(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞に由来するエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分として含む脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物であって、
前記脳炎症性疾患は、脳炎、脳髄膜炎、及び髄膜脳炎からなる群より選択される１又は複数の疾患であり、
前記幹細胞はトロンビン処理されている、
前記脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記幹細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞である、請求項１に記載の脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）、ヒト組織由来間葉系幹細胞、多能性幹細胞、及び羊膜上皮細胞からなる群より選択される、請求項２に記載の脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、及び胎盤からなる群より選択される１又は複数の組織に由来する、請求項３に記載の脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記脳髄膜炎は、細菌、寄生虫、真菌、原虫類、及びウイルスからなる群より選択される１又は複数によって誘発される、請求項１に記載の脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記脳髄膜炎は、細菌感染性脳髄膜炎である、請求項５に記載の脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物。
【請求項７】
エキソソーム以外にエキソソーム内部物質をさらに含む、請求項１に記載の脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物。
【請求項８】
経口、直腸内、血管内、筋肉内、皮下、子宮内、脳血管内、又は脳室内に投与される、請求項１に記載の脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞由来エキソソームを有効成分として含む脳炎症性疾患の治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは、未分化の細胞であって、自己複製能力を有し、且つ、２つ以上の異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞を言う。幹細胞は、分化能によって、全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、分化多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、多分化能性（多能性）幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）に分類でき、細胞学的由来によって、胚性幹細胞と成体幹細胞に分類できる。胚性幹細胞は、着床前の受精卵や発生中の胎児生殖器組織等に由来するのに対し、成体幹細胞は、成体内で存在する各器官、例えば骨髄、脳、肝、膵腸等に由来する。
【０００３】
全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、１つの完全な個体に発生していくことができる全能性を有する細胞であって、卵子と精子の受精以後８細胞期までの細胞がこのような性質を有し、この細胞を分離して子宮に移植すると、１つの完全な個体に発生していくことができる。
【０００４】
分化多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、外胚葉、中胚葉、内胚葉層由来の多様な細胞と組織に発生し得る細胞であって、受精４〜５日後に現われる胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内側に位置する内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）に由来し、これを胚性幹細胞と言い、多様な組織細胞に分化するが、新しい生命体を形成ことはできない。
【０００５】
多能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、この細胞が含まれている組織及び器官に特異的な細胞だけに分化できる幹細胞であって、胎児期、新生児期及び成体期の各組織及び臓器の成長と発達はもちろん、成体組織の恒常性維持と組織損傷時に再生を誘導する機能に関与しており、組織特異的多能性細胞を総称して成体幹細胞と言う。成体幹細胞は、人体の各種臓器に既に存在する細胞を採取し、幹細胞に発展させたもので、特定の組織だけに分化する特徴がある。しかし、最近では、成体幹細胞を利用して肝細胞等各種組織に分化させる実験が成功していて、注目される。
【０００６】
幹細胞は、自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ）、分化、永久性（ｉｍｍｏｒｔａｌ）等の特徴があり、多様な組織から得られる成体幹細胞は、一般的に胚性幹細胞に比べてソースが無制限的であり、研究者が直面し得る倫理的問題を避けることができるため、広く研究に利用されている。
【０００７】
