(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号７６に示す配列を有する相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、配列番号７７に示す配列を有するＣＤＲＨ２、及び、配列番号７８〜８６及び８８から選択されるいずれか１つに示す配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに
（ｂ）配列番号１００に示す配列を有する相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、配列番号１０２に示す配列を有するＣＤＲＬ２、及び、配列番号１０４に示す配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖、又は、
配列番号１０１に示す配列を有する相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、配列番号１０３に示す配列を有するＣＤＲＬ２、及び、配列番号１０５に示す配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖
を含む、ＣＤＩＭに結合する単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２】
配列番号１〜９及び１１のいずれか１つに含まれるＦＲ１配列を有するＦＲ１を含む重鎖を更に含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項３】
配列番号１〜９、及び１１からなる群より選択される１つの重鎖配列、及び配列番号２３及び２４からなる群より選択される１つの軽鎖配列を含む、ＣＤＩＭに結合する単離された抗原結合タンパク質。
【請求項４】
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、リポ多糖類、カルジオリピン、コンドロイチン、及びヘパリンと実質的に交差反応しない、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項５】
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号１２、及び配列番号１４からなる群より選択される１つの重鎖可変領域、及び
（ｂ）配列番号２３及び配列番号２４からなる群より選択される１つの軽鎖可変領域、
を含む、ＣＤＩＭに結合する単離された抗原結合タンパク質。
【請求項６】
ＣＤＩＭに対する結合力がＭＡｂ２１６より５倍強い、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項７】
ＣＤＩＭに対する結合力がＭＡｂ２１６より１０倍強い、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項８】
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、リポ多糖類、カルジオリピン、コンドロイチン、及び／又はヘパリンとの結合が、ＭＡｂ２１６の半分である、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項９】
モノクロナール抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、又はこれらの抗体断片である、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、又は一本鎖抗体分子である、請求項９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
ヒト抗体である、請求項９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
モノクロナール抗体である、請求項９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＥからなる群より選択される、請求項９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
ＩｇＭである、請求項９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
標識基と結合している、請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
前記標識基が、放射性同位体、放射性核種、蛍光基、酵素基、化学発光基、ビオチニル基、又は所定のポリペプチド基である、請求項１５に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
エフェクター基と結合している、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
前記エフェクター基が、放射性同位体、放射性ヌクレオチド、毒素、治療基、又は化学療法基である、請求項１７に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
前記治療基又は化学療法基が、カリケアマイシン、オーリスタチン−ＰＥ、ゲルダナマイシン、マイタンシン、及びこれらの誘導体からなる群より選択される、請求項１８に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
（ａ）Ｊ鎖が存在すること、又は（ｂ）Ｊ鎖が存在しないことにより特徴付けられる、請求項９〜請求項１９のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質の混合物であって、五量体及び六量体を含む混合物。
【請求項２２】
有効成分としての少なくとも１つの請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の単離された結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又はアジュバントを含む治療用医薬組成物。
【請求項２３】
有効成分としての少なくとも１つの請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の単離された結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又はアジュバントを含む診断用医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質を含むキット。
【請求項２５】
治療薬を更に含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記更なる治療薬が、抗腫瘍剤である、請求項２５に記載のキット。      
【請求項２７】
前記抗腫瘍剤が、抗腫瘍抗体又は化学療法剤である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
Ｂ細胞の異常増殖と関連する疾患の治療用である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２９】
前記疾患が、リンパ性がん及び白血病からなる群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記白血病が、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記疾患が、Ｂ細胞が関与する自己免疫疾患である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記疾患が、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、又はＢ細胞過増殖の状態である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記Ｂ細胞過増殖の状態が、急性又は慢性白血病、リンパ腫、ミエローマ、及び非ホジキンリンパ腫を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記疾患が、リンパ性がん、ウイルス感染、免疫不全、及び自己免疫疾患を含む、Ｂ細胞の過増殖により特徴付けられるいずれかの状態である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記抗原結合タンパク質が、エトポシド（ＶＰ−１６）、パクリタキセル（タキソール）、Ａｒａ−Ｃ（シタラビン）、ビンクリスチン、ノコダゾール、コルヒチン、ダウノルビシン、サイトカラシン、及びジャスプラキノリドからなる群より選択される化学療法剤と併用投与される、請求項２２、及び請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質に結合する固形腫瘍により特徴付けられる疾患を治療するための、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３７】
Ｂ細胞を含有する患者サンプルを、請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質と接触させることにより、Ｂ細胞の異常増殖と関連する疾患を診断する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３８】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３９】
発現に有効な配列と作動可能に結合した請求項３８に記載のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現系。
【請求項４０】
請求項３９に記載の発現系を含む、組換え宿主細胞。
【請求項４１】
前記宿主細胞が、真核宿主細胞である、請求項４０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４２】
前記宿主細胞が、酵母細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項４１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４３】
請求項４０〜請求項４２のいずれか１項に記載の細胞を培養すること、及び、前記タンパク質を回収することを含む、請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ウェブ経由、ＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１３年２月７日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、０１５５−００５Ｗ０１＿ＳＬ．ｔｘｔと表わされ、その大きさは２２５，６１９バイトである。
【０００２】
本開示は、細胞死誘導分子（以下、「ＣＤＩＭ」という）に結合するタンパク質、及びその医薬組成物に関する。特に、本開示は、腫瘍性Ｂ細胞を含むＢ細胞、並びに、ＣＤＩＭ又はＣＤＩＭ様の抗原を発現する他の腫瘍細胞を選択的に激減させ、かつ殺傷させるために有用なＣＤＩＭ結合タンパク質を提供する。また、本開示は、該ＣＤＩＭ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び該タンパク質を生成するための発現系についても提供する。更に、本開示は、ＣＤＩＭ結合タンパク質を投与することによる、Ｂ細胞増殖性疾患及びＢ細胞媒介型疾患に罹患した患者の治療方法を含む。また、本開示は、ＣＤＩＭ結合タンパク質で治療可能な患者集団を特定するための診断分析法に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫系の機能を司る主要な担い手は、リンパ球と呼ばれる白血球に由来する。リンパ球は、２つの主要なクラス、すなわちＴ細胞及びＢ細胞に分類される。Ｔ細胞（すなわち、Ｔリンパ球）は、骨髄中の幹細胞に由来し、胸腺中で発達し、リンホカインを分泌する。Ｂ細胞（すなわち、Ｂリンパ球）は、骨髄中の幹細胞に由来し、抗体の産生源となる。実際には、Ｂ細胞は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを含む異なる５種類の抗体を産生する。これらの抗体は、免疫反応を引き起こす物質、すなわち抗原を中和することができ、これは、当該抗原をブロックするために当該抗原上の特定の部位に結合することによるものである。ＩｇＭは、最大の抗体であり、かつ、赤血球上のＡ抗原及びＢ抗原に対する一次抗体である。構造的には、ＩｇＭは、複数の免疫グロブリンがジスルフィド結合により互いに共有結合したポリマーを形成し、主に五量体として、但し六量体としても存在する。ＩｇＭの分子量は、５量体型で約９００ｋＤａである。各モノマーは、２つの抗原結合部位を有するので、五量体のＩｇＭは１０個の結合部位を有する。
【０００４】
非常に多くの疾患が、変性した又は機能障害性のＢ細胞と関連している。このような疾患は、これらに限定されるものではないが、自己免疫疾患及びがんを含む。Ｂ細胞の増殖及び分化は、細胞表面上に局在する受容体により制御される。これらの受容体が架橋すると、細胞内シグナルタンパク質の活性化を誘導し、受容体シグナルを細胞内の細胞性反応をコントロールする特定標的に伝達する。多くのシグナル伝達タンパク質は、発癌遺伝子の生成物であり、かつ、多くの発癌遺伝子は、腫瘍形成と関連している。Ｂ細胞の増殖及び分化を制御するシグナル経路の分子機構は、現在も研究過程にある（Ｊｕｍａａら（２００５年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２３巻：４１５〜４４５頁）。
【０００５】
腫瘍性Ｂリンパ球が関与する疾患の例として、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＬＬ）が挙げられる。本疾患の治療が幾分か進展してきたのは、小児及び成人の両ＡＬＬに対する強化化学療法や、より適切な支持療法によるものである。再発リスクは小児集団においては低めではあるが、小児及び成人患者共に、疾患が再発した場合には悲惨な転帰に直面する。積極的治療及び幹細胞移植を行ったとしても、ＡＬＬを再発した小児の１／３未満及び成人のわずかしか生存することができない。よって、従来の化学療法を凌駕する新規の治療方法が必要とされている。ＡＬＬの場合、リツキシマブ、エプラツズマブ、及びゲムツズマブを含む様々なモノクロナール抗体を用いた非臨床試験及び初期臨床試験のデータは、モノクロナール抗体単独又は標準化学療法との併用が有望な治療選択肢であることを示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
