(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を処置するための組み合わせ医薬であって、
（ａ）トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Tripterygium wilfordii）のエタノール抽出物、及び
（ｂ）化学療法剤
を含み、
ここで前記癌は、前記化学療法剤（ｂ）単剤による処置に対して少なくとも部分的に耐性を有し、
（ａ）の少なくとも一部が、（ｂ）の投与よりも前に投与され、
前記化学療法剤（ｂ）はドセタキセルである、
前記組み合わせ医薬。
【請求項２】
トリプテリジウム・ウィルフォルディの前記エタノール抽出物は、図２に記載のＭＳ／ＬＣクロマトグラムによって同定可能である、請求項１に記載の組み合わせ医薬。
【請求項３】
前記癌は、乳癌、白血病又は前立腺癌である、請求項１に記載の組み合わせ医薬。
【請求項４】
単体で投与される時の（ｂ）の有効性を超える程度に、（ｂ）の有効性を増大させる量で（ａ）が投与される、請求項１に記載の組み合わせ医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年８月１９日に出願された米国特許出願第６１／６８４，７９２号に基づく優先権を主張し、その開示を参照により本明細書に含む。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、化学療法剤の有効性を向上させる化合物及び天然物に関する。
【背景技術】
【０００３】
薬剤耐性は常に、継続的化学療法の過程で進行する。この問題の克服は、癌の処置における主要な課題である。実際、腫瘍細胞は、化学療法剤に対するそれらの耐性を増強するために複数のメカニズムを利用する。例えば、腫瘍細胞は、多剤耐性トランスポーター及び腫瘍性上皮成長因子受容体遺伝子を過剰発現し、そしてＮＦ−Ｅ２−関連因子２、すなわちグルタチオン代謝及び薬物解毒に関与する広範囲の遺伝子を上方制御するレドックスセンシング転写因子の活性を誘発する。(Huang et al., 2005a; Makarovskiy et al., 2002; Wang et al., 2010); (Salzberg et al., 2007; Sirotnak et al., 2000); (Singh et al., 2010; Zhang et al., 2010); and (Huang and Sadee, 2003; Seruga et al., 2010) を参照のこと。ヘッジホッグ経路は、化学療法耐性に関与する別の細胞シグナル伝達経路である（Domingo-Domenech et al., 2012）。
【０００４】
現在まで、耐性の特定の機構を標的とするよう設計された単一の剤が有効であることが見出されていない。しかしながら、薬剤耐性に対処するための新規治療の１つの可能性ある源は、伝統的な漢方薬である。実際、そのような薬は、多数の疾患に起因する身体機能の不均衡を回復するために何千年もの間、使用されて来た。漢方薬による治療は、通常、潜在的に身体中の異なった部位及び経路で作用することができる複数の化学成分を含む薬草「抽出物」の摂取を伴う。従って、薬剤は、薬剤耐性の克服において新規の機会を提供するか、又は薬物の効果を単に改善できる複数の細胞及び分子機構を標的とする可能性を有する（Chow & Huang 2010, Pon et al 2010を参照のこと）。本明細書に記載される場合、その中国名（北京語）レイ・コン・テン（Lei Gong Teng）によっても知られている、１つの特定の伝統的な漢方薬であるトリプテリジウム・ウィルフォルディ（Triperygium wilfordii）のエタノール抽出物は、化学療法薬に対して耐性となっている癌細胞を感作して (sensitize)、その結果、癌が再び化学療法薬に対して敏感になる。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、トリプテリジウム・ウィルフォルディの有機溶媒抽出物、及び癌処置、特に化学療法剤による処置に対していくらかの耐性を示している癌の処置へのそれらの使用に関する。抽出物の様々な実施形態において有用なトリプテリジウム・ウィルフォルディの有機抽出物は、（ｉ）エタノール抽出物であり；そして図１に記載されるようにＭＳ／ＬＣクロマトグラムにより同定できる。
【０００６】
１つの実施形態によれば、本発明は癌の処置方法に関する。前記方法は、（ａ）トリプテリジウム・ウィルフォルディの有機溶媒抽出物、及び（ｂ）化学療法剤の組み合わせを、それを必要とする患者に投与することを包含する。トリプテリジウム・ウィルフォルディの有機溶媒抽出物（ａ）及び化学療法剤（ｂ）は、癌を処置するのに効果的な組み合わされた量で投与される。処置される癌は、化学療法剤（ｂ）単剤による処置に対して少なくとも部分的に耐性を有する。本発明の１つの実施形態によれば、前記方法は、（ｂ）単剤で投与される場合の効率よりも（ｂ）の効率を、（ａ）高める量で投与する。本発明の１つの実施形態によれば、前記癌は、乳癌、白血病又は前立腺癌であり、そしてそのような癌を処置するために現在使用される化学療法剤（ｂ）は、例えばドセタキセル (docetaxel)、ダウロルビシン（daurorubicin）、トラスツズマブ (trastuzumab)及びラパチニブ (lapatinib)である。
【０００７】
トリプテリジウム・ウィルフォルディの有機溶媒抽出物（ａ）及び化学療法剤（ｂ）は、連続的に又は同時投与され得る。それらが連続的に投与される場合、（ａ）の少なくとも一部が、（ｂ）の投与の前に投与される。トリプテリジウム・ウィルフォルディの有機溶媒抽出物（ａ）は、同じ態様で、類似するか、又は同じ化学療法組成物を用いて投与され得る。上記に示されるように、本発明の方法によれば、トリプテリジウム・ウィルフォルディの有機溶媒抽出物（ａ）及び化学療法剤（ｂ）は、同時投与されてもよく、そして（ａ）及び（ｂ）の両者を含む単一組成物の形態でもよい。従って、本発明の別の実施形態は、（ａ）トリプテリジウム・ウィルフォルディの有機溶媒抽出物及び（ｂ）化学療法剤の組み合わせ、並びに薬学的に許容される担体を含む化学療法組成物に関する。ここで、（ａ）及び（ｂ）は癌の処置に有効な併用量で投与される。
【０００８】
表の簡単な説明
表１は、１２μｇ／ｍｌのレイ・コン・テン（Ｌｅｉ  Ｇｏｎ  Ｔｅｎｇ）抽出物（ＬＧＴ−Ｅ）により前処置され、続いて種々の濃度のドセタキセルにより７２時間処置された、ドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【０００９】
表２は、種々の濃度のドセタキセルによる７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００１０】
表３は、２５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のドセタキセルにより７２時間処置された、ドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００１１】
表４は、種々の濃度のドセタキセルによる７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００１２】
表５は、５０μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のドセタキセルにより７２時間処置された、ドセタキセル耐性ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００１３】
表６は、種々の濃度のドセタキセルによる７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ドセタキセル耐性ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００１４】
表７は、２５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のドセタキセルにより７２時間処置された、ドセタキセル耐性ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００１５】
表８は、種々の濃度のドセタキセルによる７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ドセタキセル耐性ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００１６】
表９は、１２．５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のドセタキセルにより７２時間処置された、ドセタキセル耐性ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００１７】
表１０は、種々の濃度のドセタキセルによる７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ドセタキセル耐性ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００１８】
表１１は、種々の濃度のドセタキセルによる７２時間の処置後における（又は、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００１９】
