(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボタンボウフウ（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）の葉を含水エタノール（含水率：３０質量％〜４５質量％）で処理して得られる抽出物を有効成分としてなるＧＬＰ−１産生促進剤（糖尿病の治療用途を除く。）を製造する方法。
【請求項２】
ボタンボウフウ（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）の葉を含水エタノール（含水率：３０質量％〜４５質量％）で処理して得られる抽出物を有効成分としてなるＤＰＰＩＶ阻害剤（糖尿病の治療用途を除く。）を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、特定の植物又はその加工物を有効成分としてなる、ＧＬＰ−１産生促進剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤及びグルコース吸収阻害剤、並びにこれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】  生活習慣病の代表的なものに心疾患、糖尿病、脂質異常症（高脂血症）、高血圧、脳卒中等があり、これらの原因の多くは肥満との関連が大きく、特に内臓脂肪の蓄積によって引き起こされていることがわかっている。内臓脂肪の蓄積は、血中の糖質（グルコース）が活動エネルギーとして消費されず、余剰のグルコースが脂肪として組織に蓄えられることによる。【０００３】  生体中の糖代謝のメカニズムにおいて、血糖濃度の調節機能があり、食物を摂取すると炭水化物・たんぱく質・脂肪の各分解酵素等による消化過程を経て、脂肪酸・アミノ酸・ブドウ糖（グルコース）に変換され、消化管（腸管）で吸収される。腸管で吸収されたグルコースは、血中に放出され、一時的に血液中のグルコース濃度を上昇させるため、膵臓の細胞が血糖値の上昇を感知して、分泌ホルモンであるインスリンを血液中へ放出し、インスリンは肝臓細胞や脂肪細胞、筋肉組織に血液中のグルコースを取り込むよう働きかけ、グルコースをグリコーゲン（グルコースの高分子化物）にかえて細胞の中に蓄えると、血液中のブドウ糖濃度（血糖値）は低下して一定の濃度に保持される。また、運動などで下がった血糖値は、グリコーゲンからグルコースに変換され、これが血液中へ放出されて一定の血糖値を保つ仕組みがある。【０００４】  血糖値の調節メカニズムでは、食後の血糖値が高い状態のとき、腸管から血液中に分泌されるインクレチンホルモン（以下、単にインクレチンという。）が関与する。インクレチンは二種類のペプチドからなり、一つは回腸や結腸に存在するＬ細胞から分泌されるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）で、もう一つは十二指腸のＫ細胞から分泌されるグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）である。これらのペプチドは食事の摂取に伴い、血中濃度が上昇すると膵臓のβ細胞に作用して、インスリンの分泌を促進し、血糖値が正常範囲内にあるときには必要以上に分泌されない性質をもつ。また、蓄えたエネルギーを放出する作用のあるグルカゴンの分泌を抑制することにより、血糖値を下げる働きをする。【０００５】  インクレチンは膵臓以外での働きもあり、ＧＬＰ−１では中枢神経系や消化管（主に胃）に働きかけ、食欲の抑制や消化管運動を抑制する作用があり、体内に新たなグルコースを取り込まない働きをする。また、ＧＩＰでは脂肪細胞や褐色脂肪細胞に働きかけ、グルコースの取り込みを促進し、血中からグルコースを排除する働きがある。【０００６】  一方、インクレチンは分泌後、その分解酵素であるＤＰＰ（ジペプチジルペプチダーゼ）ＩＶによって速やかに分解され、生体内での活性を失うことが知られており、インクレチンの働きを円滑にするためにはＤＰＰＩＶの阻害も必要である。近年、インクレチンに関連した作用機序をもつ糖尿病治療薬が開発されている。ＧＬＰ−１産生を促進するタイプとしてＧＬＰ−１受容体作動物質があり、その特徴としてＧＬＰ−１自体の構造を変化させ、ＤＰＰＩＶによる分解を受けにくくしている。このような薬剤として、リラグルチドやエキセナチドがある（例えば、特許文献１）。また、産生されたＧＬＰ−１の分解をＤＰＰＩＶの作用から防ぐタイプとしてＤＰＰＩＶ阻害物質があり、薬剤として、ビルダグリプチンやシタグリプチン、アログリプチン等がある（例えば、特許文献２）。【０００７】  また、ＤＰＰＩＶ阻害剤は血糖値を下げる働き以外に、空腹時血糖値を下げ過ぎない作用をもっており、従来の糖尿病患者への治療薬は患者が食事を摂取しなかったり、抗糖尿病剤が効き過ぎる等の要因で、血糖値のコントロールが難しかった点が克服され、ＩＩ型糖尿病患者への新たな治療薬とされている。