(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置する、と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階；前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する、と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片をｈＣＴＯ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ−Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階；前記ｈＣＴＯは、（ｉ）３’→５’方向に前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むＣＴＯ、及び（ｉｉ）固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；  ＩＯ）に相補的なヌクレオチド配列を含むＩＯ−ハイブリダイジング部位を前記ＣＴＯの３’−または５’−末端に含み、前記ＰＴＯから放出された断片は、前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる、と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階；前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長デュープレックスを形成し、前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片の配列及び／または長さ、（ｉｉ）前記ｈＣＴＯの配列及び／または長さ、または（ｉｉｉ）前記断片の配列及び／または長さと前記ｈＣＴＯの配列及び／または長さにより調節可能なＴｍ値を有して、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態を維持する、と、
（ｅ）前記一本鎖状態のｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位を前記ＩＯとハイブリダイズさせる段階；前記固相基質上に固定された前記ＩＯは、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記ＩＯは、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてＩＯデュープレックスを形成して、前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識及び前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）前記断片に連結された標識、または前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、及び前記ＩＯに連結された標識によりターゲットシグナルを提供する、と、
（ｆ）前記延長デュープレックス及び前記ＩＯデュープレックスの両方とも二本鎖状態を維持する指定温度で前記ターゲットシグナルを測定することにより、固相で前記延長デュープレックスを検出する段階；前記延長デュープレックスの存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す、と、
を含む、ｈＣＴＯを利用するＰＴＯ切断及び延長（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈＣＴＯ；  ＰＣＥ−ｈＣＴＯ）分析によりＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出する方法。
【請求項２】
前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位が前記ＣＴＯの５’−末端に位置する場合、前記ｈＣＴＯは、前記ＣＴＯと前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位間に前記断片の延長反応を防止するブロッカー部位をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ターゲットシグナルは、前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識により提供されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｈＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、前記段階（ｄ）において、前記断片の延長は、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導して、前記ターゲットシグナルを提供することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｈＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、前記段階（ｃ）において、前記ｈＣＴＯと前記断片のハイブリダイゼーションは、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供して、前記延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、前記段階（ｃ）において、前記ｈＣＴＯと前記断片のハイブリダイゼーションは、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供して、前記延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の一つを有して、前記ｈＣＴＯは、前記相互作用的二重標識の他の一つを有して、前記段階（ｃ）において、前記ｈＣＴＯと前記断片のハイブリダイゼーションは、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供して、前記延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記ｈＣＴＯは、単一標識を有して、前記段階（ｄ）において、前記断片の延長は、前記単一標識からのシグナルの変化を誘導して、前記ターゲットシグナルを提供することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ｈＣＴＯは、単一標識を有して、前記段階（ｃ）において、前記ｈＣＴＯと前記断片のハイブリダイゼーションは、前記単一標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供して、前記延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記断片は、単一標識を有することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記ターゲットシグナルは、前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された単一標識により提供されて、前記挿入された単一標識は、前記延長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ターゲットシグナルは、前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識と前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された標識により提供されて、前記挿入された標識は、前記延長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されており、前記二つの標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子の相互作用的二重標識であって、段階（ｄ）において、前記断片の延長は、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ターゲットシグナルは、前記断片に連結された標識または前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識及び前記ＩＯに連結された標識により提供されて、前記断片に連結された標識または前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の一つを有して、前記ＩＯは、前記相互作用的二重標識の他の一つを有し、前記段階（ｅ）において、前記延長デュープレックスと前記ＩＯのハイブリダイゼーションは、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階（ａ）−（ｆ）の全てまたは一部を繰り返すことを追加的に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記段階（ａ）−（ｆ）は、一つの反応容器または個別反応容器で実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で行うことを特徴とする請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれかに記載の方法の実施における使用のためのキットであって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含むアップストリームオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置して、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する、と、
（ｃ）ｈＣＴＯ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ−Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；前記ｈＣＴＯは、（ｉ）３’→５’方向に前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むＣＴＯ、及び（ｉｉ）固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；  ＩＯ）に相補的なヌクレオチド配列を含むＩＯ−ハイブリダイジング部位を前記ＣＴＯの３’−または５’−末端に含み、前記ＰＴＯから放出された断片は、前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされて、前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、鋳型−依存的核酸重合酵素により延長されて延長デュープレックスを形成する、と、
（ｄ）前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含む前記固相基質上に固定されたＩＯ；前記ＩＯは、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてＩＯデュープレックスを形成する、と、
を含む、ｈＣＴＯを利用するＰＴＯ切断及び延長（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈＣＴＯ；  ＰＣＥ−ｈＣＴＯ）分析によりＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出するキット。
【請求項１８】
前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位が前記ＣＴＯの５’−末端に位置する場合、前記ｈＣＴＯは、前記ＣＴＯと前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位間に前記断片の延長反応を防止するブロッカー部位をさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記断片及び／または前記ｈＣＴＯは、少なくとも一つの標識を有することを特徴とする請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記標識は、単一標識または相互作用的二重標識であることを特徴とする請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記キットは、前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入される標識をさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
前記キットは、前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入される標識をさらに含み、前記断片及び／または前記ｈＣＴＯは、少なくとも一つの標識を有することを特徴とする請求項１７に記載のキット。
【請求項２３】
前記断片が標識を有するか、あるいは前記キットが前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入される標識をさらに含み、前記ＩＯは、標識を有することを特徴とする請求項１７に記載のキット。
【請求項２４】
前記キットは、ダウンストリームプライマーをさらに含むことを特徴とする請求項１７から２３のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、大韓民国特許庁に２０１３年１０月１８日に提出した大韓民国特許出願第２０１３−０１２４５８９号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。
【０００２】
本発明は、ｈＣＴＯを利用するＰＴＯ切断及び延長（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈＣＴＯ；  ＰＣＥ−ｈＣＴＯ）分析による固相におけるターゲット核酸配列の検出に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡハイブリダイゼーションは、分子生物学の基本的な過程であり、イオン強度、塩基構成、減少された核酸断片の長さ、ミスマッチング程度及び変性剤の存在により影響を受ける。ＤＮＡハイブリダイゼーションベースの技術は、特定核酸配列の決定に非常に有用な道具となり、臨床診断、遺伝子研究及び法医学的実験分析に明確に役に立つだろう。
【０００４】
しかし、大部分のハイブリダイゼーションにのみ依存する従来方法及び過程では、プローブと非ーターゲット配列間の非特異的なハイブリダイゼーションにより偽陽性結果が発生する可能性が高い。したがって、従来の方法及び過程は、信頼度を改善しなければならない問題点が残っている。
【０００５】
プローブハイブリダイゼーション過程の他にも、追加的に酵素的反応を利用した幾つかの接近法、例えば、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法が提示された。
【０００６】
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法において、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた標識プローブは、アップストリームプライマー依存的ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性により切断されて、ターゲット配列の存在を示すシグナルを発生させる（特許文献１〜３）。ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、シグナル発生のための二つの接近法を提示する：重合依存的切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ）及び重合独立的切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ）。重合依存的切断において、アップストリームプライマーの延長は、必ず核酸重合酵素が標識プローブの５’−末端に接触する前に起こらなければならない。延長反応が進行しつつ、重合酵素は、標識プローブの５’−末端をだんだん切断する。重合独立的切断において、アップストリームプライマー及び標識プローブは、非常に近接してターゲット核酸にハイブリダイズされて、アップストリームプライマーの３’−末端と核酸重合酵素の結合は、前記核酸重合酵素を標識プローブの５’−末端に接触させて標識を放出する。また、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、その５’−末端部位にターゲット配列とハイブリダイズされない５’−テイル領域を有する標識プローブが切断されて、５’−テイル領域を含む断片が形成されることを開示している。
【０００７】
ターゲット配列に非−相補的な５’−テイル領域を有するプローブが５’ヌクレアーゼにより切断され、５’−テイル領域を含む断片が放出される幾つかの方法が報告された。
【０００８】
例えば、特許文献４は、ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性により切断される切断構造を開示している。鋳型に対して非相補的な５’部位及び鋳型に対して相補的な３’部位を含むオリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリダイズされて、アップストリームオリゴヌクレオチドは、非常に近接して鋳型にハイブリダイズされる切断構造が例示されている。前記切断構造は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素または減少された合成活性を有する変形ＤＮＡ重合酵素により切断され、鋳型に非相補的な５’部位が放出される。その後、前記放出された５’部位は、ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされて切断構造を形成し、これにより漸進的な切断反応が誘導されてターゲット配列が検出される。
【０００９】
特許文献５は、３’−末端がブロッキングされたアップストリームオリゴヌクレオチドを有する切断構造が、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼにより切断されて、非相補的な５’フラップ（ｆｌａｐ）部位が放出されて、放出された５’フラップ領域が大きさ分析または相互作用的二重標識により検出される過程を開示している。特許文献６は、検出可能な放出されたフラップが核酸合成依存的な、フラップ媒介連続的増幅方法により生成されることを開示している。この方法において、第１切断構造から放出されたフラップが核酸合成依存的な方式で第２切断構造を切断し、第２切断構造からフラップを放出して、前記放出されたフラップが検出される。
【００１０】
液相における蛍光−標識プローブのハイブリダイゼーションにより、一種類の蛍光標識を利用する場合にも、メルティングカーブ分析により多数のターゲット核酸配列を同時的に検出することができる。しかし、相互作用的−二重標識プローブの５’ヌクレアーゼ媒介切断によりターゲット配列を検出する従来の技術は、マルチプレックスターゲット検出において、互いに相異なるターゲット配列に対して互いに相異なる種類の蛍光標識を必要とし、このような蛍光標識の種類数の限界のため、検出されるターゲット配列の数は制限される。
【００１１】
特許文献７は、ターゲット核酸配列に非相補的な５’部位を有するプローブの切断及びキャプチャープローブのハイブリダイゼーションを利用したターゲット検出方法を開示している。標識は、非相補的な５’部位に位置する。ターゲット配列にハイブリダイズされた標識プローブは、切断されて断片を放出して、以後断片は、キャプチャープローブにハイブリダイズされて、ターゲット配列の存在が検出される。この方法において、非切断された／完全な（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ／ｉｎｔａｃｔ）プローブは、キャプチャープローブにハイブリダイズされないことが必須的である。このためには、短い長さを有するキャプチャープローブが固相基質上に固定化されなければならない。しかし、このような制限は、固相基質におけるハイブリダイゼーションの効率性を低めて、また反応条件の最適化も難しくする。
【００１２】
したがって、当業界では、より便利で、且つ信頼性及び再現性のある方式で、ハイブリダイゼーションだけではなく５’ヌクレオ切断反応（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）のような酵素反応により、固相でターゲット配列、特に、複数のターゲット配列を、向上された正確性で検出するための新規な接近法に対する開発要求が高まっている。また、当業界では、標識（特に、蛍光標識）種類の数に制限を受けずにターゲット配列を検出するための新規なターゲット検出方法が要求されている。
【００１３】
本明細書全体にかけて多数の特許及び文献が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許及び文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容をより明確に説明する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，２１０，０１５号
【特許文献２】米国特許第５，５３８，８４８号
【特許文献３】米国特許第６，３２６，１４５号
【特許文献４】米国特許第５，６９１，１４２号
【特許文献５】米国特許第７，３８１，５３２号
【特許文献６】米国特許第６，８９３，８１９号
【特許文献７】米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、より改善された正確性及び便宜性をもって、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコールを定立して、このようなターゲット検出は、プローブハイブリダイゼーション、５’核酸切断反応を含む酵素反応、延長デュープレックスを形成するための延長及び固相における延長デュープレックスの検出によって達成される。本発明のプロトコールは、固相において、より改善された正確性及び便宜性をもって複数のターゲット配列を検出することができる。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、ｈＣＴＯを利用するＰＴＯ切断及び延長（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈＣＴＯ；  ＰＣＥ−ｈＣＴＯ）分析により、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出する方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、ｈＣＴＯを利用するＰＴＯ切断及び延長（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈＣＴＯ；  ＰＣＥ−ｈＣＴＯ）分析により、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出するためのキットを提供することにある。
【００１８】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、ｈＣＴＯを利用するＰＴＯ切断及び延長（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈＣＴＯ；  ＰＣＥ−ｈＣＴＯ）分析により、ターゲット核酸配列を固相で検出するための新規な方法及びキットを提供する。
【００２０】
本発明は、ハイブリダイゼーション反応だけではなく、ターゲット−依存的酵素反応も含む。
【００２１】
Ｉ．ＰＣＥ−ｈＣＴＯを利用したターゲットの検出
本発明の一様態において、以下の段階を含む、ｈＣＴＯを利用するＰＴＯ切断及び延長（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈＣＴＯ；  ＰＣＥ−ｈＣＴＯ）分析によりＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出する方法を提供する：
（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置する）と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片をｈＣＴＯ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ−Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記ｈＣＴＯは、（ｉ）３’→５’方向に前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むＣＴＯ、及び（ｉｉ）固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；  ＩＯ）に相補的なヌクレオチド配列を含むＩＯ−ハイブリダイジング部位（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）を前記ＣＴＯの３’−または５’−末端に含み、前記ＰＴＯから放出された断片は、前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長デュープレックスを形成し、前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片の配列及び／または長さ、（ｉｉ）前記ｈＣＴＯの配列及び／または長さ、または（ｉｉｉ）前記断片の配列及び／または長さと前記ｈＣＴＯの配列及び／または長さにより調節可能なＴｍ値を有して、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態を維持する）と、
（ｅ）前記一本鎖状態のｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位を前記ＩＯとハイブリダイズさせる段階（前記固相基質上に固定された前記ＩＯは、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記ＩＯは、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてＩＯデュープレックスを形成して、前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識及び前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）前記断片に連結された標識、または前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、及び前記ＩＯに連結された標識によりターゲットシグナルを提供する）と、
（ｆ）前記延長デュープレックス及び前記ＩＯデュープレックスの両方とも二本鎖状態を維持する指定温度で前記ターゲットシグナルを測定することにより、固相で前記延長デュープレックスを検出する段階（前記延長デュープレックスの存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）。
【００２２】
本発明者らは、より改善された正確性及び便宜性をもって、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコールを定立して、このようなターゲット検出は、プローブハイブリダイゼーション、５’核酸切断反応を含む酵素反応、延長デュープレックスを形成するための延長及び固相における延長デュープレックスの検出によって達成される。本発明のプロトコールは、固相において、より改善された正確性及び便宜性をもって複数のターゲット配列を検出することができる。
【００２３】
本発明者らは、既に、ＷＯ２０１２／０９６５２３において、以下のように連続的な段階を含むＰＴＯＣＥ分析と呼ばれる新規な接近法を提案した：ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の切断、ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）上における延長；延長デュープレックスのターゲット−依存的な形成及び延長デュープレックスの検出。前記ＰＴＯＣＥ分析において、固相におけるターゲット検出のために、前記ＣＴＯは、固相に固定されて、その後、延長デュープレックスの形成が検出される。
【００２４】
