(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される配列を含む重鎖可変領域および配列番号２に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む、インテグリンαｖβ６に特異的に結合する単離されたマウスモノクローナル抗体、またはそのキメラ形態もしくはヒト化形態。
【請求項２】
配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号４（ＣＤＲ２）、および配列番号５（ＣＤＲ３）に示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに配列番号６（ＣＤＲ１）、配列番号７（ＣＤＲ２）、および配列番号８（ＣＤＲ３）に示される軽鎖ＣＤＲ配列を含む、インテグリンαｖβ６に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号４（ＣＤＲ２）、および配列番号５（ＣＤＲ３）に示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに配列番号６（ＣＤＲ１）、配列番号７（ＣＤＲ２）、および配列番号８（ＣＤＲ３）に示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む、インテグリンαｖβ６に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体であって、重鎖可変領域がＨＡ（配列番号９）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域がＬＡ（配列番号１０）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ただし、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むマウス抗体に対して少なくとも１つの復帰変異があり、該復帰変異は重鎖可変フレームワーク領域内にある、ヒト化モノクローナル抗体。
【請求項４】
ＨＡ（配列番号９）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域であって、ただし、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むマウス抗体に対して少なくとも１つの復帰変異があり、該復帰変異は重鎖可変フレームワーク領域内にあり、かつ前記抗体が配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号４（ＣＤＲ２）、および配列番号５（ＣＤＲ３）に示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含むことを条件とする、重鎖可変領域を含み、かつ、
ＬＡ（配列番号１０）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域であって、ただし、前記抗体が配列番号６（ＣＤＲ１）、配列番号７（ＣＤＲ２）、および配列番号８（ＣＤＲ３）に示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含むことを条件とする、軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体がヒト化抗体であり、かつ配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むマウス抗体に対して少なくとも１つの復帰変異があり、該復帰変異は前記重鎖可変フレームワーク領域内にある、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むマウス抗体に対して少なくとも２つの復帰変異があり、該復帰変異は前記重鎖可変フレームワーク領域内にある、請求項５に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
ＨＡの位置Ｈ２８およびＨ３０のうち少なくとも１つがＳで占有され、ここで番号付けがＫａｂａｔ番号付与法に従っている、請求項５に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
位置Ｈ２８とＨ３０の両方ともＳで占有されている、請求項７に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
位置Ｈ７２が、ＤまたはＱで占有され、位置Ｈ７３がＴまたはＫで占有され、位置Ｈ７５がＴまたはＳで占有され、位置Ｈ７８がＶまたはＡで占有され、位置Ｈ９３がＡまたはＶで占有されている、請求項８に記載のヒト化抗体。
【請求項１０】
位置Ｌ４が、ＭまたはＬで占有され、位置Ｌ２１がＩまたはＬで占有され、位置Ｌ２２がＳまたはＦで占有され、位置Ｌ３６がＦまたはＬで占有され、位置Ｌ３７がＱまたはＦで占有され、位置Ｌ４５がＲまたはＫで占有され、位置Ｌ６３がＳまたはＴで占有されていることを除いて、前記抗体がＬＡ（配列番号１０）に示される配列を含む軽鎖可変領域を含み、番号付けがＫａｂａｔ番号付与法に従っている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体がヒト化抗体であり、かつ前記重鎖可変領域が、ＨＢ（配列番号１１）、ＨＴ（配列番号２２）、ＨＬ（配列番号１５）、ＨＵ（配列番号２３）、ＨＭ（配列番号１６）またはＨＮ（配列番号１７）に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記軽鎖可変領域が、ＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）またはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
ＨＢ（配列番号１１）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；ＨＴ（配列番号２２）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；ＨＬ（配列番号１５）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；ＨＵ（配列番号２３）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；ＨＮ（配列番号１７）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか、またはＨＭ（配列番号１６）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項９に記載のヒト化抗体。
【請求項１４】
抗原結合断片である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記重鎖可変領域がヒト重鎖定常領域に融合され、かつ前記軽鎖可変領域がヒト軽鎖定常領域に融合されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記重鎖定常領域が、Ｆｃガンマ受容体に対する結合が天然のヒト定常領域と比較して減少した天然のヒト定常領域の変異体形態である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記重鎖定常領域が、ＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
細胞毒性薬剤に結合体化されている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むマウス抗体と比較して、αｖβ６に対して５倍以内の親和性を有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むマウス抗体と比較して、αｖβ６に対して２倍以内の親和性を有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２１】
αｖβ６に対して０．１ｎＭ〜５ｎＭの範囲内の見かけの解離定数（ｋｄ）を有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
αｖβ６に対して０．１ｎＭ〜２ｎＭの範囲内の見かけの解離定数（ｋｄ）を有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
αｖβ６に対して０．５ｎＭ〜１．５ｎＭの範囲内の見かけの解離定数（ｋｄ）を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むマウス抗体のキメラ形態であり、かつ前記抗体は、ヒト重鎖定常領域に融合している配列番号１に示される配列を含む前記重鎖可変領域、およびヒト軽鎖定常領域に融合している配列番号２に示される配列を含む前記軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２５】
精製されたものである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項によって定義される、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする単離された核酸。
【請求項２７】
がんを有する患者を処置するための組成物であって、前記組成物は、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体を含み、前記抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である、組成物。
【請求項２８】
前記がんが、膀胱がん、頭頸部がん、皮膚がん、肺がん、膵臓がん、子宮がん、乳がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、ならびに胃がんである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記がんが、扁平上皮癌または腺癌である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物であって、前記抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１２年２月１７日に出願された米国仮出願第６１／６００，４９９号、および２０１２年２月２３日に出願された米国仮出願第６１／６０２，５１１号（これらの各々が、全ての目的のためにその全体が参考として援用される）の利益を主張する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本明細書において、インテグリンαｖβ６に特異的に結合するモノクローナル抗体およびこれを使用してがんを処置する方法が提供される。本明細書に記載される抗体は、１５Ｈ３抗体を含む。１５Ｈ３抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むマウスモノクローナル抗体である。１５Ｈ３マウス抗体のキメラ形態およびヒト化形態、ならびにそのヒト形態は、本発明に包含される。１５Ｈ３抗体のキメラ形態、ヒト化形態、およびヒト形態は、マウス１５Ｈ３抗体と実質的に同じ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、インテグリンαｖβ６に特異的に結合する。マウス１５Ｈ３抗体の重鎖可変領域ＣＤＲの３つは、配列番号３（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号４（Ｈ−ＣＤＲ２）、および配列番号５（Ｈ−ＣＤＲ３）に提供される配列を有する。マウス１５Ｈ３抗体の軽鎖ＣＤＲの３つは、配列番号６（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号７（Ｌ−ＣＤＲ２）、および配列番号８（Ｌ−ＣＤＲ３）に提供される配列を有する。任意選択で、αｖβ６に特異的に結合するマウス１５Ｈ３抗体と実質的に同じ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒト化抗体において、重鎖可変領域の位置Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｈ７５、Ｈ７８、またはＨ９３のうち少なくとも１つは、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基に占有されている。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｈ７５、Ｈ７８、またはＨ９３のうち少なくとも２つは、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基で占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｈ７５、Ｈ７８、またはＨ９３のうち少なくとも４つは、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基で占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０のうち少なくとも１つは、Ｓで占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０は、Ｓで占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０は、Ｓで占有され、位置Ｈ７２は、ＤまたはＱで占有され、位置Ｈ７３は、ＴまたはＫで占有され、位置Ｈ７５は、ＴまたはＳで占有され、位置Ｈ７８は、ＶまたはＡで占有され、９３位は、ＡまたはＶで占有される。任意選択でこれらの実施形態のいずれかでは、重鎖フレームワーク領域中のアミノ酸残基の多くとも１０個、多くとも９個、多くとも８個、多くとも７個、多くとも６個、または多くとも５個は、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基で占有される。任意選択で、これらの実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域のＣＤＲは配列番号１のものであり、軽鎖可変領域のＣＤＲは配列番号２のものである。任意選択で、これらの実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域のＣＤＲは実質的に配列番号１のものであり、軽鎖可変領域のＣＤＲは実質的に配列番号２のものである。任意選択で、これらの実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域のＣＤＲは、配列番号１のものであり、軽鎖可変領域のＣＤＲは配列番号２のものであり、各ＣＤＲに０、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有する。一態様では、配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号４（ＣＤＲ２）、および配列番号５（ＣＤＲ３）に示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに配列番号６（ＣＤＲ４）、配列番号７（ＣＤＲ５）、および配列番号８（ＣＤＲ６）に示される軽鎖ＣＤＲ配列を含み、各ＣＤＲに０、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有する、インテグリンαｖβ６に特異的に結合するキメラまたはヒト化抗体が、本明細書において提供される。ここで、この出願の他の場所にある通り、Ｋａｂａｔ番号付けを使用して、重鎖および軽鎖可変領域中の位置を記載する。
【０００３】
本発明は、ＨＡ（配列番号９）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、ＬＡ（配列番号１０）と少なくとも９０％同一の軽鎖可変領域を有する抗体（例えば、ヒト化抗体）も提供する。いくつかの態様では、本発明は、重鎖可変フレームワーク領域に少なくとも１つのマウス１５Ｈ３復帰変異を有するＨＡ（配列番号９）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびＬＡ（配列番号１０）と少なくとも９０％同一の軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。「可変鎖フレームワーク領域に少なくとも１つのマウス１５Ｈ３復帰変異を有する」という語句によって、アクセプタ可変鎖フレームワーク領域中にあるアミノ酸残基の少なくとも１つが、ドナーマウス１５Ｈ３抗体の対応する位置に存在するアミノ酸残基に変化することが意味される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｈ７５、Ｈ７８、またはＨ９３のうち少なくとも１つは、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基で占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｈ７５、Ｈ７８、またはＨ９３のうち少なくとも２つは、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基で占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｈ７５、Ｈ７８、またはＨ９３のうち少なくとも４つは、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基で占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｈ７５、Ｈ７８、またはＨ９３の全ては、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基で占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０の少なくとも１つは、Ｓで占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０は、Ｓで占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０は、Ｓで占有され、位置Ｈ７２は、ＤまたはＱで占有され、位置Ｈ７３は、ＴまたはＫで占有され、位置Ｈ７５は、ＴまたはＳで占有され、位置Ｈ７８は、ＶまたはＡで占有され、９３位は、ＡまたはＶで占有される。任意選択でこれらの実施形態のいずれかでは、重鎖フレームワーク領域中のアミノ酸残基の多くとも１０個、多くとも９個、多くとも８個、多くとも７個、多くとも６個、または多くとも５個は、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基で占有される。任意選択で、これらの実施形態のいずれかで、重鎖可変領域のＣＤＲは配列番号１のものであり、軽鎖可変領域のＣＤＲは配列番号２のものである。任意選択で、これらの実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域のＣＤＲは実質的に配列番号１のものであり、軽鎖可変領域のＣＤＲは実質的に配列番号２のものである。任意選択で、これらの実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域のＣＤＲは、配列番号１のものであり、軽鎖可変領域のＣＤＲは配列番号２のものであり、各ＣＤＲに０、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有する。
