(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を収容するための３つ以上の凹部が形成された細胞培養容器であって、
前記３つ以上の凹部は、いずれも、凹部の底を形成する底面を同じ基準方向に沿って１つの仮想平面上に投影したときに互いに分離した領域として投影することができるように形成されており、
前記基準方向が前記３つ以上の凹部の深さの方向であり、
前記３つ以上の凹部が、２つ以上の第１の凹部と、１つ以上の他の凹部とから構成され、
前記３つ以上の凹部の各凹部の底を形成する底面のうち前記基準方向に沿って窪みが最も深い部分を当該各凹部の最深部としたとき、
前記第１の凹部の各凹部の最深部のうち前記基準方向に沿って最も離れた一対の最深部の間の前記基準方向に沿った距離が１２μｍ以下であるように、前記第１の凹部の各凹部が形成されており、且つ
前記第１の凹部の各凹部の最深部のうちの前記一対の最深部の両方からの前記基準方向に沿った距離が等しく且つ前記基準方向に対し垂直な中間平面から、前記他の凹部の各凹部の最深部までの前記基準方向に沿った距離が６μｍを超えるように、前記他の凹部の各凹部が形成されている
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
前記他の凹部の各凹部の最深部が、前記第１の凹部の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿って６μｍを超える距離離れているように、前記他の凹部の各凹部が形成されている、請求項１の細胞培養容器。
【請求項３】
前記他の凹部の各凹部の最深部が、前記第１の凹部の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿って１２μｍを超える距離離れているように、前記他の凹部の各凹部が形成されている、請求項２の細胞培養容器。
【請求項４】
前記第１の凹部の各凹部は、前記細胞培養容器の表面上の、培養液の１つの液塊で被覆することができる領域に形成されており、
前記他の凹部の各凹部は、前記細胞培養容器の表面上の前記領域以外の領域に形成されている、請求項１〜３のいずれか１項の細胞培養容器。
【請求項５】
前記第１の凹部の各凹部の開口幅の最小値は１００μｍ以上であり、且つ最大値は１０００μｍ未満である、請求項１〜４のいずれか１項の細胞培養容器。
【請求項６】
細胞を収容するための３つ以上の凹部が形成された細胞培養容器であって、
前記３つ以上の凹部は、いずれも、凹部の底を形成する底面を同じ基準方向に沿って１つの仮想平面上に投影したときに互いに分離した領域として投影することができるように形成されており、
前記基準方向が前記３つ以上の凹部の深さの方向であり、
前記３つ以上の凹部が、２つ以上の第１の凹部と、１つ以上の他の凹部とから構成され、
前記３つ以上の凹部の各凹部の底を形成する底面のうち前記基準方向に沿って窪みが最も深い部分を当該各凹部の最深部としたとき、
前記第１の凹部の各凹部の最深部のうち前記基準方向に沿って最も離れた一対の最深部の間の前記基準方向に沿った距離が３６μｍ以下であるように、前記第１の凹部の各凹部が形成されており、且つ
前記第１の凹部の各凹部の最深部のうちの前記一対の最深部の両方からの前記基準方向に沿った距離が等しく且つ前記基準方向に対し垂直な中間平面から、前記他の凹部の各凹部の最深部までの前記基準方向に沿った距離が１８μｍを超えるように、前記他の凹部の各凹部が形成されている
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項７】
前記他の凹部の各凹部の最深部が、前記第１の凹部の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿って１８μｍを超える距離離れているように、前記他の凹部の各凹部が形成されている、請求項６の細胞培養容器。
【請求項８】
前記他の凹部の各凹部の最深部が、前記第１の凹部の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿って３６μｍを超える距離離れているように、前記他の凹部の各凹部が形成されている、請求項７の細胞培養容器。
【請求項９】
前記第１の凹部の各凹部は、前記細胞培養容器の表面上の、培養液の１つの液塊で被覆することができる領域に形成されており、
前記他の凹部の各凹部は、前記細胞培養容器の表面上の前記領域以外の領域に形成されている、請求項６〜８のいずれか１項の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記第１の凹部の各凹部の開口幅の最小値は１００μｍ以上であり、且つ最大値は１０００μｍ未満である、請求項６〜９のいずれか１項の細胞培養容器。
【請求項１１】
対物レンズを含み焦点深度がＤである観察光学系を備える光学顕微鏡を用いて、細胞培養容器に収容された細胞を観察する方法であって、
細胞培養容器として、
細胞を収容するための３つ以上の凹部が形成された細胞培養容器であって、
前記３つ以上の凹部は、いずれも、凹部の底を形成する底面を同じ基準方向に沿って１つの仮想平面上に投影したときに互いに分離した領域として投影することができるように形成されており、
前記基準方向が前記３つ以上の凹部の深さの方向であり、
前記３つ以上の凹部が、２つ以上の第１の凹部と、１つ以上の他の凹部とから構成され、
前記３つ以上の凹部の各凹部の底を形成する底面のうち前記基準方向に沿って窪みが最も深い部分を当該各凹部の最深部としたとき、
前記第１の凹部の各凹部の最深部のうち前記基準方向に沿って最も離れた一対の最深部の間の、前記基準方向に沿った距離が２Ｄ以下であるように、前記第１の凹部の各凹部が形成されており、且つ
前記第１の凹部の各凹部の最深部のうちの前記一対の最深部の両方からの前記基準方向に沿った距離が等しく且つ前記基準方向に対し垂直な中間平面から、前記他の凹部の各凹部の最深部までの前記基準方向に沿った距離がＤを超えるように、前記他の凹部の各凹部が形成されている
細胞培養容器を用い、
前記光学顕微鏡の対物レンズの光軸の方向を、前記細胞培養容器の前記基準方向に一致させて観察を行う観察工程を含む、方法。
【請求項１２】
前記観察工程が、
前記第１の凹部のいずれかの凹部に収容された細胞に前記観察光学系の焦点を合わせて観察を行う第一工程と、
前記第一工程の後に、前記細胞培養容器が前記光軸に垂直な方向に移動するように、前記細胞培養容器と前記対物レンズとを相対的に移動させて、前記第１の凹部の別の凹部に収容された細胞の観察を行う第二工程と
を含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記細胞培養容器において、前記他の凹部の各凹部の最深部が、前記第１の凹部の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿ってＤを超える距離離れているように、前記他の凹部の各凹部が形成されている、請求項１１又は１２の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養容器において、前記他の凹部の各凹部の最深部が、前記第１の凹部の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿って２Ｄを超える距離離れているように、前記他の凹部の各凹部が形成されている、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記第１の凹部の各凹部は、前記細胞培養容器の表面上の、培養液の１つの液塊で被覆することができる領域に形成されており、
前記他の凹部の各凹部は、前記細胞培養容器の表面上の前記領域以外の領域に形成されている、請求項１１〜１４のいずれか１項の方法。
【請求項１６】
前記第１の凹部の各凹部の開口幅の最小値は１００μｍ以上であり、且つ最大値は１０００μｍ未満である、請求項１１〜１５のいずれか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を個別に培養し光学顕微鏡を用いて観察するのに適した細胞培養容器、ならびに該培養容器を用いた培養細胞の観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養系で精子と卵子とを体外受精させて受精卵（接合子）を作製して、さらに受精卵を卵割、桑実胚、胚盤胞の段階を経て、透明帯から孵化した脱出胚盤胞の段階まで培養することが可能となり、この卵割から胚盤胞の段階にある受精卵を子宮に移植して産子を得る補助的生殖技術（ＡＲＴ）が、家畜領域のみならずヒトの不妊医療でも確立されている。
【０００３】
しかし、体外受精による妊娠成功率は必ずしも高くはなく、たとえばヒトにおいては、その妊娠成功率は、依然として２５〜３５％程度に留まっている。その原因の一つとして、培養において子宮への移植に適した良質な受精卵を得られる確率が高くないことが挙げられる。培養された受精卵は、専門家が顕微鏡で個別に観察することにより、子宮への移植に適した良質な受精卵であるか否か判別されている。従って、その判別にはコスト及び時間がかかるという問題がある。そこで、子宮への移植に適した良質な受精卵を低コストかつ短時間で判別する技術が求められている。
【０００４】
従来、受精卵の培養は、培養容器上のウェル内に５００μＬ程度の培養液を入れ、該培養液中で受精卵を培養する方法、培養容器上のウェル内に２０μＬ程度の微小滴を載せ、該微小滴の表面をミネラルオイルで被覆し、その中に受精卵を入れる方法（非特許文献１）等により行われていた。また、非特許文献２及び３は、培養容器上に複数の窪みを設け、それぞれの窪みごとに受精卵を導入して培養することにより受精卵を個別に管理する方法を開示している。非特許文献４は、培養容器上にメッシュ体を配置し、メッシュの編目ごとに受精卵を導入して培養することにより受精卵を個別に管理する方法を開示している。
【０００５】
さらに近年では、細胞治療・再生医療の研究開発が進み、細胞培養中の無菌環境を維持することや、細胞の品質確保、あるいは細胞を迅速且つ大量に培養し判別することについてのニーズが高まっている。そこで複数の受精卵を一つの細胞培養容器内で並行して培養することが求められており、そのための培養容器として、特許文献１では図６Ａ〜Ｃに示すように、複数の凹部が形成された細胞培養容器が開示されている。
【０００６】
この細胞培養容器は、側壁６１と底壁６２を有し、底壁６２には、それぞれ凹部６４が形成された細胞収容部６３が９個近接して形成され、９個の細胞収容部６３からなる群が４群形成されている。各凹部６４は細胞６６を収容できるように構成されている。各群の周囲にはそれを囲う内壁６５が形成されている。この細胞培養容器を使用する際には、各凹部６４内に１つずつ細胞６６を収容し、各群毎に、内壁６５で囲われた空間内に培地６８を収容し、その上部から、培養容器全体を覆うようにミネラルオイル６９を収容する。
【０００７】
図６Ａ〜Ｃに示す細胞培養容器は、培養細胞を発育状態等に応じて複数のカテゴリーに分類して群分けして培養する目的で好適である。例えば、平面図中左下に位置する凹部の群に例えば「発育が良好」というカテゴリーに属する細胞（Ａ１群細胞）を収容して培養し、同図中右下に位置する凹部の群に例えば「発育が不良」というカテゴリーに属する細胞（Ａ２群細胞）を収容して培養することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４７２４８５４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】菅原，尾川（編）、「生殖機能細胞の培養法」、日本、学会出版センター、１９９３年６月出版、第２５〜１５３頁
【非特許文献２】M. Taka, et al. Journal of Reproduction and Development, 51, 533-537 (2005)
【非特許文献３】Vajta G., et al. Molecular Reproduction and Development, 55, 256-264 (2000)
【非特許文献４】P. J. Booth, et al. Biology of Reproduction, 77, 765-779 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
図６Ａ〜Ｃに示すような、複数の凹部が形成された従来の細胞培養容器は、各凹部内で細胞が定着する底面の高さ位置が実質的に同一であった。各凹部内の細胞を観察する際は、細胞培養容器を水平な観察台上に設置した状態で鉛直方向に沿って上下いずれかから光学顕微鏡により観察することが通常であるが、従来は、各凹部内で細胞が定着する底面の高さ位置が実質的に同一であったため、一つの凹部内の細胞に観察光学系の焦点を合わせた後は、該細胞培養容器を前記観察台上で水平方向に移動させるだけで、同一群の凹部内の細胞や、他の群の凹部内の細胞を、観察光学系の焦点を再度調節することなく観察可能であった。
