(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ配列のライブラリから少なくとも１つの第１の標的ＤＮＡ配列及び少なくとも１つの第２の標的ＤＮＡ配列の少なくとも一方を検出する方法であって、
前記第１の標的ＤＮＡ配列は、前記第２の標的ＤＮＡ配列が制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を含む点において、前記第２の標的ＤＮＡ配列とは異なり、前記方法が、
（ａ）各々のＤＮＡ配列が、それぞれ、５’末端から３’末端に、１５ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さを有する第１の配列セグメント、前記制限エンドヌクレアーゼによって切断されるゲノムＤＮＡの第２の配列セグメント、及び該第１の配列セグメントと、前記制限エンドヌクレアーゼによって生じる５’オーバーハングがもしあれば、前記５’オーバーハングとの融合体に逆相補的な第３の配列セグメントを含む、前記ＤＮＡ配列のライブラリを準備する工程と、
（ｂ）前記少なくとも１つの第１の標的配列又は第２の標的配列のプラス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする、少なくとも１つの第１のリバースプライマー、
前記少なくとも１つの第１の標的配列のマイナス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のフォワードプライマー、
前記少なくとも第２の標的配列のマイナス鎖の第３の配列セグメントの５’末端領域にハイブリダイズする第１部分と、前記少なくとも１つの第２の標的配列のマイナス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする第２部分とを含む少なくとも１つの第３のフォワードプライマーであって、前記少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの第１部分が、前記少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの全長に対して２０％〜８０％の長さを有する、少なくとも１つの第３のフォワードプライマー、
を使用するＰＣＲによって前記ＤＮＡ配列のライブラリを増幅する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で増幅されたＤＮＡ配列を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ｂ）が、前記少なくとも１つの第２の標的配列のプラス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする少なくとも１つの第４のリバースプライマーを更に使用するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ配列のライブラリが確定的制限部位全ゲノム増幅により得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）がＤＮＡシークエンシング法によって行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡシークエンシング法がサンガーシークエンシング又は合成によるシークエンシングである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの第１部分が、少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの全長に対して４０％〜６０％の長さを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの第２部分が、前記制限エンドヌクレアーゼのコンセンサス配列に対応し、もしあれば、前記制限エンドヌクレアーゼによって生じた５’オーバーハングを引いて、いずれも２で除した最小と、最大３０塩基との間に含まれる塩基単位の長さを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの前記プライマーが、前記第１の標的配列又は第２の標的配列のプラス鎖又はマイナス鎖のいずれにもハイブリダイズしない５’末端領域を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記制限エンドヌクレアーゼがＭｓｅＩである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
第２の標的ＤＮＡ配列の制限部位は、
（１）第１の標的配列の単一又は複数のヌクレオチドが置換されるか若しくは欠失するか、又は第１の標的配列に単一又は複数のヌクレオチドが挿入されることによって生じた変異配列、又は
（２）第２の標的ＤＮＡ配列の制限部位は野生型配列であり、第１の標的配列に含まれる第２の標的ＤＮＡ配列の制限部位に対応する配列において、単一又は複数のヌクレオチドが置換されるか若しくは欠失するか、又は第１の標的配列に含まれる第２の標的ＤＮＡ配列の制限部位に対応する配列に、単一又は複数のヌクレオチドが挿入されることによって、第１の標的配列では制限部位が除去されている、
である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の第１のプライマー、第２のプライマー、及び第３のプライマーを含むキット。
【請求項１２】
ＤＮＡ配列のライブラリから少なくとも１つの第１の標的ＤＮＡ配列及び少なくとも１つの第２の標的ＤＮＡ配列の少なくとも一方を検出するキットであって、
前記第１の標的ＤＮＡ配列は、前記第２の標的ＤＮＡ配列が制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を含む点において、前記第２の標的ＤＮＡ配列とは異なり、
前記ライブラリの各々のＤＮＡ配列が、それぞれ、５’末端から３’末端に、１５ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さを有する第１の配列セグメント、前記制限エンドヌクレアーゼによって切断されるゲノムＤＮＡの第２の配列セグメント、及び該第１の配列セグメントと、前記制限エンドヌクレアーゼによって生じる５’オーバーハングがもしあれば、前記５’オーバーハングとの融合体に逆相補的な第３の配列セグメントを含み、前記キットが、
前記少なくとも１つの第１の標的配列又は第２の標的配列のプラス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする、少なくとも１つの第１のリバースプライマー、
前記少なくとも１つの第１の標的配列のマイナス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のフォワードプライマー、
前記少なくとも第２の標的配列のマイナス鎖の第３の配列セグメントの５’末端領域にハイブリダイズする第１部分と、前記少なくとも１つの第２の標的配列のマイナス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする第２部分とを含む少なくとも１つの第３のフォワードプライマーであって、前記少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの第１部分が、前記少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの全長に対して２０％〜８０％の長さを有する、少なくとも１つの第３のフォワードプライマー、
