(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表示される化合物、その光学異性体、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含む、腎疾患の治療用薬学的組成物。
【化１】
0006352411.tif 000006
（式中、ＸはＯＲ１を示し、Ｒ１はそれぞれＣ１〜Ｃ５の低級アルキルを示す。）
【請求項２】
前記Ｒ１が三級ブチル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ）である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記薬学的に許容される塩が、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸及びアジピン酸よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記化学式１で表示される化合物、その光学異性体、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくは溶媒和物が、ＤＰＰ−ＩＶ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−ＩＶ）阻害剤である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記薬学的組成物が他の抗糖尿病薬をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記抗糖尿病薬が、ビグアニド薬（Ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）、インスリン抵抗性改善薬（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）、インスリン分泌促進剤（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ）、α−グルコシダーゼ阻害剤（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及びカンナビノイド受容体−１拮抗薬（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記薬学的組成物がアンジオテンシン変換酵素阻害薬またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記腎疾患が糸球体腎疾患である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記腎疾患が糖尿病性腎症である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎疾患予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、生体の恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を維持する重要な臓器であって、体内体液量、血液中のイオン濃度及びｐＨを調節し、代謝性老廃物、毒素、薬物などの老廃物を排泄し、血圧の調節及びその他の代謝性、内分泌機能を実行する。さらに、ビタミンＤを活性化させて小腸内でのカルシウム吸収を助けるうえ、様々なホルモンの合成にも関与する。
このような腎臓が、排泄、調節、代謝及び内分泌的機能を正常に実行できず、全体的に機能が低下したり異常が生じた状態を腎疾患という。腎臓の損傷に起因する機能低下は、腎臓及び関連構造の増大、腎臓の萎縮、体液量の変化、電解質の不均衡、代謝性アシドーシス、ガス交換障害、抗感染機能の損傷、尿毒性毒素の蓄積などをもたらす。
【０００３】
腎疾患は、進行状態によって急性腎不全、慢性腎不全に分類され、あるいは、発病原因によって血管複合体の沈着による糸球体腎炎、糖尿病に伴う糖尿病性腎症または高血圧に伴う高血圧性腎症、抗生剤または抗癌剤などの薬物投与による中毒性腎症、細菌感染などに分けられる。  
原因となる腎臓病の種類を問わず、慢性的に腎機能障害が進行して糸球体濾過量が５０％以下に減少すると、ほとんどの場合、糸球体濾過量がますます減少し、最終的には末期腎不全に至り、血液学的異常、神経系の合併症、胃腸管系の合併症、免疫学的合併症、感染または骨形成異常症などの合併症が起こり、ひどい場合は死に至ることもある。  
【０００４】
腎疾患は、全世界的に毎年、その発病者が増加しており、しかも、症状が現れていないかあるいはちゃんと認知されておらず、初期発見しても末期腎不全に至る場合が多い。米国腎臓データシステム（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｒｅｎａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＲＤＳ）に報告されたメディケア（Ｍｅｄｉｃａｒｅ）受益者を対象とした分析によれば、２０００年に２．７％であった慢性腎不全の有病率は、２００９年に８．５％に増加した。韓国の場合も、２００６年比で、２０１０年に慢性腎不全で診療を受けた患者数は合計３７．１％、年平均に換算したときに８．２％ずつ増加したと報告されている。このような現象は、肥満及び糖尿病患者の増加による糖尿病性腎症の発症の増加とも密接な関連がある。
【０００５】
ＤＰＰ−ＩＶ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−ＩＶ）は、アデノシンデアミナーゼ複合たんぱく質（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）２またはＣＤ２６としても知られているタンパク質であって、ＤＰＰ−ＩＶ遺伝子によって暗号化される。ＤＰＰ−ＩＶは、免疫反応に関与すると報告されたことがあり、インスリンの分泌を促進し且つグルカゴンの分泌を抑制するタンパク質であるＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）の分解に関与して糖代謝に重要な役割を果たすと知られている。ＤＰＰ−ＩＶは、腎臓の近位尿細管細胞（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｕｂｕｌｅ  ｃｅｌｌ）、糸球体基底膜及び有足細胞（ｐｏｄｏｃｙｔｅ）に多数分布すると報告されている。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、ＧＬＰ−１が分解されることを防ぎ、活性を維持するようにして血糖値を下げる機能があり、低血糖を誘発する副作用がないので糖尿病治療薬として現在用いられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、腎疾患の予防または治療に効果的な組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明者らは、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤であるＤＡ１２２９が腎疾患の予防または治療効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
そこで、本発明は、下記化学式１で表示される化合物、その光学異性体、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物または溶媒和物を有効成分として含む、腎疾患予防または治療用薬学的組成物を提供する。  
【０００９】
【化１】
0006352411.tif 000002
【００１０】
（式中、ＸはＯＲ１を示し、Ｒ１はそれぞれＣ１〜Ｃ５の低級アルキルを示す。）
【００１１】