表１２は、種々の濃度のドセタキセルによる７２時間の処置後における（又は、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ドセタキセル感受性ＰＣ３細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００２０】
表１３は、種々の濃度のＬＧＴ−Ｅによる７２時間の処置後における、ドセタキセル感受性ＰＣ３細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００２１】
表１４は、種々の濃度のＬＧＴ−Ｅによる７２時間の処置後における、ドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００２２】
表１５は、種々の濃度のＬＧＴ−Ｅによる７２時間の処置後における、ドセタキセル耐性ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００２３】
表１６は、種々の濃度のＬＧＴ−Ｅによる７２時間の処置後における、ドセタキセル感受性ＤＵ１４５細胞のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００２４】
表１７は、各薬剤についてのＩＣ50を確認するために使用された、細胞系及び４種の化学療法剤の濃度範囲を報告する。
【００２５】
表１８は、ドセタキセル、ダウロルビシン、トラスツズマブ及びラパチニブ下でのＬＧＴ−ＥについてのＣＥ決定の結果を要約する。
【００２６】
表１９は、５０μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のドセタキセルにより７２時間処置された、ドセタキセル感受性ＤＵ１４５細胞のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００２７】
表２０は、種々の濃度のドセタキセルによる７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ドセタキセル−ドセタキセル感受性ＤＵ１４５細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００２８】
表２１は、１３μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のハーセプチン（Herceptin）（登録商標）により７２時間処置された、ハーセプチン（登録商標）感受性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４細胞のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００２９】
表２２は、種々の濃度のハーセプチン（登録商標）による７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ハーセプチン（登録商標）感受性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００３０】
表２３は、１３μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のハーセプチン（登録商標）により７２時間処置された、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４/Ｈｅｒ細胞のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００３１】
表２４は、種々の濃度のハーセプチン（登録商標）による７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４/ＨｅｒのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００３２】
表２５は、種々の濃度のラパチニブによる７２時間の処置後における、ハーセプチン（登録商標）感受性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００３３】
表２６は、１３μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のハーセプチン（登録商標）により７２時間処置された、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４−ＴｘＲ細胞のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００３４】
表２７は、種々の濃度のハーセプチン（登録商標）による７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４−ＴｘＲのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００３５】
表２８は、１２．５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のラパチニブにより７２時間処置された、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００３６】
表２９は、種々の濃度のラパチニブによる７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００３７】
表３０は、２５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のラパチニブにより７２時間処置された、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００３８】
表３１は、種々の濃度のラパチニブによる７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００３９】
表３２は、ラパチニブ−感受性ＨＥＲ２陽性乳腺癌系におけるラパチニブ感受性のラパチニブ用量応答分析のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００４０】
表３３は、ラパチニブ耐性ＨＥＲ２陽性乳腺癌系におけるラパチニブ感受性のラパチニブ用量応答分析のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００４１】
表３４は、１２．５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のラパチニブにより７２時間処置された、ラパチニブ耐性、ＨＥＲ２陽性乳腺癌系ＳｋＢｒ３−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００４２】
表３５は、種々の濃度のラパチニブによる７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ラパチニブ耐性、ＨＥＲ２陽性乳腺癌系ＳｋＢｒ３−ＴｘＲ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００４３】
表３６は、２５μｇ／ｍｇのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のダウロルビシンにより７２時間処置された、ダウロルビシン感受性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００４４】
表３７は、種々の濃度のダウロルビシンによる７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ダウロルビシン感受性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００４５】
表３８は、２５μｇ／ｍｇのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のダウロルビシンにより７２時間処置された、ダウロルビシン耐性骨髄性白血病Ｋ５６２/Ｄｏｘ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【００４６】
表３９は、種々の濃度のダウロルビシンによる７２時間の処置後における（但し、ＬＧＴ−Ｅによる前処置は行わない）、ダウロルビシン耐性骨髄性白血病Ｋ５６２/Ｄｏｘ細胞のＳＲＢ細胞生存率アッセイの結果を報告する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｔ.ウィルフォルディの根皮についての高圧液体クロマトグラフィー−ダイオード−アレイ検出（ＨＰＬＣ−ＤＡＤ）クロマトグラフィーフィンガープリントを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｔ.ウィルフォルディの木部組織についての高圧液体クロマトグラフィー−ダイオード−アレイ検出（ＨＰＬＣ−ＤＡＤ）クロマトグラフィーフィンガープリントを示す。
【図２】図２は、Ｔ.ウィルフォルディ抽出生成物、レイ・コン・テン抽出物（ＬＧＴ−Ｅ）についての液体クロマトグラフィー及び質量分析法クロマトグラムを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、１２μｇ／ｍｌのレイ・コン・テン抽出物（ＬＧＴ−Ｅ）により前処置され、続いて、種々の濃度のドセタキセルにより７２時間処置された、ドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表１〜４を参照のこと。
