(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の破砕物から分離された５ｋＤａ乃至１００ｋＤａのサイズを有するタンパク質分画の混合物を有効成分として含有する免疫関連疾患の治療または予防のための薬剤学的組成物。
【請求項２】
間葉系幹細胞が、ヒトの脂肪、胎盤、臍帯血、胚性幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の免疫関連疾患の治療または予防のための薬剤学的組成物。
【請求項３】
免疫反応を抑制することを特徴とする請求項１に記載の免疫関連疾患の治療または予防のための薬剤学的組成物。
【請求項４】
免疫関連疾患が炎症性疾患であることを特徴とする請求項１〜３のうち何れか１項に記載の免疫関連疾患の治療または予防のための薬剤学的組成物。
【請求項５】
間葉系幹細胞の破砕物から分離された５ｋＤａ乃至１００ｋＤａのサイズを有するタンパク質分画の混合物を有効成分として含有する免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための健康機能食品。
【請求項６】
間葉系幹細胞が、ヒトの脂肪、胎盤、臍帯血、胚性幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項５に記載の免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための健康機能食品。
【請求項７】
免疫反応を抑制することを特徴とする請求項５に記載の免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための健康機能食品。
【請求項８】
免疫関連疾患が炎症性疾患であることを特徴とする請求項５〜７のうち何れか１項に記載の免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための健康機能食品。
【請求項９】
間葉系幹細胞の破砕物から分離された５ｋＤａ乃至１００ｋＤａのサイズを有するタンパク質分画の混合物を有効成分として含有する免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための化粧料組成物。
【請求項１０】
間葉系幹細胞が、ヒトの脂肪、胎盤、臍帯血、胚性幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項９に記載の免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための化粧料組成物。
【請求項１１】
免疫反応を抑制することを特徴とする請求項９に記載の免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための化粧料組成物。
【請求項１２】
免疫関連疾患が炎症性疾患であることを特徴とする請求項９〜１１のうち何れか１項に記載の免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための化粧料組成物。
【請求項１３】
下記の段階を含む免疫反応抑制活性を有する間葉系幹細胞由来タンパク質を製造する方法：
ａ）間葉系幹細胞を破砕し, 破砕物からタンパク質を抽出する段階；及び、
ｂ）抽出されたタンパク質をサイズ別に分離して５ｋＤａ乃至１００ｋＤａのサイズを有するタンパク質を分画する段階。
【請求項１４】
間葉系幹細胞が、ヒトの脂肪、胎盤、臍帯血、胚性幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の間葉系幹細胞由来タンパク質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質を有効成分として含有する免疫関連疾患の治療または予防のための薬剤学的組成物に関する。また、本発明は、間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質を有効成分として含有する免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための健康機能食品に関する。また、本発明は、間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質を有効成分として含有する免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための化粧料組成物に関する。また、本発明は、間葉系幹細胞からタンパク質を抽出する段階と、抽出されたタンパク質をサイズ別に分離して、５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質を得る段階とを含む免疫反応抑制活性を有する間葉系幹細胞由来タンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応は、免疫に関与する細胞が外来性及び内因性異物（抗原）に対して起こす一連の反応であり、免疫反応は、大きく２つに分類して説明される。第１の分類は、Ｂリンパ球によって作られた抗体による免疫反応である体液性免疫反応（humoral immunity）と、細胞表面に表現されるタンパク質あるいは脂質などが自己（self）あるいは非自己（non-self）であるかを認識して反応する細胞媒介性免疫反応（cell mediated immunity）であり、第２の分類は、先天性免疫反応（innate immunity）と、適応免疫反応あるいは獲得免疫反応（Adaptive immunity）であるが、先天性免疫は、食細胞による異物除去とナチュラルキラー細胞（natural killer cell）による免疫反応をも含む。
