(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血中循環腫瘍細胞の解析のための生検から得られた血中循環腫瘍細胞より腫瘍を確立する方法であって、
（ａ）１またはそれ以上の血中循環腫瘍細胞を単離し、
（ｂ）該血中循環腫瘍細胞を細胞追跡用色素で標識し、
（ｃ）受精後２４から４８時間のゼブラフィッシュ胚に該血中循環腫瘍細胞を注入し、そして
（ｄ）該胚を２４時間またはそれ以上インキュベートすること
を含む、方法。
【請求項２】
細胞追跡用色素が蛍光色素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血中循環腫瘍細胞が、受精後２４から４８時間のゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
血中循環腫瘍細胞が、（ｉ）胚体部分に浸潤するか、または（ｉｉ）卵黄嚢内に留まるかどうかを決定するために胚をインキュベート後に血中循環腫瘍細胞の位置を測定することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
血中循環腫瘍細胞が胚体部分に浸潤するとき、血中循環腫瘍細胞の位置を用いて該血中循環腫瘍細胞が転移の可能性を有することを示すことをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
血中循環腫瘍細胞の位置が、蛍光顕微鏡下で血中循環腫瘍細胞の１またはそれ以上の蛍光画像を取得することにより測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ａ．血中循環腫瘍細胞巣の幅（Ｗ）および長さ（Ｌ）を測定するために画像解析ソフトウェアを用いて血中循環腫瘍細胞巣の体積を１／２（幅（Ｗ））（長さ（Ｌ））２として計算し、
ｂ．血中循環腫瘍細胞巣の侵襲性の指標(invasive index)を侵襲指標（ＩＩ）＝１／ｎ  Σ（Ｔ時間での胚における腫瘍巣の数／胚に注入された血中循環腫瘍細胞の総数）（式中、ｎは、実験で考慮される胚の数であり、Ｔは、インキュベーション時間である）として測定し、より高いＩＩ値は、原発腫瘍の浸潤の可能性がより高いことを示し、そして
ｃ．血中循環腫瘍細胞の移動指数を移動指数（ＭＩ）＝１／ｎ  Σ（Ｔ時間でのＣＤ／Ｔ時間での腫瘍巣の総数）（式中、ＣＤは血中循環腫瘍細胞が伝播する累積距離であり、ｎは実験で考慮される胚の数であり、Ｔはインキュベーション時間である）として測定し、より高いＭＩ値は、血中循環腫瘍細胞の侵襲性がより高いことを示す、
の１つまたはそれ以上により胚卵黄嚢および胚体部分における血中循環腫瘍細胞を定量化することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
血中循環腫瘍細胞巣の体積、侵襲指標または移動指数のいずれか１つが、化合物が存在するときに存在しない場合と比較して異なるかどうかを決定することをさらに含む、請求項７に記載の方法
【請求項９】
第一の胚のインキュベーションが化合物の存在下であり、かつ第二の胚のインキュベーションが化合物の不存在下であり、かつ第一の胚のインキュベーションが第二の胚のインキュベーションと比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ａ．インキュベーション後、胚および血中循環腫瘍細胞をプロテアーゼ溶液中で消化し、
ｂ．胚および血中循環腫瘍細胞をピペッティングにより分散させて、単一細胞懸濁液に解離させ、
ｃ．血中循環腫瘍細胞を固定し、蛍光顕微鏡下で単一細胞懸濁液中の細胞を計数し、
ｄ．計数された血中循環腫瘍細胞と注入された血中循環腫瘍細胞の比を計算し、
ｅ．化合物の存在下でのインキュベーションの比率と化合物の不存在下でのインキュベーションの比率を比較し、
ｆ．該化合物が血中循環腫瘍細胞に影響を与えるかどうかを決定するための比較に用いること
により、血中循環腫瘍細胞に対する化合物の効果を測定することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
血中循環腫瘍細胞の侵襲性パターンを化合物の存在下または不存在下で測定および比較することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ａ．インキュベーション後、胚および血中循環腫瘍細胞を酵素消化し、
ｂ．消化された胚および血中循環腫瘍細胞からＤＮＡを単離し、
ｃ．消化された胚および血中循環腫瘍細胞のＤＮＡから１またはそれ以上の遺伝子をＰＣＲ増幅し、
ｄ．増幅させた１またはそれ以上の遺伝子を配列決定し、
ｅ．消化された胚および血中循環腫瘍細胞のＤＮＡをバイサルファイトシーケンシングを行い、後成的修飾の位置を示すこと
により、血中循環腫瘍細胞のＤＮＡにおける変化を評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ．インキュベーション後、胚および血中循環腫瘍細胞を酵素消化し、
ｂ．消化された胚および血中循環腫瘍細胞のＲＮＡを単離し、
ｃ．ヒトの遺伝子配列に対して設計された２またはそれ以上のプライマーを用いて遺伝子発現の定量的リアルタイムＰＣＲ分析を行うこと
により、血中循環腫瘍細胞における遺伝子発現を分析することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ａ．化学固定液を用いて胚を固定し、１またはそれ以上のヒトタンパク質抗体を用いる免疫組織化学を用いて血中循環腫瘍細胞のタンパク質発現を可視化し、
ｂ．血中循環腫瘍細胞を注入しインキュベーションした後、組織切片スライド上で胚の免疫組織化学を用いて血中循環腫瘍細胞のタンパク質発現を可視化すること、
ｃ．血中循環腫瘍細胞のタンパク質発現をＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）を用いて可視化すること、および
ｄ．血中循環腫瘍細胞のタンパク質発現をウェスタンブロットを用いて可視化すること
のうち１またはそれ以上により血中循環腫瘍細胞のタンパク質発現を分析することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
血管新生促進因子を、血中循環腫瘍細胞のマイクロインジェクション前、マイクロインジェクション中またはマイクロインジェクション後に、ゼブラフィッシュ胚を含む水中に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
血管新生促進因子が増殖因子アンジオポエチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ．細胞追跡用色素が赤色蛍光を有し、
ｂ．受精後２４から４８時間の緑色蛍光タンパク質を遺伝子導入したゼブラフィッシュ胚の卵黄に血中循環腫瘍細胞を注入し、
ｃ．胚をインキュベーション後、緑色および赤色蛍光フィルターを用いて蛍光顕微鏡下で血中循環腫瘍細胞の１またはそれ以上の蛍光画像を取得し、
ｄ．画像解析ソフトウェアを用いて蛍光画像を分析し、画像中の血中循環腫瘍細胞巣の位置を得て、
ｅ．蛍光画像解析を用いて血中循環腫瘍細胞のホーミング指数を計算すること｛ホーミング指数（ＨＩ）＝１／ｎ  Σ（Ｔ時間での臓器中の血中循環腫瘍細胞巣の総数／Ｔ時間での血中循環腫瘍細胞巣の総数）（式中、ｎは実験で考慮される胚の数であり、Ｔはインキュベーション時間である。）｝
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
薬物の存在下と対比して、その不存在下で注入された血中循環腫瘍細胞の臓器へのホーミングパターンの変化を観察することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ａ．受精後２４から７２時間のゼブラフィッシュ胚に１またはそれ以上の血中循環腫瘍細胞をマイクロインジェクションし、
ｂ．血中循環腫瘍細胞を、所定の時間、ゼブラフィッシュ胚内で増殖させ、
ｃ．薬物とゼブラフィッシュ胚をインキュベートするか、または薬物をゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションし、そして
ｄ．一定時間後、該胚における血中循環腫瘍細胞を測定することにより血中循環腫瘍細胞に対する薬物の効果をモニターすること
を含む、血中循環腫瘍細胞に対する効果について薬物を試験するための方法。
【請求項２０】
血中循環腫瘍細胞のマイクロインジェクション前、マイクロインジェクション中またはマイクロインジェクション後のゼブラフィッシュ胚を含む水中に血管新生促進因子を添加することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
血管新生促進因子が増殖因子アンジオポエチンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
血中循環腫瘍細胞のマイクロインジェクション中にマイクロインジェクションにより胚に血管新生促進因子を添加することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年１２月２日に出願した米国仮特許出願第６１／７３２，３７５号に基づく優先権の利益を主張し、それは一部引用により本明細書中に包含される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒト腫瘍細胞を注入することによりゼブラフィッシュにおいて腫瘍を確立する方法に関する。また、腫瘍細胞を特徴付けるため、薬物を試験するため、および個別化医療のために、ゼブラフィッシュにおける確立されたヒト腫瘍の使用にも関する。さらに、一般的に、マルチウェルマイクロインジェクションシステム、より具体的には、ゼブラフィッシュ胚についてのマルチウェルマイクロインジェクションシステムにも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