本発明者らは、固相に固定されたＣＴＯ上における延長において、延長反応に影響を及ぼす制限、例えば、固相基質と本質的に関連のある空間的制限を解決しつつ、固相においてマルチプレックス方式でターゲットを検出する新規な方法を開発するために鋭意研究した。
【００２５】
ＰＴＯＣＥ分析において、延長デュープレックスのうち、一本を固相に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる場合、前記ハイブリダイゼーションが延長デュープレックスの他の一本の存在により邪魔される可能性がある。また、延長デュープレックスが、例えばビオチン−アビジン／ストレプトアビジンシステムを利用して固相に固定される場合、特定延長デュープレックスを固相の所望のサイトに固定することは不可能である。
【００２６】
本発明は、以下の技術的特徴を組み合わせることにより、上述の短所を解決することができる：（ｉ）延長デュープレックスのターゲット依存的形成、（ｉｉ）液相で延長デュープレックスの形成、（ｉｉｉ）延長デュープレックスにおいて一本鎖部位を持たせるようにするｈＣＴＯの使用、（ｉｖ）固相において、ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含む固定化オリゴヌクレオチドの使用。
【００２７】
前記技術的特徴を考慮し、本発明は、ｈＣＴＯを利用するＰＴＯ切断及び延長（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈＣＴＯ；  ＰＣＥ−ｈＣＴＯ）分析と命名される。
【００２８】
本発明の方法は、本発明者らのＰＴＯ及びＣＴＯを利用する、以前の方法をベースとするが、本発明者らの以前の方法の固相適用に係る問題点を解決し、より効率的に固相でターゲット核酸配列を検出することができる。
【００２９】
本発明において、延長デュープレックスは、調節可能なＴｍ値を有して、これは、複数のターゲット検出及び非−ターゲットシグナルとターゲットシグナルの区別において重要な役割をする。また、ＩＯ及びｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位間のハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）のＴｍ値も調節可能であるため、ＩＯ及びｈＣＴＯのＩＯハイブリダイジング部位間のハイブリッドの形成を維持するに十分な多様な条件下でターゲット配列が検出できる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の特徴及び利点は、下記のように要約される：
（ａ）本発明は、まずＰＴＯをターゲット核酸配列とハイブリダイズさせて、人為的に選択した配列を有するｈＣＴＯを鋳型として使用することにより、ターゲット−依存的な方式で延長デュープレックスを形成させて、最後に、前記延長鎖を固相に固定されたＩＯとハイブリダイズさせる。即ち、本発明は、ＰＴＯハイブリダイゼーション及び切断、ｈＣＴＯハイブリダイゼーション及び延長並びにＩＯハイブリダイゼーションを含む一連の反応を利用し、本発明の特異性を非常に向上させる。
（ｂ）固相は、制限された反応環境を提供することがあるため、固相基質上に固定されたオリゴヌクレオチド上で延長反応を実施する従来の接近法は、反応結果物を効率的に生成するとは限らない。本発明によると、延長デュープレックスは、ターゲット依存的方式で液相で生成されて、その存在が固相で検出される。ｈＣＴＯは、固相に固定されていないため、前記延長デュープレックスは、液相でより効率的に形成される。
（ｃ）延長デュープレックスの存在または不存在は、延長デュープレックス及び固相に固定されたＩＯ間のハイブリダイゼーションを利用して固相で検出される。したがって、本発明は、単一類型のシグナリングシステムを利用するとしても、複数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。
（ｄ）延長デュープレックスのある一本の鎖に相補的な配列を含むＩＯを利用する場合、ＩＯ及び延長デュープレックス間のハイブリダイゼーションは、前記延長デュープレックスの他の鎖の存在により邪魔されえる。本発明の方法は、延長デュープレックスにおいて、一本鎖部位を持つことのできるｈＣＴＯを利用することにより、このような問題点を完全に克服し、より効率的にＩＯ及び延長デュープレックス間のハイブリダイゼーションを可能にする。
（ｅ）本発明において、延長デュープレックスとＩＯとのハイブリダイゼーションまたは専らｈＣＴＯとＩＯとのハイブリダイゼーションは、固相に提供されるシグナルの生成、消滅または変化（減少または増加）を測定することにより決定される。前記シグナルは、断片、ｈＣＴＯまたはＩＯに連結された標識及び／または延長−依存的挿入標識により提供できる。
（ｆ）本発明は、（ｉ）断片の配列及び／または長さ、（ｉｉ）ｈＣＴＯの配列及び／または長さ、または（ｉｉｉ）断片の配列及び／または長さとｈＣＴＯの配列及び／または長さにより調節可能な、予め指定されたＴｍ値を有するターゲット依存的延長デュープレックスを提供する。また、ＩＯ及びｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位間のハイブリダイゼーションにより形成されたＩＯデュープレックスのＴｍ値は、多様に調節できる。
（ｇ）ＰＴＯの５’−タギング部位の配列、ｈＣＴＯの配列及びＩＯの配列が、ターゲット核酸配列を考慮するなく選択できるということは、注目すべきことである。これは、ＰＴＯの５’−タギング部位、ｈＣＴＯ及びＩＯのための配列プール（ｐｏｏｌ）を予めデザインすることを可能にする。ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、必ずターゲット核酸配列を考慮して準備しなければならないが、ｈＣＴＯ及びＩＯは、ターゲット核酸配列に対する考慮や知識無しに、予め制作された方式で準備することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】図１Ａは、ＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析に利用されるＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ｈＣＴＯ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ−Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及び固定化オリゴヌクレオチド（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＩＯ）の図式的な構造を示す。特に、ＰＴＯ、ｈＣＴＯ及びＩＯの３’−末端は、その延長が防止されるようにブロッキングされる。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析に利用されるＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ｈＣＴＯ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ−Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及び固定化オリゴヌクレオチド（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＩＯ）の図式的な構造を示す。特に、ＰＴＯ、ｈＣＴＯ及びＩＯの３’−末端は、その延長が防止されるようにブロッキングされる。
【図２】図２は、ＰＴＯの５’−末端に連結された単一標識を利用するＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析の一具現例を図式的に示す。ＩＯ−ハイブリダイジング部位は、ｈＣＴＯの５’−末端部位に位置する。固相基質上にその３’−末端を通じて固定されたＩＯは、ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位に相補的な配列を含む。
【図３】図３は、そのテンプレーティング部位にｉｓｏ−ｄＣ残基を有するｈＣＴＯ及びレポーター−ｉｓｏ  ｄＧＴＰを利用し、延長反応の間、延長デュープレックス内に挿入される標識を利用するＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析の一具現例を図式的に示す。ＩＯ−ハイブリダイジング部位は、ｈＣＴＯの５’−末端部位に位置して、固相基質上にその３’−末端を通じて固定されたＩＯは、ＩＯ−ハイブリダイジング部位に相補的な配列を含む。
【図４】図４は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムＤＮＡの存在を分析するための、その５’−末端部位にＩＯ−ハイブリダイジング部位を有するｈＣＴＯを利用するＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析の検出結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、より詳細に、以下のように説明できる。
【００３３】
段階（ａ）：アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション
本発明によると、まずターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる。
【００３４】
本明細書で使用される用語‘ターゲット核酸’、‘ターゲット核酸配列’または‘ターゲット配列’は、検出しようとする核酸配列を意味し、これは、ハイブリダイゼーション、アニーリングまたは増幅条件下でプライマーまたはプローブとアニーリングまたはハイブリダイズされる。
【００３５】
本明細書で使用される用語‘プローブ（ｐｒｏｂｅ）’は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位または部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。
【００３６】
本明細書で使用される用語‘プライマー’は、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡ重合酵素のような重合剤の存在時、そして適した温度とｐＨの条件で、合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３７】
特定具現例において、プローブ及びプライマーは、一本鎖デオキシリボヌクレオチド分子である。本発明で利用されるプローブまたはプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ，  ｄＧＭＰ，  ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、変形ヌクレオチドまたは非−天然ヌクレオチドを含むことができる。また、プローブまたはプライマーは、リボヌクレオチドを含むことができる。
【００３８】
プライマーは、重合剤の存在下で延長産物の合成をプライミングさせることができるほど十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含む複数の要素によって決定される。本明細書で使用された用語‘アニーリング’または‘プライミング’は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、重合酵素がヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸またはその一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。
【００３９】
本明細書で使用された用語‘ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）’は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、完全にマッチングされるか、一部ミスマッチで実質的にマッチングされる二つの核酸鎖間に起これる。ハイブリダイゼーションのための相補性は、ハイブリダイゼーション条件、特に温度によって変わる。
【００４０】
ターゲット核酸配列とアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとのハイブリダイゼーションは、最適化過程により一般に決定される適したハイブリダイゼーション条件下で行うことができる。温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーション及び洗浄時間、バッファー成分及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、オリゴヌクレオチド（アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ）の長さ、ＧＣ量及びターゲットヌクレオチド配列などの多様な因子によって様々である。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドを利用する場合、低い厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を選択することが好ましい。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、文献［Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ５  ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．（１９９９）］から確認できる。
【００４１】
用語‘アニーリング’と‘ハイブリダイゼーション’に差はなく、本明細書で混用される。
【００４２】
アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯは、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用される用語‘相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’は、指定のアニーリング条件または厳格条件下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズするほど十分相補的なことを意味し、用語‘実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、好ましくは、完全に相補的なことを意味する。
【００４３】
ＰＴＯの５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有する。ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のテンプレーティング部位は、ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を有する。本明細書で使用される用語‘非相補的’は、指定のアニーリング条件または厳格条件下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズされないほど十分非相補的なことを意味し、用語‘実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、例えば、完全に非相補的なことを意味する。
【００４４】
本明細書で使用される用語‘ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）’は、（ｉ）プローブの役割をする３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされた後、ＰＴＯから核酸切断（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）方式で放出される、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有する５’−タギング部位を含むオリゴヌクレオチドを意味する。ＰＴＯにおいて、５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位は、必ず５’→３’の順に位置しなければならない。ＰＴＯは、図１に図式的に示す。
【００４５】
一具現例において、前記段階（ａ）におけるハイブリダイゼーションは、前記３’−ターゲッティング部位が前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位が前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされない厳格条件下で実施される。
【００４６】
ＰＴＯは、どんな特定長さも要求しない。例えば、ＰＴＯの長さは、１５−１５０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１５０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、３０−１５０ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチド、３０−５０ヌクレオチド、３５−１００ヌクレオチド、３５−８０ヌクレオチド、３５−６０ヌクレオチドまた３５−５０ヌクレオチドの長さを有することができる。ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされる限り、どんな長さでも有することができる。例えば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、１０−１００ヌクレオチド、１０−８０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチドまたは２０−３０ヌクレオチドの長さを有することができる。５’−タギング部位は、ＣＴＯのキャプチャリング部位に特異的にハイブリダイズされた後延長される限り、どんな長さでも有することができる。例えば、ＰＴＯの５’−タギング部位は、５−５０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチドまたは１５−２０ヌクレオチドの長さを有することができる。
【００４７】
ＰＴＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナル（ｔｅｒｍｉｎａｌ）を有することができる。特定具現例において、ＰＴＯの３’−末端は、その延長が防止されるようにブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）される。
【００４８】
ブロッキングは、従来の方法により達成できる。例えば、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシル基にビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非−ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエートまたはアルカン−ジオール残基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して実施できる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、またはジデオキシヌクレオチドのように、３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを利用して実施できる。
【００４９】
択一的に、ＰＴＯがヘアピン構造を有するようにデザインすることができる。
【００５０】
ＰＴＯの５’−タギング部位とターゲット核酸配列間の非ハイブリダイゼーションは、特定ハイブリダイゼーション条件下で、それらの間に安定した二本鎖が形成されないことを意味する。本発明の一具現例によると、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションに関与しないＰＴＯの５’−タギング部位は、一本鎖を形成する。ＰＴＯの５’−タギング部位が自体的にヘアピン構造を形成することができる場合、ＰＴＯの５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションに関与せず、ヘアピン構造を形成する。このような場合、５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列に対し、一本鎖を形成するとみなされる。
【００５１】
アップストリームオリゴヌクレオチドは、ＰＴＯのアップストリームに位置する。
【００５２】
また、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたアップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。
【００５３】
アップストリームオリゴヌクレオチドによるＰＴＯ切断の誘導は、二つの方式で達成できる：（ｉ）アップストリームオリゴヌクレオチド延長−独立的切断誘導；及び（ｉｉ）アップストリームオリゴヌクレオチド延長−依存的切断誘導。
【００５４】
アップストリームオリゴヌクレオチドが５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導するに十分な程度にＰＴＯに近接して位置する場合、アップストリームオリゴヌクレオチドに結合した前記酵素が延長反応無しにＰＴＯを切断する。その反面、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯと離隔して位置する場合、重合酵素活性を有する酵素（例えば、鋳型−依存的重合酵素）がアップストリームオリゴヌクレオチド（例えば、アップストリームプライマー）の延長を触媒して、延長産物に結合された５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素がＰＴＯを切断する。
【００５５】
したがって、アップストリームオリゴヌクレオチドは、二つの方式でＰＴＯに対して相対的に位置することができる。アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−独立的な方式でＰＴＯの切断を誘導するに十分な程度にＰＴＯに近接して位置することができる。択一的に、アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−依存的な方式でＰＴＯ切断を誘導するに十分な程度にＰＴＯから離隔して位置することができる。
【００５６】
本明細書において、地点（ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）または位置（ｌｏｃａｔｉｏｎｓ）を言及しながら使用される用語‘近接（ａｄｊａｃｅｎｔ）’は、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位に近接して位置し、ニック（ｎｉｃｋ）を形成することを意味する。また、前記用語は、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位から１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチドまたは１〜１５ヌクレオチド離隔して位置することを意味する。
【００５７】
本明細書において、地点または位置を言及しながら使用される用語‘離隔（ｄｉｓｔａｎｔ）’は、延長反応が起こるに十分な程度のある位置または地点を含む。
【００５８】
一具現例によると、アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長‐依存的な方式でＰＴＯの切断を誘導するに十分な程度にＰＴＯから離隔して位置する。
【００５９】
一具現例によると、アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブである。アップストリームプライマーは、延長−独立的切断誘導または延長−依存的切断に適しており、アップストリームプローブは、延長−独立的切断誘導に適している。
【００６０】
選択的に、アップストリームオリゴヌクレオチドは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有することができる。特定具現例において、重なる配列は、１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、または１〜３ヌクレオチドの長さである。アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部と部分的に重なる配列を有する場合、段階（ｂ）の切断反応において、３’−ターゲッティング部位は、５’−タギング部位と共に部分的に切断される。また、重なる配列は、３’−ターゲッティング部位の所望の特定サイト（ｓｉｔｅ）が切断されるようにする。
【００６１】
一具現例によると、アップストリームプライマーは、その延長鎖を通じて、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。
【００６２】
アップストリームオリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯの切断を誘導し、ＰＴＯの５’−タギング部位またはＰＴＯの５’−タギング部位の一部を含む断片が放出される限り、アップストリームオリゴヌクレオチドによる切断反応に関する従来技術を本発明に適用することができる。例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、第７，３８１，５３２号及び米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号が本発明に適用できる。
【００６３】
一具現例によると、前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施する。ダウンストリームプライマーは、ＰＴＯとハイブリダイズするターゲット核酸配列を追加的に生成し、ターゲット検出の敏感度を向上させる。例えば、アップストリームオリゴヌクレオチドがアップストリームプライマーであり、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素がＤＮＡ重合酵素である場合、ダウンストリームプライマーは、ＤＮＡ重合酵素により、ＰＴＯがハイブリダイズできるターゲット核酸配列を追加的に生成して、これにより断片がさらに多く放出されて、結局、ターゲット検出に対する敏感度が向上する。
【００６４】
一具現例によると、アップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを利用する場合、プライマーの延長のために追加的に鋳型−依存的核酸重合酵素を使用する。
【００６５】
一具現例によると、アップストリームオリゴヌクレオチド（アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブ）、ダウンストリームプライマー及び／またはＰＴＯの５’−タギング部位は、本発明者により開発された二重プライミングオリゴヌクレオチド（ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；  ＤＰＯ）構造を有する。前記ＤＰＯ構造を有するオリゴヌクレオチドは、従来プライマー及びプローブに比べて非常に改善されたターゲット特異性を示す（参照：ＷＯ  ２００６／０９５９８１；Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＣＹＰ２Ｃ１９  ｇｅｎｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３５：６ｅ４０（２００７））。
【００６６】
一具現例によると、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、本発明者により開発された変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；  ｍＤＳＯ）構造を有する。前記変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造は、従来プローブに比べて非常に改善されたターゲット特異性を示す（参照：ＷＯ  ２０１１／０２８０４１）。
【００６７】
段階（ｂ）：ＰＴＯ切断から断片の放出
次いで、ＰＴＯの切断のための条件下で前記段階（ａ）の結果物を５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる。ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する。