適応あるいは獲得免疫反応には、抗体反応（体液性免疫）と細胞性免疫があり、それぞれは抗原特異的な反応を起こす。これに関係する主役は、リンパ球（Ｔ細胞とＢ細胞）である。リンパ球は多様な種類の抗原に対してそれぞれ特異的に反応するが、各細胞は１種類の抗原に対してのみ反応する。即ち、リンパ球はそれぞれが抗原特異反応性を担当する多くの種類の細胞集団であり、抗原刺激に対してはその抗原と反応性を有する細胞が分化増殖して抗体生産及び細胞性免疫反応を起こす。獲得免疫反応は、先天性免疫と完全に独立されたものではなく、大体の場合、Ｂリンパ球のみならず大食細胞（macrophage）や樹状細胞（dendritic cell）などとの協同作用によって起こる。
炎症とは、ある刺激に対する生体組織の防御反応の一つであり、組織変質、循環障害と滲出、組織増殖の３種類を併発する複雑な病変を称する。中耳炎のような炎症の外に、結核、梅毒、赤痢、ジフテリアなどのような伝染性疾患などで見られる病変の総称であって、大部分の病気がこれに属する。炎症には多様な原因があるが、細菌による場合が一番多い。
一般的に、炎症反応は、生体の細胞や組織に何らかの器質的変化をもたらす侵襲が加えられたときに、その損傷部位を修復再生しようとする生体の防御反応の過程である。従って、このような一連の反応には、局所の血管、体液の各種組織細胞、免疫に関わる細胞などが含まれる。分子生物学の発達につれて、炎症性疾患のサイトカイン（cytokine）という分子水準での理解が試みられており、かかる疾患に影響を及ぼす因子も一つずつ糾明されている。
今まで開発された薬剤の中で一番強力な抗炎症作用を持っている薬剤として、ステロイド製剤が知られている。しかし、ステロイド製剤は、長期間使用する場合、必ず副作用を伴う。ステロイド剤の副作用としては、体液の貯留、副腎抑制、感染に対する感受性の増加とその他の精神病、白内障、緑内障、消化性潰瘍、創傷治癒の遅延、初期感染の再活性化などが報告されている。
一方、幹細胞は未分化細胞であって、自己再生を通して長期間にわたって分裂が可能であり、特定環境の下では多様な種類の細胞に分化することができる細胞を言う。幹細胞は、起源となる組織によって、胚性幹細胞（embryonic stem cell）と成体幹細胞（adult stem cell）とに分けられる。これを利用した研究的な側面で、成体幹細胞の潜在能力は胚性幹細胞よりは制限的であるとの短所があるが、倫理的な側面では問題が少ないことから、成体幹細胞を対象にして多くの研究が進行されている。
間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells、ＭＳＣｓ）は、間葉系間質細胞（mesenchymal stromal cells）とも呼ばれる多能性細胞（multipotent cell）である。間葉系幹細胞は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞などを含む、多様な形態の細胞に分化されることができる。
幹細胞を利用した多くの研究が進められて来ており、この中で韓国公開特許公報第１０−２００９−０１２２４１５号には、動物に効果的な量で間葉系幹細胞を投与して、動物における自己免疫疾患、アレルギー反応、癌、炎症疾患、または線維症を治療し、傷の治癒を促進し、上皮損傷を修復し、動物の器官と組織における血管形成を促進する方法が提示されている。
また、韓国公開特許公報第１０−２０１０−００７６０３１号には、自己免疫疾患や炎症性疾患のような、過度な、機能不全性または調節不能性の自己型または非自己型のＴ細胞媒介型反応を治療するにあたってのＴｒ１細胞及び間葉系幹細胞の用途が提示されている。また、韓国公開特許公報第１０−２０１１−０１２７１１１号には、患者の全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の治療のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の用途が提示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、幹細胞由来の、特に、間葉系幹細胞から抽出したタンパク質を利用して、最適の免疫反応（炎症）抑制活性を示す革新的な技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