米国特許第５，５９３，６７６号は、細胞死誘導分子（ＣＤＩＭ）と呼ばれるＢ細胞特異的エピトープに結合する試薬を用いることにより、腫瘍性Ｂ細胞の細胞死を誘導する方法について記載している。本明細書では、Ｂ細胞特異的オリゴ糖エピトープＣＤＩＭを、腫瘍性Ｂ細胞マーカーとして用いる。本マーカーに特異的なＩｇＭ抗体を宿主にｉｎ  ｖｉｖｏ投与し、腫瘍性Ｂ細胞の細胞死を誘導する。同一の概念が、ｅｘ  ｖｉｖｏ臨床的症状においてＢ細胞を選択的に除去するために適用することができる。Ｂ細胞エピトープＣＤＩＭを認識するヒトモノクロナール抗体（すなわち、ＭＡｂ２１６）は、腫瘍性Ｂ細胞及び正常Ｂ細胞に対して細胞毒性を示し、かつ、ヒト末梢血及び脾臓中の全てのＣＤ１９＋及びＣＤ２０＋Ｂリンパ球に結合する。更に、ＭＡｂ２１６は、発現するアイソタイプでＢ細胞を区別せず、ＩｇＧ＋細胞及びＩｇＭ＋細胞と等しい強度で結合する。また、ＭＡｂ２１６は、ＣＤ５発現によらず全てのＢ細胞に結合する。よって、ＭＡｂ２１６は、診断及び治療において有用である。Ｂｈａｔら（２０００年）、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第５１巻：１３４〜１４０頁も参照されたい。
【０００７】
しかし、Ｂ細胞に特異的な抗体を同定し、非特異的結合及び／又は組織障害の副作用を低減させつつ、Ｂ細胞を選択的に殺傷し、かつ／又は宿主から除去することが、当技術分野において依然として必要とされている。がん治療の分野においては、そのような治療用抗体が依然として必要とされている。本出願はこのような必要性に応じるものである。
【０００８】
本開示は、実施形態を説明した添付の図面と組み合わせて参酌することにより最もよく理解される。しかし、本開示は、図面において開示された特定の実施形態に限定されるものではないものと理解される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（Ａ−Ｄ）本明細書で開示するＣＤＩＭ結合タンパク質の代表的な重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１〜２２）を表す。３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）、及び重鎖可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３）、及びＪＨ（連結領域）を示す。  （Ｅ）本明細書で開示するＣＤＩＭ結合タンパク質の代表的な軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２３及び２４）を表す。３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）及び軽鎖可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３）、及びＪＬ（連結領域）を示す。  （Ｆ）本明細書で開示する代表的な例で利用される、重鎖定常領域のアミノ酸配列（Ｉｇμ）（配列番号２５）、及び２つの軽鎖定常領域（それぞれＩｇλ及びＩｇκ）（配列番号２６及び２７）を表す。
【図２】（Ａ〜Ｖ）ＩＧＭ１〜ＩＧＭ４４と命名された、本明細書で開示する４４個の抗ＣＤＩＭ抗体の全アミノ酸配列を表す。４４個の抗体は、開示された２２本の重鎖（配列番号２８〜４９）のいずれかと、開示された２本の軽鎖（配列番号５０及び５１）のいずれかとを組み合わせることにより形成される。
【図３】本明細書で開示する代表的なＨ１〜Ｈ２２  ＣＤＩＭ結合タンパク質のＣＤＲ３配列を表す。種々の配列に含まれるアルギニン残基を下線で示す。
【図４】（Ａ〜Ｋ）本明細書で開示する抗原結合タンパク質の２２本の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号５２〜７３）の例を表す。  （Ｌ）本明細書で開示する抗原結合タンパク質の、λ鎖及びκ鎖の２本の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７４及び７５）の例を表す。
【図５】Ｈ１〜Ｈ７（パネルＡ）、及びＨ９〜Ｈ２１（パネルＢ）をそれぞれ発現するＣＨＯ細胞由来の細胞粗抽出物のネイティブＳＤＳゲルを表す。１，０４８ｋＤのバンドはＩｇＭ五量体を表し、一方１，２３６ｋＤのバンドはＩｇＭ六量体を表す。
【図６】ＣＤＩＭ結合タンパク質のヒトＢ細胞株表面に発現したＣＤＩＭへの結合、及びその後の開示抗体による細胞毒性の結果を示す。細胞培養物は採集され、フローサイトメトリーにより（１）結合を定量化するための平均蛍光強度、及び（２）生細胞と死滅細胞とを区別するためのヨウ化プロピジウムの取り込み量を分析した。図６Ａに示す通り、試験した全ての抗体が、広い用量範囲にわたりＣＤＩＭ発現ヒトＢ細胞株ＮＡＬＭ−６に結合する。図６Ｂは、抗体のＣＤＩＭエピトープへの結合後の細胞毒性の結果を示す。
【図７】抗体のＣＤＩＭエピトープへの結合後の細胞毒性の結果を示す。
【図８】（パネルＡ〜Ｅ）ＣＤＩＭ以外の抗原に対するＣＤＩＭ結合タンパク質の結合の代表例として、ＥＬＩＳＡに基づく結合データを表す。抗原として、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、脂質Ａ、カルジオリピン、及びマロンアルデヒド（ｍａｌｅｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ）ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）を用いた結果を、パネルＡ〜Ｅにそれぞれ示す。示される通り、開示された全ての抗体が、これらの選択された抗原に対して顕著に低い結合を示すか、又は結合が完全に欠如しているのに対し、ＭＡｂ２１６は広い用量範囲において全ての抗原と結合する。
【図９】（パネルＡ〜Ｆ）ＣＤＩＭ以外の抗原に対するＣＤＩＭ結合タンパク質の結合の代表例として、ＥＬＩＳＡに基づく結合データを表す。抗原として、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、リポ多糖類、カルジオリピン、コンドイトリン（ｃｈｏｎｄｏｉｔｒｉｎ）、及びヘパランを用いた結果を、パネルＡ〜Ｆにそれぞれ示す。示される通り、開示された全ての抗体は、これらの選択された抗原に対して顕著に低い結合を示すか、又は結合が完全に欠如しているのに対し、ＭＡｂ２１６は広い用量範囲において全ての抗原と結合する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書で用いる本セクションの表題は、構成を目的とするものであり、発明対象を限定するものとして解されるべきものではない。
【００１１】
本明細書において特に定義される場合を除き、本出願と関連付けて用いられる科学的用語及び技術的用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。更に、文脈により別途必要とされなければ、単数形の用語には複数形が含まれものとし、また複数形の用語には、単数形が含まれるものとする。
【００１２】
一般的に、本明細書に記載する細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びに、タンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションと関連付けて用いられる命名法、及びこれらの技法は、当技術分野で周知であり、一般的に用いられている。特に明示しない限り、本願の方法及び技法は、当技術分野において慣用されている方法により、及び、本明細書全体を通じて引用及び議論される様々な一般的でより具体的な参照文献に記載されたとおりに一般的に実施される。例えば、本明細書において参照により引用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１年）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２年）、及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０年）を参照されたい。酵素反応及び精製技法は、当技術分野において一般的に実施されているように、又は本明細書に記載したように、製造業者の仕様書に基づき実施される。本明細書に記載する分析化学、有機合成化学、医薬品及び製薬化学と関連して用いられる用語、並びに、これらの実験方法及び技法は、当技術分野で周知であり、また一般的に用いられている。化学合成、化学分析、薬剤の調剤、製剤化及び送達、並びに患者の治療は標準的な技法を利用して行うことができる。
【００１３】
本発明は、本明細書に記載された具体的な実験方法、プロトコール、及び試薬等に限定されず、様々であってよい。本明細書で用いられる用語は、具体的な実施形態を記載する目的に限定され、開示する範囲を限定する意図で用いられたものではない。開示する範囲は、特許請求の範囲により規定される。
【００１４】
実施例以外では、又は特に明記しない場合には、本明細書で用いる成分量又は反応条件を表わす全ての数字は、全ての事例において用語「約」により修飾されるものとして理解すべきである。割合（％）と関連して用いられる場合、用語「約」は±１％を意味し得る。
【００１５】
概要
本開示は、ＣＤＩＭ抗原を発現する細胞が関与する増殖性疾患を治療又は診断することと関連する材料及び方法を提供するものである。特に、本開示は、とりわけＢ細胞増殖性疾患及びＢ細胞媒介型疾患を特徴とする症状に罹患した患者における、腫瘍性Ｂ細胞の選択的殺傷及び／又は激減に有用な、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ性能が改善されたＣＤＩＭ結合タンパク質を提供するものである。更に、ＣＤＩＭ結合タンパク質は、ＣＤＩＭ抗原を発現する固形腫瘍の治療においても有用である。開示するＣＤＩＭ結合タンパク質は、単独で、又は低分子化学療法剤と併用して利用可能である。開示するＣＤＩＭ結合タンパク質に特有の細孔誘導作用、すなわち膜損傷の結果、標的細胞は化学療法分子が到達しやすい状態となる。従って、開示する結合タンパク質は、該タンパク質を投与しなければ低分子化合物に対して抵抗性である細胞を、同化合物と併用して治療するのに特に適する。
【００１６】
定義
本明細書で用いられる下記の用語は、以下に示す意味を有する。
【００１７】
用語「抗原」は、特異的免疫反応を誘導し、特異的抗体と反応する能力を有する任意の物質を意味する。
【００１８】
「抗原結合タンパク質」又は「ＣＤＩＭ結合タンパク質」は、本明細書で用いる場合、抗体様の結合活性を有する足場タンパク質、又は抗体、すなわち抗ＣＤＩＭ抗体である。
【００１９】
用語「ＣＤＩＭ」（「細胞死誘導分子」）は、本明細書で用いる場合、細胞表面分子に結合したポリｎ−アセチルラクトサミン糖類を意味する。ＣＤＩＭエピトープは、ほぼ全ての末梢Ｂリンパ球及び脾臓Ｂリンパ球上、及び特定の培養Ｂ細胞リンパ腫細胞株上に存在する。当該エピトープは、様々な組織病理学的分類の原発性Ｂ細胞リンパ腫上、及びいくつかの固形腫瘍細胞上にも存在する。
【００２０】
より具体的な用語として、ＣＤＩＭエピトープは、三次元立体構造を有し、エンド−β−ガラクトシダーゼ酵素に対して感受性である、線状Ｂ細胞ラクトサミン抗原（すなわち、末端シアル酸を持ち又は持たない、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン２型決定基）である。エピトープは、分岐又は置換を持たず、かつ、糖脂質又は糖タンパク質に結合可能である。糖タンパク質上では、エピトープはマンノースフレームワーク（例えば、ＭＧＡＴ４酵素）に分岐することができ、又は「ラージＩ」構造に分岐する長鎖であり得るが、通常は、分岐Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮａｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１の後の直鎖状の少なくとも約４個のヘキソース部分（すなわち２型）であり；良好なアフィニティーを得るためには少なくとも約６個のヘキソースであり；及び、最長では、約１２個のヘキソースである。鎖は、酵素（例えば、Ｂ３ＧＮＴ１、Ｂ４ＧＡＬＴ１）により形成され、同酵素は代替糖をエピトープに結合させる。特に、グリコシル化されたエピトープＣＤＩＭは、分子量約２０ＫＤ〜約２００ＫＤ超の範囲の複数のタンパク質上に存在する。
【００２１】
ＣＤＩＭエピトープは、抗原の糖がシアル酸でキャップ化されることにより、より成熟したグリコシル化型となることが明らかにされている。
【００２２】
用語「エピトープ」は、一般的には免疫系により認識される抗原の部分（すなわち、分子の抗原決定基）を意味する。エピトープは、糖、脂質、及び／若しくはアミノ酸、又はこれらの混合物から構成され得る。エピトープは、特異的Ｔ細胞、Ｂ細胞等の免疫細胞、及び／又は、Ｂ細胞により産生される抗体により認識される。免疫細胞は、特異的エピトープを認識し、これにより活性化されると免疫反応を開始する。あるいは、抗体が特異的エピトープを認識し、これに結合すると、エピトープを担持する細胞は、激減し、死滅化され、不活性化され、損傷し、除去され、かつ／又は、変性する。
【００２３】