前記化学式１のＲ１は三級ブチル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ）であってもよい。この化合物は、（Ｒ）−４−｛（Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ブタノイル｝−３−（ｔ−ブトキシメチル）ピペラジン−２−オン（（Ｒ）−４−｛（Ｒ）−３−ａｍｉｎｏ−４−（２，４，５−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔａｎｏｙｌ｝−３−（ｔ−ｂｕｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−２−ｏｎｅ）またはＤＡ１２２９と呼ばれ、その構造は下記化学式２のとおりである。
【００１２】
【化２】
0006352411.tif 000003
【００１３】
ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、従来から血糖を調節する糖尿病治療薬としてのみ認識されてきたが、本発明者らは、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が血糖調節効果とは別に、直接腎臓に対する保護効果を有することを実験によって確認し、本発明を完成するに至った。本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、ＤＰＰ−ＩＶ活性を抑制し、脂質代謝を増進させて血漿及び肝臓の脂質濃度を低める。さらに、腎機能を改善させる、タンパク質排泄を減少させて微量アルブミン尿を改善する、腎線維化を減少させる、腎肥大（ｎｅｐｈｒｏｍｅｇａｌｙ）を改善する、ネフリン発現量を増加させる、ネフリンの排泄を防ぐなどの効果がある。
【００１４】
本発明の組成物で予防または治療することが可能な腎疾患は、様々な原因によって誘発されて様々な臨床症状を示す可能性のあるものであり、糖尿病性腎症だけでなく、糖尿病とは無関係に発生した腎疾患、すなわち非糖尿病性腎疾患であってもよい。本発明の組成物で予防または治療することが可能な腎疾患は、例えば、糖尿病性腎症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、高血圧性腎症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性嚢胞腎（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腎疾患（糸球体腎炎など）、薬物または各種毒素によって誘発される中毒性腎症（ｔｏｘｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）などであってもよい。臨床的には、大きくアルブミン尿を特徴とする糸球体の異常に起因する糸球体性腎疾患（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）と尿細管血管間質の異常に起因する尿細管間質性疾患（ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）などであってもよい。
【００１５】
本発明において、前記薬学的に許容される塩は、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸（ｍｕｃｉｃ ａｃｉｄ）、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、アジピン酸などを含む。酢酸、クエン酸、塩酸、リンゴ酸、リン酸、コハク酸、酒石酸及びアジピン酸よりなる群から選択できるが、これに限定されない。
【００１６】
本発明の前記化学式１で表示される化合物、その光学異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩の水和物は、非共有性分子間力で結合される化学量論的または非化学量論的量の水を含むことができる。前記水和物は１当量以上、好ましくは１当量〜５当量の水を含有することができる。このような水和物は、水または水を含有する溶媒から、本発明の前記化学式１または２で表示される化合物、その光学異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩を結晶化させて製造できる。
【００１７】
本発明の前記化学式１で表示される化合物、その光学異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩の溶媒和物は、非共有性分子間力で結合される化学量論的または非化学量論的量の溶媒を含むことができる。前記溶媒として好ましいものは、不揮発性、非毒性、またはヒトへの投与に適した溶媒を挙げることができ、例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、塩化メチレンなどがある。
【００１８】
前記化学式１で表示される化合物、その光学異性体、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物または溶媒和物はＤＰＰ−ＩＶ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−ＩＶ）阻害剤である。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、ＧＬＰ−１が分解されることを防ぎ、活性を維持するようにして血糖値を下げる機能がある。
【００１９】
本発明において、前記薬学的組成物は、化学式１以外の他の付加的な活性成分を含むことができる。前記付加的な活性成分は、化学式１と同じ活性または異なる活性を有することができる。
【００２０】
たとえば、前記付加的な活性成分は抗糖尿病薬であってもよい。したがって、本発明において、前記薬学的組成物は、他の抗糖尿病薬をさらに含むことができる。前記抗糖尿病薬はビグアニド薬（Ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）、インスリン抵抗性改善薬（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）、インスリン分泌促進剤（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ）、α−グルコシダーゼ阻害剤（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及びカンナビノイド受容体−１拮抗薬（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）よりなる群から選択できるが、これに限定されない。
【００２１】
本発明のビグアニド薬は、ビグアニド（ｂｉｇｕａｎｉｄ）構造を含む嫌気性解糖促進作用、末梢でのインスリン作用を増強する効果、腸管からのグルコース吸収抑制及び肝臓での糖新生抑制効果などを有する薬物であって、前記ビグアニド薬は、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、ブホルミン（ｂｕｆｏｒｍｉｎ）及びフェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）よりなる群から選択できるが、これに限定されない。
【００２２】
本発明のインスリン抵抗性改善薬は、インスリン作用不全を改善して血糖値を減少させる作用をする薬物であって、共通的にチアゾリジンジオン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎ−ｄｉｏｎｅ、ＴＺＤ）構造を持つ特徴があり、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＰＰＡＲ）に作用する。前記インスリン抵抗性改善薬は、トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、シグリタゾン（ｃｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）及びエングリタゾン（ｅｎｇｌｉｔａｚｏｎｅ）よりなる群から選択できるが、これに限定されない。
