(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１を含むＲＮＡ配列の少なくとも８の連続する塩基に対して相補性である連続する配列を含むオリゴヌクレオチドであって、
前記ＲＮＡ配列は配列番号２を含み、
前記オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２７ａ又は配列ＵＣＡＣＡＧを含むシード領域を含むｍｉＲＮＡの前記ＲＮＡへの結合を阻害するものであり、
前記オリゴヌクレオチドが１以上の修飾された核酸塩基を含むものである、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ｍｉＲ−２７ａ  ｍｉＲＮＡが配列番号１１で示されるヌクレオチド配列を含むｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２の少なくとも９の塩基、少なくとも１０の塩基、少なくとも１１の塩基、少なくとも１２の塩基、１３の塩基、少なくとも１４の塩基、少なくとも１５の塩基、少なくとも１６の塩基、少なくとも１７の塩基、少なくとも１８の塩基、少なくとも１９の塩基、少なくとも２０の塩基、少なくとも２２の塩基、少なくとも２５の塩基、少なくとも３０の塩基、又は少なくとも３５の塩基の配列に対して相補性の連続する配列を含む請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが配列番号２の２２〜２７位に結合する請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドと配列番号２との間での塩基対合には、配列番号２の８〜２８位、８〜２７位、９〜２７位、１０〜２７位、１１〜２７位、１２〜２７位、１３〜２７位、１４〜２７位、１５〜２７位、１６〜２７位、１７〜２７位、１８〜２７位、１９〜２７位、２０〜２７位、２１〜２７位、９〜２８位、１０〜２８位、１１〜２８位、１２〜２８位、１３〜２８位、１４〜２８位、１５〜２８位、１６〜２８位、１７〜２８位、１８〜２８位、１９〜２８位、２０〜２８位又は２１〜２８位が含まれる請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが配列番号３又は配列番号４で示される配列を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
修飾された核酸塩基が、ＬＮＡ核酸塩基、ＵＮＡ核酸塩基、又は２’−Ｏ−メチル核酸塩基である請求項１〜６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号５、配列番号６又は配列番号７で示される配列を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
さらに、１以上の薬学的に許容され得る担体、賦形剤又は希釈剤を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１０】
血管もしくは対象物における血管透過性を抑制もしくは軽減する、又は
血管透過性に関連する疾患もしくは状態を処置もしくは予防する、薬品の製造のための請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１１】
血管透過性に関連する疾患又は状態が、浮腫、循環器疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患、虚血、卒中、癌、アテローム性硬化症、乾癬、糖尿病、自己免疫疾患、血小板減少症、高山病、気圧障害、医原性疾患、細菌感染、ウイルス感染、血管漏出に関連する眼の状態から選択される請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチである請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記血管漏出に関連する眼の状態が、非増殖性及び増殖性の網膜症、黄斑浮腫、緑内障及び黄斑変性症から選択される請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
浮腫の治療もしくは予防する、
腫瘍の増殖を抑制する、
虚血性傷害の治療及び／もしくは虚血性傷害からの回復を向上する、
手術創傷を治療するための、又は
術後回復を促進する、薬品の製造のための請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
浮腫が、心臓性浮腫、肺水腫、腎臓浮腫、黄斑浮腫、脳水腫、栄養不良性浮腫、リンパ浮腫、又は手術処置から生じる浮腫から選択される請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
対象の細胞又は組織にて血管形成を促進する又は誘導する薬品の製造のための請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１７】
血管形成の促進又は誘導が創傷治癒、組織修復、組織再生又は組織工学のためである請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
創傷が手術創傷であり、血管形成が術後血管形成である請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
手術創傷が、歯科手術、心臓手術、臓器移植手術、膝及び腰の置換手術並びに四肢の切断手術の結果生じる又はそれらに関連する請求項１４又は１８に記載の使用。
【請求項２０】
ＶＥ−カドヘリンの活性を調節するために薬物を製造するための請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２１】
ＶＥ−カドヘリンの活性を調節することが、血管透過性を抑制する若しくは軽減する、血管透過性に関連する疾患又は状態を治療する若しくは予防する、腫瘍の増殖を抑制する、虚血性傷害を治療する、虚血性傷害からの回復を向上させる、又は血管形成を促進する若しくは誘導する請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、標的ＲＮＡ、具体的にはＣＤＨ５又はＶＥ−カドヘリンのｍＲＮＡの活性に影響を及ぼすのに使用することができるオリゴヌクレオチドに関する。さらに詳しくは、本発明のオリゴヌクレオチドはｍｉＲ−２７ａのＶＥ−カドヘリンｍＲＮＡへの結合を阻害する。本発明はまた、血管透過性又は血管漏出を抑制し、それに関連する疾患及び状態を治療するためのそのようなオリゴヌクレオチドの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
第一世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ｍＲＮＡの活性に影響を及ぼすように意図された。そのようなオリゴヌクレオチドへの興味の理由の１つは特異的な塩基対合のために達成することができる精緻で予測可能な特異性についての潜在力である。ｍＲＮＡのような所与の核酸について高度に特異的であるオリゴヌクレオチドを設計することは理論上非常に簡単である。しかしながら、単純な塩基対合は所与の標的ｍＲＮＡの調節を達成するには十分ではない。すなわち、所与の標的ｍＲＮＡに対して相補性のオリゴヌクレオチドは標的ｍＲＮＡの活性に必ずしも影響を及ぼすわけではない。オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡのオープンリーディングフレームを標的とするのであれば、それは、たとえば、翻訳装置が翻訳の間にオリゴヌクレオチドを単に置き換えるということであり得る。従って、標的ｍＲＮＡのＲＮＡ分解酵素Ｈ切断を活性化することができるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの調節活性を改善する手段が開発された。しかしながら、そのようなオリゴヌクレオチドの短所の１つは、それらが意図した標的ｍＲＮＡ以外のＲＮＡの切断に介在して的外れの効果を生じ得ることである。それにもかかわらず、ＲＮＡ分解酵素Ｈ切断を介して作用する幾つかのオリゴヌクレオチドが種々の疾患の治療のための臨床試験に入っている。
【０００３】
さらに最近の研究は、哺乳類細胞を含む真核細胞がＲＮＡを特異性決定基として使用する複雑な遺伝子調節系（ＲＮＡｉ機構）を含むことを示している。この系は、標的ｍＲＮＡの活性を調節するために当該細胞に導入され得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって始動することができる。
【０００４】
現在、標的ＲＮＡ、特に標的ｍＲＮＡの特異的な調節のためのＲＮＡｉ機構を始動するための新規の治療剤として、相当な試みがｓｉＲＮＡを使用し始めている。しかしながら、ｓｉＲＮＡは当初考えたよりも特異性が低いことが判明していて、重大な的外れ効果を生じている。これらの的外れはｓｉＲＮＡ、又はむしろ、マイクロＲＮＡとして作用するｓｉＲＮＡのガイド鎖から生じると今や考えられている。
【０００５】
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｓｉＲＮＡのようなＲＮＡｉ機構を介して機能する内在性ＲＮＡ分子の一部類である。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのいわゆるシード配列又はシード領域を介したｍｉＲＮＡの５’末端との塩基対合を介して標的遺伝子の３’ＵＴＲに結合するその能力を少なくとも部分的に介してｍＲＮＡの分解及び翻訳の双方を調節する低分子一本鎖の非コーディングＲＮＡである。
【０００６】
現在、５００を超えるヒトｍｉＲＮＡが発見されており、ヒトの全遺伝子の３分の１を超えるものがｍｉＲＮＡによって調節されると考えられる。従って、ｍｉＲＮＡ自体を用いて標的ＲＮＡの活性を調節して治療剤としてのｍｉＲＮＡを開発する機会を開き得る。しかしながら、ｍｉＲＮＡは一般に１超える標的ＲＮＡで作用し；それらは見境がない。従って、ｍｉＲＮＡの細胞への導入又は細胞でｍｉＲＮＡのレベルを調節することが、１超える標的ｍＲＮＡに影響を及ぼし、その結果、予期しない且つ望ましくない効果を生じ得る。
【０００７】
ｍｉＲＮＡは、アンチミール及びアンタゴミールと呼ばれる相補性のオリゴヌクレオチドを用いて阻害することができる。しかしながら、各ｍｉＲＮＡはそれ自体見境がないので、所与のアンチミール又はアンタゴミールも同様に１以上の標的ｍＲＮＡの活性に影響を及ぼすであろう。
【０００８】
ｍｉＲＮＡ及び血管形成
血管透過性の厳格な制御は、血管の内膜の主な機能の１つである。内皮のこのバリア機能の喪失は、腫瘍血管の漏出、種々の呼吸窮迫症候群、化学療法の合併症と同様に急性過敏症反応を含む多数の一般的な及び臓器特異的な疾患過程の根底にある。血管透過性の制御は一般に２つのクラスに分類され；一方は漏出を誘導するトロンビン、ヒスタミン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような刺激である。他方は、現状を持続することに対して強壮効果を発揮するアンギオポエチン−１のような分子のクラスである。最終的にこれら２つの影響は、結合構造を調節するＶＥカドヘリン及びＰＥＣＡＭのような細胞／細胞結合分子にて集中する。
【０００９】
これらの刺激によって誘導される相対的に明瞭な表現型を考えると、修復又は生理学的な血管形成の状況下で漏出がどのように自己限定性であるのかは驚くべきである。本発明者らは、たとえば、血管形成の過程で血管の正常性への迅速な復元を強制するように作動する、又は新しく形成する血管の漏出を制限するように生理的な血管形成の間に作動する未だ未発見のメカニズムが存在し得ると推論した。これは、過剰な漏出を特徴とする腫瘍の新生血管とは明瞭に対照的であり、これらの制御メカニズムは迂回され得る。
【００１０】
脈管構造では、ｍｉＲＮＡは発達の調節及び腫瘍増殖や循環器疾患のような疾患に関連する。たとえば、内皮細胞に限定されるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２６は血管発達及び腫瘍の血管形成の間に高度に発現される一方で、対照的にｍｉＲ−１０１は腫瘍の血管で下方調節され、ヒストンのメチル転移酵素を介して作用して血管形成を促進する。内皮細胞では、ｍｉＲ−２９６はＶＥＧＦ反応性であり、このｍｉＲＮＡの遮断は腫瘍関連の血管形成を阻害する。ｍｉＲ−１３２は腫瘍の新生血管で誘導され、インテグリンの下流で作用して細胞増殖及び血管増殖を高めるｐｌ２０ＲａｓＧＡＰを標的とする。ｍｉＲ−９２ａはインテグリンのシグナル伝達を標的とし、その阻害は虚血性傷害に続く血流回復を改善する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、標的ＲＮＡの活性を調節するためのオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドは標的部位に結合した際、ＲＮＡ分解酵素Ｈ及び／又はＲＮＡｉ機構を動員することが可能であり得る又は不可能であり得る。
【００１２】
本明細書で開示されるのは、配列番号１で示される配列に対して相補性であり、且つそれに結合することが可能である配列を含むオリゴヌクレオチドである。通常、オリゴヌクレオチドは、配列番号１で示される配列を含むＶＥ−カドヘリン（ＣＤＨ５）ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の連続する配列対して相補性であり、且つそれに結合することが可能である配列を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の態様では、本発明は、配列番号２又は１、２若しくは３の置換を含む配列番号２を含むＲＮＡ配列の少なくとも８の連続する塩基に相補性の連続する配列を含むオリゴヌクレオチドを提供し、その際、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２７ａ、その変異体又は配列ＵＣＡＣＡＧを含むシード領域を含むｍｉＲＮＡの前記ＲＮＡへの結合を阻害する。
【００１４】
通常、ｍｉＲ−２７ａ  ｍｉＲＮＡは配列番号１１で示されるヌクレオチド配列を含むｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａである。
【００１５】