【０００８】  前述の糖代謝のメカニズムにおいては、グルコースの腸管吸収過程があるが、この過程では、小腸上皮細胞上の輸送体（ＳＧＬＴ−１）によって血中のグルコース濃度が制御されている。ＳＧＬＴ−１は主に腸管上皮に分布しており、腎臓の近位尿細管、気管、心臓等にも存在している。その機能として、腸管でグルコースの吸収を行い、また、腎臓でグルコースの再吸収を行う。なお、腎臓に存在するＳＧＬＴ−２は、腎臓でグルコースの再吸収のみを行う。ＳＧＬＴ−１及びＳＧＬＴ−２は、消化管からのグルコースを吸収し、尿中へのグルコース排泄を抑制する作用を有する。グルコースの供給バランスが崩れると、心臓部のＳＧＬＴ−１の機能が拡張し、心機能障害に陥りやすく、特にＩＩ型糖尿病患者は、心筋症や心筋虚血等の疾患を惹起する懸念がある（非特許文献１）。【０００９】  グルコース吸収阻害作用に基づく医薬品としてアカルボースやボグリホース、ミグリトール等が知られている。これらは、腸管の吸収に関与する薬剤で、腸管に存在する二糖類を単糖に分解する酵素（α−グルコシダーゼ）を阻害し、グルコースの消化吸収を緩和にする働きをもつ。ＳＧＬＴ−１阻害及びＳＧＬＴ−２阻害に基づく医薬品としてダパグリフロジン、エンパグリフロジン、カナグリフロジン等があり、これらはグルコースの再吸収抑制作用や排泄作用をもつ薬剤である（例えば、特許文献３）。【００１０】  糖代謝とりわけグルコースの代謝が正常に作動しないと、肥満や糖尿病だけでなく、生体内の糖化（グリケーション）現象を誘発する。グリケーションとは体内の余分な糖分が蛋白質と結びつく反応で、生体を構成するタンパク質のアミノ基とグルコース等の還元糖のカルボニル基とが非酵素的に反応することである。グリケーションが進行し、酸化、脱水、縮合等の様々な化学反応を経て、糖化の最終産物（ＡＧＥｓ）が形成される。ＡＧＥｓは強力な老化促進物質であり、体内に蓄積すると身体を構成する組織（臓器や骨）や血管がもろくなり、体内の組織が硬直化や化石化する。また、皮膚ではたるみ、しわができ、血管の弾力性は失われて動脈硬化が促進され、骨粗鬆症や白内障、アルツハイマー型認知症といった疾患にもつながるおそれがある。【００１１】  また、高肥満者の特徴として、内臓脂肪は細胞の受容体に結合して炎症シグナルを活発化させ、細胞に炎症を引き起こす。肥大した内臓脂肪は催炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αやＩＬ−６、あるいは炎症促進型のマクロファージであるＭ１マクロファージを増加させ、ケモカインのＭＣＰ−１等の催炎症型のアディポサイトカインを分泌すると同時に、抗炎症を示すアディポネクチンの分泌を低下させる。また、脂肪細胞に関与する免疫細胞としてはマクロファージだけにとどまらず、細胞障害型���Ｔ細胞等の炎症反応性の免疫細胞が発現誘導される。また、これらの催炎症性サイトカインによる刺激は、インスリン受容体から誘導されるインスリン刺激シグナルを抑制する。つまり、インスリンの効きが悪くなるインスリン抵抗性を生み出し、生体内でインスリンが働かなくなり、血糖値のコントロールができなくなり、糖尿病をはじめとする重篤な疾患を招くおそれがある（非特許文献２）。【００１２】  ボタンボウフウ（学名：Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）は、セリ目セリ科カワラボウフウ属の大型多年草である。別名ではチョウメイソウ（長命草）、サクナ等とも呼ばれ、分布は東アジアの亜熱帯から温帯地域に植生する。日本では九州南部から沖縄に自生し、海岸の断崖や珊瑚石灰岩で形成される岩場等に土着し、潮風や照りつける太陽等の厳しい自然条件下で生育する。草丈は約８０ｃｍで、根生葉は二回羽状に分かれ、ボタンの葉に似ており、夏には枝先に白色の小花を密生させる。葉や茎は野菜として食用に供せられ、代表的な調理方法として天麩羅、青汁、茶等がある。栄養価ではビタミンＡ、Ｂ２、Ｂ６、Ｅ、β−カロテン、カルシウム、繊維等が多く含まれる。【００１３】  また、ボタンボウフウは伝承医薬原料として高血圧、動脈硬化、リュウマチ、神経痛、喘息、百日咳、風邪、熱等に良いと言い伝えられおり、特に根は滋養強壮剤として薬用人参の代用になったこともある。近年では、活性酸素を消去する抗酸化剤、二糖類分解酵素を阻害する物質、抗酸化作用やメラニン産生抑制作用に注目し、光老化防止に有用な皮膚外用剤等として利用する提案がある（特許文献４、５、６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】再表２０１１／０５２５２３号公報
【特許文献２】特表２００９−５０８９５５号公報
