(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８、９、２８、５９、７５、７９、８０、９１、及び１０２からなる群から選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ‐ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）とを含み、ｓｉＲＮＡの目標遺伝子がアンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）である、ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記センス鎖またはアンチセンス鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことを特徴とする請求項１に記載のｓｉＲＮＡであって、前記化学的修飾は、
ヌクレオチド内の糖（ｓｕｇａｒ）構造の２´炭素位置で水酸化基（‐ＯＨ）がメチル基（‐ＣＨ３）、メトキシ基（‐ＯＣＨ３）、アミン基（‐ＮＨ２）、フッ素（‐Ｆ）、Ｏ‐２‐メトキシエチル基、Ｏ‐プロピル基、Ｏ‐２‐メチルチオエチル基、Ｏ‐３‐アミノプロピル基、Ｏ‐３‐ジメチルアミノプロピル基、Ｏ‐Ｎ‐メチルアセトアミド基およびＯ‐ジメチルアミドオキシエチルからなる群から選択されるいずれか一つで置換される修飾；
ヌクレオチド内の糖構造の酸素が硫黄で置換される修飾；
ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合およびメチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合からなる群から選択されるいずれか一つの結合になる修飾；並びに
ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）およびＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）形態への修飾；
からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、前記ｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５´末端に一つ以上のリン酸基（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）が結合されていることを特徴とする請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
下記構造式１の構造を含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
［構造式１］
0006426268.tif 000010
前記構造式１中、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、ＸおよびＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーで媒介された共有結合を意味し、Ｒは請求項１に記載のｓｉＲＮＡを意味する。
【請求項６】
下記構造式２の構造を含む請求項５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
［構造式２］
0006426268.tif 000011
前記構造式２中、ＳおよびＡＳはそれぞれ請求項５によるｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を意味し、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは請求項５に記載の定義と同一である。
【請求項７】
下記構造式３の構造を含む請求項６に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
［構造式３］
0006426268.tif 000012
前記構造式３中、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｙ、ＳおよびＡＳは、請求項６に記載の定義と同一であり、５´および３´は、それぞれ、ｓｉＲＮＡセンス鎖の５´および３´末端を意味する。
【請求項８】
親水性物質は、下記構造式４の構造を持つことを特徴とする請求項５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
［構造式４］
0006426268.tif 000013
前記構造式４中、Ａ´は親水性物質モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）、Ｊはｍ個の親水性物質モノマー同士をまたはｍ個の親水性物質モノマーとｓｉＲＮＡとを互いに連結するリンカー、ｍは１〜１５の整数、そして、ｎは１〜１０の整数を意味し、
親水性物質モノマーＡ´は化合物（１）〜化合物（３）から選択される何れか一つの化合物で、リンカーＪは、ＰＯ３−、ＳＯ３およびＣＯ２からなる群から選択される；
化合物（１）
0006426268.tif 000014
前記化合物（１）のＧは、ＣＨ２、Ｏ、ＳおよびＮＨからなる群から選択される；
化合物（２）
0006426268.tif 000015
化合物（３）
0006426268.tif 000016
【請求項９】
前記親水性物質の分子量は２００〜１０，０００であることを特徴とする請求項５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１０】
前記親水性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群より選択される何れか一つであることを特徴とする請求項５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１１】
前記疎水性物質の分子量は２５０〜１，０００であることを特徴とする請求項５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１２】
前記疎水性物質は、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸、リン脂質、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）、脂質（ｌｉｐｉｄ）、トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）及びトコトリエノール（ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ）からなる群より選択される何れか一つであることを特徴とする請求項５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１３】
前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コテスタニルホルメート及びコレスタニルアミンからなる群より選択される何れか一つであることを特徴とする請求項１２に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１４】
前記グリセリド誘導体は、モノ‐グリセリド、ジ‐グリセリド及びトリ‐グリセリドからなる群より選択される何れか一つであることを特徴とする請求項１２に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１５】
前記ＸおよびＹで表される共有結合は、非分解性結合または分解性結合であることを特徴とする請求項５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１６】
前記非分解性結合は、アミド結合またはリン酸化結合であることを特徴とする請求項１５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１７】
前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする請求項１５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１８】
請求項５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子。
【請求項１９】
互いに異なる配列を含むｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の混合物を含むことを特徴とする請求項１８に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡを有効成分として含む線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２１】
前記呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急性・慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、痰と咳、気管支炎、細気管支炎、咽頭炎、扁桃炎及び喉頭炎からなる群より選択される何れか一つであることを特徴とする請求項２０に記載の線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２２】
前記線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症（ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）からなる群より選択される何れか一つであることを特徴とする請求項２０に記載の線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２３】
請求項２０に記載の線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物を含む凍結乾燥した形態の剤形。
【請求項２４】
請求項５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を有効成分として含む線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２５】
前記呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急性・慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、痰と咳、気管支炎、細気管支炎、咽頭炎、扁桃炎及び喉頭炎からなる群より選択される何れか一つであることを特徴とする請求項２４に記載の線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２６】
前記線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症（ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）からなる群より選択される何れか一つであることを特徴とする請求項２４に記載の線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２７】
請求項２４に記載の線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物を含む凍結乾燥した形態の剤形。
【請求項２８】
請求項１８に記載のナノ粒子を有効成分として含む線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２９】
前記呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急性・慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、痰と咳、気管支炎、細気管支炎、咽頭炎、扁桃炎及び喉頭炎からなる群より選択される何れか一つであることを特徴とする請求項２８に記載の線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項３０】
前記線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症（ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）からなる群より選択される何れか一つであることを特徴とする請求項２８に記載の線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項３１】
請求項２８に記載の線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物を含む凍結乾燥した形態の剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の二重らせんオリゴＲＮＡ、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、これを含む高効率の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、および前記高効率の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子に関し、より具体的には、細胞内に効率よく送達されるようにするために、二重らせんＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の両末端に親水性物質および疎水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合を用いて接合された形態の構造を有し、水溶液で前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の疎水性相互作用によってナノ粒子形態に転換できるｓｉＲＮＡ、これを含む高効率の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、および前記高効率の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子に関し、好ましくは、ｓｉＲＮＡが呼吸器疾患関連遺伝子であるアンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）またはストラティフィン（ｓｔｒａｔｉｆｉｎ）に特異的なことを特徴とする。
【０００２】
また、本発明は、新規のｓｉＲＮＡ、これを含む高効率の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、または前記高効率の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子の発現を抑制する技術は、疾病の治療のための治療剤の開発および標的検証において重要なツールである。標的遺伝子の発現を抑制する従来の技術としては、標的遺伝子に対する導入遺伝子を導入する技術が開示されているが、プローモータを基準として逆方向（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）に導入遺伝子を導入する方法（Ｓｈｅｅｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５：８８０５‐８８０８，１９８８；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：７２４‐７２６、１９８８）とプローモータを基準として順方向（ｓｅｎｓｅ）に導入遺伝子を導入する方法（Ｎａｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：２７９‐２８９，１９９０；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：２９１‐２９９、１９９０；米国特許第５，０３４，３２３号；米国特許第５，２３１，０２０号と、米国特許第５，２８３，１８４号）である。
【０００４】
一方、最近、２０〜２５の塩基対を有する二本鎖ＲＮＡ断片の蓄積により転写後、遺伝子の抑制またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）現象が起こり、前記二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ鋳型から合成されるという事実が報告されている。前記二本鎖ＲＮＡ断片は、「小さい干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、以下ｓｉＲＮＡとする）」と名づけられた。以降、哺乳類を含む様々な生命体において、ｓｉＲＮＡは、遺伝子の発現を抑制する重要な要素であるという事実が明らかになっている（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６‐８１１、１９９８；Ｔｉｍｍｏｎｓ＆Ｆｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３９５：８５４，１９９８；Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ＆Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｃｅｌｌ，９５：１０１７‐１０２６，１９９８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４‐４９７，２００１；ＷＯ９９／３２６１９）。また、二本鎖ｓｉＲＮＡは、細胞内でＲＩＳＣ（ＲＮＡ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）タンパク質複合体によって一本鎖ＲＮＡに転換し、以降、標的ｍＲＮＡと結合してｍＲＮＡを不活性化させると知られている（Ｎｏｖｉｎａ＆Ｓｈａｒｐ，Ｎａｔｕｒｅ，４３０：１６１‐１６４，２００４）。上述のように、ｓｉＲＮＡを用いた遺伝子の発現抑制技術は、標的細胞で標的遺伝子の発現を抑制し、これによる変化を観察するものであり、標的細胞での標的遺伝子の機能を究明する研究に有用に使用される。特に、感染性ウイルスまたは癌細胞などで標的遺伝子の機能を抑制することは、当該疾病の治療方法の開発に有用に活用されることができると予測される。生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での研究および実験動物を用いた生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）研究を行った結果、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制が可能であると報告されている。一例として、国際特許公開公報ＷＯ０３／０７０９６９号には、ｓｉＲＮＡを用いて癌細胞でＢｃｌ２タンパク質の発現を抑制することにより、癌細胞を治療する方法が開示されており、ＷＯ０４／００９７６９号には、ｓｉＲＮＡを用いて血管新生を誘発するＶＥＧＦタンパク質の発現を抑制することにより、癌細胞を治療する方法が開示されている。
【０００５】
また、ｓｉＲＮＡの作用機序は、標的ｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的に標的遺伝子の発現を調節することから、既存の抗体ベースの医薬品や化学物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｒｕｇ）に比べて適用可能な対象が著しく拡大できるという利点を有する（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ．２００６  １３（４）：６６４‐６７０）。
【０００６】
ｓｉＲＮＡの優れた効果および様々な使用範囲にもかかわらず、ｓｉＲＮＡが治療剤として開発されるためには、体内でのｓｉＲＮＡの安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の改善と細胞送達効率の改善によりｓｉＲＮＡが標的細胞に効果的に送達されなければならない（Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．２００６  Ｊａｎ；１１（１‐２）：６７‐７３）。
【０００７】
前記体内安定性の向上およびｓｉＲＮＡの非特異的な細胞免疫反応（ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）問題を解決するために、ｓｉＲＮＡの一部のヌクレオチドまたは骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を核酸分解酵素抵抗性を有するように修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するか、ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）、リポソームまたはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの担体の利用などに関する研究が活発に試みられている。
【０００８】
アデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルスベクターを用いた送達システムは、トランスフェクション効率（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）が高いが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）および発癌性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が高い。一方、ナノ粒子を含む非ウイルス性（ｎｏｎ‐ｖｉｒａｌ）送達システムは、ウイルス性送達システムに比べて細胞送達効率は低いが、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での安全性が高く、標的特異的に送達が可能であり、内包されているＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの細胞または組織への取り込み（ｕｐｔａｋｅ）および内在化（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）などの改善した送達効果が高いだけでなく、細胞毒性および免疫応答（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）がほとんどないという利点を有しており、現在、ウイルス性送達システムに比べて有力な送達方法として評価されている（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００７  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ３；１１７（１２）：３６２３‐６３２）。
【０００９】
前記非ウイルス性送達システムのうち、ナノ担体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）を用いる方法は、リポソーム、カチオン高分子複合体などの様々な高分子を使用することでナノ粒子を形成し、ｓｉＲＮＡをかかるナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、すなわちナノ担体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）に担持して細胞に送達する形態を有する。ナノ担体を用いる方法では、ナノ担体としては高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、高分子ミセル（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｅｌｌｅ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）などがナノ担体として主に用いられている。このうち、リポプレックスは、カチオン脂質からなり、細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）のアニオン脂質と相互作用してエンドソームを脱安定化させて、細胞内に送達する役割をする。
【００１０】
また、ｓｉＲＮＡパッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ；センス（ｓｅｎｓｅ））鎖の末端部位に化学物質などを連結して増進した薬動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）的特徴を有するようにし、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で高い効率を誘導することができることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ  １１；４３２（７０１４）：１７３‐８，２００４）。この際、ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ；パッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ））またはアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ；ガイド（ｇｕｉｄｅ））鎖の末端に結合した化学物質の性質に応じてｓｉＲＮＡの安定性が異なる。例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）のような高分子化合物が接合した形態のｓｉＲＮＡは、カチオン性物質が存在する条件でｓｉＲＮＡのアニオン性リン酸基と相互作用して複合体を形成することにより、改善したｓｉＲＮＡ安定性を有する担体となる（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ１２９（２）：１０７‐１６，２００８）。特に、高分子複合体からなるミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）は、薬物送達担体として用いられる他のシステムである、微小球体（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などに比べてその粒径が極めて小さく、且つ分布が非常に一定しており、自発的に形成される構造であることから、製剤の品質の管理および再現性の確保が容易であるという利点がある。
【００１１】
また、ｓｉＲＮＡの細胞内送達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ））を単純共有結合またはリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合で接合したｓｉＲＮＡ接合体により、ｓｉＲＮＡの安定性の確保および効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（韓国登録特許第８８３４７１号）。しかし、ｓｉＲＮＡの化学的修飾およびポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）を接合すること（ＰＥＧＹｌａｔｉｏｎ）だけでは、生体内での低い安定性と標的臓器への送達がスムーズでないという欠点は依然として存在する。かかる欠点を解決するために、オリゴヌクレオチド、特に、ｓｉＲＮＡのような二重らせんオリゴＲＮＡに親水性および疎水性物質が結合した二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が開発されているが、前記構造体は、疎水性物質の疎水性相互作用によってＳＡＭｉＲＮＡＴＭ（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｉｃｅｌｌｅ  ＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＲＮＡ）と名づけられた自己組織化ナノ粒子を形成するが（韓国登録特許第１２２４８２８号参照）、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術は、既存の送達技術に比べて非常に粒径が小さく、且つ均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ナノ粒子を取得することができるという利点を有する。
【００１２】
喘息とともに代表的な肺疾患の一つである慢性閉塞性肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ、以下、「ＣＯＰＤ」とする）は、非可逆的な気道の閉塞を伴う点において喘息とは異なり、繰り返される感染、有害な粒子やガスの吸入や喫煙によって発生する肺の非正常的な炎症反応と、これと伴い完全に可逆的でなく、徐々に進む気流制限を示す呼吸器疾患である（Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１６３：１２５６‐１２７６，２００１）。世界的にＣＯＰＤの深刻性が強調されているが、これは、ＣＯＰＤが１９９０年の全死亡疾患の６位であったが、２０２０年には３位になると予測され、１０大疾患のうち唯一その発病率が増加する重要な疾患である。また、疾患による障害の原因としては４位になると予測されるため、ＣＯＰＤによる社会的、経済的疾病負担が急激に増加すると予想される（Ｌａｎｃｅｔ，３４９：１４９８‐１５０４，１９９７）。慢性閉塞性肺疾患は、気道および肺実質炎症による細気管支および肺実質の病理学的変化によって発生する病気であり、閉塞性細気管支炎および肺気腫（肺実質破壊）を特徴とする。慢性閉塞性肺疾患の種類には、慢性閉塞性気管支炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、慢性細気管支炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ）および肺気腫（Ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）がある。慢性閉塞性肺疾患の場合、好中球の数が増加して、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐８、ＭＩＰ‐２のようなサイトカインが分泌される。気道に炎症が生じ、筋肉壁が厚くなり、粘液分泌が増加して気管支閉塞が起こる。気管支が閉塞されると、肺胞は拡張し、損傷して、酸素と二酸化炭素の交換能力が損傷を受けることになり、呼吸不全の発生が高くなる。すでに韓国内の４５歳以上の成人の８％が慢性閉塞性肺疾患の患者であるにもかかわらず肺癌にのみ関心が偏っており、慢性閉塞性肺疾患を治療する従来の方法は、抗炎症作用を有する治療剤や気管支拡張の効果を有する治療剤を用いる程度であって、遺伝子治療剤による本質的な慢性閉塞性肺疾患の予防および治療は十分でない。前記抗炎症作用を有する代表的な治療剤は、グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）、ロイコトリエンモディファイア（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、テオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）などがある。しかし、前記グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）は、効果の面では強いが薬物副作用が問題となり、吸入療法を行っており、治療効果も選択的に作用せず、すべての免疫反応と抗炎症反応を抑制することから、場合に応じて必要な免疫反応まで抑制する問題点がある。前記ロイコトリエンモディファイア（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）は、副作用は少ないが、効果の面で限界があり、単独で使用する際に喘息を調節することができない。したがって、ほとんど補助的に使用しているという問題点がある。前記テオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）は、効果の面でも優れておらず、副作用の恐れがあるという問題点がある。したがって、慢性閉塞性肺疾患を予防し治療することができる効果に優れ、副作用��少ない新たな治療剤に対する需要が切実な状況である。
【００１３】
一方、線維症（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の一種である特発性肺線維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ、以下、「ＩＰＦ」とする）は、嚢（肺胞）壁に慢性炎症細胞が侵透して肺を硬化する様々な変化が発生して肺組織のはげしい構造的変化を引き起こし、次第に肺機能が低下し、結局には死亡に至る疾患であり、現在は効果的な治療方法がなく、ほとんどの場合、症状が現れて診断を受けると、生存期間中央値が３〜５年程度にしかならない非常に予後の悪い疾病である。発生頻度は、外国の場合、人口１０万名当たり約３〜５名程度と報告されており、ほとんど５０代後に発病率が高く、男性が女性より２倍ほど発生率が高いと知られている。
【００１４】
ＩＰＦの発病原因は、依然として明確に究明されていないが、喫煙者で頻度が高く、抗うつ剤、胃食道逆流による慢性的肺吸入、金属粉塵、木材粉塵、または溶媒剤吸入などがＩＰＦの発生と関連する危険因子として報告されているが、ほとんどの患者からは、確実な因果関係のある因子を見つけることができない。
【００１５】
ＩＰＦは、治療しなかった場合に悪化し続け、患者の約５０％以上が３〜５年内に死亡すると知られており、また、一旦病気が進み線維化によって完全に固化した後にはどのような治療を行っても好転しないため、早期に治療する場合に効果がある可能性が高いと予測している。現在、使用されている治療剤としては、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）とアザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、またはシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）の併合療法を使用する方法が知られているが、特別な効果を奏すると見ることは難しく、様々な線維化抑制剤が動物実験および小規模の患者で試みられたが、明らかな効果が立証されていない状態である。特に、末期のＩＰＦ患者では肺移植以外には他の効果的な治療方法がない。したがって、より効率的なＩＰＦの治療剤開発が切実な状況である。
【００１６】
線維症（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）は、ある理由によって組織や臓器が結合組織の過剰線維化によって堅く固化する病症の通称であるが、線維化が生じるすべての過程は、部位を問わず傷が治る過程と同一の経路で行われる。線維化の症状は、現在、完治の方法がほとんどなく、治療方法は開発および研究しているところである。効果的な線維化治療剤は、代表的な線維症である肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症（ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）だけでなく、線維症が伴われる様々な疾病に適用が可能である。したがって、効率的な線維症の治療剤の開発が切実な状況である。
【００１７】
一方、アンフィレグリンは、上皮成長因子受容体に結合して上皮成長因子受容体経路（ＥＧＦＲ  ｐａｔｈｗａｙ）を活性化させ、細胞増殖に関係するという事実が知られており、アンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡによってアンフィレグリンの発現を阻害することができ、これは、特定タイプの乳癌で治療効果を示すと開示されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８；６８：２２５‐２２６５）。また、アンフィレグリンに対するｓｈＲＮＡを用いて炎症性乳癌での細胞浸透を抑制することができ（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  ２２６（１０）：２６９１‐２７０１）、アンフィレグリン特異的ｓｈＲＮＡを用いてアンフィレグリンの発現を抑制すると、タバコの煙に露出したマウスでの肺動脈再形成（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）が抑制されるという事実が報告されている。気道平滑筋（ａｉｒｗａｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ；ＡＳＭ）過形成（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）と血管新生にアンフィレグリンが関連しており、特に、喘息患者の気道再形成（ａｉｒｗａｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を促進することと、急性喘息による組織再形成で過多分泌される表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）とアンフィレグリンが関係することが報告されている。
【００１８】
また、ストラティフィン（１４‐３‐３  ｓｉｇｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎまたはＳＦＮ）は、ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ、細胞自然死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、シグナル伝達機構調節、細胞的輸送過程（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、細胞増殖および分化、細胞生存（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）などの様々な細胞内機能に関係するという事実が知られており（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ；２００７  ３０５：２５５‐６４）、ストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡを用いてＴＧＦ‐ｂｅｔａ１‐媒介成長阻害に関係すると開示されている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１０；．２；３０５‐３０９）。また、喘息での気道再形成（Ａｉｒｗａｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）は、コラーゲンの生成および分解を調節する因子が関係しており、特に、ＭＭＰ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ‐１）がコラーゲンの分解に重要な機能をするという点およびＭＭＰ‐１の気道での発現を調節する重要な因子の一つがスタラティピンであるという点が報告されている。
【００１９】
上述のようにアンフィレグリンとストラティフィンの呼吸器疾患および線維症、特に、ＣＯＰＤおよび特発性肺線維症の治療剤の標的としての可能性が提示されている状況であるが、アンフィレグリンとストラティフィンに対するｓｉＲＮＡ治療剤およびその送達技術に関する技術開発は依然として十分でない状況であり、特異的且つ高効率にアンフィレグリンとストラティフィンの発現を阻害できるｓｉＲＮＡ治療剤およびその送達技術に関する市場の需要は非常に高い状況である。
【発明の概要】
【００２０】
本発明の目的は、特定の遺伝子に特異的で、且つ非常に高い効率で発現を阻害することができる新規の二重らせんオリゴＲＮＡ、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、これを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、および前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子を提供することにある。
【００２１】
本発明の他の目的は、前記ｓｉＲＮＡ、これを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、および前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子を有効成分として含有する線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することにある。
【００２２】
本発明のさらに他の目的は、前記線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物を、線維症または呼吸器疾患の予防または治療を必要とする個体に投与するステップを含む線維症または呼吸器疾患の予防または治療方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明による二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子の模式図である。
【図２】実施例４のアンフィレグリンｍＲＮＡの発現量の定量分析の結果を示すものであり、本発明の配列番号１〜３０の配列をそれぞれセンス鎖として有する３０種のマウスアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡを２０ｎＭの濃度で処理した場合、マウス線維芽細胞株を形質転換させた後、確認したアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。ＮＣはマウスアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡが処理されていない細胞株（対照群）から取得した総ＲＮＡでのアンフィレグリンｍＲＮＡの発現量であり、これを基準として（１００％）各ｓｉＲＮＡによるアンフィレグリンの相対的な発現量を測定した結果を示すものである。