実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２又は１、２若しくは３の置換を含む配列番号２の少なくとも若しくは約７塩基、少なくとも若しくは約８塩基、少なくとも若しくは約９塩基、少なくとも若しくは約１０塩基、少なくとも若しくは約１１塩基、少なくとも若しくは約１２塩基、少なくとも若しくは約１３塩基、少なくとも若しくは約１４塩基、少なくとも若しくは約１５塩基、少なくとも若しくは約１６塩基、少なくとも若しくは約１７塩基、少なくとも若しくは約１８塩基、少なくとも若しくは約１９塩基、少なくとも若しくは約２０塩基、少なくとも若しくは約２２塩基、少なくとも若しくは約２５塩基、少なくとも若しくは約３０塩基、又は少なくとも若しくは約３５塩基の配列に対して相補性の連続する配列を含む。
【００１６】
通常、オリゴヌクレオチドは配列番号２の２２〜２７位に結合する。
【００１７】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドと配列番号２との間の塩基対合には、配列番号２の８〜２８、８〜２７位、９〜２７位、１０〜２７位、１１〜２７位、１２〜２７位、１３〜２７位、１４〜２７位、１５〜２７位、１６〜２７位、１７〜２７位、１８〜２７位、１９〜２７位、２０〜２７位、２１〜２７位、９〜２８位、１０〜２８位、１１〜２８位、１２〜２８位、１３〜２８位、１４〜２８位、１５〜２８位、１６〜２８位、１７〜２８位、１８〜２８位、１９〜２８位、２０〜２８位又は２１〜２８位が含まれる。
【００１８】
さらなる特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３又は配列番号４で示される配列を含む。
【００１９】
さらなる特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１以上の修飾された核酸塩基を含む。例となる実施形態では、修飾された核酸塩基はＬＮＡ核酸塩基、ＵＮＡ核酸塩基及び２’Ｏ−メチル核酸塩基から選択され得る。
【００２０】
さらなる特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６又は配列番号７で示される配列を含む。
【００２１】
第２の態様では、本発明は請求項１〜８のいずれか１項のオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００２２】
実施形態では、組成物は１以上の薬学上許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物である。
【００２３】
第３の態様では、本発明は細胞にてＶＥ−カドヘリンの活性を調節する方法を提供し、該方法は有効量の第１の態様のオリゴヌクレオチドに細胞を接触させ、それによってＶＥ−カドヘリンの活性を調節することを含む。
【００２４】
特定の実施形態では、ＶＥ−カドヘリンの活性を調節することは、血管透過性を抑制する又は軽減する、血管透過性に関連する疾患又は状態を治療する又は予防する、腫瘍の増殖を抑制する、虚血性傷害を治療する、虚血性傷害からの回復を向上させる、手術創傷を治療する及び／又は術後回復を促進する、又は血管形成を促進する又は誘導する。
【００２５】
第４の態様では、本発明は血管における血管透過性を抑制する又は軽減する方法を提供し、該方法は有効量の第１の態様のオリゴヌクレオチド又は第２の態様の組成物に血管を接触させることを含む。
【００２６】
第５の態様では、本発明はそのような治療を必要とする対象にて血管透過性を抑制する又は軽減する方法を提供し、該方法は有効量の第１の態様のオリゴヌクレオチド又は第２の態様の組成物を対象に投与することを含む。
【００２７】
第６の態様では、本発明は対象における血管透過性に関連する疾患又は状態を治療する又は予防する方法を提供し、該方法は有効量の第１の態様のオリゴヌクレオチド又は第２の態様の組成物を対象に投与することを含む。
【００２８】
血管透過性に関連する疾患又は状態は、浮腫、循環器疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患、虚血、卒中、癌、アテローム性硬化症、乾癬、糖尿病、関節リウマチのような自己免疫疾患、血小板減少症、高山病、気圧障害、医原性疾患、細菌感染、ウイルス感染、たとえば、非増殖性及び増殖性の網膜症（糖尿病性網膜症を含む）、黄斑浮腫（糖尿病性黄斑浮腫を含む）、緑内障及び黄斑変性症（加齢黄斑変性症を含む）のような血管漏出に関連する眼の状態から選択され得る。
【００２９】
特定の実施形態では、浮腫は、たとえば、心臓性浮腫、肺水腫、腎臓浮腫、黄斑浮腫、脳水腫、栄養不良性浮腫、又はリンパ浮腫であり得る。浮腫は、外科的処置、特に主要な外科的処置、たとえば、心臓手術、臓器移植手術、膝及び腰の置換手術、歯科手術、又は四肢切断手術（たとえば、糖尿病合併症に関連して）の結果生じ得る。
【００３０】
第７の態様では、本発明は対象にて浮腫を治療する又は予防する方法を提供し、該方法は有効量の第１の態様のオリゴヌクレオチド又は第２の態様の組成物を対象に投与することを含む。
【００３１】
第８の態様では、本発明は対象にて腫瘍の増殖を抑制する方法を提供し、該方法は有効量の第１の態様のオリゴヌクレオチド又は第２の態様の組成物を対象に投与することを含む。
【００３２】
第９の態様では、本発明は虚血性傷害からの回復を治療する及び／又は向上させる方法を提供し、該方法は、そのような治療を必要とする対象に有効量の第１の態様のオリゴヌクレオチド又は第２の態様の組成物を投与することを含む。
【００３３】
第１０の態様では、本発明は対象の細胞又は組織にて血管形成を促進する又は誘導する方法を提供し、該方法は有効量の第１の態様のオリゴヌクレオチド又は第２の態様の組成物を対象又はそれに由来する細胞若しくは組織に投与することを含む。
【００３４】
血管形成の促進又は誘導は、たとえば、創傷治癒（手術創傷を含む）、組織修復、組織再生又は組織工学のためであり得る。血管形成は、たとえば、術後血管形成であり得る。
【００３５】
第１１の態様では、本発明は手術創傷を治療する及び術後回復を促進する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に有効量の第１の態様のオリゴヌクレオチド又は第２の態様の組成物を投与することを含む。
【００３６】
第１０の態様及び第１１の態様によれば、手術創傷は、たとえば、歯科手術、心臓手術、臓器移植手術、膝及び腰の置換手術及び四肢切断手術（たとえば、糖尿病合併症に関連して）に関連するものを含む、手術の結果生じる又は手術の過程で誘導される創傷であり得る。
【００３７】
提供されるのはまた、血管透過性の抑制又は軽減、血管透過性に関連する疾患又は状態の治療又は予防、腫瘍の増殖の抑制、虚血性傷害からの回復の治療及び／又は向上、又は血管形成の促進又は誘導で使用するための第１の態様のオリゴヌクレオチドである。
【００３８】
提供されるのはまた、血管透過性を抑制する又は軽減する、血管透過性に関連する疾患又は状態を治療する又は予防する、浮腫を治療する又は予防する、腫瘍の増殖を抑制する、虚血性傷害からの回復を治療する及び／又は向上させる、血管形成を促進する又は誘導する、及び／又は手術創傷を治療する及び術後回復を促進するために薬物を製造するための第１の態様のオリゴヌクレオチドの使用である。
【００３９】
提供されるのはまた、たとえば、ＶＥ−カドヘリンの活性、血管透過性及び血管形成及びそれらのための可能性のある治療及び治療法を検討するための研究ツールとしての第１の態様のオリゴヌクレオチドの使用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
以下の図面を参照して、非限定例のみの目的で、本発明の実施形態が本明細書で記載される。
【図１】ｍｉＲ−２７ａがＶＥ−カドヘリンを標的とすることを示す図である。（Ａ）対照細胞又はｍｉＲ−２７ａ模倣体を形質移入した細胞における４８時間後のＶＥ−カドヘリンの発現。負荷対照としてβ−アクチンを使用した。（Ｂ）５つの独立したＨＵＶＥＣ細胞株の平均値±ＳＥＭの基準化された発現。＊対照に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）フローサイトメトリーで評価したときの表面ＶＥ−カドヘリンのレベル。実線：対照模倣体、点線：ｍｉＲ−２７ａ模倣体。実験１つ（行った３つに類似する）の結果を示す。（Ｄ）ｍｉＲ−２７ａで形質移入した２４時間後のＶＥ−カドヘリンｍＲＮＡの発現のレベル。β−アクチンに対して基準化した結果は、５つの独立したＨＵＶＥＣ細胞株に由来する４つ組のｑＲＴ−ＰＣＲ反応の平均値±ＳＥＭである。＊対照に対してｐ＜０．０５。（Ｅ）対照細胞又は抗ｍｉＲ−２７ａで形質移入した細胞での形質移入の２４時間後のＨＵＶＥＣにおけるＶＥ−カドヘリンの発現。（Ｆ）３つの独立したＨＵＶＥＣ細胞株の平均値±ＳＥＭを示す。＊＊＊対照に対してｐ＜０．００１。（Ｇ）フローサイトメトリーで評価したときの表面ＶＥ−カドヘリンのレベル。実線：対照ＬＮＡ、点線：ＬＮＡ−２７。実験１つ（行った２つに類似する）の結果を示す。（Ｈ）対照模倣体又はｍｉＲ−２７ａ模倣体を伴ったＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、推定上のｍｉＲ−２７ａ結合部位（Ｗｔ、黒棒）又は変異したｍｉＲ−２７ａ結合部位（Ｍｕｔ、白棒）を含有するＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲを含有するルシフェラーゼ構築物。結果は４つの独立した実験の３つ組形質転換の平均値±ＳＥＭを表す。＊ｐ＝０．０１、Ｗｔ＋ｍｉＲ−２７ａ対Ｍｕｔ＋ｍｉＲ−２７ａ．＊＊ｐ＝．００００１、Ｗｔ＋対照対Ｗｔ＋ｍｉＲ−２７ａ。
【図２】ｍｉＲ−２７ａがＶＥ−カドヘリンの局在及び内皮細胞の透過性を変化させることを示す図である。（Ａ）、（Ｂ）形質移入の４８時間後、ＶＥ−カドヘリンについてＨＵＶＥＣを染色した。（Ａ）（ｉ）対照模倣体又は（ｉｉ）ｍｉＲ−２７ａ模倣体。（Ｂ）（ｉ）対照ＬＮＡ又は（ｉｉ）ｍｉＲ−２７ＬＮＡ。尺度棒：１００μｍ。（Ｃ）対照細胞又はｍｉＲ−２７ａ模倣体を形質移入した細胞の４８時間後に測定した透過性。示した結果は、５つの独立したＨＵＶＥＣ細胞株の基準化した平均値±ＳＥＭである。＊対照に対してｐ＜０．０５。（Ｄ）対照ＬＮＡ（黒）又はｍｉＲ−２７ＬＮＡ（白）で形質移入した細胞における刺激なしで（ＮＩＬ）又はトロンビンの刺激後に測定した透過性。結果は行った３つの平均値±ＳＥＭの代表的な実験１つに由来する。＊対照に対してｐ＜０．０５。（Ｅ）マウスの背中に皮内注射した４μｇの対照（黒）又は抗ｍｉＲ−２７ａ（白棒）によってマイルスアッセイを行った。２４時間後、ＶＥＧＦ又は対照としてのＰＢＳ（ＮＩＬ）を同じ部位に与えた。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝９匹のマウス／群。
【図３】ｍｉＲＮＡ−２７ａの過剰発現は生体内での毛細管形成を減らす一方でｍｉＲ−２７ａの阻害は生体内での透過性を低下させることを示す図である。（Ａ）対照（ｉ及びｉｉｉ）又はｍｉＲ−２７ａ模倣体（ｉｉ及びｉｖ）で形質転換し、マトリゲルに固定したＨＵＶＥＣ。陥没した管：白矢印。非常に細い管：黒矢印。（ｉ）及び（ｉｉ）の尺度棒：２００μｍ、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の尺度棒：４００μｍ。（ｖ）対照に対する比率として表される視野当たりで形成された毛細管の数。＊対照に対してｐ＜０．０５。４つの独立したＨＵＶＥＣ細胞株の平均値±ＳＥＭ。（Ｂ）ＦＧＦ−２とビヒクルのみ（ｉ、ｖ）、対照（ｉｉ、ｖｉ）又はｍｉＲＮＡ−２７ａ模倣体（ｉｉｉ、ｖｉｉ）を含有するマトリゲルプラグをマウスの皮下に埋め込んだ。代表的な組織切片及びヘマトキシリン／エオシン染色した断面切片（ｉ〜ｉｉｉ）。尺度棒：２０μｍ。定量した赤血球を含有する血管の数（ｉｖ）。代表的なＣＤ３１免疫化学（ｖ〜ｖｉｉ）。尺度棒：５０μｍ。定量したＣＤ３１陽性細胞の数（ｖｉｉｉ）。データは平均値±ＳＥＭとして表す。差異の統計的解析は、多重比較のためのボンフェローニの補正と共に一方向ＡＮＯＶＡによって比較した。対照（Ｃ）についてはｎ＝３匹のマウス及びｍｉＲＮＡ−２７ａとビヒクル（Ｖ）についてはｎ＝６匹のマウス。（Ｃ）ＶＥ−カドヘリンの過剰発現によるｍｉＲ−２７ａ模倣体の効果の反転。細胞に対照模倣体（ｉ）、ｍｉＲ−２７ａ模倣体（ｉｉ）、ＶＥ−カドヘリンプラスミド＋対照模倣体（ｉｉｉ）又はＶＥ−カドヘリン発現プラスミド＋ｍｉＲ−２７ａ模倣体（ｉｖ）で形質移入した。２４時間後、細胞をマトリゲルに固定し、２４時間にわたって眺めた。（Ｄ）ＥＣの単層を傷つけた後の経時的なｍｉＲ−２７ａ（白丸）及びＶＥ−カドヘリン（黒丸）のｍＲＮＡの発現。データは集密な細胞におけるレベルに対して基準化する。発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定し、ｍｉＲ−２７ａの結果をＵ４８に対して基準化し、及びＶＥ−カドヘリンの結果をβ−アクチンに対して基準化した。結果は２〜４の独立したＨＵＶＥＣ細胞株に由来する。
【図４】ヒトの疾患におけるｍｉＲ−２７ａの調節を示す図である。３人の肝硬変患者に由来するヒト肝臓組織をＣＤ３１について染色した。（Ａ）線維性中隔における新しい新生血管（新生血管）、黒丸、及び黒矢印（ｉｉ）で示すような小静脈を明らかにし、ＬＣＭによって捕捉した。（ｉ）尺度棒：１５μｍ、（ｉｉ）尺度棒：３０μｍ。（Ｂ）３人の患者（ａ、ｂ、ｃ）に由来する小静脈又は新生血管（Ｎｅｏ）における内皮細胞からＲＮＡを単離した。ｍｉＲ−２７ａの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって定量し、ｍｉＲ−５２０ｄ＊に対して基準化した。データは４つ組ｑＲＴ−ＰＣＲ反応の平均値±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、小静脈対新生血管。
【図５】ブロックミールがＶＥ−カドヘリ依存性の機能を調節することを示す図である。（Ａ）ウエスタンブロットによって測定したようなブロックミールＣＤ５−２又はＣＤ５−３で形質移入した細胞におけるＶＥ−カドヘリンのレベルを定量し、対照ブロックミールで形質移入した細胞におけるレベルに対して基準化した。結果は、ｎ＝４の独立した内皮細胞株について対照に対する％増加を示す。（Ｂ）形質移入の４８時間後、ＶＥ−カドヘリンについてＨＵＶＥＣを染色した。対照（ｉ）又は（ｉｉ）ブロックミールＣＤ５−２。（Ｃ）対照又はブロックミールＣＤ５−２で形質移入した細胞の未刺激の又はトロンビンで刺激した単層を介した透過性。結果を対照の透過性に対して基準化する。３〜５の実験の平均値±ＳＥＭ。（Ｄ）静脈内に注射した対照（黒）又はブロックミールＣＤ５−２（白棒）によってマイルスアッセイを行った。２４時間後、ＶＥＧＦ又はＰＢＳを皮内に投与した。ｎ＝４匹のマウス／群。＊＊ｐ＜０．００５。