細胞内シグナル伝達の適切な制御は、正常な細胞複製、増殖、細胞生理および細胞死を含む種々の生物学的機能に関与している。細胞内の正常なシグナル伝達の混乱は、身体に種々の疾患状態を引き起こし得て、該疾患状態は、複数の細胞型および身体全体の生理学的状態の関与の結果であることが多い。具体的には、癌の場合、この状況は、とりわけ、ヒト身体の多くの基礎的な炎症状態の関与があるために複雑である。肥満、アレルギー、関節炎、および糖尿病のような種々の炎症状態は、全て、如何に癌が進行し、如何に処置され得るかに大きな影響を及ぼす。従って、癌のような複雑な状態を模倣するインビボモデルの作製は、能動免疫系を有する動物モデルを必要とする。能動免疫系がなければ、癌において観察された動的細胞不均一性は、完全に再現することができない。さらに、癌の動物モデルのような臨床的有用性のために、とりわけ各個々の癌の生物学的予測、臓器侵襲および身体の他の部分への癌細胞転移の予測のために、極短期間に（化学療法を開始する前に）個々の患者の癌を模倣し、癌細胞の治療に対する応答を予測する方法が必要である。
【０００４】
例えば乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌および膵臓癌等の上皮性腫瘍については、そのような転移性腫瘍に向けて治療を集中する必要性が極めて重要である。遠隔転移した侵襲性のステージＩＶの癌腫は顕著に低い生存率を示す（seer.cancer.gov）。
【０００５】
転移性癌は、血流および／またはリンパ管への原発腫瘍からの侵襲性悪性細胞の脱離を伴う。かかる血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、それらが二次転移を発症する遠隔臓器に到達するのを可能にする。同様に、これらのＣＴＣの存在は、予後不良と関連している (Balic M, Williams A, Lin H, Datar R, Cote RJ. (2012). Circulating Tumor Cells: From Bench to Bedside. Annu Rev Med. 2012 Oct 18.)。
【０００６】
転移性疾患の患者の処置は、原発腫瘍で観察されたバイオマーカーと二次腫瘍で観察されたバイオマーカーとのよく見られる相違にもかかわらず、原発腫瘍から得られた情報に大部分依存し続けている(Naoki Niikura, Jun Liu, Naoki Hayashi, Elizabeth A. Mittendorf, Yun Gong, Shana L. Palla, Yutaka Tokuda, Ana M. Gonzalez−Angulo, Gabriel N. Hortobagyi and Naoto T. Ueno (2011); Loss of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) Expression in Metastatic Sites of HER2−Overexpressing Primary Breast Tumors. J Clin Oncol, 30:593−599; Dupont Jensen J, Laenkholm AV, Knoop A, Ewertz M, Bandaru R, Liu W, Hackl W, Barrett JC, Gardner H. (2011); PIK3CA mutations may be discordant between primary and corresponding metastatic disease in breast cancer. Clin Cancer Res. 17:667−77)。二次腫瘍および転移の環境に関する研究先駆者として、二次腫瘍の生物学を理解することは、進行性癌患者の個別化医療に新たな視点を追加し得る。本発明者らの仮説を支持して、ＣＴＣの予後に関する重要度は、種々の癌種について実証されている(Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, Matera J, Miller MC, Reuben JM, Doyle GV, Allard WJ, Terstappen LW, Hayes DF. (2004); Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351:781−91; Moreno JG, Miller MC, Gross S, Allard WJ, Gomella LG, Terstappen LW. (2005); Circulating tumor cells predict survival in patients with metastatic prostate cancer. Urology 65:713−8; Cohen SJ, Punt CJ, Iannotti N, Saidman BH, Sabbath KD, Gabrail NY, Picus J, Morse MA, Mitchell E, Miller MC, Doyle GV, Tissing H, Terstappen LW, Meropol NJ. (2009); Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann Oncol. 20:1223−9; Krebs MG, Sloane R, Priest L, Lancashire L, Hou JM, Greystoke A, Ward TH, Ferraldeschi R, Hughes A, Clack G, Ranson M, Dive C, Blackhall FH. (2011); Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non−small−cell lung cancer. J Clin Oncol. 29:1556−63)。
【０００７】
癌細胞の分子およびゲノムプロファイリングが、標的化療法および腫瘍研究における新たな傾向となってきている。しかしながら、癌細胞の分子多様性と絶えず変化しているそれらの性質の関連性、原発腫瘍とＣＴＣとの分子指標の関連性は限定されている(Powell AA, Talasaz AH, Zhang H, Coram MA, Reddy A, et al. (2012) Single Cell Profiling of Circulating Tumor Cells: Transcriptional Heterogeneity and Diversity from Breast Cancer Cell Lines. PLoS ONE 7: e33788.)。
【０００８】
癌細胞の分子およびゲノムプロファイリングは、個々の特定の癌を標的とした治療を提供し得るために重要となってきている。しかしながら、原発腫瘍のプロファイリングは、転移性ＣＴＣで生じた分子の変化を表すものではない。転移性二次腫瘍の標的療法に必要とされることは、ＣＴＣをプロファイリングするための方法である。しかし、患者の血液中に存在するＣＴＣは顕著に少なく、そのため、細胞を単離し特徴付けるのは非常に困難である。さらに、患者の血液中の少ないＣＴＣの単離は、細胞が増殖され試験され得る場合を除いて、用途が限定されている。組織培養においてＣＴＣを増殖させることは可能であるが、インビトロでの培養は、細胞の特性、特に正常組織へ浸潤し、三次元の腫瘍を形成し、そして増殖因子および血管を動員するそれらの能力を十分に表すものではない。
【０００９】
一般的な淡水魚であるゼブラフィッシュ（Danio rerio）は、重要なモデル生物であり、科学的研究にますます使用されている (Lieschke and Currie (2007) “Animal models of human disease: zebrafish swims into view.” Nature Reviews Genetics 8:353−367)。医学分野において、ゼブラフィッシュは、胚発生、心血管研究、神経の発達および網膜再生の研究においてかなり用いられており、近年、ほとんど全ての癌種で優れたモデルとして確立されている(Stoletov and Klemke (2008) “Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene 27:4509−4520)”。
【００１０】
ゼブラフィッシュは、ヒトで見られるものとよく似た発癌性化学物質に対する応答および新生物の形成を示す(Beckwith et al (2000) “Ethylnitrosourea induces neoplasia in zebrafish (Danio rerio).” Lab Invest. 80(3):379−385)。また、癌遺伝学のための素晴らしいモデルである(Stern and Zon (2003). “Cancer genetics and drug discovery in the zebrafish.” Nature Rev. Cancer 3: 533−539)。ゼブラフィッシュにおける遺伝子操作の容易性は、血管形成、アポトーシスおよび転移を理解するための優れたモデルであることに役立っている(Serbedija et al (1999) “Zebrafish angiogenesis: a novel model for drug screening.”; Angiogenesis 3:353−359; Parng et al (2002) “Zebrafish: a preclinical model for drug screening.”; Assay Dev. Technol. 1:41−48; Marques et al (2009) “Metastatic behavior of primary human tumours in a zebrafish xenotransplantation model.” BMC Cancer 9:128)。
【００１１】
ゼブラフィッシュにおける操作は、その成長の種々の段階で実行されるが、受精後４８時間（ｈｐｆ：受精後の時間）が頻繁に使用され、操作のための優先度の高い段階の１つである。大規模な遺伝学的研究、薬物スクリーニングおよび毒性試験、および癌細胞アッセイ中に多くのゼブラフィッシュ胚の処理に必要な時間および労力はしばしば、ほとんどの研究室の制限要因であり得る。しかしながら、主にそれらの細長く独特な形状のために、現在のところ、受精後４８時間（ｈｐｆ）のゼブラフィッシュ胚のマルチウェルマイクロインジェクションシステムは市販されていない。
