(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量のホスホジエステラーゼ4(PDE4)阻害剤と、ケラチノサイトの増殖に同時に影響を与えることなく該PDE4阻害剤の投与により誘発される炎症促進性サイトカインインターロイキン-22(IL-22)の発現上昇を阻害する、PDE4阻害剤の量の1000分の1未満であって10000分の1以上の量のビタミンD受容体作動薬とを含む、炎症性皮膚疾患または症状の処置に用いるための医薬組成物であって、
ビタミンD受容体作動薬が、カルシポトリオール、カルシトリオール、タカルシトールおよびマキサカルシトールからなる群から選択され、
PDE4阻害剤が、ロフルミラスト、GSK256066、オグレミラスト、テトミラスト、アプレミラスト、AN2728、2-{6-[2-(2,3-ジクロロピリジン-4-イル)アセチル]-2,3-ジメトキシフェノキシ}-N-プロピルアセトアミド (化合物A)、N-ベンジル-2-{6-[2-(3,5-ジクロロピリジン-4-イル)アセチル]-2,3-ジメトキシフェノキシ}アセトアミド (化合物B)、2-(3,5-ジクロロピリジン-4-イル)1-{2-[2-(4-フルオロフェニル)エトキシ]-3,4-ジメトキシフェニル}エタノン (化合物C)、2-(3,5-ジクロロピリジン-4-イル)-1-{9-メトキシ-スピロ[2H-1,5-ベンゾジオキセピン-3(4H),3’-オキセタン]-6-イル}エタノン (化合物D)および2-{6-[2-(3,5-ジクロロピリジン-4-イル)アセチル]-2,3-ジメトキシフェノキシ}-N-(2-ジメチルアミノエチル)アセトアミド (化合物E)からなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
ビタミンD受容体作動薬がカルシポトリオールまたはカルシポトリオール一水和物である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
PDE4阻害剤が2-{6-[2-(2,3-ジクロロピリジン-4-イル)アセチル]-2,3-ジメトキシフェノキシ}-N-プロピルアセトアミド (化合物A)または2-(3,5-ジクロロピリジン-4-イル)-1-{9-メトキシ-スピロ[2H-1,5-ベンゾジオキセピン-3(4H),3’-オキセタン]-6-イル}エタノン (化合物D)である、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
炎症性皮膚疾患または症状が、乾癬、表皮炎症、脱毛症、皮膚萎縮症、ステロイド誘発性皮膚萎縮症、皮膚老化、光皮膚老化、ざ瘡、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹、そう痒および湿疹から選択される、請求項１〜３のいずれか記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化された分化ヒトＴ細胞におけるインターロイキン−22の発現を阻害する方法ならびに該方法に使用するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホジエステラーゼは、細胞内の環状AMPおよび／または環状GMPの、それぞれ5-AMPおよび5-GMPへの加水分解を触媒する酵素であり、そのため、cAMPまたはcGMPレベルの細胞での調節に重要である。これまで同定された11のホスホジエステラーゼのうち、ホスホジエステラーゼ (PDE) 4、PDE7およびPDE8は、cAMPに対して選択的である。PDE4は、免疫および炎症性細胞、例えば好中球、マクロファージおよびＴリンパ球に発現するcAMPの最も重要な調節因子である (Z. Huang and J.A. Mancini, Current Med. Chem. 13, 2006, pp. 3253-3262)。cAMPは、炎症応答の調節の重要な二次メッセンジャーであるため、PDE4は、炎症促進性サイトカイン、例えばTNFα、IL-2、IFN-γ、GM-CSFおよびLTB4を調節することにより、炎症細胞の炎症性応答を調節することが明らかになっている。したがって、PDE4の阻害は、炎症性疾患、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD) 、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、クローン病の治療の魅力的な標的となっている(M.D. Houslay et al., Drug Discovery Today 10 (22), 2005, pp. 1503-1519; N. Press & K.H. Banner, Progress in Medicinal Chemistry 47, 2009, pp. 37-74)。アトピー性皮膚炎(AD) の患者では、PDE活性が上昇しており、PDE4阻害はまた、ADの実行可能な処置方法であると考えられる (Journal of Investigative Dermatology (1986), 87(3), 372-6; N. Ishii et al., J. Pharmacol. Exper. Ter. 346, 2013, pp. 105-112)。
【０００３】