用語「足場タンパク質」又は「抗原結合タンパク質」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸の挿入、置換、又は欠失が高度に容認される露出した表面を有するポリペプチド又はタンパク質を意味する。本発明に基づき利用可能である足場タンパク質の例として、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のタンパク質Ａ、シロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）由来のビリン結合タンパク質、又はその他のリポカリン、アンキリンリピートタンパク質、及びヒトフィブロネクチンが挙げられる（Ｂｉｎｚ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００５年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１６巻：４５９〜６９頁でレビューされている）。足場タンパク質の加工は、安定的に折りたたまれたタンパク質の構造的なフレームワーク上又は内へのアフィニティー機能の接続又は組み込みにより行われる。アフィニティー機能とは、本発明に基づくタンパク質結合アフィニティーを意味する。足場は、結合特異性を付与するアミノ酸配列から構造的に分離可能である。一般的に、このような人工的アフィニティー試薬の開発に適すると思われるタンパク質は、論理的に得ることができ、又は、最も一般的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで提示された人工的足場ライブラリ内で、精製され又は細胞表面に提示されたＣＤＩＭタンパク質に対して、それに結合する物質をパニングする等のコンビナトリアルタンパク質工学技法により得ることができ、同技法は当技術分野において公知の技能である（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．第１３巻：１６７〜１８７頁；Ｂｉｎｚ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、上掲）。更に、抗体様の結合活性を有する足場タンパク質は、足場ドメインを含有するアクセプターポリペプチドに由来してもよく、同アクセプターポリペプチドにドナーポリペプチドの結合ドメインを接続することにより、アクセプターポリペプチドを含有する足場ドメイン上にドナーポリペプチドの結合特異性を付与することができる。前記挿入された結合ドメインは、例えば、抗体、特に抗ＣＤＩＭ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）であってもよい。挿入は当業者にとって公知の様々な方法で行うことができ、例えば、ポリペプチドを合成すること、並びに当業者にとって周知の様々な形態の組換え方法によりアミノ酸をコードする核酸を合成することにより行うことができる。重要なのは、用語「重鎖」又は「軽鎖」は、開示するＣＤＲの１つ又はいくつかを含む、足場タンパク質を広く意味することであり、抗体技術における従来の用語の意味に限定されるものではないことである。
【００２４】
更に、用語「抗体」又は「ＣＤＩＭ−結合抗体」は、本明細書で用いる場合、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、組換え抗体、ヒト化抗体（Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ第３２１巻：５２２〜５２５頁、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ第３３２巻：３２３〜３２９頁、及びＰｒｅｓｔａ（１９９２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．第２巻：５９３〜５９６頁）、キメラ抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、第８１巻：６８５１〜６８５５頁）、少なくとも２つの抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、又はその抗体断片を意味する。用語「抗体断片」は、前記抗体の任意の部分を含み、好ましくはその抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、第９０巻：６４４４〜６４４８頁）、一本鎖抗体分子（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９４年）、２６９〜３１５頁）、及びＣＤＩＭに結合する所望の能力を発揮する限り、その他の断片を含む。
【００２５】
更に、用語「抗体」又は「ＣＤＩＭ結合抗体」は、本明細書で用いる場合、工学的に生み出された抗体のサブドメイン又は天然由来の抗体の変異体を含有する、抗体様分子を含んでもよい。このような抗体様分子は、ラクダ類等の天然起源（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら（２００１年）Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第７４巻：２７７〜３０２頁）由来の、又は、ヒト、ラクダ類、又はその他の種に由来するライブラリのｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ（Ｈｏｌｔら、２００３年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第２１巻：４８４〜９０頁）により得られた、単一ドメイン抗体、例えばＶＨ単独ドメイン又はＶＬ単独ドメインであってもよい。
【００２６】
本発明に基づけば、「Ｆｖ断片」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する最小限の抗体断片である。この領域は、非共有結合で協力に結合された、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体から構成される。各可変ドメインの３つのＣＤＲ（重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）が、相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を構成する立体配置を有する。全体として、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識して結合する能力を有する。「Ｆａｂ断片」は、「Ｆａｂ’断片」とは異なり、「Ｆａｂ’断片」は軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。「Ｆａｂ断片」は、抗体ヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステインを含むいくつかの残基が、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加されている。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、間にヒンジシステインを有する一対の「Ｆａｂ’断片」として当初生成される。このような抗体断片を作製する方法、例えばパパイン消化又はペプシン消化は、当業者にとって公知である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態において、抗ＣＤＩＭ抗体は、ＩｇＡ−、ＩｇＤ−、ＩｇＥ、ＩｇＧ−、又はＩｇＭ−タイプであり、好ましくは、但しこれらに限定されるものではないが、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−、ＩｇＧ４−、ＩｇＭ１−、及びＩｇＭ２−タイプを含むＩｇＧ−タイプ、又はＩｇＭ−タイプである。ほとんどの実施形態では、抗体はＩｇＭタイプである。軽鎖は、λ−１、λ−２、又はκのいずれかであり得る。Ｊ鎖は、含まれていても、又は、欠失していてもよい。
【００２８】
ＩｇＧは、これに限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むいくつかのサブタイプを有する。ＩｇＡサブタイプには、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が含まれる。ヒトでは、ＩｇＡアイソタイプは、４つの重鎖及び４つの軽鎖を有し；ＩｇＧ及びＩｇＥアイソタイプは、２つの重鎖及び２つの軽鎖を有し；かつ、ＩｇＭアイソタイプは、１０個又は１２個の重鎖及び１０個又は１２個の軽鎖（五量体又は六量体）を有する。天然由来のＩｇＭ分子では、Ｊ鎖は五量体立体配置を安定化させる。
【００２９】
重鎖Ｃ領域は、典型的にはエフェクター機能を担い得る１つ又は複数のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存する。一実施形態では、ＣＤＩＭ結合タンパク質は、ＩｇＭサブタイプのものである。完全長の軽鎖及び重鎖においては、可変領域及び定常領域は、約１２個以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域により連結されることができ、また、重鎖は更に約１０個のアミノ酸からなる「Ｄ」領域も含む。（例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編）（１９８９年）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓを参照）。
【００３０】
ＣＤＩＭ結合タンパク質
本開示の第１の態様は、ヒト末梢Ｂリンパ球、脾臓Ｂリンパ球、腫瘍性Ｂリンパ球、及びいくつかの固形腫瘍上のＣＤＩＭエピトープに結合する、単離された結合タンパク質に関する。
【００３１】
一実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１〜２２のいずれかに示す配列を有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の少なくとも１つを含む重鎖、及び／又は、配列番号２３又は２４に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の少なくとも１つを含む軽鎖を含む。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、少なくとも配列番号１〜２２に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、軽鎖とを含む。更に別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１〜２２に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３のそれぞれと、軽鎖とを含む。他の実施形態において、抗原結合タンパク質は、更に、配列番号２３又は２４のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を軽鎖に組み込まれた形で含む。いくつかの実施形態においては、抗原結合タンパク質は、更に、配列番号１〜２２に示すＦＲ１を重鎖に組み込まれた形で有する。
【００３２】
更に別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１〜２２のいずれかに示す重鎖可変領域を含む。また、本開示は、抗原結合タンパク質が、配列番号２３又は２４に示す配列を有する軽鎖可変領域を備える実施形態を含む。更に、本開示は、配列番号１〜２２のいずれかに示す重鎖可変領域、及び、配列番号２３又は２４に示す軽鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質に対する。図１Ａ〜Ｄは、本明細書で開示するＣＤＩＭ結合タンパク質の代表的な２２個の固有の重鎖可変領域を示す。図１Ｅは、２つの軽鎖可変領域（配列番号２３及び２４）を表す。図１Ｆは、重鎖定常領域（Ｉｇμ）（配列番号２５）、及び、軽鎖定常領域（Ｉｇλ及びＩｇκ）（配列番号２６及び２７）を示す。配列番号１０８は、ＣＤＩＭ結合抗体であるＭＡｂ２１６（Ｂｈａｔら、２０００年、上掲）を表し、能力及び特異性を評価する際に実験用の参照抗体として用いた。下記実施例を参照。
【００３３】
各重鎖可変領域は、重鎖定常領域に結合して完全な重鎖を形成することができ、また、各軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域に結合して完全な軽鎖を形成することができる。本明細書で開示する例示的な完全型重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２８〜４９に示す配列を有する。本明細書で開示する例示的な軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号５０及び５１に示すアミノ酸配列を有する。上述において説明したように、２つの重鎖配列及び２つの軽鎖配列は、完全型の抗体である四量体を形成し得る。本明細書は、特に、ＩＧＭ１、ＩＧＭ２、ＩＧＭ３、ＩＧＭ４、ＩＧＭ５、ＩＧＭ６、ＩＧＭ７、ＩＧＭ８、ＩＧＭ９、ＩＧＭ１０、ＩＧＭ１１、ＩＧＭ１２、ＩＧＭ１３、ＩＧＭ１４、ＩＧＭ１５、ＩＧＭ１６、ＩＧＭ１７、ＩＧＭ１８、ＩＧＭ１９、ＩＧＭ２０、ＩＧＭ２１、ＩＧＭ２２、ＩＧＭ２３、ＩＧＭ２４、ＩＧＭ２５、ＩＧＭ２６、ＩＧＭ２７、ＩＧＭ２８、ＩＧＭ２９、ＩＧＭ３０、ＩＧＭ３１、ＩＧＭ３２、ＩＧＭ３３、ＩＧＭ３４、ＩＧＭ３５、ＩＧＭ３６、ＩＧＭ３７、ＩＧＭ３８、ＩＧＭ３９、ＩＧＭ４０、ＩＧＭ４１、ＩＧＭ４２、ＩＧＭ４３、及びＩＧＭ４４と命名された例示的なＣＤＩＭ結合抗体四量体を開示する（本明細書では、総称して「ＩＧＭ１〜ＩＧＭ４４」という）。図２Ａ〜２Ｖに示す通り、これら４４個の開示するＣＤＩＭ結合タンパク質は、配列番号２８〜４９の重鎖から構成され、それぞれ配列番号５０及び５１のいずれかの軽鎖と組み合わされる。後述の表３は、様々なポリペプチド及びポリヌクレオチドの配列番号と、ＩＧＭ１〜ＩＧＭ４４抗原結合タンパク質との間の相関関係を示す。
【００３４】
一実施形態において、単離された抗原結合タンパク質はＣＤＩＭに結合し、かつ、重鎖ＣＤＲ３配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４ＧＸ５ＳＸ６Ｘ７を含み、ここで、
Ｘ１は、Ｇ、Ａ、又はＲであり、
Ｘ２は、Ｒ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ３は、Ｍ、Ｔ、又はＲであり、
Ｘ４は、Ｒ、Ｗ、又はＹであり、
Ｘ５は、Ａ、Ｓ、又はＧであり、
