(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オトメユリ（Lilium rubellum）水抽出物を有効成分とすることを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
オトメユリ（Lilium rubellum）花の水抽出物を有効成分とすることを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
我々の皮膚は個人の素因に加え、環境要因を受けながら劣化する。ここで言う、個人の素因に基づく老化は自然老化と称され、環境要因とりわけ太陽紫外線による付加的障害は光老化と称される。
【０００２】
それぞれの皮膚外観には違いがあり、自然老化すなわち非露光部の皮膚では、皮膚は菲薄化し、皮膚表面を指で押すことにより縮緬状の細かいシワが観察される。一方、光老化すなわち露光部の皮膚では、自然老化に見られた細かいシワに加えて、深くはっきりとしたシワが観察される。
【０００３】
シワが形成される原因として、皮膚真皮成分、とりわけコラーゲン、エラスチンなどの真皮マトリックス成分の減少が注目されるが、これは自然老化で見られる現象であり、光老化では少し異なる。具体的には光老化では自然老化と同様にコラーゲン量は減少するが、エラスチン量に関しては増加する。
【０００４】
この光老化における真皮構成成分量の変化は、紫外線によってＡＰ−１と呼ばれる転写因子活性タンパク質−１が誘導され、その結果コラーゲンを分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ：ＭＭＰ）と呼ばれる基質分解酵素の発現が促進されることに起因するもの考えられている。さらにＡＰ−１はＭＭＰを誘導しコラーゲンを分解するだけでなく、コラーゲンの遺伝子発現そのものも抑制することが知られている。その結果、正常なコラーゲン線維の量は減少し、その代償としてエラスチンが過剰に産生され、本来の機能を失ったエラスチンが沈着するエラストーシスが進行すると報告されている。
（非特許文献１）
【０００５】
我々化粧品技術者がターゲットにする皮膚は主に顔面であり、顔面は紫外線による影響も受けやすいため、その皮膚状態を改善させるためには、自然老化の影響だけでなく、光老化の影響も考えることが重要である。そのため、両メカニズムから考えると、顔面に生じるシワの改善には、真皮構成成分の中でも、とりわけエラスチンの産生を促進することなく、コラーゲンの産生を促進せることが重要である。これまで、コラーゲン産生を促進させる様々な物質の化粧品製剤への配合が試みられているが、安定性、安全性、効果などの点から未だ十分に満足できるものは得られていない。
【０００６】
ユリ（百合）は、ユリ目ユリ科のうち主としてユリ属（学名：Lilium）の多年草の総称である。
オニユリ、ハカタユリなど特定種の根では、滋養強壮、利尿、鎮咳などの効果から、古くから生薬として用いられている。また、マドンナリリー根エキスにエラスチン産生促進効果があること（特許文献１）、ユリ科ユリ属の植物の根にセラミド産生促進効果がある（特許文献２）ことなど、根に関しては多数の報告例が存在する。また、根以外の部位では、報告例は少ないものの、その中にはユリ科ユリ属の植物にグリコサミノグリカン産生促進効果があること（特許文献３）、テッポウユリの葉、スカシユリの花弁にヒアルロニダーゼ活性阻害効果などがあることが報告されている（特許文献４）。このようにユリに関しては古くから数多くの研究がなされているが、コラーゲン産生に関する効果については全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−０５６９３３号公報
【特許文献２】特開２００２−３７０９９８号公報
【特許文献３】特開２０１０−０１８５９４号公報
【特許文献４】特開２００３−０１２４８９号公報
【０００８】
【非特許文献１】：  化粧品・外用薬研究者のための皮膚科学  ２００５年６月、文光堂、P４９−５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願発明は、このような従来の問題点に鑑み、天然由来で安全性が高く、エラスチン産生促進効果は有さず、コラーゲン産生促進効果を有する光老化に有用な剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、上記問題点を解決すべく、鋭意検討を進めたところ、ユリ科ユリ属に含まれるオトメユリの水抽出物に優れたコラーゲン産生促進効果を見出した。
【発明の効果】
【００１１】
本願発明のコラーゲン産生促進剤は、エラスチン産生促進効果を有さず、コラーゲン産生に関し極めて高い効果を有するので、皮膚における光老化を解決することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】５０％エタノール水溶液で抽出を行った場合のコラーゲン産生促進度を示す。
【図２】水抽出を行った場合のコラーゲン産生促進度を示す。
【図３】オトメユリの各部位についてのコラーゲン産生促進度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本願発明は、オトメユリの水抽出物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤である。
本願発明で用いるオトメユリ（乙女百合、学名：Lilium rubellum）はユリ科ユリ属の植物のひとつであり、別名、ヒメサユリ（姫早百合・姫小百合）とも呼ばれる。日本特産のユリで、宮城県南部、及び新潟県、福島県、山形県が県境を接する飯豊連峰、吾妻山、守門岳、朝日連峰、周辺にしか群生していない貴重な植物である。高さは３０−５０ｃｍ程度、開花時期は６月から８月花は薄いピンク色で斑点がないのが特徴とされている。
