(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における皮膚の領域における過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる皮膚障害を治療するための医薬の製造における活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量の使用方法であって、前記医薬が皮膚の領域との接触のために提供される、使用方法。
【請求項２】
ＡＰＣの治療上有効な量が前記皮膚の領域における炎症を最小にする、請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
ＡＰＣの治療上有効な量が前記皮膚の領域における、ゆっくりと増殖するおよび／または正常なケラチノサイトのアポトーシスを最小にする、請求項１または請求項２に記載の使用方法。
【請求項４】
ＡＰＣの治療上有効な量が正常ケラチノサイトの増殖を阻害しないか、または正常ケラチノサイトの増殖を誘導する、請求項１または請求項２に記載の使用方法。
【請求項５】
ＡＰＣの治療上有効な量が前記皮膚の領域のｃｍ２当たり１μｇから５ｍｇのＡＰＣである、請求項１または請求項２に記載の使用方法。
【請求項６】
ＡＰＣがゲル、クリーム、軟膏、スプレー、またはローションの製剤の形態で前記皮膚の領域との接触のために提供される、請求項１または請求項２に記載の使用方法。
【請求項７】
ＡＰＣが皮下注射のために適応された組成物の形態で前記皮膚の領域との接触のために提供される、請求項１または請求項２に記載の使用方法。
【請求項８】
前記皮膚障害が以下のプロセスの１つまたは複数によっても特徴付けられる、請求項１または請求項２に記載の使用方法：アポトーシス、炎症、損なわれたバリア機能。
【請求項９】
前記皮膚障害が乾癬、疱疹状皮膚炎、尋常天疱瘡および白斑からなる群より選択される請求項１または請求項２に記載の使用方法。
【請求項１０】
前記皮膚障害が非膿疱性乾癬である、請求項１または請求項２に記載の使用方法。
【請求項１１】
前記乾癬が尋常性乾癬または乾癬性紅皮症である、請求項１０の使用方法。
【請求項１２】
前記皮膚障害が膿疱性乾癬である、請求項１または請求項２に記載の使用方法。
【請求項１３】
前記乾癬が全身性膿疱性乾癬、掌蹠疱症、環状（ａｎｎｕｌａ）膿疱性乾癬、稽留性肢端皮膚炎または疱疹状（ｈｅｒｐｔｉｆｏｒｍｉｓ）膿痂疹である、請求項１２に記載の使用方法。
【請求項１４】
過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる前記皮膚の領域が乾癬のプラークである、請求項１または請求項２に記載の使用方法。
【請求項１５】
抗炎症薬剤をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の使用方法。
【請求項１６】
個体における乾癬を治療するための医薬の製造における活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量の使用方法であって、前記医薬は乾癬プラークに適用される、使用方法。
【請求項１７】
個体における座瘡を治療するための医薬の製造における活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量の使用方法であって、前記医薬が、個体の皮膚の領域との接触のために提供される、使用方法。
【請求項１８】
個体の皮膚の領域における過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる皮膚障害を最小にするために使用されるＡＰＣの治療上有効な量を含む組成物であって、前記組成物が、個体の皮膚の領域との接触のために提供される、組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾癬を含むが限定されないケラチノサイトの過剰増殖によって特徴付けられる皮膚障害に、および前述のものの治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書におけるいずれの従来技術に対する言及も、この従来技術がオーストラリアまたは任意のその他の管轄区域における共通の一般的な知識の一部を形成すること、またはこの従来技術が当業者によって関連すると確認され、理解され、および考えられることが合理的に予想され得ることの承認または示唆の任意の形態ではなく、およびそのように解釈されるべきでない。
【０００３】
乾癬、最も顕著な自己免疫疾患は、性質上慢性的で、および再発性である。これは、バリア機能の障害、表皮ケラチノサイトの過剰増殖および炎症性細胞の明白な浸潤によって特徴づけられる。
【０００４】
炎症性のＴ細胞は、疾患に不可欠であるが、ケラチノサイトは、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、インターフェロン（ＩＮＦ）−γおよびＴＮＦ−α（１、２）に対する統合応答、並びに核因子ＮＦ−κΒ、表皮ケラチノサイトの免疫ホメオスタシスを維持するシグナリング分子（３，４）の活性化を介して、乾癬における病原となる炎症の重要なドライバーであることを最近のデータは示した。
【０００５】
乾癬のための治療法はない。局所的な薬物療法、光線療法、従来の全身性薬剤および生物製剤は、その症候の管理に対して選択肢を提供するだけである。薬剤の併用が中等度から重度の場合について頻繁に必要であり、および良好な長期の予後には、薬物療法の確守を必要とする（５）。
【０００６】
典型的には、局在化した疾患（１０％の体表面領域）は、局所的な薬物療法で管理され、一方でより広い領域では、光線療法または全身療法を必要とする。手掌足裏に局在化した疾患は、この領域における皮膚厚みが局所的療法に適さないため、たいてい全身的に治療される。
【０００７】
局所的治療薬は、クロベタゾールなどのコルチコステロイドおよびカルシトリオールまたはカルシポトリエンなどのビタミンＤ類似体を含む（６、７）。コルチコステロイドは、炎症を減少すること、有糸分裂活性を抑制すること、ターゲットされた領域における血管収縮を生じさせることによって作用する。ビタミンＤ類似体作用の機構は、完全には理解されていないが、これは、ケラチノサイト増殖および分化を調節すると思われる（６）。したがって、これは、非特異的であるが、両方の治療の構成要素は、細胞増殖の阻害を含む。
【０００８】
局所的なコルチコステロイドは、患部における皮膚萎縮症、刺激および乾燥を生じさせることができる。ビタミンＤ類似体は、一般に安全であるが、刺激を生じさせ得るし、一方で非常に大用量に使用される場合にカルシウム過剰血症のリスクがある（８）。
【０００９】
広範な乾癬疾患では、光線療法または全身性治療が使用される。広範な乾癬のための第一選択の治療は、ＵＶＢおよびＵＶＡなどの紫外線を介したものである。しかし、この治療は、特により明るい皮膚色をもつ患者において、火傷および皮膚癌のより大きなリスクに関連する。ＵＶ光療法は効果がないと判明する場合、低用量メトトレキサートも使用することができる。メトトレキサートは、乾癬をおさえることに相当に有効であるが、重篤な毒作用によって厳格に制限される。
【００１０】
疾患の免疫の性質についての知識が増加することにより、Ｔリンパ球、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３をターゲットする生物学的薬剤は、中等度から重度の乾癬において首尾よく利用されてきた（８）。３つの一般に使用されるＴＮＦ阻害剤は、エンブレル（エタナーセプト）、ヒュミラ（アダリムマブ）およびレミケード（インフリキシマブ）を含む。ウステキヌマブ、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３をターゲットする新たな薬剤は、２００９年に販売が承認され、抗ＴＮＦ薬剤に類似の有効性および安全プロフィールをもたらしている（９）。
【００１１】
生物学的薬剤は、以前に利用できた全身性療法を上回るかなりの利点をもたらすが、これらの薬物の臨床治験は、このような化合物の活性が長期において多数の不都合を伴うことを証明した（１０〜１１）。第１に、潜在的な結核菌（ＴＢ）感染を伴う患者では、活動性ＴＢがインフリキシマブでの治療の開始の直後に発症し得る。加えて、ＴＮＦ阻害剤での患者は、肺および播種性ヒストプラスマ症、コクシジオイデス症およびブラストミセス症などの日和見性真菌感染のリスクの増加がある。第２に、リンパ腫および皮膚癌を含む悪性腫瘍の用量依存的なリスクの増加が、いくつかの治療に当てはまる。第３に、患者の一部は、薬剤に応答しないか、または最初の応答を維持することができない。また、生物学的薬剤の利用可能度は、その高い経済的コストによって制限される。
【００１２】
活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）は、抗アポトーシス性ヒト遺伝子ｂｃｌ−２およびＭＩＨＢの遺伝子の発現（ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ）を誘導する。この抗アポトーシス機能に基づいて、ＡＰＣは、器官特異的および非特異的炎症性疾患、自己免疫疾患、新形成および感染性疾患の広範囲を含むアポトーシスが重要である状態の広範囲におけるアポトーシスの極小化について言及されてきた。留意すべきことに、ＡＰＣの使用は、これらの状態における疾患の全ての症候を治療することは示唆されておらず、単にアポトーシスを最小にするだけである（ＷＯ２００１／０７２３２８を参照されたい）。
【００１３】
さらに、本分野における多くは、ＷＯ２００１／０７２３２８において示唆されたものなどの抗アポトーシスの効果が、細胞増殖の機能障害性制御がある障害、特にケラチノサイト過剰増殖を含む障害の治療にＡＰＣを適さなくするはずであるという考えである。特に、ＡＰＣによる細胞アポトーシスの阻止を介したカルシウム誘発細胞死の減弱とは別に、ＡＰＣは、またケラチノサイト増殖に対して強力な刺激性効果を有し、およびＡＰＣは、ＥＰＣＲ、表皮成長因子受容体およびＥＲＫ１／２の活性化を経たオートクリン様式のケラチノサイト生存、増殖および遊走を促進することが知られている（１７、２０）。
【００１４】
乾癬などのケラチノサイト過剰増殖によって特徴付けられる疾患または障害の治療のための、または進行もしくは症候を最小にするための、新たなアプローチおよび療法に対する需要がある。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、上記の問題または限界の１つまたは複数に対処することを探求し、および一定の態様において、過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる皮膚障害について個体を治療する方法であって：
過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる皮膚の領域を有する個体を提供すること；
活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量と皮膚の領域を接触すること；
これにより皮膚障害について個体を治療すること、
を含む方法を提供する。
【００１６】
その他の態様において、乾癬のために個体を治療する方法であって：
乾癬のプラークを有する個体を提供すること；
活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量を含む組成物をプラークに適用すること；
これにより乾癬について個体を治療すること、
を含む方法が提供される。
【００１７】
その他の態様において、座瘡について個体を治療する方法であって：
座瘡を有する個体を提供すること；
活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量を含む組成物を座瘡に適用すること；