【００１２】
自動化マルチウェルマイクロインジェクションシステムは細胞生物学の分野でよく知られており、主に、核内または細胞質内への、例えばＤＮＡ、ＲＮＡｉ、タンパク質または精子のような他の細胞等の物質の注入に使用される。自動化システムは、手動で達成することが困難であることが多い再現可能な一貫性および精度を有する大量のマイクロインジェクションを可能にする。
【００１３】
従って、初代腫瘍細胞およびＣＴＣのプロファイリングおよび特徴付けに必要とされるのは、動物モデルにおいてインビボで腫瘍細胞を確立し、増殖させるための方法である。これは、腫瘍細胞における薬物試験を可能にし、患者における腫瘍細胞を標的とする療法を提供することができる。さらに、当技術分野で必要とされるのは、遺伝学的研究、毒性試験、薬物試験、および癌研究のための受精後４８時間のゼブラフィッシュ胚の効率的操作および注入を可能にするシステムである。
【００１４】
発明の背景
米国特許出願第１０／９２３，２５３号（またはＵＳ２００５／０１１２０３０Ａ１）は、Stephanie E. Gausにより２００４年８月２０日に出願され、“メッシュウェルプレート”と題して、溶液の迅速な排出を可能とし、かつウェル間の溶液の“吸い上げ”を阻止するために開口部を有するメッシュ構造の取り外して交換される底部を有する９６ウェルプレートのようなマルチウェルプレートを開示している。“メッシュウェルプレート”は、ゼブラフィッシュ胚をアッセイするのに特に有用であることが意図されると記載されている。
【００１５】
ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＳ２００５／０００２５５は、Alfonso Gutier−Rez Adan等により２００５年５月１２日に出願され、“胚および／または細胞の操作のための添加物”と題して、接着性を低下させ、かつ培地の流動性を保持しながら粘性を増加させるため、着床前期の胚への細胞のマイクロインジェクションを含むマイクロマニピュレーションを補助するために、合成ヒアルロン酸、大豆から得られるリン脂質または不飽和脂肪酸のような化合物を含む操作培地を補充することにより、胚および細胞の操作媒体の品質および安全性を高めるためのシステムを開示している。
【００１６】
米国特許出願第１１／２２４，３６４号（またはＵＳ２００６／００１０５１０Ａ１）は、Leandro Christmannにより２００５年９月１２日に出願され、“マイクロインジェクションアセンブリおよび鳥類の卵のマイクロインジェクションおよび再移植のための方法”と題して、顕微鏡、マイクロマニピュレータ、マイクロピペットおよび圧電発振器を含むマイクロインジェクションシステム、ならびに鳥類の卵の胚ディスクをマイクロインジェクション可能にする斜めに傾斜したマクロのモニタリングユニットを含むマイクロインジェクションアセンブリを開示している。
【００１７】
ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０００６８６８は、Daniel G. O’Connellにより２００６年２月２７日に出願され、“細胞トレイ”と題して、細胞、生物学的液体、化合物および／または固体試料の大規模マトリックスの自動処理ならびに同時モニタリングおよび分析を可能にするマルチウェル細胞トレイを開示している。
【００１８】
英国特許出願第１００４６２９号は、Jan De Sonnevilleにより２０１２年３月１９日に出願され、“アレイマイクロインジェクション装置および方法”と題して、部分球形嚢陥凹のアレイを有する表面を含むアレイマイクロインジェクション装置が開示されている。各凹部は、単一細胞または単一胚を収容可能である。細胞または胚を保持する凹部に合うインジェクタのアレイは、細胞または胚、とりわけ核に物質をマイクロインジェクションするのに使用され得る。
【００１９】
米国特許第７，３３９，０９０号は、L. Christmannにより出願され、２００８年３月４日に特許権が付与され、“マイクロインジェクション装置および使用方法”と題して、針および表示装置を含むマイクロインジェクション装置（表示装置は、直角以外の角度からオペレータへの被写体の拡大表示を提供する）を開示している。
【００２０】
ＷＯ００６５１３７号は、M. Palacios−Boyceにより２０００年１１月２日に出願され、“細胞または胚を操作するのに有用な微小電気機械装置”と題して、複合結合したシリコンウエハの対を含む細胞標識用微小電気機械システム装置に関する。
【００２１】
ＷＯ２０５８８４７号は、M. Paranjape等により２００２年８月１日に出願され、“統合型マイクロピアスインジェクターを組み込んだシングルチップのシリコン製微細加工アレイを用いた細胞の形質転換”と題して、細胞内への分子の導入のための改良された方法であって、これらの手順が高スループットレベルで行われるための効率的な手段を提供する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国特許出願第１０／９２３，２５３号
【特許文献２】ＰＣＴ／ＥＳ２００５／０００２５５
【特許文献３】米国特許出願第１１／２２４，３６４号
【特許文献４】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０００６８６８
【特許文献５】英国特許出願第１００４６２９号
【特許文献６】米国特許第７，３３９，０９０号
【特許文献７】ＷＯ００６５１３７号
【特許文献８】ＷＯ２０５８８４７号
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】seer.cancer.gov
【非特許文献２】Balic M, Williams A, Lin H, Datar R, Cote RJ. (2012). Circulating Tumor Cells: From Bench to Bedside. Annu Rev Med. 2012 Oct 18. [Epub ahead of print]
【非特許文献３】Naoki Niikura, Jun Liu, Naoki Hayashi, Elizabeth A. Mittendorf, Yun Gong, Shana L. Palla, Yutaka Tokuda, Ana M. Gonzalez−Angulo, Gabriel N. Hortobagyi and Naoto T. Ueno (2011). Loss of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) Expression in Metastatic Sites of HER2−Overexpressing Primary Breast Tumors. J Clin Oncol, 30:593−599.
【非特許文献４】Dupont Jensen J, Laenkholm AV, Knoop A, Ewertz M, Bandaru R, Liu W, Hackl W, Barrett JC, Gardner H. (2011). PIK3CA mutations may be discordant between primary and corresponding metastatic disease in breast cancer. Clin Cancer Res. 17:667−77.
【非特許文献５】Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, Matera J, Miller MC, Reuben JM, Doyle GV, Allard WJ, Terstappen LW, Hayes DF. (2004). Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351:781−91.
【非特許文献６】Moreno JG, Miller MC, Gross S, Allard WJ, Gomella LG, Terstappen LW. (2005). Circulating tumor cells predict survival in patients with metastatic prostate cancer. Urology 65:713−8.
【非特許文献７】Cohen SJ, Punt CJ, Iannotti N, Saidman BH, Sabbath KD, Gabrail NY, Picus J, Morse MA, Mitchell E, Miller MC, Doyle GV, Tissing H, Terstappen LW, Meropol NJ. (2009). Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann Oncol. 20:1223−9.
【非特許文献８】Krebs MG, Sloane R, Priest L, Lancashire L, Hou JM, Greystoke A, Ward TH, Ferraldeschi R, Hughes A, Clack G, Ranson M, Dive C, Blackhall FH. (2011). Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non−small−cell lung cancer. J Clin Oncol. 29:1556−63.
【非特許文献９】Powell AA, Talasaz AH, Zhang H, Coram MA, Reddy A, et al. (2012) Single Cell Profiling of Circulating Tumor Cells: Transcriptional Heterogeneity and Diversity from Breast Cancer Cell Lines. PLoS ONE 7: e33788.