【００６８】
本明細書で使用される用語‘ＰＴＯの切断のための条件’は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によりターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯが切断されるに十分な条件、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度、バッファ、オリゴヌクレオチドの長さ及び配列、そして酵素を意味する。例えば、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素としてＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素が利用される場合、ＰＴＯの切断のための条件は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２及び温度を含む。
【００６９】
ＰＴＯがターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、その３’−ターゲッティング部位は、ハイブリダイゼーションに関与し、５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず、一本鎖を形成する（参照：図２）。このように、一本鎖及び二本鎖構造を全部含むオリゴヌクレオチドは、当業界に知られた多様な技術により、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用して切断できる。
【００７０】
前記ＰＴＯの切断サイトは、アップストリームオリゴヌクレオチド（アップストリームプローブまたはアップストリームプライマー）の種類、アップストリームオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションサイト及び切断条件によって多様である（参照：米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、第７，３８１，５３２号及び米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号）。
【００７１】
５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出するＰＴＯの切断反応のために、多数の従来技術を利用することができる。
【００７２】
簡略に説明すると、段階（ｂ）の切断反応において、三つの切断サイトがありえる。第一の切断サイトは、ＰＴＯのハイブリダイジング部位（３’−ターゲッティング部位）及び非−ハイブリダイゼーション部位（５’−タギング部位）間のジャンクションサイト（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）である。第二の切断サイトは、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に一部ヌクレオチド離隔されたサイトである。前記第二の切断サイトは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に位置する。第三の切断サイトは、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から５’−方向に一部ヌクレオチド離隔されたサイトである。
【００７３】
一具現例によると、アップストリームプライマーの延長時、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的重合酵素によるＰＴＯの切断のための初期サイト（ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｉｔｅ）は、ＰＴＯ及びターゲット核酸配列間の二本鎖が始まる地点（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）またはその地点から１〜３ヌクレオチド離隔されたサイトである。
【００７４】
このような観点で、本明細書で５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を言及しながら使用される用語‘ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片’は、（ｉ）５’−タギング部位、（ｉｉ）５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部及び（ｉｉｉ）５’−タギング部位の一部を含む意味で使用される。また、本明細書で用語‘ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片’は、‘断片’または‘ＰＴＯ断片’で表現される。
【００７５】
一具現例によると、ＰＴＯは、ブロッカーとして５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に耐性のある少なくとも一つのヌクレオチドを含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位は、初期切断サイト及び／または連続的な切断を調節するために使用される。例えば、前記ＰＴＯのハイブリダイゼーション部位（３’−ターゲッティング部位）及び非ハイブリダイゼーション部位（５’−タギング部位）間のジャンクションサイトに切断を誘導するために、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部は、ブロッカーでブロッキングされえる。前記ブロッカー部位に含まれるブロッカーの数に制限はないが、１−１０、２−１０、３−８または３−６ブロッカーを含むことができる。ＰＴＯに存在するブロッカーは、連続的または不連続的な方式であって、好ましくは連続的な方式である。ブロッカーとして５’→３’ヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を含むヌクレオチドは、当業界に知られたあらゆるものを含む。例えば、前記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート連結（ｌｉｎｋａｇｅ）、ホスホネート連結、ホスホロアミだート連結及び２’−カーボヒドレート変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む。一具現例によると、５’→３’ヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アリールホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミダート連結、アリールホスホロアミダート連結、ホスホロセレネート連結、２’−Ｏ−アミノプロピール変形、２’−Ｏ−アルキル変形、２’−Ｏ−アリル変形、２’−Ｏ−ブチル変形、α−アノマオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）変形を含む。
【００７６】
一具現例によると、ブロッカーとしてヌクレオチドは、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）を含む。
【００７７】
ＰＴＯの５’−タギング部位の一部、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部及びＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部のように、ＰＴＯまたはＣＴＯを言及しながら使用される用語‘一部（ｐａｒｔ）’は、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０または１〜５ヌクレオチド、好ましくは、１、２、３または４ヌクレオチドで構成されたヌクレオチド配列を意味する。
【００７８】
一具現例によると、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼであり、好ましくは、５’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼである。
【００７９】
本発明において５’ヌクレアーゼ活性を有する適したＤＮＡ重合酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  （Ｔａｑ），  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  （Ｔｔｈ），  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ，  Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａｌｉｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ，  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ，  Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ，  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ，  Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ，  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ，  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ，  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ，  Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ，  Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｅｕｓを含む、多様なバクテリア種から得た熱安定性ＤＮＡ重合酵素である。特定具現例において、熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、Ｔａｑ重合酵素である。
【００８０】
択一的に、本発明は、減少された重合酵素活性を有するように変形された、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素を使用することができる。
【００８１】
一具現例によると、使用されるＦＥＮ（ｆｌａｐ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ヌクレアーゼは、５’フラップ−特異的ヌクレアーゼ（５’ｆｌａｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）である。
【００８２】
本発明に適したＦＥＮヌクレアーゼは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ，  Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ，  Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ，  Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ，  Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｙｉ，  Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ，  Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ，  Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ，  Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｌｌｉｇｉｉ，  Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ，  Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｇｎｅｕｓ，  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ，  Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ及びＡｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｓを含む、多様なバクテリア種から得たＦＥＮヌクレアーゼを含む。
【００８３】
前記段階（ａ）でアップストリームプライマーを利用する場合、ＰＴＯの切断のための条件は、アップストリームプライマーの延長反応を含むことができる。
【００８４】
一具現例によると、前記段階（ａ）でアップストリームプライマーが使用されて、前記アップストリームプライマーの延長のために鋳型−依存的重合酵素を使用されて、前記鋳型−依存的重合酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と同一な酵素である。
【００８５】
選択的に、前記段階（ａ）でアップストリームプライマーが使用されて、前記アップストリームプライマーの延長のために鋳型−依存的重合酵素が使用され、前記鋳型−依存的重合酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と相異なる酵素である。
【００８６】
段階（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とｈＣＴＯのハイブリダイゼーション
前記ＰＴＯから放出された断片は、ｈＣＴＯ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ−Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズされる。
【００８７】
前記ｈＣＴＯは、（ｉ）３’→５’方向に前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むＣＴＯ、及び（ｉｉ）固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；  ＩＯ）に相補的なヌクレオチド配列を含むＩＯ−ハイブリダイジング部位を前記ＣＴＯの３’−または５’−末端に含む。前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位は、ｈＣＴＯの３’または５’−末端に位置する。
【００８８】
ｈＣＴＯにおいて、基本構造となるＣＴＯは、以下のような部位及び機能を有する。
【００８９】
前記ＣＴＯは、前記ＰＴＯから放出された断片の延長のための鋳型としての役割をする。プライマーとしての役割をする前記断片は、前記ＣＴＯにハイブリダイズされて、延長されて延長デュープレックスを形成する。
【００９０】
前記テンプレーティング部位は、ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的である限り、どんな配列でも含むことができる。また、前記テンプレート部位は、ＰＴＯから放出された断片の延長のための鋳型としての役割ができる限り、どんな配列でも含むことができる。
【００９１】
上述のように、切断反応によりＰＴＯの５’−タギング部位を有する断片が放出される場合、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインできる。５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部を有する断片が放出される場合、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることができる。ＰＴＯの５’−タギング部位の一部を有する断片が放出される場合、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることができる。
【００９２】
さらに、ＰＴＯの切断サイトを予想することにより、ＣＴＯのキャプチャリング部位をデザインすることができる。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位が５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインする場合、５’−タギング部位の一部を有する断片または５’−タギング部位を有する断片は、キャプチャリング部位とハイブリダイズされて、延長できる。５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部を含む断片が放出される場合、前記断片は、５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされたＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズでき、前記断片の３’−末端部位にミスマッチヌクレオチドが存在するにもかかわらず、成功的に延長できる。これは、プライマーの３’−末端が一部ミスマッチヌクレオチド（例えば、１〜３ミスマッチヌクレオチド）を含むにもかかわらず、プライマーが反応条件によって延長できるからである。
【００９３】
５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部を含む断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端一部（参照：図１）は、前記切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に相補的なヌクレオチド配列を有するようにデザインすることができ、ミスマッチヌクレオチドに係わる問題を解決することができる。
【００９４】
一具現例において、前記切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端一部のヌクレオチド配列は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位上の予想される切断サイトによって選択できる。前記切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端一部のヌクレオチド配列は、１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチドまたは１〜３ヌクレオチドの長さを有することができる。
【００９５】
前記ＣＴＯの３’−末端は、前記断片とのハイブリダイゼーションに関与しない追加的なヌクレオチドを含むことができる。また、前記断片と安定してハイブリダイズされる限り、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、前記断片の一部（例えば、断片の３’−末端部位を含む断片の一部）にのみ相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。
【００９６】
本明細書で使用される用語‘５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位’は、上述のようにＣＴＯのキャプチャリング部位の多様なデザイン及び組成を含むとして本願に記載される。
【００９７】
前記ＣＴＯは、ヘアピン構造を有するようにデザインすることができる。
【００９８】
前記ＣＴＯの長さは、多様である。例えば、前記ＣＴＯは、６−１０００ヌクレオチド、６−５００ヌクレオチド、６−３００ヌクレオチド、６−１００ヌクレオチド、６−８０ヌクレオチド、６−６０ヌクレオチド、６−４０ヌクレオチド、１５−１０００ヌクレオチド、１５−５００ヌクレオチド、１５−３００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１０００ヌクレオチド、２０−５００ヌクレオチド、２０−３００ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、３０−１０００ヌクレオチド、３０−５００ヌクレオチド、３０−３００ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチドまたは３０−４０ヌクレオチドの長さである。前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、ＰＴＯから放出された断片に特異的にハイブリダイズされる限り、どんな長さでも有することができる。例えば、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５−１００ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、１０−１００ヌクレオチド、１０−６０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０  ヌクレオチドまたは１５−２０ヌクレオチドの長さである。前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＰＴＯから放出された断片の延長で鋳型の役割ができる限り、どんな長さでも有することができる。例えば、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、１−９００ヌクレオチド、１−４００ヌクレオチド、１−３００ヌクレオチド、１−１００ヌクレオチド、１−８０ヌクレオチド、１−６０ヌクレオチド、１−４０ヌクレオチド、１−２０ヌクレオチド、２−９００ヌクレオチド、２−４００ヌクレオチド、２−３００ヌクレオチド、２−１００ヌクレオチド、２−８０ヌクレオチド、２−６０ヌクレオチド、２−４０ヌクレオチド、２−２０ヌクレオチド、５−９００ヌクレオチド、５−４００ヌクレオチド、５−３００ヌクレオチド、５−１００ヌクレオチド、５−８０ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、１０−９００ヌクレオチド、１０−４００ヌクレオチド、１０−３００ヌクレオチド、１５−９００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチドまたは１５−２０ヌクレオチドの長さである。
【００９９】
前記ＣＴＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナルを有することができる。具体的に、ＣＴＯの３’−末端は、その延長が防止されるようにブロッキングされる。ＣＴＯの非−延長ブロッキングは、従来の方法によって達成できる。例えば、ブロッキングは、ＣＴＯの最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシル基にビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非−ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエートまたはアルカン−ジオールのような化学的部分を追加して実施できる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、またはジデオキシヌクレオチドのように、３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを利用して実施できる。
【０１００】
前記ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされて、断片の延長に適した形態を提供する。また、非切断ＰＴＯがその５’−タギング部位を通じてＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされるとしても、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、ＣＴＯにハイブリダイズされず、延長デュープレックスの形成が防止される。
【０１０１】
前記段階（ｃ）におけるハイブリダイゼーションは、前記段階（ａ）における説明を参照して詳細に説明できる。
【０１０２】
前記ｈＣＴＯは、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）に相補的なヌクレオチド配列を含むＩＯ−ハイブリダイジング部位を含む。
【０１０３】
前記ｈＣＴＯ上で断片の延長が発生する場合でも、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態を維持する部位である。
【０１０４】
一具現例によると、前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位は、ＣＴＯの３’−末端に連結される。このような場合、前記ｈＣＴＯは、３’→５’方向にＩＯ−ハイブリダイジング部位、キャプチャリング部位及びテンプレーティング部位を含む。ＰＴＯ断片は、キャプチャリング部位にハイブリダイズされて延長されるため、ＩＯ−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態を維持する。
【０１０５】
一具現例によると、前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位は、ＣＴＯの５’−末端に連結される。このような場合、前記ｈＣＴＯは、３’→５’方向にキャプチャリング部位、テンプレーティング部位及びＩＯ−ハイブリダイジング部位を含む。このような具現例では、キャプチャリング部位とハイブリダイズされたＰＴＯ断片が延長時、前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位が二本鎖に含まれ得る。一具現例によると、ＩＯ−ハイブリダイジング部位がＣＴＯの５’−末端に位置する場合、前記ｈＣＴＯは、ＣＴＯとＩＯ−ハイブリダイジング部位間に前記断片の延長反応を防止するブロッカー部位をさらに含む。
【０１０６】
テンプレーティング部位の５’−末端をＩＯ−ハイブリダイジング部位の５’−末端に連結して前記ｈＣＴＯが製造された場合、前記ブロッカーを使用しなくてもいい。
【０１０７】
ＩＯ−ハイブリダイジング部位は、どんな長さでも有することができる。例えば、ＩＯ−ハイブリダイジング部位は、５−１０００ヌクレオチド、５−５００ヌクレオチド、５−３００ヌクレオチド、５−１００ヌクレオチド、５−８０ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、１０−１０００ヌクレオチド、１０−５００ヌクレオチド、１０−３００ヌクレオチド、１０−１００ヌクレオチド、１０−８０ヌクレオチド、１０−６０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１５−１０００ヌクレオチド、１５−５００ヌクレオチド、１５−３００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１０００ヌクレオチド、２０−５００ヌクレオチド、２０−３００ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、３０−１０００ヌクレオチド、３０−５００ヌクレオチド、３０−３００ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチドまたは３０−４０ヌクレオチドの長さである。
【０１０８】
前記ＣＴＯと前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位間に位置し、向こうの鎖の合成に対する鋳型−依存的核酸重合酵素の作用が防止できるブロッカーは、それに適したいかなるブロッカーでも含むことができる。例えば、前記ブロッカーは、アルキレン基、リボフラノシルナフタレン、デオキシリボフラノシルナフタレン、メタホスフェート、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アリールホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミダート連結またはアリールホスホロアミダート連結を含む。一具現例において、ブロッカーとしてカーボンスペーサーが使用できる。
【０１０９】