を含む、キット。
【請求項１３】
ＡＬＫ又はＥＧＦＲ又はＰＩＫ３ＣＡの変異の診断における使用のための請求項１０又は１１に記載のキット。
【請求項１４】
第２の標的ＤＮＡ配列の制限部位は、
（１）第１の標的配列の単一又は複数のヌクレオチドが置換されるか若しくは欠失するか、又は第１の標的配列に単一又は複数のヌクレオチドが挿入されることによって生じた変異配列、又は
（２）第２の標的ＤＮＡ配列の制限部位は野生型配列であり、第１の標的配列に含まれる第２の標的ＤＮＡ配列の制限部位に対応する配列において、単一又は複数のヌクレオチドが置換されるか若しくは欠失するか、又は第１の標的配列に含まれる第２の標的ＤＮＡ配列の制限部位に対応する配列に、単一又は複数のヌクレオチドが挿入されることによって、第１の標的配列では制限部位が除去されている、である、請求項１２又は１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一又は複数のヌクレオチドの置換又は欠失若しくは挿入が制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を生じる／除去する点で異なる、ｗｔ標的ＤＮＡ配列及び／又は変異型標的ＤＮＡ配列を検出する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
シークエンシング及びＳＮＰ検出を含む異なるタイプのゲノム解析を可能とする目的で、ＤＮＡを増幅のため、単一又は幾つかの細胞上の全ゲノム増幅が使用される。
【０００３】
確定的制限部位に基づくライゲーション介在ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）を用いる全ゲノム増幅（以下、ＤＲＳ−ＷＧＡと呼ぶ）は特許文献１より既知である。
【０００４】
ＤＲＳ−ＷＧＡは、単一の細胞の増幅により優れ（例えば、非特許文献１を参照されたい）、また固定処理によるＤＮＡ分解に対し耐性であること（例えば、非特許文献２、非特許文献３を参照されたい）が示されている。
【０００５】
ＤＲＳ−ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリは、図１Ａに示される一般的な構造を有するＤＮＡフラグメントを含む。図１Ｂは、制限エンドヌクレアーゼＭｓｅＩを使用するＤＲＳ−ＷＧＡによって得られたＤＮＡライブラリフラグメントの構造の具体例を示す。
【０００６】
ＤＲＳ−ＷＧＡの下流の変異検出アッセイは、通常、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）アンプリコン内にプライマーを設計することによって行われる。ＤＲＳ−ＷＧＡは均一で安定した増幅の観点から最良の結果を提供するが、変異の存在を判定するためにアッセイを設計することは、ＲＥアンプリコン内にプライマーを設計する通常の方法では、野生型と変異型ＤＮＡとを区別できないことから、問題の変異がＲＥアンプリコン内にＤＲＳ−ＷＧＡ制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を生じる又は除去する状況では困難な可能性がある。
【０００７】
説明として、上述の問題を引き起こす変異の例を、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの制限部位ＴＴＡＡについて以下に示すが、同じ問題が任意の他の制限部位に生じる。以下の例は、平滑末端のＤＮＡフラグメントを生じる制限エンドヌクレアーゼを使用する方法を含む、ＤＲＳ−ＷＧＡに関する他の方法にも適用され得るものであって、本発明の限定を意図するものではない。
【０００８】
ケースＡ。変異は新たな制限部位（ＲＳ）を導入する
置換
置換は、１つ（又は複数）のヌクレオチドが異なるヌクレオチドと誤って置き換えられるＤＮＡ変異である。これは、特定のＤＮＡ部位のヌクレオチド配列における変化を生じる。
【０００９】
したがって、置換は、野生型（ＷＴ）ＤＮＡ配列中にＲＳが存在しない場合、変異型（Ｍ）ＤＮＡ配列中にＲＳを導入する場合がある。
【００１０】
一塩基置換の例：
ＷＴ配列            Ｍ配列                        ケース
ＶＴＡＡ            ＴＴＡＡ                    （１）
ＴＶＡＡ            ＴＴＡＡ                    （２）
ＴＴＢＡ            ＴＴＡＡ                    （３）
ＴＴＡＢ            ＴＴＡＡ                    （４）
（ここで、Ｖは、Ａ又はＣ又はＧであり（Ｔではない）、Ｂは、Ｃ又はＧ又はＴである（Ａではない））。
【００１１】
欠失
ＤＮＡ変異は、野生型（ＷＴ）ＤＮＡ配列中にＲＳが存在しない場合、変異型（Ｍ）ＤＮＡ配列中のＲＳを産生する１つ（又は複数）のヌクレオチドを除去する場合がある。
【００１２】
一塩基又は複数（ｎ）の塩基の欠失の例：
ＷＴ配列            Ｍ配列                        ケース
Ｔ［Ｖ］ｎＴＡＡ    ＴＴＡＡ                      （５）
ＴＴ［Ｖ］ｎＡＡ    ＴＴＡＡ                      （６）
ＴＴ［Ｂ］ｎＡＡ    ＴＴＡＡ                      （７）
ＴＴＡ［Ｂ］ｎＡ    ＴＴＡＡ                      （８）
【００１３】
挿入
ＤＮＡ変異は、野生型（ＷＴ）ＤＮＡ配列中にＲＳが存在しない場合、変異型（Ｍ）ＤＮＡ配列中のＲＳを産生する１つ（又は複数）のヌクレオチドを挿入する場合がある。
【００１４】
一塩基挿入の例：
ＷＴ配列            Ｍ配列                        ケース
ＶＴＡＡ            ［ｉｎｓＴ］ＴＡＡ          （９）
ＴＴＡＢ            ＴＴ［ｉｎｓＡ］ＡＢ        （１０）
及び関連の区別できないケース：
ＶＴＡＡ            Ｔ［ｉｎｓＴ］ＡＡ          （９’）
ＴＴＡＢ            ＴＴＡ［ｉｎｓＡ］Ｂ        （１０’）
【００１５】
上述の変異はいずれもＲＳを導入し、野生型アレル（存在する場合）のみが正確に増幅されシークエンシングされることから、変異は変異部位を含む領域を増幅するプライマー対を使用する場合、例えば、ＰＣＲ及びシークエンシングによっては、ＤＮＡライブラリフラグメントにおいて検出することができない。図２のケースＡ、左図においてこの状況の概要を述べる。
【００１６】
ケースＢ。上記変異は、野生型（ＷＴ）配列から制限部位を除去する
置換
置換は、ＷＴ  ＤＮＡ配列中に存在するＲＳを除去する場合がある。
ＷＴ配列            Ｍ配列                        ケース
ＴＴＡＡ            ＶＴＡＡ                    （１１）
ＴＴＡＡ            ＴＶＡＡ                    （１２）
ＴＴＡＡ            ＴＴＢＡ                    （１３）
ＴＴＡＡ            ＴＴＡＢ                    （１４）
