(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の像の画像を取得する第１の取得工程と、
前記第１の取得工程の後に第２の像の画像を取得する第２の取得工程と、
前記第１の像の画像データと前記第２の像の画像データを用いて所定の演算を行う工程と、を有し、
前記第１の取得工程は、第１の領域を通過した光束に基づいて実行され、
前記第２の取得工程は、第２の領域を通過した光束に基づいて実行され、
光学系の光軸と直交する面内で、前記第１の領域の中心位置と前記第２の領域の中心位置は、共に、前記光軸から離れており、
前記第１の領域と前記第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有し、
前記所定の演算では、被観察物体の３次元位置情報を算出し、
前記第１の領域と前記第２の領域は、回転対称な位置に形成され、
前記所定の演算は、前記第１の画像のデータと前記第２の画像のデータを用いて差演算処理を行う工程を有し、
前記差演算処理によって、差演算画像が生成され、
前記差演算画像を複数の計測領域に分割する工程と、
前記計測領域の各々について、領域内における前記差演算画像をフーリエ変換する工程と、を有し、
前記フーリエ変換によって、前記計測領域の各々においてフーリエ係数が算出されることを特徴とする３次元位置情報取得方法。
【請求項２】
前記フーリエ係数のうち、空間周波数が所定の帯域内のフーリエ係数を抽出する工程を有し、
前記抽出したフーリエ係数を用いて、前記計測領域に対応する前記被観察物体の領域について、３次元位置情報を算出することを特徴とする請求項１に記載の３次元位置情報取得方法。
【請求項３】
前記抽出したフーリエ係数を直線近似し、近似した直線の傾きを算出する工程を有し、
前記傾きから被観察物体の３次元位置情報を算出することを特徴とする請求項１に記載の３次元位置情報取得方法。
【請求項４】
光源と、
前記光源からの光を被観察物体に導光する照明光学系と、
前記被観察物体の像を形成する結像光学系と、
前記被観察物体の像を撮像する撮像素子と、
開口素子と、
前記撮像で得た画像を演算処理する処理装置と、
前記開口素子を動かす駆動機構と、を有し、
前記開口素子は、前記被観察物体の各点からの光のうちの一部を通過させる開口部を有し、
前記開口部を第１の位置に移動させることで第１の領域が形成され、前記開口部を第２の位置に移動させることで第２の領域が形成され、
前記演算処理は、
第１の像の画像を取得する第１の取得工程と、
前記第１の取得工程の後に第２の像の画像を取得する第２の取得工程と、
前記第１の像の画像データと前記第２の像の画像データを用いて所定の演算を行う工程と、を有し、
前記第１の取得工程は、前記第１の領域を通過した光束に基づいて実行され、
前記第２の取得工程は、前記第２の領域を通過した光束に基づいて実行され、
光学系の光軸と直交する面内で、前記第１の領域の中心位置と前記第２の領域の中心位置は、共に、前記光軸から離れており、
前記第１の領域と前記第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有し、
前記所定の演算では、前記被観察物体の３次元位置情報を算出し、
前記第１の領域と前記第２の領域は、回転対称な位置に形成され、
前記所定の演算は、前記第１の画像のデータと前記第２の画像のデータを用いて差演算処理を行う工程を有し、
前記差演算処理によって、差演算画像が生成され、
前記差演算画像を複数の計測領域に分割する工程と、
前記計測領域の各々について、領域内における前記差演算画像をフーリエ変換する工程と、を有し、
前記フーリエ変換によって、前記計測領域の各々においてフーリエ係数が算出されることを特徴とする３次元位置情報取得装置。
【請求項５】
前記第１の像と前記第２の像は、同一の撮像素子上に形成されることを特徴とする請求項４に記載の３次元位置情報取得装置。
【請求項６】
前記開口素子は、前記照明光学系の瞳位置、前記結像光学系の瞳位置及び前記瞳位置と共役な位置の何れか一つの位置に配置されていることを特徴とする請求項４又は５に記載の３次元位置情報取得装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は被観察物体の３次元位置情報を取得する方法及び３次元位置情報を取得する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
被観察物体を観察する装置として、例えば、顕微鏡がある。顕微鏡光学系は、一般的に、物体側から順に、対物レンズ、開口絞り、結像レンズ、撮像素子を有する。また、対物レンズの光軸と結像レンズの光軸とが一致し、開口絞りの開口の中心も光軸に一致している。
【０００３】
図１は、このような一般的な光学系における光束の様子を示す図であって、（ａ）は光束の集光状態を示す図、（ｂ）と（ｃ）は撮像素子上に形成された点像強度分布の様子を示す図である。
【０００４】
軸上物点からの光を光学系で集光すると、図１（ａ）において破線で示すように位置Ｐ２で集光する。幾何光学的には、位置Ｐ２に形成される像は点になる。しかしながら、実際には、像は点にはならない。図１（ａ）において実線で示すように、回折現象によってある広がりを持つ。このように広がりを持つ像を、ここでは、点像強度分布という。
【０００５】
被観察物体の位置と光学系の合焦位置との間にずれが生じると、点像強度分布における広がりが変化する。ただし、被観察物体の光学系の合焦位置からのずれ量が光学系の像側の焦点深度よりも小さい量に相当する場合、点像強度分布の広がりは大きく変化しない。被観察物体の光学系の合焦位置からのずれ量を、物体側ずれ量という。像側の焦点深度を焦点深度という。
【０００６】
図１（ａ）では、点像強度分布の広がりが大きく変化しない範囲を、斜線で示している。図１（ｂ）では、点像強度分布の広がりを斜線で示している。また、所定の画素領域を、４画素×４画素の領域とする。
【０００７】
被観察物体の位置と光学系の合焦位置とが一致している場合、被観察物体からの光は位置Ｐ２に集光する。一方、被観察物体の位置が光学系の合焦位置からずれている場合、被観察物体からの光は位置Ｐ２よりも位置Ｐ１側や、位置Ｐ２よりも位置Ｐ３側に集光する。物体側ずれ量が焦点深度よりも小さい量に相当する場合、被観察物体の像は、位置Ｐ１から位置Ｐ３までの間に形成される。
【０００８】
物体側ずれ量が焦点深度よりも小さい量に相当する場合、図１（ｂ）に示すように、点像強度分布の広がりは、位置Ｐ１、位置Ｐ２及び位置Ｐ３の各々で所定の画素領域内に収まる。より詳しくは、点像強度分布の広がりを示す円は、所定の画素領域に内接している。
【０００９】
位置Ｐ１、位置Ｐ２及び位置Ｐ３は、いずれも、焦点深度内の位置である。よって、物体側ずれ量が焦点深度よりも小さい量に相当する場合、物体側ずれ量の変化は、点像強度分布の明るさ、すなわち被観察物体の像の明るさの変化として現れない。
【００１０】
被観察物体の表面に凹凸がある場合、凸部の高さや凹部の深さが、物体側ずれ量に相当する。よって、凸部の高さや凹部の深さが焦点深度よりも小さい量に相当する場合、被観察物体の表面の凹凸の変化は、点像強度分布の明るさ、すなわち被観察物体の像の明るさの変化として現れない。
【００１１】
また、位置Ｐ１、位置Ｐ２及び位置Ｐ３の各々で、点像強度分布は撮像素子上の同じ場所に位置している。よって、物体側ずれ量が焦点深度よりも小さい量に相当する場合、一般的な光学系では、物体側ずれ量の変化は、点像強度分布の位置の変化、すなわち被観察物体の像の位置の変化として現れない。
【００１２】
上述のように、物体側ずれ量は、凸部の高さや凹部の深さに相当する。凸部の高さや凹部の深さが焦点深度よりも小さい量に相当する場合、被観察物体の表面の凹凸の変化は、点像強度分布の位置の変化、すなわち被観察物体の像の位置の変化として現れない。よって、凸部の高さや凹部の深さが焦点深度よりも小さい量に相当する場合、一般的な光学系では、凸部の高さや凹部の深さを検出することができないことがわかる。
【００１３】
図１（ａ）において、斜線で示した範囲の長さｄをデフォーカス量とする。画素サイズで決まる焦点深度は、点像強度分布の広がりを示す円が所定の画素（４×４画素）領域を超えない範囲として示される。図１（ａ）に示すように、結像光学系の像側の開口数をＮＡ’とすると、点像強度分布の半径φは以下の式（１）で表される。
φ＝（ｄ／２）×ＮＡ’      （１）
【００１４】
撮像素子の分解能は、画素の大きさに置き換えることができる。撮像素子の分解能の逆数は、２画素分の大きさに相当する。１画素分の大きさをｄｐｉｘとすると、２画素分の大きさは２ｄｐｉｘになる。この場合、φを２画素分の大きさで置き換えることができるので、デフォーカス量は以下の式（２）で表される。
ｄ＝４ｄｐｉｘ／ＮＡ’      （２）
【００１５】
また、λを波長、δＯＢＳを結像光学系の分解能とすると、結像光学系の分解能は以下の式（３）で表される。
δＯＢＳ＝λ／（２×ＮＡ’）      （３）
【００１６】
結像光学系の分解能と撮像素子の分解能が等しい場合、つまり結像光学系のカットオフ周波数と撮像素子のナイキスト周波数が等しいとき、δＯＢＳを２画素分の大きさで置き換えることができるので、結像光学系の分解能は以下の式（３’）で表される。
２ｄｐｉｘ＝λ／（２×ＮＡ’）      （３’）
【００１７】
式（２）と式（３’）から、デフォーカス量は以下の式（４）で表される。
ｄ＝λ／ＮＡ’２      （４）
【００１８】
結像光学系の焦点深度はλ／ＮＡ’２で表されるので、画素サイズで決まる焦点深度は結像光学系の焦点深度と一致する。よって、結像光学系の分解能と撮像素子の分解能が等しい場合、観察系の焦点深度は、結像光学系の焦点深度又は画素サイズで決まる焦点深度で表すことができる。
【００１９】
結像光学系の分解能が撮像素子の分解能より低い場合、点像強度分布を所定の画素領域以上でサンプリングすることになる。この場合、観察系の焦点深度は、結像光学系の焦点深度であるλ／ＮＡ’２で表すことができる。
【００２０】
結像光学系が顕微鏡の光学系の場合、対物レンズを交換することで結像光学系の倍率が変化する。倍率の変化に伴ってＮＡ’も変化するので、結像光学系の分解能も変化する。対物レンズの交換によって結像光学系の倍率を低くすることで、倍率が高い場合に比べてＮＡ’が大きくなる場合がある。ＮＡ’が大きくなると、結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高くなる。
【００２１】
結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合と、結像光学系の分解能と撮像素子の分解能が等しい場合とで比較する。まず、結像光学系の焦点深度について比較する。
【００２２】
ＮＡ’は、結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合の方が、結像光学系の分解能と撮像素子の分解能が等しい場合よりも大きくなる。よって、結像光学系の焦点深度は、結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合の方が、結像光学系の分解能と撮像素子の分解能が等しい場合よりも狭くなる。
【００２３】
次に、焦点深度を決めるデフォーカス量について比較する。図１（ｂ）と図１（ｃ）を比べると分かるように、点像強度分布の広がりは、結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合の方が、結像光学系の分解能と撮像素子の分解能が等しい場合よりも狭い。上述のように、画素サイズで決まる焦点深度は、点像強度分布の広がりを示す円が所定の画素領域を超えない範囲である。よって、画素サイズで決まる焦点深度は、結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合の方が、結像光学系の分解能と撮像素子の分解能が等しい場合よりも大きくなる。
【００２４】
このようなことから、結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合では、画素サイズで決まる焦点深度は結像光学系の焦点深度よりも大きくなる。よって、結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合、観察系の焦点深度は、結像光学系の焦点深度ではなく、画素サイズで決まる焦点深度で表されることになる。
【００２５】
観察系の焦点深度は、結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合の方が、結像光学系の分解能と撮像素子の分解能が等しい場合よりも大きくなる。そのため、結像光学系の分解能と撮像素子の分解能が等しい場合に検出可能な物体側ずれ量が、結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合では検出できなくなる可能性がある。
【００２６】
被観察物体の様々な情報を取得する装置として、被観察物体からの光を全て用いる装置や、被観察物体からの光の一部を用いる装置がある。被観察物体からの光の一部を用いる装置としては、特許文献１に記載の装置がある。
【００２７】
特許文献１に記載の装置は、上述の一般的な光学系とは異なる光学系をもつオートフォーカス装置である。この装置では、対物レンズ系の射出瞳位置と略共役な位置に複数の開口が配置されている。開口は、対物レンズ系の光軸から離れた位置に設けられている。この装置では、合焦位置からのずれ量を算出できる。そこで、この装置を利用すれば、被観察物体の高さ情報を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】特開２０１３−２３５１１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
