(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）及び（２）：
（１）Ｌ−リジン生産細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントを、前記細菌で生産されるアコニターゼの活性及び／または発現量がゼロにならないように低下するように改変する工程、及び、
（２）前記細菌を用いて、Ｌ−リジンを発酵生産する工程、
を含む、Ｌ−リジンを発酵生産する方法またはＬ−リジンの発酵量を増加する方法であって、
前記アコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントを改変する工程は、
Ｌ−リジン生産大腸菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子の配列番号１の核酸配列の開始コドンＡＴＧをＧＴＧに置換する工程、
Ｌ−リジン生産大腸菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子のプロモーターの配列番号４の核酸配列を配列番号３のヌクレオチド配列に置換する工程、
Ｌ−リジン生産コリネバクテリウム-グルタミクム又はコリネバクテリウム-ペキニーズの染色体にあるアコニターゼ遺伝子のプロモーターの配列番号６の核酸配列を配列番号５のヌクレオチド配列に置換する工程、
Ｌ−リジン生産大腸菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子の配列番号１の核酸配列からコード２５８４−２６７３を欠失させる工程、又は
Ｌ−リジン生産コリネバクテリウム-グルタミクム又はコリネバクテリウム-ペキニーズの染色体にあるアコニターゼ遺伝子の配列番号２の核酸配列からコード２７４０−２８２９を欠失させる工程、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアミノ酸発酵の分野に属する。具体的には、本発明はＬ−リジンの発酵生産方法及びそれに関連する方法及び使用、またそれらの方法及び使用で用いられる細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−リジン生産細菌（例えば、エシェリキア属に属する大腸菌とコリネバクテリウム属に属する細菌）の発酵によりＬ−リジンが生産されることは既に産業化されている。それらの細菌は自然環境から分離され、及び／又は変異誘発あるいは遺伝子工学的変性により得られる場合がある。
従来の研究では、ｐｎｔ、ｄａｐ又はｐｐｃなどの遺伝子の遺伝子工学的変性が注目されており、Ｌ−リジンの生産のためのアンタコニーゼ（例えば、大腸菌由来のアコニターゼＡ、コリネバクテリウム‐グルタミクム又はコリネバクテリウム‐ペキニーズ由来のアコニターゼ）をコードする遺伝子の調整エレメントに関しては注目されていない。
【０００３】
アコニターゼ（Aconitase）はＴＣＡ回路の酵素であり、クエン酸からアコニット酸へ変化、アコニット酸からイソクエン酸への変化という二段階の化学反応に触媒作用を及ぼす酵素である。
周知のエシェリキア属細菌において、ヌクレオチド配列が配列番号１で示されたａｃｎＡ遺伝子はアコニターゼＡをコードする。
しかし、最終産物であるＬ−リジンだけでなく、多くの複雑な中間代謝物から遠く離れた代謝産物による、Ｌ−リジン発酵の役割については示唆されていない。コリネバクテリウム‐グルタミクムなどのその他のＬ−リジン生産菌由来のアンタコニーゼの役割についても、報告は見当たらない。中国特開CN1289368 A及びCN101631871 Aなどに開示されたアコニターゼは、Ｌ−グルタミン酸の発酵に関するものであり、Ｌ−リジンの発酵に関するものがない。
【０００４】
本発明者は長年の研究と実践を経て、特に運に恵まれて、偶然にもアコニターゼ遺伝子とその調節エレメントの改変がＬ−リジンの生産量の増加に役立つことを見出した。
また、従来技術では、遺伝子のコピー数の増加及び有用な酵素遺伝子の部位特異的突然変異の導入により発現量及び／又は酵素活性が高められ、または有害な酵素遺伝子のノックアウトにより発現量及び／又は酵素活性を完全になくす。
しかし、本発明者は、研究によりアコニターゼ遺伝子とその調節エレメントは従来技術と異なり、簡単に増加又はノックアウトすることができないことを見出した。特に、ノックアウトによるａｃｎＡ遺伝子の不発現により、細菌の低成長を招き、実用的に用いることが困難になることを見出した。そのため、新たなＬ−リジンの生産量を増加させるためのアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントの改変方法を発明した。
【０００５】
更に、前記方法は既存方法で用いられる改変されたＬ−リジンの発酵生産量が多い細菌の染色体改変部位と干渉しない。このため、効果を高めると共に、実際に多種類の細菌を用いてＬ−リジンを生産するために有益である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は新しいＬ−リジンの発酵生産方法とそれに関連する方法を提供することである。それに関連する方法は、未改変の細菌に比べてＬ−リジンの発酵生産量を増加させる方法、Ｌ−リジンを発酵生産するための改変された細菌の使用、未改変の細菌と比べてＬ−リジンの発酵生産量を増加するための改変された細菌の使用、及び／または細菌の改変方法を含む。また、本発明は上述の方法で用いられるポリヌクレオチド、ベクター及び／または細菌などを提供する。
【０００７】
具体的には、第一に、本発明は、（１）細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントを、アコニターゼの活性及び／または発現量がゼロにならないように低下するように改変する工程、及び、（２）ステップ（１）の改変により得られた細菌を用いて、Ｌ−リジンを発酵生産する工程、を含む、Ｌ−リジンの発酵生産量を増加させる方法を提供する。
