(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＲＳ−１発現阻害剤と少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、皮膚疾患の治療に使用するための医薬組成物であって、
前記ＩＲＳ−１発現阻害剤が、ＩＲＳ−１のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはアプタマーであり、
前記皮膚疾患が、血管新生、炎症および／またはケラチノサイトの増殖によって引き起こされる皮膚疾患である、
医薬組成物。
【請求項２】
油性軟膏である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを０．１〜５ｍｇ／ｇの範囲の量で含み、
１日に少なくとも１回投与される、
請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１の少なくとも１２個のヌクレオチドからなる配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２の配列、または配列番号２と比較して少なくとも９０％の同一性を有し且つ配列番号２として血管新生および／または炎症を阻害する能力を保存している９〜５０個のヌクレオチドからなる任意の機能保存配列、を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号２の配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記機能保存配列は、配列番号３〜配列番号２１を含む群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３の配列を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
局所投与に適した形態である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
経皮組成物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、血管新生、炎症および／またはケラチノサイトの増殖によって引き起こされる皮膚疾患の治療に使用するための医薬。
【請求項１２】
前記皮膚疾患は、座瘡、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬および酒さを含む一覧から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＩＲＳ−１発現阻害剤を含む経皮組成物であって、
前記ＩＲＳ−１発現阻害剤が、ＩＲＳ−１のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはアプタマーである、経皮組成物。
【請求項１４】
前記経皮組成物は軟膏であるか、または油性軟膏である、請求項１３に記載の経皮組成物。
【請求項１５】
前記ＩＲＳ−１発現阻害剤は、前記経皮組成物中に０．１〜５ｍｇ／ｇの範囲の量で含まれるＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３または１４に記載の経皮組成物。
【請求項１６】
担体、乳化剤、硬化剤、レオロジー改質剤または増粘剤、界面活性剤、皮膚軟化剤、防腐剤、湿潤剤、緩衝剤、溶媒、保湿剤および安定化剤を含む一覧から選択される賦形剤をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の経皮組成物。
【請求項１７】
ＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドとワセリン油およびパラフィン油とを含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の経皮組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚疾患の治療に関する。より具体的には、本発明は、皮膚疾患、好ましくは、血管新生性および／または炎症性皮膚疾患（例えば乾癬）の治療に使用される局所組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬は、欧米諸国の人口のおよそ２％に生じる一般的な皮膚疾患である。この皮膚疾患は、紅斑、硬結および落屑を特徴とし、最も一般的には、鱗屑で覆われた境界が明らかな紅斑性の丘疹およびプラークとして現れる。
【０００３】
乾癬は、慢性炎症を伴う自己免疫性皮膚疾患である。未知の抗原の存在により、皮膚に侵入し、かつＴＮＦαを含む異なる種類のサイトカインを産生することにより発病プロセスを開始するエフェクターＴ細胞が生じる。乾癬病変部は、血管新生の増加および血管リモデリングも特徴とする。さらに、ケラチノサイトの増殖および分化の増加は、乾癬皮膚の落屑局面の原因にもなり得る。
【０００４】
従って、乾癬の発病機序には、（１）血管新生、（２）炎症および（３）ケラチノサイトの過剰増殖という３つの異なる経路が関与している。従って、乾癬を効率的に治療するためには、これらの３つの経路を制御する化合物または組成物が必要である。
【０００５】
インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）は、血管新生に関与する細胞質ドッキングタンパク質であり、インスリン受容体、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）受容体、プロラクチン受容体、成長ホルモン（ＧＨ）受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、インテグリン受容体ファミリーのメンバーおよびサイトカイン受容体などの活性化された細胞表面受容体の下流の重要なシグナル伝達中間体として機能する。従って、ＩＲＳ−１の阻害は、血管新生を阻害する有望な方法である。
【０００６】
ＧＳ−１０１（ＷＨＯ国際一般的名称：Ａｇａｎｉｒｓｅｎ）というインスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血管新生を阻害するのに有用なものとして欧州特許第１４０９６７２号に記載されている。
【０００７】
驚くべきことに、本発明者らは、ＧＳ−１０１が皮膚の血管新生を阻害するだけでなく、乾癬皮膚内のケラチノサイトの過剰増殖および炎症も阻害することを証明し、ＧＳ−１０１を抗乾癬剤として有望な候補として位置づけた。
【０００８】
乾癬は、紅斑性プラークを伴う皮膚疾患であるため、医薬品に最も適した投与経路は、皮膚への局所塗布すなわち経皮投与である。しかし、角質層のバリア機能により、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの巨大分子の皮膚浸透は乏しい。
【０００９】
驚くべきことに、本発明者らは、乾癬皮膚に対するＧＳ−１０１の経皮投与により、治療的有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドが表皮および真皮細胞の両方の中に浸透することも証明した。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的の１つは、皮膚疾患の治療のためのＩＲＳ−１発現阻害剤である。
【００１１】
一実施形態では、前記阻害剤は、ＩＲＳ−１のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはアプタマーである。
【００１２】
別の実施形態では、前記阻害剤は、配列番号１の少なくとも１２個のヌクレオチドからなる配列を有するＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１３】
別の実施形態では、前記ＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号２と比較して少なくとも７５％の同一性を有し、かつ配列番号２として血管新生および／または炎症を阻害する能力を保存している９〜５０個のヌクレオチドからなる任意の機能保存配列を有する。
【００１４】
別の実施形態では、前記機能保存配列は、配列番号３〜配列番号２１を含む群から選択される。
【００１５】
本発明の別の目的は、血管新生性および／または炎症性皮膚疾患を治療するための上記阻害剤を含む、皮膚疾患を治療するための組成物である。
【００１６】
一実施形態では、前記組成物は、局所投与に適した形態である。
【００１７】
別の実施形態では、前記組成物は経皮組成物である。
【００１８】
本発明の別の目的は、上記阻害剤または上記組成物と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、皮膚疾患を治療するための医薬組成物である。
【００１９】
本発明の別の目的は、上記阻害剤または上記組成物を含む皮膚疾患を治療するための薬である。
【００２０】
一実施形態では、前記皮膚疾患は、座瘡、日光角化症、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、褥瘡性潰瘍（床擦れ）、湿疹、紅皮症、血管腫（例えば、幼児期の血管腫など）、肥厚性瘢痕、扁平苔癬、苔癬様疾患、リンパ脈管新生、乾癬、化膿性肉芽腫、伝染性軟属腫、神経線維腫症、酒さ、劣性栄養障害性表皮水泡症、瘢痕（ケロイド）、強皮症、脂漏性角化症、皮膚癌（例えば、血管肉腫、基底細胞癌、血管内皮腫、カポジ肉腫、悪性黒色腫、黒色腫、扁平上皮癌など）、皮膚潰瘍、自家移植および同種移植などの皮膚移植後の皮膚損傷、スティーブンス・ジョンソン症候群および中毒性表皮壊死症、スタージ・ウェーバー症候群、結節性硬化症、静脈性潰瘍、尋常性疣贅、疣贅（例えば、ウイルス性疣贅など）、創傷、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、膿痂疹、皮膚の膿瘍、せつ・よう、蜂巣炎、急性リンパ節炎、毛巣嚢胞、皮膚および皮下組織の他の局所感染、天疱瘡および他の棘融解性疾患、類天疱瘡、他の水疱性疾患、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、おむつ（ナプキン）皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、詳細不明の接触皮膚炎、剥離性皮膚炎、内服した物質による皮膚炎、慢性単純性苔癬および痒疹、掻痒、他の皮膚炎、乾癬、類乾癬、バラ色粃糠疹、扁平苔癬、丘疹鱗屑性疾患、蕁麻疹、多形性紅斑、結節性紅斑、他の紅斑性病態、紅斑、日焼け、紫外線による他の急性の皮膚変化、非電離放射線に対する慢性曝露による皮膚変化、放射線皮膚炎、放射線に関連する皮膚および皮下組織の他の疾患、瘢痕性脱毛症、座瘡、酒さ、皮膚および皮下組織の濾胞性嚢胞、他の濾胞性疾患、エクリン汗腺疾患、アポクリン汗腺疾患、脂漏性角化症、黒色表皮症、角皮症、壊疽性膿皮症、褥瘡性潰瘍および圧迫領域、皮膚の萎縮性疾患、皮膚の肥厚性疾患、皮膚および皮下組織の肉芽腫性疾患、紅斑性狼蒼、他の局所化結合組織疾患、皮膚限定脈管炎、下肢の潰瘍、皮膚および皮下組織の他の疾患を含む一覧から選択され、好ましくは乾癬である。
