濃度で、または、100mMの濃度で、または、150mMの濃度で、または、200mMの濃度で、または、250mMの濃度で、または、300mMの濃度で含み、かつ、リン酸塩を10mMの濃度で、または、20mMの濃度で、または、30mMの濃度で、または、40mMの濃度で、または、50mMの濃度で、または、60mMの濃度で、または、70mMの濃度で、または、80mMの濃度で、または、90mMの濃度で、または、100mMの濃度で、または、150mMの濃度で、または、200mMの濃度で含む。
【００８０】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は、リン酸塩を約10mMの濃度で、または、約20mMの濃度で、または、約30mMの濃度で、または、約40mMの濃度で、または、約50mMの濃度で、または、約60mMの濃度で、または、約70mMの濃度で、または、約80mMの濃度で、または、約90mMの濃度で、または、約100mMの濃度で、または、約110mMの濃度で、または、約120mMの濃度で、または、約130mMの濃度で、または、約140mMの濃度で、または、約150mMの濃度で、または、約160mMの濃度で、または、約170mMの濃度で、または、約180mMの濃度で、または、約190mMの濃度で、または、約200mMの濃度で含む。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は、リン酸塩を10mMの濃度で、または、20mMの濃度で、または、30mMの濃度で、または、40mMの濃度で、または、50mMの濃度で、または、60mMの濃度で、または、70mMの濃度で、または、80mMの濃度で、または、90mMの濃度で、または、100mMの濃度で、または、110mMの濃度で、または、120mMの濃度で、または、130mMの濃度で、または、140mMの濃度で、または、150mMの濃度で、または、160mMの濃度で、または、170mMの濃度で、または、180mMの濃度で、または、190mMの濃度で、または、200mMの濃度で含む。
【００８２】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は約2mg/mlの本発明によるポリペプチドを含み、かつ、TRISを10mMの濃度で、または、20mMの濃度で、または、30mMの濃度で、または、40mMの濃度で、または、50mMの濃度で、または、60mMの濃度で、または、70mMの濃度で、または、80mMの濃度で、または、90mMの濃度で、または、100mMの濃度で、または、150mMの濃度で、または、200mMの濃度で、または、250mMの濃度で、または、300mMの濃度で含み、かつ、リン酸塩を10mMの濃度で、または、20mMの濃度で、または、30mMの濃度で、または、40mMの濃度で、または、50mMの濃度で、または、60mMの濃度で、または、70mMの濃度で、または、80mMの濃度で、または、90mMの濃度で、または、100mMの濃度で、または、150mMの濃度で、または、200mMの濃度で含む。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は約2mg/mlの本発明によるポリペプチドを含み、かつ、リン酸塩を約10mMの濃度で、または、約20mMの濃度で、または、約30mMの濃度で、または、約40mMの濃度で、または、約50mMの濃度で、または、約60mMの濃度で、または、約70mMの濃度で、または、約80mMの濃度で、または、約90mMの濃度で、または、約100mMの濃度で、または、約110mMの濃度で、または、約120mMの濃度で、または、約130mMの濃度で、または、約140mMの濃度で、または、約150mMの濃度で、または、約160mMの濃度で、または、約170mMの濃度で、または、約180mMの濃度で、または、約190mMの濃度で、または、約200mMの濃度で含む。
【００８４】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は約2mg/mlの本発明によるポリペプチドを含み、かつ、リン酸塩を10mMの濃度で、または、20mMの濃度で、または、30mMの濃度で、または、40mMの濃度で、または、50mMの濃度で、または、60mMの濃度で、または、70mMの濃度で、または、80mMの濃度で、または、90mMの濃度で、または、100mMの濃度で、または、110mMの濃度で、または、120mMの濃度で、または、130mMの濃度で、または、140mMの濃度で、または、150mMの濃度で、または、160mMの濃度で、または、170mMの濃度で、または、180mMの濃度で、または、190mMの濃度で、または、200mMの濃度で含む。
【００８５】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は約2mg/mlの本発明によるポリペプチドを含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で含み、かつ、リン酸塩を約10mMの濃度で、または、約20mMの濃度で、または、約30mMの濃度で、または、約40mMの濃度で、または、約50mMの濃度で、または、約60mMの濃度で、または、約70mMの濃度で、または、約80mMの濃度で、または、約90mMの濃度で、または、約100mMの濃度で、または、約110mMの濃度で、または、約120mMの濃度で、または、約130mMの濃度で、または、約140mMの濃度で、または、約150mMの濃度で、または、約160mMの濃度で、または、約170mMの濃度で、または、約180mMの濃度で、または、約190mMの濃度で、または、約200mMの濃度で含む。
【００８６】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は約2mg/mlの本発明によるポリペプチドを含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で含み、かつ、リン酸塩を10mMの濃度で、または、20mMの濃度で、または、30mMの濃度で、または、40mMの濃度で、または、50mMの濃度で、または、60mMの濃度で、または、70mMの濃度で、または、80mMの濃度で、または、90mMの濃度で、または、100mMの濃度で、または、110mMの濃度で、または、120mMの濃度で、または、130mMの濃度で、または、140mMの濃度で、または、150mMの濃度で、または、160mMの濃度で、または、170mMの濃度で、または、180mMの濃度で、または、190mMの濃度で、または、200mMの濃度で含む。
【００８７】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は約2mg/mlの本発明によるポリペプチドを含み、かつ、リン酸塩を約50mMの濃度で含み、かつ、TRISを約10mMの濃度で、または、約20mMの濃度で、または、約30mMの濃度で、または、約40mMの濃度で、または、約50mMの濃度で、または、約60mMの濃度で、または、約70mMの濃度で、または、約80mMの濃度で、または、約90mMの濃度で、または、約100mMの濃度で、または、約150mMの濃度で、または、約200mMの濃度で、または、約250mMの濃度で、または、約300mMの濃度で含み、かつ、リン酸塩を約10mMの濃度で、または、約20mMの濃度で、または、約30mMの濃度で、または、約40mMの濃度で、または、約50mMの濃度で、または、約60mMの濃度で、または、約70mMの濃度で、または、約80mMの濃度で、または、約90mMの濃度で、または、約100mMの濃度で、または、約150mMの濃度で、または、約200mMの濃度で含む。
【００８８】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は約2mg/mlの本発明によるポリペプチドを含み、かつ、リン酸塩を約50mMの濃度で含み、かつ、TRISを10mMの濃度で、または、20mMの濃度で、または、30mMの濃度で、または、40mMの濃度で、または、50mMの濃度で、または、60mMの濃度で、または、70mMの濃度で、または、80mMの濃度で、または、90mMの濃度で、または、100mMの濃度で、または、150mMの濃度で、または、200mMの濃度で、または、250mMの濃度で、または、300mMの濃度で含み、かつ、リン酸塩を10mMの濃度で、または、20mMの濃度で、または、30mMの濃度で、または、40mMの濃度で、または、50mMの濃度で、または、60mMの濃度で、または、70mMの濃度で、または、80mMの濃度で、または、90mMの濃度で、または、100mMの濃度で、または、150mMの濃度で、または、200mMの濃度で含む。
【００８９】
好ましい実施形態において、本発明による組成物のpHは約5.0〜約7.0の範囲内であり、または、約5.0〜約6.5の範囲内である。特に好ましくは、本発明による組成物のpHは6.0である。好ましくは、本発明による組成物のpHは、HClを使用して調節される。
【００９０】
さらなる実施形態において、本発明による組成物はさらに湿潤化剤を含む。湿潤化剤の例として、非イオン性の湿潤化剤が挙げられ、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート20またはポリソルベート80）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー188）；Triton；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタインまたはステアリルスルホベタイン；ラウロイルサルコシン、ミリストイルサルコシン、リノレオイルサルコシンまたはステアロイルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタインまたはセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノレアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミタミドプロピルベタインまたはイソステアラミドプロピルベタイン；ポリエチレングリコール；ポリプロピレングリコール；ならびに、エチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Pluronic類、PF68）などが挙げられる。好ましい実施形態において、湿潤化剤はポリソルベート80である。
【００９１】
さらなる実施形態において、本発明による組成物は湿潤化剤を0.002％〜0.1％の濃度で含み、好ましくは0.04％〜0.1％の濃度で含む。
【００９２】
好ましい実施形態において、本発明による組成物はポリソルベート80を0.002％〜0.1％の濃度で含み、好ましくは0.04％〜0.1％の濃度で含む。特に好ましくは、本発明による組成物はポリソルベート80を0.04％の濃度で含む。
【００９３】
さらなる実施形態において、本発明による組成物はさらにリオプロテクタントを含む。さらなる実施形態において、本発明による組成物はさらに、糖または糖アルコールをリオプロテクタントとして含む。リオプロテクタントは好ましくはトレハロースまたはトレハロース二水和物である。好ましい実施形態において、本発明による組成物はリオプロテクタントを2％〜10％の濃度で含み、特に好ましくは4％の濃度で含む。
【００９４】
好ましい実施形態において、本発明による組成物はトレハロースを2％〜10％の濃度で含み、特に好ましくは4％の濃度で含む。
【００９５】
特に好ましい実施形態において、本発明による組成物はトレハロース二水和物を2％〜10％の濃度で含み、特に好ましくは4％の濃度で含む。
【００９６】
特に好ましくは、本発明による組成物は約0.5μg/ml〜約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約50mM〜約200mMの濃度で、リン酸塩を約20mM〜約100mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロース二水和物を4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【００９７】
特に好ましくは、本発明による組成物は約0.5μg/ml〜約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約50mM〜約200mMの濃度で、リン酸塩を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロース二水和物を4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【００９８】
特に好ましくは、本発明による組成物は約0.5μg/ml〜約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、リン酸塩を約20mM〜約100mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロース二水和物を4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【００９９】
特に好ましくは、本発明による組成物は約50μg/ml〜約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、リン酸塩を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロース二水和物を4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１００】
