(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の原生生物中でＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）及びアスタキサンチンを生産する方法であって、以下の工程；
ａ）不連続な照明条件下にて混合栄養モードでシゾキトリウム属の１つ以上の株を培養するステップ、ここで当該不連続な照明は、フラッシュの形態で供給され、強度が変化することにより明相と暗相が切り替わり、その振幅は５〜１，０００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１であり、変化が１時間につき２〜３，６００回起こり、当該暗相は、当該シゾキトリウムの株が培養される期間の半分以上を占める；
ｂ）当該培養を、有機炭素含有基質の存在下、培養培地中で、数世代に渡り維持するステップ；及び
ｃ）そのように培養したシゾキトリウム株を回収するステップ；及び
ｄ）疎水性物質を回収するステップ；及び
ｅ）回収された疎水性物質からＤＨＡ及びアスタキサンチンを抽出するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
前記培養を１００ｍＭ〜１．５Ｍの濃度の有機炭素含有基質の存在下で実施し、当該有機炭素含有基質が、蔗糖、グリセロール及びグルコース、並びにこれら分子の混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地の中に存在する前記有機炭素含有基質が少なくとも３００ｍＭのグルコースおよび／またはグリセロールを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記強度変化の振幅が７０〜３００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
フラッシュの持続時間が１／１０秒間〜１０分間であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
フラッシュの持続時間が２０秒間〜１分間であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
フラッシュの数が、１時間につき５〜３，６００回であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
フラッシュの数が、１時間につき２０〜５０回であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
１時間あたりの全光照射量が、フォトンのマイクロモル数を単位として２，０００〜６００，０００マイクロモル／ｍ２であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記原生生物が、受入番号ＣＣＡＰ  ４０８７／１でＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に供託されたＦＣＣ１１０４株である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラビリンチュロマイケテス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）綱、特にシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の原生生物を混合栄養モードで特に不連続な照明および／または変化する照明の存在下にて培養する方法に関する。この方法により、バイオマスを高収率にすることと、このようにして培養された原生生物の脂質及びカロテノイド、より具体的にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びアスタキサンチンを豊富にすることが可能になる。従って、この方法により、混合栄養性であって、脂質および／またはカロテノイド、より具体的には多不飽和脂肪酸、及びアスタキサンチンの収率が高い、シゾキトリウムの株を選択することができる。また、本発明は、シゾキトリウム株に属する原生生物のうちで特に脂質及びカロテノイドの産生に適した新規な株にも関する。シゾキトリウムのこの新規な株は、混合栄養モードでのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びアスタキサンチンの産生に有用である。
【背景技術】
【０００２】
原生生物は、単純な細胞組織を有する微生物で、それらは一般に単細胞であり、時には多細胞であるが特定の組織を有しない。それらは従属栄養であっても独立栄養であってもよい。
【０００３】
現在、原生生物は多くの工業的プロジェクトの対象となっている。なぜならいくつかの種は、大量の脂質、特に多不飽和脂肪酸を蓄積または分泌することができるからである。
【０００４】
シゾキトリウムはスラウストキトリアケアエ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）科の原生生物であり、広く分布している海洋性真菌の群である。スラウストキトリドは、様々な脂質、特に多飽和脂肪酸を生産することが知られており、ある種はカロテノイドを生産することが知られている。
【０００５】
これら多不飽和脂肪酸のうちで、オメガ−３シリーズ（ＰＵＦＡ−ω３）のいくつかの非常に不飽和な脂肪酸（ＨＵＦＡ）、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡまたはＣ２０：５ω３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡまたはＣ２２：６  ω３）と、オメガ−６シリーズ（ＰＵＦＡ−ω３）からのいくつかの非常に不飽和な脂肪酸、特にアラキドン酸（ＡＲＡまたはＡＡ、またはエイコサテトラエン酸Ｃ２０：４  ω６）が、栄養学的に重要であると認識されていて、治療の用途で大きな可能性がある。