【００２１】
本発明の別の目的は、ＩＲＳ−１阻害剤を含む経皮組成物である。
【００２２】
一実施形態では、前記経皮組成物は軟膏であり、好ましくは油性軟膏である。
【００２３】
別の実施形態では、前記経皮組成物は、賦形剤、好ましくは担体、乳化剤、硬化剤、レオロジー改質剤または増粘剤、界面活性剤、皮膚軟化剤、防腐剤、湿潤剤、緩衝剤、溶媒、保湿剤および安定化剤を含む一覧の中から選択される賦形剤をさらに含む。
【００２４】
別の実施形態では、前記経皮組成物は、ＩＲＳ−１阻害剤と、油（好ましくはワセリン油およびパラフィン油）とを含む。
【００２５】
定義
本発明では、以下の用語は、以下の意味を有する。
【００２６】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、動物（好ましくはヒト）に投与された際に、副作用、アレルギー反応または他の有害反応を生じない賦形剤である。賦形剤としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆物、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。ヒトへの投与では、製剤は、食品医薬品局生物製剤(FDA Office of Biologics)基準によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度基準を満たすものでなければならない。
【００２７】
「局所投与」は、組成物の局所的効果のための目的部位（例えば皮膚）への直接的な送達、投与または塗布を特徴とする。好ましくは、局所投与は、組成物の成分を対象の血流に顕著に吸収させることなく達成する（全身作用を回避するため）。一実施形態では、目的部位が皮膚である場合、本組成物を皮膚に直接（すなわち「経皮投与」によって）投与してもよい。
【００２８】
「治療」とは、臓器、組織または細胞機能の欠損または欠如を伴う疾患、障害または病気の少なくとも１つの有害作用または症状を予防（すなわち、生じないようにする）、減少または緩和することである。従って、「治療」という用語は、治療的処置および予防的処置の両方を指し、ここでは、その目的は、病的な状態または疾患を予防または減速させる（和らげる）ことである。本発明の一実施形態では、治療を必要とするものとしては、疾患に既に罹患しているものならびに疾患に罹患しやすいものまたは疾患が予防されるべきものが挙げられる。一実施形態では、皮膚疾患が乾癬である場合、疾患の治療は、乾癬皮膚病変部の直径を小さくすることに相当するであろう。
【００２９】
「治療的有効量」とは、（ｉ）疾患または病気の１つ以上の症状の進行、激化または悪化を減速または停止させる、（ｉｉ）疾患または病気の症状を緩和する、または（ｉｉｉ）疾患または病気を治癒または治療するのに必要かつ十分な治療薬の量である。
【００３０】
数字の前の「約」は、前記数の値の±１０％を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、皮膚疾患、好ましくは血管新生性および／または炎症性皮膚疾患を治療するための、またはその治療に使用されるＩＲＳ−１阻害剤に関する。
【００３２】
一実施形態によれば、本ＩＲＳ−１阻害剤は、ＩＲＳ−１発現阻害剤である。ＩＲＳ−１発現阻害剤の例としては、ＩＲＳ−１のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡザイム、分解耐性ポリヌクレオシドアミド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）および他の核酸塩基含有ポリマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはアプタマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
一実施形態によれば、前記ＩＲＳ−１阻害剤は、（ＩＲＳ−１）アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
一実施形態によれば、ＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１：５’−ＴＡＧＴＡＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＡＧＴＡＣＧＡＡＧＡＡＧＣＧＴＴＴＧＴＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧＣＧＣＡＧＧＴＡＧＣＣＣＡＣＣＴＴＧＣＧＣＡＣＧＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧ−３’の少なくとも１２個のヌクレオチドからなる配列である。
【００３５】
一実施形態では、ＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１の少なくとも１２個の隣接するヌクレオチド、好ましくは、配列番号１の少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個の隣接するヌクレオチドからなる配列である。
【００３６】
一実施形態によれば、ＩＲＳ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＳ−１０１である。本発明によれば、ＧＳ−１０１は、配列番号２：５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’または配列番号２と比較して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９５％超、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、かつ配列番号２として血管新生および／または炎症および／またはケラチノサイトの過剰増殖を阻害する能力を保存している９〜５０、１５〜４５、２０〜４０、２５〜３０個のヌクレオチドからなる任意の機能保存配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３７】
「同一性」または「同一の」という用語は、２つ以上のヌクレオチド配列間の関係において使用されている場合、２つ以上の塩基からなる配列間の一致数によって決定されるヌクレオチド配列間の配列関連性(sequence relatedness)の程度を指す。「同一性」とは、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって扱われるギャップアラインメント（存在すれば）を有する２つ以上の配列のより短い配列間の完全な一致率の尺度である。関連するヌクレオチド配列の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法としては、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988、Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993、Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987、Sequence Analysis primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991およびCarillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるように設計されている。同一性の決定方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記述されている。好ましいコンピュータプログラムによる２つの配列間の同一性の決定方法としては、ＧＡＰ（Devereux et al., Nucl.Acid.Res.12: 387 (1984)、Genetics Computer Group、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ(Altschul et al., J.MoI. Biol. 215, 403-410 (1990))などのＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の提供源（BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH, メリーランド州ベセズダ, 20894、Altschul et al.、上記）から公的に入手可能である。また、周知のSmith Watermanアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。
【００３８】
配列番号２の機能保存配列の例は、配列番号３（５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’）である。配列番号２の機能保存配列の他の例は、以下の配列である。
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号４）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号５）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴ−３’（配列番号６）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号７）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号８）