【特許文献３】特表２０１２−５２３３７４号公報
【特許文献４】特開２００４−０２６６９７号公報
【特許文献５】特許第４２６９０３６号公報
【特許文献６】特開２００４−３５９７３２号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】  Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ＳＫ．等、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第８４巻（１）、第１１１−１１８頁、２００９年
【非特許文献２】  伊藤綾香等、Ａｄｉｐｏｓｃｉｅｎｃｅ、第６巻（１）、第１６−２１頁、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】  日常の食事では、ブドウ糖やブドウ糖果糖液糖等を配合したグルコース含有飲食品を習慣的に多種・多量に摂取しているのが実情であり、例えば、前記の二糖類分解酵素の阻害作用を発現する有効成分が現実の食事後や糖代謝や糖の吸収に対して十分な有効性を発現するとは必ずしも言えない。また、ボタンボウフウがＧＬＰ−１産生を促進したり、ＤＰＰＩＶ活性を阻害することやグルコース吸収を阻害することは従来知られていなかった。【００１７】  生体内のＧＬＰ−１は、前述のように、安定性に欠け、ＤＰＰＩＶによって分解されて失活するため、体外から摂取あるいは投与しても、体内でその活性を維持することは難しく、ＧＬＰ−１受容体作用を有する従来薬剤では、消化管に作用するため、便秘や悪心・嘔吐、下痢等の副作用を起こしやすく、また、他の糖尿病治療薬と併用した場合、ふるえやめまい、顔面蒼白等の低血糖症状が現れやすくなるために注意が喚起されており、生体内においてＧＬＰ−１産生を促進させる作用を有する天然素材由来の成分や物質の開発が求められていた。
また、ＤＰＰＩＶ阻害作用を有する従来の薬剤は、かねてよりその代謝・排泄経路における腎障害、肝障害に注意が喚起されていたが、ＤＰＰＩＶ阻害薬には多くの膵外作用（血糖値を低下させるインスリン分泌以外の作用）、例えば、心血管系では心拍出量の増加、骨格筋では糖代謝の促進等の副作用が指摘され、長期投与による新たな副作用の出現にも注意をしなければならないといった懸念もある。
また、グルコース吸収阻害作用に基づく医薬品は食後の血糖ピーク値を減少させ、食事とともに摂取する場合には有効であるが、食事以外の要因による高血糖症状（例えば、脂質異常症やＩＩ型糖尿病予備軍）の予防や改善には十分満足できるものではなかった。さらに、これらの医薬品は医師の指導と管理下で投与される必要がある等の制限を受けるものであり、ＩＩ型糖尿病を併発していない肥満者や糖尿病予備軍の者には使用し難いのが現状であった。
したがって、本発明では、日常の食生活習慣に容易に組み入れることができ、安全であり、かつ使用者を選ぶことなく適用し得るＧＬＰ−１産生促進剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤及びグルコース吸収阻害剤を開発し、さらに該剤を有効に利用することができる産業上の態様を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１８】  前記課題を解決するために、本発明者らは、生体のＧＬＰ−１産生を促進し、ＤＰＰＩＶ活性やグルコース吸収能を抑制又は阻害するための多種多様な素材について鋭意検討を重ねた結果、特定の植物を用いると極めて高いＧＬＰ−１産生促進作用、ＤＰＰＩＶ阻害作用やグルコース吸収阻害作用が発現されること、また、これを飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、動物飼料等の産業分野において有効活用し得ることを見出し、本発明を完成した。【００１９】  すなわち、本発明の特徴は次のとおりである。
（１）ボタンボウフウ（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）を有効成分としてなるＧＬＰ−１産生促進剤。
（２）ボタンボウフウ（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）を有効成分としてなるＤＰＰＩＶ阻害剤。
（３）ボタンボウフウ（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）を有効成分としてなるグルコース吸収阻害剤。
（４）有効成分がボタンボウフウ（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）を水及び／又は低級一価アルコールからなる抽出溶媒で処理して得られる抽出物である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の剤。