PDE4遺伝子ファミリーは少なくとも４つの遺伝子、A、B、CおよびDからなり、これらは高い相同性を有する(V. Boswell Smith and D. Spina, Curr. Opinion Investig. Drugs 6(11), 2006, pp. 1136-1141)。この４つのPDE4アイソフォームは、様々な組織および細胞種において異なる発現を示す。すなわち、PDE4Bは主に単球および好中球に発現するが、皮質および上皮細胞には発現しない。一方、PDE4Dは肺、皮質、小脳およびT細胞に発現する(C. Kroegel and M. Foerster, Exp. Opinion Investig. Drugs 16(1), 2007, pp. 109-124)。
【０００４】
無数のPDE4阻害剤について、炎症性疾患、原発性喘息、炎症性腸疾患およびCOPDに対する治療効果が調べられている。これらのPDE4阻害剤のうち最初のものである、テオフィリンは、弱い非選択的なホスホジエステラーゼ阻害剤であり、呼吸器疾患、例えば喘息およびCOPDの処置に用いられる。しかし、テオフィリンでの処置は、軽度および重度の副作用、例えば不整脈および痙攣を引き起こすため、テオフィリンの臨床的な有用性は限定されている(上記Kroegel and Foerster)。ホスホジエステラーゼ4は未だに抗炎症性治療の魅力的な標的であるため、いくつかの他の、より選択的なPDE4阻害剤が開発されており、臨床試験が行われている。ロリプラムのような第一世代のPDE4阻害剤は、用量限定性の副作用、主に悪心と嘔吐により、臨床開発が中止されている。第二世代のPDE4阻害剤は、副作用が顕著に減少しており、現在臨床試験が行われている(上記Houslay)。
【０００５】
PDE4阻害活性を示す化合物は、炎症性のアレルギー疾患、例えば気管支喘息、COPD、アレルギー性鼻炎および腎炎; 自己免疫性疾患、例えば関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病および全身性エリテマトーデス；中枢神経系の疾患、例えば、鬱病、健忘症および認知症；心不全、ショックおよび脳血管疾患等により引き起こされる虚血性かん流(ischemic reflux)に伴う臓器障害；インスリン抵抗性糖尿病；創傷；ならびに病因および進行において炎症が寄与している他の疾患の全身性の治療剤として用いることが提案されている。
【０００６】
PDE4阻害活性を示す化合物はまた、種々の皮膚疾患もしくは症状、例えば増殖性および炎症性皮膚障害、具体的には、乾癬、表皮炎症、脱毛症、皮膚萎縮症、ステロイド誘発性皮膚萎縮症、皮膚老化、光皮膚老化、ざ瘡、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹、そう痒および湿疹の予防、処置または改善に有益であり得る。
【０００７】
乾癬発症の原因となっている病理プロセスの１つは、乾癬プラークにおける、自己永続的炎症サイクルを誘発するサイトカインを発現する活性化免疫細胞、例えばTh1およびTh17細胞による皮膚の浸潤である。特に、サイトカインTNFα、IL-17およびIL-22は、乾癬の発症および進行に中心的重要性を担うことが示されている。活性化し、Th1/Th17表現型に分化したヒト末梢血T細胞を用いたインビトロアッセイを行い、サイトカイン発現に対する効果を測定することによって、試験化合物の抗炎症効果を評価した。
【０００８】
本発明に至る研究過程において、驚くべきことに、PDE4阻害剤をTh1/Th17アッセイにて試験すると、炎症促進性サイトカインであるIL-22および、それより低い程度ではあるが、IL-17の発現を上昇させることが明らかになった。IL-22は、乾癬およびアトピー性皮膚炎の患者において強く発現が上昇しており、このことは、IL-22の慢性皮膚炎症状態における役割を強調するものである。IL-22は、非造血系起源の細胞、例えばケラチノサイトを含む上皮細胞、内皮細胞および線維芽細胞により発現される受容体を介して、ケラチノサイトの増殖および分化の変化の誘導ならびに、炎症性分子、例えばMHCクラスI、IL-6およびIL-8の発現において重要な役割を果たし、それによって皮膚の炎症を促進する。抗炎症薬として治療剤として用い得る化合物による、抗炎症性サイトカインの予期できない発現上昇は、IL-22の発現を低下させることのできる他の治療上有効な化合物との併用処置を行う根拠となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Z. Huang and J.A. Mancini, Current Med. Chem. 13, 2006, pp. 3253-3262
【非特許文献２】M.D. Houslay et al., Drug Discovery Today 10 (22), 2005, pp. 1503-1519
【非特許文献３】N. Press & K.H. Banner, Progress in Medicinal Chemistry 47, 2009, pp. 37-74
【非特許文献４】Journal of Investigative Dermatology (1986), 87(3), 372-6
【非特許文献５】N. Ishii et al., J. Pharmacol. Exper. Ter. 346, 2013, pp. 105-112