【図３Ｂ】図３Ｂは、２５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて、種々の濃度のドセタキセルにより７２時間処置された、ドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表１〜４を参照のこと。
【図４Ａ】図４Ａは、５０μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて、種々の濃度のドセタキセルにより７２時間処置された、ドセタキセル耐性ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表５〜１０を参照のこと。
【図４Ｂ】図４Ｂは、２５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて、種々の濃度のドセタキセルにより７２時間処置された、ドセタキセル耐性ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表５〜１０を参照のこと。
【図４Ｃ】図４Ｃは、１２．５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて、種々の濃度のドセタキセルにより７２時間処置された、ドセタキセル耐性ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表５〜１０を参照のこと。
【図５】図５は、（Ａ）ドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞及び（Ｂ）ドセタキセル感受性ＰＣ４細胞のドセタキセル用量−応答分析からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表１１及び１２を参照のこと。
【図６Ａ】図６Ａは、ドセタキセル感受性ＰＣ３及びドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞、のＬＧＴ−Ｅ用量−応答分析からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表１３〜１６を参照のこと。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ドセタキセル感受性ＰＣ４細胞及びドセタキセル耐性ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞のＬＧＴ−Ｅ用量−応答分析からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表１３〜１６を参照のこと。
【図７】図７は、５０μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置された、ドセタキセル感受性ＤＵ１４５細胞のドセタキセル用量応答分析からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表１９〜２０を参照のこと。
【図８】図８は、１３μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置された、ハーセプチン（登録商標）感受性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４のハーセプチン（登録商標）用量応答分析からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を示す。表２１〜２２を参照のこと。
【図９】図９は、１３μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置された、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４のハーセプチン（登録商標）用量応答分析からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を示す。表２３〜２４を参照のこと。
【図１０】図１０は、ハーセプチン（登録商標）感受性、ＢＴ４７４のハーセプチン（登録商標）用量応答分析からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を示す。表２５を参照のこと。
【図１１】図１１は、１３μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置された、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４−ＴｘＲのハーセプチン（登録商標）用量応答分析からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイの結果を示す。表２６〜２７を参照のこと。
【図１２Ａ】図１２Ａは、１２μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて、種々の濃度のラパチニブにより７２時間処置された、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳菅癌ＢＴ４７４−ＴｘＲ細胞からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表２８〜３１を参照のこと。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、２５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて、種々の濃度のラパチニブにより７２時間処置された、ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳菅癌ＢＴ４７４−ＴｘＲ細胞からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表２８〜３１を参照のこと。
【図１３】図１３は、ラパチニブ耐性ＨＥＲ２陽性乳菅癌亜系ＳｋＢｒ３−ＴｘＲのラパチニブ感受性に対する、ラパチニブ感受性ＨＥＲ２陽性乳菅癌亜系ＳｋＢｒ３のラパチニブ用量応答分析からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表３２〜３３を参照のこと。
【図１４】図１４は、１２．５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて、種々の濃度のラパチニブにより７２時間処置された、ラパチニブ耐性ＨＥＲ−２陽性乳菅癌ＳｋＢｒ３−ＴｘＲ細胞からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表３４〜３５を参照のこと。
【図１５】図１５は、２５μｇ／ｍｇのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のダウロルビシンにより７２時間処置された、ダウロルビシン感受性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表３６〜３７を参照のこと。
【図１６】図１６は、２５μｇ／ｍｇのＬＧＴ−Ｅにより前処置され、続いて種々の濃度のダウロルビシンにより７２時間処置された、ダウロルビシン耐性骨髄性白血病Ｋ５６２/Ｄｏｘ細胞からのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞生存率アッセイ結果を示す。表３８〜３９を参照のこと。
【図１７Ａ】インビボでのＬＧＴ−Ｅの化学感作効果を例示する。図１７Ａは、０日目でのドセタキセル投与の開始がＤｏｃ処置の最初の日である、２０ｍｇのドセタキセル／ｋｇ体重による１５日間の処置期間にわたっての腫瘍サイズに関して、ＳＣＩＤマウス腫瘍宿主におけるドセタキセル感受性ＰＣＲ３−ＡＴＣＣ細胞腫瘍に対するドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞に関する。
【図１７Ｂ】インビボでのＬＧＴ−Ｅの化学感作効果を例示する。図１７Ｂは、未処置腫瘍、ＬＧＴ−Ｅ処置腫瘍、及びＬＧＴ−Ｅ及びドセタキセル処置腫瘍を包含する、図１７Ａに記載されるＰＣ３−ＴｘＲ腫瘍モデルを用いてのＰＣ３−ＴｘＲ腫瘍のドセタキセル処置に関してのＬＧＴ−Ｅ（５００ｍｇ／ｋｇ体重）の化学感作効果に関する。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な記載
Ｔ.ウィルフォルディのエタノール抽出物、及び化学療法剤の組み合わせを、それを必要とする患者に投与することにより、癌を処置するための方法及び医薬製剤が本明細書に記載され、ここで前記Ｔ.ウィルフォルディのエタノール抽出物及び化学療法剤は、癌を処理するために有効な併用量で投与される。種々の実施形態によれば、本発明の方法は、化学療法剤が単独で投与される場合、すなわちＴ.ウィルフォルディのエタノール抽出物の存在下で、化学療法剤による処置に対して少なくとも部分的に耐性がある癌を処置する。従って、種々の実施形態によれば、本発明の方法は、化学療法剤耐性癌細胞と、本明細書に記載されるようなＴ.ウィルフォルディのエタノール抽出物の少なくとも１つの成分とを接触することにより、抗癌化学療法剤耐性を克服し、そして化学療法剤に対する細胞の耐性の逆転をもたらし、それにより、化学療法剤による薬剤耐性癌細胞の死又は細胞分裂停止の誘発を可能にする。従って、本発明の処置方法は、化学療法剤に対して耐性である腫瘍細胞の増殖を阻害し、遅延し、又は妨げるために使用される。