特許文献１に記載された装置では、合焦位置からのずれ量は、被観察物体の１点についてしか算出できない。被観察物体の全体について高さ情報を得るためには、被観察物体と光学系を相対的に移動させてなくてはならい。そのため、移動機構が必要となり、また、３次元位置情報の取得に要する時間が長くなる。
【００３０】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであって、被観察物体の光学系の合焦位置からのずれ量が光学系の焦点深度よりも小さい量に相当する場合であっても、このずれ量を効率よく検出することができ、光軸方向に高い分解能を有する３次元位置情報取得方法及び３次元位置情報取得装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の３次元位置情報取得方法は、
第１の像の画像を取得する第１の取得工程と、
第１の取得工程の後に第２の像の画像を取得する第２の取得工程と、
第１の像の画像データと第２の像の画像データを用いて所定の演算を行う工程と、を有し、
第１の取得工程は、第１の領域を通過した光束に基づいて実行され、
第２の取得工程は、第２の領域を通過した光束に基づいて実行され、
光学系の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れており、
第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有し、
所定の演算では、被観察物体の３次元位置情報を算出し、
第１の領域と第２の領域は、回転対称な位置に形成され、
所定の演算は、第１の画像のデータと第２の画像のデータを用いて差演算処理を行う工程を有し、
差演算処理によって、差演算画像が生成され、
差演算画像を複数の計測領域に分割する工程と、
計測領域の各々について、領域内における差演算画像をフーリエ変換する工程と、を有し、
フーリエ変換によって、計測領域の各々においてフーリエ係数が算出されることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明の３次元位置情報取得装置は、
光源と、
光源からの光を被観察物体に導光する照明光学系と、
被観察物体の像を形成する結像光学系と、
被観察物体の像を撮像する撮像素子と、
開口素子と、
撮像で得た画像を演算処理する処理装置と、
開口素子を動かす駆動機構と、を有し、
開口素子は、被観察物体の各点からの光のうちの一部を通過させる開口部を有し、
開口部を第１の位置に移動させることで第１の領域が形成され、開口部を第２の位置に移動させることで第２の領域が形成され、
演算処理は、
第１の像の画像を取得する第１の取得工程と、
第１の取得工程の後に第２の像の画像を取得する第２の取得工程と、
第１の像の画像データと第２の像の画像データを用いて、所定の演算を行う工程とを有し、
第１の取得工程は、第１の領域を通過した光束に基づいて実行され、
第２の取得工程は、第２の領域を通過した光束に基づいて実行され、
光学系の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れており、
第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有し、
所定の演算では、被観察物体の３次元位置情報を算出し、
第１の領域と第２の領域は、回転対称な位置に形成され、
所定の演算は、第１の画像のデータと第２の画像のデータを用いて差演算処理を行う工程を有し、
差演算処理によって、差演算画像が生成され、
差演算画像を複数の計測領域に分割する工程と、
計測領域の各々について、領域内における差演算画像をフーリエ変換する工程と、を有し、
フーリエ変換によって、計測領域の各々においてフーリエ係数が算出されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、被観察物体の光学系の合焦位置からのずれ量が光学系の焦点深度よりも小さい量に相当する場合であっても、このずれ量を効率よく検出することができ、光軸方向に高い分解能を有する３次元位置情報取得方法及び３次元位置情報取得装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】一般的な光学系における光束の様子を示す図であって、（ａ）は光束の集光状態を示す図、（ｂ）と（ｃ）は撮像素子上に形成された点像強度分布の様子を示す図である。
【図２】偏心状態における光束の様子を示す図であって、（ａ）は光束の集光状態を示す図、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は撮像素子上に形成された点像強度分布の様子を示す図である。
【図３】偏心状態を生成するための光学系の構成例であって、（ａ）は第１の領域を通過した光束を示す図、（ｂ）は第２の領域を通過した光束を示す図、（ｃ）は第１の領域と第２の領域を示す図である。
【図４】画像の例であって、（ａ）は第１の画像、（ｂ）は第２の画像である。
【図５】本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートである。
【図６】本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートである。
【図７】高さ情報を算出する第２の方法を説明するための図である。
【図８】本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートである。
【図９】本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートである。
【図１０】計測領域の設定例を示す図である。
【図１１】本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートである。
【図１２】本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートである。
【図１３】計測領域をフーリエ変換し、式（１４）の演算を行った結果の画像であって、（ａ）は２次元の画像、（ｂ）は（ａ）でＹ方向の空間周波数が０である１列の情報を示す画像である。
【図１４】図１３（ｂ）のフーリエ係数の断面図とそのフーリエ係数を近似した直線を表す図である。
【図１５】第１実施形態の３次元位置情報取得装置を示す図である。
【図１６】第２実施形態の３次元位置情報取得装置を示す図である。
【図１７】第３実施形態の３次元位置情報取得装置を示す図である。
【図１８】第４実施形態の３次元位置情報取得装置を示す図である。
【図１９】３次元位置情報取得方法の応用例１を説明する図であって、（ａ）は物体側のずれ量をδＦで階層化する様子を示す図、（ｂ）は被観察物体の形状を示す図、（ｃ）は２値化した３次元画像情報を示す図である。
【図２０】３次元位置情報取得方法の応用例２を説明する図であって、（ａ）は被観察物体の第１段目の面が合焦位置と一致している様子とそのときの画像を示す図、（ｂ）は被観察物体の第２段目の面が合焦位置と一致している様子とそのときの画像を示す図、（ｃ）被観察物体の第３段目の面が合焦位置と一致している様子とそのときの画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下に、本発明に係る３次元位置情報取得方法及び３次元位置情報取得装置の実施形態を、図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施形態によりこの発明が限定されるものではない。
【００３６】
本実施形態の３次元位置情報取得方法及び３次元位置情報取得装置を説明する前に、簡単に基本的な原理の説明を行う。原理の説明では第１の領域と第２の領域を用い、第１の領域の中心と第２の領域の中心が、共に、光学系の光軸と一致していない状態（以下、「偏心状態」という）について説明する。以下では、第１の領域を使って説明する。
【００３７】
図２は偏心状態における光束の様子を示す図であって、（ａ）は光束の集光状態を示す図、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は撮像素子上に形成された点像強度分布の様子を示す図である。
【００３８】
図２（ａ）では、点像強度分布の広がりが大きく変化しない範囲を、斜線で示している。図２（ｂ）〜（ｄ）では、点像強度分布の広がりを斜線で示している。また、所定の画素領域を、４画素×４画素の領域とする。
【００３９】
被観察物体の位置と光学系の合焦位置とが一致している場合、被観察物体からの光は位置Ｐ２に集光する。一方、被観察物体の位置が光学系の合焦位置からずれている場合、被観察物体からの光は位置Ｐ２よりも位置Ｐ１側や、位置Ｐ２よりも位置Ｐ３側に集光する。
【００４０】
物体側ずれ量が焦点深度よりも小さい量に相当する場合、偏心状態では、図２（ｂ）〜（ｄ）に示すように、点像強度分布の広がりは、位置Ｐ１、位置Ｐ２及び位置Ｐ３の各々で、所定の画素領域内に収まる。より詳しくは、点像強度分布の広がりを示す円は、所定の画素領域に内接している。
【００４１】
位置Ｐ１、位置Ｐ２及び位置Ｐ３は、いずれも、焦点深度内の位置である。よって、物体側ずれ量が焦点深度よりも小さい量に相当する場合、偏心状態では、物体側ずれ量の変化は、点像強度分布の明るさ、すなわち被観察物体の像の明るさの変化として現れない。
【００４２】
被観察物体の表面に凹凸がある場合、凸部の高さや凹部の深さが、物体側ずれ量に相当する。よって、凸部の高さや凹部の深さが焦点深度よりも小さい量に相当する場合、偏心状態では、被観察物体の表面の凹凸は、点像強度分布の明るさ、すなわち被観察物体の像の明るさの変化として現れない。
【００４３】
一方、位置Ｐ１の点像強度分布と位置Ｐ３の点像強度分布は、共に、位置Ｐ２の点像強度分布に対して｜Δ｜だけ移動している。ここでは、Δ＝２画素である。点像強度分布の移動方向は、位置Ｐ２から位置Ｐ３への移動と位置Ｐ２から位置Ｐ１への移動とで、正反対になっている。よって、物体側ずれ量が焦点深度よりも小さい量に相当する場合、偏心状態では、物体側ずれ量の変化は、点像強度分布の位置の変化、すなわち被観察物体の像の位置の変化として現れる。
【００４４】
上述のように、物体側ずれ量は、凸部の高さや凹部の深さに相当する。凸部の高さや凹部の深さが焦点深度よりも小さい量に相当する場合、偏心状態では、被観察物体の表面の凹凸の変化は、点像強度分布の位置の変化、すなわち被観察物体の像の位置の変化として現れる。よって、凸部の高さや凹部の深さが焦点深度よりも小さい量に相当する場合、偏心状態では、凸部の高さや凹部の深さを検出することができる。
【００４５】
結像光学系によって被観察物体の像を形成し、その像を撮像素子で受光する場合、結像光学系の分解能と撮像素子の分解能を考慮する必要がある。結像光学系と撮像素子で構成される系を、観察系とする。
【００４６】
物体側のずれ量を被観察物体の像の明るさの変化として捉える方法では、物体側ずれ量が観察系の焦点深度よりも小さい量に相当する場合だと、上述の一般的な光学系であっても偏心状態であっても、その物体側ずれ量を検出できない。
【００４７】
一方、被観察物体の像の移動を捉える方法では、物体側ずれ量が観察系の焦点深度よりも小さい量に相当する場合、上述の一般的な光学系ではその物体側ずれ量を検出できないが、偏心状態だとその物体側ずれ量を検出できる。
【００４８】
また、結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合では、結像光学系の分解能と撮像素子の分解能が等しい場合よりも観察系の焦点深度が大きくなる。そのため、小さな物体側ずれ量の検出が、結像光学系の分解能と撮像素子の分解能が等しい場合よりも難しくなる。
【００４９】
しかしながら、偏心状態だと、図２（ｂ）〜（ｄ）に示すように、Δが１画素以上になれば、点像強度分布の位置の変化、すなわち被観察物体の像の位置の変化を検出することができる。よって、偏心状態であれば、結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合であっても、物体側ずれ量を検出することができる。
【００５０】
上述のように、物体側ずれ量は、凸部の高さや凹部の深さに相当する。凸部の高さや凹部の深さが観察系の焦点深度よりも小さい量に相当する場合、偏心状態では、被観察物体の表面の凹凸の変化は、点像強度分布の位置の変化、すなわち被観察物体の像の位置の変化として現れる。
【００５１】
よって、凸部の高さや凹部の深さが焦点深度よりも小さい量に相当する場合で、しかも結像光学系の分解能が撮像素子の分解能よりも高い場合であっても、偏心状態であれば、凸部の高さや凹部の深さを検出することができる。
【００５２】
図３は偏心状態を生成するための光学系の構成例であって、（ａ）は第１の領域を通過した光束を示す図、（ｂ）は第２の領域を通過した光束を示す図、（ｃ）は第１の領域と第２の領域を示す図である。
【００５３】
結像光学系ＯＢＳは、レンズＬ１と、レンズＬ２と、開口素子ＳＴＯと、を有する。結像光学系ＯＢＳが顕微鏡の光学系の場合、レンズＬ１は対物レンズ、レンズＬ２は結像レンズである。結像光学系ＯＢＳを挟んで一方の側には被観察物体Ｓが位置し、他方の側には撮像素子ＩＭが配置されている。撮像素子ＩＭは、物体側ずれ量が０のときの被観察物体Ｓの像位置に配置されている。
【００５４】