前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位は、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）に相補的なヌクレオチド配列を含む。前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位は、その一本鎖状態を維持するため、前記ｈＣＴＯは、非常に効率的に固相基質上に固定されたＩＯにハイブリダイズできる。
【０１１０】
前記ｈＣＴＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナルを有することができる。特定具現例において、ｈＣＴＯの３’−末端は、その延長が防止されるように‘ブロッキング’される。
【０１１１】
段階（ｄ）：一本鎖部位を含む延長デュープレックスを形成するための前記断片の延長
前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を実施する。（前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて、前記ｈＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を形成し、これにより延長デュープレックスを形成する。前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態に維持される。結果的に、一本鎖部位を含む延長デュープレックスが形成される。
【０１１２】
その反面、前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた非切断ＰＴＯは延長されず、延長デュープレックスも形成されない。
【０１１３】
本明細書で使用される用語‘延長デュープレックス（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）’は、ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた断片が鋳型−依存的核酸重合酵素とｈＣＴＯのテンプレーティング部位を鋳型として利用して延長される延長反応により形成されたデュープレックスを意味する。
【０１１４】
本明細書において断片と共に使用される用語‘延長鎖（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｔｒａｎｄ）’は、断片及び断片の延長配列で構成された配列を意味する。
【０１１５】
本明細書において断片と共に使用される用語‘延長配列（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）’は、延長鎖において、断片を除いた、新しく合成された配列のみを意味する。
【０１１６】
前記ｈＣＴＯを鋳型として利用して形成された延長デュープレックスは、‘ｈＣＴＯ−延長デュープレックス’または‘延長デュープレックスｈＣＴＯ’と表現できる。
【０１１７】
前記ｈＣＴＯ−延長デュープレックスまたは延長デュープレックスｈＣＴＯは、ｈＣＴＯ及び延長鎖のハイブリダイゼーション結果物である。
【０１１８】
前記延長デュープレックスは、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドのＴｍ値と相異なるＴｍ値を有するようにすることができる。
【０１１９】
一具現例において、前記延長デュープレックスは、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドのＴｍ値より高いＴｍ値を有する。
【０１２０】
延長デュープレックスのＴｍ値は、（ｉ）断片の配列及び／または長さ、（ｉｉ）ｈＣＴＯの配列及び／または長さ、または（ｉｉｉ）断片の配列及び／または長さとｈＣＴＯの配列及び／または長さにより調節可能である。特に、延長デュープレックスのＴｍ値は、ｈＣＴＯの基本構造であるＣＴＯの配列及び／または長さによって調節可能である。
【０１２１】
延長デュープレックスの調節可能なＴｍ値を使用して延長デュープレックスの存在を示すターゲットシグナルを提供するのは、本発明の技術的特徴である。
【０１２２】
本明細書で使用される用語‘Ｔｍ’は、二本鎖核酸分子の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の半分が一本鎖分子に解離されるメルティング温度を意味する。Ｔｍ値は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの長さ及びＧ／Ｃ含量により決定される。Ｔｍ値は、Ｗａｌｌａｃｅ  ｒｕｌｅ（Ｒ．Ｂ．  Ｗａｌｌａｃｅら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６：３５４３−３５４７（１９７９））及びｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ方法（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  Ｊ．  Ｊｒ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３５：３５５５−３５６２（１９９６））；  Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｎ．ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２４：４５０１−４５０５（１９９６））のような従来の方法により計算できる。
【０１２３】
一具現例によると、Ｔｍ値は、実際使用する反応条件下での実際Ｔｍ値を意味する。
【０１２４】
段階（ｄ）で利用される鋳型−依存的核酸重合酵素は、どんな核酸重合酵素でも可能であり、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ重合酵素Ｉの‘Ｋｌｅｎｏｗ’断片、熱安定性ＤＮＡ重合酵素及びバクテリオファージＴ７  ＤＮＡ重合酵素である。具体的に、前記重合酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  （Ｔａｑ），  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  （Ｔｔｈ），  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ，  Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａｌｉｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ，  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ，  Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ，  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ，  Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ，  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ），  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ，  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ，  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ，  Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ，  Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｅｕｓを含む多様なバクテリア種から得られる熱安定性ＤＮＡ重合酵素である。より具体的には、前記鋳型−依存的核酸重合酵素は、Ｔａｑ重合酵素である。
【０１２５】
一具現例によると、前記段階（ｂ）で利用される５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、段階（ｄ）で利用される鋳型−依存的核酸重合酵素と同一である。特に、前記段階（ｂ）で利用される５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、アップストリームプライマーの延長のために利用される鋳型−依存的核酸重合酵素及び段階（ｄ）で利用される鋳型−依存的核酸重合酵素は、互いに同一である。
【０１２６】
前記段階（ｄ）は、前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片が延長され、前記ｈＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成し、延長デュープレックスが形成される条件下で実施される。
【０１２７】
段階（ｅ）：延長デュープレックス及び固定化オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション
次いで、段階（ｄ）の結果物は、固相基質上の固定化オリゴヌクレオチド（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；  ＩＯ）とハイブリダイズされる。
【０１２８】
前記ＩＯは、固相基質上に固定されており、ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含む。前記ＩＯは、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズされて、ＩＯデュープレックスを形成する。
【０１２９】
本明細書で使用される用語‘ＩＯデュープレックス（ＩＯ  ｄｕｐｌｅｘ）’は、ＩＯ及びｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位間のハイブリダイゼーションにより形成されたデュープレックスを意味する。
【０１３０】
前記ＩＯデュープレックスは、ＩＯ及び延長デュープレックス（即ち、ｈＣＴＯ−延長デュープレックス）を形成するｈＣＴＯ間のハイブリッドだけではなく、ＩＯ及び延長デュープレックスを形成しないｈＣＴＯ間のハイブリッドも含む。
【０１３１】
分析される核酸試料内にターゲット核酸配列が存在する場合、延長デュープレックスが鋳型として作用するｈＣＴＯ上に形成されて、延長デュープレックスにおけるｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位を通じて、前記延長デュープレックスはＩＯにハイブリダイズされる。前記延長デュープレックスがｈＣＴＯ上に形成されても、前記ＩＯ−ハイブリダイジング部位は一本鎖状態を維持し、延長デュープレックス及びＩＯ間の効率的なハイブリダイゼーションを可能にする。
【０１３２】
核酸試料内にターゲット核酸配列が存在しない場合、延長デュープレックスは形成されず、前記ＩＯは、延長デュープレックスを形成していない状態のｈＣＴＯにハイブリダイズされる。
【０１３３】
本発明の一具現例によると、延長鎖とｈＣＴＯ−延長デュープレックスを形成するｈＣＴＯは、ＩＯにハイブリダイズされる。
【０１３４】
択一的に、本発明の一具現例によると、ｈＣＴＯ延長デュープレックスがＩＯにハイブリダイズされる前、ｈＣＴＯ−延長デュープレックスをｈＣＴＯ及び延長鎖に解離させて、ｈＣＴＯをＩＯにハイブリダイズさせた後、延長鎖を、ＩＯにハイブリダイズされたｈＣＴＯにハイブリダイズさせる段階を実施し、ｈＣＴＯ−延長デュープレックス及びＩＯ間のハイブリッドを得る。
【０１３５】
前記ＩＯは、ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位に特定的にハイブリダイズされる限り、どんな長さでも有することができる。例えば、前記ＩＯは、５−１０００ヌクレオチド、５−５００ヌクレオチド、５−３００ヌクレオチド、５−１００ヌクレオチド、５−８０ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、１０−１０００ヌクレオチド、１０−５００ヌクレオチド、１０−３００ヌクレオチド、１０−１００ヌクレオチド、１０−８０ヌクレオチド、１０−６０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１５−１０００ヌクレオチド、１５−５００ヌクレオチド、１５−３００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１０００ヌクレオチド、２０−５００ヌクレオチド、２０−３００ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、３０−１０００ヌクレオチド、３０−５００ヌクレオチド、３０−３００ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチドまたは３０−４０ヌクレオチドの長さである。
【０１３６】
ＩＯとｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位の配列及び長さは、固相で延長デュープレックスの存在を検出するための条件下で、ＩＯ及びｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位間のデュープレックスが維持されるように予め決定できる。
【０１３７】
ＩＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナルを有することができる。特定具現例において、ＩＯの３’−末端は、その延長が防止されるようにブロッキングされる。
【０１３８】
ＩＯの存在下でｈＣＴＯ上のＰＴＯ断片の延長が実施される場合、延長デュープレックスが形成される前に一部ｈＣＴＯがＩＯとハイブリダイズされることがあって、これによって、一部延長反応が固相で発生し得る。ただし、液相に存在するｈＣＴＯ上の延長反応が、固相延長より効率的である。
【０１３９】
特定具現例において、本発明は、延長デュープレックスの形成前は、ｈＣＴＯがＩＯにハイブリダイズされないが、ｈＣＴＯ上でＰＴＯ断片の延長反応後は、延長結果物がＩＯにハイブリダイズされるように、反応条件を調節しながら実施される。例えば、本発明で使用されるオリゴヌクレオチドの配列または反応条件（例えば、温度）は、ＰＴＯ断片のハイブリダイゼーション及び延長が、ＩＯ及びＩＯ−ハイブリダイジング部位間のハイブリダイゼーションのための条件より厳格な条件下で実施されるように選択または調節される。
【０１４０】
特定具現例において、延長デュープレックスの形成及びＩＯとのハイブリダイゼーションは、それぞれ異なるチューブ（ｔｕｂｅ）で実施されて、延長反応前の固相のＩＯとｈＣＴＯとのハイブリダイゼーションを防止する。
【０１４１】
延長デュープレックスに関与するｈＣＴＯがＩＯにハイブリダイズされたのか、もしくは延長デュープレックスに関与しないｈＣＴＯがＩＯにハイブリダイズされたのかは、固相で提供されるシグナルを検出することにより決定される。
【０１４２】
前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識及び前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）前記断片に連結された標識、または前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、及び前記ＩＯに連結された標識によりターゲットシグナルを提供する。
【０１４３】
前記延長デュープレックスは、ターゲット核酸配列が存在する場合にのみ形成されるため、延長デュープレックスの存在は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
【０１４４】
本明細書で使用される用語‘ターゲットシグナル’は、延長デュープレックスの存在を示すことのできるあらゆるシグナルを意味する。例えば、ターゲットシグナルは、標識からのシグナル（シグナル発生または消滅）及び標識からのシグナルの変化（シグナル増加または減少）を含む。
【０１４５】
ターゲットシグナルを提供する標識システムの一部は、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッド形成時、ターゲットシグナルと同一な特性のシグナルを提供することができる。前記非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッド形成時発生されるシグナルは、‘非−ターゲットシグナル’と表現される。前記非−ターゲットシグナルは、延長デュープレックスと非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯのハイブリッド間のＴｍ差を利用して除去できる（参照：ＷＯ２０１２／０９６５２３）。延長デュープレックスのＴｍ値は、任意的に調節できる。特定具現例において、延長デュープレックスのＴｍ値は、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドＴｍ値より高く調節できる。延長デュープレックスが二本鎖状態で予め指定された温度でターゲットシグナルが検出されることを考慮すると、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドのＴｍ値は、前記非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドが予め指定された温度で解離されるように調節でき、これにより、非−ターゲットシグナルが除去される。特定具現例において、ターゲット配列を含んでいない陰性対照群からのシグナルを参照として利用できる。
【０１４６】
本発明で使用される標識システムは、以下のように説明できる。
【０１４７】
（ｉ）断片及び／またはｈＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識
特定具現例において、前記ターゲットシグナルは、断片及び／またはｈＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識により提供される。延長デュープレックスは、ＰＴＯ断片及びｈＣＴＯ間に形成されて、断片及び／またはｈＣＴＯに連結された標識は、延長デュープレックスに存在し、ターゲットシグナルを提供する。
【０１４８】
標識は、相互作用的二重標識及び単一標識を含む。
【０１４９】
（ｉ−１）相互作用的二重標識
相互作用的標識システムの代表的例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチング分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴにおいてエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性または非−蛍光性である。相互作用的標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は、非−蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は、発光性（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）、例えば、生物発光性、化学発光性、電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。前記供与体分子及び受容体分子は、本発明においてそれぞれレポーター分子及びクエンチャー分子として表現できる。相互作用的標識システムは、接触媒介クエンチング（ｃｏｎｔａｃｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）に基いて検出可能なシグナルを提供する標識対を含む（Ｓａｌｖａｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００２  （３０）  ｎｏ．２１  ｅ１２２  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＡＭ．  ＣＨＥＭ．  ＳＯＣ  ２００２  （１２４）  ｐｐ  ６９５０−６９５６）。本発明において、相互作用的標識システムは、少なくとも二つの分子（例えば、染料）間の相互作用によりシグナル変化を誘導する、あらゆる標識システムを含む。
【０１５０】
相互作用的二重標識システムの一具現例において、ｈＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して；前記段階（ｄ）において、前記断片の延長は、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供する。一具現例において、ｈＣＴＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、前記段階（ｄ）において、前記断片の延長により相互作用的二重標識からのシグナルの変化が誘導されるサイトに位置する。一具現例において、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ｈＣＴＯのテンプレーティング部位に位置する。レポーター分子及びクエンチャー分子がｈＣＴＯのテンプレーティング部位に位置して、テンプレーティング部位が一本鎖状態である場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。前記段階（ｄ）で延長デュープレックスが形成されると、ｈＣＴＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに離隔されて、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングして、ターゲットシグナルを提供する。固相に固定されたＩＯにハイブリダイズされた延長デュープレックスから提供されるターゲットシグナルの検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。
【０１５１】
本明細書で使用される表現‘レポーター分子及びクエンチャー分子が構造的に近接する’とは、ランダムコイル（ｃｏｉｌ）及びヘアピン構造のような標識が結合されている鎖（例えば、断片またはｈＣＴＯ）の形態的構造により、レポーター分子及びクエンチャー分子が３次元的に互いに近接することを意味する。
【０１５２】
本明細書で使用される表現‘レポーター分子及びクエンチャー分子が構造的に離隔される’とは、二本鎖の形成時、標識が結合されている鎖（例えば、断片またはｈＣＴＯ）の形態的構造の変化により、レポーター分子及びクエンチャー分子が３次元的に離隔されることを意味する。
【０１５３】
相互作用的二重標識システムの他の具現例において、ｈＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して；前記段階（ｃ）における断片及びｈＣＴＯのハイブリダイゼーションは、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、前記延長デュープレックスは、ターゲットシグナルを維持する。一具現例において、ｈＣＴＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、前記段階（ｃ）における断片及びｈＣＴＯのハイブリダイゼーションにより相互作用的二重標識からのシグナルの変化が誘導されるサイトに位置する。一具現例において、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ｈＣＴＯのキャプチャリング部位に位置する。レポーター分子及びクエンチャー分子がｈＣＴＯのキャプチャリング部位に位置して、ｈＣＴＯのキャプチャリング部位が一本鎖状態である場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。断片がｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされると、ｈＣＴＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に離隔されて、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングして、ターゲットシグナルが提供される。延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持する。固相に固定されたＩＯにハイブリダイズされた延長デュープレックスから提供されるターゲットシグナルの検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。このような具現例では、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドが非ターゲットシグナルを提供することができる。前記非−ターゲットシグナルは、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯのハイブリッドと延長デュープレックス間のＴｍ差を利用し、検出温度を調節することにより除去できる。
【０１５４】
相互作用的二重標識システムの他の具現例において、断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して；前記段階（ｃ）において、断片及びｈＣＴＯのハイブリダイゼーションは、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持する。一具現例において、ＰＴＯ断片上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、前記段階（ｃ）において、断片及びｈＣＴＯのハイブリダイゼーションにより相互作用的二重標識からのシグナルの変化が誘導されるサイトに位置する。一具現例において、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＰＴＯ断片の５’−タギング部位に位置する。レポーター分子及びクエンチャー分子がＰＴＯ断片に位置して、ＰＴＯ断片（または５’−タギング部位）が一本鎖状態である場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。ＰＴＯ断片がｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされると、ＰＴＯ断片は、二本鎖に関与し、レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に離隔されて、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングし、これによりターゲットシグナルを提供する。延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持する。固相に固定されたＩＯにハイブリダイズされた延長デュープレックスから提供されるターゲットシグナルの検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。このような具現例では、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドが非ターゲットシグナルを提供することができる。前記非−ターゲットシグナルは、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯのハイブリッドと延長デュープレックス間のＴｍ差を利用し、検出温度を調節することにより除去できる。
【０１５５】
一具現例によると、同一な鎖上に相互作用的二重標識が存在する場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも７ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチドまたは少なくとも２０ヌクレオチド離隔されて位置する。
【０１５６】
