(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一よりも多くの別個の元素タグ（Tn）で標識された細胞の群（18）を用意すること；
前記細胞の群（18）中の候補細胞（20）を、前記候補細胞（20）の位置を識別することにより選定することであり、前記候補細胞（20）は目的とする特性を有し；
前記候補細胞（20）の前記位置（22）を、前記細胞の群（18）内でのその配置に応じて記録すること；
少なくとも一回のレーザーパルス（24）を、記録した前記位置（22）の前記候補細胞（20）に向けること、および前記少なくとも一回のレーザーパルス（24）毎に離散プルーム（26）を生成することであり、前記離散プルーム（26）それぞれには、前記一よりも多くの別個の元素タグ（Tn）が含まれ；
前記離散プルーム（26）それぞれを誘導結合プラズマ（14）中に導入すること、および前記一よりも多くの別個の各元素タグ（Tn）に対応する元素イオンの群（28）を生成すること；
前記元素イオンの群（28）それぞれを、前記離散プルーム（26）毎にマスサイトメトリーにより同時に検出すること；および
検出された元素イオン（28）を前記目的とする特性と相関させること
を含む、マスサイトメトリーによる細胞分析のための方法。
【請求項２】
一よりも多くの別個の元素タグ（Tn）で標識された前記細胞の群（18）を用意することには、前記細胞の群（18）を一よりも多くの元素結合抗体で標識することが含まれ、前記一よりも多くの元素結合抗体それぞれは、一またはそれよりも多くの別個の元素タグ（Tn）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一またはそれよりも多くの別個の元素タグ（Tn）は、遷移金属が含まれる群より選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出された元素イオン（28）を前記目的とする特性と相関させることには、前記検出された元素イオン（28）から元素タグデータ（30）を生成すること、および前記目的とする特性に対する前記元素タグデータを記録することが含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞の群（18）は一よりも多くの細胞亜群を含み、各細胞亜群が一よりも多くの別個の元素タグ（Tn）で標識される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記目的とする特性に照らして前記一よりも多くの細胞亜群を識別することが更に含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記目的とする特性は、一またはそれよりも多くの蛍光、リン光、反射、吸収、形状認識、物理的特色、またはそれらの組合せにより識別される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞の群（18）内の二次元空間における前記候補細胞（20）の前記位置（22）を表すことが更に含まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞の群（18）内の三次元空間における前記候補細胞（20）の前記位置（22）を表すことが更に含まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的とする特性を有する前記細胞の群（18）を調製することが更に含まれる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的とする特性は、一またはそれよりも多くの蛍光、リン光、反射、吸収、形状認識、物理的特色、またはそれらの組合せにより識別される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記候補細胞（20）は蛍光発光により識別される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞の群（18）は組織サンプルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
候補細胞（20）の位置（22）を識別するように構成された少なくとも一つのインタロゲーター（19）；
前記候補細胞（20）の前記位置（22）を記録するためにフォーマットを有するデータソース（21）、