【００４９】
本発明のＴ.ウィルフォルディ抽出物は、中国の吉林省（Province of Jilin, China）から得られた薬用植物であるトリプテリジウム・ウィルフォルディHook f.の根木部から得られる。上記されるように、本発明の方法は、Ｔ.ウィルフォルディのエタノール抽出を使用する。種々の実施形態によれば、本発明の方法は、一連の９５％エタノール抽出からの抽出された材料を組み合わせることにより調製された、Ｔ.ウィルフォルディのエタノール抽出物を使用する。種々の他の実施形態によれば、エタノール抽出されたＴ.ウィルフォルディ材料はさらに、シリカゲルに、抽出された材料を吸着し、そしてその吸着された材料を追加のエタノール抽出に供することにより、抽出される。エタノールは典型的には、抽出物をロータリー・エバポレーションに供することにより、抽出物から除去される。乾燥された材料は、任意には、凍結乾燥され得る。前記方法により使用される、Ｔ.ウィルフォルディの乾燥された最終エタノール抽出物はＬＧＴ−Ｅと呼ばれ、そして図２に記載される液体クロマトグラフィー及び質量分析法クロマトグラムを有することにより特徴づけられる。
【００５０】
本発明の方法により処置され得る癌は、様々な器官の固形及び血液腫瘍を包含する。固形腫瘍の非制限的な例は、転移性乳癌及び前立腺癌、例えばアンドロゲン依存性及びアンドロゲン非依存性前立腺癌を包含する。本発明の方法により処置できる血液腫瘍は、例えば血液、骨髄、脾臓、肝臓及び時々、他の組織において、未熟顆粒球、例えば好中球、好酸球及び好塩基球の異常増殖により特徴づけられる慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を包含する。
【００５１】
Ｔ.ウィルフォルディの抽出物又は抽出物成分と組み合わせて使用するために適切な本発明の化学療法剤の非制限的な例は、トポイソメラーゼ阻害剤、例えばドキソルビシン及びダウノルビシン；タキサン、例えばドセタキセル；及び標的化された細胞の表面に組込まれる受容体、例えばＨＥＲ受容体を標的とする生物学的製剤、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン (Herceptin)（登録商標）の商標名で市販されている）の標的物であるＨＥＲ２/neuを包含する。
【００５２】
本明細書において使用される場合、用語「処置する」（treating）又は「処置」（treatment）とは、化学療法剤による処置に対して耐性である癌を有する対象に、癌を治療し、治癒し、軽減し、緩和し、変更し、救済し、改善し、向上するか又は影響を与えるために、化学療法剤と共に、Ｔ.ウィルフォルディのエタノール抽出物を同時投与することを意味する。種々の実施形態によれば、本発明の方法は、本発明のＴ.ウィルフォルディのエタノール抽出物、及び同時に又は即座に連続して、抽出物と共に同時投与される化学療法剤を投与し、ところが他の実施形態によれば、Ｔ.ウィルフォルディのエタノール抽出物は、化学療法剤と接触される前、処置される癌細胞の少なくとも部分的感作を可能にするために、化学療法剤の投与の前に投与される。
【００５３】
用語「有効量」（effective amount）とは、指定される化学療法剤に対する癌細胞の耐性を低下させるために必要とされるＴ.ウィルフォルディのエタノール抽出物の量を意味する。有効量は、当業者により認識されるように、投与経路、賦形剤の使用、及び他の剤との併用の可能性に依存して、変更することができる。
【００５４】
上記されるように、本発明は、Ｔ.ウィルフォルディの抽出物又は抽出された成分を含む医薬組成物を包含する。本発明の方法を実施するために、上記医薬組成物は、経口、非経口、吸入スプレーにより、局所、直腸、経鼻、頬側、経膣、又は移植されたリザーバーを介して投与され得る。用語「非経口」（parenteral）とは、本明細書において使用される場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内、及び頭蓋内注射又は注入技術を包含する。
【００５５】
注射可能な組成物は、液体溶液又は懸濁液の何れかとしての従来の形で、注射の前、液体中、溶液又は懸濁液のために適切な固体形で、又はエマルジョンとして調製され得る。注射可能な溶液及びエマルジョンはまた、１又は２以上の賦形剤も含むことができる。例えば、適切な賦形剤は、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール又はエタノールである。さらに、所望には、投与されるべき医薬組成物はまた、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝液、安定剤、溶解促進剤、及び他のそのような剤、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート及びシクロデキストリンも含むことができる。
【００５６】
経口投与のための組成物は、任意の経口的に許容される投与形、例えばカプセル剤、錠剤、エマルジョン及び水性懸濁液、分散液及び溶液であり得るが、それらだけには限定されない。経口使用のための錠剤の場合、通常使用される担体は、ラクトース及びコーンスターチを包含する。滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムがまた、典型的には、添加される。カプセル形での経口投与のためには、有用な希釈剤は、ラクトース及び乾燥コンスターチを包含する。水性懸濁液又はエマルジョンが経口投与される場合、活性成分は、乳化剤又は懸濁化剤と共に組み合わされた油相に懸濁されるか、又は溶解され得る。
【００５７】
医薬組成物中の担体は、製剤中の活性成分と適合できるという意味において「許容される (acceptable)」（及び好ましくは、それを安定化できる）べきであり、そして処置される対象に対して有害であるべきでない。例えば、融合される二環式又は三環式化合物と共に、より溶解性の複合体を形成する１又は２以上の溶解剤、又はそれ以上の溶解剤が、活性化合物の送達のための医薬担体として使用され得る。他の担体の例としては、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ ＃１０列挙することができる。
【実施例】
【００５８】
トリプテリジウム・ウィルフォルディＨｏｏｋ．ｆの確認。Ｔ.ウィルフォルディの根を、Sanyuan Pharmaceuticals Co. Ltd. （吉林、中国人民共和国）から購入し、そして次の通りに、マカオのマカオ科学技術大学の医学と健康のための応用研究のマカオ研究所（Macau Institute of Applied Researchfor Medicine and Health of Macau University of Science and Technology, Macau）で確認した。Ｔ.ウィルフォルディの根皮及び根木部を、同じプロトコルに従って確認した。従って、根皮及び根木部組織を、それぞれ粉末に粉砕し、そして６０メッシュ篩に通した。各根又は木部調製のために、０．２ｇの粉砕された粉末を正確に計量し、そして２０ｍｌの酢酸エチルを添加した。サンプルを、４５℃で１時間、超音波処理浴を用いて抽出した。その混合物を濾過し、そして残留物を、２０ｍｌのメタノールを用いて再懸濁し、続いて、４５℃でさらに１時間、超音波処理浴に通した。酢酸エチル抽出物及びメタノール抽出物を合わせ、そしてロータリー・エバポレーターを用いて蒸発乾燥した。固形抽出物を、２ｍｌのメタノールを用いて再構成し、そして０．４５μｇのフィルターを通して濾過した。
【００５９】
ＨＰＬＣ−ＤＡＳ．高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）処理を、Agilent 1200 Series LC System and Modules (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)により実施した。分析カラムの温度を２０℃で設定し、そして検出波長は２１０ｎｍであった。線形勾配溶出を、アセトニトリル（Ａ）及び０．１％リン酸（ｖ／ｖ）（Ｂ）を含む移動相を用いて、１ｍｌ／分の流速で実施した。勾配は、４０％溶離剤Ａ及び６０％溶離剤Ｂで開始した。勾配は、２０分で５０％溶解剤Ｂ、２０分で２５％溶離剤Ｂ及び１０分で２０％溶離剤Ｂまで直線的に変化された。次に、勾配は１０分で８０％溶離剤Ｂに戻され、そしてこの％で維持された。Ｔ.ウィルフォルディ根皮及び木部組織のためのＨＰＬＣ−ダイオード−アレイ検出（ＨＰＬＣ−ＤＡＤ）クロマトグラフィーフィンガープリントは、それぞれ図１Ａ及び１Ｂに示される。
【００６０】
