(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であるかの判定方法であって、
（ａ）融合タンパク質を含む細胞を前記試験化合物に接触させることであって、複数の融合タンパク質がフォーカスを形成することができる、ことと、
（ｂ）前記試験化合物が融合タンパク質フォーカスの形成を増加させるかを判定することと
を含み、
フォーカスの形成の増加が、前記試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であることを示し、各融合タンパク質が、少なくとも１のブロモドメイン及び多量体化することができる蛍光タンパク質であるレポーターモジュールを含む前記判定方法。
【請求項２】
前記細胞がＣＨＯ―Ｋ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫまたはＵ２ＯＳ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞がＣＯＳ−７、ＨｅＬａまたはＵ２ＯＳ細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記レポーターモジュールが、ＥＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ｄｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２またはＺｓＧｒｅｅｎである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記融合タンパク質が核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＳＬがＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳまたはヌクレオプラスミンのＮＬＳである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ブロモドメインが、ＢＲＧ１、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＢＡＺ２Ｂ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ８、ＢＲＦＰ１、ＢＲＦＰ３、ＢＲＧ１、ＣＢＰ／ＣＲＥＢＢＰ、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＴＲＩＭ２４及び／またはＺＭＹＮＤ８のいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ブロモドメインが、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤ９、ＢＲＤＴ、及び／またはＢＲＧ１のいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ブロモドメインが、ＢＲＧ１、ＢＲＰＦ１、ＣＥＣＲ２、ＰＣＡＦ、及び／またはＴＡＦ１のいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ブロモドメインが、ＢＲＤ４及び／またはＢＲＤ９の少なくとも１種のブロモドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であるかの判定方法であって、
（ａ）融合タンパク質を含む細胞を前記試験化合物に接触させることであって、複数の融合タンパク質がフォーカスを形成することができる、ことと、
（ｂ）前記試験化合物が融合タンパク質フォーカスの形成を増加させるかを判定することと
を含み、
フォーカスの形成の増加が、前記試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であることを示し、各融合タンパク質が、少なくとも１のブロモドメイン及び多量体化することができる蛍光タンパク質であるレポーターモジュールを含み、前記レポーターモジュールがＥＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ｄｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２またはＺｓＧｒｅｅｎである、前記判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本特許出願は、２０１３年３月１５日出願の米国出願第６１／７９８，６４４号、及び２０１３年１１月１１日出願の米国出願第６１／９０２，６９０号の優先権を主張し、これらの出願は参照により本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
クロマチンはＤＮＡとタンパク質との複雑な結合体である。クロマチンは真核細胞の核中に存在し、ヘテロクロマチン（凝縮）とユークロマチン（拡張）の形態に分けられる。ヒストンはクロマチンの主要なタンパク質成分であり、その周りをＤＮＡが巻回する糸巻の役割を果たす。クロマチンの機能は、ＤＮＡを小さな容積中にまとめ、細胞内に収まるようにすること、ＤＮＡを強化して有糸分裂及び減数分裂を可能にすること、並びに発現及びＤＮＡの複製を制御する機構として機能することである。クロマチン構造は、ヒストンタンパク質、とりわけヒストンＨ３及びＨ４に対する、そして最も一般的には、コアであるヌクレオソーム構造の外に延びる「ヒストン尾部」内での一連の翻訳後修飾により制御される。ヒストン尾部はタンパク質−タンパク質相互作用のために遊離する傾向にあり、また、翻訳後修飾が最も起きやすいヒストンの部分でもある。これらの修飾としては、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化及びＳＵＭＯ化が挙げられる。これらのエピジェネティックなマークは、ヒストン尾部内の特定の残基上にタグを配する特定の酵素により書き込まれ及び削除され、それによりエピジェネティックなコードを形成し、該コードはその後、細胞によって解釈され、遺伝子特異的なクロマチン構造の制御、及びそれによる転写を可能にする。
【０００３】
全てのタンパク質の種類の中で、ヒストンは翻訳後修飾の影響を最も受けやすいものの一つである。ヒストン修飾体は、特定の刺激に応答して付加または削除することができて動的であり、これらの修飾は、クロマチンに対する構造変化及び遺伝子転写における変化を共に導く。それぞれ別個の種類の酵素、すなわちヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＨＡＴ）及びヒストンデアセチラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）（ＨＤＡＣ）が、特定のヒストンのリシン残基をアセチル化又は脱アセチル化する（Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１９８９、１２、５、５９９〜６０６）。
【０００４】
共有結合によるヒストンの修飾は遺伝子発現の制御の基本的な機構であり、真核細胞中での働きにおける主要なエピジェネティックな機構の一つである（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ、Ｃｅｌｌ、１２８、６９３〜７０５（２００７））。それぞれ個別の転写状態は、細胞型の特異化、分化系列決定、細胞活性化及び細胞死などの基本的な細胞過程を決定するため、それらの異常制御は疾患の領域の中で中核を占める（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９、６９２〜７０３（２００９）；Ｐｏｒｔｅｌａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２８、１０５７〜１０６８（２０１０））。遺伝子発現のエピジェネティックな制御の基本的な構成要素は、ヒストン修飾体に結合する特殊なモチーフを内部に保有するタンパク質によるかかる修飾体の解釈である。中でも、ブロモドメインはアセチル化ヒストンに結合するように進化しており、そうすることによって、ブロモドメインはクロマチン構造と遺伝子転写との間の基本的な関連を表わす（Ｆｉｌｌｉｐａｋｏｐｐｏｕｌｏｓら、Ｃｅｌｌ、１４９、２１４〜２３１（２０１２）)。
【０００５】
ブロモドメインは、約１１０アミノ酸の長さであり、多くのクロマチン関連タンパク質中に存在し、約７０のヒトタンパク質において同定されており、多くの場合他のタンパク質モチーフに隣接する（Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ  Ｆ.ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、１９９７、２２、５、１５１〜１５３；及びＴａｍｋｕｎ  Ｊ．Ｗ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９２、７、３、５６１〜５７２）。ブロモドメインと修飾ヒストンとの間の相互作用は、クロマチンの構造変化及び遺伝子制御の基礎となる重要な機構であり得る。ブロモドメイン含有タンパク質は、ガン、炎症及びウィルス複製を始めとする疾患過程に関与してきた。例えば、Ｐｒｉｎｊｈａら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ、３３（３）：１４６〜１５３（２０１２）及びＭｕｌｌｅｒら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．、１３（２９）：１〜２０（２０１１年９月）を参照されたい。
【０００６】
細胞型特異性及び適切な組織の機能には、それらの置かれた環境に密接に影響を受けるそれぞれ個別の転写プログラムの厳密な制御が必要とされる。この転写のホメオスタシスの変化は、多くの病態、中でも特に、ガン、免疫炎症、神経障害、及び代謝性疾患に直接関連する。ブロモドメインは、特有な疾患関連の転写経路を制御する役割を果たす、重要なクロマチン修飾複合体中に存在する。このことは、ブロモドメイン含有タンパク質における変異が、ガン並びに免疫及び神経機能障害に関連するとの観察によって明確になっている。従って、ファミリー全体にわたるブロモドメインの選択的な阻害は、ヒトの機能障害における新規な治療薬として様々な機会を生み出す。
【０００７】
ガン、免疫疾患、及び他のブロモドメインが関係する疾患に対する治療が必要とされている。従って、ブロモドメイン阻害化合物である化合物の識別方法が必要とされている。
【０００８】
本明細書に引用される、特許出願及び刊行物を始めとする全ての参照文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．（１９８９）１２、５、５９９〜６０６
【非特許文献２】Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ、Ｃｅｌｌ（２００７）１２８、６９３〜７０５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書においては、少なくとも１のクロマチン結合モジュール及び少なくとも１のレポーターモジュールを含む融合タンパク質及びその使用が提供される。本発明の一態様は、少なくとも１のクロマチン結合モジュール及び少なくとも１のレポーターモジュールを含む融合タンパク質であって、複数の融合タンパク質が、再局在化すること及び／またはフォーカスを形成することができる、上記融合タンパク質である。
【００１１】
いずれかの上記融合タンパク質のある実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１のクロマチン結合モジュールを含む第１のクロマチン結合性ポリペプチドを含み、第１のクロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも１の上記クロマチン結合モジュールが削除されている、第２のクロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも１のクロマチン結合モジュールによって置換されている及び／または置き換えられている。ある実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１の上記クロマチン結合モジュールを含む第１のクロマチン結合性ポリペプチドを含み、第１のクロマチン結合性ポリペプチドの上記少なくとも１のクロマチン結合モジュールが、第２のクロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも１のブロモドメインモジュールによって置き換えられている。
【００１２】
いずれかの上記融合タンパク質のある実施形態において、融合タンパク質は、約１、２、３、４、５、及び／または６のいずれかのクロマチン結合モジュールを含む。
【００１３】
いずれかの上記融合タンパク質のある実施形態において、上記レポーターモジュールは蛍光レポーターモジュールである。ある実施形態において、上記レポーターモジュールはＥＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ｄｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２またはＺｓＧｒｅｅｎを含む。
【００１４】
いずれかの上記融合タンパク質のある実施形態において、融合タンパク質は核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）（ＮＬＳ）を含む。ある実施形態において、上記ＮＳＬはＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＳＬまたはヌクレオプラスミンのＮＳＬである。
【００１５】
いずれかの上記融合タンパク質のある実施形態において、クロマチン結合モジュールはレポーターモジュールの５’に位置する。いずれかの上記融合タンパク質のある実施形態において、クロマチン結合モジュールはレポーターモジュールの３’に位置する。
【００１６】
いずれかの上記融合タンパク質のある実施形態において、クロマチン結合モジュールは、ブロモドメインモジュール、ＰＨＤフィンガーモジュール、クロモドメインモジュール、ＭＢＴドメインモジュール、チューダードメインモジュール、ＰＷＷＰドメインモジュール、ＡＤＤドメインモジュール、Ｚｆ−ＣＷドメインモジュール、アンキリンリピートモジュールまたはＷＤ４０モジュールである。ある実施形態において、クロマチン結合モジュールはブロモドメインモジュールである。
【００１７】
いずれかの上記融合タンパク質のある実施形態において、上記少なくとも１のブロモドメインモジュールは、ＢＲＧ１、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＢＡＺ２Ｂ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ８、ＢＲＦＰ１、ＢＲＦＰ３、ＢＲＧ１、ＣＢＰ／ＣＲＥＢＢＰ、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＴＲＩＭ２４及び／またはＺＭＹＮＤ８のいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む。ある実施形態において、上記少なくとも１のブロモドメインモジュールは、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤ９、ＢＲＤＴ、及び／またはＢＲＧ１のいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む。ある実施形態において、上記少なくとも１のブロモドメインモジュールは、ＢＲＧ１、ＢＲＰＦ１、ＣＥＣＲ２、ＰＣＡＦ、及び／またはＴＡＦ１のいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む。ある実施形態において、上記少なくとも１のブロモドメインモジュールは、ＢＲＤ４及び／またはＢＲＤ９の少なくとも１種のブロモドメインを含む。
【００１８】
いずれかの上記融合タンパク質のある実施形態において、ブロモドメインポリペプチドは、ＢＲＧ１、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＢＡＺ２Ｂ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ８、ＢＲＦＰ１、ＢＲＦＰ３、ＢＲＧ１、ＣＢＰ／ＣＲＥＢＢＰ、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＴＲＩＭ２４及び／若しくはＺＭＹＤ８、または少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれか１種のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記ブロモドメインポリペプチドは、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤ９、ＢＲＤＴ、及び／若しくはＢＲＧ１、または少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれか１種のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記ブロモドメインポリペプチドは、ＢＲＧ１、ＢＲＰＦ１、ＣＥＣＲ２、ＰＣＡＦ、及び／若しくはＴＡＦ１、または少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれか１種のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記ブロモドメインポリペプチドは、ＢＲＤ４及び／若しくはＢＲＤ９、または少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記ブロモドメインポリペプチドは全長ブロモドメインポリペプチドを含む。
【００１９】
いずれかの上記融合タンパク質のある実施形態において、融合タンパク質は多量体化することができる。ある実施形態において、融合タンパク質は二量体、三量体または四量体を形成することができる。ある実施形態において、融合タンパク質は二量体を形成することができる。ある実施形態において、融合タンパク質は四量体を形成することができる。
【００２０】
本発明の一態様は、本明細書記載の融合タンパク質をコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。本発明の一態様は、上記核酸配列を含む発現カセットである。本発明の一態様は、上記発現カセットを含む細胞である。
【００２１】
本発明の一態様は、本明細書記載の融合タンパク質を含む細胞である。
【００２２】
ある実施形態において、上記細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫまたはＵ２ＯＳ細胞である。ある実施形態において、上記細胞は、ＣＯＳ−７、ＨｅＬａまたはＵ２ＯＳ細胞である。
【００２３】
本発明の一態様は、試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であるかの判定方法であって、（ａ）少なくとも１のクロマチン結合モジュール及び少なくとも１のレポーターモジュールを含む融合タンパク質を含む本明細書記載の細胞を、上記試験化合物に接触させることと、（ｂ）上記試験化合物が上記融合タンパク質の再局在化を誘導するか、及び／または融合タンパク質フォーカスの形成を増加させるかを判定することとを含み、上記融合タンパク質の再局在化及び／またはフォーカスの形成の増加が、上記試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であることを示す上記判定方法である。