【０００８】
「改変」とは改変対象において変化が起こり、一定の効果をあげることを指す。染色体にある遺伝子またはその調節エレメントの改変方法は特に限定されないが、変異誘発、特定部位の突然変異誘発及び／または相同組換えを含み、後者の二つが好ましい。
染色体にある遺伝子または調節エレメントを改変することとは、当該遺伝子又は調節エレメントのヌクレオチド配列において一つまたは複数のヌクレオチドが付加され、欠失され、置換されることである。
それらの技術は広く分子生物学と微生物学の文献に記載され、すでに商品化されたもの多い。本発明の実施形態において、前記改変は、菌の染色体にある未改変のアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントが新たなアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントに改変されるように、また、改変された細菌のアコニターゼの発現量及び／または酵素活性を低下させるが完全になくならないように、Addgene社の商品化されたpKOVプラスミドを用いて、またはpK18mobsacBプラスミドを用いて、相同組換えの原理に基づいて行われる。それゆえ、本明細書において、相同組換えによる改変が好ましい。
【０００９】
本発明者は長年の研究を経て、大腸菌、コリネバクテリウム属に属する細菌などにおいて、遺伝子をノックアウトさせるような手段を用いてアコニターゼの発現量を完全になくした場合、細菌が低成長となり、アミノ酸を生産することさえできなくなることを明らかにした。それゆえ、本発明の「改変」は未改変の細菌に比べ、改変により得られた細菌のアコニターゼの発現量が低下させるが完全にはなくならないようにすることである。好ましくは、改変により得られた細菌のアコニターゼＡの発現量を２０％〜９５％低下させ、より好ましくは５０％〜９０％低下させ、例えば６５％、７０％又は８０％低下させる。
【００１０】
それに応じて、本発明は、別の使用又は方法をも提供する。例えば、第二の形態として、本発明は、（１）細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントを、アコニターゼの活性及び／または発現量が低下させるが完全にはなくならないように改変する工程、及び、
（２）ステップ（１）の改変により得られた細菌を用いて、Ｌ−リジンを発酵生産させる工程、を含む、Ｌ−リジンの発酵量を増加させる方法を提供する。
Ｌ−リジンは細菌の重要な代謝産物であり、大多数の細菌は多少一定量のＬ−リジンを発酵生産する。収率が低い状態でＬ−リジンを生産量する細菌はコスト効率が高いＬ−リジン生産に適していないが、本発明の方法は、Ｌ−リジンの発酵量を増加することができるので、本発明の方法はコストの高い分野で用いることができる。
好ましい細菌はＬ−リジンの生産量が多い細菌であることは当然であるところ、本発明の方法を用いることにより、その生産量を更に増加させることができる。また、本発明の方法または使用において、細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントの改変を除き、他の改変は行わなくともよい。例えば、細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子の調節エレメントを改変した場合、細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子を改変させなくともよい。その逆も然りである。例えば、細菌、特にＬ−リジンの生産量が多い細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子とその調節エレメントのうちの一つだけを改変してもよい。
【００１１】
例えば、第三の形態として、本発明はＬ−リジンの発酵生産のための改変により得られた細菌の使用を提供する。改変とは、細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントを改変することであり、当該改変により得られた細菌におけるアコニターゼの発現量及び／または酵素活性は低下させるが完全にはなくさない。
改変により得られた細菌は単独でＬ−リジンの発酵生産に用いてもよく、他のＬ−リジン生産細菌と共に用いてもよく、又は他の方法でＬ−リジンの発酵生産に用いてもよい。
本明細書において、特に定義されない限り（例えば、「改変により得られた」の定義がない）、「細菌」とは未改変の細菌又は改変されていない細菌であり、その染色体にあるアコニターゼ遺伝子及び当該遺伝子座前後の調節エレメントがアコニターゼの酵素活性及び／または発現量の低下がされていないアコニターゼ遺伝子とその調節エレメント、例えば、野生型細菌由来のアコニターゼ遺伝子とその調節エレメントである細菌をいう。
【００１２】
例えば、第四の形態として、本発明はＬ−リジンの発酵量の増加のための改変により得られた細菌の使用を提供する。改変とは、細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントの改変であり、当該改変により得られた細菌のアコニターゼ遺伝子の発現量及び/又は酵素活性は低下させるが完全になくさない。
【００１３】
本明細書において、細菌はＬ−リジン生産能を有する細菌で、例えば、エシェリキア属又はコリネバクテリウム属に属する細菌であってもよい。好ましい一形態はエシェリキア細菌であり、より好ましくは大腸菌であり、例えば、W3110株由来を含むK12株大腸菌の菌株である。好ましい別の形態はコリネバクテリウム細菌であってもよく、より好ましくはコリネバクテリウム‐グルタミクム又はコリネバクテリウム‐ペキニーズである。
