(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）に示されるスタチン系薬物用のキラル中間体の製造方法であって、
１）クロロ酢酸（１）とベンジルアルコール（２）を出発原料として、エーテル化反応によってベンジルオキシ酢酸（３）を生成するステップと、
２）ベンジルオキシ酢酸（３）とモルホリンとを縮合反応させて２−ベンジルオキシモルホリノアセトアミド（４）を生成するステップと、
３）２−ベンジルオキシモルホリノアセトアミド（４）と、式（５）に示されるアセトアセテートとを置換反応させて式（６）に示されるジオン中間体を生成するステップと、
４）式（６）に示されるジオン中間体を還元酵素により不斉還元反応させて式（７）に示されるキラルジオール中間体を生成するステップと、
５）式（７）に示されるキラルジオール中間体と２，２−ジメトキシプロパンとを反応させて式（８）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを生成するステップと、
６）式（８）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを脱ベンジル化して、式（９）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを得るステップと、
７）式（９）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを酸化反応させて、式（Ｉ）に示されるキラル中間体を得るステップと、を備え、
反応式は
【化１】
0006273382.tif 000016
（但し、ＲはＣ４〜Ｃ１０アルキル基を示す。）
であり、
上記のステップ４）における還元酵素は、アミノ酸配列として、
ａ）配列番号１ないし配列番号６で表される配列、
ｂ）ａ）に示される配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ改良したジケトレダ
クターゼ活性を持つ配列、又は
ｃ）ａ）における配列において１又は複数のアミノ酸残基が欠陥、付加及び／又は置換されてなるものであって、改良したジケトレダクターゼ活性を持つ配列、
から選ばれる一種を含む、ジケトレダクターゼ突然変異体であり、
ｂ）に示される配列は配列番号７に示される配列ではない、
ことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
Ｒはｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−アミル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を示す、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記式（５）に示されるアセトアセテートは、ジケテンと式（１０）に示されるアルコールとを開環付加反応させて得られるものであり、
反応式は、
【化２】
0006273382.tif 000017
である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ステップ４）における不斉還元反応は、式（６）に示されるジオン中間体を均一に溶剤に分散させ、還元酵素、ギ酸又はギ酸塩、ＮＡＤ＋を添加して、ｐＨ値を６．２〜６．４に調整した後、系を２７〜３３℃に昇温して、１７〜２４ｈ保温することによって行われる、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項５】
前記還元酵素の使用量と前記式（６）に示されるジオン中間体の使用量との質量比が０．００００５〜０．００４：１である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ジケトレダクターゼ突然変異体は、配列番号１、２、３、４、５又は６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記溶剤は、精製水、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、エタノール、ｎ−ヘプタン、トルエン、アセトン、ジメチルホルムアミド、メタノールから選ばれる一種又は複数種である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項８】
前記ギ酸塩はギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウム又はギ酸カリウムから選ばれるものであり、前記ギ酸又はギ酸塩の使用量と前記式（６）に示されるジオン中間体の使用量とのモル比は２〜１０：１である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ＮＡＤ＋の使用量と前記式（６）に示されるジオン中間体の使用量との質量比は、０．００１〜０．１：１である、請求項４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物中間体の合成分野に関し、具体的にはスタチン系薬物用のキラル中間体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スタチン系薬物（Ｓｔａｔｉｎｓ）はヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤であり、内因性コレステロールによる律速酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素の合成を競合阻害することで、細胞内のメバロン酸代謝経路を遮断することによって、細胞の内因性コレステロール合成を減少させ、更に細胞膜表面（主に肝細胞）をフィードバック刺激して低密度リポタンパク質（ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＤＬ）受容体の数を増加して活性を向上させ、血清コレステロールの除去量を増加してレベルを低下させる。スタチン系薬物は、更に肝臓によるアポリポタンパク質Ｂ−１００の合成を阻害することで、トリグリセリドを豊富に含むＡＶ、リポタンパク質の合成や分泌を減少させる。また、スタチン系薬物は初期急性冠動脈症候群患者に用いると、血管内皮の炎症反応を抑制して、粥状斑を安定させ、血管内皮の機能を改善し、アテローム性動脈硬化（ＡＳ）の進行を遅延させ、炎症を防止し、神経を保護して、血栓を予防する等の作用を有し、応用の将来性が期待できる。
【０００３】
従来、市販されたスタチン系薬物、例えばアトルバスタチン、ピタバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン等は、合成には構造式Ａのキラルジオール側鎖を出発原料とすることが必要である。
【０００４】
【化１】
0006273382.tif 000002
【０００５】
特許ＷＯ  ０３００６６５６Ａにおいて、２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースを重要中間体として、酸化、アセタール化、加水分解を行ってアルコール側鎖中間体を得る。
【０００６】
【化２】
0006273382.tif 000003
【０００７】
特許ＷＯ  ０２０６２６６Ａにおいて、６−クロロメチル−４−ヒドロキシテトラヒドロ−２ヒドロ−ピラン−２−オンを使用して（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−クロロ−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−ブチルアセテート系化合物を合成する合成経路が報告されている。ここで、ＹはＮａ、Ｃａ又はテトラアルキル四級アンモニウム塩化合物を示す。
【０００８】
【化３】
0006273382.tif 000004
【０００９】
特許ＵＳ  ２００６００４２００Ａと特許ＷＯ  ２００８０５９５１９Ａにおいて、（４Ｒ−Ｃｉｓ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−ブチルアセテートを酸化してアルデヒド基側鎖を有する中間体にする合成プロセスが報告されている。
【００１０】
【化４】
0006273382.tif 000005
【００１１】
以上のプロセスは、原料の合成、経路の選択、中間体の分離精製等について問題があり、そのため、コストが高くなり、全収率が低い。従って。安価で、プロセスが環境に優しく、製品の品質が高い合成プロセスの開発は、経済的にも社会的には価値がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許ＷＯ  ０３００６６５６Ａ
【特許文献２】特許ＷＯ  ０２０６２６６Ａ
【特許文献３】特許ＵＳ  ２００６００４２００Ａ
【特許文献４】特許ＷＯ  ２００８０５９５１９Ａ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来の合成プロセスに存在する高コスト、低収率等の欠陥を克服して、新規合成プロセスを開発するために、本発明は式（Ｉ）に示されるスタチン系薬物用のキラル中間体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の提供する製造方法は、
１）クロロ酢酸とベンジルアルコールを出発原料として、エーテル化反応によってベンジルオキシ酢酸を生成するステップと、
２）ベンジルオキシ酢酸とモルホリンを縮合反応させて２−ベンジルオキシモルホリノアセトアミドを生成するステップと、
３）２−ベンジルオキシモルホリノアセトアミドと式（５）に示されるアセトアセテートを置換反応させて式（６）に示されるジオン中間体を生成するステップと、
