(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）抗原Ａ１に特異的に結合する標的化部分Ｔ１、および
（ｉｉ）機能ドメインＦの断片Ｆ１
を含む第１のポリペプチドＰ１であって、前記断片Ｆ１自体または前記ポリペプチドＰ１自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ１、
ならびに
（ｉ）抗原Ａ２に特異的に結合する標的化部分Ｔ２、および
（ｉｉ）前記機能ドメインＦの断片Ｆ２
を含む第２のポリペプチドＰ２であって、前記断片Ｆ２自体または前記ポリペプチドＰ２自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ２
を含み、
前記抗原Ａ１が、前記抗原Ａ２と異なり、
前記ポリペプチドＰ１と前記ポリペプチドＰ２とが、抗原Ａ１およびＡ２の両方を細胞表面において有する細胞の非存在下では、互いと会合せず、
前記ポリペプチドＰ１の前記断片Ｆ１が、前記ポリペプチドＰ２の前記断片Ｆ２と二量体化すると、結果としてもたらされる二量体が、前記ドメインＦの機能に関して機能的となり、
ここで、前記断片Ｆ１が、抗体のＶＬドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＨドメインを含むか、または前記断片Ｆ１が、抗体のＶＨドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＬドメインを含む、
ポリペプチドセット。
【請求項２】
抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有する細胞が、前記ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１の、前記ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２との二量体化を誘導するのに対し、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有していない細胞は、前記ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１の、前記ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２との二量体化を誘導しない、請求項１に記載のポリペプチドセット。
【請求項３】
前記細胞の非存在下において、互いに、前記ポリペプチドＰ１およびＰ２の解離定数ＫＤが、１０−６Ｍ〜１０−３Ｍの範囲である、請求項１または２に記載のポリペプチドセット。
【請求項４】
前記細胞の存在下において、互いに、前記ポリペプチドＰ１およびＰ２の解離定数ＫＤが、１０−７Ｍを下回るか、１０−８Ｍを下回るか、もしくは１０−９Ｍを下回る、請求項１または２に記載のポリペプチドセット。
【請求項５】
前記抗原Ａ１および／または前記抗原Ａ２が、腫瘍細胞の表面上、癌幹細胞の表面上または腫瘍前駆細胞の表面上で発現する抗原である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
【請求項６】
抗原Ａ１と抗原Ａ２との組合せが、がん性細胞だけで見出され、がん細胞でない細胞では見出されない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
【請求項７】
抗原Ａ１と抗原Ａ２との組合せが、ある種のがんのがん性細胞に特異的である、請求項６に記載のポリペプチドセット。
【請求項８】
前記抗原Ａ１が、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ４、およびＨＬＡ−Ｃｗ７からなる群から選択される対立遺伝子変異体であるＭＨＣ抗原であり、
かつ／または前記抗原Ａ２が、ＣＤ４５；ＣＤ３４；ＣＤ３３；ＣＤ１３８；ＣＤ１５；ＣＤ１ａ；ＣＤ２；ＣＤ３；ＣＤ４；ＣＤ５；ＣＤ８；ＣＤ２０；ＣＤ２３；ＣＤ３１；ＣＤ４３；ＣＤ５６；ＣＤ５７；ＣＤ６８；ＣＤ７９ａ；ＣＤ１４６；サーファクタントタンパク質；シナプトフィジン；ＣＤ５６；ＣＤ５７；ニコチン性アセチルコリン受容体；筋特異的キナーゼＭＵＳＫ；電位依存性カルシウムチャネル（Ｐ／Ｑ型）；電位依存性カリウムチャネル（ＶＧＫＣ）；Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ）；ＴＳＨ；アンフィフィシン；ＨｅｐＰａｒ−１；ガングリオシドＧＱ１Ｂ、ＧＤ３、またはＧＭ１；およびグリコホリンＡからなる群から選択されるある種の細胞型または細胞系統に特異的な抗原である、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
【請求項９】
前記抗原Ａ１およびＡ２のうちのいずれかが、
ＨＬＡ−Ａ２；ＨＬＡ−Ｃｗ６；ＥｐＣＡＭ；ＣＤ２０；ＣＤ３３；ＣＤ３８；ＣＤ４５；Ｈｅｒ２；ＥＧＦＲ；ＣＤ１３８；ＣＥＡ；ＣＤ１９；ＰＳＭＡ；Ｅ−カドヘリン；Ｃａ−１２５；Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；大嚢胞症液タンパク質；ＢＣＡ−２２５；ＣＡ  １９−９；ＣＤ１１７；ＣＤ３０；上皮抗原ＢＥＲ−ＥＰ４、上皮膜抗原および上皮関連抗原ＭＯＣ−３１；表皮成長因子受容体ＨＥＲ１；血小板由来成長因子受容体ＰＤＧＦＲアルファ；黒色腫関連マーカー／Ｍａｒｔ１／Ｍｅｌａｎ−Ａ；ＣＤ１３３；ＴＡＧ７２；アクアポリン２ならびにＢ細胞の表面上のクロノタイプ抗体
からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
【請求項１０】
（ｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＥｐＣＡＭであり、他の一方が、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ１０、ＶＥＧＦ−Ｒ、もしくはＭＤＲであるか、
（ｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＭＣＳＰであり、他の一方が、メラノフェリンもしくはＥｐＣＡＭであるか、
（ｉｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＡ１２５であり、他の一方が、ＣＤ２２７であるか、
（ｉｖ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ５６であり、他の一方が、ＣＤ１４０ｂもしくはＧＤ３ガングリオシドであるか、
（ｖ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＥＧＦＲであり、他の一方が、ＨＥＲ２であるか、
（ｖｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＰＳＭＡであり、他の一方が、ＨＥＲ２であるか、
（ｖｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、シアリルルイスであり、他の一方が、ＥＧＦＲであるか、
（ｖｉｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ４４であり、他の一方が、ＥＳＡ、ＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＭＤＲ、もしくはＣＤ１１７であるか、
（ｉｘ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ３４であり、他の一方が、ＣＤ１９、ＣＤ７９ａ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１３、ＣＤ１１７、ＣＤ３３、もしくはＣＤ１５であるか、
（ｘ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ３３であり、他の一方が、ＣＤ１９、ＣＤ７９ａ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１３、ＣＤ１１７、もしくはＣＤ１５であるか、
（ｘｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＭＵＣ１であり、他の一方が、ＣＤ１０、ＣＥＡ、もしくはＣＤ５７であるか、
（ｘｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ３８であり、他の一方が、ＣＤ１３８であるか、
（ｘｉｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ２４であり、他の一方が、ＣＤ２９、もしくはＣＤ４９ｆであるか、
（ｘｉｖ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、炭酸脱水素酵素ＩＸであり、他の一方が、アクアポリン２であるか、
（ｘｖ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＨＬＡ−Ａ２であり、他の一方が、ＥｐＣＡＭであるか、
（ｘｖｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＨＬＡ−Ａ２であり、他の一方が、ＣＤ４５であるか、
（ｘｖｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＨＬＡ−Ａ２であり、他の一方が、ＥＧＦＲであるか、
（ｘｖｉｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＨＬＡ−Ａ２であり、他の一方が、Ｈｅｒ２であるか、
（ｘｉｘ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＨＬＡ−Ａ２であり、他の一方が、ＣＥＡであるか、
（ｘｘ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＥｐＣＡＭであり、他の一方が、ＣＥＡであるか、
（ｘｘｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ４５またはＣＤ３８であり、他の一方が、ＣＤ１３８であるか、
（ｘｘｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＥＧＦＲであり、他の一方が、ＣＥＡであるか、
（ｘｘｉｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、Ｈｅｒ２であり、他の一方が、ＣＥＡであるか、または
（ｘｘｉｖ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ１９であり、他の一方が、Ｂ細胞の表面上のクロノタイプ抗体である、
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
【請求項１１】
前記標的化部分Ｔ１および／もしくはＴ２が、免疫グロブリンモジュールを含むか、または
前記標的化部分Ｔ１および／もしくはＴ２が、それぞれ、前記抗原Ａ１もしくは抗原Ａ２のアプタマーもしくは天然リガンドを含む、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
【請求項１２】
前記標的化部分Ｔ１が、ＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインを含むか、またはラマ抗体、ラクダ抗体、もしくはサメ抗体の可変ドメインＶＨＨを含む、免疫グロブリンモジュールＩ１を含み、かつ／あるいは
前記標的化部分Ｔ２が、ＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインを含むか、またはラマ抗体、ラクダ抗体、もしくはサメ抗体の可変ドメインＶＨＨを含む免疫グロブリンモジュールＩ２を含む、
請求項１１に記載のポリペプチドセット。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンモジュールＩ１に含まれるＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインが、抗体のｓｃＦｖ（単鎖変異体断片）、Ｆａｂ、もしくはＦ（ａｂ’）２、または完全抗体に含まれ、かつ／あるいは
前記免疫グロブリンモジュールＩ２に含まれるＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインが、抗体のｓｃＦｖ（単鎖変異体断片）、Ｆａｂ、もしくはＦ（ａｂ’）２、または完全抗体に含まれる、
請求項１２に記載のポリペプチドセット。
【請求項１４】
前記標的化部分Ｔ１およびＴ２のうちのいずれか１つが、Ｂ細胞の表面上のクロノタイプ抗体に結合するアレルゲンまたは基質を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
【請求項１５】
前記機能ドメインＦが、免疫グロブリンモジュールであるか、またはこれを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
【請求項１６】
前記機能ドメインＦが、抗体のＦｖ（変異体断片）である、請求項１５に記載のポリペプチドセット。
【請求項１７】
前記断片Ｆ１が、抗ＣＤ３抗体、抗Ｈｉｓ抗体、もしくは抗ＤＩＧ抗体のＶＬドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗ＣＤ３抗体、抗Ｈｉｓ抗体、もしくは抗ＤＩＧ抗体のＶＨドメインをそれぞれ含むか、または前記断片Ｆ１が、抗ＣＤ３抗体、抗Ｈｉｓ抗体、もしくは抗ＤＩＧ抗体のＶＨドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗ＣＤ３抗体、抗Ｈｉｓ抗体、もしくは抗ＤＩＧ抗体のＶＬドメインをそれぞれ含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
【請求項１８】
ポリペプチドＰ１およびＰ２のうちのいずれかが、配列番号１１４〜１２９および１９７からなる群から選択されるアミノ酸配列であるか、またはこれを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかに記載のポリペプチドセットを含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１から１８のいずれかに記載のポリペプチドセットを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドセットおよびその使用に関する。特に、本発明は、それらの各々が、抗原「Ａ」に結合する標的化部分「Ｔ」および機能ドメイン断片「Ｆ」を含む２つのポリペプチドを含むポリペプチドセットであって、前記２つのポリペプチドが、その表面において（その表面上で）「Ａ」を有する基質の非存在下では、互いと会合せず、「Ｆ」が二量体化すると、結果としてもたらされる二量体が機能的となるポリペプチドセットに関する。さらに、前記セットの医療および診断的使用についても記載される。なおさらに、本発明は、前記ポリペプチドセットをコードする（１つまたは複数の）核酸分子にも関する。本発明はまた、前記ポリペプチドセットをコードする（１つまたは複数の）核酸分子のヌクレオチド配列を含むベクターにも関する。さらに、本発明は、前記ポリペプチドセットを含む医薬組成物にも関する。なおさらに、本発明は、前記ポリペプチドセットを含むキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験ならびに前臨床試験および早期臨床試験における、腫瘍の免疫療法のための二特異性抗体構築物の目覚ましい有効性について報告する、多数の画期的な論考を見る。今日、かなりの数の異なる二特異性構築物であって、サイズ、組成、薬物動態特性、および直接新生物性細胞を消失させるかまたは免疫エフェクター細胞を腫瘍細胞の溶解に動員する能力が異なる二特異性構築物が利用可能である。
【０００３】
抗体ベースのがん免疫戦略は、標的構造に対するそれらの優れた感受性および特異性に起因して、高度に有望な治療選択肢である。
【０００４】
抗体のモジュール式の構造機能的な組織化は、遺伝子操作による広範な操作を可能とする。異なる免疫グロブリン様ドメインは、特異的ドメインに関連する機能的な特色を失わずに分離および／または接合することができる。なおさらに、それらは、異種タンパク質ドメインと組み合わせ、連結することができるが、また、非ペプチド性部分とも組み合わせ、連結することもできる。したがって、従来の抗体の天然の限界を伴わずに、融合構築物を、合理的な形で開発することが可能である。
【０００５】
新規の生物学的および／または薬学的特性を伴う、抗体ベースの融合タンパク質を創成することができる。意図される適用に応じて、副作用（阻害性突然変異）を軽減するかまたは治療的有効性（活性化突然変異）を増強する突然変異誘発により、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用）およびＣＤＣ（補体依存性細胞傷害作用）を誘発するＦｃドメインの能力を改変する有望な取組みがなされている。抗体の抗原結合ドメインを検討すると、遺伝子操作により可能となる新たな適用は、なおより多様となる。
【０００６】
抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の抗原認識可変ドメインは、抗原結合能力を保存しながら、遺伝子操作を介して、ペプチドリンカーにより接合することができる。このような抗原結合単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、組織透過能が高く、血清滞留時間が短い、低分子の抗体サロゲートであって、臨床造影手順および放射線療法ならびに他の適用のための抗体サロゲートとして用いることができる。重要なことは、これらのｓｃＦｖ部分は、新規の組換え治療剤の開発における抗原特異的モジュールとして容易に使用しうることである。
【０００７】
近年の報告は、抗腫瘍治療における組換え二特異性抗体の並外れた潜在的可能性を指し示す。このような二特異性抗体は、２つの抗原であって、それらのうちの一方は腫瘍が発現させるが、他方は通例免疫細胞上で見出される抗原を認識する。抗腫瘍治療における大半の二特異性抗体は、一方で、腫瘍に関連する系統マーカーを標的化し、他方で、Ｔ細胞受容体の非可変分子であるＣＤ３ε／ＣＤ３複合体を標的化し、これにより、Ｔ細胞を動員して、腫瘍を破壊する［MuellerおよびKontermann、Bispecific antibodies for cancer immunotherapy: Current perspectives. BioDrugs、2010、24(2):89〜98］。
【０００８】
抗体の構造および機能を操作するための広範な選択肢にもかかわらず、このような抗体ベースの試薬の治療的有効性は、対象とされる抗原の性質、腫瘍内および腫瘍関連組織内の抗原への接近可能性、ならびに所望の細胞死誘導機能を誘発または媒介する抗体の傾向により制約されている。
【０００９】
例えば、患者を、致命的な機能を伴う組織上でもまた発現する抗原を指向する二特異性構築物で処置する場合、重度の副作用が観察される。リンパ腫の場合の未知数の個別に突然変異した細胞表面分子およびモノクローナルのＢ細胞受容体またはＴ細胞受容体を除き、形質転換細胞をその健常な前駆細胞から識別する腫瘍特異的抗原は利用可能でないので、これは、深刻な問題である。
【００１０】
二特異性抗体の使用に基づく治療概念は通例、エフェクター細胞の動員に依拠するので、ツール（二特異性構築物）の有効性が大きくなるほど、副作用の生じる可能性が高くなり、非形質転換組織上における抗原のわずかな発現でもなお、制御不能のオフターゲット作用を引き起こしうると考えられる。
【００１１】
２００８年に、SCIENCEは、単鎖二特異性Ｔ細胞動員（ＢｉＴＥ）抗体であるＭＴ１０３／ブリナツモマブの臨床的有効性について、それが、再発したかまたは標準的な免疫化学療法に対して不応性であるリンパ腫患者のうちの約８０％において、モノクローナル抗体であるリツキシマブについて報告された血清レベルより約５桁低い血清レベルで寛解を誘導するという最初の報告を公表した（Bargou, R.ら、Science 321、974〜977、2008）。急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）におけるこの公表および確認的な第ＩＩ相試験についてのその後の報告は、全身性の毒性およびほとんどまたは全く認められない治療活性に起因して、そのときまでほぼ２０年間にわたり深刻な崩壊状態にあった、二特異性抗体の新時代における先駆けとなった。主に、このSCIENCEの論考を受けて、二特異性抗体は再び、３５を超える異なるフォーマットが有効である急成長分野となった（Reichert、Drug Discov Today. 17（2012）954〜963）。これらのフォーマットは、サイズが異なり、抗原に対するアフィニティー、安定性、エフェクター細胞（大半はＴ細胞）を動員する能力、および薬物動態特性について最適化されている。構築物のアフィニティーまたはアビディティーは、多様な技法を用いるアフィニティー成熟により、または単に複数のｓｃＦＶドメインを直列に接合して多価構築物を創出することにより操作される。１つの標的分子ではなく、２つの標的分子を対象とすることにより、結合能の増強を提示するようにデザインされた、三特異性抗体もなお報告されている。フォーマットの安定性は、自然発生の抗体を模倣し、血清中半減期の延長およびプロテアーゼによるタンパク質分解性消化からの保護などの薬物動態特性を同時に増強するために、免疫グロブリン様のドメインを付加することにより最適化することができる。なおさらに、フォーマットの安定性は、作製を最適化することにより増強することもできる。ｓｃＦＶドメインを共有結合的に接合するのに使用されるリンカー配列は、凝集物をもたらすことが多いので、機能的な薬物を創成するために、容易にリアセンブルしうる２つまたは３つのポリペプチドをまず作製する作製ラインが確立されている。このような技法では、方向付けられたジスルフィド架橋または架橋形成試薬を使用して、２つの異なるポリペプチドを共有結合的に接合する。他の技法では、ロイシンジッパードメイン、Ｆｃドメインなどのヘテロ二量体化ドメインまたはホモ二量体化ドメイン、およびノブイントゥーホール（ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅ）技術（例えば、ＷＯ２００７／０６２４６６を参照されたい）など、他の技法を活用する。なおさらに、抗原を検出するためのいわゆるオープンサンドイッチイムノアッセイでは、抗原の結合により安定化させうるＶＨとＶＬとの相互作用も用いられている（Ueda、Nature Biotechnology 14（1996）、1714〜1718; Ohmuro-Matsuyama（2012）、Detection of Protein Phosphorylation by Open-Sandwich Immunoassay、Integrative Proteomics、Dr. Hon-Chiu Leung（編）、ISBN:978-953-51-0070-6；ＷＯ２００４／０１６７８２／ＥＰ−Ａ１１５３６００５）。
【００１２】
しかし、当技術分野において記載されている二特異性／三特異性構築物および二価構築物または多価構築物は、欠点も有する。第１に、標的分子として対象とされうる真に特異的な腫瘍抗原が存在しないことである。実際、これまでのところ対象とされている標的抗原は、腫瘍と非悪性細胞とにより共有される分化抗原であるため、二特異性抗体フォーマットが強力であるほど、付随する損傷も重度となる。その結果、先行技術の二特異性または三特異性フォーマットは、悪性細胞を非悪性細胞から識別することができない。この点で、いずれかの標的分子を発現させる細胞を破壊するための免疫細胞を動員するには、一般に１つの標的分子の結合で十分であるため、標的細胞への高いアビディティーによる結合のために開発された三特異性構築物は、高度のオフターゲット作用を付与するとわかる場合がある。したがって、三特異性構築物では、特異性と引き換えに、アビディティーを増強している。近年の多重パラメータ解析は、異常な抗原署名の発現のために、腫瘍細胞を、それらのそれぞれの元の非形質転換組織から弁別しうることを指し示している。今日、これらの知見は、世界保健機構（ＷＨＯ）による造血系新生物についての分類システムの不可欠のパートを構成し、また、他の起源のがん細胞およびがん幹細胞またはがん誘発細胞にも当てはまる。したがって、併せて悪性状態を意味する抗原の組合せを同時に発現させる細胞を標的化することが有利であろう。先行技術により開示されている抗体のうちのいずれも、標的抗原の組合せを発現させる細胞を、単一の抗原陽性細胞から識別することが可能でない。第２に、例えば、完全ＣＤ３モジュール（例えば、抗Ｃｄ３  ｓｃＦｖ）を用いる二特異性抗体技術の主要な問題は、標的細胞上の標的抗原への結合に関わりなく、Ｔ細胞を刺激またはあらかじめ刺激するこれらのタンパク質の固有の能力であり、これまでのところ観察されている多くの副作用は、逸脱したＴ細胞機能と関連すると考えられる。
【００１３】
したがって、当技術分野では、がん処置における、より特異的な処置選択肢が必要とされており、特に、がん細胞を、高度な特異性で、副作用を低減して同定し、かつ／または消失させる方途の改善が必要とされている。
【００１４】
同種幹細胞移植、すなわち、別の提供者から得られる幹細胞の患者への移植の分野でも、同様の必要が認められている。再発したかもしくは不応性である白血病または別の血液疾患を患う患者は、ドナーからの健常な造血細胞の移植と組み合わせて、（悪性造血細胞を消失させるために）化学療法／照射により処置することができる。悪性細胞の消失が不完全である場合、腫瘍は、移植により提供された健常な細胞の存在にもかかわらず、存続する悪性レシピエント細胞から再び成長する可能性がある。結果として、腫瘍処置および同種移植を受けている患者における生存率は、著明に減殺される。
【００１５】
しかし、存続する悪性細胞を高度な特異性で消失させる（そして、同様に、を同定する）ことは、困難であり、このため、多様な試みにもかかわらず、この問題に対する妥当な解決法は見出されていない。したがって、当技術分野では、他の細胞に対する副作用を最小限として、このような悪性レシピエント細胞を特異的に同定し、かつ／または消失させる方途の改善を提供することが必要とされている。
【００１６】
コンディショニング治療（放射線／化学療法）のすぐ後に施される移植片（同種幹細胞）は、造血を置きかえ、再構成しうる。移植片は、骨髄または刺激された末梢血細胞から採取され、新たに作り出される血液細胞の供給源である、約１パーセントの造血幹細胞を含有する。加えて、移植片は通常、膨大な数の免疫細胞、とりわけ、獲得免疫系の一部であるＴリンパ球であり、これらのＴ細胞が白血病性細胞に対する免疫攻撃をかける場合には極めて有益でありうるＴリンパ球も含有する。この状況は、十分に記載されており、移植片対白血病効果として知られている。他の面ではまた、Ｔ細胞を患者に対して方向付ける逸脱した免疫応答であって、移植片対宿主病として知られている免疫応答も、高頻度で観察される。
【００１７】
移植片対宿主病を最小化するために、移植片は通例、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）またはＭＨＣ（主要組織適合性複合体）に基づいて選択される。ドナーとレシピエントとの間で抗原が緊密に適合するほど、重度の移植片対宿主病の確率は低くなる。しかし、多くの患者には、完全に適合する移植片を見出すことはできない。これらの場合には、１つなおまたは複数のＨＬＡ分子が異なる骨髄幹細胞または末梢血幹細胞が使用される。これらの臨床状況は、移植後における、Ｔ細胞系を厳格に制御下に保つ厳格な免疫抑制レジメンを要請する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、特殊な種類の細胞を特異的に同定し、かつ／または消失させる方途の改善を提供することが本発明の一目的である。なおさらに、２つの特異的抗原の特異的な組合せをそれらの細胞表面において有する細胞を特異的に同定し、かつ／または消失させる方途の改善を提供することも、本発明の目的である。さらに、がん性細胞を特異的に同定し、かつ／または消失させる方途の改善を提供することも、本発明の目的である。さらに、（１）特定の由来の細胞（レシピエントまたはドナーに由来する細胞など、組織移植または細胞移植の状況にある細胞）、および（２）特殊な細胞型または細胞系統に属する細胞（造血細胞など）を特異的に同定し、かつ／または消失させる方途の改善を提供することも、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の目的は、
（ｉ）抗原Ａ１に特異的に結合する標的化部分Ｔ１、および
（ｉｉ）機能ドメインＦの断片Ｆ１
を含む第１のポリペプチドＰ１であって、前記断片Ｆ１自体またはポリペプチドＰ１自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ１、
ならびに
（ｉ）抗原Ａ２に特異的に結合する標的化部分Ｔ２、および
（ｉｉ）前記機能ドメインＦの断片Ｆ２
を含む第２のポリペプチドＰ２であって、前記断片Ｆ２自体またはポリペプチドＰ２自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ２
を含み、
前記抗原Ａ１が、前記抗原Ａ２と異なり、
前記ポリペプチドＰ１と前記ポリペプチドＰ２とが、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその表面において、またはその表面上で有する基質、より具体的には、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において、またはその細胞表面上で保有する細胞の非存在下では、互いと会合せず、
前記ポリペプチドＰ１の前記断片Ｆ１が、前記ポリペプチドＰ２の前記断片Ｆ２と二量体化すると、結果としてもたらされる二量体が、前記ドメインＦの機能に関して機能的となる、
ポリペプチドセットにより解決される。
【００２０】
本発明の目的はまた、
（ｉ）抗原Ａ１に特異的に結合する標的化部分Ｔ１、および
（ｉｉ）機能ドメインＦの断片Ｆ１
を含む第１のポリペプチドＰ１であって、前記断片Ｆ１自体またはポリペプチドＰ１自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ１、
ならびに
（ｉ）抗原Ａ２に特異的に結合する標的化部分Ｔ２、および
（ｉｉ）前記機能ドメインＦの断片Ｆ２
を含む第２のポリペプチドＰ２であって、前記断片Ｆ２自体またはポリペプチドＰ２自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ２
を含み、
前記抗原Ａ１が、前記抗原Ａ２と異なり、
（ａ）前記断片Ｆ１が、抗体のＶＬドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＨドメインを含むか、もしくは前記断片Ｆ１が、抗体のＶＨドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＬドメインを含むか、または
（ｂ）前記断片Ｆ１が、抗体のＶＬドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＨドメインを含むか、もしくは前記断片Ｆ１が、抗体のＶＨドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＬドメインを含み、
前記ポリペプチドＰ１と前記ポリペプチドＰ２とが、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその表面において、またはその表面上で有する基質、より具体的には、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において、またはその細胞表面上で保有する細胞の非存在下では、互いと会合せず、
前記ポリペプチドＰ１の前記断片Ｆ１が、前記ポリペプチドＰ２の前記断片Ｆ２と二量体化すると、結果としてもたらされる二量体が、前記ドメインＦの機能に関して機能的となる、
ポリペプチドセットによっても解決される。
【００２１】
本発明の目的はまた、
（ｉ）抗原Ａ１に特異的に結合する標的化部分Ｔ１、および
（ｉｉ）機能ドメインＦの断片Ｆ１
を含む第１のポリペプチドＰ１であって、前記断片Ｆ１自体またはポリペプチドＰ１自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ１、
ならびに
（ｉ）抗原Ａ２に特異的に結合する標的化部分Ｔ２、および
（ｉｉ）前記機能ドメインＦの断片Ｆ２
を含む第２のポリペプチドＰ２であって、前記断片Ｆ２自体またはポリペプチドＰ２自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ２
を含み、
前記抗原Ａ１が、前記抗原Ａ２と異なり、
（ｃ）前記断片Ｆ１が、抗体のＶＬドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＨドメインを含むか、もしくは前記断片Ｆ１が、抗体のＶＨドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＬドメインを含むか、
（ｄ）前記ポリペプチドＰ１と前記ポリペプチドＰ２とが、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその表面において有する基質、より具体的には、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有する細胞の非存在下では、互いと会合しないか、または
（ｅ）前記断片Ｆ１が、抗体のＶＬドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＨドメインを含むか、もしくは前記断片Ｆ１が、抗体のＶＨドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＬドメインを含み、
前記ポリペプチドＰ１と前記ポリペプチドＰ２とが、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその表面において有する基質、より具体的には、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有する細胞の非存在下では、互いと会合せず、
前記ポリペプチドＰ１の前記断片Ｆ１が、前記ポリペプチドＰ２の前記断片Ｆ２と二量体化すると、結果としてもたらされる二量体が、前記ドメインＦの機能に関して機能的となり、基質または細胞の非存在下において、互いに、前記ポリペプチドＰ１およびＰ２、特に、前記断片Ｆ１およびＦ２の解離定数ＫＤが、１０−８Ｍ〜１０−２Ｍの範囲である、
ポリペプチドセットによっても解決される。
【００２２】
本発明はさらに、以下の項目にも関する。
１．（ｉ）抗原Ａ１に特異的に結合する標的化部分Ｔ１、および
（ｉｉ）機能ドメインＦの断片Ｆ１
を含む第１のポリペプチドＰ１であって、前記断片Ｆ１自体またはポリペプチドＰ１自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ１、
ならびに
（ｉ）抗原Ａ２に特異的に結合する標的化部分Ｔ２、および
（ｉｉ）前記機能ドメインＦの断片Ｆ２
を含む第２のポリペプチドＰ２であって、前記断片Ｆ２自体またはポリペプチドＰ２自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ２
を含み、
前記抗原Ａ１が、前記抗原Ａ２と異なり、
前記ポリペプチドＰ１と前記ポリペプチドＰ２とが、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその表面において有する基質、より具体的には、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有する細胞の非存在下では、互いと会合せず、
前記ポリペプチドＰ１の前記断片Ｆ１が、前記ポリペプチドＰ２の前記断片Ｆ２と二量体化すると、結果としてもたらされる二量体が、前記ドメインＦの機能に関して機能的となる、
ポリペプチドセット。
２．抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有する細胞が、前記ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１の、前記ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２との二量体化を誘導するのに対し、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有するわけではない細胞は、前記ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１の、前記ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２との二量体化を誘導しない、項目１に従うポリペプチドセット。
３．前記標的化部分Ｔ１が、免疫グロブリンモジュール、好ましくはＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインを含む免疫グロブリンモジュールＩ１、より好ましくは抗体のｓｃＦｖ（単鎖変異体断片）を含む免疫グロブリンモジュールＩ１、またはラマ抗体、ラクダ抗体、もしくはサメ抗体の可変ドメインＶＨＨを含む免疫グロブリンモジュールを含み、
かつ／あるいは前記標的化部分Ｔ２が、免疫グロブリンモジュール、好ましくはＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインを含む免疫グロブリンモジュールＩ２、より好ましくは抗体のｓｃＦｖ（単鎖変異体断片）を含む免疫グロブリンモジュールＩ２、またはラマ抗体、ラクダ抗体、もしくはサメ抗体の可変ドメインＶＨＨを含む免疫グロブリンモジュールを含むか、
あるいは前記標的化部分Ｔ１および／または前記標的化部分Ｔ２が、それぞれ、前記抗原Ａ１または抗原Ａ２のアプタマーまたは天然リガンドを含む、
項目１または２に従うポリペプチドセット。
４．前記抗原Ａ１および／または前記抗原Ａ２が、腫瘍細胞の表面上または腫瘍前駆細胞／腫瘍前駆体細胞の表面上で発現する抗原、好ましくは血液系腫瘍細胞の表面上で発現する抗原、または非血液系腫瘍細胞の表面上で発現する抗原である、項目１〜３のうちのいずれかに従うポリペプチドセット。
５．抗原Ａ１と抗原Ａ２との組合せが、がん性細胞だけで見出され、がん性でない細胞では見出されず、好ましくは、抗原Ａ１と抗原Ａ２との組合せが、ある種のがんのがん性細胞に特異的である、項目１〜４のうちのいずれかに従うポリペプチドセット。
６．前記抗原Ａ１が、ＭＨＣ抗原、好ましくはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、もしくはＨＬＡ−ＤＭのうちのいずれかの対立遺伝子変異体、より好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の対立遺伝子変異体、より好ましくはＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ４、およびＨＬＡ−Ｃｗ７からなる群から選択される対立遺伝子変異体であり、かつ／または前記抗原Ａ２が、ある種の細胞型もしくは細胞系統に特異的な抗原である、項目１〜５のうちのいずれかに従うポリペプチドセット。
７．前記機能ドメインＦが、免疫グロブリンモジュール、好ましくは抗体のｓｃＦｖ（単鎖変異体断片）、または蛍光分子、好ましくはＧＦＰもしくはＧＦＰ変異体、または生物発光を媒介することが可能な分子、好ましくはＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼである、項目１〜６のうちのいずれかに従うポリペプチドセット。
８．前記機能ドメインＦが、担体分子、好ましくはペプチドもしくは炭水化物分子である担体分子、またはアフィニティータグ、好ましくはＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグからなる群から選択されるアフィニティータグに特異的に結合するドメインである、項目１〜７のうちのいずれかに従うポリペプチドセット。
９．前記機能ドメインＦが、放射性化合物に特異的に結合するドメイン、それ自体ではヒト細胞の細胞膜を透過することが可能ではなく、前記細胞の細胞膜と会合するとヒト細胞へと内部移行される毒素分子に特異的に結合するドメイン、蛍光分子に特異的に結合するドメイン、または生物発光を媒介することが可能な分子に特異的に結合するドメインである、項目１〜８のうちのいずれかに従うポリペプチドセット。
１０．前記断片Ｆ１が、抗体のＶＬドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＨドメインを含み、好ましくは、前記抗体が、抗ＣＤ３抗体であるか、または前記断片Ｆ１が、抗体のＶＨドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＬドメインを含み、好ましくは、前記抗体が、抗ＣＤ３抗体である、項目１〜９のうちのいずれかに従うポリペプチドセット。
１１．腫瘍を患っている患者の処置における使用のため、または腫瘍を患っている患者における診断的使用のための、好ましくは腫瘍を患っており、同種組織移植もしくは同種細胞移植を受けているか、またはこのような移植を受けることを意図する患者の処置における使用のため、あるいは腫瘍を患っており、同種組織移植もしくは同種細胞移植を受けているか、またはこれを受けることを意図する患者における診断的使用のためであり、好ましくは、前記患者へと投与される、項目１〜１０のうちのいずれかに従うポリペプチドセット。
１２．項目１〜１１のうちのいずれかに従うポリペプチドセットまたはポリペプチドセットのポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子または核酸分子セット。
１３．項目１２に従う核酸分子のヌクレオチド配列、または項目１２に従う核酸分子セットの核酸分子のうちの１つの配列を含むベクター。
１４．項目１〜１１のうちのいずれかに従うポリペプチドセット、または項目１２に従う核酸分子／核酸分子セット、または項目１３に従うベクターを含む医薬組成物であって、薬学的に許容される担体をさらに含むことが好ましい医薬組成物。
１５．項目１〜１１のうちのいずれかに従うポリペプチドセットを含むキット。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
前記抗原Ａ１は、細胞表面分子であることが好ましい。前記抗原Ａ２は、細胞表面分子であることが好ましい。前記抗原Ａ１は、細胞の悪性状態に特異的であることが好ましい。前記抗原Ａ２は、ある種の細胞型もしくは細胞系統に特異的であるか、または細胞の悪性状態に特異的であることが好ましい。前記抗原Ａ１は、悪性細胞型に特異的であることが好ましい。前記抗原Ａ２は、悪性細胞型に特異的であることが好ましい。
【００２４】
一態様では、本発明は、本明細書で規定および記載されるポリペプチドセットであるが、抗原Ａ１が、抗原Ａ２と同じであるポリペプチドセットに関する。よって、このようなポリペプチドセットＰ１およびＰ２では、Ｆ１断片を標的化部分Ｔ１へと連結することができ、Ｆ２断片を標的化部分Ｔ２へと連結することができる一方で、Ｔ１およびＴ２のいずれもが、同じ抗原に特異的に結合する。この文脈では、標的化部分Ｔ１が結合する抗原Ａ１上のエピトープは、標的化部分Ｔ２が結合する抗原Ａ２上のエピトープと同じエピトープの場合もあり、異なるエピトープの場合もある。抗原Ａ１上のエピトープが、抗原Ａ２上のエピトープと同じである場合、ポリペプチドＰ１は、Ｐ２内に含まれる標的化部分と同一な標的化部分を含みうる。本発明のこの態様はまた、Ｆドメインを破壊されたポリペプチドセットＰ１およびＰ２は、オフターゲット作用を提示しない（例えば、ＣＤ３提示Ｔ細胞があらかじめ活性化されることがなく、よって、例えば、従来の二特異性抗体と比較して毒性特性および／または副作用が小さい）利点にも基づく。
【００２５】
一実施形態では、前記断片Ｆ１と前記断片Ｆ２とは、併せて、前記機能ドメインＦである。
【００２６】
一実施形態では、前記ポリペプチドＰ１と前記ポリペプチドＰ２とは、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその表面において有する基質、より具体的には、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有する細胞の非存在下では、互いへと共有結合的に連結されない。
【００２７】
一実施形態では、前記ポリペプチドＰ１と前記ポリペプチドＰ２とは、互いへと共有結合的に連結されない。
【００２８】
前記ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２、ならびに／または、特に、その中に含まれる前記断片Ｆ１および断片Ｆ２、より特定すると、その中に含まれうるＶＨおよびＶＬは、特に、治療的介入を必要とする対象、すなわち、治療および／または診断を必要とする対象へと投与される場合、互いと会合しない。したがって、本明細書で提供される医薬手段または診断手段は、本明細書で規定される「ポリペプチドセット」内に含まれる２つのポリペプチドＰ１およびＰ２を、非会合形態で含む。前記２つのポリペプチドの会合は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける前記基質または細胞の存在下で生じる。前記基質または細胞の存在下では、安定化剤（例えば、本明細書で記載されるＣＤ３、ＨＩＳ、またはＤＩＧなどの、例えば、抗原）により、前記２つのポリペプチドの会合を（さらに）安定化させることができる。それらは、前記基質もしくは細胞の非存在下では、互いと会合せず、かつ／または前記基質もしくは細胞の非存在下では、二量体化しないことが好ましい。それらは、ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２、ならびに／または、特に、断片Ｆ１および断片Ｆ２の会合および／または二量体化を安定化させる薬剤が存在する場合でもなお、すなわち、前記ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２、ならびに／または、特に、前記断片Ｆ１および断片Ｆ２が、安定化剤／Ｐ１（Ｆ１）／Ｐ２（Ｆ２）三量体複合体（例えば、抗原／ＶＨ／ＶＬ三量体複合体）中に存在する場合でもなお、前記基質もしくは細胞の非存在下では、互いと会合せず、かつ／または前記基質もしくは細胞の非存在下では、二量体化しないことがより好ましい。
【００２９】
具体的な一実施形態では、前記ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２、ならびに／または、特に、その中に含まれる前記断片Ｆ１および断片Ｆ２、より特定すると、その中に含まれうるＶＨおよびＶＬは、好ましくは、ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２、ならびに／または、特に、断片Ｆ１および断片Ｆ２の会合および／または二量体化を安定化させる薬剤により媒介される相互作用により（例えば、抗原を媒介する相互作用により）互いと会合し、かつ／または三部分複合体構成へと二量体化する。しかし、この会合および／または二量体化は、前記基質または細胞の存在下だけで生じることが最も好ましい。
