(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物標的の捕獲方法であって、
（１）化合物と、ＤＮＡ又はＲＮＡの一方とを原料として選択するステップと、
（２）化合物と、ＤＮＡ又はＲＮＡの一方とを共有結合して標識化合物を得るステップと、
（３）遺伝子トランスファー方法を用いて、ステップ（２）で得られた標識化合物をそれぞれ細胞内にトランスファーするステップと、
（４）ステップ（３）における細胞を破砕させ、固定化した相補的ＤＮＡ又はＲＮＡによりステップ（３）でトランスファーされた標識化合物におけるＤＮＡ又はＲＮＡを捕獲し、標的を濃縮する標的捕獲ステップと、
（５）濃縮された標的を固定相から解離させ、ゲル電気泳動の方法を用いてセパレートし、プロテオミクスの方法を用いて差異タンパク質を比較することで潜在的な標的を識別する標的識別のステップと、
（６）標的確認のステップと、を含むことを特徴とする薬物標的の捕獲方法。
【請求項２】
ステップ（６）において、前記標的確認は優先度に基づいて（５）における識別された潜在的な標的を発現し、或いは（５）における識別された潜在的な標的のうち市販されているものを購入し、かつ化合物とこれらの標的との相互作用を１つずつ比較することで、最終に化合物標的の確認を実現し、ここで、前記優先度とは、差異タンパク質から細胞骨格タンパク質を除外した後に、潜在的な標的タンパク質を相対的な存在度に基づいて優先順位を決めたものをいうことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（１）において、前記化合物の分子量が１００〜４０００Ｄａであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（１）において、前記ＤＮＡ又はＲＮＡの長さは５個以上の塩基対又は塩基であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（１）において、前記ＤＮＡ又はＲＮＡに、ビオチン又は蛍光又は同位体（isotope）又はその他のトレースするための標識が標識されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（６）において、前記相互作用は標的と修飾されない化合物との親和性であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物標的の捕獲方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新規、有効的な薬物標的の選択決定は新薬開発の最優先課題である。薬物作用標的の決定は、薬物の体内の機能及び作用機構の更なる了解に寄与し、薬物の指向型合成、効果、投与方式、薬物代謝及び安全性評価方面において極めて重要な作用を発揮する。既存の方法は、薬物標的の捕獲方法が大別に二種に分かられ、一方は細胞表現型又は機能の変化に基づいて判断し、例えば、バイオチップ及び酵母ツーハイブリッド又はスリーハイブリッドに基づく捕獲技術であり、しかし、細胞内の信号チャネルが複雑であり、異なる信号分子が同一細胞機能を調節することができ、同一信号分子が異なる信号チャネルにおいて異なる作用を発揮することもできるので、細胞表現型又は機能の変化に基づいて細胞内の薬物標的を明確に判定することができない。他方の捕獲方法は薬物と薬物標的との親和性に応じて、細胞溶解液に既知の薬物で潜在の薬物標的を捕獲したが、細胞内の異なるタンパク質が異なる細胞小器官に存在し、これらの細胞小器官の間はお互いに間隔して独立の小部屋になり、細胞が分解過程において細胞内のすべてのタンパク質を混合し、このように薬物を加入した後に、正常な生理状態で薬物が作用しない標的タンパク質は全細胞分解時に相互作用してしまい、偽陽性を発生するので薬物標的の捕獲を干渉する。大部分の薬物は細胞膜を透過し細胞に進入してその作用を発揮したが、細胞膜は天然バリアとして多くの良好なイン・ビトロ生物活性を有する分子（例えば、極性が比較的高い分子）は薬物を含んで細胞に進入することができず、その相当の作用を発揮することができず、薬物の応用を制限する。
既存の薬物標的の捕獲方法の問題を解決するために、我々は、新規な薬物標的の捕獲方法の標的を設計し、すなわち、化合物とＤＮＡ又はＲＮＡ又はそのほかの特異親和性材料の一方とを共有結合させ、さらに細胞を損傷しない方式で細胞にトランスファーされ、細胞内に薬物標的の捕獲を行い、その後に捕獲した標的を識別して検証する。その利点は標的捕獲の環境が細胞内であることである。すなわち、伝統的には、まず、細胞を分解してさらに標的を捕獲する方法に対して、本発明は化合物と標的との結合過程が細胞内に発生し、実際の生理状態に近接し、結合時に細胞内のタンパク質は既存の配座を保持することができるので、体内の薬物作用過程をよくシミュレーションすることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
既存技術の欠陥を克服するために、本発明は薬物標的の捕獲方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の薬物標的の捕獲方法は、
（１）化合物及びＤＮＡ又はＲＮＡ又はその他の特異親和性材料の一方を取るステップと、
（２）化合物とＤＮＡ又はＲＮＡ又はその他の特異親和性材料の一方とを共有結合し、図１に示すような標識化合物が得られるステップと、
（３）特定の遺伝子トランスファー方法を採用し、ステップ（２）で得られた標識化合物をそれぞれ細胞にトランスファーするステップと、
（４）ステップ（３）での細胞を破砕させ、固定化した相補的ＤＮＡ又はＲＮＡでステップ（１）でのＤＮＡ又はＲＮＡを捕獲し、或いは固定化した特異親和性材料の他方でステップ（１）での親和性材料の一方を捕獲することで共有結合された標識化合物と標的との親和性によって標的を濃縮させる標的捕獲ステップと、。
（５）濃縮された標的を固定相から解離させ、ゲル電気泳動法でセパレートされ、プロテオミクスの方法で、差異タンパク質を比較することで潜在の標的を識別する標的識別ステップと、
（６）標的確認のステップと、を含む。
【０００５】
ステップ（１）において、前記化合物は、薬物自体又はその成分である。
【０００６】
ステップ（２）において、前記標識化合物とは、ビオチン又は蛍光又は同位体又はそのほかのトレースするための標識を含有したＤＮＡ又はＲＮＡが接続された化合物である。
【０００７】