【００２３】
本発明のインスリン分泌促進剤は、膵臓のβ細胞のインスリン分泌を促進する薬物であって、スルホニルウレア構造あるいは非スルホニルウレア構造の薬物（Ｎｏｎ−ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ）であってもよい。好ましくは、グリベンクラミド（ｇｌｙｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ、グリブリド（ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ））、グリピジド（ｇｌｉｐｉｚｉｄｅ）、 グリクラジド（ｇｌｉｃｌａｚｉｄｅ）、グリメピリド（ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）、トラザミド（ｔｏｌａｚａｍｉｄｅ）、トルブタミド（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）、アセトヘキサミド（ａｃｅｔｏｈｅｘａｍｉｄｅ）、カルブタミド（ｃａｒｂｕｔａｍｉｄｅ）、クロルプロパミド（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｍｉｄｅ）、グリボルヌリド（ｇｌｉｂｏｒｎｕｒｉｄｅ）、グリキドン（ｇｌｉｑｕｉｄｏｎｅ）、グリセンチド（ｇｌｉｓｅｎｔｉｄｅ）、グリソラミド（ｇｌｉｓｏｌａｍｉｄｅ）、グリソキセピド（ｇｌｉｓｏｘｅｐｉｄｅ）、グリクロピラミド(ｇｌｙｃｌｏｐｙａｍｉｄｅ）、グリシクラミド（ｇｌｙｃｙｃｌａｍｉｄｅ）及びグリペンチド（ｇｌｉｐｅｎｔｉｄｅ）よりなる群から選択されるスルホニルウレア構造の薬物であるか、あるいはレパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）またはナテグリニド（ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｅ）の非スルホニルウレア構造の薬物であるが、これに限定されない。
【００２４】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、腸内消化酵素の一種であるα−グルコシダーゼを競争的に抑制して澱粉、二糖類などの消化及び吸収を抑制する機能を持つ薬物である。前記α−グルコシダーゼ阻害剤は、アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）、ボグリボース（ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ）、エミグリテート（ｅｍｉｇｌｉｔａｔｅ）及びミグリトール（ｍｉｇｌｉｔｏｌ）よりなる群から選択できるが、これに限定されない。
【００２５】
本発明のカンナビノイド受容体−１拮抗薬は、内因性カンナビノイド（ｅｎｄｏｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ）の過剰な活性を抑制して体重、エネルギーバランスを調節するだけでなく、糖及び脂質代謝を調節する薬物である。前記カンナビノイド受容体−１拮抗薬は、リモナバント（Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）、オテナバント（Ｏｔｅｎａｂａｎｔ）、イビナバント（Ｉｂｉｎａｂａｎｔ）及びスリナバント（Ｓｕｒｉｎａｂａｎｔ）よりなる群から選択できるが、これに限定されない。
【００２６】
また、例えば、本発明の組成物の付加的な活性成分は、アンジオテンシンの作用を抑制することが可能な成分であってもよい。したがって、本発明において、前記薬学的組成物は、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｌｏｃｋｅｒ）をさらに含むことができる。
【００２７】
前記アンジオテンシン変換酵素阻害薬は、カプトプリル（ｃａｐｔｏｐｒｉｌ）、エナラプリル（ｅｎａｌａｐｒｉｌ）、ベナゼプリル（ｂｅｎａｚｅｐｒｉｌ）、イミダプリル（ｉｍｉｄａｐｒｉｌ）、リシノプリル（ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ）、ペリンドプリル（ｐｅｒｉｎｄｏｐｒｉｌ）、ラミプリル（ｒａｍｉｐｒｉｌ）、モエキシプリル（ｍｏｅｘｉｐｒｉｌ）、ホシノプリル（ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ）及びキナプリル（ｑｕｉｎａｐｒｉｌ）よりなる群から選択できるが、これに限定されない。
【００２８】
前記アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬は、カンデサルタン（ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ）、エプロサルタン（ｅｐｒｏｓａｒｔａｎ）、イルベサルタン（ｉｒｂｅｓａｒｔａｎ）、ロサルタン（ｌｏｓａｒｔａｎ）、テルミサルタン（ｔｅｌｍｉｓａｒｔａｎ）及びバルサルタン（ｖａｌｓａｒｔａｎ）よりなる群から選択できるが、これに限定されない。
【００２９】
また、例えば、本発明の組成物の付加的な活性成分は抗高血圧薬であってもよい。したがって、本発明において、前記薬学的組成物は、抗高血圧薬であるカルシウムチャンネル遮断薬（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｈａｎｅｌ  Ｂｌｏｃｋｅｒ、ＣＣＢ）、β遮断薬（ｂｅｔａ  ｂｌｏｃｋｅｒ）または利尿剤をさらに含むことができるが、これに限定されない。
【００３０】
本発明の組成物に関連して使用された用語「薬学的に許容される」は、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与したときに生理的に許容され、一般に望ましくない反応を生じさせないこのような組成物の分子本体及びその他の成分を意味する。  
【００３１】
本発明の組成物は担体をさらに含むことができる。本発明の薬学的組成物に適用された用語「担体」は、活性化合物と一緒に投与される希釈剤、賦形剤またはビヒクルを意味する。このような薬剤学的担体は、水、塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、及び落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油のような石油、動物、植物または合成起源のオイルを含むオイルなどの滅菌液体であってもよい。好適な薬剤学的担体は、文献（“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”ｂｙ  ＥＷ  Ｍａｒｔｉｎ、１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）に記述されている。本発明において、特に好ましくは、即時放出、すなわち６０分以下のような短時間にわたって活性成分のほとんどまたは全部を放出するのに適し、薬物の速やかな吸収を可能にする担体である。
【００３２】
本発明の前記化学式１で表示される化合物、その光学異性体、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物または溶媒和物は、組成物の全重量に対して０．１〜５０重量％で含むことが好ましいが、これに制限されない。
本発明の組成物は、実際の臨床投与の際に経口及び非経口の様々な剤形で投与できる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤及び界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製できる。
【００３３】