前記データソース（21）とインターフェースするレーザーアブレーションシステム（23）であって、少なくとも一回のレーザーパルス（24）を前記候補細胞（20）の前記位置（22）に向けるように構成されるレーザーアブレーションシステム（23）；および
前記レーザーアブレーションシステム（23）と連結されるマスサイトメーター（16）であって、前記候補細胞（20）と結合した元素タグを検出するように構成されるマスサイトメーター（16）
を含む、元素タグ付き細胞分析のためのシステム。
【請求項１５】
前記少なくとも一つのインタロゲータ（19）は目的とする特性をもつ前記候補細胞の前記位置（22）を識別するように構成され、かつ、前記データソース（21）は前記目的とする特性を記録するために更にフォーマットされる、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記レーザーアブレーションシステム（23）を前記データソース（21）とインターフェースするように構成されるコントロールシステム（34）を更に含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記コントロールシステム（34）は、前記データソース（21）にアクセスするように、及び前記少なくとも一回のレーザーパルス（24）を前記候補細胞の前記位置（22）に向けるように構成される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記少なくとも一つのインタロゲーター（19）は、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、およびそれらの組合せから選ばれる、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
前記データソース（21）は、文字数字式の、エミッション画像、バーコード、無線周波識別（RFID）、およびそれらの組合せから選ばれるフォーマットを含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２０】
前記マスサイトメーター（16）は、イオン検出器、および前記候補細胞の前記位置と前記イオン検出器との間で規定されるトータルパスを含み、前記トータルパスは、20および200ミリ秒の間の組合せ遅延時間を可能にするように構成される、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２１】
前記位置（22）は、候補細胞（20）の一部分の位置である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記位置（22）は、候補細胞（20）の一部分の位置である、請求項１４から２０のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマスサイトメトリーによる細胞分析用装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞生物学研究のある分野は、細胞機能、特定の反応に起因する細胞プロセス又は応答を示す生物学的特性の特定による細胞サンプルのインタロゲーションに関する。これら特性のいくつかは、伝統的な細胞ベースイメージング技術、例えば、細胞の構造的特徴の外観を可視化する顕微鏡検査のようなもの、又は、発光若しくは放射能検出を利用して免疫細胞化学及び免疫組織化学におけるマーカーを可視化することで観測される。
【０００３】
あるいは、マスサイトメトリーを用いた単一細胞分析技術を、金属結合抗体及び金属インターカレーターで標識した細胞並びに誘導結合プラズマ（ICP）イオン源に個別に導入された細胞に応用でき、誘導結合プラズマにおいて、細胞は同時に元素分析するために気化、原子化及びイオン化される。識別可能な多数の元素タグ、並びにマスサイトメーターによる同時の検出及び定量の結果、この多重化技術により測定される細胞特性は、細胞分析の範囲を、従来の細胞ベースのイメージング技術又は可視化技術の能力以上に拡張するために使用され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、細胞ベースのイメージング／可視化技術及びマスサイトメトリー技術は、細胞サンプルの別個の専用セットを分析のために必要とする。