(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【化１】
0006408687.tif 000036
（ただし、R1は、基における水素原子が任意にハロゲン、C1〜C4アルキル基、C1〜C4ハロアルキル基、アダマンチル基、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、置換または無置換のアセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、C1〜C4ハロアルコキシ基、シアノ基、置換または無置換のフェニル基、-SO2-NH2からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で置換された6〜12員のアリール基または5〜10員のヘテロアリール基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記の置換とは、基における一つまたは複数の水素原子がハロゲン、トリフルオロメチル基、ヒドロキシ基、アミノ基、C1〜C4アルキル基、C1〜C4アルコキシ基、アダマンチル基、シアノ基からなる群から選ばれる置換基で任意に置換されることである。
R2は、H、C1〜C4アルキル基からなる群から選ばれる基であるか、またはR2は存在しない。
R3は、H、C1〜C4アルキル基からなる群から選ばれる基であるか、またはR3は存在しない。
R4は、H、C1〜C4アルキル基、C1〜C4ハロアルキル基、ハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、アセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、シアノ基からなる群から選ばれる基である。
R5は、H、C1〜C4アルキル基、C3〜C7シクロアルキル基、C1〜C4アルキレン-C3〜C7シクロアルキル基、フェニル基、C1〜C4アルキレンフェニル基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記のフェニル基またはC1〜C4アルキレンフェニル基における水素原子がヒドロキシ基、ハロゲン、C1-C4アルキル基、C1-C4ハロアルキル基、C3-C7シクロアルキル基、C1-C4アルコキシ基、C1-C4ハロアルコキシ基からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で任意に置換されてもよく、ここで、R5がフェニル基を含む基である場合、前記フェニル基における隣接する2つの炭素の水素原子は任意に「-O-(CH2)n-O-」基で置換されてもよく、ここで、n=1、2または3である。
n2は、１である。
n3は、0、1、または2である。
Xは、O、NR8からなる群から選ばれ、ここで、R8は、H、C1〜C4アルキル基、C1〜C4ハロアルキル基、C3〜C7シクロアルキル基、フェニル基、C1-C4アルキレンフェニル基からなる群から選ばれる。
破線は、化学結合であるか、または存在しない。）
【請求項２】
R1は、基における水素原子がハロゲン、トリフルオロメチル基、C1〜C4アルキル基、アダマンチル基、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、置換または無置換のアセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、シアノ基、置換または無置換のフェニル基、-SO2-NH2からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で任意に置換された6〜12員のアリール基または5〜10員のヘテロアリール基からなる群から選ばれる基で、
R2は、H、メチル基からなる群から選ばれる基であるか、またはR2は存在せず、
R3は、Hからなる群から選ばれる基であるか、またはR3は存在せず、
R4は、Ｈまたはメチル基で、
R5は、C1〜C4アルキル基、C3〜C7シクロアルキル基、C1〜C4アルキレン-C3〜C7シクロアルキル基およびベンジル基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記のベンジル基における水素原子が任意にヒドロキシ基、ハロゲン、C1-C4アルキル基、C1-C4ハロアルキル基、C1-C4アルコキシ基、C1-C4ハロアルコキシ基、およびC2-C4アルキレン基からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で置換されてもよく、ここで、ベンジル基のフェニル基における隣接する2つの炭素の水素原子は任意に「-O-(CH2)n-O-」基で置換されてもよく、ここで、n=1、2または3で、
n2、n3は、1で、かつ/または
Xは、OまたはNR8で、ここで、前記のR8は、Hまたはメチル基である、
ことを特徴とする請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
R1は、フェニル基、ベンゾチアゾリル基からなる群から選ばれるアリール基またはヘテロアリール基で、ここで、前記アリール基またはヘテロアリール基における一つまたは複数の水素原子がハロゲン、トリフルオロメチル基、C1〜C4アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、置換または無置換のアセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、シアノ基、置換または無置換のフェニル基、-SO2-NH2からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で任意に置換されてもよく、かつ/または、
Xは、NR8で、ここで、前記のR8は、Hまたはメチル基である、
ことを特徴とする請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
R5は、ベンジル基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記のベンジル基における水素原子が任意にヒドロキシ基、ハロゲン、C1-C4アルキル基、C1-C4フルオロアルキル基、C1-C4フルオロアルコキシ基、およびC2-C4アルキレン基からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で置換されてもよく、ここで、ベンジル基のフェニル基における隣接する2つの炭素の水素原子は「-O-(CH2)n-O-」基で置換されてもよく、ここで、n=1、2または3であることを特徴とする請求項1に記載の化合物。
【請求項５】
以下の群から選ばれる化合物。
【化２】
0006408687.tif 000037
【化３】
0006408687.tif 000038
【請求項６】
以下の式Iaで表される化合物。
【化４】
0006408687.tif 000039
(ただし、R3、R4、R5、X、n2およびn3基の定義は請求項1に記載の通りであり、n1=1である。）
【請求項７】
請求項6に記載の式Ia化合物の製造方法であって、
【化５】
0006408687.tif 000040
（ここで、各基の定義は請求項6の通りである。）
不活性溶媒において、式Ia1化合物を式Ia2化合物と反応させ、式Ia化合物を得る工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項1に記載の式I化合物の製造方法であって、
不活性溶媒において、式Iaで表される化合物を式Ibで表される化合物のいずれかと反応させ、式I'化合物を得る工程と、
【化６】
0006408687.tif 000041
（b1） 任意に、不活性溶媒において、式I'で表される化合物を脱水素反応させ、式I''化合物を得る工程と、
【化７】
0006408687.tif 000042
（b2） 任意に、不活性溶媒において、式I'で表される化合物をR2Iと脱離反応させ、式I'''化合物を得る工程と、
【化８】
0006408687.tif 000043
（ここで、各基の定義は請求項1の通りであり、n1=1である。）
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
式I'、I''またはI'''の化合物におけるXがOであり、前記の方法は、さらに、
(i) R5がHではない場合、不活性溶媒において、式Ic化合物を加水分解反応させ、式Id化合物を得る工程と、
【化９】
0006408687.tif 000044
(ii) 不活性溶媒において、式Id化合物をR5-NH2と反応させ、式Ie化合物を得る工程と、
【化１０】
0006408687.tif 000045
（ここで、各基の定義は請求項1の通りであり、n1=1である。）
を任意に含むことを特徴とする請求項8に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１または５に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含有することを特徴とする薬物組成物。
【請求項１１】
（a） AMPK作動薬の製造、
（b） AMPKおよび/またはACCリン酸化促進剤の製造、
（c） 体外での非治療的なAMPK活性の活性化、
（d） 体外での非治療的なAMPKおよび/またはACCリン酸化の促進、
（e） AMPK活性に関連する疾患を治療する薬物組成物の製造、
に使用されることを特徴とする請求項1または５に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
活性化有効量の請求項１または５に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含むことを特徴とするAMPK活性作動薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物化学の分野に属し、1種類のピラゾロン化合物およびその使用、ならびにこのような化合物を含む薬物組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、生体の膵島機能の衰退、インスリン抵抗性などの要素による一連の代謝障害症候群で、遺伝要素、免疫機能障害、精神要素などの多くの発病要素のいずれも糖尿病につながることがある。世界保健機関の統計によると、2011年までは約3.46億人が糖尿病を罹患した。2004年では、約340万人が高血糖で死亡し、80％超の糖尿病による死亡は低所得・中等所得の国で発生した。
【０００３】
現在、2型糖尿病の治療に使用される薬物はすでに多く存在し、中にはメトホルミン、スルホニルウレア系、DPP-4阻害薬、PPARγ作動薬、α-グルコシダーゼ阻害薬、インスリンおよびGLP-1類似物などが含まれる。しかし、既存の薬物は、治療効果が顕著ではない、作用時間が短いといった問題があり、かつ一部の薬物は低血糖、体重増加、水腫、骨折、乳酸中毒や胃腸不調のような副作用もある。
【０００４】