従来の研究では、Ｌ−リジンの生産／発酵における細菌由来のアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントの役割は示唆されず、染色体にある遺伝子の改変はｐｎｔ、ｄａｐ又はｐｐｃなどの遺伝子座に注目しており、従来技術においてＬ−リジン生産菌（特にエシェリキア属またはコリネバクテリウム属に属する細菌、例えば、大腸菌、コリネバクテリウム‐グルタミクムまたはコリネバクテリウム‐ペキニーズ）由来のアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントの改変についての報告はない。それゆえ、Ｌ−リジン生産菌は、ほとんど野生型アコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントを持っている。
このため、それらの菌は、Ｌ−リジンの発酵量を増加させるための本発明の方法によって改変されてもよい。本発明の形態では、Ｌ−リジンの生産量が多い細菌も、Ｌ−リジンの生産量が少ない細菌も、Ｌ−リジンの発酵量の増加のために、本発明の方法で改変することができる。
【００１４】
実質上、第五の形態として、本発明は、改変により得られた細菌のアコニターゼの酵素活性及び／または発現量を低下させるが完全になくならないように、細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子及び／またはその調節エレメントを改変する工程を含む、細菌の改変方法を提供する。
【００１５】
第五形態の改変方法により得られた細菌はＬ−リジンの産生又は生産に用いることができる。このため、第六の形態として、本発明は第五の改変方法により得られた細菌を提供する。
本発明者の実験により、エシェリキア属細菌（例えば、大腸菌）由来のアコニターゼ遺伝子（ａｃｎＡ）のヌクレオチド配列の多くは配列番号１に示され、コリネバクテリウム属細菌（例えば、コリネバクテリウム‐グルタミクムまたはコリネバクテリウム‐ペキニーズ）由来のアコニターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の多くは配列番号２に示される。
改変された細菌においてアコニターゼの酵素活性及び／または発現量を低下させるが完全にはなくならないようにこれらのアコニターゼ遺伝子を改変することにより、Ｌ−リジンの発酵量を増加することができる。それゆえ、本発明の形態では、アコニターゼ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１又は２に示される。細菌由来のアコニターゼ遺伝子のヌクレオチド配列は本発明の方法の改変のために配列解析と配列相同性比較などの手段により得ることができる。
本発明では、改変された細菌由来のアコニターゼの酵素活性及び／または発現量を低下させるが完全になくならないのであれば、好ましい改変工程は、アコニターゼ遺伝子のヌクレオチド配列における一つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換である。
【００１６】
本発明者の経験によれば、細菌は長期進化を経ているため、細菌の酵素活性及び／または発現量を増加することが極めて困難であり、増加のための改変座は特に調査する必要があるが、酵素の活性及び／または発現量を低下するための調査は容易である。例えば、酵素のドメイン外のヌクレオチド配列を突然変異導入することができる。本発明において、細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子の改変方法は、アコニターゼ遺伝子のヌクレオチド配列における一つまたは複数のヌクレオチドの置換が好ましい。例えば、アコニターゼ遺伝子の開始コドンの置換、好ましくはＧＴＧで置換する方法である。この置換は、大腸菌、コリネバクテリウム‐グルタミクム及びコリネバクテリウム‐ペキニーズなどで行われる。また本発明において、細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子の改変方法は、アコニターゼ遺伝子のヌクレオチド配列における一つまたは複数のヌクレオチドの欠失が好ましい。例えば、アコニターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の欠失を含み、好ましくは１〜１２０個のヌクレオチドの欠失、より好ましくは１〜９０個のヌクレオチドの欠失、更に好ましくは９０個のヌクレオチドの欠失、例えば、前記アコニターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の終止コドンまでの９０個のヌクレオチドの欠失を含む。この欠失は、大腸菌、コリネバクテリウム‐グルタミクム及びコリネバクテリウム‐ペキニーズなどで行われる。
【００１７】
本明細書において、調節エレメントとは遺伝子（例えば、アコニターゼ遺伝子）の上流域又は下流域にあるポリヌクレオチドであり、前記遺伝子の発現量に影響を与えるために当該遺伝子の転写及び／または遺伝子発現を調節するポリヌクレオチドである。この調節エレメントは、コード配列及び非コード配列を含んでいてもよい。調節エレメントは遺伝子のプロモーター、エンハンサー、リプレッサーまたは転写及び／または遺伝子発現調整に関連する別のポリヌクレオチドでもよい。好ましい調節エレメントはプロモーターでもよい。本発明の一形態では、プロモーターのヌクレオチド配列は配列番号４又は６に示される。好ましい調節エレメントはリプレッサーであり、例えば、転写リプレッサーである。本発明の一形態では、転写リプレッサーのヌクレオチド配列は配列番号７に示される。プロモーター及び／またはリプレッサーの改変により、当該改変された細菌のアコニターゼの酵素活性及び／または発現量が低下されるが、完全にはなくならない。
