(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
６５％以上の割合のジサッカリド６−モノ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド４−モノ硫酸、２０％以下の割合のジサッカリド２，６−ジ硫酸、５％未満の割合のジサッカリド４，６−ジ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド２，４−ジ硫酸、１５％未満の割合の非硫酸化ジサッカリドおよび１〜１．２５の範囲の電荷密度値を有し、抗炎症性かつ抗関節炎性の生物学的活性を有する分子量が１０００〜５０００ダルトンの範囲のコンドロイチン硫酸の製造方法であって、
加水分解によりフルクトース残基を除去した後に大腸菌の莢膜性ポリサッカリドＫ４を、化学的硫酸化および続いて酸またはラジカル脱重合することにより前記コンドロイチン硫酸を得る工程
を有することを特徴とするコンドロイチン硫酸の製造方法。
【請求項２】
６５％以上の割合のジサッカリド６−モノ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド４−モノ硫酸、２０％以下の割合のジサッカリド２，６−ジ硫酸、５％未満の割合のジサッカリド４，６−ジ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド２，４−ジ硫酸、１５％未満の割合の非硫酸化ジサッカリドおよび１〜１．２５の範囲の電荷密度値を有し、抗炎症性かつ抗関節炎性の生物学的活性を有する分子量が１０００〜５０００ダルトンの範囲のコンドロイチン硫酸の製造方法であって、
大腸菌の莢膜性ポリサッカリドＫ４から１５００〜６０００ダルトンの低分子量Ｋ４を含む画分を分離する工程と、
該画分中の低分子量Ｋ４から加水分解によりフルクトース残基を除去した後の化学的硫酸化により前記コンドロイチン硫酸を得る工程と、
を有することを特徴とするコンドロイチン硫酸の製造方法。
【請求項３】
６５％以上の割合のジサッカリド６−モノ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド４−モノ硫酸、２０％以下の割合のジサッカリド２，６−ジ硫酸、５％未満の割合のジサッカリド４，６−ジ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド２，４−ジ硫酸、１５％未満の割合の非硫酸化ジサッカリドおよび１〜１．２５の範囲の電荷密度値を有し、抗炎症性かつ抗関節炎性の生物学的活性を有する分子量が１０００〜５０００ダルトンの範囲のコンドロイチン硫酸の製造方法であって、
大腸菌株ＤＳＭ２３６４４により生成される、フルクトース残基（Ｋ４−ｄ）をもともと含まない莢膜性ポリサッカリドを、化学的硫酸化および続いて酸またはラジカル脱重合することにより前記コンドロイチン硫酸を得る工程
を有することを特徴とするコンドロイチン硫酸の製造方法。
【請求項４】
６５％以上の割合のジサッカリド６−モノ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド４−モノ硫酸、２０％以下の割合のジサッカリド２，６−ジ硫酸、５％未満の割合のジサッカリド４，６−ジ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド２，４−ジ硫酸、１５％未満の割合の非硫酸化ジサッカリドおよび１〜１．２５の範囲の電荷密度値を有し、抗炎症性かつ抗関節炎性の生物学的活性を有する分子量が１０００〜５０００ダルトンの範囲のコンドロイチン硫酸の製造方法であって、
大腸菌株ＤＳＭ２３６４４により生成されるフルクトース残基をもともと含まない莢膜性ポリサッカリド（Ｋ４−ｄ）から１５００〜６０００ダルトンの低分子量画分を得る工程と、
該低分子量画分の化学的硫酸化により前記コンドロイチン硫酸を得る工程と、
を有することを特徴とするコンドロイチン硫酸の製造方法。
【請求項５】
ヒトおよび動物における急性または慢性炎症状態の予防および治療における使用のためのおよび／または筋骨格健康状態の保存のための組成物の製造におけるコンドロイチン硫酸の使用方法であって、
前記コンドロイチン硫酸が、前記ヒトおよび動物における急性または慢性炎症状態の予防および治療における使用のための、および／または筋骨格健康状態の保存のための組成物における活性成分であり、
前記コンドロイチン硫酸が、６５％以上の割合のジサッカリド６−モノ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド４−モノ硫酸、２０％以下の割合のジサッカリド２，６−ジ硫酸、５％未満の割合のジサッカリド４，６−ジ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド２，４−ジ硫酸、１５％未満の割合の非硫酸化ジサッカリドおよび１〜１．２５の範囲の電荷密度値を有し、抗炎症性かつ抗関節炎性の生物学的活性を有する分子量が１０００〜５０００ダルトンの範囲のコンドロイチン硫酸である
ことを特徴とするコンドロイチン硫酸の使用方法。
【請求項６】
前記炎症状態が骨関節炎である、請求項５に記載のコンドロイチン硫酸の使用方法。
【請求項７】
前記コンドロイチン硫酸が、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたものである、請求項５または６に記載のコンドロイチン硫酸の使用方法。
【請求項８】
コンドロイチン硫酸を有効成分として、薬学的にかつ栄養補助的に許容される賦形剤と、および任意に他の有効成分と組み合わせて含む、ヒトおよび動物における急性または慢性炎症状態の予防および治療における使用のためのおよび／または筋骨格健康状態の保存のための組成物であって、