【０００６】
必須栄養素の一つとして、ＤＨＡは、細胞の通常の機能的発達に必須であり、様々な生化学的プロセス及び機能において、重大な役割を果たす。斯かる高度不飽和の特性は、植物及び動物の両方の細胞膜の特性に関して重要な役割を果たし、低温下での、特に魚の、例えば効率的な適応、あるいは生存を可能とする、流動性、柔軟性、及び選択的透過性をもたらし得る。
【０００７】
ＤＨＡは、ヒトの脳の主要な構成要素であり、その主要な脂肪酸である。ＤＨＡは、大脳皮質の１５〜２０％を占め（成人の脳は２０ｇ以上のＤＨＡを含有する）、網膜の３０〜６０％を占める。ＤＨＡは、細胞膜に組み込まれることにより、中枢神経系の発達及び網膜の機能にとって必須であり、映像及び記憶の機構を十分に維持し、適応において主要な役割を果たす。
【０００８】
現在のところ、水産業からの魚油が、市場においてこのようなタイプの脂肪酸の主な供給源になっている。しかしこれらの油には新たな用途（養殖における食品サプリメント、マーガリンへの組み込み）があるにもかかわらず、活発な漁獲活動が理由で海の漁獲資源が少なくなりつつある。
【０００９】
したがって、これらのタイプの多不飽和脂肪酸に対する将来における要求の増大に対処するため、ＥＰＡ、ＤＨＡやＡＲＡといった脂肪酸の新たな供給源を探す必要がある。
【００１０】
原生生物は、脂肪酸を新たに合成できることに加え、魚油と比べていくつかの利点を有する。原生生物は、インビトロで制御された条件下において培養できるため、バイオマスを比較的一定の生化学的組成で産生することが可能であることに加え、魚油とは違って不快な臭いがなく、脂質にコレステロールがほとんど含まれないか、まったく含まれていない。
【００１１】
最後に、原生生物によって産生される脂質は、魚油よりも脂肪酸のプロファイルが簡単であるため、興味の対象である脂肪酸を分離する工程の数が限られる。
【００１２】
更に、カロテノイドも興味の対象となる分子である。これらは一般に色素として使用されるが、抗酸化剤としてヒトの健康に重要な役割も有している。最後に、それらは免疫系を刺激する能力を有する。
【００１３】
原生生物による脂肪酸及び／又はカロテノイドの産生を工業的スケールで実現するには、複数の因子を考慮する必要がある。例えば培養は、株、温度、光の条件、発酵装置のサイズに応じ、独立栄養条件、混合栄養条件、従属栄養条件のいずれかで実施することができる。培養は、例えば１リットルの容器の中で、実験室で、光バイオリアクターの中で、１００，０００リットルの容器の中で実施することや、開放された（数ヘクタールの）池の中で実施することもできる。しかし理想的な培養条件を開発するには、エネルギーのコストやそれ以外の資源（例えば労力、培養状態の監視の容易さ）を考慮する必要がある。
【００１４】
いずれにせよ、原生生物は、産生する脂肪酸及び／又はカロテノイドの収率増大にとって最適な条件で培養することが望ましい。したがってできるだけ大きな収率が得られることが好ましい（例えば乾燥材料が８０ｇ／ｌを超えるバイオマスと、乾燥材料の全重量に対して２５重量％超の脂肪酸、そして例えば乾燥材料の全重量に対して０．２重量％のカロテノイド）。
【００１５】
増殖に対する光の影響は、光合成生物（植物；シアノバクテリア、原生生物及び巨大藻類）に限られない。幾つかのクロロフィルを有しない生物は、それらの発生に必須である光シグナルを捕捉することが出来る光受容体を有する。フィトクロム等の光受容体は、それを有する生物の発生を制御する光センサーの典型例を表す。現在までに、様々な光受容体が報告されており、中でも、補助色素（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｉｇｍｅｎｔｓ）、クリプトクロム、フォトトロピンがよく知られている。
【００１６】
シゾキトリウムは、従属栄養条件下で、連続的な蛍光照明の存在下、従属栄養モードでＤＨＡ及びアスタキサンチンを生産することが知られている［Ｒ．  Ｐｏｏｎｔａｗｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）；  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＨＡ  ａｎｄ  ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅ  ｆｏｒｅｓｔｓ  ｉｎ  Ｔｈａｉｌａｎｄ．  ＪＳＰＳ−ＮＲＣＴ  ｃｏｒｅ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．  １３４−１３５］。
【００１７】
しかしながら、商業的開発の観点では、この培養方法は不適切である。適切であるには、大規模で閉鎖された光学培養槽中でバイオマス生産が実施されなければならない。そのような培養方法を想定するのは困難である。培養培地中で細胞密度が増大するとき、細胞が培養槽の外部から与えられる光を捕捉するのが困難になるからである。従って、培養培地を活発に撹拌することが必要となるが、斯かる手段は実質的にエネルギーの浪費である。
【００１８】
従来技術に記載されるよりもＤＨＡ及びアスタキサンチンの収率が高く、より効率的かつコスト効率に優れた産業的生産が可能な方法が望ましい。
【００１９】
ＤＨＡ及びアスタキサンチンの収量を改善するために、上記培養方法の代替手法は、混合栄養モード、即ち低強度の光供給及び有機基質の供給の存在下での培養が実施されることであり得る。
【００２０】
混合栄養性という用語は、通常は、葉緑体を有し、光の存在下で発達し、２つの炭素供給源（有機及び無機）を使用する株に関して採用される。シゾキトリウム属の株の場合、葉緑体は同定されていない。しかしながら、当該株は従属栄養性であり光に反応するので、本発明の文脈において、混合栄養性という用語はこの株のカテゴリーに対して拡大して利用され得る。