経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤及びカプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、本発明の薬学的組成物に少なくとも１種の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース及びゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウム、ステアリン酸、タルクなどの潤滑剤も使用できる。
【００３４】
経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤及びシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤及び保存剤などが含まれ得る。  
【００３５】
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤が含まれる。非水性溶剤と懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール及びゼラチンなどが使用できる。本発明の薬学的組成物は、非経口投与の際に皮下注射、静脈注射または筋肉内注射を介して投与できる。
【００３６】
本発明の薬学的組成物の投与量は、体重７０ｋｇの成人を基準にして１日０．５〜１００ｍｇ内で調節できる。但し、投与される最適の投与量は当業者によって容易に決定でき、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の含有量、剤形の種類、及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路、及び組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物などの様々な因子に応じて調節できる。
【００３７】
本発明は、治療が必要な対象体に、治療学的に有効な量の前記化学式１で表される化合物、その光学異性体、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物または溶媒和物を投与して腎疾患を予防または治療する方法を提供する。  
【００３８】
ここで使用された「治療が必要な対象体」は、ヒトを始めとする哺乳動物を意味し、「投与」は、任意の適切な方法で患者に所定の物質を提供することを意味する。「治療学的に有効な量」は、研究者、獣医師、医師またはその他の臨床医によって考えられる、動物またはヒトで生物学的または医学的反応を誘導する活性成分または薬学的組成物の量を意味するもので、これは治療される疾患または障害の症状緩和を誘導する量を含む。本発明の有効成分に対する治療上の有効投与量及び投与回数が所望の効果に応じて変化することは、当業者にとって自明である。
【００３９】
本発明は、腎疾患の治療のための薬剤学的製剤を製造するが、前記化学式１で表示される化合物、その光学異性体、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物または溶媒和物を使用する用途を提供する。
【発明の効果】
【００４０】
本発明の前記化学式１で表示される化合物、その光学異性体、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物または溶媒和物を有効成分として含む、腎疾患予防または治療用薬学的組成物は、脂質代謝を改善し、腎線維化などの組織学的損傷を防ぎ、微量アルブミン尿を改善する効果を持つ。よって、腎疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】糖尿病の時期による血漿ＤＰＰ−ＩＶ活性度の変化を示す図である。
【図２ａ】糖尿病の時期による腎臓、肝臓、心臓、脂肪組織のＤＰＰ−ＩＶ活性度の変化を示す図である。
【図２ｂ】糖尿病の時期による腎臓、肝臓、心臓、脂肪組織のＤＰＰ−ＩＶ活性度の変化を示す図である。
【図２ｃ】糖尿病の時期による腎臓、肝臓、心臓、脂肪組織のＤＰＰ−ＩＶ活性度の変化を示す図である。
【図２ｄ】糖尿病の時期による腎臓、肝臓、心臓、脂肪組織のＤＰＰ−ＩＶ活性度の変化を示す図である。
【図３ａ】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後における腎臓、肝臓、心臓、脂肪組織のＤＰＰ−ＩＶ活性度の変化を示す図である。
【図３ｂ】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後における腎臓、肝臓、心臓、脂肪組織のＤＰＰ−ＩＶ活性度の変化を示す図である。
【図３ｃ】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後における腎臓、肝臓、心臓、脂肪組織のＤＰＰ−ＩＶ活性度の変化を示す図である。
【図３ｄ】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後における腎臓、肝臓、心臓、脂肪組織のＤＰＰ−ＩＶ活性度の変化を示す図である。
【図４】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後における脂質代謝の変化を示す図である。
【図５】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後の肝臓脂肪症を観察して示す図である。
【図６】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後における微量アルブミン尿の変化を示す図である。
【図７】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後の腎メサンギウム拡大を示す図、及びこれをスコアリング（ｓｃｏｒｉｎｇ）して示す図である。
【図８】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後における腎臓の線維性タンパクの沈着を示す図である。
【図９】図８の組織学的変化をスコアリングして示す図である。
【図１０】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後における腎臓の線維性タンパク遺伝子発現を示す図である。
【図１１】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後における腎臓の脂質代謝タンパク遺伝子発現を示す図である。
【図１２】ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後における腎臓の脂質代謝タンパク遺伝子発現のＰＣＲ結果を示す図である。
【図１３】左の図は糖尿病性腎障害マウスモデルにおけるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用後の尿中ネフリン排泄量を測定して示すグラフであり、右の図はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の使用が腎糸球体のネフリン発現に及ぼす効果を免疫染色で確認して示す図である。
【図１４】非糖尿病性腎障害マウスモデルにおける腎障害誘導と同時にＤＰＰ−ＩＶ阻害剤投与時の微量アルブミン尿（Ａ）、及びネフリン排泄（Ｂ）に及ぼす効果を示す図である。
【図１５】非糖尿病性腎障害マウスモデルにおける腎障害誘導後のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤投与時の微量アルブミン尿（Ａ）、及びネフリン排泄（Ｂ）に及ぼす効果を示す図である。
【図１６】腎臓の有足細胞、近位尿細管細胞及びメサンギウム細胞に高グルコース、アンジオテンシンＩＩ及び脂肪酸の刺激を加えてＤＰＰ−ＩＶ遺伝子発現を観察して示す図である。
