(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染を治療する際、またはウイルス複製を抑制する際に使用される、医薬的に許容し得る担体または賦形剤と、構造式Ｉ：
【化１】
0006335877.tif 000015
（式中、Ｙは基−ＮＲ１Ｒ２を表し、Ｒ１およびＲ２が介在する窒素原子と共に、ピペラジニル、モルホリニル、およびチオモルホリニルからなる群より選択される、任意選択で置換されている非芳香族複素環基を表す。）
により表される抗ウイルス活性を有する化合物、またはその塩もしくは溶媒和物の治療有効量を含み、
前記ウイルス感染または複製が、ヘルペスウイルス感染または複製である、
医薬組成物。
【請求項２】
ウイルス感染が腫瘍の発症に関する腫瘍調節活性を有する、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項３】
前記非芳香族複素環基が置換されている、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項４】
前記ウイルス感染または複製が、サイトメガロウイルス感染または複製であり、好ましくは前記ウイルス感染または複製が、ヒトサイトメガロウイルス感染または複製である、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５】
前記腫瘍がサイトメガロウイルスを伴うグリオブラストーマである、請求項２に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項６】
錠剤、丸薬、カプセル、ペレット、顆粒、粉末、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、分散液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射溶液、および滅菌包装粉末からなる群より選択された形態であるか、または、経口、経直腸、筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内、鼻内、動脈内、膀胱内、眼内、経皮および局所からなる群より選択される経路を介した投与に適する、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項７】
前記化合物が、少なくとも１種の他の抗ウイルス薬と併用での共投与に適し、好ましくは前記少なくとも１種の他の抗ウイルス薬が、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、シドホビル、アシクロビルおよびバラシクロビルからなる群より選択されるか、または、前記治療薬の共投与が、単一の混合組成物、実質的に同時に投与される分離された個別の組成物、および別のスケジュールの下で投与される分離した個別の組成物から選択されるレジメンで実施される、請求項1に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
ウイルス感染を治療する際、またはウイルス複製を抑制する際に使用される、医薬的に許容し得る担体または賦形剤と、
構造式ＶＩＩＩ:
【化２】
0006335877.tif 000016
により表される抗ウイルス活性を有する化合物、またはその塩もしくは溶媒和物の治療有効量を含み、
前記ウイルス感染または複製が、ヘルペスウイルス感染または複製である、
医薬組成物。
【請求項９】
ウイルス感染が腫瘍の発症に関する腫瘍調節活性を有する、請求項８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
前記腫瘍がサイトメガロウイルスを伴うグリオブラストーマである、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１１】
前記ウイルス感染または複製が、サイトメガロウイルス感染または複製であり、好ましくは前記ウイルス感染または複製が、ヒトサイトメガロウイルス感染または複製である、請求項８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
錠剤、丸薬、カプセル、ペレット、顆粒、粉末、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、分散液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射溶液、および滅菌包装粉末からなる群より選択された形態であるか、または、経口、経直腸、筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内、鼻内、動脈内、膀胱内、眼内、経皮および局所からなる群より選択される経路を介した投与に適する、請求項８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
前記化合物が、少なくとも１種の他の抗ウイルス薬と併用での共投与に適し、好ましくは前記少なくとも１種の他の抗ウイルス薬が、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、シドホビル、アシクロビルおよびバラシクロビルからなる群より選択されるか、または、前記治療薬の共投与が、単一の混合組成物、実質的に同時に投与される分離された個別の組成物、および別のスケジュールの下で投与される分離した個別の組成物から選択されるレジメンで実施される、請求項８に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗ウイルス活性を有するアルテミシニン誘導体の使用を含む、ウイルス複製を阻害し、ウイルス感染、ウイルス疾患および障害を治療する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
化合物アルテミシニンは、キンガオス（III）としても公知で、アルテミシア・アニュア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）内で生成される四環式１，２，４−トリオキサンであり、ＭｃＣｈｅｓｎｅｙらへの米国特許第４，９２０，１４７号に記載される。アルテミシニン、ならびにその誘導体であるジヒドロアルテミシニン（ＤＨＡ）（ＩＶ）、アルテメテル（Ｖ）およびアルテスネート（ＶＩ）（図１）は、Ｓｃｈｅｉｗｅへの米国特許第６，３０６，８９６号に記載された通り、主としてマラリアの治療に用いられてきた。
【０００３】
アルテミシニンおよびその合成誘導体に関する化学試験では、不安定性の原因がアルテミシニンまたはその誘導体ジヒドロアルテミシニンのトリオキサン部分の容易な開環にあることが示されている。開環により、還元を受け易い遊離過酸化水素がもたらされる。この基を除去すれば、薬物活性が確実に破壊され、還元生成物はデスオキソ代謝産物に変換される。容易に開環させないために、Ｃ−１０の酸素原子を除去して１０−デオキシジヒドロアルテミシニンを提供することができるか、または他の基に置換することもできる。これが、一般には１０−デオキシアルテミシニン誘導体である、いわゆる「第二世代」化合物の原理をもたらした。加えて、Ｃ−９に様々な置換基を有するアルテミシニンの誘導体も、調製された。
【０００４】
Ｃ−１０の酸素原子がアミン基に置換されたアルテミシニン誘導体が製造された。例えば、Ｙａｎｇら（Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９５，５，１７９１−１７９４）は、Ｃ−１０の酸素原子が−ＮＨＡｒ（ここでＡｒは、フェニル、３−クロロフェニル、４−クロロフェニル、３−ブロモフェニル、４−ブロモフェニル、４−ヨードフェニル、４−メチルフェニル、４−メトキシフェニル、３−カルボキシルフェニル、または４−カルボキシルフェニル基を表す）に置換された１０種の新しいアルテミシニン誘導体を合成した。これらの化合物は、プラスモジウム・ベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｏｈｅｉ）のＫ１７３株に対するｉｎ  ｖｉｖｏ活性について試験し、活性であることがわかった。
【０００５】
米国特許第６，９８４，６４０号および米国特許出願公開第２００５／０１１９２３２号には、マラリア、ネオスポラ症およびコクシジウム病を起こす、それぞれプラスモジウム属、ネオスポラ属またはアイメリア属の寄生虫、とりわけプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ネオスポラ・カニヌム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）およびアイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）への感染により引き起こされた疾患の治療に効果的であることが開示された、アルテミシニンの特定のＣ−１０置換誘導体が開示される。開示された化合物は、寄生虫感染により引き起こされた疾患の治療および／または予防において使用される、一般式Ｉ：
【化１】
0006335877.tif 000002
（式中、Ｙは、ハロゲン原子、場合により置換されたシクロアルキル、アリール、Ｃ結合テロアリールもしくはヘテロシクリルアルキル基、または基−ＮＲ１Ｒ２を表し；ここでＲ１は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニルもしくはアルキニル基を表し；Ｒ２は、場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は、介在する窒素原子と共に、場合により置換された複素環基、または場合により置換されたアミノ酸エステルから誘導されたアミノ基を表す）で示されるもの、またはその塩である。
【０００６】
アルテミシニン誘導体であるアルテミソン、とりわけアルテミシド（ａｒｔｅｍｉｓｉｄｅ）が、トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）の高度阻害を呈することがＤｕｎａｙら（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００９，５３（１０），４４５０−４４５６）により示され、そしてプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）への顕著な効果を有することがＧｕｏら（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１２，５６（１），１６３−１７３）により示された。アルテミソンは、前臨床ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングにおいて神経毒性を誘発しない現在用いられている臨床アルテミシニン類とは異なる。パイロット耐容性試験において、雄ラットへの１４日間の５０ｍｇ／ｋｇアルテミソン治療は、対照に比較して全く効果を有さなかった。ヒト内皮細胞の増殖および新しい血管の生成に関する試験では、アルテミソンがジヒドロアルテミシニンよりも抗血管新生性が有意に低いことが示され、妊娠期にアルテミソンを使用することがより安全となり得ることが示唆された（Ｄ’Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２００７，２４１，６６−７４）。尿素誘導体ＲＷ１７７を含むより新しい極性誘導体も、マラリア寄生虫に対するナノモル以下の活性を有することが示された（該誘導体の構造については、図１を参照されたい）。
【０００７】
本発明の発明者の一人への米国特許第６，６４９，６４７号には、細胞毒性および抗腫瘍活性を有するトリオキサン部分を含有する化合物、とりわけ特定のアルテミシニン誘導体、ならびに癌の治療におけるそれらの使用が開示されている。これらの化合物の幾つかは、核酸に結合し得るリガンドと、核酸との化学的相互作用が可能なフリーラジカルの供給源として作用し得るトリオキサン部分を含む基と、を含む。そのような化合物と、そのような化合物を含有する医薬組成物と、の調製方法も示されている。
【０００８】
ウイルス感染は、世界全体での感染疾患による死亡および感染疾患の罹患のうちで非常に大きな割合を占める。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えばβヘルペスウイルスは、ＡＩＤＳ患者および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）または固形臓器移植のレシピエントをはじめとする免疫無防備状態の患者における罹患および死亡の主な原因である。ＣＭＶは、先天性感染の主因でもあり、新生児の１％以下に影響を及ぼして、神経障害および聴覚損失を誘発する。先天性ＣＭＶによる公的健康負担が相当な量に及ぶにもかかわらず、出生前抗ウイルス治療として、利用が確立されたものはない。
【０００９】
移植施設において、予防的抗ウイルス療法の広範な使用により、早発性ＣＭＶ疾患の発生が低減したが、晩発性疾患の発症は、次第に認識されている。予防的抗ウイルス戦略としては、（ａ）移植後の血中のＣＭＶ抗原またはＣＭＶ  ＤＮＡが陽性となった患者における先制的治療、および（ｂ）生着時にリスクのある患者全てで開始されて移植後１００日まで継続される、全身への予防（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）が挙げられる。
【００１０】
ガンシクロビル、ホスカルネットおよびシドホビルをはじめとする現在入手可能な抗ＣＭＶ薬の全てが、ウイルスＤＮＡポリメラーゼをターゲットとしている。これらの薬物は効果的ではあるが、毒性、経口生物学的利用度が低いこと、高コスト、および催奇形性により、使用が限定される。加えて、長期的または反復的抗ウイルス治療が、薬物耐性、そして場合により多剤への交叉耐性の発生に導く可能性がある。
【００１１】
ウイルス感染治療にアルテミシニン誘導体が示唆された。米国特許出願公開第２００８／０１６１３２４号に、アルテミシニンがウイルス疾患を治療する上で他の薬剤と併用すると有用になる可能性が示唆されている。アルテスネートは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の複製を阻害することが示され（Ｅｆｆｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００２，８０（４），２３３−２４２）、ＣＭＶ感染を治療するのに用いられてきた（Ｓｈａｐｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２００８，４６（９），１４５５−１４５７）。
【００１２】
先の参考資料のいずれも、ウイルス感染およびそれによる疾患を治療する際の１０−アルキルアミノアルテミシニン誘導体の使用を開示または示唆していない。
【００１３】
つまり、効果的かつ安全であり高い経口生物学的利用度を有する抗ＣＭＶ薬が、明らかに必要とされている。加えて、ウイルス感染を治療する新規な治療様式の重大なアンメットメディカルニーズが、依然として存在する。 
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
発明の概要
本発明は、抗ウイルス活性を有するアルテミシニン誘導体の使用を含む、ウイルス複製、ウイルス感染、ならびにウイルス疾患および障害を治療、減弱、または阻害する組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は一部として、複数のアルテミシニン誘導体が単独または他の抗ウイルス薬と併用でＣＭＶを治療する際に高い効力をもたらす、という予期されなかった発見に基づいている。任意の理論または作用機序に束縛されるものではないが、本発明のアルテミシニン誘導体は、ヒトＣＭＶウイルスの前初期（ＩＥ）遺伝子発現を阻害することが可能である。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、式Ｉ：