【発明の概要】
【００２１】
そこで出願人は、通常ではない光条件下での多数の実験と、さまざまな基質の添加により、混合栄養モードで培養できるシゾキトリウム種の原生生物の株を単離することで、本発明の条件下における多不飽和脂肪酸及びカロテノイド、特にＤＨＡ及びアスタキサンチンの高収率での産生を可能にした。
【００２２】
このようにして単離されて選択されたシゾキトリウムの新規な株である１つの株（ＦＣＣ１１０４）が、ブダペスト条約の規定に従ってＣＣＡＰ（藻類と原生生物の培養コレクション、スコットランド海洋科学協会、ダンスタッフネージ海洋研究所、オーバン、アルギル  ＰＡ３７１ＱＡ、スコットランド、イギリス国）に登録番号ＣＣＡＰ  ４０８７／１として寄託された。
【００２３】
培養と選択の方法は、より具体的には、光の強度と周波数がある範囲で特定の変化をする、変化する照明および／または不連続な照明（特にフラッシュの形態の照明）の存在下で原生生物を有機炭素含有基質とともに混合栄養条件下で培養するというものであった。
【００２４】
原生生物にとってストレスとなると一般に考えられる明相と暗相（または光の強度がより小さい相）の頻繁な交代により、驚くべきことに、シゾキトリウムの株で、バイオマスと脂質と多不飽和脂肪酸、及びカロテノイドの産生を増大させることができた。本発明による株を用いることで、光の照射を少なくして多不飽和脂肪酸（特にＤＨＡ及びカロテノイド、特にアスタキサンチン）を発酵装置の中で工業的に産生させる展望が開け、したがって上記培養方法と比べてエネルギーを節約することができるはずである。
【００２５】
本発明のさまざまな側面と利点を以下に詳細に記載する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
したがって本発明は、ラビリンツロマイケテス綱、特にスラウストキトリド科、特にシゾキトリウム属の原生生物を、不連続な照明および／または時間変化する照明の条件にて、混合栄養モードで培養する方法に関する。照明は強度が変化し、その振幅は一般に５マイクロモル／ｍ２秒〜１，０００マイクロモル／ｍ２秒だが、３０〜４００マイクロモル／ｍ２秒であることが好ましい。この変化は、一般に１時間につき２〜３，６００回にできるが、１時間につき２〜２００回であることが好ましい。
【００２７】
これらの培養条件により、規定量の光を照射することができる。光のこの照射は、不連続な照明の段階および／または変化する照明の段階を含むことができ、強度の変化は、振幅が同じでも異なっていてもよい。照射は、特にフラッシュの形態で行なうことができる。
【００２８】
この方法の利点は、培養で得られるバイオマスの収率が増大することである。別の利点は、このようにして培養した原生生物の多不飽和脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びカロテノイド、特にアスタキサンチンが豊富になることである。この方法は、混合栄養性で多不飽和脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びカロテノイド、特にアスタキサンチンの収率が高いラビリンツロマイケテス綱、特にスラウストキトリド科、特にシゾキトリウム属の原生生物の株を選択するのにも利用できる。
【００２９】
この原生生物の混合栄養モードでの培養は、好ましくは、１００ｍＭ〜１．５Ｍ、好ましくは３００ｍＭ〜１．２Ｍ、６００ｍＭ〜９００ｍＭの有機炭素含有基質の存在下でなされることが好ましい。細胞が高濃度の脂質及びカロテノイドを蓄積できるよう、基質は培養中を通じて連続的に添加される。培養中に追加の基質を培地に添加して一定の濃度を維持する。この有機炭素含有基質は、グルコース、セルロース、および／またはセルロースの誘導体、および／または乳酸塩、および／またはラクトース、および／または蔗糖、および／または酢酸塩、および／またはグリセロールを純粋な形態または混合物の形態で含んでいることが好ましい。
【００３０】
培地に含まれる有機炭素含有基質は、複合分子または基質混合物で構成することができる。例えばトウモロコシ、コムギ、ジャガイモに由来するデンプンの生体内変化による産物、特にデンプンのサイズが小さな分子からなる加水分解産物は、例えば、本発明に従って原生生物を混合栄養モードで培養するのに適した炭素含有基質である。
【００３１】
この方法は、より具体的には、ラビリンツロマイケテス綱、特にシゾキトリウム属の原生生物（門：  Ｍｙｘｏｍｙｃｏｔａ、目：  Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａｌｅｓ、科：  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ））［生命のＩＴＩＳカタログ、２０１０年］の株のうちで、混合栄養性であって、高収量の多不飽和脂肪酸、特にＤＨＡ、及びカロテノイド、特にアスタキサンチンを有し、特に、例えば改変Ｖｅｒｄｕｙｎ培地（海水塩１５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３  ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １  ｇ／Ｌ，  ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ  ０．５  ｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ２４  ｍｇ／Ｌ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ，  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０４  ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０  ｍｇ／Ｌ、パントテン酸塩３．２  ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン９．５  ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．１５  ｍｇ／Ｌ、消泡剤０．１  ｍＬ／Ｌ）に有機炭素含有基質を添加した有機成分に富む培地中で、１０μＥを超えて光を供給して培養出来る、新規株の使用を想定する。有機炭素含有基質は、グルコースまたはグリセロールを３００ｍＭ以上の濃度で含んでいることが好ましい。
