(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中の標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）第１の結合リガンドと、前記試験サンプルとを、該第１の結合リガンドが、存在する場合に前記試験サンプル中の前記標的分析物に結合して第１の複合体を形成する条件下で接触させる工程と、
（ｂ）前記第１の複合体と、第２の結合リガンドとを、該第１の複合体及び該第２の結合リガンドが結合して第２の複合体を形成する条件下で接触させる工程であって、該第２の結合リガンドが過酸化物生成系の中間酵素を含む、工程と、
（ｃ）前記第２の複合体を単離する工程と、
（ｄ）前記第２の複合体と、前記過酸化物生成系の中間酵素の基質とを生成物が生成する条件下で接触させる工程であって、第１のアッセイ混合物を形成する、工程と、
（ｅ）過酸化物生成酵素と、前記第１のアッセイ混合物とを過酸化物が生成する条件下で接触させる工程であって、第２のアッセイ混合物を形成する、工程と、
（ｆ）前記第２のアッセイ混合物と、第１のＥ０を有する共有結合した電気活性部分（ＥＡＭ）を含む電極を備える第１の固体支持体とを接触させる工程であって、該ＥＡＭが自己犠牲部分（ＳＩＭ）及び過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属複合体を含み、前記過酸化物が前記ＰＳＭと反応して、前記ＥＡＭから前記ＳＩＭを放出するとともに、第２のＥ０を有する前記ＥＡＭを生じる、工程と、
（ｇ）前記ＥＡＭの電気化学的特性を第１のＥ０及び第２のＥ０で測定する工程と、  （ｈ）前記電気化学的特性から前記標的分析物の存在又は濃度について検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記標的分析物がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合リガンドが第２の固体支持体に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の固体支持体が微小粒子、磁性微小粒子、ビーズ及びマイクロチャネルからなる群から選ばれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記電極が自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生成物が前記過酸化物生成酵素の基質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記過酸化物生成酵素の基質の存在を更に含み、前記生成物が前記過酸化物生成酵素の補助因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記過酸化物生成系の中間酵素がアルカリホスファターゼ（ＡＰ）又は任意の他の脱リン酸酵素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記過酸化物生成酵素が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）又は任意のフラビン依存性オキシドレダクターゼ酵素からなる群から選択される、請求項１〜５及び８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的分析物がテストステロンである、請求項１〜５及び８〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の結合リガンド及び前記第２の結合リガンドが独立してモノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体のフラグメント、タンパク質及びペプチドからなる群から選ばれる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＡＭが遷移金属を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記遷移金属が鉄、ルテニウム及びオスミウムからなる群から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＡＭがフェロセン及び置換フェロセンからなる群から選ばれる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ｅ）が、前記過酸化物生成酵素及びリサイクリング酵素と、前記第１のアッセイ混合物とを過酸化物が生成する条件下で接触させる工程であって、第２のアッセイ混合物を形成する、工程である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記生成物又は基質をリサイクルするリサイクリング酵素が含まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記過酸化物生成酵素がＮＡＤＨオキシダーゼであり、前記リサイクリング酵素がアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）である、請求項１５又は１６に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つの固有電位Ｅ０１及びＥ０２で定量可能な電気化学的シグナルを生じる遷移金属複合体に結合した官能基の変換と併せて、増幅工程を用いて生物学的標的を検出する新規の組成物及び方法に関する。特に、本発明の方法は、酵素誘発レドックス変化化学的脱離（Enzyme-Triggered Redox Altering Chemical Elimination：Ｅ−ＴＲＡＣＥ）反応を利用する。
【背景技術】
【０００２】
起電力（ＥＭＦ）は、ガルバーニ電池又はボルタ電池の２つの電極間の最大電位差であり、この場合、標準水素電極が以下の電池の左側にある：
【０００３】
【表１】
0006276706.tif 000002
【０００４】
ＥＭＦは、溶液間の液界を無視若しくは算出することができるか、又はそれが全く存在しない場合にのみ、上記電池の図式スキームの右側に位置する電極の電極電位とみなされる。
【０００５】
右側の電極の電極電位（酸化還元電位と呼ばれることが多い）は、ネルンストの式で与えられる。
【数１】
0006276706.tif 000003
【０００６】
この関係は、
【数２】
0006276706.tif 000004
が
【数３】
0006276706.tif 000005
に等しく設定され、ｐＨ及び
【数４】
0006276706.tif 000006
がゼロに等しい場合に式（２．２１）から得られる。電極電位の符号の下付き文字に、酸化還元系の酸化及び還元構成要素の符号が示される。より複雑な反応では、符号Ｅの後に電池の右半分で起こる全反応（「半電池」反応）を書くことが特に推奨される。したがって、今回の場合は、
【数５】
0006276706.tif 000007
である。
【０００７】
量
【数６】
0006276706.tif 000008
は、標準電極電位と称される。これは、酸化還元系の構成要素の酸化能力又は還元能力を表す。標準電極電位がより正になると、系の酸化型がより強い酸化剤となり、還元型がより弱い還元剤となる。同様に、標準電位がより負になると、酸化還元系の還元構成要素がより強い還元剤となり、酸化型がより弱い酸化剤となる。
【０００８】
ネルンストの式、式（１−２）における標準電極Ｅ０は、その標準的用法で下記のように表される：
【数７】
0006276706.tif 000009
（式中、Ｅ０はレドックス反応の標準電位であり、Ｒは一般気体定数（８．３１４ＪＫ−１ｍｏｌ−１）であり、Ｔはケルビン温度であり、ｎは反応中に移動した電子の数であり、Ｆはファラデー定数（９６４８７クーロン）である）。このため、Ｅ０の負極側では、酸化型が還元する傾向があり、正反応（すなわち還元）がより有利である。電気活性種の酸化状態の変化によって生じる電流はファラデー電流と称される。
【０００９】
以前の研究は、２つの固有電位Ｅ０１及びＥ０２で定量可能な電気化学的シグナルを生じる遷移金属複合体に結合した官能基の変換を用いて記載されている。例えば、特許文献１及び特許文献２（いずれもその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。この方法は概して、分析物を電極以外の固体支持体上の機能的タグを有し得る結合リガンドのサンドイッチ内に結合させることを含む。標的結合の後、過酸化物生成部分又は中間酵素及び過酸化水素を生成する基質を添加する。レドックス活性複合体が電極に結合し、過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む。酵素系により生成した過酸化物はＰＳＭと反応し、自己犠牲部分（ＳＩＭ）が除去され、２つの固有電位Ｅ０１及びＥ０２で定量可能な電気化学的シグナルを生じる遷移金属複合体に結合した官能基が変換される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１−００３３８６９号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２−０１８１１８６号
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、２つの固有電位Ｅ０１及びＥ０２で定量可能な電気化学的シグナルを生じる遷移金属複合体に結合した官能基の変換により電気化学的シグナルを触媒的に増強する増幅方法を用いて標的分析物を検出する組成物及び方法を提供する。特に、本発明は増幅工程を組み合わせることの利点を開示する。一態様では、本発明は試験サンプル中の標的分析物を検出する組成物及び方法を提供する。このため、本発明は自己組織化単分子層（ＳＡＭ）、（ｉｉ）自己犠牲部分（ＳＩＭ）及び過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属複合体を含む共有結合した電気活性部分（ＥＡＭ）、及び自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を含む電極を備える第１の固体支持体であって、上記ＥＡＭが第１のＥ０を有する、第１の固体支持体を提供する。分析物に結合する捕捉結合リガンドは、電極以外の第２の固体支持体上にある。
【００１２】
一実施の形態では、小分子標的であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を、酵素増幅系を用いて検出することができる。ＡＴＰはグリセロールとともにグリセロールキナーゼ（ＧＫ）の基質として作用し、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びグリセロール−３−リン酸を生成する。ＡＤＰ副生成物及びクレアチンリン酸は、リン酸基をクレアチンリン酸からＡＤＰへと転移させ、ＡＴＰ及びクレアチンを再生するクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の基質として作用する。次いで、グリセロールキナーゼによってＡＴＰが用いられ、別のグリセロール−３−リン酸が生成する。このため、ＡＴＰ／ＡＤＰサイクリングによって１つのＡＴＰ出発分子につき複数のグリセロール−３−リン酸分子が生成する。次いで、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（Ｇ３ＰＯ）によってグリセロール−３−リン酸が酸化されて、Ｈ２Ｏ２及びグリセロンリン酸が形成する。したがって、Ｈ２Ｏ２は出発ＡＴＰ濃度に依存して生成するが、はるかに高いＨ２Ｏ２濃度が得られる。
【００１３】
一実施の形態では、本開示は試験サンプル中の標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）標的特異的酵素、リサイクリング酵素及び過酸化物生成酵素と、上記標的サンプルとを上記標的分析物の存在下で過酸化物が生成する条件下で接触させる工程であって、アッセイ混合物を形成する、工程と、
（ｂ）上記アッセイ混合物と、第１のＥ０を有する共有結合した電気活性部分（ＥＡＭ）を含む電極を備える第１の固体支持体とを接触させる工程であって、該ＥＡＭが自己犠牲部分（ＳＩＭ）及び過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属複合体を含み、上記過酸化物が上記ＰＳＭと反応して、上記ＥＡＭから上記ＳＩＭを放出するとともに、第２のＥ０を有する上記ＥＡＭを生じる、工程と、
（ｃ）上記ＥＡＭの電気化学的特性を第１のＥ０及び第２のＥ０で測定する工程と、
（ｄ）上記電気化学的特性から上記標的分析物の存在又は濃度について検出する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００１４】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記電極が自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を更に含むものである。本開示の別の実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記標的分析物が小分子であるものである。
【００１５】
本開示の一実施の形態では、上記標的分析物が還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）である。別の実施の形態では、上記リサイクリング酵素がアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）であり、上記標的特異的酵素がＮＡＤＨオキシダーゼであり、上記過酸化物生成酵素がＮＡＤＨオキシダーゼである。
【００１６】
本開示の一実施の形態では、上記標的分析物がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。別の実施の形態では、上記標的特異的酵素がグリセロールキナーゼ（ＧＫ）であり、上記リサイクリング酵素がクレアチンキナーゼ（ＣＫ）又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）であり、上記過酸化物生成酵素がグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（Ｇ３ＰＯ）である。
【００１７】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記標的分析物がテストステロンであるものである。
【００１８】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記ＥＡＭが遷移金属を含むものである。一実施の形態では、上記遷移金属が鉄、ルテニウム及びオスミウムからなる群から選ばれる。
【００１９】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記ＥＡＭがフェロセン及び置換フェロセンからなる群から選ばれるものである。
【００２０】
別の実施の形態では、小分子標的であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を、種々の酵素増幅系を用いて検出することができる。ＡＴＰはグリセロールとともにグリセロールキナーゼ（ＧＫ）の基質として作用し、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びグリセロール−３−リン酸を生成する。次いで、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（Ｇ３ＰＯ）によってグリセロール−３−リン酸が酸化されて、Ｈ２Ｏ２及びグリセロンリン酸が形成する。次いで、グリセロンリン酸がＮＡＤＨを用いてグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）によって還元され、グリセロール−３−リン酸が再生し、これがＧ３ＰＯによって再酸化されて、別のＨ２Ｏ２分子が生成する。したがって、Ｈ２Ｏ２は出発ＡＴＰ濃度に依存して生成するが、はるかに高いＨ２Ｏ２濃度が得られる。
【００２１】
一実施の形態では、小分子標的である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を、酵素増幅系を用いて検出することができる。ＮＡＤＨはＮＡＤＨオキシダーゼ（ＮＡＯＸ）の基質として作用し、ＮＡＤ＋及びＨ２Ｏ２を生成する。ＮＡＤ＋副生成物及びエタノールはアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）の基質として作用し、アセトアルデヒドを生じ、ＮＡＤＨを再生する。次いで、ＮＡＤＨがＮＡＤＨオキシダーゼによって再酸化されて、別のＨ２Ｏ２が生成する。このため、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋サイクリングによって１つのＮＡＤＨ出発分子から複数のＮＡＤＨ分子が生成する。したがって、Ｈ２Ｏ２は出発ＮＡＤＨ濃度に依存して生成するが、はるかに高いＨ２Ｏ２濃度が得られる。
【００２２】
一実施の形態では、本開示は試験サンプル中の標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）上記試験サンプルと、結合リガンドに予め結合した標識標的分析物を含む第１の複合体とを、上記試験サンプルに由来する上記標的分析物が存在する場合に、上記第１の複合体の上記標識標的に置き換わり、第２の複合体を形成する条件下で接触させる工程であって、上記標識標的分析物が特異的結合対の第１の成員で標識されている、工程と、
（ｂ）上記第２の複合体と、第３の複合体を形成する標識リンカーを含む過酸化物生成系の中間酵素とを接触させる工程であって、上記標識リンカーが上記特異的結合対の第２の成員で標識されている、工程と、
（ｃ）上記第３の複合体を単離する工程と、
（ｄ）上記第３の複合体と、上記過酸化物生成系の中間酵素の基質とを生成物（複数の場合もあり）が生成する条件下で接触させる工程であって、第１のアッセイ混合物を形成する工程と、
（ｅ）過酸化物生成酵素及び任意にリサイクリング酵素と、上記第１のアッセイ混合物とを過酸化物が生成する条件下で接触させる工程であって、第２のアッセイ混合物を形成する、工程と、
（ｆ）上記第２のアッセイ混合物と、第１のＥ０を有する共有結合した電気活性部分（ＥＡＭ）を含む電極を備える第１の固体支持体とを接触させる工程であって、該ＥＡＭが自己犠牲部分（ＳＩＭ）及び過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属複合体を含み、上記過酸化物が上記ＰＳＭと反応して、上記ＥＡＭから上記ＳＩＭを放出するとともに、第２のＥ０を有する上記ＥＡＭを生じる、工程と、
（ｇ）上記ＥＡＭの電気化学的特性を第１のＥ０及び第２のＥ０で測定する工程と、
（ｈ）上記電気化学的特性から上記標的分析物の存在又は濃度について検出する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００２３】
本開示において使用される場合、「単離する」という用語は、物理的分離又は精製を含む任意の好適な手段によって特定の構成要素を他のものから分離することを意味する。
【００２４】
本開示の一実施の形態では、上記特異的結合対はビオチン／ストレプトアビジンである。本開示の別の実施の形態では、上記結合リガンドが第２の固体支持体に結合している。本開示の更に別の実施の形態では、上記第２の固体支持体が微小粒子、磁性微小粒子、ビーズ及びマイクロチャネルからなる群から選ばれる。
【００２５】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記電極が自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を更に含むものである。本開示の別の実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記標的分析物が小分子であるものである。
【００２６】
本開示の一実施の形態では、上記生成物（複数の場合もあり）が上記過酸化物生成酵素の基質である。本開示の別の実施の形態では、方法は上記過酸化物生成酵素の基質の存在を更に含み、上記生成物（複数の場合もあり）が上記過酸化物生成酵素の補助因子である。本開示の更に別の実施の形態では、上記補助因子をリサイクルするリサイクリング酵素が含まれる。
【００２７】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記過酸化物生成系の中間酵素がアルカリホスファターゼ（ＡＰ）又は任意の他の脱リン酸酵素であるものである。
【００２８】
本開示の別の実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記過酸化物生成酵素が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）又は任意のフラビン依存性オキシドレダクターゼ酵素からなる群から選択されるものである。
【００２９】
本開示の別の実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記過酸化物生成酵素がＮＡＤＨオキシダーゼであり、上記任意のリサイクリング酵素がアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）であるものである。
【００３０】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記標的分析物がテストステロンであるものである。
【００３１】