相互作用的二重標識システムの他の具現例において、断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の一つを有し、ｈＣＴＯは、前記相互作用的二重標識の他の一つを有して；前記段階（ｃ）において、断片及びｈＣＴＯのハイブリダイゼーションは、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持する。このような具現例において、前記相互作用的二重標識の一つは、ＰＴＯの５’−末端に位置して、他の一つは、ｈＣＴＯのキャプチャリング部位の３’−末端に位置する。相互作用的二重標識の一つがＰＴＯの５’−末端に位置して、他の一つがｈＣＴＯのキャプチャリング部位の３’−末端に位置する場合、断片及びｈＣＴＯ間のハイブリダイゼーション以前にレポーター分子及びクエンチャー分子が離隔されており、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングしない。前記段階（ｃ）において、断片がｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングし、これにより、ターゲットシグナルが提供される。延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持する。固相に固定されたＩＯにハイブリダイズされた延長デュープレックスから提供されるターゲットシグナルの検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。このような具現例では、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドが非ターゲットシグナルを提供することができる。前記非−ターゲットシグナルは、延長デュープレックスと非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯのハイブリッド間のＴｍ差を利用し、検出温度を調節することにより除去できる。
【０１５７】
本発明に有用なレポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に知られたあらゆるものが利用できる。その例は、下記のようである：  Ｃｙ２ＴＭ（５０６），  ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１  （５０９），  ＹＯＹＯＴＭ−１  （５０９），  Ｃａｌｃｅｉｎ  （５１７），  ＦＩＴＣ  （５１８），  ＦｌｕｏｒＸＴＭ  （５１９），  ＡｌｅｘａＴＭ  （５２０），  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １１０  （５２０），  Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ  ５００  （５２２），  Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ  ４８８  （５２４），  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ  （５２５），  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭ  （５２７），  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３  （５２９），  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１），  Ｃａｌｃｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ  （５３３），  ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１  （５３３），  ＴＯＴＯ１  （５３３），  ＪＯＥ  （５４８），  ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０  （５５０），  Ｄｉｌ  （５６５），  ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ  （５６８），  ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８  （５６８），  ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０  （５７０），  Ｃｙ３ＴＭ  （５７０），  ＡｌｅｘａＴＭ  ５４６  （５７０），  ＴＲＩＴＣ  （５７２），  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ  （５７５），  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ＆Ｂ  （５７５），  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ  （５７５），  Ｃａｌｃｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６），  Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ  （５８０），  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  （５８０），  ＴＡＭＲＡ  （５８２），  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ  （５９０），  Ｃｙ３．５ＴＭ  （５９６），  ＲＯＸ  （６０８），  Ｃａｌｃｉｕｍ  ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ  （６１５），  ＡｌｅｘａＴＭ  ５９４  （６１５），  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（６１５），  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ  （６２８），  ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３  （６３１），  ＹＯＹＯＴＭ−３  （６３１），  Ｒｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  （６４２），  Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  （６４８），  ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３  （６６０），  ＴＯＴＯ３  （６６０），  ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）  （６６５），  Ｃｙ５ＴＭ  （６７０），  Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  （６７１），  Ｃｙ５．５  （６９４），  ＨＥＸ  （５５６），  ＴＥＴ  （５３６），  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｕｅ  （４４７），  ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０  （５４４），  ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０  （５５９），  ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ５９０  （５９１），  ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０  （６１０），  ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５  （６３７），  ＦＡＭ  （５２０），  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  （５２０），  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３  （５２０），  Ｐｕｌｓａｒ  ６５０  （５６６），  Ｑｕａｓａｒ  ５７０  （６６７），  Ｑｕａｓａｒ  ６７０  （７０５）及びＱｕａｓａｒ  ７０５  （６１０）。括弧の数字は、ナノメートル単位の最大発光波長である。好ましくは、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＪＯＥ，  ＦＡＭ，  ＴＡＭＲＡ，  ＲＯＸ及びフルオレセインベースの標識を含む。
【０１５８】
適したレポーター−クエンチャー対は、下記のように多様な文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅ  ら，  ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７１）；  Ｗｈｉｔｅら，  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７０）；  Ｂｅｒｌｍａｎ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７１）；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｃｏｌｏｒ  ＡＮＤ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７６）；  Ｂｉｓｈｏｐ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９７２）；  Ｈａｕｇｌａｎｄ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  １９９２）；  Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９４９）；  Ｈａｕｇｌａｎｄ，  Ｒ．  Ｐ．，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  ６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  Ｏｒｅｇ．，  １９９６）；  米国特許第３，９９６，３４５号及び第４，３５１，７６０号。
【０１５９】
多様な範囲の波長または特定な波長の蛍光をクエンチングできる非−蛍光クエンチャー分子（例えば、ダーククエンチャー分子）が本発明で利用できるということは、注目すべきことである。非−蛍光クエンチャー分子の例は、ＢＨＱ及びＤＡＢＣＹＬである。
【０１６０】
相互作用的二重標識システム類型によって、レポーター分子またはクエンチャー分子からのシグナルが検出できる。
【０１６１】
ＦＲＥＴ標識において、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴのその他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｙｅ）は、レポーターとして利用されて、ロダミン染料（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｄｙｅ）は、クエンチャーとして利用される。
【０１６２】
（ｉ−２）単一標識
単一標識の一具現例において、ｈＣＴＯは、単一標識を有して、前記段階（ｄ）において、断片の延長は、単一標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供する。一具現例において、ｈＣＴＯ上の単一標識は、前記段階（ｄ）において、断片の延長により単一標識からのシグナルの変化が誘導されるサイトに位置する。一具現例において、単一標識は、ｈＣＴＯのテンプレーティング部位に位置する。一具現例において、本発明は、ｈＣＴＯがＩＯとハイブリダイズすることを含むため、二本鎖に存在するか一本鎖に存在するかによって相異なるシグナルを提供できる単一標識が、本発明で有用である。上記のような特性を有する限り、どんな単一標識でも使用できる。上記特性の単一蛍光標識の例は、単一蛍光標識の種類及び好ましい結合一を記述する文献［米国特許第７，５３７，８８６号及び第７，３４８，１４１号］に開示されている。一具現例において、前記単一蛍光標識は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ及びフルオレセインベースの標識を含む。一具現例において、標識されるヌクレオチドの残基は、５’−末端または３’−末端よりは、オリゴヌクレオチド内の内部ヌクレオチド残基に位置することが好ましい。
【０１６３】
このような単一蛍光標識がｈＣＴＯのテンプレーティング部位に位置して、前記段階（ｄ）で延長デュープレックスが形成される場合、ｈＣＴＯのテンプレーティング部位は、二本鎖状態となり、前記単一標識からの蛍光シグナル強度は、一本鎖状態で単一標識からの蛍光シグナル強度と比較し、増加するようになる。したがって、単一標識を使用する具現例において、固相におけるシグナル増加の検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。
【０１６４】
単一標識の他の具現例において、ｈＣＴＯは、単一標識を有して、前記段階（ｃ）において、断片及びｈＣＴＯのハイブリダイゼーションは、前記単一標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持する。一具現例において、ｈＣＴＯ上の単一標識は、前記段階（ｃ）において、断片及びｈＣＴＯのハイブリダイゼーションにより、単一標識からのシグナルの変化が誘導されるサイトに位置する。一具現例において、単一標識は、ｈＣＴＯのキャプチャリング部位に位置する。延長デュープレックスは、ターゲットシグナルを維持する。したがって、単一標識を使用する具現例において、固相におけるシグナル増加の検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。
【０１６５】
一具現例において、二本鎖に存在するか一本鎖に存在するかによって相異なるシグナルを提供できる単一標識が使用される。このような単一蛍光標識がｈＣＴＯのキャプチャリング部位に位置して、前記段階（ｃ）において断片がｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる場合、ｈＣＴＯのキャプチャリング部位は二本鎖状態となり、単一標識からの蛍光シグナル強度は、一本鎖状態で単一標識からの蛍光シグナル強度と比較して増加するようになる。したがって、単一標識を使用する具現例において、固相におけるシグナル増加の検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。一具現例において、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯのハイブリッドにより非ターゲットシグナルが提供でき、これは、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯのハイブリッドと延長デュープレックス間のＴｍ差を利用し、検出温度を調節することにより除去できる。
【０１６６】
単一標識のまた他の具現例において、断片は、単一標識を有して、前記段階（ｃ）において、断片及びｈＣＴＯのハイブリダイゼーションは、ターゲットシグナルを提供し、延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持する。
【０１６７】
断片に連結された単一標識は、固相で延長デュープレックスの存在を示すシグナルを提供できるようなある標識、例えば、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学的標識、金属標識、化学的標識（例えば、ビオチン）及び酵素的標識（例えば、アルカリホスファターゼ、ペロキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ）を含む。本発明で有用な単一蛍光標識は、上述のように、レポーター及びクエンチャー分子に対する説明を参照して説明できる。
【０１６８】
図２は、単一標識を有するＰＴＯ断片を利用する一具現例を図式的に示す。
【０１６９】
蛍光単一標識がＰＴＯ断片上に位置して、前記段階（ｃ）において、ＰＴＯ断片がｈＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされる場合、ＰＴＯ断片に連結された単一標識は、ターゲットシグナルを提供し、延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持する。固相に固定されたＩＯにハイブリダイズされた延長デュープレックスから提供される前記ターゲットシグナルの検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。一具現例では、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドにより非ターゲットシグナルが提供でき、これは、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯのハイブリッドと延長デュープレックス間のＴｍ差を利用して、検出温度を調節することにより除去できる。
【０１７０】
（ｉｉ）延長デュープレックス内に挿入された標識
本発明は、延長デュープレックスの存在を示すターゲットシグナルを提供するために、延長デュープレックス内に挿入された標識を利用することができる。
【０１７１】
延長反応の間に挿入される標識を利用する一具現例において、ターゲットシグナルは、延長反応の間に延長デュープレックス内に挿入された単一標識により提供されて、挿入された単一標識は、延長反応の間に挿入されるヌクレオチドに連結されている。
【０１７２】
特定具現例において、複数の同一な単一標識が挿入できる。単一標識は、固相で延長デュープレックスの存在を示すシグナルを提供できる限り、どんな標識でも含むことができる。
【０１７３】
図３は、延長反応の間に挿入される標識を利用する一具現例を図式的に示す。ＰＴＯ断片がｈＣＴＯ上で延長される場合、標識を有するヌクレオチドが挿入される。延長デュープレックス内に挿入された標識は、ターゲットシグナルを提供する。固相に固定されたＩＯにハイブリダイズされた前記延長デュープレックスからのターゲットシグナルの検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。
【０１７４】
一具現例において、延長反応の間に挿入されたヌクレオチドは、第１非天然塩基（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ）を有して、ｈＣＴＯは、第１非天然塩基に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基を有するヌクレオチドを有する。一具現例において、第２非天然塩基を有するヌクレオチドは、ｈＣＴＯのテンプレーティング部位のどんなサイトにも位置する。一具現例において、前記非−天然塩基は、特定サイト内に標識を挿入するために使用される。
【０１７５】
本明細書で使用される用語‘非天然塩基’は、水素−結合塩基対を形成できるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）のような天然塩基の誘導体を意味する。本明細書で使用される用語‘非天然塩基’は、母化合物（ｍｏｔｈｅｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として、天然塩基と相異なる塩基対パターンを有する塩基を含み、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、第５，９６５，３６４号、第６，００１，９８３号及び第６，０３７，１２０号に記載されている。非天然塩基間の塩基対は、天然塩基と同様に、二つまたは三つの水素結合を含む。また、非天然塩基間の塩基対は、特定な方式によっても形成される。非天然塩基の特定な例は、塩基対の組み合わせにおいて、下記のような塩基を含む：ｉｓｏ−Ｃ／ｉｓｏ−Ｇ，  ｉｓｏ−ｄＣ／ｉｓｏ−ｄＧ，  Ｋ／Ｘ，  Ｈ／Ｊ及びＭ／Ｎ（参照：米国特許第７，４２２，８５０号）。
【０１７６】
図３は、特定サイト内に標識を挿入するために、非−天然塩基を利用する具現例を図式的に示す。第１非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＧ）に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＣ）を有するヌクレオチドを含むｈＣＴＯに断片がハイブリダイズされる。蛍光単一標識と共に第１非天然塩基を有するヌクレオチドの存在下で延長反応が実施されて、延長デュープレックスを形成する。延長反応において、第１非天然塩基を有するヌクレオチドは、第２非天然塩基を有するヌクレオチドの向こう側のサイトに挿入される。固相に固定されたＩＯにハイブリダイズされた前記延長デュープレックスから提供されるターゲットシグナルの検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。
【０１７７】
使用される単一標識の種類及び特徴は、上述の‘断片及びｈＣＴＯに連結された標識’に対する標識システムの説明を参照して説明できる。
【０１７８】
（ｉｉｉ）延長デュープレックス内に挿入された標識と断片及び／またはｈＣＴＯに連結された標識の組み合わせ
延長反応の間に挿入された標識と断片及び／またはｈＣＴＯに連結された標識を利用する一具現例において、ターゲットシグナルは、延長反応の間に延長デュープレックス内に挿入された標識と断片及び／またはｈＣＴＯに連結された標識により提供されて、前記挿入された標識は、延長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されており、前記二つの標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子の相互作用的二重標識であって、前記段階（ｄ）における断片の延長は、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、ターゲットシグナルを提供する。
【０１７９】
一具現例において、挿入された標識と断片及び／またはｈＣＴＯに連結された標識は、前記段階（ｄ）において、断片の延長により相互作用的二重標識からのシグナルの変化が誘導されるサイトに位置する。
【０１８０】
特定具現例において、延長反応の間に挿入されたヌクレオチドは、第１非天然塩基を有して、ｈＣＴＯは、第１非天然塩基に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基を有するヌクレオチドを有する。
【０１８１】
一具現例において、前記非−天然塩基は、特定サイト内に標識を挿入するために使用される。
【０１８２】
一具現例において、断片は、（ｉ）第１非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＧ）に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＣ）を有するヌクレオチド及び（ｉｉ）レポーターをテンプレーティング部位の５’−末端に含むｈＣＴＯにハイブリダイズされる。クエンチャー分子と共に第１非−天然塩基を有するヌクレオチドの存在下で延長反応が実施されて、延長デュープレックスが形成されて、レポーター分子からのシグナルがクエンチャー分子によりクエンチングされる。即ち、前記段階（ｄ）において、断片の延長は、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルが提供される。延長反応において、第１非天然塩基を有するヌクレオチドは、第２非天然塩基を有するヌクレオチドの向こう側のサイトに挿入される。固相に固定されたＩＯにハイブリダイズされた前記延長デュープレックスからのターゲットシグナルの検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。
【０１８３】
特定具現例において、クエンチャー分子は、ｈＣＴＯに連結されており、レポーター分子は、延長反応の間に挿入される。
【０１８４】
他の具現例において、レポーターを含む断片は、第１非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＧ）に対して特異的結合親和性のある第２非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＣ）を有するヌクレオチドをテンプレーティング部位に含むｈＣＴＯにハイブリダイズされる。クエンチャー分子と共に第１非−天然塩基を有するヌクレオチドの存在下で延長反応が実施されて、延長デュープレックスが形成され、レポーター分子からのシグナルがクエンチャー分子によりクエンチングされる。即ち、断片の延長は、相互作用的二重標識のシグナル変化を誘導し、延長デュープレックスの存在を示すターゲットシグナルを提供する。クエンチャー分子が挿入されるサイトは、延長デュープレックスにおいて、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングするどんなサイトでもよい。
【０１８５】
特定具現例において、クエンチャー分子は、断片に連結されており、レポーター分子は、延長反応の間に挿入される。
【０１８６】
固相に固定されたＩＯにハイブリダイズされた延長デュープレックスからのターゲットシグナルの検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。
【０１８７】
（ｉｖ）断片に連結された標識または延長デュープレックス内に挿入された標識及びＩＯに連結された標識の組み合わせ
断片に連結された標識または延長反応の間に延長デュープレックス内に挿入された標識及びＩＯに連結された標識を利用する一具現例において、ターゲットシグナルは、断片に連結された標識または延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識及びＩＯに連結された標識により提供されて、前記断片に連結された標識または前記延長反応の間に延長デュープレックス内に挿入された標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の一つを有して、前記ＩＯは、前記相互作用的二重標識の他の一つを有し、前記段階（ｅ）において、前記延長デュープレックスとＩＯのハイブリダイゼーションは、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供する。
【０１８８】
前記ターゲットシグナルは、延長デュープレックスがＩＯにハイブリダイズされる場合にのみ提供される。
【０１８９】
一具現例において、断片に連結された標識または延長反応の間に延長デュープレックス内に挿入された標識及びＩＯに連結された標識は、前記段階（ｅ）において、延長デュープレックスとＩＯとのハイブリダイゼーションにより、相互作用的二重標識からのシグナルの変化が誘導されるサイトに位置する。
【０１９０】
一具現例において、ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位は、ｈＣＴＯの基本構造であるＣＴＯの３’−末端に位置して、ＩＯは、その５’−末端を通じて固相に固定されており、クエンチャー分子は、ＰＴＯ断片の５’−末端に連結されており、レポーター分子は、ＩＯの３’−末端に連結されている。５’−末端にクエンチャー分子を有するＰＴＯ断片がｈＣＴＯにハイブリダイズされる場合、延長デュープレックスが形成されて、前記延長デュープレックスは、ＩＯにハイブリダイズされ、延長デュープレックス上のクエンチャー分子及びＩＯ上のレポーター分子は、互いに近接するようになり、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導する。
【０１９１】
特定具現例において、レポーター分子は、ＰＴＯ断片に連結されており、クエンチャー分子は、ＩＯに連結されている。
【０１９２】
固相に固定されたＩＯにハイブリダイズされた延長デュープレックスから提供されるターゲットシグナルの検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。
【０１９３】
一具現例において、ＩＯ及び非切断ＰＴＯ／ｈＣＴＯのハイブリッド間のハイブリダイゼーション時に非−ターゲットシグナルが提供できる。前記非−ターゲットシグナルは、ｈＣＴＯ及びＩＯ間のハイブリダイゼーションが維持され、且つ非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリダイゼーションは解離される検出温度を調節することにより除去することができる。
【０１９４】
他の具現例において、ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位は、ブロッカーを通じて、基本構造のＣＴＯの５’−  末端に位置して、ＩＯは、その３’−末端を通じて固相に固定される。クエンチャー分子は、延長反応の間にＰＴＯ断片の延長鎖の３’−末端部位内に挿入されて、レポーター分子は、ＩＯの５’−末端に連結される。前記延長鎖の３’−末端に挿入されたクエンチャー分子を含む延長デュープレックスが形成されて、前記延長デュープレックスがＩＯにハイブリダイズされる場合、前記延長デュープレックス上のクエンチャー分子及び前記ＩＯ上のレポーター分子は、互いに近接するようになり、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導する。