これにより座瘡について個体を治療すること、
を含む方法が提供される。
【００１８】
その他の態様において、アトピー性皮膚炎について個体を治療する方法であって：
アトピー性皮膚炎を有する個体を提供すること；
活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量を含む組成物をアトピー性皮膚炎または前述のものを含む皮膚の領域に適用すること；
これによりアトピー性皮膚炎について個体を治療すること、
を含む方法が提供される。
【００１９】
その他の態様において、壊疽性膿皮症について個体を治療する方法であって：
壊疽性膿皮症を有する個体を提供すること；
活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量を含む組成物を壊疽性膿皮症または前述のものを含む皮膚の領域に適用すること；
これにより壊疽性膿皮症について個体を治療すること、
を含む方法が提供される。
【００２０】
もう一つの態様において、ケラチノサイト過剰増殖によって特徴付けられる障害を有する皮膚の領域において創傷治癒または組織再生を誘導する方法であって：
過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる障害を有する皮膚の領域を有する個体を提供すること；
活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量と皮膚の領域を接触すること；
これにより皮膚領域における創傷治癒または組織再生を誘導すること、
を含む方法が提供される。
【００２１】
さらなる態様において、個体における過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる皮膚障害を最小にする際の使用のための、または乾癬、座瘡もしくはアトピー性皮膚炎の治療のためのＡＰＣの治療上有効な量を含む組成物が提供される。
【００２２】
なおさらなる態様において、個体における過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる皮膚障害を最小にするための、または乾癬、座瘡もしくはアトピー性皮膚炎の治療のための医薬の製造におけるＡＰＣの使用が提供される。
【００２３】
なおさらなる態様において、個体における過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる皮膚障害を最小にするための、または乾癬、座瘡またはアトピー性皮膚炎の治療のためのＡＰＣの使用が提供される。
【００２４】
なおさらなる態様において、ＡＰＣの治療上有効な量を含む組成物、および個体における過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる障害の治療の方法におけるＡＰＣの使用のための、または乾癬、座瘡もしくはアトピー性皮膚炎の治療のための説明書を含むキットが提供され、方法は、本明細書において記述したとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】（Ａ）ヒト新生児包皮ケラチノサイトをＡＰＣで４時間、次いでＴＮＦ−αで前処理し、および細胞を７２時間インキュベートして、増殖をＭＴＴアッセイによって検出した。関連した対照と比較した＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）クリスタルバイオレットアッセイを使用して測定した、正常マウス真皮線維芽細胞（ＭＤＦ）、正常ヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）およびヒトリウマチ様滑膜線維芽細胞（ＲＳＦ、赤のもの）の増殖に対するＡＰＣの効果（平均±ＳＤ。Ｎ＝４、別々の実験。＊、‡、＃関連した対照と比較したｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ。（Ｃ）ＲＳＦをＡＰＣで２４時間処理した。ｐ２１およびｐ２７をウエスタンブロッティングによって測定した。
【図２】外来性または内因性のＡＰＣは、増殖を刺激し、および培養されたケラチノサイトのアポトーシスを妨げる。Ａ）増殖は、ＭＴＴアッセイを使用して測定し、およびデータは、対照と比較した％細胞増殖として表した。Ｂ）ＭＴＴアッセイによって検出される、７２時間後のＰＣ  ｓｉＲＮＡおよびＡＰＣ処理に応答したケラチノサイトの増殖。細胞増殖は、対照のパーセンテージとして表してある。Ｃ＆Ｄ）、ケラチノサイトをＰＣ  ｓｉＲＮＡ（０．５μｍ）で処理した。４８時間後、細胞をＴＵＮＥＬ（末端ｄＵＴＰニック−末端標識化）アッセイのために使用して、アポトーシス細胞（黒い矢印は、アポトーシス細胞を示す）を検出し（Ｃ）、高出力顕微鏡法（×２０）下でアポトーシス細胞を計数することによって定量化した（Ｄ）。データは、１５分野（±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝３）を意味する）の視野当たりのアポトーシス細胞の平均数として表してある。グラフは、３回の独立した実験の１つを表す。イメージは、３回の独立した実験の１つを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。スケールバー：４０μｍ。
【図３】ＰＣまたはＥＰＣＲ  ｓｉＲＮＡ処理は、増殖を阻害し、およびＨＵＶＥＣのアポトーシスを促進する。Ａ）ＭＴＴアッセイによって検出される、外因性ＡＰＣまたはＰＣの有無における対照、ＰＣ  ｓｉＲＮＡまたはＥＰＣＲ  ｓｉＲＮＡ（５００ｎＭ）処理に応答したＨＵＶＥＣの増殖率。細胞増殖は、７２時間にわたって対照のパーセンテージ（平均±ＳＤを意味する）として表してある。対照と比較した＊＊Ｐ＜０．０１（１本目のバー）、ＰＣｓｉＲＮＡと比較した＃＃Ｐ＜０．０１（２本目のバー）。Ｂ）組換えＡＰＣの有無におけるＥＰＣＲ（ＲＣＲ２５２）に対する遮断抗体に応答したＨＵＶＥＣの増殖。細胞増殖は、７２時間にわたって対照のパーセンテージ（平均±ＳＤを意味する）として表してある。対照と比較した＊＊Ｐ＜０．０５（１本目のバー）、ＡＰＣ単独と比較した＃Ｐ＜０．０５（５本目のバー）。Ｃ−Ｅ）ＨＵＶＥＣを対照、ＰＣ  ｓｉＲＮＡまたはＥＰＣＲ  ｓｉＲＮＡ（両方とも５００ｎＭにて）で処理した。３６時間後、トランスフェクト細胞を組換えＡＰＣ（１μｇ／ｍｌ）で１２時間処理し、および４８時間にて細胞を収集した。活性なカスパーゼ−３を免疫蛍光染色（白い矢印は、活性なカスパーゼ−３陽性細胞を示す）によって検出し（Ｃ）、インサイチュー細胞死検出キット（白い矢印は、アポトーシス細胞を示す）でアポトーシス細胞を検出した（Ｄ）。イメージは、３回の独立した実験の１つを表す。スケールバー４０μｍ。Ｅ）アポトーシス細胞（Ｄから）を顕微鏡法下で、ＤＡＰＩで同時染色された細胞を計数することによって定量化した。データは、高拡大（４０×）（平均±ＳＥＭ  ｎ＝３）下でのアポトーシス細胞の平均数として表してある。＊Ｐ＜０．０５、対照と比較した＊＊Ｐ＜０．０１（１本目のバー）、ＰＣｓｉＲＮＡ処理と比較したＰ＜０．０５（２本目のバー）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
前述のごとく、本発明時に、ケラチノサイトは、乾癬を含む皮膚炎症性障害の範囲の病理学において決定的に関与することが理解されていた。長年にわたる抗炎症療法の多くは、炎症性細胞の複製を有益に最小にすることが理解されており、炎症性細胞の増殖または複製の阻害が好ましいことを考慮すると、抗アポトーシス性であると予測されたこれらの化合物は、これらの疾患の治療における臨床的使用について考慮されなかった。これらは、抗炎症機能にもかかわらず、本発明の前に、これまでなぜＡＰＣがケラチノサイトの過剰増殖、過形成性またはそうでなければ制御されない増殖によって特徴付けられる皮膚障害を最小にする、または解決することが示唆されなかったかという理由のいくつかである。実際に、ケラチノサイト増殖に対するＡＰＣの刺激効果での公開されたデータは、本発明の前に、乾癬、座瘡およびケラチノサイト過剰増殖によって特徴付けられるその他の皮膚障害などの炎症性皮膚疾患にとってＡＰＣ療法が有害だろうことを暗示することが見られた。
【００２７】
本明細書において記述したように、本発明者らは、驚くべきことに、ＡＰＣがゆっくり増殖する、または正常なヒトケラチノサイトまたは細胞におけるアポトーシスを阻害するが、異常な、または速く増殖するケラチノサイトまたは細胞の増殖を阻害することに対しては効果を有さないことを見いだし、後者は、炎症性皮膚疾患の広範なメディエーターである。
【００２８】
これから、本発明者らは、ケラチノサイト過剰増殖と関連する皮膚障害において、抗アポトーシス性ＡＰＣを媒介したシグナルに対する応答に関して、ケラチノサイトの２つの集団が存在することを認識した。具体的には、ＡＰＣに応答するものは（すなわち、これはＡＰＣの基底レベルに応答してアポトーシスを受けない）、ゆっくりと増殖する、正常な、非炎症性細胞である。さらに、ＡＰＣに応答するものは（すなわち、これはＡＰＣの基底レベルに応答してアポトーシスを受ける）、より速く増殖する、異常な炎症性細胞である。
【００２９】
重要なことに、本発明者は、ＡＰＣがよりゆっくりと増殖する正常細胞の増殖を刺激することができる一方、これが速く増殖する細胞の増殖を阻害する独特の選択的な能力を有することを発見した。ＡＰＣが内皮およびケラチノサイトを含む基底条件下でゆっくりと増殖するか、または正常なヒト細胞の増殖を増強し、およびアポトーシスを阻害するデータを本明細書に示してある。しかし、本発明によれば、ＡＰＣは、細胞の炎症性状態に依存して細胞増殖を差動的に調節し−具体的には、ＡＰＣは、リウマチ様関節炎関節滑膜からＴＮＦ−αで刺激されたケラチノサイトおよび速く増殖する滑膜線維芽細胞の増殖を阻害する。
【００３０】
本明細書において記述した研究から、抗炎症効果は、炎症性細胞に適用されるだろうが、抗アポトーシス効果は、非炎症性であるケラチノサイトに、および炎症性のケラチノサイトにではなく、選択的に、または特異的に適用されるはずであるため、本発明者らは、本発明の前の文献の理解に反して、ケラチノサイト過剰増殖によって特徴付けられる皮膚障害の治療を必要とする患者において、ＡＰＣの抗炎症利益が実現化されるかもしれないことに想到した。
【００３１】
さらに、このような治療の結果は、非炎症性ケラチノサイトの持続的な正常な増殖（ＡＰＣの抗アポトーシス機能により生じる）、およびＡＰＣの投与を介した、抗炎症を含む状態の提供であるはずであり、炎症性の、過剰増殖性ケラチノサイトをアポトーシスにすることができる可能性を伴う。
【００３２】
Ａ．  定義
本明細書に使用され、前後関係が別途必要とする場合を除き、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びに「含むこと」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んだ」などの用語のバリエーションは、さらなる添加剤、成分、整数または工程を除外することは意図されない。
【００３３】
「ケラチノサイト」は、一般にケラチンおよびその他のタンパク質およびステロールを合成する表皮細胞をいう。これらの細胞は、表皮の９５％を構成し、真皮の表皮接合部にて未分化、または基底細胞から形成される。その特徴的な中間体フィラメントタンパク質は、サイトケラチンである。その種々の連続ステージにおいて、ケラチンは、有棘細胞層および顆粒細胞層を形成し、そこで細胞は平らになって、ゆっくりと死滅して最終層、角質層を形成し、これが徐々にはげ落ちる。
【００３４】
「過剰増殖」は、一般に迅速な分裂による異常に高速の細胞増殖をいう。過剰増殖は、いくつかの状況において、主に細胞周期のＧ１、ＳまたはＧ２期において存在する細胞から生じて得る。また、過剰増殖は、過形成ともいわれ得るし、および過剰増殖細胞は、過形成性細胞または組織ともいわれ得る。