４）式（６）に示されるジオン中間体を不斉還元反応させて式（７）に示されるキラルジオール中間体を生成するステップと、
５）式（７）に示されるキラルジオール中間体と２，２−ジメトキシプロパンを反応させて式（８）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを生成するステップと、
６）式（８）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを脱ベンジル化して式（９）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを得るステップと、
７）式（９）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを酸化反応させて式（Ｉ）に示されるキラル中間体を得るステップとを備える。
【００１５】
反応式は以下の通りである。
【００１６】
【化５】
0006273382.tif 000006
【００１７】
（但し、ＲはＣ４〜Ｃ１０アルキル基を示す。
好ましくは、Ｒはｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−アミル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を示す。）
【００１８】
前記式（５）に示されるアセトアセテートは、ジケテンと式（１０）に示されるアルコールとを開環付加反応させて得られる。
【００１９】
【化６】
0006273382.tif 000007
【００２０】
前記ステップ４）における不斉還元反応は、式（６）に示されるジオン中間体を均一に溶剤に分散させ、還元酵素、ギ酸又はギ酸塩、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を添加して、ｐＨ値を６．２〜６．４に調整した後、系を２７〜３３℃に昇温して、１７〜２４ｈ保温することによって行われる。
【００２１】
前記ステップ４）において、前記還元酵素の使用量と前記式（６）に示されるジオン中間体の使用量の質量比が０．００００５〜０．００４：１である。
【００２２】
前記還元酵素は、アミノ酸配列として、  
ａ）配列番号１ないし配列番号６で表される配列、
ｂ）ａ）に示される配列と少なくとも７０％の同一性を有し且つ改良したジケトレダクターゼ活性を持つ配列、又は
ｃ）ａ）の配列において１又は複数のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されて得られるものあって、改良したジケトレダクターゼ活性を持つ配列、
から選ばれる一種を含むジケトレダクターゼ突然変異体であり、
ｂ）に示される配列は配列番号７に示される配列ではない。
【００２３】
好ましくは、前記ジケトレダクターゼ突然変異体は配列番号１、２、３、４、５又は６に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
前記ステップ４）において、前記溶剤は精製水、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、エタノール、ｎ−ヘプタン、トルエン、アセトン、ＤＭＦ、メタノールから選ばれる一種又は複数種である。
【００２５】
前記ステップ４）において、前記ギ酸塩はギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウム又はギ酸カリウムから選ばれ、前記ギ酸又はギ酸塩の使用量と前記式（６）に示されるジオン中間体の使用量とのモル比は２〜１０：１である。
【００２６】
前記ステップ４）において、前記ＮＡＤ＋の使用量と前記式（６）に示されるジオン中間体の使用量との質量比は０．００１〜０．１：０．１：１である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の提供する製造方法は以下の利点を有する。
【００２８】
（１）従来の合成プロセスに比べて、該合成プロセスは更に新規で、スタチン系薬物の開発分野を広げる。
【００２９】
（２）中間体化合物６を酵素還元によってジオールキラル中心に容易に導入でき、特に本発明の提供するジケトレダクターゼ突然変異体は、低価な上に、品質が安定し、得たジオールは収率、純度、光学選択性が高い。
【００３０】
（３）該合成プロセスでは、クロロ酢酸とベンジルアルコールを出発原料として、中間ステップに使用される原料が低価で、プロセスが操作しやすく、最終生成物の純度及び収率が高く、全収率が９０．０％以上に達し、製造コストを効果的に低下できる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の目的、技術案及び利点を更に明らかにするため、以下、本発明の例示的な実施例の技術案を説明する。
【００３２】
本発明は式（Ｉ）に示されるスタチン系薬物用のキラル中間体の製造方法を提供し、
１）クロロ酢酸１とベンジルアルコール２を出発原料として、エーテル化反応によってベンジルオキシ酢酸３を生成するステップと、
２）ベンジルオキシ酢酸３とモルホリンを縮合反応させて２−ベンジルオキシモルホリノアセトアミド４を生成するステップと、
３）２−ベンジルオキシモルホリノアセトアミド４と式（５）に示されるアセトアセテートを置換反応させて式（６）に示されるジオン中間体を生成するステップと、
４）式（６）に示されるジオン中間体を不斉還元反応させて式（７）に示されるキラルジオール中間体を生成するステップと、
５）式（７）に示されるキラルジオール中間体と２，２−ジメトキシプロパンを反応させて式（８）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを生成するステップと、
６）式（８）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを脱ベンジル化して式（９）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを得るステップと、
７）式（９）に示される（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−カプロエートを酸化反応させて式（Ｉ）に示されるキラル中間体を得るステップと、を備える。
【００３３】
反応式は以下の通りである
【００３４】
【化７】
0006273382.tif 000008
【００３５】
（但し、ＲはＣ４〜Ｃ１０アルキル基を示す。）
【００３６】
本発明の製造方法の一実施形態によれば、Ｒは好ましくはｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−アミル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を示す。
【００３７】
本発明の製造方法の一実施形態によれば、式（５）に示されるアセトアセテートは、ジケテンと式（１０）に示されるアルコールとを開環付加反応させて得られる。
【００３８】
反応式は以下の通りである
【００３９】
【化８】
0006273382.tif 000009
【００４０】
前記ステップ１）の具体的な過程は、下記のようなものである。反応フラスコに有機溶剤とトルエンを投入し、系の温度を制御しながら、アルカリを分割して添加し、アルカリの添加が終了した後、更にベンジルアルコールを分割添加する。クロロ酢酸を有機溶剤に溶解して、温度を制御しながら前述反応系に滴下し、系をクロロ酢酸が完全になくなるまで反応させる。系を冷却させた後に、水を添加して有機溶剤を減圧除去し、水相を有機溶剤で抽出して、温度を制御しながら水相のｐＨを酸性に調整し、水相を有機溶剤で抽出した後に、乾燥濃縮させて化合物３を得る。ステップ１）で得た生成物は、純度が９７〜９９％、収率が８５〜９０％である。
【００４１】
前記ステップ１）において、反応で用いる有機溶剤は、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトニトリル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤であり、テトラヒドロフランが好ましい。添加されるアルカリは、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムエトキシド、水酸化ナトリウム、金属ナトリウム、水素化ナトリウムから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合したアルカリであり、水酸化カリウムが好ましく、添加されるアルカリとクロロ酢酸とのモル比は、１：１−１００：１、好ましくは３：１であり、添加されるベンジルアルコールとクロロ酢酸とのモル比は、１：１〜１００：１、好ましくは３：１であり、添加されるアルカリとベンジルアルコールの温度は、１０〜１００℃、好ましくは１５〜２５℃であり、クロロ酢酸の滴下温度は、３０〜１２０℃、好ましくは７０〜８０℃、クロロ酢酸溶液の滴下速度は、１ｇ／ｍｉｎ〜１００ｇ／ｍｉｎ、好ましくは１０ｇ／ｍｉｎであり、冷却後に添加される水とクロロ酢酸の質量比は１：１〜１００：１、好ましくは８：１であり、水相のｐＨ値は１〜６、好ましくは２〜３であり、酸性水相の抽出溶剤は、２−メチル、酢酸エチル、エチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤、好ましくはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、クロロ酢酸の体積に対して、抽出溶剤の使用量は３〜３０倍、好ましくは８倍とする。
【００４２】
