(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディス（Streptomyces scopuliridis）KR-001株。
【請求項２】
受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株を活性成分として含む、雑草防除のための除草剤組成物。
【請求項３】
前記雑草が、イネ科雑草、広葉雑草、または防除困難な雑草である、請求項2に記載の除草剤組成物。
【請求項４】
前記イネ科雑草が、ディジタリア・サングイナリス（Digitaria sanguinalis）、ソルガム・ビコロー（Sorghum bicolor）、アグロピロン・スミチイ（Agropyron smithii）、およびエキノクロア・クルス-ガリ（Echinochloa crus-galli）からなる群より選択されるいずれか1種である、請求項3に記載の除草剤組成物。
【請求項５】
前記広葉雑草が、ソラナム・ニグルム（Solanum nigrum）、エスキノメネ・インディカ（Aeschynomene indica）、アブチロン・アヴィセンナエ（Abutilon avicennae）、キサンチウム・ストルマリウム（Xanthium strumarium）およびカリステジア・ジャポニカ（Calystegia japonica）からなる群より選択されるいずれか1種である、請求項3に記載の除草剤組成物。
【請求項６】
前記防除困難な雑草が、シシオス・アングラタス（Sicyos angulatus）、ヒュムルス・ジャポニカス（Humulus japonicus）、アルテミシア・プリンセプス（Artemisia princeps）、エキセツム・アルベンセ（Equisetum arvense）およびトリフォリウム・レペンス（Trifolium repens）からなる群より選択されるいずれか1種である、請求項3に記載の除草剤組成物。
【請求項７】
受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株を用いて、雑草、またはその種子もしくは生息地を処理するステップを含む、雑草防除方法。
【請求項８】
前記雑草が、イネ科雑草、広葉雑草、または防除困難な雑草である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
炭素源として2〜3％(w/v)のバレイショデンプンのみおよび窒素源として1〜2％(w/v)のダイズ粉のみを含有する、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株（受託番号KCTC 12156BP）の大量生産のための培地組成物。
【請求項１０】
以下のステップ：
(1)炭素源としてバレイショデンプンのみおよび窒素源としてダイズ粉のみを含有する培地組成物を調製するステップ；および
(2) 1〜3％(w/v)のストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株（受託番号KCTC 12156BP）を用いて、ステップ(1)の該培地組成物に接種し、続いて5〜7日間培養するステップ
を含む、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株を大量生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、殺雑草活性を有する新規ストレプトマイセス・スコプリリディス（Streptomyces scopuliridis）株および該菌株の大量生産のための培地組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の種類の雑草があるので、様々な分類法が存在する。農業で用いられる一般的な分類法としては、雑草の生活環および形状による分類法が挙げられる。形状による分類法に従えば、雑草は、雑草の形状によって、イネ科雑草（grass weed）、広葉雑草、カヤツリグサ科雑草（cyperaceae weed）などに分類される。生活環による分類法に従えば、雑草は、雑草がどれだけ長く生きるかによって、一年生雑草、二年生雑草、多年生雑草などに分類される。
【０００３】
イネ科雑草（grass weed）は、茎に容易に識別可能な節間および節から延びる互生の葉を有し、葉は、保護のために茎を囲う葉鞘と、細長い形状の葉脈が平行に形成されている葉身とに分けられる。イネ科雑草としては、エキノクロア・ウティリス（Echinochloa utilis）、ディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）、アロペクルス・エクアリス（Alopecurus aequalis）（スズメノテッポウ）、セタリア・ビリディス（Setaria viridis）（エノコログサ）、フラグミテス・コムニス（Phragmites communis）（ヨシ）、ミスカンスス・シネンシス（Miscanthus sinensis）（ススキ）などが挙げられる。広葉雑草は、イネ科雑草またはスゲ類雑草（sedge weed）に属しない植物であり、文字通り、比較的広い葉を有する雑草を意味する。大抵は長円形、卵形、または針状である葉は、網のように絡み合う葉脈を有する。我々の周囲でしばしば見られる多数の雑草はこの分類に含められ、コニザ・カナデンシス（Conyza Canadensis）（ヒメムカシヨモギ）、トリフォリウム・レペンス（Trifolium repens）（シロツメクサ）、アルテミシア・プリンセプス（Artemisia princes）（ヨモギ）、カルダミネ・コマロヴィ（Cardamine komarovi）、アマランスス・マンゴスタヌス（Amaranthus mangostanus）、モノコリア・ヴァギナリスvar.プランタギネア（Monochoria vaginalis var. plantaginea）（コナギ）、ポタモゲトン・フランケティイ（Potamogeton franchetii）、およびビデンス・トリパルチテ（Bidens tripartite）などである。スゲに属する雑草はイネ科雑草と類似の特徴を共有しているが、スゲ類雑草は、茎の断面がほとんど三角形であり、小舌または耳状部がないという事実により区別される。葉は細く、隆起（ridge）および鋭い先端を有する。また、小さな花が小穂に垂れ下がる。例としては、シペルス・ミクロイリア（Cyperus microiria）（カヤツリグサ）、シペルス・セロティヌス（Cyperus serotinus）（ミズガヤツリ）、エレオカリス・クログワイ・オーウィ（Eleocharis kuroguwai ohwi）（クログワイ）、シルプス・フルヴィアティリス（Scirpus fluviatilis）、シルプス・ジュンコイデス・ロキシブ（Scirpus juncoides Roxb）（イヌホタルイ）などが挙げられる。
【０００４】
北米原産のウリ科の帰化一年生植物であるシシオス・アングラタスL.（Sciyos angulatus L.）（アレチウリ）は、国内では、住宅地、ならびに川岸、道端、鉄道、および農地に集団的に見られ、したがって、生態系を深刻に破壊する雑草である。よって、シシオス・アングラタスL.（Sciyos angulatus L.）は、環境省により野生動植物保護法（Protection of Wild Fauna and Flora Act）の下で侵襲的外来植物として指定されている。シシオス・アングラタスL.（Sciyos angulatus L.）は活発に生長し、多量の種子を生成し、コロニーを形成して増殖するので、シシオス・アングラタスL.（Sciyos angulatus L.）は、草本性植物および樹木を覆って光合成を阻害することにより、草本性植物および樹木を枯れさせ；土壌中の水および窒素を奪って妨害することにより生物学的多様性を変化させ、それにより既存の植生を破壊し；また、種子表面のトゲによって皮膚炎を引き起こすことにより、ヒトおよび家畜に直接的なダメージを引き起こす。現在、シシオス・アングラタスL.（Sciyos angulatus L.）は韓国全土に分布し、その分布範囲は拡大してきており、したがって深刻な損害をもたらしている。つまり、シシオス・アングラタスL.（Sciyos angulatus L.）防除のための防除技術を開発することが緊急に必要とされている。
【０００５】
これまでに知られているシシオス・アングラタスL.（Sciyos angulatus L.）の除去方法は、植物体を切断するかまたは引き抜くことであり、これは大きな労働力を必要とする。一部の農場で見られるシシオス・アングラタスL.（Sciyos angulatus L.）は、グリホサートなどの非選択的な有機合成除草剤を用いることにより部分的に防除される場合があるが、しかしながら、シシオス・アングラタスL.（Sciyos angulatus L.）の主な発生地または生息地が、川岸、道端、または人間が暮らしている住宅地であるので、有機合成除草剤を用いた防除は実際には極端に限定される。
【０００６】
さらに、有機合成除草剤の継続的使用により引き起こされる問題が持ち上がってきており、それは、耐性雑草の出現、生態系への潜在的影響、および環境汚染などである。また、収入の増加および生活の質を重視する風潮により、環境に優しい農業への関心が高まるにつれ、世界中の様々な国で、合成農業用農薬の使用を低減させるための規制が強められている。したがって、従来の有機合成除草剤を用いて住宅地に主に見られるシシオス・アングラタスL.（Sciyos angulatus L.）を防除することは、さらに困難になる。
【０００７】
つまり、自然な条件で容易に分解されることができ、かつヒトおよび家畜に対して低い毒性を有する天然物質または生化学製剤を用いることによる、環境に優しいシシオス・アングラタスL.（Sciyos angulatus L.）の防除のための技術が、緊急に必要とされる。
【０００８】
有機合成除草剤は、低いコストおよび高い殺雑草活性のために長い間用いられてきているが、継続的使用により引き起こされる耐性雑草の出現および環境汚染のために、生分解性でありかつ低い毒性および選択性を有する環境に優しい除草剤を開発することに対する関心が高まっている。特に、アクチノマイセス菌（actinomyces）をはじめとする微生物により産生される殺雑草活性を有する物質は、高い有効性および環境に優しい特性を有し、つまり、該物質が実験材料として、また産業応用のために、注目されてきている。
【０００９】
ストレプトマイセス属の種（Streptomyces sp.）をはじめとするアクチノマイセス菌（菌糸形態（spawn form）で増殖するグラム陽性土壌微生物である）は、除草剤などの抗生物質に加えて、様々なタイプの有益な二次代謝生成物を産生する。つまり、アクチノマイセス菌は、研究または産業応用に関して研究者から注目を集めてきた。アクチノマイセス菌により産生される二次代謝生成物が適用される、殺雑草活性を有する物質の例としては、ストレプトマイセス・サガノネンシス（Streptomyces saganonensis）により産生されるハービシジン（herbicidin）およびハービマイシン（herbimycin）、S.アクチノミセテス（S. actinomycetes）により産生されるアニスマイシン（anismycin）、S.ビリドクロモゲネス（S. viridochromogenes）により産生されるビアラホス（bialaphos）、S.アルブス亜種クロリヌスNRRL B-24108（S. albus subsp. chlorinus NRRL B-24108）により産生されるアルブシジン（albucidin）、およびS.ビリジクロモゲネス（S. viridichromogenes）およびS.ヒグロスコピクス（S. hygroscopicus）から単離されたグルホシネートアンモニウム（glufosinate-ammonium）が挙げられる。中でも、ビアロホス（bialophos）およびアンサミトシン（ansamitocin）は市販されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
