(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、Ｃｏｈｎプールにエタノールを２０％〜３０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で５．０〜６．０のｐＨで添加することによって前記Ｃｏｈｎプールから免疫グロブリンおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）を共沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成し、該第１の沈殿物には、少なくとも、Ｃｏｈｎプールに含有される免疫グロブリンの９０％以上、Ｃｏｈｎプールに含有されるＡ１ＰＩの８０％以上が含まれるステップと、
（ｂ）第１の上清を取除き、第１の沈殿物を回収するステップと、
（ｃ）第１の沈殿物中の免疫グロブリンを可溶化して、免疫グロブリンを含む可溶性部分およびＡ１ＰＩを含む不溶性部分を有する第１の懸濁液を形成するステップと、
（ｄ）第１の懸濁液の可溶性部分を第１の懸濁液の不溶性部分から分離するステップと、
（ｅ）第１の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップと
を含む、Ｃｏｈｎプールから濃縮免疫グロブリン組成物を製造するための方法であって、ステップ（ａ）の前にアルコール沈殿が行われない、前記方法。
【請求項２】
（ａ）エタノールの前記最終濃度が、２５±４％であるか、
（ｂ）エタノールの前記最終濃度が、２５±３％であるか、
（ｃ）エタノールの前記最終濃度が、２５±２％であるか、または
（ｄ）エタノールの前記最終濃度が、２５±１％である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エタノールの前記最終濃度が、２５％である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）前記ｐＨが、５．５±０．４であるか、
（ｂ）前記ｐＨが、５．５±０．３であるか、
（ｃ）前記ｐＨが、５．５±０．２であるか、または
（ｄ）前記ｐＨが、５．５±０．１である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐＨが、５．５である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｐＨが、第１の沈殿ステップの持続時間にわたって維持される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第１の沈殿ステップが、−５℃〜−９℃の温度で実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第１の懸濁液が、４．７〜５．１のｐＨを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１の懸濁液が、０．５ｍＳ／ｃｍ〜２ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第１の沈殿物が、酢酸塩および／またはリン酸塩を含む緩衝液中に懸濁される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の懸濁液の可溶性部分を第１の懸濁液の不溶性部分から分離する前記ステップが、
（ｉ）微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を第１の懸濁液と混合することと、
（ｉｉ）前記ＳｉＯ２を前記懸濁液から分離することと
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）が、３５０ｍ２／ｇ〜４１０ｍ２／ｇの平均表面積を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）が、１５ｇ／ｋｇ第１沈殿物〜８０ｇ／ｋｇ第１沈殿物の最終濃度で第１の懸濁液に添加される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、５．３〜５．７のｐＨおよび−６℃〜−８℃の温度で２４％〜２６％のアルコールを用いてＣｏｈｎプールから免疫グロブリンを沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成し、該第１の沈殿物には、少なくとも、Ｃｏｈｎプールに含有される免疫グロブリンの９０％以上、Ｃｏｈｎプールに含有されるＡ１ＰＩの８０％以上が含まれるステップと、
（ｂ）第１の上清を取除き、第１の沈殿物を回収するステップと、
（ｃ１）第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、
（ｃ２）第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）で処理するステップと、
（ｄ）第１の懸濁液の可溶性画分を第１の懸濁液の不溶性画分から分離するステップと、
（ｅ）第１の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップと
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記濃縮免疫グロブリン組成物が、ステップ（ａ）で使用された前記Ｃｏｈｎプール中に存在する少なくとも１つの免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン含有量の少なくとも９５％を含有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンクラスがＩｇＧである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ｆ）第２の沈殿ステップにおいて、第１の懸濁液の可溶性画分から免疫グロブリンを沈殿させて、第２の沈殿物および第２の上清を得るステップと、
（ｇ）第２の沈殿物を懸濁して、第２の懸濁液を形成するステップと、
（ｈ）第２の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより、さらに濃縮された免疫グロブリン組成物を形成するステップと
をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
第２の沈殿ステップが、ｐＨ６．５〜７．５で、最終濃度２２％〜２８％のエタノールを実現するように、エタノールを第１の懸濁液の可溶性画分に添加することを含む、アルコール沈殿ステップである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第２の沈殿ステップが、−３℃〜−１０℃の温度で実施される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記濃縮免疫グロブリン組成物が、ステップ（ａ）で使用された前記Ｃｏｈｎプール中の免疫グロブリンＧ含有量の少なくとも９５％を含有する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
陽イオン交換クロマトグラフィー濃縮ステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
陰イオン交換クロマトグラフィー濃縮ステップをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ウイルス不活性化および／またはウイルス除去ステップをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）ステップ（ａ）で使用されたＣｏｈｎプール１Ｌ当たり少なくとも４ｇのＩｇＧを生じるか、
（ｉｉ）ステップ（ａ）で使用されたＣｏｈｎプール１Ｌ当たり少なくとも４．２５ｇのＩｇＧを生じるか、または
（ｉｉｉ）ステップ（ａ）で使用されたＣｏｈｎプール１Ｌ当たり少なくとも４．５ｇのＩｇＧを生じる、
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）が、第１の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
フィブリノゲンが、第１の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
Ｈ因子が、第１の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
インターαトリプシンインヒビタータンパク質（ＩαＩｐ）が、第１の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
アルブミンが、第１の上清からさらに精製される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｃｏｈｎプールが、脱クリオ血漿である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の沈殿物が、少なくとも、Ｃｏｈｎプールに含有される免疫グロブリンの９５％以上、Ｃｏｈｎプールに含有されるＡ１ＰＩの９０％以上を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願の相互参照
本出願は、２０１２年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／６０２，４８８号に対する優先権を主張するものであり、この開示は参照によりあらゆる目的においてその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒト血漿からの免疫グロブリン生成物は、免疫不全を治療するために１９５２年に最初に使用された。最初は、血漿から単離された免疫グロブリンアイソタイプＧ（ＩｇＧ）の筋肉内または皮下投与が選択される方法であった。しかしながら、これらの方法では、種々の疾患の有効な治療に必要なより大量のＩｇＧの投与ができなかった。よって、静脈内に投与され得るＩｇＧ生成物が開発された。通常、静脈注射用免疫グロブリン（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（ＩＶＩＧ）は、千人を超える血液提供者の血漿からの貯蔵された免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）免疫グロブリンを含有する。通常、その調製物は、Ｆｃ依存性エフェクター機能が無傷である９５％超の非修飾ＩｇＧと、微量の免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）および免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）とを含む。典型的には、ＩＶＩＧは滅菌濾過され、製造プロセスは、ウイルスを不活性化する、および／または除去するステップを含む。これらの精製ＩｇＧ生成物は、３つの主分類の病状：（１）免疫不全：低抗体レベルを特徴とするＸ連鎖無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症（原発性免疫不全）、および後天性免疫不全状態（続発性免疫不全）、（２）炎症性疾患および自己免疫疾患、ならびに（３）急性感染症を治療するのに主に利用される。
【０００３】
特に、原発性免疫不全障害を有する多くの人々は、感染に抵抗するために必要とされる抗体が欠損している。ある特定の場合において、これらの欠損は、精製ＩｇＧの注入、一般的には静脈内投与（すなわち、ＩＶＩＧ療法）によって、補充され得る。いくつかの原発性免疫不全障害は、一般的に、その方法で治療され、これらにはＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、高ＩｇＭ症候群（ＨＩＭ）、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、および一部のＩｇＧサブクラス欠損症（Ｂｌａｅｓｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｐａｔｉｅｎｔ＆Ｆａｍｉｌｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｏｗｓｏｎ，ＭＤ：Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ；２００７（非特許文献１））を含む。
【０００４】
ＩｇＧ治療は、原発性免疫不全障害を制御するのに非常に効果的であり得るが、この療法は、疾患を治癒するのではなく、体内で生成されない抗体の一時的な代用となるだけである。したがって、患者は、典型的には生涯にわたって約１か月に１回のＩｇＧ療法の反復投与に依存する。この療法は、ＩｇＧ組成物の継続的な生成を強く要求する。しかしながら、インビトロでの組換え型ＤＮＡベクターの発現を介して生成される他の生物製剤と違って、ＩｇＧはヒト血液および血漿提供物から分画される。ゆえに、市販のＩｇＧの量は、血液および血漿提供物の可能な供給量によって制限される。
【０００５】
ＩｇＧ治療の許容性、ＩｇＧ療法が有効なさらなる適応症の識別、ならびに患者の診断およびＩｇＧ処方の増加を含む、いくつかの要因がＩｇＧの需要を左右する。特に、ＩｇＧに対する世界的な需要は、１９９０年〜２００９年の間に４倍超となり、約７％〜１０％の年率で増加し続けている（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｐ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｏｌｉｃｙ  ａｎｄ  Ｌａｗ，１１（２００９）３５９−３６７（非特許文献２））。例えば、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙは、オーストラリアでのＩｇＧの需要は、２００８〜２００９年度において１０．６％増加したと報告した（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２００８−２００９（非特許文献３））。
【０００６】
一部には、免疫グロブリン生成物の可能な供給量の世界的な需要増加および変動のために、オーストラリアおよびイギリスを含むいくつかの国々は、生成物が不足している期間中、最も必要としている患者に対するこれらの生成物の供給量を保護すべく、需要管理プログラムを実施している。
【０００７】
２００７年には、２６５０万リットルの血漿が分画され、１リットル当たり２．８グラムの平均生成収量で、７５．２メートルトンのＩｇＧが生成されたことが報告されている（上記Ｒｏｂｅｒｔ  Ｐ．（非特許文献２）を参照）。この同じ報告は、世界的なＩｇＧ収量が２０１２年までに１リットル当たり約３．４３グラムまで増加することが予期されると推定した。しかしながら、現在から２０１５年までに、年間約７％〜１３％と予測されるＩｇＧに対する世界的な需要の継続的な増加により、世界的な需要を満たすための全体的なＩｇＧ収量のさらなる改善が必要とされる。
【０００８】
いくつかのＩｇＧ調製法が、ＩｇＧ生成物の商業的供給業者によって用いられている。現在のＩｇＧ生成方法の一般的な問題は、出発材料の総ＩｇＧ含有量の少なくとも３０％〜３５％と推定される、精製プロセス中におけるＩｇＧの実質的な損失である。１つの課題は、ウイルス不活性化および有害反応を起こし得る不純物の除去の質を維持しながら、ＩｇＧの収量を増加させるようにプロセス効率を改善することである。ＩｇＧの現在の生成水準において、収量の小さな増加と見なされ得るものは、実際、極めて重要である。例えば、２００７年の生成水準において、２％の効率の上昇は、１リットル当たりさらなる５６ミリグラムに相当し、さらなる１．５メートルトンのＩｇＧを生成することになる。
【０００９】
血清および血漿タンパク質の調製および特性に関して発表された影響力をもつ一連の論文のうちの第４の連載記事において、Ｃｏｈｎら（Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４６，６８（３）：４５９−４７５（非特許文献４））は、ヒト血漿からＩｇＧ濃縮画分を単離するのを可能にする、血漿タンパク質のアルコール分画のための方法（方法６）を最初に記載している。数年後、Ｏｎｃｌｅｙら（Ｏｎｃｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４９，７１（２）：５４１−５５０（非特許文献５））は、より純粋なＩｇＧ調製物の単離をもたらす方法（方法９）を発表することにより、Ｃｏｈｎの方法を拡張した。
【００１０】
これらの方法は、血漿由来血液タンパク質の全産業の基礎を築きはしたが、川崎病、免疫性血小板減少性紫斑病、および原発性免疫不全を含む、いくつかの免疫関連疾患を治療するのに十分な高純度のＩｇＧ調製物を提供することはできなかった。したがって、より高純度のＩｇＧ製剤を提供するために、イオン交換クロマトグラフィー等の様々な技術を用いる追加の方法論が開発された。Ｈｏｐｐｅら（Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｎｃｈ  Ｍｅｄ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  １９６７（３４）：１７４９−１７５２（非特許文献６））、Ｆａｌｋｓｖｅｄｅｎ（スウェーデン特許第３４８９４２号（特許文献１））、ならびにＦａｌｋｓｖｅｄｅｎおよびＬｕｎｄｂｌａｄ（Ｆａｌｋｓｖｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  １９８０（非特許文献７））は、この目的のためにイオン交換クロマトグラフィーを先駆けて用いた。
【００１１】
血漿からの免疫グロブリンの精製のための様々な最新の方法は、カプリレート沈殿（Ｌｅｂｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ２００３（８４）：１９３−２０１（非特許文献８））、カラムクロマトグラフィーと組み合わせたＣｏｈｎ画分（Ｉ＋）ＩＩ＋ＩＩＩエタノール沈殿（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ２０００（３３）３７−３０（非特許文献９））等の沈殿ステップを用いる。最近では、Ｔｅｓｃｈｎｅｒら（Ｔｅｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ，２００７（９２）：４２−５５（非特許文献１０））が、まず貯蔵された血漿から寒冷沈降物を除去し、次に、改変されたＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ低温エタノール分画、続いて、中間体のＳ／Ｄ処理、イオン交換クロマトグラフィー、ナノ濾過、および任意で限外濾過／透析濾過を実施する、１０％ＩｇＧ生成物の生成方法を記載している。
【００１２】
これらのＩｇＧ単離法によりもたらされる純度、安全性、および収量にもかかわらず、血漿から回収されるＩｇＧの収量はまだ改善することができる。例えば、Ｔｅｓｃｈｎｅｒらは、彼らの方法が、６５％の高いＩｇＧ収率をもたらすことを報告した（上記Ｔｅｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献１０）を参照）。様々な血漿生成物会議において報告されるように、Ｂａｘｔｅｒ、ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｕｐｆｒｏｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｐｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＢｉｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、およびＦｉｎｎｉｓｈ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓによるもの等のＩｇＧの大規模な調製の平均収率は、最終容器において約６１％〜約６５％の範囲である。以前用いられた方法よりも優れているが、このＩｇＧ回収率は依然として、単離プロセス中における貯蔵された血漿画分中に存在するＩｇＧの少なくとも約３分の１の損失を表す。
【００１３】
血漿由来生成物の製造に利用可能な血漿の供給が制限されているため、いくつかの血液タンパク質の一般的な出発血漿プールからの単離は、精製を単一のフレームワークに組み込むことによって実現され得る。例えば、ＩｇＧは一般的に、Ｃｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物またはＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ａの形成を通して濃縮されており、その対応する上清は次いで、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）およびアルブミンの製造に使用される。同様に、ＩｇＧ免疫グロブリンの製造中において形成される副産物からのＨ因子の製造に関して、いくつかの方法が記載されており、国際公開公報第２００８／１１３５８９号（特許文献２）および国際公開公報第２０１１／０１１７５３号（特許文献３）が挙げられる。
【００１４】
したがって、治療用ＩｇＧ生成物を製造するための、改善されたより効率的な方法に対する必要性が存在する。さらに、これらの方法はまた、単一の血漿源から、さらなる血漿由来生成物の製造も可能にしなければならない。本発明は、現在達成可能な収率よりもおよそ２０〜２５％高い収率を提供するＩｇＧ単離方法、ならびにそこから提供されるＩｇＧ組成物を提供することによって、これらおよび他の必要性を満たす。有利には、本明細書に提供される方法は、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）、Ｈ因子、インターαインヒビタータンパク質（ＩａＩｐ）、プロトロンビン複合体、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、フィブリノゲン、ブチリルコリンエステラーゼ等を含む、他の治療上重要な血漿由来タンパク質を共に単離することを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】スウェーデン特許第３４８９４２号
【特許文献２】国際公開公報第２００８／１１３５８９号
【特許文献３】国際公開公報第２０１１／０１１７５３号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｂｌａｅｓｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｐａｔｉｅｎｔ＆Ｆａｍｉｌｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｏｗｓｏｎ，ＭＤ：Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ；２００７
【非特許文献２】Ｒｏｂｅｒｔ  Ｐ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｏｌｉｃｙ  ａｎｄ  Ｌａｗ，１１（２００９）３５９−３６７
【非特許文献３】Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２００８−２００９
【非特許文献４】Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４６，６８（３）：４５９−４７５
【非特許文献５】Ｏｎｃｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４９，７１（２）：５４１−５５０
【非特許文献６】Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｎｃｈ  Ｍｅｄ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  １９６７（３４）：１７４９−１７５２
【非特許文献７】Ｆａｌｋｓｖｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  １９８０
【非特許文献８】Ｌｅｂｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ２００３（８４）：１９３−２０１
【非特許文献９】Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ２０００（３３）３７−３０
【非特許文献１０】Ｔｅｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ，２００７（９２）：４２−５５
【発明の概要】
【００１７】
現在のＩＶＩＧおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）を生成するための方法は、免疫グロブリンＩｇＧおよびＡ１ＰＩを、ヒト血漿中に見出される他の成分から分離する複数のタンパク質沈殿ステップに依存する。例えば、多くの製造業者は、３つの初期アルコール沈殿ステップが用いられるＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法６の変化形を使用する。画分Ｉ沈殿と称される第１の沈殿ステップは、高いｐＨ（７．２）および低いエタノール濃度（８〜１０％ｖ／ｖ）で実施され、上清中に残存するＩｇＧおよびＡ１ＰＩから離してフィブリノゲンおよび第ＸＩＩＩ因子等のタンパク質を沈殿させる。ＩｇＧは次いで、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿と称され、中程度のｐＨ（６．８）および高いエタノール濃度（２０％〜２５％）で実施される第２の沈殿反応において、画分Ｉ上清から沈殿する。Ａ１ＰＩのバルクは、その後、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿と称され、低いｐＨ（５．２）および中程度のエタノール濃度（１８％）で実施される第３の初期沈殿反応においてアルブミンから分離されるように、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿反応の上清中に残存する。
【００１８】
残念なことに、上述のＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法、ならびにＩｇＧおよびＡ１ＰＩを分画するために４つの初期沈殿を用いる同等のＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎプロセスは、複雑な一連の沈殿反応において個々の成分を分離するため、分画が非効率的である。これらの初期沈殿ステップにおけるＩｇＧおよびＡ１ＰＩの収量の著しい損失は、目的でない画分への部分的な沈殿、ならびに目的の画分における不完全な沈殿に起因し得る。例えば、ＩｇＧは、画分Ｉ沈殿においてある程度フィブリノゲンおよび第ＸＩＩＩ因子と共に共沈殿し、一部のＩｇＧは、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿によって沈殿しない。溶解画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の清澄化後、ＩｇＧ収率は典型的に、出発Ｃｏｈｎプール中に存在するＩｇＧの７５％〜８５％である。したがって、出発材料の総ＩｇＧ含有量の１５％〜２５％が、これら２つの分画ステップ後に失われる。
【００１９】
本開示は、複数の初期沈殿ステップの必要性を除くことによって、貯蔵された血漿からのＩｇＧおよびＡ１ＰＩの回収を改善する。どちらかというと、本明細書に記載の方法は、画分Ｉ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、および画分ＩＶ−１の複合沈殿において通常沈殿するタンパク質のすべてを捕捉する単一初期沈殿ステップに依存する。この単一沈殿ステップは、本明細書において「画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ＋ＩＶ−１沈殿」、「画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿」、または「初期低ｐＨ、高アルコール沈殿」と称される。有利には、その後のタンパク質沈殿を用いることなく、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物からＩｇＧおよびＡ１ＰＩを効率的に抽出できることが分かった。さらに、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物が原料血漿のＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量のほぼすべてを含有し、一方、アルブミンが上清中に残存することが分かった。まとめると、これらの利点は、これら重要な市販製品の全体の回収の著しい増加をもたらす。
【００２０】
実施例に示されるように、脱クリオ血漿からのＩｇＧの精製において、初期ステップとして低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップ（画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿）を用いることは、ＩｇＧ ４．３〜４．７ｇ／Ｌ原料血漿という、かつてない収量の医薬品グレードのＩｇＧ組成物の生成を可能にする。これらの収量は、同じ血漿型からＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を製造するために用いられるような最新の製造プロセスと比較して、およそ２０％〜２５％の収率の上昇を示す。
【００２１】
したがって、いくつかの態様の中でも特に、本発明は、初期ステップにおいて、血漿または脱クリオ血漿を画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物および画分Ｉ−ＩＶ−１上清に分離する新規の血漿分画プロセスを提供する。画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物はほぼすべての免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ）ならびにα１エラスターゼインヒビター（Ａ１ＰＩ）を含有し、一方、上清は主にアルブミンを含有する。
【００２２】
１つの態様において、本発明は、Ｃｏｈｎプールから濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、脱クリオ血漿から免疫グロブリンおよびα−１アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）を共沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、（ｂ）第１の沈殿物中の免疫グロブリンを可溶化して、免疫グロブリンを含む可溶性部分およびＡ１ＰＩを含む不溶性部分を有する第１の懸濁液を形成するステップと、（ｃ）第１の懸濁液の可溶性部分を第１の懸濁液の不溶性部分から分離するステップと、（ｄ）第１の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。
【００２３】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、アルコール沈殿ステップである。
【００２４】
上述の方法の１つの実施形態において、アルコール沈殿ステップは、ｐＨ５〜６で、最終濃度２０％〜３０％のエタノール（ｖ／ｖ）を実現するように、エタノールを脱クリオ血漿に添加することを含む。
【００２５】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の沈殿ステップにおけるエタノールの最終濃度は、２５±４％である。上述の方法の１つの実施形態において、エタノールの最終濃度は、２５±３％である。上述の方法の１つの実施形態において、エタノールの最終濃度は、２５±２％である。上述の方法の１つの実施形態において、エタノールの最終濃度は、２５±１％である。上述の方法の１つの実施形態において、エタノールの最終濃度は、２５％である。
【００２６】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の沈殿ステップのｐＨは、５．５±０．４である。上述の方法の１つの実施形態において、ｐＨは、５．５±０．３である。上述の方法の１つの実施形態において、ｐＨは、５．５±０．２である。上述の方法の１つの実施形態において、ｐＨは、５．５±０．１である。上述の方法の１つの実施形態において、ｐＨは、５．５である。
【００２７】
上述の方法の１つの実施形態において、ｐＨは、第１の沈殿ステップの持続時間にわたって維持される。
【００２８】
上述の方法の１つの実施形態において、第１のアルコール沈殿ステップは、噴霧によるアルコールの添加を含む。
【００２９】
上述の方法の１つの実施形態において、第１のアルコール沈殿ステップは、インペラーに隣接した場所でのアルコールの添加を含む。別の実施形態において、アルコールは、２つ以上の場所で溶液中に導入される。１つの実施形態において、アルコールは、複数の小ポートにおいて溶液中に導入される。ある具体的な実施形態において、アルコール添加の複数の場所は、インペラーまたは他の分散要素に、またはその近くに位置している。別の実施形態において、アルコールは、複数の開口部を含む拡散ポートを通して溶液中に導入される。ある具体的な実施形態において、拡散ポート内の複数の開口部のそれぞれの開口部の１つまたは複数は、インペラーまたは他の分散要素に、またはその近位に位置している。
【００３０】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、−３℃〜−１０℃の温度で実施される。上述の方法の１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、−５℃〜−９℃の温度で実施される。
【００３１】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の沈殿物は、沈殿物１ｋｇ当たり４Ｌ〜６０Ｌの緩衝液で懸濁される。上述の方法の１つの実施形態において、第１の沈殿物は、沈殿物１ｋｇ当たり８Ｌ〜１５Ｌの緩衝液で懸濁される。
【００３２】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の懸濁液は、４．０〜５．４のｐＨを有する。上述の方法の１つの実施形態において、第１の懸濁液は、４．７〜５．１のｐＨを有する。
【００３３】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の懸濁液は、０ｍＳ／ｃｍ〜４ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。上述の方法の１つの実施形態において、第１の懸濁液は、０．５ｍＳ／ｃｍ〜２ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。
【００３４】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の沈殿物は、酢酸塩および／またはリン酸塩を含む緩衝液中に懸濁される。
【００３５】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分は、遠心分離または濾過によって第１の懸濁液の不溶性部分から分離される。
【００３６】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分を第１の懸濁液の不溶性部分から分離するステップは、（ｉ）微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を第１の懸濁液と混合することと、（ｉｉ）そのＳｉＯ２を懸濁液から分離することとを含む。
【００３７】
上述の方法の１つの実施形態において、微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）は、３５０ｍ２／ｇ〜４１０ｍ２／ｇの平均表面積を有する。
【００３８】
上述の方法の１つの実施形態において、微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）は、１５ｇ／ｋｇ第１沈殿物〜８０ｇ／ｋｇ第１沈殿物の最終濃度で第１の懸濁液に添加される。
【００３９】
上述の方法の１つの実施形態において、本方法は、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、５．３〜５．７のｐＨおよび−６℃〜−８℃の温度で２４％〜２６％のアルコールを用いて脱クリオ血漿から免疫グロブリンを沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、（ｂ）第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、（ｃ）第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）で処理するステップと、（ｄ）第１の懸濁液の可溶性画分を第１の懸濁液の不溶性画分から分離するステップと、（ｅ）第１の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。
【００４０】
上述の方法の１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ステップ（ａ）で使用されたＣｏｈｎプール中に存在するＩｇＧの免疫グロブリン含有量の少なくとも９０％を含有する。
【００４１】
上述の方法の１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ステップ（ａ）で使用されたＣｏｈｎプール中に存在するＩｇＧの免疫グロブリン含有量の少なくとも９５％を含有する。
【００４２】
上述の方法の１つの実施形態において、本方法は、（ｆ）第２の沈殿ステップにおいて、第１の懸濁液の可溶性画分から免疫グロブリンを沈殿させて、第２の沈殿物および第２の上清を得るステップと、（ｇ）第２の沈殿物を懸濁して、第２の懸濁液を形成するステップと、（ｈ）第２の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより、さらに濃縮された免疫グロブリン組成物を形成するステップとをさらに含む。