特に好ましくは、本発明による組成物は約50μg/ml〜約1mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、リン酸塩を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロース二水和物を4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１０１】
特に好ましくは、本発明による組成物は約100μg/ml〜約500μg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、リン酸塩を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロース二水和物を4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１０２】
特に好ましくは、本発明による組成物は約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、リン酸塩を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロース二水和物を4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１０３】
特に好ましくは、本発明による組成物は約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、Na2HPO4を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロース二水和物を4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１０４】
好ましくは、本発明による組成物は約0.5μg/ml〜約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約50mM〜約200mMの濃度で、リン酸塩を約20mM〜約100mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロースを4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１０５】
好ましくは、本発明による組成物は約0.5μg/ml〜約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約50mM〜約200mMの濃度で、リン酸塩を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロースを4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１０６】
好ましくは、本発明による組成物は約0.5μg/ml〜約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、リン酸塩を約20mM〜約100mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロースを4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１０７】
好ましくは、本発明による組成物は約50μg/ml〜約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、リン酸塩を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロースを4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１０８】
好ましくは、本発明による組成物は約50μg/ml〜約1mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、リン酸塩を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロースを4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１０９】
好ましくは、本発明による組成物は約100μg/ml〜約500μg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、リン酸塩を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロースを4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１１０】
好ましくは、本発明による組成物は約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、リン酸塩を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロースを4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１１１】
好ましくは、本発明による組成物は約2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を含み、かつ、TRISを約100mMの濃度で、Na2HPO4を約50mMの濃度で、ポリソルベート80を0.04％の濃度で、トレハロースを4％の濃度で含み、かつ、pHが6.0である。
【０１１２】
パーセント（％）で示される濃度は、質量比での濃度（質量／体積）を示す。
【０１１３】
加えて、本発明による組成物は、なおさらに、医薬的に許容される添加物を含有することができる（Remington's Pharmaceutical Sciences；第18版、Mack Publishing Co.、Easton、PA、USA）。そのような添加物が、例えば、保存剤または酸化防止剤である。使用することができる酸化防止剤が、例えば、アスコルベート、メチオニン、ビタミンEまたはメタ重亜硫酸ナトリウムである。保存剤が、例えば、微生物の増殖を抑制するか、または遅らせる物質である。そのような物質が、例えば、チオメルサールである。
【０１１４】
本発明の1つの実施形態が、本発明による組成物の凍結乾燥によって製造されるか、または、前記組成物の凍結乾燥によって少なくとも得ることができる固体混合物である。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態が、本発明による組成物を凍結乾燥することによって得ることができる凍結乾燥物である。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態が、本発明による組成物を実施例16に記載されるプロトコルに従って凍結乾燥することによって製造される凍結乾燥物である。
【０１１７】
さらなる実施形態において、本発明による組成物は、上記の凍結乾燥された固体混合物を好適な液体媒体における溶解により再構成することによって提供される。
【０１１８】
好ましい実施形態において、本発明による組成物は、上記の凍結乾燥された固体混合物を水における溶解により、好ましくは滅菌水における溶解により再構成することによって提供される。
【０１１９】
本発明はさらに、本発明による組成物の1つと、好ましくは同様に、使用のための説明書とを含有する製造物を提供する。1つの実施形態において、製造物は、上記で列挙された組成物の1つを含有する容器を含む。有用な容器が、例えば、ボトル、バイアル、チューブまたはシリンジである。容器は、例えば、ガラスまたはプラスチックから構成され得る。シリンジは、例えば、金属から構成される注射針を含むことができる。
【０１２０】
1つの実施形態において、容器はシリンジである。さらなる実施形態において、シリンジが注射用デバイスに含有される。好ましい実施形態において、注射用デバイスは自己注射器である。自己注射器は、作動後、その内容物を、患者または別人によるさらなる取り扱いを要することなく投与する注射装置として記載することができる。本発明において、投与は好ましくは皮下である。
【０１２１】
本発明による組成物は、BiTE分子のための先行技術で利用可能な配合物と比較して、増大した安定性および著しく増大した生物学的利用能を示す。この特性プロフィルのために、本発明による組成物は非経口投与のためにとりわけ好適である。非経口投与には、とりわけ、静脈内注射または静脈内注入、（動脈内への）動脈内注射または動脈内注入、筋肉内注射、くも膜下腔内注射、皮下注射、腹腔内注射または腹腔内注入、骨内投与、あるいは、組織内への注射が含まれる。本発明による組成物は皮下投与のためにとりわけ好適である。本発明による組成物の1つの実施形態が、組成物を皮下投与した後におけるポリペプチドの生物学的利用能が60％超であることにおいて特徴づけられる；好ましくは、これはカニクイザルにおける生物学的利用能である。
【０１２２】
本発明による組成物は、有益な薬理学的性質を有しており、ヒトおよび動物における疾患の防止および処置のために使用することができる。
【０１２３】
本発明による組成物は、一般にはヒトおよび哺乳動物における過剰増殖性疾患の処置のために好適である。本発明による組成物を使用することがその処置のために可能である過剰増殖性疾患は、特にがん疾患および腫瘍疾患の一群に属する。本発明との関連において、これらは、とりわけ下記の疾患を意味することが理解され、しかし、それらに何ら限定されない：乳癌および乳腫瘍（腺管型および小葉型、同様に、腺管上皮内型）、気道の腫瘍（小細胞性および非小細胞性の癌腫、気管支癌）、脳腫瘍（例えば、脳幹および視床下部の腫瘍、星状膠細胞腫、髄芽細胞腫、上衣細胞腫ならびに神経外胚葉性腫瘍および松果体腫瘍）、消化器官（食道、胃、胆嚢、小腸、大腸、直腸）の腫瘍、肝臓腫瘍（とりわけ、肝細胞癌、胆管癌および混合型肝細胞胆管癌）、頭頸部領域（咽頭、下咽頭、鼻咽頭、口腔咽頭、口唇および口腔）の腫瘍、皮膚腫瘍（扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚癌および非黒色腫性皮膚癌）、軟部組織の腫瘍（とりわけ、軟部組織肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫および横紋筋肉腫）、眼の腫瘍（とりわけ、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫）、内分泌腺および外分泌腺（例えば、甲状腺および副甲状腺、膵臓ならびに唾液腺）の腫瘍、尿路の腫瘍（膀胱、陰茎、腎臓、腎盂および尿管の腫瘍）、ならびに、生殖器官の腫瘍（女性における子宮内膜、子宮頸部、卵巣、膣、外陰部および子宮の癌腫、ならびに、男性における前立腺および精巣の癌腫）。これらにはまた、固形形態での増殖性血液疾患、および、循環する血液細胞としての増殖性血液疾患、例えば、リンパ腫、白血病および骨髄増殖性疾患などが含まれ、例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病および有毛細胞性白血病、ならびに、AIDS関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫および中枢神経系におけるリンパ腫が含まれる。
【０１２４】
本発明による組成物を使用することがその処置のために可能である好ましい疾患が、PSMA抗原を発現する癌腫および／または転移物である。
【０１２５】
本発明による組成物を使用することがその処置のために可能である特に好ましい疾患が、前立腺癌、前立腺癌の骨転移物、および、前立腺癌の軟部組織転移物からなる群から選択される。
【０１２６】
本発明による組成物を使用することがその処置のために可能であるさらに特に好ましい疾患が前立腺癌である。
【０１２７】
ヒトにおけるこれらの十分に記載された疾患はまた、他の哺乳動物において類似した病因により生じる可能性があり、本発明の組成物を用いて他の哺乳動物において処置することができる。
【０１２８】
本発明との関連において、用語「処置」または用語「処置する」は従来の意味で使用され、疾患もしくは健康異常と闘うか、疾患もしくは健康異常を軽減するか、疾患もしくは健康異常を減弱するか、または、疾患もしくは健康異常を緩和するという目的により患者に対応すること、患者の世話を行うこと、および、患者を看護すること、ならびに、この疾患によって、例えば、がんの場合でのように損なわれる生活の質を改善することを意味する。
【０１２９】
したがって、本発明ではさらに、様々な疾患、より具体的には上記で述べられた疾患の処置および／または防止のための本発明による組成物の使用が規定される。
【０１３０】
本発明ではさらに、様々な疾患、より具体的には上記で述べられた疾患の処置および／または防止のための医薬製造物を製造するための本発明による組成物の使用が規定される。
【０１３１】
本発明ではさらに、様々な疾患、より具体的には上記で述べられた疾患の処置および／または防止を行うための方法における本発明による組成物の使用が規定される。
【０１３２】
本発明はさらに、様々な疾患、より具体的には上記で述べられた疾患の処置および／または防止を、本発明による組成物の1つの効果的な量を使用して行うための方法を提供する。
【０１３３】
好ましい実施形態において、処置および／または防止は本発明による組成物の非経口投与である。特に好ましいものが皮下投与である。
【０１３４】
本発明による組成物は単独で使用することができ、あるいは、必要とされるならば、1つまたは複数の他の薬理学的活性物質との組合せで使用することができ、ただし、これは、この組合せが、望ましくない副作用および許容できない副作用を引き起こさないという条件のもとにおいてである。したがって、本発明はさらに、本発明による組成物の少なくとも1つと、1つまたは複数のさらなる有効成分、とりわけ、上記で述べられた疾患の処置および／または防止のためのさらなる有効成分とを含有する医薬製造物を提供する。例えば、本発明の化合物類は、がん疾患を処置するための知られている過剰増殖抑制物質、細胞分裂抑制物質または細胞傷害性物質と組み合わせることができる。