多数の研究にもかかわらず、優良な殺雑草活性および低い毒性を有する雑草防除のための天然かつ安全な除草剤を開発することは、極端に限定されている。また、研究開発中の微生物除草剤または植物由来の除草剤の大部分は、農地で見られる雑草を標的とする。つまり、優良な殺雑草活性および低い毒性を有する環境に優しい天然の農薬として用いることができる新規微生物を発見することが、いまだ必要とされている。また、天然の除草剤のための物質としての利用でのストレプトマイセス属の種の菌株の価値を増大させるために、経済的にはコストを低減させながら、微生物の増殖を拡大することができ、活性物質の生成を改善することができる最適化された培地を選択するという、新たな必要性がある。
【００１１】
微生物の培養のために、グルコース、スクロース（sugar）、およびマルトースなどをはじめとする糖類（saccharide）、グルコース抽出物、ならびに様々なタイプのデンプンが炭素源として用いられ；牛肉エキス、麦芽エキス、酵母エキス、ダイズ粉（soybean meal）、およびペプトンなどの有機窒素源、ならびにアンモニア水、硫酸アンモニウム（(NH4)2SO4）、尿素、および硝酸塩などの無機窒素源が窒素源として用いられる。また、鉱物およびビタミンなどの微量元素が、細菌増殖および二次代謝生成物の産生を助けるために用いられる。これらは微生物の培養のために最も必須の要素であり、その組み合わせおよび組成比に応じて、細菌増殖、ならびに二次代謝生成物の産生および種類での差異を生じさせる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、環境に優しい天然生成物由来の除草剤およびその大量生産方法を見出す試みの間に、本発明者らは、以下のことを確認することにより本発明を完成させた：新規ストレプトマイセス・スコプリリディス（Streptomyces scopuliridis）KR-001株、その培養液、または培養物の画分が、イネ科雑草、広葉雑草および防除困難な雑草に対する殺雑草能を示すこと；ならびに前記菌株により生成される活性物質の収量を増大させる炭素源および窒素源を選択することにより、単位生産コストを低減させるための至適条件を確立し、それにより、天然物質由来雑草防除物質の大量生産に対して、該菌株を有用に適用することができることが見出されたこと。
【００１３】
発明の概要
本発明の1つの目的は、新規ストレプトマイセス・スコプリリディス（Streptomyces scopuliridis）株を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、雑草防除のための除草剤組成物、および該組成物を用いることによる雑草を防除するための方法を提供することであり、該組成物は、活性成分として、前記菌株、その培養液、該培養液の抽出物、該培養液または抽出物の画分、および該画分の活性画分からなる群より選択されるいずれか1種以上を含有する。
【００１５】
本発明のまた別の目的は、ストレプトマイセス・スコプリリディス株を大量生産するための培地組成物およびストレプトマイセス・スコプリリディス株を大量生産する方法を提供することであり、ここで該組成物は、活性成分として、バレイショデンプンおよびダイズ粉（soybean powder）を含有する。
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明は、受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株を提供する。
【００１７】
本発明はまた、活性成分として、受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株、その培養液、該培養液の抽出物、該培養液または抽出物の画分、および該画分の活性画分からなる群より選択されるいずれか1種以上を含有する、雑草防除のための除草剤組成物もまた提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株、その培養液、該培養液の抽出物、該培養液または抽出物の画分、および該画分の活性画分からなる群より選択されるいずれか1種以上を用いて、雑草、またはその種子もしくは生息地を処理するステップを含む、雑草防除方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、ストレプトマイセス・スコプリリディス株の大量生産のための培地組成物も提供し、該組成物は、活性成分としてバレイショデンプンおよびダイズ粉を含有する。
【００２０】
さらに、本発明は、ストレプトマイセス・スコプリリディス株を大量生産する方法を提供し、該方法は、以下のステップを含む：
(1)活性成分としてバレイショデンプンおよびダイズ粉を含有する培地組成物を調製するステップ；および
(2) 1〜3％(w/v)のストレプトマイセス・スコプリリディス株を用いて、ステップ(1)の培地組成物に接種し、続いて5〜7日間培養するステップ。
【００２１】
本発明はまた、受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株、その培養液、該培養液の抽出物、該培養液または抽出物の画分、および該画分の使用も提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、大量生産のための培地組成物として使用するための、バレイショデンプンおよびダイズ粉を含有するストレプトマイセス・スコプリリディス株のための培地の使用を提供する。
【００２３】
本発明によれば、受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株、その培養液、または培養物の画分が、イネ科雑草、広葉雑草、および防除困難な雑草に対して優良な殺雑草能を示し、また至適条件の炭素源および窒素源を含有する培地組成物が、低コストで該菌株により生成される活性物質の収量を著明に増大させるので、該菌株は、雑草防除用の組成物または雑草防除方法に有用に用いることができる。
【００２４】
本発明の上記および他の目的、特徴ならびに他の利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明からより明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の16S rRNA遺伝子配列に基づく系統樹を示す図である。
【図２】茎葉処理後のそれぞれの濃度についての本発明の菌株の培養液の殺雑草活性を示す画像である。
【図３】茎葉処理後のそれぞれの濃度についての本発明の菌株の培養液の各画分（すなわち、ヘキサン画分、酢酸エチル画分、ブタノール画分、および水画分）のディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）に対する殺雑草活性を示す画像である。ヘキサン画分：ヘキサン画分；EtOAc画分：酢酸エチル画分；BuOH画分：ブタノール画分；AQ画分：水画分；およびCK：陰性対照。
【図４】土壌処理後のそれぞれの濃度についての本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分の殺雑草作用を示す画像である。
【図５】茎葉処理後のそれぞれの濃度についての本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分の殺雑草活性を示す画像である。
【図６】茎葉処理後の温室条件でのそれぞれの濃度についての本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分のシシオス・アングラタス（Sciyos angulatus）に対する雑草防除作用を示す画像である。
【図７】温室条件下での植物体への移行を通じた本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分のシシオス・アングラタス（Sciyos angulatus）防除作用を示す画像である。
【図８】茎葉処理後の圃場条件での本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分のシシオス・アングラタス（Sciyos angulatus）に対する雑草防除作用を示す画像である。
【図９】それぞれの濃度についての圃場条件下で、および画分の処理後の時点での、本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分のヒュムルス・ジャポニカスSieb. & Zucc.（Humulus japonicus Sieb. & Zucc.）（カナムグラ）に対する雑草防除作用を示す画像である。
【図１０】それぞれの濃度についての茎葉処理後の圃場条件下で、および画分の処理後の時点での、本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分のアルテミシア・プリンセプス・パムパン（Artemisia princes Pampan）（ヨモギ）に対する雑草防除作用を示す画像である。
【図１１】それぞれの濃度についての茎葉処理後の圃場条件下で、および画分の処理後の時点での、本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分のエキセツム・アルベンセL.（Equisetum arvense L.）（スギナ）に対する雑草防除作用を示す画像である。
【図１２】それぞれの濃度についての茎葉処理後の圃場条件下で、および画分の処理後の時点での、本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分のトリフォリウム・レペンスL.（Trifolium repens L.）（シロツメクサ）に対する雑草防除作用を示す画像である。
【図１３】3種類のイネ科作物（イネ、コムギ、およびオオムギである）および2種類の広葉雑草（トウガラシ、およびトマトである）に対する温室条件下での本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分による植物毒性を示す画像である。
【図１４】茎葉処理後のそれぞれの濃度についての本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分、ビアラホスおよびグルホシネートの殺雑草能を比較する画像である。
【図１５】本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分のHPLC結果のグラフを示す図である。
【図１６】本発明の菌株の酢酸エチルの活性物質画分（EA-1、EA-3、EA-4、EA-5、EA-6およびEA-7；EA：酢酸エチル画分）の殺雑草能を示す画像である。
【図１７】茎葉処理後のEA-3、EA-4およびEA-5の殺雑草能を示すグラフであって、該グラフは本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分に対してHPLCを行なうことにより得られる。
【図１８】炭素源の種類に依存するストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養物ろ液の殺雑草活性を示す画像である。
【図１９】窒素源の種類に依存するストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養物ろ液の殺雑草活性を示す画像である。