Ｔ.ウィルフォルディ抽出物の調製。Ｔ.ウィルフォルディの根木部組織（３９０．６１ｇ）を、ブレンダー中に配置し、そして小断片にブレンドした。ブレンドされた根材料を、２Ｌの９５％エタノールに添加し、１時間、音波処理し、そして次に、９５％エタノール中で一晩、浸軟した。その後、材料を真空下で加圧濾過し、そしてエタノールを集めた。加圧濾過の後に残存する残存物を、６００ｍｌの９５％エタノールにより２度、洗浄し、そして各洗浄サイクル当たり３０分間、音波処理した。２回の洗浄からのエタノールを、初期の２Ｌのエタノールと共に合わせ、そしてその合わせた抽出物を、ロータリー・エバポレーターを用いて蒸発し、そして次に、凍結乾燥した。前記抽出方法の全収量は、１６．１６ｇのエタノール抽出された材料であり、これをさらに、シリカゲル６０上に、前記蒸発された生成物を吸着し、そしてその吸着された材料を、次の順序の溶媒下で連続的抽出に供することにより分別した：９５％エタノール及びクロロホルム。エタノール及びクロロホルム抽出物の化学感作効果を定量化した。水抽出物も調製し、そしてそのＣＥを決定し、エタノール及びクロロホルム抽出物と比較した。Ｔ.ウィルフォルディの水抽出物は、中国の雲南から供給され、そしてJiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co., Ltd. (Jiangsu, China)から入手され、そしてACE Pharmaceuticals Ltd. (Hong Kong)から市販されている。
【００６１】
抽出物の化学感受性の評価。
【００６２】
化学感作効果 (chemosensitizing effect)（ＣＥ）は、化合物及び化学療法剤が同時投与される場合、化学療法剤の半最大阻害濃度（ＩＣ50）の必要とされる濃度を、前記化合物が低下させることができる（すなわち、化学感作できる (chemosensitize)）程度の尺度である。従って、ＣＥは、ＣＥ ＝ＩＣ50D/ＩＣ50E+Dとして表される。ＩＣ50Dは、化学療法剤のＩＣ50であり、この剤に対して、試験抽出物（又はＣＥを有することが疑われる他の化合物）が評価される。ＩＣ50E+Dは、試験抽出物及び化学療法剤の組み合わせのＩＣ50である。試験抽出物又は化合物のＣＥは、細胞又は特定の化学療法剤型、又は評価される治療剤の種類又は組み合わせに依存して、変化することができる。
【００６３】
しばしば、試験抽出物又は化合物はまた、ＣＥを生成するために必要とされる濃度よりも高い濃度で投与される場合、非特異的に細胞毒性（腫瘍細胞を標的化する化学療法剤とは対照的に）でもあり得る。理想的には、ＣＥを生成するために必要とされる試験化合物の濃度は、そのＩＣ50よりも有意に低い。それらの濃度間の分散は、試験抽出物又は化合物についての化学感作ユーティリティ指数（ＣＵＩ）を計算することにより定量化され得る。ＣＵＩは、ＣＵＩ＝ＣＥ×(ＩＣ50E/ＣｏｎE)として表される。ＩＣ50Eは、細胞増殖を５０％阻害する抽出物、例えばトリプテリジウム・ウィルフォルディの抽出物又は抽出された化合物の濃度である。ＣｏｎEは、所望するＣＥを生成するために必要とされる抽出物又は化合物の濃度である。次に、所望するＣＥ及びＣＵＩ値を有することが見出された抽出物及び化合物を、インビボで化学感作剤としてのそれらの可能性について試験する。
【００６４】
ＣＥ及びＣＵＩ値を、上記に記載される水、エタノール及びクロロホルム抽出物について個々に得た。それらの分析を、下記実施例５に記載されるスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）ベースの増殖アッセイを用いて、ドセタキセル耐性前立腺癌系であるＰＣ３−ＴｘＲ（University of Michigan）と組み合わせて、化学療法剤であるドセタキセルを用いて実施した。前述のすべての抽出物は、所望するＣＥ及びＣＵＩ値と関連していた。水、エタノール、及びクロロホルム抽出物のＩＣ50E+D濃度はそれぞれ、９．３、３．９７及び３．８ｎＭであり、そしてＣＵＩ値はそれぞれ、１７．７４、２７．３９及び１７．３７であった。その相対的に高いＣＵＩ値に基づいて、エタノール抽出物を、下記実施例において記録されるように、さらなる研究のために選択した。その実施例によれば、当該エタノール抽出物はレイ・コン・テン抽出物（ＬＧＴ−Ｅ）と呼ばれる。
【００６５】
ＬＧＴ−Ｅの液体クロマトグラフィー及び質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析。上で調製された、ＬＧＴ−Ｅ抽出生成物の５００ｍｇ／ｍｌ原液を、５００ｍｇのＬＧＴ−Ｅ抽出物をエタノールに溶解することにより製造した。原液を、８０％アセトニトリル下で５００μｇ／ｍｌに、さらに希釈した。１０μｌのアリコートを、API 3200 LC/MS/MS システム (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)、及びSIL-20A Prominenceオートサンプラー(Shimadzu, Columbia, MD, USA)を備えた、２つのShimadzu LC-20AD Prominence Liquid Chromatographポンプを用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために使用した。クロマトグラフィー処理を、Ｓ１３−Ｃ１８ガードカートリッジ（12.5×2.1mm, Zorbax, Agilent, Santa Clara, CA, USA）により先行されるZorbax SB C18 カラム(150 × 2.1mm, 5 μm, Zorbax, Agilent, Santa Clara, CA, USA)を用いて、実施した。
【００６６】
線形勾配溶出を、アセトニトリル（Ａ）及び０．２％蟻酸含有２ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｂ）を含む移動相を用いて、０．３５ｍｌ／分の流速で実施した。勾配は、３０％溶離剤Ａ及び７０％溶離剤Ｂで３分間、開始し、そして２分で４０％溶離Ｂまで、直線的に変化し、そして２分間、そのままであった。次に、勾配は、１分で９５％溶離剤Ｂに戻り、そしてこの％で６分間、維持した。分析カラム及びオートサンプラーの温度は、両者とも室温に設定された。次に、すべての液体クロマトグラフィー溶離剤を、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源中に導入した。質量分析条件は次の通りであった：ガス１、窒素（３０ｐｓｉ）；ガス２、窒素（３０ｐｓｉ）；ネブライザー電流（５．０ｖ）；源温度、４００℃；カーテンガス、窒素（２５ｐｓｉ）。ＬＧＴ−ＥについてのＨＰＬＣクロマトグラムが、図２に示される。
【００６７】
ＬＧＴ−ＥのＣＥを評価するために使用される細胞系。本明細書における実施例に記載されるＬＧＴ−Ｅの化学感作効果の連続した分析は、次のヒト細胞系を利用した：（ｉ）ドセタキセル耐性前立腺癌系DU145-TxR 及びPC3-TxR (Department of Medicine, University of Pittsburgh and Partners Healthcareにより提供されたが、実施例２〜７で使用されたPC3-TxR細胞は、University of Michiganから得られた)；（ii）ドセタキセル感受性系ＰＣ３及びＤＵ１４５（ATCC, Manassas, VA, USAから購入された）；（iii）ハーセプチン（登録商標）感受性ＨＥＲ２陽性乳菅癌系ＢＴ４７４（Dr. Cui, Cedars-Sinai, Beverly Hills, CAにより提供された）；（iv）ハーセプチン（登録商標）耐性ＨＥＲ２陽性乳腺癌系ＳｋＢｒ３（Dr. Xiaojiang Cui, Cedars-Sinai, Beverly Hills, CAにより提供された）；及び（ｖ）ドキソルビシン感受性及び耐性骨髄性白血病系Ｋ５６２／Ｄｏｘ（Dr. Kenneth Chan, Ohio State Universityにより提供された）。
【００６８】
実施例２
ドセタキセルに対する、ドセタキセル耐性前立腺癌細胞系ＰＣ３−ＴｒＸの感作に対するＬＧＴ−Ｅの用量−依存性効果。ＰＣ３−ＴｘＲ細胞を、１０％ウシ胎児血清により補充されたＲＰＭＩ１６４０（Thermo Scientific, Logan, UT）中、３０００個の細胞、及びペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）の溶液（Life Technologies Grand Island, NY）を含む培地１００μｌを、各ウェル中に配置することにより、蓋付きの無菌Ｆ−底Cellstar（登録商標）ウェル細胞培養プレート（カタログ番号６５５１８０、Greiner Bio-one, Monroe, NCからの購入された）中に配置した。細胞は、配置の時点で第５２継代細胞であった。三連ウェルを、試験される各実験条件に割り当て、そしてウェルの播種に続いて、２４時間の回復期間を可能にした。回復期間の間、細胞は、３７℃及び５％ＣＯ2下でインキュベートされた。
【００６９】
適切な量のＬＧＴ−Ｅ粉末をＤＭＳＯに添加し、５００ｍｇ／ｍｌの原液を形成することにより、ＬＧＴ−Ｅを調製した。原液を交互にボルテックスにかけ、そしてＬＧＴ−Ｅ粉末が溶液になるまで、音波処理した。原液を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Mediatech, Manassas, VA, 又はLife Technologies Grand Island, NY）に希釈し、所望する濃度のＬＧＴ−Ｅ（例えば、１２，２５、又は６０μｇ／ｍｌ）とした。
【００７０】
ＬＧＴ−Ｅによる細胞の前処理を、ウェルから培地を吸引し、続いて１２又は２５μｇ／ｍｌの何れかの濃度のＬＧＴ−Ｅ溶液を含むＬＧＴ−Ｅ溶液５０μｌを添加し、そして３７℃及び５％ＣＯ2の条件下で２時間、細胞をインキュベートすることにより実施した。２時間の前処置期間の最後で、ＲＰＭＩ １６４０培地（すなわち、１００、３３．３、１０．０、３．３３、１．０、０．３３３、０．１及び０．００１ ｎＭ）中、１×１０2〜１×１０-3ｍＭのドセタキセルを含むドセタキセル５０μｌアリコートを、ＬＧＴ−Ｅ培地の存在下で、前記前処置された細胞に添加した。細胞に添加される直前、ドセキタセルを、原液（ＤＭＳＯ中、１０５μＭのドセタキセル、カタログ番号０１８８５、Sigma-Aldrich, St. Louis, MOから購入された）から希釈した。ドセタキセルの添加の後、細胞を、前処置段階に使用される同じ温度及び雰囲気条件下で、さらに７２時間インキュベートした。