【０１３５】
本発明ではさらに、治療方法における上述の組成物の使用が規定され、この場合、組成物は非経口形態の投与のために好適であり、例えば、静脈内注射または静脈内注入、（動脈内への）動脈内注射または動脈内注入、筋肉内注射、くも膜下腔内注射、皮下注射、腹腔内注射または腹腔内注入、骨内投与、あるいは、組織内への注射などのために好適である。
【０１３６】
本発明ではさらに、前立腺の細胞増殖性疾患を治療的に処置するための方法における上記で述べられた組成物の使用が規定される。
【０１３７】
本発明ではさらに、前立腺の細胞増殖性疾患を治療的に処置するための方法における上記で述べられた組成物の使用であって、組成物が皮下投与のために好適である使用が規定される。
【０１３８】
本発明ではさらに、前立腺の細胞増殖性疾患を治療的に処置するための方法における上記で述べられた組成物の使用であって、組成物が皮下投与によって投与される使用が規定される。
【０１３９】
本発明はさらに、ポリペプチドを安定化するための方法であって、上記で述べられた組成物の1つ（これは、当該ポリペプチドに加えて、少なくともTRISおよびリン酸塩を含有し、かつ、pHが6.0である）を製造することを含む方法を提供する。
【０１４０】
本発明はさらに、上記で述べられた組成物を含むキットを提供する。
【０１４１】
本発明の関連における好ましい化合物類が医薬化合物類である。
【０１４２】
実施形態
本発明の1つの実施形態は、ポリペプチド、TRISおよびリン酸塩を含む液体医薬組成物を含み、前記ポリペプチドは2つのscFv抗体結合ドメインを含み、第1のscFv結合ドメインはヒトCD3イプシロンに結合することができる。
【０１４３】
上記組成物のさらなる実施形態において、上記ポリペプチドの第2の結合ドメインは細胞表面抗原に結合することができる。
【０１４４】
上記組成物のさらなる実施形態において、上記ポリペプチドは、がん細胞の表面抗原に結合することができる第2の結合ドメインを含む。
【０１４５】
さらなる実施形態において、上記ポリペプチドの第2の結合ドメインが結合することができる表面抗原は前立腺特異的膜抗原（PSMA）である。
【０１４６】
上記組成物のさらなる実施形態において、上記ポリペプチドは（VH-VL）結合ドメイン2−（VH-VL）結合ドメイン1の配置を有する。
【０１４７】
上記組成物のさらなる実施形態において、上記ポリペプチドの第1の結合ドメインは、配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
上記組成物のさらなる実施形態において、上記ポリペプチドの第2のPSMA結合性の結合ドメインは、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
さらなる実施形態において、上記組成物は、配列番号7に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、TRISおよびリン酸塩を含む。
【０１５０】
さらなる実施形態において、上記組成物は、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、TRISおよびリン酸塩を含む。
【０１５１】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを0.5μg/ml〜5mg/mlの濃度で含有する。
【０１５２】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを0.5μg/ml〜3.5mg/mlの濃度で含有する。
【０１５３】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを0.5μg/ml〜3.0mg/mlの濃度で含有する。
【０１５４】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを0.5μg/ml〜2.5mg/mlの濃度で含有する。
【０１５５】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを0.5μg/ml〜2.0mg/mlの濃度で含有する。
【０１５６】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを0.5μg/ml〜1.8mg/mlの濃度で含有する。
【０１５７】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを0.5μg/ml〜1.5mg/mlの濃度で含有する。
【０１５８】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを0.5μg/ml〜0.35mg/mlの濃度で含有する。
【０１５９】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを0.5μg/ml〜0.3mg/mlの濃度で含有する。
【０１６０】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを0.5μg/ml〜0.25mg/mlの濃度で含有する。
【０１６１】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを0.5μg/ml〜0.2mg/mlの濃度で含有する。
【０１６２】
さらなる実施形態において、上記組成物はPSMA-BiTE1を50μg/ml〜1mg/mlの濃度で含有する。
【０１６３】
さらなる実施形態において、上記組成物はPSMA-BiTE1を50μg/ml〜500μg/mlの濃度で含有する。
【０１６４】
さらなる実施形態において、上記組成物はPSMA-BiTE1を100μg/ml〜500μg/mlの濃度で含有する。
【０１６５】
さらなる実施形態において、上記組成物は上記ポリペプチドを約2mg/mlの濃度で含有する。
【０１６６】
さらなる実施形態において、上記組成物はTRISを約50mM〜約200mMの濃度で含有し、かつ、リン酸塩を約20mM〜約100mMの濃度で含有する。
【０１６７】
さらなる実施形態において、上記組成物は100mMのTRISおよび50mMのリン酸塩を含有する。
【０１６８】
さらなる実施形態において、上記組成物のpHが約5.0〜約7.0の範囲内である。
【０１６９】
さらなる実施形態において、上記組成物のpHが約5.0〜約6.5の範囲内である。
【０１７０】
さらなる実施形態において、上記組成物のpHが約5.5〜約6.5の範囲内である。
【０１７１】
さらなる実施形態において、上記組成物のpHが約6.0である。
【０１７２】
さらなる実施形態において、上記組成物のpHが、塩酸を使用して調節される。
【０１７３】
さらなる実施形態において、上記組成物はさらに湿潤化剤を含有する。
【０１７４】
さらなる実施形態において、湿潤化剤はポリソルベート80である。
【０１７５】
さらなる実施形態において、上記組成物はさらに、0.002％〜0.1％のポリソルベート80を含有する。
【０１７６】
さらなる実施形態において、上記組成物はさらに、0.04％〜0.1％のポリソルベート80を含有する。
【０１７７】
さらなる実施形態において、上記組成物はさらに、0.04％のポリソルベート80を含有する。
【０１７８】
さらなる実施形態において、上記組成物はさらにリオプロテクタントを含有する。
【０１７９】
さらなる実施形態において、上記組成物は、トレハロースを、または、好ましくはトレハロース二水和物をリオプロテクタントとして含有する。
【０１８０】
さらなる実施形態において、上記組成物はさらに、4％〜10％のトレハロースを、または、好ましくは、4％〜10％のトレハロース二水和物を含有する。
【０１８１】
さらなる実施形態において、上記組成物はさらに約4％のトレハロースを含有し、または、好ましくはさらに約4％のトレハロース二水和物を含有する。
【０１８２】
好ましい実施形態において、上記組成物はpHが6であり、かつ、50μg/ml〜1mg/mlのPSMA-BiTE1、100mMのTRIS、50mMのリン酸塩、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロース二水和物を含む。
【０１８３】
好ましい実施形態において、上記組成物はpHが6であり、かつ、50μg/ml〜500μg/mlのPSMA-BiTE1、100mMのTRIS、50mMのリン酸塩、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロース二水和物を含む。
【０１８４】
好ましい実施形態において、上記組成物はpHが6であり、かつ、50μg/ml〜500μg/mlのPSMA-BiTE1、100mMのTRIS、50mMのNa2HPO4、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロース二水和物を含む。
【０１８５】
さらなる実施形態において、上記組成物はpHが6であり、かつ、50μg/ml〜1mg/mlのPSMA-BiTE1、100mMのTRIS、50mMのリン酸塩、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロースを含む。
【０１８６】
さらなる実施形態において、上記組成物はpHが6であり、かつ、50μg/ml〜500μg/mlのPSMA-BiTE1、100mMのTRIS、50mMのリン酸塩、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロースを含む。
【０１８７】
さらなる実施形態において、上記組成物はpHが6であり、かつ、50μg/ml〜500μg/mlのPSMA-BiTE1、100mMのTRIS、50mMのNa2HPO4、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロースを含む。
【０１８８】
上記組成物の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも90％、好ましくは少なくとも96％の生物活性（これは好ましくは、実施例21に記載されるようなセルベースの活性アッセイによって確認される）を凍結乾燥ならびにその後の再構成および貯蔵（実施例21に記載されるように、2℃〜8℃で7日間、続いて、20℃＋−5℃で16時間）の後で有する。
【０１８９】
上記組成物の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも90％、好ましくは少なくとも96％の生物活性（これは好ましくは、実施例21に記載されるようなセルベースの活性アッセイによって確認される）を凍結乾燥および3カ月間または12カ月間の貯蔵の後で有する。
【０１９０】
上記組成物の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも97％の生物活性（これは好ましくは、実施例21に記載されるようなセルベースの活性アッセイによって確認される）を凍結乾燥および6℃での3カ月間または6℃での12カ月間の貯蔵の後で有する。
【０１９１】
上記組成物の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、96％を超える単量体含有量（SEC）（これは好ましくは、実施例18aに従って確認される）を、注射から生じる剪断応力の作用の後で有する。
【０１９２】
上記組成物の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、4％以下である二量体および多量体の含有量（SEC）（これは好ましくは、実施例18aに従って確認される）を、注射針を使用する緩速注射または急速注射から生じる剪断応力の作用の後で有する。
【０１９３】
上記組成物の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、4％以下である二量体および多量体の含有量（SEC）（これは好ましくは、実施例18aに従って確認される）を、注射針（ゲージ：30G；針長さ：13mm）を使用する緩速注射または急速注射から生じる剪断応力の作用の後で有する。
【０１９４】
本発明の1つの実施形態は、上記液体組成物の凍結乾燥によって得ることができる固体混合物を含む。
【０１９５】
さらなる実施形態において、上記組成物は、本発明による凍結乾燥された固体混合物を好適な液体媒体に溶解することによって再構成される。
【０１９６】
さらなる実施形態において、上記組成物の皮下投与の後における上記ポリペプチドの生物学的利用能が60％超である。
【０１９７】
さらなる実施形態において、上記組成物は治療方法において使用される。
【０１９８】
さらなる実施形態において、上記組成物は治療方法において使用され、ただし、この場合、前記方法は上記組成物の非経口投与を含む。
【０１９９】
さらなる実施形態において、上記組成物は、過剰増殖性疾患を治療的に処置するための方法において使用される。
【０２００】
さらなる実施形態において、上記組成物は、前立腺の過剰増殖性疾患を治療的に処置するための方法において使用される。
【０２０１】
さらなる実施形態において、上記組成物は、前立腺の過剰増殖性疾患を治療的に処置するための方法であって、上記組成物の皮下投与を含む方法において使用される。
【０２０２】
さらなる実施形態において、本発明は、ポリペプチドを安定化するための方法であって、当該ポリペプチドに加えて、少なくともTRISおよびリン酸塩を含有し、かつ、pHが6.0である組成物を製造することを含む方法を含む。
【０２０３】