本開示の別の実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記第１の結合リガンド及び上記第２の結合リガンドが独立してモノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体のフラグメント、タンパク質及びペプチドからなる群から選ばれるものである。
【００３２】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記ＥＡＭが遷移金属を含むものである。一実施の形態では、上記遷移金属が鉄、ルテニウム及びオスミウムからなる群から選ばれる。
【００３３】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記ＥＡＭがフェロセン及び置換フェロセンからなる群から選ばれるものである。
【００３４】
一実施の形態では、小分子標的（例えばテストステロン）を、競合ベースアッセイを用いて検出することができる。サンプルを、固体支持体に結合した結合リガンド及び結合ビオチン化標的分子を含む予め形成された第１の複合体に添加する。サンプル中の標的分子は、予め結合したビオチン化標的分子の一部に濃度依存的に置き換わり、第２の複合体を形成する。次いで、サンプルを洗い流すと、固体支持体に結合した第１及び第２の複合体の両方が保持される。第１の複合体のビオチン化標的のみに結合する過酸化物生成系の中間酵素、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）でタグ付けられたストレプトアビジンリンカーを添加し、第３の複合体を形成する。中間酵素（例えばＦＡＤＰ、ＮＡＤＰ）、オキシダーゼ酵素（例えばＤ−アミノ酸オキシダーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ）、及び任意にサイクリング酵素（アルコールデヒドロゲナーゼ）を複合体に添加すると、Ｈ２Ｏ２が生成する。シグナル出力は第３の複合体の数のみに依存し、試験サンプル中の標的の濃度に反比例する。測定されるシグナルが高いほど、試験サンプル中の標的分子の濃度は低くなる。
【００３５】
別の実施の形態では、小分子標的（例えばテストステロン）を、競合ベースアッセイを用いて検出することができる。サンプルを、固体支持体に結合した結合リガンド、結合ビオチン化標的分子、及びストレプトアビジンリンカーを介してビオチン化標的に結合した過酸化物生成系タグの中間酵素（例えばアルカリホスファターゼ）を含む予め形成された第１の複合体に添加する。サンプル中の標的分子は、予め結合したビオチン化標的分子の一部に濃度依存的に置き換わり、第２の複合体を形成する。次いで、サンプルを洗い流すと、複合した結合リガンドが保持される。中間酵素（例えばＦＡＤＰ、ＮＡＤＰ）、オキシダーゼ酵素（例えばＤ−アミノ酸オキシダーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ）、及び任意にサイクリング酵素（アルコールデヒドロゲナーゼ）の基質を複合体に添加すると、Ｈ２Ｏ２が生成する。シグナル出力は第１の複合体の数のみに依存し、試験サンプル中の標的の濃度に反比例する。測定されるシグナルが高いほど、試験サンプル中の標的分子の濃度は低くなる。
【００３６】
別の実施の形態では、小分子標的（例えばテストステロン）を、競合ベースアッセイを用いて検出することができる。サンプルを、固体支持体に結合した結合リガンド、結合ビオチン化標的分子、及びストレプトアビジンリンカーを介してビオチン化標的に結合した過酸化物生成系タグの中間酵素（例えばアルカリホスファターゼ）を含む予め形成された第１の複合体に添加する。サンプル中の標的分子は、予め結合したビオチン化標的分子の一部に濃度依存的に置き換わり、第２の複合体を形成する。置き換わったストレプトアビジンで標識されたビオチン化標的及び中間酵素を含有する上清を除去する。中間酵素（例えばＦＡＤＰ、ＮＡＤＰ）、オキシダーゼ酵素（例えばＤ−アミノ酸オキシダーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ）、及び任意にサイクリング酵素（アルコールデヒドロゲナーゼ）の基質を上清に添加すると、Ｈ２Ｏ２が生成する。シグナル出力は上清中の置き換わったビオチン化標的の量のみに依存し、試験サンプル中の標的の濃度に正比例する。測定されるシグナルが高いほど、試験サンプル中の標的分子の濃度は高くなる。
【００３７】
別の実施の形態では、小分子標的（例えばテストステロン）を、競合ベースアッセイを用いて検出することができる。サンプルを、固体支持体に結合した結合リガンドに添加する。サンプル中の標的分子は捕捉リガンドに結合し、第１の複合体を形成する。サンプルを洗い流す。結合ビオチン化標的分子を導入すると、標的分子に置き換わり、第２の複合体を形成する。ビオチン化標的分子には、任意にストレプトアビジンリンカーを介して過酸化物生成系タグの中間酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）が結合していてもよい。残存する非結合ビオチン化標的を洗い流す。任意に、ストレプトアビジンリンカーに結合した過酸化物生成系タグの中間酵素（例えばアルカリホスファターゼ）を、先の工程でビオチン化標的と予め複合していない場合に添加する。任意に、過剰な中間酵素を洗い流す。中間酵素（例えばＦＡＤＰ、ＮＡＤＰ）、オキシダーゼ酵素（例えばＤ−アミノ酸オキシダーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ）、及び任意にサイクリング酵素（アルコールデヒドロゲナーゼ）の基質を複合体に添加すると、Ｈ２Ｏ２が生成する。シグナル出力は第２の複合体の数のみに依存し、試験サンプル中の標的の濃度に反比例する。測定されるシグナルが高いほど、試験サンプル中の標的分子の濃度は低くなる。
【００３８】
一実施の形態では、本開示は、試験サンプル中の標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）第１の結合リガンドと、上記試験サンプルとを、該第１の結合リガンドが、存在する場合に上記試験サンプル中の上記標的分析物に結合して第１の複合体を形成する条件下で接触させる工程と、
（ｂ）上記第１の複合体と、第２の結合リガンドとを、該第１の複合体及び該第２の結合リガンドが結合して第２の複合体を形成する条件下で接触させる工程であって、該第２の結合リガンドが過酸化物生成系の中間酵素を含む、工程と、
（ｃ）上記第２の複合体を単離する工程と、
（ｄ）上記第２の複合体と、上記過酸化物生成系の中間酵素の基質とを生成物が生成する条件下で接触させる工程であって、第１のアッセイ混合物を形成する、工程と、
（ｅ）過酸化物生成酵素及び任意にリサイクリング酵素と、上記第１のアッセイ混合物とを過酸化物が生成する条件下で接触させる工程であって、第２のアッセイ混合物を形成する、工程と、
（ｆ）上記第２のアッセイ混合物と、第１のＥ０を有する共有結合した電気活性部分（ＥＡＭ）を含む電極を備える第１の固体支持体とを接触させる工程であって、該ＥＡＭが自己犠牲部分（ＳＩＭ）及び過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属複合体を含み、上記過酸化物が上記ＰＳＭと反応して、上記ＥＡＭから上記ＳＩＭを放出するとともに、第２のＥ０を有する上記ＥＡＭを生じる、工程と、
（ｇ）上記ＥＡＭの電気化学的特性を第１のＥ０及び第２のＥ０で測定する工程と、
（ｈ）上記電気化学的特性から上記標的分析物の存在又は濃度について検出する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００３９】
本開示の一実施の形態では、上記標的分析物がタンパク質である。本開示の別の実施の形態では、上記結合リガンドが第２の固体支持体に結合している。本開示の更に別の実施の形態では、上記第２の固体支持体が微小粒子、磁性微小粒子、ビーズ及びマイクロチャネルからなる群から選ばれる。
【００４０】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記電極が自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を更に含むものである。本開示の別の実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記標的分析物が小分子であるものである。
【００４１】
本開示の一実施の形態では、上記生成物（複数の場合もあり）が上記過酸化物生成酵素の基質である。本開示の別の実施の形態では、方法は上記過酸化物生成酵素の基質の存在を更に含み、上記生成物（複数の場合もあり）が上記過酸化物生成酵素の補助因子である。更に別の実施の形態では、上記補助因子をリサイクルするリサイクリング酵素が含まれる。
【００４２】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記過酸化物生成系の中間酵素がアルカリホスファターゼ（ＡＰ）又は任意の他の脱リン酸酵素であるものである。
【００４３】
本開示の別の実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記過酸化物生成酵素が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）又は任意のフラビン依存性オキシドレダクターゼ酵素からなる群から選択されるものである。
【００４４】
本開示の別の実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記過酸化物生成酵素がＮＡＤＨオキシダーゼであり、上記任意のリサイクリング酵素がアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）であるものである。
【００４５】
本開示の別の実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記第１の結合リガンド及び上記第２の結合リガンドが独立してモノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体のフラグメント、タンパク質及びペプチドからなる群から選ばれる。
【００４６】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記ＥＡＭが遷移金属を含むものである。一実施の形態では、上記遷移金属が鉄、ルテニウム及びオスミウムからなる群から選ばれる。
【００４７】
本開示の一実施の形態では、先行するいずれかの実施の形態は、上記ＥＡＭがフェロセン及び置換フェロセンからなる群から選ばれるものである。
【００４８】
一実施の形態では、サンドイッチベースアッセイを用いてタンパク質標的を検出することができる。サンプルを、固体支持体に結合した第１の結合リガンドに添加する。サンプル中の標的分子は捕捉リガンドに結合し、第１の複合体を形成する。試験サンプル及び過剰な第１の結合リガンドを洗い流す。過酸化物生成系タグの中間酵素を含む第２の捕捉リガンドを第１の複合体に添加する。第２の結合リガンドは第１の複合体上の標的に結合し、第２の複合体を形成する。過剰な第２の結合リガンドを洗い流す。中間酵素（例えばＦＡＤＰ、ＮＡＤＰ）、オキシダーゼ酵素（例えばＤ−アミノ酸オキシダーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ）、及び任意にサイクリング酵素（アルコールデヒドロゲナーゼ）の基質を複合体に添加すると、Ｈ２Ｏ２が生成する。シグナル出力は試験サンプル中の標的の濃度に正比例する。測定されるシグナルが高いほど、試験サンプル中の標的分子の濃度は高くなる。
【００４９】
別の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）、（ｉｉ）自己犠牲部分及び過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属複合体を含む共有結合した電気活性部分（ＥＡＭ）を含む電極を備える第１の固体支持体であって、上記第１のＥＡＭが第１のＥ０を有する、第１の固体支持体と、（ｂ）過酸化物生成酵素の基質の存在下で過酸化物を生成する過酸化物生成酵素を含む第２の固体支持体と、を含む組成物を提供する。
【００５０】
一実施の形態では、明らかな見掛け電位の過酸化物誘発変化（Ｅ−ＴＲＡＣＥ）を受ける代表的なフェロセンベースのＥＡＭの反応機構は、以下の工程に従う：
ａ）電子求引性カルバメート結合ボロン酸エステル置換リガンドを含有する出発フェロセニルＥＡＭ、及び、
ｂ）過酸化物との反応が、出発種とは異なるレドックス電位を生じるフェロセン上の電子供与性アミノリガンドをもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】電気活性分子（ＥＡＭ）１の構造及び過酸化物誘導リガンド解離の機構を示す図である。リガンドエレクトロニクスの変化がレドックス電位のシフトに関与する。
【図２】図１に示される本発明の実施形態の１つの合成スキームを示す図である。
【図３】ＰＯＭリガンドのＨ２Ｏ２誘導切断後のＥＡＭ１及び対照化合物の溶液ＣＶデータを示す図である。自己犠牲プロセス後のＥ０の変化は３３１ｍＶである。実験は炭素作用電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極及びＰｔワイヤー対電極を用いてＴＢＡＣｌＯ４（１５０ｍＭ）支持電解質を含むＴＨＦ中で行った。
【図４】ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ８．５）中の１ｍＭ過酸化水素との１０分間のインキュベーション、続くＮａ２ＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．１、下側のピーク）での５分間の洗浄の前（点線）及び後（実線）のＥＡＭ１のＳＡＭによるオーバーレイサイクリックボルタモグラムを示す図である。支持電解質は１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４、銀準参照電極、白金ワイヤー対電極であった。走査速度は１００００ｍＶ／ｓとした。
【図５】ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ８．５）中の１ｍＭグルコース及び１００ｕＭグルコースオキシダーゼとの１０分間のインキュベーション、続くＮａ２ＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．１）での５分間の洗浄の前（点線）及び後（実線）のＥＡＭ１のＳＡＭによるオーバーレイサイクリックボルタモグラムを示す図である。支持電解質は１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４、銀準参照電極、白金ワイヤー対電極であった。走査速度は１００００ｍＶ／ｓとした。
【図６】置換キノンメチドをベースとするサンプル自己犠牲スペーサー基を示す図である。
【図７】グルコースとの１０分間のインキュベーションの前（点線）及び後（実線）のヒト心臓トロポニンＩ（１０ｎｇ／ｍＬ）による抗体サンドイッチ形成に続くＥＡＭ１のＳＡＭのサイクリックボルタモグラムを示す図である。挿入図には−０．１０Ｖでの拡大したピークを示す。
【図８】本発明で使用される様々な自己犠牲部分を示す図である。「ＰＳＭ」は「過酸化物感受性部分」を表し、「ＥＡＭ」は「電気活性部分」を表す。図に示されるように、様々なモノマー自己犠牲部分（本明細書で「ＳＩＭ」と称される場合もある）を使用することができる。図ＸＡは、過酸化物との接触の際に−ＯＨ基に寄与し、ＥＡＭから放出されるフェノールベースのリンカーを生じるＰＳＭに依存する第１のタイプの自己犠牲部分を示す。ｎは１以上の整数とすることができ、１〜５が本発明で特に有用である。ｍは少なくとも１の整数であり、当業者に認められているように、ｍは使用する遷移金属複合体及びＥＡＭ中の位置の数に依存する。例えば、フェロセン等のメタロセンを使用する場合、シクロペンタジエニル環１つ当たり最大５つのＰＳＭ−ＳＩＭが存在することができ、１つの環上の位置の少なくとも１つが電極との結合に使用される。図Ｂ、Ｃ及びＤはＳＩＭのマルチマーを示す。Ｘは−ＮＨ−又は−Ｏ−とすることができる。
【図９】付加的な過酸化物感受性部分を示す図である。図ＡはＰＳＢエーテル（パラシルエタニルベンジル）部分を示し、図Ｂはペンタフルオロフェニルスルホネート（ＰＦＰＳ）部分を示す。（次の）図に示されるように、ＥＡＭ１つ当たり２つ以上の自己犠牲部分及び／又はＥＡＭ１つ当たり２つ以上のＰＳＭ−ＳＩＭが存在し得る。ホウ素含有ＰＳＭについても同様に、ＥＡＭ１つ当たり複数のＰＳＢエーテル又はＰＦＰＳ部分が存在し得る。
【図１０】Ｒ基を有するフェロセンを示す図である。示される部分は、異なる環上に結合リンカー及び自己犠牲部分及び過酸化物感受性部分を有するが、本明細書に記載されるように、それらが同じ環上にあってもよい。加えて、Ｒ基のいずれか又は全てが付加的な−ＳＩＭ−ＰＳＭ置換基及び従来の置換基（アルキル（置換アルキル、ヘテロアルキル、環式アルキル等を含む）、アリール（置換アリール及びヘテロアリールを含む）等）であってもよい。
【図１１】図１と同様に明らかな見掛け電位の過酸化物誘発変化を受ける代表的なフェロセンベースのＥＡＭの反応機構を示す図である。（Ａ）は電子求引性カルバメート結合ボロン酸エステル置換リガンドを含有する出発フェロセニルＥＡＭである。（Ｂ）過酸化物との反応が、レドックス電位（Ｅ０）を変化させるフェロセン上の電子供与性アミノリガンドをもたらすことを示す。
【図１２】過酸化水素と自己組織化単分子層上の電気活性部分（ＥＡＭ）との反応の前及び後の典型的な応答のサイクリックボルタモグラムの例を示す図である。
【図１３】Ｅ−ＴＲＡＣＥにより修飾された自己組織化単分子層（ＳＡＭ）上での過酸化水素滴定反応に対する典型的な用量応答を示す図である。
【図１４】Ｅ−ＴＲＡＣＥによるＮＡＤＨ検出のカスケードシグナル増幅図である。
【図１５】Ｅ−ＴＲＡＣＥによるＡＴＰ検出のカスケードシグナル増幅図である。
【図１６】小分子のＡＰベースのカスケード増幅についてのカスケードシグナル増幅戦略を示す図である。ビオチン化小分子の置き換えに基づく競合アッセイを記載する。生成する過酸化物はＥ−ＴＲＡＣＥによって検出する。
【図１７】タンパク質標的のＦＡＤＰベースのカスケード増幅を示す図である。生成する過酸化物はＥ−ＴＲＡＣＥによって検出する。
【図１８】タンパク質標的のＮＡＤＰベースのカスケード増幅を示す図である。生成する過酸化物はＥ−ＴＲＡＣＥによって検出する。
【図１９】Ｅ−ＴＲＡＣＥアッセイによるＮＡＤＨのシグナル増幅に続くバッファー中でのＮＡＤＨの段階希釈の検量線を示す図である。検出限界はＮＡＤＨオキシダーゼのみを用いた３ｕＭからアルコール脱水素酵素を使用するＮＡＤＨ／ＮＡＤサイクリング増幅アプローチを用いた１ｎＭまで１０００倍改善される。
【図２０】Ｅ−ＴＲＡＣＥアッセイによるＡＴＰのシグナル増幅に続くバッファー中でのＡＴＰの段階希釈の検量線を示す図である。検出限界はグリセロールキナーゼ／グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた１ｕＭからクレアチンキナーゼによるＡＴＰ／ＡＤＰサイクリング増幅アプローチを用いた３ｎＭまでほぼ１０００倍改善される。
【図２１】カスケードシグナル増幅アプローチを利用する競合アッセイを用いた小分子の段階希釈で予想される典型的な検量線を示す図である。
【図２２】Ａ．  ＦＡＤＰベースのカスケード増幅Ｅ−ＴＲＡＣＥアッセイに続く血清中でのｃＴｎＩの段階希釈の検量線を示す図である。検出限界は非増幅アプローチを用いた１００ｎｇ／ｍＬから増幅アプローチを用いた３ｐｇ／ｍＬまで数倍改善される。Ｂ．  Ｅ−ＴＲＡＣＥアッセイアプローチを用いた臨床サンプル中でのｃＴｎＩレベルを測定し、臨床イムノアナライザーによって得られるデータと比較する相関研究を示す図である。
【図２３】Ａ．  ＦＡＤＰベースのカスケード増幅Ｅ−ＴＲＡＣＥアッセイに続く血清中での甲状腺刺激ホルモンの段階希釈の検量線を示す図である。Ｂ．  Ｅ−ＴＲＡＣＥアッセイアプローチを用いた臨床サンプル中でのＴＳＨレベルを測定し、臨床イムノアナライザーによって得られるデータと比較する相関研究を示す図である。
【図２４】アルカリホスファターゼの段階希釈についてのＮＡＤＰベースのカスケード増幅を用いて得られる検量線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
米国特許出願公開第１３／６５３，９３１号、同第１２／２５３，８２８号、同第１２／２５３，８７５号、同第１２／８５３，２０４号、同第６１／３３２，５６５号、同第６１／３４７，１２１号、同第６１／３９４，４５８号、同第６１／３６６，０１３号及び同第６１／４０７，８２８号は全て、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００５３】
概要