最近、幹細胞を脳梗塞、外傷性神経損傷及び筋骨格系疾患等多様な疾患に適用して、前臨床研究や臨床研究が試みられている。しかし、現在技術的な水準は、単純な幹細胞の抽出及び培養／増殖とこれを注入する程度に止まっており、最近までの臨床研究結果、このような幹細胞治療は、まだ明白な効果を示さないものとして知られている。これより、治療効果を増進するために、多様な遺伝子操作幹細胞を利用した研究が進行されているが、遺伝子操作を利用した細胞治療は、倫理的な問題に起因して人体で適用しにくいという限界点がある。
【０００８】
その他、幹細胞を利用した治療方法を臨床に適用するのにいくつかの問題点がある。例えば、幹細胞が組織に生着した後、腫塊形成の危険性があり、幹細胞自体の大きいサイズに起因して動脈閉塞を誘発し、脳梗塞をもたらす可能性があり、急性期のように血液脳関門が開かれた状態では、脳内に移動が容易であるが、慢性期では、大きいサイズに起因して移動が制限される。
【０００９】
なお、エキソソームは、多数の種類の細胞から分泌される膜構造の小さい小胞である。エキソソームの直径は、約３０〜１００ｎｍであると報告されている。エキソソームは、電子顕微鏡を用いた研究において原形質膜から直接脱離するのではなく、多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｂｏｄｉｅｓ、ＭＶＢｓ）と呼ばれる細胞内の特定区画に起源し、細胞外に放出、分泌されることが観察された。すなわち、多胞体と原形質膜の融合が起きれば、小胞は、細胞外環境に放出され、これをエキソソームと呼ぶ。このようなエキソソームがどんな分子的機作によって作られるかについて明確になっていないが、赤血球細胞のみならず、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球、樹枝状細胞、血小板、大食細胞等を含む多様な種類の免疫細胞と腫瘍細胞、幹細胞等も、生きている状態でエキソソームを生産して分泌すると知られている。特に、幹細胞に由来するエキソソームは、受容体及びタンパク質のみならず、核成分を含有していて、細胞間のコミュニケーションの役目をするものと知られている。また、前記幹細胞に由来するエキソソームは、幹細胞に比べて動物血清を相対的に少なく含有していて、動物血清感染による症状（ｚｏｏｎｏｓｉｓ）の危険性をも排除できる。このようなエキソソームの特性を考慮すれば、エキソソームを利用した細胞治療法は、従来の幹細胞治療法の限界を克服できる新しいパラダイムになるものと期待される。
【００１０】
なお、脳炎症性疾患というのは、特定の原因によって脳に発生する炎症性疾患を意味するものであり、脳炎、脳髄膜炎、髄膜脳炎等をすべて含む概念である。脳炎というのは、脳実質の炎症性疾患を総称する言葉であって、脳を包んでいる脳髄膜に生ずる炎症（脳髄膜炎）とは区別される疾患である。脳髄膜炎と脳炎が一緒にある場合は、これを髄膜脳炎と言う。脳炎は、原因によって、感染性、血管炎性、腫瘍性、化学性、特発性等に大きく分類でき、それぞれ詳細項目によって、具体的な病因に対する脳炎にさらに分類できる。また、疾患の時間的経過によって、急性、亜急性、慢性脳炎に分類できる。現在まで脳炎症性疾患の治療のための方案として抗生剤を利用しているが、抗生剤治療によって原因菌が治療されたとしても、深刻な脳損傷、水頭症、難聴、てんかん等の副作用が起こっており、これに対する新しい治療法の開発が要求されている。しかし、現在まで、幹細胞由来エキソソームを利用した脳炎症性疾患の治療に対しては、体系的な研究が不十分な現況である。
【００１１】
これより、本発明者らは、新しい脳炎症性疾患の治療剤を開発するために研究を重ねた結果、幹細胞由来エキソソームが、神経細胞で炎症による細胞の死滅を抑制し、脳炎症性疾患動物モデルにおいて優れた治療効果があることを確認することによって、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、幹細胞由来エキソソームを有効成分として含む脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は、幹細胞由来エキソソームを有効成分として含む脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明による幹細胞由来エキソソームは、神経細胞において炎症による細胞の死滅を抑制し、脳炎症性疾患動物モデルにおいて生存率を増加させ、浮腫等炎症反応による脳損傷及び炎症性サイトカイン数値を顕著に減少させる等、優れた治療効果を有していて、脳炎症性疾患の治療に有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、トロンビン処理によって幹細胞においてエキソソームが分泌される過程をＴＥＭイメージ分析を通じて確認した図である（左：トロンビン処理前、右：トロンビン処理後）。
【図２】図２は、本発明で分離した幹細胞由来エキソソームにおいてエキソソームマーカーであるＣＤ６３及びＣＤ９が正常に発現されるかどうかを確認した図である。
【図３】図３は、神経細胞にＬＰＳを処理したとき、ＬＰＳの処理濃度による神経細胞の生存能を示す図である。
【図４】図４は、神経細胞にＬＰＳを処理した後、本発明の幹細胞由来エキソソームを処理したとき、神経細胞の生存能を示す図である。
【図５】図５は、脳炎症性疾患動物モデルを利用した実験期間中の生存率を示す図である。
【図６】図６は、脳炎症性疾患動物モデルを利用した実験終了後、脳の重さを測定した結果を示す図である。
【図７】図７は、脳炎症性疾患誘導１日及び６日後、脳のＭＲＩ撮影結果及び脳損傷部位／全体脳部位の変化を示す図である。
【図８】図８は、脳炎症性疾患動物モデルにおいて幹細胞由来エキソソーム投与の有無による脳組織内の炎症性サイトカインの発現程度を示す図である。