５’−ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号９）
５’−ＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１０）
５’−ＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１１）
５’−ＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１２）
５’−ＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１３）
５’−ＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１４）
５’−ＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１５）
５’−ＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１６）
５’−ＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１７）
５’−ＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１８）
５’−ＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１９）
５’−ＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号２０）
５’−ＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号２１）
【００３９】
一実施形態によれば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５または５０個のヌクレオチドからなる前記機能保存配列は、Ｃ末端および／またはＮ末端にさらなる核酸を有する配列番号２または配列番号３であってもよい。前記機能保存配列は、配列番号２または配列番号３の９〜１２個の隣接するヌクレオチドからなる断片であってもよい。
【００４０】
本発明のＩＲＳ−１阻害剤で治療することができる皮膚疾患の例としては、座瘡、日光角化症、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、褥瘡性潰瘍（床擦れ）、湿疹、紅皮症、血管腫（例えば、幼児期の血管腫など）、肥厚性瘢痕、扁平苔癬、苔癬様疾患、リンパ脈管新生、乾癬、化膿性肉芽腫、伝染性軟属腫、神経線維腫症、酒さ、劣性栄養障害性表皮水泡症、瘢痕（ケロイド）、強皮症、脂漏性角化症、皮膚癌（例えば、血管肉腫、基底細胞癌、血管内皮腫、カポジ肉腫、悪性黒色腫、黒色腫、扁平上皮癌など）、皮膚潰瘍、自家移植および同種移植などの皮膚移植後の皮膚損傷、スティーブンス・ジョンソン症候群および中毒性表皮壊死症、スタージ・ウェーバー症候群、結節性硬化症、静脈性潰瘍、尋常性疣贅、疣贅（例えば、ウイルス性疣贅など）、創傷などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明の一実施形態では、皮膚疾患は、真皮の炎症性疾患である。真皮の炎症性疾患の例としては、乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、紅皮症乾癬、急性熱性好中球性皮膚症、湿疹、皮脂欠乏性湿疹、異汗性湿疹、汗疱状湿疹、尋常性座瘡、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、皮膚筋炎、剥離性皮膚炎、手湿疹、汗疱、酒さ、サルコイドーシスによって引き起こされた酒さ、強皮症によって引き起こされた酒さ、スウィート症候群によって引き起こされた酒さ、全身性エリテマトーデスによって引き起こされた酒さ、蕁麻疹によって引き起こされた酒さ、帯状疱疹関連痛によって引き起こされた酒さ、スウィート病、好中球性汗腺炎、無菌性膿疱症、薬疹、脂漏性皮膚炎、バラ色粃糠疹、皮膚の菊池病、妊娠性掻痒性蕁麻疹様丘疹、スティーブンス・ジョンソン症候群および中毒性表皮壊死症、入れ墨反応、ウェルズ症候群（好酸球性蜂巣炎）、反応性関節炎（ライター症候群）、腸関連皮膚病−関節炎症候群、リウマチ様好中球性皮膚症、好中球性エクリン汗腺炎、手の甲の好中球性皮膚症、形質細胞限局性亀頭炎、亀頭包皮炎、ベーチェット病、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、手皮膚炎、光沢苔癬、扁平苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、貨幣状皮膚炎、壊疽性膿皮症、サルコイドーシス、角層下膿疱性皮膚症、蕁麻疹および一過性棘融解性皮膚症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、皮膚疾患は、増殖性皮膚疾患であり、ここでは、増殖性皮膚疾患は、表皮または真皮における細胞分裂の加速を特徴とする疾患である。増殖性皮膚疾患の例としては、乾癬、アトピー性皮膚炎、詳細不明の皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、皮膚の基底および扁平上皮細胞癌、葉状魚鱗癬、表皮剥離性角化症、前癌性角化症、座瘡および脂漏性皮膚炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明の一実施形態では、本発明の組成物は、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、膿痂疹、皮膚の膿瘍、せつ・よう、蜂巣炎、急性リンパ節炎、毛巣嚢胞、皮膚および皮下組織の他の局所感染、天疱瘡および他の棘融解性疾患、類天疱瘡、他の水疱性疾患、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、おむつ（ナプキン）皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、詳細不明の接触皮膚炎、剥離性皮膚炎、内服した物質による皮膚炎、慢性単純性苔癬および痒疹、掻痒、他の皮膚炎、乾癬、類乾癬、バラ色粃糠疹、扁平苔癬、丘疹鱗屑性疾患、蕁麻疹、多形性紅斑、結節性紅斑、他の紅斑性病態、紅斑、日焼け、紫外線による他の急性の皮膚変化、非電離放射線に対する慢性曝露による皮膚変化、放射線皮膚炎、放射線に関連する皮膚および皮下組織の他の疾患、瘢痕性脱毛症、座瘡、酒さ、皮膚および皮下組織の濾胞性嚢胞、他の濾胞性疾患、エクリン汗腺疾患、アポクリン汗腺疾患、脂漏性角化症、黒色表皮症、角皮症、壊疽性膿皮症、褥瘡性潰瘍および圧迫領域、皮膚の萎縮性疾患、皮膚の肥厚性疾患、皮膚および皮下組織の肉芽腫性疾患、紅斑性狼蒼、他の局所化結合組織疾患、皮膚限定脈管炎、下肢の潰瘍、皮膚および皮下組織の他の疾患を含む一覧から選択される皮膚疾患を治療するためのものである。
【００４４】
一実施形態では、本発明の組成物は、乾癬、座瘡、酒さ、湿疹およびアトピー性皮膚炎から選択される皮膚疾患を治療するためのものであり、好ましくは、前記疾患は乾癬である。
【００４５】
本発明は、好ましくは局所投与に適した形態、より好ましくは経皮投与に適した形態である、皮膚疾患を治療するための、またはその治療に使用されるＩＲＳ−１阻害剤を含む組成物にも関する。
【００４６】
本発明は、好ましくは局所投与に適した形態、より好ましくは経皮投与に適した形態である、皮膚疾患を治療するためのＩＲＳ−１阻害剤からなる組成物にも関する。
【００４７】
本発明は、好ましくは局所投与に適した形態、より好ましくは経皮投与に適した形態である、本質的に皮膚疾患を治療するためのＩＲＳ−１阻害剤からなる組成物にも関する。
【００４８】
本発明は、本発明のＩＲＳ−１阻害剤または組成物と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物にも関する。
【００４９】
本発明は、本発明のＩＲＳ−１阻害剤または組成物を含む薬にも関する。
【００５０】
一実施形態では、本発明の組成物は、治療的有効量のＩＲＳ−１阻害剤を含む。
【００５１】
一実施形態によれば、上記ＩＲＳ−１阻害剤は、約０．０１ｍｇ／ｇ〜約５０ｍｇ／ｇ、好ましくは約０．０５ｍｇ／ｇ〜約１０ｍｇ／ｇ、より好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｇ、さらにより好ましくは約０．５ｍｇ／ｇ〜約２ｍｇ／ｇの範囲の濃度で本発明の組成物中に存在する。一実施形態では、本ＩＲＳ−１阻害剤は、約０．５ｍｇ／ｇ〜約１ｍｇ／ｇ、好ましくは約０．７５ｍｇ／ｇ〜約０．９ｍｇ／ｇの範囲の濃度、より好ましくは約０．８６ｍｇ／ｇの濃度で本発明の組成物中に存在する。別の実施形態では、本ＩＲＳ−１阻害剤は、約１ｍｇ／ｇ〜約２ｍｇ／ｇ、好ましくは約１．５ｍｇ／ｇ〜約１．８ｍｇ／ｇの範囲の濃度、より好ましくは約１．７２ｍｇ／ｇの濃度で本発明の組成物中に存在する。
【００５２】
一実施形態によれば、上記ＩＲＳ−１阻害剤は、約０．１％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗ、好ましくは約０．５％ｗ／ｗ〜約２．５％ｗ／ｗ、好ましくは約０．７５％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗ、より好ましくは約０．８６％ｗ／ｗ〜０．１７２％ｗ／ｗの範囲の量で本発明の組成物中に存在する。
【００５３】
本発明の一実施形態では、本組成物は、局所投与に適した形態である。
【００５４】
本発明の一実施形態では、本組成物は、真皮局所投与すなわち経皮投与に適した形態である。
【００５５】
例えば、経皮投与などの局所投与に適した製剤の例としては、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、パッチ（例えば、経皮パッチなど）、ゲル剤、リポソーム製剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明は、上記ＩＲＳ−１阻害剤を含む経皮組成物にも関する。本明細書で使用される経皮組成物とは、経皮投与に適した組成物を指す。