【０００４】
本発明は、ＨＢ（配列番号１１）、ＨＦ（配列番号１２）、ＨＧ（配列番号１３）、ＨＫ（配列番号１４）、ＨＬ（配列番号１５）、ＨＭ（配列番号１６）、ＨＮ（配列番号１７）、ＨＯ（配列番号１８）、ＨＱ（配列番号１９）、ＨＲ（配列番号２０）、ＨＳ（配列番号２１）、ＨＴ（配列番号２２）、または、ＨＵ（配列番号２３）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号：２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）またはＬＧ（配列番号２９）と少なくとも９０％同一の軽鎖可変領域を含む抗体（例えば、ヒト化抗体）、ならびにその任意の組合せ（すなわち、抗体は、軽鎖可変領域の任意の１つと対をなす重鎖可変領域の任意の１つを含むことができる）も提供する。任意選択で、抗体は、ＨＡ、ＨＢ、ＨＦ、ＨＧ、ＨＫ、ＨＬ、ＨＭ、ＨＮ、ＨＯ、ＨＱ、ＨＲ、ＨＳ、ＨＴ、ＨＵと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびＬＡ、ＬＢ、ＬＣ、ＬＤ、ＬＥ、ＬＦまたはＬＧと少なくとも９５％同一の軽鎖可変領域、ならびにその任意の組合せ（すなわち、抗体は、軽鎖可変領域の任意の１つと対をなす重鎖可変領域の任意の１つを含むことができる）を含む。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｈ７５、Ｈ７８、またはＨ９３のうち少なくとも１つは、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基で占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｈ７５、Ｈ７８、またはＨ９３のうち少なくとも２つは、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基で占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０の少なくとも１つは、Ｓで占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０は、Ｓで占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０は、Ｓで占有され、位置Ｈ７２は、ＤまたはＱで占有され、位置Ｈ７３は、ＴまたはＫで占有され、位置Ｈ７５は、ＴまたはＳで占有され、位置Ｈ７８は、ＶまたはＡで占有され、９３位は、ＡまたはＶで占有される。任意選択でこれらの実施形態のいずれかでは、重鎖フレームワーク領域中のアミノ酸残基の多くとも１０個、多くとも９個、多くとも８個、多くとも７個、多くとも６個、または多くとも５個は、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸残基で占有される。任意選択で、これらの実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域のＣＤＲは配列番号１のものであり、軽鎖可変領域のＣＤＲは配列番号２のものである。任意選択で、これらの実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域のＣＤＲは実質的に配列番号１のものであり、軽鎖可変領域のＣＤＲは実質的に配列番号２のものである。任意選択で、これらの実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域のＣＤＲは、配列番号１のものであり、軽鎖可変領域のＣＤＲは配列番号２のものであり、各ＣＤＲに０、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有する。本明細書に記載される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、任意選択で、シグナルペプチドに融合されている。典型的な重鎖マウスシグナルペプチドは、配列番号３３に示され、典型的な重鎖ヒトシグナルペプチドは、配列番号３４に示され、典型的な軽鎖マウスシグナルペプチドは、配列番号３５に示され、典型的な軽鎖ヒトシグナルペプチドは、配列番号３６に示される。
【０００５】
本明細書に記載される抗体の重鎖可変領域は、重鎖定常領域と任意選択で融合され、軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域と任意選択で融合されている。重鎖定常領域は、天然のヒト定常領域であることができ、または天然のヒト定常領域の変異体形態、例えば、Ｆｃガンマ受容体に対する結合が天然のヒト定常領域と比較して減少したものであることができる。任意選択で、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプである。任意選択で、重鎖定常領域は、配列番号３０を含むアミノ酸配列を有し、軽鎖定常領域は、配列番号３１を含むアミノ酸配列を有する。任意選択で、重鎖定常領域は、配列番号３２を含むアミノ酸配列を有し、軽鎖定常領域は、配列番号３１を含むアミノ酸配列を有する。任意選択で、抗体は、細胞毒性薬剤に結合体化されている（すなわち、抗体−薬物結合体）。本発明の特定の抗体は、ヒトαｖβ６に対して１５Ｈ３抗体のマウスバージョンより大きい親和性を有する。競合結合アッセイまたは飽和結合アッセイ（実施例に記載のものなど）で決定された通り、いくつかの他の抗体は、ヒトαｖβ６に対して１５Ｈ３抗体のマウスバージョンより多くて１０倍低い、好ましくは多くて６倍低い、より好ましくはわずかに５倍低い、さらに好ましくはわずかに２倍低い親和性を有する。いくつかの態様では、本明細書に記載されるヒト化抗体は、ヒトαｖβ６に対するマウス１５Ｈ３抗体の親和性の約１０倍以内、好ましくは約５倍以内、より好ましくは約２倍以内でヒトαｖβ６に対する親和性を有する。いくつかの態様では、本明細書に記載されるヒト化抗体は、ヒトαｖβ６に対して０．１ｎＭ〜１０ｎＭ、好ましくは０．１ｎＭ〜５ｎＭ、より好ましくは０．１ｎＭ〜２ｎＭ、０．５ｎＭ〜２ｎＭまたは０．５ｎＭ〜１．５ｎＭの範囲内の見かけの解離定数（ｋｄ）を有する。
【０００６】
本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む二重特異性モノクローナル抗体も提供される。
【０００７】
本発明は、上記の抗体のいずれかの重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸をさらに提供する。
【０００８】
本発明は、患者に上記の通りの抗体の有効なレジメンを施すことを含む、がんの患者を処置する方法をさらに提供する。好ましくは、抗体は、細胞毒性薬剤に結合体化されている。がんは、αｖβ６抗原を発現するものである。任意選択で、がんは、膀胱がん、頭頸部がん（口唇、口腔、鼻腔、副鼻腔、咽頭および喉頭のがんを含む）、皮膚がん、肺がん、膵臓がん、子宮がん、乳がん（トリプルネガティブ乳がんを含む）、子宮頸がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん（ｏｖａｒｉａｎ  ｇａｎｃｅｒ）、胃がん、または肝がんである。任意選択で、がんは、扁平上皮癌または腺癌である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１に示される配列を含む重鎖可変領域および配列番号２に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む、インテグリンαｖβ６に特異的に結合する単離されたマウス１５Ｈ３モノクローナル抗体、ならびにそのキメラ形態またはヒト化形態。
（項目２）
配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号４（ＣＤＲ２）、および配列番号５（ＣＤＲ３）に示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに配列番号６（ＣＤＲ４）、配列番号７（ＣＤＲ５）、および配列番号８（ＣＤＲ６）に示される軽鎖ＣＤＲ配列を含み、かつ各ＣＤＲに０、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有する、インテグリンαｖβ６に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体。
（項目３）
インテグリンαｖβ６に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体であって、前記抗体は、
ＨＡ（配列番号９）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域であって、ただし、重鎖可変フレームワーク領域に少なくとも１つのマウス１５Ｈ３復帰変異があり、かつ前記抗体が配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号４（ＣＤＲ２）、および配列番号５（ＣＤＲ３）に示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含み、かつ各ＣＤＲに０、１、２もしくは３個の保存的アミノ酸置換を有することを条件とする、重鎖可変領域を含むか、または
ＬＡ（配列番号１０）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域であって、ただし、前記抗体が配列番号６（ＣＤＲ１）、配列番号７（ＣＤＲ２）、および配列番号８（ＣＤＲ３）に示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含み、かつ各ＣＤＲに０、１、２もしくは３個の保存的アミノ酸置換を有することを条件とする、軽鎖可変領域を含む、
ヒト化モノクローナル抗体。
（項目４）
配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号４（ＣＤＲ２）、および配列番号５（ＣＤＲ３）に示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに配列番号６（ＣＤＲ４）、配列番号７（ＣＤＲ５）、および配列番号８（ＣＤＲ６）に示される軽鎖ＣＤＲ配列を含む、項目２または３に記載の抗体。
（項目５）
ＨＡ（配列番号９）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域であって、ただし、重鎖可変フレームワーク領域に少なくとも１つのマウス１５Ｈ３復帰変異があり、かつ前記抗体が配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号４（ＣＤＲ２）、および配列番号５（ＣＤＲ３）に示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含み、かつ各ＣＤＲに０、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有することを条件とする、重鎖可変領域を含み、かつ必要に応じて、
ＬＡ（配列番号１０）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域であって、ただし、前記抗体が配列番号６（ＣＤＲ１）、配列番号７（ＣＤＲ２）、および配列番号８（ＣＤＲ３）に示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含み、かつ各ＣＤＲに０、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有することを条件とする、軽鎖可変領域を含む、項目２に記載の抗体。
（項目６）
配列番号５に示される重鎖ＣＤＲ３、配列番号８に示される軽鎖ＣＤＲ３を有し、かつ残りのＣＤＲに０、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有する、項目２、３または５に記載の抗体。
（項目７）
前記抗体がヒト化抗体であり、かつ前記重鎖可変フレームワーク領域に少なくとも１つのマウス１５Ｈ３復帰変異がある、項目５または６に記載の抗体。
（項目８）
前記重鎖可変フレームワーク領域に少なくとも２つのマウス１５Ｈ３復帰変異がある、項目７に記載のヒト化抗体。
（項目９）
ＨＡの位置Ｈ２８およびＨ３０のうち少なくとも１つがＳで占有され、ここで番号付けがＫａｂａｔ番号付与法に従っている、項目７に記載のヒト化抗体。
（項目１０）
位置Ｈ２８とＨ３０の両方ともＳで占有されている、項目９に記載のヒト化抗体。
（項目１１）
位置Ｈ７２が、ＤまたはＱで占有され、位置Ｈ７３がＴまたはＫで占有され、位置Ｈ７５がＴまたはＳで占有され、位置Ｈ７８がＶまたはＡで占有され、９３位がＡまたはＶで占有されている、項目１０に記載のヒト化抗体。
（項目１２）
位置Ｌ４が、ＭまたはＬで占有され、位置Ｌ２１がＩまたはＬで占有され、位置Ｌ２２がＳまたはＦで占有され、位置Ｌ３６がＦまたはＬで占有され、位置Ｌ３７がＱまたはＦで占有され、位置Ｌ４５がＲまたはＫで占有され、位置Ｌ６３がＳまたはＴで占有されていることを除いて、前記抗体がＬＡ（配列番号）に示される配列を含む軽鎖可変領域を含み、番号付けがＫａｂａｔ番号付与法に従っている、上述の項目のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１３）
前記抗体がヒト化抗体であり、かつ前記重鎖可変領域が、ＨＢ（配列番号１１）、ＨＴ（配列番号２２）、ＨＬ（配列番号１５）、ＨＵ（配列番号２３）、ＨＭ（配列番号１６）またはＨＮ（配列番号１７）に示されるアミノ酸配列を有する、上述の項目のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１４）
前記軽鎖可変領域が、ＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）またはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する、上述の項目のいずれかに記載の抗体。
（項目１５）
ＨＢ（配列番号１１）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；ＨＴ（配列番号２２）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；ＨＬ（配列番号１５）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；ＨＵ（配列番号２３）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；ＨＮ（配列番号１７）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか、またはＨＭ（配列番号１６）に示されるアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域およびＬＡ（配列番号１０）、ＬＢ（配列番号２４）、ＬＣ（配列番号２５）、ＬＤ（配列番号２６）、ＬＥ（配列番号２７）、ＬＦ（配列番号２８）もしくはＬＧ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、項目１１に記載のヒト化抗体。
（項目１６）
抗原結合断片である、上述の項目のいずれかに記載の抗体。
（項目１７）
前記重鎖可変領域がヒト重鎖定常領域に融合され、かつ前記軽鎖可変領域がヒト軽鎖定常領域に融合されている、上述の項目のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１８）
前記重鎖定常領域が、Ｆｃガンマ受容体に対する結合が天然のヒト定常領域と比較して減少した天然のヒト定常領域の変異体形態である、項目１７に記載の抗体。
（項目１９）
前記重鎖定常領域が、ＩｇＧ１アイソタイプのものである、項目１７に記載の抗体。
（項目２０）
細胞毒性薬剤に結合体化されている、上述の項目のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２１）
マウス１５Ｈ３抗体と比較して、αｖβ６に対して５倍以内の親和性を有する、上述の項目のいずれかに記載の抗体。
（項目２２）
マウス１５Ｈ３抗体と比較して、αｖβ６に対して２倍以内の親和性を有する、上述の項目のいずれかに記載の抗体。
（項目２３）
αｖβ６に対して０．１ｎＭ〜５ｎＭの範囲内の見かけの解離定数（ｋｄ）を有する、上述の項目のいずれかに記載の抗体。
（項目２４）
αｖβ６に対して０．１ｎＭ〜２ｎＭの範囲内の見かけの解離定数（ｋｄ）を有する、上述の項目のいずれかに記載の抗体。
（項目２５）
αｖβ６に対して０．５ｎＭ〜１．５ｎＭの範囲内の見かけの解離定数（ｋｄ）を有する、上述の項目のいずれかに記載の抗体。
（項目２６）
前記抗体が、マウス１５Ｈ３抗体のキメラ形態であり、かつヒト重鎖定常領域に融合している配列番号１に示される配列を含む前記重鎖可変領域、およびヒト軽鎖定常領域に融合している配列番号２に示される配列を含む前記軽鎖可変領域を含む、項目１に記載の抗体。
（項目２７）
精製されたものである、上述の項目のいずれかに記載の抗体。
（項目２８）
上述の項目のいずれかによって定義される、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする単離された核酸。