【００４３】
上述の方法の１つの実施形態において、第２の沈殿ステップは、アルコール沈殿ステップである。
【００４４】
上述の方法の１つの実施形態において、第２のアルコール沈殿ステップは、ｐＨ６．５〜７．５で、最終濃度２２％〜２８％のエタノールを実現するように、エタノールを第１の懸濁液の可溶性画分に添加することを含む。
【００４５】
上述の方法の１つの実施形態において、第２のアルコール沈殿ステップは、噴霧によるアルコールの添加を含む。
【００４６】
上述の方法の１つの実施形態において、第２のアルコール沈殿ステップは、インペラーに隣接した場所でのアルコールの添加を含む。別の実施形態において、アルコールは、２つ以上の場所で溶液中に導入される。１つの実施形態において、アルコールは、複数の小ポートにおいて溶液中に導入される。ある具体的な実施形態において、アルコール添加の複数の場所は、インペラーまたは他の分散要素に、またはその近くに位置している。別の実施形態において、アルコールは、複数の開口部を含む拡散ポートを通して溶液中に導入される。ある具体的な実施形態において、拡散ポート内の複数の開口部のそれぞれの開口部の１つまたは複数は、インペラーまたは他の分散要素に、またはその近位に位置している。
【００４７】
上述の方法の１つの実施形態において、第２の沈殿ステップは、−３℃〜−１０℃の温度で実施される。
【００４８】
上述の方法の１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ステップ（ａ）で使用された脱クリオ血漿中のＩｇＧ含有量の少なくとも９０％を含有する。
【００４９】
上述の方法の１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ステップ（ａ）で使用された脱クリオ血漿中のＩｇＧ含有量の少なくとも９５％を含有する。
【００５０】
上述の方法の１つの実施形態において、本方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー濃縮ステップをさらに含む。
【００５１】
上述の方法の１つの実施形態において、本方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー濃縮ステップをさらに含む。
【００５２】
上述の方法の１つの実施形態において、本方法は、ウイルス不活性化またはウイルス除去ステップをさらに含む。
【００５３】
上述の方法の１つの実施形態において、本方法は、溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化ステップを含む。
【００５４】
上述の方法の１つの実施形態において、本方法は、ナノ濾過ステップを含む。
【００５５】
上述の方法の１つの実施形態において、本方法は、ｐＨ４．０〜５．０および温度２０℃〜４０℃で少なくとも１週間、組成物をインキュベートするステップを含む。
【００５６】
上述の方法の１つの実施形態において、最終濃縮ＩｇＧ組成物は、少なくとも９８％のＩｇＧを含む。
【００５７】
上述の方法の１つの実施形態において、最終濃縮ＩｇＧ組成物は、少なくとも９９％のＩｇＧを含む。
【００５８】
上述の方法の１つの実施形態において、本方法は、ステップ（ａ）で使用された脱クリオ血漿１Ｌ当たり少なくとも４ｇのＩｇＧを生じる。
【００５９】
上述の方法の１つの実施形態において、本方法は、ステップ（ａ）で使用された脱クリオ血漿１Ｌ当たり少なくとも４．２５ｇのＩｇＧを生じる。
【００６０】
上述の方法の１つの実施形態において、本方法は、ステップ（ａ）で使用された脱クリオ血漿１Ｌ当たり少なくとも４．５ｇのＩｇＧを生じる。
【００６１】
上述の方法の１つの実施形態において、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）が、第１の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される。
【００６２】
上述の方法の１つの実施形態において、フィブリノゲンが、第１の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される。
【００６３】
上述の方法の１つの実施形態において、Ｈ因子が、第１の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される。
【００６４】
上述の方法の１つの実施形態において、インターαトリプシンインヒビタータンパク質（ＩαＩｐ）が、第１の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される。
【００６５】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の懸濁液の不溶性画分は、微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）で処理される。
【００６６】
上述の方法の１つの実施形態において、第１の上清から、アルブミンがさらに精製される。
【００６７】
１つの態様において、本発明は、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法によって調製される濃縮免疫グロブリン組成物を提供する。
【００６８】
１つの態様において、本発明は、免疫不全、炎症性疾患、自己免疫疾患、または急性感染症の治療を必要とする個人における免疫不全、炎症性疾患、自己免疫疾患、または急性感染症を治療するための方法を提供し、本方法は、請求項６４に記載の濃縮免疫グロブリン組成物を対象に投与することを含む。
[本発明1001]
（ａ）第1の沈殿ステップにおいて、Ｃｏｈｎプールにエタノールを20％〜30％（ｖ／ｖ）の最終濃度で5．0〜6．0のｐＨで添加することによって前記Ｃｏｈｎプールから免疫グロブリンおよびα−1−アンチトリプシン（Ａ1ＰＩ）を共沈殿させて、第1の沈殿物および第1の上清を形成するステップと、
（ｂ）第1の沈殿物中の免疫グロブリンを可溶化して、免疫グロブリンを含む可溶性部分およびＡ1ＰＩを含む不溶性部分を有する第1の懸濁液を形成するステップと、
（ｃ）第1の懸濁液の可溶性部分を第1の懸濁液の不溶性部分から分離するステップと、
（ｄ）第1の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップと
を含む、Ｃｏｈｎプールから濃縮免疫グロブリン組成物を製造するための方法。
[本発明1002]
エタノールの前記最終濃度が、25±4％である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
エタノールの前記最終濃度が、25±3％である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
エタノールの前記最終濃度が、25±2％である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
エタノールの前記最終濃度が、25±1％である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
エタノールの前記最終濃度が、25％である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記ｐＨが、5．5±0．4である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記ｐＨが、5．5±0．3である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記ｐＨが、5．5±0．2である、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記ｐＨが、5．5±0．1である、本発明1007の方法。
[本発明1011]
前記ｐＨが、5．5である、本発明1007の方法。
[本発明1012]
前記ｐＨが、第1の沈殿ステップの持続時間にわたって維持される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
アルコール沈殿ステップが、拡散添加によるアルコールの添加を含む、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記拡散添加が、噴霧を含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
アルコール沈殿ステップが、インペラーに隣接した場所でのアルコールの添加を含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1016]
第1の沈殿ステップが、−3℃〜−10℃の温度で実施される、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
第1の沈殿ステップが、−5℃〜−9℃の温度で実施される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
第1の沈殿物が、沈殿物1ｋｇ当たり4Ｌ〜60Ｌの緩衝液で懸濁される、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
第1の沈殿物が、沈殿物1ｋｇ当たり8Ｌ〜15Ｌの緩衝液で懸濁される、本発明1018の方法。
[本発明1020]
第1の懸濁液が、4．0〜5．4のｐＨを有する、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
第1の懸濁液が、4．7〜5．1のｐＨを有する、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
第1の懸濁液が、0ｍＳ／ｃｍ〜4ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
第1の懸濁液が、0．5ｍＳ／ｃｍ〜2ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する、本発明1001〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
第1の沈殿物が、酢酸塩および／またはリン酸塩を含む緩衝液中に懸濁される、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
第1の懸濁液の可溶性部分が、遠心分離または濾過によって第1の懸濁液の不溶性部分から分離される、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
第1の懸濁液の可溶性部分を第1の懸濁液の不溶性部分から分離する前記ステップが、
（ｉ）微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）を第1の懸濁液と混合することと、
（ｉｉ）前記ＳｉＯ2を前記懸濁液から分離することと
を含む、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）が、350ｍ2／ｇ〜410ｍ2／ｇの平均表面積を有する、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）が、15ｇ／ｋｇ第1沈殿物〜80ｇ／ｋｇ第1沈殿物の最終濃度で第1の懸濁液に添加される、本発明1001〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
（ａ）第1の沈殿ステップにおいて、5．3〜5．7のｐＨおよび−6℃〜−8℃の温度で24％〜26％のアルコールを用いてＣｏｈｎプールから免疫グロブリンを沈殿させて、第1の沈殿物および第1の上清を形成するステップと、
（ｂ）第1の沈殿物を懸濁して、第1の懸濁液を形成するステップと、
（ｃ）第1の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）で処理するステップと、
（ｄ）第1の懸濁液の可溶性画分を第1の懸濁液の不溶性画分から分離するステップと、
（ｅ）第1の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップと
を含む、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記濃縮免疫グロブリン組成物が、ステップ（ａ）で使用された前記Ｃｏｈｎプール中に存在する少なくとも1つの免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン含有量の少なくとも90％を含有する、本発明1001〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記濃縮免疫グロブリン組成物が、ステップ（ａ）で使用された前記Ｃｏｈｎプール中に存在する少なくとも1つの免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン含有量の少なくとも95％を含有する、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記免疫グロブリンクラスがＩｇＧである、本発明1030または1031の方法。
[本発明1033]
（ｆ）第2の沈殿ステップにおいて、第1の懸濁液の可溶性画分から免疫グロブリンを沈殿させて、第2の沈殿物および第2の上清を得るステップと、
（ｇ）第2の沈殿物を懸濁して、第2の懸濁液を形成するステップと、
（ｈ）第2の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより、さらに濃縮された免疫グロブリン組成物を形成するステップと
をさらに含む、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1034]
第2の沈殿ステップが、アルコール沈殿ステップである、本発明1033の方法。
[本発明1035]
アルコール沈殿ステップが、ｐＨ6．5〜7．5で、最終濃度22％〜28％のエタノールを実現するように、エタノールを第1の懸濁液の可溶性画分に添加することを含む、本発明1034の方法。
[本発明1036]
アルコール沈殿ステップが、拡散添加によるアルコールの添加を含む、本発明1034または1035の方法。
[本発明1037]
前記拡散添加が、噴霧を含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
アルコール沈殿ステップが、インペラーに隣接した場所でのアルコールの添加を含む、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1039]
第2の沈殿ステップが、−3℃〜−10℃の温度で実施される、本発明1033〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記濃縮免疫グロブリン組成物が、ステップ（ａ）で使用された前記Ｃｏｈｎプール中の免疫グロブリンＧ含有量の少なくとも90％を含有する、本発明1033〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記濃縮免疫グロブリン組成物が、ステップ（ａ）で使用された前記Ｃｏｈｎプール中の免疫グロブリンＧ含有量の少なくとも95％を含有する、本発明1040の方法。
[本発明1042]
陽イオン交換クロマトグラフィー濃縮ステップをさらに含む、本発明1001〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
陰イオン交換クロマトグラフィー濃縮ステップをさらに含む、本発明1001〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
ウイルス不活性化および／またはウイルス除去ステップをさらに含む、本発明1001〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化ステップを含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
ナノ濾過ステップを含む、本発明1044または1045の方法。
[本発明1047]
4．0〜5．0のｐＨおよび20℃〜40℃の温度で少なくとも1週間、前記組成物をインキュベートするステップを含む、本発明1044〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
最終濃縮ＩｇＧ組成物が、少なくとも98％のＩｇＧを含む、本発明1001〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記最終濃縮ＩｇＧ組成物が、少なくとも99％のＩｇＧを含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
ステップ（ａ）で使用されたＣｏｈｎプール1Ｌ当たり少なくとも4ｇのＩｇＧを生じる、本発明1001〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
ステップ（ａ）で使用されたＣｏｈｎプール1Ｌ当たり少なくとも4．25ｇのＩｇＧを生じる、本発明1050の方法。
[本発明1052]
ステップ（ａ）で使用されたＣｏｈｎプール1Ｌ当たり少なくとも4．5ｇのＩｇＧを生じる、本発明1050の方法。
[本発明1053]
α−1−アンチトリプシン（Ａ1ＰＩ）が、第1の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される、本発明1001〜1047のいずれかの方法。
[本発明1054]
フィブリノゲンが、第1の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される、本発明1001〜1047のいずれかの方法。
[本発明1055]
Ｈ因子が、第1の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される、本発明1001〜1047のいずれかの方法。
[本発明1056]
インターαトリプシンインヒビタータンパク質（ＩαＩｐ）が、第1の懸濁液の不溶性画分からさらに精製される、本発明1001〜1047のいずれかの方法。
[本発明1057]
第1の懸濁液の不溶性画分が、微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）で処理される、本発明1053〜1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
アルブミンが、第1の上清からさらに精製される、本発明1001〜1047のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記Ｃｏｈｎプールが、脱クリオ血漿である、本発明1001〜1057のいずれかの方法。
[本発明1060]
本発明1001〜1059のいずれかの方法によって調製される、濃縮免疫グロブリン組成物。
[本発明1061]
免疫不全、炎症性疾患、自己免疫疾患、または急性感染症の治療を必要とする個体における、免疫不全、炎症性疾患、自己免疫疾患、または急性感染症を治療するための方法であって、本発明1060の濃縮免疫グロブリン組成物を対象に投与することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本明細書に記載の１つの実施形態に従う、血漿分画スキームの略図である。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
発明の詳細な説明
Ｉ．導入部
いくつかの態様の中でも特に、本発明は、貯蔵された血漿から治療用タンパク質を単離するためのより効率的な方法を提供する。貯蔵された血漿を分画するための本明細書に提供される方法は、免疫グロブリンおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）を含む複数の治療上重要な血漿由来血液タンパク質の、より高い収量を提供する。特に重要な態様において、本発明は、治療用ＩｇＧ組成物の製造に使用される最新の方法と比較して、血漿から単離される免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の収量を著しく増加させる方法を提供する。１つの実施形態において、これらの増加した収量は、低ｐＨ、高アルコール条件下で、出発血漿試料（本明細書において「Ｃｏｈｎプール」と称される）から免疫グロブリンおよびＡＩＰ１を沈殿させることで、実現される。低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップは、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン組成物の大量捕捉（ｍａｓｓ  ｃａｐｔｕｒｅ）をもたらす。最新の免疫グロブリン製造プロセスと比較して、本明細書に提供される方法は、血漿の上流分画の間、免疫グロブリンの損失量を著しく減少させる。
【００７１】
本発明の方法は、ヒト血漿から治療的投与用の十分に高い純度でタンパク質を単離するのに必要とされるタンパク質沈殿ステップの数を減少させ、同時に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）等の治療上重要な血液タンパク質の回収量を増加させる。具体的には、本方法は、Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ、およびＤｅｕｔｓｃｈ分画スキームから派生した製造プロセスにおいて使用される、一般に画分Ｉ沈殿と称される初期の高ｐＨ、低アルコール沈殿ステップの必要性を排除する。代わりに、本明細書に提供される方法は、沈殿物中の血漿のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）含有量のバルクと、上清中のアルブミンのバルクとを分配する初期の低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップ（本明細書において画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿と称される）を用いる。ＩｇＧは次いで、様々な方法を通してＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＡ１ＰＩから分離され、高収量のＩｇＧ組成物をもたらす。画分Ｉ沈殿ステップを用いる方法と比較して、初期画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿ステップにおけるＩｇＧの大量捕捉は、製造プロセスの最終収量を少なくとも１０〜２５％増加させる。
【００７２】
Ｅ．Ｊ．Ｃｏｈｎは、１９４６年に、塩ではなく、エタノールを使用する血漿の分画方法を最初に確立した。これ以降、エタノール沈殿は、ＩｇＧおよびＡ１ＰＩ等の血漿由来生成物の大規模製造のために選択される方法となった。典型的には、これらの製造プロセスは、一連のエタノール分画ステップを用いて種々の血漿由来血液タンパク質の粗画分を提供し、それは種々の異なる下流の手法／技術によってさらに濃縮される。
【００７３】
Ｃｏｈｎ手法は、アルコールを用いた分画沈殿によって比較的高い（９５％）純度でアルブミンを得るために、最初に開発された。しかしながら、すぐに、より高濃縮の免疫グロブリン組成物の精製のための出発材料として、Ｃｏｈｎ法６番からの特定のタンパク質沈殿物（画分ＩＩ＋ＩＩＩ）を使用し得るということが、Ｏｎｃｌｅｙら、Ｄｅｕｔｓｃｈら、ならびにＫｉｓｔｌｅｒおよびＮｉｔｓｃｈｍａｎｎによって認められた。ＩｇＧ組成物の静脈内投与に必要とされる、より高い純度および安全性を実現するために、ＩｇＧ製造プロセスには、アルコール分画ステップ後に、いくつかの精製および仕上げステップ（例えば、一般的には吸着、または全ての異なるクロマトグラフ技術、直交流濾過等）が追加された。
【００７４】
典型的には、ＩｇＧ製造は、下流処理における出発材料としてのＣｏｈｎ法６画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物またはＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ａのいずれかに依存する。両方の画分が、２ステップのプロセスによって形成される：ｉ．）フィブリノゲンおよび第ＸＩＩＩ因子等のタンパク質が、高ｐＨ（７．２）および低エタノール濃度（８〜１０％ｖ／ｖ）で実施される初期沈殿ステップ（画分Ｉ沈殿）によって除去される、ｉｉ．）ＩｇＧは、ｐＨ６．８で、２０〜２５％（ｖ／ｖ）のエタノール（画分ＩＩ＋ＩＩＩ）によって、またはｐＨ５．８５で、１９％（ｖ／ｖ）のエタノール（沈殿物Ａ）によって、画分Ｉ上清から沈殿し、一方、アルブミンおよびＡ１ＰＩのかなりの部分が上清中に残存する。しかしながら、ＩｇＧ組成物の製造のために画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物または沈殿物Ａを出発材料として使用することは、上述のようにプロセス中のいくつかのステップでのＩｇＧの損失をもたらす。
【００７５】
これらの問題を克服するために、本発明者らは、免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩを共沈殿させて、原料血漿のＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量のほぼすべてを含有する出発材料を提供する一方で、アルブミンが上清中に残存する、初期精製ステップを開発した。この分画ステップは、Ｏｎｃｌｅｙら（上記参照）によって記載される分画沈殿ステップＩ、ＩＩ＋ＩＩＩ、およびＩＶ−１を、本明細書において画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ＋ＩＶ−１（または画分Ｉ−ＩＶ−１）沈殿と称される単一沈殿反応に本質的にまとめる。
【００７６】
１つの態様において、本発明は、出発材料として画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物を使用する、静脈内、皮下、または筋肉内投与用の高収量免疫グロブリン組成物を製造するためのプロセスを提供する。種々の実施形態において、本方法は、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物からの免疫グロブリンの抽出中に形成される懸濁液の不溶性画分への、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）の分離をさらに含む。分離された不溶性画分は次いで、血漿由来Ａ１ＰＩ組成物の製造のための出発材料として使用され得る。
【００７７】
１つの実施形態において、本発明は、貯蔵された血漿から単離されるタンパク質の治療用組成物を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの製造方法は、種々の血液タンパク質の回収を従来の方法と比較して増加させる、初期低ｐＨ、高アルコール（例えば、エタノール）沈殿ステップを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ヒト血液、血漿、またはそれらの派生物から単離された、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）、アルブミン、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）、ブチリルコリンエステラーゼ、Ｈ因子、またはインターαトリプシンインヒビター（ＩαＩ）タンパク質を含有する１つまたは複数の治療用組成物の製造に有用である。
【００７８】
ＩＩ．定義
本明細書に使用される場合、「ＩｇＧ治療」という用語は、概して、免疫不全、炎症性疾患、および自己免疫疾患等のいくつかの状態を治療するために、患者にＩｇＧ免疫グロブリンの組成物を静脈内、皮下、または筋肉内投与する治療法を指す。ＩｇＧ免疫グロブリンは、典型的には、血漿から貯蔵され、調製される。全長抗体または断片を使用することができる。ＩｇＧ免疫グロブリンは、皮下投与用により高い濃度（例えば、１０％超）に製剤化されてもよく、または筋肉内投与用に製剤化されてもよい。これは、特定の抗原（例えば、Ｒｈｏ  Ｄ因子、百日咳毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素、狂犬病等）に対して平均を上回る力価に調製される専門的なＩｇＧ調製において特に多く見られる。
【００７９】
本明細書に使用される場合、「脱クリオ血漿」は、凍結に近い温度、例えば約１０℃未満の温度で、好ましくは約６℃を超えない温度で血漿または貯蔵された血漿を解凍することによって形成される寒冷沈降物の除去後に生じる上清を指す。本発明の文脈において、血漿は、回収血漿（すなわち、エクスビボで全血から分離された血漿）または原料血漿（すなわち、プラスマフェレーシスを介して収集された血漿）を互換的に指し得る。寒冷沈降は一般的に、例えば、新鮮な血漿もまた使用され得るが、安全性および品質の考慮すべき事項について既にアッセイされている、前もって凍結された貯蔵された血漿を解凍することによって実施される。低温での凍結血漿の解凍完了後、液体上清からの固体寒冷沈降物の分離が、遠心分離または濾過によって冷却下（例えば、６℃以下）で実施される。
【００８０】
本明細書に使用される場合、「Ｃｏｈｎプール」とは、血漿試料または血漿試料プールの分画のために使用される出発材料を指す。Ｃｏｈｎプールは、全血漿、脱クリオ血漿、および前処理ステップに供された脱クリオ血漿のうちの１つまたは複数を含み得る。ある特定の実施形態において、Ｃｏｈｎプールは脱クリオ血漿試料であり、そこから１種または複数種の血液因子が、前処理ステップにおいて、例えば、固相（例えば、水酸化アルミニウム、微粉化二酸化ケイ素等）への吸着、またはクロマトグラフィーステップ（例えば、イオン交換もしくはヘパリン親和性クロマトグラフィー）によって、除去されている。第８因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、第ＩＸ因子複合体、第ＶＩＩ因子、プロトロンビン複合体、および／またはアンチトロンビンＩＩＩが挙げられるが、これらに限定されない種々の血液タンパク質は、分画の前に脱クリオ血漿試料から単離され得る。
【００８１】
本明細書に使用される場合、「濃縮組成物」という用語は、タンパク質の純度が出発血漿試料におけるタンパク質の純度を上回る、血漿試料から単離されたタンパク質組成物を指す。１つの実施形態において、濃縮組成物中のタンパク質は、出発血漿試料におけるものよりも少なくとも２５％超純粋である。他の実施形態において、濃縮組成物は、出発血漿試料よりも少なくとも５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれ以上純粋である。例えば、総タンパク質の７０％がＩｇＧである濃縮ＩｇＧ組成物は、総タンパク質の１０％がＩｇＧである出発血漿試料と比較して７倍濃縮されている。
【００８２】
本明細書に使用される場合、「拡散添加」という用語は、非局在化様式で物質を液系に添加する手段を指す。拡散添加は、例えば、液体（例えば、アルコール、ｐＨ調整剤、溶媒、洗浄剤、または他の液体）を液系（例えば、血漿画分）に噴霧するか、もしくは霧状にして吹き付ける、液体を系中に複数の場所で導入する、拡散ポートを使用して液体を系中に導入する、液体をインペラーもしくは他の分散要素に、またはその近位に導入する、あるいは固体状態で存在する化学物質を液系の広い領域にわたって分布させることによって、実現され得る。
【００８３】
本明細書に使用される場合、「噴霧する」という用語は、例えば、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿ステップ等のアルコール沈殿ステップの間に、液体物質をその微細な液滴または霧の形態で系中に送達する手段を意味する。噴霧は、スプレーヘッドまたはノズルを有し、手動で、または自動で操作されて液体から微細な霧を発生させる容器（例えば、スプレーボトル）等の任意の加圧装置によって実現され得る。典型的には、噴霧は、系内で液体の急速かつ均等な分布を確実にするために、液体物質を受ける系が連続的に撹拌されるか、またはさもなければ混合されている間に、実施される。
【００８４】
本明細書に使用される場合、「溶媒」という用語は、１種または複数種の他の物質を溶解させるか、または分散させることが可能な任意の液体物質を包含する。溶媒は、水等の自然界の無機物であってもよく、またはエタノール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、ヘキサン、石油エーテル等の有機液体であってもよい。「溶媒洗浄剤処理（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語において使用される場合、溶媒は、溶液中の脂質エンベロープウイルスを不活性化するために使用される溶媒洗浄剤混合物の一部である有機溶媒（例えば、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート）を意味する。
【００８５】
本明細書に使用される場合、「洗浄剤」という用語は、本明細書において「界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）」または「界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」という用語と互換的に使用される。界面活性剤は、典型的には、両親媒性である、すなわち、有機溶媒および水の両方において界面活性剤を可溶性にする疎水基（「尾部」）および親水基（「頭部」）の両方を含む、有機化合物である。界面活性剤は、その頭部における形式上の荷電基の存在において分類され得る。非イオン界面活性剤は、その頭部に荷電基を有さず、一方、イオン界面活性剤は、その頭部に正味荷電を担持する。双性イオン界面活性剤は、２つの逆荷電基を有する頭部を含む。一般的な界面活性剤のいくつかの例として、（硫酸、スルホン酸、またはカルボン酸陰イオンに基づく）陰イオン性では、パーフルオロオクタノエート（ＰＦＯＡもしくはＰＦＯ）、パーフルオロオクタンスルホネート（ＰＦＯＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、および他のアルキル硫酸塩、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウムもしくはＳＬＥＳとしても知られる）、アルキルベンゼンスルホネート；（第４級アンモニウム陽イオンに基づく）陽イオン性では、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、別名、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、および他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシル化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）；カプリレート、カプリル酸、ヘプタノエート（ｈｅｐｔａｎｏａｔ）、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ナノ酸（ｎａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、デカン酸等を含む長鎖脂肪酸およびそれらの塩；双性イオン性（両性）では、ドデシルベタイン、コカミドプロピルベタイン、ココアンホグリシネート；非イオン性では、アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルフェノールポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）との共重合体（ポロキサマーまたはポロキサミンとして市場で知られている）、オクチルグルコシド、デシルマルトシドを含むアルキルポリグルコシド、脂肪アルコール（例えば、セチルアルコールおよびオレイルアルコール）、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０等）、トリトン洗浄剤、およびドデシルジメチルアミンオキシドが挙げられる。
【００８６】
「治療的に有効な量または投与量」または「十分な／有効な量または投与量」は、投与されて効果をもたらす投与量を意味する。正確な投与量は、治療目的に左右され、当業者により、既知の技術を利用して確認される（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。
【００８７】
本明細書に使用される場合、「初期低ｐＨ、高アルコール沈殿」および「画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿」という用語は、互換的に、２０％〜３０％（ｖ／ｖ）の最終アルコール濃度（典型的にはエタノール）およびｐＨ５．０〜６．０でのＣｏｈｎプールからのタンパク質の沈殿を指す。概して、結果として得られる画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物は、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の少なくとも９０％、好ましくは、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％を含有する。ある好ましい実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ免疫グロブリンを含む。別の好ましい実施形態において、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）は、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿において免疫グロブリンと共沈殿する。
【００８８】
ＩＩＩ．血漿の分画
１つの態様において、本発明は、出発血漿の免疫グロブリンおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）含有量の大半が沈殿され、かつ出発血漿のアルブミン含有量の大半が上清中に保持される初期沈殿ステップを用いて、治療用タンパク質を貯蔵された血漿から分画するための方法を提供する。この初期沈殿ステップから開始することで、いくつかの治療上重要な血液タンパク質を高回収量で製造することができる。
【００８９】
