(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的ネットワークの活性化スコアを決定する方法であって、前記生物学的ネットワークは生物学的実体、プロセス又は他の生物学的ネットワークを表すノードのセットの間での因果的接続で構成され、前記生物学的ネットワークが前記ノードのセットの特定のノードに対する潜在的攪乱を表す参照ノードを有しており、前記方法がハードウェア要素で実行されるソフトウェアで実施されるものであり、前記方法が、
（ａ）前記ハードウェア要素が根ノード、及び子ノードのセットを含むツリー深さ１のツリーグラフを表すリストを構築するステップであって、前記ツリーグラフの前記根ノードが前記生物学的ネットワークを表し、各子ルートが前記生物学的ネットワークの特定ノードを表し、前記根ノードからその子ノードを指す符号付き有向エッジによって前記根ノードに接続され、
前記根ノードからその子ノードへの前記符号付き有向エッジの符号が、当該子ノードを前記生物学的ネットワークの前記参照ノードに接続する１つ又は複数の経路の前記符号から決定され、
各子ノードがまた、自身に関連付けられた重みを有し、特定の子ノードの重みは当該特定の子ノードを前記生物学的ネットワークの前記参照ノードに接続する前記１つ又は複数の経路に基づくものである、ステップと、
（ｂ）前記ハードウェア要素が前記子ノードに割り当てられた重み、及び前記符号付き有向エッジの前記符号に基づいて、前記生物学的ネットワークの活性化スコアを決定するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記生物学的ネットワークが因果的に一貫し、各重みが１に等しい値を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的ネットワークが因果的に一貫せず、前記子ノードに関連付けられた前記重みの少なくとも１つが１以外の負ではない実数値を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ツリーグラフの少なくとも１つの子ノードが、それ自体が自身に関連付けられたスコアを有する別のツリーグラフを表す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記スコア化が、ネットワークパフォーマンス振幅（ＮＰＡ）及び幾何攪乱指数（ＧＰＩ）のうちの一方である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記根ノードからその子ノードへの前記符号付き有向エッジの前記符号が、前記生物学的ネットワークの前記特定ノードから前記生物学的ネットワークの前記参照ノードまでの最短経路の正味符号から決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記最短経路の長さが、エッジ長にバイアス付与することによって決定され、エッジ長が当該エッジの相対的確率に基いてバイアス付与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的ネットワークから符号付きスパニングツリーのセットを列挙するステップをさらに含み、各スパニングツリーの特定ノード毎に符号が関連付けられており、当該符号が当該特定ノードを前記スパニングツリーの前記参照ノードに接続する経路の正味符号に基づくものである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
符号及び重みが、前記ツリーグラフの子ノードに関連付けられており、前記スパニングツリーの前記セットの最大数の符号付きスパニングツリーにおいて、前記生物学的ネットワークの当該ノードに関連付けられた符号が何であれ、前記符号及び重みは当該符号に基づくものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的ネットワークに沿って、各ランダムウォークが前記参照ノードにて開始する複数のランダムウォークを実行するステップと、
ランダムウォーク毎に、前記ツリーグラフの子ノードに関連付けられた符号及び重みを前記生物学的ネットワークの当該ノードに関連付けられた符号が何であれ、当該符号に基づいて決定するステップとをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記ランダムウォークが、前記生物学的ネットワークにあるエッジの属性に基づいてバイアス付与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
コンピュータシステムにロードされ、実行されると、生物学的ネットワークの活性化スコアを決定するように前記コンピュータシステムに演算させるコンピュータ可読命令を含むコンピュータプログラムであって、前記生物学的ネットワークは生物学的実体、プロセス又は他の生物学的ネットワークを表すノードのセットの間での因果的接続で構成され、前記生物学的ネットワークが前記ノードのセットの特定のノードに対する潜在的攪乱を表す参照ノードを有し、前記コンピュータ可読命令が、
前記コンピュータシステムに根ノード、及び子ノードのセットを含むツリー深さ１のツリーグラフを構築させるプログラムコードを含み、前記ツリーグラフの前記根ノードが前記生物学的ネットワークを表し、各子ノードが前記生物学的ネットワークの特定ノードを表し、前記根ノードからその子ノードを指す符号付き有向エッジによって前記根ノードに接続され、前記根ノードからその子ノードへの前記符号付き有向エッジの符号が、当該子ノードを前記生物学的ネットワークの前記参照ノードに接続する１つ又は複数の経路の前記符号から決定され、各子ノードがまた、自身に関連付けられた重みを有し、特定の子ノードの重みは当該特定の子ノードを前記生物学的ネットワークの前記参照ノードに接続する前記１つ又は複数の経路に基づくものであり、さらに、
前記コンピュータシステムに、前記子ノードに割り当てられた重み、及び前記符号付き有向エッジの前記符号に基づいて、前記生物学的ネットワークの活性化スコアを決定させるプログラムコードを含む、コンピュータプログラム。
【請求項１３】
装置であって、
ハードウェアプロセッサと、
前記ハードウェアプロセッサにロードされ、それによって実行されると、前記装置に生物学的ネットワークの活性化スコアを決定させるコンピュータメモリのコンピュータ可読命令と、を含み、前記生物学的ネットワークは生物学的実体、プロセス又は他の生物学的ネットワークを表すノードのセットの間での因果的接続で構成され、前記生物学的ネットワークが前記ノードのセットの特定のノードに対する潜在的攪乱を表す参照ノードを有し、前記コンピュータ可読命令が、
前記装置に根ノード、及び子ノードのセットを含むツリー深さ１のツリーグラフを構築させるプログラムコードを含み、前記ツリーグラフの前記根ノードが前記生物学的ネットワークを表し、各子ノードが、前記生物学的ネットワークの特定ノードを表し、前記根ノードからその子ノードを指す符号付き有向エッジによって前記根ノードに接続され、前記根ノードからその子ノードへの前記符号付き有向エッジの符号が、当該子ノードを前記生物学的ネットワークの前記参照ノードに接続する１つ又は複数の経路の前記符号から決定され、各子ノードがまた、自身に関連付けられた重みを有し、特定の子ノードの重みは当該特定の子ノードを前記生物学的ネットワークの前記参照ノードに接続する前記１つ又は複数の経路に基づくものであり、さらに、
前記装置に、前記子ノードに割り当てられた重み、及び前記符号付き有向エッジの前記符号に基づいて、前記生物学的ネットワークの活性化スコアを決定させる、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般的に、生物学的ネットワークの応答を特徴付ける方法及び技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネットワークは、自然科学及び社会科学からコンピュータ及び電気工学まで多くの様々な分野で複雑な系を記述するための強力な枠組みを提供する。それらの定量分析は、グラフ理論の数学的領域で研究された概念及び特性に基づく。この知識を活用すると、具体的な状況で生じる難問への対応に役立てることができる。
【０００３】
符号付きグラフは、システム生物学などの様々な学問分野に使用され、２つのノードに関連する符号付きエッジが、ネットワーク内の２つの生物学的実体間の正又は負の調節関係を表すことができる。実験及び算出技術における最近の進歩により、遺伝子の発現又はタンパク質活性などの生物学的実体を系全体で測定できるようになり、益々大きなネットワークへのそれらの統合が促進されている。この状況で、個々の生物学的実体のレベルを対応するグラフ構造に統合する系レベルの特性の導出が高い関心事となっている。何故なら、これによって分子機構を全体的な系の挙動に関連させることが可能になるからである。
【０００４】
有機体を生物学的に活性の物質に曝露すると、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び集合して細胞の表現型を画定する他の生物学的分子の間の相互作用で、複雑な応答が引き起こされる。結果として生じる生物学的影響を調査して、整合の取れた推定機構を得るには、単一の実験から数千の分子種類における系全体の変化を測定する分子プロファイリング技術を活用することができる方法論（例えば、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、又はメタボロミクス）が必要である。