【図１７】既存のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（リナグリプチン、サクサグリプチン及びシタグリプチン）と本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤とのＤＰＰ−ＩＶ活性抑制効果を比較して示す図である。
【図１８】腎臓の有足細胞に高グルコース及びアンジオテンシンＩＩの刺激を加えて既存のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（リナグリプチン、サクサグリプチン及びシタグリプチン）と本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤とのネフリン発現に及ぼす効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明を実施例及び試験例によって詳細に説明する。ところが、これらの実施例及び試験例は、本発明を例示するためのもので、本発明を限定するものではない。
また、以下に記載された試薬及び溶媒は、特別な記載がない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｋｏｒｅａから購入したものである。
【実施例】
【００４３】
〈実施例１〉体重、飲食摂取量、水分摂取量、空腹時血糖、尿量、ヘモグロビンＡ１ｃ値及び血圧の評価
（１）非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群の準備
生後６週齢のマウスを使用した。ｄｂ／ｍマウスを非糖尿病対照群（各時期別に７匹、ｎ＝２８）とし、ｄｂ／ｄｂマウスを糖尿病群（各時期別に７匹、ｎ＝２８）とＤＡ１２２９投与群（ｎ＝８）に分けた。ＤＡ１２２９投与群にはＤＰＰ−ＩＶ阻害剤であるＤＡ１２２９を０．３％（Ｗ／Ｗ、３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）用量で飼料に混ぜて供給し、糖尿病群には試料のみを供給した。
【００４４】
（２）体重、飲食摂取量、水分摂取量、空腹時血糖、尿量、ヘモグロビンＡ１ｃ値及び血圧の測定
非糖尿病対照群（ｄｂ／ｍ対照群）及び糖尿病群（ｄｂ／ｄｂ）でそれぞれ投与０、４、８、１２週目に体重、飲食摂取量、水分摂取量、空腹時血糖、尿量、ヘモグロビンＡ１ｃ値（ＨｂＡｌｃ）及び血圧（ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ、ＳＢＰ）を測定し、ＤＡ１２２９投与群では投与１２週目に測定した。ヘモグロビンＡ１ｃ値はＤＣＡ２０００＋（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｗｕｐｐｅｒｔａｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）血糖測定器で測定した。
結果は下記表１に示す。
【００４５】
【表１】
0006352411.tif 000004
【００４６】
上記表において、各値は平均±ＳＥＭとして表され、統計的分析は同じ期間に各群で行われた。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１対（ｖｓ．）ｄｂ／ｍ対照群；＃Ｐ＜０．０５対（ｖｓ．）ｄｂ／ｄｂ。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群では体重が増加し、飲食摂取量、水分摂取量、空腹時血糖、尿量が大幅に増加した。  
【００４７】
１２週間ＤＡ１２２９を投与したＤＡ１２２９投与群の場合は、糖尿病群と比較して体重、飲食摂取量、尿量には有意な差を示さなかった。ところが、水分摂取量及び空腹時血糖値は大幅に減少した。
上述した結果から、ＤＡ１２２９が血糖量を下げ且つ糖の排泄を減少させる機能を行うことが分かる。
【００４８】
〈実施例２〉ＤＰＰ−ＩＶ活性の評価
ＤＰＰ−ＩＶ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ）はインクレチンを分解する酵素である。インクレチンは、小腸から分泌されてインスリンの分泌を促進するホルモンであって、ＤＰＰ−ＩＶの活性が抑制されると、インクレチンの活性が維持されてインスリンの分泌が促進される。
【００４９】
したがって、ＤＡ１２２９によってＤＰＰ−ＩＶ活性が効果的に抑制されるか否かを確認するために、血漿及び各臓器のＤＰＰ−ＩＶ活性を評価した。前記実施例１の（１）に記載されたのと同様に、非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群を準備して実験に使用した。
【００５０】
ＤＰＰ−ＩＶ活性の測定は、従来報告された(J. Med. Chem. 2005, 48, 141-151)蛍光光度検定（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）法を用いて測定した。図１は血漿内のＤＰＰ−ＩＶ活性度を示す図である。非糖尿病対照群と糖尿病群は糖尿病の進行の各時期にＤＰＰ−ＩＶ活性における有意な差を示さなかった（図１Ａ）。ところが、投与２０週目にＤＡ１２２９投与群は非糖尿病対照群及び糖尿病群と比較してＤＰＰ−ＩＶ活性が著しく抑制されることを確認することができた（図１Ｂ）。
【００５１】
図２は非糖尿病対照群と糖尿病群の腎臓、肝臓、心臓及び脂肪組織における糖尿病の進行の各時期のＤＰＰ−ＩＶ活性度を示す図である。各臓器におけるＤＰＰ−ＩＶ活性度は高かった。非糖尿病対照群と糖尿病群は肝臓、心臓及び脂肪組織におけるＤＰＰ−ＩＶ活性度が群間で大きな差を見せなかったが（図２Ｂ〜２Ｄ）、腎臓では糖尿病が進行するほど糖尿病群のＤＰＰ−ＩＶ活性度が有意に増加した（図２Ａ）。
【００５２】
図３は投与２０週目に非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群の腎臓、肝、心臓及び脂肪組織におけるＤＰＰ−ＩＶ活性度を示す図である。各臓器において、ＤＡ１２２９投与群は非糖尿病対照群及び糖尿病群と比較してＤＰＰ−ＩＶ活性度が大幅に減少した。このような減少は腎臓で著しかった（図３Ａ）。
【００５３】
上記の結果から、ＤＡ１２２９は全ての臓器でＤＰＰ−ＩＶ活性を抑制し、特に腎臓でＤＰＰ−ＩＶ活性を効果的に抑制することが分かった。
【００５４】
〈実施例３〉脂質代謝の評価
糖尿病にかかると、脂質が正常に代謝されないため、血中脂質が増加し、肝に脂質が沈着する傾向（肝臓脂肪症）がある。ＤＡ１２２９によって脂質代謝改善効果が示されるかどうかを確認するために、次の実験を行った。前記実施例１の（１）に記載されたのと同様に、非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群を準備して実験に使用した。
【００５５】
（１）血漿中脂質濃度の評価
総コレステロールは、エステル型コレステロールと非エステル型（遊離）コレステロールを含み、中でも、ＬＤＬ−コレステロールの濃度が増加すると、動脈硬化などの問題が発生する。  
投与１２週目に非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群で血漿から脂質である総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ−コレステロール及びＬＤＬ−コレステロールの濃度を測定した。総コレステロールとトリグリセリドの濃度は、ＧＰＯ−Ｔｒｉｎｄｅｒキット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用した後、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｉｃｒｏ−Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｍａｒ、Ｆｒａｎｃｅ）で測定し、ＨＤＬ−コレステロール及びＬＤＬ−コレステロールはＴＢＡ−２００ＦＲ  ＮＥＯ（東芝、日本）で測定した。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群では総コレステロール、トリグリセリド及びＬＤＬ−コレステロールの濃度が約２倍以上増加するが、ＤＡ１２２９の投与によって、このような増加が非糖尿病対照群のレベルに回復することが観察された（図４）。