【００３５】
「過剰増殖性ケラチノサイト」は、一般に、Ｇ１、ＳまたはＧ２などの細胞周期の間期のステージにおいて存在する傾向があるケラチノサイトである。これらの細胞は、一般に細胞周期チェックポイントＧ０（ギャップゼロ）に存在する点で正常ケラチノサイトとは異なり、これは、間期とは別のステージまたは拡張Ｇ１相のいずれかであり、これには、正常なケラチノサイトがＧ１の最後にて見いだされる限定された位置が続く。また、過剰増殖性ケラチノサイトは、一般に炎症性の遺伝子および特にＮＦ−κＢシグナリング経路に関与する遺伝子の発現を有することによって特徴付けられる。
【００３６】
「正常ケラチノサイト」は、一般にＧ０において、または拡張Ｇ１相において存在する傾向があるケラチノサイトである。一般に、これらのケラチノサイトは、典型的には、ＴＮＦ−αで刺激されなかったものであり、およびこれらは、一般にＮＦ−κＢシグナリング経路の遺伝子の発現を有しない。
【００３７】
「活性化されたプロテインＣ」または「ＡＰＣ」は、一般にプロテインＳに結合し、およびタンパク質加水分解で不活性化する第Ｖａおよび第ＶＩＩＩａ因子によって、およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤の中和を介して線維素溶解を刺激することによって、抗凝血物質として機能するセリンプロテアーゼをいう。Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ６，  ２５６１−２５６７  （１９９２）；  Ｅｓｍｏｎ，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  １２，  １３５−１４５  （１９９２）；  ｖａｎ  Ｈｉｎｓｂｅｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ６５，  ４４４−４５１  （１９８５）。前駆体プロテインＣは、肝臓において主に産生される。活性化は、プロテインＣの重鎖のＮ末端基におけるドデカペプチドの除去によって達成される。プロテインＣ経路は、トロンビンが内皮細胞表面タンパク質、トロンボモジュリンに結合し、およびプロテインＣが内皮細胞プロテインＣ受容体に結合するときに開始する。ＡＰＣは、第Ｖａおよび第ＶＩＩＩａ因子を不活性化することによって形成されるトロンビンの量を制限する。Ｅｓｍｏｎ，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  １２，  １３５−  １４５  （１９９２）。
【００３８】
「治療すること」および「治療」は、疾患、状態もしくは障害を除去すること、または予防的に疾患、病態もしくは障害の症候または合併症の発症を予防することのいずれかで疾患、状態または障害と戦う目的のための患者の管理および看護を一般にいう。
【００３９】
「過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる皮膚障害」は、一般に過剰増殖性ケラチノサイト、および特に正常組織と比較して過剰増殖性ケラチノサイトの存在量が優性である疾患、状態、症候群または同様のものをいう。障害は、炎症性障害でもよく、および典型的には基底層（胚芽層）、有棘層、顆粒層、透明層および角質層の１つまたは複数を含む。皮膚障害の例は、膿疱（化膿性の）および非膿疱（非化膿性の）乾癬を含み、および本明細書において記述した形態および尋常性座瘡または嚢胞性座瘡を含む座瘡を含む。
【００４０】
「治療上有効な量」は、一般に所望の臨床結果を提供する医薬品化合物の量をいう。一定の態様において、ＡＰＣの治療上有効な量は、一般に正常ケラチノサイトに対して抗アポトーシス効果を提供し、および過剰増殖性ケラチノサイトに対してアポトーシス効果を提供し得る、またはしなくてもよい。一つの態様において、ＡＰＣの治療上有効な量は、過剰増殖性ケラチノサイトの増殖を止め、および／または抗炎症効果を提供し得る。関連した量は、本明細書において開示した本発明の方法に従って確立すること、または決定することができる。
【００４１】
「アポトーシスを誘導する量」は、一般に過剰増殖性ケラチノサイトのアポトーシスの誘導のために提供するＡＰＣの量をいう。
【００４２】
「増殖刺激性量」は、一般に非炎症性ケラチノサイト、および特にゆっくりと増殖する、正常な、非過剰増殖性ケラチノサイトの増殖の誘導を提供するＡＰＣの量をいう。
【００４３】
「抗炎症量」は、一般に過剰増殖性ケラチノサイトによって特徴付けられる皮膚障害の炎症の極小化を提供するＡＰＣの量をいう。
【００４４】
Ｂ．  治療の方法
ＡＰＣは、炎症性過剰増殖性ケラチノサイトがアポトーシスを受けることを妨げないという了解の下で、本発明者は、乾癬および座瘡などの障害に対して抗炎症効果を提供するために、以前に本発明の前に考えられたように、炎症性ケラチノサイトがアポトーシスから妨げられる、またはそうでなければ増殖する、もしくは成長するように誘導される場合にそうでなければ生じるだろうこれらの状態を増悪すること、または悪化させることなく、ＡＰＣを使用することができることを認識した。したがって、一定の態様において、過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる皮膚障害について個体を治療する方法が提供される。本方法は：
−過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる皮膚の領域を有する個体を提供すること；
−活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量と皮膚の領域を接触すること；
これにより皮膚障害について個体を治療すること、
を含む。
【００４５】
本方法に従って、ＡＰＣは、ＡＰＣまたは前述のもの含む製剤を関連した領域と接触することによって、過剰増殖性ケラチノサイトの存在によって特徴付けられる皮膚の部位または領域に直接送達される。部位または領域は、座瘡または膿疱性乾癬において生じるような開放創または裂けた皮膚表面であってもよく、またはこれは、実質的に裂けていなくてもよく、すなわち、これは、さらにプラークまたはその他の高くなった、硬化された、または線維性の組織のようでもよい。部位または領域が裂かれている、または同様の意味で開いている場合、ＡＰＣは、通常皮膚表面（たとえば、基底層（胚芽層）、有棘層、顆粒層、透明層）の下にある破裂を囲んでいる表面に、および／または曝露された組織に適用してもよい。
【００４６】
この状況において、本発明者の重要な知見は、たとえば破裂膿疱を囲んでいる領域にて、またはそうでなければ実質的に破裂していない皮膚表面にて、皮膚が実質的に破壊されていない場合、ＡＰＣを必要とされる部位に送達することができるということであった。これは、部位とＡＰＣまたは関連した製剤の直接の接触による局所的送達、敗血症などの播種性の疾患または状態の治療におけるＡＰＣの以前の臨床的全身性適用とは全く異なる何かを可能にする。本発明に従ったＡＰＣの局所的投与は、これが局所的領域へのＡＰＣ送達に関連するリスクを制限し、およびたとえば連続輸液によってＡＰＣの全身性の送達に関連するリスクを実質的に最小にするので、播種性の、または全身性であるというよりはむしろ局所的である疾患に有益で、および適用できる。
【００４７】
懸念の部位に対するＡＰＣの局所的送達は、その他の疾患および状態の治療のための当該技術分野において公知のＡＰＣの投与からの有意な出発である。本発明の時における当該技術分野において公知の方法に従って、ＡＰＣは、好ましくは非経口的に、最も好ましくは静脈内に、ヒト患者に対して約１μｇ／日から約５００ｍｇ／日または約１ＩＵ／ｋｇ／日から約６０００ＩＵ／ｋｇ／日の用量にて投与される。たとえば、米国特許第５，１５１，２６８号および第５，５７１，７８６号を参照されたい。重篤な敗血症については、Ｘｉｇｒｉｓ（商標）は、約１２μｇ／ｋｇ／ｈｒから約３０μｇ／ｋｇ／ｈｒの速度にて、連続的輸液によって投与され、約２時間の輸液後に約４５ｎｇ／ｍｌのＡＰＣの安定状態血漿濃度を与える。本発明は、一般に全身投与による連続輸液に基づいていない。むしろ、これは、本明細書において記述したＡＰＣの治療上有効な量と皮膚の領域を接触することによるＡＰＣの局所的投与に基づく。
【００４８】
ＡＰＣの治療上有効な量と接触される皮膚の領域は、炎症を起こしてもよく、または炎症は、後退していてもよい。一つの態様において、皮膚障害は、以下のプロセスの１つもしくは複数または全てによって特徴付けられる：アポトーシス、炎症、損なわれたバリア機能。
【００４９】
一つの態様において、皮膚の領域は、炎症を起こしている。１つの特に重要な例は、慢性炎症に関連した皮膚の領域である。この皮膚は、乾癬のプラークの外見を有しても、および膿疱に関連して現れてもよいが、プラークは、実質的に非膿疱性であってもよい。
【００５０】
皮膚障害は、乾癬、疱疹状皮膚炎、尋常天疱瘡、白斑および尋常性座瘡または嚢胞性座瘡からなる群より選択されてもよい。
【００５１】
皮膚障害は、非膿疱性乾癬、たとえば尋常性乾癬または乾癬性紅皮症でもよい。
【００５２】
皮膚障害は、膿疱性乾癬、たとえば全身性膿疱性乾癬、掌蹠疱症、環状（ａｎｎｕｌａ）膿疱性乾癬、稽留性肢端皮膚炎または疱疹状（ｈｅｒｐｔｉｆｏｒｍｉｓ）膿痂疹でもよい。
【００５３】
典型的には、状態が乾癬である場合、ＡＰＣと接触される皮膚の領域は、乾癬のプラークである。したがって、もう一つの態様において、乾癬について個体を治療する方法が提供される。本方法は：
−乾癬のプラークを有する個体を提供すること；
−活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量を含む組成物をプラークに適用すること；
これにより乾癬について個体を治療すること、
を含む。
【００５４】
状態が尋常性座瘡である場合、ＡＰＣと接触される皮膚の領域は、破裂および非破裂皮膚を含んでいてもよい。したがって、もう一つの態様において、座瘡について個体を治療する方法が提供される。本方法は：
−座瘡を有する個体を提供すること；
−活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量を含む組成物を座瘡に適用すること；
これにより座瘡について個体を治療すること、
を含む。
【００５５】
状態がアトピー性皮膚炎である場合、ＡＰＣと接触される皮膚の領域は、破裂および非破裂された皮膚を含んでいてもよい。したがって、もう一つの態様において、アトピー性皮膚炎について個体を治療する方法が提供される。方法は：
−アトピー性皮膚炎を有する個体を提供すること；
−活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の治療上有効な量を含む組成物をアトピー性皮膚炎に適用すること；
これによりアトピー性皮膚炎について個体を治療すること、
を含む。
【００５６】
アトピー性皮膚炎は、内因性湿疹、湾曲湿疹、小児性湿疹からなる群より選択される湿疹の形成でもよく、およびこれはまた、「痒疹ベニエ」、「神経真皮炎」または「痒疹素因（ｄｉａｔｈｅｓｉｑｕｅ）」として公知でもよい。
【００５７】
上記にかかわらず、ＡＰＣの投薬量、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる薬剤および／またはプロテインＣ活性化因子は、特定の化合物または使用される化合物の組み合わせ、治療される疾患または状態、疾患または状態の重症度、局所的投与のタイプ、化合物の排出の速度、治療の期間、動物に投与される任意のその他の薬物の同定、動物の年齢、サイズおよび種、並びに医学的な技術において公知の同様の因子で変化するだろうことが当業者には理解される。一般に、化合物または化合物の組み合わせの適切な１日量は、治療効果を生じるのに有効な最低の用量である量であるだろう。投薬量、投薬形態および投与の様式は、健全な医学的な判断の範囲内で主治医によって決定されるだろう。種々の化合物および化合物の組み合わせのための有効な投薬量、剤形および投与の様式は、経験的に決定することができ、このような決定を行うことは、当該技術分野の技術内である。