（項目２９）
がんを有する患者を処置する方法であって、前記患者に、上述の項目のいずれか１項に記載の抗体の有効なレジメンを施すことを含み、前記抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、方法。
（項目３０）
前記がんが、膀胱がん、頭頸部がん、皮膚がん、肺がん、膵臓がん、子宮がん、乳がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、ならびに胃がんである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記がんが、扁平上皮癌または腺癌である、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
上述の項目のいずれかに記載の抗体を含む医薬組成物であって、前記抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である、医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、マウス親ｍＡｂ（１５Ｈ３と称する）のアミノ酸配列と、選択されたヒト化１５Ｈ３重鎖可変（上２段のパネル）および軽鎖可変（下２段のパネル）領域との整列を示す図である。
【図２】図２は、ヒトαｖβ６を発現している２９３Ｆ細胞における、ＨＢ重鎖を有する抗体とマウス親抗体（ｍ１５Ｈ３と称する）との競合結合研究の結果を示す図である。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、αｖβ６を発現している２９３Ｆ細胞およびＦＤＣ−Ｐ１細胞に対する抗体ＨＢＬＣおよびＨＴＬＣの飽和結合研究の結果を示す図である。
【図４】図４は、αｖβ６を発現している２９３Ｆ細胞における、ＨＢ、ＨＬおよびＨＮ重鎖を有する抗体とマウス親抗体（ｍ１５Ｈ３と称する）との競合結合研究の結果を示す図である。
【図５】図５は、αｖβ６を発現している２９３Ｆ細胞における、ＨＢ、ＨＱおよびＨＲ重鎖を有する抗体とマウス親抗体（ｍ１５Ｈ３と称する）との競合結合研究の結果を示す図である。
【図６】図６は、αｖβ６を発現している２９３Ｆ細胞における、ＨＭ重鎖を有する抗体とマウス親抗体（ｍ１５Ｈ３と称する）との競合結合研究の結果を示す図である。
【図７】図７は、αｖβ６を発現している２９３Ｆ細胞における、ＨＢ、ＨＬ、ＨＳ、ＨＴおよびＨＵ重鎖を有する抗体とマウス親抗体（ｍ１５Ｈ３と称する）との競合結合研究の結果を示す図である。
【図８】図８は、Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏ  Ａｒｒａｙの膀胱がん試料に対するＩＨＣによるαｖβ６タンパク質発現の分析を示す図である。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｆは、細胞毒性アッセイにおいて親マウスと同様に作用するヒト化１５Ｈ３抗αｖβ６  ＡＤＣを示す図である。
【図９−２】図９Ａ〜９Ｆは、細胞毒性アッセイにおいて親マウスと同様に作用するヒト化１５Ｈ３抗αｖβ６  ＡＤＣを示す図である。
【図９−３】図９Ａ〜９Ｆは、細胞毒性アッセイにおいて親マウスと同様に作用するヒト化１５Ｈ３抗αｖβ６  ＡＤＣを示す図である。
【図１０】図１０は、ヌードマウスにおけるＤｅｔｒｏｉｔ５６２頭頸部がん細胞系の異種移植研究の結果を示す図である。用量は、図に示される。最初の投与は、腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達したときであった。
【図１１】図１１は、ヌードマウスにおけるＨＰＡＦＩＩ膵臓がん細胞系の異種移植研究の結果を示す図である。投与の用量および時間は、図に示される。
【図１２】図１２は、ヌードマウスにおけるＢｘＰＣ−３膵臓がん細胞系の異種移植研究の結果を示す図である。投与の用量および時間は、図に示される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、とりわけ、αｖβ６に特異的に結合するモノクローナル抗体およびその結合体を提供する。本抗体は、αｖβ６発現に付随する状態（様々ながんを含む）の処置および診断、ならびにαｖβ６の検出に有用である。αｖβ６に特異的に結合する抗体は、β６インテグリンサブユニット単体および／またはαｖβ６インテグリン複合体に特異的に結合するが、αｖサブユニット単体には結合しない。
【００１１】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定、分離および／もしくは回収された抗体ならびに／または組換え的に生成される抗体のことを指す。「精製された抗体」とは、通常、その産生または精製により生じる干渉タンパク質および他の夾雑物から少なくとも５０％ｗ／ｗ高純度である抗体のことであるが、その抗体が、その使用を容易にする目的で、過剰の薬学的に許容される担体（複数可）または他の媒体と組み合わされる可能性を除外しない。干渉タンパク質および他の夾雑物には、例えば、抗体が単離または組換え的に生成される細胞の細胞成分が含まれ得る。時には、抗体は、産生または精製由来の干渉タンパク質および夾雑物から少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５または９９％ｗ／ｗ高純度である。本明細書に記載される抗体は、マウス、キメラ、ヒト化、およびヒト抗体を含めて、単離および／または精製された形態で提供することができる。
【００１２】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体のことを指し、すなわち、少量存在する可能性がある、考え得る天然に存在する変異を除いて、その集団を含む個々の抗体は同一である。修飾語句「モノクローナル」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られるままの抗体の性質を示し、何かしら特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻：４９５頁によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されても、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁およびＭａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁に記載される技術を使用するファージ抗体ライブラリから単離されてもよく、または他の方法によって作製されてもよい。本明細書に記載される抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１３】
その標的抗原に対するモノクローナル抗体の特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の親和性を意味し、大きさは検出可能なほど高く、少なくとも１つの無関係な標的に対して起こる非特異的結合と区別できる。非特異的な結合が通常ファンデルワールス力の結果であるのに対して、特異的結合は特定の官能基間のまたは特定の空間嵌合（例えば、鍵と鍵穴タイプ）の結合の形成の結果であり得る。抗体は、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、または免疫沈降アッセイなどの技術を使用する競合および非競合イムノアッセイ系など公知の方法によって、αｖβ６に対する特異的結合をアッセイすることができる。
【００１４】
完全な抗体の基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の同一の対を２つ含み、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、最初に、切断可能なシグナルペプチドに連結されて発現される。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。
【００１５】
軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと規定する。軽鎖および重鎖において、可変および定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により接合され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む（一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，  Ｗ．編、第２版、第７章  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を参照のこと、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる）。
【００１６】
各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、完全な抗体は、２つの結合部位を有する。二官能性、二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は同じである。鎖は全て、３つの超可変領域、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、によって接合される比較的保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ全体構造を呈する。各対の２本の鎖からなるＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列され、特異的エピトープに結合可能になる。Ｎ末端からＣ末端へと、軽鎖と重鎖の両方が、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割当ては、Ｋａｂａｔの定義、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７年および１９９１年）、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２巻：８７８〜８８３頁（１９８９年）に従う。Ｋａｂａｔは、広く使用されている番号付与法（Ｋａｂａｔ番号付け）も提供し、この方法において異なる重鎖の間または異なる軽鎖の間で対応する残基には同じ番号が割り当てられる。
【００１７】
用語「抗体」とは、完全な抗体およびその抗原結合性断片を含む。通常、抗体断片は、完全抗体と競合し、それら断片は、標的に対して特異的に結合するように完全抗体から得られ、別々の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、ダイアボディ、Ｄａｂ、ナノボディ、およびＦｖを含む。断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または完全な免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離によって生成することができる。用語「抗体」とは、ダイアボディ（ホモ二量体Ｆｖ断片）またはミニボディ（ＶＬ−ＶＨ−ＣＨ３）、二重特異性抗体なども含む。二重特異性または二官能性抗体は人工的な雑種抗体であり、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する（例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９巻：３１５〜３２１頁（１９９０年）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８巻：１５４７〜５３頁（１９９２年）を参照のこと）。用語「抗体」とは、抗体自体（裸の抗体）または細胞毒性薬剤に結合体化されている抗体を含む。
【００１８】
用語「エピトープ」とは、抗体が結合する抗原上の部位のことを指す。エピトープは、連続するアミノ酸または１つもしくは複数のタンパク質の三次折りたたみによって近くに置かれる不連続なアミノ酸から形成され得る。三次折りたたみによって形成されるエピトープが変性溶剤を用いる処理で通常失われるのに対して、連続するアミノ酸から形成されるエピトープは変性溶剤への曝露に対して通常保持される。エピトープは、通常、少なくとも３個、より通常には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を固有の空間配置に含む。エピトープの空間配置を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴がある。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６年）のＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照のこと。
【００１９】
同じまたは重なり合うエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対して１つの抗体が別の抗体の結合と競合する能力を示す簡単なイムノアッセイで同定できる。その抗原に結合している抗体のＸ線結晶学によって抗体のエピトープを定義して、接触残基を同定することもできる。別法として、一方の抗体の結合を減少または消失させる抗原中のアミノ酸変異の全てが他方の結合を減少または消失させる場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を減少または消失させるアミノ酸変異のいくつかが他方の結合を減少または消失させる場合、２つの抗体は重なり合うエピトープを有する。
【００２０】
抗体間の競合は、被験抗体が、共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイによって決定される（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０巻：１４９５頁、１９９０年を参照のこと）。過剰の試験抗体（例えば、少なくとも２ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘまたは１００ｘ）が、競合結合アッセイにおいて測定される通り少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％または９９％まで参照抗体の結合を阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合している。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、および参照抗体が結合しているエピトープと十分に近い隣接するエピトープに結合して立体障害を起こす抗体を含む。
【００２１】
用語「患者」は、いずれかの治療的処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
【００２２】
用語「処置」または「処置する」とは、任意の臨床段階で、αｖβ６を発現しているがんの臨床または診断症状が発症した後に、対象に抗αｖβ６抗体または抗体−薬物結合体を投与することにより、疾患の臨床または診断症状を低減または消失させることによって証明されるように、患者においてαｖβ６を発現しているがんの進行を減速、停止、または退行させることを指す。処置は、例えば、症状の重症度、症状の数、または再発の頻度の低減を含み得る。
【００２３】
アミノ酸置換を保存的または非保存的に分類するために、以下のアミノ酸置換を保存的置換とみなす：トレオニン、アラニン、またはアスパラギンによって置換されるセリン；プロリンまたはセリンによって置換されるトレオニン；アスパラギン酸、ヒスチジン、またはセリンによって置換されるアスパラギン；グルタミン酸またはアスパラギンによって置換されるアスパラギン酸；グルタミン、リシン、またはアスパラギン酸によって置換されるグルタミン酸；アルギニン、リシン、またはグルタミン酸によって置換されるグルタミン；チロシンまたはアスパラギンによって置換されるヒスチジン；リシンまたはグルタミンによって置換されるアルギニン；イソロイシン、ロイシンまたはバリンによって置換されるメチオニン；ロイシン、バリン、またはメチオニンによって置換されるイソロイシン；バリン、イソロイシン、またはメチオニンによって置換されるロイシン；チロシンまたはトリプトファンによって置換されるフェニルアラニン；トリプトファン、ヒスチジン、またはフェニルアラニンによって置換されるチロシン；トレオニンによって置換されるプロリン；セリンによって置換されるアラニン；グルタミン酸、グルタミン、またはアルギニンによって置換されるリシン；メチオニン、イソロイシン、またはロイシンによって置換されるバリン；およびフェニルアラニンまたはチロシンによって置換されるトリプトファン。
【００２４】
パーセンテージ配列同一性は、Ｋａｂａｔ番号付与法によって最大限に整列される抗体配列を用いて決定される。整列させた後、対象の抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の可変領域全体）が参照抗体の同じ領域と比較される場合、対象と参照抗体領域とのパーセンテージ配列同一性は、対象と参照抗体領域の両方において同じアミノ酸で占有されている位置の数を、ギャップを算入しない２つの領域の整列された位置の合計数で割り、１００を掛けてパーセンテージに変換したものである。
【００２５】
値の範囲の指定は、範囲内のまたは範囲を定義する全ての整数を含む。
【００２６】