【図６】ブロックミールが虚血後の浮腫及び血管形成を調節することを示す図である。（Ａ）後肢血流を手術後時々測定し、非虚血性の後肢血流に対する虚血性の後肢血流の比率として表した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝６〜１０匹のマウス／群。（Ｂ）０日目〜３日目の間でのＬＤＢＦの拡大図を右側グラフに示す。（Ｃ）対照ブロックミール（黒棒）又はブロックミールＣＤ５−２（白棒）で処理したマウスについての後肢虚血の２４時間後の浮腫の評価。内転筋の下部を定量のために採取した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝８匹／群。（Ｄ）毛細血管密度の評価。切片をＣＤ３１について染色した。対照ブロックミール（ｉ）又はブロックミールＣＤ５−２（ｉｉ）を与えたマウス１匹について代表的な領域を示し、毛細血管の数の定量を虚血性四肢における毛細血管／筋細胞の比として示す（ｉｉｉ）。ｎ＝４〜５匹の動物。＊ｐ＜０．０２
【図７】ブロックミールの特異性を示す図である。（Ａ）ＬＮＡ２７、ＣＤ５−２又は対照（Ｃｔｒｌ）で形質移入したＨＵＶＥＣに由来するＶＥ−カドヘリン及びＳｅｍａ６Ａのウエスタンブロット解析。形質移入の４８時間後、ＨＵＶＥＣから細胞溶解物を得た。α−チューブリンを負荷対照として使用した。データは３つの独立した実験を表す。（Ｂ）（Ａ）にて記載されたように解析したＶＥ−カドヘリン及びＳｅｍａ６Ａの発現の定量的な評価。対照（白棒）、ＬＮＡ２７（黒棒）及びＣＤ５−２（縞模様棒）。＊ｐ＜０．０５（ｎ＝３〜５）。ＮＳ：対照群に対して有意差なし。平均値±ＳＥＭ。（Ｃ）ｍｉＲ−２７ａ模倣体とベクターのみ、対照ブロックミール、ＣＤ５−２又はＰＰＡＲγ（配列番号１０）におけるｍｉＲ−２７結合部位に対して向けられたブロックミールによって同時形質移入されたＨｅＬａ細胞におけるＰｓｉＣＨＥＣＫ２ＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲ（ＷＴ）に由来するルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ）活性。Ｒｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性は同じプラスミドから発現されるホタルのルシフェラーゼに対して内部的に基準化される。ルシフェラーゼ活性は、ブロックミール及びｍｉＲ−２７ａ模倣体なしで形質移入した（ベクター［−］）３’ＵＴＲレポーターのそれに対して示され、実験当たり３回の複製試料による３回の独立した実験に由来する比率の平均値±ＳＤとして提示される。ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０００１、（＊）ｐ＜０．０５。
【図８】ブロックミールが腫瘍の増殖を抑制することを示す図である。マウスに腫瘍を誘導するＢ１６Ｆ１０細胞を注射した６〜９日後のブロックミールＣＤ５−２（四角）又はスクランブル対照（丸）の静脈注射に続くＣ５７ＢＬ／６メスマウスにおける腫瘍の容積（ｍｍ３）。ｎ＝３匹のマウス／群。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
主題の明細書は、プログラムＰａｔｅｎｔｌｎバージョン３．４を用いて作成し、配列表にて本明細書で提示されるアミノ酸及びヌクレオチドの配列情報を含有する。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は配列識別子番号（配列番号）によって言及される。配列番号は、配列識別子＜４００＞１（配列番号１）、＜４００＞２（配列番号２）等に数字として相当する。具体的には、ＶＥ−カドヘリン（ＣＤＨ５）の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−２７ａの標的「抗シード」領域は配列番号１にて示される。ｍｉＲ−２７ａの「抗シード」領域を含有するヒトのＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲの領域は配列番号２にて示される。配列番号３及び４は例となるオリゴヌクレオチドの配列を示す。配列番号５〜１０は本明細書で例示されるような本試験で使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す（表１も参照のこと）。ヒトのｍｉＲ−２７ａ（ｈｓａ＿ｍｉＲ−２７ａ）の成熟配列は配列番号１１に示される。
【００４２】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は本明細書で使用されるとき、冠詞の文法上の１つ又は１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）目的語を指す。例として、「ａｎ要素」は１つの要素又は１を超える要素を意味する。
【００４３】
本明細書の文脈で、用語「約」は、同一の機能又は結果を達成する文脈で引用される値と同等であると当業者がみなす数の範囲を指すように理解される。
【００４４】
本明細書及び後に続くクレーム全体を通して、文脈が特に要求しない限り、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」のような変形は、言及される整数又は工程又は整数又は工程の群の包含を暗示するが、他の整数又は工程又は整数又は工程の群の排除を暗示しないように理解されるであろう。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド塩基、天然の核酸塩基の既知の類似体又はそれらの混合物の一本鎖配列を指す。「オリゴヌクレオチド」はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＵＮＡ又はそれらの組み合わせを含む核酸を基にした分子を含む。天然の又は非天然のリボヌクレオチド塩基を優勢に含むオリゴヌクレオチドはＲＮＡオリゴヌクレオチドと呼ばれ得る。オリゴヌクレオチドは通常、たとえば、直接化学合成又は適当な配列のクローニング及び制限を含む好適な方法によって調製され得る短い（たとえば、長さ５０ヌクレオチド未満）配列である。
【００４６】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は特定のＤＮＡ又はＲＮＡの配列に対して相補性のオリゴヌクレオチドである。通常、本発明の文脈では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡに相補性であるＲＮＡオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドはその相補性のｍｉＲＮＡに結合し、その活性を部分的に又は完全に静止させる又は抑制する。アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける塩基がすべて「標的」配列又はｍｉＲＮＡ配列に相補性である必要があるわけではなく；オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドが標的を認識するのを可能にするのに十分な相補性の塩基を含有することのみを必要とする。オリゴヌクレオチドは追加の塩基も含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、未修飾のリボヌクレオチド配列であってもよいし、又は本明細書で記載されるような種々の手段によって化学的に修飾されてもよく又は抱合されてもよい。
【００４７】
用語「ポリヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、デオキシリボヌクレオチド塩基、リボヌクレオチド塩基又は天然のヌクレオチドの既知の類似体又はそれらの混合物の一本鎖又は二本鎖のポリマーを指す。「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＵＮＡ又はそれらの組み合わせを含む核酸を基にした分子を含む。その用語は、特に指示されない限り、特定の配列と同様にそれに対して相補性の配列への参照を含む。ポリヌクレオチドは当業者に既知の種々の手段によって化学的に修飾され得る。従って、「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＵＮＡ又はそれらの組み合わせを含む核酸を基にした分子を含む。
【００４８】
オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと関連して本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオチド」はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの範囲内での単一の核酸塩基又はモノマーの単位を指す。用語「ヌクレオチド」及び「モノマー」は本明細書では相互交換可能に使用され得る。ヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＩＮＡ、ＬＮＡ、ＵＮＡ又オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドの２以上の組み合わせの一部であり得る。一部の実施形態では、核酸塩基はユニバーサル塩基であり得る。修飾された核酸塩基も以下で記載されるように本発明によって熟考される。
【００４９】
用語「相補性」は本明細書で使用されるとき、通常、ワトソン／クリックの塩基対合則に従って、すなわち、ＧとＣの間及びＡとＴ又はＵの間で塩基対合する２つの一本鎖ヌクレオチド配列の能力を指す。一部の実施形態では、ＧはＵとも対合し、逆もあり、いわゆる揺らぎ塩基対を形成する。別の実施形態では、塩基イノシン（Ｉ）は本発明のオリゴヌクレオチドの範囲内に含まれ得る。Ｉ塩基はＡ、Ｃ及びＵと対合する。さらに別の実施形態では、ユニバーサル塩基が使用され得る。ユニバーサル塩基は通常、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｕ及びＴと塩基対合することができる。ユニバーサル塩基は他の鎖上の対向する塩基と水素結合を形成しないことが多い。さらに別の実施形態では、相補性の配列はワトソン／クリックの塩基対の専ら連続した配列を指す。相補性である２つのヌクレオチド配列については、それらは塩基対合領域にわたって１００％の相補性を示す必要はないが、むしろ、塩基対合が生じるのを可能にするのに十分相補性でなければならない。従って、ある程度の配列間の不一致は認容されてもよく、配列は依然として相補性であり得る。本明細書で使用されるとき、用語「と塩基対合をすることが可能である」は「と相補性である」と相互交換可能に使用される。
【００５０】
用語「置換」は本明細書で使用されるとき、別の核酸塩基で置換されているオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの範囲内での特定の位置の核酸塩基を指す。置換は、たとえば、標的ＲＮＡにおける単一ヌクレオチド多型の存在のためであり得る。用語、置換はまた核酸塩基の欠失及び核酸塩基の付加も包含する。
【００５１】
用語「ブロックミール」は本明細書で使用されるとき、ＲＮＡ標的に結合し、前記標的に結合する１以上のｍｉＲＮＡ種の能力を遮断し、前記標的の活性に影響を及ぼす立体遮断オリゴヌクレオチドを指す。ブロックミールは細胞でのＲＮＡｉ機構又はＲＮＡ分解酵素Ｈを動員できないように構築される。ブロックミールは、たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２００８／０６１５３７及びＷＯ２０１２／０６９０５９にて記載されている。
【００５２】
本明細書の文脈では、用語「活性」はそれがポリヌクレオチド（たとえば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）、タンパク質又はポリペプチドに関するとき、ポリヌクレオチド、タンパク質又はポリペプチドによって発揮される１以上の細胞性の機能、作用、効果又は影響を意味する。たとえば、ｍＲＮＡの文脈では、活性は通常、ｍＲＮＡの発現、すなわち、タンパク質又はペプチドへの翻訳を指す。従って、本明細書で記載されるようなオリゴヌクレオチドによる標的ｍＲＮＡの活性の調節には、ｍＲＮＡの分解及び／又は翻訳の調節が含まれ得る。ｍＲＮＡの活性の調節にはｍＲＮＡの細胞内輸送に影響を及ぼすことも含まれ得る。
【００５３】
用語「抑制すること」及び「抑制」や「抑制する」のような変形は本明細書で使用されるとき、特定される事象、活性又は機能の完全な抑制を必ずしも暗示しない。むしろ、抑制は所望の効果を生じるのに十分な程度及び／又は時間であり得る。抑制は、事象、活性又は機能の予防、遅延、軽減又はさもなければ妨害であり得る。そのような抑制は実際、大きさであり、及び／又は一時的であり得る。特定の文脈では、用語「抑制する」及び「予防する」及びそれらの変形は相互交換可能に使用され得る。
【００５４】
用語「促進すること」及び「誘導すること」及び「促進」や「誘導」のようなそれらの変形は本明細書で使用されるとき、特定される事象、活性又は機能の完全な促進又は誘導を必ずしも暗示しない。むしろ、促進又は誘導は所望の効果を生じるのに十分な程度及び／又は時間であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドによる血管形成の促進又は誘導は直接的であっても間接的であってもよく、実際、大きさであり、及び／又は一時的であり得る。
【００５５】
