(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列を含み、標的分子ＶＥＧＦに対する認識能力および増強された親和性を有するＶ１９およびＶ３２Ｒによって形成される群から選択される
単離された抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲタンパク質。
【請求項２】
Ｖ１９が、複数のループによって接続され、あるループによって相互接続された２枚のβシートからなる高度可撓性可変領域を有する種々のβシートと、２つの群のシートを結合する単一ジスルフィド架橋を有する２つの群のβシートからなる単量体と、を含み、
配列番号４（図２０〜図２２および図４２）を含む、
請求項１に記載の抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲタンパク質。
【請求項３】
Ｖ３２Ｒが、βシートと、２つの群のシートを結合する単一ジスルフィド架橋を有する２つの群のβシートからなる単量体と、を含み、
配列番号６（図２３〜図２８および図４３）を含む、
請求項１に記載の抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲタンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のｖＮＡＲタンパク質をエンコードする配列番号３または５の核酸を含む
ＤＮＡ。
【請求項５】
ａ）クモハダオオセ（Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ）またはカリフォルニアネコザメ（Ｈｅｔｅｒｏｄｏｎｔｕｓ  ｆｒａｎｃｉｓｃｉ）に由来し、
ｂ）眼の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合し、その活性を中和する、
請求項１に記載のＶ１９およびＶ３２Ｒによって形成される群から選択される単離された抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲタンパク質。
【請求項６】
請求項１に記載のＶ１９およびＶ３２Ｒによって形成される群から選択される単離された抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲタンパク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む
医薬組成物。
【請求項７】
局所投与用に製剤化される、
請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
局所眼投与用に製剤化される、
請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、黄斑変性、加齢黄斑変性、網膜疾患、糖尿病網膜症、硝子体出血、網膜出血、脈絡膜炎、網膜剥離、網膜ドルーゼン、血管新生緑内障、脈絡膜疾患、ぶどう膜炎、近視、眼疾患、真菌性眼感染症、毛細血管拡張症、網膜動脈閉塞症、変性近視、網膜静脈閉塞症、脈絡網膜炎、ヒストプラズマ症、ぶどう膜疾患、三日ばしか（風疹）、眼トキソプラスマ症、網膜上膜、コロボーマ、脈絡膜新生物、網膜変性、網膜炎、網膜穿孔、角膜ヘルペス、未熟児網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、乳頭浮腫、ぶどう膜髄膜脳炎症候群、視神経乳頭ドルーゼン、網膜色素線条症、網膜色素変性症、視覚障害、交感性眼炎、瘢痕、眼球熱傷、再発性虚血、眼外傷、緑内障、眼出血、暗点、後部ぶどう膜炎、真菌血症、網膜新生物、角膜疾患、色素失調症、ヘモグロビンＣ症、線維症、角膜混濁、前部ぶどう膜炎、前房出血、サルコイドーシス、無水晶体、医原病、汎ぶどう膜炎、白内障、術後合併症、鎌状赤血球貧血、網膜血管炎、骨腫、サイトメガロウイルス網膜炎、萎縮、静脈炎、円錐角膜、スタージ・ウェーバー症候群、ウイルス性眼感染症、眼奇形、物質関連障害、貫通性眼外傷、２型糖尿病、放射線障害、鎌状赤血球形質、偽水晶体、色素性母斑、増殖性硝子体網膜症、出血、１型糖尿病、母斑、視神経疾患、血管病、カンジダ症、化学熱傷、小眼球症から選択されるＶＥＧＦ関連眼疾患で局所的に投与されるよう設計されている、
請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＶＥＧＦ関連眼疾患が好ましくは滲出型加齢黄斑変性、糖尿病網膜症または血管新生緑内障から選択される、
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＶＥＧＦ関連眼疾患を治療するために局所眼経路によって投与可能な医薬品を調製するための、有効量の請求項１に記載のＶ１９およびＶ３２Ｒによって形成される群から選択される
抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲタンパク質の使用。
【請求項１２】
前記疾患が、疾患細胞が異常な量のＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体を産生すると、過剰な血管形成が起こる血管形成過程に関連する病態でもある、
請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記血管形成過程が加齢黄斑変性、糖尿病網膜症および血管新生緑内障からなる群から選択される、
請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記血管形成過程が好ましくは糖尿病網膜症である、
請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記血管形成過程が好ましくは滲出型加齢黄斑変性である、
請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記血管形成過程が好ましくは血管新生緑内障である、
請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、黄斑変性、加齢黄斑変性、網膜疾患、糖尿病網膜症、硝子体出血、網膜出血、脈絡膜炎、網膜剥離、網膜ドルーゼン、血管新生緑内障、脈絡膜疾患、ぶどう膜炎、近視、眼疾患、真菌性眼感染症、毛細血管拡張症、網膜動脈閉塞症、変性近視、網膜静脈閉塞症、脈絡網膜炎、ヒストプラズマ症、ぶどう膜疾患、三日ばしか（風疹）、眼トキソプラスマ症、網膜上膜、コロボーマ、脈絡膜新生物、網膜変性、網膜炎、網膜穿孔、角膜ヘルペス、未熟児網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、乳頭浮腫、ぶどう膜髄膜脳炎症候群、視神経乳頭ドルーゼン、網膜色素線条症、網膜色素変性症、視覚障害、交感性眼炎、瘢痕、眼球熱傷、再発性虚血、眼外傷、緑内障、眼出血、暗点、後部ぶどう膜炎、真菌血症、網膜新生物、角膜疾患、色素失調症、ヘモグロビンＣ症、線維症、角膜混濁、前部ぶどう膜炎、前房出血、サルコイドーシス、無水晶体、医原病、汎ぶどう膜炎、白内障、術後合併症、鎌状赤血球貧血、網膜血管炎、骨腫、サイトメガロウイルス網膜炎、萎縮、静脈炎、円錐角膜、スタージ・ウェーバー症候群、ウイルス性眼感染症、眼奇形、物質関連障害、貫通性眼外傷、２型糖尿病、放射線障害、鎌状赤血球形質、偽水晶体、色素性母斑、増殖性硝子体網膜症、出血、１型糖尿病、母斑、視神経疾患、血管病、カンジダ症、化学熱傷、小眼球症から選択されるＶＥＧＦ関連眼科状態の予防または治療に有用な医薬品を調製するための、少なくとも請求項１に記載のＶ１９およびＶ３２Ｒによって形成される群から選択される
抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲタンパク質の使用。
【請求項１８】
前記眼状態が好ましくは滲出型加齢黄斑変性、糖尿病網膜症または血管新生緑内障である、
請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野、具体的には血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を遮断し、注目すべき生物学的および生物物理学的特性を有するｖＮＡＲと呼ばれるサメをベースとしたモノクローナル抗体生物製剤の生成に言及する。ｖＮＡＲ抗体は、環境条件に対して高度に耐性であり、コールドチェーンを要求しないかもしれない。さらに、これらの抗体は優れた浸透能力を有するので、治療活性を増加させる。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、医学応用にとって重要なツールである。ほとんどの抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖で構成されており、両鎖が抗原結合部位を形成する。従来にない抗体構造がラマ、ラクダおよび軟骨魚類で発見された。これらの抗体は、４つの定常ドメインおよびＶＨＨ、ラクダではｈｃＡｂおよび板鰓類ではｖＮＡＲまたはＶＨＮＡＲと命名された抗原結合部位または可変ドメインを有する単一重鎖からなる。
【０００３】
新規な治療法および診断システムを提供するために抗体技術が開発されてきた。この技術には、例えば、モノクローナル抗体；非ヒト抗原反応を減少させるよう設計されたヒト化抗体；および特性を改善するための複合抗体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の使用が含まれる。いくつかのヒトの疾患を治療するためにＦＤＡによって承認されている抗体の数は増加しており、そのうちの約３５２種が臨床試験（第Ｉ相および第ＩＩ相）中であり、臨床試験中の全タンパク質の約２５％を占めている。抗体の従来のサイズを減少させ、親和性、結合活性および特異性などの抗原結合特性を保護するための多くの努力がなされてきた。
【０００４】
抗原結合能力を有する抗体の小さなフラグメントが医学的使用のための技術的代替物の中にある。このような代替物は、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）および／または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）などの組換え分子から、ＶＨドメインを有する免疫グロブリンに基づくタンパク質のための単一結合ドメインに進歩し、今度はこれらが新たな免疫療法および免疫診断戦略を開発するために使用されている。より小さいドメインへのＦａｂ模倣物は、安定性および従来の抗体によって認識されない抗原エピトープを入手する可能性を増加させるので、有利である。
【０００５】
軟骨魚類の免疫グロブリンまたは抗体の３つのアイソタイプが存在し、これらのうちの２つはＩｇＭおよびＩｇＷと呼ばれる（ＩｇＸまたはＩｇＮＡＲＣとも呼ばれる）２本の標準的な重鎖および軽鎖を有し、１つの非定型のアイソトープはＩｇＮＡＲと呼ばれ、軽鎖と関連しない重鎖のホモ二量体である。サメ抗原受容体免疫グロブリン（ＩｇＮＡＲまたはＮＡＲと呼ばれる）は、抗原を認識するための連合特異性を有するレパートリー全体を含むために単一可変ドメイン（ｓｄＡｂフラグメント）および２つのフォーク超可変構造を有する。ＩｇＮＡＲは高可溶性および高熱安定性小分子（１２ｋＤａ）であり、インビボで優れた組織浸透性を有し、これによってＩｇＮＡＲは抗体工学および治療用抗体のための優れた資源となる。
【０００６】
本発明は、サイトカインに対する親和性およびその活性を中和する能力を有する免疫化されたサメ、カリフォルニアネコザメ（Ｈｅｔｅｒｏｄｏｎｔｕｓ  ｆｒａｎｃｉｓｃｉ）またはクモハダオオセ（Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ）に由来するＩｇＮＡＲ抗体、特にその可変領域ＶＨＮＡＲの選択および単離に関する。これらの抗体は一般的に、軟骨魚類（サメ、ガンギエイ、エイ類およびキメラ）の免疫系によって創り出される。ＩｇＮＡＲ抗体の分子配列は、５つの定常領域と、おそらくは分子レベルでの進化的収束を表す、さらにラクダ科で見られるＶＨに極めて類似の１つの可変領域とからなる。
【０００７】
Ｎｕｔｔａｌｌおよび共同研究者は、サメ、クモハダオオセ（Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ）のＩｇＮＡＲの可変領域に基づいてファージディスプレイ技術を通して、非免疫サメ抗体ライブラリーを得た。これらの領域は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）のジンジパインＫプロテアーゼ、ミトコンドリア移入受容体Ｔｏｍ７０、リゾチームおよび熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の頂端膜抗原１（ＡＭＡ１）などのタンパク質を認識する能力を有する。これらの領域が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現系でクローニングされ、高親和性単一ドメイン抗体の有りうる供給源としてサメの天然レパートリーから得られたＮＡＲの抗原特異性の最初の記載となっている。
【０００８】