【０００５】
これらの調査要件に部分的に対応する様々なアプローチが開発されている。例えば、個々の機構に対する推定を導出するために、曝露に応答して生成された差次的遺伝子発現を記述するトランスクリプトミクスのデータを、（例えば、ＭＳｉｇＤＢなどの外部データベースによって定義されるような）同様の機能又は発現パターンを有する定義済みの遺伝子のセットを考慮して解釈することができる。差次的発現遺伝子内のこれらのセットの濃縮に基づく遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）又は逆因果的推論（ＲＣＲ）のような方法により、各遺伝子セットによって提示される機構の統計学的濃縮を考慮しながら実験データの定性調査が可能になる一方、ネットワーク攪乱振幅（ＮＰＡ）スコア化のような他の方法では、機構の攪乱の程度を定量的に評価する。ＲＣＲ及びＮＰＡのアプローチは、各機構の因果的に下流にある遺伝子セットを利用し、したがって（例えば、活性化した経路が、それらの構成タンパク質に対応する転写の差次的発現に基づいて特定される場合に想定されるような）測定される差次的遺伝子発現の結果ではなく、原因である可能性が高い機構の特定（ＲＣＲ）及び定量化（ＮＰＡ）が可能になることに留意されたい。系レベルの推定機構を得るために、分子とプロセスとの関係で構成された生物学的ネットワークを使用し、活性分子の機構に関する知見を、潜在的な系レベル及び表現型の効果に関連付けることができる。このような生物学的ネットワークは、公的及び商業的データベース（例えば、京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）経路）で入手可能である。しかしながら、機構的に整合の取れた方法で活性物質の全体的生物学的影響を評価するためには、個々の機構的知見とネットワークレベルの関係とを統合する正式の方法が必要である。これは、この方向に第１のステップを含むＮＰＡのアプローチによって誘導することができる。何故なら、これが、生物学的ネットワーク内で相互接続された個々の機構を組み合わせて、攪乱の程度を測定することができる単一の集合された実体にするからである。
【０００６】
分子プロファイリングデータを使用して、生物学的活性物質又は他の環境的傷害に対する曝露（まとめて「曝露」と呼ぶ）が生物学的ネットワークに与える効果に関して系レベルで定量的な推定機構を獲得する能力には、薬物開発から消費者の安全性まで、様々な実際的用途がある。例えば、候補化合物を、治療に関連する経路内のシグナル伝達（例えば、細胞周期の阻害）に影響する能力についてスクリーニングすることができるし、又は化学的曝露によって修飾された分子の機構を、健康上のリスク（例えば、ＤＮＡ損傷の誘発）との関連の可能性について定量的に測定することができる。これらの例は両方とも、最終的な目標が治療介入か損傷の軽減か、曝露の生物学的影響を評価するという差し迫った要求を浮き彫りにする。最近、系の毒物学において、機構的粒度が上昇した化学的曝露の生物学的影響に対する理解を強調する系優先の方法論に益々焦点が集まっている。特に、環境要因の毒性試験及び評価に関する米国学術研究会議の委員会による最近の報告は、先端終末点のレベルにおける毒物学評価から、曝露が患部毒性経路に与える効果の系レベルの理解の導出へとシフトするよう提唱している。この状況で、ネットワークレベルの情報を機構的効果の定量評価とともに活用できるアプローチは、曝露の生物学的影響に対する真の系レベルの洞察を与える強力な機会を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上で言及した生物学的プロセスは高度に相互接続しているが、その根底にある生物学的機構は、各プロセスで細胞シグナル伝達経路を明示的に捕捉するために、画定された境界を有する明瞭なネットワークモデルに組織化することができる。このセグメント化によって、細胞内の明瞭な機能に寄与する各プロセスの別個の評価が可能になる。ネットワーク内のシグナル伝達事象は、生物学的実体間、プロセス間、又は他のネットワーク（ノード）間でも符号付きで有向性の原因と結果の関係（エッジ）を表す因果関係として捕捉することができる。タンパク質及び相互作用は複数の応答の調節に関与することが多いので、ノード及びエッジを複数のネットワーク間で共有し、サブネットワーク間の相互作用を明示的に提示することができる。
【０００８】
ネットワーク内の個々のノードは、実験的に測定することができる実体又は活動を表すことができ、これらの測定値をまとめてネットワークの全体的機能を推定することができる。ネットワーク内の個々のノードの測定値を個別に調べることに加えて、これらの測定値を集約して、ネットワークの正味活性化を表す全体的「スコア」にすると有利なことがある。さらに、ネットワーク内のノードには容易な測定が不可能なものもあるが、測定値に関連するシグネチャを有するこれらのノードの幾つかについて、スコアを得ることが可能なことがある。１つのノードのスコアを、ネットワーク内の他のノードのスコア又は測定値と同様に組み合わせて、ネットワークの活性化に関する全体的スコアを提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示の一態様によれば、因果的に一貫したネットワークのスコアを算出する方法は、ネットワークをＨＹＰ様構造（ノードに測定値が関連付けられている場合は「ＨＹＰ」、ノード自身がＨＹＰであり、スコアが関連付けられている場合は「メタＨＹＰ」）に変換し、次にＨＹＰ／メタＨＹＰのノードに関連付けられた測定値又はスコアに基づいて既知のＨＹＰスコア化方法（例えば、ネットワークパフォーマンス振幅（ＮＰＡ）、幾何学的攪乱指数（ＧＰＩ）など）を適用することによって提供される。
【００１０】
本開示の別の態様によれば、ネットワーク内の複数のＨＹＰのスコアに寄与する測定値の過度の重み付けを回避するために、各下流ノードに重みが関連付けられているメタＨＹＰを生成する。
【００１１】
さらに別の態様によれば、以下の技術、すなわち、スパニングツリーのサンプリング、最大スコアのスパニングツリー、又は最短路のうち１つを使用し、因果的に一貫していないネットワークから各下流ノードに重みが関連付けられているＨＹＰ又はメタＨＹＰを生成する方法について述べる。
【００１２】
本開示の他の態様は、各下流遺伝子に関連付けられた重みを使用して、（各下流ノードに重みが関連付けられている、又は関連付けられていない）メタＨＹＰをＨＹＰに変換する方法である（ここで重みは、メタＨＹＰ及びＨＹＰレベルを意図したスコア化アルゴリズムに基づく）。このアプローチは、ＨＹＰ及びメタＨＹＰレベルにおけるスコア化方法が線形関数である場合に当てはまる。
【００１３】
本開示の他の態様は、上述した枠組み及び方法を適用して、他のネットワークを表すノードを有するネットワークである「メタネットワーク」のためのメタＨＹＰを構築し、スコア化することである。
【００１４】
以上で、本開示の主題により関係がある特徴の幾つかを概略してきた。これらの特徴は単に例示であると解釈されたい。開示された本発明を様々な方法で適用するか、又は以下に記載するように本発明を変更することによって、多くの他の有利な結果を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
開示された主題及びその利点をさらに完全に理解するために、次に添付図面と組み合わせて以下の説明を参照する。
【００１６】
【図１】生物学的実体、プロセス又は他のネットワークを表すノード間の偶発的接続で構成されたネットワークを示す。
【図２】１つのソースノードが因果的エッジを介して測定可能な下流ノードのセットと接続する特定のタイプのネットワークであるＨＹＰを示す。
【図３】図１に示したものと同じネットワークを示すが、個々の各ノードに、ネットワーク内の参照ノードとの正又は負の正味因果関係を示す符号の注釈が付けられている。
【図４】本明細書で「メタＨＹＰ」と呼ばれるＨＹＰ様構造に変換された図３のネットワークを示す。
【図５】本開示によるメタＨＹＰ構造を示す。
【図６】本開示によるＨＹＰ構造に変換された図５のメタＨＹＰを示す。
【図７】因果的に一貫していないネットワークを示す。
【図８】図７の因果的に一貫していないネットワークに対応するスパニングツリーを示す。
【図９】ＳＳＴ方法を試験する際に照らし合わせる代表的ネットワークの部分を示す。
【図１０】幾つかのサンプルネットワークについて、ＳＳＴ有効ノードの重み
【数１】
0006372892.tif 000002
とそれに対応するノード符号
【数２】
0006372892.tif 000003
とを比較するための受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線（真陽性率対偽陽性率）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で使用する以下の用語は、以下の定義を有する。
「知識ベース」は、有向ネットワークであり、生物学的実体及びプロセス間に実験で観察された因果関係のネットワークであることが好ましい。
「ノード」は、測定可能な実体又はプロセスである。
「測定ノード」は、測定された実体又はプロセスである。
「参照ノード」は、ノードに対する潜在的攪乱を表す。
「シグネチャ」は、測定可能なノードの実体と、参照ノードに対するそれらの変化の予想方向との集まりである。
「差次的データセット」は、第１の状態に関連するデータ、及び第１の状態とは別個の第２の状態に関連するデータを有するデータセットである。