【化２】
0006335877.tif 000003
（式中、Ｙは、基−ＮＲ１Ｒ２を表し、ここで、
（ｉ）Ｒ１は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基を表し、Ｒ２は、場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはアラルキル基を表す；
（ii）Ｒ１およびＲ２は、介在する窒素原子と共に、複素環基、または場合により置換されたアミノ酸エステルから誘導されたアミノ基を表す；あるいは
（iii）Ｒ１は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し、Ｒ２は、−Ｘ（＝Ｚ）−Ａ基を表す、
かのいずれかであり；ここで
Ｘは、炭素原子、硫黄原子、スルホキシド基Ｓ＝Ｏ、または基ＰＲ３、Ｐ−Ｏ−Ｒ３もしくはＰ−Ｎ（Ｒ４）−Ｒ３を表し、ここでＲ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ｚは、酸素原子、硫黄原子または基ＮＲ５を表し、ここでＲ５は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ａは、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基、またはＮ（Ｒ６）２、ＮＨＮＨ２、ＮＲ６ＮＨＲ６、ＮＲ６Ｎ（Ｒ６）２、ＯＲ６、ＳＲ６、１０α−ジヒドロアルテミシニル、ＯＲ７およびＮＲ６Ｒ７から選択される基を表し、ここで各Ｒ６は、独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し、Ｒ７は、介在する基と共に場合により置換された複素環基を表すＲ５またはＲ１に、置換基として付着された結合を表す）
で示される抗ウイルス活性を有する化合物、またはその塩もしくは溶媒和物の治療有効量を含む医薬組成物を、必要とする対象に投与するステップを含む、必要とする対象においてウイルス感染を治療する方法を提供する。
【００１７】
各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００１８】
幾つかの実施形態において、本発明は、ウイルス感染を治療する際に用いられる、本明細書に定義された式Ｉで示される抗ウイルス活性を有する化合物の治療有効量を含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、ウイルス感染を治療する薬剤を調製する際の、本明細書に定義された式Ｉで示される抗ウイルス活性を有する化合物の使用を提供する。
【００２０】
一実施形態において、本明細書に定義された式Ｉで示される化合物の抗ウイルス活性は、抗サイトメガロウイルス活性である。特定の実施形態において、本発明の抗サイトメガロウイルス活性を有する化合物は、ＩＥ遺伝子の発現を阻害する。
【００２１】
特定の実施形態において、ウイルス感染は、ヘルペスウイルス感染である。追加の実施形態において、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、ウイルス感染は、フラビウイルス感染である。特定の実施形態において、フラビウイルスは、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）である。更なる実施形態において、ウイルス感染は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。模範的実施形態において、ウイルス感染は、サイトメガロウイルス感染、特にヒトサイトメガロウイルス感染である。特定の実施形態において、サイトメガロウイルスは、公知の抗ウイルス薬に耐性のあるウイルス株である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、先天性感染の症例に効果的である。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、特に移植レシピエントをはじめとし、免疫抑制患者においてＣＭＶ感染を治療、減弱または抑制するのに効果的である。
【００２２】
幾つかの実施形態において、本発明は、式Ｉ：
【化３】
0006335877.tif 000004
（式中、Ｙは、基−ＮＲ１Ｒ２を表し、ここで、
（ｉ）Ｒ１は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基を表し、Ｒ２は、場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはアラルキル基を表すか；
（ii）Ｒ１およびＲ２は、介在する窒素原子と共に、複素環基、または場合により置換されたアミノ酸エステルから誘導されたアミノ基を表すか；あるいは
（iii）Ｒ１は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し、Ｒ２は、−Ｘ（＝Ｚ）−Ａ基を表す、
のいずれかであり；ここで
Ｘは、炭素原子、硫黄原子、スルホキシド基Ｓ＝Ｏ、または基ＰＲ３、Ｐ−Ｏ−Ｒ３もしくはＰ−Ｎ（Ｒ４）−Ｒ３を表し、ここでＲ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ｚは、酸素原子、硫黄原子または基ＮＲ５を表し、ここでＲ５は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ａは、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基、またはＮ（Ｒ６）２、ＮＨＮＨ２、ＮＲ６ＮＨＲ６、ＮＲ６Ｎ（Ｒ６）２、ＯＲ６、ＳＲ６、１０α−ジヒドロアルテミシニル、ＯＲ７およびＮＲ６Ｒ７から選択される基を表し、ここで各Ｒ６は、独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し、Ｒ７は、介在する基と共に場合により置換された複素環基を表すＲ５またはＲ１に、置換基として付着された結合を表す）
で示される抗ウイルス活性を有する化合物、またはその塩もしくは溶媒和物の治療有効量を含む医薬組成物を、必要とする対象に投与するステップを含む、ウイルス複製を抑制する方法を提供する。
【００２３】
各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２４】
特定の実施形態において、ウイルス複製を抑制する方法は、細胞または臓器培養物中でウイルス複製を抑制することを含むｅｘ  ｖｉｖｏ法である。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、ウイルス複製を抑制する際に用いられる、本明細書に定義された構造式Ｉにより表される抗ウイルス活性を有する化合物の治療有効量を含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
様々な実施形態において、本発明は、ウイルス複製を抑制する薬剤の調製における、本明細書に定義された式Ｉで示される抗ウイルス活性を有する化合物の使用を提供する。
【００２７】
一実施形態において、本明細書に定義された式Ｉで示される化合物の抗ウイルス活性は、抗サイトメガロウイルス活性である。特定の実施形態において、本発明の抗サイトメガロウイルス活性を有する化合物は、ＩＥ遺伝子の発現を阻害する。
【００２８】
特定の実施形態において、ウイルス複製は、ヘルペスウイルス複製である。別の実施形態において、ウイルス複製は、フラビウイルス複製である。一実施形態において、ウイルス複製は、サイトメガロウイルス複製、特にヒトサイトメガロウイルス複製である。特定の実施形態において、サイトメガロウイルスは、公知の抗ウイルス薬に耐性のあるウイルス株である。
【００２９】
幾つかの実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物は、構造式ＶＩＩ：
【化４】
0006335877.tif 000005
（式中、Ｒ１およびＲ２は、介在する窒素原子と共に、非芳香族複素環基を表す）
により表される。
【００３０】
幾つかの実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物は、構造式ＶＩＩＩ：
【化５】
0006335877.tif 000006
により表される１０α−（４’−（Ｓ，Ｓ−ジオキソチオモルホリン−１’−イル）−１０−デオキソ−１０−ジヒドロアルテミシンである。
【００３１】
更なる実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物は、構造式ＩＸ：
【化６】
0006335877.tif 000007
により表される。
【００３２】
別の実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物は、構造式Ｘ：
【化７】
0006335877.tif 000008
（式中、Ｒ１は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ｘは、炭素原子、硫黄原子、スルホキシド基Ｓ＝Ｏ、または基ＰＲ３、Ｐ−Ｏ−Ｒ３もしくはＰ−Ｎ（Ｒ４）−Ｒ３を表し、ここでＲ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ｚは、酸素原子、硫黄原子または基ＮＲ５を表し、ここでＲ５は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ａは、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基、またはＮ（Ｒ６）２、ＮＨＮＨ２、ＮＲ６ＮＨＲ６、ＮＲ６Ｎ（Ｒ６）２、ＯＲ６、ＳＲ６、１０α−ジヒドロアルテミシニル、ＯＲ７およびＮＲ６Ｒ７から選択される基を表し、ここで各Ｒ６は、独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し、Ｒ７は、介在する基と共に場合により置換された複素環基を表すＲ５またはＲ１に、置換基として付着された結合を表す）
により表される。
【００３３】
更なる実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物は、Ｒ１が、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；Ｘが、炭素原子、硫黄原子、またはスルホキシド基Ｓ＝Ｏを表し；Ｚが、酸素原子または硫黄原子を表し；Ａが、Ｎ（Ｒ６）２、ＮＨＮＨ２、ＮＲ６ＮＨＲ６、またはＮＲ６Ｎ（Ｒ６）２基を表し、ここで各Ｒ６が、独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表す、構造式Ｘにより表される。
【００３４】
別の実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物は、ｐＨ７．２で４０ｍｇ／Ｌを超える水溶解度を有する。幾つかの実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物は、約２．０〜３．０の範囲内のｌｏｇＰを有する。特定の実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでジヒドロアルテミシニンに実質的に変換することができない。
【００３５】
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、医薬的に許容し得る担体または賦形剤を更に含む。
【００３６】
様々な実施形態において、本発明の医薬組成物は、経口、経直腸、筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内、鼻内、動脈内、膀胱内、眼内、経皮および局所からなる群より選択される経路を介した投与に好適である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３７】
幾つかの態様および実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、ペレット、顆粒、粉末、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、分散液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射溶液、および滅菌包装粉末からなる群より選択された形態である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３８】
追加の実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物は、少なくとも１種の他の抗ウイルス薬と併用で共投与される。模範的で非限定的な実施形態としては、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物と、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、シドホビル、アシクロビル、およびバラシクロビルからなる群より選択される抗ウイルス薬との共投与が挙げられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物は、少なくとも１種の他の抗ウイルス薬と共に、少なくとも相加的である治療性抗ウイルス効果をもたらす。
【００４０】
更なる実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物と少なくとも１種の他の抗ウイルス薬との共投与は、単一の混合組成物、実質的に同時に投与される分離された個別の組成物、および別のスケジュールで投与される分離した個別の組成物から選択されるレジメンで実施される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４１】
更に別の実施形態において、本発明は、本明細書に定義された式Ｉで示される抗ウイルス活性を有する化合物の治療有効量を含む医薬組成物を、必要とする対象に投与するステップを含む、必要とする対象において、腫瘍の発症に関連する腫瘍調節活性（ｏｎｃｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有するウイルス感染を治療する方法を提供する。
【００４２】
追加の実施形態において、腫瘍の発症に関連する腫瘍調節活性を有するウイルス感染を治療する際に使用される、本明細書に定義された式Ｉで示される抗ウイルス活性を有する化合物の治療有効量を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
【００４３】
更なる実施形態において、本発明は、腫瘍の発症に関連する腫瘍調節活性を有するウイルス感染を治療する薬剤を調製する際の、本明細書に定義された式Ｉで示される抗ウイルス活性を有する化合物の使用を提供する。
【００４４】
特定の実施形態において、腫瘍は、サイトメガロウイルス感染を伴うグリオブラストーマである。別の実施形態において、腫瘍は、サイトメガロウイルス感染を伴う結腸癌または前立腺癌である。別の実施形態において、腫瘍は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染を伴うバーキットリンパ腫である。別の実施形態において、腫瘍は、ＥＢＶ感染を伴うホジキンリンパ腫である。別の実施形態において、腫瘍は、ＥＢＶ感染を伴う移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）である。更に別の実施形態において、腫瘍は、ＥＢＶ感染を伴う鼻咽頭癌である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４５】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明および図面から明白となろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】複数のアルテミシニン誘導体の分子構造を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａ：アルテミソンとのインキュベーション後のＣＭＶプラーク形成の阻害を示すアルテミソン用量反応曲線である。このアッセイのアルテミソンＩＣ５０値は、１．２μＭであった。
