(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合粒子を含むイメージング剤であって、
前記複合粒子は、高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子であり、
前記高分子グラフト鎖のグラフト密度が０．１本鎖／ｎｍ2以上であり、
前記高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）が、３０，０００以上であり、
前記高分子グラフト鎖が、前記微粒子表面上の重合開始基を基点としたアクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミド誘導体およびスチレン誘導体からなる群から選択される１以上のリビングラジカル重合によって得られ、
前記高分子グラフト鎖は、前記微粒子により近い第１ブロックと、前記微粒子から遠い第２ブロックからなり、
前記第１ブロックにおける高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）が、１９，０００〜３０，０００であり、
前記第２ブロックにおける高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）が、９９，０００〜１８０，０００であり、
前記微粒子が、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、合金、および酸化鉄からなる群から選択される１以上の微粒子であり、
集積性の差により腎臓の機能を診断するための、腎機能診断用イメージング剤。
【請求項２】
前記高分子グラフト鎖の分子量分布が、１〜１．５である請求項１に記載の腎機能診断用イメージング剤。
【請求項３】
前記高分子グラフト鎖は、前記微粒子により近い第１ブロックと、前記微粒子から遠い第２ブロックからなり、
前記第１ブロックにおける高分子グラフト鎖および前記第２ブロックにおける高分子グラフト鎖の分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が、それぞれ１〜１．５である請求項１または２に記載の腎機能診断用イメージング剤。
【請求項４】
投与方法が、静脈投与である請求項１〜３のいずれかに記載の腎機能診断用イメージング剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の腎機能診断用イメージング剤が投与された腎臓のイメージング図に基づき、前記イメージング剤が投与された腎臓中の前記複合粒子の集積量を算出する手段、および
前記集積量に基づいて、前記腎臓の機能を評価する手段を備えた装置からなる腎機能診断システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合粒子を含む腎機能診断用イメージング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、血液から老廃物等をろ過し、尿を生成後、膀胱に送り出す臓器である。腎臓は、他にも恒常性維持、血圧調節、ホルモン分泌等の機能を有し、生体にとって非常に重要である。そのため、腎臓の機能が低下すると体全体に悪影響を及ぼす。
【０００３】
腎機能が低下する原因としては、免疫系の異常や薬に対するアレルギー、高血圧、糖尿病など（以上、慢性腎不全）や、出血や急激な血圧低下、感染症、熱傷に伴う脱水（以上、急性腎不全）など複数の因子が挙げられ、疾患の種別も原因別に細かく分類される。慢性腎不全を含め最終的に透析治療が必要になる腎機能疾患全般を総称し、慢性腎臓病（ＣＫＤ、ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）と呼ぶ。
【０００４】
腎臓病には、腎臓そのものに何らかの原因があって起こる一次性腎臓病と、糖尿病や高血圧、痛風など他の病気が原因で起きる二次性腎臓病がある。二次性腎臓病の糖尿病性腎症では、高血圧や高血糖値の影響で糸球体に硬化が生じて、糸球体のフィルター機能が低下し、腎機能の障害を起こす。腎機能障害としては、例えば、ネフローゼ症候群、吸収不良症候群、尿毒症が挙げられる。
【０００５】
一般的に、腎機能は、尿または血液を採取し、尿素窒素、クレアチニン、電解質（ナトリウム、カリウム、クロール）、蛋白アルブミン、糸球体濾過量等を指標にして検査する（例えば非特許文献１）。それら検査の多くは、簡便でスクリーニング検査としては有効ではあるものの、様々な要因（例えば、過激な運動、精神的ストレス、発熱など）により変動するため、腎機能を詳細に把握するためには、精密検査が必要となる。
【０００６】
精密検査の１つとして腎臓の画像診断があり、超音波やＣＴ(コンピューター断層撮影)検査は、主に形態学的な診断に適用されている。腎臓の血流評価には、ヨード造影剤を用いた造影ＣＴ検査が実施されている。泌尿器領域の腫瘍の描出には、上記検査に加えて、造影または非造影ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）も有効性が高いとされている。しかしながら、いずれの検査も腎機能の良悪を正確に診断することは困難である。
【０００７】
現在のところ、腎疾患の重症度の最終判定および治療方針決定には、腎生検による病理組織学的診断が不可欠とされている。しかしながら、腎生検は腎組織の一部を採取して顕微鏡で評価するものであり侵襲的検査であるため、出血、感染などの合併症の危険性が常に伴う。また腎生検を受けるためには、専門医と設備の整った施設に入院しなければならず、患者への肉体的・社会的負担は無視できない。
【０００８】
腎生検は主として、１）１日１．０ｇ以上の尿蛋白がみられる場合、２）原因不明の腎障害があるが、画像検査で腎臓が萎縮していない場合、３）血尿が持続し進行する慢性腎炎が疑われる場合、または、４）急速に腎機能が低下している場合に適用される。一方、腎生検の禁忌の場合として、１）慢性的な腎機能障害のため画像検査ですでに腎臓が萎縮している場合、２）出血傾向やコントロール不全な高血圧のため止血困難な場合、３）多発性嚢胞腎の場合、４）腎生検の実施中および検査中および検査後の安静が守れない患者や指示に従えない場合などがある。腎生検を行えない症例は、実際の臨床では非常に多く、問題となっている（例えば非特許文献１）。
【０００９】