１つの実施形態において、本発明は血漿試料中の血液タンパク質を分画するための方法を提供し、本方法は低ｐＨ、高アルコール条件下で免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩを出発血漿から沈殿させることを含む。この低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップは、沈殿物（本明細書において、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物と称される）および上清（本明細書において、画分Ｉ−ＩＶ−１上清と称される）の形成をもたらす。
【００９０】
画分Ｉ−ＩＶ−１上清は、出発血漿のアルブミン含有量の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を含有する。したがって、この上清は、薬学的アルブミン組成物を製造するための出発材料として使用され得る。
【００９１】
画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物は、出発血漿の免疫グロブリン含有量の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％を含有する。ある具体的な実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物は、出発血漿のＩｇＧ含有量の少なくとも９８％、好ましくは９９％を含有する。したがって、この沈殿物は、薬学的免疫グロブリン組成物を製造するための出発材料として使用され得る。１つの実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物は、薬学的ＩｇＧ組成物を製造するための出発材料として使用される。さらに別の実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物は、２つ以上の免疫グロブリンサブタイプを含有する薬学的免疫グロブリン組成物を製造するための出発材料として使用される。
【００９２】
同様に、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物は、出発血漿のＡ１ＰＩ含有量の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９８％を含有する。したがって、この沈殿物は、薬学的Ａ１ＰＩ組成物を製造するための出発材料として使用され得る。
【００９３】
画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物はまた、出発血漿のＨ因子含有量の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を含有する。したがって、この沈殿物は、薬学的Ｈ因子組成物を製造するための出発材料として使用され得る。
【００９４】
画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物はまた、出発血漿のインターαインヒビター（ＩａＩｐ）含有量の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を含有する。したがって、この沈殿物は、薬学的ＩａＩｐ組成物を製造するための出発材料として使用され得る。
【００９５】
１つの態様において、本発明は、免疫グロブリンを、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物中に見出されるＡ１ＰＩから分離するための方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の懸濁液の不溶性部分にＡ１ＰＩを残したまま、懸濁液中の免疫グロブリンを可溶化し、次いで、例えば濾過または遠心分離によって可溶性部分と不溶性部分を分離することを含む。１つの実施形態において、分離は、可溶性部分と不溶性部分を分離する前に画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理することによって促進される。理論に束縛されるものではないが、二酸化ケイ素は、免疫グロブリンと共に可溶化されているＡ１ＰＩに結合し得、懸濁液の不溶性部分に分配されたＡ１ＰＩの量を増加させる。
【００９６】
さらに、Ｈ因子およびＩａＩｐは、ある特定の条件下で粒状二酸化ケイ素に結合することが知られている（国際公開公報第２０１１／０１１７５３号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／４５０９９号、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８２４７号（これらの開示は、あらゆる目的においてその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）を参照されたい）。したがって、１つの実施形態において、本発明は、免疫グロブリンを、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物中に見出されるＡ１ＰＩ、Ｈ因子、およびＩａＩｐから分離するための方法を提供し、本方法は、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物を、免疫グロブリンを可溶化するのに十分な水または低伝導率緩衝液中に懸濁することと、懸濁液を二酸化ケイ素で処理することと、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離することとを含む。
【００９７】
上で提供される方法の１つの実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の分離された可溶性部分は、出発血漿試料のＩｇＧ含有量の少なくとも８０％を含有する。ある好ましい実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の分離された可溶性部分は、出発血漿試料のＩｇＧ含有量の少なくとも９０％を含有する。より好ましい実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の分離された可溶性部分は、出発血漿試料のＩｇＧ含有量の少なくとも９５％を含有する。さらに他の実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の可溶性部分は、出発血漿試料のＩｇＧ含有量の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上を含有する。
【００９８】
上で提供される方法の１つの実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の分離された不溶性部分は、出発血漿試料のＡ１ＰＩ含有量の少なくとも７０％を含有する。ある好ましい実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の分離された不溶性部分は、出発血漿試料のＡ１ＰＩ含有量の少なくとも８０％を含有する。より好ましい実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の分離された不溶性部分は、出発血漿試料のＡ１ＰＩ含有量の少なくとも９０％を含有する。より好ましい実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の分離された不溶性部分は、出発血漿試料のＡ１ＰＩ含有量の少なくとも９５％を含有する。さらに他の実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の分離された不溶性部分は、出発血漿試料のＡ１ＰＩ含有量の少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上を含有する。
【００９９】
初期大量沈殿ステップ（例えば、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿）を使用して分画された血液タンパク質は、好適な手法、例えば、沈殿（例えば、アルコール分画またはポリエチレングリコール分画）、クロマトグラフ法（イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー等）、濾過（限外濾過／透析濾過、ナノ濾過）、超遠心分離、電気泳動調製等によって、さらに濃縮され得る。
【０１００】
Ａ．脱クリオ血漿の調製
濃縮ＩｇＧ組成物の調製に使用される出発材料は概して、回収血漿（すなわち、エクスビボで全血から分離された血漿）または原料血漿（すなわち、プラスマフェレーシスを介して収集された血漿）のいずれかから成る。精製プロセスは、典型的には、安全性および品質の考慮すべき事項について既にアッセイされている、前もって凍結された貯蔵された血漿を解凍することから始める。解凍は、典型的には６℃を上回らない温度で行われる。低温での凍結血漿の解凍完了後、冷却下（例えば、６℃以下）で遠心分離を実施し、固体寒冷沈降物を液体上清から分離する。代替として、分離ステップは、遠心分離ではなく濾過によって実施されてもよい。液体上清（寒冷不溶性タンパク質が新鮮な解凍血漿から遠心分離によって除去された後、「脱クリオ血漿」とも称される）は、次いで、次のステップにおいて処理される。種々の追加のステップが、第８因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、第ＩＸ因子複合体、第ＶＩＩ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、プロトロンビン複合体等の単離のためにこの時点で行われてもよい。
【０１０１】
Ｂ．第１の沈殿事象  −  画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿
１つの実施形態において、本発明は、血漿試料中の血液タンパク質を分画するための方法を提供し、本方法は、第１の沈殿ステップにおいて、低ｐＨ、高アルコール条件下で免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩを出発血漿から沈殿させることを含む。この低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップは、沈殿物（画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物）および上清（画分Ｉ−ＩＶ−１上清）の形成をもたらす。
【０１０２】
１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールを出発血漿プール（Ｃｏｈｎプール）と混合することによって実施される。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５±２％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５±１％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。同様に、１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．５のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．４のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．３のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．２のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．１のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５のｐＨで実施される。さらに他の実施形態において、第１の沈殿ステップの最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、バリエーション（Ｖａｒ．）１〜２１６６から選択される。
【０１０３】
（表１）Ｃｏｈｎプールの低ｐＨ、高アルコール沈殿に有用な、ｐＨおよび最終エタノール濃度の組み合わせ
0006291423.tif 000002
【０１０４】
（表２）Ｃｏｈｎプールの低ｐＨ、高アルコール沈殿に有用な、ｐＨおよび最終エタノール濃度の組み合わせ
0006291423.tif 000003
【０１０５】
（表３）Ｃｏｈｎプールの低ｐＨ、高アルコール沈殿に有用な、ｐＨおよび最終エタノール濃度の組み合わせ
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【０１０６】
（表４）Ｃｏｈｎプールの低ｐＨ、高アルコール沈殿に有用な、ｐＨおよび最終エタノール濃度の組み合わせ
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【０１０７】
（表５）Ｃｏｈｎプールの低ｐＨ、高アルコール沈殿に有用な、ｐＨおよび最終エタノール濃度の組み合わせ
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【０１０８】
（表６）Ｃｏｈｎプールの低ｐＨ、高アルコール沈殿に有用な、ｐＨおよび最終エタノール濃度の組み合わせ
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【０１０９】
（表７）Ｃｏｈｎプールの低ｐＨ、高アルコール沈殿に有用な、ｐＨおよび最終エタノール濃度の組み合わせ
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【０１１０】
（表８）Ｃｏｈｎプールの低ｐＨ、高アルコール沈殿に有用な、ｐＨおよび最終エタノール濃度の組み合わせ
0006291423.tif 000009
【０１１１】
したがって、１つの実施形態において、本発明は血漿試料中の血液タンパク質を分画するための方法を提供し、本方法は、第１の沈殿ステップにおいて、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩを沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップとを含み、第１の上清はＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の少なくとも７５％を含有する。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。
【０１１２】
本明細書に提供される方法の１つの実施形態では、初期沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の少なくとも９０％が沈殿する。ある好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の少なくとも９５％が沈殿する。より好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の少なくとも９９％が沈殿する。ある特定の実施形態では、初期沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が沈殿する。より具体的な実施形態において、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量は、出発ＣｏｈｎプールのＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ含有量を指す。１つの具体的な実施形態において、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量は、出発ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量を指す。
【０１１３】
本明細書に提供される方法の１つの実施形態では、初期沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールのα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）含有量の少なくとも８０％が沈殿する。ある好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＡ１ＰＩ含有量の少なくとも９０％が沈殿する。より好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＡ１ＰＩ含有量の少なくとも９５％が沈殿する。ある特定の実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＡ１ＰＩ含有量の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が沈殿する。
【０１１４】
本明細書に提供される方法の１つの実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＨ因子含有量の少なくとも７０％が沈殿する。ある好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＨ因子含有量の少なくとも８０％が沈殿する。ある好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＨ因子含有量の少なくとも９０％が沈殿する。より好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＨ因子含有量の少なくとも９５％が沈殿する。ある特定の実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＨ因子含有量の少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が沈殿する。
【０１１５】
本明細書に提供される方法の１つの実施形態では、初期沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールのインターαインヒビター（ＩａＩｐ）含有量の少なくとも７０％が沈殿する。ある好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＩａＩｐ含有量の少なくとも８０％が沈殿する。ある好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＩａＩｐ含有量の少なくとも９０％が沈殿する。より好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＩａＩｐ含有量の少なくとも９５％が沈殿する。ある特定の実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＩａＩｐ含有量の少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が沈殿する。
【０１１６】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、Ｃｏｈｎプール中の血液タンパク質を分画するための方法を提供し、本方法は、第１の沈殿ステップにおいて、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって免疫グロブリン、Ａ１ＰＩ、Ｈ因子、およびＩａＩｐを沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップとを含み、第１の沈殿物が、ｉ．）出発ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、ｉｉ．）出発ＣｏｈｎプールのＡ１ＰＩ含有量の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、ｉｉｉ．）出発ＣｏｈｎプールのＨ因子含有量の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、ならびにｉｖ．）出発ＣｏｈｎプールのＩａＩｐ含有量の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含有し、さらに、第１の上清が、Ｃｏｈｎプールのアルブミン含有量の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％を含有する。１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．０〜６．０のｐＨで２２％〜２８％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールを出発血漿プール（Ｃｏｈｎプール）と混合することによって実施される。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５±２％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５±１％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。同様に、１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．５のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．４のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．３のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．２のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．１のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５のｐＨで実施される。さらに他の実施形態において、第１の沈殿ステップの最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。
【０１１７】
ＩＶ．免疫グロブリン組成物の調製
概して、本発明に従う免疫グロブリン調製物は、任意の好適な出発血漿材料、例えば、回収血漿または原料血漿から調製され得る。典型的な例において、血液または血漿は健常な提供者から収集される。通常、血液は、免疫グロブリン調製物を投与する対象と同じ種の動物から収集される（典型的には、「同種」免疫グロブリンと称される）。回収または原料血漿は、脱クリオ血漿を提供するために、寒冷沈降されてもよく、またはされなくてもよい。さらに、血漿または脱クリオ血漿はまた、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、または他のクロマトグラフ法によって１種または複数種の血液因子を除去するように処理されてもよい。免疫グロブリンは次いで、「Ｃｏｈｎプール」と称される血漿または脱クリオ血漿出発材料から低ｐＨ、高アルコール条件下で沈殿され、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物を形成する。
【０１１８】
免疫グロブリンは、好適な手法、例えば、沈殿（アルコール分画またはポリエチレングリコール分画）、クロマトグラフ法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー等）、濾過（限外濾過／透析濾過、ナノ濾過）、超遠心分離、電気泳動調製等によって、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物からさらに濃縮され得る。（例えば、Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８：４５９−７５（１９４６）、Ｏｎｃｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７１：５４１−５０（１９４９）、Ｂａｒｕｎｄｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．７：１５７−７４（１９６２）、Ｋｏｂｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．１３：９３−１０２（１９６７）、米国特許第５，１２２，３７３号および同第５，１７７，１９４号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３６４７０号、ならびに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８２４７号（これらの開示は、あらゆる目的においてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１１９】
Ａ．上流処理
いくつかの態様の中でも特に、本発明は、出発血漿の免疫グロブリンおよびα−１−アンチトリプシン含有量の大半を沈殿させる初期沈殿ステップを実施することによって、貯蔵された血漿中に存在するタンパク質を分画するための方法を提供する。初期沈殿ステップの沈殿物および上清中に見出される個々の血漿タンパク質（例えば、ＩｇＧ、Ａ１ＰＩ、Ｈ因子、ＩａＩｐ等）の純度をさらに高めるために、これらの組成物は、分画（例えば、アルコール沈殿、ＰＥＧ沈殿、塩析等によって）、クロマトグラフィー、濾過、または他の方法によって、さらに濃縮され得る。血漿由来タンパク質の濃縮のためにこれら種々の技術が任意の順序で使用され得るが、ある特別な実施形態において、第１の沈殿物および／または上清は、最初に分画され（例えば、エタノール沈殿によって）、次いで、クロマトグラフおよび／または濾過技術を使用して濃縮される。本発明の文脈において、初期沈殿反応およびその後の分画は、集合的に「上流処理」ステップと称され、クロマトグラフおよび濾過ステップは、集合的に「下流処理」と称される。
【０１２０】
１．大量免疫グロブリン沈殿
本明細書に記載のように、本発明者らは、免疫グロブリン、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）、Ｈ因子、インターαインヒビタータンパク質（ＩａＩｐ）、アルブミン、フィブリノゲン等の治療上有益な血液タンパク質を精製するために、ヒト血漿を分画するための改良された方法を発見した。本方法は、出発Ｃｏｈｎプール（すなわち、血液、血漿、および／または前処理された血漿）の免疫グロブリン、Ａ１ＰＩ、Ｈ因子、ＩａＩｐ、およびフィブリノゲン含有量の大半が沈殿され、出発Ｃｏｈｎプールのアルブミン含有量の大半が上清中に残存する、最初の精製ステップを組み込む。有利には、本発明者らは、初期沈殿物から免疫グロブリンを抽出するが、他のタンパク質を抽出しないことによって、免疫グロブリンをＡ１ＰＩ、Ｈ因子、およびＩａＩｐから分離する方法を開発した。具体的には、本発明者らは、初期沈殿物の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）で処理することが、不溶性画分中のＡ１ＰＩ、Ｈ因子、およびＩａＩｐの保持を改善することを発見した。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、沈殿物から最初に抽出され得るＡ１ＰＩ、Ｈ因子、およびＩａＩｐが、ある特定の条件下では、その後懸濁液の不溶性部分と共に除去される微粉化二酸化ケイ素に結合すると考えている。結果として得られる上清（すなわち、懸濁液の可溶性画分）の分離は、出発Ｃｏｈｎ画分の免疫グロブリン含有量の大半を含む濃縮された溶液を提供する。
【０１２１】
１つの態様において、本発明はＣｏｈｎプールから濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、第１の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）をＣｏｈｎプールから共沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、Ａ１ＰＩを懸濁液から取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。概して、免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩの沈殿のための任意の化学的方法が使用されてもよく、（例えば、エタノールまたはメタノールを使用する）アルコール沈殿、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧまたはデキストラン）を使用する沈殿、ならびに（例えば、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム等を使用する）塩析が挙げられるが、これらに限定されない。ある好ましい実施形態において、沈殿は、アルコール沈殿、好ましくはエタノール沈殿である。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１２２】
１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合することによって実施される。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５±２％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５±１％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。同様に、１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．５のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．４のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．３のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．２のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．１のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５のｐＨで実施される。さらに他の実施形態において、第１の沈殿ステップの最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１２３】
本明細書に提供される方法は、初期沈殿反応において出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の大半が沈殿するため、初期低アルコール沈殿ステップ（すなわち、画分Ｉ沈殿）に依存する最新の精製手法と比較して、最終濃縮生成物において免疫グロブリンのはるかに高い回収量を提供する。
【０１２４】
したがって、本明細書に提供される方法の１つの実施形態において、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の少なくとも９０％が、初期沈殿反応において沈殿する。ある好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の少なくとも９５％が沈殿する。より好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の少なくとも９９％が沈殿する。ある特定の実施形態では、初期沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が沈殿する。１つの具体的な実施形態において、出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量は、出発ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量を指す。
【０１２５】
本明細書に提供される実施例に示されるように、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップ（すなわち、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿）の使用は、出発ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の少なくとも９９％の沈殿をもたらす。したがって、１つの実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度となるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧ含有量の９９％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップと、第１の沈殿物からＩｇＧを回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。
【０１２６】
表１５および表３１に示されるデータからも明らかなように、Ｃｏｈｎプールのα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）含有量の９７％超がまた、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップによって沈殿される。したがって、１つの実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、Ａ１ＰＩを懸濁液から取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１２７】
さらに、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップによって、Ｃｏｈｎプールのアルブミン含有量の９０％超が沈殿せず（表３３）、ゆえに、上清から回収され得ることが分かった。したがって、１つの実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、Ａ１ＰＩを懸濁液から取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性画分を回収し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。さらに別の実施形態では、第１の上清中に見出されるアルブミンが、さらに濃縮される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１２８】
２．免疫グロブリンの抽出および分離
Ｃｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物またはＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ａと比較して、本明細書に提供される方法によって形成された初期沈殿物は、Ａ１ＰＩおよびフィブリノゲンを含む、大幅に高いレベルの非免疫グロブリンタンパク質を含有する。例えば、表３０に示されるように、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールのフィブリノゲン含有量のほぼ１００％が免疫グロブリンと共沈殿される。これは、初期低アルコール沈殿ステップ（画分Ｉ沈殿）において、フィブリノゲンのバルクが除去されるＣｏｈｎ−ＯｎｃｌｅｙおよびＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ精製スキームと対照的である。同様に、表１５および表３１に示されるように、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールのα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）含有量の９７％超が免疫グロブリンと共沈殿される。対照的に、Ｃｏｈｎ−ＯｎｃｌｅｙおよびＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ精製スキームでは、Ａ１ＰＩのバルクは免疫グロブリンと共沈殿されない。むしろ、Ａ１ＰＩは、画分ＩＩ＋ＩＩＩ上清または上清Ａ中に見出される。
【０１２９】
したがって、医薬品グレードの免疫グロブリン組成物を提供するために、初期沈殿物中に存在するＡ１ＰＩおよびフィブリノゲン等の混入物を免疫グロブリン組成物から除去する必要がある。これは、例えば、第１の沈殿物のさらなる分画（例えば、アルコール、非イオン親水性ポリマーを使用する示差沈殿、または塩析による）、クロマトグラフィー手法、または濾過手法によって実現され得る。
【０１３０】
１つの実施形態において、第１の沈殿物は、免疫グロブリンを沈殿物から抽出するのに好適な注射用水（ＷＦＩ）または低イオン強度緩衝液中に懸濁される。ある特定の実施形態において、懸濁液は次いで、微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）で処理され、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分は、Ａ１ＰＩおよびフィブリノゲンのバルクを含有する懸濁液の不溶性部分から分離される。
【０１３１】
第１の沈殿物の抽出に好適な溶液は、概して、４．０〜５．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、溶液は４．５〜５．０のｐＨを有し、他の実施形態において、抽出溶液は、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、または５．５のｐＨを有する。ある好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．７±０．１である。別の好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．８±０．１である。別の好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．９±０．１である。概して、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、第一リン酸塩、第二リン酸塩、それらの混合物等から選択される緩衝剤を使用してこれらのｐＨ要件を満たすことができる。好適な緩衝液濃度は、典型的には、５〜１００ｍＭ、または１０〜５０ｍＭ、または５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｍＭ緩衝剤の範囲である。
【０１３２】