【００１７】
上記は、Ｍ  ＤＮＡ配列とＷＴ  ＤＮＡ配列とを入れ替えた場合のケース（１）〜（４）に対応する。
【００１８】
欠失
ＤＮＡ変異は、ＲＳが野生型（ＷＴ）ＤＮＡ配列中に存在する場合、ＲＳを除去する１（又は複数）のヌクレオチドを除去する場合がある。
【００１９】
一塩基欠失の例：
ＷＴ配列            Ｍ配列                        ケース
ＶＴＴＡＡ          Ｖ［ｄｅｌＴ］ＴＡＡ        （１５）
ＴＴＡＡＢ          ＴＴ［ｄｅｌＡ］ＡＢ        （１６）
及び関連の区別できないケース：
ＶＴＴＡＡ          ＶＴ［ｄｅｌＴ］ＡＡ        （１５’）
ＴＴＡＡＢ          ＴＴＡ［ｄｅｌＡ］Ｂ        （１６’）
【００２０】
挿入
ＤＮＡ変異は、ＲＳが野生型（ＷＴ）ＤＮＡ配列中に存在する場合、ＲＳを除去する１（又は複数）のヌクレオチドを挿入する場合がある。
ＷＴ配列            Ｍ配列                        ケース
ＴＴＡＡ            Ｔ［ｉｎｓＶ］ｎＴＡＡ      （１７）
ＴＴＡＡ            ＴＴ［ｉｎｓＶ］ｎＡＡ      （１８）
ＴＴＡＡ            ＴＴ［ｉｎｓＢ］ｎＡＡ      （１９）
ＴＴＡＡ            ＴＴＡ［ｉｎｓＢ］ｎＡ      （２０）
【００２１】
上記例のように１又は複数の塩基の欠失を含む任意の（また他の多くの）場合、ＷＴ配列中に存在するＲＳを除去し、消化されていない配列を生じる。
【００２２】
変異型配列は、変異部位を含むＤＮＡ配列を増幅するプライマー対を設計することにより容易に同定され得るのに対し、野生型アレル（存在する場合）を増幅できず、遺伝型の誤った評価をもたらす。図２のケースＢ、右図においてこの状況の概要を述べる。
【００２３】
さらに、変異が存在しない場合には、ＰＣＲからは何らのシグナルもなく、ＤＲＳ−ＷＧＡの間に野生型アレルの脱落があったかどうか、又は遺伝型が単に野生型であるのかどうかを判定することはできない。
【００２４】
特許文献２は、制限部位における多型を明らかにする増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）技法を開示する。１又は複数のゲノム間の配列多型を検出する方法は、（ａ）開始核酸から、少なくとも１つのアダプターに対して適合性の末端を有するアダプターを連結可能な複数の核酸フラグメントであって、制限エンドヌクレアーゼを用いた断片化によって得られる、核酸フラグメントを提供すること、（ｂ）アダプター連結核酸フラグメントを産生等するために上記核酸フラグメントの上記末端と上記少なくとも１つのアダプターとの間でライゲーション反応を行うこと、（ｃ）上記少なくとも１つのアダプターのヌクレオチド配列に本質的に相補的な少なくとも１つの増幅プライマーを使用することにより上記アダプター連結核酸フラグメントを増幅すること、及び（ｄ）上記増幅したアダプター連結核酸フラグメントから核酸フィンガープリントを作製するとともに、配列多型の存在を判定等するため、増幅した核酸フラグメントの存在若しくは不在、又はそれらの間の相違について得られた核酸フィンガープリントを比較することにより上記ゲノムに由来する核酸フィンガープリントを作製することを含む。
【００２５】
しかしながら、この方法では、１つの具体的な多型部位を検出することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】欧州特許第１１０９９３８号
【特許文献２】欧州特許第１３５０８５３号
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Lee YS, et al: Comparison of whole genome amplification methods for further quantitative analysis with microarray-based comparative genomic hybridization. Taiwan J Obstet Gynecol. 2008, 47(1):32-41
【非特許文献２】Stoecklein N.H. et al: SCOMP is Superior to Degenerated Oligonucleotide Primed-PCR for Global Amplification of Minute Amounts of DNA from Microdissected Archival Samples. American Journal of Pathology 2002, Vol. 161, No. 1
【非特許文献３】Arneson N. et al.: Comparison of Whole Genome Amplification methods for analysis of DNA extracted from microdissected early breast lesions in formalin-fixed paraffin-embedded tissue. ISRN Oncol. 2012; 2012;710692
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
したがって、本発明の目的は、野生型標的ＤＮＡ配列及び変異型標的ＤＮＡ配列がＤＲＳ−ＷＧＡの制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位の存在において異なる場合、ＤＲＳ−ＷＧＡによって得られるような構造を有するＤＮＡフラグメントのライブラリ中の野生型標的ＤＮＡ配列及び／又は変異型標的ＤＮＡ配列を検出する、簡易かつ効率的な方式で上述の問題を解決する方法を提供することである。
【００２９】
この目的は、請求項１に規定される方法に関するように本発明により達成される。
【００３０】
本発明の更なる目的は、請求項１０に規定されるようなキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
定義
他に特に定義がなければ、本明細書に用いられる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は同等の多くの方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を下に記載している。特段の言及がない限り、本発明と共に使用される本明細書に記載される技法は、当業者によく知られている標準的な方法論である。
【００３２】
「制限部位」又は「ＲＳ」の用語は、制限エンドヌクレアーゼ（又は「ＲＥ」）によって認識されるＤＮＡ分子に沿うヌクレオチドの配列（典型的には、４塩基対〜８塩基対の長さ）を意図するものである。制限部位において、制限エンドヌクレアーゼは、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合を加水分解することによりヌクレオチドを切断する。
【００３３】
「変異依存型制限部位」（又は「ＭＤＲＳ」）の用語は、変異の結果により導入又は除去されるＲＳを意図するものである。
【００３４】
「切断部位」（又は「ＣＳ」）の用語は、ＲＥによって加水分解されるホスホジエステル結合が位置する制限部位の配列中の位置を意図するものである。
【００３５】