多くの体内診断薬において、正常な腎臓と、疾患を有した腎臓を見分けられないことが問題となっている。腫瘍や炎症の診断においては、ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース）を用いた疾患部位のＰＥＴ（陽電子放出断層撮影）検査が実施されている。しかしながら、特異性の低さから、ＦＤＧを用いる腎臓の診断は困難とされている（例えば非特許文献２）。つまり、腎臓を標的とするイメージング剤としては、正常な腎臓と疾患を有した腎臓を分けてターゲティングする機能を有することが求められている。これに対して、例えば腎線維症の診断においては、コラーゲン結合ペプチドを含む放射性医薬品（例えば特許文献１）が報告されているが、この医薬品は限定的な疾患にしか反応しない。その為、この医薬品は、著しく汎用性を欠くことから診断薬としても実用的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第Ｏ２００７／１３８２９１号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】日本腎臓学会誌、第４５巻、７３１−７３８（２００３年）
【非特許文献２】映像情報メディア学会誌、第６５巻、４４０−４４３（２０１１年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、腎臓機能を診断するのに適した新規イメージング剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、複合粒子を含むイメージング剤であって、前記複合粒子は、高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子であり、前記高分子グラフト鎖のグラフト密度が０．１本鎖／ｎｍ2以上であり、前記高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）が、３０，０００以上である腎機能診断用イメージング剤である。
【発明の効果】
【００１４】
リビングラジカル重合により、超高密度で、かつ、分子量の大きいグラフト鎖を結合させた本発明に係る複合粒子は、正常な機能を有する腎臓に集積する。一方で、機能障害のある腎臓には集積しないという驚くべき特徴を持つ。このような複合粒子を含むイメージング剤により、患者負担の大きい腎生検を実施せずに、高精度な腎臓の画像診断が可能となり、先端医療の発展に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１（ａ）】図１（ａ）は、本発明に係るイメージング剤の複合粒子（Ｒｕｎ１）を投与する前、ならびに投与１．２ヶ月後の正常マウス腎臓周囲のＭＲＩ造影画像である。
【図１（ｂ）】図１（ｂ）は、本発明に係るイメージング剤の複合粒子（Ｒｕｎ３）を投与する前、ならびに投与１時間、１日、１週間および１ヶ月後の正常マウス腎臓周囲のＭＲＩ造影画像である。
【図１（ｃ）】図１（ｃ）は、リゾビストを投与する前、ならびに投与１時間、１日、１週間および１ヶ月後の正常マウス腎臓周囲のＭＲＩ造影画像である。
【図２（ａ）】図２（ａ）は、本発明に係るイメージング剤の複合粒子（Ｒｕｎ３）を投与する前、ならびに投与１時間、１日、１週間および１ヶ月後の腎疾患モデルマウス腎臓周囲のＭＲＩ造影画像である。
【図２（ｂ）】図２（ｂ）は、リゾビストを投与する前、ならびに投与１時間、１日、１週間および１ヶ月後の腎疾患モデルマウス腎臓周囲のＭＲＩ造影画像である。
【図３】図３（ａ）〜（ｃ）は、本発明に係るイメージング剤の複合粒子（Ｒｕｎ１〜３）を投与して約１ヶ月後の正常マウス腎臓のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩ造影画像である。図３（ｄ）は、リゾビストを投与して１ヶ月後の正常マウス腎臓のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩ造影画像である。
【図４】図４（ａ）は、本発明に係るイメージング剤の複合粒子(Ｒｕｎ３）を投与して１ヶ月後の腎疾患モデルマウス腎臓のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩ造影画像である。図４（ｂ）は、リゾビストを投与して１ヶ月後の腎疾患モデルマウス腎臓のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩ造影画像である。
【図５】図５（ａ）は、本発明に係るイメージング剤の複合粒子（Ｒｕｎ２）を投与して１ヶ月後の正常マウスの蛍光顕微鏡写真である。図５（ｂ）は、本発明に係るイメージング剤の複合粒子（Ｒｕｎ３）を投与して１ヶ月後の腎疾患モデルマウスの蛍光顕微鏡写真である。円形から卵円形の白色はＤＡＰＩに染まった細胞核を表している。
【図６】図６は、本発明に係るイメージング剤の複合粒子（Ｒｕｎ３）を投与したマウスの血中残存率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
グラフト鎖間で立体反発が生じるまでに超高密度で所定の分子量の高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子が、血液循環系を介して、正常な腎臓組織に集積を示すという特徴は知られていた（２０１３年日本磁気共鳴医学会大会）。しかしながら、本発明者らは、この複合粒子が、機能障害のある腎臓には集積しないという驚くべき特徴を見出した。この知見に基づき、本発明者らは、前記課題を解決するイメージング剤を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明は、前記のとおり、複合粒子を含む腎機能診断用イメージング剤であって、前記複合粒子は、高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子であり、前記高分子グラフト鎖のグラフト密度が０．１本鎖／ｎｍ2以上であり、前記高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）が、３０，０００以上である。
【００１８】
具体的には、被験動物に本発明のイメージング剤を投与したときに、イメージング装置で撮影した腎臓の画像上に特定シグナルやコントラスト変化が確認できる場合、腎機能は正常と判断される。また、前記腎臓画像上に特定シグナルやコントラスト変化が確認できない場合、腎機能は異常と判断される。これらの知見に基づき、被検動物に本発明のイメージング剤を投与して、イメージング装置を用いて腎臓の画像を確認することにより、腎機能を診断することが可能になった。
【００１９】
また、本発明は、本発明の腎機能診断用イメージング剤が投与された腎臓のイメージング図に基づき、前記イメージング剤が投与された腎臓中の前記複合粒子の集積量を算出する手段、および前記集積量に基づいて、前記腎臓の機能を評価する手段を備えた装置からなる腎機能診断システムである。このシステムは、前記のように、本発明のイメージング剤の複合粒子が、正常な腎臓組織に集積を示すという特徴を示し、一方で、機能障害のある腎臓には集積しないという知見に基づく。