【図９】図９は、脳炎症性疾患動物モデルにおいて幹細胞由来エキソソーム投与の有無による脳組織内のタンパク質の発現程度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、幹細胞由来エキソソームを有効成分として含む脳炎症性疾患の治療用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
本発明において幹細胞とは、未分化の細胞であって、自己複製能力を有し、且つ、２つ以上の異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞を言う。
【００１８】
本発明の幹細胞は、自己または同種由来幹細胞であることができ、ヒト及び非ヒト哺乳類を含む任意類型の動物由来であることができ、前記幹細胞が成体から由来したものであってもよく、胚から由来したものであってもよく、これに限定されない。
【００１９】
本発明の幹細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞を含み、好ましくは、成体幹細胞である。前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）、ヒト組織由来間葉系幹細胞、多能幹細胞または羊膜上皮細胞であることができ、好ましくは、間葉系幹細胞であるが、これに限定されない。前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜及び胎盤等に由来する間葉系幹細胞であることができるが、これに限定されない。
【００２０】
本発明においてエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は、多様な細胞から分泌される膜構造の小さい小胞を意味する。エキソソームの直径は、約３０〜１００ｎｍであり、多胞体と原形質膜の融合が起きて、細胞外の環境に放出される小胞を意味する。
【００２１】
本発明において脳炎症性疾患は、脳に発生するすべての炎症性疾患を総称するものであり、脳炎、脳髄膜炎、髄膜脳炎を含み、好ましくは、脳髄膜炎であり、さらに好ましくは、細菌感染性脳髄膜炎である。
【００２２】
前記脳髄膜炎は、原因によって、ウイルス性と非ウイルス性に分けられる。
前記ウイルス性脳髄膜炎には、単純疱疹ウイルス、アルボウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス、巨大細胞ウイルス、日本脳炎ウイルス等による脳髄膜炎が含まれ、これに制限されない。
【００２３】
前記非ウイルス性脳髄膜炎には、細菌（例えば、ヘモフィルスインフルエンザ、ナイセリア脳炎菌、肺炎球菌、連鎖状球菌、ブドウ状球菌、大腸菌、連鎖状球菌等）、寄生虫（例えば、のう尾虫、トキソプラズマ）、真菌、原虫類（例えば、アメーバ等）等による脳髄膜炎が含まれ、これに制限されない。
【００２４】
本発明の一実施例において、幹細胞由来エキソソームが、神経細胞において炎症による細胞の死滅を抑制し、脳炎症性疾患動物モデルにおいて生存率を増加させ、浮腫等炎症反応による脳損傷及び炎症性サイトカイン数値を顕著に減少させる等、脳炎症性疾患に対する優れた治療効果があることを確認した。
【００２５】
したがって、本発明による幹細胞由来エキソソームは、脳炎症性疾患の治療のための医薬品として有用に用いられる。
【００２６】
本発明の組成物は、幹細胞由来エキソソームとともに、脳炎症性疾患の治療効果を有する公知の有効成分を１種以上さらに含有することができる。
【００２７】
本発明の組成物は、幹細胞由来エキソソームとともに、エキソソーム内部物質をさらに含むことができる。
前記エキソソーム内部物質は、エキソソームに由来する組織または細胞に由来するタンパク質、脂質、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等を含み、これに制限されない。
【００２８】
本発明の組成物は、薬学的組成物の製造に通常的に使用する適切な担体をさらに含むことができる。例えば、注射剤の場合には、保存剤、無痛化剤、可溶化剤または安定化剤等をさらに含むことができ、局所投与用製剤の場合には、基剤（ｂａｓｅ）、賦形剤、潤滑剤または保存剤等をさらに含むことができる。
【００２９】
本発明の組成物は、薬学的分野において通常の方法によって個体の身体内投与に適した単位投与型の製剤で剤形化させて投与することができる。このような目的に適した剤形としては、非経口投与製剤として注射用アンプルのような注射剤、注入バッグのような注入剤、及びエアロゾル製剤のような噴霧剤等が好ましい。前記注射用アンプルは、使用直前に注射液と混合調剤でき、注射液としては、生理食塩水、ブドウ糖、リンゲル液等を使用できる。また、注入バッグは、塩化ポリビニルまたはポリエチレン材質のものを使用できる。本発明において投与は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
【００３０】
本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で投与され得る。投与のすべての方式は、予想され得、例えば、経口、直腸内、血管内（静脈、動脈等）、筋肉内、皮下、子宮内または脳血管内の注射によって投与され得、好ましくは、治療が必要な個体の脳室内に直接生着または移植するが、これに限定されない。
【００３１】
本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、個体の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なり、当業者によって適宜選択され得る。前記組成物の投与は、一日に一回投与してもよく、数回に分けて投与してもよく、これに限定されない。