（５）抽出溶媒が含水エタノール（含水率：約１質量％〜約５０質量％）である前記（４）に記載の剤。
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の剤を少なくとも１種以上配合してなる経口組成物。
（７）血糖値上昇抑制のためのものである前記（６）に記載の組成物。
（８）食事量減少及び／又は体重減少のためのものである前記（６）に記載の組成物。
（９）態様が医薬品、医薬部外品、飲食品、食品添加物、ペットフード又は飼料である前記（６）〜（８）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【００２０】  本発明の剤は、ボタンボウフウを有効成分としてなるものであり、糖代謝に係る腸管分泌ホルモン（インクレチン）とりわけＧＬＰ−１の生体内産生を高める効果を有するため、インスリンの分泌を促して血糖値低下に寄与すること、食欲抑制や消化管（胃）運動抑制の点から抗肥満対策として利用することができる。また、前記インクレチンを分解するＤＰＰＩＶの活性を阻害する効果を奏するため、血中インクレチンの機能を保持させ、インスリン分泌を促進し、グルカゴン分泌を抑制して、血糖値を正常範囲に維持させることが可能となる。さらに、小腸管からのグルコース吸収を阻害する効果を奏するため、血中グルコース濃度を減少させ、血糖値の上昇を抑制することが可能となる。かかる効果は、前記有効成分が含水エタノール抽出物である場合により一層顕著なものとなる。本発明の剤は、日常の食事とともに摂取することができ、生体の糖代謝機能を正常化することによって、肥満、糖尿病、生体内糖化（グリケーション）により誘発される組織硬化、血管脆弱化、皮膚障害、動脈硬化、骨粗鬆症、白内障等の老化関連疾患を予防、改善あるいは治療するうえで有用であり、このための医薬品、医薬部外品、飲食品、食品添加物、ペットフード、飼料等の形態で有効利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】  次に、本発明を実施するための態様について詳細に説明する。
【００２２】  本発明の剤はボタンボウフウ（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）を有効成分としてなることを特徴するものである。原料とするボタンボウフウは本州中部以西から沖縄にかけての地域、朝鮮半島南部、中国、フィリピン等に自生し又は栽培されているものを適宜に利用すればよい。植物体の任意の部位（葉、茎、根等）を使用することができ、この乾燥粉末や、水及び／又は親水性有機溶媒で処理した抽出物を前記剤の実質的な有効成分として利用する。
【００２３】  本発明に係わるボタンボウフウは、公知の方法で乾燥粉末に加工したり、任意の方法で抽出処理して製造することができる。抽出物を製造するには、水及び／又は低級アルコールを用いて抽出処理するのが好ましい。抽出処理方法は、使用する溶媒に合わせて常圧〜加圧（大気圧＋１〜３気圧）下、常温〜溶媒の沸点の温度条件で行えばよい。抽出溶媒としては、一般の植物エキスを製造する際に用いられる公知の溶媒を適宜選択して用いればよく、例えば、水（熱水）、メタノール、エタノール、無水エタノール、ブタノール等の低級アルコール、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、これらの混合溶媒等を例示することができる。本発明では水及び／又は低級一価アルコールを用いることがより好ましく、水及び／又はエタノールがさらに好ましく、含水エタノール（含水率：約１質量％〜約５０質量％）が最も好適である。抽出溶媒が含水エタノールの場合、より具体的には、本発明の剤がＧＬＰ−１産生促進剤のときは含水率：約１質量％〜約５０質量％、ＤＰＰＩＶ阻害剤のときは含水率：約３０質量％〜約５０質量％、グルコース吸収阻害剤のときは含水率：約１質量％〜約５０質量％にするのがよい。含水率が前記範囲を外れると本発明の所望の効果が低くなる傾向がある。
【００２４】  本発明の剤は、飲食用途に使用する場合は、ボタンボウフウの葉、茎、根の部位又はこれらの混合物を原料とし、これを常法により乾燥したもの又はその粉砕物とするか、前記溶媒で抽出処理した抽出液、その濃縮物あるいは乾燥物又はその粉末とするのが製造コストや利便性の点から望ましい。
また、医薬用途に利用する場合は、前記溶媒や他の親水性有機溶媒を用いて抽出した抽出液、濃縮物、抽出物あるいはこれらをさらに溶剤分別や吸着剤分画等の処理に供して採取した高純度の精製物が望ましい。