【００２０】
本発明において、「イメージング」とは、生体内の形態や機能や代謝を様々な方法で画像化することを意味し、「イメージング剤」とは、それらを画像化するために用いられる薬剤または因子をいい、「体内診断薬」、「造影剤」、「プローブ」ともいわれる。イメージング剤は、ＣＴやＭＲＩ、光イメージングなどの生態画像化装置とともに利用されることが多く、一方で蛍光検出機器を用いて直接目視で確認することもできる。イメージング剤は、例えば、生体内の腫瘍組織、炎症組織などを画像化するために用いられるものが挙げられる。
【００２１】
本発明において、「ＭＲＩ造影剤」とは、臨床現場で利用されているＭＲＩ装置を利用した、体内画像診断法において投与される物質（薬剤）である。ＭＲＩ測定対象中に当該物質が存在する場合、存在しなかった場合に比べて、測定画像上における測定対象の写り方が大きく変化したように見えるため、画像にコントラストをつけることが可能である。
【００２２】
本発明において、「光イメージングプローブ」とは、発光イメージングや近赤外蛍光イメージング装置などを利用した、体内画像診断法において投与される物質（薬剤）で、強い蛍光を発したり、蛍光の色調を変化させたりすることが可能である。
【００２３】
本発明において、「腎機能」または「腎臓機能」とは、腎臓が体の老廃物を排泄する能力を意味する。簡易的には、尿検査による尿中タンパク質量、血液検査によるＢＵＮ（尿素窒素）およびクレアチニン値によって数値的に確認できる。詳細には、「腎機能」または「腎臓機能」は、血中クレアチニン値等を用いて単位時間当たりに腎臓のすべての糸球体により濾過される血漿量である糸球体濾過量（ＧＦＲ）や、血中および尿中クレアチニンを用いて算出するクレアチニンクリアランスによって数値的に確認できる。
【００２４】
本発明において、「高分子グラフト鎖」とは、微粒子表面から重合反応によってモノマーを２個以上伸長して形成されたポリマー鎖を意味する。また、「超高密度」とは、グラフト鎖間で立体反発が生じる程度までグラフト鎖が密集した場合のグラフト鎖の密度を意味し、この場合、グラフト鎖は、表面に垂直な方向にほぼ伸びきった形態をとる。また、「結合」とは、一般的な化学反応により形成される結合を意味し、例えば、共有結合、イオン結合等が挙げられる。
【００２５】
本発明のイメージング剤において、前記高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）は、３０，０００以上であり、３０，０００〜３２０，０００であるのが好ましく、１１８，０００〜２００，０００であるのがより好ましい。
【００２６】
本発明のイメージング剤がＭＲＩ造影剤の場合、前記微粒子は、超常磁性を示す無機微粒子が用いられる。このような無機微粒子としては、例えば、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、合金（例えば、ＦｅＰｔ、ＦｅＣｏ）、酸化鉄（例えばフェライト、マグネタイト）等が挙げられる。前記フェライトは、市販のＭＲＩ造影剤用鉄製剤において実績があり、好ましい。「フェライト」は酸化鉄を主成分とするセラミックスの総称であり、磁性材料として広く使用される。無機微粒子として、より好ましくは、スピネル型の結晶構造を有するフェライトであり、さらにより好ましくは、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）である。なお、ＳＰＩＯ（超常磁性酸化鉄）や、ＵＳＰＩＯ（Ｕｌｔｒａ−Ｓｍａｌｌ  ＳＰＩＯ）、ＭＩＯＮ（単結晶型酸化鉄ナノ粒子）と呼ばれるものは、これらに含まれる。
【００２７】
「超常磁性」とは、磁性無機ナノ微粒子で起こる現象であり、外部から磁場をかけられた際に、全体として磁化を持つようになることを意味する。超常磁性体は、強磁性体が単一の磁区しか持たない大きさまでに微細化されたナノ粒子が示す特性であり、磁場を取り除いても磁化（磁気記憶）が残る強磁性体と異なり、超常磁性体は、磁場を取り除かれると磁化を失う。したがって、超常磁性を示す前記無機微粒子の粒径は、５０ｎｍ以下であることが好ましい。この粒径は、例えば、透過型電子顕微鏡法により測定することができる。本発明の複合粒子が超常磁性を示すかどうかは、例えば、ＳＱＵＩＤ（Superconducting Quantum Interference Device、超電導量子干渉素子）磁束計装置によって確認することができる(Macromolecules, 42(4), p1219-1228, 2009)。
【００２８】
超常磁性を示す無機微粒子は、ＭＲＩ測定において、画像を作り出すために使用されるＭＲ信号を出す原子核（臨床ＭＲＩでは概して水のプロトン）の緩和時間（Ｔ1、Ｔ２共に）に影響を与える。該無機微粒子を含む鉄製剤は、主にＴ2を短くする効果（厳密には、局所磁場の不均一性誘発によるＴ2＊の短縮）によって、Ｔ2強調画像においてコントラストを強調する。
【００２９】
本発明のイメージング剤が光イメージングプローブの場合、前記微粒子は、前述した超常磁性を示す無機微粒子でも良く、超常磁性を持たない無機微粒子でも良く、また有機微粒子でも良い。本発明のイメージング剤が蛍光検出器用イメージングプローブの場合、前記複合粒子の微粒子に有機発色色素または発蛍光色素が封入または結合しているのが好ましい。「封入」とは、前記色素が微粒子内に保持された状態を意味する。別の形態としては、前記高分子グラフト鎖に有機発色色素または発蛍光色素が結合していることが好ましく、例えば、高分子グラフト鎖を重合する際に、全部または一部に当該色素を含むモノマーを利用することが好ましい。前記モノマーとしては、例えば、ローダミンメタクリレート、アミノニトロベンゾオキサジアゾールメタクリレート、フルオレセインイソチオシアネートメタクリレート等が挙げられる。
【００３０】
超常磁性を示さない無機微粒子としては、、例えばシリカ等のケイ素酸化物；金属；金属酸化物；金属硫化物等が挙げられ、ケイ素酸化物；金属；金属酸化物が好ましい。前記金属としては、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｄ等の貴金属；Ｔｉ、Ｚｒ、Ｔａ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｖ、Ｓｂ、Ｉｎ、Ｈｆ、Ｙ、Ｃｅ、Ｓｃ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｎｉ等の遷移金属等が挙げられる。有機微粒子としては、例えば、ポリスチレンなどの合成高分子、アガロースなどの多糖類などが挙げられる。これらの微粒子は、多層構造になっていても良い。
【００３１】
