(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、非小細胞肺癌細胞株由来のオートファゴソームの強化された集団を含み、ここで前記オートファゴソームの強化された集団は、
１つ以上のトル様受容体アゴニストと、
１つ以上の腫瘍抗原と、
天然のアジュバントとして作用する１つ以上の傷害関連分子パターンの分子と、
を含み、
前記１つ以上のトル様受容体アゴニスト、前記１つ以上の腫瘍抗原、および前記１つ以上の傷害関連分子パターンの分子は、前記オートファゴソームの強化された集団中にパッケージングされている、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記１つ以上のトル様受容体アゴニストが、トル様受容体２、トル様受容体３、トル様受容体４、トル様受容体７、および／もしくはトル様受容体９のアゴニスト、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物であって、前記１つ以上の腫瘍抗原が、ＷＴ１、ｐ５３、スルビビン、ＥｐｈＡ２、サイクリンＢ１、および／もしくはＸＡＧＥ１またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物であって、前記１つ以上の傷害関連分子パターンの分子が、カルレティキュリン、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、および／もしくはＧｒｐ９４、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物であって、前記非小細胞肺癌細胞株が、ＵｂＬＴ３細胞株である、組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物であって、前記非小細胞肺癌細胞株が、ＵｂＬＴ６細胞株である、組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、前記オートファゴソームの強化された集団を含む前記１つ以上の腫瘍抗原に対する免疫応答を増強するように構成された分子をさらに含んでいる、組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物であって、前記分子が、ポリイノシン：ポリシチジル酸である、組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の組成物であって、さらに非特異的なアジュバントを含んでいる、組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物であって、前記非特異的なアジュバントがＩＦＮ−γである、組成物。
【請求項１１】
哺乳動物において特異的な免疫応答を誘導するための組成物であって、
細胞株由来のオートファゴソームの強化された集団を含み、前記オートファゴソームの強化された集団が、
１つ以上のトル様受容体アゴニストと、
１つ以上の腫瘍抗原と、
天然のアジュバントとして作用する１つ以上の傷害関連分子パターンの分子と、
を含み、
前記１つ以上のトル様受容体アゴニスト、前記１つ以上の腫瘍抗原、および前記１つ以上の傷害関連分子パターンの分子は、前記オートファゴソームの強化された集団中にパッケージングされている、組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、
前記哺乳動物の末梢血から単離された末梢血単核球の小集団と前記オートファゴソームの強化された集団とを接触させ、
単離された末梢血単核球の前記接触された小集団を前記哺乳動物に注入して戻すための、組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物であって、前記単離された末梢血単核球の前記小集団が、専門的な抗原提示細胞および非専門的な抗原提示細胞を含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の組成物であって、前記末梢血単核球が、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、および／またはＣｐＧの投与後に前記哺乳動物から単離される、組成物。
【請求項１５】
請求項１１に記載の組成物であって、前記細胞株がＣＤ８０を発現するように遺伝子操作されている、組成物。
【請求項１６】
請求項１１に記載の組成物であって、前記細胞株がサイトメガロウイルスタンパク質ｐｐ６５を発現するように遺伝子操作されている、組成物。
【請求項１７】
請求項１１に記載の組成物であって、
前記１つ以上の腫瘍抗原に対して特異的な１つ以上のサイトカインの分泌を検出することによって、前記オートファゴソームの強化された集団に含まれる前記１つ以上の腫瘍抗原に対する特異的な免疫応答の誘導についてスクリーニングするための、組成物。
【請求項１８】
末梢血単核球の小集団に対して選択的なマーカを誘導できる同種異系のオートファゴソーム強化組成物を生成する細胞をスクリーニングするための方法であって、
細胞とプロテアソームインヒビタとを接触させるステップと、
前記細胞とリソソームインヒビタとを接触させるステップと、
前記得られたオートファゴソームを回収するステップと、
前記回収されたオートファゴソームの分子署名を決定するステップと、
１つ以上のトル様受容体アゴニストおよび１つ以上の分子シャペロンを前記回収されたオートファゴソームに転用する細胞を選択するステップと、
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記選択的なマーカがＢＤＣＡ３であり、かつ末梢血単核球の前記小集団が樹状細胞、またはＣＤ１４＋単球を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、前記選択的なマーカがＣＤ８０であり、かつ末梢血単核球の前記小集団が単球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＢ細胞を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法であって、前記選択的なマーカがＣＤ４０Ｌであり、かつ末梢血単核球の前記小集団が単球、またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法であって、前記１つ以上のトル様受容体アゴニストが、トル様受容体２、トル様受容体３、トル様受容体４、トル様受容体７、およびトル様受容体９のうち１つ以上のアゴニストを含み、
前記１つ以上の分子シャペロンが、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および／またはカルレティキュリンを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法であって、前記回収されたオートファゴソームが、１つ以上の傷害関連分子パターンの分子をさらに含み、前記１つ以上の傷害関連分子パターンの分子が、ＨＭＧＢ１、Ｓ１００タンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、その内容全体が全ての目的のために参照によって本明細書に援用されている、「疾患の処置のためのオートファゴソーム強化組成物（ＡＵＴＯＰＨＡＧＯＳＯＭＥ−ＥＮＲＩＣＨＥＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＯＦ  ＤＩＳＥＡＳＥ）」というタイトルの２０１２年１０月２３日出願の米国特許仮出願第６１／７１７，５８５号に対して優先権を主張する。
【０００２】
（分野）
本出願は、オートファゴソーム強化組成物、およびオートファゴソーム強化生成物をそれ自体で、または相補的な治療剤と組み合わせて投与することによって免疫応答を刺激、増強または強化する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景および要約）
宿主の専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）による外因性抗原の交差提示（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）は、腫瘍細胞由来の自己抗原または変異した自己抗原、および感染性因子由来の外来性の抗原を含む、腫瘍関連抗原に対するＴ細胞免疫応答の開始および発達において中心的な役割を果たす。腫瘍に対する特異的な免疫応答を引き起こす外因性の抗原の交差提示を抑制するように試みる、期待される癌ワクチンが、開発されている。
【０００４】
しかし、癌ワクチンによる特異的能動免疫は、動物モデルでも、臨床試験でも極めて有効ではなかった（非特許文献１）。癌免疫療法の成功に対する主な障害は、腫瘍応答性ＣＴＬの大きな最初の発達、次に持続を誘導することがワクチンにはできないということであった（非特許文献１）。現在利用可能な癌免疫療法の方法に対する別の障害は、黒色腫を除き、ほとんどの癌について可能性のある腫瘍拒絶抗原が知られておらず、優勢な腫瘍拒絶抗原は、腫瘍特異的または患者特異的である可能性が高いということである。
【０００５】
以前には、本発明者らは、プロテアソームインヒビタによって細胞タンパク質分解を低減または阻害することは、不完全なリボソーム産物（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）（ＤＲｉＰ）および短寿命タンパク質（ｓｈｏｒｔ  ｌｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＳＬｉＰ）（同様にその免疫原性フラグメント）の細胞内蓄積、ならびに「ブレブ（ｂｌｅｂ）」への分泌を生じ得ることを確認した。プロテアソームインヒビタ誘導性のオートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）の後に細胞（例えば、腫瘍または病原体感染細胞）から放出されるか、またはその中に含まれるＤＲｉｂｂｌｅは、オートファジーボディ（ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｂｏｄｙ）においてＤＲｉＰおよびＳＬｉＰ（およびそれらのフラグメント）を蓄積し得、かつ交差プライミング（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）を介して強力な免疫（例えば、抗腫瘍または抗病原体）を誘発し得ることが示されている。例えば、腫瘍由来のＤＲｉｂｂｌｅ、同様に腫瘍由来のＤＲｉｂｂｌｅをロードされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞）は、腫瘍応答性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびヘルパＴリンパ球（ＨＴＬ）を、インビトロおよびインビボの両方で、生きた腫瘍細胞または殺傷された腫瘍細胞とともにインキュベートされたＡＰＣよりも効率的に活性化し得る。特定の例では、被験体に対するＤＲｉｂｂｌｅの投与（例えば、単離されたＤＲｉｂｂｌｅ集団として、ＤＲｉｂｂｌｅを生成する細胞の集団として、またはＤＲｉｂｂｌｅをロードされた樹状細胞として）は、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の生成を増大し、かつ炎症性サイトカイン類またはケモカイン類、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、およびＴＮＦ−αのうちの１つ以上の産生を促進する。