「変異依存型切断部位」（又は「ＭＤＣＳ」）の用語は、変異の結果によって導入又は除去されるＣＳを意図するものである。
【００３６】
「アンプリコン」の用語は、ＰＣＲ増幅によって産生されるＤＮＡの領域を意図するものである。
【００３７】
「ＤＲＳ−ＷＧＡ増幅産物」又は「ＷＧＡ増幅産物」の用語は、連結されたＷＧＡプライマーに隣接する２つのＲＳ間のＤＮＡ配列を含む、ＤＲＳ−ＷＧＡの間に増幅されるＤＮＡフラグメントを意図するものである。
【００３８】
「ＷＧＡ  ＰＣＲプライマー」又は「ユニバーサルＷＧＡプライマー」又は「アダプター」の用語は、ＤＲＳ−ＷＧＡにおいて制限酵素の作用により生じた各フラグメントに連結された追加のオリゴヌクレオチドを意図するものである。
【００３９】
「オリジナルＤＮＡ」の用語は、ＤＲＳ−ＷＧＡによる増幅前のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を意図するものである。
【００４０】
「標的配列」の用語は、オリジナルＤＮＡ上の目的の領域を意図するものである。
【００４１】
「標的配列のセンス鎖」の用語は、一般的に、ｍＲＮＡと同じ配列を有し、アンチセンス鎖に相補的な５’から３’に走るＤＮＡ鎖のセグメントを意図するものである。また、センス鎖を「プラス鎖」と呼ぶ場合がある。
【００４２】
簡略化のため、本明細書では、「標的配列のプラス鎖」（ＴＳＰＳ）の用語は以下の意味を伴って使用される。
１）ヌクレオチド番号の増加に伴ってその配列上の変異依存型切断部位の３’側に変異が起こる場合において、ヌクレオチド番号の増加によりゲノムＤＮＡ配列を同定する。
２）ヌクレオチド番号の増加に伴ってその配列上の変異依存型切断部位位置の５’側に変異が起こる場合、ヌクレオチド番号の増加によりゲノムＤＮＡ配列の逆相補を同定する。
【００４３】
一貫して、「標的配列のマイナス（antipositive）鎖」（ＴＳＡＳ）の用語は、本明細書において以下の意味を伴って使用される。
３）ヌクレオチド番号の増加に伴ってその配列上の変異依存型切断部位の３’側に変異が起こる場合、ヌクレオチド番号の増加によりゲノムＤＮＡ配列の逆相補を同定する。
４）ヌクレオチド番号の増加に伴ってその配列上の変異依存型切断部位位置の５’側に変異が起こる場合、ヌクレオチド番号の増加によりゲノムＤＮＡ配列を同定する。
【００４４】
「ヌクレオチド番号の増加」の表現は、（ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ等の配列データベース中に見出されるような）染色体位置に関するナンバリングを指す。
【００４５】
「配列セグメントの５’末端領域」の表現は、参照されるヌクレオチドの配列位置がその配列セグメントの５’終末端に向いていることを意図するものである。
【００４６】
「配列セグメントの３’末端領域」の表現は、参照されるヌクレオチドの配列位置がその配列セグメントの３’終末端に向いていることを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１−１】図１Ａは、変異依存型切断部位（ＭＤＣＳ）が切断されない場合の、制限エンドヌクレアーゼＭｓｅＩを使用する特異的ＤＲＳ−ＷＧＡによって得られたＤＮＡライブラリフラグメントの一般的な構造の略図を示す。頭字語は以下の通りである：ＦＴＳ＝第１の標的配列、ＣＳ＝切断部位、ＲＳ＝制限部位、ＦＴＳＰＳ＝第１の標的配列のプラス鎖、ＦＴＳＡＳ＝第１の標的配列のマイナス鎖、ＮＵＣＬ＃＝ヌクレオチド番号（矢印の方向に従って増加する）、ＷＴ＝野生型、ＭＤＣＳ＝変異依存型切断部位。図１Ｂは、変異依存型切断部位（ＭＤＣＳ）が切断される場合の、制限エンドヌクレアーゼＭｓｅＩを使用する特異的ＤＲＳ−ＷＧＡによって得られたＤＮＡライブラリフラグメントの一般的な構造の略図を示す。追加の頭字語は以下の通りである：ＳＴＳ＝第２の標的配列、ＭＤＲＳ＝変異依存型制限部位、Ｍ＝変異型、ＳＴＳＰＳ＝第２の標的配列のプラス鎖、ＳＴＳＡＳ＝第２の標的配列のマイナス鎖。
【図１−２】図１Ｃは、第１の標的配列のプラス鎖及びマイナス鎖、並びに関連するリバースプライマー及びフォワードプライマーの配置の略図を示す。追加の頭字語は以下の通りである：Ｒ１＝第１のリバースプライマー、Ｆ２＝第２のフォワードプライマー。図１Ｄは、第２の標的配列のプラス鎖及びマイナス鎖、並びに関連するリバースプライマー及びフォワードプライマーの配置の略図を示す。追加の頭字語は以下の通りである：Ｆ３＝第３のフォワードプライマー、Ｆ３１＝第３のフォワードプライマーの第１部分、Ｆ３２＝第３のフォワードプライマーの第２部分。
【図１−３】図１Ｅは、ヌクレオチド番号を増加することにより配列上のＭＤＣＳの５’側に変異が位置する場合の、第１の標的配列のプラス鎖及びマイナス鎖、並びに関連するリバースプライマー及びフォワードプライマーの配置の略図を示す。図１Ｆは、ヌクレオチド番号を増加することにより配列上のＭＤＣＳの５’側に変異が位置する場合の、第２の標的配列のプラス鎖及びマイナス鎖、並びに関連するリバースプライマー及びフォワードプライマーの配置の略図を示す。  図１Ａ〜図１Ｆでは、切断されていない配列がＷＴ配列であり、切断された配列が変異体配列である状況に言及している。ＷＴとＭとを単純に入れ替えることにより、変異型配列が切断されず、野生型配列が切断される代替的な状況を容易に得ることができる。
【図２】変異型ＤＮＡ配列中の制限部位の導入（ケースＡ−左図）又は除去（ケースＢ）、及び従来の変異検出方法による結果を含む２つの状況の簡略図を示す図である。
【図３】実施例１のｗｔ及び変異型ＤＮＡに対する二価プライマー対を用いて行ったＰＣＲ増幅の分離した産物のゲル電気泳動の画像を示す図である。Ｃｎｔ：ＷＧＡ反応のブランク。Ｃ−：ＰＣＲ反応のブランク。
【図４】本発明による方法の作動原理の簡略図を示す図である。図４Ａは、変異が配列中に制限部位を導入する状況を示す。図４Ｂは、変異が配列中の制限部位を除去する状況を示す。
【図５】ユニバーサルＷＧＡプライマーに対してその長さの８６％が相同の制限部位を含む変異型特異的５’プライマーを用いて行ったＰＣＲ増幅の分離された産物のゲル電気泳動の画像を示す図である。
【図６】実施例３の野生型特異的５’プライマーを用いて行ったＰＣＲ増幅の分離された産物のゲル電気泳動の画像を示す図である。
【図７】実施例３の変異型特異的５’プライマーを用いて行ったＰＣＲ増幅の分離された産物のゲル電気泳動の画像を示す図である。
【図８】実施例３の野生型アレルのシークエンシングの例を示す図である。
【図９】実施例３の変異型アレルのシークエンシングの例を示す図である。
【図１０】実施例４の結果を要約する表を示す図である。
【図１１】実施例５の変異型プライマー対を用いて行ったＭ及びＷＴの個々の細胞のＰＣＲ増幅の分離された産物のゲル電気泳動の画像を示す図である。
【図１２】実施例５の野生型プライマー対を用いて行ったＭ及びＷＴの個々の細胞のＰＣＲ増幅の分離された産物のゲル電気泳動の画像を示す図である。
【図１３】実施例６の野生型の単一細胞のリバース鎖配列の例を示す図である。
【図１４】実施例６の変異型の単一細胞のリバース鎖配列の例を示す図である。
【図１５】実施例６の結果を要約する表を示す図である。
【図１６】実施例６のアッセイにより代わりに野生型と確認された、変異体ＰＣＲ産物に対して陽性（すなわち、ＰＣＲ産物単独に対して偽陽性）の野生型細胞（白血球）のリバース鎖配列の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