Ｘ６は、Ｉ、Ｖ、又はＹであり、かつ
Ｘ７は、Ｎであるか、又はアミノ酸が存在せず、
ここで、１位〜３位（重鎖可変領域の９８位〜１００位に対応し、９７位はＣＤＲ３領域に先行する不変のアルギニンである）中には、１つの、かつ１より多い数でないアルギニンが存在する。
【００３５】
別の実施形態では、単離された抗原結合タンパク質はＣＤＩＭに結合し、かつ、重鎖ＣＤＲ３配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４ＧＸ５ＳＸ６Ｘ７を含み、ここで、
Ｘ１は、Ｇ、Ａ、又はＲであり、
Ｘ２は、Ｒ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ３は、Ｍ、Ｔ、又はＲであり、
Ｘ４は、Ｒ、又はＷであり、
Ｘ５は、Ａ、又はＳであり、
Ｘ６は、Ｉ、又はＶであり、かつ
Ｘ７は、Ｎであるか、又はアミノ酸が存在せず、
ここで、１位〜３位（重鎖可変領域の９８位〜１００位に対応し、９７位はＣＤＲ３領域に先行する不変のアルギニン）中には、１つの、かつ１より多い数でないアルギニンが存在する。
【００３６】
本発明によれば、本発明の結合タンパク質を構成するアミノ酸は、従来型の２０種類のアミノ酸に限定されないものと理解される（本明細書において参照により組み込まれるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ及びＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９１年））を参照）。例えば、アミノ酸には、従来型の２０種類のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−，α−二置換型アミノ酸及びＮ−アルキルアミノ酸等の非天然のアミノ酸、乳酸、並びにその他の非従来型アミノ酸が含まれ得る。本発明の結合タンパク質に適した構成要素となり得る非従来型アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、及びその他の類似したアミノ酸、並びにイミノ酸、例えば４−ヒドロキシプロリンが挙げられる。
【００３７】
更に、本発明に基づけば、配列番号１〜５１に示すアミノ酸配列に若干の変異が入ったものも本発明に含まれるものとして考えられる。但し、そのようなアミノ酸配列の変異は、配列番号１〜５１に示す配列の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、及び最も好ましくは９９％を維持することを条件とする。変異は、フレームワーク領域内（すなわち、ＣＤＲの外）、ＣＤＲ内、又はフレームワーク領域とＣＤＲ内の両方にあってもよい。配列番号１〜５１に示すアミノ酸配列における変異、すなわち少なくとも１つのアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は置換は、機能的ドメインの境界近傍に生ずる。構造的ドメイン及び機能的ドメインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを公的又は私的な配列データベースと比較することにより識別され得る。構造及び／又は機能が公知の他の結合タンパク質で生じている、配列モチーフ又は予想されるタンパク質構造ドメインの同定には、コンピュータによる比較手法を利用することができる。既知の三次元構造に折りたたまれるタンパク質配列を同定する方法が公知である。例えば、本明細書においていずれも参照により引用される、Ｂｏｗｉｅら（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第２５３巻：１６４頁、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４年））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ及びＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１年））、及びＴｈｏｒｎｔｏｎら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ第３５４巻：１０５頁を参照すること。従って、当業者は、本発明に基づく構造的及び機能的ドメインを特定するために利用できる配列モチーフ及び構造形態を認識することができる。
【００３８】
配列番号１〜５１に示すアミノ酸配列の特に好ましい変異は、タンパク質の加水分解又は酸化への抵抗性を高め、グリコシル化パターンを変化させ、結合親和性を変化させ、又は結合タンパク質のその他の物理化学的特性若しくは機能的特性を付与若しくは改変するものである。特に、保存的アミノ酸置換が想定される。保存的な置換は、アミノ酸の側鎖が相関するアミノ酸ファミリー内で生じるものである。好ましいアミノ酸ファミリーは以下の通りである：酸性ファミリー＝アスパラギン酸、グルタミン酸；塩基性ファミリー＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；非極性ファミリー＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び非荷電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは、脂肪族ヒドロキシファミリー＝セリン及びトレオニン；アミド含有ファミリー＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族ファミリー＝アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン；並びに芳香族ファミリー＝フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンである。例えば、ロイシンのイソロイシン若しくはバリンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、トレオニンのセリンによる置換、又は同様の構造的に関連したアミノ酸とのアミノ酸置換は、特に置換がフレームワーク部位におけるアミノ酸でない場合には、得られた結合タンパク質の結合又は特性に対して重大な影響を及ぼさないと予測することが妥当である。アミノ酸変化の結果、機能的結合タンパク質、すなわちＣＤＩＭに結合する抗原結合タンパク質が得られたかどうかは、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳで分析することにより容易に確認できる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ＣＤＩＭ結合タンパク質は、抗体様の結合活性を有する「足場タンパク質」であり、配列番号１〜２４の１つ又はいくつかのＣＤＲが、上述で定義した足場に組み込まれる。ある実施形態では、少なくともＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３が足場に組み込まれる。ある実施形態では、６つ全てのＣＤＲが足場に組み込まれる。足場タンパク質が、ＣＤＩＭ結合活性を有するか否かは、天然由来のＣＤＩＭ結合抗体であるＭＡｂ２１６との結合の競合について、ＥＬＩＳＡ若しくはＦＡＣＳによる分析により、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏ機能分析により容易に確認できる。
【００４０】
更に、本発明によれば、本発明のＣＤＩＭ結合抗体は、完全ヒト抗体又はヒト化抗体であってもよい。ヒト抗体は、異種抗体、例えばマウス又はラットの可変領域及び／又は定常領域を有する抗体における問題を回避する。マウス又はラット由来タンパク質等の異種由来タンパク質が存在することにより、患者による当該抗体に対する免疫反応が誘導され、その後抗体中和により急速に抗体が排除され、治療有用性が喪失し、かつ／又は重度で生命に係わるアレルギー反応をもたらす可能性がある。
【００４１】
本明細書に記載する抗原結合タンパク質は抗体であり得、又は抗体に由来し得る。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、これに限定されるものではないが、モノクロナール抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では、時に「抗体模倣物」と呼ぶ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書では、時に「抗体コンジュゲート」と呼ぶ）、及びそれらの断片を含む抗体に基づく。本明細書に記載する抗原結合タンパク質は、腫瘍性Ｂ細胞及びいくつかの固形腫瘍細胞を含む、全てのＢ細胞上のＣＤＩＭエピトープに結合することが示されている。実施例に示すように、傷害を受けたＢ細胞が自らを修復し、生き残る能力は低下し、又は阻害される。その結果、開示する抗原結合タンパク質は、腫瘍細胞を含むＢ細胞を激減させ、殺傷する能力を有する。本明細書で開示する抗原結合タンパク質は、様々な用途を有する。いくつかの抗原結合タンパク質は、例えば、特異的結合アッセイ、ＣＤＩＭ発現細胞のアフィニティー精製、及び、固形腫瘍細胞やＢ細胞由来細胞を含むＣＤＩＭ発現細胞を同定するスクリーニングアッセイで有用である。更に、開示する抗原結合タンパク質は、Ｂ細胞増殖性疾患及び自己免疫疾患等の疾患の診断及び／又は治療において利用可能である。そのために、開示する抗原結合タンパク質は、単独で又は低分子化学療法剤と併用して利用することができる。
【００４２】
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、多価ＣＤＩＭ結合タンパク質（すなわち、ＣＤＩＭエピトープに対する２つ以上の結合部位を備えるＣＤＩＭ結合タンパク質）である。結合タンパク質は、ＣＤＩＭエピトープに対して、一般的に少なくとも約１０−６Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０−７Ｍの特異的なアフィニティー及びアビディティーを有する受容体として機能する。受容体が多価であることにより、細胞膜表面上の少なくとも２つのＣＤＩＭエピトープに同時に結合することが可能である。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンファミリーに由来する抗体が利用可能であり、特にＦｃにより開始されるプロセスと関連した様々な細胞毒性プロセスと関連することを必要とするものではない。一実施形態では、抗体はＩｇＭ分子であり、その五量体又は六量体構造は、立体障害により妨げられない架橋を可能である。ある実施形態では、抗体組成物はＩｇＭ五量体とＩｇＭ六量体との混合物であり、少なくとも２０％の六量体、少なくとも３０％の六量体、少なくとも４０％の六量体、少なくとも５０％の六量体、少なくとも６０％の六量体、少なくとも７０％の六量体、又は、少なくとも８０％の六量体を含む。あるいは、抗体断片又は抗体と同様に作用する合成代替物が利用可能である。例えば、ＣＤＩＭエピトープと特異的に結合し、かつこれを架橋することができる合成低分子が考えられる。
【００４３】
一実施形態では、抗体はＪ鎖を有し、別の実施形態では、抗体はＪ鎖を有さない。
【００４４】
一態様では、抗原結合タンパク質は、ＶＨ４〜３４生殖細胞株の配列に基づき構築された組換え抗体である。ＶＨ４〜３４遺伝子（重鎖可変領域）は、５３個の特定されたヒト機能性抗体生殖系列遺伝子の１つである。ＶＨ４〜３４遺伝子は、全てのハプロタイプに存在し、かつ、無関係の個人から単離された生殖細胞株ＤＮＡにおいて配列変異体が見出されていない。抗Ｂ細胞ＶＨ４〜３４抗体は、Ｂ細胞に対して細胞毒性である（Ｂｈａｔら（１９９７年）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１０８巻：１５１頁、及びＢｈａｔら（２００１年）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．第３９巻：５９頁）。上述で示唆したように、抗体により誘導された細胞膜の欠陥又は孔は、その他の周知の孔形成タンパク質により形成される欠陥又は孔よりも大きい。細胞を透過性にすることにより、開示するＣＤＩＭ結合タンパク質は、標的細胞の顕著な激減を実現する（特許公開番号第２０１００３２２８４９号も参照）。透過処理されたＢ細胞は、これに限定されるものではないが、放射性同位体、細胞毒性抗体、イムノコンジュゲート、リガンドコンジュゲート、免疫抑制剤、細胞増殖制御剤及び／若しくは阻害剤、毒素、並びに／又は、これらの混合物を含む、追加の細胞毒性薬剤の作用をより受けやすくなる。損傷を受けた細胞膜は、化学療法剤等の細胞毒性薬剤の進入を可能にし、このような薬剤に対して抵抗性又は不透過性の細胞においても、化学療法剤の有効性を高める。それぞれＣＤＩＭエピトープ又はＣＤＩＭ様エピトープを発現する、あらゆるＢ細胞又はがん細胞は、ＣＤＩＭ結合タンパク質で治療することができ、また開示する抗原結合タンパク質による減少及び殺傷の対象となる。
【００４５】
本開示のＣＤＩＭ結合タンパク質は、ヒト末梢Ｂリンパ球、脾臓Ｂリンパ球、及び腫瘍性Ｂリンパ球、並びにいくつかの固形腫瘍上のＣＤＩＭエピトープを認識する。多くのＩｇＭ抗体は多反応性である。すなわち、同抗体は種々異なる、構造的に無関係の自己及び非自己外来抗原に結合することができる。しかし、本明細書で開示する抗原結合タンパク質は、いくつかの天然由来ＣＤＩＭ抗体よりも多価反応性が低いことが判明した。よって、開示する抗原結合タンパク質は、非特異的結合が少なく、これにより同タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏ用途においてより優れた治療及び診断の候補となる。その多価反応性の低下は図５Ａ〜５Ｅに示されるとおりであり、ここでは、複数の非ＣＤＩＭ抗原、特にｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、脂質Ａ、カルジオリピン、及びＭＤＡ−ＬＤＬに対する結合親和力が低下し又は欠失した抗原結合タンパク質の例を示している。これにより、本抗体は「抗原沈降」（ＣＤＩＭ以外の抗原との結合）がなく、標的細胞に結合するために必要な投与量がより少ないため、開示するＣＤＩＭ結合タンパク質は、治療への応用で安全であることが示唆される。多価反応性抗体の異なる抗原に対するアフィニティーは、１０００倍程度変化し、かつ、単反応性抗体の対応する抗原に対するアフィニティーよりも一般的に低めである。いくつかの多価反応性抗体には少数の置換が認められるものの、その多くは、通常、生殖細胞系列であるか又はほぼ生殖細胞系列である。多価反応性抗体は、単反応性抗体より急速に循環系から排除され得る。多価反応性抗体が急速に排除されるのは、内因性の宿主抗原にこれらの抗体が結合することによると考えられている（Ｚｈｏｕら（２００７年）Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．第２９巻（４）：２１９〜２２８頁も参照）。自然抗体の多くは多価反応性抗体であり、幅広い抗菌活性を有する。これは、抗原刺激が存在しないことが分かっていても新生児の血清に抗菌活性があることの一つの説明となる（Ｚｈｏｕら（２００７年）、上掲、も参照）。しかし、治療目的の場合、ＣＤＩＭエピトープを発現するＢ細胞及びがん細胞への結合及び殺傷を達成するために、単一特異性の急速に排除されない抗体を採用することが一般的には望ましい。