【図２０】炭素源および窒素源の組み合わせによるストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養物ろ液の殺雑草活性を示す画像である。
【図２１】殺雑草活性を有し、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001により産生される物質A（上段）および物質B（下段）を定量する標準化されたグラフである。
【図２２】ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の至適培養培地の殺雑草活性を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下で、本明細書中で用いられる用語を詳細に説明する。
本明細書中で用いる場合、「大量生産」との用語は、ストレプトマイセス・スコプリリディスの細菌数が、当技術分野でストレプトマイセス・スコプリリディスを培養するために用いられる従来の培地（例えば、ベネット培地）中で培養したものと比較して、著明に拡大し、増加し、増大し、または強化されていることを意味し、かつ好ましくは、細菌数が、少なくとも2倍、拡大し、増加し、または強化されていることを意味する。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、「ストレプトマイセス・スコプリリディス培地組成物」との用語は、ストレプトマイセス・スコプリリディス培地、ストレプトマイセス・スコプリリディスを培養するための組成物、またはストレプトマイセス・スコプリリディス培地に添加される組成物を意味する。
【００２８】
以下で、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株を提供する。
【００２９】
単離および培養、ならびに凍結乾燥および−70℃で冷凍庫中での保存を通して、韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology；KRIBB）により忠清北道清原郡大清湖（Daecheongho, Chungown-gun, Chungcheongbuk-do）付近の森林土壌から取得された菌株が、分類され、次いで本発明に従ってストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株（本明細書以下、KR-001株と称される）として用いられた。
【００３０】
KR-001株は、16s rRNA遺伝子相同性解析を通じてストレプトマイセス・スコプリリディスRB72Tとの約99.7％の相同性を有する新規菌株として同定され、トレプトマイセス・スコプリリディスに分類されている。
【００３１】
本発明者らは、該新規菌株をストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株と命名し、受託番号KCTC 12156BPの下に2012年3月9日に韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures；KCTC）に該菌株を寄託する。
【００３２】
本発明はまた、受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株、その培養液、該培養液の抽出物、該培養液または抽出物の画分、および該画分の活性画分からなる群より選択されるいずれか1種以上を活性成分として含有する、雑草防除のための除草剤組成物も提供する。
【００３３】
前記菌株の培養液の抽出物は、有機溶媒を用いた抽出により得ることができる。好ましくは、抽出は、有機溶媒を単独で用いることにより、または2種以上の有機溶媒を続いて用いることにより行なうことができ、ここで、有機溶媒は、C1〜C4アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールなど）、ヘキサン、および酢酸エチルからなる群より選択される。
【００３４】
抽出物または培養液の画分は、好ましくは、続いて、限定するものではないがヘキサン、酢酸エチル、ブタノール、および水を用いることにより分画される。
【００３５】
活性画分は、好ましくは、限定するものではないがメタノール、エタノール、またはそれらの水溶液を溶媒として用いることにより、培養液または抽出物の画分のカラムクロマトグラフィーから6〜7分、8〜10分、または15〜20分で溶出される画分である。
【００３６】
雑草は、好ましくは、限定するものではないがイネ科雑草、広葉雑草、および防除困難な雑草からなる群より選択されるいずれか1種である。
【００３７】
イネ科雑草は、好ましくは、限定するものではないがディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）、ソルガム・ビコロー（Sorghum bicolor）（モロコシ）、アグロピロン・スミチイ（Agropyron smithii）およびエキノクロア・クルス-ガリ（Echinochloa crus-galli）からなる群より選択されるいずれか1種である。
【００３８】
広葉雑草は、好ましくは、限定するものではないがソラナム・ニグルム（Solanum nigrum）（イヌホオズキ）、エスキノメネ・インディカ（Aeschynomeme indica）（クサネム）、アブチロン・アヴィセンナエ（Abutilon avicennae）（イチビ）、キサンチウム・ストルマリウム（Xanthium strumarium）（オナモミ）およびカリステジア・ジャポニカ（Calystegia japonica）（ヒルガオ）からなる群より選択されるいずれか1種である。
【００３９】
防除困難な雑草は、好ましくは、限定するものではないがシシオス・アングラタス（Sicyos angulatus）（アレチウリ）、ヒュムルス・ジャポニカス（Humulus japonicus）（カナムグラ）、アルテミシア・プリンセプス（Artemisia princes）（ヨモギ）、エキセツム・アルベンセ（Equisetum arvense）（スギナ）およびトリフォリウム・レペンス（シロツメクサ）からなる群より選択されるいずれか1種である。
【００４０】
培養液、その抽出物、該培養液または抽出物の画分、または該画分の活性画分は、好ましくは、限定するものではないがハービシジンA（herbicidin A）、ハービシジンBおよびハービシジンFからなる群より選択されるいずれか1種以上である。
【００４１】
雑草防除のための除草剤組成物は、担体および/または希釈剤を含むことができる。本明細書中で用いる場合、「担体」との用語は、活性成分を有する不活性、有機または無機物質を意味し、担体は、処理対象の植物または他の対象物への活性成分の施用、保存、輸送および/または取扱いを容易にするために混合または製造される。希釈剤または担体の例としては、限定するものではないが、水、ミルク、エタノール、鉱油、およびグリセロールが挙げられる。
【００４２】
本発明者らは、茎葉処理後のそれぞれの濃度についてのKR-001株の培養液の、3種類のイネ科雑草および5種類の広葉雑草に対する優良な殺雑草活性を証明している（表3および図2を参照されたい）。
【００４３】
本発明者らは、培養液がヘキサン層、酢酸エチル層、ブタノール層、および水層へと分画され、続いて4種類のイネ科雑草および5種類の広葉雑草が茎葉処理を通じてそれぞれの濃度について各溶媒画分を用いて処理される場合に、酢酸エチル画分およびブタノール画分で優良な殺雑草活性が示されることを証明している（表4および図3を参照されたい）。
【００４４】
本発明者らは、それぞれの濃度について、4種類のイネ科雑草および5種類の広葉雑草に対する茎葉処理および土壌処理後の酢酸エチル画分の殺雑草能を証明している（表5および6、ならびに図4および5を参照されたい）。
【００４５】
本発明者らは、2000μg mL-1および1000μg mL-1の濃度を有する酢酸エチル画分が、温室条件下で茎葉処理後にシシオス・アングラタス（アレチウリ）を完全に防除することを証明している（図6を参照されたい）。
【００４６】
本発明者らは、酢酸エチル画分が、植物体への移行を通じて、温室条件下でシシオス・アングラタス（アレチウリ）防除作用を有することを証明している（図7を参照されたい）。
【００４７】
本発明者らは、酢酸エチル画分が、圃場条件下でシシオス・アングラタス（アレチウリ）に対してそれぞれの濃度について茎葉処理後の優良な殺雑草能を有すること、および殺雑草能が時間経過と共に増大し、このことが、優良な有効性持続性を示すことを証明している（表7および図8を参照されたい）。
【００４８】
本発明者らは、圃場条件下で茎葉処理後に、酢酸エチル画分が、防除困難な雑草（例えば、ヒュムルス・ジャポニカス（umulus japonicus）（カナムグラ）、アルテミシア・プリンセプス（Artemisia princes）（ヨモギ）、エキセツム・アルベンセ（Equisetum arvense）（スギナ）およびトリフォリウム・レペンス（シロツメクサ））を死滅させる優良な能力を有することを証明している（表8、図9、10、11および12を参照されたい）。
【００４９】
本発明者らは、イネ科作物（イネ、コムギ、およびオオムギなど）および広葉作物（トウガラシ、およびトマトなど）が茎葉処理を通じて酢酸エチル画分を用いて処理される場合に、植物毒性が5種類すべての被験作物で誘導され、このことは、作物選択性がないことを示すことを証明している（表9および図13を参照されたい）。
【００５０】
本発明者らは、同じ濃度での酢酸エチル画分、ビアラホス、およびグルホシネートの殺雑草能が茎葉処理後に互いに比較される場合、酢酸エチル画分が、ビアラホスおよびグルホシネートと同じレベルで殺雑草能を有することを証明している（図14を参照されたい）。
【００５１】
本発明者らは、溶媒としてメタノール、エタノール、またはそれらの水溶液を用いることによりカラムクロマトグラフィーから溶出される画分としての、酢酸エチル画分の活性物質を検出する（図15を参照されたい）。ハービシジンA、ハービシジンBおよびハービシジンFが、検出された画分から単離される。また、検出された画分、すなわち、活性画分が、優良な殺雑草能を有することが証明されている（図16および17を参照されたい）。
【００５２】
したがって、受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株、その培養液、該培養液の抽出物、該培養液または抽出物の画分、および該画分の活性画分は、イネ科雑草、広葉雑草、および防除困難な雑草に対して優良な殺雑草能を示し、したがって、雑草防除のための除草剤組成物の活性成分として有用に用いられる。
【００５３】
さらに、本発明は、以下のステップ：受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株、その培養液、該培養液の抽出物、該培養液または抽出物の画分、および該画分の活性画分からなる群より選択されるいずれか1種以上を用いて、雑草またはその種子もしくは生息地を処理するステップを含む、雑草防除方法を提供する。
【００５４】
本発明者らは、培養液、それぞれの溶媒画分、および酢酸エチル画分を用いて、植物の葉または土壌を処理することができる。培養液、それぞれの溶媒画分、および酢酸エチル画分は、粉剤、粗粒粉剤、微粒剤、粒剤、水和剤、乳剤、液体ビヒクル、懸濁剤（suspension concentrate）、顆粒水和剤（water degradable granule）または油性懸濁剤（oil suspension）の形態であり得る。培養液、それぞれの溶媒画分、および酢酸エチル画分は、土壌を処理するための土壌処理、および植物の茎および葉へと直接噴霧するための茎葉処理後に、イネ科雑草、広葉雑草、および防除困難な雑草に対する優良な殺雑草能を有することが証明されている。