タンパク質、ＤＮＡ及び小分子に対するＥ−ＴＲＡＣＥアッセイの感度は、過酸化水素を生成する標的依存性酵素カスケードに依存するシグナル増幅戦略によって指数関数的に増強し得る。図１ａは、タンパク質標的とのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）タグ付けサンドイッチ免疫複合体に基づくカスケードシグナル増幅の一般的アプローチを示す。同様の比色アッセイが以前に報告されている。-この系では、ＡＰがＦＡＤＰの脱リン酸化を触媒して、不活性アポ−Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ−ＡＡＯ）を「オン」にする酵素補助因子であるＦＡＤを生じる。次に、生成した各々の活性Ｄ−ＡＡＯがＤ−プロリンを酸化して過酸化水素を生じ、これを２０１１年１月１９日付けで出願された米国仮出願第６１／４３４，１２２号及び２０１１年８月１５日付けで出願された同第６１／５２３，６７９号の優先権の利益を請求する２０１２年１月１９日付けで出願された特許文献２、並びに２００９年８月７日付けで出願された米国仮出願第６１／２３２，３３９号の優先権の利益を請求する２０１０年８月９日付けで出願された米国特許出願公開第１２／８５３，２０４号、並びに２０１２年１０月１７日付けで出願された米国特許出願公開第１３／６５３９３１号（いずれもその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されるOhmxのＥ−ＴＲＡＣＥ技術を用いて検出する。このようにして検出される例示的なタンパク質標的は図１ｂに示され、血清中の心臓トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）の希釈系列を分析する。データから、低ｐｇ／ｍＬレジームでの検出限界が、このＥ−ＴＲＡＣＥ増幅アッセイを用いて血清中のｃＴｎＩについて生じ得ることが示唆される。
【００５４】
アッセイは、電極に結合し、自己犠牲部分を含み、その存在がＥＡＭに第１のＥ０を与え、不可逆的切断の際のその非存在がＥＡＭに第２のＥ０を与える電気活性部分（「ＥＡＭ」）の使用に依存する。電極は、その導入時に標的分析物に結合する捕捉結合リガンドも含有する。同様に標的分析物に結合し、グルコースオキシダーゼ酵素等の過酸化物生成部分を含む可溶性捕捉リガンドを導入する。酸素及びペルオキシダーゼ生成部分の基質（例えば、グルコースオキシダーゼ酵素をペルオキシダーゼ生成部分とした場合、酸素飽和バッファー及びグルコース）を添加すると、過酸化物が生成し、自己犠牲部分を攻撃し、ＥＡＭからの自己犠牲部分の除去を引き起こすことにより、ＥＡＭのＥ０の変化をもたらす。この相違を検出するが、かかる変化が起こる場合、これは標的分析物の存在の指標である。
【００５５】
このため、標的分析物がサンプル中に存在するか否かを決定するために、サンプルを検出電極表面に適用し、任意に洗浄し、標的分析物の代替エピトープに結合するオキシダーゼ酵素結合二次結合リガンド（例えば抗体）を添加し、標的との「サンドイッチアッセイ」フォーマットを作製する。表面を任意に洗浄し、高濃度のグルコースを含有する酸素飽和バッファーで処理する。表面上の基質オキシダーゼ酵素（本明細書で「ＳＯＸ」と称される場合もある）の存在は、単分子層表面に拡散し、固定化ＥＡＭにおいて化学的脱離反応（「自己犠牲」反応）を誘発する溶液中の過酸化水素の酵素的生成をもたらす。この不可逆的脱離反応は、例えば遷移金属複合体の「Ｒ」基（例えば置換基）を変化させることによってＥＡＭの電子環境を変化させ、それによりＥＡＭの明らかな見掛け電位を標的の存在を示す第２のＥ０へとシフトする。
【００５６】
したがって、本発明はサンプル中の標的分析物を検出する方法及び組成物を提供する。糖化ヘモグロビンのパーセンテージを直接検出する単一測定アプローチは、サンプル中に存在する全ヘモグロビンの量によって影響を受ける。全ヘモグロビンが生理学的に５ｇ／ｄＬ〜２０ｇ／ｄＬで変化することから、この範囲にわたる同じパーセンテージの糖化ヘモグロビンの直接測定は、このアプローチを用いて実現可能である。
【００５７】
標的分析物
本明細書で「標的分析物」若しくは「分析物」又は文法的な同等物は、検出対象の任意の分子、化合物又は粒子を意味する。下でより十分に説明されるように標的分析物は結合リガンド（捕捉リガンド及び可溶性結合リガンドの両方）に結合する。
【００５８】
好適な分析物としては、生体分子を含む有機分子及び無機分子が挙げられる。好ましい実施形態では、分析物は環境汚染物質（農薬、殺虫剤、毒素等を含む）；化学物質（溶媒、ポリマー、有機材料等を含む）；治療用分子（治療薬物及び乱用薬物、抗生物質等を含む）；生体分子（ホルモン、サイトカイン、タンパク質、脂質、炭水化物、細胞膜抗原及び受容体（神経受容体、ホルモン受容体、栄養素受容体及び細胞表面受容体）又はそれらのリガンド等を含む）；全細胞（原核細胞（病原性細菌等）及び哺乳動物腫瘍細胞を含む真核細胞を含む）；ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス等を含む）；並びに胞子等であり得る。
【００５９】
一部の実施形態では、標的分析物はタンパク質である。当業者に認められているように、本発明を用いて検出することができる多数の可能なタンパク性標的分析物が存在する。本明細書で「タンパク質」又は文法的な同等物は、タンパク質、オリゴペプチド及びペプチド、非天然アミノ酸及びアミノ酸類似体、並びにペプチド模倣薬構造を含有するタンパク質を含む誘導体及び類似体を意味する。側鎖は（Ｒ）配置又は（Ｓ）配置であり得る。好ましい実施形態では、アミノ酸は（Ｓ）配置又はＬ配置である。下記で論考するように、タンパク質を結合リガンドとして使用する場合、サンプル汚染物質による分解を遅らせるためにタンパク質類似体を利用することが望ましい場合もある。
【００６０】
好適なタンパク質標的分析物としては、（１）免疫グロブリン、特にＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、特に例えばヒトアルブミン、アポリポタンパク質（アポリポタンパク質Ｅを含む）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、α−フェトプロテイン、チロキシン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、抗トロンビンに対する抗体、医薬品（抗癲癇薬（フェニトイン、プリミドン、カルバマゼピン、エトスクシミド、バルプロ酸及びフェノバルビタール）、心臓作用薬（ジゴキシン、リドカイン、プロカインアミド及びジソピラミド）、気管支拡張剤（テオフィリン）、抗生物質（クロラムフェニコール、スルホンアミド）、抗鬱剤、免疫抑制剤、乱用薬物（アンフェタミン、メタンフェタミン、カンナビノイド、コカイン及びアヘン剤）を含む）に対する抗体、並びに様々なウイルス（オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば風疹ウイルス）、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例えばポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型及びＣ型を含む）、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば狂犬病ウイルス）、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ  Ｉ及びＩＩを含む）、パポーバウイルス（例えばパピローマウイルス）、ポリオーマウイルス及びピコルナウイルス等を含む）及び細菌（バシラス属；ビブリオ属、例えばコレラ菌（V. cholerae）；エシェリキア属、例えば腸管毒素原性大腸菌（E. coli）、シゲラ属、例えば志賀赤痢菌（S. dysenteriae）；サルモネラ属、例えばチフス菌（S. typhi）；マイコバクテリウム属、例えば結核菌（M. tuberculosis）、癩菌（M. leprae）；クロストリジウム属、例えばボツリヌス菌（C. botulinum）、破傷風菌（C. tetani）、クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）、ウェルシュ菌（C. perfringens）；コリネバクテリウム属、例えばジフテリア菌（C. diphtheriae）；ストレプトコッカス属、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）、肺炎レンサ球菌（S. pneumoniae）；スタフィロコッカス属、例えば黄色ブドウ球菌（S. aureus）；ヘモフィラス属、例えばインフルエンザ菌（H. influenzae）；ナイセリア属、例えば髄膜炎菌（N. meningitidis）、淋菌（N. gonorrhoeae）；エルシニア属、例えばランブル鞭毛虫（G. lamblia）、ペスト菌（Y. pestis）、シュードモナス属、例えば緑膿菌（P. aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（P. putida）；クラミジア属、例えばクラミジア・トラコマチス（C. trachomatis）；ボルデテラ属、例えば百日咳菌（B. pertussis）；トレポネーマ属、例えば梅毒トレポネーマ（T. palladium）等を含む対象の広範な病原性及び非病原性原核生物を含む）に対する抗体を含むが、これに限定されない治療又は診断関連抗体；（２）クレアチンキナーゼ、乳酸脱水素酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、トロポニンＴ、ミオグロビン、フィブ��ノゲン、コレステロール、トリグリセリド、トロンビン、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含む心臓病の指標として又はその治療に使用される酵素；アミラーゼ、リパーゼ、キモトリプシン及びトリプシンを含む膵疾患の指標；コリンエステラーゼ、ビリルビン及びアルカリホスファターゼを含む肝機能酵素及びタンパク質；アルドラーゼ、前立腺酸性ホスファターゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、並びにＨＩＶプロテアーゼ等の細菌酵素及びウイルス酵素を含むが、これらに限定されない酵素（及び他のタンパク質）；（３）エリトロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１７を含む）、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２を含む）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βを含む）、ヒト成長ホルモン、トランスフェリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、レプチン、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、毛様体神経栄養因子、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、カルシトニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロン、テストステロン等のホルモン及びサイトカイン（大半が細胞受容体のリガンドとして働く）；並びに（４）他のタンパク質（α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原ＣＥＡを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
加えて、抗体を検出し得る任意の生体分子を直接検出することもできる。すなわち、ウイルス又は細菌細胞、治療薬物及び乱用薬物等の検出を直接行うことができる。
【００６２】
好適な標的分析物としては、乳がん（ＣＡ１５−３、ＣＡ５４９、ＣＡ２７．２９）、ムチン様癌関連抗原（ＭＣＡ）、卵巣がん（ＣＡ１２５）、膵臓がん（ＤＥ−ＰＡＮ−２）並びに結腸直腸がん及び膵臓がん（ＣＡ１９、ＣＡ５０、ＣＡ２４２）のマーカーを含むが、これらに限定されない炭水化物が挙げられる。
【００６３】
標的としては、グルコース若しくはコレステロール若しくはＡＴＰ、ＦＡＤＰ、ＮＡＤＨ及び他の代謝産物等の小分子、又はテストステロン等のホルモン、又は甲状腺刺激ホルモン、トロポニンＩ等のタンパク質等が挙げられる。
【００６４】
一実施形態では、サンプル中の標的分析物の割合を決定する単一測定方法は、酵素誘発レドックス変化化学的脱離（Ｅ−ＴＲＡＣＥ）反応を用いる電気化学的測定、又は溶液中のＨ２Ｏ２を検出する標準イムノアッセイ光学試験により本明細書に記載の方法に従って行うことができ、以下の工程で説明される。
【００６５】
工程１：一次抗体による修飾：
電気化学的プラットホームの表面を、過酸化物のＥ−ＴＲＡＣＥ検出用のセンサー分子（ＥＡＭ）を含むように修飾する。さらに、第２の固体支持体を捕捉プローブで修飾する。この捕捉プローブ、例えば抗体は選択的及び同等に標的の全ての変異体タイプ（例えば、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを含むヘモグロビン）に結合する。本明細書で規定される場合、「選択的に結合する」という用語は所定の標的（例えばヘモグロビンＡ１ｃを含む全ヘモグロビン）への結合を意味し、「同等に結合する」という用語は、タンパク質（例えばヘモグロビン）及び糖化タンパク質（例えばヘモグロビンＡ１ｃ）の両方への非選択的な結合を意味する。
【００６６】
工程２：標的の添加：
標的は小分子又はタンパク質であり得る。或る特定の実施形態では、一次結合が起こると、二次支持体の表面上のほぼ全ての結合部位が飽和すると考えられる。この重要性は、総標的濃度が異なるサンプルが依然として表面に結合する標的分析物の大部分を生じることである。
【００６７】
工程３：検出抗体の添加：
或る特定の実施形態では、二次抗体を表面に導入すると、固定化標的分析物のみに結合する。これは、ＥＬＩＳＡ様サンドイッチ複合体が標的分析物によって占められる部位のみで形成され、非標的（例えば非糖化ヘモグロビン）によって占められる部位では形成されないことを意味する。
【００６８】
工程４：シグナル伝達及び検出：
標的に選択的に結合する抗標的抗体を、過酸化物生成系の中間酵素、例えばオキシダーゼ酵素（ＳＯｘ）で標識する。中間酵素標識は、過酸化水素を生じるオキシダーゼ酵素の補助因子又は基質である生成物を生成する。生成する過酸化水素は電気化学的プラットホームの電気化学的表面と反応し、電気化学的シグナルをもたらす。
【００６９】
シグナルの量は、表面に固定化した標的の量に依存するサンドイッチ複合体の数と直接相関する。固定化標的の量は元のサンプル中の全ヘモグロビンに対する標的のパーセンテージに直接左右されるため、観察されるシグナルにより、全ヘモグロビンに対するヘモグロビン標的の比率（パーセンテージ）の評価がもたらされる。
【００７０】
結合リガンドの１つであるＨｂ標的については、捕捉結合リガンド又は可溶性結合リガンドが糖化型のヘモグロビンに特異性を有する。すなわち、一実施形態では、捕捉結合リガンドがいずれかの型のヘモグロビンに結合することができる。表面を洗浄した後、過酸化物生成部分を有する糖化型（すなわちＨｂ標的）のみに特異性を有する可溶性結合リガンドを添加する。代替的には、捕捉結合リガンドは他の型のヘモグロビンに比べＨｂ１Ａｃに対して特異性を有し、かかる特異性を有しない可溶性捕捉リガンドを表面の適切な洗浄後に使用することができる。このアプローチを、糖化型又は非糖化型の検出が望まれる他の標的分析物に使用することができる。当業者に認められているように、両方の型の検出が望まれる標的分析物も存在し、これらの実施形態では、一方に特異性を有しない結合リガンドを使用する。
【００７１】
この電気活性ＳＡＭに連結した標的の単一測定検出は、サンプル中の全ヘモグロビンに対する標的の割合を決定するより単純な手段をもたらす。これには、２回の測定を行う必要がなく、光学測定、複数の抗体対、又は標的及び全ヘモグロビンの２回の別個の測定によって更なる誤差を生じるパーセンテージ計算アルゴリズムが除外されるという利点がある。
【００７２】
本開示の標的分析物は標識することができる。このため、本明細書で「標識標的分析物」とは、特異的結合対の成員で標識される標的分析物を意味する。
【００７３】
サンプル
標的分析物は概してサンプル中に存在する。当業者に認められているように、サンプル溶液は、体液（実質的に任意の生物の血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門分泌物及び膣分泌物、汗並びに精液を含むが、これらに限定されず、哺乳動物のサンプルが好ましく、ヒトのサンプルが特に好ましい）；環境サンプル（大気、農産物、水及び土壌のサンプルを含むが、これらに限定されない）；植物材料；生物兵器サンプル；研究サンプル、精製サンプル、未加工サンプル等を含むが、これらに限定されない様々なものを含み得る。当業者に認められているように、実質的に任意の実験操作をサンプルに行うことができる。一部の実施形態では、貯蔵（例えば凍結及び／又は保管）した又は新鮮な組織を利用する。パラフィン包埋サンプルは、これらのサンプルが診断及び予後診断等のサンプルと関連する付加的なデータのために非常に有用であり得ることから、多くの実施形態で特に有用である。本明細書に記載の固定及びパラフィン包埋した組織サンプルは、貯蔵可能な又は保管可能な組織サンプルを指す。大半の患者由来の病理サンプルは、組織学的分析及び後続の保管貯蔵を可能にするために日常的に固定及びパラフィン包埋される。
【００７４】
固体支持体
標的分析物は、電極を備える固体支持体を用いて検出される。本明細書で「基板」又は「固体支持体」又は他の文法的な同等物は、捕捉リガンドの付着又は結合に適切な個別の部位を含有するように修飾され得る任意の材料を意味する。好適な基板としては、金等の金属表面、下記で規定する電極、ガラス及び改質ガラス又は官能化ガラス、ガラス繊維、テフロン（登録商標）、セラミック、マイカ、プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、及びスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン（登録商標）、並びにそれらの誘導体等を含む）、ＧＥＴＥＫ（ポリプロピレンオキシドとガラス繊維とのブレンド）等、多糖、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、シリカ又はシリコン及び変性シリコンを含むシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、並びに他の様々なポリマーが挙げられ、プリント配線板（ＰＣＢ）材料が特に好ましい。
【００７５】
本発明の系は、アドレス可能な検出電極（本明細書では概して「パッド」、「アドレス」又は「微小位置（micro-location）」と称される）のマトリックスが存在するアレイフォーマットで特に有用である。本明細書で「アレイ」とは、アレイフォーマットの複数の捕捉リガンドを意味する。アレイのサイズはアレイの組成及び最終用途に依存する。約２個〜数千個の異なる捕捉基板を含有するアレイを作製することができる。
【００７６】
好ましい実施形態では、検出電極が基板上に形成される。加えて、本明細書の論考は概して金電極の使用を対象とするが、当業者に認められているように、他の電極を使用してもよい。基板は本明細書及び引用参照文献で概説されるような広範な材料を含み得る。
【００７７】
概して、好ましい材料としてはプリント配線板材料が挙げられる。配線板材料は、導電層でコーティングされ、リソグラフィー法、特にフォトリソグラフィー法を用いて処理され、電極及びインターコネクト（当該技術分野で相互接続部又はリードと称される場合もある）のパターンを形成した絶縁基板を含むものである。絶縁基板は常にという訳ではないが、概してポリマーである。当該技術分野で既知のように、１つ又は複数の層を使用して、「二次元」（例えば全ての電極及び相互接続部が平面内にある）又は「三次元」（電極が一方の表面上にあり、インターコネクトがボードの反対側まで貫通し得るか、又は電極が複数の表面上にある）のボードを作製してもよい。三次元系は、「ボード貫通」相互接続部が作製されるように、ドリリング又はエッチングに続く銅等の金属による電気めっきの使用に依存することが多い。配線板材料は、基板に既に結合した銅ホイル等のホイルを備えることが多い、付加的な銅が必要に応じて（例えば相互接続部に）例えば電気めっきによって添加される。次いで、銅表面を接着層の結合のために例えばエッチングによって粗面化する必要がある場合もある。
【００７８】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は複数の電極、好ましくは金電極を備える基板を含むバイオチップ（本明細書で「チップ」と称される場合もある）を提供する。電極の数はアレイについて概説される通りである。各々の電極が本明細書で概説されるように自己組織化単分子層を含むのが好ましい。好ましい実施形態では、単分子層形成種の１つが本明細書で概説されるように捕捉リガンドを含む。加えて、各電極が、一方の端で電極に結合し、最終的に電極を制御することができるデバイスに結合した相互接続部を有する。すなわち、各電極が独立してアドレス可能である。
【００７９】
最後に、本発明の組成物は、マイクロ流体構成要素及びロボット構成要素（例えば、米国特許第６，９４２，７７１号及び同第７，３１２，０８７号並びに関連案件（どちらもその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい）、並びにシグナル処理法を用いるコンピュータを含む検出システム（例えば米国特許第６，７４０，５１８号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい）を含む広範な付加的構成要素を含み得る。
【００８０】
電極
本発明の固体支持体は電極を備える。本明細書で「電極」とは、電子デバイスに接続した場合に電流又は電荷を感知し、それをシグナルに変換することが可能な組成物を意味する。好ましい電極は当該技術分野で既知であり、金；白金；パラジウム；ケイ素；アルミニウムを含む或る特定の金属及びその酸化物；酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、インジウムスズ酸化物、酸化パラジウム、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化モリブデン（Ｍｏ２Ｏ６）、酸化タングステン（ＷＯ３）及び酸化ルテニウムを含む金属酸化物電極；及び炭素（ガラス状炭素電極、グラファイト及びカーボンペーストを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい電極としては、金、ケイ素、炭素及び金属酸化物の電極が挙げられ、金が特に好ましい。
