(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（ＶＩａ）及び（ＶＩｂ）：
ＮＨ２−（Ａ１）ｍ−配列番号２−（Ａ２）ｎ−ＣＯＯＨ  （ＶＩａ）、
ＮＨ２−（Ａ１）ｍ−配列番号６−（Ａ２）ｎ−ＣＯＯＨ  （ＶＩｂ）
［式中：
−  ｍは、０又は１を意味する整数であり、
−  ｎは、０又は１を意味する整数であり、
−  Ａ１は、アミノ酸残基であり、
−  Ａ２は、アミノ酸残基である］
から成る群より選択されるペプチドを含む免疫原性化合物であって、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドが、ＣＲＭ１９７タンパク質から成る担体タンパク質に共有結合的に連結された、免疫原性化合物。
【請求項２】
式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドが、配列番号５及び配列番号７から成る群より選択される、請求項１記載の免疫原性化合物。
【請求項３】
式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドが、そのＮ末端アミノ酸残基によってＣＲＭ１９７タンパク質に共有結合した、請求項１〜２のいずれか一項記載の免疫原性化合物。
【請求項４】
式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドが、リンカー部分を経由してＣＲＭ１９７タンパク質に共有結合した、請求項１〜３のいずれか一項記載の免疫原性化合物。
【請求項５】
リンカー部分が、２個の反応基を有するリンカー剤とＣＲＭ１９７及び式（Ｉ）で示されるペプチドの両方との反応生成物である、請求項４記載の免疫原性化合物。
【請求項６】
リンカー剤が、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ）又はスルホ−ＳＭＰＢから成る、請求項５記載の免疫原性化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載の免疫原性化合物を１種又は複数の免疫アジュバント物質と組み合わせて含む組成物。
【請求項８】
抗原性ペプチド当量で表現されるとき、１投薬単位あたり０．０１μg〜２００μg、好ましくは１投薬単位あたり０．０５μg〜５０μg、最も好ましくは１投薬単位あたり０．１μg〜２０μgの範囲の量の免疫原性化合物を含む使用準備済みのワクチン組成物を形成するように適応されている、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
免疫アジュバント物質が、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）から成る、請求項７〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
Ａｌ３＋イオン含量として表現されるとき、０．１mg/mL〜５mg/mL、好ましくは０．０５mg/mL〜２mg/mLの範囲、最も好ましくは約１mg/mLの最終濃度の水酸化アルミニウムを含む使用準備済みのワクチン組成物を形成するように適応されている、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
最終濃度０．１mM〜５０mMのリン酸ナトリウム、好ましくは０．５mM〜１５mMのリン酸ナトリウム、最も好ましくは約１mMのリン酸ナトリウムを含む使用準備済みのワクチン組成物を形成するように適応されている、請求項８〜１０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
凍結乾燥形態を含めた、液体形態又は固体形態である、請求項８〜１１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項記載の免疫原性化合物又は請求項７〜１２のいずれか一項記載の組成物を、１種又は複数の薬学的に許容されうる担体と共に含む、ワクチン組成物。
【請求項１４】
個体のＨＩＶウイルス感染によって引き起こされる状態を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物を調製するための、請求項１〜６のいずれか一項記載の化合物の使用。
【請求項１５】
個体のＨＩＶウイルス感染によって引き起こされる状態を予防及び／又は治療するために使用するための、請求項１３記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＨＩＶファミリーのウイルスに対するワクチンの分野に関するものである。
【０００２】
背景
ヒトＨＩＶ感染の約９０％は、ＨＩＶ−１ウイルスによって起こる。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、ウイルス複製時に生じる突然変異の蓄積によって起こる、及び組換え事象によっても起こる、顕著な遺伝的変異性によって特徴づけられる。ＨＩＶ処置の化学療法の長期にわたる失敗は、特に、ＨＩＶ−１ウイルス株の高い変異原活性によって説明される。異なる経過の抗レトロウイルス療法後に、及び多剤療法（ＨＡＡＲＴ）後であっても、患者から耐性ウイルス変異体が速やかに生じたことがこれまでに示された。これらの耐性ウイルスは、それらのタンパク質コンフォメーション及び構造に特異的変化を有する。通常、ＨＩＶ−１が現行処置を回避する原因となるそのような突然変異は、処置条件下で選択を受ける結果として、代々のウイルス世代にわたり維持され、蓄積する。
【０００３】
抗ＨＩＶ−１薬を用いた処置は、ウイルスの複製を完全には遮断せず、そのことが、既存の耐性突然変異及び新興の突然変異の選択及び蓄積を可能にすることで、ウイルスが蔓延し続ける新たな機会をもたらす。既存の抗レトロウイルス薬（ＮＲＴＩ、ＮＮＲＴＩ、プロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤及びＨＡＡＲＴのようなその混合物）は、耐性ウイルス株の出現及び増殖までに、ＨＩＶ−１の複製をある程度長期間減速することができるだけである。ＨＩＶ−１耐性変異体の広い蔓延は、重大な懸念を呼ぶので、さらなる抗ＨＩＶ−１治療ツールを利用できることが必要となる。
【０００４】
さらに、ＨＡＡＲＴの明らかな臨床有用性にかかわらず、多くの副作用（脂肪異栄養症、乳酸アシドーシス、インスリン抵抗性、慢性腎疾患、高脂血症など）、生涯処置、高い服薬遵守が必要、ウイルス耐性、認知障害及び運動障害としてのＨＩＶ感染の病原作用の持続、ならびに免疫活性化という欠点が持続する。そのうえ、平均余命の延長と共に、患者は、ＨＩＶ−１感染に関連する副作用、薬物耐性、代謝障害、及びガンの出現に直面しなければならない。
【０００５】
加えて、処置された患者の２０％〜３０％は、ウイルス抑制にかかわらず、時に免疫不全を経験する。すなわち、ウイルス複製の阻害にかかわらず、それらの患者のＣＤ４＋Ｔ細胞数は減少する。これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＨＩＶ−１感染の病原性事象が、ウイルス複製の阻害にかかわらずまだ存在することを示している。それで、ＣＤ４＋Ｔ細胞を保護して抗レトロウイルス処置を補足しうる安全で入手可能な治療アプローチが必要であり、未だに満たされていない医学的ニーズを表す。
【０００６】
化学的抗レトロウイルス物質を利用するもの以外の様々な抗ＨＩＶ治療戦略が考えられており、それらには、（ｉ）抗ＨＩＶ抗体の使用、（ｉｉ）ＨＩＶ粒子の破壊に基づくワクチン、（ｉｉｉ）ＨＩＶペプチドに基づくワクチン及び（ｉｖ）ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターに基づくワクチンが含まれるが、それぞれがそれらに特異的な欠点を有する。
【０００７】
ＨＩＶが１９８３年にＡＩＤＳの原因として同定されて以来、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳを予防するために複数のワクチン候補がヒト試験で試験されてきたが、成功は非常に限られていた。国際ＡＩＤＳワクチン推進構想（ＩＡＶＩ）は、これらのワクチン及び試験のデータベースを整備している（www.IAVI.org）。これらの試験のほとんど全てが、ワクチンの安全性及び予備免疫応答の前初期（第Ｉ相）試験であった。１種のワクチン（同じ基本ｇｐ１２０ワクチンの２種の製剤）だけが大規模第ＩＩＩ相試験で試験された。ＶａｘＧｅｎ  ｇｐ１２０サブタイプＢタンパク質は、米国、カナダ、及びオランダで２００３年に完了した第ＩＩＩ相試験で無効であることが見いだされた。２００３年後期に、ＡＩＤＳＶＡＸの第２の試験がタイで完了した。両方の試験は、候補が無効であることを見いだした。以前はＨＩＶに対するタンパク質ワクチンを調製するのが困難であった。それは、エンベロープタンパク質における高い多様性、使用される実験室順応株と臨床単離株の間のエンベロープの差、ワクチン中のｇｐ１２０がモノマー的性質で、ウイルス中ではトリマーに構築されていることが原因の可能性があり、特に、抗体だけが誘導され、細胞性免疫が誘導されないせいである。さらなる参考までに、ＡＩＤＳＶＡＸタンパク質（VAXGene製）と、カナリア痘に送達された遺伝子（Aventis Pasteur製ALVAC）との組み合わせも第ＩＩＩ相試験中であり、Merckのアデノウイルスに基づく候補を試験する第４の大規模試験が始まると予想されている。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、ＨＩＶ−１を含めたウイルスの免疫コントロールの重要な要素として見なされ、関連するＣＴＬ免疫原が治療用ワクチンのために考えられている。
【０００８】
ＨＩＶの大流行により毎年数百万人が感染し続けているので、有効なワクチンの必要性が増大している。抗ＨＩＶ広域中和抗体を誘発する能力がある免疫原性生成物を開発する困難が原因で、抗ＨＩＶワクチンの開発は深刻に障害されている。
【０００９】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の初代単離株に対する広域中和性抗体（ＮｔＡｂ）の誘導は、依然として、ＡＩＤＳワクチン研究のための主要でまだ達成されていない目標である。エンベロープに基づくワクチンを用いた初期の試みは、実験室に順応した単離株に対してのみ有効な抗体を誘発した。これらの場合、防御は、ｇｐ１２０のＶ３超可変領域に対する高力価ＮｔＡｂと関連づけられた。しかし、発生した中和活性は、主として単離株に特異的であって、大部分のＨＩＶ−１初代単離株に対する有効性は最小限である。第ＩＩＩ相臨床試験でサブユニットｇｐ１２０ワクチンがＨＩＶ−１取込みから防御できないことは、課題の困難を明らかに示している。
【００１０】
それにもかかわらず、ＮｔＡｂは、ＨＩＶ感染個体中からしばしば見いだすことができる。感染初期に発生する応答は、通常、特異性が狭く、ホストに伝染したウイルスを中和するが、同時代のウイルスを中和しない。抗ウイルス処置なしに感染をコントロールできる一部の長期生存者では、そのような応答は、感染過程の間に幅広くなる。しかし、交差中和性抗体応答の性質及びその発生に至るメカニズムは、理解されていない。
【００１１】
当然、Ｅｎｖに対するＮｔＡｂは感染後数週間以内に発生するが、この初期応答は特定のウイルスサブタイプに対してのみ効果的である。しかし、ｂＮｔＡｂ（交差反応性中和Ａｂ）は、ＨＩＶの過程中に発生することがある。近年いくつかの重要な研究から、ＨＩＶ感染対象（少なくとも１年間感染）の約２５％がｂＮｔＡｂ応答を有し、「エリート中和者」の１％が大多数のクレードに対して非常に強い活性を有することが示された。重要なことに、これらの結果は、感染者の免疫系が疾患過程中にＨＩＶ−１に対するＮｔＡｂをin vivoで発生できることを実証している。これらの結果から、広域反応性Ｎｔａｂ活性が経時的に生じると思われ、慢性抗原曝露により促進されることも示唆されるが、防御性であろうｂＮｔＡｂ力価に関しては分からない。
【００１２】
低ノイズでの持続性ウイルス複製は、ＮｔＡｂを回避するためのＥｎｖの継続進化に繋がる。そのような抗原進化は、より大きく保存されたＥｎｖタンパク質領域に新しいワクチン戦略を集中させる可能性があり、主な高度保存エピトープを模倣するようにワクチン免疫原を設計できることを示唆しうる。
【００１３】
効果のある抗ＨＩＶワクチンを設計する主な障壁の一つは、ｂＮｔＡｂのターゲットが高度に多様なウイルスエンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）である一方で、保存されたエレメントは免疫原性に乏しいと思われることであった。これは、レセプター結合過程及び融合過程の際に、動態の制約及び特別な制約のために、ｂＮｔＡｂが潜在的に受攻性の部位にアクセスすることが妨害されることを意味する。実際に少量のＮｔＡｂしか記載されていない。例えば、同定された最初のｂＮｔＡｂは、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位を塞いでＣＤ４＋Ｔリンパ球上でウイルスがＣＤ４に付着するのを妨げるｂ１２であった。ｇｐ４１サブユニットは、全ての株に共通のコンフォメーション転位を伴うｇｐ１２０よりもずっと大きく保存されている。遮蔽されているか、アクセスが困難であるか、又は一過性であるｇｐ４１の保存された構造エレメントに対して非常に低いｂＮｔＡｂ活性しか誘発されず、２Ｆ５及び４Ｅ１０を含めたそれらのｂＮｔＡｂは、ｇｐ４１の膜近位エクトドメイン領域（ＭＰＥＲ）をターゲティングする。しかし、長年の研究に関わらず、エピトープがコンフォメーション依存型であるので、これらのｂＮｔＡｂを誘発できるＮｔＡｂ免疫原はまだ未知である。
【００１４】
ＨＩＶウイルス感染に対する安全で有効な予防又は治療ワクチン戦略を設計する上で遭遇する数多くの困難にかかわらず、有望な抗ＨＩＶワクチン組成物の概念に大きな進歩がとげられた。実例として、米国、カナダ、及びオーストラリアにおいて２０１２年初頭から抗ＨＩＶワクチン５７６種以上の臨床研究が行われていた。これらの臨床研究のうち２７種が第ＩＶ相段階を完了したことは指摘する価値がある。これらの進歩は、時が経つにつれ、抗ＨＩＶワクチンが、ＨＩＶウイルス感染のリスクのある個体又は既にＨＩＶウイルス感染を被っている個体を予防及び／又は治療するための、ますます具体的で信頼できる医学ツールとなることを示している。全てのこれら開発中ワクチンは、ウイルスのウイルス複製を減少させることを狙っている。
【００１５】
当技術分野で開示された有望な予防的及び治療的抗ＨＩＶワクチン戦略の一つは、「３Ｓ」と名付けられたＨＩＶ  ｇｐ４１エンベロープタンパク質の高度に保存されたモチーフに対する抗体を産生させることに関する。ＫＬＨ担体タンパク質と結合した３Ｓペプチド（ＫＬＨ−３Ｓと命名）を不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と組み合わせたものから成る免疫原性組成物は、マカクにおいて抗３Ｓ抗体を誘導することができたことが示された。その抗３Ｓ抗体は、免疫処置されたマカクにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞の低下に予防効果を有したことも示された。これらの結果は、ＨＩＶ疾患発生のコントロールを狙いとする免疫介入の追加的な戦略に道を開いた（Vieillard et al., 2008, PNAS, Vol. 105 (6): 2100-2104）。
【００１６】
この戦略は、ウイルス複製ではなくＨＩＶ−１病原性のウイルス決定因子をターゲティングする最初のものである。
【００１７】
当技術分野において、ＨＩＶ−１ウイルスによって起こる感染を予防又は治療することを狙いとする治療ツールの必要が、まだある。
【００１８】
発明の概要
本発明は、次式（Ｉ）
ＮＨ２−［Ｎｔ］ｙ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｘ１−Ｓ−Ｘ２−Ｓ−Ｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｉ−Ｗ−［Ｃｔ］ｚ−ＣＯＯＨ  （Ｉ）
［式中：
−  ｙは、０又は１を意味する整数であり、
−  ｚは、０又は１を意味する整数であり、
−  Ｎｔは、１〜１００アミノ酸長を有するペプチドから成り、
−  Ｃｔは、１〜１００アミノ酸長を有するペプチドから成り、