【００７１】
７２時間のドセタキセル処置期間に続いて、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを用いて、生存細胞を定量化した。培地を各ウェルから吸引し、そして冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（カタログ番号Ｔ６３９９、Sigma−Aldrichから購入された）の１０％溶液により置換し、そして４℃で１時間インキュベートした。ＴＣＡインキュベーションの後、ＴＣＡ溶液を吸引し、そして細胞を、水道水により５度洗浄した。最後の洗浄液を除いた後、プレートを、蓋を除いて、表面が乾燥するまで（１〜２時間を要する）、室温で放置した。次に、スルオローダミンＢ（ＳＲＢ）ナトリウム塩（カタログ番号Ｓ９０１２、Sigma−Aldrichから購入された）の０．４％溶液５０μｌを、各ウェルに添加し、そしてプレートを室温で２０〜３０分間インキュベートした。その後、ウェルを、１０ｍＭのＴＲＩＳ塩基（カタログ番号１６１−０７１９、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CAから購入された）中、１％酢酸溶液により５度洗浄した。続いて、プレートを、数時間、又は一晩、乾燥するまで放置した。乾燥されたウェルに残ったＳＲＢを、各ウェルに１００μｌのＳＲＢ可溶化溶液（１０ｍＭのＴＲＩＳ塩基）を添加し、そしてプレートを、緩やかに動く振盪機上に配置するか、又はプレートを、ＳＲＢが溶解するまで（約５〜１０分を有する）、室温で静止したままにすることにより、溶解した。固定化された生存細胞の数に直接相関する、各ウェル中のＳＲＢの量を、マイクロプレートリーダーにより、５６５ｎｍの吸光度で分光光度的に決定した。細胞生存率の増加又は減少を、ＬＧＴ−Ｅ前処置細胞と、またドセタキセルにより処置されたが、しかしＬＧＴ−Ｅによっては処置されていない細胞とを比較することにより決定した。
【００７２】
この実施例に記載される実験についての結果は、次の通りである：表１及び３は、１２及び２５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅによる前処置に関する細胞生存率を報告し；表２及び４は、割り当てられた濃度のドセタキセルのみにより細胞を処置することにより得られた対照データを報告する。図３は、表１−４のデータをグラフ形で要約する。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
【表２】
0006367801.tif 000003
【００７５】
【表３】
0006367801.tif 000004
【００７６】
【表４】
0006367801.tif 000005
【００７７】
実施例３
ドセタキセルに対する、ドセタキセル耐性前立腺癌系であるＤＵ１４５−ＴｒＸの感作に対するＬＧＴ−Ｅの用量依存効果。実施例２に記載される方法を用いて、ドセタキセル処置されたＤＵ１４５−ＴｒＸ細胞に対するＬＧＴ−Ｅ前処置の化学感作効果を研究した。この研究においては、細胞を、５０、２５又は１２．５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置し、その後、１×１０2〜１０-3ｎＭのドセタキセルを含む、１：３連続的希釈のドセタキセルのアリコート５０μｌにより細胞を処置した。ＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞を、第３８継代でプレートに配置した。表５、７及び９は、それぞれ、５０、２５及び１２．５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅによる前処置に関する細胞生存率データを報告する。表６、８及び１０は、ＬＧＴ−Ｅにより前処置されなかったＤＵ１４５−ＴｘＲ細胞から得られた対照データを報告する。図４は、表５−１０のデータを、グラフ形で要約する。
【００７８】
【表５】
0006367801.tif 000006
【００７９】
【表６】
0006367801.tif 000007
【００８０】
【表７】
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【００８１】
【表８】
0006367801.tif 000009
【００８２】
【表９】
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【００８３】
【表１０】
0006367801.tif 000011
【００８４】
実施例４
ドセタキセル耐性前立腺癌細胞のドセタキセル感受性に対するドセタキセル感受性前立腺癌細胞のドセタキセル感受性の比較。ドセタキセル耐性細胞系がそれらのそれぞれの親ドセタキセル感受性細胞系よりも、ドセタキセルに対してより耐性である程度を決定するために、ドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞系、及びＰＣ３−ＴｘＲが由来するドセタキセル感受性細胞系ＰＣ３の細胞生存率を、ＬＧＴ−Ｅ前処置の不在下でドセタキセル処置に従って比較した。細胞培養条件、ドセタキセル処置、及び細胞生存率分析を、実施例２に記載のようにして実施した。実施例２のように、１×１０2〜１×１０-3ｎＭのドセタキセルを含む、１：３で連続的に希釈されたドセタキセルのアリコート５０μｌにより、細胞を処置した。ＰＣ３−ＴｒＸ及びＰＣ３細胞を、それぞれ、第５２継代及び第１１継代でプレートに配置した。表１１及び１２は、それぞれ、ドセタキセル耐性ＰＣ３−ＴｘＲ細胞及びドセタキセル感受性ＰＣ３細胞のドセタキセル処置から得られたデータを示す。図５は、表１１及び１２のデータを、グラフ形式で要約する。
【００８５】
【表１１】
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【００８６】
【表１２】
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【００８７】
実施例５
ドセタキセル感受性及びドセタキセル耐性前立腺癌細胞についてのＬＧＴ−Ｅ  ＩＣ50の決定。ＬＧＴ−Ｅ  ＩＣ50濃度を、ドセタキセル感受性細胞系ＰＣ３及びＤＵ１４５、及びそれらのドセタキセル耐性亜系について決定した。細胞培養条件及び細胞生存率分析を、実施例２に記載のようにして実施した。実施例２とは異なって、細胞は、１００．０、３３．３、１０．０、３．３３、１．０、０．３３３、０．１又は０．００１ μｇ/ｍｌのＬＧＴ−Ｅの存在下で標準培養条件下での７２時間のインキュベーションに供され、そして細胞はドセタキセルにより処置されなかった。ＰＣ３及びＰＣ３−ＴｒＸ細胞を、それぞれ第１５継代及び第３８継代でプレートに配置し、そしてＤＵ１４５及びＤＵ１４５−ＴｒＸ細胞をそれぞれ、第４６継代でプレートに配置した。表１３及び１４は、それぞれＰＣ３及びＰＣ３−ＴｘＲ細胞から得られた細胞生存率データを報告する。表１５及び１６は、それぞれＤＵ１４５−ＴｒＸ及びＤＵ１４５細胞から得られた細胞生存率データを報告する。図６は、表１３〜１６のデータを、グラフ形式で要約する。
【００８８】
【表１３】
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【００８９】
【表１４】
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【００９０】
【表１５】
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【００９１】
【表１６】
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【００９２】
実施例６
種々の化学療法剤及び癌細胞系により対にされる場合のＬＧＴ−ＥについてのＣＥ値の比較。この比較においては、ＬＧＴ−Ｅ  ＩＣ50を、次のものについて決定した：（i）ドセタキセル感受性細胞系ＰＣ３及びＤＵ１４５、並びにそれらのドセタキセル耐性亜系により対にされたドセタキセル；（ii）それぞれ、ドキソルビシン感受性及び耐性骨髄白血病系Ｋ５６２及びＫ５６２／Ｄｏｘにより対にされたドキソルビシン；（iii）ハーセプチン（登録商標）感受性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４；及び（iv）ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＳｋＢｒ３。上記細胞系の細胞培養を、実施例２に記載された通りに実施したが、但し３，０００ではなく５，０００の細胞を、Ｋ５６２、Ｋ５６２/Ｄｏｘ、ＢＴ４７４、ＳｋＢｒ３系について、ウェル当たりに配置した。
【００９３】
ＬＴＧ−Ｅと組み合わせて、化学感作について試験される化学療法剤は、ドセタキセル、ダウノルビシン、ハーセプチン（登録商標）及びラパチニブであった。それらの薬物についてのＩＣ50を決定し、そしてそれらの研究に使用される細胞系の既知薬物感受性を確認するために、細胞系を上で詳述した通りにプレートに配置し、そして表１７に示されるようにして、前述の化学療法剤の存在下で７２時間培養し、続いて細胞生存率のＳＲＢ分析を実施した。表１７はまた、各細胞が試験される、連続的に希釈された濃度の薬物も含む。