さらなる実施形態において、本発明は、上記で記載された組成物を含むキットを含む。
【０２０４】
好ましい実施形態として、下記の実施形態が挙げられる：
【０２０５】
1．ポリペプチド、TRISおよびリン酸塩を含む液体医薬組成物であって、前記ポリペプチドは2つのscFv抗体結合ドメインを含み、第1のscFv結合ドメインはヒトCD3イプシロンに結合することができる、液体医薬組成物。
【０２０６】
2．前記ポリペプチドの第2の結合ドメインは細胞表面抗原に結合することができることを特徴とする、実施形態1による組成物。
【０２０７】
3．前記ポリペプチドは、がん細胞の表面抗原に結合することができる第2の結合ドメインを含むことを特徴とする、実施形態2による組成物。
【０２０８】
4．前記表面抗原が前立腺特異的膜抗原（PSMA）であることを特徴とする、実施形態2および3のどちらかによる組成物。
【０２０９】
5．前記ポリペプチドが（VH-VL）結合ドメイン2−（VH-VL）結合ドメイン1の配置を有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２１０】
6．前記ポリペプチドの前記第1の結合ドメインは、配列番号5に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２１１】
7．前記ポリペプチドの前記第2のPSMA結合性の結合ドメインは、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２１２】
8．ポリペプチド、TRISおよびリン酸塩を含む液体医薬組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号7に示されるアミノ酸配列を含む、液体医薬組成物。
【０２１３】
9．ポリペプチド、TRISおよびリン酸塩を含む液体医薬組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む、液体医薬組成物。
【０２１４】
10．前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜5mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２１５】
11．前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜3.5mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２１６】
12．前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜3.0mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２１７】
13．前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜2.5mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２１８】
14．前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜2.0mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２１９】
15．前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜1.8mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２２０】
16．前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜1.5mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２２１】
17．前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜0.35mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２２２】
18．前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜0.3mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２２３】
19．前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜0.25mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２２４】
20．前記ポリペプチドを0.5μg/ml〜0.2mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２２５】
21．PSMA-BiTE1を50μg/ml〜1mg/mlの濃度で含むことを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２２６】
22．PSMA-BiTE1を50μg/ml〜500μg/mlの濃度で含むことを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２２７】
23．PSMA-BiTE1を100μg/ml〜500μg/mlの濃度で含むことを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２２８】
24．前記ポリペプチドを約2mg/mlの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２２９】
25．TRISを約50mM〜約200mMの濃度で含有し、かつ、リン酸塩を約20mM〜約100mMの濃度で含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２３０】
26．100mMのTRISおよび50mMのリン酸塩を含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２３１】
27．当該組成物のpHが約5.0〜約7.0の範囲内であることを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２３２】
28．当該組成物のpHが約5.0〜約6.5の範囲内であることを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２３３】
29．当該組成物のpHが約5.5〜約6.5の範囲内であることを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２３４】
30．当該組成物のpHが約6.0であることを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２３５】
31．当該組成物のpHが、塩酸を使用して調節されることを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２３６】
32．さらに湿潤化剤を含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２３７】
33．前記湿潤化剤がポリソルベート80であることを特徴とする、実施形態32による組成物。
【０２３８】
34．0.002％〜0.1％のポリソルベート80をさらに含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２３９】
35．0.04％〜0.1％のポリソルベート80をさらに含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２４０】
36．0.04％のポリソルベート80をさらに含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２４１】
37．さらにリオプロテクタントを含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。組成物は好ましくは2％〜10％のリオプロテクタントを含有し、特に好ましくは4％のリオプロテクタントを含有する。
【０２４２】
38．前記リオプロテクタントがトレハロースであることを特徴とする、実施形態37による組成物。リオプロテクタントは好ましくはトレハロース二水和物である。
【０２４３】
39．4％〜10％のトレハロース二水和物をさらに含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２４４】
40．約4％のトレハロース二水和物をさらに含有することを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２４５】
41．pHが6であり、かつ、50μg/ml〜1mg/mlのPSMA-BiTE1、100mMのTRIS、50mMのリン酸塩、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロース二水和物を含むことを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２４６】
42．pHが6であり、かつ、50μg/ml〜500μg/mlのPSMA-BiTE1、100mMのTRIS、50mMのリン酸塩、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロース二水和物を含むことを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２４７】
43．pHが6であり、かつ、2mg/mlのPSMA-BiTE1、100mMのTRIS、50mMのNa2HPO4、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロース二水和物を含むことを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２４８】
44．前記実施形態のいずれかによる液体組成物を凍結乾燥することによって得ることができる固体混合物。
【０２４９】
45．実施形態44による凍結乾燥された固体混合物を好適な液体媒体に溶解することによって再構成されることを特徴とする液体医薬組成物。
【０２５０】
46．前記ポリペプチドは、少なくとも90％、好ましくは少なくとも96％の生物活性（これは好ましくは、実施例21に記載されるようなセルベースの活性アッセイによって確認される）を凍結乾燥ならびにその後の再構成および貯蔵（実施例21に記載されるように、2℃〜8℃で7日間、続いて、20℃＋−5℃で16時間）の後で有する、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２５１】
47．前記ポリペプチドは、少なくとも90％、好ましくは少なくとも96％の生物活性（これは好ましくは、実施例21に記載されるようなセルベースの活性アッセイによって確認される）を凍結乾燥および3カ月間または12カ月間の貯蔵の後で有する、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２５２】
48．前記ポリペプチドは、少なくとも97％の生物活性（これは好ましくは、実施例21に記載されるようなセルベースの活性アッセイによって確認される）を凍結乾燥および6℃での3カ月間または6℃での12カ月間の貯蔵の後で有する、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２５３】
49．前記ポリペプチドは、96％を超える単量体含有量（SEC）（これは好ましくは、実施例18aに従って確認される）を、注射から生じる剪断応力の作用の後で有する、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２５４】
50．前記ポリペプチドは、4％以下である二量体および多量体の含有量（SEC）（これは好ましくは、実施例18aに従って確認される）を、注射針を使用する緩速注射または急速注射から生じる剪断応力の作用の後で有する、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２５５】
51．前記ポリペプチドは、4％以下である二量体および多量体の含有量（SEC）（これは好ましくは、実施例18aに従って確認される）を、注射針（ゲージ：30G；針長さ：13mm）を使用する緩速注射または急速注射から生じる剪断応力の作用の後で有する、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２５６】
52．当該組成物の皮下投与の後における前記ポリペプチドの生物学的利用能が60％超であることを特徴とする、前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２５７】
53．治療方法において使用されるための前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２５８】
54．前記組成物の非経口投与を含む治療方法において使用されるための前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２５９】
55．過剰増殖性疾患を治療的に処置するための方法において使用されるための前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２６０】
56．前立腺の過剰増殖性疾患を治療的に処置するための方法において使用されるための前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２６１】