−  Ｘ１は、Ａ（アラニン）、Ｔ（トレオニン）、Ｓ（セリン）及びＮ（アスパラギン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ２は、Ｗ（トリプトファン）及びＡ（アラニン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ３は、Ｋ（リシン）及びＲ（アルギニン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ４は、Ｓ（セリン）及びＴ（トレオニン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ５は、Ｌ（ロイシン）、Ｙ（チロシン）及びＱ（グルタミン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ６は、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｎ（アスパラギン）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｓ（セリン）、Ｇ（グリシン）及びＫ（リシン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ７は、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｑ（グルタミン）、Ｌ（ロイシン）、Ａ（アラニン）、Ｋ（リシン）及びＥ（グルタミン酸）から成る群より選択されるアミノ酸である］
で示されるペプチドを含む免疫原性化合物であって、式（Ｉ）で示されるペプチドが、ＣＲＭ１９７タンパク質から成る担体タンパク質に共有結合的に連結された免疫原性化合物に関する。
【００１９】
いくつかの態様では、免疫原性化合物は、ＣＲＭ１９７タンパク質から成る担体タンパク質と共有結合した、配列番号２［ＮＨ２−ＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷ−ＣＯＯＨ］のペプチドを含む。
【００２０】
特に、本発明は、次式（Ｖ）
ＮＨ２−（Ａ１）ｍ−配列番号２−（Ａ２）ｎ−ＣＯＯＨ  （Ｖ）
［式中：
−  ｍは、０又は１を意味する整数であり、
−  ｎは、０又は１を意味する整数であり、
−  Ａ１は、アミノ酸残基であり、
−  Ａ２は、アミノ酸残基である］
で示されるペプチドを含む免疫原性化合物であって、
式（Ｖ）で示されるペプチドが、ＣＲＭ１９７タンパク質から成る担体タンパク質に共有結合的に連結された免疫原性化合物に関する。
【００２１】
本発明による免疫原性化合物のいくつかの態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドは、配列番号５で示されるペプチドを含む、又はそれから成る。
【００２２】
本発明による免疫原性化合物のいくつかの他の態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドは、配列番号６で示されるペプチドを含む、又はそれから成る。
【００２３】
いくつかの態様では、該免疫原性化合物は、そのＮ−末端アミノ酸残基により該担体タンパク質に直接又はリンカー部分を経由してのいずれかで共有結合している。
【００２４】
したがって、いくつかの態様では、該免疫原性化合物は、該担体タンパク質に、リンカー部分、好ましくは２個の反応性スクシンイミジル基を含むリンカー部分を経由して共有結合している。
【００２５】
本発明は、また、上記に定義の免疫原性化合物を１種又は複数の免疫アジュバント物質と組み合わせて含む組成物に関する。
【００２６】
好ましくは、該１種又は複数の免疫アジュバント物質は、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）を含む、又はそれから成る。
【００２７】
本発明は、また、上記に定義の免疫原性化合物又は組成物を、１種又は複数の薬学的に許容されうる担体と組み合わせて含むワクチン組成物を扱う。
【００２８】
本発明は、また、医薬として使用するための、又は個体のＨＩＶウイルス感染により引き起こされる状態を予防及び／もしくは治療するための、上記に定義の免疫原性化合物又は組成物に関する。
【００２９】
本発明は、また、個体のＨＩＶウイルス感染により引き起こされる状態を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物を調製するための、上記に定義の免疫原性化合物又は組成物の使用に関する。
【００３０】
本発明は、また、個体のＨＩＶウイルス感染によって引き起こされる状態を予防及び／もしくは治療するための方法であって、それを必要とする個体に上記に定義のワクチン組成物の有効量を投与するステップを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ＫＬＨ又はＣＲＭ１９７とコンジュゲーションされた３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドを免疫処置したときの抗３Ｓ−ペプチド抗体の産生を示す図である。各記号は、１匹のマウスから得られた結果を示す。各バーは、対応するマウスのプールから得られた結果の幾何平均値を表す。横座標：使用された組成物の種類；縦座標：任意単位（Ａ．Ｕ．）で表現された抗３Ｓ  ＩｇＧ力価。１任意単位は終濃度１ng/μlのマウスモノクローナル抗３Ｓ抗体１５Ｃ８ｆ２溶液によって生成したシグナルに対応する。図１Ａ：最初の注射の２１日後の結果；図１Ｂ：最初の注射の３５日後の結果；図１Ｃ：最初の注射の４９日後の結果。
【図２】図２は、マウスにおける最適な３Ｓ−ペプチド−ＣＲＭ１９７免疫コンジュゲート（３Ｓ原薬）ワクチンの用量範囲を示す図である。横座標：抗原当量として表現された免疫コンジュゲートの用量（それぞれ０（「アジュバント」）、０．０２μg、０．２μg、１μg、２μg及び４μg）。縦座標：１／中点希釈（mid-point dilution）として表現された抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ力価）。中点希釈は、最大シグナルの半値を与える抗血清の希釈である。Ｘ軸は、３Ｓ原薬の３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド当量のマイクログラム（μg）で表現された漸増する用量をワクチン接種された異なる群のマウスを表す。各記号は、１匹のマウスを表す。ＣＲＭ１９７−３Ｓ免疫コンジュゲートをワクチン接種されたマウスからの血清プールを使用してＥＬＩＳＡアッセイを基準化する。ノンパラメトリックMann Whitney検定によって計算された統計的有意性を報告する。＊：０．５＞ｐ＞０．１；＊＊：０．１＞ｐ＞０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．０１。
【図３】図３は、ラットにおける最適な３Ｓ−ペプチド−ＣＲＭ１９７ワクチン用量範囲を示す図である。横座標：担体の重量及びリンカーの重量（ペプチド当量）を考慮せずに、担体にコンジュゲーションされたペプチドの量として表現された免疫コンジュゲート（３Ｓ原薬）の用量（それぞれ０（「アジュバント」）、０．０２μg、０．２μg、１μg、２μg及び４μg）。縦座標：１／中点希釈として表現された抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ力価）。中点希釈は、最大シグナルの半値を与える抗血清の希釈である。Ｘ軸は、３Ｓ原薬のペプチド当量のマイクログラム（μg）で表現された漸増する用量をワクチン接種された異なる群のラットを表す。各記号は、１匹のラットを表す。水酸化アルミニウムと共に製剤化されたＣＲＭ１９７−３Ｓ免疫コンジュゲート２０μg及び５０μgをワクチン接種されたラットの血清プールを使用してＥＬＩＳＡアッセイを基準化する。ノンパラメトリックMann Whitney検定によって計算された統計的有意性を報告する。＊：０．５＞ｐ＞０．１；＊＊：０．１＞ｐ＞０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．０１。
【図４】図４及び５に、霊長類を含めた動物に、本明細書記載の担体タンパク質（ＫＬＨ又はＣＲＭ１９７）にコンジュゲーションされた３Ｓ１６Ｎｔｅｒを免疫処置後に得られた抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ抗体の能力を図解する。図４は、対照ウェルのＰＥ−平均蛍光を示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞表面でのＮＫｐ４４Ｌの密度を表す、測定されたＰＥ蛍光平均は、ウェル４番〜１番の細胞からの細胞蛍光測定によって測定した）。Ｙ軸は、Ｘ−平均蛍光を表す。Ｘ軸は、異なる対照を表す。３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドの存在下（３Ｓ）もしくは不在下（−）、及び１／５０希釈の抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ陰性（ウサギｎｅｇ）又は陽性（ウサギｐｏｓ）ウサギの血清の不在下（−）又は存在下。対照は、二つ組で検査し、標準偏差（エラーバー）を報告する。
【図５】図５は、被験品目のウェルのＸ−平均蛍光を示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞表面でのＮＫｐ４４Ｌの密度を表す測定されたＰＥ蛍光平均は、１６番〜４５番のウェルの細胞からの細胞蛍光測定によって測定した。Ｙ軸は、Ｘ−平均蛍光を表す。Ｘ軸は、異なる被験条件を表す。全てのウェルは３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド存在下で試験した。アジュバント加ＣＲＭ１９７−３Ｓ１６Ｎｔｅｒ免疫コンジュゲート（Ｒ１２２  ｄ４９）をワクチン接種されたラットの血清を試験した。各希釈を三つ組で試験し、標準偏差（エラーバー）を報告する。抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ陰性血清（陰性対照）を１／５０希釈で試験した。抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ陽性血清は、１／１００、１／４００、１／１６００及び１／６４００希釈で試験した。
【図６】図６は、ＣＲＭ１９７とコンジュゲーションされたｍ３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドを免疫処置して抗３Ｓ−ペプチド抗体を産生することを示す図である。各記号は、１匹のマウスから得られた結果を表し、６匹のマウスにそれを免疫処置した。対応する矢印で図解されるように、マウスにそれぞれ０、１４、２８、１６９及び２１２日目に注射した。横座標：免疫コンジュゲートの最初の注射後の期間（日数で表現）。縦座標：１／中点として表現された抗３Ｓ抗体力価。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、主として、組成物、特にＨＩＶに対するワクチン組成物を調製するために有用な新規な免疫原性化合物を提供する。
【００３３】
本発明者らは、３Ｓペプチドに対して高く効果的な抗体応答を誘導する能力に恵まれた免疫原性化合物を設計することを考慮して徹底的な研究を行った。
【００３４】
本明細書に使用される３Ｓペプチドは、本明細書において下記の式（Ｉ）で示されるペプチドとして一括して定義される。３Ｓペプチドは、当技術分野において公知の配列番号５（ＮＨ２−ＣＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷ−ＣＯＯＨ）で示される３Ｓペプチドを包含する。
【００３５】
本明細書に使用される、抗３Ｓ抗体は、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体から成り、それには、配列番号５で示される３Ｓペプチドに対する抗体が含まれる。
【００３６】
配列番号５で示される３Ｓペプチドは、以前にVieillardら（Vieillard et al., 2008, PNAS, Vol. 105 (6): 2100-2104）によって候補抗HIV抗原として同定された。Vieillardらが、周知のＫＬＨ担体タンパク質に共有結合的に連結された配列番号５で示される３Ｓペプチドから成る免疫コンジュゲート化合物を使用することによって抗３Ｓ抗体を誘導したことに気付かされる。
【００３７】
本明細書において、ＫＬＨが、免疫原性物質を抗原−タンパク質担体コンジュゲートの形態で含むワクチン組成物に現在使用されるほとんど唯一の担体タンパク質であることに気付かされる。そのうえ、ＫＬＨは、抗体を作製するために広く使用されている（Lee, Huang, Lasanthi, Jayathilaka, Lateef and Gupta, 2010. Production of antipeptide antibodies, Methods in Molecular Biology, 657:93-108, S.D. Schwartzbach and T. Osafune (eds.), Springer; Ragupathi, Gathuru and Livington, 2005, Antibody inducing polyvalent cancer vaccines, Cancer Treat Res, 123:157-150; Harris and Markl, 1999, Keyhole limpet hemocyanin (KLH): a biomedical review, Micron, 30-597-623）。
【００３８】
驚くことに、本発明者らは、Vieillardらによって使用されたＫＬＨ従来型担体タンパク質が、個体のＨＩＶファミリーのウイルス感染、特にＨＩＶ−１ウイルス感染によって引き起こされる免疫障害に対する防御効果を誘導することを狙いとする効果的な抗３Ｓ抗体応答を産生する免疫原性化合物を設計するために適さなかったことを見いだした。特に、本発明者らは、３Ｓペプチドを接ぎ合わせたＫＬＨ分子（ＫＬＨ−３Ｓ）が凝集物を形成し、そのことが様々な見かけの分子量の関連実体を含む不均一な最終免疫原性化合物に繋がったことを予想外に見いだした。したがって、本発明者らは、ＫＬＨ−３Ｓコンジュゲートを含む免疫原性化合物が、医薬として、特にヒト用医薬として使用可能な化学的に定義された産物を得ることを目指して再現性よく製造できないことを見いだした。
【００３９】
大いに驚くべきことに、本発明者らは、効果的な抗３Ｓ抗体応答が、抗原−担体コンジュゲートから成る特異的免疫原性化合物（その際、担体分子はＣＲＭ１９７タンパク質から成る）を使用することによって得ることができることを見いだした。特に、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を使用することによって、同じ抗原性ペプチドが従来型ＫＬＨ担体タンパク質に共有結合した免疫原性化合物に比べて抗３Ｓ抗体における約１００倍の増加が得られることが見いだされた。
【００４０】
ＣＲＭ１９７タンパク質は、周知のジフテリア毒素の無毒性突然変異体から成り、その突然変異体は最初にUchidaら（1973, J. Biol. Chem., Vol. 248: 3838-3844）によって記載された。ＣＲＭ１９７突然変異タンパク質は、最初、突然変異型ｔｏｘ９７遺伝子の翻訳産物として記載され、その突然変異体では、Ｇ→Ａトランジションが野生型ジフテリア毒素の位置５２のグリシン（Ｇ）残基のグルタミン酸残基（Ｅ）による置換に繋がった。
【００４１】
本出願人の知るところによると、ＣＲＭ１９７は、免疫原性化合物を調製するための、特にペプチドコンジュゲーションのための担体分子として、現在までほとんど使用されていない。本出願人の知るところによると、ＣＲＭ１９７は、オリゴ糖抗原のための、すなわち非常に特異的な免疫学的挙動を有することが当技術分野において周知の非タンパク質構造に対する抗体を産生させるための担体物質としてのみ使用されている。いっそうより正確には、ＣＲＭ１９７は、（ｉ）Streptococcus pneumoniaeの莢膜抗原由来のオリゴシド、（ｉｉ）Neisseria menigitidis由来オリゴシド及び（ｉｉｉ）Haemophilus influenza Ｂ型の莢膜多糖のための担体分子としてのみ使用されているように見える。
【００４２】
本発明は、次式（Ｉ）