ＤＮＡ配列のライブラリから少なくとも１つの第１の標的ＤＮＡ配列及び少なくとも１つの第２の標的ＤＮＡ配列の少なくとも一方を検出するための本発明による方法は、工程（ａ）〜工程（ｃ）を含む。第１の標的ＤＮＡ配列は、第２の配列中の単一又は複数のヌクレオチドの置換又は欠失若しくは挿入が制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を生じる点で第２の標的ＤＮＡ配列と異なる。図２のケースＡ、左図及び図４Ａを参照すると、第１の標的ＤＮＡ配列は野生型ＤＮＡ配列に対応し、第２の標的ＤＮＡ配列は変異型ＤＮＡ配列に対応するのに対し、図２のケースＢ、右図及び図４Ｂを参照すると、第１の標的ＤＮＡ配列は変異型ＤＮＡ配列に対応し、第２の標的ＤＮＡ配列は野生型ＤＮＡ配列に対応する。
【００４９】
工程（ａ）では、ＤＮＡ配列のライブラリを準備する。上記ライブラリの各ＤＮＡ配列は、それぞれ、５’末端から３’末端に、１５ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さを有する第１の配列セグメント、制限エンドヌクレアーゼによって切断されるゲノムＤＮＡの第２の配列セグメント、及び第１の配列セグメントと、もしあれば、ＲＥによって生じる５’オーバーハングとの融合体（union）に逆相補的な第３の配列セグメントを含む。図１Ａを参照すると、数字の１は第１の配列セグメントを示し、数字の２は第２の配列セグメントを示し、数字の３は第３の配列セグメントを示す。好ましい実施形態では、第１の配列セグメントは、ＷＧＡ  ＰＣＲプライマーに対応する。
【００５０】
制限エンドヌクレアーゼはＭｓｅＩであることが好ましい。
【００５１】
工程（ｂ）では、ＤＮＡ配列のライブラリを、
少なくとも１つの第１標的配列又は第２の標的配列のプラス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする、少なくとも１つの第１のリバースプライマー、
少なくとも１つの第１の標的配列のマイナス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のフォワードプライマー、
少なくとも第２の標的配列のマイナス鎖の第３の配列セグメントの５’末端領域にハイブリダイズする第１部分と、少なくとも１つの第２の標的配列のマイナス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする第２部分とを含む少なくとも１つの第３のフォワードプライマーであって、上記少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの第１部分が、上記少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの全長に対して２０％〜８０％の長さを有する、少なくとも１つの第３のフォワードプライマー、
を使用するＰＣＲによって増幅する。
【００５２】
第３のフォワードプライマーを、以下、簡潔に「ハイブリッドプライマー」と呼ぶことがある。
【００５３】
少なくとも１つの第２の標的配列のプラス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする少なくとも１つの第４のリバースプライマーを工程（ｂ）で使用することが好ましい。
【００５４】
少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの第１部分は、少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの全長に対して４０％〜６０％の長さを有することが好ましい。
【００５５】
少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの第２部分は、上記制限エンドヌクレアーゼのコンセンサス配列に対応し、もしあれば、上記制限エンドヌクレアーゼによって生じた５’オーバーハングを引いて、いずれも２で除した最小と、最大３０塩基との間に含まれる塩基単位の長さを有することが好ましい。
【００５６】
図４Ａを参照すると、第１のリバースプライマーは野生型リバースプライマー（ＷＴ＿Ｒ）に対応し、第２のフォワードプライマーは野生型フォワードプライマー（ＷＴ＿Ｆ）に対応し、第３のフォワードプライマーは変異型フォワードプライマー（Ｍ＿Ｆ）に対応する。一実施形態では、第１のリバースプライマーは、第１のみならず第２の標的配列のプラス鎖も増幅するように働く。しかしながら、好ましい実施形態では、第１のリバースプライマーとは異なる第４のリバースプライマーを使用して、第２の標的配列のプラス鎖を増幅する。図４Ａでは、第４のリバースプライマーは、変異型リバースプライマー（Ｍ＿Ｒ）に対応する。
【００５７】
第１のリバースプライマーが変異型リバースプライマー（Ｍ＿Ｒ）に対応し、第２のフォワードプライマーが変異型フォワードプライマー（Ｍ＿Ｆ）に対応し、第３のフォワードプライマーが野生型フォワードプライマー（ＷＴ＿Ｆ）に対応し、第４のリバースプライマーが野生型リバースプライマー（ＷＴ＿Ｒ）に対応する図４Ｂに、同じ原理が適用される。
【００５８】
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で増幅されたＤＮＡ配列を検出する。工程（ｃ）は、当該技術分野で既知の幾つかの検出方法、例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ＤＮＡシークエンシングにより行われてもよい。工程（ｃ）は、ＤＮＡシークエンシング法によって行われることが好ましい。ＤＮＡシークエンシング法は、サンガーシークエンシング、又は合成によるシークエンシングであることがより一層好ましい。
【００５９】
本発明の方法は、図１Ａに示される構造を有するＤＮＡ配列の任意のライブラリを用いて使用され得る。上記方法は、確定的制限部位全ゲノム増幅（deterministic restriction site whole genome amplification）により得られたＤＮＡ配列のライブラリを用いて使用されることが好ましい。
【００６０】
また、本発明によれば、上記に定義される第１及び／又は第２及び／又は第３のプライマーを含むキットが提供される。
【００６１】
より具体的には、
第１の標的ＤＮＡ配列が、第２の配列における単一又は複数のヌクレオチドの置換又は欠失若しくは挿入が制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を生じる点で第２の標的ＤＮＡ配列と異なり、
ライブラリの各々のＤＮＡ配列が、それぞれ、５’末端から３’末端に、１５ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さを有する第１の配列セグメント、上記制限エンドヌクレアーゼによって切断されるゲノムＤＮＡの第２の配列セグメント、及び該第１の配列セグメントと、もしあれば、該制限エンドヌクレアーゼによって生じた５’オーバーハングとの融合体に逆相補的な第３の配列セグメントを含む、ＤＮＡ配列のライブラリから少なくとも１つの第１の標的ＤＮＡ配列及び少なくとも１つの第２の標的ＤＮＡ配列の少なくとも一方を検出するキットが、
上記少なくとも１つの第１標的配列又は第２の標的配列のプラス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする、少なくとも１つの第１のリバースプライマー、