好ましい有機発色色素および発蛍光色素には、広範な非局在化電子系を有する群、例えばシアニン類、メロシアニン類、インドシアニン類、フタロシアニン類、ナフタロシアニン類、トリフェニルメチン類、ポルフィリン類、ピリリウム染料、チアピリリウム染料、スクアリリウム染料、クロコニウム染料、アズレニウム染料、インドアニリン類、ベンゾフェノキサジニウム染料、ベンゾチアフェノチアジニウム染料、アントラキノン類、ナフトキノン類、インダスレン類、フタロイルアクリドン類、トリスフェノキノン類、アゾ染料、分子内及び分子間電荷移動染料及び染料錯体、トロポン類、テトラジン類、ビス（ジチオレン）錯体、ビス（ベンゼン−ジチオレート）錯体、インドアニリン染料、ビス（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）錯体が挙げられる。好ましい有機発色色素および発蛍光色素としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び異なる吸収／発光特性を有するＧＦＰの変種のような蛍光タンパク質も有用である。
【００３２】
特定の状況においては、好ましい有機発色色素および発蛍光色素として、ある種の希土類金属（例えば、ユウロピウム、サマリウム、テルビウム又はジスプロシウム）の錯体が使用され得、蛍光ナノ結晶（量子ドット）についても同様である。前記希土類金属（例えば、ユウロピウム、サマリウム、テルビウム又はジスプロシウム）の錯体の具体例としては、フルオレセイン、ローダミン（スルホローダミン１０１（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１９）、インドシアニングリーン、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、テトラメチルローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０が挙げられる。
【００３３】
本イメージング剤の微粒子の大きさは、１０００ｎｍ以下が好ましく、５００ｎｍ以下がより好ましく、１００ｎｍ以下がさらにより好ましく、５０ｎｍ以下がさらにより好ましい。前記微粒子が超常磁性を有する場合は、５０ｎｍ以下が好ましく、２５ｎｍ以下がさらにより好ましい。
【００３４】
本発明のイメージング剤において、前記高分子グラフト鎖のグラフト密度は、０．１本鎖／ｎｍ2以上であり、０．１〜１．２本鎖／ｎｍ2であるのが好ましい。本発明において、「グラフト密度」または「密度」とは、微粒子表面の単位面積（ｎｍ2）あたりの表面に結合したグラフト鎖の本数を意味する。グラフト密度（s）は、元素分析により微粒子表面から伸長して形成された高分子グラフト鎖の量（グラフト量、ｗ）を求め、その値とコア微粒子の表面積（Ｓ、ｎｍ2）、グラフトポリマーの数平均分子量Ｍｎならびにアボガドロ数（Ａｖ）を用いて以下のようにして算出される。
算出方法：s＝（ｗ／Ｍｎ）Ａｖ／Ｓ
【００３５】
本発明のイメージング剤において、前記高分子グラフト鎖は、例えば微粒子表面上の重合開始基を基点としたモノマーのリビングラジカル重合によって得ることができる。上記モノマーの種類としては、アクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミド誘導体およびスチレン誘導体からなる群から選択される１以上が好ましいが、これらに限定されず、当業者の認識する範囲で適宜選択されてもよい。前記アクリル酸誘導体としては、ポリエチレングリコールアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート等が挙げられる。前記メタクリル酸誘導体としては、ポリエチレングリコールメタクリレート(ＰＥＧＭＡ）、(４ーヒドロキシフェニル)エチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート等が挙げられる。前記アクリルアミド誘導体としては、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、イソプロピルアクリルアミド等が挙げられる。前記メタクリルアミド誘導体としては、メタアクリルアミド、ジメチルメタクリルアミド、イソプロピルメタアクリルアミド等が挙げられる。前記スチレン誘導体としては、ポリエチレングリコールスチレン、スチレンスルホン酸等が挙げられる。
【００３６】
この高分子グラフト鎖は、別の高分子グラフト鎖と結合していてもよい。具体的にはリビングラジカル重合において、モノマーの１種として架橋性モノマーを用いてブロック共重合体をグラフトし、導入した架橋性基を反応させてもよい。前記架橋性モノマーとしては、例えば、ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、オキセタンメタクリレート、グリシジルメタクリレート等が挙げられる。前記ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を架橋性モノマーとして用いた場合、ヘキサメチレンジアミン、エチレンジアミン等を用いて架橋することができる。
【００３７】
また、この高分子グラフト鎖は、２段階以上の重合により製造されていてもよい。具体的には、ある種類のモノマー（混合物を含む）を用いてリビングラジカル重合を行い、次いで、別の種類のモノマー（混合物を含む）を用いてリビングラジカル重合を行うことにより、２段階の重合により高分子グラフト鎖を得ることができる。このような多段階の重合により得られた高分子グラフト鎖を有する複合粒子は、正常な機能を有する腎臓には集積するものの、機能障害のある腎臓には集積しないという特徴を種々設計する際に有用である。
【００３８】
またリビングラジカル重合は、ランダム重合、ブロック重合、組成傾斜型等であってもよい。高分子グラフト鎖は、その末端および末端近傍に特異的なリガンドを導入されていてもよい。そのようなリガンドを有する複合粒子を含むイメージング剤は、選択的にリガンドを標的臓器へ届けることができるので好ましい。特異的なリガンドとしては、当該分野で知られる特異的なリガンドであれば特に限定されない。
【００３９】
本発明のイメージング剤において、前記高分子グラフト鎖の分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１〜１．５であるのが好ましい。分子量分布が１〜１．５の範囲である場合、イメージング造影剤は均質なグラフト表面を有するからである。高分子グラフト鎖が、２段階以上の重合により製造されている場合、前記高分子グラフト鎖の分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、それぞれの段階の重合により得られた高分子部分の分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１〜１．５であるのが好ましい。分子量分布が１〜１．５の範囲である場合、イメージング造影剤は均質なグラフト表面を有するからである。