ＮＨ２−［Ｎｔ］ｙ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｘ１−Ｓ−Ｘ２−Ｓ−Ｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｉ−Ｗ−［Ｃｔ］ｚ−ＣＯＯＨ  （Ｉ）
［式中：
−  ｙは、０又は１を意味する整数であり、
−  ｚは、０又は１を意味する整数であり、
−  Ｎｔは、１〜１００アミノ酸長を有するペプチドから成り、
−  Ｃｔは、１〜１００アミノ酸長を有するペプチドから成り、
−  Ｘ１は、Ａ（アラニン）、Ｔ（トレオニン）、Ｓ（セリン）及びＮ（アスパラギン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ２は、Ｗ（トリプトファン）及びＡ（アラニン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ３は、Ｋ（リシン）及びＲ（アルギニン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ４は、Ｓ（セリン）及びＴ（トレオニン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ５は、Ｌ（ロイシン）、Ｙ（チロシン）及びＱ（グルタミン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ６は、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｎ（アスパラギン）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｓ（セリン）、Ｇ（グリシン）及びＫ（リシン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｘ７は、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｑ（グルタミン）、Ｌ（ロイシン）、Ａ（アラニン）、Ｋ（リシン）及びＥ（グルタミン酸）から成る群より選択されるアミノ酸である］
で示されるペプチドを含む免疫原性化合物であって、式（Ｉ）で示されるペプチドが、ＣＲＭ１９７タンパク質から成る担体タンパク質に共有結合的に連結された免疫原性化合物に関する。
【００４３】
本記載のために、式（Ｉ）で示される免疫原性化合物は、本明細書において、ＮＨ２−  ［Ｎｔ］ｙ−配列番号１−［Ｃｔ］ｚ−ＣＯＯＨ  （Ｉ）とも称することができる。
【００４４】
式（Ｉ）で示される免疫原性化合物のいくつかの態様では、Ｘ１は、好ましくはＡを意味し、式（Ｉ）で示される免疫原性化合物のいくつかの態様では、Ｘ２は、好ましくはＷを意味し、式（Ｉ）で示される免疫原性化合物のいくつかの態様では、Ｘ３は、好ましくはＫを意味し、式（Ｉ）で示される免疫原性化合物のいくつかの態様では、Ｘ４は、好ましくはＳを意味し、式（Ｉ）で示される免疫原性化合物のいくつかの態様では、Ｘ５は、好ましくはＬを意味し、式（Ｉ）で示される免疫原性化合物のいくつかの態様では、Ｘ６は、好ましくはＤを意味し、式（Ｉ）で示される免疫原性化合物のいくつかの態様では、Ｘ７は、好ましくはＤを意味する。
【００４５】
式（Ｉ）で示される免疫原性化合物のいくつかの態様では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７から成る群より選択される１種又は複数のアミノ酸は、上に明記されたそれらのそれぞれの好ましい意味を有する。いくつかの態様では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７から成る群より選択される１、２、３、４、５、６又は７種のアミノ酸は、上に明記されたそれらのそれぞれの好ましい意味を有する。
【００４６】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７から成る群より選択される７種のアミノ酸が、上に明記されたそれらのそれぞれの好ましい意味を有する態様では、そのとき該免疫原性ペプチドは、
ＮＨ２−［Ｎｔ］ｙ−配列番号２−［Ｃｔ］ｚ−ＣＯＯＨ  （ＩＩａ）
とも称することができる式（ＩＩａ）：
ＮＨ２−［Ｎｔ］ｙ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ａ−Ｓ−Ｗ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｉ−Ｗ−［Ｃｔ］ｚ−ＣＯＯＨ  （ＩＩａ）
で示されるペプチドから成る。
【００４７】
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、及びＸ７から成る群より選択される６種のアミノ酸が、上に明記されたそれらのそれぞれの好ましい意味を有し、アミノ酸Ｘ２がＡ（アラニン）を意味する態様では、そのとき該免疫原性ペプチドは、
ＮＨ２−［Ｎｔ］ｙ−配列番号６−［Ｃｔ］ｚ−ＣＯＯＨ  （ＩＩｂ）
とも称することができる式（ＩＩｂ）：
ＮＨ２−［Ｎｔ］ｙ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ａ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｉ−Ｗ−［Ｃｔ］ｚ−ＣＯＯＨ  （ＩＩｂ）
で示されるペプチドから成る。
【００４８】
１〜１００アミノ酸残基長を有するＮｔペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７，５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び１００アミノ酸残基長を有するペプチドを包含する。
【００４９】
いくつかの態様では、Ｎｔペプチドは、１０アミノ酸残基長以下を有し、それは、アミノ酸残基５個以下のアミノ酸長を包含する。
【００５０】
いくつかの態様では、ＮｔペプチドのＮ末端残基は、Ｃ（システイン）残基から成る。
【００５１】
いくつかの態様では、Ｎｔペプチドは、配列番号３の次式（ＩＩＩ）：
ＮＨ２−Ｃ−Ｙ１−Ｔ−Ｙ２−Ｖ−（ＩＩＩ）
［式中：
−  Ｙ１は、Ｔ（トレオニン）及びＰ（プロリン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｙ２は、Ａ（アラニン）、Ｔ（トレオニン）及びＮ（アスパラギン）から成る群より選択されるアミノ酸である］
で示される。
【００５２】
いくつかの他の態様では、Ｎｔペプチドは、１個のシステイン残基（「Ｃ」とも呼ばれる）から成る。
【００５３】
１〜１００アミノ酸残基長を有するＣｔペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７，５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び１００アミノ酸残基長を有するペプチドを包含する。
【００５４】
いくつかの態様では、Ｃｔペプチドは、１０アミノ酸残基長以下を有し、それは、アミノ酸残基５個以下のアミノ酸長を包含する。
【００５５】
いくつかの態様では、ＣｔペプチドのＣ末端残基は、Ｃ（システイン残基）から成る。
【００５６】
いくつかの態様では、Ｎｔペプチドは、配列番号４の次式（ＩＶ）：
−Ｙ３−Ｙ４−Ｍ−Ｔ−Ｗ−ＣＯＯＨ  （ＩＶ）
［式中：
−  Ｙ３は、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｑ（グルタミン）、Ｅ（グルタミン酸）及びＮ（アスパラギン）から成る群より選択されるアミノ酸であり、
−  Ｙ４は、Ｎ（アスパラギン）、Ｈ（ヒスチジン）、Ｓ（セリン）及びＫ（リシン）から成る群より選択されるアミノ酸である］
で示される。
【００５７】
いくつかの他の態様では、Ｃｔペプチドは、１個のシステイン残基（「Ｃ」とも呼ばれる）から成る。
【００５８】
いくつかの他の態様では、Ｃｔペプチドは、本発明の免疫原性化合物中に不在である。
【００５９】
本発明による免疫原性化合物のいくつかの特定の態様では、該ペプチドは、下記式（Ｖ）で示される。
【００６０】
したがって、本発明は、次式（Ｖ）
ＮＨ２−（Ａ１）ｍ−配列番号１−（Ａ２）ｎ−ＣＯＯＨ  （Ｖ）
［式中：
−  ｍは、０又は１を意味する整数であり、
−  ｎは、０又は１を意味する整数であり、
−  Ａ１は、アミノ酸残基であり、
−  Ａ２は、アミノ酸残基である］
で示されるペプチドを含む免疫原性化合物であって、式（Ｖ）で示されるペプチドが、ＣＲＭ１９７タンパク質から成る担体タンパク質に共有結合的に連結された免疫原性化合物に関する。
【００６１】
式（Ｖ）で示されるペプチドのいくつかの態様では、ｍは１に等しく、ｎは０に等しく、Ａ１はシステイン（Ｃ）残基を意味する。
【００６２】
本発明は、また、次式（ＶＩａ）
ＮＨ２−（Ａ１）ｍ−配列番号２−（Ａ２）ｎ−ＣＯＯＨ  （ＶＩａ）
［式中：
−  ｍは、０又は１を意味する整数であり、
−  ｎは、０又は１を意味する整数であり、
−  Ａ１は、アミノ酸残基であり、
−  Ａ２は、アミノ酸残基である］
で示されるペプチドを含む免疫原性化合物であって、式（ＶＩａ）で示されるペプチドが、ＣＲＭ１９７タンパク質から成る担体タンパク質に共有結合的に連結された免疫原性化合物に関する。
【００６３】
本発明は、また、次式（ＶＩｂ）
ＮＨ２−（Ａ１）ｍ−配列番号６−（Ａ２）ｎ−ＣＯＯＨ  （ＶＩｂ）
［式中：
−  ｍは、０又は１を意味する整数であり、
−  ｎは、０又は１を意味する整数であり、
−  Ａ１は、アミノ酸残基であり、
−  Ａ２は、アミノ酸残基である］
で示されるペプチドを含む免疫原性化合物であって、式（ＶＩｂ）で示されるペプチドが、ＣＲＭ１９７タンパク質から成る担体タンパク質に共有結合的に連結された免疫原性化合物に関する。
【００６４】
式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドのいくつかの態様では、ｍは１に等しく、ｎは０に等しく、Ａ１はシステイン（Ｃ）残基を意味する。
【００６５】
容易に明らかになるように、式（Ｖ）、（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドは、本発明による式（Ｉ）で示されるペプチドの特定の態様である。したがって、特に定めない限り、式（Ｉ）で示されるペプチドに関連して記載される本発明の免疫原性化合物の各態様は、式（Ｉ）で示されるペプチドが式（Ｖ）で示されるペプチド又は式（ＶＩａ）もしくは（ＶＩｂ）で示されるペプチドから成る同様の態様を包含する。
【００６６】
同じく容易に明らかになるように、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドは、本発明による式（Ｖ）で示されるペプチドの特定の態様である。したがって、特に定めない限り、式（Ｉ）又は式（Ｖ）で示されるペプチドに関連して記載される本発明の免疫原性化合物の各態様は、式（Ｉ）又は式（Ｖ）で示されるペプチドが式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドから成る同様の態様を包含する。
【００６７】
本明細書に使用されるように、アミノ酸残基は、アラニン（「Ａ」又は「Ａｌａ」とも呼ばれる）、アルギニン（（「Ｒ」又は「Ａｒｇ」とも呼ばれる）、アスパラギン（「Ｎ」又は「Ａｓｎ」とも呼ばれる）、アスパラギン酸（「Ｄ」又は「Ａｓｐ」とも呼ばれる）、システイン（「Ｃ」又は「Ｃｙｓ」とも呼ばれる）、グルタミン（「Ｑ」又はＧｌｎ」とも呼ばれる）、グルタミン酸（（「Ｅ」又は「Ｇｌｕとも呼ばれる）、グリシン（「Ｇ」又は「Ｇｌｙ」とも呼ばれる）、ヒスチジン（「Ｈ」又は「Ｈｉｓ」とも呼ばれる）、イソロイシン（「Ｉ」又は「Ｉｌｅ」とも呼ばれる）、ロイシン（「Ｌ」又は「Ｌｅｕ」とも呼ばれる）、リシン（「Ｋ」又は「Ｌｙｓ」とも呼ばれる）、メチオニン（「Ｍ」又は「Ｍｅｔ」とも呼ばれる）、フェニルアラニン（（「Ｆ」又は「Ｐｈｅ」とも呼ばれる）、プロリン（「Ｐ」又は「Ｐｒｏ」とも呼ばれる）、セリン（「Ｓ」又は「Ｓｅｒ」とも呼ばれる）、トレオニン（「Ｔ」又は「Ｔｈｒ」とも呼ばれる）、トリプトファン（「Ｗ」又は「Ｔｒｐ」とも呼ばれる）、チロシン（「Ｙ」又は「Ｔｙｒ」とも呼ばれる）及びバリン（「Ｖ」又は「Ｖａｌ」とも呼ばれる）を包含する。
【００６８】
予め明記したように、ＣＲＭ１９７は、免疫系の細胞へのタンパク質抗原提示のための非従来型担体分子である。ＣＲＭ１９７は、当業者に容易に入手可能である。ＣＲＭ１９７は、特に会社Pfenex Inc（San Diego, USA）により参照名ＣＲＭ１９７（ｒＤＮＡ）で販売されている。ＣＲＭ１９７は、本明細書において配列番号８で示されるタンパク質として定義される。
【００６９】
式（Ｉ）で示されるペプチドは、本明細書記載の式（Ｖ）及び式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるその特定の態様を含めて、公知のクローニング技法又は化学合成によって生成させることができる。
【００７０】
例えば、式（Ｉ）で示されるペプチドをコードするＤＮＡがクローニング技法の使用によって調製され、自己複製ベクターに挿入されてリコンビナントＤＮＡが調製される。リコンビナントＤＮＡは、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Actinomyces、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞などの適切なホストに導入され、トランスフォーマントが得られる。トランスフォーマントの培養生成物から、式（Ｉ）で示されるペプチドを含むペプチドを得ることができる。又は、式（Ｉ）で示されるペプチドをコードするＤＮＡが調製され、麦芽及びEscherichia coli細胞抽出物を使用して無細胞タンパク質合成系に供され、本発明のペプチドが合成される。式（Ｉ）で示されるペプチドが担体タンパク質に連結されるいくつかの態様では、そのとき式（Ｉ）で示されるペプチドと所望の担体タンパク質との両方を含む融合タンパク質から成る免疫原性生成物を、リコンビナントＤＮＡ技法によって合成することができる。
【００７１】
そのうえ、式（Ｉ）で示されるペプチドについて「固相法」又は「液相法」などの通例の化学合成法を用いて、脱水／縮合によってアミノ酸が連続的に結合及び伸長される。
【００７２】
上記に定義の免疫原性化合物を製造するために、必要に応じて、当業者に周知の任意の適切なリンカーを用いて、任意の適切なコンジュゲーション反応を使用することができる。
【００７３】
式（Ｖ）、（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドのある態様では、整数ｍ及び／又はｎが０に等しいとき、それぞれアミノ酸残基Ａ１及び／又はＡ２は不在である。
【００７４】
式（Ｖ）、（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドのいくつかの態様では、Ａ１は存在し（すなわち整数ｍ＝１）、Ａ２は不在である（すなわち整数ｎ＝０）。
【００７５】
式（Ｖ）、（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドのいくつかの態様では、Ａ１は不在であり（すなわち整数ｍ＝０）、Ａ２は存在する（すなわち整数ｎ＝１）。
【００７６】
式（Ｖ）、（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドのいくつかの好ましい態様では、Ａ１及び／又はＡ２が存在する場合、それ（ら）はシステイン残基から成る。
【００７７】
式（Ｖ）、（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドのいくつかの好ましい態様では、Ａ１は存在し、Ｎ末端システイン残基から成り、Ａ２は不在であり、すなわち整数ｎは０に等しい。これらの好ましい態様では、式（Ｖ）又は（ＶＩａ）で示されるペプチドは、配列番号５のペプチドから成る。これらの好ましい態様では、式（Ｖ）又は（ＶＩｂ）で示されるペプチドは、配列番号７のペプチドから成る。
【００７８】
技術的な観点で、上記式（Ｖ）又は式（ＶＩ）で示されるペプチドを含めた、式（Ｉ）で示されるペプチドは、直接的に、又はリンカー部分を経由して、それらのＮ末端アミノ酸残基を経由して、もしくはそれらのＣ末端アミノ酸残基を経由してのいずれかでＣＲＭ１９７に共有結合的に連結することができる。これらの全般的な態様では、共有結合的連結は、式（Ｉ）で示されるペプチド由来の該アミノ酸残基の利用可能なα−アミノ基又はα−カルボキシ基を伴いうる。又は、共有結合的連結は、式（Ｉ）で示されるペプチド由来の該アミノ酸残基の側鎖上に位置する、利用可能なアミノ基、カルボキシ基又はチオール基を伴いうる。