抗体エフェクター機能とは、ＩｇのＦｃドメイン（複数可）によって付与される機能のことを指す。そのような機能は、例えば、抗体依存性細胞性細胞毒性、抗体依存性細胞貪食作用または補体依存性細胞傷害であり得る。そのような機能は、例えば、食作用もしくは溶解活性を持つ免疫細胞上のＦｃ受容体に対するＦｃエフェクタードメイン（複数可）の結合によって、または補体系成分に対するＦｃエフェクタードメイン（複数可）の結合によって遂行され得る。通常、Ｆｃ−結合細胞または補体成分によって媒介される効果（複数可）は、αｖβ６標的細胞の阻害および／または枯渇をもたらす。抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現している細胞を集めることができ、抗体被覆標的細胞を近くに置くことができる。ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）を含めて、ＩｇＧに対する表面ＦｃＲを発現している細胞はエフェクター細胞として作用して、ＩｇＧ被覆細胞を破壊することができる。そのようなエフェクター細胞は、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球および好酸球を含む。ＩｇＧによるＦｃγＲの係合は、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を活性化する。ＡＤＣＣは、膜細孔形成タンパク質およびプロテアーゼの分泌によりＣＤ１６＋エフェクター細胞に媒介され、一方で、貪食作用は、ＣＤ３２＋およびＣＤ６４＋エフェクター細胞に媒介される（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、Ｐａｕｌ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｎ．Ｙ．、１９９７年、第３章、１７頁および３０頁；Ｕｃｈｉｄａら、２００４年、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１９９巻：１６５９〜６９頁；Ａｋｅｗａｎｌｏｐら、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１巻：４０６１〜６５頁；Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９９年、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｒｅａｔ．５３巻：１９９〜２０７頁を参照のこと）。ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰに加えて、細胞結合抗体のＦｃ領域は補体古典経路を活性化して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発することもできる。抗体のＦｃ領域が抗原と複合体形成するとき、補体系のＣ１ｑがその領域に結合する。細胞結合抗体に対するＣ１ｑの結合は、Ｃ４およびＣ２のタンパク質分解活性化に関わる事象のカスケードを開始して、Ｃ３転換酵素を生成することができる。Ｃ３転換酵素によるＣ３のＣ３ｂへの切断により、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９を含めた終末補体成分の活性化が可能になる。併せて、これらのタンパク質は抗体被覆細胞上に膜侵襲複合体細孔を形成する。これらの細孔は、細胞膜の健全性を損ない、標的細胞を殺す（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６版、Ｊａｎｅｗａｙら、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．、２００５年、第２章を参照のこと）。
【００２７】
用語「抗体依存性細胞性細胞毒性」またはＡＤＣＣとは、溶解活性を持っている免疫細胞（エフェクター細胞とも称する）と抗体被覆標的細胞との相互作用に依存する細胞死を誘導する機序のことである。そのようなエフェクター細胞は、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージおよび好中球を含む。エフェクター細胞は、それらの抗原結合部位を介して標的細胞に結合しているＩｇのＦｃエフェクタードメイン（複数可）に付着する。抗体被覆標的細胞の死は、エフェクター細胞活性の結果として起こる。
【００２８】
用語「抗体依存性細胞貪食作用」またはＡＤＣＰとは、ＩｇのＦｃエフェクタードメイン（複数可）に結合する食細胞性免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球および樹状細胞）によって、抗体被覆細胞が、全部または一部、内部移行される過程のことを指す。
【００２９】
用語「補体依存性細胞傷害」またはＣＤＣとは、細胞死を誘導する機序のことを指し、この機序において、標的に結合している抗体のＦｃエフェクタードメイン（複数可）は、標的細胞膜における穴の形成に至る一連の酵素反応を活性化する。通常、抗体被覆標的細胞などにある抗原抗体複合体は、補体成分Ｃ１ｑに結合し、活性化し、次に補体カスケードを活性化して標的細胞死をもたらす。補体の活性化により、白血球上の補体受容体（例えば、ＣＲ３）に結合することによりＡＤＣＣが助長される、標的細胞表面への補体成分の堆積が起こる場合もある。
【００３０】
「細胞障害性効果」とは、標的細胞の枯渇、消失および／または致死のことを指す。「細胞増殖抑止効果」とは、細胞増殖の阻害のことを指す。本明細書で使用される「細胞毒性薬剤」とは、細胞に対して細胞障害性および／または細胞増殖抑制効果を有する薬剤のことを指す。細胞毒性薬剤は、抗体に結合体化することも抗体と組み合わせて投与することもできる。
【００３１】
用語「薬学的に許容される」とは、動物、より具体的にはヒトでの使用について、連邦もしくは州政府の監督官庁によって承認されているもしくは承認できる、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。用語「薬学的に適合する原料」とは、薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または抗αｖβ６抗体を送達する媒体のことを指す。
【００３２】
語句「薬学的に許容される塩」とは、抗αｖβ６抗体もしくはその結合体または抗αｖβ６抗体と一緒に投与される薬剤の、薬学的に許容される有機または無機塩のことを指す。典型的な塩には、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐトルエンスルホン酸塩、およびパモン酸塩（すなわち、１，１’メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ３ナフトエ酸）塩）がある。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなど別の分子の包含に関わってもよい。対イオンは、親化合物の電荷を安定化する任意の有機または無機部分でもよい。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造内に１つ以上の荷電原子を有してもよい。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である実例は、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容される塩は、１つもしくは複数の荷電原子および／または１つもしくは複数の対イオンを有することができる。
【００３３】
文脈から特に明らかでない限り、用語「約」は、表示値の標準偏差の範囲内にある値を包含する。
【００３４】
Ｉ．標的分子
特に明記しない限り、αｖβ６は、ヒトαｖβ６を意味する。典型的なβ６ヒト配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３６１２２に指定される。典型的なαｖヒト配列は、ＮＣＢＩ  ＮＰ＿００２２０１．１に指定される。
【００３５】
ＩＩ．本発明の抗体
Ａ．結合特異性および機能特性
本発明は、マウス１５Ｈ３抗体ならびにキメラ、ヒト化、およびヒト１５Ｈ３抗体を提供する。
【００３６】
ヒトαｖβ６に対する本発明の抗体（例えば、マウス１５Ｈ３抗体のキメラ形態、ヒト化形態およびヒト形態）の親和性は、好ましくはヒトαｖβ６に対するマウス１５Ｈ３抗体の親和性と同等かヒトαｖβ６に対するマウス１５Ｈ３抗体の親和性より大きい、またはヒトαｖβ６に対するマウス抗体１５Ｈ３の親和性に対して倍率１０以内、倍率５以内、倍率２以内で弱くなっている、例えば、ヒトαｖβ６に対するマウス１５Ｈ３抗体の親和性より好ましくは１０分の１以上弱い、より好ましくは５分の１以上弱い、さらにより好ましくは２分の１以上弱い。標的抗原に対する抗体の親和性を測定する一方法は、抗体の見かけの解離定数を決定することによる。本発明は、ヒトαｖβ６に対して、マウス１５Ｈ３と基本的に同じ（すなわち、実験誤差範囲内）見かけの解離定数を有する抗体（例えば、マウス１５Ｈ３抗体のキメラ形態、ヒト化形態およびヒト形態）およびマウス抗体１５Ｈ３より低いまたは高い解離定数を有する抗体を包含する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体（例えば、マウス１５Ｈ３抗体のキメラ形態、ヒト化形態およびヒト形態）は、ヒトαｖβ６に対するマウス１５Ｈ３抗体の見かけの解離定数の０．１〜１０倍の範囲、好ましくは０．１〜５倍、０．１〜２倍、またはさらに０．５〜２倍の範囲内のある見かけの解離定数を有する。いくつかの態様では、ヒトαｖβ６に対する抗体の見かけの解離定数（ｋｄ）は、好ましくは０．１ｎＭ〜５ｎＭの範囲、さらにより好ましくは０．１ｎＭ〜５ｎＭの範囲、さらに好ましくは０．１ｎＭ〜２ｎＭまたは０．５ｎＭ〜１．５ｎＭの範囲内にある。マウス１５Ｈ３抗体がそうであるように、キメラ、ヒト化およびヒト１５Ｈ３抗体は、天然形態および／またはＣＨＯ細胞から組換え的に発現されたヒトαｖβ６に特異的に結合する。通常、キメラ、ヒト化およびヒト１５Ｈ３抗αｖβ６抗体は、ヒトαｖβ６に対する結合についてマウス１５Ｈ３と競合する。
【００３７】
動物モデルまたは臨床試験において、好ましい抗体は、培養増殖しているがん性細胞で示される様にがん（例えば、細胞の増殖、転移および／または生物に対する致死性）を単独で（すなわち、裸の抗体として）または細胞毒性薬剤に結合体化されて、阻害する。動物モデルは、適当な免疫不全げっ歯類株、例えば、無胸腺ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスにαｖβ６を発現しているヒト腫瘍細胞系を移植することによって形成することができる。これらの腫瘍細胞系は、皮下注射による固形腫瘍または静脈内注射による播種性腫瘍のいずれかとして免疫不全げっ歯類宿主において樹立できる。一旦宿主内に樹立されたら、実施例に記載の通りこれらの腫瘍モデルを適用して、抗αｖβ６抗体またはその結合体化形態の治療効果を評価できる。
【００３８】
Ｂ．抗体
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体由来ＣＤＲがヒト「アクセプタ」抗体配列に移植されている遺伝子工学によって作られた抗体である（例えば、Ｑｕｅｅｎ、ＵＳ５，５３０，１０１および５，５８５，０８９；Ｗｉｎｔｅｒ、ＵＳ５，２２５，５３９；Ｃａｒｔｅｒ、ＵＳ６，４０７，２１３；Ａｄａｉｒ、ＵＳ５，８５９，２０５；ならびにＦｏｏｔｅ、ＵＳ６，８８１，５５７を参照のこと）。アクセプタ抗体配列は、例えば、ヒト抗体配列、そのような配列の複合物、ヒト抗体配列の共通配列、または生殖細胞系領域配列であり得る。重鎖に好ましいアクセプタ配列は、生殖細胞系ＶＨエクソンＶＨ１−４６および、Ｊエクソン（ＪＨ）には、エクソンＪＨ−４である。軽鎖の場合、好ましいアクセプタ配列は、エクソンＶＫ２−３０（文献においてＫＶ２−３０とも記載される）、およびＪエクソンにはＪκ−２である。重鎖に好ましい代わりのアクセプタ配列には、Ｊエクソン（ＪＨ）、ＪＨ−１、ＪＨ−２、ＪＨ−３、ＪＨ−４、またはＪＨ−５を伴う生殖細胞系ＶＨエクソンＶＨ１−８またはＶＨ１−３がある。軽鎖に好ましい代わりのアクセプタ配列には、ＪエクソンＪκ−１、Ｊκ−２、Ｊκ−３、Ｊκ−４、またはＪκ−５を伴うエクソンＶＫ２−２９（文献においてＫＶ２−３０とも記載される）がある。したがって、ヒト化抗体は、完全にまたは実質的に非ヒトドナー抗体および可変領域フレームワーク配列に由来するいくつかのまたは全てのＣＤＲ、ならびに存在する場合には、完全にまたは実質的にヒト抗体配列に由来する定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖、および重鎖可変領域フレームワーク配列に由来する少なくとも１つ、２つ、通常は３つ全てのＣＤＲ、ならびに存在する場合には、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に由来する重鎖定常領域を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖、および軽鎖可変領域フレームワーク配列に由来する少なくとも１つ、２つ、通常は３つ全てのＣＤＲ、ならびに存在する場合には、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に由来する軽鎖定常領域を有する。いくつかの態様では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖とヒト化軽鎖を含む。それぞれのＣＤＲの間で対応する残基の少なくとも６０％、８５％、９０％、９５％または１００％（Ｋａｂａｔで定義される）が同一である場合、ヒト化またはヒト抗体のＣＤＲは、非ヒト抗体の対応するＣＤＲに実質的に由来するまたは実質的に同一である。いくつかの実施形態では、各ＣＤＲにある保存的アミノ酸置換が３個以下である場合、ヒト化抗体またはヒト抗体のＣＤＲは、非ヒト抗体の対応するＣＤＲに実質的に由来するまたは実質的に同一である。Ｋａｂａｔで定義される対応する残基の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が同一である場合、抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、それぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に実質的に由来する。本発明のいくつかのヒト化抗体において、抗体の重鎖可変フレームワーク領域に少なくとも１つのマウス１５Ｈ３復帰変異がある。
【００３９】
ヒト化抗体は、マウス抗体由来の６つのＣＤＲ（好ましくはＫａｂａｔで定義される）全てをしばしば組み込むが、マウス抗体由来ＣＤＲの全てではないＣＤＲ（例えば、少なくとも３、４または５つ）で作製することもできる（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９巻：３０７６頁、２００２年；Ｖａｊｄｏｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３２０巻：４１５〜４２８頁、２００２年；Ｉｗａｈａｓｈｉら、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６巻：１０７９〜１０９１頁、１９９９年；Ｔａｍｕｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６４巻：１４３２〜１４４１頁、２０００年）。
【００４０】
ＣＤＲ配置および／または抗原への結合に対するそれらの考え得る影響に基づいて、ヒト可変領域フレームワーク残基の特定のアミノ酸を置換に選ぶことができる。そのような考え得る影響についての調査は、モデリング、特定の場所でのアミノ酸の特性の検討、または特定のアミノ酸の置換もしくは変異誘発の効果の経験的な観察によるものである。
【００４１】
例えば、マウス可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基の間でアミノ酸が異なる場合、そのアミノ酸が
（１）非共有結合的に抗原に直接結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接している、
（３）さもなければＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域から約６Å以内である）、または
（４）重鎖と軽鎖との相互作用を媒介する
ことが合理的に期待されれば、ヒトフレームワークアミノ酸をマウス抗体由来の同等のフレームワークアミノ酸で置換することができる。
【００４２】
１５Ｈ３抗体はマウス抗体として同定されたが、本出願は、ヒト１５Ｈ３抗体も包含する。用語「ヒト１５Ｈ３抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列から得られ、マウス１５Ｈ３抗体と実質的に同一のＣＤＲを有し、類似の性質、すなわち、αｖβ６に対する結合特異性を示す抗体を意味する。いくつかの態様では、ヒト１５Ｈ３抗体は、本明細書に記載される重鎖可変領域と実質的に同一である重鎖可変領域および／または本明細書に記載される軽鎖可変領域と実質的に同一である軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明の１５Ｈ３抗体はヒト抗体ではない、例えば、本発明の１５Ｈ３抗体はマウス、キメラ、またはヒト化抗体である。
【００４３】