【００４６】
特定の治療に応用において、例えば自己免疫疾患を治療する場合、Ｂ細胞は様々な機構により複数の自己免疫疾患に関与しているので、ＣＤＩＭ結合タンパク質はＢ細胞に結合し、これを選択的に殺傷するのが望ましい（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｌ．（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ（Ｒｅｖｉｅｗｓ）第５巻：５６４〜５７６頁）。Ｂ細胞が急速に激減すると、免疫系の活性が低下し、その結果炎症及び組織損傷等の多くの関連する副作用が低減する。がん治療においては、細胞の過増殖及びがんの他の臓器への転移を阻止するために、腫瘍性Ｂ細胞又はがん細胞等の選択的細胞集団を殺傷するのが望ましい。本明細書では、他の薬剤及び抗癌剤との併用療法が、特定の細胞を殺傷せしめる際に有益となり得る。従って、ＣＤＩＭ結合タンパク質は、自己免疫疾患及びがんの治療において、応用することができる。
【００４７】
上述で議論したように、開示する抗原結合タンパク質がその線状ラクトサミンリガンドに結合することにより、細胞膜の分解及び大型の膜細孔形成を引き起こし、その結果細胞溶解が生ずる。例えば、ビンクリスチンと開示する抗原結合タンパク質を併用すると、各単一薬剤単独の相加的効果と比較して、Ｂ細胞に対する細胞毒性の程度は増強される。従って、ＣＤＩＭ結合タンパク質は、単独でも、他の薬剤及び／又は抗癌剤と併用しても投与することができ、それにより腫瘍の標的化及び効果を得ることができる。更に、ＣＤＩＭ結合タンパク質は、単独でも、他の薬剤及び／又は抗癌剤と併用して患者に投与することができ、それによりがん及び自己免疫疾患を含む様々な疾患を治療及び／又は診断することができる。ＣＤＩＭ結合タンパク質と併用して利用することができる他の薬剤の例を、表１に示す。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
ある実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、標識基と結合している。このような結合タンパク質は診断用途に特に適する。本明細書で用いる場合、用語「標識基」とは、検出可能なマーカーを意味し、例えば、放射標識アミノ酸、又は標識物質と結合したアビジン（例えば、蛍光マーカーに結合したストレプトアビジン、又は、光学的方法若しくは比色法により検出可能な酵素活性）により検出可能なビオチニル部分を意味する。抗体等のポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法は、当技術分野において公知であり、本発明の実施に利用可能である。適した標識基の例としては、これらに限定されるものではないが、放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、又は二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対応する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）により認識される所定のポリペプチドエピトープを挙げることができる。特定の観点では、立体障害の可能性を低減するために、標識基は、様々な長さのスペーサーアームにより結合することが望ましい。
【００５０】
あるいは、本明細書で開示する抗原結合タンパク質は、本発明の別の好ましい実施形態では、エフェクター基と結びつく場合がある。このような結合タンパク質は、治療用途に特に適する。本明細書で用いる場合、用語「エフェクター基」は、細胞毒性基、例えば、放射性同位体又は放射性核種、毒素、治療基、当技術分野において公知の他のエフェクター基等を意味する。適するエフェクター基の例として、放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、カリケアマイシン、オーリスタチン等のドラスタチン類似体、及びＤＭ１を含む、ゲルダナマイシン及びマイタンシン誘導体等の化学療法剤が挙げられる。ある観点では、立体障害の可能性を低減するために、エフェクター基は、様々な長さのスペーサーアームにより結合することが望ましい。
【００５１】
ＣＤＩＭ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び発現系
本発明の別の態様は、本発明の結合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。本発明において、用語「単離された核酸分子」とは、ゲノム、ｃＤＮＡ、若しくは合成、又はこれらの組み合わせのポリヌクレオチドを意味し、その由来に基づいて、「単離された核酸分子」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が自然界で見出されるポリヌクレオチドの全て又は一部と関連しない、（２）自然界では結合していないポリヌクレオチドと作動可能に結合している、又は（３）より長い配列の一部として自然界では存在しない。更に、用語「核酸分子」は、本明細書においては、長さが少なくとも１０塩基からなるヌクレオチドのポリマー形態を意味し、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド又はいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態、例えば、修飾又は置換された糖類等を含むヌクレオチドであってもよい。当該用語には、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ形態も含まれる。
【００５２】
ＩＧＭ１〜ＩＧＭ４４の重鎖配列をコードする完全長核酸配列（配列番号５２〜７３）の例を、図３Ａ〜Ｋに示す。ＩＧＭ１〜ＩＧＭ４４の軽鎖配列をコードする完全長核酸配列（配列番号７４及び７５）の例を図３Ｌに示す。遺伝子コードには縮重があるため、本明細書に記載するＣＤＩＭ結合タンパク質をコードするその他の核酸も考えられる。
【００５３】
本発明の一実施形態では、本発明の核酸分子は、制御配列と作動可能に結合している。用語「制御配列」は、本明細書で用いる場合、結合するコーディング配列の発現及びプロセシングを実現するのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる。原核生物では、制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を一般的に含む。真核生物では、一般的に、かかる制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。本発明によれば、用語「制御配列」は、発現及びプロセシングに必要不可欠な全ての構成要素を最小限含むことを意図しており、かつ、有利な追加の構成要素、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を含んでもよい。更に、用語「作動可能に結合した」とは、本明細書で用いる場合、構成要素の位置を意味し、構成要素が意図されたとおりに機能することができる位置関係にあることを意味する。更に、本発明において、コーディング配列と作動可能に結合した発現制御配列は、発現制御配列と適合する条件下でコーディング配列が発現する形で結合されている。
【００５４】
本発明の更なる態様は、本発明の結合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターである。核酸分子は、制御配列と作動可能に結合していてもよい。更に、ベクターは、複製開始点又は選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。本発明に基づき利用可能なベクターとして、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等が挙げられる。
【００５５】
本発明の別の態様は、本発明の核酸分子又はベクターにより形質転換された宿主細胞と関連する。形質転換は、例えばウイルス（又はウイルスベクター）内にポリヌクレオチドを封入し、宿主細胞に該ウイルス（又はベクター）を形質導入することを含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する任意の公知の方法により、又は、参照により本明細書に引用される米国特許第４，３９９２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、及び同第４，９５９，４５５により例示されるような当技術分野において公知のトランスフェクション手法により実施可能である。特に、非相同的ポリヌクレオチドを哺乳動物の細胞に導入する方法は当技術分野において周知であり、デキストラン媒介型トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介型トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソーム内カプセル化、及びＤＮＡの核内直接マイクロインジェクションを含む。本発明において利用可能な宿主細胞の例としては、哺乳動物細胞、例えばハムスター、ウサギ、ラット、ブタ、マウス、又はその他の動物細胞等のハイブリドーマ真核細胞；植物細胞及び真菌細胞、例えばコーン、タバコ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）；原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；及び抗体生成のために当技術分野で用いられるその他の細胞が挙げられる。特に、発現用宿主として入手可能な哺乳動物の細胞株は当技術分野において周知であり、これらに限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、及びいくつかのその他細胞を含む、アメリカ合衆国培養細胞株保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。
【００５６】
ＣＤＩＭ結合タンパク質の医薬組成物、並びに治療及び診断方法
本開示の更なる態様は、医薬組成物、とりわけＣＤＩＭ結合タンパク質である。結合タンパク質は、本開示の方法で用いられる医薬品として製剤化される。Ｂリンパ球のＣＤＩＭエピトープへのＣＤＩＭ結合タンパク質の結合と関連した生物学的反応を刺激し得るあらゆる組成物又は化合物が、本開示において医薬品として利用可能である。製剤及び投与に関する技法の一般詳細内容は、科学文献に十分に記載されている（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．を参照）。ＣＤＩＭ結合タンパク質の医薬製剤は、医薬品製造に関する当技術分野において公知の任意の方法により調製可能である。ＣＤＩＭ結合タンパク質は、静脈内、筋肉内、腹腔内注射、経口投与、局所投与、又はその他の経路を含む、任意の慣習的に許容される方法による投与形態に製剤化可能である。説明的事例を以下に記載する。
【００５７】
経口投与用の医薬製剤は、当技術分野において周知の薬学的に許容される担体を用いて、経口投与に適する用量で処方化可能である。かかる担体は、患者が摂取するのに適する錠剤、丸薬、粉末、カプセル、液体、ロゼンジ、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物等の単位投与剤形での医薬製剤の処方化を可能にする。経口用の医薬製剤は、ＣＤＩＭ結合タンパク質と固体添加剤を組み合わせること、所望の場合には、錠剤又は丸薬を得るのに適する追加の化合物を添加した後、任意選択的に、得られた混合物をグラインディングし、及び粒剤混合物を処理することにより入手可能である。適する固体添加剤として、炭水化物又はタンパク質充填剤が挙げられ、これには、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖；コーン、小麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物に由来するスターチ；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース；及びアラビック、トラガントを含むガム；並びにゼラチン及びコラーゲン等のタンパク質が含まれるが、但しこれらに限定されない。所望の場合には、崩壊剤又は可溶化剤、例えば架橋化ポリビニルピロリドン、カンテン、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウム等のその塩が添加され得る。経口的にも利用可能な本開示の医薬製剤として、例えばゼラチンからなるプッシュフィットカプセルの他、ゼラチン及びグリセロール又はソルビトール等のコーティング剤からなるソフトシールドカプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース若しくはスターチ等の充填剤又はバインダー、タルク若しくはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、及び任意選択的に安定剤と混合されたＣＤＩＭ結合タンパク質を含有し得る。ソフトカプセルの場合、ＣＤＩＭ結合タンパク質は、安定剤を含む又は含まない脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール等の適する液体中で溶解又は懸濁可能である。