開口素子ＳＴＯは、被観察物体Ｓから被観察物体Ｓの像までの間に配置されている。より詳しくは、開口素子ＳＴＯは、レンズＬ１とレンズＬ２との間に配置されている。開口素子ＳＴＯの形状は円形であるが、これに限られない。開口素子ＳＴＯは開口部ＡＰを有する。開口部ＡＰは、開口素子ＳＴＯの中心から離れた位置に設けられている。開口部ＡＰの形状は円形であるが、これに限られない。
【００５５】
図３（ａ）、（ｂ）では、軸上物点からの光を実線で示し、軸外物点からの光を破線で示している。軸上物点からの光と軸外物点からの光は、レンズＬ１に通過して開口素子ＳＴＯに到達する。開口素子ＳＴＯに到達した光束ＬＦのうち、一部の光束が開口部ＡＰを通過し、残りの光束は開口素子ＳＴＯで遮られる。開口部ＡＰを通過した光束はレンズＬ２を通過して、撮像素子ＩＭ上に集光する。その結果、撮像素子ＩＭ上に被観察物体Ｓの像が形成される。
【００５６】
図３（ａ）では、開口部ＡＰは光軸ＡＸよりも上側に位置している。一方、図３（ｂ）では、開口部ＡＰは光軸ＡＸよりも下側に位置している。その結果、図３（ｃ）に示すように、第１の領域ＡＲ１と第２の領域ＡＲ２が形成される。
【００５７】
開口部ＡＰは、開口素子ＳＴＯに１つしか設けられていない。そのため、第１の領域ＡＲ１と第２の領域ＡＲ２は同時には存在しない。開口素子ＳＴＯを光軸ＡＸの周りに回転させ、２つの位置で回転を停止することで、第１の領域ＡＲ１と第２の領域ＡＲ２が形成される。
【００５８】
図３（ｃ）では、第１の領域ＡＲ１の位置と第２の領域ＡＲ２の位置は光軸ＡＸに対して回転対称になっているが、両者の位置は回転対称になっていなくても良い。
【００５９】
開口部ＡＰの中心位置は光軸ＡＸから離れている。よって、結像光学系ＯＢＳの光軸ＡＸと直交する面内で、第１の領域ＡＲ１の中心位置と第２の領域ＡＲ２の中心位置も、共に、光軸ＡＸから離れている。
【００６０】
第１の領域の形状が円形の場合、第１の領域の中心位置は円の中心になる。第１領域の形状が正多角形の場合、第１の領域の中心位置は、正多角形に内接する円の中心又は外接する円の中心になる。第１の領域の形状が直交する２つの軸について線対称な形状の場合、第１の領域の中心位置は２つの軸の交点になる。また、第１の領域の重心位置を、中心位置としても良い。第２の領域の中心位置についても、第１の領域の中心位置と同じように考えれば良い。
【００６１】
また、開口部ＡＰの直径は開口素子ＳＴＯの半径よりも小さく、開口部ＡＰは光軸ＡＸを含んでいない。よって、第１の領域ＡＲ１と第２の領域ＡＲ２は、互いに重複していない。開口部ＡＰの直径を大きくして、開口部ＡＰが光軸ＡＸを含むようにしても良い。このようにしても、開口部ＡＰの中心位置は光軸ＡＸから離れているので、第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有する。
【００６２】
また、被観察物体Ｓを挟んで、結像光学系ＯＢＳと対向する位置に照明光学系を配置して、照明光学系に開口素子ＳＴＯを配置しても良い。この場合も、開口部ＡＰの中心位置は照明光学系の光軸から離れている。よって、照明光学系の光軸と直交する面内で、第１の領域ＡＲ１の中心位置と第２の領域ＡＲ２の中心位置も、共に、照明光学系の光軸から離れている。
【００６３】
開口素子ＳＴＯは、軸上物点からの光と軸外物点からの光が、共に通過する位置に配置されることが好ましい。このような位置としては、結像光学系ＯＢＳの瞳位置、又は瞳と共役な位置がある。照明光学系の瞳位置、又は瞳と共役な位置に開口素子ＳＴＯを配置しても良い。照明光学系の瞳位置は、結像光学系ＯＢＳの瞳と共役な位置とみなすことができる。
【００６４】
開口素子ＳＴＯの配置は、瞳位置又は瞳と共役な位置と厳密に一致している必要はない。光学系の瞳リレーの収差を考慮すると、開口素子ＳＴＯは、瞳位置の近傍又は瞳と共役な位置の近傍に配置されていれば良い。
【００６５】
結像光学系ＯＢＳの瞳位置に開口素子ＳＴＯを配置すると、偏心状態になる。図２で示したように、偏心状態では、物体側ずれ量が焦点深度よりも小さい量に相当する場合であっても、被観察物体Ｓの像が光軸ＡＸと直交する面内でΔだけ移動する。開口素子ＳＴＯを光軸ＡＸの周りに回転させると、開口部ＡＰの位置に応じて被観察物体Ｓの像の移動方向が変化する。
【００６６】
そこで、開口部ＡＰを第１の位置に移動させて、第１の領域を通過した光束を生成し、第１の像の画像を取得する。次に、第１の位置とは異なる位置に第２の位置に開口部ＡＰを移動させて、第２の領域を通過した光束を生成し、第２の像の画像を取得する。
【００６７】
図４は画像の例であって、（ａ）は第１の画像、（ｂ）は第２の画像である。第１の画像と第２の画像は、同じ被観察物体を蛍光観察したときの画像である。被観察物体は、細胞の集合体である。図４では、細胞の集合体の輪郭が線画で表されている。
【００６８】
図４における第１の画像と第２の画像の取得は、開口部ＡＰを光軸ＡＸに対して回転対称な２つの位置に移動させて行っている。第１の領域ＡＲ１の位置と第２の領域ＡＲ２の位置を、光軸ＡＸに対して回転対称な位置にすると、第１の画像と第２の画像の各々には、絶対値が等しく、方向が正反対の画像のずれが発生している。画像に発生したずれ量は、物体側ずれ量に対応した量である。このように、第１の像の画像と第２の像の画像には、共に、被観察物体Ｓの３次元位置情報が含まれている。
【００６９】
本実施形態の３次元位置情報取得方法及び３次元位置情報取得装置を説明する。本実施形態の３次元位置情報取得方法は、第１の像の画像を取得する第１の取得工程と、第１の取得工程の後に第２の像の画像を取得する第２の取得工程と、第１の像の画像データと第２の像の画像データを用いて所定の演算を行う工程と、を有し、第１の取得工程は、第１の領域を通過した光束に基づいて実行され、第２の取得工程は、第２の領域を通過した光束に基づいて実行され、光学系の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れており、第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有し、所定の演算では、被観察物体の３次元位置情報を算出することを特徴とする。
【００７０】
本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートを図５に示す。ステップＳ１は第１の取得工程である。第１の取得工程では、第１の像の画像を取得する。この取得は、被観察物体の各点からの光のうち、第１の領域を通過した光束に基づいて行われる。
【００７１】
ステップＳ２は第２の取得工程である。第２の取得工程は、第１の取得工程を実行した後に行われる。第２の取得工程では、第２の像の画像を取得する。この取得は、被観察物体の各点からの光のうち、第２の領域を通過した光束に基づいて行われる。
【００７２】
本実施形態の３次元位置情報取得方法では、光学系の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れている。また、第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有する。よって、第１の領域の中心と第２の領域の中心は、共に、光学系の光軸と一致していない状態になる。
【００７３】
続いて、テップ３を実行する。ステップ３は所定の演算を行う工程である。所定の演算では、第１の画像データ（第１の像の画像データ）と第２の画像データ（第２の像の画像データ）が用いられる。第１の像の画像と第２の像の画像には、共に、被観察物体Ｓの３次元位置情報が含まれている。よって、所定の演算を行うことで、被観察物体Ｓの３次元位置情報が算出される。
【００７４】
本実施形態の３次元位置情報取得方法によれば、被観察物体の光学系の合焦位置からのずれ量が光学系の焦点深度よりも小さい量に相当する場合であっても、このずれ量を効率よく検出できるので、高い分解能で３次元位置情報を取得することができる。
【００７５】
また、本実施形態に係る３次元位置情報取得方法では、第１の領域と第２の領域は、回転対称な位置に形成されていることが好ましい。
【００７６】
開口部ＡＰを光軸ＡＸに対して回転対称な２つの位置に移動させると、第１の領域ＡＲ１と第２の領域ＡＲ２は、回転対称な位置に形成されることになる。この場合、第１の画像と第２の画像の各々には、絶対値が等しく、方向が正反対の画像のずれが発生している。その結果、所定の演算における処理、例えば、合焦位置からのずれ量を求める処理が容易になる。
【００７７】
また、本実施形態に係る３次元位置情報取得方法では、所定の演算は、第１の画像のデータと第２の画像のデータを用いて差演算処理を行う工程を有し、差演算処理によって、差演算画像が生成されることが好ましい。
【００７８】
本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートを図６に示す。図５に示す工程と同じ工程には同じ番号を付し、説明は省略する。ステップＳ３１は、差演算処理を行う工程である。差演算処理を行う工程では、第１の画像のデータと第２の画像のデータを用いて差演算処理が行われる。差演算処理を実行することで、差演算画像が生成される。
【００７９】
第１の画像と第２の画像は、それぞれ、同一の画像が＋Δだけ横ずれしたものと−Δだけ横ずれしたものである。よって、差演算画像は、Δに対応した被観察物体の微分画像になる。このように、差演算処理を行うことで、被観察物体の微分画像が形成される。そして、微分干渉顕微鏡の像コントラストがシァー量（２つの偏光のずれ量）ΔＤＩＣの関数として表されるのと同様に、この微分画像の像コントラストもΔの関数として表される。
【００８０】
差演算画像から被観察物体の３次元位置情報を算出する方法の例として、２つの方法を説明する。
【００８１】
３次元位置情報を算出する第１の方法について説明する。差演算画像の像コントラストが０になっている部分では、Δが０になっている。これは、この部分では、物体側ずれ量δｚが０になっていることを意味している。そこで、以下の３つの画像を用意する。（Ｉ）差演算画像そのもの、（ＩＩ）差演算画像の絶対値をとった画像、（ＩＩＩ）差演算画像にソーベルフィルターで処理した画像。
【００８２】
そして、３つの画像の各画素値が０近傍の値になる画素領域を抽出する。このようにすることで、被観察物体の各点の中から、結像光学系の合焦位置と一致している点を抽出することができる。
【００８３】
そこで、被観察物体の位置と結像光学系の位置を光軸方向で相対的に変化させて、各位置で、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を繰り返し行うことで、被観察物体の３次元位置情報を取得することができる。（ｉ）第１の画像と第２の画像の取得、（ｉｉ）差演算処理、（ｉｉｉ）３つの画像の少なくとも１つの画像を選択し、その画像の各画素が０近傍の値になる画素領域の抽出。
【００８４】
このように、第１の方法では、従来の像コントラストから求める方法に比べて、光軸方向の位置情報を高精度に得ることが可能になる。
【００８５】
３次元位置情報を算出する第２の方法について説明する。第１の方法では、Δが０になっている部分を抽出して、被観察物体の３次元位置情報を取得している。しかしながら、物体側ずれ量と点像強度分布の移動量との間には一意的な関係がある。よって、点像強度分布の移動量を物体側ずれ量に換算することが可能である。
【００８６】
図７は、高さ情報を算出する第２の方法を説明するための図である。図３と同じ構成については同じ番号を付し、説明は省略する。図７に示すように、結像光学系ＯＢＳの瞳位置に開口素子ＳＴＯを配置すると、被観察物体Ｓからの光のうち、開口部ＡＰを通過した光だけが撮像素子ＩＭに入射する。
【００８７】
図７において、位置ＰＯは、結像光学系ＯＢＳの合焦位置である。位置ＰＯ’は、結像光学系ＯＢＳの合焦位置からずれた位置である。位置ＰＯと位置ＰＯ’との間隔δｚは、物体側ずれ量になる。
【００８８】
光線ＬＣ、光線ＬＵ及び光線ＬＬは、いずれも位置ＰＯからの光である。光線ＬＣは、開口ＡＰを通過した光束の中心の光線である。光線ＬＵは、開口部ＡＰを通過した光束において、光軸ＡＸから最も離れた位置を通過する光線である。光線ＬＬは、開口部ＡＰを通過した光束において、光軸ＡＸに最も近い位置を通過する光線である。光線ＬＣ’は位置ＰＯ’からの光である。光線ＬＣ’は、開口部ＡＰを通過した光束の中心の光線である。
【００８９】
ＮＡは、結像光学系ＯＢＳの物体側の開口数で、ＮＡ’は、結像光学系ＯＢＳの像側の開口数である。ＮＡは、レンズＬ１に入射する光線ＬＵと光線ＬＣとのなす角度により決まる。ＮＡ’は、レンズＬ２から出射する線ＬＵと光線ＬＣとのなす角度により決まる。Ωは、レンズＬ１に入射する光線ＬＣと光軸ＡＸとのなす角度、ωは、レンズＬ２から出射する光線ＬＣと光軸ＡＸとのなす角度である。
【００９０】
位置ＰＩは、位置ＰＯと共役な位置である。位置ＰＩには撮像素子ＩＭが配置されている。位置ＰＩ’は、位置ＰＯ’と共役な位置である。位置ＰＩ’は、像位置ＰＩからずれた位置である。位置ＰＩと位置ＰＩ’との間隔β２δｚは、像側ずれ量になる。βは結像光学系ＯＢＳの倍率である。
【００９１】
被観察物体Ｓの位置が位置ＰＯと一致している場合、被観察物体Ｓの位置と結像光学系ＯＢＳの合焦位置との間にずれは生じていない。この場合、光線ＬＵ、ＬＣ及びＬＬで示すように、被観察物体Ｓからの光は位置ＰＩで集光する。一方、被観察物体Ｓの位置が位置ＰＯ’と一致している場合、被観察物体Ｓの位置と結像光学系ＯＢＳの合焦位置との間にずれが生じている。この場合、光線ＬＣ’で示すように、被観察物体Ｓからの光は位置ＰＩ’で集光する。
【００９２】
