(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物と、さらに、前記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、標識を有さない第二の粒子を含む、生体試料中の前記被検物質の測定に用いる試薬キットであって、前記第一の結合物質が抗体であり、前記第二の結合物質が抗体であり、前記第一の粒子に対する前記第二の粒子の質量比が１〜６で使用され、前記化合物が、７より大きい等電点を有するアミノ酸又は塩酸グアニジンである、試薬キット。
【請求項２】
前記アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン、リジン及びオルニチンから選択される少なくとも１つの化合物である、請求項１に記載の試薬キット。
【請求項３】
前記第一の粒子の粒径が、２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項１又は２に記載の試薬キット。
【請求項４】
前記標識が、蛍光色素を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の試薬キット。
【請求項５】
前記第二の粒子の粒径が、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下である、請求項１から４の何れか一項に記載の試薬キット。
【請求項６】
被検物質が副腎皮質刺激ホルモンである、請求項１から５の何れか一項に記載の試薬キット。
【請求項７】
請求項１から６の何れか一項に記載の試薬キットと、
前記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は、前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板と、
を含む、生体試料中の前記被検物質の測定に用いる測定キット。
【請求項８】
前記基板に、前記被検物質と結合性を有さず、前記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されている、請求項７に記載の測定キット。
【請求項９】
被検物質と、前記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物と、さらに、前記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、標識を有さない第二の粒子を含む溶液を、前記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は、前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定されている第一の金属膜に接触させる工程と、
前記第一の金属膜から前記標識に応じたシグナルを検出する工程と、
を含む、被検物質の測定方法であって、前記第一の結合物質が抗体であり、前記第二の結合物質が抗体であり、前記第一の粒子に対する前記第二の粒子の質量比が１〜６で使用され、前記化合物が、７より大きい等電点を有するアミノ酸又は塩酸グアニジンである、被検物質の測定方法。
【請求項１０】
前記溶液を、前記被検物質と結合性を有さず、前記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜に接触させる工程と、
前記第二の金属膜から前記標識に応じたシグナルを検出する工程と、
前記第二の金属膜から検出したシグナルを用いて前記第一の金属膜から検出したシグナルを補正する工程と、
をさらに含む、請求項９に記載の測定方法。
【請求項１１】
被検物質が副腎皮質刺激ホルモンである、請求項９又は１０に記載の測定方法。
【請求項１２】
正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物が、アルギニン又はリジンであり、前記溶液が１５０〜２７５ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン又はリジンを含む、請求項９から１１の何れか一項に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の被検物質の測定に用いる試薬キット、生体試料中の被検物質の測定に用いる測定キット、及び被検物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料に含まれるタンパク質、酵素又は無機化合物などの被検物質を定量するための高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検物質を含むと考えられる被検試料に上記特定波長の励起光を照射した際に発する蛍光を検出することによって被検物質の存在を確認する方法である。被検物質が蛍光体でない場合には、被検物質と特異的に結合する物質を蛍光色素で標識した物質を、被検試料に接触させ、その後上記と同様にして、励起光を照射した際に発する蛍光を検出することにより、被検物質の存在を確認することができる。
【０００３】
上記の蛍光検出法において、検出の感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属膜を設けたセンサチップを用意する。そして、支持体と金属膜との界面に対して支持体における金属膜形成面の反対面側から全反射角以上の角度で励起光を入射させる。この励起光の照射により金属膜に表面プラズモンが発生し、この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって蛍光が増強され、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が向上することとなる。表面プラズモン励起による蛍光検出法（以下、「ＳＰＦ法」とする）は、落射励起による蛍光検出法と比較して約１０倍のシグナル増強度が得られる。
【０００４】
特許文献１には、抗原と少なくとも２つの抗体との間で複合体を形成する段階であって、上記抗体の１つは不溶性支持体に結合された第１の抗体であり、上記抗体の１つは第２の未結合標識抗体であり、これにより上記標識抗体の一部が上記複合体を介して不溶性支持体に結合される段階と、さらに、未標識未結合第１抗体、未標識未結合第２抗体及びこれらの混合物からなる群より選ばれる追加の抗体を、実質的に線形の標準曲線を得るような擬似一次反応を起こすのに十分な量存在するように導入する段階を有してなる液体サンプルにおける抗原の免疫検定方法が記載されている。
【０００５】
特許文献２には、特定のハイブリドーマが産生するヒトＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）及び犬ＴＳＨに結合することができるモノクローナル抗体を用いたＳＰＦ法によるＴＳＨの測定方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第２５６８９１０号公報
【特許文献２】特許第５４９２１５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の通り、特許文献１には、２つの抗体を用いたサンドイッチ免疫反応による抗原の免疫検定方法が記載されているが、測定感度は十分なものではない。また、特許文献２は、特定の寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を用いたＴＳＨの測定方法に関するものであるが、任意の被検物質についての高感度な測定方法を提供するものではない。
【０００８】