【００３０】
例えば、ロイシンジッパーおよび／または免疫グロブリンＣＨ３もしくはＦｃ断片などの定常ドメインが、ヘテロ二量体化およびホモ二量体化する場合のアフィニティー強度は、約１０−８〜１０−１１Ｍの範囲の解離定数ＫＤであると推定される（例えば、Zhu（1997）、Protein Sci. 6、781〜8; Plueckthun（1997）、Immunotech. 3、83〜105を参照されたい）。このＫＤの範囲は、前記基質または細胞の非存在下で、本発明の前記ポリペプチドＰ１およびＰ２、特に、前記断片Ｆ１およびＦ２の会合および／または二量体化が生じうる場合のＫＤを明らかに下回る。よって、一実施形態では、ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２、ならびに／または、特に、その中に含まれる断片Ｆ１および断片Ｆ２、より特定すると、その中に含まれうるＶＨおよびＶＬが、前記基質または細胞の非存在下で、互いと会合および／または二量体化する場合のＫＤは、例えば、ロイシンジッパーおよび／または免疫グロブリンＣＨ３もしくはＦｃ断片などの定常ドメインのヘテロ二量体化およびホモ二量体化のＫＤを上回るＫＤによるに過ぎない。前記基質または細胞の存在下では、ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２、ならびに／または、特に、その中に含まれる断片Ｆ１および断片Ｆ２、より特定すると、その中に含まれうるＶＨおよびＶＬが、互いと会合し、かつ／または二量体化する場合のＫＤは、例えば、ロイシンジッパーおよび／または免疫グロブリンＣＨ３もしくはＦｃ断片などの定常ドメインのヘテロ二量体化およびホモ二量体化のＫＤの範囲であるか、またはこの範囲をなお下回ることが想定される。
【００３１】
例えば、単離ＶＨドメインおよび単離ＶＬドメインの相互作用強度は一般に、低アフィニティーである。比色分光分析、蛍光分光分析、もしくは紫外線差分光分析、および／または円偏光二色性法を用いて、１０−９〜１０−６Ｍの解離定数ＫＤが決定されている（例えば、Woern、JMB（2001）305、989〜1010；Plueckthun（1992）、Immunological Reviews、130号を参照されたい）。表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＢＩＡｃｏｒｅまたはＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および抗ＨＥＬ抗体系（抗鶏卵白リゾチーム抗体ＨｙＨＥＬ１０）を用いて、Ueda（同上）およびOhmuro-Matsuyama（同上）は、単離ＶＨドメインおよび単離ＶＬドメインが、全く二量体化しない（Ｋａ＜１０５／Ｍ、検出限界を下回る）ことを見出した。しかし、コグネイト抗原の存在下では、ＶＨペプチドとＶＬペプチドとの会合が著明に増強され（Ｋａ：約１０９／Ｍ）、抗原／ＶＨ／ＶＬ三量体複合体の解離速度は目覚ましく低減され、抗原を１．４μＭとしたときのＫＤの計算値は、約２．７３×１０−５±１．４３×１０−６／秒であった。よって、本発明の文脈では、前記基質または細胞の非存在下で、本発明の前記ポリペプチドＰ１およびＰ２、特に、前記断片Ｆ１およびＦ２の会合および／または二量体化が生じうる場合のＫＤは、例えば、Woern（同上）、Plueckthun（1992；同上）、Ueda（同上）、およびOhmuro-Matsuyama（同上）の文脈で推定されている、単離ＶＨドメインおよび単離ＶＬドメインのＫＤまたはＫＤの範囲であるか、またはこれをなお上回る、特に、Woern（同上）、Plueckthun（1992；同上）、Ueda（同上）、およびOhmuro-Matsuyama（同上）の文脈で推定されている、抗原／ＶＨ／ＶＬ三量体複合体のＫＤまたはＫＤの範囲を上回るＫＤによるに過ぎないことが特に想定される。前記基質または細胞の存在下では、ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２、ならびに／または、特に、その中に含まれる断片Ｆ１および断片Ｆ２、より特定すると、その中に含まれうるＶＨおよびＶＬが、互いと会合し、かつ／または二量体化する場合のＫＤは、例えば、Woern（同上）、Plueckthun（1992；同上）、Ueda（同上）、およびOhmuro-Matsuyama（同上）の文脈で推定されている、単離ＶＨドメインおよび単離ＶＬドメインのＫＤまたはＫＤの範囲を（はるかに）下回るＫＤ、好ましくは、Plueckthun（同上）、Ueda（同上）、およびOhmuro-Matsuyama（同上）の文脈で推定されている、抗原／ＶＨ／ＶＬ三量体複合体のＫＤまたはＫＤの範囲であるか、またはこれをなお下回るＫＤであることが想定される。
【００３２】
一態様では、ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２、ならびに／または、特に、その中に含まれる断片Ｆ１および断片Ｆ２、より特定すると、その中に含まれうるＶＨおよびＶＬは、前記基質または細胞の非存在下では会合せず、かつ／または前記基質もしくは細胞の非存在下では、二量体化しない。たとえ、それらが、前記基質または細胞の非存在下で互いと会合し、かつ／または二量体化してもそれは、１０−８Ｍを上回る、好ましくは１０−６Ｍを上回る、より好ましくは１０−５Ｍを上回る、より好ましくは１０−４Ｍを上回るＫＤによるに過ぎない。別の態様では、たとえ、それらが、前記基質または細胞の非存在下で互いと会合し、かつ／または二量体化してもそれは、１０−８Ｍ〜１０−２Ｍ、好ましくは１０−７Ｍ〜１０−３Ｍ、より好ましくは１０−６Ｍ〜１０−３Ｍ、なおより好ましくは１０−５Ｍ〜１０−３Ｍの範囲のＫＤによるに過ぎない。別の態様では、ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２、ならびに／または、特に、その中に含まれる断片Ｆ１および断片Ｆ２、より特定すると、その中に含まれうるＶＨおよびＶＬは、前記基質または細胞の存在下では、会合し、かつ／または前記基質または細胞の存在下では、二量体化する。特に、それらは、前記基質または細胞の存在下では、１０−６Ｍを下回る、好ましくは１０−７Ｍを下回る、より好ましくは１０−８Ｍを下回る、より好ましくは１０−９Ｍを下回るＫＤで互いと会合し、かつ／または二量体化する。それらはまた、前記基質または細胞の存在下では、１０−１１Ｍ〜１０−６Ｍ、より好ましくは１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、なおより好ましくは１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍの範囲のＫＤで互いと会合することも可能であり、かつ／または二量体化することも可能である。
【００３３】
好ましい実施形態では、上記は、ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２、ならびに／または、特に、断片Ｆ１および断片Ｆ２の会合および／または二量体化を安定化させる薬剤が存在する場合でもなお当てはまる。例えば、本発明に従うこのような安定化剤は、例えば、本明細書で記載されるＣＤ３、ＨＩＳ、またはＤＩＧなどの抗原であって、例えば、抗体のＶＨおよびＶＬを含みうるドメインＦ（Ｆ１およびＦ２のそれぞれ、またはＦ２およびＦ３のそれぞれ）に結合することが可能な抗原でありうる。
【００３４】
本発明の文脈では、そして、特に、上記の文脈では（すなわち、前記薬剤ならびに／または前記基質もしくは細胞ならびに／または前記抗原Ａ１およびＡ２に関する文脈では）、「存在」することとは、特に、０．０１μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度、０．１〜５００μＭの範囲の濃度、０．１〜３００μＭの範囲の濃度、０．１〜１００μＭの範囲の濃度、１〜５００μＭの範囲の濃度、１０〜５００μＭの範囲の濃度で存在することを意味する。本発明の文脈では、そして、特に、上記の文脈では（すなわち、前記薬剤ならびに／または前記基質もしくは細胞ならびに／または前記抗原Ａ１およびＡ２に関する文脈では）、「非存在」であることとは、特に、上記の範囲を下回る濃度、または１ｍＭ、５００μＭ、３００μＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭ、０．００１μＭ、もしくは１ｎＭを下回る濃度で存在することを意味し、低値であるほど好ましい。
【００３５】
当業者は、特に、Ｐ１およびＰ２の二量体化、より特定すると、その中に含まれるＦ１およびＦ２の二量体化、より特定すると、その中に含まれうるＶＨおよびＶＬの二量体化のＫＤをたやすく測定することができる。それぞれの測定法の例は、ｘ線結晶構造解析；核磁気共鳴（ＮＭＲ）；等温熱量測定（ＩＴＣ）；クライオ電子顕微鏡法（ＣＥＭ）；質量分析（ＭＳ）；表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。このような方法は、例えば、Protein Surface Recognition: Approaches for Drug Discovery: Approaches for the Inhibition of Protein-Protein Interactions for Drug Discovery（Ernest Giralt、Mark Peczuh、Xavier Salvatella編、John Wiley & Sons；2010年11月12日）において記載されている。それぞれの測定法のさらなる例は、円偏光二色性解析；小帯域ゲル濾過クロマトグラフィー；蛍光ゲル遅延；沈降平衡；蛍光極性化アッセイ；ブロットオーバーレイ解析またはファーウェスタンブロット解析；アフィニティーキャピラリー電気泳動解析；蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）であり、このような方法は、例えば、Protein Interactions: Methods and Applications：261（Methods in Molecular Biology）；Haian Fu（編）；Humana Press；1（2004年3月23日）において記載されている。本発明に従う、ＫＤを測定する好ましい方法は、蛍光相関分光分析（ＦＣＳ）である。この方法は、例えば、Douglas Magde（Physical Review Letters 29、11、1972、S.705〜708ページ）において記載されている。
【００３６】
特定の一態様では、本明細書で言及されるＫＤは、４〜３８℃、好ましくは４〜２０℃（例えば、１０℃）、もしくは２０〜３８℃（例えば、３０℃）の温度、および／または４．５〜８のｐＨ（例えば、７のｐＨ）（ｉ）に適用されるＫＤであるか、（ｉｉ）これらにおけるＫＤであるか、または（ｉｉｉ）これらにおいて測定されるＫＤである。
【００３７】
本発明の文脈における「会合しない」とは、特に、ドメインＦの機能に関して、機能的に会合しないこと、すなわち、Ｆ１およびＦ２が機能的なＦを形成することを可能としないことを意味する。よって、本発明の一態様では、Ｐ１とＰ２とは、Ｆ１およびＦ２により機能ドメインＦが形成されない限りにおいて、互いと結合（例えば、共有結合的に）しうる。しかし、Ｐ１とＰ２とは、分離されていることが好ましい。
【００３８】
一実施形態では、前記抗原Ａ１および／または前記抗原Ａ２は、分子である。
【００３９】
一実施形態では、前記抗原Ａ１および／または前記抗原Ａ２は、タンパク質性である。
【００４０】
一実施形態では、前記抗原Ａ１および／または前記抗原Ａ２は、非タンパク質性である。
【００４１】
一実施形態では、前記標的化部分Ｔ１は、前記抗原Ａ１と非共有結合的に結合する。
【００４２】
一実施形態では、前記標的化部分Ｔ２は、前記抗原Ａ２と非共有結合的に結合する。
【００４３】
一実施形態では、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその表面において有する基質が、前記ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１の、前記ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２との二量体化を誘導するのに対し、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において有するわけではない基質は、前記ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１の、前記ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２との二量体化を誘導しない。
【００４４】
一実施形態では、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有する細胞が、前記ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１の、前記ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２との二量体化を誘導するのに対し、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有するわけではない細胞は、前記ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１の、前記ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２との二量体化を誘導しない。この文脈では、「二量体化を誘導する」とは、特に、「並置およびその後の二量体化を可能とする」を意味する。
【００４５】
一実施形態では、前記標的化部分Ｔ１は、免疫グロブリンモジュールを含み、かつ／または前記標的化部分Ｔ２は、免疫グロブリンモジュールを含む。
【００４６】
一実施形態では、前記標的化部分Ｔ１は、ＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインを含む、免疫グロブリンモジュールＩ１、好ましくは、抗体のｓｃＦｖ（単鎖変異体断片）、抗体のＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２（例えば、Ｆｃドメインの、例えば、追加の部分を伴う）、または完全抗体を含む、免疫グロブリンモジュールＩ１を含む。
【００４７】
および／または前記標的化部分Ｔ２は、ＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインを含む、免疫グロブリンモジュールＩ２、好ましくは、抗体のｓｃＦｖ（単鎖変異体断片）、抗体のＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２（例えば、Ｆｃドメインの、例えば、追加の部分を伴う）、または完全抗体を含む、免疫グロブリンモジュールＩ２を含む。
【００４８】
一実施形態では、前記標的化部分Ｔ１および／または前記標的化部分Ｔ２は、ラマ抗体、ラクダ抗体、またはサメ抗体の可変ドメインＶＨＨを含む、免疫グロブリンモジュールを含む。
【００４９】
一実施形態では、前記標的化部分Ｔ１および／または前記標的化部分Ｔ２は、それぞれ、前記抗原Ａ１または抗原Ａ２のアプタマーまたは天然リガンドである。
【００５０】
一実施形態では、前記標的化部分Ｔ１および／または前記標的化部分Ｔ２は、抗体のＦｖまたはｓｃＦｖ（（単鎖）変異体断片）を含む。
【００５１】
一実施形態では、標的化部分Ｔ１およびＴ２内に含まれる免疫グロブリンモジュールは、
（ｉ）配列番号７８および７９（ＣＤＲ１および３）ならびにＤＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号７５〜７７（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体のＶドメイン；
（ｉｉ）配列番号８３および８４（ＣＤＲ１および３）ならびにＤＤＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号８０〜８２（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＨＬＡ−Ｃｗ６抗体のＶドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号８８および８９（ＣＤＲ１および３）ならびにＷＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号８５〜８７（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶドメイン；
（ｉｖ）配列番号９３および９４（ＣＤＲ１および３）ならびにＳＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号９０〜９２（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗Ｈｅｒ２抗体のＶドメイン；
（ｖ）配列番号９８および９９（ＣＤＲ１および３）ならびにＤＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号９５〜９７（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＥＧＦＲ１抗体のＶドメイン；
（ｖｉ）配列番号１０３および１０４（ＣＤＲ１および３）ならびにＳＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号１００〜１０２（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＥＡ抗体のＶドメイン；
（ｖｉｉ）配列番号１０７および１０８（ＣＤＲ１および３）ならびにＬＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号１０５および１０６（ＣＤＲ１および２）ならびにＣＤＲ３もしくは配列番号１３２〜１３４（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ４５抗体のＶドメイン；
（ｖｉｉｉ）配列番号１１２および１１３（ＣＤＲ１および３）ならびにＹＴＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号１０９〜１１１（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ１３８抗体のＶドメイン；ならびに
（ｉｘ）配列番号１５８および１５９（ＣＤＲ１および３）ならびにＤＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号１５５〜１５７（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ１９抗体のＶドメイン
からなる群から選択されるＶドメインを含む。
【００５２】
さらに好ましい実施形態では、標的化部分Ｔ１および／またはＴ２内に含まれる免疫グロブリンモジュールは、
（ｉ）配列番号５２を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５１を含むＶＨドメインを含む、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体のＶドメイン；
（ｉｉ）配列番号５４を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５３を含むＶＨドメインを含む、抗ＨＬＡ−Ｃｗ６抗体のＶドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号５６を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５５を含むＶＨドメインを含む、抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶドメイン；
（ｉｖ）配列番号５８を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５７を含むＶＨドメインを含む、抗Ｈｅｒ２抗体のＶドメイン；
（ｖ）配列番号６０を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５９を含むＶＨドメインを含む、抗ＥＧＦＲ１抗体のＶドメイン；
（ｖｉ）配列番号６２を含むＶＬドメインおよび／または配列番号６１を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＥＡ抗体のＶドメイン；
（ｖｉｉ）配列番号６４を含むＶＬドメインおよび／または配列番号６３を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ４５抗体のＶドメイン；ならびに
（ｖｉｉｉ）配列番号６６を含むＶＬドメインおよび／または配列番号６５を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ１３８抗体のＶドメイン；
（ｉｘ）配列番号１５３を含むＶＬドメインおよび／または配列番号１５２を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ１９抗体のＶドメイン
からなる群から選択されるＶドメインを含む。
【００５３】
さらに好ましい実施形態では、標的化部分Ｔ１および／またはＴ２内に含まれる免疫グロブリンモジュールは、配列番号６７〜７４および１５４のうちのいずれか１つを含むＶドメインを含む。
【００５４】
一実施形態では、ポリペプチドＰ１は、一般構造Ｆ１−Ｔ１を有し、かつ／またはポリペプチドＰ２は、一般構造Ｆ２−Ｔ２を有する。Ｆ断片とＴ部分とは、リンカーで隔てる（例えば、Ｆ１−リンカー−Ｔ１および／またはＦ２−リンカー−Ｔ２）こともでき、かつ／または（１つまたは複数の）さらなるアミノ酸ストレッチ１および／もしくは２で挟む（ストレッチ−Ｆ１−（リンカー）−Ｔ１−ストレッチ２および／またはストレッチ１−Ｆ２−（リンカー）−Ｔ２−ストレッチ２）こともできる。上記の一般構造は、ポリペプチドのＮ末端〜Ｃ末端、すなわち、Ｎ−Ｆ１−Ｔ１−Ｃおよび／またはＮ−Ｆ２−Ｔ２−Ｃ、Ｎ−Ｆ１−リンカー−Ｔ１−Ｃおよび／またはＮ−Ｆ２−リンカー−Ｔ２−Ｃ、ならびにＮ−ストレッチ１−Ｆ１−（リンカー）−Ｔ１−ストレッチ２−Ｃおよび／またはＮ−ストレッチ１−Ｆ２−（リンカー）−Ｔ２−ストレッチ２−Ｃであることが好ましい。標的化部分が、ＦｖまたはｓｃＦｖなどの免疫グロブリンモジュールＩであるか、またはこれを含む場合、ポリペプチドＰ１は、一般構造Ｆ１−ＶＨ１−ＶＬ１を有することが可能であり、かつ／もしくはポリペプチドＰ２は、一般構造Ｆ２−ＶＨ２−ＶＬ２を有することが可能であるか、またはポリペプチドＰ１は、一般構造Ｆ１−ＶＬ１−ＶＨ１を有することが可能であり、かつ／もしくはポリペプチドＰ２は、一般構造Ｆ２−ＶＬ２−ＶＨ２を有することが可能である。これらの場合にはまた、Ｆ断片とＴ部分とは、リンカーで隔てる（例えば、Ｆ１−リンカー−ＶＨ／ＶＬ１−ＶＬ／ＶＨ１および／またはＦ２−リンカー−ＶＨ／ＶＬ２−ＶＬ／ＶＨ２）こともでき、かつ／または（１つまたは複数の）さらなるアミノ酸ストレッチ１および／もしくは２で挟む（ストレッチ１−Ｆ１−（リンカー）−ＶＨ／ＶＬ１−ＶＬ／ＶＨ１−ストレッチ２および／またはストレッチ１−Ｆ２−（リンカー）−ＶＨ／ＶＬ２−ＶＬ／ＶＨ２−ストレッチ２）こともできる。この場合にはまた、上記の一般構造は、ポリペプチドのＮ末端〜Ｃ末端、すなわち、Ｎ−Ｆ１−ＶＨ／ＶＬ１−ＶＬ／ＶＨ１−Ｃおよび／またはＮ−Ｆ２−ＶＨ／ＶＬ２−ＶＬ／ＶＨ２−Ｃ、Ｎ−Ｆ１−リンカー−ＶＨ／ＶＬ１−ＶＬ／ＶＨ１−Ｃおよび／またはＮ−Ｆ２−リンカー−ＶＨ／ＶＬ２−ＶＬ／ＶＨ２−Ｃ、ならびにＮ−ストレッチ１−Ｆ１−（リンカー）−ＶＨ／ＶＬ１−ＶＬ／ＶＨ１−ストレッチ２−Ｃおよび／またはＮ−ストレッチ１−Ｆ２−（リンカー）−ＶＨ／ＶＬ２−ＶＬ／ＶＨ２−ストレッチ２−Ｃであることも好ましい。リンカーはまた、ＶＨとＶＬとの間またはＶＬとＶＨとの間にも存在させることができる。
【００５５】
上記のリンカー、特に、Ｖドメインの間のリンカーは、１〜２５アミノ酸、好ましくは１２〜２０アミノ酸、好ましくは１２〜１６または１５〜２０アミノ酸を含みうる。上記のリンカーは、１つまたは複数の（Ｇ３Ｓ）モチーフおよび／または（Ｇ４Ｓ）モチーフ、特に、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの（Ｇ３Ｓ）モチーフおよび／または（Ｇ４Ｓ）モチーフ、好ましくは３つまたは４つの（Ｇ３Ｓ）モチーフおよび／または（Ｇ４Ｓ）モチーフ、より好ましくは３つまたは４つの（Ｇ４Ｓ）モチーフを含みうる。
【００５６】
一実施形態では、前記免疫グロブリンモジュールＩ１と前記断片Ｆ１とは、１〜１２アミノ酸、好ましくは３〜１２アミノ酸を含むリンカーにより隔てられており、かつ／または前記免疫グロブリンモジュールＩ２と前記断片Ｆ２とは、１〜１２アミノ酸、好ましくは３〜１２アミノ酸を含むリンカーにより隔てられている。
【００５７】
一実施形態では、Ｉ１のＶＬドメインは、１２〜２５アミノ酸を含むリンカー、好ましくは配列（Ｇ３Ｓ）３もしくは（Ｇ３Ｓ）４または（Ｇ４Ｓ）３もしくは（Ｇ４Ｓ）４を伴うリンカーにより、Ｉ１のＶＨドメインへと連結されており、かつ／またはＩ２のＶＬドメインは、１２〜２５アミノ酸を含むリンカー、好ましくは配列（Ｇ３Ｓ）３もしくは（Ｇ３Ｓ）４または（Ｇ４Ｓ）３もしくは（Ｇ４Ｓ）４を伴うリンカーにより、Ｉ２のＶＨドメインへと連結されている。
【００５８】
言及した通り、上記のリンカーは、（Ｇ３Ｓ）モチーフおよび／または（Ｇ４Ｓ）モチーフを含みうる。代替的なリンカーは、ＧＥＧＴＳＴＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＤモチーフからなるか、またはこれを含みうる。当業者は、さらなる苦労を伴わずに、当技術分野で知られているさらなる（ペプチド）リンカーを見出し、用いることができる。
【００５９】
前記さらなるアミノ酸ストレッチ１および／または２は、１〜２００、１〜１００、１〜７０、１〜６５、１〜５０、１〜２５、または１〜２０アミノ酸からなるか、またはこれを含みうる。
【００６０】
一実施形態では、前記抗原Ａ１および／または前記抗原Ａ２は、腫瘍細胞の表面上または腫瘍前駆細胞／腫瘍前駆体細胞の表面上で発現する抗原、好ましくは血液系腫瘍細胞の表面上で発現する抗原、より好ましくは急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、慢性リンパ性白血病細胞、リンパ腫細胞、骨髄増殖性症候群細胞、骨髄異形成細胞、より好ましくは骨髄腫細胞からなる群から選択される細胞の表面上で発現する抗原であるか、または前記抗原Ａ１および／または前記抗原Ａ２は、非血液系腫瘍細胞の表面上で発現する抗原、好ましくは腎細胞がん細胞、膀胱がん細胞、肺がん細胞、中皮腫細胞、前立腺がん細胞、脳がん細胞、骨がん細胞、肉腫細胞、軟組織がん細胞、卵巣がん細胞、子宮頸がん細胞、乳がん細胞、子宮内膜がん細胞、子宮がん細胞、胚細胞腫瘍細胞、肛門がん細胞、直腸がん細胞、結腸がん細胞、小腸がん細胞、胃がん細胞、消化管間質腫瘍細胞、肝がん細胞、膵臓がん細胞、胆管がん細胞、胆嚢がん細胞、頭頸部がん細胞、下咽頭がん細胞、喉頭がん細胞、食道がん細胞、皮膚がん細胞、好ましくは黒色腫細胞、小児がん細胞、内分泌腫瘍細胞、カルチノイド腫瘍細胞、胸腺腫細胞、甲状腺がん細胞、膵島細胞腫瘍細胞、副腎細胞腫瘍細胞、神経内分泌腫瘍細胞、および原発不明がん（原発不明のがん）の細胞からなる群から選択される細胞である。このようながんについての詳細な情報は、「Cancer Medicine」、JF Holland、E Frei（編）、Mcgraw-Hill Professional、8版（2010）およびこの文献中で引用されている参考文献など、関連文献において見出すことができる。
【００６１】
一実施形態では、抗原Ａ１と抗原Ａ２との組合せは、血液細胞または血液細胞の前駆体細胞上だけで、好ましくは１種類の血液細胞上だけで見出される。
【００６２】
一実施形態では、抗原Ａ１と抗原Ａ２との組合せは、標的、特に、がん性細胞上だけで見出され、標的細胞でない細胞上、特に、がん性でない細胞上では見出されない（または無視できる程度でだけ見出される）。好ましい実施形態では、抗原Ａ１と抗原Ａ２との組合せは、ある種のがんのがん性細胞に特異的である。
【００６３】
一実施形態では、抗原Ａ１と抗原Ａ２との組合せは、ある種の細胞、好ましくはある種のがん細胞を、他の任意の細胞から弁別する。
【００６４】
この文脈では、「ある種のがん」とは、がんが形成される器官と同じ器官を特徴とする種類のがん、または（異常な）抗原Ａ１とＡ２との対と同じ対を特徴とすることが好ましい種類のがんを意味しうる。
【００６５】
一実施形態では、抗原Ａ１と抗原Ａ２との組合せは、腫瘍前駆細胞／腫瘍前駆体細胞である前駆細胞／前駆体細胞上で見出され、腫瘍前駆細胞／腫瘍前駆体細胞でない前駆細胞／前駆体細胞上では見出されない。
【００６６】
一実施形態では、前記抗原Ａ１は、細胞の悪性状態に特異的な抗原であり、前記抗原Ａ２は、前記細胞の細胞型または細胞系統に特異的な抗原である。
【００６７】
一実施形態では、
ａ）抗原Ａ１は、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）であり、抗原Ａ２は、ＣＤ１０（表面抗原分類１０）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ヒト表皮成長因子受容体２）、ＶＥＧＦ−Ｒ（血管内皮成長因子受容体）、ＥＧＦＲ（表皮成長因子受容体；また、ＨＥＲ１（ヒト表皮成長因子受容体１）またはＥｒｂＢ１とも呼ばれる）、もしくはＭＤＲ（多剤耐性タンパク質）であるか、または
ｂ）抗原Ａ１は、ＭＣＳＰ（黒色腫に関連するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）であり、抗原Ａ２は、メラノフェリンもしくはＥｐＣＡＭであるか、または
ｃ）抗原Ａ１は、ＣＡ１２５（がん抗原１２５／炭水化物抗原１２５）であり、抗原Ａ２は、ＣＤ２２７（ＰＥＭ（多型性上皮ムチン）もしくはＭＵＣ１（ムチン−１））であるか、または
ｄ）抗原Ａ１は、ＣＤ５６であり、抗原Ａ２は、ＣＤ１４０ｂ（ＰＤＧＦＲβ（血小板由来成長因子受容体ベータ））もしくはＧＤ３ガングリオシドであるか、または
ｅ）抗原Ａ１は、ＥＧＦＲであり、抗原２は、ＨＥＲ２であるか、または
ｆ）抗原Ａ１は、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）であり、抗原２は、ＨＥＲ２であるか、または
ｇ）抗原１は、シアリルルイスであり、抗原２は、ＥＧＦＲであるか、または
ｈ）抗原１は、ＣＤ４４であり、抗原２は、ＥＳＡ（上皮表面抗原）（ＣＤ３２６、ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＭＤＲ（多剤耐性タンパク質）、もしくはＣＤ１１７であるか、または
ｉ）抗原１は、ＣＤ３４であり、抗原２は、ＣＤ１９、ＣＤ７９ａ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＨＬＡ−ＤＲ（ヒト白血球抗原ＤＲ）、ＣＤ１３、ＣＤ１１７、ＣＤ３３、もしくはＣＤ１５であるか、または
ｊ）抗原１は、ＣＤ３３であり、抗原２は、ＣＤ１９、ＣＤ７９ａ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＨＬＡ−ＤＲ（ヒト白血球抗原ＤＲ）、ＣＤ１３、ＣＤ１１７、もしくはＣＤ１５であるか、または
ｋ）抗原１は、ＭＵＣ１であり、抗原２は、ＣＤ１０、ＣＥＡ、もしくはＣＤ５７であるか、または
ｌ）抗原１は、ＣＤ３８であり、抗原２は、ＣＤ１３８であるか、または
ｍ）抗原１は、ＣＤ２４であり、抗原２は、ＣＤ２９もしくはＣＤ４９ｆであるか、または
ｎ）抗原１は、炭酸脱水素酵素ＩＸであり、抗原２は、アクアポリン、好ましくはアクアポリン２である。
【００６８】
一実施形態では、前記抗原Ａ１および／または前記抗原Ａ２は、ＨＬＡ−Ａ（ＨＬＡ−Ａ：主要組織適合性複合体クラスＩＡ［ヒト（Homo sapiens）］；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３１０５、２０１３年１月１３日更新；ＤＡＱＢ−９０Ｃ１１．１６−００２；第６染色体；ＮＣ＿０００００６．１１（２９９１０２４７〜２９９１３６６１）；ＨＬＡ−Ａ２について：１．ｍＲＮＡ＝ＬＯＣＵＳ：ＮＭ＿００１２４２７５８＝バージョンＮＭ＿００１２４２７５８．１、ＧＩ：３３７７５２１６９＝ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ１９１３０９．１  ＰＲＩ  １３−ＪＡＮ−２０１３；２．タンパク質＝Ｐ７９４９５［ＵｎｉＰａｒｃ］、最終改定日：１９９７年５月１日、バージョン１；ＨＬＡ−Ｃｗ６について：ｍＲＮＡ＝ＬＯＣＵＳ  ＨＵＭＭＨＣＣＷ６Ａ＝ＧｅｎＢａｎｋ：ＶＥＲＳＩＯＮ：Ｍ２８１６０．１、ＧＩ：５３１１９７ＰＲＩ（１８−ＡＵＧ−１９９４）；タンパク質＝Ｑ２９９６３［ＵｎｉＰａｒｃ］、最終改定日：２００３年８月２２日、バージョン２）；ＥｐＣＡＭ（ＥＰＣＡＭ：上皮細胞接着分子［ヒト（Homo sapiens）］；また、ＥＳＡ；ＫＳＡ；Ｍ４Ｓ１；ＭＫ−１；ＤＩＡＲ５；ＥＧＰ−２；ＥＧＰ４０；ＫＳ１／４；ＭＩＣ１８；ＴＲＯＰ１；ＥＧＰ３１４；ＨＮＰＣＣ８；ＴＡＣＳＴＤ１としても知られている；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４０７２、２０１３年１月６日更新；ｍＲＮＡ＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００２３５４．２、ＧＩ：２１８５０５６６９ＰＲＩ  ０６−ＪＡＮ−２０１３；タンパク質＝Ｐ１６４２２［ＵｎｉＰａｒｃ］、最終改定日：２００７年１１月１３日、バージョン２）；ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ：タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型Ｃ［ヒト（Homo sapiens）］；また、ＬＣＡ；ＬＹ５；Ｂ２２０；ＣＤ４５；Ｌ−ＣＡ；Ｔ２００；ＣＤ４５Ｒ；ＧＰ１８０としても知られている；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５７８８、２０１３年１月１３日更新；ｍＲＮＡ＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００２８３８．４、ＧＩ：３９２３０７００６  ＰＲＩ  １３−ＪＡＮ−２０１３；タンパク質＝Ｐ０８５７５−１＝アイソフォーム１、最終改定日：２００３年７月１９日、バージョン２；タンパク質＝Ｐ０８５７５−２＝アイソフォーム２）；Ｈｅｒ２（ＥＲＢＢ２：ｖ−ｅｒｂ−ｂ２：赤芽球性白血病ウイルス性がん遺伝子相同体２、神経／膠芽腫由来がん遺伝子相同体（トリ）［ヒト（Homo sapiens）］；また、ＮＥＵ；ＮＧＬ；ＨＥＲ２；ＴＫＲ１；ＣＤ３４０；ＨＥＲ−２；ＭＬＮ  １９；ＨＥＲ−２／ｎｅｕとしても知られている；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２０６４、２０１３年１月１３日更新；ｍＲＮＡ転写物変異体１＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００４４４８．２、ＧＩ：５４７９２０９５、ＰＲＩ  ０６−ＪＡＮ−２０１３；ｍＲＮＡ転写物変異体２＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００１００５８６２．１、ＧＩ：５４７９２０９７、ＰＲＩ  ０６−ＪＡＮ−２０１３；タンパク質＝Ｐ０４６２６−１＝アイソフォーム１、最終改定日：１９８７年８月１３日、バージョン１；タンパク質＝Ｐ０４６２６−２＝アイソフォーム２；タンパク質＝Ｐ０４６２６−３＝アイソフォーム３；タンパク質＝Ｐ０４６２６−４＝アイソフォーム４）；ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ：表皮成長因子受容体［ヒト（Homo sapiens）］；また、ＥＲＢＢ���ＨＥＲ１；ｍＥＮＡ；ＥＲＢＢ１；ＰＩＧ６１としても知られている；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１９５６、２０１３年１月１３日更新；ｍＲＮＡ転写物変異体１＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００５２２８．３、ＧＩ：４１３２７７３７、ＰＲＩ  １３−ＪＡＮ−２０１３；ｍＲＮＡ転写物変異体２＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿２０１２８２．１、ＧＩ：４１３２７７３１、ＰＲＩ  １３−ＪＡＮ−２０１３；ｍＲＮＡ転写物変異体３＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿２０１２８３．１、ＧＩ：４１３２７７３３、ＰＲＩ  １３−ＪＡＮ−２０１３；ｍＲＮＡ転写物変異体４＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿２０１２８４．１、ＧＩ：４１３２７７３５、ＰＲＩ  １３−ＪＡＮ−２０１３；タンパク質＝Ｐ００５３３−１＝アイソフォーム１、最終改定日：１９９７年１１月１日、バージョン２；タンパク質＝Ｐ００５３３−２＝アイソフォーム２；タンパク質＝Ｐ００５３３−３＝アイソフォーム３；タンパク質＝Ｐ００５３３−４＝アイソフォーム４）；ＣＤ１３８（ＳＤＣ１：シンデカン１［ヒト（Homo sapiens）］；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６３８２、２０１３年１月６日更新；ｍＲＮＡ転写物変異体１＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００１００６９４６．１、ＧＩ：５５７４９４７９、ＰＲＩ  ０６−ＪＡＮ−２０１３；ｍＲＮＡ転写物変異体２＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００２９９７．４、ＧＩ：５５９２５６５７、ＰＲＩ  ０６−ＪＡＮ−２０１３；タンパク質＝Ｐ１８８２７［ＵｎｉＰａｒｃ］、最終改定日：２００９年５月５日、バージョン３）；ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５：がん胎児抗原関連細胞接着分子５［ヒト（Homo sapiens）］；また、ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅとしても知られている；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１０４８、２０１３年１月１３日更新；ｍＲＮＡ＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００４３６３．２、ＧＩ：９８９８６４４４、ＰＲＩ  １３−ＪＡＮ−２０１３；Ｐ０６７３１、最終改定日：２０１１年１月１１日、バージョン３）；およびＣＤ１９（ＣＤ１９ＣＤ１９分子［ヒト（Homo sapiens）］；また、Ｂ４；ＣＶＩＤ３としても知られている；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９３０、２０１３年１月５日更新；ｍＲＮＡ転写物１＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００１１７８０９８．１、ＧＩ：２９６０１０９２０、ＰＲＩ  ０６−ＪＡＮ−２０１３；ｍＲＮＡ転写物２＝ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００１７７０．５、ＧＩ：２９６０１０９１９、ＰＲＩ  ０６−ＪＡＮ−２０１３；タンパク質＝Ｐ１５３９１［ＵｎｉＰａｒｃ］、最終改定日：２００７年１１月１３日、バージョン６）からなる群から選択される。
【００６９】
一実施形態では、前記抗原Ａ１および／または前記抗原Ａ２は、ＭＨＣ抗原、好ましくはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、またはＨＬＡ−ＤＭのうちのいずれかの対立遺伝子変異体、より好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の対立遺伝子変異体、より好ましくはＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ４、ＨＬＡ−Ｃｗ６、およびＨＬＡ−Ｃｗ７からなる群から選択される対立遺伝子変異体である。
【００７０】
一実施形態では、前記抗原Ａ１は、ＨＬＡ−Ａ２である。
【００７１】
一実施形態では、前記抗原Ａ１および／または前記抗原Ａ２は、ＣＤ４５、アクアポリン、好ましくはアクアポリン２、スカベンジャー受容体クラスＢメンバー１（ＳＣＡＲＢ１）、ＣＤ３４、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１４６、シナプトフィジン、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的キナーゼ（ＭＵＳＫ）、電位依存性カルシウムチャネル（Ｐ／Ｑ型）、電位依存性カリウムチャネル（ＶＧＫＣ）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ）、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）受容体、アンフィフィシン、ＨｅｐＰａｒ−１、ガングリオシドＧＱ１Ｂ、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ１およびグリコホリンＡからなる群から選択される。
【００７２】
好ましい実施形態では、前記抗原Ａ１は、ＭＨＣ抗原であり、前記抗原Ａ２は、ある種の細胞型または細胞系統に特異的な抗原である。
【００７３】
一実施形態では、前記機能ドメインＦは、免疫グロブリンモジュール、好ましくは抗体のｓｃＦｖ（単鎖変異体断片）、より好ましくは抗体のＦｖ（変異体断片）、または蛍光分子、好ましくは二分子蛍光相補分子、より好ましくはＧＦＰもしくはＧＦＰ変異体、または生物発光を媒介することが可能な分子、好ましくはルシフェラーゼ分子、より好ましくはＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼである。
【００７４】
一実施形態では、前記機能ドメインＦは、抗体のＦｖ（変異体断片）である。
【００７５】
一実施形態では、前記機能ドメインＦは、抗原に特異的に結合するか、またはこれに特異的に結合することが可能である。具体的な態様では、前記抗原は、ヒト免疫系の細胞上に存在する抗原でありうる。好ましい実施形態では、前記結合は、前記ヒト免疫系の細胞を活性化させる。
【００７６】
一実施形態では、前記機能ドメインＦは、Ｔ細胞動員ドメイン、好ましくはＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｔ細胞受容体、またはＣＤ２８に特異的に結合するＴ細胞動員ドメイン、より好ましくはＣＤ３εに特異的に結合するＴ細胞動員ドメイン、ＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）動員ドメイン、好ましくはＣＤ１ａ、ＣＤ１６ａ、またはＣＤ５６に特異的に結合するＮＫ細胞動員ドメイン、マクロファージ細胞動員ドメイン、好ましくはＣＤ１６ａ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ８９、またはＣＤ６４に特異的に結合するマクロファージ細胞動員ドメイン、単球動員ドメイン、好ましくはＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４、またはＣＤ８９に特異的に結合する単球動員ドメイン、顆粒球動員ドメイン、好ましくはＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４、またはＣＤ８９に特異的に結合する顆粒球動員ドメイン、好中性顆粒球動員ドメイン、好ましくはＣＤ８９（ＦｃαＲＩ）に特異的に結合する好中性顆粒球動員ドメイン、または活性化好中性顆粒球、単球、および／もしくはマクロファージ動員ドメイン、好ましくはＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）に特異的に結合する活性化好中性顆粒球、単球、および／もしくはマクロファージ動員ドメインである。
【００７７】
一実施形態では、前記機能ドメインＦは、診断用化合物または治療用化合物へと連結された抗原に特異的に結合するドメインである。
【００７８】
一実施形態では、前記機能ドメインＦは、担体分子またはアフィニティータグに特異的に結合するドメインである。前記担体分子は、診断用化合物または治療用化合物へと連結することが好ましい。前記アフィニティータグは、診断用化合物または治療用化合物へと連結することが好ましい。
【００７９】
前記アフィニティータグは、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）タグ、およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグからなる群から選択されることが好ましい。
【００８０】
前記担体分子は、ペプチドまたは炭水化物分子であることが好ましい。好ましい実施形態では、前記機能ドメインＦは、担体分子、好ましくは診断用化合物または治療用化合物へと連結された担体分子に特異的に結合するドメインであり、前記担体分子は、ゼラチン、イヌリン、デキストラン、およびヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される。
【００８１】
一実施形態では、前記治療用化合物は、放射性化合物、好ましくは９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１３１Ｉ、３２Ｐ、１０Ｂ、または２１３Ｂｉを含む放射性化合物である。一実施形態では、前記治療用化合物は、毒素である。前記毒素は、炭疽菌（B. anthracis）浮腫因子、炭疽菌（B. anthracis）致死因子、ウェルシュ菌（C. perfringens）イオタ毒素、ボツリヌス菌（C. botulinum）Ｃ２毒素、Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ、ジフテリア菌（C. diphtheriae）ジフテリア毒素の断片Ａ、ブルクホルデリア（Burkolderia）属種の志賀毒素（サブユニットＡ）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）１３株ｐｆｏＡ毒素のペルフリンゴリシンＯ、リシンＡ鎖、植物ＲＩＰであるブーガニン、ヒトＲＮアーゼ３リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＡファミリー３）、および炭疽菌致死因子のエンドペプチダーゼからなる群から選択されることが好ましい。本発明に従う毒素のさらなる非限定的な例は、配列番号１６０〜１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列であるかまたはこれらを含む毒素である。