【０００６】
本発明者らは、Ｄｒｉｂｂｌｅを生成および単離するための方法を以前に開示している（特許文献１）。この方法は、標的細胞と十分な量のプロテアソームインヒビタとを、ＤＲｉｂｂｌｅを生成するのに十分な条件、例えば、細胞中のタンパク質分解を実質的に阻害する条件下で接触させることを包含する。いくつかの例では、この方法はさらに、標的細胞と、十分な量のオートファジー誘導因子とを、プロテアソームインヒビタとの接触の前、間または後に接触させるステップを包含する。この細胞はまた、タンパク質のグリコシル化を低減する１つ以上の因子と接触されてもよい。一例では、この細胞を、十分な量のプロテアソームインヒビタ（例えば、２０ｎＭのベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ））、オートファジー誘導因子（例えば、ラパマイシンまたはＨＢＳＳ）およびＮＨ４Ｃｌと、細胞によるＤｒｉｂｂｌｅの産生を刺激するために十分な条件下で接触させる。一例では、このような条件下で生成されたＤＲｉｂｂｌｅは、細胞からこのようなＤＲｉｂｂｌｅを分離することによって回収される。１つの例示的な方法では、細胞を、細胞中でタンパク質分解を実質的に阻害するのに十分な条件、例えば、６〜２４時間のインキュベーションの条件下で、プロテアソームインヒビタを含み得る十分量の組成物と接触させてもよい。次いで、細胞を、その細胞中でオートファジーを誘発するのに十分な条件、例えば、オートファジー誘導因子とともに６〜２４時間のインキュベーションの条件下でインキュベートしてもよい。次いで、得られた細胞およびＤＲｉｂｂｌｅは、ＤＲｉｂｂｌｅが溶液中に残っているままでその細胞がペレットにされるような条件下で遠心分離してもよい。次いで、ＤＲｉｂｂｌｅを含んでいる上清を取り出してもよく、次いでＤＲｉｂｂｌｅをペレットにするのに十分な条件下で遠心分離してもよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２２０５３０号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）．２００４年，第１０巻：９０９〜１５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、本発明者らは、先行技術で開示されるＤＲｉｂｂｌｅの生成および単離のための方法が、オートファゴソームの強化された集団そしてそれらの構成要素材料を生成して単離して、有効なワクチンとしてさらに利用されるようにするためには不十分であり得ると認識していた。本発明の開示は、有効なワクチンを生成し得る細胞株（癌細胞株および非癌細胞株の両方を含む）をスクリーニングするための新規な方法を記述している。この細胞株は、オートファゴソームを生成するとして特徴付けられてもよく、これは、トル様受容体（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＴＬＲ）リガンド、傷害関連分子パターン（ｄａｍａｇｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）（ＤＡＭＰ）、および分子シャペロンを、プロテアソームインヒビタおよびＮＨ４Ｃｌでの処置の時に、ＤＲｉＰ、ＳＬｉＰおよび他の腫瘍抗原に加えて含んでもよい。さらにＤｒｉｂｂｌｅ内に含まれる腫瘍抗原の交差提示は、ＡＰＣの一般的な集団に対して提示された場合、腫瘍に対して有効な免疫応答を生じるには不十分である場合がある。本開示は、ＣＬＥＣ９Ａを発現して有効な免疫応答を生じる樹状細胞（ＤＣ）の特定のサブセットに対して強化されたオートファゴソーム組成物を提示することによって、強化されたオートファゴソーム内に含まれる抗原の有効な交差提示のための方法を記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の問題を認識し、この問題に少なくとも部分的に取り組むため組成物および方法を開発した。一例では、ある組成物であって、非小細胞肺癌細胞株由来のオートファゴソームの強化された集団を含んでおり、ここでこのオートファゴソームの強化された集団は、１つ以上のトル様受容体アゴニストと、１つ以上の腫瘍抗原と、１つ以上の傷害関連分子パターンの分子とを含む。この方法では、異なる腫瘍タイプを保有している患者における標的化された免疫応答を刺激するために、既製のワクチンが投与に利用可能であり得る。
【００１１】
別の例では、哺乳動物で特定の免疫応答を誘導する方法は、ある細胞株由来のオートファゴソームの強化された集団を含んでいる組成物を提供するステップを包含し、このオートファゴソームの強化された集団は、１つ以上のトル様受容体アゴニストと、１つ以上の腫瘍抗原と、１つ以上の傷害関連分子パターンの分子とを含んでいる。この方法では、既製のワクチンが、患者自身の血球由来の炎症誘発アジュバントを補充しながら、異なる腫瘍タイプを保有している患者に投与されてもよい。
【００１２】
さらに別の例では、末梢血単核球の小集団に対して選択マーカの発現を誘発できる同種異系のオートファゴソーム強化組成物を生成する細胞をスクリーニングするための方法であって、ある細胞とプロテアソームインヒビタとを接触させるステップと、この細胞とリソソームインヒビタとを接触させるステップと、得られたオートファゴソームを回収するステップと、この得られたオートファゴソームの分子署名を決定するステップと、１つ以上のトル様受容体アゴニストおよび／または１つ以上の分子シャペロンをオートファゴソームに転用する細胞を選択するステップと、を包含する。この方法では、トル様受容体アゴニスト、腫瘍抗原、および傷害関連分子パターンの分子は、多数の癌のタイプに対して特異的な免疫応答を引き起こす能力を有する同種異系のオートファゴソーム強化組成物中にパッケージングされ得る。さらに、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、単球、または樹状細胞とともに培養された場合、得られた同種異系のオートファゴソーム強化組成物は、ＢＤＣＡ３、および／またはＣＤ８０の発現を誘発または上方制御し得、さらに、ＩＬ−８または他のサイトカインのＰＢＭＣによる分泌を誘発し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６のＮＳＣＬＣ細胞株における上位５００の最も上方制御された遺伝子の上方制御を共有する種々の癌を有する患者の割合を示しているグラフである。
【図２Ａ】抗原ＧＡＰＤＨおよびＥＥＦ１Ａ１の分解に対するＮＨ４Ｃｌ保護の存在を示しているＳＤＳ−ページゲルを示すデジタル画像である。
【図２Ｂ】ベルケイド処置が、処置された細胞から生成されるＡＡＥＣ中のユビキチン化タンパク質および短寿命抗原の比を増大することを示しているＳＤＳページゲルを示しているデジタル画像である。
【図３Ａ】ＡＡＥＣ中のＮＣＩ優先癌抗原の存在を表にしているチャートである。
【図３Ｂ】ＡＡＥＣ中のＮＣＩ優先癌抗原の存在を示しているＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示しているデジタル画像である。
【図３Ｃ】ＡＡＥＣ中のＮＣＩ優先癌抗原の存在を表にしている追加のチャートである。
【図３Ｄ】追加の抗原および複数のロットにおける検出の一貫性を経時的に示す。
【図３Ｅ】ＡＡＥＣに含まれる潜在的な非突然変異抗原のまとめの表である。
【図４Ａ】ＡＡＥＣに含まれるＤＡＭＰの存在を表にしているチャートである。
【図４Ｂ】２つの異なる細胞株由来のＡＡＥＣ中の種々のＤＡＭＰの存在を示しているＳＤＳページゲルを示すデジタル画像である。
【図５Ａ】ＡＡＥＣが高レベルのＴＬＲリガンドを含むことを示しているデータを提示しているグラフである。
【図５Ｂ】ＡＡＥＣがＤＡＭＰを含むことを示しているデータを提示しているデジタル画像である。
【図６】ＡＡＥＣ中のＴＬＲリガンドの存在を示しているグラフである。
【図７Ａ】ＡＡＥＣでの処置後のＢＤＣＡ３＋細胞の割合の用量依存性の増大を示しているデータを提示しているグラフである。
【図７Ｂ】ＣＤ１４＋細胞およびＢＤＣＡ３＋細胞の誘導が相関していることを示しているデータを提示しているグラフである。
【図７Ｃ】ＡＡＥＣでの処置後のＩＬ−８濃度の用量依存性の増大を示しているデータを提示しているグラフである。
【図８Ａ】ＵｂＬＴ３由来のＡＡＥＣでの処置後のヒトＣＤ１４＋細胞におけるＢＤＣＡ３＋細胞の割合の用量依存性の増大を示しているデータを提示している細胞数測定のプロットである。
【図８Ｂ】ＡＡＥＣが、ビヒクルまたはＴＬＲ４アゴニストＭＰＬよりもＢＤＣＡ３＋細胞の良好な誘導因子であることを示しているデータを提示しているグラフである。
【図９Ａ】ＢＤＣＡ３＋細胞のＡＡＥＣ誘導性の上方制御が、ＴＬＲアンタゴニストによって阻害されることを示しているデータを提示している細胞数測定のプロットである。
【図９Ｂ】ＴＬＲ９アンタゴニストおよびコントロールのＯＤＮの滴定後、ＢＤＣＡ３＋ＣＤ１４＋細胞の割合を示している２つのドナーからのデータを提示しているグラフである。
【図９Ｃ】複数回の処置後のドナーＰＢＭＣ中のＩＬ−８の濃度を示しているデータを提示しているグラフである。
【図９Ｄ】種々の同時培養処置でのＡＡＥＣ取り込みの有効性を示しているデータを提示しているグラフである。
【図９Ｅ】単球上でのＣＤ８０の発現を上方制御するＡＡＥＣが、少なくとも一部はＴＬＲ９経路を通じてそのように上方制御することを示しているデータを提示しているグラフである。
【図１０】種々の処置に対する応答におけるＢＤＣＡ３＋細胞の誘導の割合を示しているグラフである。
【図１１Ａ】種々の処置に応答した２例のドナー患者由来の細胞中のＩＬ−８の濃度を示しているグラフである。
【図１１Ｂ】ＡＡＥＣタッチしたＣＤ１４＋細胞の存在下でＣＤ４＋細胞の増殖を示しているグラフである。
【図１１Ｃ】ＣＤ４＋細胞増殖の関数としてＴＮＦ−αの分泌を示しているグラフである。
【図１２Ａ】治療後の数例の患者における抗癌免疫応答を検出するためのＡＡＥＣの免疫モニタリング使用を実証するチャートである。