したがって、別々のサンプルを基にした個々の独立した細胞分析技術の結果を、細胞情報の範囲を拡大させるために組み合わせると、根本的に不確実となりやすい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以上のことを考慮し且つ本発明の教示に従い、出願人は、細胞の群の多次元分析が、技術の組み合わせを用い、各技術が異なるプロセスに基づいてインタロゲーションするという事実を利用することで実行可能であると認識している。細胞の群は、各技術に必要な条件に応じて最初に調製されることができ、目的とするそれぞれの特性に応じて、各プロセスによって与えられた条件からの実質的な干渉なしに、各プロセスが同じ細胞の群に累積的に適用されることができる。インタロゲーションプロセスのシーケンスは、後続の各技術の条件を保存する傾向があるような順序で選定することができ、最終測定用マスサイトメトリー検出器により実行されるインタロゲーションで得られる。レーザーアブレーションマスサイトメトリープロセスは、事前に目的とする特性を有すると識別された候補細胞だけを標的とするように構成され得る。各候補細胞についてマスサイトメトリー分析からの結果と、対応する目的とする特性との間の直接的な相関関係を、細胞の同じ群に対して確立することができる。
【０００６】
本教示の他の態様は、マスサイトメトリーによる細胞分析のための方法である。本方法には、一よりも多く（「二つ以上」とも言う）の別個の元素タグで標識された細胞の群を用意する工程と、細胞の群中の候補細胞を、目的とする特性を有する候補細胞の位置を識別することにより選定する工程とが含まれる。細胞の群内での配置に応じた候補細胞の位置を記録し、少なくとも一回のレーザーパルスを記録した位置の候補細胞に向けた際に、少なくとも一回のレーザーパルス毎に離散プルーム（discrete plume）が生成されるようにする。各離散プルームは、二つ以上の別個の元素タグを含む。本方法には、各離散プルームを誘導結合プラズマ中に導入し、二つ以上の別個の各元素タグに対応する元素イオンの群を生成する工程が更に含まれ、元素イオンの群は離散プルーム毎にマスサイトメトリーにより同時に検出される。検出された元素イオンを、目的とする特性と相関させる。
【０００７】
本発明の教示の更に他の態様は、元素タグ付けされた細胞の分析システム（以下、「装置」と言うことがある）である。システムは、候補細胞の位置を識別するように構成された少なくとも一つのインタロゲーターと、候補細胞の位置を記録するためにフォーマットされたデータソースとを有する。レーザーアブレーションシステムはデータソースとインターフェースされ（連動され）、そこではレーザーアブレーションシステムは少なくとも一回のレーザーパルスを候補細胞の位置に向けるように構成される。本システムは、レーザーアブレーションシステムと連結しているマスサイトメーターを更に含み、そこではマスサイトメーターは候補細胞と結合した元素タグを検出するように構成される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
当業者は、以下に記載の図面が単に例示を目的としているということを理解するであろう。図面は本出願人の教示の範囲を制限するものではない。添付の図面において、同様の部品には同様の参照番号を付ける。
【図１】本発明の教示の一実施形態に係るシステムおよびプロセスの絵図である。
【図１Ａ】図1に示すシステムの概略図である。
【図２】本発明の教示に係る多次元細胞情報を含む例示的マトリクスである。
【図３】図１の実施形態に係る基部のクローズアップ図である。
【図４】本発明の教示に係るICPイオン源の実施形態の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の教示と共に使用され、様々な要素に関する用語「a」又は「an」は、文脈上明確な指示のない限り、「一またはそれよりも多く（一以上）」又は「少なくとも一つ」という意味を含むことを理解されたい。図１を最初に参照するが、ここで図１は、ほとんどの場合参照番号10で示される細胞分析装置の図的記述を表す。細胞分析装置10は、マスサイトメトリー16の誘導結合プラズマ（ICP）イオン源14と連結している基部12を含む。一般的に、ICPイオン源14は、マスサイトメトリー16の不可欠な構成要素といえるが、明確にするために、ICPイオン源14をマスサイトメトリー16から切り離して表す。基部12は、例えばガラス顕微鏡スライドなどであり、細胞群18を保持するように構成される面を提供し、そこから候補細胞20が特定され、又はインタロゲーター19により目的とする特性を有するとして特定され、マスサイトメーター16による分析に続く。細胞分析装置10は、細胞群18内での位置22の候補細胞20に向けられる少なくとも一回のレーザーパルス24を供給するためのレーザーアブレーション装置23を更に含む。マスサイトメーター16は、レーザーアブレーション装置を制御し、対応する元素タグデータ30を作成するためのコントロールシステム（制御装置）34を含み得る。本装置の概略図を図１Ａに示す。