【００３２】
本発明の組成物は、脳炎症性疾患の治療のために、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を用いた方法と併用して使用できる。
【００３３】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明を容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１：幹細胞由来エキソソームの分離
幹細胞由来エキソソームを分離するために、超遠心分離機（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を利用した。より具体的に、ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞を培養培地に１×１０５細胞／ｍＬの濃度となるように希釈した後、６０ｍｍ培養ディッシュに３ｍＬずつ分注し、１週間培養した。培養ディッシュで幹細胞が完全に増殖されたことを確認した後、５０Ｕ／ｍＬ濃度のトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）が希釈されている培養培地に交替し、さらに２４時間培養した。その後、培養液を２ｍＬ遠心分離チューブに分けて入れ、４℃、１０，０００ｇで３０分間遠心分離した後、上澄み液を新しいチューブに移して細胞破片（ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。前記上澄み液をさらに４℃、１００，０００ｇで２時間超遠心分離し、上澄み液を除去し、最終的にエキソソームを分離した（最終濃度１５ｍｇ／ｍＬ）。
【００３５】
幹細胞由来エキソソームの分泌過程をＴＥＭイメージを通じて確認し、前記過程を通じて分離したエキソソームにおいてエキソソームマーカーであるＣＤ６３及びＣＤ９（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）の発現をウェスタンブロットを通じて確認した。その結果をそれぞれ図１及び図２に示す。
【００３６】
図１に示されたように、トロンビン処理によって間葉系幹細胞でエキソソームが分泌されることを確認した。
【００３７】
また、図２に示されたように、分離された幹細胞由来エキソソームは、正常にエキソソームマーカーであるＣＤ６３及びＣＤ９を発現していることを確認した。
【００３８】
実施例２：ｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞由来エキソソームの神経細胞保護効果検証
前記実施例１で収得した幹細胞由来エキソソームの神経細胞保護効果を検証するために、下記のような実験を行った。
【００３９】
まず、妊娠週齢１８．５日になった白鼠から胎児を取り出して大脳皮質を分離した後、１次膠細胞及び神経細胞とともに、７日間培養した。前記細胞にＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）を濃度別に処理した後、細胞死滅程度を観察した。その結果を図３に示した。
【００４０】
図３に示されたように、ＬＰＳが１０μｇ／ｍＬの濃度であるとき、約４０％の神経細胞が死滅することを確認し、その後、前記濃度条件で処理した神経細胞を脳炎症細胞モデルとして利用した。
【００４１】
次に、前記のように、ＬＰＳを１０μｇ／ｍＬの濃度で処理した神経細胞に前記実施例１で収得した幹細胞由来エキソソームを１５μｇずつ処理した後、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｋｉｔ（Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を利用して細胞生存能を測定した。その結果を図４に示す。
【００４２】
図４に示されたように、細胞死滅が誘導された神経細胞に本発明による幹細胞由来エキソソームを処理する場合、神経細胞の死滅程度が顕著に抑制されることを確認し、これを通じて、幹細胞由来エキソソームの神経細胞保護効果を確認した。
【００４３】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｖｏで幹細胞由来エキソソームの脳炎症性疾患の治療効果検証
３−１．細菌感染性脳髄膜炎動物モデルのデザイン
細菌感染性脳髄膜炎動物モデルを作るために、生後１０日になった新生白鼠を吸入麻酔した後、ステレオタキシックフレーム（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｆｒａｍｅ）を利用して右側脳室に１×１０３  ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）のＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（１０ｕＬ）を３１  ｇａｕｚｅ注射器で６０秒にわたってゆっくり投与し、抗生剤（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ、２００ｍｇ／ｋｇ）を１２時間間隔で２日間投与した。本発明の幹細胞由来エキソソームの脳髄膜炎治療効果を確認するために、モデリング（細菌感染性脳髄膜炎誘発）１日後である、生後１１日（Ｐ１１）目に、前記実施例１で収得した間葉系幹細胞由来エキソソーム（２０μｇ）を１０ｕＬのＰＢＳに希釈した後、一酸化窒素（ＮＯ）吸入麻酔の下にステレオタキシックフレームを利用して、実験群（ＭＥＮ＋ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）白鼠の右側脳室内にゆっくり投与した。脳髄膜炎対照群（ＭＥＮ）の場合、生理食塩水を白鼠の右側脳室内に投与し、比較群（ＭＥＮ＋ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）には、線維芽細胞由来エキソソームを同一の容量で白鼠の右側脳室内に投与した。