【００５６】
（２）肝臓脂肪症（ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）の評価
投与１２週目に非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群から採取した肝組織をミクロトームで断片化した後、アルコール脱水過程を経て、パラフィン包埋した。この断片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ）で染色した後、顕微鏡（ＳＴＭ６−ＬＭ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＮＤＴ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）で脂質沈着有無を観察した（図５）。非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群では肝組織の脂質沈着が増加したが、ＤＡ１２２９投与群ではこのような増加が非糖尿病対照群のレベルに回復することが観察された。
上記の結果から、ＤＡ１２２９は糖尿病によって減少した脂質代謝を増加させる効果があることが分かる。
【００５７】
〈実施例４〉腎機能の評価
ＤＡ１２２９投与で、腎疾患により低下した腎機能が改善されるかどうかを確認するために、次の実験を行った。前記実施例１の（１）に記載されたのと同様に、非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群を準備した。
【００５８】
（１）血漿クレアチニンの評価
クレアチンは、腎臓によって排泄される物質であって、腎臓クリアランスの問題が発生すると、血漿中のクレアチニンの濃度が高くなる。
【００５９】
【表２】
0006352411.tif 000005
【００６０】
上記の表では、各値は平均±ＳＥＭとして表され、統計的分析は同じ期間に各群で行われた。†Ｐ＜０．０１対（ｖｓ．）ｄｂ／ｄｂ。
ＴＢＡ−２００ＦＲ  ＮＥＯ（東芝、日本）を用いて、変形ヤッフェ法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｊａｆｆｅ  ｍｅｔｈｏｄ）(Kang YS et al., CCR2 antagonism improves insulin resistance, lipid metabolism, and diabetic nephropathy in type 2 diabetic mice. Kidney Int. 2010 Nov;78(9):883-894, Kang YS et al., Visfatin is upregulated in type-2 diabetic rats and targets renal cells. Kidney Int. 2010 Jul;78(2):170-181)により血漿中のクレアチニン濃度を測定した。
前記表２から、非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群では血漿クレアチニン濃度が増加し、ＤＡ１２２９投与群では血漿クレアチニン濃度が大幅に減少したことを確認することができる。  
【００６１】
（２）微量アルブミン尿の観察
糖尿病が進行すると、腎糸球体が破壊されてタンパク質（アルブミン）が排泄される現象が現れ、少量が排泄された場合を微量アルブミン尿という。微量アルブミン尿は腎疾患の最初の指標の一つであり、糖尿病が進行すればするほど、腎糸球体がひどく破壊されてタンパク質の排泄量が増加する。前記実施例１の（１）に記載されたのと同様に、非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群を準備し、実験に使用した。
【００６２】
投与０、４、８、１２週目に非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群で２４時間尿中へ排泄されるアルブミンの量を測定して微量アルブミン尿を観察した。ＥＬＩＳＡキット（Ｓｈｉｂａｙａｇｉ、Ｓｈｉｂｕｋａｗａ、日本）を使用した後、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｉｃｒｏ−Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｍａｒ、Ｆｒａｎｃｅ）によって、排泄されるアルブミンの量を測定した。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群では排泄されるアルブミンの量が増加し、このような増加は糖尿病が進行すればするほど顕著になった。ところが、ＤＡ１２２９投与群では、４週目まで微量アルブミン尿が現れておらず、その後も糖尿病群よりも一層少ない量のアルブミンが尿中へ排泄された（図６）。
上記の結果から、ＤＡ１２２９投与によって腎臓の排泄機能が改善されてタンパク質排泄が減少することが分かる。  
【００６３】
〈実施例５〉腎メサンギウム拡大の組織学的評価
腎疾患で腎臓破壊が進行すると、腎臓でメサンギウム拡大（ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）が起こる。したがって、非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群で糸球体のメサンギウムの拡大を確認した。前記実施例１の（１）に記載されたのと同様に、非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群を準備して実験を進行し、投与１２週目に確認した。
腎糸球体組織を採取してミクロトームで断片化した後、アルコール脱水過程を経て、パラフィン包埋した。この断片をＰＡＳ（ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ）で染色し、顕微鏡（ＳＴＭ６−ＬＭ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＮＤＴ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）で観察し（図７Ｂ）、病理学者がこれをスコアリングした（図７Ａ）。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群ではメサンギウム拡大が観察されるが、ＤＡ１２２９投与群ではこのような効果が非糖尿病対照群に近いレベルに改善された。
上記の結果から、ＤＡ１２２９が腎糸球体破壊効果を改善することが分かる。  
【００６４】
〈実施例６〉腎線維化の評価
腎疾患で腎臓に線維性タンパク質が沈着して、病気が進行するにつれて腎臓が破壊される症状が現れる。  
ＴＧＦβ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  β１）は、腎臓の線維化を誘発するサイトカインであり、タイプＩＶコラーゲンは線維組織を形成する基質である。ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１）は血栓の生成を誘発する。この３種のタンパク質はいずれも腎線維化の指標である。
ＤＡ１２２９が腎線維化を抑制する効果を示すか否かを確認するために、次の実験を行った。前記実施例１の（１）に記載されたのと同様に、非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群を準備して実験を行い、投与１２週目に確認した。
【００６５】