【００５５】
したがって、本発明の受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株、その培養液、該培養液の抽出物、該培養液または抽出物の画分、および該画分の活性画分は、茎葉処理または土壌処理後に優良な殺雑草能を示し、それにより、雑草、その種子、またはその生息地を処理することにより雑草を防除する方法に有用に用いられる。
【００５６】
本発明はまた、ストレプトマイセス・スコプリリディス株の大量生産のための培地組成物も提供し、該組成物は、活性成分としてバレイショデンプンおよびダイズ粉を含有する。
【００５７】
好ましくは、バレイショデンプンは1〜3％(w/v)で含有され、かつダイズ粉は0.5〜2％(w/v)で含有され、より好ましくは、バレイショデンプンは3％(w/v)で含有され、かつダイズ粉は2％(w/v)で含有される。
【００５８】
好ましくは、ストレプトマイセス・スコプリリディス株は、限定するものではないが、受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株である。
【００５９】
好ましくは、組成物は、限定するものではないがグルコースをさらに含む。
【００６０】
好ましくは、組成物は、限定するものではないが1％(w/v)のバレイショデンプン、1％(w/v)のグルコースおよび1％(w/v)のダイズ粉を含有する。
【００６１】
本発明の具体例では、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養培地に関して、微生物増殖に対してかつ殺雑草活性を有する物質の産生に対して好適な炭素源を選択するために、従来のベネット培地が、前培養したストレプトマイセス・スコプリリディスを含有する培養液を用いて接種されている対照培養物ろ液、ならびにダイズペプトンを含む最小栄養培地に炭素源であるグルコース、スクロース、可溶性デンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン、マルトース、および糖蜜を添加し、次に、前培養した菌株を含む培養液を用いて該培地に接種することにより得られる培養物ろ液の最終pH、微生物増殖度、および殺雑草活性の測定の結果として、対照培養液と比較した場合に、それにバレイショデンプン、トウモロコシデンプン、およびマルトースが添加された培養液が、非常に良好な細菌増殖、および約70％の殺雑草活性を示すこと、ならびに生成される活性物質の量が、培養物ろ液のpHが5〜7付近である場合に最大であることを、本発明者らは証明している（表11および図18を参照されたい）。
【００６２】
さらに、微生物増殖および殺雑草活性を有する物質の産生に対して好適な窒素源を選択するために、対照培養物ろ液、ならびにグリセロールを含む基礎培地に窒素源であるスキムミルク、トリプトン、牛肉エキス、ペプトン、コーンスティープリカー（CSL）、ダイズ粉、カゼインペプトン、または酵母エキスを添加し、次に、前培養したストレプトマイセス・スコプリリディスを含む培養液を用いて該培地に接種することにより得られる培養物ろ液の最終pH、微生物増殖、および殺雑草活性の測定の結果として、対照培養液と比較した場合に、それに酵母エキスおよび牛肉エキスが添加された培養液が、好ましい細菌増殖、40〜50％の殺雑草活性、およびpH6〜7の範囲に入る最終pHを示すことを、本発明者らは証明している。添加されたダイズ粉を含む培養液は正常範囲の微生物増殖を示すが、その殺雑草活性は優良であることもまた、証明されている（表12および図19を参照されたい）。
【００６３】
また、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養培地に関して、微生物増殖および殺雑草活性を有する物質の産生に対して好適な比での炭素源および窒素源を選択するために、対照培養物ろ液、ならびに炭素源であるバレイショデンプン、トウモロコシデンプン、またはマルトースを添加し、かつ窒素源である牛肉エキス、ダイズ粉、または酵母エキスを添加し、次に、前培養したストレプトマイセス・スコプリリディスを含む培養液を用いて結果物に接種することにより得られる培養物ろ液の最終pH、微生物増殖、および殺雑草活性の測定の結果として、炭素源としてバレイショデンプン、および窒素源としてダイズ粉を、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株を培養するために用いる場合、細菌増殖は好ましいものであり；90％の殺雑草活性が見られ；かつ最終pHが5〜7の範囲に入ることを、本発明者らは証明している（表13および図20を参照されたい）。
【００６４】
さらに、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株に関して、微生物増殖および殺雑草活性を有する物質の産生に対して好適な、炭素源および窒素源最適化培地組成物を確立するために、対照培養物ろ液、1〜3％(w/v)バレイショデンプン、および0.5〜2.0％(w/v)ダイズ粉を添加し、次に、前培養したストレプトマイセス・スコプリリディスを含む培養液を結果物に接種することにより得られる培養物ろ液、ならびに1％(w/v)バレイショデンプン、1％(w/v)グルコース、および1％(w/v)ダイズ粉を添加し、次に、前培養した菌株を含む培養液を結果物に接種することにより得られる培養物ろ液の、殺雑草活性を有する物質の含有量の測定の結果として、単位生産コストおよび殺雑草能を有する産生される物質の量に関して、3％(w/v)バレイショデンプン、および2％(w/v)ダイズ粉が添加された培養培地が最も好適であり、それにより、3％(w/v)バレイショデンプン、および2％(w/v)ダイズ粉を含む培地が、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養培地としての至適培養培地となることを、本発明者らは証明している（表15および16、ならびに図21を参照されたい）。
【００６５】
また、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の至適培養培地の殺雑草活性を評価するために、至適培地を用いてストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株が培養されている培養液を、茎葉処理のためにディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）に噴霧する場合、至適培地を用いる培養物由来の培養液が、強力な殺雑草能を示すことを、本発明者らは証明している（図22を参照されたい）。
【００６６】
したがって、本発明のストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の大量生産のための至適条件で炭素源および窒素源を混合することにより調製される培地組成物は、優良な微生物増殖、および殺雑草活性を示し、かつ生産コスト減少効果を有し、つまり、該培地組成物は、雑草防除剤の製造のためのストレプトマイセス・スコプリリディス株の大量培養に有用に用いることができる。
【００６７】
さらに、本発明は、活性成分としてバレイショデンプンおよびダイズ粉を含有する培地組成物を用いることによる、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の大量生産方法を提供する。
【００６８】
以下のステップ：
(1) 活性成分としてバレイショデンプンおよびダイズ粉を含有する培地組成物を調製するステップ；ならびに
(2) 1〜3％(w/v)のストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株をステップ(1)の培地組成物に接種し、次に、5〜7日間培養するステップ
を含む、ストレプトマイセス・スコプリリディス株の大量生産方法が提供される。
【００６９】
好ましくは、ステップ(1)の培地組成物は、限定するものではないがグルコースをさらに含む。
【００７０】
好ましくは、ステップ(1)の培地組成物は、限定するものではないが1〜3％(w/v)バレイショデンプン、および0.5〜2％(w/v)ダイズ粉を含有する。
【００７１】
好ましくは、ステップ(1)の培地組成物にストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株を接種した後に、結果物を25〜30℃にて150〜300rpmで5〜7日間培養し、より好ましくは、結果物を27℃にて170rpmで5日間培養する。
【００７２】
好ましくは、ストレプトマイセス・スコプリリディス株は、限定するものではないが、受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株である。
【００７３】
したがって、本発明の活性成分としてバレイショデンプンおよびダイズ粉を含有する培地組成物を用いることにより生成されるストレプトマイセス・スコプリリディス株の培養液は、優良な微生物増殖、優良な殺雑草活性および生産コスト減少効果を示し、つまり、該培養液は、雑草防除剤の製造のためのストレプトマイセス・スコプリリディス株の大量培養に有用に用いることができる。
【００７４】
本発明はまた、雑草防除のための除草剤組成物としての、受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株、その培養液、該培養液の抽出物、該培養液または抽出物の画分、および該画分の使用も提供する。
【００７５】
したがって、本発明の受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株、その培養液、該培養液の抽出物、該培養液または抽出物の画分、および該画分の活性画分は、イネ科雑草、広葉雑草、および防除困難な雑草に対する優良な殺雑草能を示し、つまり、本発明は、雑草防除のための除草剤組成物の活性成分として有用に用いることができる。
【００７６】
さらに、本発明は、大量生産のための培地組成物として使用するための、活性成分としてバレイショデンプンおよびダイズ粉を含むストレプトマイセス・スコプリリディス株の培地の使用を提供する。
【００７７】
したがって、本発明の受託番号KCTC 12156BPで寄託されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株、その培養液、該培養液の抽出物、該培養液または抽出物の画分、および該画分の活性画分は、イネ科雑草、広葉雑草、および防除困難な雑草に対する優良な殺雑草能を示し、つまり、本発明は、雑草防除のための除草剤組成物の活性成分として有用に用いることができる。
【００７８】
以下で、本発明を詳細に説明する。
しかしながら、下記の実施例は本発明を具体的に説明するためだけのものであり、本発明の内容はそれに限定されない。
【実施例】
【００７９】
＜実施例１＞菌株の単離
忠清北道清原郡大清湖（Daecheongho, Chungown-gun, Chungcheongbuk-do）周辺の森林土壌から、菌株を単離した。寒天（フミン酸-ビタミンを含む）培地を用い、細菌および真菌の増殖を阻害するために、適切な濃度のシクロヘキサミドまたはナリジクス酸を添加して用いた。各1gの土壌サンプルを、10mLの滅菌生理食塩溶液に添加し、ボルテックスにより十分に混合した。続いて、各サンプルの100μLを、単離培地上に塗り広げ、28℃にて一定期間、培養および観察した。培養条件は、培養期間中、定期的に観察し、培養されたコロニーを新たな培地に接種して、単一コロニーを単離した。次に、顕微鏡観察により選別を行なった。アクチノマイセス菌の単離培地および培養条件は、以下の通りである（表1）。
【００８０】