位置ＰＯでは、被観察物体Ｓからの光線ＬＣは、角度Ωで結像光学系ＯＢＳに入射する。ここで、被観察物体Ｓがδｚだけ結像光学系ＯＢＳから遠ざかると、被観察物体Ｓからの光は光線ＬＣ’になる。位置ＰＯでは、光線ＬＣ’は光軸ＡＸからｈだけ離れた位置を通過する。ｈは以下の式（５）で表される。
ｈ＝δｚ×ｔａｎΩ      （５）
ここで、
ｈは、位置ＰＯにおける光線ＬＣ’の高さ、
である。
【００９３】
式（５）に示すように、被観察物体Ｓのδｚのずれは、位置ＰＯにおける物点ＯＢが、光軸ＡＸと直交する方向にｈだけ移動したことと等価になる。
【００９４】
光線ＬＣ’は、結像光学系ＯＢＳを通過した後、位置ＰＩ’で光軸ＡＸと交差して、位置ＰＩに到達する。位置ＰＩには撮像素子ＩＭが配置されている。撮像素子ＩＭ上での光線ＬＣ’の入射位置は、光軸ＡＸからｈ’だけ離れた位置になる。ｈ’は以下の式（６）で表される。
ｈ’＝β×ｈ＝β×δｚ×ｔａｎΩ      （６）
ここで、
ｈ’は、位置ＰＩにおける光線ＬＣ’の高さ、
である。
【００９５】
β２δｚが結像光学系ＯＢＳの焦点深度よりも小さい場合であっても、式（６）は成立する。ｈ’＝Δであることから、式（６）は以下の式（７）で表される。
Δ＝β×δｚ×ｔａｎΩ      （７）
ここで、
Δは、光軸と直交する面内における点像強度分布の移動量、
である。
【００９６】
したがって、撮像素子ＩＭにおいて、ある画素でのΔが検出できれば、その画素に対応した被観察物体Ｓにおける位置のδｚを求めることができる。その結果、被観察物体Ｓにおける３次元位置情報（ｘ，ｙ，δｚ）を求めることができる。
【００９７】
位相限定相関法では、第１の画像と第２の画像から、被観察物体Ｓの像（点像強度分布）の相対的な移動量を求めることは可能である。しかしながら、位相限定相関法では、一方の画像に対する他方の画像の移動方向は求めることはできない。よって、位相限定相関法では、被観察物体Ｓが合焦位置に対して前後のどちら側に位置しているかを求めることができない。
【００９８】
これに対して、本実施形態に係る３次元位置情報取得方法では、一方の画像に対する他方の画像の移動方向を求めることができる。第１の画像と第２の画像には、被観察物体Ｓの像の移動量と移動方向の情報が含まれている。そこで、第１の画像のデータと第２の画像のデータを用いて差演算処理を行い、差演算画像を形成する。
【００９９】
第１の画像と第２の画像には、被観察物体Ｓの像の移動方向の情報が含まれている。よって、差演算画像では、被観察物体Ｓの像の移動方向に応じて像コントラストが変化する。結像光学系ＯＢＳの合焦位置に対する被観察物体Ｓのずれの方向に応じて、被観察物体Ｓの像の移動方向が変化する。そこで、差演算画像の像コントラストの変化から、被観察物体Ｓの像の移動量を、移動方向も含めて求めることにより、被観察物体が合焦位置に対して前後のどちら側にずれているかを求めることができる。
【０１００】
このように、差演算画像の像コントラストを解析することにより、物体側ずれ量として被観察物体Ｓの３次元位置情報（ｘ，ｙ，δｚ）を求めることができる。また、物体側ずれ量が結像光学系ＯＢＳの焦点深度を超える量に相当する場合は、被観察物体Ｓと結像光学系ＯＢＳの相対距離を変化させれば良い。すなわち、光軸に沿う方向で走査を行えば良い。このようにすることで、物体側ずれ量が結像光学系ＯＢＳの焦点深度を超える量に相当する場合であっても、３次元位置情報の取得が可能になる。
【０１０１】
また、本実施形態に係る３次元位置情報取得方法では、所定の演算は、差演算画像をフーリエ変換する工程を有することが好ましい。
【０１０２】
本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートを図８に示す。図６に示す工程と同じ工程には同じ番号を付し、説明は省略する。ステップＳ３２は、差演算画像をフーリエ変換する工程である。
【０１０３】
被観察物体が蛍光標本である場合を例に説明する。被観察物体の蛍光像の強度分布は、以下の式（８）で表される。説明を簡略化するために１次元モデルを用いている。
【数１】
0006408893.tif 000002
ここで、
ｆｘは、空間周波数、
Ｉ（ｘ）は、蛍光像の強度分布、
Ｍ（ｆｘ）は、結像光学系の伝達関数、
Ｏ（ｆｘ）は、蛍光の発光分布ｏ（ｘ）のフーリエ変換、
である。
【０１０４】
第１の画像と第２の画像を用いて差演算を行うと、差演算画像における像強度分布は以下の式（９）で表せる。
【数２】
0006408893.tif 000003
ここで、
Ｉ＋Δ（ｘ）は、第１の画像の像強度分布、
Ｉ−Δ（ｘ）は、第２の画像の像強度分布、
である。
【０１０５】
また、第１の画像と第２の画像を用いて和演算を行うと、和演算画像における像強度分布は以下の式（１０）で表せる。
【数３】
0006408893.tif 000004
【０１０６】
差演算画像の像強度分布と和演算画像の像強度分布の各々を、フーリエ変換する。フーリエ変換後の強度分布は、それぞれ、以下の式（１１）、（１２）で表される。ここでＦ［  ］はフーリエ変換を表す演算子である。
【数４】
0006408893.tif 000005
【数５】
0006408893.tif 000006
【０１０７】
差演算画像をフーリエ変換することで、３次元位置情報が三角関数で表される。よって、容易に３次元位置情報を取得することができる。
【０１０８】
また、本実施形態に係る３次元位置情報取得方法は、差演算画像を複数の計測領域に分割する工程と、計測領域の各々について、領域内における差演算画像をフーリエ変換する工程と、を有し、フーリエ変換によって、計測領域の各々においてフーリエ係数が算出されることが好ましい。
【０１０９】
本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートを図９に示す。図５に示す工程と同じ工程には同じ番号を付し、説明は省略する。ステップＳ３３は、差演算画像を複数の計測領域に分割する工程である。ステップＳ３４は、各計測領域の各々について、領域内における差演算画像をフーリエ変換する工程である。
【０１１０】
計測領域の設定例を図１０に示す。差演算画像ＳＩＭは、複数の細胞の集合体の画像である。本実施形態に係る３次元位置情報取得方法では、差演算画像ＳＩＭを複数の計測領域に分割する。図１０には、分割された１つの計測領域ＭＡが示されている。この計測領域ＭＡに対して、式（１１）と式（１２）を用いてフーリエ変換を行う。フーリエ変換によって、計測領域ＭＡにおいてフーリエ係数が算出される。
【０１１１】
本実施形態の３次元位置情報取得方法では、差演算画像ＳＩＭ内の任意の位置に計測領域ＭＡを設定し、設定した位置で計測領域ＭＡの領域内における差演算画像をフーリエ変換する。次に、別の位置に計測領域ＭＡを移動させ、移動させた位置で計測領域ＭＡの領域内における差演算画像をフーリエ変換する。このように、計測領域ＭＡの移動と移動した位置でのフーリエ変換を繰り返し行う。このようにすることで、差演算画像を複数の計測領域に分割することと同等の作用効果が得られる。
【０１１２】
差演算画像を複数の計測領域に分割し、計測領域を差演算画像内で走査することで、ＸＹ面内の分解能を向上させることができる。その結果、高い分解能で３次元位置情報を取得することができる。
【０１１３】
また、本実施形態の３次元位置情報取得方法は、フーリエ係数のうち、空間周波数が所定の帯域内のフーリエ係数を抽出する工程を有し、抽出したフーリエ係数を用いて、計測領域に対応する被観察物体の領域について、３次元位置情報を算出することが好ましい。
【０１１４】
本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートを図１１に示す。図９に示す工程と同じ工程には同じ番号を付し、説明は省略する。ステップＳ３５は、フーリエ係数のうち、空間周波数が所定の帯域内のフーリエ係数を抽出する工程である。ステップＳ３６では、フーリエ係数のうち、空間周波数が所定の帯域内のフーリエ係数を抽出し、抽出したフーリエ係数を用いて、計測領域に対応する被観察物体の領域について、３次元位置情報を算出する。
【０１１５】
フーリエ変換を行うことで、フーリエ係数が求まる。式（１１）の虚部Ｉｍ｛  ｝と式（１２）の実部Ｒｅ｛  ｝の比を求めると、以下の式（１３）が得られる。
【数６】
0006408893.tif 000007
【０１１６】
式（１３）は、差演算画像におけるフーリエ係数と、和演算画像におけるフーリエ係数との比を取ったものである。更に式（１３）のアークタンジェントを求めると、以下の式（１４）が得られる。
【数７】
0006408893.tif 000008
【０１１７】
このように、式（１４）に基づいて、フーリエ変換後のスペクトル画像（フーリエ空間での画像）の各画素値から近似的にΔｆｘが求まる。式（１４）におけるΔは画素数を単位とした値である。一方、物体側ずれ量は長さを単位とした値である。撮像素子の１つの画素の大きさは、μｍ等の長さの単位で表されるので、画素の大きさと画素数から、物体側ずれ量を長さの単位として求めることができる。
【０１１８】
計測領域の画像をフーリエ変換すると、計測領域のフーリエ係数が求まる。計測領域内の各画素には電気的なノイズを含め様々なノイズ成分が含まれていることがある。このノイズ成分は画素単位で独立的に含まれることから、フーリエ変換されると高い空間周波数成分に多く含まれてくる。一方、ノイズの影響は低い空間周波数成分では小さくなる。したがって、低い空間周波数成分を用いてΔを求めることでノイズの影響が低減される。
【０１１９】
そこで、所定の帯域を設定して、空間周波数が所定の帯域内のフーリエ係数を抽出する。設定する帯域を、空間周波数が０に近い帯域とすることで、空間周波数が低いフーリエ係数を抽出することができる。その結果、ノイズが少なく、正確な３次元位置情報を取得することができる。
【０１２０】
また、本実施形態の３次元位置情報取得方法では、抽出したフーリエ係数を直線近似し、近似した直線の傾きを算出する工程を有し、傾きから被観察物体の３次元位置情報を算出することが好ましい。
【０１２１】
本実施形態の３次元位置情報取得方法のフローチャートを図１２に示す。図１１に示す工程と同じ工程には同じ番号を付し、説明は省略する。ステップＳ３６は、抽出したフーリエ係数を直線近似し、近似した直線の傾きを算出する工程である。ステップ３６では、抽出したフーリエ係数を直線近似し、近似した直線の傾きから被観察物体の３次元位置情報を算出する。
【０１２２】
直線近似の例を示す。図１３は、計測領域をフーリエ変換し、式（１４）の演算を行った結果の画像であって、（ａ）は２次元の画像、（ｂ）は（ａ）の矢印で示している、Ｙ方向の空間周波数が０である１列の情報を示す画像である。図１４は、図１３（ｂ）のフーリエ係数の断面図とそのフーリエ係数を近似した直線を表す図である。
【０１２３】
計測領域ＭＡの領域内における差演算画像をフーリエ変換することで、計測領域ＭＡのフーリエ係数が求まる。更に、フーリエ変換を用いて、式（１３）と式（１４）の処理を行い、計測領域ＭＡのフーリエ係数を演算した結果を直線近似することで、直線の傾きからΔが求まる。
【０１２４】
上述のように、空間周波数が低いフーリエ係数を用いると、ノイズが少なく、正確な３次元位置情報を取得することができる。ステップ３５では、空間周波数が所定の帯域内のフーリエ係数が抽出されている。そこで、図１４に示すように、抽出したフーリエ係数を直線近似し、近似した直線の傾きを算出する。この傾きは、差演算を行った２つの画像の計測領域ＭＡにおける横ずれ量に相当する。横ずれ量が求まると、式（７）からδｚを求めることができる。よって、この傾きは、３次元位置情報に対応している。
【０１２５】
図１４で求めた直線の傾きは、図１３（ｂ）に示した１６の画素のうちの中央の画素（０周波数）近傍における傾きとみなすことができる。図１４では、１列の画素のフーリエ係数を使って、空間周波数が所定の帯域内のフーリエ係数の抽出と、抽出したフーリエ係数の直線近似を行っている。しかしながら、Ｙ方向の周波数が０前後の複数列の画素を使って平均化を行い、平均化した画素のフーリエ係数を使っても良い。このようにすることで、ノイズの少ない結果が得られる。
【０１２６】
画像内の任意の位置に計測領域ＭＡを設定し、設定した位置で、空間周波数が所定の帯域内のフーリエ係数の抽出と、抽出したフーリエ係数の直線近似と、近似した直線の傾きの算出を行う。そして、算出した傾きを、計測領域ＭＡの中央の画素における傾きにする。次に、別の位置に計測領域ＭＡを移動させ、移動した位置で、空間周波数が所定の帯域内のフーリエ係数の抽出と、抽出したフーリエ係数の直線近似と、近似した直線の傾きの算出を行う。そして、算出した傾きを、計測領域ＭＡの中央の画素における傾きにする。このように、計測領域ＭＡの移動と移動した位置での処理を繰り返し行う。その結果、画像の画素に対応した傾きが求まる。
【０１２７】
本実施形態の３次元位置情報取得方法では、各画素における傾きから各画素での横ずれ量が符号の正負を含めて求まる。そのため、δｚについても、合焦位置に対して前後のどちらにずれているかを含めてδｚを求めることができる。そして、このδｚと画素の位置情報から３次元位置情報を求めている。このようなことから、本実施形態の３次元位置情報取得方法によれば、ノイズが少なく、より正確な３次元位置情報を取得することができる。
【０１２８】