用語「ＲＮＡｉ機構」は本明細書で使用されるとき、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの活性又はＲＮＡｉ経路に必要な細胞成分を指す。ＲＮＡｉ機構の主要な成分はＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ複合体）である。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「有効量」は非毒性であるが、所望の効果を提供するのに十分な剤又は化合物の量又は用量を意味することの範囲内に含まれる。必要とされる正確な量又は用量は、治療される種、対象の年齢及び全身状態、治療される状態の重症度、投与される特定の剤、及び投与の方式等のような因子に応じて対象ごとに異なるであろう。従って、正確な「有効量」を特定するのは可能ではない。しかしながら、所与の症例については、適当な「有効量」は日常の実験のみを用いて当該技術で普通の技量の者によって決定され得る。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、用語「治療すること」、「治療」、「予防すること」及び「予防」は、状態又は症状を改善する、状態又は疾患の発症を防ぐ、又はさもなければ、どんな方法であれ、状態又は疾患又は望ましくない症状の進行を防ぐ、妨害する、遅らせる又は反転する任意の使用及び使用すべてを指す。従って、用語「治療すること」及び「予防すること」等は最も広い文脈で考慮されるべきである。たとえば、治療は、患者が全体として回復するまで治療されることを必ずしも暗示しない。複数の症状を示す又は複数の症状を特徴とする状態では、治療又は予防は症状すべてを改善する、防ぐ、妨げる、遅らせる又は反転することは必ずしも必要ではなく、前記症状の１以上を防ぎ、妨げ、遅らせ又は反転させればよい。一部の障害の文脈では、本発明の方法には、障害に関連する高度に望ましくない事象又は障害の進行の不可逆的な転帰の発生を軽減する又は改善するという点で障害を「治療する」ことが関与するが、それ自体、事象又は転帰の当初の発生を防がなくてもよい。従って、治療には特定の障害の症状の改善又は特定の障害を発症するリスクを防ぐこと又はさもなければ軽減することが含まれる。
【００５８】
用語「血管透過性に関連する疾患又は状態」は本明細書で使用されるとき、血管透過性（通常、過剰な血管透過性又は過剰透過性）から生じる、をもたらす、を特徴とする又はさもなければ、に関連する疾患又は状態を指す。従って、疾患又は状態と血管透過性との間の関連は直接的であってもよいし、間接的であってもよく、一時的であってもよく、空間的に分離されてもよい。本明細書の文脈では、用語、血管透過性又は過剰血管透過性及び血管漏出は相互交換可能に使用され得る。
【００５９】
用語「対象」は本明細書で使用されるとき、哺乳類を指し、それには、ヒト、霊長類、家畜（たとえば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）、実験動物（たとえば、マウス、ラット、モルモット）、ペット動物（たとえば、イヌ、ネコ）、捕獲野生動物（たとえば、キツネ、カンガルー、シカ）が挙げられる。好ましくは、哺乳類はヒト又は実験動物である。一層さらに好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００６０】
本明細書で開示され、例示されるのは、配列ＣＵＧＵＧＡに結合するｍｉＲＮＡ（たとえば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−２７ａ）の能力を遮断し、それによってｍｉＲＮＡが前記配列を含むポリヌクレオチドの活性又は発現に影響するのを抑える前記配列に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドである。通常、配列はＶＥ−カドヘリンｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内に存在する。
【００６１】
従って、本発明の態様の１つは、配列番号２又は１、２若しくは３の置換を含む配列番号２を含むＲＮＡ配列の少なくとも８の連続する塩基に対して相補性である連続する配列を含むオリゴヌクレオチドを提供し、その際、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２７ａ、その変異体、又は配列ＵＣＡＣＡＧを含むシード領域を含むｍｉＲＮＡの前記ＲＮＡへの結合を阻害する。
【００６２】
提供されるのはまた、本明細書で開示されるようなオリゴヌクレオチドを用いて細胞にてＶＥ−カドヘリンの活性を調節する組成物及び方法である。
【００６３】
さらに、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドには治療応用もある。本明細書で例示されるように、ｍｉＲ−２７ａは血管の整合性を制御するように内皮細胞間結合を調節する。ｍｉＲ−２７ａ又はＶＥ−カドヘリンとのその特異的な相互作用の阻害は血管形成の非存在下で血管漏出を阻害する。血管漏出が多数の血管性、炎症性及び腫瘍性の疾患の主要な病態生理学的なメカニズムであるので、本明細書で記載され、例示される試験は抗血管透過性療法について新しい機会を提供する。
【００６４】
従って提供されるのはまた、本明細書で開示されるようなオリゴヌクレオチドを用いて、血管における血管透過性を抑制する又は軽減する組成物及び方法、血管透過性に関連する疾患又は状態を治療する又は予防する組成物及び方法、虚血性傷害からの回復を治療する及び／又は向上させる組成物及び方法、手術創傷を治療する及び術後回復を促進する組成物及び方法、血管形成を促進する又は誘導する組成物及び方法、浮腫を治療する組成物及び方法、及び腫瘍の増殖を抑制する組成物及び方法である。
【００６５】
本開示のオリゴヌクレオチドには、キットの成分として、たとえば、ＶＥ−カドヘリンの活性、血管透過性、及び血管形成及びそのための潜在的な治療及び治療法の究明を促進することを含む、医学及び生物学研究活動における研究ツールとしての応用も見いだされる。
【００６６】
通常、シード配列ＵＣＡＣＡＧを含むｍｉＲＮＡはｍｉＲ−２７ａである。ヒト成熟ｍｉＲ−２７ａ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ）のヌクレオチド配列は配列番号１１にて提供される。ｍｉＲ−２７ａ  ｍｉＲＮＡに関する追加の配列情報はｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｑｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌにて見いだすことができる。本明細書で熟考されるのはまたこのｍｉＲＮＡの変異体である。変異体には、ｍｉＲ−２７ａの配列に実質的に類似するヌクレオチド配列が含まれる。たとえば、変異体ｍｉＲＮＡは、配列番号１０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を示す配列を含み得る。
【００６７】
オリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは通常、配列番号２で示される配列又は１、２若しくは３の置換を含む配列番号２の配列の少なくとも約９の連続する塩基、少なくとも約１０の連続する塩基、少なくとも約１１の連続する塩基、少なくとも約１２の連続する塩基、少なくとも約１３の連続する塩基、少なくとも約１４の連続する塩基、少なくとも約１５の連続する塩基、少なくとも約１６の連続する塩基、少なくとも約１７の連続する塩基、少なくとも約１８の連続する塩基、少なくとも約１９の連続する塩基、少なくとも約２０の連続する塩基、少なくとも約２２の連続する塩基、少なくとも約２５の連続する塩基、少なくとも約３０の連続する塩基、及び少なくとも約３５の連続する塩基から成る群から選択される配列に対して相補性の連続する配列を含む。
【００６８】
実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号２で示される配列又は１、２若しくは３の置換を含む配列番号２の配列のわずか８の連続する塩基、わずか９の連続する塩基、わずか１０の連続する塩基、わずか１１の連続する塩基、わずか１２の連続する塩基、わずか１３の連続する塩基、わずか１４の連続する塩基、わずか１５の連続する塩基、わずか１６の連続する塩基、わずか１７の連続する塩基、わずか１８の連続する塩基、わずか１９の連続する塩基、わずか２０の連続する塩基、わずか２２の連続する塩基、わずか２５の連続する塩基、わずか３０の連続する塩基、及びわずか３５の連続する塩基から成る群から選択される配列に対して相補性の連続する配列を含み得る。
【００６９】
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号２で示される配列又は１、２若しくは３の置換を含む配列番号２の配列の８の連続する塩基、９の連続する塩基、１０の連続する塩基、１１の連続する塩基、１２の連続する塩基、１３の連続する塩基、１４の連続する塩基、１５の連続する塩基、１６の連続する塩基、１７の連続する塩基、１８の連続する塩基、１９の連続する塩基、２０の連続する塩基、２１の連続する塩基、２２の連続する塩基、２３の連続する塩基、２４の連続する塩基、２５の連続する塩基、３０の連続する塩基、及び３５の連続する塩基から成る群から選択される配列に対して相補性の連続する配列を含み得る。
【００７０】
通常、オリゴヌクレオチドは、配列番号２の２２〜２７位に結合し、この領域はｍｉＲ−２７ａのシード配列の相補体を表し、ＶＥ−カドヘリンｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するｍｉＲ−２７ａの標的部位（「抗シード」領域）である。オリゴヌクレオチドと配列番号２との間の塩基対合には、配列番号２の８〜２８位、８〜２７位、９〜２７位、１０〜２７位、１１〜２７位、１２〜２７位、１３〜２７位、１４〜２７位、１５〜２７位、１６〜２７、１７〜２７位、１８〜２７位、１９〜２７位、２０〜２７位、２１〜２７位、９〜２８位、１０〜２８位、１１〜２８位、１２〜２８位、１３〜２８位、１４〜２８位、１５〜２８位、１６〜２８位、１７〜２８位、１８〜２８位、１９〜２８位、２０〜２８位又は２１〜２８位が含まれ得る。
【００７１】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドと配列番号２との間の塩基対合は配列番号２の２７位で終了する。他の実施形態では、塩基対合は配列番号２の２８位、２９位、３０位、３１位、３２位又は３３位で終了し得る。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドと配列番号２との間の塩基対合は配列番号２の２２位で始まる。他の実施形態では、塩基対合は配列番号２の２１位、２０位、１９位、１８位、１７位、１６位、１５位、１４位、１３位、１２位、１１位、１０位、９位、８位、７位、６位又は５位で開始し得る。
【００７２】
当業者は、本発明のオリゴヌクレオチドが正確な機能又はオリゴヌクレオチドの用途に応じて好適な長さであってもよいことを十分に理解するであろう。通常、オリゴヌクレオチドは長さ８〜２５塩基の間である。一層さらに通常では、オリゴヌクレオチドは長さ１０〜２０塩基の間である。
【００７３】
その標的ＲＮＡへの強力な結合のために、オリゴヌクレオチドの長さを増やし得る。場合によっては、さらに短いオリゴヌクレオチド用いて細胞への送達が改善され得る。さらに、他の場合では、標的ＲＮＡの抗シード配列に対する個々のオリゴヌクレオチドの位置が調整され得る。たとえば、配列番号２の標的ＲＮＡの２２〜２７位に対して相補性の塩基の位置は、それらが、たとえば、オリゴヌクレオチドの５’末端、オリゴヌクレオチドの３’末端、又はオリゴヌクレオチドの中間にて若しくは中間に向かって置かれるように調整され得る。通常、２２〜２７位に対して相補性の塩基の位置は、それらが１位、２位、３位、４位、５位若しくは６位で、又は２位、３位、４位、５位若しくは６位の上流の位置で、又は１位、２位、３位、４位、５位若しくは６位の下流の位置で開始するようにオリゴヌクレオチドにて配置され、その際、位置はオリゴヌクレオチドの５’末端から数えられる。
【００７４】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡの配列、たとえば、配列番号２の配列は１、２又は３の置換を含み得る。或いは、配列は置換を含まなくてもよい。置換が存在する場合、それらはオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとの間の相補性の領域に局在し得る。置換は、所与の標的ＲＮＡのｍｉＲＮＡ調節を増減させ得る単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であり得る。ＳＮＰは所与の標的ＲＮＡの異常なｍｉＲＮＡ調節を生じるように新しいｍｉＲＮＡ標的部位を創り得る。ＲＮＡ編集も置換を生じ得る。
【００７５】
本発明のオリゴヌクレオチドはＲＮＡ分解酵素Ｈを活性化することが可能であり得る。ＲＮＡ分解酵素ＨはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を切断し、ＲＮＡ分解酵素Ｈの活性化のための構造的な要件は当業者に周知である。同様に、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞性のＲＮＡｉ機構を動員し、標的ＲＮＡにＲＮＡｉ機構を向けることが可能であり得る。これは、標的ＲＮＡの切断又は標的ＲＮＡの翻訳抑制を生じ得る。
【００７６】
しかしながら、本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡｉ機構もＲＮＡ分解酵素Ｈも動員することができない。従って通常、本発明のオリゴヌクレオチドは特定の標的ＲＮＡにてＲＮＡｉ機構の活性を遮断することが可能である。ＲＮＡｉ機構が標的配列を認識しないように標的ＲＮＡの標的配列（ｍｉＲＮＡ結合部位）を隔離することによって、オリゴヌクレオチドはそうし得る。この活性を持つ本発明のオリゴヌクレオチドは、それらが、標的ＲＮＡにおける特定のｍｉＲＮＡ結合部位にて所与のｍｉＲＮＡの調節活性を遮断するので、ブロックミールとも呼ばれ得る。本発明のオリゴヌクレオチドによってＲＮＡ分解酵素Ｈの動員又は活性化を防ぐ能力を達成するために、オリゴヌクレオチドは通常５以上の連続するＤＮＡ核酸塩基を含まない。
【００７７】
本明細書で記載され、本明細書で開示される態様及び実施形態に従って使用するための本発明のオリゴヌクレオチドは、以下でさらに記載されるように、オリゴヌクレオチドの用途及び機能に応じて種々の配列及び構造的修飾を含み得る。当業者は、本明細書で記載される配列及び構造的修飾が例示のみであり、本発明の範囲がこれらの修飾への参照によって限定されるべきではないが、オリゴヌクレオチドが所望の機能又は活性を保持するという条件で、むしろ、当業者に既知の追加の修飾も採用され得るということを十分に理解するであろう。
【００７８】
