(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数の植物細胞を含む植物であって、内因性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子のヌクレオチド配列が、前記１つ又は複数の細胞を表１Ｂ（配列番号３〜１０）に示す標的部位に結合する１つ又は複数の亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするベクターで形質転換することにより突然変異されており、発現されたＭＤＨタンパク質の活性が前記ＭＤＨタンパク質の野生型の活性と比較して低下し、前記植物からの作物収量が増加するように突然変異されている、１つ又は複数の植物細胞を含む植物。
【請求項２】
前記内因性ＭＤＨ遺伝子がミトコンドリアＭＤＨ遺伝子（ｍＭＤＨ）である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記突然変異が、ＭＤＨ遺伝子の１つ又は複数のＮＡＤＨ結合ドメインにある、請求項１又は請求項２に記載の植物。
【請求項４】
前記突然変異が、前記植物において配列番号１のアミノ酸残基１０４〜１３６及び／若しくは１７１〜２２０内にある、請求項１から３のいずれか一項に記載の植物。
【請求項５】
ＭＤＨの１つ又は複数の対立遺伝子が突然変異されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の植物。
【請求項６】
１つ又は複数の改変植物細胞を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の植物の植物部位。
【請求項７】
葉、茎、根、花、種子又は果実である、請求項６に記載の植物部位。
【請求項８】
前記植物がトマト、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ及びアルファルファからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の植物。
【請求項９】
前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼが、フィンガー１からフィンガー５まで又はフィンガー１からフィンガー６まで順序付けられた５つ又は６つの亜鉛フィンガードメインを含み、各亜鉛フィンガードメインが認識らせん領域を含み、前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼが表１Ａの１つの横列に順序付けられ、示されている前記認識らせん領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１０】
前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼが非古典的亜鉛フィンガードメインを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１１】
ＭＤＨ遺伝子が植物細胞中で改変されるように１つ又は複数の亜鉛フィンガーヌクレアーゼを前記植物細胞に導入するステップを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の植物を生産する方法。
【請求項１２】
前記植物細胞中でそれぞれが亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質の対を発現させるステップを含み、前記融合タンパク質の対が二量体化し、ＭＤＨタンパク質活性が低下するようにＭＤＨを切断する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
外因性核酸配列を前記細胞に導入するステップをさらに含み、前記外因性配列が前記ＭＤＨ遺伝子に組み込まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記突然変異が１つ又は複数のＮＡＤＨ結合ドメインにおける突然変異を含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＤＨタンパク質活性の低下が、光合成の増加、前記植物細胞内のクエン酸回路の改変、前記植物細胞中のリンゴ酸のより高いレベル、前記細胞中のＯＡＡレベルの低下及び／又は果実収量の増加をもたらす、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の植物又は請求項６若しくは請求項７に記載の種子を植えるステップを含む、作物収量を増加させる方法であって、前記植物がトマト、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、及びアルファルファからなる群から選択される、方法。
【請求項１７】
前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼが、フィンガー１からフィンガー５まで又はフィンガー１からフィンガー６まで順序付けられた５つ又は６つの亜鉛フィンガードメインを含み、各亜鉛フィンガードメインが認識らせん領域を含み、前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼが表１Ａの１つの横列に順序づけられ、示されている前記認識らせん領域を含む、請求項６又は７に記載の植物部位。
【請求項１８】
前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼが、非古典的亜鉛フィンガードメインを含む、請求項６又は７に記載の植物部位。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それらの開示がそれらの全体として参照により組み込まれる、２０１２年５月２日に出願した米国特許仮出願第６１／６４１，７７６号及び２０１３年３月１３日に出願した米国特許仮出願第６１／７８０，５１２号の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究のもとになされた発明に対する権利に関する陳述
該当せず。
【０００３】
本開示は、ゲノム工学、特に、内因性植物リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子の発現変化及び／又は標的改変の分野に属する。
【背景技術】
【０００４】
バイオテクノロジーは、食糧生産の全世界的規模の需要が増加するという課題に対処する取り組みにおける必須の手段として出現した。農業の生産性の改善、例えば、収量の増大又は遺伝子組換えによる病虫害抵抗性への従来のアプローチは、突然変異育種又は形質転換による作物種のゲノムへの新規遺伝子の導入に依拠している。両方法は、本質的に非特異的であり、比較的に非効率的である。例えば、従来の植物形質転換法は、ランダム配置でゲノムに組み込まれる外因性ＤＮＡをもたらす。したがって、所望の属性を有する遺伝子導入系を同定し、単離するために、何千もの固有のランダム組込み事象を発生させ、その後、所望の事象についてスクリーニングすることが必要である。結果として、従来の植物形質エンジニアリングは、骨が折れ、多大な時間を要し、予測不可能な取り組みである。さらに、これらの組込みのランダム性のため、意図しないゲノムの崩壊に起因する多面的効果が発生したかどうかを予測することが困難となる。結果として、遺伝子組み換えによる導入遺伝子又は形質を有する植物系の作製、単離及び特徴付けは、極めて労働及び費用集約的で、成功の確率が低い過程であった。
【０００５】
標的遺伝子改変は、植物システムにおける従来の慣行の物流上の課題（logistical challenge）を克服しており、したがって、長年にわたるものであるが、基礎植物生物学研究及び農業バイオテクノロジーにおけるわかりにくい目標であった。しかし、イネにおけるポジティブ−ネガティブ（positive-negative）薬物選択による「標的遺伝子組換え」又は事前に工学改変された（pre-engineered）制限部位の使用を除いて、すべての植物種（モデル及び作物）における標的ゲノム改変は、最近まで非常に困難であることが判明していた（Teradaら(2002)、Nat Biotechnol、20巻(10号)、1030頁、Teradaら(2007)、Plant Physiol、144巻(2号)、846頁、D'Halluinら(2008)、Plant Biotechnology J.、6巻(1号)、93頁）。
【０００６】
最近、ゲノムＤＮＡの標的切断のための方法及び組成物が記載された。そのような標的切断事象は、例えば、標的突然変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的突然変異（例えば、欠失、置換及び／又は挿入）を誘導し、あらかじめ定められた染色体遺伝子座における標的組換え及び組込みを促進するために用いることができる。例えば、参照によりそれらの開示がそれらの全体としてすべての目的のために組み込まれる、Urnovら(2010)、Nature、435巻(7042号)、646〜51頁、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、第２００５０２０８４８９号、第２００５００２６１５７号、第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号、第２００９０２６３９００号、第２００９０１１７６１７号、第２０１０００４７８０５号、第２０１１０２０７２２１号、第２０１１０３０１０７３号、第２０１１０８９７７５号及び国際公開第２００７／０１４２７５号を参照のこと。切断は、遺伝子工学的改変亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼなどの特定のヌクレアーゼを用いることにより、又は特異的切断を導くための遺伝子工学的改変ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いることにより起こりうる。米国特許出願公開第２００８０１８２３３２号は、植物ゲノムの標的改変のための非古典的亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用を記載しており、米国特許出願公開第２００９０２０５０８３号は、植物ＥＰＳＰＳ遺伝子座のＺＦＮ媒介性標的改変を記載しており、米国特許出願公開第２０１００１９９３８９号は、植物Ｚｐ１５遺伝子座の標的改変を記載しており、米国特許出願公開第２０１１０１６７５２１号は、脂肪酸生合成に関与する植物遺伝子の標的改変を記載している。さらに、Moehleら(2007)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、104巻(9号)、3055〜3060頁は、特定の遺伝子座における標的遺伝子付加のために設計されたＺＦＮを用いることを記載している。
【０００７】
炭素消化作用は、すべての生命体の代謝機能の中心となるものである。ＡＴＰを合成し、そのエネルギーを恒常性、成長及び繁殖のために利用する能力は、生物界全体にわたって保存され、公知の生物学的過程の大部分に影響を及ぼす。真核生物におけるＡＴＰ合成の基本的な構成要素は、有機酸から酸化レドックス補因子ＮＡＤ＋及びＦＡＤに電子を移動させて、ＮＡＤＨ、ＦＡＤＨ２及び二酸化炭素を形成させる、クエン酸又はクレブス回路としても公知であるトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路である。ＴＣＡ回路は、ミトコンドリア内で生じ、植物において、その反応中に生成した中間体は、多くの生合成経路の基質としての役割を果たし、アスパラギン酸、グルタミン酸、核酸、ポルフィリン及び脂肪酸の産生のための主要なインプットは、ＴＣＡ回路に由来する。さらに、ＴＣＡ回路の中間体は、光呼吸及び光合成のエネルギー過程において重要な役割を果たす。したがって、ＴＣＡ回路は、葉緑体、ミトコンドリア及び細胞質ゾルレドックス機能間の連結としての役割を果たすと考えられる。
【０００８】
リンゴ酸は、ＴＣＡ回路の中間体の１つであり、ピルビン酸を生成させるリンゴ酸酵素及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）の両方の基質としての役割を果たす。ＭＤＨは、ＮＡＤＨを介してオキサロ酢酸（ＯＡＡ）のリンゴ酸への可逆性還元を触媒し、リンゴ酸／アスパラギン酸シャトルに関与する。ほとんどの植物は、核遺伝子によりコードされる、ミトコンドリア及び細胞質ゾル酵素を含むＭＤＨの複数のイソ型を含む。植物ミトコンドリアＭＤＨ（ｍＭＤＨ）は、次の３種類の反応に関与する：リンゴ酸のＯＡＡへの変換、ＯＡＡのリンゴ酸への還元及びＯＡＡのＣ４経路還元。トウモロコシ（Ｃ４草）において、５つの独立した染色体上の５つの異なるＭＤＨ遺伝子座が存在し、それらのうちの２つは、細胞質ゾルイソ型をコードするが、他の３つは、ミトコンドリア酵素をコードする。古典的変異体解析を用いて、ＭＤＨの２つの細胞質ゾル型の機能の完全な喪失が植物の成長及び繁殖に有害な影響を有さなかったことが示され、細胞質ゾル機能が欠失可能であると思われた。対照的に、３つのミトコンドリア酵素の完全な喪失は、致死性をもたらしたことから、植物は、生存するために少なくとも１つの機能性対立遺伝子を必要とした（Goodmanら(1981)、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、78巻、1783〜1785頁）。同様に、ダイズにおけるミトコンドリアＭＤＨ−１（Ｍｄｈ１−ｎ）の天然に存在する自然ヌル対立遺伝子の観察により、ミトコンドリアＭｄｈ２遺伝子が安定なままである限り、明らかな植物表現型は存在しなかったことが示された（Imsandeら(2001)、J. Heredity、92巻、333〜338頁）。
【０００９】
植物代謝における基本的な役割があるにもかかわらず、ＴＣＡ回路におけるリンゴ酸の機能は、依然として完全には理解されていない。ＭＤＨ突然変異植物は、より遅い成長速度及び光呼吸特性の変化を示す。例えば、Tomazら(2010)、Plant Physiol.、154巻(3号)、1143〜1157頁を参照のこと。全植物体又は果実におけるアンチセンス及びＲＮＡｉ試験で、植物が乾燥（新鮮でない）果実重量の増加を有すること、並びに植物が野生型対照よりも葉における高いアスコルビン酸レベルを有するが、短い昼間条件（光呼吸に有利である）下で生育させた場合、植物が矮性表現型を示し、葉、幹及び根におけるバイオマスの減少を有していたことなどの相反する結果が示された（Nunes-Nesiら(2005)、Plant Physiol.、137巻、611〜622頁、Nunes-Nesiら(2007)、Physiol. Plant、129巻、45〜56頁、Nunes-Nesi (2008)、J. Exp. Bot.、59巻、1675〜1684頁、Finkmeier及びSweetlove (2009)、F1000 Biology Reports I:47、doi:10.3410/B1-47）。さらに、ｍＭＤＨ発現の低下を有するｍＭＤＨアンチセンス系は、根面積の低下及び根成長の阻害をもたらした、この酵素の活性の低下（野生型の３９％）を示した（Van der Merweら(2009)、Plant Physiol.、149巻、653〜669頁、Van der Merweら(2010)、Plant Physiol.、153巻、611〜621頁）。さらに、ｍＭＤＨアンチセンス系は、果実の乾燥の増大（より多くのＨ２Ｏの喪失）及び真菌感染への感受性の増大を示した（Centenoら(2011)、Plant Cell、23巻、162〜184頁）。米国特許出願公開第２００９０１２３６２６号は、アスパラギンレベルを低下させ、ひいては植物及び植物産物の加工に関連する加熱により蓄積するアクリルアミドのレベルを低下させるＭＤＨ  ＲＮＡｉの使用を記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、植物及びその子孫における安定な遺伝性の遺伝子改変を確立するための植物における、例えば、ＭＤＨ遺伝子の標的ゲノム改変により、ＭＤＨ遺伝子の発現を変化させるための組成物及び方法が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下を提供する。
［１］内因性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子が、発現されたＭＤＨタンパク質の活性が改変され、植物からの作物収量が増加するように改変されている、１つ又は複数の植物細胞を含む植物。
［２］上記内因性ＭＤＨ遺伝子がミトコンドリアＭＤＨ遺伝子（ｍＭＤＨ）である、上記［１］に記載の植物。
［３］上記改変が、ＭＤＨ遺伝子の１つ又は複数のＮＡＤＨ結合ドメインにおける突然変異を含む、上記［１］又は上記［２］に記載の植物。
［４］上記突然変異が、配列番号１のアミノ酸残基１０４〜１３６及び／若しくは１７１〜２２０内に、又は異なる植物種における同等に番号付けされアライメントされた領域内にある、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の植物。
［５］ＭＤＨの１つ又は複数の対立遺伝子が改変されている、上記［１］から［４］のいずれか一項に記載の植物。
［６］１つ又は複数の改変植物細胞を含む、上記［１］から［５］のいずれか一項に記載の植物の植物部位。
［７］
葉、茎、根、花、種子又は果実である、上記［６］に記載の植物部位。
［８］上記植物がトマト、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ及びアルファルファからなる群から選択される、上記［１］から［５］のいずれか一項に記載の植物又は上記［６］若しくは上記［７］に記載の植物部位。
［９］上記改変が、ＤＮＡ結合ドメイン及び機能的ドメインを含む融合タンパク質を用いて行われる、上記［１］から［５］のいずれか一項に記載の植物又は上記［６］若しくは上記［７］に記載の植物部位。
［１０］上記融合タンパク質が亜鉛フィンガーヌクレアーゼである、上記［９］に記載の植物又は植物部位。
［１１］上記亜鉛フィンガーヌクレアーゼが、フィンガー１からフィンガー５まで又はフィンガー１からフィンガー６まで順序付けられた５つ又は６つの亜鉛フィンガードメインを含み、各亜鉛フィンガードメインが認識らせん領域を含み、上記亜鉛フィンガーヌクレアーゼが表１Ａの１つの横列に順序付けられ、示されている上記認識らせん領域を含む、上記［１０］に記載の植物又は植物部位。
［１２］上記亜鉛フィンガーヌクレアーゼが非古典的亜鉛フィンガードメインを含む、上記［１０］又は上記［１１］に記載の植物又は植物部位。
［１３］上記融合タンパク質がポリヌクレオチドとして上記植物細胞に導入されている、上記［９］から［１３］のいずれか一項に記載の植物又は植物部位。
［１４］ＭＤＨ遺伝子が植物細胞中で改変されるように１つ又は複数の亜鉛フィンガーヌクレアーゼを上記植物細胞に導入するステップを含む、上記［１］から［５］のいずれか一項に記載の植物を生産する方法。
［１５］上記植物細胞中でそれぞれが亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質の対を発現させるステップを含み、上記融合タンパク質の対が二量体化し、ＭＤＨタンパク質活性が低下するようにＭＤＨを切断する、上記［１４］に記載の方法。
［１６］外因性核酸配列を細胞に導入するステップをさらに含み、上記外因性配列が上記ＭＤＨ遺伝子に組み込まれる、上記［１５］に記載の方法。
［１７］上記改変が１つ又は複数のＮＡＤＨ結合ドメインにおける突然変異を含む、上記［１４］から［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］上記ＭＤＨタンパク質活性の変化が、光合成の増加、上記植物細胞内のクエン酸回路の改変、上記植物細胞中のリンゴ酸のより高いレベル、上記細胞中のＯＡＡレベルの低下及び／又は果実収量の増加をもたらす、上記［１４］から［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］上記［１］から［５］のいずれか一項に記載の植物又は上記［６］若しくは上記［７］に記載の植物部位を植えるステップを含む、作物収量を増加させる方法。
［２０］上記植物がトマト、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ及びアルファルファからなる群から選択される、上記［１９］に記載の方法。
本開示は、ＭＤＨにおける１つ又は複数の標的突然変異を含む、ＭＤＨ遺伝子（単数又は複数）並びに細胞（例えば、種子）、細胞系、生物（例えば、植物）等の標的改変のための方法及び組成物を提供する。ＭＤＨ遺伝子は、例えば、ミトコンドリアＭＤＨ遺伝子（ｍＭＤＨ）であり得る。上記のように、アンチセンス及びＲＮＡ干渉技術によるＭＤＨ酵素機能の低下を示す試験は、例えば、果実収量に対するＭＤＨ阻害の影響（単数又は複数）に関する相反する結果をもたらしている。これらの試験に基づいて、ＴＣＡ回路フラックスの抑制が光合成に対する負の影響を有すると予想されよう。したがって、ＭＤＨ機能（活性）を低下させるＭＤＨにおける標的突然変異を含む植物（及び植物細胞）がＭＤＨ改変細胞を含む植物からの作物収量の増加をもたらすことを本発明者らが示したことは、驚くべきことであり、且つ予期しないことである。収量の増加は、例えば、果実収量の増加、植物（若しくは植物の果実）のバイオマスの増加、果肉のより高い含量、より大きな植物体、乾燥重量の増加、固形分含量の増加、収穫時のより高い総重量、作物の色の強さ及び／又は均一性の増大、化学物質（例えば、油、脂肪酸、炭水化物、タンパク質）の特性の変化、等を含みうる。
【００１２】
したがって、１つの態様において、本明細書で開示するのは、内因性ＭＤＨ遺伝子の発現が、ＭＤＨの発現が減少するように改変されており、植物が作物収量の増加を示す植物細胞を含む植物である。特定の実施形態において、内因性ＭＤＨ遺伝子の発現は、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、亜鉛フィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクタードメイン）及び機能ドメインを含む融合タンパク質を用いて変化させる。特定の実施形態において、該植物細胞は、ＭＤＨ遺伝子（例えば、ｍＭＤＨ）の標的改変を含み、ＭＤＨの発現を減少させる標的改変は、ヌクレアーゼ、例えば、内因性遺伝子を切断し、その発現を減少させるＤＮＡ結合ドメイン及び機能ドメイン（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ）を含む融合タンパク質によってもたらされる。改変（例えば、欠失、置換及び／又は挿入）は、例えば、ＭＤＨ遺伝子のＮＡＤＨ結合領域（例えば、遺伝子の第１及び／又は第２のＮＡＤＨ結合領域）における１つ又は複数のアミノ酸の改変であり得る。特定の実施形態において、改変は、植物細胞における内因性ＭＤＨ遺伝子の第１及び／又は第２のＮＡＤＨ結合領域における１つ又は複数のアミノ酸、例えば、野生型ＭＤＨアミノ酸配列（例えば、配列番号１（野生型トマトＭＤＨ配列）、配列番号１２６（野生型トウモロコシＭＤＨ配列）及び／又は配列番号１２５（野生型ダイズＭＤＨ配列））に対して番号付けし、アライメントした（例えば、図１０）、１０４〜１３６及び／又は１７１〜２２０位における１つ又は複数のアミノ酸を変化させることを含む。
【００１３】
亜鉛フィンガータンパク質は、表１Ａの１つの横列に示す認識らせん領域を含み、且つ／又は表１Ｂに示す標的配列に結合しうる。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクタードメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼ及び／又はＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ単一ガイドＲＮＡを含む。ＭＤＨ発現の標的改変（例えば、標的ゲノム改変）は、ＭＤＨ活性を増大又は低下させ、例えば、遺伝子産物の異常な転写をもたらす突然変異を作出する（例えば、フレームシフト、新規停止コドン又は他の突然変異により）ことによりＭＤＨ活性を低下させる可能性がある。特定の実施形態において、ヌクレアーゼを用いる標的改変は、インデル、例えば、表４に示すようなインデルとしても公知の小挿入及び／又は欠失を含む。細胞における改変は、１つ又は複数の対立遺伝子の改変であり得る（例えば、パラロガス遺伝子における同型接合体、異型接合体）。本明細書で述べる植物細胞のいずれも、植物又は植物の一部（例えば、種子、花、果実）、例えば、トマト（例えば、Ｍ８２若しくはＭｏｎｅｙｍａｋｅｒ）、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、アルファルファなどの変種内に存在しうる。
【００１４】
他の態様において、本明細書で述べるのは、ＭＤＨ遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ））である。亜鉛フィンガータンパク質は、１つ又は複数の亜鉛フィンガー（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はそれ以上の亜鉛フィンガー）を含んでいてよく、いずれかのＭＤＨ遺伝子内の配列に結合するように遺伝子工学的に改変することができる。本明細書で述べる亜鉛フィンガータンパク質のいずれも、ＭＤＨ発現の改変が達成される限り、ＭＤＨのコーディング配列内又は隣接配列（例えば、プロモーター若しくは他の発現エレメント）内の標的部位に結合し得る。特定の実施形態において、亜鉛フィンガータンパク質は、ｍＭＤＨ遺伝子における標的部位、例えば、表１Ｂに示す標的配列に結合する。他の実施形態において、成分亜鉛フィンガーの認識らせん領域を、表１Ａの１つの横列に示すようにフィンガー１からフィンガー５（Ｆ１〜Ｆ５）に又はフィンガー１からフィンガー６（Ｆ１〜Ｆ６）に順序付ける。亜鉛フィンガータンパク質の１つ又は複数の成分亜鉛フィンガー結合ドメインは、古典的（Ｃ２Ｈ２）亜鉛フィンガー又は非古典的（例えば、Ｃ３Ｈ）亜鉛フィンガーであり得る（例えば、Ｎ末端及び／又はＣ末端亜鉛フィンガーは、非古典的フィンガーであり得る）。
【００１５】
他の態様において、本明細書で開示するのは、融合タンパク質であり、各融合タンパク質は、１つ又は複数のＭＤＨ遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、亜鉛フィンガータンパク質）を含む。特定の実施形態において、タンパク質は、ＭＤＨ結合亜鉛フィンガータンパク質及び機能ドメイン、例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン及び／又は切断ドメイン（若しくは切断半ドメイン）を含む融合タンパク質である。特定の実施形態において、融合タンパク質は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。切断ドメイン及び切断半ドメインは、例えば、様々な制限エンドヌクレアーゼ及び／又はホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。１つの実施形態において、切断半ドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。