【００３２】
「株」とは、シゾキトリウム属の天然の株に加えて、天然の株の突然変異をも意味する。
【００３３】
シゾキトリウムのこの新規な株は、以下に記載する本発明の方法による選択と培養の方法によって単離し、選択することができる。
【００３４】
本発明によるシゾキトリウム株の代表的な１つの株は、出願人が単離したＦＣＣ１１０４株であり、ＣＣＡＰに登録番号ＣＣＡＰ  ４０８７／１として寄託された。このような株は、本発明によれば、変化する光または不連続な光を照射して混合栄養モードで培養するとき、大量のバイオマスと脂質及びカロテノイド、特にＤＨＡ及びアスタキサンチンを産生することができる。
【００３５】
継続中の分類分析によれば、ＣＣＡＰ  ４０８７／１株は、シゾキトリウム種に属する。本発明は、本願に記載したような混合栄養培養条件で増殖できて脂肪酸、例えばＤＨＡ、および／またはカロテノイド、例えばアスタキサンチンの産生が可能なラビリンツロマイケテス綱のあらゆる株に関する。本発明は、本願に記載したような混合栄養培養条件で増殖できて脂肪酸、例えばＤＨＡ、及びカロテノイド、例えばアスタキサンチンの産生が可能なシゾキトリウム属の原生生物のあらゆる種にも関する。
【００３６】
本発明は、本願に記載されるような混合栄養培養条件下で増殖し、脂肪酸、例えばＤＨＡ、及びカロテノイド、例えばアスタキサンチンを生産できるシゾキトリウム属の原生生物にも関する。
【００３７】
本発明によって単離されたシゾキトリウム株により、混合栄養条件下で、大量のバイオマスと、脂質及びカロテノイドを産生させることができ、当該脂質は、ＤＨＡに富む。なおそのＤＨＡは、原生生物に含まれる全脂質の４０％超、または５０％超、または６０％超を占めることができる。
【００３８】
また、本発明のシゾキトリウムの単離された株は、混合栄養条件下で、顕著な量のカロテノイド、特にアスタキサンチンを生産でき、その量は、原生生物の全乾燥重量に対して０．１％超、又は０．１５％、又は０．２％である。
【００３９】
当該株は、生産性（１時間あたりの１リットルの培養物あたりの所望の産物の量）が、０．０１５  ｍｇ／Ｌ／ｈ超、又は０．０２０  ｍｇ／Ｌ／ｈ超、又は０．０２５  ｍｇ／Ｌ／ｈのレベルに達してもよい。
【００４０】
本発明において、混合栄養条件下、可変および／または不連続な照明、特にフラッシュの存在下で培養されたシゾキトリウムの株（例えば発明者らにより単離されたＦＣＣ１１０４株）は、アスタキサンチンの生産が可能である。一方、従属栄養条件下では、アスタキサンチンは検出されない。更に、本発明の幾つかの態様に係る混合栄養モードで取得されるバイオマスの量は、従属栄養条件下で取得される量と同等又は上回る（例えば約１０〜１８％）。「従属栄養条件」とは、照明を点灯しない以外は同一の培養条件であることを意味する。
【００４１】
従って、本発明は、ラビリンツロマイケテス綱、スラウストキトリド科、特にシゾキトリウム属、特に供託されたシゾキトリウム種の原生生物を、混合栄養モード下、時間中に変動し、又は不連続、例えばフラッシュの形態である照明の存在下で培養することにより、脂肪酸及びカロテノイド、例えばＤＨＡ及びアスタキサンチンを生産する方法に関する。
【００４２】
従って、本発明は、混合栄養的特徴を有し、時間中に変動し、又は不連続、例えばフラッシュの形態である照明の存在下で、高収量の高不飽和脂肪酸及びカロテノイド、例えばＤＨＡ及びアスタキサンチンを生産する、ビリンツロマイケテス綱、スラウストキトリド科、特にシゾキトリウム属、特に供託されたシゾキトリウム種の原生生物の株を選択する方法に関する。
【００４３】
特に混合栄養モードで培養するときに培養物に変化する照明および／または不連続な照明を照射すると、原生生物の増殖に好ましい影響があり、特に脂質及びカロテノイドの産生に関して原生生物の生産性を増大させうることがわかった。
【００４４】
発明者は、理論に囚われることなく、不連続な光および／または変化する光を原生生物に照射すると、増殖と脂質及びカロテノイド合成にとって有利な“ストレス”を生じさせることができると考えている。この現象は、自然界において原生生物は環境の制約に対抗するため予備の脂質及びカロテノイドを蓄積する傾向を有するという事実によって一部が説明できよう。
【００４５】
不連続な照明とは、複数の暗い期間によって区切られた照明を意味する。暗い期間は、１／４の時間、好ましくは半分以上の時間存在することができ、その間に藻類が培養される。
【００４６】
本発明の好ましい一実施態様によれば、照明は不連続であり、フラッシュの形態であることがより好ましい。フラッシュは、本発明の意味では、短時間の照明、すなわち３０分未満の照明である。フラッシュの持続時間は１５分未満が可能であり、５分未満が好ましく、１分未満がさらに好ましい。本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間は、１秒未満にすることができる。フラッシュの持続時間は、例えば１／１０秒、２／１０秒、３／１０秒、４／１０秒、５／１０秒、６／１０秒、７／１０秒、８／１０秒、９／１０秒のいずれかが可能である。光の照射またはフラッシュは、一般に１５秒よりも長い期間にわたる。フラッシュの持続時間は一般に５秒間〜１０分間だが、１０秒間〜２分間が好ましく、２０秒間〜１分間がより好ましい。