【００１１】
このような従来の細胞培養容器は、顕微鏡観察時に観察者が各凹部内の細胞を連続して観察する際に、観察者が観察対象細胞の位置を誤った場合、例えば、本来Ａ１群細胞を観察すべきところが、誤ってＡ２群細胞を観察してしまった場合に、観察者が誤りに気が付かないという可能性があった。
【００１２】
一方で、従来の平坦なシャーレや類似の凹部を複数含む容器のなかには、本来平坦であるはずの平坦面が精度が悪く平坦でないものや、同一高さであるはずの複数の凹部の壁面が同一高さでないものがあった。このような容器を用いると、同一のカテゴリーに属し同一の管理下にある細胞であっても、観察時に細胞ごとに焦点を調整する必要があるという問題があった、
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで本明細書では上記課題の解決手段として以下の発明を開示する。
本発明は、
細胞を収容するための凹部が３つ以上形成された細胞培養容器であって、
前記３つ以上の凹部は、いずれも、凹部の底を形成する底面を同じ基準方向に沿って１つの仮想平面上に投影したときに互いに分離した領域として投影することができるように形成されており
前記３つ以上の凹部が、第１凹部群を構成する２つ以上の凹部と、１つ以上の他の凹部とから構成され、
前記各凹部の底を形成する底面のうち前記基準方向に沿って窪みが最も深い部分を当該各凹部の最深部としたとき、
前記第１凹部群の各凹部の最深部のうち前記基準方向に沿って最も離れた一対の最深部の間の前記基準方向に沿った距離が１２μｍ以下であるように、前記第１凹部群の各凹部が形成されており、且つ
前記第１凹部群の各凹部の最深部のうちの前記一対の最深部の両方からの前記基準方向に沿った距離が等しく且つ前記基準方向に対し垂直な中間平面から、前記他の各凹部の最深部までの前記基準方向に沿った距離が６μｍを超えるように、前記他の各凹部が形成されている
ことを特徴とする細胞培養容器
に関する。
【００１４】
焦点深度６μｍの観察光学系（例えば開口数ＮＡ＝０．４０の２０倍の対物レンズと、１０倍の接眼レンズを含む総合倍率Ｍ＝２００倍の観察光学系）を備えた光学顕微鏡を用いれば、前記観察光学系の物体側焦点から光軸に沿って前後各６μｍ（計１２μｍ）の範囲に位置する試料の鮮明な観察像を得ることができる。そして本発明の細胞培養容器に対して前記光学顕微鏡を前記対物レンズの光軸が前記基準方向と一致するように設置し、前記対物レンズと前記細胞培養容器との間の距離を適宜調整すれば、前記第１凹部群の凹部の最深部の全てを、前記対物レンズからの前記光軸に沿った距離が前記範囲内となるように位置させ、且つ前記他の凹部の最深部の全てを、前記対物レンズからの前記光軸に沿った距離が前記範囲から外れるように位置させることが可能である。本発明の細胞培養容器と前記光学顕微鏡とをこのように配置すれば、前記第１凹部群の各凹部内の細胞は、前記対物レンズと前記細胞培養容器との前記光軸方向に沿った距離をほとんど変えずに前記細胞培養容器を前記光軸に対し垂直方向に相対移動させることにより連続的に観察可能である。また、前記相対移動の際に、前記他の凹部のいずれかに収容された細胞が誤って観察視野内に位置することとなった場合でも該細胞の鮮明な像は得られないため、細胞間の誤認を防ぐことができる。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、前記他の各凹部の最深部が、前記第１凹部群の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿って６μｍを超える距離離れているように、前記他の各凹部が形成されている。当該好ましい実施形態によれば、前記光学顕微鏡の焦点深度６μｍの観察光学系の焦点を前記第１凹部群の凹部内の細胞のいずれか１つに合わせた後は、前記細胞培養容器を前記光軸に対し垂直方向に相対移動させて前記他の凹部のいずれかに収容された細胞が誤って視野内に位置することとなった場合には、該細胞には焦点が合わず不鮮明な像しか得られないため、細胞を誤認する可能性を更に低減することができる。
【００１６】
本発明の更に好ましい実施形態では、前記他の各凹部の最深部が、前記第１凹部群の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿って１２μｍを超える距離離れているように、前記他の各凹部が形成されている。当該更に好ましい実施形態によれば、前記光学顕微鏡の焦点深度６μｍの観察光学系の焦点を前記第１凹部群の凹部内の細胞のいずれか１つに合わせた後は、前記細胞培養容器を前記光軸に対し垂直方向に相対移動させて前記他の凹部のいずれかに収容された細胞が誤って視野内に位置することとなった場合には、該細胞には焦点が合わず更に不鮮明な像しか得られないため、細胞を誤認する可能性を更に低減することができる。
【００１７】
本発明はまた、
細胞を収容するための凹部が３つ以上形成された細胞培養容器であって、
前記３つ以上の凹部は、いずれも、凹部の底を形成する底面を同じ基準方向に沿って１つの仮想平面上に投影したときに互いに分離した領域として投影することができるように形成されており
前記３つ以上の凹部が、第１凹部群を構成する２つ以上の凹部と、１つ以上の他の凹部とから構成され、
前記各凹部の底を形成する底面のうち前記基準方向に沿って窪みが最も深い部分を当該各凹部の最深部としたとき、
前記第１凹部群の各凹部の最深部のうち前記基準方向に沿って最も離れた一対の最深部の間の前記基準方向に沿った距離が３６μｍ以下であるように、前記第１凹部群の各凹部が形成されており、且つ
前記第１凹部群の各凹部の最深部のうちの前記一対の最深部の両方からの前記基準方向に沿った距離が等しく且つ前記基準方向に対し垂直な中間平面から、前記他の各凹部の最深部までの前記基準方向に沿った距離が１８μｍを超えるように、前記他の各凹部が形成されている
ことを特徴とする細胞培養容器
に関する。
【００１８】
焦点深度１８μｍの観察光学系（例えば開口数ＮＡ＝０．２５の１０倍の対物レンズと、１０倍の接眼レンズを含む総合倍率Ｍ＝１００倍の観察光学系）を備えた光学顕微鏡を用いれば、前記観察光学系の物体側焦点から光軸に沿って前後各１８μｍ（計３６μｍ）の範囲に位置する試料の鮮明な観察像を得ることができる。そして本発明の細胞培養容器に対して前記光学顕微鏡を前記対物レンズの光軸が前記基準方向と一致するように設置し、前記対物レンズと前記細胞培養容器との間の距離を適宜調整すれば、前記第１凹部群の凹部の最深部の全てを、前記対物レンズからの前記光軸に沿った距離が前記範囲内となるように位置させ、且つ前記他の凹部の最深部の全てを、前記対物レンズからの前記光軸に沿った距離が前記範囲から外れるように位置させることが可能である。本発明の細胞培養容器と前記光学顕微鏡とをこのように配置すれば、前記第１凹部群の各凹部内の細胞は、前記対物レンズと前記細胞培養容器との前記光軸方向に沿った距離をほとんど変えずに前記細胞培養容器を前記光軸に対し垂直方向に相対移動させることにより連続的に観察可能である。また、前記相対移動の際に、前記他の凹部のいずれかに収容された細胞が誤って観察視野内に位置することとなった場合でも該細胞の鮮明な像は得られないため、細胞間の誤認を防ぐことができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、前記他の各凹部の最深部が、前記第１凹部群の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿って１８μｍを超える距離離れているように、前記他の各凹部が形成されている。当該好ましい実施形態によれば、前記光学顕微鏡の焦点深度１８μｍの観察光学系の焦点を前記第１凹部群の凹部内の細胞のいずれか１つに合わせた後は、前記細胞培養容器を前記光軸に対し垂直方向に相対移動させて前記他の凹部のいずれかに収容された細胞が誤って視野内に位置することとなった場合には、該細胞には焦点が合わず不鮮明な像しか得られないため、細胞を誤認する可能性を更に低減することができる。
【００２０】
本発明の更に好ましい実施形態では、前記他の各凹部の最深部が、前記第１凹部群の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿って３６μｍを超える距離離れているように、前記他の各凹部が形成されている。当該更に好ましい実施形態によれば、前記光学顕微鏡の焦点深度１８μｍの観察光学系の焦点を前記第１凹部群の凹部内の細胞のいずれか１つに合わせた後は、前記細胞培養容器を前記光軸に対し垂直方向に相対移動させて前記他の凹部のいずれかに収容された細胞が誤って視野内に位置することとなった場合には、該細胞には焦点が合わず更に不鮮明な像しか得られないため、細胞を誤認する可能性を更に低減することができる。
【００２１】
本発明はまた、
対物レンズを含み焦点深度がＤである観察光学系を備える光学顕微鏡を用いて、細胞培養容器に収容された細胞を観察する方法であって、
細胞培養容器として、
細胞を収容するための凹部が３つ以上形成された細胞培養容器であって、
前記３つ以上の凹部は、いずれも、凹部の底を形成する底面を同じ基準方向に沿って１つの仮想平面上に投影したときに互いに分離した領域として投影することができるように形成されており、
前記３つ以上の凹部が、第１凹部群を構成する２つ以上の凹部と、１つ以上の他の凹部とから構成され、
前記各凹部の底を形成する底面のうち前記基準方向に沿って窪みが最も深い部分を当該各凹部の最深部としたとき、
前記第１凹部群の各凹部の最深部のうち前記基準方向に沿って最も離れた一対の最深部の間の、前記基準方向に沿った距離が２Ｄ以下であるように、前記第１凹部群の各凹部が形成されており、且つ
前記第１凹部群の各凹部の最深部のうちの前記一対の最深部の両方からの前記基準方向に沿った距離が等しく且つ前記基準方向に対し垂直な中間平面から、前記他の各凹部の最深部までの前記基準方向に沿った距離がＤを超えるように、前記他の各凹部が形成されている
細胞培養容器を用い、
前記光学顕微鏡の対物レンズの光軸の方向を、前記細胞培養容器の前記基準方向に一致させて観察を行う観察工程を含む、方法
に関する。
【００２２】
焦点深度Ｄの観察光学系を備えた光学顕微鏡を用いれば、前記観察光学系の物体側焦点から光軸に沿って前後各Ｄ（計２Ｄ）の範囲内に位置する試料の鮮明な観察像を得ることができる。本発明の方法では、前記対物レンズの光軸の方向を、前記細胞培養容器の前記基準方向に一致させ、前記対物レンズと前記細胞培養容器との間の距離を適宜調整して観察を行うことにより、前記第１凹部群の凹部の最深部の全てを、前記対物レンズからの前記光軸に沿った距離が前記範囲内となるように位置させ、且つ前記他の凹部の最深部の全てを、前記対物レンズからの前記光軸に沿った距離が前記範囲から外れるように位置させた状態での観察が可能である。このため、前記第１凹部群の各凹部内の細胞は、前記対物レンズと前記細胞培養容器との前記光軸方向に沿った距離をほとんど変えずに前記細胞培養容器を前記光軸に対し垂直方向に相対移動させることにより連続的に観察可能である。また、前記相対移動の際に、前記他の凹部のいずれかに収容された細胞が誤って観察視野内に位置することとなった場合でも該細胞の鮮明な像は得られないため、細胞間の誤認を防ぐことができる。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、前記観察工程が、
前記第１凹部群のいずれかの凹部に収容された細胞に前記観察光学系の焦点を合わせて観察を行う第一工程と、
前記第一工程の後に、前記細胞培養容器が前記光軸に垂直な方向に移動するように、前記細胞培養容器と前記対物レンズとを相対的に移動させて、前記第１凹部群の他の凹部に収容された細胞の観察を行う第二工程と
を含む。
【００２４】
当該好ましい実施形態によれば、前記第１凹部群の複数の凹部内の細胞を速やかに観察することができる。また、前記第１凹部群の凹部内の細胞と前記他の凹部内の細胞と誤認する可能性が低い。
【００２５】
本発明の更に好ましい実施形態では、前記細胞培養容器において、前記他の各凹部の最深部が、前記第１凹部群の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿ってＤを超える距離離れているように、前記他の各凹部が形成されている。当該好ましい実施形態によれば前記観察工程において、前記観察光学系の焦点を前記第１凹部群の凹部内の細胞のいずれか１つに合わせた後で前記細胞培養容器を前記光軸に対し垂直方向に相対移動させて前記他の凹部のいずれかに収容された細胞が誤って視野内に位置することとなった場合でも、該細胞には焦点が合わず不鮮明な像しか得られないため、細胞を誤認する可能性を更に低減することができる。
【００２６】