【００１０】
大抵は、マスサイトメトリーにおいて、単一細胞内の同時多重パラメーター分析のため、細胞群18を二つ以上の異なる元素タグTnで標識することが可能である。異なる元素タグTnは、典型的には、本教示の譲受人に譲渡された、米国特許出願公開第2010/0144056号として公開された、同時係属米国特許出願第12/513,011号明細書に記載のように、遷移金属を含む群から選定することができる。便宜上、Tnにおける「n」という表記は、変数を表し、異なる遷移元素や金属同位体を表すことが可能である。種々の実施形態において、例えば、細胞群18は二つ以上の親和性試薬で標識でき、異なる種類の元素結合抗体などの場合、各種抗体が一以上の異なる元素タグTnでタグ付けされている。各種抗体と結合した異なる金属又は元素タグTnは、いくつか例だけを挙げるなら、Gd、Nd、Tb、Eu、Gd、Dy、Ho、Sm、Er、Ybのいずれか一つ又はそれらの組み合わせの金属同位体である。各種元素結合抗体は、その異なる元素タグTnで一意的に識別可能である。大体において知られるように、金属結合抗体への親和性を持つ細胞群20の細胞は、二つ以上の元素タグTnで標識された状態を維持できる。したがって、マスサイトメトリー16による元素分析の際、細胞の元素記号は抗体と結合した異なる元素タグTnで表される。
【００１１】
上述のように、本教示の出願人は、以下の条件a）〜c）により、目的とする異なる特性を検出するためのインタロゲーションプロセスは、同じ細胞群18と共に多面的細胞分析に組み込むことができると認識している：a）最初に、細胞群は、各インタロゲーションプロセスに対応する目的とする特性を示すか、又はそれが示されるように条件（s、「s」は以下、複数も可能であることを示す）を用いて調製することができ；b）分析のシーケンスは、後続のインタロゲーションプロセスのために目的とするそれぞれの特性の完全性を保つように選択することができ；そしてc）各分析からの結果は相互相関され得る。元素タグ（s）を含む標識された細胞は、イオン化の間、ICPイオン源14により気化されるため、マスサイトメトリー検出プロセスは多面的細胞分析の最終インタロゲーターの基盤となり得る。したがって、標識された細胞群18は最初のインタロゲーションプロセスを受けて、目的とするものと考えられる特性を有する候補細胞20で、二つ以上の異なる元素タグTnと結合しているもの以外を特定することが可能である。種々の実施形態において、例えば、目的とする特性を、生死のどちらも選択可能な候補細胞20を特定するために生存性決定とすることができ、そして目的とする別の特性は、物理的な形状や生死どちらかの状態の候補細胞に固有の物理的特徴を基にしてもよい。更なる目的とする特性は、前述の目的とする特性のいずれかに依存するか無関係であり、例えば免疫染色法の条件と関連する他の発光特性に対応し、目的とする特定のタンパク質を有する候補細胞を特定することができる。したがって、目的とするそれぞれの特性は、同一又は異なる候補細胞20中のその特定の物理的場所（s）で表され得ると予想される。開示する最初のインタロゲーションプロセスは、通常光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡に対応するが、電子顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いるような他の細胞ベースのイメージング／可視化型のインタロゲーター19が考慮されてきており、これらの使用は独立して又はそれらの組み合わせで取り入れられ得る。したがって、候補細胞切片プロセスでは、最初のインタロゲーションは、目的とする対応の特性を有する候補細胞を特定するよう構成された少なくとも一つのインタロゲーター19により実行することができる。一旦候補細胞20が特定されれば、候補細胞20の位置は、細胞群18内での位置付けに対するその座標により決定されるため、目的とするそれぞれの特性に対して、独立して又はそれらの組み合わせで記録することができる。図２に示されるように、データソース21内の候補細胞の位置22と、目的とする対応の特性とに関する情報は、制御装置34によりアクセス可能であるフォーマットにコードすることができ、及び多面的細胞情報36を含むマトリックスの一部となり得る。