【００２４】
本発明の一態様は、本明細書記載の融合タンパク質、核酸配列、発現カセットまたは細胞を備えるキットである。
本発明の特定の態様では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
少なくとも１のクロマチン結合モジュール及び少なくとも１のレポーターモジュールを含む融合タンパク質であって、複数の融合タンパク質がフォーカスを形成することができる前記融合タンパク質。
（項目２）
少なくとも１のクロマチン結合モジュールを含む第１のクロマチン結合性ポリペプチドを含む項目１記載の融合タンパク質であって、第１のクロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも１の前記クロマチン結合モジュールが削除されている、第２のクロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも１のクロマチン結合モジュールによって置換されている及び／または置き換えられている、前記融合タンパク質。
（項目３）
少なくとも１のクロマチン結合モジュールを含む第１のクロマチン結合性ポリペプチドを含む項目１または２に記載の融合タンパク質であって、第１のクロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも１の前記クロマチン結合モジュールが、第２のクロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも１のブロモドメインモジュールによって置き換えられている、前記融合タンパク質。
（項目４）
前記少なくとも１のレポーターモジュールが、少なくとも１の蛍光レポーターモジュールを含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目５）
前記少なくとも１のレポーターモジュールが、ＥＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ｄｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２またはＺｓＧｒｅｅｎを含む、項目４記載の融合タンパク質。
（項目６）
核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目７）
前記ＮＳＬがＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳまたはヌクレオプラスミンのＮＬＳである、項目６記載の融合タンパク質。
（項目８）
前記少なくとも１のクロマチン結合モジュールが、前記レポーターモジュールの５’に位置する、項目１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目９）
前記少なくとも１のクロマチン結合モジュールが、前記レポーターモジュールの３’に位置する、項目１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
前記少なくとも１のクロマチン結合モジュールが、ブロモドメインモジュール、ＰＨＤフィンガーモジュール、クロモドメインモジュール、ＭＢＴドメインモジュール、チューダードメインモジュール、ＰＷＷＰドメインモジュール、ＡＤＤドメインモジュール、Ｚｆ−ＣＷドメインモジュール、アンキリンリピートモジュールまたはＷＤ４０モジュールである、項目１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
前記少なくとも１のクロマチン結合モジュールがブロモドメインモジュールである、項目１０に記載の融合タンパク質。
（項目１２）
前記少なくとも１のブロモドメインモジュールが、ＢＲＧ１、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＢＡＺ２Ｂ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ８、ＢＲＦＰ１、ＢＲＦＰ３、ＢＲＧ１、ＣＢＰ／ＣＲＥＢＢＰ、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＴＲＩＭ２４及び／またはＺＭＹＮＤ８のいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１３）
前記少なくとも１のブロモドメインモジュールが、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤ９、ＢＲＤＴ、及び／またはＢＲＧ１のいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１４）
前記少なくとも１のブロモドメインモジュールが、ＢＲＧ１、ＢＲＰＦ１、ＣＥＣＲ２、ＰＣＡＦ、及び／またはＴＡＦ１のいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
前記少なくとも１のブロモドメインモジュールが、ＢＲＤ４及び／またはＢＲＤ９の少なくとも１種のブロモドメインを含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１６）
前記ブロモドメインポリペプチドが、ＢＲＧ１、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＢＡＺ２Ｂ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ８、ＢＲＦＰ１、ＢＲＦＰ３、ＢＲＧ１、ＣＢＰ／ＣＲＥＢＢＰ、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＴＲＩＭ２４、及び／若しくはＺＭＹＮＤ８、または少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれか１種のアミノ酸配列を含む、項目１１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１７）
前記ブロモドメインポリペプチドが、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤ９、ＢＲＤＴ、及び／若しくはＢＲＧ１、または少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれか１種のアミノ酸配列を含む、項目１１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１８）
前記ブロモドメインポリペプチドが、ＢＲＧ１、ＢＲＰＦ１、ＣＥＣＲ２、ＰＣＡＦ、及び／若しくはＴＡＦ１、または少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれか１種のアミノ酸配列を含む、項目１１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１９）
前記ブロモドメインポリペプチドが、ＢＲＤ４及び／若しくはＢＲＤ９、または少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのアミノ酸配列を含む、項目１１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目２０）
前記ブロモドメインポリペプチドが全長ブロモドメインポリペプチドを含む、項目１６〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目２１）
多量体化することができる、項目１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目２２）
二量体、三量体または四量体を形成することができる、項目１〜２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目２３）
二量体を形成することができる、項目２２記載の融合タンパク質。
（項目２４）
四量体を形成することができる、項目２２記載の融合タンパク質。
（項目２５）
項目１〜２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
（項目２６）
項目２５記載の核酸配列を含む発現カセット。
（項目２７）
項目１〜２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む細胞。
（項目２８）
ＣＨＯ―Ｋ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫまたはＵ２ＯＳ細胞である、項目２７記載の細胞。
（項目２９）
ＣＯＳ−７、ＨｅＬａまたはＵ２ＯＳ細胞である、項目２８記載の細胞。
（項目３０）
試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であるかの判定方法であって、
（ａ）項目２７〜２９のいずれか１項に記載の細胞を前記試験化合物に接触させることと、
（ｂ）前記試験化合物が融合タンパク質の局在化を変化させるか、及び／または融合タンパク質フォーカスの形成を増加させるかを判定することと
を含み、
局在化の変化及び／またはフォーカスの形成の増加が、前記試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であることを示す、前記判定方法。
（項目３１）
項目１〜２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、核酸配列、発現カセットまたは細胞を備えるキット。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ある本発明の融合タンパク質を表わす図である。
【図２】図２は、レポーターモジュールが多量体（例えば、二量体または四量体）を形成できるタンパク質を含む場合に、融合タンパク質が阻害剤に応答してドット及び／又はフォーカスを形成することを実証する結果を表わす図である。
【図３】図３は、ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４融合タンパク質（Ａ）及び、クロマチンへの結合を防止する両方のブロモドメインモジュール中の点変異を有するＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４融合タンパク質（Ｂ）を表わす図である。変異体ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４融合タンパク質は、阻害剤の非存在下であっても核内でドット／フォーカスに局在化した（図３Ｂ）一方で、野生型の融合タンパク質は、同一条件下で拡散した局在化を示した（図３Ａ）。
【図４】図４は、阻害化合物が、ブロモドメインがクロマチンに結合することを防止したことを実証した更なる結果を表わす図であり、クロマチンはヘキスト３３３４２で染色されていた。
【図５】図５は、融合タンパク質の再局在化の速やかな動態を示す結果を表わす図である。阻害剤の効果は、フォーカスの形成を追跡することによってリアルタイムで監視することができた。
【図６】図６は、局在化及びフォーカスの形成は、細胞の設定において、阻害剤の効力を判定するために用いることができる定量可能な表現型であることを実証した結果を表わす図である。
【図７】図７は、阻害剤に応答したフォーカスの形成の、可能な機構に関する一つの非限定的なモデルを表わす図である。
【図８】図８Ａ、Ｂは、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、及びＢＲＤＴブロモドメイン阻害化合物ＪＱ１の非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）における、ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ２融合タンパク質の局在化を表わす図である。ＪＱ１処理により、ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ２融合タンパク質のクロマチンとの相互作用が破壊され、ドット／フォーカスが形成された。
【図９】図９Ａ、Ｂは、ＪＱ１の非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）における、ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ３融合タンパク質の局在化を表わす図である。ＪＱ１処理により、ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ３融合タンパク質のクロマチンとの相互作用が破壊され、ドット／フォーカスが形成された。
【図１０】図１０Ａ、Ｂは、ＢＲＤ９ブロモドメイン阻害化合物ＢＤｉ−Ｂ及びＢＤｉ−Ｃの非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）における、ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質の局在化を表わす図である。阻害剤処理により、ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質のクロマチンとの相互作用が破壊され、ドット／フォーカスが形成された。
【図１１】図１１Ａ、Ｂは、ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質（Ａ）及び、クロマチンへの結合を防止するブロモドメインモジュール中の点変異（Ｎ２１６Ｙ）を有するＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質（Ｂ）の局在化を表わす図である。クロマチンに対する結合親和性をもたない変異体ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎは、クロマチン阻害化合物の非存在下であっても蛍光ドットを形成した。
【図１２】図１２Ａ〜Ｄは、ＤＭＳＯを伴う（Ａ）及びＢＲＤ９ブロモドメイン阻害化合物ＢＤｉ−Ｄを伴う（Ｂ）ＢＲＤ９−ｍＶｅｎｕｓ融合タンパク質の局在化、及びクロマチンへの結合を防止するブロモドメインモジュール中の点変異（Ｎ２１６Ｙ）を有する変異体ＢＲＤ９−ｍＶｅｎｕｓ（Ｃ）のＤＭＳＯを伴う（Ｄ）局在化を表わす図である。ブロモドメイン阻害化合物またはブロモドメイン変異のいずれによっても、ドット／フォーカスは形成されなかった。
【図１３】図１３Ａ〜Ｃは、ＮＬＳ−ＣＥＣＲ２．ＢＤ−ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質（Ａ）のＣＥＣＲ２ブロモドメイン阻害化合物ＢＤｉ−Ｅの非存在下及び存在下での（Ｂ）局在化を表わす図である。ＢＤｉ−Ｅ処理により、クロマチンへ結合しない場合には、ＮＬＳ−ＣＥＣＲ２．ＢＤ−ＺｓＧｒｅｅｎフォーカスが形成される。
【図１４】図１４は、分画及びウェスタンブロッティングを用いるなどの生化学的方法を含んだ、他の検知方法を実証する結果を表わす図である。
【図１５】図１５Ａ、Ｂは、ＮＬＳ−ＴＡＦ１．ＢＤ１．ＢＤ２−ＺｓＧｒｅｅｎ（Ａ）のＴＡＦ１ブロモドメイン阻害化合物ＢＤｉ−Ｆの非存在下及び存在下（Ｂ）での局在化を表わす図である。結果は、阻害剤が融合タンパク質のクロマチンへの結合を破壊し、融合タンパク質が、クロマチンから遊離した後にフォーカスを形成したことを示した。
【図１６】図１６は、クロマチンに対する結合を防止する、両方のブロモドメイン中の点変異を有する変異体ＮＬＳ−ＴＡＦ１．ＢＤ１．ＢＤ２−ＺｓＧｒｅｅｎタンパク質の局在化を表わす図である（Ａ）。結果は、変異体融合タンパク質は、阻害化合物の非存在下であっても、フォーカスを形成したことを示した（Ｂ）。
【図１７】図１７Ａ、Ｂは、ＢＡＺ２Ｂ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質（ＢＲＤ９ブロモドメインモジュールがＢＡＺ２Ｂのブロモドメインモジュールによって置き換えられたＢＲＤ９ブロモドメインポリペプチド）（Ａ）の、ＢＡＺ２Ｂブロモドメイン阻害化合物ＢＤｉ−Ｇの非存在下及び存在下（Ｂ）での局在化を表わす図である。ＢＤｉ−Ｇ処理により、ＢＡＺ２Ｂ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質のクロマチンとの相互作用が破壊され、ドット／フォーカスが形成された。
【図１８】図１８は、ＰＣＡＦ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質（ＢＲＤ９ブロモドメインモジュールがＰＣＡＦのブロモドメインモジュールによって置き換えられたＢＲＤ９ブロモドメインポリペプチド）（Ａ）の、ＰＣＡＦブロモドメイン阻害化合物ＢＤｉ−Ｈの非存在下及び存在下（Ｂ）での局在化を表わす図である。ＢＤｉ−Ｈ処理により、ＰＣＡＦ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質のクロマチンとの相互作用が破壊され、ドット／フォーカスが形成された。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ある本発明の態様は、少なくとも１のクロマチン結合モジュール及び少なくとも１のレポーターモジュールを含む融合タンパク質であって、複数の融合タンパク質がフォーカスを形成することができる上記融合タンパク質を対象とする。これらの融合タンパク質を用いて、試験化合物がクロマチン阻害化合物であるかを判定することができる。本発明のある実施形態は、融合タンパク質を利用して、試験化合物がクロマチン阻害化合物であるかを判定するアッセイを提供する。必ずしも本発明を限定するものではないが、融合タンパク質は、未処理の状態において、クロマチン結合モジュールとクロマチンとの間の相互作用によってクロマチンと結合すると考えられている。例えば、ブロモドメインモジュールはアセチル化クロマチンに結合する。クロマチン結合モジュールの結合部位が阻害剤によって妨害された場合、融合タンパク質はクロマチンから解離してフォーカスを形成する。細胞内の標的の会合アッセイを用いて、投与量に応じる形態でフォーカスの形成を監視することができる。細胞の核内のフォーカスは、例えば蛍光検知を用いた高含有量顕微鏡観察によって可視化及び定量化し、試験化合物のクロマチン阻害化合物としての効能を判定することができる。
【００２７】
概括的な技術