よって、本発明では、上記のような目的のために、鋭意研究を進めた結果、驚くべきことに、間葉系幹細胞から抽出された特定サイズを有するタンパク質が顕著に優れた炎症抑制活性を有する点を見つけて、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質は、免疫反応を効果的に抑制することから、これに関わる多様な免疫関連疾患において利用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＮｉＳＯ４処理によって免疫反応を誘発した後、脂肪由来間葉系幹細胞を培養した条件培地（conditioned medium）から抽出されたタンパク質処理によるＩＬ１α分泌量の変化を示したグラフである。
【図２】ＮｉＳＯ４処理によって免疫反応を誘発した後、脂肪由来間葉系幹細胞を培養した条件培地から抽出されたタンパク質処理によるＩＬ１β分泌量の変化を示したグラフである。
【図３】ＬＰＳ処理によって免疫反応を誘発した後、脂肪由来間葉系幹細胞を培養した条件培地から抽出されたタンパク質処理によるＩＬ１α分泌量の変化を示したグラフである。
【図４】ＬＰＳ処理によって免疫反応を誘発した後、脂肪由来間葉系幹細胞を培養した条件培地から抽出されたタンパク質処理によるＩＬ１β分泌量の変化を示したグラフである。
【図５】ＮｉＳＯ４処理によって免疫反応を誘発した後、多様な間葉系幹細胞から抽出された１００ｋＤａ以下のタンパク質処理によるＩＬ１α分泌量の変化を示したグラフである。
【図６】ＮｉＳＯ４処理によって免疫反応を誘発した後、多様な間葉系幹細胞から抽出された１００ｋＤａ以下のタンパク質処理によるＩＬ１β分泌量の変化を示したグラフである。
【図７】ＬＰＳ処理によって免疫反応を誘発した後、多様な間葉系幹細胞から抽出された１００ｋＤａ以下のタンパク質処理によるＩＬ１α分泌量の変化を示したグラフである。
【図８】ＬＰＳ処理によって免疫反応を誘発した後、多様な間葉系幹細胞から抽出された１００ｋＤａ以下のタンパク質処理によるＩＬ１β分泌量の変化を示したグラフである。
【図９】重症のアトピー性皮膚炎を患っている患者の右手の甲の様子と、脂肪由来間葉系幹細胞から抽出された１００ｋＤａ以下のタンパク質を１０日間処理した様子を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳しく説明する。但し、本発明は、多様な形態に変更して具現されることができ、ここで説明する具現例に限定されるものではない。
一つの側面において、本発明は、間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質を有効成分として含有する免疫関連疾患の治療または予防のための薬剤学的組成物に関する。
他の側面において、本発明は、間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質を有効成分として含有する免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための健康機能食品に関する。
さらに他の側面において、本発明は、間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質を有効成分として含有する免疫関連疾患の改善、緩和または予防のための化粧料組成物に関する。
望ましい具現例において、間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質は、間葉系幹細胞から抽出された１００ｋＤａ以下のサイズを有するタンパク質である。一番望ましい具現例において、間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質は、間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１００ｋＤａのサイズを有するタンパク質である。
本発明の免疫関連疾患に対する用途は、間葉系幹細胞から抽出された特定サイズ範囲の分子量を有するタンパク質が免疫反応を抑制または鎮静させるとの事実を見つけた点に起因する。
本発明の用途である免疫関連疾患は、特に限定されるものではないが、ベーチェット病（Behcet's disease）、多発性筋炎／皮膚筋炎、自己免疫性血球減少症、自己免疫性心筋炎、アトピー性皮膚炎、喘息、一次性肝硬変、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群（Goodpasture Syndrome）、自己免疫性髄膜炎、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus）、アジソン病（Addison's disease）、円形脱毛症、強直性脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病（Crohn's disease）、インスリン依存性糖尿病、栄養障害性水疱性表皮剥離症（dystrophic epidermolysis bullosa）、精巣上体炎（epididymitis）、糸球体腎炎（glomerulonephritis）、グレーブス病（Graves' disease）、ギラン・バレー症候群（Guillain-Barre syndrom）、橋本病（Hashimoto's thyroiditis）、溶血性貧血、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡（Pemphigus Vulgaris）、乾癬、リウマチ熱、リウマチ性関節炎（rheumatoid arthritis）、サルコイドーシス（sarcoidosis）、皮膚硬化症、脊椎関節症（spondylarthrosis）、甲状腺炎、血管炎、白斑症（Vitiligo）、粘液水腫（myxedema）、悪性貧血、潰瘍性大腸炎などを例にあげることができる。