【図２Ｂ】図２Ｂ：アルテミソンとのインキュベーション後のＣＭＶ  ＤＮＡ蓄積の阻害を示す、アルテミソン用量反応曲線である。
【図３Ａ】図３Ａ：アルテスネートとのインキュベーション後のＣＭＶプラーク形成の阻害を示すアルテスネート用量反応曲線である。このアッセイのアルテスネートＩＣ５０値は、１５μＭであった。
【図３Ｂ】図３Ｂ：アルテスネートとのインキュベーション後のＣＭＶ  ＤＮＡ蓄積の阻害を示す、アルテスネート用量反応曲線である。
【図４】感染（ｈｐｉ）から２４時間および７２時間後の、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）および初期−後期（ｐｐ６５）ウイルス遺伝子の発現の免疫蛍光顕微鏡検査結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａ：未治療感染細胞対照と薬物治療された感染細胞との対比によるＨＣＭＶ  ＩＥ抗原陽性細胞を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂ：未治療感染細胞対照と薬物治療された感染細胞との対比によるＨＣＭＶ  ｐｐ６５抗原陽性細胞を示す。比較するために、未治療感染細胞対照における抗原陽性細胞を１００％として表す。
【図６Ａ】ＨＣＭＶ感染および非感染脱落膜臓器培養物の組織病理学分析結果を示す。図６Ａ〜６Ｂ：培養開始時および８日目に調製された非感染脱落膜培養物のＨ＆Ｅ染色切片（５ミクロン）である。矢印は、脱落膜の表面上皮を指す。図６Ｃ〜６Ｄ：６ｄｐｉで得た、Ｈ＆Ｅ染色を受けたＨＣＭＶ  ＰＴ３０株（１０４ＰＦＵ／ウェル）に感染させた２種の異なる培養切片を示す。黒い矢印は、「フクロウの目」封入体を有する感染細胞を示し；白い矢印は、顆粒状の細胞質内封入体を示し、黒い矢じりは、核形不整の濃染核を示す。図６Ｅ〜６Ｆ：６ｄｐｉで得た、ウイルス前初期（ＩＥ）（核染色を示す）蛋白質および早期−後期（ｐｐ６５）（主に細胞質染色を示す）蛋白質の免疫組織化学分析を受けたＨＣＭＶ  ＰＴ３０株（１０４ＰＦＵ／ウェル）に感染させた培養切片を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｂ：培養開始時および８日目に調製された非感染脱落膜培養物のＨ＆Ｅ染色切片（５ミクロン）である。矢印は、脱落膜の表面上皮を指す。
【図６Ｃ】図６Ｃ〜６Ｄ：６ｄｐｉで得た、Ｈ＆Ｅ染色を受けたＨＣＭＶ  ＰＴ３０株（１０４ＰＦＵ／ウェル）に感染させた２種の異なる培養切片を示す。黒い矢印は、「フクロウの目」封入体を有する感染細胞を示し；白い矢印は、顆粒状の細胞質内封入体を示し、黒い矢じりは、核形不整の濃染核を示す。
【図６Ｄ】図６Ｃ〜６Ｄ：６ｄｐｉで得た、Ｈ＆Ｅ染色を受けたＨＣＭＶ  ＰＴ３０株（１０４ＰＦＵ／ウェル）に感染させた２種の異なる培養切片を示す。黒い矢印は、「フクロウの目」封入体を有する感染細胞を示し；白い矢印は、顆粒状の細胞質内封入体を示し、黒い矢じりは、核形不整の濃染核を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅ〜６Ｆ：６ｄｐｉで得た、ウイルス前初期（ＩＥ）（核染色を示す）蛋白質および早期−後期（ｐｐ６５）（主に細胞質染色を示す）蛋白質の免疫組織化学分析を受けたＨＣＭＶ  ＰＴ３０株（１０４ＰＦＵ／ウェル）に感染させた培養切片を示す。
【図６Ｆ】図６Ｅ〜６Ｆ：６ｄｐｉで得た、ウイルス前初期（ＩＥ）（核染色を示す）蛋白質および早期−後期（ｐｐ６５）（主に細胞質染色を示す）蛋白質の免疫組織化学分析を受けたＨＣＭＶ  ＰＴ３０株（１０４ＰＦＵ／ウェル）に感染させた培養切片を示す。
【図７Ａ】脱落膜培養物中のＨＣＭＶ感染動態。脱落膜臓器培養物を、ＨＣＭＶ（１０４ＰＦＵ／ウェル）で感染させた。図７Ａ．モック感染細胞；図７Ｂ．２日目；図７Ｃ．３日目；および図７Ｄ．５日目の、共焦顕微鏡検査により検出された生存組織中のＰＴ３０株感染細胞の画像である。
【図７Ｂ】図７Ｂ．２日目
【図７Ｃ】図７Ｃ．３日目；および図７Ｄ．５日目の、共焦顕微鏡検査により検出された生存組織中のＰＴ３０株感染細胞の画像である。
【図７Ｄ】図７Ｃ．３日目；および図７Ｄ．５日目の、共焦顕微鏡検査により検出された生存組織中のＰＴ３０株感染細胞の画像である。
【図８】脱落膜培養物中のＨＣＭＶ感染動態である。ＰＮａｓｅ  Ｐ遺伝子のＤＮＡコピーにより標準化された、示されたウイルス株による感染後の組織溶解物中のウイルスＤＮＡ蓄積である。ＰＴ３０：u；ＴＢ４０／Ｅ：n；ＡＤ１６９：△；およびＣＩ８５１：×。
【図９】感染させた脱落膜培養物中のＨＣＭＶの細胞指向性を示す図である。１０ｄｐｉで、ＵＬ８３（ｐｐ６５）融合ＧＦＰを発現するＨＣＭＶ  ＴＢ４０／Ｅ株に感染させ、示された細胞型に対するモノクローナル抗体で染色し、ＤＡＰＩで対比染色し、細胞核を視覚化した脱落膜培養物から、凍結切片を調製した。ウイルス（ＧＦＰで標識）と特異的細胞マーカとの共局在を、共焦顕微鏡像検査により分析した。矢印は、共局在を示す細胞、特異的細胞マーカとの共局在を示さなかった感染細胞、および染色させた非感染細胞を指している。ＣＫ７．サイトケラチン７；ｖＷＦ．フォン・ヴィレブランド因子；Ｖｉｍ．ビメンチン。
【図１０】抗ウイルス薬（ＧＣＶ：●；ＡＣＶ：■）による脱落膜臓器培養物におけるＨＣＭＶ感染の阻害を示す。結果は、未治療培養物中に存在する標準化ＨＣＭＶ  ＤＮＡの量のパーセント率±標準誤差として表す。エラーバーは、標準誤差が低値であるために即座に見ることができない。治療された脱落膜培養物と未治療の脱落膜培養物との間に有意差が認められた（対応のある両側ｔ検定によりｐ＜０．０５）。
【図１１Ａ】ＨＣＭＶ高度免疫グロブリン（ＨＩＧ）による、脱落膜臓器培養物中のＨＣＭＶ感染の中和および吸着後阻害を示す図である。図１１Ａ：ウイルス中和を検査するために、ＨＣＭＶ  ＨＩＧの示された希釈物を、ＨＣＭＶ  ＴＢ４０／Ｅ株の１０５ＰＦＵと共に感染前に１時間インキュベートした。
【図１１Ｂ】図１１Ｂ：吸着後２４時間目に感染細胞を十分に洗浄した後、ＨＣＭＶ  ＨＩＧの示された希釈物を感染させた脱落膜培養物（１０５ＰＦＵ／ウェル）の培地に添加した。脱落膜組織溶解物中のウイルスＤＮＡを８ｄｐｉに定量し、値をＲＮａｓｅ  Ｐ  ＤＮＡコピーにより標準化した。結果は、未治療培養物中に存在する標準化ＨＣＭＶ  ＤＮＡの量のパーセント率として表す。アスタリスクは、治療された脱落膜培養物と未治療の脱落膜培養物との有意差を示す（対応のある両側ｔ検定によりｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、抗ウイルス活性、特に抗ＣＭＶ活性を有するアルテミシニン誘導体の使用を含む、ウイルス複製、ウイルス感染、ならびにウイルス疾患および障害を治療、予防、減弱、および阻害する組成物および方法を提供する。
【００４８】
ＨＣＭＶ遺伝子発現は、ウイルス遺伝子の３つの一般的分類：前初期（ＩＥ、主にＩＥ１およびＩＥ２）遺伝子、主にウイルスＤＮＡ合成において役割を演じる遺伝子を含む後期−初期遺伝子、およびビリオン構成成分をコードする後期ウイルス遺伝子、に関係する事象の高度に協調的な連鎖を介して起こる。ＨＣＭＶの複製周期は緩やかであり、子孫の放出を開始するのに４８〜７２時間を要するが、ＩＥ遺伝子産物の発現は、ウイルス侵入の直後に開始し、感染後２４時間目に明確に検出され得る。早期に発現するウイルスの機能は、感染の後期において調節的役割を担う。早期から後期への切り替えは、感染後２４〜３６時間までは遅延的で、ウイルスＤＮＡ合成の際に起こり、感染後７２〜９６時間目に存在する後期遺伝子発現が最大レベルになる。
【００４９】
ガンシクロビルをはじめとする現在認可されている抗ＨＣＭＶ薬は全て、ウイルスＤＮＡポリメラーゼを阻害し、つまりＩＥ遺伝子発現を阻害せず、むしろ後期遺伝子発現を阻害する。
【００５０】
本発明は、本発明は一部として、複数の１０−アミノアルテミシニン誘導体がＨＣＭＶ複製の早期段階および後期段階を遮断することが可能である、という予期されなかった発見に基づいている。意外にも本発明の化合物は、感染後に発現する最初の遺伝子であるウイルスＩＥ遺伝子の発現を効果的に阻害することが示された。早期遺伝子発現を阻害する能力が、後期ウイルス遺伝子発現のみに影響を及ぼす、これまで知られた抗ウイルス薬を上回る顕著な利点を提供する。
【００５１】
こうして本発明は、式Ｉ：
【化８】
0006335877.tif 000009
（式中Ｙは、基−ＮＲ１Ｒ２を表す）で示される抗ウイルス活性を有する化合物、またはその塩もしくは溶媒和物の治療有効量を、必要とする対象に投与すること、それにより該対象におけるウイルス感染を治療することを含むステップを含む、必要とする対象においてウイルス感染を治療する方法を提供する。
【００５２】
幾つかの態様および実施形態において、Ｒ１は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基を表し、Ｒ２は、場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはアラルキル基を表す。
【００５３】
別の態様および実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、介在する窒素原子と共に、複素環基、または場合により置換されたアミノ酸エステルから誘導されたアミノ基を表す。
【００５４】
更に別の態様および実施形態において、Ｒ１は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し、Ｒ２は、−Ｘ（＝Ｚ）−Ａ基を表し、ここで
Ｘは、炭素原子、硫黄原子、スルホキシド基Ｓ＝Ｏ、または基ＰＲ３、Ｐ−Ｏ−Ｒ３もしくはＰ−Ｎ（Ｒ４）−Ｒ３を表し、ここでＲ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ｚは、酸素原子、硫黄原子または基ＮＲ５を表し、ここでＲ５は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ａは、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基、またはＮ（Ｒ６）２、ＮＨＮＨ２、ＮＲ６ＮＨＲ６、ＮＲ６Ｎ（Ｒ６）２、ＯＲ６、ＳＲ６、１０α−ジヒドロアルテミシニル、ＯＲ７およびＮＲ６Ｒ７から選択される基を表し、ここで各Ｒ６は、独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し、Ｒ７は、介在する基と共に場合により置換された複素環基を表すＲ５またはＲ１に、置換基として付着された結合を表す。
【００５５】
各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５６】
様々な実施形態において、本発明の抗ウイルス活性を有する化合物は、本明細書の以下に定義された式ＶＩＩ、ＶＩＩＩＸまたはＸ：
【化９】
0006335877.tif 000010
（式中、Ｒ１およびＲ２は、介在する窒素原子と共に、非芳香族複素環基を表す）； 
【化１０】
0006335877.tif 000011
【化１１】
0006335877.tif 000012
【化１２】
0006335877.tif 000013
（式中、Ｒ１は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ｘは、炭素原子、硫黄原子、スルホキシド基Ｓ＝Ｏ、または基ＰＲ３、Ｐ−Ｏ−Ｒ３もしくはＰ−Ｎ（Ｒ４）−Ｒ３を表し、ここでＲ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ｚは、酸素原子、硫黄原子または基ＮＲ５を表し、ここでＲ５は、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；
Ａは、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基、または基Ｎ（Ｒ６）２、ＮＨＮＨ２、ＮＲ６ＮＨＲ６、もしくはＮＲ６Ｎ（Ｒ６）２、または基ＯＲ６もしくはＳＲ６（ここで各Ｒ６は、独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表す）または１０α−ジヒドロアルテミシニル基を表すか、あるいはＡは、基ＯＲ７またはＮＲ６Ｒ７（ここで各Ｒ６は、先に定義された基を表し、Ｒ７は、介在する基−Ｘ（＝Ｚ）−（ここでＺは、基ＮＲ５を表す）と共に場合により置換された複素環基を形成するＲ５に、置換基として付着する結合を表すか、またはＲ７は、介在する基−Ｎ−Ｘ（＝Ｚ）−と共に場合により置換された複素環基を形成するＲ１に、置換基として付着する結合を表す）を表す）のいずれかにより表される。
【００５７】
各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５８】
本明細書において、ウイルス感染を治療する薬剤の調製のための、式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸまたはＸのいずれかの抗ウイルス活性を有する化合物の使用が、開示される。本発明は更に、ウイルス感染を治療する際に使用される、式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸもしくはＸのいずれかの抗ウイルス活性を有する化合物、またはそれを含む医薬組成物を提供する。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「治療すること」は、治療される状態、障害または疾患に関連する、または誘発された少なくとも１種の症状の消失、軽減、または緩和を包含する。幾つかの実施形態において、本明細書で用いられる用語「治療すること」は、ウイルス量の減少を伴うウイルス複製の阻害を指す。したがって用語「治療すること」は、更に、予防的または先制的治療、即ち感染していない患者、または感染していて無症候の患者における感染および疾患の予防を包含する。一実施形態において、治療は、ｅｘ  ｖｉｖｏで実施される。本明細書で用いられる用語「治療有効量」は、対象に単回または反復投与すると効果的になり対象への治療的利益を提供する、薬剤量を指す。一実施形態において、治療的利益は、ウイルス活性を阻害することである。本明細書で用いられる用語「投与すること」は、本発明の化合物または組成物と接触させることを指す。投与は、細胞もしくは組織培養物に、または生存している生物体、例えば哺乳動物、特にヒトに遂行することができる。
【００６０】
式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸもしくはＸのいずれかの抗ウイルス活性を有する化合物、または該化合物および医薬的に許容し得る担体もしくは賦形剤を含む組成物を投与するステップを含む、ウイルス複製を抑制する方法は、本発明の範囲内である。追加の実施形態は、ウイルス複製を抑制する薬剤の調製のための、式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸまたはＸのいずれかの抗ウイルス活性を有する化合物の使用を提供する。幾つかの態様および実施形態によれば、本発明は、ウイルス複製を抑制する際に使用される、式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸもしくはＸのいずれかの抗ウイルス活性を有する化合物、または該物質を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、本明細書で提供される方法および使用は、細胞または臓器培養物を、式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸもしくはＸのいずれかの抗ウイルス活性を有する化合物、または該化合物および医薬的に許容し得る担体もしくは賦形剤を含む組成物と接触させるステップを含む、細胞または臓器培養物においてウイルス複製を抑制することに関する。