上記少なくとも１つの第１の標的配列のマイナス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のフォワードプライマー、
上記少なくとも第２の標的配列のマイナス鎖の第３の配列セグメントの５’末端領域にハイブリダイズする第１部分と、上記少なくとも１つの第２の標的配列のマイナス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする第２部分とを含む少なくとも１つの第３のフォワードプライマーであって、上記少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの第１部分が、上記少なくとも１つの第３のフォワードプライマーの全長に対して２０％〜８０％の長さを有する、少なくとも１つの第３のフォワードプライマー、
を含む。
【００６２】
上記キットは、少なくとも１つの第２の標的配列のプラス鎖の第２の配列セグメントの３’末端領域にハイブリダイズする少なくとも１つの第４のリバースプライマーを更に含むことが好ましい。
【００６３】
上記キットを、ライブラリのＤＮＡフラグメントの第２の配列セグメントの末端の制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を生じる又は排除する任意の種類の変異を検出するために使用してもよい。上記キットを、（未分化リンパ腫キナーゼ）ＡＬＫ遺伝子又は（上皮成長因子受容体）ＥＧＦＲ遺伝子又は（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ触媒アルファポリペプチド）ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中の変異の診断に使用することが好ましい。
【実施例】
【００６４】
実施例１−二価プライマーのアプローチ
ＡＬＫ遺伝子のコドン１１７４におけるヘテロ接合型のＣからＡへの置換を有し、フェニルアラニンをロイシンにする（Ｆ１１７４Ｌ）、ＳＹ５Ｙ細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２２６６（商標））に対して予備試験を行った。フランキング配列を考慮すると、ヘテロ接合型置換は変異型アレル中に１つの新たな制限部位（ＲＳ）を導入するのに対し、野生型アレルはＲＳを全く有しない。
【００６５】
図２は、変異により生じたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリにおける配列及び形質転換の簡略図である。
【００６６】
ＲＳに対して起こる変異を検出するため、以下のアプローチを試験した。全ゲノム増幅のユニバーサルプライマー（ＤＲＳ−ＷＧＡプライマー、配列ＡＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴを有する配列番号１）を利用して、３’プライマーがＲＳに関して３’中の領域を重複する、新たなＰＣＲプライマー対において５’プライマーを設計した。
【００６７】
上記戦略は、
ＤＲＳ−ＷＧＡプライマーと９５％の相同性を有する５’プライマーと、
他のＤＲＳ−ＷＧＡ増幅産物に代えて標的領域を選択的に増幅するため、ＰＣＲに必要な特異性を提供する３’ＰＣＲプライマーと、
を含む二価プライマー対の設計にある。
【００６８】
この二価プライマー対は、理論上、野生型（ＷＴ）配列及び変異体（Ｍ）配列の増幅に役立つ。
【００６９】
実験的証拠は、このアプローチが結果的に乏しく、不適切であり、またＲＳにおける変異の検出を保証できないことを示す。図３に示されるように、二価プライマーの使用は、サイズの異なる多くの増幅バンドをもたらし、明確に区別できる予想されるサイズのバンドを何らもたらさない、非特異的な増幅を提供する（例えば、Ｆ１１７４Ｌヘテロ接合型変異を有し、ＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）によって単離され、ＤＲＳ−ＷＧＡを用いて増幅される、単一のＳＹ５Ｙ細胞に対して。変異型配列について１３２ｂｐ、ＷＴ配列について１６９ｂｐ）。増幅は、変異型（Ｍ）試料、野生型（ＷＴ）試料及びＰＣＲ陰性対照（Ｃ−）試料のいずれにも明確で特異的なバンドを与えることができなかった。ＷＧＡの陰性対照（Ｃｔｒ−）は、非特異的バンドを示すに過ぎない。
【００７０】
この乏しい結果に寄与する１つの因子は、連結されたＷＧＡプライマーに９５％対応する５’二価プライマーがＤＲＳ−ＷＧＡライブラリの全てのＤＮＡフラグメントに存在し、３’二価プライマーがＰＣＲ反応に十分な特異性を提供しないことである。
【００７１】
例として、ヒトゲノム参照（ホモ・サピエンスｈｇ１９）は、３，０９５，６９３，９８１塩基を含む。ゲノムが４塩基の制限部位（例えば、ＴＴＡＡ）で制限エンドヌクレアーゼにより消化される場合、生じるＤＮＡフラグメントの平均長さは４（可能性のある塩基）〜４の累乗（考慮される消化配列の長さ）＝２５６である。よって、作製されるＤＮＡライブラリは、ＤＮＡにおけるヌクレオチドのランダム配列の単純化した仮説により、およそ３，０９５，６９３，９８１／２５６≒１２，１００，０００の異なるフラグメントを含む。それらはいずれも同じ５’プライマー（一次ＰＣＲに由来するＷＧＡプライマーに対応する）を含む。
【００７２】
したがって、上記二価プライマー対の使用は、非特異的なバンドを与える。
【００７３】
実施例２−ハイブリッドプライマーの相同性範囲の限界
実施例１で使用されたものと同じＳＹ５Ｙ細胞株に対してであるが、本発明の方法を使用して、増幅試験を行った。
【００７４】
ＤＲＳ−ＷＧＡ産物における野生型（ＷＴ）アレル及び変異型（Ｍ）アレルの両方の増幅を試験するため、個々のＳＹ５Ｙ細胞を、純粋な単一細胞を提供するＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）を用いて単離した。
【００７５】
その長さの８６％がＷＧＡユニバーサルプライマーと一致する１つの５’ＰＣＲプライマーを使用する増幅アプローチは、ＷＴ又はＭアレルのいずれの増幅についても解決策を提供しなかった。図５に示されるように、上記増幅は、変異型（Ｍ）試料、野生型（ＷＴ）試料、及びＰＣＲ陰性対照（Ｃ−）試料のいずれにおいても明確で特異的なバンドを与えることができなかった。ＷＧＡの陰性対照（Ｃｔｒ−）は、非特異的なバンドを示すに過ぎない。
【００７６】
ＷＧＡユニバーサルプライマーと種々の相同性パーセントを有するプライマーを試験した。結果を下記の表１に要約する。
【００７７】
【表１】
0006352277.tif 000002
【００７８】
表１において、Ｆ３２欄は、「第３のフォワードプライマーの第２部分」の塩基数単位での長さ、すなわち、制限エンドヌクレアーゼオーバーハングを除いた、オリジナルＤＮＡと同じ配列を有するプライマー部分を報告する。
【００７９】
表１の結果より、上記方法の要求を満たすため、安定した解決法を特定しなければならないことが明らかである。幾つかの試験は、ＷＧＡユニバーサルプライマーとのハイブリッドプライマーの理想的な同一性パーセントは、２０％〜８０％であり、より一層優れた効率性を伴う場合は４０％〜６０％の範囲であることを示した。
【００８０】
実施例３  変異体アレル（ＡＬＫ遺伝子）における新たなＲＳの導入−アッセイ設計