【００１６】
他の態様において、本明細書で提供するのは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、亜鉛フィンガータンパク質）及び／又は本明細書で述べる融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドである。特定の実施形態において、本明細書で述べるのは、プロモーターに作動可能に連結した、本明細書で述べる１つ又は複数のＺＦＰをコードするポリヌクレオチドを含むＺＦＰ発現ベクターである。１つの実施形態において、１つ又は複数のＺＦＰは、ＺＦＮである。
【００１７】
ＺＦＰ及びこれらのＺＦＰを含む融合タンパク質は、遺伝子のコーディング領域内、或いは例えば、リーダー配列、トレーラー配列若しくはイントロン、又はプロモーター配列などの遺伝子内又は遺伝子に隣接する非コーディング配列における、或いはコーディング領域の上流又は下流の非転写領域内の１つ又は複数のＭＤＨ遺伝子（例えば、ｍＭＤＨ遺伝子）に結合し、且つ／又は切断しうる。特定の実施形態において、ＺＦＰ又はＺＦＮは、ＭＤＨ遺伝子のコーディング配列若しくは調節配列に結合し、且つ／又は切断する。
【００１８】
他の態様において、本明細書で述べるのは、本明細書で述べる１つ又は複数のタンパク質、融合タンパク質及び／又はポリヌクレオチドを含む組成物である。植物細胞は、１つの固有のＭＤＨ遺伝子標的又は複数のパラロガスＭＤＨ標的を含み得る。したがって、本明細書で述べる組成物は、植物細胞における１つ又は複数のＭＤＨ遺伝子を標的とする１つ又は複数のＺＦＰ含有タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）を含みうる。ＺＦＰは、植物細胞におけるすべてのパラロガス若しくは相同遺伝子及び選択される特定のパラロガス若しくは相同遺伝子又はいくつかのパラロガス及びいくつかの相同遺伝子の組合せを標的としうる。
【００１９】
他の態様において、本明細書で提供するのは、植物細胞における１つ又は複数のＭＤＨ遺伝子（例えば、内因性ｍＭＤＨ遺伝子）の発現を変化させる方法であり、方法は、ＭＤＨの発現が変化するように細胞中の１つ又は複数のＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質（例えば、亜鉛フィンガータンパク質）を発現させることを含む。特定の実施形態において、方法は、ＭＤＨの発現を妨げる小挿入及び／又は欠失（「インデル」）を創るために亜鉛フィンガーヌクレアーゼの対（タンパク質及び／又はタンパク質をコードするポリヌクレオチド）を用いることを含む。他の実施形態において、方法は、例えば、導入遺伝子又は発現促進エレメントの標的挿入により、ＭＤＨの発現を促進するために亜鉛フィンガーヌクレアーゼの対を用いることを含む。他の実施形態において、ＭＤＨの発現を変化させる方法は、１つ又は複数の亜鉛フィンガー転写因子（ＭＤＨ結合亜鉛フィンガータンパク質及び活性化又は抑制ドメインなどの転写調節ドメインである機能ドメインを含む融合タンパク質）を用いることを含む。特定の実施形態において、ＭＤＨの発現／機能の変化は、植物細胞内の光合成の増加をもたらす。特定の実施形態において、ＭＤＨの発現／機能の変化は、植物細胞内のクエン酸回路の改変をもたらす。特定の実施形態において、ＭＤＨの発現／機能の変化は、植物細胞中のリンゴ酸のより高いレベルをもたらす。他の実施形態において、ＭＤＨの発現／機能の変化は、細胞中のＯＡＡレベルの低下をもたらす。１つの実施形態において、植物細胞におけるＭＤＨの発現／機能の変化は、植物の収量の増加をもたらす。特定の実施形態において、収量の増加は、突然変異植物の最初のトラスから得られた各果実のより大きい新鮮重量及び収穫されたすべての果実のより大きい総新鮮重量をもたらす。
【００２０】
他の態様において、本明細書で提供するのは、ＭＤＨ遺伝子の発現の変化及びその改変を検出するため且つ／又は測定するための、核酸及び抗体、並びにそれを用いる方法である。
【００２１】
他の態様において、本明細書で述べるのは、細胞中の１つ又は複数のＭＤＨ遺伝子を改変する方法である。特定の実施形態において、方法は、（ａ）タンパク質形の１つ若しくは複数のヌクレアーゼ及び／又はヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ（単数又は複数））が発現し、１つ若しくは複数のＭＤＨ遺伝子が切断され、それにより、１つ若しくは複数のＭＤＨ遺伝子を改変するような条件下で１つ若しくは複数のＭＤＨ遺伝子における標的部位に結合する１つ若しくは複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）をコードする１つ若しくは複数の発現ベクターを植物細胞に導入することを含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの標的部位は、ｍＭＤＨ遺伝子に存在する。他の実施形態において、複数のＭＤＨ遺伝子が切断される。さらに、本明細書で述べる方法のいずれかにおいて、１つ又は複数の遺伝子の切断は、例えば、ＭＤＨ活性が変化（例えば、増大又は低下）するように、切断領域におけるヌクレオチドの欠失、付加及び／又は置換をもたらしうる。
【００２２】
さらに他の態様において、本明細書で述べるのは、植物細胞中のＭＤＨ活性が変化するように外因性配列（導入遺伝子）を植物細胞のゲノムに導入する方法であり、方法は、（ａ）細胞を外因性配列（ドナーベクター）と接触させるステップと、（ｂ）細胞中の本明細書で述べた１つ又は複数のヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ）を発現させるステップとを含み、ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同的組換えによるゲノムへのドナーベクターの組込みを刺激するように、１つ又は複数のヌクレアーゼが染色体ＤＮＡを切断する。特定の実施形態において、外因性配列をＭＤＨ遺伝子内に導入する。他の実施形態において、外因性配列をＭＤＨ遺伝子の近くに導入する。ＭＤＨ活性は、増大又は低下させることができる。本明細書で述べた方法のいずれかにおいて、１つ又は複数のヌクレアーゼは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと遺伝子組換え亜鉛フィンガー結合ドメインとの間の融合であり得る。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、改変ＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼを含む。本明細書で述べた方法のいずれかにおいて、外因性配列は、タンパク質産物をコードしうる。
【００２３】
さらなる態様において、本明細書で述べた方法のいずれかにより得た植物細胞も提供する。
【００２４】
他の態様において、本明細書で提供するのは、本明細書で述べた植物細胞を含む植物である。
【００２５】
他の態様において、本明細書で提供するのは、本明細書で述べたように得られる植物細胞を含む植物からの種子である。
【００２６】
他の態様において、本明細書で提供するのは、本明細書で述べたように得られる植物細胞を含む植物から得られる果実である。
【００２７】
本明細書で述べた組成物（細胞若しくは植物）又は方法のいずれかにおいて、植物細胞は、単子葉又は双子葉植物細胞を含みうる。特定の実施形態において、植物細胞は、作物植物、例えば、トマト（又は他の果実作物）、ジャガイモ、トウモロコシ、ダイズ、アルファルファ等である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】トマト（Solanum lyocpersicum）（ｖ．Ｍ８２）のミトコンドリアＭＤＨ（ｍＭＤＨ）遺伝子の様々な構造エレメントを示す概略図である。
【図２】（パネルＡ及びＢ）トマトミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍＭＤＨ）遺伝子のゲノム構成及び配列を示す図である。図２Ａにエクソン１、３、４及び６におけるＺＦＮ（エクソンの上の短い左及び右向矢印）の標的部位（エクソンの上の短い左及び右向矢印）を示す。図２Ａの標識ＺＦＮ結合配列番号は、表１に記載するＺＦＮ番号と一致し、表１における１０７８３０Ｌが図２Ａに８３０Ｌと記載され、表１における１０７８３０Ｒが図２Ａに８３０Ｒと記載され、表１における１０７８３２Ｌが図２Ａに８３２Ｌと記載され、表１における１０７８３２Ｒが図２Ａに８３２Ｒと記載され、表１における１０７８３３Ｌが図２Ａに８３３Ｌと記載され、表１における１０７８３３Ｒが図２Ａに８３３Ｒと記載され、表１における１０７８３５Ｌが図２Ａに８３５Ｌと記載され、表１における１０７８３５Ｌが図２Ａに８３５Ｒと記載されている。図２Ｂ（配列番号２）にｍＭＤＨ遺伝子座の配列を示し、エクソンは、下線が引かれ、ＺＦＮ標的部位は、太字で示す。
【図３】ｐＫＧ７４７９のプラスミドマップを示す概略図である。
【図４】ｐＫＧ７４８０のプラスミドマップを示す概略図である。
【図５】ｐＫＧ７４８１のプラスミドマップを示す概略図である。
【図６】ｐＫＧ７４８２のプラスミドマップを示す概略図である。
【図７】プロトプラストにおけるＺＦＮ活性によりトマトｍＭＤＨ遺伝子において引き起こされた小挿入又は欠失（「インデル」）の配列解析を示す図である。ＺＦＮをトマトプロトプラストにおいて一時的に発現させ、ＨＲＭ解析を用いてインデルを検出した。各ＺＦＮのｍＭＤＨ標的部位を下線を引いた結合部位とともに示す。欠失（−として示す）又は挿入（太字）を含む増幅産物を各標的配列の下に示す。
【図８】（パネルＡ及びＢ）Ｆ２植物におけるｍＭＤＨ活性を示すグラフである。図８Ａは、１０７８３２＿９−６系（−３ｂｐインデル）に由来するＦ２植物におけるｍＭＤＨ活性の測定を示すグラフである。「１２６  ９−６ＷＴ」は、インデル突然変異を欠くＦ２植物の生化学的アッセイの結果を識別し、「１１５  ９−６Ｍ」は、インデル突然変異について同型接合のＦ２植物を識別し、「１３２  ９−６Ｈ」は、インデル突然変異について異型接合のＦ２植物を識別する。図８Ｂは、１０７８３２＿１０−２系（−２ｂｐインデル）に由来するＦ２植物におけるｍＭＤＨ活性の測定を示すグラフである。ＷＴ４８は、インデル突然変異を欠くＦ２植物を識別し、「Ｍ６０」は、インデル突然変異について同型接合のＦ２植物を識別し、「Ｈ３２」は、インデル突然変異について異型接合のＦ２植物を識別する。
【図９】１０７８３２＿９−６系のトマト果実収量を示すグラフである。平均トマト重量（ｇ）を、ｍＭＤＨ遺伝子座における−３ｂｐ突然変異に関して分けた３クラスのＦ２植物についてＹ軸に示す。「ＷＴ」は、インデルを欠くＦ２植物を示し、「Ｈｅｔ」は、インデルについて異型接合のＦ２植物を示し、「Ｈｏｍｏ」は、インデルについて同型接合のＦ２植物を示す。
【図１０】ダイズ（配列番号１２５）、トウモロコシ（配列番号１２６）及びトマト（配列番号１）ｍＭＤＨ酵素の配列アライメントを示す図である。
【図１１】トマトゲノムに発生するｍＭＤＨ突然変異の配列アライメントを示す図である。
【図１２】ｍＭＤＨ酵素により触媒される生化学的反応を示す概略図である。
【図１３】ＮＡＤＨ酸化について分光光度法によるモニタリングにより測定した野生型及び２つの突然変異トマトｍＭＤＨ酵素の比活性を示す表である。「ｍＭＤＨ  ｄｅｌ３」突然変異は、野生型酵素の活性の約２３％を保持しており、「ｍＭＤＨ  ｄｅｌ３  ＮＡＤＨ  ＢＳ１」突然変異の活性は、野生型酵素の約１．５％と有意に低下している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、植物細胞又は植物における１つ又は複数のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子の発現の変化、例えば、植物細胞（例えば、トウモロコシ、トマト、ダイズ等）におけるミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍＭＤＨ）遺伝子などのＭＤＨ遺伝子の標的ゲノム改変のための方法及び組成物に関する。特に、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、亜鉛フィンガータンパク質）並びに機能ドメイン（例えば、転写調節ドメイン及び／又はヌクレアーゼ）を含む融合タンパク質の使用により、ＭＤＨの発現を変化させる。特定の実施形態において、標的改変は、１つ又は複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）を用いてＭＤＨ遺伝子を切断して、ＭＤＨ遺伝子座における改変（例えば、突然変異）をもたらすことによって達成される。切断は、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬ  ＤＮＡ結合ドメイン、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓシステム又は前述のもののキメラ組合せなどのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質の使用により標的とされる。特定の実施形態において、改変は、内因性ＭＤＨ遺伝子の第１及び／又は第２のＮＡＤＨ結合領域における１つ又は複数のアミノ酸、例えば、配列番号１（野生型トマトＭＤＨ配列）、配列番号１２５（野生型トウモロコシＭＤＨ配列）及び／又は配列番号１２６（野生型ダイズＭＤＨ配列）に対して番号付けし、アライメントした、１０４〜１３６及び／又は１７１〜２２０位における１つ又は複数のアミノ酸を変化させるようなＭＤＨ遺伝子の突然変異（置換、欠失及び／又は挿入）を含む。
【００３０】
特定の実施形態において、ヌクレアーゼ（単数又は複数）は、１つ又は複数のＺＦＮを含む。ＺＦＮは、一般的に切断ドメイン（又は切断半ドメイン）及び内因性ＭＤＨ遺伝子における標的部位に結合する亜鉛フィンガー結合ドメインを含む。ＺＦＮは、タンパク質として、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、且つ／又はポリペプチドとポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの組合せとして導入することができる。亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、一般的に切断半ドメインの二量体化の後に二量体タンパク質として機能し、ホモ二量体及び／又はヘテロ二量体を形成しうる。「左」及び「右」認識ドメインに結合するＺＦＮ単量体が会合して活性ヌクレアーゼを形成しうる、必須のヘテロ二量体ＺＦＮが記載された。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号を参照のこと。したがって、適切な標的部位があるとすると、「左」単量体が「右」単量体とともに活性ＺＦヌクレアーゼを形成しうる。これによって、様々な組合せで用いることができる立証された左及び右ドメインに基づく有用なヌクレアーゼ部位の数が著しく増加する。例えば、４つのホモ二量体ＺＦヌクレアーゼの結合部位を再結合させることにより、さらなる１２のヘテロ二量体ヌクレアーゼが得られる。より重要なことに、それは、すべての新たな導入外因性配列（導入遺伝子）が、遺伝子を削除するために又はそれに隣接するさらなる遺伝子を標的とするために用いることができる固有のＺＦＮ部位により隣接された状態になるような遺伝子導入デザインへの系統的アプローチを可能にする。さらに、この方法は、ＺＦＮ依存性二本鎖切断により促進される単一遺伝子座に積み重ねる戦略を単純化しうる。
【００３１】
亜鉛フィンガー結合ドメインは、古典的（Ｃ２Ｈ２）亜鉛フィンガー又は非古典的（例えば、Ｃ３Ｈ）亜鉛フィンガーであり得る。さらに、亜鉛フィンガー結合ドメインは、１つ又は複数の亜鉛フィンガー（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はそれ以上の亜鉛フィンガー）を含んでいてよく、いずれかのＭＤＨ遺伝子内の配列に結合するように遺伝子工学的に改変することができる。ＭＤＨ遺伝子への結合に用いる具体例としてのＭＤＨ結合亜鉛フィンガータンパク質の認識らせん領域を表１Ａに示し、ＭＤＨ遺伝子内の具体例としての標的部位を表１Ｂを示す。細胞中のそのような融合タンパク質（或いは複数のタンパク質及び／又はこれらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の存在は、融合タンパク質（単数又は複数）のその（それらの）結合部位（単数又は複数）への結合及びＭＤＨ遺伝子（単数又は複数）内の切断をもたらす。
【００３２】
一般
方法の実施、並びに本明細書で開示した組成物の調製及び使用は、特に示さない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造及び解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ及び当業者の技術の範囲内の関連分野における通常の技術を用いるものである。これらの技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、Second edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989及びThird edition、2001; Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons、New York、1987及び定期的更新; the series METHODS IN ENZYMOLOGY、Academic Press、San Diego; Wolffe、CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION、Third edition、Academic Press、San Diego、1998; METHODS IN ENZYMOLOGY、Vol. 304、「Chromatin」(P. M. Wassarman及びA. P. Wolffe編)、Academic Press、San Diego、1999;並びにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、Vol. 119、「Chromatin Protocols」(P. B. Becker編) Humana Press、Totowa、1999を参照のこと。
【００３３】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義で用いられ、線状又は環状の構造を有し、一本又は二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味する。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限されると解釈すべきでない。当用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基、糖及び／又はリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されているヌクレオチドを含みうる。一般的に、個々のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する。すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【００３４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、同義で用いられて、アミノ酸残基のポリマーを意味する。当用語は、１つ又は複数のアミノ酸が対応する天然アミノ酸の化学的類似体又は修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３５】
「結合」は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合性相互作用を意味する。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合性相互作用のすべての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基との接触）。そのような相互作用は、一般的に１０−６Ｍ−１又はそれより低い解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和力」は、結合の強さを意味し、結合親和力の増加は、より低いＫｄと相関する。
【００３６】
「結合タンパク質」は、他の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／又はタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合する（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）ことができ且つ／又はそれは、異なるタンパク質又は複数のタンパク質の１つ若しくは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、複数の種類の結合活性を有しうる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合及びタンパク質結合活性を有する。
【００３７】
「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（又は結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位により安定化している結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ又は複数の亜鉛フィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合する、タンパク質、又はより大きなタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば亜鉛フィンガータンパク質又はＺＦＰと短縮される。
【００３８】
亜鉛フィンガー結合ドメインは、あらかじめ定められたヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子工学的に改変」することができる。亜鉛フィンガータンパク質を遺伝子工学的に改変する方法の非限定的な例は、設計及び選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、その設計／組成が主として合理的な基準によってもたられる天然に存在しないタンパク質である。設計の合理的な基準は、置換規則及び既存のＺＦＰ設計及び結合データの情報を保存したデータベースにおける処理情報に関するコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号及び第６，５３４，２６１号を参照のこと。また国際公開第９８／５３０５８号、国際公開第９８／５３０５９号、国際公開第９８／５３０６０号、国際公開第０２／０１６５３６号及び国際公開第０３／０１６４９６号も参照のこと。
【００３９】
「選択された」亜鉛フィンガータンパク質は、その産生が、ファージディスプレイ、相互作用トラップ又はハイブリッド選択などの経験的方法によって主としてもたらされる天然に見いだされないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、米国特許第５，９２５，５２３号、米国特許第６，００７，９８８号、米国特許第６，０１３，４５３号、米国特許第６，２００，７５９号、国際公開第９５／１９４３１号、国際公開第９６／０６１６６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第９８／５４３１１号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１９７号及び国際公開第０２／０９９０８４号を参照のこと。
【００４０】
「配列」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、線状、環状又は分枝状であり得、一本鎖又は二本鎖であり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を意味する。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を意味する。ドナー配列は、任意の長さのもの、例えば、長さが２〜１０，０００ヌクレオチド（又はその間又はそれ以上の任意の整数値）、好ましくは長さが約１００〜１０００ヌクレオチド（又はその間の任意の整数）、より好ましくは長さが約２００〜５００ヌクレオチドであり得る。
【００４１】
「相同で、同一でない配列」は、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列が第２の配列と同一でない第１の配列を意味する。例えば、突然変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異遺伝子の配列と相同であり、同一でない。特定の実施形態において、２つの配列の間の相同性の程度は、通常の細胞メカニズムを利用して、その間の相同的組換えを可能にするのに十分である。２つの相同で、同一でない配列は、任意の長さであってよく、それらの非相同性の程度は、単一ヌクレオチド（例えば、標的相同的組換えによるゲノムの点突然変異の矯正のための）と小さな又は１０キロ塩基以上（例えば、染色体におけるあらかじめ定めた異所における遺伝子の挿入のための）と大きなものであり得る。相同で、同一でない配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチド又はヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を用いることができる。
【００４２】