Ｄｏｏｌｅｙおよび共同研究者は、２００３年に、コモリザメ（Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ  ｃｉｒｒａｔｕｍ）で産生された標的化ライブラリーを選択した。これらのサメをニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）で免疫化すると、ナノモル親和性（１０−７〜１０−１０Ｍに及ぶ）および熱変性に対する高い耐性を有する、ＨＥＬ抗原に対する高度特異的クローンが得られた（これらは１００℃で３時間のインキュベーション後にその活性の２０％超を維持したので）。
【０００９】
ＩｇＮＡＲの遺伝子をグループ分けすると、各グループは単一可変単純領域（ＶＨ）、３つの多様性エレメント（Ｄ）および単一結合遺伝子（Ｊ）からなる。ＩｇＮＡＲ  ＶＨの主要なレパートリーは、４つの組換えイベントによって、配列と長さの両方に関してＣＤＲ３の多様なレパートリーを得ることによって生成される。
【００１０】
その高い機能性のために、これらの単鎖抗原受容体が発見された直後に、サメタンパク質を用いた異なる技術が開発された。単離およびクローニングされた可変ドメインは極めて安定であり、これはラクダ科抗体のドメインよりも２０％小さく、元の受容体と同じ抗原結合能力を有する。
【００１１】
この技術の利点は、従来の抗体の特性を小分子の利点と組み合わせているというところである；これらは高い特異性と低い固有毒性を有し；これらは、その分子量が低いために、その標的部位に到達する可能性が高くなり；これらは酵素を阻害することができ、細胞受容体の結合部位に到達することもできる。これら全ての特性を治療的使用のために利用することができる。さらに、これらは局所経路を含む、多様な経路によって投与する大きな可能性を有する。最後に、その製造が用意で、低コストである。
【００１２】
文献から、ＶＥＧＦおよびその受容体（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３）の過剰発現が微小血管透過性および血管形成の増加を引き起こし、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）および血管新生緑内障などの眼病態をもたらしていることが明らかである。ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３受容体の細胞分布は、網膜脈管構造とニューロン要素の両方での正常な網膜におけるＶＥＧＦファミリーの種々の特異的な機能を示唆している。
【００１３】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、新たな血管、特に酸素および栄養素をがん性組織に供給するものの形成を規定する、内皮細胞透過性、細胞増殖および血管形成を誘導する能力を有する腫瘍由来因子として記載されてきた。多くの他の因子が血管形成に関与しているが、ＶＥＧＦが主要な媒介物である。
【００１４】
ＶＥＧＦ（またはＶＥＧＦ−Ａ）は、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄおよび血小板増殖因子を含む増殖因子のサブファミリーに属するヘパリン結合糖タンパク質である。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの選択的スプライシングパターンの結果として、ＶＥＧＦは少なくとも７つのアイソフォームで存在する。４つの主要なアイソフォームはＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６である（添字はタンパク質のアミノ酸の数を指す）。優勢な種はヘパリンに対する親和性を有するＶＥＧＦ１６５であるので、このアイソフォームの一部はタンパク質分解切断によって結合および放出される。残りは遊離であり、内皮細胞上の受容体に結合するために利用可能であり、これは２つの別個の工程：可溶性アイソフォームの分泌および結合型アイソフォームのタンパク質分解切断の結果である。ＶＥＧＦの異なるアイソフォームの生理学的重要性は明らかでないが、ＶＥＧＦ１６５は血管形成の主要な調節因子である。
【００１５】
ＶＥＧＦは主に２つの受容体：ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１としても知られている）およびＶＥＧＦ受容体−２（Ｆｌｋ−１またはＫＤＲとしても知られている）に結合する。これらの受容体の各々は、７つの免疫グロブリン型領域を有する細胞外ドメイン（ＶＥＧＦに結合する）、単一膜貫通領域およびチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインを有する。これらの受容体は主に、発達組織の血管内皮細胞に見られる。
【００１６】
ＶＥＧＦ受容体−２との結合によって、血管形成が直接刺激され、血管内皮細胞の増殖、血管内皮細胞の移入、未成熟内皮細胞の生存および血管透過性増加をもたらす一連のシグナル伝達経路が活性化される。
【００１７】
ＶＥＧＦ受容体−１は最初のうち、ＶＥＧＦ受容体−２に結合することができるＶＥＧＦの分子の数を減少させることによって「デコイ受容体」として作用すると考えられていたが、最近の研究は、ＶＥＧＦ受容体−１もマイトジェンシグナルを誘導することができることを示している。
【００１８】
血管形成は新たな血管構造の形成であり、腫瘍および眼疾患の確立などの病理学的過程において重要な役割を果たす。糖尿病網膜症は、新たな血管の異常な増殖および網膜中の線維組織の出現として知られており、黄斑の下で起こると、黄斑変性と呼ばれ、虹彩で起こると、血管新生緑内障と呼ばれる。
【００１９】
糖尿病網膜症は１型と２型の両方の糖尿病患者で、特に、疾患がうまく制御されない場合に、疾患を有して数年後に起こる網膜の状態である。２つの型の糖尿病網膜症：早期または非増殖性糖尿病網膜症と増殖性または進行型糖尿病網膜症が存在する。増殖性糖尿病網膜症は、網膜虚血に反応した新たな血管の異常増殖およびその後の線維増殖ならびに網膜前または硝子体出血の発生を特徴とする。１１その重要性は、これが世界中で不可逆性の盲目の主因の１つであり、適切な注意を払い、時宜を得た処置を施すことによって防ぐことができるという事実にある。糖尿病網膜症は、糖尿病患者における典型的な眼の微小血管傷害の存在および発達として定義される。
【００２０】
加齢黄斑変性は、６０歳を超えた患者における失明の主因である。黄斑は網膜の中心領域であり、読書、テレビ鑑賞、人々の派閥を見ることに使用される微細な視力、一般的に任意の細部の視力を担っている。１２ＡＲＭＤは、失明の一般的原因である黄斑の変性状態である。これを滲出型（新生血管型）または萎縮型（非新生血管型）として分類することができる。患者の約１０％は滲出型黄斑変性を患っている。
【００２１】
滲出型黄斑変性の有用な治療は、その意図が新生血管膜を除去することである「血管新生抑制」と呼ばれる眼の中への医薬の１回または数回の注射の適用を伴う。治療を時宜を得た様式で行い、それほど多くの瘢痕が生じない限り、この治療により、患者の９０％超が視力を維持することを達成し、患者の約３分の２が視力を改善した。
【００２２】
循環が外傷または疾患（上記のものなど）を通して損傷した組織で、新たな血管が発達する。角膜血管新生は、脈絡毛細管にブルッフ膜を通過させ、次いで、網膜色素上皮の下（１型）および／または網膜の下（２型）で増殖させる、血管の異常増殖である。これは、ブルッフ膜の破裂、ＶＥＧＦなどのサイトカインの放出、炎症、網膜色素上皮の酸化ストレスまたは血管不全によって起こり得る。この状態は滲出型黄斑変性の主因であり、網膜色素線条症、脈絡膜破裂、病的近視、網脈絡膜病変および散弾状網脈絡膜症を含む種々の障害に関連し得る。
【００２３】
虹彩血管新生の現象も存在する。虹彩の前面上の新たな血管の異常な形成は、一般的に糖尿病網膜症、網膜中心静脈閉塞症、頸動脈疾患、ブドウ膜黒色腫、長期の網膜剥離などの網膜虚血をもたらした異なる状態に関連する。血管新生は、瞳孔縁および通常、同時に、前眼房の角で始まり、表面全体に広がっていく。新たな血管は線維組織膜と結合し、これによって線維柱帯を通した眼房水の通過が遮断され（血管新生緑内障）、瞳孔境界のブドウ膜外反症を引き起こし得る。その通常の治療は、新たな血管の形成を防ぐためにレーザー光凝固術を施すことからなる。
【００２４】
血管新生緑内障は、虹彩中の新たな血管の形成の結果として生じる特別な型の続発性緑内障である。これらの新たな血管は最終的に、眼の前眼房からの眼房水の循環の妨害を引き起こし、これによって高眼圧が誘因される。これは慢性の、継続した網膜の酸素不足から生じる。これに反応して、系が血管新生を刺激するいくつかの物質を産生する。
【００２５】
血管新生の現象が関与している他の病理過程は、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、黄斑変性、加齢黄斑変性、網膜疾患、糖尿病網膜症、硝子体出血、網膜出血、脈絡膜炎、網膜剥離、網膜ドルーゼン、血管新生緑内障、脈絡膜疾患、ぶどう膜炎、近視、眼疾患、真菌性眼感染症、毛細血管拡張症、網膜動脈閉塞症、変性近視、網膜静脈閉塞症、脈絡網膜炎、ヒストプラズマ症、ぶどう膜疾患、三日ばしか（風疹）、眼トキソプラスマ症、網膜上膜、コロボーマ、脈絡膜新生物、網膜変性、網膜炎、網膜穿孔、角膜ヘルペス、未熟児網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、乳頭浮腫、ぶどう膜髄膜脳炎症候群、視神経乳頭ドルーゼン、網膜色素線条症、網膜色素変性症、視覚障害、交感性眼炎、瘢痕、眼球熱傷、再発性虚血、眼外傷、緑内障、眼出血、暗点、後部ぶどう膜炎、真菌血症、網膜新生物、角膜疾患、色素失調症、ヘモグロビンＣ症、線維症、角膜混濁、前部ぶどう膜炎、前房出血、サルコイドーシス、無水晶体、医原病、汎ぶどう膜炎、白内障、術後合併症、鎌状赤血球貧血、網膜血管炎、骨腫、サイトメガロウイルス網膜炎、萎縮、静脈炎、円錐角膜、スタージ・ウェーバー症候群、ウイルス性眼感染症、眼奇形、物質関連障害、貫通性眼外傷、２型糖尿病、放射線障害、鎌状赤血球形質、偽水晶体、色素性母斑、増殖性硝子体網膜症、出血、１型糖尿病、母斑、視神経疾患、血管病、カンジダ症、化学熱傷、小眼球症である。
【００２６】
世界中では、２億８５００万人の人々が種々の原因からの視力障害を有しており、これらの人々のうちの３９００万人が盲目である。１４「慢性盲目の主な原因としては、白内障、緑内障、加齢黄斑変性、角膜混濁、糖尿病網膜症、トラコーマおよび小児の眼状態ならびにビタミンＡの欠乏によって引き起こされるものが挙げられる。加齢性盲目ならびに制御不能な糖尿病によるものが世界中で増加している。全盲目のうちの４分の３が予防可能または治療可能である」。
【００２７】
ＶＥＧＦ活性の阻害分子を使用して、ＶＥＧＦ作用に依存する血管新生過程を制限することができる。
【００２８】
抗ＶＥＧＦ抗体がリガンドに結合し、よって自由循環ＶＥＧＦを排除し、その受容体との結合を防止する。抗体は高度に特異的で、ＶＥＧＦにのみ結合するので、この目的のために使用されてきた；ＶＥＧＦに結合する全ての受容体によって媒介される血管形成促進効果を阻害することができる。
【００２９】
しかしながら、１９９７年に、ＦｅｒｒａｒａおよびＤａｖｉｓ−Ｓｍｉｔｈによって記載された動物モデルで特異的抗ＶＥＧＦ抗体が腫瘍増殖を阻害することができることが示され、抗ＶＥＧＦ抗体のヒトのバージョンの開発が始まったので、ＶＥＧＦ媒介シグナル伝達を阻害するための異なる戦略が開発されている。
【００３０】
ベバシズマブは抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。これはがん治療用に承認された最初の抗血管形成薬であり、これは化学療法レジメンと組み合わせた転移性結腸直腸癌の第一選択治療としての使用について承認されている。これは腫瘍退縮および中〜長期生存率増加を含むプラスの臨床成績により、多くの臓器のがんで試験されてきた。
【００３１】
２００４年、ＦＤＡはペガプタニブ、硝子体内注射によって投与される眼用の最初の抗血管形成薬を承認した。この抗ＶＥＧＦは、加齢黄斑変性の患者での試験で分析された。結果は、この抗体で治療していない患者では５０％であるのに対して、治療した患者の７０％で視力の安定化を示した。
【００３２】
２００６年、ＦＤＡは、抗ＶＥＧＦヒト化マウスモノクローナル抗体の組換えＦａｂフラグメントである眼科用ラニビズマブの使用を承認した。これも、盲目につながる血管新生を阻害するため、特に全ての形態の黄斑変性、特に滲出型ＡＲＭＤを治療するための眼疾患の治療で成功して使用されてきた。
【００３３】
ラニビズマブの施用経路は硝子体内注射である。しかしながら、網膜剥離および重度の感染症がラニビズマブによって引き起こされる副作用の中にある。マウスにおいては、これが視覚機能に必須である網膜の光受容体およびミュラー細胞の死を引き起こすことが報告されている。
【００３４】
ＶＥＧＦの活性を阻害することによって作用し、眼内に投与される他の眼科用薬物には以下のものがある：黄斑変性に関連する脈絡膜血管新生の選択的治療として使用されるベルテポルフィン；滲出型加齢黄斑変性を治療するために使用されるアフリベルセプト、およびデキサメタゾン、硝子体内インプラントとして施用すると、黄斑浮腫を引き起こす炎症過程を減少させることが示されているコルチコステロイド。