前記ステップ２）の具体的な過程は、以下の通りである。反応フラスコに有機溶剤とベンジルオキシ酢酸（化合物３）を添加して、系の温度を制御しながら塩化アシルを滴下し、滴下終了後、系を化合物３がなくなるまで撹拌し、次に低沸点物質を減圧除去して、使用に備える。反応フラスコに有機溶剤、モルホリン及びアルカリを加え、系の温度を制御しながら上記の濃縮液を滴下し、滴下終了後、保温してモルホリンがなくなるまで撹拌し、希塩酸を添加して反応をクエンチさせ、分液して有機相を順に水、飽和炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄して、濃縮させてベンジルオキシモルホリノアセトアミド（化合物４）を得る。ステップ２）で得た生成物は純度が９７〜９９％、収率が８５〜９０％である。
【００４３】
前記ステップ２）において、有機溶剤は、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトニトリル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤であり、ジクロロメタンが好ましく、添加される塩化アシルは、塩化オキサリル、塩化チオニル、塩化アセチルから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合物であり、塩化オキサリルが好ましく、塩化アシルの滴下温度は−１０〜５０℃、好ましくは１０〜２０℃であり、添加される塩化アシルと化合物３とのモル比は１：１〜１０：１、好ましくは１．５：１であり、塩化アシル液の滴下速度は１ｇ／ｍｉｎ〜１００ｇ／ｍｉｎ、好ましくは６ｇ／ｍｉｎであり、添加されるアルカリは、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムエトキシド、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジンから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合したアルカリであり、トリエチルアミンが好ましく、添加されるアルカリと化合物３とのモル比が１：１〜１０：１、好ましくは１．５：１とし、濃縮液の滴下温度は−１０〜５０℃、好ましくは１０〜２０℃とする。
【００４４】
前記ステップ３）の具体的な過程は、以下の通りである。反応フラスコに有機溶剤とアルカリを添加して、系の温度を制御しながら化合物５を滴下し、滴下終了後、系の温度を低下させ、系の温度を制御しながら有機アルカリ溶液を滴下し、滴下終了後、化合物４を滴下して化合物４がなくなるまで撹拌する。反応系を酸性水溶液でクエンチさせ、分液後に、水相を有機溶剤で二回抽出して、有機相を併合して飽和食塩水で一回洗浄し、濃縮させて化合物６の粗生成物を得て、有機溶剤を添加して結晶化させて固体化合物６を得る。ステップ３）で得た生成物は純度が９６．０〜９７．０％、収率が６５〜７０％である。
【００４５】
前記ステップ３）において、有機溶剤は、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、トルエン、ジ２−メチルテトラヒドロフラン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤であり、テトラヒドロフランが好ましく、使用されるアルカリは、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムエトキシド、水酸化ナトリウム、金属ナトリウム、水素化ナトリウムから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合したアルカリであり、水素化ナトリウムが好ましく、化合物５の滴下温度は、−１０〜５０℃、好ましくは０〜２０℃、化合物５の滴下速度は、１ｇ／ｍｉｎ〜１００ｇ／ｍｉｎ，好ましくは１０ｇ／ｍｉｎであり、使用される有機アルカリは、ジイソプロピルエチルアミノリチウム、ｎ−ブチルリチウム、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム、ナトリウムエトキシド、ナトリウムメトキシド及びナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシドから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合物であり、ｎ−ブチルリチウムが好ましく、クエンチ用酸性水溶液は、塩酸、重硫酸ナトリウム、塩化アンモニウム及びリン酸水素ナトリウムから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合物であり、３質量％の希塩酸溶液が好ましく、抽出用有機溶剤は、トルエン、２−メチルテトラヒドロフラン、ジクロロメタン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤であり、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルが好ましい。
【００４６】
前記ステップ４）の具体的な過程は、以下の通りである。６−（ベンジルオキシ）−３，５−ジオキソｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物６）を均一に溶剤に分散させ、均一に撹拌した後に、還元酵素、ギ酸又はギ酸塩、ＮＡＤ＋を添加し、ギ酸等の水溶液でｐＨ＝６．２〜６．４を調整し、系を２７〜３３℃に昇温して１７〜２４ｈ保温する。反応終了後、系を６５〜７０℃に昇温して酵素タンパク質を破壊し、有機溶剤を添加して、珪藻土パッドを通して分液し、水相を有機溶剤で逆抽出して、有機相を併合し、濃縮させて生成物を得て、次のステップの反応に直接用いる。ステップ４）で得た生成物は純度が９２〜９５％、収率が７０〜８５％、ｅｅ値が９９．５％超え、ｄｅ値が９０〜９９．５％である。
【００４７】
前記ステップ４）において、化合物６分散用の溶剤は、精製水、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、エタノール、ｎ−ヘプタン、トルエン、アセトン、ＤＭＦ、メタノールから選ばれ、精製水が好ましく、分散溶剤の使用量は、化合物６の体積に対して、１〜１０倍、好ましくは４倍であり、還元酵素の使用量は、化合物６の使用量に対して、０．０５〜４ｍｇ／ｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｇであり、反応の全体積は、化合物６に対して、１０〜６０倍、好ましくは３０倍であり、ギ酸又はギ酸塩と化合物６とのモル比は２：１〜１０：１、好ましくは２：１であり、ギ酸塩は、ギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸カリウムから選ばれ、ギ酸アンモニウムが好ましく、ＮＡＤ＋と化合物６との質量比は、０．００１：１〜０．１：１、好ましくは０．０３：１であり、系のｐＨ範囲は４．０〜９．０、好ましくは６．２＋０．２であり、抽出用の有機溶剤は、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、エチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ｎ−ヘプタン、トルエン、キシレンから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤であり、酢酸イソプロピルが好ましい。
【００４８】
前記ステップ５）の具体的な過程は、以下の通りである。有機溶剤に（３Ｒ，５Ｓ）−６−ベンジルオキシ−３，５−ジヒドロキシｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物７）、２，２−ジメトキシプロパン及び触媒量の酸を順に添加して、化合物７がほぼなくなるまで反応させて、酸を添加して洗浄し、アルカリを添加して系を中和し、低沸点物質を減圧除去した後に水を添加し、分液して水相を有機溶剤で複数回抽出し、有機相を併合して飽和食塩水で一回洗浄し、有機相をシリカゲルパッドに通過させた後に、濃縮させて生成物を得て、次のステップの反応に直接用いる。ステップ５）で得た生成物は純度が９２〜９５％、収率が８８〜９２％である。
【００４９】
上記前記ステップ５）において、反応用の有機溶剤はメタノール、アセトン、アセトニトリル、ジクロロメタン、トルエン、テトラヒドロフラン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤であり、アセトンが好ましく、有機溶剤の使用量は、化合物７の体積に対して、３〜２０倍、好ましくは１０倍であり、反応温度は−１０〜６０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、添加される２，２−ジメトキシプロパンと化合物７とのモル比は１：１〜１０：１であり、２：１が好ましく、添加される触媒量の酸は、塩酸、硫酸、ピリジンｐ−トルエンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸から選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合酸であり、ピリジンｐ−トルエンスルホン酸塩が好ましく、添加される触媒量の酸と化合物７との質量比は、０．０１：１〜０．１：１であり、０．０２：１が好ましく、洗浄用酸は、塩酸、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸から選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合酸であり、３質量％の希塩酸が好ましく、洗浄用酸と化合物７との質量比は０．０１：１〜１：１であり、０．０５：１が好ましく、系中和用のアルカリは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウムから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合アルカリであり、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液が好ましく、反応後の処理用抽出溶剤は酢酸エチル、エチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ｎ−ヘプタン、トルエン、キシレンから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤であり、酢酸エチルが好ましい。