57．当該組成物の皮下投与を含む、前立腺の過剰増殖性疾患を治療的に処置するための方法において使用されるための前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２６２】
58．実施形態1〜9の少なくとも1つによるポリペプチドを安定化するための方法であって、当該ポリペプチドに加えて、少なくともTRISおよびリン酸塩を含有し、かつ、pHが6.0である組成物を製造することを含む方法。
【０２６３】
59．実施形態1〜57のいずれかによる組成物を含むキット。
【０２６４】
60．前記液体医薬組成物が、水性医薬組成物であり、好ましくは無菌の水性医薬組成物である前記実施形態のいずれかによる組成物。
【０２６５】
61．前記実施形態のいずれかによる組成物を含有するシリンジ。
【実施例】
【０２６６】
実施例1：PSMA-BiTE1分子の熱安定性を改善するための緩衝液スクリーニング
示差走査蛍光測定法（DSF）を使用して、最小分子量を有するPSMA-BiTE1タンパク質ドメインの平均融解点（Tm1）を種々の緩衝液系において測定した。平均融解点は、様々な緩衝液系における試験されたタンパク質の安定性の尺度である；Tm値が大きいほど、タンパク質の安定性もまた大きくなる。タンパク質の熱安定性が大きいほど、安定な医薬配合物を製造するためのその好適性が良好である。
【０２６７】
緩衝液スクリーニングのために、pH5.0〜pH8.0のpH範囲における標準的な緩衝液を使用した。製造された配合物のPSMA-BiTE1濃度は約0.2mg/mlであった。平均融解点をDSF法によって確認した。
【０２６８】
【表１】
0006321667.tif 000002
【０２６９】
クエン酸塩およびNa2HPO4に基づく緩衝液系は、PSMA-BiTE1タンパク質ドメインの融解点を上昇させることに関して正の効果を示した。クエン酸塩およびNa2HPO4の正の効果をさらなる実験において詳しく調べた。
【０２７０】
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）系緩衝液は単独では、タンパク質の融解点における明確な上昇を引き起こさなかった（表2）。
【０２７１】
【表２】
0006321667.tif 000003
【０２７２】
表1と同様に、表2もまた、示差走査蛍光測定法によって確認される場合の、最小分子量を有するPSMA-BiTE1タンパク質ドメインの平均融解点（Tm）を種々の緩衝液系において示す。Tm値が57.7℃〜64.6℃の間であった。様々な緩衝液系の組合せにより、より高いTm値を達成することができなかった。
【０２７３】
pH5.5〜pH6.5でのリン酸塩緩衝液およびpH5.0〜pH6.5でのクエン酸塩緩衝液におけるPSMA-BiTE1配合物が、最も高い融解点を示した（DSF法に従って63.0℃を超えるTm）。
【０２７４】
実施例2：PSMA-BiTE1凝集物形成に対する非イオン性界面活性剤の影響
PSMA-BiTE1分子は、試験されたすべての緩衝液系において撹拌ストレス試験の後で凝集物を形成した。凝集したPSMA-BiTE1分子がT細胞活性化をもたらす効率は予測可能または制御可能でないか、あるいは、限定された程度に予測可能または制御可能であるにすぎない。したがって、凝集物形成が撹拌ストレスまたは剪断力の作用から生じることを妨げる安定剤を見出すことが必須であった。撹拌ストレス試験において、様々な非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート80またはポリソルベート20）がPSMA-BiTE1分子を安定化し、かつ、凝集を妨げ得ることが明らかになった。0.01％〜0.04％（質量／体積）の間での界面活性剤濃度が安定化のために十分であった（表3〜表7を参照のこと）。
【０２７５】
実施例3：多価カチオンの存在下におけるPSMA-BiTE1二量体形成
PSMA-BiTE1配合物の濃縮時におけるPSMA-BiTE1凝集物の割合における増大を、非イオン性界面活性剤を加えることによって防止することができなかった。
【０２７６】
したがって、多価カチオン（例えばMg2+およびCa2+）の存在下におけるPSMA-BiTE1分子の静電的安定化を調べた。多価カチオンは、溶解されたタンパク質の表面電位に対する直接的な影響を有しており、したがって、安定化様式で、または、それどころか、不安定化様式で作用することができる。
【０２７７】
PSMA-BiTE1分子を、塩化マグネシウムを使用して安定化させることができる。PSMA-BiTE1二量体の割合が、濃縮後、無視できる程度にしか増大せず、＜3％未満のままであった（表3）。単量体および二量体の割合をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により測定した。
【０２７８】
【表３】
0006321667.tif 000004
【０２７９】
しかしながら、より高濃度での無機塩の添加は薬学的に安全でなく、かつ／または、前記添加物は凍結乾燥における課題となる。この理由から、PSMA-BiTE1分子を安定化し、かつ、同時に、薬学的に安全である代替賦形剤について探索を行った。
【０２８０】
実施例4：PSMA-BiTE1単量体を安定化するための代替賦形剤の特定
偶然にも、様々なアミノ酸およびそれらの誘導体がとりわけ、PSMA-BiTE1単量体をより高濃度で安定化することに対する試験に含まれた。アミノ酸およびその誘導体は無機塩でなく、したがって、薬学的に安全であるとして分類される。これらの物質のいくつか（例えば、リシン）が驚くべきことに、濃縮時および濃縮後におけるPSMA-BiTE1分子の安定性に対する正の影響を示した（表4）。
【０２８１】
【表４】
0006321667.tif 000005
【０２８２】
リシンおよびヒスチジンをリン酸塩緩衝液に加えることによって、PSMA-BiTE1分子は、許容できない割合の二量体（≧5％）の形成を伴うことなく濃縮することができた。しかしながら、二量体の割合が低い場合（＜5％）の配合物は撹拌ストレス試験の期間中に不安定化した。このことが、溶液が濁ることから認識された（試験物(test volume)1および試験物2；「混濁」は凝集を示しており、「OK」は、凝集がほとんどないか、または全くないことを示している）。
【０２８３】
実施例5：PSMA-BiTE1分子の安定性に対するpHの影響
二量体形成に対するpHの影響を調べるために、pH6.0を有する配合物を製造した。この配合物は、pH7.3における配合物の二量体割合と同程度であった二量体割合を示した。そのうえ、二量体の割合はまた、撹拌ストレスの期間中も安定していた。このことが、濁りがないことから明らかであった（表5）。pH6.0の正の影響を好適な安定剤および配合物についてのさらなる探索のために使用した。
【０２８４】
【表５】
0006321667.tif 000006
【０２８５】
pH6.0でのリン酸塩緩衝液におけるPSMA-BiTE1の安定性は驚くべきものであった。凝集が撹拌ストレスの作用の結果として生じることなく、50mMのNa2HPO4、50mMのリシン、0.04％のポリソルベート20および10％のトレハロース二水和物をpH6.0で含む配合物において、分子を1.6mg/mlにまで一気に濃縮することが可能であった。
【０２８６】
実施例6：緩衝剤組合せの試験
さらなる実験において、リン酸塩との組合せでの添加物（例えば、アルギニン、TEAまたはTRISなど）によるPSMA-BiTE1分子の安定性における増大に関する、可能性のある相乗効果を調べた。0.8％のPSMA-BiTE1二量体の最も低い割合が、50mMのNa2HPO4および100mMのTRISの、pH6.0での緩衝剤組合せの場合に生じた。この配合物はまた、撹拌ストレスの後で十分に安定であった。このことが、溶液の濁りがないことから認識可能であった（表6）。TRISの安定化効果は驚くべきものであった。なぜならば、アルギニンまたはTEAの添加では、アルギニンまたはTEAはともに、タンパク質の場合におけるそれらの安定化効果（すなわち、凝集減少効果）について知られているが、安定化効果がPSMA-BiTE1分子の場合には何らなかったからである。
【０２８７】
【表６】
0006321667.tif 000007
【０２８８】
実施例1において示されるように、クエン酸塩緩衝液の使用はPSMA-BiTE1分子の熱安定性における増大を引き起こした。しかしながら、試験物の濃縮の後では、クエン酸塩により緩衝化された試験物における二量体の割合が、リン酸塩緩衝液を用いた試験物の場合よりも実質的に高かった（表7を表6と比較されたい）。したがって、リン酸塩緩衝液が、濃縮時におけるPSMA-BiTE1二量体の形成を最小限に抑えるためにクエン酸塩緩衝液よりも良好に適する。また、配合物におけるクエン酸塩は、ガラス層間剥離を引き起こす可能性があり、現在は使用してはならない。
【０２８９】
【表７】
0006321667.tif 000008
【０２９０】
実施例7：TRIS−リン酸塩緩衝液系におけるPSMA-BiTE1分子の熱安定性
下記配合物の最小分子量を有するPSMA-BiTE1タンパク質ドメインの平均融解点（Tm1）を求めた。
【０２９１】
50mMのNa2HPO4、100mMのTRIS、0.04％のポリソルベート80、4％のトレハロース二水和物、pH6.0（HClにより調節）における0.2mg/mlのPSMA BiTE。DSCによって、61.1℃のTm1が測定された。
【０２９２】
実施例8：リン酸塩／TRIS配合物におけるPSMA-BiTE1分子に対する撹拌ストレスの影響
一般に、BiTE分子は撹拌ストレスによって物理的に不安定化される。すなわち、BiTE分子は凝集物を形成する（この凝集物は動的光散乱（DLS）により検出することができる）。凝集物の形成が約0.2mg/mlの低いBiTE濃度でさえ生じる。対照的に、タンパク質含有量が0.2mg/ml未満である場合には、BiTE分子が容器壁にますます吸着する。
【０２９３】
界面活性剤（例えば、ポリソルベート20またはポリソルベート80）を加えることによって、容器壁（例えば、注射シリンジ、輸液バッグなどの容器壁）へのPSMA-BiTE1分子の吸着をいくつかの緩衝液系において（例えば、リン酸塩系緩衝液およびリシン系緩衝液において）防止すること、また、同様に、凝集物の形成を静止状態において防止することが可能であった。ポリソルベート80は、PSMA-BiTE1分子の吸着を防止するために組成物において少なくとも0.002％の濃度で存在しなければならない。
【０２９４】
PSMA-BiTE1分子を、pH6.0における界面活性剤添加物を伴うリン酸塩緩衝液に溶解することによって、凝集物の形成を静止状態および撹拌ストレスの作用時の両方において防止することが可能であった。上述の配合物（pH6.0における界面活性剤添加物を伴うリン酸塩緩衝液）は、凝集物の形成を最小限に抑えることに関して、リシンを伴う配合物よりも優れていた。
【０２９５】
【表８】
0006321667.tif 000009
【０２９６】
実施例9：濃度に対するPSMA-BiTE1凝集の依存性
標準的な緩衝液系において、二量体および多量体の割合がPSMA-BiTE1分子の濃度とともに増大した。しかしながら、二量体および多量体は、治療使用のための配合物ではほんの限られた程度にしか許容され得ない。なぜならば、二量体および多量体は配合物および治療用タンパク質の有効性に影響し、かつ、望まれていない免疫学的影響を誘発する可能性があるからである。典型的には、二量体は、最大でも5％の値に制限されており、様々な試みが、できる限り前記値よりも低く保つために行われる。多量体および低分子量（LMW）フラグメントは同様に最小限に抑えなければならないか、または、全く存在してはならない。単量体／二量体比、同様にまた、多量体および低分子量フラグメントの割合が、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を使用して測定される。
【０２９７】
50mMのNa2HPO4および100mMのTRISを含む緩衝液系を、pH6.0で使用した場合、濃縮時のPSMA-BiTE1分子の間における二量体および多量体の形成を十分に低下させることが可能であった。
【０２９８】
この緩衝液系は、2mg/mlを超える含有量を有する安定なBiTE配合物をもたらすことを可能にした（表9）。
【０２９９】
【表９】
0006321667.tif 000010
【０３００】
実施例10：PSMA-BiTE1安定性に対するトレハロースおよびポリソルベートの影響
トレハロースおよびポリソルベートの添加は、SEC測定によって求められ得るように、二量体、多量体またはLMWフラグメントの増大した形成を引き起こしていない。
【０３０１】
実施例10a：PSMA-BiTE1安定性に対するトレハロースおよびポリソルベートの影響
トレハロース二水和物およびポリソルベートの添加は、二量体、多量体またはLMWフラグメントの増大した形成を引き起こさなかった（表10）。
【０３０２】
【表１０】
0006321667.tif 000011
【０３０３】
実施例11：PSMA-BiTE1分子の貯蔵安定性
PSMA-BiTE1分子の貯蔵安定性を、貯蔵時間の関数としての二量体および／または多量体の割合における増大に基づいて求めることができる。これらの凝集物の割合における増大が急速であるほど、貯蔵安定性が低くなる。
【０３０４】
90μg/ml、500μg/mlおよび2mg/mlの濃度におけるPSMA-BiTE1分子は二量体および／または多量体の形成に関して9日間の期間にわたって安定であることを実験的に示すことができる。これらの配合物を、室温（約20℃）での4時間から16時間までの初期段階の後、約2℃〜8℃で注射シリンジにおいて保つ。組成物は、PSMA-BiTE1分子に加えて、50mMのNa2HPO4、100mMのTRIS、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロースを含有する。PSMA-BiTE1単量体の割合を、SEC-HPLCを使用して測定し、実験開始時（すなわち、0日目）におけるPSMA-BiTE1単量体の割合と比較する。