【００４４】
３−２．生存率及び脳組織分析
実験期間中の生存率を分析し、実験終了後、脳の重さを測定し、ＭＲＩ撮影を通じて脳組織の損傷された部位を分析した。
【００４５】
より具体的に、細菌感染性脳髄膜炎誘発６日後、各白鼠の四肢を固定し、胸郭を切開して心臓と肺の組織を露出させた後、２３ケージ針を左心室内に固定し、右心房を穿刺して、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を灌流させた。その後、頭蓋骨を切開し、注意深く脳組織を採取し、その重さを測定した。また、脳髄膜炎誘発１日後及び６日後の白鼠の脳を７−ｔｅｓｌａｒ磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を利用して撮影し、脳髄膜炎による損傷の程度をＤＷＩ（Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｉｍａｇｅ）領域で確認した。脳ＭＲＩイメージは、Ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを利用して脳室拡張とＤＷＩの脳実質慶色部位を測定し、脳損傷と定義し、「全体損傷された脳の体積／全体脳の体積」を求めた。以上の実験結果を図５〜図７にそれぞれ示す。
【００４６】
図５に示されたように、脳髄膜炎対照群（ＭＥＮ）及び比較群（ＭＥＮ＋ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に比べて間葉系幹細胞由来エキソソームを投与した実験群（ＭＥＮ＋ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）の生存率が高く現われることを確認した。
【００４７】
また、図６に示されたように、正常群（ＮＣ）に比べて脳髄膜炎対照群（ＭＥＮ）の脳の重さが有意に減少するのに対し、間葉系幹細胞由来エキソソームを投与した実験群（ＭＥＮ＋ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）の脳の重さは、正常群と大きい差異がないことを確認した。
【００４８】
また、図７に示されたように、脳髄膜炎対照群（ＭＥＮ、Ｓａｌｉｎｅ）は、深刻な脳実質の浮腫（ｅｄｅｍａ）と脳室拡張の所見が認められ、脳損傷が観察されたが、間葉系幹細胞由来エキソソームを投与した実験群（ＭＥＮ＋ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）は、脳髄膜炎対照群（ＭＥＮ）及び比較群（ＭＥＮ＋ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に比べて実験期間中に脳損傷の程度が顕著に改善されることを確認した。
【００４９】
３−３．脳組織内のタンパク質発現分析
前記実施例３−２で分離された脳組織からタンパク質を分離した後、従来公知されたＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）方法を通じて炎症性サイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）の発現程度を測定し、ウェスタンブロットを通じてＣａｓｐａｓｅ−３及びＧＦＡＰの発現程度を分析した。以上の実験結果を図８及び図９にそれぞれ示す。
【００５０】
図８に示されたように、脳の炎症性サイトカインの数値が正常群（ＮＣ）に比べて脳髄膜炎対照群（ＭＥＮ）で急激に増加した。一方、間葉系幹細胞由来エキソソームを投与した実験群（ＭＥＮ＋ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）は、前記のような脳の炎症性サイトカインの数値が脳髄膜炎対照群に比べて有意に好転され、これは、比較群（ＭＥＮ＋ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に比べて顕著に優れた結果であった。
【００５１】
また、図９に示されたように、反応性膠化の程度と細胞の死滅程度を判断できるＣａｓｐａｓｅ−３及びＧＦＡＰの発現が正常群（ＮＣ）に比べて脳髄膜炎対照群（ＭＥＮ）で急激に増加し、脳損傷が起きたことを確認した。一方、間葉系幹細胞由来エキソソームを投与した実験群（ＭＥＮ＋ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）は、前記のようなタンパク質発現が脳髄膜炎対照群に比べて有意に減少し、これは、比較群（ＭＥＮ＋ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に比べて顕著に優れた結果であった。
【００５２】
以上の実験結果を通じて、幹細胞由来エキソソームが、神経細胞で炎症による細胞の死滅を抑制し、脳炎症性疾患の動物モデルにおいて生存率を増加させ、浮腫等炎症反応による脳損傷及び炎症性サイトカイン数値を顕著に減少させる等、脳炎症性疾患に対する優れた治療効果を有していることを確認した。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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