【００４７】
一般に、フラッシュの数は１時間につき約２〜３６００回である。この数は、例えば１時間につき１００〜３６００回にすることができる。この数は、１時間につき１２０〜３０００回、または４００〜２５００回、さらには６００〜２０００回、または８００〜１５００回にすることもできる。この数は、１時間につき２〜２００回にすることもできるが、１０〜１５０回が好ましく、１５〜１００回がより好ましく、２０〜５０回がさらに好ましい。フラッシュは、定期的な時間間隔で発生させること、または不定期な時間間隔で発生させることができる。定期的な時間間隔での発生の場合、１時間あたりのフラッシュの数は、時間間隔（Ｔ）を持つ頻度（Ｆ）に対応し、Ｆ＝１／Ｔになると考えられる。この時間間隔は１秒〜３０分、または１秒〜３６秒、または１．２秒〜３０秒、または１．４４秒〜９秒、または１．８秒〜６秒、または２．４秒〜４．５秒にすることができる。この時間間隔は１８秒〜３０分にすることもできるが、２４秒〜６分が好ましく、３６秒〜４分がより好ましく、７２秒〜３分がさらに好ましい。１時間あたりのフラッシュの数は、フラッシュの強度と持続時間の関数として選択される（下記参照）。一般に、フラッシュの形態で照射する光の強度は５〜１０００マイクロモル／ｍ２秒だが、５〜５００マイクロモル／ｍ２秒または５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒が好ましく、１５０〜３００マイクロモル／ｍ２秒がより好ましい。定義により、１マイクロモル／ｍ２秒は、文献でしばしば用いられる単位である１μＥ／ｍ２秒に対応する（アインシュタイン）。
【００４８】
本発明の特別な一実施態様によれば、光の強度は５０〜２００マイクロモル／ｍ２秒であり、フラッシュの時間間隔は、フラッシュの持続時間が１秒間〜１分間だと１０秒〜６０分である。
【００４９】
本発明の別の一実施態様によれば、照明は変化させることができる。これは、照射が暗相によって中断されることはないが、光の強度が時間とともに変化することを意味する。光の強度のこの変化は規則的であり、周期的または循環式にすることができる。本発明によれば、連続した照明の段階と不連続な照明の段階を組み合わせた光照射にすることもできる。
【００５０】
本発明によれば、どのような照明条件であれ、培養している原生生物に対する光の強度（１秒あたり、１平方メートルあたりのフォトンのマイクロモル数（マイクロモル／ｍ２秒）を単位として表示）が、１時間のうちに少なくとも１回は変化する。光の強度のこの変化の振幅は、一般に、５〜１，０００、または５０〜８００、または１００〜６００マイクロモル／ｍ２秒である。光の強度は、５〜４００マイクロモル／ｍ２秒で変化させることもできる。光の強度変化の振幅は７０〜３００マイクロモル／ｍ２秒が好ましく、１００〜２００マイクロモル／ｍ２秒がより好ましい。
【００５１】
光のこの強度は、変化する照明という条件では、１時間に数回、順番に、例えば５０と１００マイクロモル／ｍ２秒に、または５と４００マイクロモル／ｍ２秒に、または５０と８００マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。光のこの強度は、順番に５０と２００マイクロモル／ｍ２秒にできることが好ましい。あるいは不連続な照明という条件では、光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と５０マイクロモル／ｍ２秒に、または０と１００マイクロモル／ｍ２秒にすることができるが、順番に０と２００マイクロモル／ｍ２秒にできることがさらに好ましい。光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と３００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と６００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と８００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と１，０００マイクロモル／ｍ２秒にすることもできる。
【００５２】
本発明の一実施態様によれば、どのような照明条件であれ、培養している原生生物に対する光の強度は、細胞密度の関数として変化する。細胞がより密になるほど、光を強くすることができる。細胞密度は１ｍｌあたりの細胞の数であり、当業者に知られている技術に従って測定される。
【００５３】
培養の初期段階において細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜１５マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜１０マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば１５〜２００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、２０〜５０マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば５０〜７００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、５０〜１５０マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。
【００５４】