【００１８】
本発明では、細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子の調節エレメントの好ましい改変工程は、改変により得られた細菌のアコニターゼの酵素活性及び／または発現量を低下させるが完全になくならないのであれば、アコニターゼ遺伝子の調節エレメントのヌクレオチド配列における一つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換である。
【００１９】
本発明者の経験によれば、細菌は長期進化を経ているため、細菌のプロモーター又はエンハンサーの転写活性を増加することは極めて困難であり、増加のための改変座は特に調査する必要があるが、プロモーター又はエンハンサーの転写活性を低下させるための調査は相対的に容易である。例えば、プロモーターと遺伝子の開始コドンとの距離を拡げるために、一つまたは複数のヌクレオチド配列を付加することができ、又は元のプロモーターを転写活性の弱いプロモーターに置換する。本発明において、細菌の染色体のアコニターゼ遺伝子の調節エレメントの好ましい改変工程は、アコニターゼ遺伝子のプロモーターにおける一つまたは複数のヌクレオチドの置換であり、例えば、転写活性の弱いプロモーターで置換することであり、より好ましくは、配列番号３又は５に示されるヌクレオチド配列で置換することである。
【００２０】
また、本発明において、細菌の染色体にあるアコニターゼ遺伝子の調節エレメントの好ましい改変工程は、アコニターゼ遺伝子の転写リプレッサーのヌクレオチド配列の付加であり、例えば、新たな転写リプレッサーのヌクレオチド配列の付加または元の転写リプレッサーのヌクレオチド配列のコピー数の増加である。転写リプレッサーは、発現量を増加させるため、及びより効率的にアコニターゼ遺伝子の転写を抑制するため、プロモーター（特に転写活性の強いプロモーター）の後ろに付加する。本発明の形態では、配列番号７及び８に示されるヌクレオチド配列をタンデムに付加する。
【００２１】
また、本発明は上述の方法に用いられる、ポリヌクレオチド及び／またはベクターなどの中間産物、及びそれらの使用をも提供する。例えば、第七の形態として、本発明は、以下のヌクレオチド配列、
（ａ）配列番号１で示されたヌクレオチド配列の開始コドンを置換（好ましくはＧＴＧで置換）して得られたヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号１又は２で示されたヌクレオチド配列における欠失（好ましくは１〜１２０個のヌクレオチド、より好ましくは１〜９０個のヌクレオチド、さらに好ましくは９０個のヌクレオチドの欠失）により得られたヌクレオチド配列、例えば、配列番号１又は２で示されたヌクレオチド配列の終止コドンまでの９０個のヌクレオチドを欠失させて得られたヌクレオチド配列
（ｃ）配列番号７及び８に示されたタンデム配列のヌクレオチド配列
から選ばれる、ポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
第八の形態として、本発明は、第七の形態で提供されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２３】
第九の形態として、本発明は、第一、二、三及び／または第四の形態に係る方法または使用において、第七の形態で提供されるポリヌクレオチド及び／または第八の形態で提供されるベクターの使用を提供する。即ち本発明の第一、二、三及び／または第四の形態における方法または使用において、本発明の第七の形態で提供されるポリヌクレオチド及び／または第八の形態で提供されるベクターを用いられた。
【００２４】
第十の形態として、本発明は、本発明の第五の形態に係る細菌の生産における、本発明の第七の形態で提供されるポリヌクレオチド及び／または第八の形態で提供されるベクターの使用を提供する。即ち本発明の第五の形態に係る細菌の生産過程において、本発明の第七の形態で提供されるポリヌクレオチド及び／または第八の形態で提供されるベクターが使用された。
【００２５】
本発明の有利な効果は、Ｌ−リジンの生産量が多い及び少ない細菌を用いる際にＬ−リジンの発酵生産量の増加するための新たな技術を提供し、また証明すること、既存方法で改変されたＬ−リジンの生産量が多い大部分の細菌の染色体にある改変座と干渉することなく、生産量を更に増加させることができること、細菌の発酵によりＬ−リジンの実際の発酵生産に役立つこと、普及しやすいことを含む。
【実施例】
【００２６】
本発明を理解しやすくするために、以下では具体的な実施例をあげて詳しく説明する。特に指摘すべきなのは、これらの実施例は一例に過ぎず、本発明の権利範囲を制限するものではない。本発明の明細書によれば、本発明の多くの変化、変更は当業者にとって自明である。
また、本発明を説明するために公開文献を引用し、これらの公開文献に示された全文内容は本発明に参照により組み込まれる。
【００２７】
以下の実施例により本発明の形態が更に説明する。特別の指定がなければ、実施例で用いられる技術は本分野の技術者によく用いるものであり、市販の常用計器、試薬（「分子クローン実験ガイドブック（第3版）」（科学出版社）、「微生物学実験（第4版）」（高等教育出版社）および計器と試薬のパンフレットを参考）である。
【００２８】
実施例1  アコニターゼの開始コドンをATGからGTGへの置換
野生型大腸菌、E. coli K12 W3110菌株（日本製品評価技術基盤機構生物資源センター(NITE Biological Resource Center, NBRC)で購入可）の染色体をテンプレートに、プライマーP1とP2、P3とP4それぞれを用いてPCR反応を行った。長さ510 bpと620 bpのDNA断片（Up1断片とDown1断片と名付ける）が得られた。PCR反応の工程は以下に示されるように、変性反応を94℃で30秒、アニーリング反応を52℃で30秒、伸長反応を72℃で30秒を30サイクルで行う。