本発明による方法は、制限エンドヌクレアーゼによる不完全な消化の場合であっても増幅（及びシークエンシング）を保証する。実際、制限エンドヌクレアーゼの活性は、標的ＤＮＡにおいて全てのＲＳについては保証されず、ＤＲＳ−ＷＧＡによる増幅に成功するにもかかわらず、ＷＧＡプライマー（一次ＰＣＲ）が別のＲＳ中にあっても、統計学的にごく一部の消化されていないＲＳがＤＲＳ−ＷＧＡに存在する。
【００８１】
消化されていない部位の場合、変異体配列に対して設計された唯一のプライマー対の変異導入アッセイに対する使用は、標的の増幅及びシークエンシングを可能としない。
【００８２】
以前に開示されるように、コドン１１７４におけるヘテロ接合型のＣからＡへの置換を有し、フェニルアラニンをロイシンにする（Ｆ１１７４Ｌ）、ＳＹ５Ｙ細胞株に対して増幅試験を再び行った。そのようにしてヘテロ接合型置換は、変異型アレルに新たなＲＳを導入するのに対し、野生型アレルはいかなるＲＳも有しない。
【００８３】
ＷＴアレル及びＭアレルの増幅に使用したＰＣＲプライマー配列を表２に示す。変異体アレルフォワードプライマーについて、ＷＧＡプライマーに相同なプライマー配列の第１部分を太字及び下線で示し、制限エンドヌクレアーゼオーバーハングを除いた、オリジナルＤＮＡと同じ配列を有するプライマーの第２部分（Ｆ３２＝８塩基）を四角で囲って示す。
【００８４】
【表２】
0006352277.tif 000003
【００８５】
ＤＲＳ−ＷＧＡ産物におけるＷＴアレル及びＭアレルの両方の増幅を試験するため、純粋な単一の細胞を提供するＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）を用いて個々のＳＹ５Ｙ細胞を単離した。
【００８６】
変異の検出に対する陰性対照として、個々のリンパ球を、同じくＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）を用いて単離し、ＤＲＳ−ＷＧＡにより増幅した。
【００８７】
ＷＴ（リンパ球）及びヘテロ接合型Ｍ（ＳＹ５Ｙ）の両方に対するＷＴアレルのＰＣＲ増幅は、ＷＴアレルの排他的な増幅を可能とする、特異的に設計されたＷＴ５’プライマーの使用により完璧に達成された。
【００８８】
図６で観察できるように、非特異的な（aspecific）増幅産物は存在しなかった。その代り、予想されたＰＣＲバンド（１３２ｂｐ）を明確に区別できる。
【００８９】
同じリンパ球及びＳＹ５Ｙ細胞についてＭ特異的５’プライマーを試験して、標的配列及びユニバーサルＤＲＳ−ＷＧＡプライマーにまたがって設計されたプライマーにより提供される増幅の特異性を検出した。
【００９０】
図７からわかり得るように、この場合には、予想どおり、ＳＹ５Ｙ単一細胞ＤＲＳ−ＷＧＡ  ＤＮＡにおいてのみ特異的な増幅が得られた。標的変異に関してＷＴであるリンパ球に由来するＤＲＳ−ＷＧＡ  ＤＮＡは、予想された増幅について陰性であり、非特異的ＰＣＲ増幅のみが存在した。
【００９１】
達成される増幅が特異的であり、シークエンシングを可能とすることを実証するため、上記増幅産物の全てをそれらの３’末端からシークエンシングした。対応するＷＴ又はＭの状態を、上述の方法により達成される特異性を示す全ての増幅産物について確認した。ＷＴアレルのシークエンシングの例を図８に示し、Ｍアレルのシークエンシングの例を図９に示す。
【００９２】
結果を表３に要約する。
【００９３】
【表３】
0006352277.tif 000004
【００９４】
好ましい実施形態では、第３のフォワードプライマー（Ｆ３）の第２部分（Ｆ３２）は、第１の標的配列のマイナス鎖（ＦＴＳＡＳ）、すなわち、本実施例では野生型配列に対してミスプライム（mis-prime）しないように、３０ヌクレオチドよりも短く、そのようにして、偽陽性（そのＰＣＲ産物の長さ及び配列により）をもたらす可能性のあるＰＣＲ反応を開始する。第２部分（Ｆ３２）の長さは２０ヌクレオチドよりも短いことがより好ましい。上記第３のフォワードプライマー（Ｆ３）の上記第２部分（Ｆ３２）の長さは、１０ヌクレオチドよりも短いか、又はそれに等しいことがより一層好ましい。
【００９５】
第３のフォワードプライマー（Ｆ３）の第２部分（Ｆ３２）は、十分な特異性を提供しない程短すぎてはならない（例えば、表１の結果を参照されたい）。とりわけ、第３のフォワードプライマーの上記第２部分の長さは、制限部位のコンセンサス配列の長さから消化したＤＮＡの５’オーバーハングの長さを引いて、いずれも２で除したよりも大きくなくてはならない。より大きな特異性を得るため、第３のフォワードプライマー（Ｆ３）の第２部分（Ｆ３２）は、少なくとも３ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも６ヌクレオチドであり、制限部位のコンセンサス配列の長さから消化したＤＮＡの５’オーバーハングの長さを引いて、いずれも２で除したよりも長くなくてはならない。
【００９６】
実施例４  変異体アレル（ＡＬＫ遺伝子）における新たなＲＳの導入−アッセイの確認
上述の方法を５４個の単一細胞を用いて更に確認した。
１０個の単一の生存する新鮮なＳＹ５Ｙ、
予め室温にて２０分間２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、Ｉｎｓｉｄｅ  Ｐｅｒｍ（Miltenyi Biotec）で透過処理した、１９個の単一ＳＹ５Ｙ、
予めＣｙｔｏＣｈｅｘ（商標）で固定し、Ｉｎｓｉｄｅ  Ｐｅｒｍで透過処理した、１９個の単一ＳＹ５Ｙ、
２個の単一の新鮮な生存するリンパ球、
予め室温にて２０分間２％ＰＦＡで固定し、Ｉｎｓｉｄｅ  Ｐｅｒｍ（Miltenyi Biotec）で透過処理した、２個の単一リンパ球。
【００９７】
上記方法は、１００％のＳＹ５Ｙ細胞及びリンパ球細胞においてＷＴアレルを増幅し、９／１０＝９０％の生存するＳＹ５Ｙ、ｃｙｔｏ−ｃｈｅｘ／ｉｎｓｉｄｅ−ｐｅｒｍにより固定し透過処理した１６／１９＝８４％のＳＹ５Ｙ細胞、室温で２０分間ＰＦＡ２％／ｉｎｓｉｄｅ−ｐｅｒｍで固定し透過処理した１７／１９＝８９％のＳＹ５Ｙ細胞、及び０／４＝０％のリンパ球において変異体アレルを増幅した。
【００９８】
結果を図１０に示し、表４に要約する。
【００９９】
【表４】
0006352277.tif 000005
【０１００】
これらの結果は、より多数の試料に対する本発明の方法の有効性及びロバスト性を示す。
【０１０１】
実施例５  変異体アレル（ＥＧＦＲ遺伝子）におけるＲＳの除去−アッセイ設計
ＥＧＦＲ遺伝子における５つのコドンの欠失を有するＨＣＣ−８２７細胞株に対して、増幅試験を行った。上記欠失は、制限部位（ＲＳ）を除去し、ヒトゲノムに対して単一のＰＣＲ及びプライマー対を使用する場合には、Ｍアレルの検出を可能とするが、ＲＳを有するＷＴアレルの検出はできない。
【０１０２】
ＷＴ条件の対照として、リンパ球と共にＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）によって個々のＨＣＣ−８２７細胞を単離した。
【０１０３】
Ｍアレル（ＲＳの欠失を伴う）及びＷＴアレル（まだＲＳを保持している）に対して標的化された２つの異なるプライマー対を設計し、ＷＴ及びＭの両方の条件の正確な同定を導いた。
【０１０４】
ＷＴアレル及びＭアレルの増幅に使用したＰＣＲプライマー配列を表５に示す。野生型アレルフォワードプライマーについて、ＷＧＡプライマーに相同のプライマー配列の第１部分を太字及び下線で示し、制限エンドヌクレアーゼオーバーハングを除いた、オリジナルＤＮＡと同じ配列を有するプライマーの第２部分（Ｆ３２＝１６ｂ）を四角で囲って示す。