【００１２】
その後、データソース21内での記録した各位置22についての情報にアクセスすることにより、制御装置34は、少なくとも一回のレーザーパルス24を対応する候補細胞20に向けることができ、その結果、離散プルーム26の形状の細胞物質の一部を切除することができる。通常、各レーザーパルスは離散プルーム26を生成することができ、一連のレーザーパルスが一連の対応する離散プルーム26を生成できるようにする。その結果、各離散プルーム26毎に候補細胞20から切除された物質は二つ以上の異なる元素タグTnを含むことができる。マスサイトメトリー分析の際、候補細胞20由来の二つ以上の別個の元素タグTnの検出は、結合親和性試薬の存在を示すことができ、図２に例示されるように、候補細胞20の目的とする特性と相関させることができる。
【００１３】
連続した各プルーム26の空間的分離を維持しながら、各プルーム26は輸送され、個別の独立したエンティティとしてICPイオン源14に導入される。各離散プルーム26がICPイオン源14に入る度に、各元素タグTnは各元素タグTnに定量的に相関する元素イオンにイオン化される。二つ以上の異なる元素タグTnが候補細胞20内にあることもできるので、ICPイオン源14は各元素タグTn毎に異なる元素イオン群を生成する。結果として、各離散プルーム26毎に、ICPイオン源14は図１において通常（M+）と表される元素イオン群28を生成することができる。各元素イオン群28は、イオンの質量対電荷比（m/z）によってマスサイトメーター16で検出できる。本発明の教示に従い、マスサイトメーター16は各種元素イオンを同時に検出でき、そして重複を最小化するための高速イオンの走行時間を利用して、マスサイトメーター16は連続したレーザーパルスに由来する元素イオン群間を区別することができる。元素タグデータ30は、データの全体セット32において単一データファイルの連続体として図１に示され、各プルーム26の連続体のための元素イオン群28の検出から同時に得られたデータを表す。したがって、細胞分析装置10は二つ以上の異なる元素タグTnのそれぞれを同時にレーザーパルス24毎に検出及び特定し、候補細胞の目的とする特性に対して記録される元素タグデータ30を生成することができる。
【００１４】
一方一般的に、単一レーザーパルス24は完全に候補細胞を切除して二つ以上の異なる元素タグTnを含むプルームを生成することができ、二つ以上の異なる元素タグTnの最大強度を達成するために、候補細胞20は連続したレーザーパルス24が細胞内に入り込むか、又は隣接面を貫通することが必要な場合がある。その上細胞プロファイリングは、時間及び空間精度を伴うエネルギー供給能力を有する適切なレーザー配置により達成することができる。多数のレーザーパルス24が、候補細胞20内に含まれる元素タグTnを取り除くために使用され得る。例えば、分析中、各レーザーパルス24が標識された候補細胞20の連続層を切除するので、二つ以上の異なる元素タグTnに相当する元素イオン群28は同時にマスサイトメーター16により検出され得る。検出された各々の元素イオン群28は、候補細胞20の各層で切除された物質を表すことができる。上述のように、離散プルーム26の若干は金属元素を含まないことができ、又は離散プルーム26の一部は金属元素の種々の濃度進行を含むことができる。このようにして、マスサイトメーター16により行われる同時測定のそれぞれについて、セット32内のデータ30は、一つ又は複数の元素タグTnの存在又はある場合には不在を基にした定性的および定量的情報を含むことができる。得られたデータ30のそれぞれは、標識された候補細胞20の断面又は厚さのプロファイルについての情報の一部を提供することができる。
【００１５】