アデノシン一リン酸活性化プロテイン キナーゼ（AMPK）は、体内の糖・脂質代謝において主要な作用を果たし、細胞内のエネルギー状態の変化を反映するエネルギー指標および代謝の主要なスイッチで、その活性化は2型糖尿病患者の糖・脂質代謝障害を顕著に改善し、体内のインスリン感度を上げることができ、2型糖尿病の治療の新しい標的と確認された。研究では、現在見出された多くの2型糖尿病を治療する薬物または天然産物は体内で間接的にAMPKを活性化させることが可能で、その治療効果の一部はAMPKの活性化によるものであるが、これらの間接作動薬は胃腸不調、体重増加などの副作用が存在する。そのため、AMPK小分子作動薬、特に直接AMPKに作用する小分子作動薬の探求・発見は、2型糖尿病の治療を求める有効なアプローチの一つである。
このように、本分野では、副作用の少ない新規なAMPK作動薬の開発が切望されている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、副作用の少ない新規なAMPK作動薬を提供することである。
本発明の第一では、式Iで表される化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化１】
0006408687.tif 000002
【０００６】
（ただし、R1は、H、C1〜C4アルキル基、基における水素原子が任意にハロゲン、C1〜C4アルキル基、C1〜C4ハロアルキル基、アダマンチル基、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、置換または無置換のアセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、C1〜C4ハロアルコキシ基、シアノ基、置換または無置換のフェニル基、-SO2-NH2からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で置換された6〜12員のアリール基または5〜10員のヘテロアリール基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記の置換とは、基における一つまたは複数の水素原子がハロゲン、トリフルオロメチル基、ヒドロキシ基、アミノ基、C1〜C4アルキル基、C1〜C4アルコキシ基、アダマンチル基、シアノ基からなる群から選ばれる置換基で任意に置換されることである。
【０００７】
R2は、H、C1〜C4アルキル基からなる群から選ばれる基であるか、またはR2は存在しない。
R3は、H、C1〜C4アルキル基からなる群から選ばれる基であるか、またはR3は存在しない。
R4は、H、C1〜C4アルキル基、C1〜C4ハロアルキル基、ハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、アセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、シアノ基からなる群から選ばれる基である。
【０００８】
R5は、H、C1〜C4アルキル基、C3〜C7シクロアルキル基、C1〜C4アルキレン-C3〜C7シクロアルキル基、フェニル基、C1〜C4アルキレンフェニル基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記のフェニル基またはC1〜C4アルキレンフェニル基における水素原子がヒドロキシ基、ハロゲン、C1-C4アルキル基、C1-C4ハロアルキル基、C3-C7シクロアルキル基、C1-C4アルコキシ基、C1-C4ハロアルコキシ基からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で任意に置換されてもよく、ここで、R5がフェニル基を含む基である場合、前記フェニル基における隣接する2つの炭素の水素原子は任意に「-O-(CH2)n-O-」基で置換されてもよく、ここで、n=1、2または3である。
n1は、0、1、または2である。
n2は、0、1、2、または3である。
n3は、0、1、または2である。
Xは、O、NR8からなる群から選ばれ、ここで、R8は、H、C1〜C4アルキル基、C1〜C4ハロアルキル基、C3〜C7シクロアルキル基、フェニル基、C1-C4アルキレンフェニル基からなる群から選ばれる。
破線は、化学結合であるか、または存在しない。）
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記のC1〜C4ハロアルキル基は、C1〜C4フッ素化基を含み、好ましくはトリフルオロメチル基である。
もう一つの好適な例において、R1は、ハロゲン、トリフルオロメチル基から選ばれる1〜5個の置換基で置換されたフェニル基である。
もう一つの好適な例において、前記の6〜12員のアリール基は、フェニル基またはナフチル基である。
もう一つの好適な例において、前記のC1〜C4アルキレンフェニル基は、ベンジル基、-C(シクロプロピル)-フェニル基を含む。
【００１０】
もう一つの好適な例において、R1は、基における水素原子がハロゲン、トリフルオロメチル基、C1〜C4アルキル基、アダマンチル基、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、置換または無置換のアセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、シアノ基、置換または無置換のフェニル基、-SO2-NH2からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で任意に置換された6〜12員のアリール基または5〜10員のヘテロアリール基からなる群から選ばれる基で、
R2は、H、メチル基からなる群から選ばれる基であるか、またはR2は存在せず、
R3は、Hからなる群から選ばれる基であるか、またはR3は存在せず、
R4は、Ｈまたはメチル基で、
R5は、C1〜C4アルキル基、C3〜C7シクロアルキル基またはベンジル基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記のベンジル基における水素原子が任意にヒドロキシ基、ハロゲン、C1-C4アルキル基、C1-C4ハロアルキル基、C1-C4アルコキシ基、C1-C4ハロアルコキシ基、およびC2-C4アルキレン基からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で置換されてもよく、ここで、ベンジル基のフェニル基における隣接する2つの炭素の水素原子は任意に「-O-(CH2)n-O-」基で置換されてもよく、ここで、n=1、2または3で、
n1、n2、n3は、1で、かつ/または
Xは、OまたはNR8で、ここで、前記のR8は、Hまたはメチル基である。
【００１１】
もう一つの好適な例において、R1は、フェニル基、ベンゾチアゾリル基からなる群から選ばれるアリール基またはヘテロアリール基で、ここで、前記アリール基またはヘテロアリール基における一つまたは複数の水素原子がハロゲン、トリフルオロメチル基、C1〜C4アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、置換または無置換のアセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、シアノ基、置換または無置換のフェニル基、-SO2-NH2からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で任意に置換されてもよく、かつ/または、
Xは、NR8で、ここで、前記のR8は、Hまたはメチル基である。
【００１２】
もう一つの好適な例において、R5は、ベンジル基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記のベンジル基における任意の水素原子が任意にヒドロキシ基、ハロゲン、C1-C4アルキル基、C1-C4フルオロアルキル基、C1-C4フルオロアルコキシ基、およびC2-C4アルキレン基からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で置換されてもよく、ここで、ベンジル基のフェニル基における隣接する2つの炭素の水素原子は「-O-(CH2)n-O-」基で置換されてもよく、ここで、n=1、2または3である。
もう一つの好適な例において、前記のC1〜C4アルキル基は、重水素化メチル基である。
もう一つの好適な例において、前記の化合物は、
【００１３】
【化２】
0006408687.tif 000003
【００１４】
【化３】
0006408687.tif 000004
からなる群から選ばれる。
【００１５】
本発明の第二では、以下の式Iaで表される化合物を提供する。
【化４】
0006408687.tif 000005
(ただし、R3、R4、R5、X、n1、n2およびn3基の定義は前記の通りである。）
【００１６】
本発明の第三では、本発明の第二に記載の式Ia化合物の製造方法であって、
【化５】
0006408687.tif 000006
（ただし、各基の定義は、本発明の第二に記載の通りである。）
【００１７】
不活性溶媒において、式Ia1化合物を式Ia2化合物と反応させ、式Ia化合物を得る工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、式では、-X-R5は-OCH3である。
もう一つの好適な例において、前記の反応は塩基の存在下で行われ、好ましくは、前記の塩基は、K2CO3、Na2CO3、Cs2CO3、NaH、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００１８】
本発明の第四では、本発明の第一に記載の式I化合物の製造方法であって、
不活性溶媒において、式Iaで表される化合物を式Ibで表される化合物のいずれかと反応させ、式I'化合物を得る工程と、
【化６】
0006408687.tif 000007
【００１９】
（b1） 任意に、不活性溶媒において、式I'で表される化合物を脱水素反応させ、式I''化合物を得る工程と、
【化７】
0006408687.tif 000008
【００２０】
（b2） 任意に、不活性溶媒において、式I'で表される化合物をR2Iと脱離反応させ、式I'''化合物を得る工程と、
【化８】
0006408687.tif 000009
（ただし、各基の定義は、本発明の第一に記載の通りである。）
を含む方法を提供する。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記式Ia化合物は、本発明の第三に記載の方法で製造されるものである。
もう一つの好適な例において、前記の工程（2）および工程（3）では、R3はHである。
もう一つの好適な例において、前記工程（1）は、塩基の存在下で行われ、好ましくはEt3Nおよび/またはEtONaのの存在下で行われ、より好ましくはEtONaは新製されたEtONaである。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記工程（2）では、前記の脱水素反応はパラジウム/炭素、2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノンからなる群から選ばれる試薬の存在下で、好ましくは10％パラジウム/炭素の存在下で行われる。