【発明の概要】
【００２４】
発明の概要
本発明の目的
本発明の目的は、動物モデルにおける初代腫瘍細胞およびＣＴＣのプロファイリングおよび特徴付けの技術的問題を克服すること、およびゼブラフィッシュ胚の効率的な操作および注入を可能にするシステムを提供することである。
【００２５】
本発明者等は、これらの技術的課題が、ゼブラフィッシュへ異種移植されたヒトＣＴＣからの生存増殖可能な腫瘍の発生、注入されたＣＴＣの転移の可能性の検討、単離されたＣＴＣの臓器特異性の予測、および治療薬への応答の評価を含む種々の方法により解決されることを見出した。癌の進行および化学療法に対する応答を予測するハイスループットな早期アッセイ法もまた提供される。
【００２６】
発明の説明
本発明の一面において、生検または外科的に切除された腫瘍から得られた初代腫瘍細胞から三次元の腫瘍を発生させるために、
（ａ）腫瘍細胞を単離し、
（ｂ）腫瘍細胞を細胞追跡用色素で標識し、
（ｃ）受精後２４から４８時間（ｈｐｆ）のゼブラフィッシュ胚に該細胞をインジェクションし、
（ｄ）該胚を２４時間またはそれ以上インキュベートする
各工程を含んでなる方法が提供される。
【００２７】
一態様において、腫瘍細胞は血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）から得られる。
【００２８】
別の態様において、細胞追跡用色素は蛍光色素である。
【００２９】
別の面において、本発明は、原発腫瘍の浸潤または転移の可能性を予測する方法であって、
（ａ）腫瘍細胞をゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入し、
（ｂ）注入された腫瘍細胞を有する胚をインキュベートし、
（ｃ）インキュベーション後、腫瘍細胞の位置を観察し、
（ｄ）（ｉ）腫瘍細胞が、卵黄嚢を経て胚体部分に浸潤するか、または（ｉｉ）該細胞が卵黄嚢内に留まり、非浸潤性初代腫瘍細胞に近い挙動をするかを解析すること、
を含む方法を提供する。
【００３０】
本発明の別の態様において、疾患の再発可能性がより高い癌患者を同定するための方法が提供される。該方法は、
（ａ）初代腫瘍細胞を胚の卵黄に注入し、
（ｂ）注入された腫瘍細胞を有する胚をインキュベートし、
（ｃ）インキュベーション後、腫瘍細胞の位置を観察し、
（ｄ）該腫瘍細胞が胚体部分に進入するとき、原発腫瘍の浸潤および転移の可能性が高いとすること
を含む。
【００３１】
別の態様において、癌細胞侵襲は、
（ａ）固形腫瘍から腫瘍細胞を単離し、
（ｂ）該細胞を細胞追跡用色素で標識し、
（ｃ）受精後２４−４８時間（ｈｐｆ）のゼブラフィッシュ胚の卵黄に該細胞をマイクロインジェクションし、
（ｄ）該胚を摂氏３５℃で２４時間またはそれ以上インキュベートし、
（ｅ）蛍光顕微鏡下で腫瘍細胞の蛍光画像を自動取得し、
（ｆ）画像解析ソフトウェアを用いて腫瘍巣(tumor foci)の自動化分析を行い（ここで、得られるデータは、腫瘍巣の幅（Ｗ）および長さ（Ｌ）、各病巣のシグナルの強度、および画像内のスポットの位置である。）、
（ｇ）取得した画像上の腫瘍巣の面積が病巣のサイズおよび体積を提供し、体積は１／２ＷＬ２(式中、Ｗは幅であり、Ｌは長さである。)により計算され得て、
（ｈ）原発腫瘍の浸潤の可能性を測定するために腫瘍巣の位置を用いること｛ここで、侵襲性の指標(invasive index)は、侵襲指標（ＩＩ）＝１／ｎ  Σ（Ｔ時間での胚における腫瘍巣の数／胚に注入された腫瘍細胞の総数）（式中、ｎは、実験で考慮される胚の数であり、Ｔは、インキュベーション時間である）として測定され得る。｝、
（ｉ）腫瘍の侵襲性を測定するために腫瘍巣の位置を用い得ること｛ここで、移動指数は、移動指数（ＭＩ）＝１／ｎ  Σ（Ｔ時間でのＣＤ／Ｔ時間での腫瘍巣の総数）(式中、ＣＤは腫瘍細胞が伝播する累積距離であり、ｎは実験で考慮される胚の数であり、Ｔはインキュベーション時間である)として計算され得る。｝
を含む工程により定量化され得る。
【００３２】
別の態様において、腫瘍巣(tumor foci)の体積、侵襲指標、または移動指数のうちいずれか１つが、該化合物が存在するときに存在しない場合と比較して異なるかどうかを決定することにより、腫瘍細胞による化合物に対する応答を測定するための方法が提供される。
【００３３】
本発明の別の態様において、好適な臓器への定着（ホーミング）の予測は、蛍光標識された血管新生を有するトランスジェニックフィッシュ（例えばＴｇ（Ｆｌｉ：ＥＧＦＰ）等）を用いた画像解析により自動化された方法で行うことができる。血管新生に基づき、胚における腫瘍巣(tumor foci)の位置を予測することができる。該方法は、
（ａ）固形腫瘍から腫瘍細胞を単離し、
（ｂ）例えばＰＫＨ−２６(Sigma)またはＤｉＤ(Lifetech)等の赤色蛍光を有する細胞追跡用色素を用いて細胞を標識し、
（ｃ）受精後２４−４８時間（ｈｐｆ）のＴｇ（Ｆｌｉ：ＥＧＦＰ）ゼブラフィッシュ胚の卵黄に該細胞をマイクロインジェクションし、
（ｄ）該胚を摂氏３５℃で２４時間またはそれ以上インキュベートし、
（ｅ）緑色および赤色蛍光の両方のフィルターを用いて蛍光顕微鏡下で腫瘍細胞の蛍光画像を自動取得し、
（ｆ）画像解析ソフトウェアを用いて腫瘍巣の自動化分析を行い（得られたデータは、画像中の病巣の位置を示す。）
（ｇ）画像解析を用いて、自動化された方法で腫瘍のホーミング指数を予測すること｛ホーミング指数（ＨＩ）＝１／ｎ  Σ（Ｔ時間での臓器中の病巣の総数／Ｔ時間での腫瘍巣の総数）（式中、ｎは実験で考慮される胚の数であり、Ｔはインキュベーション時間である。）として計算され得る｝
を含む。
【００３４】
別の態様において、本発明は、腫瘍の侵襲、転移または臓器へのホーミング過程の間のゼブラフィッシュの免疫系における変化をモニターする方法であって、
（ａ）免疫細胞において発現された蛍光タンパク質を有する遺伝的に改変された胚を用いて、特定の免疫細胞の局在および数の変化をモニターすること。例えば、ｇａｔａ２−ＧＦＰを発現するゼブラフィッシュ胚は、ゼブラフィッシュの身体のあらゆる部分に存在する好酸球の局在をモニターし、ならびにその数を測定するために用いることができる。
（ｂ）胚全体の免疫組織化学的染色を用いて免疫細胞の局在および計数をモニターすること
を含む、方法を提供する。
【００３５】
本発明の別の面において、合成または天然の化合物または生物学的物質の有無下でインキュベーション後に腫瘍細胞の生存数を測定する方法が提供され、以下
（ａ）ゼブラフィッシュ胚をプロテアーゼ溶液中で消化し、
（ｂ）細胞をピペッティングにより穏やかに分散させて、ゼブラフィッシュ胚を解離させて単一細胞懸濁液とし、
（ｃ）細胞を固定し、蛍光顕微鏡下で計数し、
（ｄ）生存蛍光腫瘍細胞の総数と細胞の注入数の比を処理ゼブラフィッシュ胚と未処理ゼブラフィッシュ胚とで比較して、合成または天然の化合物および生物学的物質の効果を未処理胚と比較して予測すること
を含む方法が提供される。
【００３６】
別の態様において、腫瘍細胞の侵襲性のパターンを薬物の存在下または不存在下で測定し、比較すること、および細胞の侵襲性が薬物の存在下で異なるかどうかを比較することを含む方法が、腫瘍細胞の侵襲性に対する薬物の効果を予測するために提供される。
【００３７】
別の態様において、薬物の存在下または不存在下で腫瘍細胞の臓器へのホーミングパターンの変化を観察することを含む方法が、癌細胞の臓器ホーミング嗜好に対する薬物の効果を予測するために提供される。
【００３８】
本発明の別の面において、腫瘍細胞のＤＮＡにおける変化を評価するために、
（ａ）腫瘍細胞を含む全胚またはゼブラフィッシュ組織の一部を酵素消化し、
（ｂ）消化された胚または組織からＤＮＡを単離し、
（ｃ）ヒトの遺伝子配列に対して設計されたＰＣＲプライマーを用いて目的の遺伝子をＰＣＲ増幅し、
（ｄ）配列決定して、変異を位置決定し、
（ｅ）バイサルファイトシーケンシングを行い、後成的修飾の位置を示すこと
を含む方法が提供される。
【００３９】
本発明の別の面において、癌細胞における遺伝子発現を分析するために、
（ａ）腫瘍細胞を含む全胚またはゼブラフィッシュ組織の一部を酵素消化し、
（ｂ）消化された胚または組織からＲＮＡを単離し、
（ｃ）ヒトの遺伝子配列に対して設計された特定のプライマーを用いて遺伝子発現の定量的リアルタイムＰＣＲ分析を行うこと、
を含む方法が提供される。
【００４０】
本発明の別の面において、癌細胞におけるタンパク質発現を分析するために、
（ａ）４％パラホルムアルデヒドのような化学固定液を用いて全胚を固定し、ヒトタンパク質に特異的な抗体を用いる免疫組織化学を用いてタンパク質発現を可視化すること、
（ｂ）腫瘍細胞を注入した後、ゼブラフィッシュ胚の組織切片スライド上の免疫組織化学を用いてタンパク質発現を可視化すること、
（ｃ）タンパク質発現をＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）またはウェスタンブロットを用いて可視化すること、
のうち１つを含む方法が提供される。
【００４１】