核酸及びアミノ酸配列の同一性を決定するための技術は、当技術分野で公知である。一般的に、そのような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定し、且つ／又はそれによりコードされるアミノ酸配列を決定し、これらの配列を第２のヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もこの方法で決定し、比較することができる。一般的に、同一性は、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列のそれぞれ正確なヌクレオチドごと又はアミノ酸ごとの一致を意味する。２つ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）は、それらの同一性の百分率を決定することによって比較することができる。２つの配列の同一性の百分率は、核酸配列であるか又はアミノ酸配列であるかにかかわりなく、より短い配列の長さで割り、１００を掛けた２つのアライメントした配列の間の正確な一致の数である。核酸配列のおおよそのアライメントは、Smith及びWaterman、Advances in Applied Mathematics、2巻、482〜489頁(1981)の局所相同性アルゴリズムによって行われる。このアルゴリズムは、Dayhoff、Atlas of Protein Sequences and Structure、M. O. Dayhoff編、5 suppl.、3巻、353〜358頁、National Biomedical Research Foundation、Washington, D. C.、USAにより開発され、Gribskov、Nucl. Acids Res.、14巻(6号)、6745〜6763頁(1986)により標準化されたスコア行列を用いることによってアミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性の百分率を決定するためのこのアルゴリズムの具体例としての実装は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションで行われる。配列間の同一性又は類似性の百分率を計算するための適切なプログラムは、当技術分野で一般的に公知であり、例えば、他のアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターとともに用いられるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメーターを用いて用いることができる：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ：ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、インターネットで見いだすことができる。本明細書で述べる配列に関して、配列同一性の所望の程度の範囲は、約８０％〜１００％及びその間の整数値である。一般的に、配列間の同一性の百分率は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【００４３】
或いは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間の安定な二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションとそれに続く一本鎖特異的ヌクレアーゼ（単数又は複数）による消化及び消化断片のサイズの測定によって決定することができる。配列が、上述の方法を用いて決定したとき、分子の規定の長さにわたる少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示す場合、２つの核酸又は２つのポリペプチド配列は、互いに実質的に相同である。本明細書で用いているように、実質的に相同は、指定のＤＮＡ又はポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列も意味する。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、当該システムについて定義される、例えば、緊縮条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当業者には公知である。例えば、Sambrookら、前出；Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach、編集者B. D. Hames及びS. J. Higgins、(1985) Oxford、Washington DC、IRL Pressを参照のこと。
【００４４】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、次のように測定することができる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、そのような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率及び強さに影響を及ぼす。部分的に同一の核酸配列は、標的分子への完全に同一の配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に抑制する。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの抑制は、当技術分野で周知であるハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価することができる（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Second Edition、(1989) Cold Spring Harbor、N.Y.参照）。そのようなアッセイは、様々な程度の選択性を用いて、例えば、低緊縮性から高緊縮性までの様々な条件を用いて行うことができる。低緊縮性の条件を用いる場合、非特異的結合の非存在は、非特異的結合事象が存在しない場合に、第２のプローブが標的にハイブリダイズしないように、部分的な程度の配列同一性さえも欠く第２のプローブ（例えば、標的分子との約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて評価することができる。
【００４５】
ハイブリダイゼーションベースの検出システムを用いる場合、参照核酸配列と相補的である核酸プローブを選択し、次いで、適切な条件を選択することにより、プローブと参照配列は、互いに選択的にハイブリダイズ又は結合して、二重鎖分子を形成する。中等度に緊縮性のハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、一般的に、選択される核酸プローブの配列との少なくとも約７０％の配列同一性を有する長さが少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。緊縮性ハイブリダイゼーション条件は、一般的に、選択される核酸プローブの配列との約９０〜９５％より大きい配列同一性を有する長さが少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、プローブ及び参照配列が特定の程度の配列同一性を有する場合、当技術分野で公知であるように決定することができる（例えば、Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach、編集者B. D. Hames及びS. J. Higgins、(1985) Oxford、Washington DC、IRL Pressを参照のこと）。
【００４６】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーション緊縮性は、ハイブリダイゼーション条件がミスマッチヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を不利にする程度を意味し、より高い緊縮性は、ミスマッチハイブリッドのより低い許容度と相関する。ハイブリダイゼーションの緊縮性に影響を及ぼす因子は、当業者に周知であり、温度、ｐＨ、イオン強度並びに例えば、ホルムアミド及びジメチルスルホキシドなどの有機溶媒の濃度を含むが、これらに限定されない。当業者に公知であるように、ハイブリダイゼーション緊縮性は、より高い温度、より低いイオン強度及びより低い溶媒濃度によって増大する。
【００４７】
ハイブリダイゼーションの緊縮性条件に関して、例えば、以下の因子を変化させることによって特定の緊縮性を設定するために多くの同等の条件を用いることができることが当技術分野で周知である：プローブ配列の長さ及び性質、様々な配列の塩基組成、塩及び他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、硫酸デキストラン及びポリエチレングリコール）の存在又は非存在、ハイブリダイゼーション反応の温度及び時間パラメーター、並びに様々な洗浄条件。特定の一連のハイブリダイゼーション条件の選択は、当技術分野における標準的方法に従って選択される（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Second Edition、(1989) Cold Spring Harbor、N.Y.参照）。
【００４８】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の過程を意味する。本開示の目的のために、「相同的組換え（ＨＲ）」は、例えば、細胞中の二本鎖切断の修復中に起こるそのような交換の特殊な形を意味する。この過程は、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復への「ドナー」分子を用いる、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、ドナーから標的への遺伝情報の移動をもたらすため、「非交差遺伝子変換」又は「ショートトラクト遺伝子変換」として様々な名称で公知である。特定の理論により拘束されることを望むものではないが、そのような移動は、切断標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修復、及び／又はドナーを用いて標的の一部となる遺伝情報を再合成する「合成依存性鎖アニーリング」、及び／又は関連過程を伴いうる。そのような特殊なＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部又はすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような標的分子の配列の変化をしばしばもたらす。
【００４９】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を意味する。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素又は化学加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法により開始させることができる。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こりうる。ＤＮＡ切断は、平滑末端又は付着末端の生成をもたらしうる。特定の実施形態において、融合ポリペプチドを標的二本鎖ＤＮＡ切断に用いる。
【００５０】
「切断ドメイン」は、ＤＮＡ切断の触媒活性を有する１つ又は複数のポリペプチド配列を含む。切断ドメインは、単一ポリペプチド鎖に含まれうる。又は切断活性は、２つ（又はそれ以上）のポリペプチドの会合に起因しうる。
【００５１】
「切断半ドメイン」は、（同一の又は異なる）第２のポリペプチドとともに切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。
【００５２】
「遺伝子工学的に改変された切断半ドメイン」は、他の切断半ドメイン（例えば、他の遺伝子工学的に改変された切断半ドメイン）と必須のヘテロ二量体を形成するように改変された切断半ドメインである。例えば、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、第２００７／０２１８５２８号及び第２００８／０１３１９６２号も参照のこと。
【００５３】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主としてＤＮＡ、並びにヒストン及び非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４のそれぞれ２つを含む八量体と会合したＤＮＡの約１５０塩基対を含み、リンカーＤＮＡ（生物に依存する可変長の）がヌクレオソームコアの間に延在する。ヒストンＨ１の分子は、一般的にリンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、原核生物及び真核生物の両方のすべての種類の細胞核タンパク質を含むことを意味する。細胞クロマチンは、染色体及びエピソームクロマチンの両方を含む。
【００５４】
「染色体」は、細胞のゲノムのすべて又は一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である、その核型によってしばしば特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つ又は複数の染色体を含みうる。
【００５５】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の部分でない核酸を含む複製核酸、核タンパク質複合体又は他の構造である。エピソームの例は、プラスミド及び特定のウイルスゲノムを含む。
【００５６】
「アクセシブル領域（accessible region）」は、核酸に存在する標的部位が標的部位を認識する外因性分子によって結合されうる細胞クロマチンにおける部位である。特定の理論により拘束されることを望むものではないが、アクセシブル領域は、ヌクレオソーム構造内にパッケージングされないものであると考えられる。アクセシブル領域の異なる構造は、化学及び酵素プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性によってしばしば検出することができる。
【００５７】
「標的部位」又は「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在するときに、結合分子が結合する核酸の部分を定義する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、ＥＣＯＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
【００５８】
「外因性」分子は、通常は細胞中に存在しないが、１つ又は複数の遺伝学的、生化学的又は他の方法により細胞に導入することができる分子である。「細胞中の通常の存在」は、細胞の特定の発育段階及び環境条件に関して判断される。したがって、例えば、花の発育の初期の段階中のみに細胞中に存在する分子は、完全に発育した花の細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘発される分子は、非熱ショック細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、ポリペプチド若しくはその断片のコーディング配列、機能不全内因性分子の機能型又は正常機能内因性分子の機能不全型を含みうる。さらに、外因性分子は、宿主細胞中の内因性遺伝子のオルソログである他の種のコーディング配列を含みうる。
【００５９】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリー法により生成されるような小分子、又はタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上述の分子の修飾誘導体などの巨大分子、或いは１つ若しくは複数の上述の分子を含む複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含み、一本鎖又は二本鎖であり得、線状、分枝状又は環状であり得、任意の長さであり得る。核酸は、二重鎖を形成することができるもの並びに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号及び第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼ及びヘリカーゼを含むが、これらに限定されない。したがって、該用語は、植物細胞に、例えば、植物細胞中のＭＤＨ遺伝子に導入された外因性配列である「導入遺伝子」又は「対象の遺伝子」を含む。
【００６０】
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質又は核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞に導入された感染ウイルスゲノム、プラスミド若しくはエピソーム、又は細胞中に通常存在しない染色体を含み得る。細胞に外因性分子を導入する方法は、当業者に周知であり、プロトプラスト形質転換、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、アグロバクテリウム媒介形質転換、脂質媒介転移（すなわち、中性及びカチオン脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント（例えば「遺伝子銃」を用いる）、リン酸カルシウム共同沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介転移及びウイルスベクター媒介転移を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
それに反して、「内因性」分子は、特定の環境条件下での特定の発育段階において特定の細胞中に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体若しくは他のオルガネラ、又は天然に存在するエピソーム核酸を構成し得る。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子及び酵素を含み得る。
【００６２】
本明細書で用いているように、「外因性核酸の産物」という用語は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）及び翻訳産物（ポリペプチド）を含む。
【００６３】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合により連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学的種類の分子であってよく、又は異なる化学的種類の分子であってよい。第１の種類の融合分子の例は、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合）及び融合核酸（例えば、上述の融合タンパク質をコードする核酸）を含むが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例は、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合及び副溝バインダーと核酸との間の融合を含むが、これらに限定されない。
【００６４】
細胞中の融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達又は細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって起こり、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成し得る。トランススプライシング、ポリペプチド切断及びポリペプチドライゲーションも細胞中のタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチド及びポリペプチドの送達の方法は、本開示における他所に示す。
【００６５】
「遺伝子」は、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記参照）並びにそのような調節配列がコーディング及び／又は転写配列に隣接するか否かにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム侵入部位などの翻訳制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位並びに遺伝子座制御領域を含むが、これらに必ずしも限定されない。
【００６６】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を意味する。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ若しくは他の種類のＲＮＡ）又はｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化及び編集などの方法により修飾されているＲＮＡ並びに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化及びグリコシル化により修飾されたタンパク質も含む。
【００６７】
遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子の活性の変化を意味する。発現のモジュレーションは、遺伝子の活性化及び遺伝子の抑制を含み得るが、これらに限定されない。
【００６８】
「植物」細胞は、単子葉（単子葉植物）又は双子葉（双子葉植物）植物の細胞を含むが、これらに限定されない。単子葉植物の非限定的な例は、トウモロコシ、イネ、オオムギ、オートムギ、コムギ、モロコシ、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、タマネギ、バナナ及びココナツなどの穀物用植物を含む。双子葉植物の非限定的な例は、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿、テンサイ、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズ、カノーラ（ナタネ）及びアルファルファを含む。植物細胞は、植物のあらゆる部分及び／又は植物の発育のあらゆる段階からのものであり得る。
【００６９】
「対象の領域」は、例えば、外因性分子に結合することが望しい、遺伝子又は遺伝子内若しくは隣接する非コーディング配列などの細胞クロマチンの領域である。結合は、標的ＤＮＡ切断及び／又は標的組換えの目的のためのものであり得る。対象の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）又は感染ウイルスゲノムに存在し得る。対象の領域は、遺伝子のコーディング領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列若しくはイントロンなどの転写非コーディング領域内、又はコーディング領域の上流若しくは下流の非転写領域内にあり得る。対象の領域は、最小で単一ヌクレオチド対若しくは長さが最大２，０００ヌクレオチド対、又は任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
【００７０】
「作動的連結」及び「作動的に連結された」（又は「作動可能に連結された」）という用語は、両構成要素が正常に機能し、構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介することができる可能性をもたらすように構成要素が配置されている、２つ以上の構成要素（配列エレメントなど）の並置に関して同義で用いられる。実例として、転写調節配列が、１つ又は複数の転写調節因子の存在又は非存在に応じてコーディング配列の転写のレベルを制御する場合、プロモーターなどの転写調節配列は、コーディング配列に作動的に連結されている。転写調節配列は、一般的にコーディング配列とシスで作動的に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、隣接していないにもかかわらず、コーディング配列に作動的に連結されている転写調節配列である。
【００７１】
融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結された」という用語は、構成要素のそれぞれが、それがそのように連結されていなかったかのように、他の構成要素と連係して同じ機能を果たすという事実を意味し得る。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位及び／又はその結合部位に結合することができ、一方、切断ドメインが標的部位の近くのＤＮＡを切断することができる場合、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインは、作動的連結の状態にある。
【００７２】
タンパク質、ポリペプチド又は核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチド又は核酸と同じでないが、全長タンパク質、ポリペプチド又は核酸と同じ機能を保持しているタンパク質、ポリペプチド又は核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多い、より少ない又は同じ数の残基を有し、且つ／又は１つ若しくは複数のアミノ酸若しくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コーディング機能、他の核酸とハイブリダイズする能力）を測定する方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質の機能を測定する方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト又は免疫沈降アッセイにより測定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によりアッセイすることができる。Ausubelら、前出を参照のこと。他のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共同免疫沈降、２ハイブリッドアッセイ又は遺伝学的及び生化学的相補性により測定することができる。例えば、Fieldsら(1989)、Nature、340巻、245〜246頁、米国特許第５，５８５，２４５号及びＰＣＴ国際公開第９８／４４３５０号を参照のこと。
【００７３】
ＤＮＡ結合ドメイン
ＤＮＡ結合ドメインを本明細書に開示する方法に用いることができる。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質を含む。亜鉛フィンガー結合ドメインは、１つ又は複数の亜鉛フィンガーを含む。Millerら(1985)、EMBO J.、4巻、1609〜1614頁、Rhodes(1993)、Scientific American、2月、56〜65頁、米国特許第６，４５３，２４２号。本明細書で述べる亜鉛フィンガー結合ドメインは、一般的に２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の亜鉛フィンガーを含む。
【００７４】
一般的に、単一亜鉛フィンガードメインは、長さが約３０アミノ酸である。構造研究により、各亜鉛フィンガードメイン（モチーフ）が２つのベータシート（２つの不変システイン残基を含むベータターンで保持された）並びに２つのシステイン及び２つのヒスチジンによる亜鉛原子の配位により特定の立体構造で保持されている、アルファらせん（２つの不変ヒスチジン残基を含む）を含むことが示された。