【００５０】
前記ステップ６）の具体的な過程は、以下の通りである。有機溶剤に（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物８）及び金属触媒を添加し、系を密閉させた後、窒素ガスで五回置換して、さらに水素ガスで三回置換し、化合物８がほぼなくなるまで反応させ、放圧した後に釜を開いて系を取り出し、吸引濾過して濾過ケーキを有機溶剤で二回洗浄し、濃縮させて得られる生成物を次のステップの酸化反応に直接用いる。生成物は純度が９５−９８％，収率が９２−９５％である。
【００５１】
前記ステップ６）において、反応用の有機溶剤は、メタノール、アセトン、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤であり、酢酸エチルが好ましく、反応溶剤としての酢酸エチルの使用量は化合物８の体積に対して、３〜２０倍、好ましくは１０倍であり、添加される金属触媒は、水酸化パラジウム、パラジウム炭素、モリブデン炭素、二酸化モリブデン、Ｒａｎｅｙ−Ｎｉから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した触媒であり、水酸化パラジウムが好ましい。添加される金属触媒と化合物８との質量比は０．０１：１〜１：１であり、０．０５：１が好ましく、濾過ケーキ洗浄用の溶剤は、メタノール、アセトン、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤であり、酢酸エチルが好ましい。
【００５２】
前記ステップ７）の具体的な過程は、以下の通りである。有機溶剤に２−（（４Ｒ，６Ｓ）−６−メトキシ−２，２−ジメチル−［１，３］ジエポキシ−４−イル）−アセテート（化合物９）を添加して、温度を低下させた後、ジメチルスルホキシドと所定量のアルカリを添加し、次に酸化剤を分割添加し、化合物９が完全に反応した後、水を添加してクエンチさせ、分液して水相を有機溶剤で逆抽出し、有機相を併合して精製水で洗浄し、濃縮させて目的化合物（式Ｉ化合物）を得る。目的生成物は純度が９２−９６％、収率が８０−８５％である。
【００５３】
前記ステップ７）において、反応用の有機溶剤は、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、トルエン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤であり、ジクロロメタンが好ましく、反応用の有機溶剤の使用量は化合物９の体積に対して３〜２０倍、好ましくは１０倍であり、添加されるジメチルスルホキシドと化合物９とのモル比は０．０１：１−２０：１、好ましくは１０：１であり、添加されるアルカリは、トリエチルアミン、ピリジン、エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合アルカリであり、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが好ましく、添加されるアルカリと化合物９とのモル比は、１：１〜５０：１、好ましくは３．５：１であり、添加される酸化剤は、次亜塩素酸ナトリウム−ＴＥＭＰＯ、三酸化硫黄ピリジン−ジメチルスルホキシド、活性二酸化マンガン、ＰＣＣ酸化剤、ＰＤＣ酸化剤、ＤＭＰであり、三酸化硫黄ピリジンが好ましく、添加される酸化剤と化合物９とのモル比は、０．０１：１〜２０：１、好ましくは１０：１であり、酸化剤の添加速度は０．０１Ｋｇ／ｈ〜１Ｋｇ／ｈ、好ましくは０．４Ｋｇ／ｈであり、反応をクエンチさせるための水の使用量は化合物９の体積に対して、３〜２０倍、好ましくは５倍であり、後処理用の抽出溶剤は、酢酸エチル、ジクロロメタン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、トルエン、ｎ−ヘプタンから選ばれる一種又は複数種を任意の比率で混合した混合溶剤であり、ジクロロメタンが好ましい。
【００５４】
式（５）に示されるアセトアセテートの具体的な製造過程は、以下の通りである。反応フラスコにアルコール（化合物１０）、反応溶剤及び触媒を投入して、系の温度を制御しながら、ジケテンを滴下した後に、保温しながら原料が完全になくなるまで反応させる。反応溶剤と過剰なジケテンを蒸留除去した後に、減圧精留してアセトアセテート（化合物５）を得る。
【００５５】
上記の過程において、使用される触媒は酢酸ナトリウム、ピペリジン、イソプロピルアミン、４−ジメチルアミノピリジン又はこのような反応を触媒可能なその他の化合物から選ばれ、前記触媒とアルコール（化合物１０）とのモル比は０．０１〜０．５：１、好ましくは０．０５〜０．１０：１であり、使用される反応溶剤はテトラヒドロフラン、トルエン又はアセトニトリルであり、また、溶剤を使用しなくてもよい。反応温度は−１０〜１１０℃、好ましくは１０〜７０℃であり、ジケテンとアルコールとのモル比は、０．５−３：１、好ましくは１〜１．２：１である。得られる化合物を減圧蒸留により精製しても、その他の公知の化学精製方法により精製してもよい。
【００５６】
上記製造方法において、用いる還元酵素は既知のジケトレダクターゼ、又はその突然変異体のいずれでもよい。本発明の製造方法の好適な一実施形態において、還元酵素はアミノ酸配列として、
ａ）配列番号１ないし配列番号６で表される配列、
ｂ）ａ）に示される配列と少なくとも７０％の同一性を有し且つ改良したジケトレダクターゼ活性を持つ配列、又は
ｃ）ａ）の配列において１又は複数のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されて得られるものであって、改良したジケトレダクターゼ活性を持つ配列、
から選ばれる一種を含むジケトレダクターゼ突然変異体であり、
ｂ）に示される配列は配列番号７に示される配列ではない。
【００５７】
上記のジケトレダクターゼ突然変異体は、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＫ１２１菌株のジケトレダクターゼ（ＤＫＲ）遺伝子（例えば配列番号７に示される）を出発遺伝子として、遺伝子突然変異を行い、指向性スクリーニング法によってジケトレダクターゼ突然変異体を得る。そのアミノ酸配列は下記の配列を含有する。
【００５８】
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列であって、突然変異部位がＦ２３１Ｗである。
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＩＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＶＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＷＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列であって、突然変異部位がＩ９４Ｖ＋Ｆ２３１Ｗである。
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＶＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＶＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＷＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列であって、突然変異部位がＩ９４Ｖ＋Ｖ１５１Ｑ＋Ｆ２３１Ｗである。
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＶＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＱＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＷＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列であって、突然変異部位がＶ２３９Ｉ＋Ｒ２５７Ｋである。
５ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＩＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＶＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＦＧＰＦＱＩＭＤＩＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＫＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（５）配列番号５に示されるアミノ酸配列であって突然変異部位がＶ１５１Ｑ＋Ｒ２５７Ｋである。