ステップ（５）において、前記標的識別は濃縮された標的を固定相から解離させ、ゲル電気泳動法でセパレートし、プロテオミクスの方法で、差異タンパク質を比較することで潜在の標的を識別する。
【０００８】
ステップ（６）において、前記標的確認は優先度によって（５）で識別された標的を発現し、或いは購入し、かつ化合物とこれらの標的との相互作用を１つずつ比較することで、最終に化合物標的の確認を実現する。
【０００９】
ステップ（１）において、前記化合物の分子量は１００〜４０００Ｄａである。
【００１０】
ステップ（１）において、前記化合物は、ステップ（２）において共有結合するための、化学修飾され、かつ標的化合物と類似する生物活性を有する化合物である。
【００１１】
ステップ（１）において、前記ＤＮＡ又はＲＮＡは前記範囲のいずれの配列であってかつステップ（２）において化合物と共有結合するための官能基を有する。
【００１２】
ステップ（１）において、前記ＤＮＡ又はＲＮＡの長さは５個以上の塩基対又は塩基である。
【００１３】
ステップ（１）において、前記標識はビオチン又は蛍光又は同位体又はその他のトレースするための標識である。
【００１４】
ステップ（１）において、そのほかの親和性材料の一方は任意の明らかな細胞毒性がなく、ステップ（２）において化合物と共有結合される特異親和性材料対の一方である。
【００１５】
ステップ（２）において、前記標識化合物は識別されるべきの標的化合物と類似する活性を有する化合物である。ステップ（３）において、前記遺伝子トランスファーの方法は明らかな細胞損傷を引き起こさないすべてのトランスファー方法である。
【００１６】
ステップ（３）において、前記遺伝子トランスファー方法は陽イオン性リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ナノ粒子トランスフェクション又は電気穿孔トランスフェクション及びその他の核酸を細胞にトランスファーすることができる技術手段である。
【００１７】
前記「遺伝子トランスファー」とは、物理、化学又は生物方法を使用して核酸を細胞に転移する過程を意味する。
【００１８】
前記「特異親和性材料」とは、相互作用し、かつ特異結合することができる一対の分子、例えば、相補的核酸フラグメント 、酵素と基質、酵素と抑制剤、酵素と補酵素、ホルモンと細胞受容体、ビタミンと結合タンパク質、抗体と抗原を意味する。
【００１９】
ステップ（１）において、前記ＤＮＡ又はＲＮＡはランダムの二本鎖配列である時に、ステップ（４）において捕獲するための相補的ＤＮＡ又はＲＮＡはランダムの二本鎖配列のうちの一本鎖に相補することができる一本鎖配列である。捕獲時に、ランダムの二本鎖配列に対して融解する必要がある。
【００２０】
ステップ（６）において、前記相互作用は標的と修飾されない化合物との親和性である。
【００２１】
ステップ（６）において、前記優先度とは、差異タンパク質から細胞骨格タンパク質を除外した後に、潜在の標的タンパク質を（相対的）存在度に基づいて優先順位を決める。
【００２２】
本発明の方法は膜透過性が悪い化合物を細胞にトランスファーさせることで、細胞内に標的と結合し、真実の生理環境により近接する標的識別を実現し、化合物の疾患への作用機構のために確かな証拠を提供する。また、該発明技術は新規であり、方法が簡単であり、速度が速く、コストが低く、応用への見通しが非常によい。
【００２３】
明らかに、本発明の上記内容に基づいて、本分野の通常の技術知識及び慣用手段に従って、本発明の上記基本技術思想を逸脱しない前提で、そのほかの複数種の改正、置換、又は変更を行うことができる。
【００２４】
以下、実施例形式の具体的な実施形態によって、本発明の上記内容をさらに詳しく説明する。本発明の上記保護主題の範囲は以下の実施例に限定されることがしない。本発明の上記内容に基づいて実現した技術はいずれも本発明の範囲に属する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は標識化合物分子の構成式である。
【図２】図２は化合物１−３の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図３】図３は化合物１−５の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図４】図４は標識化合物１のＨＰＬＣ純度分析である。
【図５】図５は標識化合物１の質量スペクトル分析である。
【図６】図６はレーザー共焦点顕微鏡で観察した標識化合物１の細胞内の位置決め状況であり、青色が細胞核を示し、緑色がＦＩＴＣ標識の標識化合物１を示す。
【図７】図７  Ｌａｎｅ１:ビオチン統合対照化合物が２直接的に細胞溶解液からタンパク質を捕獲する。ｌａｎｅ２−３:全細胞溶解液、Ｌａｎｅ４:タンパク質分子量ケール、Ｌａｎｅ５:標識化合物１を細胞にトランスファーして標的タンパク質を捕獲した後に、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）電磁ビーズ統合標識化合物１で細胞溶解液から捕獲したタンパク質
【図８】図８は差異タンパク質比較及び潜在の標的識別である。
【図９】図９は修飾されない化合物のＰＴＰ１Ｂに対するＩＣ５０値測定である。
【図１０】図１０はレーザー共焦点顕微鏡で観察した標識化合物３の細胞内の位置決め情況であり、青色が細胞核を示し、緑色がＦＩＴＣ標識の標識化合物３を示す。
【図１１】図１１はレーザー共焦点顕微鏡で観察した標識化合物４の細胞内の位置決め情況であり、青色が細胞核を示し、緑色がＦＩＴＣ標識の標識化合物４を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
実施例１
１.  標識化合物の合成
１．１  化合物結合部位の選択：化合物の構造活性相関に基づいて、化合物活性に影響しない反応部位を決定する。
１．２  化合物修飾：二官能基試薬で化合物を修飾し、ただし、反応しない官能基は標識化合物のための反応に適合すべきである。
１．３  ＤＮＡ又はＲＮＡ又はその他の特異親和性材料の一方の修飾：二官能基試薬で修飾を行う。
１．４  標識化合物の合成：修飾された化合物と修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡ又はその他の特異親和性材料の一方とを共有結合させる。
【００２７】
２．標識化合物を細胞にトランスファーする。