本発明は、生体試料中の被検物質の測定に用いる試薬キットであって被検物質の測定感度を向上させることができる試薬キットを提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、上記試薬キットを含む測定キット、及び被検物質の測定感度を向上させることができる被検物質の測定方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、被検物質と、上記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子とを反応させる際に、正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物の存在下で反応を行うことによって、標識を有する上記第一の粒子が基板と非特異反応することを抑制し、被検物質の測定感度を向上できることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
【００１０】
（１）被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物とを含む、生体試料中の上記被検物質の測定に用いる試薬キット。
（２）上記化合物が、アミノ酸である、（１）に記載の試薬キット。
（３）上記アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン、リジン及びオルニチンから選択される少なくとも１つの化合物である、（２）に記載の試薬キット。
（４）上記第一の粒子の粒径が、２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、（１）から（３）の何れかに記載の試薬キット。
（５）上記標識が、蛍光色素を含む、（１）から（４）の何れかに記載の試薬キット。
（６）上記第一の結合物質が抗体である、（１）から（５）の何れかに記載の試薬キット。
（７）さらに、上記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾された第二の粒子を含む、（１）から（６）の何れかに記載の試薬キット。
（８）上記第二の粒子の粒径が、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下である、（７）に記載の試薬キット。
（９）上記第二の結合物質が抗体である、（７）又は（８）に記載の試薬キット。
（１０）被検物質が副腎皮質刺激ホルモンである、（１）から（９）の何れかに記載の試薬キット。
（１１）（１）から（１０）の何れかに記載の試薬キットと、
上記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は、上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板と、
を含む、生体試料中の上記被検物質の測定に用いる測定キット。
（１２）上記基板に、上記被検物質と結合性を有さず、上記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されている、（１１）に記載の測定キット。
（１３）被検物質と、上記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物とを含む溶液を、上記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は、上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定されている第一の金属膜に接触させる工程と、
上記第一の金属膜から上記標識に応じたシグナルを検出する工程と、
を含む、被検物質の測定方法。
（１４）上記溶液が、上記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾された第二の粒子をさらに含む、（１３）に記載の測定方法。
（１５）上記溶液を、上記被検物質と結合性を有さず、上記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜に接触させる工程と、
上記第二の金属膜から上記標識に応じたシグナルを検出する工程と、
上記第二の金属膜から検出したシグナルを用いて上記第一の金属膜から検出したシグナルを補正する工程と、
をさらに含む、（１３）又は（１４）に記載の測定方法。
（１６）被検物質が副腎皮質刺激ホルモンである、（１３）から（１５）の何れかに記載の測定方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の試薬キット、測定キットおよび測定方法によれば、生体試料中の被検物質の測定おける測定感度を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
［試薬キット］
本発明の試薬キットは、生体試料中の被検物質の測定に用いるためのものであり、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物とを含む。本発明の試薬キットは、上記の通り、第一の粒子と、正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物とを含むが、第一の粒子と上記化合物とは混合物としてキットに含まれていてもよいし、別々にキットに含まれていてもよい。
【００１３】
（生体試料）
生体試料としては、被検物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
【００１４】
（被検物質）
被検物質としては、特に限定されないが、例えば、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コルチゾール、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合蛋白３型（ＩＧＦＢＰ−３）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、尿中ＧＨ、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、ＴＳＨ刺激性レセプター抗体（ＴＳＡｂ）、チロキシン（Ｔ４）、抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体（抗ＴＰＯ抗体）、マイクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、サイログロブリン、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ｆＴ４、ｆＴ３、１，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ、Ｉ型コラーゲン架ＮN-テロペプチド（ＮＴｘ）、インタクトＩ型プロコラーゲン−Ｎ−プロペプチド（Ｉｎｔａｃｔ  ＰＩＮＰ）、オステオカルシン、カルシトニン、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、デオキシピリジノリン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、Ｌ−ドーパ、３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニルエチレングリコール（ＭＨＰＧ）、バニリルマンデル酸（ＶＭＡ）、カテコールアミン、セロトニン、メタネフリン、１１−デオキシコルチゾール、１７−ケトジェニックステロイド（１７−ＫＧＳ）、１７−ＯＨプレグネノロン、アルドステロン、アンドロステロン、アンドロステンジオン、１１−ヒドロキシコルチコステロイド（１１−ＯＨＣＳ）、コルチコステロン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン（ＤＯＣ）、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、プレグネノロン、５αジヒドロテストステロン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）βサブユニット、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、エストロゲン、エストロン（Ｅ１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、テストステロン、プレグナンジオール、プレグナントリオール、プロゲステロン、Ｃペプチド（ＣＰＲ）、血管作動性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、インスリン、ガストリン、グルカゴン、抗グルタミン酸脱炭酸酵素抗体（抗ＧＡＤ抗体）、抗インスリノーマ抗原２抗体（抗ＩＡ−２抗体）、抗インスリン抗体、心筋トロポニンＴ、心室筋ミオシン軽鎖Ｉ、ヒト心臓由来脂肪酸結合蛋白（Ｈ−ＦＡＢＰ）、ヒト心房性利尿ペプタイド（ＨＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）、ミオグロビンなどを挙げることができる。被検物質の特に好ましい一例としては、ＡＣＴＨである。