各単離菌株を、寒天培地上で培養した。その後、細菌細胞を回収し、20％滅菌グリセロール中に懸濁し、−70℃の冷凍庫に保存した。また、長期保存のために、凍結乾燥を行ない、すなわち、各単離菌株を固形培地上で培養し、10％滅菌スキムミルク中に懸濁し、凍結乾燥して、4℃以下で保存した。
【００８１】
【表１】
0006273279.tif 000002
【００８２】
＜実施例2＞菌株の同定
＜実施例1＞で単離された菌株を同定するために、16S rRNA遺伝子配列解析を行なった。
【００８３】
具体的には、該菌株の16S rRNA遺伝子の配列を取得するために、コロニーPCRを行なった。爪楊枝を用いて単一コロニーをピックアップし、PCRプレミックス（iNtRON Biotechnology, 大韓民国）と混合して、27fプライマーおよび1492rプライマーを用いることにより16S rRNA遺伝子を増幅した。Wizard PCR prep kit（Promega, Medison, WI, USA）を用いることにより、増幅されたPCR産物を精製し、Macrogen（Daejeon, 大韓民国）により配列解析を行なった。NCBIのBLASTを用いて、該配列をGenBankデータベース中の配列と比較した。該配列をCLUSTAL Wを介してアライメントし、PHYDITプログラム・バージョン3.0を用いて系統樹を構築した。該菌株の16S rRNA遺伝子の配列（配列番号1）を近隣結合アルゴリズムに基づいて解析した。
【００８４】
その結果、該菌株は、ストレプトマイセス・スコプリリディスRB72Tと99.7％の相同性を示す菌株であることが見出された（図1）。本発明で用いる菌株は、ストレプトマイセス・スコプリリディス株であると同定され、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001と命名され、受託番号KCTC 12156BPの下に、2012年3月9日に韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology；KRIBB）に寄託されている。
【００８５】
＜実施例3＞茎葉処理後の各濃度についてのストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の活性の測定
茎葉処理後の＜実施例1＞で取得されたストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の活性を測定するために、下記の方法により実験を行なった。
【００８６】
具体的には、500mLのベネット液体培地を500mLバッフル付きフラスコに加えた。続いて、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株を前培養した1％の培養液をフラスコに接種した。その後、結果物を、180rpmにて27℃で7日間培養した。次に、培養液の上清を採取し、1、1/2、および1/4濃度へと希釈した（0.1％Tween-20を含む）。1つの鉢当たり14mLの量の結果物を用いて、3種類のイネ科雑草（ディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）、ソルガム・ビコロー（モロコシ）、およびエキノクロア・クルス-ガリ）、および5種類の広葉雑草（ソラナム・ニグルム（イヌホオズキ）、エスキノメネ・インディカ（Aeschynomeme indica）（クサネム）、アブチロン・アヴィセンナエ（イチビ）、キサンチウム・ストルマリウム（オナモミ）およびカリステジア・ジャポニカ（ヒルガオ））に対して葉面処理を行なった。5日後、外部病徴および有効性が、植物毒性指数に基づいて目視検査により評価されるように、殺雑草能を評価した。ベネット培地の組成成分を、以下の［表2］に示した。
【００８７】
その結果、図2および表3に示されている通り、8種類の雑草植物種に対する未希釈培養液の殺雑草能は90〜100％であり、1/2濃度での殺雑草能は70〜100％であった。被験雑草の中でも、ディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）、ソラナム・ニグルム（イヌホオズキ）およびエスキノメネ・インディカ（Aeschynomeme indica）（クサネム）に対する殺雑草能は比較的強かった。培養液の処理後の時間と共に、殺雑草能は増大し、このことは、有効性持続効果を示す。主要な病徴はバーンダウン（burn down）であり、1/4濃度では、一部のイネ科雑草植物種の色が紫色に変化した（表3および図2）。
【００８８】
【表２】
0006273279.tif 000003
【００８９】
【表３】
0006273279.tif 000004
【００９０】
＜実施例4＞茎葉処理後のストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001培養液由来の溶媒画分の活性の測定
各溶媒画分について＜実施例3＞で取得された培養液の殺雑草能を測定するために、以下の通りに実験を行なった。
【００９１】
具体的には、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液を、ヘキサン層、酢酸エチル層、ブタノール層、および水層へと分画した。ディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）に対する茎葉処理のために、各溶媒に対する画分を、8μg mL-1、16μg mL-1、32μg mL-1、63μg mL-1、125μg mL-1、250μg mL-1および500μg mL-1の濃度で用いた。5日後、外部病徴および有効性が、植物毒性指数に基づいて目視検査により評価されるように、殺雑草能を評価した。
【００９２】
その結果、図3および表4に示される通り、酢酸エチル層およびブタノール層では活性が示されたが、ヘキサン層および水層では活性が示されなかった。特に、最も強い殺雑草能は、酢酸エチル層で実証された。8μg mL-1、16μg mL-1、32μg mL-1、63μg mL-1、125μg mL-1、250μg mL-1および500μg mL-1の酢酸エチル濃度でのディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）に対する殺雑草能は、それぞれ、80％、90％、95％、100％、100％、100％および100％であった。つまり、強力な殺雑草能が示されたことが証明されている。各溶媒画分についての活性物質の収量は、ヘキサン画分について0.03％、酢酸エチル画分について3.61％、ブタノール画分について17.84％、および水画分について73.67％であると評価された（表4および図3）。
【００９３】
【表４】
0006273279.tif 000005
【００９４】
＜実施例5＞土壌処理後のストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の画分の効果の測定
土壌処理についての＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の画分の効果を測定するために、以下の通りに実験を行なった。
【００９５】
具体的には、処理の前日に、4種類のイネ科雑草（ディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）、ソルガム・ビコロー（モロコシ）、エキノクロア・クルス-ガリおよびアグロピロン・スミチイ（Agropyron amithii））、および5種類の広葉雑草（ソラナム・ニグルム（イヌホオズキ）、エスキノメネ・インディカ（Aeschynomeme indica）（クサネム）、アブチロン・アヴィセンナエ（イチビ）、キサンチウム・ストルマリウム（オナモミ）およびカリステジア・ジャポニカ（ヒルガオ））を播種し、温室条件下で管理した（30/20±5℃、明/暗＝14/10時間）。ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の酢酸エチル画分を調製して2000μg mL-1、1000μg mL-1、500μg mL-1、250μg mL-1および125μg mL-1の濃度を有するものにし、噴霧処理した。処理の15日後、植物毒性指数（0〜100％）に基づいて、目視検査により、外部病徴および有効性を評価した。
【００９６】
その結果、図4および表5に示される通り、2000μg mL-1の濃度での酢酸エチル画分の、被験雑草植物種に対する殺雑草能は95〜100％であり、また、完全雑草防除活性（100％）が、1000μg mL-1の濃度でのソルガム・ビコロー（モロコシ）およびアブチロン・アヴィセンナエ（イチビ）を除く雑草植物種全体に対して示された。2000μg mL-1および1000μg mL-1の濃度では、他の雑草植物種は地面に現れないが、ソルガム・ビコロー（モロコシ）およびアブチロン・アヴィセンナエ（イチビ）は地上（上？）に見られ、しかしそれらはバーンダウンした。それぞれの雑草種子が発芽後に処理層を通過する酢酸エチル画分と接触させられ、それによりバーンダウンされたので、これらの病徴が示されたと推測された。被験雑草植物種の中でも、ディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）、アグロピロン・スミチイ（Agropyron amithii）、ソラナム・ニグルム（イヌホオズキ）、キサンチウム・ストルマリウム（オナモミ）およびカリステジア・ジャポニカ（ヒルガオ）は500μg mL-1の濃度で完全にバーンダウンし、アグロピロン・スミチイ（Agropyron amithii）およびカリステジア・ジャポニカ（ヒルガオ）は250μg mL-1（アグロピロン・スミチイに関して）および125μg mL-1（カリステジア・ジャポニカに関して）の濃度で完全にバーンダウンし、このことは、アグロピロン・スミチイ（Agropyron amithii）およびカリステジア・ジャポニカ（ヒルガオ）が最も感受性が高い植物種であったことを意味する（図4および表5）ことが証明されている。
【００９７】
【表５】
0006273279.tif 000006
【００９８】
＜実施例6＞茎葉処理後のストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の画分の活性の測定
茎葉処理についての＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の画分の効果を測定するために、以下の通りに実験を行なった。
【００９９】
具体的には、4種類のイネ科雑草（ディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）、ソルガム・ビコロー（モロコシ）、エキノクロア・クルス-ガリおよびアグロピロン・スミチイ（Agropyron amithii））、および5種類の広葉雑草（ソラナム・ニグルム（イヌホオズキ）、エスキノメネ・インディカ（Aeschynomeme indica）（クサネム）、アブチロン・アヴィセンナエ（イチビ）、キサンチウム・ストルマリウム（オナモミ）およびカリステジア・ジャポニカ（ヒルガオ））を播種し、9日間、温室条件下で生長させた。続いて、＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分を希釈し、噴霧茎葉処理のために、液体が2000μg mL-1、1000μg mL-1、500μg mL-1、250μg mL-1、125μg mL-1および62.5μg mL-1の濃度を有するように、薬物配合液（50％アセトン、および0.1％Tween-20を含む）を調製した。処理の12日後、植物毒性指数（0〜100％）に基づいて目視検査により、外部病徴および有効性を評価した。