【００８１】
本明細書に記載の電極は平面として示されるが、これは電極の可能な形態の１つにすぎず、図解のみを目的とするものある。電極の形態は用いられる検出方法によって異なる。
【００８２】
本発明の電極は概してバイオチップカートリッジに組み込まれ、広範な構成をとることができ、作用電極及び参照電極、インターコネクト（「ボード貫通」インターコネクトを含む）、並びにマイクロ流体構成要素を備えることができる。例えば、米国特許第７，３１２，０８７号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。加えて、バイオチップは概して、本明細書に記載の構成要素を有する作用電極、参照電極及び対／補助電極を備える。
【００８３】
バイオチップカートリッジは生体分子のアレイを備える基板を含み、様々な形で構成することができる。例えば、チップは試薬の導入及び除去用の入口及び出口を有する反応チャンバを備えることができる。加えて、カートリッジは、サンプルを導入し、試薬を添加し、反応を行った後、サンプルを検出用のアレイを備える反応チャンバに添加するようにマイクロ流体構成要素を有するキャップ又は蓋を備えることができる。
【００８４】
自己組織化単分子層
電極は自己組織化単分子層（「ＳＡＭ」）を含む。本明細書で「単分子層」又は「自己組織化単分子層」又は「ＳＡＭ」とは、自発的に表面に化学吸着した比較的秩序だった分子の集合体を意味し、分子は互いにほぼ並行し、表面にほぼ垂直に配向する。分子の各々が表面に付着する官能基と、単分子層内の隣接分子と相互作用して比較的秩序だったアレイを形成する部分とを含む。「混合」単分子層は、少なくとも２つの異なる分子が単分子層を構成する不均一単分子層を含む。本明細書で概説されるように、単分子層の使用は表面への生体分子の非特異的結合の量を低減し、核酸の場合、オリゴヌクレオチドと電極との距離の結果としてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの効率を増大させる。このため、単分子層は標的酵素を電極表面から離しておくことを容易にする。加えて、単分子層は電荷担体を電極の表面から離しておく働きをする。このため、この層は電極とＲｅＡＭ、又は電極と溶媒中の帯電種との間の電気的接触を防止するのを助ける。かかる接触は直接的な「短絡」又はサンプル中に存在し得る帯電種による間接的な短絡をもたらし得る。したがって、単分子層は、最低限の「ホール」が存在するように電極表面上の均一層に密集しているのが好ましい。このため、単分子層は電極への溶媒の接近性を遮断する物理的障壁として働く。
【００８５】
一部の実施形態では、単分子層は導電性オリゴマーを含み、特に導電性オリゴマーは概して下記のようにＥＡＭを電極表面に結合するために使用される。本明細書で「導電性オリゴマー」とは、好ましくは線状の実質的に導電性のオリゴマーを意味し、その一部の実施形態が文献内で「分子ワイヤー」と称される。本明細書で「実質的に導電性の」とは、オリゴマーが１００Ｈｚで電子を移動させることが可能であることを意味する。概して、導電性オリゴマーは、導電性オリゴマーのモノマー単位間に実質的に重なりあったπ軌道、すなわち結合π軌道を有するが、導電性オリゴマーは１つ又は複数のシグマ（σ）結合を含有していてもよい。加えて、導電性オリゴマーは、結合したＥＡＭへ又はそれから電子を注入又は受容するその能力によって機能的に規定され得る。さらに、導電性オリゴマーは本明細書で規定されるように絶縁体よりも導電性である。加えて、本発明の導電性オリゴマーは、それ自体が電子を供与又は求引し得る電気活性ポリマーとは区別される。
【００８６】
導電性オリゴマーのより詳細な説明は、国際公開第１９９９／５７３１７号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に見られる。特に、国際公開第１９９９／５７３１７号の１４頁〜２１頁の構造１〜９に示される導電性オリゴマーが本発明に使用される。一部の実施形態では、導電性オリゴマーは以下の構造を有する：
【化１】
0006276706.tif 000010
【００８７】
加えて、単分子層中の少なくとも一部の導電性オリゴマーの末端は電子的に露出している。本明細書で「電子的に露出する」とは、末端に極めて接近したＥＡＭの配置の際及び適切なシグナルによる開始後に、ＥＡＭの存在に依存するシグナルが検出され得ることを意味する。導電性オリゴマーは末端基を有していても又は有していなくてもよい。このため、好ましい実施形態では、付加的な末端基は存在せず、導電性オリゴマーは例えばアセチレン結合等の末端基で終了する。代替的には、一部の実施形態では、本明細書で「Ｑ」と表されることもある末端基が付加される。末端基は幾つかの理由、例えばＥＡＭの検出に対する導電性オリゴマーの電子的有用性に寄与するため、又は他の理由、例えば非特異的結合の防止からＳＡＭの表面を変更するために使用され得る。例えば、標的分析物がＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸である場合に、核酸が反発される又は表面への付着が防止され、ハイブリダイゼーションが促進されるように負に帯電した表面を形成する負に帯電した基が末端上に存在し得る。好ましい末端基としては、−ＮＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ及び−ＣＨ３等のアルキル基、並びに（ポリ）エチレングリコール等の（ポリ）アルキル酸化物が挙げられ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｈ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｈ及び−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４Ｈが好ましい。
【００８８】
一実施形態では、異なるタイプの末端基を有する導電性オリゴマーの混合物を使用することが可能である。このため、例えば一部の末端基は検出を促進することができ、一部は非特異的結合を防止することができる。
【００８９】
一部の実施形態では、電極は、好ましくは電極表面上の単分子層の形態で不動態化剤を更に含む。一部の分析物については、結合リガンドが電極から離れている場合に分析物結合（すなわちハイブリダイゼーション）の効率が増大し得る。加えて、単分子層の存在は表面に対する非特異的結合を減少させることができる（本明細書で概説される末端基の使用によって更に促進され得る）。不動態化剤層は、電極表面から離れた結合リガンド及び／又は分析物の維持を促進する。加えて、不動態化剤は電荷担体を電極表面から離しておく働きをする。このため、この層は電極と電子移動部分との間、又は電極と溶媒中の帯電種との間の電気的接触を防止するのを助ける。かかる接触は直接的な「短絡」又はサンプル中に存在し得る帯電種による間接的な短絡をもたらし得る。したがって、不動態化剤の単分子層は、最低限の「ホール」が存在するように電極表面上の均一層に密集しているのが好ましい。代替的には、不動態化剤は単分子層の形態でなくてもよく、導電性オリゴマー又は他の特徴部の密集を助けるものであればよい。
【００９０】
このため、不動態化剤は電極への溶媒の接近性を遮断する物理的障壁として働く。そのように、不動態化剤自体は実際には（１）導電性又は（２）非導電性、すなわち絶縁性の分子であり得る。このため、一実施形態では、不動態化剤は本明細書に記載されるように、電極への電荷移動を遮断又は減少させる末端基を有する又は有しない導電性オリゴマーである。導電性であってもよい他の不動態化剤としては、−（ＣＦ２）ｎ−、−（ＣＨＦ）ｎ−及び−（ＣＦＲ）ｎ−のオリゴマーが挙げられる。好ましい実施形態では、不動態化剤は絶縁体部分である。
【００９１】
一部の実施形態では、単分子層は絶縁体を含む。「絶縁体」は好ましくは線状の実質的に非導電性のオリゴマーである。本明細書で「実質的に非導電性」とは、絶縁体を介した電子移動速度が導電性オリゴマーを介した電子移動速度よりも遅いことを意味する。言い方を変えれば、絶縁体の電気的抵抗は導電性オリゴマーの電気的抵抗よりも高い。しかしながら、−（ＣＨ２）１６分子等の概して絶縁体とみなされるオリゴマーであっても、遅い速度ではあるが電子を移動させ得ることにも留意されたい。
【００９２】
一部の実施形態では、絶縁体は約１０−７Ω−１ｃｍ−１以下の伝導性Ｓを有し、約１０−８Ω−１ｃｍ−１未満が好ましい（Gardner et al., Sensors and Actuators A 51 (1995) 57-66（引用することにより本明細書の一部をなすものとする））。
【００９３】
概して、絶縁体はシグマ結合を有するアルキル又はヘテロアルキルオリゴマー又は部分であるが、任意の特定の絶縁体分子は芳香族基又は１つ若しくは複数の共役結合を含有し得る。本明細書で「ヘテロアルキル」とは、少なくとも１つのヘテロ原子、すなわち窒素、酸素、硫黄、リン、ケイ素又はホウ素が鎖に含まれるアルキル基を意味する。代替的には、絶縁体は、好ましくは実質的に電子移動を阻害又は遅延させる働きをする１つ又は複数のヘテロ原子又は結合を付加した導電性オリゴマーによく似たものであり得る。一部の実施形態では、絶縁体はＣ６〜Ｃ１６アルキルである。
【００９４】
絶縁体を含む不動態化剤は、電極への部分又は導電性オリゴマーの密集、絶縁体の親水性又は疎水性、及び絶縁体の柔軟性、すなわち回転柔軟性、ねじれ柔軟性又は縦方向柔軟性を変更する本明細書で規定のＲ基で置換されていてもよい。例えば、分岐アルキル基を使用することができる。加えて、絶縁体を含む不動態化剤の末端は、単分子層の露出表面に影響を与える付加的な基（本明細書で末端基（「ＴＧ」）と称される場合もある）を含有し得る。例えば、サンプルによる非特異的結合を阻害するため、又は分析物の結合動態に影響を与えるために帯電した中性又は疎水性基の付加が行われ得る。例えば、或る特定の標的分析物の結合を促す若しくは妨げる、又は反発する若しくは表面ヘの付着を防止するために、帯電表面を形成する帯電基が末端上に存在し得る。
【００９５】
不動態化剤の長さは必要に応じて異なる。概して、不動態化剤の長さは、上記で概説したような導電性オリゴマーの長さと同様である。加えて、導電性オリゴマーは不動態化剤と基本的に同じ長さを有するか又はそれより長く、結合リガンドが過酸化物により接近可能となる。
【００９６】
単分子層は、絶縁体を含む単一タイプ又は異なるタイプの不動態化剤を含み得る。
【００９７】
好適な絶縁体は当該技術分野で既知であり、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＲＨ）ｎ−及び−（ＣＲ２）ｎ−、エチレングリコール又は酸素の代わりに他のヘテロ原子、すなわち窒素又は硫黄を用いた誘導体（電極が金である場合、硫黄誘導体は好ましくない）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、絶縁体はＣ６〜Ｃ１６アルキルを含む。
【００９８】
一部の実施形態では、電極は金属表面であり、必ずしも相互接続又は電気化学を行う能力を有する必要はない。
【００９９】
電気活性部分
ＳＡＭに加えて、電極はＥＡＭを含む。本明細書で「電気活性部分（ＥＡＭ）」又は「遷移金属複合体」又は「レドックス活性分子」又は「電子移動部分（ＥＴＭ）」は、可逆的に又は半可逆的に１つ又は複数の電子を移動させることが可能な金属含有化合物を意味する。電子供与能及び電子受容能が相対的なものである、すなわち或る特定の実験条件下で電子を失うことができる分子は、異なる実験条件下で電子を受容することが可能であることが理解されよう。
【０１００】
可能な遷移金属複合体の数が非常に多く、電子移動化合物の当業者が本発明において多数の化合物を利用することが可能であることを理解されたい。本明細書で「遷移金属」とは、原子が部分的又は完全な電子殻を有する金属を意味する。本発明での使用に好適な遷移金属としては、カドミウム（Ｃｄ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、オスミウム（Ｏｓ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、タングステン（Ｗ）及びイリジウム（Ｉｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、Ｆｅ、Ｒｅ、Ｗ、Ｍｏ及びＴｃに加えて第一遷移金属系列、白金金属（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ及びＰｔ）が本発明で特に使用される。本発明で使用される金属は、酸化状態の変化の際に配位部位の数が変化しない金属、例えばルテニウム、オスミウム、鉄、白金及びパラジウムでもあり、オスミウム、ルテニウム及び鉄がとりわけ有用である。概して、遷移金属は本明細書（又は引用参照文献）でＴＭ又はＭと表される。
【０１０１】
遷移金属及び配位リガンドは金属複合体を形成する。本明細書で「リガンド」又は「配位リガンド」（本明細書又は引用参照文献の図で「Ｌ」と表される）は、概して配位共有結合を介して１つ若しくは複数のその電子を１つ若しくは複数の中心原子若しくはイオンに供与するか、又は共有結合を介してその電子をそれらと共有する原子、イオン、分子又は官能基を意味する。
【０１０２】
一部の実施形態では、小極性リガンドが使用される。概して本明細書で「Ｌ」と表される好適な小極性リガンドは、本明細書でより十分に説明されるように大きく２つのカテゴリーに分けられる。一実施形態では、小極性リガンドは、概して不十分な脱離基又は良好なシグマドナーとしてのその特徴、及び金属の固有性のために効果的に金属イオンに不可逆的に結合する。これらのリガンドは「置換的に不活性」と称される場合もある。代替的には、下記でより十分に説明されるように、小極性リガンドは金属イオンに可逆的に結合することができ、標的分析物の結合の際に、分析物は、その良好な脱離基特性又は不十分なシグマドナー特性のために効果的に小極性リガンドを置き換える１つ又は複数の金属の配位原子を生じ得る。これらのリガンドは「置換的に不安定」と称される場合もある。リガンドは、高い溶媒再構成エネルギーに寄与することから双極子を形成するのが好ましい。
【０１０３】
遷移金属複合体の構造の一部を下に示す：
【化２】
0006276706.tif 000011
【０１０４】
Ｌは金属イオンに結合する配位原子を生じる共リガンドである。当業者に認められているように、共リガンドの数及び性質は金属イオンの配位数に依存する。単座、二座又は多座共リガンドを任意の位置で使用することができる。このため、例えば金属の配位数が６である場合、導電性オリゴマーの末端のＬ、核酸に由来するＬ、及びｒが合計６となる。このため、金属の配位数が６である場合、ｒは０（全ての配位原子が他の２つのリガンドから与えられる場合）から全ての共リガンドが単座である場合の４という範囲とすることができる。このため、概して、ｒは金属イオンの配位数及び他のリガンドの選択に応じて０〜８である。
【０１０５】
一実施形態では、金属イオンの配位数は６であり、導電性オリゴマーに結合するリガンド及び核酸に結合するリガンドの両方が少なくとも二座である、すなわちｒが好ましくは０、１（すなわち、残りの共リガンドが二座である）又は２（２つの単座共リガンドが使用される）である。
【０１０６】
当該技術分野で認められているように、共リガンドは同じであっても又は異なっていてもよい。好適なリガンドは、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、炭素原子又はリン原子（金属イオンに応じる）を配位原子として用いるリガンド（概して文献内でシグマ（σ）ドナーと称される）、及びメタロセンリガンド等の有機金属リガンド（概して文献内でパイ（π）ドナーと称され、本明細書でＬｍと表される）という２つのカテゴリーに分けられる。好適な窒素供与リガンドは当該技術分野で既知であり、シアノ（Ｃ≡Ｎ）、ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジン及びビピリジンの置換誘導体；テルピリジン及び置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（略称ｐｈｅｎ）、並びに４，７−ジメチルフェナントロリン及びジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（略称ｄｐｐｚ）等のフェナントロリンの置換誘導体；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（略称ｈａｔ）；９，１０−フェナントレンキノンジイミン（略称ｐｈｉ）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（略称ｔａｐ）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（略称ｃｙｃｌａｍ）及びイソシアニドが挙げられるが、これらに限定されない。縮合誘導体を含む置換誘導体を使用してもよい。一部の実施形態では、ポルフィリン及びポルフィリンファミリーの置換誘導体を使用することができる。例えば、Comprehensive Coordination Chemistry, Ed. Wilkinson et al., Pergammon Press, 1987, Chapters 13.2 (pp 73-98), 21.1 (pp. 813-898) and 21.3 (pp 915-957)（全て引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。
【０１０７】
当該技術分野で認められているように、ドナー（１）が金属に結合し、ドナー（２）が周囲の媒体（溶媒、タンパク質等）との相互作用に利用可能である任意のリガンドドナー（１）−架橋−ドナー（２）を、とりわけシアノ（Ｃがドナー（１）であり、Ｎがドナー（２）であり、パイ系がＣＮ三重結合である）のように、ドナー（１）及びドナー（２）がパイ系を介して結合する場合に本発明で使用することができる。一例は、ビピリジンによく似ているが、「背面」に媒体との相互作用のためにＮドナーを有するビピリミジンである。その他の共リガンドとしては、シアネート、イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、チオシアネート、イソニトリル、Ｎ２、Ｏ２、カルボニル、ハロゲン化物、アルコキシド、チオレート、アミド、リン化物、並びにスルフィノ、スルホニル、スルホアミノ及びスルファモイル等の硫黄含有化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
一部の実施形態では、複数のシアノを種々の金属との複合のための共リガンドとして使用する。例えば、７つのシアノでＲｅ（ＩＩＩ）に結合し、８つでＭｏ（ＩＶ）及びＷ（ＩＶ）に結合する。このため、本発明では、Ｒｅ（ＩＩＩ）で６つ以下のシアノ及び１つ若しくは複数のＬ、又はＭｏ（ＩＶ）若しくはＷ（ＩＶ）で７つ以下のシアノ及び１つ若しくは複数のＬを使用することができる。Ｗ（ＩＶ）系を有するＥＡＭは、より不活性であり、より調製が容易であり、より有利な還元電位を有することから他のものに勝る特定の利点を有する。概して、より大きなＣＮ／Ｌ比はより大きなシフトをもたらす。
【０１０９】
炭素、酸素、硫黄及びリンを用いる好適なシグマ供与リガンドが当該技術分野で既知である。例えば、好適なシグマ炭素ドナーは、Cotton and Wilkenson, Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, 1988（引用することにより本明細書の一部をなすものとする；例えば３８頁を参照されたい）に見られる。同様に、好適な酸素リガンドとしては、クラウンエーテル、水及び当該技術分野で既知の他のリガンドが挙げられる。ホスフィン及び置換ホスフィンも好適である。Cotton and Wilkensonの３８頁を参照されたい。
【０１１０】
酸素、硫黄、リン及び窒素供与リガンドは、ヘテロ原子が配位原子として働くように結合する。
【０１１１】