抽出緩衝液は、好ましくは０．５ｍＳ／ｃｍ〜２．０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。例えば、ある特定の実施形態において、抽出緩衝液の伝導率は、０．５±０．１ｍＳ／ｃｍ、または０．６±０．１、０．７±０．１、０．８±０．１、０．９±０．１、１．０±０．１、１．１±０．１、１．２±０．１、１．３±０．１、１．４±０．１、１．５±０．１、１．６±０．１、１．７±０．１、１．８±０．１、１．９±０．１、もしくは２．０±０．１ｍＳ／ｃｍである。当業者は、適切な伝導率を有する抽出緩衝液の生成方法を知っている。１つの特別な実施形態において、抽出緩衝液は、４．８±０．２のｐＨおよび０．７〜０．９ｍＳ／ｃｍの伝導率で、５ｍＭ  第一リン酸ナトリウムおよび５ｍＭ  酢酸塩を含有する。
【０１３３】
１つの実施形態において、微粉化二酸化ケイ素は、濾過の前に画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液と混合される。１つの実施形態において、この前処理ステップは、微粉化二酸化シリカ粒子（例えば、ヒュームドシリカ；Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標））の添加を含み、懸濁液が絶えず混合される４０〜８０分のインキュベーション期間が続く。ある特定の実施形態において、インキュベーション期間は、約５０分〜約７０分、または約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０分、もしくはそれ以上である。概して、処理は、０℃〜１０℃で、または２℃〜８℃で実施される。ある特定の実施形態において、処理は、約０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃で実施され得る。ある特別な実施形態において、処理は、２℃〜１０℃で実施される。ある好ましい実施形態において、処理は、５℃〜１０℃で実施される。
【０１３４】
１つの実施形態において、ヒュームドシリカは、２０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜１００ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濃度で添加される。別の実施形態において、ヒュームドシリカは、３０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜８０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濃度で添加される。ある特定の実施形態において、ヒュームドシリカは、約２０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物、または約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濃度で添加され得る。１つの具体的な実施形態において、ヒュームドシリカ（例えば、Ａｅｒｏｓｉｌ３８０または同等物）は、４０±２０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液に添加される。別の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液に添加される。混合は、２℃〜８℃で少なくとも５０〜７０分間行われる。
【０１３５】
ある特定の実施形態において、ＳｉＯ２は、０．０１ｇ／ｇ総タンパク質〜１０ｇ／ｇ総タンパク質の濃度で免疫グロブリン組成物に添加される。別の実施形態において、ＳｉＯ２は、０．０１ｇ／ｇ総タンパク質〜５ｇ／ｇ総タンパク質の濃度で免疫グロブリン組成物に添加される。別の実施形態において、ＳｉＯ２は、０．０２ｇ／ｇ総タンパク質〜４ｇ／ｇ総タンパク質の濃度で免疫グロブリン組成物に添加される。１つの実施形態において、ＳｉＯ２は、総タンパク質１グラム当たり少なくとも０．１ｇの最終濃度で添加される。別の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、総タンパク質１グラム当たり少なくとも０．２ｇの濃度で添加される。別の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、総タンパク質１グラム当たり少なくとも０．２５ｇの濃度で添加される。他の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、総タンパク質１グラム当たり少なくとも１ｇの濃度で添加される。別の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、総タンパク質１グラム当たり少なくとも２ｇの濃度で添加される。別の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、総タンパク質１グラム当たり少なくとも２．５ｇの濃度で添加される。さらに他の具体的な実施形態において、微粉化二酸化ケイ素は、少なくとも０．０１ｇ／ｇ総タンパク質、または総タンパク質１グラム当たり少なくとも０．０２ｇ、０．０３ｇ、０．０４ｇ、０．０５ｇ、０．０６ｇ、０．０７ｇ、０．０８ｇ、０．０９ｇ、０．１ｇ、０．２ｇ、０．３ｇ、０．４ｇ、０．５ｇ、０．６ｇ、０．７ｇ、０．８ｇ、０．９ｇ、１．０ｇ、１．５ｇ、２．０ｇ、２．５ｇ、３．０ｇ、３．５ｇ、４．０ｇ、４．５ｇ、５．０ｇ、５．５ｇ、６．０ｇ、６．５ｇ、７．０ｇ、７．５ｇ、８．０ｇ、８．５ｇ、９．０ｇ、９．５ｇ、１０．０ｇ、もしくはそれ以上の濃度で添加される。
【０１３６】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１３７】
さらに、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップによって、Ｃｏｈｎプールのアルブミン含有量の９０％超が沈殿せず（表３３）、ゆえに、上清から回収され得ることが分かった。したがって、１つの実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、懸濁液の可溶性部分に存在するＩｇＧが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＡ１ＰＩが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するフィブリノゲンが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＨ因子が、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＩａＩｐが、さらに濃縮される。さらに別の実施形態では、第１の上清中に見出されるアルブミンが、さらに濃縮される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１３８】
３．分画
１つの実施形態において、第１の懸濁液（Ｉ−ＩＶ−１糊状懸濁液）の可溶性部分から回収された免疫グロブリンは、分画によりさらに濃縮される。概して、分画の任意の方法（例えば、アルコールもしくはポリマー沈殿、塩析等）が使用され得る。ある好ましい実施形態において、免疫グロブリンは、エタノール沈殿によって第１の懸濁液の可溶性部分を分画することでさらに濃縮される。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、少なくとも１つの混入物を沈殿させずに、免疫グロブリンを沈殿させるのに適した最終濃度およびｐＨでエタノールを第１の懸濁液の可溶性部分に添加することで濃縮される。別の実施形態において、免疫グロブリンは、免疫グロブリンを沈殿させずに、少なくとも１つの混入物を沈殿させるのに適した最終濃度およびｐＨでエタノールを第１の懸濁液の可溶性部分に添加することで濃縮される。
【０１３９】
初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップから回収された物質の追加の分画が、任意選択である。ある特定の実施形態において、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップから回収された免疫グロブリン組成物は、本明細書に記載の種々の下流処理ステップのうちの１つまたは複数を使用して、さらに濃縮されてもよい。他の実施形態において、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップから回収された組成物は、１つまたは複数の追加の沈殿ステップを用いてさらに処理されてもよい。ある特定の実施形態において、さらなる免疫グロブリン沈殿ステップを使用して、免疫グロブリン組成物を濃縮する、保管用免疫グロブリンを調製する、および／または運搬用免疫グロブリン組成物を調製することができる。
【０１４０】
１つの実施形態において、本発明はＣｏｈｎプールから濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、第１の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）をＣｏｈｎプールから共沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、懸濁液からＡ１ＰＩを取り出すステップと、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、免疫グロブリンを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態において、第１の懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１４１】
一例となる実施形態において、第２の沈殿ステップは、エタノールを２２％〜２８％（ｖ／ｖ）の最終濃度で６．５〜７．５のｐＨで第２の懸濁液の可溶性部分（例えば、濾過または遠心分離後に形成された、懸濁液の濾液または上清）と混合することによって実施される。１つの実施形態において、エタノールは、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるように混合される。別の実施形態において、エタノールは、２５±２％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるように混合される。別の実施形態において、エタノールは、２５±１％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるように混合される。別の実施形態において、エタノールは、２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるように混合される。同様に、１つの実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．５のｐＨで実施される。別の実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．４のｐＨで実施される。別の実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．３のｐＨで実施される。別の実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．２のｐＨで実施される。別の実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．１のｐＨで実施される。別の実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０のｐＨで実施される。ある特別な実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．３のｐＨで２５±３％（ｖ／ｖ）の最終エタノール濃度を使用して実施される。
【０１４２】
ある好ましい実施形態において、第１の懸濁液またはその可溶性画分は、第２の沈殿ステップを実施する前に洗浄剤で処理される。１つの実施形態において、第１の懸濁液またはその可溶性画分は、第２の沈殿ステップを実施する前にクエン酸塩でさらに処理される。ある特別な実施形態において、ポリソルベート８０が第１の懸濁液またはその可溶性画分に添加され、組成物は少なくとも３０分間インキュベートされる。別の特別な実施形態において、クエン酸ナトリウム二水和物が第１の懸濁液またはその可溶性画分にさらに添加され、組成物は少なくともさらに３０分間インキュベートされる。１つの実施形態において、ポリソルベート８０が約０．２％（ｗ／ｖ）の最終濃度で添加される。１つの実施形態において、クエン酸ナトリウム二水和物が次いで、約８ｇ／Ｌの最終濃度で溶液中に混合される。ある特別な実施形態において、連続的に撹拌しながら約２〜８℃の温度でインキュベーションが実施される。
【０１４３】
ある特別な実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧ含有量の９９％〜１００％をＣｏｈｎプール血漿から沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、免疫グロブリンを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１４４】
ある具体的な実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧ含有量の９９％〜１００％をＣｏｈｎプール血漿から沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、エタノールを２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で７．０±０．３のｐＨで第１の懸濁液と混合することによって、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、免疫グロブリンを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１４５】
１つの実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、懸濁液からＡ１ＰＩを取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性画分を回収するステップと、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、免疫グロブリンを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。１つの実施形態において、第１の懸濁液から分離されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１４６】
ある具体的な実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、懸濁液からＡ１ＰＩを取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性画分を回収するステップと、エタノールを２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で７．０±０．３のｐＨで第１の懸濁液と混合することによって、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、免疫グロブリンを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。１つの実施形態において、第１の懸濁液から分離されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１４７】
別の実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９９％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、Ａ１ＰＩを懸濁液から取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性部分を回収するステップと、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、第２の沈殿物から免疫グロブリンを回収し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。１つの実施形態において、第１の懸濁液から分離されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。別の実施形態において、第１の上清中に存在するアルブミンが、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある好ましい実施形態において、Ｃｏｈｎプールのアルブミン含有量の９０％〜１００％が、第１の上清中に存在する。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１４８】
別の実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９９％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、Ａ１ＰＩを懸濁液から取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性部分を回収するステップと、エタノールを２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で７．０±０．３のｐＨで第１の懸濁液の可溶性部分と混合することによって、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、第２の沈殿物から免疫グロブリンを回収し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。１つの実施形態において、第１の懸濁液から分離されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。別の実施形態において、第１の上清中に存在するアルブミンが、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある好ましい実施形態において、Ｃｏｈｎプールのアルブミン含有量の９０％〜１００％が、第１の上清中に存在する。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１４９】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離し、第１の懸濁液の可溶性部分を回収するステップと、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、免疫グロブリンを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１５０】
ある具体的な実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離し、第１の懸濁液の可溶性部分を回収するステップと、エタノールを２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で７．０±０．３のｐＨで第１の懸濁液の可溶性部分と混合することによって、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、免疫グロブリンを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１５１】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離するステップと、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、第２の沈殿物から免疫グロブリンを回収し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、懸濁液の可溶性部分に存在するＩｇＧが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＡ１ＰＩが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するフィブリノゲンが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＨ因子が、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＩａＩｐが、さらに濃縮される。さらに別の実施形態では、第１の上清中に見出されるアルブミンが、さらに濃縮される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１５２】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離するステップと、エタノールを２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で７．０±０．３のｐＨで第１の懸濁液の可溶性部分と混合することによって、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、第２の沈殿物から免疫グロブリンを回収し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、懸濁液の可溶性部分に存在するＩｇＧが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＡ１ＰＩが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するフィブリノゲンが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＨ因子が、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＩａＩｐが、さらに濃縮される。さらに別の実施形態では、第１の上清中に見出されるアルブミンが、さらに濃縮される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１５３】
１つの実施形態において、免疫グロブリンは、沈殿物を冷たい抽出緩衝液と懸濁することによって、第２の沈殿物から回収される。例えば、第２の沈殿物は、沈殿物１部 対 注射用水（ＷＦＩ）または低伝導率緩衝液２〜１５部の比率で懸濁される。ある好ましい実施形態において、第２の沈殿物は、沈殿物１部 対 ＷＦＩ４〜５部、好ましくは３．５部の比率で懸濁された。１つの実施形態において、懸濁ステップは、０℃〜８℃の温度で実施される。１つの実施形態において、溶液の最終ｐＨは、４．５〜５．６、好ましくは５．２±０．２に調整される。１つの実施形態において、このｐＨ調整は、酢酸を用いて実施される。１つの実施形態において、免疫グロブリンの可溶性を高めるために、懸濁液の伝導率を２．５〜６．０ｍＳ／ｃｍに増加させる。１つの実施形態において、塩化ナトリウムの添加によって伝導率を増加させる。
【０１５４】
第２の沈殿物の抽出に適した溶液には、ＷＦＩおよび低伝導率緩衝液が挙げられる。１つの実施形態において、低伝導率緩衝液は、約１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。他の実施形態において、低伝導率緩衝液は、約９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。ある好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約６ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。別の好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約４ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。別の好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。
【０１５５】
１つの実施形態において、免疫グロブリンを含む懸濁液の可溶性部分が、不溶性部分から分離される。１つの実施形態において、これは、懸濁液を０．１μｍ〜０．４μｍの公称孔径を有するデプスフィルターで濾過することによって行われる。１つの実施形態において、デプスフィルターの公称孔径は、０．２μｍ（例えば、Ｃｕｎｏ  ＶＲ０６フィルターまたは同等物）である。１つの実施形態では、さらなる免疫グロブリンを回収するために、濾過後にフィルターをＷＦＩまたは好適な緩衝液で洗浄し、その後洗浄液を濾液に添加する。ある好ましい実施形態において、フィルターの後洗浄は、約２．５〜約６．０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する塩化ナトリウム溶液を使用して実施される。別の実施形態において、第２の懸濁液は、可溶性部分を回収するために遠心分離される。
【０１５６】
Ｂ．下流処理
免疫グロブリンおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）を沈殿させるがアルブミンを沈殿させない初期沈殿ステップを使用する分画の後に得られた免疫グロブリン画分は、クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡＰ）、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等）、濾過（例えば、限外濾過および／または透析濾過）、ならびに１つまたは複数のウイルス低減ステップ（例えば、ナノ濾過、溶媒および洗浄剤処理、ＵＶ照射、熱処理、低ｐＨインキュベーション等）が挙げられるが、これらに限定されない当該技術分野でよく知られた方法に従って、さらに濃縮され得る。
【０１５７】
１つの実施形態において、本発明はＣｏｈｎプールから濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップならびに少なくとも１つの下流処理ステップ（例えば、クロマトグラフィー）を含む。ある特定の実施形態において、本方法は、少なくとも１つの下流処理ステップの前に第２の沈殿ステップをさらに含む（例えば、ＰｐｔＧ沈殿ステップ）。この第２の沈殿は、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿物の懸濁液が下流精製に直接使用されてもよいため、任意選択である。
【０１５８】
１つの実施形態において、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップを使用して調製された血漿由来組成物中に存在する免疫グロブリンは、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを実施することによってさらに濃縮される。１つの実施形態において、クロマトグラフィーステップは、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡＰ）、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーから選択される。ある特別な実施形態において、免疫グロブリンは、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施することによって濃縮される。別の実施形態において、免疫グロブリンは、陽イオン交換クロマトグラフィーを実施することによってさらに濃縮される。ある具体的な実施形態において、免疫グロブリンは、陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの両方を実施することによってさらに濃縮される。
【０１５９】
ある特別な実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離し、免疫グロブリンを陽イオン交換樹脂に結合させるステップと、免疫グロブリンを陽イオン交換から溶出し、陽イオン交換溶出液を形成するステップと、陽イオン交換溶出液を陰イオン交換樹脂と接触させるステップと、樹脂に結合しない免疫グロブリンを回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーステップから回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。別の実施形態において、Ｃｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％、好ましくは９０％〜１００％は、第１の上清中に存在する。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、本方法は、少なくとも１つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。ある好ましい実施形態において、本方法は、少なくとも２つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。より好ましい実施形態において、本方法は、少なくとも３つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１６０】
ある特別な実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離し、第１の懸濁液の可溶性部分を回収するステップと、エタノールを２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で７．０±０．３のｐＨで第１の懸濁液の可溶性部分と混合することによって、第２の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、免疫グロブリンを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、免疫グロブリンを第２の沈殿物から回収するステップと、免疫グロブリンを陽イオン交換樹脂に結合させるステップと、免疫グロブリンを陽イオン交換から溶出し、陽イオン交換溶出液を形成するステップと、陽イオン交換溶出液を陰イオン交換樹脂と接触させるステップと、樹脂に結合しない免疫グロブリンを回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーステップから回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。別の実施形態において、Ｃｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％、好ましくは９０％〜１００％は、第１の上清中に存在する。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、本方法は、少なくとも１つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。ある好ましい実施形態において、本方法は、少なくとも２つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。より好ましい実施形態において、本方法は、少なくとも３つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１６１】
１つの特別な実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩをＣｏｈｎプールから沈殿させるステップと、沈殿した免疫グロブリンとＡ１ＰＩを分離するステップと、陽イオン交換クロマトグラフィーを実施することによって、免疫グロブリン組成物を濃縮するステップと、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施することによって、免疫グロブリン組成物をさらに濃縮するステップとを含む。１つの実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップにおいて使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。１つの実施形態において、本方法は、少なくとも１つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。ある好ましい実施形態において、本方法は、少なくとも２つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。より好ましい実施形態において、本方法は、少なくとも３つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１６２】
別の特別な実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩをＣｏｈｎプールから沈殿させるステップと、沈殿した免疫グロブリンとＡ１ＰＩを分離するステップと、第２の沈殿ステップにおいて、分離された免疫グロブリンを沈殿させるステップと、陽イオン交換クロマトグラフィーを実施することによって、免疫グロブリン組成物を濃縮するステップと、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施することによって、免疫グロブリン組成物をさらに濃縮するステップとを含む。１つの実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップにおいて使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。１つの実施形態において、本方法は、少なくとも１つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。ある好ましい実施形態において、本方法は、少なくとも２つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。より好ましい実施形態において、本方法は、少なくとも３つのウイルス低減／不活性化ステップをさらに含む。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１６３】
別の特別な実施形態において、本発明は、濃縮免疫グロブリン組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩをＣｏｈｎプールから沈殿させるステップと、沈殿した免疫グロブリンとＡ１ＰＩを分離するステップと、第２の沈殿ステップにおいて、分離された免疫グロブリンを沈殿させるステップと、免疫グロブリン組成物を溶媒および洗浄剤で処理して、ウイルスを不活性化するステップと、陽イオン交換クロマトグラフィーを実施することによって、免疫グロブリン組成物を濃縮するステップと、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施することによって、免疫グロブリン組成物をさらに濃縮するステップと、免疫グロブリン組成物をナノ濾過し、ウイルスを除去するステップとを含む。１つの実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップにおいて使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。１つの実施形態において、本方法は、５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌの最終タンパク質濃度になるように限外濾過／透析濾過によって、免疫グロブリン組成物を濃縮することをさらに含む。ある特別な実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物の最終濃度は、５±１％（ｗ／ｖ）である。別の特別な実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物の最終濃度は、１０±１％（ｗ／ｖ）である。別の特別な実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物の最終濃度は、１５±１％（ｗ／ｖ）である。別の特別な実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物の最終濃度は、２０±２％（ｗ／ｖ）である。別の特別な実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物の最終濃度は、２５±２％（ｗ／ｖ）である。１つの実施形態において、濃縮免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ組成物である。
【０１６４】
Ｃ．画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物からのＩｇＧの例示的濃縮
１．画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の抽出
画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物のＩｇＧ含有物を可溶化するために、冷たい抽出緩衝液を使用して、沈殿物１部 対 抽出緩衝液１５部の典型的な比率で分画ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を再懸濁する。他の好適な再懸濁液比率、例えば、１：８〜１：３０、または１：１０〜１：２０、または１：１２〜１：１８、または１：１３〜１：１７、または１：１４〜１：１６が用いられてもよい。ある特定の実施形態において、再懸濁液比率は、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、またはそれよりも高くてもよい。
【０１６５】