【００３５】
米国特許第８４９６９３３号明細書、Ｐａｎｉａｇｕａ−Ｓｏｌｉｓらは、抗原受容体能力を有する板鰓類のＩｇＮＡＲ型免疫グロブリンに起源を持つ、ＶＨＮＡＲまたはｖＮＡＲと呼ばれる可変領域に属するタンパク質の選択、単離および製造に言及している。このｖＮＡＲはＶ１３と呼ばれ、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合するその能力によって選択された。ｖＮＡＲはＶＥＧＦの活性を中和することによって作用し、その配列によって特徴付けられ、選択および最適化されており、全体が参照により本明細書に組み込まれる、本発明の最も近い先行技術である。
【００３６】
中でも高血圧、タンパク尿、出血、手術創の治癒に対する損傷、致命的合併症（例えば、動脈血栓、胃腸穿孔および可逆性後頭葉限局性白質脳症）のような二次効果または副作用、投与経路、方法の侵襲性、高用量、生物学的利用能、不安定性ならびに高コスト、長期治療がより優れた性能を有する新たな分子を研究する必要性をもたらすので、抗ＶＥＧＦ療法の試験は、いつ治療を開始するか、投薬頻度、およびどのようにこれらの戦略が医療で推し進められ得るのかなどの種々の投薬戦略を試してきた。このような代替があってさえ、副作用を除去または低減するために、眼治療用のＶＥＧＦの活性を阻害するより優れた薬物を開発することが要求されている。
【００３７】
本発明は、その三次元構造、その配列およびＶＥＧＦに対する親和性を特徴とし、眼状態の治療において、特に糖尿病網膜症、黄斑変性、血管新生緑内障または血管形成に関連する眼状態を治療するのに有用な新規なクローンおよびＶ１９、Ｖ３２Ｒと呼ばれる分子および上記のＶ１３を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３８】
【特許文献１】米国特許第８４９６９３３号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３９】
本発明は、免疫グロブリンの重鎖で構成されるＩｇＮＡＲとして知られているサメをベースとした治療用モノクローナル抗体の生成に言及する。具体的には、本発明は、これらの重鎖の可変ドメイン（ｖＮＡＲ）の選択に関する。この場合、これらは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）として知られているサイトカインを認識する能力を特徴とする。ｖＮＡＲは、その生物学的および生物物理学的特性のためにバイオテクノロジーの分野で着目されている。ｖＮＡＲ抗体は環境条件に対して高度な耐性があり、局所治療作用の高い能力を有する。ラクダ免疫グロブリンに由来する可変ドメイン（ＶＨＨとして知られている）と共に、ｖＮＡＲは抗原を認識することができる最小の生体分子である。これらの特性のために、ｖＮＡＲは、モノクローナル抗体を用いる従来の療法の不都合および欠点を上回る。
【００４０】
さらに、本発明は、抗原受容体能力を有する板鰓類のＩｇＮＡＲ型免疫グロブリンに起源を持つ、ＶＨＮＡＲまたはｖＮＡＲと呼ばれる可変領域に属するタンパク質の選択、単離および精製に言及する。これらが起源を持つクローンをＶＥＧＦｖＮＡＲ  Ｖ３２ＲおよびＶ１９と呼び、抗体をＶ３２ＲおよびＶ１９と呼ぶ（ｖ１９またはｖ３２Ｒとしても定義される）。
【００４１】
本発明は、その三次元構造、その配列およびＶＥＧＦに対する親和性を特徴とし、眼状態の治療において、特に糖尿病網膜症、黄斑変性、血管新生緑内障または血管形成に関連する眼状態を治療するのに有用な新たなクローンおよびＶ１９、Ｖ３２Ｒと呼ばれる分子および上記のＶ１３を記載する。
【００４２】
新たなクローンが実験室考案ではないこと、およびこれらが実際に先行技術に対する驚くべき、予期しない技術的利点を提供する異なる抗体を含むことを証明するために、クローンＶ１３の特性評価も本明細書に含め−米国特許第８４９６９３３号明細書で以前記載されている−、結果を比較するために、これを本発明の開発で行われる同じ単離および精製プロトコルに供した。さらに、収率を改善するため、タンパク質の発現および精製のための最良の条件を検出する、ならびにＶＥＧＦと結合し、これを中和する得られたクローンの各々の性能についてのその後の評価を得るために、本発明の開発中に発現および精製の異なる試験および方法を行った。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】仮定される保存されたドメインが検出されたところを示す、タンパク質抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲ  Ｖ１３のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】クローンＶ１３、Ｖ３２Ｒ  ｙ  Ｖ１９に相当する配列の間のアラインメントを示す図である。
【図３】構築物：Ａ：ｐＥＴ２０ｂ＋（ｖＮＡＲ１および３）、Ｂ：ｐＥＴ２８ａ＋（ｖＮＡＲ２  ａｄ  ４）を産生するために使用される発現プラスミドを示す図である。
【図４】周辺質分画ならびに可溶性および不溶性細胞質分画を得るまでの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養液の処理を示す図である。
【図５】シグナルペプチド（ｓｐ）を有するＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒの細胞成分分画検出の分析を示す図である。Ａ：ＳＤＳ  ＰＡＧＥ１５％アクリルアミド還元条件、クマシーブルーで染色。Ｂ：シグナルペプチド（ｓｐ）を有するＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒの細胞成分分画検出の分析。ニトロセルロース膜にエレクトロブロットする、抗Ｈｉｓ（１：３０００）＋ペルオキシダーゼと結合した抗マウス二次抗体（１：３０００）とのハイブリダイゼーション。ＥＣＬ（増強した化学発光の頭字語）によって明らかにした。１レーン毎の試料：１）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ細胞外分画３０℃、２）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ細胞外分画３０℃、３）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ周辺質分画３０℃、４）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ周辺質分画３７℃、５）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ可溶性細胞質分画３０℃、６）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ可溶性細胞質分画３７℃、７）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ不溶性細胞質分画（封入体）３０℃、８）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ不溶性細胞質分画（封入体）３７℃。
【図６】シグナルペプチドを有さないＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒの細胞成分分画検出の分析を示す図である。Ａ：ＳＤＳ  ＰＡＧＥ１５％アクリルアミド還元条件、クマシーブルーで染色。Ｂ：シグナルペプチドを有さないＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒの細胞成分分画検出の分析。ニトロセルロース膜にエレクトロブロットする、抗Ｈｉｓ（１：３０００）＋ペルオキシダーゼと結合した抗マウス二次抗体（１：３０００）とのハイブリダイゼーション。ＥＣＬによって明らかにした。１レーン毎の試料：１）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ細胞外分画３０℃、２）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ細胞外分画３０℃、３）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ周辺質分画３０℃、４）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ周辺質分画３７℃、５）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ可溶性細胞質分画３０℃、６）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ可溶性細胞質分画３７℃、７）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ不溶性細胞質分画（封入体）３０℃、８）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒ不溶性細胞質分画（封入体）３７℃。
【図７】シグナルペプチド（ｓｐ）を有するＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９の細胞成分分画検出の分析を示す図である。Ａ：ＳＤＳ  ＰＡＧＥ１５％アクリルアミド還元条件、クマシーブルーで染色。Ｂ：シグナルペプチド（ｓｐ）を有するＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９の細胞成分分画検出の分析。ニトロセルロース膜にエレクトロブロットする、抗Ｈｉｓ（１：３０００）＋ペルオキシダーゼと結合した抗マウス二次抗体（１：３０００）とのハイブリダイゼーション。ＥＣＬによって明らかにした。１レーン毎の試料：１）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９細胞外分画３０℃、２）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９細胞外分画３０℃、３）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９周辺質分画３０℃、４）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９周辺質分画３７℃、５）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９可溶性細胞質分画３０℃、６）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９可溶性細胞質分画３７℃、７）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９不溶性細胞質分画（封入体）３０℃、８）ｓｐＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９不溶性細胞質分画（封入体）３７℃。
【図８】シグナルペプチドを有さないＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９の細胞成分分画検出の分析を示す図である。Ａ：ＳＤＳ  ＰＡＧＥ１５％アクリルアミド還元条件、クマシーブルーで染色。Ｂ：シグナルペプチドを有さないＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９の細胞成分分画検出の分析。ニトロセルロース膜にエレクトロブロットする、抗Ｈｉｓ（１：３０００）＋ペルオキシダーゼと結合した抗マウス二次抗体（１：３０００）とのハイブリダイゼーション。ＥＣＬによって明らかにした。１レーン毎の試料：１）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９細胞外分画３０℃、２）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９細胞外分画３０℃、３）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９周辺質分画３０℃、４）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９周辺質分画３７℃、５）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９可溶性細胞質分画３０℃、６）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９可溶性細胞質分画３７℃、７）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９不溶性細胞質分画（封入体）３０℃、８）ＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９不溶性細胞質分画（封入体）３７℃。