【００７９】
しかし、式（Ｉ）で示されるペプチドがそれらのＣ末端を経由してＣＲＭ１９７に共有結合的に連結された上記に定義の免疫原性化合物は、最適ではないことが見いだされた。それは、そのような免疫原性ペプチドは凝集物を形成する傾向があり、そのことが化学的に定義され容易に再現できる薬学的組成物を得るための重大な欠点となるおそれがあるからである。
【００８０】
したがって、上記に定義の免疫原性化合物のいくつかの好ましい態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドは、それらのＮ末端を経由してＣＲＭ１９７に共有結合している。
【００８１】
さらに、上記に定義の免疫原性化合物において、式（Ｉ）で示されるペプチドは、最も好ましくは適切なリンカー剤を経由してＣＲＭ１９７に共有結合的に連結されている。式（Ｉ）で示されるペプチドとＣＲＭ１９７とを架橋するリンカー剤の存在が、分子に幾分の柔軟性を導入することで、式（Ｉ）で示されるペプチドに含まれる関連エピトープが免疫系細胞、すなわち主にＴ細胞及びＢ細胞の表面に存在する対応するレセプターによりよく利用できるようになることが本明細書において見いだされた。
【００８２】
したがって、上記に定義の免疫原性化合物のいくつかの好ましい態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドは、リンカー部分を経由してＣＲＭ１９７に共有結合している。
【００８３】
いくつかの好ましい態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドは、それらのＮ末端によってリンカー部分を経由してＣＲＭ１９７に共有結合している。
【００８４】
該リンカー部分は、リンカー剤をＣＲＭ１９７及び式（Ｉ）で示されるペプチドの両方と反応させることによって得られる。
【００８５】
好ましい態様では、リンカー剤は、２個の別個の反応基、それぞれ（ｉ）スクシンイミジル基及び（ｉｉ）マレイミド基を有する。各反応基は、それぞれ（ｉ）ＣＲＭ１９７及び（ｉｉ）式（Ｉ）で示されるペプチドの、アミノ基又はチオール基との反応に利用可能である。
【００８６】
その種のリンカー剤は、当技術分野においてごく周知であり、市販により容易に入手可能である。
【００８７】
しかし、これらのヘテロ二官能性リンカー剤のいくつかは、特にワクチン組成物の製造が探究されるときに最適ではないことが本明細書において見いだされた。例証として、本発明者らは、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）のようなヘテロ二官能性リンカー剤の使用が、非常に難水溶性の最終生成物に繋がったことを見いだした。投与準備済みの最終形態のワクチン組成物は、通常、最終的に１種又は複数の薬学的に許容されうる水溶性溶媒も含有する場合がある水性塩類水溶液又は懸濁液から成るので、ワクチン組成物を製造する点から見て免疫原性化合物が低水溶性であることは、実質的な技術的欠点から成るおそれがある。本明細書の実施例に例示するように、ＣＲＭ１９７がＭＢＳを経由して式（Ｉ）で示されるペプチドに共有結合的に連結された免疫コンジュゲートは、それが凝集物を形成する傾向のせいでワクチン組成物の活性成分として使用できないにもかかわらず、免疫原性を維持し、すなわちin vivoで注射したときに関連する抗３Ｓ抗体を産生することができる。
【００８８】
驚くことに、本発明者らは、ワクチン組成物の免疫原性活性成分として適格であるという観点で、完全に水溶性でありうることで液体組成物の全体にわたり均一に分布しうる限られたファミリーのリンカー剤が、本明細書に定義の免疫原性化合物を製造するために最も適切であると判定した。該限られたファミリーのリンカー剤は、それぞれＳＭＰＢ及びスルホ−ＳＭＰＢという名のリンカー剤を包含する、又はそれから成りさえする。
【００８９】
したがって、上記に定義の免疫原性化合物のいくつかの好ましい態様では、該リンカー剤は、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート）及びスルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート）から成る群より選択される。
【００９０】
一般に２種のタンパク質をリンカー剤と、より詳細にはＳＭＰＢ及びスルホ−ＳＭＰＢから成る群より選択されるリンカー剤とコンジュゲーションする方法は、当業者に周知である。例示的に、そのようなプロトコールは、Pierce Company（Illinois, Etats-Unis）によって公表されているパンフレットに開示されている。
【００９１】
ＳＭＰＢ及びスルホ−ＳＭＰＢは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基及びマレイミド基の両方を含むヘテロ二官能性リンカー剤から成る。ＳＭＰＢ又はスルホ−ＳＭＰＢを使用したコンジュゲーションは、通常、２ステップ手順で行われる。第１ステップで、アミン含有タンパク質（例えばＣＲＭ１９７）は、モル濃度が数倍過剰のリンカー剤とｐＨ７〜９で反応され、アミド結合が形成され、続いて過剰の未反応のリンカー剤が、通常は脱塩又は透析によって除去される。第２ステップで、スルフヒドリル含有分子（例えば式（Ｉ）で示されるペプチド）が、既に第１のタンパク質と結合したマレイミド基（例えば既にＣＲＭ１９７に共有結合的に連結されたリンカー鎖の遊離マレイミド基）とｐＨ６．５〜７．５で反応して安定なチオエーテル結合を形成するために添加される。
【００９２】
式（Ｉ）で示されるペプチドをＣＲＭ１９７担体タンパク質に共有結合的に連結するためのリンカー剤としてＳＭＰＢ又はスルホ−ＳＭＰＢを使用することは、下式（ＶＩＩ）：
【００９３】
【化１】
0006352251.tif 000002
［式中：
−  Ｒ１は、ＣＲＭ１９７の一反応基から成り、但し、Ｒ１に結合したＮＨ基は、ＣＲＭ１９７のＮ末端に位置するα−アミノ基又は（ｉｉ）ＣＲＭ１９７のリシン（Ｋ）アミノ酸残基由来の側鎖アミノ基から得られ、
−  Ｒ２は、式（Ｉ）で示されるペプチドから成り、但し、Ｒ２に結合した硫黄（Ｓ）原子は、式（Ｉ）で示されるペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置するシステイン残基のスルフヒドリル（ＳＨ）基から得られる。いくつかの態様では、スルフヒドリル部分は、非天然アミノ酸の部分、又は式（Ｉ）で示されるペプチドの末端に存在する任意の他の分子でありうる。
【００９４】
当技術分野において公知のように、ＣＲＭ１９７タンパク質は、式（Ｉ）で示される複数のペプチドが、式（ＶＩＩ）で示されるコンジュゲートにおけるＣＲＭ１９７に連結することができるように複数の反応基Ｒ１を含む。
【００９５】
したがって、上記に定義の免疫原性化合物の最も好ましい態様は、ＣＲＭ１９７の複数の反応基が、配列番号５又は配列番号７を有する式（Ｉ）で示されるペプチド（そのペプチドは、そのＮ末端にシステイン残基を有する）に上記式（ＶＩＩ）で表される共有結合的連結により共有結合的に連結された態様である。
【００９６】
上記に定義の免疫原性化合物のいくつかの態様では、平均数が２〜２０個の範囲の式（Ｉ）で示されるペプチドが、ＣＲＭ１９７の１分子に共有結合的に連結されている。好ましい態様では、平均数が７〜８個の式（Ｉ）で示されるペプチドが含まれる、平均数が５〜１０個の式（Ｉ）で示されるペプチドが、ＣＲＭ１９７の１分子に共有結合的に連結されている。
【００９７】
本発明は、また、上記に定義の免疫原性化合物を１種又は複数の免疫アジュバント物質と組み合わせて含む組成物に関する。
【００９８】
上記に定義の免疫原性化合物を含み、さらに、１種又は複数の免疫アジュバント物質を含む、本明細書に定義の組成物は、また、本明細書において「免疫原性組成物」又は「ワクチン組成物」と呼ばれることがある。
【００９９】
いくつかの態様では、本発明による免疫原性組成物と本発明によるワクチン組成物との間で、そのような組成物を呼ぶために用いられた用語以外に実質的な区別をすることはできない。但し、ワクチン組成物の特徴がヒト又は獣医学的用途の販売許可の交付のための様々な薬務局の技術的要件に従うべきであることを除く。その代わりに、本発明による免疫原性組成物は、動物への投与のために、例えば検出試薬又は診断試薬としてのさらなる使用を含めたさらに有用でありうる抗３Ｓ抗体を産生するために使用可能でありながら、薬務局の要件に従わない場合がある。
【０１００】
より正確には、免疫原性組成物は、発生した抗体が免疫処置された哺乳生物に予防効果又は治療効果を発揮すると予想されない状況において、哺乳生物、例えばマウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ又はヤギ生物に投与されたときに式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を発生させることを狙いとする。本発明による免疫原性組成物は、これらの抗体のさらなる非治療的使用のために、例えばＨＩＶ−１ウイルス検出試薬又はＨＩＶ−１由来ペプチド検出試薬として、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を生成させるために使用することができる。
【０１０１】
他方で、本発明によるワクチン組成物は、発生した抗体が、免疫処置された哺乳生物において予防効果又は治療効果を発揮すると予想される状況で、該ワクチン組成物が投与された哺乳生物において式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を発生させることを狙いとする。
【０１０２】
したがって、本発明による組成物は、（ｉ）免疫原性組成物及び（ｉｉ）ワクチン組成物の両方を包含する。さらに、免疫原性組成物及びワクチン組成物は、免疫アジュバント物質及びその中に含有される賦形剤を含めた補助物質の種類が異なりうる。本発明による免疫原性組成物は、予防効果も治療効果も探究されない、ＨＩＶウイルスによる感染の点でリスクがない動物を含めた動物に抗３Ｓ抗体生成を引き起こしうる。本発明によるワクチン組成物は、それを投与された個体において、ＨＩＶウイルス感染に対する予防効果又は治療効果、特にＨＩＶ感染個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞減少に対する予防効果を発揮する抗３Ｓ抗体の生成を引き起こすことを狙いとし、それは、ウイルス病原性の減少を引き起こす。
【０１０３】
本明細書に定義の免疫原性組成物又はワクチン組成物のいくつかの態様では、免疫アジュバントは、（ｉ）無機塩、（ｉｉ）エマルション、（ｉｉｉ）微生物天然又は合成誘導体、（ｉｖ）組み合わせアジュバント、（ｖ）サイトカイン由来又はアクセサリー分子由来アジュバント、及び（ｖｉ）粒子状製剤から成る群より選択することができる。
【０１０４】
適切な免疫アジュバントの一覧は、下表に記載されている。
【０１０５】
【表１】
0006352251.tif 000003
【０１０６】
無機塩を含む免疫アジュバントは、好ましくは、（１）アルミニウム塩、好ましくは式ＫＡｌ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ、及び（２）リン酸カルシウムから成る群より選択される。
【０１０７】
エマルション系免疫アジュバントは、好ましくは、（１）ＭＦ５９（マイクロフルイダイゼーションされた洗剤で安定化されたスクアレン水中油型エマルション、（２）不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡとも呼ばれる）、（３）Montanide ISA 51（油中水型安定化エマルション）、及び（４）ＩＳＡ−７２０（水及びスクアレンを含む安定化組成物）から成る群より選択される。
【０１０８】
天然又は合成微生物誘導体を含む免疫アジュバントは、好ましくは、（１）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（例えばCorixa, Hamilton, Mont., USA製）（２）Detox（ＭＰＬ＋ＣＷＳ）（モノホスホリルリピドＡ及びミコバクテリア細胞壁骨格の油滴エマルションから成る）、（３）ＯＭ−１７４（Escherichia coliリピドＡから得られた可溶性アジュバント）、（４）無毒性細菌毒素、好ましくはE. coli由来熱不安定性毒素、コレラ毒素、特にそのＢサブユニット（それぞれＬＴＢ及びＣＴＢと呼ばれる）などの改変毒素、ならびに（５）免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチドであるＣｐＧ  ＯＤＮから成る群より選択される。
【０１０９】
組み合わせアジュバントは、好ましくは、（１）ＡＳ０４（ミョウバンとモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）との組み合わせ）、（２）ＡＳ０２（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）とＱＳ−２１（例えばAquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass., USA製）との組み合わせを含む水中油型エマルション）、及び（３）ＡＳ０１（２種の免疫刺激成分：３’−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及びQuillaja saponaria 21（ＱＳ−２１）を有するリポソームの液体懸濁物から成る）から成る群より選択される。
【０１１０】
サイトカイン由来又はアクセサリー分子由来アジュバントは、好ましくは、（１）ＩＬ−２、ＩＬ−１２（例えばGenetics Institute、Cambridge, Mass., USA製）、ＧＭ−ＣＳＦ（例えばHoffman La-Roche, Basel, Switzerland製）及びＦｌｔ３などのサイトカイン、ならびに（２）Ｂ７．１のようなアクセサリー分子から成る群より選択される。
【０１１１】
粒子状製剤は、好ましくは、（１）ＤＮＰＣ／Ｃｈｏｌ又はＤＣ  Ｃｈｏｌのリポソーム（後者はリポソームに自己組織化できる類脂質性免疫調節剤から成る）などのリポソーム、（２）Virosomes（商標）（単層リポソームビヒクル）、免疫刺激性再構成型インフルエンザビロソーム［ＩＲＩＶ］、（３）ISCOMS（登録商標）（サポニン及び脂質の構造化複合体）、（４）ポリ乳酸（ＰＬＡ）及び乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＬＧミクロパーティクル、ならびに（５）Proteosomes（商標）から成る群より選択される。
【０１１２】
上記の免疫アジュバント化合物又は組成物は、特にそれらが市販されていることから、当業者に容易に入手可能である。
【０１１３】
しかし、本発明者らは、具体的に本明細書に定義の免疫原性化合物を使用した場合、該免疫原性化合物を免疫アジュバント物質として水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）と組み合わせたときに効果的な抗体応答、すなわち、ヒト個体における予防効果又は治療効果に応じる程度の抗体応答が得られることを見いだした。水酸化アルミニウム系免疫アジュバント物質は、粒子径分布約１〜１０μm及び平均粒子径約２〜３μmを有するコロイド状懸濁物の形態の粒子状物質から成る（Lindblad, 2004, Immunology and Cell Biology, Vol. 82 : 497-505）。
【０１１４】
顕著には、本発明者らは、特に周知の免疫アジュバントであるリン酸アルミニウムを含めた他の極めて慣例的な免疫アジュバント物質が、水酸化アルミニウムに比べて低い抗３Ｓペプチド抗体力価レベルを誘導させ、その抗体力価レベルは、研究室用試薬として抗体を生成するために有用でありうるが、予防的又は治療的医学効果を発揮することができる抗３Ｓ抗体を内因性生成するには断然低すぎることを見いだした。
【０１１５】
したがって、本発明による組成物の好ましい態様では、該免疫アジュバント物質は、水酸化アルミニウムから成る。
【０１１６】