【００７５】
亜鉛フィンガーは、古典的Ｃ２Ｈ２亜鉛フィンガー（すなわち、亜鉛イオンが２つのシステイン及び２つのヒスチジン残基により配位されているもの）並びに例えば、Ｃ３Ｈ亜鉛フィンガー（亜鉛イオンが３つのシステイン残基及び１つのヒスチジン残基により配位されているもの）及びＣ４亜鉛フィンガー（亜鉛イオンが４つのシステイン残基により配位されているもの）などの非古典的亜鉛フィンガーを含む。植物に用いる非古典的ＺＦＰに関しては国際公開第０２／０５７２９３号及び米国特許出願公開第２００８０１８２３３２号も参照のこと。
【００７６】
遺伝子工学的に改変された亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して新規な結合特異性を有し得る。遺伝子工学的改変法は、合理的な設計及び様々な種類の選択を含むが、これらに限定されない。合理的な設計は、例えば、各三つ組又は四つ組ヌクレオチド配列が、特定の三つ組又は四つ組配列に結合している亜鉛フィンガーの１つ又は複数のアミノ酸配列と関連している、三つ組（又は四つ組）ヌクレオチド配列及び個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを用いることを含む。
【００７７】
ファージディスプレイ及び２ハイブリッドシステムを含む、具体例としての選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，１４０，４６６号、第６，２００，７５９号及び第６，２４２，５６８号並びに国際公開第９８／３７１８６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／８８１９７号及び英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。
【００７８】
亜鉛フィンガー結合ドメインの結合特異性の向上は、例えば、国際公開第０２／０７７２２７号に記載された。
【００７９】
個々の亜鉛フィンガーが３つのヌクレオチド（すなわち、三つ組）配列（又は１つのヌクレオチドが重複し得る４つのヌクレオチド配列、隣接亜鉛フィンガーの４つのヌクレオチド結合部位を有する）に結合するので、亜鉛フィンガー結合ドメインを結合するように遺伝子工学的に改変される配列（例えば、標的配列）の長さは、遺伝子工学的に改変された亜鉛フィンガー結合ドメインにおける亜鉛フィンガーの数を決定する。例えば、フィンガーモチーフが重複サブサイトに結合していないＺＦＰについては、６つのヌクレオチド標的配列が２つのフィンガー結合ドメインにより結合され、９つのヌクレオチド標的配列が３つのフィンガー結合ドメインにより結合される等である。本明細書で述べたように、標的部位における個々の亜鉛フィンガーに対する結合部位（すなわち、サブサイト）は、隣接している必要はなく、多フィンガー結合ドメインにおける亜鉛フィンガー間のアミノ酸配列（すなわち、フィンガー間リンカー）の長さ及び性質によって１つ又はいくつかのヌクレオチドによって分離させることができる。
【００８０】
多フィンガー亜鉛フィンガー結合ドメインにおいて、隣接亜鉛フィンガーは、約５つのアミノ酸のアミノ酸リンカー配列（いわゆる「古典的」フィンガー間リンカー）によって、或いは、１つ又は複数の非古典的リンカーによって分離させることができる。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号及び第６，５３４，２６１号を参照のこと。３つを超えるフィンガーを含む遺伝子工学的に可変された亜鉛フィンガー結合ドメインについては、特定の亜鉛フィンガー間へのより長い（「非古典的」）フィンガー間リンカーの挿入が場合によっては望ましい可能性がある。その理由は、それによって結合ドメインによる結合の親和力及び／又は特異性が増大する可能性があるからである。例えば、米国特許第６，４７９，６２６号及び国際公開第０１／５３４８０号を参照のこと。したがって、多フィンガー亜鉛フィンガー結合ドメインは、非古典的フィンガー間リンカーの存在及び配置に関しても特徴付けることができる。例えば、３つのフィンガー（２つの古典的フィンガー間リンカーにより結合された）、長リンカー及び３つの付加的なフィンガー（２つの古典的フィンガー間リンカーにより結合された）を含む６フィンガー亜鉛フィンガー結合ドメインは、２ｘ３構造と表される。同様に、２つのフィンガー（その間に古典的リンカーを有する）、長リンカー及び２つの付加的なフィンガー（古典的リンカーにより結合された）を含む結合ドメインは、２ｘ２構造と表される。３つの２フィンガーユニット（それらのそれぞれにおいて２つのフィンガーが古典的リンカーにより結合された）を含み、各２フィンガーユニットが長リンカーによって隣接する２フィンガーユニットに結合されているタンパク質は、３ｘ２構造と呼ばれる。
【００８１】
多フィンガー結合ドメインにおける２つの隣接亜鉛フィンガーの間の長又は非古典的フィンガー間リンカーの存在は、しばしば、２つのフィンガーが、標的配列における直接隣接していないサブサイトに結合することを可能にする。したがって、標的部位におけるサブサイトの間に１つ又は複数のヌクレオチドのギャップが存在し得る。すなわち、標的部位は、亜鉛フィンガーによって接触されない１つ又は複数のヌクレオチドを含み得る。例えば、２ｘ２亜鉛フィンガー結合ドメインは、１つのヌクレオチドにより分離された２つの６ヌクレオチド配列に結合し得る。すなわち、それは、１３ヌクレオチド標的部位に結合する。Mooreら(2001a)、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、98巻、1432〜1436頁、Mooreら(2001b)、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、98巻、1437〜1441頁及び国際公開第０１／５３４８０号も参照のこと。
【００８２】
前述のように、標的サブサイトは、単一亜鉛フィンガーにより結合される３又は４ヌクレオチド配列である。特定の目的のために、２フィンガーユニットは、「結合モジュール」と表される。結合モジュールは、例えば、特定の６ヌクレオチド標的配列に結合する多フィンガータンパク質（一般的に３フィンガー）の状況における２つの隣接フィンガーを選択することにより得ることができる。或いは、モジュールは、個々の亜鉛フィンガーのアセンブリーにより構築することができる。国際公開第９８／５３０５７号及び国際公開第０１／５３４８０号も参照のこと。
【００８３】
或いは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼから得ることができる。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Belfortら(1997)、Nucleic Acids Res.、25巻、3379〜3388頁、Dujonら(1989)、Gene、82巻、115〜118頁、Perlerら(1994)、Nucleic Acids Res.、22巻、1125〜1127頁、Jasin(1996)、Trends Genet.、12巻、224〜228頁、Gimbleら(1996)、J. Mol. Biol.、263巻、163〜180頁、Argastら(1998)、J. Mol. Biol.、280巻、345〜353頁及びNew England Biolabsカタログも参照のこと。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように遺伝子工学的に改変することができる。例えば、Chevalierら(2002)、Molec. Cell、10巻、895〜905頁、Epinatら(2003)、Nucleic Acids Res.、31巻、2952〜2962頁、Ashworthら(2006)、Nature、441巻、656〜659頁、Paquesら(2007)、Current Gene Therapy、7巻、49〜66頁、米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照のこと。
【００８４】
他の代替法として、ＤＮＡ結合ドメインは、ロイシンジッパータンパク質から得ることができる。ロイシンジッパーは、遺伝子発現に関連する重要な転写因子である多くの真核生物調節タンパク質におけるタンパク質間相互作用に関与するクラスのタンパク質である。ロイシンジッパーは、動物、植物、酵母等を含むいくつかの生物界にわたるこれらの転写因子における共有される共通の構造モチーフを意味する。ロイシンジッパーは、２つのポリペプチドのロイシン残基がらせんの同じ面で終わるように、ロイシン残基がαらせんを通して均等に間隔をあける様態で特定のＤＮＡ配列に結合している２つのポリペプチドにより形成される（ホモ二量体又はヘテロ二量体）。ロイシンジッパーのＤＮＡ結合特異性は、本明細書で開示するＤＮＡ結合ドメインに利用することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、該ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体ザントモナス属（Xanthomonas）に由来するＴＡＬエフェクターからの遺伝子工学的改変ドメインである（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Millerら(2011)、Nature Biotechnology、29（2号）巻、143〜8頁、Bochら(2009)、Science、2009年10月29日（10.1126/science. 117881）並びにMoscou及びBogdanove(2009)、Science、2009年10月29日（10.1126/science. 1178817）並びに米国特許出願公開第２０１１０２３９３１５号、第２０１１０１４５９４０号及び第２０１１０３０１０７３号参照）。
【００８６】
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ヌクレアーゼシステムは、ゲノム工学に用いることができる細菌システムに基づく最近遺伝子工学的に改変されたヌクレアーゼシステムである。これは、多くの細菌及び古細菌の適応免疫応答の部分に基づいている。ウイルス又はプラスミドが細菌に侵入した場合、侵入者のＤＮＡのセグメントが「免疫」応答によりＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。次にこのｃｒＲＮＡが部分的相補性の領域を介してｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる他の種類のＲＮＡと会合して、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡにおけるｃｒＲＮＡと相同の領域にＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導する。Ｃａｓ９は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含まれる２０ヌクレオチドガイド配列により指定された部位のＤＳＢにおける平滑末端を生じさせる。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識及び切断のためにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。このシステムは、今やｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを１つの分子（「単一ガイドＲＮＡ」）に結合させることができるように遺伝子工学的に改変されており、単一ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分は、所望の配列を標的とするようにＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導するために遺伝子工学的に改変することができる（Jinekら(2012)、Science、337巻、816〜821頁、Jinekら(2013)、eLife 2:e00471及びDavid Segal(2013)、eLife 2:e00563参照）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ゲノムにおける所望の標的における二本鎖切断端（ＤＳＢ）を作出するために遺伝子工学的に改変することができ、ＤＳＢの修復は、誤りがちな修復の増加をもたらす修復阻害剤の使用による影響を受け得る。
【００８７】
切断ドメイン
上述のように、ＤＮＡ結合ドメインは、切断（ヌクレアーゼ）ドメインと関連付けることができる。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ機能を保持しながら、それらのＤＮＡ結合特異性を変化させることができる。さらに、亜鉛フィンガータンパク質も切断ドメインと融合させて、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成することができる。本明細書で開示する融合タンパク質の切断ドメイン部分は、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを得ることができる具体例としてのエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。例えば、2002-2003 Catalogue、New England Biolabs、Beverly、MA及びBelfortら(1997)、Nucleic Acids Res.、25巻、3379〜3388頁を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮアーゼＩ、ミクロコカルヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linnら(編)、Nucleases、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1993年も参照のこと）。ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの非限定的な例は、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩを含み、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Belfortら(1997)、Nucleic Acids Res.、25巻、3379〜3388頁、Dujonら(1989)、Gene、82巻、115〜118頁、Perlerら(1994)、Nucleic Acids Res.、22巻、1125〜1127頁、Jasin(1996)、Trends Genet.、12巻、224〜228頁、Gimbleら(1996)、J. Mol. Biol.、263巻、163〜180頁、Argastら(1998)、J. Mol. Biol.、280巻、345〜353頁及びNew England Biolabsカタログも参照のこと。これらの酵素（又はその機能的断片）の１つ又は複数のものは、切断ドメイン及び切断半ドメインの源として用いることができる。
【００８８】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡ（認識部位における）に配列特異的に結合し、結合の部位における又はその近くのＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位におけるＤＮＡを切断し、分離可能な結合及び切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、１つの鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド及び他の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドにおけるＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、第５，４３６，１５０号及び第５，４８７，９９４号並びにLiら(1992)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、4275〜4279頁、Liら(1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻、2764〜2768頁、Kimら(1994a)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91巻、883〜887頁、Kimら(1994b)、J. Biol. Chem.、269巻、31,978〜31,982頁を参照のこと。したがって、１つの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメイン（又は切断半ドメイン）及び遺伝子工学的に改変されていてもよく又はされていなくてもよい、１つ若しくは複数の亜鉛フィンガー結合ドメインを含む。
【００８９】
切断ドメインを結合ドメインから分離できる、具体例としてのＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特別な酵素は、二量体として活性である（Bitinaiteら(1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95巻、10,570〜10,575頁）。したがって、本開示の目的のために、開示した融合タンパク質に用いるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断半ドメインであると考えられる。したがって、亜鉛フィンガー−ＦｏｋＩ融合体を用いた、標的二本鎖切断及び／又は細胞配列の標的置換のために、それぞれＦｏｋＩ切断半ドメインを含む、２つの融合タンパク質を用いて、触媒的に活性な切断ドメインを再構成することができる。或いは、亜鉛フィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ切断半ドメインを含む単一ポリペプチド分子も用いることができる。亜鉛フィンガー−ＦｏｋＩ融合体を用いる標的切断及び標的配列改変に関するパラメーターは、本開示における他所に示す。
【００９０】
切断ドメイン又は切断半ドメインは、切断活性を保持している、又は多量体化して（例えば、二量体化して）、機能的切断ドメインを形成する能力を保持しているタンパク質の一部であり得る。
【００９１】
具体例としてのＩＩＳ型制限酵素は、その全体として参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００７／０１４２７５号に記載されている。
【００９２】
切断特異性を向上させるために、切断ドメインも改変することができる。特定の実施形態において、切断半ドメインの変異体を用い、これらの変異体が切断半ドメインのホモ二量体化を最小限にする又は妨げる。そのような改変切断半ドメインの非限定的な例は、その全体として参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００７／０１４２７５号に詳細に記載されている。実施例も参照のこと。特定の実施形態において、切断ドメインは、ホモ二量体化を最小限にする又は妨げる遺伝子工学的に改変された切断半ドメイン（二量体化ドメイン変異体とも呼ばれる）を含み、当業者に公知であり、例えば、それらすべての開示が、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号、第２００７０３０５３４６号及び第２００８０１３１９６２号に記載されている。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７及び５３８位のアミノ酸残基は、ＦｏｋＩ切断半ドメインの二量体化に影響を及ぼすためのすべての標的である。
【００９３】
必須ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩのさらなる遺伝子工学的に改変された切断半ドメインも本明細書で述べるＺＦＮに用いることができる。必須ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの具体例としての遺伝子工学的に改変された切断半ドメインは、第１の切断半ドメインがＦｏｋＩの４９０及び５３８位のアミノ酸残基における突然変異を含み、第２の切断半ドメインがアミノ酸残基４８６及び４９９における突然変異を含む対を含む。
【００９４】
したがって、１つの実施形態において、４９０における突然変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、５３８における突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、４８６における突然変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し、４９９における突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。具体的には、本明細書で述べる遺伝子工学的改変切断半ドメインは、１つの切断半ドメインにおける４９０（Ｅ→Ｋ）及び５３８（Ｉ→Ｋ）位を突然変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ぶ遺伝子工学的改変切断半ドメインを生成させることにより、また他の切断半ドメインにおける４８６（Ｑ→Ｅ）及び４９９（Ｉ→Ｌ）位を突然変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ぶ遺伝子工学的改変切断半ドメインを生成させることにより調製した。本明細書で述べる遺伝子工学的改変切断半ドメインは、異常な切断が最小限又は根絶されている必須ヘテロ二量体変異体である。例えば、その開示がすべての目的のためにその全体として参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号を参照のこと。特定の実施形態において、遺伝子工学的改変切断半ドメインは、４８６、４９９及び４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けした）における突然変異、例えば、４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、４９６位における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）又はＧｌｕ（Ｅ）残基で置換する突然変異を含む（それぞれ「ＥＬＤ」及び「ＥＬＥ」ドメインとも呼ぶ）。他の実施形態において、遺伝子工学的改変切断半ドメインは、４９０、５３８及び５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けした）における突然変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基又はＡｒｇ（Ｒ）残基で置換する突然変異を含む（それぞれ「ＫＫＫ」及び「ＫＫＲ」ドメインとも呼ぶ）。他の実施形態において、遺伝子工学的改変切断半ドメインは、４９０及び５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けした）における突然変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基又はＡｒｇ（Ｒ）残基で置換する突然変異を含む（それぞれ「ＫＩＫ」及び「ＫＩＲ」ドメインとも呼ぶ）。（米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号参照）他の実施形態において、遺伝子工学的改変切断半ドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」及び／又は「Ｓｈａｒｋｅｙ’」突然変異を含む（Guoら(2010)、J. Mol. Biol.、400巻(1号)、96〜107頁参照）。
【００９５】
本明細書で述べる遺伝子工学的改変切断半ドメインは、適切な方法を用いて、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、第２００８０１３１９６２号及び第２０１１０２０１０５５号に記載されているような野生型切断半ドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発によって調製することができる。
【００９６】
或いは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素（split-enzyme）」技術（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号参照）を用いて核酸標的部位においてｉｎ  ｖｉｖｏでアセンブルすることができる。そのようなスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物上で発現させることができるか、或いは個々の構成要素が例えば、自己切断２Ａペプチド又はＩＲＥＳ配列により分離されている場合、１つの読み取り枠に結合させることができる。構成要素は、個々の亜鉛フィンガー結合ドメイン又はメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
【００９７】
ヌクレアーゼは、例えば、国際公開第２００９／０４２１６３号及び第２００９００６８１６４号に記載されているような酵母ベースの染色体システムで使用前に活性についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当技術分野で公知の方法を用いて容易に設計することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、第２００５０２０８４８９号、２００５００２６１５７号、第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号、第２００６００６３２３１号及び国際公開第０７／０１４２７５号を参照のこと。ヌクレアーゼの発現は、構成型プロモーター又は誘導型プロモーター、例えば、ラフィノース及び／又はガラクトースの存在下で活性化され（抑制解除され）、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。
【００９８】
融合タンパク質