本発明の更に好ましい実施形態では、前記細胞培養容器において、前記他の各凹部の最深部が、前記第１凹部群の各凹部の最深部のいずれからも、前記基準方向に沿って２Ｄを超える距離離れているように、前記他の各凹部が形成されている。当該好ましい実施形態によれば前記観察工程において、前記観察光学系の焦点を前記第１凹部群の凹部内の細胞のいずれか１つに合わせた後で前記細胞培養容器を前記光軸に対し垂直方向に相対移動させて前記他の凹部のいずれかに収容された細胞が誤って視野内に位置することとなった場合でも、該細胞には焦点が合わず更に不鮮明な像しか得られないため、細胞を誤認する可能性を更に低減することができる。
【００２７】
上記の３つの本発明の、更に好ましい実施形態では、前記第１凹部群の各凹部は、前記細胞培養容器の表面上の、培養液の１つの液塊で被覆することができる領域に形成されており；前記他の各凹部は、前記細胞培養容器の表面上の前記領域以外の領域に形成されている。より詳細には、前記他の各凹部は、前記細胞培養容器の表面上において、前記１つの液塊により前記第１凹部群の各凹部が形成された前記領域を被覆した場合に、前記１つの液塊とは分離した、培養液の１又は複数の液塊で被覆することができる、前記細胞培養容器の表面上の領域に形成されている。当該更に好ましい実施形態によれば、第１凹部群の各凹部内に収容した複数の細胞を個別管理しつつ培養液の１つの液塊内で培養することが可能となり、複数の細胞からの培養液内部に蓄積したタンパク質、ホルモン、酵素等の細胞分泌物が互いの細胞に相互作用するパラクライン効果を期待できる。また、容量の小さい第１凹部群の各凹部内で個別に細胞を培養することにより、細胞の自己分泌物が作用するオートクライン効果も期待できる。更に、他の凹部内に収容した細胞は、第１凹部群の各凹部内に収容した細胞とは異なる培養液の液塊中で培養することが可能であるため、第１凹部群の各凹部に収容した複数の細胞を１つの培養液の液塊中で培養しながら、複数の細胞のうちの一部の細胞を抜き出して他の凹部内で培養を継続することが可能である。当該更に好ましい実施形態の具体例としては、前記細胞培養容器が、内部空間が形成された第１収容部を備え；前記第１凹部群の各凹部が、前記第１収容部における、前記内部空間を形成する面に形成されており；前記他の各凹部は、前記細胞培養容器における、前記第１収容部以外の部分に形成されている、という例が挙げられる。
【００２８】
上記の３つの本発明の、更に好ましい実施形態では、前記第１凹部群の各凹部の開口幅の最小値は１００μｍ以上であり、且つ最大値は１０００μｍ未満である。当該更に好ましい実施形態によれば、第１凹部群の各凹部の開口幅の最小値は１００μｍ以上とすることにより、各凹部に受精卵等の比較的大きな細胞を収容し培養することが可能である。第１凹部群の各凹部の開口幅の最大値を１０００μｍ未満とすることにより、第１凹部群の各凹部を小さい面積の領域内に密集して配置することが可能であり、且つ、当該各凹部内での細胞の移動が小さく観察が容易である。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、複数種類の細胞を１つの細胞培養容器で培養することができ、且つ、光学顕微鏡での観察時の種類の異なる細胞同士の誤認を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】本発明の細胞培養容器１の実施形態１を水平面上に載置し平面視したときの模式図である。
【図１Ｂ】図１ＡにおけるＩ−Ｉ’に沿った断面模式図である。
【図１Ｃ】図１ＡにおけるＩＩ−ＩＩ’に沿った断面模式図である。
【図１Ｄ】図１ＡにおけるＩＩＩ−ＩＩＩ’に沿った断面模式図である。
【図１Ｅ】図１Ａにおける領域Ｆを拡大した拡大図（模式図）である。
【図１Ｆ】図１ＥにおけるＩＶ−ＩＶ’に沿った断面模式図、Ｖ−Ｖ’に沿った断面模式図およびＶＩ−ＶＩ’に沿った断面模式図を第１収容部底面９０の高さが同じになるように並べて示す図である。
【図１Ｇ】図１Ｄに示す断面模式図のうち左側の第２凹部５００の近傍の拡大図（模式図）である。
【図１Ｈ】図１Ａ〜Ｄに示す本発明の細胞培養容器１の実施形態１において、培養液の１つの液塊Ｄ１により第１凹部４１１〜４１８を被覆し、培養液の液塊Ｄ２により各第２凹部５００を被覆し、全体をオイルＯ１で被覆したときの、図１ＡにおけるＩＩＩ−ＩＩＩ’に沿った断面を模式的に示した図である。
【図２】本発明の細胞培養容器１の実施形態２における第１凹部４１１〜４１８の近傍の拡大図（模式図）であり、図１Ｅにおける８つの第１凹部４００が、第１凹部４１１〜４１８に置き換わった実施形態２において、ＩＶ−ＩＶ’に沿った断面模式図、Ｖ−Ｖ’に沿った断面模式図およびＶＩ−ＶＩ’に沿った断面模式図を第１収容部底面９０の高さが同じになるように並べて示す図である。
【図３Ａ】本発明の細胞培養容器１の実施形態３における、第２凹部５２０の近傍の拡大図（模式図）である。第２凹部５２０の底面の中心を通り該底面に垂直な面で切った断面模式図である。
【図３Ｂ】本発明の細胞培養容器１の実施形態３における、第２凹部５３０の近傍の拡大図（模式図）である。第２凹部５３０の底面の中心を通り該底面に垂直な面で切った断面模式図である。
【図４Ａ】本発明の細胞培養容器１の実施形態４を水平面上に載置し平面視したときの模式図である。
【図４Ｂ】図４Ａにおける領域Ｇを拡大した拡大図（模式図）である。
【図４Ｃ】図４ＢにおけるＶＩＩ−ＶＩＩ’に沿った断面模式図、ＶＩＩＩ−ＶＩＩＩ’に沿った断面模式図およびＩＸ−ＩＸ’に沿った断面模式図を第１収容部底面９０の高さが同じになるように並べて示す図である。
【図５Ａ】本発明の細胞培養容器１の実施形態５を水平面上に載置し平面視したときの模式図である。
【図５Ｂ】図５ＡにおけるＸ−Ｘ’に沿った断面模式図である。
【図５Ｃ】図５ＡにおけるＸＩ−ＸＩ’に沿った断面模式図である。
【図６Ａ】複数の凹部を有する従来の細胞培養容器を示す平面図である。
【図６Ｂ】図６Ａに示す細胞培養容器に細胞及び培地を満たした状態での、内壁で囲われた細胞収容部の近傍の断面の模式図である。
【図６Ｃ】図６ＢにＨで示す部分の形状を説明するための模式図である。
【図７Ａ】本発明の細胞培養容器１の実施形態１の変形例を、水平面上に載置し平面視したときの模式図である。
【図７Ｂ】図７ＡにおけるＸＩＩ−ＸＩＩ’に沿った断面模式図である。
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｂに示す発明の細胞培養容器１の実施形態１の変形例において、培養液の１つの液塊Ｄ１により第１凹部４１１〜４１８を被覆し、培養液の液塊Ｄ２により各第２凹部５００を被覆し、全体をオイルＯ１で被覆したときの、図７ＡにおけるＸＩＩ−ＸＩＩ’に沿った断面を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、光学顕微鏡を用いた観察に適した細胞培養容器に関する。また、当該細胞培養容器と光学顕微鏡とを用いて細胞を観察する方法に関する。
【００３２】
そこで以下には細胞培養容器について説明し、続いて観察方法について説明する。なお図示する図面はいずれも模式図であって実際の寸法形状を正確に反映した図ではない。また、図示する具体例は説明のための一例であって本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
＜細胞培養容器／実施形態１＞
本発明の細胞培養容器の一例である実施形態１を図１Ａ〜Ｈを参照して説明する。
図１Ａ〜Ｈに示す細胞培養容器１は、容器底部２０と、容器底部２０の周縁から上方に向け立設された容器側壁部３０とを備え、容器底部２０の中央部に、細胞及び培養液を収容するための内部空間を有する第１収容部４０が形成されている。容器底部２０の、収容部４０と容器側壁部３０との間の部分には４つの第２収容部５０が形成されている。第１収容部４０の底面には８つの第１凹部４１１〜４１８が形成されている。また第２収容部５０には第２凹部５００が形成されている。
【００３４】
本発明の第一の特徴は第１凹部及び第２凹部の構造にあるが、先に培養容器１全体の構成を説明し、後に各凹部の構造の特徴を説明する。
【００３５】
第１収容部４０は、第１収容部底部４１と、第１収容部底部４１の周縁に立設された第１収容部周壁４２とを少なくとも含み、上方に開口した有底の内部空間４５（第１収容部内部空間と称することがある）を有する。第１収容部周壁４２は、それが囲う内部空間４５が細胞及び培養液を収容可能であればどのような構造を有していてもよいが、より好ましくは、図示するように、第１収容部底部４１の周縁に立設され外縁に進むに従って高くなるように形成された第１収容部第１周壁４３と、第１収容部第１周壁４３の上端と接続し、更に外縁に進むに従って高くなるように形成された第１収容部第２周壁４４とを含む。第１収容部周壁４２の上端と容器底部２０とは、第１収容部外壁４６により接続されている。
【００３６】
図１Ｅは、図１Ａにおける領域Ｆを拡大した模式図である。第１収容部底部４１に８つの第１凹部４１１〜４１８が形成されている。図１Ｆには、８つの第１凹部４１１〜４１８が形成された第１収容部底部４１の、図１ＥにおけるＩＶ−ＩＶ’に沿った断面模式図、Ｖ−Ｖ’に沿った断面模式図およびＶＩ−ＶＩ’に沿った断面模式図を、第１収容部底部４１の表面であって、第１収容部内部空間４５の底を形成する第１収容部底面９０の高さが同じになるように並べて示す。図１Ｇには、第２収容部５０に形成された第２凹部５００の断面の拡大模式図を示す。第１凹部４１１〜４１８は、それぞれ第１収容部底面９０に形成されている。第１凹部４１１〜４１８は、窪んだ形状の底面４０１により底が形成され、更に、底面４０１の周縁から起立する周壁面４０２により側面が形成される。第２凹部５００は、窪んだ形状の底面５０１により底が形成され、更に、底面５０１の周縁から起立する周壁面５０２により側面が形成される。底面５０１は容器底部２０の底面２１を窪ませて形成されており、周壁面５０２は容器底部２０の底面２１上に立設された環状の周壁５１の内周側の面である。本発明において「凹部」とは一端が開口し、他端及び側方が閉塞した有底穴状の空間を指し、第１凹部４１１〜４１８のように部材の壁面に直接窪みとして設けられた凹部であってもよいし、部材の壁面から突出した部材により形成された凹部であってもよいし、第２凹部５００のように、部材の壁面に直接窪みが設けられるとともに、一部の壁面が、部材壁面から突出した他の部材により形成されていてもよい。
【００３７】
本発明では、凹部を囲う壁面のうち、凹部の開口に対向する面を「底面」といい、凹部の底は底面により形成される。一般的に培養時に細胞は凹部の底面上に保持される。凹部の底面を、凹部の深さ方向に垂直な仮想平面に投影して形成される領域は、その形状が特に限定されず、任意の形状、例えば、円状（円形および楕円形を含む）、三角形、四角形、五角形、六角形、八角形等の多角形であることができる。
【００３８】
第１収容部４０、容器底部２０及び容器側壁部３０を有する細胞培養容器１を用いて細胞培養する場合、図１Ｈに示すように、第１収容部４０の内部空間４５内に培養液の液塊Ｄ１を収容し、更に、培養液の乾燥を防ぐために、液塊Ｄ１を含んだ第１収容部４０全体と収容部外の容器底部２０とを覆うようにオイルＯ１を満たして培養を行う。第１収容部４０内で複数の細胞、例えば受精卵を一度にグループで培養する場合、発育の悪い細胞を同一の液塊Ｄ１内に配置し続けることによって発育の良好な細胞の発育を阻害する可能性がある。このような場合に発育の悪い細胞を第１収容部４０から取り出し、培養液の別の液塊中に移して培養を継続することが求められる。このとき、仮に第２収容部５０を有していない細胞培養容器を用いた場合、容器底部２０の底面、すなわち容器側壁部３０が設けられる側の面２１上に独立した培養液の液塊を形成し、該液塊中で発育の悪い細胞の培養が継続される。細胞培養容器１において表面を親水化する場合、底面２１も親水化されるため培養液の液塊を形成することが難しい。この問題を解決すために、培養液の液塊を形成するための第２凹部５００が形成された第２収容部５０を容器底部２０の第１収容部４０と容器側壁部３０との間の部分に少なくとも１つ設ける。すなわち内部空間４５内に細胞及び培養液の液塊Ｄ１を収容し細胞培養を行うための第１収容部４０と、液塊Ｄ２を収容するための第２収容部５０とを一体化して同一の細胞培養容器とすることにより、第１収容部４０内での細胞培養と、第２収容部５０内での細胞培養とを並行して進めることが容易となる。
【００３９】
次に、本発明の凹部の特徴について主に図１Ｄ〜Ｈを参照して説明する。
細胞培養容器１では、細胞を収容するための凹部が３つ以上、具体的には、第１凹部４１１〜４１８が８つ、第２凹部５００が４つ形成されている。下記の説明では便宜上、８つの第１凹部４１１〜４１８により構成される群を「第１凹部群」とし、４つの第２凹部５００のそれぞれを「他の凹部」と称する。
【００４０】