もう一つの好適な例において、前記工程（3）では、前記の反応は塩基の存在下で行われ、好ましくは、前記の塩基は、LDA、K2CO3、NaOH、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００２３】
もう一つの好適な例において、式I'、I''またはI'''の化合物におけるXがOであり、前記の方法は、さらに、
(i) R5がHではない場合、不活性溶媒において、式Ic化合物を加水分解反応させ、式Id化合物を得る工程と、
【化９】
0006408687.tif 000010
【００２４】
(ii) 不活性溶媒において、式Id化合物をR5-NH2と反応させ、式Ie化合物を得る工程と、
【化１０】
0006408687.tif 000011
（ここで、各基の定義は請求項1の通りである。）
を含む。
【００２５】
もう一つの好適な例において、式Icおよび式Ieでは、R5は同じでも異なってもよい。
もう一つの好適な例において、前記の工程（i）はアルカリ金属水酸化物の存在下で行われ、好ましくは、前記のアルカリ金属水酸化物は、LiOH、NaOH、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の工程（ii）は縮合剤の存在下で行われ、好ましくは、前記の縮合剤は、EDCI（1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩）、ピリジン/EDC/HOBT、DCC、DCC/HOBt、DCC/DMAP、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００２６】
本発明の第五では、式I化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含有する薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、治療有効量または安全有効量の式I化合物またはその薬学的に許容される塩を含有する。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、0.0001〜99wt％の式I化合物またはその薬学的に允許許容される塩と、残量の薬学的に許容される担体とを含有する。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、AMPK活性に関連する疾患の治療に使用される。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、糖・脂質代謝障害疾患の治療に使用され、好ましくは、糖尿病、肥満からなる群から選ばれる疾患の治療に使用される。
【００２７】
本発明の第六では、本発明の第一に記載の化合物の使用であって、
（a） AMPK作動薬の製造、
（b） AMPKおよび/またはACCリン酸化促進剤の製造、
（c） 体外での非治療的なAMPK活性の活性化、
（d） 体外での非治療的なAMPKおよび/またはACCリン酸化の促進、
（e） AMPK活性に関連する疾患を治療する薬物組成物の製造、
における使用を提供する。
【００２８】
もう一つの好適な例において、体外での非治療的なAMPK活性の活性化に使用される場合、前記の活性化は投与量に依存する活性化である。
もう一つの好適な例において、体外での非治療的なAMPK活性の活性化に使用される場合、前記の活性化は濃度に依存する活性化である。
もう一つの好適な例において、体外での非治療的なAMPK活性の活性化に使用される場合、前記の活性化は分子レベルの活性化または細胞レベルの活性化である。
【００２９】
本発明の第七では、活性化有効量の式I化合物またはその薬学的に許容される塩を含むAMPK活性作動薬を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の作動薬は、分子AMPK作動薬である。
もう一つの好適な例において、前記の作動薬は、細胞内AMPK作動薬である。
【００３０】
本発明の第八では、AMPKを活性化する方法であって、必要な対象に安全有効量の式I化合物またはその薬学的に許容される塩を施用する方法を提供する。
本発明の第九では、AMPK活性に関連する疾患を治療する方法であって、必要な対象に式I化合物またはその薬学的に許容される塩を施用する方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の対象は、哺乳動物（例えばヒト）を含む。
【００３１】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図1は、各化合物の分子レベルにおける異なる濃度のAMPK（α2β1γ1）活性化の実験結果である。
【図２ＡＢ】図2A、Bは、L6筋管細胞において小分子化合物のAMPKおよびACCリン酸化に対する刺激を検出し、AMPKを顕著に活性化できた化合物を選んでそのブドウ糖吸収に対する促進作用およびAMPKに対する依存性を検出したものである。
【図３】図3は、HepG2細胞におけるZM-1の異なる濃度と異なる処理時間でのAMPKとACに対するリン酸化刺激である。
【図４】図4は、ZM-1のSDラットの初代肝臓細胞におけるAMPKおよびACCリン酸化に対する刺激である。
【００３３】
具体的な実施形態
本発明者は、長期間にわたって深く研究したところ、直接AMPKを活性化する活性を有し、肥満や糖尿病などを治療する薬物の製造に有用なピラゾロン化合物の製造に成功した。上記の知見に基づき、発明者らは本発明を完成させた。
【００３４】
用語
本発明において、前記のアルキル基は、直鎖または分岐鎖のアルキル基を含み、前記のアルケニル基は、直鎖または分岐鎖のアルケニル基を含み、前記のアルキニル基は、直鎖または分岐鎖のアルキニル基を含み，前記のハロゲンは、F、Cl、BrまたはIで、好ましくはFまたはBrである。
【００３５】
特別に説明しない限り、本発明において、用語「置換」とは、基における一つまたは複数の水素原子がC1〜C4アルキル基、C3〜C7シクロアルキル基、C1〜C4アルコキシ基、ハロゲン、ヒドロキシ基、カルボキシ基（-COOH）、C1〜C4アルデヒド基、C2〜C4アシル基、C2〜C４エステル基、アミノ基、フェニル基からなる群から選ばれる置換基で置換されることで、前記のフェニル基は、無置換のフェニル基または1〜3個の置換基を有する置換フェニル基を含み、前記置換基はハロゲン、C1〜C4アルキル基、シアノ基、OH、ニトロ基、C3〜C7シクロアルキル基、C1〜C4アルコキシ基、アミノ基から選ばれる。
【００３６】
特に、ここでは、特別に説明しない限り、記載された原子は、その全部の同位体の形態を含み、たとえば、「水素原子」と記載された場合、水素原子、重水素原子、三重水素原子またはこれらの組み合わせを指す。本発明において、ある元素の各同位体原子の存在比は当該元素の自然界における天然に存在する状態でもよく、ある同位体が豊富に集まった状態でもよい。
【００３７】
用語「C1〜C4アルキル基」とは、炭素原子を1〜4個有する直鎖または分岐鎖のアルキル基で、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基や類似の基が挙げられる。
用語「C3〜C7シクロアルキル基」とは、炭素原子を3〜7個有するシクロアルキル基で、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘプチル基や類似の基が挙げられる。
【００３８】
用語「5〜10員のアリール基」とは、炭素原子を5〜10個有するアリール基で、例えばフェニル基、ナフチル基や類似の基が挙げられる。
用語「5〜10員のヘテロアリール基」とは、炭素原子またはヘテロ原子（N、O、Sから選ばれる）を5〜10個有するヘテロアリール基で、例えばピロリル基、ピリジル基、フリル基や類似の基が挙げられる。
【００３９】
用語「C1〜C4アルコキシ基」とは、炭素原子を1〜4個有する直鎖又は分岐鎖のアルコキシ基で、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基や類似の基が挙げられる。
用語「C1〜C4アシル基」とは、「-CO-アルキル基」構造、好ましくは「-CO-C1〜C4アルキル基」構造を有するもので、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、イソプロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、sec-ブチリル基、tert-ブチリル基や類似の基が挙げられる。
【００４０】
用語「C1〜C4エステル基」とは、アルキル-COO-構造、好ましくはC1〜C4アルキル-COO-構造を有する基で、例えばCH3COO-、C2H5COO-、C3H8COO-、：(CH3)2CHCOO-、n-C4H9COO-、t-C4H9COO-や類似の基が挙げられる。
用語「C2〜C10のエステル基」とは、炭素原子を2〜10個有する、「-COO-C1〜C9アルキル基」のような構造の基で、例えばCH3COO-、C2H5COO-、C3H8COO-、(CH3)2CHCOO-、n-C4H9COO-、t-C4H9COO-や類似の基が挙げられる。
用語「ハロゲン」とは、F、Cl、BrおよびIである。
【００４１】
ここで、各化合物の略称は、以下の表に示す。
【表Ａ】
0006408687.tif 000012
【００４２】
式I化合物
本発明は、以下の一般式Iで表される化合物を提供する。
【化１１】
0006408687.tif 000013
（ただし、R1は、H、C1〜C4アルキル基、基における水素原子が任意にハロゲン、C1〜C4アルキル基、C1〜C4ハロアルキル基、アダマンチル基、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、置換または無置換のアセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、C1〜C4ハロアルコキシ基、シアノ基、置換または無置換のフェニル基、-SO2-NH2からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で置換された6〜12員のアリール基または5〜10員のヘテロアリール基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記の置換とは、基における一つまたは複数の水素原子がハロゲン、トリフルオロメチル基、ヒドロキシ基、アミノ基、C1〜C4アルキル基、C1〜C4アルコキシ基、アダマンチル基、シアノ基からなる群から選ばれる置換基で任意に置換されることである。
【００４３】
R2は、H、C1〜C4アルキル基からなる群から選ばれる基であるか、またはR2は存在しない。
R3は、H、C1〜C4アルキル基からなる群から選ばれる基であるか、またはR3は存在しない。