融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築の方法は、当業者に公知である。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、亜鉛フィンガードメイン）及び調節又は切断ドメイン（若しくは切断半ドメイン）を含む融合タンパク質並びにそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの設計及び構築の方法は、それらの全体として参照により組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号及び第６，５３４，２６１号並びに米国特許出願公開第２００７／０１３４７９６号、第２００５／００６４４７４号、第２００８０１８２３３２号、第２００９０２０５０８３号、第２０１００１９９３８９号、第２０１１０１６７５２１号、第２０１１０２３９３１５号、第２０１１０１４５９４０号及び第２０１１０３０１０７３号に記載されている。特定の実施形態において、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを構築する。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに挿入することができ、ベクターは、細胞に導入することができる（ベクター及びポリヌクレオチドを細胞に導入する方法に関するさらなる開示については下記を参照のこと）。
【００９９】
本明細書で述べる方法の特定の実施形態において、亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、亜鉛フィンガー結合ドメイン及びＦｏｋＩ制限酵素の切断半ドメインを含む融合タンパク質を含み、２つのそのような融合タンパク質を細胞中で発現させる。細胞中の２つの融合タンパク質の発現は、２つのタンパク質の細胞への送達、１つのタンパク質及びタンパク質のうちの１つをコードする１つの核酸の細胞への送達、タンパク質のうちの１つをそれぞれコードする２つの核酸の細胞への送達、又は両タンパク質をコードする単一の核酸の細胞への送達によって起こり得る。さらなる実施形態において、融合タンパク質は、２つの切断半ドメイン及び亜鉛フィンガー結合ドメインを含む単一ポリペプチド鎖を含む。この場合、単一融合タンパク質は、細胞中で発現し、理論により拘束されることを望むものではないが、切断半ドメインの分子内二量体の形成の結果としてＤＮＡを切断すると考えられる。
【０１００】
特定の実施形態において、亜鉛フィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近くなり、切断半ドメインがカルボキシ末端に最も近くなるように、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合体）の成分を配置する。これは、ＤＮＡ結合ドメインがアミノ末端に最も近く、切断半ドメインがカルボキシ末端に最も近い、ＦｏｋＩ酵素に由来するものなどの天然に存在する二量体化切断ドメインにおける切断ドメインの相対的配向を反映する。これらの実施形態において、機能的ヌクレアーゼを形成するための切断半ドメインの二量体化は、結合部位の５’末端が互いに近接している、反対側のＤＮＡ鎖上の部位への融合タンパク質の結合によってもたらされる。
【０１０１】
さらなる実施形態において、切断半ドメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近くなり、亜鉛フィンガードメインがカルボキシ末端に最も近くなるように、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合体）の成分を配置する。これらの実施形態において、機能的ヌクレアーゼを形成するための切断半ドメインの二量体化は、結合部位の３’末端が互いに近接している、反対側のＤＮＡ鎖上の部位への融合タンパク質の結合によってもたらされる。
【０１０２】
さらなる実施形態において、第１の融合タンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端に最も近い切断半ドメイン及びカルボキシ末端に最も近い亜鉛フィンガードメインを含み、第２の融合タンパク質は、亜鉛フィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、切断半ドメインがカルボキシ末端に最も近くなるように配置する。これらの実施形態において、両融合タンパク質は、同じＤＮＡ鎖に結合し、カルボキシ末端に最も近い亜鉛フィンガードメインを含む第１の融合タンパク質の結合部位は、アミノ末端に最も近い亜鉛フィンガードメインを含む第２の融合タンパク質の結合部位の５’側に位置する。
【０１０３】
開示した融合タンパク質の特定の実施形態において、亜鉛フィンガードメインと切断ドメイン（又は切断半ドメイン）との間のアミノ酸配列は、「ＺＣリンカー」と表される。ＺＣリンカーは、上述のフィンガー間リンカーと区別すべきである。切断を最適化するＺＣリンカーを得ることに関する詳細については、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号及び第２００３０２３２４１０号並びに国際公開第０５／０８４１９０号を参照のこと。
【０１０４】
１つの実施形態において、本開示は、表１Ａに示す１つ又は複数の認識らせんアミノ酸配列を有する亜鉛フィンガータンパク質（例えば、表１Ａの１つの横列に示す認識らせんを有する成分亜鉛フィンガードメインで構成された亜鉛フィンガータンパク質）を含むヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）を提供する。他の実施形態において、本明細書で開示するのは、表１Ａに示す１つ又は複数の認識らせんアミノ酸配列を有するＺＦＰ、例えば、順序付けし、表１Ａの１つの横列に示す認識らせんアミノ酸配列を有するＺＦＰをコードするヌクレオチド配列を含むＺＦＰ発現ベクターである。他の実施形態において、本明細書で開示するのは、表１Ｂに示す標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）又は表１Ｂに示す標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）をコードするポリヌクレオチドである。
【０１０５】
標的部位
開示する方法及び組成物は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）及び調節ドメイン又は切断（例えば、ヌクレアーゼ）ドメイン（若しくは切断半ドメイン）を含む融合タンパク質を含み、該ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、亜鉛フィンガードメイン）は、１つ又は複数の植物ＭＤＨ遺伝子の細胞クロマチン中の配列に結合することにより、転写調節ドメイン又は切断ドメイン（若しくは切断半ドメイン）の活性を該配列の近傍に向け、それにより、標的配列の近傍における転写をモジュレートする又は切断を誘導する。
【０１０６】
本開示における他所で示したように、亜鉛フィンガードメインなどのＤＮＡ結合ドメインは、実質的に所望の配列に結合するように遺伝子工学的に改変することができる。したがって、遺伝子調節、切断又は組換えが望まれる配列を含む対象の領域を特定した後に、対象の領域における１つ又は複数の配列に結合するように１つ又は複数の亜鉛フィンガード結合ドメインを遺伝子工学的に改変することができる。特定の実施形態において、本明細書で述べたＺＦＰは、表１Ｂに示す標的部位に結合する。
【０１０７】
ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、標的部位）による結合のためのＭＤＨ遺伝子の細胞クロマチン中の対象のゲノム領域における標的部位の選択は、例えば、選択された配列に結合するＺＦＰを設計する方法も開示している、米国特許第６，４５３，２４２号及び／又は米国特許出願公開第２０１１０２３９３１５号、第２０１１０１４５９４０号及び第２０１１０３０１０７３号に開示されている方法に従って達成することができる。ヌクレオチド配列の簡単な視察も標的部位の選択に用いることができることは、当業者に明らかである。したがって、標的部位の選択のあらゆる手段を特許請求する方法に用いることができる。
【０１０８】
標的部位は、一般的に複数の隣接標的サブサイトで構成されている。標的サブサイトは、個々の亜鉛フィンガーにより結合される配列（通常は、ヌクレオチド三つ組又は隣接四つ組と１つのヌクレオチドにより重複し得るヌクレオチド四つ組のいずれか）を意味する。例えば、国際公開第０２／０７７２２７号を参照のこと。亜鉛フィンガータンパク質がほとんどの接触をしている鎖を標的鎖「主要認識鎖」又は「主要接触鎖」と呼ぶ場合、いくつかの亜鉛フィンガータンパク質は、標的鎖における３塩基三つ組及び非標的鎖上の第４の塩基に結合している。亜鉛フィンガータンパク質については、標的部位は、一般的に少なくとも９ヌクレオチドの長さを有し、したがって、少なくとも３つの亜鉛フィンガーを含む亜鉛フィンガー結合ドメインにより結合されている。しかし、例えば、１２ヌクレオチド標的部位への４フィンガー結合ドメイン、１５ヌクレオチド標的部位への５フィンガー結合ドメイン又は１８ヌクレオチド標的部位への６フィンガー結合ドメインの結合も可能である。明らかであるように、より長い標的部位へのより大きな結合ドメイン（例えば、７、８、９フィンガー及びそれ以上）の結合も可能である。
【０１０９】
標的部位が３ヌクレオチドの倍数である必要はない。例えば、交差鎖相互作用（cross-strand interactions）が起こる場合（例えば、米国特許第６，４５３，２４２号及び国際公開第０２／０７７２２７号参照）、多フィンガー結合ドメインの１つ又は複数の個々の亜鉛フィンガーは、重複四つ組サブサイトに結合することができる。結果として、３フィンガータンパク質は、１０ヌクレオチド配列に結合することができ、この場合、第１０のヌクレオチドは、末端フィンガーにより結合される四つ組の一部であり、４フィンガータンパク質は、１３ヌクレオチド配列に結合することができ、この場合、第１３のヌクレオチドは、末端フィンガーにより結合される四つ組の一部である等である。
【０１１０】
多フィンガー結合ドメインにおける個々の亜鉛フィンガーの間のアミノ酸リンカー配列の長さ及び性質も標的配列への結合に影響を及ぼす。例えば、多フィンガー結合ドメインにおける隣接亜鉛フィンガー間のいわゆる「非古典的リンカー」、「長リンカー」又は「構造化リンカー」の存在は、これらのフィンガーが、直接的に隣接しないサブサイトに結合することを可能にし得る。そのようなリンカーの非限定的な例は、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号及び国際公開第０１／５３４８０号に記載されている。したがって、亜鉛フィンガー結合ドメインの標的部位における１つ又は複数のサブサイトは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上のヌクレオチド互いに分離することができる。ほんの１例だけを示すと、４フィンガー結合ドメインは、配列に２つの隣接する３ヌクレオチドサブサイト、介在ヌクレオチド及び２つの隣接する三つ組サブサイトを含む１３ヌクレオチド標的部位に結合することができる。異なる数のヌクレオチドにより分離された標的部位に結合するための人工ヌクレアーゼを連結させるための組成物及び方法については米国特許出願公開第２００９０３０５４１９号も参照のこと。配列（例えば、標的部位）間の距離は、互いに最も近い配列の端から測定したときの２つの配列の間に介在するヌクレオチド又はヌクレオチド対の数を意味する。
【０１１１】
特定の実施形態において、転写因子機能を有するＺＦＰは、例えば、ＺＦＰ及び転写調節ドメイン（例えば、活性化又は抑制ドメイン）を含む融合タンパク質を構築することによって設計する。遺伝子発現のモジュレーションのためにＤＮＡ結合ドメインに融合させることができる適切な転写調節ドメインの非限定的な例は、例えば、米国特許第６，５３４，２６１号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号及び第８，３９９，２１８号並びに米国特許出願公開第２００８０１８２３３２号に記載されている。転写因子機能のために、単純な結合及びプロモーターとの十分な近接が一般的に必要なすべてである。プロモーターに対する正確な位置決め、配向及び限度内の距離は、さほど問題にならない。この特徴があるため、人工転写因子を構築するための標的部位の選択にかなりの柔軟性をもたせることが可能になる。したがって、ＺＦＰにより認識される標的部位は、調節ドメインに場合によって連結された、ＺＦＰによる遺伝子発現の活性化又は抑制を可能にする標的遺伝子における適切な部位であり得る。好ましい標的部位は、転写開始部位に隣接する、その下流又は上流の領域を含む。さらに、標的部位は、エンハンサー領域、レプレッサー部位、ＲＮＡポリメラーゼ休止部位及び特異的調節部位（例えば、ＳＰ−１部位、低酸素応答エレメント、核受容体認識エレメント、ｐ５３結合部位）、ｃＤＮＡコード領域又は発現配列タグ（ＥＳＴ）コーディング領域における部位に位置する。
【０１１２】
他の実施形態において、ヌクレアーゼ、例えば、ＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮを設計する。細胞中のＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメインを含む融合タンパク質を含むヌクレアーゼ（又はそれぞれが亜鉛フィンガー結合ドメイン及び切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質）の発現は、標的配列の近傍における切断をもたらす。特定の実施形態において、切断は、標的部位を分離する２つの亜鉛フィンガードメイン／切断半ドメイン融合分子の結合に依存する。２つの標的部位は、反対側のＤＮＡ鎖上に存在し得る。或いは、両標的部位が同じＤＮＡ鎖上に存在し得る。
【０１１３】
遺伝子発現の調節
様々なアッセイを用いて、ＺＦＰ分子などのＤＮＡ結合タンパク質が遺伝子発現をモジュレートするかどうかを判定することができる。特定のタンパク質の活性は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて、例えば、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ及び抗体を用いる免疫組織化学アッセイ）、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザン、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ試験）、比色分析、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、表現型アッセイなどを用いて、例えば、タンパク質若しくはｍＲＮＡレベル、産物レベル、酵素活性、リポーター遺伝子の転写活性化若しくは抑制を測定することにより評価することができる。
【０１１４】
ＤＮＡ結合タンパク質は、一般的に最初にＥＬＩＳＡアッセイを用い、次に酵母発現システムを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性について試験する。例えば、ＺＦＰは、しばしば最初にリポーター遺伝子を用いた一過性発現システムを用いて試験し、次にｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの両方で細胞及び全植物中の標的内因性遺伝子の調節を試験する。ＤＮＡ結合タンパク質は、細胞中で組換えにより発現させ、植物に移植した細胞中で組換えにより発現させ、又は遺伝子導入植物中で組換えにより発現させ、さらに以下で述べる送達担体を用いて植物又は細胞にタンパク質として投与することができる。細胞は、固定化し、溶液中に入れ、植物に注入することができ、或いは遺伝子導入又は非遺伝子導入植物中に天然で存在するものでよい。
【０１１５】
遺伝子発現のモジュレーションは、本明細書で述べたｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの１つを用いて試験する。試料又はアッセイ（Samples or assays）をＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰ）で処理し、試験化合物を含まない対照試料と比較して、モジュレーションの程度を検討する。内因性遺伝子発現の調節については、ＤＮＡ結合タンパク質は、一般的に２００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下、最も好ましくは２５ｎＭ以下のＫｄを有する。
【０１１６】
結合タンパク質の影響は、上述のパラメーターのいずれかを検査することにより測定することができる。適切な遺伝子発現、表現型の又は生理学的な変化をＤＮＡ結合タンパク質（例えばＺＦＰ）の影響の評価に用いることができる。機能に関する結果（functional consequences）を完全な細胞又は植物を用いて判断する場合、植物の成長、公知及び未同定遺伝マーカーへの転写の変化（例えば、ノーザンブロット又はオリゴヌクレオチドアレイ試験）、細胞成長などの細胞代謝の変化又はｐＨ変化並びにｃＧＭＰなどの細胞内二次メッセンジャーの変化などの様々な影響も測定することができる。
【０１１７】
内因性遺伝子発現の調節に関する好ましいアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することができる。１つの好ましいｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法において、培養細胞中の内因性遺伝子発現のＺＦＰ調節は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてタンパク質の産生を検査することによって測定することができる。試験試料を、空ベクター又は他の遺伝子を標的とする非関連ＺＦＰで処理した対照細胞と比較する。
【０１１８】
他の実施形態において、内因性遺伝子発現の調節は、標的遺伝子ｍＲＮＡ発現のレベルを測定することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定する。遺伝子発現のレベルは、増幅を用いて、例えば、ＰＣＲ（実時間ＰＣＲなど）、ＬＣＲ又はハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼプロテクション、ドットブロッティングを用いて測定する。ＲＮアーゼプロテクションは、１つの実施形態において用いられる。タンパク質又はｍＲＮＡのレベルは、直接又は間接標識検出剤、例えば、本明細書で述べたような、蛍光又は放射性標識核酸、放射性又は酵素標識抗体などを用いて検出する。
【０１１９】
或いは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＡＴ又はβ−ｇａｌなどのリポーター遺伝子に作動可能に連結した標的遺伝子プロモーターを用いたリポーター遺伝子システムを案出することができる。リポーター構築物は、一般的に培養細胞に共トランスフェクトする。最適なＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰ）による処理後、リポーター遺伝子の転写、翻訳の量、又は活性を当業者に公知の標準的技術により測定する。
【０１２０】
遺伝子導入及び非遺伝子導入植物もｉｎ  ｖｉｖｏでの内因性遺伝子発現の調節を検討するための好ましい実施形態として用いる。遺伝子導入植物は、最適なＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰ）を安定に発現することができる。或いは、最適なＺＦＰを一時的に発現する、又はＺＦＰを送達担体で投与した植物を用いることができる。内因性遺伝子発現の調節は、本明細書で述べたアッセイのいずれかを用いて試験する。
【０１２１】
標的切断の方法
開示した方法及び組成物は、細胞クロマチンにおける対象の領域における（例えば、ゲノムにおける、例えば、ＭＤＨ遺伝子内又はそれに隣接する所望の又はあらかじめ定めた部位における）ＤＮＡを切断するために用いることができる。そのような標的ＤＮＡ切断のために、亜鉛フィンガー結合ドメインなどのＤＮＡ結合ドメインを、あらかじめ定めた切断部位における又はその近くの標的部位に結合するように遺伝子工学的に改変し、遺伝子工学的改変ＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメインを含む融合タンパク質を細胞に導入し、且つ／又はポリヌクレオチドから発現させる。融合タンパク質の亜鉛フィンガー部分の標的部位への結合により、ＤＮＡは、切断ドメインにより標的部位の近くで切断される。
【０１２２】
或いは、それぞれが亜鉛フィンガー結合ドメイン及び切断半ドメインを含む、２つの融合タンパク質を細胞中で発現させ、機能的切断ドメインが再構成され、ＤＮＡが標的部位の近傍で切断されるように並置されている標的部位に結合させる。１つの実施形態において、切断は、２つの亜鉛フィンガー結合ドメインの標的部位の間で起こる。亜鉛フィンガー結合ドメインの１つ又は両方を遺伝子工学的に改変することができる。
【０１２３】
亜鉛フィンガー結合ドメイン−切断ドメイン融合ポリペプチドを用いた標的切断のために、結合部位は、切断部位を含んでいてよく、或いは結合部位の近位端は、切断部位から１、２、３、４、５、６、１０、２５、５０又はそれ以上のヌクレオチド（又は１から５０ヌクレオチドまでのいずれかの整数値）の位置にあってよい。切断部位に対する結合部位の正確な位置は、個々の切断ドメイン及びＺＣリンカーの長さに依存する。それぞれが亜鉛フィンガー結合ドメイン及び切断半ドメインを含む、２つの融合タンパク質を用いる方法では、結合部位は、一般的に切断部位の両側に位置する。したがって、第１の結合部位の近位端は、切断部位の一側の１、２、３、４、５、６、１０、２５又はそれ以上のヌクレオチド（又は１から５０ヌクレオチドまでのいずれかの整数値）の位置にあってよく、第２の結合部位の近位端は、切断部位の他側の１、２、３、４、５、６、１０、２５又はそれ以上のヌクレオチド（又は１から５０ヌクレオチドまでのいずれかの整数値）の位置にあってよい。切断部位をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでマッピングする方法は、当業者に公知である。
【０１２４】
したがって、本明細書で述べた方法は、切断ドメインに融合させた遺伝子工学的改変亜鉛フィンガー結合ドメインを用いることができる。これらの場合、結合ドメインは、標的配列の切断が望まれる部位又はその近くに結合するように遺伝子工学的に改変する。該融合タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入する。細胞に導入又は細胞中で発現したならば、融合タンパク質は、標的配列に結合し、標的配列又はその近くを切断する。切断の正確な部位は、切断ドメインの性質及び／又は結合ドメインと切断ドメインの間のリンカー配列の存在及び／又は性質に依存する。それぞれが切断半ドメインを含む、２つの融合タンパク質を用いる場合、結合部位の近位端間の距離は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５又はそれ以上のヌクレオチド（又は１から５０ヌクレオチドまでのいずれかの整数値）であり得る。切断の最適なレベルは、２つの融合タンパク質の結合部位間の距離（例えば、Smithら(2000)、Nucleic Acids Res.、28巻、3361〜3369頁、Bibikovaら(2001)、Mol. Cell. Biol.、21巻、289〜297頁参照）及び各融合タンパク質におけるＺＣリンカーの長さの両方にも依存し得る。米国特許第７，８８８，１２１号、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号並びに国際公開第０５／０８４１９０号、国際公開第０５／０１４７９１号及び国際公開第０３／０８０８０９号も参照のこと。
【０１２５】
特定の実施形態において、切断ドメインは、両方が結合ドメインを含む単一ポリペプチドの一部である、２つの切断半ドメイン、すなわち、第１の切断半ドメイン及び第２の切断半ドメインを含む。切断半ドメインは、それらがＤＮＡを切断するように機能する限り、同じアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列を有し得る。
【０１２６】
切断半ドメインは、別個の分子として提供することもできる。例えば、各ポリペプチドが結合ドメイン及び切断半ドメインを含む、２つの融合ポリペプチドを細胞に導入することができる。切断半ドメインは、それらがＤＮＡを切断するように機能する限り、同じアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列を有し得る。さらに、結合ドメインは、融合ポリペプチドの結合により、切断ドメインの再構成（例えば、半ドメインの二量体化による）を可能にする互いに対する空間的配向で２つの切断半ドメインが存在するように一般的に配置されている標的配列に結合し、それにより、機能的切断ドメインを形成するように半ドメインが互いに対して配置され、対象の領域における細胞クロマチンの切断がもたらされる。一般的に、再構成された切断ドメインによる切断は、２つの標的配列の間に位置する部位で起こる。該タンパク質の１つ又は両方をその標的部位に結合するように遺伝子工学的に改変することができる。
【０１２７】
２つの融合タンパク質は、同又は反対極性で対象の領域に結合することができ、それらの結合部位（すなわち、標的部位）は、任意の数のヌクレオチド、例えば、０〜２００ヌクレオチド又はそれらの間の任意の整数値のヌクレオチドにより分離させることができる。特定の実施形態において、それぞれが亜鉛フィンガー結合ドメイン及び切断半ドメインを含む、２つの融合タンパク質の結合部位は、他の結合部位に最も近い各結合部位の端から測定したとき、５〜１８ヌクレオチド離して、例えば、５〜８ヌクレオチド離して、又は１５〜１８ヌクレオチド離して、又は６ヌクレオチド離して、又は１６ヌクレオチド離して配置することができ、切断は、結合部位の間で起こる。
【０１２８】
ＤＮＡが切断される部位は、一般的に２つの融合タンパク質の結合部位の間にある。ＤＮＡの二本鎖切断は、しばしば２つの一本鎖切断、又は１、２、３、４、５、６若しくはそれ以上のヌクレオチドにより埋め合わされる「ニック」に起因する（例えば、天然ＦｏｋＩによる二本鎖ＤＮＡの切断は、４ヌクレオチドにより埋め合わされる一本鎖切断に起因する）。したがって、切断は、必ずしも各ＤＮＡ鎖上の正確に反対部位で起こらない。さらに、融合タンパク質の構造及び標的部位間の距離は、切断が単一ヌクレオチド対に隣接して起こるかどうか、又は切断がいくつかの部位で起こるかどうかに影響を及ぼし得る。しかし、標的組換え及び標的突然変異誘発（下文参照）を含む、多くの応用について、ヌクレオチドのある範囲内の切断が一般的に十分であり、特定の塩基対間の切断は必要ではない。
【０１２９】