【００８２】
一実施形態では、前記診断用化合物は、放射性化合物、好ましくは９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、８２Ｒｂ、または２０１Ｔｌを含む放射性化合物である。一実施形態では、前記診断用化合物は、蛍光化合物、好ましくはＧＦＰ、ＧＦＰ変異体、またはＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレセイン）、ＰＥ（フィコエリトリン）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８または関連の色素など）、またはシアニン色素（Ｃｙ３（インドカルボシアニン）もしくはＣｙ５（インドジカルボシアニン）または関連の色素など）などの蛍光低分子化合物であり、一実施形態では、前記診断用化合物は、生物発光を媒介することが可能な分子、好ましくはルシフェラーゼ分子、より好ましくはＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼである。
【００８３】
一実施形態では、前記断片Ｆ１は、抗体のＶＬドメインを含み、前記断片Ｆ２は、同じ抗体のＶＨドメインを含み、好ましくは、前記抗体は、抗ＣＤ３抗体、より好ましくは抗ＣＤ３ε抗体もしくは抗Ｈｉｓ抗体もしくは抗ＤＩＧ抗体であるか、または前記断片Ｆ１は、抗体のＶＨドメインを含み、前記断片Ｆ２は、同じ抗体のＶＬドメインを含む、好ましくは、前記抗体は、抗ＣＤ３抗体、より好ましくは抗ＣＤ３ε抗体もしくは抗Ｈｉｓ抗体もしくは抗ＤＩＧ抗体である。
【００８４】
別の実施形態では、それぞれがＦ１およびＦ２断片内に含まれるか、またはそれぞれがＦ２およびＦ１断片内に含まれるＶＬドメインおよびＶＨドメインはまた、同じ抗原に特異的（そして同じエピトープまたは異なるエピトープに特異的）であるか、または異なる抗原に特異的な、２つの異なる抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインでもありうる。これは、例えば、新たな特異性を創出する（例えば、ファージディスプレイ法により）場合に使用されることが想定される。
【００８５】
別の実施形態では、Ｆドメイン内に含まれる免疫グロブリンモジュールは、
（ｉ）配列番号１８〜２０（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号１５〜１７（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｉ）配列番号２４〜２６（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号２１〜２３（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号３０〜３２（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号２７〜２９（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｖ）配列番号３６および３７（ＣＤＲ１および３）ならびにＤＴＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号３３〜３５（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｖ）配列番号４１および４２（ＣＤＲ１および３）ならびにＹＴＮ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号３８〜４０（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；ならびに
（ｖｉ）配列番号４６および４７（ＣＤＲ１および３）ならびにＫＶＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号４３〜４５（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗Ｈｉｓ抗体のＶドメイン；
（ｖｉｉ）配列番号５０および１３１（ＣＤＲ１および３）ならびにＹＳＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号４８および４９（ＣＤＲ１および２）ならびにＡ（ＣＤＲ３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＤＩＧ抗体のＶドメイン
からなる群から選択されるＶドメインを含む。
【００８６】
別の好ましい実施形態では、Ｆドメイン内に含まれる免疫グロブリンモジュールは、
（ｉ）配列番号２を含むＶＬドメインおよび／または配列番号１を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｉ）配列番号４を含むＶＬドメインおよび／または配列番号３を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号６を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｖ）配列番号８を含むＶＬドメインおよび／または配列番号７を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｖ）配列番号１０を含むＶＬドメインおよび／または配列番号９を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；ならびに
（ｖｉ）配列番号１２を含むＶＬドメインおよび／または配列番号１１を含むＶＨドメインを含む、抗Ｈｉｓ抗体のＶドメイン；
（ｖｉｉ）配列番号１４を含むＶＬドメインおよび／または配列番号３０を含むＶＨドメインを含む、抗ＤＩＧ抗体のＶドメイン
からなる群から選択されるＶドメインを含む。
【００８７】
一実施形態では、前記機能ドメインＦは、毒素分子、好ましくはそれ自体ではヒト細胞の細胞膜を透過することが可能ではなく、好ましくは、前記細胞の細胞膜と会合するとヒト細胞へと内部移行する毒素分子であって、好ましくは、前記細胞の細胞膜との前記会合が、２つの分子、好ましくは前記細胞膜と会合する２つの分子から形成されるヘテロ二量体に特異的に結合することにより媒介され、好ましくは、前記２つの分子が、本明細書で記載されるポリペプチドＰ１およびＰ２である毒素分子に特異的に結合するドメインである。一実施形態では、前記機能ドメインＦは、細菌性２成分Ａ−Ｂ毒素のＡ成分（活性成分）に特異的に結合するドメインである。一実施形態では、前記機能ドメインＦは、炭疽菌（B. anthracis）浮腫因子、炭疽菌（B. anthracis）致死因子、ウェルシュ菌（C. perfringens）イオタ毒素、ボツリヌス菌（C. botulinum）Ｃ２毒素、Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ、ジフテリア菌（C. diphtheriae）ジフテリア毒素の断片Ａ、ブルクホルデリア（Burkolderia）属種の志賀毒素（サブユニットＡ）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）１３株ｐｆｏＡ毒素のペルフリンゴリシンＯ、リシンＡ鎖、植物ＲＩＰであるブーガニン、ヒトＲＮアーゼ３リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＡファミリー３）、および炭疽菌致死因子のエンドペプチダーゼからなる群から選択される毒素に特異的に結合するドメインである。本発明に従う毒素のさらなる非限定的な例は、配列番号１６０〜１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列であるかまたはこれらを含む毒素である。
【００８８】
一実施形態では、前記機能ドメインＦは、蛍光分子、好ましくはそれ自体ではヒト細胞の細胞膜を透過することが可能ではない蛍光分子に特異的に結合するドメインである。前記蛍光分子は、ＧＦＰもしくはＧＦＰ変異体、またはＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレセイン）、ＰＥ（フィコエリトリン）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８または関連の色素など）、またはシアニン色素（Ｃｙ３（インドカルボシアニン）もしくはＣｙ５（インドジカルボシアニン）または関連の色素など）などの蛍光低分子化合物であるか、またはこれを含む分子であることが好ましい。
【００８９】
一実施形態では、前記機能ドメインＦは、生物発光を媒介することが可能な分子、好ましくはルシフェラーゼ分子、より好ましくはＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼに特異的に結合するドメインである。
【００９０】
一実施形態では、前記機能ドメインＦは、蛍光分子、好ましくは二分子蛍光相補分子、より好ましくはＧＦＰ、またはＹＦＰ、ＣＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、もしくはＣｅｒｕｌｅａｎなどのＧＦＰ変異体である。
【００９１】
本発明に従うポリペプチドセット内に含まれる特定のポリペプチドＰ１またはＰ２の例は、配列番号１１４〜１２９および１９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００９２】
一般に、本発明は、任意の所望されない細胞集団の処置または消失およびこの所望されない細胞集団に随伴する任意の障害または疾患の処置または防止に関する。この目的で、本発明のポリペプチドセットは用いられる。
【００９３】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットは、腫瘍もしくはがんを患っている患者の処置における使用のため、または腫瘍もしくはがんを患っている患者における診断的使用のためのポリペプチドセット、好ましくは腫瘍もしくはがんを患っており、同種組織移植もしくは同種細胞移植を受けているか、またはこのような移植を受けることを意図する患者の処置における使用のため、あるいは腫瘍もしくはがんを患っており、同種組織移植もしくは同種細胞移植を受けているか、またはこれを受けることを意図する患者における診断的使用のためのポリペプチドセットであって、好ましくは、前記患者へと投与されるポリペプチドセットである。
【００９４】
処置または診断される腫瘍の例は、それらの腫瘍細胞またはがん細胞について、抗原Ａ１および／またはＡ２に関する本明細書の上記の腫瘍である。
【００９５】
一実施形態では、前記処置は、場合によって、同じ細胞型のドナーの組織／細胞または同じ細胞型をもたらすドナーの前駆体細胞のレシピエントへの移植の後において、またはこれと並行して、ある種の細胞型、好ましくはがん性細胞型のレシピエントの組織／細胞、またはある種の細胞型、好ましくはがん性細胞型をもたらすレシピエントの前駆体細胞の消失を伴う。
【００９６】
一実施形態では、本発明のポリペプチドセットは、造血系新生物に対する、例えば、ＨＬＡ抗原が不適合の同種移植状況における使用のためのポリペプチドセット、特に、この不適合状況の治療的利用における使用のためのポリペプチドセットである。この例示的な状況では、レシピエントのＨＬＡハプロタイプ（ＨＬＡｐａｔｉｅｎｔ）由来および造血系統（ＣＤ４５）由来の二重の情報は、もっぱら、患者の白血病性芽球上および他の造血細胞上で提示される。レシピエント由来の他の全ての細胞は、レシピエントのハプロタイプは発現させるが、造血系統抗原ＣＤ４５は発現させない（例えば、レシピエントの非造血細胞は、ＨＬＡ−Ａ２については陽性であるが、ＣＤ４５については陰性である）。同様に、全てのドナーの造血細胞は、ドナーのＨＬＡハプロタイプ分子を発現させ、これは、患者はＨＬＡ−Ａ２について陽性であるが、ドナーはＨＬＡ−Ａ２について陽性でない不適合移植の状況では、ドナーの造血細胞が、ＣＤ４５陽性ではあるが、ＨＬＡ−Ａ２陰性であることを意味する。結果として、本発明はまた、患者はＨＬＡ−Ａ２について陽性であるが、ドナーはＨＬＡ−Ａ２について陽性でない場合において、ＨＬＡ−Ａ２を指向する二分子相補単鎖抗体構築物と、造血系統マーカーであるＣＤ４５に特異的であり、全ての血液系新生物を含めた、患者の全ての造血細胞を特異的に標的化する第２の構築物とに関する。よって、第１のポリペプチドＰ１は、Ｆ１抗ＣＤ３のＶＬ断片（例えば、断片Ｆ１）へと融合させた、患者のＨＬＡを指向する単鎖可変断片抗体構築物（標的化部分Ｔ１）を含みうる。第２のポリペプチドＰ２は、Ｆ２抗ＣＤ３−ＦｖのＶＨスプリット断片（断片Ｆ２）へと融合させた、造血系統マーカーに特異的な単鎖可変断片構築物（例えば、ＣＤ４５；標的化部分Ｔ２）を含みうる。
【００９７】
一実施形態では、前記消失は、免疫系の細胞、毒素、または放射性化合物による、前記レシピエントの組織／細胞または前記レシピエントの前駆体細胞の破壊を伴う。
【００９８】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットは、同種組織移植または同種細胞移植を受けている患者における診断的使用のためのポリペプチドセットであり、前記患者は、腫瘍を患う患者であることが好ましい。
【００９９】
一実施形態では、前記診断的使用は、レシピエントの異なる細胞型または細胞系統の細胞、およびドナーの同じまたは異なる種類または細胞系統の細胞の間における、レシピエントのある種の細胞型の細胞または細胞系統の特異的検出を伴う。
【０１００】
一実施形態では、前記診断的使用は、悪性でないレシピエント細胞、およびドナー細胞の間における、悪性細胞であるレシピエント細胞の特異的検出を伴う。一実施形態では、前記ポリペプチドセットを、患者へと投与する。
【０１０１】
前記患者は、哺乳動物、より好ましくはヒトであることが好ましい。
【０１０２】
一実施形態では、前記投与を、ボーラス投与または連続投与により行う。
【０１０３】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットのポリペプチドＰ１およびＰ２を並行して投与する。別の実施形態では、前記ポリペプチドセットのポリペプチドＰ１およびＰ２を逐次的に投与する。
【０１０４】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットのポリペプチドＰ１またはＰ２のうちの一方を、ボーラス投与により投与するのに対し、他の一方は、連続投与により投与する。
【０１０５】
一実施形態では、投与されるポリペプチドの量は、ポリペプチドＰ１もしくはポリペプチドＰ２またはポリペプチドＰ１およびＰ２の各々について、１日当たり０．５μｇ／ｍ２〜１日当たり５００μｇ／ｍ２の範囲、好ましくはポリペプチドＰ１もしくはポリペプチドＰ２またはポリペプチドＰ１およびＰ２の各々について、１日当たり５μｇ／ｍ２〜１日当たり２００μｇ／ｍ２の範囲、より好ましくはポリペプチドＰ１もしくはポリペプチドＰ２またはポリペプチドＰ１およびＰ２の各々について、１日当たり１０μｇ／ｍ２〜１日当たり８０μｇ／ｍ２の範囲にある。
【０１０６】
一実施形態では、投与されるポリペプチドの量は、ポリペプチドＰ１もしくはポリペプチドＰ２またはポリペプチドＰ１およびＰ２の各々について、１日当たり０．０５μｇ／ｍ２〜１日当たり０．５μｇ／ｍ２の範囲にある。
【０１０７】
一実施形態では、投与されるポリペプチドＰ１の量は、投与されるポリペプチドＰ２の量と異なる。
【０１０８】
一実施形態では、投与されるポリペプチドの量は、ポリペプチドＰ１もしくはポリペプチドＰ２またはポリペプチドＰ１およびＰ２の各々について、１日当たり０．５μｇ／ｍ２〜１日当たり５０μｇ／ｍ２の範囲にある。一実施形態では、投与されるポリペプチドの量は、ポリペプチドＰ１もしくはポリペプチドＰ２またはポリペプチドＰ１およびＰ２の各々について、１日当たり５０μｇ／ｍ２〜１日当たり１００μｇ／ｍ２の範囲にある。一実施形態では、投与されるポリペプチドの量は、ポリペプチドＰ１もしくはポリペプチドＰ２またはポリペプチドＰ１およびＰ２の各々について、１日当たり１００μｇ／ｍ２〜１日当たり２００μｇ／ｍ２の範囲にある。一実施形態では、投与されるポリペプチドの量は、ポリペプチドＰ１もしくはポリペプチドＰ２またはポリペプチドＰ１およびＰ２の各々について、１日当たり２００μｇ／ｍ２〜１日当たり３００μｇ／ｍ２の範囲にある。一実施形態では、投与されるポリペプチドの量は、ポリペプチドＰ１もしくはポリペプチドＰ２またはポリペプチドＰ１およびＰ２の各々について、１日当たり３００μｇ／ｍ２〜１日当たり４００μｇ／ｍ２の範囲にある。一実施形態では、投与されるポリペプチドの量は、ポリペプチドＰ１もしくはポリペプチドＰ２またはポリペプチドＰ１およびＰ２の各々について、１日当たり４００μｇ／ｍ２〜１日当たり５００μｇ／ｍ２の範囲にある。一実施形態では、投与されるポリペプチドの量は、ポリペプチドＰ１もしくはポリペプチドＰ２またはポリペプチドＰ１およびＰ２の各々について、１日当たり５００μｇ／ｍ２〜１日当たり１ｍｇ／ｍ２の範囲にある。
【０１０９】
投与されるポリペプチドＰ１およびＰ２の量を導出するためのさらなる基準点はまた、二特異性抗体構築物により実行される研究（例えば、Bargou Rら、Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody. Science. 2008；321(5891):974〜7；およびTopp MSら、Targeted therapy with the T-cell-engaging antibody blinatumomab of chemotherapy-refractory minimal residual disease in B-lineage acute lymphoblastic leukemia patients results in high response rate and prolonged leukemia-free survival. J Clin Oncol. 2011、29:2493〜8）を照会することによっても得ることができる。
【０１１０】
一実施形態では、前記投与は、少なくとも１２時間にわたるか、または少なくとも１日間にわたるか、または少なくとも２日間にわたるか、または少なくとも３日間にわたるか、または少なくとも４日間にわたるか、または少なくとも５日間にわたるか、または少なくとも６日間にわたるか、または少なくとも７日間にわたるか、または少なくとも８日間にわたるか、または少なくとも９日間にわたるか、または少なくとも１０日間にわたるか、または少なくとも１１日間にわたるか、または少なくとも１２日間にわたるか、または少なくとも１３日間にわたるか、または少なくとも１４日間にわたるか、または少なくとも１５日間にわたるか、または少なくとも１６日間にわたるか、または少なくとも１７日間にわたるか、または少なくとも１８日間にわたるか、または少なくとも１９日間にわたるか、または少なくとも２０日間にわたるか、または少なくとも２１日間にわたるか、または少なくとも２２日間にわたるか、または少なくとも２３日間にわたるか、または少なくとも２４日間にわたるか、または少なくとも２５日間にわたるか、または少なくとも２６日間にわたるか、または少なくとも２７日間にわたるか、または少なくとも２８日間にわたるか、または少なくとも２９日間にわたるか、または少なくとも３０日間にわたるか、または少なくとも５週間にわたるか、または少なくとも６週間にわたり連続的に行う。
【０１１１】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットまたは前記ポリペプチドセットのポリペプチドのうちの１つの前記投与を、静脈内で、好ましくは静脈内注射により行う。
【０１１２】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットまたは前記ポリペプチドセットのポリペプチドのうちの１つの前記投与を、皮下で、好ましくは皮下注射により行う。
【０１１３】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットを、免疫調節薬および／またはステロイド、好ましくはプレドニゾロンもしくはプレドニゾンからなる群から選択される１つまたは複数の薬物と組み合わせて投与する。
【０１１４】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットを、放射性化合物、好ましくは抗原、担体分子、またはアフィニティータグへと連結された放射性化合物と組み合わせて投与し、この場合、前記放射性化合物、前記抗原、前記担体分子、または前記アフィニティータグには、前記機能ドメインＦが特異的に結合する。
【０１１５】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットを、毒素、好ましくは抗原、担体分子、またはアフィニティータグへと連結された毒素と組み合わせて投与し、この場合、前記毒素、前記抗原、前記担体分子、または前記アフィニティータグには、前記機能ドメインＦが特異的に結合する。
【０１１６】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットを、蛍光分子、好ましくは抗原、担体分子、またはアフィニティータグへと連結された蛍光分子と組み合わせて投与し、この場合、前記フルオロフォア、前記抗原、前記担体分子、または前記アフィニティータグには、前記機能ドメインＦが特異的に結合する。
【０１１７】
一実施形態では、前記機能ドメインＦは、前記ポリペプチドセットが投与される前記患者の免疫系により外来として認識されない抗原に特異的に結合するドメインである。
【０１１８】
一実施形態では、上記の２つのポリペプチドセット（第１のポリペプチドセットおよび第２のポリペプチドセット）を、同時に、または逐次的に投与する。好ましい一実施形態では、前記第１のポリペプチドセットは、前記第２のポリペプチドセットとは異なる断片Ｆ１およびＦ２を有する。好ましい一実施形態では、前記第１のポリペプチドセットは、前記第２のポリペプチドセットと同じ断片Ｆ１およびＦ２を有する。好ましい一実施形態では、前記第１のポリペプチドセットの標的化部分Ｔ１およびＴ２は、前記第２のポリペプチドセットの標的化部分Ｔ１およびＴ２のそれぞれと同じ抗原に結合する。好ましい一実施形態では、前記第１のポリペプチドセットの標的化部分Ｔ１およびＴ２は、前記第２のポリペプチドセットの標的化部分Ｔ１およびＴ２と異なる抗原に結合する。
【０１１９】
一実施形態では、前記患者は、前記ポリペプチドセットによる処置の前に、好ましくは化学療法、放射線療法、または手術による腫瘍の除去であるがん処置を受けているか、または前記ポリペプチドセットによる処置と並行して、好ましくは化学療法、放射線療法、または手術による腫瘍の除去であるがん処置を受ける。
【０１２０】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットまたは前記ポリペプチドセットのポリペプチドのうちの１つは、原核生物または真核生物の発現系により産生されているか、または新規のペプチド合成により作製される。
【０１２１】
一実施形態では、前記ポリペプチドセットまたは前記ポリペプチドセットのポリペプチドのうちの１つは、前記患者へと導入される核酸からのタンパク質発現により、前記患者内で創成される。
【０１２２】
アレルギー疾患または自己免疫疾患を患う患者は多い。これらの場合のうちの多くにおいて、Ｂ細胞のクローン集団は、患者の組織またはアレルゲンとの複合体が発現させる抗原と反応する、逸脱した抗体を産生し、アナフィラキシー反応を引き起こす。いずれの場合でも、逸脱したＢ細胞クローンを特異的に消失させることが望ましい。
【０１２３】
この目的のために、コンビナトリアル系を、一方のアーム（Ｐ１またはＰ２、特に、Ｔ１またはＴ２）が、Ｂ細胞関連抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、またはＣＤ１３８）を認識し、他方のアーム（それぞれ、Ｐ２またはＰ１、特に、Ｔ２またはＴ１）が、自己免疫疾患を引き起こす抗体が結合するアレルゲンまたは基質となるように改変することができる。これらの２つの構築物が、ＣＤ１９（ＣＤ２０、ＣＤ３８、またはＣＤ１３８）陽性であり、表面上でクロノタイプ抗体を同時に提示するＢ細胞に結合すると、接合された抗ＣＤ３  ＶＨとＶＬとは、相互作用し、Ｂ細胞上に正確にＣＤ３結合部位を再構成しうる。このアレルゲン特異的または抗原特異的アセンブリーは、標的Ｂ細胞クローンの枯渇を最終的に結果としてもたらすであろう。
【０１２４】
よって、本発明に従う、前記抗原Ａ１およびＡ２のうちのいずれかはまた、Ｂ細胞、特に、自己免疫障害を引き起こすＢ細胞の表面上のクロノタイプ抗体でもありうる。
【０１２５】
この文脈では、例えば、前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方は、ＣＤ１９であることが可能であり、他の一方は、Ｂ細胞、特に、自己免疫障害を引き起こすＢ細胞の表面上のクロノタイプ抗体でありうる。
【０１２６】
本発明のこの態様に従うと、前記標的化部分Ｔ１およびＴ２のうちのいずれか１つは、Ｂ細胞の表面上のクロノタイプ抗体に結合し、かつ／またはクロノタイプ抗体に結合すると、自己免疫障害を引き起こすことが可能なアレルゲンまたは基質を含みうる。前記標的化部分Ｔ１およびＴ２のうちのいずれか１つの中に含まれる、アレルゲンの非限定的な例は、例えば、イヌの体毛アレルゲン、ネコの体毛アレルゲン（例えば、Ｆｅｌ  ｄ１、Ｆｅｌｄ  ｄ１Ａ、Ｆｅｌｄ  ｄ１Ｂ）、もしくはモルモットの体毛アレルゲンなどの体毛アレルゲン、または例えば、カバノキアレルゲン、雑草アレルゲン、花粉アレルゲンなどの花粉アレルゲンである。さらなる非限定的な例は、ダニアレルゲン（例えば、Ｔｙｒ  ｐ  ２、Ｄｅｒ  Ｐ１、Ｄｅｒ  ｆ  ２）、ネコアレルゲン（例えば、Ｆｅｌ  ｄ  １、Ｆｅｌｄ  ｄ１Ａ、Ｆｅｌｄ  ｄ１Ｂ）、ラッカセイアレルゲン（例えば、コングルチン７）、腐朽菌アレルゲン（例えば、Ａｌｔ  ａ  １）、イヌアレルゲン（例えば、Ｃａｎ  ｆ  １）、スプルーのコムギアレルゲン（例えば、アルファ／ベータ−グリアジン）、チャバネゴキブリアレルゲン（例えば、Ｂｌａ  ｇ  １．０２変異体アレルゲン）、カバノキアレルゲンまたは（主要な）花粉アレルゲン（例えば、Ｃｙｎ  ｄ  １、Ｐｈａ  ａ  １、Ｄａｃ  ｇ  ３、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  １、Ｐｒｏｆｉｌｉｎ、Ｂｅｔ  ｖ  １−Ｌ、Ｂｅｔ  ｖ  １−Ａ）、主要なリンゴアレルゲン（例えば、Ｍａｌ  ｄ  １）、牛乳アレルゲン（例えば、アルファ−ラクトアルブミン、アルファ−Ｓ１−カゼイン）、鶏卵アレルゲン（例えば、リゾチームＣ、オボアルブミン）、およびウマアレルゲン（例えば、ラセリン、Ｅｑｕ  ｃ  １）などである。前記標的化部分Ｔ１およびＴ２のうちのいずれか１つの中に含まれる、さらなる非限定的で好ましいアレルゲンの例は、ヒト骨髄腫細胞系Ｕ２６６抗体であるＩｇＥ−ＮＤに対する抗原である。前記標的化部分Ｔ１およびＴ２のうちのいずれか１つの中に含まれる、さらなる非限定的で好ましいアレルゲンの例は、配列番号１６９〜１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列であるかまたはこれを含むアレルゲンである。
【０１２７】
この文脈では、本発明はまた、本明細書で記載されるポリペプチドセットにも関し、特に、上記の態様における、
（ｉ）自己免疫障害；および
（ｉｉ）過敏性障害
からなる群から選択される障害の処置または防止における使用のための、本明細書で記載されるポリペプチドセットにも関する。
【０１２８】
本発明に従って処置または防止される自己免疫障害の非限定的な例は、
（ｉ）アレルギー性障害；
（ｉｉ）多発性硬化症；
（ｉｉｉ）乾癬；
（ｉｖ）全身性エリテマトーデス；
（ｖ）シェーグレン症候群；
（ｖｉ）関節リウマチ；
（ｖｉｉ）特発性血小板減少性紫斑病；
（ｖｉｉｉ）糖尿病；
（ｘｉ）血管炎；
（ｘ）クローン病；および
（ｘｉ）アミロイドーシス
からなる群から選択される。
【０１２９】
本発明に従って処置または防止される過敏性障害の非限定的な例は、アレルギー（クームス−ゲル分類に従うＩ型過敏性反応）、抗体依存性細胞傷害反応（ＩＩ型過敏性反応）、免疫複合体疾患（ＩＩＩ型過敏性反応）、遅延型過敏症（ＩＶ型過敏性反応）、および受容体媒介性自己免疫疾患（Ｖ型過敏性反応）からなる群から選択される。
【０１３０】
好ましい実施形態では、前記自己免疫障害または過敏性障害は、同種幹細胞移植に随伴するか、またはこれにより誘発される（すなわち、クームス−ゲル分類に従うＩ型〜Ｖ型過敏性障害のうちのいずれかである）。
【０１３１】
病原体（例えば、ウイルスなどの、例えば、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ）に感染した多くの細胞は、それらの細胞表面上で、病原体によりコードされるタンパク質を発現させる。よって、本発明に従う、前記抗原Ａ１およびＡ２のうちのいずれかはまた、例えば、細胞の表面上の、ＨＩＶタンパク質、ＥＢＶタンパク質、またはＣＭＶタンパク質など、このような病原体によりコードされるタンパク質でもありうる。この文脈では、本発明はまた、感染性疾患、例えば、ウイルス性の感染性疾患の処置または防止における使用のための、本明細書で記載されるポリペプチドセットにも関する。病原体によりコードされるタンパク質の特定の例は、http://www.uniprot.org/uniprot/から得ることができ、ＨＩＶ  ｇｐ１２０（Ｑ７８７０６）；ＥＢＶ  ＬＭＰ−２（Ｐ１３２８５）；ＣＭＶ  ｇＢ（Ｐ０６４７３）；ＨＢＶ  ＨＢＳ（Ｑ９ＪＧ３６）；ＨＣＶ  Ｅ１（Ｃ４Ｂ７５１）；ＨＣＶ  Ｅ２（Ｑ６ＴＲＢ１）；ヒトアデノウイルスＣ種血清型２のＨＡｄＶ−２（Ｐ０３２７６）である。
【０１３２】
本発明の目的はまた、上記の実施形態で規定したポリペプチドセットまたはポリペプチドセットのポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子または核酸分子セットによっても解決され、この場合、前記核酸分子または前記核酸分子セットの核酸分子は、細菌細胞または真核細胞によりコードされる（１つまたは複数の）ポリペプチドの分泌を媒介する輸出シグナルを含むことが好ましい。
【０１３３】
本発明に従う核酸分子または核酸分子セットの非限定的な例は、配列番号１３５〜１５０および１９６のうちのいずれか１つに描示されているヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数を含む。
【０１３４】
本発明の目的はまた、上記で規定した核酸分子のヌクレオチド配列または上記で規定した核酸分子セットの核酸分子のうちの１つの配列を含むベクターによっても解決される。
【０１３５】
本発明の目的はまた、前記核酸／核酸セットまたは前記ベクターを含む細胞によっても解決される。
【０１３６】
本発明の目的はまた、上記で規定したポリペプチドセット、または上記で規定した核酸分子／核酸分子セット、または上記で規定したベクターを含み、薬学的に許容される担体をさらに含むことが好ましい医薬組成物によっても解決される。
【０１３７】
本発明の目的はまた、上記で規定したポリペプチドセット、および／または本発明に従う核酸分子もしくは核酸分子セット、および／または本発明に従うベクターを含むキットによっても解決される。
【０１３８】
一実施形態では、前記キットに含まれる前記ポリペプチドセットのポリペプチドは、単一のバイアルに含有される。
【０１３９】
好ましい一実施形態では、前記キットに含まれる前記ポリペプチドセットのポリペプチドは、個別のバイアルに含有される。
【０１４０】
一実施形態では、前記キットに含まれる前記ポリペプチドセットのポリペプチドのうちの１つまたは複数を凍結乾燥させる。
【０１４１】
一実施形態では、前記キットに含まれる前記ポリペプチドセットのポリペプチドのうちの１つまたは複数を溶解させる。
【０１４２】
本発明の目的はまた、
（ｉ）腫瘍もしくはがんを患っており、かつ／または同種細胞移植もしくは同種組織移植を受けている患者；
（ｉｉ）自己免疫障害を患っている患者；あるいは
（ｉｉｉ）過敏性障害を患っている患者
を処置するための方法によっても解決される。
前記方法は、
−ポリペプチドセットを得るステップであって、前記ポリペプチドセットが、
（ｉ）抗原Ａ１に特異的に結合する標的化部分Ｔ１、および
（ｉｉ）機能ドメインＦの断片Ｆ１
を含む第１のポリペプチドＰ１であって、前記断片Ｆ１自体またはポリペプチドＰ１自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ１、
ならびに
（ｉ）抗原Ａ２に特異的に結合する標的化部分Ｔ２であって、前記抗原Ａ２が、ある種の細胞型または細胞系統に特異的な細胞表面分子である標的化部分Ｔ２、および
（ｉｉ）機能ドメインＦの断片Ｆ２
を含む第２のポリペプチドＰ２であって、前記断片Ｆ２自体またはポリペプチドＰ２自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ２
を含み、
前記抗原Ａ１が、前記抗原Ａ２と異なり、
前記ポリペプチドＰ１と前記ポリペプチドＰ２とが、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその表面において有する基質、より具体的には、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有する細胞の非存在下では、互いと会合せず、
前記ポリペプチドＰ１の前記断片Ｆ１が、前記ポリペプチドＰ２の前記断片Ｆ２と二量体化すると、結果としてもたらされる二量体が、前記ドメインＦの機能に関して機能的となるステップと、
−前記ポリペプチドセットを前記患者へと投与するステップと
を含みうる。
【０１４３】
このような処置法では、前記ポリペプチドセットは、上記の実施形態で規定したポリペプチドセットである。
【０１４４】
本発明の目的はまた、細胞移植または組織移植を受けている患者を処置するための、上記のポリペプチドセットを用いる方法によっても解決される。
【０１４５】
本発明の目的はまた、上記の実施形態で規定したタンパク質セットの、上記で規定し、記載した疾患または障害を患う患者、例えば、がんを患い、かつ／または細胞移植または組織移植を受けている患者を処置するための、医薬を製造するための使用によっても解決される。
【０１４６】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語は、３０を超えるアミノ酸を含有するアミノ酸の直線状の分子鎖を指す。場合によって、ポリペプチドには、１つまたは複数のジスルフィド結合を組み入れることもでき、ポリペプチドを化学修飾することもできる。なおさらに、場合によって、非タンパク質性のエレメント（フルオロフォア、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー、または低分子など）を、前記アミノ酸の直線状の分子鎖へと接合することもできる。このようなポリペプチドは、任意の知られている方法により作製することができる。ポリペプチドは、例えば、前記ポリペプチドをコードする核酸から発現させることにより創成することもでき、固相合成法により合成することもでき、既存の分子をコンジュゲーションまたは連結することにより、例えば、化学的連結により作製することもできる。
【０１４７】
「ポリペプチドＰ１」という用語は、（ｉ）抗原に特異的に結合する標的化部分と、（ｉｉ）機能ドメインの断片であって、前記断片自体または前記ポリペプチドＰ１自体のいずれも前記機能ドメインの機能に関して機能的でない断片とを含むポリペプチドを指すのに用いられる。「ポリペプチドＰ２」という用語は、（ｉ）抗原に特異的に結合する標的化部分と、（ｉｉ）機能ドメインの断片であって、前記断片自体または前記ポリペプチドＰ２自体のいずれも前記機能ドメインの機能に関して機能的でない断片とを含むポリペプチドを指すのに用いられる。
【０１４８】
本明細書で用いられる「ドメイン」という用語は、ポリペプチドの全体またはポリペプチドの一部分のアミノ酸配列を組み入れたアミノ酸の直線状の分子鎖を指す。場合によって、ドメインには、１つまたは複数のジスルフィド結合を組み入れることもでき、ドメインを化学修飾することもできる。なおさらに、場合によって、ドメインは、非タンパク質性のエレメント（フルオロフォアなど）を含みうる。しかし、一実施形態では、「ドメイン」という用語は、化学修飾されているか、または（１つまたは複数の）非タンパク質性のエレメントを含む化合物を含まない。
【０１４９】
本明細書で用いられる「機能ドメイン」とは、ある種の結合パートナーもしくは抗原への特異的結合、ある種の受容体の特異的な活性化、毒性作用の媒介、または適切な波長の光により励起されたときの蛍光発光など、ある種の機能を果たすことが可能なドメインである。
【０１５０】
「機能ドメインＦ」という用語はまた、非タンパク質性の化合物も包含することを意図することが好ましい。しかし、一実施形態では、「機能ドメインＦ」という用語は、タンパク質性化合物またはその機能的パートを指す。
【０１５１】
本明細書で用いられる「ドメインの断片」という用語は、ドメインの一部には対応するが、ドメインの全体には対応しない、アミノ酸の直線状の分子鎖を指す。場合によって、ドメインの断片には、１つまたは複数のジスルフィド結合を組み入れることもでき、ドメインの断片を化学修飾することもできる。なおさらに、場合によって、ドメインは、非タンパク質性のエレメントまたはこのような非タンパク質性のエレメントの一部を含みうる。
【０１５２】
「断片Ｆ１」という用語は、機能ドメインの断片を指すのに用いられる。「断片Ｆ２」という用語は、機能ドメインの断片を指すのに用いられる。
【０１５３】
本明細書で用いられる、対になる略号：Ｐ１、Ｐ２；Ｔ１、Ｔ２；Ｆ１、Ｆ２；Ａ１、Ａ２；およびＩ１、Ｉ２は、それぞれ、異なるポリペプチド、標的化部分、断片、抗原、および免疫グロブリンモジュールを指示することを意図する。それらは、それぞれ、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド；第１の標的化部分、第２の標的化部分；第１の断片、第２の断片；第１の抗原、第２の抗原；および第１の免疫グロブリンモジュール、第２の免疫グロブリンモジュールと同義である。
【０１５４】
本明細書で用いられる「部分」という用語は、ポリペプチドの全体またはポリペプチドの一部分のアミノ酸配列を組み入れたアミノ酸の直線状の分子鎖を指す。場合によって、部分には、１つまたは複数のジスルフィド結合を組み入れることもでき、部分を化学修飾することもできる。なおさらに、場合によって、部分は、非タンパク質性のエレメント（オリゴヌクレオチドなど）を含みうる。しかし、一実施形態では、「部分」という用語は、化学修飾されているか、または（１つまたは複数の）非タンパク質性のエレメントを含む化合物を含まない。
【０１５５】
「標的化部分Ｔ１」という用語は、抗原、例えば、抗原Ａ１に特異的に結合する部分を指すのに用いられる。「標的化部分Ｔ２」という用語は、抗原、例えば、抗原Ａ２に特異的に結合する部分を指すのに用いられる。
【０１５６】
本明細書で用いられる「リンカー」とは、ポリペプチド内のアミノ酸の配列であって、前記ポリペプチドの２つのパートまたは前記ポリペプチドに含まれる２つのドメインを接合する配列である。
【０１５７】
本発明で用いられる「核酸分子」という用語は、３０を超えるヌクレオチドからなる直線状の分子鎖を規定する。この用語は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなどのＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
【０１５８】
本明細書で用いられる「構築物」という用語は、１つまたは複数の組換えヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。この用語はまた、組換えヌクレオチド配列から発現させるポリペプチド、または人工的に作製された分子もしくは組換え分子であって、同じタンパク質内で天然には見出されない２つ以上のアミノ酸配列を含む分子であるポリペプチドも包含する。
【０１５９】
相互作用パートナーもしくは抗原に特異的に結合する、または相互作用パートナーもしくは抗原を特異的に結合する分子またはドメインの文脈において本発明で用いられる「〜に特異的に結合する（specifically binds to）」または「〜を特異的に結合する（specifically binds）」という用語は、分子またはドメインが、好ましくは非共有結合的結合により、前記相互作用パートナーもしくは抗原に結合するか、または、好ましくは非共有結合的結合により、前記相互作用パートナーもしくは抗原を結合することが可能であり、相互作用パートナーまたは抗原の構造と類似する構造を伴う他の任意の相互作用パートナーまたは抗原と交差反応しないかまたは本質的に交差反応しないことを意味する。
【０１６０】
抗原（抗原Ａ１またはＡ２など）に特異的に結合する標的化部分（標的化部分Ｔ１またはＴ２など）の文脈では、「〜に特異的に結合する」という用語は、前記標的化部分が、前記抗原に特異的に結合することが可能な状況、または前記標的化部分が、実際にそれに結合する状況を指すことを意図する。
【０１６１】
Ｔ細胞動員ドメイン、ＮＫ細胞動員ドメイン、マクロファージ細胞動員ドメイン、単球動員ドメイン、顆粒球動員ドメイン、好中性顆粒球動員ドメイン、または活性化好中性顆粒球、単球、および／もしくはマクロファージ動員ドメインの文脈では、抗原もしくは分子「に特異的に結合すること」または抗原もしくは分子「に特異的に結合する」という用語は、それぞれのドメインが、前記抗原もしくは分子に特異的に結合することが可能な状況、またはそれぞれのドメインが、実際にそれに結合する状況を指すことを意図する。
【０１６２】
抗原、分子、化合物、担体分子、またはアフィニティータグ「に特異的に結合する」ドメインである機能ドメインの文脈では、「〜に特異的に結合する」という用語は、前記機能ドメインが、前記抗原、分子、化合物、担体分子、もしくはアフィニティータグに特異的に結合することが可能な状況、または前記機能ドメインが、実際にそれに結合する状況を指すことを意図する。
【０１６３】
機能ドメイン「が特異的に結合する」毒素、フルオロフォア、抗原、担体分子、またはアフィニティータグの文脈では、この用語は、前記機能ドメインが、前記毒素、フルオロフォア、抗原、担体分子、もしくはアフィニティータグに特異的に結合することが可能な状況、または前記機能ドメインが、実際にそれに結合する状況を指すことを意図する。
【０１６４】
本出願において用いられる分子または抗原は、それを、前記細胞型／前記細胞系統の細胞は発現させるが、他の細胞型または他の細胞系統の細胞は発現させない（または無視できる程度でだけ発現させる）場合、「ある種の細胞型または細胞系統に特異的」である。いくつかの実施形態では、分子または抗原は、それを、前記細胞型／前記細胞系統の細胞が発現させ、前記細胞型／前記細胞系統の細胞以外で前記抗原を同様に発現させる他の細胞型または他の細胞系統の細胞は少数に限る一方で、前記細胞型／前記細胞系統の細胞以外の大半の他の細胞型または他の細胞系統の細胞は前記抗原を発現させない（または無視できる程度でだけ発現させる）場合も、「ある種の細胞型または細胞系統に特異的」である。「ある種の細胞型または細胞系統に特異的」という用語はまた、他の細胞型／他の細胞系統の細胞においてもまた、わずかであるが検出可能な前記分子の発現がありうるという意味で、前記細胞型／前記細胞系統の細胞が、他の細胞型／他の細胞系統の細胞より大きな割合で、または高比率もしくは高量で、前記分子または抗原を発現させることも意味しうる。ある種の細胞型または細胞系統についてのマーカーの文脈において本明細書で用いられる「マーカー」という用語は、上記の細胞型または細胞系統の細胞のそれぞれに特異的な分子または抗原を指す場合がある。
【０１６５】
本明細書で用いられる「アプタマー」という用語は、特異的な標的分子に高いアフィニティーで結合する、オリゴ核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）またはペプチド性分子もしくは非ペプチド性分子からなる低分子化合物を指す。
【０１６６】
本明細書で用いられる「担体分子」という用語は、本発明に従うポリペプチドセットを投与される患者の免疫系により外来として認識されないか、または本発明に従うポリペプチドセットを投与される患者による免疫反応を引き起こさないか、もしくは弱い免疫反応を引き起こすにとどまる分子または分子の一部を指す。このような「担体分子」には、抗体などの別の分子を結合させるか、または結合させることが可能であることが好ましい。ある種の実施形態では、担体分子を、第２の分子または第２の分子の一部、例えば、フルオロフォアまたは毒素へと、共有結合的に、または非共有結合的に接合する。
【０１６７】
「ＭＨＣ」という用語は、Ｔ細胞への抗原提示に要請され、また、急速な移植片拒絶の一因ともなる細胞表面分子を含む分子群をコードする遺伝子のセットである、主要組織適合性複合体を指す。ヒトでは、ＭＨＣに、遺伝子であるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＨＱ、およびＨＬＡ−ＤＲが含まれる。本出願では、この用語は、主要組織適合性複合体の遺伝子のほか、これらの遺伝子によりコードされる遺伝子産物を指すのにも用いられる。「ＨＬＡ」という用語は、ヒト白血球抗原を指す。本明細書で用いられる「ＨＬＡ」とは、「ＭＨＣ」のヒト形態である。
【０１６８】
本明細書で用いられる「対立遺伝子変異体」という用語は、染色体の同じ遺伝子座を占有する２つ以上の代替的な遺伝子の形態のうちのいずれかを意味する。例えば、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、およびＨＬＡ−Ａ３は、ＨＬＡ−Ａの対立遺伝子変異体のうちの３つである。本明細書ではまた、対立遺伝子変異体という用語を、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を意味するのにも用いる。
【０１６９】