【０１０５】
【表５】
0006352277.tif 000006
【０１０６】
図１１は、Ｍプライマー対によるＭ及びＷＴの個々の細胞のＰＣＲ増幅の結果を示し、図１２は、ＷＴプライマー対によるＭ及びＷＴの個々の細胞のＰＣＲ増幅の結果を示す。
【０１０７】
図１３は、ＤＲＳ−ＷＧＡにより増幅されたｇＤＮＡと比較したＷＴ単一細胞のリバース鎖配列を示し、図１４は、ＤＲＳ−ＷＧＡにより増幅されたｇＤＮＡと比較したＭ単一細胞のリバース鎖配列を示す。
【０１０８】
実施例６  変異体アレル（ＥＧＦＲ遺伝子）におけるＲＳの除去−アッセイの確認
上述の方法を６０個の単一細胞を用いて更に確認した。
Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ濃縮プロトコルに従って処理した３１個の単一のＨＣＣ−８２７、
Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ濃縮プロトコルに従って処理した１１個の単一のリンパ球、
１７個の単一の新鮮な生存するリンパ球。
【０１０９】
上記方法は、２８／３１＝９０％の単一ＨＣＣ−８２７においてＷＴアレルを増幅し、３１／３１＝１００％の単一ＨＣＣ−８２７においてＭアレルを増幅した。
【０１１０】
１１個のＶｅｒｉｄｅｘ処理したリンパ球を考慮すると、１１／１１＝１００％がＷＴ  ＰＣＲに関して陽性ＰＣＲ産物を生じ、３／１１＝２７％がＭ−ＰＣＲに関して陽性ＰＣＲ産物を生じた。これらの産物をシークエンシングして、ＷＴと確認した。したがって、シークエンシングによるＤＮＡの検出により、Ｖｅｒｉｄｅｘ処理したリンパ球に対する特異性は、なおも１００％であるのに対して、ＰＣＲの陽性（positivity）のみに依存すると、その特異性は（本試験では）８／１１＝７３％である。ゲル電気泳動によるＤＮＡ産物の長さの検出は、同様に、その長さを区別し、実際にそれが野生型であることを判定することを可能とし、リアルタイムＰＣＲによるＤＮＡ産物の検出は、ＷＴ産物とＭ産物とを区別しない。１７個の新鮮なリンパ球を考慮すると、１７／１７＝１００％がＷＴ  ＰＣＲに関して陽性ＰＣＲ産物を生じ、０／１７＝０％がＭ−ＰＣＲに関して陽性ＰＣＲ産物を生じた。これらの産物をシークエンシングし、ＷＴと確認した。
【０１１１】
１つのリンパ球当たり２つのＷＴアレルが存在することから、Ｖｅｒｉｄｅｘ処理（３／２２＝１４％）と新鮮なリンパ球（０／３４＝０％）との間の消化されていないＲＳの差は統計学的に有意である。
【０１１２】
これは、ＲＥ消化活性が不完全な場合の上述の方法のロバスト性を実証する。
【０１１３】
結果を図１５に示し、表６に要約する。
【０１１４】
【表６】
0006352277.tif 000007
【０１１５】
上記実施例は、本発明による方法が、制限エンドヌクレアーゼの消化活性が不完全な場合であっても、増幅（及びシークエンシング）を保証することを示す。ＲＥの活性は、（上述の実施例のように）細胞が供される処理のため、又は制限部位周辺の特異的配列に関連する他の理由により、標的ＤＮＡ中に存在する全てのＲＳの効果的な消化を常に保証することはできない。
【０１１６】
全ゲノム増幅に成功するにもかかわらず、ユニバーサル（一次ＰＣＲ）プライマーが別のＲＳに接続されても、統計学的にごくわずかな消化されていないＲＳがＤＲＳ−ＷＧＡに存在する。
【０１１７】
消化されていない部位の場合、第３の標的配列（ＭＤＲＳを含む）に対してたった１回のＰＣＲの使用は、上記標的の増幅及びシークエンシングを可能としない。制限酵素による不完全なＤＮＡ消化の場合、ＤＲＳ−ＷＧＡライブラリにＷＴ及びＭの両方のアレルが存在すれば、本発明の方法はそれらの検出を可能とする。
【０１１８】
図１６は、Ｍ−ＰＣＲに陽性のＶｅｒｉｄｅｘ処理したリンパ球３個のうち１個のシークエンシング結果の例を示す。これは、第２のフォワードプライマーにより正確に増幅され、シークエンシングされた第２の標的配列（ＭＤＲＳを含むが、ＷＧＡの間に消化されない）の場合である。
【０１１９】
実施例７  変異体アレル（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子）における新たなＲＳの導入。
別の実施例として、単一のヌクレオチドの変化ＡＴＧ／ＴＡＡＴに起因するＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のエクソン２１の変異Ｍ１０４３Ｉを、本発明による方法によって検出することができる。
【０１２０】
本発明の方法及びキットの特徴の解析より、得られる利点が明らかである。
【０１２１】
とりわけ、ＤＮＡ配列のライブラリをＰＣＲによって増幅するために使用されるプライマーの具体的な設計により、上記方法は、優れた特異性及びロバスト性を伴って、第１の標的ＤＮＡ配列及び第２の標的ＤＮＡ配列（ＤＲＳ−ＷＧＡの制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位の存在において相違する）を差次的に検出することを可能とする。
【０１２２】
さらに、第４のリバースプライマーの使用は、迅速、簡便かつ費用効率の良い、より一層特異的かつロバストな検出、及び増幅産物のサイズに基づく検出を可能とする。
【０１２３】
さらに、本発明の方法は、特異的かつロバストな方式で変異を検出するため確定的制限部位全ゲノム増幅の下流に適用されてもよい。これらの変異は、さもなければ利用可能な従来の検出方法では検出することができない。
【０１２４】
さらに、ＤＮＡシークエンシング法、とりわけサンガーシークエンシング又はパイロシークエンシングの使用は、ＤＮＡライブラリの制限エンドヌクレアーゼによる消化が不完全な場合に起こり得る疑陽性であっても、正確な検出を保証する。
【０１２５】
さらに、ＷＧＡプライマーと２０％〜８０％、より良好には４０％〜６０％の第３のプライマーの同一性パーセントが、最適な結果の取得を可能とする。
【０１２６】
最後に、これに伴い添付の特許請求の範囲の保護の範囲から逸脱することなく、開示され、示される方法及びキットに対する変更及び変形を行ってもよいことが明らかである。
【０１２７】
とりわけ、上記方法は、第１、第２、第３、及び場合によっては第４のプライマーを用いるＰＣＲ増幅を干渉しない更なるプライマー対を使用することにより多重化されてもよい。
【０１２８】
さらに、１又は複数の上記プライマーは、上記第１の標的配列又は第２の標的配列のプラス鎖又はマイナス鎖のいずれにもハイブリダイズしない５’末端配列を更に含んでもよい。この特徴を、有利には、以下の１又は複数の目的、
試料タグによりＰＣＲ産物をバーコード付けする、
次世代シークエンシング用にＰＣＲ産物中にアダプターを導入する、
多重化標的ＰＣＲ反応において偽性プライミングを回避する、
ため使用することができる。
【０１２９】
さらに、ＰＣＲ反応に由来するＷＧＡ産物は一部のバックグラウンドシグナルを示す可能性があることから、シークエンシングに異なるプライマーを使用することが有利な場合がある。これは、配列プロットの信号対ノイズ（signal-to-noise）及び可読性を改善する、特異性の格別な積み重ね（layer）を追加する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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