R4は、H、C1〜C4アルキル基、C1〜C4ハロアルキル基、ハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、アセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、シアノ基からなる群から選ばれる基である。
【００４４】
R5は、H、C1〜C4アルキル基、C3〜C7シクロアルキル基、フェニル基、C1〜C4アルキレンフェニル基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記のフェニル基またはC1〜C4アルキレンフェニル基における水素原子がヒドロキシ基、ハロゲン、C1-C4アルキル基、C1-C4ハロアルキル基、C3-C7シクロアルキル基、C1-C4アルコキシ基、C1-C4ハロアルコキシ基からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で置換されてもよく、ここで、R5がフェニル基を含む基である場合、前記フェニル基が隣接する2つの炭素における水素原子は任意に「-O-(CH2)n-O-」基で置換されてもよく、ここで、n=1、2または3である。
n1は、0、1、または2である。
n2は、0、1、2、または3である。
n3は、0、1、または2である。
【００４５】
Xは、O、NR8からなる群から選ばれ、ここで、R8は、H、C1〜C4アルキル基、C1〜C4ハロアルキル基、C3〜C7シクロアルキル基、フェニル基、C1-C4アルキレンフェニル基からなる群から選ばれる。
破線は、化学結合であるか、または存在しない。）
もう一つの好適な例において、前記のC1〜C4ハロアルキル基は、C1〜C4フッ素化基を含み、好ましくはトリフルオロメチル基である。
もう一つの好適な例において、R1は、ハロゲン、トリフルオロメチル基から選ばれる1〜5個の置換基で置換されたフェニル基である。
もう一つの好適な例において、前記の6〜12員のアリール基は、フェニル基またはナフチル基である。
【００４６】
もう一つの好適な例において、前記のC1〜C4アルキレンフェニル基は、ベンジル基、-C(シクロプロピル)-フェニル基を含む。もう一つの好適な例において、R1は、基における水素原子がハロゲン、トリフルオロメチル基、C1〜C4アルキル基、アダマンチル基、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、置換または無置換のアセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、シアノ基、置換または無置換のフェニル基、-SO2-NH2からなる群から選ばれる置換基で置換された6〜12員のアリール基または5〜10員のヘテロアリール基からなる群から選ばれる基で、
R2は、H、メチル基からなる群から選ばれる基であるか、またはR2は存在せず、
R3は、Hからなる群から選ばれる基であるか、またはR3は存在せず、
R4は、Ｈまたはメチル基で、
R5は、C1〜C4アルキル基、C3〜C7シクロアルキル基またはベンジル基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記のベンジル基における任意の水素原子が任意にヒドロキシ基、ハロゲン、C1-C4アルキル基、C1-C4ハロアルキル基、C1-C4ハロアルコキシ基、またはC2-C4アルキレン基からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で置換されてもよく、ここで、ベンジル基のフェニル基における隣接する2つの炭素における水素原子は「-O-(CH2)n-O-」基で置換されてもよく、ここで、n=1、2または3で、
n1、n2、n3は、1で、
Xは、OまたはNR8で、ここで、前記のR8は、Hまたはメチル基で、
破線は、化学結合であるか、または存在しない。
【００４７】
もう一つの好適な例において、R1は、フェニル基、ベンゾチアゾリル基からなる群から選ばれるアリール基またはヘテロアリール基で、ここで、前記アリール基またはヘテロアリール基における一つまたは複数の水素原子がハロゲン、トリフルオロメチル基、C1〜C4アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、置換または無置換のアセチルオキシ基(AcO)、カルボキシ基、C1〜C4アルコキシ基、シアノ基、置換または無置換のフェニル基、-SO2-NH2からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で置換されてもよく、かつ/または、
Xは、NR8で、ここで、前記のR8は、Hまたはメチル基である。
【００４８】
中でも、好適な活性が良い化合物において、R5は、ベンジル基からなる群から選ばれる基で、ここで、前記のベンジル基における任意の水素原子が任意にヒドロキシ基、ハロゲン、C1-C4アルキル基、C1-C4ハロアルキル基、C1-C4ハロアルコキシ基、またはC2-C4アルキレン基からなる群から選ばれる一つまたは複数の置換基で置換されてもよく、ここで、ベンジル基のフェニル基における隣接する2つの炭素における水素原子は「-O-(CH2)n-O-」基で置換されてもよく、ここで、n=1、2または3である。
【００４９】
もう一つの好適な例において、前記の化合物は、
【化１２】
0006408687.tif 000014
【００５０】
【化１３】
0006408687.tif 000015
からなる群から選ばれる。
【００５１】
式I化合物の製造
また、本発明は、式I化合物の製造方法であって、
不活性溶媒において、式Iaで表される化合物を用いて式Ibで表される化合物のいずれかと反応させ、式I'化合物を得る工程と、
【化１４】
0006408687.tif 000016
【００５２】
（b1） 任意に、不活性溶媒において、式I'で表される化合物を用いて脱水素反応させ、式I''化合物を得る工程と、
【化１５】
0006408687.tif 000017
（b2） 任意に、不活性溶媒において、式I'で表される化合物を用いてR2Iと脱離反応させ、式I'''化合物を得る工程と、
【化１６】
0006408687.tif 000018
（ただし、各基の定義は前記の通りである。）
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００５３】
もう一つの好適な例において、前記の工程（2）および工程（3）では、R3はHである。
もう一つの好適な例において、前記工程（1）は、塩基の存在下で行われ、好ましくはEt3Nおよび/またｈEtONaのの存在下で行われ、より好ましくはEtONaは新製されたEtONaである。
もう一つの好適な例において、前記工程（2）では、前記の脱水素反応はパラジウム/炭素、2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノンからなる群から選ばれる試薬の存在下で、好ましくは10％パラジウム/炭素の存在下で行われる。
もう一つの好適な例において、前記工程（3）では、前記の反応は塩基の存在下で行われ、好ましくは、前記の塩基は、LDA、K2CO3、NaOH、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００５４】
式I'、I''またはI'''化合物では、XがOである場合、前記の方法は、さらに、
【化１７】
0006408687.tif 000019
【００５５】
(i) 不活性溶媒において、式Ic化合物を用いて加水分解反応させ、式Id化合物を得る工程と、
【化１８】
0006408687.tif 000020
(ii) 不活性溶媒において、式Id化合物を用いてR5-NH2と反応させ、式Ie化合物を得る工程と、
（ただし、各基の定義は前記の通りである。式Icおよび式Ieでは、R5は同じでも異なってもよい。）
を含む。
【００５６】
もう一つの好適な例において、前記の工程（i）はアルカリ金属水酸化物の存在下で行われ、好ましくは、前記のアルカリ金属水酸化物は、LiOH、NaOH、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の工程（ii）は縮合剤の存在下で行われ、好ましくは、前記の縮合剤は、EDCI（1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩）、ピリジン/EDC/HOBT、DCC、DCC/HOBt、DCC/DMAP、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００５７】
各反応原料は、本分野で既知の方法によって製造してもよく、あるいは市販品として入手してもよい。一つの好適な例において、前記式Ia化合物は、以下の方法によって製造される。
【化１９】
0006408687.tif 000021
不活性溶媒において、式Ia1化合物を用いて式Ia2化合物と反応させ、式Ia化合物を得る。
もう一つの好適な例において、前記の反応は塩基の存在下で行われ、好ましくは、前記の塩基は、K2CO3、Na2CO3、Cs2CO3、NaH、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００５８】
一つの好適な式I化合物の製造方法は、以下の工程を含む。
【化２０】
0006408687.tif 000022
【００５９】
具体的に、置換の3-エトキシカルボニル-4-ピペリドン塩酸塩A1を置換のベンジルブロミド（A2）と塩基である炭酸カリウムの存在下で縮合させ、中間体A3を得る。置換のアリールヒドラジンまたはその塩酸塩（A4）をピペリドン中間体A3と反応させてピラゾロン化合物A5を得る。R3がHである場合、化合物A5を10％ Pd/Cで脱水素させ、二重結合化合物A6を得る。R3がHである場合、化合物A5に塩基であるLDAおよび相応のヨウ化アルキルを加え、化合物A7を得る。化合物A6、A7は加水分解を経て相応の酸に転化し、当該酸は縮合剤、たとえばEDCI（1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩）の存在下で相応のアミンと作用させて一般式Iで表される化合物を得る。
上記各反応式において、各基の定義は前記の通りである。
【００６０】
式I化合物の使用
また、本発明は、前記の式I化合物の使用を提供する。
本発明の一つの好適な例において、前記式I化合物はAMPK作動薬の製造に使用され、前記のAMPK活性作動薬は活性化有効量の式I化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。前記の作動薬は、分子AMPK作動薬でも細胞内AMPK作動薬でもよい。
本発明の一つの好適な例において、前記式I化合物はAMPKおよび/またはACCリン酸化促進剤の製造に使用される。
【００６１】
本発明のもう一つの好適な例において、前記式I化合物は体外での非治療的なAMPK活性の活性化に使用される。体外での非治療的なAMPK活性の活性化に使用される場合、前記の活性化は投与量に依存する活性化または濃度に依存する活性化である。もう一つの好適な例において、体外での非治療的なAMPK活性の活性化に使用される場合、前記の活性化は分子レベルの活性化または細胞レベルの活性化である。