【０１９５】
特定具現例において、レポーター分子は、延長反応の間に挿入されて、クエンチャー分子は、ＩＯに連結される。
【０１９６】
固相に固定されたＩＯにハイブリダイズされた延長デュープレックスから提供されるターゲットシグナルの検出は、延長デュープレックスの存在を決定できるようにする。
【０１９７】
一具現例において、延長反応の間に挿入されたヌクレオチドは、第１非天然塩基を有して、ｈＣＴＯは、前記第１非天然塩基に特異的結合親和性のある第２非天然塩基を有するヌクレオチドを有する。
【０１９８】
一具現例において、前記非天然塩基は、特定サイトに標識を挿入するために使用される。
【０１９９】
前記ＩＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に直接的または間接的に固定される。一具現例において、ＩＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定される。具体的に、その３’−末端を通じて固相基質上に固定される。
【０２００】
ＩＯは、共有または非共有結合方式で固相基質の表面上に固定化できる。固定化されたＩＯが固相基質の表面上に間接的に固定化される場合、適したリンカーを利用する。本発明で有用なリンカーは、固相基質の表面上におけるプローブ固定化に利用されるリンカーならどんなものでもよい。例えば、アミン官能性を有するアルキルまたはアリール化合物、またはチオール官能性を有するアルキルまたはアリール化合物がＩＯ固定化のためのリンカーとして利用できる。また、ポリ（Ｔ）テイルまたはポリ（Ａ）テイルがリンカーとして使用できる。前記リンカーとしてのポリ（Ｔ）テイルまたはポリ（Ａ）テイルは、ＩＯの配列として考慮されない。
【０２０１】
一具現例によると、本発明で利用される固相基質は、マイクロアレイである。本発明の反応環境を提供するマイクロアレイは、当業界に知られた如何なるものでもよい。本発明の全ての過程、即ち、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション、切断、延長、メルティング及び蛍光検出は、マイクロアレイ上で実施される。マイクロアレイ上に固定化されたＩＯは、ハイブリダイズ可能なアレイ要素（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ  ａｒｒａｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として利用される。マイクロアレイを製作するための固相基質（Ｓｏｌｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、金属（例えば、金、金と銅の合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ２ウェハー、ゲルマニウム、ガリウムアルセニド、カーボン、炭素ナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これらに限定されるものではない。前記固相基質は、ｄｉｐｓｔｉｃｋ、プレート、粒子（例えば、ビーズ）、親和性カラム及びメンブレインの形態でありえる。本発明の多数の固定化されたＩＯは、固相基質上の一つのアドレサブル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）領域または複数のアドレサブル領域に固定化されて、固相基質は、２〜１，０００，０００個のアドレサブル部位を含むことができる。フォトリソグラフィー、インクゼッティング、機械的マイクロスポッティング及びその類似方法のような従来製作技術により、アレイまたは特定応用のためのアレイを生産するために、固定化されたＩＯが制作できる。
【０２０２】
固定化されたＩＯが物理的に分離されえるため、固相で実施する本発明は、一種類の標識を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。このような点で、固相において、本発明により検出可能なターゲット核酸配列の数は制限されない。
【０２０３】
一具現例において、本方法は、固相（固相基質）を洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）する段階をさらに含む。固相基質の洗浄を実施しない場合も、固相基質上でシグナルが検出できる。例えば、共焦点顕微鏡を使用し、液相における標識からのシグナルに影響を受けずに、固相基質上のシグナルのみを検出することができる。
【０２０４】
段階（ｆ）：ターゲットシグナルの検出
最終的に、延長デュープレックスは、ターゲットシグナルを測定することにより固相で検出されて、前記延長デュープレックスの存在は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
【０２０５】
ターゲットシグナルは、延長デュープレックスが維持される場合にのみ提供されるため、シグナル検出時、延長デュープレックスは解離されず、二本鎖状態を維持することが要求される。延長デュープレックスは、ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位を通じてＩＯに結合されるため、シグナル検出時、ＩＯとＩＯ−ハイブリダイジング部位も二本鎖状態を維持することが要求される。
【０２０６】
したがって、ターゲットシグナルを固相で検出する場合、延長デュープレックス及びＩＯデュープレックスの両方とも二本鎖状態である、予め指定された温度が適用される。
【０２０７】
シグナリングシステムの類型によって、非切断ＰＴＯの５’−タギング部位及びｈＣＴＯ間のハイブリダイゼーションにより非−ターゲットシグナルが提供できる（参考：図２）。このような場合、非−ターゲットシグナルは、ハイブリダイゼーション条件を調節して除去できる。
【０２０８】
一例として、前記延長デュープレックス及びＩＯデュープレックスの両方とも二本鎖状態を維持し、且つ非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドは、実質的に解離される、予め指定された温度でシグナルが検出される。
【０２０９】
本明細書において、延長デュープレックスの検出温度と関連して本発明で使用される表現‘非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドが実質的に解離される温度’は、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドが全部または一部解離される温度を含む。
【０２１０】
一具現例において、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドが一部解離される温度においても、本発明は実施できる。このような場合、分析される試料からのシグナルがターゲット核酸配列の存在を示すかどうか確認するために、ターゲット配列を含んでいない陰性対照群からのシグナルを利用できる。
【０２１１】
一具現例において、ターゲット検出のための温度は、延長デュープレックス、ＩＯデュープレックス及び／または非切断ＰＴＯの５’−タギング部位及びｈＣＴＯ間のハイブリッドのＴｍ値を考慮して決定する。
【０２１２】
一具現例において、延長デュープレックス及びＩＯデュープレックスのＴｍ値は、非切断ＰＴＯの５’−タギング部位及びｈＣＴＯ間のハイブリッドのＴｍ値より高く（例えば、５℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上または３０℃以上高く）なるように調節できる。
【０２１３】
一具現例において、予め指定された温度は、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドのＴｍ値から１０℃または５℃を引いたＴｍ値より高い。予め指定された温度は、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドのＴｍ値より高くてよい。予め指定された温度は、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドのＴｍ値に５℃足したＴｍ値より高くてよい。
【０２１４】
延長デュープレックスのＴｍ値は、（ｉ）断片の配列及び／または長さ、（ｉｉ）ｈＣＴＯの配列及び／または長さ、または（ｉｉｉ）断片の配列及び／または長さとｈＣＴＯの配列及び／または長さによって多様に調節可能である。また、ＩＯ及びｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位間のハイブリダイゼーションにより形成されたＩＯデュープレックスのＴｍ値も多様に調節できる。このようなＴｍ値の調節を考慮すれば、非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯのハイブリッドを解離させるに適した温度は、容易に決定できる。
【０２１５】
プライマー、ＰＴＯ、ｈＣＴＯ及びＩＯは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰｓ及び／またはＮＭＰｓから構成できる。択一的に、プライマー、ＰＴＯ、ｈＣＴＯ及びＩＯは、変形ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，  参照：ＰＣＴ出願公開第ＷＯ  ９２／２０７０２号）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，  参照：ＰＣＴ出願公開第ＷＯ  ９８／２２４８９号、第ＷＯ  ９８／３９３５２号及び第ＷＯ  ９９／１４２２６号）を含むことができる。プライマー、ＰＴＯ、ｈＣＴＯ及びＩＯは、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含むことができる。用語‘ユニバーサル塩基’は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれに対して、ほとんど区別無しに塩基対を形成することができるものを意味する。
【０２１６】
上述のように、ＰＴＯは、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に離隔されて位置する一つのサイトで切断できる。前記切断サイトは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に位置できる。ＰＴＯ断片がＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部を含む場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部にハイブリダイズされるｈＣＴＯのサイトは、ユニバーサル塩基、縮退性配列（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、ＰＴＯがＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に一つのヌクレオチド離隔されて位置するサイトで切断される場合、前記ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために、ｈＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端一部は、ユニバーサル塩基を含むことが有利である。もし、ＰＴＯがＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に２個のヌクレオチド離隔されて位置するサイトで切断される場合、ｈＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端は、縮退性配列を含み、その３’−方向に隣接したヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含むことが有利である。このように、３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部の多様なサイトでＰＴＯの切断が起こる場合、ｈＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮退性配列を利用することが有用である。また、アップストリームプライマー延長−依存的切断誘導下で、同一な５’−タギング部位を有するＰＴＯｓを複数のターゲット核酸配列スクリーニングに利用する場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部が相異なっているＰＴＯ断片を生成することができる。このような場合、ユニバーサル塩基及び縮退性配列は、ｈＣＴＯに有用に使用される。ｈＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮退性配列を利用する戦略は、複数のターゲット核酸配列のスクリーニングのために、一種のｈＣＴＯまたは最小限の種類のｈＣＴＯを使用できるようにする。
【０２１７】
一具現例によると、本発明の方法は、反復サイクルの間に変性を含み、前記段階（ａ）−（ｆ）の全部または一部（例えば、（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）または（ａ）−（ｅ））を繰り返す段階を追加的に含む。このような反復は、ターゲット核酸配列及び／またはターゲットシグナルを増幅できるようにする。
【０２１８】
前記変性は、加熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼ作用）、及び結合タンパク質を含む従来の技術により実施できるが、これらに限定されるものではない。例えば、変性は、８０〜１０５℃の温度範囲で加熱して達成できる。このような処理を達成するための一般的な方法は、文献［Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）］に開示されている。
【０２１９】
特定具現例において、前記反復サイクル数は、ＰＴＯが十分切断されて、過量の延長鎖が生成されるように調節される。
【０２２０】
一具現例によると、段階（ａ）−（ｆ）は、一つの反応容器または個別反応容器で実施する。例えば、段階（ａ）−（ｂ）、（ｃ）−（ｄ）または（ｅ）−（ｆ）を個別反応容器で実施することができる。
【０２２１】
特定具現例において、段階（ａ）−（ｂ）及び（ｃ）−（ｆ）は、一つの反応容器または個別反応容器で実施される。前記段階（ａ）−（ｂ）及び（ｃ）−（ｆ）は、一つの反応容器でも相異なる方式で実施できる。例えば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位及びターゲット核酸配列間のハイブリダイゼーションが、断片及びｈＣＴＯ間のハイブリダイゼーションに対して不利な、より厳格な条件下で起これる場合、段階（ａ）−（ｂ）の反復は、段階（ｃ）−（ｆ）過程無しに進行でき、段階（ｃ）−（ｆ）は、段階（ａ）−（ｂ）の完了後に進行できる。
【０２２２】
特定具現例において、段階（ａ）−（ｄ）及び（ｅ）−（ｆ）は、個別反応容器で実施される。
【０２２３】
一部段階の反復、反復過程において、変性の介入（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）、一部段階の分離及び検出時点が、本発明の思想内で多様に変形できることは、当業者に明白である。
【０２２４】
特定具現例において、反復サイクルの間に変性を含む反復がアップストリームプライマーを含む段階（ａ）の反応混合物を利用して実施される場合、前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で、例えばＰＣＲ方法によって実施される。
【０２２５】
特定具現例において、反復サイクルの間に変性を含む反復がアップストリームプローブを含む段階（ａ）の反応混合物を利用して実施される場合、前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施される。
【０２２６】
本明細書で使用される用語‘核酸試料’は、核酸分子を含む非生物学的試料（例えば、食品、水、空気、土壌及び廃水）または生物学的試料を意味する。生物学的試料は、動物、植物、人間、菌類、バクテリア及びウイルスに由来する。生物学的試料は、生物学的供給源からの細胞、組織または流体、血液、血漿、血清、リンパ、牛乳、小便、糞便、眼球液、唾液、精液、脳抽出物、脊髄液、虫垂、脾臓及び扁桃組織抽出物などである。
【０２２７】
本発明は、検出及び／または増幅しようとするターゲット核酸配列が、ある特定配列または長さを有するように要求することなく、前記ターゲット核酸配列は、あらゆるＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＡＮ）及びＲＮＡ分子を含む。ターゲット核酸配列は、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい。
【０２２８】
ｍＲＮＡを初期物質として利用する場合、アニーリング段階の実施以前に逆転写段階が必須的であり、その詳細な内容は、文献［Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）；  及びＮｏｏｎａｎ，  Ｋ．  Ｆ．ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０３６６  （１９８８）］に開示されている。逆転写のために、ランダムヘキサマー、ｍＲＮＡのポリテイルにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドｄＴプライマーまたはターゲット特異的プライマーが利用できる。
【０２２９】
ターゲット核酸配列は、あらゆる天然（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウイロイド核酸を含む。また、前記核酸分子は、組換えにより生産されたまたは生産できるようなある核酸分子、または化学的に合成されたまたは合成できるようなある核酸分子でありえる。したがって、前記核酸配列は、自然から発見されるか、あるいは自然から発見されない。前記ターゲット核酸配列は、知られた、あるいは知られていない配列を含む。
【０２３０】
また、本発明は、ヌクレオチド変異の検出に有用である。特定具現例において、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。本明細書で使用される用語‘ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）’は、連続的ＤＮＡ断片において、特定サイトのＤＮＡ配列におけるある単一または複数のヌクレオチド置換、欠失または挿入を意味する。このような連続的ＤＮＡ断片は、一つの遺伝子または一つの染色体のある他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）または多形性対立遺伝子変異（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ａｌｌｅｌｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）でありえる。例えば、本発明で検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、突然変異、欠失、挿入、置換及び転座を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノム内の多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性に係わる変異及び腫瘍−誘発変異を含む。本明細書で使用された用語‘ヌクレオチド変異’は、核酸配列の特定サイトにおけるあらゆる変異を含む。即ち、用語‘ヌクレオチド変異’は、核酸配列の特定サイトにおける野生型及びそのあらゆる突然変異型を含む。
【０２３１】
ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異の検出のための本発明において、使用されるプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書でマッチング鋳型（ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）と表現される。使用されるプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に非相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書でミスマッチング鋳型（ｍｉｓｍａｔｃｈｉｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）と表現される。
【０２３２】
ヌクレオチド変異の検出のために、アップストリームプライマーの３’−末端は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異サイトの向こう側に位置するようにデザインすることができる。一具現例によると、アップストリームプライマーの３’−末端は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を有する。ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を有するアップストリームプライマーの３’−末端は、マッチング鋳型にアニーリングされて延長され、ＰＴＯ切断を誘導する。その結果、形成されたＰＴＯ断片は、ｈＣＴＯにハイブリダイズされ、延長されて延長デュープレックスを形成し、ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位は、ＩＯにハイブリダイズされて、固相基質上でターゲットシグナルを提供する。逆に、アップストリームプライマーの３’−末端がミスマッチング鋳型のヌクレオチド変異にミスマッチされる場合、延長のためにプライマーの３’−末端のアニーリングが必須的な条件下では、アップストリームプライマーがミスマッチング鋳型とハイブリダイズされる場合でもアップストリームプライマーの３’−末端は延長されず、これにより、延長デュープレックスが形成されない。
【０２３３】
択一的に、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を有するＰＴＯのハイブリダイゼーションに依存的なＰＴＯ切断を利用することができる。例えば、調節された条件下で、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＴＯは、マッチング鋳型にハイブリダイズされた後、切断される。その結果、形成されたＰＴＯ断片は、ｈＣＴＯにハイブリダイズされて延長され、ＩＯにハイブリダイズされてターゲットシグナルを提供する。その反面、調節された条件下で、前記ＰＴＯは、ヌクレオチド変異サイトに非相補的な配列を有するミスマッチング鋳型にハイブリダイズされず、切断されない。特に、このような場合、ＰＴＯのヌクレオチド変異に相補的な配列は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の中間に位置する。
【０２３４】
一具現例によると、人為的なミスマッチヌクレオチドの使用は、ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの区別可能性を向上させる。
【０２３５】
択一的に、本発明は、特定ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの選択性のために、３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に位置したヌクレオチド変異区別サイト（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）を有するＰＴＯを使用する。ヌクレオチド変異の検出のために、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に位置して、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を有する。
【０２３６】
ＰＴＯがヌクレオチド変異区別サイトに相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（即ち、マッチ鋳型）とハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部は、マッチ鋳型と二本鎖を形成するが、ＰＴＯがヌクレオチド変異区別サイトに非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（即ち、ミスマッチ鋳型）にハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部は、ミスマッチング鋳型と二本鎖を形成しない。
【０２３７】
本明細書でＰＴＯを言及しながら使用される用語‘ヌクレオチド変異区別サイト（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）’は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部上に存在する、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列である。
【０２３８】
一具現例によると、前記ヌクレオチド変異区別サイトは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端から１０ヌクレオチド、より好ましくは、８ヌクレオチド、さらに好ましくは、６ヌクレオチド、よりさらに好ましくは、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチド以内に離隔されて位置する。好ましくは、前記ヌクレオチド変異区別サイトは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端に位置する。
【０２３９】
プローブのヌクレオチド変異区別サイトまたはターゲット配列上のヌクレオチド変異サイトにおいて言及される用語‘サイト（ｓｉｔｅ）’は、本明細書において単一ヌクレオチドだけではなく、多数のヌクレオチドも含む意味として使用される。
【０２４０】
関心のあるヌクレオチド変異における、このような区別されるハイブリダイゼーションパターンは、ＰＴＯの初期切断サイトの差異を提供して、これにより、２種のＰＴＯ断片が生成されて、関心のあるヌクレオチド変異の存在有無によってシグナル差が発生するということは注目すべきことである。
【０２４１】
前記関心のあるヌクレオチド変異の存在下で、ＰＴＯ及びマッチング鋳型間にハイブリッドの切断によって第１断片が生成されて、関心のあるヌクレオチド変異の非存在下で、ＰＴＯ及びミスマッチング鋳型間のハイブリッドの切断により第２断片が生成される。前記第２断片は、前記第２断片を前記第１断片と異ならせる追加的な３’−末端部位を含む。
【０２４２】
単一ヌクレオチド変異の検出のための一具現例において、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端は、ターゲット核酸配列の単一ヌクレオチド変異に相補的な配列を有する。上述のように、マッチング鋳型にハイブリダイズされたＰＴＯの切断は、例えば、アップストリームプライマー延長−依存的切断誘導下で、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端に３’−方向にすぐ近接（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ａｄｊａｃｅｎｔ）したサイトで誘導できる。ＰＴＯ断片の３’−末端は、単一ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチドを有する。ＰＴＯ断片は、ヌクレオチド変異に該当する配列を含むキャプチャリング部位を有するｈＣＴＯとハイブリダイズされた後、延長され、延長デュープレックスを形成する。前記延長デュープレックスは、ＩＯにハイブリダイズされてターゲットシグナルを提供する。もし、同一なＰＴＯが、単一ヌクレオチド変異を除いてはマッチング鋳型と同一な配列を有するミスマッチング鋳型にハイブリダイズされる場合、ＰＴＯの切断は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端から３’−方向に２個のヌクレオチド離隔されたサイトで生成できる。ＰＴＯ断片の３’−末端は、単一ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチド以外に、追加的に切断されたヌクレオチドを有する。前記追加的に切断されたヌクレオチドにハイブリダイズされたｈＣＴＯのサイトが、前記追加的に切断されたヌクレオチドに非相補的な配列を有するようにデザインされた場合、ＰＴＯ断片の３’−末端は、ｈＣＴＯにハイブリダイズされず、その結果、調節された条件下でＰＴＯ断片は延長されない。