前記コンドロイチン硫酸が、６５％以上の割合のジサッカリド６−モノ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド４−モノ硫酸、２０％以下の割合のジサッカリド２，６−ジ硫酸、５％未満の割合のジサッカリド４，６−ジ硫酸、１％未満の割合のジサッカリド２，４−ジ硫酸、１５％未満の割合の非硫酸化ジサッカリドおよび１〜１．２５の範囲の電荷密度値を有し、抗炎症性かつ抗関節炎性の生物学的活性を有する分子量が１０００〜５０００ダルトンの範囲のコンドロイチン硫酸である
ことを特徴とする組成物。
【請求項９】
前記他の有効成分が、グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸塩、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ヒアルロン酸、アミノ酸、コラーゲン、加水分解コラーゲン、多価不飽和脂肪酸、ケラチン、デルマチン、メチルスルホニルメタン（ＭＳＭ）、葉酸、還元葉酸、ビタミン、ビタミンＢ群、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）、アスコルビン酸またはアスコルビン酸マンガンから選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
カプセル、ソフトゲルカプセル、錠剤、液体、または溶解されることにより飲料となる粉末の形態としての、請求項８または９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー技術を用いて得られる非硫酸化コンドロイチン骨格の化学的硫酸化およびその後の脱重合により生成される、またはもともと低分子量により特徴付けられるバイオテクノロジー的起源のポリサッカリドの硫酸化により生成される、極めて低分子量（１０００〜５０００ダルトン）のコンドロイチン硫酸(ＣＳ)、および、骨関節炎の治療および予防、ならびに急性および慢性炎症過程における前記ＣＳの使用に関する。特に、本発明は、主に６−位において実質的にモノ硫酸化されており、４−硫酸塩をほとんどまたは全く有さないと共に、モノ／ジ硫酸化ジサッカリド比、トリ硫酸化およびポリ硫酸化ジサッカリドの不存在、電荷密度および発揮される生物学的活性において天然ＣＳと同等である、バイオテクノロジー的ＣＳに関する。本発明のコンドロイチン６−硫酸(Ｃ６Ｓ)は、陸生起源の動物(ウシ、ブタおよびトリ)の組織から抽出された１４０００〜２６０００ダルトンの分子量値を特徴とするコンドロイチン硫酸および海洋起源の動物（サメ、イカ、ガンギエイおよび硬骨魚）の組織から抽出された全て分子量が５００００ダルトンを超えるコンドロイチン硫酸よりも低い分子量（１０００〜５０００ダルトン）を示す。本発明のＣ６Ｓは、また、既知の種類の低分子量ＣＳよりもさらに低い分子量を有する。この特徴は、本発明のコンドロイチン６−硫酸に、より優れた生物学的利用能およびその結果として優れた効率を与える。
【０００２】
骨関節炎の治療および予防において低分子量バイオテクノロジー的コンドロイチン６−硫酸(Ｃ６Ｓ)を用いることは、関節炎およびその随伴症状の研究のために通常用いられる良く知られた動物モデルにおけるその抗炎症性活性の実験的検証により支持される。記載された低分子量バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓは、医薬製品用のＯＥＣＤガイドラインに従って行われる毒物学的研究において示されるように、優れた耐性も示す。
【背景技術】
【０００３】
コンドロイチン硫酸(ＣＳ)は、最近、欧州リウマチ学会(ＥＵＬＡＲ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ)により、多くの臨床所見と臨床試験の種々のメタ分析とに基づいて、膝（Ｊｏｒｄａｎ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６２，１１４５，２００３）、腰（Ｊｏｒｄａｎ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６２，１１４５，２００３）および手（Ｚｈａｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６６，３７７，２００７）の骨関節炎の治療における骨関節炎用症候性遅効性薬物（ＳＹＳＡＤＯＡ）として薦められている。最近の臨床試験は、ＣＳがヒト軟骨組織の細胞外構造を修飾することも示した（Ｒｅｇｉｎｓｔｅｒ  ＪＹ，Ｈｅｒａｕｄ  Ｆ，Ｚｅｇｅｌｓ  Ｂ，Ｂｒｕｙｅｒｅ  Ｏ．  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ７，１０５１，２００７．Ｋａｈａｎ  Ａ，Ｕｅｂｅｌｈａｒｔ  Ｄ，Ｄｅ  Ｖａｔｈａｉｒｅ  Ｆ，Ｄｅｌｍａｓ  ＰＤ，Ｒｅｇｉｎｓｔｅｒ  ＪＹ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６０，５２４，２００９）。ＣＳは、また、栄養補助食品として、単独でまたは他の成分と組み合わされて広く用いられている（ＭｃＡｌｉｎｄｏｎ  ＴＥ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  ２８３，１４６９，２０００．  Ｖｏｌｐｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ａｎａｌ  Ｍｅｔｈ  １，１９５，２００８．  Ｖｏｌｐｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃ  １，２２，２００９）。