【図１２Ｂ】ワクチン接種後の患者における抗癌免疫応答を検出するためのＡＡＥＣの免疫モニタリング使用を実証するヒストグラムである。
【図１２Ｃ】免疫応答の特異性を実証しているヒストグラムである。
【図１２Ｄ】ｐｐ６５に対する免疫応答の特異性を実証しているヒストグラムである。
【図１３】ＡＡＥＣ処置に対する応答における種々の癌のタイプを有する患者由来の細胞中のＩＦＮ−γの誘導を示すグラフである。
【図１４】Ａ−Ｉ：種々の組み合わせでＭＤＡ−ＣＤ８０  ＡＡＥＣとともにインキュベートしたドナー細胞からのＣＤ８０発現のＬＳＲ分析を示している細胞数測定のプロットである。赤丸は、ＡＡＥＣが膜通過により効率的であることを強調している。
【図１５】Ａ−Ｅ：エキソソームを用いて、および用いずに、ＭＤＡ−ＣＤ８０  ＡＡＥＣの種々の画分とともにインキュベートしたドナー細胞からのＣＤ８０発現のＬＳＲ分析を示している細胞数測定のプロットである。赤丸は、エキソソームが、ＣＤ８０膜通過に関与するとは考えられないことを強調している。
【図１６】Ａ−Ｊ：ＣＤ８０がオートファゴソーム上で発現されることを実証しているＡＡＥＣのアリア分析を示す。
【図１７Ａ】ＡＡＥＣから種々の細胞タイプへのＣＤ８０の移動を実証している棒グラフを示す。
【図１７Ｂ】ＣＤ８０またはＣＤ４０Ｌを発現するように遺伝子操作されたＨＥＫ−２９３細胞由来のＡＡＥＣはまた、膜タンパク質移動にも関与し得ることを実証しているフローサイトメトリーのプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（詳細な説明）
本開示は、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験のための２つの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍細胞株由来の同種異系のオートファゴソーム強化組成物（ＡＡＥＣ）を記述する。これらの細胞株は、本明細書においては、ＵｂＬＴ３（非特異的な組織病理学）およびＵｂＬＴ６（腺癌様）と称される。下には、マウス乳房腫瘍を処置するために、ならびに黒色腫、前立腺および頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を有する患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において免疫応答を刺激するために用いられるこれらの組成物の例を示す。さらに、ＮＳＣＬＣ細胞株由来のＡＡＥＣが多くの追加の癌で見出される抗原を含むことが遺伝子プロファイリングによって示され、タンパク質分析によって確認される。例えば、これらの癌は、肺、卵巣、肉腫、結腸および直腸の腺癌などを含み得る。細胞株由来のＡＡＥＣの単一の改変体のこの広範な有用性に対して利点となるのは、それらがより安価に生成され得、かつ種々の癌を処置するために容易に利用可能になり得、患者の状況におけるそれらの使用がますます容易になるということである。本実施例の実施形態では、癌ワクチンにおけるＡＡＥＣの有用性を記述しているが、ＡＡＥＣはまた、さらなる無関係の疾患状態の処置において、炎症応答を誘発するために、または下記のように、オートファゴソームからアクセプタ細胞に対して標的された方式でドナー膜タンパク質を移動するために用いられてもよい。
【００１５】
ＤＲｉｂｂｌｅワクチンは、プロテアソームおよびリソソームインヒビタで処置された腫瘍細胞由来であり得る、可能性のある癌治療剤として以前に記載された。本発明の開示は、同種異系のオートファゴソーム強化組成物をそれから誘導する細胞株を選択するための新規な方法を利用し、かつ組成物の誘導を簡易にしながら治療の潜在的な適用を広範にする。下に示される例は、ＮＳＣＬＣ細胞株由来のオートファゴソーム強化組成物を包含する。本発明者らは、ＮＳＣＬＣ由来のオートファゴソーム強化組成物における広範な種々の癌のタイプにみられる無数の抗原の存在を実証した。癌抗原に加えて、オートファゴソーム強化組成物は、ＤＡＭＰ類、分子シャペロンタンパク質、種々のサイトカイン、およびＴＬＲアゴニストを含んでもよい。オートファゴソーム強化組成物に存在し得るこれらの追加の構成要素は、抗原を保存するように作用し、それによって、それらは効率的に交差提示され得、同様に、抗原提示細胞の機能的活性を強化して、免疫応答を患者において刺激し得る。免疫応答の効率的な刺激は、癌細胞または病原体感染細胞に対して有効な攻撃を開始することを補助し得る。さらに、オートファゴソーム強化組成物の構成要素の詳細な特徴付けによって、治療目的のための組成物をさらに精製することおよび標的化が可能になる。
【００１６】
ＤＲｉｂｂｌｅワクチンの以前の実施形態は、患者由来の腫瘍細胞または同種の利用可能な癌細胞株からのワクチンの生成を想定していた。これらのワクチンでは、ワクチンが誘導された癌において有望な結果が得られた。しかし、数種の癌細胞は、インビトロでは容易に培養されず、この以前の方法を利用して、これらの癌種のワクチンを誘導することは困難だと判明している場合がある。本発明の開示は、インビトロで培養することが公知の細胞または組織種を選択するため、およびこれらの細胞または組織種に由来し得る組成物または生成物を生成して、患者生検に由来する細胞を培養する必要性なしに安定な組成物を生成することを可能にするための方法を記述している。いくつかの実施形態では、この組成物は、追加の抗原および／または他の追加の免疫学的に反応性の分子を発現するように遺伝子操作されている細胞から誘導され得る。本発明者らは、この組成物が広範な癌もしくは感染性疾患にまたがって適用可能であり得る既製のワクチン、製品、または免疫刺激因子として実現され得ることを認識している。ワクチンに関して記載されているが、この開示は、ヒト疾患の処置のための他の組成物の方法、組成物および適用を包含すると評価されるべきである。
【００１７】
多数の癌の種類および組織学について潜在的な癌治療剤としてのそれらの役割に加えて、ＡＡＥＣおよび他のオートファゴソーム強化組成物の炎症促進特性が本明細書に開示されている。本発明者らは、ＡＡＥＣが、ＴＬＲ−リガンド、ＤＡＭＰ類および種々のサイトカイン類を含み得ることを実証した。これらの分子およびＡＡＥＣに含まれ得る他の分子は、抗原として直接機能するのではない場合もあるが、適切なＡＰＣによって取り込まれた場合、サイトカイン産生および免疫応答を刺激する他の細胞シグナルを誘導することによって炎症促進の目的を果たす場合もあり、選択されたオートファゴソーム強化組成物が標的とし得る疾患の有効な処置につながる場合もある。
【００１８】
オートファゴソーム強化組成物およびその関連の産生および特徴付けの方法は、癌および感染性疾患に用いられる現在のワクチンと比較して異なる。例えば、オートファゴソーム強化組成物は、オートファゴソームが非存在下で交差提示される場合、通常は非効率的に交差提示されるＳＬｉＰおよびＤＲｉＰの両方を組み込んでもよい。正常な細胞条件では、これらの分子の交差提示は、それらの分子がプロテアソームまたはリソソームによって高度に分解されるせいで、効率的ではない場合がある。これらのタンパク質生成物をオートファゴソームに組み込むことによって、それらが効率的に交差提示される環境が創出され、オートファゴソーム強化組成物中のさらなる分子シャペロンタンパク質の存在は、これらの抗原を保存するように働いて、交差提示のためのそれらの有効性を拡大し得る。
【００１９】
さらに、オートファゴソーム強化されたワクチンは、それらが種々の腫瘍関連抗原を提示するので、標的された免疫応答の有効な刺激因子であり得る。これらの抗原はまた、オートファゴソームが、ＨＳＰ−９０、ＨＳＰ−７０のようなタンパク質シャペロン分子、および抗原の完全性を保護するように機能し得るカルレティキュリンも含んでいるため、組成物中で固有に保存されてもよい。さらに、このオートファゴソームは、傷害関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を含む。これらのＤＡＭＰ類は、壊死細胞などに存在し、ワクチン中に含まれる天然のアジュバントとして作用し得る。ＡＡＥＣ中に存在するＤＡＭＰとしては、ＨＭＧＢ１、Ｓ１００タンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡが挙げられ得る。オートファゴソーム強化組成物は、トル様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含んでもよい。これらのＴＬＲアゴニストは、先天性免疫応答を刺激し、これは、年齢、癌療法、または進行性の腫瘍増殖の影響に伴って二次的に免疫機能の低下した患者に対して有益であり得る。
【００２０】
さらに、ＡＡＥＣ、およびオートファゴソーム強化組成物は一般には、アジュバントとしてまたは別の形で機能する分子との同時投与のための適切な候補である。一例では、このワクチンは、免疫応答を誘導することが公知の分子であるＩＦＮ−γおよびＴＬＲアゴニストと一緒に、ＤＣに投与された。この組み合わせは、３ＬＬ肺癌およびＢ１６Ｆ１０黒色腫に対して堅強な抗腫瘍応答を誘導することが示された。非特異的なアジュバント、例えば、ミョウバン、ＣｐＧ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌまたはそれらの組み合わせは、オートファゴソーム強化組成物と組み合わせて投与され得る。特定の細胞または組織タイプを標的とする特定のアジュバントまたは治療剤は、このような細胞または組織集団内の免疫応答の位置を見つけるために、オートファゴソーム強化されたワクチンと組み合わせて投与されてもよい。
【００２１】
アジュバントまたは関連の化合物との同時投与に加えて、このワクチンは、独立した治療有用性を有するか、またはＡＡＥＣ内の化学成分を保存し得る化合物を含む追加の化合物とともに処方されてもよい。
【００２２】
処置の過程は、複数回のワクチン投与を包含し得る。各回のワクチン投与は、種々のアジュバントまたはアジュバントの組み合わせを利用し得る。この作用過程は、最初のワクチン投与よりも先に決定されてもよいし、または患者の応答をモニターするための分子、細胞または全身アッセイ、画像手順もしくは他のこのような試験によって評価されるような、ワクチンおよび付随するアジュバントに対する患者応答によって情報を得てもよい。下記の一例では、ＡＡＥＣを用いて、炎症反応を刺激する、ＢＤＣＡ３＋（血液樹状細胞（ＤＣ）抗原−３＋）単球の生成を刺激してもよい。これらの単球を単離して、その後の回のワクチン接種と組み合わせてアジュバントとして投与してもよい。
【００２３】