【００５７】
本発明の一実施形態では、経皮組成物は、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、パッチ、フォーム剤、ローション剤、エマルション（マクロエマルション、マイクロエマルションまたはナノエマルション）、例えば、経皮パッチ、ゲル剤、リポソーム製剤などである。好ましくは、本発明の経皮組成物は、軟膏である。
【００５８】
本発明の一実施形態では、軟膏は、油性軟膏、乳化軟膏（例えば、水中油型もしくは油中水型軟膏など）または水溶性軟膏であり、好ましくは、油性軟膏である。
【００５９】
本発明の一実施形態では、油性軟膏は、例えば、植物および動物油、植物性および動物性脂肪、ワックス、ワセリン（例えば、白色ワセリンまたはワセリン油など）およびパラフィン（例えば、液体パラフィンまたはパラフィン油など）などの基剤を使用する。
【００６０】
本発明の一実施形態では、本経皮組成物は、１種以上の賦形剤をさらに含む。好適な薬学的に許容される賦形剤は、当業者によく知られている。好適な賦形剤の例としては、担体、乳化剤、硬化剤、レオロジー改質剤または増粘剤、界面活性剤、皮膚軟化剤、防腐剤、湿潤剤、緩衝剤、溶媒、保湿剤および安定化剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
担体の例としては、水、緩衝生理食塩水、ワセリン（Ｖａｓｅｌｉｎｅ、白色ワセリンとしても知られている）、ペトロラタム、油（例えば、鉱油、植物油、動物油、パラフィン油、ヒマシ油またはワセリン油など）、有機および無機ワックス（例えば、微結晶性ワックス、パラフィンワックス、蜜蝋およびオゾケライトワックスなど）、天然ポリマー（例えば、キサンタンガム、ゼラチン、セルロース、コラーゲン、澱粉またはアラビアゴムなど）、合成ポリマー、アルコール類、ポリオール類などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態では、担体は、乳化剤、油相成分および水相成分を含むクリーム基剤である。
【００６２】
周知の軟膏またはローションの基剤（賦形剤）の例としては、ワセリン、プラスチベース（商標）（ポリエチレン（平均分子量：約２１０００Ｄａ）および液体パラフィンを用いて調製された基剤）またはＥＳＭＡ−Ｐ（商標）（微結晶性ワックスで調製）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
乳化剤の例としては、セチルアルコール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、カルボキシポリメチレン、ポリカルボフィル、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、ポリオキシエチレンおよび、単独または脂肪アルコール類（例えば、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびセトステアリルアルコールなど）と組み合わせた例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのその誘導体ならびにソルビタンエステル（例えば、ソルビタン脂肪酸エステルなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
油相成分の例としては、ワセリン（例えば、白色ワセリン、黄色ワセリンまたはワセリン油など）、パラフィン（例えば、液体パラフィンまたはパラフィン油など）、ジメチコンおよびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
水相成分の例としては、水、グリセリンおよびプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
硬化剤の例としては、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコールおよびセチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
レオロジー改質剤または増粘剤の例としては、カルボマー（例えば、カーボポール（登録商標）など）およびポリオキシエチレン獣脂アミン（例えば、エトミーン（Ｅｔｈｏｍｅｅｎ（登録商標）など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
界面活性剤の例としては、アニオン性、カチオン性、両性および非イオン性界面活性剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウリル硫酸マグネシウム、ワックスまたはそれらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
皮膚軟化剤の例としては、白色または黄色ペトロラタム（白色または黄色ワセリン）、液体ペトロラタム（液体ワセリン）、パラフィンまたはアクアフォー（ａｑｕａｐｈｏｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
防腐剤の例としては、例えば、ニパギン（ヒドロキシ安息香酸メチル）、ニパソール（ｎｉｐａｓｏｌ）（ヒドロキシ安息香酸塩）、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベンカリウム、プロピルパラベンナトリウム、パラヒドロキシ安息香酸エステル、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸、パラベン、クロロブタノール、フェノール、チメロサール、安息香酸ナトリウムおよびベンジルアルコールなどの抗菌性防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
湿潤剤の例としては、プロピレングリコールおよびアルギン酸プロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
緩衝剤の例としては、水酸化ナトリウム、クエン酸および水酸化カリウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
溶媒の例としては、水、２−プロパノール、ベンジルアルコールおよびプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
保湿剤の例としては、グリセリン、鉱油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油およびワセリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
一実施形態では、本経皮組成物は、好適な添加剤を含む。好適な添加剤の例としては、ワセリン、プロピレングリコール、パラフィン、ワックス（例えば、蜜蝋など）、ポリエチレングリコールまたはそれらの混合物（例えば、マクロゴール（マクロゴールは異なる分子量のポリエチレングリコールからなる混合物である）など）、ステアリルアルコール、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸エステル（パラベン）、ゲル化炭化水素、クエン酸、スクアレン、ラノリン、グリセリン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、動物性および植物性脂肪、油、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
安定化剤の例としては、炭水化物（例えば、スクロース、ラクトースおよびトレハロースなど）、糖アルコール類（例えば、マンニトールおよびソルビトールなど）、アミノ酸（例えば、ヒスチジン、グリシン、フェニルアラニンおよびアルギニンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明の一実施形態では、本経皮組成物は軟膏であり、好ましくはＩＲＳ−１阻害剤と油（好ましくはパラフィン油およびワセリン油）とを含む油性軟膏である。本発明の別の実施形態では、本経皮組成物は、ＩＲＳ−１阻害剤と、油（好ましくはパラフィン油およびワセリン油）とからなる油性軟膏である。
【００７８】
一実施形態によれば、上記ＩＲＳ−１阻害剤は、本経皮組成物の総重量に対して約０．０１重量％〜約５０重量％、好ましくは約０．０５％ｗ／ｗ〜約１０％ｗ／ｗ、より好ましくは約０．１％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは約０．５％ｗ／ｗ〜約２．５％ｗ／ｗの範囲の濃度で本発明の組成物中に存在する。一実施形態では、本ＩＲＳ−１阻害剤は、約０．５％ｗ／ｗ〜約１％ｗ／ｗ、好ましくは約０．７５％ｗ／ｗ〜約０．９％ｗ／ｗの範囲の濃度、より好ましくは約０．８６％ｗ／ｗの濃度で本発明の組成物中に存在する。別の実施形態では、本ＩＲＳ−１阻害剤は、約１％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗ、好ましくは約１．５％ｗ／ｗ〜約１．８％ｗ／ｗの範囲の濃度、より好ましくは約１．７２％ｗ／ｗの濃度で本発明の組成物中に存在する。
【００７９】
一実施形態によれば、本発明の経皮組成物は、本経皮組成物の総重量に対して約５０重量％〜約９９．９９重量％、好ましくは約９０％ｗ／ｗ〜約９９．９５％ｗ／ｗ、より好ましくは約９５％ｗ／ｗ〜約９９．９％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは約９８％ｗ／ｗ〜約９９．５％ｗ／ｗの範囲の量で賦形剤を含む。
【００８０】
一実施形態によれば、本発明の経皮組成物は、本経皮組成物の総重量に対して約２５重量％〜約９０重量％、好ましくは約５０％ｗ／ｗ〜約７０％ｗ／ｗ、好ましくは約５５％ｗ／ｗ〜約６５％ｗ／ｗの範囲、より好ましくは約６０％ｗ／ｗの量でパラフィン油を含む。
【００８１】
一実施形態によれば、本発明の経皮組成物は、本経皮組成物の総重量に対して約１０重量％〜約７５重量％、好ましくは約３０％ｗ／ｗ〜約５０％ｗ／ｗ、好ましくは約３５％ｗ／ｗ〜約４５％ｗ／ｗの範囲、より好ましくは約４０％ｗ／ｗの量でワセリン油を含む。