【００９４】
【表１７】
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【００９５】
ＩＣ50濃度を、ドセタキセル、ダウノルビシン、ハーセプチン（登録商標）及びラパチニブについて決定した後、薬物についてのＣＥ値を、実施例２及び４に記載のようにして調製され、プレートに配置され、そして生存性アッセイされた化学療法剤耐性細胞の培養物を、１２．５、２５及び５０μｇ／ｍｌでのＬＧＴ−Ｅにより前処置することにより決定した。実施例２のように、前処置期間は２時間であった。表１８は、化学療法剤についてのＣＥ決定の結果を要約する。
【００９６】
【表１８】
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【００９７】
実施例７
ドセタキセルに対する、ドセタキセル感受性前立腺癌細胞系ＤＵ１４５の感作に対するＬＧＴ−Ｅの用量−依存性効果。実施例２に記載される方法を用いて、ドセタキセル処置されたＤＵ１４５に対するＬＧＴ−Ｅ前処置の化学感作効果を研究した。この研究においては、細胞を、５０μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置し、その後、１×１０2〜１×１０-3ｎＭのドセタキセルを含む、１：３で連続的に希釈された、ドセタキセルの５０μｌアリコートにより、細胞を処置した。表１９は、細胞生存率データを報告する。表２０は、ＬＧＴ−Ｅにより前処置されなかったＤＵ１４５細胞から得られた対照データを報告する。図７は、表１９及び２０のデータを、グラフ形式で要約する。
【００９８】
【表１９】
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【００９９】
【表２０】
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【０１００】
実施例８
ハーセプチン（登録商標）感受性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４のＬＴＧ−Ｅ前処置により提供される、限定された追加のハーセプチン（登録商標）感作。ＢＴ４７４細胞のハーセプチン（登録商標）のために適合されるように、実施例２及び９に記載される細胞培養方法を用いて、ハーセプチン（登録商標）処置されたＢＴ４７４細胞に対するＬＴＧ−Ｅ前処置の化学感作効果を研究した。この研究においては、細胞を、１３μｇ／ｍｌのＬＴＧ−Ｅにより前処置し、その後、１×１０2〜１×１０-3μＭのハーセプチン（登録商標）を含む、１：３で連続的に希釈されたハーセプチン（登録商標）の５０μｌアリコートにより細胞を処置した。表２１は、ハーセプチン（登録商標）処置の前、ＬＴＧ−Ｅによる前処置に関する細胞生存率データを報告する。表２２は、ハーセプチン（登録商標）処置の前、ＬＴＧ−Ｅにより前処置されていない細胞から得られた対照データを報告する。図８は、表２１及び２２のデータを、グラフ形式で要約する。
【０１０１】
【表２１】
0006367801.tif 000022
【０１０２】
【表２２】
0006367801.tif 000023
【０１０３】
実施例９
ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４／ＨｅｒのＬＴＧ−Ｅ前処置により提供されるＬＥＴ−Ｅ−介在性ハーセプチン（登録商標）感作。ＢＴ４７４細胞のハーセプチン（登録商標）のために適合されるように、実施例２及び９に記載される細胞培養方法を用いて、ハーセプチン（登録商標）処置されたＢＴ４７４/Ｈｅｒ細胞に対するＬＴＧ−Ｅ前処置の化学感作効果を研究した。この研究においては、細胞を、１３μｇ／ｍｌのＬＴＧ−Ｅにより前処置し、その後、１×１０2〜１×１０-3μＭのハーセプチン（登録商標）を含む、１：３で連続的に希釈されたハーセプチン（登録商標）の５０μｌアリコートにより細胞を処置した。表２３は、ハーセプチン（登録商標）処置の前、ＬＴＧ−Ｅによる前処置に関する細胞生存率データを報告する。表２４は、ハーセプチン（登録商標）処置の前、ＬＴＧ−Ｅにより前処置されていない細胞から得られた対照データを報告する。図９は、表２３及び２４のデータを、グラフ形式で要約する。
【０１０４】
【表２３】
0006367801.tif 000024
【０１０５】
【表２４】
0006367801.tif 000025
【０１０６】
実施例１０
ラパチニブのＩＣ50を、ハーセプチン（登録商標）感受性ＢＴ４７４細胞系について決定した。細胞培養条件及び細胞生存率分析を、実施例２に記載のようにして実施したが、但し５０００の細胞をウェル当たり配置した。しかしながら、実施例２とは異なって、細胞は、表２５に示される濃度（μＭ）のラパチニブの存在下で標準培養条件下で７２時間のインキュベーションに供された。ラパチニブＩＣ50データがまた、表２５に報告され、そして図１０にグラフで表される。
【０１０７】
【表２５】
0006367801.tif 000026
【０１０８】
実施例１１
ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４−ＴｘＲのＬＴＧ−Ｅ前処置により提供されるＬＥＴ−Ｅ−介在性ハーセプチン（登録商標）感作。ＢＴ４７４細胞のハーセプチン（登録商標）のために適合されるように、実施例２及び９に記載される細胞培養方法を用いて、ハーセプチン（登録商標）処置されたＢＴ４７４−ＴｘＲ細胞に対するＬＴＧ−Ｅ前処置の化学感作効果を研究した。この研究においては、細胞を、１３μｇ／ｍｌのＬＴＧ−Ｅにより前処置し、その後、１×１０2〜１×１０-3μＭのハーセプチン（登録商標）を含む、１：３で連続的に希釈されたハーセプチン（登録商標）の５０μｌアリコートにより細胞を処置した。表２６は、ハーセプチン（登録商標）処置の前、ＬＴＧ−Ｅによる前処置に関する細胞生存率データを報告する。表２７は、ハーセプチン（登録商標）処置の前、ＬＴＧ−Ｅにより前処置されていない細胞から得られた対照データを報告する。図１１は、表２６及び２７のデータを、グラフ形式で要約する。
【０１０９】
【表２６】
0006367801.tif 000027
【０１１０】
【表２７】
0006367801.tif 000028
【０１１１】
実施例１２
ハーセプチン（登録商標）耐性、ＨＥＲ２陽性乳管癌系ＢＴ４７４−ＴｘＲのＬＴＧ−Ｅ前処置により提供されるＬＥＴ−Ｅ−介在性ラパチニブ感作。ＢＴ４７４細胞のために適合されるように、実施例２及び９に記載される細胞培養方法を用いて、ラパチニブ処置されたＢＴ４７４−ＴｘＲ細胞に対するＬＴＧ−Ｅ前処置の化学感作効果を研究した。この研究においては、細胞を、１２．５又は２５μｇ／ｍｌのＬＴＧ−Ｅにより前処置し、その後、１×１０2〜１×１０-3μＭのラパチニブを含む、１：３で連続的に希釈されたラパチニブの５０μｌアリコートにより細胞を処置した。表２８及び３０は、ラパチニブ処置の前、１２．５又は２５μｇ／ｍｌのＬＴＧ−Ｅによる前処置に関する細胞生存率データを報告する。表２９及び３１は、ラパチニブ処置の前、ＬＴＧ−Ｅにより前処置されていない細胞から得られた対照データを報告する。図１２は、表２８−３１のデータを、グラフ形式で要約する。
【０１１２】
【表２８】
0006367801.tif 000029
【０１１３】
【表２９】
0006367801.tif 000030
【０１１４】
【表３０】
0006367801.tif 000031
【０１１５】
【表３１】
0006367801.tif 000032
【０１１６】
実施例１３
ラパチニブ感受性ＨＥＲ２陽性乳癌系ＳｋＢｒ３のラパチニブ感受性の、そのラパチニブ耐性亜系のそのラパチニブ感受性に対する比較。ラパチニブ耐性細胞系がそれらのそれぞれの親ラパチニブ感受性細胞系よりも、ラパチニブに対してより耐性である程度を決定するために、ラパチニブ耐性ＳｋＢｒ３−ＴｘＲ細胞系、及びＳｋＢｒ３−ＴｘＲが由来するラパチニブ感受性細胞系ＳｋＢｒ３の細胞生存率を、化学感作前処置段階の不在下でラパチニブ処置に従って比較した。細胞培養条件、及び細胞生存率分析を、実施例２に記載のようにして実施した。実施例２におけるように、細胞を、２０、６．７、２、０．７、０．２、０．０７又は０．０２ μMのラパチニブを含むアリコート５０μｌにより処置した。表３２及び３３は、それぞれ、ＳｋＢｒ３及びＳｋＢｒ３−ＴｘＲ系におけるラパチニブ用量−応答を示す。図１３は、表３２−３３のデータを、グラフ形式で要約する。
【０１１７】
【表３２】
0006367801.tif 000033
【０１１８】
【表３３】
0006367801.tif 000034
【０１１９】
実施例１４
ハーセプチン（登録商標）及びラパチニブ耐性、ＨＥＲ２陽性乳腺癌系ＳｋＢｒ３−ＴｘＲのＬＴＧ−Ｅ前処置により提供されるＬＥＴ−Ｅ−介在性ラパチニブ感作。実施例２及び９に記載される細胞培養方法を用いて、但し、５０００の ＳｋＢｒ３−ＴｘＲ細胞をプレート当たり配置し、ラパチニブ処置されたＳｋＢｒ３−ＴｘＲ細胞に対するＬＴＧ−Ｅ化学感作効果を研究した。この研究においては、細胞を、１２．５μｇ／ｍｌのＬＴＧ−Ｅにより前処置し、その後、２０、６．７、２、０．７、０．２、０．０７又は０．０２ μMのラパチニブを含む、ラパチニブの５０μｌアリコートにより細胞を処置した。表３４は、前処置に関する細胞生存率データを報告する。表３５は、ラパチニブ処置の前、ＬＧＴ−Ｅにより前処置されていない細胞から得られた対照データを報告する。図１４は、表３４及び３５のデータを、グラフ形式で要約する。