【図９】シグナルペプチドを有するＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒに相当する不溶性細胞質分画を示す図である。Ａ：添加したタンパク質の可溶化およびＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ粗１ｍｌアフィニティカラムにおけるＦＰＬＣクロマトグラフィー（オンカラムリフォールディング）。Ｂ：アクリルアミドゲル電気泳動（１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析。
【図１０】シグナルペプチドを有さないＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒに相当する不溶性細胞質分画を示す図である。Ａ：添加したタンパク質の可溶化およびＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ粗１ｍｌアフィニティカラムにおけるＦＰＬＣクロマトグラフィー（オンカラムリフォールディング）。Ｂ：アクリルアミドゲル電気泳動（１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析。
【図１１】シグナルペプチドを有するＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９に相当する不溶性細胞質分画を示す図である。Ａ：添加したタンパク質の可溶化およびＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ粗１ｍｌアフィニティカラムにおけるＦＰＬＣクロマトグラフィー（オンカラムリフォールディング）。Ｂ：アクリルアミドゲル電気泳動（１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析。
【図１２】シグナルペプチドを有さないＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９に相当する不溶性細胞質分画を示す図である。Ａ：添加したタンパク質の可溶化およびＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ粗１ｍｌアフィニティカラムにおけるＦＰＬＣクロマトグラフィー（オンカラムリフォールディング）。Ｂ：アクリルアミドゲル電気泳動（１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析。
【図１３】２００〜３００ｎｇ／ウェルのｒｈＶＥＧＦを取り付けた間接ＥＬＩＳＡを示す図である。一次抗体ｖＮＡＲ  Ｖ１３、Ｖ１９またはＶ３２Ｒ、ｐｒｅｐｓ  Ｂ、オンカラムリフォールディングによって精製。対照：一次抗体ｖＮＡＲをオンカラムリフォールディング（１ｍｇ／ｍｌ）によって精製。二次抗体：ウサギ抗ＨＡ１：１０００、三次抗体：ヤギ抗ウサギＨＲＰＯ１：１０００。対照＋抗ＶＥＧＦ  Ａｂｃａｍ、５００または５０ｎｇ／ウェル。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）によって明らかにした。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【図１４】ウエスタンブロット解析を示す図である。ｒｈＶＥＧＦ試料（５００ｎｇ）およびＢＳＡ対照（５０００ｎｇ）のアクリルアミドゲル電気泳動（１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。Ｂ：ニトロセルロース膜にエレクトロブロットし、対応するｖＮＡＲ（１０μｇ）、抗ＨＩＳ（１：３０００）＋ペルオキシダーゼと結合した抗マウス二次抗体（１：３０００）と引き続いてハイブリダイゼーションすることを示す。ＥＣＬによって明らかにした。
【図１５】Ｕ９３７細胞（１０６）についてのフローサイトメトリーを示す図である；細胞膜を透過処理し、ＶＥＧＦｖＮＡＲ１で処理する、すなわちＳＰ−ＶＥＧＦｖＮＡＲＯＲＦ−６Ｈｉｓ−ＨＡはこの場合、Ｖ１３（可溶性細胞外）＋抗ＨＩＳ抗体（１：２００）＋ヤギ抗ウサギａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（１：２００）である。ａ）ＶＥＧＦｖＮＡＲ１細胞外。ｂ）対照抗ＶＥＧＦ（Ａｂｃａｍ）。
【図１６】Ｕ９３７細胞（１０６）についてのフローサイトメトリー；細胞膜を透過処理し、ＶＥＧＦｖＮＡＲ２で処理する、すなわちＳＰ−ＶＥＧＦｖＮＡＲＯＲＦ−６Ｈｉｓ−ＨＡはこの場合、Ｖ１３（リフォールディングされた不溶性細胞質分画）＋抗ＨＩＳ抗体（１：２００）＋ヤギ抗ウサギａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（１：２００）である。Ａ）ＶＥＧＦｖＮＡＲ２（リフォールディングされている）。Ｂ）対照抗ＶＥＧＦ（Ａｂｃａｍ）。
【図１７】ＶＥＧＦについて６ｎｓの刺激中に測定した平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）値を示す図である。Ｙ軸はＲＭＳＤを表し、Ｘ軸はダイナミックステップ数（各ステップは２ピコ秒である）を表す。
【図１８】ＶＥＧＦ残基の平均変動を示す図である。Ｙ軸はＲＭＳＤ値を表し、Ｘ軸は残基の数を表す。
【図１９】ＶＥＧＦのダイナミックからの初期（灰色）および最後の（シアン）構造の重ね合わせを示す図である。
【図２０】ｖＮＡＲ  Ｖ１９について５ｎｓの刺激中に測定した平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）値を示す図である。Ｙ軸はＲＭＳＤを表し、Ｘ軸はダイナミックステップ数（各ステップは２ピコ秒である）を表す。
【図２１】ｖＮＡＲ  Ｖ１９残基の平均変動を示す図である。Ｙ軸はＲＭＳＤ値を表し、Ｘ軸は残基の数を表す。
【図２２】ｖＮＡＲ  Ｖ１９のダイナミックからの初期（灰色）および最後の（シアン）構造の重ね合わせを示す図である。
【図２３】ｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒについて２０ｎｓの刺激中に測定した平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）値を示す図である。Ｙ軸はＲＭＳＤを表し、Ｘ軸はダイナミックステップ数（各ステップは２ピコ秒である）を表す。
【図２４】ｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒ残基の平均変動を示す図である。Ｙ軸はＲＭＳＤ値を表し、Ｘ軸は残基の数を表す。
【図２５】赤色（高い移動性を有する領域）から青色（より静的）まで、ダイナミック中に観察された変動を色コードによって示すｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒ構造の画像である。
【図２６】濃青色で強調した最も可動性の領域を有するダイナミックの最後の（シアン）構造上へのＶ３２Ｒの初期（灰色）構造の重ね合わせを示す図である。
【図２７】ｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒ（各ステップは２ピコ秒である）のダイナミックの各瞬間についての結合の自由エネルギーの値を示す図である。Ｙ軸は全体的エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を表し、Ｘ軸はダイナミックステップ数を表す。
【図２８】ダイナミック中にｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒによって達成される密度エネルギー値を示す図である。Ｙ軸は密度を示し、Ｘ軸は全体的エネルギー値（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を示す。点線は分布に関連するガウス関数を表す。
【図２９】ｖＮＡＲ  Ｖ１９（マゼンタの鎖）とＶＥＧＦ（緑色およびシアンの鎖）の複合体のモデル１を示す図である。
【図３０】ｖＮＡＲ  Ｖ１９（マゼンタの鎖）とＶＥＧＦ（緑色およびシアンの鎖）の複合体のモデル２を示す図である。
【図３１】ｖＮＡＲ  Ｖ１９（マゼンタの鎖）とＶＥＧＦ（緑色およびシアンの鎖）の複合体のモデル３を示す図である。
【図３２】ｖＮＡＲ  Ｖ１９（マゼンタの鎖）とＶＥＧＦ（緑色およびシアンの鎖）の複合体のモデル４を示す図である。
【図３３】ｖＮＡＲ  Ｖ１９（マゼンタの鎖）とＶＥＧＦ（緑色およびシアンの鎖）の複合体のモデル５を示す図である。
【図３４】複合体対照（２Ｚ８Ｖ）についての相互作用のマップを示す図である。Ｖ１９ホモログ（垂直に示される鎖Ｄ）とその受容体（水平に示される鎖Ａ）との間の相互作用を画像中に示す。カラースケールは相互作用エネルギーの値に基づく：赤色はより好ましい相互作用を表し；青色はあまり好ましくないことを表す。
【図３５ａ】複合体ＶＥＧＦ−Ｖ１９についての相互作用のマップを示す図である。
【図３５ｂ】複合体ＶＥＧＦ−Ｖ１９についての相互作用のマップを示す図である。
【図３５ｃ】複合体ＶＥＧＦ−Ｖ１９についての相互作用のマップを示す図である。
【図３５ｄ】複合体ＶＥＧＦ−Ｖ１９についての相互作用のマップを示す図である。
【図３５ｅ】複合体ＶＥＧＦ−Ｖ１９についての相互作用のマップを示す図である。図３５ａから３５ｅにおいて、Ｖ１９（垂直に示される鎖Ｃ）とその受容体（水平に示される鎖Ａおよび鎖Ｂ）との間の相互作用を画像中に示す。カラースケールは相互作用エネルギーの値に基づく：赤色はより好ましい相互作用を表し；青色はあまり好ましくないことを表す。
【図３６】ｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒ（マゼンタの鎖）とＶＥＧＦ（緑色およびシアンの鎖）の複合体のモデル１を示す図である。
【図３７】ｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒ（マゼンタの鎖）とＶＥＧＦ（緑色およびシアンの鎖）の複合体のモデル２を示す図である。
【図３８】ｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒ（マゼンタの鎖）とＶＥＧＦ（緑色およびシアンの鎖）の複合体のモデル３を示す図である。
【図３９】ｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒ（マゼンタの鎖）とＶＥＧＦ（緑色およびシアンの鎖）の複合体のモデル４を示す図である。
【図４０ａ】複合体ＶＥＧＦ−Ｖ３２Ｒについての相互作用のマップを示す図である。
【図４０ｂ】複合体ＶＥＧＦ−Ｖ３２Ｒについての相互作用のマップを示す図である。
【図４０ｃ】複合体ＶＥＧＦ−Ｖ３２Ｒについての相互作用のマップを示す図である。
【図４０ｄ】複合体ＶＥＧＦ−Ｖ３２Ｒについての相互作用のマップを示す図である。図４０ａから図４０ｄにおいて、Ｖ３２Ｒ（垂直に示される鎖Ｃ）とその受容体（水平に示される鎖Ａおよび鎖Ｂ）との間の相互作用を画像中に示す。カラースケールは相互作用エネルギーの値に基づく：赤色はより好ましい相互作用を表し；青色はあまり好ましくないことを表す。
【図４１】ＶＥＧＦのジスルフィド架橋を示す図である。
【図４２】ｖＮＡＲ  Ｖ１９のジスルフィド架橋を示す図である。
【図４３】ｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒのジスルフィド架橋を示す図である。
【図４４】多重配列アラインメントを示す図である。
【図４５】ＶＥＧＦ（緑色）に結合したＶ１９（黄色）のＣＤＲ表示（マゼンタ）を示す図である。
【図４６ａ】Ｖ１９のＣＤＲの領域とＶＥＧＦ、Ｖ１９のＡＲＧ１０１とＶＥＧＦのＧＬＵ１７からのより重要な相互作用を示す図である。
【図４６ｂ】Ｖ１９のＣＤＲの領域とＶＥＧＦ、ＧＬＵ１０３とＡＲＧ１０からのより重要な相互作用を示す図である。
【図４７】ＶＥＧＦ（緑色）に結合したＶ３２Ｒ（黄色）のＣＤＲ表示（マゼンタ）を示す図である。
【図４８ａ】Ｖ３２ＲのＣＤＲの領域とＶＥＧＦ、Ｖ３２ＲのＧＬＵ９８とＶＥＧＦのＡＲＧ４３およびＧＬＮ２４；ＡＲＧ９１とＧＬＮ２４およびＡＳＰ２１；ＨＩＳ９０とＰＨＥ２３；ＡＲＧ９１とＡＳＰ２１からのより重要な相互作用を示す図である。
【図４８ｂ】Ｖ３２ＲのＣＤＲの領域とＶＥＧＦ、Ｖ３２ＲのＬＹＳ９５とＶＥＧＦのＧＬＵ２５；ＡＲＧ１００とＧＬＵ５４；ＴＹＲ１０４とＣＹＳ５５からのより重要な相互作用を示す図である。
【図４９】インサイツリフォールディング（オンカラムリフォールディング）ＨｉｓＴｒａｐアプリケーションテンプレートの理論的勾配を示す図である。合計分離時間＝１６０分＋試料のアプリケーション時間
【図５０】実験の設計を示す図である。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートで試験したｖＮＡＲ抗体濃度を示しており（Ａ〜Ｈ行、１〜１２列が４連に要求される）、同様に陽性および陰性対照を実験全体で使用した。