【図３】実施例６のアンフィレグリンｍＲＮＡの発現量の定量分析の結果を示すものであり、本発明の配列番号８、９または２８の配列をそれぞれセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを濃度を異ならせて（０．２、１および５ｎＭ）処理した場合、マウス線維芽細胞株を形質転換させた後、確認したアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【図４】実施例７のアンフィレグリンｍＲＮＡの発現量の定量分析の結果を示すものであり、本発明の配列番号３１〜１３０の配列をそれぞれセンス鎖として有する１００種のヒトアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡで１ｎＭの濃度でヒト肺腫瘍細胞株を形質転換させた後、確認したアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【図５】実施例７のストラティフィンｍＲＮＡの発現量の定量分析の結果を示すものであり、本発明の配列番号２３１〜３３０の配列をそれぞれセンス鎖として有する１００種のヒトストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡで１ｎＭの濃度でヒト肺腫瘍細胞株を形質転換させた後、確認したストラティフィンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【図６】実施例８のアンフィレグリンｍＲＮＡの発現量の定量分析の結果を示すものであり、本発明の配列番号４０、４２、４３、４５、４６、５２、５３、５８、５９、６１、６３、６５、６９、７５、７９、８０、８１、９１、９２、９４、９８、１０２、１１５、１１７、１２０または１２８の配列をそれぞれセンス鎖として有する２６種のヒトアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡを０．２ｎＭ処理した場合、形質転換された細胞株でのアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【図７】実施例８のストラティフィンｍＲＮＡの発現量の定量分析の結果を示すものであり、本発明の配列番号２３１、２３４、２３８、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５７、２５８、２６０、２６１、２６２、２６３、２６７、２６８、２７０、２７２、２７３、２７５、２７８、２８３、２８４、２９０、２９７、２９９、３００、３０２、３０３、３０７、３１１、３１４、３２０、３２４、３２６、３２７または３２８の配列をそれぞれセンス鎖として有する４７種のヒトストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡで０．２ｎＭの濃度で肺腫瘍細胞株を形質転換させた後、形質転換された細胞株でのストラティフィンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【図８】実施例９のアンフィレグリンｍＲＮＡの発現量の定量分析の結果を示すものであり、本発明の配列番号７９、８０または９１の配列をそれぞれセンス鎖として有する３種のヒトアンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡで濃度別（１００、２００、５００ｎＭ）にヒト肺腫瘍細胞株を形質転換させた後、形質転換された細胞株でのアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【図９】実施例９のストラティフィンｍＲＮＡの発現量の定量分析の結果を示すものであり、本発明の配列番号２４８、２５７、２６８、２９０または３２７の配列をそれぞれセンス鎖として有する５種のヒトストラティフィン特異的ＳＡＭｉＲＮＡで濃度別（５０、１００、２００ｎＭ）にヒト肺腫瘍細胞株を形質転換させた後、形質転換された細胞株でのストラティフィンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
他に定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において熟練した専門家によって通常理解されるものと同一の意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常使用されるものである。
【００２５】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１〜３３０からなる群から選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ‐ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）とを含むｓｉＲＮＡを提供する。
【００２６】
本発明はまた、下記構造式１の構造を含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を提供し、下記構造式１中、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、ＸおよびＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、ＲはｓｉＲＮＡを意味する。
【００２７】
［構造式１］
0006426268.tif 000002
【００２８】
本発明はまた、前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子を提供する。
【００２９】
本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡ、二重らせんオリゴＲＮＡ構造体またはナノ粒子を含む線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００３０】
本発明はまた、前記線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物を線維症または呼吸器疾患の予防または治療を必要とする個体に投与するステップを含む線維症または呼吸器疾患の予防または治療方法を提供する。
【００３１】
本発明では、新規のアンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）またはストラティフィン（ｓｔｒａｔｉｆｉｎ）特異的ｓｉＲＮＡを製造した。結果、前記新規のアンフィレグリンまたはストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡは、アンフィレグリンまたはストラティフィンをエンコードするｍＲＮＡと相補的に結合するように設計された塩基配列であることから、アンフィレグリンまたはストラティフィンの発現を効果的に抑制できるということを確認した。
【００３２】
本発明は、一観点において、配列番号１〜３３０からなる群から選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ；第１オリゴヌクレオチド）と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ‐ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ；第２オリゴヌクレオチド）とを含むｓｉＲＮＡに関する。
【００３３】
５´‐ｇｇａｇｕａｕｇａｕａａｕｇａａｃｃａ‐３´（配列番号１）、
５´‐ｃａｇｕａｇｕａｇｃｕｇｕｃａｃｕａｕ‐３´（配列番号２）、
５´‐ａｇａｃｕｃａｃａｇｃｇａｇｇａｕｇａ‐３´（配列番号３）、
５´‐ｃａｃａａａｕａｕｃｃｇｇｃｕａｕａｕ‐３´（配列番号４）、
５´‐ｃａｃｃａｕａａｇｃｇａａａｕｇｃｃｕ‐３´（配列番号５）、
５´‐ｇａｕｕａｃｕｕｕｇｇｕｇａａｃｇｇｕ‐３´（配列番号６）、
５´‐ｃａｇｕｕｇｕｃａｃｕｕｕｕｕａｕｇａ‐３´（配列番号７）、
５´‐ｇｇａｃｃｕａｕｃｃａａｇａｕｕｇｃａ‐３´（配列番号８）、
５´‐ｃｇｕｕａｕｃａｃａｇｕｇｃａｃｃｕｕ‐３´（配列番号９）、
５´‐ｃｃｕａｇｃｕｇａｇｇａｃａａｕｇｃａ‐３´（配列番号１０）、
５´‐ｇｇａａｇａｇａｇｇｕｕｕｃｃａｃｃａ‐３´（配列番号１１）、
５´‐ｃｕｃａｇａｇｇａｇｕａｕｇａｕａａｕ‐３´（配列番号１２）、
５´‐ｃｇｇｕｇｇａｃｕｕｇａｇｃｕｕｕｃｕ‐３´（配列番号１３）、
５´‐ｇｇｕｇｇｕｇａｃａｕｇｃａａｕｕｇｕ‐３´（配列番号１４）、
５´‐ｃａｇｇｇａａｕａｕｇａａｇｇａｇａａ‐３´（配列番号１５）、
５´‐ｇｇａｇｇｃｕｕｃｇａｃａａｇａａａａ‐３´（配列番号１６）、
５´‐ｃｃｇｇｕｇｇａａｃｃａａｕｇａｇａａ‐３´（配列番号１７）、
５´‐ｃｃｇｇｃｕａｕａｕｕａｕａｇａｕｇａ‐３´（配列番号１８）、
５´‐ａｇａａｕｃｃａｕｇｃａｃｕｇｃｃａａ‐３´（配列番号１９）、
５´‐ｃａａｇｇａｃｃｕａｕｃｃａａｇａｕｕ‐３´（配列番号２０）、
５´‐ｃａａａｕａｕｃｃｇｇｃｕａｕａｕｕａ‐３´（配列番号２１）、
５´‐ｇｇｇａｃｕａｃｇａｃｕａｃｕｃａｇａ‐３´（配列番号２２）、
５´‐ｇｃｇａａｕｇｃａｇａｕａｃａｕｃｇａ‐３´（配列番号２３）、
５´‐ｇｃｃａｃａｃｃｇｇａａａｕｇａｃａｕ‐３´（配列番号２４）、
５´‐ａｇａｇｕｕｇａａｃａｇｇｕｇａｕｕａ‐３´（配列番号２５）、
５´‐ｇａａｃｃａｃａａａｕａｕｃｃｇｇｃｕ‐３´（配列番号２６）、
５´‐ｃａｕａａｇｃｇａａａｕｇｃｃｕｕｃｕ‐３´（配列番号２７）、
５´‐ｇｕｕｕｃｃａｃｃａｕａａｇｃｇａａａ‐３´（配列番号２８）、
５´‐ｃａｇｇｕｇａｕｕａａｇｃｃｃａａｇａ‐３´（配列番号２９）、
５´‐ｃｃａｃａｃｃｇｇａａａｕｇａｃａｕｕ‐３´（配列番号３０）、
５´‐ｇａｇｔｇａａａｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔ‐３´（配列番号３１）、
５´‐ｃａｇａｇｔｔｇａａｃａｇｇｔａｇｔｔ‐３´（配列番号３２）、
５´‐ｃｔｇｇａｔｔｇｇａｃｃｔｃａａｔｇａ‐３´（配列番号３３）、
５´‐ｇａａａａｃｔｃａｃａｇｃａｔｇａｔｔ‐３´（配列番号３４）、
５´‐ｇａａａｃｔｔｃｇａｃａａｇａｇａａｔ‐３´（配列番号３５）、
５´‐ｃａｇｇａａａｔａｔｇａａｇｇａｇａａ‐３´（配列番号３６）、
５´‐ｇｃａａａｔａｔａｔａｇａｇｃａｃｃｔ‐３´（配列番号３７）、
５´‐ｇｇｔｇｃｔｇｔｃｇｃｔｃｔｔｇａｔａ‐３´（配列番号３８）、
５´‐ｔｃａｇａｇｔｔｇａａｃａｇｇｔａｇｔ‐３´（配列番号３９）、
５´‐ｇａａａｇａａａｃｔｔｃｇａｃａａｇａ‐３´（配列番号４０）、
５´‐ｇａｃａａｔａｃｇｔｃａｇｇａａａｔａ‐３´（配列番号４１）、
５´‐ｃａｇｇａｔａｔｃａｃａｔｔｇｇａｇｔ‐３´（配列番号４２）、
５´‐ｃｔｃｔｔｔｃｃａｇｔｇｇａｔｃａｔａ‐３´（配列番号４３）、
５´‐ｃｇｇｃｔｃａｇｇｃｃａｔｔａｔｇｃｔ‐３´（配列番号４４）、
５´‐ｇｇａｃｃａｃａｇｔｇｃｔｇａｔｇｇａ‐３´（配列番号４５）、
５´‐ｇｃｔｇｃｔｇｇａｔｔｇｇａｃｃｔｃａ‐３´（配列番号４６）、
５´‐ｇｔｔａｔｔａｃａｇｔｃｃａｇｃｔｔａ‐３´（配列番号４７）、
５´‐ｔｇｇａｃｃｔｃａａｔｇａｃａｃｃｔａ‐３´（配列番号４８）、
５´‐ｃｔｇｇｃｔａｔａｔｔｇｔｃｇａｔｇａ‐３´（配列番号４９）、
５´‐ｇａｃｇｇａａａｇｔｇａａａａｔａｃｔ‐３´（配列番号５０）、
５´‐ｇｔａｔｇａｔａａｃｇａａｃｃａｃａａ‐３´（配列番号５１）、
５´‐ａｃａｔｔｇｇａｇｔｃａｃｔｇｃｃａａ‐３´（配列番号５２）、
５´‐ｃｃａａｇｔｃａｔａｇｃｃａｔａａａｔ‐３´（配列番号５３）、
５´‐ａｇｔｇａａａｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔａ‐３´（配列番号５４）、
５´‐ｇａｔａａｃｇａａｃｃａｃａａａｔａｃ‐３´（配列番号５５）、
５´‐ｔｇｃａｔｔａｇｃａｇｃｃａｔａｇｃｔ‐３´（配列番号５６）、
５´‐ｇｃａｔｔｃａｃｇｇａｇａａｔｇｃａａ‐３´（配列番号５７）、
５´‐ｇｇａｇｔｃａｃｔｇｃｃａａｇｔｃａｔ‐３´（配列番号５８）、
５´‐ａｇｇｔｇｃａｃｇａａｇｇｔａａａａａ‐３´（配列番号５９）、
５´‐ｃａｇｃａｔｇａｔｔｇａｃａｇｔａｇｔ‐３´（配列番号６０）、
５´‐ｃｔｔａｇａａｇａｃａａｔａｃｇｔｃａ‐３´（配列番号６１）、
５´‐ａｇａｇｔｔｇａａｃａｇｇｔａｇｔｔａ‐３´（配列番号６２）、
５´‐ｔｇａｔｇａｇｔｃｇｇｔｃｃｔｃｔｔｔ‐３´（配列番号６３）、
５´‐ａｔａｔａｔａｇａｇｃａｃｃｔｇｇａａ‐３´（配列番号６４）、
５´‐ｇａｇｔｔｇａａｃａｇｇｔａｇｔｔａａ‐３´（配列番号６５）、
５´‐ｃａｔｔｃａｃｇｇａｇａａｔｇｃａａａ‐３´（配列番号６６）、
５´‐ｇｇａｃｃｃｔｔｔｔｔｇｔｔａｔｇａｔ‐３´（配列番号６７）、
５´‐ｃａｇａａｇａｇｔａｔｇａｔａａｃｇａ‐３´（配列番号６８）、
５´‐ｃｃａｇｔｇｇａｔｃａｔａａｇａｃａａ‐３´（配列番号６９）、
５´‐ｇｃｔｇｔｔａｔｔａｃａｇｔｃｃａｇｃ‐３´（配列番号７０）、
５´‐ｇｇｇａａｇｃｇｔｇａａｃｃａｔｔｔｔ‐３´（配列番号７１）、
５´‐ｃａｃａｇｔｇｃｔｇａｔｇｇａｔｔｔｇ‐３´（配列番号７２）、
５´‐ａｇｔｃａｇａｇｔｔｇａａｃａｇｇｔａ‐３´（配列番号７３）、
５´‐ｔｇｇａａｇｃａｇｔａａｃａｔｇｃａａ‐３´（配列番号７４）、
５´‐ｃａｃｇａａｇｇｔａａａａａｇｔａｔｔ‐３´（配列番号７５）、
５´‐ａｇａａｇａｇｔａｔｇａｔａａｃｇａａ‐３´（配列番号７６）、
５´‐ｇａａｇｃｇｔｇａａｃｃａｔｔｔｔｃｔ‐３´（配列番号７７）、
５´‐ｇｇｃｔａｔａｔｔｇｔｃｇａｔｇａｔｔ‐３´（配列番号７８）、
５´‐ｇａｇｔｃａｃｔｇｃｃａａｇｔｃａｔａ‐３´（配列番号７９）、
５´‐ｃａａｔｇｇａｃｃｃｔｔｔｔｔｇｔｔａ‐３´（配列番号８０）、
５´‐ｇｃａｃｇａａｇｇｔａａａａａｇｔａｔ‐３´（配列番号８１）、
５´‐ｔｇａａａｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔａｇｔ‐３´（配列番号８２）、
５´‐ｔｇｇａｔｃａｔａａｇａｃａａｔｇｇａ‐３´（配列番号８３）、
５´‐ｇｔｇａｇｔｇａａａｔｇｃｃｔｔｃｔａ‐３´（配列番号８４）、
５´‐ｇａｃｃｔｃａａｔｇａｃａｃｃｔａｃｔ‐３´（配列番号８５）、
５´‐ｃｃｔｃａａｔｇａｃａｃｃｔａｃｔｃｔ‐３´（配列番号８６）、
５´‐ｇｃｔｇａｔｇｇａｔｔｔｇａｇｇｔｔａ‐３´（配列番号８７）、
５´‐ｇｇａａｇｃａｇｔａａｃａｔｇｃａａａ‐３´（配列番号８８）、
５´‐ｃａｇｔａａｃａｔｇｃａａａｔｇｔｃａ‐３´（配列番号８９）、
５´‐ｇｃｔａｔａｇｃａｔａａｃｔｇａａｇａ‐３´（配列番号９０）、
５´‐ｇｇａｔａｔｃａｃａｔｔｇｇａｇｔｃａ‐３´（配列番号９１）、
５´‐ｃｃｃｔｔｔｔｔｇｔｔａｔｇａｔｇｇｔ‐３´（配列番号９２）、
５´‐ｇｔａｔａｔａａａｇｇｔｇｃａｃｇａａ‐３´（配列番号９３）、
５´‐ｇｇａｃｃｔｃａａｔｇａｃａｃｃｔａｃ‐３´（配列番号９４）、
５´‐ｇｃｔｃｔｔｇａｔａｃｔｃｇｇｃｔｃａ‐３´（配列番号９５）、
５´‐ｔｇｃｔｇｃｔｇｇａｔｔｇｇａｃｃｔｃ‐３´（配列番号９６）、
５´‐ｇａａｃｃａｃａａａｔａｃｃｔｇｇｃｔ‐３´（配列番号９７）、
５´‐ｃｇｇｔｃｃｔｃｔｔｔｃｃａｇｔｇｇａ‐３´（配列番号９８）、
５´‐ｔｔｃｃａａｃａｃｃｃｇｃｔｃｇｔｔｔ‐３´（配列番号９９）、
５´‐ａｇａｇｃａｃｃｔｇｇａａｇｃａｇｔａ‐３´（配列番号１００）、
５´‐ｔｃｔｔｔｃｃａｇｔｇｇａｔｃａｔａａ‐３´（配列番号１０１）、
５´‐ｃｃｔｔｔｔｔｇｔｔａｔｇａｔｇｇｔｔ‐３´（配列番号１０２）、
５´‐ｃａｃｃｔｇｇａａｇｃａｇｔａａｃａｔ‐３´（配列番号１０３）、
５´‐ｃｔｇａｇｇａａｃｇａａａｇａａａｃｔ‐３´（配列番号１０４）、
５´‐ｇｔｇａａａｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔａｇ‐３´（配列番号１０５）、
５´‐ｃｔａｃｔｃｔｇｇｇａａｇｃｇｔｇａａ‐３´（配列番号１０６）、
５´‐ｃｔｇｇｇａａｇｃｇｔｇａａｃｃａｔｔ‐３´（配列番号１０７）、
５´‐ａｃｔａｃｔｃａｇａａｇａｇｔａｔｇａ‐３´（配列番号１０８）、
５´‐ｃａｔｇｃａａａｔｇｔｃａｇｃａａｇａ‐３´（配列番号１０９）、
５´‐ｔｇａｇｇｔｔａｃｃｔｃａａｇａａｇｔ‐３´（配列番号１１０）、
５´‐ａｃｔｃｇｇｃｔｃａｇｇｃｃａｔｔａｔ‐３´（配列番号１１１）、
５´‐ｔｔｃａｃｇｇａｇａａｔｇｃａａａｔａ‐３´（配列番号１１２）、
５´‐ｃｔｇｃｔｇｇａｔｔｇｇａｃｃｔｃａａ‐３´（配列番号１１３）、
５´‐ｔｇａｔｔｃａｇｔｃａｇａｇｔｔｇａａ‐３´（配列番号１１４）、
５´‐ｔｇｃｃａａｇｔｃａｔａｇｃｃａｔａａ‐３´（配列番号１１５）、
５´‐ｃｔｃａａｇａａｇｔｇａｇａｔｇｔｃｔ‐３´（配列番号１１６）、
５´‐ｇｃｃａａｇｔｃａｔａｇｃｃａｔａａａ‐３´（配列番号１１７）、
５´‐ｃｔｃａｇａａｇａｇｔａｔｇａｔａａｃ‐３´（配列番号１１８）、
５´‐ｔｔｃｔｇｃａｔｔｃａｃｇｇａｇａａｔ‐３´（配列番号１１９）、
５´‐ｔａａｇａｃａａｔｇｇａｃｃｃｔｔｔｔ‐３´（配列番号１２０）、
５´‐ａｇｇｔｔａｃｃｔｃａａｇａａｇｔｇａ‐３´（配列番号１２１）、
５´‐ａａｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔａｇｔｇａａ‐３´（配列番号１２２）、
５´‐ａｔｇａｔｔｃａｇｔｃａｇａｇｔｔｇａ‐３´（配列番号１２３）、
５´‐ａａａｃａａｇａｃｇｇａａａｇｔｇａａ‐３´（配列番号１２４）、
５´‐ｔｔｔｃｔｇｃａｔｔｃａｃｇｇａｇａａ‐３´（配列番号１２５）、
５´‐ｃａａａｔａｃｃｔｇｇｃｔａｔａｔｔｇ‐３´（配列番号１２６）、
５´‐ｔｃｔｔｃｃａａｃａｃｃｃｇｃｔｃｇｔ‐３´（配列番号１２７）、
５´‐ｇａａｇｃａｇｔａａｃａｔｇｃａａａｔ‐３´（配列番号１２８）、
５´‐ｇａｔｇａｔｔｃａｇｔｃａｇａｇｔｔｇ‐３´（配列番号１２９）、
５´‐ｔｇｃａｔｔｃａｃｇｇａｇａａｔｇｃａ‐３´（配列番号１３０）、
５´‐ｃｔｃａｇｔｇａｇｇａｃｔｃｃｔａｃａ‐３´（配列番号１３１）、
５´‐ｃａｃｔａｃｇａｇａｔａｇｃｃａａｃａ‐３´（配列番号１３２）、
５´‐ｃａｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａｔ‐３´（配列番号１３３）、
５´‐ａｇｃｔｃｃｔｇａｇａｇａｃａａｃｃｔ‐３´（配列番号１３４）、
５´‐ｔｃａｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａ‐３´（配列番号１３５）、
５´‐ａｇａｇａｃａａｃｃｔｇａｃｇｃｔｇｔ‐３´（配列番号１３６）、
５´‐ｃｃｇａａｃｇｇｔａｔｇａａｇａｃａｔ‐３´（配列番号１３７）、
５´‐ｃｔｇａａｃａｇｇｃｃｇａａｃｇｇｔａ‐３´（配列番号１３８）、
５´‐ｃｔｃｃｔｇａｇａｇａｃａａｃｃｔｇａ‐３´（配列番号１３９）、
５´‐ｇａｃａｔｇｇｃａｇｃｔｔｔｃａｔｇａ‐３´（配列番号１４０）、
５´‐ｃｇａａｃｇｇｔａｔｇａａｇａｃａｔｇ‐３´（配列番号１４１）、
５´‐ａｇｔａｃｃｇｇｇａｇａａｇｇｔａｇａ‐３´（配列番号１４２）、
５´‐ａｃｔｔｔｔｃａｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａ‐３´（配列番号１４３）、
５´‐ｇｃａｔｃｇａｇｃａｇａａｇａｇｃａａ‐３´（配列番号１４４）、
５´‐ｇｃｇａａａｃｃｔｇｃｔｔｔｃｃｇｔａ‐３´（配列番号１４５）、
５´‐ｇｔｇａａａｇａｇｔａｃｃｇｇｇａｇａ‐３´（配列番号１４６）、
５´‐ｇｃｇａｔｇａｃａａｇａａｇｃｇｃａｔ‐３´（配列番号１４７）、
５´‐ａｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａｔａ‐３´（配列番号１４８）、
５´‐ｔｃａｇｔｇａｇｇａｃｔｃｃｔａｃａａ‐３´（配列番号１４９）、
５´‐ｇｇｔａｇａｇａｃｃｇａｇｃｔｃａｇａ‐３´（配列番号１５０）、
５´‐ｃｃｇａｇｇｔｇａａａｇａｇｔａｃｃｇ‐３´（配列番号１５１）、
５´‐ｃａｇｇｃｃｇａａｃｇｇｔａｔｇａａｇ‐３´（配列番号１５２）、
５´‐ｃｇｇｔａｔｇａａｇａｃａｔｇｇｃａｇ‐３´（配列番号１５３）、
５´‐ｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｇｃａｃｃｔｃａｔ‐３´（配列番号１５４）、
５´‐ａａｇａａｇｃｇｃａｔｃａｔｃｇａｔｔ‐３´（配列番号１５５）、
５´‐ｃｔｇｇａｃｔｃｇｃａｃｃｔｃａｔｃａ‐３´（配列番号１５６）、
５´‐ｇｇａｃｔｃｇｃａｃｃｔｃａｔｃａａａ‐３´（配列番号１５７）、
５´‐ｇａａｇｃｇｃａｔｃａｔｃｇａｔｔｃｔ‐３´（配列番号１５８）、
５´‐ｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａｔａｇ‐３´（配列番号１５９）、
５´‐ａａｇｇｔａｇａｇａｃｃｇａｇｃｔｃａ‐３´（配列番号１６０）、
５´‐ａｇｃｇａａａｃｃｔｇｃｔｔｔｃｃｇｔ‐３´（配列番号１６１）、
５´‐ｇａｃｔａｃｔａｃｃｇｃｔａｃｃｔａｇ‐３´（配列番号１６２）、
５´‐ｃａｇａｇａｇｃｃｇｃｇｔｃｔｔｃｔａ‐３´（配列番号１６３）、
５´‐ｇａｔｇａｃａａｇａａｇｃｇｃａｔｃａ‐３´（配列番号１６４）、
５´‐ｃａｔｃｇａｇｃａｇａａｇａｇｃａａｃ‐３´（配列番号１６５）、
５´‐ｔｇｃａｇｃｔｃｃｔｇａｇａｇａｃａａ‐３´（配列番号１６６）、
５´‐ａｃｇｇｔａｔｇａａｇａｃａｔｇｇｃａ‐３´（配列番号１６７）、
５´‐ｔｇｇａｃｔｃｇｃａｃｃｔｃａｔｃａａ‐３´（配列番号１６８）、
５´‐ｇｇｃｇａｔｇａｃａａｇａａｇｃｇｃａ‐３´（配列番号１６９）、
５´‐ｔｇａａｃａｇｇｃｃｇａａｃｇｇｔａｔ‐３´（配列番号１７０）、
５´‐ａｇｇｃｃｇａａｃｇｇｔａｔｇａａｇａ‐３´（配列番号１７１）、
５´‐ｔｃｇａｇｃａｇａａｇａｇｃａａｃｇａ‐３´（配列番号１７２）、
５´‐ｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａｔａｇｃｃａａ‐３´（配列番号１７３）、