【０００４】
コンドロイチン硫酸(ＣＳ)は、脊椎動物と無脊椎動物の両方に存在するグリコサミノグリカン(ＧＡＧ)クラスに属する天然ポリサッカリドであり、ベータ１−３結合により互いに結合していると共に異なる位置において硫酸化されているグルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の残基を交互に入れ替えることにより形成されるジサッカリド配列からなる。
【０００５】
ＣＳは動物組織中に存在し、構造的および生理学的機能を有する。それは、主に、その起源に応じて異なる割合で存在する、ＧａｌＮＡｃの４−位または６−位においてモノ硫酸化されている二種類のジサッカリド単位（それぞれ、ジサッカリドＡおよびＣと呼ばれる）からなる。ＣＳ骨格は、非硫酸化ジサッカリドも、通常は少量含む。ＧｌｃＡの２−位およびＧａｌＮＡｃの６−位（ジサッカリドＤ）、ＧｌｃＡの２−位およびＧａｌＮａｃの４−位、またはＧａｌＮＡｃの４−および６−位（ジサッカリドＥ）のような種々の位置において酸素原子を介して結合している二つの硫酸基を有するジ硫酸化ジサッカリドが、特定の動物供給源に応じて種々の割合でＣＳ骨格中に存在し得る（Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６１，１２７１，２００９．（非特許文献１）Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９６，３１６８，２００７．Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１２，６３９，２００６）。ＧｌｃＡの３−位における硫酸化の存在は可能であるが、極めて少量であり；その存在は陸生起源のＣＳにおいては稀であり、海洋起源の高度に硫酸化されたものにおいては可能性がより高い（Ｆｏｎｇｍｏｏｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２，３６８９５，２００７）。
【０００６】
ＣＳの繰り返しジサッカリド単位の式を以下に示す。
【０００７】
【化１】
0006273264.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６は、独立してＨまたはＳＯ３−である。）
繰り返しジサッカリド単位中のカルボキシレートおよび硫酸基の陰性電荷は、通常、ナトリウムイオンにより中和される。
【０００９】
種々に硫酸化されたジサッカリドを特定するために最も一般的に用いられる頭字語の意味を以下に示す
Ｄｉ−０Ｓ  （Ｒ２＝Ｈ；Ｒ４＝Ｈ；Ｒ６＝Ｈ）
Ｄｉ−６Ｓ（Ｃ）  （Ｒ２＝Ｈ；Ｒ４＝Ｈ；Ｒ６＝ＳＯ３−）
Ｄｉ−４Ｓ（Ａ）  （Ｒ２＝Ｈ；Ｒ４＝ＳＯ３−；Ｒ６＝Ｈ）
Ｄｉ−４，６ｄｉＳ（Ｅ）  （Ｒ２＝Ｈ；Ｒ４＝ＳＯ３−；Ｒ６＝ＳＯ３−）
Ｄｉ−２，６ｄｉＳ（Ｄ）  （Ｒ２＝ＳＯ３−；Ｒ４＝Ｈ；Ｒ６＝ＳＯ３−）
Ｄｉ−２，４ｄｉＳ（Ｂ）  （Ｒ２＝ＳＯ３−；Ｒ４＝ＳＯ３−；Ｒ６＝Ｈ）
Ｄｉ−２，４，６ｔｒｉＳ  （Ｒ２＝ＳＯ３−；Ｒ４＝ＳＯ３−；Ｒ６＝ＳＯ３−）。
【００１０】
異なる動物供給源に由来するＣＳのサンプルは、異なる分子量および電流密度によっても特徴付けられ、この後者のパラメーターは特定の硫酸化された基と直接関連している。
【００１１】
表１は、種々の動物種の軟骨から抽出された天然ＣＳ中に見られる主なジサッカリドを示す。
【００１２】
【表１】
0006273264.tif 000003
【００１３】
表１中：Ｍｎ＝数平均分子量；Ｍｗ＝重量平均分子量；多分散性指標＝Ｍｗ／Ｍｎ；電荷密度はジサッカリド単位当たりの硫酸基の数；ＮＤ＝不検出
陸生動物から誘導される種々の種類のＣＳは同様の分子量パラメーター（ＭｎおよびＭｗ）を有するが、それらは、より高い分子量値を有する海洋種とは異なる。陸生起源のＣＳは、１４〜２６ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）を有するが、イカ、軟骨魚および硬骨魚から得られる海洋起源のＣＳは、５０ｋＤａを超える分子量（Ｍｗ）を有する。陸生ＣＳサンプルは、１．０を下回る電荷密度（ＣＤ）値によっても特徴付けられ、一方、海洋ＣＳサンプルは、常に、１．０を超えるＣＤ値を有する。
【００１４】
ジ硫酸化ジサッカリドは、通常、陸生ＣＳ中では微量存在し、海洋起源のＣＳ中ではより多く存在する。さらに、天然ＣＳ中には、有意量のポリ硫酸化ジサッカリド（トリおよびテトラ硫酸塩）は観察されない。
【００１５】
天然ＣＳは、表２に示すように、同じ種であっても、異なる器官および組織の間では相違を示す。
【００１６】
【表２】
0006273264.tif 000004
【００１７】
表２中：Ｍｎ＝数平均分子量；Ｍｗ＝重量平均分子量；多分散性指標＝Ｍｗ／Ｍｎ；電荷密度はジサッカリド単位当たりの硫酸基の数；ＮＤ＝不検出
種々の組織および器官について、１００％６−硫酸化または４−硫酸化ジサッカリドのポリサッカリドまたはオリゴサッカリドＣＳの鎖の存在が文献に報告されている（Ｓａｍｐａｉｏ  Ｌ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，９２０５，１９８１；  Ｏｋａｙａｍａ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ７２，７４５，１９８８；Ａｍｂｒｏｓｉｕｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ  １２０１，５４，２００８；Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ３７０，１９６，２００６）。