【０１００】
その結果、図5および表6に示される通り、2000μg mL-1および1000μg mL-1の処理濃度での9種類の雑草に対する殺雑草能は90〜100％であり、このことは強い活性を示唆し、500μg mL-1の濃度では80〜100％であり、良好であった。外部病徴は薬物処理の初期相で見られ、処理からの時間経過と共に増大する効果が示された。殺雑草能は薬物処理の10日後に保たれていた。つまり、残留効果持続性があったことが証明されている。主要な病徴としては、処理の初期相に水浸状小斑点（water soaked spot）が形成され、雑草は時間と共にバーンダウンし、最終的には枯れた葉になった。雑草植物種に応じて、250μg mL-1以下の濃度で強力な殺雑草能が示されたこと、ならびに62.5μg mL-1の濃度でソルガム・ビコロー（モロコシ）、ソラナム・ニグルム（イヌホオズキ）、およびエスキノメネ・インディカ（Aeschynomeme indica）（クサネム）に対する95％以上の殺雑草能が示されたことが証明された（図5および表6）。
【０１０１】
【表６】
0006273279.tif 000007
【０１０２】
＜実施例7＞温室条件下での茎葉処理後のストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の画分のシシオス・アングラタス（アレチウリ）防除作用の評価
温室条件下での茎葉処理後の＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の画分の、シシオス・アングラタス（アレチウリ）に対する防除作用を測定するために、以下の通りに実験を行なった。
【０１０３】
具体的には、3葉期まで生長させたシシオス・アングラタス（アレチウリ）を、温室条件下での茎葉処理を通じて2000μg mL-1および1000μg mL-1の濃度で酢酸エチル画分を用いて処理した。7日後に、目視検査を行なった。
【０１０４】
その結果、図6に示される通り、茎葉処理後に24時間経過したときに、外部病徴が現われ始め、5日後には両方の濃度（2000μg mL-1および1000μg mL-1）でシシオス・アングラタス（アレチウリ）は完全に抑制されたことが証明されている（図6）。
【０１０５】
＜実施例8＞温室条件下での植物体への移行を介したストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の画分のシシオス・アングラタス（アレチウリ）防除作用の評価
温室条件下での植物体への移行を介した、＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の画分のシシオス・アングラタス（アレチウリ）防除作用を測定するために、以下の通りに実験を行なった。
【０１０６】
具体的には、温室条件下でシシオス・アングラタス（アレチウリ）を播種した。第3葉が広がったときに、1000μg mL-1の濃度を有するように調製した酢酸エチル画分を浸み込ませているガーゼを準備し、続いて、アルミホイルを用いてガーゼと共に密閉することにより、第3葉の茎を局所的に処理した。次に、シシオス・アングラタス（アレチウリ）を、植物体への十分な吸収のために24時間暗条件下に置いた。処理の24時間後、ガーゼおよびアルミホイルを取り除いた。シシオス・アングラタス（アレチウリ）を同じ温室条件下で管理しながら、移行が生じているか否かを毎日観察した。処理の6日後に、目視検査を行なった。
【０１０７】
その結果、図7に示されている通り、局所処理の2日後に外部病徴が現われ始めたこと；および処理の6日後に、処理されたシシオス・アングラタスは第2葉（下葉である）および第4葉（上葉である）の周囲から進行するバーンダウンを伴って4葉期まで発達した一方で、未処理のシシオス・アングラタスは7葉期まで発達した。したがって、酢酸エチル画分の上方移行および下方移行が同時に行なわれたことが証明されている（図7）。
【０１０８】
＜実施例9＞圃場条件下での茎葉処理後のストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の画分のシシオス・アングラタス（アレチウリ）防除作用の評価
茎葉処理後の＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の画分のシシオス・アングラタス（アレチウリ）防除作用を測定するために、以下の通りに実験を行なった。
【０１０９】
具体的には、＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分が、環境省により「侵襲的外来植物」として指定されている環境に有害な植物であるシシオス・アングラタス（アレチウリ）に対して、温室条件下で強力な防除作用を示したことが証明されているので、圃場施用試験を、実際的な圃場条件下で行なった。圃場試験の場所は、京畿道楊平郡介軍面仰徳里31-15（31-15 Angdeok-ri, Gaegun-myeon, Yangpyeong-gun, Gyeonggi-do）に位置する公民館前のNamhangangbyeon地区であり、試験期間は2011年9月22日から2011年10月6日までであった。薬物処理が行われた際の生育状況としては、シシオス・アングラタス（アレチウリ）は、2m〜3mの全長を有する10葉期〜15葉期であった。処理区域は1m×1mであり、各濃度当たり300mLが処理された。酢酸エチル画分を計り分け、最終濃度が2000μg mL-1および4000μg mL-1となるようにした。次に、画分を少量のアセトン中に溶解させ、希釈して、薬物配合液へと調製した（（50％アセトン、および0.1％Tween-20を含む）。続いて、目視検査を、処理の5、8、および14日後に行なった。
【０１１０】
その結果、図8および表7に示されている通り、圃場条件下での本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分の、シシオス・アングラタス（アレチウリ）に対する殺雑草能が、薬物処理後の時間経過と共に増大すること、および有効性持続性は優良であり、シシオス・アングラタス（アレチウリ）防除作用は、処理の5、8、および14日後に、それぞれ50％、90％、および100％（4000μg mL-1の濃度で）ならびに40％、70％および80％（2000μg mL-1の濃度で）となったことが示されている。典型的には、天然物質由来の殺雑草活性を有する物質は即効性であり、したがって、薬物処理の数時間後に有効性が現われ始め、有効性の持続期間は短く、つまり、薬物処理後の一定時間で再生が起こることが知られている。しかしながら、前記酢酸エチル画分は、2週間後に殺雑草能を保持し、このことは、有効性での優良な持続性を有する特性を示唆する。さらに、薬物で処理された葉に加えて、薬物で処理された葉の下部に位置する茎が立ち枯れ病のように折れるという病徴を考慮すると、下部の茎への移行があることが見出された（図8および表7）。
【０１１１】
【表７】
0006273279.tif 000008
【０１１２】
＜実施例10＞茎葉処理後の防除困難な雑草（ヒュムルス・ジャポニカス（カナムグラ）、アルテミシア・プリンセプス（Artemisia princes）（ヨモギ）、エキセツム・アルベンセ（スギナ）およびトリフォリウム・レペンス（シロツメクサ））に対するストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の画分の雑草防除作用
圃場条件下での＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の画分の、ヒュムルス・ジャポニカス（カナムグラ）、アルテミシア・プリンセプス（Artemisia princes）（ヨモギ）、エキセツム・アルベンセ（スギナ）およびトリフォリウム・レペンス（シロツメクサ）などの防除困難な雑草に対する雑草防除作用を測定するために、以下の通りに実験を行なった。
【０１１３】
具体的には、大田広域市儒城区（Yuseong-gu, Daejeon）の韓国化学研究所（Korea Research Institute of Chemical Technology）の圃場周辺の、試験対象の雑草が自生していた選択された領域に対して試験を行ない、試験期間は2011年10月4日から2011年10月16日までであった。処理区域は1m×1mであり、各濃度当たり200mLが処理された。＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分を計り分け、最終濃度が2000μg mL-1および4000μg mL-1となるようにした。続いて、結果物を少量のアセトン中に溶解させ、希釈して、薬物配合液へと調製して（50％アセトン、および0.1％Tween-20を含む）、処理した。目視検査を、薬物処理の5、10、および15日後（ヒュムルス・ジャポニカスに対して）、5、8、および10日後（アルテミシア・プリンセプス（Artemisia princes）およびエキセツム・アルベンセに対して）ならびに4、8、および12日後（トリフォリウム・レペンスに対して）に行なった。
【０１１４】
＜10-1＞ヒュムルス・ジャポニカス（カナムグラ）防除作用の評価
図9および表8に示されている通り、＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分は、ヒュムルス・ジャポニカス（カナムグラ）に対して優良な雑草防除作用を示し、2000μg mL-1および4000μg mL-1の濃度での処理5日後に、約40％および30％の雑草防除作用がそれぞれ見られ、その後、効果は迅速に高まり、10日後にはそれぞれ100％および95％が見られ、15日後には両方の処理濃度で100％の殺雑草能が見られた（表8および図9）。殺雑草能はシシオス・アングラタス（アレチウリ）で示された病徴と同様に時間経過と共に継続的に増大し、殺雑草能は処理後15日間保持される。つまり、有効性持続効果を保持する特性があることが証明されている。
【０１１５】
【表８】
0006273279.tif 000009
【０１１６】
＜10-2＞アルテミシア・プリンセプス（ヨモギ）防除作用の評価
図10および表8に示されている通り、＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分は、優良なアルテミシア・プリンセプス（ヨモギ）防除作用を示し、2000μg mL-1および4000μg mL-1の濃度で、完全なアルテミシア・プリンセプス（Artemisia princes）（ヨモギ）防除作用が見られた。効果は処理の3日後に現われ始めた。5日後に、2000μg mL-1の濃度では80％が防除され、4000μg mL-1の濃度では完全な防除作用が見られた。その後、8日後に、両方の濃度での雑草防除が100％となり、したがって、殺雑草能が保持されたことが証明されている（表8および図10）。
【０１１７】
＜10-3＞エキセツム・アルベンセ（スギナ）防除作用の評価
図11および表8に示されている通り、＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分は、優良なエキセツム・アルベンセ（スギナ）防除作用を示し、迅速な有効性の発現により、処理5日後に4000μg mL-1および2000μg mL-1の濃度にて95％および90％の殺雑草能がそれぞれ見られ、完全なバーンダウンが8日後に見られた（表8および図11）。
【０１１８】
＜10-4＞トリフォリウム・レペンス（シロツメクサ）防除作用の評価