５´‐ｇｇｔｇａａａｇａｇｔａｃｃｇｇｇａｇ‐３´（配列番号１７４）、
５´‐ｇｃｃｇａａｃｇｇｔａｔｇａａｇａｃａ‐３´（配列番号１７５）、
５´‐ａｇｇａｇａｔｇｃｃｇｃｃｔａｃｃａａ‐３´（配列番号１７６）、
５´‐ｇｇａｇｃｇａａａｃｃｔｇｃｔｔｔｃｃ‐３´（配列番号１７７）、
５´‐ｃａｇｔｇａｇｇａｃｔｃｃｔａｃａａｇ‐３´（配列番号１７８）、
５´‐ａｇｃｇｃａｔｃａｔｃｇａｔｔｃｔｇｃ‐３´（配列番号１７９）、
５´‐ｃａｔｃａｔｇｃａｇｃｔｃｃｔｇａｇａ‐３´（配列番号１８０）、
５´‐ｇｃｃｇｃｇｔｃｔｔｃｔａｃｃｔｇａａ‐３´（配列番号１８１）、
５´‐ｇａｇａｃａａｃｃｔｇａｃｇｃｔｇｔｇ‐３´（配列番号１８２）、
５´‐ｃｇａｔｇａｃａａｇａａｇｃｇｃａｔｃ‐３´（配列番号１８３）、
５´‐ｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａｔａｇｃｃ‐３´（配列番号１８４）、
５´‐ｃｃａｃｔａｃｇａｇａｔａｇｃｃａａｃ‐３´（配列番号１８５）、
５´‐ｇｃｔｃｃｔｇａｇａｇａｃａａｃｃｔｇ‐３´（配列番号１８６）、
５´‐ａｔｃａｔｃｇａｔｔｃｔｇｃｃｃｇｇｔ‐３´（配列番号１８７）、
５´‐ｔｇａｇａｇａｃａａｃｃｔｇａｃｇｃｔ‐３´（配列番号１８８）、
５´‐ａｇａｃａｔｇｇｃａｇｃｔｔｔｃａｔｇ‐３´（配列番号１８９）、
５´‐ｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａｔａｇｃ‐３´（配列番号１９０）、
５´‐ｇａａｃａｇｇｃｃｇａａｃｇｇｔａｔｇ‐３´（配列番号１９１）、
５´‐ａｔｇｃａｇｃｔｃｃｔｇａｇａｇａｃａ‐３´（配列番号１９２）、
５´‐ａｃｃｇａｇｃｔｃａｇａｇｇｔｇｔｇｔ‐３´（配列番号１９３）、
５´‐ｃｃｔｇａｇａｇａｃａａｃｃｔｇａｃｇ‐３´（配列番号１９４）、
５´‐ｃａｃａｃｃｃｔｃａｇｔｇａｇｇａｃｔ‐３´（配列番号１９５）、
５´‐ｔｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａｔａｇｃｃａ‐３´（配列番号１９６）、
５´‐ａｃａｔｇｇｃａｇｃｔｔｔｃａｔｇａａ‐３´（配列番号１９７）、
５´‐ｔｇａｃａａｇａａｇｃｇｃａｔｃａｔｃ‐３´（配列番号１９８）、
５´‐ａａｇｇａｇａｔｇｃｃｇｃｃｔａｃｃａ‐３´（配列番号１９９）、
５´‐ｃｔｔｔｔｃａｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃ‐３´（配列番号２００）、
５´‐ｔｃｃｔｇａｇａｇａｃａａｃｃｔｇａｃ‐３´（配列番号２０１）、
５´‐ｇｃａｇｃｔｃｃｔｇａｇａｇａｃａａｃ‐３´（配列番号２０２）、
５´‐ａｇｃｃｇｃｇｔｃｔｔｃｔａｃｃｔｇａ‐３´（配列番号２０３）、
５´‐ａｔｔｃｔｇｃｃｃｇｇｔｃａｇｃｃｔａ‐３´（配列番号２０４）、
５´‐ａｃｔｃｇｃａｃｃｔｃａｔｃａａａｇｇ‐３´（配列番号２０５）、
５´‐ａｇａｃｃｇａｇｃｔｃａｇａｇｇｔｇｔ‐３´（配列番号２０６）、
５´‐ｇａｃｔｃｇｃａｃｃｔｃａｔｃａａａｇ‐３´（配列番号２０７）、
５´‐ａｇａａｇｃｇｃａｔｃａｔｃｇａｔｔｃ‐３´（配列番号２０８）、
５´‐ｇｇｇｔｇａｃｔａｃｔａｃｃｇｃｔａｃ‐３´（配列番号２０９）、
５´‐ｃａａｇａｃｃａｃｃｔｔｃｇａｃｇａｇ‐３´（配列番号２１０）、
５´‐ｃｔａｃｇａｇａｔａｇｃｃａａｃａｇｃ‐３´（配列番号２１１）、
５´‐ｔｔｔｃａｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａ‐３´（配列番号２１２）、
５´‐ａｇｇｔｇａａａｇａｇｔａｃｃｇｇｇａ‐３´（配列番号２１３）、
５´‐ａａｇｃｇｃａｔｃａｔｃｇａｔｔｃｔｇ‐３´（配列番号２１４）、
５´‐ｇｃａｔｃａｔｃｇａｔｔｃｔｇｃｃｃｇ‐３´（配列番号２１５）、
５´‐ａａｃｇｇｔａｔｇａａｇａｃａｔｇｇｃ‐３´（配列番号２１６）、
５´‐ａｔｃｇａｇｃａｇａａｇａｇｃａａｃｇ‐３´（配列番号２１７）、
５´‐ａｃｔａｃｔａｃｃｇｃｔａｃｃｔａｇｃ‐３´（配列番号２１８）、
５´‐ｔｔｔｔｃａｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇ‐３´（配列番号２１９）、
５´‐ａｃｇａｇａｔａｇｃｃａａｃａｇｃｃｃ‐３´（配列番号２２０）、
５´‐ａｃｔａｃｃｇｃｔａｃｃｔａｇｃｃｇａ‐３´（配列番号２２１）、
５´‐ａｃｔａｃｇａｇａｔａｇｃｃａａｃａｇ‐３´（配列番号２２２）、
５´‐ｃｃｃｇａｇｇｔｇａａａｇａｇｔａｃｃ‐３´（配列番号２２３）、
５´‐ｃａｇｃｔｃｃｔｇａｇａｇａｃａａｃｃ‐３´（配列番号２２４）、
５´‐ｃａｔｃｇａｔｔｃｔｇｃｃｃｇｇｔｃａ‐３´（配列番号２２５）、
５´‐ｇａｇａｇａｃａａｃｃｔｇａｃｇｃｔｇ‐３´（配列番号２２６）、
５´‐ｇｃｇｃａｔｃａｔｃｇａｔｔｃｔｇｃｃ‐３´（配列番号２２７）、
５´‐ｇａａｇｇｔａｇａｇａｃｃｇａｇｃｔｃ‐３´（配列番号２２８）、
５´‐ｔｃａｔｃｇａｔｔｃｔｇｃｃｃｇｇｔｃ‐３´（配列番号２２９）、
５´‐ｇａａｃｇｇｔａｔｇａａｇａｃａｔｇｇ‐３´（配列番号２３０）、
５´‐ｃｇｔａｇｇａａｔｔｇａｇｇａｇｔｇｔ‐３´（配列番号２３１）、
５´‐ｃａｃｔａｃｇａｇａｔｃｇｃｃａａｃａ‐３´（配列番号２３２）、
５´‐ｇｃｔｇｔｃｃａｇｔａｔｔｇａｇｃａｇ‐３´（配列番号２３３）、
５´‐ｇａｃｃａｔｇｔｔｔｃｃｔｃｔｃａａｔ‐３´（配列番号２３４）、
５´‐ｃｇａｇａｃａａｃｃｔｇａｃａｃｔｇｔ‐３´（配列番号２３５）、
５´‐ｃｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａｔｃ‐３´（配列番号２３６）、
５´‐ｃｃｔｇｃｇａａｇａｇｃｇａａａｃｃｔ‐３´（配列番号２３７）、
５´‐ｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇａｔｃｇｔａｇｇａ‐３´（配列番号２３８）、
５´‐ｃｃａａｇａｃｃａｃｔｔｔｃｇａｃｇａ‐３´（配列番号２３９）、
５´‐ｇｔｃｔｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇａｃｃａｔ‐３´（配列番号２４０）、
５´‐ｃｔｃｔｇａｔｃｇｔａｇｇａａｔｔｇａ‐３´（配列番号２４１）、
５´‐ｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇａｃｃａｔｇｔｔｔ‐３´（配列番号２４２）、
５´‐ｔｇｇｃｃａａｇａｃｃａｃｔｔｔｃｇａ‐３´（配列番号２４３）、
５´‐ｃｇａｃａａｇａａｇｃｇｃａｔｃａｔｔ‐３´（配列番号２４４）、
５´‐ｃｔｇｃｃｇａｇａｇｇａｃｔａｇｔａｔ‐３´（配列番号２４５）、
５´‐ｇｃｃｔｃｔｇａｔｃｇｔａｇｇａａｔｔ‐３´（配列番号２４６）、
５´‐ｇｃｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｃｔｃｃａａａ‐３´（配列番号２４７）、
５´‐ｃｔｇｃｃｔｃｔｇａｔｃｇｔａｇｇａａ‐３´（配列番号２４８）、
５´‐ｇｃｃｃｔｇａａｃｔｔｔｔｃｃｇｔｃｔ‐３´（配列番号２４９）、
５´‐ｔｇｃｃｔｃｔｇａｔｃｇｔａｇｇａａｔ‐３´（配列番号２５０）、
５´‐ｔｇａｃｃａｔｇｔｔｔｃｃｔｃｔｃａａ‐３´（配列番号２５１）、
５´‐ｃｃａｔｇｔｔｔｃｃｔｃｔｃａａｔａａ‐３´（配列番号２５２）、
５´‐ｇｇｔｇａｃｇａｃａａｇａａｇｃｇｃａ‐３´（配列番号２５３）、
５´‐ａｃｔｔｔｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａ‐３´（配列番号２５４）、
５´‐ｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａ‐３´（配列番号２５５）、
５´‐ｃｔｃｔｃｃｔｇｃｇａａｇａｇｃｇａａ‐３´（配列番号２５６）、
５´‐ｃｃａｇｇａｃｃａｇｇｃｔａｃｔｔｃｔ‐３´（配列番号２５７）、
５´‐ｃｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇａｔｃｇｔａ‐３´（配列番号２５８）、
５´‐ｃｃｇａａｃｇｃｔａｔｇａｇｇａｃａｔ‐３´（配列番号２５９）、
５´‐ｃｃｃｔｇａａｃｔｔｔｔｃｃｇｔｃｔｔ‐３´（配列番号２６０）、
５´‐ｃｃｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａｔ‐３´（配列番号２６１）、
５´‐ｇａｇａｃａａｃｃｔｇａｃａｃｔｇｔｇ‐３´（配列番号２６２）、
５´‐ｇｃａｔｇｔｃｔｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇａ‐３´（配列番号２６３）、
５´‐ｔｇｇｃｔｇａｇａａｃｔｇｇａｃａｇｔ‐３´（配列番号２６４）、
５´‐ｇｃｃｇａａｃｇｃｔａｔｇａｇｇａｃａ‐３´（配列番号２６５）、
５´‐ｃｔｇｔｃｃａｇｔａｔｔｇａｇｃａｇａ‐３´（配列番号２６６）、
５´‐ｇｔａｔｔｇａｇｃａｇａａａａｇｃａａ‐３´（配列番号２６７）、
５´‐ｃａｇｃｔｇｔｔｇａｇｃｇｃａｃｃｔａ‐３´（配列番号２６８）、
５´‐ｇａｃａａｃｃｔｇａｃａｃｔｇｔｇｇａ‐３´（配列番号２６９）、
５´‐ｔｇｇａｇａｇａｇｃｃａｇｔｃｔｇａｔ‐３´（配列番号２７０）、
５´‐ｃｇａａｃｇｃｔａｔｇａｇｇａｃａｔｇ‐３´（配列番号２７１）、
５´‐ｇｇｔｇｃｔｇｔｃｃａｇｔａｔｔｇａｇ‐３´（配列番号２７２）、
５´‐ｇａａｇｃｇｃａｔｃａｔｔｇａｃｔｃａ‐３´（配列番号２７３）、
５´‐ｔｃｇｔａｇｇａａｔｔｇａｇｇａｇｔｇ‐３´（配列番号２７４）、
５´‐ｇｃｔｇｃｇａｇａｃａａｃｃｔｇａｃａ‐３´（配列番号２７５）、
５´‐ｔｇｃｔｇｔｃｃａｇｔａｔｔｇａｇｃａ‐３´（配列番号２７６）、
５´‐ｃｔｇｔｔｃｔｔｇｃｔｃｃａａａｇｇｇ‐３´（配列番号２７７）、
５´‐ｃｃｔｃｔｇａｔｃｇｔａｇｇａａｔｔｇ‐３´（配列番号２７８）、
５´‐ｃｃａｃｃｇｇｔｇａｃｇａｃａａｇａａ‐３´（配列番号２７９）、
５´‐ｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａｇａｔｃｇ‐３´（配列番号２８０）、
５´‐ｃｔａｃｃｔｇａａｇａｔｇａａｇｇｇｔ‐３´（配列番号２８１）、
５´‐ｃｔａｔａａｇａａｃｇｔｇｇｔｇｇｇｃ‐３´（配列番号２８２）、
５´‐ｃｔｃｔｇｇｃｃａａｇａｃｃａｃｔｔｔ‐３´（配列番号２８３）、
５´‐ｃｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｃｔｃｃａａａｇ‐３´（配列番号２８４）、
５´‐ｃｃａｃｔｔｔｃｇａｃｇａｇｇｃｃａｔ‐３´（配列番号２８５）、
５´‐ｔｇａｇａａｃｔｇｇａｃａｇｔｇｇｃａ‐３´（配列番号２８６）、
５´‐ｃｔｇｇｃｃａａｇａｃｃａｃｔｔｔｃｇ‐３´（配列番号２８７）、
５´‐ｔｔｇａｇｃａｇａａａａｇｃａａｃｇａ‐３´（配列番号２８８）、
５´‐ｔｇｃｇａｇａｃａａｃｃｔｇａｃａｃｔ‐３´（配列番号２８９）、
５´‐ａｇｃｔｇｔｔｇａｇｃｇｃａｃｃｔａａ‐３´（配列番号２９０）、
５´‐ｇａａｃｔｔｔｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃａｃ‐３´（配列番号２９１）、
５´‐ａａａａｇｃａａｃｇａｇｇａｇｇｇｃｔ‐３´（配列番号２９２）、
５´‐ｔｃｔｃｃｔｇｃｇａａｇａｇｃｇａａａ‐３´（配列番号２９３）、
５´‐ｃｔｇｔｔｇａｇｃｇｃａｃｃｔａａｃｃ‐３´（配列番号２９４）、
５´‐ｃｃｔｇａａｃｔｔｔｔｃｃｇｔｃｔｔｃ‐３´（配列番号２９５）、
５´‐ｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｃｔｃｃａａａｇｇ‐３´（配列番号２９６）、
５´‐ａｇｇｃｃｇａａｃｇｃｔａｔｇａｇｇａ‐３´（配列番号２９７）、
５´‐ａｔｔｇａｇｇａｇｔｇｔｃｃｃｇｃｃｔ‐３´（配列番号２９８）、
５´‐ｇｔｇａｃｃａｔｇｔｔｔｃｃｔｃｔｃａ‐３´（配列番号２９９）、
５´‐ｃａａｇａｃｃａｃｔｔｔｃｇａｃｇａｇ‐３´（配列番号３００）、
５´‐ａａｃｔｔｔｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃａｃｔ‐３´（配列番号３０１）、
５´‐ｔｇａｔｃｇｔａｇｇａａｔｔｇａｇｇａ‐３´（配列番号３０２）、
５´‐ｇｇａｇａｇａｇｃｃａｇｔｃｔｇａｔｃ‐３´（配列番号３０３）、
５´‐ａｇｃａｇｇｃｃｇａａｃｇｃｔａｔｇａ‐３´（配列番号３０４）、
５´‐ａｇｇａｃａｔｇｇｃａｇｃｃｔｔｃａｔ‐３´（配列番号３０５）、
５´‐ａｃｇａｃａａｇａａｇｃｇｃａｔｃａｔ‐３´（配列番号３０６）、
５´‐ａｃｃａｔｇｔｔｔｃｃｔｃｔｃａａｔａ‐３´（配列番号３０７）、
５´‐ｔｇｃｃｇａｇａｇｇａｃｔａｇｔａｔｇ‐３´（配列番号３０８）、
５´‐ｔｃｔｇａｔｃｇｔａｇｇａａｔｔｇａｇ‐３´（配列番号３０９）、
５´‐ｔｇｇｇｔｇｔｇａｃｃａｔｇｔｔｔｃｃ‐３´（配列番号３１０）、
５´‐ｔｇａａｃｔｔｔｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃａ‐３´（配列番号３１１）、
５´‐ｇａａｔｔｇａｇｇａｇｔｇｔｃｃｃｇｃ‐３´（配列番号３１２）、
５´‐ｔｔｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇａ‐３´（配列番号３１３）、
５´‐ｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇａｔｃｇｔａｇ‐３´（配列番号３１４）、
５´‐ｇｇｃｃｃｔｇａａｃｔｔｔｔｃｃｇｔｃ‐３´（配列番号３１５）、
５´‐ｇｃｃａａｇａｃｃａｃｔｔｔｃｇａｃｇ‐３´（配列番号３１６）、
５´‐ｔｃｔｇｇｃｃａａｇａｃｃａｃｔｔｔｃ‐３´（配列番号３１７）、
５´‐ｃｔｇａａｃｔｔｔｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃ‐３´（配列番号３１８）、
５´‐ａａｇｃｇｃａｔｃａｔｔｇａｃｔｃａｇ‐３´（配列番号３１９）、
５´‐ｔｇｔｔｇａｇｃｇｃａｃｃｔａａｃｃａ‐３´（配列番号３２０）、
５´‐ｔａｃｃｔｇａａｇａｔｇａａｇｇｇｔｇ‐３´（配列番号３２１）、
５´‐ａｃｃａｃｔｔｔｃｇａｃｇａｇｇｃｃａ‐３´（配列番号３２２）、
５´‐ａｃｇａｇｇｃｃａｔｇｇｃｔｇａｔｃｔ‐３´（配列番号３２３）、
５´‐ｇａｔｃｃｃａｃｔｃｔｔｃｔｔｇｃａｇ‐３´（配列番号３２４）、
５´‐ｃｔｔｔｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃａｃｔａｃ‐３´（配列番号３２５）、
５´‐ｇｃｃｇａｇａｇｇａｃｔａｇｔａｔｇｇ‐３´（配列番号３２６）、
５´‐ｇｃｔｇｔｔｇａｇｃｇｃａｃｃｔａａｃ‐３´（配列番号３２７）、
５´‐ｃａｇｇａｃｃａｇｇｃｔａｃｔｔｃｔｃ‐３´（配列番号３２８）、
５´‐ｃｃｔａｔａａｇａａｃｇｔｇｇｔｇｇｇ‐３´（配列番号３２９）、
５´‐ｃｔｇｇｇｔｇｔｇａｃｃａｔｇｔｔｔｃ‐３´（配列番号３３０）
【００３４】
本発明における「ｓｉＲＮＡ」は、特定の遺伝子（例えば、呼吸器疾患関連遺伝子）、好ましくは、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）またはストラティフィン（ｓｔｒａｔｉｆｉｎ）タンパク質をエンコードするｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡを意味する。また、アンフィレグリンまたはストラティフィンなど、呼吸器疾患関連遺伝子に対する特異性が維持される限り、前記配列番号１〜３３０による配列を含むセンス鎖またはこれに相補的なアンチセンス鎖で一つ以上の塩基が置換、欠失または挿入された配列を含むｓｉＲＮＡも本発明の権利範囲に属することは、当業界における通常の技術者にとって自明である。
【００３５】
また、本発明によるｓｉＲＮＡは、アンフィレグリンまたはストラティフィンに対する特異性が維持される限り、ｓｉＲＮＡのセンス鎖がアンフィレグリンまたはストラティフィン遺伝子の結合部位と１００％相補的な塩基配列である場合、すなわち、完全一致（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）するものだけでなく、一部の塩基配列が一致しない場合、すなわち、不完全一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）があるものも含む。
【００３６】
本発明によるｓｉＲＮＡは、一本鎖または二本鎖の３´末端に一つまたはそれ以上の非結合の（ｕｎｐａｉｒｅｄ）ヌクレオチドを含む構造であるオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含むことができる。
【００３７】
本発明において、前記センス鎖またはアンチセンス鎖は、好ましくは、１９〜３１個のヌクレオチドからなることを特徴としてもよく、これに限定されるものではない。
【００３８】
本発明において、配列番号１〜１３０からなる群から選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡは、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）に特異的なことを特徴としてもよい。アンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡは、好ましくは、配列番号２、６〜９、１１、１７〜２１、２３、２４、２８、２９、４０、４２、４３、４５、４６、５２、５３、５８、５９、６１、６３、６５、６９、７５、７９、８０、８１、９１、９２、９４、９８、１０２、１１５、１１７、１２０または１２８の配列を含むセンス鎖と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを特徴としてもよく、これに限定されるものではない。より好ましくは、配列番号８、９、２８、５９、７５、７９、８０、９１、９２または１０２の配列を含むセンス鎖と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを特徴としてもよい。
【００３９】
本発明において、配列番号１３１〜３３０からなる群から選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡは、ストラティフィン（ｓｔｒａｔｉｆｉｎ）特異的なことを特徴としてもよい。ストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡは、好ましくは、配列番号２３１、２３４、２３８、２４１〜２５５、２５７、２５８、２６０〜２６３、２６７、２６８、２７０、２７２、２７３、２７５、２７８、２８３、２８４、２９０、２９７、２９９、３００、３０２、３０３、３０７、３１１、３１４、３２０、３２４、３２６、３２７または３２８の配列を含むセンス鎖と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを特徴としてもよく、これに限定されるものではない。より好ましくは、配列番号２４１、２４８、２５７、２５８、２６３、２６８、２９０または３２７の配列を含むセンス鎖と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを特徴としてもよい。
【００４０】
本発明において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、生体内安定性の向上のために、核酸分解酵素抵抗性の付与および非特異的免疫反応の減少のための様々な化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことを特徴としてもよく、化学的修飾は、ヌクレオチド内の糖（ｓｕｇａｒ）構造の２´炭素位置で水酸化基（‐ＯＨ）がメチル基（‐ＣＨ３）、メトキシ基（‐ＯＣＨ３）、アミン基（‐ＮＨ２）、フッ素（‐Ｆ）、Ｏ‐２‐メトキシエチル基、Ｏ‐プロピル基、Ｏ‐２‐メチルチオエチル基、Ｏ‐３‐アミノプロピル基、Ｏ‐３‐ジメチルアミノプロピル基、Ｏ‐Ｎ‐メチルアセトアミド基およびＯ‐ジメチルアミドオキシエチルからなる群から選択されるいずれか一つで置換される修飾；ヌクレオチド内の糖構造の酸素が硫黄で置換される修飾；ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合およびメチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合からなる群から選択されるいずれか一つの結合になる修飾と、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）およびＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）形態への修飾；からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴としてもよく（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５５，６１‐６５  ２００４；ＵＳ５，６６０，９８５；ＵＳ５，９５８，６９１；ＵＳ  ６，５３１，５８４；ＵＳ５，８０８，０２３；ＵＳ  ６，３２６，３５８；ＵＳ  ６，１７５，００１；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３９‐１１４３、２００３；ＲＮＡ，９：１０３４‐１０４８，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３１：５８９‐５９５、２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（１７）５７６１‐７７３，２０１０；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（５）：１８２３‐１８３２，２０１１）、これに限定されるものではない。