また、本実施形態の３次元位置情報取得装置は、光源と、光源からの光を被観察物体に導光する照明光学系と、被観察物体の像を形成する結像光学系と、被観察物体の像を撮像する撮像素子と、開口素子と、撮像で得た画像を演算処理する処理装置と、開口素子を動かす駆動機構と、を有し、開口素子は、被観察物体の各点からの光のうちの一部を通過させる開口部を有し、開口部を第１の位置に移動させることで第１の領域が形成され、開口部を第２の位置に移動させることで第２の領域が形成され、演算処理は、第１の像の画像を取得する第１の取得工程と、第１の取得工程の後に第２の像の画像を取得する第２の取得工程と、第１の像の画像データと第２の像の画像データを用いて所定の演算を行う工程と、を有し、第１の取得工程は、第１の領域を通過した光束に基づいて実行され、第２の取得工程は、第２の領域を通過した光束に基づいて実行され、光学系の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れており、第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有し、所定の演算では、被観察物体の３次元位置情報を算出することを特徴とする。
【０１２９】
第１実施形態の３次元位置情報取得装置について説明する。図１５は第１実施形態の３次元位置情報取得装置を説明するための図であって、（ａ）は３次元位置情報取得装置を示す図、（ｂ）は開口部の位置を示す図、（ｃ）は演算処理を示す図である。
【０１３０】
３次元位置情報取得装置１１は蛍光顕微鏡である。蛍光観察では、被観察物体に励起光が照射されていれば蛍光が発せられる。そのため、図１５（ａ）では、励起光を照射する照明光学系を、透過型の照明光学系にしている。しかしながら、透過型の照明光学系の代わりに、落射型の照明光学系を使用することに問題はない。
【０１３１】
また、暗視野照明では、結像光学系の開口数より大きい角度で照明光を照射するが、このような照明光学系を、透過型また落射型のいずれの構成で用いることでも良い。更に、暗視野照明の入射角を大きくして、被観察物体に対して略垂直な方向から照明する照明光学系を用いても良い。
【０１３２】
図１５（ａ）に示すように、３次元位置情報取得装置１１は、光源１と、照明光学系２と、結像光学系３と、撮像素子４と、開口素子５と、処理装置６と、駆動機構７と、を有する。被観察物体Ｓを挟んで一方の側に照明光学系２が配置され、他方の側に結像光学系３が配置されている。
【０１３３】
照明光学系２は、レンズ２ａとレンズ２ｂを有する。３次元位置情報取得装置１１は蛍光顕微鏡であるため、照明光学系２と被観察物体Ｓとの間に励起フィルタ８が配置されている。励起フィルタ８は、光源１から被観察物体Ｓまでの間であれば、どの位置に配置されていても良い。
【０１３４】
照明光学系２と結像光学系３との間には、ステージ９が配置されている。被観察物体Ｓはステージ９の上に載置されている。ステージ９は光軸ＡＸに沿う方向と、光軸ＡＸと直交する方向に移動可能になっている。
【０１３５】
結像光学系３は、レンズ３ａとレンズ３ｂを有する。レンズ３ａは対物レンズ、レンズ３ｂは結像レンズである。レンズ３ａとレンズ３ｂとの間には、バリアフィルタ１０が配置されている。バリアフィルタ１０は、被観察物体Ｓから撮像素子４までの間であれば、どの位置に配置されていても良い。
【０１３６】
また、開口素子５は被観察物体Ｓから撮像素子４までの間に配置されている。図１５（ａ）では、レンズ３ａとレンズ３ｂとの間に開口素子５が配置されている。図１５（ｂ）に示すように、開口素子５の形状は円形であるが、これに限られない。
【０１３７】
開口素子５は、開口部５ａを有している。開口部５ａは、開口素子５の中心から離れた位置に設けられている。開口部５ａの直径は、開口素子５の半径より小さい。よって、図１５（ｂ）に示すように、開口部５ａの領域は、開口素子５の中心を含まない。
【０１３８】
開口部５ａは、開口素子５の中心から離れた位置に設けられていれば、開口部５ａの直径は開口素子５の半径よりも大きくても良い。図１５（ｂ）では、開口部５ａの形状は円形であるが、これに限られない。
【０１３９】
開口素子５は、不透明な基板、例えば、金属板で構成することができる。この場合、開口部５ａは、金属板に形成された空孔である。また、開口素子５は、透明な基板、例えば、ガラス板やプラスチック板で構成することもできる。この場合、開口部５ａは基板そのものになる。開口部５ａ以外の部分には、不透明な物質が塗布又は蒸着されている。
【０１４０】
また、開口素子５は、液晶素子で構成することもできる。液晶を動作させる領域を変化させることで、開口部５ａ以外の部分を不透明にすることができる。開口素子５を液晶素子で構成した場合、開口素子５を常時、結像光学系３の光路中に配置しておくことができる。
【０１４１】
撮像素子４は、被観察物体Ｓの像位置に配置されている。被観察物体Ｓの位置と結像光学系３の合焦位置が一致したときに、被観察物体Ｓの像が形成される。撮像素子４の位置は、この時の像位置である。
【０１４２】
撮像素子４は被観察物体Ｓの像を撮像する。撮像素子４では、被観察物体Ｓの像の光強度が電気信号に変換される。これにより、被観察物体Ｓの像の画像が取得される。撮像素子４からの電気信号は処理装置６に入力され、処理装置６に被観察物体Ｓの像の画像データが保持される。
【０１４３】
処理装置６には、駆動機構７が接続されている。駆動機構７は開口素子５を、例えば、開口素子５を回転又はスライドさせる。開口素子の動きに対応して、開口部５ａの位置が変化する。
【０１４４】
図１５（ａ）では、駆動機構７は、光軸ＡＸを回転軸として開口素子５を回転させている。これより、開口部５ａの位置が変化する。開口素子５と移動機構７は、結像光学系３の光路に対して挿脱可能になっている。そのために、３次元位置情報取得装置１１は、不図示の移動機構を備えている。結像光学系３の光路中に開口素子５を位置させることで、３次元位置情報の取得を行うことができ、光路の外に開口素子５を位置させることで、蛍光像の観察や撮像を行うことができる。
【０１４５】
光源１から出射した照明光は照明光学系２を通過して、励起フィルタ８に入射する。励起フィルタ８では、特定の波長域の光のみが励起フィルタ８を透過する。励起フィルタ８を透過した光、いわゆる励起光は被観察物体Ｓに入射する。励起光が照射された被観察物体Ｓでは、蛍光が発生する。
【０１４６】
図１５（ａ）では、軸上の点で発生した蛍光が実線で示され、軸外の点で発生した蛍光が破線で示されている。励起光と蛍光は、レンズ３ａに入射する。レンズ３ａを通過した励起光と蛍光は、開口素子５に到達する。開口素子５では、開口部５ａを励起光と蛍光が通過する。開口部５ａは、被観察物体Ｓの各点からの光のうちの一部を通過させる。開口部５ａは、軸上物点からの光と軸外物点からの光が共に通過する位置に配置することが好ましい。
【０１４７】
開口部５ａを通過した励起光と蛍光は、バリアフィルタ１０に入射する。バリアフィルタ１０では、蛍光のみがバリアフィルタ１０を透過する。蛍光はレンズ３ｂに入射し、レンズ３ｂで撮像素子４上に集光される。撮像素子４上には、被観察物体Ｓの蛍光像が形成される。
【０１４８】
３次元位置情報の取得について説明する。第１の取得工程が実行される。処理装置６から指示に基づいて、駆動機構７は開口素子５を回転させる。そして、第１の位置で、駆動機構７は開口素子５の回転を止める。図１５（ａ）は、開口部５ａが第１の位置に移動した状態を示している。光軸ＡＸに沿う方向から見た場合、図１５（ｂ）に示すように、開口部５ａは０°の位置に移動している。０°の位置とは、Ｘ軸よりも０°の表示側の位置で、且つ、Ｙ軸上の位置（Ｙ軸上で正の領域）である。
【０１４９】
開口部５ａを第１の位置に移動させることで、第１の領域が形成される。被観察物体Ｓの各点からの光のうち、第１の領域を通過した光束によって、第１の蛍光像が撮像素子４上に形成される。第１の蛍光像は撮像素子４によって撮像され、これにより第１の蛍光像の画像の取得が行われる。
【０１５０】
第１の取得工程が終了すると、第２の取得工程が実行される。処理装置６から指示に基づいて、駆動機構７は開口素子５を回転させる。そして、第２の位置で、駆動機構７は開口素子５の回転を止める。第２の位置は、第１の位置から１８０°回転した位置である。光軸ＡＸに沿う方向から見た場合、図１５（ｂ）では、開口部５ａは１８０°の位置に移動している。１８０°の位置とは、Ｘ軸よりも１８０°の表示側の位置で、且つ、Ｙ軸上の位置（Ｙ軸上で負の領域）である。１８０°の位置と０°の位置は、Ｘ軸に対して線対称になっている。
【０１５１】
開口部５ａを第２の位置に移動させることで、第２の領域が形成される。被観察物体Ｓの各点からの光のうち、第２の領域を通過した光束によって、第２の蛍光像が撮像素子４上に形成される。第２の蛍光像は撮像素子４によって撮像され、これにより第２の蛍光像の画像の取得が行われる。第１の蛍光像と第２の蛍光像は、被観察物体Ｓの同一領域の像である。
【０１５２】
開口部５ａは、開口素子５の中心から離れた位置に設けられている。よって、結像光学系３の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れている。また、第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有している。
【０１５３】
本実施形態の３次元位置情報取得装置では、第１の像と第２の像は、同一の撮像素子上に形成されることが好ましい。
【０１５４】
同一の撮像素子上に第１の像と第２の像を形成することにより、第１の像と第２の像を画像として取り込む際に発生する位置ずれを防止できる。その結果、第１の画像と第２の画像の全体としての位置合わせの処理が不要になるので、３次元位置情報取得装置１１の構成を簡素にすることができる。
【０１５５】
本実施形態の３次元位置情報取得装置では、開口素子は、照明光学系の瞳位置、結像光学系の瞳位置及び瞳位置と共役な位置の何れか一つの位置に配置されていることが好ましい。
【０１５６】
このようにすることで、軸上物点からの光と軸外物点からの光が共に通過する位置に、第１の領域と第２の領域を形成することができる。
【０１５７】
第２の取得工程が終わると、所定の演算を行う工程を実行する。第１の画像と第２の画像を用いて３次元位置情報を取得する方法については既に説明したので、以下簡単に説明する。
【０１５８】
所定の演算を行う工程では、第１の蛍光像の画像データと第２の蛍光像の画像データを用いて差演算を行う。第１の画像の像強度分布Ｉ０と第２の画像の像強度分布Ｉ１８０を用いて差演算を行い、差演算画像Ｉ０−Ｉ１８０を生成する。また、２つの画像を用いて和演算を行い、和演算画像Ｉ０＋Ｉ１８０を生成する。
【０１５９】
そして、差演算画像Ｉ０−Ｉ１８０と和演算画像Ｉ０＋Ｉ１８０の各々を、複数の計測領域に分割する。図１４（ｃ）において、ＭＡ（Ｘｍ，Ｙｍ）は、１つの計測領域である。ＭＡ（Ｘｍ，Ｙｍ）は、中心座標がＣＰ（Ｘｍ，Ｙｍ）で、Ｘ方向の幅がＷｘ、Ｙ方向の幅がＷｙであり、Ｘ方向にＸｍ±Ｗｘ／２、Ｙ方向にＹｍ±Ｗｙ／２の領域である。
【０１６０】
ＭＡ（Ｘｍ，Ｙｍ）について、点像強度分布の移動量を算出する。この算出は、式（１４）に基づいて行われる。ここで、第１の領域と第２の領域では、開口部５ａはＹ軸上に位置しているので、点像強度分布の移動方向はＹ軸に沿う方向になる。ＣＰ（Ｘｍ，Ｙｍ）における点像強度分布の移動量をΔ（Ｘｍ，Ｙｍ）とすると、Ｙ軸に沿う方向の点像強度分布の移動量はΔｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）で表すことができる。式（１４）から、Δｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）が求まる。
【０１６１】
被観察物体Ｓ上には、ＣＰ（Ｘｍ，Ｙｍ）の共役点が存在する。ＣＰ（Ｘｍ，Ｙｍ）の共役点の位置をｃｐ（ｘｍ、ｙｍ）とする。Δｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）が求まると、式（７）からδｚを算出できる。ここで、Δｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）は、ＣＰ（Ｘｍ，Ｙｍ）における量である。式（７）から算出したδｚはｃｐ（ｘｍ、ｙｍ）における量であるから、δｚ（ｘｍ、ｙｍ）と表すことができる。
【０１６２】
δｚ（ｘｍ、ｙｍ）は、被観察物体Ｓ上の点ｃｐ（ｘｍ、ｙｍ）における物体側ｚ方向のずれ量である。すなわち、δｚ（ｘｍ、ｙｍ）は、点ｃｐ（ｘｍ、ｙｍ）における被観察物体Ｓの表面から合焦位置までの距離を表している。
【０１６３】
計測領域ＭＡを所定の量でＹ方向に移動させながら各位置でΔｙを算出し、算出したΔｙからδｚを求める。このようにすることで、Ｙ方向の各位置における被観察物体Ｓの表面から合焦位置までの距離が求まる。更に、計測領域ＭＡを所定の量でＸ方向に移動させながら各位置でΔｙを算出し、算出したΔｙからδｚを求める。このように、計測領域ＭＡをＸＹ走査させることで、被観察物体Ｓの３次元位置情報を取得することができる。
【０１６４】
このように、本実施形態の３次元位置情報取得装置によれば、被観察物体の光学系の合焦位置からのずれ量が光学系の焦点深度よりも小さい量に相当する場合であっても、このずれ量を検出できるので、高い分解能で３次元位置情報を取得することができる。
【０１６５】
また、本実施形態の３次元位置情報取得装置では、開口部を第３の位置に移動させることで第３の領域が形成され、開口部を第４の位置に移動させることで第４の領域が形成されるようにしても良い。
【０１６６】
例えば、被観察物体Ｓの構造が繊維状だと、計測領域ＭＡのＹ方向の幅Ｗｙより長い領域でエッジ等が無く略一様になっている場合がある。このような被観察物体では、被観察物体が合焦位置からｚ方向にずれた位置にある時でも、その差演算画像は計測領域ＭＡの範囲内で像コントラストが低くなる。そのため、傾きΔｙが正確に求められなくなることがある。このような被観察物体では、計測領域ＭＡのＸ方向にエッジ等が存在する。よって、ｘ方向の差画像からΔｘを求めることで、δｚを求めることが可能になる。