別段の表示がない限りにおいて、本発明の実施においては、（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術が用いられることとなり、これらの技術は当業者の技量の範囲内である。かかる技術は、「分子クローニング：実験室便覧」（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”）、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「オリゴヌクレオチド合成」（“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”）（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「動物細胞培養」（“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「酵素学の方法」（”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．);「分子生物学における最近のプロトコル」（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、及び定期的な改訂版）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応」（“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”）（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；「分子クローニングの実務手引」（“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”）（Ｐｅｒｂａｌ  Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｖ．、１９８８）などの文献に詳しく説明されている。
【００２８】
本発明で用いられるまたは記載されるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド及び低分子は、当技術分野において公知の標準的な技術を用いて生成させることができる。
【００２９】
定義
本明細書において用いられる用語「クロマチン結合モジュール」とは、クロマチンと相互作用するクロマチン結合性ポリペプチドの領域及び／またはドメインの配列をいう。クロマチン結合モジュールとしては、以下のドメイン：ＡＤＤ、アンキリンリピート、ブロモドメイン、クロモドメイン、ＭＢＴ、ＰＨＤフィンガー、ＰＷＷＰ、チューダー、ＷＤ４０又はＺｆ−ＣＷ（Ｍｉｙｏｎｇ  Ｙｕｎら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）、２１：５６４〜５７８も参照されたく、該文献は、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる。）の少なくとも１を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書において用いられる用語「クロマチン結合性ポリペプチド」とは、天然配列クロマチン結合性ポリペプチド、天然配列ポリペプチドのポリペプチド変異体及び（本明細書中で更に定義される）ポリペプチド変異体をいう。本明細書記載のクロマチン結合性ポリペプチドは、ヒト組織型由来若しくは別な出所由来などの様々な出所から単離されたクロマチン結合性ポリペプチド、又は組換え法若しくは合成法によって調製されたクロマチン結合性ポリペプチドであってもよい。「天然配列クロマチン結合性ポリペプチド」は、相当する天然由来のクロマチン結合性ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。クロマチン結合性ポリペプチドは、少なくとも１のクロマチン結合モジュールを含む。
【００３１】
「クロマチン結合性ポリペプチド変異体」またはその変化体とは、本明細書に定義される、本明細書に開示のいずれかの天然配列クロマチン結合性ポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、一般的には活性なクロマチン結合性ポリペプチドであるクロマチン結合性ポリペプチドを意味する。かかるクロマチン結合性ポリペプチド変異体としては、例えば、天然アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に、１又は複数のアミノ酸残基が付加された若しくは欠失したクロマチン結合性ポリペプチドが挙げられる。通常、クロマチン結合性ポリペプチド変異体は、天然配列クロマチン結合性ポリペプチド配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有することとなる。通常、クロマチン結合性変異体ポリペプチドは、長さが少なくとも約１０アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸であるか、又はそれを超える。クロマチン結合性変異体ポリペプチドは、任意選択で、天然のクロマチン結合性ポリペプチド配列と比較して１以下の保存的アミノ酸置換、あるいは天然のクロマチン結合性ポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下の保存的アミノ酸置換を有することとなる。
【００３２】
用語「ブロモドメインモジュール」とは、クロマチンと相互作用するブロモドメインポリペプチドのブロモドメインの配列をいう。ある実施形態において、ブロモドメインモジュールは全長ブロモドメインを含む。ブロモドメインの構造及び機能についての概括的な総説としては、例えば、Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓら、Ｃｅｌｌ  １４９、２１４〜２３１（２０１２）を参照されたく、該文献は本明細書によりその全体が参照により組み込まれる。
【００３３】
本明細書において用いられる用語「ブロモドメインポリペプチド」とは、天然配列クロマチン結合性ポリペプチド、天然配列ポリペプチドのポリペプチド変異体及び（本明細書中で更に定義される）ポリペプチド変異体をいう。本明細書記載のブロモドメインポリペプチドは、ヒト組織型由来若しくは他の出所由来などの様々な出所から単離されたブロモドメインポリペプチド、又は組換え法若しくは合成法によって調製されたブロモドメインポリペプチドであってもよい。「天然配列ブロモドメインポリペプチド」は、相当する天然由来のブロモドメインポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ブロモドメインポリペプチドは、少なくとも１のブロモドメインモジュールを含む。
【００３４】
「ブロモドメインポリペプチド変異体」またはその変化体とは、本明細書に定義される、本明細書に開示のいずれかの天然配列ブロモドメインポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、一般的には活性なブロモドメインポリペプチドであるブロモドメインポリペプチドを意味する。かかるブロモドメインポリペプチド変異体としては、例えば、天然アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に、１又は複数のアミノ酸残基が付加された若しくは欠失したブロモドメインポリペプチド変異体が挙げられる。通常、ブロモドメインポリペプチド変異体は、天然配列クロマチン結合性ポリペプチド配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有することとなる。通常、ブロモドメイン変異体ポリペプチドは、長さが少なくとも約１０アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸であるか、又はそれを超える。ブロモドメイン変異体ポリペプチドは、任意選択で、天然のブロモドメインポリペプチド配列と比較して１以下の保存的アミノ酸置換、あるいは天然のブロモドメインポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下の保存的アミノ酸置換を有することとなる。
【００３５】
用語「レポーターモジュール」は、クロマチン結合モジュールのクロマチンへの結合を防止する化学化合物に応答して、融合タンパク質の局在化または分子特性の変化の検知を可能にするアミノ酸配列をいう。例えば、レポーターモジュールは、「結合した」状態と「結合していない」状態の間の測定可能な特性の差異を導入する。例えば、ＴＡＧ−ＢＭ−ＲＭを検知するために、ＴＡＧに対する抗体を用いた間接的蛍光法を用いることができる［ＢＭ：結合モジュール、ＲＭ：レポーターモジュール］。
【００３６】
用語「核酸」とは、糖、リン酸及びプリン又はピリミジンのいずれかである塩基を含む単量体（ヌクレオチド）からなる、一本鎖または二本鎖の形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及びそれらのポリマーをいう。特に限定しない限りにおいて、この用語は、対照となる核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の表示がない限りにおいて、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補配列、並びに明示的に示された配列を包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１または複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによってなすことができる。
【００３７】
用語「ヌクレオチド配列」とは、一本鎖または二本鎖とすることができ、任意選択で、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー中に組み込むことが可能な合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーをいう。用語「核酸」、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は互換的に用いられる。
【００３８】
「単離された」ポリペプチドは、その天然の環境の成分から分離されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動集束）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）によって測定された９５％超または９９％超の純度まで精製される。ポリペプチドの純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ  ８４８：７９〜８７（２００７）を参照されたい。
【００３９】
「単離された」核酸とは、その天然の環境の成分から分離された核酸分子をいう。単離された核酸としては、当該核酸分子を通常含む細胞中に含まれる核酸分子を包含するが、該核酸分子は、染色体外またはその天然の染色体上の位置と異なる染色体上の位置に存在する。
【００４０】
対照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）で表したアミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、必要であれば、最大のパーセントで表したアミノ酸配列同一性を達成するためのギャップを導入した後の、当該配列同一性の一部として如何なる保存的置換の考慮もなしでの、対照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントで表したアミノ酸配列同一性を測定するためのアラインメントは、当業者の技量の範囲内にある種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公衆の利用に供されたコンピュータソフトウェアを用いて行うことができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要ないずれかのアルゴリズムを始めとする、配列を整列させるための適当なパラメータを決定することができる。但し、本発明の目的のためには、％で表したアミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて与えられる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社によって作成され、ソースコードは米国著作権局（ワシントンＤＣ、２０５５９）にユーザー書類と共に提出され、該ソースコードは同局に米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）より公衆の利用に供されており、すなわちソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄを始めとするＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変わらない。ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較のために用いられる状況においては、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、配列Ｂとの、あるいは配列Ｂを対照とした所与のアミノ酸配列Ａの％で表したアミノ酸配列同一性（代わりに、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、配列Ｂとの、あるいは配列Ｂを対照とした、ある％で表したアミノ酸配列同一性を有する若しくは含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、以下のように計算される：
１００×分率（Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは当該プログラムのＡとＢとの配列アラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一の一致として点数付けされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％で表したアミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％で表したアミノ酸配列同一性とは等しくならないであろうことが認識されることとなろう。特に別段の記載がない限りにおいて、本明細書において用いられる全ての％で表したアミノ酸配列同一性の値は、直前の段落で説明したように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００４１】
ペプチドの文脈における用語「実質的同一性」は、ペプチドが、対照配列に対して、指定の比較ウィンドウにわたって、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、若しくは９４％、または更に９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むことを指す。ある実施形態において、最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、ＪＭＢ、４８、４４３（１９７０））の相同性アラインメントアルゴリズムを用いて行われる。２のペプチド配列が実質的に同一であることを示すこととは、一方のペプチドが、第２のペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に反応性であることである。従って、例えば、２のペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、一方のペプチドは第２のペプチドと実質的に同一である。このように、本発明のある実施形態は、本明細書に記載の核酸分子と実質的に同一である核酸分子を提供する。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「ベクター」とは、それが連結している別の核酸を増殖させることができる核酸分子をいう。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクターのみならず、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを包含する。ある種のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【００４３】
「作動可能に連結された」とは、単一の核酸フラグメント上での複数の核酸配列の繋がりであって、上記配列の一つの機能が別の配列の機能によって影響されるような上記繋がりをいう。例えば、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して、上記２の配列が、調節ＤＮＡ配列がコード化ＤＮＡ配列の発現に影響を与えるように（例えば、コード化配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にあるように）配置されている場合には、「作動可能に連結された」または「関連付けられた」といわれる。コード化配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に配置されるとき、「作動可能に連結される」。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを意味する。但し、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は簡便な制限部位でのライゲーションによりなされる。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプターすなわちリンカーが従来の通例に従って用いられる。加えて、酵素をコードする核酸の多数のコピーが発現ベクター中で連結することができる。かかる多数の核酸は、リンカーによって分離することができる。
【００４４】
「発現」とは、細胞における内在性遺伝子または導入遺伝子の転写及び／または翻訳をいう。例えば、アンチセンス構築物の場合、発現とは、アンチセンスＤＮＡのみの転写を指すことができる。加えて、発現とは、センス（ｍＲＮＡ）または機能的ＲＮＡの転写及び安定な蓄積を指すことができる。発現とはまた、タンパク質の産生を指すこともできる。
【００４５】
本明細書で用いられる「発現カセット」とは、作動可能に終結シグナルに連結された着目するヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、適当な宿主細胞中で特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができるＤＮＡ配列を意味する。上記ＤＮＡ配列はまた、一般的には、当該ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含む。着目するヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであってもよく、これは、その成分の少なくとも１がその他の成分の少なくとも１に関して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在する、但し異種発現に有用な組換え形態で得られたものであってもよい。かかる発現カセットは、着目するヌクレオチド配列に連結した転写開始領域を含むこととなる。かかる発現カセットは、着目する遺伝子の挿入のための複数の制限部位を備え、調節領域の転写調節下に置かれてもよい。発現カセットは更に、選択可能なマーカー遺伝子を含有してもよい。
【００４６】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に用いられ、外因性核酸が導入された細胞をいい、かかる細胞の後代を包含する。宿主細胞は「形質転換体」及び「形質転換細胞」を包含し、該形質転換体及び形質転換細胞は、一次形質転換細胞及び、継代の数に拘わらず、上記一次形質転換細胞に由来する後代を包含する。後代は、核酸の内容が親細胞に対して完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。初めに形質転換された細胞においてスクリーニングすなわち選択されたものと同様の機能または生物学的活性を有する変異後代が本明細書に含まれる。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「測定可能な親和性」及び「測定可能に阻害する」とは、以下の（ｉ）と（ｉｉ）との間のブロモドメインの活性の測定可能な低下であって、（ｉ）ブロモドメイン阻害剤またはその組成物、及びかかるブロモドメインを含む試料、（ｉｉ）上記化合物またはその組成物を含まない、かかるブロモドメインを含む同等の試料、である上記測定可能な低下である。