【００４０】
本発明のイメージング剤において、複合粒子は、例えば以下のようにして製造することができる。まず、重合開始基含有カップリング剤としての化合物を、化学吸着法により微粒子表面に固定する。そして、１種類以上のモノマーを供給してリビングラジカル・グラフト重合を行う。重合開始基含有カップリング剤を予め微粒子表面に固定することにより、微粒子表面上でグラフト密度を一定に保持しつつグラフト重合を進行させることができる。つまり、グラフト量はグラフト鎖のＭｎ（数平均分子量）に比例して増大させることができ、重合をリビング的に進行させ、微粒子表面上のほぼすべてのグラフト鎖をほぼ均等に成長させることができる。すなわち、本発明の複合粒子においては、微粒子表面上の隣接グラフト鎖間の立体障害が軽減されているのである。なお、リビングラジカル・グラフト重合の間、微粒子の表面に固定していない重合開始剤を共存させてもよい。
【００４１】
重合開始基含有カップリング剤としての化合物は、微粒子との親和性等を考慮して選択することができる。具体的には、その重合開始基含有カップリング剤としては、下式（Ｉ）に示すシラン化合物が好ましい。
【００４２】
【化１】
0006372800.tif 000002
【００４３】
前記式中、ｎは整数であり、３〜１０が好ましく、４〜８がより好ましい。Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基であり、Ｃ1またはＣ3アルキル基が好ましい。Ｒ2は、Ｃ1またはＣ2アルキル基である。Ｘはハロゲン原子であり、臭素または塩素原子が好ましい。式（Ｉ）で表わされる化合物としては、（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシプロピルトリエトキシシラン（ＢＰＥ）、（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシヘキシルトリエトキシシラン（ＢＨＥ）等が挙げられる。
【００４４】
微粒子が酸化鉄である場合、その重合開始基を含有しないカップリング剤としては、アルキルシランカップリング剤等が挙げられる。
【００４５】
微粒子表面のグラフト密度は、重合開始基含有カップリング剤と重合開始基を含有しないカップリング剤との割合を調整することで、変更することができる。具体的には、微粒子が酸化鉄ナノ粒子である場合、重合開始基含有カップリング剤と重合開始基を含有しないカップリング剤との割合が１：０であれば、グラフト密度は０．１本鎖／ｎｍ2以上である。
【００４６】
重合終了後、目的とする複合粒子は、反応液から当該分野で通常用いられる方法、例えば抽出、蒸留、洗浄、濃縮、沈殿、ろ過、乾燥、吸着、析出、クロマトグラフィーなどの方法を単独または組み合わせることにより、単離することができる。
【００４７】
本発明のイメージング剤は、正常な腎臓に集積し、障害のある腎臓には集積しないため、その集積性が正常腎臓と疾患腎臓の間で差を有することを特徴とする。腎臓の疾患としては例えば、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症、膜性腎症、水腎症、造影剤腎症、腎盂腎炎、腎不全、急性腎炎、慢性腎炎、間質性腎炎、腎障害、ネフローゼ症候群、吸収不良症候群、尿毒症、高血圧性腎硬化症、糖尿病性糸球体硬化症、腎結石、アミロイド腎、腎静脈血栓症、Ａｌｐｏｒｔ症候群、又は腎腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明のイメージング剤は、経口および非経口のいずれの方式でも投与可能である。すなわち、本発明は、投与方法が経口または非経口投与であるイメージング剤である。経口投与の場合、本発明のイメージング剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤またはシロップ剤等の形態で投与できる。非経口投与の場合、本発明のイメージング剤は、例えば、注射剤、座剤、点眼剤、経肺剤、経鼻投与剤、軟膏、クリーム剤等の形態で投与できる。注射剤の場合、例えば、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与等により、投与される。すなわち、本発明は、投与方法が、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与、好ましくは静脈投与であるイメージング剤である。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、希釈剤などの医薬上許容される添加剤を用いて従来周知の方法により製造することができる。
【００４９】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例により限定されない。
【００５０】
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＢＰＥ：（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシプロピルトリエトキシシラン
ＢＰＰ：１−（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシ−２−プロペン
ＰＥＧＭＡ：ポリエチレングリコールメタクリレート
ＰＥＭＡ：（４−ヒドロキシフェニル）エチルメタクリレート
ｄＮ−ｂｉｂｙ：Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ、ジノニルビピリジン
ＥＢＩＢ：エチル２−ブロモイソブチレート
ＭＥＯＮＰ：ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート
ＲＨＯＭＡ：ローダミンメタクリレート
ＮＢＤＭＡ：アミノニトロベンゾオキサジアゾールメタクリレート
ＧＰＣ：ゲル濾過クロマトグラフィー
ＴＧＡ：熱重量分析
ＭＲＩ：磁気共鳴イメージング
ＣＫＤ：慢性腎臓病
ＣＴ：コンピューター断層撮影
ＦＤＧ：フルオロデオキシグルコース
ＰＥＴ：陽電子放出断層撮影
ＳＰＥＣＴ：単一光子放射断層撮影
ＢＵＮ：尿素窒素
ＧＦＲ：糸球体濾過量
ＳＰＩＯ：超常磁性酸化鉄
ＵＳＰＩＯ：極小超常磁性酸化鉄
ＭＩＯＮ：単結晶型酸化鉄ナノ粒子
ＳＱＵＩＤ：超電導量子干渉素子
【実施例１】
【００５１】
＜複合粒子（微粒子が酸化鉄ナノ粒子）の製造例＞
（１）重合開始基含有カップリング剤（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシプロピルトリエトキシシラン（ＢＰＥ）の合成