【００５８】
一定の態様において、仮説によって拘束されないが、ＡＰＣが本発明の選択的な（すなわち、非炎症性の非過剰増殖性細胞に選択的な）抗アポトーシス活性および抗炎症活性を提供するのは、この接触によると考えられるので、ＡＰＣは、皮膚ケラチノサイトとＡＰＣの接触を可能にするように提供されることが重要である。一般に、ＡＰＣと接触した細胞は、以下の特徴、高レベルの活性化されたマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−２および内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、並びに活性化されたＭＡＰキナーゼＥＲＫのより低い活性、およびＡＰＣと細胞のこのような接触を有することによって認識することができ、およびしたがって、治療の治療有効性は、これらの細胞表現型について評価することによって確立することができる。
【００５９】
一定の態様において、ＡＰＣの治療上有効な量は、一般に正常ケラチノサイトに対する抗アポトーシス効果および過剰増殖性ケラチノサイトに対するアポトーシスの効果を提供する。この結果は、以下の通りに評価することができる：細胞生存／増殖（ＭＴＴ）アッセイおよび細胞アポトーシス（ＴＵＮＥＬアッセイ）を測定すること、これによりＡＰＣの治療上有効な量が提供されたかどうかを確立すること。例示的な方法は、さらに本明細書に示してある。
【００６０】
一つの態様において、ＡＰＣの治療上有効な量は、過剰増殖性ケラチノサイトの増殖を止めて、および／または抗炎症効果を提供し得る。この結果は、以下の通りに評価することができる：
−細胞生存度／増殖（ＭＴＴアッセイ）を測定すること；
−炎症性サイトカイン−ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１／２３もしくはＴＮＦ−αについて酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、または
−ＥＰＣＲについてＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．ＭＮ）；
−アポトーシスについてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）またはＰＩプラスアネキシンでのＦＡＣＳ解析；
−ＮＦ−κＢなどの炎症性シグナリング分子を検出するためのウエスタンブロット；
これにより、ＡＰＣの治療上有効な量が提供されたかどうかを確立すること。
【００６１】
もう一つの態様において、上記の結果は、皮膚組織のｇあたり１μｇから１００ｍｇのＡＰＣから皮膚の領域におけるＡＰＣの局所的組織中濃度を確立することによって得られる。これは、同じ慢性のプラークから局所的麻酔下で皮膚パンチ生検を摂取することによって決定することができる。次いで、ＡＰＣの量を当該技術分野において公知の方法によって決定してもよい。一つの例において、生検組織は、氷上で細かく切り刻んで、および溶解する。遠心の後、透明な上清を使用して、ＥＬＩＳＡによってＰＣ濃度をおよび色素産生基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＰＣａアッセイ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）によってＡＰＣ活性を測定する。酵素活性は、λ４５０ｎｍにて単位時間あたりに生成される遊離発色団の吸光度の増大を測定することによって決定される。
【００６２】
一定の態様において、ＡＰＣの治療上有効な量は、ＡＰＣが適用される皮膚の領域のｃｍ２当たり０．１μｇから５０００μｇ、またはＡＰＣが適用される皮膚の領域のｃｍ２当たり１μｇから２０００μｇ、またはＡＰＣが適用される皮膚の領域のｃｍ２当たり１０μｇから１０００μｇ、またはＡＰＣが適用される皮膚の領域のｃｍ２当たり１０μｇから２００μｇまたは１０μｇから４００μｇまたは１０μｇから８００μｇである。
【００６３】
ＡＰＣは、状態の性質に依存して毎日２回までで１週につき１回投与してもよい。これは、一般に２０週の連続した日数を超えない間、または６週の連続した日数を超えないものからしか提供されない。
【００６４】
Ｂ．１  治療の方法−局所的
たとえば、ペースト、ゲル、クリーム、油、ローション、泡、軟膏または同様の物質を使用する局所的治療方法は、関連した皮膚領域が裂かれた皮膚表面を含むものである場合に、これがＡＰＣの炎症性ケラチノサイトがある皮膚組織の関連した層への透過を可能にするので、特に有用である。しかし、これらの治療は、また、皮膚表面が、たとえば乾癬のプラークに実質的に裂かれていない場合に適用され得る。
【００６５】
一つの態様において、ＡＰＣの治療上有効な量は、皮膚の領域のｃｍ２当たり０．１から２０００μｇ、好ましくは２０〜２００μｇのＡＰＣであってもよい。より高い量は、一般に、皮膚がより激しく影響を受ける場合に一般に好ましく、および病変が潰瘍を伴わずに存在する場合、重篤な慢性プラーク−タイプ乾癬で好ましく［１２以上の乾癬領域および重症度指数（ＰＡＳＩ）、１０以上の体表面領域（ＢＳＡ））］、この場合、ＡＰＣは、潰瘍の治癒を促進し得る。皮膚が高度に影響を受けない場合、たとえば病変が潰瘍を伴わずに存在する場合、より低い量が好ましいであろう。
【００６６】
製剤におけるＡＰＣの濃度は、１０ｕｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間であってもよく、および皮膚領域に適用される組成物の容積は、約１００μｌから１０ｍｌである。
【００６７】
一般に関連した状態が乾癬である場合、組成物は、一般に約１０ｍｍの厚さ、好ましくは約３ｍｍの厚さの層で指またはスパチュラなどの無菌の表面で皮膚に提供される。次いで、これを皮膚領域および周囲の領域内に刷り込み、またはマッサージしてもよい。適用は、一般に１日につき１回から１週につき１回および一般に２０週を超えず、または１２週を超えない。
【００６８】
類似の提供手順および投薬療法は、座瘡またはアトピー性皮膚炎の治療に適用してもよい。
【００６９】
一つの態様において、ＡＰＣを含む組成物は、固体の基質、すなわち包帯、ドレッシングまたは同様のものに適用してもよく、次いで基質を関連した皮膚領域に固定される。
【００７０】
Ｂ．２  治療の方法−皮内注射
一定の態様において、上記の結果は、基底ラインよりも少なくとも２倍高いＡＰＣの局所的濃度を確立することによって得られる。ＡＰＣのこの量は、上で述べたとおりＥＬＩＳＡおよび色素産生基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＰＣａアッセイを使用して皮膚生検のＡＰＣ活性を測定することによって測定することができる。皮内または皮下注射は、角質層が無処置であり、およびトピック皮膚層を超えてＡＰＣの限られた透過があるような性質があるときに、投与経路として一般に好ましい。一般に、１ｍｌの注射器で（〜２８〜３４Ｇ）針での微細ゲージ針を使用してもよい。ｃｍ２当たりの〜１の注射で、皮膚の表面領域をカバーするために、複数の注射を与えてもよい。注射当たりの量は、１０μｌから１ｍｌで変化するだろうし、典型的な量は、５０μｌである。一般に、投与は、１日につき１回から１週につき１回まで、および一般に２０週より長くない。皮内または皮下注射は、ＡＰＣのトピック適用と並行して使用することができる。ケラチノサイト過剰増殖によって特徴付けられるその他の状態をこの治療に供してもよいが、好ましい適応症は、乾癬またはアトピー性皮膚炎である。
【００７１】
皮下／皮内投与の例示的な態様は、病変が潰瘍の有無において存在する場合に、重篤な慢性プラーク−タイプ乾癬［１２以上の乾癬領域および重症度指数（ＰＡＳＩ）、１０以上の体表面領域（ＢＳＡ））］において有用であり得る。ＡＰＣは、プラークまたは病変のサイズに応じて、２００〜２０００μｇの用量にて、１２週週間につき２回、続いて４週間の追跡期間、皮下に投与される。注射は、５００μｌから５ｍｌ、好ましくは１ｍｌの総容積で３０ゲージ針によって行われる。ＡＰＣは、病変を囲む等間隔の部位に複数回注射され（皮内に、または皮下に）−病変が＜１０ｃｍ２である場合、４部位があり、および部位および用量の数は、病変サイズの増大に比例して増大する。ＡＰＣは、等張性の緩衝された塩溶液を作製するために水に溶解される。必要に応じて、この治療は、局所的治療と組み合わせることができる。液体におけるＡＰＣは、毎日、皮下治療の同期間の間続けて病変に適用することができる。両方の研究において（局所的治療の有無にで）、ＰＡＳＩ、スタティックＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｇｌｏｂａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ｓＰＧＡ）、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｌｉｆｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＤＬＱＩ）、有害事象およびルーチン血液学的および研究室値（たとえば、サイトカイン、組織学的検査、ＰＣ／ＡＰＣ活性）を解析することができる。予想される結果：１２週にて、全ての患者におけるＰＡＳＩ＞３０％の改善および患者の５０％におけるＰＡＳＩにおける＞６０％の改善が予想される。
【００７２】
一つの態様において、上記方法は、ＡＰＣの抗炎症量と皮膚の領域を接触する工程を含む。
【００７３】
一つの態様において、上記方法は、ＡＰＣの増殖刺激性量と皮膚の領域を接触する工程を含む。
【００７４】
一つの態様において、上記方法は、ＡＰＣのアポトーシスを誘導する量と皮膚の領域を接触する工程を含む。
【００７５】
Ｃ．  ＡＰＣおよびその製剤
上記した方法における使用のためのＡＰＣは、組成物の形態を取っても、またはそうでなければ、下記のとおりのプロセスによって得てもよい。
【００７６】
ＡＰＣは、血漿から精製したプロテインＣのインビトロ活性化によって調製しても、または当該技術分野に周知の方法によって組換えＤＮＡ技術によって調製してもよい。たとえば、米国特許第４，９８１，９５２号、第５，１５１，２６８号、第５，８３１，０２５号、第６，１５６，７３４号、第６，２６８，３４４号および第６，３９５，２７０号を参照されたい。
【００７７】
あるいは、ＡＰＣは、組換えＤＮＡ技術によって直接調製してもよい。たとえば、米国特許第４，９８１，９５２号、第５，１５１，２６８号、第６，１５６，７３４号、第６，２６８，３４４号および第６，３９５，２７０号を参照されたい。組換え活性プロテインＣは、インビトロで組換えヒトプロテインＣチモーゲンを活性化することによって、またはプロテインＣの活性化された形態の細胞から直接的な分泌によって産生してもよい。プロテインＣは、たとえばチモーゲンとしてのヒト腎臓２９３細胞からの分泌、次いで精製して、当業者に公知の技術による活性化を含むトランスジェニック動物、トランスジェニック植物または多様な真核細胞において産生してもよい。
【００７８】
ＡＰＣは、任意の動物の種由来であってもよいが、ヒトＡＰＣが好ましい。
【００７９】
ＡＰＣの断片および誘導体を本発明の実施において使用してもよいが、ただし、これらは本明細書において記述した活性を示す。たとえば、米国特許第５，１５１，２６８号、第５，４５３，３７３号および第５，５１６，６５０号およびＰＣＴ出願ＷＯ  ８９／１２６８５ＷＯ  ０１／５６５３２、ＷＯ  ０１／５９０８４およびＷＯ  ０１／７２３２８を参照されたい。