【００８２】
本発明の一実施形態によれば、本経皮組成物は、約１：１０〜約１：０．１、好ましくは約１：５〜約１：０．３、より好ましくは約１：２〜約１：１の範囲、さらにより好ましくは約１：１．５のワセリン油：パラフィン油の比でワセリン油およびパラフィン油を含む。
【００８３】
本発明の一実施形態では、本経皮組成物は、ＩＲＳ−１阻害剤の皮膚への放出を制御し、かつＩＲＳ−１阻害剤の皮膚への接触時間を増加させるためにそれ自体を長時間にわたって皮膚に付着させるかその上に維持する送達システムを含む。持続放出または遅延放出に適した担体の例としては、ゼラチン、アラビアゴム、キサンタンガムポリマー、熱可塑性樹脂（例えば、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルエステル、ポリハロゲン化ビニリデンおよびハロゲン化ポリオレフィンなど）、エラストマー（例えば、ブラジリエンシス、ポリジエンおよびハロゲン化天然および合成ゴムなど）ならびにフレキシブルな熱硬化性樹脂（例えば、ポリウレタン、エポキシ樹脂など）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
一実施形態によれば、本発明の経皮組成物は、約０．０１ｍｇ／ｇ〜約５０ｍｇ／ｇ、好ましくは約０．０５ｍｇ／ｇ〜約１０ｍｇ／ｇ、より好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｇ、さらにより好ましくは約０．５ｍｇ／ｇ〜約２ｍｇ／ｇの濃度で上記ＩＲＳ−１阻害剤を含む。一実施形態では、本発明の経皮組成物は、約０．５ｍｇ／ｇ〜約１ｍｇ／ｇ、好ましくは約０．７５ｍｇ／ｇ〜約０．９ｍｇ／ｇの範囲の濃度、より好ましくは約０．８６ｍｇ／ｇの濃度でＩＲＳ−１阻害剤を含む。別の実施形態では、本発明の経皮組成物は、約１ｍｇ／ｇ〜約２ｍｇ／ｇ、好ましくは約１．５ｍｇ／ｇ〜約１．８ｍｇ／ｇの範囲の濃度、より好ましくは約１．７２ｍｇ／ｇの濃度でＩＲＳ−１阻害剤を含む。
【００８５】
本発明は、血管新生性および／または炎症性皮膚疾患を治療するための、またはその治療に使用される上記経皮組成物にも関する。
【００８６】
本発明者らは、本発明のＩＲＳ−１阻害剤の局所塗布により、ケラチノサイトおよび線維芽細胞ならびにヒト乾癬皮膚生検組織におけるＶＥＧＦ−Ａ発現の減少が誘発されることを証明した（実施例を参照）。従って、本発明の第１の実施形態では、本発明のＩＲＳ−１阻害剤は、ＶＥＧＦ発現を阻害し、このようにして皮膚血管新生を阻害する。
【００８７】
本発明者らは、本発明のＩＲＳ−１阻害剤の局所塗布により、ヒト線維芽細胞およびヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）の両方ならびにヒト乾癬皮膚生検組織においてＴＮＦα発現の減少が誘発されることも証明した。さらに、この局所塗布により、乾癬皮膚内のＣＤ４＋およびＣＤ３リンパ球が正常なレベルまで減少する。ＣＤ４＋およびＣＤ３リンパ球による乾癬皮膚のＴＮＦα過剰発現および浸潤は、炎症の顕著な特徴である。従って、本発明の第２の実施形態では、本発明のＩＲＳ−１阻害剤は、炎症を阻害する。
【００８８】
本発明者らは、本発明のＩＲＳ−１阻害剤の局所塗布により、細胞培養物におけるケラチノサイト増殖の減少が誘発されることも証明した。ケラチノサイトの増殖および分化の増加は、乾癬皮膚の落屑局面の原因であると考えられている。従って、本発明の第３の実施形態では、本発明のＩＲＳ−１阻害剤は、ケラチノサイトの過剰増殖を阻害する。
【００８９】
本発明の意味では、これらの３つの実施形態は排他的なものではなく、対象は、これらの実施形態の１つ、２つまたは３つに関わる場合もある。
【００９０】
驚くべきことに、本発明者らは、本ＩＲＳ−１阻害剤の局所塗布により、乾癬皮膚における例えばＶＥＦＧ−ＡまたはＴＮＦαなどのタンパク質の病的過剰発現を、生理的発現レベルよりも低いこれらのタンパク質の発現レベルを誘発することなく、生理的レベルに回復させることを証明した。
【００９１】
一実施形態では、本発明のＩＲＳ−１阻害剤、組成物または経皮組成物を、それを必要としている対象に局所的経路によって投与する。
【００９２】
一実施形態では、治療的有効量の本発明のＩＲＳ−１阻害剤、組成物または経皮組成物を前記対象に投与する。
【００９３】
一実施形態では、本発明の組成物または経皮組成物は軟膏であり、例えば乾癬病変部などの治療される皮膚区域を完全に覆うために、皮膚に塗布する。
【００９４】
本発明の一実施形態では、本発明のＩＲＳ−１阻害剤、組成物または経皮組成物を、少なくとも２日に１回、好ましくは少なくとも１日に１回、より好ましくは少なくとも１日に２回投与する。一実施形態によれば、本発明のＩＲＳ−１阻害剤、組成物または経皮組成物を、１日に２回、好ましくは朝および晩に、皮膚に局所投与する。
【００９５】
本発明の一実施形態では、本発明のＩＲＳ−１阻害剤、組成物または経皮組成物を、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも３、４、５、６週間またはそれ以上の期間にわたってそれを必要としている対象に投与する。
【００９６】
一実施形態では、本発明のＩＲＳ−１阻害剤、組成物または経皮組成物が投与される対象は哺乳類であり、好ましくはヒトである。
【００９７】
一実施形態では、本発明のＩＲＳ−１阻害剤、組成物または経皮組成物が投与される対象は、血管新生性および／または炎症性疾患を発症するリスクがあるか、その疾患に罹患しているか、好ましくはその疾患と診断されている。一実施形態では、対象は、乾癬と診断されており、対象の皮膚に乾癬病変を呈している。
【００９８】
本発明は、治療的有効量の本発明のＩＲＳ−１阻害剤、組成物または経皮組成物を、好ましくは経皮経路によってそれを必要としている対象に投与することを含む、前記対象における皮膚疾患の治療方法にも関する。一実施形態では、前記皮膚疾患は乾癬である。
【００９９】
本発明は、治療的有効量の本発明のＩＲＳ−１阻害剤、組成物または経皮組成物を、好ましくは経皮経路によって皮膚疾患に罹患している対象に投与することを含む、前記対象における皮膚血管新生の阻害方法にも関する。
【０１００】
本発明は、治療的有効量の本発明のＩＲＳ−１阻害剤、組成物または経皮組成物を、好ましくは経皮経路によって皮膚疾患に罹患している対象に投与することを含む、前記対象における皮膚炎症の阻害方法にも関する。
【０１０１】
本発明は、治療的有効量の本発明のＩＲＳ−１阻害剤、組成物または経皮組成物を、好ましくは経皮経路によって皮膚疾患に罹患している対象に投与することを含む、前記対象におけるケラチノサイトの過剰増殖の阻害方法にも関する。
【０１０２】
一実施形態によれば、本発明の組成物または経皮組成物は、用量単位形態で与えられる。用量単位形態は、例えば、管、フラスコ、瓶、注射器などの容器手段または本組成物または本経皮組成物を中に入れることができる他の容器手段であると有利である。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ヒト皮膚由来の微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）、線維芽細胞およびケラチノサイトにおけるＧＳ−１０１によるＩＲＳ−１発現の用量依存的阻害を示す写真とグラフの組み合わせである。細胞を指示濃度のＧＳ−１０１と共に６時間インキュベートした後、細胞を溶解した。細胞溶解物中のＩＲＳ−１タンパク質発現を、ウェスタンブロット（Ａ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｂ、ＣおよびＤはそれぞれＨＭＥＣ、ヒト線維芽細胞およびヒトケラチノサイトに関するグラフ）により測定した。
【図２】ＧＳ−１０１がヒト線維芽細胞およびケラチノサイトおいてＶＥＧＦ発現を用量依存的に阻害することを示すグラフの組み合わせである。ヒトケラチノサイトにおけるＶＥＧＦのｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質（Ｂ）の発現。ヒト線維芽細胞におけるＶＥＧＦのｍＲＮＡ（Ｃ）およびタンパク質（Ｄ）の発現。
【図３】ヒト線維芽細胞におけるＧＳ−１０１によるＴＮＦαのｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質（Ｂ）の発現の用量依存的阻害を示すグラフの組み合わせである。
【図４】ヒト皮膚由来の微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）を含む培養物中でＧＳ−１０１と共に６時間インキュベートした後のＴＮＦα発現の用量依存的阻害を示す写真とグラフの組み合わせである。ＥＬＩＳＡ（Ｂ）およびウェスタンブロット（Ｃ）によるＴＮＦαのｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質の定量化。
【図５】ヒトケラチノサイトにおけるＧＳ−１０１によるＴＮＦα産生（ＥＬＩＳＡ）の用量依存的阻害を示すグラフである。
【図６】生体外でヒト皮膚の表皮（Ａ）および真皮（Ｂ）にＧＳ−１０１を単回局所塗布してから２４時間後のＧＳ−１０１濃度を示すグラフである。
【図７】ＧＳ−１０１（０．８６％ｗ／ｗ）による１日に２回で６週間の局所的治療により患者の乾癬皮膚病変部生検組織においてＩＲＳ−１発現が阻害されることを示す写真とグラフの組み合わせである。Ａ）ＩＲＳ−１標識の代表的な画像。Ｂ）ヒト皮膚生検組織におけるＩＲＳ−１タンパク質の免疫蛍光染色の定量化。
【図８】ＧＳ−１０１（０．８６％ｗ／ｗ）による１日に２回で６週間の局所的治療により乾癬患者の病変部におけるＶＥＧＦ発現が阻害されたことを示す写真とグラフの組み合わせである。Ａ）ＶＥＧＦ標識の代表的な画像。Ｂ）ヒト皮膚生検組織におけるＶＥＧＦタンパク質の免疫蛍光染色の定量化。
【図９】ＧＳ−１０１（０．８６％ｗ／ｗ）による１日に２回で６週間の局所的治療により乾癬皮膚病変部においてＴＮＦα発現が阻害されたことを示す写真とグラフの組み合わせである。Ａ）ＴＮＦα標識の代表的な画像。Ｂ）ヒト皮膚生検組織におけるＴＮＦαタンパク質の免疫蛍光染色の定量化。