（１）組織学的評価
腎糸球体組織を採取してミクロトームで断片化した後、アルコール脱水過程を経て、パラフィン包埋した。この断片を免疫組織化学方法で染色し、顕微鏡（ＳＴＭ６−ＬＭ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＮＤＴ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）で、腎臓に沈着したＴＧＦβ１、タイプＩＶコラーゲン及びＰＡＩ−１をそれぞれ確認し（図８）、染色された程度及び範囲を基準として病理学者がこれをスコアリングした（図９）。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群ではＴＧＦβ１が増加したが、ＤＡ１２２９投与群ではこのような効果が大幅に減少した（図８のＡ、図９）。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群ではタイプＩＶコラーゲンが増加したが、ＤＡ１２２９投与群では非糖尿病対照群のレベルに減少した（図８のＢ、図９）。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群ではＰＡＩ−１が増加したが、ＤＡ１２２９投与群では非糖尿病対照群のレベルに減少した（図８のＣ、図９）。
【００６６】
（２）遺伝子発現の評価
前記（１）で確認した線維性タンパク質の減少が遺伝子発現レベルで起こるかどうかを確認するために、ＴＧＦβ１、タイプＩＶコラーゲン及びＰＡＩ−１のｍＲＮＡ発現を確認した。腎臓組織試料からｍＲＮＡを抽出し、ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ試薬が含有されたＰＣＲ容器内でＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  １．５システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）リアルタイムＰＣＲ機械を用いてｍＲＮＡを増幅させた。糖尿病群と非糖尿病対照群におけるそれぞれの標的遺伝子の発現程度をβ−アクチンの発現程度で割った値を図１０に示した。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群ではＴＧＦβ１のｍＲＮＡ発現が増加したが、ＤＡ１２２９投与群では大幅に減少した。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群ではタイプＩＶコラーゲンのｍＲＮＡ発現が２倍以上増加したが、ＤＡ１２２９投与群では減少した。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群ではＰＡＩ−１のｍＲＮＡ発現が約２倍増加したが、ＤＡ１２２９投与群では大幅に減少した。
上記の結果から、ＤＡ１２２９が腎線維化の抑制に優れた効果を発揮することが分かる。  
【００６７】
〈実施例７〉腎臓の脂質代謝の評価
ＡＢＣＡ１は組織からの脂質流出に関与するタンパク質であり、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ（ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）は脂質合成に関与するタンパク質である。ＡＢＣＡ１遺伝子及びＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ遺伝子の発現を確認して、腎臓で脂質代謝が減少するかどうか、及びＤＡ１２２９投与によってこのような現象が改善されるかどうかを確認するために、前記遺伝子のｍＲＮＡ発現を確認した。前記実施例１の（１）に記載されたのと同様に、非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群を準備して実験を行い、投与１２週目に確認した。
腎臓組織試料からｍＲＮＡを抽出し、ＳＹＢＲグリーン（ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ）試薬が含有されたＰＣＲ容器内でＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  １．５システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）リアルタイムＰＣＲ機械を用いてｍＲＮＡを増幅させた。結果は図１１及び図１２に示した。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群ではＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現が減少したが、ＤＡ１２２９群では大幅に増加した。
非糖尿病対照群と比較して、糖尿病群ではＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼのｍＲＮＡ発現が増加したが、ＤＡ１２２９投与群では非糖尿病対照群のレベルに減少した。
上記の結果から、ＤＡ１２２９は腎臓組織への脂質沈着を防ぎ且つ脂質合成を減少させることが分かる。  
【００６８】
〈実施例８〉ネフリン排泄及びネフリン発現に対する影響の評価
ネフリン（ｎｅｐｈｒｉｎ）は、糸球体の濾過膜を形成する有足細胞（ｐｏｄｏｃｙｔｅ）の細胞膜に発現するタンパク質であって、隣接した有足細胞との結合で濾過障壁（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）を形成する。糸球体の損傷によりアルブミン尿が現れる場合、有足細胞のネフリン発現が減少してネフリン障壁が損傷し、尿中へのネフリン分泌が増加する。したがって、投与１２週目に非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群で尿中へのネフリン排泄及び腎臓でのネフリン発現を観察した。前記実施例１の（１）に記載されたのと同様に、非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群を準備し、実験に使用した。
【００６９】
（１）ネフリン排泄の評価
非糖尿病対照群、糖尿病群及びＤＡ１２２９投与群それぞれの尿を採取し、Ｅｘｏｃｅｌｌ社（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）ＥＩＡキットを用いて尿中のネフリン含有量を定量した。これを尿量に比例するクレアチニン（ｃｒｅａｔｉｎｉｎ）排泄量に補正（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｊａｆｆｅ法で測定）して図１３の左のグラフで示した。グラフで示されるように、糖尿病群では非糖尿病対照群よりも尿中のネフリン含有量が増加したが、ＤＡ１２２９投与群では尿中のネフリン含有量が大幅に減少したことを確認することができた。
【００７０】
（２）ネフリン発現の評価
また、各群の腎臓を摘出し、腎臓組織を分離し、ネフリンに対して特異的な抗体で免疫染色して顕微鏡で観察し、図１３の右の図に示した。図１３の右の図から、糖尿病群では非糖尿病対照群と比較して観察された腎糸球体からのネフリンは少なかったが、ＤＡ１２２９投与群ではネフリンは多く観察されることが分かる。
上記の結果から、ＤＡ１２２９投与によって糸球体のネフリン障壁が保存されて腎糸球体の構造が維持され、尿中へのネフリン排泄が減少することが分かる。  
【００７１】
〈実施例９〉非糖尿病性腎障害マウスモデルにおける微量アルブミン尿の観察及びネフリン排泄に対する影響の評価
血糖値や糖尿病とは関係なく、ＤＡ１２２９が腎臓に及ぼす影響を調べるために、非糖尿病性腎障害マウスモデルを準備して次の実験を行った。  
【００７２】
（１）非糖尿病性腎障害マウスモデルの準備