別の面において、本発明は、受精後４８時間（ｈｐｆ）のゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクションを自動化するマルチウェルマイクロインジェクションシステムを提供する。該システムは、（Ａ）ホールディングフレーム、ホールディングフレーム内に支持されるボトムホールディングプレート、および複数の取り外し可能なマルチウェルモジュールを含む。各マルチウェルモジュールは、溝板および取り外し可能なインサートから構成される。各溝板は、直線状に配置された円錐形開口底部を有する複数の胚ホールディングウェルを有する。各溝板は、円筒形状を有し、それ故に、このウェルを通して液体ハンドリングを可能にする、溝板の外縁に１ウェルモジュールを有する。各溝板は、垂直な側面および溝板の各溝と位置を合わせた上部の円形開口部を有し、それ故に、溝板の上に配置されたとき、胚を保持し、取り扱うウェルを形成する、取り外し可能なインサートを有する。蓋が、ホールディングフレーム、溝板および取り外し可能なインサートを覆うために提供される。該システムはまた、（Ｂ）可変角度および／または高さで胚を注入可能にするためのマルチウェルプレート上に回転可能に位置するマイクロインジェクションマイクロピペットを含む。
【００４２】
別の態様において、本発明は、受精後２４から７２時間後のゼブラフィッシュ胚の自動化マイクロインジェクションのための方法であって、特に本明細書に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステムのマルチウェルモジュールに関連させて、受精後２４から７２時間後の複数のゼブラフィッシュ胚を配置し、そしてゼブラフィッシュ胚の卵黄に選択された分子をマイクロインジェクションすること、を含む方法を提供する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、受精後２４から７２時間のゼブラフィッシュ胚の卵黄に腫瘍細胞をマイクロインジェクションし、腫瘍細胞のマイクロインジェクション中またはマイクロインジェクション後のいずれかに、ゼブラフィッシュ胚の卵黄に血管新生促進因子、例えばアンジオポエチンをマイクロインジェクションするか、またはゼブラフィッシュの幼生が泳ぐ水中に血管新生促進因子、例えばアンジオポエチンを添加することを含む、腫瘍細胞がゼブラフィッシュの胚に効率的に取り込まれるようにするための方法を提供する。
【００４４】
別の態様において、本発明は、腫瘍細胞に対する効果について薬物を試験するための方法であって、受精後２４から７２時間のゼブラフィッシュ胚に腫瘍細胞をマイクロインジェクションし、該腫瘍を、所定の時間、ゼブラフィッシュ胚内で増殖させ、腫瘍細胞に対する効果について試験される薬物を該ゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションし、そして腫瘍細胞の量を測定することにより腫瘍細胞に対する薬物の効果をモニターすること、を含む方法を提供する。
【００４５】
発明の変形
本発明の一面において、マルチウェルマイクロインジェクションシステムの変形は、以下のものを含む。
複数の胚ホールディングウェルのそれぞれが、溝板の外周縁にてウェルモジュールの底部へ円錐形底部で相互に接続されているもの；
マイクロインジェクションの自動化が、ロボットアームにより制御されるマイクロピペットホルダーを用いて行われるもの；
マイクロインジェクションの自動化が、ロボットアームによって制御されるマイクロピペットユニットを用いて行われるもの；
マイクロピペットインジェクションシステムが、可変角度および／または高さで胚を注入するために、回転可能に位置決めするように構成され、配置されるもの；
ロボットアームの位置および／または角度が、手動で、または市販のソフトウェアコントロールインターフェースにより調節可能であるか、または特にゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションのために設計されている特定の自動注入システムの開発によって調節可能であるもの；
ロボットアームが、胚構造のヒトによる視覚認識、または細胞の蛍光標識手段、または液体の注入の成功を検出可能にプログラムされているソフトウェア手段(該ソフトウェアは、市販のソフトウェアコントロールインターフェースであるか、または特にゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションのために設計されている特定の自動注入システムの開発によるもの）による胚構造の視覚認識によって制御されるもの；
注入部位および注入プロトコルの選択のための自動化がソフトウェアのアップデートにより変更されるもの；および
自動化マイクロインジェクションシステムが、市販のマイクロインジェクターインジェクションシステムにより制御されるか、または特にゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションのために設計されている特定の自動注入システムの開発によって制御されるもの。
【００４６】
本発明の一面において、腫瘍細胞に対する効果について薬物を試験するための方法の変形は、腫瘍細胞をインジェクション前に例えば脂溶性蛍光色素であるＤｉＯで染色するか、または染色しないで、受精後２４から７２時間のゼブラフィッシュ胚に該腫瘍細胞をマイクロインジェクションし、そして腫瘍細胞のゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクション前、マイクロインジェクション中またはマイクロインジェクション後のいずれかに、受精後２４から７２時間のゼブラフィッシュ胚の胚中に血管新生促進因子、例えば、増殖因子アンジオポエチンをマイクロインジェクションするか、またはゼブラフィッシュ幼生が泳ぐ水中に血管新生促進因子、例えばアンジオポエチンを添加することを含む。
【００４７】
発明の他の特徴
当該装置は、適当な位置にホールディングフレームおよび溝板を有し、取り外し可能なインサートなしで用いられ得て、それにより、溝板の溝に胚を保持するのが可能であり、可変角度でのマイクロインジェクションのためにマイクロピペットによりアクセス可能である。この構成において、溝板によって形成される各円錐ウェルを覆うゴムで裏打ちされた開口部を有する取り外し可能なインジェクションカバープレートは、溝板上に位置され得て、受精後４８時間のゼブラフィッシュ胚の注入をガイドするために使用され得る。
【００４８】
本発明はまた、胚構造の視覚的認識を通してロボットアームを制御するオプションを提供する。そのような場合において、ソフトウェアは、液体または標識された細胞が蛍光性であるとき、注入の成功の検出を可能にするように設計され得る。インジェクション部位の選択のための自動化およびインジェクションのプロトコルはまた、単純なソフトウェアのアップデートによって変更することができる。視覚認識システムによる自動化はまた、より少数の胚および空のウェルを用いることを可能にする。
【００４９】
本明細書に記載の装置は、市販の手動マイクロインジェクターと共に使用することもできる。手動操作であっても、この装置は、追加の操作およびチューブの標識化を減らすことによって労力を軽減し得る。胚はウェルから取り出されないので、胚の混合および標識ミス、ならびに胚にストレスを誘発する可能性が大幅に低減される。
【００５０】
生きた胚がウェル中に存在するとき、ウェル中の液体の交換は、ロボットアームを用いて実行することができない。しかしながら、内部に生きた胚が存在しないウェル中の培地を交換する機能は、ロボットアームを用いて実行可能である。また、生きている胚を含むウェル内の液体の手動での交換は、胚に強いストレスになることがある。この方法により、円筒形状を有する溝板の外縁でのウェルモジュールからの溶液の緩やかな交換が、胚への不必要なストレスを軽減することができる。
【００５１】
本発明は、液体および細胞をマイクロインジェクションするための多数の胚の取り扱いを容易にするだけでなく、ハイスループットな様式で胚への腫瘍片の適切な配置および注入を可能にする。
【００５２】
本明細書に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステムは、経済的であり、“１回使用”用に製造されでもよい。
【００５３】
本明細書に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステムおよび使用方法は、多数の胚の取り扱いを大幅に簡素化し、多数の実験に亘って注入の精度および一貫性を向上させる。単一のモジュール内の全てのウェルが連結されているため、全ての胚が同じ処理を受ける。乾燥による培地容量の不均等な損失、またはウェル当たりの不均等な添加は、ウェルからウェルへの何らの差異をもたらすことはない。同じ処理群の胚は全て等しくそのような変化に曝されている。
【００５４】
その好ましい態様において、このマルチウェルマイクロインジェクションシステムは、９６ウェル形式で使用するためのものであるが、このシステムは、同様に、６ウェル、１２ウェルまたは２４ウェルプレートフォーマットに変更することができる。
【００５５】
その好ましい実施形態において、このマルチウェルマイクロインジェクションシステムは、受精後４８時間のゼブラフィッシュの胚を使用するためのものであるが、受精後２４から７２時間のゼブラフィッシュ胚の操作のため、他の種の魚、例えばメダカ由来の胚、およびアフリカツメガエル、げっ歯動物、イヌ、および他の実験動物由来の胚の操作のために、使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１−１】図１：侵襲性および非侵襲性原発肺腫瘍細胞の薬物に対する異なる応答。図１Ａ：画像により捕捉された３０の異種移植片の腫瘍座標を図示する。