【００２５】  前述のようにして得られるボタンボウフウの乾燥物、抽出物、精製物等は、固体状、ペースト状又は液体状の形態となし、これらをそのまま本発明の剤としてもよいが、本発明の剤が利用される用途における公知の添加物を必要に応じて併用して、常法により含有せしめて組成物として調製することもできる。ここで、公知の添加物は経口摂取するために通常利用されるものや外用剤として通常利用されるものが望ましく、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤、流動化剤、保存剤、界面活性剤、安定剤、希釈剤、溶解剤、等張化剤、殺菌剤、防腐剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料等の添加物質を使用することが可能である。
【００２６】  本発明においては、前述した剤を飲食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品、飼料、その他産業分野の様々な製品の配合原料の一部として使用することができる。とりわけ、ＧＬＰ−１産生促進作用、ＤＰＰＩＶ阻害作用及び／又はグルコース吸収阻害作用を十分に発現させるために経口組成物となすことが好ましく、この経口組成物の好適な態様は飲食品、医薬品又は医薬部外品である。これらの例を以下に述べるが、本発明はこれにより限定されるものではない。なお、前述した三種類の剤を複数配合する組成物の場合、各剤の比率は期待する作用・効果に応じて適宜に設定することができる。
【００２７】  本発明の剤を配合する経口組成物の形態は、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤等の経口用製剤となすことが可能である。かかる製剤組成物におけるボタンボウフウの含有量は、併用する原料の種類や含有量等により一律に規定し難いが、前記抽出物の場合は概ね０．０１質量％〜９０質量％程度、より望ましくは約０．１質量％〜約７０質量％である。前記含有量が約０．０１質量％を下回ると本発明の所望の効果が認められなくなり、約９０質量％を超えると実用的な製剤組成物を調製することが難しくなる。前記抽出物以外（未抽出物や精製物）の場合は、抽出収率や精製濃縮率を考慮して算出すればよい。本発明の前記組成物は、これを望ましくは経口的に摂取又は投与して利用する。本発明の経口組成物を摂取又は投与する量の目安は、該組成物に含まれる前記抽出物ベースで、ヒト成人１日あたり約０．５ｇ〜約１０ｇ、望ましくは約０．０５ｇ〜約０．１ｇである。
【００２８】  飲食品の具体例として、野菜ジュース、果汁飲料、清涼飲料、茶等の飲料類、即席麺、スープ、ゼリー、プリン、ヨーグルト、ケーキプレミックス製品、菓子類、ふりかけ、味噌、醤油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、植物性クリーム、焼肉用たれや麺つゆ等の調味料、麺類、うどん、蕎麦、スパゲッティ、ハムやソーセージ等の畜肉魚肉加工食品、ハンバーグ、コロッケ、佃煮、ジャム、牛乳、クリーム、バター、スプレッドやチーズ等の粉末状、固形状又は液状の乳製品、マーガリン、パン、ケーキ、クッキー、チョコレート、キャンディー、グミ、ガム等の各種一般加工食品のほか、粉末状、顆粒状、丸剤状、錠剤状、ソフトカプセル状、ハードカプセル状、ペースト状又は液体状の栄養補助食品、特定保健用食品、機能性食品、健康食品、濃厚流動食や嚥下障害用食品の治療食等を挙げることができる。
【００２９】  医薬品や医薬部外品として利用する場合は、前記剤とともに本発明の趣旨を逸脱しない範囲で薬学的に許容される公知の賦形剤や添加物質を併用し、常法により加工して錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等の製剤にする。これを経口服用して、生体内のＧＬＰ−１産生促進作用、ＤＰＰＩＶ阻害作用及び／又はグルコース吸収阻害作用に基づき、肥満の予防、改善や治療のため、生体内の血糖値上昇を抑制するため、糖代謝異常に関連する前記各種疾患及び症状の予防、改善や治療のため等に適用することができる。なお、これら医薬品や医薬部外品に配合される前記剤の含量や投与量は、前述の経口組成物の場合に準じる。
【００３０】  また、前記剤をペットフードや家畜用飼料として利用するには、前述の飲食品の場合と同様に、前記剤を公知の各種餌料や飲用水に配合し、公知の原材料や添加物質とともに錠剤状、顆粒状、カプセル状等の形態に加工することができる。これらの飼料における前記剤の含量や摂取量は前述の経口組成物の場合とほぼ同様である。
【実施例】
【００３１】  次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。各例において、％、部及び比率はいずれも質量基準である。【００３２】製造例１