【００８０】
ＡＰＣは、ヒトＡＰＣのタンパク質分解性、アミド溶解性、エステル分解性およびヒトＡＰＣに特徴的な生物学的（抗凝固性、抗炎症、または線維素溶解促進）活性を有する誘導体でもよい。プロテインＣ誘導体の例は、Ｇｅｒｌｉｔｚ、ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，４５３，３７３号およびＦｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５１６，６５０号によって記述され、その全ての教示は、参照により本明細書に援用される。
【００８１】
ＡＰＣの適切な医薬組成物は、ＡＰＣおよび薬学的に許容される担体を含む。たとえば、米国特許第６，３９５，２７０号および第６，１５９，４６８号およびＰＣＴ出願ＷＯ  ９８／４８８１８、ＷＯ  ０１／５６５３２およびＷＯ  ０１／７２３２８）を参照されたい。ＡＰＣ含有組成物は、一般に増量剤（スクロース、マンニトール、トレハロースおよびラフィノースなど）、塩（塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなど）、緩衝液（クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−アセテートおよびリン酸ナトリウムなど）およびＡＰＣを含む高純度の安定な凍結乾燥された製品であるものでもよい。たとえば、安定な凍結乾燥された組成物は、約１部のＡＰＣ、約７−８の部の間の塩および約５−７部の間の増量剤の重量比を含んでいてもよい。このような安定な凍結乾燥された組成物の例は：バイアル当たり５．０ｍｇ  ＡＰＣ、３０ｍｇスクロース、３８ｍｇ  ＮａＣｌおよび７．５６ｍｇシトラート（ｐＨ  ６．０）である。
【００８２】
Ｃ．１  局所的に投与される製剤
一つの特に好ましい態様において、ＡＰＣは、上のＢ節の元で記述した方法に従って関連した皮膚病変、プラークまたは関連した障害の被験体のその他の皮膚表面への局所的な投与のために適応された組成物または製剤の形態で提供される。このような製剤の例は、直接滴に関連した部位へのＡＰＣの局所的投与を可能にする関連した表面に適用することができるものを含む。これらの製剤は、ゲル、油、スプレー、ロールオン式製剤、軟膏、ローション、泡および同様のものを含む。一つの態様において、ＡＰＣは、メチルセルロースゲルの形態で提供されてもよく、および炭水化物および塩などのスタビライザを含んでもよい。
【００８３】
皮膚軟膏は、通常石油系油基材中の有機、健康、美容または医薬の成分の組み合わせでもよい。これは、皮膚軟膏をより濃く、より水溶性でない製剤にし、これはより長く体の表面上にとどまり、その結果、成分が広く多様な問題を治療するためにより効率的に機能することができる。（Ｔｈｅｒａｐｅｘなどの）企業から注文することができる多くの天然および有機皮膚軟膏がある。
【００８４】
また、プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）泡（０．０５％）を使用してもよい。これは、米国においてコルチコステロイド応答性の皮膚症の炎症性およびそう痒性症状の治療のためにおよびカナダにおいて中等度から重度のアトピー性皮膚炎の炎症性およびそう痒性徴候のために使用されるエマルジョンエアロゾル泡である（Ｏｌｕｘ−Ｅ（プロピオン酸クロベタゾール）泡、０．０５％のＳｔｉｅｆｅｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ（２０１１）。
【００８５】
製剤がゲルである場合、これは１０〜５０００μｇ／ｇのゲルの量でＡＰＣを含んでいてもよい。
【００８６】
Ｃ．２  注射可能薬物製剤
ＡＰＣの特に好ましい製剤は、商標Ｘｉｇｒｉｓ（商標）下で、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄｉａｎａによって販売される製品である。Ｘｉｇｒｉｓ（商標）は、静脈内注入のための無菌の凍結乾燥粉末として供給される。Ｘｉｇｒｉｓ（商標）の５ｍｇバイアルは、５．３ｍｇ／バイアルのヒト組換えＡＰＣ、３１．８ｍｇ／バイアルのスクロース、４０．３ｍｇ／バイアルのＮａＣｌおよび１０．９ｍｇ／バイアルのクエン酸ナトリウムを含み、およびＸｉｇｒｉｓ（商標）の２０ｍｇバイアルは２０．８ｍｇ／バイアルのヒト組換えＡＰＣ、１２４．９ｍｇ／バイアルのスクロース、１５８．１ｍｇ／バイアルのＮａＣｌおよび４２．９ｍｇ／バイアルのクエン酸ナトリウムを含む。バイアルを無菌注射用水、ＵＳＰで再構成して、約２ｍｇ／ｍｌのＡＰＣの濃度を与え、および次いで患者に投与するために、この希釈されたＡＰＣを０．９％のＳｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎに添加して約１００〜約５０００μｇ／ｍｌのＡＰＣの濃度を与える。これは、上のＢ節の元で記述したとおり、皮下注射技術によるＡＰＣの投与のための特に好ましい製剤である。
【００８７】
局所的に、または皮下注射によって投与されるかどうかにかかわらず、一定の態様において、関連した製剤は、ＡＰＣの代わりに、またはこれに加えてプロテインＣを含んでいてもよい。たとえば、ＡＰＣを産生するように内因性プロテインＣ経路によってインビボにおいて活性化されるだろう有効なプロテインＣの量を投与することができる。たとえば、米国特許第５，１５１，２６８号およびＰＣＴ出願ＷＯ９３／０９８０７を参照されたい。上記の如く、プロテインＣは、血漿から精製することができ、または組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。たとえば、米国特許第４，９５９，３１８号、第４，９８１，９５２号、第５，０９３，１１７号、第５，１５１，２６８号、第５，５７１，７８６号、第６，１５６，７３４号、第６，２６８，３４４号および第６，３９５，２７０号を参照されたい。プロテインＣを含む適切な医薬組成物は、公知である（たとえば、米国特許第５，１５１，２６８号および第５，５７１，７８６号を参照されたい）。
【００８８】
また、ＡＰＣの内因性産生は、動物におけるプロテインＣの合成を増加させる薬剤の量を投与することによって増加することができる。たとえば、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０９８０７を参照されたい。適切な薬剤は、筋肉増強剤（たとえば、ダナゾール（ｄａｎａｚｏｌｏｌ））を含む。たとえば、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０９８０７を参照されたい。
【００８９】
一定の態様において、ＡＰＣの内因性産生は、内因性に合成されたプロテインＣからの、および／または同時投与したプロテインＣからのインビボでのＡＰＣの産生を生じさせるのに有効なプロテインＣ活性化因子の量を投与することによって増加することができる。たとえば、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０９８０７を参照されたい。プロテインＣ活性化因子は、ＡＰＣの生成を生じさせ、または増加させる任意の化合物である。適切なプロテインＣ活性化因子は、トロンビン、α−トロンビン、活性部位アシル化トロンビン、トロンビンの類似体および突然変異体（たとえば、トロンビンＥ１９２ＱおよびトロンビンＫ５２Ｅ）、可溶性トロンビン−トロンボモジュリン複合体、トロンビン−トロンボモジュリン複合体のクリアランスまたは減衰を妨げるだろう薬剤、トロンボモジュリンの合成を増強する、またはクリアランスを遅延させる薬剤、毒液（ＰｒｏｔａｃまたはＲｕｓｓｅｌ  Ｖｉｐｅｒ毒液など）、第Ｘａ因子、プラスミン、トリプシンおよびプロテインＣからのＡＰＣの生成を生じさせ、または増大することができる、任意のその他の毒液、酵素または化合物である。たとえば、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０９８０７を参照されたい。好ましいプロテインＣ活性化因子は、トロンビンおよび活性部位アシル化トロンビンである。
【００９０】
いくつかの態様において、ＡＰＣは、１つまたは複数の炎症、細胞増殖およびアポトーシス症を制御するためのもう一つの薬剤と共に投与してもよい。一つの特に好ましい薬剤は、抗ＩＬ−１７抗体、特にＩｘｅｋｉｚｕｍａｂであり、これはＰａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｐｌａｑｕｅ  Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ（ＮＥＪＭ、２０１２）における第ＩＩ相研究において偽薬と比較して皮膚疾患重症度スコアの有意な改善を示した。炎症を制御するための薬剤のその他の例は、ＴＮＦ−α阻害剤および抗炎症サイトカインおよびバイオ医薬品を含む。
【００９１】
この明細書において開示され、および定義された発明は、言及した、またはテキストもしくは図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の全ての代わりの組み合わせまで拡大することが理解されよう。これらの異なる組み合わせの全ては、本発明の種々の代わりの側面を構成する。
【００９２】
本発明のさらなる側面および前述のパラグラフにおいて記述した側面のさらなる態様は、実施例によって示される、および添付の図面を参照して、以下の記述から明らかになるだろう。
【実施例】
【００９３】
実施例１．ゆっくりと増殖する、非炎症性ケラチノサイトおよび乾癬皮膚ケラチノサイトに対するＡＰＣの選択的抗アポトーシス活性を確立する前臨床治験
活性な慢性プラーク乾癬を伴う６人の患者および６人の正常な個体を動員する。彼らは、標本抽出の前に少なくとも４週の間、いずれの治療も受けなかった。２回の６ｍｍのパンチ生検を同じ慢性プラークから局所的麻酔薬下で採取する。ケラチノサイトは、我々が以前に記述したとおりに単離する（２０）。
【００９４】
正常ケラチノサイトをサイトカイン［ＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（５ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１７Ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）］の混合物で処理して、乾癬の表現型を誘導する。ＡＰＣをケラチノサイトに１、１０μｇ／ｍｌにて添加し、および２４、４８および７２時間処理する。細胞増殖／生存を、ＭＴＴアッセイ（Ｂｒｄｕ増殖アッセイ）を使用して調べる。細胞アポトーシスを、ＴＵＮＥＬアッセイ、フローサイトメトリー（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）またはＰＩプラスアネキシン−Ｖ）によって調べる。サイトカイン産生および４つの選択した乾癬関連遺伝子ＴＮＦ、ＤＥＦＢ４、ＣＡＭＰ、ＰＩ３をＲＴ−リアルタイムＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによって検出する。アポトーシスシグナル分子カスパーゼ３、８および９、並びにＭＡＫキナーゼＥＲＫの活性化および発現をウエスタンブロットによって検出する。
【００９５】
結果は、ＡＰＣが乾癬ケラチノサイトのアポトーシスを誘導し、および増殖を遅らせ、一方これが正常なケラチノサイトの増殖および生存を刺激することを示すだろう。また、ＡＰＣは、炎症性サイトカインＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７およびＩＬ−６、並びに乾癬関連分子ＴＮＦ、ＤＥＦＢ４、ＣＡＭＰ、ＰＩ３のレベルをまた減少させる。炎症性メディエーターで処理した正常対照細胞において、細胞増殖は増強され、およびＡＰＣの添加は、この効果を逆転させる。全体として、結果は、ＡＰＣが乾癬ケラチノサイトと関連する炎症を阻害することができるだけでなく、これがこれらの細胞と関連する特徴過剰な増殖も減少させることを明らかに示すだろう。