【０３０５】
実施例11a：PSMA-BiTE1分子の貯蔵安定性
PSMA-BiTE1分子の貯蔵安定性を、貯蔵時間の関数としての二量体および／または多量体の割合における増大に基づいて求めることができる。これらの凝集物の割合における増大が急速であるほど、貯蔵安定性が低くなる。
【０３０６】
90μg/ml、500μg/mlおよび2mg/mlの濃度におけるPSMA-BiTE1分子は二量体および／または多量体の形成に関して9日間の期間にわたって安定であったことを実験的に示すことが可能であった（表11）。これらの配合物を、室温（約20℃）での4時間から16時間までの初期段階の後、約2℃〜8℃で注射シリンジにおいて保った。組成物は、PSMA-BiTE1分子に加えて、50mMのNa2HPO4、100mMのTRIS、0.04％のポリソルベート80および4％のトレハロース二水和物を含有した。PSMA-BiTE1単量体の割合を、SEC-HPLCを使用して測定し、実験開始時（すなわち、0日目）におけるPSMA-BiTE1単量体の割合と比較した。PSMA-BiTE1開始濃度が90μg/mlおよび500μg/mlである組成物の場合において9日後、この相対的純度が100％であった。すなわち、単量体の割合がこの期間にわたって低下していなかった。2mg/mlのPSMA-BiTE1分子を有する組成物の場合、相対的純度が9日後において97％であった。これは、単量体が（0日目での97.58％から9日目での94.81％に）約3％低下したことに完全に合致している。
【０３０７】
【表１１】
0006321667.tif 000012
【０３０８】
他の実験では、1週間の経過にわたる2℃〜8℃での、PSMA-BiTE1濃度が2mg/mlである液体配合物において、二量体の割合における（3％から5.5％への）2.5％の中程度の上昇が、多量体の安定した割合と一体となって認められた（表12）。したがって、この濃度において、PSMA-BiTE1分子は、喪失を事実上全く伴わない容器への充填、および、喪失を事実上全く伴わない使用を保証するために十分に長い期間にわたって安定である。
【０３０９】
しかしながら、長期間の貯蔵（すなわち、1週間よりも相当に長い期間にわたる貯蔵）のために、PSMA-BiTE1溶液は、その安定性を保証するために凍結（−80℃）または凍結乾燥することができる。生物活性の保持を伴うPSMA-BiTE1含有配合物の凍結乾燥が、実施例17に示されるように可能であった。
【０３１０】
【表１２】
0006321667.tif 000013
【０３１１】
実施例12：PSMA-BiTE1安定性に対するpHの影響
原理的に、PSMA-BiTE1分子は、TRIS、リン酸塩（この場合にはNa2HPO4）、トレハロースおよびポリソルベートを含有する選択された配合物において、pH5.0〜7.5の間のpH範囲で安定である。しかしながら、pH6を超えるpHでは、二量体の割合が剪断応力の後で増大する。
【０３１２】
実施例12a：PSMA-BiTE1安定性に対するpHの影響
原理的に、PSMA-BiTE1分子は、TRIS、リン酸塩（この場合にはNa2HPO4）、トレハロース二水和物およびポリソルベートを含有する選択された配合物において、pH5.0〜7.5の間のpH範囲で安定である。しかしながら、pH6を超えるpHでは、二量体の割合（＞2％）が剪断応力の後で増大する（表13）。
【０３１３】
【表１３】
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【０３１４】
実施例13：PSMA-BiTE1安定性に対するTRISおよびリン酸塩の影響
配合物における種々の緩衝液濃度に関する調査は、配合物における緩衝液濃度を変化させることができることを示した：20mM〜100mMのNa2HPO4および50mM〜200mMのTRISがpH6.0において、PSMA-BiTE1二量体の形成を最小限に抑えることに関して有用である。すべての組合せが濃縮および剪断応力の作用を許容する。
【０３１５】
TRISの非存在下では、PSMA-BiTE1分子を濃縮することが可能でなく、また、Na2HPO4の非存在下では、二量体の割合が、剪断応力の後で、＞2％超に増大した。また、リン酸塩緩衝液は、pH6.0において良好な緩衝化作用を示した。リン酸塩緩衝液はPSMA-BiTE1分子の熱安定性を支援する。
【０３１６】
【表１４】
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【０３１７】
実施例14：PSMA-BiTE1安定性に対する様々な湿潤化剤の影響
様々なポリソルベートが配合物中のPSMA-BiTE1分子を剪断応力に対して安定化することができる。しかしながら、最も良い結果がポリソルベート80により達成された。他の安定剤、例えば、Synperonic F68なども同様に、正の効果を有した。
【０３１８】
0.04％〜0.10％（質量／体積）のポリソルベート80が、PSMA-BiTE1分子に対する良好な安定化効果を剪断応力時に有した。0.004％（質量／体積）のポリソルベートは、剪断応力の作用の後での二量体の形成における許容できない増大を防止するためにこの場合には十分でなかった。
【０３１９】
【表１５】
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【０３２０】
実施例15：配合物の安定性に対するPSMA-BiTE1濃度の影響
配合物（50mMのNa2HPO4、100mMのTRIS、pH6.0、4％（質量／体積）のトレハロース、0.04％（質量／体積）のポリソルベート80）を使用する場合、2mg/mlまでのPSMA-BiTE1濃度をもたらすことが可能である。より高いPSMA-BiTE1濃度では、二量体の割合が明確に増大する。しかしながら、許容できない値が、4mg/mlを超えるPSMA-BiTE濃度および剪断応力の作用の後でのみ測定される（約11.2mg/mlのPSMA-BiTE濃度における9.25％の二量体）。
【０３２１】
実施例15a：配合物の安定性に対するPSMA-BiTE1濃度の影響
配合物（50mMのNa2HPO4、100mMのTRIS、pH6.0、4％（質量／体積）のトレハロース二水和物、0.04％（質量／体積）のポリソルベート80）を使用した場合、2mg/mlまでのPSMA-BiTE1濃度をもたらすことが可能であった。より高いPSMA-BiTE1濃度では、二量体の割合が明確に増大した。しかしながら、許容できない値が、4mg/mlを超えるPSMA-BiTE濃度および剪断応力の作用の後でのみ測定された（約11.2mg/mlのPSMA-BiTE濃度における9.25％の二量体）。
【０３２２】
【表１６】
0006321667.tif 000017
【０３２３】
実施例16：凍結乾燥
PSMA-BiTE1組成物を完成させた後、PSMA-BiTE1組成物を凍結乾燥した。数多くの凍結乾燥装置がこの目的のために入手可能である（例えば、SP Scientificから得られるGenesis Super XL）。凍結乾燥が、物質を凍結し、続いて、氷を、液相を通過することなく昇華させることによって達成される。
【０３２４】
【表１７】
0006321667.tif 000018
【０３２５】
凍結段階において、製造物を室温から−45℃にまで30分以内の「傾斜」で、すなわち、連続的に冷却した。製造物溶液を完全に凍結させるために、この温度を240分間保持した。
【０３２６】
この後には、一次乾燥段階が続いた。100μbarのチャンバー真空度で、組成物を−20℃まで60分以内で加熱した。この温度を1000分間保持する；その後、一次乾燥を完了した。続く二次乾燥のために、組成物を25℃に10μbarの真空度で加熱した。これらの条件を、残留水分を2％以下（Karl Fischer滴定による検出）にまで除くために1140分間保持した。
【０３２７】
乾燥プロセスが終了したとき、装置に通気し、凍結乾燥容器を密封した。
【０３２８】
実施例17a：長期貯蔵および再構成の後におけるPSMA-BiTE1凍結乾燥物の生物活性
PSMA-BiTE1分子を含有する組成物（表18a）を、2℃〜8℃および25℃／60％の相対湿度で12カ月までの期間にわたって凍結乾燥物として貯蔵した。3カ月後および12カ月後、溶液をそれぞれの場合において凍結乾燥物から再構成し、セルベースの活性アッセイで分析した。測定（Promegaから得られるCytoTox-Glo Cytotoxicity Assayによる）により、変化していない生物活性が、上記条件のもとでの6カ月および12カ月の両方の貯蔵の後で明らかにされた。
【０３２９】
さらに、再構成されたPSMA-BiTE1溶液の貯蔵安定性を分析した。再構成後、溶液を最初は冷蔵庫（2℃〜8℃）で7日間貯蔵し、その後、室温（＋20±5℃）で16時間貯蔵した。続いて、PSMA-BiTE1分子の生物活性を同様に、この場合にはセルベースの活性アッセイによって確認した。PSMA-BiTE1分子の生物活性が、上述のさらなる貯蔵の後での再構成された溶液において96％であった。
【０３３０】
したがって、凍結乾燥された配合物におけるPSMA-BiTE1分子の生物活性が、上述の貯蔵条件のもとでの6カ月〜12カ月にわたる貯蔵の後で安定であった。同じことが、2℃〜8℃での7日間および室温での16時間の貯蔵を行った後のこの凍結乾燥物から再構成される溶液に当てはまる。
【０３３１】
実施例17b：長期貯蔵および再構成の後におけるPSMA-BiTE1凍結乾燥物の2つの代表的な回分物(バッチ)の安定性−単量体（SECおよびCGE）、生物活性（セルベースの活性アッセイ）および粒子（HIACおよびMFI）の観点から
PSMA-BiTE1分子を含有する組成物（表18a）を、2℃〜8℃および25℃／60％の相対湿度で12カ月までの期間にわたって凍結乾燥物として貯蔵した。3カ月後および12カ月後、溶液をそれぞれの場合において凍結乾燥物から再構成し、とりわけセルベースの活性アッセイで分析した。測定（Promegaから得られるCytoTox-Glo Cytotoxicity Assayによる）により、変化しない生物活性、また、同様に、SECおよびCGEでの単量体の割合におけるほんのわずかな変化が、上記条件のもとでの3カ月および12カ月の両方の貯蔵の後で明らかにされた（表18b）。
【０３３２】
加えて、サイズが2μm超から25μm超にまで及ぶタンパク質粒子をマイクロフローイメージング（micro-flow imaging）（MFI）およびHIACによって測定した（表18c）。値は、測定精度の限界の範囲内で、貯蔵期間中、両方の回分物(バッチ)について安定したままであった。
【０３３３】
【表１８】
0006321667.tif 000019
【０３３４】
凍結乾燥物は1.2mlの注射用水により再構成されるべきものである。その後に得られる投与用溶液は濃度が2mg/mlである。バイアイルは、過剰充填の結果として、2.6mgのPSMA-BiTE1を伴って1.3mlを含有する。
【０３３５】
【表１９】
0006321667.tif 000020
【０３３６】
【表２０】
0006321667.tif 000021
【０３３７】
さらに、再構成されたPSMA-BiTE1溶液の貯蔵安定性を分析した。再構成後、溶液を最初は冷蔵庫（2℃〜8℃）で7日間貯蔵し、その後、室温（＋20±5℃）で16時間貯蔵した。続いて、PSMA-BiTE1分子の生物活性を同様に、この場合にはセルベースの活性アッセイによって確認した。PSMA-BiTE1分子の生物活性が、上述のさらなる貯蔵の後での再構成された溶液において96％であった。
【０３３８】
したがって、上述の貯蔵条件のもとでの3カ月〜12カ月にわたる貯蔵の後、凍結乾燥された配合物におけるPSMA-BiTE1分子の生物活性は、それぞれの場合において測定精度の限界の範囲内で安定であった。他の測定パラメーター（SEC、生物活性、MFIおよびHIACのデータ）もまた、この結果を示す。同じことが、2℃〜8℃での7日間および室温での16時間の貯蔵を行った後のこの凍結乾燥物から再構成される溶液に当てはまる。
【０３３９】
実施例18：PSMA-BiTE1二量体の形成に対する注射用シリンジおよびカニューレによる投与における剪断応力の影響
組成物：2.17mg/mlのPSMA-BiTE1分子、50mMのNa2HPO4、100mMのTRIS、pH6.0、4％のトレハロース、0.04％のポリソルベート80
【０３４０】
材料：使い捨てシリンジ（BD、2ml）、カニューレ（BD Microlance、30G1/2（REF：304000））ならびに褐色ガラスバイアル（6R）およびCryoTube。
【０３４１】
手順：
30個のバイアルを解凍する。6個のバイアルを「開始値」として使用する。それぞれの実験のために、6個のバイアルを使用する。すなわち、シリンジ／カニューレを使用して抜き取り、すべてを褐色ガラスまたはCryoTubeに注入する。
【０３４２】
実験：
1．CryoTubeへのPSMA-BiTE1組成物の緩速注入（SyS Cryo）
2．褐色ガラスへのPSMA-BiTE1組成物の緩速注入（SyS Glass）
3．CryoTubeへのPSMA-BiTE1組成物の急速注入（SyR Cryo）
4．褐色ガラスへのPSMA-BiTE1組成物の急速注入（SyR Glass）
【０３４３】
続いて、二量体の形成を示差走査蛍光測定法（DSF）によって測定する。
【０３４４】
実施例18a：PSMA-BiTE1二量体の形成に対する注射用シリンジおよびカニューレによる投与における剪断応力の影響
組成物：2.17mg/mlのPSMA-BiTE1分子、50mMのNa2HPO4、100mMのTRIS、pH6.0、4％のトレハロース二水和物、0.04％のポリソルベート80