第１の沈殿物の抽出に好適な溶液は、概して、４．０〜５．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、溶液は４．５〜５．０のｐＨを有し、他の実施形態において、抽出溶液は、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、または５．５のｐＨを有する。ある好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．７±０．１である。別の好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．８±０．１である。別の好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．９±０．１である。概して、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、第一リン酸塩、第二リン酸塩、それらの混合物等から選択される緩衝剤を使用してこれらのｐＨ要件を満たすことができる。好適な緩衝液濃度は、典型的には、５〜１００ｍＭ、または１０〜５０ｍＭ、または５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｍＭ緩衝剤の範囲である。
【０１６６】
抽出緩衝液は、好ましくは０．５ｍＳ／ｃｍ〜２．０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。例えば、ある特定の実施形態において、抽出緩衝液の伝導率は、０．５±０．１ｍＳ／ｃｍ、または約０．６±０．１、０．７±０．１、０．８±０．１、０．９±０．１、１．０±０．１、１．１±０．１、１．２±０．１、１．３±０．１、１．４±０．１、１．５±０．１、１．６±０．１、１．７±０．１、１．８±０．１、１．９±０．１、もしくは２．０±０．１ｍＳ／ｃｍである。当業者は、適切な伝導率を有する抽出緩衝液の生成方法を知っている。
【０１６７】
一例となる実施形態において、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物は、５ｍＭ  第一リン酸ナトリウムおよび５ｍＭ  酢酸塩を含有しｐＨが酢酸で４．８±０．２に調整されている抽出緩衝液を使用して、１：１５のペースト 対 緩衝液の比率で抽出される。１つの実施形態において、溶液のｐＨは、抽出プロセスの持続時間にわたって４．８±０．３のｐＨに維持される。ある具体的な実施形態において、溶液のｐＨは、抽出プロセスの持続時間にわたって４．８±０．２のｐＨに維持される。
【０１６８】
概して、抽出は、０℃〜１０℃で、または２℃〜８℃の温度で実施される。ある特定の実施形態において、抽出は、０±１℃、１±１℃、２±１℃、３±１℃、４±１℃、５±１℃、６±１℃、７±１℃、８±１℃、９±１℃、または１０±１℃で実施され得る。ある特別な実施形態において、抽出は、２℃〜１０℃で実施される。典型的に、抽出プロセスは、懸濁液を連続的に撹拌しながら、６０〜３００分間、または１２０〜２４０分間、または１５０〜２１０分間続けて行われる。ある特定の実施形態において、抽出プロセスは、約６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００分間、またはそれ以上続けて行われる。ある好ましい実施形態において、抽出プロセスは、連続的撹拌を伴って少なくとも１６０分間続けて行われる。
【０１６９】
２．二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）処理
Ｃｏｈｎ−ＯｎｃｌｅｙおよびＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ精製と比較して、本明細書に提供される方法によって形成された初期免疫グロブリン含有沈殿物は、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含む、大幅に高いレベルの非免疫グロブリンタンパク質を含有する。Ｈ因子およびＩａＩｐは、微粉化二酸化ケイ素に結合し、続いて溶出され得ることが知られている（国際公開公報第２０１１／０１１７５３号および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４５０９９号（これらの開示はあらゆる目的においてその全体が参照により両方明示的に組み込まれる）を参照されたい）。有利には、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の抽出後および画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の濾過前にＳｉＯ２処理ステップを含めることは、画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の濾過中に形成されるＡ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐの、不溶性濾過ケークへの分離を補助することが分かった。
【０１７０】
したがって、１つの実施形態において、微粉化二酸化ケイ素は、濾過前に画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液と混合される。１つの実施形態において、この前処理ステップは、微粉化二酸化シリカ粒子（例えば、ヒュームドシリカ；Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標）の添加を含み、懸濁液が絶えず混合される、４０〜８０分のインキュベーション期間が続く。ある特定の実施形態において、インキュベーション期間は、約５０分〜約７０分、または約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０分、もしくはそれ以上である。概して、処理は、０℃〜１０℃で、または２℃〜８℃で実施される。ある特定の実施形態において、処理は、約０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃で実施され得る。ある特別な実施形態において、処理は、２℃〜１０℃で実施される。ある好ましい実施形態において、処理は、５℃〜１０℃で実施される。
【０１７１】
ある特定の実施形態において、ヒュームドシリカは、２０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜１００ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濃度で添加される。ある特定の実施形態において、ヒュームドシリカは、約２０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物、または約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濃度で添加され得る。１つの具体的な実施形態において、ヒュームドシリカ（例えば、Ａｅｒｏｓｉｌ３８０または同等物）は、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液に添加される。混合は、２℃〜８℃で少なくとも５０〜７０分間行われる。
【０１７２】
ある特定の実施形態において、ＳｉＯ２は、０．０１ｇ／ｇ総タンパク質〜１０ｇ／ｇ総タンパク質の濃度でＩｇＧ組成物に添加される。別の実施形態において、ＳｉＯ２は、０．０１ｇ／ｇ総タンパク質〜５ｇ／ｇ総タンパク質の濃度でＩｇＧ組成物に添加される。別の実施形態において、ＳｉＯ２は、０．０２ｇ／ｇ総タンパク質〜４ｇ／ｇ総タンパク質の濃度でＩｇＧ組成物に添加される。１つの実施形態において、ＳｉＯ２は、総タンパク質１グラム当たり少なくとも０．１ｇの最終濃度で添加される。別の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、総タンパク質１グラム当たり少なくとも０．２ｇの濃度で添加される。別の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、総タンパク質１グラム当たり少なくとも０．２５ｇの濃度で添加される。他の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、総タンパク質１グラム当たり少なくとも１ｇの濃度で添加される。別の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、総タンパク質１グラム当たり少なくとも２ｇの濃度で添加される。別の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、総タンパク質１グラム当たり少なくとも２．５ｇの濃度で添加される。さらに他の具体的な実施形態において、微粉化二酸化ケイ素は、少なくとも０．０１ｇ／ｇ総タンパク質、または総タンパク質１グラム当たり少なくとも０．０２ｇ、０．０３ｇ、０．０４ｇ、０．０５ｇ、０．０６ｇ、０．０７ｇ、０．０８ｇ、０．０９ｇ、０．１ｇ、０．２ｇ、０．３ｇ、０．４ｇ、０．５ｇ、０．６ｇ、０．７ｇ、０．８ｇ、０．９ｇ、１．０ｇ、１．５ｇ、２．０ｇ、２．５ｇ、３．０ｇ、３．５ｇ、４．０ｇ、４．５ｇ、５．０ｇ、５．５ｇ、６．０ｇ、６．５ｇ、７．０ｇ、７．５ｇ、８．０ｇ、８．５ｇ、９．０ｇ、９．５ｇ、１０．０ｇ、もしくはそれ以上の濃度で添加される。
【０１７３】
３．画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の濾過
免疫グロブリンを含有する画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液の可溶性部分をフィブリノゲン、Ａ１ＰＩ、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する不溶性部分から分離するために、懸濁液は典型的にはデプス濾過を使用して濾過される。本明細書に提供される方法において用いられ得るデプスフィルターには、金属製、ガラス製、セラミック製、有機（ケイ藻土等）デプスフィルター等が挙げられる。好適なフィルターの例には、限定することなく、Ｃｕｎｏ  ５０ＳＡ、Ｃｕｎｏ  ９０ＳＡ、およびＣｕｎｏ  ＶＲ０６フィルター（３Ｍ）が挙げられる。代替として、分離ステップは、濾過ではなく遠心分離によって実施されてもよい。
【０１７４】
ある特定の実施形態において、濾過助剤、例えば、Ｃｅｌｐｕｒｅ  Ｃ３００（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ）またはＨｙｆｌｏ−Ｓｕｐｅｒ−Ｃｅｌ（Ｗｏｒｌｄ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ）が、二酸化シリカ処理後、デプス濾過を促進するために懸濁液に添加される。濾過助剤は、０．１ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜１．０ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物、または０．２ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜０．８ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物、または０．３ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜０．７ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度で添加される。他の実施形態において、濾過助剤は、０．１ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜０．７ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物、または０．２ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜０．６ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物、または約０．３ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜約０．０５ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度で添加され得る。ある特定の実施形態において、濾過助剤は、約０．０１ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物、または約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、もしくは１．０ｋｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度で添加される。
【０１７５】
濾過中の免疫グロブリンの損失を最小化するために、形成された濾過ケークは、濾過ケーク中に存在する非免疫グロブリンタンパク質を可溶化するには十分でない懸濁緩衝液またはそれと同様の緩衝液の少なくとも１デッドボリューム、好ましくは少なくとも２デッドボリューム、より好ましくは少なくとも３デッドボリュームで洗浄されるべきである。１つの実施形態において、フィルターおよび濾過ケークは、緩衝液の少なくとも３．０デッドボリュームで後洗浄される。別の実施形態において、フィルターおよび濾過ケークは、緩衝液の少なくとも３．６デッドボリュームで後洗浄される。別の実施形態において、フィルターおよび濾過ケークは、好適な緩衝液を使用して、濾過された懸濁液体積の少なくとも５０％で後洗浄される。別の実施形態において、フィルターおよび濾過ケークは、好適な緩衝液を使用して、濾過された懸濁液体積の少なくとも７５％で後洗浄される。別の実施形態において、フィルターおよび濾過ケークは、好適な緩衝液を使用して、濾過された懸濁液体積の少なくとも１００％で後洗浄される。典型的には、濾過された懸濁液体積の２００％以下が、フィルターおよび濾過ケークを洗浄するために使用されるべきである。
【０１７６】
ある具体的な実施形態において、洗浄緩衝液は、１０００Ｌ当たり９０〜１５０ｍＬの氷酢酸を含有する溶解緩衝液である。１つの実施形態において、後洗浄抽出緩衝液のｐＨは、約４．６〜約５．３である。ある好ましい実施形態において、後洗浄緩衝液のｐＨは、約４．７〜約５．２である。別の好ましい実施形態において、後洗浄緩衝液のｐＨは、約４．８〜約５．１である。さらに別の好ましい実施形態において、後洗浄緩衝液のｐＨは、約４．９〜約５．０である。
【０１７７】
４．洗浄剤処理
さらなる混入物を画分Ｉ−ＩＶ−１濾液から除去するために、試料は次いで洗浄剤処理に供される。血漿に由来する画分の洗浄剤処理の方法は、当該技術分野においてよく知られている。概して、任意の標準非イオン洗浄剤処理が、本明細書に提供される方法と組み合わせて使用され得る。例えば、洗浄剤処理のための一例となるプロトコルが、以下に提供される。
【０１７８】
ポリソルベート８０を撹拌しながら約０．２％（ｗ／ｖ）の最終濃度で画分Ｉ−ＩＶ−１濾液に添加し、試料を約２〜８℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする。次いで、クエン酸ナトリウム二水和物を約８ｇ／Ｌの最終濃度で溶液中に混合し、連続的に撹拌しながら約２〜８℃の温度で試料をさらに３０分間インキュベートする。
【０１７９】
ある特定の実施形態において、任意の好適な非イオン洗浄剤が使用され得る。好適な非イオン洗浄剤の例には、限定することなく、オクチルグルコシド、ジギトニン、Ｃ１２Ｅ８、ルブロール、トリトンＸ−１００、ノニデットＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ２０（すなわち、ポリソルベート２０）、Ｔｗｅｅｎ８０（すなわち、ポリソルベート８０）、アルキルポリ（エチレンオキシド）、Ｂｒｉｊ洗浄剤、アルキルフェノールポリ（エチレンオキシド）、ポロキサマー、オクチルグルコシド、デシルマルトシド等が挙げられる。
【０１８０】
１つの実施形態において、プロセスの改善は、拡散添加で洗浄剤試薬（例えば、ポリソルベート８０およびクエン酸ナトリウム二水和物）を添加することによって実現される。これら試薬の拡散添加は、アルコール濃度およびｐＨの局所変動を単一のエントリーポイントでの添加と比較して最小化する。１つの実施形態において、拡散添加は、流動的添加ではなく噴霧を含む。別の実施形態において、拡散添加は、複数のポートからの試薬の添加を含む。１つの実施形態において、拡散添加は、拡散ポートからの試薬の添加を含む。ある特定の実施形態において、試薬を系中に導入するために使用される少なくとも１つのポートは、インペラーまたは他の分散要素に、またはその近くに位置している。他の実施形態において、洗浄剤試薬は、試料が添加物の急速な分布を確実にするように混合されている間に、改変画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾液に固体として添加され得る。ある特定の実施形態において、流動的添加で生じるような局所的な一極集中が生じないように、濾液の非局在化表面積にわたって固体を振りかけることによって固形試薬を添加することが好ましい。
【０１８１】
５．第２の沈殿事象  −  沈殿Ｇ
残留不純物を除去するために、第２の沈殿は、２５％のアルコールを使用して６．５〜７．５のｐＨで実施される。簡潔に言うと、画分Ｉ−ＩＶ−１抽出は、好適なｐＨ調整溶液（例えば、水酸化ナトリウムまたは酢酸）で６．５〜７．５、好ましくは６．８〜７．２、より好ましくは６．９〜７．１、最も好ましくは７．０のｐＨに調整される。次いで、約２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるように冷たいアルコールを溶液に添加し、混合物を撹拌しながら約−６℃〜約−１０℃で少なくとも１時間インキュベートし、第２の沈殿物（すなわち、沈殿物Ｇ）を形成する。１つの実施形態において、混合物は、少なくとも２時間、または少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、もしくはそれ以上インキュベートされる。ある好ましい実施形態において、混合物は、少なくとも２時間インキュベートされる。より好ましい実施形態において、混合物は、少なくとも４時間インキュベートされる。さらにより一層好ましい実施形態において、混合物は、少なくとも８時間インキュベートされる。
【０１８２】
ある特定の実施形態において、より高いパーセンテージのＩｇＧが、沈殿反応へのアルコールの添加中、および／または添加後、溶液のｐＨを調整することによってＩ−ＩＶ−１抽出から沈殿され得る。同様に、沈殿プロセス中に溶液のｐＨが変動するため、反応混合物のｐＨは、インキュベーション全体を通して、監視および／または調整され得る。別の実施形態において、ＩｇＧの収量の改善は、沈殿用アルコールおよび／または混合物のｐＨを調整するために使用される溶液を、アルコールまたはｐＨ調整剤の拡散添加によって添加することによって実現される。これら試薬の拡散添加は、アルコール濃度およびｐＨの局所変動を単一のエントリーポイントでの添加と比較して最小化する。１つの実施形態において、拡散添加は、流動的添加ではなく噴霧を含む。別の実施形態において、拡散添加は、複数のポートからの試薬の添加を含む。１つの実施形態において、拡散添加は、拡散ポートからの試薬の添加を含む。ある特定の実施形態において、試薬を系中に導入するために使用される少なくとも１つのポートは、インペラーまたは他の分散要素に、またはその近くに位置している。
【０１８３】
６．沈殿物Ｇ（Ｐｐｔ  Ｇ）の懸濁および濾過
沈殿物ＧのＩｇＧ含有量を可溶化するために、冷たい抽出緩衝液を使用して、ＰｐｔＧを再懸濁する。簡潔に言うと、沈殿物Ｇは、沈殿物１部 対 注射用水（ＷＦＩ）または低伝導率緩衝液２〜５部の比率で溶解される。ある好ましい実施形態において、沈殿物Ｇは、沈殿物１部 対 ＷＦＩ１〜１５部、好ましくは３．５部の比率で溶解される。懸濁ステップは、典型的には、４０〜９５のＡＵ２８０−３２０値を実現するために、０℃〜８℃の温度で行われる。少なくとも２時間撹拌される溶液の最終ｐＨは、次いで、４．５〜５．６に、好ましくは５．２±０．２に調整される。１つの実施形態において、このｐＨ調整は、酢酸を用いて実施される。ＩｇＧの可溶性を高めるために、懸濁液の伝導率を２．５〜６．０ｍＳ／ｃｍに増加させる。１つの実施形態において、塩化ナトリウムの添加によって伝導率を増加させる。
【０１８４】
沈殿物Ｇの抽出に適した溶液には、ＷＦＩおよび低伝導率緩衝液が挙げられる。１つの実施形態において、低伝導率緩衝液は、約１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。他の実施形態において、低伝導率緩衝液は、約９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。ある好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約６ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。別の好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約４ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。別の好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。
【０１８５】
懸濁ＰｐｔＧ溶液は、次いで、任意の非溶解粒子を除去するために、０．１μｍ〜０．４μｍの公称孔径を有する好適なデプスフィルターで濾過される。１つの実施形態において、デプスフィルターの公称孔径は、約０．２μｍ（例えば、Ｃｕｎｏ  ＶＲ０６フィルターまたは同等物）である。別の実施形態において、懸濁ＰｐｔＧ溶液は、清澄化上清を回収するために遠心分離される。さらなるＩｇＧを回収するために、濾過後にフィルターをＷＦＩまたは好適な緩衝液で洗浄し、その後洗浄を濾液に添加する。ある好ましい実施形態において、フィルターの後洗浄は、約２．５〜約６．０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する塩化ナトリウム溶液を使用して実施される。
【０１８６】
７．溶媒および洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理
血漿由来生成物中に存在する種々のウイルス混入物を不活性化するために、清澄化ＰｐｔＧ濾液は次に、溶媒洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供される。血漿由来の画分の洗浄剤処理方法は、当該技術分野においてよく知られている（概説については、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ＪＰ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００６；１９（１）：２０５−４２を参照されたい）。概して、任意の標準Ｓ／Ｄ処理が、本明細書に提供される方法と組み合わせて使用され得る。例えば、Ｓ／Ｄ処理のための一例となるプロトコルが、以下に提供される。
【０１８７】
トリトン  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、およびトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）が、それぞれ約１．０％、０．３％、および０．３％の最終濃度で清澄化ＰｐｔＧ濾液に添加される。混合物は、次いで、１８℃〜２５℃の温度で少なくとも１時間撹拌される。
【０１８８】
１つの実施形態において、Ｓ／Ｄ試薬（例えば、トリトンＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、およびＴＮＢＰ）は、拡散添加によって添加される。ある具体的な実施形態において、Ｓ／Ｄ試薬は、流動的添加ではなく噴霧によって添加される。別の実施形態において、洗浄剤試薬は、固体として清澄化ＰｐｔＧ濾液にて添加され、Ｓ／Ｄ成分の急速な分布を確実にするように混合される。ある特定の実施形態において、流動的添加で生じるような局所的な一極集中が生じないように、濾液の非局在化表面積にわたって固体を振りかけることによって固形試薬を添加することが好ましい。
【０１８９】
８．イオン交換クロマトグラフィー
ＩｇＧをさらに精製し、濃縮するために、陽イオン交換および／または陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることができる。イオン交換クロマトグラフィーを使用してＩｇＧを精製し、濃縮する方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許第５，８８６，１５４号は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を低ｐＨ（約３．８〜４．５）で抽出した後に、カプリル酸を使用してＩｇＧを沈殿させて、最終的に２つの陰イオン交換クロマトグラフィーステップを実施する方法を記載している。米国特許第６，０６９，２３６号は、アルコール沈殿に全く依存しないクロマトグラフィーのＩｇＧ精製スキームを記載している。国際出願ＰＣＴ国際公開公報第２００５／０７３２５２号は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出、カプリル酸処理、ＰＥＧ処理、および単一の陰イオン交換クロマトグラフィーステップを含むＩｇＧ精製方法を記載している。米国特許第７，１８６，４１０号は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分ＩＩ沈殿物の抽出、続いてアルカリ性ｐＨで単一の陰イオン交換ステップが実施されるＩｇＧ精製方法を記載している。米国特許第７，５５３，９３８号は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出、カプリレート処理、および１回または２回いずれかの陰イオン交換クロマトグラフィーステップを含む方法を記載している。米国特許第６，０９３，３２４号は、約６．０〜約６．６のｐＨで操作されるマクロ多孔性陰イオン交換樹脂の使用を含む精製方法を記載している。米国特許第６，８３５，３７９号は、アルコール分画を用いずに、陽イオン交換クロマトグラフィーに依存する精製方法を記載している。上記公報の開示は、参照によりあらゆる目的においてその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９０】
１つの実施形態において、Ｓ／Ｄ処理されたＰｐｔＧ濾液は、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの両方に供され得る。例えば１つの実施形態において、Ｓ／Ｄ処理されたＰｐｔＧ濾液は、ＩｇＧがその樹脂に結合するのに適した条件下で陽イオン交換樹脂に接触され得る。次いで、そのＳ／Ｄ試薬は、吸着されたＩｇＧから洗い流され、続いてＩｇＧは、好適な溶出緩衝液で樹脂から溶出される。この様式で、陽イオン交換クロマトグラフィーステップを使用して、Ｓ／Ｄ試薬を調製物から除去する、ＩｇＧを含有する溶液を濃縮する、および／または不純物を組成物から除去することができる。
【０１９１】
１つの実施形態において、ＩｇＧは、約８．０〜９．０のｐＨを有する溶出緩衝液を使用して陽イオン交換樹脂から溶出される。ある特定の実施形態において、ｐＨ溶出緩衝液は、約８．２〜約８．８、または約８．４〜約８．６のｐＨ、または約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、もしくは９．０のｐＨを有し得る。ある好ましい実施形態において、溶出緩衝液のｐＨは、約８．５±０．１である。
【０１９２】
同様に、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してＩｇＧ組成物中の不純物を減少させることができる。１つの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、１種または複数種の不純物が陰イオン交換樹脂に結合されるがＩｇＧは結合されない溶液条件下で実施される。ある具体的な実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、弱酸性条件、すなわち、５．０〜７．０、好ましくは５．５〜６．５のｐＨで、陰イオン交換樹脂への混入物の結合には適しているがＩｇＧの結合には適していない低イオン強度で実施される。
【０１９３】
ある具体的な実施形態において、陽イオン交換カラムからの溶出液は低ｐＨ、例えば約５．５〜約６．５に調整され、溶液の伝導率が低下するように適切な緩衝液で希釈され得る。ある特定の実施形態において、陽イオン交換溶出液のｐＨは、約５．７〜約６．７、または約５．９〜約６．５のｐＨ、または約５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、もしくは６．７のｐＨに調整され得る。ある好ましい実施形態において、溶出液のｐＨは、約６．４±０．１のｐＨに調整される。溶出液は次いで、調製物中に見出されるいくつかの混入物を結合させる陰イオン交換カラムに負荷される。カラムの負荷および洗浄中に、ＩｇＧ画分を含有するカラム通過画分は収集される。ある特定の実施形態において、本発明のイオン交換クロマトグラフィーステップは、カラム法、バッチ法、またはその２つの組み合わせにおいて、実施され得る。１つの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーの前にＩｇＧ組成物のｐＨを調整するために使用される溶液は、拡散添加により添加される。ある具体的な実施形態において、溶液は、流動的添加ではなく噴霧によって添加される。
【０１９４】
９．ナノ濾過
本明細書に提供されるＩｇＧ組成物のウイルス負荷を減少させるために、好適なナノ濾過装置を使用して、組成物はナノ濾過され得る。ある特定の実施形態において、ナノ濾過装置は、約１５ｎｍ〜約２００ｎｍの平均孔径を有する。この使用に適したナノフィルターの例としては、限定することなく、ＤＶＤ、ＤＶ５０、ＤＶ２０（Ｐａｌｌ）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＰ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐｌａｎｏｖａ  １５Ｎ、２０Ｎ、３５Ｎ、および７５Ｎ（Ｐｌａｎｏｖａ）が挙げられる。ある具体的な実施形態において、ナノフィルターは、約１５ｎｍ〜約７２ｎｍ、または約１９ｎｍ〜約３５ｎｍ、または約１５ｎｍ、１９ｎｍ、３５ｎｍ、もしくは７２ｎｍの平均孔径を有し得る。ある好ましい実施形態において、ナノフィルターは、Ａｓａｈｉ  ＰＬＡＮＯＶＡ  ３５Ｎフィルターまたはその同等物等の約３５ｎｍの平均孔径を有する。ある特別な実施形態において、陰イオン交換ステップから回収されたＩｇＧ組成物は、３０ｎｍ〜４０ｎｍ、好ましくは３５±２ｎｍの孔径を有するナノフィルターを使用してナノ濾過される。別の好ましい実施形態において、ナノフィルターは、Ａｓａｈｉ  ＰＬＡＮＯＶＡ  ２０Ｎフィルター（１９±２ｎｍ）またはその同等物等の約１９または２０ｎｍの平均孔径を有する。ある特別な実施形態において、陰イオン交換ステップから回収されたＩｇＧ組成物は、１５ｎｍ〜２５ｎｍ、好ましくは１９±２ｎｍの孔径を有するナノフィルターを使用してナノ濾過される。
【０１９５】
１０．限外／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）
精製プロセス中の任意のステップにおいて、限外濾過／透析濾過を実施してＩｇＧ組成物を濃縮することができる。１つの実施形態において、ナノ濾液は、ＵＦ／ＤＦによって濃縮される。１つの実施形態において、ナノ濾液は、限外濾過によって約２％〜約１０％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度に濃縮され得る。ある特定の実施形態において、限外濾過は、オープンチャネルスクリーンを有するカセット内で行われ、限外濾過膜は、約１００ｋＤａ未満、または約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０ｋＤａ未満、またはそれより小さいｋＤａの公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）を有する。ある好ましい実施形態において、限外濾過膜は、５０ｋＤａ以下のＮＭＷＣＯを有する。
【０１９６】
１つの実施形態において、オープンチャネル膜が、収量と保存安定性に影響を与えずに、結果として得られるＩｇＧ組成物を最新のＩＶＩＧ（例えば、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）液体、１０％ＩｇＧ）と比べてタンパク質濃度（２００ｍｇ／ｍＬ）の高さをほぼ２倍にするために、生成プロセスの終了付近で、特別に設計された後洗浄剤および製剤と共に使用される。大抵の市販の限外濾過膜では、主要タンパク質を損なわずに、２００ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度に達することができない。これらの膜は早期に詰まり、ゆえに、適切な後洗浄を達成するのは難しい。したがって、オープンチャネル膜構成を用いなければならない。オープンチャネル膜を用いても、タンパク質を著しく損なうことなく（損失が２％未満）、要求される濃度を得るために、特別に設計された後洗浄手法が利用されなければならない。さらに意外なこととして、２００ｍｇ／ｍＬの高いタンパク質濃度によって、低ｐＨ保存ステップのウイルス不活性化能力が低下することはない。
【０１９７】
限外濾過ステップが完了した後、静脈または筋肉内投与に適した溶液に対する透析濾過により、濃縮液をさらに濃縮してもよい。ある特定の実施形態では、透析濾過溶液は、安定剤および／または緩衝剤を含んでもよい。ある好ましい実施形態において、安定剤および緩衝剤は、適切な濃度、例えば、約０．２０Ｍ〜０．３０Ｍ、または約０．２２Ｍ〜約０．２８Ｍ、または約０．２４Ｍ〜約０．２６Ｍの、または０．２０±０．０１Ｍ、０．２１±０．０１Ｍ、０．２２±０．０１Ｍ、０．２３±０．０１Ｍ、０．２４±０．０１Ｍ、０．２５±０．０１Ｍ、０．２６±０．０１Ｍ、０．２７±０．０１Ｍ、０．２８±０．０１Ｍ、０．２９±０．０１Ｍ、もしくは０．３±０．０１Ｍの濃度のグリシンである。ある好ましい実施形態では、透析濾過緩衝液は、０．２５±０．０１Ｍのグリシンを含む。
【０１９８】
典型的には、透析濾過に対する最小交換体積は、当初の濃縮液の体積の少なくとも約３倍、または、当初の濃縮液の体積の少なくとも約４、５、６、７、８、９倍またはそれ以上である。ＩｇＧ溶液は、約５％〜約２５％（ｗ／ｖ）、または約６％〜約１８％（ｗ／ｖ）、または約７％〜約１６％（ｗ／ｖ）、または約８％〜約１４％（ｗ／ｖ）、または約９％〜約１２％の最終タンパク質濃度に、あるいは約５％、または６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、もしくはそれよりも高い最終濃度に濃縮され得る。１つの実施形態において、少なくとも約２３％の最終タンパク質濃度は、後洗浄画分を濃縮溶液に添加することなく、実現される。別の実施形態において、少なくとも約２４％の最終タンパク質濃度は、後洗浄画分を濃縮溶液に添加することなく、実現される。別の実施形態において、少なくとも約２４％の最終タンパク質濃度は、後洗浄画分を濃縮溶液に添加することなく、実現される。１つの実施形態において、溶液のｐＨは、透析濾過後、４．６〜５．１である。
【０１９９】
一例となる実施形態において、ＩｇＧ組成物のｐＨは、限外濾過の前に約４．５に調整される。溶液は、限外濾過を通して５±２％ｗ／ｖのタンパク質濃度に濃縮される。ＵＦ膜は、５０，０００ダルトン以下の公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）を有する（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒスルホン膜）。１０体積のｐＨ４．５±０．２の０．２５Ｍグリシン溶液に対して濃縮液を透析濾過する。限外−透析濾過操作を通して、溶液を約２℃〜約８℃の温度に維持する。透析濾過後、溶液は、少なくとも１１％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度に濃縮される。
【０２００】
１１．製剤
透析濾過ステップが完了した後、溶液のタンパク質濃度は、透析濾過緩衝液で、約５％〜約２０％（ｗ／ｖ）、または約６％〜約１８％（ｗ／ｖ）、または約７％〜約１６％（ｗ／ｖ）、または約８％〜約１４％（ｗ／ｖ）、または約９％〜約１２％の最終濃度に、あるいは約５％、または６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、もしくは２５％の最終濃度に調整される。１つの実施形態において、溶液の最終タンパク質濃度は、約９％〜約１１％、より好ましくは約１０％である。
【０２０１】
製剤化されたバルク溶液は、絶対孔径が約０．２２ミクロン以下、例えば約０．２ミクロンの膜フィルターを通して濾過することにより、さらに殺菌される。次いで、溶液は、適切に密封するための最終容器内に無菌で分注され、検査用の試料が採取される。
【０２０２】
１つの実施形態において、ＩｇＧ組成物は、透析濾過緩衝液で、１０．２±０．２％（ｗ／ｖ）の濃度にさらに調整される。別の実施形態において、ＩｇＧ組成物は、１５±１％（ｗ／ｖ）の濃度に調整される。別の実施形態において、ＩｇＧ組成物は、２０±１％（ｗ／ｖ）の濃度に調整される。別の実施形態において、ＩｇＧ組成物は、２５±１％（ｗ／ｖ）の濃度に調整される。ｐＨは、必要に応じて、約４．４〜約４．９に調整される。最終的に、溶液は滅菌濾過され、３週間、３０℃またはほぼその温度でインキュベートされる。
【０２０３】
Ｄ．免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）
１つの態様において、本発明は、濃縮免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）組成物をＣｏｈｎプールから調製するための方法を提供し、本方法は、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）をＣｏｈｎプールから共沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、Ａ１ＰＩを懸濁液から取り出すステップと、ＩｇＧを含有する第１の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。概して、免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩの沈殿のための任意の化学的方法が使用されてもよく、（例えば、エタノールまたはメタノールを使用する）アルコール沈殿、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧまたはデキストラン）を使用する沈殿、ならびに（例えば、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム等を使用する）塩析が挙げられるが、これらに限定されない。ある好ましい実施形態において、沈殿は、アルコール沈殿、好ましくはエタノール沈殿である。