【００９６】
実施例２．１２週間にわたる皮下ＡＰＣでの第２相パイロット治験
患者選択：重篤な慢性プラーク−タイプ乾癬［１２以上の乾癬領域および重症度指数（ＰＡＳＩ）、１０以上の体表面領域（ＢＳＡ）］である５人の患者を記載してある。主要な包含基準は、少なくとも６ヶ月間安定なプラーク乾癬にかかっていた１８〜７０歳の患者を含む。主要な除外基準は、ｉ）非プラークまたは薬物で誘導された乾癬を有する患者；ｉｉ）研究２８日前以内にリツキシマブ、アバタセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、シクロスポリンまたはミコフェノール酸およびエタナーセプトまたはアナキンラなどの生物剤の使用、ｉｉｉ）研究前の８週間の間に任意の光線療法を含む抗乾癬治療研究前の４週の間に刺激の少ない緩和剤以外での乾癬のために任意の標準的な局所的療法での治療を受けた患者、ｉｖ）研究の間の局所的療法の使用は、頭皮、腋窩および鼠径部にだけクラスＩＩＩ〜ＶＩＩ糖質コルチコイドに限られる；ｖ）任意の能動的または最近の感染症または悪性もしくはその他の自己免疫疾患歴を含み、妊婦も除外基準である。
【００９７】
治療：患者には、１２週間またはプラークが分解するときまで、皮下に１週につき２回４００μｇ  ＡＰＣ／プラークで投与する。ＡＰＣは（前述したように）、末梢周辺に、および乾癬のプラーク下に均一に注射し、およびその他の体側に対称的に局在化される対照プラークに媒体単独（偽薬）を同様に注射する。次いで、患者を、最終的な処理後さらに４週間追跡する。
【００９８】
測定：ＰＡＳＩ、スタティックＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｇｌｏｂａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ｓＰＧＡ）、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｌｉｆｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＤＬＱＩ）、有害事象およびルーチン血液学的および研究室値（たとえば、サイトカイン、組織学的検査、ＰＣ／ＡＰＣ活性）を解析する。安全考慮点は、出血リスク、頭痛、疲労、感染およびアレルギーを含む。関連した細胞および生化学イベントは、白血球、好中球および血小板数；凝固活性、ＰＣ／ＡＰＣレベルおよび血清におけるＡＰＣに対する抗体形成を含む。４ｍｍの生検を採取して、ＰＣ／ＡＰＣおよびＥＰＣＲの組織学的検査、およびアカントーシス、過角化症および不全角化、表皮有糸分裂活性、乳頭状浮腫、拡張およびキャピラリーのねじれおよび、真皮における、角質層、並びに有棘層における好中球などの主な乾癬のパラメーターの評価をそれぞれ行う。
【００９９】
統計分析：ベースライン値、並びに治療の間の週における、および治療の４週間後の値を片側２試料ｔ検定を使用して０．０５の有意水準にて比較する。
【０１００】
結果および考察：ＡＰＣ治療は、安全なことが示され、および十分に許容されるだろうし、および患者は、乾癬病変の少なくとも６０％の回復を示すだろうし、５人の患者のうちの３人は、プラークの完全な回復を示す。ＡＰＣの効果は、４週間の追跡調査の間持続されるだろう。全ての患者は、改善されたＰＡＳＩ、ｓＰＧＡ、ＤＬＱＩを示し、および治療に応答して有害作用なし、および形成されるＡＰＣ抗体なしであろう。表皮の厚みおよび皮膚における炎症性細胞の有意な減少を観察すること、およびＥＰＣＲのケラチノサイト発現の増大、しかし循環ＰＣ／ＡＰＣレベルは、影響を受けない。全体として、結果は、ＡＰＣが安全であり、および乾癬プラークのために十分に許容され、および高度に効果的であることを示すだろう。
【０１０１】
実施例３．１０人の患者における尋常性座瘡についての皮下ａＰＣでの第２相パイロット治験
患者選択：尋常性座瘡である１０人の患者を記載してある。主要な包含基準は：少なくとも６ヶ月間両顔の座瘡を有した１８〜３０歳の患者を含む。主要な除外基準は、任意の能動的または最近の感染症の証拠、または悪性もしくはその他の自己免疫疾患歴、妊婦を含む。
【０１０２】
治療：患者は、１２週間１日に一度または座瘡が回復するとき、ゲル形形態の２００μｇ  ＡＰＣを投与される。患者は、ＬおよびＲの記したゲルの２つのチューブが提供され、および指定された患部（顔の右面上にＲおよび顔の左面上にＬ）にチューブから搾った２ｃｍのゲルを適用し、および均一に塗り込むよう勧められる。次いで、患者を、最終的な治療後にさらに４週間追跡する。
【０１０３】
測定：写真を治療前および４週ごとに撮り、および座瘡領域を、コンピューターを利用するイメージ解析を使用して算出した。有害事象およびルーチンの血液学的および研究室値（たとえば、サイトカイン、組織学的検査、ＰＣ／ＡＰＣ活性）を解析する。出血リスク、頭痛、疲労、感染、アレルギーを含む安全性をモニターする。関連した細胞および生化学イベントは、白血球、好中球および血小板数；凝固活性、ＰＣ／ＡＰＣレベルおよび血清におけるＡＰＣに対する抗体形成を含む。
【０１０４】
統計学的解析：ベースライン値、並びに治療の間の週における、および治療の４週間後の値を片側２試料ｔ検定を使用して０．０５の有意水準にて比較する。
【０１０５】
結果および考察：ＡＰＣ治療は、安全なことが示され、および十分に許容されるだろうし、および患者は、座瘡の少なくとも５０％の回復を示すだろう。ＡＰＣの効果は、４週間の追跡調査の間持続されるだろう。有害作用なし、および形成されるＡＰＣ抗体なしであろう。表皮の厚みおよび皮膚における炎症性細胞の有意な減少およびＥＰＣＲのケラチノサイト発現の増大があるはずだが、しかし循環ＰＣ／ＡＰＣレベルは、影響を受けない。全体として、結果は、ＡＰＣが安全であり、および尋常性座瘡のために十分に許容され、および高度に効果的であることを示すだろう。
【０１０６】
実施例４  ゲル製剤および治療適用
本実施例は、活性成分活性プロテインＣおよび以下の不活性成分を含む、非無菌、低バイオ負荷、保存された、カルボキシルメチルセルロースナトリウムに基づいた局所的ゲルを提供する：カルボキシメチルセルロースナトリウム、氷酢酸、１−リジンハイドロクロライド、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、酢酸ナトリウム三水和物、塩化ナトリウムおよび注射用水。ゲルの各グラムは、１００μｇの活性化されたプロテインＣを含む。
【０１０７】
実施例５  ゲル製剤および治療適用
Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）＊Ｕｌｔｒｅｚ３０重合体（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｉｎｃ）は、キサンタンガムとの組み合わせにおいて１％のサリチル酸および５％の電解質を含む抽出物の存在下においてｐＨ  ４にてこの冷却プロセス製剤において優れた粘性を提供する。Ｇｌｕｃａｍ（商標）＊  Ｅ  ２０湿潤剤は、グリセリンと共に、湿り気を与える。下は、処方である。
【０１０８】
ＩＮＣＩ名、商品名  重量％  機能
Ａ．  １．  脱イオン水  ７９．１５  希釈剤
２．  二ナトリウムＥＤＴＡ、Ｐｒｏｔｅｃｈｅｍ  ＮＡ２  ０．０５  キレート化剤  ３．  、Ｃａｒｂｏｍｅｒ、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）＊Ｕｌｔｒｅｚ  ３０重合体  ０．８０  レオロジー改変剤
Ｂ．  ４．  グリセリン、グリセリン、９９．７％のＵＳＰ  ２．００  湿潤剤    
５．  メチルＧｌｕｃｅｔｈ−２０、Ｇｌｕｃａｍｍ（商標）＊  Ｅ−２０湿潤剤  １．００  湿潤剤
６．  キサンタンガム、Ｋｅｆｔｒｏｌ（登録商標）ＣＧ  ０．２５  増粘剤
７．  水酸化ナトリウム（１８％の溶液）  １．７５  中和剤
Ｄ．  ８．  ブチレングリコール  ６．００  可溶化剤
９．  アルコール、エチルアルコール  ２．００  可溶化剤
１０．  サリチル酸  １．００  抗座瘡薬剤
Ｅ．  １１．  ＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＣＯ−４０  ０．２５  可溶化剤
１２．  ラウリルラクタート、Ｓｃｈｅｒｃｅｍｏｌ（商標）＊ＬＬ  Ｅｓｔｅｒ  ０．２５  軟化薬  
Ｆ．  １３．  フェノキシエタノール（および）エチルヘキシルグリセリン、  Ｅｕｘｙｌ（登録商標）ＰＥ  ９０１０  ０．５０  保存剤
１４．  水、グリセリン  ５．００  抗刺激物。
【０１０９】
手順：
１．  ＰＡＲＴ  Ｄ成分を合わせ、およびサリチル酸結晶が完全に溶解されるまで混合する。後の添加のためにわきに置く。
【０１１０】
２．  水にＥＤＴＡ二ナトリウムを溶解する。ＥＤＴＡ二ナトリウムが完全に溶解されたときに、混合速度を＠４００−５００  ｒｐｍに設定し、水にＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）Ｕｌｔｒｅｚ  ３０ｐ重合体を溶解する。重合体が完全には水和するまで、混合し続ける。
【０１１１】
３．  ＰＡＲＴ  Ｂ成分を均一のスラリーに予め混合する。ＰＡＲＴ  Ａに添加する。均一性を維持するために、必要に応じて混合速度を高める。
【０１１２】
４．  ＰＡＲＴ  ＣをＰＡＲＴ  Ａ／Ｂに添加し、および均一性を維持するために、必要に応じて混合速度を高める。１０分間混合し続ける。
【０１１３】
５．  バッチにＰＡＲＴ  Ｄを添加し、および必要に応じて粘度変化のための任意のはねを減少させるように混合速度を調整する。均一まで混合する。
【０１１４】
６．  ＰＡＲＴ  Ｅ成分を予め混合し、およびバッチに添加する。均一まで混合する。
【０１１５】
７．  ＰＡＲＴ  Ｆ成分を、添加の間に十分に混合しながら個々に添加する。
【０１１６】
ＡＰＣは、１０〜５０００μｇ／ｇゲルまたは０．０１〜０．０５ｗ／ｗ％の量に添加する。
【０１１７】
このゲルは、直接病変領域に適用することができる。
【０１１８】
実施例６  製剤でのスプレーおよび治療適用
ＡＰＣは、注射によってＡＰＣについて上記の通りに等張性無菌溶液に溶けやすくした。スプレー送達は、抜き取り針を使用して２．５ｍｌの注射器内にバイアルの含量まで抜き取ることによって達成した。殺菌されたスプレーノズルを（針の代わりに）注射器の末端に適合して、治療（ＡＰＣまたは生理食塩水）を、全ての影響を受ける表面をカバーするためにプラーク上に均一に吹き付けた。したがって、噴霧剤は、微粒化を得るために必要とされなかったし、単に圧力だけを注射器に適用した。適用は、必要に応じて好ましくは日に一度繰り返した。この技術は、治療の均等な適用範囲を提供する一貫した様式で行うこと、および繰り返すことが容易である。
【０１１９】
実施例７  正常ケラチノサイトに対する抗アポトーシス効果および過剰増殖性ケラチノサイトに対するアポトーシス効果の評価のための技術。
【０１２０】
本発明に従って、ＡＰＣの治療上有効な量は、正常ケラチノサイトに対する抗アポトーシスの効果および過剰増殖性ケラチノサイトに対するアポトーシス効果を一般に提供する。この結果は、以下の通りインビトロにおいてまたはインサイチューにおいて評価することができる：
インビトロ方法１
未処置の能動的乾癬の皮膚を、生検パンチを使用して取り出し、およびケラチノサイトを単離する。簡潔には、細胞（３０００細胞／ウェル）を９６ウェル−プレートに、２００μｌの最終容積に播種して、次いで４時間インキュベートして細胞を付着させる。次いで、細胞を０．１、１および１０μｇ／ｍｌにてＡＰＣで７２時間処理する。