【０３４５】
材料：使い捨てシリンジ（BD、2ml）、カニューレ（BD Microlance、30G1/2（REF：304000））ならびに褐色ガラスバイアル（6R）およびCryoTube。
【０３４６】
手順：30個のバイアルを解凍した。6個のバイアルを「開始値」として使用した。それぞれの実験のために、6個のバイアルを使用した。すなわち、シリンジ／カニューレを使用して抜き取り、すべてを褐色バイアルまたはCryoTubeに注入した。
【０３４７】
実験：
1．CryoTubeへのPSMA-BiTE1組成物の緩速注入（SyS Cryo）
2．褐色ガラスへのPSMA-BiTE1組成物の緩速注入（SyS Glass）
3．CryoTubeへのPSMA-BiTE1組成物の急速注入（SyR Cryo）
4．褐色ガラスへのPSMA-BiTE1組成物の急速注入（SyR Glass）
【０３４８】
【表２１】
0006321667.tif 000022
【０３４９】
二量体の形成を示差走査蛍光測定法（DSF）によって測定した。組成物を注射用シリンジおよびカニューレにより注入した後での二量体の割合における著しい増大を報告することができなかった。この結果は、本発明による配合物がすべての場合において、生じた剪断応力の作用に関して安定であることを示す。
【実施例１】
【０３５０】
実施例19：再構成後のPSMA-BiTE1溶液の安定性（2℃〜8℃で28時間まで）ならびに0.9％生理的食塩水溶液における2つの希釈物および1つの温度（25℃）での8時間までのPSMA-BiTE1溶液の安定性
単量体、二量体および多量体の割合をSECクロマトグラフィーによって測定した。
【０３５１】
組成物：2.0mg/mlのPSMA-BiTE1分子、50mMのNa2HPO4、100mMのTRIS、pH6.0、4％のトレハロース二水和物、0.04％のポリソルベート80
【０３５２】
材料：0.9％NaClおよび注射用水
【０３５３】
手順：16個の凍結乾燥されたPSMA-BiTE1バイアルを、1.1mlの注射用水（WFI）を加えることによって再構成した。これらのバイアルの内、8個のバイアルを2℃〜8℃で貯蔵し、4個のバイアルを0.066mg/mlの濃度に0.9％NaCl溶液により希釈し、4個のバイアルを0.66mg/mlの濃度に0.9％NaCl溶液により希釈した。これらを25℃でインキュベーションし、0h、2h、4hおよび8hの時間でSECによって調べた。
【０３５４】
【表２２】
0006321667.tif 000023
【０３５５】
予想されるように、WFIを使用して再構成されるサンプルは、2℃〜8℃において2mg/mlの溶液について予想され得る二量体における増大を再び示す。単量体における低下は明らかに、二量体における増大と相関しており、多量体が全く形成されない。
【０３５６】
0.9％NaCl溶液における希釈は、PBSにおける結果と匹敵する結果を示す。0.666mg/mlの場合、単量体／二量体比は一定のままであり、0.066 mg/mlの場合、この場合には単量体における増大が認められる。
【０３５７】
実施例20：皮下投与の場合におけるPSMA-BiTE1溶液の安定性に関するモデル実験
この目的を達成するために、再構成されたPSMA-BiTE1溶液を2つの希釈物および2つの温度（25℃＆37℃）でPBSにおいて調べた。単量体、二量体および多量体ならびにフラグメント（LMW）の割合の測定をSECクロマトグラフィーによって行い、同様に、肉眼で見えない粒子（SVP）の測定をMFIによって行った。
【０３５８】
組成物：2.0mg/mlのPSMA-BiTE1分子、50mMのNa2HPO4、100mMのTRIS、pH6.0、4％のトレハロース二水和物、0.04％のポリソルベート80
【０３５９】
材料：PBS
【０３６０】
手順：希釈されたPSMA-BiTE-1溶液の皮下投与条件のもとでの安定性を求めるために、8個の凍結乾燥されたPSMA-BiTE1バイアルをそれぞれ、1.1mlのWFIを加えることによって再構成した。PBSを使用して、4個のバイアルを0.066mg/mlの濃度に希釈し、4個のバイアルを0.66mg/mlの濃度に希釈した。これらを25℃（コントロール）および37℃でインキュベーションし、0h、2h、4hおよび8hの時間でSECおよびMFIによって測定した。
【０３６１】
【表２３】
0006321667.tif 000024
【０３６２】
PBSによる希釈および37℃でのPBS中でのインキュベーションは、PSMA-BiTE1分子が皮下投与のこれらの模擬条件のもとで安定であることを示す。0.66mg/mlの場合、本発明者らは、安定な単量体／二量体比を両方のインキュベーション温度について有する。対照的に、0.066mg/mlの場合には、本発明者らは、二量体の割合が低下し、かつ、単量体の割合が増大するという効果を認めている。これは、濃度依存的かつ時間依存的である可逆的な二量体形成の影響である。SVPの場合、わずかな濃度依存的、温度依存的および時間依存的なSVP形成に対する傾向が認められ、しかしながら、このことは安定性の問題を表していない。このことから、皮下投与のための配合物の好適性が示される。
【０３６３】
実施例21：用量範囲探索試験のための0.9％NaCl溶液におけるPSMA-BiTE1希釈物の安定性
PSMA-BiTE1凍結乾燥物を1.2mlのWFIにより再構成し、0.004％のポリソルベート80含有量に調節された0.9％濃度のNaCl溶液と混合した。これは、高度に希釈された溶液の生物活性における喪失を回避するために必要であった。この目的を達成するために、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）における1％濃度のポリソルベート80溶液を作製した。この溶液を市販の0.9％濃度のNaCl溶液（例えば、Baxer Viaflo 250ml）に加えて、0.004％の最終濃度を達成した。この溶液を使用して、0.05μg/mlから2000μg/mlにまで及ぶPSMA-BiTE1の希釈物を下記の段階で作製した：
・0.05μg/ml
・0.7μg/ml
・2μg/ml
・18μg/ml
・90μg/ml
・500μg/ml
・2000μg/ml
【０３６４】
この目的を達成するために、無菌の空の輸液バッグ（例えば、Impromediform GmbHから得られる150mlのバッグ、REF MF 1661）を使用し、これに、状態調節された生理的食塩水溶液を最初に入れた。対応する量の再構成されたPSMA-BiTE1溶液をこの溶液に加え、バッグを回転させることによって混合した。1mlのアリコート(aliquot)を2mlのシリンジ（例えば、Injekt 2 ml/Luer Lock Solo Braun（REF 46067001V））に詰め、B. Braunから得られるCombiストッパー（REF 4495101）により密封した。
【０３６５】
その後、これらのシリンジを9日間まで、2℃〜8℃で冷蔵庫に貯蔵した。この貯蔵には、4時間または20時間にわたる室温(RT)（20℃+/-5℃）での貯蔵が含まれた。測定のために、皮下投与用の注射針（BD Microlance 3 30G1/2" 0.3*13 mm）をシリンジ（REF 304000）に取り付け、溶液を、シリンジを介して2mlのバイアル（ガラスタイプ1）に排出した。
【０３６６】
希釈溶液の生物活性を細胞傷害性アッセイで調べた。回収率（タンパク質含有量）を（電気化学発光アッセイ）ECLアッセイで確認した。
【０３６７】
ECLアッセイにおける限られた測定範囲のために、アッセイ溶液を下記のように、分析に先立って、状態調節された0.9％濃度の生理的食塩水溶液で希釈することが必要であった：
・0.05μg/ml：非希釈
・0.7μg/ml：1:50
・2μg/ml：1:200
・18μg/ml：1:1000
【０３６８】
表21aおよび表21bは、0.05μg/mlから18μg/mlまでのPSMA-BiTE1の範囲の最終的な注射用溶液の9日間の貯蔵期間にわたる貯蔵試験の結果を示す。タンパク質濃度が、すべての最終濃度について安定したままである。相対的濃度（T0値と比較した場合）が79％〜117％の範囲内である。この物質クラスを用いた以前の経験に基づいて、T0値に関して±40％〜±50％の差の許容基準が確認された。測定されたデータは十分にこの許容範囲の範囲内にある。
【０３６９】
【表２４】
0006321667.tif 000025
【０３７０】
【表２５】
0006321667.tif 000026
【０３７１】
表21aおよび表21bにおいて使用される略号：
BiTE：PSMA-BiTE1分子
A：アッセイ
Ave：平均
T0値：時間0における値
【０３７２】
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assayにおける使用のために、アッセイ溶液を下記のようにアッセイ媒体により希釈することが必要であった：
18μg/ml：1:36
90μg/ml：1:180
500μg/ml：1:1000
2000μg/ml：1:4000
【０３７３】
アッセイ物質の生物学的活性を「相対的生物活性」として表す。相対的生物活性を下記のように求める：
【０３７４】
相対的生物学的活性＝EC50（参照基準）／EC50（アッセイコントロール）
【０３７５】
表22は、18μg/ml〜2000μg/mlのPSMA-BiTE1を含有する最終的な輸液溶液の生物活性が9日間の貯蔵期間にわたって安定なままであることを示す。相対的生物活性が、T0値と比較した場合、77％〜132％の範囲内で、9日間の貯蔵期間の期間中に変動する。
【０３７６】
したがって、これらの結果は十分に、以前に決定された、50％〜200％という生物活性の許容範囲にある。
【０３７７】
【表２６】
0006321667.tif 000027
【０３７８】
【表２７】
0006321667.tif 000028
【０３７９】
表22aおよび表22bにおいて使用される略号：
BiTE：PSMA-BiTE1分子
A：アッセイ
Ave：平均
T0値：時間0における値
【０３８０】
希釈され、9日間貯蔵される溶液の生物活性における違いは、T0値と比較して、±33％以下であった。貯蔵期間の期間中における生物活性の明確な喪失を示す明らかな傾向が何ら認められない。18μg/mlのPSMA-BiTE1を含有するアッセイ溶液は貯蔵期間の期間中の生物活性におけるわずかな低下を示し、しかし、より高濃度のアッセイ溶液が検討されるときにはこの傾向を確認することができなかった。
【０３８１】
加えて、ECLアッセイにおいて、18μg/mlの濃度は、タンパク質濃度における低下を貯蔵期間にわたって何ら示さなかった。
【０３８２】
まとめると、18μg/ml〜2000μg/mlの濃度範囲におけるPSMA-BiTE1の最終的注射用溶液の貯蔵であって、＋20℃±5℃での20時間までの期間を含めて、＋2℃〜8℃の温度での9日までの間、使用される希釈条件と、また、貯蔵システムおよび投与システムと適合し得る貯蔵が可能であると述べることができる。
【０３８３】
実施例22：皮下投与後のPSMA-BiTE1の生物学的利用能
50mMのNa2HPO4、100mMのTRIS、pH6.0、4％のトレハロース、0.04％のポリソルベート80の配合物を使用する場合、高い生物学的利用能を皮下投与後に達成することが可能である。PSMA-BiTE1分子の皮下の生物学的利用能が4頭のメスのカニクイザルで調べられる。投薬量が皮下投与のために45μg/kgであり、これを5および15μg/kg体重（BW）の静脈投与と比較する。2mg/mlのストック溶液を生理学的食塩水溶液により希釈する。静脈投与の注入時間が1時間であり、注入比率が1ml/kg BWである。選択された注射部位が浅静脈（小伏在静脈）である。皮下投与のために、試験溶液を0.15ml/kg BWで胸部側面領域に注射する。血中レベルを、ELISAアッセイを使用して調べる。この目的を達成するために、ECL技術を使用する。この方法の定量下限（LLOQ）が4μg/lである。
【０３８４】
実施例22a：皮下投与後のPSMA-BiTE1の生物学的利用能
50mMのNa2HPO4、100mMのTRIS、pH6.0、4％のトレハロース二水和物、0.04％のポリソルベート80の配合物を使用する場合、66％の生物学的利用能を皮下投与後に達成することが可能である。PSMA-BiTE1分子の皮下の生物学的利用能を4頭のメスのカニクイザルで調べた。投薬量が皮下投与のために45μg/kgであり、これを5および15μg/kg体重（BW）の静脈投与と比較した。2mg/mlのストック溶液を生理学的食塩水溶液により希釈した。静脈投与の注入時間が1時間であり、注入比率が1ml/kg BWであった。選択された注射部位が浅静脈（小伏在静脈）であった。皮下投与のために、試験溶液を0.15ml/kg BWで胸部側面領域に注射した。血中レベルを、ELISAアッセイを使用して調べた。この目的を達成するために、ECL技術を使用した。この方法の定量下限（LLOQ）が4μg/lであった。
【０３８５】
<方法>
[PSMA-BiTE分子の製造]
BiTE分子、より具体的にはPSMA-BiTE分子を製造するための方法が、例えば、国際公開第2010037836(A2)号に記載される。
【０３８６】
最初に、PSMA-BiTE1をコードする組換えBiTE DNA構築物(コンストラクト)を、好適な発現ベクターに組み込み、それによって真核生物CHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞に安定的に導入した。トランスフェクションされたCHO細胞を、好適な培養培地を伴うバイオリアクターで培養し、分泌されたタンパク質を細胞のろ過によって分離した。BiTE分子の精製は、緩衝剤物質をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によってTRISおよびリン酸塩により置き換えること、ならびに、限外ろ過および透析ろ過によるその後の濃縮を含んだ。加えて、ポリオール（好ましくはトレハロース）および湿潤化剤（好ましくはポリソルベート80）を加えた。組成物を−60℃未満で貯蔵した。