特に、本発明は、炎症性疾患の用途に関するものであり、かかる炎症性疾患は特に限定されるものではないが、アレルギー、皮膚炎、アトピー、結膜炎、歯周炎（periodontitis）、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、へんとう腺炎（tonsillitis）、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛（Fibromyalgia）、乾癬性関節炎（Psoriatic arthritis）、骨関節炎（arthrosteitis）、リウマチ性関節炎、肩関節周囲炎（frozen shoulder syndrome）、腱炎、腱鞘炎、腱周囲炎、筋炎、肝炎、膀胱炎、腎炎（nephritis）、シェーグレン症候群、多発性硬化症、及び、急性／慢性炎症性疾患からなる群から選択される何れか一つであり得る。
本発明の組成物において、間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質は、組成物の総重量に対して０．０１％乃至１００％含有されることができ、望ましくは、１％乃至５０％含有されることができる。含量は、剤形または組成物に含有されるその他の成分の含量に応じて適宜調節することができる。しかし、組成物内の間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質の含量が０．０１％未満の場合は、実質的な効果を期待し難い可能性があり、５０％を超過する場合は、期待効能に対比して非経済的である可能性があることから、組成物の総重量に対して０．０１％乃至５０％含有されることが望ましい。
本発明の一具現例において、本発明の組成物は、有効成分である間葉系幹細胞から抽出された５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質以外に、免疫関連疾患に対する効果を上昇または補強させ得るように、免疫関連疾患に有効であることが既に知られているか、これから知られる、その他の公知の化合物や天然抽出物を共に含むことができる。
本発明の一具現例において、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される一つ以上の担体をさらに含有することができる。薬剤学的に許容される担体は、特に制限されず、剤形化に通常使われるラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル（methylhydroxybenzoate）、ヒドロキシ安息香酸プロピル（propylhydroxybenzoate）、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどであり得る。本発明の薬剤学的組成物は、上記担体以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含有することができる。
本発明の薬剤学的組成物の適切な投与量は、剤形化方法、投与方式、患者の状態、症状の程度などの多様な要因によって異なり得るが、一日０．０１ｍｇ／ｋｇ乃至２，０００ｍｇ／ｋｇを投与することが望ましい。本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与することができ、非経口投与の場合、塗布、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。例えば、本発明の薬剤学的組成物がアトピー性皮膚炎の治療に使われるときには、症状のある皮膚に局所的に塗布する方式で投与されるのが望ましい。
本発明の一具現例において、本発明の健康機能食品は、食品用として許容される一つ以上の添加剤をさらに含有することができる。食品用として許容される一つ以上の添加剤は、特に制限されず、食品に配合可能な通常的な成分、例えば、水、風味剤、香味剤、着色剤、安定化剤、防腐剤、アルコール、炭酸化剤、果肉、増粘剤、ビタミン、植物抽出物、有機酸、ミネラル、栄養剤などであり得る。
本発明の健康機能食品の形態は、特に制限されないが、飲み物、ガム、茶、菓子、ビタミン複合体、及び健康補助食品からなる群から選択される何れか一つの形態であり得る。