図12および表8に示されている通り、＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分は、優良なトリフォリウム・レペンス（シロツメクサ）防除作用を示し、処理4日後には斑点が形成されてこれが進行し、8日後に葉が完全にバーンダウンした。続いて、12日後には茎までもバーンダウンした。したがって、殺雑草能が保持され、有効性発現速度は同様に迅速であることが証明されている（表8および図12）。
【０１１９】
＜実施例11＞温室条件下でのストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の画分の作物選択性の評価
＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の画分の作物選択性を評価するために、以下の通りに実験を行なった。
【０１２０】
具体的には、＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分の作物選択性が評価され、この場合、シシオス・アングラタス（アレチウリ）をはじめとする様々なタイプの雑草に対する該画分の優良な殺雑草能が評価された。被験作物は、イネ、コムギ、およびオオムギなどの3種類のイネ科作物ならびにトウガラシおよびトマトなどの2種類の広葉作物であった。処理時のそれぞれの作物の生育状況は、以下の通りであった：イネについて3.5葉；コムギについて1.2葉；オオムギについて1葉；トウガラシについて3.7葉；およびトマトについて4.4葉。処理濃度は、4000μg mL-1、2000μg mL-1、1000μg mL-1、500μg mL-1、250μg mL-1および125μg mL-1であった。作物に対する植物毒性の程度は、処理の14日後に目視検査により評価した。
【０１２１】
その結果、図13および表9に示されている通り、植物毒性は5種類すべての被験作物で引き起こされ、したがって作物選択性はないことが証明されている。特に、重度の植物毒性が、広葉作物であるトウガラシおよびトマトで引き起こされ、最も重度である100％の植物毒性が処理濃度の全範囲にてトマトで引き起こされ、70〜100％の植物毒性が一定範囲の処理にてトウガラシで引き起こされた。比較的低い植物毒性が広葉作物で引き起こされ、50〜80％が処理濃度の範囲内でオオムギに対して見られ、比較的低い30％以下の植物毒性が、イネおよびコムギで引き起こされた。したがって、アクチノマイセス菌由来の殺雑草活性を有する物質は作物選択性を有さず、つまり、該物質は非選択的に用いられるべきであることが証明されている（図13および表9）。
【０１２２】
【表９】
0006273279.tif 000010
【０１２３】
＜実施例12＞ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の画分と対照化合物との殺雑草能の比較
＜実施例4＞で取得された培養液の画分の殺雑草能を評価するために、ビアラホスおよびグルホシネートの殺雑草能を一緒に比較した。
【０１２４】
具体的には、園芸用の床土を、350cm2の表面積を有するプラスチック製角型鉢に入れ、ディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）をはじめとする4種類のイネ科雑草およびソラナム・ニグルム（イヌホオズキ）をはじめとする3種類の広葉雑草（broad weed）を、温室条件下でそれぞれ播種した（25±3℃、14/10h＝明/暗）。播種の15日後、培養液の酢酸エチル画分、ビアラホス、およびグルホシネートを希釈して、濃度が250、500および1000μg mL-1になるように、薬物配合液（50％アセトン、および0.1％Tween-20を含有する）へと調製した。続いて、薬物配合液を、14mL/鉢の量で、茎葉に処理した。その後、目視検査により殺雑草能を評価した。
【０１２５】
その結果、図14に示される通り、＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分、ビアラホス、およびグルホシネートは、250μg mL-1、500μg mL-1および1000μg mL-1の濃度で同様のレベルの殺雑草能を示したことが証明されている（図14）。つまり、本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分の殺雑草能は、対照化合物であるビアラホスまたはグルホシネートのものと同様であったことが見出されている。
【０１２６】
＜実施例13＞ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養液の画分中の殺雑草活性を有する物質の評価
＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の画分中の殺雑草活性を有する物質を評価するために、以下の通りに実験を行なった。
【０１２７】
具体的には、＜実施例4＞で取得された本発明の菌株の培養液の酢酸エチル画分に対して、HPLCを行なった。分析条件は、以下の通りであった（表10）。
【０１２８】
結果として、Rtにて、6分50秒、9分10秒、および15分30秒でピークが特定された（図15）。
【０１２９】
【表１０】
0006273279.tif 000011
【０１３０】
＜実施例14＞ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001の培養液の酢酸エチル活性物質画分の化合物およびその殺雑草能の評価
＜実施例12＞で、Rt.にて6分50秒、9分10秒、および15分30秒で得られた化合物、ならびにその殺雑草能を評価するために、以下の通りに実験を行なった。
【０１３１】
具体的には、上記の分析条件（表10）を用いて、＜実施例12＞で、Rt.にて6分50秒、9分10秒、および15分30秒で得られた化合物に対して分取HPLCを行ない、化合物を第1〜第7画分に分けた。茎葉処理により、112.5μg mL-1、225μg mL-1、450μg mL-1および900μg mL-1の濃度で各画分を用いてディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）を処理した。外部病徴および有効性が、植物毒性指数に基づいて目視検査により評価されるように、5日後に殺雑草能を評価した。
【０１３２】
その結果、図16および17に示される通り、第3、4および5画分で優良な殺雑草能が示された。優良な殺雑草能を示した第3、4および5画分を、単離および精製した。その後、Rt.にて6分50秒、9分10秒、および15分30秒の構造物は、文献とのデータ比較により、ハービシジンB、ハービシジンAおよびハービシジンFとして立証された（The Journal of Antibiotics 1982, 35 1711-1714.を参照されたい）（図16および17）。
【０１３３】
＜実施例15＞ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の工業的大量生産のための培地用の至適炭素源の研究
ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養培地であった［表2］に記載のベネット培地の組成成分を簡潔化することにより生産コストを下げるために、かつストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株を効率よく大規模に培養するために、微生物培養の間に工業的に用いられる種々の炭素源の中で、微生物増殖および殺雑草活性を有する物質の産生に対して好適な培地を選択するための実験を行なった。
【０１３４】
具体的には、0.5％(w/v)のダイズペプトン（5g/L）を500mLバッフル付きフラスコに加えて、最小栄養培地を調製した。続いて、工業的原料であったグルコース、スクロース、可溶性デンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン、マルトースおよび糖蜜（各1.0％(w/v)（10g/L））をそれぞれ加えた。その後、2％の＜実施例1＞で前培養した培養液を用いて結果物に接種し、170rpmにて27℃で5日間、振盪培養した。各培養液についての最終pHおよび微生物増殖の程度を測定した。殺雑草活性を評価するために、細菌が完全に除去された培養物ろ液を8倍に希釈した（0.1％Tween-20を含む）。希釈液を、温室条件下（30±5℃、明/暗＝14時間/10時間）で茎葉処理のためにディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinali）（オニメヒシバ）に噴霧した。3日後、外部病徴および殺雑草能の程度に基づいて目視検査を行なった（0；効果なし、100；完全な防除）。また、対照として、［表2］に記載の500mLのベネット培地を、500mLのバッフル付きフラスコに加えた。続いて、2％の＜実施例1＞で前培養した培養液を用いて培地に接種し、170rpmにて27℃で5日間、振盪培養した。
【０１３５】
その結果、表11および図18に示されている通り、以下のことが見出されている：ベネット培地培養液と比較して、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン、およびマルトースが添加された培地は非常に優良な細菌増殖および約70％の殺雑草活性を示したこと；ならびに可溶性デンプンが添加された培地はベネット培地と同様の細菌増殖および60％であった優良な殺雑草活性を示したこと。また、比較的高い殺雑草活性を示した、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン、およびマルトースが添加された培地は、pH6〜7の範囲に入るpH、および非常に良好な（+++）細菌増殖を有することが証明されている。その一方で、比較的低い殺雑草活性（すなわち、20％）を有する、スクロースおよび糖蜜などの炭素源が添加された培地のpHは、pH9付近である高pHを有し、通常レベル（++）の細菌増殖を示した。つまり、結果から、以下のことが証明されている：殺雑草活性を有する物質の生成量または代謝生成物の種類は、炭素源の種類に依存して変化し；培養物ろ液のpHは、該変化により影響され；ならびに、最終的に、活性物質の生成量はpH5〜7付近で最も高く、それにより比較的高い殺雑草活性を示した（表11および図18）。
【０１３６】
【表１１】
0006273279.tif 000012
【０１３７】
＜実施例16＞ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の工業的大量生産のための培地の至適窒素源の研究
＜実施例15＞に記載された通り、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養培地であったベネット培地の組成成分を簡潔化することにより生産コストを下げるために、かつストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株を効率よく大規模に培養するために、微生物培養の間に工業的に用いられる種々の窒素源の中で、微生物増殖および殺雑草活性を有する物質の産生に対して好適な培地を選択するための実験を行なった。
【０１３８】
具体的には、炭素源として2％グリセロール（20mL/L）が添加された基礎培地を500mLのバッフル付きフラスコ中で調製し、続いてスキムミルク、トリプトン、牛肉エキス、ペプトン、コーンスティープリカー（CSL）、ダイズ粉、カゼインペプトン、酵母エキス、およびダイズペプトンなどの、0.5％(w/v)（5g/L）の有機的形態の窒素源を加えた。その後、2％の＜実施例1＞で前培養した培養液を用いて培地に接種し、170rpmにて27℃で5日間、振盪培養した。＜実施例15＞と同じ方法により、微生物増殖および殺雑草活性について培養液を調査した。また、対照として、［表2］に記載の500mLのベネット培地を、500mLのバッフル付きフラスコに入れ、2％の＜実施例1＞で前培養した培養液を用いて接種した。続いて、結果物を170rpmにて27℃で5日間、振盪培養した。