【０２０４】
１つの実施形態において、本発明は、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップにおいてＩｇＧを脱クリオ血漿から沈殿させることによって、濃縮免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）組成物を調製するための方法を提供する。ある具体的な実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールを脱クリオ血漿に添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧを脱クリオ血漿から沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップと、ＩｇＧを第１の沈殿物から回収し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。
【０２０５】
１つの実施形態において、本方法は、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される最終濃度およびｐＨになるようにエタノールを脱クリオ血漿に添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧを脱クリオ血漿から沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップと、ＩｇＧを第１の沈殿物から回収し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。
【０２０６】
１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合することによって実施される。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５±２％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５±１％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。同様に、１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．５のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．４のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．３のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．２のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．１のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５のｐＨで実施される。さらに他の実施形態において、第１の沈殿ステップの最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。
【０２０７】
本明細書に提供される方法は、初期沈殿反応において出発Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の大半が沈殿するため、初期低アルコール沈殿ステップ（すなわち、画分Ｉ沈殿）に依存する最新の精製手法と比較して、最終濃縮生成物においてはるかに高いＩｇＧ回収量を提供する。
【０２０８】
したがって、本明細書に提供される方法の１つの実施形態では、初期沈殿反応において出発ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の少なくとも９０％が沈殿する。ある好ましい実施形態では、初期沈殿反応において出発ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の少なくとも９５％が沈殿する。より好ましい実施形態では、初期沈殿反応において出発ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の少なくとも９９％が沈殿する。ある特定の実施形態では、初期沈殿反応において出発ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が沈殿する。
【０２０９】
本明細書に提供される実施例に示されるように、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップ（すなわち、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿）の使用は、出発ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の少なくとも９９％の沈殿をもたらす。したがって、１つの実施形態において、本発明は、濃縮ＩｇＧ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧ含有量の９９％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップと、ＩｇＧを第１の沈殿物から回収し、それにより濃縮免疫グロブリン組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。
【０２１０】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮ＩｇＧ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、Ａ１ＰＩを懸濁液から取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性画分を回収し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。
【０２１１】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮ＩｇＧ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、Ａ１ＰＩを懸濁液から取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性画分を回収し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。さらに別の実施形態では、第１の上清中に見出されるアルブミンが、さらに濃縮される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。
【０２１２】
医薬品グレードのＩｇＧ組成物を提供するために、初期沈殿物中に存在するＡ１ＰＩおよびフィブリノゲン等の混入物を免疫グロブリン組成物から除去する必要がある。これは、例えば、第１の沈殿物のさらなる分画（例えば、アルコール、非イオン親水性ポリマーを使用する示差沈殿、または塩析による）、クロマトグラフィー手法、または濾過手法によって実現され得る。
【０２１３】
１つの実施形態において、第１の沈殿物は、ＩｇＧを沈殿物から抽出するのに好適な注射用水（ＷＦＩ）または低イオン強度緩衝液中に懸濁され、懸濁液は次いで、微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）で処理され、ＩｇＧを含有する懸濁液の可溶性部分は、Ａ１ＰＩおよびフィブリノゲンのバルクを含有する懸濁液の不溶性部分から分離される。
【０２１４】
第１の沈殿物の抽出に好適な溶液は、概して、４．０〜５．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、溶液は４．５〜５．０のｐＨを有し、他の実施形態において、抽出溶液は、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、または５．５のｐＨを有する。ある好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．７±０．１である。別の好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．８±０．１である。別の好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．９±０．１である。概して、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、第一リン酸塩、第二リン酸塩、それらの混合物等から選択される緩衝剤を使用してこれらのｐＨ要件を満たすことができる。好適な緩衝液濃度は、典型的には、５〜１００ｍＭ、または１０〜５０ｍＭ、または５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｍＭ緩衝剤の範囲である。
【０２１５】
抽出緩衝液は、好ましくは０．５ｍＳ／ｃｍ〜２．０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。例えば、ある特定の実施形態において、抽出緩衝液の伝導率は、０．５±０．１ｍＳ／ｃｍ、または０．６±０．１、０．７±０．１、０．８±０．１、０．９±０．１、１．０±０．１、１．１±０．１、１．２±０．１、１．３±０．１、１．４±０．１、１．５±０．１、１．６±０．１、１．７±０．１、１．８±０．１、１．９±０．１、もしくは２．０±０．１ｍＳ／ｃｍである。当業者は、適切な伝導率を有する抽出緩衝液の生成方法を知っている。１つの特別な実施形態において、抽出緩衝液は、４．８±０．２のｐＨおよび０．７〜０．９ｍＳ／ｃｍの伝導率で、５ｍＭ  第一リン酸ナトリウムおよび５ｍＭ  酢酸塩を含有する。
【０２１６】
１つの実施形態において、ヒュームドシリカは、分離（例えば、濾過または遠心分離）の前に、２０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜１００ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濃度で添加される。別の実施形態において、ヒュームドシリカは、３０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜８０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濃度で添加される。ある特定の実施形態において、ヒュームドシリカは、約２０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物、または約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濃度で添加され得る。１つの具体的な実施形態において、ヒュームドシリカ（例えば、Ａｅｒｏｓｉｌ３８０または同等物）は、４０±２０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液に添加される。別の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液に添加される。混合は、２℃〜８℃で少なくとも５０〜７０分間行われる。
【０２１７】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、濃縮ＩｇＧ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、ＩｇＧを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、ＳｉＯ２は、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように添加される。
【０２１８】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮ＩｇＧ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、ＩｇＧを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、懸濁液の可溶性部分に存在するＩｇＧが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＡ１ＰＩが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するフィブリノゲンが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＨ因子が、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＩａＩｐが、さらに濃縮される。さらに別の実施形態では、第１の上清中に見出されるアルブミンが、さらに濃縮される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、ＳｉＯ２は、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように添加される。
【０２１９】
１つの実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分から回収されたＩｇＧは、分画によりさらに濃縮される。概して、分画の任意の方法（例えば、アルコールもしくはポリマー沈殿、塩析等）が使用され得る。ある好ましい実施形態において、ＩｇＧは、第１の懸濁液の可溶性部分をエタノール沈殿により分画することによって、さらに濃縮される。１つの実施形態において、ＩｇＧは、ＩｇＧを沈殿させるのに適しているが、少なくとも１つの混入物を沈殿させない最終濃度およびｐＨでエタノールを第１の懸濁液の可溶性部分に添加することによって濃縮される。別の実施形態において、ＩｇＧは、少なくとも１つの混入物を沈殿させるのに適しているが、ＩｇＧを沈殿させない最終濃度およびｐＨでエタノールを第１の懸濁液の可溶性部分に添加することによって濃縮される。
【０２２０】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮ＩｇＧ組成物をＣｏｈｎプールから調製するための方法を提供し、本方法は、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）をＣｏｈｎプールから共沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、懸濁液からＡ１ＰＩを取り出すステップと、第２の沈殿ステップにおいてＩｇＧを第１の懸濁液から沈殿させて、ＩｇＧを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、ＩｇＧを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態において、第１の懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。
【０２２１】
一例となる実施形態において、第２の沈殿ステップは、エタノールを２２％〜２８％（ｖ／ｖ）の最終濃度で６．５〜７．５のｐＨで第２の懸濁液の可溶性部分（例えば、濾過または遠心分離後に形成された、懸濁液の濾液または上清）と混合することによって実施される。１つの実施形態において、エタノールは、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるように混合される。別の実施形態において、エタノールは、２５±２％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるように混合される。別の実施形態において、エタノールは、２５±１％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるように混合される。別の実施形態において、エタノールは、２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるように混合される。同様に、１つの実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．５のｐＨで実施される。別の実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．４のｐＨで実施される。別の実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．３のｐＨで実施される。別の実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．２のｐＨで実施される。別の実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．１のｐＨで実施される。別の実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０のｐＨで実施される。ある特別な実施形態において、第２の沈殿ステップは、７．０±０．３のｐＨで２５±３％（ｖ／ｖ）の最終エタノール濃度を使用して実施される。
【０２２２】
ある特別な実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧ含有量の９９％〜１００％をＣｏｈｎプール血漿から沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第２の沈殿ステップにおいてＩｇＧを第１の懸濁液から沈殿させて、ＩｇＧを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、ＩｇＧを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。
【０２２３】
ある具体的な実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧ含有量の９９％〜１００％をＣｏｈｎプール血漿から沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、エタノールを２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で７．０±０．３のｐＨで第１の懸濁液と混合することによって、第２の沈殿ステップにおいてＩｇＧを第１の懸濁液から沈殿させて、ＩｇＧを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、ＩｇＧを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。
【０２２４】
１つの実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、懸濁液からＡ１ＰＩを取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性画分を回収するステップと、第２の沈殿ステップにおいてＩｇＧを第１の懸濁液から沈殿させて、ＩｇＧを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、ＩｇＧを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。１つの実施形態において、第１の懸濁液から分離されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。
【０２２５】
ある具体的な実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、懸濁液からＡ１ＰＩを取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性画分を回収するステップと、エタノールを２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で７．０±０．３のｐＨで第１の懸濁液と混合することによって、第２の沈殿ステップにおいてＩｇＧを第１の懸濁液から沈殿させて、ＩｇＧを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、ＩｇＧを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。１つの実施形態において、第１の懸濁液から分離されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。
【０２２６】
別の実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９９％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、Ａ１ＰＩを懸濁液から取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性部分を回収するステップと、第２の沈殿ステップにおいてＩｇＧを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、ＩｇＧを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、ＩｇＧを第２の沈殿物から回収し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。１つの実施形態において、第１の懸濁液から分離されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。別の実施形態において、第１の上清中に存在するアルブミンが、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある好ましい実施形態において、Ｃｏｈｎプールのアルブミン含有量の９０％〜１００％が、第１の上清中に存在する。
【０２２７】
別の実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９９％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、Ａ１ＰＩを懸濁液から取り出すステップと、第１の懸濁液の可溶性部分を回収するステップと、エタノールを２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で７．０±０．３のｐＨで第１の懸濁液の可溶性部分と混合することによって、第２の沈殿ステップにおいてＩｇＧを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、ＩｇＧを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、ＩｇＧを第２の沈殿物から回収し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。１つの実施形態において、第１の懸濁液から分離されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。別の実施形態において、第１の上清中に存在するアルブミンが、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある好ましい実施形態において、Ｃｏｈｎプールのアルブミン含有量の９０％〜１００％が、第１の上清中に存在する。
【０２２８】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮ＩｇＧ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、ＩｇＧを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離し、第１の懸濁液の可溶性部分を回収するステップと、第２の沈殿ステップにおいてＩｇＧを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、ＩｇＧを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、ＩｇＧを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、ＳｉＯ２は、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように添加される。
【０２２９】
ある具体的な実施形態において、本発明は、濃縮ＩｇＧ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、ＩｇＧを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離し、第１の懸濁液の可溶性部分を回収するステップと、エタノールを２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で７．０±０．３のｐＨで第１の懸濁液の可溶性部分と混合することによって、第２の沈殿ステップにおいてＩｇＧを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、ＩｇＧを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、ＩｇＧを第２の沈殿物から回収し、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、ＳｉＯ２は、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように添加される。
【０２３０】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮ＩｇＧ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、ＩｇＧを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離するステップと、第２の沈殿ステップにおいてＩｇＧを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、ＩｇＧを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、ＩｇＧを第２の沈殿物から回収し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＡ１ＰＩが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するフィブリノゲンが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＨ因子が、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＩａＩｐが、さらに濃縮される。さらに別の実施形態では、第１の上清中に見出されるアルブミンが、さらに濃縮される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、ＳｉＯ２は、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように添加される。
【０２３１】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮ＩｇＧ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＩｇＧおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、ＩｇＧを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離するステップと、エタノールを２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で７．０±０．３のｐＨで第１の懸濁液の可溶性部分と混合することによって、第２の沈殿ステップにおいてＩｇＧを第１の懸濁液の可溶性部分から沈殿させて、ＩｇＧを含む第２の沈殿物および少なくとも１つの混入物を含む第２の上清を形成するステップと、ＩｇＧを第２の沈殿物から回収し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮ＩｇＧ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第２の沈殿物から回収されたＩｇＧは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＡ１ＰＩが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するフィブリノゲンが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＨ因子が、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＩａＩｐが、さらに濃縮される。さらに別の実施形態では、第１の上清中に見出されるアルブミンが、さらに濃縮される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、ＣｏｈｎプールのＩｇＧ含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある特定の実施形態において、第１の沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、ＳｉＯ２は、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように添加される。
【０２３２】
１つの実施形態において、ＩｇＧは、沈殿物を冷たい抽出緩衝液で懸濁することによって、第２の沈殿物から回収される。例えば、第２の沈殿物は、沈殿物１部 対 注射用水（ＷＦＩ）または低伝導率緩衝液２〜５部の比率で懸濁される。ある好ましい実施形態において、第２の沈殿物は、沈殿物１部 対 ＷＦＩ４〜５部、好ましくは３．５部の比率で懸濁された。１つの実施形態において、懸濁ステップは、０℃〜８℃の温度で実施される。１つの実施形態において、溶液の最終ｐＨは、４．８〜５．６、好ましくは５．２±０．２に調整される。１つの実施形態において、このｐＨ調整は、酢酸を用いて実施される。１つの実施形態において、ＩｇＧの可溶性を高めるために、懸濁液の伝導率を２．５〜６．０ｍＳ／ｃｍに増加させる。１つの実施形態において、塩化ナトリウムの添加によって伝導率を増加させる。
【０２３３】
第２の沈殿物の抽出に適した溶液には、ＷＦＩおよび低伝導率緩衝液が挙げられる。１つの実施形態において、低伝導率緩衝液は、約１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。他の実施形態において、低伝導率緩衝液は、約９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。ある好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約６ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。別の好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約４ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。別の好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。
【０２３４】
１つの実施形態において、ＩｇＧを含む第１の懸濁液の可溶性部分が、不溶性部分から分離される。１つの実施形態において、これは、懸濁液を０．１μｍ〜０．４μｍの公称孔径を有するデプスフィルターで濾過することによって行われる。１つの実施形態において、デプスフィルターの公称孔径は、０．２μｍ（例えば、Ｃｕｎｏ  ＶＲ０６フィルターまたは同等物）である。１つの実施形態において、さらなるＩｇＧを回収するために、濾過後にフィルターをＷＦＩまたは好適な緩衝液で洗浄し、その後洗浄液を濾液に添加する。ある好ましい実施形態において、フィルターの後洗浄は、約２．５〜約６．０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する塩化ナトリウム溶液を使用して実施される。別の実施形態において、第２の懸濁液は、可溶性部分を回収するために遠心分離される。
【０２３５】
本発明の１つの態様において、濃縮ＩｇＧ組成物を調製するために提供される方法は、少なくとも１つのさらなる血液因子を同じＣｏｈｎプールから精製することをさらに含む。１つの実施形態において、本方法は、少なくとも２つのさらなる血液タンパク質を同じＣｏｈｎプールから精製することをさらに含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも３つのさらなる血液タンパク質を同じＣｏｈｎプールから精製することをさらに含む。さらに他の実施形態において、本方法は、少なくとも４、５、６、またそれ以上のさらなる血液タンパク質を同じＣｏｈｎプールから精製することをさらに含む。ＩｇＧと同じＣｏｈｎプールから共精製され得る例となる血液タンパク質には、限定することなく、アルブミン、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）、Ｈ因子、インターαインヒビタータンパク質（ＩａＩｐ）、プロトロンビン複合体、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、フィブリノゲン、ブチリルコリンエステラーゼ等が挙げられる。
【０２３６】
１つの実施形態では、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）が、ＩｇＧと同じＣｏｈｎプールからさらに精製される。ある具体的な実施形態では、Ａ１ＰＩが、第１の懸濁液の不溶性画分から精製される。
【０２３７】
別の実施形態では、フィブリノゲンが、ＩｇＧと同じＣｏｈｎプールからさらに精製される。ある具体的な実施形態では、フィブリノゲンが、第１の懸濁液の不溶性画分から精製される。別の具体的な実施形態では、Ａ１ＰＩおよびフィブリノゲンの両方が、第１の懸濁液の不溶性画分から精製される。
【０２３８】
別の実施形態では、Ｈ因子が、ＩｇＧと同じＣｏｈｎプールからさらに精製される。ある具体的な実施形態では、Ｈ因子が、第１の懸濁液の不溶性画分から精製される。別の具体的な実施形態では、Ａ１ＰＩおよびＨ因子の両方が、第１の懸濁液の不溶性画分から精製される。
【０２３９】
別の実施形態では、インターαインヒビタータンパク質（ＩａＩｐ）が、ＩｇＧと同じＣｏｈｎプールからさらに精製される。ある具体的な実施形態では、ＩａＩｐが、第１の懸濁液の不溶性画分から精製される。別の具体的な実施形態では、Ａ１ＰＩおよびＩａＩｐの両方が、第１の懸濁液の不溶性画分から精製される。
【０２４０】
別の実施形態では、アルブミンが、ＩｇＧと同じＣｏｈｎプールからさらに精製される。ある具体的な実施形態では、アルブミンは、形成された第１の上清から精製される。ある具体的な実施形態において、形成された第１の上清からアルブミンが精製され、一方、形成された第１の懸濁液の不溶性部分から、少なくとも１つのさらなる血液因子が精製される。
【０２４１】
１つの実施形態において、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップから回収された免疫グロブリンは、下流のＫｉｓｔｌｅｒ−ＮｉｔｓｃｈｍａｎｎまたはＤｅｕｔｓｃｈらの分画に従ってさらに濃縮される。例えば、回収された免疫グロブリン組成物は、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ  Ｂ沈殿またはＤｅｕｔｓｃｈらのβグロブリン沈殿と類似したステップに供され得る。これらのステップで用いられる条件は、免疫グロブリンＧが上清中に残存する一方で、αおよびβグロブリンの沈殿をもたらす。
【０２４２】
したがって、１つの態様において、本発明は、（ｉ）初期低ｐＨ、高アルコール沈殿において免疫グロブリンおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）をＣｏｈｎプールから共沈殿させるステップと、（ｉｉ）沈殿物から免疫グロブリンを回収するステップと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの非γグロブリンタンパク質を、第１の沈殿物から回収された免疫グロブリン組成物から沈殿させるステップと、（ｉｖ）第２の沈殿ステップから上清を回収するステップとを含む、濃縮免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）組成物を調製するための方法を提供する。ある特定の実施形態において、これらの方法は、追加の沈殿ステップ（例えば、沈殿物Ｇ沈殿）、陰イオンおよび／または陽イオン交換ステップ、１つまたは複数の限外濾過／透析濾過ステップ、ならびに１つまたは複数のウイルス低減または不活性化ステップ（例えば、Ｓ／Ｄ処理、ナノ濾過、低ｐＨでのインキュベーション等）をさらに含み得る。
【０２４３】
Ｖ．α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）組成物の調製
供給された血漿から血液タンパク質を製造するための現代の方法は、１９４０年代および１９５０年代に行われた初期研究から派生している。この研究が主としてアルブミンおよびγ免疫グロブリン（ＩｇＧ）の精製に着目していたため、開発された分画スキームは、治療上より重要となっているさらなる血液タンパク質の回収には最適化されていなかった。例えば、血漿の初期高ｐＨ、低アルコール沈殿（例えば、画分Ｉ沈殿）の使用は、画分Ｉ沈殿物中のＨ因子、ＩａＩｐ、およびある程度の免疫グロブリンの一部の損失をもたらす。さらに、その後続く沈殿ステップ（例えば、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿または沈殿Ａ）によって実現される免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩの分離は不完全であり、不完全な沈殿による上清中の免疫グロブリンの損失ならびに部分沈殿による沈殿物中のＡ１ＰＩの損失を伴う。したがって、複数の血液タンパク質のより高い収量を提供する最新の分画方法が必要とされる。