【００６１】
式ＩのＲ１により表されるアルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、幾つかの実施形態において、置換される。別の実施形態において、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、非置換である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６２】
式ＩのＲ１もしくはＲ２により表される、または式ＸのＲ１、ＡもしくはＺにより表される、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキル基は、幾つかの実施形態において置換される。別の実施形態において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキル基は、非置換である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６３】
本明細書で提供される１０−アミノアルテミシニン誘導体は、極度に高い抗ウイルス効力を示す。この特性を優れた安全性および耐容性プロファイルと併せることで、それらは、ウイルス感染ならびにそれにより生じた疾患および障害の治療に関して興味深い選択肢となる。
【００６４】
別の実施形態において、式IのＹは、Ｒ１およびＲ２が介在する窒素原子と共に非芳香族複素環基を形成する、基−ＮＲ１Ｒ２を表す。別の実施形態において、非芳香族複素環基は、置換される。別の実施形態において、非芳香族複素環基は、非置換である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６５】
別の実施形態において、非芳香族複素環基は、極性部分で置換される。
【００６６】
別の実施形態において、非芳香族複素環基は、ピペラジンである。特定の実施形態において、非芳香族複素環基は、モルホリンである。別の実施形態において、非芳香族複素環基は、チオモルホリンである。別の実施形態において、非芳香族複素環基は、モルホリノ−スルホンである。別の実施形態において、非芳香族複素環基は、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、およびモルホリノスルホニルからなる群より選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明の化合物は、アルテミソン（式ＶＩＩＩ）である。「１０α−（４’−（Ｓ，Ｓ−ジオキソチオモルホリン−１’−イル）−１０−デオキソ−１０−ジヒドロアルテミシン」および「ＢＡＹ４４−９５８５」としても公知のアルテミソンは、Ｂａｙｅｒ  ＡＧ（ドイツ）から入手可能である。
【００６８】
別の実施形態において、本発明の化合物は、1０α−（４’−ベンジルピペラジン−１’−イル）−１０−デオキソ−１０−ジヒドロアルテミシニンである。
【００６９】
別の実施形態において、本発明の化合物は、1０α−（モルホリノ）−１０−デオキソ−１０−ジヒドロアルテミシンである。
【００７０】
別の実施形態において、本発明の化合物は、1０α−（１−（２−ピペリミジル）−ピペラジノ）−１０−デオキソ−１０−ジヒドロアルテミシニンである。
【００７１】
別の実施形態において、本発明の化合物は、1０α−（スルフアミノ）−ジヒドロアルテミシニンである。
【００７２】
幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、Ｒ１が水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表し；Ｘが炭素原子、硫黄原子、またはスルホキシド基Ｓ＝Ｏを表し；Ｚが酸素原子または硫黄原子を表し；ＡがＮ（Ｒ６）２、ＮＨＮＨ２、ＮＲ６ＮＨＲ６、またはＮＲ６Ｎ（Ｒ６）２（ここで各Ｒ６は、独立して、水素原子、または場合により置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールもしくはアラルキル基を表す）を表す、構造式Ｘにより表される。
【００７３】
特定の実施形態において、本発明の化合物は、Ｙが−ＮＲ１Ｒ２基を表し、Ｒ１が水素原子を表し、Ｒ２が−Ｘ（＝Ｚ）−Ａ基を表し、ここでＸがスルホキシド基Ｓ＝Ｏを表し、Ｚが酸素原子を表し、ＡがＮＨ２基を表す、構造式Ｉにより表される。
【００７４】
アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、他に指示がなければ、直鎖状または分枝状であってもよく、１２以下、６以下、または４以下の炭素原子を含んでいてもよい。アルキル基の非限定的例は、メチル、エチル、プロピルおよびブチルである。幾つかの実施形態において、アルケニルまたはアルキニル基は、アルカ−１−エニルまたはアルカ−１−イニル基ではない。これらの実施形態によれば、二重または三重Ｃ−Ｃ結合の一部を形成する炭素原子と、その基が付着する窒素原子との間に、少なくとも１つのメチレン基−ＣＨ２−または類似のｓｐ３−混成軌道の中心が存在する。アルケニルおよびアルキニル基の非限定的例としては、プロペニル、ブテニル、プロピニルおよびブチニル基が挙げられる。アルキル部分が別の基の一部、例えばアラルキル基のアルキル部分を形成する場合、それは、６以下、または４以下の炭素原子を含んでいてもよい。模範的アルキル部分は、メチルおよびエチルである。
【００７５】
アリール基は、任意の芳香族炭化水素基であってもよく、６〜２４、好ましくは６〜１８、より好ましくは６〜１６、とりわけ６〜１４の炭素原子を含んでいてもよい。アリール基の非限定的例としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、およびピリル基、とりわけフェニルまたはナフチル、特にフェニル基が挙げられる。アリール部分が別の基の一部、例えばアラルキル基のアリール部分を形成する場合、それは、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリルまたはピリル、とりわけフェニルまたはナフチル、特にフェニル部分であってもよい。
【００７６】
アラルキル基は、アリール基により置換された任意のアルキル基であってもよい。適切なアラルキル基は、７〜３０個、特に７〜２４個、とりわけ７〜１８個の炭素原子を含む。アラルキル基の非限定的例としては、ベンジル、ナフチルメチル、アントリルメチル、フェナントリルメチルおよびピリルメチル基が挙げられる。模範的なアラルキル基は、ベンジル基である。
【００７７】
シクロアルキル基は、任意の飽和環状炭化水素基であってもよく、３〜１２個、例えば３〜８個、とりわけ３〜６個の炭素原子を含んでいてもよい。シクロアルキル基の非限定的例は、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシル基である。
【００７８】
ヘテロアリール基は、少なくとも１つのヘテロ原子を含む任意の芳香族単環式または多環式環系であってもよい。典型的にはヘテロアリール基は、酸素、硫黄および窒素原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む、５〜１８員、特に５〜１４員、とりわけ５〜１０員の芳香族環系である。非限定的なヘテロアリール基としては、ピリジル、ピリリウム、チオピリリウム、ピロリル、フリル、チエニル、インドリニル、イソインドリニル、インドリジニル、イミダゾリル、ピリドニル、ピロニル、ピリミジニル、ピラジニル、オキサゾリル、チアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、ピリダジニル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、およびアクリジニル基が挙げられる。Ｃ−結合ヘテロアリール基は、ヘテロ芳香族環系中の炭素原子を介して、本発明の化合物の四環式１，２，４−トリオキサン部分に結合された、先に定義されたヘテロアリール基である。
【００７９】
複素環基は、少なくとも１つのヘテロ原子を含む任意の単環式または多環式環系であってもよく、不飽和または部分飽和または完全飽和であってもよい。つまり用語「複素環式」は、先に定義されたヘテロアリール基、および非芳香族複素環基を包含する。典型的には複素環基は、酸素、硫黄および窒素原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む３〜１８員、特に３〜１４員、とりわけ５〜１０員の環系である。複素環基の非限定的例としては、先に挙げられた特定のヘテロアリール基に加え、ピラニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、モルホリノスルホニル、テトラヒドロイソキノリニルおよびテトラヒドロフラニル基が挙げられる。
【００８０】
ヘテロシクリルアルキル基は、複素環基により置換された任意のアルキル基であってもよい。典型的には複素環部分は、先に定義された３〜１８員、特に３〜１４員、とりわけ５〜１０員複素環基であり、アルキル部分は、Ｃ１〜６アルキル、またはＣ１〜４アルキル、例えばメチル基である。
【００８１】
アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、シスチン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、ヒドロキシプロリンまたはフェニルグリシンなどの任意のα−アミノ酸であってもよく、Ｄ−配置およびＬ−配置の両方を含む。アミノ酸エステルは、そのようなアミノ酸の任意のエステル、例えばＣ１〜４アルキルエステルなどのアルキルエステルであってもよい。
【００８２】
前述の置換基のいずれかが、場合により置換された、と称される場合、場合により存在する置換基は、医薬化合物の開発および／またはそのような化合物の修飾に慣例的に用いられて、構造／活性、安定性、生物学的利用度または他の特性に影響を及ぼすもののうちの任意の１種または複数種であってもよい。そのような置換基の具体的例としては、例えばハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、シクロアルキル、アルキル、アルケニル、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ホルミル、アルコキシカルボニル、カルボキシル、アルカノイル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホナネート、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、アリールスルホナネート、カルバモイル、アルキルアミド、アリール、アラルキル、場合により置換されたアリール、複素環式、およびアルキル−またはアリール置換複素環基が挙げられる。前述の置換基のいずれかが、アルキルまたはアルケニル置換基を表すか、または含む場合、これは、直鎖状または分枝状であってもよく、１２個以下、６個以下、とりわけ４個以下の炭素原子を含んでいてもよい。シクロアルキル基は、３〜８個、例えば３〜６個の炭素原子を含んでいてもよい。アリール基またはアリール部分は、６〜１０個の炭素原子、例えばフェニル基を含んでいてもよい。複素環基または複素環部分は、先に定義された５〜１０員環系であってもよい。ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、もしくはヨウ素原子、およびハロ部分を含む任意の基、例えばこれらのハロゲン原子の任意の１つまたは複数を含むハロアルキル基であってもよい。
【００８３】
一態様において、Ｙは、ハロゲン原子、特にフッ素または臭素、とりわけフッ素原子を表してもよい。
【００８４】
別の態様において、Ｙは、Ｃ３〜８シクロアルキル基、Ｃ６〜１８アリール基、５〜１０員Ｃ結合ヘテロアリール基または５〜１０員ヘテロシクリル−Ｃ１〜６アルキル基を表してもよく、各基は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、アミノ、Ｃ１〜４アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４アルキル）アミノ、カルボキシル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員複素環式、およびＣ１〜４アルキル−またはフェニル置換された５〜１０員複素環基からなる群より選択される１つまたは複数の置換基により場合により置換されていてもよい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。幾つかの態様および実施形態によれば、Ｙは、ハロゲン原子、ヒドロキシル、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４ハロアルコキシ、アミノ、Ｃ１〜４アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４アルキル）アミノおよびカルボキシル基からなる群より選択される１つまたは複数の置換基により場合により置換されたＣ６〜１８アリール基を表してもよい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特にＹは、フェニル、ナフチル、アントリルまたはフェナントリル基を表してもよく、各基は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、メチル、ビニル、Ｃ１〜４アルコキシおよびカルボキシル基からなる群より選択される１つまたは複数の置換基により場合により置換されていてもよい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８５】
化合物の別の部分群において、Ｙは、フェニル、フルオロフェニル、クロロフェニル、ブロモフェニル、トリエチルフェニル、ビニルフェニル、メトキシフェニル、ジメトキシフェニル、トリメトキシフェニル、カルボキシルフェニル、ナフチル、ヒドロキシナフチル、メトキシナフチル、アントリル、またはフェナントリル基を表してもよい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。Ｙがフェニルまたはトリメトキシフェニル基を表し得る化合物も、本発明の範囲内に含まれる。
【００８６】