【非特許文献６】V. Boswell Smith and D. Spina, Curr. Opinion Investig. Drugs 6(11), 2006, pp. 1136-1141
【非特許文献７】C. Kroegel and M. Foerster, Exp. Opinion Investig. Drugs 16(1), 2007, pp. 109-124
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ビタミンD受容体作動薬であるカルシポトリオールは、Th1/Th17細胞に分化した活性化ヒトT細胞を用いたインビトロアッセイにて、IL-22の発現を強力に阻害し得ることが見出されている。このアッセイにて、カルシポトリオールを、一連のPDE4阻害剤とともに試験したとき、PDE4阻害剤を介するIL-22の発現上昇は相殺されたが、予期できないことに他の炎症促進性サイトカイン、特にTNFαに対するPDE4阻害剤の阻害効果は維持された。
【００１１】
したがって、一つの局面において、本発明は、活性化および分化ヒトT細胞における炎症促進性サイトカインであるインターロイキン22(IL-22)の発現上昇の阻害方法に関し、ここで、該発現上昇は、治療上有効量のホスホジエステラーゼ4(PDE4)阻害剤を投与することにより誘発されたものであり、該方法は、PDE4阻害剤とともに、ビタミンD受容体作動薬をIL-22の発現上昇を阻害するのに十分な量で、連続的に、または同時に投与することを含む。
【００１２】
他の局面において、本発明は、治療有効量のPDE4阻害剤および、PDE4阻害剤の投与により誘発される、炎症促進性サイトカインIL-22の発現上昇を阻害するのに十分な量のビタミンD受容体作動薬ならびに、薬学的に許容される担体もしくはビヒクルを含む、炎症性疾患または症状の処置に使用するための、医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】1μMの濃度の、臨床開発が行われている7種類のPDE4阻害剤による、Th1/Th17細胞におけるIL-22の発現上昇を示すグラフを表す。
【図２】化合物Aによる、Th1/Th17細胞における用量依存的なIL-22の発現上昇を示すグラフを表す。
【図３】濃度120nMのカルシポトリオールと濃度5.6μMの化合物Aの、単独または組合せでの、Th1/Th17細胞におけるTNFα (図3a)およびIL-22 (図3b)の発現に対する効果を示すグラフを表す。「MC 903」はカルシポトリオールである。
【図４】濃度100nMのカルシポトリオールおよび、濃度1μMの５種類の異なるPDE4阻害剤の、Th1/Th17細胞におけるIL-22の発現に対する効果を示すグラフを表す。「MC 903」はカルシポトリオールである。
【図５】濃度100nMのカルシポトリオールおよび濃度1μMの7種類の異なるPDE4阻害剤の、Th1/Th17細胞におけるIL-22の発現に対する効果を示すグラフを表す。「Calcip」はカルシポトリオールである。
【図６】1μMの化合物Aの単独での、または濃度100nMの４種類の異なるビタミンD類似体との組合せにおける、Th1/Th17細胞におけるIL-22の発現に対する効果を示すグラフを表す。
【図７】異なる濃度のカルシポトリオール(MC903)の、1μMの濃度の化合物Aの存在下または非存在下における、Th1/Th17細胞におけるIL-22の発現に対する効果を示すグラフを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
本明細書において、「ビタミンD受容体作動薬（または短くは「ビタミンD作動薬」）」という語は、ビタミンD受容体の活性を刺激する生物学的に活性な化合物を指すことを意図する。ビタミンD受容体作動薬は、天然のビタミンD誘導体または合成ビタミンD類似体から選択してよい。カルシトリオール、カルシポトリオール、マキサカルシトールおよびタカルシトールは、本明細書に記載するTh1/Th17アッセイにおいて、IL-22の発現を低下させることが明らかになったビタミンD受容体作動薬の例である (図6を参照のこと)。
【００１５】
「カルシポトリオール」は、以下の式
【化１】
0006367819.tif 000002
で表されるビタミンD類似体である。
【００１６】
カルシポトリオールは、２つの結晶形態、すなわち無水物および一水和物の形態で存在することが明らかになっている。カルシポトリオール一水和物およびその製造方法は、WO 94/15912に記載されている。「カルシポトリオール」という語は、全ての形態の該化合物を含むことを意図する。
【００１７】
「ロフルミラスト」は、化合物3-(シクロプロピルメトキシ)-N-(3,5-ジクロロピリジン-4-イル)-4-(ジフルオロメトキシ)ベンズアミドである。
【００１８】
「テトミラスト」は、化合物6-[2-(3,4-ジエトキシフェニル)チアゾール-4-イル]ピリジン-2-カルボン酸である。
【００１９】
「GSK-256066」は、化合物6-[3-(N,N-ジメチルカルバモイル)フェニルスルホニル]-4-(3-メトキシフェニルアミノ)-8-メチルキノリン-3-カルボキサミド ヒドロクロリドである。
【００２０】
「オグレミラスト」は、化合物N-(3,5-ジクロロピリジン-4-イル)-4-(ジフルオロメトキシ)-8-メチルスルホニルアミド)ジベンゾ(b,d)フラン-1-カルボキサミドである。