全ての第１凹部４１１〜４１８及び第２凹部５００は、いずれも、それぞれの底面４０１、５０１を同じ基準方向、すなわち図１Ｆ及び図１ＧにおいてＡで示す軸に沿った方向（以下「基準方向Ａ」と表す）に沿って１つの仮想平面、例えば図１Ｆ及び図１ＧにおいてＢで示す、前記基準方向Ａに垂直な仮想平面、の上に投影したときに互いに分離した領域、すなわち図１Ｆに示す底面４０１が投影された領域Ｃ、及び、図１Ｇに示す底面５０１が投影された領域Ｄとして投影することができるように形成されている。このことはすなわち、光学顕微鏡による観察の際に、Ａで示す軸に沿った基準方向に光学顕微鏡の対物レンズの光軸が向くように、対物レンズ及び細胞培養容器１を設置すれば、細胞培養容器１に対し光軸の方向を一定に保持したままで第１凹部４１１〜４１８及び第２凹部５００のそれぞれの底面４０１、５０１上にある細胞を観察可能であることを意味する。より好ましくは、全ての凹部の底面から開口に向かう方向は、同一方向に沿うように形成され、更に好ましくは、細胞培養容器１を水平面上に載置したとき、全ての凹部は、底面から開口に向かう方向が鉛直方向に向くように形成される。
【００４１】
そして、第１凹部４１１〜４１８及び第２凹部５００のそれぞれについて、底面４０１、５０１のうち基準方向に沿って窪みが最も深い部分を当該凹部の最深部４０３、５０３とする。「最深部」は各凹部の底面のうちの一部を指し、点状であってもよいし、線状であってもよいし、面状であってもよい。図示する最深部４０３、５０３は点状である。
【００４２】
本発明の細胞培養容器１は、基準方向Ａが鉛直方向と一致するように細胞培養容器１を設置し、第１凹部４１１〜４１８及び第２凹部５００の各々で細胞培養を実施すると、細胞は重力により最深部４０３、５０３上に位置することができるように構成されている。１つの細胞培養容器１に含まれる各凹部４１１〜４１８、５００の底面４０１、５０１のうち、最深部４０３、５０３を含む、培養時に細胞と直接接触する部分の形状は同一であることが好ましい。
【００４３】
図１Ｆに示すように、第１凹部４１６の最深部４０３が基準方向Ａに垂直な平面ａ１上にあり、第１凹部４１１、４１３、４１５及び４１８の最深部４０３が基準方向Ａに垂直な平面ａ２上にあり、第１凹部４１４の最深部４０３が基準方向Ａに垂直な平面ａ３上にあり、第１凹部４１２及び４１７の最深部４０３が基準方向Ａに垂直な平面ａ４上にある。実施形態１において、第１凹部４１１〜４１８の最深部４０３のうち基準方向Ａに沿って最も離れた一対の最深部は、第１凹部４１６の最深部４０３と、第１凹部４１２又は４１７の最深部４０３との対である。本発明では、当該一対の最深部４０３の両方からの基準方向Ａに沿った距離が等しく且つ基準方向Ａに対し垂直な平面を「中間平面」と称し、図中ではａｍで示す。
【００４４】
また、第２凹部５００の最深部５０３を通り基準方向Ａに垂直な平面を平面ｂとする。図示していないが、図１Ａ〜Ｈに示す実施形態１では４つの第２凹部５００の全ての最深部５０３が平面ｂ上に位置する。
【００４５】
この実施形態１では、基準方向Ａに一致するように光学顕微鏡の対物レンズを設置し、１つの第１凹部４１１〜４１８内の細胞に焦点を合わせた後は、細胞培養容器１が基準方向Ａと垂直な方向に移動するように細胞培養容器１と対物レンズとを相対的に移動させることにより、他の第１凹部４００に収容された細胞について再度焦点を合わせることなく観察することができる。
【００４６】
本発明では「焦点深度」という用語をＪＩＳ  Ｚ８１２０において「顕微鏡では、鮮明に見える物体空間での光軸方向における範囲」と規定されている通りの意味で用いる。具体的には、観察光学系の物体側焦点を観察対象物に合わせたときの前記観察対象物の光軸上の位置（合焦位置）から、前記観察対象物を対物レンズに対して光軸方向に相対移動させても焦点が合っていると見做すことができる光軸上の範囲を指す。観察光学系の焦点深度がＤであるとき、物体空間において合焦位置から光軸に沿って距離がＤ離れた位置までの範囲で焦点が合っていると見做すことができる、換言すれば、物体空間において光軸方向に沿って合焦位置を中心とした２Ｄの範囲で焦点が合っていると見做すことができる。
【００４７】
焦点深度の値は観察光学系の方式、観察手段等に応じて定まる値である。例えば、対物レンズと接眼レンズを含む光学顕微鏡を用い、人間の眼で観察する場合の焦点深度はＢｅｒｅｋの式によって算出することができる。
Ｄ＝ｎ×［（ω×２５００００）／（ＮＡ×Ｍ）＋λ／（２×ＮＡ２）］（μｍ）
式中、ｎは観察対象物と対物レンズとの間の媒質の屈折率であり、ωは人間の眼の分解能であり、ＮＡは対物レンズの開口数であり、Ｍは総合倍率、すなわち対物レンズの倍率と接眼レンズの倍率との積であり、λは観察光の波長（単位：μｍ）である。
【００４８】
上記Ｂｅｒｅｋの式において、観察対象物と対物レンズとの間の媒質が空気である場合ｎ＝１であり、人間の眼の視角を５分とした場合ω＝０．００１４であり、緑の可視光で観察する場合λ＝０．５５（μｍ）と仮定できる。この仮定のもとでは、開口数ＮＡ＝０．２５の１０倍の対物レンズと、１０倍の接眼レンズを含む総合倍率Ｍ＝１００倍の観察光学系の焦点深度Ｄは約１８．４μｍと算出でき、開口数ＮＡ＝０．４０の２０倍の対物レンズと、１０倍の接眼レンズを含む総合倍率Ｍ＝２００倍の観察光学系の焦点深度Ｄは約６．１μｍと算出できる。
【００４９】
細胞培養容器１において、観察に用いる光学顕微鏡の観察光学系の焦点深度をＤとしたとき、基準方向Ａに沿って最も離れた一対の最深部である、第１凹部４１６の最深部４０３と、第１凹部４１２又は４１７の最深部４０３との対の間の基準方向Ａに沿った距離、すなわち平面ａ１と平面ａ４との距離ｄ１を、２Ｄ以下に設定すれば以下の効果が実現できる。すなわち、全ての第１凹部４１１〜４１８は中間平面ａｍから基準方向Ａに沿ってＤ以下の距離しか離れていないため、光学顕微鏡の対物レンズを光軸が基準方向Ａに沿うように設置し、その観察光学系の焦点を中間平面ａｍ上に合わせれば、全ての第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞を観察するには、対物レンズの光軸に対して垂直な方向に細胞培養容器を相対移動させて対物レンズの光軸が前記細胞を通るようにすればよく、各細胞を観察する毎に焦点調整をすることは不要であるか最小限で済むため、素早い観察が可能である。
【００５０】
更に好ましくは、平面ａ１と平面ａ４との距離ｄ１をＤ以下に設定する。この場合、全ての第１凹部４１１〜４１８は相互に、基準方向Ａに沿ってＤ以下の距離しか離れていないため、第１凹部４１１〜４１８のいずれかの底面４０１上の細胞に焦点を合わせた後は、第１凹部４１１〜４１８の他のいずれか１つの底面４０１上の細胞を観察する際の焦点調整は不要となるためより好ましい。
【００５１】
なお距離ｄ１は実施形態２及び実施形態４に示すように０であってもよい。
また、距離ｄ１、すなわち第１凹部４１１〜４１８の最深部４０３のうち基準方向Ａに沿って最も離れた一対の間の基準方向Ａに沿った距離、を３６μｍ以下、より好ましくは３０μｍ以下、更に好ましくは２０μｍ以下、更に好ましくは１８μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以下、更に好ましくは１２μｍ以下、更に好ましくは８μｍ以下、最も好ましくは６μｍ以下となるように設定すれば、上記の総合倍率Ｍ＝１００倍の観察光学系（Ｄは約１８．４μｍ）を用いて観察を行った場合に、第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞を連続的に観察することが可能となる。特に、距離ｄ１が１８μｍ以下であれば、上記の総合倍率Ｍ＝１００倍の観察光学系を用いた場合に第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞を一度の焦点調整のみで連続的に観察することができる。
【００５２】
同様に距離ｄ１を１２μｍ以下、更に好ましくは８μｍ以下、最も好ましくは６μｍ以下となるように設定すれば、上記の総合倍率Ｍ＝２００倍の観察光学系（Ｄは約６．１μｍ）を用いて観察を行った場合に、第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞を連続的に観察することが可能となる。特に、距離ｄ１が６μｍ以下であれば、上記の総合倍率Ｍ＝２００倍の観察光学系を用いた場合に第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞を一度の焦点調整のみで連続的に観察することができる。
【００５３】
更に、この実施形態１において、４つの第２凹部５００の最深部５０３は、いずれも平面ｂ上に位置する。そして４つの第２凹部５００はそれぞれ、その最深部５０３の中間平面ａｍからの基準方向Ａに沿った距離ｄ２、すなわち平面ａｍと平面ｂとの間の距離がＤよりも大きくなるように形成されている。この場合、光学顕微鏡の対物レンズを光軸が基準方向Ａに沿うように設置し、その観察光学系の焦点を中間平面ａｍ上に合わせて８つの第１凹部４１１〜４１８内の細胞を観察可能とした状態では、全ての第２凹部５００の最深部５０３が光軸方向に沿った鮮明な像が得られる範囲内から外れるため、観察光学系の焦点を中間平面ａｍ上に合わせて第１凹部４１１〜４１８内の細胞を観察する際に、誤って対物レンズの光軸が第２凹部５００のいずれかに収容された細胞を通ったとしても、該細胞の鮮明な像は得られず細胞間の誤認を防ぐことができる。
【００５４】
また距離ｄ２を好ましくは６μｍ超（６μｍを超える値を指す、以下同様）、より好ましくは７μｍ以上、より好ましくは１２μｍ超、更に好ましくは１３μｍ以上、更に好ましくは１８μｍ超、更に好ましくは１９μｍ以上、更に好ましくは３６μｍ超、更に好ましくは３７μｍ以上、最も好ましくは４０μｍ以上とすれば、上記の総合倍率Ｍ＝２００倍の観察光学系（Ｄは約６．１μｍ）を用いて観察を行った場合に、第２凹部５００の底面５０１上の細胞と、第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞とを相互に誤認する事故を防ぐことができる。特に、距離ｄ２を１２μｍ超または更に大きく設定した場合にこの効果が特に高い。
【００５５】
また同様に距離ｄ２を１８μｍ超、更に好ましくは１９μｍ以上、更に好ましくは３６μｍ超、更に好ましくは３７μｍ以上、最も好ましくは４０μｍ以上とすれば、上記の総合倍率Ｍ＝１００倍の観察光学系（Ｄは約１８．４μｍ）を用いて観察を行った場合に、第２凹部５００の底面５０１上の細胞と、第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞とを相互に誤認する事故を防ぐことができる。特に、距離ｄ２を３６μｍ超または更に大きく設定した場合にこの効果が特に高い。
【００５６】
本実施形態の好ましい形態では、４つの第２凹部５００の最深部５０３が、第１凹部４１１〜４１８の最深部４０３のいずれからも、基準方向Ａに沿ってＤを超える距離離れるように設定する、すなわち平面ａ１〜ａ４と平面ｂとの間の距離がいずれも２Ｄを超えるように設定する。８つの第１凹部４１１〜４１８の最深部４０３のうち、各第２凹部５００の最深部５０３までの基準方向Ａに沿った距離が最も小さいものは、第１凹部４１２又は４１７の最深部４０３であるから、上記の４つの第２凹部５００の最深部５０３が、第１凹部４１１〜４１８の最深部４０３のいずれからも、基準方向Ａに沿ってＤを超える距離離れるようにするには、各第２凹部５００の最深部５０３から、第１凹部４１２又は４１７の最深部４０３までの基準方向Ａに沿った距離ｄ３がＤよりも大きくなるようにすればよい。距離ｄ３は、「他の各凹部の最深部と、第１凹部群の凹部の最深部のうち前記他の各凹部の最深部からの基準方向に沿った距離が最も短いものとの間の、前記基準方向に沿った距離」と表現することもできる。距離ｄ３がＤよりも大きい場合、光学顕微鏡の対物レンズを光軸が基準方向Ａに沿うように設置し、第１凹部４１１〜４１８のいずれの底面４０１上の細胞に観察光学系の焦点を合わせたとしても、その後に、対物レンズの光軸に対し垂直な方向のみに細胞培養容器を相対移動させただけでは第２凹部５００の底面５０１上の細胞には焦点が合わないため観察が不可能である。同様に、第２凹部５００の底面５０１上の細胞に観察光学系の焦点を合わせた後で、対物レンズの光軸に対し垂直な方向に細胞培養容器を相対移動させたとしても、第１凹部４１１〜４１８のどの底面４０１上の細胞も観察することができない。このため、第２凹部５００の底面５０１上の細胞と、第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞とを相互に誤認する事故を防ぐことができる。
【００５７】