【００４８】
本明細書で用いられる語句「実質的に類似の」とは、（一般的に、一方がある分子に関連し、他方が対照／比較体分子に関連する）２の数値間の十分に高い程度の類似性であって、当業者が、当該２の値の間の差異が、当該数値（例えばＫｄ値）により測定された生物学的特性の文脈の範囲内で、統計的に有意ではないと見なすような、上記類似性をいう。上記２の値の間の差異は、対照／比較体の値の関数として、例えば、約２０％未満、約１０％未満、及び／または約５％未満であってもよい。語句「実質的に正常」とは、「対照（例えば、正常な対照）に対して実質的に類似することをいう。
【００４９】
語句「実質的に異なる」とは、（一般的に、一方がある分子に関連し、他方が対照／比較体分子に関連する）２の数値間の十分に高い程度の差異であって、当業者が、当該２の値の間の差異が、当該数値（例えばＫｄ値）により測定された生物学的特性の文脈の範囲内で、統計的に有意であると見なすような、上記差異をいう。上記２の値の間の差異は、対照／比較体分子の値の関数として、例えば、約１０％を超え、約２０％を超え、約３０％を超え、約４０％を超え、及び／または約５０％を超えてもよい。
【００５０】
「相関させる」又は「相関させること」とは、第１の分析又はプロトコルの性能及び／又は結果を、第２の分析又はプロトコルの性能及び／又は結果と、何らかの方法で比較することを意味する。例えば、第２の分析又はプロトコルを行うに当たり、第１の分析又はプロトコルの結果を用いることができ、及び／または、第２の分析又はプロトコルを行うべきかを決定するために、第１の分析又はプロトコルの結果を用いることができる。ポリヌクレオチドの分析又はプロトコルの実施形態に関しては、上記ポリヌクレオチドの発現分析又はプロトコルの結果を用いて、特定の治療計画を実行するべきかを決定することができる。
【００５１】
「個体」または「対象者」は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、上記個体または対象者はヒトである。
【００５２】
本明細書で用いられる「治療」（及び「治療する」または「治療すること」などの文法上のその変化体）とは、治療を受けている個体の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入をいい、予防のため又は臨床病理の経過の中のいずれかで実施することができる。治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患のいずれかの直接的または間接的な病理学的結果の低減、転移の防止、疾患進行速度の低減、病態の改善または緩和、及び緩解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるまたは疾患の進行を遅らせるために用いられる。
【００５３】
用語「医薬製剤」とは、その中に含まれる活性成分の生物学的活性を有効ならしめるような形態であり、且つ当該製剤が投与されることとなる対象者に許容できないほどに毒性である追加の成分を含有しない製剤をいう。
【００５４】
「薬学的に許容される担体」とは、医薬製剤中の活性成分以外の成分であって、対象者に対して非毒性である上記成分をいう。薬学的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別段に示されない限りにおいて、単に、当該範囲内に入る各個別の値を個々に参照することの省略表現法としての役割を果たすのみであり、各個別の値は、それが本明細書に個々に記載されるのと同等に、本明細書に組み込まれる。
【００５６】
当業者によって理解される通り、本明細書における「約」の付された値またはパラメータの参照は、当該の値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を包含する（及び表す）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を包含する。
【００５７】
本発明の実施形態を説明する文脈における、用語「ａ」及び「ａｎ」並びに「ｔｈｅ」及び類似の用語の使用は、本明細書に別段の表示がない、または文脈と明らかに矛盾しない限りにおいて、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含んでいる」（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）、「有している」（“ｈａｖｉｎｇ”）、「包含している」（“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”）、及び「含有している」（“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”）は、別段の表示がない限りにおいて、オープンエンドの用語（すなわち、「含んでいるが、それに限定されない」を意味する）として解釈されるべきある。本明細書に記載の本発明の態様及び実施形態は、「〜からなる」（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ”）及び／または「本質的に〜からなる」（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ”）の態様及び実施形態を包含すると理解される。
【００５８】
スクリーニング方法及び融合タンパク質
本明細書においては、ブロモドメインモジュールを含むポリペプチドを調節する化合物を識別するための化合物のスクリーニング方法、及び該方法において有用な組成物が提供される。特に、本明細書においては、少なくとも１のクロマチン結合モジュール及び少なくとも１のレポーターモジュールを含む融合タンパク質、並びに少なくとも１のクロマチン結合モジュール及び少なくとも１のレポーターモジュールを含む融合タンパク質を用いる、化合物のスクリーニング方法が提供される。
【００５９】
本明細書においては、少なくとも１のクロマチン結合モジュール及び少なくとも１のレポーターモジュールを含む融合タンパク質であって、複数の融合タンパク質がフォーカスを形成することができる融合タンパク質が提供される。
【００６０】
一態様において、本明細書では、試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であるかの判定方法であって、（ａ）少なくとも１のクロマチン結合モジュール及び少なくとも１のレポーターモジュールを含む融合タンパク質を含む本明細書記載の細胞を、上記試験化合物に接触させることと、（ｂ）上記試験化合物が融合タンパク質の分布パターンを変化させるか、及び／または融合タンパク質フォーカスの形成を増加させるかを判定することとを含み、分布パターンの変化及び／またはフォーカスの形成の増加が、上記試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であることを示す上記判定方法が提供される。いくつかの実施形態において、上記クロマチン結合モジュールはブロモドメインモジュールである。
【００６１】
いくつかの態様において、本明細書では、クロマチン結合モジュールを特異的に結合させ、該モジュールのクロマチンとの相互作用を阻害することができる化合物の識別方法であって、（ａ）少なくとも１のクロマチン結合モジュール及び少なくとも１のレポーターモジュールを含む融合タンパク質を含む細胞を、試験化合物に接触させることと、（ｂ）上記試験化合物の存在下及び非存在下で、上記融合タンパク質を含む上記細胞中のレポーターシグナルの分布を測定することとを含み、上記試験化合物の存在下では、該試験化合物の非存在下と比較してレポーターシグナルフォーカスが増加することが、上記試験化合物がクロマチン結合モジュールを特異的に結合させ、該モジュールのクロマチンとの相互作用を阻害することができる化合物であることを示す上記識別方法が提供される。いくつかの実施形態において、上記クロマチン結合モジュールはブロモドメインモジュールである。
【００６２】
いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、約１、２、３、４、５、または６のいずれかのクロマチン結合モジュールを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、約１のクロマチン結合モジュールを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、２のクロマチン結合モジュールを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１の、第１のクロマチン結合性ポリペプチド由来のクロマチン結合モジュール、及び少なくとも１の、第２のクロマチン結合性ポリペプチド由来のクロマチン結合モジュールを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、１の、第１のクロマチン結合性ポリペプチド由来のクロマチン結合モジュール、及び１の、第２のクロマチン結合性ポリペプチド由来のクロマチン結合モジュールを含む。
【００６３】
上記方法及び融合タンパク質のいずれかのいくつかの実施形態において、上記少なくとも１のクロマチン結合モジュール（例えば、ブロモドメインモジュール）は、その内因性及び／または天然の文脈にある。いくつかの実施形態において、内因性の文脈では、融合タンパク質は、少なくとも１のクロマチン結合モジュール及び少なくとも１のレポーターモジュールを含む、天然のクロマチン結合性ポリペプチドまたは上記天然のクロマチン結合性ポリペプチドのフラグメントのアミノ酸配列を含む。例えば、上記内因性の文脈において、融合タンパク質は、天然のブロモドメインポリペプチドのアミノ酸配列、例えばＢＲＧ１、を含み、上記アミノ酸配列は少なくとも１のブロモドメイン、及び少なくとも１のレポーター構築物を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、クロマチン結合性ポリペプチドの全長配列を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、クロマチン結合モジュールを含むクロマチン結合性ポリペプチドのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、上記クロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも約５０、６０、７０、８０、及び９０％を含み、クロマチン結合モジュールを含む。いくつかの実施形態において、クロマチン結合モジュールはブロモドメインモジュールである。いくつかの実施形態において、上記クロマチン結合性ポリペプチドはブロモドメインポリペプチドである。
【００６４】
上記方法及び融合タンパク質のいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも１のクロマチン結合モジュール（例えば、ブロモドメインモジュール）は、外因性及び／または非天然の文脈にある。外因性及び／または非天然の文脈における上記クロマチン結合モジュール（例えば、ブロモドメインモジュール）としては、（ｉ）天然のクロマチン結合性ポリペプチドと比較して、クロマチン結合性ポリペプチド内の異なるアミノ酸の位置／文脈におけるクロマチン結合モジュール、（ｉｉ）第２のクロマチン結合性ポリペプチドの文脈における第１のクロマチン結合性ポリペプチドのクロマチン結合モジュール、及び／または（ｉｉｉ）関連のないポリペプチドの文脈におけるクロマチン結合モジュール（例えば、非クロマチン結合性ポリペプチド）が挙げられ得るが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、天然のクロマチン結合性ポリペプチドと比較して、クロマチン結合性ポリペプチド内の異なるアミノ酸の位置／文脈における少なくとも１のクロマチン結合モジュール、及び天然のクロマチン結合性ポリペプチドと比較して、クロマチン結合性ポリペプチド内の同一または類似のアミノ酸の位置／文脈における少なくとも１のクロマチン結合モジュールを含む。いくつかの実施形態において、上記クロマチン結合モジュールはブロモドメインモジュールである。いくつかの実施形態において、上記クロマチン結合性ポリペプチドはブロモドメインポリペプチドである。
【００６５】
上記方法及び融合タンパク質のいずれかのある実施形態において、融合タンパク質は、第１のクロマチン結合性ポリペプチドを含み、ここで該第１のクロマチン結合性ポリペプチドの１又は複数のクロマチン結合モジュールは、少なくとも１の第２のクロマチン結合性ポリペプチドのクロマチン結合モジュールによって置換されている及び／または置き換えられている。例えば、実施例７は、融合タンパク質が蛍光タンパク質及びヒトＢＲＤ９をコードするＤＮＡ配列を含む本発明のある実施形態を提示し、そこでは、ブロモドメインをコードする配列は、ヒトＢＡＺ２ＢまたはヒトＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂのブロモドメイン配列によって置き換えられていた。
【００６６】
上記方法及び融合タンパク質のいずれかのいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、多数のクロマチン結合モジュールを有するクロマチン結合性ポリペプチドを含み、クロマチン結合モジュールはクロマチンに対して十分な親和性を有する。ある例において、天然のタンパク質は多数のクロマチン結合モジュールを含む場合があり、１のモジュールを阻害しても、融合タンパク質はクロマチンから遊離しない。一方、あるクロマチン結合モジュールは、単独で小さなモジュールとして発現した場合、十分にクロマチンに結合しないことがある。これらの場合、別なクロマチン結合性ポリペプチド由来の骨格を有するキメラタンパク質を用いて、これらの問題を解決することができる。クロマチン結合性ポリペプチドが再局在化／フォーカス形成アッセイに適しているかを評価するために、クロマチン結合モジュールの結合ポケットに変異を導入し、結合能を破壊することができる。上記変異体融合タンパク質が依然としてクロマチンに結合することができ、野生型融合タンパク質と比較して異なる分布パターンを示さないならば、上記クロマチン結合性ポリペプチドを本特許に記載の方法において用いることは、おそらくできない。このような形の結果は、着目するクロマチン結合モジュール以外の領域も、クロマチンに対する親和性に寄与し得ることを示している。この課題を解決するために、クロマチンに対する親和性もたない骨格を有するキメラクロマチン結合性ポリペプチドを用いて、アッセイを確立することができる。
【００６７】
上記方法及び融合タンパク質のいずれかのいくつかの実施形態において、融合タンパク質は第１のクロマチン結合性ポリペプチドを含み、ここで１又は複数のクロマチン結合モジュールは複製され及び／または繰り返されている。他の実施形態において、融合タンパク質は第１のクロマチン結合性ポリペプチドを含み、ここで少なくとも１の第２のクロマチン結合性ポリペプチド由来のクロマチン結合モジュール。上記方法及び融合タンパク質のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマチン結合モジュールはブロモドメインモジュールである。いくつかで実施形態において、上記クロマチン結合性ポリペプチドはブロモドメインポリペプチドである。
【００６８】
上記方法及び融合タンパク質のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマチン結合モジュールは、ブロモドメインモジュール、ＰＨＤフィンガーモジュール、クロモドメインモジュール、ＭＢＴドメインモジュール、チューダードメインモジュール、ＰＷＷＰドメインモジュール、ＡＤＤドメインモジュール、Ｚｆ−ＣＷドメインモジュール、アンキリンリピートモジュール及び／またはＷＤ４０モジュールである。
【００６９】
上記方法及び融合タンパク質のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマチン結合モジュールはブロモドメインモジュールである。いくつかの実施形態において、ブロモドメインモジュールは、可変の長さのループ領域（ＺＡ及びＢＣループ）によって連結された、４のαヘリックス（αＺ、αＡ、αＢ、αＣ）の左巻きバンドルを含む保存されたフォールドによって特徴付けられるアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、ブロモドメインモジュールは、ヒストンのε-Ν−アセチル化リシン残基（Ｋａｃ）への結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ブロモドメインは、中央の深い疎水性のキャビティーによってＫａｃを認識し、該キャビティーでは、Ｋａｃが水素結合によりアスパラギン残基に固定される。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１のブロモドメインモジュールは、ＡＳＨ１Ｌ、ＡＴＡＤ２、ＢＡＺ１Ａ、ＢＡＺ１Ｂ、ＢＡＺ２Ａ、ＢＡＺ２Ｂ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤ７、ＢＲＤ８、ＢＲＤ９、ＢＲＤＴ、ＢＲＰＦ１、ＢＲＰＦ３、ＢＲＷＤ３、ＣＥＣＲ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＰ３００、ＦＡＬＺ、ＧＣＮ５Ｌ２、ＫＩＡＡ１２４０、ＬＯＣ９３３４９、ＭＬＬ、ＰＢ、ＰＣＡＦ、ＰＨＩＰ、ＰＲＫＣＢＰ１、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＰ１００、ＳＰ１１０、ＳＰ１４０、ＴＡＦ１、ＴＡＦ１Ｌ、ＴＩＦ１ａ、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ６６、ＷＤＲ９、ＺＭＹＮＤ１１、及び／またはＭＬＬ４のいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む。いくつかの実施形態において、ブロモドメインモジュールは、表１中のタンパク質の少なくとも１のブロモドメインを含む。いくつかの実施形態において、ブロモドメインモジュールは、表１にＵｎｉＰｒｏｔ配列番号のブロモドメインとして識別される配列を含む（標準的な配列を始めとするＵｎｉＰｒｏｔ配列は、２０１３年１１月１日にアクセスした配列であり、本明細書によりそれらの全体が参照により組み込まれる）。ある実施形態において、上記少なくとも１のブロモドメインモジュールは、ＢＲＧ１、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＢＡＺ２Ｂ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ８、ＢＲＦＰ１、ＢＲＦＰ３、ＢＲＧ１、ＣＢＰ／ＣＲＥＢＢＰ、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＴＲＩＭ２４、及び／またはＺＭＹＮＤ８のいずれかの少なくとも１のブロモドメインを含む。ある実施形態において、上記少なくとも１のブロモドメインモジュールは、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤ９、ＢＲＤＴ及びＢＲＧ１のいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む。ある実施形態において、上記少なくとも１のブロモドメインモジュールは、ＢＲＧ１、ＢＲＰＦ１、ＣＥＣＲ２、ＰＣＡＦ、及び／またはＴＡＦｌのいずれか１種の少なくとも１のブロモドメインを含む。ある実施形態において、上記少なくとも１のブロモドメインモジュールは、ＢＲＤ４及び／またはＢＲＤ９のブロモドメインを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、約１、２、３、４、５、または６のいずれかのブロモドメインモジュールを含む。