【００２１】
「アプレミラスト」は、化合物(+)-N-[2-[1(S)-(3-エトキシ-4-メチルフェニル)-2-(メチルスルホニル)エチル]-1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イル]アセトアミドである。
【００２２】
「AN2728」は、化合物4-(1-ヒドロキシ-1,3-ジヒドロ-2,1-ベンゾオキサボロール-5-イルオキシ)ベンゾニトリルである。
【００２３】
化合物Aは、化合物2-{6-[2-(2,3-ジクロロピリジン-4-イル)アセチル]-2,3-ジメトキシフェノキシ}-N-プロピルアセトアミドである。
【００２４】
化合物Bは、化合物N-ベンジル-2-{6-[2-(3，5-ジクロロピリジン-4-イル)アセチル]-2，3-ジメトキシフェノキシ}アセトアミドである。
【００２５】
化合物Cは、化合物2-(3，5-ジクロロピリジン-4-イル)1-{2-[2-(4-フルオロフェニル)エトキシ]-3,4-ジメトキシフェニル}エタノンである。
【００２６】
化合物Dは、化合物2-(3，5-ジクロロピリジン-4-イル)-1-{9-メトキシ-スピロ[2H-1，5-ベンゾジオキセピン-3(4H)，3’-オキセタン]-6-イル}エタノンである。
【００２７】
化合物Eは、化合物2-{6-[2-(3，5-ジクロロピリジン-4-イル)アセチル]-2，3-ジメトキシフェノキシ}-N-(2-ジメチルアミノエチル)アセトアミドである。
【００２８】
「IL-22発現上昇」という語は、分化しているが未処置のT細胞(Th1/Th17細胞)におけるIL-22の発現上昇ならびに、PDE4阻害剤で処置した、分化したT細胞におけるIL-22のさらなる発現上昇の両方を指すことを意図する。
【００２９】
発明の態様
乾癬性の皮膚病変において、樹状細胞およびT細胞は互いに相互作用し、そしてケラチノサイトとも相互作用し、分子レベルで乾癬を規定する複雑なサイトカインネットワークを介して、自然免疫および獲得免疫と関連する。自然免疫細胞、特に炎症性樹状細胞によって、乾癬性の皮膚で産生される重要なサイトカインは、TNFαならびにIL-12およびIL-23であり、これらはともにT細胞のTh1またはTh17細胞への分化にそれぞれ重要な役割を果たす。Th1細胞は以前からIFN-γの産生により特徴付けられ、一方、Th17細胞は、シグネチャーサイトカインIL-17、IL-22およびIL-26を産生する。これらの重要なメディエーターの、乾癬の病変形成における重要性は、臨床において、TNFα、IL-17およびIL-12/IL-23の生物製剤による標的化の成功により確認されている。
【００３０】
Th17サブセットが乾癬および他の慢性免疫介在性の炎症性疾患、例えば乾癬性関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症および炎症性腸疾患において主要な役割を果たすことから、他のヘルパーT細胞サブセットの誘導の原因となる因子を抑制しながら、同時に系統／表現型特異的な転写因子の活性化による分化プログラムを構成するように規定されたサイトカイン環境によりTH1/Th17細胞に分化した活性化ヒトT細胞を用いて、インビトロ細胞アッセイを開発した(以下の実施例１を参照)。得られたTh1/Th17細胞を、異なる投与レベルおよび２つの有効成分の異なる投与量比の効果について、炎症促進性サイトカインであるIL-6、IL-8、IL-17、IL-22およびTNF-αの発現レベルを、異なる試験濃度を個々にまたは同時に適用した場合の結果と比較することによって、試験した。
【００３１】
ひとつの態様において、ビタミンD受容体作動薬は、カルシポトリオール、カルシトリオール、アルファカルシドール、タカルシトール、マキサカルシトールおよびパリカルシトールからなる群から選択してよい。現在好ましい局所投与の態様では、ビタミンD受容体作動薬は、カルシポトリオールまたはカルシポトリオール一水和物である。
【００３２】
PDE4阻害剤によるIL-22の発現上昇は、末尾の図１に見られるように、クラスエフェクトであると考えられるため、該PDE4阻害剤は、広範囲の公知PDE4阻害剤、例えばロフルミラスト、GSK256066、オグレミラスト、テトミラスト、アプレミラスト、AN2728、化合物A、化合物B、化合物C、化合物Dおよび化合物Eからなる群から選択されてよい。現時点での好ましい態様では、PDE4阻害剤は、化合物A (2-{6-[2-(2，3-ジクロロピリジン-4-イル)アセチル]-2，3-ジメトキシフェノキシ}-N-プロピルアセトアミド)および化合物D (2-(3，5-ジクロロピリジン-4-イル)-1-{9-メトキシ-スピロ[2H-1，5-ベンゾジオキセピン-3(4H)，3’-オキセタン]-6-イル}エタノン)である。
【００３３】