化合物の変換に適合し、明らかな細胞損傷を引き起こさない遺伝子トランスファー方法を選択し、陽イオン性リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ナノ粒子トランスフェクション又は電気穿孔トランスフェクション及びそのほかの核酸を細胞にトランスファーすることができる技術手段を含み、標識化合物を細胞に効果的にトランスファーする。
【００２８】
３.  標的捕獲
３．１  室温にてＲＩＰＡ分解バッファーを溶解し、プロテアーゼ抑制剤を加入し、氷において準備する。
３．２  ＰＢＳで１回洗浄し、細胞スクレイパーで細胞を剥離する。遠心分離して細胞を収集し、細胞沈殿が残されて予備する。
３．３  ２μＬ細胞沈殿ごとに２０μＬのプロテアーゼ抑制剤が添加された細胞溶解液を加入する。
３．４  ３０分間氷浴反応する。
３．５  ４℃にて１４０００ｇ  １０分間遠心分離する。
３．６  即刻に上澄みを予冷されたプラスチック管まで吸い取り、すなわち、得られた細胞質タンパク質を抽出する。即刻に使用してもよく、−７０°Ｃで冷凍保存してもよい。
３．７  溶解液体積に基づいて、二倍の溶解液体積の結合バッファーを含有した電磁ビーズ又は固定化したその他の高親和性材料を加入し、２０分間培養する。
３．８  磁石で電磁ビーズを吸着し、或いは固定化したその他の高親和性材料を濾過し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で３回洗浄する。
３．９  少量の以上のような２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを加入し、８０度で３分間加熱し、その後に快速に上澄みを吸い取り、サンプルがさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥセパレートを行った後に銀染色する。
【００２９】
４．  標的識別
４．１  タンパク質バンドと空白制御提出に対してタンパク質質量スペクトル同定を行い、化合物と結合したタンパク質の詳細情報を獲得する。
４．２  親和濃縮されたタンパク質と空白制御との差異を比較し、潜在の化合物標的を決定する。
【００３０】
５．  標的確認
５．１  優先度に従って４．２で識別された潜在の化合物標的を発現し、或いは購入する。
５．２  化合物で潜在の標的に対して１つずつ親和性実験を行い、比較された後に、最終に化合物標的を確認する。
【００３１】
以下、実験例の方式によって本発明の有益な効果を検証する。
【００３２】
実験例１
標識化合物１の合成
１、実験材料及び試薬
化合物１−１は参考文献の方法（Ｄ．Ｐ．Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７，５０:４６８１−４６９８）によって本会社で合成する。５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸（５'−（ＣＨ２）１２−Ａ１９−３'−ＦＩＴＣ）は英い捷基（上海）貿易有限会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）で受託合成する。そのほかの化学合成が使用した試薬はそれぞれＡｌｄｒｉｃｈ又はＴＣＩから購入して得られる。
【００３３】
２、標識化合物１の合成
標識化合物１の合成経路は以下の通りである。
0006262848.tif 000002
【００３４】
化合物１−２:４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル
４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル（１−１）（２５０ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）、臭化プロパルギル（７０ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）及びΝ，Ν−ジイソプロピルエチルアミン（１．５ｍＬ）を２０ｍＬのΝ，Ν−ジメチルホルムアミドに溶解し、かつ９０°Ｃにて５時間攪拌し、室温まで冷却し、減圧し蒸留して粗生成物が得られ、カラムクロマトグラフィーによって４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル（２）（白色固体、１３０ｍｇ，４９％収率）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳＩ）:６６８，６７０（Ｍ＋Ｈ）＋;６９０，６９２（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【００３５】
化合物１−３:４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸
水酸化リチウム（２００ｍｇ，２．３８ｍｍｏｌ）を４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル（１−２）（１００ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）の５ｍＬテトラヒドロフランと５ｍＬ水溶液に加入し、室温にて終夜攪拌する。反応液に２Ｎ塩酸を加入してかつｐＨ２まで酸性化し、濃縮して粗生成物が得られる。粗生成物はＨＰＬＣで調製した後に４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸（１−３）（白色固体，４０ｍｇ，４２％収率）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳＩ）:６２６，６２８（Μ＋Η）＋;１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）:δ８．４５（ｓ，１Ｈ），７．４３（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｔ，Ｊ＝７．６Ηｚ，１Η），７．２１（ｍ，２Ｈ），７．０３（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｍ，３Ｈ），４．８８（ｓ，２Ｈ），４．１５（ｍ，４Ｈ），３．２８（ｍ，２Ｈ），３．２０（ｍ，１Ｈ），２．７０（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｍ，１Ｈ），１．７３（ｍ，２Ｈ），１．２４（ｍ，３Ｈ）。（１Ｈ  ＮＭＲ  図２参照）
【００３６】
化合物１−５:４−アジド安息香酸スクシンイミドエステル