【図１−２】図１Ｂ：パクリタキセルで処理した２８の異種移植片の腫瘍座標。
【図１−３】図１Ｃ：パクリタキセルおよびカルボプラチンで処理した２９の異種移植片の腫瘍座標。（−Ｄ＝薬剤なしコントロール、＋Ｐ＝パクリタキセル処理、Ｃ＋Ｐ＝カルボプラチンおよびパクリタキセル処理）。
【図１−４】図１Ｄ：未処理および処理した異種移植片の計算された移動指数（−Ｄ＝薬剤なしコントロール、＋Ｐ＝パクリタキセル処理、Ｃ＋Ｐ＝カルボプラチンおよびパクリタキセル処理）。図１Ｅ：未処理および処理した異種移植片の計算された侵襲指標。（−Ｄ＝薬剤なしコントロール、＋Ｐ＝パクリタキセル処理、Ｃ＋Ｐ＝カルボプラチンおよびパクリタキセル処理）。図１Ｆ：脳転移腫瘍が異種移植片で観察され、患者において観察された臓器ホーミングが再現された。図１Ｇ：異種移植片における脳転移腫瘍の薬物応答。（−Ｄ＝薬物なしコントロール、＋Ｐ＝パクリタキセル処理、Ｃ＋Ｐ＝カルボプラチンおよびパクリタキセル処理）。
【図１−５】図１Ｈ：パクリタキセルで処理した異種移植片における侵襲性および非侵襲性細胞の薬物応答。薬物応答は、生存について９つ、死について９つの、ＭＧＭＴの発現により測定された。図１Ｉ：パクリタキセルおよびカルボプラチンで処理した異種移植片における侵襲性および非侵襲性細胞の薬物応答。
【図２】図２は、本発明の一面のマルチウェルプレートアセンブリの平面図である。
【図３】図３は、図２の態様の取り外し可能なモジュールの１つの平面図である。
【図４】図４は、図２の態様のホールディングフレーム内にある溝板を有する胚を操作するウェルを示す断面図である。
【図５】図５は、図２の態様の胚を操作するウェルオルソログよび取り外し可能なインサートの拡大された断面図である。
【図６】図６Ａは、受精後４８時間（ｈｐｆ）のゼブラフィッシュ胚の水平断面図であり、図６Ｂは、受精後４８時間（ｈｐｆ）のゼブラフィッシュ胚の横断面図である。
【図７】図７は、溝板中の受精後４８時間のゼブラフィッシュ胚の配置を、図２の態様のインジェクションカバープレートおよびマイクロインジェクション用のマイクロピペットと共に示す、概略側面図である。
【図８】図８は、図２の態様のマイクロインジェクション用の回転可能なマイクロピペットの概略側面図である。
【図９】図９は、溝板中の受精後４８時間のゼブラフィッシュ胚を、本発明の態様による受精後４８時間のゼブラフィッシュ胚への腫瘍のマイクロインジェクション用のマイクロピペットのためのガイドとしてのインジェクションカバープレートと共に示す、概略側面図である。
【図１０】図１０は、胚が本発明の態様による溝板中にある間に、マイクロインジェクション用のマイクロピペットの回転可能な角度を示す、溝板中の受精後４８時間のゼブラフィッシュ胚の概略側面図である。
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、本発明の態様により、マイクロインジェクションのために溝板中の胚へのアクセスを可能にしながら、マイクロピペットの回転性を示す、溝板中の受精後４８時間のゼブラフィッシュ胚の概略側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
発明の詳細な説明
概要
癌細胞の分子および遺伝子プロファイリングは、標的療法および腫瘍学研究において新たな傾向となっている。しかしながら、癌細胞の分子多様性およびそれらの絶え間なく変化する性質の関連付け、原発腫瘍の分子特性ならびにそれらの浸潤または転移腫瘍細胞の関連付けには限界がある。転移性癌に対する現在の化学療法の限定された有効性、および癌細胞のゲノムプロファイリングの限定された適用で定義されるシナリオにおいて、本発明者等は、侵襲および転移について臨床的に関連する生理的情報を取得するために、腫瘍組織（例えば、外科的に切除される原発腫瘍、生検、ＣＴＣなど）から代表的かつ生物学的に適切な生存３Ｄ腫瘍を作成する可能性を探究した。
【００５８】
癌処置のための個別の、かつ標的化された対処のために、患者の腫瘍の生理（例えば、増殖、浸潤能、転移、臓器ホーミングなど）および種々の抗癌治療に対する応答を予測し得る迅速なアッセイ法が必要とされる。
【００５９】
しかしながら、個別化および標的化された治療アプローチは、すべての癌の動的性質によりさらに複雑になる。結果として、すべての原発、浸潤または転移腫瘍は、細胞の不均一集団で構成されている。従って、種々の生理的または分子カテゴリーに癌細胞集団を分離／分別する方法が重要である。
【００６０】
本発明は、癌の進行および処置への応答の予測のためのアッセイおよび方法を提供する。該方法は、改良された“Cancer Progression and Response Matrix”を使用してよい。従って、本発明の任意の態様は、予測可能な腫瘍の進行および処置への応答に基づいて個別化および標的化された治療の設計を容易にするために使用され得る。
【００６１】
定義
本明細書で用いる以下の用語は、特に他に記載されない限り、それら本来の意味を有する。
【００６２】
“対象”または“患者”または“個体”は、典型的にヒトを含むが、げっ歯動物、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタおよび霊長動物を含み、かつこれらに限定されない他の動物も含み得る。
【００６３】
“腫瘍”は、生理的、組織学的、分子および／または構造的異常のいくつかの形態を有する対象の身体中または身体上に見られる細胞塊を含む。
【００６４】
“癌”は、無制御に増殖する異常な細胞を有する疾患のクラスの任意のメンバーを含む。これは、任意のステージまたはグレードを含む、良性、侵襲性、局在、転移前、転移、転移後、軟部または固形組織の区別なく、全ての新生物状態および全ての癌を含む。
【００６５】
“生物学”または“生理学”は、典型的に、形態学、生理学、解剖学、挙動、起源、および分布を含む。
【００６６】
“病態生理学”は、全て典型的に、ある状態に関連する無秩序な生理的プロセスを意味する。特に、癌は、染色体異常、遺伝子変異およびエピジェネティックな変化を含む、進行性の遺伝子異常によって引き起こされる疾患群である。特に、ヌクレオチド配列における変化を伴わないゲノムに対する機能的に関連する修飾であるエピジェネティックな変化は、癌細胞の全体的な生物学の調節に重要な役割を果たす。エピジェネティックな変化は、環境的曝露により観察されている。
【００６７】
“生検”は、診断または予後評価のために細胞または組織試料を取得する過程を意味する。任意の公知の生検技術は、本発明の方法および組成物に適用することができる。代表的な生検技術は、切除生検、切開生検、針生検および外科的生検を含むが、これらに限定されない。用いる生検技術の選択は、評価されるべき組織の種類ならびに腫瘍の位置、大きさおよび種類によって変わる。
【００６８】
“侵襲”は、浸潤または侵入を意味する。特に、侵襲性腫瘍細胞は、周囲の組織に浸潤可能な細胞である。必ずしも全ての腫瘍細胞が浸潤する能力を有するわけではない。
【００６９】
“転移”は、癌の原発部位から離れた位置での二次性悪性腫瘍（“転移腫瘍”）の発生を意味する。それは、１つの臓器または身体の一部からの癌細胞の別の隣接していない臓器または部分への拡散である。癌細胞は初めに、循環系に移動（血管内へ侵入）し、次いで、二次性腫瘍を構築するために二次部位へ移動（血管外へ溢出）する。
【００７０】
“血中循環腫瘍細胞”または“ＣＴＣ”は、血管内への侵入を経て循環系で見出される腫瘍細胞である。血中循環腫瘍外細胞は、血中循環腫瘍細胞、播種性癌細胞、および癌幹細胞を含むが、これらに限定されない。血中循環腫瘍細胞は、全血、痰、気管支肺胞洗浄、尿、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、注射針吸引液などの何れかの利用可能な生体液から得られる可能性がある。
【００７１】
“臓器ホーミング”は、転移の臓器への血中循環腫瘍細胞の播種を伴う。原発腫瘍は、特定の遠く離れた“標的”臓器に転移する傾向がある。例えば、肺癌は、しばしば脳に転移する傾向がある。臓器ホーミングに関与する生理学はよく理解されていないが、プロセスまたは臓器の選択は無作為なプロセスではない。
【００７２】
“シグナル伝達”は、細胞外シグナル伝達分子が細胞表面受容体（“シグナル伝達分子”または“シグナル伝達因子”）を活性化するときに起こる。次に、この受容体は、典型的に、生化学反応の順序付けられた配列を含む応答を生成する細胞内分子を変化させる。
【００７３】