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＩＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＱＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＦＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＫＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、又は
（６）配列番号６に示されるアミノ酸配列であって、突然変異部位がＩ９４Ｖ＋Ｖ１５１Ｑである。
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＶＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＱＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＦＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ。
【００５９】
上記のジケトレダクターゼ突然変異体のコードＤＮＡ配列として、以下のＤＮＡ配列を含む。
【００６０】
（１）配列番号９：配列番号８に示されるジケトレダクターゼ遺伝子配列において６９１−６９３ｂｐ番目のＴＴＣがＴＧＧに突然変異してなるもの、
（２）配列番号１０：配列番号８に示されるジケトレダクターゼ遺伝子配列において６９１−６９３ｂｐ番目のＴＴＣがＴＧＧに突然変異し、且つ２８０−２８２ｂｐ番目のＡＴＴがＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧに突然変異してなるもの、
（３）配列番号１１：配列番号８に示されるジケトレダクターゼ遺伝子配列において６９１−６９３ｂｐ番目のＴＴＣがＴＧＧに突然変異し、２８０−２８２ｂｐ番目のＡＴＴがＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧに突然変異し、且つ４５１−４５３ｂｐ番目のＧＴＣがＣＡＡ又はＣＡＧに突然変異してなるもの、
（４）配列番号１２：配列番号８に示されるジケトレダクターゼ遺伝子配列において７１５−７１７ｂｐ番目のＧＴＣがＡＴＴ、ＡＴＣ又はＡＴＡに突然変異し、且つ７６９−７７１ｂｐ番目のＣＧＣがＡＡＡ又はＡＡＧに突然変異してなるもの、
（５）配列番号１３：配列番号８に示されるジケトレダクターゼ遺伝子配列において４５１−４５３ｂｐ番目のＧＴＣがＣＡＡ又はＣＡＧに突然変異し、且つ７６９−７７１ｂｐ番目のＣＧＣがＡＡＡ又はＡＡＧに突然変異してなるもの、又は
（６）配列番号１４：配列番号８に示されるジケトレダクターゼ遺伝子配列において４５１−４５３ｂｐ番目のＧＴＣがＣＡＡ又はＣＡＧに突然変異し、且つ２８０−２８２ｂｐ番目のＡＴＴがＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧに突然変異してなるもの。
【００６１】
本発明で用いる技術用語「同一性」とは本分野の公知の意味を有し、当業者にとっては、異なる配列間の同一性を測定する規則、標準が公知のものである。本発明で使用される、異なる程度の同一性で限定された配列は、改良したジケトレダクターゼ活性を同時に具備しなければならない。当業者にとっては、ジケトレダクターゼの活性を測定して変異体配列をスクリーニングする方法及び手段が公知のものである。当業者であれば、本願で開示された内容の示唆に基づき、このような変異体配列を簡単に製造できる。いくつかの実施形態において、前記ジケトレダクターゼ変異体の配列は配列番号７又は８に示される配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％の同一性を有し、且つ改良したジケトレダクターゼ活性を持ち又は改良したジケトレダクターゼ活性をコードにより有するアミノ酸配列である。例えば、前記アミノ酸配列における一つ又は複数のアミノ酸残基に対して保存的アミノ酸置換を行ってもよく、例えば一つ又は複数のアミノ酸残基として、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０個のアミノ酸残基が挙げられる。アミノ酸の保存的アミノ酸は本分野において公知のものである。
【００６２】
本発明で用いる用語「改良したジケトレダクターゼ活性」とは、部位特異的飽和突然変異誘発技術によって得られたジケトレダクターゼの生物学的活性が出発ジケトレダクターゼに比べて改良したことを意味し、例えば、触媒活性が向上し、基質スペクトルが広がり、熱安定性が向上し、ｐＨ安定性が向上し、又は、例えば初期のジケトレダクターゼに比べて、発現量が少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、５００％又はそれ以上増加する。
【００６３】
本発明を明らかに説明するため、下記の実施例をもって本発明の前記製造方法を認証し、これら実施例は説明用の代表例に過ぎず、本発明の保護範囲を制限するものではない。
【００６４】
実施例のすべての実験用材料は、断わりのない限り、いずれも市販品として入手する。本発明の実施例では、出発化合物から説明するが、当業者であれば、ある中間生成物が入手可能な場合は、本発明の実施例のプロセスがいずれの中間体及びステップから開始してもよい、と理解できる。
【００６５】
実施例１  ジケトレダクターゼ突然変異体の製造及びスクリーニング
１、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＫ１２１菌株由来のジケトレダクターゼ（ＤＫＲ）（配列番号７）の部位特異的飽和突然変異誘発
【００６６】
ジケトレダクターゼ（ＤＫＲ）のアミノ酸配列についてＳｗｉｓｓ−ｍｏｄｅｌウエブサイトにおいてタンパク質の三次元構造をシミュレートし、次にＤｏｃｋｉｎｇによって基質とタンパク質の結合シミュレートを行い、最終的にＰｙｍｏｌ分析によって、基質とＮＡＤの結合、ＮＡＤプロトン移動に関与する可能性があるアミノ酸を突然変異アミノ酸とした。
【００６７】
突然変異アミノ酸及びその両側における塩基配列（突然変異アミノ酸について表１．中の突然変異部位参照）に基づき、Ｐｒｉｍｍｅｒ５．０を使用して対応する突然変異プライマー（表１）を設計した。ジケトレダクターゼ遺伝子を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ製、製品番号６９７４４）をテンプレートとして、プラスミド全周をＰＣＲによって完全な線状断片とし、ＤＰｎ Ｉで上記ＰＣＲ産物を消化して親テンプレートを除去した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培養皿に塗布し、３７℃で培養して一晩放置した。
【００６８】
【表１−１】
0006273382.tif 000010
【表１−２】
0006273382.tif 000011
【表１−３】
0006273382.tif 000012
【表１−４】
0006273382.tif 000013
【００６９】
２、ジケトレダクターゼ突然変異体の初期スクリーニング
ステップ１の前記内容に基づき、上記培養皿上の単一コロニーを取って９６ディープウェルプレートに接種し、各ウェルに予め５０μｍ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地を０．５ｍｌ添加して、３７℃で振とう培養を３ｈ行った後、ＩＰＴＧを最終濃度が０．２ｍＭになるまで添加し、１８℃で１６ｈ誘導発現させ、６０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離して菌体を収集し、菌体に対して超音波細胞破砕器（ＪＹ９２−２Ｄ、寧波新芝生物科技股イ分有限公司製）により細胞を破砕し、４℃、１００００ｇで２０ｍｉｎ遠心分離して上澄液を得て、マイクロプレートリーダーで初期の活性スクリーニングを行った。９６ウェルプレートに３０μＬのＤＭＳＯ、主原料として１．５μＬの６−ベンジルオキシ−３，５−ジオキソ−ｔｅｒｔ−ブチルカプロエート（３０ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯに溶解したもの）、２．５μＬのＮＡＤＨ（２０ｍｇ／ｍＬ）、２１６μＬのリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝６．０）を添加して、３４０ｎｍでバックグラウンド検出を行い、次に各ウェルにそれぞれ調製済みの突然変異体酵素液５０μＬを添加し、添加直後に３０℃で３４０ｎｍの吸光度の変化を測定した。
【００７０】
酵素活性は、下記の計算式により求められた。
【００７１】
酵素活性（μ／ｍＬ）＝（△Ａ×６０×Ｖ１）／（６．２２×ｔ×Ｖ２）
ただし、△Ａは反応過程中の吸光度の変化を示し、
Ｖ１は反応系の全体積を示し、
６．２２は消光係数であり、
ｔは△Ａの検出時間を示し、
Ｖ１は添加される酵素液の体積を示す。
【００７２】
３、ジケトレダクターゼ突然変異体の再スクリーニング
ステップ２において酵素活性が親より高い突然変異体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地５００ｍｌに接種し、３７℃で振とう培養をＯＤ６００＝０．６になるまで行い、最終濃度が０．２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加して、１８℃で誘導発現させた。１６ｈ誘導発現させた後、６０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離して菌体を収集した。菌体に対して超音波細胞破砕器（ＪＹ９２−２Ｄ、寧波新芝生物科技股イ分有限公司製）により細胞を破砕し、４℃、１００００ｇで２０ｍｉｎ遠心分離して上澄液を得て、活性の検出に用いた。１０ｍｌの反応フラスコに、主原料として