抗癌剤アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ、以下「ＡＤＸ」という）を注射すると、糸球体有足細胞の損傷を誘発して非糖尿病性腎障害を起こす。  
生後６週齢のマウス３０匹にＡＤＸ１３ｍｇ／ｋｇを単回静脈注射した後、３つの群に分け（ｎ＝１０／群）、第１群には直ちにＤＡ１２２９投与を開始して３週間投与することにより、腎障害が発生して進行すると同時にＤＡ１２２９投与が行われるようにし、第２群には３週間待って腎障害が発生することを確認した後、２週間ＤＡ１２２９を投与して腎障害がある程度進行した後、ＤＡ１２２９投与が行われるようにした。第３群は何らの付加的な措置を取らずに対照群とした。第１群及び第２群では、ＤＡ１２２９は０．３％（Ｗ／Ｗ、３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）の用量で飼料に混ぜて投与した。対照群には飼料のみを供給した。投与５週目に、第１群〜第３群で微量アルブミン尿及びネフリン排泄を測定した。
【００７３】
（２）微量アルブミン尿の観察及びネフリン排泄に及ぼす影響の評価
投与３週目に、第１群〜第３群で前記実施例４の（２）に記載されたのと同様の方法で微量アルブミン尿（尿中のアルブミン）を観察し、前記実施例８に記載されたのと同様の方法で尿中ネフリン排泄量に及ぼす影響を評価した。
腎障害を誘導したと同時にＤＡ１２２９を投与した第１群に対する結果は図１４に示した（黒い棒は対照群たる第３群、白い棒は第１群に該当）。図１４から、ＤＡ１２２９投与によって尿中アルブミン排泄量（Ａ）と尿中ネフリン排泄量（Ｂ）が全て有意に減少することを確認することができた。
腎障害誘導の後にＤＡ１２２９を投与した第２群に対する結果は図１５に示した（黒い棒は対照群たる第３群、白い棒は第１群に該当）。図１５から、ＤＡ１２２９投与によって尿中アルブミン排泄量（Ａ）及び尿中ネフリン排泄量（Ｂ）が全て有意に減少することを確認することができた。左の図から、ＤＡ１２２９によるアルブミン排泄減少効果が、時間が経つほど著しく現れることを確認することができる。
上記の結果から、ＤＡ１２２９は糖尿病性腎症だけでなく、非糖尿病性で糸球体が損傷して現れる腎疾患においても糸球体を保護する効果を示すことが分かる。  
【００７４】
〈実施例１０〉糖尿病で発生する刺激時の腎臓細胞のＤＰＰ−ＩＶ発現の評価
糖尿病で発生する刺激によって、腎臓を構成する各細胞においてＤＰＰ−ＩＶ遺伝子発現が増加するかどうかを確認するために、次の実験を行った。  
腎臓組織を構成する細胞である有足細胞（ｐｏｄｏｃｙｔｅ）、近位尿細管細胞（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｕｂｕｌｅ  ｃｅｌｌ）及びメサンギウム細胞（ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ）に、それぞれ糖尿病で発生する刺激と同様にグルコース３０ｍＭ、アンジオテンシンＩＩ１００ｎＭ、遊離脂肪酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）１００ｕＭを４８時間加えた。その後、ＤＰＰ−ＩＶ遺伝子発現を確認した。各細胞で得られた試料からｍＲＮＡを抽出し、ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ試薬が含有されたＰＣＲ容器内でＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  １．５システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）リアルタイムＰＣＲ機械を用いてｍＲＮＡを増幅させた。
メサンギウム細胞ではＤＰＰ−ＩＶ遺伝子発現の増加が観察されなかったが、有足細胞及び近位尿細管細胞ではＤＰＰ−ＩＶ遺伝子発現の増加が観察された（図１６）。
上記の結果から、糖尿病性腎症において有足細胞を含む腎臓細胞のＤＰＰ−ＩＶ発現が増加することが分かる。
【００７５】
〈比較例〉ＤＡ１２２９とその他のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の腎保護効果の比較
ＤＰＰ−ＩＶ抑制機序に作用する薬物であるリナグリプチン（ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、サクサグリプチン（ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）及びシタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）とＤＡ１２２９の効果を次のとおり比較した。  
【００７６】
（１）有足細胞におけるＤＰＰ−ＩＶ活性抑制効果の比較
ＤＡ１２２９、リナグリプチン、サクサグリプチン及びシタグリプチンをそれぞれ０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭの濃度で含む培地で有足細胞を７２時間培養した。その後、培地を除去し、有足細胞をリン酸緩衝液で洗浄した後、前記実施例２と同様に、以前に報告された方法(J. Med. Chem. 2005, 48, 141-151)のとおり蛍光光度検定方法を用いてＤＰＰ−ＩＶの活性を測定した。
結果は図１７に示した。図１７から、ＤＡ１２２９が濃度依存的に有足細胞でＤＰＰ−ＩＶの活性を抑制し、その効果はリナグリプチン及びシタグリプチンより優れるうえ、サクサグリプチンとは類似することが分かる。
【００７７】
（２）糖尿病と同様の刺激時のネフリン発現量に及ぼす影響の比較  
ＤＡ１２２９、リナグリプチン、サクサグリプチン及びシタグリプチンが、糖尿病で発生する刺激と同様にグルコース及びアンジオテンシンＩＩの刺激下においてネフリンの発現量に及ぼす効果を次のとおり確認した。  
グルコース３０ｍＭ、アンジオテンシンＩＩ１００ｎＭ、及びそれぞれＤＡ１２２９ １０ｎＭ、リナグリプチン１０ｎＭ、サクサグリプチン１ｎＭ、シタグリプチン１０ｎＭを含む培地で有足細胞を７２時間培養した。その後、培地を除去し、細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）させた後、細胞内に発現したネフリンの変化を、ポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＳＣ−１９０００）を用いてウェスタンブロットで測定した。
【００７８】
結果は図１８に示した。図１８から、正常グルコース（ｎｏｒｍｏｇｌｕｃｏｓｅ）を処理した対照群（ＮＧ、左の一番目）と比較してグルコースとアンジオテンシンＩＩの処理によってネフリンの発現が減少するが（左の２番目）、ＤＡ１２２９によって対照群と同等のレベルにネフリン発現量が維持されることが分かる（左の３番目）。一方、リナグリプチン、サクサグリプチン処理群のネフリン発現量は、グルコースとアンジオテンシンＩＩのみを処理した群より高かったが、ＤＡ１２２９処理群よりは遥かに低く、シタグリプチン処理群のネフリン発現量はグルコースとアンジオテンシンＩＩのみを処理した群とはほとんど差がなかった。
上記の結果から、ＤＡ１２２９が、市販の既存のＤＰＰ４阻害剤であるリナグリプチン、サクサグリプチン及びシタグリプチンよりもＤＰＰ−ＩＶ活性抑制効果に優れるうえ、糖尿病で発生するのと同様の刺激を加えた場合でも腎糸球体でネフリン発現を維持する効果に優れることが分かる。  
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の腎疾患予防または治療用薬学的組成物は、脂質代謝を改善し、腎線維化を始めとする組織学的損傷を防ぎ、微量アルブミン尿を改善し、腎糸球体のネフリンを維持する効果を持つ。よって、腎疾患の治療に有用である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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