本明細書で用いられる「抗原」という用語は、抗体または抗体の抗原結合パートが特異的に結合するか、または特異的に結合することが可能なことが知られている分子を指す。その最も広い意味で、「抗原Ａ１」とは、上記で規定した抗原を指す。その最も広い意味で、「抗原Ａ２」とは、上記で規定した抗原を指す。「抗原Ａ１」および「抗原Ａ２」という呼称は、「抗原Ａ１」と「抗原Ａ２」との弁別を可能とするために選び出されている。「ＭＨＣ抗原」とは、また、主要組織適合性複合体にも属する分子である抗原である。ＭＨＣ抗原には、ＭＨＣクラスＩ抗原（ヒトでは、抗原であるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ）、およびＭＨＣクラスＩＩ抗原（ヒトでは、抗原であるＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲ）が含まれる。細胞が「抗原を保有する」または「抗原をその細胞表面において保有する」という語句は、細胞が、前記細胞の細胞表面に存在し、前記細胞の外部に由来する抗体にアクセス可能な抗原を発現させる状況を指すことを意図する。基質が「抗原をその表面において有する」という語句は、前記抗原が、前記基質の表面に存在し、前記基質へと適用された抗体にアクセス可能な状況を指すことを意図する。
【０１７０】
本明細書で用いられる「細胞の悪性状態に特異的な抗原」という用語は、ある種の細胞型の悪性細胞（悪性Ｂ細胞である腫瘍細胞など）は、その細胞表面において保有するが、悪性でない同じ細胞型の細胞（非悪性Ｂ細胞など）は、その細胞表面において保有しない（または無視できる程度でだけ保有する）抗原を指す。
【０１７１】
本明細書で用いられる「悪性細胞型に特異的な抗原／分子」という用語は、ある種の細胞型の悪性細胞（悪性Ｂ細胞である腫瘍細胞など）は、その細胞表面において保有するが、悪性でない同じ細胞型の細胞（非悪性Ｂ細胞など）または他の細胞型の細胞（Ｔ細胞または肝細胞など）は、その細胞表面において保有しない（または無視できる程度でだけ保有する）抗原／分子を指す。いくつかの実施形態では、「悪性細胞型に特異的な抗原／分子」という用語は、ある種の細胞型の悪性細胞（悪性Ｂ細胞である腫瘍細胞など）は、その細胞表面において保有するが、悪性でない同じ細胞型の細胞（非悪性Ｂ細胞など）は、その細胞表面において保有せず（または無視できる程度でだけ保有し）、そのある種の細胞型以外で少数の他の細胞型の細胞だけがそれらの細胞表面において保有する一方で、大半の他の細胞型の細胞は保有しない（または無視できる程度でだけ保有する）抗原／分子を指す。「悪性細胞型に特異的な抗原／分子」という用語はまた、悪性でない同じ細胞型の細胞においてもまた、わずかであるが検出可能な前記分子の発現がありうるという意味で、前記ある種の細胞型の悪性細胞が、悪性でない同じ細胞型の細胞より大きな割合で、または高比率もしくは高量で、前記抗原／分子を発現させることも意味しうる。ある種の細胞の悪性状態または悪性細胞型についてのマーカーの文脈において本明細書で用いられる「マーカー」という用語は、上記のある種の細胞の悪性状態または悪性細胞型のそれぞれに特異的な分子または抗原を指す場合がある。
【０１７２】
本明細書で用いられる「免疫グロブリンドメイン」という用語は、抗体鎖の球状領域から本質的になるドメインを指す。免疫グロブリンドメインは、それらが、抗体分子の免疫グロブリンフォールド特徴を保持するという点で特徴付けられる。ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭなどの免疫グロブリンは、多様な数の重鎖および軽鎖からなる。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する。各軽鎖可変領域（ＶＬ）および各重鎖可変領域（ＶＨ）は、また、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域を含有する。ＣＤＲは、主に免疫グロブリンの抗原への結合の一因となる。
【０１７３】
「ＶＨ」または「ＶＨドメイン」という用語は、互換的に用いられ、抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬドメイン」という用語は、互換的に用いられ、抗体の免疫グロブリン軽鎖可変領域を指す。
【０１７４】
本明細書で用いられる「免疫グロブリンモジュール」という用語は、１つまたは複数の、好ましくは２つ以上の免疫グロブリンドメインを含み、抗原に結合することが可能な分子、分子の一部、または分子アセンブリーを指す。「免疫グロブリンモジュール」は、１つまたは複数の、好ましくは２つ以上の免疫グロブリンドメインのアミノ酸配列を組み入れたアミノ酸の直線状の分子鎖を含むことが好ましい。場合によって、「免疫グロブリンモジュール」は、１つまたは複数の、好ましくは２つ以上のジスルフィド結合を含む。「免疫グロブリンモジュール」という用語には、抗体の「単鎖変異体断片」を含むか、またはこれからなる、分子または分子の一部が包含される。「免疫グロブリンモジュール」という用語にはまた、ラマ抗体、ラクダ抗体、またはサメ抗体のＶＨＨドメインを含むか、またはこれからなる、分子または分子の一部も包含される。
【０１７５】
「免疫グロブリンモジュールＩ１」という用語は、ＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインを含む免疫グロブリンモジュールを指すのに用いられる。前記免疫グロブリンモジュールＩ１の前記ＶＬドメインと前記ＶＨドメインとは、同じ抗体に由来することが好ましい。前記免疫グロブリンモジュールＩ１の前記ＶＬドメインと前記ＶＨドメインとは、二量体を形成することが好ましい。前記二量体は、抗原に特異的に結合することが可能であることが好ましい。前記抗原は、例えば、抗原Ａ１でありうる。一実施形態では、前記「免疫グロブリンモジュールＩ１」は、抗原、例えば、抗原Ａ１に特異的に結合することが可能な、抗体の「単鎖変異体断片」を含む。
【０１７６】
「免疫グロブリンモジュールＩ２」という用語は、ＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインを含む免疫グロブリンモジュールを指すのに用いられる。前記免疫グロブリンモジュールＩ２の前記ＶＬドメインと前記ＶＨドメインとは、同じ抗体に由来することが好ましい。前記免疫グロブリンモジュールＩ２の前記ＶＬドメインと前記ＶＨドメインとは、二量体を形成することが好ましい。前記二量体は、抗原に特異的に結合することが可能であることが好ましい。前記抗原は、例えば、抗原Ａ２でありうる。一実施形態では、前記「免疫グロブリンモジュールＩ２」は、抗原、例えば、抗原Ａ２に特異的に結合することが可能な、抗体の「単鎖変異体断片」を含む。
【０１７７】
ＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインを含む免疫グロブリンモジュールの構築物内では、ＶＬドメインを、対応するＶＨドメインのＮ末端側またはＣ末端側に配置することができる。当業者は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのどの配置が、特異的な単鎖変異体断片ドメインにより適するのかを決定することが可能である。
【０１７８】
本明細書で用いられる「Ｆｖ」および「変異体断片」という用語は、完全な抗原認識部位および結合部位を含有する、最小限の抗体断片である抗体の断片を指す。この領域は、緊密な非共有結合的会合下にある１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域とによる二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）からなる。この構成では、ＶＨドメインとＶＬドメインとは、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上において抗原結合特異性を伴う抗原結合部位を併せて規定する。
【０１７９】
「ｓｃＦｖ」、「単鎖Ｆｖ」、および「単鎖変異体断片」という用語は互換的に用いられ、従来の二本鎖抗体の重鎖（ＶＨ）可変領域と軽鎖（ＶＬ）可変領域とが接合されて、一本鎖を形成する、抗体または抗体の一部分を指示することを意図する。適正なフォールディングおよび活性の結合部位の創出を可能とする２つの鎖の間にリンカーを挿入することが典型的である。
【０１８０】
本明細書で用いられる「ラマ抗体」という用語は、ラマに由来する抗体または抗体の一部を指す。本明細書で用いられる「ラクダ抗体」という用語は、ラクダに由来する抗体または抗体の一部を指す。本明細書で用いられる「サメ抗体」という用語は、サメに由来する抗体または抗体の一部を指す。ラマ抗体、ラクダ抗体、およびサメ抗体は、単一のドメインであるＶＨＨ（ＶＨおよびＶＬ鎖ではなく）により構成される抗原結合部分を有する。
【０１８１】
本明細書で用いられる「Ｔ細胞動員ドメイン」という表現は、Ｔ細胞の細胞表面上で存在する抗原に特異的に結合するドメインを指すことを意図する。前記Ｔ細胞動員ドメインが前記抗原に結合すると、前記Ｔ細胞を活性化させることが好ましい。同様に、「ＮＫ細胞動員ドメイン」という表現は、ナチュラルキラー細胞の細胞表面上で存在する抗原に特異的に結合するドメインを指す。前記ＮＫ細胞動員ドメインが前記抗原に結合すると、前記ナチュラルキラー細胞を活性化させることが好ましい。「マクロファージ細胞動員ドメイン」という表現は、マクロファージ細胞の細胞表面上で存在する抗原に特異的に結合するドメインを指す。前記マクロファージ細胞動員ドメインが前記抗原に結合すると、前記マクロファージ細胞を活性化させることが好ましい。「単球動員ドメイン」という表現は、単球の細胞表面上で存在する抗原に特異的に結合するドメインを指す。前記単球動員ドメインが前記抗原に結合すると、前記単球を活性化させることが好ましい。「顆粒球動員ドメイン」という表現は、顆粒球の細胞表面上で存在する抗原に特異的に結合するドメインを指す。前記顆粒球動員ドメインが前記抗原に結合すると、前記顆粒球を活性化させることが好ましい。「好中性顆粒球動員ドメイン」という表現は、好中性顆粒球の細胞表面上で存在する抗原に特異的に結合するドメインを指す。前記好中性顆粒球動員ドメインが前記抗原へと結合すると、前記好中性顆粒球を活性化させることが好ましい。「活性化好中性顆粒球、単球、および／またはマクロファージ動員ドメイン」という表現は、活性化好中性顆粒球、単球および／またはマクロファージの細胞表面上で存在する抗原に特異的に結合するドメインを指す。前記活性化好中性顆粒球、単球、および／またはマクロファージ動員ドメインが前記抗原へと結合すると、前記単球および／またはマクロファージを活性化させることが好ましい。
【０１８２】
本明細書で用いられる「生物発光を媒介することが可能な分子」という用語は、（１つまたは複数の）適切な基質の存在下で、生物発光を引き起こす反応を触媒する酵素活性を有する分子（または分子の機能的パート）を指す。この用語は、ホタルルシフェラーゼまたはＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼなどのルシフェラーゼを包含する。
【０１８３】
本明細書で用いられる「ＧＦＰ変異体」という用語は、オワンクラゲ（Aequorea victoria）に由来する緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列から、蛍光の増大または異なる色の蛍光を結果としてもたらす改変を導入することにより誘導されるアミノ酸配列を有する分子を指す。この用語は、とりわけ、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、Ｖｅｎｕｓ（Nagai Tら、A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol.、2002年1月;20(1):87〜90）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ（Ｓ７２Ａ置換、Ｙ１４５Ａ置換、およびＨ１４８Ｄ置換により増強されたＣＦＰ）を包含することを意図する。
【０１８４】
「増強ＧＦＰ」（そして、同様に、「増強ＹＦＰ」、「増強ＣＦＰ」）は、Kainら（1995）、Biotechniques 19（4）:650〜55で報告されている通り、「ヒト化」されたＧＦＰ（ＹＦＰ、ＣＦＰ）を指す。「ヒト化」とは、ヒト細胞内でタンパク質を発現させるために、コドンを最適化するように、ＧＦＰ（ＹＦＰ、ＣＦＰ）の核酸配列にもたらされた変化を指す。
【０１８５】
本明細書で用いられる「二分子蛍光相補分子」という用語は、それら自体では蛍光性ではないが、２つの断片の間でヘテロ二量体化すると、蛍光発光が可能な二量体を形成する２つの断片としてもたらされうる蛍光分子を指す。
【０１８６】
本明細書で用いられる「治療用化合物」という用語は、疾患または疾患状態を防止するか、処置するか、緩和するか、または治癒させるのに適した化合物を指す。「治療用化合物」とは、細胞内に入ると、その細胞の死を引き起こすことが可能な化合物であることが好ましい。いくつかの実施形態では、治療用化合物は、致命的な細胞構造を損傷させるか、または致命的な細胞過程を遮断する化学物質または放射性化合物でありうる。
【０１８７】
本明細書で用いられる「診断用化合物」という用語は、臨床検査室または生化学検査室もしくは医療診断検査室において用いられる方法などの一般的な検出法により検出されうる化合物、例えば、蛍光化合物、放射性化合物、または生物発光を媒介する分子を指す。
【０１８８】
「前駆細胞／前駆体細胞」という用語は、出生後の動物／ヒトにおいて見出され、１つまたは複数の特殊な細胞型へと分化する潜在的可能性を有することが典型的な、未成熟細胞、未分化細胞、または部分的に分化した細胞を指すことを意図する。「腫瘍前駆細胞／腫瘍前駆体細胞」という用語は、腫瘍細胞を発生させるように特性を変化させた（例えば、それらの増殖挙動または遺伝子発現パターンに関して）前駆細胞／前駆体細胞を指示する。このような腫瘍前駆細胞／腫瘍前駆体細胞の例は、例えば、白血病性前駆体細胞または白血病性前駆細胞である。
【０１８９】
本明細書で用いられる「がん」という用語は、悪性細胞、細胞群、または悪性新生物を指す。この用語は、がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、および芽細胞腫を含むことを意図する。「がん性細胞」とは、がんの一部であるかまたはがんに由来する細胞である。「腫瘍」という用語は、「がん」という用語と互換的に用いられる。
【０１９０】
本明細書で用いられる「血液系腫瘍」という用語は、血液系または造血系（骨髄細胞、造血細胞、および成熟血液細胞の前駆体細胞など）のがんを指す。いくつかの実施形態では、「血液系腫瘍」という用語は、血液系新生物を指す。本明細書で用いられる「非血液系腫瘍」という用語は、血液系腫瘍ではない腫瘍を指す。
【０１９１】
本明細書で用いられる「同種組織移植または同種細胞移植を受けている患者」という用語は、患者が、別の患者から得られた移植細胞または移植組織を施されるかまたは施されている状況を指す。この側面に関して好ましい状況は、ＨＬＡ抗原が不適合の状況である。投与されるポリペプチドの量の文脈において本明細書で用いられる「μｇ／ｍ２」という単位は、前記ポリペプチドを投与される患者の体表面１平方メートル当たりのある量のポリペプチド（ペプチドは、静脈内注射または皮下注射など、任意の適正な投与経路により投与することができる）を指す。例えば、「ポリペプチドＰ１について、投与されるポリペプチドの量は、１日当たり５０μｇ／ｍ２である。」という表現は、１日当たりに投与されるポリペプチドＰ１の量が、ポリペプチドＰ１を投与される患者の体表面１平方メートル当たり５０μｇである状況を指すことを意図する。体表面が２ｍ２の患者の場合なら、これは、１日当たり１００μｇのポリペプチドＰ１を投与することを意味するであろう。
【０１９２】
本発明者らは驚くべきことに、本発明に従うポリペプチドセットにより、上記で指摘した先行技術の問題を克服することができ、上記の目的を達成しうることを見出した。なおさらに、本発明者らは驚くべきことに、本発明に従うポリペプチドセットにより、２つの抗原の特異的な組合せを伴う細胞を、高度な特異性で、副作用を低減して同定し、かつ／または消失させうることも見出した。
【０１９３】
あらかじめ形成されたＦ単位（例えば、抗ＣＤ３単位）を用いないことは、本発明のコンビナトリアル戦略の１つの利点である。Ｆ１とＣＤ３  ＶＨおよびＣＤ３  ＶＬとは、それらの二量体化を安定化させる薬剤（例えば、例えば、ＣＤ３、ＨＩＳ、またはＤＩＧなどのドメインＦに結合することが可能な抗原）の存在下でもなお、それ自体ではヘテロ二量体化せず、このために、機能的なＦドメインを結果としてもたらさない（例えば、Ｔ細胞を刺激しない）。もっぱら、相補性構築物であるＰ１およびＰ２の両方が、所与の細胞の表面上で同時に結合する状況下において、２つの成分であるＦ１およびＦ２は、Ｆドメイン（例えば、ＣＤ３結合部位）を再構成する。したがって、Ｆドメインの機能（例えば、Ｔ細胞の活性化）は、必要とされる場所において正確に生じ、全身的には生じない。よって、本発明のコンビナトリアル戦略は、例えば、通常の二特異性抗体戦略と比較して、毒性作用が低いと仮定することができる。これはまた、付属の実施例によって、特に、ＨＬＡ−Ａ２陽性マウスが、ＨＬＡ−Ａ２反応性構築物を注入した後で任意の臨床作用を受けなかった、同種移植のｉｎ  ｖｉｖｏモデルによっても証拠立てられる。
【０１９４】
特に、あらかじめ規定された抗原署名を発現させる細胞をタグ付けするため、各々が抗原結合単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）および抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ドメインまたは可変重鎖（ＶＨ）ドメインからなる２つの単鎖ポリペプチドを、最終的な二部分（二分子）構築物（二分子／三特異性抗体構築物）の一部としてデザインした。これらの２つのハイブリッド断片が、単一の細胞の表面において、それらのそれぞれの抗原に結合すると、ＶＬドメインとＶＨドメインとは、互いと相互作用して、元の抗原結合部位を再構成し、これにより、所望の要件を満たす。
【０１９５】
言及した通り、細胞表面上でおける両方の標的抗原の結合が機能的なヘテロ二量体化に必須であることは、本発明のポリペプチドセットの１つの利点である。２つの相補性パートのセルフアセンブリーおよび一方のアームだけのその抗原への結合の後に続くＴ細胞刺激は除外することができ、これにより、ＶＨまたはＶＬの結合自体のアフィニティーは低く、ＶＨ／ＶＬヘテロ二量体は、抗原の非存在下で急速に解離する傾向があることを示す公表データも裏付けられる（Colman、1987、Nature 326、358〜363; Amit、1986、Science 233、747〜753; Law、2002、Int Immunol 14、389〜400; Ueda、1996、Nat Biotechnol 14、1714〜1718）。
【０１９６】
当技術分野でよく知られているホモ二量体化ドメインまたはヘテロ二量体化ドメイン（ロイシンジッパー、Ｆｃドメイン、ノブイントゥーホールなど）とは対照的に、ＶＨとＨＬとの相互作用のアフィニティーは低い。しかし、ＶＨ／ＶＬ相互作用は、特異的抗原に結合した後で安定化されうることが示されている。理論に束縛されることなく述べると、本発明に従うＶＨ／ＶＬ相互作用は、両方の断片が、例えば、標的細胞の表面上でおいて、それらのコグネイトの標的抗原に既に結合した後の状況だけにおいて生じる。これもまた理論に束縛されることなく述べると、オンターゲットの同時的な結合の後、構築物は、抗原との三量体の複合体を形成しうるように、緊密に近接する。こうしてオンターゲットで相補された本発明の三特異性ヘテロ二量体は、抗ＣＤ３が再構成されれば、ドメインＦの機能に関して機能的となる、例えば、Ｔ細胞を腫瘍細胞の破壊へと動員および刺激する。
【０１９７】
本発明の構築物であるＰ１およびＰ２の１つの利点、例えば、誘発される免疫応答のコンビナトリアル性以外に、本発明の文脈では、驚くべきことに、Ｆドメインを破壊された二分子構築物、例えば、ｓｃＦｖ−抗ＣＤ３は、オフターゲット作用を提示しないことも見出された。
【０１９８】
本発明に従うポリペプチドセット、特に、その中に含まれるポリペプチドＰ１およびＰ２は、ＢｉＴＥ構築物などの従来の二特異性構築物と比較して安定性を増大させ、かつ／または保管寿命（特に、４℃における）を改善した、さらなる利点を有する。これらの従来の二特異性構築物は、凝集する傾向がある（特に、４℃において）。
【０１９９】
本発明のポリペプチドであるＰ１およびＰ２、より特定すると、その中に含まれるＦ１およびＦ２、より特定すると、その中に含まれうるＶＨおよびＶＬは、それらの疎水性界面に起因して、アルブミンに結合することが可能なことが想定される。これは、滞留時間の改善；すなわち、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるバイオアベイラビリティーの増大であるが、また、血清試料中または血液試料中などの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるバイオアベイラビリティーの増大をもたらす。
【０２００】
本発明に従うポリペプチドセットは、第１のポリペプチドＰ１および第２のポリペプチドＰ２を含む。第１のポリペプチドＰ１は、機能ドメインＦの断片Ｆ１へと融合させた第１の標的化部分Ｔ１（抗原Ａ１に特異的に結合することが可能である）を含む（図１Ａの上図を参照されたい）。第２のポリペプチドＰ２は、機能ドメインＦの第２の断片Ｆ２へと連結された第２の標的化部分Ｔ２（抗原Ａ２に特異的に結合することが可能である）を含む（図１Ａの下図を参照されたい）。重要なことは、機能ドメインのそれぞれの断片Ｆ１およびＦ２は、それら自体では非毒性であり、２つのポリペプチドＰ１とＰ２との間でパートナー形成がなされない限り、生物学的機能を果たすことは不可能なことである。ポリペプチドＰ１およびＰ２の両方が、抗原Ａ１およびＡ２の両方を発現させる単一の細胞の表面においてそれらの抗原に同時に結合すると、機能ドメインＦの断片Ｆ１およびＦ２は、併せて緊密に近接し、それらはヘテロ二量体化し、これにより、所望の生物学的機能を相補する（図１Ｂを参照されたい）。他方で、抗原Ａ１だけ（図１Ｃ）もしくは抗原Ａ２だけ（図１Ｄ）を発現させるか、または抗原のうちのいずれも発現させない細胞は、生物学的機能の相補を引き起こさない。したがって、生物学的機能は、抗原Ａ１およびＡ２の両方をそれらの細胞表面において有する細胞の存在下で、ポリペプチドＰ１およびＰ２の両方が、このような細胞へと同時的に結合したときに限り、高度な特異性で達成される。機能ドメインＦの性質に応じて、抗原Ａ１およびＡ２の両方を発現させる細胞の特異的な同定／検出または消失など、異なる目的を達成することができる。
【０２０１】
例示的な一実施形態では、本発明の原理は、腫瘍細胞の特異的な消失に適用される。
【０２０２】
新規の組織病理学的解析およびフローサイトメトリー解析は、造血系新生物およびがんならびに多様な由来の他のがん幹細胞について知られている通り、単一の表面マーカーによってではなく、異常な抗原の組合せ／プロファイルの発現によって、腫瘍細胞を検出し、それらの非形質転換対応物と弁別しうることを明らかにしている。したがって、単一の抗原では、ある種の腫瘍細胞を特異的に同定するのに十分でない可能性があるのに対し、２つの抗原の特異的な組合せは、腫瘍細胞を他の任意の種類の細胞から識別することを可能としうる。
【０２０３】
例えば、本発明に従うポリペプチドセットは、それらの細胞表面における抗原であるＣＤ３３およびＣＤ１９の同時的な発現を特徴とするがん細胞を特異的に消失させるのに用いることができる。この抗原の組合せは、ある種の急性白血病細胞上で見出され、これらの細胞を、それらの細胞表面においてＣＤ３３またはＣＤ１９を保有しうるが、それらの細胞表面においてＣＤ３３およびＣＤ１９の両方を保有するわけではない、他の任意の細胞（非悪性細胞など）から弁別する。（Ossenkoppeleら、Review of the relevance of aberrant antigen expression by flow cytometry in myeloid neoplasms. Br J Haematol 2011、153(4):421〜36）。
【０２０４】
ＣＤ３３およびＣＤ１９の両方をそれらの細胞表面において保有するこれらの白血病性細胞を特異的に消失させるために、第１のポリペプチドＰ１の第１の標的化部分Ｔ１は、ＣＤ３３に特異的な単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）でありうる。機能ドメインＦの断片Ｆ１としては、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメインＶＬを選び出すことができる。第２のポリペプチドＰ２の第２の標的化部分Ｔ２は、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖでありうる。機能ドメインＦの断片Ｆ２としては、この抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメインＶＨを選び出すことができる。抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメインＶＬおよび重鎖可変ドメインＶＨの各々は、それら自体では非毒性であり、また、ポリペプチドＰ１とＰ２との間でパートナー形成がなされない限り、それらの生物学的機能（すなわちＣＤ３抗原に効果的に結合する機能）を果たすことも不可能である。
【０２０５】
ＣＤ３３およびＣＤ１９の両方をその細胞表面上で有する白血病性細胞の存在下では、ポリペプチドＰ１およびＰ２の両方がその細胞に同時に結合する。結果として、機能群Ｆの断片Ｆ１およびＦ２（すなわち、この抗ＣＤ３抗体のＦｖである抗ＣＤ３可変ドメインの重鎖および軽鎖）は、併せて緊密に近接し、それらはヘテロ二量体化し、これにより、所望の生物学的機能を相補し、Ｐ１とＰ２との二量体がＣＤ３に特異的に結合することを可能とする。
【０２０６】
ＣＤ３とは、Ｔ細胞の表面上で存在する細胞表面分子である。この分子は、Ｔ細胞シグナル伝達複合体の一部であり、ＣＤ３特異的抗体が結合した後のＴ細胞の表面上でおけるＣＤ３分子の架橋形成により、Ｔ細胞の活性化がもたらされる。ＣＤ３抗原をＴ細胞の表面上で動員することにより、ポリペプチドＰ１およびＰ２のヘテロ二量体は、Ｔ細胞を動員し、それらを活性化することが可能となる。結果として、細胞傷害性Ｔ細胞応答の典型的なエフェクター機構が誘発され、細胞溶解：細胞傷害性タンパク質であるパーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシンを含有する溶解性顆粒の放出がもたらされる。パーフォリンは、これを介してグランザイムが侵入し、アポトーシスを誘導しうる小孔を、標的細胞の膜内に形成する。これらの効果により、ＣＤ３３抗原およびＣＤ１９抗原の両方をそれらの細胞表面において保有する白血病性細胞の特異的な破壊がもたらされる。
【０２０７】
白血病性細胞以外の細胞は、ＣＤ３３抗原およびＣＤ１９抗原の両方をそれらの細胞表面において有するわけではない。したがって、それらは、ポリペプチドＰ１およびＰ２の両方を動員することが可能でなく、ＣＤ３結合能の相補およびＣＤ３陽性Ｔリンパ球の動員も達成されない。結果として、白血病性細胞以外の細胞は影響を受けず、精密な特異性を伴う悪性細胞の破壊が達成される。
【０２０８】
これは、従来の二特異性抗体とは顕著に対照的である。Ｔ細胞を動員し、ＣＤ３３を発現させる細胞に対する特異性を有する従来の二特異性構築物であれば、全てのＣＤ３３陽性細胞の破壊を媒介するであろう。ＣＤ３３は、多くの骨髄細胞および骨髄前駆細胞上で発現する骨髄系統マーカーであるので、これらの細胞を破壊すれば、長期にわたり持続する無形成が結果としてもたらされ、おそらくは患者の死亡が結果としてもたらされるであろう。Ｔ細胞を動員し、ＣＤ１９陽性細胞に対する特異性を有する従来の二特異性構築物であれば、ＣＤ１９抗原をそれらの細胞表面において保有する全ての細胞の消失をもたらすであろう。ＣＤ１９は、Ｂリンパ球のかなりのサブセット上で発現する。これらの細胞の破壊であれば、重度の免疫系の欠損をもたらすであろう。したがって、ＣＤ３３およびＣＤ１９を表面上で同時に発現させる白血病性細胞を消失させる以外に、ＣＤ３３およびＣＤ１９に対する特異性を伴う従来の二特異性抗体を適用すれば、骨髄細胞およびＢリンパ球の実質的なサブセットの消失がもたらされるであろう。
【０２０９】
したがって、従来の二特異性抗体が、消失させる細胞上の１つの抗原だけを認識するのに対し、本発明に従うエフェクターの活性化は、同定する／消失させる細胞の表面上でおける、２つの特異的抗原の同時的な認識を要請する。その結果、本発明は、特異性の著明な改善および副作用の低減を達成する。
【０２１０】
当業者には、本発明の原理内では、上記の例示的な実施形態に対する多様な変更が可能なことが明らかである。
【０２１１】
例えば、上記の例示的な実施形態で記載した手法は、同定する／消失させる細胞上に同時に存在するが、他の細胞型上には同時に存在しない、抗原Ａ１およびＡ２のそれぞれに特異的に結合する適切な標的化部分Ｔ１およびＴ２を単に選び出すことにより、ＣＤ３３およびＣＤ１９陽性急性白血病細胞以外の、他の種類の腫瘍細胞の同定／消失にも容易に適合させることができる。上記で引用した通り、全てのではないにせよ、多くのがん細胞は（また、がん細胞の前駆細胞／前駆体細胞も）、それ自体では通常の組織上で広く発現するが、非生理学的組合せで発現する場合は悪性表現型を示す、多数の細胞表面分子を発現させる。例えば、ＣＤ３４は、造血幹細胞についてのマーカーであり、ＣＤ７は、リンパ系細胞のサブセット上で検出することができる。しかし、ＣＤ３４とＣＤ７との組合せは、悪性腫瘍と強く関連し、２つの抗原の異常な共発現は、かなりの比率の急性骨髄性白血病において検出することができる（Ossenkoppeleら、Review of the relevance of aberrant antigen expression by flow cytometry in myeloid neoplasms. Br J Haematol 2011、153(4):421〜36.）。同様に、卵巣がん幹細胞についても、ＣＤ４４とＣＤ１１７との異常な共発現が記載されており、膵臓がん誘発細胞についても、ＣＤ４４およびＣＤ２４との異常な共発現が記載されており、結腸がん幹細胞および乳がん幹細胞においても、ＥｐＣＡＭとＣＤ４４との組合せが記載されている（Natasha Y. Frank、Tobias Schatton、Markus H. Frank; The therapeutic promise of the cancer stem cell concept. J Clin Invest. 2010; 120:41〜50）。ＣＤ２４およびＣＤ２９のほか、ＣＤ２４およびＣＤ４９ｆの発現も、乳がんに特異的であることが見出されている（Vassilopoulos Aら、Identification and characterization of cancer initiating cells from BRCA1 related mammary tumours using markers for normal mammary stem cells. Int J Biol Sci 2008; 4:133〜142）。なおさらに、骨髄腫を示すＣＤ３８およびＣＤ１３８など、抗原の発現レベルが高度な組合せは、多数の悪性腫瘍を示す。
【０２１２】
上記で列挙したがん特異的抗原の組合せおよび科学文献から知られる組合せに加えて、特異的な腫瘍細胞上で同時に発現するが、他の細胞上では発現しない２つの抗原のさらなる組合せも、当業者は、簡単に導出することができる。
【０２１３】
第１に、当業者は、それぞれの細胞型の悪性状態に特異的な抗原を、適切な細胞型マーカーまたは細胞系統マーカーと組み合わせることにより、ある種のがんに特異的な抗原の組合せに到達することができる。例えば、炭酸脱水素酵素ＩＸは、腎細胞がんおよび腎細胞がんの転移と強く関連するマーカーであり、これにより、腎細胞の悪性状態についてのマーカーを表す。しかし、この膜に存在するマーカーはまた、通常の腸管細胞上でも発現する。アクアポリンなどの腎臓系統マーカーを、第２の抗原として選択することにより、結果としてもたらされる２つの抗原の組合せは、腎細胞がん細胞および腎細胞がんの転移から結果としてもたらされる細胞に特異的であるのに対し、非悪性腎細胞（炭酸脱水素酵素ＩＸを発現させない）または腸管に由来する細胞（アクアポリンを発現させない）のいずれも、選択される抗原対を特徴としない。
【０２１４】
多様な細胞型の悪性状態のマーカーについての詳細な情報、および多数の細胞型または細胞系統のマーカーについての詳細な情報は、文献資料およびウェブベースの資料（詳細については、下記を参照されたい）から入手可能であるか、または簡単な実験（下記を参照されたい）により得ることができる。
【０２１５】
細胞の悪性状態のマーカーの例には、上皮細胞および乳管型乳がん細胞についてのＥ−カドヘリン；類上皮悪性腫瘍、ならびに卵巣がん細胞、腺がん細胞、および乳がん細胞についてのＣａ−１２５；乳がん細胞についてのＨｅｒ−２／ｎｅｕ；乳がん細胞についての大嚢胞症液タンパク質（ｇｒｏｓｓ  ｃｙｓｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＢＲＳＴ−２タンパク質）；肺がん細胞および乳がん細胞についてのＢＣＡ−２２５（乳がん関連糖タンパク質）；膵臓がん細胞、胆管がん細胞、および腸管がん細胞についてのＣＡ  １９−９（炭水化物抗原１９−９）；結腸直腸がん細胞についてのＣＥＡ；ｇｉｓｔ（消化管間質腫瘍）細胞（ならびに骨髄細胞およびマスト細胞）についてのＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）；リード−スタンバーグ細胞（ならびにＫｉ−１活性化Ｔ細胞およびＢ細胞）についてのＣＤ３０；上皮がん細胞についての上皮抗原（ＢＥＲ−ＥＰ４）、上皮膜抗原、および上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）；多様ながん細胞についての表皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）；多様ながん細胞についての血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）アルファ；黒色腫細胞についての黒色腫関連マーカー／Ｍａｒｔ１／Ｍｅｌａｎ−Ａ；がん幹細胞集団および他の細胞集団についてのＣＤ１３３；腺がん細胞についてのＴＡＧ７２（腫瘍関連ｇｐ  ７２）が含まれる。
【０２１６】
１つの／複数の細胞の悪性状態のマーカーのさらなる例には、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１９、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ６、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）ＩｇＥ、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｓＴｎ（シアリルＴｎ抗原）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｉｇα、Ｉｇβ、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｃｏｒａ抗原、ＥｐｈＡ２、Ｌ６およびＣＯ−２９、ＣＣＲ５、βＨＣＧ、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭酸脱水素酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−アルファ前駆体、Ａ３３抗原、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児型アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＩＩ型ミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）受容体、エンドシアリン、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＦ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、Ｇ２５０、ｇｐ１００、Ｆ１９抗原、およびＥｐｈＡ２が含まれる。
【０２１７】
ある種の細胞型／細胞系統または少数の細胞型／細胞系統に特異的な抗原（細胞型マーカー／細胞系統マーカー）の例には、造血細胞についてのＣＤ４５；内皮細胞、幹細胞、および間質細胞についてのＣＤ３４；骨髄細胞についてのＣＤ３３；形質細胞および上皮細胞のサブセットについてのＣＤ１３８；上皮、骨髄、およびリード−スタンバーグ細胞についてのＣＤ１５；胸腺皮質細胞およびランゲルハンス細胞についてのＣＤ１ａ；胸腺細胞、Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞についてのＣＤ２；Ｔ細胞についてのＣＤ３；ヘルパーＴ細胞についてのＣＤ４；Ｔ細胞、Ｂ細胞のサブセット、および胸腺がん細胞についてのＣＤ５；細胞傷害性Ｔ細胞についてのＣＤ８；Ｂ細胞についてのＣＤ２０；活性化Ｂ細胞についてのＣＤ２３；内皮細胞についてのＣＤ３１；Ｔ細胞、骨髄細胞、Ｂ細胞のサブセット、組織球、および形質細胞についてのＣＤ４３；ＮＫ細胞についてのＣＤ５６；神経内分泌細胞、およびＮＫ細胞についてのＣＤ５７；マクロファージについてのＣＤ６８；Ｂ細胞および形質細胞についてのＣＤ７９ａ；内皮細胞系統についてのＣＤ１４６；肺細胞についてのサーファクタントタンパク質；神経内分泌細胞についてのシナプトフィジン、ＣＤ５６、またはＣＤ５７；筋細胞についてのニコチン性アセチルコリン受容体または筋特異的キナーゼ（ＭＵＳＫ）；筋細胞およびニューロンについての電位依存性カルシウムチャネル（Ｐ／Ｑ型）または電位依存性カリウムチャネル（ＶＧＫＣ）またはＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ）；甲状腺についてのＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）受容体；筋細胞についてのアンフィフィシン；肝細胞につてのＨｅｐＰａｒ−１；神経細胞についてのガングリオシドＧＱ１Ｂ、ＧＤ３、またはＧＭ１；ならびに赤血球生成細胞系統細胞についてのグリコホリンＡが含まれる。
【０２１８】
本発明の目的で、対象の細胞型または細胞系統に対する特異性が不完全な抗原に依拠することが有利でありうる状況があることに注意されたい。例えば、対象の細胞型／細胞系統上でもっぱら見出され、他の任意の細胞型／細胞系統上では見出されない抗原が、知られていない状況、または抗原の専一的特異性を確認することが可能でない状況ではまた、対象の細胞型／細胞系統以外に、１つまたは複数の他の細胞型／細胞系統上に存在する抗原も検討することができる。同様の検討は、細胞の悪性状態のマーカー、なおまたは２つの抗原の組合せの特異性にも当てはまる。したがって、例えば、本発明の目的で、対象の細胞だけに特異的なのではなく、また、１つまたは複数の（少数の）他の悪性細胞の細胞型／細胞系統／種類にも特異的な２つの抗原の組合せを選択する状況もある。
【０２１９】
第２に、当業者は、簡単な実験により、ある種のがんに特異的な抗原の組合せに到達することができる。これは、（１）消失させる腫瘍細胞上の表面抗原を決定するステップと、（２）これらの腫瘍細胞表面抗原間で、他の細胞型上では同時に存在しない（または、いくつかの実施形態では、少数の他の細胞型だけに存在する）２つの抗原を同定するステップとを含みうる。
【０２２０】
それぞれの種類のがんについて、刊行された文献（例えば、David J. Dabbs、Diagnostic immnohistochemistry、Churchill Livingstone、3版（2010）；またはF LinおよびJ Prichard、Handbook of Practical Immnohistochemistry: Frequently Asked Questions、Springer、New York、1版（2011）を参照されたい）から、このような情報が既に利用可能でありうるため、消失させる腫瘍細胞上の表面抗原を決定する実験が必要でない場合もあることが多い。ウェブベースの資料を介して、なおより広範な情報も利用可能である。例えば、米国国立がん研究所（ＮＣＩ）のＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）は、多様な正常細胞、前がん細胞、およびがん細胞の遺伝子発現プロファイルを、体系的に決定している（Strausberg RL. The Cancer Genome Anatomy Project: building a new information and technology platform for cancer research. Molecular Pathology of Early Cancer、1999、（Srivastava, S.、Henson, D.E.、Gazdar, A.編、IOS Press）、365〜370ページ）。ＣＧＡＰのイニシアチブにより作成される資料は、自由に利用可能であり（http://cgap.nci.nih.gov/）、全てのＣＧＡＰデータおよび必要な解析ツールへのアクセスを包含する。同様に、米国国立がん研究所のＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＣＧＣＩ）も、異なる腫瘍に関与するゲノム変化を特徴付けるためのツール、例えば、第２世代の配列決定を用いるエクソーム解析およびトランスクリプトーム解析を含めた、ゲノムの特徴付けの方法に焦点を当てている。ＣＧＣＩにより作成されるデータは、一般にアクセス可能なデータベース（http://cgap.nci.nih.gov/cgci.html）を介して利用可能である。したがって、多くの場合、対象の腫瘍細胞上の、知られている多様な細胞表面タンパク質の存在または非存在についての情報は、これらの一般にアクセス可能なデータベースを単にチェックすることにより、導出することができる。次いで、所望の場合、以下で記載される方法に従う、腫瘍細胞／腫瘍組織の免疫細胞化学解析／免疫組織化学解析による第２のステップにおいて、この情報を検証することができる。
【０２２１】
対象の腫瘍細胞／腫瘍組織が発現させるタンパク質について入手可能な情報がない場合、当業者は、腫瘍細胞／腫瘍組織上の抗原の特徴付けを、抗体パネルを伴う免疫細胞化学法／免疫組織化学法により実行することができる（例えば、F LinおよびJ Prichardによる、「Handbook of Practical Immnohistochemistry: Frequently Asked Questions」、Springer、New York、1版（2011）；またはE HarlowおよびD Laneによる、「Using Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1998）を参照されたい）。略述すると、腫瘍から単離した組織学的調製物または細胞を、潜在的表面抗原を指向する第１の抗体と共にインキュベートし、洗浄するステップの後、第１の抗体のＦｃドメインを指向する第２の抗体によるインキュベーションを行う。標的化された抗原の発現を視覚化するために、この第２の抗体を、フルオロフォアまたはＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）などの酵素で標識する。細胞の表面抗原についてのハイスループットの抗原プロファイリングを目的として用いうる抗体パネルは、多数の製造元から市販されている。
【０２２２】
加えて、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  ＣｏｍｐａｎｙのＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）ベースのハイスループットアレイ技術であるＢＤ  ＦＡＣＳ（商標）ＣＡＰ（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｆｉｌｅ）など、細胞表面におけるタンパク質の発現を同定するおよび解析するための、ハイスループットのプロテオミクスによる細胞の特徴付けにとりわけ専用のツールが市販されている。
【０２２３】
上記の免疫細胞化学解析／免疫組織化学解析／プロテオミクス解析に先立って（または、場合によっては、置きかえて）、腫瘍細胞のゲノムワイド遺伝子発現プロファイリングまたは対象の腫瘍細胞／腫瘍組織が発現させるタンパク質についての質量分析を行うことができる。例えば、腫瘍細胞のゲノムワイド遺伝子発現プロファイリングを実行して、多様な細胞表面分子の発現についてチェックすることができ、次いで、腫瘍細胞の細胞表面上でおけるこのような抗原の存在を、上記の抗体ベースの染色法を介して確認することができる。
【０２２４】
（がん）細胞の表面抗原を特徴付ける手法についてのさらなる情報は、関与の科学文献（例えば、Zhou J、Belov L、Huang PY、Shin JS、Solomon MJ、Chapuis PH、Bokey L、Chan C、Clarke C、Clarke SJ、Christopherson RI. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J Immunol Methods. 2010；355:40〜51；またはCarter P、Smith L、Ryan M. Identification and validation of cell surface antigens for antibody targeting in oncology. Endocr Relat Cancer. 2004；11:659〜87）において入手可能である。
【０２２５】
次の段階では、当業者は、腫瘍細胞の細胞表面抗原間で、他の細胞型では同時に発現しない２つの抗原の組合せを同定することができる。
【０２２６】
文献または一般に利用可能なデータベースが、他の細胞型に由来する抗原の存在または非存在についての詳細な情報を既に提供している場合があることが多い。
【０２２７】
多様な細胞型における多様な細胞表面分子の発現については、過去数十年間にわたり、体内のほとんどの細胞型についての免疫表現型検査および遺伝子発現プロファイリングにより、研究者が体系的に研究している。例えば、３６０を超える「表面抗原分類」抗原（またはＣＤ抗原）の発現についての詳細な情報が、印刷物（例えば、Zola H、Swart B、Nicholson I、およびVoss Eによる、「Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers」、John Wiley & Sons、1版（2007））およびオンラインデポジトリー（例えば、www.hcdm.org/MoleculeInformation/tabid/54/Default.aspx）において入手可能であり、これには、抗原の組織分布および発現レベルについての情報のほか、抗原反応性抗体およびこれらの抗体が結合するエピトープについての情報が含まれる。
【０２２８】