【００１４】
本願発明で用いるオトメユリ水抽出物の抽出部位は花である。一般概念として花と称される部分全体を指し、外観上花弁と同視されるガクも含まれる。言い換えれば、本願発明で言う「花」とは、花軸よりも先端部分を指す。本願では、「花部」と称す場合もあるが、同義である。
花は、開花した花の他、蕾の状態でも使用出来る。又、花弁やガクのみを選択して採取して利用することも出来る。もっとも、採取工程の都合で多少他の部位が混合されていても差し支えない。
必要に応じてオトメユリの花を乾燥させ、又は乾燥することなく粉砕した後、水抽出を行うことが出来る。
【００１５】
本願発明で用いるオトメユリ水抽出物の抽出法は、特に限定されない。例えば、乾燥植物１質量部に対して１〜１００質量部の水を用い、５〜７０℃の、好ましくは１０〜６０℃の温度で、１〜７日間、特に３〜４日間抽出するのが好ましい。抽出後は、ろ過を行い、そのままの状態でも利用できるが、必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色などの精製処理を行うことも出来る。更には、凍結乾燥等をして粉末の状態で用いることも出来る。
【００１６】
本願発明のコラーゲン産生促進剤は、抽出物のまま或いは粉末の状態で、そのまま用いることも出来るが、一般的な基剤に混合して用いることも出来る。基剤に混合して用いる場合には、原則的にはコラーゲン産生促進剤は有効量存在すればよいことになるが、乾燥残分質量換算で、コラーゲン産生促進剤中０．００１〜５．０質量％の濃度範囲とすることが望ましく、特に０．０１〜１．０質量%の範囲が最適である。オトメユリ水抽出物の含有量が０．００１質量%未満であると即効的な効果が期待しにくく、５．０質量%以上加えても効果はほぼ一定である
【００１７】
以下、本願発明の実施例について具体的に説明するが、本願発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、特記しない限り配合量は質量％で示す。
【００１８】
＜コラーゲン量測定試験＞
〔サンプルの調製〕
各種ユリ（ソルボンヌ、ルレーブ、マルコポーロ、ビビアナ、オトメユリ、ヒメユリ）の花（花弁及びガク）を乾燥させ、ユリ乾燥原体とした。乾燥原体１：抽出溶媒１０の割合の質量比で混合し、抽出溶媒が５０％エタノール水溶液の場合は室温、１週間、抽出溶媒が水の場合は６０℃、５時間の条件で抽出物の抽出を行った。抽出後、凍結乾燥にて固形分を得た。
尚、各ユリの学名は以下の通りである。
ソルボンヌ（Lilium cv. Sorbonne）、ルレーブ（Lilium cv. Le Reve）、マルコポーロ（Lilium cv. Marco Polo）
ビビアナ（Lilium cv.Viviana）、オトメユリ（Lilium rubellum）、ヒメユリ（Lilium concolor）。
【００１９】
〔細胞の培養〕
ヒト線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ、理研バイオリソースセンター）のトリプシン処理を行ない、１０％牛胎児血清を含有するＤ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地で細胞を分散させ、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２．５×１０４  ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種し、１日間、３７℃で培養を行なった。なお培地量は各ｗｅｌｌあたり０．５ｍｌになるように添加し培養した。
１日間培養を行った後、各種ユリより抽出した抽出物（水抽出、５０％エタノール水溶液抽出）を添加し、さらに３日間培養を行った。添加量は、それぞれの抽出物中の固形分が培地中に５０ｐｐｍ，２５ｐｐｍ，１２．５ｐｐｍ，６．２５ｐｐｍ，３．１２５ｐｐｍになるように調製した。
【００２０】
〔評価方法〕
細胞内に産生されたコラーゲン量の測定は培養後、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、０．１％シリウスレッド酢酸溶液を０．３ｍＬ添加し室温で１時間放置したあと、１０ｍＭ  ＨＣｌで５回洗浄した。その後、０．１Ｍ  ＮａＯＨを０．５ｍＬ添加して５分間放置することで細胞を溶解し５４０ｎｍの吸光度を測定した。コラーゲン産生量は、抽出物の代わりに水を添加したサンプルをｃｏｎｔｒｏｌとし、対ｃｏｎｔｒｏｌ比で算出した。また、陽性対照物質としては、ビタミンＣ誘導体であるアスコルビン酸リン酸マグネシウム塩（ＶｃＰＭｇ、Ｖｃ−ＰＭｇと表記する場合がある）を用いた。
【００２１】
コラーゲン産生促進度（％）は式１に示す計算式で算出した。
【式１】
【００２２】
0006262113.tif 000002
【００２３】
図１及び図２にコラーゲン産生量の測定結果を示した。
この結果より、５０％エタノール水溶液でユリを抽出した場合には、いずれのユリについてもコラーゲン産生促進効果は殆ど認められないことが分かる。一方で、水抽出をした場合には、ソルボンヌ、ルレーブ、マルコポーロ、ビビアナ、ヒメユリは、５０％エタノール水溶液で抽出した場合同様コラーゲン産生促進効果は殆ど認められなかったが、オトメユリは、濃度依存的に顕著な効果があることが確認された。
このことから、オトメユリの花の水抽出物には他のユリの花の抽出物には存在しない、特有のコラーゲン産生効果成分が存在すること思われた。
【００２４】