表１  ブロモドメインポリペプチド及びブロモドメインモジュール
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0006408555.tif 000004
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【００７０】
上記方法及び融合タンパク質のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマチン結合性ポリペプチドはブロモドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ブロモドメインポリペプチドは、（天然に及び／または内因的に）可変の長さのループ領域（ＺＡ及びＢＣループ）によって連結された、４のαヘリックス（αＺ、αＡ、αＢ、αＣ）の左巻きバンドルを含む保存されたフォールドによって特徴付けられるアミノ酸配列を含むブロモドメインモジュールを含む。いくつかの実施形態において、ブロモドメインポリペプチドのブロモドメインモジュールは、ヒストンのε−Ν−アセチル化リシン残基（Ｋａｃ）への結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ブロモドメインポリペプチドのブロモドメインモジュールは、中央の深い疎水性のキャビティーによってＫａｃを認識し、該キャビティーでは、Ｋａｃが水素結合によりアスパラギン残基に固定される。いくつかの実施形態において、ブロモドメインポリペプチドは、少なくとも１の表１のブロモドメインポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ブロモドメインポリペプチドは、表１にＵｎｉＰｒｏｔ配列番号として識別される配列を含む（標準的な配列を始めとするＵｎｉＰｒｏｔ配列は、２０１３年１１月１日にアクセスした配列であり、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）。上記融合タンパク質のいずれかのある実施形態において、ブロモドメインポリペプチドは、ＢＲＧ１、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＢＡＺ２Ｂ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ８、ＢＲＦＰ１、ＢＲＦＰ３、ＢＲＧ１、ＣＢＰ／ＣＲＥＢＢＰ、ＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ、ＴＲＩＭ２４、及び／またはＺＭＹＮＤ８、あるいは少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれかのアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ブロモドメインポリペプチドは、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤ９、ＢＲＤＴ、及び／またはＢＲＧ１、あるいは少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれか１種のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ブロモドメインポリペプチドは、ＢＲＧ１、ＢＲＰＦ１、ＣＥＣＲ２、ＰＣＡＦ、及び／またはＴＡＦ１、あるいは少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれか１種のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ブロモドメインポリペプチドは、ＢＲＤ４及び／またはＢＲＤ９、あるいは少なくとも１のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ブロモドメインポリペプチドは、全長ブロモドメインポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ブロモドメインモジュールを含むブロモドメインポリペプチドのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、及び９０％のブロモドメインポリペプチドを含み、ブロモドメインモジュールを含む。
【００７１】
本明細書に記載の融合タンパク質はレポーターモジュールを含む。レポーターモジュールは当技術分野で公知であり、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、蛍光タンパク質、及び／またはルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の融合タンパク質及び方法のいずれかのいくつかの実施形態において、レポーターモジュールは、多量体に受け入れ可能な及び／または多量体に会合するレポータータンパク質（「多量体レポータータンパク質」）である。いくつかの実施形態において、上記多量体レポータータンパク質は偏性の二量体タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記多量体レポータータンパク質は偏性の三量体タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記多量体レポータータンパク質は偏性の四量体タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記多量体レポータータンパク質は能力があり、及び／またはタンパク質凝集体を形成する。いくつかの実施形態において、上記多量体レポータータンパク質は能力があり、及び／またはタンパク質オリゴマーを形成する。ある実施形態において、レポーターモジュールは蛍光レポーターモジュールを含む。上記蛍光レポーターモジュールは蛍光タンパク質を含む（例えば、Ｏｌｅｎｙｃｈら、（２００６）。Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１．５．１〜２１．５．３４；Ｎａｔｈａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２０、４２４７〜４２６０（２００７）；Ｄａｙら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ、２００９、３８、２８８７〜２９２１を参照されたい）。いくつかの実施形態において、上記蛍光レポーターモジュールは、表２に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記蛍光レポーターモジュールは、ＥＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ｄｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２、及び／またはＺｓＧｒｅｅｎのいずれか１種のアミノ酸配列を含む。
表２  蛍光レポートモジュール
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【００７２】
本明細書に記載の融合タンパク質及び方法のいずれかのいくつかの実施形態において、融合タンパク質は核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態において、ＮＬＳはクロマチン結合性ポリペプチドのＮＬＳを含む。いくつかの実施形態において、ＮＬＳはブロモドメインポリペプチドのＮＬＳを含む。ある実施形態において、ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳまたはヌクレオプラスミンのＮＬＳである。
【００７３】
レポーターモジュールは、融合タンパク質内の任意の位置であって、検知を可能にし、クロマチン結合モジュールのクロマチンとの相互作用を大幅には妨害しない（例えば、妨害しない）上記位置であることができる。本明細書に記載の融合タンパク質及び方法のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマチン結合モジュールは、レポーターモジュールの５’に位置する。本明細書に記載の融合タンパク質及び方法のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマチン結合モジュールは、レポーターモジュールの３’に位置する。
【００７４】
本明細書に記載の融合タンパク質及び方法のいずれかのいくつかの実施形態において、融合タンパク質は多量体化することができる。ある実施形態において、融合タンパク質は、二量体、三量体または四量体を形成することができる。ある実施形態において、融合タンパク質は二量体を形成することができる。ある実施形態において、融合タンパク質は四量体を形成することができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はタンパク質凝集体を形成することができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はオリゴマー化することができる。
【００７５】
複数の融合タンパク質は、例えば、レポーターモジュールにおけるタンパク質の多量体化によって会合し、フォーカスを形成することができる。このとき、フォーカスは検知することができる。ある実施形態において、レポーターモジュールは蛍光レポーターモジュールを含む。
【００７６】
本明細書に記載の融合タンパク質及び方法のいずれかのいくつかの実施形態において、フォーカス及び／またはドットの形成は、対照試料すなわち参照試料中の融合タンパク質の局在化を比較することにより判定される。いくつかの実施形態において、対照試料すなわち参照試料中の融合タンパク質の局在化は、クロマチン結合モジュール阻害化合物の非存在下での、細胞中の融合タンパク質の局在化である。いくつかの実施形態において、クロマチン結合モジュール阻害化合物による細胞の処理及び／またはクロマチン結合モジュール阻害化合物の存在により、細胞中のフォーカスの数は、非処理の細胞及び／またはクロマチン結合モジュール阻害化合物の非存在と比較して、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％のいずれかよりも大きく増加する。フォーカス及び／またはドットの大きさ及び形状は、クロマチン結合モジュールに依って変化し得る。
【００７７】
本発明の融合タンパク質はフォーカスを形成することができ、該フォーカスは本技術分野で公知の方法を用いて検知し測定することができる。いくつかの実施形態において、上記フォーカスの形成は、融合タンパク質がクロマチン並びにフォーカス及び／またはドットの形成から解離したことを示す。タンパク質のクロマチンからの解離及び核局在化の検知方法は本技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、上記検知方法は直接的な検知である。いくつかの実施形態において、上記検知方法は、レポーターモジュールに対する蛍光標識された抗体、または融合タンパク質の一部としての改質タンパク質エピトープタグを用いた間接的な検知である。融合タンパク質の局在化は蛍光顕微鏡観察を用いて判定される。いくつかの実施形態において、上記検知方法は、分子の大きさに基づいた生化学的分画及びそれに続く、融合タンパク質、レポーターモジュールまたは融合タンパク質の一部としての改質タンパク質エピトープタグに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングである。
【００７８】
ある実施形態において、クロマチン結合モジュールは、クロマチンと相互作用する転写抑制因子の悪性脳腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ）（ＭＢＴ）ファミリーの一員を含まない。ある実施形態において、クロマチン結合モジュールは全長Ｌ３ＭＢＴＬ３を含まない。ある実施形態において、クロマチン結合モジュールはＬ３ＭＢＴＬ３の３つのＭＢＴドメインを含まない。ある実施形態において、レポーターモジュールはＧＦＰを含まない。
【００７９】
本明細書においては、本明細書に記載の方法によって識別されたクロマチン結合モジュール阻害化合物が更に提供される。いくつかの実施形態において、クロマチン結合モジュール阻害化合物は低分子阻害剤である。いくつかの実施形態において、クロマチン結合モジュール阻害化合物はブロモドメインモジュール阻害化合物である。
【００８０】
クロマチン結合モジュール及びクロマチン結合性ポリペプチドのポリペプチド変異体
クロマチン結合モジュール及びクロマチン結合性ポリペプチドの変異体が、本明細書記載の方法において、及び本明細書記載の融合タンパク質における使用に有用である。ポリペプチドの保存的置換を、表３に「好ましい置換」との見出しの下に示す。かかる置換によって生物学的活性が変化する場合には、表３に「代表的置換」と名付けられた、あるいはアミノ酸の種別に関連して更に後述のより実質的な変化を導入し、生成物を選別してもよい。
表３。
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【００８１】
上記ポリペプチドの生物学的特性の実質的な改変は、置換であって、（ａ）例えば、シートまたはらせん構造としての、当該置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）当該分子の標的部位における電荷若しくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持することに対する当該置換の効果が有意に異なる上記置換を選択することにより達成される。非保存的置換は、これらの類型の一つの構成員を別な類型のものに交換することを必要とする。アミノ酸は、共通する側鎖の特性に応じて以下のような群に分けることができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）連鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
（７）大きな疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
【００８２】
更なる実施形態において、本発明のポリペプチドは、１または複数の天然に存在しないアミノ酸または修飾アミノ酸を含んでもよい。「天然に存在しないアミノ酸残基」とは、上記に列挙した天然に存在するアミノ酸残基以外の残基をいい、該残基はポリペプチド鎖中において隣接するアミノ酸残基（複数可）を共有結合により結合させることが可能であるものである。非天然アミノ酸としては、ホモリシン、ホモアルギニン、ホモセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソブタン酸、３−アミノイソブタン酸、２−アミノピメリン酸、ターシャリーブチルグリシン、２，４−ジアミノイソブタン酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフタアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、シトルリン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸及びチオプロリンが挙げられるが、これらに限定されない。修飾アミノ酸としては、天然並びに非天然のアミノ酸であって、可逆的若しくは不可逆的に化学的にブロックされた、または、例えば、Ｎ−メチル化Ｄ及びＬアミノ酸、別な官能基に化学的に修飾された側鎖官能基のような、それらのＮ末端アミノ基若しくはそれらの側鎖基上で修飾された上記アミノ酸が挙げられる。例えば、修飾アミノ酸としては、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、アスパラギン酸（β−メチルエステル）、アスパラギン酸の修飾アミノ酸，Ｎ−エチルグリシン、グリシンの修飾アミノ酸、またはアラニンカルボキサミド及びアラニンの修飾アミノ酸が挙げられる。更なる非天然アミノ酸及び修飾アミノ酸、並びにそれらをタンパク質及びペプチドに組み込む方法は本技術分野において公知である（例えば、Ｓａｎｄｂｅｒｇら、（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：２４８１〜９１；Ｘｉｅ及びＳｃｈｕｌｔｚ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：５４８〜５５４；Ｈｏｄｇｓｏｎ及びＳａｎｄｅｒｓｏｎ（２００４）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．３３：４２２〜４３０を参照されたい）。
【００８３】
クロマチン結合モジュールを含むポリペプチドの変異体はまた、実質的にクロマチン結合モジュールの活性に影響を与えることなく、本技術分野で公知の情報に基づいて作製することができる。例えば、クロマチン結合モジュール及び／またはクロマチン結合モジュールの変異体を含むポリペプチドは、クロマチン結合モジュール及び／または異なる残基によって置換されたクロマチン結合モジュールを含むポリペプチド中に、少なくとも１のアミノ酸残基を有することができる。
【００８４】
かかる置換変異体を生成させるための簡便な方法はファージディスプレイを含む。ファージディスプレイされた変異体は、次いで、本明細書開示の該変異体の生物学的活性（例えば、結合親和性）に関して選別される。クロマチン結合モジュール及び／または修飾のためのクロマチン結合モジュールを含むポリペプチドの候補領域を識別するために、アラニンスキャニング変異誘発を行い、クロマチン結合に有意に寄与する高度可変領域残基を識別することができる。かかる変異体が生成されると、変異体のパネルを本明細書記載の選別に供し、１または複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体を更なる開発のために選択することができる。
【００８５】
本明細書記載の方法に用いられる核酸、発現カセット、ベクター、及び細胞
本明細書においては、本明細書記載の融合タンパク質をコードする核酸、及び本明細書記載の融合タンパク質を含む核酸を含む発現カセット、ベクターが提供される。本明細書においては、単離された及び／または実質的に精製された融合タンパク質、並びに本明細書記載の融合タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が提供される。更に、本明細書記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター及び発現カセットが提供される。
【００８６】