ほんの一例として、配列の残基間でのホスホロチオエート（たとえば、ホスホロモノチオエート又はホスホロジチオエート）結合の付加、又は１以上のモルフォリン環の主鎖への包含によってオリゴヌクレオチド配列を修飾し得る。残基間の代わりの非リン酸結合には、ホスホネート結合、ヒドロキシルアミン結合、ヒドロキシルヒドラジニル結合、アミド結合及びカルバメート結合、メチルホスホネート、ホスホロチオレート、ホスホルアミダイト又はボロン誘導体が挙げられる。オリゴヌクレオチドに存在するヌクレオチド残基は天然に存在するヌクレオチドであってもよいし、又は修飾されたヌクレオチドであってもよい。好適な修飾されたヌクレオチドには、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−Ｏ−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、ユニバーサル塩基、たとえ、５−ニトロ−インドール；ＬＮＡ、ＵＮＡ、ＰＮＡ及びＩＮＡ核酸塩基、２’−デオキシ−２’−フルオロ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）及びアラビノ核酸（ＡＮＡ）が挙げられる。リボヌクレオシドにて天然に存在するリボース糖部分は、たとえば、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環、又はシクロヘキセニル基によって置換され得る。代わりに又は加えて、オリゴヌクレオチド配列は一方の末端又は双方の末端にて１以上の好適な化学部分に抱合され得る。たとえば、オリゴヌクレオチドは、３’末端にてヒドロキシプロリノール結合のような好適な結合を介してコレステロールに抱合され得る。
【００７９】
特定の当該修飾には、相補性配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める、すなわち、相補性配列に対合するオリゴヌクレオチド塩基の融解温度を高める、又はオリゴヌクレオチドの生物安定性を高めるものが挙げられる。そのような修飾には、２’−Ｏ−フルオロ基、２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−メトキシエチル基が挙げられる。ＬＮＡ、ＵＮＡ、ＰＮＡ及びＩＮＡモノマーの使用も通常採用される。さらに短いオリゴヌクレオチドについては、通常、さらに高い比率の親和性を高める修飾が存在する。オリゴヌクレオチドが長さ１２又は１０未満の核酸塩基であるならば、それは全体として、親和性を高める単位、たとえば、ＬＮＡモノマー、ＵＮＡモノマー又は２’−Ｏ−メチルＲＮＡ核酸塩基で構成され得る。
【００８０】
特定の実施形態では、塩基又は糖のいずれかで修飾されていないモノマーに比べて塩基又は糖のいずれかで修飾されたオリゴヌクレオチドにおけるモノマーの分画は、９９％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満であり得、９９％を上回り、９５％を上回り、９０％を上回り、８５％を上回り、７５％を上回り、７０％を上回り、６５％を上回り、６０％を上回り、５０％を上回り、４５％を上回り、４０％を上回り、３５％を上回り、３０％を上回り、２５％を上回り、２０％を上回り、１５％を上回り、１０％を上回り、及び５％を上回り又は１％を上回り得る。
【００８１】
脂質及び／又はペプチドもオリゴヌクレオチドに抱合され得る。そのような抱合は、生物利用効率を改善し得るし、且つオリゴヌクレオチドがＲＮＡ分解酵素Ｈを活性化する及び／又はＲＮＡｉ機構を動員するのを防ぎ得る。さらに大きくさらに嵩高の部分の抱合は通常、オリゴヌクレオチドの中心部分、たとえば、最も中心の５つのモノマーのいずれかにて行われる。或いは、配列番号１〜５のいずれかの２２〜２７位の１つに相補性の塩基の１つにて。さらに別の実施形態では、部分はオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端にて抱合され得る。例となる疎水性部分の１つは、オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機構を動員するのを防ぎ、オリゴヌクレオチドの生物利用効率を改善するオリゴヌクレオチドに抱合され得るコレステロール部分である。たとえば、コレステロール部分は、オリゴヌクレオチドの３’末端にて又はオリゴヌクレオチドの５’末端にて配列番号２の配列の２２〜２７位に対して相補性の核酸塩基の１以上に抱合され得る。
【００８２】
異なる修飾がオリゴヌクレオチドの中での異なる位置に配置されてオリゴヌクレオチドがＲＮＡ分解酵素Ｈを活性化しすぎるのを防ぎ、ＲＮＡｉ機構を動員することが可能であることを防ぐ。
【００８３】
特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合がオリゴヌクレオチドにおけるモノマーを接続してオリゴヌクレオチドの生物安定性を改善し得る。オリゴヌクレオチドの結合すべてがホスホロチオエート結合であり得る。別の実施形態では、ホスホロチオエート結合の分画は、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５０％未満であり得、９５％を上回り、９０％を上回り、８５％を上回り、８０％を上回り、７５％を上回り、７０％を上回り、６５％を上回り、６０％を上回り及び５０％を上回り得る。
【００８４】
実施形態では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ核酸塩基を含まなくてもよい。このことは、オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機構を動員することができることを防いでオリゴヌクレオチドの生物安定性を高めるのに役立ち得る。たとえば、オリゴヌクレオチドはＬＮＡ及びＤＮＡの核酸塩基から成ってもよく、それらは上記で概説したようにホスホロチオエート結合によって接続されてもよい。代わりの実施形態では、オリゴヌクレオチドはＤＮＡ核酸塩基を含まない。代わりの実施形態では、オリゴヌクレオチドはモルフォリノ及び／又はＬＮＡ核酸塩基を含まない。
【００８５】
実施形態では、オリゴヌクレオチドはＤＮＡ核酸塩基とＲＮＡ核酸塩基のミックスを含んでオリゴヌクレオチドがＲＮＡ分解酵素Ｈを活性化するのを防ぎ、オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機構を動員するのを防ぎ得る。たとえば、ＤＮＡ核酸塩基とＲＮＡ核酸塩基がオリゴヌクレオチドの長さに沿って交互に存在してもよく、又は代わりに、１以上のＤＮＡ核酸塩基が互いに隣接して位置してもよく、１以上のＲＮＡ核酸塩基が互いに隣接して位置してもよい。
【００８６】
別の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドはＬＮＡモノマーと２’−Ｏ−メチルＲＮＡ核酸塩基のミックスを含む。上記のように、ＬＮＡと２’−Ｏ−メチルＲＮＡ核酸塩基がオリゴヌクレオチドの長さに沿って交互に存在してもよく、又は代わりに、１以上のＬＮＡ核酸塩基が互いに隣接して位置してもよく、１以上の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ核酸塩基が互いに隣接して位置してもよい。
【００８７】
一部の実施形態では、相補性の配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めるオリゴヌクレオチドに存在する核酸塩基の数は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２の核酸塩基である。一部の実施形態では、相補性の配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めるオリゴヌクレオチドに存在する核酸塩基の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２の核酸塩基である。
【００８８】
特定の実施形態では、相補性の配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める核酸塩基は、オリゴヌクレオチド側面、すなわち、オリゴヌクレオチドの５’  末端及び３’末端の一方又は双方に又はその近傍に位置してもよく、又はオリゴヌクレオチドの中心又はその近傍に位置してもよい。相補性の配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める核酸塩基は、オリゴヌクレオチドの長さにわたって均一に分布してもよい。
【００８９】
特定の例となる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６及び配列番号７の１つに示されるような配列を有する。
【００９０】
ＶＥ−カドヘリン活性及び治療上の適応
ｍｉＲ−２７ａ、その変異体又は配列ＵＣＡＣＡＧを含むシード領域を含むｍｉＲＮＡの標的ＲＮＡへの結合を阻害する本発明のオリゴヌクレオチドの能力のお蔭で、本発明の態様は、細胞においてＶＥ−カドヘリンの活性を調節する方法を提供するが、該方法は有効量の本発明のオリゴヌクレオチドに細胞を接触させ、それによってＶＥ−カドヘリンの活性を調節することを含む。
【００９１】
オリゴヌクレオチドに細胞を接触させる工程は、試験管内、生体外又は生体内で発生し得る。細胞は対象から得られる生物試料に存在し得る。
【００９２】
本発明の別の態様は、そのような治療を必要とする対象にて血管透過性を抑制する又は軽減する方法を提供するが、該方法は有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。
【００９３】
本発明の別の態様は、対象にて血管透過性に関連する疾患又は状態を治療する又は予防する方法を提供するが、該方法は有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。
【００９４】
本発明の別の態様は、虚血性傷害からの回復を治療する及び／又は向上させる方法を提供するが、該方法はそのような治療を必要とする対象に有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
【００９５】
本発明の実施形態が関連する血管透過性に関連する疾患又は状態には、浮腫、循環器疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患、虚血、卒中、癌、アテローム性硬化症、乾癬、糖尿病、関節リウマチのような自己免疫疾患、血小板減少症、高山病、気圧障害、医原性疾患、細菌感染、ウイルス感染、たとえば、非増殖性及び増殖性の網膜症（糖尿病性網膜症を含む）、黄斑浮腫（糖尿病性黄斑浮腫を含む）、緑内障及び黄斑変性症（加齢黄斑変性症を含む）のような血管漏出に関連する眼の状態が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。浮腫は、全身性浮腫、局所性浮腫又は臓器特異的浮腫であり得る。浮腫は、たとえば、心臓性浮腫、肺水腫、腎臓浮腫、黄斑浮腫、脳水腫、栄養不良性浮腫、又はリンパ浮腫であり得る。浮腫は、外科的処置、特に主要な外科的処置、たとえば、心臓手術、臓器移植手術、膝及び腰の置換手術、歯科手術、又は四肢切断手術（たとえば、糖尿病合併症に関連して）の結果生じ得る。
【００９６】
本発明の別の態様は、腫瘍増殖を抑制する方法を提供するが、該方法は、そのような治療を必要とする対象に有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
【００９７】
本明細書で開示される本発明の実施形態は、本発明のオリゴヌクレオチドを用いた細胞及び組織における血管形成の促進又は誘導も提供し、促進又は誘導は生体内又は生体外で生じ得る。非限定例として、血管形成の促進が所望であり得る状況は、創傷治癒（慢性、急性及び手術の創傷）、一部の婦人科障害及び不妊に治療、冠状動脈疾患及び眼の状態の治療、卒中の予防、組織の修復又は再生、及び組織工学（たとえば、三次元の足場構築）の中にある。本発明の実施形態に従って治療可能である創傷の非限定例には、手術創傷、たとえば、静脈性潰瘍及び糖尿病性潰瘍のような潰瘍、火傷及び組織外傷の他の形態が挙げられる。本発明の特定の実施形態は手術創傷の治療及び術後回復の促進に関する。治療可能である手術創傷は、手術の結果生じる創傷、又はたとえば、歯科手術、心臓手術、臓器移植手術、膝及び腰の置換手術及び四肢切断手術（たとえば、糖尿病合併症に関連して）を含む手術の経過中に誘導される創傷であり得る。
【００９８】
医薬組成物
本明細書で開示される実施形態に従って医薬組成物の形態で本発明のオリゴヌクレオチドが投与されてもよく、組成物は１以上の薬学上許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤を含んでもよい。そのような組成物は、たとえば、非経口（たとえば、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内）、経口（舌下を含む）、鼻内、又は局所の経路のような従来の又は好適な経路によって投与され得る。適当な濃度のオリゴヌクレオチドが治療される生体の部位に直接送達されることが必要とされる状況では、投与は全身性ではなく限局性であり得る。限局性の投与は、必要とされる部位への非常に高い局所濃度のオリゴヌクレオチドを送達する能力を提供するので、所望の治療効果又は予防効果を達成するのに好適である一方で、生体の他の臓器の化合物への暴露を回避し、それによって潜在的に副作用を軽減する。
【００９９】
特定の個体のための本発明の化合物の特定の用量レベルは、たとえば、採用される特定のオリゴヌクレオチドの活性、治療される個体の年齢、体重、全身状態及び食事、投与の時間、排泄の速度及び他の治療又は治療法との併用を含む種々の因子に左右されることが理解されるであろう。主治医により選択される用量のレベル及びパターンによって単回又は複数回の投与を実施することができる。幅広い範囲の用量が適用可能であり得る。患者を考慮して、たとえば、約０．１ｍｇ〜約１ｍｇの剤が１日当たり、体重のｋｇ当たり投与され得る。投与計画を調整して最適な治療応答を提供し得る。たとえば、幾つかの分割した用量を毎日、毎週、毎月若しくは他の好適な時間間隔で投与してもよく、又は状況の要件によって示されるように用量を比例して減らしてもよい。
【０１００】
薬学上許容可能なキャリア又は希釈剤の例は、脱塩水又は蒸留水；生理食塩水溶液；たとえば、ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油又はココナッツ油のような植物系の油；たとえば、メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン及びメチルフェニルポリシロキサンのようなポリシロキサンを含むシリコーン油；揮発性シリコーン；たとえば、流動パラフィン、軟パラフィン又はスクアランのような鉱物油；たとえば、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体；低級アルカノール、たとえば、エタノール又はイソプロパノール；低級アラルカノール；低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はグリセリン；たとえば、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル又はオレイン酸エチルのような脂肪酸エステル；ポリビニルピロリドン；寒天；カラーギーナン；トラガカントゴム又はアカシアゴム及びワセリンである。通常、キャリア（単数）又はキャリア（複数）は組成物の１０％〜９９．９重量％を形成するであろう。