【０１６７】
そこで、０°の位置（第１の位置）や１８０°の位置（第２の位置）とは別に、９０°の位置（第３の位置）と２７０°の位置（第４の位置）に開口部５ａを移動させて、第３の画像と第４の画像を取得する。
【０１６８】
第１の画像の像強度分布Ｉ０と第２の画像の像強度分布Ｉ１８０を用いて差演算を行い、差演算画像Ｉ０−Ｉ１８０を生成する。また、２つの画像の像強度分布を用いて和演算を行い、和演算画像Ｉ０＋Ｉ１８０を生成する。差演算画像Ｉ０−Ｉ１８０と和演算画像Ｉ０＋Ｉ１８０からΔｙが求まる。
【０１６９】
次に、第３の画像の像強度分布Ｉ９０と第４の画像の像強度分布Ｉ２７０を用いて差演算を行い、差演算画像Ｉ９０−Ｉ２７０を生成する。また、２つの画像の像強度分布を用いて和演算を行い、和演算画像Ｉ９０＋Ｉ２７０を生成する。差演算画像Ｉ９０−Ｉ２７０と和演算画像Ｉ９０＋Ｉ２７０からΔｘが求まる。
【０１７０】
Δｘの値とΔｙの値について、所定の値との比較を行う。計測領域ＭＡの範囲内で、計測被検物体Ｓの表面に境界やエッジ等が存在する場合、Ｘ方向とＹ方向の差演算画像の像コントラストは略同じになるので、検出されるΔｘの値とΔｙの値は略同じ値になる。そこで、ΔｘとΔｙの平均値又はΔｘとΔｙのどちらかの値をΔの値とする。そして、このΔを用いてδｚを求める。
【０１７１】
しかし、被観察物体の構造が繊維状で繊維がＹ方向に伸びている場合、Ｙ方向の差演算画像の像コントラストは低くなる。この状態で、Δｙの値が所定の値よりも小さくなると、被観察物体が合焦位置と一致しているのか否かの区別が付かなくなる。このようなときでも、Ｘ方向の差演算画像の像コントラストからΔｘの値が求められる場合は、Δｘの値をΔの値とする。逆に、繊維がＸ方向に伸びている場合は、Δｘの値では、被観察物体が合焦位置と一致しているのか否かの区別が付かなくなる。このようなときには、Δｙの値をΔの値とする。そして、このΔを用いてδｚを求める。
【０１７２】
上述したように、例えば被観察物体の構造が繊維状であり、繊維がＹ方向に伸びている場合では、Ｙ方向の差演算画像の像コントラストが小さくなるので、Δｙの値が所定の値よりも小さくなることがある。この場合、被観察物体が合焦位置と一致していると判定されるので、δｚを求めることができない。これに対して、第１の画像の像強度分布Ｉ０、第３の画像の像強度分布Ｉ９０、第２の画像の像強度分布Ｉ１８０及び第４の画像の像強度分布Ｉ２７０を取得している場合は、Δｘの値が所定の値よりも大きくなるので、δｚを求めることができる。
【０１７３】
第２実施形態の３次元位置情報取得装置について説明する。図１６は第２実施形態の３次元位置情報取得装置を示す図である。図１５と同じ構成には同じ番号を付し、説明は省略する。
【０１７４】
３次元位置情報取得装置２０は、金属等の表面を観察する落射型顕微鏡である。第２実施形態の３次元位置情報取得装置は、結像光学系３の瞳位置ＰＰ以外の瞳位置に、開口素子５を配置した例である。このような構成においても、第１実施形態の３次元位置情報取得装置と同様の効果が得られることを示す。図１６では、照明光は破線で示され、観察物体Ｓからの光は実線で示されている。
【０１７５】
３次元位置情報取得装置２０は、光源１と、照明光学系２と、結像光学系３と、撮像素子４と、開口素子５と、を有する。処理装置と駆動機構は図示を省略している。照明光学系２と結像光学系３は、被観察物体Ｓよりも撮像素子４側に配置されている。
【０１７６】
光源１から出射した照明光は照明光学系２を通過して、開口素子５に到達する。開口素子５では、開口部５ａを照明光が通過する。開口部５ａは、照明光のうちの一部を通過させる。開口部５ａを通過した照明光は、ハーフミラー２１で反射され、レンズ３ａに入射する。レンズ３ａに入射した照明光は、被観察物体Ｓに照射される。被観察物体Ｓはステージ２２に載置されている。
【０１７７】
図１６では、照明光が１点に集光している様子を示している。しかしながら、光源１は面光源なので、被観察物体Ｓ上の必要な範囲に照明光が照射されている。
【０１７８】
被観察物体Ｓからの光はレンズ３ａに入射し、ハーフミラー２１を透過し、レンズ３ｂに入射する。レンズ３ｂに入射した被観察物体Ｓからの光は、レンズ３ｂで撮像素子４上に集光される。撮像素子４上には、被観察物体Ｓの像が形成される。
【０１７９】
３次元位置情報取得装置２０では、開口素子５は結像光学系３の瞳位置ＰＰに配置されていない。開口素子５は照明光学系２に配置されている。開口素子５の配置位置は照明光学系２の瞳位置で、この位置は結像光学系３の瞳位置ＰＰと共役な位置である。３次元位置情報取得装置２０においても、開口部５ａの位置を変えることで、第１の領域と第２の領域が形成される。
【０１８０】
図１６に示すように、３次元位置情報取得装置２０においても、開口部５ａは、開口素子５の中心から離れた位置に設けられている。よって、照明光学系２の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れている。また、第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有している。
【０１８１】
また、結像光学系３の瞳位置ＰＰにおいても、結像光学系３の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れている。また、第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有している。
【０１８２】
３次元位置情報の取得について説明する。第１の取得工程が実行される。第１の取得工程では、開口素子５の回転が行われ、第１の位置で開口素子５の回転が停止する。開口部５ａを第１の位置に移動させることで、第１の領域が形成される。第１の領域を通過した光束によって、被観察物体Ｓが照明される。被観察物体Ｓの第１の像が撮像素子４上に形成される。第１の像は撮像素子４によって撮像され、これにより第１の像の画像の取得が行われる。
【０１８３】
第１の取得工程が終了すると、第２の取得工程が実行される。第２の取得工程では、開口素子５の回転が行われ、第２の位置で開口素子５の回転が停止する。開口部５ａを第２の位置に移動させることで、第２の領域が形成される。第２の領域を通過した光束によって、被観察物体Ｓが照明される。被観察物体Ｓの第２の像が撮像素子４上に形成される。第２の像は撮像素子４によって撮像され、これにより第２の像の画像の取得が行われる。
【０１８４】
第２の取得工程が終わると、所定の演算を行う工程を実行する。第１の画像の像強度分布Ｉ０と第２の画像の像強度分布Ｉ１８０を用いて３次元位置情報を取得する方法は既に説明したので、ここでの説明は省略する。
【０１８５】
第３実施形態の３次元位置情報取得装置について説明する。図１７は第３実施形態の３次元位置情報取得装置を示す図である。図１５と同じ構成には同じ番号を付し、説明は省略する。
【０１８６】
３次元位置情報取得装置３０は、微分干渉顕微鏡である。第３実施形態の３次元位置情報取得装置は、結像光学系３の瞳位置ＰＰ以外の瞳位置に、開口素子５を配置した例である。このような構成においても、第１実施形態の３次元位置情報取得装置と同様の効果が得られることを示す。
【０１８７】
３次元位置情報取得装置３０は、光源１と、照明光学系２と、結像光学系３と、撮像素子４と、開口素子５と、を有する。ステージ、処理装置及び駆動機構は図示を省略している。被観察物体Ｓを挟んで一方の側に照明光学系２が配置され、他方の側に結像光学系３が配置されている。
【０１８８】
光源１から出射した照明光は位相変調器３１を通過して、照明光学系２に入射する。照明光は、レンズ２ａを通過して、開口素子５に到達する。開口素子５では、開口部５ａを照明光が通過する。開口部５ａは、照明光のうちの一部を通過させる。開口部５ａを通過した照明光は、ノマルスキープリズム３２を通過して、レンズ２ｂに入射する。レンズ２ｂに入射した照明光は、被観察物体Ｓに照射される。
【０１８９】
図１７では、照明光が１点に集光している様子を示している。しかしながら、光源１は面光源なので、被観察物体Ｓ上の必要な範囲に照明光が照射されている。
【０１９０】
被観察物体Ｓからの光はレンズ３ａに入射し、ノマルスキープリズム３３と偏光素子３４を通過し、レンズ３ｂに入射する。レンズ３ｂに入射した被観察物体Ｓからの光は、レンズ３ｂで撮像素子４上に集光される。撮像素子４上には、被観察物体Ｓの像が形成される。
【０１９１】
３次元位置情報取得装置３０では、開口素子５は結像光学系３の瞳位置ＰＰに配置されていない。開口素子５は照明光学系２に配置されている。開口素子５の配置位置は照明光学系２の瞳位置ＰＰで、この位置ＰＰは結像光学系３の瞳位置ＰＰと共役な位置である。３次元位置情報取得装置３０においても、開口部５ａの位置を変えることで、第１の領域と第２の領域が形成される。
【０１９２】
図１７に示すように、３次元位置情報取得装置３０においても、開口部５ａは、開口素子５の中心から離れた位置に設けられている。よって、照明光学系２の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れている。また、第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有している。
【０１９３】
また、結像光学系３の瞳位置ＰＰにおいても、結像光学系３の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れている。また、第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有している。
【０１９４】
３次元位置情報の取得について説明する。第１の取得工程が実行される。第１の取得工程では、開口素子５の回転が行われ、第１の位置で開口素子５の回転が停止する。開口部５ａを第１の位置に移動させることで、第１の領域が形成される。第１の領域を通過した光束によって、被観察物体Ｓが照明される。被観察物体Ｓの第１の像が撮像素子４上に形成される。第１の像は撮像素子４によって撮像され、これにより第１の像の画像の取得が行われる。
【０１９５】
第１の取得工程が終了すると、第２の取得工程が実行される。第２の取得工程では、開口素子５の回転が行われ、第２の位置で開口素子５の回転が停止する。開口部５ａを第２の位置に移動させることで、第２の領域が形成される。第２の領域を通過した光束によって、被観察物体Ｓが照明される。被観察物体Ｓの第２の像が撮像素子４上に形成される。第２の像は撮像素子４によって撮像され、これにより第２の像の画像の取得が行われる。
【０１９６】
３次元位置情報取得装置１１や３次元位置情報取得装置２０では、取得された画像は蛍光や散乱光による光の強度のみを表す画像である。一方、３次元位置情報取得装置３０は微分干渉顕微鏡を用いた装置なので、被観察物体が持つ位相分布が、像強度分布として可視化される。よって、３次元位置情報取得装置３０では、被観察物体の像は、位相が光の強度に置き換えられた画像として取得される。この画像は位相分布以外にも被観察物体を透過した背景光の成分を含んでいる。そのため、被観察物体の位相分布から３次元位置情報を取得するには、第２の取得工程を実行する前に、取得した画像を、背景光成分を取り除いた画像に変換する必要がある。
【０１９７】
そのために、第１の取得工程において、相変調器のリターデーション量を＋θに設定した画像と、相変調器のリターデーション量を−θに設定した画像を取得する。それぞれの画像を、Ｉ（＋θ、０°）、Ｉ（−θ、０°）とする。
【０１９８】
同様に、第２１の取得工程において、相変調器のリターデーション量を＋θに設定した画像と、相変調器のリターデーション量を−θに設定した画像を取得する。それぞれの画像を、Ｉ（＋θ、１８０°）、Ｉ（−θ、１８０°）とする。
【０１９９】
更に、９０°の位置（第３の位置）と２７０°の位置（第４の位置）に開口部５ａを移動させて、第３の画像と第４の画像を取得する。この時も、相変調器のリターデーション量を＋θに設定した画像と、相変調器のリターデーション量を−θに設定した画像を取得する。各画像を、Ｉ（＋θ、９０°）、Ｉ（−θ、９０°）、Ｉ（＋θ、２７０°）及びＩ（−θ、２７０°）とする。
【０２００】
以下の式（１５）〜（１８）で表される演算を行なって、第１の画像の像強度分布Ｉ０、第２の画像の像強度分布Ｉ１８０、第３の画像の像強度分布Ｉ９０及び第４の画像の像強度分布Ｉ２７０を生成する。
Ｉ０＝｛Ｉ（＋θ、０°）−Ｉ（−θ、０°）｝
／｛Ｉ（＋θ、０°）＋Ｉ（−θ、０°）｝      （１５）
Ｉ９０＝｛Ｉ（＋θ、９０°）−Ｉ（−θ、９０°）｝
／｛Ｉ（＋θ、９０°）＋Ｉ（−θ、９０°）｝      （１６）
Ｉ１８０＝｛Ｉ（＋θ、１８０°）−Ｉ（−θ、１８０°）｝
／｛Ｉ（＋θ、１８０°）＋Ｉ（−θ、１８０°）｝      （１７）
Ｉ２７０＝｛Ｉ（＋θ、２７０°）−Ｉ（−θ、２７０°）｝
／｛Ｉ（＋θ、２７０°）＋Ｉ（−θ、２７０°）｝      （１８）
【０２０１】
第１の画像の像強度分布Ｉ０、第２の画像の像強度分布Ｉ１８０、第３の画像の像強度分布Ｉ９０及び第４の画像の像強度分布Ｉ２７０を用いて３次元位置情報を取得する方法は既に説明したので、ここでの説明は省略する。
【０２０２】
第４実施形態の３次元位置情報取得装置について説明する。図１８は第４実施形態の３次元位置情報取得装置を示す図である。図１５と同じ構成には同じ番号を付し、説明は省略する。
【０２０３】