【図１０】ＧＳ−１０１（０．８６％ｗ／ｗ）による６週間の局所的臨床的治療により乾癬皮膚病変部においてＣＤ４＋リンパ球が正常なレベルに回復することを示す写真とグラフの組み合わせである。Ａ）ヒト皮膚生検組織におけるＣＤ４＋タンパク質の免疫蛍光染色。Ｂ）ヒト皮膚生検組織におけるＣＤ４＋タンパク質の免疫蛍光染色の定量化。
【図１１】ＧＳ−１０１（０．８６％ｗ／ｗ）による６週間の局所的臨床的治療により乾癬皮膚病変部においてＣＤ３リンパ球が正常なレベルに回復することを示す写真とグラフの組み合わせである。Ａ）ヒト皮膚生検組織におけるＣＤ３タンパク質の免疫蛍光染色。Ｂ）ヒト皮膚生検組織におけるＣＤ３タンパク質の免疫蛍光染色の定量化。
【図１２】１０００細胞／ウェル（Ａ）および５０００細胞／ウェル（Ｂ）の細胞密度で播種された非希釈ＫＧＭ中で培養されたＮＨＥＫの増殖に対するＧＳ−１０１の阻害効果。結果は、３回の平均±標準偏差である。
【図１３】１０００細胞／ウェル（Ａ）および５０００細胞／ウェル（Ｂ）の細胞密度で播種されたＮＨＥＫの増殖に対する半希釈したＫＧＭに再懸濁したＧＳ−１０１の阻害効果。結果は、３回の平均±標準偏差である。
【図１４】ＧＳ−１０１治療（０．８６ｍｇ／ｇ）により乾癬病変部におけるケラチノサイト増殖マーカーＫｉ６７（Ａ）およびケラチン１６（Ｂ）の発現が減少したことを示すグラフの組み合わせである。データは平均±標準誤差である。Ａ：＊プラセボ治療した病的な皮膚に対してｐ＝０．０００２、‡健康な皮膚に対してｐ＝０．００２３、†健康な皮膚に対してｐ＝０．０１４、Ｂ：＊プラセボ治療した病的な皮膚に対してｐ＝０．０２６５。  実施例
【０１０４】
以下の実施例により、本発明をさらに例示する。
【０１０５】
実施例１：本発明の軟膏
【表１】
0006273273.tif 000002
【０１０６】
実施例２：試験管内（in vitro）、生体外（ex vivo）および生体内での本発明の組成物の効果
【０１０７】
材料および方法
ＧＳ−１０１（配列番号３）は、以下の配列：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’の８０３６Ｄａの分子量を有する２５塩基長のホスホロチオエートである。ＧＳ−１０１は、無菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中で、室温で最長３ヶ月安定であり、試験管内実験のためにそのまま使用した。ＧＳ−１０１の優良医薬品製造基準（ＧＭＰ：Good manufacturing practice）バッチは、Gene Signal社（フランスのエヴリー、Ａｌ−Ｍａｈｍｏｏｄ、２００２ａ，ｂ，ｃ）によって提供された。この試験で使用したスクランブルオリゴヌクレオチドは、以下の配列：５’−ＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＣＴＣＴＣＧＡＣＧＴＧＣ−３’（配列番号２２）を有していた。皮膚用軟膏（０．８６％ｗ／ｗ）に組み込まれたＧＳ−１０１を用いて、生体内治療を行った。
【０１０８】
試験設計
この二重盲検、無作為化、用量範囲決定、単一施設、ラテン方格法試験は、慢性の中等度から重度の尋常性乾癬に罹患している患者において、プラセボに対して２種類の用量のＧＳ−１０１の安全性および有効性を評価するために設計した。各患者の３箇所の乾癬プラーク（２箇所の難治性病変部を含む）を治療した。低用量（０．８６ｍｇ／ｇ）のＧＳ−１０１、高用量（１．７２ｍｇ／ｇ）のＧＳ−１０１またはプラセボ（溶媒）により、各病変部を治療した。治療は無作為化および二重盲検で行った。治験の間、患者の所与のプラークに対して同じ唯一の治療を１日に２回行った。その手順は、治験審査委員会(investigational review board)により認可されていた。全ての患者に書面によるインフォームドコンセントおよび秘密保持契約書を渡した。
【０１０９】
ＧＳ−１０１は、以下の配列：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’の８０３６Ｄａの分子量を有する２５塩基長のホスホロチオエートである。ＧＳ−１０１の優良医薬品製造基準バッチは、Gene Signal社（フランスのエヴリー）によって提供された。
【０１１０】
試験対象母集団
治療意図（ＩＴＴ）集団は、１２人の患者（１０人の男性）で構成されていた。大きな逸脱を示した患者はいなかった。安全性評価対象集団は１２人の患者で構成されていた。各患者の３箇所の乾癬プラーク（２箇所の難治性病変部を含む）を治療した。低用量（０．８６ｍｇ／ｇ）のＧＳ−１０１、高用量（１．７２ｍｇ／ｇ）のＧＳ−１０１またはプラセボ（溶媒）により各病変部を治療した。治療は無作為化および二重盲検で行った。治験の間、患者の所与のプラークに対して同じ唯一の治療を１日に２回行った。治療した病変部（１２人×３箇所）を全てＩＴＴ解析に含めた。無作為化患者の大部分は、乾癬と診断されてから２年以上が経過していた。関節症性乾癬の患者はいなかった。ＰＡＳＩスコアは４〜７の範囲であり、その中央値は６であり、体表面積（ＢＳＡ）の割合は３〜６％の範囲であり、その中央値は５％であった。１２人の患者のうち、１人（８．３％）の患者に対してのみ、試験前に３ヶ月以内の乾癬治療を行った。その治療はビタミンＤ類似体であった。３つの治療群において、病変部の大部分が難治性部位に位置していた（プラセボ群および１．７２ｍｇ／ｇ用量群において１１／１２箇所（９１．７％）の難治性病変部、０．８６ｍｇ／ｇ用量群において１０／１２箇所（８３．３％）の難治性病変部）。上肢が標的病変部の主な位置であった（プラセボ群では７箇所（５８．３％）の病変部、０．８６ｍｇ／ｇ群では６箇所（５０％）の病変部、１．７２ｍｇ／ｇ群では８箇所（６６．７％）の病変部）。
【０１１１】
有効性および安全性の評価
第一の目的は、プラセボと比較して６週間の治療後のＧＳ−１０１の有効性を比較することにある。主要評価項目は、写真で測定したベースラインと６週目との間の治療された乾癬プラークの割合評価であった。治療が盲検化された状態で、各時点で各病変部の面積を測定した。副次的評価項目には、未来の治験で使用される用量の評価、プラセボと比較した３週間の治療後の局所塗布されたＧＳ−１０１の有効性の評価ならびに６週間にわたる局所塗布されたＧＳ−１０１の安全性および忍容性の評価が含まれていた。有害事象、深刻な有害事象ならびに６週間にわたる日常的な血液学的および実施室数値を評価して、安全性を評価した。
【０１１２】
統計分析
ＳＡＳソフトウェアバージョン９．２を用いて、全てのデータを分析した。全ての統計的検定を５％の有意水準で両側で行った。試料の大きさが小さかったため、試験の電力レベルは考慮しなかった。記述統計を古典的に報告した。コルモゴロフ・スミルノフ検定およびアンダーソン・ダーリング検定を用いて、標的病変部の面積、標的病変部の面積における割合変化および病変部の直径変数の正規性を目視で確認した。乾癬病変部データに関する全てのパラメータを治療群（プラセボ、０．８６ｍｇ／ｇおよび１．７２ｍｇ／ｇ）および標的病変部ごとにまとめた。全分析データセットに関する他のパラメータをまとめた。一次有効性パラメータは連続パラメータであり、固定効果を用いるラテン方格法の分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較した。
【０１１３】
リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ
各種濃度のＧＳ−１０１（０〜２０μＭ）または溶媒に２４時間曝露した後、培養したヒト細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）の全ｍＲＮＡを、NucleoSpin RNA IIキットを用いて抽出した。ＲＮＡの収率および純度を分光学的分析により評価した。先に記載したように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った（Ｖｏｇｈｅｌら、２００７年）。簡単に言うと、ランダムな六量体プライマーおよびモロニーマウス白血病ウイルス（２００Ｕ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて０．５μｇの全ＲＮＡを逆転写し、合成されたｃＤＮＡを、ＰＣＲ産物および以下のプライマーを検出するためにＤＮＡ結合色素サイバーグリーンＩを用いるリアルタイムＰＣＲ増幅に直接使用した：ＩＲＳ−１（センス：５’−ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号２３）、アンチセンス：５’−ＡＧＧＴＣＣＴＡＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡ−３’（配列番号２４））、ＶＥＧＦ−Ａ（センス：５’−ＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＣＧＡＡ−３’（配列番号２５）、アンチセンス：５’−ＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＣＡＴＴＧＧ−３’（配列番号２６））、ＴＮＦα（センス：５’−ＡＡＴＣＴＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＣＡ−３’（配列番号２７）、アンチセンス、５’−ＴＧＡＴＣＧＴＡＣＡＧＧＴＧＣＡＴＣＧＴ−３’（配列番号２８））、およびＧＡＰＤＨ（センス：５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡ−３’（配列番号２９）、アンチセンス：５’−ＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧ−３’（配列番号３０））。DNA Engine OPTICON 2連続蛍光検出器（MJ Research社、マサチューセッツ州ウォータータウン）を用いて、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。その結果を方程式：ＣｏｐｙＴＦ／ＣｏｐｙＧＡＰＤＨ＝２Ｃ（ｔ）ＧＡＰＤＨ−Ｃ（ｔ）ＴＦを用いて定量化した。１．５％アガロースゲル上での電気泳動により全てのＰＣＲ産物を分析し、臭化エチジウムで可視化し、ＧｅｎｅＳｎａｐ６．００．２６ソフトウェア（Ｓｙｎｇｅｎｅ社、メリーランド州フレデリック）を用いて分析した。ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ分析ソフトウェアバージョン３．０２．００（Ｓｙｎｇｅｎｅ社）を用いて濃度測定分析を行った。