さらに、本発明者らは、最適な抗３Ｓ抗体応答を得るために、好ましい条件で水酸化アルミニウムを使用して、Ａｌ（ＯＨ）３粒子の凝集を回避し、最終液体懸濁物中のこれらの粒子の均一分布を確実にできることを見いだした。
【０１１７】
本発明によると、使用準備済みの最終組成物が１００〜２００mM ＮａＣｌ及び０．５〜２．０mMリン酸ナトリウム、最も好ましくは１５０mM ＮａＣｌ及び１mMリン酸ナトリウムを含むとき、水酸化アルミニウム粒子凝集物の形成が回避できる、又は少なくとも実質的に遅延もしくは低減できることが見いだされた。この態様によると、粒子が免疫原性化合物を吸着する能力が変化せずに、水酸化アルミニウム粒子の凝集率が非常に最小化され、この特異的条件は、組成物が効果的な予防的抗３Ｓペプチド抗体生成を引き起こす能力を高める。
【０１１８】
したがって、本発明による組成物のいくつかの態様では、該組成物は、Ａｌ３＋イオン含量として表現されるとき０．１mg/mL〜５mg/mL、好ましくは０．０５mg/mL〜２mg/mLの範囲、最も好ましくは約１mg/mLの最終濃度の水酸化アルミニウムを含む使用準備済みのワクチン組成物を形成するように適応されている。欧州薬局方によると、アルミニウムアジュバントの量は、１回あたりアルミニウム１．２５mg未満、米国（連邦規制基準による）では１回あたりアルミニウム８５０μg未満であるべきである。
【０１１９】
また、本発明による組成物のある態様によると、該組成物は、最終濃度０．１mM〜５０mMのリン酸ナトリウム、好ましくは０．５mM〜１５mMのリン酸ナトリウム、最も好ましくは約１mMのリン酸ナトリウムを含む使用準備済みのワクチン組成物を形成するように適応されている。
【０１２０】
特定の一局面では、本発明による組成物は、抗原性ペプチド当量で表現されるとき１投薬単位あたり０．０１μg〜２００μg、好ましくは１投薬単位あたり０．０５μg〜５０μg、最も好ましくは１投薬単位あたり０．１μg〜２０μgの範囲の量の該免疫原性化合物を含む使用準備済みのワクチン組成物を形成するように適応されている。
【０１２１】
本明細書に使用される「抗原性ペプチド当量」として表現される免疫原性化合物の量は、考慮された免疫原性化合物物質中に含有される式（Ｉ）のペプチドの量から成る。本発明によると、ＣＲＭ１９７の１分子に連結された、式（Ｉ）で示されるペプチドの量は、好ましくはアミノ酸分析によって測定される。この方法は、タンパク質のアミノ酸組成を決定するために慣例的に使用される方法論である。タンパク質は、共有結合したアミノ酸残基が直鎖ポリマーとして構築されたものから成る高分子である。ペプチド結合は、酸性条件でインキュベーションされると切断され、アミノ酸の放出に繋がる。次に、加水分解生成物に関してアミノ酸分析が行われる。
【０１２２】
本発明によると、アミノ酸分析は、好ましくはＣＲＭ１９７に対する式（Ｉ）で示されるペプチドの結合率を決定するために使用される。これは、ＣＲＭ１９７及び接ぎ合わされたペプチドの両方に存在するアミノ酸もあれば、ＣＲＭ１９７にのみ存在するＦ（フェニルアラニン）などのアミノ酸もあることから可能であった。ＣＲＭ１９７にのみ存在するアミノ酸、ならびにＣＲＭ１９７及びそれにコンジュゲーションされた式（Ｉ）で示されるペプチドの両方に存在するアミノ酸の結果に基づき、ＣＲＭ１９７への式（Ｉ）で示されるペプチドの結合比を決定する計算が可能であった。
【０１２３】
典型的には、ＣＲＭ１９７と式（Ｉ）で示されるペプチドとの間のコンジュゲートの加水分解後に、被験試料中に存在するアミノ酸が、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分離される。通常、この装置はプレカラム又はポストカラム誘導体化能を有し、検出器は、使用される誘導体化法に応じて紫外−可視又は蛍光検出器である。検出器からのアナログ信号を変換するため及び各アミノ酸を定量するためにインテグレーターが使用される（Amino acid analysis of peptide loading ratios in conjugate vaccines: a comparison of electrochemical detection and 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate pre-column derivatization methods Nahas DD et al Bioconj Chem 2008 Jan 19(1) 322-6 Epub 2007 dec 12）。１分子のＣＲＭ１９７に連結された、式（Ｉ）で示されるペプチドの量は、質量分析によっても測定することができる。
【０１２４】
本発明による組成物は、液体又は固体形態でありうる。
【０１２５】
いくつかの態様では、本発明による組成物は、液体懸濁物濃縮液又は使用準備済みの液体懸濁物のいずれかとしての液体懸濁物から成る。
【０１２６】
他の態様では、本発明による組成物は、固体粒子状物質（すなわちコンジュゲート）から成り、その固体粒子状物質は、特に凍結乾燥物質を含み、注射前にアジュバント及び他の賦形剤と接触されなければならない。
【０１２７】
本発明は、また、上記に定義の免疫原性化合物、又は上記に定義の組成物を１種又は複数の薬学的に許容されうる担体と共に含むワクチン組成物に関する。
【０１２８】
そのような免疫原性組成物の製剤は、当業者に周知である。本発明の免疫原性組成物は、好ましくは薬学的に許容されうる担体を含む。適切な薬学的に許容されうる担体及び／又は希釈剤には、任意及び全ての通常の溶媒、分散媒、フィラー、固体担体、水溶液、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。適切な薬学的に許容されうる担体には、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどの１種又は複数、さらにはその組み合わせが挙げられる。薬学的に許容されうる担体は、さらに、湿潤剤又は乳化剤、抗体の有効期限又は有効性を高める保存料又は緩衝剤などの少量の補助物質を含みうる。薬学的に許容されうる担体の調製及び使用は、当技術分野において周知である。任意の通常の媒体又は薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、本発明の免疫原性組成物中へのその使用が考えられている。
【０１２９】
そのような免疫原性組成物は、非経口的に、例えば皮下又は筋肉内のいずれかの注射により、さらには経口又は経鼻的、及び他の粘膜経路により投与することができる。他の投与様式は、非限定的に、例えば経口製剤、肺製剤、坐剤及び経皮適用を採用する。例えば経口製剤は、非限定的に、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような普通に採用される賦形剤を含む。
【０１３０】
上記に定義の免疫原性化合物を、適切な免疫アジュバント物質及び適切な薬学的に許容されうる（１種又は複数の）賦形剤と組み合わせて含む組成物は、個体に投与されたときに高力価の抗３ＳペプチドＩｇＧ抗体の生成を誘導することが本明細書の実施例に示されている。
【０１３１】
重要なことに、本明細書における実施例は、本発明による組成物を免疫処置された個体の血清中から見いだされる抗３Ｓペプチド抗体が、ＣＤ４＋Ｔ細胞表面でのＮＫｐ４４Ｌ発現を用量依存的に阻害することを示している。
【０１３２】
当技術分野において公知のように、ＣＤ４＋Ｔ細胞表面でのＮＫｐ４４Ｌ発現の阻害は、ＨＩＶ感染個体におけるＮＫ細胞活性化及びＣＤ４＋Ｔ細胞へのＮＫ細胞の細胞傷害性を減少させることによりＣＤ４＋Ｔ細胞の減少に予防効果を引き起こす。
【０１３３】
本発明は、また、医薬として使用するための上記に定義の免疫原性化合物又は上記に定義の組成物に関する。
【０１３４】
本発明は、また、個体のＨＩＶウイルス感染によって引き起こされる状態を予防及び／又は治療するために使用するための、上記に定義の免疫原性化合物又は上記に定義の組成物に関する。
【０１３５】
本明細書に使用される、個体のＨＩＶ−１ウイルス感染を予防又は治療することは、（ｉ）ＡＩＤＳを含めた、該個体のＨＩＶ−１ウイルス感染に結びつく疾患を予防又は治療すること、及び（ｉｉ）ＨＩＶ−１疾患の進行を予防することを包含する。
【０１３６】
本明細書に使用される用語「ＨＩＶ感染」は、一般に、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）によるホスト動物、特にヒトホストの感染を包含する。「ＨＩＶ−１」は、本明細書において、ＨＩＶ−１ファミリーでの任意の株、形態、サブタイプ、クレード及び変種を表すために使用することができる。したがって、ＨＩＶ−１感染を処置することは、任意のＨＩＶ−１ファミリーのレトロウイルスのキャリアであるヒト又は活動性ＡＩＤＳと診断されたヒトの処置、及びそのようなヒトにおけるＡＩＤＳ関連状態の治療又は予防を包含する。ＨＩＶ−１のキャリアは、当技術分野において公知の任意の方法によって同定することができる。例えば、ヒトが抗ＨＩＶ−１抗体陽性であること、又はＨＩＶ−１陽性であること、又はＡＩＤＳの症状を有することに基づき、そのヒトをＨＩＶ−１キャリアとして同定することができる。すなわち、「ＨＩＶ−１感染を処置すること」は、例えば、急性原発性感染症候群（無症候性でありうるか、又は発熱、倦怠感、下痢、及び頭痛などの神経症状を有するインフルエンザ様疾患に関連しうる）、無症候感染（循環ＣＤ４＋Ｔ細胞数の漸減を伴う長い無症候期）、及びＡＩＤＳ（より重篤なＡＩＤＳ定義疾患及び／又は効果的な免疫機能と適合したレベル未満への循環ＣＤ４細胞数の減少によって定義される）が含まれるＨＩＶ−１感染のいくつかの進行段階の任意の一段階にある患者を処置することとして理解されたい。加えて、「ＨＩＶ−１感染を治療又は予防すること」は、また、例えばＨＩＶ−１汚染血との接触、輸血、体液交換、感染者との「危険な」性交、偶発的針穿刺、汚染された器具を用いて刺青もしくは鍼をされていること、又は妊娠、分娩もしくはその後での母親から乳児へのウイルス伝染による、過去のＨＩＶ−１曝露の疑い後のＨＩＶ−１による感染疑いを処置することを包含する。
【０１３７】
用語「ＨＩＶ−１感染を処置する」は、また、抗レトロウイルス療法に関連して、患者がウイルス量及び／又はＣＤ４  Ｔ細胞数に関してそのような療法に完全応答性又は部分応答性のいずれかであると理解されたい。
【０１３８】
用語「ＨＩＶ−１感染を予防する」は、ＨＩＶ−１感染を有さないが、遅かれ早かれＨＩＶ−１による感染の危険があると考えられるヒトを処置することを包含しうる。
【０１３９】
用語「ＡＩＤＳを処置する」は、より重篤なＡＩＤＳ定義疾患及び／又は有効な免疫機能と適合性のレベル未満への循環ＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少を示す患者を処置することを意味する。用語「ＡＩＤＳを処置する」は、また、ＡＩＤＳ関連状態を処置することを包含し、ＡＩＤＳ関連状態は、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、進行性全身性リンパ節腫（ＰＧＬ）、抗ＨＩＶ抗体陽性状態、及びＨＩＶ陽性状態などのＡＩＤＳ又はＨＩＶ−１感染症、ＡＩＤＳ関連神経状態（認知症又は熱帯性不全対麻痺など）、カポジ肉腫、血小板減少性紫斑病、Pneumocystis carinii肺炎、Mycobacterial tuberculosis、食道カンジダ症、脳トキソプラズマ症、ＣＭＶ網膜炎、ＨＩＶ関連脳症、ＨＩＶ−１関連消耗症候群などの関連する日和見感染症に付随又は関連する障害及び疾患を意味する。
【０１４０】
したがって、本明細書に使用される用語「ＡＩＤＳを予防する」は、ＨＩＶ−１感染を有する、又はＨＩＶ−１感染を有する疑いのある、又はＨＩＶ−１感染のリスクがある患者においてＡＩＤＳ（より重篤なＡＩＤＳ定義疾患及び／又は有効な免疫機能と適合性のレベル未満への循環ＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少によって特徴づけられる）及び／又はＡＩＤＳ関連状態の発症を予防することを意味する。
【０１４１】
したがって、本明細書に使用される用語「ＨＩＶ−１の進行を予防する」は、ＨＩＶ−１感染を有する患者においてそのＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少を予防すること、及び／又はそのウイルス量の増加を予防することを意味し、それらは、疾患の合併症及び疾患の重症度増加に結びつく二つの主なマーカーである。
【０１４２】
本発明は、また、個体のＨＩＶウイルス感染によって引き起こされる状態を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物を調製するための、上記に定義の免疫原性化合物又は上記に定義の組成物の使用を扱う。
【０１４３】
本発明は、また、個体のＨＩＶウイルス感染によって引き起こされる状態を予防及び／又は治療するための方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に定義のワクチン組成物の有効量を投与するステップを含む方法に関する。
【０１４４】
本発明は、さらに、下記の実施例により例示されるが、それに限定されることはない。
【０１４５】
実施例
実施例１：免疫原性化合物の調製及びそれらの特性のいくつかの決定
Ａ．  免疫原性化合物の調製
以下の免疫原性化合物又はコンジュゲートを合成した。それらは、架橋剤分子としてＭＢＳ又はＳＭＰＢのいずれかを使用してＫＬＨ及びＣＲＭ１９７から得た。使用されたペプチドは、そのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかに追加的なシステイン残基を有する、配列番号２から成る３Ｓペプチドであった。
−  ＣＲＭ１９７−ＭＢＳ−Ｎｔｅｒ（Ｃｙｓ）−３Ｓ
−  ＣＲＭ１９７−ＳＭＰＢ−Ｎｔｅｒ（Ｃｙｓ）−３Ｓ
−  ＣＲＭ１９７−ＳＭＰＢ−Ｃｔｅｒ（Ｃｙｓ）−３Ｓ
−  ＫＬＨ−ＭＢＳ−Ｎｔｅｒ（Ｃｙｓ）−３Ｓ
【０１４６】
明確にするために、上記「Ｎｔｅｒ（Ｃｙｓ）−３Ｓ」と名付けられるペプチドは、本明細書における配列番号５の３Ｓペプチドから成る。
【０１４７】
２種のヘテロ二官能性架橋剤：スルホ−ＳＭＰＢ（スルホ−（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）及びスルホ−ＭＢＳ（スルホ−（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル）を試験した。これらの分子は、ポリエチレン鎖によってＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルに連結されたマレイミド部分から成る（Cross-linking of protein by w-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimido esters. Partis M.D and al. Journal of Protein Chemistry, vol.2, No 3, 1983）。スクシンイミド部分は、タンパク質のアミノ基と反応することができる。この反応が起こった後、マレイミド部分は３Ｓペプチドのスルフヒドリル基と反応する。それらは長さが異なり、スルホ−ＭＢＳについて７．３Å及びスルホ−ＳＭＰＢについて１１．６Åである。リンカーの脱離及び緩衝液交換は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって行った。
【０１４８】