そこで、前記効果がコラーゲンそのものの産生を促進した結果であるのか、或いは、細胞を増殖させた結果によるものであるかを更に検討した。細胞増殖を測定するための試験は、前述と同様の方法で細胞を培養し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を用いて測定した。表１は、図２で示したものの内、コントロール、オトメユリ、陽性対象のアスコルビン酸リン酸マグネシウム塩の細胞増殖度（％）を示す。細胞増殖度（％）は、式２に示す計算式で算出した。
【式２】
【００２５】
0006262113.tif 000003
【００２６】
【表１】
0006262113.tif 000004
【００２７】
表１の結果から、オトメユリの花の水抽出物のコラーゲン産生促進効果は、単純に細胞増殖度が上がった結果ではなく、細胞あたりのコラーゲン産生量が増加したものであることが分かった。
【００２８】
次に効果の高かったオトメユリに関して、花部以外の茎部、葉部、根部の水抽出物においてもコラーゲン産生効果を有するかを調べた。
【００２９】
〔サンプルの調製〕
茎部、葉部、根部のサンプルの調製は、オトメユリの部位を代えた以外は、前述の花のサンプルを調製した場合と同様に行った。
【００３０】
結果を図３に示した。
オトメユリでは茎部、葉部、根部の水抽出物にはコラーゲン産生促進効果は見られなかった。尚、図示はしていないが５０％エタノール水溶液で抽出した場合も同様の結果であった。このことから、オトメユリの花の水抽出物は他のユリ種や部位にはない、コラーゲン産生促進効果を特徴的に持つことが明らかになった。
【００３１】
〔エラスチン産生促進効果の確認〕
〔サンプルの調製〕
オトメユリの花のサンプル調製は、前述の方法と同様である。
【００３２】
〔細胞の培養〕
ヒト線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ、理研バイオリソースセンター）のトリプシン処理を行ない、１０％牛胎児血清を含有するＤ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地で細胞を分散させ、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２．５×１０４  ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種し、１日間、３７℃で培養を行なった。なお培地量は各ｗｅｌｌあたり０．５ｍｌになるように添加し培養した。
１日間培養を行った後、１％牛胎児血清を有するＤ−ＭＥＭに培地交換した。その後、ユリ抽出物を添加し、さらに１日間培養を行った。添加量は、オトメユリの花の抽出物の固形分が培地中に５０ｐｐｍ，２５ｐｐｍ，１２．５ｐｐｍになるように調製した。なお、コントロールは同量の水を加えた。２４時間培養後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、総ＲＮＡを抽出した。
【００３３】
この総ＲＮＡに対してＰｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ＲＣＲ  Ｋｉｔ  （ＴａＫａＲａ）  を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、トロポエラスチン、ＧＡＰＤＨの発現量を以下のプライマー及び酵素を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて測定した。
【００３４】
プライマーは、トロポエラスチンセンスプライマー（５‘−ＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＣＣＴＴＴＧＧ−３’）、アンチセンスプライマー（５‘−ＧＣＡＧＴＴＴＣＣＣＴＧＴＧＧＴＧＴＡＧ−３’）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸  デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）用センスプライマー（５‘−ＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ−３’）、アンチセンスプライマー（５‘−ＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡ−３’）を用いた。ＰＣＲの反応にはＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。
【００３５】
【表２】
0006262113.tif 000005
【００３６】
結果を表２に示した。
表２より、オトメユリにはエラスチンの前駆体であるトロポエラスチンの産生を促進する効果はないことが確認できた。他のユリ種では、エラスチン産生促進効果があることが知られているが、オトメユリの花弁水抽出物ではその効果はないことから、オトメユリ花弁水抽出物に含まれるコラーゲン産生を増加させる効果成分はオトメユリに特徴的なものであることが示唆される。また、オトメユリ花弁水抽出物はエラスチン産生促進効果を持たないことから、光老化でのエラスチン蓄積を悪化させないという効果も期待出来る。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明のオトメユリ水抽出物は、高いコラーゲン産生促進効果を示すと同時にエラスチンの産生促進効果はないことから、光老化に起因する皮膚内の現象を改善することが期待出来る。
【図１】
0006262113.tif 000006
【図２】
0006262113.tif 000007
【図３】
0006262113.tif 000008