【０１２１】
１）ＭＴＴアッセイによる細胞生存／増殖率：このアッセイにおいて、生存可能な細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼは、テトラゾリウム環を切断して、水性溶液において不溶性である紫のＭＴＴホルマザン結晶を生じる。結晶は、酸性化されたイソプロパノールに溶解することができる。生じる紫の溶液を分光測光法で測定する。細胞数の増大は、形成されるＭＴＴホルマザンの量の増大および吸収の増大を生じる。処理の完了の３時間前に、１０μｌの５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを細胞に添加する、３時間のさらなるインキュベーションの後、ＭＴＴ溶液を除去し、および１００μｌのＤＭＳＯによって置換する。それぞれのウェルの光学密度を６３０ｎｍの参照波長で５７０ｎｍの波長にて決定する。細胞の生存度は、ＯＤに直接相関がある。ＡＰＣは、用量依存的様式で生存度を減少させた。
【０１２２】
２）アポトーシスの割合検出は、ＴＵＮＥＬアッセイ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）またはＰＩプラスアネキシン−Ｖ）と共にＦＡＣＳ解析および活性なカスパーゼ活性によっていた。
【０１２３】
ＴＵＮＥＬアッセイは、製造業者の説明書に従ってインサイチュー細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐｔｙ．  Ｌｔｄ．、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して行う。簡潔には、細胞を新たに調製した０．１％のクエン酸ナトリウム中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過化し、およびフルオレセイン標識したｄＵＴＰの存在下においてターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼと共にインキュベートした（３７℃にて６０分）。ＴＵＮＥＬ陽性細胞を、抗フルオレセインペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）抱合抗体およびＰＯＤ基質反応を使用して視覚化した。切片をＤＡＰＩでの対比染色剤で着色した。アポトーシス細胞の頻度は、高拡大視野（４０×）下でＴＵＮＥＬ陽性細胞および総細胞数を計数し、およびＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合（％）を算出することによって盲検研究者によって決定した。
【０１２４】
ＦＡＣＳ解析：ケラチノサイトをトリプシン処理し、およびＦＡＣＳ洗浄緩衝液（５％のＦＣＳを含むＰＢＳ）で洗浄する。２００μｌの細胞懸濁液を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）もしくはＰＩプラスアネキシン−Ｖまたは抱合抗体とインキュベートし、およびその後に細胞周期／細胞アポトーシスおよびタンパク質発現についてフロー・サイトメーターによって検出する。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析する。
【０１２５】
活性カスパーゼ活性は、ウエスタンブロットによって検出する。処理後、ケラチノサイトをＰＢＳで３回洗浄し、およびプロテアーゼ阻害剤を補った溶解緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１％のＮＰ−４０、０．０２ＭのＴｒｉｓ、６Ｍ尿素／Ｈ２Ｏ）およびホスフェート阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を添加した。細胞可溶化液を１５分間１０，０００ｇにて遠心分離し、および上清を１０％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、およびＰＤＶＦ膜へ転写する。抗ヒトカスパーゼ−３、８および９抗体を検出する。免疫活性は、ＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して検出する。不均等な充填に対して標準化するために抗ヒトβ−アクチン抗体を含めた。
【０１２６】
全てのアポトーシスアッセイにおいて、ＡＰＣは、速く増殖するケラチノサイトのアポトーシスを促進する。
【０１２７】
インビトロ方法２
目的は、ＡＰＣ処理プラークからのケラチノサイトが偽薬処理細胞よりアポトーシスの傾向があるかどうかを決定することである。ＡＰＣを、２つの方法を使用して乾癬プラークに送達する（〜５〜５０ｃｍ２のサイズ）：ｉ）局所的注射（１００ｎｇ〜１ｍｇ）；ｉｉ）溶液をスプレーする（１０ｎｇ〜１ｍｇ）、０．５ｍｌの注射器の末端に殺菌したスプレーノズルを使用する）。ＡＰＣまたは偽薬のいずれかで処理した能動的乾癬の皮膚を、生検穿孔を使用して取り除き、およびケラチノサイトを単離する。細胞を、上記の通りにＦＡＣＳ解析を使用してアポトーシスについて即時に測定する。結果は、偽薬処理した皮膚と比較して、ＡＰＣ処理した皮膚からのアポトーシス細胞が有意高レベルであることを示した。
【０１２８】
インサイチュー方法
インサイチュー細胞アポトーシス：目的は、ＡＰＣ処理プラークからのケラチノサイトが偽薬処理細胞よりアポトーシスの傾向があるかどうかを決定することである。ＡＰＣを、２つの方法を使用して乾癬プラークに送達する（〜５〜５０ｃｍ２のサイズ）：ｉ）局所的注射（１００ｎｇ〜１ｍｇ）；ｉｉ）溶液をスプレーする（１０ｎｇ〜１ｍｇ）、０．５ｍｌの注射器の末端に殺菌したスプレーノズルを使用する）。ＡＰＣまたは偽薬のいずれかで処理した能動的乾癬の皮膚を、生検穿孔を使用して取り除く。皮膚を固定し、および細胞アポトーシスを製造業者の説明書に従ってインサイチュー細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐｔｙ．  Ｌｔｄ．、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して検出する。簡潔には、細胞を新たに調製した０．１％のクエン酸ナトリウム中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過化し、およびフルオレセイン標識したｄＵＴＰの存在下においてターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼと共にインキュベートした（３７℃にて６０分）。ＴＵＮＥＬ陽性細胞を、抗フルオレセインペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）抱合抗体およびＰＯＤ基質反応を使用して視覚化した。切片をＤＡＰＩでの対比染色剤で着色した。アポトーシス細胞の頻度は、高拡大視野（４０×）下でＴＵＮＥＬ陽性細胞および総細胞数を計数し、およびＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合（％）を算出することによって盲検研究者によって決定した。ＡＰＣで処理した皮膚は、偽薬処理した皮膚と比較して、ＴＵＮＥＬ陽性アポトーシス細胞のレベルが有意に高い。
【０１２９】
乾癬のマウスモデル
乾癬異種移植ＳＣＩＤマウスモデル（必要とされる８２匹のマウス）は、前述したように行う（Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ、２００１  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ）。簡潔には、ヒト乾癬プラーク（１ｃｍ２）を、全層皮膚試料を取り除いた後に、〜８週齢のＳＣＩＤマウスの後部上へ移植する。乾癬の移植は、３〜４週において許容され、および乾癬様の疾患は、少なくとも１０週間維持される。ＡＰＣは、２つの方法を使用して乾癬発症後に、８週までの間に影響を受けた皮膚（８／群）に３回／週送達する：ｉ）皮内注射（１０ｎｇ〜１００μｇ）；ｉｉ）０．５ｍｌの注射器の末端に殺菌したスプレーノズルを使用して溶液を吹き付ける（１０ｎｇ〜１００μｇ）。生理食塩水を偽薬対照として使用する。０日目（処理前）および２８日目（処理後）に採取したパンチ生検（２ｍｍ）を一発凍結して、免疫染色および組織学のために処理して、表皮性厚、レーテ釘長（表皮厚の指標）および炎症性細胞の浸潤物を決定する。２８日目において、炎症性メディエーター、分化マーカーおよび接合部タンパク質を測定するために、皮膚を収集する。ＡＰＣ処理は、皮膚の厚みおよび炎症性細胞、特に好中球およびＴ細胞の数を減少させる。ＡＰＣ処理した皮膚における炎症性サイトカインは、偽薬と比較して、減少され、特に腫瘍壊死因子−αおよび間接関連タンパク質、および特にｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１  クローディン、オクルーディンおよびＪＡＭ−Ａが増加される。
【０１３０】
ＢｒｄＵ組み込みを使用する細胞増殖：ＤＮＡ合成を受けている細胞のラベリングを達成するために、成体マウスには、安楽死の２時間前にＢｒｄＵ（１００ｍｇ／ｋｇ）の１回の注射を受け、およびマウス皮膚を収集し、および１０％のホルマリンで固定する。増殖細胞を抗ＢｒｄＵ抗体での免疫染色によって検出する。ＡＰＣ処理細胞は、有意に少ないＢｒｄＵ組み込みを示し、より低い増殖能力を示す。
【０１３１】
実施例８  ５人の患者における１ヶ月にわたる皮下ＡＰＣでの第２相パイロット治験
患者
少なくとも６ヶ月間安定なプラーク乾癬を有し、光線療法または全身性乾癬療法を受け、または候補であった１８〜７０歳の患者。
【０１３２】
除外：
非プラークまたは薬物で誘導される乾癬である患者。
【０１３３】
研究前の８週の間に任意の光線療法を含む抗乾癬の治療および研究前の４週の間に刺激の少ない緩和剤以外の乾癬のための任意の標準的な局所的療法で治療を受けた患者。研究の間の局所的療法の使用は、頭皮、腋窩および鼠径部にだけクラスＩＩＩ〜ＶＩＩ糖質コルチコイドに限られるだろう。
【０１３４】
研究の前の３週の間の感染について臨床証拠がある患者および癌歴がある患者。
【０１３５】
研究デザイン
５人の患者において１ヶ月間の毎週の皮下ＡＰＣ（１００ｕｇ）での第２相パイロット治験。
【０１３６】
ＡＰＣ投与プロトコル。
【０１３７】
５人の別途健康な、慢性プラーク乾癬である男性患者をＡＰＣでの治療のために選択する。薬物を１００ｕｇの投薬量で４週間にわたって毎週投与する。
【０１３８】
ＡＰＣを乾癬プラーク下に直接皮下に注射し、および媒体単独（偽薬）を他方の体側に対称的に局在した対照プラーク下に注射する。その他の２つと同等の対照プラークは、いずれの注射においても研究のために選択しない。
【０１３９】
報告
記述的解析（ベースライン）
局所的な治療前、光線療法前、全身療法前、生物学的療法前の静的医師の全体的な評価の手段によって評価した、ベースライン個体群統計（年齢、重量、ＢＭＩ、民族性）および疾患特徴（乾癬の期間、乾癬によって影響を受ける体領域の割合、平均ＰＡＳＩスコア、顕著な、または重篤な乾癬の存在）。
【０１４０】
有効性および安全性評価
フォトドキュメンテーションおよび／または２０ｍＨｚ超音波による療法の終了（３１日目）後の１日目（療法前）から３日までの有効性。
【０１４１】
３つの異なるプラーク（ＡＰＣおよび媒体投与の部位を含む）をそれぞれの患者において詳細にモニターして、エコープアーバンドにおいて（表皮アカントーシスおよび上皮における浸潤物の両方を表す）、それぞれの患者の乾癬領域におけるパーセンテージ改善および重症度指数（ＰＡＳＩ）減少を決定する。
【０１４２】
組織学的および免疫組織化学的検査、並びにｍＲＮＡについて、１週における、および２４日目（療法の最後）におけるＡＰＣの４日前の皮膚生検（４ｍｍのパンチ生検）。