本発明の更に好ましい実施形態では、距離ｄ３は２Ｄよりも大きくなるように設定される。この場合、観察光学系の焦点を第１凹部４１１〜４１８内の細胞のいずれか１つに合わせた後で細胞培養容器１を光軸に対し垂直方向に相対移動させて４つの第２凹部５００のいずれかに収容された細胞が誤って視野内に位置することとなった場合でも、該細胞には焦点が合わず更に不鮮明な像しか得られないため、細胞を誤認する可能性を更に低減することができる。
【００５８】
また距離ｄ３を好ましくは６μｍ超、より好ましくは７μｍ以上、より好ましくは１２μｍ超、更に好ましくは１３μｍ以上、更に好ましくは１８μｍ超、更に好ましくは１９μｍ以上、更に好ましくは３６μｍ超、更に好ましくは３７μｍ以上、最も好ましくは４０μｍ以上とすれば、上記の総合倍率Ｍ＝２００倍の観察光学系（Ｄは約６．１μｍ）を用いて観察を行った場合に、第２凹部５００の底面５０１上の細胞と、第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞とを相互に誤認する事故を防ぐことができる。特に、距離ｄ３を１８μｍ超または更に大きく設定した場合にこの効果が特に高い。
【００５９】
また同様に距離ｄ３を１８μｍ超、更に好ましくは１９μｍ以上、更に好ましくは３６μｍ超、更に好ましくは３７μｍ以上、最も好ましくは４０μｍ以上とすれば、上記の総合倍率Ｍ＝１００倍の観察光学系（Ｄは約１８．４μｍ）を用いて観察を行った場合に、第２凹部５００の底面５０１上の細胞と、第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞とを相互に誤認する事故を防ぐことができる。特に、距離ｄ３を３６μｍ超または更に大きく設定した場合にこの効果が特に高い。
【００６０】
本発明の細胞培養容器は、より好ましくは、図１Ｈに示すように、第１凹部群の第１凹部４１１〜４１８はいずれも、細胞培養容器１の表面上の、培養液の単一の液塊Ｄ１で被覆することができる領域（以下「第１領域」という）、具体的には、１つの第１収容部４０の内部空間４５を形成する面である第１収容部底面９０及び／又は第１収容部周壁面９１、に形成され、且つ、他の凹部である第２凹部５００はいずれも、細胞培養容器１の表面上の前記第１領域以外の領域（以下「第２領域」という）、具体的には、容器底部２０の底面２１の、第１収容部４０と容器側壁部３０との間の領域、に形成される。各第２凹部５００は、液塊Ｄ１とは分離した、培養液の１又は複数の液塊Ｄ２で被覆することができるように構成されている。換言すれば、各第２凹部５００は、細胞培養容器１の表面上において、第１凹部群の各凹部４１１〜４１８を含む前記第１領域を培養液の単一の液塊Ｄ１で被覆した場合に、液塊Ｄ１とは分離した、培養液の１又は複数の液塊Ｄ２で被覆することができる領域に形成されている。これらの特徴を有する細胞培養容器１によれば以下の効果が実現できる。すなわち、第１凹部４１１〜４１８に個別に細胞を配置し、それらが形成された第１領域を培養液の単一の液塊Ｄ１で被覆することにより、複数の細胞を個別管理しつつ同じ培養系で培養することが可能となり、複数の細胞からの培養液内部に蓄積したタンパク質、ホルモン、酵素等の細胞分泌物が互いの細胞に相互作用するパラクライン効果を期待できる。また、より小さい第１凹部４１１〜４１８の群を設けることで、小さい空間内で個々の細胞を培養することが可能となり、細胞の自己分泌物が作用するオートクライン効果も期待できる。更に、第２凹部５００を備える第２収容部５０を、第２領域に形成することにより、第２凹部５００内に収容した細胞は、第１凹部４１１〜４１８内に収容した細胞とは異なる培養液の液塊Ｄ２中で培養することが可能であるため、第１凹部４１１〜４１８に収容した複数の細胞を、第１収容部４０内の共通の培養液の液塊Ｄ１中で培養しながら、複数の細胞のうちの一部の細胞を抜き出して第２凹部５００内の液塊Ｄ２中で培養を継続することが可能である。培養液の液塊Ｄ１及びＤ２の乾燥を防ぐためには、容器底部２０の底面２１の全体を覆うようにオイルＯ１が満たされることが好ましい。
【００６１】
図１Ａ〜Ｈに示すように細胞培養容器１が第１収容部４０を備える場合、内部空間４５の形状としては、好ましくは図示するように、一端が開口した有底穴状の形状が好ましいがこの形状に特に限定されない。内部空間４５を形成する面のどの部分に第１凹部４１１〜４１８が形成されていてもよいが、より好ましくは、内部空間４５の底を形成する第１収容部底面９０に第１凹部４１１〜４１８が形成される。内部空間４５の容量は特に限定されないが、好ましくは１０μｌ〜３ｍｌである。より好ましくは、内部空間４５に小容量の培養液、例えば１０μｌ〜１００μｌの培養液の液塊Ｄ１を収容でき、かつ１０μｌ〜１００μｌの培養液の液塊Ｄ１によって第１収容部底面９０の全面を覆うことが可能であり、液塊Ｄ１の高さが０．３５ｍｍ以上、より好ましくは０．５ｍｍ以上となるように内部空間４５が形成されている。このためには、第１収容部底面９０の面積は、好ましくは０．７５ｍｍ２以上、より好ましくは３ｍｍ２以上、さらに好ましくは５ｍｍ２以上であり、好ましくは２０ｍｍ２以下、より好ましくは１３ｍｍ２以下である。第１収容部底面９０の面積を０．７５ｍｍ２以上とすることにより、細胞、好ましくはヒト受精卵を収容可能な複数の第１凹部を第１収容部底面９０に配置することができる。また、第１収容部底面９０の面積を、２０ｍｍ２以下とすることにより、小容量の培養液（例えば１０μｌ）の液塊Ｄ１でも、第１収容部底面９０の全面を覆うことが可能であり、液塊Ｄ１が第１収容部底面９０上で大きく移動することを防止できる。
【００６２】
また、第１凹部４１１〜４１８は以下の特徴を備えることが好ましい。すなわち、第１凹部４１１〜４１８はそれぞれ、細胞を収容可能な開口幅を有することが好ましい。本発明において、各凹部の開口幅は、当該凹部の開口の周縁を、前記基準方向Ａに垂直な仮想平面上に投影したときに、前記周縁が形成する図形の幅の寸法を指す。更に、開口幅の最小値とは、前記図形の重心を間に介して対向する、前記図形の周縁上の一対の点の間の距離の最小値（例えば前記図形が円の場合は直径の長さ、楕円の場合は短径の長さ）を指す。第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最小値が、培養する細胞の最大寸法より大きいとき、第１凹部４１１〜４１８は細胞を収容可能である。本発明の培養容器により受精卵を培養する場合、胚盤胞の段階まで培養することが望ましいため、第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最小値は、胚盤胞の段階の細胞の最大寸法より大きいものであることが望ましい。胚盤胞の段階の細胞の最大寸法は通常１００μｍ〜２８０μｍであることから、第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最小値は、通常１００μｍ以上であり、より好ましくは２５０μｍ以上である。更に、第１凹部４１１〜４１８は、小さい面積の領域内に密集して配置することができる寸法を有することが好ましい。第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最大値は、通常、第１凹部４１１〜４１８のうち隣接する凹部間のピッチよりも小さくなるように設定される。第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最大値は好ましくは１０００μｍ未満であり、より好ましくは７００μｍ未満である。ここで、第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最大値とは、当該凹部の開口の周縁を、前記基準方向Ａに垂直な仮想平面上に投影したときに、前記周縁が形成する図形において、前記図形の重心を間に介して対向する、前記図形の周縁上の一対の点の間の距離の最大値を指す。第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最大値を１０００μｍ未満とすることにより隣接する第１凹部４１１〜４１８間の凹部間のピッチを小さい値にすることができ、第１収容部底面９０内の小さな面積の領域に第１凹部４１１〜４１８を密集させることが可能となるため、細胞を個別に管理しつつ多くの細胞を同時に培養でき、更に顕微鏡の一視野に多くの細胞が入るため、一度に多くの細胞を観察することができる。また、第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最大値を１０００μｍ未満とすることにより、第１凹部内での細胞の移動が小さく観察が容易となる。
【００６３】
例えば、細胞培養容器１を用いてウシ受精卵を培養する場合、第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最小値は、通常２５０μｍ以上、好ましくは２６０μｍ以上、さらに好ましくは２７０μｍ以上であり、第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最大値は通常１０００μｍ未満、さらに好ましくは７００μｍ未満である。また、第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最小値は、Ｘ＋ｍ（ここでＸは細胞の最大径を表す）と規定することもできる。ここで、ｍは、好ましくは１０μｍ以上、さらに好ましくは２０μｍ以上である。
【００６４】
また、第１凹部４１１〜４１８の深さは、特に限定されるものではないが、浅過ぎると、培養容器の輸送時や細胞の分裂時などに細胞が動き、細胞が第１凹部４１１〜４１８の範囲外に出てしまう恐れがあるため、確実に細胞を第１凹部４１１〜４１８内に保持できるように適宜設定される。一方、深過ぎると、第１凹部４１１〜４１８内に培養液や細胞を導入することが難しくなるため、細胞を第１凹部４１１〜４１８内に保持しつつ、深過ぎない値になるよう適宜設定される。例えば、深さの上限を、第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最大値と最小値との平均値に対して３倍以下とすることができる。さらに、培養液の導入を容易にするためには、深さは、第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最大値と最小値との平均値の１倍以下であることが好ましく、１／２以下であることが特に好ましい。また、第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最大値と最小値との平均値が小さく、深さが深いほど対流が起きにくくなるため、細胞の呼吸や代謝に伴って、周辺の培養液の組成変化が起きやすくなる可能性がある。細胞は、周辺の培養液の組成の影響を受けて成長しやすさが変化するため、細胞の成長を促すように生物学的な影響を考慮して直径と深さを設定することが好ましい。各第１凹部４１１〜４１８の深さは５０〜５００μｍ、特に５０〜３００μｍ、とりわけ１００〜３００μｍの範囲であると、作業性向上および培養細胞を安定的に保持できる点から好ましい。例えば、ウシ受精卵を培養するための細胞培養容器の場合、深さは８０μｍ以上、さらに好ましくは１２５μｍ以上とすることが好ましい。なお、各凹部の深さは最深部から開口端までの前記基準方向に沿った距離を指す。
【００６５】
第１凹部４１１〜４１８のうち隣接する凹部間のピッチは１０００μｍ以下とすることが好ましい。ただし、上記ピッチは収容する細胞の種類に依存して異なる。例えば、ウシ受精卵を収容する場合、近接する凹部間のピッチは通常１０００μｍ以下、好ましくは７００μｍ以下である。観察装置として、１／２インチのＣＣＤ素子、４、１０、２０倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡がよく用いられるが、このような観察装置で、４倍の対物レンズを選択した場合の観察可能な視野はおよそ１．６ｍｍ×１．２ｍｍであり、この観察視野内に４個以上の第１凹部４１１〜４１８が含まれるように設計することが好ましい。第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最小値がウシ受精卵の直径（約２５０μｍ）より大きい３００μｍだとすると、ピッチが９００μｍ以下の場合、１．６ｍｍ×１．２ｍｍの顕微鏡視野内に２×２＝４個の受精卵を観察することができ、ピッチが６５０μｍ以下の場合、１．６ｍｍ×１．２ｍｍの顕微鏡視野内に３×２＝６個の受精卵を観察することができ、ピッチが４３０μｍ以下の場合、１．６ｍｍ×１．２ｍｍの顕微鏡視野内に４×３＝１２個の受精卵を観察することができる。観察視野内に４個以上の第１凹部４１１〜４１８が含まれるように設計することで、例えば培養細胞の自動判別を行う場合に、一度に多数個の細胞を処理でき、また視野内の一つの受精卵と他の受精卵との比較判別が容易になるため、判別操作をより効率的に行うことができる。
【００６６】