【００２９】
プライマー配列は以下の通りである。
P1: 5’-CGCGGATCCGGAGTCGTCACCATTATGCC-3’
P2: 5’-TCTCGTAGGGTTGACGACACAGCTCCTCCTTAATGACAGG-3’ 
P3: 5’-CCTGTCATTAAGGAGGAGCTGTGTCGTCAACCCTACGAGA-3’
P4: 5’-ATTGCGGCCGCTCCATTCACCGTCCTGCAAT-3’
【００３０】
二つのDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離純化し、プライマーP1とP4を用いてオーバーラップPCR反応を行うためのテンプレートとして混ぜ合わせ、約1200 bpの断片（Up-Down1断片と名付ける）が得られた。PCR反応の工程は以下に示され、変性反応を94℃で30秒、アニーリング反応を52℃で30秒、伸長反応を72℃で60秒を30サイクルで行う。
【００３１】
アガロースゲル電気泳動で分離純化されたUp-Down1とpKOVプラスミド（Addgene社で購入可）をBam HI/Not Iを用いてダイジェストした。ダイジェーション産物をアガロースゲル電気泳動で分離純化し、更なる導入のためのベクターpKOV-Up-Down1とするためにライゲーションした。ベクターpKOV-Up-Down1は配列解析会社によるベクターの遺伝子配列解析により決定され、ａｃｎＡ遺伝子断片における正確な点突然変異（A-G）を有し、そして更なる使用のために保存された。
【００３２】
構築されたpKOV-Up-Down1プラスミドをエレクトロポレーションでＬ−リジンの生産量の少ないE. coli NRRL B-12185菌株（アメリカ農業研究サービス系統保存機関（Agricultural Research Service Culture Collection；NRRL）で購入可、その構築方法はUS4346170Aを参考のこと）とＬ−リジンの生産量の多いE. coli K12 W3110 △3菌株（中国科学院微生物研究所で購入可、それはE. coli K12 W3110を変異誘発して得られたリジン生産菌）ぞれぞれに導入する。二つの菌株は、遺伝子配列解析により、染色体に野生型acnA遺伝子及び上下流エレメントを持つことが確認された（Genbank登録番号U00096.2の1333855から1336530参照のこと）。
Addgene社のpKOVプラスミドハンドブックに従い、30℃100 rpmでLB培地で二時間培養させた後、相同組換えにおける陽性である単クローンを選ぶ。遺伝子配列解析によりそれらの染色体にある野生型acnA遺伝子の開始コドンがＡＴＧからＧＴＧへと突然変異したことが確認された。最終的に、ａｃｎＡ遺伝子の開始コドン突然変異を有する、Ｌ−リジン生産量の少ない／多い大腸菌が得られ、それぞれにYP-13633とYP-13664と名付けた。テストによると、得られた二種の菌株のアコニターゼ発現量は約７５〜８５％低下した（培地により差異あり）。
【００３３】
実施例２    アコニターゼの活性低下のためのアコニターゼ遺伝子配列の突然変異
（１）大腸菌の構築
アコニターゼ活性を低下させるために、大腸菌のａｃｎＡ遺伝子における終止コドンまでの９０個のヌクレオチドを欠失させた。具体的には、野生型大腸菌、E. coli K12 W3110菌株の染色体をプライマーP5とP6、P7とP8それぞれを用いたPCR反応のためのテンプレートとして抽出した。長さ752 bpと657 bpのDNA断片が得られ、それぞれをUp2断片、Down2断片と名付けた。PCR反応の工程は以下に示すように、変性反応を94℃で30秒、アニーリング反応を52℃で30秒、伸長反応を72℃で30秒を30サイクルで行う。
【００３４】
プライマー配列は以下の通りである。
P5: 5’-CGCGGATCCCGTCACACGATCCGATACCT-3’
P6: 5’-CGGCAAGCAAATAGTTGTTATACGACTTCCTGGCTACCAT -3’ 
P7: 5’-ATGGTAGCCAGGAAGTCGTATAACAACTATTTGCTTGCCG-3’ 
P8: 5’-ATTGCGGCCGC CATGGGGCGATTTCCTGATG-3’
【００３５】
二つのDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離純化し、プライマーP5とP8を用いたオーバーラップPCR反応のためのテンプレートとして混ぜ合わせた。約1400 bpの断片が得られ、Up-Down2断片と名付けた。PCR反応の工程は以下に示すように、変性反応を94℃で30秒、アニーリング反応を52℃で30秒、伸長反応を72℃で60秒を30サイクルで行う。
【００３６】
アガロースゲル電気泳動で分離純化されたUp-Down2とpKOVプラスミド（Addgene社で購入可）をBam HI/Not Iを用いてダイジェストした。ダイジェーション産物をアガロースゲル電気泳動で分離純化し、更なる導入のためのベクターpKOV-Up-Down2とするためにライゲーションした。ベクターpKOV-Up-Down2は配列解析会社によるベクターの遺伝子配列解析により決定され、ａｃｎＡ遺伝子断片における終止コドンまでの９０bp塩基の欠失を有し、更なる使用のために保存された。
【００３７】
Addgene社のpKOVプラスミドハンドブックに従い、構築されたpKOV-Up-Down2プラスミドをエレクトロポレーションでＬ−リジンの生産量の少ないE. coli NRRL B-12185菌株（その構築方法はUS4346170Aを参考のこと）とＬ−リジンの生産量の多いE. coli K12 W3110 △3菌株それぞれに導入した。