上述のように、本明細書で述べた融合タンパク質（単数又は複数）は、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドとして導入することができる。例えば、それぞれが前述のポリペプチドの１つをコードする配列を含む、２つのポリヌクレオチドは、細胞に導入することができ、ポリペプチドが発現し、それぞれがその標的配列に結合する場合、切断は、標的配列及びその近くで起こる。或いは、両融合ポリペプチドをコードする配列を含む単一ポリヌクレオチドを細胞に導入する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ或いは修飾形又は類似体或いはＤＮＡ及び／又はＲＮＡであり得る。
【０１３０】
切断特異性を向上させるために、さらなる組成物を本明細書で述べた方法に用いることもできる。例えば、単一の切断半ドメインは、限られた二本鎖切断活性を示し得る。それぞれが３フィンガー亜鉛フィンガードメイン及び切断半ドメインを含む、２つの融合タンパク質を細胞に導入する方法において、どちらか一方のタンパク質が約９ヌクレオチド標的部位を指定する。１８ヌクレオチドの集合標的配列は、哺乳類及び植物ゲノムにおいて独特であり得るが、所定の９ヌクレオチド標的部位は、ヒトゲノムにおいて平均で約２３，０００回発生する。したがって、単一半ドメインの部位特異的結合に起因する非特異的切断が起こり得る。したがって、本明細書で述べる方法は、２つの融合タンパク質とともに細胞中で発現するＦｏｋＩ（又はそれをコードする核酸）などの切断半ドメインの優性阻害突然変異体の使用を企図する。優性阻害突然変異体は、二量体化することができるが、切断することができず、また二量体化される半ドメインの切断活性も阻害する。融合タンパク質にモル過剰量の優性阻害突然変異体を供給することにより、両融合タンパク質が結合している領域のみが、二量体化及び切断が起こるのに十分に高い局所濃度の機能的切断半ドメインを有する。２つの融合タンパク質の１つのみが結合している部位において、その切断半ドメインは、優性阻害突然変異半ドメインとともに二量体を形成し、望ましくない非特異的切断は起こらない。
【０１３１】
発現ベクター
本明細書で述べた１つ又は複数の融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）をコードする核酸は、複製及び／又は発現のために原核又は真核細胞への形質転換用のベクターにクローニングすることができる。ベクターは、原核生物ベクター（例えば、プラスミド若しくはシャトルベクター、昆虫ベクター）又は真核生物ベクターであり得る。融合タンパク質をコードする核酸は、細胞への投与用の発現ベクターにもクローニングすることができる。
【０１３２】
融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）を発現させるために、融合タンパク質をコードする配列を一般的に、転写を誘導するプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングする。適切な原核生物及び真核生物プロモーターは、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed. 2001)；Kriegler、Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；及びCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubelら、前出）に記載されている。タンパク質を発現させるための細菌発現システムは、例えば、E. coli, Bacillus sp., and Salmonella (Palvaら、Gene、22巻:229〜235頁(1983))において利用可能である。そのような発現システムのキットは、市販されている。哺乳類細胞、酵母及び昆虫細胞の真核生物発現システムは、当業者に周知であり、これらも市販されている。
【０１３３】
融合タンパク質をコードする核酸の発現を誘導するために用いられるプロモーターは、個々の用途に依存する。例えば、宿主細胞に適合する強い構成的プロモーターは、一般的に融合タンパク質の発現及び精製に用いられる。
【０１３４】
対照的に、融合タンパク質を植物遺伝子の調節のためにｉｎ  ｖｉｖｏで投与する場合（以下の「植物細胞への核酸の送達」の項を参照）、融合タンパク質の個々の用途に応じて、構成的、調節（例えば、発育中、組織若しくは細胞型により、又は環境により）又は誘導性プロモーターが用いられる。植物プロモーターの非限定的な例は、シロイヌナズナ（A. thaliana）ユビキチン３（ｕｂｉ−３）（Callisら、1990、J. Biol. Chem.、265巻、12486〜12493頁）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumifacience）マンノピンシンターゼ（Δｍａｓ）（Petolinoら、米国特許第６，７３０，８２４号）及び／又はキャッサバベインモザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）（Verdaguerら、1996、Plant Molecular Biology、31巻、1129〜1139頁）に由来するプロモーター配列を含む。実施例も参照のこと。
【０１３５】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、一般的に原核生物又は真核生物のいずれかの宿主細胞における核酸の発現に必要なすべての付加的なエレメントを含む転写単位又は発現カセットを含む。一般的な発現カセットは、例えば、融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター（リボソーム結合部位を含む）及び例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結又は翻訳終結に必要なシグナルを含む。カセットのさらなるエレメントは、例えば、エンハンサー、異種スプライシングシグナル、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルスの２Ａ配列（Mattionら(1996)、J. Virol.、70巻、8124〜8127頁）及び／又は核局在シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。
【０１３６】
細胞内に遺伝情報を輸送するために用いられる特定の発現ベクターは、融合タンパク質の意図する用途、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原虫等における発現に関して選択される（下記の発現ベクター参照）。標準的な細菌及び動物発現ベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４Ａ１号並びに国際公開第０５／０８４１９０号、国際公開第０５／０１４７９１号及び国際公開第０３／０８０８０９号に詳細に記載されている。
【０１３７】
標準的な感染方法を用いて、標準的な技術を用いて精製することができる、大量のタンパク質を発現する細菌、植物、哺乳類、酵母又は昆虫細胞系を作製することができる（例えば、Colleyら、J. Biol. Chem.、264巻、17619〜17622頁(1989)、Guide to Protein Purification、in Methods in Enzymology、182巻(Deutscher編、1990)参照）。真核又は原核細胞の形質転換は、標準的な技術を用いて実施される（例えば、Morrison、J. Bact.、132巻、349〜351頁(1977)、Clark-Curtiss & Curtiss、Methods in Enzymology、101巻、347〜362頁（Wuら、編、1983参照）。
【０１３８】
そのような宿主細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の方法のいずれかを用いることができる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト注入、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム、マイクロインジェクション、裸ＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、アグロバクテリウム媒介形質転換、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））媒介形質転換（エピソーム及び組込み）、及び宿主細胞にクローンゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外来物質を導入するための他の周知の方法（例えば、Sambrookら、前出を参照）のいずれかの使用を含む。用いられる個々の遺伝子工学的方法が最適なタンパク質を発現することができる宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を成功裏に導入することができるだけでよい。
【０１３９】
植物細胞への核酸の送達
上述のように、ＤＮＡ構築物は、従来の様々な技術により所望の植物宿主（例えば、そのゲノムに）に導入することができる。そのような技術のレビューについては、例えば、Weissbach & Weissbach、Methods for Plant Molecular Biology(1988、Academic Press、N.Y.)、Section VIII、421〜463頁及びGrierson & Corey、Plant Molecular Biology (1988、2d Ed.)、Blackie、London、7〜9章を参照のこと。それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９０２０５０８３号、第２０１００１９９３８９号、第２０１１０１６７５２１号及び第２０１１０１８９７７５号も参照のこと。
【０１４０】
例えば、ＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーション及びマイクロインジェクションなどの技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入することができる。又は、ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ粒子ボンバードメントなどのバイオリスティック法を用いて植物組織に直接導入することができる（例えば、Kleinら(1987)、Nature、327巻、70〜73頁を参照）。或いは、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換により植物細胞に導入することができる（例えば、その全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９０１０４７００号を参照）。或いは、ＤＮＡ構築物は、適切なＴ−ＤＮＡ境界／フランキング領域と組み合せ、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacience）宿主ベクターに導入することができる。癌遺伝子の不活性化並びにバイナリーベクターの開発及び使用を含む、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacience）媒介形質転換技術は、科学文献に十分に記載されている。例えば、Horschら(1984)、Science、233巻、496〜498頁及びFraleyら(1983)、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA、80巻、4803頁を参照のこと。
【０１４１】
さらに、遺伝子移入は、リゾビウム属種（Rhizobium sp.）、ＮＧＲ２３４、アルファルファ根粒菌（Sinorhizoboium meliloti）、ミヤコグサ根粒菌（Mesorhizobium loti）、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス及びキャッサバベインモザイクウイルス及び／又はタバコモザイクウイルスなどの非アグロバクテリウム細菌又はウイルスを用いて達成することができる。例えば、Chungら(2006)、Trends Plant Sci.、11巻(1号)、1〜4頁を参照のこと。
【０１４２】
バイナリーＴ−ＤＮＡベクター（Bevan(1984)、Nuc. Acid Res.、12巻、8711〜8721頁）又は共培養法（Horschら(1985)、Science、227巻、1229〜1231頁）を用いて細胞を細菌により感染させる場合、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacience）宿主の病原性機能が、植物細胞ＤＮＡへの構築物及び隣接マーカーを含むＴ鎖の挿入を誘導する。一般的に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換システムを用いて、双子葉植物を遺伝子工学的に改変する（Bevanら(1982)、Ann. Rev. Genet、16巻、357〜384頁、Rogersら(1986)、Methods Enzymol.、118巻、627〜641頁）。アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換システムは、単子葉植物及び植物細胞にＤＮＡを移入することに加えて、形質転換するためにも用いることができる。米国特許第５，５９１，６１６号、Hernalsteenら(1984)、EMBO J、3巻、3039〜3041頁、Hooykass-Van Slogterenら(1984)、Nature、311巻、763〜764頁、Grimsleyら(1987)、Nature、325巻、1677〜179頁、Boultonら(1989)、Plant Mol. Biol.、12巻、31〜40頁及びGouldら(1991)、Plant Physiol.、95巻、426〜434頁を参照のこと。
【０１４３】
代替遺伝子移入及び形質転換法は、裸ＤＮＡのカルシウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はエレクトロポレーション媒介性取込み（Paszkowskiら(1984)、EMBO J、3巻、2717〜2722頁、Potrykusら(1985)、Molec. Gen. Genet.、199巻、169〜177頁、Frommら(1985)、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、82巻、5824〜5828頁及びShimamoto(1989)、Nature、338巻、274〜276頁）及び植物組織のエレクトロポレーション（D'Halluinら(1992)、Plant Cell、4巻、1495〜1505頁）によるプロトプラスト形質転換を含むが、これらに限定されない。植物細胞形質転換のさらなる方法は、マイクロインジェクション、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））媒介ＤＮＡ取込み（Kaepplerら(1990)、Plant Cell Reporter、9巻、415〜418巻）及びマイクロプロジェクタイルボンバードメント（Kleinら(1988)、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、85巻、4305〜4309頁及びGordon-Kammら(1990)、Plant Cell、2巻、603〜618頁参照）を含む。
【０１４４】
開示した方法及び組成物は、外因性配列をＭＤＨ遺伝子に挿入するために用いることができる。植物ゲノムに導入された導入遺伝子の発現がその組込み部位に決定的に依存するので、これは有用である。したがって、例えば、除草剤耐性、昆虫抵抗性、栄養素、抗生物質又は治療用分子をコードする遺伝子を標的組換えにより、それらの発現に有利な植物ゲノムの領域に挿入することができる。
【０１４５】
上述の形質転換技術のいずれかにより作製される形質転換植物細胞は、形質転換遺伝子型及びひいては所望の表現型を有する全植物を再生するために培養することができる。そのような再生技術は、組織培養増殖培地中の特定の植物ホルモンの操作に依拠し、一般的に所望のヌクレオチド配列とともに導入された殺生物及び／又は殺草マーカーに依拠している。培養プロトプラストからの植物の再生は、Evansら、「Protoplasts Isolation and Culture」in Handbook of Plant Cell Culture、124〜176頁、Macmillian Publishing Company、New York、1983及びBinding、Regeneration of Plants、Plant Protoplasts、21〜73頁、CRC Press、Boca Raton、1985に記載されている。再生はまた、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚又はその一部から得ることができる。そのような再生技術は、一般的にKleeら(1987)、Ann Rev. of Plant Phys.、38巻、467〜486頁に記載されている。
【０１４６】
植物細胞に導入された核酸は、本質的にあらゆる植物に所望の形質を付与するために用いることができる。本開示の核酸構築物及び上述の様々な形質転換法を用いて本明細書で述べた所望の生理学的及び農学的特性を得るために、様々な植物及び植物細胞系を遺伝子工学的に改変することができる。好ましい実施形態において、遺伝子工学的改変の標的植物及び植物細胞は、穀類（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、キビ、オオムギ）、果菜類（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、砂糖大根、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）、顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、球果植物及びマツ（例えば、マツ、モミ、トウヒ）、ファイトレメディエーションに用いる植物（例えば、重金属蓄積植物）、油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）及び実験の目的のために用いる植物（例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis））を含む作物などの単子葉及び双子葉植物を含むが、これらに限定されない。したがって、開示した方法及び組成物は、アスパラガス属（Asparagus）、カラスムギ属（Avena）、アブラナ属（Brassica）、カンキツ属（Citrus）、スイカ属（Citrullus）、トウガラシ属（Capsicum）、カボチャ属（Cucurbita）、ニンジン属（Daucus）、ムカシヨモギ属（Erigeron）、グリシン属（Glycine）、ゴシッピウム属（Gossypium）、オオムギ属（Hordeum）、アキノゲシ属（Lactuca）、ドクムギ属（Lolium）、トマト属（Lycopersicon）、リンゴ属（Malus）、キャッサバ属（Manihot）、タバコ属（Nicotiana）、オオアラセイトウ属（Orychophragmus）、イネ属（Oryza）、ワニナシ属（Persea）、インゲンマメ属（Phaseolus）、エンドウ属（Pisum）、ナシ属（Pyrus）、サクラ属（Prunus）、ダイコン属（Raphanus）、ライムギ属（Secale）、ナス属（Solanum）、モロコシ属（Sorghum）、コムギ属（Triticum）、ブドウ属（Vitis）、ササゲ属（Vigna）及びトウモロコシ属（Zea）の種を含むが、これらに限定されない広範囲の植物にわたる用途を有する。
【０１４７】
植物細胞に導入される核酸の導入は、本質的にあらゆる植物に所望の形質を付与するために用いることができる。特性の実施形態において、植物細胞におけるＭＤＨ発現／機能の変化は、果実収量の増加、植物（若しくは植物の果実）のバイオマスの増加、果肉のより高い含量、集中的実止り（concentrated fruit set）、より大きな植物体、新鮮重量の増加、乾燥重量の増加、固形分含量の増加、収穫時のより高い総重量、作物の色の強さ及び／又は均一性の増大、化学物質（例えば、油、脂肪酸、炭水化物、タンパク質）の特性の変化等を有する植物をもたらす。
【０１４８】
当業者は、外因性配列を植物細胞に一過性に組み込むことができることを認識する。外因性ポリヌクレオチド配列の導入は、配列が導入された植物細胞の細胞機構を利用することができる。植物細胞に一過性に組み込まれるＺＦＮを含む外因性ポリヌクレオチド配列の発現は、インデル、反転又は挿入を同定し、確認するために標的配列のゲノムＤＮＡを解析することによりアッセイすることができる。これらの種類の再配列は、ゲノムＤＮＡ配列内の標的部位の切断及びその後のＤＮＡ修復によってもたらされる。さらに、外因性ポリヌクレオチド配列の発現は、当業者に公知のマーカー遺伝子発現の試験を可能にする方法を用いてアッセイすることができる。マーカー遺伝子の一過性発現は、様々な植物、組織及びＤＮＡ送達システムを用いて報告された。一過性解析システムは、対象の植物種を用いる一過性植物アッセイにおける組織のエレクトロポレーション又は粒子ボンバードメントによる直接遺伝子送達を含むが、これに限定されない。そのような一過性システムは、様々な組織源からのプロトプラストのエレクトロポレーション又は対象の特定の組織の粒子ボンバードメントを含むであろうが、これらに限定されない。本開示は、部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）を評価し、ＭＤＨ標的遺伝子内の突然変異を導入するための一過性発現システムの使用を含む。適切な送達システムにより一過性に試験することが想定される植物組織の例は、葉基組織、カルス、子葉、根、胚乳、胚、花組織、花粉及び表皮組織を含むであろうが、これらに限定されない。
【０１４９】
当業者は、外因性ポリヌクレオチド配列を遺伝子導入植物に安定に組み込むことができることを認識する。外因性ポリヌクレオチド配列が作動可能であることが確認されたならば、それは、有性交配により他の植物に導入することができる。交配させる種によって、多くの標準的な育種技術を用いることができる。
【０１５０】
形質転換植物細胞、カルス、組織又は植物は、形質転換ＤＮＡに存在するマーカー遺伝子によりコードされる形質について遺伝子工学的改変植物物質を選択又はスクリーニングすることによって同定し、単離することができる。例えば、選択は、遺伝子構築物の形質転換が耐性を付与する阻害量の抗生物質又は除草剤を含む培地上で遺伝子工学的改変植物物質を増殖させることによって行う。さらに、形質転換植物及び植物細胞は、組換え核酸構築物に存在し得る可視マーカー遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、Ｂ又はＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニングすることにより同定することもできる。そのような選択及びスクリーニングの方法は、当業者に周知である。
【０１５１】
物理学的及び生化学的方法も、安定に挿入された遺伝子構築物を含む植物若しくは植物細胞形質転換体、又は部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）の一過性発現により生ずる標的遺伝子改変ゲノムＤＮＡを含む植物細胞を同定に用いることができる。これらの方法は、１）組換えＤＮＡ挿入の構造を検出し、決定するためのサザン解析又はＰＣＲ増幅、２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出し、検討するためのノーザンブロット、Ｓ１  ＲＮアーゼプロテクション、プライマー伸長又は逆転写酵素ＰＣＲ増幅、３）そのような遺伝子産物が遺伝子構築物によりコードされる場合、酵素又はリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ、４）遺伝子構築物産物がタンパク質である場合、タンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット法、免疫沈降又は酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を含むが、これらに限定されない。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色法及び免疫染色法などのさらなる技術も特定の植物器官及び組織における組換え構築物の存在又は発現を検出するために用いることができる。すべてのこれらのアッセイを行う方法は、当業者に周知である。
【０１５２】
本明細書で開示した方法を用いた遺伝子操作の効果は、対象の組織から単離されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の例えば、ノーザンブロットにより観測することができる。一般的に、ｍＲＮＡが存在する又はｍＲＮＡの量が増加した場合、対応する導入遺伝子が発現していると推測することができる。遺伝子及び／又はコードされたポリペプチド活性を測定する他の方法を用いることができる。用いる基質及び反応生成物又は副生成物の増加又は減少を検出する方法によって、異なる種類の酵素アッセイを用いることができる。さらに、発現したポリペプチドのレベルは、免疫化学的に、すなわち、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び電気泳動検出アッセイ（染色又はウエスタンブロットを用いる）などの当業者に周知の他の抗体ベースのアッセイにより測定することができる。１つの非限定的な例として、ＥＬＩＳＡアッセイを用いたＡＡＤ−１及びＰＡＴタンパク質の検出は、その参考資料がその全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９００９３３６６号に記載されている。導入遺伝子は、植物の一部の組織又は一部の発育段階で選択的に発現させることができ、或いは、導入遺伝子は、実質的にすべての植物組織で、実質的にその全ライフサイクルに沿って発現させることができる。しかしながら、コンビナトリアル発現モードも適用できる。
【０１５３】
本開示は、上述の遺伝子導入植物の種子も含み、種子は、導入遺伝子又は遺伝子構築物を有する。本開示は、上述の遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞系又は細胞をさらに含み、前記子孫、クローン、細胞系又は細胞は、導入遺伝子又は遺伝子構築物を有する。
【０１５４】