【００１５】
副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）は、３９個のアミノ酸からなるペプチドホルモン（分子量４，５００）である。ＡＣＴＨは下垂体から分泌され、副腎を刺激し、コルチゾールを分泌させる。代謝異常疾患の中で最も多いクッシング症候群の診断において、ＡＣＴＨはコルチゾールと併せて重要な測定項目である。クッシング症候群の原因には下垂体原因のＰＤＨ（pituitary dependent hyperadrenocorticism；下垂体依存性）と副腎原因のＡＴ（adrenal tumor；副腎腫瘍性）があり、ＡＣＴＨ刺激試験後のコルチゾールが高値の検体においてＡＣＴＨが高値であればＰＤＨ、低値であればＡＴの可能性が高いと診断することができる。ＡＣＴＨは立体構造を形成しないため、血液中に含まれるプロテアーゼに分解されやすいため、採血後は検体を冷却しながら、速やかにＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）血漿に調整したものを取り扱う必要がある。
【００１６】
（正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物）
本発明の試薬キットは、生体試料中の被検物質（特に好ましくはＡＣＴＨ）の測定に用いるためのものであり、好ましくは免疫反応を利用して、被検物質を測定（好ましくは定量）するものである。本発明による測定方法においては、被検物質（ＡＣＴＨ等）と特異的な結合性を有する第三の結合物質、または被検物質に対して結合性を有する第一の結合物質が、静電相互作用によって被検物質（ＡＴＣＨ等）と結合していると推定される。表面にマイナス電荷を帯びたラテックス粒子を第一の粒子として選択する場合には、ラテックス粒子と金膜上の抗体との静電相互作用による非特異的結合が生じ、被検物質の濃度と検出シグナルの十分な相関が得られず、十分な感度を有する検量線が得られないという問題がある。このような現象を解決するためには、非特異反応に対するブロッキング剤を用いることが考えられ、本発明では、正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物を用いることで上記問題を解決できることを見出した。
【００１７】
正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物としては、具体的には側鎖にアミノ基を有するアミノ酸、又は上記アミノ酸に類似した構造を有する化合物であることが好ましい。正電荷を有するアミノ基の数は１以上であれば特に限定されないが、１〜５個が好ましく、１〜３個がより好ましい。化合物中のアミノ基が正電荷を有しているかどうかは、化合物の等電点により判断することができ、等電点が７より大きければｐＨ７付近の生体試料中で正電荷を有するものとみなすことができる。
【００１８】
等電点の測定方法としては、通常の表面電位計、あるいはゼータ電位計で測定することが可能である。具体的には、測定しようとする化合物の水溶液を準備し、ｐＨを変化させながらその水溶液のゼータ電位を市販の表面電位計で測定し、ゼロになったときのｐＨを等電点として採用することが出来る。具体的な数値としては、アルギニン１０．７６、リジン９．７４、ヒスチジン７．５９、グリシン５．９７である。
【００１９】
側鎖にアミノ基を有するアミノ酸の例として、タンパク質を構成するアミノ酸としてはアルギニン、ヒスチジン及びリジンを挙げることができる。これらのアミノ酸は、等電点が７より大きいことから、ｐＨ７付近の生体試料中で正電荷を有していることが裏付けられている。その他にオルニチンや、アミノ酸以外では塩酸グアニジンといったアルギニンに類似の構造を有する化合物も用いることができるが、特にアルギニン、リジンが好ましい。
【００２０】
正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物の使用量は、反応液中の濃度に換算して、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以上４００ｍｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましく、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上２７５ｍｍｏｌ／Ｌ以下が更に好ましい。
【００２１】
（第一の結合物質）
本発明で用いる第一の結合物質は、被検物質と特異的な結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗原、抗体、又はこれらの複合体を使用できるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。結合物質が抗体である場合は、被検物質と特異的な結合性を有する抗体として、例えば、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
【００２２】
抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルのどちらも使用可能である。
【００２３】
特に、被検物質がＡＣＴＨである場合には、静電相互作用により被検物質（ＡＣＴＨ）と特異的な結合性を有する第一の結合物質としては、抗ＡＣＴＨモノクローナル抗体が好ましく用いられる。ＡＣＴＨの分子量を考慮してサンドイッチ方式を選択することが好ましく、この場合には、ペアとなる抗体を金膜に被覆する必要があるが、金膜上及び第一の粒子上の両方に、これらの抗ＡＣＴＨモノクローナル抗体を用いることが可能である。
【００２４】
（第一の粒子）
本発明で用いる第一の粒子は、上記した第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する粒子である。第一の粒子は、乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定はされない。第一の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第一の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
【００２５】
ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸又はメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
【００２６】
第一の粒子は標識を有する。標識は、蛍光を発することが好ましい。重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合には、そのまま蛍光ラテックス粒子として使用することができる。重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合には、ラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって、蛍光ラテックス粒子を作製することができる。即ち、蛍光ラテックス粒子は、水および水溶性有機溶剤を含むラテックス粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどによりラテックス粒子の内部に含浸させることにより製造することが可能である。