【００５８】
本開示の水性懸濁物は、水性懸濁物の製造に適する添加剤と混合したＣＤＩＭ結合タンパク質を含有する。かかる添加剤として、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、及びアカシアガム等、及び分散剤又は湿潤剤、例えば天然由来のリン脂質（例えば、レシチン）、アルキレン酸化物と脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシエタノール）、酸化エチレンと脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、又は酸化エチレンと脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）等が挙げられる。水性懸濁物は、１つ又は複数の防腐剤、例えばエチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート等、１つ又は複数の着色剤、１つ又は複数の着香料、及び１つ又は複数の甘味料、例えばスクロース、アスパルテーム、又はサッカリン等も含み得る。処方物は、モル浸透圧濃度について調整可能である。
【００５９】
油性懸濁物は、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、又はココナッツ油等の植物油中、又は液体パラフィン等の鉱物油中でＣＤＩＭ結合タンパク質を懸濁することにより処方化可能である。油性懸濁物は、増粘剤、例えば、みつろう、ハードパラフィン、又はセチルアルコール等を含み得る。甘味料は、美味な経口調製物を提供するために添加され得る。これらの処方物は、アスコルビン酸等の酸化防止剤を添加することにより保存可能である。
【００６０】
水の添加による水性懸濁物の調製に適する本開示の分散性粉末及び粒剤は、分散剤、懸濁剤、及び／又は湿潤剤、並びに１つ又は複数の防腐剤と混合したＣＤＩＭ結合タンパク質から処方化可能である。適する分散剤、又は湿潤剤、及び懸濁剤の例として、上述で開示したものが挙げられる。追加の添加剤、例えば甘味料、着香料、及び着色剤も存在し得る。
【００６１】
ＣＤＩＭ結合タンパク質の医薬製剤は、水中油型エマルジョの形態でもあり得る。油相は、オリーブ油又はラッカセイ油等の植物油、液体パラフィン等の鉱物油、又はこれらの混合物であり得る。適する乳化剤として、天然起源のガム、例えばアカシアガム及びトラガントガム等、天然由来のリン脂質、例えば大豆レシチン等、脂肪酸とヘキシトール無水物とに由来するエステル又は部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート等、及びこれらの部分エステルと酸化エチレンとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等が挙げられる。エマルジョンは、甘味料及び着香料も含み得る。シロップ及びエリキシル剤は、甘味料、例えばグリセロール、ソルビトール、又はスクロース等と共に処方化され得る。かかる処方物は、粘滑剤、防腐剤、着香料、又は着色剤も含み得る。
【００６２】
ＣＤＩＭ結合タンパク質が、静脈内注射により送達される場合には、医薬製剤は、滅菌状態の注射型調製物の形態、例えば滅菌状態の注射型水性又は油性の懸濁物であり得る。この懸濁物は、すでに上述した、適した分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、公知技術により処方化され得る。滅菌注射型調製物は、無毒の非経口的に許容される賦形剤又は溶媒中の滅菌注射液又は懸濁物でもあり得る。採用し得る許容される媒体及び溶媒として、とりわけ水及び等張性塩化ナトリウムのリンガー溶液が挙げられる。更に、滅菌性の不揮発性油が、溶媒又は懸濁媒体として慣習的に利用され得る。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含め、任意の無菌不揮発性油が採用され得る。更に、オレイン酸等の脂肪酸も、注射型の調製物で同様に利用可能である。
【００６３】
本開示の方法は、リンパ性がん又は白血病（例えば、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病又はＡＬＬ）、Ｂ細胞が関与するあらゆる形態の自己免疫疾患（例えば、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス又はＳＬＥ）、あらゆる形態のＢ細胞過増殖、例えばリンパ腫及びミエローマ（例えば、非ホジキンリンパ腫）、ＣＤＩＭ抗原を発現する特定の形態の固形腫瘍、及び／又は関連する症状に罹患した、ヒト及びヒト以外の患者を治療するものである。本方法に適切なＣＤＩＭ結合タンパク質の量は、治療的に有効な用量と考えられる。あるいは、別の薬剤又は別の薬物と併用した場合でも、本発明の方法に適切なＣＤＩＭ結合タンパク質の量は、治療的に有効な用量と考えられる。その他の薬剤として、例えば、これに限定されるものではないが、放射性同位体、細胞毒性抗体、イムノコンジュゲート、リガンドコンジュゲート、免疫抑制剤、細胞増殖制御剤及び／若しくは阻害剤、毒素、又はこれらの混合物を含む、細胞毒性薬が挙げられる。化学療法剤又は化合物（表１も参照）としては、多くの場合、微小管の重合又は脱重合を妨害する薬剤、例えばタキサン、ビンカアルカロイド、又はコルヒチン、又はこれらの混合物等が挙げられる。ビンカアルカロイドとして、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、若しくはビノレルビン、又はこれらの混合物が挙げられる。タキサンとしては、これらに限定されるものではないが、パクリタキセル、ドセタキセル、又はこれらの混合物が挙げられる。開示する抗原結合タンパク質と併用して投与可能な細胞毒性抗体は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒ、α−４／β−１インテグリン（ＶＬＡ４）、ＢＬＹＳ受容体、細胞表面イディオタイプＩｇ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、又はこれらの混合物を含むＢ細胞上の細胞表面受容体に対して、通常、特異的に結合する。従って、細胞毒性抗体は、エファリズマブ（ラプティバ（ＲＡＰＴＩＶＡ））、リツキシマブ（リツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ））、ダクリズマブ（ゼナパックス（ＺＥＮＡＰＡＸ））、エプラツズマブ、バシリキシマブ（シムレクト（ＳＩＭＵＬＥＣＴ））、抗ＣＤ５２（キャンパス（ＣＡＭＰＡＴＨ））、ナタリズマブ、インフリキシマブ（レミケード（ＲＥＭＩＣＡＤＥ））等であり得る。免疫抑制剤として、グルココルチコイド、カルシニュリン阻害剤、抗増殖薬／代謝拮抗剤、又は免疫抑制抗体が挙げられるが、但しこれらに限定されない。１つの実施形態では、薬剤として、エトポシド（ＶＰ−１６）、パクリタキセル（タキソール（ｔａｘｏｌ））、ａｒａ−Ｃ（シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ））、ビンクリスチン、ノコダゾール、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｓｉｎｅ）、ダウノルビシン、サイトカラシン、ジャスプラキノリド等が挙げられる。
【００６４】
本発明の１つの実施形態では、医薬組成物に含まれる本明細書で開示する少なくとも１つの結合タンパク質は、エフェクター、例えばカリケアマイシン、オーリスタチン−ＰＥ、放射性同位体等、又は毒性の化学療法剤、例えばゲルダナマイシン及びマイタンシン等と結合している。特に、これらの結合タンパク質融合体は、除去するために、ＣＤＩＭを発現する細胞、例えばがん細胞に対して標的化するのに有用である。
【００６５】
更に、本明細書で開示する結合タンパク質を放射性同位体と結合させることにより、腫瘍治療に有利となる。化学療法及びその他の形態のがん治療とは異なり、放射線免疫療法又は放射性同位体−結合タンパク質併用物の投与は、正常で健康な周辺組織に最低限の障害をもたらすものの、がん細胞を直接標的とする。この「魔弾」を用いて、今日利用可能な他の形態の治療法よりもかなり少ない量の放射性同位体で患者を治療することができる。しかるべき放射性同位体として、イットリウム９０（９０Ｙ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、ラジオシルバー（ｒａｄｉｏｓｉｌｖｅｒ）−１１１、ラジオゴールド（ｒａｄｉｏｇｏｌｄ）−１９９、及びビスマス２１３が挙げられる。放射性同位体を結合タンパク質に結合させるには、例えば従来型の二官能性キレートを用いて実施可能である。銀及び金は一価の状態で存在し得るので、イオウベースのリンカーを利用し得るラジオシルバー−１１１及びラジオゴールド−１９９に使用することができる（Ｈａｚｒａら．（１９９４年）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．第２４〜２５号：１〜７頁）。銀放射性同位体を結合させる場合、アスコルビン酸で免疫グロブリンを還元するステップを含んでもよい。更に、チウキセタンは、イブリツモマブ・チウキセタン（ゼヴァリン（Ｚｅｖａｌｉｎ））を形成する、イブリツモマブに付加したＭＸ−ＤＴＰＡリンカーキレート剤である（Ｗｉｔｚｉｇ、Ｔ．Ｅ．（２００１年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第４８巻増刊１号：９１〜５頁）。イブリツモマブ・チウキセタンは、ラジオアイソタイプ、例えばインジウム１１１（１１１Ｉｎ）、又は９０Ｙと反応して、１１１Ｉｎ−イブリツモマブ・チウキセタン及び９０Ｙ−イブリツモマブ・チウキセタンをそれぞれ形成し得る。
【００６６】
更に、本明細書で開示する結合タンパク質は、特にがんの治療で用いられる場合、毒性の化学療法剤、例えばカリケアマイシン（Ｈａｍａｎｎら．（２００２年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．第１３巻：４０〜４６頁）、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒら、（２００２年）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．第９２巻：１５４９〜１９５１頁）、及びマイタンシン、例えばマイタンシノイド薬、ＤＭ１（Ｌｉｕら．（１９９６年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、第９３巻：８６１８〜８６２３号）と融合することができる。酸性又は還元性の条件下で、又は特定のプロテアーゼに曝露した際に薬物を放出する異なるリンカーは、本技術と共に利用可能である。本発明によれば、本明細書で開示する結合タンパク質は、当技術分野の記載に従い融合することができる。
【００６７】
例えば、オーリスタチン−ＰＥは、海洋性の殻がない軟体動物ペプチド成分、ドラスタチン１０の構造的修飾物である微小管阻害薬である。オーリスタチン−ＰＥは、抗腫瘍活性及び抗腫瘍血管活性の両方を有する（Ｏｔａｎｉら．（２０００年）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第９１巻：８３７〜４４頁）。例えば、オーリスタチン−ＰＥは、膵臓がん細胞株において細胞増殖を阻害し、また細胞周期停止及びアポトーシスを誘導する（Ｌｉら．（１９９９年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第３巻：６４７〜６５３頁）。従って、オーリスタチン−ＰＥの抗腫瘍活性及び抗腫瘍血管活性が特定の腫瘍を特異的に標的とするために、オーリスタチン−ＰＥを、本明細書で開示する結合タンパク質と融合させることができる。
【００６８】
投与スケジュール及びこの用途に有効な量、すなわち「投与計画」は、疾患又は状態の段階、疾患又は状態の重症度、有害な副作用の重症度、患者の健康の全身状態、患者の身体状態、年齢等を含む様々な因子に依存する。患者について投薬レジメンを計算する際には、投与方法も考慮される。投薬レジメンは、薬物動態、すなわち吸収速度、生物学的利用能、代謝、クリアランス等についても考慮しなければならない（例えば、Ｌｉｅｄｔｋｅら（２０１２年）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ第９７巻（１）：３０〜３７頁を参照）。
【００６９】
最新技術により、臨床医が個々の患者毎に投薬レジメンを決定することができる。ＣＤＩＭ結合タンパク質は、単独で又はその他の化合物と併用して投与可能である。その他の化合物と併用して投与される場合には、より良好な患者反応及びより持続的な転帰が期待される。併用される化合物は、相乗的に又は相加的に作用し得る。
【００７０】