その上、細胞群18の厚みが平均細胞直径よりも大きい場合、例えば細胞培地が存在して細胞が重複して層になる場合や、厚い組織切片又は未切断の全組織標本の場合などがあり、図３に一般化して示される。その結果、一つ又は複数の特定した候補細胞20又は候補細胞20の一部分の位置は、細胞群18の上部または下部表面のいずれかから一定の距離を置いて埋め込まれ得る。例えば様々な実施態様において、埋め込まれた候補細胞又は細胞20は共焦点顕微鏡法を使用した蛍光顕微鏡検査法により特定され、位置付けされた細胞の構造画像が供給される。候補細胞20を選択するための他の技術は、目的とするそれらの特性の特定に基づくことができ、いくつか例を挙げるなら、リン光、反射、吸収が包含され得る。したがって、埋め込まれた候補細胞又は細胞20の位置や位置詳細は、例えば三次元空間におけるデカルト（直交）座標系、（Χ, Ｙ, Ζ）で定義可能であり、図３において座標のZ軸の値は、細胞群18の厚さの中での深度（depth）を表す。三次元座標は（図２での例示のように）記録され、表現するために使用され得、細胞群18内での位置付けに対して候補細胞20の位置が特定される。この場合、候補細胞20の位置22を本発明の教示に従い元素タグTn分析技術にかけるとき、深度座標Zは目的とする特性とみなすことができ、そしてレーザーパルス24の予想回数を提示するために使用することができ、例えばそれは典型的には埋め込まれた候補細胞20に到達するために要求されることがある。連続したレーザーパルス24により生成される連続した離散プルーム26は、少なくとも一回のレーザーパルス24がZ座標の埋め込まれた候補細胞20に到達するまでは元素タグTnを含まないことができる。逆に言えば、候補細胞20に到達し元素タグTnを含むプルームを生成させるために設定されるレーザーパルスの実際の回数、及び検出された元素イオン群28は、二つの相互に排他的な細胞ベースの技術を相互較正する手段として、記録した深度Zと相関させることができる。
【００１６】
本発明の教示が種々の実施形態と共に説明されているが、本発明の教示はそれらの実施形態に限定されるものではない。それどころか、本発明の教示は当業者によって理解されるような、様々な代替物、修飾物、及び等価物を包含する。例えば、本教示の出願人は、元素タグTn結合標識と同時に、当業者に一般的に既知のように、候補細胞20を特定するためのイメージング／可視化処理により検出可能である目的とする特性を示すために条件を用いて、細胞群18が最初に調製され得ると認識している。このため、細胞群18は、元素タグTnの結合親和性試薬標識に加えて、蛍光体標識タンパク質及び／又は蛍光レポータータンパク質の内因性発現を用いて調製される。その上、元素タグTn結合抗体は発光特性を加えることで、二つ以上の相互に排他的な細胞ベースの分析技術によって検出可能な二重特性を提供するように調製することができる。種々の実施形態において、例えば、CD34タンパク質は、一定の機能を有すると思われる生体サンプル中の標識に使用されるフルオレセインに加え、148Nd元素同位体にタグ付けされ得る。蛍光顕微鏡検査法を用い、生体サンプルは最初に検査することができ、CD34を発現する候補細胞は特定されて顕微鏡スライドガラス上に分離することができる。分離（「単離」を含む）したCD34発現候補細胞の位置は、本発明の教示に係るマスサイトメトリーにより、元素検出のための標的となり得る。本実施例では、検出された元素イオン群28は、定量化の提供又は確認目的の方法として、フルオレセインの検出と相関させることができる。
【００１７】
種々の実施形態において、記録した候補細胞20の情報は、制限されないが、その位置22を含み、それに様々なデータソースフォーマット中にある場合もあり、制御装置34により様々なプロトコルを用いてアクセスすることもできる。例えば、蛍光発光画像などのような細胞群18の視覚表示は、各候補細胞20を特定し表示するために使用されることができる。この場合、データソース21と制御装置34との間のインターフェースは、適切な視覚認識ソフトウェアを有する光学検出装置であり得る。ソフトウェアは、発光像から候補細胞20の位置を測定し、次いで少なくとも一回のレーザーパルス24を候補細胞20の位置に向けるように構成することができる。あるいは、記録した情報は、バーコード（1D又は2D）リーダー／スキャナーで具体化されるような様々な光学機械可読インターフェースにより、又は無線周波識別（RFID、無線自動識別）やそれらのバリエーション及び組み合わせを用いる他のインターフェースを通して表示され取り出すことができる。その上、目的とする特性を伴う候補細胞20の位置は一般的に、制御装置34でアクセス可能な英数字データ記録として記録され得、又はデータはレーザーアブレーション装置の動作制御装置に手動で、又はマスサイトメトリー装置に直接入力することができる。候補細胞の情報が転送されるインターフェースフォーマットに関わりなく、レーザーアブレーション装置の構成は、記録した情報が少なくとも一回のレーザーパルス24を候補細胞20の位置22に向けることについて位置座標を提供するように設計される。