【００２７】
標識を有する第一の粒子としては、蛍光色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等を蛍光粒子として使用することもできる。蛍光発色は、紫外光等を吸収して励起し、基底状態に戻る際に放出されるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、黄緑（励起波長５０５ｎｍ／放出波長５１５ｎｍ、以下同じ）、青（３５０〜３５６ｎｍ／４１５〜４４０ｎｍ）、赤（５３５〜５８０ｎｍ／５７５〜６０５ｎｍ）、オレンジ（５４０ｎｍ／５６０ｎｍ）、レッド・オレンジ（５６５ｎｍ／５８０ｎｍ）、クリムゾン（６２５ｎｍ／６４５ｎｍ）、ダークレッド（６６０ｎｍ／６８０ｎｍ）などの蛍光発色が用いられ得る。これらの蛍光を発する蛍光粒子は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能であり、同社においてＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）の商品名で市販されている。
【００２８】
標識を有する第一の粒子の粒径は、平均粒径として定義される。第一の粒子の平均粒径は、特に限定されず、好ましい範囲は、粒子の材質や被検物質を定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましく、２２０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下であることがより好ましく、２４０ｎｍ以上２８０ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
【００２９】
本発明に用いられる粒子の平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することが可能である。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されているが、これらの測定法の中で、動的光散乱法で計測することが好ましく、本発明では、平均粒径は、２５℃にて、粘度０．８８７２ＣＰ（０．８８７２ｍＰａ・ｓ）、水の屈折率１．３３０の条件で測定したメジアン径（５０％径、ｄ５０）として求めるものとする。
【００３０】
本発明で用いる第一の粒子は、上記した第一の結合物質により修飾されている。標識を有する第一の粒子に、第一の結合物質を結合するための方法は特に限定されない。例えば、特開２０００−２０６１１５号公報やモレキュラープローブ社ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアＦ８８１３に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、抗体などの結合物質を粒子に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、及び共有結合による化学結合を用いた方法、のいずれの方法も採用可能である。抗体などの結合物質を粒子に固定させた後に結合物質が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
【００３１】
（第二の結合物質）
本発明の試薬キットは、好ましくは、さらに、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾された第二の粒子を含んでいてもよい。
被検物質を含む陽性となる被検試料だけでなく、被検物質を含まない陰性の被検試料に対しても反応して陽性となる被検試料が存在しており、擬陽性の解決が課題として認識されている。このような擬陽性を示す原因は明確にはなっていないが、血清中に含まれる何らかの因子が存在して非特異反応を起こすことが原因の一つではないかと考えられている。本発明では、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾された第二の粒子を併用することで、このような問題を解決することが好ましい。
【００３２】
第二の結合物質としては、被検物質（例えばＡＴＣＨ等）と特異的な結合性を有さない物質を使用することができ、上記したような擬陽性を示す原因物質に結合する可能性のある物質を使用することが好ましく、さらに第一の結合物質に対して親和性を有しない化合物を使用することが好ましい。第二の結合物質としては、抗体、あるいは抗体に対して結合するタンパク質（Protein A、Protein G）などを使用することができ、抗体が好ましい。例えば、第二の結合物質が抗体である場合には、その抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることが可能である。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体も使用可能である。本発明では、第二の結合物質として、特に抗ＣＲＰ抗体を使用する態様が好ましい。
【００３３】
（第二の粒子）
第二の粒子としては、標識を有しないことが好ましく、また第二の粒子は乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定されない。
第二の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第二の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
【００３４】
ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸又はメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
【００３５】
第二の結合物質で結合された第二の粒子の粒径は、平均粒径として定義される。第二の粒子の平均粒径は、粒子の材質や被検物質を定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましく、１２０ｎｍ以上１８０ｎｍ以下であることがより好ましく、１３０ｎｍ以上１７０ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
第一の粒子と第二の粒子の使用比率については、第一の粒子に対する第二の粒子の質量比が１〜６であることが好ましく、２〜６であることが更に好ましい。
【００３６】
［測定キット］
本発明の測定キットは、上記した本発明の試薬キットと、被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は、第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む。上記基板には、被検物質と結合性を有さず、第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されていてもよい。
【００３７】
（第三の結合物質）
第三の結合物質は、被検物質と特異的な結合性を有する物質である限り特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、又はこれらの複合体が挙げられ、抗体を用いることが好ましい。第三の結合物質が抗体である場合は、被検物質に対して特異性を有する抗体として、例えば、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
【００３８】
抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルのどちらも使用可能である。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