更なる態様において、Ｙは、Ｒ１が水素原子もしくはＣ１〜６アルキル基を表し、Ｒ２がＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜４シクロアルキル、Ｃ６〜１０アリールもしくはＣ７〜１６アラルキ基を表すか、またはＲ１およびＲ２が介在する窒素原子と共に、５〜１０員複素環基もしくはアミノ酸のＣ１〜６アルキルエステルから得られたアミノ基を表し、各基がハロゲン原子、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル、フェニル、ハロフェニル、Ｃ３〜４アルキルフェニル、Ｃ１〜４ハロアルキルフェニル、Ｃ１〜４アルコキシフェニル、ベンジル、ピリジルおよびピリミジニル基からなる群より選択される１つまたは複数の置換基により場合により置換されている、基−ＮＲ１Ｒ２を表してもよい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特にＹは、Ｒ１が水素原子もしくはＣ１〜４アルキル基を表し、Ｒ２がＣ１〜４アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、フェニルもしくはベンジル基を表すか、またはＲ１およびＲ２が介在する窒素原子と共に、６〜１０員複素環基、もしくはアミノ酸のＣ１〜４アルキルエステルから得られたアミノ基を表し、各基がハロゲン原子、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４アルコキシカルボニル、フェニル、ハロフェニル、Ｃ１〜４アルキルフェニル、Ｃ１〜４ハロアルキルフェニル、Ｃ１〜４アルコキシフェニル、ベンジル、ピリジルおよびピリミジニル基からなる群より選択される１つまたは複数の置換基により場合により置換されている、基−ＮＲ１Ｒ２を表してもよい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８７】
これらの化合物の別の部分群において、Ｙは、プロピルアミノ、シクロペンチルアミノ、シクロヘキシルアミノ、フェニルアミノ、フルオロフェニルアミノ、クロロフェニルアミノ、ブロモフェニルアミノ、ヨードフェニルアミノ、メトキシカルボニルフェニルアミノ、ビフェニルアミノ、ベンジルアミノ、フルオロベンジルアミノ、ビス（トリフルオロメチル）ベンジルアミノ、フェニルエチルアミン、フェニルメトキシカルボニルメチルアミノ、ジエチルアミノ、モルホリニル、チオモルホリニル、モルホリノスルホニル、インドリニル、テトラヒドロイソキノリニル、フェニルピペラジニル、フルオロフェニルピペラジニル、クロロフェニルピペラジニル、メチルフェニルピペラジニル、トリフルオロメチルフェニルピペラジニル、メトキシフェニルピペラジニル、ベンジルピペラジニル、ピリジルピペラジニルおよびピリミジニルピペラジニル基を表す。模範的化合物としては、非限定的に、Ｙがプロピルアミノ、フェニルアミノ、ブロモフェニルアミノ、ヨードフェニルアミノ、ビフェニルアミノ、ベンジルアミノ、ビス（トリフルオロメチル）ベンジルアミノ、フェニルエチルアミノ、フェニル−メトキシカルボニルメチルアミノまたはモルホリニル基が挙げられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８８】
別の実施形態において、Ｙが基−ＮＲ１Ｒ２を表し、Ｒ２がフェニル、３−クロロフェニル、４−クロロフェニル、３−ブロモフェニル、４−ブロモフェニル、４−ヨードフェニル、４−メチルフェニル、４−メトキシフェニル、３−カルボキシルフェニル、または４−カルボキシルフェニル基である場合には、Ｒ１が場合により置換されたアルキル基であることを前提に、本発明の方法は、先に定義された一般式Ｉで示される化合物を使用する。
【００８９】
本発明の化合物の１種または複数種は、塩として存在し得る。本発明のアルテミシニン誘導体の適切な塩は、塩基付加塩および酸付加塩の両方を包含する。特定の実施形態において、式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸまたはＸで示される適切な化合物と適切な酸、例えば有機酸または鉱酸との反応により形成され得る酸付加塩は、本発明により包含される。鉱酸との反応により形成される酸付加塩、とりわけ塩酸または臭化水素酸との反応により形成される塩は、本発明の原理によれば適切である。Ｙが基−ＮＲ１Ｒ２を表し、ここでＲ１およびＲ２が、先に定義された通りである、式Iで示される化合物は、そのような酸付加塩の形成に特に適している。
【００９０】
一般式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸまたはＸで示される化合物が、異なる幾何および光学異性体として存在し得ることも、認識されなければならない。つまり本発明は、個々の異性体と、そのような異性体の混合物の両方を包含する。本発明は、本発明の化合物の溶媒和物、および本明細書に記載された塩の溶媒和物も包含する。「溶媒和物」は、本発明の化合物と１種または複数種の溶媒分子との物理的会合を意味する。この物理的会合は、水素結合をはじめとする様々な度合いのイオン結合および共有結合を含む。「溶媒和物」は、溶液相と単離可能な溶媒和物の両方を包含する。適切な溶媒和物の非限定的例としては、エタノラート、メタノラートなどが挙げられる。「水和物」は、溶媒分子が水である、溶媒和物である。
【００９１】
本発明は、本発明の化合物およびその塩の多形も包含する。用語「多形」は、Ｘ線回折、ＩＲまたはラマンスペクトル、融点などの特定の物理的特性により特徴づけ得る、物質の特定の結晶または非晶質状態を指す。
【００９２】
本発明の化合物を製造する方法は、当該技術分野で公知であり、とりわけ米国特許第６，９８４，６４０号および米国特許出願公開第２００５／０１１９２３２号に記載されており、それらの内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００９３】
別の実施形態において、本発明の化合物は、ｐＨ７．２で４０ｍｇ／Ｌを超える水溶解度を示す。別の実施形態において、水溶解度は、約４０〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲内である。更に別の実施形態において、水溶解度は、約３０〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲内である。更に別の実施形態において、水溶解度は、約５０〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲内である。追加の実施形態において、水溶解度は、約６０〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲内である。様々な実施形態において、水溶解度は、約４０〜８００ｍｇ／Ｌの範囲内である。特定の実施形態において、水溶解度は、約４０〜６００ｍｇ／Ｌの範囲内である。幾つかの実施形態において、水溶解度は、約４０〜４００ｍｇ／Ｌの範囲内である。別の実施形態において、水溶解度は、約４０〜２０００ｍｇ／Ｌの範囲内である。特定の実施形態において、水溶解度は、約２０〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲内である。更に別の実施形態において、水溶解度は、約２０〜８００ｍｇ／Ｌの範囲内である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９４】
幾つかの態様および実施形態によれば、本発明の化合物は、約２．０〜３．０（初めと終わりを含む）のｌｏｇＰを示す。本明細書で用いられるｌｏｇＰは、オクタノール／水分配係数を指す。特定の実施形態において、ｌｏｇＰは、約２．１〜２．９（初めと終わりを含む）である。別の実施形態において、ｌｏｇＰは、約２．２〜２．８（初めと終わりを含む）である。更に別の実施形態において、ｌｏｇＰは、約２．３〜２．７（初めと終わりを含む）である。追加の実施形態において、ｌｏｇＰは、約２．１〜３．０（初めと終わりを含む）である。更なる実施形態において、ｌｏｇＰは、約２．２〜３．０（初めと終わりを含む）である。別の実施形態において、ｌｏｇＰは、約２．０〜２．９（初めと終わりを含む）である。特定の実施形態において、ｌｏｇＰは、約２．０〜２．８（初めと終わりを含む）である。特定の実施形態において、ｌｏｇＰは、約２．４〜２．８（初めと終わりを含む）である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９５】
幾つかの態様および実施形態によれば、本発明の化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでジヒドロアルテミシニンに実質的に変換することができない。この特性が、既に低い神経毒性の可能性を低下させることにより、これらの化合物の安全性を増大することが企図される。本明細書で用いられる「実質的に変換された」は、標準的代謝的運命アッセイにより検出可能な程度まで、ジヒドロアルテミシニンにｉｎ  ｖｉｖｏ変換することを指す。代謝的運命アッセイは、当該技術分野で周知であり、例えば、１４Ｃまたは２Ｈで標識された本発明の化合物をヒト肝臓ミクロゾームに投与し、その後、生成された代謝産物を１Ｄおよび２Ｄ核磁気共鳴（ＮＭＲ）により同定すること、を含む（Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，２０８２−２０８８）。別の実施形態において、当該技術分野で公知の任意の他の代謝的運命アッセイが用いられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９６】
特定の実施形態において、本発明の方法により治療、阻害、減弱または抑制されるウイルス感染は、ヘルペスウイルス感染である。別の実施形態において、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型、ＨＳＶ２型、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、およびヒトヘルペスウイルス８（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）からなる群より選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書で用いられるヒトヘルペスウイルス６は、変異体ＡおよびＢの両方を包含する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、ウイルス感染は、αヘルペスウイルス感染である。特定の実施形態において、ウイルス感染は、βヘルペスウイルス感染である。別の実施形態において、ウイルス感染は、γヘルペスウイルス感染である。更に別の実施形態において、ウイルス感染は、サイトメガロウイルス感染である。模範的実施形態において、ウイルス感染は、ヒトサイトメガロウイルス感染である。別の実施形態において、ウイルス感染は、フラビウイルス感染である。特定の実施形態において、フラビウイルス感染は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）感染である。更なる実施形態において、ウイルス感染は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。更なる実施形態において、ウイルス感染は、当該技術分野で公知のウイルス感染の任意の他の型である。
【００９７】
本発明の組成物および方法が、ウイルス感染そのものだけでなく、ウイルス感染により生じた疾患および障害も治療する用途を有することは、当業者に理解されよう。つまり、例えば本発明は、本明細書に定義された式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸもしくはＸのいずれかで示される抗ウイルス活性を有する化合物、または前記化合物および医薬的に許容し得る担体もしくは賦形剤を含む医薬組成物の治療有効量を、必要とする対象に投与することを含む、必要とする対象における腫瘍への腫瘍調節活性を有するウイルス感染を治療する方法を提供する。例えば、ＨＣＭＶは、グリオブラストーマの悪性表現型を調節し得ることを示す幾つかの証拠が存在し、ＨＣＭＶ配列およびウイルス遺伝子発現は、全てではないがほとんどの悪性グリオーマに存在する（Ｄｚｉｕｒｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎｅｕｏｎｃ／ｎｏｒ２２７）。つまり幾つかの態様および実施形態によれば、本発明は、本明細書に定義された式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸもしくはＸのいずれかで示される抗ウイルス活性を有する化合物、または前記化合物および医薬的に許容し得る担体もしくは賦形剤を含む医薬組成物の治療有効量を、必要とする対象に投与することを含む、必要とする対象において腫瘍、特にサイトメガロウイルスに伴うグリオブラストーマへの腫瘍調節活性を有するウイルス感染を治療する方法を提供する。本発明の方法は、グリオブラストーマ患者のサイトメガロウイルスの直接的な標的化、あるいはグリオブラストーマ患者の形質転換された表現型の調節を包含する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、サイトメガロウイルスに侵された対象においてグリオブラストーマの発症を予防する、または発症の可能性を低下させる。
【００９８】
更に、ＣＭＶが非限定的に結腸癌、前立腺癌などの腫瘍に伴うＣＭＶ感染の治療、ならびにＥＢＶが非限定的にバーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、および鼻咽頭癌などの腫瘍に伴うＥＢＶの治療が、本発明に包含される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９９】
本発明の化合物が、ヒトおよび動物におけるウイルス感染および疾患の予防、減弱または治療、および制御に有用であることも、当業者に理解されよう。幾つかの実施形態において、治療は、先天性感染の症例において効果的である。追加の実施形態において、治療は、移植レシピエントをはじめとする免疫抑制患者におけるＣＭＶ感染の症例において効果的である。特定の実施形態において、治療は、ｅｘ  ｖｉｖｏで効果的である。ＨＣＭＶに感染した新生児、ＨＣＭＶに感染した妊婦、および移植レシピエントの治療は、本発明の範囲内である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１００】
特定の態様および実施形態において、本発明は、本発明の化合物および少なくとも１種の他の抗ウイルス薬を含む併用療法を提供する。一実施形態において、本発明の化合物は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤と併用で用いられる。別の実施形態において、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、ガンシクロビル、ホスカルネット、およびシドホビルからなる群より選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。更に別の実施形態において、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、当業者に公知である、任意の他のウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤である。特定の実施形態において、本発明の化合物は、非限定的にガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、シドホビル、アシクロビル、バラシクロビル、および当業者に公知の任意の他の抗ウイルス薬をはじめとする抗ウイルス薬と併用で用いられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。追加の実施形態において、本発明の化合物は、マリバビル、レテルモビル（ＡＩＣ２４６としても公知）、ＣＭＸ−００１、ＣＭＶ高度免疫グロブリンおよびＣＭＶモノクローナル抗体のうちのいずれか１つと併用で用いられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０１】