【００４１】
本発明において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５´末端に一つ以上のリン酸基（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）が結合されていることを特徴としてもよく、好ましくは、１〜３個のリン酸基が結合されていることを特徴とする。
【００４２】
本発明は、他の観点において、下記構造式１の構造を含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に関するものであり、下記の構造式１中、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、ＸおよびＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、ＲはｓｉＲＮＡを意味する。
【００４３】
［構造式１］
0006426268.tif 000003
【００４４】
本発明による二重らせんオリゴＲＮＡの形態としては、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）およびｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）などが好ましいが、これに限定されるものではなく、ｍｉＲＮＡに対する拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）の役割が可能な一本鎖のｍｉＲＮＡ阻害剤も含まれる。
【００４５】
以下、本発明による二重らせんオリゴＲＮＡついては、ｓｉＲＮＡを中心に説明するが、本発明の二重らせんオリゴＲＮＡと同一の特性を有する他の二重らせんオリゴＲＮＡにも適用され得るということは、当業界の通常の技術者にとって自明である。
【００４６】
本発明において、下記構造式２の構造を含むことを特徴としてもよく、下記構造式２中、ＳおよびＡＳはそれぞれ構造式１によるｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を意味し、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは構造式１での定義と同一である。
【００４７】
［構造式２］
0006426268.tif 000004
【００４８】
本発明において、前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記構造式３の構造を含むことを特徴としてもよく、下記構造式３中、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｙ、ＳおよびＡＳは、構造式２での定義と同一であり、５´および３´は、ｓｉＲＮＡセンス鎖の５´および３´末端を意味する。
【００４９】
［構造式３］
0006426268.tif 000005
【００５０】
本発明において、二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、本発明による呼吸器疾患関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明による前記構造式１〜３において、ｓｉＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡが使用されてもよく、これは、当業界の通常の技術者にとって自明である。
【００５１】
本発明において、親水性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドンまたはポリオキサゾリンであってもよく、親水性物質の分子量は、好ましくは、２００〜１０，０００であることを特徴としてもよく、これに限定されるものではなく、前記親水性物質は、好ましくは、カチオン性または非イオン性高分子物質であることを特徴としてもよい。
【００５２】
特に、構造式１〜構造式３での親水性物質（Ａ）は、下記構造式４のような形態の親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）形態で用いられてもよく、かかる親水性物質ブロックを、必要に応じて適切な個数（構造式４でのｎ）を使用することにより、一般の合成高分子物質などを使用する場合に発生し得る多分散性による問題点を大幅に改善することができる。
【００５３】
［構造式４］
0006426268.tif 000006
【００５４】
前記構造式４中、Ａ´は親水性物質モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）を、Ｊはｍ個の親水性物質モノマー同士またはｍ個の親水性物質モノマーとｓｉＲＮＡを互いに連結するリンカー、ｍは１〜１５の整数、ｎは１〜１０の整数を意味し、（Ａ´ｍ‐Ｊ）で表される繰り返し単位が親水性物質ブロックの基本単位に相当する。
【００５５】
前記構造式４中、親水性物質モノマー（Ａ´）は、非イオン性親水性高分子のモノマーのうち本発明の目的を満たすものであれば、制限なく使用が可能であり、好ましくは、表１に記載の化合物（１）〜化合物（３）から選択されるモノマー、より好ましくは、化合物（１）のモノマーが使用されてもよく、化合物（１）において、Ｇは、好ましくは、ＣＨ２、Ｏ、ＳおよびＮＨから選択されてもよい。
【００５６】
特に、親水性物質モノマーの中でも特に化合物（１）で表されるモノマーは、様々な官能基を導入することができ、生体内親和性に優れ、免疫反応を少なく誘導するなど、生体適合性（ｂｉｏ‐ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）に優れ、構造式１〜構造式３による構造体内に含まれたオリゴヌクレオチドの生体内安定性を増加させ、送達効率を増加させることができるという利点を有しており、本発明による構造体の製造に非常に適する。
【００５７】
【表１】
0006426268.tif 000007
【００５８】
構造式１〜構造式３での親水性物質は、総分子量が１，０００〜２，０００の範囲内であることが好ましい。したがって、例えば、化合物（１）によるヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）が使用される場合、ヘキサエチレングリコールスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）の分子量が３４４であるため、繰り返し回数（ｎ）は３〜５であることが好ましい。
【００５９】
特に、本発明は、必要に応じて、前記構造式４中、（Ａ´ｍ‐Ｊ）で表される親水性基の繰り返し単位、すなわち、親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）がｎで表される適切な個数で使用されることができることを特徴とする。前記各親水性物質ブロック内に含まれる親水性物質モノマーであるＡ´とＪは、独立して、各親水性物質ブロックの間において同一であってもよく、相違していてもよい。すなわち、親水性物質ブロックが三つ使用される場合（ｎ＝３）、第一のブロックには化合物（１）による親水性物質モノマーが、第二のブロックには化合物（２）による親水性物質モノマーが、第三のブロックには化合物（３）による親水性物質モノマーが使用されるなど、すべての親水性物質ブロック別に異なる親水性物質モノマーが使用されてもよく、すべての親水性物質ブロックに化合物（１）〜化合物（３）による親水性物質モノマーから選択されるいずれか一つの親水性物質モノマーが同様に使用されてもよい。同様に、親水性物質モノマーの結合を媒介するリンカーもまた、各親水性物質ブロック別にすべて同一のリンカーが使用されてもよく、各親水性物質ブロック別に相違するリンカーが使用されてもよい。また、親水性物質モノマーの個数であるｍもまた、各親水性物質ブロックの間において同一であってもよく、相違していてもよい。すなわち、第一の親水性物質ブロックでは、親水性物質モノマーが三つ連結（ｍ＝３）され、第二の親水性物質ブロックでは、親水性物質モノマーが５個（ｍ＝５）、第三の親水性物質ブロックでは、親水性物質モノマーが４個連結（ｍ＝４）されるなど、互いに異なる個数の親水性物質モノマーが使用されてもよく、すべての親水性物質ブロックで同一の個数の親水性物質モノマーが使用されてもよい。
【００６０】
また、本発明において、前記リンカー（Ｊ）は、ＰＯ３−、ＳＯ３およびＣＯ２からなる群から選択されることが好ましいが、これに制限されるものではなく、使用される親水性物質のモノマーなどに応じて、本発明の目的を満たす限り、いかなるリンカーが使用されてもよいことは、通常の技術者にとっては自明である。
【００６１】
本発明において、疎水性物質は、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸、リン脂質、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）、脂質（ｌｉｐｉｄ）、トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）またはトコトリエノール（ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ）であることを特徴としてもよく、前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コテスタニルホルメートまたはコレスタニルアミンであることを特徴としてもよく、前記グリセリド誘導体は、モノ‐グリセリド、ジ‐グリセリドまたはトリ‐グリセリドであることを特徴としてもよく、前記脂質は、カチオン脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ）、アニオン脂質（ａｎｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ）、疎水脂質（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｌｉｐｉｄ）であることを特徴としてもよい。また、疎水性物質の分子量は、好ましくは、２５０〜１，０００であることを特徴としてもよく、これに限定されるものではない。
【００６２】
本発明において、疎水性物質は、親水性物質の反対側の末端（ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｄ）に結合され、ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいかなる位置に結合されてもよい。
【００６３】
本発明において、前記ＸおよびＹで表される共有結合は、非分解性結合または分解性結合であることを特徴としてもよい。前記非分解性結合は、アミド結合またはリン酸化結合であることを特徴としてもよく、前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴としてもよく、これに限定されるものではない。前記共有結合を媒介するリンカーは、親水性物質または疎水性物質とアンフィレグリンまたはストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡ末端に共有結合し、特定の環境で分解が可能な結合を提供する限り、特に限定されるものではない。したがって、親水性物質または疎水性物質とアンフィレグリンまたはストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡを活性化するために結合させるいかなる化合物を使用してもよい。
【００６４】
本発明は、さらに他の観点において、本発明による二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子に関するものである。本発明による二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の場合、疎水性物質の疎水性相互作用によって自己組織化ナノ粒子を形成するが（韓国登録特許公報第１２２４８２８号）、かかるナノ粒子は、体内への送達効率および体内での安定性が極めて優れるだけでなく、粒径の均一性に優れ、ＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）が容易であることから、薬物としての製造工程が簡単である。
【００６５】
より具体的に、アンフィレグリンまたはストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、疎水性および親水性物質を両方とも含んでいる両親媒性であり、親水性部分は、体内に存在する水分子と水素結合などの相互作用により親和力を有しており、外側に向かうことになり、疎水性物質は、それらの間の疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）により内側に向かうことになり、熱力学的に安定したナノ粒子を形成する。すなわち、ナノ粒子の中心に疎水性物質が位置し、アンフィレグリンまたはストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡの外側方向に親水性物質が位置して、アンフィレグリンまたはストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡを保護する形態のナノ粒子を形成する。このように形成されたナノ粒子は、アンフィレグリンまたはストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡの細胞内送達およびアンフィレグリンまたはストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡの効能を向上させる。
【００６６】
本発明において、ナノ粒子は、同一の配列を有するｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体だけで形成されてもよく、互いに異なる配列を含むｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が混合されて構成されることを特徴としてもよい。
【００６７】
本発明は、他の観点において、本発明によるｓｉＲＮＡ、二重らせんオリゴＲＮＡ構造体またはナノ粒子を有効成分として含有する線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物に関するものである。
【００６８】
本発明による線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物は、結合組織再形成（ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）、特に、肺動脈再形成（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）および気道再形成（ａｉｒｗａｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を抑制して、線維症または呼吸器疾患の予防または治療に効果を示す。
【００６９】
本発明において、呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急・慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、痰と咳、気管支炎、細気管支炎、咽頭炎、扁桃炎または喉頭炎であることを特徴としてもよく、線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症（ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）および肺癌などから選択されることを特徴としてもよく、これに限定されるものではない。
【００７０】
本発明の組成物には、投与のために上述の有効成分以外にさらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んでもよい。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能である必要があり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち一つの成分または二つ以上の成分を混合して使用してもよく、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳液などの注射用剤形に製剤化してもよい。特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）した形態の剤形に製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥剤形の製造のために、本発明が属する技術分野において通常知られている方法が使用されてもよく、凍結乾燥のための安定化剤が追加されてもよい。さらに、当分野における適正な方法で、またはレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を用いて、各疾病に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００７１】
本発明の組成物は、通常の患者の症状と疾病の深刻度に基づいて本技術分野における通常の専門家が決定することができる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの様々な形態に製剤化してもよく、単位‐投与量または多‐投与量容器、例えば、シールされたアンプルおよびビンなどで提供されてもよい。
【００７２】
本発明の組成物は、経口または非経口投与が可能である。本発明による組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与が可能である。特に、呼吸器疾患の治療のために気管支内点滴注入による肺への投与も可能である。本発明による組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率または疾病の深刻度などに応じてその範囲が様々であり、本技術分野における通常の専門家が容易に決定することができる。また、臨床投与のために、公知の技術を用いて本発明の組成物を適する剤形に製剤化することができる。
【００７３】
本発明は、他の観点において、本発明による薬学組成物を含む凍結乾燥された形態の剤形に関する。
【００７４】
本発明は、さらに他の観点において、（ａ）固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）をベースとして親水性物質を結合させるステップと、（ｂ）前記親水性物質が結合された固形支持体をベースとしてＲＮＡ一本鎖を合成するステップと、（ｃ）前記ＲＮＡ一本鎖５´末端に疎水性物質を共有結合させるステップと、（ｄ）前記ＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成するステップと、（ｅ）合成が完了した後、固形支持体からＲＮＡ‐高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖を分離および精製するステップと、（ｆ）製造されたＲＮＡ‐高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖のアニーリングにより二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造するステップと、を含む呼吸器疾患関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造方法に関する。
【００７５】
本発明において、前記固形支持体が細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）、ポリスチレン、シリカゲル、セルロースペーパーであることを特徴とするが、これに限定されるものではない。固形支持体がＣＰＧである場合、直径は４０〜１８０μｍであることが好ましく、孔径は５００〜３０００Åであることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００７６】
本発明において、前記（ｄ）ステップが、（ａ）ステップの前；または（ａ）〜（ｃ）ステップおよび（ｅ）ステップのいずれか一つのステップで行われることを特徴としてもよい。
【００７７】
本発明において、前記（ｅ）ステップの後、精製されたＲＮＡ‐高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖は、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、目的とするＲＮＡ‐高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖が製造されたかを確認することができる。また、前記（ｂ）ステップで合成されたＲＮＡ一本鎖と相補的な配列を含むＲＮＡ一本鎖は、５´末端にリン酸基が結合された形態で用いられたことを特徴としてもよい。