ボタンボウフウ（鹿児島県喜界島産）の葉を蒸気式乾燥機にて乾燥させ、乾燥物を約３ｍｍ角以下のサイズに破砕し、これをさらに粉砕機で処理して篩過した微粉末（試料１）を製造した。【００３３】製造例２
製造例１に記載の方法で得たボタンボウフウの微粉末１００ｇに水８００ｍＬを加え、８０〜９０℃で６０分間加熱した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度水６００ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して抽出物（試料２）４０．２ｇを製造した。【００３４】製造例３
製造例１に記載の方法で得たボタンボウフウの微粉末１０ｇに含水エタノール（含水率４５％）８０ｍＬを加え、７５〜８０℃で１時間加熱還流した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度含水エタノール（含水率４５％）６０ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して抽出物（試料３）３．８ｇを製造した。【００３５】製造例４
製造例１に記載の方法で得たボタンボウフウの微粉末、１０ｇに含水エタノール（含水率３０％）８０ｍＬを加え、７５〜８０℃で１時間加熱還流した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度含水エタノール（含水率３０％）６０ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して抽出物（試料４）３．５ｇを製造した。【００３６】製造例５
製造例１に記載の方法で得たボタンボウフウの微粉末１０ｇに９９％エタノール８０ｍＬを加え、７５〜８０℃で１時間加熱還流した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度９９％エタノール６０ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して抽出物（試料５）２．１６ｇを製造した。【００３７】比較製造例１
静岡県産の緑茶の乾燥葉を粗細断し、これをさらに粉砕機で処理して篩を通過した微粉末（試料６）を製造した。【００３８】比較製造例２
静岡県産の緑茶の乾燥葉１ｋｇを粗細断し、水３Ｌを加えて、常圧下、８５℃で２０分間適宜に撹拌した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度水２Ｌを加えて同様に加熱し、撹拌、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮した。濃縮した溶液を合成吸着剤のダイアイオン（登録商標）ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）を充填したカラムクロマトグラフィー処理に供した。水５Ｌを通液して洗浄した後、含水エタノール（含水率３０％）５Ｌを通液し、該含水エタノールに可溶の画分を回収した。この溶液を減圧下で濃縮し、噴霧乾燥及び粉砕して、粉末状の緑茶抽出物（試料７）２５ｇを得た。この抽出物をＨＰＬＣ分析した結果、カテキン類（エピガロカテキンガレートを主成分とし、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキン等）の含量は９０．２％であり、カフェイン含量は０．１％及びその他であった。【００３９】試験例１：ＧＬＰ−１産生促進作用
検体としてボタンボウフウの乾燥粉末及び抽出物（試料１、試料２、試料３、試料４及び試料５）を用いてＧＬＰ−１産生作用を試験した。ＧＬＰ−１産生細胞（住商ファーマインターナショナル社製、細胞名「ＮＣＩ−Ｈ７１６」）を１０％ＦＢＳ‐ＲＰＭＩ１６４０培地で前培養した。Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅコートされた９６ｗｅｌｌ用マイクロプレートに１×１０５個／ｗｅｌｌ播種し、１０％ＦＢＳ‐ＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地で２日間培養した。
各試料を終濃度１．２５、２．５、５．０ｍｇ／ｍＬになるようＨＢＳＳに溶解して添加後４時間インキュベートし、次いで、上清を回収して遠心分離処理したものを検体として用いた。以降の試験手順は全てＴｏｔａｌ  ＧＬＰ−１−ＨＳ  ＥＬＩＳＡ測定キット（矢内原研究所社製）のマニュアルに従い実施した。抗体コートされた測定プレートに２５μＬの検体又は標準液と１００μＬの緩衝液を加えて、室温で１８時間振とうした後、反応液を除き、洗浄液でウェル内を洗い、次いで、標識特異抗体溶液を１００μＬ加え１時間振とうし、反応液を除き、洗浄液でウェル内を洗い、ＳＡ−ＨＲＰ溶液を１００μＬ加え、遮光状態で０．５時間室温で振とうし、さらに、酵素基質液を１００μＬ加えて遮光状態で０．５時間室温で静置した。酵素反応停止液を１００μＬ加え、吸光度４５０ｎｍで測定した。標準品により検量線を引き、ＧＬＰ−１産生量を求め、ＢＣＡ法によるタンパク質で補正した値を算出した。【００４０】  この結果を表１に示した。同表において、数値は同時に実施した試料未添加の場合を１としたときの相対値で示した。表１から、本発明に係るボタンボウフウの乾燥粉末及び抽出物のいずれにもＧＬＰ−１産生増強作用が認められ、とりわけ含水エタノール抽出物（試料３、試料４、試料５）では強いＧＬＰ−１産生促進作用が発現することを確認した。【００４１】