【０１０１】
注射用の用途に好適な医薬形態には、無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び無菌の注射用の溶液若しくは分散液の即時の調製のための無菌の粉剤が挙げられる。製剤は製造及び保存の条件下では安定でなければならず、細菌や真菌のような微生物の混入活動に対して保護されなければならない。キャリアは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコール等）、好適なそれらの混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であることができる。たとえば、レクチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合必要とされる粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。微生物の活動の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、たとえば、糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の延長された吸収は、組成物における吸収を遅らせる剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【０１０２】
無菌の注射用溶液は、必要に応じて、上記で列挙された種々の他の成分と共に適当な溶媒にて必要な量の活性化合物を組み入れ、その後濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒及び上記で列挙されたものに由来する必要な他の成分を含有する無菌のビヒクルに種々の滅菌した有効成分を組み入れることによって調製される。無菌の注射用溶液を調製するための無菌の粉剤の場合、調製の好まれる方法は、あらかじめ無菌濾過したその溶液から有効成分に加えて追加の所望の成分が得られる真空乾燥法及び凍結乾燥法である。
【０１０３】
活性剤が好適に保護される場合、それらは、たとえば、不活性の希釈剤と共に又は吸収できる食用のキャリアと共に経口で投与されてもよく、又は硬質若しくは軟質の殻ゼラチンのカプセルに被包されてもよく、又は錠剤に圧縮されてもよく、食事の食物と共に直接組み込まれてもよい。経口の治療投与については、活性化合物は賦形剤と共に組み入れられてもよく、摂取可能な錠剤、頬内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で使用されてもよい。そのような組成物及び調製物は、少なくとも１重量％の活性化合物を含有すべきである。組成物及び調製物の比率は当然変化してもよく、都合上、単位の重量の約５％〜約８０％の間であってもよい。そのような治療上有用な組成物における活性化合物の量は好適な投与量が得られるようにということである。本発明に係る好まれる組成物又は調製物は経口の投与単位形態が約０．１μｇ〜２０００ｍｇの活性剤を含有するように調製される。
【０１０４】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセル等は、以下に列記されるような成分：たとえば、アカシアゴム、コーンスターチ又はゼラチンのような結合剤；たとえば、リン酸二カルシウムのような賦形剤；たとえば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等のような崩壊剤；たとえば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；及びスクロースのような甘味剤も含有してもよく、ラクトース又はサッカリンを添加してもよく、又はたとえば、ペパーミントのような風味剤、冬緑油又はサクランボ風味を添加してもよい。投与単位形態がカプセルである場合、それは、上記の種類の物質に加えて、液状キャリアを含有し得る。コーティングとして、又はさもなければ、投与単位の物理的形態を改変するために種々の他の物質が存在し得る。たとえば、錠剤、丸薬又はカプセルはシェラック、糖又は双方によってコーティングされ得る。シロップ又はエリキシルは甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、染料及びたとえば、サクランボ又はオレンジの風味のような風味剤を含有し得る。当然、任意の投与単位形態を調製するのに使用される物質は、薬学上純粋であるべきであり、採用される量にて実質的に非毒性であるべきである。加えて、オリゴヌクレオチドは持続放出型の調製物及び製剤に組み込まれ得る。
【０１０５】
本発明は併用治療法を熟考し、その際、本明細書で記載されるようなオリゴヌクレオチドは所望の治療転帰又は予防転帰を促進し得る他の好適な剤と共に同時投与される。たとえば、癌又は腫瘍の文脈では、本発明の実施形態に従ってオリゴヌクレオチドを採用して腫瘍の血管形成及び／又は腫瘍の転移を抑制し、又は軽減しながら、たとえば、化学療法又は放射線療法のような進行中の抗癌療法又は抗腫瘍療法を維持することを求め得る。「同時投与される」によって、同一の若しくは異なる経路を介した同じ製剤若しくは２つの異なる製剤における同時投与、又は同一の若しくは異なる経路による順次投与を意味する。「順次」投与によって剤の投与間の秒、分、時間又は日の時間差を意味する。投与は任意に順であってもよい。
【０１０６】
本発明の実施形態は本発明に従って使用するためのキットも提供する。たとえば、本発明のキットは本明細書で開示されるような１以上のブロックミール及び対照として使用するための任意で暗号化したオリゴヌクレオチドを含有し得る。そのようなキットは、たとえば、ＶＥ−カドヘリンの活性、血管透過性又は血管形成の究明を含む医学又は生物学の研究活動に使用され得る。本発明に係るキットはブロックミールを使用するのに必要とされる、たとえば、緩衝液及び／又は希釈液のような他の成分も含み得る。キットは通常、種々の成分及び本発明の方法でキット成分を使用するための指示書を収容するための容器を含む。
【０１０７】
従来の出版物（又はそれに由来する情報）又は知られている任意の事項に対する本明細書における参照は、その従来の出版物（又はそれに由来する情報）又既知の事項が、本明細書が関連する試みの分野にて常識の一部を形成するという認識又は承認又は示唆の形態ではなく、そのように解釈されるべきではない。
【０１０８】
本発明は今や、以下の具体的な実施例を参照して説明されるが、実施例は本発明の範囲を限定するとは決して解釈されるべきではない。
【０１０９】
［実施例］
以下の実施例は本発明の説明に役立つものであり、本明細書の全体を通した記載の開示の一般的性質を限定するとは決して解釈されるべきではない。
【０１１０】
一般的な方法
細胞培養
以前記載された（Ｌｉｔｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）とおりにＨＵＶＥＣを単離し、培養し、継代２〜４の間で使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞は１０％ＦＢＳで補完したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）にて維持した。
【０１１１】
オリゴヌクレオチド
ヒトのｍｉＲ−２７ａのマイクロＲＮＡ（Ｍｉｒｉｄｉａｎ）模倣体はＤｈａｒｍａｃｏｎによって合成された。ｍｉＲ−２７ａのＬＮＡ阻害剤（ＬＮＡ−２７ａ）はＥｘｉｑｏｎによって設計され、合成された。ブロックミールはすべてＭｉｒｒＸによって設計され、合成された。ステルスＲＮＡｉ（商標）ｓｉＲＮＡ標的化ヒトＶＥ−カドヘリンｍＲＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって設計され、合成された。以下の実施例で記載される実験で使用したオリゴヌクレオチドの配列は表１及び本明細書の最後に現れる配列表にて提供する。
【０１１２】
【表１】
0006430945.tif 000002
【０１１３】
プラスミド
ＰｓｉＣＨＥＣＫ  ＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲ（ＷＴ）は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ下流のプラスミドＰｓｉＣＨＥＣＫ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ）にヒトＶＥ−カドヘリン遺伝子に由来する３’ＵＴＲ全体をクローニングすることによって調製した。このプラスミドは、ルシフェラーゼ活性の内部基準化として作用するホタルルシフェラーゼ発現カセットを含有する。ＰｓｉＣＨＥＣＫ  ｍｕｔ−ＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲ（Ｍｕｔ）は、プラスミドＰｓｉＣＨＥＣＫ  ＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲにおけるＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲのｍｉＲ−２７ａ結合部位を変異させることによって調製した。
【０１１４】
レポータープラスミドｐＭｉＲ−標的、ｐＭｉｒ．ＰＰＡＲＧ  ３’ＵＴＲ及びｐＭｉｒ．ＳＰＲＹ２  ３’ＵＴＲはＯｒｉｇｅｎｅによって調製された。ｐＭｉｒ．ＰＰＡＲＧ  ３’ＵＴＲは、ホタルルシフェラーゼのレポーターのすぐ下流にクローニングされたヒトのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ遺伝子に由来する３’ＵＴＲを含有する一方で、ｐＭｉｒ．ＳＰＲＹ２  ３’ＵＴＲは、ヒトＳｐｒｏｕｔｙホモログ２（ショウジョウバエ）の３’ＵＴＲを伝えるように同様に構築される。ｐＭｉＲ−標的は空のベクター対照として役立った。形質移入実験については、ｐＭｉＲ−標的、ｐＭｉｒ．ＰＰＡＲＧ  ３’ＵＴＲ及びｐＭｉｒ．ＳＰＲＹ２  ３’ＵＴＲに由来するホタルのルシフェラーゼ活性を、形質移入対照として役立ったプラスミドｐＧＬ４．７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）に由来するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発現に対して基準化した。
【０１１５】
一時的な形質移入及びルシフェラーゼアッセイ
製造元の指示書に従って、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ形質移入試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＴ２５フラスコにてＨＵＶＥＣ細胞の形質移入を行った。フラスコ当たり４×１０５個の細胞で細胞を播き、２４時間インキュベートした後、１５ｎＭの最終濃度でのマイクロＲＮＡ模倣体、又は３０ｎＭの最終濃度でのＬＮＡ、ブロックミール又はＶＥ−カドヘリンｓｉＲＮＡによって形質移入した。形質移入の２４時間後、ルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした。ＶＥ−カドヘリンの再構成実験については、製造元の指示書に従って、Ａｍａｘａ（登録商標）ＨＵＶＥＣ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キット（Ｌｏｎｚａ）を用いて、１μｇの適当なプラスミドを１５ｎＭの最終濃度でのｍｉＲＮＡ模倣体と共に同時形質移入した。
【０１１６】
製造元の指示書に従ってリポフェクトアミン２０００を用いて９６穴プレートにて３つ組でＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞の形質移入を行った。ウェル当たり６×１０３個の細胞をプレートに播き、２４時間インキュベートした後、ウェル当たりでルシフェラーゼレポーター構築物（７０ｎｇ）、ブロックミール又はＬＮＡ（３．７５ｎＭ）及びｍｉＲ−２７ａ−模倣体（３．７５ｎＭ〜３０ｎＭ）を含む同時形質移入を行った。内部対照として、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するプラスミドｐＧＬ４．７３（０．５ｎｇ）を同時形質移入し、２４時間後、ＰｏｌａｒＳｔａｒ  Ｏｍｅｇａ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いてルシフェラーゼ活性を定量した。
【０１１７】
ｍｉＲＮＡマイクロアレイ
以前記載された（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）とおりにアレイを行った。各時点でプールされたこれらの生物複製物に由来するデータと共に２つの別々のＨＵＶＥＣ細胞株の実験に由来するＲＮＡを用いて競合ハイブリッド形成を行った。ＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ  ４．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって駆動されるＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナーを用いてアレイを走査した。自由に利用可能な統計的なプログラミング及びグラフィック環境Ｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いて解析を行った。差次的に発現されるｍｉＲＮＡは、差次的発現の大きさと一貫性の組み合わせにて遺伝子をランク付けする経験的ベイズ法（Ｓｍｙｔｈ，  ２００４）を用いて特定した。
【０１１８】
ｍｉＲＮＡマイクロアレイのデータの解析
Ｌｉｍｍａ（マイクロアレイデータの線形モデル）パッケージの中での基準化ツールを用いてアレイから生成されたＳＰＯＴ出力ファイルを読み取り、基準化した。一般に、二色アレイについてのマイクロアレイの基準化には、プリントチップ群の変動のために生じ得る各アレイ内で対数比の値（Ｍ値）を基準化すること（アレイ内の基準化）と、アレイ間でのチャンネル強度（Ａ値）を基準化することとが関与する。ここで使用されるアレイでは、プリントチップ群当たりのスポットの数が少ないために、グローバルレス法（関数「ＮｏｒｍａｌｉｚｅＷｉｔｈｉｎＡｒｒａｙｓ」による）を用いてアレイ内基準化を行った。関数（「ＮｏｒｍａｌｉｚｅＷｉｔｈｉｎＡｒｒａｙｓ」）による初期設定五分位数法をアレイ間基準化に用いた。