ＡＡＥＣ中にＤＲｉＰおよびＳＬｉＰを蓄積するために、ベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ）または同様のプロテアソームインヒビタを予め使用して、それによってＤＲｉＰおよびＳＬｉＰがプロテアソームによって分解されることを防いだ。プロテアソーム阻害はまた、オートファジーを増大させるが、本発明者らは、これが、オートファジーを増大する最も効率的な方法ではない場合もあることを確認した。
【００２４】
本開示のオートファゴソーム強化組成物は、複数のＴＬＲアゴニストおよび複数の腫瘍抗原を含む。プロテアソーム阻害は、感染性疾患に対する応答を刺激するために必要な抗原に関して組成物を限定し、かつ膜−タンパク質移動を刺激するために必要なタンパク質に関して組成物を制限し得る。従って、オートファゴソーム強化組成物は、ＮＨ４ＣＬ、クロロキン、ラパマイシンまたは他のオートファジー刺激因子のような、プロテアソーム阻害なしにオートファゴソームを強化する、当該分野で公知の因子との接触を通じて生成され得る。オートファジーはまた、飢餓によって細胞または組織中で誘導されてもよい。
【００２５】
専門的な抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）による抗原交差提示は、ｐＡＰＣによって合成されない抗原、例えば、腫瘍関連抗原またはウイルス抗原に対する適応免疫応答の発達のための第一のステップである（ここではｐＡＰＣによる直接提示は、ウイルス回避機構によって覆される）。これらの例では、交差提示に利用可能な抗原は、死滅細胞または死にそうな細胞から誘導される。本発明者らは、これらの抗原のための新規なオートファジー支援の抗原交差−提示経路（ＡＡＡＸＰ）を特定した。この経路は、死滅した細胞関連抗原を交差提示するのに極めて効率的である樹状細胞のサブセットに対して、ＣＬＥＣ９Ａ受容体を介したオートファゴソームの特異的な認識により抗原交差−提示の有効性を調節し得る。本発明者らは、腫瘍由来のオートファゴソームによるワクチン接種が、樹立されたマウス腫瘍の複数のモデルにおいて腫瘍チャレンジからの異種の保護および高い治療有効性をもたらしたことを認識した。
【００２６】
ＡＡＥＣは、ＣＬＥＣ９Ａ−ＣＤ８α＋ｃＤＣでも、ＣＬＥＣ９Ａ−ＰＤＣＡ−１ｈｉｐＤＣでもなく、マウスＣＬＥＣ９Ａ＋ＰＤＣＡ−１ｄｉｍ樹状細胞（ここではｘＤＣと呼ぶ）によって排他的に交差提示され得る。遺伝子アレイの分析によって、ｘＤＣは、ＣＤ８α−ｃＤＣよりもｐＤＣに密接に関連していることが明らかになった。さらに、機能的なｘＤＣが、キメラマウスの骨髄（ＢＭ）中で、ｐＤＣの枯渇後、またはＢａｔｆ３欠損ＢＭでの再構成後のいずれかで見出され得る。しかし、ｘＤＣは、ＩＲＦ８欠損ＢＭで再構成されたキメラマウスでは失われている。さらに、ＣＬＥＣ９Ａ＋ＣＤ１１ｃ−ｘＤＣ前駆体（ｐｒｅ−ｘＤＣ）は、マウスのＢＭおよび脾臓で見出され得、そしてＡＡＥＣの食作用の際に機能的な交差提示樹状細胞（ｘＤＣ）に分化し得る。さらに、ＣＬＥＣ９ＡおよびＢＤＣＡ発現によって特徴づけられるような、マウスｘＤＣおよびプレ−ｘＤＣのヒト等価物が、ヒトのＰＢＭＣおよびＧ−ＣＳＦ動員の血液に存在し得る。
【００２７】
＜実施例１＞
［同種異系のオートファゴソーム強化組成物およびこの組成物を生成するための方法］
図１は、ＵｂＬＴ３またはＵｂＬＴ６の細胞株における、５００の最も上方制御された遺伝子のうちでこれらの遺伝子の上方制御を有する種々の形態の癌を有する患者の割合を示す。データは、以下のタイプの癌に由来するものであって、カッコ内は患者の数である：卵巣（２３２例の患者）、前立腺（８５例の患者）、乳癌（４５１例の患者）、肉腫（１４９例の患者）、肺扁平上皮（１７８例の患者）、結腸（１９３例の患者）、グリア芽細胞腫（１２２例の患者）、腺癌（１１２例の患者）、腎乳頭（７５例の患者）、子宮（２３２例の患者）、神経膠腫（１４４例の患者）、および腎ＲＣＣ（３８９例の患者）。図１に示されるとおり、ベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ）およびＮＨ４Ｃｌでの処置後、ＮＳＣＬＣの細胞株ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６のマイクロアレイ分析（各々、正常な肺ＲＮＡと比較）によって、これらの細胞株において上方制御された多くの遺伝子が癌ゲノムアトラス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）（ＴＣＧＡ）データセットで他の癌の中でもまた上方制御されることが示される。最も有意に上方制御された上位の５００の遺伝子（ＳＡＭ  Ｅｘｃｅｌ）をＴＣＧＡにおけるマイクロアレイのデータと比較した（ｚスコア＞３）。ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６の処置腫瘍細胞は、様々な病因の多くの患者の腫瘍に共通している少なくとも１つの遺伝子を共有することがデータによって示される。特に、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、肉腫、肺扁平上皮細胞肉腫、ならびに結腸および直腸の腺癌を有する患者を含む多くの患者の癌は、チェックされた５００００個の遺伝子のうち、ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６と共通して数百の上方制御された遺伝子を有している。マイクロアレイデータは、ＨＮＳＣＣには利用可能ではないが、２９１例のＨＮＳＣＣ患者についてのＲＮＡＳｅｑデータセットによって、分析された３００の遺伝子のうち、ＵｂＬＴ３と比較して、１サンプルあたり発現された共通する遺伝子の平均が２５であること、およびＵｂＬＴ６については２９であることが示される（データ示さず）。
【００２８】
以前に、本発明者らは、ＤＲｉｂｂｌｅとして公知のＡＡＥＣの改変体を生成して単離するための方法を開示した（米国特許出願公開第２００９／０２２０５３０号）。この開示の目的のためには、「同種異系のオートファゴソーム強化組成物（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ  Ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」または「ＡＡＥＣ」および「ＤＲｉｂｂｌｅ」という用語は、交換可能に用いられてもよいが、ＡＡＥＣは、ＤＲｉｂｂｌｅの特定のサブセットを指すことが理解されるべきである）。この方法は、標的細胞と、十分な量のプロテアソームインヒビタとを、ＡＡＥＣを生成するために十分な条件、例えば、細胞中でタンパク質分解を実質的に阻害する条件下で接触させるステップを包含する。いくつかの例では、この方法はさらに、この標的細胞と、十分な量のオートファジー誘導因子とを、プロテアソームインヒビタとの接触の前、間または後に接触させるステップを包含する。この細胞はまた、タンパク質のグリコシル化を低減する１つ以上の因子と接触されてもよい。一例では、この細胞を、十分な量のプロテアソームインヒビタ（例えば、２０ｎＭのＶｅｌｃａｄｅ）、オートファジー誘導因子（例えば、ラパマイシンまたはＨＢＳＳ）およびＮＨ４Ｃｌと、細胞によるＡＡＥＣの産生を刺激するために十分な条件下で接触させる。一例では、このような条件下で生成されたＡＡＥＣは、細胞からこのようなＡＡＥＣを分離することによって回収される。１つの例示的な方法では、細胞を、細胞中でタンパク質分解を実質的に阻害するのに十分な条件、例えば、６〜２４時間のインキュベーションという条件下で、プロテアソームインヒビタを含み得る十分量の組成物と接触させてもよい。次いで、細胞を、その細胞中でオートファジーを誘発するのに十分な条件、例えば、オートファジー誘導因子とともに６〜２４時間のインキュベーションという条件下でインキュベートしてもよい。いくつかの実施形態では、高い基礎オートファジー速度を有する細胞株を、細胞の継続するオートファジーを活用するのに十分な条件下でインキュベートしてもよい。次いで、得られた細胞およびＡＡＥＣを、ＡＡＥＣが溶液中に残っているままでその細胞がペレットにされるような条件下で遠心分離してもよい。次いで、ＡＡＥＣを含んでいる上清を取り出してもよく、次いでＡＡＥＣをペレットにするのに十分な条件下で遠心分離してもよい。他の実施形態では、この細胞を、オートファゴソームの放出を刺激するために超音波処理してもよい。得られた環境を次に遠心分離して、浄化された上清が、溶液中にＡＡＥＣを保持するように、細胞および高密度の細胞細片を取り除く。次に、ＡＡＥＣ含有溶液をＡＡＥＣをペレットにする条件下で遠心分離してもよい。次いで、このペレットにされたＡＡＥＣを洗浄して、下流の適用のために適切な緩衝液中に懸濁してもよい。
【００２９】
図２Ａは、タンパク質ＧＡＰＤＨおよびＥＥＦ１Ａ１の分解に対するＮＨ４ＣＬ保護の存在を示しているＳＤＳページゲルを示すデジタル画像である。このように、ペプチド抗原は、分解から保護されて、ＡＡＥＣにパッケージングされ得る。図２Ｂに示すとおり、ベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ）およびＮＨ４Ｃｌでの細胞の処置は、処置なしで生じたＡＡＥＣと比較した場合、得られたＡＡＥＣのタンパク質組成物を変更する。ベルケイドおよびＮＨ４Ｃｌによる処置は、ユビキチン化タンパク質および短寿命抗原の相対含量を増大させた。例えば、処置された細胞によって生成されたＡＡＥＣは、βアクチンに対するユビキチン化タンパク質の比が増大している。ＮＰＭ１、ｐ６２、ｐ５３、および生存は、全てが、未処置の細胞から生成されたＡＡＥＣの場合と比較して、βアクチンに対して高い比で存在する。
【００３０】
ＡＡＥＣは、それらが、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＮＣＩ）が優先している少なくとも６つの癌抗原を含み得るので、癌に対する有望な治療剤である。図３Ａは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイで行った、正常な肺ＲＮＡとともにベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ）およびＮＨ４Ｃｌで処置したＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６細胞の遺伝子プロファイリングを示す。発現を、ＮＣＩの上位癌抗原優先順位決定リストと比較した。遺伝子プロファイリングは、各々の条件について３つの独立したＲＮＡサンプルで行った。示される全ての遺伝子についての発現の標準偏差は、５％未満である。図３Ｂは、６つの抗原（ＷＴ１、ｐ５３、スルビビン、ＥｐｈＡ２、サイクリンＢ１、およびＸＡＧＥ１）のタンパク質発現をＵｂＬＴ３またはＵｂＬＴ６細胞における遺伝子発現とともに示しており、ウエスタンブロットによってＤＲｉｂｂｌで確認した。図３Ｃは、ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６由来のＡＡＥＣにおけるＮＣＩ優先抗原の存在のさらなる確認を示す。抗原としては、ＷＴ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｐ５３、スルビビン、ＥｐｈＡ２、サイクリンＢ１、ＸＡＧＥ１、およびＰＤＧＦＲ−βが挙げられる。図３Ｄは、ウエスタンブロットによって実証されるとおり、ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６由来のＡＡＥＣにおける４つのＮＳＣＬＣ標的の存在を示す。標的タンパク質としては、ＰＫＭ２、ＬＤＨＢ、ＥＩＦ４Ａ１、およびＥＮＯ１が挙げられる。ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６のＡＡＥＣ中に含まれている抗原を示しているまとめの表は、図３Ｅに示す。