本発明は、重鎖可変領域がＨＡ（配列番号９）と少なくとも９０％の同一性を示し、軽鎖可変領域がＬＡ（配列番号１０）と少なくとも９０％同一性を示す１５Ｈ３抗体を提供する。いくつかの態様では、抗体はヒト化抗体であり、重鎖可変フレームワーク領域に少なくとも１つのマウス１５Ｈ３復帰変異がある。加えて、本発明は、ヒト化重鎖可変領域が配列番号１１〜２３と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列同一性を示し、ヒト化軽鎖可変領域が配列番号１０および２４〜２９と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列同一性を示す１５Ｈ３抗体（およびその任意の組合せ）を提供する。本発明は、重鎖可変領域が配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示し、ヒト化軽鎖可変領域が配列番号１０と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示す抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が配列番号２４と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示す抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が配列番号２５と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示す抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が配列番号２６と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示す抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が配列番号２７と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示す抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が配列番号２８と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示す抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が配列番号２９と少なくとも９０％、９５％もしくは９９％または１００％の配列同一性を示す抗体を提供する。いくつかの態様では、これらの抗体はヒト化抗体であり、それぞれの抗体中の復帰変異のいくつかまたは全てが保持されている。換言すれば、そのような抗体において、好ましくは、位置Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｈ７５、Ｈ７８、またはＨ９３の少なくとも１つは、マウス１５Ｈ３抗体の対応する位置のアミノ酸で占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０の少なくとも１つは、Ｓで占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０は、Ｓで占有される。任意選択で、そのような抗体のいずれかにおいて、位置Ｈ２８およびＨ３０は、Ｓで占有され、位置Ｈ７２は、ＤまたはＱで占有され、位置Ｈ７３は、ＴまたはＫで占有され、位置Ｈ７５は、ＴまたはＳで占有され、位置Ｈ７８は、ＶまたはＡで占有され、９３位は、ＡまたはＶで占有される。好ましくは、例えば、重鎖可変領域が配列番号１１〜２３と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列同一性を示し、軽鎖可変領域が配列番号１０および２４〜２９と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列同一性を示す１５Ｈ３ヒト化抗体について記載される抗体のいずれかにおいて、そのＣＤＲ領域は、マウスドナー抗体、すなわち、マウス１５Ｈ３抗体（配列番号３〜８）のＣＤＲ領域と同一である、または実質的に同一である。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔで定義される。本発明の抗体には、抗体ＨＢＬＡ、ＨＢＬＢ、ＨＢＬＣ、ＨＢＬＤ、ＨＢＬＥ、ＨＢＬＦ、ＨＢＬＧ、ＨＬＬＡ、ＨＬＬＢ、ＨＬＬＣ、ＨＬＬＤ、ＨＬＬＥ、ＨＬＬＦ、ＨＬＬＧ、ＨＭＬＡ、ＨＭＬＢ、ＨＭＬＣ、ＨＭＬＤ、ＨＭＬＥ、ＨＭＬＦ、ＨＭＬＧ、ＨＮＬＡ、ＨＮＬＢ、ＨＮＬＣ、ＨＮＬＤ、ＨＮＬＥ、ＨＮＬＦ、ＨＮＬＧ、ＨＲＬＡ、ＨＲＬＢ、ＨＲＬＣ、ＨＲＬＤ、ＨＲＬＥ、ＨＲＬＦ、ＨＲＬＧ、ＨＳＬＡ、ＨＳＬＢ、ＨＳＬＣ、ＨＳＬＤ、ＨＳＬＥ、ＨＳＬＦ、ＨＳＬＧ、ＨＴＬＡ、ＨＴＬＢ、ＨＴＬＣ、ＨＴＬＤ、ＨＴＬＥ、ＨＴＬＦ、ＨＴＬＧ、ＨＵＬＡ、ＨＵＬＢ、ＨＵＬＣ、ＨＵＬＤ、ＨＵＬＥ、ＨＵＬＦ、およびＨＵＬＧがある。
【００４４】
別の考え得る変形は、ＣＤＲ中の特定の残基をヒトＣＤＲ配列、通常は実証されたヒト化抗体の設計に使用されるヒトアクセプタ配列のＣＤＲ、の対応する残基と置換することである。いくつかの抗体において、ＣＤＲの一部、すなわち結合に必要とされるＣＤＲ残基のサブセット、ＳＤＲと称する、だけがヒト化抗体において結合を保持するのに必要である。抗原と接触しておらずＳＤＲの中にないＣＤＲ残基は、過去の研究（例えばＣＤＲ  Ｈ２の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は、しばしば必要とされない）に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１頁、１９８７年）の外側にあるＫａｂａｔ  ＣＤＲの領域から、分子モデリングおよび／もしくは経験によって、またはＧｏｎｚａｌｅｓら、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１巻：８６３頁（２００４年）に記載の通りに同定することができる。そのようなヒト化抗体の１つもしくは複数のドナーＣＤＲ残基が存在していないかまたはドナーＣＤＲ全体が除外されている位置において、その位置を占有しているアミノ酸は、アクセプタ抗体配列または保存的置換において対応する位置（Ｋａｂａｔ番号付けによる）を占有しているアミノ酸であることができる。含められる、ＣＤＲ中のドナーアミノ酸に対するアクセプタのそのような置換の数は、競合要件のバランスを反映している。そのような置換は、ヒト化抗体におけるマウスアミノ酸の数を低減し、結果的に潜在的免疫原性を低減させる際に潜在的に有利である。
【００４５】
本明細書の好ましい実施形態では、ヒト化およびヒト１５Ｈ３抗体のＣＤＲ領域は、マウス１５Ｈ３抗体（配列番号３〜８）のＣＤＲ領域と同一である、または実質的に同一である。本明細書に記載される抗体のいずれかにおいて、ＣＤＲ領域は、０、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有するマウス１５Ｈ３抗体（すなわち、配列番号３〜８）のものであり得る。本明細書に記載される抗体のいずれかにおいて、ＣＤＲ領域は、各ＣＤＲに０、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有するマウス１５Ｈ３抗体（すなわち、配列番号３〜８）のものであり得る。本明細書に記載される抗体のいずれかにおいて、ＣＤＲ領域は、重鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ２ならびに軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および任意選択でＣＤＲ３に０、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有するマウス１５Ｈ３抗体（すなわち、配列番号３〜８）のものであり得る。分子モデリングおよび経験的推論により、本明細書に記載される抗体のいずれかにおいて、保存的アミノ酸置換は、例えば、軽鎖のＣＤＲ１の２４、２５、３２、３３、および／もしくは３４位、軽鎖のＣＤＲ２の５３〜５６位、重鎖のＣＤＲ１の３１および／もしくは３２位、ならびに／または重鎖のＣＤＲ２の６１〜６５位であり得ることが決定された。加えて、本明細書に記載される抗体のいずれかにおいて、以下の３つの位置は対応するヒトアミノ酸で置き換え得る：重鎖ＣＤＲ２の６４位リシンは、グルタミンで置き換えることができ、軽鎖ＣＤＲ１の２４位リシンは、アルギニンで置き換えることができ、軽鎖ＣＤＲ２の５４位ロイシンは、アルギニンで置き換えることができる。
【００４６】
Ｃ．定常領域の選択
本明細書に記載される抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結できる。定常領域の選択は、一部において、抗体依存性細胞媒介細胞毒性、抗体依存性細胞貪食作用および／または補体依存性細胞傷害が望ましいかどうかによって決まる。例えば、ヒト同位体ＩｇＧ１とＩｇＧ３は強力な補体依存性細胞傷害を、ヒトアイソタイプＩｇＧ２は弱い補体依存性細胞傷害を有し、ヒトＩｇＧ４は補体依存性細胞傷害がない。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４より強力な細胞媒介エフェクター機能も誘導する。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。抗体は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含有する四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして、または重鎖と軽鎖可変ドメインがスペーサによって連結されている一本鎖抗体として発現させることができる。
【００４７】
ヒト定常領域は、異なる個体間でアロタイプ変形およびイソアロタイプ変形を示し、すなわち、１つまたは複数の多形位置において、定常領域は異なる個体では異なることができる。イソアロタイプを認識する血清が１つまたは複数の他のアイソタイプの非多形領域に結合するという点で、イソアロタイプはアロタイプと異なる。
【００４８】
重鎖のＣ末端リシンなど、軽鎖および／または重鎖のアミノまたはカルボキシ末端の１つまたはいくつかのアミノ酸は、その分子の一部または全てにおいて、存在していなくても誘導体化されていてもよい。定常領域に置換を作製して、補体媒介細胞傷害もしくはＡＤＣＣなどのエフェクター機能を増減させる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏら、米国特許第５，８３４，５９７号；およびＬａｚａｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０３巻：４００５頁、２００６年を参照のこと）またはヒトにおける半減期を延長する（例えば、Ｈｉｎｔｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７９巻：６２１３頁、２００４年を参照のこと）ことができる。
【００４９】
典型的な置換には、アミノ酸２３４、２３５、２３７、２３９、２６７、２９８、２９９、３２６、３３０、または３３２位の天然アミノ酸のシステイン残基へのアミノ酸置換、好ましくはヒトＩｇＧ１アイソタイプにおけるＳ２３９Ｃ変異（定常領域の置換は、ＥＵインデックスに従う）がある（ＵＳ２０１００１５８９０９）。追加のシステイン残基の存在により、鎖間ジスルフィド結合形成が可能になる。そのような鎖間ジスルフィド結合形成により立体障害が起こり、それによってＦｃ領域−ＦｃγＲ結合相互作用の親和性が減少することがあり得る。ＩｇＧ定常領域のＦｃ領域にまたはその近傍に導入されるシステイン残基（複数可）は、治療剤と結合体化させるための部位として役立つこともある（例えば、薬物のマレイミド誘導体などチオール特異的試薬を使用して細胞障害性薬物をカップリングさせる）。治療剤の存在により立体障害が起こり、それによってＦｃ領域−ＦｃγＲ結合相互作用の親和性がさらに減少する。２３４、２３５、２３６および／または２３７位のいずれかにおける他の置換は、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体に対する親和性を減少させる（例えば、ＵＳ６，６２４，８２１、ＵＳ５，６２４，８２１を参照のこと）。
【００５０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の半減期も、そのエフェクター機能に影響を与える場合がある。抗体の半減期を増減させて、その治療活性を修飾することができる。ＦｃＲｎは、β２−ミクログロブリンと非共有結合的に会合するＭＨＣクラスＩ抗原と構造的に類似している受容体である。ＦｃＲｎは、ＩｇＧの異化および組織間のそれらのトランスサイトーシスを調節する（ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ、２０００年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８巻：７３９〜７６６頁；ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ、２００２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．２５巻：９７〜１１３頁）。ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用は、ｐＨ６．０（細胞内小胞のｐＨ）で起こるがｐＨ７．４（血液のｐＨ）では起こらず、この相互作用により、ＩｇＧの血液循環への再循環が可能になる（ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ、２０００年、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８巻：７３９〜７６６頁；ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ、２００２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．２５巻：９７〜１１３頁）。ＦｃＲｎ結合に関わるヒトＩｇＧ１の領域がマップされた（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７６巻：６５９１〜６０４頁）。ヒトＩｇＧ１の位置Ｐｒｏ２３８、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｐ３１２、Ｇｌｕ３８０、Ｇｌｕ３８２、またはＡｓｎ４３４におけるアラニン置換は、ＦｃＲｎ結合を増強する（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７６巻：６５９１〜６０４頁）。これらの置換を有するＩｇＧ１分子の血清半減期は長い。その結果、これらの修飾したＩｇＧ１分子はそれらのエフェクター機能を遂行し、したがって無修飾のＩｇＧ１と比較して、より長期間にわたってそれらの治療効果を発揮できる可能性がある。ＦｃＲｎに対する結合を増加させる他の典型的な置換には、２５０位のＧｌｎおよび／または４２８位のＬｅｕがある。定常領域における全ての位置に対してＥＵ番号付けを使用している。
【００５１】
保存されているＡｓｎ２９７に共有結合的に付着しているオリゴ糖は、ＩｇＧのＦｃ領域の、ＦｃγＲに結合する能力に関わる（Ｌｕｎｄら、１９９６年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７巻：４９６３〜６９頁；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５巻：２６〜３１頁）。ＩｇＧに対するこのグリコフォームの操作は、ＩｇＧ媒介ＡＤＣＣを著しく改善することができる。このグリコフォームへのバイセクト（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン修飾の付加（Ｕｍａｎａら、１９９９年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７巻：１７６〜１８０頁；Ｄａｖｉｅｓら、２００１年、Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．７４巻：２８８〜９４頁）またはこのグリコフォームからのフコースの除去（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７７巻：２６７３３〜４０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７８巻：６５９１〜６０４頁；Ｎｉｗａら、２００４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４巻：２１２７〜３３頁）は、ＩｇＧ  ＦｃとＦｃγＲとの結合を改善し、それによってＩｇ媒介ＡＤＣＣ活性を増強するＩｇＧ  Ｆｃ操作の２つの例である。
【００５２】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の溶剤曝露されたアミノ酸の全体的な置換により、ＦｃγＲ結合親和性が改変されたＩｇＧバリアントが生成した（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７６巻：６５９１〜６０４頁）。親ＩｇＧ１と比較したとき、Ｔｈｒ２５６／Ｓｅｒ２９８、Ｓｅｒ２９８／Ｇｌｕ３３３、Ｓｅｒ２９８／Ｌｙｓ３３４、またはＳｅｒ２９８／Ｇｌｕ３３３／Ｌｙｓ３３４のＡｌａへの置換に関わるこれらバリアントのサブセットは、ＦｃγＲに対する結合親和性とＡＤＣＣ活性の両方の増加を実証する（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７６巻：６５９１〜６０４頁；Ｏｋａｚａｋｉら、２００４年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．３３６巻：１２３９〜４９頁）。
【００５３】
抗体の補体結合活性（Ｃ１ｑ結合とＣＤＣ活性の両方）は、Ｌｙｓ３２６およびＧｌｕ３３３での置換によって改善できる（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２００１年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６巻：２５７１〜２５７５頁）。ヒトＩｇＧ２主鎖に対する同じ置換により、Ｃ１ｑに十分結合せず補体活性化活性が激しく欠損している抗体アイソタイプを、Ｃ１ｑに結合し、かつＣＤＣを媒介できる抗体に変換することができる（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２００１年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６巻：２５７１〜７５頁）。他のいくつかの方法を適用して、抗体の補体結合活性も改善した。例えば、ＩｇＧのカルボキシル末端にＩｇＭの１８アミノ酸カルボキシル末端尾部断片を移植することにより、ＣＤＣ活性が大きく増強される。これは、通常なら検出可能なＣＤＣ活性がないＩｇＧ４でも観察される（Ｓｍｉｔｈら、１９９５年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４巻：２２２６〜３６頁）。また、ＩｇＧ１重鎖のカルボキシ末端の近くに位置するＳｅｒ４４４のＣｙｓでの置換は、ＩｇＧ１の尾部−尾部二量体化を誘導し、単量体ＩｇＧ１に比べてＣＤＣ活性を２００倍増加させた（Ｓｈｏｐｅｓら、１９９２年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８巻：２９１８〜２２頁）。加えて、Ｃ１ｑに対する特異性を備えた二重特異性ダイアボディ構築物も、ＣＤＣ活性を与える（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら、１９９７年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５巻：６２９〜３１頁）。
【００５４】