本発明の方法は、炎症性疾患または症状の処置に適当である。以下の実施例１に記載する細胞アッセイにおいて、カルシポトリオールと化合物Aを共投与することによって、Th1/Th17細胞において、広範囲のサイトカイン阻害が見られることが示された。化合物AによるTNFαおよびIL-6の阻害ならびにカルシポトリオールによるIL-22、IL-17およびIL-8の阻害は、組み合わせ処置によって維持された。最も有利なことに、カルシポトリオールの共投与により、化合物Aおよび他のPDE4阻害剤が介在するIL-22の発現が下方制御された。したがって、PDE4阻害剤とビタミンD受容体作動薬の共投与は、PDE4阻害剤の抗炎症効果を有意に増加させ、ステロイド処置の魅力的な代替となり得ると考えられる。末尾の図7に示す結果は、カルシポトリオールのIL-22発現に対する効果が、ケラチノサイトの増殖に影響を与える濃度よりもはるかに低い濃度で達成できることを示している。このことは、PDE4阻害剤とビタミンD受容体作動薬の組合せが、ケラチノサイトの増殖に同時に影響を与えることなく抗炎症性効果が必要とされている症状の処置に使用し得ることを示している。
【００３４】
PDE4阻害剤とビタミンD受容体作動薬の組み合わせで処置し得る炎症性疾患または症状の例は、炎症性アレルギー性疾患、例えば気管支喘息、COPD、アレルギー性鼻炎および腎炎; 自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病および全身性エリテマトーデス; 心不全、ショック、および脳血管疾患等により引き起こされる虚血性かん流に伴う臓器障害; インスリン耐性糖尿病; 創傷; ならびに、炎症が病因および進行に寄与している他の疾患である。本発明の方法を、免疫介在性の炎症性疾患、例えば乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症および炎症性腸疾患の処置に用いることは特に重要である。
【００３５】
現時点での好ましい態様において、本発明の方法は、炎症性の皮膚疾患または症状の処置に用いてよい。PDE4阻害剤とビタミンD受容体作動薬の組み合わせで、有利に処置しうる炎症性皮膚疾患または症状の例としては、乾癬、表皮炎症、脱毛症、皮膚萎縮症、ステロイド誘発性皮膚萎縮症、皮膚老化、光皮膚老化、ざ瘡、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹、そう痒および湿疹が挙げられる。該方法を、IL-22の発現上昇が重要な役割を果たす皮膚疾患から選択される炎症性皮膚疾患または症状、例えば乾癬およびアトピー性皮膚炎の処置に用いることは特に重要である。
【００３６】
末尾の図7に示す結果に基づいて、PDE4阻害剤によるIL-22の発現上昇を阻害するのに十分なビタミンD受容体作動薬の濃度は、該PDE4阻害剤の、治療上有効な濃度の10分の1よりもさらに低くてよいと考えられている。ビタミンD受容体作動薬の濃度は、PDE4阻害剤の治療上有効量の10分の1よりも低い濃度であってよい。ビタミンD受容体作動薬の濃度は、PDE4阻害剤の濃度の25分の1、50分の1、100分の1、250分の1、500分の1、750分の1または1000分の1未満であってもよいと考えられている。
【００３７】
したがって、該アッセイにおけるPDE4阻害剤の濃度が1μMであるとき、該PDE4阻害剤によるIL-22発現上昇を阻害するのに十分なビタミンD受容体作動薬の濃度は、100nM以下であってよい。該ビタミンD受容体作動薬の濃度は、(PDE4阻害剤の濃度が1μMの場合)都合良く、100nM〜100pMの範囲であってよい。より具体的には、ビタミンD受容体作動薬の濃度は、75nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、10nM、5nM、1nM、0.5nMまたは0.1nMであってよい。
【００３８】
本発明の方法に用いる医薬組成物は、治療上有効量のPDE4阻害剤およびPDE4阻害剤の投与によって誘発されるIL-22発現上昇を阻害するのに十分な量のビタミンD受容体作動薬ならびに薬学的に許容される担体またはビヒクルを含む。
【００３９】
適当な組成物としては、例えば、経口（持続性または徐放性放出を含む）、経皮、眼、局所、皮膚、経鼻または頬側投与に適当な形態のものが含まれる。本発明の組成物の局所投与は、特に、炎症性皮膚疾患又は症状の処置に用いる場合に適当である。
【００４０】
本発明の組成物は、製薬分野でよく知られた任意の方法、例えばRemington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., 2000に記載された方法によって製剤してよい。全ての方法は、有効成分を担体と混合する工程を含んでおり、該担体は、１以上の賦形剤である。一般的に、該組成物は、有効成分を均一におよび緻密に液体担体または、細かく粉砕された固体担体またはその両方と混合した後、必要であれば、所望の剤形に成形することによって製剤される。
【００４１】
経口投与に適当な本発明の組成物は、カプセル剤、サシェ剤、錠剤またはトローチ剤として、それぞれが予め規定された量の有効成分を含む別々のユニットの形態であっても; 散剤または顆粒剤の形態であっても; 水性の液体または非水性の液体、例えばエタノールまたはグリセロール中の液剤または懸濁剤の形態であっても;または、水中油型乳剤または油中水型乳剤の形態であってもよい。該油は、食用油、例えば綿実油、ごま油、ココナッツ油またはピーナッツ油であってもよい。水性の懸濁剤に適当な分散剤または懸濁剤としては、合成または天然のゴム、例えばトラガカント、アルギン酸、アカシア、デキストラン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマーおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。有効成分は、ボーラス剤、舐剤またはペースト剤の形態で投与してよい。