遺伝子配列解析によりそれらの菌株は、染色体に野生型ａｃｎＡ遺伝子及び上下流エレメントを持つことが確認された。相同組換えにおける陽性である単クローンを選び、遺伝子配列解析によりそれらの染色体にある野生型ａｃｎＡ遺伝子の終止コドンまでの９０bp塩基の欠失を有することが確認された。
最終的に、acnA酵素活性が低下されたＬ−リジン生産量の少ない／多い大腸菌株が得られ、それぞれにYP-13675とYP-13699と名付けた。得られた二つの改変された菌株のアコニターゼ活性は約６０〜８０％低下した（培地により差異あり）。
【００３８】
（２）コリネバクテリウム（Corynebacterium）の構築
アコニターゼ活性を低下させるため、コリネバクテリウムのａｃｎ遺伝子における終止コドンまでの90bp塩基を欠失させた。構築プロセスは上記ステップ（１）と同じであるが、コリネバクテリウム‐ペキニーズAS1.299（Corynebacterium pekinense，コリネバクテリウム‐グルタミクムに似ているために誤認されることもある、中国一般微生物保存センター（CGMCC）で購入可）のゲノムを以下に示す以下のプライマーP9〜P12（それぞれ上述のプライマーP4〜P8に相当）を用いたオーバーラップPCR反応のためのテンプレートとして用いた。542 bp の断片（Up2）、527 bp の断片（Down2）、約1069 bp の断片（Up-Down2）が得られた。
【００３９】
プライマー配列は以下の通りである。
P9: 5’-CGGGATCCTGCAGCTCAGTACTTGGAT-3’
P10: 5’-AAAGTCTTCTAATTAC TTACTGCGTCGAACTCGACG-3’ 
P11: 5’-GTTCGACGCAGTAAGTAATTAGAAGACTTTTGAT-3’ 
P12: 5’-TCCCCCGGGGAATACCGGGTCGGTGCG-3’
【００４０】
アガロースゲル電気泳動で分離純化されたUp-Down2とpK18mobsacBプラスミド（アメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC）で購入可）をそれぞれBam HI/Sma Iを用いてダイジェストした。ダイジェーション産物をアガロースゲル電気泳動で分離純化し、ａｃｎ遺伝子における終止コドンまでの90bp塩基が欠失された相同組み換えベクターpKOV-Up-Down2とするためにライゲーションした。構築されたベクターpKOV-Up-Down2は配列解析がなされ、エレクトロポレーションでＬ−リジンの生産量の少ないコリネバクテリウム‐ペキニーズAS1.299菌株とＬ−リジンの生産量の少ないコリネバクテリウム‐グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032菌株（ATCCで購入可）とＬ−リジンの生産量の多いコリネバクテリウム‐ペキニーズAS1.563菌株（中国一般微生物保存センターで購入可）に導入された。
遺伝子配列解析により後者の二つの菌株はコリネバクテリウム‐ペキニーズAS1.299由来のａｃｎ遺伝子を持つことが確認され、そのヌクレオチド配列は配列番号２で示される。30℃120 rpmでBHIS培地で二時間培養させた後、相同組換えにおける陽性である単クローンを選び、遺伝子配列解析により確認した。最終的に、ａｃｎ遺伝子の突然変異を有し、Ｌ−リジン生産量の少ない／少ない／多いコリネバクテリウムが得られ、それぞれにYP-14808、YP-14852とYP-14837と名付けた。
【００４１】
実施例３  アコニターゼ遺伝子のプロモーターから転写活性の弱いプロモーターへの置換
（１）大腸菌の構築
E. coli K12 W3110のａｃｎＡ遺伝子の上流配列を分析することにより、野生型acnA遺伝子の発現量を低下させるためのacnA遺伝子のORF上流において、野生型プロモーター領域（ヌクレオチド配列は配列番号４に示される）を置換するための転写活性の弱いプロモーター（ヌクレオチド配列は配列番号３に示される）を準備した。
【００４２】
具体的には、野生型大腸菌株、E. coli K12 W3110の染色体をプライマーP13とP14、P15とP16を用いたPCR反応のためのテンプレートとして抽出した。長さ580 bpと618 bpのDNA断片が得られ、それぞれをUp3断片、Down3断片と名付けた。転写活性の弱いプロモーターを含むプラスミドをプライマーP17とP18を用いたPCR反応のテンプレートとして用いた。そして、長さ161 bpの転写活性の弱いプロモーター断片が得られ、P断片と名付けた。PCR反応の工程は以下に示すように、変性反応を94℃で30秒、アニーリング反応を52℃で30秒、伸長反応を72℃で30秒を30サイクルで行う。
【００４３】
三つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離純化し、プライマーP13とP18を用いたオーバーラップPCR反応のためのテンプレートとして混ぜ合わせた。約716 bpの断片が得られ、Up-P断片と名付けた。PCR反応の工程は以下に示すように、変性反応を94℃で30秒、アニーリング反応を52℃で30秒、伸長反応を72℃で60秒を30サイクルで行う。
【００４４】
アガロースゲル電気泳動で分離純化されたUp-PとDown3断片をプライマーP13とP16を用いたオーバーラップPCR反応のためのテンプレートとして混ぜ合わせた。約1334 bpの断片が得られ、Up-P-down断片と名付けた。PCR反応の工程は以下に示すように、変性反応を94℃で30秒、アニーリング反応を52℃で30秒、伸長反応を72℃で60秒を30サイクルで行う。
【００４５】
上述で用いられるプライマー配列は以下の通りである。