【００３１】
さらに、ＤＡＭＰは、マイクロアレイデータによって示されるとおり、処置されたＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６の細胞において、ならびにＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル電気泳動によって示されるとおりＡＡＥＣにおいて高度に発現され得る。ＤＡＭＰは、非感染性の炎症性反応を介して免疫応答を開始および持続させ、本質的には、「危険な（ｄａｎｇｅｒ）」シグナルを免疫系に送ることが可能である。図４Ａ〜図４Ｂは、このデータを示す。図４Ａは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイで行われた、ベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ）およびＮＨ４Ｃｌで処置されたＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６の細胞、ならびに正常な肺ＲＮＡの遺伝子プロファイリングを示す。発現は、ＮＣＩの上位癌抗原優先リスト（Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９：５３２３−５３３７）と比較した。遺伝子プロファイリングは、各々の条件について３つの独立したＲＮＡサンプルで行った。示された全ての遺伝子についての発現の標準偏差は、５％未満である。図１０Ｂは、６つの抗原（ＷＴ１、ｐ５３、スルビビン、ＥｐｈＡ２、サイクリンＢ１、およびＸＡＧＥ１）のタンパク質発現を、ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６細胞における遺伝子発現とともに示しており、これはＡＡＥＣにおいてウエスタンブロットで確認されている。
【００３２】
本明細書に記載の方法（例えば、プロテアソームインヒビタおよびＮＨ４Ｃｌでの処置）を用いて処置した場合、ＵｂＬＴ３のＡＡＥＣは、高レベルのＴＬＲリガンドおよびＤＡＭＰを発現する。トル様受容体は、マクロファージおよび樹状細胞のような細胞の表面で発現されるクラスのタンパク質を含み、かつ細胞ストレスに関連する分子および／または病原体を認識し、かつ結合し得る。ＴＬＲ−アゴニストに対する結合の際、ＴＬＲは、活性化され、かつ炎症性サイトカインおよび／または１型インターフェロンの産生をもたらすシグナル伝達カスケードを引き起こす。図５Ａおよび図５Ｂは、ＡＡＥＣにおけるＴＬＲリガンドの発現に対するデータを示す。図５Ａでは、ＵｂＬＴ３のＡＡＥＣ内のＴＬＲ−２、−４または−９アゴニストの存在および力価を、単一のヒトＴＬＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を発現するように形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を用いて評価した。力価は、ポジティブおよびネガティブ（非リガンド）のコントロールと比較した。図５Ｂは、ＵｂＬＴ３のＡＡＥＣの３つの異なるバッチのＤＡＭＰのタンパク質発現を示しているウエスタンブロットを示す。
【００３３】
さらに、ＡＡＥＣは、複数のＴＬＲリガンドを含んでもよい。これらのＴＬＲリガンドは、微生物抗原を模倣し、かつ先天性免疫応答を刺激する。このことは、患者にＡＡＥＣを投与した場合、有益である。図６は、種々のＴＬＲリガンドの存在を、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞におけるそれらの活性により、視覚的な分光写真によって示す。単一のヒトＴＬＲをトランスフェクトされたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞を用いて、ＡＡＥＣ中のＴＬＲアゴニストを測定した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６のＡＡＥＣは、ＴＬＲ２、３、４、７および９に対するアゴニストを含む。ＡＡＥＣを、５０ｕｇ／ｍｌで添加した。全細胞の照射された腫瘍を１０５／ｍｌで添加した。ポジティブコントロールは、ＴＬＲ２（ＬＴＡ）＠５００ｎｇ／ｍｌ、ＴＬＲ３（ポリ（Ｉ：Ｃ），ＬＭＷ）＠１０μｇ／ｍｌ、ＴＬＲ４（ＬＰＳ）＠５００ｐｇ／ｍｌ、ＴＬＲ７（ＣＬ０９７）＠５０μｇ／ｍｌ、ＴＬＲ９（ＯＤＮ２００６）＠１０μｇ／ｍｌ、ＮＵＬＬ１（ＴＮＦａｌｐｈａ＠１０００ｎｇ／ｍｌ）である。
【００３４】
本明細書に記載され、図１〜６に関するデータによって、１つ以上の組成物、およびこれらの組成物を生成する細胞をスクリーニングするための１つ以上の方法が可能になり得る。組成物であって、非小細胞肺癌細胞株由来のオートファゴソームの強化された集団を含んでおり、ここでこのオートファゴソームの強化された集団は、１つ以上のトル様受容体アゴニストと、１つ以上の腫瘍抗原と、１つ以上の傷害関連分子パターンの分子とを含む。この１つ以上のトル様受容体アゴニストは、トル様受容体２、トル様受容体３、トル様受容体４、トル様受容体７、および／もしくはトル様受容体９のアゴニスト、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。この１つ以上の腫瘍抗原は、ＷＴ１、ｐ５３、スルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＥｐｈＡ２、サイクリンＢ１、および／もしくはＸＡＧＥ１またはそれらの組み合わせを含んでもよい。この１つ以上の傷害関連分子パターンの分子は、カルレティキュリン、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、および／もしくはＧｒｐ９４、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。いくつかの例では、このオートファゴソームの強化された集団は、ＵｂＬＴ３細胞株由来であってもよい。いくつかの例では、このオートファゴソームの強化された集団は、ＵｂＬＴ６細胞株由来であってもよい。この組成物はさらに、このオートファゴソームの強化された集団を含んでいる抗原に対する免疫応答を強化するように構成された分子を含んでもよい。この分子は、ポリイノシン：ポリシチジル酸であってもよい。この組成物はさらに、非特異的なアジュバントを含んでもよい。
【００３５】
別の例では、末梢血単核球の小集団で選択マーカの発現を誘導できる同種異系のオートファゴソーム強化組成物を生成する細胞をスクリーニングするための方法は、細胞とプロテアソームインヒビタとを接触させるステップと、この細胞とリソソームインヒビタとを接触させるステップと、得られたオートファゴソームを収集するステップと、この得られたオートファゴソームの分子署名を決定するステップと、１つ以上のトル様受容体アゴニストおよび／または１つ以上の分子シャペロンをこのオートファゴソームに転用する細胞を選択するステップと、を包含する。この選択マーカは、ＢＤＣＡ３であってもよく、かつ末梢血単核球の小集団は樹状細胞を含んでもよい。この選択マーカは、ＣＤ８０であってもよく、かつ末梢血単核球のこの小集団は単球を含んでもよい。
【００３６】
＜実施例２＞
［ヒトＰＢＭＣにおける炎症促進性ＢＤＣＡ３発現単球の誘導］
第二の実施例は、ＡＡＥＣを用いてヒトＰＢＭＣおよびリンパ節（ＬＮ）由来の単一細胞懸濁物中でＢＤＣＡ３発現単球の増大を誘導し得る方法を記述する。
【００３７】
ＢＤＣＡ３発現樹状細胞（ＤＣ）は、トル様受容体３（ＴＬＲ３）による刺激の際、ヘルパＴ１型（ＴＨ１）および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答を増強することが公知のサイトカインであるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）およびインターフェロンβを産生する。ＢＤＣＡ３＋ＤＣはまた、ＣＤ８＋細胞の交差提示に重要である。これらの活性のおかげで、ＢＤＣＡ３＋ＤＣは、抗腫瘍免疫応答を刺激するために重要であり得る。
【００３８】
上記のとおり、ＡＡＥＣは、プロテアソーム分解およびリソソーム媒介性タンパク質分解への阻害が組み合わさった際に腫瘍細胞によって生成され得、そして種々の腫瘍抗原、ならびにＤＡＭＰおよびＴＬＲリガンドを含んでもよい。ＡＡＥＣはマウスのＣＬＥＣ９Ａ＋交差提示樹状細胞によって効率的に取り込まれて、樹立されたマウス腫瘍に対して治療免疫を惹起可能である場合がある。ここで本発明者らは、ＰＢＭＣおよびリンパ節由来の単一細胞懸濁物を用いて、ヒト骨髄性細胞に対してＡＡＥＣが有している可能性がある相互作用および影響を記載している。
【００３９】
図７は、ＡＡＥＣが血液ＣＤ１４＋ＢＤＣＡ３−単球によって効率的に取り込まれる実施例を示す。ＡＡＥＣとの相互作用によって、単球上で血液ＤＣマーカＢＤＣＡ３の用量依存性の誘導が生じた。単球上のＢＤＣＡ３上方制御は、ブロッキングするオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いたＴＬＲ９ブロックによって部分的にブロックされ得る。
【００４０】