本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間が例えば１分未満または１秒未満であるとき、光の強度は上記の値よりも大きくすることができる。培養の初期段階において細胞の密度が１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜２００マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜１００マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば３０〜５００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば１００〜１，０００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、２００〜５００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。
【００５５】
本発明の一実施態様によれば、１時間に培養物に照射する光の量は所定の値に留まる。この量は、約２，０００〜６００，０００、好ましくは２，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ２である。この量は、１時間あたり約４，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２にすることができる。
【００５６】
本発明の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が９，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に２０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は２０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１２，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に４５回照射する。各フラッシュは持続時間が１５秒間であり、強度は５マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が３，３７５マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２４０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【００５７】
光の強度に関して上に説明したように、本発明の一実施態様によれば、培養物に照射する光の量は、細胞密度の関数として変化させることができる。培養の初期段階において細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、１時間あたりの光の全照射量は、一般に約１５００〜８０００マイクロモル／ｍ２だが、１５００〜６０００マイクロモル／ｍ２であることが好ましく、２０００〜５０００マイクロモル／ｍ２であることがさらに好ましい。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、１時間あたりの光の全照射量を６０００〜６７，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば６０００〜５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく、１２，０００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、１時間あたりの光の全照射量を例えば４５，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば４５，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく５０，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。
【００５８】
本発明の一実施態様によれば、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５〜１０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２２５０マイクロモル／ｍ２〜４５００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１５〜５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１３，５００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５０〜１５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４５，０００〜１３５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【００５９】
本発明の一実施態様によれば、例えばフラッシュの持続時間が１分間未満または１秒間未満のとき、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は５０〜１００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１５，０００マイクロモル／ｍ２〜３０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に５０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００〜３００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１００，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は３５０〜４５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４２０，０００〜５４０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【００６０】