【００３９】
（第一の結合物質に対して結合性を有する物質）
第一の結合物質に対して結合性を有する物質としては、特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、又はこれらの複合体が挙げられる。抗体の調製方法および抗体の種類は、第三の結合物質について記載した内容と同様である。
【００４０】
（第四の結合物質）
第四の結合物質は、被検物質と結合性を有さず、第一の結合物質に対して結合性を有する物質である。第四の結合物質としては、例えば、第一の結合物質（抗体）に対する抗体、結合物質（抗体）に対して結合するタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）など、第一の結合物質に対して親和性を持つ化合物を使用することが好ましく、中でも更に好ましくは、抗体を使用することができる。抗体の調製方法および抗体の種類は、第三の結合物質について記載した内容と同様である。また、標識を有する第一の粒子に結合した第一の結合物質の一部が、第四の結合物質とリガンド−非リガンドの関係となる化合物を好ましく用いることができる。
【００４１】
（結合物質を基板に固定化する方法）
抗体などの第三の結合物質および第四の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Ｎｕｎｃ社の提供するＴｅｃｈ  Ｎｏｔｅｓ  Ｖｏｌ．  ２−１２などに記載されており、一般的なＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）などを配することによる表面修飾を施しても良く、結合物質としての抗体を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、及び共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。抗体を基板に固定させた後に抗体が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
【００４２】
（基板）
本発明で用いる基板は、金属膜が形成された基板であり、その形態は特に限定されないが、後述する表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行う場合には、後述する流路、及び表面に反応部位である金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るような物質を用いることができる。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の金属が挙げられ、特に金が好ましい。上記の金属は単独又は組み合わせて使用することも可能である。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は特に制限はないが、例えば、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるものが好ましく、更には、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるものが好ましく、特に１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるものが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００４３】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタリング法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができるが、基板への金属膜の良好な付着性を実現するために、スパッタリング法により金属膜を形成することが好ましい。
【００４４】
金属膜は、好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。ＳＰＦ法による蛍光検出のための基板の一例としては、ポリメチルメタクリレート上に、金膜をスパッタリング法で作製した基板などを挙げることができる。
【００４５】
［被検物質の測定方法］
本発明による被検物質の測定方法は、被検物質と、上記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物とを含む溶液を、上記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は、上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定されている第一の金属膜に接触させる工程と、上記第一の金属膜から上記標識に応じたシグナルを検出する工程とを含む。
上記溶液は、上記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾された第二の粒子をさらに含んでいてもよい。
また本発明による被検物質の測定方法は、上記溶液を、上記被検物質と結合性を有さず、上記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜に接触させる工程と、上記第二の金属膜から上記標識に応じたシグナルを検出する工程と、上記第二の金属膜から検出したシグナルを用いて上記第一の金属膜から検出したシグナルを補正する工程とをさらに含んでいてもよい。
【００４６】
（測定方法）
本発明の測定方法は、被検物質の存在の有無の検出や被検物質の量の測定（すなわち、定量）などを含む、最も広い概念として解釈される。本発明の測定方法の具体的な実施態様としてはサンドイッチ法または競合法が挙げられ、サンドイッチ法が好ましい。
【００４７】
＜サンドイッチ法＞
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質を測定することができる。まず、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質、及び被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質を予め用意しておく。第一の結合物質を、標識を有する第一の粒子に結合させて、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された第一の粒子を作製する。次いで第三の結合物質を用意し、基板上に固定して反応部位（テストエリア）とする。また、第四の結合物質を用意し、基板上に固定してコントロールエリアとする。別途、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質を用意し、標識を有さない第二の粒子に結合させて、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された標識を有しない第二の粒子を作製する。上記の第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と、第一の粒子と第二の粒子の混合物とを混合溶解し、この混合溶解した液を基板に適用し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に被検物質が存在する場合には、反応部位で、被検物質と、第一の粒子に結合した第一の結合物質との間、及び被検物質と反応部位上の第三の結合物質との間で反応（抗原及び抗体を用いた場合には、抗原抗体反応）が起こり、被検物質の量に応じた第一の粒子が反応部位上に固定される。サンドイッチ法では、反応部位上に固定した第三の結合物質と、被検物質との反応、及び被検物質と第一の粒子に結合している第一の結合物質との反応が終了した後、基板上のテストエリア及びコントロールエリアで結合しなかった第一の粒子を除去する目的で、洗浄を行うこともできる。次いで反応部位に結合した第一の粒子からのシグナル強度を検出することで、正確な被検物質の濃度を測定することができる。なお、蛍光強度と被検物質の濃度は、正の相関関係がある。