【００１８】
全てのこれらの特徴は、分子量および電荷密度の両方において天然ＣＳの著しい不均一性を示すが、ＣＳが「天然様」であると決めることができるパラメーターを識別することができる。海洋起源のＣＳに匹敵する電荷密度を有すると共に異常な硫酸化パターンが存在しないことを特徴とするコンドロイチン６−硫酸は、天然グリコサミノグリカンへの構造的類似性を示す。その証明された生体内抗炎症性活性は、天然様ＣＳの定義をさらに支持し、関節炎性疾患に関連する症状の治療におけるその使用を支持する。
【００１９】
ＣＳに部分的に類似している構造を有するポリサッカリド前駆体供給源として微生物を用い、次に、天然型に類似のＣＳを生成するために化学的硫酸化を用いてＣＳを製造するバイオテクノロジー的方法を見つけるために、多くの試みが成された。
【００２０】
一部の細菌は、グリコサミノグリカンに類似の構造を有する莢膜性ポリサッカリドを生成する；例えば、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌa  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）は、非硫酸化コンドロイチンと同等のポリサッカリドを生成する（Ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓ  Ｐ．Ｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，３３７（１７），１５４７，２００２）。しかしながら、血清型Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４を有する大腸菌株は、ＧｌｃＡ単位の３−位において結合しているβ−フルクロース残基を有するコンドロイチン骨格を持つ莢膜性ポリサッカリドを生成する（ポリサッカリドＫ４）。
【００２１】
大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４からの莢膜性ポリサッカリドＫ４を用いて開始するバイオテクノロジー的ＣＳの生成の一例がＥＰ１３０４３３８に報告されており、これは、液状培地で生成されたポリサッカリドＫ４が抽出および精製され、次に、再溶解され、酸加水分解に付されて、ポリマーのＧｌｃＡ残基に結合しているフルクトース残基を除去する方法を記載している。ＣＳ（ＣＨ）の非硫酸化骨格に一致している脱フルクトシル化ポリマーは、次に、種々の化学的合成方法に従ってＧａｌＮＡｃ残基の４−または６−位において硫酸化されて、分子量６〜２５ｋＤａのＣＳが生成される。しかしながら、ＥＰ１３０４３３８に記載のバイオテクノロジー的ＣＳは、その抗炎症性および抗関節炎性活性については全く評価されておらず、関節炎および／または骨関節炎の治療におけるその使用は単なる仮定のままである。このことは特に重要である。何故なら、ＥＰ１３０４３３８に記載のポリサッカリドの７０％しか厳密には天然コンドロイチン硫酸の構造を有しておらず、残りの３０％は主に非硫酸化コンドロイチン（ＣＨ）だからである。さらに、分子量５ｋＤａ未満のオリゴサッカリドは考慮されていない。
【００２２】
最近の公開物（Ｂｅｄｉｎｉ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２０１１）は、生成されたポリサッカリドＫ４が、同じ鎖中のＧａｌＮＡｃ残基の４−位および／または６−位において硫酸化される過程を記載している。ここでも、記載されたバイオテクノロジー的ＣＳは、抗炎症性または抗関節炎性活性について評価されておらず、関節炎および／または骨関節炎および関連炎症過程の治療および予防におけるその使用は評価されていない。合成過程から得られるバイオテクノロジー的ＣＳの鎖への構造的修飾が存在し、それにより、合成過程中にヒドロキシル基があまり保護されていないために、ＧｌｃＡのＣ３においてその基が異常に硫酸化すると、同じ著者は仮定している。この異常は、ＧｌｃＡにおいて３−硫酸化している前記ＣＳが汚染物として存在しているヘパリンの静脈内投与の後にヒトにおいて重度の毒性を引き起こすことが知られている。この毒性はＣＳの経口投与においては全く観察されていないが、その種類の異常な硫酸化による毒性効果の危険性は残っている。このことも、同じ著者により、別の最近の公表物（Ｂｅｄｉｎｉ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊ．２０１２［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）において示されている。
【００２３】
さらに、Ｂｅｄｉｎｉらにより記載（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２０１１）されているバイオテクノロジー的ＣＳは、分子量が１７ｋＤａ程度であり、従って、抽出起源の天然産物の低い生物学的利用能を潜在的に示している。これらの全ての理由により、Ｂｅｄｉｎｉらにより記載されているバイオテクノロジー的ＣＳは、関節炎および／または骨関節炎の治療および予防において用いられる見込みがない。
【００２４】
関節炎の治療において用いるための低分子量型のＣＳの例は確かに存在する（Ｃｈｏ  ＳＹ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２７，４７，２００４，Ｄａｓ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｏｓｔｅｏａｒｔ．Ｃａｒｔｉｌ．８，３４３，２０００）が、それらは、全て、動物起源のＣＳの脱重合により得られるものであり、そのことは、ウイルス、プリオンおよび他の伝染性感染因子の存在を排除できないことを意味している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／００４０６３号パンフレット