「倍率変化」は、初期値から最終値まで量が変化する程度を述べる数字であり、詳細には、最終値を初期値で割って算出する。
「符号付きグラフ」（すなわち、符号付きエッジがあるグラフ）は、本開示の状況で、系の生物学的性質における調整及びシグナル伝達に関する情報を提供する代表的構造であり、符号付きグラフでは、正の有向エッジ
【数３】
0006372892.tif 000004
は２つの実体間の活性化関係（例えば、タンパク質活性）を捕捉し、負の有向エッジ
【数４】
0006372892.tif 000005
は阻害関係を捕捉する。
【００１８】
「因果的に一貫したネットワーク」は、均衡しているグラフであり、「因果的に一貫していないネットワーク」は、不均衡なグラフである。機能的定義として、及び因果的に一貫したネットワークの場合、任意の所与のノード対間の全経路は同じ正味符号を有し、因果的に一貫していないネットワークの場合、任意の２つのノードに、正の正味符号を有する少なくとも１つの経路、さらに負の正味符号を有する少なくとも１つの経路がある。正味符号は、経路に沿って偶数の「阻害」又は「減少」のエッジがある場合は正であり、経路に沿って奇数の「阻害」又は「減少」のエッジがある場合、正味符号は負である。
【００１９】
「ネットワークモデル」は、最上位ネットワークが組織化されて１つ又は複数のサブネットワークになる相互接続階層であり、各サブネットワーク内のシグナル伝達事象は、一般的に一次文献で報告された実験の証拠に基づき、生物学的実体（ノード）間の符号付きで有向性の原因と結果の関係（エッジ）を表す因果関係として捕捉される。タンパク質及び相互作用は複数の応答の調節に関与することが多いので、多くのノード及びエッジを複数のサブネットワーク間で共有し、したがってサブネットワーク間の相互作用が明示的に提示される。ネットワークモデル階層の基部には、個々の分子機構について述べ、所与の知識ベース内で、ノードの直接の実験的攪乱に基づき観察されている遺伝子発現の増加又は減少を表す遺伝子セットの因果的上流とすることができるノードがある。これらのノードは、それらの下流の遺伝子発現関係とともにＨＹＰと呼ばれる。
【００２０】
「ＨＹＰ」は、１つの「ソース」ノードが因果的エッジを介して測定可能な下流ノードのセットと接続される特定タイプのネットワークである。通常、ＨＹＰは、特定の生物学的活性（例えば、特定のキナーゼの活性化の発生量の増加、又は成長因子信号伝達経路を述べるさらに複雑なネットワークモデル）を表すノードを、それによって正又は負に調節される測定可能な下流の実体（例えば、遺伝子発現値）に接続する因果関係のセットで構成された特定タイプのネットワークモデルである。ＨＹＰは、仮説サブネットワークと見なすこともできる。
【００２１】
ネットワーク、サブネットワーク及びＨＹＰは、所与の実験内で評価することができる生物学的応答の範囲を演繹的に画定する。
【００２２】
ネットワーク攪乱振幅（ＮＰＡ）は、トランスクリプトームデータから生物学的実体において曝露により誘発された攪乱の程度を評価する既知の方法である。ＮＰＡのスコア化は、ＨＹＰ内の関係を用い、ＨＹＰ内の下流ノードの変化の大きさ及び方向に基づいて、個別的又は集合した実体に対応する発生量又は活性の変化を表すスコアを生成する。ＮＰＡ方法を拡大して、活性ネットワークの変化に関するスコアを生成することができる。
【００２３】
特に、この方法は、評価すべきコントラストのセット（例えば、処理済み対コントロールの比較）、及び実験で捕捉した可能応答の整合のとれた演繹的記述を提供するネットワークモデルについて得られた差次的測定値（例えば、差次的遺伝子発現測定値）を入力として取得する。次に、この方法は差次的測定値をネットワークモデルと統合して、各コントラストのスコアを生成する。
【００２４】
したがって、ＮＰＡスコア化は通常、ネットワークの各ノードの寄与率を合計することにあり、グラフのエッジによって決定されるようなネットワーク内の残りのノードに対するそれらの相対的符号によって調整される。このようなアプローチは、ネットワークが因果的に一貫している（又はグラフ理論の言語で「均衡している」）場合に使用される。
【００２５】
ＨＹＰスコア化の別の既知の技術はＧＰＩ（幾何学的攪乱指数）であり、これはＨＹＰに含まれる遺伝子の処理により誘発される平均差次的発現を算出する。ＧＰＩを計算する式が、ＰＣＴ／ＥＰ／２０１２／０６１０３５号明細書に記載されている。
【００２６】
図１は、生物学的実体、プロセス又は他のネットワークを表すノード（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ）間の因果的接続で構成されたネットワーク１００を表す。このネットワーク１００で、矢印は因果増大関係（例えば、ノードＡがノードＢを増加させる、ノードＢがノードＣを増加させる、及びノードＣがノードＤを増加させる）を表す。円で終了するエッジは、因果減少関係（例えば、ノードＡがノードＥを減少させる、及びノードＥがノードＣ及びＦを減少させる）を表す。
【００２７】
図２はＨＹＰ１０２を示す。上述したように、ＨＹＰ１０２は、１つの「ソース」ノード（本図ではノードＥ）が因果エッジを介して測定可能な下流ノード（本図ではノードＭ、Ｎ、Ｏ、Ｐ及びＱ）のセットに接続する特定タイプのネットワークである。測定可能なノードは斜線ハッシュ表示によって表される。
【００２８】
図３は、図１に描いたものと同じネットワーク１００を示すが、そのノードを参照ノードに接続するのが、これらのノードを接続する任意の経路を介した偶数（「＋」）の因果接続か、奇数（「−」）の因果接続かに基づいて、各ノードが、参照ノード（本図ではノードＢ）との正又は負の正味因果関係を示す「＋」又は「−」の符号付きで表される。
【００２９】
図４は、ＨＹＰ様構造に変換された後の図３のネットワークを示し、これを本明細書では「メタＨＹＰ」１０４と呼ぶ。メタＨＹＰは、全ネットワークを表すノードを、そのノードが参照ノードに対して（それぞれ）正味の正の関係を有するか、又は正味の負の関係を有するかに応じて、因果的に増加又は因果的に減少したネットワーク内の各ノードに接続することによって生成される。メタＨＹＰの測定可能なノードは、斜線のハッシュ表示によって表される。
【００３０】
図５はメタＨＹＰ１０６を示し、ノードの幾つかは測定可能ではなく、代わりにＨＹＰによって表され（この例ではノードＢ及びＥ）、次にこれが測定可能な下流ノード（例えば、ノードＧからＱ）を有する。測定可能なノードは、斜線のハッシュ表示によって表される。ノードＢのＨＹＰ及びノードＥのＨＹＰは両方とも、測定可能な下流ノードＭ及びＮを共有していることに留意されたい。
【００３１】
図６は、メタＨＹＰからの測定可能な実体及び下流ＨＹＰがすべて、１セットのＨＹＰ下流測定可能実体に組み合わせられたＨＹＰへと変換された後の図５のメタＨＹＰ１０６を示す。各測定可能実体には、ＨＹＰ構築プロセス中に重み付け係数（図示せず）を割り当てることが好ましい。
【００３２】
因果的に一貫したネットワークのネットワークスコア化
ネットワークの構造は、ノードの測定値及び／又はノードＨＹＰスコアを、ネットワークによって記述されるプロセスの変化を表すネットワークスコアへと集約するよう案内する。詳細には、さらに本開示の第１の態様によれば、特定の実施形態では、最初にネットワークをＨＹＰ様構造に変換し、次に（前述したように、以下に記載するような幾つかの変更を加えて）ＨＹＰスコア化方法を適用することによって、ネットワークをスコア化する。ネットワーク内のノードを単一のＨＹＰ様構造に集約するプロセスでは、ネットワークが因果的に一貫している必要がある（グラフ理論で「均衡したグラフ」と呼ぶ）、すなわち、ネットワーク内の任意の２つのノード間の正味因果関係が、ノード間を横断する経路に依存していない。このアプローチによると、ネットワーク内の単一のノードを、最初に「参照ノード」として選択し、ネットワーク内の他の各ノードの因果関係を評価するために照らし合わせる基準点を提供する。ネットワークの各ノードについて、そのノードと参照ノードの間の経路を最初に選択する（これら２つのノード間の任意の経路は、因果的に一貫したネットワークで同一の結果を生成する）。経路は、その経路に沿ったエッジの方向に関係なく選択することができる（すなわち、経路は、因果接続の方向で（「下流」）、又は逆方向で（「上流」）横断するか、上流又は下流エッジの任意の組み合わせで横断することができる）。経路に沿った因果減少エッジの数を数え、これが奇数である場合は開始ノードが参照ノードと正味減少関係（すなわち、正味で負の因果関係）を有し、これが偶数である場合は開始ノードが参照ノードと正味増加関係（すなわち、正味で正の因果関係）を有する。このプロセスを図３に示す。次に、ＨＹＰ様構造を、ＨＹＰの上流ノード（「ソース」）として働くネットワークを表すノードで構築し、この上流ノードの下流にあるネットワーク内の各ノードは、参照ノードとの正味関係に応じて因果増大又は減少エッジによって接続される。これを図４に示す。参照ノードは、常に因果増大エッジを介してソースノードに接続される。
【００３３】