カップリング反応は２段階反応であった。第１段階は、架橋剤を用いたＣＲＭ１９７の活性化であった。ジメチルスルホキシド中に希釈したリンカー、１５ミリグラムを、コンジュゲーション緩衝液（ＰＢＳ １０mM ｐＨ７〜ｐＨ７．４）体積５〜２０ml中のＣＲＭ１９７、２０ミリグラムに添加し、室温で３０〜９０分間静かに混合した（Protective immunogenicity of two synthetic peptides selected from the amino acid sequence od Bordetella pertussis toxin subunit S1. Askelof P. and al. PNAS, vol.87, pp 1347-1351, February 1990）。この反応に続いて、ＳＥＣ（ＰＤ１０カラム（GE Healthcare, Chalfont St. Giles United Kingdom）又はＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２カラム（Biorad Marnes-la-Coquette, France））による活性化ＣＲＭ１９７の精製を行った。第二に、活性化ＣＲＭ１９７と３Ｓ由来ペプチドを室温で３０分〜２時間混合し、活性化ＣＲＭ１９７にペプチドを共有結合させた。活性化ＣＲＭ１９７の未反応のマレイミド基を遮断するために、コンジュゲーション反応後にシステイン−ＨＣｌ（SIGMA, Missouri, USA）を過剰に溶液に添加する（A practical approach to crosslinking. Mattson G. and al. Molecular Biology Reports 17: 167-183, 1993）。このステップは、多量体の創出を限定した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーによって免疫コンジュゲートを精製した。アミノ酸分析（ＡＡＡ）を用いて免疫コンジュゲートを分析してペプチド／ＣＲＭ１９７比を決定した。ＣＲＭ１９７−３Ｓペプチドは、リオプロテクター（lyoprotector）で凍結乾燥した（Lyophilisation and development of solid protein pharmaceuticals. Wang W. International Journal of Pharmaceutics 203 (2000) 1-60; Fundamentals of freeze-drying. Nail S.L and al. Pharm Biotechnol. 2002; 14:281-360）。
【０１４９】
Ｂ．  これらの免疫原性化合物の特性
驚くことに、得られた、Ｃ末端にＣｙｓを有する配列番号２の３Ｓペプチド、ＣＲＭ１９７担体、及びリンカーとしてのＳＭＰＢ又はＭＢＳに対応する全ての免疫コンジュゲートは、たとえ長時間経った後であっても、加熱しても振盪しても、水にも０．９％ＮａＣｌ溶液にも不溶性であった。これらの免疫コンジュゲートは、均一で再現性のある物質を得るために適切ではなかったので、これらの化合物を動物において試験しなかった。
【０１５０】
驚くことに、Ｎ末端にＣｙｓを有する配列番号２の３Ｓペプチド、ＣＲＭ１９７担体、及びリンカーとしてＭＢＳを使用する免疫コンジュゲートは、たとえ長時間経った後であっても、加熱しても振盪しても、水にも０．９％ＮａＣｌ溶液にも不溶性であった。たとえこれらの免疫コンジュゲートは均一で再現性のある化合物を得るために適切ではなかったにせよ、これらの化合物をマウスにおいて試験した。
【０１５１】
驚くことに、Ｎ末端にＣｙｓを有する配列番号２の３Ｓペプチド、ＣＲＭ１９７担体、及びリンカーとしてのＳＭＰＢに対応する免疫コンジュゲートは、水又は０．９％ＮａＣｌ溶液に自然溶解性であることが見いだされた。そのような免疫コンジュゲートをさらに研究した。
【０１５２】
実施例２：比較アッセイ
Ａ．  材料及び方法
Ａ．１．  実施例２で試験された様々な免疫コンジュゲート化合物は、実施例１に開示されたように調製した。
【０１５３】
Ａ．２．  様々な被験組成物を下表１に開示する。
【０１５４】
【表２】
0006352251.tif 000004
【０１５５】
−  ＳＭＰＢ及びＭＢＳは、PIERCE（Illinois, USA）又はSIGMA（Missouri, USA）から購入した。
−  Adjuphos（登録商標）２％（リン酸アルミニウムゲル）はBrenntag（Frederikssund, Denmark）から購入した。Adjuphos（登録商標）は、最終濃度を注射１回あたりＡｌ３＋イオン３００μgの投与に合わせたＡｌ３＋イオン最終濃度３mg/mlで使用した。
−  Alhydrogel（登録商標）２％（水酸化アルミニウムゲル）は、Brenntag（Frederikssund, Denmark）から購入した。Alhydrogel（登録商標）は、最終濃度を注射１回あたりＡｌ３＋イオン３００μgの投与に合わせたＡｌ３＋イオン最終濃度３mg/mlで使用した。
−  不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）は、SIGMA（Missouri, USA）から購入した。ＩＦＡ５０μlと水性免疫コンジュゲート溶液５０μlとの混合物を１時間ボルテックス撹拌することによって、ＩＦＡを免疫コンジュゲート化合物と共に乳化した。
【０１５６】
Ａ．３．  動物
動物は、Charles River Laboratories（Lyon, France）によって提供された、実験０日目に８週齢のＢＡＬＢ／ｃＪ雌であった。
【０１５７】
Ａ．４．  投与方法
表１に記載された各組成物を、抗原性ペプチド当量として表現されるとき用量４０μgで皮下経路によってマウスに注射した。
【０１５８】
それぞれ０日目、１４日目及び２８日目にマウスに各組成物１００μlを皮下注射した。
【０１５９】
各マウスの体重は、それぞれ０、１４、３５及び４９日目に経過観察した。
【０１６０】
Ａ．５．  ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイは、抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドとも呼ばれる配列番号２のペプチドを認識するＩｇＧ抗体の測定を行うように計画した。抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ抗体力価は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。表１において報告された、０日目、１４日目及び２８日目に１回あたり３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド当量２０又は５０μgの免疫コンジュゲートをワクチン接種されたラットの血清プールを使用して、異なる９６ウェルプレート間の値を基準化した。
【０１６１】
４９日目血清の８種の希釈を試験する（１／５０から１／１５０、１／４５０、１／１３５０、１／４０５０、１／１２１５０、１／３６４５０、及び１／１０９３５０まで）。Nunc Maxisorpマイクロプレートにコーティングされた抗原は、免疫コンジュゲートの合成のために使用されたリンカーと異なるリンカー、すなわちＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USAから購入したImject（登録商標）マレイミド活性化ＢＳＡタンパク質キットから生成）を用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲーションされた３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドである。抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲーション型ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｆｃ）（Jackson Immunoresearch, West Grove, USA）及びＨＲＰ基質：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Sigma, Missouri, USA）を使用する比色反応によって明らかにする。
【０１６２】
Ｂ．  結果
抗３Ｓ抗体のＩｇＧ力価は、材料及び報告の節に記載されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。
【０１６３】
結果を図１に示す。
【０１６４】
図１の結果は、それぞれ２１日目（図１Ａ）、３５日目（図１Ｂ）及び４９日目に（図１Ｃ）、担体タンパク質としてＫＬＨを含む免疫コンジュゲート化合物（Ｅ、Ｆ及びＧ）が、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を含む免疫コンジュゲート化合物（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）に比べて非常に低い抗３Ｓ抗体生成を誘導することを示している。
【０１６５】
図１の結果は、また、リンカー剤としてＭＢＳを使用することによって得られた免疫コンジュゲート化合物（Ｂ及びＤ）が、保存時間が長くなるほど多くの量の凝集物を含有する不均一な懸濁物を形成する能力のせいで、あまり使えないものの、良好な免疫原性を有することを示している。化合物Ａ及びＣ中に存在する免疫コンジュゲートは、同様に良好な免疫原性を表す。明確にするために、それを今後「３Ｓ原薬」と呼ぶ。
【０１６６】
図１の結果は、また、Adjuphos（登録商標）を有する組成物が凝集物を形成する傾向にあるので、難しい取扱い特性を有する最終生成物から成るという事実にかかわらず、免疫アジュバント物質としてAdjuphos（登録商標）を含有する組成物（Ａ、Ｂ）が、免疫アジュバント物質としてAlhydrogel（登録商標）を含有する組成物と同じ程度の免疫原性を有することを示している。
【０１６７】
実施例３：免疫コンジュゲートの製剤の最適化
アルミニウム塩への抗原吸着は、アジュバント効果に重要であり、ワクチン抗原、特に塩の製剤化は、アルミニウムと抗原との間の潜在的相互作用の重要な要素である。水酸化アルミニウムの表面は、アルミニウムに配位したヒドロキシル基から構成される。リン酸アルミニウムの表面電荷は、ヒドロキシル基とリン酸基との両方から構成される。アルミニウムアジュバントによるタンパク質の吸着は複合過程であり、静電力、疎水力及び他の引力の寄与を伴う。
【０１６８】
これらの製剤研究の目標は、均一でオパール様の外観を有し、静かに振盪した後に眼に見える凝集物を有さないワクチン調製物を得ることであった。本研究のターゲットは、１時間インキュベーション後にアルミニウム粒子上に３Ｓ原薬の少なくとも９５％を吸着する製剤を得ることであった。
【０１６９】
最初の探索的研究で、３Ｓ原薬を１３５mM塩化ナトリウム及び０．５mMリン酸ナトリウム中で水酸化アルミニウムアジュバントと混合した。凝集物が観察されたが、３Ｓ原薬のほぼ１００％がアルミニウム塩上に吸着された。リン酸アルミニウムを使用したとき、この混合物は均一な溶液をもたらしたが、３Ｓ原薬の８０％だけがアルミニウム塩上に吸着された。製剤のスクリーニングを行った。異なる生理化学的パラメーター：ｐＨ、塩化ナトリウム濃度及びリン酸塩濃度を試験した。吸着研究は、１mg/mLアルミニウムイオンを含有する懸濁物中で行った。低吸着チューブを使用して、タンパク質３７．５μg（ペプチド当量１２．５μgに対応）をアジュバント懸濁物と混合して、終体積０．２５０mLとした。水酸化アルミニウムとの製剤では、リン酸陰イオンでｐＨをｐＨ７．２に調整した。調製物を静かに混合した。予備実験から、吸着は数分で完了することが示された。懸濁物を遠心分離し、透明な上清をタンパク質について分析した。上清の抗原濃度は、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Pierce, Rockford, IL, USA）のマイクロプロトコールを用いて決定した。マイクロプレートでの手順にならった。吸光度を５６２nmで測定した。
【０１７０】
凝集物を避けるために製剤にリン酸陰イオンを添加する効果を研究した。アジュバントをリン酸陰イオンで前処理することによって抗原に関してアルミニウムの表面電荷を最適化することが可能でありうる。この処置は、静電引力により塩基性タンパク質の吸着を招きうる。ｐＨをコントロールするためにワクチン調製物中にリン酸陰イオンも含ませる。
【０１７１】
イオン強度の効果も検討した。イオン強度を２５０mMに増加させるための塩化ナトリウムの添加は、吸着率を改善した。水酸化アルミニウムを使用して、調製物中へのリン酸陰イオンの添加によって製剤の外観は改善した。
【０１７２】
一貫して均一でオパール様の外観を示す２種の製剤が得られた：
製剤１：７mMリン酸ナトリウム、１３５mM塩化ナトリウム、Ａｌ３＋イオンが１mg/mLの水酸化アルミニウム（ｐＨ７）
製剤２：１５mMリン酸ナトリウム、１３５mM塩化ナトリウム、Ａｌ３＋イオンが１mg/mLの水酸化アルミニウム（ｐＨ７）
【０１７３】
リン酸アルミニウムを使用すると、これらの製剤は均一でオパール様であったが、吸着能は９５％というターゲットに到達しなかった。対照的に、追加的なリン酸陰イオンであるリン酸アルミニウムは、陰性表面荷電を増加させた。したがって、リン酸陰イオンを有するリン酸アルミニウムの処理は、吸着されるタンパク質のタイプ、すなわち塩基性を変化させるとは予想されない。本発明者らは、リン酸アルミニウムアジュバントをＨＣｌで前処理してｐＨを低下させることによってリン酸アルミニウムアジュバントの表面電荷を改変した。アジュバント製剤のｐＨを５．５まで低下させると、１００％という吸着が得られた。したがって、次の製剤３を選択した：
製剤３：１５０mM塩化ナトリウム、Ａｌ３＋イオンが１mg/mLのリン酸アルミニウム（ｐＨ５．５）
【０１７４】
これら３種の製剤は、マウスにおいて類似の免疫原性を表した。エージング中の吸着に対するリン酸陰イオンの作用を限定するために、１mg/mLのＡｌ３＋イオン、７mMリン酸ナトリウム及び１３５mM塩化ナトリウム（ｐＨ７）の製剤１を選択した。製剤の最適化を継続した。リン酸ナトリウム及び塩化ナトリウム濃度を変化させて、二つの基準：１００％近い吸着及び均一／オパール様の外観により許容されうる製剤を得た。等張調製物を得るために、塩化ナトリウムの濃度を１５０mMに増加させた。リン酸陰イオンは、水酸化アルミニウムの表面への吸着に影響するおそれがあるので、調製物中の濃度を１mMに減少させた。Ａｌ３＋イオン濃度１mg/mLの水酸化アルミニウムを１mMリン酸ナトリウム及び１５０mM塩化ナトリウムと共に有する製剤（ｐＨ７．２）を選択した（製剤４：１mMリン酸ナトリウム、１５０mM塩化ナトリウム、Ａｌ３＋イオンが１mg/mLの水酸化アルミニウム（ｐＨ７．２））。最後に、異なる実験（製剤及び安定性試験）後に、アジュバント及び３Ｓ原薬のｐＨに適合性のｐＨ６．８を選択した（製剤５：１mMリン酸ナトリウム、１５０mM塩化ナトリウム、Ａｌ３＋イオンが１mg/mLの水酸化アルミニウム（ｐＨ６．８））。
【０１７５】
製剤５は、上記理由（免疫原性、水酸化アルミニウム上への免疫コンジュゲートの良好な吸着、オパール様の外観、ヒトでの使用に応じること、ｐＨ、ヒトでの使用のために選択された等張性）から選択した。
【０１７６】
製剤５に製剤化された３Ｓ原薬を、今後「ＶＡＣ−３Ｓ」と呼ぶ。
【０１７７】
実施例４：最適な用量範囲の決定
本実施例は、マウス及びラットにおける３Ｓ原薬候補の免疫応答により、ヒトに注射することができる３Ｓ原薬の量を説明する。
【０１７８】
Ａ．  方法
最初のヒト試験で使用されるべき最大ヒト用量を決定するために、マウスＢａｌＢ／ＣＢｙＪ（Charles River Laboratories, Lyon, France）及びラットCD（登録商標）ＩＧＳ（Charles River Laboratories, Lyon, France）において３Ｓ原薬又はＣＲＭ１９７−３Ｓ１６Ｎｔｅｒを用いて２種の用量範囲判定研究を行った。被験製剤は、水酸化アルミニウム（１mg/mLのＡｌ３＋イオン、１５０mM塩化ナトリウム及び３．６mMリン酸ナトリウムに入れたものである。記載された実験では、３Ｓ原薬の被験ロット中のリン酸ナトリウム濃度が高すぎるので、３Ｓ原薬は、３．６mMリン酸ナトリウムで試験した。医薬品、すなわち「ＶＡＣ−３Ｓ」は、３．６mMリン酸ナトリウムの代わりに１mMリン酸ナトリウムで製剤化されている。水酸化アルミニウムへの３Ｓ原薬の吸着は、１から３．６mMリン酸塩の間で同等である。そのうえ、免疫原性のブリッジング実験は、３．６mMリン酸ナトリウムで製剤化されたＶＡＣ−３Ｓと３Ｓ原薬との間で行う。臨床試験で、投与スケジュールは、１か月間隔で３回のワクチン接種である。マウス及びラットでも、３回のワクチン接種で同じスケジュールを行ったが、間隔は１４日であった。３Ｓ原薬に対する生物学的応答として抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ力価を測定した。そのような抗体は、３ＳペプチドとヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上のそのレセプターとの間の相互作用を阻害することが知られている。
【０１７９】