【０１３９】
その結果、表12および図19に示されている通り、酵母エキスおよび牛肉エキスが窒素源として添加された場合、細菌増殖は非常に良好（+++）であり；培養物ろ液の8倍希釈液が処理された場合に40〜50％の殺雑草能が見られ；かつ炭素源の場合と同じく最終pHは6〜7の範囲に入った。つまり、各窒素源について、細菌増殖と培養物ろ液のpHとの間には密接な相関関係があることが証明されている。なお、ダイズ粉が添加された場合には、細菌増殖は通常レベル（++）であり、しかしながら、殺雑草活性は、酵母エキスまたは牛肉エキス添加培地のものと同様のレベルであった。一般的に、細菌増殖と生成される二次代謝生成物の量とはほとんど比例する。しかしながら、培養環境によっては、細胞数のみが増大して、二次代謝生成物の生成は実質的には小さい場合があり、逆に、細菌増殖が比較的乏しく、しかしながら生成される二次代謝生成物の量は比較的大きい場合がある。ダイズ粉が添加された培地は通常の細菌増殖を示したが、優良な殺雑草活性を示したので、殺雑草能を示す活性物質の生成は活発に行なわれたことが証明されている（表12および図19）。
【０１４０】
【表１２】
0006273279.tif 000013
【０１４１】
＜実施例17＞ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の工業的大量生産のための至適培地の選択
工業的培地構成成分の中から＜実施例15＞および＜実施例16＞で選択された優良な殺雑草活性を有する炭素源および窒素源を組み合わせることにより、殺雑草活性を有するストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の物質の生成のための至適培地を選択した。
【０１４２】
具体的には、500mLのバッフル付きフラスコに、炭素源であった1％(w/v)のバレイショデンプンおよびトウモロコシデンプンまたはマルトース、ならびに窒素源であった0.5％(w/v)の牛肉エキス、ダイズ粉または酵母エキスを加え、ここで炭素源および窒素源は＜実施例15＞および＜実施例16＞で選択されたものであり、優良な殺雑草活性を有した。続いて、2％の＜実施例1＞で前培養した培養液を用いてフラスコに接種した。各培地の初期pHを6.95〜7.10に調整した。その後、結果物を170rpmにて27℃で5日間、振盪培養した。各培地についての殺雑草活性を評価するために、＜実施例15＞に記載されている通りに、噴霧茎葉処理によりディジタリア・サングイナリス（Digotaris sanguinalis）（オニメヒシバ）を処理した。3日後、外部病徴および殺雑草能の程度に基づいて目視検査（0；効果なし、100；完全な防除）を行なった。また、対照として、［表2］に記載の500mLのベネット培地を、500mLのバッフル付きフラスコに入れ、2％の＜実施例1＞で前培養した培養液を用いてフラスコに接種した。続いて、170rpmにて27℃で5日間、結果物を振盪培養した。
【０１４３】
その結果、表13および図20に示されている通り、以下のことが証明されている：炭素源としてトウモロコシデンプンが用いられた場合、殺雑草活性は培養5日目で比較的高かったが、しかしながら、殺雑草活性は培養7日目には低くなる傾向にあった；バレイショデンプンが用いられた場合、培養5日目の殺雑草活性はトウモロコシデンプンのものよりも若干低かったが、しかしながら、培養7日目に活性は一定に維持されていた；およびマルトースが用いられた場合、比較的低い殺雑草活性が見られた。さらに、窒素源としてダイズ粉が用いられた場合、炭素源の種類に関わりなく、細菌増殖は概ね良好であり、殺雑草活性は比較的高かったことが証明されている。培養物ろ液の最終pH、細菌増殖、および殺雑草活性の相関関係を解析した際に、＜実施例15＞および＜実施例16＞での結果と同様に、低pHでは細菌増殖が非常に良好（+++）であり、殺雑草活性が高かったことが証明されている。つまり、殺雑草活性を有する物質の産生、培養期間中の安定性および減少を考慮して、＜実施例15＞での結果から、炭素源としてのバレイショデンプン、および窒素源としてのダイズ粉が、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の培養のために最終的に選択された（表13および図20）。
【０１４４】
【表１３】
0006273279.tif 000014
【０１４５】
＜実施例18＞ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の工業的大量生産のための至適培地組成
バレイショデンプンとダイズ粉との最適比、および該比に依存した殺雑草活性を決定するために、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の殺雑草活性を有する物質の産生に対して最も好適であった至適培地組成物を確立し、ここで、＜実施例17＞で選択されたバレイショデンプンが最終的に選択された炭素源であり、ダイズ粉が最終的に選択された窒素源であった。
【０１４６】
具体的には、＜実施例15＞および＜実施例17＞と同じ方法により、1〜3％(w/v)のバレイショデンプンおよび0.5〜2％(w/v)のダイズ粉を添加することにより培地を調製し、ここで、＜実施例15＞、＜実施例16＞および＜実施例17＞で選択されたバレイショデンプンが最終的に選択された炭素源であり、ダイズ粉が最終的に選択された窒素源であった。また、上記の方法により、炭素源としてバレイショデンプンおよびグルコース（各1％(w/v)（10g/L））、ならびに窒素源としてダイズ粉（1％(w/v)（10g/L））を添加した。続いて、2％の＜実施例1＞で前培養した培養液を接種した。次に、各培地を、170rpmにて27℃で5日間、振盪培養した。それぞれの培養培地中の殺雑草活性を有する物質の含有量を定量するために、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株により産生され、かつ殺雑草活性を有する物質AおよびBを、各濃度について調製した。続いて、下記の［表14］に記載される条件下でのHPLC分析により、各濃度について示されたピーク下面積を定量して、較正曲線を構築した。したがって、各培養培地中のAおよびBの含有量を、HPLC分析を通じて定量し、ここで、AおよびBは殺雑草活性を有する物質であった。それぞれの濃度についての殺雑草活性を有する物質であったAおよびBのHPLC分析は、三重試験で行なった。HPLC分析は、Shimadzu ODSカラム（4.6×300mm）および移動相として35％メタノールを用いて245nmにて行ない、至適培地組成および培養条件を確立した。
【０１４７】
【表１４】
0006273279.tif 000015
【０１４８】
その結果、表15および図21に示される通り、以下のことが証明されている：殺雑草活性を有する物質である生成されたAの量は、3％バレイショデンプンと2％ダイズ粉との組み合わせ（C/N比＝2：1）で734.27μg/mLであり、これは最も高く、ベネット培地のもの（131.13μg/mL）よりも6倍多かった；該組み合わせに対する単位生産コストは、174.60ウォンであり、これは、ベネット培地のもの（2,240.92ウォン）よりも13倍低かった。殺雑草活性を有する物質であるBに関して、以下のことが証明されている：最高値（すなわち、64.32μg/mL）は2％バレイショデンプンと2％ダイズ粉との組み合わせ（C/N比＝1：1）で示されたが；しかしながら、バレイショデンプンの濃度に無関係に、ダイズ粉の量が増大するにつれて産生量が増大する傾向にあった。また、以下のことが証明されている：炭素源としてバレイショデンプンとグルコース（各1％）との組み合わせおよびダイズ粉（1％）（C/N比＝2：1）を有する培地は、3％のバレイショデンプンと2％のダイズ粉との組み合わせ（C/N比＝2：1）を有する培地よりも安価な生産コストを示したが、殺雑草活性を有する物質であった生成されたAの量は少なかった（表15および図21）。
【０１４９】
【表１５】
0006273279.tif 000016
【０１５０】
つまり、＜実施例18＞での結果から、ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の殺雑草活性を有する物質の産生に対して最も好適である至適培地が確立され、至適培地組成および培養条件は以下の［表16］に記載された。
【０１５１】
【表１６】
0006273279.tif 000017
【０１５２】
＜実施例19＞ストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の工業的大量生産のための至適培地の殺雑草活性の影響の評価
＜実施例18＞でのストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株の大量培養に対する至適培地の影響を評価するために、殺雑草活性を調査した。
【０１５３】
具体的には、［表2］に記載のベネット培地を用いることによりストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株が培養された培養液、および＜実施例18＞の至適培地を用いることによりストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株が培養された培養液を、8倍に希釈した。続いて、温室条件下にて噴霧茎葉処理により該希釈液を用いてディジタリア・サングイナリス（Digitaris sanguinalis）（オニメヒシバ）を処理した。3日後、外部病徴を評価した。
【０１５４】
その結果、図22に示される通り、至適培地中でストレプトマイセス・スコプリリディスKR-001株が培養された培養液は、未処理またはベネット培地を用いて培養された培養液に対して、顕著に強い殺雑草能を示したことが証明されている（図22）。
【０１５５】
［受託番号］
寄託機関：韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology；KRIBB）
受託番号：KCTC12156BP
寄託日：20120309
【０１５６】
0006273279.tif 000018
【図１】
0006273279.tif 000019
【図２】
0006273279.tif 000020
【図３】
0006273279.tif 000021
【図４】
0006273279.tif 000022
【図５】
0006273279.tif 000023
【図６】
0006273279.tif 000024
【図７】
0006273279.tif 000025
【図８】
0006273279.tif 000026
【図９】
0006273279.tif 000027
【図１０】
0006273279.tif 000028
【図１１】
0006273279.tif 000029
【図１２】
0006273279.tif 000030
【図１３】
0006273279.tif 000031
【図１４】
0006273279.tif 000032
【図１５】
0006273279.tif 000033
【図１６】
0006273279.tif 000034
【図１７】
0006273279.tif 000035
【図１８】
0006273279.tif 000036
【図１９】
0006273279.tif 000037
【図２０】
0006273279.tif 000038
【図２１】
0006273279.tif 000039
【図２２】
0006273279.tif 000040
【配列表】
0006273279000001.app