本発明の組成物が、追加の治療薬（例えば、他の抗ウイルス薬）との併用療法として投与しなければならない場合、治療は、任意の順序で連続して、同時に、またはそれらの組み合わせで実施されてもよい。例えば本発明の化合物の投与は、追加の治療薬（複数可）の投与の前、その投与の後、その投与と同時に実施され得る。例えば全体的な治療期間は、本発明の化合物ごとに決定され得る。追加的薬剤（複数可）は、本発明の化合物での治療の開始前に、または本発明の化合物での治療に続いて、投与され得る。追加として、更なる薬剤（複数可）は、本発明の化合物を投与する期間に投与され得るが、全治療期間にわたり実施する必要はない。別の実施形態において、治療レジメンは、１つの薬剤での前治療に続いて、他の薬剤または複数の他の薬剤の追加を含む。別の投与順序も、企図される。別の投与としては、本発明の化合物の投与に続いて、更なる薬剤を投与し、それに続いて本発明の化合物を投与することを含む。本発明の化合物と更なる薬剤（複数可）との併用の治療効力は、少なくとも相加的である。幾つかの実施形態において、治療効力は、相乗的であり、即ち、成分それぞれの全体的用量を少なくしてもよく、それにより対象の副作用は有意に少なく、それにもかかわらず十分な抗ウイルス効果が実現される。
【０１０２】
別の実施形態において、有効成分としての、本明細書に定義された式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸまたはＸのいずれかで示される抗ウイルス活性を有する化合物を含む医薬組成物は、医薬的に許容し得る担体または賦形剤を更に含み得る。
【０１０３】
医薬的に許容し得る担体または賦形剤は、任意の材料であってもよく、その有効成分は、投与を容易にするように配合される。担体または賦形剤は、通常は気体であるが液体を形成するように圧縮された材料、および通常は医薬組成物を配合する際に用いられる任意の担体または賦形剤を含む、固体または液体であってもよい。典型的には本発明による組成物は、有効成分の重量に対して、０．５〜９５重量％含有する。
【０１０４】
本発明の化合物は、例えば錠剤、丸薬、カプセル、ペレット、顆粒、粉末、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、分散液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射溶液、および滅菌包装粉末として配合されてもよい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。これらの配合剤は、例えばラクトース、デンプンもしくはタルクなどの従来の固体担体もしくは賦形剤、または例えば水、脂肪油もしくは液体パラフィンなどの液体担体を用いて、公知の方法により製造され得る。用いられ得る他の担体または賦形剤としては、非限定的に、ゼラチン、デキストリン、ならびに大豆、小麦およびオオバコ種子の蛋白質などの動物または植物性蛋白質由来の材料；アカシア、グアー、寒天およびキサンタンなどのガム；多糖類;アルギン酸塩；カルボキシメチルセルロース；カラギーナン；デキストラン;ペクチン；ポリビニルピロリドンなどの合成ポリマー；ゼラチン−アカシア複合体などのポリペプチド／蛋白質または多糖複合体；マンニトール、デキストロース、ガラクトースおよびトレハロースなどの糖；シクロデキストリンなどの環状糖；リン酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびケイ酸アルミニウムなどの無機塩；ならびに、非限定的にグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、およびＬ−フェニルアラニンなどの、２〜１２個の炭素原子を有するアミノ酸およびその誘導体が挙げられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０５】
錠剤崩壊剤、可溶化剤、防腐剤、酸化予防剤、界面活性剤、粘度増強剤、着色剤、香料添加剤、ｐＨ調整剤、甘味剤または矯味剤などの補助成分が、該組成物に組み入れられていてもよい。適切な着色剤としては、非限定的に、赤色、黒色および黄色酸化鉄、ならびにＥｌｌｉｓ＆Ｅｖｅｒａｒｄから入手可能なＦＤ＆Ｃ染料、例えばＦＤ＆Ｃ青色２号、およびＦＤ＆Ｃ赤色４０号が挙げられる。適切な香料添加剤としては、非限定的に、ミント、ラズベリー、甘草、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、カラメル、バニラ、チェリーおよびブドウの香料、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。適切なｐＨ調整剤としては、非限定的に、クエン酸、酒石酸、リン酸、塩酸およびマレイン酸が挙げられる。適切な甘味剤としては、非限定的に、アスパルテーム、アセスルファームＫ、およびタウマチンが挙げられる。適切な矯味剤としては、非限定的に、重炭酸ナトリウム、イオン交換樹脂；シクロデキストリン包接化合物、吸着剤またはマイクロカプセル化された化学薬品が挙げられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０６】
特定の実施形態において、送達ビヒクルが用いられる。本発明の医薬組成物のための模範的送達ビヒクルは、リポソームである。リポソームは、対象において、本発明の化合物を対象に送達するのに十分な時間、安定性を保持することが可能である。本発明の範囲内のリポソームは、好ましくは投与された対象において、好ましくは少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、更により好ましくは少なくとも約２４時間、安定している。
【０１０７】
本発明の化合物および組成物の適切な投与経路としては、例えば経口、経直腸、経皮、局所、経粘膜、とりわけ経鼻、腸管、または非経口送達、例えば筋肉内、皮下および髄内注射に加え、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、動脈内、膀胱内（膀胱の中へ）、または眼内注射が挙げられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０８】
特定の態様および実施形態によれば、本発明の化合物および組成物は、経口投与に特に適する。本発明の化合物および組成物を経口投与することにより、全身への効果が実現され得ることが企図される。一実施形態において、本発明の化合物および組成物は、鼻呼吸経路を通して投与される。医薬的に許容し得る溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用により噴霧され得る。噴霧された溶液を噴霧デバイスから直接吸い込んでもよく、または噴霧デバイスをフェイスマスクテントもしくは間欠的な陽圧呼吸模擬装置に取り付けてもよい。溶液、懸濁液、または粉末組成物が、適切な手法で該組成物を送達するデバイスから、経口または経鼻投与されてもよい。
【０１０９】
非経口、皮内、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液としては、典型的には以下の成分が挙げられる：滅菌希釈液、例えば注射用水、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール（または他の合成溶媒）、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、重亜硫酸ナトリウム）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）、緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩）、および等張性を調整する薬剤（例えば、塩化ナトリウム、デキストロース）。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムなどにより調整され得る。非経口調製剤は、アンプル、ディスポーザブルシリンジまたは反復投与用ガラスもしくはプラスチックバイアルに封入され得る。
【０１１０】
非経口投与用に適応する医薬組成物としては、非限定的に、水性および非水性滅菌注射溶液または懸濁液が挙げられ、それらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および組成物を意図するレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含み得る。そのような組成物は、例えば水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油も含み得る。即時注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。そのような組成物は、好ましくは本発明の化合物および／または他の治療剤（複数可）の治療有効量を、適切量の担体と共に含み、対象に適切に投与するための形態を提供する。
【０１１１】
投与レジメンは、状態の感染性および重症度、患者集団、年齢、体重などに応じて当業者により決定され得る。ＨＣＭＶをはじめとする特定の障害または状態の治療において効果的となる本発明の化合物量は、障害または状態の性質に依存し、標準の臨床技術により決定され得る。加えて本明細書の以下に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、動物アッセイ（例えば、モルモット経胎盤移行モデルおよび新生仔マウスモデル）およびｅｘ  ｖｉｖｏアッセイを場合により用いて、最適な投薬範囲の同定を支援してもよい。用いられる正確な用量は、投与経路、および疾患または障害の進行にも依存し、実施者の判断および各患者の状況に従って決定しなければならない。典型的には、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、１０〜７５ｍｇ／ｋｇ体重などの範囲内の投薬量が用いられ得る。本発明の化合物の模範的で非限定的な量としては、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇが挙げられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。あるいは投与された量を測定して、投与された化合物のモル量として表すことができる。例示であり限定ではなく、本発明の化合物（例えば、式Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、またはＸのいずれかで示される化合物）は、０．１μＭ〜１０ｍＭの範囲内、例えば約０．１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、および１０ｍＭで投与され得る。あるいは投与された量を測定して、ｍｇ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ、またはｎｇ／ｍｌとして表すことができる。例示であり限定ではなく、抗ウイルス薬は、１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌ、例えば１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、１〜１０００μｇ／ｍｌ、１〜１００μｇ／ｍｌ、１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、１〜１００ｍｇ／ｍｌなどの量で投与され得る。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、動物モデルまたはｅｘ  ｖｉｖｏモデルテストのバイオアッセイもしくはシステムから求めた用量反応曲線から外挿され得る。
【０１１２】
投与スケジュールは、１日１回、１日２回、１日３回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に３回、または当業者に公知の任意の他の投与スケジュールで実施され得る。加えて投与は、連続で、即ち毎日、または間欠的であってもよい。本明細書で用いられる用語「間欠的」または「間欠的に」は、規則的または不規則的間隔で停止および開始することを意味する。例えば間欠的投与は、１週間に１〜６回投与され得、または周期での投与（例えば、１日１回を連続で２〜８週間、その後、休薬期間は最大１週間投与しない）を意味する場合があり、または数日間ずつ交互での投与を意味する場合がある。
【０１１３】
以下の実施例は、本発明の幾つかの実施形態をより完全に示すために表されている。しかしそれらは、本発明の広い範囲を限定すると解釈されてはならない。
【０１１４】
実験の詳細の区分
実施例１：プラーク減少アッセイにより決定されたアルテミソンおよび化合物ＩＸの強力な抗ウイルス活性
材料および実験方法
ウイルス、細胞、および被験化合物
用いられたＣＭＶ株は、ＡＤ１６９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）、およびＴＢ４０／Ｅであった。加えて、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで先天性感染の新生仔の尿から採取し、３〜５代増殖させた低継代臨床単離物ＣＩ７０４およびＣＩ８９３を幾つかの実験に用いた。ＣＭＶ株は全て、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）細胞中で増殖させて、力価測定した。無細胞ウイルスストックおよび細胞結合型臨床単離物を、−７０℃で保存した。ウイルスストックは、アガロース培地で覆われたＨＦＦ単層を含む２４ウェル組織培養プレート中で、１０倍の系列希釈により力価測定した。７〜１０日間インキュベーションした後、プラークを計数し、ウイルス力価をミリリットル（ｍｌ）あたりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）として決定した。アルテミソン、アルテミシド、ＲＷ１７７、化合物ＩＸ、およびアルテスネートの原液を、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ濃度で新たに調製した。１０ｍＭ原液として貯蔵されたガンシクロビルを、比較アッセイにおいて用いた。
【０１１５】
プラーク減少アッセイ
２４ウェル培養プレートにおいて、細胞の単層に、６０〜１０ＰＦＵ／ウェルを含むウイルス懸濁液０．２ｍｌを接種した。３７℃で６０分間吸着させた後、接種物を除去し、培地を、被験薬を含むアガロース培地オーバーレイと交換した。以下の最終薬物濃度を用いた：アルテミソン：０、０．１、１、５、１０、２５、および５０μＭ；アルテスネート：０、１、５、１０、２５、５０、および１００μＭ；ガンシクロビル、アルテミシド、化合物ＩＸおよびＲＷ１７７：０、０．１、１、５、１０、２５、および５０μＭ。プレートを５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０日間インキュベートした。その後、プラークを顕微鏡で計数した。プラーク数を対照値の５０％まで減少させるのに必要な薬物濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【０１１６】
結果
アルテミソンの抗ウイルス活性を、標準のプラーク減少アッセイを利用して細胞培養で生育しているウイルスに様々な薬物濃度を適用することにより決定した。顕著な抗ウイルス活性を有することが知られる化合物であるアルテスネートを、並行して試験した。ガンシクロビルを、更なる陽性対照として用いた。各薬物およびウイルスを用いた少なくとも３種の別個の実験のＩＣ５０値を平均して、結果を平均±標準偏差値として報告する。アルテミソンおよびアルテスネートのプラーク減少アッセイの代表的曲線を、それぞれ図２Ａおよび３Ａに示す。アルテミソンは、細胞毒性を呈さず、ガンシクロビルと同様の抗ウイルス活性を示した（０．９±０．３μＭ）。比較すると、アルテスネートの平均ＩＣ５０は、１０．８±４．２μＭであった。つまり、アルテミソンは、アルテスネートよりも優れた、高い抗ウイルス効力を有する。重要なこととして、アルテミソンは、実験室で得られたＣＭＶ株と低継代ＣＭＶ臨床単離物の両方に対して広範囲の抗ウイルス活性を示した。アルテスネートに比較して優れたアルテミソンの抗ウイルス活性は、網膜上皮細胞（ＲＰＥ）の更なる細胞型培養系でも示された。化合物ＩＸのＣＭＶ抗ウイルス活性が優れていて、２．１±０．６μＭのＩＣ５０値であることも見出された。つまり本発明の化合物ＩＸも、効果的な抗ＣＭＶ剤として用いられ得る。