【０３８７】
[示差走査蛍光測定法（DSF）]
PSMA-BiTE1分子の（例えば、剪断応力の後での）安定性に関する測定を、7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を使用して行った。種々のPSMA-BiTE1濃度物（0.15mg/ml〜0.005mg/mlの間）を96ウエルプレート（マイクロタイタープレート）において蛍光性色素（例えば、「Sypro（登録商標）Orange 5000」）と混合し、PCRシステム（7500 Fast Real-Time PCR System、Applied Biosystems）で測定した。温度を20℃から90℃に上げた。タンパク質の融解点を蛍光検出により確認した（これは、蛍光性色素がタンパク質の疎水性領域と反応するときに温度依存的様式で生じる）。
【０３８８】
[示差走査熱量測定法（DSC）]
PSMA-BiTE1分子の熱変性（thermal unfolding）温度（Tm）をDSCによって確認した。この目的のために、サンプルを20℃から105℃に加熱し、ポリペプチドの融解点を、熱量計を使用して確認した。GE Healthcareから得られるVP-DSC装置を使用した。
【０３８９】
[撹拌ストレス]
サンプルを温度制御チャンバー（MMM、FrioCell 200）において実験室用振とう機（IKA、HS 260）での撹拌によってストレス付加した。撹拌の決定的に重要な品質パラメーターを300rpmおよび20℃において24時間後に確認した。
【０３９０】
[目視検査]
PSMA-BiTE溶液の安定性を、溶液を暗い背景のもとで保持し、目に見える粒子または濁度について調べることによって剪断応力の後で目視検査した。撹拌ストレス試験の後での透明な溶液は、二量体および／または多量体の形成がほとんどないか、または全くないことを示しており、これに対して、溶液の目に見える濁度は、二量体および／または多量体の大きい割合と相関する。
【０３９１】
[動的光散乱（DLS）]
動的光散乱は、溶解されたサンプルまたは懸濁されたサンプルに対するレーザーの散乱光を分析するための方法である。流体力学的半径を測定し、これにより、結果として、PSMA-BiTE1分子の凝集状態を推測することが可能になる。流体力学的半径を、Horiba LB 550（Retsch Technology）を使用して測定した。
【０３９２】
[タンパク質含有量の決定]
タンパク質含有量を、Nanodrop 2000（Thermo Scientific）を使用して280nmにおいて分光法により測定した。すべてのサンプルを、対応するプラシーボ溶液または緩衝剤溶液に対して測定した。
【０３９３】
それぞれのサンプル溶液をNanodrop装置の測定区画に3回ピペット注入し（2μl）、それぞれの場合において二連で測定した；その後、これらの測定された値（n＝6）を平均化した。タンパク質含有量［mg/ml］を、平均化された測定値から、以前に作製されたタンパク質校正関数（タンパク質含有量に関しての吸収の依存性）により計算した。
【０３９４】
[電気化学発光測定（ECLアッセイ）]
この方法のために、電気化学的刺激の後で発光するSULFO-TAG（商標）標識を使用した。刺激を、いわゆるMULTI-ARRAYマイクロプレートの電極の表面で行った。発光を、検出器を使用しておよそ620nmにおいて測定した。
【０３９５】
測定は、溶液中のPSMA-BiTE1分子がポリクローナルなヤギ抗PSMA-BiTE1抗体によってマイクロプレートに固定化された「サンドイッチ」法に基づいていた。Penta-His-ビオチンをその後、固定化されたBiTE分子に結合させ、SULFO-TAG（商標）コンジュゲート化ストレプトアビジンによって検出した。サンプルを、Sector Imager 2400で読み取った。
【０３９６】
[サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）]
単量体および二量体、ならびに、同様に、低分子量（LMW）画分および高分子量（HMW）画分の割合を求めるために、サイズ排除クロマトグラフィーを、HPLCシステムを使用して行った。測定を、蛍光検出器を使用して行い、計算を面積百分率法によって行った。使用されるカラムは、タンパク質のSECのための標準的なカラムであり、例えば、Tosoh Biosep TSKゲルG3000 SWXL（5μm、300mm（長さ）×7.8mm(内径).）、または、同等物であった。
【０３９７】
[静脈投与および皮下投与の後における血清中のPSMA-BiTE1濃度の決定]
カニクイザルの血清におけるPSMA-BiTE1の濃度をELISAによって測定した。検出を電気化学発光によって行った。検出限界（LLOQ）が0.98μg/lであり、精度が3％〜28％であり、正確度が70％〜100％であった。
【０３９８】
[セルベース活性アッセイ]
セルベースの細胞傷害性アッセイを、PSMA-BiTE1サンプルの相対的活性を求めるための常法的アッセイとして使用する。ヒト／カニクイザルのCD3陽性細胞およびヒト／カニクイザルのPSMA陽性細胞に対するPSMA-BiTE1の二重特異性結合のために、標的細胞のT細胞媒介溶解がT細胞（エフェクター細胞）の活性化の後で生じる。
【０３９９】
細胞傷害性を、Promegaから得られる発光性のCytoTox-Glo Cytotoxicity Assayによって検出する。ここで使用される測定された値は、放出される光シグナルの量であり、これは瀕死細胞の数と相関する。さらなる活性アッセイが国際公開第2010037836(A2)号に記載される。
【０４００】
[PSMA-BiTE1サンプルの相対的活性を求めるためのセルベースの細胞傷害性アッセイ]
(装置および材料)
1．クリーンベンチ
2．細胞培養インキュベーター
3．顕微鏡
4．細胞計数器、例えば、血球計数器
5．96ウエルU底プレート、透明（例えば、Greiner Bio-one）
6．96ウエル平底プレート、白色（例えば、Nunc、3058078）
7．細胞培養フラスコ
8．マルチプレート測定装置
(試薬)
1．エフェクター細胞、例えば、MC15
2．標的細胞、例えば、C4-2
3．0.4％トリパンブルー
4．ペニシリン−ストレプトマイシン
5．L-グルタミン（200mM）
6．インターロイキン2
7．培地−MC15：Advanced RPMI1640
8．胎児ウシ血清（FCS）、例えば、Gibco 10270106
9．PBS、例えば、Gibco 20012
10．培地−C4-2：L-グルタミンを伴うPRMI1640、例えば、Gibco 11835063
11．検出試薬、例えば、CytoTox Glo、Promega G9291
(生育培地)
MC15細胞のための培地、例えば
900mlのAdvanced RPMI1640
＋100mlのFCS
＋10mlのペニシリン−ストレプトマイシン
＋10mlのL-グルタミン（200mM）
＋10μl〜20μlの［100U/ml〜200U/ml］インターロイキン2
C4-2細胞のための培地、例えば
900mlのL-グルタミン含有RPMI1640
＋100mlのFCS
＋10mlのペニシリン−ストレプトマイシン
(アッセイ培地)
アッセイ培地、例えば
900mlのL-グルタミン含有RPMI1640
＋100mlのFCS
(MC15細胞培養の開始)
アッセイ用の細胞を液体窒素中で保った。細胞を37℃で急速解凍した。その後、細胞を15mlの冷培地に再懸濁し、10分間インキュベーションした。その後、細胞を、例えば、700gで7分間、遠心分離し、上清を捨て、ペレットを10mlの生育培地に再懸濁した。
細胞を、およそ3日間〜4日間、37℃および5％CO2でインキュベーションした。
(MC15の継代培養)
培養液から得られる生細胞のアリコートを計数する。
170gで7分間遠心分離する。
上清を捨て、ペレットを0.5×106細胞/ml〜1.5×106細胞/mlの濃度に生育培地により調節する。細胞は1週間あたり2回〜3回、継代しなければならない。
(C4-2細胞培養の開始)
アッセイ用の細胞を液体窒素中で保つ。細胞を37℃で急速解凍する。その後、細胞を20mlの培地に再懸濁する。その後、遠心分離を、例えば、700gで7分間行う。上清を捨て、ペレットを10mlの生育培地に再懸濁する。
細胞を、およそ3日間〜4日間、37℃および5％CO2でインキュベーションする。
(C4-2の継代培養)
培地をフラスコから取り出し、捨てる。
細胞層を10mlのPBSにより注意深くすすぐ。
2ml〜3mlのトリプシンを加え、細胞層が剥離するまで37℃でインキュベーションする（およそ5分〜15分）。
10mlの培地を加え、細胞を溶解する。
遠心分離を、例えば、170gで7分間行う。
上清を捨て、ペレットを10mlの生育培地に再懸濁し、細胞を計数し、細胞を好適な密度に培地により調節する。
細胞を、およそ3日間〜5日間、37℃および5％CO2でインキュベーションする。細胞は1週間につき1回〜2回、継代しなければならない。
(アッセイのための細胞の調製)
細胞を上記のように剥離させる。
エフェクター細胞（MC15）を2×10E6細胞/mlの濃度にアッセイ培地において調節する。
標的細胞（C4-2）を4×10E5細胞/mlの濃度にアッセイ培地において調節する。
等体積の標的細胞およびエフェクター細胞を1:1混合する（細胞混合物）。
(サンプル、アッセイコントロールおよび参照物質の調製)
サンプル、アッセイコントロールおよび参照物質（RF）を室温に平衡化し、十分に混合し、それらをすべて、同じ第1の濃度（V1；例えば、500ng/ml）にアッセイ培地により調節する。その後、連続希釈（例えば、1:6、n＝7）を、最良適合の用量反応曲線を得るためにアッセイ培地を使用して行う。
(試験手順)
サンプル、アッセイコントロールおよび参照物質の添加
サンプル、アッセイコントロールおよび参照物質のアリコート（例えば、25μl）を96ウエル平底プレートの対応するウエルに移す。
細胞混合物（例えば、50μl）を96ウエル平底プレートの各ウエルに移す。
プレートを、例えば、400rpmで1分間、撹拌する。
プレートを37℃および5％CO2で16h〜24hインキュベーションする。
(細胞傷害性および相対的活性の決定)
(検出試薬の添加および測定)
試薬の希釈および添加、ならびに、同様に、その後の測定を、製造者（例えば、CytoTox-Glo、Promega）からの説明書に従って行う。
ウエルあたり15μlの試薬を加える。
プレートを、例えば、400rpmで1分間、撹拌する。
室温でおよそ15分間インキュベーションする。
発光を、好適なマルチプレート測定装置を使用して測定する。
(評価)
(最良適合曲線)
それぞれの濃度における平均測定値を、サンプル、アッセイコントロールおよび参照物質の反復試験物について求める。
用量応答曲線を、サンプル、アッセイコントロールおよび参照物質のそれぞれの系列について描く。この目的のために、平均測定値を、BAY2010112の最終濃度（例えば、500000pg/ml〜1.79pg/ml）に対してプロットする。
好適な最良適合曲線を、サンプル、アッセイコントロールおよび参照物質の濃度レベルの平均測定値により当てはめる。
(相対的活性（決定）)
サンプルと参照物質との活性比を求め、記録する。統計学的ソフトウエアを使用することができる。
(判定)
参照物質と比較されるサンプルの相対的活性は仕様書に対応しなければならない。
【０４０１】
[PSMA-BiTE1ポリペプチドの濃度の決定（UV/VIS分光法）]
本方法は欧州薬局方（Ph. Eur.、2.2.25、280nmにおけるUV-VIS分光法）に従って行われ、他の分子の濃度を求めるためにもまた好適である。
【０４０２】
最初に、PSMA-BiTE1分子の吸光係数を実験的に求めた。この目的を達成するために、既知PSMA-BiTE1濃度の溶液の吸光度を求めた（この場合、濃度（mol/lの単位で）がPSMA-BiTE1分子のモル質量（1.8673×105g/mol）に基づいて確立される）。吸光度、経路長および濃度に基づいて、PSMA-BiTE1分子の吸光係数を下記の式に従って計算することが可能であった：
e＝A／c×d、式中、
A＝好適な波長（この場合には280nm）における吸光度（または吸収、ただし、光散乱は無視する）
c＝濃度（mol/l）
d＝経路長（mm）。
【０４０３】
その後、吸光度値をx軸における関連濃度に対してy軸にプロットして、標準曲線を得た。これらの標準曲線を使用した場合、続いて、PSMA-BiTE1溶液の濃度を吸光度に基づいて直接に読み取ることが可能であった。
【０４０４】
上述の標準曲線を作成するために、ベール・ランベルトの法則が、測定される溶液に対して適用可能でなければならない。すなわち、とりわけ、吸収性物質が溶液に均一に分布されなければならず、また、測定されるスペクトル範囲の範囲内における吸収係数の変動が無視可能でなければならず、また、測定される溶液は、相互作用に関連した変動が生じないように十分に低い濃度に濃縮されなければならない。
【０４０５】
分子の吸光係数を使用する場合、タンパク質濃度（mol/lの単位で）はまた、下記の式に従って、測定された吸光度（または280nmにおける吸収）に基づいて逆に計算することができる：
タンパク質濃度［mol/l］＝A×V／e×d、式中、
A＝280nmにおける吸収
d＝セル長（cm）（標準セル、1.00cm）
V＝試験溶液の希釈度
e＝280nmにおけるPSMA-BiTE1の吸光係数＝111315M-1×cm-1。
【配列表】
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