説明的事例として、ＣＤＩＭ結合タンパク質について以下に記載するガイドラインは、投薬レジメン、すなわち本明細書で開示する方法を実践する際に投与されるあらゆるＣＤＩＭ結合タンパク質の用量スケジュール及び用量レベルを決定するガイダンスとして利用可能である。ＣＤＩＭ結合タンパク質の臨床的有効性は、ビンクリスチン又は類似した薬剤等の第２の化合物を同時投与することにより強化され得る。同様に、低分子化学療法剤の有効性は、ＣＤＩＭ抗原結合タンパク質との同時投与により強化され得る。ＣＤＩＭ結合タンパク質は、およそ０．２５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で有効である。ＣＤＩＭ結合タンパク質処方物の単回又は複数回投与は、リンパ性がん又は白血病（例えば、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病又はＡＬＬ）、Ｂ細胞が関与するあらゆる形態の自己免疫疾患（例えば、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス又はＳＬＥ）、又はあらゆる形態のＢ細胞過増殖、例えばリンパ腫及びミエローマ（例えば、非ホジキンリンパ腫）及び／又は関連する状態に罹患している患者が要求し、また容認する用量及び頻度に応じて実施され得る。処方物は、状態を有効に改善する十分量のＣＤＩＭ結合タンパク質を提供すべきである。例えば、本明細書で開示する４４個の抗原結合タンパク質の任意の１つが、単剤療法により（すなわち、その他の投薬を行わないで）、又は例えばビンクリスチン若しくはその他の薬剤との併用療法で患者に投与され得る（上述参照）。Ｂ細胞上のＣＤＩＭエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質は、約２．５〜約３０００ｍｇ／ｍ２、より好ましくは、約２５〜１０００ｍｇ／ｍ２、又は特に、約７５、１５０、３００、又は６００ｍｇ／ｍ２の用量で投与され得る。更なる態様では、抗体は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、及びより好ましくは、約１．２５、２．５、５、１０、又は２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。抗ＣＤＩＭ抗体は、一般的に毎週投与され、またいくつかの実施形態では、週１回より頻繁に、１日１回ほどの高頻度で投与される。追加の細胞毒性抗体も１週間当たり１０〜３７５ｍｇ／ｍ２の量で４週間投与可能であり、又は１週間当たり０．４〜２０ｍｇ／ｋｇの量で、２〜１０週間、併用療法の形態で投与可能である。１つの実施形態では、ＣＤＩＭ結合タンパク質は、現在のところ、単剤療法として約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの量で毎日患者に投与される。別の実施形態では、ＣＤＩＭ結合タンパク質は、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン又はこれらの混合物からなる群より選択される第２の薬剤を用いる併用療法において、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの量で毎日患者に投与される。
【００７１】
特に、患者に投与される選択的ＣＤＩＭ結合タンパク質の用量は、年齢、疾患の程度、薬物の忍容性、及び併用薬、及び状態に応じて変化し得る。ＣＤＩＭ結合タンパク質は、ＣＤＩＭ結合タンパク質の効果を増強するために、及び有害な副作用を低減するために、別の薬物と併用して患者に投与され得る。第２の薬物を用いる場合、ＣＤＩＭ結合タンパク質を同時投与したときの活性は、１０％〜９０％強化され得るが、また併用療法は、併用治療がもはや有益でない又は不要とみなされるまで継続する。ＣＤＩＭ結合タンパク質は、それぞれ同時に又は規定のタイムフレーム内で、患者に投与され得る。異なるＣＤＩＭ結合タンパク質が、分離した丸薬又は錠剤の状態で、又は合剤型ピルの形態で患者に同時投与可能である。
【００７２】
障害及び疾患
本開示のＣＤＩＭ結合タンパク質は、リンパ性がん又は白血病、Ｂが関与するあらゆる形態の自己免疫疾患、又はあらゆる形態のＢ細胞過増殖、例えば急性又は慢性白血病、リンパ腫、及びミエローマ、及び／又は関連する疾患に罹患している患者を治療するのに利用可能である。リンパ性がん、ウイルス感染、免疫不全、又は自己免疫疾患を含むＢ細胞の過増殖を特徴とするあらゆる状態は、ＣＤＩＭ結合タンパク質で治療可能である。同様に、ＣＤＩＭエピトープ又はＣＤＩＭ様の抗原を発現するあらゆる腫瘍細胞又はがん細胞は、ＣＤＩＭ結合タンパク質で治療可能である。
【００７３】
本開示は、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、グレーヴス病、及び自己免疫性血小板減少症を含む、但しこれらに限定されない自己免疫と関連する障害を対象として、Ｂ細胞を選択的に殺傷及び激減させるための改善したＣＤＩＭ結合タンパク質について記載する。自己反応性Ｂ細胞は、自己タンパク質を標的とした自己抗体を分泌する。Ｂリンパ球は、自己抗体を産生するだけでなく、その抗体産生細胞としての機能と独立して重要な制御的役割も演じている。自己反応性Ｂ細胞は、病原性Ｔ細胞を活性化させて炎症促進性のサイトカインを産生させる能力を有するので、これは自己免疫の観点から重要である。重症筋無力症、尋常性天疱瘡、グレーヴス病、及び自己免疫性血小板減少症は、病原性抗体が臨床表現型である状態の好例である（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ、Ｊ．Ｆ、上掲を参照）。更に、自己免疫疾患は、Ｂ細胞を過剰反応性にし、またＢ細胞数を増加させるが、これらは大規模な炎症及び組織障害を防止するために排除されるべきである。従って、Ｂリンパ球を激減させることは、かかる自己免疫疾患の治療において有用である。多くのリウマチ性自己免疫疾患、例えばリウマチ性関節炎の治療は、細胞毒性の免疫抑制剤及びコルチコステロイドの使用に主に依存するので、患者は、多くの場合更なる重度の副作用を経験する。更に、患者の再発率はなおも高い。より安全でより有効な薬物、例えば本開示のＣＤＩＭ結合タンパク質が必要とされている。
【００７４】
リンパ性がんは、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫、Ｂ前駆体ＡＬＬ、成人ＡＬＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む、但しこれらに限定されない、Ｂ細胞を起源とするあらゆる急性又は慢性白血病又はリンパ腫である。ＣＤＩＭ結合タンパク質は、がん性Ｂ細胞上に見出されるエピトープＣＤＩＭに結合する。
【００７５】
開示するＣＤＩＭ抗原結合タンパク質による治療に反応する患者の予測を可能にするために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ分析が実施可能である。融合としてＣＤＩＭ抗原結合タンパク質を投与して治療する前に、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断が実施可能であり、同診断は対象組織上にあるＣＤＩＭ抗原の可視化を可能にする。治療に対する患者の反応の予測が可能となるしかるべきレベルの反応性が規定され得る。あるいは、この種の分析は、腫瘍細胞量に基づき投与パラメータを規定するのに役立つ可能性がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は、患者リンパ球細胞（末梢血液、骨髄等）のサンプルについて治療前に実施可能である。細胞は、標準的なフローサイトメトリー解析法を用いて、ＣＤＩＭ抗原結合タンパク質で染色される。治療後の陽性転帰の予測を可能にするカットオフ値が規定される。例えば、陽性転帰を予測する、最低平均蛍光強度が規定され得る。
【００７６】
下記の具体的な実施例は、本開示を説明するように意図されており、また特許請求の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００７７】
代表的なＣＤＩＭ結合タンパク質の作成及び配列測定
【００７８】
プラスミドＤＮＡの構築。５’末端及び３’末端それぞれにＸｂａＩ−Ｋｐｎ１部位を有するＨシリーズμ鎖構築物重鎖可変領域（Ｈ１〜Ｈ２２と命名）を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより全て合成した。全てのＨシリーズμ鎖構築物を、各重鎖可変領域をＸｂａＩ−Ｋｐｎ１断片として単離し、そしてμ定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｍｕ  ｒｅｇｉｏｎ）を範囲に含むＫｐｎ１−ＢａｍＨＩ断片を用いて３部ライゲーション（ｔｈｒｅｅ  ｐａｒｔ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）でこれら断片を、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した発現ベクターＡＢ１１と共に連結することにより組み立てた。ライゲーションしたプラスミドをコンピテント・バクテリアにトランスフォームした。得られたクローン化プラスミドを直接配列決定法により確認した。ＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクションするためのＤＮＡが適切な量得られるように、Ｑｉａｇｅｎを用いてプラスミドミディプレップを作成した。
【００７９】
軽鎖プラスミドも同様に構築した。λインサートを３部ラゲーションでクローン化した；λ可変領域をＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片として設計し、これをＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩλ定常領域断片と混合し、そしてＸｂａＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間でＡＢ２ベクターにライゲーションした。Ｌ２κインサートをＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片として単離し、そしてＡＢ２−κベクターにライゲーションした。
【００８０】
Ｈ１〜Ｈ２２／Ｌ２プラスミドＤＮＡによるＣＨＯ−Ｓ細胞のトランスフェクション。重鎖及び軽鎖に対応するＤＮＡを、ＰＥＩ技法を用いて同時トランスフェクション用として調製した（等しい量のＬ２及びＨ１〜２２）。トランスフェクションで用いられるＣＨＯ−Ｓ細胞（１Ｅ８個の対数増殖段階）をＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。ＤＮＡ：ＰＥＩを１：２で混合し、そしてこのＤＮＡ：ＰＥＩ混合物を、０．５×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、及びＨＴを補充したＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ中のＣＨＯ−Ｓ細胞に添加した。シェイカーフラスコ中、オーバーナイトでインキュベーションした後、培地を０．５×Ｐ／Ｓ、Ｇｌｕを含むＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯに置換した。トランスフェクション後の７日目に、細胞の遠心分離により細胞培養物上清（１００ｍｌ）を採取した。これらＩｇＭ例について特徴付けを行うために、１５ｍｌの細胞培養上清をＣｅｎｔｒｉｃｏｎで１０倍に濃縮した。
【００８１】
２２個の異なる重鎖可変領域のアミノ酸配列を図１Ａ〜Ｄに示す。２つの異なる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図１Ｅに示す。重鎖及び軽鎖の定常領域のアミノ酸配列を図１Ｆに示す。κ又はλ定常領域のいずれも利用可能と理解される。識別及び単離されたＣＤＩＭ結合タンパク質、ＩＧＭ１〜ＩＧＭ４４を代表するアミノ酸配列を図２Ａ〜２Ｖに示す。Ｈ１〜Ｈ２２のＣＤＲ３配列を図３に示す。
【００８２】
４４個の開示するＣＤＩＭ結合タンパク質をコードするのに利用可能なポリヌクレオチド配列の例を、図４Ａ〜Ｌに示す。遺伝子コードの縮重に起因して、全く同一のアミノ酸配列をコードするのにその他の配列も利用可能であることが理解される。抗体の重鎖可変領域の様々な相補性決定領域（ＣＤＲＨ）及びフレームワーク（ＦＲ）領域について、その配列を、フレームワーク１（ＦＲ１）、相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、フレームワーク２（ＦＲ２）、相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、フレームワーク３（ＦＲ３）及び相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）を含め決定した。
【実施例２】
【００８３】
ＣＤＩＭ結合タンパク質の作成
【００８４】
本実施例は、いくつかの開示する結合タンパク質の作成方法について記載する。配列は重鎖及び軽鎖可変領域変異体から構成された（κ及びλ定常領域の両方がコードされた）。重鎖及び軽鎖変異体の特定の組み合わせを、ＣＨＯ細胞、すなわちＤＧ４４ＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、一時的トランスフェクションを実施した。１０〜１００μｇ／ｍｌの発現レベルが、初回トランスフェクションから得られた。ＩｇＭ抗体を、アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ゲル電気泳動による評価を行い、そして細胞結合、細胞毒性分析、及びＥＬＩＳＡ試験により、複数の生体分子に対する結合について生物活性を試験した。機能分析から得られた結果を、第一選択候補の指針として用いた。選択したら、第一候補を、ＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクションし、２０プレート（約２０００ウェル）にサブ−クローン化し、そして最高レベルの分泌についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。トップ５０のクローンをＴ７５フラスコで増殖させ、その後ベスト２４のクローンをシェイカーフラスコに移した。これら２４クローンに由来するＩｇＭを精製、定量し、そしてトップ６のクローン（ＩｇＭ抗体分泌レベルにより選択した）を、高レベルで分泌する細胞株の増殖を促進するために、メトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ）中での更なる選択条件下で増殖させた。
【実施例３】
【００８５】
非還元式ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたＩｇＭ発現評価
【００８６】
非還元式ゲル電気泳動は、プロテオミクスで一般的に用いられる分離方法であり、また分子量及びオリゴマー構造に基づきタンパク質を分離する。非還元条件の下では、タンパク質ジスルフィド結合は切断されずに残り、従ってＩｇＭオリゴマーは、五量体又は六量体構造として分離可能である。