【００５２】
【化２】
0006372800.tif 000003
【００５３】
ＢＰＥの合成は、２段階反応により行った。第１段階として、アリルアルコール（１７０ｇ）、トリエチルアミン（２３７ｇ）およびジクロロメタン（２Ｌ）の混合溶液を氷冷し、その中へ２−ブロモイソブチリルブロマイド（４５０ｇ）を滴下した。その後、反応液を０℃で３時間攪拌し、さらに室温で１０時間攪拌した。反応液を濃縮し、ＴＨＦを加え、塩を析出させ、濾過し、濾液を濃縮した後、得られたものをクロロホルム（１Ｌ）により希釈し、それを１Ｎ塩酸水溶液（２×１Ｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２×１Ｌ）、純水（２×１Ｌ）の順で洗浄した。有機相を乾燥し、濃縮後、減圧蒸留により精製し、１−（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシ−２−プロペン（ＢＰＰ）を収率９０％で得た。
第２段階として、フラスコの中へＢＰＰ（１００ｇ）、トリエトキシシラン（１７０ｇ）およびカルステッド触媒（６００μＬ）を順次入れ、その混合液をアルゴン雰囲気下、室温で１２時間攪拌した。反応後減圧蒸留により精製し、ＢＰＥを収率７０％で合成した。
【００５４】
（２）オレイン酸被覆酸化鉄ナノ粒子の合成
Hyeonらの報告（Nature Materials, Vol.3, p891-895, 2004）に従い、オレイン酸被覆酸化鉄ナノ粒子を合成した。先ず、オレイン酸鉄錯体を合成した。塩化鉄（ＦｅＣｌ3６Ｈ2Ｏ、１０．８ｇ）とオレイン酸ナトリウム（３６．５ｇ）を、エタノール（８０ｍＬ）、水（６０ｍＬ）およびヘキサン（１４０ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、その溶液を７０℃で４時間攪拌した。反応終了後、上層の有機層を回収し、前記有機層を純水で３回洗浄した。その後、前記有機層をロータリーエバポレータで減圧濃縮し、溶媒を除去した。得られた残渣を７０℃で１晩、真空乾燥してオレイン酸鉄錯体を得た。このオレイン酸鉄錯体（３６ｇ）とオレイン酸（５．７ｇ）をトリオクチルアミン（２００ｇ）に溶かし、その溶液を、５℃／ｍｉｎの昇温速度で３７０℃まで加熱した。３７０℃に達した後、さらに、同温度で３０分間、還流下で加熱を続けた。その後、反応溶液を室温まで冷却し、ＴＨＦで希釈した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ）でオレイン酸被覆酸化鉄ナノ粒子を回収した。透過型電子顕微鏡法により前記酸化鉄ナノ粒子の投影面積円相当径（平均粒径）を測定したところ、２０ｎｍであった。この酸化鉄は、Ｘ線回折法により、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）であることを確認した。
【００５５】
（３）オレイン酸被覆酸化鉄ナノ粒子表面への開始基の導入
（２）で得た前記酸化鉄ナノ粒子をＴＨＦに分散させ、分散液（１ｗｔ％）を作成した。前記分散液へアンモニア水（１ｗｔ％）を加え、しばらく攪拌した後、（１）で得たＢＰＥ（２ｗｔ％）を加え、３日間、室温で攪拌した。この溶液を攪拌中、定期的に、超音波照射した。その後、粒子を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ）で回収し、ＴＨＦによる再分散、遠心分離をくりかえすことにより、開始基を有する酸化鉄ナノ粒子を得た。
【００５６】
（４）酸化鉄ナノ粒子を用いた表面開始リビングラジカル重合
【００５７】
【化３】
0006372800.tif 000004
【００５８】
（ｉ）Ｒｕｎ１の合成
（３）で得た開始基を有する酸化鉄ナノ粒子(０．３ｇ)、ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ）(９．８５ｇ)、ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）（２．１５ｇ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（１６ｍｇ）、ジノニルビピリジン（ｄＮ−ｂｉｂｙ）（９４ｍｇ）およびエチル２−ブロモイソブチレート（ＥＢＩＢ）（２．２ｍｇ）、ＴＨＦ（１７．５８ｇ）をパイレックス製ガラス管に入れ凍結融解法により脱気し真空下で封管した後、６０℃で１５時間重合して、高分子グラフト鎖（第１ブロック）が酸化鉄ナノ粒子表面に結合した複合粒子を得た。得られた第１ブロックのフリーポリマーの分子量（Ｍｎ）および分子量分布指数（Ｍｗ／Ｍｎ）は、それぞれ３０，０００および１．２７であった。複合粒子（微粒子が酸化鉄ナノ粒子）の精製は、遠心分離によりアセトン、ＴＨＦへの再分散を繰り返すことにより行った。
【００５９】
さらに、得られた複合粒子（２００ｍｇ）、ＰＥＧＭＡ(１５ｇ)、（４−ヒドロキシフェニル）エチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）（３３ｍｇ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ（３１ｍｇ）、ｄＮ−ｂｉｂｙ（２５９ｍｇ）およびＥＢＩＢ（０．６ｍｇ）、ＴＨＦ(１４．５１ｇ)をパイレックス製ガラス管に入れ凍結融解法により脱気し真空下で封管した後、６０℃で１５時間重合して、高分子グラフト鎖（第１ブロックおよび第２ブロックの結合体）が酸化鉄ナノ粒子表面に結合した複合粒子を得た。得られた第２ブロックのフリーポリマーのＭｎおよびＭｗ／Ｍｎは、それぞれ１２０，０００および１．１７であった。複合粒子（微粒子が酸化鉄ナノ粒子）の精製は、遠心分離によりＴＨＦへの再分散を繰り返すことにより行った。
【００６０】
ＭＥＯＮＰ由来の活性エステル基を用いてポリマー鎖を架橋するために、複合粒子（３００ｍｇ）、ヘキサメチレンジアミン（２．６ｍｇ）、トリエチルアミン（１ｍｇ）、ＴＨＦ（６０ｍL）を混合し２４時間室温にて撹拌した。架橋した粒子の精製は、遠心分離によりＴＨＦ、アセトン、水への再分散を繰り返すことにより行った。
【００６１】
最終的に得られたＲｕｎ１の複合粒子の高分子グラフト鎖は、数平均分子量（Ｍｎ）が１５０，０００であった。複合粒子は、純水に分散させ室温保存した。高分子グラフト鎖の分子量及び分子量分布は、複合粒子をフッ化水素で処理することにより、高分子グラフト鎖を酸化鉄ナノ粒子から切り出し、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により求めた。熱重量分析（ＴＧＡ）により求めたグラフト量から、グラフト密度を算出した結果、０．１２５鎖／ｎｍ2であった。