【００４８】
＜競合法＞
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質を測定することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として当業界においてよく知られている。まず、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質と、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質を予め調製する。次いで第一の結合物質を第一の粒子に結合させ、第二の結合物質を第二の粒子に結合させる。また、第一の結合物質に対して結合性を有する、被検物質そのもの、または被検物質と類似な部位を持ち被検物質と同様の第一の結合物質に対するエピトープを持つ化合物を基板上に固定し反応部位とする。次に、第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と、第一の粒子と第二の粒子の混合物とを混合溶解し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に被検物質が存在しない場合には、第一の粒子に結合した第一の結合物質と、反応部位上に固定した第一の結合物質に対して結合性を有する被検物質そのもの又は被検物質と同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ類似化合物とにより、基板上で反応が起こる。一方、被検物質が存在する場合には、第一の結合物質に被検物質が結合するため、第一の結合物質に対して結合性を有する、被検物質そのもの、または被検物質と類似な部位を持ち被検物質と同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ化合物との、反応部位上における反応が阻害され、標識を有する第一の粒子が反応部位上への固定が阻害される。競合法では、予め、被検物質濃度が異なる被検物質量既知の試料を複数用意し、この試料及び結合物質標識蛍光粒子を反応部位上に接触させつつ、反応部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各被検物質濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、被検物質濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する被検物質濃度の検量線を取得する。このように取得した検量線に基づき、目的とする被検試料を用いた蛍光量の時間変化の結果から、被検試料に含まれる被検物質量を定量することができる。
【００４９】
（流路）
本発明の好ましい態様においては、被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と、標識を有する第一の粒子と、さらに所望により第二の粒子とを混合した混合物を溶解する。この溶解液を基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、被検試料と、標識を有する第一の粒子（および所望により第二の粒子）とを反応部位まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、標識を有する第一の粒子（及び所望により第二の粒子）を含む被検試料液を点着する点着口、第三の結合物質が固定化された反応部位としての金属薄膜、及び金属薄膜を超えて流路が存在し、被検試料が、金属薄膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属薄膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口が設けることができる。
【００５０】
（標識に応じたシグナルを検出する方法）
本発明においては、標識に応じたシグナルを検出する。上記の通り標識は蛍光を発することが好ましく、この場合には、蛍光を検出することにより、標識に応じたシグナルを検出することができる。蛍光の検出方法としては、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、又は表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。蛍光強度の検出は、通常、抗原抗体反応後一定時間、例えば、数分〜数時間後に終了する。免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、蛍光強度と被検物質の濃度の関係から、被検物質の濃度を定量することができる。なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。なお、ＳＰＦ法は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法）よりも高感度に測定することができる。
【００５１】
表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）バイオセンサーとしては、例えば、特開２００８−２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーを用いることができる。
【００５２】
（被検物質量の測定方法）
本発明におけるＳＰＦ法での被検物質の定量方法の一例としては、以下の方法により被検物質を定量することができる。具体的には、各濃度既知の被検物質を含む試料を準備し、蛍光を検出する部位を流下させつつ、蛍光検出部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各被検物質濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、被検物質濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する被検物質濃度の検量線を取得する。光シグナルシステムとしては、被検物質ごとに対応する検量線に基づき、目的とする被検試料の被検物質量を特定することができる。
【００５３】
本発明における表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）系は、基板上の金属薄膜上に固定化された被検物質の量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を、例えば濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法では、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと検体中の抗原が、抗体反応により結合し、凝集する。この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方式が、ラテックス凝集法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便な被検物質の検出方法を提供できる。
【００５４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１
（１）平均粒子径２６０ｎｍラテックス粒子の製造
スチレン（和光純薬（株）社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（和光純薬（株）社製）１ｇ（１２ｍｍｏｌ）を超純水３３０ｍＬに懸濁した。得られた混合物を８５℃に昇温し、過硫酸カリウム（和光純薬（株）社製）１ｇを２５ｍＬに溶解させた水溶液を添加した。得られた混合物を８５℃、２５０ｒｐｍ（回転／分）で６時間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍ、６時間の条件で行う遠心分離を３回繰り返して精製し、沈殿物を超純水に再分散させることでラテックス粒子を得た。その後、固形分濃度が１質量％となるように超純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃でメジアン径（５０％径、ｄ５０）を求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は２６０ｎｍであった。