【表１】
0006273440.tif 000002
【００４２】試験例２：ＤＰＰＩＶ阻害作用
検体としてボタンボウフウの乾燥粉末及び抽出物（試料１〜試料５）、比較検体として緑茶抽出物（試料７）を用いてＤＰＰＩＶ阻害作用を試験した。試験手順は全てＤＰＰＩＶ活性測定キット（米国ＡｎａＳｐｅｃ社製）のマニュアルに従い実施した。各試料を０．２５、０．５、１、２ｍｇ／ｍＬ（終濃度）となるようにＤＭＳＯ水溶液（終濃度０．２％）で希釈し、各試料溶液１０μＬ、ＤＰＰＩＶ液４０μＬをアッセイプレートに添加した。次いで、基質溶液５０μＬを加えて混合し、３７℃、３０分間インキュベートした後、励起波長：３５４ｎｍ、蛍光波長：４４２ｎｍにおける蛍光強度を測定した。試料を添加しない対照の蛍光強度に対する検体の蛍光強度からＤＰＰＩＶ阻害率を算出した。ＤＰＰＩＶ阻害率は次の計算式から求めた。
ＤＰＰＩＶ阻害率（％）＝｛１−（対照−試料）／（対照−ブランク）｝×１００【００４３】  この結果を表２に示した。同表において、数値は同時に実施した対照試験の値を１００としたときの相対値で示した。表２から、本発明に係るボタンボウフウの乾燥粉末及び抽出物のいずれにもＤＰＰＩＶ阻害作用が認められ、とりわけ含水エタノール抽出物（試料３、４、５）では強いＤＰＰＩＶ阻害作用が発現することを確認した。【００４４】
【表２】
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【００４５】試験例３：ＣＡＣＯ−２細胞によるグルコース吸収抑制作用
検体としてボタンボウフウの乾燥粉末及び抽出物（試料１〜試料５）、比較検体としてリンゴンベリーエキス末（ＢＥＩＪＮＧ  ＧＩＮＫＯ  ＧＲＯＵＰ社製、比較試料１）、赤ワインエキスＲ（メディエンス社製、比較試料２）用いてＣＡＣＯ−２細胞によるグルコース吸収抑制作用を試験した。
ＣＡＣＯ−２細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製、商品名「ＣＡＣＯ−２」）を２４ｗｅｌｌ用マイクロプレート用のインサートウェル上に１×１０４個播種し、電気抵抗値が２５０Ω／ｃｍ２以上になるまで１０％ＦＢＳ‐ＤＭＥＭｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養した。検体を添加する前にＡｐｉｃａｌ側、Ｂａｓａｌ側をＨＢＳＳに交換して３０分間インキュベートした。グルコース（１０ｍｇ／ｍＬ）及び試料を終濃度１．２５、２．５、５．０ｍｇ／ｍＬになるようＨＢＳＳに溶解して添加後、３０分おきにＢａｓａｌ側の細胞通過液を回収し、１．０〜１．５時間インキュベートした細胞通過液のグルコース濃度をグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業社製）で測定した。検体を添加しない場合のグルコース濃度（対照）に対する検体を添加した場合のグルコース濃度からグルコース吸収阻害率を算出した。グルコース吸収抑制率は次の計算式から求めた。
グルコース吸収抑制率（％）＝｛１−（対照−試料）／（対照−ブランク）｝×１００【００４６】  この結果を表３に示した。同表において、数値は同時に実施した対照試験の値を１００としたときの相対値で示した。表３から、本発明に係るボタンボウフウの乾燥粉末及び抽出物のいずれにもグルコース吸収抑制作用が認められ、とくに含水エタノール抽出物（試料３、４、５）の場合には強力なグルコース吸収抑制作用を発現することが認められた。【００４７】
【表３】
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【００４８】試験例４：米飯摂取による血糖値上昇抑制試験
以下の試験に同意を得たボランティアの成人７名（３０歳代：男性３名、女性４名）に、単回摂取による試験を実施した。