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６１，１２７１，２００９
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】アジュバント関節炎（ＡＡ）を患うラットの、低分子量バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓで治療した後の体重増加。記号；ＨＣ：健康対照、ＡＣ：関節炎対照、Ｔ：Ｃ６Ｓで治療した群（０〜２８日目）、ＰＴ：Ｃ６Ｓで予備治療した群（−１４〜２８日目）。値は、グラム±ＳＥＭで表す。
【図２】低分子量バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓで治療した後のアジュバント関節炎（ＡＡ）を患うラットの後肢の浮腫の評価。記号；ＨＣ：健康対照、ＡＣ：関節炎対照、Ｔ：Ｃ６Ｓで治療した群（０〜２８日目）、ＰＴ：Ｃ６Ｓで予備治療した群（−１４〜２８日目）。割合増加：体積（ｍｌ）の増加として測定。割合の計算：［（ｎ日目の値／０日目の値）×１００］−１００。値は、％±ＳＥＭで表す。
【図３】アジュバント関節炎（ＡＡ）を患うラットにおける、低分子量バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓで治療した後の研究中の浮腫状態の進行。記号；ＨＣ：健康対照、ＡＣ：関節炎対照、Ｔ：Ｃ６Ｓで治療した群（０〜２８日目）、ＰＴ：Ｃ６Ｓで予備治療した群（−１４〜２８日目）。ＡＡ誘発後の０、７、１４、２１および２８日目の体積増加の割合の評価。値は、％で表す。
【図４】アジュバント関節炎（ＡＡ）を患うラットにおける、低分子量バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓで治療した後の関節炎スコア。記号；ＨＣ：健康対照、ＡＣ：関節炎対照、Ｔ：Ｃ６Ｓで治療した群（０〜２８日目）、ＰＴ：Ｃ６Ｓで予備治療した群（−１４〜２８日目）。スコア：前足の関節周囲腫脹および紅斑（１〜５）、後足の関節周囲腫脹および紅斑（１〜８）、尾の基部のかさぶたの直径（１〜５）。値は、単位±ＳＥＭで表す。
【図５】アジュバント関節炎（ＡＡ）を患うラットにおける、低分子量バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓで治療した後の研究中の関節炎スコアの進行。記号；ＨＣ：健康対照、ＡＣ：関節炎対照、Ｔ：Ｃ６Ｓで治療した群（０〜２８日目）、ＰＴ：Ｃ６Ｓで予備治療した群（−１４〜２８日目）。ＡＡ誘発後の０、７、１４、２１および２８日目のスコアの評価。値は、単位で表す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（発明の説明）
バイオテクノロジー的技術により得られる非硫酸化コンドロイチン骨格の化学的硫酸化およびその後の脱重合により生成される１０００〜５０００ダルトン、好ましくは２０００〜４０００ダルトンの低い分子量を有するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、天然ＣＳに匹敵する抗炎症活性、向上した生物学的利用能および好ましい安全性プロフィールを有することが今回発見された。記載されたＣＳは、主に６−位において実質的にモノ硫酸化されており、４−位においてはほとんど硫酸化されておらず、天然ＣＳと同等のモノ／ジ硫酸化ジサッカリド比と電荷密度を有する。
【００２９】
本発明のＣＳは、天然ＣＳの、より具体的には海洋起源のＣＳの全ての特徴を示す。これは、モノ硫酸化ジサッカリドとジ硫酸化ジサッカリドとの同様の相対的割合、ジ硫酸化ジサッカリドの同様の分布、および、結果として、低い４−硫酸塩／６−硫酸塩比に関係する同様の電荷密度（ＣＤ）を有する。
【００３０】
本発明のバイオテクノロジー的ＣＳは以下の特別の特徴も有する：非常に低い分子量（１０００〜５０００ダルトン、または好ましくは２０００〜４０００ダルトン）；６−硫酸化ジサッカリドの特に高い割合；トリ硫酸化ジサッカリドが殆ど全く存在していないこと；ＧｌｃＡ残基の３−位における硫酸化が実質的に存在していないこと。特に、トリ硫酸化ジサッカリドおよび、ＧｌｃＡの３−位において硫酸化されているジサッカリドの存在は、既知の種類の合成ＣＳの特徴を示すと共に、しばしば、それらの治療的用途において悪影響を及ぼす。
【００３１】
表３は、本発明によるバイオテクノロジー的コンドロイチン６−硫酸の物理化学的特徴を示す。
【００３２】
【表３】
0006273264.tif 000005
【００３３】
本発明の特別の局面によれば、既知の技術（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｊａｎｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７，１１７−１２４，ＦＥＢＳ１９８８）による熱酸加水分解により予め脱フルクトシル化された大腸菌株Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４（ＷＯ０１／０２５９７）から天然に生成される莢膜性ポリサッカリドＫ４に適用される、または非硫酸化コンドロイチンの構造を有する他のポリサッカリドに適用されるＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５８２９７に記載の化学的合成過程によりＣ６Ｓを得ることができる。あるいは、Ｋ４のフルクトシル化に関与するＫｆｏＥ遺伝子において誘発される突然変異が原因で、天然非硫酸化ＣＨに一致するポリサッカリドを生成する、ＷＯ２０１２００４０６３(特許文献１)に記載された大腸菌株ＤＳＭ２３６４４の培地から、出発非硫酸化コンドロイチン（ＣＨ）を得ることができる。本発明のこの局面によれば、ポリサッカリドは、好ましくはＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５８２９７に記載の方法に従って、化学的硫酸化を受ける。