氷浴で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ，５７０ｍｇ，３．７ｍｍｏｌ）を４−アジド安息香酸（５００ｍｇ，３．０６ｍｍｏｌ）を含有した１０ｍＬ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに加入し、その後にＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（４４０ｍｇ，３．７ｍｍｏｌ）を加入する。反応は遮光及び窒素雰囲気で１時間反応し、その後に室温まで加温し遮光して終夜攪拌する。減圧して蒸留し、Ν，Ν−ジメチルホルムアミドが除去され、その後に残部が酢酸エチルに溶解され、かつ水で３回洗浄し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、粗生成物が得られる。カラムクロマトグラフィーによって生成物４−アジド安息香酸スクシンイミドエステル（１−５）（白色固体，７８０ｍｇ，９７．５％収率）が得られる。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）:δ８．１１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｓ，４Ｈ）（１Ｈ  ＮＭＲ  図３参照）
【００３７】
化合物１−６:４−アジドベンズアミド１２−アルキル１９ポリアデニル化フルオレセイン
５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸（５'−（ＣＨ２）１２−Ａ１９−３'−ＦＩＴＣ）（５０ｎｍｏｌ）と４−アジド安息香酸スクシンイミドエステル（１−５）（５μｍｏ１，１００ｅｑ．）の５００μＬ  ０．５Μ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ρΗ９）と５０μＬジメチル・スルホキシド混合溶液を室温にて低速で終夜振動する。その後に、反応系は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムで分離され、凍結乾燥して４−アジドベンズアミド１２−アルキル１９ポリアデニル化フルオレセイン（１−６）（淡黄色固体、９０％収率以上）が得られる。
【００３８】
標識化合物１:４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−（４−（フルオレセイン１９ポリアデニル酸）１２−イソアミドフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）（（１−フェニルカルバモイルピペリジル）−４−メチル）アミノ）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸
３μＬの溶液Ａ（硫酸銅とトリス[（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル]アミンがモル比１:２で体積比４:３:１の水／ジメチル・スルホキシド／ｔｅｒｔ−ブタノールの溶液に溶解され、濃度が１０ｍＭである）を溶液Ｂ（４−アジドベンズアミド１２−アルキル１９ポリアデニル化フルオレセイン（１−６）（１５ｎｍｏｌ）の２０μＬ水溶液と４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸（１−３）（９６０ｎｍｏｌ）の５μＬ  ＤＭＳＯ溶液）に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、６０μＬの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム（６００ｎｍｏｌ）水溶液を上記反応系に加入し、室温にて低速で終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムで分離して純化して生成物４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−（４−（フルオレセイン１９ポリアデニル酸）１２−イソアミドフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）アミノ）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸（１）（淡黄色固体、約８０％収率）が得られる。（標識化合物１のＨＰＬＣ純度分析が図４に示し、標識化合物１の質量スペクトル分析が図５に示す）
【００３９】
３、対照化合物２の合成
対照化合物２の合成経路は以下のとおりである。
0006262848.tif 000003
【００４０】
化合物２−３:Ｎ−ｔ−ブトキシホルミル−３−（４−アジドベンゾイル）ピロール
アジド安息香酸（２−１）（３２６ｍｇ，２ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｔ−ブトキシホルミル−３−アミノピロール（２−２）（３７２ｍｇ，２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．１４ｇ，３ｍｍｏｌ）、Ν，Ν−ジイソプロピルエチルアミン（１．５ｍＬ）を２０ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、かつ室温にて２時間攪拌し、ジメチルメタンで希釈された後に順次に水で３回洗浄し、飽和塩水で３回洗浄し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、粗生成物が得られる。カラムクロマトグラフィーによってＮ−ｔ−ブトキシホルミル−３−（４−アジドベンゾイル）ピロール（２−３）（黄色油状，５０３ｍｇ，９８％収率）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳＩ）:２７６（Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ）＋３３２（Ｍ＋Ｈ）＋;３５４（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【００４１】
化合物２−４:４−アジド−Ｎ−（３−ピロリジニル）ベンズアミド
トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）をＮ−ｔ−ブトキシホルミル−３−（４−アジドベンゾイル）ピロール（２−３）（５０３ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）の５ｍＬ  ジクロロメタン溶液に加入し、室温にて２時間攪拌する。濃縮して粗生成物４−アジド−Ｎ−（３−ピロリジニル）ベンズアミド（２−４）（黄色油状，３４０ｍｇ，７６％収率）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳＩ）:２３２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００４２】
化合物２−６:４−アジド−Ｎ−（１−（５−（２−カルボニルヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ[３，４−ｄ]イミダゾール−４−アルキル）バレリル）ピロリジン−３−アルキル）ベンズアミド
４−アジド−Ｎ−（３−ピロリジニル）ベンズアミド（２−４）（３４０ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）、ビオチン（２−５）（４３９ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（６８４ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）、Ν，Ν−ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）を２０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、かつ室温にて２時間攪拌し、ジメチルメタンで希釈した後に水で３回洗浄し、飽和塩水で３回洗浄し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、粗生成物が得られる。カラムクロマトグラフィーによって（２−６）（黄色油状，４５８ｍｇ，６７％収率）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳＩ）:４５８（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００４３】
対照化合物２：４−ブロム−３−カルボキシメトキシ−５−（３−（（（１−（４−（（１−（５−（２−カルボニルヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ[３，４−ｄ]イミダゾール−４−アルキル）バレリル）ピロリジン−３−アルキル）カルバモイル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−アルキル）メチル）（（１−（フェニルカルバモイル）ピペリジル−４−アルキル）メチル）アミノ）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸
化合物（２−６）（２３ｍｇ，５０ｕｍｏｌ）、４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸（２−７）（３１ｍｇ，５０ｕｍｏｌ）、硫酸銅（２．５ｍｇ，１０ｕｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（４ｍｇ，２０ｕｍｏｌ）、トリエチルアミン（７ｕｌ、５０ｕｍｏｌ）を５ｍＬのΝ，Ν−ジメチルホルムアミドと０．５ｍＬの水に溶解し、室温にて２時間攪拌し、減圧し蒸留して粗生成物が得られる。高速液体クロマトグラフィーによって調製して（２）（黄色固体，３０ｍｇ，５５％収率）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳＩ）:１０８５（Ｍ＋Ｈ）＋。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）:δ８．８２（ｓ，１Ｈ），８．６９（ｄｄ，Ｊ＝６．４，１５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．４６（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｍ，４Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈｔ），７．２９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Η），７．２１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｍ，２Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ηｚ，１Η），６．４５（ｓ，１Ｈ），６．３６（ｓ，１Ｈ），４．８７（ｓ，２Ｈ），４．７６（ｓ，２Ｈ），４．１５−４．５２（ｍ，５Ｈ），３．４−３．７（ｍ，７Ｈ），２．５９−３．１（ｍ，６Ｈ），１．９−２．３（ｍ，６Ｈ），１．２−１．８（ｍ，１１Ｈ）。
【００４４】
実験例３  標識化合物１のトランスファー
【００４５】
１、実験材料及び試薬
ＨｅｐＧ２細胞株は中国科学院上海生命科学研究院から購入し、ＲＰＭＩ−１６４０培地は上海前塵生物科技有限会社（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｓｈａｎｇｈａｉ）から購入し、ウシ胎仔血清は天津こう洋生物製品科技有限会社から購入し、トリプシンとＯｐｔｉ−ＭＥＭは上海英駿生物技術有限会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｈａｎｇｈａｉ）から購入し、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬は羅氏中国会社（Ｒｏｃｈｅ）から購入し、そのほかの細胞培養ディッシュなどの用品はいずれも康寧中国会社（Ｃｏｍｉｎｇ  Ｃｈｉｎａ）から購入し、５'−ＮＨ２−（ＣＨ２）１２−ＰＯ４−Ａ５−３'−ＦＩＴＣ、５'−ＮＨ２−（ＣＨ２）１２−ＰＯ４−Ａ１９−３'−ＦＩＴＣ、５'−ＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡ−３'及び５'−ＮＨ２−（ＣＨ２）１２−ＰＯ４−ＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧ−３'−ＦＩＴＣはいずれも英い捷基（上海）貿易有限会社で合成する。
【００４６】
２、小分子化合物のトランスファー前の細胞準備