被験者は測定の前日２２時以降に水以外の飲食を控え、測定日の朝（８時３０分）に空腹時血糖値を測定した。試験１回目は水のみを摂取し（コントロール群）、試験２回目はボタンボウフウ粉末（試料１）１ｇを２５ｍＬの水に懸濁した溶液を摂取し（試料１群）、試験３回目は緑茶葉粉末（試料６）１ｇを２５ｍＬの水に懸濁した溶液を摂取した（試料６群）。水と試料を摂取した５分後に、市販包装米飯「サトウのごはん」（佐藤食品工業社製）２００ｇを少量の水とともに摂取し、米飯摂取後３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分に血糖値を測定し、ボタンボウフウの食後血糖値に及ぼす影響を評価した。なお、血糖値の測定は血糖自己測定器（ロシュ・ダイアグノスティックス社製、「アキュチェックアビバ」（登録商標））を用いた。評価はボタンボウフウの摂取時又は非摂取時の血糖値対時間の変化図を描いて、この変化図における血中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。【００４９】  この結果、血中濃度曲線下面積で比較すると、試料１群はコントロール群と比べ、有意に低い値となった。また、試料６群と比較しても、低い値となった。中でも試料１群は食後３０分の血糖値（最高血糖値）がコントロール群及び試料６群に比べ低い値を示した。この結果より、本発明に係るボタンボウフウ粉末は食後の血糖値上昇抑制効果があることを確認した。【００５０】試験例５：ヒトモニター試験
以下の試験に同意を得たボランティアの成人女性２０名（３０歳〜５５歳、平均年齢：４３．５歳）に、初めの４週間はプラセボ（デキストリン：２５０ｍｇ）を１日２回摂取し（コントロール群）、コントロール摂取終了後、試料１（２５０ｍｇ／回）を同様に摂取する（試料１群）試験を実施した。試験終了時に体重の変化や食事内容等のアンケート調査によって評価を行った。【００５１】  この結果、試料１群においては、体重が減少した：１３名、変化しなかった：７名であった。体重の変化した１３名は、間食の量及び回数が減少し、食事量が減少した等の変化があった。この結果より、本発明に係るボタンボウフウが体重の減少や生活習慣（食事パターン）を改善する上で有用であることを示唆する。【００５２】試作例１：ハードカプセル
前記の試料１をカプセル充填機に供して、常法により１粒あたり内容量が２５０ｍｇのゼラチン被覆ハードカプセル製剤を試作した。錠剤（製造例１のボタンボウフウを配合したもの）をモニター試験で経口摂取してもらったところ、体重の減少や食事量の減少が認められる知見を得た。したがって、本錠剤は肥満予防のための経口摂取可能な栄養補助食品、医薬品又は動物用飼料として利用することができる。【００５３】試作例２：錠剤
以下に示す原料を常法により打錠して錠剤を試作した。ここで、ボタンボウフウ抽出物としては、前記の製造例２〜４で得たボタンボウフウ抽出物（試料２〜４）のいずれか１種を使用した。これらの錠剤はいずれも安定で服用し易いものであり、栄養補助食品や医薬品として利用することができる。
（配合原料）                          （１錠当たりの質量（ｍｇ））
１．ボタンボウフウ                                    ５０
２．デキストリン                                    １００
３．バレイショデンプン                                ３９
４．微結晶セルロース                                  ３０
５．合成ケイ酸アルミニウム                            ３０
６．ステアリン酸カルシウム                              １【００５４】試作例３：栄養補助食品
前記試料１を１ｇ、ロイシンを４００ｍｇ、イソロイシンを２５０ｍｇ、バリンを２００ｍｇ、アルギニンを３００ｍｇとし、これらの混合、篩過した粉末を包装充填し、栄養補助食品を試作した。この栄養補助食品はヒトのみならずペットフードにも利用することができる。【００５５】試作例４：食品（麺類）
前記の試料１を１５ｇ、そば粉を３５０ｇ、強力粉を１５０ｇとし、これらを混ぜ合わせながら、篩にかけ、水を１５０ｍｌ混合して、そばを試作した。これは市販品と比べて風味や食感に違和感のないものであった。【００５６】試作例５：清涼飲料水、ドリンク剤
市販の清涼飲料水及びドリンク剤１００ｍＬに前記試料１又は試料３を５００ｍｇ又は１００ｍｇ加えて十分に混合し飲料を試作した。この飲料は元の清涼飲料水及びドリンク剤と比較して風味及び保存安定性で何ら遜色のないものであった。これは清涼飲料又はドリンク剤として利用することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５７】  本発明の剤は、医薬品、飲食品、飼料等の分野において、ＧＬＰ−１産生促進、ＤＰＰＩＶ阻害及び／又はグルコース吸収阻害することで、肥満や糖代謝関連疾患を予防、改善あるいは治療するための製品に有効利用する。