【０１１７】
これに反して、寄生虫に対して高い活性を有する１０−アルキルアミノアルテミシニン誘導体であるアルテミシドおよびＲＷ１７７（図１）は、顕著に劣る抗ウイルス活性を有しており（ＩＣ５０値＞４０μＭ）、アルテミソンおよび化合物ＩＸの非常に驚くべき抗ウイルス活性が強調された。
【０１１８】
実施例２：ウイルスＤＮＡ定量によるアルテミソンの強力な抗ウイルス活性の確認
材料および実験方法
ウイルスＤＮＡの定量
薬物を添加した、または添加していない感染細胞中のウイルスＤＮＡ量（ゲノムコピー数／ウェルとして表す）を、細胞からＤＮＡ抽出後、ＣＭＶ  ｇＢ遺伝子から得られたプライマーおよびプローブを使用して、リアルタイムＰＣＲアッセイにより決定した。このアッセイは、５０コピー/ｍｌの感度で６ｌｏｇ範囲にわたり直線性のある定量を示すことが公知である。
【０１１９】
結果
実施例１の結果を、リアルタイムＰＣＲを用いたウイルスＤＮＡの定量により確認した。これらのアッセイにより、アルテミソンが高い抗ウイルス効力を有し、アルテスネートよりもかなり優れていることが確認された。アルテミソンおよびアルテスネートのウイルスＤＮＡ蓄積量の代表的曲線を、それぞれ図２Ｂおよび３Ｂに示す。
【０１２０】
つまり抗ウイルス感受性およびウイルスＤＮＡ定量アッセイから、アルテミソンがＣＭＶ複製およびウイルスＤＮＡ合成の非常に効果的な阻害剤であることが明らかとなった。
【０１２１】
実施例３：アルテミソンはＣＭＶ前初期（ＩＥ）遺伝子発現を効果的に阻害する
材料および実験方法
ウイルス遺伝子発現の分析
ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を、ＨＣＭＶ  ＡＤ１６９株に感染させた。感染後（ｈｐｉ）１時間目に、アルテミソン（２５μＭ）またはガンシクロビル（２５μＭ）を生育培地に添加して、ＩＥおよびｐｐ６５の発現を分析するために、それぞれ２４および７２ｈｐｉの免疫蛍光分析の準備に取り掛かるまで、細胞を薬物の存在下で更にインキュベートした。未治療感染細胞対照およびモック感染細胞を、並行して分析した。
【０１２２】
免疫蛍光アッセイ
８ウェルスライドガラス上で生育させた細胞を、０．１ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ｍｏｉ）で感染させた。上清を２４および７２ｈｐｉに除去して、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドにより室温で３０分間固定させた。細胞をＰＢＳ＋１％ＮＨ４Ｃｌで５回洗浄し、０．１％ＴＸ１００により５分間浸透させて、ＰＢＳ＋１％ＮＨ４Ｃｌで５回洗浄した。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いて１時間ブロッキングした後、指示された一次モノクローナル抗体（ＩＥ１／２またはｐｐ６５）を、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡに適切に希釈された細胞に添加して、室温で２時間または４℃で一晩のいずれかでインキュベートした。二次抗体を、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に適切に希釈された細胞に、室温で３０分間添加して、ＰＢＳにより洗浄した。
【０１２３】
市販の封入剤により封入した後、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）核染料（全ての細胞で核を青色に染色する）を添加して、細胞を蛍光顕微鏡検査により分析した。結果は、少なくとも３回の独立した実験でモニタリングし、各治療群について少なくとも５視野でスコアリングした（それぞれ５００〜８００細胞）。
【０１２４】
結果
アルテミソンおよびガンシクロビルで治療された感染細胞中で得られた代表的な免疫蛍光画像を、図４に示す。アルテミソン治療により、２４ｈｐｉでウイルスＩＥ遺伝子発現の有意な減少をもたらした。これは、ＩＥ遺伝子発現を阻害しないガンシクロビルでの治療の際に得られた結果とは、明確に対照的であった（表１；図５Ａ）。
【０１２５】
ＩＥ遺伝子発現の減少と一致して、アルテミソン治療はガンシクロビルと同じく、ウイルス後期（ｐｐ６５）遺伝子発現を非常に効率的に減少させた（表１；図４、５Ｂ）。
【表１】
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【０１２６】
ガンシクロビルは、ＨＣＭＶ前初期（ＩＥ）遺伝子発現を阻害しないが、アルテミソンは、ＩＥ遺伝子発現を効果的に阻害し、アルテミソンおよびガンシクロビルは両者とも、ＨＣＭＶ後期遺伝子発現を効果的に阻害する。つまり、任意の理論または作用機序に束縛されるものではないが、アルテミソンは、ガンシクロビルとは異なり、ウイルスＤＮＡ合成前のウイルス複製の非常に早い段階での阻害に関与する新規な作用機序を示すことが企図される。
【０１２７】
実施例４：アルテミソンでの併用療法
従来の抗ＨＣＭＶ薬の効力に対するアルテミソン治療の影響を検討するために、ＨＣＭＶ感染細胞を、アルテミソンとガンシクロビルとの併用により治療した。中間濃度のガンシクロビル（１μＭ）を用いると、アルテミソンでの併用治療は、ＨＣＭＶ複製への付加的阻害効果を導いた。
【０１２８】
実施例５：治療効率の評価
本発明の抗ＣＭＶ化合物の治療効力を評価するために、母体脱落膜のＨＣＭＶ感染のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを、内容が全体として本明細書に組み入れられるＪ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１１；８５：１３２０４−１３２１３に記載された通り使用した。特にＨＣＭＶ伝播および病原性の試験は、ＨＣＭＶ感染に関する動物モデルが存在しないため大きく限定される。モルモット経胎盤移行モデルおよび新生仔マウスモデルが、ワクチンおよびウイルス誘発脳症状の実験的評価に関して非常に価値があることが立証されているが、ＨＣＭＶの種特異性により、先天性ヒト感染の実験モデリングが妨げられてきた。Ｅｘ  ｖｉｖｏ感染の脱落膜培養物は、処置的治療をスクリーニングするための独特の代理的ヒトモデルとなり得る。Ｅｘ  ｖｉｖｏモデルを利用して、本発明のアルテミシニン誘導体での治療に応答して生じる様々な生理学的および病理学的工程をモニタリングし、それにより治療の効力を決定することができる。
【０１２９】
材料および実験方法
細胞およびウイルス
初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を用いて、内容が全体として本明細書に組み入れられる、Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００１，９８，１８９５−９００；およびＷｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９５，９５，２５７−６３に記載されたＨＣＭＶ株を増殖させて単離した。ＨＦＦを、１０％牛胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，イスラエル、ベイトハエメック）および０．２５μｇ／ｍｌ  Ｆｕｎｇｉｓｏｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州）を補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。用いられたＨＣＭＶ株は、ＡＤ１６９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）、ＵＬ３２融合ＧＦＰを発現するＴＢ４０／Ｅ株（ドイツのＣ．Ｓｉｎｚｇｅｒ氏から供与）、ＵＬ８３融合ＧＦＰを発現するＴＢ４０／Ｅ（ＲＶ１３０５株；ドイツのＭ．Ｗｉｎｋｌｅｒ氏から供与）、およびＧＦＴを発現する無細胞ＨＣＭＶ臨床由来株であるＣＭＶＰＴ３０−ｇｆｐ（ＰＴ３０）であった。これらのウイルス株を、無細胞ウイルスストックとして保持した。加えて、細胞結合型ウイルスとして、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで先天性感染の新生仔の尿から採取されて３〜５代増殖させた、低継代臨床単離物ＣＩ８５１を用いた。ＣＩ８５１の無細胞ストックを感染細胞の音波処理により調製し、その後ペレット化された細胞残屑を除去した。洗浄した上清のウイルス力価を、ＨＦＦでの標準のプラークアッセイにより決定した。
【０１３０】
脱落膜臓器培養物の調製および感染
妊娠第一期に人工妊娠中絶を受けた女性の脱落膜組織を、深部の擦過により得て、間質の栄養膜細胞浸潤を伴う脱落膜組織を含む基底部および胎盤床から母体組織を得た。この試験は、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより認可され、ヘルシンキ宣言、Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅガイドライン、およびイスラエル保険省のヒト実験ガイドラインに従って実施した。ドナーは全て、署名したインフォームドコンセントを提出した。術後４時間以内に送達された組織を、切片作製まで氷上に保持した。脱落膜臓器培養物を調製するために、組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ミクロトーム（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｅｃｔｉｏｎｅｒ，ＴＣ−２，Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｃｏｒｐ．）により、約１０の細胞層を含む薄い切片（２５０μｍ厚）に切り出して、２５％  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２４、１０％牛胎仔血清、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，イスラエル、ベイトハエメック）および０．２５μｇ／ｍｌ  Ｆｕｎｇｉｓｏｎｅを含むＤＭＥＭ中、３７℃の５％ＣＯ２中でインキュベートした。
【０１３１】
脱落膜臓器培養物の感染のために、組織を切片作製の直後に４８ウェルプレートに入れて（最適な生存性を保持するために約５枚／ウェル）、指示されたウイルス（他に指示がなければ１０４プラーク形成単位／ウェル）を１２時間接種して、効果的にウイルスを吸着させた。ウイルス吸着に続いて、培養物を十分に洗浄して、実験期間の間、２〜３日ごとに培地交換しながら更にインキュベートした。
【０１３２】
組織生存性のモニタリング
ミトコンドリア脱水素酵素（ＭＴＴ）アッセイ：組織切片をＭＴＴ基質（３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］）（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）と共に３７℃で１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄して、１００％エタノールを添加して有色結晶の生成物を溶解した。四重測定の試料の吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ，オランダ）を用い、６５０ｎｍを参照波長として５４０ｎｍの波長で読み取った。ブラッドフォードアッセイ（Ｋｏｌｏｄｋｉｎ−Ｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８２，９９９−１０１０）により試験された各抽出物の蛋白質量に関して吸光度値を標準化することにより、生存性を決定した。
【０１３３】
グルコース消費アッセイ：インキュベートされた組織の培地中のグルコースレベルを、Ａｃｃｕ−ｃｈｅｃｋ（商標）血糖感知装置（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）により、４８時間の培養後にモニタリングした。
【０１３４】
組織学および免疫組織化学分析
脱落膜組織を３７％ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋して、５μｍ切片に切り出した。切片をキシレンで脱パラフィンして、再水和し、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０１３５】
ＨＣＭＶ抗原の免疫組織化学的検出のために、組織切片を０．０１Ｍクエン酸緩衝液に入れて、水浴で９０℃まで１５分間加温して、室温に放冷し、ＣＡＳ−Ｂｌｏｃｋ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国カリフォルニア州）に希釈されたＨＣＭＶに対する一次マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）；前初期（ＩＥ）、ｐｐ６５、もしくはｇＢ抗原（１：１０００希釈；Ｖｉｒｕｓｙｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国メリーランド州）；または陰性対照として働く一次抗体不含のＣＡＳ−Ｂｌｏｃｋと共にインキュベートした。その後、切片を洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，米国カリフォルニア州）と共にインキュベートした。切片を再度洗浄し、ＨＣＭＶ抗原をＨＲＰ基質３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）により検出し、その後、ヘマトキシリンで対比染色させた。
【０１３６】
免疫蛍光
免疫蛍光染色のための組織標本を、４％パラホルムアルデヒドに固定し、ＯＣＴに包埋して、液体窒素で急速冷凍して、１０μｍ切片に切り出した。非特異的抗体結合を回避するために、凍結切片をＣＡＳ−Ｂｌｏｃｋで処理して、ＣＡＳ−Ｂｌｏｃｋのみ、または特異的細胞マーカに関する以下の抗体を含むＣＡＳ−Ｂｌｏｃｋと共にインキュベートした：サイトケラチン７に対するｍＡｂ（１：３００希釈、Ｄａｋｏ  Ｇｌｏｓｔｒｕｐ４、デンマーク）を、ＣＴＢの検出に用い；ビメチンに対するｍＡｂ（１：１００希釈、Ｄａｋｏ）を、脱落膜間質細胞の検出に用い；ＣＤ１１ｃに対するｍＡｂ（１：５０希釈、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国カリフォルニア州）を、樹状細胞の検出に用い；ＣＤ６８に対するｍＡｂ（１：２００希釈、Ａｂｃａｍ、英国ケンブリッジ）を、マクロファージの検出に用い、フォン・ヴィレブランド因子に対するウサギポリクローナル抗体（１：８００希釈、Ｄａｋｏ）を、内皮細胞の検出に用いた。切片を洗浄し、ｃｙ５コンジュゲートヤギ抗マウスまたはｃｙ５コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（１：２００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，米国ペンシルバニア州）と共にインキュベートし、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）核染料を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、カリフォルニア州バーリンゲーム）に封入した。スライドをＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．ｚ１．共焦顕微鏡を用いて視覚化し、Ｚｅｎ  ２００９ソフトウエアを用いて解析した。