なおさらに、化学コミュニティーにより作成される大量のゲノムデータへのアクセスを提供する、一般に利用可能なデータベースが存在する。例えば、米国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）プラットフォーム（Barrett Tら、NCBI GEO: archive for functional genomics data sets--10 years on. Nucleic Acids Res. 2011；39（データベース特集号）:D1005-10）は、マイクロアレイ、次世代配列決定、および他の形態のハイスループットの機能的ゲノムデータの膨大なコレクションを収蔵し、これらへのアクセスをもたらし、この情報に容易にアクセスするためのウェブベースのインターフェースおよびアプリケーションもさらに提供している（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。
【０２２９】
対象の腫瘍細胞以外の他の細胞型を収載しないと考えられるこれらの資料を介して、２つの抗原の対を同定したら、当業者は、Ｐ１およびＰ２ポリペプチド構築物をさらに開発するための、抗原の組合せの適切性を容易に検証することができる。同定された２つの抗原の組合せが、腫瘍細胞以外の他の細胞型では実際に同時には発現しないことのこのような検証を、２つの抗原に対する抗体により分類された細胞型および／または組織の（最適な程度に大きな）コレクションについての、免疫組織化学解析／免疫細胞化学解析により実行することができる。任意の種類の細胞および組織は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得ることができ、病理学教室からも得ることができ、大学および研究機関と関連する組織バンクからも得ることができる。適切な抗原の組合せは、もっぱら腫瘍細胞を染色し、健常な組織または健常な細胞は染色しない（すなわち、腫瘍細胞は、対の抗体の両方で染色されるが、他の組織／細胞は抗体の両方で染色されるわけではない）抗体の対として規定される。
【０２３０】
多くの状況では、最も高度な特異性（好ましくは絶対的な特異性）が当然ながら所望されるが、低度な特異性が受容可能な状況があることに注意されたい。例えば、ポリペプチドセットを診断目的で用いる場合、他の細胞型または組織とのある程度の交差反応性は受容可能でありうる（とりわけ、充実性腫瘍の場合、さらなる位置情報が、腫瘍細胞を交差反応細胞から弁別する一助となるので）。なおさらに、ポリペプチドセットを治療目的で用いる場合もまた、処置される患者における疾患の重症度および交差反応性の影響を受ける細胞型／組織に応じて、他の細胞型または組織とのある程度の交差反応性は受容可能でありうる。移植環境の文脈（下記を参照されたい）では、低度な特異性が受容可能でありうる他の状況が生じうる。
【０２３１】
適切な抗原の組合せについての手がかりを、文献または公表のデータベースから導出できない場合、他の細胞型に由来する腫瘍細胞の細胞表面抗原の存在／非存在を、簡単な実験によりチェックすることができる。この目的のために、上記で指摘された供給源から得られる様々な細胞型および／または組織を、プロテオミクスによる細胞の特徴付け、免疫細胞化学解析／免疫組織化学解析、および／または遺伝子発現プロファイリングにかけることができる（多様な異なる治療状況または診断状況に適合させうる、多様な本発明に従う構築物をデザインするために用いうるデータを得るためには、非腫瘍細胞／腫瘍組織についてのこのような解析を一度だけ実行しなければならないことに注意されたい）。得られた結果を、対象の腫瘍細胞の細胞表面抗原についての情報と比較したら、対象の腫瘍細胞以外の他の任意の細胞上には存在しない２つの抗原の組合せを容易に同定することができる。
【０２３２】
腫瘍細胞に特異的な２つの抗原の対を同定する、同様の体系的な手法はまた、ゲノムワイド遺伝子発現プロファイリングに続いて、免疫組織化学に依拠する、Ｂａｌａｇｕｒｕｎａｔｈａｎによる近年の刊行物（Yoganand Balagurunathan、Gene expression profiling-based identification of cell-surface targets for developing multimeric ligands in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther 2008；7．3071〜3080）においても記載されている。この論考の著者らは、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、相当数の膵臓がん検体および通常の組織試料について、ｍＲＮＡ遺伝子発現プロファイルのデータベースを作成した。細胞表面分子をコードする遺伝子についての発現データは、腫瘍細胞上で優先的に発現するが、通常の組織内では発現しない遺伝子の組合せを同定するための、多変量規則ベースの計算法により解析した。次いで、膵臓の腫瘍組織についての標準的な免疫組織化学法および通常の組織マイクロアレイを用いて、腫瘍特異的な抗原の組合せを構成する抗原の異常な共発現を確認した。
【０２３３】
対象の腫瘍細胞に特異的なこのような抗原の組合せを同定および検証したら、ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２の構築物を、標準的なタンパク質操作法および分子生物学法により操作することができる（例えば、G HowardおよびM Kaser、Making and Using Antibodies: A Practical Handbook、CRC Press、1版（2006）; Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York（2001）を参照されたい）。
【０２３４】
多くの細胞表面分子について、特異的なモノクローナル抗体が特徴付けられており、したがって、たやすく利用可能である。したがって、多くの場合、当業者は、同定された抗原の組合せの抗原に特異的なモノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞に対してアクセスすることができる。所与の抗原に特異的な抗体パネルから選び出すための選択肢を有するので、当業者は、抗原を発現させる細胞の、エフェクター細胞からの距離を最小化するために、膜に近接するエピトープに結合する反応性抗体を選び出すことができる（Bluemel C、Hausmann S、Fluhr P、Sriskandarajah M、Stallcup WB、Baeuerle PA、Kufer P. Epitope distance to the target cell membrane and antigen size determine the potency of T cell-mediated lysis by BiTE antibodies specific for a large melanoma surface antigen. Cancer Immunol Immunother.2010年8月；59(8):1197〜209）。このような抗体が、同定された抗原の組合せの抗原の一方または両方に対して利用可能でない場合は、抗原に対するモノクローナル抗体を、標準的な技法により創成することができる（例えば、G HowardおよびM Kaser、Making and Using Antibodies: A Practical Handbook、CRC Press、1版（2006））。なおさらに、多様な業者が、特製のモノクローナル抗体およびハイブリドーマ細胞を創成するための完全なサービスを提供している。
【０２３５】
対象のモノクローナル抗体の可変ドメインをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡは、ＰＣＲ増幅またはクローニング（Orlandi R、Gussow PT、Jones: Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A 1989、86(10):3833〜3837; Wang Z、Raifu M、Howard M、Smith L、Hansen D、Goldsby R、Ratner D: Universal PCR amplification of mouse immunoglobulin gene variable regions: the design of degenerate primers and an assessment of the effect of DNA polymerase 3' to 5'exonuclease activity. J Immunol Methods 2000、233(1〜2):167〜177; Essono S、Frobert Y、Grassi J、Cremino C、Boquet D: A general method allowing the design of oligonucleotide primers to amplify the variable regions from immunoglobulin cDNA. J Immunol Methods 2003、279:251〜266; G HowardおよびM Kaser、Making and Using Antibodies: A Practical Handbook、CRC Press、1版（2006））により、ハイブリドーマから得ることもでき、それぞれの抗体の可変断片のＤＮＡの配列を含む既に確立されているベクターから得ることもできる。配列は、多くの配列が寄託されている公表データベースから抽出しうることが多く、次いで、多様な市販のサービスプロバイダー（例えば、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＵＳＡ）により提供される遺伝子合成により構築物を創成することもなお可能である。
【０２３６】
ポリペプチドＰ１の構築物を形成するために、同定された抗原対の第１の抗原に特異的な抗体の可変断片Ｆｖをコードする配列（または、場合によって、その配列に由来する単鎖可変断片の配列）を、第１の標的化部分（Ｔ１）に用い、適切なリンカー（例えば、１２アミノ酸未満をコードする）を介して、機能ドメイン（例えば、抗ＣＤ３抗体のＶＬドメイン）の第１の断片Ｆ１をコードする配列へと連結する。同様に、ポリペプチドＰ２の構築物を形成するために、同定された抗原対の第２の抗原に特異的な抗体の可変断片Ｆｖをコードする配列（または、場合によって、その配列に由来する単鎖可変断片の配列）を、第２の標的化部分（Ｔ２）に用い、適切なリンカーを介して、機能ドメイン（例えば、抗ＣＤ３抗体のＶＨドメイン）の第２の断片Ｆ２をコードする配列へと連結する。
【０２３７】
本発明に従うポリペプチドＰ１またはＰ２の任意の構築物については、構築物を具体的な必要に適合させるために、構築物または構築物を形成するために用いられる配列に対する修飾を検討する。例えば、ヒトにおけるその免疫原性を低減するかまたは消失させる形で、構築物を修飾することができる。配列がマウス抗体などの非ヒト親抗体に由来する場合は、親抗体の抗原結合特性を保持するかまたは実質的に保持しながら、ヒトにおける免疫原性の低減を結果としてもたらす（当業者には「ヒト化」抗体／構築物として知られている）、配列への修飾を実行することができる。
【０２３８】
当業者には、本出願において記載されている実施形態および変更に応じるための、上記の手順の多様な改変および適合が明らかである。
【０２３９】
標的化部分Ｔ１およびＴ２が特異的に結合する抗原に関する変更に加えて、多様な他の修飾も可能である。例えば、標的化部分Ｔ１および／またはＴ２としての単鎖変異体断片（ｓｃＦｖ）ではなく、他の種類の一価抗体または抗体様の構造を使用することもできる。例えば、ラマ、ラクダ、またはサメ抗体に由来する抗体／抗体様の構造を用いることができる。ラマ抗体、ラクダ抗体、およびサメ抗体は、単一のドメインにより構成される抗原結合部分（ＶＨおよびＶＬ鎖ではなく）を有するので、結果としてもたらされるポリペプチドＰ１またはＰ２ははるかに小型であり、このため、腫瘍組織へと良好に浸透しうる。
【０２４０】
さらに、多くの腫瘍関連抗原は、細胞表面結合受容体であるので、標的化部分Ｔ１および／またはＴ２の単鎖Ｆｖは、このような細胞表面結合受容体の天然リガンドまたは人工リガンドで置きかえることができる。これらの天然リガンドまたは人工リガンドなどの抗体は、標的受容体に対する優れた特異性を付与する。代替的に、標的化部分Ｔ１および／またはＴ２は、アプタマーでもありうる。
【０２４１】
なおさらに、標的化部分の抗原に対する結合アフィニティーを増強するために、標的化部分を、グリコシル化または他の種類の翻訳後修飾もしくは化学修飾により多量体化および／または改変することもでき、部位指向突然変異誘発またはファージディスプレイ選択過程を介して最適化することもできる。
【０２４２】
なおさらに、断片Ｆ１およびＦ２（すなわち、上記の例示的な実施形態における、抗ＣＤ３  ＦｖのＶＬ断片およびＶＨ断片）は、２つの断片の相補に対して異なる生物学的効果を結果としてもたらす、異なる機能ドメインＦの断片で置きかえることができる。抗ＣＤ５６、抗ＣＤ１ａ、または抗ＣＤ１６ａの断片を用いることにより、ナチュラルキラー細胞を動員し、活性化させることができる。抗ＣＤ１６の断片を用いることにより、ナチュラルキラー細胞、好中性多型核白血球、単球、およびマクロファージを動員し、活性化させることができる。抗ＣＤ３２ａ、抗ＣＤ３２ｂ、抗ＣＤ８９、抗ＣＤ１６ａ、または抗ＣＤ６４の断片を用いることにより、マクロファージを動員し、活性化させることができる。抗ＣＤ３２ａ、抗ＣＤ３２ｂ、抗ＣＤ６４、または抗ＣＤ８９の断片を用いることにより、単球を動員し、活性化させることができる。抗ＣＤ１６ｂ、抗ＣＤ８９、抗ＣＤ３２ａ、抗ＣＤ３２ｂ、または抗ＣＤ６４の断片を用いることにより、顆粒球を動員し、活性化させることができる。なおさらに、抗ＣＤ３と代替的に、抗ＣＤ２、抗ＣＤ５、抗ＣＤ２８、または抗ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）の断片を用いることによってもまた、Ｔ細胞を動員し、活性化することができる。抗体の結合を介するエフェクター細胞の動員および活性化に関するさらなる情報またはさらなる選択肢は、公表された文献、例えば、Roland E. Kontermann（編）による「Bispecific Antibodies」、Springer Berlin Heidelberg、1版（2011）から入手可能である。
【０２４３】
さらなる選択肢は、２つの断片が相補するとエフェクター細胞上で抗原に結合するが、エフェクター細胞のこの抗原への結合が、前記エフェクター細胞の活性化を引き起こさない、機能ドメインＦの断片Ｆ１およびＦ２を伴うポリペプチドセットＰ１およびＰ２を用いることである。次いで、このポリペプチドセット（「第１のポリペプチドセット」）を、相補すると、同じエフェクター細胞上の第２の異なる抗原に結合するが、ここでもまた、エフェクター細胞のこの抗原への結合が、エフェクター細胞の活性化を引き起こさない、機能ドメインＦの断片を伴う第２のポリペプチドセットと組み合わせて用いる（例えば、患者へと投与する）。第１のポリペプチドセットおよび第２のポリペプチドセットが結合する抗原は、エフェクター細胞上で、２つの抗原のうちの１つだけが結合しても、エフェクター細胞の活性化を結果としてもたらさないが、エフェクター細胞上で抗原の両方が同時に結合すれば、エフェクター細胞の活性化がもたらされるように選び出す。これは、（１）エフェクター細胞上で、個別には機能せず、第２の抗原の共刺激を要請する抗原を用いうる利点、および（２）ある種の細胞（がん細胞など）を他の細胞から差別化する特異性を決定付ける異なる抗原の数を、２つの異なる抗原（第１のポリペプチドセットと第２のポリペプチドセットとは、それぞれ、同じ標的化部分Ｔ１およびＴ２を有する）から、４つの異なる抗原（第１のポリペプチドセットと第２のポリペプチドセットとは、標的化部分を共有しない）まで増大させうる利点を有する。
【０２４４】
同様の効果は、標的化部分は異なるが、機能ドメインは同じ２つのポリペプチドセットにより達成することができる。これらのポリペプチドセットは、通常は各ポリペプチドセット自体でエフェクター細胞を活性化させることを可能とするエフェクター細胞抗原を指向する機能ドメインを有するようにデザインする。しかし、いずれのポリペプチドセットも、有効なエフェクター細胞の活性化を引き起こすには余りに低すぎる濃度で用いる。ポリペプチドセットの両方が同時に存在する（例えば、患者へと同時的に投与するとき）場合、各ポリペプチドセット自体はエフェクター細胞を活性化することが可能ではない（その低濃度に起因して）が、ポリペプチドセットの両方の組合せはエフェクター細胞を活性化することが可能である（２つのポリペプチドセットの効果が相乗作用的に作用し、これにより、２つのポリペプチドセットにより引き起こされる効果の合計は、エフェクター細胞を活性化させるのに十分であるため）。
【０２４５】
エフェクター細胞の動員／活性化に対する別の代替法として述べると、二特異性抗体構築物について十分に確立されている「前処理」法（Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Goldenberg DM、Chatal JF、Barbet J、Boerman O、Sharkey RM. Update Cancer Ther. 2007年3月;2(1):19〜31）を追求することもできる。この目的のために、Ｆ１およびＦ２を、抗原に特異的な抗体のＶＨ断片およびＶＬ断片、担体分子（すなわち、前記ポリペプチドセットが投与される患者の免疫系により外来として認識されない分子／分子の一部、またはそれが投与される患者による免疫反応を引き起こさないか、もしくは弱い免疫反応を引き起こすにとどまる分子）、またはアフィニティータグで置換する。ポリペプチドＰ１およびＰ２の投与に続き（またはこれと同時に）、前記抗原、担体分子、またはアフィニティータグへとカップリングされた治療用化合物または診断用化合物を投与する。ポリペプチドＰ１およびポリペプチドＰ２のいずれも、抗原Ａ１およびＡ２の両方をそれらの表面に保有する細胞だけに結合する。結果として、これらの細胞だけにおいて、機能的な相補により、前記抗原、担体分子、またはアフィニティータグを介して、治療用化合物または診断用化合物を動員することが可能な結合部位の創成がもたらされる。この手法は、毒素もしくは放射性物質などの治療用化合物または診断用化合物の正確な投与および投薬の可能性と組み合わせて、標的細胞の専一的対象化を可能としながら、抗原を発現させないかまたは抗原のうちの１つだけを発現させる細胞には影響を及ぼさない。
【０２４６】
適切な担体分子は、例えば、ペプチドまたは炭水化物分子でありうる。担体分子は、代謝的に不活性で、血中に残存し、それらが十分に低分子である場合は、腎臓を介して消失する、一般的な血漿増量剤である、ゼラチン、デキストラン、またはヒドロキシエチルデンプンでありうることが好ましい。代替的に、担体分子は、糸球体クリアランスを決定するために臨床で日常的に用いられる、代謝的な不活性分子であるイヌリンでありうる（そして、加えて、イヌリンを特異的に認識する抗体も存在する）。
【０２４７】
適切なアフィニティータグは、例えば、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）タグでありうる。
【０２４８】
抗原、担体分子、またはアフィニティータグへとカップリングさせた治療用化合物は、例えば、放射性化合物または毒素でありうる。
【０２４９】
適切な放射性化合物は、例えば、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１３１Ｉ、３２Ｐ、１０Ｂ、または２１３Ｂｉを含む化合物である。放射性化合物へと連結された抗原、担体分子、またはアフィニティータグが、第１の抗原および第２の抗原の両方を発現させる細胞へと動員されると、放射能の腫瘍部位への蓄積がもたらされ、腫瘍細胞／腫瘍組織の特異的な破壊が結果としてもたらされる。
【０２５０】
代替的に、抗原、担体分子、またはアフィニティータグへとカップリングさせた治療用化合物は、例えば、あらかじめ細胞表面に結合しなければ細胞膜を越えることが可能でない毒性化合物でありうる。
【０２５１】
この前提条件は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、ボツリヌス菌（C. botulinum）、Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）、炭疽菌（B. anthracis）など、多数の病原性細菌に由来する、古典的なＡＢ毒素のＡ成分により満たされる。ＡＢ毒素とは、内部細胞機能に干渉する２成分のタンパク質複合体である。Ａ成分とは、「活性」成分（すなわち、膜を透過すると細胞を死滅させる）であるが、それ自体では細胞膜を越えることが可能でない。Ｂ成分とは、それ自体は非毒性であるが、成分Ａの取込みおよび膜透過に不可欠な「結合」成分である。
【０２５２】
例えば、炭疽菌（Bacillus anthracis）の防御抗原（ＰＡ）とは、活性炭疽菌外毒素の浮腫因子および致死因子（ＬＦ）の取込みを媒介する、古典的な毒素のＢ成分である。ＬＦ自体は、膜を透過せず、このため、その病原能を発揮できないので、ＰＡ成分を伴わないＬＦは、非毒性である（Pezard C、Berche P、Mock M.「Contribution of individual toxin components to virulence of Bacillus anthracis」、1991 Infect. Immun. 59(10):3472）。しかし、細胞表面分子に結合すると、ＬＦは内部移行され、細胞に対して高度に毒性となる。
【０２５３】
ポリペプチドＰ１とポリペプチドＰ２とが二量体化すると、機能ドメインＦの機能が再構成される。再構成された機能ドメインの、毒素へとカップリングさせた抗原、担体分子、またはアフィニティータグとの相互作用を介して、毒素は、標的細胞の細胞膜へと動員され、細胞へと組み込まれ、細胞を死滅させる。
【０２５４】
大半は抗体様のドメインまたは天然のリガンドである標的化部分を、毒素成分へとカップリングさせた、いわゆる抗毒素において既に広く用いられている（例えば、Immunotoxins for targeted cancer therapy. Kreitman RJ、AAPS J. 2006年8月18日；8(3):E532〜51を参照されたい）ので、当業者が、この原理を、本発明の目的へと適合させることは容易である。例には、ジフテリア毒素に基づく抗毒素（一部のＴ細胞リンパ腫の処置について、ＦＤＡにより承認されている、デニロイキンディフチトクス（米国における商標名：Ｏｎｔａｋ）など）または炭疽菌（B. anthracis）致死因子に基づく抗毒素（Pastan I、Hassan R、FitzGerald DJ、Kreitman RJ（2007）。「Immunotoxin treatment of cancer」。Annu. Rev. Med. 58:221〜37）が含まれる。
【０２５５】
ＡＢ毒素の適切なＡ成分は、例えば、炭疽菌（B. anthracis）浮腫因子、炭疽菌（B. anthracis）致死因子、ウェルシュ菌（C. perfringens）イオタ毒素、ボツリヌス菌（C. botulinum）Ｃ２毒素、Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼジフテリア菌（C. diphtheriae）ジフテリア毒素断片Ａでありうる。
【０２５６】
代替的に、治療用化合物は、例えば、細胞内に入ると毒性であり、あらかじめ細胞表面に結合しなくとも、それ自体で細胞膜を越えることが可能な細胞傷害性化合物でありうる。この場合には、治療用化合物をカップリングさせる抗原、担体分子、またはアフィニティータグを、結果としてもたらされるコンジュゲート（すなわち、抗原／担体分子／アフィニティータグへと連結された治療用化合物）が、細胞表面へとあらかじめ結合しなければ、このコンジュゲートが、細胞膜を越え、細胞に侵入することを阻止するように選択する（適切な担体分子は、例えば、ヒドロキシエチルデンプン担体でありうる）。したがって、このようなコンジュゲートは、それらの細胞表面にあらかじめ結合しなければ、細胞に侵入しないが、細胞表面に結合すると、このようなコンジュゲートは細胞へと内部移行され、毒性化合物が細胞を死滅させる。コンジュゲートは、本発明のポリペプチドセットの存在下で、抗原Ａ１およびＡ２の両方をそれらの細胞表面において同時に発現させる細胞へと動員されない限り、細胞に結合しない。このような細胞は、ポリペプチドＰ１およびＰ２の両方に結合し、これらを動員し、再構成された機能ドメインは、抗原／担体分子／アフィニティータグに特異的に結合し、これらを動員し、この結果、治療用化合物の内部移行がもたらされる。その結果、抗原Ａ１およびＡ２の両方をそれらの細胞表面において保有する細胞の特異的な殺滅が達成される。この文脈において用いられうる細胞傷害性化合物には、例えば、アウリスタチン、リシン、サポニン、ブリドイン１、ブーガニン、ゲロニン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、抗葉酸、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ、アブリン、モデクシン、またはリステリオリシンＯが含まれる。
【０２５７】
抗原、担体分子、またはアフィニティータグへとカップリングさせた診断用化合物は、例えば、放射性化合物、フルオロフォア、または生物発光を媒介することが可能な化合物でありうる。
【０２５８】
適切な放射性化合物は、例えば、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、８２Ｒｂ、または２０１Ｔｌを含む化合物である。このような化合物は、臨床においてよく知られている医療用造影手順により検出される。
【０２５９】
代替的に、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＧＦＰ変異体（例えば、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、またはＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質））などの蛍光化合物を診断用化合物として用いることもでき、ＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレセイン）もしくはＰＥ（フィコエリトリン）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓにより販売されているＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８および関連色素など）、またはシアニン色素（Ｃｙ３（インドカルボシアニン）もしくはＣｙ５（インドジカルボシアニン）または関連の色素など）などの蛍光低分子化合物を診断用化合物として用いることもできる。
【０２６０】
代替的に、ルシフェラーゼ、例えば、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Chopra A. Gaussia princeps luciferase. Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)［オンラインのデータベース］。Bethesda（MD）：National Library of Medicine（US）、NCBI；2004〜2012. http://micad.nih.gov.から入手可能である）など、生物発光を媒介することが可能な化合物を、診断用化合物として用いることもできる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける造影のためのＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの使用は、十分に確立されている（例えば、Santos EBら、Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nat Med. 2009年3月;15(3):338〜44. Epub 2009年2月15日；またはInoue Yら、Gaussia luciferase for bioluminescence tumor monitoring in comparison with firefly luciferase. Mol Imaging. 2011年10月1日;10(5):377〜85. doi:10.2310/7290.2010.00057. Epub 2011年4月26日を参照されたい；さらなる詳細についてはまた、下記も参照されたい）。
【０２６１】
なおさらに、断片Ｆ１およびＦ２（すなわち、上記の例示的な実施形態における、抗ＣＤ３  ＦｖのＶＬ断片およびＶＨ断片）を、治療用化合物または診断用化合物に特異的な抗体のＶＬ断片およびＶＨ断片で置きかえることもできる（すなわち、この場合には、機能ドメインＦを、治療用化合物または診断用化合物に直接結合させることが可能である）。この場合、「前処理」法の文脈において上記の同じ治療用化合物および診断用化合物を検討することができる。
【０２６２】
さらに、断片Ｆ１およびＦ２（すなわち、上記の例示的な実施形態における、抗ＣＤ３  ＦｖのＶＬ断片およびＶＨ断片）は、それら自体では生物学的に不活性であるが、２つの断片が会合し、機能的な相補がなされ、これにより、抗原Ａ１およびＡ２の両方を保有する細胞の特異的な同定が可能となると、それらの機能（すなわち、蛍光または生物発光を媒介するそれらの能力）を取り戻す、蛍光化合物または生物発光化合物の断片で置きかえることもできる。
【０２６３】
当技術分野では、この文脈において用いられうる、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＧＦＰ誘導体（ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）およびＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、Ｖｅｎｕｓ（Nagai Tら、A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 2002年1月;20(1):87〜90）、またはＣｅｒｕｌｅａｎ（Ｓ７２Ａ置換、Ｙ１４５Ａ置換、およびＨ１４８Ｄ置換により増強されたＣＦＰ）など）が含まれるがこれらに限定されない、多数の蛍光の分子がよく知られ、特徴付けられている。これらの分子については、二分子蛍光相補（ＢｉＦＣ）と呼ばれる過程において緊密に近接する状況下でセルフアセンブルするスプリット断片が記載されている。
【０２６４】
例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｍ１５３Ｔ置換を伴うＶｅｎｕｓ、またはＣｅｒｕｌｅａｎは、アミノ酸１５５の後でスプリットしうる（すなわち、例えば、断片Ｆ１が、ＧＦＰのアミノ酸１〜１５５を含みうるのに対し、断片Ｆ２は、ＧＦＰのアミノ酸１５６〜２４５を含みうるか、またはこの逆が成り立つ）。代替的に、ＹＦＰまたはＶｅｎｕｓは、アミノ酸１７３の後でスプリットしうる。スプリットＧＦＰおよびスプリットＧＦＰ変異体についてのさらなる詳細は、Kerppola TK.、Visualization of molecular interactions using bimolecular fluorescence complementation analysis: characteristics of protein fragment complementation. Chem Soc Rev. 2009；38:2876〜86において見出すことができる。
【０２６５】
生物発光を媒介し、この文脈において用いられうる分子の例は、スプリットルシフェラーゼでありうる。活性とされる共因子を要請せず、青色光を発する反応において、基質である腔腸動物ルシフェリン（セレンテラジン）の酸化を触媒する、ガウシア・プリンケプス（Gaussia princeps）のルシフェラーゼ、またはＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの誘導体（Remy IおよびMichnick S、A highly sensitive protein-protein interaction assay based on Gaussia luciferase. Nature Methods-3、977〜979（2006））が特に適する。例えば、断片Ｆ１が、ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼのＮ末端〜Ｇｌｙ−９３の断片を含みうるのに対し、断片Ｆ２は、ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼのＧｌｕ−９４〜Ｃ末端の断片を含みうるか、またはこの逆が成り立つ（詳細については、Remy IおよびMichnick S、Nature Methods、2006を参照されたい）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧａｕｓｓｉａスプリットルシフェラーゼ系の適用は、確立されており（Lukerら、In vivo imaging of ligand receptor binding with Gaussia luciferase complementation. Nature Medicine 2011、doi:10.1038/nm.2590）、当業者による、本発明の目的への簡単な適合が可能である。
【０２６６】
がん細胞が組織に浸潤し、全ての形質転換細胞の完全な消失が治癒の前提条件である場合、腫瘍病変の生体内造影は、極めて重要である。一部の臨床環境では既に利用されている蛍光または生物発光の手術中における使用（van Dam GMら、Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat Med. 2011年9月18日;17(10):1315〜9; Lukerら、In vivo imaging of ligand receptor binding with Gaussia luciferase complementation. Nature Medicine 2011、doi:10.1038/nm.2590）と同様に、手術部位において播種性がん細胞を探索する外科医は、対象とされる抗原プロファイルを異常に発現させる細胞を検出するために、標的化部分へと融合させたスプリットＧＦＰもしくはスプリットＧＦＰ誘導体およびレーザー支援マルチスペクトル蛍光カメラシステムを用いうる。
【０２６７】
相補スプリットルシフェラーゼを検出するためには、ルシフェリンまたはセレンテラジンでありうるルシフェラーゼ基質の適用が必須である。セレンテラジンは、ＡＴＰに依存せずに光を発し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける造影およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける適用について十分に確立されているため、セレンテラジンが好ましい。外科医は、腫瘍をポリペプチドＰ１およびＰ２でタグ付けして、非毒性量のセレンテラジンを静脈内注射した後、がん細胞を視覚化することが可能であろう。
【０２６８】
別の例示的な実施形態では、造血系腫瘍を患い、別の者（ドナー）からの健常な造血細胞の移植を施された患者の文脈において、本発明の原理を適用する。この場合、健常な造血細胞をドナーから移植した後で、残存するレシピエントの悪性造血細胞を特異的に消失させる（または検出する）ために、本発明に従うポリペプチドセットを用いることができる。
【０２６９】
造血系腫瘍を患う患者における悪性造血細胞を破壊するために、患者を、化学療法および／または放射線療法にかけることができる。その後、患者には、ドナーからの健常な造血細胞の移植を施す。
【０２７０】
移植片拒絶または移植片対宿主病の危険性を最小化するために、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）分子の同じセットを有するドナーからの組織／細胞（例えば、骨髄）の移植が通例では好ましい。しかし、ＭＨＣ分子のセットが同じドナー（「ＨＬＡ同一ドナー」）を同定できないことが多い。したがって、ＭＨＣ変異体のセット内に１つまたは２つの不適合を伴う移植片、最大で３つの不適合を伴う非関連臍帯血、またはハプロタイプの一致する移植片を使用することが多くなりつつある。したがって、レシピエントの細胞が発現させるＭＨＣ分子のセットと、ドナーの細胞が発現させるＭＨＣ分子のセットの間に、少なくとも１つの顕著な差違があることが一般的である。
【０２７１】
本発明のこの例示的な実施形態に従う移植では、それらのＨＬＡ変異体のうちの少なくとも１つに関してレシピエント細胞とは異なるドナー細胞を用いる。これは、レシピエント細胞の細胞表面には存在するがドナー細胞の細胞表面には存在しない、少なくとも１つの「弁別抗原」があることを意味する。例えば、患者（すなわち、レシピエント）がＨＬＡ−Ａ２陽性であるのに対し、ドナーはＨＬＡ−Ａ２陰性である場合、弁別抗原は、ＨＬＡ−Ａ２でありうる。
【０２７２】
化学療法／放射線療法にもかかわらず、レシピエントの個々の悪性造血細胞は、根絶を免れる可能性がある。存続する悪性造血細胞はレシピエント細胞であるので、それらは、レシピエント細胞をドナー細胞から差別化する弁別抗原を保有する。同時に、それらは、造血系統由来の細胞であり、このため、ＣＤ４５など、この細胞系統のマーカーを、それらの細胞表面に有する。患者の白血病性芽球および他の造血細胞は、弁別抗原（この場合、ＨＬＡ−Ａ２）と、造血細胞系統のマーカー（この場合、ＣＤ４５）とを同時に提示する唯一の細胞である。本発明に従うポリペプチドセットは、これらの細胞を特異的に消失させるために、この事実を利用する。
【０２７３】
この目的のために、第１のポリペプチドＰ１の第１の標的化部分Ｔ１は、レシピエント細胞上だけに存在する弁別抗原（この場合、ＨＬＡ−Ａ２）に特異的なｓｃＦｖでありうる。機能ドメインＦの断片Ｆ１としては、ＣＤ３ε特異的抗体の軽鎖（ＶＬ）可変領域を選び出すことができる。第２のポリペプチドＰ２の第２の標的化部分Ｔ２は、ＣＤ４５に特異的な単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）でありうる。機能ドメインＦの断片Ｆ２としては、前記ＣＤ３ε特異的抗体の重鎖（ＶＨ）可変領域を選び出すことができる。（当然ながら、ＣＤ３ε特異的抗体の重鎖（ＶＨ）可変領域を断片Ｆ１として用い、前記ＣＤ３ε特異的抗体の軽鎖（ＶＬ）可変領域を断片Ｆ２として用いることも同様に可能である。当業者に明らかである通り、これは、一般的な原理であり、断片Ｆ１に用いられる断片と断片Ｆ２に用いられる断片とを切り換えることが一般に可能である。）ＶＨの非存在下では、ＣＤ３ε特異的抗体のＶＬがＣＤ３εを動員することは可能でなく、ＶＬの非存在下では、ＣＤ３ε特異的抗体のＶＨがＣＤ３εを動員することも可能でない。したがって、Ｐ１またはＰ２のいずれも、それ自体でＣＤ３εに結合することが可能ではない。
【０２７４】
しかし、弁別抗原（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）およびＣＤ４５抗原の両方が単一の細胞上に存在する場合、それらのそれぞれが抗原へと結合すると、２つのポリペプチドＰ１とＰ２とは緊密に近接する。結果として、対合していなかったＶＨドメインとＶＬドメインとはアセンブルし、ポリペプチドＰ１とポリペプチドＰ２とのヘテロ二量体化を結果としてもたらし、ＣＤ３εに結合することが可能なＶＨドメインおよびＶＬドメインからの、機能的な可変抗体断片Ｆｖの形成を結果としてもたらす（図２を参照されたい）。
【０２７５】
結果として、Ｔ細胞は、ＣＤ３εを介して動員され、活性化し、ＨＬＡ−Ａ２およびＣＤ４５の両方をその細胞表面上で保有する細胞を、細胞傷害性Ｔ細胞応答により、特異的に消失させる。
【０２７６】
当業者は、本発明の原理内では、この例示的な実施形態に対する多様な変更が可能なことを理解する。
【０２７７】
例えば、ポリペプチドＰ２では、造血細胞系統マーカーＣＤ４５を認識するｓｃＦｖ断片を、異なる細胞系統または細胞型のマーカーを認識するｓｃＦｖ断片で置きかえることができる、すなわち、標的化部分Ｔ２は、造血細胞系統以外の細胞系統、またはある種の細胞型に特異的な抗原に特異的に結合するドメインでありうる（この文脈において用いられうる多様な細胞系統マーカーおよび細胞型マーカーの詳細なリストについては、David J. Dabbs、Diagnostic immnohistochemistry、Churchill Livingstone、3版（2010）；またはF LinおよびJ Prichard、Handbook of Practical Immnohistochemistry: Frequently Asked Questions、Springer、New York、1版（2011）を参照されたい）。ポリペプチドセットを、代替的な細胞系統マーカー／細胞型マーカーへと適合させるには、ポリペプチドＰ２の標的化部分Ｔ２を、所望の代替的な細胞系統マーカー／細胞型マーカーに対する結合特異性を有する標的化部分で置きかえれば十分である。
【０２７８】
例えば、転移性腎細胞がん（ＲＣＣ）の状況ならば、当業者は、発現が腎細胞に制約された細胞表面タンパク質についての情報のための上記で引用したデータベースを照会しうるであろう。他の多くの分子の間で、当業者は、アクアポリンファミリーのある種のメンバーの発現が、腎細胞および赤血球に限定されることを知るであろう。この情報を得たら、当業者は、腎細胞および赤血球に限定されるアクアポリンファミリーメンバーを認識するポリペプチドＰ２であって、ＣＤ３ε特異的抗体の重鎖（ＶＨ）可変領域へと融合させたポリペプチドＰ２を構築することになる。腎細胞がんを患う患者が、ＨＬＡ  Ａ２陽性であり、健常なドナーからの腎臓移植片がＨＬＡ  Ａ２陰性である場合、患者を処置する医師は、２つの構築物（抗ＣＤ３（ＶＨ）へと融合させた抗アクアポリン、および前記ＣＤ３ε特異的抗体の軽鎖（ＶＬ）へと融合させた抗ＨＬＡ  Ａ２）を使用しうる。この場合には、前記アクアポリンとＨＬＡ  Ａ２とを同時に発現させる全ての細胞は、腎細胞がん細胞および転移性組織である細胞および組織であるＴ細胞による溶解のためにタグ付けされる。健常なドナーにより提供された腎細胞は、ＨＬＡ  Ａ２陰性であり、攻撃されることはない。赤血球は、個体発生過程と共にＨＬＡの発現を失い、このため、ＨＬＡ分子をそれらの表面上で保有しないので、大量のアクアポリンを発現させるにもかかわらず、攻撃を免れる。ここでもまた、従来の、アクアポリンを対象とする非相補二特異性抗体であれば、ドナーおよびレシピエントに由来する全ての腎細胞の殺滅のほか、赤血球の殺滅も媒介するであろう。ＨＬＡ  Ａ２陽性患者におけるＨＬＡ  Ａ２を対象とする二特異性抗体は、赤血球を除くあらゆるレシピエント細胞が、ＨＬＡ  Ａ２を発現させ、再度標的化されたＴ細胞により攻撃されうるので、致死性となる可能性が極めて高いであろう。
【０２７９】
別の例は、肝細胞がん（ＨＣＣ）である。肝細胞は、大部分が、リポタンパク質のトラフィキングを含めた、多数の代謝性過程に関与する。この目的のために、肝細胞は、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）の受容体（スカベンジャー受容体クラスＢメンバー１、ＳＣＡＲＢ１）をそれらの表面上で発現させる。ＳＣＡＲＢ１を腫瘍細胞の表面上で発現させるＨＣＣおよび転移を患うＨＬＡ  Ａ２陽性患者の処置は、前記ＣＤ３ε特異的抗体の重鎖（ＶＨ）可変領域へと融合させた、ＳＣＡＲＢ１を対象とするｓｃＦｖドメインを含むポリペプチドＰ２構築物およびポリペプチドＰ１（前記ＣＤ３ε特異的抗体の軽鎖（ＶＬ）へと融合させた抗ＨＬＡ  Ａ２  ｓｃＦｖ）、ならびに健常なＨＬＡ  Ａ２陰性ドナーからの肝細胞の移植により達成することができる。この場合には、全ての肝細胞ならびにＳＣＡＲＢ１およびＨＬＡ  Ａ２の両方を発現させる肝細胞由来の悪性細胞を、Ｔリンパ球による溶解のためにタグ付けすることになる。ＨＬＡ  Ａ２を欠くドナー肝細胞のほか、ＨＬＡ  Ａ２を発現させる正常なＳＣＡＲＢ１陰性ドナー細胞も溶解を免れる。ＳＣＡＲＢ１の発現はまた、副腎におけるステロイド合成に関与する細胞についても報告されているので、これらの細胞もまた、方向転換されたＴ細胞により破壊され、アジソン病を結果としてもたらす可能性が極めて高いであろう。
【０２８０】
ある種の細胞型または細胞系統または少数の細胞型／細胞系統に特異的な多様なマーカーが知られている（例のリストについては、上記を参照されたい）。系統マーカー、分化抗原、および組織マーカーのほか、それらの組織分布についての一層の情報は、公表されている情報源（例えば、David J. Dabbs、Diagnostic immnohistochemistry、Churchill Livingstone、3版（2010）；またはF LinおよびJ Prichard、Handbook of Practical Immnohistochemistry: Frequently Asked Questions、Springer、New York、1版（2011）を参照されたい）および公表データベース（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＥＢＩ）のＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｔｌａｓ（http://www.ebi.ac.uk/gxa/）；またはＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）プラットフォーム（上記を参照されたい）など）から容易にアクセス可能である。なおさらに、このようなマーカーは、当業者が、抗原の腫瘍特異的組合せの同定について上記の同様の方法を用いて、簡単に同定および／または検証することができる。
【０２８１】
ある種の好ましい実施形態では、ある種の細胞型または細胞系統に対する特異性が不完全な抗原を用いる（すなわち、複数の細胞型または細胞系統に存在するが、好ましくは少数の細胞型または細胞系統だけに存在する抗原を用いる）。いくつかの実施形態では、他の細胞型／他の細胞系統においてもまた、わずかであるが検出可能な前記分子の発現がありうるという意味で、前記細胞型／前記細胞系統が、他の細胞型／他の細胞系統より大きな割合で、または高比率もしくは高量で発現させる抗原を用いる。
【０２８２】
上記の例示的な実施形態で用いられたＨＬＡ−Ａ２（レシピエント細胞がこのＨＬＡ抗原について陽性であり、ドナー細胞がこれについて陰性である限りにおいて用いられた）以外に、概念を、他の任意のＨＬＡハプロタイプへとさらに適合させることもできる。可能なＨＬＡ抗原には、とりわけ、ＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ３、ＨＬＡ  Ａ２５、ＨＬＡ  Ｂ７、ＨＬＡ  Ｂ８、ＨＬＡ  Ｂ３５、ＨＬＡ  Ｂ４４、およびＨＬＡ  Ｃｗ３、ＨＬＡ  Ｃｗ４、ＨＬＡ  Ｃｗ６、ＨＬＡ  Ｃｗ７が含まれる。ポリペプチドセットを、代替的なＨＬＡ抗原へと適合させるには、ポリペプチドＰ１の標的化部分Ｔ１を、所望の代替的なＨＬＡ抗原に対する結合特異性を有する標的化部分で置きかえることで十分である。標的化部分Ｔ１の適切な選び出しにより、当然ながらまた、ドナー細胞を特異的に消失させることも可能である。
【０２８３】