【０１１９】
線形モデル化のツール及び差次的発現の大きさと一貫性の組み合わせにて遺伝子をランク付けする経験的ベイズの統計的計算を用いてＬｉｍｍａにて差次的発現の解析も行った。Ｌｉｍｍａにおける「ｔｏｐｔａｂｌｅ」関数を用いて、平均倍数変化（Ｍ）、管理されたｔ−統計、ｐ値、複数の検定について補正されたｐ値及びＢ−統計（以下でさらに詳細に説明される）を含む所与の時点での各ｍｉＲＮＡに関する要約統計を提供した。
平均対数倍数変化（Ｍ）：各時点対比（たとえば、３時間対０時間）での反復にわたっての各ｍｉＲＮＡの平均ｌｏｇ２の倍数変化を表す。
管理されたｔ−統計：管理されたｔ−統計は、標準誤差が遺伝子にわたって管理されている、すなわち、単純ベイズモデルを用いて共通の値に圧縮されていることを除いて普通のｔ−統計と同じ解釈を有する。
Ｐ値：所与の時点でのその遺伝子についての倍数変化の有意性を表す。これは複数の検定について調整されて調整されたｐ−統計を提供することができる。ベンジャミニ／ホフバーグの補正を調整に使用した。
Ｂ−統計：発現の確率対非発現の確率の対数（基本実験）オッズを表す。
【０１２０】
ＲＮＡの抽出及びｑＲＴ−ＰＣＲ
製造元の指示書に従って、Ｔｒｉｚｏｌ抽出（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＨＵＶＥＣから全ＲＮＡを単離した。高能力ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１μｇのＤＮＡ分解酵素処理した全ＲＮＡから相補性のＤＮＡをランダムプライムした。ｍｉＲＮＡ発現の解析については、製造元の指示書に従って（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイを用いたＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。
【０１２１】
マトリゲル管形成アッセイ
以前記載された（Ｇａｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）ようにマトリゲルアッセイを行った。手短には、製造元の指示書に従って、マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を融解し、１００μｌのマトリゲルを平底９６穴プレートに加え、３７℃で１時間重合させた。次いでＨＵＶＥＣをＨＵＶＥＣ培地中ウェル当たり３．６×１０４個でプレートに入れた。２４時間にわたって規則的な間隔で写真を撮影した。
【０１２２】
透過性アッセイ
以前記載された（Ｇａｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）ように透過性アッセイを行った。手短には、形質移入の２４時間後、ＨＵＶＥＣ培地にてトランスウェル当たり１×１０５個でＨＵＶＥＣ細胞を２４時間プレートに入れ、次いでさらに２４時間、２％ＦＣＳのＨＵＶＥＣ培地に入れた。ＦＩＴＣを結合したデキストラン（２μｇ）をウェルすべての上側チャンバーに加えた。４８５ｎｍの励起波長及び５３０ｎｍの放射波長でＬＳ５０Ｂ発光分光計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてトランスウェルの下側チャンバーにおけるＦＩＴＣデキストランの量を測定した。透過性は、上側チャンバーから下側チャンバーに通過するＦＩＴＣデキストランの量として得られる。形質移入処置の２４時間後、ｍｉＲ−２７ａを過剰発現しているＨＵＶＥＣをトランスウェルに入れ、対照模倣体で形質移入した細胞と同じ方法で処理した。
【０１２３】
免疫ブロット
氷冷した溶解緩衝液（１％のＮＰ−４０、５ＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＥＧＴＡ，５００ｍＭのＮａＦ、１００ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを伴った１ＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５）にてＨＵＶＥＣを溶解した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（ＢｉｏＲａｄ）用いてタンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質をアクリルアミドゲル上に負荷し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、ＰＢＳ−Ｔにおける５％脱脂粉乳でブロックし、ＶＥ−カドヘリン一次抗体（Ｃ−１９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で探査し、その後、適当な二次抗体で探査した。洗浄後、化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ８  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって反応性バンドを検出した。膜を洗浄し、負荷対照としての抗β−アクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて再探査した。
【０１２４】
ＶＥ−カドヘリンの局在
ＬａｂＴｅｋスライド（試験管内の技法）に４８時間載せた細胞を用いて、記載された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）ように局在試験を行った。フルオレセイン用の励起フィルターを装着し、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｉｇｈｔ冷却カラーデジタルカメラ（ニコン）に捕捉されたニコンＥｃｌｉｐｓｅＴｉ−Ｕ倒立顕微鏡（ニコン）上の４０倍の対物レンズを用いてＶＥ−カドヘリンの局在を観察した。ＮＩＳ−ＡＲ先端研究ソフトウエア（ニコン）を用いて明度及び明暗差について画像を調整した。
【０１２５】
コラーゲンアッセイ
以前記載された（Ｇａｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）ようにコラーゲン毛細管形成アッセイを行った。２０ｎｇ／ｍｌの酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）及び複合体多細胞管の形成を促進するα２β１−インテグリン（ＡＣ１１）に対する抗体の添加によって毛細管形成を刺激した。
【０１２６】
マトリゲルプラグアッセイ
以前記載された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）ようにマトリゲルプラグアッセイを行った。６〜８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスにＦＧＦ−２（０．５μｇ、（Ｓｉｇｍａ，ＭＩ）、９０μｇの対照又はｍｉＲ−２７ａ模倣体又は模倣体なし（ビヒクル）及びＦｕＧＥＮＥ６（２．５μｌ）を含有する５００μｌのマトリゲルを皮下注射した（右脇腹）。１４日後、プラグを切除し、１０％パラホルムアルデヒドで固定した。５μｍの断面切片をヘマトキシリン／エオシンで染色した。プラグにおける赤血球を含有する血管を１００倍拡大のもとで光学顕微鏡によって定量し、３つの無作為な視野の平均値として表した。ＤＰＣコントローラ３．１．１．２６７ソフトウエアを用いたＤＰ７０カメラに繋いだＢＸ５１顕微鏡上にてパネルＡについてはＵｐｌａｎＦｌ  ２０Ｘ／０．５０対物レンズを、パネルＢについてはＵＰｌａｎＦｌ  ４０Ｘ／０．７７対物レンズを用いて、室温にて画像を取得した。データの取得に続いて、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて明度と明暗差の調整を行った。２つの異なるバッチのｍｉＲＮＡ模倣体を用いて２つの別々の日に実験を行った。
【０１２７】
レーザーの捕捉
Ａｒｃｔｕｒｕｓ  ＰｉｘＣｅｌｌ  Ｈｅ機器を用いて小静脈及び新しい新生血管からの内皮細胞の切除を達成した。レーザーの直径を７．５μｍに設定し、レーザーのパルスを０．２秒に設定した。内皮細胞をＣａｐＳｕｒｅ  Ｍａｃｒｏ  ＬＣＭカップに移した。２つの内皮細胞の集団について患者当たりおよそ５〜１０のＬＣＭカップを回収した。Ａｒｃｔｕｒｕｓ  ＰｉｘＣｅｌｌ  ＩＩｅ顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上のＵＰｌａｎＦｌ  ４ｘ／０．１３、ＵＰｌａｎＦｌ  １０ｘ／０．３０、ＬＣＰｌａｎＦｌ  ２０ｘ／０．４０の対物レンズを用いて室温にて画像を取得し、日立１／２インチの単一チップＣＣＤカラーカメラ（日立）に捕捉した。ＬＣＭバージョン２．０のソフトウエアを用いて明度と明暗差について画像を調整した。
【０１２８】
生体内透過性のためのマイルスアッセイ
以前記載された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）ように本質的に生体内透過性のモデルとしてマイルスアッセイを行った。８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊマウスにて４μｇの対照ＬＮＡ又はｍｉＲ−２７ａＬＮＡを背部に皮内注射した。翌日、１００μｌの５％エバンスブルー色素を静脈内注射し、次いで１５分後、ＰＢＳ又は１０μｇのＶＥＧＦをＬＮＡと同じ部位に皮内注射し、３０分後マウスを屠殺した。透過性は、注射部位からの青色色素の潅流として測定した。定量については、冒された領域の生検を採取し、色素を５６℃で一晩ホルムアミドに溶出させ、吸光度を６２０ｎｍで読み取った。合計９匹のマウスを用いた。実験は異なる２日に行った。
【０１２９】
片側後肢虚血のマウスモデル
左の大腿の動脈及び静脈全体を結紮し、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスから外科的に摘出した（Ｅｇａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。体重のｋｇ当たり３０ｍｇの用量で尾静脈を介してブロックミールを全身性に注射した。高画質レーザードップラー撮像装置（英国、Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて後肢の血流を測定した。左右両方の後肢にて様々な時点（手術前、０、１、２、３、７及び１０日目）にてレーザードップラー血流（ＬＤＢＦ）測定を行った。レーザー走査の間、メトキシフルランでマウスを麻酔し、加熱したパッド（３７℃）上に置き、体温による変動をできるだけ抑えた。最低３回の反復走査で後肢を走査した。偽手術した（右）後肢の血流に対する虚血（左）の比率を算出し、平均した。
【０１３０】
後肢虚血モデルを用いた透過性アッセイ
各群８匹の動物にて、手術及びブロックミールによる処理の２４時間後、０．５％のエバンスブルー（２００μｌ）を静脈注射した。色素を３０分間循環させた後、マウスを屠殺した。内転筋群の筋肉を摘出し、秤量した。組織中のエバンスブルーを５５℃にて２４時間ホルムアミドで抽出し、ＬａｂＳｙｓｔｅｍ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ及びＭｕｌｔｉＳｏｆｔプレートリーダーを用いて６２０ｎｍでのその蛍光を測定した。血管透過性は、筋肉のグラム重量当たりの吸光度での色素の漏出のレベルとして表した。
【０１３１】
毛細血管密度の測定
メトキシフルランでマウスを麻酔し、心臓穿刺によって心臓からおよそ１ｍＬの血液を採取した。次に、頸椎脱臼にてマウスを安楽死させた。虚血四肢及び非虚血四肢の大腿内側内転筋を回収し、８μｍの厚さの凍結切片として処理した。氷冷アセトンで１０分間、切片を固定し、ラット抗マウスラミニン（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、フィトエリスリンに結合させた抗ＣＤ３１（１：２００、Ａｂｃａｍ）及びＦＩＴＣに結合させた抗平滑筋アクチン（１：５００、Ａｂｃａｍ）を含む抗体のカクテルで染色した。切片を洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素３５０（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に結合させた二次抗体抗ラットによって染色した。オリンパスＩＸ７１顕微鏡及びオリンパスＤＰ７１カメラ用いて各動物から、２００倍拡大で（オリンパスＬＵＣＰＬＦＬＮ、２０倍対物レンズ、ＮＡ０．４５）１０の異なる無作為な顕微鏡視野を得た。取得ソフトウエアは双方ともオリンパスに由来するＤＰコントローラ（バージョン３．１．１．２６７）及びＤＰマネージャー（３．１．１．２０８）から成る。ＩｍａｇｅＪバージョン１．４６ａソフトウエアを用いて画像を解析した。毛細血管密度は筋細胞の数当たりの毛細血管の数として表した。
【０１３２】
統計学
特に言及されない限り、Ｔ検定を実施した。
【０１３３】
倫理
ヒトの倫理的な認可はオーストラリア、シドニーのＲｏｙａｌ  Ｐｒｉｎｃｅ  Ａｌｆｒｅｄ病院から得、動物の倫理的な認可はシドニー大学又はＮＳＷ大学のいずれかの動物倫理委員会から得た。
【０１３４】
実施例１：試験管内血管形成の間の調節されたｍｉＲＮＡの特定
ｍｉＲＮＡのマイクロアレイを用いて毛細管形成の間に調節されているマイクロＲＮＡを特定した。結果は、正のＢ値及びＭ値に基づいて、処理の間、３３の上方調節されたｍｉＲＮＡ及び６９の下方調節されたｍｉＲＮＡを明らかにした。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒ及びｍｉＲａｎｄａを含むＷｅｂに基づいた標的予測アルゴリズムを用いて透過性の調節に関与する最も調節された可能性が高いｍｉＲＮＡの潜在的な標的を検討した。特に関心があるのは、固形腫瘍における細胞／細胞の相互作用及び接着に関与し、且つＶＥＧＦが介在するシグナル伝達に関与する内皮細胞特異的なカルシウム依存性の接着分子であるＶＥ−カドヘリンを標的とすると予測されたｍｉＲ−２７ａだった。ＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲは、後に「Ａ」が続く成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位で正確に一致するｍｉＲ−２７ａについての単一の予測された８量体部位を含有する（シード領域＋８位）。ｍｉＲ−２７ａ、及びこのｍｉＲＮＡ群の他の２つのメンバー、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２４のｍｉＲＮＡマイクロアレイの発現プロファイルを、さらに３つの独立したＨＵＶＥＣ細胞株のプールを用いたｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した（データは示さず）。