トランスファー前の２４ｈに、トリプシンで対数期成長期のＨｅｐＧ２細胞を消化し、１０％血清を含有した培地で細胞密度が０．５×１０６細胞／ｍＬになるように調整し、新たに１５ｃｍ細胞培養ディッシュに接種し、３７°Ｃにて、５％ＣＯ２培養箱で培養する。２４ｈに細胞密度が６０％−７０％に達すると実験に用いられる。
【００４７】
３、小分子化合物のトランスファー
１つの１５ｍＬ無菌遠心分離管（管Ａ）を取り、４ｎｍｏｌ標識化合物１を加入し、相応体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭと均一に混合し、総体積が２ｍＬになるように調整する。トランスフェクション試薬をゆっくり均一に揺動し、１６０μＬ  トランスフェクション試薬を取って他管（管Ｂ）における１．８４ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭと混合する。Ａ管とＢ管とを混合させ、チップでゆっくりピペットし、室温にて２０分間培養する。
【００４８】
６ｍＬ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を混合物に加入し、均一に混合する。ＨｅｐＧ２細胞培養ディッシュにおける過去の培地を廃棄し、かつ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地でゆっくり１回ピペットし、その後に上記混合物をＨｅｐＧ２細胞培養ディッシュに転移し、３７°Ｃにて、５％のＣＯ２培養箱で培養する。６ｈ後、レーザー共焦点顕微鏡で化合物の細胞内の位置決め結果を観察し、図６に示すように、５ｂｐより大きい一本鎖、二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡランダム又はｐｏｌｙＡフラグメントはいずれもＸ−ｔｒｅｍｅｓｉＲＮＡに細胞にトランスファーされることができ、大部分が細胞質にあり、少数が細胞核に進入する。
【００４９】
４、分解細胞を収集して総タンパク質を抽出する。
６ｈ培養した後に標識化合物１とトランスフェクション試薬混和物とを含有した培地を流れ捨てて、１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）液を加入し、培養ディッシュをゆっくりと１回左右振って残された混和物を洗濯し、その後に流れ捨てて、６ｍＬのトリプシン溶液を加入し、ゆっくり振って、トリプシン溶液をすべての細胞をカバーさせ、室温にて２−３分間静置し、チップでゆっくりピペットされ、かつ細胞懸濁液を１５ｍＬ遠心分離管に転移し、室温にて、１０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離される。
上澄みを廃棄し、１ｍＬ  ＰＢＳ再懸濁細胞を加入し、室温にて、１０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離する。
総体積３ｍＬの細胞溶解液と３０μＬ  ｃｏｃｋｔａｉｌプロテアーゼ抑制剤を加入し、細胞が完全に分解するまでに１５−２０分間氷浴する。
【００５０】
実験例４  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）電磁ビーズ統合標識化合物１はトランスファーした細胞分解物から標的タンパク質を捕獲する。
【００５１】
１、材料及び試薬
Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ電磁ビーズ：Ｄｙｎａ電磁ビーズ(r)Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
結合バッファー：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭＬｉＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、ＰＨ７．５。
溶出バッファー：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＨ７．５。
銀染色キット：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ。
【００５２】
２、標的捕獲
２．１  電磁ビーズ活性化：４００μＬ電磁ビーズを取り、１．５ｍＬ遠心分離管に置く。等体積の結合バッファーで３~４回洗濯された後に、最終に電磁ビーズを結合バッファーに懸濁させ、「電磁ビーズ懸濁液」として定義され、予備する。
２．２  結合：４．５ｍＬ電磁ビーズ懸濁液と３ｍＬ標識化合物１のトランスファーされた後のＨｅｐＧ２−ＰＴ分解物とを混合させ、室温にて２０〜３０分間遮光培養する。
２．３  洗濯：電磁ビーズが磁石で管底に吸着され、上澄み１を収集する。溶出バッファーを加入して電磁ビーズを再懸濁させ、吸着後に、上澄み２を収集する。１回繰り返して洗濯し、上澄み３を収集する。
２．４  放出：ＥＰ管に２μＬ溶出バッファーを加入して電磁ビーズを再懸濁させ、８０°Ｃにて３分間加熱した後に、即刻に磁石に置く。上澄みを収集し、「放出物」が得られる。
２．５  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ:２０μＬ放出物と空白細胞溶解液の上部試料を取って電気泳動する。電気泳動が完了した後に、銀染色法でタンパク質を検出する。
【００５３】
実験例５  ビオチン統合対照化合物２は直接的に細胞分解物から標的タンパク質を捕獲する。
【００５４】
１、分解細胞から総タンパク質を抽出する。
室温にてＲＩＰＡタンパク質溶解液を溶解し、氷において準備する。１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）液を加入し、培養ディッシュをゆっくりと１回左右振って残された混和物を洗濯し、その後に流れ捨てて、０．５ｍＬタンパク質溶解液を加入し、ゆっくり回動し、タンパク質溶解液をすべての細胞をカバーさせ、細胞スクレイパーでゆっくり細胞を剥離させ、かつ細胞懸濁液を２ｍＬ遠心分離管に転移し、その後に０．５ｍＬタンパク質溶解液を加入し、細胞スクレイパーでもう１回平板をゆっくり削り取って、かつ細胞懸濁液を同一遠心分離管に転移させ、１ｈ氷浴し、その後に細胞が完全に分解するまで超音する（超音条件：２ｓ作業、４ｓ間隔、合計５個の循環）。溶解液を４°Ｃにて、１００００ｒｐｍで、１０ｍｉｎ遠心分離され、上澄みを取って実験を行う。
【００５５】