【０２４３】
一具現例によると、前記３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部に存在するヌクレオチド変異に相補的な配列を有するＰＴＯの切断サイトは、マッチング鋳型またはミスマッチング鋳型とのハイブリダイゼーションによって相異なっており、これによって、前記ある一つのハイブリダイゼーション反応から放出されるＰＴＯ断片は、例えば、その３’−末端一部、またはその３’−末端において相異なる配列を有する。
【０２４４】
一具現例によると、ＰＴＯ断片の３’−末端一部における相異を考慮したｈＣＴＯのヌクレオチド配列の選択は、マッチング鋳型をミスマッチング鋳型と区別できるようにする。
【０２４５】
一具現例によると、それぞれのＰＴＯ断片の生成は、ｈＣＴＯの延長反応により、区別して検出できる。
【０２４６】
一具現例によると、前記第２断片が前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる場合、前記第２断片が延長されることを防止するために、前記ｈＣＴＯが前記第２断片の追加的な３’−末端部位とハイブリダイズされないように選択された配列を、前記ｈＣＴＯが有する。
【０２４７】
上述のように、前記第１断片の延長は、ＩＯとｈＣＴＯ−延長デュープレックスのハイブリダイゼーションにより検出される。
【０２４８】
一具現例によると、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部は、前記ヌクレオチド変異区別サイトから１〜１０ヌクレオチド（または、１〜５ヌクレオチド）以内に離隔されて位置する非−塩基対形成部分（ｎｏｎ−ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）を含む。
【０２４９】
ＰＴＯが変異区別サイトに非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記非−塩基対形成部分は、３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部がターゲット核酸配列と二本鎖を形成することを防止する。非−塩基対形成部分（例えば、人為的ミスマッチヌクレオチド）の使用は、ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの区別可能性を向上させる。
【０２５０】
一具現例によると、ＰＴＯがヌクレオチド変異区別サイトに相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列とハイブリダイズされる場合、前記非−塩基対形成部分は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端一部及びターゲット核酸配列間に二本鎖の形成を抑制しない。
【０２５１】
一具現例によると、非−塩基対形成部分は、ＰＴＯ及びマッチング鋳型のハイブリッド上の初期切断サイトと、ＰＴＯ及びミスマッチング鋳型のハイブリッド上の初期切断サイト間の距離を拡大させる。
【０２５２】
一具現例によると、非−塩基対形成部分配列の導入は、初期切断サイト、特に、ＰＴＯ及びミスマッチング鋳型間のハイブリッド上の初期切断サイトを調節できるようにする。
【０２５３】
一具現例によると、非−塩基対形成部分は、ヌクレオチド変異区別サイトのダウンストリームに位置する。
【０２５４】
非−塩基対形成部分は、ターゲット核酸配列間に塩基対を形成しないあらゆる部分を含む。非塩基対形成部分は、（ｉ）人為的なミスマッチ塩基、塩基対を形成できない天然／非天然塩基、塩基対を形成できないように変形された塩基、またはユニバーサル塩基を含むヌクレオチド、（ｉｉ）塩基対を形成できないように変形された非塩基対形成ヌクレオチド、または（ｉｉｉ）非−塩基対形成化合物（ｎｏｎ−ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）である。
【０２５５】
例えば、非−塩基対形成部分は、アルキレン基、リボフラノシルナフタレン、ジオキシリボフラノシルナフタレン、メタホスフェート、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アリールホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミダート連結及びアリールホスホロアミダート連結を含む。従来のカーボンスペーサーも非−塩基対形成部分として使用される。非−塩基対形成部分としてのユニバサル塩基は、ＰＴＯの切断サイトを調節するに有用である。
【０２５６】
デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含む塩基対は、天然塩基間の結合強度より低い結合強度を有するため、ユニバーサル塩基は、特定ハイブリダイゼーション条件下で非−塩基対形成部分として利用できる。
【０２５７】
５’−末端一部に導入された非−塩基対形成部分は、１−１０、１−５、または１−２個の部分を含む。５’−末端一部内の多数の非−塩基対形成部分は、連続的または不連続的方式で存在できる。特定具現例において、非−塩基対形成部分は、２−５個の連続的な部分を含む。
【０２５８】
特定具現例において、非−塩基対形成部分は、非−塩基対形成化合物である。
【０２５９】
一具現例によると、ＰＴＯのヌクレオチド変異区別サイト及び非−塩基対形成部分は、３’−ターゲッティング部位の５’−末端から１０ヌクレオチド、８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチド以内に離隔されて位置する。
【０２６０】
５’−末端にターゲット核酸配列に非相補的なテイル及び５’−末端部位にヌクレオチド変異区別サイトを全部含むプローブが、ヌクレオチド変異区別サイトのヌクレオチドに対するミスマッチ鋳型にハイブリダイズされる場合、前記５’−末端部位は、一本鎖を形成することができて、他の部位は、ターゲット核酸配列と二本鎖を形成することができる。プローブデザイン観点でこのようなプローブは、ＰＴＯと相異なっているが、前記プローブがミスマッチング鋳型にハイブリダイゼーションされると、ＰＴＯ構造を有するプローブと見なされる。したがって、ＰＴＯを利用する本発明の分析方法によって、シグナルが発生できる。前記応用は、プローブのヌクレオチド変異区別サイトに非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列を検出するに有用である。
【０２６１】
増幅ブロッカー（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋｅｒ）を利用した選択的増幅（Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法と共に、ＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析は、効率的に少量のヌクレオチド変異を検出することができる。
【０２６２】
一般に臨床試料は、多量の野生型対立遺伝子（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｌｌｅｌｅ）及び少量の突然変異対立遺伝子（Ｍｕｔａｎｔ  ａｌｌｅｌｅ）を含む。増幅段階において、多量の野生型対立遺伝子の増幅は、大部分の増幅試薬を消耗する可能性が高く、したがって、突然変異対立遺伝子は増幅できず、シグナル発生が阻害される。このような問題を克服するために、野生型対立遺伝子の増幅は防止しつつ、突然変異対立遺伝子を選択的に増幅するための方法が提示された。
【０２６３】
代表的に、増幅ブロッカーとしてＰＮＡまたはＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドを利用する方法が報告された（ＵＳ  ２００４／００１４１０５，  ＵＳ  ７，８０３，５４３，  ＵＳ  ８，２０６，９２９，  Ｈ．  Ｏｒｕｍ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：５３３２−５３３６（１９９３）  Ａ．  Ｓｅｎｅｓｃａｕら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ３３０４−３３０８（２００５），  Ｙ．  Ｎａｇａｉら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：７２７６−７２８２（２００５），  Ｈｅｎｒｉｋら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：５３３２−５３３６（１９９３）及びＬｕｏら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ３４，  Ｎｏ  ２  ｅ１２  （２００６））。前記方法は、‘クランピング方法（ｃｌａｍｐｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）’と呼ばれる。
【０２６４】
一般に、クランピングのための増幅ブロッカーは、同一条件下で、専ら増幅ブロッカーに完全に相補的な配列を有する鋳型にのみハイブリダイズされて、単一ミスマッチを有する鋳型にはハイブリダイズされないようにデザインされる。プライマーアニーリングまたは鎖延長（Ｃｈａｉｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）を抑制する増幅ブロッカーにハイブリダイズされた鋳型は増幅されず、増幅ブロッカーにハイブリダイズされていない鋳型のみが増幅される。ＰＮＡ及びＬＮＡのような核酸類似体は、単一塩基差だけでも相当なＴｍ差を示すという点で、増幅ブロッカーとして有用である。
【０２６５】
使用される重合酵素がヌクレアーゼ活性を有する場合、増幅ブロッカーは、前記ヌクレアーゼ活性に対する耐性を有することが要求される。
【０２６６】
ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異領域に相異なる配列を有する二つの変異体（ｖａｒｉａｎｔ）類型が一つの試料に存在する場合、増幅ブロッカーは、関心のあるヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列は増幅させて、他のヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列は増幅させないことにより、より効率的な方式で、関心のあるターゲットヌクレオチド変異を検出することができる。特に、増幅ブロッカーの使用は、多量の野生型対立遺伝子及び少量の突然変異対立遺伝子を含む臨床試料から少量の突然変異対立遺伝子を検出するに非常に有用である。
【０２６７】
増幅ブロッカーを使用するとしても、野生型対立遺伝子の増幅が完全に防止されない可能性かある。しかし、ヌクレオチド変異に対し優れた区別可能性を有するＰＴＯを利用するＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析は、従来技術により、ほとんど検出されない少量の突然変異対立遺伝子を検出することができる。
【０２６８】
特定具現例において、プライマーのダウンストリームに位置する増幅ブロッカーは、プライマーの延長をブロッキングする。
【０２６９】
特定具現例において、前記増幅ブロッカーは、天然（ｎａｔｕｒａｌ）ヌクレオシド／ヌクレオチド、ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体またはこれらの組み合わせで作られたオリゴヌクレオチドである。
【０２７０】
特定具現例において、前記増幅ブロッカーは、５’ヌクレアーゼ活性に耐性のあるバックボーンを有するヌクレオシド／ヌクレオチドを含む。５’ヌクレアーゼ活性に耐性のあるバックボーンを有するヌクレオシド／ヌクレオチドは、本技術分野の当業者に知られているあらゆるものを含む。例えば、前記ヌクレオシド／ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート連結（ｌｉｎｋａｇｅ）、ホスホネート連結、ホスホロアミだート連結及び２’−カーボヒドレート変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む。特定具現例において、５’ヌクレアーゼに耐性のあるバックボーンを有するヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アリールホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミダート連結、アリールホスホロアミダート連結、ホスホロセレネート連結、２’−Ｏ−アミノプロピール変形、２’−Ｏ−アルキル変形、２’−Ｏ−アリル変形、２’−Ｏ−ブチル変形、α−アノマオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）変形を含む。
【０２７１】
一具現例によると、前記増幅ブロッカーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、モルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ブリッジ核酸（ＢＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホルアミダート（ＮＰ）オリゴマー、Ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅバインダー連結オリゴヌクレオチド（ＭＧＢ−Ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴマー、Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネートオリゴマー、ホスホルアミダート、β−ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、α−ホスホジエステルオリゴヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含む。
【０２７２】
特定具現例において、前記増幅ブロッカーは、５’−ヌクレアーゼ活性に耐性を有して、ハイブリダイゼーションにおいてそのＴｍ値は、一つのミスマッチによっても大きく影響を受ける。上述の特性を有する代表的な例は、ＰＮＡまたはＬＮＡを含む増幅ブロッカーである。
【０２７３】
前記増幅ブロッカーは、どんな長さでも有することができる。例えば、前記増幅ブロッカーは、５−１００ヌクレオチド、５−８０ヌクレオチド、５−５０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、１０−１００ヌクレオチド、１０−８０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチドまたは２０−３０ヌクレオチドの長さである。
【０２７４】
特定具現例において、前記増幅ブロッカーは、その延長が防止されるように、その３’−末端がブロッキングされる。
【０２７５】
ターゲット核酸配列上のヌクレオチド変異領域の向こう側に位置する増幅ブロッカーのヌクレオチド変異区別サイトは、前記増幅ブロッカーが非−ターゲットヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列の増幅は抑制するが、ターゲットヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列の増幅は抑制しない限り、増幅ブロッカーのどのサイトにも位置することができる。
【０２７６】
一具現例によると、増幅ブロッカーのヌクレオチド変異区別サイトは、非−ターゲットヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０２７７】
特定具現例において、増幅ブロッカーのヌクレオチド変異区別サイトは、その５’−末端部位、中間部位または３’−末端部位に位置することができる。
【０２７８】
前記増幅ブロッカーは、増幅ブロッカーのアップストリームに位置するプライマーから２００ヌクレオチド超過、１００ヌクレオチド超過、５０ヌクレオチド超過、３０ヌクレオチド超過、２０ヌクレオチド超過、１０ヌクレオチド超過、５ヌクレオチド超過、２ヌクレオチド超過、または１ヌクレオチド超過として離隔できる。前記増幅ブロッカーは、前記プライマーに隣接することができる。
【０２７９】
増幅ブロッカーと共にＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析を、ヌクレオチド変異を検出するために利用する場合、ＰＴＯ及び増幅ブロッカーは、ターゲット核酸配列の二本鎖の中、同一鎖または相異なる鎖に位置するようにデザインすることができる。同一鎖に位置するようにデザインされる場合、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションにおいて、ＰＴＯ及び増幅ブロッカーは、相互間に影響を与えることがあり、反応条件または配列の調節が要求されることがある。
【０２８０】
一具現例によると、本発明で使用されるターゲット核酸配列は、増幅プライマーにより前−増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である。
【０２８１】
本発明の利点は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を同時に検出（マルチプレックス）するという点でさらに目立つ。
【０２８２】
一具現例によると、前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために実施されて、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のアップストリームオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ｈＣＴＯは、少なくとも２種のｈＣＴＯを含み、前記ＩＯは、少なくとも２種のＩＯを含む。
【０２８３】
一具現例によると、本発明は、ＰＴＯに対する少なくとも２種のダウンストリームプライマーを利用して実施される。
【０２８４】
本発明により検出できるターゲット核酸配列は、多様な核酸配列、例えば、ゲノム内配列、人為的に分離または断片化された配列及び合成配列（例えば、ｃＤＮＡ配列及びバーコード配列）を含む。例えば、ターゲット核酸配列は、免疫−ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）のための核酸マーカー配列を含む。ＩＰＣＲは、ＰＣＲと共に、核酸マーカー配列及び抗体間のコンジュゲートを使用し、これは、タンパク質を含む多様な種類のターゲットを検出するために幅広く適用される（ｓｅｅ  Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８  ｐｐ：１２０−１２２（１９９２），  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，６６５，５３９，  Ｎｉｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３  ｐｐ：２０８−２１６（２００５），  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｐｕｂ．  Ｎｏ．  ２００５／０２３９１０８  ａｎｄ  Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２  ｐｐ：７９６−８００（２０１０））。本発明のターゲット核酸分子は、ＩＰＣＲ方法で使用される核酸マーカーを含み、本発明は、ＩＰＣＲ方法で核酸マーカーを検出するために適用できる。
【０２８５】
ＩＩ．ターゲット核酸配列の増幅を含む一具現例
本発明の他の様態において、本発明は、以下の段階を含む、ｈＣＴＯを利用するＰＴＯ切断及び延長（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈＣＴＯ；  ＰＣＥ−ｈＣＴＯ）分析によりＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記ＰＴＯは、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置して、前記ＰＴＯは、その延長が防止されるように、その３’−末端がブロッキングされている）と、
（ｂ）前記プライマーの延長及び前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記ＰＴＯが前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされると、前記アップストリームプライマーは、延長されて、前記延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片をｈＣＴＯ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ−Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記ｈＣＴＯは、（ｉ）３’→５’方向に前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むＣＴＯ、及び（ｉｉ）固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；  ＩＯ）に相補的なヌクレオチド配列を含むＩＯ−ハイブリダイジング部位を前記ＣＴＯの３’−または５’−末端に含み、前記ＰＴＯから放出された断片は、前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長デュープレックスを形成し、前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片の配列及び／または長さ、（ｉｉ）前記ｈＣＴＯの配列及び／または長さ、または（ｉｉｉ）前記断片の配列及び／または長さと前記ｈＣＴＯの配列及び／または長さにより調節可能なＴｍ値を有して、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態を維持する）と、
（ｅ）前記一本鎖状態のｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位を前記ＩＯとハイブリダイズさせる段階（前記固相基質上に固定された前記ＩＯは、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記ＩＯは、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてＩＯデュープレックスを形成して、前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識及び前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）前記断片に連結された標識、または前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、及び前記ＩＯに連結された標識によりターゲットシグナルを提供する）と、
（ｆ）前記延長デュープレックス及び前記ＩＯデュープレックスの両方とも二本鎖状態を維持する指定温度で前記ターゲットシグナルを測定することにより、固相基質上で前記延長デュープレックスを検出する段階（前記延長デュープレックスの存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）。
【０２８６】
増幅反応を伴うＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析の具現例は、前記段階（ａ）でプライマー対を利用することを除いては、上述のＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析と同様であるため、その共通する内容は、本明細書の複雑性を招来する過度なる重複を避けるために省く。
【０２８７】
一具現例によると、前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、段階（ａ）−（ｆ）の全てまたは一部（例えば、段階（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）または（ａ）−（ｅ））を少なくとも２回以上繰り返すことを追加的に含む。前記反応の反復は、少なくとも５、１０、２０または３０回以上であり、多くとも７０、６０、５０または４０回以下である。
【０２８８】
ＩＩＩ．アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性に基づいたＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析
本発明のまた他の様態において、本発明は、以下の段階を含む、ｈＣＴＯを利用するＰＴＯ切断及び延長（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈＣＴＯ；  ＰＣＥ−ｈＣＴＯ）分析によりＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列をＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされない）と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記ＰＴＯは、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記ＰＴＯは、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断され、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片をｈＣＴＯ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ−Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記ｈＣＴＯは、（ｉ）３’→５’方向に前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むＣＴＯ、及び（ｉｉ）固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；  ＩＯ）に相補的なヌクレオチド配列を含むＩＯ−ハイブリダイジング部位を前記ＣＴＯの３’−または５’−末端に含み、前記ＰＴＯから放出された断片は、前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長デュープレックスを形成し、前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片の配列及び／または長さ、（ｉｉ）前記ｈＣＴＯの配列及び／または長さ、または（ｉｉｉ）前記断片の配列及び／または長さと前記ｈＣＴＯの配列及び／または長さにより調節可能なＴｍ値を有して、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態を維持する）と、
（ｅ）前記一本鎖状態のｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位を前記ＩＯとハイブリダイズさせる段階（前記固相基質上に固定された前記ＩＯは、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記ＩＯは、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてＩＯデュープレックスを形成して、前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識及び前記断片及び／または前記ｈＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）前記断片に連結された標識、または前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、及び前記ＩＯに連結された標識によりターゲットシグナルを提供する）と、