【０１３５】
実施例２：ｍｉＲ−２７ａはＶＥ−カドヘリンの発現及びＶＥ−カドヘリン依存性の機能を変化させる
ｍｉＲ−２７ａがＶＥ−カドヘリンの発現を調節するかどうかを判定するために、ｍｉＲ−２７ａ模倣体で形質移入した細胞にてＶＥ−カドヘリンタンパク質のレベルを測定した。ＶＥ−カドヘリンタンパク質の発現には有意な低下（２５％±４％、ｎ＝５）があり（図１Ａ及び１Ｂ）、フローサイトメトリーによって解析された細胞表面の発現（図１Ｃ）及びｍＲＮＡ（３１％±７％、ｎ＝５）（図１Ｄ）にて同様の大きさの低下があった。逆に、ロックド核酸（ＬＮＡ）（ＬＮＡ−２７ａ；配列番号８）を含有する抗ｍｉＲ−２７ａアンチマーを用いたｍｉＲ−２７のノックダウンは、ＶＥ−カドヘリンタンパク質発現の（図１Ｅ及び１Ｆ）の上方調節（２２％±４％）及び細胞表面の発現（図１Ｇ）の上方調節を生じた。
【０１３６】
ＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲ全体を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時形質移入した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｍｉＲ−２７ａの異所性の発現はルシフェラーゼ活性を抑制した（３３％±３％、ｎ＝４）。ｍｉＲＮＡの部位の変異はルシフェラーゼ活性の抑制を反転することができた（図１Ｈ）ということは、ＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−２７ａとｍｉＲ−２７ａ結合部位の間での直接的な相互作用を裏付けている。
【０１３７】
ＶＥ−カドヘリンが決定的に関与することが分かっている設定でｍｉＲ−２７ａの過剰発現（ｍｉＲ−２７ａ模倣体）の効果を調べた。ｍｉＲ−２７ａ模倣体は細胞の生存性には影響を有さず、内皮細胞の増殖で小さいが、有意な増加を誘導した。内皮細胞単層では、対照模倣体で形質移入した細胞はＶＥ−カドヘリンで装飾され、特徴的な近接して置かれた結合を示した（図２Ａ）。対照的に、ｍｉＲ−２７ａ模倣体の細胞は結合間にギャップを有し、ＶＥ−カドヘリンの染色に対してさらに広範なパターンがあり、細胞はさらに良く見せられた（図２Ａｉｉ）。抗ｍｉＲ−２７ａＬＮＡで形質移入した細胞はＶＥ−カドヘリンの分布にも変化を示した。緩く詰まった単層では、対照細胞はさらに多くの細胞間ギャップ及び染色のさらに広範なパターンを示した（図２Ｂｉ）。対照的に、抗ｍｉＲ−２７ａの細胞はさらにきつく置かれた結合を示し、細胞間ギャップは少なかった（図２Ｂｉｉ）。崩壊した結合に一致してｍｉＲ−２７ａ模倣体の細胞は透過性の小さいが、有意な増加を示した（図２Ｃ）のに対して、抗ｍｉＲ−２７ａＬＮＡで形質移入した細胞は、強力な透過性誘導剤であるトロンビンによる刺激に続く内皮細胞の透過性を抑制した（図２Ｄ）。抗ｍｉＲ−２７ＬＮＡは生体内でも有効だった。図２Ｅは、抗ｍｉＲ−２７ａＬＮＡがマウスにおけるＶＥＧＦに対する血管透過性を有意に低減し、これに一致して、ＬＮＡは組織における内在性のｍｉＲ−２７ａのレベルも抑制したことを明らかにしている（データは示さず）。最終的に、ｍｉＲ−２７ａ模倣体の過剰発現はマトリゲルプラグアッセイを用いた試験管内での毛細管形成（図３Ａ）及び生体内での血管形成（図３Ｂ）を阻害した。
【０１３８】
ＶＥ−カドヘリンが毛細管形成の主要な調節因子であることを確認するために、ｓｉＲＮＡを用いてＶＥ−カドヘリンノックダウンし、ｍｉＲ−２７ａ模倣体で見られるものに類似するおよそ２０〜３０％のノックダウンを得た（データは示さず）。細胞は生きたままだったが、マトリゲルに入れられると、毛細管は細く、壊れる傾向にあり、対照で生じるような安定なネットワークをもはや形成せず（データは示さず）、表現型はｍｉＲ−２７ａの過剰発現で見られるものに非常に類似していた。次いで、ＶＥ−カドヘリンの発現プラスミドを用いてｍｉＲ−２７ａ過剰発現効果の救済実験を行った。ＶＥ−カドヘリン発現の量にておよそ５倍の増加がこの発現プラスミドで達成された。ＶＥ−カドヘリンの過剰発現は、マトリゲルにて毛細管を形成する能力でｍｉＲ−２７ａ模倣体の効果を部分的に反転することができた（図３Ｃ）。引っ掻きアッセイ用いてＥＣの移動を誘導すると、ｍｉＲ−２７ａは迅速に下方調節された一方で、ＶＥ−カドヘリンのｍＲＮＡレベルは上方調節された。創傷の２４時間後まで、ｍｉＲ−２７ａのレベルは高く、これに一致したが、ＶＥ−カドヘリンｍＲＮＡのレベル（図３Ｄ）はタンパク質（データは示さず）と同様に低下していた。総合して、これらの結果は、ＶＥ−カドヘリンが内皮細胞におけるｍｉＲ−２７ａの主要な標的であり、その調節は観察された毛細管形成の混乱を生じることを示唆している。
【０１３９】
実施例３：ｍｉＲ−２７ａは疾患における新生血管にて下方調節される
上述のデータは、限定された血管形成応答を受けている血管における内皮細胞が、成熟した非血管形成性の血管における内皮細胞に比べて低下したレベルのｍｉＲ−２７ａを有するはずであることを示唆している。この仮説を調べるために、本発明者らは、血管形成が生じることは分かっているが、腫瘍増殖に関連しない疾患の患者に由来する血管におけるｍｉＲ−２７ａの発現を検討した。３人の肝硬変患者からパラフィン包埋した肝臓の切片を得た。再生結節を取り囲む線維性の領域は血管形成を介して新しい血管が形成する（新生血管）状況であることが知られ、正常な肝臓のこの領域はそのような新生血管を含まれない（Ｍｅｄｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。レーサー捕捉マイクロダイセクション（ＬＣＭ）によって小静脈及び新生血管（図４Ａ）から内皮細胞を採取し、試料からＲＮＡを単離した。Ｔａｑｍａｎ低密度アレイ（ＴＬＤＡ）用いて解析したｍｉＲＮＡの特性は、患者間で検出されたｍｉＲＮＡの数には変動があったが、３人の患者のそれぞれで新生血管と同様の数のｍｉＲＮＡが小静脈で検出されることを示していた。検出されたｍｉＲＮＡについての平均Ｃｔは群間及び患者間の双方で類似していた。当初のアレイスクリーンでは、ｍｉＲ−５２０ｄ＊が高度に安定であることが見いだされたので、ｑＲＴ−ＰＣＲの基準化対照として使用した。ＬＣＭ試料の細胞性の純度に対処するには、捕捉された物質の量の限界のために内皮細胞又は肝細胞に特異的なｍＲＮＡのレベルを検討することはできなかった。しかしながら、肝臓のｍｉＲＮＡ全集団の７０％を占め、他の組織では検出できない高度に豊富で肝臓特異的なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２２（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２））が試料のいずれでも検出されなかったということは、捕捉された細胞には肝細胞が有意には混入しなかったことを示唆している。
【０１４０】
次いでｍｉＲ−２７ａの発現についてｑＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡ試料を分析し、結果をｍｉＲ−５２０ｄ＊の発現に対して基準化した（図４Ｂ）。３人の患者すべてについて、小静脈に由来する細胞に比べて、新生血管の集団に由来する細胞ではｍｉＲ−２７ａのレベルに有意な低下があった。従って、患者数は少ないが、データは、ｍｉＲ−２７ａの下方調節が調節された血管形成に関連するという考えを支持している。
【０１４１】
実施例４：ＶＥ−カドヘリンに対するブロックミールはＶＥ−カドヘリンの発現を調節する
ｍｉＲＮＡは、少なくとも部分的に、標的結合で使用される高度に保存されたシード配列のために複数の遺伝子を標的とすることができる。従ってｍｉＲＮＡに直接結合する拮抗剤を用いてｍｉＲＮＡの活性を調節することは、調節解除される複数の標的遺伝子につながり、（ｍｉＲＮＡの）所与の機能についてどの標的が決定的であるのかを示さない。ｍｉＲ−２７ａのどの標的が透過性及び血管形成のｍｉＲ−２７ａの調節に決定的であるのかをさらに良く理解するために、ブロックミールを使用した。ブロックミールは、標的ＲＮＡにおける特定のｍｉＲＮＡ結合部位に結合し、それによって標的部位へのｍｉＲＮＡの結合を妨げる立体的なアンチセンスオリゴヌクレオチド遮断剤である。本試験で使用されたブロックミールは、ＶＥ−カドヘリンのｍＲＮＡにおけるｍｉＲ−２７ａ結合部位に相補性の１５量体のＬＮＡ／２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドとして設計され、ＣＤ５−１（配列番号５）、ＣＤ５−２（配列番号６）及びＣＤ５−３（配列番号７）と呼ばれた。
【０１４２】
ＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−２７ａ結合部位に結合するように設計された２つの異なるブロックミールであるＣＤ５−２（配列番号６）及びＣＤ５−３（配列番号７）を用いて、本発明者らはＶＥ−カドヘリンのレベルが内皮細胞にて有意に高められることを示した（図５Ａ）。さらに、それが抗ｍｉＲ−２７ａＬＮＡで見られるのと同様のＶＥ−カドヘリンのレベル一貫して調節したので、ブロックミールＣＤ５−２に関して調べた。ブロックミールＣＤ５−２はまた、ＶＥ−カドヘリンの内皮細胞単層の結合への局在も調節し（図５Ｂ）、トロンビンに対する透過性も抑制し（図５Ｃ）、マイルスアッセイで測定したようにＶＥＧＦが誘導する血管漏出も抑制した（図５Ｄ）。
【０１４３】
実施例５：ＶＥ−カドヘリンに対するブロックミール及び虚血性傷害
本発明者らはまた、マウスにおける後肢虚血に続く回復に対するＣＤ５−２ブロックミールの効果も検討した。ｍｉＲ−２７ａは傷害後、最初の２日以内に迅速に下方調節され、その後、正常レベル又はやや高いレベルに戻る。虚血の誘導の直後、０日目に単回全身注射としてブロックミールＣＤ５−２を与えた。ブロックミールは７日目に測定したとき、血流の有意な改善をもたらした（図６Ａ）。さらに、虚血からの回復は２４時間以内に明らかだった（図６Ｂ）。ブロックミールＣＤ５−２は最初の２４時間以内に虚血筋肉における浮腫の減少を生じた（図６Ｃ）。さらにＣＤ５−２はＣＤ３１の染色で評価されたように血管形成を刺激した（図６Ｄ）。ブロックミールのｍｉＲ−２７−ＶＥ−カドヘリンへの標的化に一致して、虚血筋肉の中でのＣＤ３１陽性の血管におけるＶＥ−カドヘリンの発現で上昇があった（データは示さず）。非虚血筋肉における毛管現象に対するＣＤ５−２の効果はなかった（データは示さず）。虚血の回復には浮腫の制限及び血管形成の程度が影響するので、これらの結果はブロックミールがこれらの態様の双方に影響していることを示している。要約すると、ブロックミールＣＤ５−２は、虚血性傷害の時点での単回のボーラス静脈注射として送達されても虚血後の回復を向上させた。回復に関連するのは浮腫の抑制及び血管形成応答の向上だった。
【０１４４】
上記で記載されたブロックミールはＶＥ−カドヘリンにおけるｍｉＲ−２７ａ結合部位を標的とするように設計されたが、この部位は他の予測された標識にて相同性が高い。従って、本発明者らは、ｍｉＲ−２７ａが検証する２つの他の標的ＳＥＭＡ６Ａ及びＰＰＡＲγ（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）に対するＶＥ−カドヘリンが指向するブロックミールの特異性を検討した。抗ｍｉＲ−２７ａＬＮＡは、標的ｍＲＮＡであるこれらに一致して、ＶＥ−カドヘリン及びＳＥＭＡ６Ａのタンパク質発現の上昇を誘導したが、ＣＤ５−２だけはＶＥ−カドヘリンの有意な上昇を誘導した（図７Ａ及び７Ｂ）。同様に、ＬＮＡはＰＰＡＲγタンパク質の発現も有意に調節したのに対してＣＤ５−２は調節しなかった（データは示さず）。本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲ全体（１５４８ｂｐ領域）を含有するプラスミドを用いたＶＥ−カドヘリンの調節も検討した。ＨｅＬａ細胞では、ｍｉＲ−２７ａの過剰発現はＶＥ−カドヘリンのルシフェラーゼ活性の予想された阻害を引き起こした。ブロックミールＣＤ５−２はｍｉＲ−２７ａが介在する阻害を反転したのに対してＰＰＡＲγにおけるｍｉＲ−２７ａ結合部位に対して設計されたブロックミールはそうしなかった（図７Ｃ）。ＬＮＡはｍｉＲ−２７ａの過剰発現が原因で生じる抑制を反転させた。ＶＥ−カドヘリンにおけるｍｉＲ−２７部位の変異はＣＤ５−２による抑制を無効にした。タンパク質の発現及び転写レポーターアッセイを用いたこれらの実験は、ブロックミールの設計における選択性の程度を明らかにし、ブロックミールＣＤ５−２はＶＥ−カドヘリンに対する活性を示すが、ＳＥＭＡ６Ａ及びＰＰＡＲγに対する活性は示さない。さらに、それは、ブロックミールがＶＥ−カドヘリンの３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−２７ａ部位に結合するが、たぶん必要な付属タンパク質の動員の欠如にためにｍｉＲＮＡの分解機構を活性化しないことを示唆している。
【０１４５】
実施例６：ＶＥ−カドヘリンに対するブロックミールは腫瘍増殖を抑制する
ＶＥ−カドヘリンに対するブロックミールの上述の効果を考えて、本発明者らは、生体内でのこれらブロックミールの投与の腫瘍増殖に対する効果を検討した。２００μｌのＰＢＳ中の同系のＢ１６Ｆ１０細胞（４×１０５）をＣ５７ＢＬ／６メスマウス（８週齢）の背部右脇腹領域にて皮下注射した。腫瘍が眼に見えると（Ｂ１６Ｆ１０細胞注射の６日後）、ブロックミールＣＤ５−２又はスクランブル対照をマウス（１群３匹）に静脈注射した。式Ｖ＝ＪＩ×［ｄ２×Ｄ］／６を用いてノギスによって毎日、腫瘍容積を測定したが、式中、ｄは腫瘍の短径であり、Ｄは腫瘍の長径だった。図８に示すように、ブロックミールＣＤ５−２を投与したマウスでは、スクランブル対照ブロックミールを投与したマウスよりも実質的に遅い速度で腫瘍容積が増大した。
【０１４６】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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