【００３４】
簡単に説明すると、ジサッカリド単位の硫酸化につながる合成過程は以下のようなものである
ａ）ポリサッカリドＫ４の脱フルクトシル化において得られる、アンモニウム塩として、またはアルカリ金属塩のいずれかとして、特にナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩として単離された非硫酸化コンドロイチンは、カチオン交換樹脂上で脱塩化され、ｐＨが７〜７．５となるまで化学量論量で添加されたアルキルアンモニウムヒドロキシド基で、好ましくはテトラブチルアンモニウムヒドロキシドで再塩化され、凍結乾燥または噴霧乾燥により乾燥される
ｂ）工程ａ）に記載のテトラブチルアンモニウムＣＨ塩を、極性非プロトン性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含んでなり０〜３０℃の温度に維持されている溶液に撹拌下に加え、次に、硫酸化複合体を、一定温度に維持しつつ撹拌下に、２〜５のモル比でそのＣＨに加える
ｃ）最後に、重炭酸ナトリウムを化学量論的モル比でまたは過剰に硫酸化剤に加え、同時に、温度を６５℃まで上昇させて溶媒を蒸発除去する。次に、水を加え、続いて再蒸留する。最終的溶液を限外濾過し、透析する。最終的に、ＣＳナトリウム塩を濾過し、１０％より低い残留湿度まで減圧下に乾燥する
得られたＣＳの分子寸法を、次に、既知のラジカル脱重合（Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．，２７９，１９３−２００，１９９５）または酸性脱重合技術に従って必要な分子量分布が得られるように制御して行われる脱重合過程により小さくする。
【００３５】
酸性脱重合は、ＣＳを水中に再懸濁させ、ＨＣｌを濃度１Ｍまで加えることにより溶液を酸性化し、６０℃に加熱することにより行われる。
【００３６】
脱重合により発生したオリゴサッカリドの分子量は、溶液のサンプルを短い間隔で採取し、それぞれ３００および１５０Ａの２つの５μｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＳＥＣ（登録商標）−５（親水性中性ポリマー単層）カラムで順次行なわれるＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析によりオリゴサッカリドの分子量を決めることにより計算される。所望の分子量値に達したときにｐＨが６〜８に調節されるようにＮａＯＨまたは重炭酸ナトリウムで中和することにより反応が中断される。
【００３７】
あるいは、得られるオリゴサッカリドの最終的分子量を既述のように制御してラジカル加水分解により脱重合を行うことができる。
【００３８】
ＣＳを水中に再懸濁させ、そのＣＳ溶液が酸性化を必要としているか塩基性化を必要としているかに応じて、１０％塩酸または水酸化ナトリウム溶液を加えることにより、ｐＨを７．５に補正する。６０℃に維持された溶液に、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の９％溶液を加える。所望の分子量が達成されたか確認するために、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを前述のように行う。溶液を室温（２０〜２５℃）まで冷却し、ｐＨを６．０まで下げることにより反応を中断させる。
【００３９】
表４は、脱重合の最後までの反応工程中にＳＥＣ−ＨＰＬＣで分析されたオリゴサッカリドに典型的な分子量値を示す。
【００４０】
【表４】
0006273264.tif 000006
【００４１】
本発明のＣ６Ｓは、先に示した手順に従って、大腸菌株Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４の発酵から得られるポリサッカリドＫ４の低分子量画分を基質として用いて化学的硫酸化することにより得ることもできる。この場合、培養ブロスを、微生物を失活させるように８０℃で６０分間加熱することにより発酵の最後に処理し、次に、ＥＰ１３０４３３８におけるように遠心分離および限外濾過し；得られる上澄みを、次に、ゲル濾過カラムに乗せ、フラクションを集め、既知の技術により各々のウロン酸含量を調べる。ウロン酸試験に陽性のフラクションを合わせることにより、２つの別個のプールを単離することができる：すなわち、既知のポリサッカリドに相当すると共に量的に全サッカリドの８０％に相当する高分子量Ｋ４（４０〜７０ｋＤａ）を含む第１のプール、および、溶出体積を基準に第１のプールと明らかに分離すると共に、１５００〜６０００ダルトンの間で平均値の前後の分散が少ない低分子量Ｋ４を含む第２のプールである。前記第２の低分子量プールに含まれるオリゴサッカリドとＫ４との同一性は、ウロン酸アッセイへの同時陽性反応、および、ジサッカリド単位の出現を伴う、コンドロイチナーゼＡＢＣによる消化性により示される。
【００４２】