【００１８】
種々の実施形態において、基部12は、一般的に顕微鏡適用の資材要件と一致するガラス顕微鏡スライドとして説明されており、本出願人は、いくつか例を挙げるなら、ステンレス鋼、石英、セラミックス、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、及びポリエーテルエーテルケトン（PEEK）の一つまたは組み合わせのような他の材料で作られる基部12を検討してきた。あるいはまた、図３を参照すると、基部12は細胞群18を支える顕微鏡スライド38から分離することができる支持体又は構造であり得る。例えば、光学顕微鏡において、二つ以上の異なる元素タグTnで標識された細胞群18は、顕微鏡スライド38に載せられ、下から照射されるか（典型的な透照光学顕微鏡法用）、又は対物レンズを介して上から照射される（典型的な蛍光顕微鏡法用）。顕微鏡光学系により撮像された画像は、物理的形状又は蛍光プローブ（s）の存在などのような目的とする特性に応じて候補細胞20を特定するために使用され得る。目的とする特性を伴う特定した候補細胞20の位置は、生体サンプルの細胞分析に関する情報を表すために記録することができる。通常、特定プロセスは必要に応じて繰り返すことができ、二つ以上の候補細胞20が細胞群18内に位置されることができる。一旦一つ又は複数の候補細胞20が特定されると、顕微鏡スライド38とその内容物はそれらを支えるための基部12に移され得る。各候補細胞20の位置に関する情報は、例えば、細胞群18内での二次元又は三次元空間のいずれかで示される直交座標で表すことができ、少なくとも一回のレーザーパルス24を候補細胞20に向けるのに利用することができ、少なくとも一回のレーザーパルス24毎に離散プルーム26が生成する。
【００１９】
本教示の出願人は、各元素タグデータ30が少なくとも一回のレーザーパルス24のそれぞれに対応するように、連続した各プルーム26と、対応するイオンとの空間的分離は、それらが基部からICPイオン源14の間のパス及びイオン源14からマスサイトメーター16のイオン検出器の間のパスを移動する間中維持されると認識している。例えば、レーザーアブレーションのために典型的に使用される、フェムト秒パルスレーザーなどのような固体レーザーは、10及び100 Hzの間のパルス率で操作されるように構成することができる。この周波数範囲では、プルーム26は10乃至100ミリ秒毎に生成され得る。下限値を考慮すると、装置10は、10ミリ秒オーダーの最大遅延時間を有することが要求される。本教示の種々の実施形態によると、マスサイトメーター16は、静電レンズを有する線形イオン経路と、並列元素イオンの検出が可能なイオン検出器とを含む「フロースルー」分析装置として特徴付けることができる。この構成では、10ミリ秒オーダーの遅延時間が達成され、同時検出のために元素イオン（M+）の群が加速されマスサイトメーター16内を通過することができる。結果として、イオン検出器が元素イオン群28のそれぞれを別々に検出する可能性を実現させることができる。
【００２０】
マスサイトメーター16の上流の対応する空間的弁別性を維持するために、基部12でのレーザーアブレーションの位置と、プラズマへの入口部との間のパスの構成は、乱流を最小限に抑えながら、プルーム26の分離を最大化するように選択することができる。下限では、イオン化前の各プルーム26の分離を維持するための10ミリ秒オーダーの遅延時間は、プルームの移動距離が最小となるパス及びそれらを加速する対応手段により達成し得る。通常、ICPイオン源14は、図４に示されるようにインジェクターチューブ42を利用し、キャリアガスの流れ（示されていない）は各離散プルーム26をプラズマ44に向けるよう適切に加えられ得る。したがって、インジェクターチューブ42は、プルーム26を受け取るために2000より小さいレイノルズ数を有するなど、層流の又は層流に近い流動形状を提供するように構成され得、且つ、キャリアガスがプルーム26と流れるよう、乱流を最小限に抑えることができるように構成され得る。このようにして、種々の実施形態において、基部12及びイオン源14の間並びにイオン源14及びマスサイトメーター16のイオン検出器の間のトータルパスに対応する合計遅延時間は20ミリ秒及び200ミリ秒の間であることができる。