【００４２】
錠剤は、有効成分を１以上の賦形剤とともに圧縮または成形することにより製造し得る。圧縮錠剤は、適当な機器で、フリーフロー形態、例えば粉末または顆粒形態の有効成分を圧縮することにより製造してよく、結合剤、例えばラクトース、グルコース、デンプン、ゼラチン、アカシアゴム、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシポロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコールまたはワックス等；滑剤、例えばオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたは塩酸ナトリウム等；崩壊剤、例えばデンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウムまたはクロスポピドンまたは分散剤、例えばポリソルベート80と混合してもよい。成形錠剤は、適当な機器で、粉末化した有効成分と、不活性な液体希釈剤で湿らせた適当な担体との混合物を成形することにより製造し得る。
【００４３】
経口投与のためには、PDE4阻害剤は、体重1kgあたり0.01〜2mg、より具体的には、体重1kgあたり0.1〜1.5mgまたは0.25〜1.25mgまたは0.5〜1mgの量で投与してよい。ビタミンD作動薬の量は、合わせて調節すべきであり、0.00001〜0.001mg/kgの量で投与してよい。
【００４４】
経皮用組成物は、硬膏剤またはパッチ剤の形態であってよい。
【００４５】
眼への投与に適当な組成物は、有効成分の無菌水性製剤であってよく、該製剤は、微結晶形態、例えば水性微結晶性懸濁剤の形態であってよい。眼への投与に有効成分を用いるために、リポソーム製剤または生分解性ポリマーシステム、例えばEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, vol.2, 1989に記載されているものを用いてもよい。
【００４６】
局所投与または眼への投与に適当な組成物としては、液体または半固体製剤、例えば、リニメント剤、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤、エアロゾル、スプレー剤、フィルム、水中油型もしくは油中水型乳剤、例えばクリーム剤またはペースト；または液剤または懸濁剤、例えば滴下剤が挙げられる。眼の処置用の組成物は、好ましくは、さらにシクロデキストリンを含んでいてよい。
【００４７】
局所投与には、該PDE4阻害剤は、典型的に、該組成物の約0.01〜20重量%の量で、例えば該組成物の約0.1%〜約10重量%の量で存在していてよいが、該組成物の約50%までの量で存在していてもよい。ビタミンD受容体作動薬の量は、それにしたがって調節するべきであり、典型的には、組成物の約0.0001〜約2.0重量%の量で該組成物中に存在していてよい。
【００４８】
経鼻投与または頬側投与に適当な組成物としては、散剤、自己噴霧型およびスプレー製剤、例えばエアとロゾルおよびアトマイザーが挙げられる。該製剤は、例えば、Modern Pharmaceutics, 2nd ed., G.S. Banker and C.T. Rhodes (Eds.), page 427-432, Marcel Dekker, New York; Modern Pharmaceutics, 3th ed., G.S. Banker and C.T. Rhodes (Eds.), page 618-619 and 718-721, Marcel Dekker, New YorkおよびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, vol. 10, J. Swarbrick and J.C. Boylan (Eds), page 191-221, Marcel Dekker, New Yorkにより詳細に記載されている。
【００４９】
上記の有効成分に加えて、本発明の組成物は１以上のさらなる成分、例えば、希釈剤、緩衝剤、香味剤、着色剤、界面活性剤、増粘剤、保存剤、例えばメチルヒドロキシベンゾエート(抗酸化剤を含む)、乳化剤等を含んでいてよい。
【実施例】
【００５０】
実施例1
カルシポトリオールとPDE4阻害剤の抗炎症効果を評価するための、活性化した分化ヒトT細胞を用いたインビトロアッセイ
末梢血T細胞の、特定のT細胞サブポピュレーションへの分化の可塑性が文献に記載されている。したがって、種々の系列の炎症性T細胞集団が、一定の期間のインビトロ培養により樹立できること、ならびにインビトロの細胞ベースのアッセイで使用し得ることは知られていることであり、該アッセイにおいて、炎症性T細胞の表現型および抗炎症性薬剤の効果の両方を評価し得る。
【００５１】
乾癬および／または他のTh17関連性疾患の、可能性のある新規な治療を試験するために、ヒトTh1/Th17細胞を作成することは、特に重要なことであった。
【００５２】
材料および方法
最初に、CD4+ T細胞を、RosetteSep（登録商標） separation system (STEMCELL) を用いて、健康なドナーのヒト末梢血からネガティブ単離した。