融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）及び融合タンパク質をコードする発現ベクターは、遺伝子の調節、標的切断及び／又は組換えのために植物に直接投与することができる。特定の実施形態において、植物は、複数のパラロガスＭＤＨ標的遺伝子を含む。したがって、植物における１つ又は複数のこれらのパラロガス遺伝子を標的とするために、１つ又は複数の異なる融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする発現ベクターを植物に投与することができる。
【０１５５】
有効量の投与は、処理する植物細胞と最終的に接触するように融合タンパク質を導入するために通常用いられる経路のいずれかにより行う。ＺＦＰは、好ましくは許容される担体を用いて、適切な方法で投与する。そのようなモジュレーターを投与する適切な方法は、利用可能であり、当業者に周知であり、複数の経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、しばしば他の経路よりも迅速且つ効果的な反応をもたらし得る。
【０１５６】
担体も用いることができ、組成物を投与するために用いられる個々の方法によって、またさらに投与される個々の組成物によっても一部、決定される。したがって、利用できる担体の多種多様な適切な製剤が存在する。
（実施例）
【実施例１】
【０１５７】
トマト（Solanum lycopersicum）のミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍＭＤＨ）標的遺伝子の特徴付け
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子は、生物体内に複数のパラロガスコピーとして一般的に存在する。生物体内に類似のパラロガスリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子配列が存在するにもかかわらず、単一ミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍＭＤＨ）遺伝子配列が同定され、トマト（Solanum lycopersicum）から単離された。最初に、文献に記載されていた公知のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子配列の部分を比較することによっていくつかのポリヌクレオチド配列データベースからミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍＭＤＨ）遺伝子配列が同定されたが、ポリヌクレオチド配列データベースには多くの異なるポリヌクレオチド配列が含まれていた。配列アライメントの多くの比較の後、２種のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子配列、すなわち、ｍＭＤＨ配列（以下に述べる）及びグリコソームＭＤＨ（ｇＭＤＨ）配列（受託番号：ＡＹ７２５４７６）の完全な配列が同定された。配列データベースのスクリーニング努力により、Ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓにおけるトマトゲノム配列データベース可用性オンライン（Bombarelyら(2011)、Nuc Acids Res.(Database issue):D1149-55も参照）から受託番号：Ｓｏｌｙｃ０７ｇ０６２６５０（配列番号１）としてｍＭＤＨ遺伝子座が同定された。
【０１５８】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定されたｍＭＤＨ遺伝子配列を用いて、２つの異なるトマト遺伝子型Ｍ８２及びＭｏｎｅｙｍａｋｅｒからのｍＭＤＨ遺伝子配列を確認した。同定されたｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｍＭＤＨ遺伝子配列に基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを設計した。約６ｋｂのＰＣＲ断片を各トマト遺伝子型から単離し、クローニングし、配列を決定した。驚くべきことに、わずかな差が一般的に予想されるので、トマト遺伝子型からの配列決定ｍＭＤＨ遺伝子は、最初にｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定され、単離されたｍＭＤＨ遺伝子座との差を示さなかった。
【０１５９】
単離された新規ｍＭＤＨ遺伝子配列をさらなる亜鉛フィンガー試薬の設計に用いた。
【実施例２】
【０１６０】
ミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍＭＤＨ）遺伝子に結合するように設計された亜鉛フィンガータンパク質の製造
トマト（S. lycopersicum）ｖ．Ｍ８２のｍＭＤＨ遺伝子コーディング領域（図１参照）における様々な機能ドメインをコードするＤＮＡ配列に対する亜鉛フィンガータンパク質を以前に記載されたように設計した。例えば、Urnovら(2005)、Nature、435巻、646〜651頁を参照のこと。具体例としての標的配列及び認識らせんを表１Ａ（認識らせん領域設計）及び表１Ｂ（標的部位）に示す。表１Ｂにおいて、ＺＦＰ認識らせんにより接触される標的部位におけるヌクレオチドを大文字で示し、非接触ヌクレオチドを小文字で示す。
【０１６１】
【表１】
0006352250.tif 000002
【０１６２】
【表２】
0006352250.tif 000003
【０１６３】
ｍＭＤＨ亜鉛フィンガー設計を、ＣＣＨＣ構造を有する少なくとも１つのフィンガーを有するタンパク質をコードするベクターに組み込んだ。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１８２３３２号を参照のこと。特に、各タンパク質における最後のフィンガーは、認識らせんのＣＣＨＣ骨格を有していた。非古典的亜鉛フィンガーコード配列をＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Wahら(1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95巻、10564〜10569頁の配列のアミノ酸３８４〜５７９）に４アミノ酸ＺＣリンカー及びトウモロコシ（Zea mays）由来のｏｐａｑｕｅ−２核局在シグナルを介して融合させて、ｍＭＤＨ亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成した。Shuklaら(2009)、Nature、459巻、437〜441頁に記載されているような２Ａリボソームシャッタリングシグナルを用いたバイシストロン性発現構築物における融合タンパク質の発現は、ＣｓＶＭＴプロモーターのような比較的に強く、構成的及び異所性プロモーター又はトマトＡＡ６（Solanum lycopersicum AA6）（ＡＡ６）プロモーターに由来するプロモーターにより促進された。
【０１６４】
活性ヌクレアーゼを同定することが以前に示された発芽酵母に基づくシステムを用いて最適な亜鉛フィンガーを切断活性について検証した。例えば、米国特許出願公開第２００９０１１１１１９号、Doyonら(2008)、Nat Biotechnol.、26巻、702〜708頁、Geurtsら(2009)、Science、325巻、433頁を参照のこと。ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために種々の機能ドメインに対する亜鉛フィンガーを選択した。想定されるｍＭＤＨゲノムポリヌクレオチド標的部位に結合するように設計し、製造し、試験した多くのＺＦＮのうち、４つのＺＦＮが高レベルのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を有すると確認され、さらなる実験のために選択された。表１Ａを参照のこと。これらの４つのＺＦＮは、植物体における４つの固有のｍＭＤＨゲノムポリヌクレオチド標的部位に効率よく結合し、切断することができると特徴付けられた。
【０１６５】
図２Ａ及び２Ｂ（配列番号２）に４つのＺＦＮ対のＺＦＮポリヌクレオチド結合／標的部位と関連付けたｍＭＤＨ遺伝子座のゲノム構成を示す。第１のＺＦＮ対（１０７８３０Ｌ／１０７８３０Ｒ；図２Ａでそれぞれ「８３０Ｌ」及び「８３０Ｒ」と呼ぶ）は、エクソン１内に結合し、第２のＺＦＮ対（１０７８３２Ｌ／１０７８３２Ｒ；図２Ａでそれぞれ「８３２Ｌ」及び「８３２Ｒ」と呼ぶ）は、エクソン３内に結合し、第３のＺＦＮ対（１０７８３３Ｌ／１０７８３３Ｒ；図２Ａでそれぞれ「８３３Ｌ」及び「８３３Ｒ」と呼ぶ）は、エクソン４内に結合し、第４のＺＦＮ対（１０７８３５Ｌ／１０７８３５Ｒ；図２Ａでそれぞれ「８３５Ｌ」及び「８３５Ｒ」と呼ぶ）は、エクソン６内に結合する。
【実施例３】
【０１６６】
トマトにおける発現のための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ構築物
酵母アッセイを用いて同定し、実施例２で述べた４つの具体例としての亜鉛フィンガーヌクレアーゼのＺＦＮ発現構築物を含むプラスミドベクターを当技術分野で公知の技能及び技術を用いて設計し、完成した。各亜鉛フィンガーをコードする配列を、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの上流に配置したｏｐａｑｕｅ−２核局在シグナル（Maddaloniら(1989)、Nuc. Acids Res.、17巻(18号)、7532頁）をコードする配列に融合させた。
【０１６７】
次に、ｏｐａｑｕｅ−２核局在シグナル：：亜鉛フィンガーヌクレアーゼ融合配列を相補性ｏｐａｑｕｅ−２核局在シグナル：：亜鉛フィンガーヌクレアーゼ融合配列と対にした。したがって、各構築物は、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルスの２Ａ配列（Mattionら(1996)、J. Virol.、70巻、8124〜8127頁）によって分離された２つのｏｐａｑｕｅ−２核局在シグナル：：亜鉛フィンガーヌクレアーゼ融合配列からなる単一読み取り枠を含んでいた。ＺＦＮコーディング配列の発現は、高度に発現する構成的ＡＡ６プロモーター（米国特許出願公開第２００９／０３２８２４８号）により促進され、ｎｏｓ３’ｐｏｌｙＡ非翻訳領域（Bevanら(1983)、Nucl. Acid Res.、11巻、369〜385頁）により隣接されていた。
【０１６８】
得られた４つのプラスミド構築物ｐＫＧ７４７９（ＺＦＮ１０７８３０Ｌ／Ｒ構築物を含む）、ｐＫＧ７４８０（ＺＦＮ１０７８３２Ｌ／Ｒ構築物を含む）、ｐＫＧ７４８１（ＺＦＮ１０７８３３Ｌ／Ｒ構築物を含む）及びｐＫＧ７４８２（ＺＦＮ１０７８３５Ｌ／Ｒ構築物を含む）は、制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定により確認された。図３〜６を参照のこと。
【実施例４】
【０１６９】
大規模プラスミド単離
プロトプラストトランスフェクション用の大量のＤＮＡを以下のプロトコールを用いて作製するために大規模プラスミドＤＮＡ単離プロトコールを用いた。最初に、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２５０ｍＬのＬＢ培地に実施例３で上述した亜鉛フィンガーヌクレアーゼ構築物の１つを含む大腸菌（Escherichia coli）の株ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を３７℃で一夜接種した。次いで、培養を６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られたペレットを２０ｍＬの滅菌ＧＴＥ緩衝液（１リットル当たり：１０ｇのグルコース、２５ｍＬのｐＨ８．０の１Ｍトリス及び２０ｍＬのｐＨ８．０の０．５Ｍ  ＥＤＴＡ）及び２０ｍｇのリソザイム（Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）に再懸濁した。次に、３０ｍＬのＮａＯＨ−ＳＤＳ緩衝液（２００ｍＭ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ（重量／容量））を加え、ボルテックスせずに十分に混合し、氷上で３分間インキュベートした。最後に、２２．５ｍＬの酢酸カリウム緩衝液（２９４．５ｇ／Ｌ）を加え、試料を氷上で１０分間インキュベートした。得られたスラリーを遠心分離し（５℃で６，０００ｒｐｍで２５分間）、上清を滅菌フィルターペーパーに通した後に収集した。
【０１７０】
次に、６０ｍＬのイソプロパノール（１容）をろ液上清に加え、室温で１０分間インキュベートした。次いで、混合物を遠心分離し（室温で６，０００ｒｐｍで３０分間）、上清を捨て、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。２回目の遠心分離（室温で６，０００ｒｐｍで５分間）の後、上清を除去し、ペレットを４ｍＬのＴＥ（１０ｍMトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解し、４μｌのＲＮアーゼ溶液を加え、溶液を室温で２０分間インキュベートした。次いで、試料を１２ｍＬ管に移し、４００μｌのｐＨ５．２の３Ｍ  ＮａＯＡｃ及び４ｍＬのフェノールを加え、ボルテックスミキサーで混合し、次いで、遠心分離した（室温で４，０００ｒｐｍで１０分間）。遠心分離済み試料の上相を新たな管に収集し、４ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加え、ボルテックスミキサーで混合し、遠心分離した（室温で４，０００ｒｐｍで１０分間）。再び、遠心分離済み試料の上相を収集し、８ｍＬの無水エタノールを加え、−２０℃で３０分間インキュベートした。
【０１７１】
さらに１回の遠心分離（５℃で４，０００ｒｐｍで３０分間）の後にペレットを７０％エタノールですすぎ、遠心分離し（室温で４，０００ｒｐｍで５分間）、次いで、フローキャビネット中で風乾した。ペレットを４ｍＬのＭＩＬＬＩ−Ｑ（商標）精製水に溶解し、アリコートを１．５ｍＬエッペンチューブに入れた。次に、０．５ｍＬのＰＥＧ溶液（４０％ポリエチレングリコール６，０００（重量／容量）、ＭｇＣｌ２：６Ｈ２Ｏ、フィルター（０．２μｍ））を加え、室温で３０分間インキュベートし、チューブを遠心分離した（１４，０００ｒｐｍで１０分間）。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、次いで、遠心分離した（１４，０００ｒｐｍで５分間）。この処置を２回反復した。上清を捨て、ペレットを０．５ｍＬの最終容量のＭＩＬＬＩ−Ｑ（商標）水に溶解した。ＮＡＮＯ  ＤＲＯＰ（商標）装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いてプラスミドＤＮＡ濃度を測定した。
【実施例５】
【０１７２】
トマトプロトプラストの単離及びトランスフェクション
トマト葉プロトプラストの単離及び再生は、以前に記載され（Shahin(1985)、Theor. Appl. Genet.、69巻、235〜240頁、Tanら(1987)、Theor. Appl. Genet.、75巻、105〜108頁、Tanら(1987)、Plant Cell Rep.、6巻、172〜175頁）、このプロトコールのために用いることができる具体例としての溶液及び培地は、これらの刊行物に見いだされる。手短に述べると、トマト（Solanum lycopersicum）種子を０．１％次亜塩素酸ナトリウムで滅菌し、２５℃及び５０〜７０％の相対湿度で２，０００ルクスでの１６／８時間の光周期を用いて無菌ＭＳ２０培地上でｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させた。次に、１ｇの新たに収穫した葉を５ｍＬのＣＰＷ９Ｍ液体培地を含む皿に入れた。外科用メスの刃を用いて収穫した葉を主葉柄に垂直に切断した。葉の切片は、幅が約１ｍｍであった。
【０１７３】
葉切片を２５ｍＬの酵素溶液（２％セルロースＯＮＯＺＵＫＡ  ＲＳ（商標）、０．４％マセロザイムＯＮＯＺＵＫＡ  Ｒ１０（商標）、２，４−Ｄ（２ｍｇ／ｍＬ）、ＮＡＡ（２ｍｇ／ｍＬ）、ＢＡＰ（２ｍｇ／ｍＬ）を含むＣＰＷ９Ｍ、ｐＨ５．８）を含む新鮮なプレートに移し、暗所で２５℃で一夜消化を進めた。それをオービタルシェーカー（４０〜５０ｒｐｍ）上に１時間置くことによってプロトプラストを取り除いた。プロトプラストを５０μｍふるいに通すことによってプロトプラストを細胞デブリから分離し、ふるいをＣＰＷ９Ｍで２回洗浄した。次に、プロトプラストを重力の８５倍（ｘｇ）で遠心分離し、上清を捨て、ペレットを半容のＣＰＷ９Ｍ溶液に溶解した。
【０１７４】
最後に、プロトプラストを３ｍＬのＣＰＷ９Ｍ溶液に溶解し、次いで、層状の界面が形成され、２つの溶液の間に混合が起こらないように、３ｍＬのＣＰＷ１８Ｓを注意深く加えた。プロトプラストを重力の８５倍で１０分間遠心分離し、相間層に浮遊している生存プロトプラストを長パスツールピペットを用いて収集した。ＣＰＷ９Ｍ培地をさらに加えてプロトプラストの容積を１０ｍLに増加させ、回収されたプロトプラストの数を血球計算板で測定した。プロトプラスト懸濁液を５℃で重力の８５倍で１０分間遠心分離した。上清を捨て、プロトプラストペレットをＣＰＷ９Ｍ洗浄培地中に１０６ｍL−１の最終濃度に再懸濁した。
【０１７５】
次いで、ＺＦＮ構築物による単離プロトプラストのトランスフェクションを行った。１０ｍＬ管中で、２５０μＬのプロトプラスト懸濁液及びプラスミドＤＮＡ（２０μｇ又は３０μｇの濃度で用いた）並びに２５０μｌのＰＥＧ溶液（４０％ＰＥＧ４０００、０．１Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）２、０．４Ｍマンニトール）を緩やかであるが、十分に混合した。室温で２０分間のインキュベーションの後、５ｍＬの冷０．２７５Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）２を１滴ずつ加えた。プロトプラスト懸濁液を４℃で重力の８５倍で１０分間遠心分離した。遠心分離の後、上清を捨て、プロトプラストを４ｍＬの液体Ｋ８ｐ培地に再懸濁した。プロトプラストを暗所で２８℃で４８時間インキュベートし、次いで、ゲノムＤＮＡの単離のために遠心分離により収集した。
【０１７６】
トマト細胞プロトプラスト中のＺＦＮの活性化は、上述のプロトコールを用いてトマトプロトプラストをトランスフェクトすることにより試験した。多数のトマトプロトプラストを単離し、ＰＥＧ媒介トランスフェクションプロトコールを用いてプラスミドＤＮＡをプロトプラストの細胞に導入した。一般的に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むリポーター構築物のようなリポーター構築物を用いる場合、最大８０％のトランスフェクション率が認められる。トマト細胞に導入された多数のプラスミドコピーは、プラスミドによりコードされる大量のタンパク質を産生する。この結果、ＧＦＰタンパク質を発現したトマト細胞は、トランスフェクション後４８時間まで検出できる。しかし、４８時間以内に細胞中のプラスミドＤＮＡが消失するので、導入された構築物の発現は、一過性である。
【実施例６】
【０１７７】
トマトプロトプラストにおけるＺＦＮ活性
トマトプロトプラスト中のＺＦＮ構築物の発現及びトマトゲノムＤＮＡのｍＭＤＨ遺伝子座を切断するＺＮＦの活性を測定するために、フットプリント解析を次のように完了した。トマトプロトプラストを単離し、次の４つの具体例としてのＺＦＮ構築物の１つを運ぶプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした：ｐＫＧ７４７９（ＺＦＮ１０７８３０Ｌ／Ｒ構築物を含む）、ｐＫＧ７４８０（ＺＦＮ１０７８３２Ｌ／Ｒ構築物を含む）、ｐＫＧ７４８１（ＺＦＮ１０７８３３Ｌ／Ｒ構築物を含む）又はｐＫＧ７４８２（ＺＦＮ１０７８３５Ｌ／Ｒ構築物を含む）。細胞内に導入された後、ＺＦＮが発現し、ＺＦＮ酵素が特異的なｍＭＤＨ標的部位におけるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導した。ＤＮＡ  ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路に関与するタンパク質により修復され、この修復過程は、時に誤りがちであり、ＤＳＢ導入部位における小挿入又は欠失（「インデル」）をもたらす。ＺＦＮ処理の後、ｍＭＤＨ標的部位をＰＣＲ増幅し、得られたインデルを高分解能融解（ＨＲＭ）曲線解析及び／又は配列決定を用いて検出し、定量した。
【０１７８】
トマトＭ８２品種のプロトプラスト（約２５０，０００個）を単離し、種々の濃度（２０又は３０μｇ）のｐＫＧ７４７９、ｐＫＧ７４８０、ｐＫＧ７４８１及びｐＫＧ７４８２プラスミドをトランスフェクトし、４８時間後に細胞を収集した。陰性対照として、ＡＡ６：：ＧＦＰ構築物を含むプラスミドを用いてトマトプロトプラストのトランスフェクションを実施した。次いで、ＤＮＥＡＳＹ  ＭＩＮＩ  ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて各試料からゲノムＤＮＡを単離し、ＤＮＡ濃度を測定した。各トランスフェクト済みプロトプラスト試料の、導入されたＺＦＮ構築物に対応する、関連標的部位をＨＥＲＣＵＬＡＳＥ  ＩＩ  ＦＵＳＩＯＮ  ＫＩＴ（商標）を用いて製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）の指示に従って増幅した。すべての標的部位をＨＥＲＣＵＬＡＳＥ  ＩＩ  ＦＵＳＩＯＮ  ＫＩＴ（商標）を用いて製造業者の指示に従って、ＧＦＰ対照構築物でトランスフェクトされた陰性対照試料から増幅した。ＰＣＲ増幅のために用いたプライマーを表２Ａ（ＰＣＲ解析）及び２Ｂ（ＨＲＭ解析）に示す。
【０１７９】
【表３】
0006352250.tif 000004
【０１８０】
【表４】
0006352250.tif 000005
【０１８１】
ＰＣＲ増幅産物をＰＣＲ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、５０ｎｇの精製ＤＮＡを、製造業者の指示に従ってＺＥＲＯ  ＢＬＵＮＴ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＫＩＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングするのに用いた。次に、２μｌのライゲーションミックスで大腸菌（Escherichia coli）ＯＮＥ−ＳＨＯＴ  ＴＯＰ１０コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の形質転換を起こさせ、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地上でコロニーを選択した。表２に示すＨＲＭプライマーを用いて製造業者の指示に従ってＨＥＲＣＵＬＡＳＥ  ＩＩ  ＦＵＳＩＯＮ  ＫＩＴ（商標）ＰＣＲ反応（最終容積５０μｌ）を行わせた。各組又はＰＣＲプライマーは、約２００ｂｐの断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物は、ＨＲＭ解析に用いた。
【０１８２】
ＨＲＭ解析の完結（completion）は、当技術分野公認の手順を用いて実施した。手短に述べると、ＰＣＲ産物を、非処理（無ＺＦＮ）ゲノムＤＮＡにおいて同じプライマーを用いて得られた野生型ＰＣＲ産物と１：１の比で混合した。ＳＹＢＲ（登録商標）緑色色素を加え、ＰＣＲ産物の融解曲線プロファイルをＲＯＣＨＥ  ＬＩＧＨＴ  ＣＹＣＬＥＲ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で測定した。野生型非処理ＰＣＲ産物と有意に異なっていた融解曲線を有するＰＣＲ産物を同定し、保存した。次いで、Ｍ１３Ｆ及びＭ１３Ｒプライマーを用いたＰＣＲ反応を、ＨＲＭ法を用いて同定された細菌クローンにおいて直接的に完結させ、得られたＰＣＲ産物を精製し、配列を決定した。この解析の結果を表３及び図７に示す。
【０１８３】
【表５】
0006352250.tif 000006
【０１８４】
示したように、インデルの形成がすべてのＺＦＮ標的部位で検出され、４つすべてのＺＦＮがトマトプロトプラストにおいて活性であることが実証された。所定のＺＦＮ構築物の効率の推定は、インデルを含む処理により産生されたＰＣＲ産物の数を計算することによって行うことができる。ＴＦＮ１０７８３０及び１０７８３２は、最高の数のインデルＰＣＲ産物（それぞれ４．１％及び５．５％）をもたらした。一方、ＺＦＮ１０７８３３及び１０７８３５については、インデルＰＣＲ産物の数は、有意により低かった（それぞれ２％及び０．７％）。ＧＦＰプラスミドで処理した対照トマトプロトプラストから得られたＰＣＲ産物におけるインデルの検出はされなかった。
【実施例７】
【０１８５】
ｍＭＤＨ遺伝子座における突然変異を含む植物の単離
トマトプロトプラストをトマト品種Ｍ８２及びＭｏｎｅｙｍａｋｅｒから単離し、ｐＫＧ７４７９、ｐＫＧ７４８０、ｐＫＧ７４８１及びｐＫＧ７４８２によるトランスフェクションを前述のように実施した。トランスフェクションからのトマト植物の再生のために、プロトプラストを最終的に２ｍＬのアルギン酸溶液（マンニトール９０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  １４０ｍｇ／Ｌ、アルギン酸Ｎａ  ２０ｇ／Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））に再懸濁し、反転により十分に混合した。この懸濁液から、１ｍＬの細胞をＣａ−寒天プレート（７２．５ｇ／Ｌマンニトール、７．３５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、８ｇ／Ｌ寒天）上に均一に重層し、重合させた。次いで、アルギン酸ディスクを４ｍＬのＫ８ｐ培地を含む４ｃｍペトリ皿に移し、暗所で２８℃で７日間生育させた。割り当てたインキュベーション時間の後、アルギン酸ディスクを薄いストリップに薄切し、ＧＭ−ＺＧ培地を含むプレート上に暗所で２８℃で３週間のせて、カルスの発育を促進した。この期間のインキュベーションの後に、個々のカルスをストリップから採取し、新鮮なＧＭ−ＺＧ培地上に配置し、光の当たるところで２５℃で生育させた。３週間後、カルスを新鮮なＧＭ−ＺＧ培地に移した。カルスが約２ｃｍのサイズに達するまで、この処置を２回反復した。
【０１８６】
次に、カルスを培地（ＭＳ２０−ＺＩ；ＭＳ２０＋２ｍｇ／Ｌゼアチン＋０．１ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ）に移して芽の形成を促進し、芽が形成されるまで移しを反復した。次いで、ＤＮＡの単離のために各芽から１つの葉を除去し、表２に示したプライマー及び前述のＰＣＲ反応を用いて関連ｍＭＤＨ標的部位を増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を精製し、配列を決定して、ｍＭＤＨ遺伝子座における突然変異を含んでいた芽を特定した。これらの根を発根培地（ＭＳ２０＋０．５ｍｇ／１ＩＢＡ）及び最終的に温室に移した。