【０２４４】
本発明は、初期沈殿物中の免疫グロブリン、Ａ１ＰＩ、および他の血液タンパク質ならびに初期上清中のアルブミンを分画する初期沈殿ステップの使用を通して、これらの要件を満たす方法を提供する。ある好ましい実施形態において、この初期沈殿は、低ｐＨ、高アルコール条件下で実施される。
【０２４５】
１つの態様において、本発明は、Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩ含有量のバルクを沈殿させる初期ステップを使用して、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）を、貯蔵された血漿から製造するための方法を提供する。ある特別な実施形態において、この初期ステップは、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップである。本明細書に提供される実施例に示されるように、出発ＣｏｈｎプールのＡ１ＰＩ含有量の９５％超がこれらの条件下で沈殿する。さらに、本発明は、この初期沈殿においてＡ１ＰＩおよび免疫グロブリンを効率的に分離するための方法を提供する。
【０２４６】
１つの態様において、本発明は、濃縮α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）組成物をＣｏｈｎプールから調製するための方法を提供し、本方法は、第１の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩをＣｏｈｎプールから共沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物中に存在する免疫グロブリンを可溶化して、免疫グロブリンを含む可溶性部分およびＡ１ＰＩを含む不溶性部分を有する第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分を分離するステップと、Ａ１ＰＩを第１の懸濁液の不溶性部分から回収し、それにより濃縮Ａ１ＰＩ組成物を形成するステップとを含む。概して、免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩの沈殿のための任意の化学的方法が使用されてもよく、（例えば、エタノールまたはメタノールを使用する）アルコール沈殿、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧまたはデキストラン）を使用する沈殿、ならびに（例えば、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム等を使用する）塩析が挙げられるが、これらに限定されない。ある好ましい実施形態において、沈殿は、アルコール沈殿、好ましくはエタノール沈殿である。
【０２４７】
１つの実施形態において、本発明は、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップにおいてＡ１ＰＩを脱クリオ血漿から沈殿させることによって、濃縮Ａ１ＰＩ組成物を調製するための方法を提供する。ある具体的な実施形態において、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールを脱クリオ血漿に添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＡ１ＰＩを脱クリオ血漿から沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップと、Ａ１ＰＩを第１の沈殿物から回収し、それにより濃縮Ａ１ＰＩ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。
【０２４８】
１つの実施形態において、本方法は、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される最終濃度およびｐＨになるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＡ１ＰＩをＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップと、Ａ１ＰＩを第１の沈殿物から回収し、それにより濃縮Ａ１ＰＩ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。
【０２４９】
１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．０〜６．０のｐＨで２２％〜２８％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合することによって実施される。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５±２％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５±１％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。別の実施形態において、２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。同様に、１つの実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．５のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．４のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．３のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．２のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５±０．１のｐＨで実施される。別の実施形態において、第１の沈殿ステップは、５．５のｐＨで実施される。さらに他の実施形態において、第１の沈殿ステップの最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。
【０２５０】
本明細書に提供される方法は、初期沈殿反応において出発ＣｏｈｎプールのＡ１ＰＩ含有量の大半が沈殿するため、初期低アルコール沈殿ステップ（すなわち、画分Ｉ沈殿）に依存する最新の精製手法と比較して、最終濃縮生成物においてはるかに高いＡ１ＰＩ回収量を提供する。
【０２５１】
したがって、本明細書に提供される方法の１つの実施形態では、初期沈殿反応において、出発Ｃｏｈｎプールのα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）含有量の少なくとも８０％が沈殿する。ある好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＡ１ＰＩ含有量の少なくとも９０％が沈殿する。より好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＡ１ＰＩ含有量の少なくとも９５％が沈殿する。最も好ましい実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＡ１ＰＩ含有量の少なくとも９７％が沈殿する。ある特定の実施形態では、初期沈殿反応において、出発ＣｏｈｎプールのＡ１ＰＩ含有量の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が沈殿する。
【０２５２】
本明細書に提供される実施例に示されるように、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップ（すなわち、画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿）の使用は、出発ＣｏｈｎプールのＡ１ＰＩ含有量の少なくとも９５％の沈殿をもたらす。したがって、１つの実施形態において、本発明は、濃縮Ａ１ＰＩ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいてＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を第１の上清から分離するステップと、Ａ１ＰＩを第１の沈殿物から回収し、それにより濃縮Ａ１ＰＩ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の沈殿物から回収されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。
【０２５３】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮Ａ１ＰＩ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物中に存在する免疫グロブリンを可溶化して、免疫グロブリンを含む可溶性部分およびＡ１ＰＩを含む不溶性部分を有する第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分を分離するステップと、Ａ１ＰＩを第１の懸濁液の不溶性部分から回収し、それにより濃縮Ａ１ＰＩ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分から回収された免疫グロブリンは、さらに濃縮される。別の実施形態において、第１の懸濁液の不溶性画分から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の９９％〜１００％が沈殿する。
【０２５４】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮Ａ１ＰＩ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物中に存在する免疫グロブリンを可溶化して、免疫グロブリンを含む可溶性部分およびＡ１ＰＩを含む不溶性部分を有する第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分を分離するステップと、Ａ１ＰＩを第１の懸濁液の不溶性部分から回収し、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在しており、それにより濃縮Ａ１ＰＩ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分から回収された免疫グロブリンは、さらに濃縮される。別の実施形態において、第１の懸濁液の不溶性部分から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。さらに別の実施形態では、第１の上清中に見出されるアルブミンが、さらに濃縮される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。
【０２５５】
１つの実施形態において、第１の沈殿物は、沈殿物から免疫グロブリンを抽出するのに適した注射用水（ＷＦＩ）または低イオン強度緩衝液中に懸濁され、懸濁液は次いで、微粉化二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）で処理され、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分は、Ａ１ＰＩ含有量のバルクを含有する懸濁液の不溶性部分から分離される。
【０２５６】
第１の沈殿物からの免疫グロブリンの抽出に好適な溶液は、概して、４．０〜５．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、溶液は４．５〜５．０のｐＨを有し、他の実施形態において、抽出溶液は、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、または５．５のｐＨを有する。ある好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．７±０．１である。別の好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．８±０．１である。別の好ましい実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、４．９±０．１である。概して、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、第一リン酸塩、第二リン酸塩、それらの混合物等から選択される緩衝剤を使用してこれらのｐＨ要件を満たすことができる。好適な緩衝液濃度は、典型的には、５〜１００ｍＭ、または１０〜５０ｍＭ、または５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｍＭ緩衝剤の範囲である。
【０２５７】
抽出緩衝液は、好ましくは０．５ｍＳ／ｃｍ〜２．０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。例えば、ある特定の実施形態において、抽出緩衝液の伝導率は、０．５±０．１ｍＳ／ｃｍ、または０．６±０．１、０．７±０．１、０．８±０．１、０．９±０．１、１．０±０．１、１．１±０．１、１．２±０．１、１．３±０．１、１．４±０．１、１．５±０．１、１．６±０．１、１．７±０．１、１．８±０．１、１．９±０．１、もしくは２．０±０．１ｍＳ／ｃｍである。当業者は、適切な伝導率を有する抽出緩衝液の生成方法を知っている。１つの特別な実施形態において、抽出緩衝液は、４．８±０．２のｐＨおよび０．７〜０．９ｍＳ／ｃｍの伝導率で、５ｍＭ  第一リン酸ナトリウムおよび５ｍＭ  酢酸塩を含有する。
【０２５８】
１つの実施形態において、ヒュームドシリカは、分離（例えば、濾過または遠心分離）の前に、２０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜１００ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濃度で添加される。別の実施形態において、ヒュームドシリカは、３０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物〜８０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濃度で添加される。ある特定の実施形態において、ヒュームドシリカは、約２０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物、または約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濃度で添加され得る。１つの具体的な実施形態において、ヒュームドシリカ（例えば、Ａｅｒｏｓｉｌ３８０または同等物）は、４０±２０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液に添加される。別の具体的な実施形態において、ヒュームドシリカは、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液に添加される。混合は、２℃〜８℃で少なくとも５０〜７０分間行われる。
【０２５９】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、濃縮Ａ１ＰＩ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩを含有する懸濁液の不溶性部分から分離するステップと、Ａ１ＰＩを第１の懸濁液の不溶性部分から回収し、それにより濃縮Ａ１ＰＩ組成物を形成するステップとを含む。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態では、第１の沈殿物から回収された免疫グロブリンは、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液から取り出されたＡ１ＰＩは、さらに濃縮される。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、ＳｉＯ２は、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように添加される。
【０２６０】
１つの実施形態において、本発明は、濃縮Ａ１ＰＩ組成物を調製するための方法を提供し、本方法は、５．０〜６．０のｐＨで２０％〜３０％の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールに添加することによって、第１の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩ含有量の９５％〜１００％をＣｏｈｎプールから沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液を微粉化二酸化ケイ素で処理するステップと、免疫グロブリンを含有する懸濁液の可溶性部分を、Ａ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含有する懸濁液の不溶性部分から分離するステップとを含み、ここでＣｏｈｎプールのアルブミン含有量の８０％〜１００％は第１の上清中に存在している。１つの実施形態において、２５±３％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにエタノールをＣｏｈｎプールと混合する。１つの実施形態では、懸濁液の可溶性部分に存在する免疫グロブリンが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＡ１ＰＩが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するフィブリノゲンが、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＨ因子が、さらに濃縮される。別の実施形態では、懸濁液の不溶性部分に存在するＩａＩｐが、さらに濃縮される。さらに別の実施形態では、第１の上清中に見出されるアルブミンが、さらに濃縮される。ある好ましい実施形態では、第１の沈殿ステップにおいて、Ｃｏｈｎプールの免疫グロブリン含有量の９９％〜１００％が沈殿する。ある特定の実施形態において、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップで使用される最終エタノール濃度およびｐＨは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に記載されるように、Ｖａｒ．１〜２１６６から選択される。ある具体的な実施形態において、第１の懸濁液の可溶性部分と不溶性部分は、濾過によって分離される。１つの実施形態において、ＳｉＯ２は、４０±１０ｇ／ｋｇ画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の最終濃度になるように添加される。
【０２６１】
１つの実施形態において、ＩｇＧを含有する第１の懸濁液の可溶性部分は、懸濁液を０．１μｍ〜０．４μｍの公称孔径を有するデプスフィルターで濾過することによって、Ａ１ＰＩを含有する不溶性部分から分離される。１つの実施形態において、デプスフィルターの公称孔径は、０．２μｍ（例えば、Ｃｕｎｏ  ＶＲ０６フィルターまたは同等物）である。１つの実施形態において、さらなるＩｇＧを回収するために、濾過後にフィルターをＷＦＩまたは好適な緩衝液で洗浄し、その後洗浄液を濾液に添加する。別の実施形態において、第１の懸濁液は、可溶性部分と不溶性部分を分離するために遠心分離される。
【０２６２】
１つの実施形態において、Ａ１ＰＩは、Ａ１ＰＩ抽出緩衝液中の不溶性部分を懸濁することによって分離された不溶性部分から回収される。例えば、１つの実施形態において、分離された不溶性部分は、不溶性物質１部 対 注射用水（ＷＦＩ）または低伝導率緩衝液２〜１５部の比率で懸濁されて、第２の懸濁液を形成する。別の実施形態では、分離された不溶性部分は、不溶性物質１部 対 注射用水（ＷＦＩ）または低伝導率緩衝液２〜１０部の比率で懸濁される。別の実施形態では、分離された不溶性部分は、不溶性物質１部 対 注射用水（ＷＦＩ）または低伝導率緩衝液３〜７部の比率で懸濁される。さらに他の実施形態では、分離された不溶性部分は、不溶性物質１部 対 注射用水（ＷＦＩ）または低伝導率緩衝液２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０部、またはそれ以上の比率で懸濁される。１つの実施形態において、抽出は、少なくとも２時間撹拌される。別の実施形態では、抽出は、少なくとも４時間撹拌される。別の実施形態では、抽出は、少なくとも８時間撹拌される。別の実施形態では、抽出は、６〜１２時間撹拌される。１つの実施形態では、抽出は、１０℃〜２５℃で実施される。別の実施形態では、抽出は、１７±５℃で実施される。別の実施形態では、抽出は、１７±４℃で実施される。別の実施形態では、抽出は、１７±３℃で実施される。別の実施形態では、抽出は、１７±２℃で実施される。別の実施形態では、抽出は、１７±１℃で実施される。１つの実施形態において、Ａ１ＰＩを含有する可溶性部分は、濾過、例えば、デプス濾過によって不溶性部分から分離される。別の実施形態において、Ａ１ＰＩを含有する可溶性部分は、遠心分離によって不溶性部分から分離される。
【０２６３】
Ａ１ＰＩの抽出に適した溶液には、ＷＦＩおよび低伝導率緩衝液が挙げられる。１つの実施形態において、低伝導率緩衝液は、約１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。他の実施形態において、低伝導率緩衝液は、約９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。ある好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約６ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。別の好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約４ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。別の好ましい実施形態において、低伝導率緩衝液は、約２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。１つの実施形態では、ＷＦＩまたは低伝導率緩衝液は、８．０〜９．５のｐＨを有する。ある特別な実施形態では、Ａ１ＰＩ抽出緩衝液のｐＨは、８．８±０．５である。ある具体的な実施形態では、Ａ１ＰＩ抽出緩衝液のｐＨは、８．８±０．４である。ある具体的な実施形態では、Ａ１ＰＩ抽出緩衝液のｐＨは、８．８±０．３である。ある具体的な実施形態では、Ａ１ＰＩ抽出緩衝液のｐＨは、８．８±０．２である。ある具体的な実施形態では、Ａ１ＰＩ抽出緩衝液のｐＨは、８．８±０．１である。さらに他の実施形態において、Ａ１ＰＩ抽出緩衝液のｐＨは、８．０±０．２、８．１±０．２、８．２±０．２、８．３±０．２、８．４±０．２、８．５±０．２、８．６±０．２、８．７±０．２、８．８±０．２、８．９±０．２、９．０±０．２、９．１±０．２、９．２±０．２、９．３±０．２、９．４±０．２、または９．５±０．２である。
【０２６４】
１つの実施形態において、第１の懸濁液の分離された不溶性部分は、Ａ１ＰＩ緩衝液を使用する抽出の前に、Ａ１ＰＩを抽出するのに適していないＷＦＩまたは低イオン強度緩衝液中に懸濁されて、中間懸濁液を形成する。この実施形態において、本方法は、７．０を超えないｐＨでＷＦＩまたは低イオン強度緩衝液中に不溶性部分を懸濁することと、中間懸濁液の可溶性部分と不溶性部分を分離することと、中間懸濁液の不溶性部分中のＡ１ＰＩを回収することとを含む。１つの実施形態では、中間懸濁液は、不溶性物質１部 対 ＷＦＩまたは緩衝液２〜１５部の比率で不溶性物質を懸濁することによって形成される。１つの実施形態において、ＷＦＩまたは低イオン強度緩衝液は、４．５〜６．５のｐＨを有する。別の実施形態において、低イオン強度緩衝液は、５．５±０．４のｐＨを有する。別の実施形態において、低イオン強度緩衝液は、５．５±０．３のｐＨを有する。別の実施形態において、低イオン強度緩衝液は、５．５±０．２のｐＨを有する。別の実施形態において、低イオン強度緩衝液は、５．５±０．１のｐＨを有する。さらに他の実施形態において、低イオン強度緩衝液は、４．５±０．２、４．６±０．２、４．７±０．２、４．８±０．２、４．９±０．２、５．０±０．２、５．１±０．２、５．２±０．２、５．３±０．２、５．４±０．２、５．５±０．２、５．６±０．２、５．７±０．２、５．８±０．２、５．９±０．２、６．０±０．２、６．１±０．２、６．２±０．２、６．３±０．２、６．４±０．２、または６．５±０．２のｐＨを有する。１つの実施形態において、可溶性部分は、濾過、例えば、デプス濾過によって、Ａ１ＰＩを含有する不溶性部分から分離される。別の実施形態において、可溶性部分は、Ａ１ＰＩを含有する不溶性部分から遠心分離によって分離される。
【０２６５】
１つの実施形態では、第１の懸濁液の不溶性部分から抽出されたＡ１ＰＩは、限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡＰ）、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等）、濾過（例えば、限外濾過および／または透析濾過）、ならびに１つまたは複数のウイルス低減ステップ（例えば、ナノ濾過、溶媒および洗浄剤処理、ＵＶ照射、熱処理、低ｐＨインキュベーション等）が挙げられる、当該技術分野においてよく知られた方法に従って、さらに濃縮される。
【０２６６】
１つの実施形態において、第１の懸濁液の不溶性部分から抽出されたＡ１ＰＩは、分画によってさらに濃縮される。概して、分画の任意の方法（例えば、アルコールもしくはポリマー沈殿、塩析等）が使用され得る。ある好ましい実施形態において、組成物は、二価カチオン、好ましくは亜鉛を用いてＡ１ＰＩを清澄化抽出溶液から沈殿させることによってさらに濃縮される。１つの実施形態において 、塩化亜鉛は、１ｍＭ〜１５ｍＭの最終濃度で溶液に添加される。ある具体的な実施形態において、塩化亜鉛は、１ｍＭ〜４ｍＭの最終濃度で溶液に添加される。より具体的な実施形態において、塩化亜鉛は、２．０ｍＭ〜３．０ｍＭの最終濃度で溶液に添加される。
【０２６７】
ある特定の実施形態において、Ａ１ＰＩは、当該技術分野で知られている精製方法、例えば、国際公開公報第１９９５／３５３０６号、国際公開公報第１９９８／００１５４号、ならびに米国特許第５，９８１，７１５号、同第７，８０７，４３５号、および同第７，８７９，８００号（これらの開示は、参照によりあらゆる目的においてその全体が明示的に本明細書に組み込まれる）に従って、さらに濃縮される。
【０２６８】
ＶＩ．薬学的組成物
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかに従って調製される血漿由来タンパク質の組成物を提供する。ある特定の実施形態において、これらの組成物は、薬学的投与用に製剤化される（すなわち、薬学的組成物）。
【０２６９】
１つの実施形態において、本発明は、第１の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）をＣｏｈｎプールから共沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液から免疫グロブリンを可溶化して、免疫グロブリンを含む懸濁液の可溶性部分ならびにＡ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含む懸濁液の不溶性部分を形成するステップと、懸濁液の可溶性部分を懸濁液の不溶性部分から分離するステップとを含む方法によって調製される血漿由来タンパク質組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本組成物は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、アルブミン、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）、ブチリルコリンエステラーゼ、Ｈ因子、補体系のタンパク質、ならびにインターαトリプシンインヒビター（ＩαＩ）タンパク質から選択される、血漿由来タンパク質を含む。
【０２７０】
概して、免疫グロブリンおよびＡ１ＰＩの沈殿のための任意の化学的方法が使用されてもよく、（例えば、エタノールまたはメタノールを使用する）アルコール沈殿、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧまたはデキストラン）を使用する沈殿、ならびに（例えば、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム等を使用する）塩析が挙げられるが、これらに限定されない。ある好ましい実施形態において、沈殿は、アルコール沈殿、好ましくはエタノール沈殿である。
【０２７１】
１つの実施形態において、組成物は、薬学的投与用に製剤化される。ある具体的な実施形態において、組成物は、静脈内投与用に製剤化される。別の具体的な実施形態において、組成物は、筋肉内投与用に製剤化される。別の実施形態において、組成物は、皮下投与用に製剤化される。さらに別の実施形態において、組成物は、眼内投与用に製剤化される。
【０２７２】
１つの実施形態において、本明細書に提供される薬学的組成物は、本明細書に提供される方法を用いて単離された血漿由来タンパク質組成物を製剤化することによって調製される。概して、製剤化された組成物は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つのウイルス不活性化または除去ステップに供されることになる。本明細書に提供される方法と共に用いられるウイルス不活性化または除去ステップの非限定的な例としては、溶媒洗浄剤処理（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ  １９９４（５  Ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ２１−Ｓ２８およびＫｒｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２００３（４３）：１０２３−１０２８、この両方が、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）、ナノ濾過（Ｈａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  １９８９（５６）２３０−２３６およびＹｕａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．１９９１（７２（ｐｔ８））：２０２１−２０２４、この両方が、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）、ならびに高温での低ｐＨインキュベーション（Ｋｅｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  １９９１（３１）４２３−４２７およびＬｏｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  １９９４（２２）：１３−１９）が挙げられる。ある特定の実施形態において、本組成物は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、アルブミン、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）、ブチリルコリンエステラーゼ、Ｈ因子、補体系のタンパク質、ならびにインターαトリプシンインヒビター（ＩαＩ）タンパク質から選択される、血漿由来タンパク質を含む。
【０２７３】
１つの実施形態において、本明細書に提供される薬学的組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、および／または眼内投与に適した１種または複数種の緩衝剤またはｐＨ安定剤を含む。本明細書に提供される血漿由来タンパク質組成物を製剤化するのに適した緩衝剤の非限定的な例には、グリシン、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、グルタミン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、ヒスチジンもしくは他のアミノ酸、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、炭酸塩、または適切なｐＨに調整されているそれらの任意の組み合わせが挙げられる。概して、緩衝剤は、製剤中で好適なｐＨを長期間維持するのに十分である。ある好ましい実施形態において、緩衝剤はグリシンである。ある特定の実施形態において、本組成物は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、アルブミン、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）、ブチリルコリンエステラーゼ、Ｈ因子、補体系のタンパク質、ならびにインターαトリプシンインヒビター（ＩαＩ）タンパク質から選択される、血漿由来タンパク質を含む。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される薬学的組成物は、任意で、組成物のモル浸透圧濃度を調整するための薬剤をさらに含み得る。モル浸透圧濃度調整剤（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）の非限定的な例には、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、スクロース、グルコース、右旋糖、レブロース、フルクトース、ラクトース、ポリエチレングリコール、ホスフェート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、グルコノグルコヘプトン酸カルシウム、ジメチルスルホン等が挙げられる。
【０２７５】
典型的には、本明細書に提供される製剤は、生理的モル浸透圧濃度、約２８５〜２９５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇに相当するモル浸透圧濃度を有する（Ｌａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ｌｅｘｉ−Ｃｏｍｐ  １９９９：１２５４。ある特定の実施形態において、製剤のモル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは約２４０〜約３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。ある特別な実施形態において、製剤のモル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、または２１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２４５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２５５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２６０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２６５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２７０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２７５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２８５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２９５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、もしくは３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。
【０２７６】
本明細書に提供される血漿由来製剤は、概して、液体形態で長期間安定している。ある特定の実施形態において、製剤は、室温で少なくとも約３カ月、または室温で少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４カ月安定している。製剤はまた、概して、冷蔵条件下（典型的には約２℃〜約８℃）で６もしくは少なくとも約１８カ月、または冷蔵条件下で少なくとも約２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、もしくは４５カ月安定している。
【０２７７】
ＶＩＩ．治療方法
１つの態様において、本発明は、本明細書に提供される方法に従って調製される血漿由来タンパク質の治療的に有効な投与量を投与することによる、血液タンパク質欠損または機能障害に関連する疾患または障害の治療を必要とする対象における前記疾患または障害を治療するための方法を提供する。ある特定の実施形態において、本組成物は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、アルブミン、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）、ブチリルコリンエステラーゼ、Ｈ因子、補体系のタンパク質、ならびにインターαトリプシンインヒビター（ＩαＩ）タンパク質から選択される、血漿由来タンパク質を含む。
【０２７８】