【００７８】
本発明は他の観点において、本発明による線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物を、線維症または呼吸器疾患の予防または治療を必要とする個体に投与するステップを含む線維症または呼吸器疾患の予防または治療方法に関する。
【００７９】
本発明において、呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急・慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、痰と咳、気管支炎、細気管支炎、咽頭炎、扁桃炎または喉頭炎であることを特徴としてもよく、線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症（ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）であることを特徴としてもよく、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものに解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。
【００８１】
実施例１：標的塩基配列のデザインおよびｓｉＲＮＡの製造
アンフィレグリン（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００１６５７．２）、ストラティフィン（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００６１４２．２）、アンフィレグリン（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００９７０４．２）、ストラティフィン（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０１８７５４．２）に結合することができる標的塩基配列（センス鎖）をデザインし、前記標的塩基配列の相補的配列であるアンチセンス鎖のｓｉＲＮＡを製造した。
【００８２】
まず、（株）バイオニアで開発された遺伝子デザインプログラム（Ｔｕｒｂｏ  ｓｉ‐Ｄｅｓｉｇｎｅｒ）を使用し、当該遺伝子のｍＲＮＡ配列でｓｉＲＮＡが結合することができる標的塩基配列をデザインした。本発明のアンフィレグリンおよびストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡは、１９個のヌクレオチドからなるセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖からなる二本鎖構造である。また、いかなる遺伝子の発現を阻害しない配列のｓｉＲＮＡであるｓｉＣＯＮＴ（ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡ；配列番号３３１の配列をセンス鎖として有する）を製造した。前記ｓｉＲＮＡは、β‐シアノエチルホスホラミダイト（β‐ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結して製造した（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：４５３９‐４５５７，１９８４）。具体的に、ＲＮＡ合成装置（３８４  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を使用して、ヌクレオチドが付着された固形支持体上で、遮断除去（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）およびキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）からなる一連の過程を繰り返して、所望の長さを有するＲＮＡを含む反応物を取得した。前記反応物をＤａｉｓｏ  ｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ、Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製し、これをＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）を用いて標的塩基配列と合致するかを確認した。次に、センスとアンチセンスＲＮＡ本を結合して、目的とする配列番号１〜配列番号３３１から選択されるいずれか一つの配列をセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを製造した。
【００８３】
実施例２：二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ  ＬＰ）の製造
本発明で製造した二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ  ＬＰ）は、下記構造式５のような構造を有する。
【００８４】
［構造式５］
0006426268.tif 000008
【００８５】
前記構造式５中、ＳはｓｉＲＮＡのセンス鎖；ＡＳはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖；ＰＥＧは親水性物質としてポリエテレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）；Ｃ２４は疎水性物質としてジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）が含まれたテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）；５´および３´は二重らせんオリゴＲＮＡ末端の方向性を意味する。
【００８６】
前記構造式５でのｓｉＲＮＡのセンス鎖は、既存の特許（韓国公開特許公報第２０１２‐０１１９２１２号）の実施例１に記載の方法により製造された３´ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ、Ｍｎ＝２，０００）‐ＣＰＧを支持体として、上述の方式通りにβ‐シアノエチルホスホアミダイトを用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法により、３´末端部位にポリエチレングリコールが結合されたセンス鎖の二重らせんオリゴＲＮＡ‐親水性物質構造体を合成した後、ジスルフィド結合が含まれているテトラドコサンを５´末端に結合して、所望のＲＮＡ‐高分子構造体のセンス鎖を製造した。前記鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、上述の反応によりセンス鎖と相補的な配列のアンチセンス鎖を製造した。
【００８７】
合成が完了すると、６０℃の水浴（ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ）で２８％（ｖ／ｖ）アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ）を処理して合成されたＲＮＡ一本鎖とＲＮＡ高分子構造体をＣＰＧから取り外した後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応により保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ‐高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ‐メチルピロリドン（Ｎ‐ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）およびトリエチルアミントリヒドロフルオライド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を体積比１０：３：４の割合で処理し、２´ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ‐ｂｕｔｕｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）を除去した。
【００８８】
前記反応物をＤａｉｓｏｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ、Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製し、これをＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）を用いて標的塩基配列と合致するかを確認した。次に、それぞれの二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造するために、センス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのカリウムアセテート（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭのマグネシウムアセテート（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０〜７．５）に入れて、９０℃の恒温水槽で３分反応させた後、また３７℃で反応させて、配列番号６、９、２８、５９、７５、７９、８０、９１、９２、１０２、２４１、２４８、２５７、２５８、２６３、２６８、２９０または３２７の配列をセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（以下、それぞれ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ｍＡＲ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ｈＡＲ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ｈＳＦＮ及びＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＣＯＮＴとする）をそれぞれ製造した。製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動によりアニーリングされたことを確認した。
【００８９】
実施例３：二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ  ＬＰ）からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の製造および粒径の測定
実施例２で製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ  ＬＰ）は、二重らせんオリゴＲＮＡの末端に結合された疎水性物質の間の疎水性相互作用によりナノ粒子、すなわちミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）を形成する（図１）。
【００９０】
ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ｈＡＲ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ｈＳＦＮ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ｍＡＲ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ｍＳＦＮ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＣＯＮＴからなるナノ粒子の粒径ＰＤＩ（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）分析により該当ＳＡＭｉＲＮＡ  ＬＰからなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の形成を確認した。
【００９１】
３‐１：ナノ粒子の製造
前記ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ｈＡＲを１．５ｍｌ  ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）に５０μｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、‐７５℃、５ｍＴｏｒｒの条件で４８時間凍結乾燥によりナノ粒子パウダーを製造した後、溶媒であるＤＰＢＳに溶解して均質化されたナノ粒子を製造した。
【００９２】
ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ｈＳＦＮ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ｍＡＲ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ｍＳＦＮ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＣＯＮＴからなるナノ粒子も同一の方法で製造した。
【００９３】
３‐２：ナノ粒子の粒径および多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ、ＰＤＩ）測定
ゼータ電位測定装置（Ｚｅｔａ‐ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）により前記ナノ粒子の粒径を測定した。実施例３‐１で製造された均質化されたナノ粒子は、ゼータ電位測定装置（Ｎａｎｏ‐ＺＳ、ＭＡＬＶＥＲＮ、イギリス）で粒径を測定したが、物質に対する屈折率（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）は１．４５９、吸収率（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）は０．００１とし、溶媒であるＤＰＢＳの温度２５℃およびそれによる粘度（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）は１．０２００および屈折率は１．３３５である条件で測定した。１回の測定は、１５回の繰り返しによる粒径測定で行われ、これを６回繰り返した。
【００９４】
ＰＤＩ値が低いほど当該粒子が均一に分布していることを示す数値であり、本発明のナノ粒子は、非常に均一な粒径に形成されることが分かった。
【００９５】
実施例４：マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）細胞株でマウスに対する標的遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを用いたアンフィレグリンの発現抑制
実施例１で製造された配列番号１〜配列番号３０の配列をそれぞれセンス鎖として有するアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡを用いて線維芽細胞株であるマウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）を形質転換させ、前記形質転換された線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）細胞株でアンフィレグリンの発現プロファイル、すなわち前記ｓｉＲＮＡによる発現抑制程度を分析した。
【００９６】
４‐１：線維芽細胞株の培養
アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から手に入れたマウス線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）をＲＰＭＩ‐１６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【００９７】
４‐２：マウス線維芽細胞株で標的ｓｉＲＮＡのトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
実施例４‐１で培養された１×１０５線維芽細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で１２‐ウェルプレートで１８時間ＲＰＭＩ  １６４０で培養した後、培地を除去した後、各ウェル当たり５００μｌのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分注した。
【００９８】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）１．５μｌとＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地２４８．５μｌを混合して混合液を製造し、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１〜３０のいずれか一つの配列をセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）２０μｌをＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地２３０μｌに添加し、最終濃度が２０ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ）混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させてトランスフェクション用溶液を製造した。
【００９９】
次に、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルにトランスフェクション用溶液をそれぞれ５００μｌずつ分注し、６時間培養した後、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭ培地を除去した。これにＲＰＭＩ  １６４０培養培地１ｍｌずつ分注した後、２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１００】
４‐３：アンフィレグリンｍＲＮＡの定量分析
実施例４‐２でトランスフェクトされた細胞株から全体のＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いてアンフィレグリンｍＲＮＡの発現量を相対定量した。
【０１０１】
４‐３‐１：トランスフェクトされた細胞からのＲＮＡの分離およびｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、前記実施例４‐２でトランスフェクトされた細胞株から全体のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌのエッペンチューブに満たされいるＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）にチューブ１本当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅装置（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズし、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【０１０２】
４‐３‐２：アンフィレグリンｍＲＮＡの相対定量分析
実施例４‐３‐１で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲによりアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な量を下記のような方法で定量した。９６‐ウェルプレートの各ウェルに前記実施例４‐３‐１で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレグリンｍＲＮＡの発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ３μｌと２ＸＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸留水６μｌ、アンフィレグリンｑＰＣＲプライマー（配列番号３３６および３３７（表２）；１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れて混合液を作製した。一方、アンフィレグリンｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＲＰＬ１３Ａ（６０Ｓ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１３ａ）を標準遺伝子とした。前記混合液で満たされた９６‐ウェルプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ  ９６  Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化およびｃＤＮＡの二次構造を除去した後、９４℃で３０秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の４つの過程を４２回繰り返して行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。
【０１０３】