３次元位置情報取得装置４０は、共焦点蛍光顕微鏡である。図１８では、照明光は破線で示され、観察物体Ｓからの光は実線で示されている。照明光と観察物体Ｓからの光が同じ光路を進む箇所は、実線になっている。
【０２０４】
３次元位置情報取得装置４０は、光源１と、照明光学系２と、結像光学系３と、撮像素子４と、開口素子５と、を有する。処理装置と駆動機構は図示を省略している。照明光学系２と結像光学系３は、被観察物体Ｓよりも撮像素子４側に配置されている。
【０２０５】
光源１から出射した照明光は照明光学系２を通過して、励起フィルタ８に入射する。励起フィルタ８では、特定の波長域の光のみが励起フィルタ８を透過する。励起フィルタ８を透過した光、いわゆる励起光は、ダイクロイックミラー４１で反射されてピンホールディスク４２に入射する。励起光は照明光学系２によって、ピンホールディスク４２上に集光される。励起光はピンホールディスク４２内のピンホールを通過して、結像光学系３に入射する。
【０２０６】
レンズ３ｂを通過した励起光は、開口素子５に到達する。開口素子５では、開口部５ａを励起光が通過する。開口部５ａは、励起光のうちの一部を通過させる。開口部５ａを通過した励起光はレンズ３ａを介して、被観察物体Ｓに入射する。励起光が照射された被観察物体Ｓでは、蛍光が発生する。
【０２０７】
図１８では、照明光が１点に集光している様子を示している。しかしながら、光源１は面光源なので、ピンホールディスク４２の全体に励起光が照射される。よって、ピンホールディスク４２内の各ピンホールから励起光が出射する。その結果、被観察物体Ｓ上の必要な範囲に、ピンホールディスク４２内のピンホールと共役な点像の集合体として、励起光が照射される。
【０２０８】
励起光と蛍光は、レンズ３ａに入射する。レンズ３ａを通過した励起光と蛍光は、開口素子５に到達する。開口素子５では、開口部５ａを励起光と蛍光が通過する。開口部５ａは、被観察物体Ｓの各点からの光のうちの一部を通過させる。
【０２０９】
開口部５ａを通過した励起光と蛍光は、レンズ３ｂを通過して、ピンホールディスク４２上に集光する。励起光と蛍光はピンホールディスク４２内のピンホールを通過して、ダイクロイックミラー４１を透過し、バリアフィルタ１０に入射する。バリアフィルタ１０では、蛍光のみがバリアフィルタ１０を透過する。蛍光はレンズ４３に入射し、レンズ４３で撮像素子４上に集光される。撮像素子４上には、被観察物体Ｓの蛍光像が形成される。
【０２１０】
３次元位置情報取得装置４０では、開口素子５は結像光学系３の瞳位置ＰＰに配置されている。３次元位置情報取得装置４０においても、開口部５ａの位置を変えることで、第１の領域と第２の領域が形成される。
【０２１１】
図１８に示すように、３次元位置情報取得装置４０においても、開口部５ａは、開口素子５の中心から離れた位置に設けられている。よって、結像光学系３の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れている。また、第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有している。
【０２１２】
３次元位置情報の取得について説明する。第１の取得工程が実行される。第１の取得工程では、開口素子５の回転が行われ、第１の位置で開口素子５の回転が停止する。開口部５ａを第１の位置に移動させることで、第１の領域が形成される。第１の領域を通過した光束によって、被観察物体Ｓが照明される。被観察物体Ｓの第１の像が撮像素子４上に形成される。第１の像は撮像素子４によって撮像され、これにより第１の像の画像の取得が行われる。
【０２１３】
第１の取得工程が終了すると、第２の取得工程が実行される。第２の取得工程では、開口素子５の回転が行われ、第２の位置で開口素子５の回転が停止する。開口部５ａを第２の位置に移動させることで、第２の領域が形成される。第２の領域を通過した光束によって、被観察物体Ｓが照明される。被観察物体Ｓの第２の像が撮像素子４上に形成される。第２の像は撮像素子４によって撮像され、これにより第２の像の画像の取得が行われる。
【０２１４】
第２の取得工程が終わると、所定の演算を行う工程を実行する。第１の画像の像強度分布Ｉ０と第２の画像の像強度分布Ｉ１８０を用いて３次元位置情報を取得する方法は既に説明したので、ここでの説明は省略する。
【０２１５】
３次元位置情報取得装置４０では、結像光学系３によって、ピンホールディスク４２上には点像が形成される。ピンホールディスク４２内のピンホールの直径は、この点像の直径と略同じに設定されている。これは、結像光学系３の倍率が高い場合の共焦点効果を十分に確保するためと、撮像素子４上に形成される蛍光像の明るさを十分に確保するためである。
【０２１６】
図１（ｂ）で示した４×４画素の領域を、ピンホール内の領域とみなす。結像光学系３の倍率が高い場合、ピンホールディスク４２上に形成された点像の強度分布は、図１（ｂ）に示す斜線の範囲になる。結像光学系３の倍率が低い場合は、結像光学系３の倍率が高い場合に比べてＮＡ’が大きくなることが多い。ＮＡ’が大きいと、ピンホールディスク４２上に形成された点像の強度分布は、図１（ｃ）に示す斜線の範囲になる。
【０２１７】
結像光学系３のＮＡ’が大きい場合、点像強度分布における広がりはピンホールの直径よりも小さくなる。この場合、点像強度分布における広がりが大きくなるまで、像の明るさには変化が生じない。そのため、従来の共焦点顕微鏡では、ＮＡ’が大きい光学系、例えば結像光学系３の倍率が低い場合は、結像光学系３の倍率が高い場合に比べて共焦点効果が低下する。その結果、結像光学系３の倍率が低い場合は、光軸方向の分解能が低下する。
【０２１８】
しかしながら、３次元位置情報取得装置４０では、結像光学系３の瞳位置に開口素子５が配置されている。これにより、結像光学系３の光軸と直交する面内で、第１の領域の中心位置と第２の領域の中心位置は、共に、光軸から離れている。また、第１の領域と第２の領域は、互いに重複しない領域を少なくとも有している。
【０２１９】
そのため、被観察物体Ｓが結像光学系３の合焦位置からずれると、ピンホール内の点像強度分布がピンホールディスク４２の面内で移動し、これに伴って、撮像素子４上に投影される点像も撮像素子４上を移動する。
【０２２０】
しかも、物体側ずれ量が焦点深度よりも小さい量に相当する場合であっても、点像強度分布はピンホール内で移動する。これに伴って、撮像素子４上に投影される点像も、撮像素子４上を移動する。物体側ずれ量が焦点深度よりも小さい量に相当する場合であっても、そのずれ量を検出することができる。
【０２２１】
このように、３次元位置情報取得装置４０では、Δを求めることにより、被観察物体Ｓの各点について合焦位置からのずれ量を求めることができる。よって、３次元位置情報取得装置４０では、結像光学系３の倍率が低い場合であっても、実質的に共焦点効果が低下しないので、３次元位置情報を取得することができる。
【０２２２】
また、３次元位置情報取得装置４０では、物体側ずれ量が焦点深度よりも大きい量に相当する場合は、ピンホールディスク４２内のピンホールによって、物体側ずれ量が大きい部分からの発した蛍光は、ピンホールによってその大半が遮光されてしまう。よって、撮像素子上には、被観察物体Ｓのボケ像は形成されない。
【０２２３】
このように、３次元位置情報取得装置４０では、３次元位置情報の取得精度と、被観察物体Ｓの３次元蛍光画像のＳ／Ｎを向上させることができる。
【０２２４】
３次元位置情報取得方法の応用例１を説明する。図１９は、３次元位置情報取得方法の応用例１を説明する図であって、（ａ）は物体側のずれ量をδＦで階層化する様子を示す図、（ｂ）は被観察物体の形状を示す図、（ｃ）は２値化した３次元画像情報を示す図である。
【０２２５】
ここでは、第１の画像と第２の画像から、各画素におけるΔが式（１４）に基づいて算出され、被観察物体におけるδｚが式（７）に基づいて求まっているものとする。
【０２２６】
図１９（ａ）に示すように、結像光学系の被観察物体側の焦点深度を等間隔でＮ分割した値をδＦとし、被観察物体が結像光学系の合焦位置から遠ざかる方向をマイナスとし、被観察物体が結像光学系の合焦位置近づく方向をプラスとする。
【０２２７】
δｚ（ｘｍ，ｙｍ）をδＦで階層化すると、以下の式（１９）で表される。
δｚ（ｘｍ，ｙｍ）＝ｎδＦ  （ただし、ｎδＦ−δＦ／２≦δｚ（ｘｍ，ｙｍ）＜ｎδＦ＋δＦ／２））      （１９）
ここで、ｎ＝０、±１、±２、・・・・・±Ｎである。
【０２２８】
階層化されたδｚのなかから、１つの階層を選択する。階層化されたδｚに対応するΔは、式（７）から逆算できるので、選択した階層に該当するΔ’を求め、Δ’の値を持つ画素の値を１、それ以外の画素の値を０にする。画素の値が１のときは、被観察物体が存在することを表し、画素の値が０のときは、被観察物体が存在しないことを表す。
【０２２９】
このようにすることで、２値化した３次元画像情報Ｓ（Ｘｍ，Ｙｍ，Δ’（Ｘｍ，Ｙｍ））が生成される。Ｓ（Ｘｍ，Ｙｍ，Δ’（Ｘｍ，Ｙｍ））から被観察物体をδＦでセクショニングした３次元位置情報を取得することができる。
【０２３０】
例えば、図１９（ａ）における、Ｑ１〜Ｑ６の各点の物体側ずれ量は、以下のように表される。
Ｑ１（ｘＱ１，ｙＱ１）については、δｚＱ１（ｘＱ１，ｙＱ１）＝−２δＦ。
Ｑ２（ｘＱ２，ｙＱ２）については、δｚＱ２（ｘＱ２，ｙＱ２）＝  １δＦ。
Ｑ３（ｘＱ３，ｙＱ３）については、δｚＱ３（ｘＱ３，ｙＱ３）＝  １δＦ。
Ｑ４（ｘＱ４，ｙＱ４）については、δｚＱ４（ｘＱ４，ｙＱ４）＝  ３δＦ。
Ｑ５（ｘＱ５，ｙＱ５）については、δｚＱ５（ｘＱ５，ｙＱ５）＝  １δＦ。
Ｑ６（ｘＱ６，ｙＱ６）については、δｚＱ６（ｘＱ６，ｙＱ６）＝  １δＦ。
【０２３１】
１δＦを選択すると、階層化された値１δＦの持つ点は、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ５及びＱ６なのでこれらの点が抽出される。１δＦに該当するΔ’は、Δ１δＦ’になる。上述のように、第１の画像と第２の画像から、Δを算出した画像が生成されている。そこで、この画像を使って、Δ１δＦ’値を持つ画素の値を１とし、それ以外の画素の値を０として、２値化した３次元画像情報Ｓを生成する。
【０２３２】
図１９（ｂ）では、被観察物体において階層化された値１δＦを持つ場所が、斜線で示されている。よって、２値化した３次元画像情報Ｓは、図１９（ｃ）のようになる。
【０２３３】
第１の画像や第２の画像は、被観察物体の光の強度情報を有している。よって、これらの画像と２値化した３次元画像情報Ｓから、被観察物体をδＦでセクショニングした画像を取得することができる。
【０２３４】
更に、光軸に沿う方向で、被観察物体と結像光学系の合焦位置の相対位置を変化させても良い。いわゆるｚ走査を行うことで、結像光学系の合焦位置を被観察物体に対してｚ方向に移動させることが可能になる。このようにすることで、各合焦位置での３次元位置情報とｚ走査の間隔の値を用いて、広範囲な３次元位置情報を取得することができる。
【０２３５】
３次元位置情報取得方法の応用例２を説明する。図２０は、３次元位置情報取得方法の応用例２を説明する図であって、（ａ）は被観察物体の第１段目の面が合焦位置と一致している様子とそのときの画像を示す図、（ｂ）は被観察物体の第２段目の面が合焦位置と一致している様子とそのときの画像を示す図、（ｃ）被観察物体の第３段目の面が合焦位置と一致している様子とそのときの画像を示す図である。
【０２３６】
本実施形態の３次元位置情報取得装置では、第１の取得工程を実施することで第１の像の画像が取得され、第２の取得工程を実施することで第２の像の画像が取得される。更に、第１の位置や第２の位置とは別に、第３の位置と第４の位置に開口部５ａを移動させることで、第３の像の画像と第４の像の画像を取得する。４つの像の画像は光強度を示す画像で、図２０ではＩ（Ｘｍ，Ｙｍ）で示されている。
【０２３７】
所定の演算を行う工程では、第１の画像の像強度分布Ｉ０と第２の画像の像強度分布Ｉ１８０を用いて差演算を行い、差演算画像Ｉ０−Ｉ１８０を生成する。また、２つの画像の像強度分布を用いて和演算を行い、和演算画像Ｉ０＋Ｉ１８０を生成する。次に、第３の画像の像強度分布Ｉ９０と第４の画像の像強度分布Ｉ２７０を用いて差演算を行い、差演算画像Ｉ９０−Ｉ２７０を生成する。また、２つの画像の像強度分布を用いて和演算を行い、和演算画像Ｉ９０＋Ｉ２７０を生成する。
【０２３８】
更に４つの画像の像強度分布を用いて、規格化された差演算画像ＩＮｘと差演算画像ＩＮｙを形成する。差演算画像ＩＮｘと差演算画像ＩＮｙは、それぞれ、以下の式（２０）と（２１）で表される。
【０２３９】
ＩＮｘ＝（Ｉ０−Ｉ１８０）／（Ｉ０＋Ｉ１８０）      （２０）
ＩＮｙ＝（Ｉ９０−Ｉ２７０）／（Ｉ９０＋Ｉ２７０）      （２１）
を形成する。
【０２４０】
続いて、０に近い値を閾値δＴとして設定する。そして、ＩＮｘとＩＮｙの各画素の値に対して、画素の値が閾値以下のときはその画素の値を１とし、画素の値が閾値よりも大きいときはその画素の値を０にする。このようにして、ＩＮｘに関する２値化画像ＭｘとＩＮｙに関する２値化画像Ｍｙを形成する。２値化画像は、図２０ではＩ（Ｘｍ，Ｙｍ）×Ｍ（Ｘｍ，Ｙｍ）で示されている。
【０２４１】
２値化画像Ｍｘと２値化画像Ｍｙは、それぞれ、以下の式（２２）と（２３）で表される。
【０２４２】
Ｍｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）＝１  （ただし、ＩＮｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）＜｜δＴ｜）      
Ｍｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）＝０  （ただし、ＩＮｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）＞｜δＴ｜）      （２２）
Ｍｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）＝１  （ただし、ＩＮｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）＜｜δＴ｜）      
Ｍｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）＝０  （ただし、ＩＮｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）＞｜δＴ｜）      （２３）
【０２４３】
ＩＮｘとＩＮｙの各画素の値は、点像強度分布の移動量Δｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）とΔｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）に対応する。よって、ＩＮｘとＩＮｙの各画素の値が０近傍の値であるということは、Δｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）とΔｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）がそれぞれ０近傍の値であること表している。この場合、式（７）から求めたδｚｘ（ｘｍ，ｙｍ）とδｚｙ（ｘｍ，ｙｍ）も０近傍の値になる。従って、Ｍｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）とＭｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）において、値が１の画素は、被観察物体Ｓのなかで合焦位置と一致している部分を表し、値が０の画素は、被観察物体Ｓのなかで合焦位置から外れた部分を表している。
【０２４４】
各画素について、以下の式（２４）で画像情報を計算すると、被観察物体Ｓの画像から結像光学系の合焦位置と一致している部分のみを抽出した画像ＩＳＥＣ（Ｘｍ，Ｙｍ）を得ることができる。この画像は、図１９ではＭ（Ｘｍ，Ｙｍ）で示されている。
ＩＳＥＣ（Ｘｍ，Ｙｍ）＝｛Ｉ０（Ｘｍ，Ｙｍ）＋Ｉ９０（Ｘｍ，Ｙｍ）
＋Ｉ１８０（Ｘｍ，Ｙｍ）＋Ｉ２７０（Ｘｍ，Ｙｍ）｝
×Ｍｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）×Ｍｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）      （２４）
【０２４５】
被観察物体Ｓと結像光学系３の相対位置をδＴに対応する量だけ変化させて、被観察物体Ｓの画像を取得し、各位置においてＩ（Ｘｍ，Ｙｍ）を算出することにより、各位置における被観察物体Ｓのセクショニング画像を検出することができる。
【０２４６】
δＴに対応するｚ変化量を用いてＭｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）×Ｍｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）を再構成することで、被観察物体の３次元位置情報を求めることができる。更に、Ｉ（Ｘｍ，Ｙｍ）を再構成することで、被観察物体の３次元位置構造を求めることができる。
【０２４７】
ＩＮｘの代わりにＩＮｘにＸ方向のソーベルフィルターを演算した画像を用いてＭｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）を算出し、ＩＮｙの変わりにＩＮｙにＹ方向のソーベルフィルターを演算した画像を用いてＭｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）を算出しても良い。
【０２４８】
また、開口部を０°、９０°、１８０°、２７０°の位置に回転させて画像を取得する例を示したが、回転対称な位置である０°と１８０°の位置に、開口部の位置を回転させて画像を取得しても良い。取得した第１の画像の像強度分布Ｉ０と第２の画像の像強度分布Ｉ１８０の２つの画像だけを用いても、同様の結果が得られる。
【０２４９】
３次元位置情報取得方法の応用例３を説明する。δｚを求めるときに、各計測領域でΔｘとΔｙが算出される。Δｘは第３の画像の像強度分布Ｉ９０と第４の画像の像強度分布Ｉ２７０とのｘ方向の像の横ずれ量であることから、第３の画像の像強度分布Ｉ９０と第４の画像の像強度分布Ｉ２７０とを合成したときに、合成画像のΔｘに対応する画素部分ではｘ方向に像のボケが生じる。同様に第１の画像の像強度分布Ｉ０と第２の画像の像強度分布Ｉ１８０とを合成したときに、合成画像のΔｙに対応する画素部分ではｙ方向に像のボケが発生する。
【０２５０】
そこで、ｘ方向にΔｘの横ずれを補正した後に第３の画像の像強度分布Ｉ９０と第４の画像の像強度分布Ｉ２７０とを合成すると、Δｘに対応する画素部分では像の横ずれ量が０となるので、合焦位置での画像を生成することができる。一方、像の横ずれ量が０であった画素部分には、−Δｘの像移動が発生する。本来、この画素部分ではボケは発生していない。それにもかかわらず、Δｘの補正によって像にボケが発生する。よって、像の横ずれ量が０であった画素部分については、横ずれの補正は行わないようにする。
【０２５１】
このように、像の横ずれ量を調整して画素毎に合焦位置を変化させて、ボケ像を回復させる処理をリフォーカスと呼ぶ。Ｙ方向についても同様に、Δｙの横ずれを補正した後に第１の画像の像強度分布Ｉ０と第２の画像の像強度分布Ｉ１８０とを合成することでリフォーカス処理が可能である。
【０２５２】
リフォーカスの手法としては、一方の画像を他方の特定の画素に対して、Ｘ方向では第３の画像の像強度分布Ｉ９０と第４の画像の像強度分布Ｉ２７０との間でΔｘだけ相対移動させて画像を合成し、Ｙ方向では第１の画像の像強度分布Ｉ０と第２の画像の像強度分布Ｉ１８０との間でΔｙだけ相対移動させて画像を合成する。このＸＹ２方向の合成画像を更に合成することもある。しかしながら、ΔｘとΔｙは整数とは限らない。一方、画像の移動では画素の数は整数で表される。
【０２５３】
そこで、ΔｘとΔｙに基づいて画像を移動させるために、Δｘに対応する整数画素数Δｘ’とΔｙに対応する整数画素数Δｙ’を算出する。そして、第３の画像の像強度分布Ｉ９０と第４の画像の像強度分布Ｉ２７０とのリフォーカスでは画像をΔｘ’だけ相対移動させて合成し、第１の画像の像強度分布Ｉ０と第２の画像の像強度分布Ｉ１８０とのリフォーカスでは画像をΔｙ’だけ相対移動させ合成する。
【０２５４】
以上、画素単位で画像を移動させてリフォーカスを行う方法について説明したが、リフォーカスの手法としては式（１２）を用いる方法もある。式（１０）や式（１２）から横ずれ量Δと和演算画像の関係が分かるので、Δが計測により既知になれば補正（リフォーカス）が可能になる。上述のように、Δは式（１４）から求めることができる。
【０２５５】
式（１２）では、説明を簡略化するために１次元での演算を表しているが、実際には２次元の演算を行っている。よって、式（１２）におけるΔもｘ方向とｙ方向のそれぞれの成分を持つ。そこで、ｘ成分にはΔｘを用い、ｙ成分にはΔｙを用い、式（１２）の両辺をｃｏｓ（２πΔｆ）で割り算する。この割り算によって、式（１２）の右辺ではΔを含む項が消滅するので、割り算を行った後の式（１２）の右辺の結果には横ずれが含まれないことになる。
【０２５６】
式（１２）の左辺は、和演算画像の像強度分布を表しているので、式（１２）の右辺の演算結果も、和演算画像の像強度分布を表している。そこで、割り算を行った後の右辺の演算結果をフーリエ変換することで、横ずれのない和演算画像の像強度分布が得られる。すなわち、像のｘ方向とｙ方向のそれぞれについて横ずれが補正できるので、合焦画像が形成できる。
【０２５７】
この時、割り算には、整数化されたΔｘ’とΔｙ’ではなく、整数化されていないΔｘとΔｙが用いられる。すなわち、Δは整数値に限定されない。よって、１画素より小さい横ずれ量でのリフォーカスが可能になる。その結果、より正確なボケ像補正（リフォーカス）が可能になる。
【０２５８】
第１実施形態の３次元位置情報取得装置１１では、蛍光像の画像が取得される。そこで、Ｉ０、Ｉ９０、Ｉ１８０及びＩ２７０において、各画素について、Δｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）に対応する整数画素数Δｘ’（Ｘｍ，Ｙｍ）と、Δｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）に対応する整数画素数Δｙ’（Ｘｍ，Ｙｍ）を算出する。
【０２５９】
整数画素数Δｘ’（Ｘｍ，Ｙｍ）を用いて、第３の画像の像強度分布Ｉ９０と第４の画像の像強度分布Ｉ２７０に対してリフォーカス処理を行い、Δｘ’（Ｘｍ，Ｙｍ）に対応した画素部分のｘ方向のボケ像の回復を行う。続いて、整数画素数Δｙ’（Ｘｍ，Ｙｍ）を用いて、第１の画像の像強度分布Ｉ０と第２の画像の像強度分布Ｉ１８０に対してリフォーカス処理を行い、Δｙ’（Ｘｍ，Ｙｍ）に対応した画素部分のｙ方向のボケ像の回復を行う。
【０２６０】
各画素についてリフォーカス処理を行うことで、ｘ方向のボケ像を回復した合焦位置での蛍光画像Ｉｘが生成され、ｙ方向も同様にボケ像を回復した合焦位置での蛍光画像Ｉｙが生成される。蛍光画像Ｉｘと蛍光画像Ｉｙから合成した蛍光画像Ｉを形成する。蛍光画像Ｉｘと蛍光画像Ｉｙは、共にボケのない合焦位置の画像となる。よって、蛍光画像Ｉもボケのない合焦位置での画像になる。このように、リフォーカス処理を行うことで、蛍光画像Ｉは全ての画素が合焦位置での画像になるので、ｚ方向の距離情報が無くなったように見える画像（全焦点画像）を形成することが出来る。
【０２６１】
更に、この蛍光画像Ｉと２値化した３次元画像情報Ｓ（Ｘｍ，Ｙｍ，Δ’（Ｘｍ，Ｙｍ））を用いることにより、被観察物体内の各位置情報に蛍光強度を対応させることができる。その結果、被観察物体の３次元蛍光画像を形成することができる。
【０２６２】
３次元位置情報取得方法の応用例４を説明する。第３実施形態の３次元位置情報取得装置３０では、微分位相像の画像が取得される。取得された画像は光の位相を表す画像なので、位相分布を求めることができる。
【０２６３】
第１の画像の像強度分布Ｉ０、第３の画像の像強度分布Ｉ９０、第２の画像の像強度分布Ｉ１８０及び第４の画像の像強度分布Ｉ２７０のそれぞれに、デコンボリューション処理を行い、被観察物体の位相分布φ０（Ｘｍ，Ｙｍ）、φ９０（Ｘｍ，Ｙｍ）、φ１８０（Ｘｍ，Ｙｍ）及びφ２７０（Ｘｍ，Ｙｍ）を再生する。
【０２６４】
整数画素数Δｘ’（Ｘｍ，Ｙｍ）を用いて、φ９０（Ｘｍ，Ｙｍ）とφ２７０（Ｘｍ，Ｙｍ）に対してリフォーカス処理を行い、２つの画像を合成した全画素でボケがない位相分布φｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）を形成する。続いて、整数画素数Δｙ’（Ｘｍ，Ｙｍ）を用いて、φ０（Ｘｍ，Ｙｍ）とφ１８０（Ｘｍ，Ｙｍ）に対してリフォーカス処理を行い、２つの画像を合成した全画素でボケがない位相分布φｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）を形成する。φｘ（Ｘｍ，Ｙｍ）とφｙ（Ｘｍ，Ｙｍ）から、被観察物体のボケの影響のない位相分布φ（Ｘｍ，Ｙｍ）を算出する。
【０２６５】
更に、位相分布φ（Ｘｍ，Ｙｍ）、２値化した３次元画像情報Ｓ（Ｘｍ，Ｙｍ，Δ’（Ｘｍ，Ｙｍ））及びδＦから観察物体の３次元位相分布を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【０２６６】
以上のように、本発明の３次元位置情報取得方法及び３次元位置情報取得装置では、被観察物体の光学系の合焦位置からのずれ量が光学系の焦点深度よりも小さい量に相当する場合であっても、このずれ量を効率よく検出できる。よって、光軸方向に高い分解能で３次元位置情報を取得できる方法や装置に適している。
【符号の説明】
【０２６７】
１  光源
２  照明光学系
２ａ、２ｂ  レンズ
３  結像光学系
３ａ、３ｂ  レンズ
４  撮像素子
５  開口素子
５ａ  開口部
６  処理装置
７  駆動機構
８  励起フィルタ
９  ステージ
１０  バリアフィルタ
１１、２０、３０、４０  ３次元位置情報取得装置
２１  ハーフミラー
２２  ステージ
３１  位相変調器
３２、３３  ノマルスキープリズム
３４  偏光素子
４１  ダイクロイックミラー
４２  ピンホールディスク
４３  レンズ
ＰＰ  光学系の瞳
【図１】
0006408893.tif 000009
【図２】
0006408893.tif 000010
【図３】
0006408893.tif 000011
【図４】
0006408893.tif 000012
【図５】
0006408893.tif 000013
【図６】
0006408893.tif 000014
【図７】
0006408893.tif 000015
【図８】
0006408893.tif 000016
【図９】
0006408893.tif 000017
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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