慣例により、結果として生じるＨＹＰ様構造内のノードの幾つかが直接測定されず、代わりにＨＹＰスコア化方法（例えば、ＮＰＡ又はＧＰＩアルゴリズム）によってスコア化することができるＨＹＰである場合、このＨＹＰ様構造をメタＨＹＰと呼ぶ（複数のＨＹＰのうちの１つのＨＹＰであるからである）。この概念を図５に示す。しかしながら、ネットワーク内のノードの測定値のみを考慮に入れる（しかし、いずれのＨＹＰスコアも考慮しない）場合、このＨＹＰ様構造を単にＨＹＰと呼ぶ。機能的には、メタＨＹＰとＨＹＰの間に違いはないが、慣例により、そのスコアが他のＨＹＰのスコアから導出されることを明確にするために、メタＨＹＰと別個に命名する。ここで、簡潔さを期して、メタＨＹＰはいかなる測定可能なノードも含まず、スコア化及び測定の両方が実行されたノードで構成されたメタＨＹＰも、本明細書に記載する枠組み内で同様に考察することができる。
【００３４】
特定の実施形態では、ＨＹＰスコア化アルゴリズムを直接使用して、ネットワークの集約の結果であるＨＹＰをスコア化することができる。ＨＹＰスコア化アルゴリズムは、自身がＨＹＰである下流ノードの差次的測定値の代わりにスコアを置換することによって、メタＨＹＰのスコア化にも使用することができる。例えば、強度式を適用してメタＨＹＰをスコア化する場合、式は以下のようになる。
【数５】
0006372892.tif 000006
ここで、βｉは下流ＨＹＰｉのスコア又はノードｉの測定値のログ倍率変化であり、
【数６】
0006372892.tif 000007
はメタＨＹＰ内のノードｉの予測された調節（増大又は減少）に関連する方向であり、Ｎは関連付けられたスコア又は測定値を有するメタＨＹＰ内の下流ノードの数である。
【００３５】
因果的に一貫していないネットワークのネットワークスコア化
因果的に一貫していないモデルの場合、任意の２つのノード間の正味因果関係は、どちらの経路を選択するかに依存する（すなわち、奇数の因果減少エッジを有する経路があれば、同じ２つのノード間で偶数の因果減少エッジを有する経路もある）。したがって、以上で概略した単純明快なメタＨＹＰ構築プロセスは可能ではない。
【００３６】
最短経路
別の実施形態によれば、因果的に一貫していないネットワークからメタＨＹＰを構築する１つの方法は、各ノードと参照ノード間に正味の正の因果関係を有する最短経路、及び各ノードと参照ノード間に正味の負の因果関係を有する最短経路を特定することである。ノード毎に、正の最短経路が負の最短経路より短い場合、そのノードはメタＨＹＰの因果増大に割り当てられ、正の最短経路が負の最短経路より長い場合、そのノードはメタＨＹＰの因果減少に割り当てられる。正の最短経路と負の最短経路が同じ長さであるノードは、メタＨＹＰから削除される。２つのノード間の経路の長さを算出する場合、各エッジは同じ「長さ」を有することができ、その結果、長さは経路にあるエッジの数を表す。あるいは、ネットワーク内に複数のタイプの増大エッジ及び減少エッジがある場合、異なるタイプのエッジは、全体的な経路長に対して異なる「長さ」寄与率を有することができる。例えば、直接の因果増大又は減少エッジは、直接的関係と明示的に表されていない因果増大又は減少エッジより短い長さを有することができる。この方法は、因果的に一貫していないネットワークを解明し、メタＨＹＰを生成する「最短経路」方法と呼ばれる。
【００３７】
因果的に一貫していないネットワークからメタＨＹＰを構築する別の実施形態は、増大又は減少を絶対的に決定するのではなく、参照ノードに対して各ノードが有する増大又は減少の相対的な程度を推定することを含む。このような方法は、下流ノードに接続する各因果エッジが、そのエッジの増大又は減少の程度について述べる０〜１の重み付け係数ｓｉが追加的に関連付けられているメタＨＹＰを生成する。これらの重み付け係数は、メタＨＹＰ内の各エッジに関連付けられた符号（増大又は減少）に関係するので、符号重みと呼ばれる。
【００３８】
ランダムウォーク
ある実施形態によれば、符号重みを算出する１つの方法は、ネットワークで反復ランダムウォークを実行することを含み、各ランダムウォーカは「＋」又は「−」の内部状態を有し、さらにその現在状態を各ノードに、そのノードに最初に訪れた時に割り当てる。ネットワークを横断中に、アルゴリズムの各ウォーカは有効なスパニングツリーを生成することもでき、全ウォーカからのスパニングツリーのセットは、符号付きグラフのスパニングツリー全部のうち代表的サンプルを生成することが知られている。この実施形態では、方法はスパニングツリーを組み合わせてネットワークの単一のメタＨＹＰを生成し、したがってこの方法はサンプル値スパニングツリー（ＳＳＴ）方法と呼ばれる。以下のセクションでは、このアプローチに関してさらなる詳細を提供する。
【００３９】
ＳＳＴ方法
均衡した符号付きグラフＧ＝（ノード，エッジ）及びその全ノード上で画定された量Ｘｎ（例えば、遺伝子の差次的発現、又は推定攪乱振幅［３］など）があると仮定すると、Ｇ上でのＸｎの集約は下式のように定義される。
【数７】
0006372892.tif 000008
ここで、
【数８】
0006372892.tif 000009
は、ｎと１つの参照ノードＲＥＦとを関連させるＧの任意の経路にわたるエッジ符号の積によって与えられるノードの符号である。Ｇは均衡したグラフであるので、
【数９】
0006372892.tif 000010
は選択された経路に依存せず、したがって全ノードｎで明白に定義される（
【数１０】
0006372892.tif 000011
は、「ネットワーク内の残りのノードに対する相対的符号」である）。有向符号付きグラフにおけるエッジ方向は、この状況に関係ないことに留意されたい。
【００４０】
ＳＳＴ方法は、スパニングツリーの概念に基づく。すなわち、ｔがツリーであり、Ｇの全ノードを接続するＧのサブグラフである場合、５はＧのスパニングツリーである。スパニングツリーの１つの有用な特性は、式（１）で導出された集約量ＸＧを、任意のｔに関して下式のように同様の意味で書き換えることができるという事実に由来する。
【数１１】
0006372892.tif 000012
ここで、
【数１２】
0006372892.tif 000013
はノードｎと参照ノードＲＥＦの間で
【数１３】
0006372892.tif 000014
の１つの単独経路にわたって計算されている。Ｇのすべてのスパニングツリーｔ１．．．ｔＮ（Ｇ）を列挙できるとすると、ＸＧは同様の意味で下式のように書き換えることができる。
【数１４】
0006372892.tif 000015
ＳＳＴ方法の重要な利点は、Ｇが不均衡なグラフである場合でも、式（３）が明確な輪郭を有することである。この特性は、スパニングツリーの列挙がエッジ符号（すなわち、
【数１５】
0006372892.tif 000016
又は
【数１６】
0006372892.tif 000017
）に依存せず、所与のスパニングツリーｔについて
【数１７】
0006372892.tif 000018
が明確に画定されるという事実に由来する。式（３）のスパニングツリーｔ及びノードｎについて和を入れ替えると、最終式になる。
【数１８】
0006372892.tif 000019
ここで、下式の通りである。
【数１９】
0006372892.tif 000020
式（４）は、均衡したグラフィでのみ有効であるＸＧの最初の定義を拡張する。これは、不均衡なグラフの場合、離散型ノード符号
【数２０】
0006372892.tif 000021
を連続する有効なノード重み
【数２１】
0006372892.tif 000022
で置換する。これは、Ｇ上でのＸｎの明確な集約を計算することができるすべての可能なスパニングツリーの「位相平均」を表す。ノードの有効重み
【数２２】
0006372892.tif 000023
は、本明細書の特定の集約方法（式（１））の一般化も行い、不均衡なグラフの２つのノード（ｎとＲＥＦ）間で一般的に適用可能な「位相平均化した」符号付き関係を表す。
【００４１】
実際、すべてのスパニングツリーの明示的列挙は、大きい不均衡なグラフでは非現実的になる。したがって、ＳＳＴ方法の別の態様は、式（５）のすべてのスパニングツリーｔ１．．．ｔＮ（Ｇ）の網羅的な合計を、スパニングツリーＴ（Ｇ）の算出可能な代表的サブセットを含む近似で置換することが好ましい。これに対する１つの算出のアプローチは、オルダス方法を適用することであり、これはグラフ上でランダムウォークを使用し、スパニングツリーの適切な均一のサンプルを生成する。特に、この算出方法は、「符号付き」ウォーカをグラフに沿って移動させることを含み、その軌跡及び符号
【数２３】
0006372892.tif 000024
は、以下のローカルルールのセットによって決定される（Ｇが接続されているものと仮定する）。
１．各ウォーカは、参照ノードＲＥＦにて正の符号「＋１」で始まる。
２．ウォーカは、現在のノードに接続された横断すべきエッジをランダムに選択する。エッジの選択は、エッジの符号又は方向の無関係である。
３．ウォーカの符号は、「増大」エッジ（
【数２４】
0006372892.tif 000025
）を横断する場合は保持され、「減少」エッジ（
【数２５】
0006372892.tif 000026
）を横断する場合は反転する。
４．次のノードをそのウォーカが既に訪れていない場合、ウォーカは次のノードを訪問済みとマークし、その符号をそのノードに割り当てる。
５．次のノードをそのウォーカが既に訪れている場合は、ウォーカはそのノードからの符号を採用する。
６．グラフの全ノードを訪れるまで継続する。
【００４２】
以上で説明したオルダス方法の枠組みで、式（５）は下式に置換することができる。
【数２６】
0006372892.tif 000027
ここで、Ｎ±（ｎ，Ｇ）は、ノードｎを訪れたランダムウォーカの数を正／負の符号とともに記録する。Ｎ＋（ｎ，Ｇ）＋Ｎ−（ｎ，Ｇ）は、Ｔ（Ｇ）のサンプリングされたスパニングツリーの総数であり、これは
【数２７】