一部の実施形態では、有機金属リガンドを使用する。レドックス部分として使用される純粋に有機の化合物、及び複素環又は環外置換基としてドナー原子とのδ結合有機リガンドを有する様々な遷移金属配位複合体に加えて、パイ結合有機リガンドを有する広範な遷移金属有機金属化合物が利用可能である（Advanced Inorganic Chemistry, 5th Ed., Cotton & Wilkinson, John Wiley & Sons, 1988, chapter 26、Organometallics, A Concise Introduction, Elschenbroich et al., 2nd Ed., 1992, VCH、及びComprehensive Organometallic Chemistry II, A Review of the Literature 1982-1994, Abel et al. Ed., Vol. 7, chapters 7, 8, 10 & 11, Pergamon Press（引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい）。かかる有機金属リガンドとしては、シクロペンタジエニドイオン［Ｃ５Ｈ５（−１）］等の環式芳香族化合物、並びにビス（シクロペンタジエニル）金属化合物類（すなわちメタロセン）を生じるインデニリデン（−１）イオン等の様々な環置換誘導体及び環縮合誘導体が挙げられる。例えば、Robins et al., J. Am. Chem. Soc. 104:1882-1893 (1982)及びGassman et al., J. Am. Chem. Soc. 108:4228-4229 (1986)（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。これらの中でも、フェロセン［（Ｃ５Ｈ５）２Ｆｅ］及びその誘導体が、広範な化学的（Connelly et al., Chem. Rev. 96:877-910 (1996)（引用することにより本明細書の一部をなすものとする））及び電気化学的（Geiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 23:1-93及びGeiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 24:87（引用することにより本明細書の一部をなすものとする））電子移動又は「レドックス」反応に使用される典型例である。様々な第一列、第二列及び第三列遷移金属のメタロセン誘導体が、リボース環又は核酸のヌクレオシド塩基に共有結合するレドックス部分の有力な候補である。他の潜在的に好適な有機金属リガンドとしては、ビス（アレーン）金属化合物を生じるベンゼン等の環状アレーン並びにその環置換誘導体及び環縮合誘導体が挙げられ、ビス（ベンゼン）クロムが典型例である。アリル（−１）イオン又はブタジエン等の他の環状π結合リガンドが潜在的に好適な有機金属化合物をもたらし、他のパイ結合及びデルタ結合リガンドと伝導する全てのかかるリガンドが、金属と炭素との結合が存在する一般的な有機金属化合物類を構成する。架橋有機リガンド及び付加的な非架橋リガンドを有し、金属−金属結合を有する及び有しないかかる化合物の様々な二量体及びオリゴマーの電気化学的研究は、核酸分析において有力な候補レドックス部分である。
【０１１２】
共リガンドの１つ又は複数が有機金属リガンドである場合、リガンドは概して有機金属リガンドの炭素原子の１つを介して結合するが、結合は複素環リガンドの他の原子を介するものであってもよい。好ましい有機金属リガンドとしては、置換誘導体を含むメタロセンリガンド及びメタロセネオファンが挙げられる（Cotton and Wilkenson（上掲）の１１７４頁を参照されたい）。例えば、メチルシクロペンタジエニル等のメタロセンリガンドの誘導体（ペンタメチルシクロペンタジエニルのように複数のメチル基を有するのが好ましい）を用いて、メタロセンの安定性を増大することができる。好ましい実施形態では、メタロセンの２つのメタロセンリガンドの一方のみが誘導体化される。
【０１１３】
本明細書に記載されるように、リガンドの任意の組合せを用いることができる。好ましい組合せとしては、以下のものが挙げられる：ａ）全てのリガンドが窒素供与リガンドである；ｂ）全てのリガンドが有機金属リガンドである；及びｃ）導電性オリゴマーの末端のリガンドがメタロセンリガンドであり、核酸によって与えられるリガンドが窒素供与リガンドであり、必要に応じて他のリガンドが窒素供与リガンド若しくはメタロセンリガンド、又はその混合物である。
【０１１４】
概して、金属の存在により複数のプロリガンドが互いに結合して複数の酸化状態をもたらすことから、非大環状キレート剤を含むＥＡＭは金属イオンに結合し、非大環状キレート化合物を形成する。
【０１１５】
一部の実施形態では、窒素供与プロリガンドが使用される。好適な窒素供与プロリガンドは当該技術分野で既知であり、ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジン及びビピリジンの置換誘導体；テルピリジン及び置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（略称ｐｈｅｎ）、並びに４，７−ジメチルフェナントロリン及びジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（略称ｄｐｐｚ）等のフェナントロリンの置換誘導体；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（略称ｈａｔ）；９，１０−フェナントレンキノンジイミン（略称ｐｈｉ）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（略称ｔａｐ）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（略称ｃｙｃｌａｍ）及びイソシアニドが挙げられるが、これらに限定されない。縮合誘導体を含む置換誘導体を使用してもよい。金属イオンを配位的に飽和させず、別のプロリガンドの付加を必要とする大環状リガンドがこの目的で非大環状とみなされることに留意されたい。当業者に認められているように、多数の「非大環状」リガンドを共有結合して、配位的に飽和しているが、環状骨格を欠く化合物を形成することが可能である。
【０１１６】
一部の実施形態では、単座（例えば、少なくとも１つのシアノリガンド）、二座、三座及び多座リガンドの混合物をＥＡＭの構造に使用することができる。
【０１１７】
少なくとも第１の自己犠牲部分が結合したメタロセン、特にフェロセンであるＥＡＭが本発明で特に有用であるが、一部の実施形態では、下記のように２つ以上の自己犠牲部分が結合している（本明細書に広く記載される自己犠牲部分を有する他のＥＡＭを使用してもよいことにも留意されたい）。一部の実施形態では、２つ以上の自己犠牲部分がフェロセンに結合する場合、全てシクロペンタジエニル環の１つに結合する。一部の実施形態では、自己犠牲部分は異なる環に結合する。一部の実施形態では、１つの部位が電極への結合に使用される限り、シクロペンタジエニル環の一方又は両方が自己犠牲部分で飽和することが可能である。
【０１１８】
一部の実施形態では、ＥＡＭは置換１，１’−フェロセンを含む。フェロセンは空気中で安定している。フェロセンは捕捉リガンド及びアンカー基の両方で容易に置換され得る。フェロセンの周囲の環境を変化させるだけでなく、シクロペンタジエニル環の回転を防ぐフェロセン上の捕捉リガンドに標的タンパク質が結合すると、エネルギーがおよそ４ｋＪ／ｍｏｌ変化する（国際公開第１９９８／５７１５９号、Heinze and Schlenker, Eur. J. Inorg. Chem. 2974-2988 (2004)、Heinze and Schlenker, Eur. J. Inorg. Chem. 66-71 (2005)、及びHolleman-Wiberg, Inorganic Chemistry, Academic Press 34th Ed, at 1620、全て引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。
【化３】
0006276706.tif 000012
【０１１９】
他の一部の実施形態では、ＥＡＭは１，３−二置換フェロセンを含む。１，３−二置換フェロセンは既知であるが（Bickert et al., Organometallics 1984, 3, 654-657、Farrington et al.,Chem. Commun. 2002, 308-309、Pichon et al., Chem. Commun. 2004, 598-599、及びSteurer et al., Organometallics 2007, 26, 3850-3859を参照されたい）、ＳＡＭにおけるこの種の分子の電気化学的研究は文献内で報告されていない。シクロペンタジエニル（Ｃｐ）環の回転がエクリプス配座の両方のＣｐ置換基で起こり得る１，１’−二置換フェロセンとは対照的に、１，３−二置換フェロセンの位置異性体はこれらのＣｐ基間の堅固な形状を強化する分子構造をもたらす。このため、金アンカーの有機硫黄基等のアンカー基を有する１，３−二置換フェロセン、並びに受容体基、タンパク質捕捉リガンド及び／又は酵素反応部分等の捕捉リガンドは、受容体が限られた自由度で溶液／ＳＡＭ界面に提示されるＳＡＭベースの電気化学的バイオセンシング用途に適している（Ｘがアンカー基であり、Ｙが捕捉リガンドを含み得る図１を参照されたい）。化合物１〜化合物５等の１，３−二置換フェロセンの代表例が図１２に示される。アンカー及び捕捉リガンドの両方に結合する１，３−二置換フェロセンの例を下に示す。
【化４】
0006276706.tif 000013
【０１２０】
一連の１，３−二置換フェロセン誘導体（１−４）を、金でのＳＡＭ形成用の異なる官能部分及び有機硫黄アンカー基を用いて合成し、下に示す。
【化５】
0006276706.tif 000014
【０１２１】
開示の方法での使用に好適な付加的なフェロセンＥＡＭは、２０１１年１１月４日付けで出願された米国仮出願第６１／５５５，９４５号の利益を請求する、２０１２年１１月２日付けで出願された米国特許出願公開第１３／６６７，７１３号に開示されている（いずれもその全体が引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする）。
【０１２２】
加えて、ＥＡＭは概して、ＥＡＭの電極への結合に用いられるＥＡＭの導電性オリゴマーへの結合のための結合部分を有する。概して、必須というわけではないが、フェロセン等のメタロセンの場合、図１に概略的に示されるように自己犠牲部分（複数の場合もあり）はシクロペンタジエニル環の１つに結合し、結合部分は他の環に結合するが、同じ環への結合も起こり得る。当業者に認められているように、いずれの環についても自己犠牲部分と少なくとも１つの結合リンカーとの任意の組合せを使用することができる。
【０１２３】
自己犠牲部分（複数の場合もあり）及び結合部分（複数の場合もあり）に加えて、フェロセンは、少なくとも自己犠牲基の存在下又は非存在下におけるＥ０を変化させることを含む様々な理由で付加することができる付加的な置換基も含み得る。関連の引用される参照文献において「Ｒ」基として示されることが多い好適な置換基は、２００８年１０月１７日付けで出願された米国特許出願公開第１２／２５３，８２８号、２００８年１０月１７日付けで出願された米国特許出願公開第１２／２５３，８７５号、２０１０年５月７日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３３２，５６５号、２０１０年５月２１日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３４７，１２１号、及び２０１０年７月２０日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３６６，０１３号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に列挙されている。
【０１２４】
下記のような一部の実施形態では、過酸化物感受性部分がＥＡＭに直接結合し、過酸化物感受性部分が過酸化物に曝露されるとＥ０の変化をもたらす場合、ＥＡＭは自己犠牲部分を含まない。下記のように、一実施形態では、フェロセンがピナコールボロン酸エステル部分に結合する場合に第１のＥ０を有し、例えば過酸化物の存在下で除去されると第２のＥ０を有するように、過酸化物感受性部分がＥＡＭ（この場合、フェロセン）に直接結合する。
【化６】
0006276706.tif 000015
【０１２５】
自己犠牲部分
本発明のＥＡＭは、ＥＡＭがそれが存在する場合に第１のＥ０を有し、下記のように除去されると第２のＥ０を有するようにＥＡＭに共有結合する少なくとも１つの自己犠牲部分を含む。
【０１２６】
「自己犠牲スペーサー」という用語は、２つの化学的部分を正常に安定した三部分分子へと共有結合することが可能な二官能性化学的部分を指す。自己犠牲スペーサーは、第１の部分への結合が切断されると第２の部分から自発的に分離することが可能である。本発明では、自己犠牲スペーサーは過酸化物感受性部分、例えばホウ素部分をＥＡＭに連結する。図１に概略的に示されるように、過酸化物へと曝露されると、ホウ素部分が除去され、スペーサーが離れる。概して、不可逆的な反復結合転位反応が電子供与性アルコール官能基（すなわちキノンメチドモチーフ）によって開始する任意のスペーサーを、酸化条件下でアルコールを生成する誘発部分として働くホウ素基を用いて設計することができる。代替的には、ホウ素部分は遷移金属のプロキレート剤であるリガンド中の潜在フェノール酸素を遮蔽することができる。酸化の際に、リガンドが変形し、ＳＡＭにおいてＥＡＭ形成を開始する。例えば、サンプルキレートリガンドは、鉄に結合するサリチルアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾンである。
【０１２７】
当業者には理解されるように、広範な自己犠牲部分を広範なＥＡＭ及び過酸化物感受性部分とともに使用することができる。自己犠牲リンカーは、米国特許出願公開第２００９００４１７９１号、同第２０１００１４５０３６号、並びに米国特許第７，７０５，０４５号及び同第７，２２３，８３７号（特に自己犠牲スペーサーの開示について、全てその全体が引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする）を含む多数の参照文献に記載されている。
【０１２８】
本発明で特に有用な幾つかの自己犠牲リンカーを図６に示す。自己犠牲スペーサーは単一のモノマー単位、又は同じモノマー（ホモポリマー）若しくは異なるモノマー（ヘテロポリマー）のポリマーを含み得る。代替的には、自己犠牲スペーサーは、先願の「酵素を検出する電気化学的アッセイ（Electrochemical Assay for the Detection of Enzymes）」、米国特許出願公開第１２／２５３，８２８号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０３６３号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されるような化学的構造に類似した切断後のＥＡＭの環境を変化させるＳＡＭ中のＥＡＭの隣接基であり得る。
【０１２９】
過酸化物感受性部分
自己犠牲スペーサーは、過酸化物感受性部分（ＰＳＭ、本明細書でＰＯＭと称される場合もある）と本発明のＥＡＭとを結び付ける。概して、過酸化物感受性部分は図１に示されるようにホウ素を含有するものである。
【０１３０】
例えば、本明細書の図面は、過酸化物がカルバミン酸ベンジルとｐ−置換ピナコールホウ酸エステルとのアミンへの変化を誘発するフェロセン誘導体の使用を示す。この自己脱離性基は、過酸化水素の存在下でのアミン官能基化フルオロフォアの生成について以前に記載されている（Sella, E.; Shabat, D. Self-immolative dendritic probe for the direct detection of triacetone triperoxide.  Chem. Commun. 2008, 5701-5703、及びLo, L. -Cl; Chu, C.-Y. Development of highly selective and sensitive probes for hydrogen peroxide. Chem. Commun. 2003, 2728-2729、どちらも引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。他のかかる基（アリールホウ酸エステル及びアリールボロン酸）も上記文献（Sella and Lo）に記載されている。加えて、フェロセニルアミンが、対応するカルバメート誘導体と比較してより低い電位（約１５０ｍＶ）でレドックス挙動を示すことが知られている（Sagi et al., Amperometric Assay for Aldolase Activity; Antibody-Catalyzed Ferrocenylamine Formation. Anal. Chem. 2006, 78, 1459-1461（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい）。
【０１３１】
可溶性捕捉結合リガンド
ＳＡＭ及びＥＡＭに加えて、一部の実施形態では、電極は捕捉結合リガンドを含む。本明細書で「結合リガンド」又は「結合種」は、標的分析物の存在を調査するために使用され、標的分析物に結合する化合物を意味する。概して、本明細書に記載の大半の実施形態については、標的分析物分子１つ当たり少なくとも２つの結合リガンド（検出表面に結合する「捕捉」又は「アンカー」結合リガンド、及び標的分析物に独立して結合し、直接的又は間接的にＳＯＸ等の少なくとも１つの標識を含む可溶性結合リガンド）が使用される。本明細書で「捕捉結合リガンド」は、標的分析物に結合する電極表面に結合している標的分析物に結合する結合リガンドを意味する。本明細書で「可溶性結合リガンド」は、捕捉結合リガンドとは異なる部位で標的分析物に結合する溶液中に存在する結合リガンドを意味する。
【０１３２】
当業者に認められているように、結合リガンドの組成は標的分析物の組成によって決まる。広範な分析物に対する結合リガンドは既知であるか、又は既知の技法を用いて容易に発見することができる。例えば、分析物がタンパク質である場合、結合リガンドはタンパク質（特に抗体又はそのフラグメント（ＦＡｂ等）を含む）又は小分子を含む。
【０１３３】
概して、抗体は捕捉結合リガンド及び可溶性結合リガンドの両方として有用である。
【０１３４】
可溶性結合リガンドは、過酸化物を生成する酵素等の過酸化物生成部分も含む。本明細書で規定されるように、「過酸化物生成系（"peroxide generating system" or "peroxide-generating system"）」という用語は、過酸化物をその基質から直接生成する１つ又は複数の酵素、及び／又は中間体、例えば過酸化物を生成する別の酵素の補助因子若しくは前駆基質（pre-substrate）を生成する中間酵素を意味する。一例では、過酸化物生成部分は過酸化物を生成する酵素、例えば「過酸化物生成酵素」であり得る。グルコースオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ等を含む広範なかかる酵素が既知である。広範な好適なオキシダーゼ酵素が当該技術分野で既知である（グルコースオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）及びコリンオキシダーゼを含むが、これらに限定されないＥＣ  １．１．３．４に分類される任意のグルコースオキシダーゼ酵素を参照されたい）。アスペルギルス種（例えばアスペルギルス・ニガー（A. niger））、ペニシリウム種、ストレプトミセス種、マウス等）を含むが、これらに限定されない細菌、真菌及び動物（哺乳動物）を含む広範な生物に由来するグルコースオキシダーゼ酵素も既知である。ＥＣ  １．３．３．６に分類されるアシルＣｏＡオキシダーゼも有用である。
【０１３５】
本明細書で「中間酵素」という用語は、別の中間酵素又は過酸化物生成酵素等の別の酵素の基質又は補助因子である生成物を生成する酵素を意味する。例えば、可溶性結合リガンドは、基質との反応によって過酸化物を生成する可溶性アポ−オキシダーゼ酵素（すなわち、アポ−ＤＡＡＯに結合するＦＡＤへと変換されるＦＡＤＰ）のリン酸化前駆体からの必須の補助因子の生成を触媒するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）等の酵素を含有し得る。この戦略はアポ−酵素、リン酸化補助因子及びオキシダーゼ酵素基質の濃度が表面固定化標的に対して高い場合に標的結合事象のカスケード増幅を可能にする。
【０１３６】
本明細書で規定されるように、本明細書で「標的特異的酵素」という用語は、標的分析物、例えばＡＴＰに特異的な酵素、例えばグリセロールキナーゼを意味する。
【０１３７】
本明細書で規定されるように、本明細書で「リサイクリング酵素」という用語は、ＮＡＤ＋からのＮＡＤＨの生成等の別の酵素の必須の基質を再生又はリサイクルする酵素を意味する。
【０１３８】
概して、捕捉結合リガンドは検出目的での検出表面への標的分析物の結合を可能にする。一実施形態では、結合は特異的であり、結合リガンドは結合対の一部である。本明細書で「特異的に結合する」とは、分析物と試験サンプルの他の構成要素又は汚染物質とを区別するのに十分な特異性でリガンドが分析物に結合することを意味する。本明細書で「特異的な結合対」とは、抗体／抗原及び受容体／リガンド等の結合リガンドの相補対を意味する。結合は、非特異的な結合を除去する洗浄工程を含むアッセイ条件下で分析物が結合したままであるのに十分であるものとする。一部の実施形態では、例えば或る特定の生体分子の検出において、結合リガンドへの分析物の結合定数は少なくとも約１０−４Ｍ−１〜１０−９Ｍ−１であり、少なくとも約１０−５Ｍ−１〜１０−９Ｍ−１が好ましく、少なくとも約１０−７Ｍ−１〜１０−９Ｍ−１が特に好ましい。
【０１３９】
広範な分析物に対する結合リガンドは既知であるか、又は既知の技法を用いて容易に発見することができる。例えば、分析物が一本鎖核酸である場合、結合リガンドは概して実質的に相補的な核酸である。代替的には、米国特許第５，２７０，１６３号、同第５，４７５，０９６号、同第５，５６７，５８８号、同第５，５９５，８７７号、同第５，６３７，４５９号、同第５，６８３，８６７号、同第５，７０５，３３７号及び関連特許（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に概略的に記載されるように、実質的に任意の標的分析物に結合する核酸「アプタマー」を開発することができる。同様に、分析物は核酸結合タンパク質であってもよく、捕捉結合リガンドは一本鎖又は二本鎖核酸である。代替的には、分析物が一本鎖又は二本鎖核酸である場合、結合リガンドは核酸結合タンパク質であり得る。分析物がタンパク質である場合、結合リガンドは上記のタンパク質（特に抗体又はそのフラグメント（ＦＡｂ等）を含む）、小分子又はアプタマーを含む。好ましい結合リガンドタンパク質は抗体及びペプチドを含む。当業者に認められているように、好ましくは特異的に結合する任意の２つの分子を分析物又は結合リガンドとして使用することができる。好適な分析物／結合リガンド対としては、抗体／抗原、受容体／リガンド、タンパク質／核酸；核酸／核酸、酵素／基質及び／又は阻害剤、炭水化物（糖タンパク質及び糖脂質を含む）／レクチン、炭水化物及び他の結合パートナー、タンパク質／タンパク質；及びタンパク質／小分子が挙げられるが、これらに限定されない。これらは野生型又は誘導体配列であり得る。