【化９】
0006273382.tif 000014
（６−ベンジルオキシ−３，５−ジオキソ−ｔｅｒｔ−ブチルカプロエート）０．０５ｇ、０．５ｍｌのポリエチレングリコールＰＥＧ−４００を加え、原料を溶解させた後、４．０ｍｌのリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝６．０）を添加して、主原料を均一に緩衝液に分散させ、１．５ｍｇのＮＡＤ＋、２０．６ｍｇのギ酸アンモニウム、コエンザイムとして１０ｍｇのギ酸デヒドロゲナーゼ及び０．５ｍｌのジケトレダクターゼを添加して、系のｐＨを６．０にし、更に、３０±３℃で１６ｈ保温後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で追跡し、転化物のスポットが明らかで、主原料のスポットが明らかでない系を選択して酢酸エチルで抽出し、静置して分液し、有機相をＨＰＬＣ分析に供した。
【００７３】
親より触媒活性が優れた突然変異体を選択し、シークエンシングして、突然変異部位を分析し、更に拡大培養を行い、触媒活性を再測定した結果、突然変異体Ｆ２３１Ｗ  （配列番号１）、Ｉ９４Ｖ＋Ｆ２３１Ｗ（配列番号２）、１９４Ｖ＋Ｖｌ５１Ｑ＋Ｆ２３１Ｗ（配列番号３）、Ｖ２３９Ｉ＋Ｒ２５７Ｋ（配列番号４）、Ｖ１５１Ｑ＋Ｒ２５７Ｋ（配列番号５）及びＩ９４Ｖ＋Ｖ１５１Ｑ（配列番号６）の触媒活性は親よりも大幅に向上した。再スクリーニング結果は表２に示される。ソフトウェアを使用してジケトレダクターゼの三次元構造についてコンピューターシミュレーション分析を行ったところ、Ｉ９４はＮＡＤ結合領域に位置し、Ｖ１５１、Ｆ２３１、Ｖ２３９及びＲ２５７の四個のアミノ酸はいずれも基質結合部位の付近に位置し、これらアミノ酸の変化によって基質結合特異性が向上し、更に酵素活性が高められる可能性がある。
【００７４】
【表２】
0006273382.tif 000015
【００７５】
４、ジケトレダクターゼ突然変異体のクローン及び発現
ジケトレダクターゼ突然変異体の発現及び同定を簡便に実施するために、遺伝子の５’末端と３’末端の何れにも対応する制限酵素切断部位が設計されている。Ｎｄｅ Ｉ及びＸｈｏ Ｉを使用してそれぞれ目的遺伝子とｐＥＴ−２２ｂ（＋）（腸菌においてタンパク質を発現可能なその他の発現プラスミドも使用可能）を独立して同時に切断し、切断された目的遺伝子とプラスミドの大きな断片とをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結反応させて、その産物を大腸菌ＤＨ５ａ菌株のコンピテント細胞に形質転換し、次に形質転換されたコンピテント細胞を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培養板に塗布して、３７℃で培養して一晩放置した。
【００７６】
上記培養皿で成長した単一コロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で振とう培養して一晩放置し、菌体を収集してプラスミド抽出、ＰＣＲ法による同定及び二重消化による同定（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行った後、正確なクローニングベクターをｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｒ−Ｍとして命名し且つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培養板に塗布して、３７℃で培養して一晩放置した。上記培養板で成長した単一コロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地５ｍｌに接種し、コロニーに対してＰＣＲ法によって同定して、正確な発現ベクターを含む大腸菌を更に誘導発現させた。上記菌液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地５００ｍｌに移して、３７℃でＯＤ６００＝０．５〜０．６になるまで振とう培養し、ＩＰＴＧを最終濃度がそれぞれ０．２〜ｌ．０ｍＭになるまで加え、１８〜２５℃で誘導発現を１０〜１６ｈ行った後、菌液を取り出して、６０００ｇで、１０ｍｉｎ遠心分離して菌体を収集し、−２０℃で冷凍保存して使用に備えた。菌体に対して、超音波細胞破砕器（ＪＹ９２−２Ｄ、寧波新芝生物科技股イ分有限公司製）により細胞を破砕し、４℃、１００００ｇで２０ｍｉｎ遠心分離して上澄液と沈殿を得た。上澄液に対して垂直電気泳動装置でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行ったところ、発現させたジケトレダクターゼ突然変異体はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約３０ＫＤの分子量に泳動される。
【００７７】
実施例２  スタチン系薬物用のキラル中間体の製造
（１）ベンジルオキシ酢酸（化合物３）の合成
反応フラスコにテトラヒドロフラン９６０ｇとトルエン４１ｇを添加し、系の温度を１０〜２０℃に制御し、５３４．０ｇの水酸化カリウムを四回で加え、水酸化カリウムの添加が終了した後、１３７１．１ｇのベンジルアルコールを三回で加えた。３００．１ｇのクロロ酢酸を４８０．５ｇのテトラヒドロフランに溶解させた後、滴下温度を７０−８０℃に制御し、クロロ酢酸のテトラヒドロフラン溶液を前述系に滴下して、クロロ酢酸が完全に消費されるまで反応させた。系冷却後、３．１２Ｋｇの精製水を添加してテトラヒドロフランを減圧除去し、水相をトルエンで四回抽出して、１０〜２０℃で塩酸を使用して水相のｐＨを３に調整し、水相をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで二回抽出した後、濃縮させて収率８８．３％にてＧＣ純度≧９９．２％のベンジルオキシ酢酸（化合物３）  ４２１．３ｇを得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ： １２．２８ （ｂｒ, １Ｈ）, ７．３４−７．３０ （ｍ, ５Ｈ）, ４．５９ （ｓ, ２Ｈ）, ４．１２ （ｓ, ２Ｈ）。
【００７８】
（２）２−ベンジルオキシ−モルホリノアセトアミド（化合物４）の合成
反応フラスコに７００．５ｇのジクロロメタンと１１０．１ｇの化合物３を添加して、系の温度を１０〜２０℃に制御しながら５７５．３ｇの塩化オキサリルを滴下し、塩化オキサリルの添加が終了した後、ｌｈ撹拌し、次に低沸点物質を濃縮除去して、使用に備えた。４８．０ｇのモルホリン、７５．５ｇのトリエチルアミン及び４８０．１ｇのトルエンを反応フラスコに添加し、温度を１０℃程度に制御して、上記濃縮液を反応フラスコの系に滴下した。滴下終了後、ｌｈ撹拌し、次に希塩酸を添加して反応をクエンチさせて分液し、有機相を順に水、飽和炭酸水素ナトリウム、水でそれぞれ一回洗浄し、濃縮させて収率９０．３％にてＨＰＬＣ純度≧９７．５％の２−ベンジルオキシ−モルホリノアセトアミド（化合物４）  １１６．０ｇを得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ： ７．３３−７．２８ （ｍ, ５Ｈ）,４．５６ （ｓ, ２Ｈ）, ４．１４ （ｓ, ２Ｈ）, ３．６３−３．５７ （ｍ, ６Ｈ）, ３．４５−３．４４ （ｂｒ, ２Ｈ）。
【００７９】
（３）ｔｅｒｔ−アミルアセトアセテート（化合物５ａ）の合成
５００ｇのｔｅｒｔ−アミルアルコールと３４．６ｇの４−ジメチルアミノピリジンを２．５Ｌの無水テトラヒドロフランに溶解させ、５℃程度に降温し、次に蒸留したばかりのジケテン５２４．３ｇをゆっくり滴下した。滴下終了後、２０℃程度に昇温して反応させ、ＴＬＣでモニターしながら完全に反応させた。溶剤と過剰なジケテンを蒸留除去し、次に減圧蒸留（５〜８ｍｍＨｇ、８０−９０℃）によって精製して、収率７５．２％にて、ＧＣ純度≧９８．５％のｔｅｒｔ−アミルアセトアセテート（化合物５ａ）  ７３２．５ｇを得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３, ４００ ＭＨｚ） δ ： ６．１１ （ｓ, ２Ｈ）, ３．３９（ｓ, ２Ｈ）, ２．２８ （ｓ, ３Ｈ）, １．８１ （ｑ, Ｊ＝７．４    Ｈｚ, ２Ｈ）, １．４７ （ｓ, ６Ｈ）, ０．９２ （ｔ, Ｊ＝ ７．５ Ｈｚ, ３Ｈ）。
【００８０】
（４）６−（ベンジルオキシ）−３，５−ジオキソシクロペンチルカプロエート（化合物６ａ）の合成
７２．３ｇの水素化ナトリウムを１６００．１ｇのテトラヒドロフランに懸濁させ、温度を１０℃程度に制御しながら３８７．３ｇのｔｅｒｔ−アミルアセトアセテートを滴下し、温度を−２０℃程度に低下させて、次に７２２．５ｍＬのｎ−ブチルリチウムをゆっくり滴下し、滴下終了後、３００．３ｇの化合物４をさらに滴下し、ＴＬＣでモニターしながら完全に反応させた。希塩酸を系に添加して反応をクエンチさせ、分液後、水相をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで抽出し、有機相を併合して濃縮させて収率７０．０％にてＨＰＬＣ純度≧９８．２％の６−（ベンジルオキシ）−３，５−ジオキソシクロペンチルカプロエート（化合物６ａ）  ２００．８ｇを得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ： ７．３２−７．２３ （ｍ, ５Ｈ）,６．０８ （ｓ, ２Ｈ）, ５．２３ （ｓ, ２Ｈ）, ３．２４ （ｓ, ２Ｈ）, ３．０９ （ｓ, ２Ｈ）, １．１４−１．０２ （ｍ, ８Ｈ）, ０．８８ （ｔ, Ｊ＝ ７．６ Ｈｚ, ３Ｈ）。