【図５１】使用する抗体：（Ａ）基準抗体＊、（Ｂ）Ｖ１３＊＊、（ｃ）Ｖ３２Ｒ、（ｄ）Ｖ１９の存在下での管長分析の曲線下面積の平均＋標準偏差を表す柱状図である。＊ラニビズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）。＊＊参照特許である米国特許第８４９６９３３号明細書のクローン。
【図５２】使用する抗体：（Ａ）基準抗体＊、（Ｂ）Ｖ１３＊＊、（ｃ）Ｖ３２Ｒ、（ｄ）Ｖ１９の存在下での分岐点分析の曲線下面積の平均＋標準偏差を表す柱状図である。＊ラニビズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）。＊＊参照特許である米国特許第８４９６９３３号明細書のクローン。
【図５３】ネットワーク形成におけるＶＥＧＦおよびｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒ抗体の効果を表す像である。未処理対照（Ａ）が、試験の１４日の過程で管の最小形成を示すＶＥＧＦ４ｎｇ／ｍＬでの処理が、対照に対して管（Ｂ）の形成の増加を示す。Ｖ３２Ｒ抗体濃度が高いほど、管形成が減少することを示す（Ｃ〜Ｈ）。
【図５４】ネットワーク形成におけるＶＥＧＦおよびｖＮＡＲ  Ｖ１９抗体の効果を表す像である。未処理対照（Ａ）が、試験の１４日の過程で管の最小形成を示す。ＶＥＧＦ４ｎｇ／ｍＬでの処理が、対照に対して管（Ｂ）の形成の増加を示す。Ｖ１９抗体濃度が高いほど、管形成が減少することを示す（Ｃ〜Ｈ）
【図５５】ネットワーク形成におけるＶＥＧＦおよびｖＮＡＲ  Ｖ１３＊抗体の効果を表す像である。未処理対照（Ａ）が、試験の１４日の過程で管の最小形成を示す。ＶＥＧＦ４ｎｇ／ｍＬでの処理が、対照に対して管（Ｂ）の形成の増加を示す。Ｖ１３抗体濃度が高いほど、管形成が減少することを示す（Ｃ〜Ｈ）。＊参照特許である米国特許第８４９６９３３号明細書のクローン。
【図５６】ネットワーク形成におけるＶＥＧＦおよび基準抗体＊の効果を表す像である。未処理対照（Ａ）が、試験の１４日の過程で管の最小形成を示す。ＶＥＧＦ４ｎｇ／ｍＬでの処理が、対照に対して管（Ｂ）の形成の増加を示す。基準抗体濃度が高いほど、管形成が減少することを示す図である（Ｃ〜Ｈ）。＊ラニビズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、免疫グロブリンの重鎖で構成されるＩｇＮＡＲ（新たな抗原受容体の頭字語）として知られているサメをベースとした治療用モノクローナル抗体の生成に言及する。具体的には、本発明は、これらの重鎖の可変ドメイン（ｖＮＡＲ）の選択に関する。この場合、これらは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）として知られているサイトカインを認識する能力を特徴とする。ｖＮＡＲは、その生物学的および生物物理学的特性のためにバイオテクノロジーの分野で着目されている。ｖＮＡＲ産物は環境条件に対して高度な耐性があり、局所治療作用の高い能力を有する。ラクダ免疫グロブリン（ＶＨＨとして知られている）に由来する可変ドメインと共に、ｖＮＡＲは抗原を認識することができる最小の生体分子である。これらの特性のために、ｖＮＡＲは、モノクローナル抗体を用いる従来の療法の不都合および欠点を上回る。
【００４５】
本発明は、抗原受容体能力を有する板鰓類のＩｇＮＡＲ型免疫グロブリンに起源を持つ、ＶＨＮＡＲまたはｖＮＡＲと呼ばれる可変領域に属するタンパク質の選択、単離および精製に言及する。これらが起源を持つクローンをＶＥＧＦｖＮＡＲ  Ｖ３２ＲおよびＶ１９と呼び、それぞれの抗体をＶ３２ＲおよびＶ１９と呼ぶ（ｖ１９またはｖ３２Ｒとしても定義される）。
【００４６】
ＶＥＧＦに対して高く、極めて特異的な親和性を有するので、本発明は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を遮断するｖＮＡＲ系生物製剤の開発にも言及する。これらの産生された分子を異なる単離および精製プロトコルに供した。これらは、その配列および三次元構造、ならびにその親和性および他の関連分子よりも効率的な中和能力をもたらすその標的分子を認識する能力などのその固有の特性を特徴とする。
【００４７】
クローンの選択に使用されるベクターは、アンピリシンおよびカルベニシリンに対する耐性を有するｐＣＯＭｂ３Ｘである。産生菌株はＥＲ２５３７であり、使用する発現菌株はＴＯＰ１０Ｆ’およびＢＬ２１（ＤＥ３）とし、後者はプロテアーゼの欠損が収率を改善するのに寄与するので、発現用に選択した。
【００４８】
実施例１では、Ｖ１９およびＶ３２Ｒクローン、ならびに先行技術に記載され、Ｖ１９およびＶ３２Ｒの特性評価に沿って比較として使用されたＶ１３クローンが由来する、ファージディスプレイによって免疫化された標本の遺伝子バンクを得ることが記載されている。ＴＯＰ１０Ｆ’で発現される細胞膜周辺腔から選択されるｖＮＡＲタンパク質を用いてＥＬＩＳＡを行った。抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲの発現および認識についてのＥＬＩＳＡの結果から、クローンをＶＥＧＦに対する親和性によってスクリーニングし、続けて各々の配列を得た。
【００４９】
新たなクローンが実験室考案ではないこと、およびこれらが実際に先行技術に対する驚くべき、予期しない技術的利点を提供する異なる抗体を含むことを証明するために、クローンＶ１３の特性評価も本明細書に含め−米国特許第８４９６９３３号明細書で以前記載されている−、結果を比較するために、これを本発明の開発で行われる同じ単離および精製プロトコルに供した。
【００５０】
ＶＥＧＦに特異的なクローン１３のタンパク質を体系化するＤＮＡ配列は以下のものである（配列リストで配列番号１として同定される）。実施例４は配列を得る方法を示している：
GCAAGCCTGGACCAAACACCAAGAACGGCAACGAGAGAGACAGGCGAATCCCTGAGCATTAACTGCGTCCTCACTGATACTAGCCATATTTTGTTCGGCACAAAATGGCTCTGGAATAATCCGGGTTCAA CAGATTGGGAAAGCATAACGATTGGCGGACGATATGCTGAATCAGTCAACAACCAAGCAAAGTCATTTTCTCTGCAAATCAAGGACCTGACAGTTGAAGACAGTGGCACCTATTACTGCAAGCGCAAAC CATAGGAAGACGCAAAAATCTACTTCCACGCCCATTGGTGAACGGTATAGCTGCGATGGGGTATAGCTCCAGTGACTACGACGGAGCTGGCACCGTGCTGACTGTGAAC
【００５１】
得られたクローンＶ１３は、ヒトＶＥＧＦに対する高い特異性を有することを特徴としており、そのアミノ酸配列は以下（配列番号２として配列リストで同定される）である：
ASLDQTPRTA TRETGESLSI NCVLTDTSHI LFGTKWLWNN PGSTDWESIT IGGRYAESVN NQAKSFSLQI KDLTVEDSGT YYCKAQTIGR RKNLLPRPLV NGIAAMGYSS SDYDGAGTVL TVN
【００５２】
図１は、保存されたドメインを示す、米国特許第８４９６９３３号明細書に記載される抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲ  Ｖ１３のタンパク質配列を示している。
【００５３】
クローンＶ１９を、種クモハダオオセ（Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ）のサイトカインＶＥＧＦ１６５に対してパニング４ラウンドから選択した。
【００５４】
クローンＶ１９のプラスミドＤＮＡ配列（４１８ｂｐ）は以下であり、配列番号３に相当する：
CAACGGGTTGAACAAACACCAAGAACAGCAACAAAAGAGACGGGCGAATCACTGACCATCAACTGCGTCCTAAGAGATGCTAGTTTTGAATTAAAAGACACGGGCTGGTATCGGACAAAATTGGGTTCAACAAATGAGCAGAGTATATCAATTGGCGGACGATATGTTGAAACAGTCAACAAGGGATCAAAGTCCTTTTCTCTGAGAATTAGTGATCTGAGAGTTGAAGACAGTGGCACGTATAAGTGTCAAGCATTCTATTCTCTTCCGTTGGGCGATTACAACTATTCTCTGCTGTTTAGGGGTGAGAAAGGAGCTGGCACCGTGCTGACTGTGAAC
【００５５】
ｖＮＡＲ１９（Ｖ１９）についてのアミノ酸配列は配列番号４に相当する：
AQRVEQTPRTATKETGESLTINCVLRDASFELKDTGWYRTKLGSTNEQSISIGGRYVETVNKGS
KSFSLRISDLRVEDSGTYKCQAFYSLPLGDYNYSLLFRGEKGAGTVLTVN
【００５６】
４ラウンドを使用した種カリフォルニアネコザメ（Ｈｅｔｅｒｏｄｏｎｔｕｓ  ｆｒａｎｃｉｓｃｉ）の免疫化スキームから選択されたクローンＶ３２ＲのプラスミドＤＮＡ配列（４２１ｂｐ）は以下であり、配列番号５に相当する：
GCAAGCCTGGACCAAACACCAAGAACGGCAACGAGAGAGACGGGCGAATCCCTGACCATTAACTGCGTCTTCACTGATTCTAGCTGTGGTTTGTGCGGCACATCTTGGTTCCGGAATAATCCGGGTTCAACAGATTGGGAACGCATAACGATTGGCGGACGATATGTTGAATCAGTCAACAAGGGAGCAAAGTCATTTTCTCTGCAAATCAAGGACCTGACAGTTGAAGACAGTGTCACCTATTACTGCAAAGCGCAAGGTCATCGATACTTCAGTAAGGTGTGCGAGCTGCGATGTCCCAGTTACTACTACGACGGAGCTGGCACCGTGCTGACTGTGAAC
【００５７】
ｖＮＡＲ  ｖ３２Ｒのアミノ酸配列は配列番号６に相当する：
AASLDQTPRTATRETGESLTINCVFTDSSCGLCGTSWFRNNPGSTDWERITIGGRYVESVNKGAKSFSLQIKDLTVEDSVTYYCKAQGHRYFSKVCELRCPSYYYDGAGTVLTVN
【００５８】
図２は、基準としてのクローンＶ１３、Ｖ３２Ｒ  ｙ  Ｖ１９に相当する、およびその差を示す配列間のアラインメントを示す図である。
【００５９】
以前得られた収率を改善するため、タンパク質の発現および精製のための最良の条件を検出する、ならびにＶＥＧＦと結合し、これを中和する得られたクローンの各々の性能についてのその後の評価を得るために、本発明の開発中に発現および精製の異なる試験および方法を行った。
【００６０】
６ＨｉｓおよびＨＡタグのコード配列と、そのカルボキシ末端で融合した抗体ＶＥＧＦｖＮＡＲをコードする遺伝子の合成を行った。この合成の重要な特徴は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で発現するためのコドンの最適化であった。合成遺伝子を２つの細菌プラスミドにクローニングした。これらを使用して大腸菌ＤＨ５α菌株のコンピテントセルを形質転換した。表１は、配列Ｖ１３、Ｖ１９  ｙ  Ｖ３２Ｒの各々について試験した構築物を示している。
【表１】
0006426198.tif 000002
【００６１】
これらの構築物を産生するために使用する発現プラスミド、図３Ａおよび図３ＢはｐＥＴ２０ｂ＋（ｖＮＡＲ１および３）およびｐＥＴ２８ａ＋（ｖＮＡＲ２および４）である。対象となる配列のサブクローンニングを、シグナルペプチドｐｅｌＢを含むベクターに行う。
【００６２】
ＶＥＧＦｖＮＡＲのクローニングを細菌発現ベクター（ｐＥＴ２０ｂ＋）で実施する。組換え抗体のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の増幅＋単離を、特異的オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって合成遺伝子から行った。制限酵素を使用することによって、増幅したフラグメントを、特異的に選択された細菌発現ベクターと、それが持つ、いったん発現したらタンパク質を周辺質に向けるｐｅｌＢシグナルにサブクローニングした。ライゲーション混合物（プラスミド＋インサート）を大腸菌ＤＨ５α菌株のコンピテントセルに形質転換した後、クローンを得た。
【００６３】
対象となる配列をシグナルペプチドｐｅｌＢを含まないベクターにサブクローニングするために、ＶＥＧＦｖＮＡＲの細菌発現ベクター（ｐＥＴ２８ａ＋）へのクローニングを並行して行い、抗体の第２のサブクローニングを、前のクローニングで使用したのと同じ合成ｃＤＮＡ鋳型から、ただし、タンパク質全体を細胞質に向けるために、この時はシグナルペプチドを除外して行った。
【００６４】
ｐＥＴ２０ｂ＋とｐＥＴ２８ａ＋の両方で、得られた形質転換体を、固体培養（ＬＢ寒天／アンピシリン）での選択によって個別化し、確認法としての配列決定によるプラスミドＤＮＡの保存および分析のための遺伝子構築により２つの形質転換体を選択する。