重鎖のアミノ酸残基３１８、３２０、および３２２の少なくとも１つをＡｌａなど異なる側鎖を有する残基に変異させることによって、補体活性を減少させることができる。３つの残基のうちいずれか１つの代わりに、他のアルキル置換された非イオン性残基、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、もしくはＶａｌなど、または芳香族無極性残基、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏなども、Ｃ１ｑ結合を減少させるかまたは無効にする。Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＣｙｓおよびＭｅｔを残基３１８でなく、３２０および３２２で使用して、Ｃ１ｑ結合活性を減少させるかまたは無効にすることができる。極性残基による３１８（Ｇｌｕ）残基の置き換えは、Ｃ１ｑ結合活性を修飾する可能性があるが無効にする可能性はない。残基２９７（Ａｓｎ）をＡｌａと置き換えることにより、溶解活性が除去されるが、Ｃ１ｑに対する親和性は少ししか減少しない（約３分の１）。この変更は、グリコシル化部位および補体活性化に必要な炭水化物の存在を無効化する。この部位における任意のその他の置換も、グリコシル化部位を無効化する。以下の変異およびその任意の組合せも、Ｃ１ｑ結合を減少させる：Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ａ、およびＰ３１１Ｓ（ＷＯ０６／０３６２９１を参照のこと）。
【００５５】
ヒト定常領域に対する参照は、任意の天然のアロタイプまたは天然のアロタイプにおいて多形位置を占有している残基の任意の交換を含む定常領域を含む。また、Ｆｃガンマ受容体結合を減少させるかまたはＦｃＲＮに対する結合を増加させるために上に示した変異など、天然のヒト定常領域と比較して１、２、５、または１０までの変異は存在してもよい。
【００５６】
Ｄ．抗体の発現
キメラまたはヒト化抗体は、通常は組換え発現によって生成される。通常、組換えポリヌクレオチド構築物は、天然に付随のまたは異種のプロモータ領域を含めた、抗体鎖のコード配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはそれにトランスフェクトできるベクター内にある真核生物プロモータ系である。ベクターを適当な宿主に一旦組み込んだら、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現、ならびに交差反応抗体の採集および精製に適切な条件で維持される。
【００５７】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチド部分を発現させるのに好ましい宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ、（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ＮＹ、１９８７年）を参照のこと。完全な異種タンパク質を分泌することができるいくつかの適切な宿主細胞系が当業者によって開発され、ＣＨＯ細胞系（例えば、ＤＧ４４）、様々なＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ならびにＳｐ２／０およびＮＳ０を含めた抗体非生成骨髄腫が含まれる。好ましくは、細胞は、非ヒトである。これらの細胞用の発現ベクターは、複製起点、プロモータ、エンハンサなどの発現制御配列（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．８９巻：４９頁（１９８６年））、ならびにリボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終了配列など必要なプロセシング情報部位を含むことができる。好ましい発現制御配列は、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウィルス、牛パピロマウィルスなどから得られるプロモータである。Ｃｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８巻：１１４９頁（１９９２年）を参照のこと。
【００５８】
αｖβ６に対するヒト抗体は、下に記載した様々な技術によって得られる。ヒト抗体を生成する方法には、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２巻：３６１〜３６７頁（１９８３年）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号；およびＥｎｇｌｅｍａｎら、米国特許第４，６３４，６６６号のトリオーマ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、ＷＯ９３／１２２２７（１９９３年）；ＵＳ５，８７７，３９７、ＵＳ５，８７４，２９９、ＵＳ５，８１４，３１８、ＵＳ５，７８９，６５０、ＵＳ５，７７０，４２９、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，５４５，８０６、Ｎａｔｕｒｅ  １４８巻、１５４７〜１５５３頁（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻、８２６頁（１９９６年）、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、ＷＯ９１／１０７４１（１９９１年）を参照のこと）、ならびにファージディスプレイ法（例えば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７、ＵＳ５，８７７，２１８、ＵＳ５，８７１，９０７、ＵＳ５，８５８，６５７、ＵＳ５，８３７，２４２、ＵＳ５，７３３，７４３およびＵＳ５，５６５，３３２を参照のこと）がある。
【００５９】
一旦発現させたら、抗体は、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含めた当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、１９８２年）を参照のこと）。
【００６０】
ＩＩＩ．核酸
本発明は、上記の重鎖および軽鎖のいずれかをコードする核酸をさらに提供する。通常、核酸は、重鎖および軽鎖に融合されたシグナルペプチドもコードする。核酸のコード配列は、例えばプロモータ、エンハンサ、リボゾーム結合部位、転写終了シグナルなどの調節配列と作動可能に連結されて、コード配列の発現を確実にすることができる。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、単離された形態で存在することができ、または１つもしくは複数のベクターにクローニングされることができる。核酸は、例えば、固体の状態の合成または重なり合うオリゴヌクレオチドのＰＣＲによって合成することができる。重鎖および軽鎖をコードする核酸は１つの連続する核酸として、例えば、発現ベクター内に接合することができ、または別個である、例えば、各々の発現ベクターにクローニングすることができる。典型的な核酸は、配列番号３７（マウス重鎖）、配列番号３８（マウス軽鎖）、配列番号３９（ＨＡ）、配列番号４０（ＨＢ）、配列番号４１（ＨＬ）、配列番号４２（ＨＴ）、配列番号４３（ＨＮ）、配列番号４４（ＨＵ）、配列番号４５（ＬＡ）、配列番号４６（ＬＣ）、配列番号４７（ＬＦ）、配列番号４８（ＬＧ）、配列番号４９（マウス重鎖シグナルペプチド）、配列番号５０（ヒト重鎖シグナルペプチド）、配列番号５１（マウス軽鎖シグナルペプチド）、および配列番号５２（ヒト軽鎖シグナルペプチド）に示される。核酸は、単離された形態で提供され得る。単離された核酸分子は、その自然環境の成分から同定、分離および／もしくは回収されたものまたは天然に存在しないものである。
【００６１】
ＩＶ．抗体薬物結合体
抗αｖβ６抗体を、細胞障害性部分（薬学的に適合するその塩を含める）に結合体化して、抗体薬物結合体（ＡＤＣ）を形成することができる。抗体に結合体化するのに特に適切な部分は、細胞毒性薬剤（例えば、化学療法剤）、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体もしくは化合物、または毒素である（これらの部分は併せて治療剤と称される）。例えば、抗αｖβ６抗体は、化学療法剤または毒素（例えば、細胞増殖抑止剤または細胞破壊剤、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）などの細胞毒性薬剤に結合体化することができる。細胞毒性薬剤の有用な種類の例には、例えば、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡアルキル化剤、およびチューブリン阻害剤がある。典型的な細胞毒性薬剤には、例えば、オーリスタチン、カンプトセシン、デュオカルマイシン、エトポシド、マイタンシノイド（例えば、ＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ３、ＤＭ４）、タキサン、ベンゾジアゼピン含有化合物（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）を含めたベンゾジアゼピンならびにビンカアルカロイドがある。タンパク質、特に抗体に治療剤を結合体化する技術は周知である。（例えば、Ａｌｌｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１０年１４巻：１〜９頁；Ｓｅｎｔｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．、２００８年、１４巻（３号）：１５４〜１６９頁を参照のこと）。
【００６２】
治療剤（例えば、細胞毒性薬剤）は、（例えば、加水分解によって、抗体分解によってまたは切断剤によって）抗体から切り出されない限りその活性が減少する様式で結合体化できる。結合体が、αｖβ６を発現しているがん細胞に内部移行されたときに抗体から切断されるように（例えば、エンドソーム的に、または例えばｐＨ感受性もしくはプロテアーゼ感受性によって、リソソーム環境で、またはカベオラ環境で）、αｖβ６を発現しているがん細胞の細胞内環境において切断に感受性であるが細胞外環境に対して実質的に感受性でない切断可能なリンカーを用いて、そのような治療剤を抗体に付着させることができる。そのような治療剤を切断不可能なリンカーで抗体に付着させることもできる。
【００６３】
通常、ＡＤＣは、治療剤と抗αｖβ６抗体の間にリンカー領域を含む。上述の通り、リンカーの切断により細胞内環境（例えば、リソソームもしくはエンドソームまたはカベオラ内）にある抗体から治療剤が遊離されるように、リンカーを細胞内条件で切断可能にすることができる。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームのプロテアーゼを含めた、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの態様では、ペプチジルリンカーは、少なくとも長さ２アミノ酸または少なくとも長さ３アミノ酸である。切断剤には、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンがあり得る（例えば、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３巻：６７〜１２３頁を参照のこと）。最も典型的なものは、αｖβ６を発現している細胞に存在する酵素によって切断可能なペプチジルリンカーである。例えば、がん性組織において高発現している、チオール依存的プロテアーゼ、カテプシン−Ｂによって切断可能なペプチジルリンカー（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＶａｌ−Ｃｉｔペプチドを含むリンカー）を使用することができる。リンカーは、例えば、治療剤（例えば、薬物）に直接付着しており、抗体の分解によって遊離されるマレイミド−アルキレン−またはマレイミド−アリールリンカーなどの切断不可能なリンカーであることもできる。
【００６４】
ＡＤＣが細胞外環境（例えば、血漿中）に存在するとき、通常、リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性でないとは、ＡＤＣの試料中にあるリンカーの約２０％以下、通常は約１５％以下、より通常には約１０％以下、およびさらにより通常には約５％以下、約３％以下または約１％以下が切断されることを意味している。例えば、（ａ）ＡＤＣ（「ＡＤＣ試料」）と（ｂ）等モル量の結合体化していない抗体または治療剤（「対照試料」）の両方を独立に血漿と一緒に予め定めた時間（例えば、２、４、８、１６、または２４時間）インキュベートし、次いで例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定したＡＤＣ試料中に存在する結合体化していない抗体または治療剤の量を対照試料中に存在する量と比較することによって、リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性でないかどうか決定することができる。
【００６５】
リンカーは、細胞内移行を促進することもできる。リンカーは、治療剤に結合体化されている場合（すなわち、本明細書に記載されるＡＤＣのリンカー−治療剤部分の環境において）、細胞内移行を促進することができる。別法として、リンカーは、治療剤と抗αｖβ６抗体の両方に結合体化されている場合（すなわち、本明細書に記載されるＡＤＣの環境において）、細胞内移行を促進することができる。
【００６６】
典型的な抗体−薬物結合体には、薬物成分がオーリスタチン薬物であることを意味するオーリスタチン系抗体−薬物結合体がある。オーリスタチンはチューブリンに結合し、微小管動態ならびに核および細胞分裂に干渉し、抗がん活性を有することが示された。通常、オーリスタチン系抗体−薬物結合体は、オーリスタチン薬物と抗αｖβ６抗体の間にリンカーを含む。リンカーは、例えば、切断可能なリンカー（例えば、ペプチジルリンカー）または切断不可能なリンカー（例えば、抗体の分解によって遊離されるリンカー）であり得る。オーリスタチンは、オーリスタチンＥまたはその誘導体であり得る。オーリスタチンは、例えば、オーリスタチンＥとケト酸の間で形成されるエステルであり得る。例えば、オーリスタチンＥは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応して、それぞれ、ＡＥＢおよびＡＥＶＢを生成することができる。他のオーリスタチンには、ＭＭＡＦおよびＭＭＡＥがある。典型的なオーリスタチンの合成および構造は、米国特許出願公開第７，６５９，２４１号、第７，４９８，２９８号、第２００９−０１１１７５６号、第２００９−００１８０８６号および第７，９６８，６８７号に記載されており、その各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
典型的なオーリスタチン系抗体薬物結合体には、以下に示すようにｖｃＭＭＡＥ、ｖｃＭＭＡＦおよびｍｃＭＭＡＦ抗体薬物結合体：
【００６８】
【化１】
0006273214.tif 000002
または薬学的に許容されるその塩があり、Ａｂは本明細書に記載の抗体であり、ｖａｌ−ｃｉｔはバリン−シトルリンジペプチドを表す。薬物負荷は、ｐ、抗体当たりの薬物−リンカー分子数、によって表される。文脈に応じて、ｐは、抗体当たりの薬物−リンカー分子の平均数を表すことができ、平均薬物負荷も意味した。ｐは、１〜２０の範囲内にあり、好ましくは１〜８である。いくつかの好ましい実施形態では、ｐが平均薬物負荷を表すとき、ｐは約２〜約５の範囲内にある。いくつかの実施形態では、ｐは、約２、約３、約４または約５である。製剤中の抗体当たりの薬物の平均数は、質量分析、ＨＩＣ、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣなど従来の手段によって特徴付けられてもよい。いくつかの態様では、抗αｖβ６抗体は、抗体のシステイン残基を介して薬物−リンカーに付着している。いくつかの態様では、システイン残基は、抗体に操作されているものである。他の態様では、システイン残基は、鎖間ジスルフィドシステイン残基である。
【００６９】
Ｖ．αｖβ６に対する他の抗体
マウス１５Ｈ３抗体および１５Ｈ３抗体のキメラ形態、ヒト化形態、またはヒト形態と同様に、αｖβ６の細胞外ドメインに結合する他の抗体は、本発明のいくつかの方法、特に膀胱がんの処置法に使用することができる。好ましくは、そのような実施形態では、抗体は細胞毒性薬剤に結合体化されている。抗αｖβ６抗体の一群は公知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１００３３０１０３号および第２０１１０２９４９８２号ならびに米国特許第７，４６５，４４９号、第７，９４３，７４２号および第６，６９２，７４１号を参照のこと、その各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
αｖβ６または１つもしくは複数のその細胞外ドメインを免疫することによって、αｖβ６に対する他の抗体を新たに作製することができる。免疫原に対する他の非ヒト、例えば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラットモノクローナル抗体の産生は、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ  ＮＹ（１９８８年）（全ての目的のために参照により組み込まれる）に記載された通り実施することができる。そのような免疫原は、ペプチド合成によってまたは組換え発現によって、天然の供給源から得ることができる。
【００７１】