0006372892.tif 000028
の近似の収束を確実に行うように選択される。サンプリングされたスパニングツリー
【数２８】
0006372892.tif 000029
は、式（６）の
【数２９】
0006372892.tif 000030
を算出するために明示的に必要とされないことに留意されたい。しかしながら、所与のウォーカについては、ステップ４中に横断したすべてのエッジを収集することによって、これを再構築することができる。
【００４３】
ＳＳＴ方法の検証
例示の目的で、ＳＳＴ方法を最初に、図７に示す整合のとれないフィードフォワードループ（ＩＦＦＬ）に適用する。この例示的なネットワークでは、ノードＡ及びＢに関連する２つの経路
【数３０】
0006372892.tif 000031
及び
【数３１】
0006372892.tif 000032
が、それらの連結エッジの符号の積によって定義されるように、同じ符号を有していない。同じことがノード対（Ａ，Ｃ）にも当てはまり、ネットワークの残りのノードＢ及びＣに対するノードＡの相対的符号が曖昧であることを示す。これらの観察結果は、因果的に一貫していないネットワーク又は「不均衡な」グラフのケースに対応し、これらについて集約手順を明確に実行することができない。図８は、図７のネットワークのスパニングツリーを示す。対応するグラフに適合可能な３つのスパニングツリー｛ｔ１，ｔ２，ｔ３｝が容易に構築されるので、ＳＳＴ方法のサンプリング部分が（この例では）不要である。これで、式（５）は以下の集約重み：
【数３２】
0006372892.tif 000033
を直接生成する。ここで、通常は遺伝子の差次的発現に対応する以下のノード値ＸＡ＝ＸＢ＝ＸＣ＝１であると仮定すると、式（４）から集約値ＸＩＦＦＬ＝１．６６７が得られる。この結果は、個別の値の合計より小さく、これらのノード値Ｘｎがグラフのエッジ
【数３３】
0006372892.tif 000034
と一致していないことを反映している。スパニングツリーに関して、式（３）により（Ｘ（ｔ１），Ｘ（ｔ２），Ｘ（ｔ３））＝（３，１，１）が生成される。この結果は、スパニングツリーｔ１がＸＩＦＦＬに対する最高の寄与値を提供することを示し、これは不調和エッジ
【数３４】
0006372892.tif 000035
を含んでいないからである。他のノード値Ｘｎを使用することにより、同様の配慮をすることができる。この簡単な例から、スパニングツリーに基づく集約により量的に一貫した結果が得られ、ノードに基づく表現とスパニングツリーに基づく表現との両方を有意義に使用し、その結果を解釈できるという結論を下すことができる。
【００４４】
アプローチをさらに検証するために、ＳＳＴ方法を、肺の現実の生物学的プロセスを誠実に記述するように構築され、したがって負のフィードバック及び矛盾した調節関係を含む複雑で因果的に一貫していないネットワークに適用した。これらのネットワークの多くで、少数のエッジを除去して、因果的に一貫していないネットワークを、所望の因果的に一貫していないネットワークに生物学的に最も近く、因果的に一貫しているネットワークへと還元した。エッジを除去する決断は、各ノードと参照ノード間の予想／所望の因果関係に基づいて下した。例えば、負の調節因子を、それらの転写調節を通してネットワークに正で関連させるのではなく、それらの阻害因子の活性を通してネットワークに負で関連させるように、フィードバックループを編集した。そうすることにより、因果的に一貫していないネットワークに基づいて計算したＳＳＴの結果を、これに対応するプルーニングされて因果的に一貫したネットワークのバージョンで得た集約結果と比較することが可能であった。これにより、算出と生物学の両方の視点からＳＳＴアルゴリズムを試験する機会が提供される。
【００４５】
これらのネットワークモデルをコードするために使用される言語の特定のセマンティクスにより、上述したランダムウォークのルールのステップ２を変更して、ネットワークの余分な粒状性を考慮した。タンパク質及びその活性に関連する分子内エッジは、適合率がより高く、したがって２つの因果的に連結しているが、直接相互作用することが知られている異なるタンパク質の活性に関連する直接的な分子間エッジよりも、スパニングツリー内に保持される可能性が高くなる。直接相互作用することが知られていない２つの因果的に連結したタンパク質の活性に関連する間接的な分子間エッジは、重みが最低である。その結果、以下のステップ２にわずかに適応させたルールとなる。
２．モード毎に、ウォーカは各エッジの確率にしたがって、横断すべきエッジをランダムに選択する。相対的確率は以下の通りである。
ａ．分子内エッジ（分子とそれらの活性との関係）：１
ｂ．直接的な分子間エッジ（直接結合し、増大／減少する）：１／２
ｃ．間接的な分子間エッジ（増大／減少）：１／３
ｄ．発現エッジ（ＲＮＡ発生量の変化につながる関係）：１／４
【００４６】
この方法で適応させたＳＳＴ方法を、次に１４４のノード及び２４１のエッジを含む「低酸素ストレス」ネットワークで実行した。１，０００のスパニングツリーを使用すると、２０，０００のスパニングツリー（最大差０．０５未満）を使用したノード重みからの中央値の差が０．０１未満の（式（６）で得られた）ノード重み
【数３５】
0006372892.tif 000036
を生成するのに十分であった。並行して、手作業で生物学的調査を実行し、４つのエッジを除去することによって、生物学的完全性を保持しているネットワークのプルーニングされた因果的に一貫したバージョンを生成した。ＳＳＴの有効ノード重み
【数３６】
0006372892.tif 000037
と明確なノード符号
【数３７】
0006372892.tif 000038
との比較で、符号レベルで異なる単一のノードでのみ特定された。ＳＳＴの結果をさらに詳細に検査すると、図９を拡大したネットワークの領域に興味深い構成が明らかになった。すなわち、ＨＩＦ１Ａ（低酸素症誘発因子１−アルファ）の転写、ＴＸＮＩＰ（チオレドキシン相互作用タンパク質）ＲＮＡの発生量、及びＴＸＮＩＰタンパク質の発生量の間に、因果的な一貫性のなさが存在する。この因果的な一貫性のなさは２つの経路、すなわち、
【数３８】
0006372892.tif 000039
及び
【数３９】
0006372892.tif 000040
で示され、これは符号が反対である。ＳＳＴの結果は、最初の経路が好ましいことを示す。すなわち、それらを接続する「減少」エッジ（
【数４０】
0006372892.tif 000041
）に合致して、ＴＸＮＩＰタンパク質が負の符号を有し、ＨＩＦ１Ａが正の符号を有する。さらに、ＴＸＮＩＰのＲＮＡ発生量に関するＳＳＴの有効重みが、ゼロに非常に近く、それはこのノードの符号がほぼ不明瞭で、したがって集約に対するこのノードの寄与率が小さいことを意味する。生物学的視点から、ＴＸＮＩＰ  ＲＮＡノードをタンパク質ノードに接続するエッジを、除去すべく選択した。何故なら、タンパク質発生量及びＴＸＮＩＰの活性は、経路の負の調節因子であり、したがって集約したネットワークのスコアに対して負の寄与率を有していなければならないからである。これらの考慮事項はＳＳＴの結果と適合する。この特定のケースは、ＳＳＴ方法がさらに複雑なネットワークへと拡大可能であり、その結果がネットワークの生物学的内容を反映することを示す。
【００４７】
以上で検討した低酸素ストレスネットワークと同様に、因果的に一貫するよう手作業でプルーニングしたグラフのセットに照らし合わせてその性能をベンチマーキングすることにより、ＳＳＴ方法をさらに検証した。様々な細胞増殖、細胞ストレス、ＤＡＣＳ、及び肺炎症の出版物に含まれる８１（＝１５＋７＋３２＋２３）のネットワークのセットで、２６（＝７＋５＋２＋１２）は因果的に一貫せず、１９（＝４＋２＋２＋１１）は上述したものと同じ要件を使用して、因果的に一貫したネットワークに手作業で変換することができた。ＳＳＴ方法を使用して、有効ノード重み
【数４１】
0006372892.tif 000042
を算出し、次にこれを、手作業で分解した対応するネットワークで定義されたノード符号
【数４２】
0006372892.tif 000043
と比較した。
【数４３】
0006372892.tif 000044
から予測値が得られ、
【数４４】
0006372892.tif 000045
から実際値が得られる分類の問題という見地から、ＳＳＴ方法は高い正確さを示すことが判明し、ラベリング誤り方向は４．４％の割合であった（
【数４５】
0006372892.tif 000046
についてはゼロ閾値を使用し、全ネットワークにわたって平均する；個別のネットワークについては、ラベリング誤りの割合は０％〜１９％の範囲であった）。図１０に示すように、ＳＳＴ方法で測定した全体的ＡＵＲＯＣ（ＲＯＣ曲線下面積）は０．９９２（個別のネットワークについては０．９０〜１．０の範囲）であり、ラベリング誤り事象の大部分はゼロに近い有効ノード重みで発生した。これらの結果は、低酸素ストレスネットワークのケースでＳＳＴ方法に引き出された結論を他のネットワークに拡張できることを示し、これはアプローチの信頼性を確実に裏付ける。
【００４８】
最後に、ＳＳＴ方法は、ノード値集約にも使用され、特に遺伝子発現データを含むネットワーク攪乱振幅（ＮＰＡ）及び生物学的影響因子（ＢＩＦ）のスコア化計算を適用した。ＳＳＴ方法はデータ駆動型ではないので、遺伝子発現データはその結果の内容を変化させず、むしろ以上で提示した
【数４６】
0006372892.tif 000047
と
【数４７】
0006372892.tif 000048