近接する第１凹部４１１〜４１８の間のピッチは、近接する第１凹部４１１〜４１８の中心間の距離である。第１凹部４１１〜４１８の中心は、第１凹部４１１〜４１８の開口の周縁を、前記基準方向Ａに垂直な仮想平面上に投影したときに、前記周縁が形成する図形の重心位置とし、開口の周縁が円形であればその円の中心をさす。上記第１凹部４１１〜４１８間のピッチは通常平均ピッチをさし、平均ピッチは、ある凹部に関しては、近接する全ての凹部とのピッチから平均値を算出したものを指す。第１凹部４１１〜４１８間のピッチの寸法は、通常、第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最大値よりも大きい。第１凹部４１１〜４１８の開口幅の最大値の寸法は、開口の開口幅の最大値の外縁が円形であればその直径を指す。近接する凹部は１ｍｍ２あたり好ましくは１個以上、より好ましくは４個以上の密度で配置されている。
【００６７】
第１凹部４１１〜４１８の開口の周縁が円形である場合、近接する凹部間のピッチは、Ｘ＋ｍ＋ｎ（ここで、Ｘは細胞の最大径を表し、ｍは凹部の開口の周縁が形成する円の直径から細胞の最大径を引いた長さを表し、ｎは凹部間の仕切りの長さを表す）と規定することもできる。凹部間の仕切りとは、近接する凹部間の開口の周縁の間の最短距離をさす。ここでｍは通常１００μｍ以下、好ましくは７０μｍ以下、さらに好ましくは５０μｍ以下であり、ｎは通常６００μｍ以下、好ましくは３５０μｍ以下、さらに好ましくは１５０μｍ以下である。
【００６８】
上記のようなピッチで第１凹部４１１〜４１８を密に配置することにより、細胞を個別に管理しつつ多くの細胞を同時に培養でき、さらに顕微鏡の一視野に多くの細胞が入るため、一度に多くの細胞を観察することができる。
【００６９】
本発明の細胞培養容器を用いれば、グループ管理が可能になるため、良好の発育の細胞を第１凹部群の凹部に収容して培養し、その他の細胞は他の凹部に収容して培養することが可能となる。
【００７０】
第２凹部５００のサイズは特に限定されない。各第２凹部５００の容量は１０〜３０μＬであることが好ましい。各第２凹部５００の開口幅の最小値は１．５〜５ｍｍであることが好ましい。ここで第２凹部５００の開口幅の最小値とは、第２凹部５００の開口の周縁を、前記基準方向Ａに垂直な仮想平面上に投影したときに、前記周縁が形成する図形において、該図形の重心を間に介して対向する、前記図形の周縁上の一対の点の間の距離の最小値（例えば前記図形が円の場合は直径の長さ、楕円の場合は短径の長さ）を指す。容器底部２０の底面２１から周壁５１の上端までの高さは０．２〜３ｍｍであることが好ましい。内径及び高さがこの範囲であると容量１０〜３０μＬの細胞培養液を均一に広げつつ保持しやすい。周壁５１の径方向の厚さは０．１〜２ｍｍが好ましい。厚さがこの範囲であると液が漏れにくく邪魔になりにくい。
【００７１】
各凹部４１１〜４１８、５００の壁面は、各凹部の最深部４０３、５０３から凹部の外縁に進むに従って高くなるような傾斜面を有することが好ましい。なお、本発明において凹部の「壁面」とは、有底穴状の空間である凹部を画定する面であり、第１凹部底面４０１、第２凹部底面５０１、第１凹部周壁面４０２、第２凹部周壁面５０２等を含む概念である。各凹部は、通常、細胞培養容器の底部側に底がくるように形成される。凹部の傾斜面の形状（プロファイル）は、凹部の最深部４０３、５０３から凹部の外縁へ向かって曲線状に高くなる場合、階段状に高くなる場合等、適宜採用することができるが、特に直線部分を含むこと、すなわち凹部の最深部４０３、５０３から凹部の外縁へ進むに従い、その経路の全区間もしくは一部の区間が直線状に高くなる傾斜面であることが好ましい。直線部分を含むことで、凹部内に配置した細胞の移動が抑制され、細胞を凹部の最深部に固定し易くなる。したがって、顕微鏡で観察した場合に鮮明な画像を得ることができる。
【００７２】
傾斜面の表面粗さは、大きい値であると、顕微鏡で透過観察を行った画像を輪郭抽出処理に付す際に、傾斜面上の凹凸に起因して明瞭な輪郭が得られない恐れがあるため、可能な限り小さい値であることが好ましい。具体的には、最大高さＲｙ（粗さ曲線からその平均線の方向に基準長さだけを抜き取り、この抜き取り部分における山頂線と谷底線との間隔をいう）が１．０μｍ未満、特に０．５μｍ未満であることが好ましい。なお、傾斜面の表面粗さは、細胞培養容器の鋳型を作製する際に磨き処理を施す等して、鋳型の加工精度を高めることにより小さくすることができる。
【００７３】
各凹部４１１〜４１８、５００の壁面は、好ましくは円錐状又は円錐台状の部分を含む。円錐状又は円錐台状の部分は、細胞培養容器の底部側に、円錐の頂点又は円錐台の上面及び下面のうち面積の小さい方がくるように形成される。円錐状には、円錐及び楕円錐、これらに類似の形状、例えば、円錐又は楕円錐の頂点が丸みを帯びている形状、円錐面が外側に膨らんでいる形状、円錐面が内側に凹んでいる形状などが含まれる。円錐台状には、円錐台及び楕円錐台、これらに類似の形状、例えば、円錐台又は楕円錐台の上面又は下面と円錐面との接合部が丸みを帯びている形状、円錐面が外側に膨らんでいる形状、円錐面が内側に凹んでいる形状などが含まれる。凹部の壁面が、円錐台状の部分を含む場合、円錐台の上面及び下面のうち細胞培養容器の底部側にくる面積の小さい方の直径は、細胞の最大径より小さいことが好ましい。具体的には、面積の小さい方の直径が、細胞の最大径の２分の１以下であることが好ましい。２分の１以下であると、細胞が凹部の中心に配置されやすくなり、移動も抑制され、細胞の撮影が容易になる。また、特に、面積の小さい方の直径が、１０μｍ以下であることが好ましい。直径が１０μｍ以下であると、撮影の際に、光の屈折、散乱などの影響を受けて観察しにくくなる中央の領域が狭くなり、鮮明な画像が得られるため有効である。なお、凹部の円錐状及び円錐台状の部分において円錐面は曲面であり、平面を含まないことが好ましい。凹部の壁面は、通常、細胞培養容器の底部側に、上記のような傾斜面、好ましくは円錐状又は円錐台状の部分を有する。凹部の壁面は、上記のような傾斜面より開口部側に、細胞培養容器の底部に垂直な壁面を有していてもよい。
【００７４】
凹部の壁面が円錐状又は円錐台状の部分を含む場合、円錐又は円錐台の中心線と母線とのなす角度は、通常８９〜４５°、好ましくは８８〜６５°、より好ましくは８５〜８０°である。一定の角度以上とすることにより、重力を駆動源として、細胞を配置したい場所（最深部）へ移動させやすく、一定の角度以下とすることにより、顕微鏡で透過観察する際の傾斜面での反射、散乱が起こりにくくなり、鮮明な観察像を得ることができる。
【００７５】
凹部４１１〜４１８、５００が細胞培養容器の底部に平行な底面とそれに垂直な側面とからなる場合は、細胞が凹部内で移動して側面に接触する場合があり、その状態で細胞の撮像を行うと、撮影された画像において輪郭抽出処理により細胞の画像を抽出することが困難であるという問題があるが、凹部の壁面が、凹部の最深部から凹部の外縁に進むに従って高くなるような傾斜面を有する場合、好ましくは円錐状又は円錐台状の部分を含む場合は、培養される細胞は自動的に凹部の底の部分に存在することとなり、凹部が細胞培養容器の底部に垂直な側面を傾斜面より開口部側に有していたとしても、これに接触したままとなることはなく、撮像された細胞の画像の輪郭抽出処理を問題なく実施することができる。
【００７６】
以下、図面に示す他の実施形態を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施形態には限定されない。また、本明細書の図面では各構成の寸法及び形状に関わらず同じ機能を有する構成は同じ符号を付しており、上記実施形態１との特段の相違点を除き説明を省略する。
【００７７】
上記の通り、図１Ａ〜Ｈに示す実施形態１に係る細胞培養容器１は、内部空間４５が形成された第１収容部４０を備え、内部空間４５の底を形成する第１収容部底面９０に第１凹部４１１〜４１８が形成され、第２凹部５００は、第１収容部４０以外の部分に形成されている。この実施形態１によれば、液塊Ｄ１は、第１収容部周壁面９１により周縁が支持され内部空間４５内で安定するため好ましい。しかし第１凹部４１１〜４１８が形成される第１領域は、第１収容部周壁面９１等の壁部により周縁が支持されている必要はない。たとえは図７Ａ〜Ｃに示す、実施形態１に係る細胞培養容器１の変形例のように、容器底部２０の底面２１のうち平坦な領域内の一部が第１領域Ｅを構成していてもよい。この場合、培養液の１つの液塊Ｄ１により第１領域Ｅの全体を被覆することができる。容器底部２０の底面２１の第１領域Ｅの親疎水性を調整することで、適当な形状の培養液の液塊Ｄ１を形成することができる。図７Ａ〜Ｃに示す細胞培養容器１では、各第２凹部５００は、容器底部２０の底面２１のうち、第１領域Ｅ以外の領域である第２領域Ｈに形成される。第１領域Ｅは通常は円形の領域であり、その寸法は特に限定されないが、面積は好ましくは０．７５ｍｍ２以上、より好ましくは３ｍｍ２以上、さらに好ましくは５ｍｍ２以上であり、好ましくは２０ｍｍ２以下、より好ましくは１３ｍｍ２以下である。第１領域Ｅの面積を０．７５ｍｍ２以上とすることにより、細胞、好ましくはヒト受精卵を収容可能な複数の第１凹部を第１領域Ｅに配置することができる。また第１領域Ｅの面積を、２０ｍｍ２以下とすることにより、小容量の培養液（例えば１０μｌ）の液塊Ｄ１でも第１領域Ｅの全面を覆うことが可能である。
【００７８】
図１Ａ〜Ｈ及び図７Ａ〜Ｃに示す実施形態１及びその変形例では、各第２凹部５００がそれぞれ独立した液塊Ｄ２により被覆されるが、この形態には限定されず、複数の第２凹部５００が１つの液塊Ｄ２により被覆されるように配置されていてもよい（図示せず）。
【００７９】
また、図１Ａ〜Ｈ及び図７Ａ〜Ｃに示す実施形態１及びその変形例では、液塊Ｄ２の周縁は起立した壁面である周壁面５０２（図１Ｇ参照）により支持されているが、この形態には限定されない。例えば、容器底部２０の底面２１の平坦な領域の１又は複数の部分に液塊Ｄ２が被覆することができるように細胞培養容器１が構成されており、前記各部分に１つ以上の第２凹部が形成されていてもよい（図示せず）。この場合、第２凹部は、典型的には、容器底部２０の底面２１を直接窪ませて形成することができる。
【００８０】
＜細胞培養容器／実施形態２＞
図２には、実施形態２に係る細胞培養容器１において第１凹部４００の近傍のみを拡大して説明する。実施形態２は、実施形態１に係る細胞培養容器１での８つの第１凹部４１１〜４１８がそれぞれ図２に示す８つの第１凹部４００に置き換えられていることを除いて実施形態１と同一である。各第１凹部４００の寸法、位置、ピッチ、形状等に関する好適な実施形態は、下記の点を除いて、実施形態１において第１凹部４１１〜４１８について説明したのと同様であり、説明を省略する。
【００８１】
実施形態１は、第１凹部４１１〜４１８の最深部４０３が、基準方向Ａに垂直な複数の平面上に位置する例であったのに対して、図２に示す実施形態２では、各第１凹部４００の最深部４０３は、全て、平面ａ上に位置し、互いの間の基準方向Ａに沿った距離が０である、すなわち実施形態１における距離ｄ１に相当する距離が０である。実施形態２での平面ａは実施形態１での中間平面ａｍと平面ａ１〜ａ４が一致したものである。平面ａと平面ｂとの間の基準方向Ａに沿った距離は、実施形態１での距離ｄ２及びｄ３に相当し、実施形態２はそれらの値が同一の場合である。実施形態２において、これらの距離が実施形態１について詳述したｄ２、ｄ３の要件を満たすとき、実施形態１と同様の効果を達成することができる。なお距離ｄ１に相当する距離は０であるから、距離ｄ１に関する要件は必然的に満たされる。
【００８２】
＜細胞培養容器／実施形態３＞
図３Ａには、実施形態３に係る細胞培養容器１において、第２凹部５２０を有する第２収容部５２の近傍のみを拡大して説明し、図３Ｂには、実施形態３に係る細胞培養容器１において、第２凹部５３０を有する第２収容部５３の近傍のみを拡大して説明する。細胞培養容器１の他の構成については実施形態１と同一である。各第２凹部５２０、５３０の寸法、位置、ピッチ、形状等に関する好適な実施形態は、下記の点を除いて、実施形態１において第２凹部５００について説明したのと同様であり、説明を省略する。
【００８３】
図３Ａ及びＢに示す実施形態３は、図１Ａに示す４つの第２凹部５００及びそれを形成する第２収容部５０のうち、図中左側の上下２つ（図１Ｄの左側の１つ）が、図３Ａに示す第２凹部５２０及び第２収容部５２置き換わり、図中右側の上下２つ（図１Ｄの右側の１つ）が、図３Ｂに示す第２凹部５３０及び第２収容部５３に置き換わったものである。
【００８４】
実施形態３は、第１凹部群（第１凹部４１１〜４１８）以外の凹部が複数あり、それぞれの最深部が、基準方向Ａに垂直な複数の平面上に位置する例である。
【００８５】