ＰＣＲが終了した後、それぞれ取得した標的遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値は、ＲＰＬ１３Ａ遺伝子により補正された標的遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列であるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群とし、△Ｃｔ値の差を求めた。前記△Ｃｔ値と計算式２（‐△Ｃｔ）×１００を用いてアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号１〜配列番号３０の配列をセンス鎖として有する）が処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量した（図２）。
【０１０４】
高効率のｓｉＲＮＡを選別するために最終濃度２０ｎＭの濃度でアンフィレグリンｍＲＮＡの発現量が、対照群に比べて７０％以上の発現量の減少を示し、配列番号２、６〜９、１１、１７〜２１、２３、２４、２８および２９の配列をそれぞれセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ１５種を選別した。
【０１０５】
【表２】
0006426268.tif 000009
【０１０６】
実施例５：線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）細胞株で選別されたｓｉＲＮＡを用いたアンフィレグリンの発現抑制
実施例４で選別された配列番号２、６〜９、１１、１７〜２１、２３、２４、２８および２９の配列をそれぞれセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを用いて、線維芽細胞株であるマウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）を形質転換させ、前記形質転換された線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）細胞株でアンフィレグリンｍＲＮＡの発現プロファイルを分析した。
【０１０７】
５‐１：線維芽細胞株の培養
アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から手に入れたマウス線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）をＲＰＭＩ‐１６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１０８】
５‐２：線維芽細胞株で標的ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
実施例５‐１で培養された１×１０５線維芽細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で１２‐ウェルプレートで１８時間ＲＰＭＩ  １６４０で培養した後、培地を除去した後、各ウェル当たり５００μｌのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分注した。
【０１０９】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）２μｌとＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地２４８μｌを混合して混合液を製造し、室温で５分間反応させた後、前記実施例４で選別された配列番号２、６〜９、１１、１７〜２１、２３、２４、２８および２９の配列をそれぞれセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）５μｌをＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地２４５μｌに添加し、最終濃度が５ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ）混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させてトランスフェクション用溶液を製造した。
【０１１０】
次に、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルにトランスフェクション用溶液をそれぞれ５００μｌずつ分注し、６時間培養した後、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭ培地を除去した。これにＲＰＭＩ  １６４０培養培地１ｍｌずつ分注した後、２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１１１】
５‐３：アンフィレグリンｍＲＮＡの定量分析
実施例５‐２でトランスフェクトされた細胞株から全体のＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いてアンフィレグリンｍＲＮＡ発現を相対定量した。
【０１１２】
５‐３‐１：トランスフェクトされた細胞からのＲＮＡの分離およびｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、前記実施例５‐２でトランスフェクトされた細胞株から全体のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌのエッペンチューブに満たされいるＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）にチューブ１本当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅装置（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズし、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【０１１３】
５‐３‐２：アンフィレグリンｍＲＮＡの相対定量分析
実施例５‐３‐１で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲによりアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な量を下記のような方法で定量した。９６‐ウェルプレートの各ウェルに実施例５‐３‐１で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレグリンｍＲＮＡの発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ３μｌと２ＸＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸留水６μｌ、アンフィレグリンｑＰＣＲプライマー（配列番号３３６および３３７（表２）；１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れて混合液を作製した。一方、アンフィレグリンｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子であるＲＰＬ１３Ａを標準遺伝子とした。前記混合液で満たされた９６‐ウェルプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ  ９６  Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化およびｃＤＮＡの二次構造を除去した後、９４℃で３０秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の４つの過程を４２回繰り返して行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了した後、それぞれ取得した標的遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値はＲＰＬ１３Ａ遺伝子により補正された標的遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列のｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群とし、△Ｃｔ値の差を求めた。前記△Ｃｔ値と計算式２（‐△Ｃｔ）×１００を用いてアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡが処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量して配列番号２、６〜９、１１、１７〜２１、２３、２４、２８および２９の配列をそれぞれセンス鎖として有するアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡの発現量変化を相対定量した。
【０１１４】
高効率のｓｉＲＮＡを選別するためにｓｉＲＮＡを処理した後、標的遺伝子の発現が５０％抑制される値であるＩＣ５０を確認するために、最終濃度５ｎＭの濃度でアンフィレグリンｍＲＮＡの発現量が対照群と対比して最大の発現量の減少を示す配列番号８、９および２８の配列をそれぞれセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ３種を選別した。
【０１１５】
実施例６：線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）細胞株で選別されたｓｉＲＮＡを用いたアンフィレグリンの発現抑制
実施例５で選別された配列番号８、９および２８の配列をそれぞれセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを用いて線維芽細胞株であるマウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）を形質転換させ、前記形質転換された線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）細胞株でアンフィレグリンｍＲＮＡの発現プロファイルを分析し、ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認した。
【０１１６】
６‐１：線維芽細胞株の培養
アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から手に入れたマウス線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）をＲＰＭＩ‐１６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１１７】
６‐２：線維芽細胞株で標的ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
実施例６‐１で培養された１×１０５線維芽細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で１２‐ウェルプレートで１８時間ＲＰＭＩ  １６４０で培養した後、培地を除去した後、各ウェル当たり５００μｌのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分注した。
【０１１８】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）２μｌとＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地２４８μｌを混合して混合液を製造し、室温で５分間反応させた後、実施例５で選別された配列番号８、９および２８の配列をそれぞれセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）０．２、１、５μｌをＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地２４９．８、２４９、２４５μｌに添加し、最終濃度が０．２、１、５ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ）混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させてトランスフェクション用溶液を製造した。
【０１１９】
次に、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルにトランスフェクション用溶液をそれぞれ５００μｌずつ分注し、６時間培養した後、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭ培地を除去した。これにＲＰＭＩ  １６４０培養培地１ｍｌずつ分注した後、２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１２０】
６‐３：アンフィレグリンｍＲＮＡの定量分析
実施例６‐２でトランスフェクトされた細胞株から全体のＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いてアンフィレグリンｍＲＮＡの発現量を相対定量した。
【０１２１】
６‐３‐１：トランスフェクトされた細胞からのＲＮＡの分離およびｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、実施例６‐２でトランスフェクトされた細胞株から全体のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌのエッペンチューブに満たされいるＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）にチューブ１本当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅装置（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズし、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【０１２２】
６‐３‐２：アンフィレグリンｍＲＮＡの相対定量分析
実施例６‐３‐１で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲによりアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な量を下記のような方法で定量した。９６‐ウェルプレートの各ウェルに実施例６‐３‐１で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレグリンｍＲＮＡの発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ３μｌと２ＸＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸留水６μｌ、アンフィレグリンｑＰＣＲプライマー（配列番号３３６および３３７（表２）；１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れて混合液を作製した。一方、アンフィレグリンｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子であるＲＰＬ１３Ａを標準遺伝子とした。前記混合液で満たされた９６‐ウェルプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ  ９６  Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化およびｃＤＮＡの二次構造を除去した後、９４℃で３０秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の４つの過程を４２回繰り返して行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了した後、それぞれ取得した標的遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値は、ＲＰＬ１３Ａ遺伝子により補正された標的遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列のｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群とし、△Ｃｔ値の差を求めた。前記△Ｃｔ値と計算式２（‐△Ｃｔ）×１００を用いてアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡが処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量した（図３）。
【０１２３】
その結果、配列番号８、９および２８の配列をそれぞれセンス鎖として有するアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡすべてが０．２ｎＭの低濃度でも５０％以上のアンフィレグリンｍＲＮＡの発現量の減少を示し、非常に高効率でアンフィレグリン発現を阻害する効果を示すことを確認した。
【０１２４】
実施例７：標的塩基配列のデザインおよびｓｉＲＮＡの製造
実施例１で製造された配列番号３１〜１３０および２３１〜３３０の配列をセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを用いて肺腫瘍細胞株であるヒト肺腫瘍細胞株（Ａ５４９）を形質転換させて、前記形質転換された肺腫瘍細胞（Ａ５４９）細胞株で標的遺伝子の発現プロファイルを分析した。
【０１２５】
７‐１：ヒト肺腫瘍細胞株の培養
アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から手に入れたヒト肺腫瘍細胞（Ａ５４９）細胞株は、ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１２６】
７‐２：ヒト肺腫瘍細胞株への標的ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
実施例７‐１で培養された１．２×１０５肺腫瘍細胞（Ａ５４９）細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で６‐ｗｅｌｌプレートで１８時間ＤＭＥＭ培地で培養した後、培地を除去した後、各ウェル（ｗｅｌｌ）当たり５００μｌのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）を分注した。
【０１２７】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）３．５μｌとＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地２４６．５μｌを混合して混合液を製造し、室温で５分間反応させた後、実施例１で製造したそれぞれの配列番号３１〜１３０および２３１〜３３０の配列をセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）１μｌをＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地２３０μｌに添加し、最終濃度が１ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で１５分間反応させてトランスフェクション用溶液を製造した。
【０１２８】
次に、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェル（ｗｅｌｌ）にトランスフェクション用溶液をそれぞれ５００μｌずつ分注し、６時間培養した後、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭ培地を除去した。これにＲＰＭＩ  １６４０培養培地１ｍｌずつ分注した後、２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１２９】
７‐３：標的遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
実施例７‐２でトランスフェクトされた細胞株から実施例４‐３と同一の方法で全体のＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いて標的遺伝子のｍＲＮＡの発現量を相対定量した。
【０１３０】
７‐４：トランスフェクトされた細胞からのＲＮＡの分離およびｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を用いて、実施例７‐２でトランスフェクトされた細胞株から全体のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０、ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌのエッペンチューブに満たされいるＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０（ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）にチューブ１本当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅装置（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズして、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９０℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【０１３１】