【０１４０】
捕捉結合リガンド（例えば捕捉抗体）は電極に共有結合するか（通常は結合リンカーを介する）、又は共有的にではないが強固に結合する、例えばビオチン／ストレプトアビジン反応（例えばＳＡＭ表面上のビオチン、抗体等のストレプトアビジン結合捕捉リガンド、又は逆の場合）を用いて、核酸反応（例えば、捕捉リガンドは核酸（「ワトソン」）を有し、表面は相補的な核酸（「クリック」）を有し得る）によって結合する、抗体のＦｃフラグメントに結合するプロテインＧを用いて結合することができる。
【０１４１】
本明細書に記載の本発明が、違法な爆発性過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）のセンサーとしても用いられ得ることにも留意されたい。
【０１４２】
アンカー基
本発明は、ＥＡＭ（任意に導電性オリゴマーによって電極表面に結合する）、ＳＡＭ、及び電極表面上の捕捉結合リガンドを含む化合物を提供する。概して、一部の実施形態では、これらの部分はアンカー基を用いて電極に結合している。本明細書で「アンカー」又は「アンカー基」は、本発明の化合物を電極に結合する化学基を意味する。
【０１４３】
当業者に認められているように、アンカー基の組成はそれが結合する表面の組成に応じて異なる。金電極の場合、ピリジニルアンカー基及びチオールベースアンカー基の両方が特に有用である。
【０１４４】
導電性オリゴマーの共有結合は、使用する電極及び導電性オリゴマーに応じて様々な方法で達成することができる。概して、下記構造１において「Ａ」で示される或るタイプのリンカーを使用する場合、Ｘは導電性オリゴマーであり、網掛けした表面は電極である。
【化７】
0006276706.tif 000016
【０１４５】
この実施形態では、Ａはリンカー又は原子である。「Ａ」の選択は電極の特徴に一部依存する。このため、例えば金電極を使用する場合、Ａは硫黄部分であり得る。代替的には、金属酸化物電極を使用する場合、Ａは酸化物の酸素に結合したケイ素（シラン）部分であり得る（例えば、Chen et al., Langmuir 10:3332-3337 (1994)、Lenhard et al., J. Electroanal. Chem. 78:195-201 (1977)（どちらも引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい）。炭素ベース電極を使用する場合、Ａはアミノ部分であり得る（好ましくは一次アミン；例えばDeinhammer et al., Langmuir 10:1306-1313 (1994)を参照されたい）。このため、好ましいＡ部分としては、シラン部分、硫黄部分（アルキル硫黄部分を含む）及びアミノ部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
一部の実施形態では、電極は炭素電極、すなわちガラス状炭素電極であり、結合はアミン基の窒素を介したものである。代表的な構造は米国特許出願公開第２００８０２４８５９２号（特にそれに記載の構造並びに種々のアンカー基の説明及び付随の文章について、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の構造１５に示される。この場合も付加的な原子、すなわちリンカー及び／又は末端基が存在していてもよい。
【０１４７】
上記の米国特許出願公開第２００８０２４８５９２号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の構造１６では、酸素原子は金属酸化物電極の酸化物に由来する。Ｓｉ原子は他の原子を含有する、すなわち置換基を含有するケイ素部分であってもよい。他の電極へのＳＡＭの他の結合が当該技術分野で既知である。例えばインジウムスズ酸化物電極の結合、更にはインジウムスズ酸化物電極へのリン酸塩の化学吸着についてのNapier et al., Langmuir, 1997を参照されたい（H. Holden Thorpe, CHI conferenceにて口頭発表, May 4-5, 1998）。
【０１４８】
好ましい一実施形態では、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）を電極として使用し、アンカー基はホスホン酸含有種である。
【０１４９】
１）硫黄アンカー基
構造１では単一部分として示されているが、導電性オリゴマーは２つ以上の「Ａ」部分によって電極に結合していてもよい。この「Ａ」部分は同じであっても又は異なっていてもよい。このため、例えば電極が金電極であり、「Ａ」が硫黄原子又は部分である場合、下記構造２、３及び４に概略的に示されるように、複数の硫黄原子を電極への導電性オリゴマーの結合に用いることができる。当業者に認められているように、他のかかる構造を作製することができる。構造２、３及び４では、Ａ部分は単なる硫黄原子であるが、置換硫黄部分を使用してもよい。
【０１５０】
このため、例えば下記構造６に概略的に示されるように電極が金電極であり、「Ａ」が硫黄原子又は部分である場合、下記構造２、３及び４に概略的に示されるように、複数の硫黄原子を電極への導電性オリゴマーの結合に用いることができる。当業者に認められているように、他のかかる構造を作製することができる。構造２、３及び４では、Ａ部分は単なる硫黄原子であるが、置換硫黄部分を使用してもよい。
【化８】
0006276706.tif 000017
【化９】
0006276706.tif 000018
【化１０】
0006276706.tif 000019
【０１５１】
構造４と同様に、電極に結合した３つの硫黄部分を有する単一の炭素原子で終わる導電性オリゴマーを得ることが可能であり得ることにも留意されたい。
【０１５２】
別の態様では、本発明は結合チオールを含むアンカーを提供する。結合チオールアンカーを有する幾つかの例示的な複合体を図１０に示す。一部の実施形態では、アンカーはアルキルチオール基を含む。例の一部を図１０Ａ及び図４Ｂに示す。それぞれカルベン及び４−ピリジルアラニンをベースとする２つの化合物を図１０Ｂに示す。
【０１５３】
別の態様では、本発明は、金電極等の電極での分析物検出用の電気活性部分の構築においてアンカー基として働く結合多点結合型チオ含有化合物を提供する。すなわち、スペーサー基（ＥＡＭ、ＲｅＡＭＣ又は「空」単分子層形成種に結合することができる）は２つ以上の硫黄原子を用いて結合している。これらの多点結合型アンカー基は、本明細書に記載されるように線状又は環状であり得る。
【０１５４】
一部の実施形態では、アンカー基は金表面に結合する２つの硫黄原子を含有する「二点結合型」であり、線状であるが、場合によっては他の多点結合型（例えば「三点結合型」）の系を含むことが可能であり得る。かかる多点結合型アンカー基は安定性の増大を示し、及び／又は立体的に困難な頭基を有するチオール含有アンカーからのＳＡＭの調製のフットプリントの増大を可能にする。
【０１５５】
一部の実施形態では、アンカーは環状ジスルフィドを含む（「二点結合型」）。場合によっては他の多点結合型（例えば「三点結合型」）の環系アンカー基を含むことが可能であり得る。環の原子の数は例えば５〜１０で変化することができ、下記で論考する多環式アンカー基も含まれる。
【０１５６】
一部の実施形態では、アンカー基は下に示すように先端窒素原子及び分子内ジスルフィド結合を有する７員環である［１，２，５］−ジチアゼパン単位を含む：
【化１１】
0006276706.tif 000020
【０１５７】
構造（ＩＩＩａ）において、環の炭素原子が付加的に置換され得ることにも留意されたい。当業者に認められているように、他の員数の環も含まれる。加えて、他の環状アルカン（環状ヘテロアルカンを含む）又は芳香環構造で置換された上に示す［１，２，５］−ジチアゼパン等の環状ヘテロアルカンを含み得る多環式環構造を使用することができる。  
【０１５８】
一部の実施形態では、アンカー基及びスペーサーの一部は下に示す構造を有する：
【化１２】
0006276706.tif 000021
【０１５９】
ここでの「Ｒ」基は、ＥＡＭの遷移金属構成要素の末端配位リガンドを有する結合オリゴフェニルエチニレン単位を含む任意の置換基であり得る。
【０１６０】
アンカーは、Li et al., Org. Lett. 4:3631-3634 (2002)（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載の二点結合型中間体（Ｉ）（Ｒ＝Ｉである式ＩＩＩの化合物）から合成される。Wei et al, J. Org, Chem. 69:1461-1469 (2004)（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）も参照されたい。
【０１６１】
硫黄原子の数は本明細書に概説するように変更することができ、特定の実施形態ではスペーサー１つ当たり１つ、２つ及び３つが用いられる。
【０１６２】
当業者に認められているように、本発明の組成物は、下記及び２００８年１０月１７日付けで出願された米国特許出願公開第１２／２５３，８２８号、２００８年１０月１７日付けで出願された米国特許出願公開第１２／２５３，８７５号、２０１０年５月７日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３３２，５６５号、２０１０年５月２１日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３４７，１２１号、２０１０年７月２０日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３６６，０１３号に概説されるものを含む様々な方法で作製することができる。一部の実施形態では、組成物は米国特許第６，０１３，４５９号、同第６，２４８，２２９号、同第７，０１８，５２３号、同第７，２６７，９３９号、米国特許出願公開第０９／０９６５９３号及び同第６０／９８０，７３３号、並びに２００８年８月７日付けで出願された米国仮出願第６１／０８７，１０２号（いずれもその全体が全ての目的で引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示される方法に従って作製される。
【０１６３】
用途
本発明の系は、本明細書で概説される様々な標的分析物の検出に使用される。一部の実施形態では、図１１〜図１３に概略的に示されるように「サンドイッチ」タイプのアッセイが用いられる。他の実施形態では、例えばＡＴＰ及びＮＡＤＨ等の特定の代謝産物の検出のために、他のフォーマットが用いられる。
【０１６４】
一部の実施形態では、例えば「サンドイッチ」タイプのフォーマットにおいて、試験サンプル中に含有される標的分析物を、ＰＳＭ−ＳＩＭ−ＥＡＭ混合物、捕捉結合リガンド及び任意にＳＡＭを含む電極に添加する。この添加に続いて、任意の洗浄工程及び可溶性結合リガンドの添加を行うが、当業者に認められているように、これらの添加は同時に行っても、又は溶液結合リガンドをチップへの添加の前に標的分析物を含有するサンプルに添加してもよい。表面を再び任意に洗浄し、過酸化物感受性部分の基質、例えばグルコースを、存在する場合に過酸化物が生成し、ＳＩＭが切断される条件下で添加する。
【０１６５】
一部の実施形態では、例えば図１２及び図１３に示されるように、対象の代謝産物（例えば標的分析物又は標的代謝産物）を使用する特異的なペルオキシダーゼ生成酵素が存在する場合、系は異なる形状をとる。例えば、図１２では、概してＳＡＭを有する電極が少なくとも２つの種を含有する：（１）フェロセンベースの誘導体として図１２に示される自己犠牲部分を有するＥＡＭ（本明細書に記載され、当業者に認められているように、他のＥＡＭを使用してもよい）、及び（２）結合ペルオキシダーゼ生成酵素、この場合は示されるようにＮＡＤＨオキシダーゼ。本明細書で概説されるように、ペルオキシダーゼ生成酵素は多数の異なる方法で電極表面に結合することができる。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０３７９号に概略的に説明されるように、酵素が単分子層形成種の末端に結合する場合に、結合はカップリング化学を用いる「直接的な」ものであってもよい。代替的には、図１２に示されるように、多数の「サンドイッチ」タイプの結合を用いて、例えばビオチンが結合している単分子層種、ストレプトアビジン及びビオチン標識酵素を用いて酵素を結合することができる。
【０１６６】
一部の実施形態では、例えば米国特許第７，５９５，１５３号（特に結合配置の概要について、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の構造７に概略的に示されるように、これら２つの種は電極表面に単一部分として結合することができる。
【０１６７】
これらの条件は概して生理学的条件である。概して、複数のアッセイ混合物を並行して異なる濃度で用い、様々な濃度に対する差次的応答を得る。典型的には、これらの濃度の１つを陰性対照、すなわちゼロ濃度又は検出レベル未満とする。加えて、任意の様々な他の試薬がスクリーニングアッセイに含まれていてもよい。これらとしては、最適結合を促進し、及び／又は非特異的な若しくはバックグラウンド相互作用を低減するのに使用することができる塩等の試薬、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤等が挙げられる。また、別の形でアッセイの効率を改善する試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等を使用することができる。構成要素の混合物は、必要な結合をもたらす任意の順序で添加してもよい。
【０１６８】
［ペルオキシダーゼの生成は複合体のＰＧＭ−ＳＩＭ構成要素の喪失をもたらし、ＥＡＭのＥ０の変化を生じる。一部の実施形態では、ＥＡＭのＥ０は約２０ｍＶ、３０ｍＶ、４０ｍＶ、５０ｍＶ、７５ｍＶ、８０ｍＶ、９０ｍＶ〜１００ｍＶ変化し、２００ｍＶ、３００ｍＶ又は５００ｍＶの変化を生じる一部の実施形態が達成される。一部の実施形態では、ＥＡＭのＥ０の変化は減少である。一部の実施形態では、ＥＡＭのＥ０の変化は増大である。
【０１６９】
電子移動は概して電子的に開始し、電圧が好ましい。適用電位の正確な制御及び変動は、ポテンシオスタット及び三電極系（１つの参照電極、１つの試料電極及び１つの対電極）又は二電極系（１つの試料電極及び１つの対電極）によって行うことができる。これにより、一部はレドックス活性分子の選択、一部は使用する導電性オリゴマーに依存する系のピーク電子移動電位に適用電位を整合させることができる。
【０１７０】
検出
レドックス活性分子と電極との間の電子移動は様々な方法で検出することができ、好ましくは、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、キャパシタンス及びインピーダンスを含む電子検出が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法には、ＡＣ又はＤＣ電流に基づく時間又は周波数に依存する方法、パルス法、ロックイン法及びフィルタリング（ハイパス、ローパス、バンドパス）が含まれる。一部の実施形態では、電子移動検出のみが必要とされ、他の実施形態では、電子移動速度が決定され得る。
【０１７１】
一部の実施形態では、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、キャパシタンス及びインピーダンスを含む電子検出を用いる。好適な技法としては、電解重量法；クーロメトリー（制御電位クーロメトリー及び一定電流クーロメトリーを含む）；ボルタンメトリー（サイクリックボルタンメトリー、パルスボルタンメトリー（正規パルスボルタンメトリー、矩形波ボルタンメトリー、差分パルスボルタンメトリー、Ｏｓｔｅｒｙｏｕｎｇ矩形波ボルタンメトリー及び定電量パルス法））；ストリッピング分析（陽極ストリッピング分析、陰極ストリッピング分析、矩形波ストリッピングボルタンメトリー）；コンダクタンス測定（電解コンダクタンス、直接分析）；時間依存性電気化学的分析（クロノアンペロメトリー、クロノポテンショメトリー、サイクリッククロノポテンショメトリー及びアンペロメトリー、ＡＣポログラフィー、クロノガルバメトリー及びクロノクーロメトリー）；ＡＣインピーダンス測定；静電容量測定；ＡＣボルタンメトリー及び光電気化学が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
一部の実施形態では、電子移動のモニタリングはアンペロメトリー検出によって行われる。この検出方法は、本発明の組成物を含有する電極と、試験サンプル中の補助（対）電極との間に電位（分離参照電極と比較する）を適用することを伴う。標的分析物の存在下又は非存在下のサンプル中で効率の異なる電子移動を誘導する。
【０１７３】
アンペロメトリーにより電子移動を測定するデバイスは高感度電流検出を伴い、電圧電位を制御する手段、通常はポテンシオスタットを含む。この電圧をレドックス活性分子の電位に対して最適化する。
【０１７４】
一部の実施形態では、代替的な電子検出モードを利用する。例えば、ポテンショメトリー（又はボルタンメトリー）測定は非ファラデー（正味電流フローなし）プロセスを伴い、ｐＨ検出器及び他のイオン検出器で従来用いられている。同様のセンサーを使用して、レドックス活性分子と電極との間の電子移動をモニタリングする。加えて、絶縁体（抵抗等）及び導体（伝導性、インピーダンス及びキャパシタンス等）の他の特性を用いて、レドックス活性分子と電極との間の電子移動をモニタリングすることができる。最後に、電流（電子移動等）を生成する任意の系では小磁場も生成し、一部の実施形態ではこれをモニタリングしてもよい。
【０１７５】
本発明の組成物で観察される高速の電子移動の利点の１つが、時間分解能によって電子電流に基づくモニターのシグナル対ノイズ結果を大幅に増強し得ることであることを理解されたい。本発明の高速の電子移動は、高いシグナル及び電子移動の開始と終了との間の常同的遅延の両方をもたらす。例えば電子移動のパルス開始及び検出の「ロックイン」増幅器を用いて特定の遅延のシグナルを増幅することによって、シグナル対ノイズの大きさの改善を達成することができる。
【０１７６】
一部の実施形態では、直流電流（ＤＣ）法を用いて電子移動を開始し、検出する。上述のように、先のレドックス活性分子の第１のＥ０及び後の反応レドックス活性分子の第２のＥ０によって分析物の検出が可能になる。当業者に認められているように、多数の好適な方法を用いて電子移動を検出することができる。
【０１７７】
一部の実施形態では、交流電流（ＡＣ）法を用いて電子移動を開始する。第１の入力電気的シグナルを、好ましくは少なくとも試料電極（本発明の複合体を含有する）及び対電極を介して系に適用し、電極と第２の電子移動部分との間の電子移動を開始する。電圧を参照電極及び作用電極に適用する三電極系を用いてもよい。この実施形態では、第１の入力シグナルは少なくともＡＣ成分を含む。ＡＣ成分は変動振幅及び周波数であってもよい。概して、本方法での使用については、ＡＣ振幅は約１ｍＶ〜約１．１Ｖの範囲であり、約１０ｍＶ〜約８００ｍＶが好ましく、約１０ｍＶ〜約５００ｍＶがとりわけ好ましい。ＡＣ周波数は約０．０１Ｈｚ〜約１０ＭＨｚの範囲であり、約１Ｈｚ〜約１ＭＨｚが好ましく、約１Ｈｚ〜約１００ｋＨｚがとりわけ好ましい。
【０１７８】
一部の実施形態では、第１の入力シグナルはＤＣ成分及びＡＣ成分を含む。すなわち、試料電極と対電極との間のＤＣオフセット電圧を第２の電子移動部分の電気化学的電位によって掃引する。掃引を用いて系の最大応答が見られるＤＣ電圧を同定する。これは概して、レドックス活性分子の電気化学的電位又はその前後である。この電圧を決定した後、掃引又は１つ若しくは複数の均一ＤＣオフセット電圧を用いることができる。約１Ｖ〜約＋１．１ＶのＤＣオフセット電圧が好ましく、約５００ｍＶ〜約＋８００ｍＶがとりわけ好ましく、約３００ｍＶ〜約５００ｍＶが特に好ましい。ＤＣオフセット電圧に加えて、変動振幅及び周波数のＡＣシグナル成分を適用する。レドックス活性分子がＡＣ摂動に応答するのに十分に低い溶媒再構成エネルギーを有する場合、電極とレドックス活性分子との間の電子移動によってＡＣ電流が生じる。
【０１７９】
一部の実施形態では、ＡＣ振幅を変化させる。理論に束縛されるものではないが、振幅の増大によって駆動力が増大するようである。このため、より高い過電圧を生じるより高い振幅が、より速い電子移動速度をもたらす。このため、概して、その周波数でより高い過電圧を用いることにより、任意の単一周波数での応答の改善（すなわち、より高い出力シグナル）が同じ系で得られる。このため、振幅を高周波数で増大させて、系を介した電子移動速度を増大させ、感度の増大をもたらすことができる。加えて、上述のように、レドックス活性分子の第１及び第２のＥ０を電子移動速度に基づいて測定し、これを用いて周波数又は過電圧に基づき２つを区別することが可能である。
【０１８０】
一部の実施形態では、系の測定は少なくとも２つの別個の振幅又は過電圧で行われ、複数の振幅での測定が好ましい。上述のように、振幅の変化の結果としての応答の変化が系の同定、校正及び定量化の基礎となり得る。
【０１８１】