Ｂ．  マウスにおける最適用量範囲の決定
マウス９匹６群に漸増する用量の３Ｓ医薬品をワクチン接種した：体積０．０５mLの１５０mM塩化ナトリウム、３．６mMリン酸ナトリウム、及びアジュバントとしての１mg/mL水酸化アルミニウムに入れて製剤化された０．０２、０．２、１、２、及び４μgの３Ｓ１６Ｎｔｅｒ−ペプチド当量の３Ｓ原薬。マウス６匹の１群にアジュバントのみをワクチン接種した。
【０１８０】
４、２及び１μgのペプチド当量という用量は、有意差のない抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ抗体力価を誘導する。
【０１８１】
したがって、アジュバント加３Ｓ原薬０．０５mLを２週間間隔で３回単一部位にワクチン接種後のマウスにおいて、３Ｓ原薬によって誘導される免疫応答（循環抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ抗体力価）のプラトーは、０．２から１μgの３Ｓ１６Ｎｔｅｒ−ペプチド当量の間に含まれる値で始まる。
【０１８２】
Ｃ．  ラットにおける最適用量範囲の決定
ラット６匹５群に漸増する用量の３Ｓ医薬品をワクチン接種した：ワクチン接種１回あたり体積０．５mLの１５０mM塩化ナトリウム、３．６mMリン酸ナトリウム、及びアジュバントとしての１mg/mL水酸化アルミニウムに入れて製剤化された０．０２、０．２、２、２０及び４０μgの３Ｓ１６Ｎｔｅｒ−ペプチド当量の原薬。ラット６匹の１群は陰性対照としてワクチン接種しなかった。
【０１８３】
ペプチド当量４０μgのワクチン接種は、ペプチド当量２μg（幾何平均＝１／１４１３、ｐ＝０．０３）よりも、ペプチド当量０．２μg（幾何平均＝１／１７３６、ｐ＝０．０２）よりも、及びペプチド当量０．０２μg（幾何平均＝  １／８６１、ｐ＝０．００９）よりも、有意に高い抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ力価（幾何平均＝１／５７７６）を生じる。
【０１８４】
ペプチド当量４０μgのワクチン接種は、ペプチド当量２０μgのワクチン接種と有意差のない抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ抗体力価を生じる（それぞれ幾何平均：１／５７７６及び１／４２８４、ｐ＝０．７０）。
【０１８５】
したがって、原薬によって誘導される免疫応答（循環抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ抗体力価）のプラトーは、アジュバント加３Ｓ原薬を２週間間隔で３回注射した後のラットにおいて２から２０μgの間の３Ｓ１６Ｎｔｅｒ−ペプチド当量に含まれる値で始まる。
【０１８６】
Ｄ．  ヒトにおける最適用量範囲の決定
本発明者らが使用した理論的根拠は、マウスにおいて抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ抗体力価のプラトーを得るために必要なアジュバント加３Ｓ原薬の用量が、ヒトにおいて抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ抗体力価のプラトーを得るために必要な用量の１０分の１に対応するというものである。これは、抗Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧのプラトーが、２（０．２μgの１０倍）から１０μg（１μgの１０倍）の間の３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド当量でヒトにおいて達成されるであろうことを意味する。
【０１８７】
本発明者らは、ラットにおいて抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ抗体力価のプラトーを得るために必要なアジュバント加３Ｓ原薬の用量が、ヒトにおいて抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ抗体力価のプラトーを得るために必要な用量と同じ用量に対応するであろうと考えた。
【０１８８】
結果として、マウスにおいて行われた用量範囲の結果によると、ヒトにおける免疫応答のプラトーは、２から１０μgの間の３Ｓ１６Ｎｔｅｒ−ペプチド当量に含まれる最小用量のアジュバント加３Ｓ原薬で達成されると予想することができよう。
【０１８９】
ラットにおいて行われた用量範囲の結果によると、ヒトにおける免疫応答のプラトーは、２から２０μgの間の３Ｓ１６Ｎｔｅｒ−ペプチド当量に含まれる最小用量のアジュバント加３Ｓ原薬で達成されると予想することができよう。
【０１９０】
ヒトに注射されるべきアジュバント加３Ｓ原薬の最大ヒト用量は、１mg/ml水酸化アルミニウム、１５０mM塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウム緩衝液０．５mL中に製剤化するとき、ワクチン接種１回あたり３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド当量１０μgと設定した。
【０１９１】
したがって、ヒトにおいて使用されるべき用量は、例えばワクチン接種１回あたり３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド当量１０μgであるべきであり、好ましくはワクチン接種１回あたり０．１から２０μgの間の３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド当量の範囲でありうる。
【０１９２】
実施例５：ワクチン組成物の予防効果
実施例５の目的は、アジュバント加３Ｓ原薬をワクチン接種されたラットの抗血清が３Ｓペプチド、すなわち３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドによって誘導された活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞表面でのＮＫｐ４４Ｌの発現を阻害する能力を試験することであった。
【０１９３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞はヒトＰＢＭＣから選別し、ＰＨＡ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）で３日間活性化させ、次にリコンビナントＩＬ−２（Novartis, Horsham, United Kingdom）を用いて３日間エクスパンションさせた。細胞表面にＮＫｐ４４Ｌの発現を誘導するために、細胞を３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド（Covalab, Villeurbanne, France）存在下に置いた。
【０１９４】
細胞表面でのＮＫｐ４４Ｌの発現は、細胞蛍光測定によって測定された特異的蛍光染色強度を用いて測定した。
【０１９５】
ワクチン接種されたラットの抗血清によるＮＫｐ４４Ｌの発現阻害を研究した。抗血清は、異なる希釈で三つ組にして試験した。
【０１９６】
Ａ．  材料及び方法
細胞：
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥＦＳ（「Etablissement Francais du Sang」）に注文した白血球−血小板残留物パウチから磁気分離によって得た。
【０１９７】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、以下のプロトコールによりパウチから選別した：
１．  パウチを５０mL  Falconチューブ４本に分配する：４×１５mL
２．  ＲＰＭＩ１６４０＋glutamax培地（ref 72400-054, GIBCO, Life Technologies, Carlsbad, USA）で５０mLにする
３．  ５０mLチューブ８本中のFicoll（Ref 17-829E, Eurobio, Les Ulis, France））１５mL上に希釈血液を分配する
４．  ２８００rpmで２０分間、ブレーキをかけずに室温で遠心分離する
５．  白血球のリングを回収し、５０mLチューブ４本に１本あたり最大２５mLでそれらを分配する
６．  チューブをＲＰＭＩ１６４０培地で５０mLにする
７．  ２０００rpmで７分間、室温で遠心分離する
８．  上清を捨てる
９．  ペレットをプールし、ＲＰＭＩ１６４０培地５０mLで洗浄し、１５００rpmで５分間、室温で遠心分離する
１０．  トリパンブルーに入れて細胞を計数する
１１．  ４億個のＰＢＭＣを選別する
１２．  選別用緩衝液（Ｍｇ及びＣａ不含ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２mM ＥＤＴＡ）１５mL中で細胞を洗浄する。磁気ビーズの貪食を避けるために、その時点から細胞を４℃又は氷中で維持する）
１３．  ２０×１０６個のＰＢＭＣあたり磁気ビーズ１０μL=４億個のＰＢＭＣについて磁気ビーズ懸濁液２００μLを添加する（MACS CD4 microbeads, Miltenyi Biotec, Paris, France）
１４．  ４℃で３０分間インキュベーションする。
１５．  選別用緩衝液１mL中に細胞を再懸濁する
１６．  quadroMACSマグネット（Miltenyi Biotec, Paris, France）に２本のＬＳカラム（Miltenyi Biotec, Paris, France）を装着する
１７．  選別用緩衝液３mLで２本のＬＳカラムのそれぞれを平衡化する
１８．  重力によって細胞懸濁液にカラムを通過させる（各カラムで０．５mL）
１９．  選別用緩衝液５mLで各カラムを２回洗浄する
２０．  マグネットからカラムを取り外す
２１．  選別用緩衝液５mLで、最初は重力によって、２回目はピストンを使用して、各カラムを２回溶出する
２２．  各カラムから溶出した細胞を完全培地１５mL（ＲＰＭＩ１６４０＋glutamax、１０％非働化ＳＶＦ Gibco、可欠アミノ酸１００×（ref GIBCO, Life Technologies, Carlsbad, USA）、抗生物質／抗真菌薬（ref 15240-112, GIBCO, Life Technologies, Carlsbad, USA）で洗浄する
２３．  アセティックブルー（acetic blue）に入れて細胞を計数する
【０１９８】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させ、以下のプロトコールによりエクスパンションさせた：
１．  ５千万個のＣＤ４＋Ｔ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿通気インキュベーター中に立てた７５cm2フラスコ（Ref 353136, Falcon, lieu, pays）中の完全培地３０mLに入れて培養した。
２．  フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を最終濃度１μg/mLで添加する:培地１mLあたり１mg/mLを１μL分量。（ＰＨＡはThermo Fisher Scientific, Waltham, USA製）
３．  ＰＨＡ活性化の３日後に１００UI/mL ＩＬ−２（Aldesleukine, lieu, pays）を添加する。
【０１９９】
ＰＨＡ活性化及びＩＬ−２エクスパンションの間に培地が若干黄色になったときはいつも培地を半分交換する。
【０２００】
試験品目
ラット（Rattus norvegicus）Ｃｒｌ／ＣＤ（ＳＤ）の血清を試験した：０日目、１４日目及び２８日目に、この動物に水酸化アルミニウムアジュバント加３Ｓ原薬を１回あたり２μgの３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド当量でワクチン接種した。４９日目にその動物の血清は抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ抗体陽性であった。
【０２０１】
陰性対照として、ラット４８２の免疫処置前血清を試験した。
【０２０２】
対照
陽性対照：Charles River Laboratories, Lyon, FranceからのウサギNew Zealand（Oryctolagus cuniculus）から４９日目に採取した抗血清を１／５０希釈で陽性対照として使用した。このウサギに０日目、１４日目及び２８日目に水酸化アルミニウムアジュバント加ＣＲＭ１９７−（３Ｓ１６Ｎｔｅｒ）免疫コンジュゲートをワクチン接種し、４９日目にその動物の血清は抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ陽性であった。
【０２０３】
陰性対照：無関係のワクチンをワクチン接種されたウサギの抗血清を１／５０希釈で陰性対照として使用した。
【０２０４】
表２：実験対照のウェルの識別番号
対照は、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド不在下又は存在下で二つ組で試験した。ウェル及びチューブの識別番号を下表２に示す。
【０２０５】
【表３】
0006352251.tif 000005
【０２０６】
３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドへのin vitro曝露に応答してＮＫｐ４４Ｌの発現を許すＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化状態が分からないので、全ての対照を検証しなければならない。
【０２０７】
実験を検証するために、ＮＫｐ４４Ｌは、ウェル６、７、１０及び１１の細胞の表面に発現されなければならず、ウェル４、５、８、９、１２、１３、１４及び１５の細胞の表面に発現されてはならない。
【０２０８】
プロトコール
１．  被検血清を三つ組で試験する、
２．  ２mg/mL  ３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド溶液の１／４０希釈液２０μL：ＩＶＶ−Ｂ１２２  ２５μL＋完全ＲＰＭＩ１６４０培地９７５μL。したがって、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドは最終濃度５μg/mLであった、
３．  フラスコからのＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞懸濁液１８０μL
【０２０９】
血清の１／５０希釈のために、ウェル１個あたり血清４μLを添加する。
血清の１／１００希釈のために、１／４希釈の血清８μLを添加する。
血清の１／４００希釈のために、１／１６希釈の血清８μLを添加する。
血清の１／１６００希釈のために、１／６４希釈の血清８μLを添加する。
【０２１０】
表３：ラット血清のウェルの識別番号
ラット血清は、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドの存在下で三つ組で試験した。ウェル及びチューブの識別番号を表３に示す。
【０２１１】
【表４】
0006352251.tif 000006
【０２１２】
ウェル３個を細胞蛍光測定分析用の対照として使用する。
【０２１３】
表４：細胞蛍光測定用対照ウェルの識別番号
ウェル１では細胞を染色しなかった；ウェル２では、バックグラウンドを判定するために細胞を抗ＩｇＭ−ＰＥ抗体単独の存在下に置いた；ウェル３では、細胞を抗ＣＤ４−ＡＰＣ単独で染色した。
【０２１４】
【表５】
0006352251.tif 000007
【０２１５】
４．  マイクロプレートを細胞インキュベーター（３７℃、加湿雰囲気、５％ＣＯ２）中で４時間インキュベーションする。
５．  マイクロプレートを４００ｇで５分間遠心分離する。
６．  上清を除去する
７．  １０μＬ／ウェルのマウス抗ＮＫｐ４４Ｌ  ＩｇＭ７．１＋３０μＬ／ウェルのＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ（抗体溶液５００μL＋ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ  １５００μL）を添加する
８．  ４℃で１時間インキュベーションする
９．  １５０μL/ウェルのＰＢＳ、０．５％ＢＳＡを添加する
１０．  マイクロプレートを４００ｇで５分間遠心分離する。