クロマチン結合モジュールを含むポリペプチド及び／または本明細書に記載のクロマチン結合モジュールをコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な合成及び／または組換え技術を用いて得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、適宜の細胞源から単離及び配列決定することができる。クロマチン結合モジュールを含むポリペプチド及び／またはクロマチン結合モジュールの細胞源としては、ハイブリドーマ細胞などの、クロマチン結合モジュールを含むポリペプチド及び／またはクロマチン結合モジュールを産生する細胞を挙げられるであろう。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機またはＰＣＲ技術を用いて合成することができる。ブロモドメインを含むポリペプチド及び／またはブロモドメインをコードする配列は、それが得られた後、宿主細胞中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。利用可能であり、本技術分野で公知の多くのベクターを、本発明の目的のために用いることができる。適当なベクターの選択は、主として、当該ベクターに挿入される核酸の大きさ、及び当該ベクターによって形質転換されることとなる特定の宿主細胞に依存することとなる。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅若しくは発現、またはそれらの両方）及び当該ベクターの、該ベクターが存在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、様々な成分を含有する。上記ベクターの成分はとしては、一般に、複製起点（特に、ベクターが原核細胞に挿入されるとき）、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
クロマチン結合モジュールを含むポリペプチド及び／またはクロマチン結合モジュールのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、本技術分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びクロマチン結合モジュールを含むポリペプチド及び／またはクロマチン結合モジュールの、以前に調製された変異体または非変異版のカセット変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
ある実施形態において、本発明は、標的配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含有するベクターを提供する。本明細書において用いられる「発現カセット」とは、適宜の宿主細胞において、特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる核酸配列を意味し、該カセットは、作動可能に終結シグナルに連結されてもよい着目するヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。コード化領域は通常、着目する機能的ＲＮＡ、例えばＲＮＡｉ分子をコードする。着目するヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであってもよい。核酸は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（２００１）に記載されるものなどの標準的な技術を用いて、ベクター中に操作することができる。
【００８９】
一般に、宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主との関連で用いられる。上記ベクターは通常、複製部位、並びに形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を有する。加えて、宿主微生物と適合するレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターを、これらの宿主との関連で、形質転換用ベクターとして用いることができる。
【００９０】
構成的または誘導性プロモーターのいずれかを、当業者によって確認することができる特定の状況のニーズに応じて、本発明で使用することができる。様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介してソースＤＮＡからプロモーターを除去し、単離したプロモーター配列を選択したベクターに挿入することにより、本明細書記載のポリペプチドをコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。天然プロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方を、本明細書に記載の融合タンパク質の直接増幅及び／または発現に用いることができる。但し、異種プロモーターは一般に、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、より大きな転写及び発現された標的遺伝子のより高い収量を可能とすることから、これらが好ましい。
【００９１】
いくつかの実施形態において、組換えベクター内の各シストロンは、分泌シグナル配列成分及び／または発現されたポリペプチドの膜を横断しての移行を指示する核局在化シグナルを含む。一般に、上記シグナル配列はベクターの成分であってもよく、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択される上記シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって開裂される）シグナル配列であるべきである。
【００９２】
本明細書においては、本明細書記載の融合タンパク質を含む核酸を含む発現カセット及び／またはベクターを含む細胞もまた提供される。本明細書においては、本明細書記載の融合タンパク質を含む細胞が提供される。いくつかの実施形態において、上記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は哺乳動物細胞である。ある実施形態において、上記細胞はＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＨＥ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、及び／またはＵ２ＯＳ細胞である。ある実施形態において、上記細胞はＣＯＳ−７、ＨｅＬａ、及び／またはＵ２ＯＳ細胞である。
【００９３】
宿主細胞は、上記発現ベクターで形質転換すなわち形質移入され、または上記発現ベクターがパッケージ化されたウィルスで形質導入され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に修飾された従来の栄養培地で培養される。形質移入とは、いずれかのコード化配列が実際に発現されるかどうかに拘わらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みをいう。一般に、形質移入が成功したことは、このベクターの操作のいずれかの徴候が宿主細胞内で生じたときに認識される。
【００９４】
発現ベクターにおいて誘導性プロモーターが用いられる場合には、当該プロモーターの活性化に適した条件下でタンパク質発現が誘導される。本技術分野で公知であるように、用いるベクター構築物に応じて、様々な他の誘導因子が用いられてもよい。炭素、窒素及び無機リン酸源以外の任意の必要な補助剤もまた、単独で、または複合窒素源などの、別な補助剤又は培地との混合物として導入されて、適当な濃度で含まれていてもよい。培地は、任意選択で、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群より選択される１種または複数種の還元剤を含有してもよい。
【００９５】
細胞を培養物から除去し、培養上清を濾過し、産生されたタンパク質を更に精製するために濃縮してもよい。発現されたポリペプチドは、免疫親和性カラムまたはイオン交換カラム上での分画アッセイ；エタノール沈殿アッセイ；逆相ＨＰＬＣアッセイ；シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィーアッセイ；等電点クロマトグラフィーアッセイ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイ；硫酸アンモニウム沈殿アッセイ；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過アッセイ；疎水性の親和性樹脂、マトリックス上に固定化された適宜の抗原を用いるリガンド親和性アッセイ；及びウエスタンブロットアッセイなどの、一般的に知られる方法を用いて更に単離及び同定することができる。
【００９６】
治療／予防方法及び／または使用
本明細書記載の方法のいずれかによって識別されたクロマチン結合モジュール阻害化合物は、治療方法において有用であり得る。
【００９７】
一態様において、薬剤として使用するためのクロマチン結合モジュール阻害化合物が提供される。更なる態様において、ガンの治療方法に用いるためのクロマチン結合モジュール阻害化合物が提供される。ある実施形態において、本発明は、個体における治療方法であって、ガンを治療するために、有効量のクロマチン結合モジュール阻害化合物を当該個体に投与することを含む上記治療方法に用いるためのクロマチン結合モジュール阻害化合物を提供する。ある実施形態において、治療方法に用いるためのクロマチン結合モジュール阻害化合物が提供される。ある実施形態において、ガンを有する個体の治療方法であって、有効量のクロマチン結合モジュール阻害化合物を当該個体に投与することを含む上記治療方法に用いるためのクロマチン結合モジュール阻害化合物が提供される。かかる実施形態の一つにおいて、上記方法は、有効量の、例えば後述する、少なくとも１種の追加の治療薬を上記個体に投与することを更に含む。更なる実施形態において、本発明は、ガンの治療に用いるためのクロマチン結合モジュール阻害化合物を提供する。ある実施形態において、本発明は、個体におけるガンの治療方法であって、ガンを治療するために、有効量のクロマチン結合モジュール阻害化合物を当該個体に投与することを含む上記治療方法に用いるためのクロマチン結合モジュール阻害化合物を提供する。更なる実施形態において、本発明は、ガンの治療に用いるためのクロマチン結合モジュール阻害化合物を提供する。ある実施形態において、本発明は、個体における細胞増殖の阻害方法であって、細胞増殖を阻害するために、有効量のクロマチン結合モジュール阻害化合物を当該個体に投与することを含む上記阻害方法に用いるためのクロマチン結合モジュール阻害化合物を提供する。いくつかの実施形態において、クロマチン結合モジュール阻害化合物はブロモドメインモジュール阻害化合物である。上記実施形態のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
【００９８】
更なる態様において、本明細書では、例えば上記治療方法のいずれかに用いるための、上記クロマチン結合モジュール阻害化合物のいずれかを含む医薬製剤が提供される。一実施形態において、医薬製剤は、上記クロマチン結合モジュール阻害化合物のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、一般的に、用いられる投薬量及び濃度において受容者に対して非毒性であり、該担体としては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを始めとする抗酸化剤；（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又またはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなどの）防腐剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを始めとする他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）；並びに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における代表的な薬学的に許容される担体としては、更に、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質である、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰの）などの間質性薬剤分散剤が挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を始めとするある代表的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法が、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１種または複数種の更なるグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、クロマチン結合モジュール阻害化合物及び少なくとも１種の、例えば後述の、追加の治療薬を含む。
【０１００】
クロマチン結合モジュール阻害化合物は、治療において、単独または他の薬剤との組み合わせのいずれかで用いることができる。例えば、クロマチン結合モジュール阻害化合物は、少なくとも１種の更なる治療薬と同時投与されてもよい。
【０１０１】
かかる上述の併用療法は、（複数の治療薬が同一または別個の製剤中に含まれる）併用投与、及び個別投与を包含し、個別投与の場合、本明細書記載のクロマチン結合モジュール阻害化合物の投与は、更なる治療薬の投与の前に、同時に、及び／または後に行うことができる。
【０１０２】
本明細書記載のクロマチン結合モジュール阻害化合物（及び任意の更なる治療薬）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに、局所治療が所望であるならば、病巣内投与、局所投与、または眼内投与を始めとする、任意且つ適宜の手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、例えば、投与が短期であるか長期であるかに一部依存して、静脈内注射又は皮下注射とするなどの注射による等の、任意且つ適宜の経路によることができる。本明細書においては、単一投与または種々の時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を始めとする様々な投薬スケジュールが企図されるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
ブロモドメインによって媒介される障害の例としては、聴神経腫、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（単球性、骨髄芽球、腺ガン、血管肉腫、星状細胞腫、骨髄単球性及び前骨髄球性）、急性Ｔ細胞白血病、基底細胞ガン、胆管ガン、膀胱ガン、脳腫瘍、乳ガン、気管支ガン、子宮頸ガン、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛ガン、慢性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性（顆粒球）白血病、慢性骨髄性白血病、結腸ガン、結腸直腸ガン、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺ガン、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、不良増殖性変化（異形成及び化生）、胎生期ガン、子宮内膜ガン、内皮肉腫、上衣腫、上皮ガン、赤白血病、食道ガン、エストロゲン受容体陽性乳ガン、本態性血小板血症、ユーイング腫瘍、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、胚細胞精巣ガン、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、Ｈ鎖病、血管芽腫、肝ガン、肝細胞ガン、ホルモン非感受性前立腺ガン、平滑筋肉腫、白血病、脂肪肉腫、肺ガン、リンパ管内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ芽球性白血病、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、膀胱、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚及び子宮の悪性腫瘍及び過剰増殖性障害、Ｔ細胞またはＢ細胞起源のリンパ性悪性疾患、白血病、リンパ腫、髄様ガン、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄性白血病、骨髄腫、粘液肉腫、神経芽細胞腫、ＮＵＴ正中ガン（ＮＵＴ（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＮＭＣ）、非小細胞肺ガン、乏突起膠腫、口腔癌、骨肉腫、卵巣ガン、膵臓ガン、乳頭腺ガン、乳頭ガン、松果体腫、真性赤血球増加症、前立腺ガン、直腸ガン、腎細胞ガン、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮脂腺ガン、精上皮腫、皮膚ガン、小細胞肺ガン、固形腫瘍（ガン及び肉腫）、小細胞肺ガン、胃ガン、扁平上皮ガン、滑膜腫、汗腺ガン、甲状腺ガン、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、精巣腫瘍、子宮ガン並びにウィルムス腫瘍を始めとするガンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０４】
上記方法のいずれかのある実施形態において、上記ガンは肺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸直腸ガン、及び／またはメラノーマである。ある実施形態において、上記ガンは肺である。ある実施形態において、上記肺ガンはＮＳＣＬＣである。ある実施形態において、上記ガンは乳ガンである。ある実施形態において、上記ガンはメラノーマである。
【０１０５】
製品／キット
本明細書においては、本明細書記載の融合タンパク質、核酸、発現カセット、ベクター、及び／または細胞を含む、クロマチン結合モジュール阻害化合物を識別するために有用な物質を収納する製品もまた提供される。上記製品は、容器及び該容器上のまたは該容器に同伴するラベル又は添付文書を備える。適当な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、静注用溶液バッグ等が挙げられる。上記容器はガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。上記容器は、それ自体であるか、またはクロマチン結合モジュール阻害化合物を識別するために有効な別な組成物と組み合わせられた組成物を保持する。
【０１０６】
上記ラベル又は添付文書は、当該組成物が、クロマチン結合モジュール阻害化合物を識別するために用いられることを示す。更に、上記製品は、（ａ）その中に収納された組成物を有する第１の容器であって、該組成物が、本明細書に記載の融合タンパク質、核酸、発現カセット、ベクター、及び／または細胞を含む上記容器、及び（ｂ）その中に収納された組成物を有する第２の容器であって、該組成物が、更なる薬剤を含む上記容器を備えていてもよい。本発明のこの実施形態における上記製品は、当該組成物が、クロマチン結合モジュール阻害化合物を識別するために用いることができることを示す添付文書を更に備えていてもよい。