【０１１４】
免疫標識
組織切片化の直後に、組織切片を−８０℃で保存した。免疫標識のために、組織切片を室温で数分間解凍した後、この組織切片を蒸留水に浸漬させて過剰な液体を洗い流した。次いで、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液と共に室温で１時間インキュベートして組織切片を飽和させた。次いで、組織切片を、抗ＴＮＦαｍＡｂ（マウス抗ヒトＴＮＦα、クローン５２Ｂ８３、整理番号：ｓｃ−５２７４６、Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅ社、フランスのモンルージュ）、抗ＶＥＧＦｍＡｂ（クローンＣ−１、Santa cruz社）、抗ヒトＣＤ３精製ポリクローナル抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、整理番号：１４−００３８−８２）または抗ヒトＣＤ４精製ポリクローナルの抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、整理番号：１４−００４８−８２）のいずれかで標識した。標識のために、実験手順を暗室で行った。飽和した組織切片を、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中で１／１００になるまで１〜２時間希釈した指示されたｍＡｂと共にインキュベートした。次いで、組織切片を、ＰＢＳにより各５分間で３回室温で洗浄し、ＰＢＳ中で１／１００になるまで１時間希釈したウマ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−フルオレセイン複合体（整理番号：ＦＩ−２０００、Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅ社、フランスのモンルージュ）と共にインキュベートした。この後、ＰＢＳにより各５分間で３回室温で洗浄した。次いで、洗浄した組織切片を水性封入剤（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、Ｖｅｃｔｏｒ社、整理番号：Ｈ−１５００）で封入した。次いで、画像収集のためのＤＣ３００Ｆカメラを備えた蛍光顕微鏡（Lieca DMR蛍光顕微鏡）で、標識した組織切片を調べた。NIH Image社のＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて標識の定量化を行った。治験へ組み入れの際に無作為に選択された３人の患者の３箇所の病変部のそれぞれに対応する３種類の生検組織を用いて全ての分析を行った。各標識の「ｎ」は、分析した組織切片の数に対応している。同じ組織切片を用いる独立した一連の実験において、免疫組織化学手順および分析を３回繰り返した。
【０１１５】
標識の定量化
ＮＩＨ−Ｉｍａｇｅ社のソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて、標識の定量化を行った。ＴＮＦα標識の総密度の測定により、定量化を達成した。
【０１１６】
経皮吸収試験
２．０２ｃｍ２の拡散のために利用可能な表面を有するＦｒａｎｚ（商標）拡散セル（ＬＡＲＡＳＰＩＲＡＬ社、フランスのディジョン）に装着したヒトのデルマトーム皮膚生検組織を、ＧＳ−１０１の経皮吸収について生体外で定量的に試験した。皮膚の真皮の一部を、皮膚に吸収される皮膚用軟膏（約１０ｍｇ）に組み込まれたＧＳ−１０１と共に浴に入れた。ＧＳ−１０１の濃度を経時的に測定した。
【０１１７】
皮膚生検組織の調製
美容整形手術中に採取されたヒト皮膚群から１つの皮膚生検組織（白人のドナー、ＰＭＩＣ番号４０１、年齢不詳、２００７年９月から凍結）を得た。皮膚生検組織から付着皮下脂肪をメスで除去し、以下の２つの部分に分割した。
・正常な皮膚（部分Ｉ）
・剥離された皮膚（部分ＩＩ）：絆創膏（Ｓｃｏｔｃｈ）で剥離して人工的に損傷させた皮膚すなわち角質層（角層［細片］）を含まない皮膚。角層は皮膚への拡散に対する主なバリアとして見なされるため、角質層の重要な部分が絆創膏で除去されているこのモデルは、正常なヒトの皮膚よりも高い浸透性を特徴とする。正常な組織と比較した剥離された組織の経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）を測定して、絆創膏剥離の有効性を確認する。この部分に対して、１３５ｇ／ｃｍ２（重量測定値＝５００ｇ）の制御圧力下で、皮膚標本に（皮膚の左右および上下から交互に）連続的に貼られた１０枚の絆創膏(Havane Impega Adhesive Tape Scotch)を用いて、ヒト皮膚ドナーの角層を除去した。
【０１１８】
次いで、Ｂｒｏｗｎ（商標）デルマトーム（Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ社、フランスのランジス、９４５７３）を用いて、２枚の皮膚（部分ＩおよびＩＩ）をデルマトームで約２５０／５００μｍの理論上の一定の厚さに薄く切った。拡散セルに装着する前に、特定の装置（１／１００ｍｍの読み取り値を有する厚さ制御システム、Ets G. Boutillon、フランスのシュノーヴ、２１３００）を用いて、各皮膚試料に対して皮膚の厚さの精度管理を行った。次いで、皮膚試料を無作為化し、どんな他の処理も施すことなく、拡散セルに装着した。
【０１１９】
経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）の測定に用いる前に、各拡散セルに対して実験モデルの皮膚バリアおよび水密性の完全性を確認した。蒸発計（Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ（商標）、Ｃｏｕｒａｇｅ＆Ｋｈａｚａｋａ社、ドイツのケルン）を用いて、表皮区域に対して直接測定を行った。
【０１２０】
プローブを皮膚表面の適所に２分間置いたままにした。次いで、ＴＥＷＬを１分間記録した。同じ解剖学的部位に対して、試験のために使用されている他のセルおよび文献（Ｒｏｕｇｉｅｒ、１９９４年）からのデータと比較して異常なＴＥＷＬを示すあらゆるセルを実験ノートに記録した。
【０１２１】
ケラチノサイト増殖の阻害
正常なヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）（Ｌｏｎｚａ社）を、空気中に５％のＣＯ２中、３７℃でケラチノサイト増殖培地（ＫＧＭ、Ｌｏｎｚａ社）で増殖させた。約７５％の集密で、細胞をＨＥＰＥＳで洗浄し、３ｍＬのトリプシンの存在下で、３７℃で５分間剥離した。トリプシン中和溶液（ＴＮＳ、Ｌｏｎｚａ社）を用いてトリプシンを中和し、細胞を９００ｇで５分間収集し、５％の血清を含有するＫＧＭに懸濁し、計数した。
【０１２２】
次いで、漸増濃度のＧＳ−１０１を添加したＫＧＭ中に、１ウェル（９６−ウェルミクロプレート）当たり１０００または５０００個のいずれかでＮＨＥＫを分配し、５％のＣＯ２中、３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより増殖を測定した。別の平行した一連の実験では、ＫＧＭを、刺激因子を含んでいないケラチノサイト塩基性溶媒（対照）で５０％に希釈した。
【０１２３】
結果および考察
試験対象母集団
治療意図（ＩＴＴ）・安全性評価対象集団は、チュニスの陸軍病院の皮膚科から集めた平均年齢４８±１４歳の１２人の患者（１０人の男性）で構成されていた。ベースラインでは、ボディマス指数は、２２ｋｇ／ｍ２〜３０ｋｇ／ｍ２の範囲であり、中央値は２５ｋｇ／ｍ２であった。平均体重は７５．８±１１．９ｋｇであった。患者の半数は一度も喫煙したことがなく、４人（３３．３％）の患者は現在喫煙者であり、２人（１６．７％）の患者は３年未満の喫煙経験者であった。ベースラインでは、平均収縮期血圧（ＳＢＰ）および平均ＤＢＰはそれぞれ、１３３±１１ｍｍＨｇおよび７１±８ｍｍＨｇであった。平均心拍数は７７．０±５．４ｂｐｍであった。大きな逸脱を示した患者はいなかった。治療した病変部（１２人×３箇所）を全てＩＴＴ解析に含めた。
【０１２４】
大部分の患者は、乾癬と診断されてから２年以上が経過していた。関節症性乾癬に罹患している患者はいなかった。乾癬面積重症度指数（ＰＡＳＩ）のスコアは、４〜７の範囲であり、その中央値は６であり、体表面積（ＢＳＡ）の割合は、３〜６％の範囲であり、その中央値は５％であった。１２人の患者のうち、１人（８．３％）の患者に対してのみ、試験前に３ヶ月以内の乾癬治療（ビタミンＤ類似体）を行った。
【０１２５】
有効性および安全性
０．８６ｍｇ／ｇまたは１．７２ｍｇ／ｇのＧＳ−１０１の６週間の局所塗布による１２人の患者の治療により、プラセボと比較して、治療した病変部において有意な減少（ｐ＜０．０５）が生じた（表１）。
【表２】
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【０１２６】
プラセボ治療群において治療された面積の僅かな増加が観察された（中央値：２２％）。プラセボの最小二乗平均（ＬＳ平均）差は、０．８６ｍｇ／ｇおよび１．７２ｍｇ／ｇ群のそれぞれで−３８．９％（９５％ＣＩ（−７５．８％、−２．０％））および−３７．４％（−７４．３％、−０．５％）であった。プラセボと比較して治療から３週間後という早さで、ＧＳ−１０１で治療した病変部の大きさにおいて有意な減少が観察された（ｐ＜０．０１）。プラセボのＬＳ平均差は、０．８６ｍｇ／ｇおよび１．７２ｍｇ／ｇ群のそれぞれで−３７．３％（−６２．７％、−１１．９％）および−３８．３％（−６３．８％、−１２．９％）であった。
【０１２７】
安全性評価対象集団には、試験治療薬の少なくとも１回の用量が投与された全ての患者が含まれていた（ｎ＝１２）。ＧＳ−１０１の安全性は、有害作用が全く報告されず良好であった。患者の中に刺激、灼熱感または滲出を訴えたものはいなかった。各治療群において、ベースラインで１箇所の病変部に対して軽度な痒みが報告され、３週目に痒みは報告されず、６週目に１箇所の病変部に対して中程度の痒みが報告された。
【０１２８】
ＧＳ−１０１はＩＲＳ−１発現を用量依存的に阻害する