全サッカリドの量の２０％であるオリゴサッカリドＫ４の前記フラクションを、次に、ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５８２９７に開示されている脱フルクトシル化および化学的硫酸化過程に、１０００〜５０００ダルトンの範囲の最終的分子量を有するＣＳが得られるまで付する。
【００４３】
あるいは、ＷＯ  ２０１２００４０６３に記載の大腸菌株ＤＳＭ２３６４４の発酵から回収された天然に脱フルクトシル化されたオリゴサッカリドＫ４−ｄの低分子量フラクションの硫酸化を含む前述の過程に類似の過程により、低分子量バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓを得ることができる。
【００４４】
このように得られた低分子量Ｃ６Ｓを、ラットにおける実験動物関節炎モデル（アジュバント関節炎：ＡＡ）における効能について評価し、得られた結果を、９００ｍｇ／ｋｇで毎日経口治療した後の同じ実験モデル（Ｂａｕｅｒｏｖａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １９，１３７３，２０１１）において用いられる抽出起源の医薬品グレード天然ＣＳについての結果と比較した。
【００４５】
ＡＡは、不完全フロイントアジュバント中のウシ型結核死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）の単回皮内注射により誘発した。この研究は、健康動物（ＨＣ）の一つの群、未治療関節炎動物（ＡＣ）の一つの群、および二つの異なる方式で治療した関節炎動物の二つの群を含んでいた。第１の治療方式は、関節炎を誘発する前に、バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓを１日に９００ｍｇ／ｋｇで１４日間投与する予備治療を含み、ＡＡの誘発後に２８日間続けた（ＰＴ）。第２の治療方式は、バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓを１日に９００ｍｇ／ｋｇで、ＡＡの誘発後の２８日間だけ投与することを含んでいた（Ｔ）。
【００４６】
ラットの体重の生理的増加は未治療関節炎動物（ＡＣ）において非常に低く、研究の終了時において健康対照の体重増加の約４０％であった。バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓでの予備治療（ＰＴ群）は、この減少を制限し、体重の増加は、健康対照の７３％まで増えた。治療単独（Ｔ）も体重の回復において効果的であると分かったが、程度は低かった（健康対照の増加と比較して５４％の増加）（図１）。これは、低分子量バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓの全身的な抗炎症作用に起因する。動物の体重増加へのこの効果は、ウシ起源の高分子量ＣＳを用いて同じ投与量で行ったＢａｕｅｒｏｖａらの研究（Ｂａｕｅｒｏｖａ  Ｋ．  Ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １９，１３７３，２０１１）で見られるものよりも高い。この発見は、本発明のバイオテクノロジー的Ｃ６Ｓの優れた腸内吸収を確認するものである。
【００４７】
関節炎の重症度は、肢の腫脹（浮腫）の増加水準に基づいて定量化し、後肢で発生した浮腫は、予備治療動物（ＰＴ）において著しく減少した（図２）。バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓでの予備治療は、未治療対照と比較して、研究全体において浮腫を著しく減少させた（図３）。
【００４８】
関節周囲紅斑、発生した浮腫、および尾の基部におけるアジュバント注射部位におけるかさぶたの直径を含む臨床因子を考慮するパラメーターである全関節炎スコアの低下においても、予備治療は効果的であると分かった。関節炎評価スケールは６〜３１のスコアを割り当てた。関節炎対照群（ＡＣ）は２３の値を得、健康対照（ＨＣ）の１２に対してＰＴ群は１９の値を達成した（図４）。さらに、予備治療は、ＡＡ誘発後の１〜２８日目である亜急性期の全体において効果的であると分かった（図５）。治療単独（Ｔ）群は、研究期間中、関節炎スコアに大きな影響は与えなかった。
【００４９】
本発明のＣ６Ｓを、細胞レベルでの潜在的遺伝毒性およびラットにおける急性経口毒性を評価するように設計された種々のプロトコールに従って動物および細胞培地における毒物学的安全性についても試験した。用いた全ての試験は、医薬製品用のＯＥＣＤガイドラインに従って認証し行った。
【００５０】
バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓを細菌細胞における突然変異誘発試験（細菌性復帰突然変異、Ｒｅｆ．ＯＥＣＤ４７１）に付して、大腸菌およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の栄養要求性菌株における復帰突然変異体の出現を誘発する産物の性能を試験した。細菌変異原性の著しい増加は観察されなかった。
【００５１】
バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓの遺伝毒性を、真核細胞培地上の二つの他の試験においても実験した。すなわち、生体外のチャイニーズハムスター卵巣細胞における染色体異常についての試験（ＯＥＣＤ  Ｒｅｆ．４７３）、および、ネズミリンパ腫細胞での変異原性試験（Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌ５１７８Ｙ  ＴＫ＋／＋  ｍｏｕｓｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌｓ，Ｐｒｏｔ．ＯＥＣＤ  ４７６）である。用いた最高Ｃ６Ｓ濃度までにおいて二つの試験において遺伝毒性の著しい増加は見られなかった（それぞれ、５０００μｇ／プレートおよび５０００μｇ／ｍｌ）。