非ヒト抗体のヒト化、キメラまたはベニヤ形態（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）を作製することができる。ヒト化抗体を生成するための一般的な方法論は、Ｑｕｅｅｎ、ＵＳ５，５３０，１０１およびＵＳ５，５８５，０８９；Ｗｉｎｔｅｒ、ＵＳ５，２２５，５３９；Ｃａｒｔｅｒ、ＵＳ６，４０７，２１３；Ａｄａｉｒ、ＵＳ５，８５９，２０５；ならびにＦｏｏｔｅ、ＵＳ６，８８１，５５７に記載されている。キメラ抗体とは、非ヒト抗体（例えば、マウス）の軽鎖および重鎖の可変領域が、ヒト軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせられる抗体である。そのような抗体は、実質的または完全にマウス抗体の結合特異性を保持しており、約２／３がヒト配列である。ベニヤ抗体とは、非ヒト抗体のＣＤＲのいくつかおよび通常は全てならびに非ヒト可変領域フレームワーク残基のいくつかを保持しているが、Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、例えば露出している残基（Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８巻：４８９頁、１９９１年）をヒト抗体配列の対応する位置の残基で置き換えている、ヒト化抗体の形態である。その結果、ＣＤＲが完全にまたは実質的に非ヒト抗体由来であり、置換によって非ヒト抗体の可変領域フレームワークがさらにヒト様になるように作製された抗体になる。
【００７２】
αｖβ６に対するヒト抗体は、上記の通り様々な技術によって得ることができる。
【００７３】
必要に応じて、１５Ｈ３抗体など典型的な抗体と同じまたは重なり合うエピトープ特異性を得るために、競合結合アッセイまたは別の方法によっていずれかの抗体を選択することができる。
【００７４】
ＶＩ．治療用途
本発明の抗体を、単独でまたは抗αｖβ６抗体薬物結合体として使用して、がんを処置することができる。そのようながんのいくつかは、タンパク質（例えば、実証された抗体の１つを使用するイムノアッセイによる）またはｍＲＮＡレベルのいずれかで測定される検出可能なレベルのαｖβ６を示す。そのようながんのいくつかは、同じ型の、好ましくは同じ患者の非がん性組織と比較して、αｖβ６レベルの上昇を示す。より高いまたはより低いレベルを処置することもできるが、処置可能ながん細胞におけるαｖβ６の典型的なレベルは、細胞当たり１０００〜２００，０００個のαｖβ６分子である。一般に、固形腫瘍の処置には、より高いコピー数、例えば、細胞当たり少なくとも約１５、０００個のαｖβ６分子が好ましい。任意選択で、処置を実施する前にがんのαｖβ６レベルが測定される。
【００７５】
αｖβ６発現に付随する、処置可能ながんの例には、例えば、膀胱がん、頭頸部がん（例えば、口唇、口腔、鼻腔、副鼻腔、咽頭、および喉頭のがんを含む）、皮膚がん、肺がん、膵臓がん、子宮がん、乳がん（トリプルネガティブ乳がんを含む）、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、ならびに肝がんがある。一態様では、扁平上皮癌および腺癌はαｖβ６発現に付随し、処置可能ながんの例である。本処置は、これらの種類の原発性または転移性腫瘍の患者に適用することができる。本処置は、処置を受けていない、従来の処置（例えば、ホルモン、タモキシフェン、ハーセプチン）に抵抗性がある、またはそのような処置に対する応答の後に再発した患者に適用することもできる。抗αｖβ６抗体およびその結合体を使用して、αｖβ６を発現するがんを処置することができる。一実施形態では、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗αｖβ６抗体またはその結合体を使用して、αｖβ６を発現している膀胱がん、頭頸部がん（例えば、口唇、口腔、鼻腔、副鼻腔、咽頭、および喉頭がんを含む）、皮膚がん、肺がん、膵臓がん、子宮がん、乳がん（トリプルネガティブ乳がんを含む）、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、または肝がんの対象を処置する。一実施形態では、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗αｖβ６抗体またはその結合体を使用して、αｖβ６を発現している扁平上皮癌または腺癌の対象を処置する。
【００７６】
本出願は、膀胱がん細胞の表面にαｖβ６タンパク質を発現させる最初の信頼性のある開示であると考えられる。したがって、αｖβ６指向性療法を使用して、αｖβ６を発現している膀胱がんに罹患している患者を処置することができる（例えば、抗αｖβ６抗体、ペプチドまたはその結合体）。膀胱がんを処置するためのαｖβ６指向性療法には、本明細書に開示する抗体および結合体、例えば、キメラ、ヒト、およびヒト化１５Ｈ３抗体ならびにその結合体があるが、そのような抗体または療法に限定されない。
【００７７】
ヒト、ヒト化またはキメラ抗体は、単独でまたはその結合体として、発症を遅延させ、重症度を減少させ、さらなる悪化を阻害し、および／または少なくとも１つのがんの兆候もしくは症状を改善する、投与量、投与経路および投与の頻度を意図する有効なレジメンで施される。レジメンは、治療上有効なレジメンと称することができる。いくつかの実例では、治療効果は、同じ患者における病歴対照または過去の経験と比較して個々の患者において観察できる。他の実例では、治療効果は、未処置患者の対照集団と比較した処置済み患者集団における臨床前または臨床試験で実証できる。
【００７８】
モノクローナル抗体の典型的な投与量は、例えば、患者体重の０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、より通常には１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇ、もしくは１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、または２ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇ、もしくは２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇ、もしくは３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。抗体薬物結合体の典型的な投与量は、例えば、対象の体重の０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜７．５ｍｇ／ｋｇ、もしくは２ｍｇ／ｋｇ〜７．５ｍｇ／ｋｇもしくは３ｍｇ／ｋｇ〜７．５ｍｇ／ｋｇ、または０．１〜２０もしくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｋｇ）あるいは固定用量として１０〜１５００もしくは２００〜１５００ｍｇである。いくつかの方法において、患者は少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも３ｍｇ／ｋｇの用量を投与され、３週間毎に１回以上投与される。投与量は、障害が急性か慢性かにかかわらず、その他の因子の中で、細胞障害性薬物の同一性、投与の頻度、患者の状態および、もしあれば、従前の処置に対する応答に応じて決まる。
【００７９】
投与は、必要でなくても通常は非経口である。投与は、腫瘍に直接局在化させることもできる。静脈内または皮下投与による体循環への投与が好ましい。静脈内投与は、例えば、３０〜９０分間などにわたる点滴または単回のボーラス注射によることができる。
【００８０】
投与の頻度は、他の因子中でも循環中の抗体または結合体の半減期、患者の状態および投与経路に応じて決まる。頻度は、患者の状態の変化または処置するがんの進行に呼応して、例えば、毎日、毎週、毎月、年４回、または不規則間隔であることができる。継続的な処置過程において、より多いまたは少ない頻度の投薬も可能であるが、静脈内投与の典型的な頻度は１週間に２回〜年４回の間である。継続的な処置過程において、より多いまたは少ない頻度の投薬も可能であるが、静脈内投与の他の典型的な頻度は毎週、４週間のうち３回、または３週間毎である。皮下投与の場合、より多いまたは少ない頻度の投薬も可能であるが、典型的な投薬頻度は毎日〜毎月である。
【００８１】
投与される投薬の回数は、がんの性質（例えば、急性または慢性症状を示すかどうか）および処置に対する障害の応答に応じて決まる。いくつかの態様では、急性障害または慢性障害の急性憎悪の場合、１〜１０の間の投与がしばしば十分である。時には、単回ボーラス投与、任意選択で分割形態が、急性障害または慢性障害の急性増悪に十分である。急性障害または急性憎悪の再発に対して、処置を繰り返すことができる。慢性障害の場合、少なくとも１、５もしくは１０年間または患者の生涯にわたってずっと、一定の間隔、例えば、毎週、２週間に１回、毎月、年４回、６カ月毎に抗体を投与することができる。
【００８２】
非経口投与用の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与の投与量）で提供することができる。医薬組成物は、１つまたは複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または佐剤を使用して処方することができる。処方は、選択される投与経路に応じて決まる。注射の場合、抗体は、水溶液、好ましくは（注射部位における不快感を減少させるために）Ｈａｎｋ溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水もしくは酢酸緩衝液など生理的に適合する緩衝液に処方することができる。溶液は、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有することができる。別法として、抗体は、使用前に適切な媒体、例えば、無菌の発熱物質を含まない水、で構成する凍結乾燥形態であることもできる。液体処方中の抗体の濃度は、例えば、１〜１００ｍｇ／ｍＬであることができる。
【００８３】
本発明の抗体および抗体薬物結合体を用いる処置は、化学療法、放射線、幹細胞処置、外科手術、処置される障害に対して有効な他の処置と組み合わせることができる。いくつかの態様では、本明細書に記載される抗体および抗体薬物結合体は、処置しようとする特定の疾患に対する標準的な治療である他の療法（例えば、第一選択の標準的な治療または第二もしくは第三選択の処置またはさらにサルベージ療法）と一緒に投与されることになる。αｖβ６に対する抗体および抗体薬物結合体と一緒に投与できる他の薬剤の有用な種類には、例えば、他の標的化療法および／または非標的化療法の両方がある。例には、がん性細胞で発現する他の受容体に対する抗体または抗体薬物結合体、αｖβ６を標的にしたペプチドまたはその結合体、抗チューブリン剤（例えば、オーリスタチン）、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、モノ（プラチナ）、ビス（プラチナ）および３核プラチナ錯体ならびにカルボプラチンなどのプラチナ錯体）、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン（ｌｅｘｉｔｒｏｐｓｉｎｓ）、ニトロソ尿素、プラチノール、予形成化合物、プリン代謝拮抗薬、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどがある。
【００８４】
ＶＩＩ．他の用途
抗αｖβ６抗体を使用して、臨床診断もしくは処置に関連してまたは研究においてαｖβ６を検出することができる。がんにおけるαｖβ６の発現は、がんが本発明の抗体を用いて処置可能であることの指標を与える。抗体は、αｖβ６を持つ細胞および様々な刺激に対するその応答を検出する実験室研究用の研究試薬として販売することもできる。そのような使用において、モノクローナル抗体は、蛍光分子、スピン標識分子、酵素またはラジオアイソタイプで標識することができ、αｖβ６のアッセイを実施するのに必要な試薬全てを含むキットの形態で提供することができる。本明細書に記載される抗体を使用して、αｖβ６タンパク質の発現を検出し、がんが抗αｖβ６  ＡＤＣで処置可能かどうか決定することができる。抗体を使用して、例えば、親和性クロマトグラフィーによって、αｖβ６を精製することもできる。
【００８５】
上または下で引用される全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、こうして参照により組み込まれるものとして個々の項目が具体的および個別に示される場合と同程度に、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。配列の異なるバージョンが異なる時点での受託番号と関連付けられる場合、この出願の有効な出願日での受託番号と関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、実際の出願より前の日、または適用可能であれば、受託番号を記載する優先権主張の出願日を意味する。特段の具体的な指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、任意の他のものと組み合わせて使用できる。本発明は、明確さと理解を目的として例示および例により一部詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および修正が実施されてもよいことは、明らかになろう。
【実施例】
【００８６】
材料
以下の実施例において記載される細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、国立がん研究所（ＮＣＩ）またはＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ（ＤＭＳＺ）に指定された条件に従って培養で維持された。Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞系、ＨＰＡＦＩＩ細胞系、およびＢｘＰＣ３細胞系は、ＡＴＣＣから入手した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）ヒト上皮腎臓細胞および対応するトランスフェクタントは、製造者によって記載の通り維持された。細胞培養試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｄａｌｅ、ＣＡ）および他の供給元から入手した。二次抗体試薬は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入した。組換えヒトαｖβ６は社内で調製した。組換えαｖβ３およびαｖβ８は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞は、内在性インテグリンαｖを発現し、その細胞にヒト、カニクイザルまたはマウスインテグリンβ６をコードする完全長ｃＤＮＡを安定にトランスフェクトして、それぞれ、ＨＥＫ２９３Ｆ：ｈｕβ６、ＨＥＫ２９３Ｆ：ｃｙｎｏβ６およびＨＥＫ２９３Ｆ：ｍｕβ６細胞系を生成した。空のベクター（ＨＥＫ２９３Ｆ：ベクター）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を陰性対照として使用した。内在性マウスインテグリンαｖを発現するマウス３Ｔ３およびＦＤＣ−Ｐ１細胞にヒトおよびマウスインテグリンβ６の完全長ｃＤＮＡクローンをトランスフェクトして、それぞれ、３Ｔ３：ｈｕβ６およびＦＤＣ−Ｐ１：ｍｕβ６を生成した。
【００８７】
方法論：
飽和結合アッセイ
以下の抗原を発現している細胞系を使用して飽和結合研究を行った：２９３Ｆ：ｈｕβ６；２９３Ｆ：ｃｙｎｏβ６；ＦＤＣＰ１：ｍｕβ６およびラットＮＢＴ−ＩＩ。抗原を発現している細胞０．２５〜０．５×１０６個を、９６ウェルｖ底プレートに、１ウェル毎に分注した。ｍ１５Ｈ３、ｈ１５Ｈ３（ＨＢＬＣ）およびｈ１５Ｈ３（ＨＴＬＣ）を、同等のレベルのビオチンで直接標識し、０．１ｐＭ〜１５０ｎＭの範囲の濃度で、細胞に添加した。細胞を、氷上で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ウシ胎仔血清、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％ＮａＮ３）で３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中でＰＥ結合体化ストレプトアビジン（０．５μｇ／ｍＬ）と共に氷上で４５分間インキュベートし、３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。結合は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して検出した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して、見かけのＫｄを算出した。
【００８８】
ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳに希釈した１μｇ／ｍＬ組換えヒトαｖβ６、αｖβ３およびαｖβ８で４℃で終夜コーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗浄した。洗浄緩衝液を取り除き、プレートをＴＢＳブロッキング緩衝液（１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡを加えたＴＢＳ）中で、室温で３０分間ブロッキングした。プレートを洗浄し、次いで４．６ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度でＴＢＳブロッキング緩衝液に希釈したビオチン化抗体（ｍ１５Ｈ３またはｈ１５Ｈ３）と共に１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１μｇ／ｍＬ  ＨＲＰ−ストレプトアビジンと共に１時間インキュベートし、洗浄し、次いでＴＭＢ基質と共に１０分間インキュベートした。１Ｍ  Ｈ２Ｓ０４で反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＴプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して読み取った。
【００８９】
競合結合アッセイ
２９３Ｆ：ｈｕβおよびＨＥＫ２９３Ｆ：ｃｙｎｏβ６細胞系を使用して競合結合アッセイを行った。抗原を発現している細胞１×１０５個を、氷上で９６ウェルｖ底プレートの各ウェルに分注した。細胞を、２ｎＭ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７標識マウス１５Ｈ３および濃度を増加させた（０．０２４ｎＭ〜１００ｎＭ）未標識のヒト化１５Ｈ３構築物と共に１時間インキュベートした。細胞をペレット化し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞をペレット化し、ＰＢＳ／ＢＳＡ  １２５μＬに再懸濁した。蛍光をフローサイトメトリによって分析し、飽和蛍光シグナルのパーセントを使用して、結合している標識マウス１５Ｈ３のパーセントを決定し、続いて様々な傾きを有するシグモイド用量反応曲線にデータをフィッティングすることによってＥＣ５０を推定した。