P13: 5’-CGCGGATCCGAAGAAATTGAGGTCATGTT-3’
P14: 5’-GGTTTCTTAGACGTCGGATTCGTTTCGTTTCTGTTTCATT-3’
P15: 5’-ATCAGCAGGACGCACTGACCCATTAAGGAGGAGCTATGTCG-3’
P16: 5’- ATTGCGGCCGCTCCATTCACCGTCCTGCAATT-3’ 
P17: 5’-AATGAAACAGAAACGAAACGCAATCCGACGTCTAAGAAACC-3’
P18: 5’- CGACATAGCTCCTCCTTAATGGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT-3’
【００４６】
アガロースゲル電気泳動で分離純化されたUp-P-downとpKOVプラスミド（Addgene社で購入可）をそれぞれBam HI/Not Iを用いてダイジェストした。ダイジェーション産物をアガロースゲル電気泳動で分離純化し、更なる導入のためのベクターpKOV-Up-P-Downとするためにライゲーションした。ベクターpKOV-Up-P-Downは、配列解析会社によるベクターの遺伝子配列解析により決定され、転写活性が弱いプロモーターの正確な配列を有し、そして更なる使用のために保存された。
【００４７】
構築されたpKOV-Up-P-DownプラスミドをエレクトロポレーションでＬ−リジンの生産量の少ないE. coli NRRL B-12185菌株とＬ−リジンの生産量の多いE. coli K12 W3110 △3菌株それぞれに導入した。二つの菌株は遺伝子配列解析により、野生型ａｃｎＡ遺伝子とその上下流エレメントを持つことが確認された。その上流プロモーターはGenbank登録番号CP004009.1の2102518から2102713までの配列の通りである。
Addgene社のpKOVプラスミドハンドブックに従い、30℃100 rpmでLB培地で二時間培養させ、相同組換えにおける陽性である単クローンを選び、遺伝子配列解析によりその染色体にある野生型ａｃｎＡ遺伝子の上流のプロモーターが転写活性の弱いプロモーターで置換されたことを確認された。最終的に、ａｃｎＡプロモーター突然変異を有し、Ｌ−リジン生産量の少ない／多い大腸菌の両方が得られ、それぞれにYP-13627とYP-13682と名付けた。得られた二つの菌株のアコニターゼ発現量は約６５〜８０％低下した。
【００４８】
（２）コリネバクテリウムの構築
コリネバクテリウムのａｃｎ遺伝子上流配列を分析することにより、コリネバクテリウム由来のａｃｎＡ遺伝子のORFの上流において、166 bp野生型プロモーター領域（ヌクレオチド配列は配列番号６で示される）を置換するための転写活性の弱いプロモーター（ヌクレオチド配列は配列番号５で示される）を準備した。構築プロセスは前記ステップ（１）と同じであるが、以下の点で異なる。
【００４９】
コリネバクテリウム‐ペキニーズAS1.299（中国一般微生物保存センターで購入可）のゲノムを以下のプライマーP19〜P24（それぞれ上述のプライマーP13〜P18に相当）を用いたＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。そして、581 bpの断片（Up3）、581 bpの断片（Down3）、130 bpの断片（P）、約1284bpの断片（Up-P-down）が得られた。
【００５０】
用いられるプライマーの配列は以下の通りである。
P19: 5’-CGGGATCCGCCAAAGCAACCAACCCC-3’
P20: 5’-CTTTTTAGTTTTCAACGGTCGGATTTGCTCGAAAT-3’ 
P21: 5’- GCCGAAAC AAAGTAGCCGAAGCAGACGCCGTCG-3’
P22: 5’-CGGAATTCTGACCTGGTGGACGATAC-3’
P23: 5’-CGAGCAAATCCGACCGTTGAAAACTAAAAAGCTGG-3’
P24: 5’-GCGTCTGCTTCGGCTACTTTGTTTCGGCCACCC-3’
【００５１】
アガロースゲル電気泳動で分離純化されたUp-P-downとpK18mobsacBプラスミドをそれぞれBam HI/Eco RIを用いてダイジェストした。ダイジェーション産物をアガロースゲル電気泳動で分離純化し、更なるプロモーターの置換のための相同組換えベクターpK18mobsacB-Up-P-Downとするためにライゲーションした。
遺伝子配列解析により確認してから、構築されたpK18mobsacB-Up-P-DownプラスミドをエレクトロポレーションでＬ−リジンの生産量の少ないコリネバクテリウム‐ペキニーズAS1.299菌株とＬ−リジンの生産量の少ないコリネバクテリウム‐グルタミクムATCC 13032菌株とＬ−リジンの生産量の多いコリネバクテリウム‐ペキニーズAS1.563菌株に導入した。
遺伝子配列解析により後者の二つの菌株はコリネバクテリウム‐ペキニーズAS1.299由来のacn遺伝子およびその染色体上下流エレメントを持つことが確認された。30℃120 rpmでBHIS培地で二時間培養させた後、相同組換えにおける陽性である単クローンを選び、遺伝子配列解析により確認した。最終的には、ａｃｎプロモーター突然変異を有し、Ｌ−リジン生産量の少ない／少ない／多いコリネバクテリウムが得られ、それぞれにYP-14755、YP-14732とYP-14780と名付けた。
【００５２】
実施例4  アコニターゼ遺伝子の転写リプレッサーをコードする遺伝子acnRのコピー数増加
acn遺伝子の転写レベルを低下させるため、アコニターゼ遺伝子の転写リプレッサーをコードする遺伝子acnRのコピー数を増加させた。