２、対照化合物２の共培養
それぞれ５００μＬの上澄みを２個の５ｍＬ遠心分離管に取り、それぞれ１）及び2）と標識され、ただし、１）に２ｎｍｏｌの対照化合物２を加入し、2）に対照化合物２を加入しなくて陰性対照を行い、反転して均一に混合した後に４°Ｃにて１ｈ培養する。
【００５６】
３、標的捕獲
３．１  材料及び試薬
結合バッファー：１００  ｍＭ  ＰＢＳ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２。溶出バッファー：ＳＤＳ−Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ、遠心分離コラム
３．２  結合
必要であるバッファーとストレプトアビジン媒体とを室温までバランスさせる。その後に、ストレプトアビジン媒体が遠心分離コラムに加入され、収集管において、５００×ｇ１分間遠心分離して媒体原液を除去する。等体積の結合バッファーを遠心分離コラムに加入し、５００×ｇ１分間遠心分離し、溶出液を廃棄する。以上のステップを２回繰り返し、溶出液を廃棄する。遠心分離コラムを新たな収集管に置いて、サンプル／対照を加入し、ゆっくりピペットして均一に混合した後に室温にて１０分間培養する。等体積の結合バッファーを遠心分離コラムに加入し、５００×ｇ１分間遠心分離し、溶出液を廃棄する。以上のステップを４回繰り返し、溶出液を廃棄する。末回の溶出後に、媒体を吸出し、溶出バッファーを加入して１０分間沸騰水浴してタンパク質を放出する。
【００５７】
４.  銀染色
４．１  試薬
固定液：５０％ＭｅＯＨ、１０％ＨＡＣ、４０％Ｈ２Ｏ
銀染色液：０．３６％ＮａＯＨ２１ｍｌ＋１．４ｍｌアンモニア水（アンモニア水含有量が約２８−３０％）＋４ｍｌ（２０％ＡｇＮＯ３）、水で１００ｍｌに補充する。１５ｍｉｎ内に使用する（ＡｇＮＯ３を加入する時にゆっくり加入し、黄色がなくなるまで絶えずに攪拌する必要がある）
着色液：０．５ｍｌ  １％クエン酸＋５０ｕｌ  ホルムアルデヒド（ホルムアルデヒド含有量が約３７−４０％）が１００ｍｌまで定容する。停止液：１％酢酸
タンパク質  Ｍａｒｋｅｒ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  プレキャストゲル
【００５８】
４．２  銀染色
収集したサンプル／対照、タンパク質Ｍａｒｋｅｒを９０ｅＶで電気泳動された後に、固定液を加入して１時間固定する。脱イオン水で１０ｍｉｎ×３回洗浄する。１５ｍｉｎ銀染色する。脱イオン水で数回洗浄する。バンドが生じたまで着色した後に停止液を加入する。
【００５９】
５、実験結果
図７に示すように、直接的に細胞溶解液において行われた標的捕獲（Ｌａｎｅｌ）と細胞膜を透過して細胞内に行われた標的捕獲（Ｌａｎ）の対比によれば、細胞内の薬物標的の捕獲方法は少ない不純タンパク質を含有し、真正の標的の確認過程において容易になる。従って細胞内の標的捕獲は、細胞表現型応用に基づくものであり、正確率が高い。
【００６０】
実験例６  プロテオミクス方法の標識化合物１に捕獲された標的タンパク質に対する識別及び順位付け
【００６１】
１、標的識別
１．１  差異タンパク質分析：標的タンパク質を捕獲するためのＰＡＧＥゲル（図７）と空白制御とはそれぞれ北京ゲノミクス研究所でタンパク質分析及び比較を行う（結果が図８に示す）。
１．２  潜在標的タンパク質の順位付け：２．１の比較結果に基づいて、差異タンパク質から骨架タンパク質などを除外し、潜在の標的タンパク質を（相対）存在度に基づいて優先度の順位付けを行う（結果が図８に示す）。
【００６２】
実験例７  標識化合物１に捕獲された標的確認
【００６３】
１、材料及び試薬
ヒト完全長ＰＴＰ１Ｂタンパク質はＳｉｇｍａ会社（Ｃａｔ#  ＳＲＰ０２１５，Ｌｏｔ#３０００９２０３２２）から購入し、基質（４−ニトロフェニルりん酸二ナトリウム（六水和物））はＳｉｇｍａ会社（Ｃａｔ#７１７６８）から購入し、実験用の緩衝液などはＳｉｇｍａから購入する。
【００６４】
２、標的タンパク質の確認
２．１  化合物のＰＴＰ１Ｂ抑制性に対する試験：１０μＬの異なる濃度の化合物を９０μＬ基質含有の、ＰＴＰ１Ｂの反応系に加入し、終濃度がそれぞれ１０，３，１，０．３，０．１，０．０３，０．０１，０．００３，０．００１、０．０００３，０μΜであり、室温にて１５ｍｉｎ反応し、６０ｓごとに４０５ｎｍ箇所にその吸収値を測定する。化合物を含有しない反応レート（吸光値増加量／反応時間）１００％で、各濃度点の反応レートの相対パーセントを計算する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ作図ソフトウェアを採用してｓｉｇｍｏｉｄａｌｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ）モデルで曲線適合を行い、検出待ち化合物のＩＣ５０値を計算する（図９）。
２．２  標的識別のための修飾されない化合物は識別された標的に対して１つずつ確認し、該化合物がＰＴＰ１Ｂのみに抑制性を有することを発見することでＰＴＰ１Ｂが該化合物の細胞内標的であることを確定する。
【００６５】
実施例８  標識化合物３の合成及びトランスファー
【００６６】
標識化合物３の合成経路は以下の通りである。
0006262848.tif 000004
【００６７】
化合物３−２:
５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸（５'−（ＣＨ２）１２−Ａ１９−３'−ＦＩＴＣ）（８０ｎｍｏｌ）、アジド酢酸（化合物３−１）（１．６μｍｏｌ，２００ｅｑ．）、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）-４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴ−ＭＭ，１．６μｍｏｌ，２００ｅｑ．）の８０μＬ  ０．５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）、１６０μＬ脱イオン水及び１６０μＬジメチル・スルホキシド混合溶液を室温にて低速に終夜振動する。その後に、反応系は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムによって分離され、凍結乾燥して化合物（化合物３−２）（白色固体）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ（ＴＯＦ）:６７２０
【００６８】