との比較に関して異なる視点を提供する。この目的で、公衆データセットを使用し、このデータセットは、正常なヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞のＴＮＦ治療の効果について述べている（Ａｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ識別子Ｅ−ＭＴＡＢ−１０２７）。１９の生物学的ネットワーク（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＰＧＥ２、Ｈｙｐｏｘｉｃ  Ｓｔｒｅｓｓ、Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｓｔｒｅｓｓ、ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ＴＰ６３  Ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ｓｅｎｓｅｃｅｎｃｅ、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｔｙｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＴＣ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｔｈ１  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、及びＴｈ１７  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）のうち、８つのネットワークの組織文脈がＮＨＢＥ細胞と整合した。これらの８つのネットワークのＮＰＡ  ＧＰＩスコアを、それらの因果的に一貫していないバージョンについてはＳＳＴの有効ノード重み
【数４８】
0006372892.tif 000049
を、プルーニングされた因果的に一貫しているバージョンについてはノード符号
【数４９】
0006372892.tif 000050
を使用して算出した。ネットワーク毎に、１６の可能なコントラスト（４つの治療用量及び４つの時間点）にわたって対の値を比較した。８つのネットワークのうち６つが約０．９の相関を示した。Ｎｏｔｃｈは低い相関（０．５４０）を示し、Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ（−０．０８１）も同様で、後者は、
【数５０】
0006372892.tif 000051
及び
【数５１】
0006372892.tif 000052
に異なる符号を有するノード全部が、複製老化がＭＡＲＫシグナル伝達に与える影響を関係づけるネットワークの単一の因果的に一貫していない領域に存在するという事実に由来する。後者の例は、ＳＳＴ方法が予想と概ね整合するノード方向を生成することができるが、実験から引き出され、ネットワークで記述された特定の生物学的性質の観点で、結果となる知見を調査することも望ましいことを指摘している。以上の例で、ＴＮＦが仲介したＭＡＲＫの活性は、ネットワークの単一領域にある少数のネットワークノードを通して、Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ（複製老化）ネットワークに大きな影響を与えることになった。この領域が、ＳＳＴ方法によって分解された因果的一貫性のなさを含んでいたという事実から、知見を調査して、これが生物学的に関連があることを確認することにさらに焦点を当てることができる。
【００４９】
以下では、上述したＳＳＴ技術を一般化する。そのために、また限定する意図ではなく、ウォーカの横断ルールを以下に述べる。
１．各ウォーカは、参照ノードにて「＋」の初期内部状態で始まる。
２．各相互作用で、ランダムウォーカは、現在のノードに接続された横断すべき因果エッジをランダムに選択する。
・異なるタイプのエッジは、ランダムウォークにバイアス付与する異なる相対的確率を有することができる。例えば、ランダムウォーカにバイアス付与して、直接的関係と明示的に示されていない因果的増大又は減少エッジと比較して、直接的な因果的増大又は減少エッジを横断する可能性が２倍になるように選択することができる。
３．ウォーカの内部状態は、「増大」エッジを横断する場合は保持され、「減少」エッジを横断する場合は反転する。
４．次のノードをそのウォーカが既に訪れていない場合、ウォーカはそのノードに現在の内部状態のマークを付ける。
５．次のノードをそのウォーカが既に訪れている場合、ウォーカはそのノードからの符号を採用する。
６．そのウォーカがサブネットワークのすべての因果的に接続されたノードを訪れるまで、ステップ２〜５を繰り返す。
７．多数（例えば、１０００）のウォーカに対して、この手順を繰り返す。
【００５０】
全ウォーカがネットワークの横断を終了すると、一実施形態により、下式を用いて各ノードｉの符号重みｓｉを算出する。
【数５２】
0006372892.tif 000053
ここで、
【数５３】
0006372892.tif 000054
及び
【数５４】
0006372892.tif 000055
は、それぞれノードｉを「＋」及び「−」の符号でマークしたウォーカの数を示す。
【数５５】
0006372892.tif 000056
が
【数５６】
0006372892.tif 000057
より大きい場合は、負の符号よりも正の符号を有して参照ノードからノードｉに到達するランダムウォーカが多く、したがってノードｉは、因果増大エッジでメタＨＹＰのソースノードに接続する。
【数５７】
0006372892.tif 000058
が
【数５８】
0006372892.tif 000059
より小さい場合は、正の符号よりも負の符号を有して参照ノードからノードｉに到達するランダムウォーカが多く、したがってノードｉは、因果減少エッジでメタＨＹＰのソースノードに接続する。各エッジには追加的に、そのノードがソースノードと正又は負で関係する程度を示す符号重みｓｉで注釈が付けられる。
【数５９】
0006372892.tif 000060
が
【数６０】
0006372892.tif 000061
と等しい場合、同じ数のランダムウォーカが、正と負の符号を有するノードｉに到達した。このシナリオでは、ノードをメタＨＹＰから削除する（あるいは、符号重みｓｉ＝０との増大関係を割り当てる）ことができる。
【００５１】
ＳＳＴ方法によって決定された符号重みがあれば、各ノードに関連付けられた重みを組み込むよう多少修正したＨＹＰスコア化アルゴリズムを使用して、メタＨＹＰスコアを算出することができる。例えば、強度式を適用して、符号重みでメタＨＹＰをスコア化する場合、強度式は下式のようになる。
【数６１】
0006372892.tif 000062
ここで、βｉは下流ＨＹＰｉのスコア、又はノードｉの測定値のログ倍率変化であり、
【数６２】
0006372892.tif 000063
はメタＨＹＰ内のノードｉの予測された調節（増大又は減少）に関連付けられた方向であり、ｓｉは符号重みであり、Ｗｉは各ノードに関連付けられた正味重みである。ここで、正味重みは符号重みにのみ依存するが、正味重みを有するこの公式は、追加の重みを各ノードに導入する方法でメタＨＹＰを変更する追加の方法を考慮する場合に重要になる（以下のＨＹＰオーバラップの説明を参照されたい）。
【００５２】
因果的に一貫していないネットワークのメタＨＹＰを生成する代替方法も、ＳＳＴ方法で使用したものと同じランダムウォーク手順の結果を活用する。この方法は、各ウォーかの結果を組み合わせて、ネットワーク内の各ノードに関連付けられた単一の符号重みにするのではなく、個々の各ランダムウォーカから各ノードに割り当てられた符号のセットを使用して、ランダムウォーカ毎に異なるメタＨＹＰを生成する。各メタＨＹＰのスコアを、データセットの各コントラストについて算出し、各コントラストの最大絶対スコアを有するメタＨＹＰを特定し、そのコントラストに対して選択する。スコアの大きさが最高のメタＨＹＰは、根底にあるスコア及び／又は差次的測定値に最も整合するメタＨＹＰである。あるいは、方法は、全コントラストにわたって最高の絶対平均スコアを有するメタＨＹＰを選択することができる。これを考慮して、方法は、スコアの大きさが最高のメタＨＹＰ及び関連付けられたスパニングツリーを特定し、したがって方法は最大スコアスパニングツリー（ＭＳＳＴ）と呼ばれる。
【００５３】
要約すると、以上のセクションでは、ＳＳＴ方法で不均衡なグラフのノード間の符号付き関係を定義するための解決法について述べている。既に述べたように、この方法は最小構造としてスパニングツリーの概念を用い、ノード対の間の明確な関係を可能にする。これで、符号付きグラフ上でランダムウォークを用いて構築したスパニングツリーの代表的サンプルを平均することによって、２つのノード間の関係の連続的尺度が画定される。その観点から、不均衡なグラフを「過度に豊かな」符号付きグラフと見なすことができ、そこでは対毎のノードの関係、したがって元の集約手順を明確に画定することができない。グラフに適合するスパニングツリーの代表的サンプルを要約することにより、拡張した集約手順中に廃棄される情報はなく、したがってネットワークの生物学的内容が維持される。
【００５４】