【００８１】
（５）（３Ｒ，５Ｓ）−６−（ベンジルオキシ）−３，５−ジヒドロキシｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物７ａ）の合成
反応フラスコに精製水（４．０  ｍＬ／ｇの化合物６ａ）と６−（ベンジルオキシ）−３，５−ジオキソｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物６ａ、１．０ｍｏｌ）を加え、均一に撹拌した後、化合物６ａの質量に対して約０．１ｍｇ／ｇのジケトレダクターゼ突然変異体Ｉ９４Ｖ＋Ｆ２３１Ｗ粗酵素液、ギ酸アンモニウム（２．０ｍｏｌ）、ＮＡＤ＋（０．０３ｍｏｌ）を添加し、ｐＨ＝６．２〜６．４に調整した後、系を３０℃程度に昇温して、約２０ｈ保温した。反応終了後、系を６５〜７０℃に昇温して酵素タンパク質を破壊し、酢酸エチルを添加してシリカゲルパッドを通過させ、分液して、水相を酢酸エチルで逆抽出し、有機相を併合して濃縮させ、生成物として純度が９５％、収率が７３．１％、ｅｅ値が９９．３％超え、ｄｅ値が９３．５％である、（３Ｒ，５Ｓ）−６−（ベンジルオキシ）−３,５−ジヒドロキシｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物７ａ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ  ：  ７．３７−７．３０ （ｍ, ５Ｈ）, ６．１２ （ｓ, ２Ｈ）, ４．５９ （ｄ, Ｊ＝ ７．２Ｈｚ, ３０ ２Ｈ）, ４．３１ （ｂｒ, １Ｈ）, ４．１４ （ｂｒ, １Ｈ）, ３．０９ （ｓ, ２Ｈ）, １．１４−１．０２ （ｍ, ８Ｈ）, ０．８８ （ｔ, Ｊ＝ ７．６ Ｈｚ,３Ｈ）。
【００８２】
（６）（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物８ａ）の合成
反応フラスコにアセトン（１０．０ｍＬ／ｇの化合物７ａ）、（３Ｒ,５Ｓ）−６−ベンジルオキシ−３，５−ジヒドロキシｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物７ａ、１．０ｍｏｌ）、２，２−ジメトキシプロパン（２．０ｍｏｌ）及び触媒量のｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム塩（０．０２ｍｏｌ）を添加して撹拌し、２０℃程度で原料（化合物７ａ）がほぼなくなるまで反応させ、３質量％の希塩酸（０．０５ｍｏｌ）を加えて洗浄し、更に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加して系を中和し、低沸点物質を減圧除去した後、水を添加して分液し、水相を酢酸エチルで２回抽出し、有機相を併合して飽和食塩水で一回洗浄し、有機相をシリカゲルパッドに通過させた後、濃縮させて、生成物として、純度９３．５％、収率９０．３％の（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物８ａ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ： ７．３５−７．２８ （ｍ, ５Ｈ）, ６．１３ （ｓ, ２Ｈ）, ４．８０ （ｄ, Ｊ＝ ７．５ Ｈｚ, ２Ｈ）, ４．３３−４．２８ （ｍ, １Ｈ）, ４．１２−４．０７ （ｍ, １Ｈ）, ２．８７−２．６４ （ｍ, ２Ｈ）, １．８３−１．７９ （ｍ, ２Ｈ）, １．３７−    １．２９ （ｍ, １４Ｈ）, ０．８８ （ｔ, Ｊ＝ ７．５ Ｈｚ, ３Ｈ）。
【００８３】
（７）（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物９ａ）の合成
反応フラスコに酢酸エチル（１０．０ｍＬ／ｇの化合物８ａ）、（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物８ａ、１．０ｍｏｌ）及び金属触媒としての水酸化パラジウム（５％）を添加して撹拌し、系を密閉した後、窒素ガスで五回置換し、次に水素ガスで三回置換し、系を２０℃程度で原料（化合物８ａ）がほぼなくなるまで反応させた。窒素ガスで三回置換して放圧した後、系を吸引濾過して、濾過ケーキを酢酸エチルで二回洗浄し、濾液とリンス液を混合して乾固するまで濃縮させ、製品として純度９６．７％、収率９３．９％の（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物９ａ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） ５： ４．３３−４．２６ （ｍ, １Ｈ）, ４．０１−３．９８ （ｍ, １Ｈ）, ３．８１−３．４８ （ｍ, ２Ｈ）, ２．４６−２．３０ （ｍ, ２Ｈ）, １．７９−１．７６ （ｍ, ２Ｈ）, １．４２−１．３３ （ｍ, １４Ｈ）, ０．８８ （ｔ, Ｊ＝ ７．６ Ｈｚ, ３Ｈ）。
【００８４】
（８）（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ホルミル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物ｌａ）の合成
反応フラスコにジクロロメタン（１０．０ｍＬ／ｇの化合物９ａ）と２−（（４Ｒ，６Ｓ）−６−メトキシ−２，２−ジメチル−［１，３］ジエポキシ−４−イル）−アセテート（化合物９ａ、１．０ｍｏｌ）を添加して撹拌し、系の温度を−１０〜０℃に低下させ、ジメチルスルホキシド（１０．０ｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．５ｍｏｌ）を添加し、次に三酸化硫ピリジン（３．２５ｍｏｌ）を分割して添加し、添加終了後、保温して化合物９ａがほぼなくなるまで反応させた。次に、系に精製水を添加して反応をクエンチさせ、分液して水相をジクロロメタンで一回逆抽出し、有機相を併合して精製水で洗浄し、乾固するまで濃縮させ、目的側鎖生成物として純度９３．２％、収率８２．５％の（４Ｒ−Ｃｉｓ）−６−ホルミル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（式Ｉａ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ： ９．５８ （ｓ, １Ｈ）, ４．３４−４．３０ （ｍ, ２Ｈ）, ２．４３−２．３７ （ｍ, ２Ｈ）, ２．４６−２．３０ （ｍ, ２Ｈ）, １．５７−１．４３ （ｍ, ２Ｈ）, １．４３−１．３６ （ｍ, １２Ｈ）, ０．８９ （ｔ, Ｊ＝ ７．８ Ｈｚ, ３Ｈ）。
【００８５】
実施例３  スタチン系薬物用のキラル中間体の製造
（１）ベンジルオキシ酢酸（化合物３）の合成
反応フラスコに７２０．３ｇのテトラヒドロフランと４１．１ｇのトルエンを添加し、系の温度を１０−２０℃に制御して、３８２．１ｇの水酸化ナトリウムを分割して添加し、水酸化ナトリウムの添加が終了した後、系に１３７１．１ｇのベンジルアルコールを三回添加した。３００．２ｇのクロロ酢酸を７２０．５ｇのテトラヒドロフランに溶解した後、滴下温度を７０−８０℃に制御して、クロロ酢酸のテトラヒドロフラン溶液を前述系に滴下し、系をクロロ酢酸が使用済みになるまで反応させた。系冷却後、３．１Ｋｇの精製水を添加し、次にテトラヒドロフランを減圧除去して、水相をトルエンで四回抽出し、１０−２０℃で塩酸を使用して水相のｐＨを３．２に調整し、水相をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで二回抽出した後、濃縮させて収率８６．２％にてＧＣ純度≧９９．１％のベンジルオキシ酢酸（化合物３） ４１０．５ｇを得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ： １２．２８ （ｂｒ, １Ｈ）, ７．３４−７．３０ （ｍ, ５Ｈ）, ４．５９ （ｓ, ２Ｈ）, ４．１２１５ （ｓ, ２Ｈ）。
【００８６】
（２）２−ベンジルオキシ−モルホリノアセトアミド（化合物４）の合成
反応フラスコに７００．０ｇのトルエンと１１０．１ｇの化合物３を添加し、系の温度を１０−２０℃に制御して５５７．３ｇの塩化チオニルを滴下し、塩化チオニルの添加が終了した後、系をｌｈ撹拌し、濃縮させて低沸点物質を除去し、使用に備えた。４８．０ｇのモルホリン、７５．１ｇのトリエチルアミン及び４８０．０ｇのトルエンを反応フラスコに加え、温度を１５℃程度に制御して、上記濃縮液を反応フラスコの系に滴下した。滴下終了後、ｌｈ撹拌して希塩酸を添加して反応をクエンチさせ、分液して有機相を順に水、飽和炭酸水素ナトリウム、水でそれぞれ一回洗浄し、濃縮させて、収率９０．２％にてＨＰＬＣ純度≧９７．５％の２−ベンジルオキシ−モルホリノアセトアミド（化合物４）  １１６．３ｇを得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ： ７．３３−７．２８ （ｍ, ５Ｈ）, ４．５６ （ｓ, ２Ｈ）, ４．１４ （ｓ, ２Ｈ）, ３．６３−３．５７ （ｍ, ６Ｈ）, ３．４５−３．４４ （ｂｒ, ２Ｈ）。
【００８７】
（３）ｔｅｒｔ−アミルアセトアセテート（化合物５ａ）の合成