【００９０】
定量的フローサイトメトリ分析
一次抗体としてマウスαｖβ６  ｍＡｂ、および製造業者（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）によって記載の通りＤＡＫＯ  ＱｉＦｉＫｉｔフローサイトメトリ間接アッセイを使用して、細胞表面のαｖβ６コピー数の定量化を決定し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを用いて評価した。
【００９１】
細胞毒性アッセイ
腫瘍細胞を、抗αｖβ６抗体薬物結合体と共に３７℃で９６時間インキュベートした。結合しない（ｈ００）ＡＤＣを、陰性対照として使用した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して細胞生存率を決定し、Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＴプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で結果を測定した。媒体処理した細胞（対照＝１００％）と比較して生存率を５０％低下させるのに必要な化合物の濃度であるＩＣ５０として、結果を記録する。
【００９２】
抗体薬物結合体の産生
抗αｖβ６抗体の抗体薬物結合体は、ＵＳ２００５０２３８６４９に記載の通り調製した。薬物リンカーｖｃＭＭＡＥとｍｃＭＭＡＦの両方については、ＵＳ２００５０２３８６４９に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ活性研究
ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（動物７〜１０匹／群）に培養で増殖させた腫瘍細胞を移植した。２５％マトリゲル中の５×１０５個の細胞を使用してＤｅｔｒｏｉｔ５６２（ＡＴＣＣ）を移植し、２５％マトリゲル中の１×１０６個を使用してＨＰＡＦＩＩ（ＡＴＣＣ）を移植した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したら（ｑ４ｄ×４回の腹腔内注射）、ヒト化αｖβ６  ＡＤＣまたは結合しない対照ＡＤＣを用いる投薬を開始した。ノギスを使用して腫瘍体積をモニタリングし、腫瘍体積がおよそ８００ｍｍ３に達したら、動物を安楽死させた。１匹または複数の動物を安楽死させるまで、腫瘍体積中央値プロットを各群に対して続けた。動物の手順の全ては、実験動物ケア評価認証協会によって公認された施設において動物飼育使用委員会によって承認されたプロトコルの下で実施した。
【００９４】
免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色方法
Ｍｕｌｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（ＴＭＡ）（ｃａｔ＃ＭＣ５００１）は、ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ  Ｉｎｃ．から購入した。全ての試料をＢｏｎｄ−Ｍａｘ（商標）自動染色機（Ｌｅｉｃａ）で処理した。
【００９５】
ＦＦＰＥ組織のＩＨＣ染色：
Ｂｏｎｄ（商標）Ｄｅｗａｘ溶液（Ｌｅｉｃａ、ｃａｔ＃ＡＲ９２２２）を７２℃で使用して、マルチ腫瘍アレイブロックＭＣ５００１のパラフィン切片を保持するスライドを脱パラフィンし、再水和した。ＥＤＴＡに基づくＢｏｎｄ（商標）Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（Ｌｅｉｃａ、ｃａｔ＃ＡＲ９６４０）を使用して、抗原回復を９５〜１００℃で２０分間実施した。スライドは、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ  ｃａｔ＃Ｘ０９０９）で３０分間処理した後、５μｇ／ｍＬ一次抗体マウス抗インテグリンβ６クローン４３７２１６（ＲｎＤ  ＭＡＢ＃４１５５１）と共に２５℃で４５分間インキュベートした。バックグラウンド染色の陰性対照として、アイソタイプ適合性マウスＩｇＧ２ｂ（Ｚｙｍｅｄ  ＃０２−６３００）を５μｇ／ｍＬで使用した。自動化ＩＨＣ染色のために、アルカリホスファターゼ−Ｆａｓｔ  Ｒｅｄに基づく検出キット（Ｂｏｎｄ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒ  ＡＰ  Ｒｅｄ検出キット；Ｌｅｉｃａ、ｃａｔ＃ＤＳ９３０５）を使用した。発色現像の後、切片をヘマトキシリンで対比染色し、カバーガラスを被せた。病理学者によってスライドを評価およびスコア付けし、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１顕微鏡を使用して画像を撮像した。
【００９６】
凍結組織のＩＨＣ：
凍結切片を保持するスライドを、アセトン中で、−２０℃で１０分間インキュベートして、組織を固定した。ＰｅｒｏｘＡｂｏｌｉｓｈ（Ｂｉｏｃａｒｅ  ｃａｔ＃ＰＸＡ９６）過酸化物ブロッキング試薬を２５℃で１５分間適用して、内在性ペルオキシダーゼを消失させた。スライドを、アビジンブロック（Ｖｅｃｔｏｒ  ｃａｔ＃ＳＰ−２００１）で、続けてビオチンブロック（Ｖｅｃｔｏｒ  ｃａｔ＃ＳＰ−２００１）で、２５℃で各１５分間順次インキュベートした。スライドを、１０μｇ／ｍＬヒト化抗インテグリンβ６クローン１５Ｈ３一次抗体と共に６０分間インキュベートした。５０ｍＭ  ＭｎＣｌを含有するＢｏｎｄ（商標）Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｌｅｉｃａ  ｃａｔ＃ＡＲ９３５２）に一次および二次抗体を調製した。バックグラウンド染色の陰性対照として、１０μｇ／ｍＬヒトＩｇＧ（Ａｎｃｅｌｌ  ｃａｔ＃２９５−０１０）を使用した。一次抗体インキュベーションの後に、ビオチン化ヤギ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｃａｔ＃１０９−０６６−０９８）を５μｇ／ｍＬで使用し、２５℃で３０分間インキュベートした。ビオチン化二次抗体の検出のために、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  ｃａｔ＃ＰＫ−７１００）を２５℃で３０分間適用した。Ｂｏｎｄ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ検出キット（Ｌｅｉｃａ  ｃａｔ＃ＤＳ９８００）を使用して、ＤＡＢ発色現像した。切片をヘマトキシリンで対比染色し、カバーガラスを被せた。病理学者によってスライドを評価およびスコア付けし、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１顕微鏡を使用して画像を撮像した。
【００９７】
結果
１．マウス抗体の結合
マウスαｖβ６モノクローナル抗体１５Ｈ３抗体および選択されたそのヒト化バージョンのＫＤを、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスに対して決定した。ラットを除外して、遺伝子工学によって作られた細胞系（２９３Ｆ：ｈｕβ６、２９３Ｆ：ｃｙｎｏβ６またはＦＤＣ−Ｐ１：ｍｕβ６）を使用して、インテグリンβ６オルトログに対する競合および飽和結合研究を行った。遺伝子工学によって作られた細胞系は内在性αｖを発現し、このαｖは組換えβ６鎖と一組になって、内在性αｖと組換えβ６からなるヘテロ二量体受容体が生成される。ラットαｖβ６に対する親和性は、ラットＮＢＴ−ＩＩ膀胱癌細胞を使用して決定され、この細胞は内在性αｖβ６を発現する。
【００９８】
【表１】
0006273214.tif 000003
１５Ｈ３抗体の生成
およそ５×１０６個の３Ｔ３：ｈｕβ６トランスフェクタントの腹腔内注射によりＢＡＬＢ／ｃマウスを３回免疫した。融合の３日前に、マウスは、静脈内（６μｇ）および腹膜内（３０μｇ）に投与される精製組換えヒトαｖβ６の最後の注射を受けた。ポリエチレングリコールを使用して、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞に脾臓およびリンパ節から採取したリンパ球を融合した。融合した細胞を、ハイブリドーマ増殖培地（４ｍＭ  グルタミン、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ、１０％Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＩＭＤＭ）中で終夜回復させた。回復の後に、細胞を遠沈し、次いで、半固体培地に播いた。半固体培地は、ハイブリドーマ選択用のＨＡＴおよびＩｇＧ産生用のＣｌｏｎｅＤｅｔｅｃｔをプラスしたハイブリドーマ増殖培地で補充されたＣｌｏｎｅＭａｔｒｉｘ培地からなった。ハイブリドーマを、３７℃で１０日間インキュベートした。１０日目に、ＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＩｇＧを生成しているハイブリドーマクローンを採集し、ＨＴをプラスしたＩｇＧを枯渇させたハイブリドーマ増殖培地を含有する９６ウェルプレートに移した。ハイブリドーマ培養上清を２９３Ｆ：ｈｕβ６トランスフェクタントに対してスクリーニングし、検出にＡｌｅｘｉｆｌｕｏｒ−６４７標識二次抗体を使用して陽性クローンを同定した。プレートを、ＦＭＡＴ８２００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読み取った。２９３Ｆ：ｈｕβ６および２９３Ｆ：ｃｙｎｏβ６に結合したが２９３Ｆ：ベクターには結合しなかったハイブリドーマを直接コンジュゲーション用として展開した。直接結合体化した抗体パネルを、結合および細胞毒性アッセイで試験した。ｍ１５Ｈ３は、複数のαｖβ６陽性腫瘍細胞系に対してＡＤＣとして細胞毒性活性を示し、ヒトおよびカニクイザル形態抗原に対して同等の親和性を有していたので、リード抗体として選択した。抗体が２９３Ｆ：ｈｕβ６トランスフェクタントに結合するがαｖβ５陽性親系統（２９３Ｆ：ベクター）に結合しないことが示されたＦＭＡＴおよびＦＡＣＳ結合研究において、マウス１５Ｈ３およびヒト化１５Ｈ３の特異性を確認した。抗体が組換えヒトαｖβ６には結合するがαｖβ３またはαｖβ８には結合しなかったＥＬＩＳＡにより、ｍ１５Ｈ３およびｈ１５Ｈ３の結合特異性も確認した。
【００９９】
ヒト化抗体の設計および試験
この実施例において、ヒト化の出発点またはドナー抗体は、マウス１５Ｈ３抗体である。重鎖に対するＶＨ１−４６およびＪＨ４ならびに軽鎖に対するＶＫ２−３０およびＪｋ２によって提供されるゲノム配列を使用した。
【０１００】
１巡目のヒト化において、ヒトアクセプタ配列がドナー配列と異なっている位置において１３の位置が重鎖の中に同定され（Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４１、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ６９、Ｈ７１、Ｈ７２、Ｈ９３、およびＨ１０８）、６つの位置が軽鎖の中に同定され（Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ３６、Ｌ３７、Ｌ４５およびＬ６３）、これらの位置は、抗原が直接に接触する、ＣＤＲのコンフォメーションに影響を及ぼす、または重鎖と軽鎖の間の充填に影響を及ぼすことにより抗体結合に影響を及ぼす可能性がある。これら位置の異なる入れ替えで復帰変異を組み込んで、ヒト化重鎖を８種類およびヒト化軽鎖を５種類作製した。復帰変異には、下線を引き、太字にしてある。（表２および３）。残りの位置は、ヒトアクセプタ配列由来残基で占有されている。
【０１０１】
【表２】
0006273214.tif 000004
【０１０２】
【表３】
0006273214.tif 000005
次いでヒト化抗体を発現させ、ヒト化重鎖および軽鎖のこれらの鎖の入れ替えを表した。重鎖の全てを発現させたが、ＨＢ重鎖だけが評価可能な結合を実証した（図２）。軽鎖の全てが、ＨＢ重鎖との組合せで結合を示した。
【０１０３】
１巡目のヒト化の結合データに基づいて、２巡目のヒト化を実施した。Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ７２、およびＨ９３に加えて、ヒトアクセプタ配列がドナー配列と異なっている３つの位置、Ｈ７３、Ｈ７５、Ｈ７８が重鎖の中に同定され、これらの位置は、抗原が直接に接触する、ＣＤＲのコンフォメーションに影響を及ぼす、または重鎖と軽鎖の間の充填に影響を及ぼすことにより抗体結合に影響を及ぼす可能性がある。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ３６、Ｌ３７、Ｌ４５、およびＬ６３に加えて、１つの位置、Ｌ４が軽鎖の中に同定された。これら位置の異なる入れ替えで復帰変異を組み込んで、追加のヒト化重鎖を１０種類および追加のヒト化軽鎖を１種類作製した。復帰変異には、下線を引き、太字にしてある。（表４および５）。残りの位置は、ヒトアクセプタ配列由来残基で占有されている。
【０１０４】
【表４】
0006273214.tif 000006
【０１０５】
【表５】
0006273214.tif 000007
重鎖の全て（ＨＯおよびＨＫを除く）を発現させた。結合曲線を、図４〜７に示す。
【０１０６】
ＥＣ５０を、下の表６に要約する。
【０１０７】
【表６】
0006273214.tif 000008
発現データ
ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）を使用する様々な腫瘍型の免疫組織化学的分析に、抗Ｂ６クローン４３７２１６（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【０１０８】
【表７】
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凍結組織を使用する様々な腫瘍型の免疫組織化学的分析に、抗Ｂ６クローン４３７２１６（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【０１０９】
【表８】
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ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）および凍結組織を使用する様々な正常な組織型の免疫組織化学的分析にも、抗Ｂ６クローン４３７２１６（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。正常な乳房、膵臓、食道、喉頭、肺、皮膚、子宮、乳房、結腸、前立腺、胃および卵巣の全てで、Ｂ６発現が全くなかった。
【０１１０】
１５Ｈ３抗体を使用して、凍結腫瘍および正常組織試料も染色した。正常組織試料は、Ｂ６発現について陰性だった。トリプルネガティブ乳がん組織の２３％（３／１３）は、穏やか〜強力なＢ６発現を示した。膵臓がん試料（５／５試料）肺がん試料（１０／１０）および胃がん試料（１０／１０）の１００％が、強力なＢ６発現を示した。
【０１１１】
マウス１５Ｈ３
ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性
細胞毒性アッセイを使用して、抗αｖβ６  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性を測定した。定量的ＦＡＣＳ分析により、様々な細胞系においてαｖβ６発現の調査を実施した。下の表を参照すると、マウス１５Ｈ３  ＡＤＣ（ｖｃＭＭＡＥまたはｍｃＭＭＡＦ（ＵＳ２００５０２３８６４９に記載される小分子および／またはリンカーの両方）と結合体化されているマウス１５Ｈ３抗体）は、αｖβ６細胞を殺すのに有効であった。
【０１１２】
【表９】
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図９は、細胞毒性アッセイにおいてヒト化１５Ｈ３抗αｖβ６  ＡＤＣが親マウスと同様に作用したことを示す。
【０１１３】
ヒト化抗αｖβ６  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
膵臓がん（ＨＰＡＦＩＩ、ＢｘＰＣ−３）ならびに頭頸部がん（Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２）モデルを使用して、選択したヒト化αｖβ６  ＡＤＣ（抗体当たり平均４薬物）の抗腫瘍活性をｉｎ  ｖｉｖｏで（図１０〜１２）実証した。ｖｃＭＭＡＥに結合体化されているαｖβ６  ＡＤＣは、未処置および対照ＡＤＣと比較して有意な腫瘍遅延または腫瘍寛解を示した。ｈ１５Ｈ３−ｖｃＭＭＡＥ（４）とは、抗体当たり平均４個のｖｃＭＭＡＥ薬物リンカー分子を有するマウス親抗体のヒト化形態の抗体薬物結合体のことを指す。ｈ００−ｖｃＭＭＡＥ（４）とは、抗体当たり平均４個のｖｃＭＭＡＥ薬物リンカー分子を有する、結合しない対照抗体の抗体薬物結合体のことを指す。ｈ１５Ｈ３−１はＨＢＬＣ構築物であり、ｈ１５Ｈ３−２はＨＬＬＣ構築物であり、ｈ１５Ｈ３−３はＨＴＬＣ構築物である。
【０１１４】
【化２】
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【０１１５】
【化３】
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【０１１６】
【化４】
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【０１１７】
【化５】
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【０１１８】
【化６】
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【０１１９】
【化７】
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【０１２０】
【化８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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