【０１４３】
組織学および免疫組織化学
組織学的研究は、アカントーシス、過角化症および不全角化、表皮有糸分裂活性、乳頭状浮腫、拡張およびキャピラリーのねじれおよび、真皮における、角質層、並びに有棘層における好中球などの主な乾癬のパラメーターの評価をそれぞれ行う。
【０１４４】
免疫組織化学的研究
安全性
有害事象、重篤な有害事象、ルーチンの血液学的および研究室値、ＡＰＣに対する抗体形成。
【０１４５】
副作用および痒み
遅延型過敏性反応（ＤＴＨ）。
【０１４６】
参照文献
１．  Ｃｈｉｒｉｃｏｚｚｉ，  Ａ．，  Ｇｕｔｔｍａｎ−Ｙａｓｓｋｙ，  Ｅ．，  Ｓｕａｒｅｚ−Ｆａｒｉｎａｓ，  Ｍ．，  Ｎｏｇｒａｌｅｓ，Ｋ．  Ｅ．，  Ｔｉａｎ，  Ｓ．，  Ｃａｒｄｉｎａｌｅ，  Ｉ，  Ｃｈｉｍｅｎｔｉ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｒｕｅｇｅｒ，  Ｊ．  Ｇ．  （２０１１）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １３１，  ６７７−６８７
２．  Ｎｅｓｔｌｅ，  Ｆ．  Ｏ．，  Ｄｉ  Ｍｅｇｌｉｏ，  Ｐ．，  Ｑｉｎ，  Ｊ．  Ｚ．，  ａｎｄ  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，  Ｂ．  Ｊ．  （２００９）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９，  ６７９−６９１
３．  Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ，  Ｍ．  （２００９）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９，  ７７８−７８８
４．  Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ，  Ｍ．  （２０１２）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２４６，  ３４６−３５８
５．  Ｚａｎｎｉ，  Ｇ．  Ｒ．  （２０１２）  Ｃｏｎｓｕｌｔ  Ｐｈａｒｍ  ２７，  ８６−８８，  ９０，  ９３−８６
６．  Ｂｅｒｔｈ−Ｊｏｎｅｓ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，  Ｐ．  Ｅ．  （１９９２）  Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２７，  ７１−７８
７．  Ｋｕｒｉａｎ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｂａｒａｎｋｉｎ，  Ｂ．  （２０１１）  Ｓｋｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｌｅｔｔ  １６，  ４−７
８．  Ｔｒａｎ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｓ．  Ｒ．  （２０１１）  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇ  Ｔｒｅａｔ  ２２，  １８−２６９．  Ｈｅｒｒｉｅｒ，  Ｒ．  Ｎ．  （２０１１）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ６８，  ７９５−８０６
１０．  Ｍｏｎｔｅｓｕ，  Ｍ．  Ａ．，  Ａｄｄｉｓ，  Ｇ．  Ｍ．，  Ｓａｔｔａ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｃｏｔｔｏｎｉ，  Ｆ．  （２０１１）  Ｇ  Ｉｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ  １４６，  ２７３−２８１
１１．  Ｗａｌｌｉｓ，  Ｒ．  Ｓ．  （２０１１）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２５，  ８９５−９１０
１２．  Ｅｓｍｏｎ，  Ｃ．  Ｔ．  （２００４）  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ３２，  Ｓ２９８−Ｓ３０１
１３．  Ｘｕｅ，  Ｍ．，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｃ．  Ｊ．  （２００７）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８２，  １３６１０−１３６１６
１４．  Ｘｕｅ，  Ｍ．，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｄ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｐ．  Ｎ．，  Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｃ．  Ｊ．  （２００５）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １２５，  １２７９−１２８５
１５．  Ｅｓｍｏｎ，  Ｃ．  Ｔ．  （２００４）  Ｍａｔｕｒｉｔａｓ  ４７，  ３０５−３１４
１６．  Ｙｕｋｓｅｌ，  Ｍ．，  Ｏｋａｊｉｍａ，  Ｋ．，  Ｕｃｈｉｂａ，  Ｍ．，  Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｏｋａｂｅ，  Ｈ．  （２００２）  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．  ８８，  ２６７−２７３  
１７．  Ｘｕｅ，  Ｍ．，  Ｍａｒｃｈ，  Ｌ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｐ．  Ｎ．，  Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｃ．  Ｊ．  （２００７）  Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．
１８．  Ｘｕｅ，  Ｍ．，  Ｍａｒｃｈ，  Ｌ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｐ．  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｃ．  Ｊ．  （２００７）  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ５６，  ２８６４−２８７４
１９．  Ｌａｙ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｄｏｎａｈｕｅ，  Ｄ．，  Ｔｓａｉ，  Ｍ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，  Ｆ．  Ｊ．  （２００７）  Ｂｌｏｏｄ  １０９，  １９８４−  １９９１
２０．  Ｘｕｅ，  Ｍ．，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｐ．，  Ｋｅｌｓｏ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｃ．  （２００４）  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２９９，  １１９−  １２７
２１．  ｖａｎ  Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ，  Ａ．  Ｊ．，  ｄｅ  Ｂｏｅｒ，  Ｈ．  Ｃ，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｅｒ，  Ｅ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｒａｂｅｌｉｎｋ，  Ｔ．  Ｊ．  （２０１０）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ６９，  ｉ５７−ｉ６０
２２．  Ｆｅｉｓｔｒｉｔｚｅｒ，  Ｃ，  ａｎｄ  Ｒｉｅｗａｌｄ，  Ｍ．  （２００５）  Ｂｌｏｏｄ  １０５，  ３１７８−３１８４
２３．  Ｆｉｎｉｇａｎ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｄｕｄｅｋ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，  Ｐ．  Ａ．，  Ｃｈｉａｎｇ，  Ｅ．  Ｔ．，  Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｃａｍｐ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｙｅ，  Ｓ．  Ｑ．，  ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ，  Ｊ．  Ｇ．  （２００５）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２４．  Ｘｕｅ，  Ｍ．，  Ｃｈｏｗ，  Ｓ．  Ｏ．，  Ｄｅｒｖｉｓｈ，  Ｓ．，  Ｃｈａｎ，  Ｙ．  Ｋ．，  Ｊｕｌｏｖｉ，  Ｓ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｃ．  Ｊ．  （２０１１）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８６，  ６７４２−６７５０
２５．  Ｖｅｔｒａｎｏ，  Ｓ．，  Ｐｌｏｐｌｉｓ，  Ｖ．  Ａ．，  Ｓａｌａ，  Ｅ．，  Ｓａｎｄｏｖａｌ−Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｍ．，  Ｄｏｎａｈｕｅ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｃｏｒｒｅａｌｅ，  Ｃ，  Ａｒｅｎａ，  Ｖ．，  Ｓｐｍｅｌｌｉ，  Ａ．，  Ｒｅｐｉｃｉ，  Ａ．，  Ｍａｌｅｓｃｉ，  Ａ．，  Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，  Ｆ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄａｎｅｓｅ，  Ｓ．  （２０１１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８，  １９８３０−１９８３５
２６．  Ｕｃｈｉｂａ，  Ｍ．，  Ｏｋａｊｉｍａ，  Ｋ．，  Ｏｉｋｅ，  Ｙ．，  Ｉｔｏ，  Ｙ．，  Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，  Ｋ．，  Ｉｓｏｂｅ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｓｕｄａ，  Ｔ．  （２００４）  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９５，  ３４−４１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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