標識化合物３：
６μＬの溶液Ａ（硫酸銅とトリス[（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル] アミンはモル比１:２で体積比４:３:１の水／ジメチル・スルホキシド／ｔｅｒｔ−ブタノールの溶液を溶解し、濃度が１０ｍＭである）を溶液Ｂ（化合物３−２（５０ｎｍｏｌ）の４０μＬ水溶液と４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ν−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸（化合物１−３）（３ｕｍｏｌ）の１００μＬ  ＤＭＳＯ溶液）に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、１２０μＬの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム（１２００ｎｍｏｌ）水溶液を上記反応系に加入し、室温にて低速に終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムで分離純化して生成物である標識化合物３（淡黄色固体）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ（ＴＯＦ）:７３４５。
【００６９】
実施例３において標識化合物１と同じトランスファー方法を採用して、レーザー共焦点顕微鏡で観察して図１０に示すような結果が得られる。すなわち、標識化合物１のように、標識化合物３はＸ−ｔｒｅｍｅｓｉＲＮＡに細胞内にトランスファーされることができ、大部分が細胞質にあり、少数が細胞核に進入する。この結果によれば、同一化合物が異なるＤＮＡ／ＲＮＡに接続しても、細胞にトランスファーすることもできる。
【００７０】
実施例９  標識化合物４の合成及びトランスファー
【００７１】
標識化合物４の合成経路は以下の通りである。
0006262848.tif 000005
【００７２】
化合物４−２:
将化合物４−１（４４１ｍｇ，１ｍｍｏｌ）、臭化プロパルギル（９５ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１３８ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのΝ，Ν−ジメチルホルムアミドに溶解し、室温にて終夜攪拌する。減圧して蒸留して粗生成物が得られる。５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、順次に水で３回洗浄し、飽和塩水で３回洗浄し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、化合物４−２（黄色固体，２８７ｍｇ，６０％収率）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳＩ）:４２４（Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ）＋;４８０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７３】
化合物４−３:
化合物４−２（８７ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）、水酸化リチウム一水化合物（１２６ｍｇ，３ｍｍｏｌ）を５ｍＬのメタノールと５ｍＬの水に溶解し、回流して終夜攪拌する。蒸留してアルコールが除去される。２０ｍＬの水で希釈し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２．０程度に酸性化され、凍結乾燥して粗生成物が得られる、直接的に逆相高速液体分離によって化合物４−３（黄色固体，２１６ｍｇ，８０％収率）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳＩ）:４１０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７４】
標識化合物４：
６μＬの溶液Ａ（硫酸銅とトリス[（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル] アミンがモル比１:２で体積比４:３:１の水／ジメチル・スルホキシド／ｔｅｒｔ−ブタノールの溶液に溶解し、濃度が１０ｍＭである）を溶液Ｂ（化合物４−４（５０ｎｍｏｌ）の４００μＬ水溶液と化合物４−３（３ｕｍｏｌ）の１００μＬ    ＤＭＳＯ溶液）に加入し、ボルテックスして遠心分離された後にに、１２０μＬの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム（１２００ｎｍｏｌ）水溶液を上記反応系に加入し、室温にて低速に終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムによって分離純化して標識化合物４（淡黄色固体）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ（ＴＯＦ）:７１９１
【００７５】
実施例３における標識化合物１と同じトランスファー方法を採用して、レーザー共焦点顕微鏡で観察し、図１１に示すような結果が得られる。標識化合物１と同じであり、標識化合物４はＸ−ｔｒｅｍｅｓｉＲＮＡに細胞にトランスファーされることができ、大部分が細胞質にあり、少数が細胞核に進入する。結果によれば、異なる化合物分子は本発明の方法を採用して細胞にトランスファーされることもできる。
【００７６】
以上のように、本発明の方法は細胞内の薬物標的の捕獲及び検証を効果的に行うことができ、薬物の作用機構に対して直接、確かな証拠を提供する。
【図１】
0006262848.tif 000006
【図２】
0006262848.tif 000007
【図３】
0006262848.tif 000008
【図４】
0006262848.tif 000009
【図５】
0006262848.tif 000010
【図６】
0006262848.tif 000011
【図７】
0006262848.tif 000012
【図８】
0006262848.tif 000013
【図９】
0006262848.tif 000014
【図１０】
0006262848.tif 000015
【図１１】
0006262848.tif 000016
【配列表】
0006262848000001.app