【００８７】
ＣＨＯ−Ｓ細胞上清の一時的トランスフェクションにより、ＩｇＭ抗体の発現を確認するために、Ｖｏｒａｕｅｒ−Ｕｈｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３５９巻（２０１０年）：２１〜２７頁の記載に従い、非還元式ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。この実施例では、一時的にトランスフェクションしたＩｇＭ  ｍＡｂｓを、純度及び多量体構造についてどのように調査したか、その方法について記載する。対象となるタンパク質サンプルを、ＮｕＰａｇｅ  ＳＤＳサンプルバッファーを用いて室温で５分間インキュベーションする。インキュベーション後、分子量標準物質及び試験サンプルをゲル上にロードし、色素先端部がゲル底部に到達するまで、１００Ｖの一定電圧で約２時間泳動する。電気泳動後、ゲルをＸＣｅｌｌ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ装置から取り出し、固定化し、そしてコロイダルブルー色素で染色する。
【００８８】
五量体及び六量体の形成を実証するために、様々なＣＤＩＭ結合タンパク質サンプル（それぞれＬ１〜Ｌ７、及びＬ９〜Ｌ２１）でトランスフェクションした濃縮済みのＣＨＯ細胞上清について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＮａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ  ３〜１２％ビス−トリスゲルを用いて、非還元式ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。
【００８９】
図５は、コロイダルブルー染色プロトコール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に基づき染色したＳＤＳゲルを示し、１，０４８ｋＤに明瞭なバンドを認め、これはＩｇＭ五量体を表し、また１，２３６ｋＤにも明瞭なバンドを認め、これはＩｇＭ六量体を表す。図で認識可能なように、ＩｇＭの例について六量体形成と比較すると、五量体形成の方（実線矢印）が支配的である。同様に、単離されたヒトＩｇＭ２１６も、５量体型（点線矢印）の方が支配的であるが、但しこのＩｇＭフォーマットに含まれるλ軽鎖はより短いことに起因して低めの分子量として認められる。
【実施例４】
【００９０】
ＣＤＩＭ結合タンパク質のＣＤＩＭ抗原に対する結合
【００９１】
この実施例は、開示する抗体の結合特性をどのように調査したか、その方法について記載する。抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより調製した。図６Ａでは、ＣＤＩＭ抗原を細胞表面に発現する、ヒトｐｒｏ−Ｂ細胞株のＮＡＬＭ−６を、一連の組換えＩｇＭ抗体を用いて染色した。抗体を用いて、２０μｇ／チューブから始まり、２倍ずつ段階稀釈して最終濃度０．０３９μｇまで用量反応性を調べた。細胞を容積１００μｌの氷上の３％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で１時間染色し、ＤｙＬｉｇｈｔ−４８８融合化抗ヒトＩｇＭによる後続染色（Ｊａｃｋｓｏｎ免疫）が、１μｇ／ｍｌ、４℃で２０分間、これに続いた。
【００９２】
ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ分析ソフトウェアを用いて、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター上でＣＤＩＭ結合分析を実施した。結果を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＹ軸に、そして一次抗体濃度（μｇ／１００μｌ）をＸ軸にプロットした生データポイントとして示す。
【００９３】
非線形回帰曲線近似法を用いて結果を近似させるために、ＧｒａｐｈＰａｄ分析プログラムを用いてデータを再分析した。各抗体のＥＣ５０（μｇ／１００μｌ）は、（ａ）ＩＧＭ１について１０．６、（ｂ）ＩＧＭ２３について２．２、（ｃ）ＩＧＭ３４について２．２、及び（ｄ）ＩＧＭ３６について１．７であった。
【実施例５】
【００９４】
ＣＤＩＭ結合タンパク質の細胞への結合に起因する細胞毒性
【００９５】
この実施例は、ＣＤＩＭ結合タンパク質の細胞毒性をどのように調査したか、その方法について記載する。ヒトＰｒｏ−Ｂ細胞株のＮＡＬＭ−６を、上述図６Ａの記載と同様に染色した。図６Ｂでは、１時間染色した後に細胞生存率を測定して細胞殺傷力を評価した。ヨウ化プロピジウムを取り込まなかった細胞の割合を定量することにより、生存細胞の割合（％）を計算した。結果を、生存率（％）をＹ軸、及び濃度（μｇ／１００μｌ）をＸ軸にプロットして、生データとして示す。
【００９６】
同様の結果を、ＧｒａｐｈＰａｄ分析プログラムを用いてグラフ化し、また非線形回帰曲線近似法を用いてデータ近似した。上述と同一のアプローチを用いて抗体毎にＥＣ５０を計算した。各抗体のＥＣ５０（μｇ／１００μｌ）は、（ａ）ＩＧＭ１について３．０、（ｂ）ＩＧＭ２３について０．６、（ｃ）ＩＧＭ３４について０．６、及び（ｄ）ＩＧＭ３６について０．３であった。
【００９７】
図６Ａ及び６Ｂの結果は、開示する抗体が広い用量範囲にわたりヒトＢ細胞に結合すること、及びこれらの抗体は、Ｂ細胞に対して細胞毒性を有し、細胞死を引き起こすことを示す。
【実施例６】
【００９８】
ＣＤＩＭ結合タンパク質のヒト補体依存性細胞毒性分析に起因する細胞毒性
【００９９】
「補体依存性細胞毒性」又は「ＣＤＣ」は、補体存在下で標的細胞が溶解することを意味する。古典的な補体経路の活性化は、補体系（Ｃｌｑ）の第１の構成要素が、抗体に結合することにより開始されるが、この場合、抗体はその同種抗原に結合する。補体の活性化を評価するために、Ｈｉｎｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６年１月１日；第１７６巻（１）：３４６〜５６頁の記載に従い、ＣＤＣ分析を実施することができる。要するに、この実施例は、ＣＤＩＭ結合タンパク質の細胞毒性をどのように調査したか、その方法について記載する。ヒトｐｒｏ−Ｂ  ＮＡＬＭ−６細胞（５０，０００）を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに蒔いた。発現した対象抗体を含有する連続希釈上清を含め又含めずに、試験するのに最適な希釈度でヒト補体を添加する。２４時間後、比色分析用の基質ＣＣＫ８を３時間添加し、次にマイクロタイタープレートリーダー上で、光学濃度（ＯＤ）を４５０ｎｍの波長において測定した。ＯＤ増加量を定量すると、それは生存する増殖性ＮＡＬＭ−６細胞に直接比例する。次に、上清を含まない未処理のＮａｌｍ６のＯＤを、生存率１００％を計算するのに用い、上清を含むＯＤ値をしかるべく標準化して生存率（％）を得る。図８では、生存率（％）をＹ軸に、上清の抗体含有濃度（ｕｇ／ｍｌ）をＸ軸にプロットした結果を示す。これらの結果を、ＧｒａｐｈＰａｄプログラムを用いて分析し、またデータを４パラメータ、非線形回帰曲線近似法を用いてモデル化した。抗体毎にＩＣ５０を、上述と同一のアプローチを用いて計算した。
【実施例７】
【０１００】
非ＣＤＩＭ抗原に対するＣＤＩＭ結合タンパク質の結合
【０１０１】
この実施例は、ＣＤＩＭ以外の抗原に対するＣＤＩＭ結合タンパク質の結合特異性について記載する。抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。抗体を広い用量範囲にわたり、市販のＥＬＩＳＡキットにおいて入手可能な抗原パネルに対して試験した。抗原で事前コーティングされたＥＬＩＳＡプレート、ｓｓＤＮＡ（Ｉｎｏｖａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｄｓＤＮＡ（Ｉｎｏｖａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．）、カルジオリピン（Ｉｎｏｖａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．）、ＭＤＡ−ＬＤＬ（マロンジアルデヒドで修飾された低密度リポタンパク質）（Ｒｏｃｋｙ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ．）は、様々なベンダーから購入した。脂質Ａ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）は、エタノールに溶解された抗原として購入し、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングする前に、これを１００ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．５中で稀釈した。抗ＣＤＩＭ抗体は表示濃度で用い、また製造業者の推奨法によりＥＬＩＳＡを実施した。要するに、プレートをＢＳＡ−ミルク粉末で１時間ブロックし、その後洗浄した。開示する抗体を表示濃度で添加した。抗体を結合させるべく１．５時間、室温で放置し、その後洗浄ステップが続いた。ＨＲＰ−融合化抗ヒトＩｇＭ抗体を添加し、その後基質を添加した。４５０ｎｍにおける吸収を用いて結果を数値化した（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ）。図８及び９に示す通り、ＭＡｂ２１６は、試験した全ての抗原に結合するが、一方、開示する各抗体は、結合の低下（すなわち、ｓｓＤＮＡ）、又は抗原に対する特異性の完全喪失（すなわち、カルジオリピン）を示している。これらの結果から、開示する抗体はＭＡｂ２１６よりも厳密な抗原結合特異性を有することが実証される。
【０１０２】
表２は、本明細書で開示する様々なＣＤＩＭ結合タンパク質の効力特性及び特異性特性について要約する。
【０１０３】
【表２】
0006335796.tif 000003
【０１０４】
表２は、重鎖可変領域Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、Ｈ１９、Ｈ２０、及びＨ２１をそれぞれ含むＣＤＩＭ結合タンパク質について、図６及び図７で示したデータを要約する。ＥＬＩＳＡの数値は、ＩｇＭ重鎖及び軽鎖の一時的トランスフェクション後に、調整された培地中で求められたＩｇＭ濃度を表す。細胞毒性ＩＣ５０は、ヒト補体及びＮａｌｍ−６細胞と共に抗体をインキュベーションしたときに、５０％の細胞死を引き起こすような、最大ＩｇＭ抗体濃度の１／２である（図６も参照）。ＩＣ５０値は、本明細書で開示する様々なＣＤＩＭ結合タンパク質の効力を表す。
【０１０５】
その他の抗原への付加的結合（ＬＰＳ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ等）は、ＥＬＩＳＡフォーマットで認められる結合である（図９Ａ〜９Ｆも参照）。ＩｇＭサンプルの様々な抗原に対する相対的反応性は、ＩｇＭが１０μｇ／ｍｌのときの最大反応（ＯＤ４５０ｎｍ）に基づく。示す数値は、様々なＣＤＩＭ結合タンパク質の非特異性に関する数値を表す。相対的反応性のスコアリングは以下の通り：ＯＤ４５０が０〜０．３のとき、スコアは（−）マイナスとなる。ＥＬＩＳＡの最大数値が０．３〜１、１〜２、２〜３、及び３超のとき、スコアは、それぞれ（＋）、（＋＋）、（＋＋＋）、及び（＋＋＋＋）となる。
【０１０６】
本開示の範囲及び精神から逸脱しない本開示の様々な修正形態及び変形形態は、当業者にとって明白である。本開示は、具体的な実施形態と関連付けて記載されているが、特許請求の範囲をかかる具体的な実施形態に不当に限定すべきでない。本開示を実施するために記載した方式の様々な修正が当業者により理解され得るが、それも特許請求の範囲に含まれるように意図されている。
【０１０７】
【表３Ａ】
0006335796.tif 000004
【０１０８】
【表３Ｂ】
0006335796.tif 000005
【０１０９】
【表３Ｃ】
0006335796.tif 000006
【０１１０】
【表４】
0006335796.tif 000007
【図１Ａ】
0006335796.tif 000008
【図１Ｂ】
0006335796.tif 000009
【図１Ｃ】
0006335796.tif 000010
【図１Ｄ】
0006335796.tif 000011
【図１Ｅ】
0006335796.tif 000012
【図１Ｆ】
0006335796.tif 000013
【図２Ａ】
0006335796.tif 000014
【図２Ｂ】
0006335796.tif 000015
【図２Ｃ】
0006335796.tif 000016
【図２Ｄ】
0006335796.tif 000017
【図２Ｅ】
0006335796.tif 000018
【図２Ｆ】
0006335796.tif 000019
【図２Ｇ】
0006335796.tif 000020
【図２Ｈ】
0006335796.tif 000021
【図２Ｉ】
0006335796.tif 000022
【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図２Ｐ】
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【図２Ｑ】
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【図２Ｒ】
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【図２Ｓ】
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【図２Ｔ】
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【図２Ｕ】
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【図２Ｖ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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