【００５２】
最後に、経口投与後の急性毒性を、スプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットにおいて体重１ｋｇ当たり２０００ｍｇの投与量まで実験した。投与後１４日間観察を続けた後、ラットは患っている臨床兆候を示さず、死亡も発生しなかった。さらに、研究の最後に行った剖検は、試験した組織および器官における毒性の兆候を示さなかった。
【００５３】
提案された治療または健康使用のために、本発明によるＣ６Ｓは、薬剤、ダイエットサプリメントまたは食品添加物の有効成分として用いられ、場合により、グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸塩、Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸、アミノ酸、コラーゲン、加水分解コラーゲン、多価不飽和脂肪酸、ケラチン、デルマチン、メチルスルホニルメタン（ＭＳＭ）、葉酸、還元葉酸、ビタミン、ビタミンＢ群、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）、アスコルビン酸またはアスコルビン酸マンガンのような他の有効成分と組み合わされて用いられる。
【００５４】
本発明による製剤としては、例えば、カプセル、ソフトゲルカプセル、錠剤、液状ドリンクおよび再構成される粉末ドリンクが挙げられる。
【００５５】
本発明によるＣ６Ｓの投与量は１００〜３０００ｍｇ／日、好ましくは１０００〜２０００ｍｇ／日、より好ましくは１２５０〜１７５０ｍｇ／日である。
【００５６】
本発明を、以下の実施例においてより詳細に説明する。
【実施例】
【００５７】
（実施例１）
ラットにおける関節炎（アジュバント関節炎：ＡＡ）の誘発、および低分子量バイオテクノロジー的Ｃ６Ｓを用いる治療
重さ１５０〜１９０ｇの４０匹の雄ルイスラットをランダムに動物各１０匹の４つの群に分け、温度２２±２℃に維持された環境中でポリプロピレンケージに住まわせ、水摂取を制限しないで標準的実験室食を餌とする。
【００５８】
実験群は以下の通りであった
１）未治療健康対照群（ＨＣ）
２）アジュバント誘発関節炎を有する未治療対照群（ＡＣ）
３）ＡＡの誘発後２８日間、体重１ｋｇ当たり９００ｍｇ／日の投与量でバイオテクノロジー的Ｃ６Ｓで経口治療した関節炎ラットの群（実験の０〜２８日目）（Ｔ）
４）ＡＡの誘発前１４日間およびＡＡの誘発後２８日間、体重１ｋｇ当たり９００ｍｇ／日の投与量でバイオテクノロジー的Ｃ６Ｓで経口予備治療した群（実験の−１４〜２８日目）（ＰＴ）。
【００５９】
不完全フロイントアジュバント中の加熱不活化したウシ型結核死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を含む混合物１ｍｌを尾の基部に単回皮内注射することにより０日目のラットにおいて関節炎を実験的に誘発させた
本発明のＣ６Ｓを蒸留水に濃度２０ｍｇ／ｍｌで溶解させ、１日１回、チューブで強制的に経口投与した。
【００６０】
（実施例２）
体重をモニターすることによるラットにおけるＡＡの評価へのバイオテクノロジー的Ｃ６Ｓの効果
ラットの体重は、ＡＡの誘発前（０日目）、７、１４および２１日目、および治療の最後（２８日目）に測定した。このパラメーターへの治療の効果は、治療期間中に、異なる群の体重増加を比較することにより評価した。測定された値を表５に報告する。
【００６１】
【表５】
0006273264.tif 000007
【００６２】
（実施例３）
生じた浮腫をモニターすることによるラットにおけるＡＡの評価へのバイオテクノロジー的Ｃ６Ｓの効果
関節炎の結果として生じた浮腫を、測定に適したキャリパーを用いて、後肢の体積の増加を観察することにより測定した。測定は、ＡＡの誘発前（０日目）、および研究の７、１４、２１および２８日目に行った。
【００６３】
データは、以下の式により計算される浮腫の増加の割合として表される
式：［（ｎ日目の値／０日目の値）×１００］−１００
「０日目の値」は最初の日における測定値であり、「ｎ日目の値」は考察した日における測定値である。測定された値を表６に報告する。
【００６４】
【表６】
0006273264.tif 000008
【００６５】
（実施例４）
関節炎スコアをモニターすることによるラットにおけるＡＡの評価へのバイオテクノロジー的Ｃ６Ｓの効果
関節炎スコアは、足関節の腫脹（浮腫）の観察、関節周囲紅斑の程度、および尾の基部におけるアジュバント注射部位におけるかさぶたの直径にスコアを割り当てることにより評価した。関節炎スコアまたは関節造影写真は、各動物について、浮腫の合計（ｍｌ、スコア１〜８）＋前肢の直径（ｍｍ、最大スコア１〜５）＋脊柱と平行に測定したウシ型結核死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）の適用の部位におけるかさぶたの直径（ｍｍ、最大スコア１〜５）として測定した。
【００６６】
測定された値を表７に報告する。
【００６７】
【表７】
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【図１】
0006273264.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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