【０１０７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために加えられる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって見出された技術を代表し、それ故に、本発明の実施のための好ましい様式を構成すると見なすことができることが、当業者によって認識されるべきである。但し、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【０１０８】
実施例
以下は、本発明の融合タンパク質及び融合タンパク質の使用方法の実施例である。本明細書に提供される一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０１０９】
実施例１
ブロモドメイン阻害化合物によるクロマチンからの遊離に際しての、核内のＦＰタグ付けしたブロモドメイン含有タンパク質上の蛍光タグ（ＦＰ）の局在化の変化を理解するために、ＦＰ−ＢＲＤ４のある融合構成によって、核内において、ＦＰタグ付けしたタンパク質が阻害剤依存的に再局在化し、フォーカスが形成された。
【０１１０】
方法
蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＦＰ）タグ（ｄｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ  ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、またはＺｓＧｒｅｅｎ）を、ヒトＥＦ１プロモーターの制御下でＴｅｔ−ＯＮ  ３Ｇ転写因子を発現するレンチウィルスベクター中のヒトＢＲＤ４をコードするＤＮＡ配列（ＢＲＤ４イソ型ショート（ＢＲＤ４  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｓｈｏｒｔ）のアミノ酸残基１〜７１９；ＮＣＢＩ  ＮＰ＿０５５１１４．１）のインフレームの上流にクローニングした。誘導性ＴＲＥ３Ｇプロモーターの下流にあるＦＰ−ＢＲＤ４タンパク質の発現を、ドキシサイクリンにより誘導することができた。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−９６）を感染させ、１５μｇ／ｍｌのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を共焦点顕微鏡観察用のＮｕｎｃ（商標）Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標）ＩＩチャンバースライドまたは高含有量顕微鏡観察用の９６ウェルプレートに播種した。細胞を２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで１６時間処理し、その後ＤＭＳＯまたはＢＲＤ４阻害剤のいずれかと共に２〜４時間インキュベートした後に画像化した。加熱ステージを有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０倒立型共焦点顕微鏡またはＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡を用いて、ＦＰタグ付けしたＢＲＤ４タンパク質の局在化を調べた。得られた画像をＺｅｉｓｓ  ＺＥＮソフトウェアを用いて解析した。高含有量顕微鏡観察に関しては、化合物で処理した細胞を４％ホルムアルデヒドで１５分間固定化し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。画像をＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）上で取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて解析した。
【０１１１】
結果
異なる蛍光タンパク質（ＦＰ）でタグ付けした誘導性ＢＲＤ４を安定して有するＵ２ＯＳ細胞株を作製した。Ｎ末端ＦＰタグはｄｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ  ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、またはＺｓＧｒｅｅｎを含んでいた（図１）。ＦＰ−ＢＲＤ４発現をドキシサイクリンによって誘導し、細胞を、ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＢＲＤ４ブロモドメイン阻害剤ＪＱ１のいずれかで４時間処理し、その後共焦点顕微鏡を用いて生細胞を画像化した。ＪＱ１（ＣＡＳ番号１２６５２４−７０−４）は、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４及びＢＲＤＴのブロモドメインを阻害する化合物である。ＤＭＳＯで処理した場合には、ＦＰでタグ付けしたＢＲＤ４タンパク質がクロマチンに結合し、核内に拡散して分布した（図２）。興味深いことに、ＪＱ１処理により、ＥＧＦＰ−ＢＲＤ４、ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＤｓＲｅｄ２−ＢＲＤ４及びＴｕｒｂｏＧＦＰ−ＢＲＤ４のタンパク質が再局在化し、蛍光ドット／フォーカスが形成された。しかし、ＪＱ１によるｍＯｒａｎｇｅ２−ＢＲＤ４、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＲＤ４及びＥｍｅｒａｌｄ−ＧＦＰ−ＢＲＤ４のＢＲＤ４ブロモドメインの阻害は、核内のＦＰタグ付けした融合タンパク質の局在化を変化させなかった。これらの知見は、ＢＲＤ４が、多量体（例えば、二量体または四量体）を形成する傾向を有する蛍光タンパク質でタグ付けされた場合に、蛍光ＢＲＤ４融合タンパク質が、ブロモドメイン阻害剤に応答して凝集し、ドット／フォーカスを形成したことを示した。重要なことは、両方のブロモドメインにおいて点変異を有する変異体ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４タンパク質はクロマチンに結合することができず、従ってブロモドメイン阻害剤の効果と類似し、ブロモドメイン阻害剤の非存在下であっても、核内のドット／フォーカスに局在化した（図３Ｂ）。野生型ＢＲＤ４融合タンパク質は、同じ条件下で拡散した局在化を示した（図３Ａ）。ブロモドメイン阻害化合物の、クロマチンへのブロモドメインの結合の防止を更に分析するために、クロマチンをＤＮＡ結合色素ヘキスト３３３４２でマークした。図４に示すように、ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４タンパク質とクロマチンとの有意な共局在化があった。一方、ブロモドメイン阻害化合物ＢＤｉ−Ａでの処理により、ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４の蛍光ドットが生成し、それらのドットはクロマチンと重なり合わなかった（図４）。まとめると、これらの結果は、ブロモドメインの結合活性が、ブロモドメイン阻害化合物によって阻害される、またはブロモドメイン内の点変異によって消失した場合に、ＦＰ−ＢＲＤ４タンパク質が再局在してドット／フォーカスを形成したことを実証した。
【０１１２】
ドット／フォーカス形成の動態を調べるために、ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４を発現する安定な細胞をＤＭＳＯまたは化合物ＢＤｉ−Ａ（ＢＲＤ４のブロモドメイン阻害剤）で５分間、１０分間、１５分間、３０分間または６０分間処理し、続いて固定化及び共焦点顕微鏡観察を行った。ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４タンパク質の再局在化が１０分の時点で認められ、ドット／フォーカス形成が３０分までに劇的に起こった（図５）。これらの結果はＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４の再局在化の速やかな動態を示し、ブロモドメイン阻害剤の効果は、顕微鏡観察で蛍光フォーカス形成を追跡することによって、リアルタイムで監視することができた。
【０１１３】
ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４の再局在化に対するＢＲＤ４阻害剤の効果を定量化するために、安定な細胞を９６ウェルプレートに播種し、ドキシサイクリンと共にインキュベートして、ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４の発現を誘導した。細胞を種々の濃度のＪＱ１で４時間処理した後に固定化した。その後、高含有量顕微鏡観察により画像を得て、ＭｅｔａＸｐｒｅｓを用いて解析し、細胞当たりの蛍光ドットの数を測定した。得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで解析して、ＥＣ５０値を計算した。予想されたように、より高いＪＱ１濃度においてより多くのＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４ドットが観察され、ＪＱ１濃度の低下に伴って徐々に減少した。このＢＲＤ４の再局在化アッセイにおいて、計算されたＪＱ１（ＣＡＳ番号１２６８５２４−７０−４）のＥＣ５０は９３ｎＭであり、「ドットアッセイ」と呼ばれる（図６）。これらの結果は、再局在化／ドット形成は定量可能な表現型であり、細胞の設定において、これを用いてブロモドメイン阻害剤の効力を判定することができることを示した。
【０１１４】
考察
ブロモドメインタンパク質はクロマチンと相互作用し、様々な翻訳後修飾を有するヒストン尾部に結合する能力をもつ。可能性のある、但し非限定的な一モデルを図７に示す。本明細書に示すように、ＢＲＤ４ブロモドメイン阻害化合物及びＢＲＤ４のブロモドメインにおける変異によって、ＢＲＤ４タンパク質がクロマチンから遊離した。ＢＲＤ４を、多量体（例えば、二量体または四量体）を形成する能力を有するＦＰでタグ付けした場合には、ＦＰタグの親和性が、核内でＦＰタグ付けしたＢＲＤ４の凝集を促進し、ドット／フォーカスを形成させた。更に、本明細書に示すように、単量体のＦＰ（ｍＯｒａｇｎｅ２及びｍＣｈｅｒｒｙ）でタグ付けしたＢＲＤ４は、阻害剤依存性のドット／フォーカスの形成を示さなかった（図２）。加えて、結合能を無効にしたＢＲＤ４ブロモドメインの変異により、ＢＲＤ４ブロモドメイン阻害剤の非存在下であっても、「ドット」表現型が生成する（図３）。阻害剤に応答したＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４の再局在化、凝集及びドット／フォーカス形成は、ブロモドメインの結合親和性の阻害に起因していた。このシステムにおいて、上記ＦＰタグは、タグ付けしたブロモドメインタンパク質の凝集及びフォーカスの形成を促進することを始めとする複数の目的を果たし、且つ検知方法としての役割を果たした。
【０１１５】
実施例２
全長ＺｓＧｒｅｅｎ及びＢＲＤ２を含有する融合タンパク質を細胞内で発現させて、ＢＲＤ２ブロモドメイン阻害化合物に応答した局在化の変化を分析した。
【０１１６】
方法
蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）を、ヒトＥＦ１プロモーターの制御下でＴｅｔ−ＯＮ  ３Ｇ転写因子を発現するレンチウィルスベクター中のヒトＢＲＤ２をコードするＤＮＡ配列（ＮＰ＿００１１０６６５３．１）のインフレームの上流にクローニングした。誘導性ＴＲＥ３Ｇプロモーターの下流にあるＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ２をコードする領域の発現を、ドキシサイクリンにより誘導することができた。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−９６）を感染させ、１５μｇ／ｍｌのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を共焦点顕微鏡観察用のＮｕｎｃ（商標）Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標）ＩＩチャンバースライドに播種した。細胞を２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで１６時間処理し、その後ＤＭＳＯまたはＢＲＤ２阻害剤のいずれかと共に４時間インキュベートした後に画像化した。加熱ステージを有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０倒立型共焦点顕微鏡またはＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡を用いて、ＦＰタグ付けしたＢＲＤ２の核内の局在化を調べた。得られた画像をＺｅｉｓｓ  ＺＥＮソフトウェアを用いて解析した。
【０１１７】
結果及び考察
Ｎ末端にＺｓＧｒｅｅｎタグ付けした誘導性の全長ＢＲＤ２（図８Ａ）を安定的に有するＵ２ＯＳ細胞株を、レンチウィルスの感染及びブラストサイジン選択により生成させた。ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ２タンパク質が、ブロモドメイン阻害剤によりクロマチンから遊離した後に、ドット／フォーカスを形成するか否かを試験するために、安定したＵ２ＯＳ／ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ２細胞をドキシサイクリンで誘導し、１０μΜのビヒクル（ＤＭＳＯ）またはブロモドメイン阻害剤ＪＱ１（ＣＡＳ番号１２６５２４−７０−４）のいずれかで４時間処理した後に、共焦点顕微鏡を用いて生細胞を画像化した。ＪＱ１処理により、核内でＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ２タンパク質が再局在化し、ドット／フォーカスが形成された（図８Ｂ）。この阻害剤依存性のフォーカス形成表現型は、二量体または多量体を形成するＦＰタグと融合したＢＲＤ４の場合に観察された凝集表現型と類似していた（図２）。
【０１１８】
実施例３
全長ＺｓＧｒｅｅｎ及びＢＲＤ３を含有する融合タンパク質を細胞内で発現させて、ＢＲＤ３ブロモドメイン阻害化合物に応答した局在化の変化を分析した。
【０１１９】
方法
蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）を、ヒトＥＦ１プロモーターの制御下でＴｅｔ−ＯＮ  ３Ｇ転写因子を発現するレンチウィルスベクター中のヒトＢＲＤ３をコードするＤＮＡ配列（ＮＰ＿０３１３９７．１）のインフレームの上流にクローニングした。誘導性ＴＲＥ３Ｇプロモーターの下流にあるＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ３をコードする領域の発現を、ドキシサイクリンにより誘導することができた。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−９６）を感染させ、１５μｇ／ｍｌのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を共焦点顕微鏡観察用のＮｕｎｃ（商標）Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標）ＩＩチャンバースライドに播種した。細胞を２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで１６時間処理し、その後ＤＭＳＯまたはＢＲＤ３阻害剤のいずれかと共に４時間インキュベートした後に画像化した。加熱ステージを有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０倒立型共焦点顕微鏡またはＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡を用いて、ＦＰタグ付けしたＢＲＤ３の核内の局在化を調べた。得られた画像をＺｅｉｓｓ  ＺＥＮソフトウェアを用いて解析した。
【０１２０】
結果及び考察
Ｎ末端にＺｓＧｒｅｅｎタグ付けした誘導性の全長ＢＲＤ３（図９Ａ）を安定的に有するＵ２ＯＳ細胞株を、レンチウィルスの感染及びブラストサイジン選択により生成させた。ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ３タンパク質が、ブロモドメイン阻害剤によりクロマチンから遊離した後に、ドット／フォーカスを形成するか否かを試験するために、安定したＵ２ＯＳ／ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ３細胞をドキシサイクリンで処理し、１０μΜのビヒクル（ＤＭＳＯ）またはブロモドメイン阻害剤ＪＱ１（ＣＡＳ番号１２６５２４−７０−４）のいずれかと共に４時間インキュベートした後に、生細胞を画像化した。ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ２及びＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ４について得られた知見と類似して、ＺｓＧｒｅｅｎ−ＢＲＤ３タンパク質は、ＢＲＤ３ブロモドメイン阻害化合物ＪＱ１に応答して蛍光ドット／フォーカスを形成した（図９Ｂ）。
【０１２１】
実施例４
ＢＲＤ９ブロモドメインを阻害する化合物の細胞上の効果を判定するための方法を確立するために、この例における実験を設計し実施した。全長ＢＲＤ９及び蛍光タンパク質を含有する融合タンパク質を細胞内で発現させて、ブロモドメイン阻害剤により引き起こされる局在化の変化及びフォーカスの形成を分析した。
【０１２２】
方法
蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎまたはｍＶｅｎｕｓ）を、ヒトＥＦ１プロモーターの制御下でＴｅｔ−ＯＮ  ３Ｇ転写因子を発現するレンチウィルスベクター中のヒトＢＲＤ９をコードするＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ  ＮＰ＿０７６４１３．３）のインフレームの下流にクローニングした。誘導性ＴＲＥ３Ｇプロモーターの下流にあるＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ及びＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎをコードする領域の発現を、ドキシサイクリンにより誘導することができた。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−９６）を感染させ、１５μｇ／ｍｌのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を共焦点顕微鏡観察用のＮｕｎｃ（商標）Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標）ＩＩチャンバースライドに播種した。細胞を２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで１６時間処理し、その後ＤＭＳＯまたはＢＲＤ９阻害剤（ＢＤｉ−Ｂ、ＢＤｉ−Ｃ及びＢＤｉ−Ｄ）のいずれかと４時間インキュベートした後に画像化した。加熱ステージを有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０倒立型共焦点顕微鏡またはＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡を用いて、ＦＰタグ付けしたＢＲＤ９の核内の局在化を調べた。得られた画像をＺｅｉｓｓ  ＺＥＮソフトウェアを用いて解析した。