実施形態３では、第２凹部５２０の最深部５０３は基準方向Ａに垂直な平面ｂ１上にあり、第２凹部５３０の最深部５０３は基準方向Ａに垂直な平面ｂ２上にあり、互いに、基準方向Ａに沿って離れている。また第１凹部４１１〜４１８の最深部４０３は基準方向Ａに垂直な複数の平面ａ１〜ａ４（図３Ａ、３Ｂ中ではａ２とａ３は省略する）上にある。
【００８６】
この実施形態３において、第２凹部５２０は、その最深部５０３の中間平面ａｍからの基準方向Ａに沿った距離ｄ２’がＤを超えるように形成されており、且つ、第２凹部５３０は、その最深部５０３の中間平面ａｍからの基準方向Ａに沿った距離ｄ２’’がＤを超えるように設計されることが好ましい。この場合、焦点深度Ｄの観察光学系を備えた光学顕微鏡の対物レンズを光軸が基準方向Ａに沿うように設置し、その観察光学系の焦点を中間平面ａｍ上に合わせて８つの第１凹部４１１〜４１８内の細胞を観察可能とした状態では、第２凹部５２０、５３０の最深部５０３は共に鮮明な像が得られる範囲内から外れるため、観察光学系の焦点を中間平面ａｍ上に合わせて第１凹部４１１〜４１８内の細胞を観察する際に、誤って対物レンズの光軸が第２凹部５００のいずれかに収容された細胞を通ったとしても、該細胞の鮮明な像は得られないため、細胞間の誤認を防ぐことができる。
【００８７】
また距離ｄ２’，ｄ２’’を好ましくは６μｍ超、より好ましくは７μｍ以上、より好ましくは１２μｍ超、更に好ましくは１３μｍ以上、更に好ましくは１８μｍ超、更に好ましくは１９μｍ以上、更に好ましくは３６μｍ超、更に好ましくは３７μｍ以上、最も好ましくは４０μｍ以上とすれば、上記の総合倍率Ｍ＝２００倍の観察光学系（Ｄは約６．１μｍ）を用いて観察を行った場合に、第２凹部５２０、５３０の底面５０１上の細胞と、第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞とを相互に誤認する事故を防ぐことができる。特に、距離ｄ２’，ｄ２’’を１８μｍ超または更に大きく設定した場合にこの効果が特に高い。
【００８８】
また同様に距離ｄ２’，ｄ２’’を１８μｍ超、更に好ましくは１９μｍ以上、更に好ましくは３６μｍ超、更に好ましくは３７μｍ以上、最も好ましくは４０μｍ以上とすれば、上記の総合倍率Ｍ＝１００倍の観察光学系（Ｄは約１８．４μｍ）を用いて観察を行った場合に、第２凹部５２０、５３０の底面５０１上の細胞と、第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞とを相互に誤認する事故を防ぐことができる。特に、距離ｄ２’，ｄ２’’を３６μｍ超または更に大きく設定した場合にこの効果が特に高い。
【００８９】
実施形態３ではより好ましくは、第２凹部５２０、５３０の最深部５０３を、８つの第１凹部４１１〜４１８の最深部４０３のいずれからも、基準方向Ａに沿ってＤを超える距離だけ離れるように設定する、すなわち平面ａ１と平面ｂ１との距離ｄ３’及び平面ａ２と平面ｂ２との距離ｄ３’’を共にＤを超える距離に設定すると、実施形態１及び２と同様に、第１凹部４００の底面４０１上の細胞と、第２凹部５２０の底面５０１又は第２凹部５３０の底面５０１上の細胞との観察時の誤認を防止できる。更に、距離ｄ３’及びｄ３’’を共に２Ｄを超える距離に設定すると、上記の効果が特に高い。
【００９０】
また距離ｄ３’，ｄ３’’を好ましくは６μｍ超、より好ましくは７μｍ以上、より好ましくは１２μｍ超、更に好ましくは１３μｍ以上、更に好ましくは１８μｍ超、更に好ましくは１９μｍ以上、更に好ましくは３６μｍ超、更に好ましくは３７μｍ以上、最も好ましくは４０μｍ以上とすれば、上記の総合倍率Ｍ＝２００倍の観察光学系（Ｄは約６．１μｍ）を用いて観察を行った場合に、第２凹部５２０、５３０の底面５０１上の細胞と、第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞とを相互に誤認する事故を防ぐことができる。特に、距離ｄ３’，ｄ３’’を１８μｍ超または更に大きく設定した場合にこの効果が特に高い。
【００９１】
また同様に距離ｄ３’，ｄ３’’を１８μｍ超、更に好ましくは１９μｍ以上、更に好ましくは３６μｍ超、更に好ましくは３７μｍ以上、最も好ましくは４０μｍ以上とすれば、上記の総合倍率Ｍ＝１００倍の観察光学系（Ｄは約１８．４μｍ）を用いて観察を行った場合に、第２凹部５２０、５３０の底面５０１上の細胞と、第１凹部４１１〜４１８の底面４０１上の細胞とを相互に誤認する事故を防ぐことができる。特に、距離ｄ３’，ｄ３’’を３６μｍ超または更に大きく設定した場合にこの効果が特に高い。
【００９２】
＜細胞培養容器／実施形態４＞
図４Ａ〜Ｃに示す細胞培養容器１は、実施形態１における第２収容部５０が存在しない点、及び、第１収容部４０の第１収容部底面９０に形成された８つの第１凹部４１１〜４１８の代わりに、以下の特徴を有する第１凹部４５０、第２凹部４６０、第３凹部４７０がそれぞれ３つずつ形成されている点を除いて、実施形態１と同一である。第１凹部４５０、第２凹部４６０、第３凹部４７０の寸法、位置、ピッチ、形状等に関する好適な実施形態は、下記の点を除いて、実施形態１において第１凹部４１１〜４１８について説明したのと同様であり、説明を省略する。
【００９３】
図４Ａにおける領域Ｇの拡大図を図４Ｂに示す。また図４Ｃには、図４ＢにおけるＶＩＩ−ＶＩＩ’に沿った断面模式図、ＶＩＩＩ−ＶＩＩＩ’に沿った断面模式図およびＩＸ−ＩＸ’に沿った断面模式図を第１収容部底面９０の高さが同じになるように並べて示す。
【００９４】
実施形態４では、３つの第１凹部４５０が構成する群を「第１凹部群」とし、３つの第２凹部４６０が構成する群を「第２凹部群」とし、３つの第３凹部４７０が構成する群を「第３凹部群」とする。３つの第２凹部４６０と第３凹部４７０はそれぞれ、本発明における「他の凹部」の一例である。
【００９５】
３つの第１凹部４５０の最深部４５３は、基準方向Ａに対し垂直な平面ａ５上に位置しており、３つの第１凹部４５０の最深部４５３の間の、基準方向Ａに沿った距離はゼロである。平面ａ５は、実施形態１での中間平面ａｍと各第１凹部の最深部を通り基準方向Ａに垂直な平面とが一致したものに相当する。基準方向Ａに沿って対物レンズの光軸を設置し、第１凹部４５０のうちの一つに収容された細胞に焦点を合わせれば、他の第１凹部４５０内の細胞は、対物レンズの光軸に対し垂直な方向に細胞培養容器を相対移動させることにより観察可能である。なお、同様の効果を得るには、実施形態１で説明した通り、第１凹部群を構成する第１凹部４５０のそれぞれが、基準方向Ａに対し垂直な複数の平面上に存在し、且つ、基準方向Ａに沿って最も離れた一対の最深部４５３の間の基準方向Ａに沿った距離が、実施形態１での距離ｄ１と同様に設定されていればよい。
【００９６】
３つの第２凹部４６０の最深部４６３は、基準方向Ａに対し垂直な平面ｂ５上に位置しており、３つの第２凹部４６０の最深部４６３の間の基準方向Ａに沿った距離はゼロである。このため、基準方向Ａに沿って対物レンズの光軸を設置し、第２凹部４６０のうちの一つに収容された細胞に焦点を合わせれば、他の第２凹部４６０内の細胞は、対物レンズの光軸に対し垂直な方向に細胞培養容器を相対移動させることにより観察可能である。なお、同様の効果を得るには、実施形態１での第１凹部群の凹部４１１〜４１８と同様に、第２凹部群を構成する第２凹部４６０のそれぞれが、基準方向Ａに対し垂直な複数の平面上に存在し、且つ、基準方向Ａに沿って最も離れた一対の最深部４６３の間の基準方向Ａに沿った距離が、実施形態１での距離ｄ１と同様に設定されていればよい。
【００９７】
３つの第３凹部４７０の最深部４７３は、基準方向Ａに対し垂直な平面ｃ５上に位置しており、３つの第３凹部４７０の最深部４７３の間の基準方向Ａに沿った距離はゼロである。このため、基準方向Ａに沿って対物レンズの光軸を設置し、第３凹部４７０のうちの一つに収容された細胞に焦点を合わせれば、他の第３凹部４７０内の細胞は、対物レンズの光軸に対し垂直な方向に細胞培養容器を相対移動させることにより観察可能である。なお、同様の効果を得るには、実施形態１での第１凹部群の凹部４１１〜４１８と同様に、第３凹部群を構成する第２凹部４７０のそれぞれが、基準方向Ａに対し垂直な複数の平面上に存在し、且つ、基準方向Ａに沿って最も離れた一対の最深部４７３の間の基準方向Ａに沿った距離が、実施形態１での距離ｄ１と同様に設定されていればよい。
【００９８】
そして平面ａ５、平面ｂ５及び平面ｃ５の互いの間の距離をＤを超える距離に設定すると、他の実施形態で説明したのと同様に第１凹部４５０の底面４０１上の細胞と、第２凹部４６０の底面４０１上の細胞と、第３凹部４７０の底面４０１上の細胞との間の観察時の誤認を防止できる。この効果は、平面ａ５、平面ｂ５及び平面ｃ５の互いの間の距離を２Ｄを超える距離に設定することにより更に顕著である。
【００９９】
また、平面ａ５、平面ｂ５及び平面ｃ５の互いの間の距離を好ましくは６μｍ超、より好ましくは７μｍ以上、より好ましくは１２μｍ超、更に好ましくは１３μｍ以上、更に好ましくは１８μｍ超、更に好ましくは１９μｍ以上、更に好ましくは３６μｍ超、更に好ましくは３７μｍ以上、最も好ましくは４０μｍ以上とすれば、上記の総合倍率Ｍ＝２００倍の観察光学系（Ｄは約６．１μｍ）を用いて観察を行った場合に、第１凹部４５０の底面４０１上の細胞と、第２凹部４６０の底面４０１上の細胞と、第３凹部４７０の底面４０１上の細胞とを相互に誤認する事故を防ぐことができる。特に、平面ａ５、平面ｂ５及び平面ｃ５の互いの間の距離を１２μｍ超または更に大きく設定した場合にこの効果が特に高い。
【０１００】
また、平面ａ５、平面ｂ５及び平面ｃ５の互いの間の距離を好ましくは１８μｍ超、更に好ましくは１９μｍ以上、更に好ましくは３６μｍ超、更に好ましくは３７μｍ以上、最も好ましくは４０μｍ以上とすれば、上記の総合倍率Ｍ＝１００倍の観察光学系（Ｄは約１８．４μｍ）を用いて観察を行った場合に、第１凹部４５０の底面４０１上の細胞と、第２凹部４６０の底面４０１上の細胞と、第３凹部４７０の底面４０１上の細胞とを相互に誤認する事故を防ぐことができる。特に、平面ａ５、平面ｂ５及び平面ｃ５の互いの間の距離を３６μｍ超または更に大きく設定した場合にこの効果が特に高い。
【０１０１】
＜細胞培養容器／実施形態５＞
図５Ａ〜Ｃには、実施形態５に係る細胞培養容器１を示す。実施形態５では、実施形態１における第１収容部周壁４２が、以下の特徴を有する第１収容部周壁４２に置き換えられている点を除いて、実施形態１と同一の特徴を備える。
【０１０２】
実施形態５において、第１収容部周壁４２は、第１収容部底部４１の周縁に立設されており、第１収容部周壁４２の表面のうち収容空間４５を囲う第１収容部周壁面９１は、第１収容部４０の底面から開口に向かって収容空間４５が広がるように形成されている。そして、第１収容部周壁面９１には、第１収容部４０の底面から開口に進むに従って階段状に立ち上がった複数の段付き部４７が形成されている。各段付き部４７は、収容部４０の底面から開口に向かう方向に延びる内側面４８と、内側面４８に連続すると共に第１収容部底面９０の中央から周縁に向かう方向に延びる上面４９とを有する。この実施形態５では、第１収容部４０の内部空間４５に収容した培養液に気泡が含まれている場合に、気泡が第１収容部周壁面９１の段付き部４７の近傍に集まり易く、培養液の液面の中央部には集まりにくい。このため、第１凹部４００が形成された領域を培養液の液面の中央部を通じて観察することが容易である。なお図５Ａ〜Ｃでは、階段状の複数の段付き部４７は、第１収容部周壁面９１の周方向の全体にわたり形成されている例を示すが、これには限定されず、第１収容部周壁面９１の周方向の一部の領域のみに階段状の複数の段付き部４７が形成され、他の領域は平滑な傾斜面により形成されていてもよい。
【０１０３】
なお、実施形態５において、第１凹部４１１〜４１８及び第２凹部５００の特徴は実施形態１と同様であり、第１凹部４１１〜４１８及び第２凹部５００を実施形態２〜４として説明した他の形態に変形することも同様に可能である。
【０１０４】
＜細胞培養容器の他の特徴＞
本発明の細胞培養容器において「第１凹部群」を構成する凹部の数は特に限定されないが、例えば、２〜２５、好ましくは３〜１５、より好ましくは４〜１０である。第１凹部群以外の他の凹部の数は特に限定されず、１〜２０、好ましくは２〜１５、より好ましくは４〜１０である。
【０１０５】