１１．  上清を除去する
１２．  二次抗体抗マウスＩｇＭ−ＰＥをＰＢＳ、０．５％ＢＳＡで１／２５希釈した液５０μL／ウェルを添加する。
１３．  ４℃で３０分間インキュベーションする。
１４．  １５０μL／ウェルのＰＢＳ、０．５％ＢＳＡを添加する。
１５．  マイクロプレートを４００ｇで５分間遠心分離する。
１６．  抗ヒトＣＤ４−ＡＰＣ抗体をＰＢＳ、０．５％ＢＳＡで１／２５希釈した液５０μＬを添加する。
１７．  細胞懸濁液をＦＡＣＳチューブ中に移す。
１８．  室温で１５分間インキュベーションする。
１９．  各チューブに１×ＰＢＳ  ２mLを添加する
２０．  ４００ｇで５分間遠心分離する
２１．  １×ＰＢＳ  ３００μLを添加する
２２．  細胞蛍光測定装置でチューブを取得する
装置ＳＮ：ＡＮ５２２５７ソフトウェアバージョン：Gallios
太字の数字はウェル識別番号に対応する。
データは分析日にソフトウェアGalliosで分析し、印刷する。
結果は、細胞のＰＥマーカーのＸ−平均蛍光を報告するものである。
−  ＡＰＣ強度／前方側方強度ドットプロットでＣＤ４＋Ｔ細胞にゲート設定
−  ＳＳＣ強度／前方側方強度ドットプロットでリンパ球にゲート設定
【０２１６】
このＸ−平均値は、ＣＤ４＋Ｔ細胞表面のＮＫｐ４４Ｌマーカーの密度を表す。
【０２１７】
Ｂ．  結果
【０２１８】
【表６】
0006352251.tif 000008
【０２１９】
図４に、対照ウェルのＰＥ−平均蛍光を示す。
【０２２０】
得られた結果は：
−  血清なし、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドなしのウェルでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞はＮＫｐ４４Ｌを発現しなかった。
−  血清なし、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドの存在下のウェルでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞はＮＫｐ４４Ｌを平均レベル６２で発現した。
−  １／５０希釈のウサギ抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ抗体陰性血清あり、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドなしのウェルでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞はＮＫｐ４４Ｌを発現しなかった。
−  １／５０希釈のウサギ抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ抗体陰性血清あり、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド存在下のウェルでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は平均レベル６３のＮＫｐ４４Ｌを発現しなかった。
−  １／５０希釈のウサギ抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ抗体陽性血清あり、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドあり又はなしのウェルでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞はＮＫｐ４４Ｌを発現しなかった。
【０２２１】
これらの結果は、本実験に使用されたin vitro活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞が、
−  それらの表面にＮＫｐ４４Ｌを自然には発現せず、
−  ３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチドへの曝露に応答してそれらの表面にＮＫｐ４４Ｌを発現する能力があり、
−  この発現が無関係の抗血清により誘導も阻害もされず、
−  ＮＫｐ４４Ｌの表面が抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ  ＩｇＧ陽性血清によって完全に阻害された
ことを示した。
【０２２２】
さらに、図５の、試験項目のウェルのＸ−平均蛍光の結果を示す。
【０２２３】
得られた結果は：
１／５０希釈のラット抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ抗体陰性血清あり、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド存在下のウェルでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は平均蛍光レベル５３でＮＫｐ４４Ｌを発現した、
−  １／５０希釈のラット抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ抗体陽性血清あり、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド存在下のウェルでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＮＫｐ４４Ｌの表面発現は完全に阻害された。
−  １／１００希釈のラット抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ抗体陽性血清あり、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド存在下のウェルでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、平均蛍光レベル１４でＮＫｐ４４Ｌを発現した。
−  １／４００及び１／１６００希釈の抗３Ｓ１６Ｎｔｅｒ抗体陽性血清あり、３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド存在下のウェルでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌの表面発現は阻害されなかった
ことを示す。
【０２２４】
実施例５を要約するために、得られた結果は、活性化ＣＤ４＋Ｔリンパ球のin vitroヒト細胞モデルにおいて、alhydrogelアジュバント加３Ｓ原薬をワクチン接種されたラットの抗血清は、両方ともＣＤ４＋Ｔリンパ球表面でのＮＫｐ４４Ｌ発現を用量依存的に大きく阻害した。これは、これらのワクチン調製物が、ＣＤ４＋Ｔリンパ球上のＮＫｐ４４Ｌ発現に及ぼす３Ｓペプチドの作用を機能的に遮断することができる抗体を誘導する能力を反映している。
【０２２５】
実施例６：ヒト使用のための注射用組成物の調製及び投与方法
ワクチンの調製：
ＶＡＣ−３Ｓは、緩衝等張食塩水中に水酸化アルミニウムに吸着した３Ｓ原薬を含有する筋肉内注射用無菌懸濁液である。ＶＡＣ−３Ｓの製造は、ＧＭＰを遵守して行った。
【０２２６】
ＶＡＣ−３Ｓを得るために、Brenntag提供の水酸化アルミニウム（１mg/mLのＡｌ３＋イオン）（２％Alhydrogel 85、欧州薬局方）、１５０mM塩化ナトリウム（欧州薬局方）及び１mMリン酸ナトリウム（欧州薬局方）と共に０．５mL中に濃度０．０２mg/mLの３Ｓ１６Ｎｔｅｒペプチド当量となるように３Ｓ原薬を製剤化する。注射用製品は、ワクチンの製剤化に使用する。最終ｐＨは６．８である。ＶＡＣ−３Ｓは保存料を含有しない。
【０２２７】
注射剤：
振盪後、ワクチンは、使用準備済みの均一な白色懸濁物である。ワクチンは、三角筋に筋肉内注射することができる。無菌針を備える無菌シリンジを注射に使用する。患者は、各０．５mLの投与3回を、４週間のワクチン接種間隔で受けるべきである。
【０２２８】
実施例７：免疫原性化合物の調製
Ａ．  免疫原性化合物の調製
以下の免疫原性化合物又はコンジュゲートを合成した。それは、ＣＲＭ１９７から架橋剤分子としてＳＭＰＢを使用して得られた（実施例１に示す）。使用されたペプチドは、架橋剤の化学的カップリングを可能にしてＣＲＭ１９７−ＳＭＰＢ−Ｎｔｅｒ（Ｃｙｓ）−ｍ３Ｓをもたらすためにそのアミノ末端に追加的なシステイン残基を有する、配列番号６（ＮＨ２−ＰＷＮＡＳＡＳＮＫＳＬＤＤＩＷ−ＣＯＯＨ）から成る突然変異型３Ｓ（ｍ３Ｓ）ペプチドであった。
【０２２９】
明確にするために、上記「Ｎｔｅｒ（Ｃｙｓ）−ｍ３Ｓ」と名付けられるペプチドは、本明細書における配列番号７の３Ｓペプチドから成る。
【０２３０】
ヘテロ二官能性架橋剤スルホ−ＳＭＰＢ（スルホ−（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）を使用した。これらの分子は、ポリエチレン鎖によってＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルに連結されたマレイミド部分から成る（Cross-linking of protein by w-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimido esters. Partis M.D and al. Journal of Protein Chemistry, vol.2, No 3, 1983）。スクシンイミド部分は、タンパク質のアミノ基と反応することができる。この反応が起こった後、マレイミド部分は、３Ｓペプチドのスルフヒドリル基と反応する。スルホ−ＭＢＳについて７．３Å及びスルホ−ＳＭＰＢについて１１．６Åと、それらは長さが異なる。リンカー脱離及び緩衝液交換は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって行った。
【０２３１】
カップリング反応は二ステップ反応であった。第一ステップは、架橋剤を用いたＣＲＭ１９７の活性化であった。ジメチルスルホキシドで希釈したリンカー、１５ミリグラムを、コンジュゲーション緩衝液（ＰＢＳ  １０mM ｐＨ７〜ｐＨ７．４）体積５〜２０mL中の２０ミリグラムのＣＲＭ１９７に添加し、室温で３０〜９０分間静かに混合した（Protective immunogenicity of two synthetic peptides selected from the amino acid sequence of Bordetella pertussis toxin subunit S1. Askelof P. and al. PNAS, vol.87, pp 1347-1351, February 1990）。この反応に続いて、ＳＥＣ（ＰＤ１０カラム（GE Healthcare, Chalfont St. Giles United Kingdom）又はＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２カラム（Biorad Marnes-la-Coquette, France））による活性化ＣＲＭ１９７の精製を行った。第二に、活性化ＣＲＭ１９７及び３Ｓ由来ペプチドを室温で３０分〜２時間混合し、ペプチドを活性化ＣＲＭ１９７に共有結合させる。活性化ＣＲＭ１９７の未反応のマレイミド基を遮断するために、コンジュゲーション反応後に溶液にシステイン−ＨＣｌ（SIGMA, Missouri, USA）を過剰に添加する（A practical approach to crosslinking. Mattson G. and al. Molecular Biology Reports 17: 167-183, 1993）。このステップは、多量体の創出を制限した。次に、免疫コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。免疫コンジュゲートは、アミノ酸分析（ＡＡＡ）を用いて分析して、ペプチド／ＣＲＭ１９７比を決定した。
【０２３２】
Ｂ．  これらの免疫原性化合物の特性
Ｎ末端にＣｙｓ残基、ＣＲＭ１９７担体及びリンカーとしてのＳＭＰＢを含む、得られた、配列番号７のｍ３Ｓペプチドに対応する免疫コンジュゲートは、水又は０．９％ＮａＣｌ溶液に自然に可溶性であることが見いだされた。そのような免疫コンジュゲートの免疫原性を下記実施例１０でさらに研究した。
【０２３３】
実施例８：実施例９の免疫原性化合物の免疫原性
Ａ．  材料及び方法
Ａ．１．  実施例１０で試験された免疫コンジュゲート化合物は、実施例９に開示されたように調製した。
【０２３４】
実施例３に記載のように製剤化した。そのために、Alhydrogel（登録商標）２％（水酸化アルミニウムゲル）をアジュバントとして使用し、Brenntag（Frederikssund, Denmark）から購入した。Alhydrogel（登録商標）をＡｌ３＋イオンの最終濃度１mg/mLで使用し、その最終濃度は、注射１回あたり５０μgのＡｌ３＋イオンの投与に適合させる。
【０２３５】
Ａ．２．  動物
動物は、Charles River Laboratories（Lyon, France）によって提供されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ雌であり、実験０日目に８週齢であった。
【０２３６】
Ａ．３．  投与方法
実施例５記載のワクチン調製物は、抗原性ペプチド当量として表現されるとき用量２μgでマウスに筋肉内経路により注射した。
【０２３７】
それぞれ０日目、１４日目、２８日目及び１６９日目及び２１２日目に各被験組成物５０μLをマウスに筋肉内注射した。
【０２３８】
Ａ．５．  ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイは、抗ｍ３Ｓペプチド抗体とも呼ばれる配列番号６のペプチドを認識するＩｇＧ抗体の測定を行うために設計した。
【０２３９】
抗ｍ３Ｓ  ＩｇＧ抗体力価は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。
【０２４０】
１６９日目、２０４日目及び２６０日目の血清の８種の希釈（１／３０００、１／６０００、１／１２０００、１／２４０００、１／４８０００、１／９６０００、１／１９２０００、及び１／３８４０００）を試験した。Nunc Maxisorpマイクロプレートにコーティングされた抗原は、免疫コンジュゲートの合成に使用されたリンカーと異なるリンカーＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USAから購入したImject（登録商標）マレイミド活性化BSAタンパク質キットから生成）でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲーションされたｍ３Ｓペプチドである。抗ｍ３Ｓ  ＩｇＧ抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Jackson Immunoresearch, West Grove, USA）にコンジュゲーションされたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）及びＨＲＰ基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Sigma, Missouri, USA）を使用する比色反応によって顕色させる。
【０２４１】
Ｂ．  結果
抗３Ｓ抗体のＩｇＧ力価は、材料及び方法の節に記載されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。
【０２４２】
結果を図６に示す。
【０２４３】
図６の結果は、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を含む免疫コンジュゲート化合物が、０日目、１４日目及び２８日目に３回ワクチン接種後の１６９日目に高い抗ｍ３Ｓ抗体の生成を誘導することを示している。
【０２４４】
図６の結果は、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を含む免疫コンジュゲート化合物が、０日目、１４日目及び２８日目及び１６９日目に４回ワクチン接種後の２６０日目に高い抗ｍ３Ｓ抗体の生成を誘導することを示している。
【０２４５】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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