具体的には、コリネバクテリウム‐ペキニーズAS1.299のゲノムを、プライマーP25とP26、P27とP28それぞれを用いたPCR反応のためのテンプレートとして用いた。長さ715 bpと797 bpのDNA断片が得られ、それぞれをUp4断片、Down4断片と名付けた。プライマーP29とP30を用いたPCR反応を行い、長さ567 bpのacnR断片が得られ、R断片と名付けた。そのヌクレオチド配列は配列番号７で示される。
また、発現プラスミドpXMJ19（Biovector Science Lab, Inc社で購入可）を、プライマーP31とP32を用いPCR反応のためのテンプレートとして用いた。164 bpの転写活性の強いプロモーターPtacが得られ、Ptac断片と名付けた。そのヌクレオチド配列は配列番号８に示される。PCR反応の工程は、変性反応を94℃で30秒、アニーリング反応を52℃で30秒、伸長反応を72℃で30秒、を30サイクルで行う。
【００５３】
上述で用いられるプライマー配列は以下の通りである。
P25: 5’-CGGGATCCTTCGCAACCGATAGAGCA-3’
P26: 5’-CACGAATTATGCAGAATAAGCCTTTAAGTAACAA-3’ 
P27: 5’-TAAACGCGACTAAGCGTGACCATTAAAAGGCT-3’ 
P28: 5’-CGGAATTCAAAAGCCTATTAAGTGTC-3’
P29: 5’-TTCACACAGGAAAGTGTCCGTAGCGGCAGGCGA-3’
P30: 5’-TTTAATGGTCACGC TTAGTCGCGTTTACGGACAG-3’
P31: 5’-TTAAAGGCTTATTCTGCATAATTCGTGTCGCTC-3’
P32: 5’-GCCGCTACGGACACTTTCCTGTGTGAAATTGTTA-3’
【００５４】
アガロースゲル電気泳動で分離純化されたR断片とPtac断片を、プライマーP31とP30を用いたオーバーラップPCR反応のためのテンプレートとして混ぜ合わせた。約731bpの断片が得られ、Ptac-R断片と名付けた。
アガロースゲル電気泳動で分離純化されたUp4断片とPtac-R断片を、プライマーP25とP30を用いたオーバーラップPCR反応のためのテンプレートとして混ぜ合わせて、約1446bpの断片が得られ、Up4-Ptac-R断片と名付けた。
アガロースゲル電気泳動で分離純化されたUp4-Ptac-R断片とDown4断片を、プライマーP25とP28を用いたオーバーラップPCR反応のためのテンプレートとして混ぜ合わせ、約2243bpの断片が得られ、Up-Ptac-R-Down断片と名付けた。PCR反応の工程は以下に示すように、変性反応を94℃で30秒、アニーリング反応を52℃で30秒、伸長反応を72℃で60秒を30サイクルで行う。
【００５５】
アガロースゲル電気泳動で分離純化されたUp-Ptac-R-DownとpK18mobsacBプラスミドをそれぞれBam HI/Eco RIを用いてダイジェストした。ダイジェーション産物をアガロースゲル電気泳動で分離純化し、染色体の非コード領域遺伝子座に定額外のacnRのコピーを挿入するための相同組換えベクターpK18mobsacB-Up-Ptac-R-Downとするためにライゲーションした。
ベクターpK18mobsacB-Up-Ptac-R-Downは配列解析会社によるベクターの遺伝子配列解析により決定され、Ptac-acnR遺伝子断片を有し、更なる使用のために保存された。
【００５６】
構築されたpK18mobsacB-Up-Ptac-R-DownプラスミドをエレクトロポレーションでＬ−リジンの生産量の少ないコリネバクテリウム‐ペキニーズAS1.299菌株とＬ−リジンの生産量の少ないコリネバクテリウム‐グルタミクムATCC 13032菌株とＬ−リジンの生産量の多いコリネバクテリウム‐ペキニーズAS1.563菌株に導入した。30℃120 rpmでBHIS培地で二時間培養させ、相同組換えにおける陽性である単クローンを選び、遺伝子配列解析により確認した。染色体の非コード領域遺伝子座に定額外のacnR遺伝子のコピーが挿入された、Ｌ−リジン生産量の少ない／少ない／多いコリネバクテリウムが得られ、それぞれにYP-14857、YP-14896とYP-14860と名付けた。
【００５７】
実施例５  リジン発酵実験
E. coliの発酵のため、E. coli K12 W3110 △3菌株、E. coli NRRL B-12185菌株および実施例１〜３で構築されたE.coli菌株それぞれを表１の種培地２５ｍＬに接種し、37℃220rpmで、９時間培養させた。それから、１ｍＬの種培地の培養菌を表１の発酵培地２５ｍＬに接種し、37℃220rpmで、48時間培養させた。培養が完成した時、HPLCでＬ−リジンの生産を測定した。
【００５８】
【表１】
0006335196.tif 000002
【００５９】
コリネバクテリウムの発酵のため、コリネバクテリウムAS1.299菌株、ATCC13032菌株、AS1.563菌株および実施例２〜４で構築されたコリネバクテリウム菌株それぞれを表２の種培地３０ｍＬに接種し、30℃、220rpmで、８時間培養させた。1 mLの種培地の培養菌を表２の発酵培地３０ｍＬに接種し、30℃、220rpmで、４８時間培養させた。培養が完成した時、HPLCでＬ−リジンの生産を測定した。
【００６０】
【表２】
0006335196.tif 000003
【００６１】
結果は表３の通りである。大腸菌であれコリネバクテリウムであれ、相応菌株のアコニターゼ自身を突然変異（例えば、欠失又は置換）することにより当該酵素の活性を低下させることも、または相応菌株のアコニターゼの調節エレメントを改変（例えば、置換又は挿入）することにより当該酵素の発現量を低下させることも、Ｌ−リジン生産量の増加を促す。
【００６２】
【表３】
0006335196.tif 000004
【配列表】
0006335196000001.app