本発明者らは、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）、ヒト線維芽細胞およびヒトケラチノサイトを漸増濃度のＧＳ−１０１に曝露し、その後、抗ＩＲＳ−１ｍＡｂを用いて細胞溶解物のウェスタンブロットを行って、ＩＲＳ−１の発現に対するＧＳ−１０１の影響を調べた。ＧＳ−１０１のスクランブルオリゴヌクレオチド形態とは対照的に、ＧＳ−１０１は、ＩＲＳ−１発現を用量依存的に防止した（図１Ａ）。ＥＬＩＳＡによるＩＲＳ−１タンパク質の定量化により、ＧＳ−１０１が、ＨＭＥＣ、線維芽細胞およびケラチノサイトにおいてＩＲＳ−１発現を用量依存的に減少させることを確認した（図１Ｂ〜図１Ｄ）。
【０１２９】
ＧＳ−１０１はＶＥＧＦおよびＴＮＦα発現の両方を用量依存的に阻害する
本発明者らは、ヒトケラチノサイトおよびヒト線維芽細胞において、ＶＥＧＦ−ＡおよびＴＮＦαの両方のｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルを定量化した。ＧＳ−１０１と共に６時間インキュベートした後、ケラチノサイトおよび線維芽細胞においてＶＥＧＦ−Ａ転写物（ｑＲＴ−ＰＣＲで測定）が減少し（図２Ａおよび図２Ｃ）、これはタンパク質発現の減少に匹敵していた（図２Ｂおよび図２Ｄ）。
【０１３０】
本発明者らは、ヒト線維芽細胞におけるＴＮＦαのｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルも定量化した。ＧＳ−１０１と共に６時間インキュベートした後、ヒト線維芽細胞においてＴＮＦα（図３Ａ）転写物が減少した。ｍＲＮＡにおけるこの減少は、ヒト線維芽細胞によるタンパク質発現の減少に匹敵していた（図３Ｂ）。
【０１３１】
ＨＭＥＣにおけるＴＮＦαのメッセンジャーＲＮＡおよびタンパク質発現レベルも調べた。ＧＳ−１０１と共に６時間インキュベートした後、ＨＭＥＣにおいてＴＮＦα（図４Ａ）転写物が減少し、これは、ＥＬＩＳＡ（図４Ｂ）およびウェスタンブロット（図４Ｃ）により測定したＨＭＥＣによるＴＮＦαタンパク質発現の減少に匹敵していた。
【０１３２】
最後に、ヒトケラチノサイトをＧＳ−１０１と共に６時間インキュベートすると、ＥＬＩＳＡ（図５）で測定したＴＮＦαタンパク質発現が減少した。
【０１３３】
まとめると、これらの結果は、ＧＳ−１０１が、ＨＭＥＣ、線維芽細胞およびケラチノサイトなどの多くの皮膚由来の細胞において、転写および翻訳段階の両方でＶＥＧＦおよびＴＮＦαの両方を阻害することを実証している。
【０１３４】
ＧＳ−１０１の生体外単回局所塗布によりヒト皮膚の表皮および真皮の両方において治療濃度が得られる
ＧＳ−１０１は皮膚用軟膏に組み込まれている（１．７２ｍｇ／ｇ）。本発明の組成物に相当するこの新しいＧＳ−１０１製剤の妥当性を試験するために、ヒト皮膚（正常な皮膚と絆創膏剥離により人工的に損傷させた皮膚）により、ＧＳ−１０１の生体外経皮吸収試験を行った。結果から、ＧＳ−１０１軟膏（１．７２ｍｇ／ｇ）の単回局所塗布により、２４時間後に表皮（図６Ａ）および真皮（図６Ｂ）の両方において治療濃度のＧＳ−１０１が得られるということが分かった。これらの結果は、局所塗布後のＧＳ−１０１の真皮への浸透を示している。
【０１３５】
ＧＳ−１０１による１日に２回で６週間の局所的臨床的治療によりヒト乾癬皮膚におけるＩＲＳ−１発現が阻害された
６週間の治療期間の終了時に３人の乾癬患者から３種類の生検組織すなわちｉ）健康な皮膚、ｉｉ）未治療の病的皮膚、およびｉｉｉ）ＧＳ−１０１（０．８６ｍｇ／ｇ）で治療した病的皮膚を採取した。免疫組織化学により、組織切片内のＩＲＳ−１タンパク質レベルを監視した。
【０１３６】
２人の独立調査官により、ヒト皮膚生検組織のＩＲＳ−１標識（図７Ａ）を定量化した。病的組織を用いた３回の一連の実験の結果から、測定したＩＲＳ−１で標識された平均粒径（ｎ＝２２）およびＩＲＳ−１標識の総密度（ｎ＝２２）において有意差（ｐ＜０．０５）がないことが分かり、これは、組織切片、標識プロセスおよび定量化手順の質が良いことを示している。但し、ＩＲＳ−１で標識した粒子の数は、プラセボ治療した病的な試料と比較して、ＧＳ−１０１で治療した皮膚病変部おいて、３回の一連の実験で８１±３１％（ｐ＝０．０３８２、ｎ＝８）、４４±９％（ｐ＝０．００９１、ｎ＝６）および６１±２６％（ｐ＝０．０１１９、ｎ＝８）減少した。これらの結果は、ＩＲＳ−１標識の総面積を測定して確認し、これは、ＧＳ−１０１での治療により、ヒト乾癬皮膚生検組織においてＩＲＳ−１発現が７３±２５％（ｐ＝０．００９５、ｎ＝２２）阻害されることを全体として実証している（図７Ｂ）。
【０１３７】
ＧＳ−１０１による１日に２回で６週間の臨床的局所的治療により乾癬皮膚病変部においてＶＥＧＦおよびＴＮＦα発現が阻害された
抗ＶＥＧＦおよび抗ＴＮＦαｍＡｂを用いる免疫組織化学により、乾癬皮膚病変部生検組織においてＶＥＧＦおよびＴＮＦαの両方の発現を測定した。３回の一連の実験から収集されたヒト皮膚試料におけるＶＥＧＦ標識の代表的な画像が、図８Ａに示されている。２人の独立調査官によって行われた定量化の蓄積されたデータの結果から、ＶＥＧＦ標識が、健康な皮膚組織生検（５．１３７×１０７±０．９３７×１０７画素、ｎ＝１６）と比較して、ＧＳ−１０１で治療した病的組織試料（平均±標準誤差：３．１７３×１０７±０．５７５×１０７画素、ｎ＝１６）において減少したことが分かる（図８Ｂ）。重要なことに、これらの結果から、未治療の病的皮膚病変部（５．７４４×１０７±０．８２６×１０７画素、ｎ＝１６）と比較して、ＧＳ−１０１で治療した乾癬病変部生検組織（３．１７３×１０７±０．５７５×１０７画素、ｎ＝１４）においてＶＥＧＦ標識が４５±１８％（ｐ＝０．０１５９）減少したことが明らかである（図８Ｂ）。
【０１３８】
図９Ａは、ＧＳ−１０１で治療した乾癬患者または治療していない乾癬患者の皮膚生検組織におけるＴＮＦα標識の代表的な画像を示す。３回の一連の実験でなされた定量化を１つにまとめると、健康な皮膚試料（２，３８９，０００±３３９，８５３画素、ｎ＝１４）と比較して、ＧＳ−１０１で治療した病的組織におけるＴＮＦα標識の密度（３３３，６８６±７８，１１４画素、ｎ＝１４）が８６±１５％（ｐ＜０．０００１）小さいことが明らかである（図９Ｂ）。同様に、未治療の病的組織（２，１１７，０００±２７７，４２２画素、ｎ＝１４）と比較して、ＧＳ−１０１で治療した病的組織におけるＴＮＦα標識の密度は８４±１４％（ｐ＜０．０００１）小さかった（図９Ｂ）。
【０１３９】
ＧＳ−１０１による６週間の局所的臨床的治療により乾癬皮膚内のＣＤ４＋およびＣＤ３リンパ球が正常なレベルまで減少する
ＧＳ−１０１での治療後のヒト乾癬皮膚におけるＴＮＦα発現の阻害の重要性を考慮し、かつＴＮＦαの主な産生源が一般にリンパ球であることが広く認められているため、本発明者らは、免疫組織化学によりヒト乾癬皮膚生検組織内のＣＤ４＋およびＣＤ３リンパ球のレベルに対するＧＳ−１０１治療の影響を調べた。ＣＤ４＋標識の代表的な画像が図１０Ａに示されている。ＣＤ４＋標識の測定により、乾癬皮膚が健康な皮膚よりも６２．０７±１９．８％多く（ｐ＝０．０２４、ｎ＝１２）含まれていることが分かった。対照的に、３回の一連の実験の定量化を１つにまとめると、未治療の病的組織（１２．９８×１０７±１．５９×１０７画素、ｎ＝１２）と比較して、ＧＳ−１０１で治療した病的組織試料におけるＣＤ４＋標識の密度（７．９６×１０７±０．８２×１０７画素、ｎ＝１２）が３９±１４％（ｐ＝０．０１０２）小さいことが明らかである（図１０Ｂ）。重量なことに、これらの結果から、健康な皮膚組織（８．０１×１０７±１．３１６×１０７画素、ｎ＝１２）およびＧＳ−１０１で治療した病的組織（７．９６×１０７±０．８２×１０７画素、ｎ＝１２）における当量のＣＤ４＋標識も実証されている（図１０Ｂ）。これらの発見は、ＧＳ−１０１での治療により乾癬皮膚におけるＣＤ４＋のレベルが回復することを強調している。
【０１４０】
図１１Ａは、ヒト皮膚組織のＣＤ３標識の代表的な画像を示す。３回の一連実の験の定量化を１つにまとめると、未治療の病的組織（３．５９×１０７±０．８５４×１０７画素、ｎ＝１４）と比較して、ＧＳ−１０１で治療した病的皮膚生検組織におけるＣＤ３標識の総密度（１．５０×１０７±０．３０×１０７画素、ｎ＝１７）が５８±２３％（ｐ＝０．０１９）小さい（図１１Ｂ）ことが明らかである。重量なことに、ＧＳ−１０１治療（１．５０×１０７±０．３０×１０７画素、ｎ＝１７）により、健康な皮膚組織（１．４６×１０７±０．２９×１０７画素、ｎ＝１５）において当量のＣＤ３標識が得られる（図１１Ｂ）。
【０１４１】
ＧＳ−１０１はケラチノサイト増殖を阻害する
１０００細胞／ウェルの細胞密度を有する非希釈ＫＧＭ中で試験した場合、ＧＳ−１０１は、最大１３％のＮＨＥＫ増殖を阻害した（図１２Ａ）。５０００細胞／ウェルの細胞密度では、ＧＳ−１０１は、ＮＨＥＫ増殖を２０％阻害した（図１２Ｂ）。
【０１４２】
別の一連の実験では、本発明者らは、５０％に希釈したＫＧＭ（すなわち、全ての刺激因子を含むＫＧＭ培地が刺激因子を含まないＫＢＭで半分に希釈されている）を使用した。これらの条件下で、ＧＳ−１０１は、両方の細胞密度（１０００および５０００細胞／ウェル）においてＮＨＥＫ増殖を３０％阻害した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。
【０１４３】
最後に、炎症は、乾癬病変部においてケラチノサイト増殖を刺激することが知られており、従って、本発明者らは、増殖マーカーであるＫｉ６７の発現を測定した。ＧＳ−１０１での治療から６週間後に、Ｋｉ６７の発現は、未治療の病変部と比較して５６±３％（ｐ＝０．０００２、ｎ＝１０）減少した（図１４Ａ）。
【０１４４】
ケラチノサイト増殖に対するＧＳ−１０１の効果をさらに確認するために、本発明者らは、ケラチノサイト増殖の特異的マーカー（ＣＫ１６）を測定した。ＧＳ−１０１で治療した乾癬皮膚は、プラセボ治療した乾癬皮膚に対して、４５．８±７．８％（ｐ＝０．０２６５、ｎ＝５）のより少ないＣＫ１６標識を示した（図１４Ｂ）。
【０１４５】
まとめると、これらの発見は、ＧＳ−１０１治療が強力な抗炎症効果を有し、かつ乾癬皮膚においてリンパ球の浸潤およびケラチノサイトの増殖の両方を阻害することを実証している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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