最後の点の精製した組換えＤＮＡを用いて、本発明者らはタンパク質発現に適した大腸菌菌株、上記のプロテアーゼが欠損した菌株、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株における形質転換に進んだ。得られたクローンを個別化し、再度、その性質をコロニー−ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動によって確認した。
【００６５】
陽性クローンを用いることによって、タンパク質の発現を、２つの温度（３０℃および３７℃）と２つのインキュベーション時間：１６時間および２０時間で細菌培養液５０ｍｌから始めて小規模で評価した。タンパク質を製造するための最良の条件を得るために、温度および時間のこれらの変数を試験する。このパイロット研究は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中でのクローン産生からの液体培地中の細菌培養液および発現誘導因子ＩＰＴＧの使用に基づく。
【００６６】
培養液を遠心分離によって処理することによって、細胞を培養培地から分離した。一方では、細胞をショ糖媒介浸透圧ショックによって処理して周辺質分画を得て；他方では、細胞をリゾチーム、洗剤および超音波処理で溶解して、これらを遠心分離によって分離した可溶性および不溶性細胞内成分から抽出した。プロセススキームは図４にあるが、方法論は図３に記載される。
【００６７】
この段階で、各細胞分画中のタンパク質の量を評価し、次いで、その機能性、すなわち、各分画から得られたタンパク質による認識またはｈＶＥＧＦタンパク質との特異的結合を決定するために、対象となる組換えタンパク質の発現レベルを、異なる細胞分画の各々で分析した（培養培地中への分泌タンパク質、周辺質、細胞質および封入体）。
【００６８】
ヒスチジンテールおよびＨＡを維持して、シグナルペプチドを有するおよび有さない全てのクローンについての構築を行った。発現レベルをこれらの各々で評価した。
【００６９】
分泌されたまたは細胞内の（可溶性もしくは不溶性分画中）ｖＮＡＲタンパク質の異なる位置を分析した。表２に提示される結果は、ｖＮＡＲの発現レベルに相当する。このような結果においては、ｖＮＡＲタンパク質が発現し、封入体を形成しているように思われる（封入体が不溶性細胞質分画中に生じていることを意味する）。
【００７０】
最初に検討された最良の候補物質の１つが細胞外ＶＥＧＦｖＮＡＲ１であった。これは電気泳動によって同定されたが、ＥＬＩＳＡによる親和性試験の後、本発明者らは、最も活発な画分(or 一番の活性画分が)が不溶性細胞質である一方、このタンパク質分画が標的分子に対する親和性をほとんど有さないことを発見した。、
【００７１】
実施例２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）産生者クローンを得て、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイを行って前に精製した各発現ｖＮＡＲの認識を測定するまでさらに処理することを記載している。
【００７２】
実施例３は、細胞成分分画：周辺質、細胞外、可溶性細胞質および封入体に相当する不溶性細胞質を得るためのプロトコルを記載している。これらの分画の各々で、同様にウエスタンブロット解析から、タンパク質濃度を測定した。結果を図５〜図８に示す。
【００７３】
得られた結果から、本発明者らは、シグナルペプチドの存在が分画のいずれにおいても発現を改善せず；さらに、これが存在しないと封入体として不溶性細胞質分画中に存在する異なるｖＮＡＲから得られる濃度が向上すると結論づけた。
【００７４】
上記組換え法によって得られた活性ｖＮＡＲタンパク質が封入体を形成していることが分かったので、本発明の開発中に行った研究は、タンパク質を脱凝集させ、これらを手順にかかわらず標的分子との結合能力を損なうことなく純粋な、可溶性の状態で得るために、特異的な代替方法を適用することによってタンパク質を溶解することに向けられた。
【００７５】
以前得られた収率を改善するため、タンパク質の検出および精製のための最良の条件を入手する、ならびにＶＥＧＦと結合し、これを中和する、得られたクローンの各々の性能についてのその後の評価を得るために、本発明の開発中に発現および精製の異なる試験および方法を行った。
【表２】
0006426198.tif 000003
【００７６】
Ｖ１３分子に使用される第１の精製方法は、以下のステップから基本的になるオンベンチリフォールディング（Ｏｎ−ｂｅｎｃｈ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）として知られる方法であった：１）超音波処理による細胞溶解、２）封入体の単離、３）尿素の緩衝液による可溶化、４）アフィニティカラムまたは固定化金属イオン（ＴＡＬＯＮ（商標））による精製、５）グルタチオン還元系（ＧＳＨ、Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｇ）を含む緩衝液によるリフォールディング、および６）非変性緩衝液を用いたアフィニティクロマトグラフィー（Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ）による過程を通った可溶化およびリフォールディングされたタンパク質の溶出。
【００７７】
本出願に含まれる代替法は、以下のステップからなるオンカラムリフォールディング（Ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）（またはインサイツリフォールディング）として知られている：１）超音波処理による細胞溶解、２）封入体の単離、３）塩化グアニジンによる可溶化、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐカラムでのクロマトグラフィーによるタンパク質精製および尿素の変性緩衝液を用いたカラムリフォールディング；および４）可溶化およびリフォールディングしたタンパク質の溶出。両方法で、以下で詳細に記載されるように、ｖＮＡＲは変性およびリフォールディング過程を受けて、その三次構造を再獲得するだろう。
【００７８】
オンカラムリフォールディング技術による処理を行うために、これを大腸菌中での発現のために最適化された、対象となる配列を含有するプラスミドから開始しなくてはならない。ｖＮＡＲ抗体ならびに６つのＨＩＳおよびＨＡタグによって形成される融合タンパク質をエンコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中にある設計を使用した。対象となる分子と融合したこれらのタグは、発現の生物学的システムの産生の監視とその後の精製の両方を可能にするので必要であり；この場合、標準化された手順を用いると、これらのタグの存在は分子の性能に何ら干渉せず、これらのタグは製造段階において後で除去される。
【００７９】
オンカラムリフォールディングの方法は、固定化金属上でのアフィニティクロマトグラフィーによる精製方法であり、６×Ｈｉｓを有する融合タンパク質に特異的な親和性樹脂を使用し、この場合、対象となるタンパク質は不溶性分画中にある。オンカラムリフォールディングプロセスを行う前に、タンパク質は塩化グアニジンによる可溶化を受ける。オンカラムリフォールディングプロセス中、変性したタンパク質の試料はカラムに注入され、ここで試料は親和性によって保持される一方、結合緩衝液（Ａ１）が維持される（実施例５参照）。可溶化緩衝液（Ａ２）に切り替えた後、リフォールディング勾配が開始し最大１００％まで継続される。この点で、タンパク質リフォールディングのプロセスが終わっている。その後、この緩衝液を溶出緩衝液（Ａ３）によって徐々に置き換えると、タンパク質がアフィニティカラムに結合するまで、結合したタンパク質の放出が引き起こされる。最後に、タンパク質を含有する溶出分画をアクリルアミドゲル電気泳動−ＳＤＳで分析してその大きさおよび組成を研究した。
【００８０】
２８０ｎｍで吸光度を有する１ｍｌ分画は可溶化形態であり、これをアフィニティカラムによって固定し、インサイツでリフォールディングし、次いで、異なる分画でイミダゾールを添加することによって溶出する。
【００８１】
このクロマトグラフィーシステムに供した溶出タンパク質を、アクリルアミドゲル電気泳動（各分画１５μＬ）およびウエスタンブロットによって分析してその性質を検証する。こうして回収した試料は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．３Ｍイミダゾール、１００ｍＭ  Ｌ−アルギニン緩衝液中で見られた。この処理の結果を図９〜図１２に記載する。その後、抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲの機能検証を、ヒトＶＥＧＦ  Ａアイソフォーム１６５である標的分子との結合特性を分析することによって行った。この機能検証のために行った分析はＥＬＩＳＡ、ドットブロット、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー、免疫蛍光法および免疫組織化学であった。
【００８２】
分かるように、高い親和性を示すタンパク質はＶ３２Ｒであり、全てが付与された米国特許第８４９６９３３号明細書に記載されている分子Ｖ１３より親和性が優れている。同じ分子Ｖ１３を２つの異なる処理と比較すると、適用した「新たな」方法によって達成された改善が観察される。ＥＬＩＳＡアッセイの結果を図１３に示す。ウエスタンブロット解析の結果を図１４に示す。
【００８３】
図１４は、得られたＶ１３に照らして、ＶＥＧＦを認識するタンパク質、本発明のｖＮＡＲ  Ｖ１９およびＶ３２の量を比較様式で示している。新たなタンパク質、Ｖ１９とＶ３２Ｒの両方が、Ｖ１３より有意に高い親和性および認識能力を有している。
【００８４】
抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲ分子を最適化し、その親和性特性を有意に増加させると、結果としてその中和能力も増加し、ＶＥＧＦを中和するのに必要なｖＮＡＲの量は低くなる。（実施例10参照）
【００８５】
端的に述べると、本発明者らは、親和性の試験で、得られた新たな標的分子が、米国特許第８４９６９３３号明細書で得られたものより親和性および活性が高いことを見出した。
【００８６】
フローサイトメトリーアッセイによる精製およびリフォールディングしたｖＮＡＲの機能検証を行った。この目的のために、細胞株Ｕ９３７、異なるサイトカインおよびケモカインを発現している骨髄系統の単球を使用した。ＶＥＧＦが構成的に発現および分泌されている。この細胞株は、バイオメディカルサイエンスで一般的に使用されるモデルである。細胞内レベルでの抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲ  Ｖ１３、Ｖ１９およびＶ３２Ｒの結合能力を測定した。アッセイは実施例６に記載する。Ｖ１３についての結果を図１５および図１６に示す。
【００８７】
本発明で提供される分子はインシリコで特性評価した。三次元構造（三元）をホモロジーモデリングおよび分子動態シミュレーションによる詳細化によって調製した。
【００８８】
最適構造についての検索を３連続フィルタを通して行う：１）接触パターンに基づく複合体のグループ化；２）各グループの最良の代表の予備的エネルギーの分析；および３）最も安定な結合様式を見つけるための優れたエネルギーを有する２つの複合タンパク質−タンパク質の分子動態。相互作用のエネルギーパターンを最適構造で分析した。
【００８９】
対照として、Ｖ１９の近い類似体の相互作用を、この種の相互作用についての基準結合自由エネルギーを提供するＡＭＡ１タンパク質（記号ＰＤＢ：２Ｚ８Ｖ）１８を用いて分析した。
【００９０】
Ｖ１９およびＶＥＧＦ分子の場合、最適構造を既に公開されている既存の類似体結晶構造から作成し、この場合、欠損残基のみをモデル化し、得られた構造を分子動態によって緩和した。使用したシミュレーション時間は５〜６ｎｓであった。タンパク質Ｖ１９の構造は結晶構造ＰＤＢ、記号：１ＶＥＳ１９、アラニン１１１のバリンへの突然変異に由来していた。ＶＥＧＦタンパク質の結晶はＰＤＢ、記号１ＶＰＦ２０から得られた。
【００９１】
前記構造の安定性を評価するために、動態を通して出発構造と比較して、タンパク質の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を測定した。ＲＭＳＤ値が小さいほど安定である。全体的と残基のレベルでの両方で測定を行った。
【００９２】
いったん構造を分析したら、タンパク質−タンパク質複合体を得た。このために、各複合体のいくつかのタンパク質−タンパク質ドッキング分析を行い（ＶＥＧＦ−Ｖ１９およびＶＥＧＦ−Ｖ３２Ｒ）、ここでは最適であると判断されるまで、結合および配向の異なる領域を評価した。
【００９３】
ＶＥＧＦ
【００９４】
動態を通した全体的変動値（ＲＭＳＤ）は２Åを超えなかった（図１７）が、この値の周りで多くの変動があった。系は、１または２回転のαヘリックスによって接続されたβシートの２つの群で構成された二量体である。これらの構造モチーフは高度に可動性であり、言及された変動をもたらす。
【００９５】
概して、約２５残基毎に位置するβシートの相互接続ループを除いて、残基１個当たりの変動値は２Åを超えなかった（図１８）。系が二量体であるので、変動パターンは両サブユニットについて繰り返される。