【０１２０】
【表３４】
0006367801.tif 000035
【０１２１】
【表３５】
0006367801.tif 000036
【０１２２】
実施例１５
ダウノルビシン感受性骨髄性白血病系Ｋ５６２におけるダウノルビシンに対する感作のＬＧＴ−Ｅ介在性上昇は存在しない。実施例２に記載される細胞培養方法を用いて、ダウノルビシン処置されたＫ５６２細胞に対するＬＴＧ−Ｅの化学感作効果を研究した。この研究においては、細胞を、２５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置し、その後、細胞を、３０〜１×１０-3μＭのダウノルビシンを含む、１：３で連続的に希釈された５０μｌのアリコートにより処置した。表３６は、ダウノルビシン処置の前、ＬＴＧ−Ｅによる前処置に関する細胞生存率データを報告する。表３７は、ダウノルビシン処置の前、ＬＫＧＴ−Ｅにより前処置されていない細胞から得られる対照データを報告する。図１５は、表３６及び３７のデータを、グラフ形式で要約する。
【０１２３】
【表３６】
0006367801.tif 000037
【０１２４】
【表３７】
0006367801.tif 000038
【０１２５】
実施例１６
ダウノルビシン耐性骨髄性白血病系Ｋ５６２/Ｄｏｘにおけるダウノルビシンに対する感作のＬＧＴ−Ｅ介在性上昇。実施例２に記載される細胞培養方法を用いて、ダウノルビシン処置されたＫ５６２/Ｄｏｘ細胞に対するＬＴＧ−Ｅの化学感作効果を研究した。この研究においては、細胞を、２５μｇ／ｍｌのＬＧＴ−Ｅにより前処置し、その後、細胞を、３０〜１×１０-3μＭのダウノルビシンを含む、１：３で連続的に希釈された５０μｌのアリコートにより処置した。表３８は、ダウノルビシン処置の前、ＬＴＧ−Ｅによる前処置に関する細胞生存率データを報告する。表３９は、ダウノルビシン処置の前、ＬＫＧＴ−Ｅにより前処置されていない細胞から得られる対照データを報告する。図１６は、表３８及び３９のデータを、グラフ形式で要約する。
【０１２６】
【表３８】
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【０１２７】
【表３９】
0006367801.tif 000040
【０１２８】
実施例１７
ＬＧＴ−Ｅは、インビボでドセタキセルのための効果的化学感作剤である。ＬＧＴ−Ｅがドセタキセルのための化学感作剤であることが示された結果に基づいて、インビボ研究を、ドセタキセルの化学療法効果に対する、経口投与されたＬＧＴ−Ｅの有効性を評価するために企画した。このことを目標にして、ＣＤ−１マウス（Charles River Laboratories International, Inc. Wilmington, MA）における経口最大許容量（ＭＴＤ）を、７日間にわたって、１００、２５０、５００、７５０及び１０００ｍｇ／ｋｇの増大する単一の一度のみの経口用量、及び６２．５、１２５、２５０又は５００ｍｇ／ｋｇの毎日の用量を投与することにより決定した。特に、ＭＴＤは、（i）非致死的である；（ii）対照動物に比べて１０％を越えない体重増加の位相差を引き起こさない；及び（iii）明白な器官機能障害又は副作用を引き起こさない、用量として定義される。単一及び複数回投与アプローチの場合、ＭＴＤは約５００ｍｇ／ｋｇであった。
【０１２９】
ＬＴＧ−ＥについてのＭＴＤの同定に続いて、ドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、i.v.）と組み合わせて投与されるＬＧＴ−Ｅ（５００ｍｇ／ｋｇ、強制経口投与）の抗腫瘍効果を、ドセタキセル処置のみと比較した。より具体的には、それらの研究は、体重１５〜２０ｇであり、生後４〜６週であり、そしてＨＥＰＡ−濾過され空気下でケージに収容された（１２時間の明／暗サイクル）６匹の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）雄マウス（Taconic Farms, Inc. Oxnard, CA）を包含した。腫瘍は、ＰＣ３及びＰＣ３−ＴｘＲ細胞をマウス中に皮下注入することにより、マウスにおける形成を引き起こされた。細胞注入を実施するために、まずＰＣ３及びＰＣ３−ＴｘＲ細胞を、マトリゲル（Matrigel）(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, U.S.A.)及びＲＰＭＩ １６４０ (Mediatech, Manassas, VA, 又はLife Technologies Grand Island, NY)の１：１混合液に別々に懸濁した。次に、細胞を、注射によりマウスの脇腹中に皮下移植した。細胞の注入に続いて、１９日間、一貫して腫瘍増殖を示したマウスを、腫瘍研究に使用した。さらに具体的には、それらの研究は、異種移植片腫瘍が、半楕円体（semiellipoid）についての式、すなわち体積＝幅2×（長さ／２）を用いて計算して、約１２０ｍｍ3の体積に達した場合に開始された。
【０１３０】
腫瘍研究は、処置の最初の日に開始し、１５日間にわたって、各マウスの腫瘍サイズの変化を測定するために、上記に記載される基本的方法に従って実施された。研究における腫瘍含有マウスを、次の６種のグループにランダム化した：グループ（１）マウスは、ＰＣ３細胞腫瘍異種移植変を有し、そしてドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内（ＩＶ）、週１度、ｎ＝９）によってのみ処置され、グループ（２）マウスは、ＰＣ３−ＴｘＲ細胞腫瘍異種移植変を有し、そしてまったく処置されなかった（ｎ＝７）。研究の間にわたってのグループ（１）及び（２）の腫瘍サイズの変化が、図９Ａに示されている。グループ（３）マウスは、ＰＣ３−ＴｘＲ細胞腫瘍異種移植片を有し、そしてドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、週１度、ｎ＝８）により処置され；グループ（４）マウスは、ＰＣ３−ＴｘＲ細胞腫瘍異種移植片を有し、そしてＬＴＧ−Ｅ（５００ｍｇ／ｋｇ、強制経口投与（ＰＯ）による、毎日、ｎ＝８）により処置され；グループ（５）マウスは、ＰＣ３−ＴｘＲ細胞腫瘍異種移植片を有し、そしてドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、週１度）及びＬＴＧ−Ｅ（２５０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ、毎日）により処置され；そしてグループ（６）マウスは、ＰＣ３−ＴｘＲ細胞腫瘍異種移植片を有し、そしてドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、週１度）及びＬＴＧ−Ｅ（５００ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ、毎日、ｎ＝９）により処置された。この研究の間にわたってのグループ（３−６）の腫瘍サイズの変化が、図２３に示される。
【０１３１】
この研究の間にわたってのグループ（１）及びグループ（２）の腫瘍サイズの変化が、図２３に示され、これは、ＰＣ３及びＰＣ３−ＴｘＲ細胞の両者がＳＣＩＤマウスにおいて首尾よく増殖されたことを示した。研究の間にわたってのグループ（３〜６）の腫瘍サイズの変化が図[]に示される。ＬＧＴ−Ｅ単独では、何れの抗腫瘍効果も示されなかったが、しかしドセタキセルのみのグループに比べて、ドセタキセルの抗腫瘍効果を優位に増強した。
【０１３２】
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【図１Ａ】
0006367801.tif 000041
【図１Ｂ】
0006367801.tif 000042
【図２】
0006367801.tif 000043
【図３Ａ】
0006367801.tif 000044
【図３Ｂ】
0006367801.tif 000045
【図４Ａ】
0006367801.tif 000046
【図４Ｂ】
0006367801.tif 000047
【図４Ｃ】
0006367801.tif 000048
【図５】
0006367801.tif 000049
【図６Ａ】
0006367801.tif 000050
【図６Ｂ】
0006367801.tif 000051
【図７】
0006367801.tif 000052
【図８】
0006367801.tif 000053
【図９】
0006367801.tif 000054
【図１０】
0006367801.tif 000055
【図１１】
0006367801.tif 000056
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
0006367801.tif 000058
【図１３】
0006367801.tif 000059
【図１４】
0006367801.tif 000060
【図１５】
0006367801.tif 000061
【図１６】
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【図１７Ａ】
0006367801.tif 000063
【図１７Ｂ】
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