５００．０ｇのｔｅｒｔ−アミルアルコールと３４．６ｇの４−ジメチルアミノピリジンを２．５Ｌの無水テトラヒドロフランに溶解して、５℃程度に降温し、次に、蒸留した直後のジケテン５２４．２ｇをゆっくり滴下した。滴下終了後、１５℃程度に降温して反応させ、ＴＬＣでモニターしながら完全に反応させた。溶剤と過剰なジケテンを蒸留除去し、次に減圧蒸留（５〜８ミリメートルの水銀柱、８０〜９０℃）により精製して収率７５．３％にてＧＣ純度≧９８．５％のｔｅｒｔ−アミルアセトアセテート（化合物５ａ）  ７３２．２ｇを得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３, ４００ ＭＨｚ） δ ： ６．１１ （ｓ, ２Ｈ）, ３．３９ （ｓ, ２Ｈ）, ２．２８ （ｓ, ３Ｈ）, １．８１ （ｑ, Ｊ＝７．４ Ｈｚ, ２Ｈ）, １．４７ （ｓ, ６Ｈ）, ０．９２ （ｔ, Ｊ＝ ７．５ Ｈｚ, ３Ｈ）。
【００８８】
（４）６−（ベンジルオキシ）−３，５−ジオキソシクロペンチルカプロエート（化合物６ａ）の合成
１４４．６ｇの水酸化ナトリウムを１６００．２ｇのテトラヒドロフランに懸濁させ、温度を１０℃程度に制御しながら３８７．５ｇのｔｅｒｔ−アミルアセトアセテートを滴下し、温度を約−２０℃に低下させて、次に、７２２ｍＬのジプロピルエチルリチウムをゆっくり滴下して、滴下終了後、３００．２ｇの化合物４を添加し、ＴＬＣでモニターしながら完全に反応させた。希塩酸を系に添加して反応をクエンチさせ、分液後、水相をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで抽出して、有機相を併合して濃縮させて、収率６８．２％にてＨＰＬＣ純度≧９８．３％の６−（ベンジルオキシ）−３，５−ジオキソシクロペンチルカプロエート（化合物６ａ）  １９４．８ｇを得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ： ７．３２−７．２３ （ｍ, ５Ｈ）, ６．０８ （ｓ, ２Ｈ）, ５．２３ （ｓ, ２Ｈ）, ３．２４ （ｓ, ２Ｈ）, ３．０９ （ｓ, ２Ｈ）, １．１４−１．０２ （ｍ, ８Ｈ）, ０．８８ （ｔ, Ｊ＝ ７．６Ｈｚ, ３Ｈ）。
【００８９】
（５）（３Ｒ，５Ｓ）−６−（ベンジルオキシ）−３，５−ジヒドロキシｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物７ａ）の合成
反応フラスコに精製水（４．０ｍＬ／ｇの化合物６ａ）と６−（ベンジルオキシ）−３，５−ジオキソｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物６ａ、１．０ｍｏｌ）を添加して、均一に撹拌した後、化合物６ａの質量に対して約０．１ｍｇ／ｇのジケトレダクターゼ突然変異体Ｉ９４Ｖ＋Ｖ１５１Ｑ＋Ｆ２３１Ｗ粗酵素液、ギ酸アンモニウム（２．０ｍｏｌ）、ＮＡＤ＋（０．０３ｍｏｌ）を添加し、ｐＨ＝６．２〜６．４に調整した後、系を３０℃程度に昇温して、２０ｈ保温した。反応終了後、系を６５〜７０℃に昇温して酵素タンパク質を破壊し、酢酸エチルを加えて、シリカゲルパッドに通過させ、分液して、水相を酢酸エチルで逆抽出し、有機相を併合して濃縮させ、製品として純度が９３．１％、収率が７３．２％、ｅｅ値が９９．３％超え、ｄｅ値が９２．８％の（３Ｒ，５Ｓ）−６−（ベンジルオキシ）−３，５−ジヒドロキシｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物７ａ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ： ７．３７−７．３０ （ｍ, ５Ｈ）, ６．１２ （ｓ, ２Ｈ）, ４．５９ （ｄ, Ｊ＝ ７．２Ｈｚ, ２Ｈ）, ４．３１ （ｂｒ, １Ｈ）, ４．１４ （ｂｒ, １Ｈ）, ３．０９ （ｓ, ２Ｈ）, １．１４−１．０２ （ｍ, ８Ｈ）, ０．８８ （ｔ, Ｊ＝ ７．６ Ｈｚ, ２０ ３Ｈ）。
【００９０】
（６）（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物８ａ）の合成
反応フラスコにアセトン（１０．０ｍＬ／ｇの化合物７ａ）、（３Ｒ，５８）−６−ベンジルオキシ−３，５−ジヒドロキシｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物７ａ、１．０ｍｏｌ）、２，２−ジメトキシプロパン（２．０ｍｏｌ）及び触媒量の塩酸（０．０２ｍｏｌ）を添加して撹拌し、系を約２５℃で原料化合物７ａがほぼなくなるまで反応させ、３質量％の希塩酸（０．０５ｍｏｌ）を添加して洗浄し、更に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加して系を中和し、低沸点物質を減圧除去した後、水を添加して分液し、水相を酢酸エチルで２回抽出し、有機相を併合して飽和食塩水で一回洗浄し、有機相をシリカゲルパッドに通過させた後、濃縮させて、製品として純度９４．０％、収率９０．２％の（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物８ａ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）δ ： ７．３５−７．２８ （ｍ, ５Ｈ）, ６．１３ （ｓ, ２Ｈ）, ４．８０ （ｄ, Ｊ＝ ７．５ Ｈｚ, ２Ｈ）, ４．３３−４．２８ （ｍ, １Ｈ）, ４．１２−４．０７ （ｍ, １Ｈ）, ２．８７−２．６４ （ｍ, ２Ｈ）, １．８３−１．７９ （ｍ, ２Ｈ）,１．３７−１．２９ （ｍ, １４Ｈ）, ０．８８ （ｔ, Ｊ＝ ７．５ Ｈｚ, ３Ｈ）。
【００９１】
（７）（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物９ａ）の製造
反応フラスコに酢酸エチル（１０．０ｍＬ／ｇの化合物８ａ）、（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物８ａ、１．０ｍｏｌ）及び金属触媒としての水酸化パラジウム（５％）を添加して撹拌し、系を密閉させた後、窒素ガスで五回置換して、水素ガスで三回置換し、系を約２５℃で化合物８ａがほぼなくなるまで反応させた。窒素ガスで三回置換し、放圧後、系を吸引濾過して、濾過ケーキを酢酸エチルで二回洗浄し、濾液とリンス液を混合して、乾固するまで濃縮させ、製品として純度９６．３％、収率９２．６％の（４Ｒ−Ｃｉｓ）−６−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物９ａ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ： ４．３３−４．２６ （ｍ, １Ｈ）, ４．０１−３．９８ （ｍ, １Ｈ）, ３．８１−３．４８ （ｍ, ２Ｈ）, ２．４６−２．３０ （ｍ, ２Ｈ）, １．７９−１．７６ （ｍ, ２Ｈ）, １．４２−１．３３ （ｍ, １４Ｈ）, ０．８８ （ｔ, Ｊ＝ ７．６ Ｈｚ, ３Ｈ）。
【００９２】
（８）（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ホルミル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（化合物ｌａ）の合成
反応フラスコにジクロロメタン（１０．０ｍＬ／ｇの化合物９ａ）と２−（（４Ｒ，６Ｓ）−６−メトキシ−２，２−ジメチル−［１，３］ジエポキシ−４−イル）−アセテート（化合物９ａ、１．０ｍｏｌ）を添加して撹拌し、系の温度を−１０〜０℃に低下させてジメチルスルホキシド（１０ｍｏｌ）とトリエチルアミン（３．５ｍｏｌ）を添加し、次に、三酸化硫黄ピリジン（３．２５ｍｏｌ）を三回で加え、添加終了後、保温しながら化合物９ａがほぼ消えるまで反応させた。次に、系に精製水を加えて反応をクエンチさせ、分液して水相をジクロロメタンで一回逆抽出し、有機相を併合して、精製水で洗浄し、乾固するまで濃縮させて、目的側鎖生成物として純度９５．１％、収率８２．７％の（４Ｒ−ｃｉｓ）−６−ホルミル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−ｔｅｒｔ−アミルカプロエート（式Ｉａ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ： ９．５８ （ｓ, １Ｈ）, ４．３４−４．３０ （ｍ, ２Ｈ）, ２．４３−２．３７ （ｍ, ２Ｈ）, ２．４６−２．３０ （ｍ, ２Ｈ）, １．５７−１．４３ （ｍ, ２Ｈ）, １．４３−１．３６ （ｍ, １２Ｈ）, ０．８９ （ｔ, Ｊ＝ ７．８ Ｈｚ, ３Ｈ）。
【００９３】
実施例４  スタチン系薬物用のキラル中間体の製造
アセトアセテートをシクロアミルアセトアセテートに変更した以外、製造過程は実施例１と同様にした。
【００９４】
製造過程は、以下の通りである。
【００９５】
５００．０ｇのシクロペンタノールと２０．５ｇのイソプロピルアミンを５℃程度に冷却し、次に、蒸留したばかりのジケテン５００．０ｇをゆっくり滴下する。滴下終了後、６０〜７０℃に加熱して反応させ、ＴＬＣで検出しながら完全に反応させる。温度を４０℃以下に低下させ、過剰なジケテンを蒸留除去して、収率８０．２％にて、ＧＣ純度≧９７．５％のシクロアミルアセトアセテート（化合物５ｂ）  ７９０．５ｇを得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３, ４００ ＭＨｚ） δ ： ５．２２ （ｔ, Ｊ＝ ５．８ Ｈｚ, １Ｈ）, ３．４０ （ｓ, ２Ｈ）, ２．２５ （ｓ, ３Ｈ）, １．９１−１．７９ （ｍ, ２Ｈ）, １．７８−１．６６ （ｍ, ５Ｈ）, １．６５−１．５３ （ｍ, ２Ｈ）。
【００９６】
本発明を説明するために、本発明の好適な実施形態を開示したが、当業者にとって、請求項書類に限定される本発明の主旨や範囲を脱逸せずに、本発明に各種の修正、添加及び置換を行ってもよいことが明らかである。
【配列表】
0006273382000001.app