初期構造の重ね合わせは、シミュレーションの最後の５００ｐｓの最小化平均構造と一致する（図１９）。
【００９６】
Ｖ１９
【００９７】
変動全体に関して、系は安定であった。動態を通した全体的ＲＭＳＤ値は２Åを超えなかった（図２０）。Ｖ１９の構造はループによって接続された種々のβシートからなり、これらのループの可動性および溶媒への再配向がタンパク質のＲＭＳＤを変動させる。
【００９８】
残基による変動は低く（図２１）、最大４Åの値が得られる残基８５〜１００の間の領域を除いて概して２Åを超えなかった。この領域は、ループによって相互接続された２枚のβシートからなる、抗体の可変領域に相当し、高い可撓性を有し、他のタンパク質と結合するための認識部位となっている。
【００９９】
初期構造にシミュレーションの最後の５００ｐｓの最小化平均構造を重ねると、上記ループを除いて、残基８５〜１００の間に位置する、構造間での類似性が観察された（図２２）。
【０１００】
Ｖ３２Ｒ
【０１０１】
ホモロジーモデリングを行って、これを分子動態によって詳細化した。これは、２０ｎｓのシミュレーション時間で、構造２Ｚ８Ｖ１８  ｙ  ２Ｉ２６２１に基づくモデルから始まった。全体的にと前記のレベルでの両方で前記構造の安定性を評価するために、ＲＭＳＤ値を出発構造に関して、動態を通して測定した。
【０１０２】
変動全体は４Åに達した。最初のナノ秒で、モデルはその初期構造から離れて、シミュレーションの残りの間安定なままであった（図２３）。
【０１０３】
残基による変動は、残基４０〜５０の間と残基９０〜１１０の間にある２つの領域で４Å超の値に達する有意な変動を示した。いったん残基９０〜１１０に相当するループのアンフォールディングが生じると、タンパク質は安定になった。残りの変動は、βシートを接続するループ、ならびにＣ末端に蓄積した（図２４参照）。
【０１０４】
図２５は、ｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒの最も可動性の領域を表す像を示している。初期構造と最後の５００ｐｓの最小化平均の重ね合わせで、２つの構造が類似であることが分かった。残基Ｇ８９〜Ｙ１０５およびＲ３９〜Ｒ４９で変動が検出された（図２６）。Ｖ３２Ｒのエネルギー分析によって、分子の最も可能性が高いエネルギー値が−３２５０Ｋｃａｌ／ｍｏｌであることが示されている（図２７および図２８）。
【０１０５】
タンパク質−タンパク質ドッキング
【０１０６】
タンパク質−タンパク質ドッキングの技術を用いて相互作用モデルを作成した。異なる結合ゾーンおよび最適な配向を見出すために、得られた結果を選別した。選別ステップは以下であった：
１）その接触パターンに基づく複合体のグループ化およびｖＮＡＲが抗体認識ループの領域を通してＶＥＧＦと相互作用していない解答の除去。
２）ＡＰＢＳ（適応性のあるポワソン−ボルツマンソルバー（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｐｏｉｓｓｏｎ−Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ  Ｓｏｌｖｅｒ））の計算による受容体およびリガンドの静電気学の研究および静電気的ショックが観察された解答の除去。
３）各グループの最良の代表の予備的エネルギー分析。他のモデルのエネルギー計算、および両タンパク質間の接触面の関数におけるその値の補正。
４）以下の基準に基づいて試験するためのモデルの選択：
・総エネルギー値（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）
・ファンデルワールスエネルギー
・水素架橋のエネルギーと合わせたファンデルワールスエネルギー
【０１０７】
タンパク質−タンパク質ドッキングＶ１９−ＶＥＧＦ
【０１０８】
この選別工程の後、５つの結合パターンが得られ（図２９〜図３３）、構造、エネルギー安定性および接触マップを研究するために、分子動態をこれらに適用した。
【０１０９】
対照モデルに対する比較エネルギー
【０１１０】
ＶＥＧＦとＶ１９との間の結合様式を最も良く表すモデルを選択しようとするために、対照複合体（２Ｚ８Ｖの結晶のＶ１９のホモログ）を参照して各々の相互作用エネルギーの比較試験を行った。エネルギー値を相互作用面に基づいて補正する；エネルギーをサマトリー（ｓｕｍｍａｔｏｒｙ）として計算するので、得られた値と関与する面との間の著しい補正が存在した。他方、総エネルギーはクーロン項からなり；別のものはファンデルワールス力に関連し、これは水素架橋の強度で完成する。ＡＭＡ１−Ｖ１９のホモログの複合体の場合、人工物の実際の相互作用を選択する際に、エネルギー評価においてクーロン項をなしで済ますことがより緻密であることが分かった。分解も表３の結果に提示する。
【０１１１】
表３は、ＶＥＧＦ−Ｖ１９複合体について選択されたモデルの相互作用エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を示している。動態の最後の５００ｐｓの最小化平均構造についてエネルギー値および咬合面を計算した。（Ｅｔｏｔａｌ：総エネルギー；Ｅｖｄｗ：ファンデルワールスエネルギー；ＥＨＢ：水素架橋のエネルギー；ＳＡＳＡ：溶媒露出表面積）。
【表３】
0006426198.tif 000004
【０１１２】
データおよび前の節で試験した構造安定性に照らして、モデル２をＶＥＧＦとｖ１９との間の結合様式として捨てた。
【０１１３】
対照モデルに対する接触の比較
【０１１４】
図３４は、対照複合体（２Ｚ８Ｖの結晶のＶ１９のホモログ）の接触と比較するためのモデルの各々の接触行列を示している。結晶中のＶ１９のホモログとその受容体との間の相互作用に照らして、Ｖ１９中に３つの相互作用領域が存在すると言うことができる：Ｘ末端（残基１〜２）に相当するゾーン１；二次認識ループに相当する残基２５〜３５の間に構成されるゾーン２、および８９位と１０３位との間の残基を含み、主要な認識ループに相当するゾーン３。
【０１１５】
複合体ＶＥＧＦ−Ｖ１９のモデルからの相互作用マップ（図３５ａ〜図３５ｅ）について、対照複合体のＶ１９について結合ゾーン図の予想される重複が確認された。
【０１１６】
変動パターンと合わせて得られた全てのデータにより、本発明者らの分子一致モデル１のモデル（図２９）が、対照複合体（ｖＮＡＲ  Ｖ１９のホモログとＡＭＡ１）で見られるのと同様の接触パターンを有するのに加えて、シミュレーションの全体にわたって最良の構造安定性および相互作用エネルギーを提供することが示された。
【０１１７】
タンパク質−タンパク質ドッキングｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒ−ＶＥＧＦ
【０１１８】
主な配向を網羅するＶＥＧＦとｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒとの間の結合の４つのモデル（図３６〜図３９）を分離した。その構造およびエネルギー安定性ならびにその接触マップを判断するために、２０ｎｓの分子動態に沿ったエネルギーを分析した。これを行うために、本発明者らはＶＥＧＦおよびｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒを詳細化した後に得られた構造で始める。その後、タンパク質−タンパク質ドッキングの技術を用いて相互作用モデルを作成した。前の場合と同じプロトコルにしたがって、異なる結合ゾーンおよび最適な配向を見出すために、得られた結果を選別した。
【０１１９】
対照モデルに対する比較エネルギー
【０１２０】
ＶＥＧＦとＶ３２Ｒとの間の結合様式を最も良く表すモデルを選択しようとするために、対照複合体（２Ｚ８Ｖの結晶のＶ１９のホモログ）を参照して各々の相互作用エネルギーの比較試験を行った。エネルギー値を相互作用面に基づいて補正した；エネルギーをサマトリーとして計算したので、得られた値と関与する面との間の著しい補正が存在した。他方、総エネルギーはクーロン項からなり；別のものはファンデルワールス力に関連し、これは水素架橋の強度で完成する。ＡＭＡ１−Ｖ１９のホモログの複合体の場合、人工物の実際の相互作用を選択する際に、エネルギー評価においてクーロン項なしで済ますことがより緻密であることが分かった。そのため、この場合、この種の分解が繰り返される。表４は、ＶＥＧＦ−Ｖ３２Ｒ複合体について選択されたモデルの相互作用エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を示している。動態の最後の５００ｐｓの最小化平均構造についてエネルギー値および咬合面を計算した。（Ｅｔｏｔａｌ：総エネルギー；Ｅｖｄｗ：ファンデルワールスエネルギー；ＥＨＢ：水素架橋のエネルギー；ＳＡＳＡ：溶媒露出表面積）。
【表４】
0006426198.tif 000005
【０１２１】
データおよび前の節で試験した構造安定性に照らして、モデル４をＶＥＧＦとｖ３２Ｒとの間の結合様式として捨てた。
【０１２２】
対照モデルに対する接触の比較
【０１２３】
Ｖ１９−ＶＥＧＦドッキングの場合のように、対照複合体（２Ｚ８Ｖの結晶のＶ１９のホモログ、図３４）の接触と比較するためのモデルの各々の接触行列を検討する。複合体モデルＶＥＧＦ−Ｖ３２Ｆの相互作用マップ（図４０ａ〜図４０ｄ）の場合、対照複合体のＶ１９について見られる結合ゾーンが繰り返されると予想される。
【０１２４】
変動パターンと合わせて得られた全てのデータにより、本発明者らの分子一致モデル３のモデル（図３８）が、構造安定性および相互作用エネルギーの機能において最適と考えられることが示された。その上、このモデルは、対照複合体で観察された相互作用のパターンを再現した。
【０１２５】
前の全てのデータに基づいて、本発明の分子の特性評価に広範な支持を提供する追加の情報が得られた。
【０１２６】
ジスルフィド架橋
【０１２７】
試験で処理するタンパク質中に存在するジスルフィド架橋（ＳＳ）を以下に示す。具体的には、前記ジスルフィド架橋を形成するシステインに、ＦＡＳＴＡフォーマット（ヌクレオチド配列またはペプチド配列のいずれかを表すためのテキストベースフォーマット、この中ではヌクレオチドまたはアミノ酸を一文字記号を用いて表す）の配列上において、黄色のＸで印をつける。以下は、架橋を形成するシステインの対による記載である。タンパク質のナンバリングは残基番号１で始まり、鎖は変わるがナンバリングは連続的である。
【０１２８】
ＶＥＧＦ
【０１２９】
各サブユニット中に３個のジスルフィド架橋およびサブユニット間に２個の架橋を有する二量体は、合計８個のジスルフィド架橋を有し、これは１６個のシステインを意味する（図４１および表５）。
＞ＶＥＧＦ：Ａ｜ＰＤＢＩＤ｜鎖｜配列（配列番号７）：
1     VVKFMDVYQRSYXHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSXVPLMRXGGXXNDEGLEXVPTEE
61    SNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKXEXRPK
＞ＶＥＧＦ：Ｂ｜ＰＤＢＩＤ｜鎖｜配列（配列番号７）：
95    VVKFMDVYQRSYXHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSXVPLMRXGGXXNDEGLEXVPTEE
155    SNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKXEXRPK
【表５】
0006426198.tif 000006
【０１３０】
ｖＮＡＲ  Ｖ１９
【０１３１】
これは２つの群のシートを結合する単一ジスルフィド架橋を有する、２つの群のβシートからなる単量体であり、これは２個のシステインを意味する（２２−８３）（図４２）。
＞ｖ１９｜ＰＤＢＩＤ｜鎖｜配列（配列番号８）：
1     AWVEQTPRTATKETGESLTINXVLRDASFELKDTGWYRTKLGSTNEQSISIGGRYVETVN
61    KGSKSFSLRISDLRVEDSGTYKXQAFYSLPLGDYNYSLLFRGEKGAGTVLTVK
【０１３２】
大腸菌中で産生するためのコドンの最適化中に、配列、配列番号４と配列番号８との間の下線を施したアミノ酸の差が得られた。これはその構造を変化させない；その後の試験で証明された配列は配列番号４であった；そのため、これがＶ１９の工業スケーリングにとって好ましい実施形態である。
【０１３３】
ｖＮＡＲ  Ｖ３２Ｒ
【０１３４】
これは２つの群のシートを結合する単一ジスルフィド架橋を有する、２つの群のβシートからなる単量体であり、これは２個のシステインを意味する（２４−８５）（図４３）。
＞ｖ３２Ｒ｜ＰＤＢＩＤ｜鎖｜配列（配列番号９）：
1     MAASLDQTPRTATRETGESLTINXVFTDSSCGLCGTSWFRNNPGSTDWERITIGGRYVES
61    VNKGAKSFSLQIKDLTVEDSVTYYXKAQGHRYFSKVCELRCPSYYYDGAGTVLTVNGQAG
121   Q
【０１３５】