ＳＳＴ方法は、ランダムウォークを使用して、大きい「因果的に一貫していない」ネットワークを含む恣意的な符号付きグラフのノード値を集約する。このアプローチは、グラフのすべてのスパニングツリーから代表的サンプリングを行い、サンプリングしたすべてのスパニングツリーの平均値としてノードの有効重みを近似する。ＳＳＴ方法は、符号付きグラフでノード値（例えば、遺伝子の差次的発現、ノードＮＰＡスコアなど）を集約する必要がある様々な状況に適用可能であり、恣意的なグラフのサイズに拡張可能である。
【００５５】
ＨＹＰオーバラップの説明
多くのＨＹＰはオーバラップする測定値のセットで支援することができ（図５参照）、これによってそれらのスコアが相互依存し、これらのＨＹＰ内で特に攪乱された生物学的性質を捕捉するこれらスコアの能力が低下して、最終的に特定の機構的洞察を導出する能力を妨害する。このようなオーバラップの効果を低下させるために、メタＨＹＰスコア化プロセスを変更し、ＨＹＰがメタＨＹＰ内の他のＨＹＰとオーバラップする程度に基づいて、メタＨＹＰスコアに対する各ＨＹＰｉの寄与率ｗｉを調整する。このプロセスは、一意のサブネットワークへの重みを最高にし、他のサブネットワークと類似したサブネットワークへの重みを低下させた。
【００５６】
メタＨＹＰ内の下流ＨＹＰ間に存在するオーバラップの量を定量化するために、ＨＹＰスコア間に予想される相関を、以下のように計算することができる。Ｎ個の測定値（値は、ＨＹＰ内にない遺伝子では０、因果減少関係で接続される遺伝子では−１、因果増大関係で接続される遺伝子では＋１）を有する２つのＨＹＰ（２つの定数項ベクトル）ｅ１及びｅ２と、ＨＹＰ内の測定値に関する差次的測定値ベクトルＸ（Ｎ個の独立成分を有し、必ずしもガウスではなく、同じ標準偏差σを有するランダムベクトル）とについて考察する。ベクトルｅ１とｅ２の間のコサインは、これらＨＹＰを支援する測定値の類似性の尺度を提供する。さらに、強度スコア化方法の場合、ｅ１とｅ２の間のコサインが、任意の測定値のセットについて、これら２つのＨＹＰのスコア間に予想される相関であることを示すのは単純明快である。
【数６３】
0006372892.tif 000064
【００５７】
一実施形態では、次に予想される相関マトリクスを使用し、対応する列の逆絶対列合計を使用して、オーバラップの重みｗｉを計算する。一般的に、絶対列合計が大きいほど、他と相関するサブネットワークの対応が高くなる。特に、オーバラップの重みは下式のように算出することができる。
【数６４】
0006372892.tif 000065
【００５８】
強度式を適用して、このような重み付け係数でメタＨＹＰをスコア化する場合、式は以下のようになる。
【数６５】
0006372892.tif 000066
ここで、βｉは下流ＨＹＰｉのスコア又はノードｉの測定値のログ倍率変化であり、
【数６６】
0006372892.tif 000067
はメタＨＹＰ内のノードｉの予測された調節（増大又は減少）に関連付けられた方向であり、ｗｉは以上で定義したようなノードｉのオーバラップの重みである。
【００５９】
一般的に、重みを掛け合わせて、積の全ノードにわたる合計によって各ノードの重みを正規化することにより、ＨＹＰ内の下流ノードに関連付けられた複数の重みを組み合わせ、単一の重みＷｉにすることができる。例えば、オーバラップの重み及び符号の重みを組み合わせて、メタＨＹＰのノード毎に単一の重みにするには、下式になる。
【数６７】
0006372892.tif 000068
【００６０】
メタＨＹＰのＨＹＰへの変換
根底となるスコア又は差次的測定値の一次結合としてスコアを算出するＮＰＡ方法を使用して、メタＨＹＰをスコア化する場合、下流ＨＹＰの根底となる差次的データの一次関数として、メタＨＹＰを再公式化することが可能である。以下ではこのアプローチについて述べる。この変換は、直接構築されたＨＹＰ及びネットワークから構築されたＨＹＰを同等に処理できるようにするという点で有用である。
【００６１】
メタＨＹＰからＨＹＰを構築するには、一実施形態によれば、最初に（例えば、強度式を使用して）根底となるＨＹＰスコアの関数としてメタＨＹＰのスコアを公式化する。次に、各ＨＹＰスコアの公式をメタＨＹＰスコアの等式に代入する。メタＨＹＰとＨＹＰのスコア化関数が、根底となる成分（メタＨＹＰの場合はＨＹＰスコア、ＨＹＰの場合は測定可能値）の一次結合である限り、この公式は、メタＨＹＰ内のＨＹＰの根底をなす測定可能値の一次結合を表す。各ＨＹＰの寄与率を合計することにより、複数のＨＹＰの下流にある測定可能値の寄与率を集合させ、測定可能値毎に単一の項にすることができる。これで、メタＨＹＰスコアの解析公式（各下流ＨＹＰの測定可能値の解析関数として表される）に基づき、メタＨＹＰのＨＹＰを構築する。特に、各測定可能値はＨＹＰの下流として現れ、ネットワークのソースノードを各測定可能値に関連させるエッジの符号は、スコアに対するそのノードの寄与率の符号に基づく。正の寄与率を有する測定可能値は、因果増大関係を介して接続され、負の寄与率を有する測定可能値は因果減少関係を介して接続される。さらに、寄与率の絶対値に等しい重み付け係数（メタＨＹＰの公式で測定可能値の前にある係数）は、各下流測定可能値に割り当てられる。したがって、メタＨＹＰは、各下流測定可能値からの重み付けされた寄与率を有するＨＹＰで表される。ＨＹＰがこの方法でメタＨＹＰから構築される場合は、重み付け係数が合計１になるという要件がない。
【００６２】
メタＨＹＰの以下の強度式について考察する。
【数６８】
0006372892.tif 000069
ここで、βｉは下流ＨＹＰｉのスコア又はノードｉの測定値のログ倍率変化を表す。これら２つのケースを別個に考察すると、ＡはＨＹＰスコアによって表されるメタＨＹＰのノードのセットであり、Ｂは測定値によって表されるメタＨＹＰのノードのセットである。
【数６９】
0006372892.tif 000070
ここで、
【数７０】
0006372892.tif 000071
はノード
【数７１】
0006372892.tif 000072
の測定値のログ倍率変化を表し、
【数７２】
0006372892.tif 000073
は下流
【数７３】
0006372892.tif 000074
のスコアを表す。各ｋのＨＹＰスコアを一次ＨＹＰスコア化方法によって算出する場合、各
【数７４】
0006372892.tif 000075
の式を包括的に下式のように表すことができる。
【数７５】
0006372892.tif 000076
ここで、
【数７６】
0006372892.tif 000077
はＨＹＰｋ内の下流ノードのセットＡｋにあるノードｌの測定値のログ倍率変化を表し、ここで、項αｌは任意の重み付け係数（例えば、Ｗｋ）、換算係数（例えば、ＧＰＩ  ＨＹＰスコア化方法では１−ｐｖａｌｌ）、及び方向ｄｌを含む。メタＨＹＰ内の各ＨＹＰｋがこのようにスコア表示されていると、メタＨＹＰスコアを下式のように公式化することができる。
【数７７】
0006372892.tif 000078
【００６３】
この式は、測定値のログ倍率変化の重み付けした合計にすぎないので、複数の項で生じる（すなわち、メタＨＹＰ内の複数のＨＹＰで下流測定値として現れる）各測定値の重みを合計することができる。したがって、メタＨＹＰの強度は下式のように表すことができる。
【数７８】
0006372892.tif 000079
ここで、
【数７９】
0006372892.tif 000080
はメタＨＹＰ内の任意のＨＹＰで下流として現れるノードｍの測定値のログ倍率変化を表し、項αｍは測定したノードｍに関連付けられた正味重み付け係数である。この形態で、メタＨＹＰのスコアを計算して、測定値のログ倍率変化の一次関数にしている。したがって、メタＨＹＰをＨＹＰと交換することができ、ここで（ネットワークを表す）ソースコードを下流ノードｍに接続するエッジの符号が、符号（αｍ）によって与えられ（負は因果減少エッジ、正は因果増大エッジである）、各ノードに関連付けられた重み付け係数が
【数８０】
0006372892.tif 000081
によって与えられる。メタＨＹＰをＨＹＰに変換する能力があるので、この枠組みを追加的に任意のＨＹＰ様構造に拡張することができ、ここで下流ノードは他のメタＨＹＰ又はＨＹＰによって表される。
【００６４】
可能化テクノロジー
本明細書に記載する技術は、同一所有の同時係属出願の米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０００３８６０８号明細書、第２００５／０１６５５９４号明細書、第２００５／０１５４５３５号明細書、及び第２００７／０２２５９５６号明細書に記載されているようなコンピュータに実施された可能化テクノロジーを使用して実施される。参照により本明細書に組み込まれ開示を含むこれらの特許出願は、因果に基づく系の生物学的モデリングツール及び方法論について述べている。一般的に、このアプローチは、生物系の生物学的関係に関する仮説をたてるために、生物学的要素を表す複数のノードを含むデータベース、及びノード間の関係を述べる関係記述子を使用するソフトウェアで実施する方法を提供し、データベースのノード及び関係記述子は、生物学的表明の集合を含み、そこから１つ又は複数の候補生物学的表明が選択される。調査するためにデータベース内の標的ノードを選択した後、標的ノードの攪乱を規定する。それに応答して、標的ノードに影響する可能性があるか、標的ノードの影響を受けるデータベースの所与のノード及び関係記述子を横断する。横断ステップ中に生成されたデータに応答して、さらに解析するために候補の生物学的表明を特定することができる。これらの生物学的表明、及び本明細書に記載するノードは、標的ノードにとって重要なシグネチャ（すなわち、シグネチャの参照ノード）を含む。
【００６５】