一部の実施形態では、ＡＣ周波数を変化させる。異なる周波数で、異なる分子は異なる形で応答する。当業者に認められているように、周波数の増大により概して出力電流が増大する。しかしながら、電子が電極とレドックス活性分子との間を移動することができる速度よりも周波数が大きい場合、より高い周波数によって出力シグナルの喪失又は減少が引き起こされる。或る時点で、周波数はレドックス活性分子を阻害する均一溶媒を通る電子移動速度よりも大きくなり、出力シグナルも低下する。
【０１８２】
加えて、ＡＣ法を用いることにより、共有結合核酸以外の実体による任意の単一周波数でのバックグラウンドシグナルの大幅な低減、すなわち不要なシグナルの「ロックアウト」又は「フィルタリング」が可能になる。すなわち、溶液中の電荷担体又はレドックス活性分子の周波数応答がその拡散係数により制限される。したがって、高周波数では、電荷担体は、その電荷を電極に移動させるのに十分に急速には拡散せず、及び／又は電荷移動動態は十分な速度ではない可能性がある。これは、不動態化層の単分子層を利用しないか、又は単分子層が部分的若しくは不十分な、すなわち溶媒が電極に接近可能である実施形態において特に重要である。上記で概説したように、ＤＣ法では、電極が溶媒に接近可能な「ホール」の存在によって系を「短絡する」溶媒電荷担体が生じる。しかしながら、本ＡＣ法を用いると、単分子層の有無を問わずに、溶液中の１つ又は複数の電荷担体の周波数応答を防止する１つ又は複数の周波数を選ぶことができる。これは、血液等の多くの体液がアンペロメトリー検出法を妨げ得る相当量のレドックス活性分子を含有することから特に重要である。
【０１８３】
一部の実施形態では、系の測定は少なくとも２個の別個の周波数で行われ、複数の周波数での測定が好ましい。複数の周波数はスキャンを含む。好ましい実施形態では、周波数応答を少なくとも２個、好ましくは少なくとも約５個、より好ましくは少なくとも約１０個の周波数で決定する。
【０１８４】
シグナル処理
入力シグナルを伝達して電子移動を開始した後、出力シグナルを受信又は検出する。出力シグナルの存在及び大きさは、入力シグナルの過電圧／振幅；入力ＡＣシグナルの周波数；電子移動部分間の介在媒体の組成、すなわちインピーダンス；ＤＣオフセット；系の環境；及び溶媒に依存する。所与の入力シグナルでは、出力シグナルの存在及び大きさは、概して金属イオンの酸化状態の変化をもたらすのに必要とされる溶媒再構成エネルギーに依存する。このため、ＡＣ成分及びＤＣオフセットを含む入力シグナルを伝達すると、電子が電極とレドックス活性分子との間で移動し、溶媒再構成エネルギーが十分に低い場合、周波数は範囲内であり、振幅は出力シグナルを生じるのに十分となる。
【０１８５】
一部の実施形態では、出力シグナルはＡＣ電流を含む。上記で概説したように、出力電流の大きさは多数のパラメーターに依存する。これらのパラメーターを変化させることによって、系を様々に最適化することができる。
【０１８６】
概して、本発明で生成するＡＣ電流は約１フェムトアンペア〜約１ミリアンペアの範囲であり、約５０フェムトアンペア〜約１００マイクロアンペアの電流が好ましく、約１ピコアンペア〜約１マイクロアンペアがとりわけ好ましい。
【０１８７】
装置
本発明は、ＡＣ検出方法を用いて分析物を検出する装置を更に提供する。装置は、少なくとも第１の測定電極又は試料電極と、第２の測定電極又は対電極とを有する試験チャンバを備える。三電極系も有用である。第１及び第２の測定電極を、液体試験サンプルの存在下で２つの電極が電気的に接触することができるように試験サンプル受容領域と接触させる。
【０１８８】
更に別の実施形態では、第１の測定電極はスペーサーを介して、好ましくは本明細書に記載されるような導電性オリゴマーを介して共有結合したレドックス活性複合体を含む。代替的には、第１の測定電極は共有結合したレドックス活性分子及び結合リガンドを含む。
【０１８９】
装置は試験チャンバ、すなわち測定電極に電気的に接続された電源を更に備える。電源は必要に応じてＡＣ電圧及びＤＣ電圧を供給することが可能であるのが好ましい。
【０１９０】
一実施形態では、装置は入力シグナル及び出力シグナルを比較することが可能なプロセッサを更に備える。プロセッサは電極と連結し、出力シグナルを受信することにより、標的分析物の存在を検出するように作られている。
【実施例】
【０１９１】
実施例１：
一般的方法及び材料
特に指定のない限り、全ての合成操作は標準的なシュレンク法を用いて乾燥アルゴン雰囲気下で行った。反応媒体については、溶媒をGlass Contours（Laguna Beach，CA）から入手したＤｏｗ−Ｇｒｕｂｂｓ溶媒系１により中性アルミナで乾燥させた。これらの溶媒を使用前にアルゴンで脱酸素化した。ＥＭＤプレコートアルミニウムプレート（シリカゲル６０、Ｆ２５４、EMD Chemicals， Inc.，Gibbstown，NJ）を用いたＴＬＣによって反応をモニタリングした。スポットを以下の方法の１つによって可視化した：ヨウ素蒸気、ＵＶ光への曝露、又はリンモリブデン酸による染色後の加熱。フラッシュクロマトグラフィーを陽圧実験室空気下、シリカ（シリカゲル６０、粒径：４０μｍ〜６３μｍ；Sorbent Technologies，Atlanta，GA）上で行った。１Ｈ  ＮＭＲスペクトル及びプロトンデカップリング１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルをBrukerのＡｖａｎｃｅ  ＩＩＩ分光計（１Ｈでは４９９．３７ＭＨｚ、１３Ｃでは１２５．５８ＭＨｚ）で記録し、BrukerのＴＯＰＳＰＩＮ  ２．１ソフトウェアで処理した。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）を、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法又は大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）法を用いるＡｇｉｌｅｎｔ  ６２１０飛行時間型（ＴＯＦ）ＬＣ／ＭＳ装置を使用して行った。
【０１９２】
クロロホルム−ｄ１はCambridge Isotope Laboratoriesから購入した。化合物２及びｐ−ピナコールホウ酸ベンジルアルコールは、以前記載されているように合成した（Bertin, P. A.; Meade, T. J. Tetrahedron Lett. 2009, 50, 5409-5412; Sella, E.、Shabat, D. Chem. Commun. 2008, 5701-5703、どちらも引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする）。他の全ての試薬は商業的供給源から購入し、特に指定のない限り更に精製することなく使用した。
【０１９３】
化合物３
テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）中の化合物２（０．５００ｇ、１．２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２５ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液に、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）（０．２８５ｍＬ、１．３２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１．５時間撹拌し、減圧下で濃縮した。粗残渣をカラムクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチル：ジクロロメタン  ０．５：１．５：８）によって精製し、表題化合物を赤色／橙色固体として得た（０．４６０ｇ、１．０４ｍｍｏｌ、８７％）。１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ｛１Ｈ｝  ＮＭＲ及びＨＲＭＳは表題化合物と一致した。
【０１９４】
化合物４
トルエン（２０ｍＬ）中の化合物３（０．４６０ｇ、１．０４ｍｍｏｌ）の溶液をＡｒでしっかりと脱気し、１００℃に１．５時間加熱し、ｐ−ピナコールホウ酸ベンジルアルコール（０．２６８ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）及びジラウリン酸ジブチルスズ（ＤＢＴＬ）（０．０１８ｍＬ、０．０３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を更に２時間１００℃に維持した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗残渣をカラムクロマトグラフィー（ジエチルエーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン、１：２：２）によって精製して、表題化合物を淡橙色固体として得た（０．４８０ｇ、０．７４１ｍｍｏｌ、７１％）。１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ｛１Ｈ｝  ＮＭＲ及びＨＲＭＳは表題化合物と一致した。
【０１９５】
化合物５
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の化合物４（０．１３５ｇ、０．２０９ｍｍｏｌ）の溶液を氷浴中で冷却した。トリフルオロ酢酸：ジクロロメタン（１：１（ｖ／ｖ）、５ｍＬ）を５分間かけて滴加した。１５分後、氷浴を取り外し、反応混合物を室温まで加温した。４５分後、揮発性物質を真空で除去し、表題化合物のトリフルオロ酢酸塩を褐色／橙色固体として得た（定量的）。１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ｛１Ｈ｝  ＮＭＲ及びＨＲＭＳは表題化合物と一致した。
【０１９６】
化合物１
ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１：１（ｖ／ｖ）、５ｍＬ）中の１１−メルカプトウンデカン酸（０．０４５ｇ、０．２０６ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（０．０７８ｇ、０．２０６ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物５（０．１０５ｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．０８３ｍＬ、０．４７７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈し、ブライン（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、粗残渣へと濃縮し、これをカラムクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチル：ジクロロメタン、０．５：１．５：８）によって精製して、表題化合物を黄色固体として得た（０．０３５ｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、３０％）。１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ｛１Ｈ｝  ＮＭＲ及びＨＲＭＳは表題化合物と一致した。
【０１９７】
電気化学
サイクリックボルタンメトリーをＴＨＦ中、０．１５Ｍ  ｎ−Ｂｕ４ＮＣｌＯ４支持電解質（０．５ｍＬ）を用いてＣＨＩモデル６６０Ａ電気化学分析装置（CHI Instruments Inc.）によってＳＡＭ修飾金を作用電極として、Ａｇ／ＡｇＣｌワイヤー参照電極及び白金ワイヤー対電極（Bioanalytical Systems）の三電極系を使用して行った。モデル化合物（緑色）は化合物４を過酸化水素で処理することによって調製した。結果を図３に示す。
【０１９８】
実施例２：Ｈ２Ｏ２の直接添加の結果としての２つの固有電位Ｅ０１及びＥ０２での定量可能な電気化学的シグナルの測定
Ａ．目的
この研究の目的は、ｐＨ１０．１で洗浄し、ｐＨ８．５でインキュベートしたＥＡＭ１の希釈ＳＡＭ（ＰＢ２５＿４９）に対する５分間及び１０分間のＨ２Ｏ２インキュベーション時間の影響を試験することであった。Ｈ２Ｏ２は、ＥＡＭ上のフェロセンを新たな電位で現れる新たな誘導体へと分解する。
【０１９９】
Ｂ．材料
【０２００】
【表２】
0006276706.tif 000022
【０２０１】
【化１３】
0006276706.tif 000023
【０２０２】
Ｃ．手順
１日目：
チップの洗浄及び組立て
１３個（アッセイ１２個＋内部参照試験１個）のチップを以下のように洗浄した：インサートを有するガラスジャーにチップを入れ、０．２％ＴＷＥＥＮ  ２０溶液中で５分間超音波処理し、ｎａｎｏｐｕｒｅ水及びエタノールでリンスした後、アルゴンで乾燥させた。次いで、チップをプラズマ洗浄装置で１０分間クリーニングし、エタノールでリンスし、アルゴンで乾燥させた。金属ベース、ガスケット及びＰＤＭＳスタンプを石鹸で手洗いし、エタノールでリンスし、風乾した。金属ベースの中央の両面テープの上にチップ、チップの上にＰＤＭＳスタンプ、ＰＤＭＳスタンプの上にガスケットを乗せ、全てをバインダークリップで留めることによってチップを組み立てた。
【０２０３】
実験ストックの調製
以下のものをＥＡＭアリコートに組み合わせることによってＥＡＭストックを調製した。
【０２０４】
【表３】
0006276706.tif 000024
【０２０５】
ＳＡＭ溶液の調製
以下のものを別個のガラスバイアルに組み合わせることによってＳＡＭ溶液を調製した。
【０２０６】
【表４】
0006276706.tif 000025
【０２０７】
ＳＡＭインキュベーション
チップ１〜１２に５００μＬの上で調製したＳＡＭ溶液を添加し、続いて一晩インキュベーションした。全てのチップをエタノールの入ったプラスチック容器に入れ、パラフィルムで密閉した（エタノールの蒸発及びチップの乾燥を回避する）。これをアルミホイルで覆った。
【０２０８】
２日目：
内部参照測定：
１，１’−フェロセンジメタノールの１ｍＭ溶液を１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４溶液中で調製した。１．３ｍｇの１，１’−フェロセンジメタノールを５ｍＬの１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４と合わせた。１，１’−フェロセンジメタノールのＭＷ＝２４６．０９。５００μＬの１ｍＭ  １，１’−フェロセンジメタノール溶液を清浄なチップに添加した。準１参照電極及び白金対電極をシステムに取り付け、ＣＶを記録した。
【０２０９】
チップ上での適当なＳＡＭ形成を確認する初期試験：
一晩のインキュベーションの後、チップをインキュベーション容器から取り出した。ＳＡＭ堆積溶液をバイアルに回収し、乾燥させて、リサイクルＥＡＭを更なる使用のために得た。一晩のインキュベーションの後、チップ１〜１２を下記の工程に従って洗浄した：
エタノール  ８回
ｎａｎｏｐｕｒｅ水  ４回
試験バッファー、１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４  ２回
５００μＬの１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４をチップ１、３、５、６、７、９、１１及び１２に添加した後、チップをスイッチボックスに差し込んだ。参照電極及び対電極をＥＣシステムに取り付けた。ＣＨＩ  ６５０Ｃからの白色のワニ口クリップを参照電極（準１）、緑色のクリップを作用電極、赤色のクリップを対電極（予め火炎処理し、ＥｔＯＨ及び水でリンスした白金ワイヤー）に接続した。
【０２１０】
ＣＨＩ  ６５０Ｃシステムを全てのチップの試験に使用した。各試験について、６つのファイルを使用した：１００００ｍＶ／ｓ、１００ｍＶ／ｓ、１００００ｍＶ／ｓ長、マルチＣＶ（２０サイクル）及びＡＣＶ（順方向及び逆方向）。
【０２１１】
マルチプレクサーを本実験の全てのチップの試験に使用した。
【０２１２】
初期試験の後、チップ１〜５及び７〜１１を以下のように洗浄した：
ｎａｎｏｐｕｒｅ水  ８回
１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ１０．１）  ２回
チップ６及び１２は以下のように洗浄した：
ｎａｎｏｐｕｒｅ水  ８回
１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）  ２回
【０２１３】
種々の濃度の過酸化水素の調製：
種々の濃度のＨ２Ｏ２溶液を、使用直前に１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．１）中で作製した。元のＨ２Ｏ２ストックは１Ｍであり、５７μＬの５０％Ｈ２Ｏ２と９４３μＬのｎａｎｏｐｕｒｅ水とを組み合わせることによって作製した。このストックを４℃の冷蔵庫に一晩静置し、変旋光させた。その後、希釈物を下記のように作製した。
【０２１４】
【表５】
0006276706.tif 000026
【０２１５】
種々の濃度のＨ２Ｏ２のチップへの添加及び試験：
作製した過酸化水素溶液を十分にボルテックスした。それぞれの過酸化水素溶液５００μＬを各々のチップ（１〜１２）に添加し、溶液を完全に混合した。インキュベーションを、溶液をピペットチップによって４：３０、２：３０及び０：３０の時点で混合しながら５分間、更には溶液をピペットチップによって７：３０、５：００及び２：３０の時点で混合しながら１０分間室温で行った。それぞれのＨ２Ｏ２インキュベーションの後、チップを以下のように洗浄した：
ｎａｎｏｐｕｒｅ水  ８回
１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ１０．１）又は１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）  ２回
【０２１６】
各ウェルをそれぞれのバッファー５００μＬとともに５分間インキュベートした。チップをバッファーとインキュベートした後、チップを以下のように洗浄した：
ｎａｎｏｐｕｒｅ水  ８回
１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４  ２回
【０２１７】
工程ＶＩ  ｄ、ｅ及びｆに示されるようにスイッチボックスを全てのチップの試験に使用した。試験後、チップを洗浄し、エタノール及び水でクリーニングした後、分解した。
【０２１８】
実験概要
【０２１９】
【表６】
0006276706.tif 000027
【０２２０】
実施例３：ＡＴＰ増幅プロトコル
完全溶解バッファー（０．５×ＨＥＰＥＳ）中でのＡＴＰ全用量応答曲線
グリセロール（２ｍＭ）、グリセロールキナーゼ（ＧＫ、１．３３Ｕ／ｍＬ）、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（Ｇ３ＰＯ−１．３３Ｕ／ｍＬ）、クレアチンキナーゼ１８×（１８Ｕ／ｍＬ）、クレアチンリン酸（ＰＣ、３０ｍＭ）、０ｎＭ〜１０μＭ  ＡＴＰを使用した。
【０２２１】
以下のバッファーを使用した：０．５×ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４、２９ｍＭマルトシド）、１：２００  ｂｅｎｚｏｎａｓｅ、１：２０００プロテアーゼ阻害剤、及び以下のように調節した１：１００ホスファターゼ阻害剤カクテル（０．５×）：２．５ｍＭ  ＮａＦ、３μＭオルトバナジウム酸ナトリウム、５００μＭピロリン酸ナトリウム十水和物、５００μＭ  β−グリセロリン酸及び２．５ｍＭ  ＮａＮ３（Ｈ２Ｏ２のカタラーゼ阻害剤としてホスファターゼ阻害剤カクテルに添加）。
【０２２２】
０ｎＭ〜１０μＭ  ＡＴＰを以下のように調製した：ＡＴＰ段階希釈物は、最終アッセイにおける［ＭｇＣｌ２］が１ｍＭとなるように１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するｎａｎｏｐｕｒｅ水中で１０倍で作製した。１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するｎａｎｏｐｕｒｅ水を用いて、ＧＫ及びＧ３ＰＯ等の酵素を再構成した。各々の構成要素の所望の最終アッセイ濃度を以下のようにした。
【０２２３】
１０Ｕ／アリコートのＧＫを以下のように調製した：１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する２５０μＬの水中で再構成した（０．０４Ｕ／μＬ）。５μＬの０．０４Ｕ／μＬストックを取り、最終アッセイ濃度１．３３Ｕ／ｍＬで各ウェルに添加した（１４０μＬのアッセイ容量では、５μＬのＧＫを各データ点で添加した）。
【０２２４】
５Ｕ／アリコートのＧ３ＰＯを以下のように調製した：１２５μＬバッファー中で再構成して０．０４Ｕ／ｕＬとした。５μＬの０．０４Ｕ／ｕＬストックを取り、最終アッセイ濃度１．３３Ｕ／ｍＬで各ウェルに添加した。合計１４０μＬのアッセイ容量について５μＬのＧ３ＰＯを用いた。
【０２２５】
３５０Ｕ／ｍｇのクレアチンキナーゼを以下のように調製した：０．５ｍｇのＣＫを水中３００μＬの２０％グリセロールに溶解し、０．５８Ｕ／μＬとした。次いで、５μＬの０．５８Ｕ／μＬのストックを、１４０μＬの全アッセイ容量についてデータ点で添加した。
【０２２６】
クレアチンリン酸（３０ｍＭ）を、５７４ｍｇの固体を５ｍＬの水に溶解し、そのストック５μＬを各チューブに用いて１４０μＬの全アッセイ容量とすることによって得た。
【０２２７】
グリセロール（２ｍＭ）を、２２μＬのグリセロールストックを取り、それを４９７８μＬのバッファーに添加して５ｍＬの全ストックとして調製し、この５ｍＬストック５μＬを各ウェルに添加して１４μＬの全容量とした。
【０２２８】
５μＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅストックを１ｍＬの０．５×ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に添加し、０．５×ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）中１：２００のＢｅｎｚｏｎａｓｅを得た。
【０２２９】
ホスファターゼ阻害剤カクテル（調節、１：１００）を以下のように調製した。２５０ｍＭ  ＮａＮ３を、０．５×バッファー中のその最終濃度が２．５ｍＭ  ＮａＮ３となるように５ｍＬ（５０×）ホスファターゼ阻害剤カクテル溶液に添加した。酢酸Ｚｎの１Ｍストック１μＭを、０．５×溶解バッファー中の酢酸Ｚｎの最終濃度が１００μＭとなるように１００μＬの５０×ホスファターゼ阻害剤カクテルアリコートに添加した。１０μＬのホスファターゼ阻害剤カクテルを０．５×ＨＥＰＥＳ溶解バッファーに添加した。
【０２３０】
０．５μＬのプロテアーゼ阻害剤を１ｍＬの０．５×ＨＥＰＥＳ溶解バッファーに添加し、０．５×ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中のプロテアーゼ阻害剤（２０００倍希釈）を得た。
【０２３１】
アッセイ条件は、三連で行われる１４０μＬの各サンプルの２．５時間のインキュベートからなるものであった。以下の構成要素を、標的試験のためにチップ上に置く前に２．５時間のインキュベーション用のチューブに添加した：
０．５×ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中で２．５時間のインキュベーションの際に、４６．７μＬのＮａ２ＣＯ３（１００ｍＭ）を添加することによってｐＨを１０に調整した。
合計１８６．７μＬのサンプル（１つの濃度当たり）及び２５％のサンプル希釈物がｐＨ１０への調整の過程で生じた。
３０μＬのサンプルを三連で各チップに一度に添加し、インキュベートし（１０分間）、２つの異なる洗浄ステーションで同時に洗浄した。
【０２３２】
以下の容量の各構成要素を添加した：バッファー１００μＬ；ＧＫ  ５μＬ；Ｇ３ＰＯ  ５μＬ；ＣＫ  ５μＬ；クレアチンリン酸（３０ｍＭ）５μＬ；グリセロール（２ｍＭ）５μＬ；ＡＴＰ  １５μＬ；ＡＤＨＰ  ５μＬ；及びＨＲＰ  ５μＬ
【０２３３】
Ｅ−チップ実験
平均ピーク電流比及び面積比を１０個全ての濃度で分析し、全用量応答曲線に対する標準誤差を得た。初回試験は行わず、チップをエタノールで８回、水で４回洗浄し、即座に標的溶液とともに１０分間インキュベートした。１０分間のインキュベーションの際に、チップを水で４回、ＬｉＣｌＯ４で２回洗浄し、１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４試験溶液を用いて試験した。
【０２３４】
実施例４：ＮＡＤＨ増幅プロトコル
以下のバッファーを使用した：０．５×ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（２９ｍＭマルトシド）、１：２００  ｂｅｎｚｏｎａｓｅ、以下のように調節した１：２０００ホスファターゼ阻害剤カクテル（０．５×）：２．５ｍＭ  ＮａＦ、３μＭオルトバナジウム酸ナトリウム、５００μＭピロリン酸ナトリウム十水和物、５００μＭ  β−グリセロリン酸及び２．５ｍＭ  ＮａＮ３及び１００μＭ酢酸亜鉛。
【０２３５】
ウェル／チューブ中の所望の濃度は以下の通りであった。
【０２３６】
【表７】
0006276706.tif 000028
【０２３７】
ＮＡＤＨオキシダーゼは、１００μＬの全ＮＡＤＨ反応溶液に１．４５μＬのストックを添加することによって調製した。エタノールは、１００μＬのＮＡＤＨ反応溶液に４μｌの１００％エタノールを添加することによって調製した。ＡＤＨ（４μｇ／μＬ）は、水及び２０％グリセロールに２．４ｍｇ／６００μＬを添加することによって調製し、この溶液２μＬを１００μＬの反応サンプルに添加した。
【０２３８】
ＦＡＤは５．８ｍｇを１０００μＬのｎａｎｏｐｕｒｅ水に溶解することによって調製し、７．５ｍＭストックを得た。７．５ｍＭストックを用いて、１３．３μＬの７．５ｍＭストックを添加し、１００μＬまで希釈することによって１ｍＭストックを作製した。最後に、１μＬの１ｍＭストックを１００μＬの反応混合物に添加した。
【０２３９】
ＮＡＤＨを最終濃度１μＭ、３００ｎＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０３ｎＭで調製した。
【０２４０】
各反応混合物は１ウェル当たり以下の濃度であった。
【０２４１】
【表８】
0006276706.tif 000029
【０２４２】
各構成要素を９６ウェルプレートに添加し、２時間インキュベートした。２時間後、各々の反応サンプル９０μＬを取り、３０μＬの４００ｍＭ炭酸塩溶液を添加することによってｐＨをｐＨ１０に調整した。次いで、３０μＬをｅ−チップ上で三連でインキュベートした。
【０２４３】
Ｅ−チップ材料は以下のものからなる：
ＥＡＭ２（１ｍｇ／１ｍＬのＥｔＯＨ）：
【化１４】
0006276706.tif 000030
【化１５】
0006276706.tif 000031
【０２４４】
ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の化合物６（０．２１５ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の０℃の溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（０．１１４ｇ、３．００ｍｍｏｌ）を添加した。ＭｅＯＨ（６ｍＬ）を１５分間かけてゆっくりと添加した。反応混合物を撹拌し、室温まで１時間加温した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解し、ブライン（３×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で粗固体へと濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製によって、７を橙色固体として得た（１９７ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ、９１％）。
【０２４５】
ＡｃＯＨ（３５ｍＬ）中の化合物７（０．５３５ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）及びアジ化ナトリウム（０．７２６ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）の溶液を６０℃で２０時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３（水溶液）（３×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で粗褐色油へと濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製によって、８を橙色油として得た（０．４４１ｇ、１．４１ｍｍｏｌ、７６％）。
【０２４６】
ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の化合物８（０．４３０ｇ、１．３７ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（０．４３１ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）の溶液を６０℃で２０時間撹拌した。反応混合物を減圧下で粗油へと濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製して、９を暗橙色油として得た（０．３７１ｇ、１．２９ｍｍｏｌ、９４％）。
【０２４７】
トルエン（４０ｍＬ）中の１１−メルカプトウンデカン酸（２．７０ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）、トリチルクロリド（４．１４ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（５．１７ｍｍｏｌ、２８．７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２０時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、Ｈ２Ｏ（３×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で粗黄色油へと濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製によって、１０を白色固体として得た（４．１４ｇ、７３％）。
【０２４８】
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の化合物９（０．３５５ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）及び１０（０．５７１ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）の０℃の溶液に、１−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]−３−エチルカルボジイミドＨＣｌ（０．２４９ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）を添加した。５時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で粗褐色油へと濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製によって、１１を粘性の橙色油として得た（０．７２４ｇ、０．９９ｍｍｏｌ、８０％）。
【０２４９】
ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）中の化合物１１（０．７２０ｇ、０．９９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）中の水酸化カリウム（０．３３３ｇ、５．９３ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を７０℃で加熱した。２４時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で粗残渣へと濃縮した。粗残渣をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）に溶解し、ｐＨ４．０まで酸性化し、ＤＣＭ（４×１００ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で橙色油へと濃縮した。橙色油をカラムクロマトグラフィーによって精製し、１２を明黄色固体として得た（０．５８９ｇ、０．８４ｍｍｏｌ、８５％）。
【０２５０】
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の化合物１２（０．４５６ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジフェニルリン酸アジド（１６８μＬ、０．７８ｍｍｏｌ）、続いてトリエチルアミン（１３６μＬ、０．９８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２０時間撹拌し、減圧下で粗赤色油へと濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製によって、１３を赤色／橙色固体として得た（０．４００ｇ、０．５５ｍｍｏｌ、８５％）。
【０２５１】
トルエン（３０ｍＬ）中の化合物１３（０．２９８ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）及び１４（０．１０６ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジラウリン酸ジ−ｎ−ブチルスズ（１２μＬ、０．００２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１００℃で４時間撹拌し、減圧下で粗褐色油へと濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製によって、１５を明黄色油として得た（０．３０５ｇ、０．３３ｍｍｏｌ、８０％）。
【化１６】
0006276706.tif 000032
【０２５２】
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の化合物１５（０．１３４ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（２ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（２００μＬ）、トリエチルシラン（１１５μＬ、０．７２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、減圧下で粗褐色油へと濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製によって、２を黄色固体として得た（０．０７２ｇ、０．１０ｍｍｏｌ、７２％）。
【０２５３】
全てのチップについて、以下の手順を行い、ＳＡＭを堆積させた。チップをＥｔＯＨで再度リンスし、アルゴンで乾燥させた。機械を洗浄することによって付属部（ガスケット、タブ）をクリーニングし、ＥｔＯＨでリンスし、風乾した。ベースを手でクリーニングした。上記で調製した２００μＬの堆積溶液を各チップに添加し、チップをＥｔＯＨインキュベーションチャンバ内で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーションの後、チップを容器から取り出した。次いで、チップを以下のように洗浄した：８×ＥｔＯＨ、４×ｎａｎｏｐｕｒｅ水。
【０２５４】
各チップを下記表に指定するようにインキュベートした。サンプルに使用したバッファーは、酢酸亜鉛及びアジ化ナトリウムで調節したホスファターゼ阻害剤を含む完全溶解バッファーであった。サンプルを１：４の比率の４００ｍＭの炭酸塩でｐＨ１０にｐＨ調整した。各々の濃度をチップ上で三連とした。１０分間の標的インキュベーションの後、チップを４×水、２×ＬｉＣｌＯ４で洗浄し、試験した。
【０２５５】
【表９】
0006276706.tif 000033
【０２５６】
実施例５：ＴＳＨタンパク質測定
使用した試薬は以下のとおりであった：抗ＴＳＨロード磁気ビーズ（捕捉、ＭＰ）、１０μｇ／μＬのＭＰ；ＴＳＨ抗原、１ｍＵ／ｍＬ；ビオチン−抗ＴＳＨコンジュゲート（二次）、０．８５ｍｇ／ｍＬ；アルカリホスファターゼ−ストレプトアビジンコンジュゲート（ＳＡ−ＡＰ）、１．５ｍｇ／ｍＬ；ＦＡＤＰ、１０ｍＭ；Ａｐｏ−ＤＡＡＯ酵素（ＤＡＡＯ）、３．９ｍｇ／ｍＬ−１００μＭ；Ｄ−プロリン、１Ｍ；ＴＢＳ、２０×（１Ｍ  Ｔｒｉｓ）；ＰＢＳ、２０×（１Ｍ  ＰＯ４）；ＢＳＡ、１０％濾過溶液；Ｔｗｅｅｎ２０、１０％濾過溶液；及び炭酸ナトリウム、４００ｍＭ。
【０２５７】
Ｅ−チップ材料は以下のものからなる：
ＥＡＭ（１ｍｇ／１ｍＬのＥｔＯＨ）：
【化１７】
0006276706.tif 000034
【０２５８】
既知のＴＳＨ含量を有する臨床血清サンプルをNorthShoreのコア施設から入手し、下記のように希釈した。
【表１０】
0006276706.tif 000035
【０２５９】
磁気ビーズ結合アッセイは先の磁気ビーズアッセイと同様の構成であった。標的は組み換えＴＳＨ抗原の段階希釈物からなり、段階希釈濃度は以下の通りとした：結合バッファー（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．３％ｔｗｅｅｎ）中で３０μＩＵ／ｍＬ、３μＩＵ／ｍＬ、０．３μＩＵ／ｍＬ、０．０３μＩＵ／ｍＬ及び０μＩＵ／ｍＬ。捕捉抗体を含む磁気ビーズストックを予洗浄し、１０μｇ／μＬで予めブロッキングした。ストックをＰＢＳで５０倍に希釈し、１００μＬを各チューブに添加した（２０μｇ／チューブ）。標的の添加前にビーズをペレット化し、バッファーを除去する。ＴＳＨ抗原を３０μＩＵ／ｍＬ、３μＩＵ／ｍＬ、０．３μＩＵ／ｍＬ、０．０３μＩＵ／ｍＬ及び０μＩＵ／ｍＬへと段階希釈し、３．１６倍の段階希釈物を作製した。ビーズからバッファーを除去し、１００μＬの各標的希釈物を個々のチューブに添加し、各標的希釈物を添加した後、迅速にボルテックスして混合し、シェーカー（２００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ）で３０分間インキュベートした。
【０２６０】
抗体溶液（４ｎｇ／μＬ）をチューブ１つ当たり１００μＬに十分な結合バッファー中で調製した。ビーズを磁気バーでペレット化し、上清を除去し、５００μＬの洗浄バッファーを添加することによって洗浄した後、チューブ壁での液滴形成を回避するために短時間ボルテックスし、遠沈した。ビーズを磁気バーでペレット化し、洗浄バッファーを除去し、１００μＬの抗体溶液を各チューブに添加した。溶液を迅速にボルテックスして混合し、シェーカー（２００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ）で室温で１５分間インキュベートした。
【０２６１】
２２．５ｎｇ／μＬのＳＡ−ＡＰ溶液１ｍＬを結合バッファー（ＢＢ）中で調製した。ビーズを磁気バーでペレット化することによって洗浄し、洗浄バッファーを除去した。溶液を短時間ボルテックスして混合した後、遠沈した。ビーズを磁気バーでペレット化し、洗浄バッファーを除去した。１００μＬのＳＡ−ＡＰ溶液を各チューブに添加し、迅速にボルテックスして混合し、シェーカー（２００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ）で室温で１０分間インキュベートした。
【０２６２】
ビーズを上記のように４回洗浄した。洗浄バッファーでの洗浄後、１００μＬのＴＢＳ（ｐＨ８．５）を添加し、バッファー中のビーズを清浄なチューブに慎重に移した。２０μＭのＦＡＤＰ溶液を、２μＬの１０ｍＭ  ＦＡＤＰストックを１ｍＬのＴＢＳ（ｐＨ８．５）に添加することによって調製した。ビーズを磁気バーでペレット化し、最終インキュベーションのために取り出した。９５μＬの基質溶液を各チューブに添加し、迅速にボルテックスして混合し、シェーカー（２００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ）で３０分間インキュベートした。インキュベーションの際に、８×エタノール及び４×ｎａｎｏｐｕｒｅ水で洗浄することによってＥ−チップを調製した。
【０２６３】
インキュベーションが完了した後、ビーズを磁気バーでペレット化し、９０μＬの基質溶液を新たなチューブに移して、ＦＡＤＰ変換を停止させた。１０×ＤＡＡＯ溶液を、２μＭ  ＤＡＡＯ酵素及び３５０ｍＭ  Ｄ−プロリンをＴＢＳバッファー（ｐＨ８．５）中で作製することによって調製した。１０×ＤＡＡＯ溶液を各チューブに添加して反応を開始させ（各反応の開始を１５秒ずらす）、添加毎に短時間ボルテックスし、チューブ内で５分間インキュベートした。ｐＨを１０に調整した。１４．２８μＬの４００μＭ炭酸ナトリウムを１００μＬに添加し（ＤＡＡＯと同じ順序で添加し、同様にチューブ間を１５秒間あけ、チューブ全体で一定のインキュベーション時間を維持する）、各添加後に短時間ボルテックスした。
【０２６４】
Ｅ−チップから水を吸引した。３６μＬのｐＨ調整溶液を３つの反復チップの各々に添加した。容量を反復チップに迅速に添加し、各標的希釈物についてサンプル全体で一定のＥ−チップインキュベーション時間を維持するようにずらした。サンプルを１０分間インキュベートした。インキュベーション後、Ｅ−チップから溶液を吸引し、４×水及び２×１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４で洗浄した。チップを０．５Ｖ／ｓの走査速度でＣＨＩマルチプレクサーで試験した。
【０２６５】
データ分析
データ分析をＥＤＡＳを実行可能なバージョンのＭａｔｌａｂで行った。ピーク電流比（ｉ２／ｉ１−２）を各ボルタモグラムの下位曲線から決定した。
【０２６６】
結果
本実験で生成した標準曲線は先の実験よりも高いシグナルを有し、インキュベーション時間を減らした短縮プロトコルを用いて、古いビーズロットと新たなビーズロットとの間のシグナルの一貫性を確認した。標準曲線は各ＴＳＨ用量で僅かな誤差を有し、これはより高用量のＴＳＨで僅かに増大した。図２３に示されるように、臨床サンプル（１４２、１４４、１４５、１４７、１４６）からのシグナルは全て標準曲線の範囲内であった。Northshoreによって決定されるようにシグナルはＴＳＨ値の増大とともに増大する。
【０２６７】
本明細書に記載の実施例及び実施形態が例示のみを目的とすることが理解されよう。文脈上明らかに除外される場合を除き、本発明の一態様について開示される全ての実施形態を、任意の好適な組合せで本発明の他の態様について開示される実施形態と組み合わせることができる。本発明の範囲を逸脱することなく様々な修正及び変更を本発明に加えることができることが当業者には明らかであろう。このため、本発明の修正及び変更が添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内にある限り、本発明がそれらを包含することが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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