【０１２３】
結果及び考察
Ｃ末端にＺｓＧｒｅｅｎタグ付けした誘導性の全長ＢＲＤ９（図１０Ａ）を安定的に有するＵ２ＯＳ細胞株を、レンチウィルスの感染及びブラストサイジン選択により生成させた。ブロモドメイン阻害のＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎの局在化に対する効果を更に調べるために、蛍光融合タンパク質の発現をドキシサイクリンによって誘導し、細胞を１０μΜのビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＢＲＤ９ブロモドメイン阻害剤（化合物ＢＤｉ−ＣまたはＢＤｉ−Ｄ）のいずれかで４時間処理した後に、共焦点顕微鏡を用いて生細胞を画像化した。ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎの局在化は、両方のＢＲＤ９阻害剤に応答して、拡散した分布から蛍光ドット／フォーカスへと変化した（図１０Ｂ）。これらの結果は、ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎがＢＲＤ９ブロモドメイン阻害剤によってクロマチンから排除され、その後蛍光ドット／フォーカスを形成したことを示した。更に、ＢＲＤ９のブロモドメインに点変異（Ｎ２１６Ｙ）を導入し、その結合能を無効にした場合には（図１１Ａ）、クロマチン阻害化合物の非存在下であっても、クロマチンに対する結合親和性のない変異体ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎが蛍光ドットを形成した（図１１Ｂ）。まとめると、このブロモドメイン変異体タンパク質の「ドット」表現型もまた、化合物処理した野生型ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎの「ドット」表現型が、ＢＲＤ９ブロモドメインの機能的破壊に起因することを示した。
【０１２４】
「ドット／フォーカス」表現型に対するＦＰタグの寄与を調べるために、ＢＲＤ９を、単量体ＦＰであり、タンパク質凝集を促進しなかったｍＶｅｎｕｓに融合させた（図１２Ａ）。予想されたように、ＤＭＳＯまたはＢＲＤ９阻害剤（化合物ＢＤｉ−Ｄ）のいずれかを伴うＢＲＤ９−ｍＶｅｎｕｓに関して明確な局在化の差異はなく、また蛍光シグナルは核中で均等に分布した（図１２Ｂ）。ｍＶｅｎｕｓタグ付けしたＢＲＤ９のブロモドメイン変異体対立遺伝子（Ｎ２１６Ｙ）を生起させ、更にブロモドメイン阻害剤を伴う知見を確認した（図１２Ｃ）。変異体ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ（図１１Ｂ）とは対照的に、変異体ＢＲＤ９−ｍＶｅｎｕｓは、クロマチンに結合することができないにも拘わらず、核内に拡散して位置した（図１２Ｄ）。これらの結果は、ここでも、タグ付けしたブロモドメインタンパク質の局在化に対する蛍光タンパク質の効果を実証した。ＺｓＧｒｅｅｎタンパク質は四量体を形成する能力を有していたのに対して、ｍＶｅｎｕｓは単量体タンパク質として存在していた。ＦＰタグがオリゴマー化する傾向を有した場合には、阻害剤によってクロマチンから遊離したタグ付けしたブロモドメインタンパク質は凝集することができ、蛍光ドット／フォーカスを形成した。タグがオリゴマーを形成することができなかった場合は（例えば、ｍＶｅｎｕｓ）、タグ付けしたブロモドメインタンパク質は、クロマチンに結合しなかったにもかかわらず、拡散した分布を維持した。殆どの細胞におけるクロマチンの分布は拡散し（図４）、顕微鏡は、結合した状態と結合していない状態の間で、ＢＲＤ９−ｍＶｅｎｕｓの拡散した局在化を区別するだけの解像度を有していなかったことに留意されたい。
【０１２５】
実施例５
ブロモドメイン含有タンパク質の他の領域の非存在下であり、レポーターモジュール（ここでは蛍光タンパク質タグ）を伴う、アッセイ方法を確立し且つ細胞内での阻害剤活性を測定するための、ブロモドメインモジュールの使用を検討した。
【０１２６】
方法
核局在化配列の３のコピー（ＤＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号１）を、ＣＥＣＲ２ブロモドメインをコードするＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ  ＮＰ＿１１３６０１．２のアミノ酸残基４２４〜５３８）であって、それにＺｓＧｒｅｅｎコード化配列が続く上記配列のＮ末端に融合させた。この融合発現構築物を、ヒトＥＦ１プロモーターの制御下でＴｅｔ−ＯＮ  ３Ｇ転写因子を発現するレンチウィルスベクター中にクローニングした。誘導性ＴＲＥ３Ｇプロモーターによって制御されるＮＬＳ−ＣＥＣＲ２．ＢＤ−ＺｓＧｒｅｅｎの発現をドキシサイクリンにより誘導した。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−９６）を感染させ、１５μｇ／ｍｌのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を顕微鏡分析用の６ウェルまたは９６ウェルプレートに播種した。細胞を２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで１６時間処理し、その後ＤＭＳＯまたはＣＥＣＲ２阻害剤のいずれかと共に４時間インキュベートした後、４％ホルムアルデヒドで固定化した。ニコン社倒立型蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００）またはＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて、ＮＬＳ−ＣＥＣＲ２．ＢＤ−ＺｓＧｒｅｅｎの核内における局在化を調べた。
【０１２７】
上記融合タンパク質のコード化配列を上述のレンチウィルスベクターから増幅し、ｐＥＴ系細菌発現ベクターに連結した。ＣＥＣＲ２を融合していない親ＺｓＧｒｅｅｎタンパク質を発現するベクターをＣｌｏｎｔｅｃｈ社より購入した。各ベクトルをＢＬ−２１  ｐＬｙｓＳ  ロゼッタ細胞（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に形質転換し、カルベニシリン上に播種することにより単一のコロニーを選択した。培養物をＬＢ培地中で増殖させ、ＩＰＴＧ（Ａ６００＝０．４−０．６）の添加によりタンパク質の発現を誘導した。２．５時間の発現後に細胞を採取し、−８０℃で一晩保存した。細胞を５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させ、超音波処理によって溶解させた。ライセートの遠心分離及び濾過により細胞デブリを除去し、その後サイズ排除カラム（ＳＥＣ−３０００、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）に適用した。インライン検出器（ＦＰ−２０２０プラス、日本分光社）を用いて緑色蛍光タンパク質を検知した。
【０１２８】
結果及び考察
誘導性ＮＬＳ−ＣＥＣＲ２．ＢＤ−ＺｓＧｒｅｅｎ（図１３Ａ）を安定的に有するＵ２ＯＳ細胞株を、レンチウィルスの感染及びブラストサイジン選択により生成させた。融合タンパク質は、ＣＥＣＲ２ブロモドメイン阻害剤の非存在下で、核内に拡散して局在化し、均一な分布を示した。ＣＥＣＲ２阻害剤（化合物ＢＤｉ−Ｅ）と共にインキュベートすることにより、ＺｓＧｒｅｅｎタグ付けしたタンパク質の蛍光ドット／フォーカスが形成された（図１３Ｂ）。このことは、ＣＥＣＲ２．ＢＤのクロマチンへの結合が上記阻害剤によって阻害され、核質に遊離されたことを示した。遊離のＮＬＳ−ＣＥＣＲ２．ＢＤ−ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質はその後凝集し、蛍光体ドット（フォーカス）を形成した。
【０１２９】
ＣＥＣＲ２を融合していないＺｓＧｒｅｅｎとの比較のために、ＮＬＳ−ＣＥＣＲ２．ＢＤ−ＺｓＧｒｅｅｎ融合体を大腸菌中で発現させた。細胞を溶解し、ライセートを、ＺｓＧｒｅｅｎタンパク質を可視化するための蛍光検知付きのゲル濾過（サイジングカラム）に供した。ＣＥＣＲ２融合タンパク質は、巨大タンパク質複合体（＞７００ｋＤ）を示唆する空隙容量画分で溶出した。予想されたように、ＣＥＣＲ２を融合していないＺｓＧｒｅｅｎタンパク質は四量体及び二量体を形成するが、空隙容量で溶出する種は形成しない（図１４）。これらの結果は、蛍光ドットが大きなタンパク質凝集体を含有するという我々のモデル（図７）と一致した。
【０１３０】
実施例６
細胞における阻害活性を判定するためのアッセイ方法を確立するために、タンデムブロモドメインモジュールをタグ（例えば、蛍光タンパク質タグ）と共に用いるという概念であって、但しブロモドメイン含有タンパク質の他の領域は必ずしも用いないとの上記概念を探索するために、以下の実験を行った。
【０１３１】
方法
核局在化配列の３のコピー（ＤＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号１）を、ＴＡＦ１（ＮＣＢＩ＿ＮＰ  ００４５９７．２のアミノ酸残基１４０６〜１６４０）の２のタンデムのブロモドメインのコード化ＤＮＡ配列であって、それにＺｓＧｒｅｅｎコード化配列が続く上記配列のＮ末端に融合させた。Ｑ５（登録商標）部位特異性変異誘発キット（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社)を用いて、１４８１及び１６０４の位置のアスパラギン残基がチロシンに変異したブロモドメイン変異体対立遺伝子を生成させた。野生型及び変異体融合発現構築物の両方を、ヒトＥＦ１プロモーターの制御下でＴｅｔ−ＯＮ  ３Ｇ転写因子を発現するレンチウィルスベクター中にクローニングした。誘導性ＴＲＥ３Ｇプロモーターによって制御されるＮＬＳ−ＴＡＦ１．ＢＤ−ＺｓＧｒｅｅｎの発現をドキシサイクリンにより誘導した。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−９６）を感染させ、１５μｇ／ｍｌのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を顕微鏡観察用の６ウェルまたは９６ウェルプレートに播種した。細胞を２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで１６時間処理し、その後ＤＭＳＯまたはＣＥＣＲ２阻害剤のいずれかと共に４時間インキュベートした後、４％ホルムアルデヒドで固定化した。加熱ステージを有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０倒立型共焦点顕微鏡またはＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡を用いて、核内の蛍光タンパク質の局在化を調べた。得られた画像をＺｅｉｓｓ  ＺＥＮソフトウェアを用いて解析した。
【０１３２】
結果及び考察
誘導性ＮＬＳ−ＴＡＦ１．ＢＤ１．ＢＤ２−ＺｓＧｒｅｅｎ（図１５Ａ）を安定して有するＵ２ＯＳ細胞株をドキシサイクリンと共にインキュベートし、蛍光タンパク質の発現を誘導し、その後ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＴＡＦ１ブロモドメイン阻害剤で４時間処理した。ビヒクル比較対照においては、ＺｓＧｒｅｅｎタグ付けしたＴＡＦ１ブロモドメインが核内に拡散して分布し、これは融合タンパク質がクロマチンに結合したことを示していた。一方、ＴＡＦ１ブロモドメイン阻害化合物（ＢＤｉ−Ｆ）の存在下では、タグ付けしたタンパク質が再局在化し、蛍光ドット／フォーカスを形成した（図１５Ｂ）。これらの結果は、ブロモドメイン阻害剤が、ＦＰタグ付けしたブロモドメインタンパク質のクロマチンへの結合を破壊し、ＦＰタグ付けしたブロモドメインタンパク質が、クロマチンから遊離した後に蛍光ドット／フォーカスを形成したことを示した。更に、ブロモドメインの結合能を消失させる点変異が、ＮＬＳ−ＴＡＦ１．ＢＤ１．ＢＤ２−ＺｓＧｒｅｅｎの両方のＴＡＦ１ブロモドメインに導入され（図１６Ａ）、得られたレンチウィルス構築物を用いて安定したＵ２ＯＳ細胞を作製した場合に、ブロモドメイン変異体タンパク質は、ブロモドメイン阻害化合物の非存在下であっても、蛍光ドット／フォーカスを形成した（図１６Ｂ）。従って、２のブロモドメインモジュールを含有するＦＰ融合タンパク質は、ブロモドメイン阻害化合物に応答して蛍光ドット／フォーカスを形成し、この型式の改質された細胞系を用いて、潜在的なブロモドメイン阻害化合物の細胞内活性を測定することができる。
【０１３３】
実施例７
この実施例における実験は、全長ブロモドメインのブロモドメインモジュールをキメラブロモドメインモジュールで置換することにより、別なブロモドメインについての蛍光の再局在化／ドット形成アッセイを開発するためのタンパク質を含有する、全長ブロモドメインの骨格を用いることの実現可能性を判定するために設計し実行した。
【０１３４】
方法
蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）を、ヒトＢＲＤ９をコードするＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ  ＮＰ＿０７６４１３．３）であって、当該ブロモドメインをコードするＤＮＡ配列（アミノ酸残基１１４〜２５３）が、ヒトＢＡＺ２Ｂのブロモドメイン配列（ＮＣＢＩ  ＮＰ＿０３８４７８．２、アミノ酸残基２０３９〜２１６６）またはヒトＰＣＡＦ／ＫＡＴ２Ｂ（ＮＣＢＩ  ＮＰ＿００３８７５．３、アミノ酸残基６９６〜８２０）によって置換された上記ＤＮＡ配列のインフレームの下流にクローニングした。キメラＢＡＺ２Ｂ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎまたはＰＣＡＦ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ融合配列を、ヒトＥＦ１プロモーターの制御下でＴｅｔ−ＯＮ  ３Ｇ転写因子を発現するレンチウィルスベクター中にクローニングした。誘導性ＴＲＥ３Ｇプロモーターの下流にあるＺｓＧｒｅｅｎタグ付けしたキメラタンパク質の発現を、ドキシサイクリンにより誘導することができた。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−９６）を感染させ、１５μｇ／ｍｌのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を共焦点顕微鏡観察用のＮｕｎｃ（商標）Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標）ＩＩチャンバースライドに播種した。細胞を２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで１６時間処理し、キメラ蛍光タンパク質の発現を誘導した。ＢＡＺ２Ｂ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎを発現する細胞を、ＤＭＳＯまたはＢＡＺ２Ｂ阻害剤のいずれかと共に４時間インキュベートし、その後画像化した。ＰＣＡＦ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎを発現する細胞を、ＤＭＳＯまたはＰＣＡＦ阻害剤のいずれかと共に１６時間インキュベートし、その後画像化した。加熱ステージを有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０倒立型共焦点顕微鏡またはＩｍｇａｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いてＺｓＧｒｅｅｎタグ付けしたキメラタンパク質の局在化を調べた。得られた画像をＺｅｉｓｓ  ＺＥＮソフトウェアを用いて解析した。
【０１３５】
結果及び考察
他のブロモドメインについてのアッセイシステムを確立するためにＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ再局在化アッセイ（実施例４に記載）を用いることの可能性を探索するために、ＢＲＤ９ブロモドメインがＢＡＺ２Ｂのブロモドメインで置換されたキメラＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ発現構築物（ＢＡＺ２Ｂ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎと呼ぶ）を生成させた。誘導性ＢＡＺ２Ｂ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ（図１７Ａ）を安定して有するＵ２ＯＳ細胞をドキシサイクリンと共にインキュベートして蛍光タンパク質の発現を誘導し、続いてビヒクル（ＤＭＳＯ）またはブロモドメイン阻害化合物で処理した。ブロモドメインの上流に位置するＢＲＤ９の核局在化配列が、ＺｓＧｒｅｅｎタグ付けしたキメラタンパク質を核に導いた。ビヒクルの比較対象においては、このキメラタンパク質の分布は核内に拡散した。一方、ＢＡＺ２Ｂブロモドメイン阻害化合物（ＢＤｉ−Ｇ）による処置はキメラタンパク質の局在化を変化させ、蛍光ドット／フォーカスを形成した（図１７Ｂ）。これらの結果は、ＢＡＺ２Ｂ阻害剤がＢＡＺ２Ｂ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎタンパク質とクロマチンとの間の相互作用を破壊し、続いて、ＺｓＧｒｅｅｎタグの凝集特性に起因して、蛍光ドット／フォーカスが形成されたことを示した。
【０１３６】
同様に、ＰＣＡＦブロモドメインに関して細胞アッセイを確立することができるか否かを判定するために、ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ骨格を用いてＰＣＡＦブロモドメインのキメラ構築物（図１８Ａ）を生成させ、ＰＣＡＦブロモドメイン阻害化合物を分析した。Ｕ２ＯＳ／ＰＣＡＦ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎ細胞をドキシサイクリンと共に一晩インキュベートして、ＺｓＧｒｅｅｎタグ付けしたキメラタンパク質の発現を誘導し、続いてビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＰＣＡＦ阻害化合物（ＢＤｉ−Ｈ）処理を行った。ＤＭＳＯの存在下では、ＰＣＡＦ−ＢＲＤ９−ＺｓＧｒｅｅｎタンパク質は核内に拡散して分布し、ＰＣＡＦブロモドメイン阻害剤によって、タンパク質が再局在化し、ドット／フォーカスが形成された（図１８Ｂ）。この結果は、ブロモドメインモジュールの結合活性を阻害するブロモドメイン阻害化合物の存在下では、ＺｓＧｒｅｅｎタグ付けしたブロモドメインタンパク質が再局在化し、ドット／フォーカスを形成したことと整合した。まとめると、この実施例の実験データは、置換された他のタンパク質由来のブロモドメインモジュールを含有する、ＦＰタグ付けした、ブロモドメインを含有するキメラタンパク質は、ブロモドメイン阻害化合物に応答し、蛍光ドット／フォーカスを形成することができることを実証した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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