臨床サンプルでは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧの組み合わせでワクチン接種された黒色腫患者は、ＣＤ１４＋ＢＤＣＡ３＋細胞のレベルの増大を、それらの腫瘍−排出ＬＮで示した。ＡＡＥＣと同様に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧまたはＣｐＧ単独でのインビトロ刺激は、単球およびＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１４−ＤＣの両方でＢＤＣＡ３誘導をもたらした。血液単球に加えて、ＡＡＥＣはまた、黒色腫患者のＬＮ単一細胞懸濁物中に存在するＣＤ１４＋ＣＤ１１ｃ＋細胞でＢＤＣＡ３発現を増大し得る。これらのサンプルでは、ＢＤＣＡ３誘導は、上清中の分泌されたＩＬ−８のレベルの増大と相関していた（ｒ＝０．７６，ｐ＜０．０１）。実際、ＰＢＭＣ由来の分別されたＡＡＥＣ誘導性ＣＤ１４＋ＢＤＣＡ３＋細胞は、同じ培養物からのＣＤ１４＋ＢＤＣＡ３−細胞、または分別されたビヒクル処理のＢＤＣＡ３−単球に比較して高レベルのＩＬ−８を生じた。ＩＬ１０誘導性のＣＤ１４＋ＢＤＣＡ３＋組織ＤＣは、寛容原性であり、かつＴ細胞応答を抑制すると記載されてきたが、本発明者らは、ＡＡＥＣ誘導性のＣＤ１４＋ＢＤＣＡ３＋単球が、最適以下の用量の抗ＣＤ３抗体の存在下で濃度依存的にＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞増殖を刺激し得ることを見出した。これらの同時培養物中のＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞は、高レベルのＴｈ１サイトカイン、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを生成し得、ＴＮＦαは増殖と相関しており（ｒ＝０．９７，ｐ＜０．００１）、ＡＡＥＣ活性化単球について潜在的な炎症促進性の役割を思わせる。
【００４１】
ＬＮ中に存在するＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞上でのＢＤＣＡ３発現の誘導、およびＩＬ−８分泌の増大は、培養物中に存在するＣＤ１４＋細胞の頻度と相関している。ＣＤ１４＋細胞は、種々の異なる細胞型に分化できる単球である。ＢＤＣＡ３発現の誘導と相関するそれらの頻度の増大は、ＢＤＣＡ３発現の炎症促進性の応答を示すものである。図７Ａ〜図７Ｃは、ＡＡＥＣに特異的なＢＤＣＡ３の用量依存性の誘導を示しているデータを示し、この誘導は、ＣＤ１４＋細胞の漸増と相関している（Ｒ２＝０．９９，ｐ＜０．００１）。この相関によって、ＡＡＥＣが、免疫応答の誘導に有益であり得るＣＤ１４＋細胞の上方制御に関与し得ることが示唆される。凍結保存した黒色腫ＬＮ単一細胞懸濁物を解凍して、なにもなし（Ａｇなし）、ヘタスターチ（ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）（ビヒクル）、６μｇまたは１２μｇのＵｂＬＴ３  ＡＡＥＣ（ＤＲｂ）が含有されるＸ−ｖｉｖｏ１５媒体（４８ウェルプレート中で１ｍｌあたり百万個の細胞）とともに２０時間同時培養した。図７Ａおよび７Ｂは、１２色のフローサイトメトリーによって特徴付けられた回収された細胞を示しており、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０３、ＢＤＣＡ３／ＣＤ１４１およびＣＤ８３を見ている。死滅細胞は、生／死染色によって排除して、ゲートをＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｏｎｅ（ＦＭＯ）コントロールに基づいて設定した。図７Ｂは、ＣＤ１１ｃ＋ＤＲ＋細胞でのＡＡＥＣ誘導性のＢＤＣＡ３発現とＣＤ１４＋細胞の頻度との間のピアソン相関を示す。図７Ｃは、回収の前に取り出された同じ実験アッセイの上清におけるＩＬ−８の誘導を示す。分泌されたサイトカインは、サイトカインビーズアレイで評価した。
【００４２】
ＡＡＥＣは、ＣＤ１４＋ヒト単球でＢＤＣＡ３の発現を誘発し得る。図８Ａ〜図８Ｂは、ＢＤＣＡ３の発現がＣＤ１４＋ヒト単球で増大されることを示している実験データを示す。実験のためには、健常なドナーＰＢＭＣ（１ｍｌあたり１００万個）をヘタスターチ（ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）（ビヒクル）とともに同時培養して、漸増濃度のＵｂＬＴ３  ＡＡＥＣまたはＴＬＲ４アゴニスト  ＭＰＬ（５００ｎｇ／ｍｌ）で処置した。次いで、細胞を２０時間後フローサイトメトリーによって表現型分類した。図８Ａは、１つの代表的なドナーからのヒストグラムプロットを示す。影付きのグラフは、試料特異的な（蛍光マイナス１）ＦＭＯコントロールを表す。オープンのグラフは、ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１４＋単球上でのＢＤＣＡ３−ＦＩＴＣ発現を示す。図８Ｂは、７５μｇのＡＡＥＣ（ＤＲｂ）を用いて、２例の健常ドナーでの３つの別の実験を表すグラフを示す。＊＊＊ｐ＜０．０００１一元Ａｎｏｖａで、チューキーの多重比較検定を用いる（Ｐｒｉｓｍ）。
【００４３】
ＴＬＲ−９阻害は、ＣＤ１４＋単球でのＢＤＣＡ３発現のＡＡＥＣ媒介性の誘導を低減し、かつＡＡＥＣ接触したＰＢＭＣ培養物中のＩＬ−８分泌を低減する。ＴＬＲ−９は、特定のＯＤＮでブロックされ得、この受容体のブロックは、ＴＬＲ−９発現細胞内の細胞内経路の活性化を阻害し、これが全体として免疫応答の活性化をもたらす。図９Ａ〜図９Ｄに示される実験は、ビヒクル、ＵｂＬＴ３  ＤＲｉｂｂｌｅ（７５μｇ／ｍｌ）（３７℃で２０分のインキュベーション後）、ＴＲＬ２、ＴＲＬ４またはＴＲＬ９のアンタゴニスト、またはコントロールを用いてまたは用いずに培養したヒトＰＢＭＣ（９６ウェルプレート中で、２００μｌ中で２×１０５）で行った。図９Ａは、最高濃度の抗ＴＬＲ（ＴＬＲ２／４について７．５μｇ／ｍｌ、ＴＬＲ９について１３．８μＭ）を用いて、ＢＤＣＡ３発現（オープン）およびＦＭＯコントロール（影付き）を示しているヒストグラムプロットを示す。図９Ｂは、２例のドナーについて抗ＴＬＲ９およびコントロールＯＤＮの滴定によるＢＤＣＡ３＋ＣＤ１４＋細胞の％を示す。図９Ｃは、ＣＢＡで決定した、ＰＢＭＣの中のＡＡＥＣ接触した培養物＋／−ＴＬＲアンタゴニストのＩＬ−８分泌を示す。図９Ｄは、種々のＴＬＲアンタゴニストにおいてインキュベートしたＰＢＭＣによるＡＡＥＣ取り込みを示す。ＵｂＬＴ３のＡＡＥＣに０．５μＭの赤外脂質色素（３分ＲＴ）をロードし、次いで、洗浄し、２×１０５ＰＢＭＣ（ＴＬＲアンタゴニストと２時間プレインキュベート）とともに同時培養した。４℃でＵｂＬＴ３のＡＡＥＣとともに培養したＰＢＭＣを能動的取り込みのコントロールとして用いた（ｎ＝１，二連）。
【００４４】
図９Ｅによって、３例のドナーからＰＢＭＣに添加されたＵｂＬＴ３由来のＡＡＥＣが、これらの抗原提示細胞の成熟に関連する副刺激分子であるＣＤ８０を発現する単球のパーセントを増大することが示される。この効果は、ＴＬＲ９を通じたシグナル伝達をブロックすることによって阻害され得るが、ＴＬＲ９のモックインヒビタを加えることでは阻害されない。
【００４５】
図１０は、４例の健常ドナー由来のＰＢＭＣのＣＤ１４＋単球に対する種々の処置に応答したＢＤＣＡ３＋細胞の誘導を示す。実験は、ＰＢＭＣ（４８ウェルプレート中でＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ中、５百万個／ｍｌ）中で行い、これは刺激なし（ｎｏ  ｓｔｉｍ）、５μｇ／ｍｌのＣｐＧ−Ａ（ＯＤＮ−２２１６）、５μｇ／ｍｌのＣｐＧ−Ｂ（ＯＤＮ−７９０９）またはＣｐＧ−＋１０００ＩＵ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（ＣｐＧ＋ＧＭ）とともに４８時間培養した。ＣＤ１４＋単球でのＢＤＣＡ３＋発現を、４色フローサイトメトリー（ＶＵｍｃ）で評価した。
【００４６】
ＡＡＥＣ接触単球（ＢＤＣＡ３−およびＢＤＣＡ３＋の両方）は、高レベルのＩＬ−８を生成し、かつ最適以下の抗ＣＤ３刺激と組み合わせてＴ細胞増殖を刺激する。Ｔ細胞増殖の刺激を、免疫応答の誘導を示すものとして用いる。ＡＡＥＣの存在下におけるＣＤ４の増殖増大は、標的の癌抗原、感染または標的化免疫応答が有益である他の疾患に向かう免疫応答を刺激するためにこの組成物が患者に投与される場合があるので有益である。図１１Ａ〜図１１Ｂは、ＩＬ−８およびＴ細胞増殖の上方制御の示すデータを示す。これらの実験について、２例の健常ドナーのＰＢＭＣをビヒクルまたは７５μｇ／ｍｌのＵｂＬＴ３  ＡＡＥＣとともに２０時間同時培養した。ＣＤ４＋ＣＤ２５−およびＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ１４＋（ＢＤＣＡ３−）単球を、ビヒクル処理したサンプルから分別した。ＣＤ１４＋ＢＤＣＡ３−およびＣＤ１４＋ＢＤＣＡ３＋細胞を、ＡＡＥＣ処理サンプルから分別した。ドナー１から分別したＣＤ１４＋細胞を、ドナー２から分別したＴ細胞と同時培養し、逆もまた同様であった。図１１Ａは、ＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳ中で一晩培養した５０００の分別したＣＤ１４＋細胞からのＩＬ−８濃度を示す。この上清は、２０時間後に回収した（１サンプルあたり三連）（２つの実験で同様の結果）。図１１Ｂは、分別されたビヒクルまたはＡＡＥＣ処理ＣＤ１４＋の存在下で２μｇのプレート結合したＯＫＴ３（抗ＣＤ３）で刺激されたＣＤ４Ｔ細胞の増殖を示す。図１１Ｃでは、ＴＮＦ−α濃度は、３日目および５日目の両方でＣＤ４の増殖と相関している。
【００４７】
ＵｂＬＴ３のＡＡＥＣは、ヒト黒色腫ＬＮサンプルにおいてＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞でＢＤＣＡ３発現を誘導することが見出され得る。誘導のレベルは、これらのサンプルにおけるＣＤ１４＋細胞の存在と相関していた。ＬＮサンプルと同様に、ＡＡＥＣは、ＢＤＣＡ３発現を健常なドナー単球上で誘導した。ＴＬＲ４アゴニストであるＭＰＬは、ヒト単球でＢＤＣＡ３発現を誘導せず、このことはＴＲＬ４依存性の機構を示唆している。ＵｂｉＬＴ３  ＡＡＥＣは、種々のＴＬＲを刺激する高レベルのリガンドを発現することが見出され得る。ＴＬＲ２、ＴＬＲ４またはＴＬＲ９活性化の阻害は、ＡＡＥＣ誘導性のＢＤＣＡ３誘導におけるＴＬＲ９の寄与を示した（２例のドナーで観察された）。興味深いことに、ＣｐＧまたはＣｐＧ＋ＧＭ−ＣＳＦの皮内注射で処置された黒色腫患者は、それらのセンチネルＬＮにおいてＢＤＣＡ３＋ＤＣサブセットの頻度の上昇を示した（Ｓｌｕｉｊｔｅｒら、準備中）。ＣｐＧまたはＣｐＧ＋ＧＭ−ＣＳＦによるＰＢＭＣのインビトロ刺激は、ＣＤ１４＋単球でＢＤＣＡ３を誘導し、単球上でのＴＬＲ９刺激とＢＤＣＡ３発現との間の関係が確認された。ＢＤＣＡ３誘導に加えて、ＡＡＥＣは、黒色腫ＬＮおよび健常なドナーＰＢＭＣ培養物におけるＩＬ−８の産生を誘導し得る。ＰＢＭＣドナーの２／２で、ＴＬＲ９阻害は、ＩＬ−８産生を低減したが、ＴＬＲ４阻害は、１／２のドナーでＩＬ−８のレベルを低減した（１実験）。分別されたＡＡＥＣ誘導性のＢＤＣＡ３＋細胞は、コントロールの単球よりも有意に高レベルのＩＬ−８を産生した（各々２例のドナーの２つの実験）。未処理の単球とは対照的に、ＡＡＥＣ処理ＰＢＭＣから分別されたＢＤＣＡ３＋およびＢＤＣＡ３−単球は、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖（＋ＯＫＴ３）およびＩＦＮ−γ産生を刺激し得る（示さず）。ＡＡＥＣ誘導性のＢＤＣＡ３＋単球はさらに、ＣＤ８Ｔ細胞増殖（示さず）およびＴＮＦ−α産生を刺激した。これらのデータによって、ＡＡＥＣは、ヒト単球において炎症促進性の変化を誘発し得ることが示唆される。