本発明の細胞培養容器は、上記実施形態４のように、第１凹部群以外に１又は２以上の他の凹部群を含んでいてもよい。より好ましくは、他の凹部群がそれぞれ２つ以上の凹部により構成され、各凹部群内では、各凹部の最深部のうち基準方向に沿って最も離れた一対の最深部の間の基準方向に沿った距離が２Ｄ以下、更に好ましくはＤ以下であるように、各凹部が形成されている。具体的には、各凹部群内では、各凹部の最深部のうち基準方向に沿って最も離れた一対の最深部の間の基準方向に沿った距離は、好ましくは３６μｍ以下、より好ましくは３０μｍ以下、更に好ましくは２０μｍ以下、更に好ましくは１８μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以下、更に好ましくは１２μｍ以下、更に好ましくは８μｍ以下、最も好ましくは６μｍ以下である。また、各凹部群を構成する複数の凹部の最深部のうち基準方向に沿って最も離れた一対の最深部の両方からの前記基準方向に沿った距離が等しく且つ基準方向に対し垂直な平面を、当該凹部群の「中間平面」としたとき、第１凹部群及び他の凹部群に含まれる各凹部は、それ自身が属する凹部群以外の全ての凹部群の中間平面のいずれからも、基準方向に沿ってＤを超える距離、より好ましくは２Ｄを超える距離だけ離れているように形成されている。このような特徴を備える細胞培養容器を用い、基準方向に対物レンズの光軸の方向が一致するように光学顕微鏡を設置すれば、ある凹部群の中間平面上に光学系の焦点を合わせたときに、当該凹部群の凹部内に収容された細胞は、対物レンズの光軸に対し垂直な方向に細胞培養容器を相対移動させることにより容易に観察可能であり、尚且つ、他の凹部群の凹部内に収容された細胞との誤認を防ぐことができる。更に好ましい実施形態では、第１凹部群及び他の凹部群に含まれる凹部は、それ自身が属する凹部群以外の凹部群を構成する各凹部の最深部のいずれからも、基準方向に沿ってＤを超える距離離れている、より好ましくは２Ｄを超える距離離れているように形成されている。具体的には、第１凹部群及び他の凹部群に含まれる凹部の最深部は、それ自身が属する凹部群以外の凹部群を構成する各凹部の最深部のいずれからも、基準方向に沿った距離が、好ましくは６μｍ超、より好ましくは７μｍ以上、より好ましくは１２μｍ超、更に好ましくは１３μｍ以上、更に好ましくは１８μｍ超、更に好ましくは１９μｍ以上、更に好ましくは３６μｍ超、更に好ましくは３７μｍ以上、最も好ましくは４０μｍ以上超の距離だけ離れるとなるように形成される。このような特徴を備える細胞培養容器を用い、基準方向に対物レンズの光軸の方向が一致するように光学顕微鏡を設置すれば、同一凹部群内の１つの凹部に収容された細胞に焦点を合わせたあとは、同一群内の他の凹部の細胞は、対物レンズの光軸に対し垂直な方向に細胞培養容器を相対移動させることにより容易に観察可能であり、尚且つ、他の凹部群の細胞との誤認を防ぐことができる。このような実施形態では、各凹部群を構成する凹部の数は特に限定されないが、例えば２〜２５、好ましくは３〜１５、より好ましくは４〜１０である。また、複数の凹部群を含む場合、凹部群の数は例えば２〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜５である。
【０１０６】
本発明の細胞培養容器の材質は、特に制限されない。具体的には、金属、ガラス、及びシリコン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。本発明の培養容器は、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、プラスチック材料からなる培養容器を製造する場合には、慣用の成形法、例えば射出成形により製造することができる。
【０１０７】
光学顕微鏡での観察のためには、細胞培養容器は光透過性の材料により形成されていることが好ましい。
【０１０８】
本発明の細胞培養容器は、受精卵の発育を促進するような表面処理又は表面コートがなされていてもよい。特に、受精卵の発育を促進するために、他の器官の細胞、例えば、子宮内膜細胞や卵管上皮細胞と共培養をする場合、これらの細胞をあらかじめ培養容器に接着させる必要がある。このような場合に、培養容器の表面に細胞接着性の材料をコートすると有利である。
【０１０９】
本発明の細胞培養容器を用いれば、グループ管理が可能になるため、良好の発育の細胞を第１凹部群の凹部に収容して培養し、その他の細胞は他の凹部に収容して培養することが可能となる。
【０１１０】
＜細胞の観察方法＞
本発明は、対物レンズを含み焦点深度がＤである観察光学系を備える光学顕微鏡を用いて、細胞培養容器に収容された細胞を観察する方法であって、細胞培養容器として、上記の特徴を有する細胞培養容器を用いることを特徴とする方法に関する。
【０１１１】
本発明の細胞培養容器を用いて培養し観察する細胞としては、特に限定されないが、個別管理が必要とされる細胞が好ましい。個別管理が必要とされる細胞とは、培養中及び培養後において個々の細胞を特定する必要があるものをさし、複数の細胞を培養している培養容器において互いに混同してしまうことが望ましくない細胞をさす。個別管理が必要とされる細胞としては、例えば、受精卵、卵細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）及びｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）が挙げられる。卵細胞は、未受精の卵細胞をさし、未成熟卵母細胞及び成熟卵母細胞が含まれる。受精卵は、受精後、卵割により２細胞期、４細胞期、８細胞期と細胞数が増えていき、桑実胚を経て、胚盤胞へと発生する。受精卵には、２細胞胚、４細胞胚及び８細胞胚などの初期胚、桑実胚、胚盤胞（初期胚盤胞、拡張胚盤胞及び脱出胚盤胞を含む）が含まれる。胚盤胞は、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を意味する。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性又は全能性細胞をさす。ｉＰＳ細胞は、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の遺伝子（転写因子）を導入することにより、ＥＳ細胞に似た分化万能性を持たせた細胞をさす。すなわち、本発明において培養の対象となる細胞には、受精卵や胚盤胞のように複数の細胞の集合体も包含される。本発明の培養容器は、好ましくは哺乳動物及び鳥類の細胞、特に哺乳動物の細胞の培養に好適である。哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒト及びサルなどの霊長類、マウス、ラット及びウサギなどの齧歯類、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマ及びブタなどの家畜が挙げられる。本発明の培養容器は、ウシの受精卵の培養に特に好適である。
【０１１２】
本方法では光学顕微鏡の対物レンズの光軸の方向を本発明の細胞培養容器の基準方向に一致させて観察を行う。具体的には、対物レンズとＸＹＺステージとを光軸がＺ軸方向と一致するように組み合わせて設置し、該ＸＹＺステージ上に細胞培養容器を載置して観察を行うことができる。
【０１１３】
第１凹部群の凹部内に収容された細胞を観察する場合は、
第１凹部群のいずれかの凹部に収容された細胞に観察光学系の焦点を合わせて観察を行う第一工程と、
前記第一工程の後に、細胞培養容器が光軸に垂直な方向、すなわちＸＹ方向に移動するように、細胞培養容器と対物レンズとを相対的に移動させて、第１凹部群の他の凹部に収容された細胞の観察を行う第二工程と
を行えばよい。この場合、ＸＹ方向の操作のみで、Ｚ方向の操作（焦点合わせ）を行うことなく第１凹部群の各凹部内の細胞の観察が可能であるため作業が効率的である。また、第１凹部群の凹部以外の凹部には焦点が合わないため、細胞の誤認が生じにくい。
【０１１４】
また、第１凹部群以外の凹部のいずれかに収容された細胞を観察する場合は、目的とする凹部に収容された細胞に観察光学系の焦点を合わせて観察を行えばよい。
【実施例】
【０１１５】
ポリスチレンを用いて、図１Ａ〜Ｈに示す実施形態１に係る細胞培養容器１を作成した。ただし、図１Ａに示す８つの第１凹部４１１〜４１８の中央部に、更にもう一つの第一凹部を追加で設けた。また、９つの第１凹部の最底部４０３のうち基準方向Ａに沿って最も離れた一対の最深部４０３間の距離は、基準方向Ａに沿って８μｍであった。また、４つの第２凹部５００の最底部５０３の、互いの間の基準方向Ａに沿った距離は０ではなく、実施形態３に示すように、基準方向Ａに垂直な複数の平面上に位置していた。
【０１１６】
各第１凹部及び各第２凹部の最深部の位置を、各凹部の最深部から、第１収容部４０の第１収容部底面９０を含む平面までの距離で示す。各凹部の最深部はいずれも、前記平面に対して、第１収容部内部空間４５が存在するのと反対の側に位置している。前記平面は、細胞培養容器１を水平面上に載置したときの水平方向に沿うように形成されている。細胞培養容器１に対して、対物レンズの光軸が前記平面に対して垂直となるように光学顕微鏡を設置した。
【０１１７】
容器の寸法：細胞培養容器１の容器側壁部３０が囲う部分は円形であり、その内径は約３５ｍｍとした。容器側壁部３０の高さは１１ｍｍとした。第１収容部４０の周囲を囲う第１収容部外壁４６の高さは２．９ｍｍであり、第１収容部４０の内部空間４５の開口端の直径は１０ｍｍであり、第１収容部底面９０の直径は３．８ｍｍであった。また、第２収容部５０は外径４．８ｍｍ、内径３．８ｍｍであった。
【０１１８】
第１凹部４００の、底面４０１の開口側の縁部は直径２８５μｍの円形であり、周壁面４０２の開口側の縁部は直径５２５μｍの円形であった。また、隣接する第１凹部４００の間の中心間距離は７１２μｍであった。
【０１１９】
＜実験１＞
第１収容部４０に設けた９つの第１凹部のうちの１つである第１凹部（１）（最深部から前記平面までの距離：２２６μｍ）と、他の１つである第１凹部（２）（最深部から前記平面までの距離：２３４μｍ）に、ガラスビーズ（直径１５０μｍ）を入れて透過型の光学顕微鏡によって２００倍率で観察を行った。このとき用いた光学顕微鏡の観察光学系は、開口数ＮＡ＝０．４０の２０倍の対物レンズと、１０倍の接眼レンズとを含む総合倍率Ｍ＝２００倍の観察光学系であり、上記Ｂｅｒｅｋの式（ただしｎ＝１、ω＝０．００１４、λ＝０．５５μｍとする）によれば、焦点深度Ｄは約６．１μｍである。
【０１２０】
第１凹部（１）内のガラスビーズに焦点を合わせて観察した後、細胞培養容器１をＸＹステージ操作のみで第１凹部（２）内のガラスビーズ観察した際に焦点の変化は少なく、問題なく観察が可能であった。
【０１２１】
＜実験２＞
９つの第１凹部のうちの１つである第１凹部（１）（最深部から前記平面までの距離：２２６μｍ）、４つの第２凹部の１つである第２凹部（３）（最深部から前記平面までの距離：２５７μｍ）、他の１つである第２凹部（４）（最深部から前記平面までの距離：２８８μｍ）、他の１つである第２凹部（５）（最深部から前記平面までの距離：１８５μｍ）それぞれに、実施例１と同様にガラスビーズを入れて２００倍率で観察を行った。
【０１２２】
第１凹部（１）にてガラスビーズの焦点を合わせて観察した後、ＸＹステージ操作のみで第２凹部（３）〜（５）内のガラスビーズを観察した際には焦点がずれており、Ｚ軸方向の調整によって焦点を再度調整する必要があった。
【符号の説明】
【０１２３】
１・・・細胞培養容器
４０・・・第１収容部
４５・・・第１収容部の内部空間
９０・・・第１収容部底面
４００、４１１〜４１８、４５０・・・第１凹部群を構成する凹部
５００、５２０、５３０、４６０、４７０・・・他の凹部
４０１、５０１・・・凹部の底面
４０３、５０３、４５３、４６３、４７３・・最深部
Ａ・・・基準方向
Ｂ・・・凹部の底面が投影される仮想平面
Ｃ、Ｄ・・・凹部の底面が投影された領域
Ｄ１、Ｄ２・・・培養液の液塊
ａｍ・・・中間平面
【図１Ａ】
0006405752.tif 000002
【図１Ｂ】
0006405752.tif 000003
【図１Ｃ】
0006405752.tif 000004
【図１Ｄ】
0006405752.tif 000005
【図１Ｅ】
0006405752.tif 000006
【図１Ｆ】
0006405752.tif 000007
【図１Ｇ】
0006405752.tif 000008
【図１Ｈ】
0006405752.tif 000009
【図２】
0006405752.tif 000010
【図３Ａ】
0006405752.tif 000011
【図３Ｂ】
0006405752.tif 000012
【図４Ａ】
0006405752.tif 000013
【図４Ｂ】
0006405752.tif 000014
【図４Ｃ】
0006405752.tif 000015
【図５Ａ】
0006405752.tif 000016
【図５Ｂ】
0006405752.tif 000017
【図５Ｃ】
0006405752.tif 000018
【図６Ａ】
0006405752.tif 000019
【図６Ｂ】
0006405752.tif 000020
【図６Ｃ】
0006405752.tif 000021
【図７Ａ】
0006405752.tif 000022
【図７Ｂ】
0006405752.tif 000023
【図７Ｃ】
0006405752.tif 000024