培養物への光の照射は、発酵装置の外壁の周囲に配置した複数のランプによって実現できる。クロックが、これらのランプを決められた照射時間だけ稼働させる。発酵装置は、日光があたらない容器の中に位置している。その容器の周囲温度は制御できることが好ましい。
【００６１】
出願人が確認できたように、このようにして選択した株が混合栄養モードで不連続な光および／または変化する光の存在下においてうまく増殖できるという事実があるため、上記の株は多不飽和脂肪酸及びカロテノイド、特にＤＨＡ及びアスタキサンチンをより多く産生することができる。
【００６２】
したがって本発明の培養方法により、出願人が単離してＣＣＡＰにＣＣＡＰ  ４０８７／１という番号で寄託した株と同様、混合栄養性であって多不飽和脂肪酸及びカロテノイドの収率が高い、ラビリンツロマイケテス綱、特にスラウストキトリド科、特にシゾキトリウム属の原生生物の株を選択することができる。この培養方法は、
ａ）強度が変化し、その変化の振幅は５〜１，０００マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜４００マイクロモル／ｍ２秒であり、その変化は１時間に２〜３，６００回、好ましくは５〜４００回である、不連続な照明および／または時間変化する照明という条件下でラビリンツロマイケテス綱、特にシゾキトリウム属の原生生物の１種類以上の株を混合栄養モードで培養するステップと、
ｂ）培地の中で有機炭素含有基質の存在下にてこの培養物を数世代にわたって維持するステップと、必要に応じて
ｃ）このようにして培養した原生生物を回収するステップ
を含むことを特徴とする。
【００６３】
“回収ステップ”とは、より具体的には、上記の継代の間に細胞の数が最も増加した株の単離を意味する。
【００６４】
株を選択するため、ラビリンツロマイケテス綱、特にスラウストキトリド科、特にシゾキトリウム属の原生生物のさまざまな株を同一の容器内の複数のマイクロプレート上で並列に培養し、そのさまざまな培養物の条件と変化をしっかりとモニタすることができる。したがってさまざまな株が、不連続な照明および／または変化する照明に対してと、場合によっては培地に添加した１種類または複数種類の炭素含有基質に対してどのように応答するかが容易にわかる。
【００６５】
不連続な照明および／または変化する照明と炭素含有基質の添加に対して好ましい応答をする株が、品質（脂質プロファイル中に多不飽和脂肪酸がより豊富に存在し、カロテノイドの中でアスタキサンチンがより豊富になる）と量（脂質が、ＤＨＡをより多い割合で含み、乾燥物質がより多い割合でアスタキサンチンを含有する）の面で脂質及びカロテノイドの産生に関して一般に最高の収率を提供する。
【００６６】
原生生物は、発酵装置の中で不均一な集団から選択することができる。その集団から、本発明の選択法により、特定の範囲の光強度と特定の周波数を持つ不連続な光および／または変化する光を混合栄養という培養条件と組み合わせて有利な変異体を選択する。この場合、培養は、培養物の中で原生生物を多くの世代にわたって維持しながら実施し、次いで培養が終わったとき、培地の中で過半を占めるようになった成分を単離する。
【００６７】
本発明の培養方法により、脂質及びカロテノイドを産生させることができる。
【００６８】
この場合、本発明の方法は、更に次の工程：
ｄ）原生生物から疎水性物質を回収する工程；及び任意で
ｅ）回収された疎水性物質からＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）及びアスタキサンチンを抽出する工程
を含む。
【００６９】
本発明の培養方法は、本発明の混合栄養条件において増殖できてＤＨＡ及びアスタキサンチンの産生が可能なシゾキトリウム属のあらゆる種にも適用できる。
【００７０】
本発明の培養方法により、培養で得られるバイオマスの産生を最適化することができる。この方法により、このようにして培養された原生生物の脂肪酸及びカロテノイド、特にＤＨＡ及びアスタキサンチンを豊富にすることもできる。
【００７１】
したがって本発明は、上記の方法に従って培養または選択することが好ましい混合栄養性のシゾキトリウム属の原生生物の培養を通じてバイオマスの産生と脂質（特に脂肪酸）及びカロテノイドの産生を最適化し、次いでこのようにして培養した原生生物を回収してそこから疎水性成分、特にＤＨＡを含む脂質及びアスタキサンチンを含むカロテノイドを抽出することも目的とする。
【００７２】
脂質（ＤＨＡを含む）を選択的に抽出する方法は当業者に知られており、例えば［Ｂｌｉｇｈ，  Ｅ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，  Ｗ．Ｊ．  （１９５９）；  Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ３７：９１１−９１７］に記載されている。
【００７３】