１つの態様において、本発明は、血液タンパク質欠損または機能障害に関連する状態の治療において使用するための医薬を製造するための、本明細書に提供される方法に従って調製される血漿由来タンパク質組成物の使用を提供する。ある特定の実施形態において、血漿由来タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、アルブミン、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）、ブチリルコリンエステラーゼ、Ｈ因子、補体系のタンパク質、ならびにインターαトリプシンインヒビター（ＩαＩ）タンパク質から選択される。
【０２７９】
１つの実施形態において、血漿由来タンパク質組成物は、第１の沈殿ステップにおいて免疫グロブリンおよびα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）をＣｏｈｎプールから共沈殿させて、第１の沈殿物および第１の上清を形成するステップと、第１の沈殿物を懸濁して、第１の懸濁液を形成するステップと、第１の懸濁液から免疫グロブリンを可溶化して、免疫グロブリンを含む懸濁液の可溶性部分ならびにＡ１ＰＩ、フィブリノゲン、Ｈ因子、およびＩａＩｐを含む懸濁液の不溶性部分を形成するステップと、懸濁液の可溶性部分を懸濁液の不溶性部分から分離するステップとを含む方法によって、調製される。ある特定の実施形態において、本組成物は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、アルブミン、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）、ブチリルコリンエステラーゼ、Ｈ因子、補体系のタンパク質、ならびにインターαトリプシンインヒビター（ＩαＩ）タンパク質から選択される、血漿由来タンパク質を含む。
【実施例】
【０２８０】
ＶＩＩＩ．実施例
実施例１  −  ＮＧ２  Ｃ９１
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）組成物は、一連の沈殿反応を通して血漿を分画することによって、商業用に製造される。一般的な方法論では、不純物を、第１のアルコール沈殿ステップにおいて免疫グロブリン含有脱クリオ血漿から沈殿させる。次いで、結果として得られた上清からＩｇＧ免疫グロブリンを沈殿させて、続いてさらに濃縮する。アルコール分画の間にヒト血漿から回収されるＩｇＧの収量を増加するために、ＩｇＧ沈殿反応において５．５〜７．０のｐＨ値および２０％〜２５％のエタノール濃度を試験した。
【０２８１】
簡潔に言うと、エタノールを８％（ｖ／ｖ）の最終濃度で脱クリオ血漿に７．２±０．２のｐＨで混合し、その混合物を０℃でインキュベートし、形成された沈殿物（画分Ｉ）をその上清（画分Ｉ上清）から分離することによって、血漿由来免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）、およびアルブミン生成物の商業的製造において使用される中間体である、画分Ｉ上清を形成した。次いで、結果として得られた画分Ｉ上清を６００ｇの試料に分注した。表９に示されるように、個々の試料のｐＨを５．５〜７．０に調整し、エタノールを２０％〜２５％の最終濃度になるように混合した。
【０２８２】
表９に示されるように、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）の製造において使用される従来のＣｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物（２５％のエタノール；ｐＨ６．８）および改変画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を調製するために用いられるものと同様の条件は、不完全な沈殿によって上清中の総ＩｇＧの２．９％および６．７％の損失をもたらした。しかしながら、反応のｐＨを６．０以下に低下させ、少なくとも２２．５％の最終エタノール濃度を使用することによって、ＩｇＧ損失は著しく減少することが分かった。例えば、ｐＨ５．５における２２．５％のアルコールの使用は、上清中の総ＩｇＧのたった０．４％の損失しかもたらさなかった。同様に、ｐＨ６．０または５．５における２５％のアルコールの使用は、上清中の総ＩｇＧのたった０．５％および０．１％の損失しかもたらさなかった。表１０に示されるように、これは、従来のおよび改変画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物と比較して、それぞれ、沈殿物におけるＩｇＧ ３００ｍｇ／Ｌ血漿およびＩｇＧ １２５ｍｇ／Ｌ血漿よりも多い増加と同じである。
【０２８３】
（表９）出発材料（画分Ｉ上清）のタンパク質含有量に対するパーセントとして示される、沈殿上清中のタンパク質の収率
0006291423.tif 000010
【０２８４】
（表１０）ｇ／Ｌ血漿として示される、沈殿上清中のタンパク質の収量
0006291423.tif 000011
【０２８５】
実施例２  −  ＮＧ２  Ｃ９６
実施例１に述べたような低ｐＨ（５．５）、高エタノール（２５％）沈殿を使用して、初期８％エタノール沈殿を伴っておよび伴わずに実施されるＩｇＧ精製スキームの実験比較を行い、ＩｇＧの回収においてさらなる増加が得られるかどうかを判定した。
【０２８６】
簡潔に言うと、ｐＨ７．４および０℃で８％（ｖ／ｖ）の最終濃度のエタノールを使用して実施される初期沈殿ステップ（画分Ｉ）を用いて（ＮＧ２Ｃ９６／１）、または用いずに（ＮＧ２Ｃ９６／２）、１００ｋｇの脱クリオ血漿を処理した。脱クリオ血漿（ＮＧ２Ｃ９６／１）または画分Ｉ上清（ＮＧ２Ｃ９６／２）のｐＨをｐＨ５．５±０．１に調整し、エタノールを２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるように混合した。次いで、タンパク質沈殿が可能となるようにその混合物を−５±２℃で５時間インキュベートした。結果として得られた沈殿物（沈殿物（Ｉ）＋ＩＩ＋ＩＩＩ）および上清（上清（Ｉ）＋ＩＩ＋ＩＩＩ）を遠心分離によって分離した。沈殿反応の規模のために、各反応物に対し２回の遠心分離が必要であった。各遠心分離から結果として得られた沈殿物を別々に処理した。
【０２８７】
緩衝液１５部当たり沈殿物１部の割合で、５ｍＭの一ナトリウムリン酸塩、５ｍＭの酢酸ナトリウム、および６００ｍｇ／Ｌの氷酢酸を含有する緩衝液中に沈殿物を懸濁し、ｐＨを４．８±０．２に調整し、４℃〜８℃で２時間撹拌してタンパク質を抽出した。抽出インキュベーション後、ヒュームドシリカ（ＳｉＯ２）４０ｇ／（沈殿物（Ｉ）＋ＩＩ＋ＩＩＩ）ｋｇを反応物中に混合し、４℃〜８℃で５０分間撹拌した。次いで、Ｃｅｌｌｐｕｒｅ濾過助剤４００ｇ／（沈殿物（Ｉ）＋ＩＩ＋ＩＩＩ）ｋｇを混合し、Ｃｕｎｏ５０ＳＡ膜を通してその反応物を濾過することで不溶性物質を除去し、（Ｉ）＋ＩＩ＋ＩＩＩ濾液および濾過ケークを形成した。濾過ケークを５ｍＭの一ナトリウムリン酸塩、５ｍＭの酢酸ナトリウム、および１５０ｍｇ／Ｌの氷酢酸を含有する緩衝液で洗浄し、その濾液を、（Ｉ）＋ＩＩ＋ＩＩＩ濾液に添加した。
【０２８８】
ポリソルベート８０を０．２％（ｗ／ｗ）の最終濃度までその濾液に添加し、溶液を３０分間インキュベートした。次いで、クエン酸ナトリウム二水和物を０．８％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで溶液に添加し、溶液をさらに３０分間インキュベートした。第２のインキュベーション後、水酸化ナトリウムを使用して溶液のｐＨを７．０に調整し、２５％の最終濃度になるようにエタノールを混合した。沈殿を可能にするために、温度は０℃〜−１０℃に下げられた。沈殿物（ＰｐｔＧ）および上清（ＰｐｔＧ上清）を遠心分離によって分離した。
【０２８９】
精製反応の各サブステップのＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ免疫グロブリン含有量を判定した。表１１に示されるように、初期画分Ｉ沈殿ステップの排除は、最終組成物におけるＩｇＧの著しく大きい収量をもたらした（溶解されたＰｐｔＧのＮＧ２Ｃ９６／２（画分Ｉ沈殿を用いない）を、ＮＧ２Ｃ９６／１（画分Ｉ沈殿を用いる）と比較する。同様に、溶解ＰｐｔＧ画分のＩｇＡ（表１２）およびＩｇＭ（表１３）含有量は、初期画分Ｉ沈殿ステップを用いずに形成された。
【０２９０】
特に、画分Ｉ沈殿ステップは、一部には免疫グロブリン含有組成物からフィブリノゲンを除去するために使用される。初期画分Ｉ沈殿ステップを用いずに形成された溶解ＰｐｔＧ画分の最終フィブリノゲン含有量は、初期画分Ｉ沈殿ステップを用いて形成されたＰｐｔＧ画分の含有量よりもおよそ６倍多いが、分画スキームによって、脱クリオ血漿出発材料中に存在するフィブリノゲン含有量の９９％超が除去されている（表１４）。
【０２９１】
（表１１）初期８％エタノール画分Ｉ沈殿ステップを用いて、および用いずに、低ｐＨ、高アルコール沈殿反応を使用して血漿を分画したときに形成された種々の画分の、ｇ／Ｌ出発血漿として示されるＩｇＧ含有量
0006291423.tif 000012
【０２９２】
（表１２）初期８％エタノール画分Ｉ沈殿ステップを用いて、および用いずに、低ｐＨ、高アルコール沈殿反応を使用して血漿を分画したときに形成された種々の画分の、ｇ／Ｌ出発血漿として示されるＩｇＡ含有量
0006291423.tif 000013
【０２９３】
（表１３）初期８％エタノール画分Ｉ沈殿ステップを用いて、および用いずに、低ｐＨ、高アルコール沈殿反応を使用して血漿を分画したときに形成された種々の画分の、ｇ／Ｌ出発血漿として示されるＩｇＭ含有量
0006291423.tif 000014
【０２９４】
（表１４）初期８％エタノール画分Ｉ沈殿ステップを用いて、および用いずに、低ｐＨ、高アルコール沈殿反応を使用して血漿を分画したときに形成された種々の画分の、ｇ／Ｌ出発血漿として示されるフィブリノゲン含有量
0006291423.tif 000015
【０２９５】
実施例３  −  ＮＧ２  Ｃ９９
従来の上流Ｃｏｈｎ−ＯｎｃｌｅｙおよびＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎアルコール分画ステップ（すなわち、Ｃｏｈｎ画分ＩおよびＩＩ；Ｃｏｈｎ画分ＩおよびＩＩ＋ＩＩＩ；またはＫｉｓｔｌｅｒ  Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ８〜１０％エタノール、沈殿Ａおよび沈殿Ｂ）に代わる低ｐＨ、高アルコール沈殿の使用をさらに調査するために、ＮＧ２Ｃ９６／２およびＮＧ２Ｃ９６／２Ｂ  ＰｐｔＧ沈殿物を組み合わせ、ＩｇＧ免疫グロブリンについてさらに濃縮した。
【０２９６】
簡単に言うと、組み合わせたＮＧ２Ｃ９６／２およびＮＧ２Ｃ９６／２Ｂ  ＰｐｔＧ沈殿物を、酢酸でｐＨ４．７５±０．７５に、および塩化ナトリウムで４．５±１．５ｍＳ／ｃｍの伝導率に調整された注射用水（ＷＦＩ）に懸濁した。濾過助剤を添加し、懸濁液をＣｕｎｏ  ＶＲ０６膜を通して濾過し、清澄化ＰｐｔＧ濾液（ＶＲ０６）を形成した。次いで、清澄化濾液を標準的な手法に従って溶媒および洗浄剤（Ｓ／Ｄ処理）で処理した。
【０２９７】
Ｓ／Ｄ処理された濾液を、１０ｍＭの酢酸ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化されたＣＭセファロースカラムに負荷し、その通過画分（ＣＭ  Ｄ／Ｎ）を収集した。次いで、そのカラムを１０ｍＭの酢酸ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄し、その洗浄液（ＣＭ  Ｗ）を収集した。５５ｍＭの一ナトリウムリン酸塩および１０ｍＭのＴＲＩＳを含有する溶出緩衝液（ｐＨ８．５）を使用して、免疫グロブリンをカラムから溶出した。その溶出液を３つの画分に収集した：１００ｍＡＵ未満のＯＤ２８０を有する溶出液の第１の部分を含む、画分１（ＣＭ  Ｅ−ＶＬ）；溶出ピークの前端（ｌｅａｄｉｎｇ  ｅｄｇｅ）で１００ｍＡＵを超えるＯＤ２８０と、溶出ピークの後端（ｌａｇｇｉｎｇ  ｅｄｇｅ）で４００ｍＡＵを超えるＯＤ２８０とを有する溶出液のピークを含む、画分２（ＣＭ  Ｅ）；ならびに４００ｍＡＵ未満のＯＤ２８０を有するピークの後側の溶出液の部分を含む、画分３（ＣＭ  Ｅ−ＮＬ）。
【０２９８】
それぞれ氷酢酸および注射用水（ＷＦＩ）を使用して、画分２溶出液のｐＨを６．４に、および伝導率を２．３ｍＳ／ｃｍに調整した。次いで、画分２溶出液を１５ｍＭの一ナトリウムリン酸塩を含有する緩衝液（ｐＨ６．４）で平衡化されたＡＮＸセファロース高速流陰イオン交換樹脂に、１００ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂の負荷濃度で負荷した。ＩｇＧの大半を含む陰イオン交換通過画分を収集した（ＡＮＸ  Ｄ／Ｎ）。２Ｍの塩化ナトリウムを含む溶液（ＡＮＸ  ２Ｍ  ＮａＣｌ）を使用して、陰イオン交換樹脂に結合しているタンパク質をカラムから溶出した。
【０２９９】
グリシンを陰イオン交換通過画分に添加し、５％のタンパク質濃度が実現されるまで０．２５Ｍのグリシンを含む溶液（ｐＨ５．２）に対して、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２Ｍｉｎｉ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、その試料を限外および透析濾過した（ＵＦ／ＤＦ）。免疫グロブリン溶液を１０％の最終タンパク質濃度までさらに濃縮し、ｐＨを４．５に調整した（透析濃縮物（ｄｉａ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ））。次いで、その１０％の免疫グロブリン溶液をＭｉｌｌｉｐａｋ  ２０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して滅菌濾過し、最終免疫グロブリン組成物を形成した（最終容器）。
【０３００】
精製反応の各サブステップについて生化学的プロファイルを判定した（表１５および表１６）。データに示されるように、最終組成物は、薬学的投与に対して許容されるパラメータ内のごく低レベルの非ＩｇＧタンパク質を含んだ。
【０３０１】
（表１５）初期８％エタノール画分Ｉ沈殿ステップを用いずに低ｐＨ、高アルコール沈殿反応を使用して血漿を分画したときに形成された種々の画分の、生物化学的特性評価
0006291423.tif 000016
【０３０２】
（表１６）初期８％エタノール画分Ｉ沈殿ステップを用いずに低ｐＨ、高アルコール沈殿反応を使用して血漿を分画したときに形成された種々の画分の、さらなる生物化学的特性評価
0006291423.tif 000017
【０３０３】
実施例４  −  ＮＧ２  Ｃ１００
フィブリノゲンを除去するための初期低アルコール沈殿ステップを用いない低ｐＨ、高アルコール沈殿の使用を検証するため、実施例２および３において試料ＮＧ２Ｃ９６／２に関して記載されたように、その処理に対していくつかの変更を伴って、２００ｋｇの脱クリオ血漿を分画および濃縮した。まず、低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップ（Ｉ−ＩＶ１沈殿）をｐＨ５．５ではなく５．１で２５％のエタノールを用いて実施した。第２に、懸濁Ｉ−ＩＶ１沈殿物を、ＳｉＯ２ ４０ｇ／ｋｇ沈殿物ではなく、ヒュームドシリカ（ＳｉＯ２）３３ｇ／ｋｇ沈殿物Ｉ−ＩＶ１で処理した。第３に、ＣＭ陽イオン交換溶出液を、１００ｍｇタンパク質／ｍＬ ＡＮＸ樹脂ではなく、１５０ｍｇタンパク質／ｍＬ ＡＮＸ樹脂の濃度でＡＮＸ陰イオン交換樹脂に負荷した。最後に、Ｃｕｎｏ  ＶＲ０６で濾過した陰イオン交換通過画分をＰＬＡＮＯＶＡ（登録商標）３５Ｎ（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．；Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に通し、限外／透析濾過の前にナノ濾過ステップを実施した。
【０３０４】
精製の各ステップのＩｇＧ含有量を判定し、その結果を表１７に提供する。ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤ（登録商標）製造プロセス（ＩｇＧ ３．７ｇ／Ｌ原料血漿）に対する平均ＩｇＧ収量と比較して、本実施例において使用された精製方法は、ＩｇＧ ４．４ｇ／Ｌ原料血漿という著しく高い収量をもたらす。これは、ＩｇＧ収量のほぼ２０％の増加を表す。最終ＩｇＧ組成物の生物化学的特性評価が、表１０に報告される。表中に見られるように、最終ＩｇＧ組成物は、９９％を超える純度を有し、ＩｇＧ単量体／二量体含有量は９９．８％を超える。最終容器はごく微量の不純物を含有し、そのレベルは規制基準内である。
【０３０５】
（表１７）初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップを用いて脱クリオ血漿から濃縮したときに形成された画分の、ＩｇＧ含有量
0006291423.tif 000018
【０３０６】
（表１８）初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップを用いて２００Ｌの脱クリオ血漿から濃縮された最終ＩｇＧ組成物の、生物化学的特性評価
0006291423.tif 000019
【０３０７】
実施例５  −  Ｐ０２９１０ＮＧ２
１００ｇタンパク質／ｍＬ ＡＮＸ樹脂および１５０ｇタンパク質／ｍＬ ＡＮＸ樹脂の負荷濃度でのＣＭ陽イオン交換溶出液のＡＮＸ陰イオン交換カラムの通過の効果を比較するために、２００Ｌの脱クリオ血漿を初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％）沈殿ステップを介して分画し、実施例２および３において試料ＮＧ２Ｃ９６／２に関して記載されたように処理してＰｐｔＧ沈殿物を形成した。形成された上流画分のＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ含有量を判定し、それぞれ表１９、表２０、および表２１に報告する。
【０３０８】
結果として得られたＰｐｔＧ沈殿物を２つの１．８ｋｇの試料に分け、それを、一方の試料が１００ｍｇタンパク質／ｍＬ ＡＮＸ樹脂の負荷濃度でＡＮＸ陰イオン交換樹脂を通過し（Ｐ０３０１０ＮＧ２）、他方が１５０ｍｇタンパク質／ｍＬ ＡＮＸ樹脂の負荷濃度でＡＮＸ陰イオン交換樹脂を通過した（Ｐ０３１１０ＮＧ２）ことを除いて、実施例２および３において試料ＮＧ２Ｃ９６／２に関して記載されたように、最終容器に濃縮した。
【０３０９】
精製の各下流濃縮ステップのＩｇＧ含有量を判定し、その結果を表２２および表２３に提供する。ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤ（登録商標）製造プロセス（ＩｇＧ ３．７ｇ／Ｌ原料血漿）に対する平均ＩｇＧ収量と比較して、本実施例において使用された精製方法は、ＩｇＧ ４．３ｇ／Ｌ原料血漿という著しく高い収量をもたらす。これは、ＩｇＧ収量の１６％の増加を表す。最終ＩｇＧ組成物の生物化学的特性評価が、表１６および表１７に報告される。表中に見られるように、最終ＩｇＧ組成物は、９９％を超える純度を有し、ＩｇＧ単量体／二量体含有量は９９．８％を超える。最終容器はごく微量の不純物を含有し、そのレベルは規制基準内である。
【０３１０】
（表１９）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％のエタノール）沈殿反応を用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、ＩｇＧ含有量
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【０３１１】
（表２０）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％のエタノール）沈殿反応を用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、ＩｇＡ含有量
0006291423.tif 000021
【０３１２】
（表２１）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％のエタノール）沈殿反応を用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、ＩｇＭ含有量
0006291423.tif 000022
【０３１３】
（表２２）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％のエタノール）沈殿反応およびＡＮＸ陰イオン交換負荷濃度１００ｍｇ／ｍＬ ＡＮＸ樹脂（Ｐ０３０１０ＮＧ２）を使用して血漿を分画したときに形成された下流画分の、ＩｇＧ含有量
0006291423.tif 000023
【０３１４】
（表２３）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％のエタノール）沈殿反応およびＡＮＸ陰イオン交換負荷濃度１５０ｍｇ／ｍＬ ＡＮＸ樹脂（Ｐ０３１１０ＮＧ２）を使用して血漿を分画したときに形成された下流画分の、ＩｇＧ含有量
0006291423.tif 000024
【０３１５】
（表２４）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％のエタノール）沈殿反応およびＡＮＸ陰イオン交換負荷濃度１００ｍｇ／ｍＬ ＡＮＸ樹脂（Ｐ０３０１０ＮＧ２）を使用して脱クリオ血漿から濃縮された最終ＩｇＧ組成物の、生物化学的特性評価
0006291423.tif 000025
【０３１６】
（表２５）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％のエタノール）沈殿反応およびＡＮＸ陰イオン交換負荷濃度１５０ｍｇ／ｍＬ ＡＮＸ樹脂（Ｐ０３１１０ＮＧ２）を使用して脱クリオ血漿から濃縮された最終ＩｇＧ組成物の、生物化学的特性評価
0006291423.tif 000026
【０３１７】
実施例６  −  ＮＧ２Ｃ１０７Ｂ
ＩｇＧ免疫グロブリンの製造において使用される低ｐＨ、高アルコール沈殿物の不溶性部分からのα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＰＩ）の抽出の可能性を精査した。簡潔に言うと、抽出された画分Ｉ−ＩＶ−１沈殿物の濾過中に形成された不溶性濾過ケークの２つの５００ｋｇの試料（１番および３番）を、まず７±２℃で２．８部の水（ｗ／ｗ）に懸濁し、試料のｐＨを５．５±０．１に調整した。懸濁液をＣＵＮＯ  １０ＣＰ膜を通して濾過し、濾液（１．濾液（Ｆｉｌｔｒａｔ））および第２の濾過ケークを形成した。次いで、第２の濾過ケークを５部の水（ｗ／ｗ）に懸濁し、懸濁液の温度を１７±２℃に調整し、試料のｐＨを８．８±０．２に調整し、次いで温度およびｐＨを維持しながらその試料を８時間撹拌し、不溶性物質からＡ１ＰＩを抽出した。
【０３１８】
インキュベーション後、懸濁液１ｋｇ当たり１０ｍｍｏｌのＴｒｉｓおよび１５０ｍｍｏｌの塩化ナトリウムを試料に添加し、ｐＨを８．０±０．１に調整した。懸濁液１ｋｇ当たり１７６ｇのＰＥＧ３３５０を試料に添加し、それを１７±２℃で１時間インキュベートした。次いで、懸濁液を濾過し、不溶性物質を、抽出されたＡ１ＰＩを含有する上清（２．濾液（Ｆｉｌｔｒａｔ））から除去した。
【０３１９】
次いで、０．３５ｇ塩化亜鉛／ｋｇ濾液（２．５ｍＭ  ＺｎＣｌ；試料番号１）または０．５４ｇ／ｋｇの塩化亜鉛／ｋｇ濾液（４．０ｍＭ  ＺｎＣｌ；試料番号３）のいずれかの添加によって粗Ａ１ＰＩを第２の濾液から沈殿させて、ｐＨを７．５±０．２に調整し、試料を７±２℃で３時間インキュベートした。塩化亜鉛沈殿物を遠心分離（ＺｎＣｌ２遠心分離）によって回収した。Ａ１ＰＩを５０ｍＭのＥＤＴＡナトリウムを用いて塩化亜鉛沈殿物から抽出した（Ｚｎ−ＥＤＴＡ−濃縮物（ｃｏｎｚ））。
【０３２０】
濃縮プロセスの各ステップに対するＡ１ＰＩ（ａ１Ａ）含有量および活性を判定し、表２６に示す。ＥＤＴＡ抽出ステップにおいて、活性Ａ１ＰＩ約４００ｍｇ／Ｌ原料血漿を回収した。特に、Ａ１ＰＩを３８±２℃および約９．２のｐＨで抽出した際、活性Ａ１ＰＩ約６００ｍｇ／Ｌ原料血漿を回収した。
【０３２１】
（表２６）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％のエタノール）沈殿反応および亜鉛沈殿を用いて血漿を分画したときに形成された下流画分の、α−１−アンチトリプシン含有量
0006291423.tif 000027
【０３２２】
実施例７  −  Ｐ０３４１０ＮＧ２ＡおよびＢ
脱クリオ血漿の低ｐＨ、高アルコール沈殿からのＩｇＧの回収におけるｐＨの効果を精査した。簡潔に言うと、吸着によって第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、およびアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）を除去するように処理された１００Ｌの脱クリオ血漿を、５．４（試料Ａ；Ｐ０３４１０ＮＧ２Ａ）または５．６（試料Ｂ；Ｐ０３４１０ＮＧ２Ｂ）のいずれかのｐＨで２５％のエタノールを用いる沈殿によって分画した。次いで、試料を処理し、ＳｉＯ２ ４０ｇ／ｋｇ沈殿物ではなくＳｉＯ２ ５０ｇ／ｋｇ沈殿物Ｉ−ＩＶ−１を沈殿Ｉ−ＩＶ−１懸濁液と混合したことを除いて、実施例２に記載のように沈殿Ｇ沈殿物（ＰｐｔＧ沈殿物）および上清（ＰｐｔＧ上清）を形成した。
【０３２３】
形成された画分のＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ含有量を判定し、それぞれ表２７、表２８、および表２９に報告する。特に、初期沈殿がｐＨ５．４（９３．８％）またはｐＨ５．６（８８．８％）で実施されるとき、画分Ｉ−ＩＶ−１  ＣＵＮＯ濾液において原料血漿のＩｇＧ含有量の約９０％が回収される。同様に、画分Ｉ−ＩＶ−１懸濁液において原料血漿のＩｇＡおよびＩｇＭ含有量のほぼすべてが回収される。
【０３２４】
（表２７）低ｐＨ（Ａ＝５．４；Ｂ＝５．６）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップを用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、ＩｇＧ含有量
0006291423.tif 000028
【０３２５】
（表２８）低ｐＨ（Ａ＝５．４；Ｂ＝５．６）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップを用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、ＩｇＡ含有量
0006291423.tif 000029
【０３２６】
（表２９）低ｐＨ（Ａ＝５．４；Ｂ＝５．６）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップを用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、ＩｇＭ含有量
0006291423.tif 000030
【０３２７】
分画スキームをさらに特徴付けるため、フィブリノゲン（表３０）、Ａ１ＰＩ（表３１）、α−２−マクログロブリン（表３２）、アルブミン（表３３）、トランスフェリン（表３４）、およびＣ３（表３５）の含有量を種々の上流画分に対して判定した。
【０３２８】
（表３０）低ｐＨ（Ａ＝５．４；Ｂ＝５．６）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップを用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、フィブリノゲン含有量
0006291423.tif 000031
【０３２９】
（表３１）低ｐＨ（Ａ＝５．４；Ｂ＝５．６）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップを用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、α−１−アンチトリプシン含有量
0006291423.tif 000032
【０３３０】
（表３２）低ｐＨ（Ａ＝５．４；Ｂ＝５．６）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップを用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、α−２−マクログロブリン含有量
0006291423.tif 000033
【０３３１】
（表３３）低ｐＨ（Ａ＝５．４；Ｂ＝５．６）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップを用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、アルブミン含有量
0006291423.tif 000034
【０３３２】
（表３４）低ｐＨ（Ａ＝５．４；Ｂ＝５．６）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップを用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、トランスフェリン含有量
0006291423.tif 000035
【０３３３】
（表３５）低ｐＨ（Ａ＝５．４；Ｂ＝５．６）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップを用いて血漿を分画したときに形成された上流画分の、補体成分３（Ｃ３）含有量
0006291423.tif 000036
【０３３４】
実施例８  −  Ｐ０３５１０ＮＧ２およびＰ０３６１０ＮＧ２
初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップを用いて形成されたＰｐｔＧ沈殿物の下流処理の間における、１００ｇタンパク質／ｍＬ ＡＮＸ樹脂および１５０ｇタンパク質／ｍＬ ＡＮＸ樹脂の負荷濃度でのＣＭ陽イオン交換溶出液のＡＮＸ陰イオン交換カラムの通過の効果をさらに精査した。簡潔に言うと、２ｋｇのＰ０３４１０ＮＧ２Ａ  ＰｐｔＧ沈殿物を、第１の試料（Ｐ０３５１０ＮＧ２）は１５７ｍｇタンパク質／ｍＬ ＡＮＸ樹脂の濃度でＡＮＸ陰イオン交換樹脂に負荷して、および第２の試料（Ｐ０３６１０ＮＧ２）は１０６ｍｇタンパク質／ｍＬ ＡＮＸ樹脂の濃度でＡＮＸ陰イオン交換樹脂に負荷して、実施例４に記載のように処理した。
【０３３５】
精製の各下流ステップのＩｇＧ含有量を判定し、その結果を表２２および表２３に提供する。ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤ（登録商標）製造プロセス（ＩｇＧ ３．７ｇ／Ｌ原料血漿）に対する平均ＩｇＧ収量と比較して、本実施例において使用された精製方法は、原料血漿１Ｌ当たり４．７２ｇのＩｇＧおよび４．６７ｇのＩｇＧという著しく高い収量をもたらす。これは、ＩｇＧ収量の２５％を超える増加を表す。最終ＩｇＧ組成物の生物化学的特性評価が、表３８および表３９に報告される。表中に見られるように、最終ＩｇＧ組成物は、９９％を超える純度を有し、ＩｇＧ単量体／二量体含有量は９９．８％を超える。最終容器はごく微量の不純物を含有し、そのレベルは規制基準内である。
【０３３６】
（表３６）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップおよび陰イオン交換負荷濃度１５７ｍｇ／ｍＬ ＡＮＸ樹脂（Ｐ０３５１０ＮＧ２）を使用して血漿を分画したときに形成された上流画分の、ＩｇＧ含有量
0006291423.tif 000037
【０３３７】
（表３７）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップおよび陰イオン交換負荷濃度１０６ｍｇ／ｍＬ ＡＮＸ樹脂（Ｐ０３６１０ＮＧ２）を使用して血漿を分画したときに形成された上流画分の、ＩｇＧ含有量
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【０３３８】
（表３８）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップおよび陰イオン交換負荷濃度１５７ｍｇ／ｍＬ ＡＮＸ樹脂（Ｐ０３５１０ＮＧ２）を使用して脱クリオ血漿から濃縮された最終ＩｇＧ組成物の、生物化学的特性評価
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【０３３９】
（表３９）初期低ｐＨ（５．４）、高アルコール（２５％）初期沈殿ステップおよび陰イオン交換負荷濃度１０６ｍｇ／ｍＬ ＡＮＸ樹脂（Ｐ０３６１０ＮＧ２）を使用して脱クリオ血漿から濃縮された最終ＩｇＧ組成物の、生物化学的特性評価
0006291423.tif 000040
【０３４０】
実施例９  −  分画生成物のさらなる特性評価
初期低ｐＨ、高アルコール沈殿を含む精製方法を使用して実現される免疫グロブリンＧ収量および純度を、従来のＣｏｈｎ沈殿Ｉおよび沈殿ＩＩ＋ＩＩＩ中間体を使用して実現されるものと比較した。
【０３４１】
初期低ｐＨ、高アルコール沈殿を用いる３つの大規模ＩｇＧ精製の収量および純度（実施例５（「Ｐ０３０１０ＮＧ２」）に記載のロット３０１０、実施例８（「Ｐ０３６１０ＮＧ２」）に記載のロット３６１０、ならびにロット３０１０および３６１０と同様に調製された第３のロット１１１１）を、２０１０年に単一の製造工場において調製されたＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤ（１０％免疫グロブリン輸液（ヒト）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の平均収量と比較した。ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤ精製プロセスは、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿物ではなくＣｏｈｎ画分ＩおよびＣｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩ中間体を通して行われたことを除いて、ロット３０１０、３６１０、および１１１１を調製するために用いられるプロセスと実質的に同様である。実験用ロットの調製中に形成された沈殿物Ｇ生成物、ならびにＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤについて平均化された沈殿物Ｇ生成物の特性評価が、表４０に示される。
【０３４２】
（表４０）初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップを経て実験用ＩｇＧロット３０１０、３６１０、および１１１１を調製したときに形成された沈殿物Ｇ（ＰｐｔＧ）中間体、ならびにＣｏｈｎ画分ＩおよびＩＩ＋ＩＩＩ沈殿ステップを経た２０１０年の単一の製造工場調製物としてのＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤ調製物について平均化された沈殿物Ｇ（ＰｐｔＧ）中間体の、生物化学的特性評価
0006291423.tif 000041
【０３４３】
表４０に見られるように、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップの使用は、Ｃｏｈｎ画分ＩおよびＩＩ＋ＩＩＩ沈殿ステップを経るＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤ精製方法と比較して、沈殿物Ｇ中間ステップにおけるＩｇＧ回収の著しい増加をもたらした（初期高アルコール、低ｐＨ沈殿ステップの８８．９〜９６．６％のＩｇＧ回収対Ｃｏｈｎ画分ＩおよびＩＩ＋ＩＩＩ沈殿ステップの８２．９％）。
【０３４４】
補体成分３（Ｃ３）およびフィブリノゲンのより高いレベルからも明らかなように、実験用ロット３０１０、３６１０、および１１１１において形成されたＩｇＧ沈殿物Ｇ中間体は、平均ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤ沈殿物Ｇ中間体が有するものよりも若干低い純度を有するが、これらの中間体のフィブリノゲン含有量は、それでもなおＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  ＬＩＱＵＩＤ製造においてみられる値の範囲内である。しかしながら、実験用ロットが上述のようにさらに処理された場合、最終ＩｇＧ生成物は、表４１に示されるように、試験されたすべての製造規格を満たした。
【０３４５】
（表４１）初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップを経た実験用ロット３０１０、３６１０、および１１１１における最終貯蔵ヒトＩｇＧ組成物の生物化学的特性評価
0006291423.tif 000042
【０３４６】
実施例１０  −  アルブミン組成物の特性評価
本明細書に記載の新たな免疫グロブリンＧ製造プロセス（例えば、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿ステップを経るもの）が血漿タンパク質副産物の製造を支持し得るかをさらに検証するために、低ｐＨ、高アルコール上清からアルブミンを精製した。
【０３４７】
アルブミンをＣｏｈｎ画分ＩＶ−１およびＩＶ−４上清から精製するための方法は、当該技術分野でよく知られている。典型的には、Ｃｏｈｎ画分ＩＶ−１およびＩＶ−４上清は、Ｃｏｈｎ画分ＩおよびＣｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿等の中間アルコール沈殿ステップを経るプロセスにおいて形成される。本実施例において、初期低ｐＨ、高アルコール沈殿からの上清を画分ＩＶ−１上清の代わりに使用したことを除いて、標準的な方法に従ってアルブミンを調製した。表４２に見られるように、低ｐＨ、高アルコール上清からの精製は、試験されたすべての品質管理要件を満たすアルブミン（１８．９２ｇ／Ｌ血漿）の高収量をもたらした。
【０３４８】
（表４２）上述の大規模低ｐＨ、高アルコール沈殿上清から調製されたアルブミン組成物の生物化学的特性評価
0006291423.tif 000043
【０３４９】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、単に説明目的のためのものであり、それらに照らし合わせて様々な修正または変更が、当業者に示唆されることになり、本出願の趣旨および権限ならびに添付の請求項の範囲内に含まれるべきであると理解される。本明細書で引用されるすべての公報、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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