なおさらに、アセンブルするとＣＤ３εに結合することが可能なドメインを形成するＶＬドメインおよびＶＨドメイン（すなわち、ポリペプチドＰ１およびＰ２それぞれの断片Ｆ１および断片Ｆ２）ではなく、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを、アセンブルすると、結果としてもたらされる二量体に異なる機能を付与するドメイン／断片で置きかえることもできる。この点で、２つの細胞表面抗原の特異的な組合せにより同定される腫瘍細胞の消失／検出に関する例示的な実施形態について上記の全ての変更は同様に適用可能である。例えば、アセンブルすると、相補機能ドメインは、Ｔ細胞以外のエフェクター細胞の結合／活性化を媒介する場合もあり、「前処理」法へと適合する場合もあり、治療用化合物または診断用化合物に結合する場合もあり、蛍光分子／生物発光を媒介することが可能な分子を形成する場合もある。
【０２８４】
腫瘍細胞を特異的に消失させるための本発明の原理の適用に関する例示的な実施形態において上記の、断片Ｆ１およびＦ２を選び出すための多様な選択肢、ならびに標的化部分Ｔ１またはＴ２を選び出すための多様な選択肢も、当然ながら、同様に検討されうる。
【０２８５】
記載した例示的な実施形態および変更から、当業者には、上記の本発明の原理は、腫瘍細胞または細胞移植後において残存する悪性レシピエント細胞の高度に特異的な同定／消失に用いうるだけでなく、また、それを他の種類の細胞から弁別する、２つの抗原の特異的な組合せを保有する他の任意の種類の細胞の同定／消失にも用いうることが明らかであろう。
【０２８６】
以下では、図面に言及する。
【図面の簡単な説明】
【０２８７】
【図１Ａ−Ｂ】本発明の原理を示す図である。図１Ａ：抗原ならびにポリペプチドＰ１およびＰ２のデザインを示す図である。図１Ｂ：細胞が、抗原１および２の両方を、その細胞表面上で発現させる場合、ポリペプチドＰ１とポリペプチドＰ２とが、この細胞の表面に同時的に結合すると、Ｐ１とＰ２とが緊密に近接し、断片Ｆ１とＦ２との会合を引き起こし、相補によるドメインＦの生物学的機能が回復することを示す図である。抗原Ａ１（図１Ｃ）または抗原Ａ２（図１Ｄ）だけが細胞表面上で存在する場合、生物学的機能の回復は生じない。
【図１Ｃ−Ｄ】本発明の原理を示す図である。図１Ａ：抗原ならびにポリペプチドＰ１およびＰ２のデザインを示す図である。図１Ｂ：細胞が、抗原１および２の両方を、その細胞表面上で発現させる場合、ポリペプチドＰ１とポリペプチドＰ２とが、この細胞の表面に同時的に結合すると、Ｐ１とＰ２とが緊密に近接し、断片Ｆ１とＦ２との会合を引き起こし、相補によるドメインＦの生物学的機能が回復することを示す図である。抗原Ａ１（図１Ｃ）または抗原Ａ２（図１Ｄ）だけが細胞表面上で存在する場合、生物学的機能の回復は生じない。
【図２】造血系新生物に対する、ＨＬＡ抗原が不適合の同種移植環境における本発明の例示的な実施形態を示す図である。この状況では、レシピエントのＨＬＡハプロタイプ（ＨＬＡｐａｔｉｅｎｔ）由来および造血系統（ＣＤ４５）由来の二重の情報は、もっぱら、患者の白血病性芽球上および他の造血細胞上で提示される。第１のポリペプチドＰ１は、抗ＣＤ３のＶＬ断片（断片Ｆ１）へと融合させた、患者のＨＬＡを指向する単鎖可変断片抗体構築物（標的化部分Ｔ１）を含む。第２のポリペプチドＰ２は、抗ＣＤ３  ＦｖのＶＨスプリット断片（断片Ｆ２）へと融合させた、造血系統マーカーであるＣＤ４５に特異的な単鎖可変断片構築物（標的化部分Ｔ２）を含む。  ＣＤ４５：造血細胞に特異的な抗原。ＨＬＡｐａｔｉｅｎｔ：患者細胞に特異的なＨＬＡ抗原、すなわち、患者細胞（＝細胞移植のレシピエントの細胞）の表面上では存在するが、ドナー細胞の表面には存在しない、ヒトＭＨＣの対立遺伝子変異体。αＣＤ４５  ｓｃＦｖ：ＣＤ４５に対する結合特異性を伴うｓｃＦｖ。αＨＬＡｐａｔｉｅｎｔ  ｓｃＦｖ：ＨＬＡｐａｔｉｅｎｔに対する結合特異性を伴うｓｃＦｖ。ＣＤ３（ＶＨ）：ＣＤ３に対する結合特異性を伴う抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域。ＣＤ３（ＶＬ）：ＣＤ３に対する結合特異性を伴う抗体の免疫グロブリン軽鎖可変領域。  ２つの構築物が、それらのαＣＤ４５  ｓｃＦｖおよびαＨＬＡｐａｔｉｅｎｔ  ｓｃＦｖのそれぞれを介して、ＣＤ４５抗原およびＨＬＡｐａｔｉｅｎｔ抗原の両方を保有する細胞へと結合すると、ＣＤ３（ＶＨ）のＣＤ３（ＶＬ）とのアセンブリーにより、ＣＤ３に対する結合特異性を伴う抗体の機能的な相補がもたらされ、これにより、それらの細胞表面におけるＣＤ３分子を介して、Ｔ細胞の特異的な動員および活性化が可能となる。
【図３Ａ】図４〜９で描示される実験において用いられる構築物を示す図である。（構築物８５がＦｌａｇタグを有するのに対し、構築物７１はｍｙｃタグを有するという事実により、構築物８５は、構築物７１と異なる。構築物７５がＦｌａｇタグを有するのに対し、構築物８２はｍｙｃタグを有するという事実により、構築物７５は、構築物８２と異なる。）ＶＨＣＤ３：抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域；ＶＬＣＤ３：抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域；ＶＨＡ２：抗ＨＬＡ−Ａ２抗体の重鎖可変領域；ＶＬＡ２：抗ＨＬＡ−Ａ２抗体の軽鎖可変領域；ＶＬ４５：抗ＣＤ４５抗体の重鎖可変領域；ＶＨ４５：抗ＣＤ４５抗体の軽鎖可変領域；Ｌ１８、Ｌ７、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ１９：それぞれ、１８、７、１５、６、１９アミノ酸のリンカー。
【図３Ｂ】図４〜９で描示される実験において用いられる構築物を示す図である。（構築物８５がＦｌａｇタグを有するのに対し、構築物７１はｍｙｃタグを有するという事実により、構築物８５は、構築物７１と異なる。構築物７５がＦｌａｇタグを有するのに対し、構築物８２はｍｙｃタグを有するという事実により、構築物７５は、構築物８２と異なる。）ＶＨＣＤ３：抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域；ＶＬＣＤ３：抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域；ＶＨＡ２：抗ＨＬＡ−Ａ２抗体の重鎖可変領域；ＶＬＡ２：抗ＨＬＡ−Ａ２抗体の軽鎖可変領域；ＶＬ４５：抗ＣＤ４５抗体の重鎖可変領域；ＶＨ４５：抗ＣＤ４５抗体の軽鎖可変領域；Ｌ１８、Ｌ７、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ１９：それぞれ、１８、７、１５、６、１９アミノ酸のリンカー。
【図４】アッセイ系を対比するのに用いられる、従来のタンデム二特異性単鎖ｓｃＦｖ構築物を示す図である。略述すると、ＣＤ３およびＨＬＡ  Ａ２に対する特異性を伴う二特異性抗体構築物を、表示される通りにＨＬＡ  Ａ２陽性およびＣＤ４５陽性骨髄腫細胞系であるＵ２６６と、ＨＬＡ  Ａ２陰性Ｔ細胞（単球を枯渇させた末梢血単核細胞）との共培養物に対して滴定し、Ｔ細胞によるインターロイキン２の産生を決定した。それらのそれぞれのＦｌａｇタグまたはＭｙｃタグにより異なる、２つのＦｖＣＤ３−ＨＬＡ−Ａ２構築物８５および７１について、実質的なＴ細胞刺激能を検出した（構築物のドメイン構造については、図３を参照されたい。）。ＨＬＡ−Ａ２−ＣＤ３構成における二特異性タンデムＦｖ構築物は、それほど有効でなく、ＨＬＡ−Ａ２またはＣＤ３を対象とする単鎖構築物は、Ｔ細胞を全く刺激しなかった。陽性対照は、非特異的ＰＨＡ−Ｌ（フィトヘマグルチニン）刺激を用いて実施する。
【図５】本発明に従う相補構築物の対を用いる場合は、精密で高度に特異的であるが、２つの構築物の対のうちの１つだけを個別に用いる場合は精密で高度に特異的ではない、Ｔ細胞刺激能を示す図である。略述すると、ＶＬＣＤ３−ｓｃＦｖＨＬＡ−Ａ２（構築物４２）、ＶＨＣＤ３−ｓｃＦｖＣＤ４５（ＶＬ−ＶＨ）（構築物４５）、およびＶＨＣＤ３−ｓｃＦｖＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ）（構築物５５）を、個別に、または構築物４２と構築物４５とを組み合わせて、または構築物４２と構築物５５とを組み合わせて、記載したＵ２６６とＴ細胞との共培養物に対して滴定した。４２／４５または４２／５５の組合せについては、高いＴ細胞刺激能が実証されたが、これらの構築物のうちの１つだけを個別に施した場合の活性は微小であった。これらの結果は、Ｔ細胞の動員機能を再構成または相補するためには、ＦｖＣＤ３のＶＬドメインとＶＨドメインとが協働しなければならないことを示す。重要なことは、ｓｃＦｖＣＤ４５の標的化部分を（ＶＬ−ＶＨ）構成から（ＶＨ−ＶＬ）構成へと切り換えうることから、構築物のモジュール式の特徴により、標的化部分の、所望の特異性を伴う別の標的化部分による置きかえが可能となることが明らかに指し示されることである。アッセイ系は、ＩＬ２を産生するようにＴ細胞を刺激することがなかった、単鎖構築物であるＣＤ４５（ＶＬ−ＶＨ）およびＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ）の使用と対比した。
【図６】３つの競合的遮断実験のうちの第１の実験を示す図である。二特異性タンデム構築物であるＦｖＣＤ３−ＨＬＡ−Ａ２（構築物７１）を、記載したＵ２６６とＴ細胞との共培養物へと施し、Ｔリンパ球によって誘導されるＩＬ２産生により、刺激機能を決定した。Ｔ細胞による刺激機能は、ＨＬＡ  Ａ２分子上の標的化されたエピトープを占有する単鎖構築物（構築物４（１００倍濃度））により遮断された。ＨＬＡ  Ａ２特異的な単鎖構築物またはＣＤ３特異的な単鎖構築物（構築物４（１００倍濃度）または構築物３６（９倍濃度））によるＴ細胞の内因性刺激は、除外された。ＰＨＡ−Ｌは、陽性対照として用いた。
【図７】競合的エピトープ遮断実験において、「三ドメイン構築物」（すなわち、本発明に従う構築物）はまず、単一の細胞の表面に結合して、二量体化し、Ｔ細胞の動員機能を相補しなければならないことを示す図である。略述すると、構築物４２および４５を、Ｕ２６６細胞とＨＬＡ−Ａ２陰性Ｔリンパ球との共培養物へと施し、Ｔ細胞のＩＬ２産生により、刺激能を決定した。ＨＬＡ  Ａ２分子上またはＣＤ４５分子上のエピトープを、構築物４または４６（いずれも１００倍濃度）により競合的に遮断する実験状況では、Ｔ細胞による刺激機能が無効化された。これらの結果は、Ｔ細胞の動員機能を回復または相補するためには、２つのそれぞれの「三ドメイン構築物」が、細胞の表面に同時に結合しなければならないことを明らかに指し示す。いずれの構築物（４２、４５、４、４６および３６）による内因性の刺激活性も、異なる濃度を用いて除外した。
【図８】構築物４２と５５との組合せについての、図７と類似の実験を示す図である。ここでもまた、ＨＬＡ  Ａ２分子上またはＣＤ４５分子上の抗原エピトープの競合的遮断により、２つの「三ドメイン構築物」の組合せによるＴ細胞刺激能が無効化された。重要なことは、これらの結果からもまた、標的化モジュールを、適切な特異性を伴う別のモジュールで容易に置きかえうることが示されることである。より重要なことは、構築物４２のＶＬ−ＶＨ−ＶＬ構成および構築物５５のＶＨ−ＶＨ−ＶＬ構成が、ＨＬＡ  Ａ２抗原およびＣＤ４５抗原の両方を発現させる基質にあらかじめ結合することのない構築物の、ホモ二量体化もしくはヘテロ二量体化またはセルフアセンブリーを妨げることである。
【図９】ＶＬＣＤ３−ｓｃＦｖＨＬＡ−Ａ２構築物およびＶＨＣＤ３−ｓｃＦｖＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ）構築物の両方（「両方の構築物」）を含む試料中のＨＬＡ  Ａ２陰性Ｔ細胞によるＵ２６６細胞の溶解を示す図である。２つの構築物のうちの１つだけを含む対照試料中では、著明な溶解が観察されなかった。
【図１０】ポリペプチドのオンターゲットの回復を示す図である。各々が、ＣＤ３特異的抗体（断片Ｆ１およびＦ２）の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）または可変重鎖ドメイン（ＶＨ）へと融合させた特異的な単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ、ＶＨ−ＶＬ）からなる、２つの個別のポリペプチド（Ｐ１およびＰ２）が、標的細胞上のそれらのそれぞれの抗原に結合することにより、Ｔ細胞を動員するための、ＶＨ／ＶＬヘテロ二量体化および機能的なＣＤ３結合部位の形成が可能となる。
【図１１Ａ−Ｂ】ＣＤ３  ＶＨ／ＶＬ二量体化により、Ｔ細胞が動員され、二重抗原拘束されることを示す図である。全てのＨＬＡ−Ａ２陽性およびＣＤ４５陽性であるＵ２６６骨髄腫細胞、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）の初代細胞、およびＴＨＰ−１急性骨髄性白血病細胞を、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびポリペプチドで表示される通りプローブした。Ｔ細胞の動員を、反応性インターロイキン２（ＩＬ−２）産生（Ａ）および標的細胞の溶解（Ｂ）により評価したことを示す図である。二特異性タンデムｓｃＦｖ（ＣＤ３（ＶＨ−ＶＬ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ）抗体を、陽性対照として用いたことを示す図である（Ｃ）。ＴＨＰ−１細胞上におけるポリペプチドの結合が、表示される通り、過剰なｓｃＦｖＣＤ４５阻害剤（左）およびｓｃＦｖＨＬＡ−Ａ２阻害剤（右）（標的細胞上の個々の抗原エピトープを遮断する）により競合的に遮断されることを示す図である。ドナーＰＢＭＣによる反応性ＩＬ２産生について探索したことを示す図である（Ｄ）。単独または二重の抗原陰性細胞系であるＲＡＪＩおよびＫＭＳ−１２−ＢＭを、ポリペプチドでプローブした。ＰＨＡ−Ｌは、ＰＢＭＣに対する非特異的な刺激対照として用いた。
【図１１Ｃ−Ｄ】ＣＤ３  ＶＨ／ＶＬ二量体化により、Ｔ細胞が動員され、二重抗原拘束されることを示す図である。全てのＨＬＡ−Ａ２陽性およびＣＤ４５陽性であるＵ２６６骨髄腫細胞、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）の初代細胞、およびＴＨＰ−１急性骨髄性白血病細胞を、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびポリペプチドで表示される通りプローブした。Ｔ細胞の動員を、反応性インターロイキン２（ＩＬ−２）産生（Ａ）および標的細胞の溶解（Ｂ）により評価したことを示す図である。二特異性タンデムｓｃＦｖ（ＣＤ３（ＶＨ−ＶＬ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ）抗体を、陽性対照として用いたことを示す図である（Ｃ）。ＴＨＰ−１細胞上におけるポリペプチドの結合が、表示される通り、過剰なｓｃＦｖＣＤ４５阻害剤（左）およびｓｃＦｖＨＬＡ−Ａ２阻害剤（右）（標的細胞上の個々の抗原エピトープを遮断する）により競合的に遮断されることを示す図である。ドナーＰＢＭＣによる反応性ＩＬ２産生について探索したことを示す図である（Ｄ）。単独または二重の抗原陰性細胞系であるＲＡＪＩおよびＫＭＳ−１２−ＢＭを、ポリペプチドでプローブした。ＰＨＡ−Ｌは、ＰＢＭＣに対する非特異的な刺激対照として用いた。
【図１２Ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける条件付けＣＤ３  ＶＨ／ＶＬ相補による標的化治療を示す図である（Ａ）。１．２５×１０５個のＣＭＶ特異的ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーＴ細胞および表示される通りポリペプチド（０．５μｇ）と併せた５×１０６個のＴＨＰ−１急性白血病性細胞（腫瘍細胞：Ｔ細胞比＝４０／１）を腹腔内注射した後におけるマウス（群１つ当たりのｎ＝６）の生存を示す図である（Ｂ）。カスパーゼ３の活性化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、表示される通り、ドナーＴ細胞およびポリペプチド（３ｎＭ）を伴う共培養後の、ＨＬＡ−Ａ２／ＣＤ４５二重陽性ＴＨＰ−１およびＣＤ４５陽性であるがＨＬＡ−Ａ２陰性であるバイスタンダー細胞におけるフローサイトメトリーにより評価した。二特異性タンデムｓｃＦｖ（ＣＤ３（ＶＨ−ＶＬ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））抗体を、陽性対照として用いた。
【図１２Ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける条件付けＣＤ３  ＶＨ／ＶＬ相補による標的化治療を示す図である（Ａ）。１．２５×１０５個のＣＭＶ特異的ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーＴ細胞および表示される通りポリペプチド（０．５μｇ）と併せた５×１０６個のＴＨＰ−１急性白血病性細胞（腫瘍細胞：Ｔ細胞比＝４０／１）を腹腔内注射した後におけるマウス（群１つ当たりのｎ＝６）の生存を示す図である（Ｂ）。カスパーゼ３の活性化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、表示される通り、ドナーＴ細胞およびポリペプチド（３ｎＭ）を伴う共培養後の、ＨＬＡ−Ａ２／ＣＤ４５二重陽性ＴＨＰ−１およびＣＤ４５陽性であるがＨＬＡ−Ａ２陰性であるバイスタンダー細胞におけるフローサイトメトリーにより評価した。二特異性タンデムｓｃＦｖ（ＣＤ３（ＶＨ−ＶＬ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））抗体を、陽性対照として用いた。
【図１３】ＥＧＦＲおよびＥｐＣＡＭを指向するポリペプチドにより、Ｔ細胞が、がん細胞の破壊に動員されることを示す図である。ＥＧＦＲおよびＥｐＣＡＭ二重陽性ヒト結腸がん細胞系であるＣＯＬＯ−２０６Ｆおよび黒色腫細胞系であるＦＭ−５５（ＥＧＦＲ陽性であるがＥｐＣＡＭ陰性）を、表示される通り、ＥＧＦＲに特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＥＧＦＲ（ＶＨ−ＶＬ））およびＥｐＣＡＭに特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＥｐＣＡＭ（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、ＰＢＭＣでプローブした。Ｔ細胞の動員は、標的細胞における反応性インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の産生（Ａ）およびカスパーゼ３の活性化（Ｂ）により評価した。
【図１４】ＨＬＡ−Ａ２およびＣＥＡを指向するポリペプチドにより、Ｔ細胞が、腫瘍細胞の破壊に方向転換されることを示す図である。ヒト結腸がん細胞系であるＣＯＬＯ−２０６Ｆ、黒色腫細胞系であるＦＭ−５５、および卵巣がん細胞系であるＯＶＣＡＲを、表示される通り、ＨＬＡ−Ａ２に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））およびＣＥＡに特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＣＥＡ（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、ＰＢＭＣでプローブした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図１５】ＨＬＡ−Ａ２およびＥＧＦＲを指向するポリペプチドにより、Ｔ細胞が、腫瘍細胞の破壊に方向転換されることを示す図である。ヒト細胞系であるＣＯＬＯ−２０６Ｆ、ＦＭ−５５、およびＯＶＣＡＲを、表示される通り、ＨＬＡ−Ａ２に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））およびＥＧＦＲに特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＥＧＦＲ（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、ＰＢＭＣでプローブした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図１６】ＨＬＡ−Ａ２およびＨｅｒ２を指向するポリペプチドにより、Ｔ細胞が、腫瘍細胞の破壊に方向転換されることを示す図である。ヒト細胞系であるＣＯＬＯ−２０６Ｆ、ＦＭ−５５、およびＯＶＣＡＲを、表示される通り、ＨＬＡ−Ａ２に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））およびＨｅｒ２に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−Ｈｅｒ２（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、ＰＢＭＣでプローブした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図１７】ＣＤ４５およびＨＬＡ−Ａ２を指向するポリペプチドにより、Ｔ細胞が、腫瘍細胞の破壊に方向転換されることを示す図である。この実験では、抗ＣＤ４５による標的化部分および抗ＨＬＡ−Ａ２による標的化部分のためのスプリット抗ＣＤ３断片（ＣＤ３（ＶＨ）およびＣＤ３（ＶＬ））を、図５、７〜９、１１，１２、１４〜１６において用いられる、ＣＤ４５ポリペプチドおよびＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドと比較して交換した。ヒト骨髄腫細胞系であるＵ２６６を、表示される通り、ＣＤ４５に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ））およびＨＬＡ−Ａ２に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、ＰＢＭＣによりプローブした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図１８】ＥＧＦＲおよびＥｐＣＡＭを指向するポリペプチドにより、Ｔ細胞が、腫瘍細胞の破壊に方向転換されることを示す図である。ヒト結腸がん細胞系であるＣＯＬＯ−２０６ＦおよびＣＸ−１、ならびに卵巣がん細胞系であるＯＶＣＡＲを、表示される通り、ＥｐＣＡＭに特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＥｐＣＡＭ（ＶＨ−ＶＬ））およびＥＧＦＲに特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＥＧＦＲ（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、ＰＢＭＣでプローブした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図１９】Ｈｅｒ２およびＥｐＣＡＭを指向するポリペプチドにより、Ｔ細胞が、腫瘍細胞の破壊に方向転換されることを示す図である。ヒト卵巣がん細胞系であるＯＶＣＡＲを、表示される通り、ＥｐＣＡＭに特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＥｐＣＡＭ（ＶＨ−ＶＬ））、およびＨｅｒ２に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−Ｈｅｒ２（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、ＰＢＭＣでプローブした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図２０】ＣＤ４５およびＣＤ１３８を指向するポリペプチドにより、Ｔ細胞が、腫瘍細胞の破壊に方向転換されることを示す図である。ヒト骨髄腫細胞系であるＡＭＯ−１を、表示される通り、ＣＤ４５に特異的なポリペプチド（上パネルのＣＤ３（ＶＬ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ）、下パネルのＣＤ３（ＶＨ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ））およびＣＤ１３８に特異的なポリペプチド（上パネルのＣＤ３（ＶＨ）−ＣＤ１３８（ＶＨ−ＶＬ）、下パネルのＣＤ３（ＶＬ）−ＣＤ１３８（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、ＰＢＭＣでプローブした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図２１】単一の抗原（ＣＤ１３８）を、ＣＤ１３８を指向するポリペプチドで標的化することにより、Ｔ細胞が、腫瘍細胞の破壊に方向転換されることを示す図である。ヒト骨髄腫細胞系であるＡＭＯ−１を、表示される通り、ＣＤ１３８に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＣＤ１３８（ＶＨ−ＶＬ）およびＣＤ３（ＶＨ）−ＣＤ１３８（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、ＰＢＭＣでプローブした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図２２】単一の抗原（ＣＤ４５）を、ＣＤ４５を指向するポリペプチドで標的化することにより、Ｔ細胞が、腫瘍細胞の破壊に方向転換されることを示す図である。ヒト骨髄腫細胞系であるＡＭＯ−１およびＵ２６６を、表示される通り、ＣＤ４５に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ）およびＣＤ３（ＶＨ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、ＰＢＭＣでプローブした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図２３】細胞表面上の単一の抗原を指向して、抗原上の２つの異なるエピトープ（上方）または同じエピトープ（下方）を標的化する、２つのポリペプチドのオンターゲットの回復を示す図である。２つの個別のポリペプチド（Ｐ１およびＰ２）の、標的細胞上の同じ抗原上のそれらのそれぞれのエピトープへの結合である。２つの異なるエピトープを標的化するには、各ポリペプチドの標的化部分は、特異的な単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）からなる。同じエピトープを標的化するには、各ポリペプチドの標的化部分は、同じ単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）からなる。標的化部分を、ペプチドリンカーを介して、ＣＤ３特異的抗体（断片Ｆ１およびＦ２）の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）または可変重鎖ドメイン（ＶＨ）へと融合させ、ＶＨ／ＶＬヘテロ二量体化およびＴ細胞を動員するための機能的なＣＤ３結合部位の形成（機能ドメイン）を可能とする。
【図２４】ポリペプチドパートのキットにより、異なるエフェクター経路を用いて、標的細胞を死滅させる可能性を示す図である。この目的のために、抗ＣＤ３モジュール（Ｆ１およびＦ２）を、抗ＨＩＳ（ヘキサ−ヒスチジン）モジュールで置きかえ、ポリペプチド１および２の同時的な結合の後、ヘキサ−ヒスチジン結合部位を相補し、これにより、ヒスチジンで標識されたペイロード（例えば、ＨＩＳでタグ付けされた毒素）に結合させる。ポリペプチドＰ１の標的化部分Ｔ１（ＶＨ−ＶＬ）は、ＨＬＡ−Ａ２に特異的に結合し、ポリペプチドＰ２の標的化部分Ｔ２（ＶＨ−ＶＬ）は、ＣＤ４５に特異的に結合する。ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１は、ヘキサヒスチジンタグに対する抗体のＶＨドメインを含み、ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２は、同じ抗体のＶＬドメインを含む。ヒト骨髄性白血病細胞系であるＴＨＰ−１を、表示のポリペプチドと組み合わせて、ヒスチジン（Ｈｉｓ）でタグ付けした０．０１μｇ／ｍｌのウェルシュ菌（Clostridium perfringens）イオタ毒素成分Ｉａでプローブした。培養物中で４８時間後、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイを用いて、細胞生存率を測定した。結果は、その組合せでプローブした細胞については、アッセイバックグラウンドに照らした生存率の低減を示すが、個々のポリペプチドでプローブした細胞については、アッセイバックグラウンドに照らした生存率の低減を示さない。対照のＴＨＰ−１細胞は、毒素を伴わない培養物中で同時に成長させた。試料は、２連として試行および解析した。
【図２５】ヒスチジン（Ｈｉｓ）でタグ付けされた志賀毒素サブユニットＡを０．０１μｇ／ｍｌの濃度で用いて、ＨＬＡ−Ａ２およびＣＤ４５を指向するポリペプチドであって、Ｈｉｓタグに対するスプリット抗体を含むポリペプチドは、腫瘍細胞を死滅させることを示す図である。実験環境は、図２４における環境と同じであった。
【図２６】ヒスチジン（Ｈｉｓ）でタグ付けされた志賀毒素サブユニットＡを０．１μｇ／ｍｌの濃度で用いて、ＨＬＡ−Ａ２およびＣＤ４５を指向するポリペプチドであって、Ｈｉｓタグに対するスプリット抗体を含むポリペプチドは、腫瘍細胞を死滅させることを示す図である。実験環境は、図２４／２５における環境と同じであった。
【図２７】ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）に特異的な抗体のＶＨおよびＶＬであり、ジゴキシゲニンで標識された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）分子を用いて、ＥＧＦＲおよびＥｐＣＡＭを指向するポリペプチドであって、Ｆ１およびＦ２を伴う機能ドメインＦを含むポリペプチドは、腫瘍細胞をマーキングすることを示す図である。ポリペプチドＰ１の標的化部分Ｔ１（ＶＨ−ＶＬ）は、ＥＧＦＲに特異的に結合し、ポリペプチドＰ２の標的化部分Ｔ２（ＶＨ−ＶＬ）は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する。ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１は、ジゴキシゲニンに対する抗体のＶＨドメインを含み、ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２は、同じ抗体のＶＬドメインを含む。ヒト結腸がん細胞系であるＣｏｌｏ−２０６Ｆを、まず、表示のポリペプチドでプローブした後、ジゴキシゲニンで標識されたＨＲＰでプローブした。試料は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔを用いて解析し、ＢｉｏＲＡＤマイクロプレートリーダーにより吸光度を読み取った。解析のために、色素原のブランク試料（ジゴキシゲニン−ＨＲＰを伴わない）を、０に設定した。試料は、２連として試行および解析した。
【図２８】ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＣＷ６を指向するポリペプチドは、Ｔ細胞を、患者細胞の破壊に方向転換することを示す図である。知られているＨＬＡハプロタイプを伴う初代患者細胞を用いた。Ａ５１＝ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）を伴う患者の細胞であって、ＨＬＡ−Ｃｗ６ハプロタイプについてホモ接合性の細胞。Ａ４９＝同種骨髄移植後における患者の細胞であって、ＨＬＡ−Ｃｗ６ハプロタイプについてヘテロ接合性の細胞。患者細胞を、表示される通り、ＣＤ４５に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ））およびＨＬＡ−Ｃｗ６に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＨＬＡ−ＣＷ６（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、健常なＰＢＭＣと共に、３０時間にわたりインキュベートした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図２９】ＥＧＦＲおよびＥｐＣＡＭを指向するポリペプチドは、Ｔ細胞を、患者初代がん細胞の破壊に方向転換することを示す図である。Ａ４４腫瘍細胞は、転移性膵臓がんを伴う４８歳男性患者の悪性腹水から回収した。患者の腫瘍細胞を、表示される通り、ＥｐＣＡＭに特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＥｐＣＡＭ（ＶＨ−ＶＬ））およびＥＧＦＲに特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＥＧＦＲ（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、３０時間にわたり、患者自身のＰＢＭＣ（静脈切開術により回収された）と共にインキュベートした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図３０】ＣＤ４５およびＨＬＡ−Ａ２を指向するポリペプチドは、ＣＭＶに拘束されるＣＤ８＋Ｔ細胞を、腫瘍細胞の破壊に方向転換することを示す図である。ヒト腫瘍細胞であるＴＨＰ−１およびＵ２６６を、表示される通り、ＨＬＡ−Ａ２に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））およびＣＤ４５に特異的なポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ））の存在下において、３０時間にわたり、ＨＬＡ−Ａ２陰性健常ドナーに由来する、ＣＭＶに拘束されるＴ細胞と共にインキュベートした。二特異性タンデムｓｃＦｖ（ＣＤ３（ＶＨ−ＶＬ）×ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））抗体を、陽性対照として用いた。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価した。試料は、２連として試行および解析した。
【図３１】アレルゲン特異的なポリペプチドおよび細胞型特異的なポリペプチドからなるポリペプチドパートのキットにより、自己免疫障害または過敏性障害を引き起こすＢ細胞クローンを消失させる原理理念を示す図である。第１のポリペプチドＰ１は、その標的化部分において、アレルゲン（例えば、Ｂｅｔｖ−１Ａ、Ｄｅｒ−ｆ２、コングルチン−７、Ｃａｎ−ｆ１、Ｆｅｌｄ−ｄ１）を有する。第２のポリペプチドＰ２は、その標的化部分において、細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＣＤ３８）を標的化する特異的な単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ、ＶＨ−ＶＬ）を有する。両方の標的化部分を、ＣＤ３特異的抗体の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）または可変重鎖ドメイン（ＶＨ）（断片Ｆ１およびＦ２）へと融合させる。
【０２８８】
以下では、本明細書、付属の実施例、および図面のほか、（部分的に）特許請求の範囲においてもまた言及される、ある種の（ヒト）遺伝子またはタンパク質に言及する。本明細書の下記では、対応する（例示的な）遺伝子受託番号が提示される。また、本明細書の別の箇所のほか、付属の実施例でも、さらなる受託番号が提示される。
【０２８９】
ＣＤ４５：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５７８８、２０１３年１月１３日更新、３版。タンパク質＝Ｐ０８５７５−１＝アイソフォーム１、最終改定日：２００３年７月１９日。バージョン２
ＣＤ３４：タンパク質：Ｐ２８９０６−１／２、最終改定日：１９９８年７月１５日。バージョン２。
ＣＤ３３：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４５、２０１２年１２月３０日更新：タンパク質：Ｐ２０１３８［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２００６年１０月１７日。バージョン２。チェックサム：１Ｃ７３Ｅ５８８２４０ＦＢＡＤ８
ＣＤ１３８：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６３８２、２０１３年１月６日更新、４版。タンパク質＝Ｐ１８８２７［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２００９年５月５日。バージョン３。
ＣＤ１５：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２５２６、２０１３年１月５日更新
ＣＤ１ａ：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９０９、２０１２年１２月３０日更新、Ｐ０６１２６［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２０１０年２月９日。バージョン４。チェックサム：Ｃ５７５Ｃ３Ｃ５３８Ｆ０ＡＡ２９
ＣＤ２：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９１４、２０１３年１月５日更新；Ｐ０６７２９［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２００７年１０月２３日。バージョン２。チェックサム：Ａ０３Ｄ８５３Ｃ３Ｂ６１８９１７
ＣＤ３ｅ：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９１６、２０１３年１月５日更新、Ｐ０７７６６［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９６年２月１日。バージョン２。チェックサム：Ａ１６０３Ｄ０１ＣＥ９９５７Ｄ７
ＣＤ４：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９２０、２０１３年１月１３日更新；Ｐ０１７３０［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９８８年１１月１日。バージョン１。チェックサム：２０ＥＤ８９３Ｆ９Ｅ５６Ｄ２３６
ＣＤ５：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９２１、２０１２年１２月３０日更新；Ｐ０６１２７［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２０１０年１１月３０日。バージョン２。チェックサム：９１３１ＡＥＣ９６８３ＥＥ１Ｄ３
ＣＤ８ａ：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９２５、２０１２年１２月３０日更新；アイソフォーム１／２（膜）Ｐ０１７３２−１／２（ｍＣＤ８アルファ）［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９８６年７月２１日。バージョン１。チェックサム：ＦＣＣＡ２９ＢＡＡ７３７２６ＢＢ
ＣＤ２０：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９３１、２０１３年１月６日更新；Ｐ１１８３６［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９８９年１０月１日。バージョン１。チェックサム：ＡＣ５４２０Ｆ８Ｂ６２６ＢＤＤ１
ＣＤ２３：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２０８、２０１３年１月４日更新；Ｐ０６７３４［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９８８年１月１日。バージョン１。チェックサム：Ｆ８６７０８Ｃ０Ｅ６５１５Ｂ８７
ＣＤ３１：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５１７５、２０１３年１月１３日更新；アイソフォームＬｏｎｇ［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９０年４月１日。バージョン１。チェックサム：Ｃ５７ＢＢＦＡ２００Ａ４０７Ａ６、Ｐ１６２８４−１／２／３／４／５／６＝アイソフォーム１〜６
ＣＤ４３：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６６９３、２０１２年１２月３０日更新；Ｐ１６１５０［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９０年４月１日。バージョン１。チェックサム：Ｃ９Ｃ９ＡＢ８４３５Ｄ５Ｅ１ＦＥ
ＣＤ５６：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４６８４、２０１２年１２月３０日更新；アイソフォーム１［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２００８年７月２２日。バージョン３。チェックサム：ＦＤ３Ｂ９ＤＥ８０Ｄ８０２５５４、Ｐ１３５９１−２／１／３／４／４／６、アイソフォーム１〜６
ＣＤ５７：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２７０８７、２０１３年１月５日更新
ＣＤ６８：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９６８、２０１３年１月６日更新；アイソフォームＬｏｎｇ（ＣＤ６８．１）［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２００７年５月１５日。バージョン２。チェックサム：６９Ｅ６８Ｄ６９ＥＤＥ８ＥＦＢ０、Ｐ３４８１０−１／２、アイソフォーム１／２
ＣＤ７９ａ：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９７３、２０１３年１月５日更新；アイソフォーム１（Ｌｏｎｇ）［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９４年６月１日。バージョン２。チェックサム：６Ｅ５Ｂ８３７４０９９６９２９２、Ｐ１１９１２−１／２、アイソフォーム１／２
ＣＤ１４６：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４１６２、２０１２年１２月３０日更新；アイソフォーム１［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２００６年１月１０日。バージョン２。チェックサム：Ｅ４６ＣＢ８ＡＣ７ＢＡ０７３８Ｅ、Ｐ４３１２１−１／２、アイソフォーム１／２。
サーファクタントタンパク質（ＡおよびＢ）：
Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６４４０、２０１２年１２月３０日更新、およびＧｅｎｅ  ＩＤ：６４３９、２０１２年１２月３０日更新、Ｐ０７９８８［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９２年５月１日。バージョン３。チェックサム：９ＦＤ７Ｆ６６６７８Ａ３５１５３、およびアイソフォーム１［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９０年４月１日。バージョン２。チェックサム：Ｃ２６Ａ２１Ｅ３３Ｃ６０ＡＡ７８、Ｐ１１６８６−１／２、アイソフォーム１／２
シナプトフィジン：
Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６８５５、２０１２年１２月３０日更新、Ｐ０８２４７［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９１年８月１日。バージョン３。チェックサム：５９２２８９Ｃ４３Ｂ１２ＥＦＡ７
ニコチン性アセチルコリン受容体：
Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１３８、２０１２年１２月３０日更新、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１３６、２０１３年１月６日更新、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１３９、２０１３年１月１３日更新、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１３７、２０１２年１２月３０日更新、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１４１、２０１３年１月５日更新
筋特異的キナーゼＭＵＳＫ：
Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４５９３、２０１３年１月８日更新、アイソフォーム１［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９８年１月１日。バージョン１。チェックサム：３ＤＤＣ２０Ｅ１７９ＦＡ０１０Ｃ、Ｏ１５１４６−１／２、アイソフォーム１／２
電位依存性カルシウムチャネル（Ｐ／Ｑ型）：
Ｇｅｎｅ  ＩＤ：７７３、２０１３年１月５日更新；アイソフォーム１（１Ａ−１）（ＢＩ−１−ＧＧＣＡＧ）［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９９年７月１５日。バージョン２。チェックサム：２Ｆ２Ｆ３７８ＡＣＥ０２ＦＤ５６、Ｏ００５５５−１／２／３／４／５／６／７、アイソフォーム１〜７、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２５３９８、２０１３年１月１１日更新、Ｊ３ＫＰ４１［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２０１２年１０月３日。バージョン１。チェックサム：ＡＥＤＦ４Ｄ２Ａ５Ｅ４９２６３Ｆ
電位依存性カリウムチャネル（ＶＧＫＣ）：
Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３７３７、２０１２年１２月３０日更新、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３７３６、２０１３年１月８日更新、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３７４２、２０１３年１月８日更新
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ）：
Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２９０４、２０１３年１月５日更新、Ｑ１３２２４［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２００１年６月２０日。バージョン３。チェックサム：４０ＡＥＢ１２ＢＥ６Ｅ５０ＣＥＦ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２９０２、２０１２年１２月３０日更新、アイソフォーム３（Ｌｏｎｇ）（ＮＲ１〜３）［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９４年６月１日。バージョン１。チェックサム：ＣＤＦ５４０２７６９Ｅ５３０ＡＢ、Ｑ０５５８６−１／２／３／４／５、アイソフォーム１〜５
ＴＳＨＲ：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：７２５３、２０１３年１月４日更新、アイソフォームＬｏｎｇ［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２００５年３月２９日。バージョン２。チェックサム：Ｄ２ＥＥ９ＣＥＢＦＤ６４Ａ６５Ｆ、Ｐ１６４７３−１／２／３、アイソフォーム１〜３
アンフィフィシン：
Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２７３、２０１３年１月８日更新、アイソフォーム１（１２８ｋＤａ）［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９６年２月１日。バージョン１。チェックサム：７８Ｂ４Ｆ７５ＡＢ７５ＢＡ３５７、Ｐ４９４１８−１／２、アイソフォーム１〜２
ガングリオシドＧＱ１Ｂ：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２９９０６、２０１２年１２月３０日更新
ＧＤ３：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１７１８９、２０１２年６月２２日更新
Ｃａ−１２５：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４０２５、２０１２年１２月３０日更新、Ｑ８ＷＸＩ７［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：２００３年３月１日。バージョン２。チェックサム：Ｂ３Ｅ７ＢＤＦ１９９９７Ａ４４０
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２０６４、２０１３年１月１３日更新、４版。タンパク質＝Ｐ０４６２６−１／２／３／４＝アイソフォーム１〜４、最終改定日：１９８７年８月１３日。バージョン１。
大嚢胞症液タンパク質１５；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５３０４、２０１２年１２月３０日更新
ＣＤ１１７：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３８１５、２０１３年１月６日更新
ＣＤ３０：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４３、２０１３年１月６日更新；アイソフォームＬｏｎｇ［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９２年１２月１日。バージョン１。チェックサム：７Ａ４０７ＣＣ７８Ａ６Ｅ０ＢＣ８、Ｐ２８９０８−１／２、アイソフォーム１／２
血小板由来成長因子受容体ＰＤＧＦＲアルファ：
Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５１５９、２０１３年１月１３日更新、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５１５６、２０１３年１月１３日更新、アイソフォーム１［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９０年４月１日。バージョン１。チェックサム：５Ｅ３ＦＢ９９４０ＡＣＤ１ＢＥ８、Ｐ１６２３４−１／２／３、アイソフォーム１〜３；Ｐ０９６１９［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９８９年７月１日。バージョン１。チェックサム：０３８Ｃ１５Ｅ５３１Ｄ６Ｅ８９Ｄ
黒色腫関連マーカー／Ｍａｒｔ１：
Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２３１５、２０１２年１２月３０日更新；Ｑ１６６５５［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９６年１１月１日。バージョン１。チェックサム：Ｂ７５５ＢＦＦ３９ＣＦＣＢ１６Ｅ
ＣＤ１３３：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８８４２、２０１３年１月１３日更新；アイソフォーム１（ＡＣ１３３〜１）（Ｓ２）［ＵｎｉＰａｒｃ］。最終改定日：１９９８年６月１日。バージョン１。チェックサム：Ｄ２１ＣＢＣ０５ＡＤＢ２ＤＥＤＦ、Ｏ４３４９０−１／２／３／４／５／６／７、アイソフォーム１〜７
【０２９０】
以下では、本発明を例示するために示されるものであり、これを限定するために示されるものではない例に言及する。
【実施例１】
【０２９１】
組換え抗体構築物のクローニング
ハイブリドーマ細胞に由来し、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４５抗体、および抗ＨＬＡ  Ａ２抗体それぞれの可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を、分子生物学の標準的な方法（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York（2001）を参照されたい）により、図３に描示される抗体構築物を創成するのに用いた。組換えタンパク質が発現したときに同定および精製を容易にする、異なるアフィニティータグ（Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ）を保有するように構築物をデザインした。構築物のドメイン配置、アフィニティータグ、およびリンカーの詳細については、図３を参照されたい。
【０２９２】
ｐｅｌＢリーダーは、細菌において発現するタンパク質を細菌性ペリプラズムへと方向付けるアミノ酸配列をコードする。リーダー配列は、細菌性酵素により切断され、タンパク質を単離することができる。
【実施例２】
【０２９３】
組換え抗体の発現および精製
ペリプラズムタンパク質の発現：
適切な原核生物発現ベクターを用いて、組換え抗体構築物を、大腸菌（E. coli）ＴＧ１株のペリプラズム中で発現させた。０．１％のブドウ糖および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを組み入れた２×ＴＹ培地２リットルに、形質転換されたＴＧ１の一晩にわたる培養物２０ｍｌを接種し、３７℃で指数増殖期（ＯＤ６００：０．８〜０．９）まで成長させた。抗体断片は、ラクトースプロモーターの制御下にあるので、タンパク質発現は、１ｍＭのＩＰＴＧを添加した後、ＲＴ（室温）で振とうしながら、さらに３時間にわたりインキュベートすることにより、誘導した。細胞は、２，７５０×ｇおよび４℃で１０分間にわたり遠心分離することにより採取し、１００ｍｌの適切な緩衝液中に再懸濁させた。５０μｇ／ｍｌの新たに溶存させたリゾチーム［Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ］を添加し、氷上で２５分間にわたりインキュベートすることにより、細胞溶解を実施した。その後、１０ｍＭのＭｇＳＯ４を添加して、スフェロプラストを安定化させ、細胞を、６，２００×ｇおよび４℃で１０分間にわたり遠心分離した。最後に、ペリプラズムタンパク質を含有する、得られた上清を、ＰＢＳに対して４℃で一晩にわたり透析し、上記で言明した通り、１５分間にわたり再度遠心分離した。その後、組換えタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ−ＩＭＡＣ（ニッケルニトリロ三酢酸固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）により精製した。
【０２９４】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）：
組換えタンパク質をＨｉｓ６タグで精製するために、固定化ニッケルニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）アガロースビーズ［Ｑｉａｇｅｎ］により、ＩＭＡＣを実施した。第１に、１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムを、２０ｍＭのイミダゾールを伴う約１０ｍｌの滅菌ＰＢＳまたはリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化する必要があった。次いで、細胞質中の発現から沈殿させたか、またはペリプラズム中の発現から透析した粗タンパク質を、カラムへと徐々に適用した。約２０ｍｌの適切なＩＭＡＣ用洗浄緩衝液（２０〜３５ｍＭのイミダゾールを含有するリン酸ナトリウム緩衝液）で洗浄した後、タンパク質が流動物中にもはや検出されなくなるまで、結合したタンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを組み入れたリン酸ナトリウム緩衝液を伴う５００μｌの画分中で、カラムから溶出させた。
【０２９５】
回収された全ての洗浄画分および溶出画分を、１０μｌずつの各試料を９０μｌの１×ブラッドフォード溶液へと添加することによって定性的ブラッドフォードアッセイにより、タンパク質の存在について調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により精製過程の検証を実施した。この目的で、溶出した画分を、粗タンパク質画分、流動画分、および洗浄画分と並行して、還元条件にかけた。最後に、比色反応により決定された陽性画分を、ピーク画分およびマイナー画分へとプールし、４℃で一晩にわたりＰＢＳに対して透析した。刺激アッセイで使用するためには、精製されたタンパク質を滅菌濾過する必要があり、それらの濃度を決定した。加えて、タンパク質を定量化した後、２μｇのさらに用いられる画分もまた、還元条件下および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法により解析した。
【０２９６】
実施例２の代替法では、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）により、（ＶＨ）ＣＤ３−ＥＧＦＲ（ＶＨ−ＶＬ）、（ＶＨ）ＣＤ３−ＣＥＡ（ＶＨ−ＶＬ）、（ＶＨ）ＣＤ３−Ｈｅｒ２（ＶＨ−ＶＬ）、（ＶＨ）ＣＤ３−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ）、（ＶＨ）ＣＤ３−ＨＬＡ−ＣＷ６（ＶＨ−ＶＬ）（ＶＨ）ＣＤ３−ＣＤ１３８（ＶＨ−ＶＬ）、（ＶＨ）抗Ｄｉｇ−ＥＧＦＲ（ＶＨ−ＶＬ）、（ＶＨ）抗Ｈｉｓ−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ）、（ＶＬ）ＣＤ３−ＣＥＡ（ＶＨ−ＶＬ）、（ＶＬ）ＣＤ３−ＥｐＣＡＭ（ＶＨ−ＶＬ）、（ＶＬ）抗Ｄｉｇ−ＥｐＣＡＭ（ＶＨ−ＶＬ）、（ＶＬ）抗Ｈｉｓ−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ）、（ＶＬ）ＣＤ３−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ）をコードするＤＮＡを合成し、タンパク質を作製および単離した。ＤＮＡは、大腸菌（E.coli）における発現（ベクターＥ３）のためにコドンを最適化し、発現を最適化し、２リットルの標準的なＬＢ培地中で成長させ、タンパク質は、Ｎｉ−ＨｉＴｒａｐカラムによりワンステップで、封入体またはペリプラズム（ｐｅｌＢリーダー）から得た。細菌性内毒素は、１×リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）５リットルに対する透析により除去した。濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を基準物質とするブラッドフォードタンパク質アッセイにより測定した。純度は、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに対する濃度測定解析により推定した。アリコートは、−８０℃または＋４℃で保存した。保存緩衝液として、１×ＰＢＳ、５％のグリセロール、０．５％のラウロイルサルコシンナトリウム、ｐＨ７．４を用いた。
【実施例３】
【０２９７】
細胞培養法
細胞の培養：
哺乳動物細胞を、Ｔ７５組織培養フラスコ内の２０ｍｌの適切な培養培地中、５％のＣＯ２を伴う３７℃で培養した。２〜３日ごとに細胞を分けた。接着細胞を、１×トリプシン−ＥＤＴＡで引きはがすことがまず必要であった。生体染色液、エオシン、またはトリパンブルーを用いて、細胞をカウントした。保存のために、コンフルエンシーが６０〜８０％の細胞を、４５０×ｇで５分間にわたり遠心分離することにより採取し、１０％のＤＭＳＯを伴うＦＣＳ中に再懸濁させ、Ｃｒｙｏｖｉａｌ中でアリコート分割し、−８０℃の温度へと徐々に凍結させた。細胞は、水浴中３７℃で素早く融解させ、５ｍｌの培地へと注意深く添加した。ＤＭＳＯを除去するために、細胞を再度遠心分離し、新鮮な培地中に再懸濁させ、組織培養フラスコへと移した。
【０２９８】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製：
リンパ球および単球を含むＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌベースのリンパ球分離溶液であるＬＳＭ  １０７７（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いる密度遠心分離により、健常ヒトドナーの軟膜からあらかじめ単離した。それにもかかわらず、これらのＰＢＭＣは、使用時において、不均一な細胞集団として現れたので、残存する赤血球、顆粒球、および血小板からの分離を以下の通りに繰り返した。融解させたＰＢＭＣであって、１０％のＦＣＳおよびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含有する３０ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地中に再懸濁させたＰＢＭＣを、１０ｍｌのＬＳＭ  １０７７上に注意深く積み重ね、制動を伴わずに、８００×ｇで５分間にわたり遠心分離した。上部相を廃棄した後、中間相内で濃縮されたＰＢＭＣを、清浄な試験管へと移し、３０ｍｌの培地中に再懸濁させ、４５０×ｇで５分間にわたり遠心分離した。直径１０ｃｍの組織培養プレート内で、一晩にわたり、ＰＢＭＣを培養して、単球のプレートへの接着を可能とすることにより、単球を除去した。最後に、溶液中に残存するＰＢＭＣを採取した。
【０２９９】
実施例３の代替法では、転移性膵臓がんを伴う患者に由来する原発性ヒトがん細胞を患者の腹水バッグから抽出した（図２９）。回収された新鮮な悪性腹水を伴う４リットルを、２リットルのガラスボトル内に４℃で一晩にわたり保存した。翌日、ガラスの底部から細胞ペレットを、１×ＰＢＳ中で洗浄し、培養培地（２００μＭのｌ−グルタミン、１０％の熱不活化ＦＢＳ、ペニシリン（２００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（２００μｇ／ｍＬ）、およびピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を補充したＤＭＥＤ）中に再懸濁させた。接着細胞は、３６℃、５％ＣＯ２、湿度９０％のインキュベーター内で培養した。同じ日、腹水を、患者から回収し、ＰＢＭＣ抽出のために、２０ｍｌの末梢血を回収した。白血病性初代細胞は、適合同種幹細胞移植の３２日後において再発した、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を伴う７１歳の男性患者から得た（図１１Ａ）。白血病性Ｔ−ＰＬＬ細胞は、患者の末梢血から、ＰＢＭＣとして抽出した。試料を取り出したとき、日常的な臨床診断法によれば、患者は、その血球数中に＞９０％の白血病性芽球を有した。全ての患者は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇの倫理委員会により承認されている説明同意文書に署名した。
【０３００】
実施例３の代替法では、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的ヒトＴ細胞の創成：略述すると、樹状細胞（ＤＣ）は、ＨＬＡ−Ａ０２０１陰性でＢ０７０２＋であるドナーのＰＢＭＣに由来するプラスチック接着単球から創成した。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ４含有ＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）中で７２時間にわたる培養の後、ＩＬ４（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（８００ＩＵ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）に加えて、２．５ｕｇ／ｍｌのＣＭＶ  ｐｐ６５に由来するペプチドＴＰＲＶＴＧＧＧを含有する培地中でＤＣを成熟させた。１６時間後、ＤＣに照射（３０Ｇｙ）し、５％のＡＢ血清およびＩＬ２１（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中、１：４の比で、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ５７−ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞と共に共インキュベートした。１０〜１２日目における評価の前、培養の３、５、および７日目に、新鮮な培地、ＩＬ７、およびＩＬ１５を添加した。細胞は、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ  ＤＣ培地中で培養した。ＰＡＡ製のヒトＡＢ血清を用いた。全ての実験を通して、１つの単一のバッチを用いた。ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１は、ＰｅｐｒｏｔｅｃｈまたはＣｅｌｌｇｅｎｉｘから購入した（結果は同一であった）。ＧＭ−ＣＳＦは、Ｇｅｎｔａｕｒから購入した。ＬＰＳ（大腸菌（E.coli）Ｏ：１５）は、Ｓｉｇｍａから購入した。ＨＬＡ−Ｂ０７０２拘束ＣＭＶ特異的ペプチドＴＰＲＶＴＧＧＧは、ｊｐｔから購入した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために、ＡＰＣ標識したＭＨＣ−マルチマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ）を用いて、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞をさらに精製した。室温でＭＨＣマルチマー染色を実施した後、抗ＡＰＣビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により、ＭＨＣ−マルチマー＋  Ｔ細胞の単離を行った。
【実施例４】
【０３０１】
機能アッセイ
フローサイトメトリー：
抗体融合タンパク質の抗原提示腫瘍細胞および／またはＴリンパ球への結合をフローサイトメトリーにより調べた。この目的で、２．５〜５×１０５個の細胞を、１０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖまたは９６ウェルＶ字型プレート上にウェル１つ当たり１００μｌずつの適切な緩衝液（ＰＢＳ＋ウシ血清アルブミンまたは他の許容される緩衝液など）中で滴定された０．００４〜４μｇ／ｍｌの融合タンパク質と共に、４℃で２時間にわたりインキュベートした。１５０μｌの適切な緩衝液で３回洗浄した後、細胞を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈｉｓ６タグまたは抗Ｆｌａｇタグまたは抗ｍｙｃタグ抗体と共にＲＴで３０分間にわたりインキュベートし、２回再度洗浄した。バックグラウンド染色についてゲーティングし、調べるため、さらに、１つは非染色細胞とし、１つは、タンパク質を伴わない、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈｉｓ６タグ抗体で染色した細胞とする、各細胞型の試料２つずつを調製した。最後に、細胞を、５００μｌの適切な緩衝液中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ試験管へと移し、フローサイトメトリーにより解析した。
【０３０２】
ＰＢＭＣ刺激アッセイ：
細胞ベースの刺激アッセイにおいて、組換えタンパク質の刺激特性を調べた。こうして、誘導されるＩＬ−２放出との関連で、ＰＢＭＣへの刺激を測定することにより、二特異性抗体および「三ドメイン構築物」により媒介されるＴ細胞活性化を決定した。
【０３０３】
構築物の刺激活性の測定：
ＣＤ４５陽性／ＨＬＡ  Ａ２骨髄腫細胞系であるＵ２６６を、ウェル１つ当たり１００μｌの培養培地中に細胞１０５個の密度で、平底９６ウェル細胞培養プレートに播種した。滴定された刺激性タンパク質を、表示される通りにウェル１つ当たり１００μｌずつの培地中に添加し、３７℃および５％のＣＯ２で１時間にわたりプレインキュベートして、十分な結合を確保した。次いで、前日に融解させて単離した非刺激ＰＢＭＣを、表示の密度で添加し、３７℃および５％のＣＯ２で２４時間にわたりインキュベートした。最後に、プレートを、４５０×ｇで５分間にわたり遠心分離して、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２を定量化するために、細胞非含有上清を採取した。
【０３０４】
ＩＬ−２サンドイッチＥＬＩＳＡ：
刺激活性についての指標として、二特異性抗体により誘導されるＴ細胞活性化を、ＩＬ−２放出との関連で測定した。ＰＢＭＣにより刺激したら、上清中に分泌されるＩＬ−２の濃度を、ＩＬ−２サンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した。
【０３０５】
第１に、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ウェル１つ当たり４００ｎｇ／１００μｌのマウス抗ヒトＩＬ−２抗体により、４℃で一晩にわたりコーティングした後、非特異的結合部位を、適切な遮断緩衝液により、ＲＴで２時間にわたり飽和させた。その間、１，０００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−２最大濃度で始める、ＩＬ−２基準物質の１：２による希釈系列を、希釈用試薬中２連で調製した。次いで、ＩＬ−２を含有する上清を、１０％のＦＣＳおよびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン−ストレプトマイシン）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で１：３に希釈した。希釈した上清および基準物質の両方を、ＥＬＩＳＡプレートへと移し、ＲＴで２時間にわたりインキュベートした。その後、ＩＬ−２を、ウェル１つ当たり１７．５ｎｇ／１００μｌのビオチニル化ヤギ抗ヒトＩＬ−２抗体と共に、ＲＴで２時間にわたりインキュベートすることにより検出した。最後に、希釈用試薬中で１：２００に希釈したＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを、ウェル１つ当たり１００μｌずつ添加して、ＲＴで２０分間にわたりインキュベートした。各プレートは、ＴＭＢ基質溶液を用いて現像した。バックグラウンドシグナルを達成するために、各プレート上で少なくとも２つずつのウェルを、希釈用試薬または培地だけと検出抗体にＴＭＢを加えてインキュベートした。各インキュベーションステップの間、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳだけで１回洗浄した。
【０３０６】
各基準試料の吸光度シグナルを、ＩＬ−２濃度に対してプロットすることにより、７点の検量線を作成した。したがって、各上清のＩＬ−２の量は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を用いて、単相指数関数連関（one phase exponential association）のための非線形回帰式で近似された検量線を内挿することにより決定することができた。
【０３０７】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ（実施例４の代替法）：
１００μｌの細胞培養物上清中で、製造元のプロトコールに従って、ヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて、ＩＦＮ−γ濃度を測定した。略述すると、５０μＬのインキュベーション緩衝液を、プレコーティングされた９６ウェルプレートの各ウェルへと添加した。５０μＬのＳｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒを、ゼロウェルへと添加した。５０μＬの基準物質および試料を各ウェルへと添加した。５０μＬのビオチニル化Ｈｕ  ＩＦＮ−γ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液を、各ウェルへと添加した。プレートの側面を静かにタッピングして、混合した。プレートを、プレートカバーで覆い、室温で１時間３０分にわたりインキュベートした。溶液をウェルから完全に吸引し、液体を廃棄した。ウェルを４回洗浄した。１００μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ作業溶液を、各ウェルへと添加した。プレートを、プレートカバーで覆い、室温で４５分間にわたりインキュベートした。溶液をウェルから完全に吸引し、液体を廃棄した。１００μＬのＳｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎを、各ウェルへと添加した。ウェル内の液体は、青色に変わった。暗所内、室温で１５〜３０分間にわたりインキュベートした。１００μＬのＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを、各ウェルへと添加した。プレートの側面を静かにタッピングして、混合した。ウェル内の溶液は、青色から黄色へと変化した。各ウェルの吸光度は、ＢｉｏＲａｄプレートリーダーにより４５０ｎｍで読み取った。
【０３０８】
細胞傷害作用アッセイ：
ＨＬＡ−Ａ２／ＣＤ４５陽性細胞系であるＵ２６６または骨髄腫細胞系であるＵ２６６を、３５０μｌのＰＢＳ中に１０μＭのＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｖｙｂｒａｎｔ  ＣＦＤＡ  ＳＥ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅｒ  Ｋｉｔ）により、暗所内、室温（ＲＴ）で１０分間にわたり標識した。標識化反応は、５ｍｌのウシ胎仔血清（ＦＣＳ）の添加後、ＲＴで１分間にわたるインキュベーションにより停止させた。２回洗浄の後、ＣＦＳＥ標識した標的細胞を、アッセイ培地中に再懸濁させ、１：１０（２ｍｌ中に５×１０５個のＵ２６６および５×１０６個のＰＢＭＣ）の比で、ＨＬＡ−Ａ２陰性の健常ドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、および表示される通り２７ｎＭの抗体構築物と共に共インキュベートした。Ｔｒｉｔｏｎで処理された試料を陽性対照（１００％の溶解）として用い、抗体構築物を伴わない試料を陰性対照（０％の溶解）として用いた。２４時間後、アポトーシス細胞を７ＡＡＤ染料（Ｂｉｏｚｏｌ、ＲＴで１０分間にわたる）で視覚化し、ＣＦＳＥで標識されたＵ２６６細胞の特異的溶解％を、フローサイトメトリー法を使用して計算した。
【０３０９】
カスパーゼ３アッセイ（実施例４の代替法）：
標的細胞をＴ細胞と共に共インキュベート（腫瘍細胞：Ｔ細胞比を２：１とする）した後に、特異的なポリペプチドを伴うかまたは伴わずに、４時間にわたり染色を実施した。まず、ＨＬＡ−Ａ２およびＣＤ４５についての表面染色を実施した後、固定および透過（Ｆｉｘ＋Ｐｅｒｍ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を実施した。次いで、活性化カスパーゼ３抗体を３０分間にわたり添加した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。細胞を、１×ＰＢＳ＋５％のヒト血清（ＨＳ、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で洗浄し、ＢＤ−ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ−ＩＩ上で解析した。特異的アポトーシス％を、（実験値％−自発的放出％）／（１００％−自発的放出％）×１００として計算した。
【０３１０】
ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ（実施例４の代替法）：
ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイ（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）を用いて、毒素への曝露後における細胞の増殖および生存率を測定した。略述すると、細胞を、ウェル（９６ウェルプレート）１つ当たり１００μｌの細胞培養培地中で成長させた。解析するために、ウェル１つ当たり１０μｌずつのａｌａｍａｒＢｌｕｅを添加し、インキュベーター内で３０〜１２０分間にわたりインキュベートした。吸光度は、ＢｉｏＲａｄプレートリーダーにより、５７０ｎＭおよび６００ｎＭで読み取った。ブランクには、培地だけを用いた。異なるポリペプチド群間における細胞増殖の低減差パーセントは、毒素を伴わない培養物中の細胞成長を対照として用いて、製造元により指示される通りに計算した。
【０３１１】
ジゴキシゲニンアッセイ（実施例４の代替法）：
まず、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ｇｍｂＨ）を、モル比１／３のジゴキシゲニンＮＨＳエステル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ｇｍｂＨ）で標識した。Ｄｉｇ−ＨＲＰを、Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ（商標）クロマトグラフィーカラム（ＢｉｏＲａｄ）で清浄化し、暗所内、４℃で保存した。まず、Ｃｏｌｏ−２０６Ｆ細胞を、表示された多様な濃度のポリペプチドと共に、９０分間にわたりインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｄｉｇ−ＨＲＰを伴う細胞培養培地中に再懸濁させ、３０分間にわたりインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。５０μＬのＳｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を、暗所内、室温で１５〜３０分間にわたり添加した。５０μＬのＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、ＢｉｏＲａｄプレートリーダーにより、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０３１２】
マウス（実施例４の代替法）：
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験（図１２Ａ）用のＨＬＡ．Ａ２トランスジェニック免疫欠損マウス（ＮｏｄＳｃｉｄ  ＩＬ−２ｒｇ  −／−ＨＬＡ．Ａ２／Ｂ２ｍ  ｔｇ；株番号：１４５７０、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）は、欧州ガイドラインに従って、本発明者らの公認の動物施設（ＺＥＭＭ、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ）において維持した。６〜１０週齢の雌マウスを、群１つ当たりのマウス６匹ずつの５群（ｎ＝３０）へと分けた。５×１０６個のＴＨＰ−１細胞、１．２５×１０５個のＣＭＶ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞（腫瘍細胞：Ｔ細胞比：４０／１）、および０．５μｇのポリペプチドを、表示される通りに腹腔内（ｉ．ｐ）注射した。注射の後、マウスを、毎日の目視によりモニタリングした。１３日目に、マウス１匹当たり１．１６×１０５個のＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による２回目の注射を施し、ポリペプチドの注射を、週３日繰り返した。体重の増大が８０％を超えるか、または施設のガイドラインに従って瀕死であると考えられる場合は、動物を屠殺した。
【０３１３】
実施例５〜９または図４〜１１において用いられる構築物のドメイン構造、アフィニティータグ、およびリンカーまたはポリペプチドを、図３に示す。図４〜３０において用いられるこれらの構築物および全ての構築物またはポリペプチドは、実施例１および２において記載されている通りに調製した。実施例５〜９における細胞培養アッセイおよび機能アッセイ、ならびに図４〜３０による培養アッセイ、機能アッセイ、およびｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、実施例３および４において記載されている通りに実行した。
【実施例５】
【０３１４】
ＣＤ４５およびＨＬＡ  Ａ２陽性骨髄腫標的細胞系であるＵ２６６を、健常ドナーに由来するＨＬＡ  Ａ２陰性Ｔ細胞（単球を枯渇させたＰＢＭＣ（末梢血単核細胞））、ならびに、量を変化させる、表示（番号：８５、８２、７５および７１）のＨＬＡ  Ａ２およびＣＤ３二特異性抗体構築物と共に共インキュベートした。ＰＨＡ−Ｌ（フィトヘマグルチニン、Ｔ細胞の非特異的刺激を引き起こすレクチン；１μｇ／ｍｌの最終濃度）を、陽性対照として用い、ＨＬＡ  Ａ２に対する特異性を伴う単鎖ｓｃＦｖ構築物（番号：４）、またはＣＤ３に対する特異性を伴う単鎖ｓｃＦｖ構築物（番号：３６）を調査した。Ｔ細胞によるＩＬ２（インターロイキン２）産生を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。構築物を伴わない実験状況では、ＩＬ２産生が見出されなかった。得られたデータを、図４に描示する。
【実施例６】
【０３１５】
ＣＤ４５およびＨＬＡ  Ａ２陽性骨髄腫標的細胞系であるＵ２６６を、健常ドナーに由来するＨＬＡ  Ａ２陰性Ｔ細胞（単球を枯渇させたＰＢＭＣ）と共に共インキュベートし、量を変化させる「三ドメイン構築物」を、個別に（番号：４２、４５、５５；図３に描示されている構築物を指す番号）、または組合せ（４２＋４５または４２＋５５）で添加した。ＰＨＡ−ＬおよびＣＤ４５に対する特異性を伴う単鎖ｓｃＦｖ構築物（番号：４６および１７）は、対照として施した。Ｔ細胞によるＩＬ２産生を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。構築物を伴わない実験状況では、ＩＬ産生が見出されなかった。得られたデータを、図５に描示する。
【実施例７】
【０３１６】
ＣＤ４５およびＨＬＡ  Ａ２陽性骨髄腫標的細胞系であるＵ２６６を、健常ドナーに由来するＨＬＡ  Ａ２陰性Ｔ細胞（単球を枯渇させたＰＢＭＣ）、ならびに単独（番号：７１；２７ｎＭ）の、またはＨＬＡ  Ａ２上の抗原性エピトープを遮断する単鎖ｓｃＦｖ構築物（番号：４；構築物７１の濃度と比較して１００倍の過剰、すなわち、２７００ｎＭ）、もしくはＣＤ３上の抗原性エピトープを遮断する単鎖ｓｃＦｖ構築物（番号：３６；構築物７１の濃度と比較して９倍の過剰、すなわち、２４３ｎＭ）と組み合わせたＨＬＡ  Ａ２およびＣＤ３二特異性抗体構築物と共に共インキュベートした。Ｔ細胞によるＩＬ２産生を、ＥＬＩＳＡ法により測定し、ＰＨＡ−Ｌを、対照として施す。得られたデータを、図６に描示する。
【実施例８】
【０３１７】
ＣＤ４５およびＨＬＡ  Ａ２陽性骨髄腫標的細胞系であるＵ２６６を、健常ドナーに由来するＨＬＡ  Ａ２陰性Ｔ細胞（単球を枯渇させたＰＢＭＣ）、および構築物４２と４５との組合せと共に共インキュベートした。Ｔ細胞による刺激機能は、ＨＬＡ  Ａ２に特異的な単鎖構築物（番号：４）、またはＣＤ４５に特異的な単鎖構築物（番号：４６）により遮断した。Ｔ細胞による刺激機能の相補を、構築物４２および４５を個別にアッセイすることにより、またはＣＤ３を指向する単鎖ｓｃＦｖ構築物（番号：３６）アッセイすることにより調べた。Ｔ細胞によるＩＬ２産生を、ＥＬＩＳＡ法により測定し、ＰＨＡ−Ｌを、対照として施す。構築物の濃度は、別段に指し示さない限り、２７ｎＭとした（「９×」とは、２４３ｎＭの濃度を指し示し、「１００×」とは、２７００ｎＭの濃度を指し示す）。得られたデータを、図７に描示する。
【実施例９】
【０３１８】
ＣＤ４５およびＨＬＡ  Ａ２陽性骨髄腫標的細胞系であるＵ２６６を、健常ドナーに由来するＨＬＡ  Ａ２陰性Ｔ細胞（単球を枯渇させたＰＢＭＣ）、および構築物４２と５５との組合せと共に共インキュベートした。Ｔ細胞による刺激機能は、ＨＬＡ  Ａ２に特異的な単鎖構築物（番号：４）、またはＣＤ４５に特異的な単鎖構築物（番号：４６）により遮断した。Ｔ細胞による刺激機能の相補を、構築物４２および５５を個別にアッセイすることにより、またはＣＤ３を指向する単鎖ｓｃＦｖ構築物（番号：３６）アッセイすることにより調べた。Ｔ細胞によるＩＬ２産生を、ＥＬＩＳＡ法により測定し、ＰＨＡ−Ｌを、対照として施す。構築物の濃度は、別段に指し示さない限り、２７ｎＭとした（「９×」とは、２４３ｎＭの濃度を指し示し、「１００×」とは、２７００ｎＭの濃度を指し示す）。得られたデータを、図８に描示する。
【０３１９】
前出の実施例の結果は、２つの構築物（４２＋４５）または（４２＋５５）は、その後、Ｔ細胞の動員機能を相補するためには、まず、単一の細胞の表面でそれらのリガンドに結合しなければならないことを明らかに裏付けている。
【実施例１０】
【０３２０】
ＶＬＣＤ３−ｓｃＦｖＨＬＡ  Ａ２（２７ナノモル）もしくはＶＨ−ｓｃＦｖＣＤ４５（２７ナノモル）またはこれらの構築物両方の組合せ（各々２７ナノモルずつ）の存在下における、ＣＤ４５およびＨＬＡ  Ａ２陽性骨髄腫標的細胞系であるＵ２６６の、ＨＬＡ  Ａ２陰性Ｔ細胞（単球を枯渇させたＰＢＭＣ）による溶解を、フローサイトメトリーベースの技法を用いて決定した。溶解パーセントは、アポトーシス性Ｕ２６６細胞を、全Ｕ２６６細胞により除して、バックグラウンドのアポトーシスを減じることにより計算した。得られたデータを、図９に描示する。
【実施例１１】
【０３２１】
最終的な二部分構築物の一部として、各々が、抗原結合単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ドメインまたは可変重鎖（ＶＨ）ドメインとからなる、２つのポリペプチドをデザインした（図１０）。これらの２つのポリペプチドが、それらのそれぞれの抗原に、単一の細胞の表面上で結合すると、ＶＬドメインとＶＨドメインとが互いと相互作用して、元の抗ＣＤ３結合部位を再構成する。こうしてオンターゲットで形成された三特異性ヘテロ二量体は、Ｔ細胞を、腫瘍細胞の破壊に、動員および刺激する。
【０３２２】
この情況は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｔリンパ球が、２つの異なるポリペプチドと共にインキュベートされた標的細胞と直面するとき、完全に検証される。原理の実証として述べると、主要組織適合性抗原であるＨＬＡ−Ａ２および造血系統マーカーＣＤ４５を、第１の抗原および第２の抗原として標的としたが、Ｕ２６６骨髄腫細胞、Ｔ細胞系統の前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を伴う患者に由来する初代細胞、およびＴＨＰ−１急性骨髄白血病性芽球上では、これらのいずれもが発現する（図１１）。記載したＶＬ／ＶＨ間相互作用に起因して、本三特異性ヘテロ二量体は、インターロイキン２（ＩＬ−２）を分泌し（図１１ａ）、標識された腫瘍細胞をナノモル濃度で溶解させる（図１１ｂ）ように、Ｔ細胞を強力に刺激し、細胞傷害作用の有効性は、陽性対照として使用した二特異性Ｔ細胞活性化抗体の細胞傷害作用の有効性（図１１Ａ、左パネル）（Mack、1995、Proc Natl Acad Sci 92、7021〜7025）と酷似する。ポリペプチドを、互いに対して個別に添加したところ、それらは、標的細胞を溶解させるようにＴリンパ球を誘導しなかった。これらの結果は、標的抗原に対する十分なアフィニティーを付与するには、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのいずれもが要請されることを指し示す構造データと符合する（図１１Ａ、Ｂ）（Colman、1987、Nature 326、358〜363; Amit、1986、Science 233、747〜753）。なおさらに、結果は、ＶＨアームまたはＶＬアームの潜在的なホモ二量体化が結果としてもたらす生物学的効果は、測定可能であるが無視できることを明らかにする。
【０３２３】
ＶＨ／ＶＬヘテロ二量体化が生じるには、まず２つの分子がそれらの抗原に標的細胞の表面上で結合しなければならないことを裏付けるために、ＨＬＡ−Ａ２およびＣＤ４５に特異的な単鎖可変断片を用いて、標的上のそれぞれのエピトープを遮断した。図１１ｃにおいて示される通り、大きな過剰で存在する場合、これらの阻害剤は、２つのポリペプチドが、Ｔ細胞を誘発することを、用量依存的に阻止した。さらに、標的細胞を存在させなかった場合（データは示さない）、またはＣＤ４５だけを発現させる標的細胞（ＲＡＪＩ細胞、図１１Ｄ）、もしくは標的分子のいずれも発現させない標的細胞（ＫＭＳ−１２−ＢＭ、図１１Ｄ）をプローブした場合も、Ｔ細胞は刺激されなかった。
【実施例１２】
【０３２４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける概念実証のために、同種ドナー幹細胞（ＨＬＡ−Ａ２陰性、ＣＤ４５陽性）に、生着し、造血を再構成する可能性を与えるには、ＨＬＡ−Ａ２およびＣＤ４５陽性である患者の全ての遺残白血病性細胞および造血細胞を消失させなければならない、同種不適合幹細胞移植モデル（図２を参照されたい）によった。二部分構築物の特異性を調べるために、事実上全ての有核細胞上でヒトＨＬＡ−Ａ２トランス遺伝子を発現させる免疫欠損マウスを用いたが、問題は、ＨＬＡ−Ａ２陽性であるがＣＤ４５陰性であるマウス組織が、付随する損傷を受けるのかどうかであった。ヒト抗マウス免疫反応性を回避するため、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対する特異性について選択された、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来するＣＤ８  Ｔリンパ球を伴うかまたは伴わずに、ＴＨＰ−１細胞を腹腔内注射した。腹腔内腫瘍は、ポリペプチドを施されないマウス、およびＴ細胞を伴わずに単一種類の分子または両方のポリペプチドの組合せで処置されたマウスにおいて、急速に発症した。全ての場合において、致死性播種性疾患が、３〜４週間以内に発症した（図１２Ａ）。これとは著しく対照的に、Ｔ細胞および両方のポリペプチドの注射の繰り返しで処置された全ての腫瘍保有マウスは、注射部位に触知可能な腫瘍を伴ったが、３１日目の実験終了時まで生存した。これらの結果は、二部分構築物が、Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて標的分子（ＨＬＡ−Ａ２およびＣＤ４５）の両方を同時に発現させる腫瘍細胞におけるそれらの特異性に関わりなく、真に方向転換させることを明らかに示す。余談として述べると、ＨＬＡ−Ａ２に対してＴ細胞を動員する二特異性抗体であれば、Ｔ細胞を、全てのＨＬＡ−Ａ２陽性マウス組織に対して方向転換させることにより、大きな破壊をもたらすであろう。同様に、ＣＤ４５結合二特異性抗体であれば、ドナーに由来するＴＨＰ−１白血病性芽球およびＴ細胞を含めた、全ての造血細胞の溶解を媒介したであろう。しかし、本発明者らの環境では、ＨＬＡ−Ａ２特異的ポリペプチドのＨＬＡ−Ａ２トランスジェニック動物への注射により、明らかな毒性が引き起こされることはなかった。
【０３２５】
バイスタンダーに対する可能な毒性をさらに検討するために、本発明者らは、ＴＨＰ−１細胞およびＨＬＡ−Ａ２陰性であるがＣＤ４５陽性である単球（後者は健常なバイスタンダーコンパートメントを表す）についての高感度のアポトーシスアッセイを使用した。図１２Ｂに描示する通り、本発明者らは、同じウェル内で、ポリペプチドまたは二特異性陽性対照とドナーＴ細胞との組合せにより処置された、ＴＨＰ−１細胞では、カスパーゼ３の活性化を観察したが、単球では、カスパーゼ３の活性化を観察しなかった。Ｔ細胞および個々のポリペプチドと共に培養されたＴＨＰ−１細胞には影響が見られなかった。これらの観察もまた、もっぱら二重の抗原陽性標的集団ではアポトーシスが惹起されるのに対し、ＨＬＡ−Ａ２陰性のバイスタンダー細胞は免れることを明らかに示す。これらの実験は、ＨＬＡ不適合幹細胞移植を伴う白血病患者の切迫した臨床状況を極めて正確にモデル化している。弁別的なＨＬＡ分子とＣＤ４５とを用いるコンビナトリアル法は、ドナーのＴ細胞を、骨髄およびリンパ系の両方に由来する白血病性芽球に対して再度標的化することにより、所望の移植片対白血病効果を増強することを目的とする。
【実施例１３】
【０３２６】