ルテインを含むカロテノイドの抽出及び解析方法は、当業者に知られており、例えばＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  （Ｓ．Ｗ．  Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｓ．Ｗ．  Ｊｅｆｆｒｅｙ，  Ｒ．Ｆ．Ｃ．  Ｍａｎｔｏｕｒａ，  Ｃ．Ａ．  Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，  Ｔ．  Ｂｊｏｒｎｌａｎｄ，  Ｄ．  Ｒｅｐｅｔａ，  Ｎ．  Ｗｅｌｓｃｈｍｅｙｅｒ  ：  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＨＰＬＣ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｓ  ａｎｄ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｒｉｎｅ  ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ．  Ｍａｒｉｎｅ  ｅｃｏｌｏｇｙ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｓｅｒｉｅｓ  ：  Ｖｏｌ．  ７７：  １８３−１９６，  １９９１）に記載されている。
【００７４】
本発明は、上記の本発明の方法に従って得ることのできるラビリンツロマイケテス綱、特にラビリンツリド及びスラウストキトリド科、特にシゾキトリウム属の原生生物の株にも関する。これら原生生物は多不飽和脂肪酸及びカロテノイドが豊富である。このような原生生物の全脂質には、一般に、その原生生物に含まれる全脂質の４０％超、５０％超、または６０％超のＤＨＡが含まれる。本発明の態様において、そのような原生生物中に含まれるアスタキサンチンは、乾燥材料の全重量の０．１％超、０．１５％超、又は０．２％超で存在してもよい。
本発明態様の原生生物のアスタキサンチンの生産性（１時間あたりの１リットルの培養物あたりの所望の産物の量）は、０．０１５  ｍｇ／Ｌ／ｈ超、又は０．０２０  ｍｇ／Ｌ／ｈ超、又は０．０２５  ｍｇ／Ｌ／ｈ超であってもよい。
【実施例１】
【００７５】
コンピュータで監視する専用の自動制御装置を備えた有効体積が１〜２リットルの発酵装置（バイオリアクター）の中でシゾキトリウムＦＣＣ１１０４を培養する。このシステムのｐＨは、塩基（１Ｎの水酸化ナトリウム溶液）および／または酸（２Ｎの硫酸溶液）を添加して調節する。培養温度は２６℃に設定する。ラッシュトンの配置（下方にポンピングする３枚刃のインペラ）に従ってシャフトに取り付けた３つの撹拌用ロータを利用して撹拌する。溶存酸素圧は、培地中で、撹拌速度（２５０〜６００ｒｐｍ）、通気速度（０．２５〜１ｖｖｍ）、又は酸素通気量（０．１〜０．５ｖｖｍ）により制御される。監視のための自動化システムに組み込まれた調整パラメーターにより、定常ｐＯ２を１５％に維持することが出来る。バイオリアクターには、透明な容器を取り囲む外部照射システムが取り付けられている。光の強度及び照射サイクルは、コンピューターで制御された専用の自動化デバイスにより調整される。
【００７６】
温度制御した容器（２６℃）内の撹拌台（１４０ｒｐｍ）の上で事前培養物を反応装置に接種し、１００〜２００μＥの光を照射した。事前培養とバイオリアクター内での培養は、改変Ｖｅｒｄｕｙｎ培地（海水塩１５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３  ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １  ｇ／Ｌ，  ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ  ０．５  ｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ２４  ｍｇ／Ｌ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ，  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０４  ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０  ｍｇ／Ｌ、パントテン酸塩３．２  ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン９．５  ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．１５  ｍｇ／Ｌ）の中で実施する。バイオリアクター内で、フラッシュ（可変／不連続照明）を伴い、既存の混合栄養培養条件下、従属栄養条件下、及び独立栄養条件下で培養を実施するのに用いる有機炭素含有基質は、濃度が３００ｍＭ〜１Ｍのグルコースである。
【００７７】
培養物のモニタリング
【００７８】
乾燥重量を測定して全バイオマスの濃度をモニタリングする（ＧＦ／Ｆフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ社）で濾過し、次いで１０５℃にて少なくとも２４時間にわたって乾燥させた後、計量する）。
【００７９】
全脂質を定量するため、７．１０８細胞／ｍｌを抽出した。脂質の抽出法は当業者に知られている。
【００８０】
カロテノイド、特にアスタキサンチンの定量において、１０８細胞／ｍｌが抽出された。アスタキサンチンを含むカロテノイドの抽出及び解析方法は、当業者に知られている。
【００８１】
照明（混合栄養条件下での培養用）
【００８２】
培養物に１時間につき３０回のフラッシュを照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は８０マイクロモル／ｍ２秒である。
【００８３】
バイオリアクターの中での培養物に対する光の照射は、発光ダイオードの外壁の周囲に配置した複数のＬＥＤ（発光ダイオード）ランプによってなされた。照明時間又はパルスにおいて、時計がＬＥＤランプを点灯する（不連続光を照射するフラッシュ混合栄養条件下での培養において）。
【００８４】
【表１】
0006352819.tif 000002