【００４８】
図１２Ａは、治療後の数例の患者における抗癌免疫応答を検出するためのＡＡＥＣの治療的な免疫モニタリング使用を実証しており、かつ腫瘍−排出リンパ節が癌によってプライムされ、ＡＡＥＣを用いて検出され得る細胞を含むことを立証するチャートを示す。癌患者から単離されたＰＢＭＣを単離して、ＡＡＥＣでの処置に応答したＩＦＮ−γの産生をアッセイする実験で利用した。ＩＦＮ−γの産生の増大は、ＩＦＮ−γが免疫機能の重要な強化因子であるので、癌ワクチンでの処置に有益であり得る。ＩＦＮ−γは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を刺激し、抗原提示を増大し、それによって、免疫応答を活性化するために重要な膨大な転写の変更を生じる。ＨＮＳＣＣ、黒色腫および前立腺癌を有する患者は、ＮＳＣＬＣ細胞由来のＡＡＥＣで刺激した場合、ＩＦＮ−γを生じる。図１２Ａは、ＨＮＳＣＣ（ｎ＝４）、黒色腫（ｎ＝４）、または前立腺癌（ｎ＝４）を有する患者由来のＰＢＭＣまたは（リンパ節）ＬＮからの直接のエキソビボのＩＦＮ−γ産生を示す。細胞を、完全な媒体中で５％のヒトアルブミン（５×１０６／ｍｌ）と再懸濁して、ＵｂＬＴ３またはＵｂＬＴ６のＡＡＥＣに対して３６〜４０時間暴露した。上清を、サイトカインビーズアレイ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析した。遺伝子アレイデータに基づいて、腎細胞癌患者由来のＡＡＥＣをネガティブコントロールとして用いた。２例の健常ドナー由来のＰＢＭＣを試験し、両方ともＩＦＮ−γ産生についてネガティブであった。ＡＡＥＣは、ウエスタンブロットで測定して、ＭＨＣクラスＩ分子を含まない。これらの知見によって、ＡＡＥＣは、抗癌免疫応答の発達を特定するために有用であり、かつ抗癌免疫のバイオマーカとして利用され得ることが示唆される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＡＡＥＣは、ＮＳＣＬＣから誘導され得る。しかし、ＡＡＥＣは、多数のまたは多様な癌細胞または非癌細胞に由来し得る。これには、ごく少数の例を挙げれば、乳房腺癌由来のもの、例えば、ＢｒＣＡ−１５２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８、結腸癌由来のもの、例えば、ＨＣＴ１１６またはＴ８４、リンパ腫由来のもの、例えば、ＥＬ４、黒色腫由来のもの、例えば、ＭＥＬ−３０、ＭＥＬ−６８、および／またはＭＥＬ−４０などの細胞株を挙げることができる。さらに、ＡＡＥＣは、同系の組織由来であってもよく、これには、本明細書に記載の方法による患者腫瘍からの誘導を含む。上記のとおり、ＡＡＥＣを誘導および投与するための方法は、癌ワクチンにのみ適用される必要はなく、細菌、真菌、ウイルスまたは原生動物抗原を含むオートファゴソーム強化組成物を開発するために適切であり得る。
【００５０】
図１２Ｂは、ワクチン接種後の免疫応答を示した患者がＡＡＥＣを用いて検出され得ることを実証しているアッセイを示す。このアッセイは、多くの癌によって共有される広範な未知の癌抗原集団に対して免疫応答を評価するための方法を記述する。いくつかの実施例では、このアッセイは、血液中での抗癌免疫応答を評価するかまたはスコア付するために利用され得る。
【００５１】
図１２Ｃではさらに、ワクチン接種した患者における免疫応答は、ＡＡＥＣを用いて検出できることが示される。正常な腎臓由来のＡＡＥＣは刺激性ではなかった。
【００５２】
図１２Ｄは、ｐｐ６５に対する免疫応答の特異性を実証し、およびＵｂＬＴ３  ＡＡＥＣ（ＣＭＶに対する免疫を有する患者におけるｐｐ６５構築物を含まない）との交差反応はないことを実証するヒストグラムである。ＡＡＥＣを用いて、ワクチン接種後に免疫応答を示した患者における免疫応答を検出した。正常な腎臓由来のＡＡＥＣは刺激性ではなかった。免疫応答は、ｐｐ６５に対して、ＵｂｉＬＴ３（ＬＴ３．ｐｐ６５ＤＲｂ）Ｄｒｉｂｂｌｅ（ＡＡＥＣ）では検出されたが、ＵｂＬＴ３  ＡＡＥＣ（ＬＴ３ＤＲｂ）に対しても、正常な腎臓ＡＡＥＣ（ＮＫ  ＤＲｂ）に対しても検出されなかった。
【００５３】
上記の実験からのデータによって、ＢＤＣＡ３発現単球は、患者の単離されたＰＢＭＣおよびＬＮで誘導され得ることが示される。上記のように、これらの細胞は、臨床設定にいて、同種異系のオートファゴソーム強化組成物の投与に有益である炎症促進性応答を有し得る。これらの細胞およびサイトカインの存在に対する炎症促進性の応答は、年齢または以前の抗癌処置に伴う二次的な免疫機能の低下を有する患者における免疫系の回復を補助し得る。さらに、この炎症促進性の応答は、特定の癌または感染性因子を標的し得る先天性免疫応答の急速な拡大を示唆する。この応答は、インビボでＡＡＥＣの投与後に生じ得る（皮内、皮下、静脈内、または鼻腔内の経路を介して）。さらに、それらの潜在的な炎症活性のおかげで、ＢＤＣＡ３＋ＤＣは、患者由来のＰＢＭＣから単離して、ワクチン接種のアジュバントとして用いてもよい。
【００５４】
本明細書に記載の、図７〜図１２に関するデータは、免疫応答を誘導するための１つ以上の方法を可能にし得る。一例では、哺乳動物で特定の免疫応答を誘導する方法は、細胞株由来のオートファゴソームの強化された集団を含む組成物を提供するステップを包含し、このオートファゴソームの強化された集団は、１つ以上のトル様受容体アゴニストと、１つ以上の腫瘍抗原と、１つ以上の傷害関連分子パターンの分子とを含んでいる。
【００５５】
この方法はさらに、哺乳動物の末梢血から末梢血単核球を単離するステップと、末梢血単核球の小集団と、オートファゴソームの強化された集団とを接触させるステップと、この接触された末梢血単核球を哺乳動物に注入して戻すステップとを包含してもよい。この末梢血単核球の小集団は、専門的な抗原提示細胞および非専門的な抗原提示細胞を含んでもよい。この末梢血単核球は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、および／またはＣｐＧの投与後に哺乳動物から単離されてもよい。この細胞株は、ＣＤ８０を発現するように遺伝子操作されている。この細胞株は、サイトメガロウイルスタンパク質ｐｐ６５を発現するように遺伝子操作されていてもよい。この方法は、１つ以上の腫瘍抗原に対して特異的な１つ以上のサイトカインの分泌を検出することによる、オートファゴソームの強化された集団に含まれる１つ以上の腫瘍抗原に対する特定の免疫応答の誘導のためのスクリーニングをさらに包含し得る。特定の免疫応答の誘導のためのスクリーニングは、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、および／または細胞内染色アッセイを含んでもよい。
【００５６】
＜実施例３＞
［非小細胞肺癌細胞株由来ＡＡＥＣでのさらなる癌の処置］
別の例では、実施例１において上記される方法と同様の方法は、ワクチンが多くの公知の癌抗原および免疫刺激因子を含み得るので、さらなる癌の可能な処置として細胞株由来の同種異系のオートファゴソーム強化組成物を利用する。
【００５７】
本明細書で上記されるとおり、腫瘍由来のＡＡＥＣは、関連の癌抗原およびＤＡＭＰを含むタンパク質の複合混合物を没収し得る。前臨床試験では、固有の優勢な腫瘍抗原の特異性が同種の腫瘍チャレンジに対してのみ防御する明確に定義されたＭＣＡ肉腫モデルを用いて、ＡＡＣＥは同系腫瘍に対して交差防御を提供し得る（全腫瘍細胞ワクチンは交差防御を提供し得なかった）ことが示される（Ｔｗｉｔｔｙら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１：６４６７−６４８１）。さらに、ＡＡＥＣは、それが由来し得るインタクトな腫瘍とは異なり、樹立したマウス乳房腫瘍に対して、同種異系の腫瘍細胞由来である場合でさえ治療免疫を提供し得る。これによって、単一のＮＳＣＬＣ腫瘍細胞株は、多様なセットのＮＳＣＬＣ組織学および可能性としては他の癌のタイプに対してワクチンとして用いられ得るという可能性が生じる。本発明者らは、第一相／第二相の臨床試験のために２つのＮＳＣＬＣ腫瘍細胞株、ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６からＡＡＥＣを産生した。それらの遺伝子発現プロフィールが完全に異なることにかかわらず（１９９３５の遺伝子のうち８２１３が２つの細胞株の間で示差的に発現される）、本発明者らは、ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６が、他の癌のタイプで見出される共通の上方制御された遺伝子を共有することを記述している。
【００５８】
ボルテゾミブおよびＮＨ４Ｃｌ（ＤＲｉｂｂｌｅワクチン生産に重要な２つのタンパク質分解インヒビタ）を用いた処置の前後のＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６腫瘍細胞のマイクロアレイ分析を正常な肺組織と比較した。癌ゲノムアトラス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）（ＴＣＧＡ）データセットとの比較によって、ワクチン細胞株中で上方制御された多くの遺伝子がまた、他の癌でも上方制御されることが示された（図８）。さらに、ウエスタンブロット分析によって、優先癌抗原の国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＮＣＩ）のリスト（Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９：５３２３−５３３７）の少なくとも６つの癌抗原が、ＡＡＥＣに含まれ得ることが示される（図３Ａ〜Ｅ）。いくつかの癌についてのＴＣＧＡデータは、ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６（ＨＮＳＣＣ）で上方制御された遺伝子の同様のプロフィールを示すが、その他は、遺伝子発現において共通する変化はほとんどない。従って、ＮＳＣＬＣ由来のＡＡＥＣは、他のタイプの癌を有する患者にとって良好なワクチンとして機能し得る。関連の癌抗原を発現することに加えて、マイクロアレイデータによって、いくつかのＤＡＭＰが上方制御されることが示される（図４Ａ）。ウエスタンブロットによって、カルレティキュリン、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、およびＧｒｐ９４をはじめとするＤＡＭＰ類が全て、ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６のＤＲｉｂｂｌｅワクチンに存在することが示される（図４Ｂ）。