【００５３】
次に、CD4+T細胞を、細胞表面の蛋白質CD3およびCD28を特異的な抗体で架橋することにより活性化した。
【００５４】
次に、Th1/Th17分化を誘導するために、活性化CD4+ T細胞を、X-VIVO 15血清不含培地中で、以下に記載する増殖および分化因子混合物の存在下に、培養液1mlあたり2-5 x 106個の密度で、フラスコ培養した:
rhIL-2 (10ng/ml)
rhTGF-β (10ng/ml)
rhIL-1β (10ng/ml)
rhIL-6 (10ng/ml)
rhIL-23 (20ng/ml)
抗IL-4抗体 (1μg/ml)
抗IL-13抗体 (1μg/ml)
【００５５】
培養培地は1日おきに交換し、T細胞は、Th1/Th17細胞に完全に分化するまで最大5〜7日間培養した。
【００５６】
T細胞がTh1/Th17に分化すると、細胞を分化培地から出して洗浄し、アッセイ培地(10ng/ml rhIL-2のみを含有するX-VIVO 15培地)中に、細胞の最終濃度1.5x106個/mlの細胞懸濁液を、ウェルあたり0.250ml入れ(0.25〜0.375 x 106個/ウェル/試料)、試験化合物を加えて、または加えずに、24時間処置した。タイムポイントの最後に、抗炎症性薬剤の効果を、細胞培養上清中に放出された、表現型関連性のサイトカインのレベルを測定することにより評価する。各処置について２組みの操作を重複して行い、異なるドナー由来の細胞を用いる。
【００５７】
結果
インビトロの培養および分化時のTh1/Th17表現型の特徴付け
CD4+ T細胞を、インビトロで最大7日間培養した。Th1/Th17細胞の表現型を、細胞培養上清のサイトカイン解析により評価した。具体的には、分化圧(differentiation pressure)下で5〜7日間培養した後、T細胞を分化培地から出して洗浄し、1〜1.5 x 106個/mlの最終濃度で基本培地に加えた。基本培地は、分化圧を含まない増殖培地であり、これは、2mM glutamaxおよび1 x ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10ng/ml rhIL-2のみを含むX-VIVO15培地である。
【００５８】
また、Th1/Th17表現型間の変動は、ドナーの違いによって見られた; しかし、該変動は通常は僅少であり、Th1/Th17への分化が起こらないことは極めて稀である（1%未満）。
【００５９】
分化したヒトTh1/Th17細胞によるサイトカイン発現解析により、該細胞が、Th1関連性のサイトカインであるIFNγならびにTh17関連性のサイトカインIL-17およびIL-22をよく発現することが示された。
【００６０】
Th1/Th17細胞の炎症モデルにおける、カルシポトリオールと化合物Aの組合せの評価
5〜6日間かけて分化させた後、全ての細胞を注意深く洗浄し、IL-2 (X-VIVO + 10 ng/ml IL-2) 含有増殖倍中に、細胞数1〜1.5 x 106個/mlの最終濃度で加えた。カルシポトリオール(12nM、100nMおよび120nM) および化合物A (0.5μM、1μMおよび5.6μM)の希釈液を、単独または組み合わせで、完全に分化したヒトTh1/Th17細胞に添加した。アッセイは２組みで重複して行い、未分化のヒトT細胞 (陰性対照) および処置または未処置の分化ヒトTh1/Th17細胞を含んでいた。全ての細胞は、0.1% DMSOを含有するアッセイ培地中で、試験化合物を加え、または加えずに、類似の条件下で培養した。
【００６１】
Th1/Th17細胞は、試験化合物の存在下または非存在下にて24時間培養した。
【００６２】
全ての試料から上清を回収し、サイトカイン発現について評価した(IL-6、IL-8、IL-17、IL-22およびTNF-α)。ELISAで測定したIL-22を除き、全てのサイトカインを、MSDキットを用いて測定した(pg/ml)。
【００６３】
結果
データ解析およびグラフ作成は、ExcelまたはGraphPad Prismを用いて行った。統計解析は、一元配置分散分析法(1way ANOVA)を行い、ダネットの多重比較検定を用いて補正した。
【００６４】
実施した全てのアッセイにおいて、カルシポトリオールは、単独で、IL-22 (図3b参照)、IL-8の発現を強く阻害し、ある程度までのIL-17の発現を阻害したが、TNFαおよびIL-6の発現には何の影響も及ぼさなかった。
【００６５】
化合物A (図2および3b参照) および他の試験したPDE4阻害剤 (図1、4および5参照) は単独で、IL-22の発現を上昇させ、IL-17の発現をある程度まで上昇させた。その一方、化合物AはTNFα (図3a参照) の発現を強力に低下させ、IL-6の発現を僅かに低下させたが、IL-8には何の影響も及ぼさなかった。
【００６６】
カルシポトリオールと化合物Aを共投与した場合、該組み合わせ処置によって、ヒトTh1/Th17細胞における広範囲のサイトカインの阻害が見られた。組み合わせ処置において、化合物AによるTNFαおよびIL-6の阻害ならびにカルシポトリオールによるIL-22、IL-17およびIL-8の阻害は維持されていた(TNFαおよびIL-22については、それぞれに図3aおよび3bを参照)。このときの、カルシポトリオールとPDE4阻害剤の比は1:50であった。