【００６２】
（ｉｉ）Ｒｕｎ２の合成
（３）で得た開始基を有する酸化鉄ナノ粒子(０．２ｇ)、ＰＥＧＭＡ(６．７８ｇ)、ＭＥＯＮＰ（１．２２ｇ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（１１ｍｇ）、ｄＮ−ｂｉｂｙ（６５ｍｇ）およびＥＢＩＢ（１．５ｍｇ）、ＴＨＦ(１１．７ｇ)をパイレックス製ガラス管に入れ凍結融解法により脱気し真空下で封管した後、６０℃で１５時間重合して、高分子グラフト鎖（第１ブロック）が酸化鉄ナノ粒子表面に結合した複合粒子を得た。得られた第１ブロックのフリーポリマーのＭｎおよびＭｗ／Ｍｎは、それぞれ２０，０００および１．１１であった。複合粒子（微粒子が酸化鉄ナノ粒子）の精製は、遠心分離によりアセトン、ＴＨＦへの再分散を繰り返すことにより行った。
【００６３】
さらに、得られた複合粒子（２００ｍｇ）、ＰＥＧＭＡ(９．９６ｇ)、ＰＥＭＡ（２２ｍｇ）、ローダミンメタクリレート（ＲＨＯＭＡ）（１３ｍｇ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（３０ｍｇ）、ｄＮ−ｂｉｂｙ（１７２ｍｇ）およびＥＢＩＢ（０．４ｍｇ）、ＴＨＦ(８．６ｇ)、ジメチルスルホキシド（１ｇ）をパイレックス製ガラス管に入れ凍結融解法により脱気し真空下で封管した後、６０℃で１５時間重合して、高分子グラフト鎖（第１ブロックおよび第２ブロックの結合体）が酸化鉄ナノ粒子表面に結合した複合粒子を得た。得られた第２ブロックのフリーポリマーのＭｎおよびＭｗ／Ｍｎは、それぞれ１８０，０００および１．４０であった。複合粒子（微粒子が酸化鉄ナノ粒子）の精製は、遠心分離によりＴＨＦへの再分散を繰り返すことにより行った。
【００６４】
ポリマー鎖の架橋および高分子グラフト鎖の分子量及び分子量分布の算出は、Ｒｕｎ１と同様の方法で行った。
【００６５】
最終的に得られたＲｕｎ２の複合粒子の高分子グラフト鎖は、数平均分子量（Ｍｎ）が２００，０００であった。ＴＧＡにより求めたグラフト量から、グラフト密度を算出した結果、０．１５２鎖／ｎｍ2であった。
【００６６】
（ｉｉｉ）Ｒｕｎ３の合成
３）で得た開始基を有する酸化鉄ナノ粒子(０．５ｇ)、ＰＥＧＭＡ(１７ｇ)、ＭＥＯＮＰ（３ｇ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（２８ｍｇ）、ｄＮ−ｂｉｂｙ（１６２ｍｇ）およびＥＢＩＢ（３．９ｍｇ）、ＴＨＦ(２９．２ｇ)をパイレックス製ガラス管に入れ凍結融解法により脱気し真空下で封管した後、６０℃で１５時間重合して、高分子グラフト鎖（第１ブロック）が酸化鉄ナノ粒子表面に結合した複合粒子を得た。得られた第１ブロックのフリーポリマーのＭｎおよびＭｗ／Ｍｎは、それぞれ１９，０００および１．１５であった。複合粒子（微粒子が酸化鉄ナノ粒子）の精製は、遠心分離によりアセトン、ＴＨＦへの再分散を繰り返すことにより行った。
【００６７】
さらに、得られた複合粒子（８０ｍｇ）、ＰＥＧＭＡ（４．７７ｇ）、ＰＥＭＡ（１０ｍｇ）、アミノニトロベンゾオキサジアゾールメタクリレート（ＮＢＤＭＡ）（１６ｍｇ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（１４ｍｇ）、ｄＮ−ｂｉｂｙ（８３ｍｇ）およびＥＢＩＢ（０．２ｍｇ）、ＴＨＦ（１１ｇ）をパイレックス製ガラス管に入れ凍結融解法により脱気し真空下で封管した後、６０℃で１０時間重合して、高分子グラフト鎖（第１ブロックおよび第２ブロックの結合体）が酸化鉄ナノ粒子表面に結合した複合粒子を得た。得られた第２ブロックのフリーポリマーのＭｎおよびＭｗ／Ｍｎは、それぞれ９９，０００および１．３４であった。複合粒子（微粒子が酸化鉄ナノ粒子）の精製は、遠心分離によりＴＨＦへの再分散を繰り返すことにより行った。
【００６８】
ポリマー鎖の架橋および高分子グラフト鎖の分子量及び分子量分布の算出は、Ｒｕｎ１および２と同様の方法で行った。
【００６９】
最終的に得られたＲｕｎ３の複合粒子の高分子グラフト鎖は、数平均分子量（Ｍｎ）が１１８，０００であった。ＴＧＡにより求めたグラフト量から、グラフト密度を算出した結果、０．１３２鎖／ｎｍ2であった。
Ｒｕｎ１〜３で得られた複合粒子の高分子グラフト鎖の物性を、以下の表１にまとめる。
【００７０】
【表１】
0006372800.tif 000005
【実施例２】
【００７１】
＜イメージング剤のＭＲＩ装置による評価＞
実施例Ｒｕｎ１〜３の複合粒子を含むイメージング剤を用いてＭＲＩ実験を行った。比較対照として、既存酸化鉄型ＭＲＩ造影剤であるリゾビスト（富士フイルムＲＩファーマ株式会社）を用いた。動物は、正常マウス（８週齢、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス）および腎疾患モデルマウス（８週齢、ＨＩＧＡ雄マウス、ＩｇＡ腎症モデル）をそれぞれ用いた。
【００７２】
麻酔下のマウスをＭＲＩ装置（１１．７Ｔ超高磁場ＭＲＩ 装置 (Ｂｒｕｋｅｒ、ＡＶＡＮＣＥ ＩＩ ５００ＷＢ））にセットし、腹部領域の投与前（プレ）ＭＲＩ撮影を行った後、前記イメージング剤またはリゾビストの生理食塩水による分散液（２００μｍｏｌ  Ｆｅ／ｋｇ）を尾よりそれぞれ静脈投与した。ＭＲＩ撮影は、投与前、投与１時間、１日、１週間、１または１．２ヶ月後にそれぞれ行った。撮像条件は、２Ｄ−ＦＬＡＳＨ（ＴＲ/ＴＥ＝４００ｍｓ/３ｍｓまたは２００ｍｓ／１．７ｍｓ、ＦＡ＝３０ ｄｅｇｒｅｅ、 ＦＯＶ＝２５．６ｍｍ、ｍａｔｒｉｘ＝２５６ｘ２５６、ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ＝０．５ｍｍ、ＮＳ＝８または４）で行った。投与１または１．２ヶ月後のＭＲＩ撮影後、各マウスは４％パラホルムアルデヒドで灌流固定し、腎臓摘出後、ｅｘ ｖｉｖｏ で高精細画像をＭＲＩ撮影した（ＴＲ/ＴＥ＝５００ｍｓ/６ｍｓ、ＦＡ＝３０ ｄｅｇｒｅｅ、ＦＯＶ＝１０ｍｍ、ｍａｔｒｉｘ＝５１２ｘ５１２、ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ＝０．１２ｍｍ、ＮＳ＝１２８）。
【００７３】
正常マウスに本発明のイメージング剤（Ｒｕｎ１および３の複合粒子を含む）を投与した場合のＭＲＩ画像を図１（ａおよびｂ）に、正常マウスに比較対照であるリゾビストを投与した場合のＭＲＩ画像を図１（ｃ）に示す。図１（ｃ）に示すように、正常マウスに比較対照であるリゾビストを投与した場合、投与前に白色画像として撮影された腎臓（円内）が、投与１時間後に全体が暗くなり、１日後以降は投与前の腎臓の色調に戻った。一方で、図１（ａ）および（ｂ）に示すように、本発明のイメージング剤（Ｒｕｎ１および３の複合粒子を含む）を投与した正常マウスでは、投与前に白色画像として撮影された腎臓が、投与１時間後から若干暗くなり、１日後には腎髄質領域が明らかに暗くなり、その陰影は投与１ヶ月後まで継続された。これらの結果から、本発明のイメージング剤における複合粒子は、正常マウスの腎臓へ集積することにより、Ｔ２短縮効果を発揮し、信号強度を長期間低下させることが示された。