７‐５：標的遺伝子ｍＲＮＡの相対定量分析
実施例７‐４で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲにより呼吸器疾患関連遺伝子ｍＲＮＡの相対的な量を下記のような方法で定量した。９６‐ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに実施例７‐４で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ３μｌと２ＸＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、ｑＰＣＲプライマー（アンフィレグリン遺伝子、配列番号３３８および３３９；ストラティフィン遺伝子、配列番号３４２および３４３；表２；Ｆ、Ｒそれぞれ１０ｐｍｏｌｅ／μｌ；ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を３μｌ入れて混合液を作製した。一方、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＲＰＬ１３Ａを標準遺伝子とした。前記混合液で満たされた９６‐ｗｅｌｌプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ  ９６  Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を用いて下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化およびｃＤＮＡの二次構造を除去した後、９４℃で３０秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の４つの過程を４２回繰り返して行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了した後、それぞれ取得した標的遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値は、ＲＰＬ１３Ａ遺伝子により補正された標的遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列のｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群とし、△Ｃｔ値の差を求めた。
【０１３２】
前記△Ｃｔ値と計算式２（‐△Ｃｔ）×１００を用いてアンフィレグリン（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号３１〜１３０の配列をセンス鎖として有する）が処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量した（図４）。
【０１３３】
また、ストラティフィン（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号２３１〜３３０の配列をセンス鎖として有する）が処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量した（図５）。
【０１３４】
その結果、本発明の１ｎＭの濃度で５０％以上の発現阻害を表すヒトアンフィレグリン２６種及びヒトストラティフィン４７種のｓｉＲＮＡは高い標的遺伝子の発現阻害を表すことが確認できた（図６および図７参照）。
【０１３５】
実施例８：ヒト肺腫瘍細胞（Ａ５４９）細胞株で高効率のヒトに対するアンフィレグリンおよびストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡ選別
実施例７‐５で選定された配列をセンス鎖として有する２６種のヒトアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡおよび４７種のヒトストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡを用いてヒト肺腫瘍細胞（Ａ５４９）を形質転換させ、前記形質転換された肺腫瘍細胞（Ａ５４９）細胞株で標的遺伝子の発現プロファイルを分析し、高効率のｓｉＲＮＡを選別した。
【０１３６】
８‐１：ヒト肺腫瘍細胞株の培養
アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から手に入れたヒト肺腫瘍細胞（Ａ５４９）細胞株は実施例７‐１と同一の条件で培養した。
【０１３７】
８‐２：ヒト肺腫瘍細胞株への標的ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
実施例８‐１で培養された１．２×１０５肺腫瘍細胞（Ａ５４９）細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で６‐ｗｅｌｌプレートで１８時間ＤＭＥＭ培地で培養した後、培地を除去した後、各ウェル（ｗｅｌｌ）当たり５００μｌのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）を分注した。
【０１３８】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）３．５μｌとＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地２４６．５μｌを混合して混合液を製造し、室温で５分間反応させた後、前記実施例７‐５で選別したヒトアンフィレグリン２６種およびヒトストラティフィン４７種の配列をセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）０．２μｌをＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地２３０μｌに添加し、最終濃度が０．２ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で１５分間反応させてトランスフェクション用溶液を製造した。
【０１３９】
次に、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェル（ｗｅｌｌ）にトランスフェクション用溶液をそれぞれ５００μｌずつ分注し、６時間培養した後、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭ培地を除去した。これにＲＰＭＩ  １６４０培養培地１ｍｌずつ分注した後、２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１４０】
８‐３：標的遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
実施例８‐２でトランスフェクトされた細胞株から実施例４‐３と同一の方法で全体のＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いて標的遺伝子のｍＲＮＡの発現量を相対定量した。
【０１４１】
８‐４：トランスフェクトされた細胞からのＲＮＡの分離およびｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を用いて、実施例８‐２でトランスフェクトされた細胞株から全体のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０、ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌのエッペンチューブに満たされいるＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０（ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）にチューブ１本当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅装置（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズして、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９０℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【０１４２】
８‐５：標的遺伝子ｍＲＮＡの相対定量分析
実施例８‐４で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲにより呼吸器疾患関連遺伝子ｍＲＮＡの相対的な量を下記のような方法で定量した。９６‐ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに実施例８‐４で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ３μｌと２ＸＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、ｑＰＣＲプライマー（アンフィレグリン遺伝子、配列番号３３８および３３９；ストラティフィン遺伝子、配列番号３４２および３４３；表２；Ｆ、Ｒそれぞれ１０ｐｍｏｌｅ／μｌ；ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を３μｌ入れて混合液を作製した。一方、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子であるＲＰＬ１３Ａを標準遺伝子とした。前記混合液で満たされた９６‐ｗｅｌｌプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ  ９６  Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を用いて下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化およびｃＤＮＡの二次構造を除去した後、９４℃で３０秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の４つの過程を４２回繰り返して行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了した後、それぞれ取得した標的遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値はＲＰＬ１３Ａ遺伝子により補正された標的遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列であるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群とし、△Ｃｔ値の差を求めた。
【０１４３】
前記△Ｃｔ値と計算式２（‐△Ｃｔ）×１００を用いてアンフィレグリン（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡが処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量した（図６）。
【０１４４】
また、ストラティフィン（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡが処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量した（図７）。
【０１４５】
その結果、７種の高効率のヒトアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号５９、７５、７９、８０、９１、９２または１０２）の場合に、本発明の０．２ｎＭの濃度でヒトアンフィレグリンの発現が７０％以上阻害され、８種の高効率のヒトストラティフィン特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号２４１、２４８、２５７、２５８、２６３、２６８、２９０または３２７）の場合に、本発明の０．２ｎＭの濃度でヒトストラティフィンの発現が６０％以上阻害された。したがって、これらのｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を効率よく阻害することを確認することができた。
【０１４６】
実施例９：ＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子を用いた腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制
実施例８‐５で選定されたヒトアンフィレグリン３種の配列（７９、８０、９１）およびヒトストラティフィン５種の配列（２４８、２５７、２６８、２９０、３２７）をセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを用いて、前記実施例３‐１で製造したＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子でヒト肺腫瘍細胞（Ａ５４９）を形質転換させ、形質転換された肺腫瘍細胞（Ａ５４９）細胞株で標的遺伝子の発現プロファイルを分析した。
【０１４７】
９‐１：ヒト肺腫瘍細胞株の培養
アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から手に入れたヒト肺腫瘍細胞（Ａ５４９）細胞株は、実施例７‐１と同一の条件で培養した。
【０１４８】
９‐２：ＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子を用いたヒト肺腫瘍細胞株の形質転換
前記実施例９‐１で培養された０．８×１０５ヒト肺腫瘍細胞（Ａ５４９）細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で１２‐ウェル（ｗｅｌｌ）プレートで１８時間ＤＭＥＭ培地で培養した。実施例３‐１で製造されたアンフィレグリン配列７９、８０、９１およびストラティフィン配列２４８、２５７、２６８、２９０、３２７を有するＳＡＭｉＲＮＡを５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭのトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）用溶液に作製するために、１３．３μｌ、２６．６μｌ、５３．２μｌ、１３３．０μｌのＳＡＭｉＲＮＡと９８６．７μｌ、９７３．４μｌ、９７６．８μｌ、８６７．０μｌのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）をそれぞれ混合して１ｍｌを製造した。細胞培養液を除去した後、各ウェル（ｗｅｌｌ）当たり１ｍｌのトランスフェクション溶液を処理し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件で培養した。トランスフェクションは、毎１２時間ごとに新たな溶液に交替され、総４８時間４回繰り返して行った。
【０１４９】
９‐３：標的遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
実施例９‐２でトランスフェクトされた細胞株から実施例４‐３と同一の方法で全体のＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いて標的遺伝子のｍＲＮＡの発現量を相対定量した。
【０１５０】
９‐４：トランスフェクトされた細胞からのＲＮＡの分離およびｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を用いて、実施例９‐２でトランスフェクトされた細胞株から全体のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０、ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌのエッペンチューブに満たされいるＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０（ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）にチューブ１本当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅装置（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズし、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９０℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【０１５１】
９‐５：標的遺伝子ｍＲＮＡの相対定量分析
実施例９‐４で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲにより呼吸器疾患関連遺伝子ｍＲＮＡの相対的な量を下記のような方法で定量した。９６‐ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに実施例９‐４で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、ｑＰＣＲプライマー（アンフィレグリン遺伝子、配列番号３３８および３３９；ストラティフィン遺伝子、配列番号３４２および３４３（表２）；Ｆ、Ｒそれぞれ１０ｐｍｏｌｅ／μｌ；ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を３μｌ入れて混合液を作製した。一方、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子であるＲＰＬ１３Ａを標準遺伝子とした。前記混合液で満たされた９６‐ｗｅｌｌプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ  ９６  Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を用いて下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化およびｃＤＮＡの二次構造を除去した後、９４℃で３０秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の４つの過程を４２回繰り返して行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了した後、それぞれ取得した標的遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値は、ＲＰＬ１３Ａ遺伝子により補正された標的遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列であるＳＡＭｉＲＮＡ‐ＣＯＮＴ（ｓｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群とし、ΔＣｔ値の差を求めた。
【０１５２】
前記ΔＣｔ値と計算式２（‐ΔＣｔ）×１００を用いてアンフィレグリン（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ＳＡＭｉＲＮＡが処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量した（図８）。
【０１５３】
また、ストラティフィン（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ＳＡＭｉＲＮＡが処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量した（図９）。
【０１５４】
その結果、ＳＡＭｉＲＮＡ‐ｈＡＲ＃８０とＳＡＭｉＲＮＡ‐ｈＳＦＮ＃２４８、＃２９０によるヒト肺腫瘍細胞株（Ａ５４９）の標的遺伝子の発現は、それぞれ５００ｎＭあるいは２００ｎＭ処理の際に７０％阻害されることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明によるｓｉＲＮＡは、呼吸器疾患関連遺伝子、特に、アンフィレグリンまたはストラティフィンの発現を非常に効率よく阻害することができ、本発明によるｓｉＲＮＡ、これを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、および前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子は、線維症または呼吸器疾患の予防または治療に有用に使用することができる。
【０１５６】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとってかかる具体的技術は、単に好ましい実施態様であって、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
0006426268.tif 000017
【図２】
0006426268.tif 000018
【図３】
0006426268.tif 000019
【図４】
0006426268.tif 000020
【図５】
0006426268.tif 000021
【図６】
0006426268.tif 000022
【図７】
0006426268.tif 000023
【図８】
0006426268.tif 000024
【図９】
0006426268.tif 000025
【配列表】
0006426268000001.app