【００２１】
その上、種々の実施形態において、基部12は、各プルーム26の移動時間が最小となるように、ICPイオン源14に対して位置付けることができる。例えば、ICPイオン源14は、密接に連結したレーザーアブレーション-ICPイオン源を提供するための基部12を含むように構造化され得る。レーザーアブレーション-ICPイオン源は、レーザーパルス24の入射口を有する統合エンクロージャ、プルームを捕らえて輸送するキャリアガス、及び元素イオン群28を生成させるためのICPイオン源を伴って構成することができる。キャリアガスの流れは、アブレーションの位置22で各離散プルーム26を一掃し、プラズマ44に直接各プルーム26を渡すように設定し得る。
【００２２】
種々の実施形態において、「細胞群」という用語は、通常薄く切り取られた生体組織サンプル又は未切断の全組織標本に含まれる細胞に関する一方、本発明の教示は、細胞培養において典型的に見られる細胞に等しく適用することができる。種々の実施形態において、細胞群18は細胞亜群の混合物であってもよく、各細胞亜群が異なる細胞源又は異なる生物学的エンティティに由来してもよい。この場合、細胞の由来は目的とする特性のいずれかにより特徴付けることができる。例えば、一よりも多くの生物学的エンティティから採取されたサンプルであって、各サンプルが一よりも多くの異なる元素タグTnではっきりと標識することができる細胞亜群に関連するサンプルを検討する。各細胞亜群が同じ細胞群18に統合されることで、各サンプルからの細胞は、はっきりと標識された元素結合抗体を同じ細胞群20内にまとめて発現できる。統合した細胞群18はインタロゲートされ、候補細胞20は、いくつかの目的とする特性に基づき、候補細胞の由来がわからなくても特定、選択される。本発明の教示に従う元素分析にて、元素タグTnが検出され得、対応する候補細胞20が特定の生物学的エンティティに関連するものとして特定され得る。したがって、目的とする特性と検出された元素イオン24との間の関係は相関することができ、その細胞亜群と、考えられる細胞の由来とを示す目的とする特性が決定される。一般的に、本発明の教示の利点は、非破壊細胞を含む細胞群に適応できることであり、非破壊候補細胞が特定され、更にマスサイトメトリーによりその元素タグが分析され得る。
【００２３】
細胞分析中の、各プルーム26と、対応する元素イオン群28との空間的な分離を維持するための条件を設定するための試みが説明されている一方、本教示の出願人は一部の空間拡散または重複はあり得ると認識している。したがって、出願人は、二つ以上の得られた元素データ30に適応される、各レーザーパルス24から作成される情報にとっての実質的な損失のない平均化したアプローチを検討してきた。あるいは、得られた各元素データ30をまとめてセット32にする統合的アプローチは、多面的細胞分析のマスサイトメトリー情報部分を表すのに十分であり得る。種々の実施形態において、FFTなどのようなデータ分析アルゴリズムは、統合データセット32をデコンボリューション（逆畳み込み）するために使用され得る。アルゴリズムの異なる形態は、分析装置10内で動作することができ、又は、一般的に知られるように、応用的なポストデータ取得となり得る。
【００２４】
さらに、制御装置34は、本発明の教示に従った多機能目的を果たすように構成することができる。制御装置34は、レーザーアブレーション装置の制御に関連して、対応する元素タグTnを生成するように説明されたが、制御装置34は、典型的には論理制御の下で機能し、種々の段階の自動化を提供するか、又はフィードバックのシーケンスを実行するために、分析装置10を自動化するのを可能にするための制御アクションを提供することができる。種々の実施形態において、例えば、制御装置34は自動サンプル処理装置と連結したプロセッサ駆動装置であってもよく、インタロゲーション及び特定、情報の記録とアクセス、レーザーパルスの方向付け、マスサイトメトリー検出プロセス並びに自律的又はユーザー介入のデータ相関を実行する。
【図１】
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【図１ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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