本発明の一具現例において、本発明の化粧料組成物は、化粧用として許容される一つ以上の添加剤をさらに含有することができる。化粧用として許容される一つ以上の添加剤は、特に制限されず、一般化粧料に配合される通常的な成分、例えば油分、水、界面活性剤、保湿剤、アルコール、増粘剤、色素、防腐剤、香料、キレート剤、賦形剤、希釈剤、紫外線遮断剤、脂肪酸などであり得る。
本発明の化粧料組成物は、特別な制限なく、トナー、乳液、クリーム、ジェル、美容液、ファンデーション、化粧水、パッチ、パック、せっけん、洗顔剤及び洗浄剤からなる群から選択される何れか一つの剤形であり得る。
さらに他の側面において、本発明は、ａ）間葉系幹細胞からタンパク質を抽出する段階；及び、ｂ）抽出されたタンパク質をサイズ別に分離して５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質を得る段階；を含む免疫反応抑制活性を有する間葉系幹細胞由来タンパク質を製造する方法に関する。
望ましい具現例において、ｂ）段階は、抽出されたタンパク質をサイズ別に分離して５ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａのサイズを有するタンパク質を得る段階である。
本発明の間葉系幹細胞は、ヒトの脂肪、胎盤、臍帯血、または骨髄から抽出されたヒト間葉系幹細胞であることが望ましい。また、ヒト胚性幹細胞から間葉細胞を分化誘導した後、抽出されたものを間葉系幹細胞として使用することができる。一例として、本発明の間葉系幹細胞は、成人の脂肪組織から分離した間葉系幹細胞と骨髄由来の間葉系幹細胞を利用しており、このうち、脂肪由来の間葉系幹細胞は、脂肪組織内に存在する細胞に対して数段階の精製過程を経て得ることができ、骨髄由来の間葉系幹細胞も、脂肪由来細胞とは異なる方式の精製過程を経て得ることができる。
本発明では、代表的な免疫反応（炎症）誘導物質であるＮｉＳＯ４（硫酸ニッケル）とＬＰＳ（lipopolysaccharide）を利用して、サイトカインＩＬ１αとＩＬ１βの分泌を増加させた後、特定分子量の間葉系幹細胞由来タンパク質を処理して、ＩＬ１αとＩＬ１βの分泌が減少するか否かを確認した。ＮｉＳＯ４の場合は、アレルギー誘発物質で、先天性免疫（１次、初期免疫あるいは炎症反応）により敏感に反応する物質であり、ＬＰＳは、１次、２次免疫全てに反応して免疫反応を誘発する物質であることが知られている。また、免疫反応のとき、ＩＬ１αとＩＬ１βの分泌水準は互いに異なり得、一般的にＩＬ１αの方がより敏感に反応することと知られている。
下記の実施例を通して、本発明をより詳しく説明する。しかし、下記の実施例は、本発明の内容を具体化するためのものに過ぎず、実施例によって本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【０００８】
細胞の培養及び培地の用意
ヒト角質細胞（keratinocyte）は、無血清培地であるＣＥＦＯｇｒｏ ＨＫ（ＣＢ−ＨＫ−ＧＭ；韓国CEFO Co.製）培地を使用し、３７℃、ＣＯ２培養器で培養した。
脂肪由来間葉系幹細胞はＣＥＦＯｇｒｏ ＡＤＭＳＣ（ＣＢ−ＡＤＭＳＣ−ＧＭ；韓国 CEFO Co.製）培地で、骨髄由来間葉系幹細胞はＣＥＦＯｇｒｏ ＢＭＭＳＣ（ＣＢ−ＢＭＭＳＣ−ＧＭ；韓国CEFO Co.製）培地で、胚性幹細胞由来間葉系幹細胞（ヒト胚性幹細胞から間葉系幹細胞を分化誘導する）はＣＥＦＯｇｒｏ ＥＳＭＳＣ（ＣＢ−ＥＳＭＳＣ−ＧＭ；韓国CEFO Co.製）培地で培養し、これらは何れも、角質細胞と同様に、３７℃、ＣＯ２培養器で培養した。
条件培地（ＣＭ；conditioned medium）は、Ｔ７５フラスコで間葉系幹細胞を１×１０６細胞になるように培養した後、ゼノフリー（Xeno-Free）／無血清培地（ＣＥＦＯ−ＸＦ−ＧＭ）に入れて２４時間培養した後、培養液のみを集めて３，５００ｇを１０分間遠心分離した後、ペレット（pellet）は除去し上澄液のみを採って、０．４５μｍのポア（pore）でフィルタリングして用意した。
間葉系幹細胞からタンパク質抽出
１×１０６個の間葉系幹細胞を捕集し、４℃の条件下で、超音波破砕機（ＶＣＸ５００；米国SONICS&MATERIALS.INC製）を利用して、１５秒間超音波を適用した（Pulse On）後、５秒間休止期（Pulse Off）を持つように調整し、振幅パワーを２０％にして、超音波を１分以内に全３回繰り返し処理した。
超音波破砕されたサンプル１５，０００ｇを５分間遠心分離して、上澄液のみを採り、ペレットは除去した。
また、抽出されたタンパク質と条件培地は、タンパク質の量を定量した後に、凍結乾燥して保管した。
抽出されたタンパク質のサイズ別分離
１，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ、１００ｋＤａ、５ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）のポアサイズを含むポリエーテルスルホン・メンブレンが備えられた２０ｍｌ容量のＶｉｖａｓｐｉｎ−２０限外ろ過チューブ（イギリス Vivascience社製）を使用し、４℃の条件下で３，５００ｇを３０分間遠心分離して抽出されたタンパク質をサイズ別に分離した。