“分子遺伝学的腫瘍マーカー”または“ＭＧＴＭ”は、腫瘍の発生、増殖、侵襲および転移等の腫瘍の生物学的特徴に基づいて同定されている。いくつかの例は、癌遺伝子（Ｋ−ｒａｓ、ｅｒｂＢ−１（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）、ｂｃｌ−２、ｃ−／Ｎ−／Ｌ−ｍｙｃ、ｃ−ｋｉｔ）、腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３、ＲＢ、ｐ１６、ｐ２７、ＦＨＩＴ、ＲＡＳＳＦ１Ａ）、テロメラーゼ、侵襲および転移マーカー（ＭＭＰ、ＶＥＧＦ、ＣＯＸ−２）、細胞接着因子（Ｅ−カドヘリン、ベータ−カテニン）、上皮性マーカー（サイトケラチン、ＣＥＡ）、アポトーシスマーカー（カスパーゼ−３、切断されたＰＡＲＰ）、一塩基多型（ＳＮＰ）、および抗癌剤感受性マーカー（ＭＲＰ、ＬＲＰ、ＭＤＲ、ベータ−チューブリン、ＥＲＣＣ１）を含むが、これに限定されない。抗癌剤の存在下での、シグナル伝達経路の異なる活性化／不活性化ならびに細胞の侵襲性および／または臓器ホーミングの変化は、それぞれの患者に適当な用量での好適な癌治療レジメンの選択に役立ち得る。所定の患者に対する化学療法の効果の予測を含む、複数の関連する適用が存在していてよい。
【００７４】
“化合物”は、粗物質として得られたか、天然物（植物源または人工源（例えば実験室で人工的に合成されたような）を経て性質上利用可能なもの）から精製された、広範な全ての化合物または物質を意味する。
【００７５】
“合成または天然の化合物および生物学的物質”は、医薬または治療物質、非医薬物質、天然に存在する物質、人工的に作製された物質、生き物（植物、動物など）から生成された物質、または生き物ではない源から抽出された物質もしくは鉱物を含むが、これらに限定されない。これらは、化学療法薬、医薬製剤、自然健康製品、粉末、茶および抽出物、血清、ワクチン、抗原、抗毒素などを含んでいてよい。
【００７６】
“免疫調節”は、免疫強化（免疫系の活性化）、免疫抑制（免疫系の抑制）、または免疫寛容の誘導のような免疫応答の調節である。具体的には、腫瘍微小環境における免疫細胞と悪性細胞との複雑な現象があり、実際に、免疫系が腫瘍の促進および阻害の両方の役割を有するように、顕著な予後関連性が存在する。腫瘍浸潤免疫細胞、および腫瘍部位での慢性炎症は、増殖、進行、侵襲および転移疾患に重要な役割を果たす。従って、免疫調節は、疾患の進行に大きな影響を与え得る。従って、本発明の文脈において、免疫調節は、患者の腫瘍細胞塊を伴う腫瘍浸潤免疫細胞の免疫応答の調節、免疫系の調節因子（インターロイキンおよびインターフェロン）の調節ならびに宿主免疫系、特にゼブラフィッシュ免疫細胞の調節を意味する。
【実施例】
【００７７】
血中循環腫瘍細胞のインジェクションの例
実施例１：ゼブラフィッシュへの乳癌細胞株  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の注入
ゼブラフィッシュの卵を収集し、摂氏３６℃にて４８時間、Ｅ３培地（５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１７ｍＭ  ＫＣｌ、０．３３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．３３ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％メチレンブルー）中でインキュベートした。該胚をトリカインで麻酔し、ピンセット（Ｄｕｍｏｎｔ  ＃５  ｆｏｒｃｅｐｓ）を用いて卵殻を剥がした。
【００７８】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（転移性乳癌細胞）を、Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン中で増殖させ、ＣＭ−ＤｉＩを用いて標識した（Ｖｉｂｒａｎｔ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ、４ｎｇ／ｕｌ  終濃度、３７℃で４分インキュベート後、４℃で１５分インキュベート）。５０個の細胞を、１つのトリカインで麻酔した受精後４８時間のゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入した。画像をインジェクションの２４時間後に取得した。
【００７９】
結果：インジェクション後、単離されたＣＴＣは、インジェクション部位に局在化したが、ゼブラフィッシュ胚の尾部全体にも見ることができ、ゼブラフィッシュ胚における転移パターンを形成することができた。
【００８０】
実施例２：血液から単離されたＣＴＣからのゼブラフィッシュにおける腫瘍の発生
ＣＴＣは、脳に転移を有するステージ４の肺癌患者および１名の対照となる健康な個体からの２０ｍｌの血液（抗凝固剤としてＥＤＴＡ−Ｃａ）から収集された。ＣＴＣは、製造業者の指示書に従い、抗体で被覆した磁気ビーズ(Dynabeads, Lifetech)を用いて順次正（抗ＥｐＣａｍ ＢｅｒＰ４ 抗体、ＡｂＣａＭ）および負（抗ＣＤ４５、ＡｂＣａｍ）の選択により収集された。各工程で２回のキャプチャー−ウォッシュ−リリース（Two−capture−wash−release）を行った。収量は、転移患者から約１１０細胞であったが、健康なドナーからは細胞が検出されなかった。得られたＣＴＣをＤｉＯ(Vibrant, Lifetech, 終濃度２００ｍＭ)を用いて、３７℃にて２０分間染色した。総数１００個の染色されたＣＴＣ細胞を、１つのトリカインで麻酔した受精後４８時間（ｈｐｆ）のゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入した。画像をインジェクションの２４時間後に得た。
【００８１】
結果：単離されたＣＴＣは、ゼブラフィッシュ幼生の脳組織における腫瘍形成能および転移形成能を有した。
【００８２】
実施例３：薬物に対する侵襲性および非侵襲性の原発性肺腫瘍細胞の異なる応答
脳への転移を示した末期の肺癌患者からの腫瘍組織を切片にし、業者指示書に従いリベラーゼＤＬ（Ｒｏｃｈｅ）中でインキュベートした。肺細胞を７０μｍのセルストレーナーに通し、２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０に再懸濁させて計数した。細胞生存性をトリパンブルー排除法により確認した。細胞を、業者指示書に従って蛍光追跡ＰＫＨ−６７（Ｓｉｇｍａ）色素で標識し、２５ｍＭのグルコースを含むＰＢＳ中に再懸濁した。ＮａｎｏｊｅｃｔＩＩマイクロマニピュレータ装置を用いて、１００個の細胞を卵黄嚢にインジェクトした。１グループの胚は、対照としてＰＢＳ＋グルコースのみをインジェクトした。次いで、該胚を抗生物質／抗真菌剤を含むＴＥ水溶液中でインキュベートし、インキュベーター中、摂氏３５℃で一晩培養した。腫瘍移植後２４時間のインキュベーション後、卵黄嚢中の腫瘍細胞の存在を確実にするために、胚を蛍光顕微鏡下で撮像した。薬物／処置剤を種々の濃度で添加し、胚を含むプレートをさらに３日間、３５℃でインキュベートした。胚をトリカインで麻酔し、蛍光顕微鏡下で再度画像を取得した。この実験で用いた薬物は、パクリタキセルのみ、またはパクリタキセルとカルボプラチンの組み合わせであった。薬物応答を、生存について９遺伝子（増殖および細胞周期）および死について９遺伝子（アポトーシス）の、１８遺伝子（ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＢＣＬ−Ｂ、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−Ｗ、ＭＣＬ１、ＣＤＣ２、ＣＹＣＬＩＮ−Ｄ、ＣＹＣＬＩＮ−Ａ１、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＯＫ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＭＦ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ）の発現を通して測定した。
【００８３】
結果：図示される腫瘍座標（図１）は、薬物処理の存在下または不存在下における侵襲および転移パターンの顕著に高い再現性を示す。侵襲指標、移動指数ならびにホーミング指数により測定されるとおり、薬物の存在下において、非侵襲性腫瘍細胞と比較して侵襲性腫瘍の異なる応答がある。非侵襲性および侵襲性細胞の生存（細胞周期および増殖によって測定される）および死（アポトーシスによって測定される）における非常に明確な相違もある。
【００８４】
マイクロインジェクション装置の使用例
図２から５の説明
図２から５に示す通り、本発明の一面のマルチウェルプレートアセンブリ１０は、複数の胚ハンドリングウェル２４を支持するベースプレート２８を含むホールディングフレーム１２を含む。この態様において、アセンブリ１０は、９６ウェルプレート形式で作られ、他の基準を用いることもできるが、国際標準に準拠している。従って、このセットアップは、全ての標準的なマイクロタイタープレートリーダーで使用可能であり、全ての好適な液体ハンドラーで操作することができる。マルチウェルプレートアセンブリ１０は、好ましくはマルチウェルプレートアセンブリ１０のウェルの位置をマークするラベルを備えている、安全性、単離、およびウェルからの液体の乾燥を防ぐ、蓋１６を含む。
【００８５】
この態様において、８つの分離可能な、取り外し可能なモジュール１８（図３に詳述）を、ホールディングフレーム１２にマウントする。８つの分離可能な、取り外し可能なモジュール１８のそれぞれ１つは、溝板２０および溝板２０上にマウントされる取り外し可能なインサート２２を有している。図４に示す通り、溝板２０は、上記の複数の胚ハンドリングウェル２４および側部の液体ハンドリングウェル２６を含む。