本発明のもう一つの好適な例において、前記式I化合物は体外での非治療的なAMPKおよび/またはACCリン酸化の促進に使用される。
【００６２】
本発明のもう一つの好適な例において、前記式I化合物は、AMPK活性に関連する疾患を治療する薬物組成物の製造に使用される。もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、糖・脂質代謝障害疾患の治療に使用され、好ましくは、糖尿病、肥満からなる群から選ばれる疾患の治療に使用される。
【００６３】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、通常の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われた。特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。
【００６４】
化合物の製造実施例
下記製造実施において、NMRはVarian製のMercury-Vx 300M装置によって測定され、NMR基準物質はδ H 7.26 ppm(CDCl3)で、質量分析はAgilent 1200 Quadrupole LC/MS装置が使用され、試薬は主に上海化学試薬公司によって提供され、TLC薄層クロマトグラフィーのシリカゲル板は山東煙台会友シリカゲル開発有限公司製の型番HSGF 254で、化合物の精製に使用された順相カラムクロマトグラフィーのシリカゲルは山東青島海洋化社工場分工場製の型番zcx-11、200-300メッシュである。
【００６５】
製造実施例1 メチル4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-オキシ-3a,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(3H)-イル)メチル)安息香酸
エチル 1-(4-(メトキシカルボニル)ベンジル)-4-ピペリドン-3-カルボン酸
【化２１】
0006408687.tif 000023
97mgの3-エトキシホルミル-4-ピペリドン塩酸塩(0.467mmol)および96.3mgの4-ブロモメチル安息香酸メチル(0.420mmol)を反応瓶に入れ、アセトニトリルで溶解させ、64.4mgのK2CO3(0.467mmol)を入れ、室温で一晩反応させ、翌日TLCモニタリングでは完全に反応したと示された。減圧でアセトニトリルを回転で除去し、水に溶解させた後、酢酸エチルで3回抽出し、有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、減圧で溶媒を回転で除去し、カラムクロマトグラフィーによって分離し、PE:EA=5:1で、化合物B10を得、白色固体119mgで、収率89％であった。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.01 (dd, J = 8.4, 1.8 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.20 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.68 (s, 2H), 3.19 (s, 1H), 2.60 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.26 ppm (td, J = 7.2, 1.8 Hz, 3H).
【００６６】
メチル4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-オキシ-3a,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(3H)-イル)メチル)安息香酸
【化２２】
0006408687.tif 000024
化合物B10(10.9g, 34mmol)および3-トリフルオロメチル-4-フルオロフェニルヒドラジン塩酸塩(8.21g, 35.7mmol)を180mLのメタノールに溶解させ、トリエチルアミン(5mL, 35.7mmol)を入れ、60℃に加熱し、1h反応させ、TLCモニタリングでは原料B10が完全に反応したと示された。加熱を止め、室温に冷却し、新しく調製したナトリウムメトキシドのメタノール溶液(68mmol，60mL)を入れ、室温で一晩撹拌した。翌日、反応液をゆっくり700mLの5％のクエン酸溶液に注ぎ、固体が析出し、ろ過し、固体を水で3回洗浄し、固体を集めてCaCl2で真空乾燥し、化合物ZM-3を得、褐色固体13.5gであった。（有色不純物があり、メタノール/水系で再結晶させて白色固体を得、収率85％であった）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.20 - 8.08 (m, 2H), 8.03 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.24 - 7.15 (m, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.74 (s, 2H), 3.62 - 3.49 (m, 2H), 3.31 - 3.17 (m, 1H), 2.81 - 2.53 (m, 2H), 2.35 - 2.16 ppm (m, 2H).
【００６７】
製造実施例2 メチル4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-オキシ-6,7-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(3H)-イル)メチル)安息香酸
【化２３】
0006408687.tif 000025
化合物ZM-3 (13g, 28.9mmol)を500mLのメタノールと150mLの酢酸エチルに懸濁させ、10％ Pd/C(7g)を入れ、室温で一晩撹拌した。翌日、TLCモニタリングでは原料が完全に反応したと示され、セライトでろ過し、固体を塩化メチレン/メタノール=1/1溶液で数回洗浄し、ろ液を合併して約100mLに濃縮させ、固体が析出し、ろ過して黄色固体を得、少量のDCMを入れて洗浄し、黄色固体ZM-2を6.5g得、収率50％であった。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.24 - 8.20 (m, 2H), 8.11(d, J = 7.8Hz, 2H),7.98(s, 1H), 7.42 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.20 - 7.15 (m, 1H), 4.65(s, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.55-3.50 (t, 2H), 2.92 - 2.97 ppm (t, 2H).
【００６８】
製造実施例3 N-(3,4-ジメトキシベンジル)-4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-オキシ-6,7-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(3H)-イル)メチル)ベンズアミド
(1) 4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-オキシ-6,7-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(3H)-イル)メチル)安息香酸
【化２４】
0006408687.tif 000026
化合物ZM-2(7.1g, 15.8mmol)を250mLのメタノールに懸濁させ、LiOH(1.33g, 31.6mmol)の水溶液を120mL入れ、室温で一晩撹拌した。翌日、溶液が清澄し、TLCモニタリングでは原料が完全に反応したと示され、減圧で大半のメタノールを除去し、1N HCl溶液を入れてpH=1〜2の間にし、固体が析出し、減圧でろ過して固体を収集し、固体に水を入れて3回洗浄し、真空乾燥して白色固体6.4gを得、収率90％であった。
【００６９】
(2) N-(3,4-ジメトキシベンジル)-4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-オキシ-6,7-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(3H)-イル)メチル)ベンズアミド
【化２５】
0006408687.tif 000027
化合物433(6.1g,14mmol)および3,4-ジメトキシベンジルアミン(2.8g,16.8mmol)を200mLのDMFに溶解させ、順にHOBT(100mg)、トリエチルアミン(5ml,35.6 mmol)を入れ、室温で10分間撹拌した後、EDCI(6.6g,35.6mmol)を入れ、室温で一晩撹拌した。翌日、TLCモニタリングでは原料が完全に反応したと示された。反応液を600mL氷水に注ぎ、固体が析出し、固体を収集し、固体を順に5％クエン酸溶液および水で洗浄し、乾燥して7.5gを得た。さらに精製し、固体に塩化メチレン/石油エーテル=1/5の溶液100mLを入れて30分間撹拌し、固体を収集し、このように3回繰り返し、白色固体6.9gを得、収率84％で、HPLC＞99.74％であった。
【００７０】
ZM-1
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.23- 8.21 (m, 2H), 7.98(s, 1H), 7.84(d, J = 8.1Hz, 2H),7.35 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.21 - 7.14(m, 1H), 6.92-6.83 (m,3H),6.33(t,1H),4.65(s, 2H), 4.60(d, J = 5.7Hz, 2H),  3.88 (s, 6H), 3.55-3.50 (t, 2H), 2.92 - 2.87 ppm (t, 2H)
同様の方法によって化合物を得た。
ZM-6
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.26- 8.24 (m, 2H), 7.95(s, 1H), 7.54(d, J = 8.1Hz, 2H),7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.21 - 7.10(m, 1H), 6.93-6.86 (m, 3H),6.75(t,1H),4.68(s, 2H), 4.63(d, J = 5.7Hz, 2H),  3.88 (s, 6H), 3.56-3.510 (t, 2H), 2.92 - 2.87(t, 2H) , 2.90ppm(s,3H).