充実性腫瘍へと挑むために、本発明者らは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）抗原および表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗原を、コンビナトリアル法の標的とした。いずれの抗原も、多様ながん腫において過剰発現し、第ＩＩ相臨床試験および第ＩＩＩ相臨床試験で広範に研究されている。ＥＧＦＲの発現が、細胞増殖と密接に関連するのに対し、ＥｐＣＡＭは、事実上全ての単層上皮の基底外側表面に存在し、近年では、Ｗｎｔ経路内のシグナル伝達タンパク質と同様に作用することが見出されている（Maetzel、2009、Nat Cell Biol 11、162〜171）。図１３ａが例示する通り、２つのポリペプチドは、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の、共インキュベートされるドナーリンパ球からの放出を誘発し、二重陽性がん細胞系であるＣＯＬＯ−２０６Ｆのアポトーシスを、ナノモル濃度で媒介する（図１３ａ、ｂ）が、これは、組合せで施される場合に限り、いずれかのパート単独で施される場合には当てはまらない。神経上皮組織の子孫細胞として、黒色腫細胞系であるＦＭ−５５は、ＥｐＣＡＭを欠き、したがって、ポリペプチドに対して完全に耐性であった（図１３ａ、ｂ）。ＥＧＦＲおよびＥｐＣＡＭの発現は、増殖性がん細胞では広く重複するが、例えば、それぞれ、ＥＧＦＲ抗原またはＥｐＣＡＭ抗原だけを発現させる、肝臓および膵臓の非増殖性上皮細胞は、２方面攻撃に対してそれほど感受性でないか、またはこれから保護されるはずである。臨床試験では、高アフィニティーのＥｐＣＡＭモノクローナル抗体の肝毒性および膵毒性は、用量制限的となっていることが注目に値する（総説については、Munz、2010、Cancer Cell Int 10:44を参照されたい）。
【実施例１４】
【０３２７】
異なるポリペプチドの組合せを用い、異なるヒト細胞系における多様な細胞表面抗原を標的化する、広範なｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、二部分機能相補戦略についてのさらなる検証を実施した。
【０３２８】
ＨＬＡ  Ａ２陽性ヒト腫瘍細胞系であるＦＭ−５５（黒色腫）、Ｃｏｌｏ−２０６Ｆ（結腸がん）、およびＯＶＣＡＲ（卵巣がん）を、健常ドナーに由来するＨＬＡ−Ａ２陰性ＰＢＭＣ、ＨＬＡ−Ａ２（ＣＤ３（ＶＬ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））に対するポリペプチド、およびＣＥＡ（ＣＤ３（ＶＨ）−ＣＥＡ（ＶＨ−ＶＬ））、ＥＧＦＲ（ＣＤ３（ＶＨ）−ＥＧＦＲ（ＶＨ−ＶＬ））、またはＨｅｒ２（ＣＤ３（ＶＨ）−Ｈｅｒ２（ＶＨ−ＶＬ））を標的化する第２のポリペプチドと共に共インキュベートした。リンパ球によるＩＬ２またはＩＦＮ−γの産生は、ＥＬＩＳＡ法により測定した。これらのデータは、（ｉ）特異的な抗原の組合せ、抗原署名は、多様な由来（皮膚組織、神経上皮組織、胃組織、および卵巣組織）のがん腫上で発現しうること、（ｉｉ）抗原署名は、抗原署名に特異的なポリペプチドセットを用いる本発明者らの二部分機能相補戦略により接近可能であることを裏付ける。得られたデータを、図１４、１５、および１６に描示する。
【実施例１５】
【０３２９】
それらの元の抗体ドメインをオンターゲットで回復してＴ細胞を動員するための、それらの特異的な相補能力を保持する機能ドメインの交換可能性を裏付けるために、ポリペプチドセットの断片Ｆ１と断片Ｆ２とを、互いと交換した。したがって、ＣＤ４５およびＨＬＡ−Ａ２の標的抗原に対するポリペプチドセットを用いた。ＣＤ４５に対するポリペプチドは、断片Ｆ１としてのＣＤ３（ＶＬ）を有し、ＨＬＡ−Ａ２に対するポリペプチドは、断片Ｆ２としてのＣＤ３（ＶＨ）を有した。ＣＤ４５およびＨＬＡ−Ａ２陽性骨髄腫細胞系であるＵ２６６を、健常ドナーに由来するＨＬＡ−Ａ２陰性Ｔ細胞、ならびに量を変化させるＣＤ４５に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ））およびＨＬＡ−Ａ２に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））と共に共インキュベートした。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価し、ＥＬＩＳＡ法により測定した。ポリペプチドを伴わない実験状況では、ＩＦＮγ産生が見出されなかった。得られたデータを、図１７に描示する。
【実施例１６】
【０３３０】
がんの抗体療法のための標的として既に用いられている抗原（ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、およびＨｅｒ２）（Ｈｅｒ２は、乳がんにおけるトラスツズマブの標的であり、ＥＧＦＲは、結腸直腸がんにおけるセツキシマブの標的であり、ＥｐＣＡＭは、新生物性腹水を処置するためのカツマキソマブの標的である）のセットを標的化することにより、二部分機能相補戦略についてさらに調べた。ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、およびＨｅｒ２陽性細胞（Ｃｏｌｏ−２０６Ｆ、ＣＸ−１、およびＯＶＣＡＲ）を、健常ドナーに由来するＰＢＭＣ、ならびにＥＧＦＲに対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＥＧＦＲ（ＶＨ＋ＶＬ））、ＥｐＣＡＭに対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＥｐＣＡＭ（ＶＨ＋ＶＬ））、およびＨｅｒ２に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−Ｈｅｒ２（ＶＨ＋ＶＬ））の組合せと共に共インキュベートした。リンパ球刺激機能の相補は、反応性ＩＦＮγの産生により評価し、ＥＬＩＳＡ法により測定した。ポリペプチドを伴わない実験状況では、ＩＦＮγ産生が見出されなかった。得られたデータを、図１８および１９に描示する。
【実施例１７】
【０３３１】
臨床と密接に相関する抗原の組合せについて調べるため、ＣＤ４５とＣＤ１３８との組合せを用いて、ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞を標的化した。ヒトＭＭ細胞の大部分は、ＣＤ４５およびＣＤ１３８に陽性である。ＣＤ４５に対するＴ細胞動員二特異性抗体であれば、患者の全ての造血細胞を死滅させるであろうし、ＣＤ１３８に対するＴ細胞動員二特異性抗体であれば、多様な通常の組織（上皮細胞、内皮細胞、栄養膜細胞、および消化管の腺細胞；The Human Protein Atlas、Version: 10.0、アトラスの改定：２０１２年９月１２日）におけるその発現のために、重度の副作用を引き起こすであろう。これに対し、ＣＤ４５とＣＤ１３８との組合せは、もっぱら形質細胞上およびＭＭ細胞上で見出され、したがって、標的化療法のための良好な抗原署名である。ＣＤ４５およびＣＤ１３８陽性ヒト多発性骨髄腫細胞系であるＡＭＯ−１を、健常ドナーに由来するＰＢＭＣ、ならびにＣＤ４５に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＣＤ４５（ＶＨ＋ＶＬ））とＣＤ１３８に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＣＤ１３８（ＶＨ＋ＶＬ））との組合せと共に共インキュベートした。リンパ球刺激機能の相補は、反応性ＩＦＮγの産生により評価し、ＥＬＩＳＡ法により測定した。単独のポリペプチドを伴う実験状況またはポリペプチドを伴わない実験状況では、ＩＦＮγ産生が見出されなかった。得られたデータを、図２０に描示する。
【実施例１８】
【０３３２】
二部分機能相補戦略のさらなる適用は、細胞表面上の単一の抗原を標的化し、単一の抗原陽性腫瘍細胞を死滅させることである。機能的な抗ＣＤ３結合部位を伴うＴ細胞動員二特異性抗体の１つの主要な欠陥は、非特異的なＴ細胞活性化およびサイトカインの放出により引き起こされる重度の副作用である（Linke, R.ら、Catumaxomab: clinical development and future directions. MAbs 2、129〜136（2010））。本二部分機能相補戦略の利点は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３機能ドメインが回復されるのは、標的細胞上に限るという事実である。標的細胞を伴わなければ、Ｔ細胞活性化ドメインは存在しない。ＣＤ４５およびＣＤ１３８陽性ヒト多発性骨髄腫細胞であるＡＭＯ−１およびＵ２６６を、健常ドナーに由来するＰＢＭＣ、ならびに単一の標的抗原であるＣＤ１３８に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＣＤ１３８（ＶＨ＋ＶＬ）＋ＣＤ３（ＶＬ）−ＣＤ１３８（ＶＨ＋ＶＬ））またはＣＤ４５に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＣＤ４５（ＶＨ＋ＶＬ）＋ＣＤ３（ＶＬ）−ＣＤ４５（ＶＨ＋ＶＬ））の組合せと共に共インキュベートした。リンパ球刺激機能の相補は、反応性ＩＦＮγの産生により評価し、ＥＬＩＳＡ法により測定した。単独のポリペプチドを伴う実験状況またはポリペプチドを伴わない実験状況では、ＩＦＮγ産生が見出されなかった。得られたデータを、図２１および２２に描示する。図２３では、標的抗原Ａ１上の２つの異なるエピトープ（上方）または同じエピトープ（下方）を標的化するポリペプチドセットを用いることにより、単一抗原法を例示する。
【実施例１９】
【０３３３】
本実施例は、ペイロード送達の標的化のために、機能相補戦略をさらに洗練させることができ、異なるエフェクター経路により、標的細胞を死滅させることが可能なことを裏付ける例である。結合したポリペプチドセットのＦ１断片とＦ２断片とをオンターゲットで相補することにより、新たに形成される抗体結合部位を、それが特異的な任意の分子に結合させることができる。ＨＩＳタグ付けされたペイロードを標的細胞へと正確に方向付けるために、抗ＨＩＳ（ヘキサ−ヒスチジン）抗体のＶＨ断片およびＶＬ断片を用いた。ポリペプチド１（抗Ｈｉｓ（ＶＬ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ）およびポリペプチド２（抗Ｈｉｓ（ＶＨ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ）の、それらの特異的な標的抗原であるＣＤ４５およびＨＬＡ−Ａ２への同時的な結合の後、ヒスチジンで標識されたペイロードに高アフィニティーで結合するヘキサ−ヒスチジンの結合部位を、オンターゲットで相補する。ペイロードは、本実施例で施される、ＨＩＳタグ付けされた毒素でありうる。ＣＤ４５およびＨＬＡ−Ａ２陽性細胞であるＴＨＰ−１を、ＣＤ４５に対するポリペプチド（抗Ｈｉｓ（ＶＬ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ））およびＨＬＡ−Ａ２に対するポリペプチド（抗Ｈｉｓ（ＶＨ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））と組み合わせた、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ付けされたウェルシュ菌（Clostridium perfringens）イオタ毒素成分Ｉａ（図２４）またはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ付けされた志賀毒素サブユニットＡ（図２５、２６）と共に共インキュベートした。ｈｉｓタグ付けされた毒素の結合の相補およびその後の標的細胞の殺滅は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイを用いて細胞生存率を測定することにより評価した。用いられたポリペプチドの最高濃度（８０ｎＭ）では、細胞生存率の低減として測定される、標的細胞の殺滅における明確な差違が、両方のポリペプチドの組合せを伴う実験状況において、単独のポリペプチドによる実験状況と比較して見出された。
【実施例２０】
【０３３４】
二部分機能相補戦略の汎用性、柔軟性、および交換可能性をさらに裏付けるために、抗ジゴキシゲニン抗体のＶＨ断片およびＶＬ断片を用いて、ジゴキシゲニンで標識されたＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）により、二重抗原陽性細胞を同定およびマーキングした。ＥＧＦＲおよびＥｐＣＡＭ陽性Ｃｏｌｏ−２０６Ｆ細胞を、ＥＧＦＲに対するポリペプチド（抗Ｄｉｇ（ＶＨ）−ＥＧＦＲ（ＶＨ＋ＶＬ））およびＥｐＣＡＭに対するポリペプチド（抗Ｄｉｇ（ＶＬ）−ＥｐＣＡＭ（ＶＨ＋ＶＬ））と共に共インキュベートした。ジゴキシゲニン−ＨＲＰによるＣｏｌｏ−２０６Ｆ細胞の標識化によって指し示される抗ジゴキシゲニンの機能ドメインのオンターゲットの相補を、標準的なＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いてペルオキシダーゼ活性を測定することにより評価した。Ｄｉｇ−ＨＲＰにより標識された標的細胞の明確な差違は、両方のポリペプチドの組合せを伴う実験状況において、単独のポリペプチドと比較して見出された。得られたデータを、図２７に描示する。
【実施例２１】
【０３３５】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を、二重抗原に拘束される二部分機能相補のための一方のアームとして用いて、ポリペプチドの機能ドメインを、抗ＨＬＡ−Ｃｗ６抗体のＶＨ断片およびＶＬ断片と交換することにより、このハプロタイプ戦略をさらに検証した。ＨＬＡ−Ｃｗ６陽性初代患者ＰＢＭＣを、健常ドナーに由来するＨＬＡ−Ｃｗ６陰性ＰＢＭＣ、ＣＤ４５に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ））およびＨＬＡ−Ｃｗ６に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＨＬＡ−Ｃｗ６（ＶＨ−ＶＬ））と共に共インキュベートした。リンパ球によるＩＦＮγ産生は、ＥＬＩＳＡ法により測定した。これらのデータは、ＨＬＡ−Ａ２以外のハプロタイプを伴う患者の造血細胞を、１つの標的化ドメイン（抗ＨＬＡ−Ａ２、図５、７〜９、１１〜１２）を、別の標的化ドメイン（抗ＨＬＡ−Ｃｗ６）で単に交換することにより標的化しうることを裏付ける。得られたデータを、図２８に描示する。
【実施例２２】
【０３３６】
単離されたばかりの初代患者がん細胞および臨床または臨床試験でがん治療のために既に用いられている抗原標的（ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、およびＨｅｒ２）を用いて、二重抗原誘導型二部分機能相補戦略を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの患者アッセイにおいてさらに検証した。転移性膵臓がんを伴う４８歳の男性患者の悪性細胞を、患者自身の末梢血リンパ球ならびにＥＧＦＲに対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＥＧＦＲ（ＶＨ＋ＶＬ））、ＥｐＣＡＭに対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＥｐＣＡＭ（ＶＨ＋ＶＬ））、Ｈｅｒ２に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−Ｈｅｒ２（ＶＨ＋ＶＬ））、ＣＥＡに対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＣＥＡ（ＶＨ−ＶＬ））、およびＨＬＡ−Ａ２に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））の組合せと共に共インキュベートした。リンパ球刺激機能の相補は、反応性ＩＦＮγの産生により評価し、ＥＬＩＳＡ法により測定した。ポリペプチドを伴わない実験状況では、ＩＦＮγ産生が見出されなかった。これらのデータは、患者自身の免疫細胞を用いてその悪性形質転換細胞を標的化し、死滅させる、この戦略の潜在的可能性を裏付ける。得られたデータを、図２９に描示する。
【実施例２３】
【０３３７】
高度に濃縮されたＣＤ３／ＣＤ８陽性ＣＭＶ拘束Ｔ細胞集団を用いて、その特異性に関わりなく、任意のＴ細胞が、本相補戦略により二重抗原陽性腫瘍細胞を死滅させるためのエフェクター細胞として用いられうることを示した。ＣＤ４５およびＨＬＡ−Ａ２陽性Ｕ２６６細胞およびＴＨＰ−１細胞を、ＨＬＡ−Ａ２陰性健常ドナーに由来するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的Ｔ細胞、ならびに量を変化させるＣＤ４５に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＨ）−ＣＤ４５（ＶＨ−ＶＬ））およびＨＬＡ−Ａ２に対するポリペプチド（ＣＤ３（ＶＬ）−ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））と共に共インキュベートした。二特異性タンデムｓｃＦｖ（ＣＤ３（ＶＨ−ＶＬ）×ＨＬＡ−Ａ２（ＶＨ−ＶＬ））抗体を、陽性対照として用いた。Ｔ細胞の動員は、反応性ＩＦＮγの産生により評価し、ＥＬＩＳＡ法により測定した。単独のポリペプチドを伴う実験状況またはポリペプチドを伴わない実験状況では、ＩＦＮγ産生が見出されなかった。得られたデータを、図３０に描示する。同じ凍結アリコートバッチに由来する細胞であるＣＭＶ特異的Ｔ細胞およびＴＨＰ−１細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルに用いた（図１２Ａ）。
【実施例２４】
【０３３８】
この例示は、二部分機能相補戦略により、アレルゲン／自己免疫特異的なＢ細胞クローンを標的化する潜在的可能性を描示する。合成アレルゲンを標的化部分として用いることにより、ポリペプチドへと連結されたアレルゲンは、アレルゲン特異的なＢ細胞クローンの表面上で発現する、そのクロノタイプのＢ細胞受容体に特異的に結合するであろう。二部分戦略の第２のアームでは、その後の標的細胞の殺滅を伴う、後続のエフェクタードメインの相補を、アレルゲン特異的なＢ細胞クローンへと拘束する、Ｂ細胞特異的なポリペプチド（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８）を用いる。この戦略の最終目標は、他の特異性を伴うＢ細胞またはＦｃ−受容体を介して、疾患の一因となる抗体に結合する、Ｂ細胞以外の細胞（例えば、マスト細胞または好塩基球）を温存し（図３１の下方）ながら、アレルギー疾患または自己免疫疾患を引き起こすＢ細胞クローンを消失させる（図３１の上方）ことである。
【０３３９】
本明細書、特許請求の範囲、および／または付属の図面で開示される本発明の特色は、個別に、かつ、その任意の組合せで、本発明をその多様な形態で実現するための材料でありうる。
本発明は以下を提供する。
［１］
（ｉ）抗原Ａ１に特異的に結合する標的化部分Ｔ１、および
（ｉｉ）機能ドメインＦの断片Ｆ１
を含む第１のポリペプチドＰ１であって、前記断片Ｆ１自体または前記ポリペプチドＰ１自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ１、
ならびに
（ｉ）抗原Ａ２に特異的に結合する標的化部分Ｔ２、および
（ｉｉ）前記機能ドメインＦの断片Ｆ２
を含む第２のポリペプチドＰ２であって、前記断片Ｆ２自体または前記ポリペプチドＰ２自体のいずれも前記ドメインＦの機能に関して機能的でないポリペプチドＰ２
を含み、
前記抗原Ａ１が、前記抗原Ａ２と異なり、
前記ポリペプチドＰ１と前記ポリペプチドＰ２とが、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその表面において有する基質の非存在下では、互いと会合せず、
前記ポリペプチドＰ１の前記断片Ｆ１が、前記ポリペプチドＰ２の前記断片Ｆ２と二量体化すると、結果としてもたらされる二量体が、前記ドメインＦの機能に関して機能的となる、
ポリペプチドセット。
［２］
前記ポリペプチドＰ１と前記ポリペプチドＰ２とが、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有する細胞の非存在下では、互いと会合しない、請求項１に記載のポリペプチドセット。
［３］
抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有する細胞が、前記ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１の、前記ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２との二量体化を誘導するのに対し、抗原Ａ１およびＡ２の両方をその細胞表面において保有するわけではない細胞は、前記ポリペプチドＰ１の断片Ｆ１の、前記ポリペプチドＰ２の断片Ｆ２との二量体化を誘導しない、請求項１または２に記載のポリペプチドセット。
［４］
前記基質または細胞の非存在下において、互いに、前記ポリペプチドＰ１およびＰ２の解離定数ＫＤが、１０−８Ｍ〜１０−２Ｍの範囲、１０−７Ｍ〜１０−３Ｍの範囲、もしくは１０−６Ｍ〜１０−３Ｍの範囲であり、かつ／または前記基質または細胞の存在下において、互いに、前記ポリペプチドＰ１およびＰ２の解離定数ＫＤが、１０−６Ｍを下回るか、１０−７Ｍを下回るか、１０−８Ｍを下回るか、もしくは１０−９Ｍを下回る、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［５］
前記抗原Ａ１および／または前記抗原Ａ２が、腫瘍細胞の表面上または腫瘍前駆細胞／腫瘍前駆体細胞の表面上で発現する抗原である、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［６］
前記抗原が、血液系腫瘍細胞の表面上または非血液系腫瘍細胞の表面上で発現する、請求項５に記載のポリペプチドセット。
［７］
抗原Ａ１と抗原Ａ２との組合せが、がん性細胞だけで見出され、がん性でない細胞では見出されない、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［８］
抗原Ａ１と抗原Ａ２との組合せが、ある種のがんのがん性細胞に特異的である、請求項７に記載のポリペプチドセット。
［９］
前記抗原Ａ１が、ＭＨＣ抗原であり、
かつ／または前記抗原Ａ２が、ある種の細胞型または細胞系統に特異的な抗原である、
請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［１０］
前記ＭＨＣ抗原が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、またはＨＬＡ−ＤＭのうちのいずれかの対立遺伝子変異体である、請求項９に記載のポリペプチドセット。
［１１］
前記ＭＨＣ抗原が、ＭＨＣクラスＩ分子の対立遺伝子変異体である、請求項９または１０に記載のポリペプチドセット。
［１２］
前記ＭＨＣ抗原が、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ４、およびＨＬＡ−Ｃｗ７からなる群から選択される対立遺伝子変異体である、請求項９から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［１３］
前記ある種の細胞型または細胞系統に特異的な抗原が、
ＣＤ４５；ＣＤ３４；ＣＤ３３；ＣＤ１３８；ＣＤ１５；ＣＤ１ａ；ＣＤ２；ＣＤ３；ＣＤ４；ＣＤ５；ＣＤ８；ＣＤ２０；ＣＤ２３；ＣＤ３１；ＣＤ４３；ＣＤ５６；ＣＤ５７；ＣＤ６８；ＣＤ７９ａ；ＣＤ１４６；サーファクタントタンパク質；シナプトフィジン；ＣＤ５６；ＣＤ５７；ニコチン性アセチルコリン受容体；筋特異的キナーゼＭＵＳＫ；電位依存性カルシウムチャネル（Ｐ／Ｑ型）；電位依存性カリウムチャネル（ＶＧＫＣ）；Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ）；ＴＳＨ；アンフィフィシン；ＨｅｐＰａｒ−１；ガングリオシドＧＱ１Ｂ、ＧＤ３、またはＧＭ１；およびグリコホリンＡ
からなる群から選択される、請求項９から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［１４］
前記抗原Ａ１およびＡ２のうちのいずれかが、
ＨＬＡ−Ａ２；ＨＬＡ−Ｃｗ６；ＥｐＣＡＭ；ＣＤ４５；Ｈｅｒ２；ＥＧＦＲ；ＣＤ１３８；ＣＥＡ；ＣＤ１９；Ｅ−カドヘリン；Ｃａ−１２５；Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；大嚢胞症液タンパク質；ＢＣＡ−２２５；ＣＡ  １９−９；ＣＤ１１７；ＣＤ３０；上皮抗原ＢＥＲ−ＥＰ４、上皮膜抗原および上皮関連抗原ＭＯＣ−３１；表皮成長因子受容体ＨＥＲ１；血小板由来成長因子受容体ＰＤＧＦＲアルファ；黒色腫関連マーカー／Ｍａｒｔ１／Ｍｅｌａｎ−Ａ；ＣＤ１３３；ＴＡＧ７２；ならびにＢ細胞の表面上のクロノタイプ抗体
からなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［１５］
（ｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＥｐＣＡＭであり、他の一方が、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ１０、ＶＥＧＦ−Ｒ、もしくはＭＤＲであるか、
（ｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＭＣＳＰであり、他の一方が、メラノフェリンもしくはＥｐＣＡＭであるか、
（ｉｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＡ１２５であり、他の一方が、ＣＤ２２７であるか、
（ｉｖ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ５６であり、他の一方が、ＣＤ１４０ｂもしくはＧＤ３ガングリオシドであるか、
（ｖ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＥＧＦＲであり、他の一方が、ＨＥＲ２であるか、
（ｖｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＰＳＭＡであり、他の一方が、ＨＥＲ２であるか、
（ｖｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、シアリルルイスであり、他の一方が、ＥＧＦＲであるか、
（ｖｉｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ４４であり、他の一方が、ＥＳＡ、ＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＭＤＲ、もしくはＣＤ１１７であるか、
（ｉｘ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ３４であり、他の一方が、ＣＤ１９、ＣＤ７９ａ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１３、ＣＤ１１７、ＣＤ３３、もしくはＣＤ１５であるか、
（ｘ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ３３であり、他の一方が、ＣＤ１９、ＣＤ７９ａ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１３、ＣＤ１１７、もしくはＣＤ１５であるか、
（ｘｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＭＵＣ１であり、他の一方が、ＣＤ１０、ＣＥＡ、もしくはＣＤ５７であるか、
（ｘｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ３８であり、他の一方が、ＣＤ１３８であるか、
（ｘｉｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ２４であり、他の一方が、ＣＤ２９、もしくはＣＤ４９ｆであるか、
（ｘｉｖ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、炭酸脱水素酵素ＩＸであり、他の一方が、アクアポリン２であるか、
（ｘｖ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＨＬＡ−Ａ２であり、他の一方が、ＥｐＣＡＭであるか、
（ｘｖｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＨＬＡ−Ａ２であり、他の一方が、ＣＤ４５であるか、
（ｘｖｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＨＬＡ−Ａ２であり、他の一方が、ＥＧＦＲであるか、
（ｘｖｉｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＨＬＡ−Ａ２であり、他の一方が、Ｈｅｒ２であるか、
（ｘｉｘ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＨＬＡ−Ａ２であり、他の一方が、ＣＥＡであるか、
（ｘｘ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＥｐＣＡＭであり、他の一方が、ＣＥＡであるか、
（ｘｘｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ４５であり、他の一方が、ＣＤ１３８であるか、
（ｘｘｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＥＧＦＲであり、他の一方が、ＣＥＡであるか、
（ｘｘｉｉｉ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、Ｈｅｒ２であり、他の一方が、ＣＥＡであるか、または
（ｘｘｉｖ）前記抗原Ａ１およびＡ２のうちの一方が、ＣＤ１９であり、他の一方が、Ｂ細胞の表面上のクロノタイプ抗体である、
請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［１６］
前記標的化部分Ｔ１および／もしくはＴ２が、免疫グロブリンモジュールを含むか、または
前記標的化部分Ｔ１および／もしくはＴ２が、それぞれ、前記抗原Ａ１もしくは抗原Ａ２のアプタマーもしくは天然リガンドを含む、
請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［１７］
前記標的化部分Ｔ１が、ＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインを含むか、またはラマ抗体、ラクダ抗体、もしくはサメ抗体の可変ドメインＶＨＨを含む、免疫グロブリンモジュールＩ１を含み、かつ／あるいは
前記標的化部分Ｔ２が、ＶＨドメインへと連結されたＶＬドメインを含むか、またはラマ抗体、ラクダ抗体、もしくはサメ抗体の可変ドメインＶＨＨを含む免疫グロブリンモジュールＩ２を含む、
請求項１６に記載のポリペプチドセット。
［１８］
前記免疫グロブリンモジュールＩ１が、抗体のｓｃＦｖ（単鎖変異体断片）、Ｆａｂ、もしくはＦ（ａｂ’）２、または完全抗体を含み、かつ／あるいは
前記免疫グロブリンモジュールＩ２が、抗体のｓｃＦｖ（単鎖変異体断片）、Ｆａｂ、もしくはＦ（ａｂ’）２、または完全抗体を含む、
請求項１７に記載のポリペプチドセット。
［１９］
前記免疫グロブリンモジュールが、
（ｉ）配列番号７８および７９（ＣＤＲ１および３）ならびにＤＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号７５〜７７（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体のＶドメイン；
（ｉｉ）配列番号８３および８４（ＣＤＲ１および３）ならびにＤＤＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号８０〜８２（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＨＬＡ−Ｃｗ６抗体のＶドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号８８および８９（ＣＤＲ１および３）ならびにＷＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号８５〜８７（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶドメイン；
（ｉｖ）配列番号９３および９４（ＣＤＲ１および３）ならびにＳＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号９０〜９２（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗Ｈｅｒ２抗体のＶドメイン；
（ｖ）配列番号９８および９９（ＣＤＲ１および３）ならびにＤＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号９５〜９７（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＥＧＦＲ１抗体のＶドメイン；
（ｖｉ）配列番号１０３および１０４（ＣＤＲ１および３）ならびにＳＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号１００〜１０２（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＥＡ抗体のＶドメイン；
（ｖｉｉ）配列番号１０７および１０８（ＣＤＲ１および３）ならびにＬＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号１０５および１０６（ＣＤＲ１および２）ならびにＣＤＲ３もしくは配列番号１３２〜１３４（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ４５抗体のＶドメイン；
（ｖｉｉｉ）配列番号１１２および１１３（ＣＤＲ１および３）ならびにＹＴＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号１０９〜１１１（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ１３８抗体のＶドメイン；ならびに
（ｉｘ）配列番号１５８および１５９（ＣＤＲ１および３）ならびにＤＡＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号１５５〜１５７（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ１９抗体のＶドメイン
からなる群から選択されるＶドメインを含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［２０］
前記免疫グロブリンモジュールが、
（ｉ）配列番号５２を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５１を含むＶＨドメインを含む、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体のＶドメイン；
（ｉｉ）配列番号５４を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５３を含むＶＨドメインを含む、抗ＨＬＡ−Ｃｗ６抗体のＶドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号５６を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５５を含むＶＨドメインを含む、抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶドメイン；
（ｉｖ）配列番号５８を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５７を含むＶＨドメインを含む、抗Ｈｅｒ２抗体のＶドメイン；
（ｖ）配列番号６０を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５９を含むＶＨドメインを含む、抗ＥＧＦＲ１抗体のＶドメイン；
（ｖｉ）配列番号６２を含むＶＬドメインおよび／または配列番号６１を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＥＡ抗体のＶドメイン；
（ｖｉｉ）配列番号６４を含むＶＬドメインおよび／または配列番号６３を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ４５抗体のＶドメイン；ならびに
（ｖｉｉｉ）配列番号６６を含むＶＬドメインおよび／または配列番号６５を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ１３８抗体のＶドメイン；
（ｉｘ）配列番号１５３を含むＶＬドメインおよび／または配列番号１５２を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ１９抗体のＶドメイン
からなる群から選択されるＶドメインを含む、請求項１６から１９のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［２１］
前記免疫グロブリンモジュールが、配列番号６７〜７４および１５４のうちのいずれか１つを含むＶドメインを含む、請求項１６から２０のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［２２］
前記標的化部分Ｔ１およびＴ２のうちのいずれか１つが、Ｂ細胞の表面上のクロノタイプ抗体に結合するアレルゲンまたは基質を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［２３］
前記機能ドメインＦが、免疫グロブリンモジュール、または蛍光分子、または生物発光を媒介することが可能な分子であるか、またはこれを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［２４］
前記機能ドメインＦが、抗体のＦｖ（変異体断片）またはｓｃＦｖ（単鎖変異体断片）である、請求項２３に記載のポリペプチドセット。
［２５］
前記機能ドメインＦが、担体分子またはアフィニティータグに特異的に結合するドメインである、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［２６］
前記担体分子が、ペプチドまたは炭水化物分子である、請求項２５に記載のポリペプチドセット。
［２７］
前記アフィニティータグが、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）タグ、およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグからなる群から選択される、請求項２６に記載のポリペプチドセット。
［２８］
前記機能ドメインＦが、放射性化合物に特異的に結合するドメイン、それ自体ではヒト細胞の細胞膜を透過することが可能ではなく、前記細胞の細胞膜と会合するとヒト細胞へと内部移行される毒素分子に特異的に結合するドメイン、蛍光分子に特異的に結合するドメイン、または生物発光を媒介することが可能な分子に特異的に結合するドメインである、請求項１から２７のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［２９］
前記断片Ｆ１が、抗体のＶＬドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＨドメインを含むか、または前記断片Ｆ１が、抗体のＶＨドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＬドメインを含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［３０］
前記断片Ｆ１が、抗ＣＤ３抗体、抗Ｈｉｓ抗体、もしくは抗ＤＩＧ抗体のＶＬドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＨドメインを含むか、または前記断片Ｆ１が、抗ＣＤ３抗体、抗Ｈｉｓ抗体、もしくは抗ＤＩＧ抗体のＶＨドメインを含み、前記断片Ｆ２が、同じ抗体のＶＬドメインを含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［３１］
前記免疫グロブリンモジュールが、
（ｉ）配列番号１８〜２０（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号１５〜１７（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｉ）配列番号２４〜２６（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号２１〜２３（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号３０〜３２（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号２７〜２９（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｖ）配列番号３６および３７（ＣＤＲ１および３）ならびにＤＴＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号３３〜３５（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｖ）配列番号４１および４２（ＣＤＲ１および３）ならびにＹＴＮ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号３８〜４０（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；ならびに
（ｖｉ）配列番号４６および４７（ＣＤＲ１および３）ならびにＫＶＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号４３〜４５（ＣＤＲ１〜３）を含むＶＨドメインを含む、抗Ｈｉｓ抗体のＶドメイン；
（ｖｉｉ）配列番号５０および１３１（ＣＤＲ１および３）ならびにＹＳＳ（ＣＤＲ２）を含むＶＬドメイン、ならびに／または配列番号４８および４９（ＣＤＲ１および２）ならびにＡ（ＣＤＲ３）を含むＶＨドメインを含む、抗ＤＩＧ抗体のＶドメイン
からなる群から選択されるＶドメインを含む、請求項２３から３０のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［３２］
前記免疫グロブリンモジュールが、
（ｉ）配列番号２を含むＶＬドメインおよび／または配列番号１を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｉ）配列番号４を含むＶＬドメインおよび／または配列番号３を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号６を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｉｖ）配列番号８を含むＶＬドメインおよび／または配列番号７を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；
（ｖ）配列番号１０を含むＶＬドメインおよび／または配列番号９を含むＶＨドメインを含む、抗ＣＤ３抗体のＶドメイン；ならびに
（ｖｉ）配列番号１２を含むＶＬドメインおよび／または配列番号１１を含むＶＨドメインを含む、抗Ｈｉｓ抗体のＶドメイン；
（ｖｉｉ）配列番号１４を含むＶＬドメインおよび／または配列番号３０を含むＶＨドメインを含む、抗ＤＩＧ抗体のＶドメイン
からなる群から選択されるＶドメインを含む、請求項２３から３１のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［３３］
ポリペプチドＰ１およびＰ２のうちのいずれかが、配列番号１１４〜１２９および１９７からなる群から選択されるアミノ酸配列であるか、またはこれを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［３４］
がんおよび／もしくは腫瘍を患っている患者の処置における使用のため、またはがんおよび／もしくは腫瘍を患っている患者における診断的使用のための、請求項１から３３のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［３５］
がんおよび／または腫瘍を患っており、同種組織移植もしくは同種細胞移植を受けているか、またはこのような移植を受けることを意図する患者の処置における使用のため、あるいはがんおよび／または腫瘍を患っており、同種組織移植もしくは同種細胞移植を受けているか、またはこれを受けることを意図する患者における診断的使用のための、請求項３４に記載のポリペプチドセット。
［３６］
前記患者へと投与するためのものである、請求項３４または３５に記載のポリペプチドセット。
［３７］
（ｉ）自己免疫障害；および
（ｉｉ）過敏性障害
からなる群から選択される障害の処置または防止における使用のための、請求項１から３３のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［３８］
前記自己免疫障害が、
（ｉ）アレルギー性障害；
（ｉｉ）多発性硬化症；
（ｉｉｉ）乾癬；
（ｉｖ）全身性エリテマトーデス；
（ｖ）シェーグレン症候群；
（ｖｉ）関節リウマチ；
（ｖｉｉ）特発性血小板減少性紫斑病；
（ｖｉｉｉ）糖尿病；
（ｘｉ）血管炎；
（ｘ）クローン病；および
（ｘｉ）アミロイドーシス
からなる群から選択される、請求項３７に記載のポリペプチドセット。
［３９］
前記過敏性障害が、アレルギー（クームス−ゲル分類に従うＩ型過敏性反応）、抗体依存性細胞傷害反応（ＩＩ型過敏性反応）、免疫複合体疾患（ＩＩＩ型過敏性反応）、遅延型過敏症（ＩＶ型過敏性反応）、または受容体媒介性自己免疫疾患（Ｖ型過敏性反応）である、請求項３７に記載のポリペプチドセット。
［４０］
前記自己免疫障害または過敏性障害が、同種幹細胞移植に随伴するか、またはこれにより誘発される、請求項３９に記載のポリペプチドセット。
［４１］
感染性疾患の処置または防止における使用のための、請求項１から３３のいずれか一項に記載のポリペプチドセット。
［４２］
請求項１から３３のいずれか一項に記載のポリペプチドセットまたはポリペプチドセットのポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子または核酸分子セット。
［４３］
配列番号１３５〜１５０および１９６のうちのいずれか１つに描示されているヌクレオチド配列を含む、請求項４２に記載の核酸分子または核酸分子セット。
［４４］
請求項４２もしくは４３に記載の核酸分子のヌクレオチド配列、または請求項４２もしくは４３に記載の核酸分子もしくは核酸分子セットのうちの１つの配列を含むベクター。
［４５］
請求項１から３３のいずれかに記載のポリペプチドセット、または請求項４２もしくは４３に記載の核酸分子／核酸分子セット、または請求項４４に記載のベクターを含む医薬組成物であって、薬学的に許容される担体をさらに含むことが好ましい医薬組成物。
［４６］
請求項１から３３のいずれかに記載のポリペプチドセット、請求項４２もしくは４３に記載の核酸分子もしくは核酸分子セット、または請求項４４に記載のベクターを含むキット。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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