本開示の態様は、１つ又は複数の機械又はコンピュータデバイス上で通常はソフトウェアで実践することができる。一般化すると、機械又はコンピュータデバイス（「コンピュータ実体」）は通常、コモディティであるハードウェア及びソフトウェアと、記憶装置（ディスク、ディスクアレイなど）と、メモリ（ＲＡＭ、ＲＯＭなど）とを備える。システムに使用される特定のコンピュータ実体は、開示された主題を制限するものではない。所与の機械は、通常の方法で機械をネットワークに接続するネットワークインタフェース及びソフトウェアを含む。主題又はその特徴は、独立したプログラムとして、又は１つ又は複数のネットワークに接続された、又は接続可能な機械のセットを使用する管理されたサービスとして実施することができる。さらに一般的には、一緒になって上述した本発明の機能を促進又は提供する１つ又は複数のコンピュータ関連の実体（システム、機械、プロセス、プログラム、ライブラリー、機能など）のセットを使用する製品又はサービスが提供される。典型的な実装では、サービスは１つ又は複数のコンピュータのセットを含む。代表的な機械は、コモディティである（例えば、Ｐｅｎｔｉｕｍクラスの）ハードウェアを実行するネットワークベースのサーバ、オペレーティングシステム（例えば、Ｌｉｎｕｘ、Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＯＳ−Ｘなど）、アプリケーション実行時環境（例えば、Ｊａｖａ、．ＡＳＰ）、及び所与のシステム又はサブシステムの機能を提供するアプリケーション又はプロセッサ（例えば、プラットフォームに応じてＡＪＡＸテクノロジー、Ｊａｖａアプレット又はサーブレット、リンク可能なライブラリー、ネイティブコードなど）のセットである。ディスプレイを使用して出力を提供することができる。既述したように、製品又はサービス（又はその任意の機能）は、独立したサーバに、又は分散した機械のセットにわたって、又は任意のタブレット又はハンドヘルド式コンピュータデバイスに実装することができる。通常、サーバ又はコンピュータデバイスは、所望の実装環境に応じて公的に経路指示可能なインターネット、イントラネット、プライベートネットワーク、又はその任意の組み合わせに接続する。
【００６６】
別の態様によれば、コンピュータ可読命令を含むコンピュータプログラム製品が提供される。コンピュータ可読命令は、コンピュータシステムにロードされ、実行されると、上述した様々な算出方法に従ってコンピュータシステムに演算させる。
【００６７】
さらに一般的には、本明細書に記載する技術は、一緒になって上述した機能を促進又は提供する１つ又は複数のコンピュータ関連実体（システム、機械、プロセス、プログラム、ライブラリー、機能など）のセットを使用して提供される。典型的な実装では、ソフトウェアを実行する根底となる代表的な機械は、コモディティであるハードウェア、オペレーティングシステム、アプリケーション実行時環境、及びアプリケーション又はプロセス及び関連するデータのセットを含み、これは所与のシステム又はサブシステムの機能を提供する。記載のように、機能は独立した機械で、又は分散した機械のセットにわたって実施することができる。
【００６８】
本開示の態様を実践することができるコンピュータプラットフォームは、同じ場所に設置されたハードウェア及びソフトウェアの資源、又は物理的、論理的、仮想的及び／又は地理的に別個の資源を含む。プラットフォームとの間で通信するのに使用される通信ネットワークは、バケットベース、非パケットベース、及び秘密又は非秘密、又はそれらの何らかの組み合わせとすることができる。
【００６９】
このようなテクノロジープラットフォームの１つ又は複数の機能は、クラウド系のアーキテクチャで実装することができる。周知のように、クラウドコンピューティングは、構成可能なコンピュータ資源（例えば、ネットワーク、ネットワーク帯域幅、サーバ、処理、メモリ、記憶装置、アプリケーション、仮想機械、及びサービス）の共用プールに対するオンデマンドのネットワークアクセスを可能にするためのサービスデリバリのモデルであり、これは最小限の管理努力又はサービスのプロバイダとの対話で迅速に提供及び解除することができる。全体的又は部分的に活用することができる入手可能なサービスモデルには、Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ａｓ  ａ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＳａａＳ）（クラウドのインフラストラクチャでプロバイダのアプリケーションが実行される）、Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ａｓ  ａ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＰａａＳ）（顧客がプロバイダのツールを使用して生成することができるアプリケーションをクラウドのインフラストラクチャ上に配備する）、Ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓ  ａ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＩａａＳ）（顧客が自身の処理、記憶装置、ネットワーク及び他のコンピュータ資源をプロビジョニングし、オペレーティングシステム及びアプリケーションを配備・実行することができる）が含まれる。
【００７０】
コンピュータ実体又はシステムの所与の構成要素について別個に述べてきたが、機能の幾つかは所与の命令、プログラムシーケンス、コード部分などで組み合わせるか、共用できることが当業者には認識される。
【００７１】
上述した数学的導出は代表的であり、限定するものではない。技術は特に、作用物質の生物学的影響の評価を定量化する、生物学的ネットワークの応答を特徴付ける、ｉｎ  ｖｉｖｏ系の複雑な攪乱の生物学的影響を機構的に評価することなどに使用することができる。本明細書のアプローチは、個々の分子機構から系レベルのプロセスまで、生物学的実体をスコア化する統一され整合性のある枠組み、さらに各レベルのスコアを計算する方法を促進する。記載されるように、スコアは、活性の既知の効果に基づくその活性の程度、例えば、遺伝子の差次的発現、他の生物学的分子（例えば、タンパク質）の差次的レベル又は活性などの客観的評価を表す。本明細書に記載する定量方法は、トランスクリプトミクスによって測定した曝露に対する生物学的応答に対して、包括的な推定機構を提供する。この方法に可能な１つの使用法は、ある範囲の生物学的プロセス（治療に関係ある、及び関係ないプロセスを含む）に対する様々な治療薬の相対的効果を理解するために、その生物学的影響の比較評価を提供することである。さらに、消費者製品の環境曝露の生物学的影響を、系毒物学の新規のアプローチとして評価することができた。
【００７２】
したがって、例えば、上述したネットワークスコア化方法の１つの用途は、環境毒素に対する曝露で起こりえる効果を測定することである。このようなシナリオでは、生物学的ネットワークは、酸化ストレス応答、ＤＮＡ損傷応答、及びアポトーシスシグナル伝達経路のような細胞ストレスを感知し、反応する様々な経路を表す。細胞系統又は動物モデルを問題の毒素に曝露する実験から、トランスクリプトミクスのデータを収集し、このトランスクリプトミクスのデータからネットワークスコアを算出する。次に、特定のネットワークスコアを使用して、どの生物学的経路が毒素の影響を受けるか評価する。また、様々な毒素にまたがってネットワークスコアを比較し、様々な経路に対する毒素の相対的効果を算出及び／又はランク付けすることができる。例えば、酸化ストレス経路に対して毒素を最高スコアから最低スコアまでランク付けし、どの毒素が潜在的により強力な酸化ストレスの誘発因子であるか決定することができる。ある範囲の生物学的ネットワークにまたがって、このようなアプローチは様々な経路に対する様々な毒素の相対的影響を評価し、毒素の毒性プロファイルを比較する手段を提供し、そのネットワーク及びサブネットワークスコアを、既知の露光効果及び毒性限界を有する別の毒素のスコアと比較することによって、１つの毒素の曝露限界を算出する。
【００７３】
別の例示的用途は、治療薬又は処置の効果の測定にある。適切な実験系（例えば、細胞系統又は動物モデル）を薬物で処置し、トランスクリプトミクスのデータを収集する。薬物の１つ又は複数の標的経路を表すネットワークをスコア化して、薬物の影響を評価し、関連するシグナル伝達経路を表すネットワークをスコア化して、薬物の潜在的な標的外の効果を検査する。さらに、様々なストレス及び毒素経路を表すネットワークをスコア化して、薬物の潜在的な毒性効果を評価しえる。最後に、単一の薬物の様々な用量、又は同じ経路（又は複数の経路）を標的とする様々な薬物を、標的経路におけるそれらの効果、関連する経路、及び毒性経路について比較し、所望の効果を有する用量又は薬物を特定する。
【００７４】
これらは代表的な使用ケースにすぎない。
【００７５】
本発明について説明してきたが、以下で請求の範囲を示す。
【図１】
0006372892.tif 000082
【図２】
0006372892.tif 000083
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006372892.tif 000088
【図８】
0006372892.tif 000089
【図９】
0006372892.tif 000090
【図１０】
0006372892.tif 000091