【０１８７】
これらの実験におけるトマト植物のゲノムに生じた突然変異の要約を表４に示す。ＺＦＮ結合部位を下線付きで示し、欠失ヌクレオチド（−）を示す。アステリスクを示した植物識別番号は、ｍＭＤＨの両コピーにおける同じ突然変異を有し、記載した突然変異について同型接合性と判定された植物を示す。
【０１８８】
【表６】
0006352250.tif 000007
【０１８９】
繁殖力があった突然変異植物系を次いで親植物と交配し、Ｆ１種子を採取した。Ｆ１苗をスクリーニングして、親突然変異植物に存在したインデル突然変異を検出し、これらの植物を成熟するまで生育させ、自花受精させて、Ｆ２種子を生産させた。Ｆ２種子から生育するトマト植物は、トマト収量に対する突然変異の影響を判定するために用いることができる。
【実施例８】
【０１９０】
ｍＭＤＨ遺伝子座における突然変異の分子的及び生化学的確認
各突然変異植物系からのＦ２種子を発芽させ、突然変異部位を増幅することにより１２の苗の遺伝子型を判定し、ＰＣＲ産物の配列を決定して、苗が野生型配列を有するのか、又はインデル突然変異について異型接合性若しくは同型接合性であるのかを判定した。次いで各型（合計６）の２つの苗を成熟するまで生育させ、果実をつけさせた（set fruit）。各植物から組織試料を採取し、ｍＭＤＨタンパク質レベル及びｍＭＤＨ活性に対する種々の突然変異の影響を測定した。ｍＭＤＨタンパク質レベルは、ウエスタンブロッティングを用いて半定量的に測定し、ｍＭＤＨ活性は、トマト植物果実収量を測定することにより測定した。
【０１９１】
ｍＭＤＨタンパク質レベルを測定するために、ｍＭＤＨエピトープ（ＲＳＥＶＡＧＦＡＧＥＥＱＬＧＱＡ、配列番号６２）によるウサギの接種により産生させ、大腸菌（E. coli）において過剰発現させた組換えｍＭＤＨタンパク質を用いて試験したポリクローナル抗ｍＭＤＨ抗体を植物由来のタンパク質の検出のために用いた。ｍＭＤＨは、遺伝子導入及び対照植物から得られた葉試料中に検出された。遺伝子導入及び対照植物からの植物抽出物を、ＤＴＴを含むＮＵＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともに９０℃で１０分間インキュベートし、ＭＥＳ分離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてアクリルアミドプレキャストゲルで電気泳動に分離したｍＭＤＨタンパク質標準とともに分析した。タンパク質は、次いでＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製造業者のプロトコールを用いてニトロセルロース膜上に電気的に転移させた。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックし、０．１％ＰＢＳＴで洗浄した後、抗ｍＭＤＨ抗血清と続いてヤギ抗ウサギホスファターゼによりｍＭＤＨタンパク質を検出した。検出されたタンパク質は、等量で混合されたＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｏｌ  Ｅｎｈａｍｃｅｒ（商標）及びＳｔａｂｌｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて化学発光により視覚化した。
【０１９２】
ｍＭＤＨタンパク質の存在を検出し、その分子量を測定するためにＦ２突然変異植物ファミリー上でウエスタンブロットアッセイを完了した。全長ｍＭＤＨタンパク質は、インデル突然変異を欠くＦ２対照植物及びインデル突然変異について異型接合性のＦ２植物において検出することができた。しかし、ｍＭＤＨ読取り枠を崩壊させたインデル突然変異について同型接合性であったＦ２植物においてはｍＭＤＨタンパク質のシグナルを検出することができなかった。同型接合性インデルを含んでいたＦ２植物は、切断型ｍＭＤＨタンパク質配列を形成した。ｍＭＤＨタンパク質配列は、成熟前の停止コドンを導入することにより、又はｍＭＤＨタンパク質を短縮することにより切断された。切断型ｍＭＤＨタンパク質は、より低い分子量を有するバンドとしてウエスタンブロット上に存在すると予期された。しかし、そのようなより小さなバンドは検出されなかった。これらの結果から、切断型タンパク質が細胞中で分解したことが示唆される。保存されたＮＡＤ結合ドメイン内の１つ、２つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失又は変化をもたらした同型接合性インデル突然変異を含んでいた（すなわち、ｍＭＤＨタンパク質が切断されていなかった）Ｆ２突然変異植物１０７８３２＿８−３及び１０７８３２＿９−６は、ウエスタンブロットアッセイにより示されたように全長ｍＭＤＨタンパク質を産生した。
【０１９３】
Ｆ２植物におけるｍＭＤＨ活性を測定するために生化学的アッセイを完了した。ｍＭＤＨタンパク質は、リンゴ酸及びＮＡＤ＋のオキサロ酢酸及びＮＡＤＨへの並びに逆の変換を触媒する。変換されたＮＡＤＨは、Ｏ．Ｄ．３４０ｎｍに吸収極大を示すが、この波長ではＮＡＤ＋は、無視できる吸光度を有する。したがって、試料のｍＭＤＨ活性は、ＮＡＤＨのオキサロ酢酸の存在下でのＮＡＤ＋への変換率を追跡することにより測定することができる。直径が約２ｃｍの５つの葉パンチを個々のＦ２植物の若い葉から採取し、抽出緩衝液（１０ｍＭジチオトレイトール、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液）中で４℃で破砕した。葉抽出物を冷却遠心機で１０，０００ｇで２０分間遠心分離し、上清を傾斜し、酵素調製物をアッセイに用いるまで氷上に置いた。アッセイのために、１．５ｍｌのアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐH８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を管にピペットで移し、１００μｌの酵素抽出物を加え、水浴中で３７℃で５分間インキュベートした。カクテルを石英キュベットに分注し、５０μｌのＮＡＤＨを加え（トリス−ＨＣｌ、ｐH８．０中６ｍＭ  ＮＡＤＨ）、３４０ｎｍに設定した分光光度計に入れた。初期の読み取り値及びその後の吸光度の低下を１５秒間隔で３分まで記録し、これらの読み取り値を対照とした。次に、５０μｌのオキサロ酢酸を加え（蒸留水に新たに調製した０．３Ｍオキサロ酢酸）、吸光度を３分間記録した。フレーム及びヌルインデル突然変異について分離したＦ２系におけるｍＭＤＨ活性を図８に示す。
【０１９４】
インデル突然変異（−３ｂｐ）について分離された系統１０７８３２＿９−６に由来するＦ２植物は、ウエスタンブロット上に全長ｍＭＤＨタンパク質を産生した。生化学的アッセイにおいては、ｍＭＤＨ活性は、試験したすべての植物で同様であった。生化学的アッセイの結果は、試験したすべての植物で同じ傾向を示した。試験した植物は、インデル突然変異を含み、単一アミノ酸を欠くｍＭＤＨタンパク質を産生したヌル、異型接合性及び同型接合性植物を含んでいた。したがって、アミノ酸の喪失は、生化学的アッセイにおけるｍＭＤＨ活性に負の影響を与えなかった。それにもかかわらず、生化学的アッセイがｍＭＤＨ活性の中等度の低下を検出するのに十分な感度を有さない可能性があるので、生化学的効率がやはりわずかに損なわれる可能性がある。系統１０７８３２＿１０−２に由来し、インデル突然変異（−２ｂｐ）について分離するＦ２植物も生化学的アッセイを用いて試験した。このインデル突然変異についてヌル及び異型接合性であった植物は、同様なレベルのｍＭＤＨ活性をもたらした。インデル突然変異について同型接合性であった植物は、有意に低下したｍＭＤＨ活性を示した。ｍＭＤＨタンパク質のウエスタンブロットは、これらの植物に検出されなかった。
【実施例９】
【０１９５】
トマト果実収量に対するｍＭＤＨ遺伝子座における突然変異の影響
トマト果実収量に対する前述の突然変異の影響を判定するために、最初のトマトトラスのすべての果実を収穫し、Centenoら(2011)、Plant Cell、23巻、162〜184頁に記載されている方法を用いてトマトの数及び各トマトの新鮮重量を測定した。
【０１９６】
インデル突然変異体１０７８３２＿９−６（−３ｂｐ）に由来するＦ２植物において、突然変異植物（異型接合性又は同型接合性）の最初のトラスから得られた各トマトの平均新鮮重量及び収穫されたすべてのトマトの総新鮮重量を測定した。同型接合性１０７８３２＿９−６トマト植物から得られたトマトの新鮮重量は、対照植物（突然変異を含まない）から得られたトマトの新鮮重量より大きかった。図９を参照のこと。１０７８３２＿９−６トマト植物におけるｍＭＤＨ遺伝子座に発生させた突然変異は、果実収量を増加させたタンパク質活性の低下をもたらした。対照的に、ｍＭＤＨ読み取り枠の崩壊をもたらしたインデル突然変異について異型接合性であったトマト植物は、成長の低下及びより低い総果実収量を示した。したがって、植物において測定されたｍＭＤＨ活性の低下は、総トマト果実収量の増加をもたらすインデル突然変異について同型接合性である。
【実施例１０】
【０１９７】
酵素反応速度及び活性に対するｍＭＤＨ遺伝子座における突然変異の影響
前述のようにＺＦＮ切断により発生するトマトゲノムにおけるｍＭＤＨ酵素の突然変異を、トマト（配列番号１）、ダイズ（配列番号１２５）及びトウモロコシ（配列番号１２６）の天然ｍＭＤＨ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド配列に導入する。
【０１９８】
天然型のこれらの酵素のアライメントを図１０に示す。これにより、異なる植物種のｍＭＤＨ酵素が高いレベルの配列類似性及び保存タンパク質モチーフを共有していることが明らかになっている。ＺＦＮ切断によりトマトｍＭＤＨ酵素にもたらされた突然変異を図１１に示すが、これらのペプチド配列は、表４に示す切断ＤＮＡ配列に対応する。
【０１９９】
本開示の実施形態としてさらに含めるのは、ｍＭＤＨ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド配列を通して組み込まれる新規突然変異である。第１及び第２のＮＡＤＨ結合部位の両方が導入された突然変異の大部分を含む。野生型（天然）配列に対して番号付けした１つ又は複数のアミノ酸の具体例としての突然変異（例えば、欠失及び／又は挿入）は、配列番号１に示すトマトＭＤＨ配列に対して番号付けし、アライメントした１つ若しくは複数のアミノ酸残基１０４〜１３６（Ｖ、Ｖ、Ｉ、Ｉ、Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｐ、Ｇ、Ｍ、Ｔ、Ｒ、Ｄ、Ｄ、Ｌ、Ｆ、Ｎ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｋ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、Ａ）及び／又は配列番号１に示すトマトＭＤＨ配列に対して番号付けしたアミノ酸残基１７１〜２２０（Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｋ、Ｌ、Ｆ、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｄ、Ｖ、Ｖ、Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ａ、Ｋ、Ｖ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｖ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｖ、Ｇ、Ｇ、Ｈ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｑ）における突然変異；配列番号１２６に示すトウモロコシＭＤＨ配列に対して番号付けし、配列番号１に対してアライメントしたアミノ酸残基１０４〜１３６（Ｖ、Ｖ、Ｉ、Ｉ、Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｐ、Ｇ、Ｍ、Ｔ、Ｒ、Ｄ、Ｄ、Ｌ、Ｆ、Ｎ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｋ、Ｎ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ａ）及び／又はアミノ酸残基１７１〜２２０（Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｋ、Ｌ、Ｆ、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｔ、Ｌ、Ｄ、Ｖ、Ｖ、Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ａ、Ｎ，Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｔ、Ｄ、Ｖ、Ｎ、Ｖ、Ｐ，Ｖ、Ｖ、Ｇ、Ｇ、Ｈ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｑ）における１つ若しくは複数の突然変異；並びに配列番号１２５に示すダイズＭＤＨ配列に対して番号付けし、配列番号１に対してアライメントした１つ若しくは複数のアミノ酸残基１０４〜１３６（Ｖ、Ｖ、Ｉ、Ｉ、Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｐ、Ｇ、Ｍ、Ｔ、Ｒ、Ｄ、Ｄ、Ｌ、Ｆ、Ｎ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｅ、Ｔ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、Ａ）及び／又はアミノ酸残基１７１〜２２０（Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｌ、Ｆ、Ｇ，Ｖ、Ｔ、Ｔ、Ｌ、Ｄ、Ｖ、Ｖ、Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｐ、Ｖ，Ａ，Ｇ、Ｖ、Ｎ、Ｖ、Ｐ、Ｖ、Ｖ、Ｇ、Ｇ、Ｈ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｑ）における突然変異を含むが、これらに限定されない。
【０２００】
ＭＤＨにおけるそのような突然変異をコードするポリヌクレオチド配列を以下に示す（配列番号１３２〜１３７及び配列番号１２４）：
トウモロコシｍＭＤＨ突然変異＃１（３ヌクレオチド欠失）（配列番号１３２）
トウモロコシｍＭＤＨ突然変異＃２（９ヌクレオチド欠失）（配列番号１３３）
ダイズｍＭＤＨ突然変異＃１（３ヌクレオチド欠失）（配列番号１３４）
ダイズｍＭＤＨ突然変異＃２（９ヌクレオチド欠失）（配列番号１３５）
トマトｍＭＤＨ  ｄｅｌ３（配列番号１３６）
トマトｍＭＤＨ  ｄｅｌ９（配列番号１３７）
ＮＡＤＨ結合ドメイン１におけるトマトｍＭＤＨ  ｄｅｌ（配列番号１２４）
【０２０１】
突然変異ｍＭＤＨ読み取り枠を含むプラスミドの構築
６×Ｈｉｓタグに融合させたトマトｍＭＤＨ  ＯＲＦを含むプラスミドｐＫＧ７４９５をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ＱＩＡＧＥＮ  ＧＥＬ  ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて５．８ｋｂｐベクターバンドをアガロースゲルから単離した。トマトｍＭＤＨ配列の一部をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位に隣接させて合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ）。これらの配列は、第２のＮＡＤＨ結合ドメインにおける３ｂｐ配列（ヌクレオチド５４３〜５４５が欠失；配列番号１３６）を失っており、これらのゲノム位置におけるＺＦＮ切断によってトマト植物にもたらされた突然変異に対応している。第２のトマトｍＭＤＨ突然変異は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片上に合成し、第１のＮＡＤＨ結合ドメインにおける３ｂｐ（ヌクレオチド３５３〜３５５；配列番号１２４）を失っていた。すべての断片をｐＫＧ７４９５ベクター内にライゲーションし、配列決定によりクローンを確認した。これらの構築物は、大腸菌（E. coli）における異種産生系において過剰発現させたＮＡＤＨ結合ドメインの両方におけるインフレーム欠失を有する一連のトマト突然変異ｍＭＤＨクローンをもたらす。
【０２０２】
ミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍＭＤＨ）の過剰発現及び精製
野生型及び突然変異ｍＭＤＨ構築物を大腸菌（E. coli）発現ベクターにクローニングした。ベクターＤＮＡをＯＮＥ  ＳＨＯＴ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。過剰発現したとき、得られた酵素がＮ末端ヘキサヒスチジンタグを含むように、標的遺伝子をクローニングした。コロニーを１００μｇ／ｍＬカルベネシリンを含むＬＢプレート上で３７℃で一夜増殖させた。単一コロニーを用いて、同じ培地の５０ｍＬ  ＬＢ種子培養を播種した。培養を３７℃で一夜増殖させ、その後、１００  １００μｇ／ｍＬカルベネシリンを含む１．２Ｌ  ＬＢを播種するために用いた。野生型ｍＭＤＨ酵素については、培養を０．６のＯＤ６００の１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。誘導を３７℃で４時間進行させ、そこで細胞を８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより採取した。すべての変異体を氷浴中に１０分間入れ、その後、２００μＭ  ＩＰＴＧで低温（１９℃）で１８時間誘導した。
【０２０３】
細胞ペレットを１５〜２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．２、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール及び５％グリセロール）に再懸濁した。可溶化したならば、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ錠剤）及びリソザイム（１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。溶液を４℃で２０分間撹拌し、氷上で４ｘ１分バーストで音波処理した。細胞デブリを遠心分離（４５分間１６，５００ｒｐｍ）により除去し、そこで、粗溶解物を緩衝液Ａで平衡化した１ｍＬ  Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＦＦカラムに加えた。タンパク質標的は、２０カラム容量にわたり０〜１００％緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．２、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール及び５％グリセロール）の直線勾配を用いて溶出した。ｍＭＤＨを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び活性アッセイにより同定した。陽性画分を一緒にプールし、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜を装着したＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ装置により濃縮した。濃縮画分をＰＤ１０ゲルろ過を用いてイミダゾールを欠く緩衝液Ａに交換した。タンパク質濃度は、Ｅｘｐａｓｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｏｒｔａｌ  ＰｒｏｔＰａｒａｍツールを用いて計算した理論モル減衰係数を用いて決定した。脱塩酵素を液体窒素でフラッシュ凍結し、さらなる使用まで−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、精製タンパク質の分子量が約３７ｋＤａのそれらの計算重量と一致していたことが示された。
【０２０４】
野生型及び突然変異ｍＭＤＨの比活性
酵素アッセイは、マイクロプレートリーダーで３５℃で実施し、２００μＬの最終容積中１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．２、４００μＭ  ＮＡＤＨ、０．００７５〜０．０４５μＭ  ｍＭＤＨ又はｍＭＤＨ突然変異体を含んでいた。３ｍＭの最終濃度にオキサロ酢酸を添加することにより開始する前に反応物を３５℃で１分間インキュベートした。分光光度法によりＮＡＤＨ酸化をモニターすることにより（？３４０ｎｍ）、初期速度を測定した。速度は、モル減衰係数６２２０Ｍ−１ｃｍ−１を用いてｍＯＤ／ｍｉｎからμＭ  ｍｉｎ−１に変換した。酵素アッセイの結果を図１３及び表５に示す。
【０２０５】
示したように、野生型及び２つの突然変異トマトｍＭＤＨ酵素の比活性は、分光光度法によりＮＡＤＨ酸化をモニターすることにより測定した。配列番号１２４でコードされる第１のＮＡＤＨ結合配列の突然変異（表５及び図１３で「ｍＭＤＨ  ｄｅｌ３  ＮＡＤＨ  ＢＳ１」と表示）は、有意に減少し、野生型酵素の活性の約１．５％をもたらす。比較すると、配列番号１３６でコードされる第２のＮＡＤＨ結合配列の突然変異（表５及び図１３で「ｍＭＤＨ  ｄｅｌ３」と表示）は、野生型酵素の活性の約２３％を保持している。ｍＭＤＨ酵素におけるＮＡＤＨ結合部位内に導入された突然変異は、酵素活性の低下をもたらし、結果として、ｍＭＤＨ酵素内にこれらの突然変異を含むトマト植物は、より大きな量の新鮮重量を有する果実を産生する。
【０２０６】
【表７】
0006352250.tif 000008
【０２０７】
ミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍＭＤＨ）の異種発現及び過剰発現のためのベクターのｍＭＤＨ酵素構築物内へのさらなる突然変異の組込み
トマト、ダイズ及びトウモロコシの天然及び突然変異ｍＭＤＨ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド配列をベクターに導入し、異種発現のために微生物体中に形質転換させる。突然変異ｍＭＤＨ読み取り枠を含むプラスミドの構築物を６×Ｈｉｓタグ又は単離のために用いる他の配列と融合させることができる。ｍＭＤＨポリヌクレオチド配列の断片を合成する。断片は、制限酵素部位により隣接され、ｍＭＤＨ読み取り枠を含むプラスミドに容易にクローニングすることができる。断片は、第１及び第２のＮＡＤＨ結合ドメインを通して約３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ又は９ｂｐの突然変異を含むように設計する。ｍＭＤＨ読み取り枠の第２のＮＡＤＨ結合ドメインに導入されたこれらの様々な突然変異に加えて、トマト植物においてもたらされた突然変異をトマト、ダイズ及びトウモロコシのｍＭＤＨ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド配列に組み込む。結果として、ＮＡＤＨ結合ドメインの両方におけるフレーム内欠失を含む一連の突然変異ｍＭＤＨコーディング配列がトマト、ダイズ及びトウモロコシから単離された酵素について形成される。
【０２０８】
ミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍＭＤＨ）の過剰発現及び精製
トマト、ダイズ及びトウモロコシのコード配列内に導入された様々な突然変異を含むプラスミドをケミカルコンピテント大腸菌（Escherichia coli）細胞に形質転換させる。形質転換細菌コロニーを増殖させる。単一コロニーを用いて種子培養に接種する。培養を増殖させ、その後、培地に播種するために用いる。培養を誘導し、培養の増殖を分光光度計を用いてモニターする。誘導は、細胞が採取されるまで一定の期間にわたり進行させる。
【０２０９】
培養を遠心分離し、得られた細胞ペレットを溶解緩衝液に再懸濁する。再懸濁細胞溶液を音波処理するか又は当業者に公知の他の方法を用いて溶解する。遠心分離により細胞デブリを除去する。タンパク質を溶出する。ｍＭＤＨを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び活性アッセイにより同定する。陽性画分を一緒にプールし、濃縮する。濃縮画分を脱塩処理する。タンパク質濃度は、Ｅｘｐａｓｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｏｒｔａｌ  ＰｒｏｔＰａｒａｍツールを用いて計算した予測モル減衰係数を用いて決定する。脱塩酵素を液体窒素でフラッシュ凍結し、さらなる使用まで−８０℃で保存するか、又は直ちに分析することができる。
【０２１０】
野生型及び突然変異ｍＭＤＨ活性の評価
酵素アッセイは、緩衝液、ＮＡＤＨ及び精製ｍＭＤＨ酵素（必要に応じて追加の試薬を含める）を含む最終カクテル中で実施する。反応は、オキサロ酢酸（０〜５０ｍＭ）の添加により開始させる。初期酵素反応速度は、３４０ｎｍにおける減少（ＮＡＤＨ酸化）を分光光度法によりモニターすることにより測定する。ｍＭＤＨ酵素に導入された様々な突然変異での速度は、モル減衰係数６２２０Ｍ−１ｃｍ−１を用いてμＭ  ｍｉｎ−１に変換することにより決定する。突然変異の組込みによる酵素の改変は、ｍＭＤＨ酵素の基質特異性の改善をもたらす。ｍＭＤＨ酵素は、図１２に示す生化学的反応を触媒するものであり、ｍＭＤＨ酵素は、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元を用いてリンゴ酸のオキサロ酢酸への酸化を可逆的に触媒する。試験した様々なｍＭＤＨ酵素のうち、最も好ましい総括速度パラメーター（ｋｃａｔ／Ｋｍ値）をもたらす突然変異が特定される。これらの突然変異は、低下した活性を有するｍＭＤＨ酵素をもたらし、結果として、これらのｍＭＤＨ酵素の突然変異を含む植物は、より大きい量の新鮮重量を有する種子及び果実を産生する。
【０２１１】
本明細書で言及したすべての特許、特許出願及び刊行物は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１２】
理解の明確さの目的のために例示及び実施例としてある程度詳細に開示を行ったが、本開示の精神又は範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を実施することができることは、当業者に明らかである。したがって、前述の説明及び実施例は、制限するものと解釈すべきではない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
0006352250.tif 000019
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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