【００７４】
腎疾患モデルマウスに本発明のイメージング剤（Ｒｕｎ３の複合粒子を含む）を投与した場合のＭＲＩ画像を図２（ａ）に、腎疾患モデルマウスに比較対照であるリゾビストを投与した場合のＭＲＩ画像を図２（ｂ）に示す。図２（ｂ）に示すように、腎疾患モデルマウスでは、リゾビストを投与した場合、投与前に白色画像として撮影された腎臓（円内）が、投与１時間後に全体が暗くなり、１日後以降は投与前の腎臓の色調に戻る傾向が認められた。この変化は正常マウスの変化と同様であった。一方で、図２（ａ）に示すように、本発明のイメージング剤（Ｒｕｎ３の複合粒子を含む）を投与した腎疾患モデルマウスでは、投与前に白色画像として撮影された腎臓は、投与１時間から１ヶ月が経過しても腎臓への集積は認められなかった。これらの結果から、比較対照であるリゾビストとは異なり、本発明のイメージング剤における複合粒子は腎疾患を有する腎臓には集積せず、正常な腎臓にだけ集積するため、コントラストを強調させる腎機能診断用ＭＲＩ造影剤として実用的に機能することが確認できた。
【００７５】
正常マウスに本発明のイメージング剤（Ｒｕｎ１〜３の複合粒子を含む）を投与して約１ヶ月後の高精細ＭＲＩ画像（ｅｘ vivoＭＲＩ撮影）を図３（ａ〜ｃ）に、正常マウスに比較対照であるリゾビストを投与して１ヶ月後の高精細ＭＲＩ画像（ｅｘ vivoＭＲＩ撮影）を図３（ｄ）に示す。
【００７６】
腎疾患モデルマウスに本発明のイメージング剤（Ｒｕｎ３の複合粒子を含む）を投与して１ヶ月後の高精細ＭＲＩ画像（ｅｘ vivoＭＲＩ撮影）を図４（ａ）に、腎疾患モデルマウスに比較対照であるリゾビストを投与して１ヶ月後の高精細ＭＲＩ画像（ｅｘ vivoＭＲＩ撮影）を図４（ｂ）に示す。
【００７７】
本発明のイメージング剤またはリゾビストを投与して１ヶ月後の腎臓の高精細画像（ｅｘ vivoＭＲＩ撮影）を比較すると、比較対照であるリゾビストは、いずれのマウスにおいても腎皮質領域に陰影像が確認された（図３（ｄ）および図４（ｂ）参照）。一方、本発明のイメージング剤では、正常マウスにおいては、腎皮質領域だけでなく、髄質の外層領域にも陰影像が確認されたものの、腎疾患マウスの腎臓には陰影像が認められなかった（図３（ａ）〜（ｃ）および図４（ａ）参照）。これらの結果から、比較対照であるリゾビストとは異なり、本発明のイメージング剤における複合粒子は腎疾患を有する腎臓には集積せず、正常な腎臓にだけ集積するため、コントラストを強調させる腎機能診断用ＭＲＩ造影剤として実用的に機能することが確認できた。
【実施例３】
【００７８】
＜イメージング剤の光イメージング装置による評価＞
実施例２において、本発明のイメージング剤の投与１ヶ月後のＭＲＩ撮影後、各マウスは４％パラホルムアルデヒドで灌流固定し、腎臓摘出後、腎臓はパラフィン包埋後、組織切片を作成し、蛍光顕微鏡を使用して組織レベルでの評価を行った。なお、正常マウスおよび腎疾患モデルマウス蛍光イメージング実験にはＲｕｎ２および３を用いた。
【００７９】
正常マウスに本発明のイメージング剤（Ｒｕｎ２の複合粒子を含む）を投与して１ヶ月後の蛍光顕微鏡写真の画像を図５（ａ）に、腎疾患モデルマウスに本発明のイメージング剤（Ｒｕｎ３の複合粒子を含む）を投与して１ヶ月後の蛍光顕微鏡写真の画像を図５（ｂ）に示す。正常マウスの図５（ａ）において、本発明のイメージング剤に含まれる複合粒子に含まれる蛍光物質（ローダミン）は、糸球体や周囲の尿細管内に赤色点（図５（ａ）の写真では、明るい微細顆粒点）として認められた。一方、腎疾患モデルマウスの図５（ｂ）において、蛍光が認められず、すなわち、本発明のイメージング剤に含まれる複合粒子に含まれる蛍光物質（ＮＢＤ）の蓄積は確認できなかった。これらの結果から、本発明のイメージング剤の複合粒子は、腎疾患を有する腎臓には集積せず、正常な腎臓にだけ集積するため、蛍光イメージング剤として実用的に機能することが確認できた。
【実施例４】
【００８０】
＜複合粒子の血中滞留評価＞
（ｉ）複合粒子の放射性同位元素（ＲＩ）による標識
複合粒子（Ｒｕｎ３）の分散液（複合粒子濃度として１ｗｔ％、溶媒＝純水、１００μＬ）をマイクロ遠心チューブに入れ、さらにＮａ１２５Ｉ（５μＬ、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ  ＮＥＺ０３３）、次いでクロラミンＴ溶液（濃度＝０．２ｍｇ／ｍ１、溶媒＝０．５Ｍリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ含有、１００μＬ）を加え、ボルテックスミキサーで２分間攪拌した。そこへメタ重亜硫酸ナトリウム溶液（濃度＝４ｍｇ／ｍＬ、溶媒＝純粋、１００μＬ）をさらに加え、ボルテックスミキサーで２分間攪拌した。得られた混合物をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）で分離精製（溶出液；生理食塩水）し、微粒子（１２５Ｉ標識複合粒子）含有留出を１２５Ｉ標識複合粒子分散液として回収した。
【００８１】
（ｉｉ）ＲＩ標識複合粒子の体内動態評価
（ｉ）で製造した１２５Ｉ標識複合粒子分散液（Ｒｕｎ３）を、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾より静脈内投与した。所定時間経過後にマウス尾より採血しガンマカウンター（ＡＲＣ−３０１Ｂ、アロカ株式会社）により放射活性を測定し、複合粒子の血中残存率を求めた（図６）。
その結果、複合粒子（Ｒｕｎ３）は投与２４時間後まで高い血中残存率（２２％）を維持し、血中滞留性が高いことを示した。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明のイメージング剤は、ＣＴやＭＲＩ、光イメージングなどの生態画像化装置、ならびに蛍光検出機器を用いた、腎機能診断に用いることができる。
【図１（ａ）】
0006372800.tif 000006
【図１（ｂ）】
0006372800.tif 000007
【図１（ｃ）】
0006372800.tif 000008
【図２（ａ）】
0006372800.tif 000009
【図２（ｂ）】
0006372800.tif 000010
【図３】
0006372800.tif 000011
【図４】
0006372800.tif 000012
【図５】
0006372800.tif 000013
【図６】
0006372800.tif 000014