ZM-7
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.14- 8.12(m, 1H), 8.01-7.90(m, 4H), 7.62(s, 1H), 7.42-7.40(m, 1H), 7.33-7.30(m, 1H), 7.05-7.02(m, 1H), 6.75-6.71 (m, 2H), 6.64-6.61(m,1H), 4.52(s, 2H), 4.44(d, J = 5.7Hz, 2H),  3.73 (s, 3H), 3.71(s, 3H), 3.43-3.38 (t, 2H), 2.63 - 2.58 ppm(t, 2H)
【００７１】
ZM-8
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.25- 8.21 (m, 2H), 7.92(s, 1H), 7.84(d, J = 8.1Hz, 2H),7.35 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.33-7.30(m, 5H), 7.21 - 7.14(m, 1H), 6.62(t,1H), 4.65(s, 2H), 4.60(d, J = 5.7Hz, 2H), 3.53-3.48 (t, 2H), 2.89 - 2.84 ppm(t, 2H)
ZM-9
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.27- 8.21 (m, 2H), 7.92(s, 1H), 7.85(d, J = 8.1Hz, 2H),7.35 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.30-7.28 (m, 1H), 7.20-7.15(t, 1H), 6.95-6.87 (m,3H), 6.36(t,1H),4.65(s, 2H), 4.63(d, J = 5.7Hz, 2H),  3.81 (s, 3H), 3.54-3.50 (t, 2H), 2.92 - 2.87 ppm(t, 2H)
ZM-10
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.24- 8.21 (m, 2H), 7.95(s, 1H), 7.82(d, J = 8.1Hz, 2H),7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.18- 7.15(m, 1H), 6.13(s, 1H), 4.65(s, 2H), 3.56-3.50(m, 4H), 3.02(s, 3H), 2.92 - 2.86 (t,2H), 1.27-1.24 ppm (t, 3H) 
【００７２】
ZM-11
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.22- 8.21 (m, 2H), 7.97(s, 1H), 7.83(d, J = 8.1Hz, 2H),7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.21 - 7.14(m, 1H), 6.46 (s, 2H), 6.31(t,1H), 4.64(s, 2H), 4.61(d, J = 5.7Hz, 2H),  3.90 (s, 9H), 3.54-3.50 (t, 2H), 2.92 - 2.86 ppm (t, 2H)
ZM-12
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.23- 8.21 (m, 2H), 7.92(s, 1H), 7.84(d, J = 8.1Hz, 2H),7.35 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.21 - 7.14(m, 1H), 6.85-6.78 (m,3H), 6.38(t,1H), 5.95(s, 2H), 4.65(s, 2H), 4.54(d, J = 5.7Hz, 2H), 3.54-3.50 (t, 2H), 2.91- 2.87 ppm(t, 2H)
ZM-13
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.24- 8.21 (m, 2H), 7.96(s, 1H), 7.83(d, J = 8.1Hz, 2H),7.37(d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.21 - 7.14(m, 1H), 6.88-6.83 (m,3H), 6.45(t,1H),5.96(s, 2H), 4.62(s, 2H), 4.60(d, J = 5.7Hz, 2H), 3.55-3.50 (t, 2H), 2.92 - 2.87 ppm(t, 2H)
【００７３】
ZM-14
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.23- 8.21 (m, 2H), 7.92(s, 1H), 7.82(d, J = 8.1Hz, 2H), 7.38-7.36 (m,5H), 7.35 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.21 - 7.14(m, 1H), 6.38(d,1H), 5.36-5.32(m, 1H), 4.64(s, 2H), 3.53-3.48 (t, 2H), 2.90 - 2.85 (t, 2H) , 1.52 ppm (d, 3H)
ZM-15
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.24- 8.22 (m, 2H), 7.92(s, 1H), 7.82(d, J = 8.1Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.21 - 7.15(m, 1H), 6.16(t,1H), 4.65(s, 2H), 3.55-3.51 (t, 2H), 3.34-3.29 (t, 2H),2.91 - 2.87 (t, 2H) , 1.86-1.58(m, 5H), 1.28-1.21(m, 4H), 1.06-1. 0.98ppm (m, 2H)
ZM-16
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.26- 8.25 (m, 2H), 7.92(s, 1H), 7.83(d, J = 8.1Hz, 2H),7.45 - 7.43(m, 1H),7.35 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.33-7.30(m, 1H),  6.89-6.85 (m,3H), 6.43(t,1H), 4.63(s, 2H), 4.58(d, J = 5.7Hz, 2H), 3.88 (s, 6H), 3.53-3.48 (t, 2H), 2.92 - 2.87 ppm(t, 2H)
【００７４】
ZM-17
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.04- 8.00 (m, 3H), 7.81-7.78(m, 4H), 7.28(d, J = 8.1Hz, 2H), 6.87-6.80 (m, 3H), 4.64(s, 2H), 4.51(t,1H), 3.81 (s, 6H), 3.47-3.44 (t, 2H), 2.83 - 2.78ppm(t, 2H)
ZM-18
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.06(s,1H), 7.91-7.88(d, J = 8.4Hz, 1H), 7.85-7.82(d, J = 8.1Hz, 2H ), 7.77-7.74(d, J = 8.4Hz, 1H), 7.42-7.39(t, 1H), 7.28(d, J = 8.1Hz, 2H), 6.89-6.80 (m, 3H), 6.30(t,1H), 4.65(s, 2H), 4.56(d,2H), 3.85 (s, 6H), 3.55-3.50 (t, 2H), 2.96 - 2.91ppm(t, 2H)
ZM-19
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.24- 8.22 (m, 2H), 7.95(s, 1H), 7.81-7.77(m , 2H), 7.38 - 7.35(m, 1H), 7.25-7.20 (m, 1H), 6.89-6.85 (m,3H), 6.43(t,1H), 4.63(s, 2H), 4.58(d, J = 5.7Hz, 2H), 3.89 (s, 6H), 3.59-3.53 (t, 2H), 2.93 - 2.87(t, 2H) , 2.37ppm(s,3H)
【００７５】
ZM-20
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.24- 8.21 (m, 2H), 7.94(s, 1H), 7.83(d , J = 8.1Hz, 2H), 7.32 (d , J = 8.1Hz, 2H), 7.25-7.20 (m, 1H), 6.91 (d, J = 7.2Hz, 1H), 6.65 (d, J = 11.1Hz, 1H), 6.66(t,1H), 4.64(s, 2H), 4.61(d, J = 5.7Hz, 2H), 3.85 (s, 6H), 3.54-3.50 (t, 2H), 2.90 - 2.87(t, 2H) 
ZM-21
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.23- 8.21 (m, 2H), 7.93(s, 1H), 7.81(d, J = 8.1Hz, 2H),7.36 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.21 - 7.14(m, 1H),7.02-6.98(m, 2H), 6.84(d, 1h), 6.39(s,1H), 4.64(s, 2H), 3.87(s,3H), 3.86(s, 3H), 3.53-3.48 (t, 2H), 2.90 - 2.85 (t, 2H) , 1.84ppm (s, 6H)
ZM-22
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.23- 8.21(m, 2H), 7.92(s, 1H), 7.82(d, J = 8.1Hz, 2H),7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.21 - 7.14(m, 1H), 6.90-6.81 (m,3H), 6.39(t, 1H), 4.64(s, 2H), 4.56(d, J = 5.7Hz, 2H), 4.12(t, 2H), 3.86(s, 3H), 3.54-3.50 (t, 2H), 2.90- 2.85 (t, 2H), 1.43 ppm (t, 3H)
【００７６】
ZM-23
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.23- 8.21(m, 2H), 7.91(s, 1H), 7.85(d, J = 8.1Hz, 2H),7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.21 - 7.14(m, 1H), 6.90-6.81 (m,3H), 6.35(t, 1H), 4.64(s, 2H), 4.58(d, J = 5.7Hz, 2H), 4.12(t, 2H), 3.86(s, 3H), 3.54-3.50 (t, 2H), 2.91- 2.85 (t, 2H), 1.44ppm (t, 3H)
ZM-27
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.23- 8.21 (m, 2H),8.01(s,1H), 7.87(d, J = 8.1Hz, 2H), 7.36(d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.20 - 7.16(m, 2H), 6.92-6.90(m,1H), 6.78-6.25 (t,1H), 6.58(t,1H), 4.65(s,2H)，4.61(d, J = 5.4Hz, 2H), 3.86(s, 3H), 3.55-3.50 (t, 2H), 2.91 - 2.88 ppm (t, 2H)