（ｆ）前記延長デュープレックス及び前記ＩＯデュープレックスの両方とも二本鎖状態を維持する指定温度で前記ターゲットシグナルを測定することにより、固相基質上で前記延長デュープレックスを検出する段階（前記延長デュープレックスの存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）。
【０２８９】
アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性に基づいた本方法は、アップストリームオリゴヌクレオチドを利用しないことを除いては、アップストリームオリゴヌクレオチドを利用するＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析による方法と同様であるため、その共通する内容は、本明細書の複雑性を招来する過度なる重複を避けるために省く。
【０２９０】
興味深いことに、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性に基づいた本方法は、アップストリームオリゴヌクレオチドを使用しなくても、ＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析により、ターゲットシグナルを実際に提供する。
【０２９１】
本方法のために、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する従来の酵素を使用することができる。５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的重合酵素のうち、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する幾つかの酵素があって、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素がある。
【０２９２】
ターゲット核酸配列の増幅及びＰＴＯの切断効率を考慮すると、本発明のＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析は、好ましくアップストリームオリゴヌクレオチドを使用して実施される。
【０２９３】
一具現例によると、本発明は、反復サイクルの間に変性を含み、段階（ａ）−（ｆ）の全てまたは一部（例えば、段階（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）または（ａ）−（ｅ））を少なくとも２回以上繰り返すことを追加的に含む。前記反応の反復は、少なくとも５、１０、２０または３０回以上であり、多くとも７０、６０、５０または４０回以下である。
【０２９４】
ＩＶ．ターゲット検出用キット
本発明の追加的な様態において、本発明は、以下を含む、ｈＣＴＯを利用するＰＴＯ切断及び延長（ＰＣＥ−ｈＣＴＯ）分析によりＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出するためのキットを提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含むアップストリームオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置して、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）ｈＣＴＯ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ−Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（前記ｈＣＴＯは、  （ｉ）３’→５’方向に前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むＣＴＯ、及び（ｉｉ）固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；  ＩＯ）に相補的なヌクレオチド配列を含むＩＯ−ハイブリダイジング部位を前記ＣＴＯの３’−または５’−末端に含み、前記ＰＴＯから放出された断片は、前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされて、前記ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、鋳型−依存的核酸重合酵素により延長されて延長デュープレックスを形成する）と
（ｄ）前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含む前記固相基質上に固定されたＩＯ（前記ＩＯは、前記ｈＣＴＯのＩＯ−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてＩＯデュープレックスを形成する）。
【０２９５】
本発明のキットは、上述の本発明の検出方法を実施するために制作されるため、その共通する内容は、本明細書の複雑性を招来する過度なる重複を避けるために省く。
【０２９６】
特定具現例において、ＩＯ−ハイブリダイジング部位がＣＴＯの５’−末端に位置する場合、前記ｈＣＴＯは、ＣＴＯとＩＯ−ハイブリダイジング部位間に前記断片の延長反応を防止するブロッカー部位をさらに含む。
【０２９７】
一具現例において、前記キットは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む。
【０２９８】
一具現例において、前記キットは、鋳型−依存的核酸重合酵素をさらに含む。
【０２９９】
一具現例において、前記キットは、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素をさらに含む。
【０３００】
一具現例において、前記断片及び／または前記ｈＣＴＯは、少なくとも一つの標識を有する。
【０３０１】
一具現例において、前記標識は、単一標識または相互作用的二重標識である。
【０３０２】
一具現例において、前記キットは、延長反応の間に延長デュープレックス内に挿入される標識をさらに含む。
【０３０３】
一具現例において、前記キットは、延長反応の間に延長デュープレックス内に挿入される標識をさらに含み、前記断片及び／または前記ｈＣＴＯは、少なくとも一つの標識を有する。
【０３０４】
一具現例において、前記断片が標識を有するか、あるいは前記キットが前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入される標識をさらに含み、前記ＩＯは、標識を有する。
【０３０５】
一具現例において、前記ＰＴＯ、ｈＣＴＯ及び／またはＩＯは、その延長が防止されるように、３’−末端がブロッキングされる。
【０３０６】
一具現例において、前記キットは、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために利用されて、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ｈＣＴＯは、少なくとも２種のｈＣＴＯを含み、前記ＩＯは、少なくとも２種のＩＯを含む。
【０３０７】
一具現例において、前記ＩＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定される。
【０３０８】
一具現例において、前記キットは、ダウンストリームプライマーをさらに含む。
【０３０９】
上述の本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡ重合酵素助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）に必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、前記キットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、及びＤＮＡ重合酵素活性を抑制する抗体を含むことができる。また、前記キットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するに必要な試薬を含むことができる。特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、別途の包装またはコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）内に上述の構成成分を含むように採択される。
【０３１０】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【０３１１】
実施例１：５’−末端部位にＩＯ−ハイブリダイジング部位を有するｈＣＴＯを利用するＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析の評価
本発明者らは、マイクロアレイ上で単一標識されたＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ｈＣＴＯ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ−Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及び固定化オリゴヌクレオチド（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；  ＩＯ）を利用したＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析が、ターゲット核酸配列を検出できるかどうかを実験した。
【０３１２】
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーの延長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素を使用した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸配列として使用した。
【０３１３】
その５’−末端に蛍光分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するＰＴＯは、その３’−末端がカーボンスペーサーでブロッキングされている。その５’−末端部位にＩＯ−ハイブリダイジング部位を有するｈＣＴＯは、その３’−末端及びＩＯ−ハイブリダイジング部位とテンプレーティング部位との間にブロッカーを有する。ＩＯは、リンカーアーム（Ｌｉｎｋｅｒ  ａｒｍ）としてポリ（Ｔ）１０を有して、これをその３’−末端のアミノ基（ＡｍｉｎｏＣ７）を使用してガラススライドの表面に固定した。その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブを、その３’−末端のアミノ基（ＡｍｉｎｏＣ７）を使用してガラススライドの表面上に固定した。
【０３１４】
本実施例において、もしＮＧが存在する場合、ＮＧに特異的にハイブリダイズされたＰＴＯは、切断されて、蛍光レポーターが標識されたＰＴＯ断片が生成される。前記ＰＴＯ断片は、ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にアニーリングされて、ＩＯ−ハイブリダイゼーション部位とテンプレーティング部位との間に位置するブロッカーの向こう側の位置前まで前記ｈＣＴＯのテンプレーティング部位上で延長されて、一本鎖ＩＯ−ハイブリダイジング部位を有する蛍光レポーターが標識されたｈＣＴＯ−延長デュープレックスを形成する。前記ｈＣＴＯ−延長デュープレックスは、マイクロアレイ上において、その一本鎖ＩＯ−ハイブリダイゼーション部位を利用してＩＯにハイブリダイズされて、スポット上で蛍光シグナルを生成する。しかし、もしＮＧが存在しない場合、ｈＣＴＯは、蛍光レポーターが標識されたｈＣＴＯ−延長デュープレックスを形成せず、マイクロアレイ上でｈＣＴＯがＩＯにハイブリダイズされる場合でも、ｈＣＴＯは、スポット上で蛍光シグナルを生成しない。
【０３１５】
したがって、スポット上において、蛍光シグナルの存在または不存在の評価は、ターゲット核酸配列の存在を決定することができる。ＰＴＯの切断及び断片の延長、ＩＯにｈＣＴＯ−延長デュープレックスのハイブリダイゼーションを、マイクロアレイ上で同時に行った。反応以後、ＩＯを有する蛍光レポーターが標識されたｈＣＴＯデュープレックスの存在または不存在を分析した。
【０３１６】
本実施例で使用したアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、ｈＣＴＯ、ＩＯ及びマーカーの配列は、下記のとおりである：
ＮＧ＿Ｆ  ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：１）
ＮＧ＿Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：２）
ＰＴＯ  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：３）
ｈＣＴＯ−１  ５’−ＴＣＣＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴ［Ｓｐａｃｅｒ  １８］ＡＧＧＧＴＡＴＣＣＡＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：４）
ＩＯ−１  ５’−ＡＣＣＴＡＡＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（配列番号：５）
Ｍａｒｋｅｒ  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（配列番号：６）
（Ｉ：  デオキシイノシン）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯ−ＮＶの５’−タギング部位を示す）
【０３１７】
ＮＳＢ９  ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ，  Ｋｏｒｅａ）をＩＯ及びマーカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及び６）の製作に利用した。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度５０μＭになるように溶解させたＩＯ及びマーカーをＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ，  Ｃｈｉｎａ）を利用し、ＮＳＢ９  ＮＨＳスライド上にプリントした。前記ＩＯ及びマーカーを３ｘ１  フォーマット（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ  ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）し、このように製作されたマイクロアレイを、約８５％湿度に維持されるチャンバに一晩中インキュベートした。それから、前記スライドを２ｘ  ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ｐＨ  ７．４及び７．０ｍＭ  ＳＤＳを含有したバッファー溶液で３７℃で３０分間洗浄し、非−特異的に結合されたＩＯ及びマーカーを除去して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ−機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥して、使用前まで４℃暗室で保管した。
【０３１８】
ＮＧのゲノムＤＮＡ  １００ｐｇ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）  １０ｐｍｏｌｅ、ダウンストリームプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）  １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）  ５ｐｍｏｌｅ、ｈＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）  ０．５ｐｍｏｌｅ及び２Ｘマスターミックス（２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及び２．４ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素）（Ｓｏｌｇｅｎｔ，  Ｋｏｒｅａ）  １５μｌを含有した３０μｌの最終容量でＰＣＥ−ｈＣＴＯ反応を実施して、ＩＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）が交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。前記スライドを熱循環器（ＧｅｎｅＰｒｏ  Ｂ４Ｉ，  Ｃｈｉｎａ）内のｉｎ  ｓｉｔｕブロック上に位置させた。ＰＣＥ−ｈＣＴＯ反応を下記のように実施した：９５℃で１５分間変性させて、９５℃で３０秒及び５５℃で６０秒の反応過程を４０回繰り返した後、５５℃で３０分間ハイブリダイゼーションした。
【０３１９】
前記反応以後、前記スライドを６０℃で蒸留水で１分間洗浄した。本発明者らは、洗浄により非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドが除去される温度を選択した。前記イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ４３００Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ，  ＵＳＡ）を利用し、５−μｍピクセル解像度でスキャニングして行った。蛍光強度を、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェアのＧｅｎｅＰｉｘ  ｐｒｏ７．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ，  ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度を、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値（ｓｐｏｔ−ｍｅｄｉａｎｓ）で表現した。再現性を試験するために、スポットを３個ずつスポッティングした。蛍光強度は、３個のスポットの平均値で示した。
【０３２０】
図４に示されたように、ターゲットが存在する場合、ターゲットが存在しない場合と比較し、蛍光強度が明らかに増加した。このような結果は、マイクロアレイ上において、単一標識ＰＴＯ、ｈＣＴＯ及びＩＯを利用するＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析がターゲット核酸配列を検出できることを示す。
【０３２１】
実施例２：３’−末端部位にＩＯ−ハイブリダイジング部位を有するｈＣＴＯを利用するＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析の評価
本発明者らは、マイクロアレイ上で単一標識されたＰＴＯ、３’末端にＩＯ−ハイブリダイジング部位を有するｈＣＴＯ及びＩＯを利用したＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析が、ターゲット核酸配列を検出できるかどうかを実験した。
【０３２２】
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーの延長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素を使用した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸配列として使用した。
【０３２３】
その５’−末端に蛍光分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するＰＴＯは、その３’−末端がカーボンスペーサーでブロッキングされている。ｈＣＴＯ及びＩＯは、その３’−末端にブロッカーを有する。ＩＯは、リンカーアーム（Ｌｉｎｋｅｒ  ａｒｍ）としてポリ（Ｔ）１０を有して、これをその５’−末端のアミノ基（ＡｍｉｎｏＣ６）を使用してガラススライドの表面上に固定した。その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブを、その３’−末端のアミノ基（ＡｍｉｎｏＣ７）を使用してガラススライドの表面上に固定した。
【０３２４】
本実施例において、もしＮＧが存在する場合、ＮＧに特異的にハイブリダイズされたＰＴＯは、切断されて、蛍光レポーターが標識されたＰＴＯ断片が生成される。前記ＰＴＯ断片は、ｈＣＴＯのキャプチャリング部位にアニーリングされて、前記ｈＣＴＯのテンプレーティング部位上で延長されて、一本鎖ＩＯ−ハイブリダイジング部位を有する蛍光レポーターが標識されたｈＣＴＯデュープレックスを形成する。前記ｈＣＴＯデュープレックスは、マイクロアレイ上において、一本鎖ＩＯ−ハイブリダイゼーション部位を利用してＩＯにハイブリダイズされて、スポット上で蛍光シグナルを生成する。しかし、もしＮＧが存在しない場合、ｈＣＴＯは、蛍光レポーターが標識されたｈＣＴＯデュープレックスを形成せず、マイクロアレイ上でｈＣＴＯがＩＯにハイブリダイズする場合でも、ｈＣＴＯは、スポット上で蛍光シグナルを生成しない。
【０３２５】
したがって、スポット上において、蛍光シグナルの存在または不存在の評価は、ターゲット核酸配列の存在を決定することができる。ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長、ＩＯにｈＣＴＯデュープレックスのハイブリダイゼーションを、マイクロアレイ上で同時に行った。反応以後、ＩＯと共に蛍光レポーターが標識されたｈＣＴＯデュープレックスの存在または不存在を分析した。
【０３２６】
本実施例で使用したアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、ｈＣＴＯ、ＩＯ及びマーカーの配列は、下記のとおりである：
ＮＧ＿Ｆ  ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：１）
ＮＧ＿Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：２）
ＰＴＯ  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：３）
ｈＣＴＯ−２  ５’−ＡＧＧＧＴＡＴＣＣＡＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：７）
ＩＯ−２  ５’−［ＡｍｉｎｏＣ６］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＡＡＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＧＧＡ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：８）
Ｍａｒｋｅｒ  ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（配列番号：６）
（Ｉ：  デオキシイノシン）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯ−ＮＶの５’−タギング部位を示す）
【０３２７】
ＮＳＢ９  ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ，  Ｋｏｒｅａ）をＩＯ及びマーカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６及び８）の製作に利用した。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度５０μＭになるように溶解させたＩＯ及びマーカーをＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ，  Ｃｈｉｎａ）を利用し、ＮＳＢ９  ＮＨＳスライド上にプリントした。前記ＩＯ及びマーカーを３ｘ１  フォーマット（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ  ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティングし、このように製作されたマイクロアレイを、約８５％湿度に維持されるチャンバに一晩中インキュベートした。それから、前記スライドを２ｘ  ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ｐＨ  ７．４及び７．０  ｍＭ  ＳＤＳを含有したバッファー溶液で３７℃で３０分間洗浄し、非−特異的に結合されたＩＯ及びマーカーを除去して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ−機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥して、使用前まで４℃暗室で保管した。
【０３２８】
ＮＧのゲノムＤＮＡ  １００ｐｇ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）  １０ｐｍｏｌｅ、ダウンストリームプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）  １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）  ５ｐｍｏｌｅ、ｈＣＴＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）  ０．５ｐｍｏｌｅ及び２Ｘマスターミックス（２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ  ２００μＭ及び２．４ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素）（Ｓｏｌｇｅｎｔ，  Ｋｏｒｅａ）  １５μｌを含有した３０μｌの最終容量でＰＣＥ−ｈＣＴＯ反応を実施して、ＩＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）が交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。前記スライドを熱循環器（ＧｅｎｅＰｒｏ  Ｂ４Ｉ，  Ｃｈｉｎａ）内のｉｎ  ｓｉｔｕブロック上に位置させた。ＰＣＥ−ｈＣＴＯ反応を下記のように実施した：９５℃で１５分間変性させて、９５℃で３０秒及び５５℃で６０秒の反応過程を４０回繰り返した後、５５℃で３０分間ハイブリダイゼーションした。
【０３２９】
前記反応以後、前記スライドを６０℃で蒸留水で１分間洗浄した。本発明者らは、洗浄により非切断ＰＴＯ及びｈＣＴＯ間のハイブリッドが除去される温度を選択した。前記イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ４３００Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ，  ＵＳＡ）を利用し、５−μｍピクセル解像度でスキャニングして行った。蛍光強度を、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェアのＧｅｎｅＰｉｘ  ｐｒｏ７．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ，  ＵＳＡ）を利用して分析した。蛍光強度を、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値（ｓｐｏｔ−ｍｅｄｉａｎｓ）で表現した。再現性を試験するために、スポットを３個ずつスポッティングした。蛍光強度は、３個のスポットの平均値で示した。
【０３３０】
ターゲットが存在する場合、ターゲットが存在しない場合と比較し、蛍光強度が明らかに増加した。このような結果は、マイクロアレイ上において、単一標識ＰＴＯ、ｈＣＴＯ及びＩＯを利用するＰＣＥ−ｈＣＴＯ分析がターゲット核酸配列を検出できることを示す。
【０３３１】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１Ａ】
0006295322.tif 000002
【図１Ｂ】
0006295322.tif 000003
【図２】
0006295322.tif 000004
【図３】
0006295322.tif 000005
【図４】
0006295322.tif 000006
【配列表】
0006295322000001.app