【００６７】
結論は、以下の通りである：
化合物Aは、ヒトTh1/Th17細胞において、単独で、TNFα (図3a)およびIL-6の発現を有意に阻害し、IL-22 (図3b)の発現を有意に上昇させる；
上述のIL-22発現上昇能は、用量依存的であり (図2)、いくつかのPDE4阻害剤について観察されている (図1)；
カルシポトリオールは、ヒトTh1/Th17細胞において、単独で、IL-22 (図3b)の発現を有意に阻害し、IL-8を阻害し、IL-17の発現をある程度阻害する；
カルシポトリオールと化合物Aの組合せ処置は、ヒトTh1/Th17細胞において、広範囲のサイトカインの阻害を示す。TNFαおよびIL-6の化合物Aによる阻害ならびにIL-22、IL-17およびIL-8のカルシポトリオールによる阻害は、組合せ処置によって維持される。
【００６８】
いくつかのPDE4阻害剤の単独もしくはカルシポトリオールとの組み合わせにおける効果
臨床開発がおこなわれている、いくつかのPDE4阻害剤 (ロフルミラスト、テトミラスト、GSK256066、オグレミラスト、アプレミラストおよびAN2728) を、単独で、またはカルシポトリオールと組み合わせて、ヒトTh1/Th17細胞の活性についての効果を試験した。
【００６９】
図5に示すように、カルシポトリオール100nM単独での処置は、ビヒクル処置対照（点線で表示）と比較して、ヒトTh1/Th17細胞によるIL-22の発現および分泌を有意に阻害する。逆に、化合物Aまたは試験した全てのPDE4阻害剤は、単独で、ヒトTh1/Th17細胞によるIL-22の発現を上昇させる。
【００７０】
さらに、PDE4阻害剤とカルシポトリオールの組合せによる処置は、PDE4阻害剤が組合せに存在するにもかかわらず、ヒトTh1/Th17細胞によるIL-22の発現および分泌を有意に阻害する。言い換えれば、ここで試験した、臨床開発中のPDE4阻害剤(ロフルミラスト、テトミラスト、GSK256066、オグレミラスト、アプレミラストおよびAN2728) は全て、化合物Aに匹敵する有効性を示し、PDE4活性の阻害が介在するIL-22発現の上昇は、カルシポトリオールにより拮抗され得る。
【００７１】
いくつかのビタミンD類似体の、単独または化合物Aとの組み合わせにおける効果
臨床的に用いられているいくつかのビタミンD類似体 (カルシポトリオール、カルシトリオール、タカルシトールおよびマキサカルシトール) を、単独または化合物Aと組合せて用いた場合の、ヒトTh1/Th17細胞の活性に対する効果を試験した。
【００７２】
図6に示すように、ビヒクル処置した対照（点線で表示）と比較して、100nM のカルシポトリオール単独での処置は、ヒトTh1/Th17細胞によるIL-22の発現および分泌を有意に阻害する。同様に、試験した全てのビタミンD類似体も (全て100nMで試験した)、単独での処置は、ヒトTh1/Th17細胞によるIL-22の発現および分泌を有意に阻害し、該効果は100nMのカルシポトリオールによる処置で見られるものと同程度である。
【００７３】
逆に、ビヒクル処置対照と比較して、化合物Aの単独での処置は、ヒトTh1/Th17細胞によるIL-22の発現を上昇させる。
【００７４】
さらに、化合物AとビタミンD類似体の組合せによる処置は、ビタミンD類似体が組合せの一部であるにもかかわらず、ヒトTh1/Th17細胞によるIL-22の発現および分泌を有意に阻害する。言い換えれば、この試験で用いた、臨床で用いられているビタミンD類似体(カルシポトリオール、カルシトリオール、タカルシトールおよびマキサカルシトール) は全て、PDE4活性の阻害が介在するIL-22の発現上昇への拮抗について、カルシポトリオールと同等の有効性を示す。
【００７５】
化合物Aの存在下および非存在下における、異なる濃度のカルシポトリオールの効果
濃度1μMの化合物Aの存在下または非存在下で、異なる濃度のカルシポトリオール (MC903) の、ヒトTh1/Th17細胞の活性に対する効果について試験した。該試験の目的は、PDE阻害剤により介在されるIL-22の発現上昇を阻害するのに必要な、カルシポトリオールの最小濃度を特定することである。
【００７６】
図7に示すように、ビヒクル処置対照（点線で表示）と比較して、100nMのカルシポトリオール単独での処置は、ヒトTh1/Th17細胞によるIL-22の発現および分泌を阻害し、一方、化合物A単独での処置は、ヒトTh1/Th17細胞によるIL-22の発現を上昇させる。
【００７７】
種々の濃度のカルシポトリオール (100nM、1nM、500pMおよび100pM) を用いて、化合物Aとともに処置を行うと、IL-22発現上昇が阻害された。この効果は、濃度10pMのカルシポトリオールで消失した。
【００７８】
結果より、カルシポトリオールのIL-22の発現に対する効果が、ケラチノサイトの増殖に影響を与えるのに必要な濃度 (28nM)よりもはるかに低い濃度で得られることが示される。これは、PDE4阻害剤とビタミンD受容体作動薬の組合せが、ケラチノサイトの増殖に影響を与えることなく抗炎症性効果が必要な症状の処置に用い得ることを意味している。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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