【００５６】
（２）平均粒子径１５０ｎｍラテックス粒子の製造
スチレン（和光純薬（株）社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（和光純薬（株）社製）３ｇ（４２ｍｍｏｌ）を超純水４４０ｍＬに懸濁した。得られた混合物を９５℃に昇温し、過硫酸カリウム（和光純薬（株）社製）１ｇを１０ｍＬに溶解させた水溶液を添加した。得られた混合物を９５℃、２５０ｒｐｍで６時間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍ、６時間の条件で行う遠心分離を３回繰り返して精製し、沈殿物を超純水に再分散させることでラテックス粒子を得た。その後、固形分濃度が１質量％となるように、超純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃でメジアン径（５０％径、ｄ５０）を求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は１５０ｎｍであった。
【００５７】
３．蛍光ラテックス粒子の作製
上記（１）で作製した平均粒子径２６０ｎｍのラテックス粒子の固形分濃度が２質量％となるように純水で調整した水分散液を１００ｍＬ用意し、２５℃の温度でメタノール１００ｍＬを１０分間かけて攪拌しながら添加した。このラテックス分散液に、別途準備した、蛍光色素（ＮＫ１３６、（株）林原生物化学研究所製）溶液（ＮＫ１３６  １０ｍｇをN,N-ジメチルホルムアミド１ｍＬ, ＣＨＣｌ３ ９ｍＬ, エタノール１６ｍＬに溶解したもの）を、６０分間かけて滴下した。滴下終了後、エパポレーターで有機溶媒を減圧留去した。その後、遠心分離を行って上澄み液を除去した後に、沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ水溶液）へ再分散させた。この操作を合計で３回繰り返し、２質量％蛍光ラテックス粒子の作製を終了した。
【００５８】
（４）副腎皮質刺激ホルモンに対する抗体（抗ＡＣＴＨ抗体）で修飾した蛍光ラテックス粒子の製造  
２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（平均粒子径２６０ｎｍ）２７５μＬに、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（２‐モルホリノエタンスルホン酸）バッファー(ｐＨ６．６)溶液８８μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗ＡＣＴＨモノクローナル抗体（Anti-ACTH  MC49039-7；製造方法は後記する）１７６μＬを添加し、得られた混合物を室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩；和光純薬（株）社製）水溶液を５μＬ加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／Ｌのグリシン（和光純薬（株）社製）水溶液を８．８μＬ添加して、得られた混合物を１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。上清を取り除き、沈殿物にＰＢＳ溶液(ｐＨ７．４)５００μＬを加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、沈殿物に１質量％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させた。このようにして抗ＡＣＴＨ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
【００５９】
（モノクローナル抗体の作製）
抗ＡＣＴＨモノクローナル抗体（Anti-ACTH  MC49039-7）および後述する抗ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）モノクローナル抗体（MM50175）は、それぞれマウス腹水法を用いて、以下のように作製した。
ＡＣＴＨを化学合成し、マウスに免疫した後に脾臓細胞を抽出し、ミエローマ（製品名P3-X63-Ag8-U1、コスボバイオ社製）と混合し、ポリエチレングリコール（PEG）法にて細胞融合を実施した。使用細胞は、最終免疫してから3日後に採取した脾臓細胞を使用した。細胞比は、脾臓細胞 ： ミエローマ = 10 ： 1とした。細胞播種は、脾臓細胞として0.5〜1.0× 10５ cells/wellで96-well plateに播種した。使用した培地は、ＲＰＭＩ−１６４０（Roswell Park Memorial Institute medium） 、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清  Fetal bovine serum）、および ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン混合培地 hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium）を適宜使用した。最終的に増殖した融合細胞（ハイブルドーマ）をマウス腹腔内に注射し、一定期間の経時後に腹水を取り出し、遠心分離、精製工程を経て得られたものを抗ＡＣＴＨモノクローナル抗体として採取した。また、抗ＡＣＴＨモノクローナル抗体の作製と同様にして、大腸菌の培養液から精製したＣＲＰ（オリエンタル酵母工業（株）社製）を用いて、抗ＣＲＰモノクローナル抗体を作製した。
【００６０】
（５）蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子の製造
２質量％（固形分濃度）ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）３００μＬに、２５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳバッファー(ｐＨ５．６)溶液９６μＬおよび超純水２５mLを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗ＣＲＰモノクローナル抗体（MM50175）１８２μＬを添加し、得られた混合物を室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ水溶液９．６μＬを加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／Ｌのグリシン（和光純薬（株）社製）水溶液を３０μＬ添加して、得られた混合物を３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、ラテックス粒子を沈降させた。上清を取り除き、沈殿物にＰＢＳ溶液(ｐＨ７．４)を６００μＬ加え、超音波洗浄機によりラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、沈殿物に１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液６００μＬを加えて、ラテックス粒子を再分散させた。このようにして抗ＣＲＰ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
【００６１】
（６）蛍光標識粒子と蛍光標識を有さない粒子の乾燥粒子の製造