【００５９】
マウスでは、ＡＡＥＣ類は、同系のＭＣＡ肉腫の集団に対して交差防御を提供し得るが、照射を受けた全細胞ワクチンは、無効であって、５０年パラダイムを破ることが示された。また、ＡＡＥＣ類は、同種異系の乳房腫瘍モデルでは全細胞ワクチンと比較した場合防御を提供し得る。広範な種々の癌を処置するためのＡＡＥＣの使用は、臨床転帰に関して有益であり得、同様に多くの現在利用可能な癌治療薬のネガティブな副作用のいくつかを軽減することを支持する証拠がある。この目標を支持する、ヒト細胞株を利用する実験が行われている。ＮＳＣＬＣの腫瘍細胞株、ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６は、共通の過剰発現される遺伝子を多くの他のタイプの癌と共有する。これらの細胞株ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６は、ＮＣＩの上位癌抗原のリストに列挙されている遺伝子、および多くのＤＡＭＰ類をコードする遺伝子を過剰発現した。これらの細胞株および本明細書に開示される方法を利用することで、オートファゴソーム強化されたワクチンが創出され得る。ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６由来のＡＡＥＣは、ＮＣＩの上位癌抗原リストに列挙される少なくとも６つの癌抗原および少なくとも５つのＤＡＭＰを発現し得、５つのＴＬＲ受容体を刺激する。得られたＡＡＥＣは、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、黒色腫、および前立腺癌を有する患者由来のリンパ節（ＬＮ）またはＰＢＭＣ細胞の単一細胞懸濁物からのＩＦＮ−γ産生を刺激し得、このことは、ＮＳＣＬＣのＡＡＥＣが、多様なセットの癌においてＩＦＮ−γ応答を刺激し得ることを示唆し、かつこれらの癌および他のタイプの癌を有する患者用の有望な治療薬を示している。
【００６０】
５〜９の樹立された腫瘍モデルでのＡＡＥＣの治療能力を試験するために、３つの乳癌細胞株を３つの異なるＨ２バックグラウンド（Ｈ２ｂ、Ｈ２ｄおよびＨ２ｑ）で利用して、十字交差の実験デザインでＡＡＥＣの治療能力を試験した。照射された「同種異系の」または「同系の」腫瘍による全細胞ワクチン接種は、それぞれＢＡＬＢ／ｃ、ＦＶＢ／ｎまたはＣ５７ＢＬ／６マウスで、樹立後５日、９日または７日目の４Ｔ１、ＦＡＴまたはＣ５７ＭＧ腫瘍に対して有意な治療有効性を提供できなかった（９つの独立した実験からのデータ）。対照的に、同系のオートファゴソーム強化組成物、または２つの同種異系のオートファゴソーム強化組成物のうちの１つのいずれかによる免疫療法は、研究された全ての組み合わせで治療効果を提供し得る（ｐ＜０．０５  ｎ＝１５〜６５／群）。図１３は、この研究のデータを表し、ここで白四角＝防御なし、「Ｘ」未了、影付き四角＝有意な防御である。これらのデータは、同種異系のオートファゴソーム強化組成物を含む免疫療法が種々の癌の集団に対して治療影響を提供し得るという考えを強力に支持する。具体的には、これはヒトの癌に対するこのストラテジーの使用を支持しており、ここでは抗癌免疫応答の欠如は、悪い転帰に関連するという強力な証拠がある（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２）。
【００６１】
＜実施例４＞
［オートファゴソーム強化組成物は、膜タンパク質移動に効率的であり得る］
別の例では、本発明者らは、オートファゴソーム強化組成物が「トロゴサイトーシス（ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）」として公知の細胞現象と類似の膜タンパク質移動に効率的であり得ることを示した。トロゴサイトーシスは、レシピエント細胞が原形質膜のフラグメントおよび表面分子をドナー細胞から獲得するプロセスである。本発明者らはまた、ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６細胞株によって発現される膜貫通タンパク質が、これらの細胞株由来のＡＡＥＣを用いてトロゴサイトーシス様プロセスでリンパ球および単球に効率的に移動され得ることも見出した。例えば、ＡＡＥＣ類は、ＭＤＡ−ＣＤ８０、ＵｂＬＴ３−ＣＤ８０、および／またはＨＥＫ２９３細胞から、上記の方法を介して作製され得る。これらのＭＤＡ−ＣＤ８０、ＵｂＬＴ３−ＣＤ８０、またはＨＥＫ２９３由来のＡＡＥＣ（ＣＤ８０または他の表面マーカを発現し得る）が腫瘍細胞またはＰＢＭＣと混合される場合、膜タンパク質移動が生じ得る。図１４Ａ〜図１４Ｉは、膜タンパク質のこの移動を示している（この場合、ＣＤ−８０）。さらに、図１４Ａ、図１４Ｄ、および図１４Ｈは、ＡＡＥＣがＡＡＥＣを含まない処置よりもＣＤ−８０の移動を容易に誘導し得ることを実証している。ＣＤ８０陰性の白血球の原形質膜に対するＣＤ８０の移動は、フローサイトメトリーによって検出された。図１５Ａ〜図１５Ｅは、この移動がＡＡＥＣに特異的であり得、そして単にエキソソームの存在下で有効性が低いことを示している。さらに、図１６Ａ〜図１６Ｊは、ＭＤＡ−ＣＤ８０ＡＡＥＣにおいて発現されたＣＤ８０の大部分が、オートファゴソーム特異的なマーカＬＣ３の発現に相当していることを示す。
【００６２】
図１７Ａは、これらの知見のいくつかをまとめており、ＣＤ−８０がＡＡＥＣからＰＢＭＣＳに移動され得ることを示している。移動は、ＣＤ４＋細胞および単球に最も効果的であるが、ＣＤ８０はまた、コントロールの実験についてよりも有意に有効に、ＣＤ８＋細胞およびＢ細胞に移され得る。さらに、図１７Ｂは、ＡＡＥＣを介した分子移動が、ＭＤＡ−ＣＤ８０腫瘍細胞株に特有ではなく、ＣＤ８０発現に特異的な分子移動でもないことを示す。ＨＥＫ−２９３細胞を、ＣＤ８０またはＣＤ４０Ｌのいずれかを発現するために一過性にトランスフェクトした。次に、得られた遺伝子操作された細胞を用いて、本明細書に記載のようなＡＡＥＣを生成した。図１７に示すとおり、ＨＥＫ−２９３−ＣＤ８０のＡＡＥＣも、およびＨＥＫ−２９３−ＣＤ４０ＬのＡＡＥＣも両方とも、この発現された分子を関連のＰＢＭＣに効率的に移動できた。
【００６３】
このデータによって、ＡＡＥＣは、膜タンパク質の移動に効率的であることが示唆される。これは、アクセプタ細胞で免疫調節分子の発現を可能にするために用いられ得るＡＡＥＣの現象であって、これによって遺伝子療法も全細胞療法も必要なしに、組成物レシピエント中の膜タンパク質発現の誘導が可能になる現象を示し得る。さらに、このデータによって、このトロゴサイトーシス様の現象は、オートファゴソーム強化組成物内に含まれるオートファゴソーム由来のタンパク質に関与することが示され、かつオートファゴソーム強化組成物は、サイトカイン、抗原またはＤＡＭＰの公正な放出を上回る免疫応答を刺激するのに役割を有し得ることが示唆され得る。さらにこのデータによって、細胞は、有効なＡＡＥＣの生成を可能にするように遺伝子操作され得ることが示される。次に、これによって、特定の癌または感染性疾患を標的とする広範な基盤の潜在的なＡＡＥＣが可能になり得る。本明細書の実施例に示されるとおり、ＣＤ８０を含んでいるＡＡＥＣは、ＣＤ８０を専門的および非専門的なＡＰＣの両方に移動し得、さらに抗癌免疫をプライムしてブーストするその能力を増大する。ＣＤ８０に加えて、他の分子、例えば、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、および他の適切な分子は、抗原提示細胞への移行のために遺伝子操作によりＡＡＥＣ中に入れられ得る。
【００６４】
オートファゴソーム強化組成物が標的疾患に向かう免疫応答を誘発し得る多面的な性質によって、これらの組成物が癌よりも広範な疾患の処置に適切なものとなり得る。オートファゴソーム強化組成物は、ウイルス、原生生物または細菌の感染、例えば、ブタ生殖器呼吸器合胞体ウイルス（ＰＲＲＳＶ）およびマラリアの処置において有用であり得る。さらに、これらのオートファゴソーム強化組成物は、ワクチン接種を上回る有用性を有し得る。本発明者らは、オートファゴソーム強化組成物が、他の細胞上のオートファゴソーム中に含まれる膜タンパク質をトロゴサイトーシスし得ることを示唆するデータを記述する。膜タンパク質、例えば、腫瘍細胞または他の細胞上の特定の細胞マーカを、さらに標的特異的細胞に挿入するようにこの特性を開発することが可能であり得る。
【００６５】
追加の細胞株をＡＡＥＣの産生に用いる場合、誘導されたワクチンを、上記のような同様の遺伝子分析およびプロテオーム解析に供してもよい。このような分析は、各々のワクチンロットについてのプロフィールを決定し得、このようなプロフィールを、公知の腫瘍細胞株の対応するプロフィールによって比較して（例えば、ＵｂＬＴ３およびＵｂＬＴ６については図７に示すとおり）どの腫瘍タイプが各々のワクチンロットに応答し得るかを決定してもよい。これらの各種のワクチンロットは、癌細胞株に由来し得、原生動物、ウイルスまたは細菌感染に対する応答においても同様である。
【００６６】
本開示は、特定の実施形態を含むが、多数の変形例が可能であるので、特定の実施形態とは限定の意味にみなされるものではない。本開示の主題は、本明細書に開示される種々の要素、特徴、機能および／または特性の全ての新規なおよび非自明的な組み合わせおよびサブコンビネーションを包含する。以下の特許請求の範囲は、新規および非自明的とみなされる特定の組み合わせおよびサブコンビネーションを具体的に指摘する。これらの特許請求の範囲は、「ある、１つの（ａｎ：不定冠詞）」要素もしくは「ある第一の（ａ  ｆｉｒｓｔ）」要素またはその等価物を指してもよい。このような特許請求の範囲は、このような要素が１つ以上組み込まれている場合を包含するものであり、このような要素が２つ以上存在する場合を必要とすることもなく、排除することもないと理解されるべきである。特徴、機能、要素および／または特性の他の組み合わせおよびサブコンビネーションは、本発明の特許請求の範囲の補正を通じて、または本出願もしくは関連出願中の新しい特許請求の範囲の提示を通じて特許請求され得る。このような特許請求の範囲はまた、もとの特許請求の範囲に対して範囲の点で広範であろうと、狭かろうと、等しかろうと、または異なろうと、やはり本開示の主題内に包含されるとみなされる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ−１６Ｊ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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