【０１３７】
ＨＣＭＶ  ＤＮＡおよびＲＮＡの定量
感染させた脱落膜組織およびＨＦＦ細胞培養物を十分に洗浄し、対応する上清（最後の培地交換の２日後に採取）と共に−７０℃で貯蔵した。
【０１３８】
ＤＮＡおよびＲＮＡを、それぞれＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ抽出キットおよびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ドイツ、ヒルデン）を用い、製造業者の使用説明書に従って試料から抽出した。７９００ＨＴ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国カリフォルニア州フォスターシティー）で、Ｂｏｅｃｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２，１１４２−１１４８に記載されたＨＣＭＶ糖蛋白質Ｂ（ｇＢ）から得られたプライマーおよびプローブを用いて、精製されたＤＮＡ試料を定量リアルタイムＰＣＲ反応に供した。このアッセイは、６ｌｏｇ範囲にわたり直線性のある定量を示した。精製されたＲＮＡ試料を、ＧｏＳｃｒｉｐｔ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国マディソン）を用いた逆転写に供し、Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８，１８１７−１８３０に記載された通り後期ＨＣＭＶ  Ｒ１６０４６１のスプライシングを受けたｍＲＮＡの定量リアルタイムＰＣＲを実施した。比較および速度論分析のために、組織およびＨＦＦ細胞培養物中のウイルスＤＮＡコピー数を、細胞のシングルコピー遺伝子ＲＮａｓｅ  Ｐにより標準化した。ＲＮａｓｅ  Ｐを、Ｔａｑｍａｎ  ＲＮａｓｅ  Ｐキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、製造業者の使用説明書に従って定量した。ウイルスｍＲＮＡコピー数を、細胞内ハウスキーピング遺伝子Ｇ６ＰＤにより標準化した。
【０１３９】
抗ウイルス治療およびアッセイ
抗ウイルス薬ガンシクロビルおよびアシクロビル（Ｓｉｇｍａ）を、２５μＭ、５０μＭ、２５０μＭおよび５００μＭの濃度で用いた。薬物を、ウイルス吸着後の培地に添加した。
【０１４０】
抗体による中和を測定するために、指示されたウイルス株を１：１０、１：１００、および１：１０００希釈されたＨＣＭＶ  ＨＩＧ(Ｍｅｇａｌｏｔｅｃｔ；１００ｍｇ蛋白質／５０ＩＵ／ｍｌ；Ｂｉｏｔｅｓｔ，ドイツ）と共に室温で１時間プレインキュベートし、その後、プレインキュベートさせたウイルス／抗体混合物を組織に接種した。
【０１４１】
吸着後処置実験において、同じＨＣＭＶ  ＨＩＧ希釈物を、ウイルス吸着の２４時間目に培地に添加した後、十分に洗浄し、結合の緩いウイルスを除去した。
【０１４２】
組織を、薬物または抗体の存在下で、実験期間の間、更にインキュベートした。薬物または抗体を、培地交換の際に再度補充した。
【０１４３】
薬物あたり少なくとも５回の独立した反復実験を利用して、標準化された組織ウイルスＤＮＡコピー数を５０％減少させるのに必要な薬物濃度（ＩＣ５０）を決定することにより、抗ウイルス薬の感受性をアッセイした。
【０１４４】
結果
脱落膜臓器培養物の樹立
新しい妊娠第一期脱落膜組織を、薄い切片（２５０μｍ厚）に切片作製して、栄養素の接近性を確保した。切片作製の直後に、脱落膜臓器培養物を４８ウェルプレートに入れて（約５枚／ウェル）、濃縮ＤＭＥＭ中でインキュベートし、頻繁に培地交換して、最適な生存性を維持した。ＭＴＴおよびグルコース消費アッセイの両方によりモニタリングされる脱落膜組織生存性を、ｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベーションの少なくとも１２日間維持した。更に、培養の開始時（０日目）および８日目に得られた切片の組織学的検査から、典型的な脱落膜の形態学的特徴が保持され、目に見える細胞死の兆候がないことが実証された（図６Ａ〜６Ｂ）。つまり脱落膜組織の外植片は、ＨＣＭＶ感染と典型的には４〜７日以内に起こる伝播を裏付け、かつモニタリングするのに必要な時間にわたり、依然として生存性があり、自然な形態を持続する。
【０１４５】
脱落膜のＨＣＭＶ感染速度論
ＨＣＭＶへの脱落膜臓器培養物の感受性を評価するために、脱落膜組織培養物を、無細胞臨床由来ＰＴ３０株に感染させて、ＧＦＰを発現させた（Ｆｏｘ−Ｃａｎａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６９，５５−６８）。ＨＦＦ、臍静脈内皮細胞、および網膜上皮細胞への広い細胞指向性を保持することが示されたこのウイルス株を、ＨＣＭＶの広いｉｎ  ｖｉｖｏ細胞指向性を表して、感染の視覚的モニタリングを提供するように選択した。
【０１４６】
ｅｘ  ｖｉｖｏ感染させた脱落膜の組織病理学的特徴を評価するために、感染組織の組織切片を、６ｄｐｉに検査した。ｅｘ  ｖｉｖｏ感染させた組織の組織切片は、天然ＨＣＭＶ感染の典型的な組織病理学的特性を示し、巨細胞の外観は「フクロウの目」封入体、顆粒状の細胞質内封入体、および核形不整の濃染核を有した（図６Ｃ〜６Ｄ）。
【０１４７】
感染させた切片の免疫組織化学分析から、前初期およびｐｐ６５初期−後期遺伝子の両方に加え（図６Ｅ〜６Ｆ）、ｇＢ（感染後、後期に発現することが公知）の発現が明らかとなった。モック感染切片および二次抗体のみと反応させた感染切片をはじめとする対照組織は全て、免疫組織化学染色では陰性であった。これらの知見から、感染させた脱落膜組織においてＨＣＭＶが完全な複製サイクルを受けることが示される。
【０１４８】
脱落膜中のウイルス伝搬速度に従うために、ＰＴ３０感染させた生存組織を、共焦顕微鏡検査によりＧＦＰ発現細胞に関して１日１回モニタリングした。図７Ａ〜７Ｄに示される通り、ＧＦＰ発現は、最初、感染後（ｄｐｉ）２日目に検出され、それは個々の細胞に出現した。感染細胞のプラーク様クラスターの形成と共に、感染の緩やかな進行が３〜７ｄｐｉまでに認められた（図７Ａ〜７Ｄ）。臓器培養物感染のこの速度パターンは、異なる対象から得られた８０を超える脱落膜組織において一定して観察され、内皮指向性（ｅｎｄｏｔｈｅｌｏｉｔｒｏｐｉｃ）のＴＢ４０／Ｅ株に感染させて、後期構造蛋白質ｐｐ１５０に融合したＧＦＰを発現させた後に、同様にモニタリングすることができた。
【０１４９】
時間経過に伴う感染の進行を更に定量するために、ウイルス株ＰＴ３０、ＴＢ４０／Ｅ、ＡＤ１６９、および低継代臨床株ＣＩ８５１に感染させた後（１０４ＰＦＵ／ウェル）、感染させた脱落膜培養物中のウイルスＤＮＡの蓄積をリアルタイムＰＣＲにより測定した。図８に示す通り、組織に結合するウイルスＤＮＡが時間と共に一定して増加し（感染後早期に検出された残りのインプットＤＮＡレベルを超え）、それは全てのウイルス株について実証され、ウイルスＤＮＡ蓄積の１．３〜２ｌｏｇ増加が全てのウイルス株で２〜９ｄｐｉに観察され、感染組織内の活発なＤＮＡ合成を反映していることが示された。その上、ＨＣＭＶ真正後期（ｔｒｕｅ−ｌａｔｅ）ＲＮＡ  Ｒ１６０４６１の定量分析から、ＴＢ４０／ＥおよびＡＤ１６９の両方で７ｄｐｉ以内に１．９ｌｏｇの上昇が実証された。これらの知見をＧＦＰ発現の拡散パターン（２種の異なるＧＦＰ発現ウイルス株で独立して実証された）および後期ウイルス蛋白質の発現と併せると、脱落膜臓器培養物中の活発なウイルス複製が裏付けられる。
【０１５０】
ＨＣＭＶは脱落膜中の広範囲の細胞に感染する
ＨＣＭＶはｉｎ  ｖｉｖｏで広範囲の細胞指向性が特徴づけられているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、一般に単一細胞型の培養に限定される。脱落膜内のＨＣＭＶの細胞指向性を定義するために、感染細胞の型を同定した。臨床由来株ＴＢ４０／ＥおよびＰＴ３０（広範囲の細胞指向性を特徴とする）、ならびに内皮指向性の低い株ＡＤ１６９により感染させた脱落膜組織を検査した。ＨＣＭＶ感染組織の凍結切片を、特異的細胞マーカを用いた共焦免疫蛍光法により分析した。図９に、浸潤性栄養膜細胞（サイトケラチン７）、内皮細胞（フォン・ヴィレブランド因子）、脱落膜細胞（ビメチン）、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ）、およびマクロファージ（ＣＤ６８）のマーカによる、ＴＢ４９／Ｅ株のウイルス共局在を示す。類似の細胞指向性がＰＴ３０で示されており、ＨＣＭＶによる主要な脱落膜細胞型の全てでｅｘ  ｖｉｖｏ感染が示された。ＡＤ１６９株での感染後の並行実験において、ビメチン陽性間質脱落膜細胞のみのウイルス共局在が、実証され得る。
【０１５１】
脱落膜臓器培養物のＨＣＭＶ感染の阻害
近年の試験により、母体胎児移行および先天性疾患を予防する際の出生前抗ウイルス的介入の潜在的適用性が示唆された（Ｊａｃｑｕｅｍａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  ＢＪＯＧ，１１４，１１１３−１１２１；およびＮｉｇｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５３，１３５０−１３６２）。現在入手し得る抗ＨＣＭＶ薬（即ち、ガンシクロビル、ホルカルネット、およびシドホビル）は全て、催奇形性と見なされているが、アシクロビルおよびＨＣＭＶ  ＨＩＧをはじめとする新規の代替的抗ウイルス薬の選択肢が探求されてきた。
【０１５２】
抗ウイルス活性を評価するための脱落膜臓器培養物の効力を評定するため、および脱落膜中のＨＣＭＶ複製に対する抗ウイルス薬のｅｘ  ｖｉｖｏ効果を検査するために、感染させた脱落膜培養物を異なる濃度のガンシクロビルおよびアシクロビルと共にインキュベートした。脱落膜培養物をＨＣＭＶ株ＴＢ４９／Ｅ（１０５ＰＦＵ／ウェル）に感染させて、ガンシクロビル（ＧＣＶ）またはアシクロビル（ＡＣＶ）濃度を増加させてインキュベートした。治療および未治療の脱落膜組織溶解物中のウイルスＤＮＡを、８ｄｐｉに定量し、値をＲＮａｓｅ  Ｐ  ＤＮＡコピー数により標準化させた。
【０１５３】
図１０には、感染組織中のウイルスＤＮＡ蓄積の用量依存的減少により測定された通り、両方の抗ウイルス薬が脱落膜培養物中のＨＣＭＶ複製を阻害したことが示される。アシクロビルと比較すると、ガンシクロビルは、より高い抗ウイルス効力を示した（ＩＣ５０が１．５μＭ対１８．３μＭ）。これらの知見から、ｅｘ  ｖｉｖｏ感染させた脱落膜培養物は、抗ウイルス的介入効果の試験および本発明の化合物の治療効力の評定に有用であり得ることが実証される。
【０１５４】
感染させた脱落膜培養物中のＨＣＭＶ  ＨＩＧの抗ウイルス効果を検査した。中和活性の試験から、ウイルスと共にプレインキュベートされた場合のＨＣＭＶ  ＨＩＧ調製物が、脱落膜のＨＣＭＶ感染を中和できることが示された（図１１Ａ）。ウイルスを５０％中和するための計算されたＨＩＧ濃度は、３６μｇ／ｍｌであった。ＨＣＭＶ  ＩｇＧ陰性血清では、抗ウイルス効果は全く観察されなかった。この知見は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの母体−胎児移行の予防におけるＨＩＧの予防効果と相関し得る。脱落膜培養物中のＨＣＭＶ  ＨＩＧの中和活性が、線維芽細胞培養物中の中和活性よりも高かったことに、留意しなければならない。比較実験において、ＨＣＭＶ  ＨＩＧの中和力価は、ＨＦＦ細胞培養物よりも脱落膜培養物で１０倍を上回る低さであった。ＨＩＧの潜在的治療効果を更に検査するために、ウイルス吸着後に添加された場合の抗ウイルス活性を検査した。組織は、吸着後２４時間目に十分に洗浄し、その後、ＨＩＧの希釈率を増加させながら培地に添加した。ＨＣＭＶ複製の有意な用量依存性阻害が明瞭に示され（図１１Ｂ）、ＩＣ５０は６５２μｇ／ｍｌであった。吸着後に添加された場合のＨＩＧの阻害効果は、感染後の後期にプラーク様クラスターの拡散が減少することによっても明白となった。対照的に、吸着後の阻害作用は、ＨＦＦ細胞培養物中では観察されなかった。これらの試験から、脱落膜中で併せて起こるＨＣＭＶ  ＨＩＧの中和および吸着後抗ウイルス効果が明らかとなった。
【０１５５】
こうして、組織中の活発なウイルス複製が、１）感染後２〜９日間隔でのウイルスＤＮＡの一定した増加と共に、ＧＦＰ発現ＨＣＭＶ株に感染した後のＧＦＰ発現細胞の小増殖層が徐々に進行すること；２）感染臓器培養物中の前早期および真正後期の両方のＲＮＡおよび蛋白質の発現；３）自然な感染の典型的な組織病理学的特徴の出現；ならびに４）抗ウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤ガンシクロビルによるウイルス拡散およびＤＮＡ蓄積の用量依存的阻害、により実証された。これらの知見を組み合わせると、ウイルス親和性および拡散の動的態様に取り組むためのｅｘ  ｖｉｖｏ感染脱落膜臓器培養物の能力が実証される。
【０１５６】
脱落膜中のＨＣＭＶ臨床由来株に感染させた、浸潤性ＣＴＢ、内皮細胞、マクロファージ、間質脱落膜細胞および樹状細胞などの広範囲の細胞が同定された。この知見は、脱落膜の独特の多重細胞性を反映している。脱落膜中の感染細胞は、線維芽細胞中および上皮／内皮細胞中で特徴づけられたウイルス侵入の２つの異なる経路、即ちそれぞれ融合による経路（細胞表面で）およびエンドサイトーシスによる経路を表す。ＨＣＭＶのエンドサイトーシスによる侵入は、ウイルスｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８−１３１複合体を必要とすることが示されたが、ＵＬ１２８−１３１蛋白質は、ＨＣＭＶの融合による侵入にとって肝要ではない。
【０１５７】
ＨＣＭＶ  ＨＩＧのウイルス中和効果と感染後効果を組み合わせあることで、脱落膜臓器培養物中のｅｘ  ｖｉｖｏモデルによる、母体−胎児境界部分で新たな抗ウイルス的介入の効果を評価する能力が実証される。例えば感染させた脱落膜臓器培養物は、抗ＨＣＭＶ薬の出生前の予防的および治療的使用を行う臨床試験のためのメカニズム上の原理を提供することができた。新規な脱落膜臓器培養物中のＨＣＭＶ感染のｅｘ  ｖｉｖｏモデリングにより、広い標的細胞範囲が、臨床由来および検査室由来の両ウイルス株の伝播の一定した細胞間様式と共に明らかとなった。このモデルを利用して、本発明の化合物の効力を、新規で効果的で非催奇形性の抗ＨＣＭＶ薬として評価することができる。
【０１５８】
特定の実施形態の前述の記載から、他者が、現在の知識を適用することにより、過度の実験を行わず一般的概念から逸脱せずに、そのような特定の実施形態を様々な適用例に向けて即座に改良および／または適合させ得る、という本発明の一般的性質が完全に明らかとなり、それゆえそのような適合および改良は、開示された実施形態の均等物の意味および範囲内で解釈されるべきであり、解釈されることを意図する。本明細書で用いられる語法または用語法が、限定ではなく説明を目的としていることが理解されなければならない。様々な開示された機能を実行する手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱せずに様々な別の形態をとることができる。
【０１５９】
本発明の主旨および範囲内での様々な変更および改良がこの詳細な説明から当業者に明白となるため、本発明の好ましい実施形態を示しながら詳細な説明および具体的実施例が例示によって与えられたに過ぎないことは、理解されなければならない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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