超純水２４０μＬ、２０質量％スクロース水溶液４１７μＬ、２０質量％ＢＳＡ水溶液２２９μＬ、抗ＡＣＴＨ抗体修飾蛍光ラテックス粒子（平均粒子径２６０ｎｍ）の１質量％溶液１２５μＬ、および抗ＣＲＰ抗体修飾ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）の１質量％溶液５５４μＬを混合して、混合物Ａを調製した。ポリプロピレン（株式会社プライムポリマー社製、プライムポリプロ（登録商標）ランダムＰＰグレード）を基体としたカップを準備し、上記混合物Ａを２０μＬ添加した。その後、スーパードライ乾燥機（東洋リビング（株）社、ウルトラスーパードライ００シリーズ）を用いて、１２時間かけて含水量を２５質量％以下となるまで乾燥させて、蛍光標識粒子と蛍光標識を有さない粒子の乾燥粒子を製造した。
【００６２】
（７）基板の作製
ポリメチルメタクリレート(三菱レイヨン（株）社製、アクリペット（登録商標）ＶＨ−００１)を基体とした基板の片面に、テストエリアおよびコントロールエリア共に幅４ｍｍ、厚さ３６ｎｍとなるように、テストエリアに用いる金膜と、その隣に、コントロールエリアに用いる金膜とを、マグネトロンスパッタリング法により作製した。この基板を幅５ｍｍとなるように裁断して基板を作製した。この基板のテストエリアの金膜上には、第三の結合物質として、抗ＡＣＴＨモノクローナル抗体（ヤマサ醤油（株）社製、７５９５）を含む液（濃度：1０μｇ／ｍＬ ｉｎ１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）を点着し、１時間、２５℃の条件下で抗体を金膜上に物理吸着させた。同様に、コントロールエリアの金膜上には、第四の結合物質として、抗マウス抗体（Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２、製品名：ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を含む溶液（濃度：１０μｇ／ｍＬ  ｉｎ１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）を点着し、１時間、２５℃の条件下で抗体を金膜上に物理吸着させた。
【００６３】
（８）基板の洗浄およびブロッキング
予め調製した洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬（株）社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））３００μＬを用いて、（７）で作製した基板を洗浄した。洗浄は３回繰り返し行った。洗浄終了後、金膜上の抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Thermo Scientific社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）３００μＬを添加し、１時間、２５℃の条件下で静置した。その後、洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬（株）社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を用いて再度基板を洗浄した。その後、安定化剤としてImmunoassay  Stabilizer（ＡＢＩ社製）３００μＬを基板に添加し、２５℃の条件で３０分間放置した。その後、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
【００６４】
（９）センサチップの作製  
特開２０１０−１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、作製した基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。
【００６５】
（１０）被検試料の準備
イヌ血漿は、北山ラベスから購入した東洋ビーグル犬の血漿を使用し、被検物質の濃度が異なる被検試料１及び被検試料２を準備した。
【００６６】
（１１）蛍光粒子を用いたＡＣＴＨの免疫測定  
（１０）で準備した被検試料１及び２（イヌ血漿）の各１００μＬと、Ｌ−（＋）アルギニン塩酸塩（和光純薬（株）製、分子量２１０．６６）２５μｍｏｌ（５．２７ｍｇ）とを充分に混合して、Ｌ−（＋）アルギニン塩酸塩濃度が２５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにして混合試料を製造した。次に、（６）で調製した、抗ＡＣＴＨ抗体標識蛍光乾燥粒子と抗ＣＲＰ抗体標識乾燥粒子を入れたカップを、２５℃５０％相対湿度の環境で１５日間保存した後に、上記で製造した混合試料をそれぞれをカップに添加し、混合物を１０分間攪拌した。得られた混合液を、（９）で作製した流路型センサチップにそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を１０μＬ／分の速度で流下させた。流下させている間、ＡＣＴＨ抗体を固定した金膜面上の蛍光強度の時間当たりの変化量（シグナル［ｍＡ／分］）を１．５分間継続して測定した。それぞれの基板のテストエリアから得られたシグナルを、コントロールエリアのシグナルを用いて補正した。補正の結果として単位時間における増加速度の補正値を求めた。後の検量線作成および被検試料中のＡＣＴＨ濃度の算出には、この蛍光シグナル補正値を用いて行う。
【００６７】
（１２）対照機による測定
当業者により広く使用されている、シーメンス（株）社製IMMULYZE1000全自動免疫化学発光測定装置を対照機とし、取り扱い説明書に従って上記（１０）で準備した被検試料１及び２中の被検物質の濃度を測定した。結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
0006277099.tif 000002
【００６９】
（１３）感度の評価
対照機で測定した測定値から、被検試料１はＡＣＴＨ濃度が低く、濃度ゼロとみなすことができ、一方、被検試料２はＡＣＴＨ濃度が比較的高いことがわかった。この値を基準にし、（１１）において蛍光粒子を用いたＡＣＴＨの免疫測定で得られた被検試料１および２のテストエリアから得られた蛍光シグナル値を、それぞれＮ（ノイズ）およびＳ（シグナル）として表し、得られた比（Ｓ／Ｎ）を、下記の基準で評価し、結果を表２に示した。測定感度はＡＣＴＨ濃度が低い（略ゼロである）Ｎの値に対する、ＡＣＴＨ濃度が比較的高いＳの値の比が大きければ大きいほど高感度な測定が可能となることがわかる。
【００７０】
感度の評価基準：
Ｃ：Ｓ／Ｎが５未満の場合
Ｂ：Ｓ／Ｎが５以上８未満の場合
Ａ：Ｓ／Ｎが８以上の場合
【００７１】
実施例２〜４および比較例１〜３
実施例１のアルギニン塩酸塩のかわりに表２に記載の添加物質を、実施例１におけるアルギニン塩酸塩のモル濃度と同じモル濃度となるように添加した以外は実施例１と同様にして、実施例２〜４および比較例１〜３を実施した。感度の評価の結果を表２に示す。
【００７２】
【表２】
0006277099.tif 000003
【００７３】
表２の結果から、本発明の正電荷を有するアミノ基を少なくとも１つ有する化合物によって測定感度が向上する効果が確認された。特に、アルギニン及びリジンが優れた効果を示すことが表２の結果から明らかである。塩化マグネシウムは切片上昇は抑制できるが、ＡＣＴＨと抗体との反応性が著しく低下している。グリシンも効果が得られていないことがわかった。
【００７４】
実施例５〜１１及びおよび比較例４
実施例１のアルギニンの添加濃度を２５０ｍｍｏｌ／Ｌから変化させた以外は実施例１と同様にして、実施例５〜１１および比較例４（アルギニンの添加なし）を実施した。感度の評価の結果を表３に示した（実施例１も併記した。）
【００７５】
【表３】
0006277099.tif 000004
【００７６】
表３の結果から、アルギニンの添加量は多いほどＮ（被検試料１のシグナル）は改善するが、Ｓ（被検試料２のシグナル）も低下し、Ｓ／Ｎとしては最適値までは添加濃度が高いほど改善することが分かった。