サイズ別に分離されたタンパク質と条件培地は、タンパク質の量を定量した後に、凍結乾燥して保管した。
サイトカイン分泌測定
角質細胞を２４ウェルプレート（米国Corning社製）に１．２×１０５の数で接種し、ＣＥＦＯｇｒｏ ＨＫ培地で２４時間培養した。免疫反応を誘導するために、代表的な炎症誘導物質であるＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）とＮｉＳＯ４（７５μｇ／ｍｌ）を、各サンプルに２４時間処理し、同時に、サイズ別に分離された間葉系幹細胞由来タンパク質を処理した。
サイズ別に分離されたタンパク質とともにＬＰＳとＮｉＳＯ４が処理されたサンプルから培養液を収去して、ＩＬ１αとＩＬ１βの分泌の程度（ｐｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ（米国  R&D SYSTEMS社製）を利用してＲ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳのマニュアルによって測定し、その結果を図１乃至図８に示した。
図のグラフのうち、Ｃｏｎｔｒｏｌは角質細胞培地を利用して正常な方法で培養した対照群サンプルであり、ＣＹＴＯ−ＮはＣｏｎｔｒｏｌにＮｉＳＯ４を処理して免疫反応を誘導したサンプルであり、ＣＹＴＯ−ＬはＣｏｎｔｒｏｌにＬＰＳを処理して免疫反応を誘導したサンプルである。ＷｈｏｌｅはＮｉＳＯ４またはＬＰＳを処理した実験群に脂肪由来間葉系幹細胞を培養した条件培地の全体分子量のタンパク質を処理したサンプルである（即ち、サイズ別分離はしない）。
また、図１乃至図４のうち、１００ｋＤ ａｂｏｖｅと１００ｋＤ ｕｎｄｅｒは、ＮｉＳＯ４またはＬＰＳを処理したサンプルに脂肪由来間葉系幹細胞を培養した条件培地から抽出されたタンパク質を１００ｋＤａ超過と１００ｋＤａ以下とに分けて処理した実験群である。図５乃至図８のうち、ＡＤＭＳＣ、ＢＭＭＳＣ、ＥＳＭＳＣはそれぞれ、ＮｉＳＯ４またはＬＰＳを処理したサンプルに脂肪、骨髄、胚性幹細胞由来間葉系幹細胞から抽出した１００ｋＤａ以下のタンパク質を処理した実験群である。
具体的に、図１及び図２はそれぞれ、ＮｉＳＯ４処理によって免疫反応を誘発した後、脂肪由来間葉系幹細胞を培養した条件培地から抽出されたタンパク質処理によるＩＬ１αとＩＬ１β分泌量の変化を示したグラフである。角質細胞に免疫反応を誘導するＮｉＳＯ４を処理した場合、サイトカインＩＬ１αとＩＬ１β分泌量が増加することが確認でき、Ｗｈｏｌｅと１００ｋＤ ｕｎｄｅｒの場合は１００ｋＤ ａｂｏｖｅ及びＣＹＴＯ−Ｎに比べて免疫反応のときに増加するサイトカインの含量が減少して免疫反応が鎮まることが確認できた。
図３及び図４はそれぞれ、ＬＰＳ処理によって免疫反応を誘発した後、脂肪由来間葉系幹細胞を培養した条件培地から抽出されたタンパク質処理によるＩＬ１αとＩＬ１β分泌量の変化を示したグラフである。角質細胞に免疫反応を誘導するＬＰＳを処理した場合、サイトカインＩＬ１αとＩＬ１β分泌量が増加することが確認でき、Ｗｈｏｌｅと１００ｋＤ ｕｎｄｅｒの場合は１００ｋＤ ａｂｏｖｅ及びＣＹＴＯ−Ｌに比べて免疫反応のときに増加するサイトカインの含量が減少して免疫反応が鎮まることが確認できた。
図１乃至図４に示されているように、１００ｋＤ ａｂｏｖｅの場合には、むしろ免疫反応を増加させる可能性があることを確認した。
図５及び図６はそれぞれ、ＮｉＳＯ４処理によって免疫反応を誘発した後、多様な間葉系幹細胞から抽出された１００ｋＤａ以下のタンパク質処理によるＩＬ１αとＩＬ１β分泌量の変化を示したグラフである。角質細胞に免疫反応を誘導するＮｉＳＯ４を処理した場合、サイトカインＩＬ１αとＩＬ１β分泌量が増加することが確認でき、ＡＤＭＳＣ、ＢＭＭＳＣ及びＥＳＭＳＣ処理群はＣＹＴＯ−Ｎに比べて免疫反応のときに増加するサイトカインの含量が減少して免疫反応が鎮まることが確認できた。
図７及び図８は、ＬＰＳ処理によって免疫反応を誘発した後、多様な間葉系幹細胞から抽出された１００ｋＤａ以下のタンパク質処理によるＩＬ１αとＩＬ１β分泌量の変化を示したグラフである。角質細胞に免疫反応を誘導するＬＰＳを処理した場合、サイトカインＩＬ１αとＩＬ１β分泌量が増加することを確認し、ＡＤＭＳＣ、ＢＭＭＳＣ及びＥＳＭＳＣ処理群はＣＹＴＯ−Ｌに比べて免疫反応のときに増加するサイトカインの含量が減少して、免疫反応が鎮まることを確認することができた。
アトピー性皮膚炎に対する適用
重症のアトピー性皮膚炎を患っている患者の右手の甲に脂肪由来間葉系幹細胞から抽出された１００ｋＤａ以下のタンパク質を毎日朝夕２回にわたって２ｍｌずつ均一に塗布して好転状態を観察した。処理前と処理後１０日目の様子を図９に示した。図９からも確認できるように、脂肪由来間葉系幹細胞から抽出された１００ｋＤａ以下のタンパク質を処理したときにアトピー症状が顕著に好転した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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