ZM-28
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.24- 8.21 (m, 2H), 7.92(s,1H), 7.82(d, J = 8.4Hz, 2H), 7.32(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.17-7.13(m, 1H), 6.86-6.66 (m,3H), 6.35(t,1H), 4.63(s,2H), 3.86 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.52-3.47 (t, 2H), 2.89 - 2.85(t, 2H),1.32ppm(s, 4H)
【００７７】
ZM-29
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.23- 8.20 (m, 2H), 7.92(s,1H), 7.84(d, J = 8.4Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.20-7.15(m, 1H), 6.86-6.83 (m,3H), 6.38(t,1H), 4.65(s,2H), 4.57(d, J = 6Hz, 2H), 4.51(m, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.55-3.50 (t, 2H), 2.91 - 2.86(t, 2H),1.36 ppm(d, J = 6.3Hz ,6H) 
ZM-30
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.19- 8.14 (m, 2H), 7.77(d, J = 8.4Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.30-7.28(m, 1H), 7.17 - 7.14(m, 1H), 6.96-6.91 (m,2H), 6.86-6.82(m, 1H), 6.38(t,1H), 4.65(d, J = 6Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.60(q, 2H), 3.19(m,1H), 3.00(dd,J 1 = 10.5, J2 = 1.5Hz, 1H), 2.72-2.70(m, 1H), 2.68-2.63(m, 1H), 2.22-2.19(m, 1H), 2.07-2.04(m, 1H), 1.59ppm(s, 3H)
【００７８】
ZM-31
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.23- 8.21 (m, 2H), 7.89(s,1H), 7.85(d, J = 8.1Hz, 2H), 7.35(d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.20 - 7.16(m, 2H), 6.77-6.25 (t,1H), 6.75-6.23 (t,1H), 6.59(t,1H), 4.65(s,2H)，4.64(d, J = 5.4Hz, 2H), 3.55-3.50 (t, 2H), 2.92 - 2.88 ppm (t, 2H)
ZM-32
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.23- 8.21 (m, 2H), 7.90(s,1H), 7.85(d, J = 8.1Hz, 2H), 7.34(d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.18 - 7.13(m, 2H), 6.95-6.93(m,1H), 6.82-6.30 (t,1H), 6.55(t,1H), 4.65 (s,2H)，4.58(d, J = 5.4Hz, 2H), 3.87(s, 3H), 3.55-3.50 (t, 2H), 2.91 - 2.88 ppm (t, 2H)
【００７９】
製造実施例4 N-(3,4-ジメトキシベンジル)-4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-1-メチル-3-オキシ-2,3,6,7-テトラヒドロ-1H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(4H)-イル)メチル)ベンズアミド
(1) メチル  4-((2-(2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-11-メチル-3-オキシ-2,3,6,7-テトラヒドロ-1H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(4H)-イル)メチル)安息香酸
【化２６】
0006408687.tif 000028
アルゴンの保護下で、化合物ZM-3(40mg, 0.089mmol)を5mLの無水THFに溶解させ、0℃に冷却し、ゆっくりLDA(2M，0.1mL)を滴下し、この温度で10分間撹拌した後、MeI(40L)を入れ、0℃で0.5時間撹拌し、室温に昇温して2時間撹拌し、TLCモニタリングでは原料が完全に反応したと示された。飽和塩化アンモニウムを入れて反応をクエンチングし、酢酸エチルで抽出し(3回)、有機相に水を加え、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、カラムにかけ、DCM/MeOH=50/1で、25mgを得、収率60％であった。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.02(d, J = 8.1Hz, 2H), 7.60-7.58 (m, 2H), 7.45 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.27 - 7.24(m, 1H), 3.93(s,3H), 3.78 (s, 2H), 3.33(s, 2H), 2.97(s, 3H), 2.81-2.77 (t, 2H), 2.63 - 2.59 ppm (t, 2H)
【００８０】
(2) 4-((2-(2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-11-メチル-3-オキシ-2,3,6,7-テトラヒドロ-1H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(4H)-イル)メチル)安息香酸
【化２７】
0006408687.tif 000029
化合物ZM463m(25mg, 0.054mmol)を5mLのメタノールに溶解させ、LiOH(5mg,0.11mmol)の水溶液を1mL入れ、室温で一晩撹拌した。翌日、TLCモニタリングでは原料が完全に反応したと示され、減圧で大半のメタノールを除去し、1N HCl溶液を入れてpH=1〜2の間にし、酢酸エチルで抽出し(3回)、有機相に水を加え、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、産物449を20mg得、収率90％であった。
【００８１】
(3) N-(3,4-ジメトキシベンジル)-4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-1-メチル-3-オキシ-2,3,6,7-テトラヒドロ-1H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(4H)-イル)メチル)ベンズアミド
【化２８】
0006408687.tif 000030
化合物449(20mg,0.045mmol)および3,4-ジメトキシベンジルアミン(15mg，0.089mmol)を5mLのDMFに溶解させ、順にHOBT(2mg)、トリエチルアミン(20ml，0.14 mmol)を入れ、室温で10分間撹拌した後、EDCI(25mg,0.13mmol)を入れ、室温で一晩撹拌した。翌日、TLCモニタリングでは原料が完全に反応したと示された。反応液を10mLの氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し(3回)、有機相に水を加え、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、カラムにかけ、DCM/MeOH=30/1で、20mgを得、収率76.7％であった。
【００８２】
ZM-5
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.75(d, J = 8.1Hz, 2H), 7.59-7.57 (m, 2H), 7.42 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.30 - 7.26(m, 1H), 6.89-6.85(m,3H), 6.70(t,1H), 4.55(d, J = 5.4Hz, 2H),  3.84(s,6H), 3.72 (s, 2H), 3.25(s, 2H), 2.96(s, 3H), 2.81-2.77 (t, 2H), 2.61 - 2.59 ppm (t, 2H)
同様の方法によって以下の化合物を得た。
ZM-24
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.73(d, J = 8.1Hz, 2H), 7.65-7.57 (m, 2H), 7.44 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.30 - 7.26(m, 1H), 6.89-6.85(m,3H), 6.70(t,1H), 4.58(d, J = 5.4Hz, 2H), 4.12(t, 2H), 3.86(s, 3H), 3.76 (s, 2H), 3.30(s, 2H), 2.97(s, 3H), 2.81-2.77 (t, 2H), 2.61 - 2.59 (t, 2H), 1.43 ppm (t, 3H)
【００８３】
ZM-25
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.78(d, J = 8.1Hz, 2H), 7.64-7.57 (m, 2H), 7.42(d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.30 - 7.24(m, 1H), 6.85-6.78 (m,3H), 6.35(t,1H), 4.58(d, J = 5.4Hz, 2H), 4.52(m, 1H), 3.86(s, 3H), 3.75 (s, 2H), 3.30(s, 2H), 2.97(s, 3H), 2.81-2.77 (t, 2H), 2.61 - 2.59 (t, 2H), 1.36 ppm(d, J = 6.3Hz ,6H)
ZM-26
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.76(d, J = 8.1Hz, 2H), 7.65-7.57 (m, 2H), 7.43(d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.30 - 7.27(m, 1H), 6.89-6.83(m,3H), 6.33(t,1H), 4.58(d, J = 5.4Hz, 2H), 4.12(t, 2H), 3.86(s, 3H), 3.76 (s, 2H), 3.30(s, 2H), 2.97(s, 3H), 2.81-2.77 (t, 2H), 2.61 - 2.59 (t, 2H), 1.43 ppm (t, 3H)
【００８４】
製造実施例5 N-(3,4-ジメトキシベンジル)-4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3a-メチル-3-オキシ-3a,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(3H)-イル)メチル)ベンズアミド