【００８６】
各胚ハンドリングウェル２４は、好ましくは、円筒形の上部セクション３０および円錐形の下部セクション３２を有する。側部の液体ハンドリングウェル２６は、好ましくは、完全に円筒形である。側部の液体ハンドリングウェル２６および胚ハンドリングウェル２４は、それらの出口端で横断するドレインチャネル３４により相互に接続されている。取り外し可能なインサート２２は、その外縁部でホールディングフレーム１２に隣接しており、その下縁部で胚ハンドリングウェル２４の外縁部に隣接している。取り外し可能なインサート２２は、胚のより良好な操作のために取り外し可能である。取り外し可能なインサート２２のマウントは、各胚ハンドリングウェル２４間に上記の相互接続があるため、気密性にする必要がない。ベースプレート２８は、好ましくは透明でＵＶ照射可能であるべきである。取り外し可能なインサート２２は着色されていてよい。
【００８７】
図２から４に示す通り、この態様において、胚を培養するための１１個の胚ハンドリングウェル２４（Ｗ１−１１）および１つの側面の液体ハンドリングウェル２６がある。上記の通り、側面の液体ハンドリングウェル２６および胚ハンドリングウェル２４は、それらの出口端で横断するドレインチャネル３４により相互に接続されている。従って、１つのウェル（例えば、ウェルＷ１）での液体量の変化は、他のウェル（例えば、ウェルＷ２からＷ１１）によって補償される結果となる。これは、ウェルの乾燥ムラを防ぐことができ、全てのウェルが同じ液体量を有し得る。従って、全ての液体の取り扱い、培地の変更などは、液体ハンドリングロボットにより液体ハンドリングウェル２６中で行われ得て、それ故に、胚の取り扱い、損傷またはストレスを実質的に防止することができる。
【００８８】
全ての操作は、溝板２０で行われる。上記の通り、胚ハンドリングウェル２４は、ゼブラフィッシュ幼生を置くことのできる円錐形の底部３２を有する。ゼブラフィッシュ幼生の形状は図６Ａおよび６Ｂに後述される通りであり、一旦麻酔されると、それらは、卵黄を上側にして胚ハンドリングウェル２４の円錐形の底部３２に落ちる。図７に示す通り、カバープレート３６は、取り外し可能なインサート２２の代わりに溝板２０の上に配置され得る。図７に示す通り、このカバープレート３６は、胚へ血管新生促進因子と共に腫瘍細胞をインジェクションするためのガイドとして作用し得る。
【００８９】
図４の破線内の長方形の領域を、図５に拡大して表示する。
【００９０】
図６Ａおよび６Ｂの説明
図６Ａは、受精後４８時間（ｈｐｆ）のゼブラフィッシュ胚の水平方向の横断面であり、図６Ｂは、受精後４８時間（ｈｐｆ）のゼブラフィッシュ胚の垂直横断面図である。
【００９１】
図７および８の説明
図７に示す通り、マイクロピペットユニット４０は、好ましくはガラス製であり、交換可能なマイクロピペット４２を有していてよい。受精後４８時間のゼブラフィッシュ胚４８は、円錐形セクション３２の下側の狭い端内にその背側５０を、そして円錐形セクション３２の上側の広い端にその卵黄５２を配して、胚ハンドリングウェル２４の円錐形の底部セクション３２に配置される。そのように提供されるユニットは、カバープレート３６により保護されている。マイクロピペットユニット４０は、カバープレート３８の開口部を通して卵黄５２へ血管新生促進因子、好ましくは増殖因子アンジオポエチンと共に腫瘍細胞をインジェクトするために配置される。
【００９２】
図８に示す通り、交換可能なマイクロピペット４２を有するマイクロピペットユニット４０は、ロボットアーム５４により制御される。血管新生促進因子、好ましくは増殖因子アンジオポエチンを含む腫瘍細胞の液体溶液は、導管５６によりロボットアーム５４によって注入される。ロボットインジェクタアーム５４は、コントロールアーム５８によって任意の角度で回転させることができる。回転は、矢印６０によって概略的に示される。
【００９３】
図９、１０および１１の説明
図９は、卵黄５２への、血管新生促進因子、好ましくは増殖因子アンジオポエチンと共に腫瘍をインジェクションするためのガイドとしてのカバープレート３６の使用を示す図７の単純な複製である。
【００９４】
図１０に示す通り、操作は、所定の位置に取り外し可能なインサートを配置せずに顕微鏡６２下で行われ得る。これは、任意の角度で胚の操作が可能であり、胚体部５０、５２の任意の部分にインジェクションを行うことができる。
【００９５】
図１１Ａに示す通り、マイクロピペットユニット４０は、破線で示す傾斜位置に実線で示す垂直位置から回転させることができ、故に、胚体部５０、５２の任意の部分に注入が可能となる。
【００９６】
図１１Ｂに示す通り、マイクロピペットユニット４０は、破線で示す傾斜位置に実線で示す垂直位置から回転させることができ、故に、胚体部５０、５２の任意の部分に注入が可能となる。図１１Ｂはまた、胚体部５０、５２も回転可能であることを示す。
【００９７】
操作工程
胚は、受精後４８時間で卵殻を剥がし、ガラスピペットを用いてウェルに移動させる。要すれば、胚は、腫瘍細胞の取り込み可能性および効率を増大するために、血管新生促進因子、好ましくは増殖因子アンジオポエチンで処理され得る。培地をカバープレート３６を通して一部除去し、トリカインを添加して、胚を麻酔する。トリカイン溶液は、工程の時間短縮のために各ウェル２４に添加され得る。胚は麻酔され、溝板２０の胚ハンドリングウェル２４の下部の円錐形の底部３２に落ちる。胚ハンドリングウェル２４の底部に円錐形３２があり、卵黄５２が胚体部５０の他の部分よりも軽いため、幼生は、卵黄５２を上向きにして落ちる。必要に応じて、インジェクションカバープレート３６は、血管新生促進因子、好ましくは増殖因子アンジオポエチンと共に腫瘍細胞を誘導するように位置し得る。ガラスマイクロピペット４０を取り付けたロボットアーム５４を用いて、血管新生促進因子、好ましくは増殖因子アンジオポエチンと共に腫瘍細胞を胚の卵黄５２へ注入する。卵黄嚢は、それ自体迅速に密封される。
【００９８】
一旦インジェクションが完了すると、インジェクションカバープレート３６が除去され、取り外し可能なインサート２２がウェル２４を作成するために配置される。
【００９９】
ウェル２６を介するトリカイン溶液のピペッティングによる除去は、ウェル２４において液体を交換することができ、新鮮な培地がウェル２６によって再び充填される。従って、各１１列の胚のためのウェル２４は充填され、各胚は麻酔から回復し得る。一旦回復すると、それらは、自身のウェル中を自由に泳ぎ回り、近隣の胚と混合しない。これは、個々の胚の持続的な追跡を可能にする。ゼブラフィッシュ幼生が内部で泳ぎ、それと共に蓋１６を有する全体的に組み立てられたユニットは、互いに積み重ねられていてよく、他のマイクロタイタープレートと同じくインキュベーターに格納され得る。
【０１００】
好ましくは、溝板２０は透明であるため、幼生は、それを処理する必要なくリアルタイムにＵＶ下で観察され得る。要すれば、幼生は、上記の通り、それらを処理する必要なく、観察のために麻酔され得る。腫瘍の増殖はソフトウェアを用いて測定可能であるだけでなく、水泳行動をリアルタイムで観察することもできる。そのような観察は、手動で行われ得るか、または検出ソフトウェアを用いることにより可能である。
【０１０１】
上記の実施例を実行後、幼生を安楽死させ染色する必要がある場合、幼生の全ての取り扱いおよび液体の交換は、このプレート内で行うことができる。全胚染色における最も重要な工程の１つは、適当な混合のための溶液中の胚を振動させることである。
【０１０２】
この工程は、一般的に、混合がシェーカー上であっても殆どの９６ウェルプレートによくないため、エッペンドルフチューブ中で行われる。ウェル２６のみ上下にピペッティングすることにより、全ての１１個の胚を単一のモジュールで揺動することができる。同様に、プログラムされた液体ハンドラーを用いて、プレート全体の全てのそのような工程を最適化することができる。
【０１０３】
すべての染色が行われると、腫瘍塊の尺度としての蛍光がＵＶプレートリーダーを用いて直接計算され得る。この同じ装置は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、モルホリノ等の他のインジェクションにも同様に用いることができる。
【図１−１】
0006430392.tif 000002
【図１−２】
0006430392.tif 000003
【図１−３】
0006430392.tif 000004
【図１−４】
0006430392.tif 000005
【図１−５】
0006430392.tif 000006
【図２】
0006430392.tif 000007
【図３】
0006430392.tif 000008
【図４】
0006430392.tif 000009
【図５】
0006430392.tif 000010
【図６】
0006430392.tif 000011
【図７】
0006430392.tif 000012
【図８】
0006430392.tif 000013
【図９】
0006430392.tif 000014
【図１０】
0006430392.tif 000015
【図１１】
0006430392.tif 000016