(1) メチル  4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3a-メチル-3-オキシ-3a,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(3H)-イル)メチル)安息香酸
【化２９】
0006408687.tif 000031
【００８５】
化合物333(340mg, 1.02mmol)および3-トリフルオロメチル-4-フルオロフェニルヒドラジン塩酸塩(276g, 1.02mmol)を10mLのメタノールに溶解させ、トリエチルアミン(0.14mL, 1.02mmol)を入れ、60℃に加熱し、4h反応させ、TLCモニタリングでは原料が完全に反応したと示された。加熱を止め、室温に冷却し、新しく調製したナトリウムメトキシドのメタノール溶液(2mmol, 60mL)を入れ、室温で一晩撹拌した。翌日、反応液をゆっくり20mLの5％のクエン酸溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出し(3回)、有機相に水を加え、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、カラムにかけ、石油エーテル/酢酸エチル=4/1で、463-2を160mgを得、収率35％であった。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.19- 8.15 (m, 2H), 8.02(d, J = 7.8Hz, 2H), 7.42 (d, J = 7.8Hz, 2H), 7.20 - 7.18(m, 1H),3.93 (s, 3H), 3.74-3.58(q, 2H), 3.24-3.19 (m,1H), 3.00(dd,J 1 = 10.5,J2 = 1.5Hz, 1H), 2.75-2.69(m, 1H), 2.68-2.61(m, 1H), 2.24-2.19(m, 1H), 2.07-2.04(m, 1H), 1.59ppm(s, 3H)。
【００８６】
(2) 4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3a-メチル-3-オキシ-3a,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(3H)-イル)メチル)安息香酸
【化３０】
0006408687.tif 000032
化合物463-2(40mg，0.086mmol)を5mLのメタノールに溶解させ、LiOH(10mg，0.2mmol)の水溶液を1mL入れ、室温で一晩撹拌した。翌日、TLCモニタリングでは原料が完全に反応したと示され、減圧で大半のメタノールを除去し、1N HCl溶液を入れてpH=1〜2の間にし、酢酸エチルで抽出し(3回)、有機相に水を加え、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、産物449-2を38mg得、収率85％であった。
【００８７】
(3) N-(3,4-ジメトキシベンジル)-4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3a-メチル-3-オキシ-3a,4,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(3H)-イル)メチル)ベンズアミド
【化３１】
0006408687.tif 000033
【００８８】
化合物449-2(20mg, 0.045mmol)および3,4-ジメトキシベンジルアミン(15mg，0.089mmol)を5mLのDMFに溶解させ、順にHOBT(2mg)、トリエチルアミン(20ml，0.14 mmol)を入れ、室温で10分間撹拌した後、EDCI(25mg,0.13mmol)を入れ、室温で一晩撹拌した。翌日、TLCモニタリングでは原料が完全に反応したと示された。反応液を10mLの氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し(3回)、有機相に水を加え、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、カラムにかけ、DCM/MeOH=30/1で、ZM-6を10mg得、収率38％であった。
ZM-33
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.19- 8.14 (m, 2H), 7.78(d, J = 8.4Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.17 - 7.14(m, 1H), 6.92-6.83 (m,3H),6.38(t,1H), 4.63(d, J = 6Hz, 2H),  3.81 (s, 6H), 3.68(q, 2H), 3.18(m,1H), 3.00(dd,J 1 = 10.5,J2 = 1.5Hz, 1H), 2.72-2.70(m, 1H), 2.68-2.63(m, 1H), 2.22-2.19(m, 1H), 2.07-2.04(m, 1H), 1.59ppm(s, 3H)。
【００８９】
製造実施例6 N-(3-メトキシ-4-デューテロメトキシベンジル)4-((2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-オキシ-6,7-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-c]ピリジン-5(3H)-イル)メチル)ベンズアミド
【化３２】
0006408687.tif 000034
【００９０】
化合物ZM-30(50mg, 0.088mmol)およびp-トルエンスルホン酸デューテロメチル(50mg,0.25mmol)を3mLのDMFに溶解させ、炭酸セシウム(300mg)、テトラブチルアンモニウムヨージド(10mg)を入れ、40℃で2時間撹拌した。TLCモニタリングでは原料が完全に反応したと示された。反応液を10mLの氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し(3回)、有機相に水を加え、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、カラムにかけ、DCM/MeOH=30/1で、ZM-34を30mg得、収率58％であった。
ZM-34
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.23- 8.21 (m, 2H), 7.95(s, 1H), 7.83(d, J = 8.1Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.18 - 7.14(m, 1H), 6.90-6.83 (m,3H), 6.56(t,1H), 4.64(s, 2H), 4.56(d, J = 5.7Hz, 2H),  3.86 (s, 3H), 3.52-3.48(t, 2H), 2.84- 2.89 ppm (t, 2H)
【００９１】
実験実施例1
1．試験目的：AMPK(α2β1γ1)のアロステリック活性化が可能な小分子化合物を選別する。
2．試験原理：基質のペプチド断片にAMPKでリン酸化される部位が含まれ、反応系(含2mM MgCl2、400μM DTT、160nM 基質ペプチド、4μM ATPおよび1.6nM AMPK)においてその一方の末端にビオチンが連結される。ビオチン末端において、ビオチンがストレプトアビジン-XL665(アクセプター)と連結し、標識が完成される。45分間のリン酸化反応の後、当該基質から生成したリン酸化基質（すなわち産物）はこの部位を認識する抗リン酸化部位抗体(ドナーが標識されたもの)と結合し、もう一方のビオチンがストレプトアビジン-XL665(アクセプター)と連結することで、PE社のEvisionで生じたFRET信号を検出することができる。最終に、AMPK活性は、波長665nmの読み値と波長615nmの読み値の比(665nm/615nm)で表される。
【００９２】
3．検出試薬：大腸菌発現システムで発現させ、精製して得られたヒト由来AMPK (α2β1γ1)タンパク質、Cisbio社から購入されたHTRF KinEASE-STK S1キット、Sigma社から購入されたATPを使用した。
4．実験方法：
1）200nM AMPK(α2β1γ1)タンパク質を200nM CaMKKβとともに30度で4時間水浴し、AMPKを完全にリン酸化させた。
2）PE社から購入された白色浅底プレートを使用し、酵素反応系(2mM MgCl2、400μM DTT、160nM 基質ペプチド、4μM ATPおよび1.6nM AMPK)を構築し、30度で45分間反応させ、リン酸化ペプチド断片を認識する抗体とXL665を含む検出バッファーを入れ、室温で3時間インキュベートした後信号を検出した。
【００９３】
5．実験結果：図1および表1に示すように、小分子化合物のAMPKに対する活性化はEC50と活性化倍数(Fold)で表された。
【表１】
0006408687.tif 000035
【００９４】
6．結果と検討：
表1および図1に示すように、化合物ZM-1などの一連の化合物は分子レベルで顕著にAMPKをアロステリック活性化させる能力を有する。
【００９５】
実験実施例2
1．検出目的：分子レベルで顕著にAMPKを活性化させる小分子化合物が細胞内AMPKを活性化させる作用を有するか検出する。
2．実験原理：小分子化合物はAMPKをアロステリック活性化させ、その基質であるアセチル補酵素Aカルボキシラーゼ(ACC)のSer-79位のリン酸化につながる。
3．検出試薬：AMPK、phospho-AMPK(T172)、phospho-ACC(S79)、Total ACC抗体はCell Signaling Technologyから購入された。
【００９６】
4．実験方法：
1）細胞は無血清培地に変えて2時間飢餓させた後、化合物を入れて(0.4％DMSO)1時間処理した後、サンプリングした細胞をPBSで1回洗浄した後、1×SDSゲル仕込み緩衝液(50 mM Tris-HCl (pH6.8)，100 mM DTT，2％ SDS，10％グリセリン，0.1％ブロモフェノールブルー)を入れて細胞を分解させた(24ウェルプレートに70μl/ウェル入れた)。
2）サンプルを100℃で10分間加熱した後、12000 gで10分間遠心させて上清液を取ってSDS-PAGE電気泳動を行い、条件は、スペーサーゲル：70ボルトで、分離ゲル：90ボルトであった。
3）電気泳動終了後、Biorad湿式転写・電気転写システムによってタンパク質を硝酸セルロースフィルムに転写させた。目的バンドを切り取った後、バンドをブロッキング液(5％ BSA含有TBST)に置いて室温で1時間ブロッキングした。その後、バンドを一次抗体溶液に置いて4℃で一晩インキュベートした。
4）翌日、目的バンドをTBSTに置き、室温で3×10分間洗浄した。その後、バンドを二次抗体溶液(ヒツジ抗ウサギとヒツジ抗マウスはいずれも1：8000で、TBSTに溶解させた)に置いて室温で1時間インキュベートし、そしてTBSTでフィルムを3×15分間洗浄した後、ECL試薬で現像した。
【００９７】
5．実験結果：
図2A、Bに示すように、選ばれた分子レベルで顕著にAMPKを活性化させる小分子のうち、ZM-1は細胞レベルでAMPKに対する活性化効果が最も良く、L6筋細胞を1時間処理した場合、投与量依存的にAMPKを顕著に活性化することができ、かつその下流のACCリン酸レベルが相応に上方調節した。
図3に示すように、異なる濃度のZM-1でHepG2細胞を処理した場合、濃度勾配に依存してAMPK、ACCリン酸化レベルの上方調節に刺激を与えた。
図4に示すように、異なる濃度のZM-1でSDラット初代肝臓細胞を処理した場合、濃度勾配に依存してAMPK、ACCリン酸化レベルの上方調節に刺激を与えた。
【００９８】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１−１】
0006408687.tif 000046
【図１−２】
0006408687.tif 000047
【図２ＡＢ】
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【図３】
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【図４】
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