配列番号９中の最後の５個の下線を施したアミノ酸がヒスチジンタグに先行し、工業製造で除去されるものであるので、Ｖ３２Ｒの好ましい実施形態は配列番号６に相当することに留意すべきである。
【０１３６】
相補性決定領域（ＣＤＲＳ）
【０１３７】
抗体の配列から、非冗長データベースｎｒを用いて、ローカルＢＬＡＳＴサーバー（ベーシックローカルアラインメントサーチツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）についての英略語）を用いて検索を行った。抗体のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有する配列を回収した。その後、ＢＬＡＳＴによって得られた配列および抗体の配列の多重アラインメントを行った。この目的のために、ソフトウェアＭＡＦＦＴ（高速フーリエ変換を用いた多重アラインメントについての英略語）を用いた。
【０１３８】
この多重アラインメントでは、この種の抗体の不変および可変領域（ＣＤＲに関連する）であるものが観察される。図４４で分かるように、明確に保存された領域、他の半保存（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）（配列の全セット中に変異があるが、アミノ酸がサブセットレベルで保存されており、これらの変異の進化的起源を示唆している）および最後に特異性を提供するものである可変領域が存在する。
【０１３９】
２つの明らかに異なるＣＤＲを見つけることができる：
・ＣＤＲ１：４５位と５１位との間
・ＣＤＲ２：１０５位と１３９位との間
【０１４０】
これらの位置は、配列のセットのために多重アラインメントによって提供されるグローバルナンバリングを指す。
【０１４１】
図４５および図４７では、Ｖ１９およびＶ３２Ｒに関するＣＤＲの領域の概要を示す。ＣＤＲの領域とＶＥＧＦからの最も重要な相互作用のいくつかの詳細を図４６ａ、図４６ｂおよび図４８ａ、図４８ｂに示す。
【０１４２】
インビトロモデルにおける抗血管形成活性
【０１４３】
ｖＮＡＲ抗体：Ｖ１３（米国特許第８４９６９３３号明細書で前記）、Ｖ１９およびＶ３２Ｒの活性を、ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ（登録商標）血管形成キットを用いた抗血管形成アッセイによって評価した。この試験の目的は、実施例１０に記載される市販の抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）を基準とみなして、形成パラメータおよび管の分岐を分析して、Ｖ１３、Ｖ１９およびＶ３２Ｒ抗体が血管の形成（血管形成）を阻害することができるかどうか、およびその差を決定することであった。
【０１４４】
この試験から、ｖＮＡＲ  Ｖ１３（米国特許第８４９６９３３号明細書で前記）、Ｖ１９およびＶ３２Ｒ抗体が、市販の抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）と類似の動態で、ＶＥＧＦサイトカインによって媒介される血管新生過程を阻害することができると結論づけることができた（図５０〜図５２）。全ての場合で、抗体濃度依存性血管形成阻害効果が観察される。阻害値２つのパラメータ（表６）を考慮した（ＩＣ５０）は、Ｖ１９とＶ３２Ｒの両方が、抗体Ｖ１３（米国特許第８４９６９３３号明細書で前記）に対して、血管形成に対する阻害効果を生み出すために最大１２倍少ない濃度の抗体、および市販の基準抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）と類似の濃度を要することを示している。
【０１４５】
本発明の目的は、糖尿病網膜症、血管新生緑内障または滲出型加齢黄斑変性ならびにＶＥＧＦ媒介血管新生の現象が関与する眼状態を治療または予防するのに有用で、かつその活性成分が単離および精製されたｖＮＡＲタンパク質によって構成され、その特異的アミノ酸配列、その三次構造およびその有意に増加した親和性、ＶＥＧＦの中和および認識能力を特徴とする抗ＶＥＧＦ分子を提供することである。このようなｖＮＡＲ組換えタンパク質をここではＶ１３、Ｖ１９およびＶ３２Ｒと呼び、そのアミノ酸配列を、それぞれ、それ自体が本発明の実施形態である配列番号２、配列番号４および配列番号６として定義する。
【０１４６】
本発明の非限定的な実施形態は、血管新生現象が関与しており、以下のいずれかであり得る病理学的過程の治療または予防に寄与する眼投与用のｖＮＡＲ  Ｖ３２ＲおよびＶ１９タンパク質の使用である：網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、黄斑変性、加齢黄斑変性、網膜疾患、糖尿病網膜症、硝子体出血、網膜出血、脈絡膜炎、網膜剥離、網膜ドルーゼン、血管新生緑内障、脈絡膜疾患、ぶどう膜炎、近視、眼疾患、真菌性眼感染症、毛細血管拡張症、網膜動脈閉塞症、変性近視、網膜静脈閉塞症、脈絡網膜炎、ヒストプラズマ症、ぶどう膜疾患、三日ばしか（風疹）、眼トキソプラスマ症、網膜上膜、コロボーマ、脈絡膜新生物、網膜変性、網膜炎、網膜穿孔、角膜ヘルペス、未熟児網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、乳頭浮腫、ぶどう膜髄膜脳炎症候群、視神経乳頭ドルーゼン、網膜色素線条症、網膜色素変性症、視覚障害、交感性眼炎、瘢痕、眼球熱傷、再発性虚血、眼外傷、緑内障、眼出血、暗点、後部ぶどう膜炎、真菌血症、網膜新生物、角膜疾患、色素失調症、ヘモグロビンＣ症、線維症、角膜混濁、前部ぶどう膜炎、前房出血、サルコイドーシス、無水晶体、医原病、汎ぶどう膜炎、白内障、術後合併症、鎌状赤血球貧血、網膜血管炎、骨腫、サイトメガロウイルス網膜炎、萎縮、静脈炎、円錐角膜、スタージ・ウェーバー症候群、ウイルス性眼感染症、眼奇形、物質関連障害、貫通性眼外傷、２型糖尿病、放射線障害、鎌状赤血球形質、偽水晶体、色素性母斑、増殖性硝子体網膜症、出血、１型糖尿病、母斑、視神経疾患、血管病、カンジダ症、化学熱傷、小眼球症。
【０１４７】
本発明の別の実施形態は、ｖＮＡＲ：Ｖ３２ＲおよびＶ１９を発現するＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ３２ＲおよびＶＥＧＦｖＮＡＲ  ｖ１９と呼ばれる大腸菌のクローンを含む、工業規模製造用のこれらのｖＮＡＲを発現する細菌クローンの各々に関する。
【０１４８】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるベクターを含む、コード配列を含むことを特徴とするｖＮＡＲ  Ｖ３２ＲおよびＶ１９をエンコードするプラスミドベクターに関する。
【０１４９】
本発明の実施形態は、ＶＥＧＦ活性の中和が要求される疾患を予防または治療するための医薬品を調製するためのｖＮＡＲ  Ｖ３２ＲおよびＶ１９タンパク質の使用を含み、薬物は眼科用であり得る。
【０１５０】
本発明の実施形態は、有効成分として薬学的に正しい用量の本発明のｖＮＡＲタンパク質を含有することを特徴とする眼科用医薬組成物であり、これらの組成物はベース組成物または担体が必要な安定性および保存をこれらのタンパク質に提供することを特徴とする。
【０１５１】
以下の実施例を提示して本明細書に記載される生物製剤の性能を実証するが、これらの実施例は例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１５２】
実施例
【実施例１】
【０１５３】
免疫ライブラリーの作成およびＶＥＧＦに特異的なｖＮＡＲクローンの選択：
【０１５４】
サメ標本の免疫化が最初のステップであり、ヒト組換えサイトカインＶＥＧＦ１６５を静脈内投与することによって、ＰＢＳ中タンパク質１μｇを用いて２０週間の免疫化プロトコルを続けた。最初の２回の免疫化は完全形態のフロイントアジュバントも含み、同じ期間中、１５日毎に負荷を行った。各増強前に、本発明者らは尾静脈から１ｍＬの瀉血を行った。この血清を−２０℃で保管した。
【０１５５】
次のステップは標本の脾臓からの全ＲＮＡ抽出であり、脾臓をフェノール−クロロホルムＲＮＡ抽出およびイソプロパノールからの沈殿の標準的プロトコルにしたがって、最後の免疫化の７日後に解剖すると、１．２μｇ／μＬの全ＲＮＡが得られ、分光光度法によって純度を試験した。
【０１５６】
その後、２０μＭの初期濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドGTTCACAGTCAGCACGGTGCCAGCTC（配列番号１０）および全ＲＮＡ１μｇを用いて、慣用的な方法による逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。約６２０ｂｐのフラグメントから、２％アガロースゲルを通して可視化し、臭化エチジウムで乾燥させ、ＰＣＲ反応を行って２本のＤＮＡ鎖を得た。
【０１５７】
ＤＮＡの二本鎖を得るために、本発明者らは、以下の７つのセンスオリゴヌクレオチドの混合物も使用した：GCACGGCTTGAACAAACACC（配列番号１１）、CAACGGGTTGAACAAACACC（配列番号１２）、ACAAGGGTAGACCAAACACC（配列番号１３）、GCAAGGGTGGACCAAACACC（配列番号１４）、GCATGGGTAGACCAAACACC（配列番号１５）、GCAAGCCTGGACCAAACACC（配列番号１６）、GCATTGACGGACCAAACACC（配列番号１７）。
【０１５８】
センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドの両方が、これらに制限酵素ＳｆｉＩのための認識部位を与えるさらなる配列を有する。増幅したフラグメントを、２％アガロースゲルおよび最終濃度５０ｎｇ／μＬ、（１００ボルトで３０分）の電気泳動によって分析した。使用したオリゴヌクレオチドセットによる予想サイズに対応するフラグメントサイズ（約３２０〜３５０ｂｐをゲルから切断した）。その後、特別なキットを用いて、ＤＮＡをゲルから抽出した。この工程を十分な量のＤＮＡが得られるまで繰り返した。
【０１５９】
次いで、ｖＮＡＲ遺伝子に相当する、ＰＣＲによって得られた精製したＤＮＡフラグメント１．５μｇを、消化するＤＮＡ１μｇ当たり制限酵素ＳｆｉＩ  ５Ｕにより消化して、５０℃で５時間インキュベートした。混合物を不活性化し、−８０℃で保管した。
【０１６０】
以下のステップは、クローニングしたｖＮＡＲがファージ上で発現されるように（ファージディスプレイ）、ＳｆｉＩ酵素のための２つの切断部位を有するクローニングベクター、ファージミド発現ベクターｐＣＯＭｂ３Ｘを調製するというものであった。消化産物を１％アガロースゲルで精製して、制限ベクターを回収し、一方は約３５００ｂｐおよび他方は約１５００ｂｐの２つのフラグメントを得た。
【０１６１】
第１のフラグメントは両消化部位中の消化されたベクターに相当し、第２のフラグメントは結果として生じたスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントに相当する。これらを１％アガロースゲル上で可視化し、両バンドを切断し、引き続いて研和−凍結を通してＤＮＡ抽出した。これらを精製し、２６０ｎｍで分光光度計によって定量化した。
【０１６２】
その後、本発明者らは、続けて小規模でのＶＨＮＡＲフラグメントとｐＣＯＭｂ３Ｘベクターのライゲーションを行って、消化されたフラグメントの全ての状態を検証し、次いで、これを大規模で行う。ライゲーションを、酵素Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて１：１モル比で、ｖＮＡＲインサートと前に消化したｐＣＯＭｂ３Ｘベクターとの間で行った。ライゲーションの陽性対照は、消化されたベクター＋両切断部位で消化によって産生されたスタッファーフラグメントを含んでいた。Ｔ４リガーゼを用いるおよび用いない、スタッファーフラグメントを含まない消化されたベクターの陰性対照を用いて、ベクターが自身にライゲーションされていないことを確認した。また、消化されたベクターを用い、酵素Ｔ４リガーゼを用いない対照を作製して、ベクターが十分消化されていることを確認した。
【０１６３】
ライゲーションの効率を、最後に電気穿孔した大腸菌を３段階希釈でＬＢ寒天平板上に蒔くことを含む標準的な方法論にしたがって、エレクトロコンピテントセル大腸菌ＥＲ２５３７への電気穿孔（２００Ω、２．５ｋＶ、４ｍｓ）によって検証し、コロニー形成単位を得た（ＣＦＵ）。ＣＦＵおよびライゲーションの数、ならびに播種体積を考慮して、ライブラリーのサイズを計算した。
【０１６４】
ＶＥＧＦ１６５について得られた免疫ライブラリーのサイズは６．３６×１０８ＣＦＵ／ｍＬ（大規模）であり、これを免疫化プロトコル後にサメによって産生される変異性を表すとみなすことができる。陰性対照では、アンピシリン（２０μｇ／ｍＬ最終濃度）を含有するＬＢ寒天平板上での増殖はなかった。
【０１６５】
電気穿孔した細胞を培養して一次ライブラリー増幅を行い、アンピシリンおよびカナマイシンを含有するＳＢ培地で一晩培養する従来の方法論にしたがって、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を使用し、次いで、これらを遠心分離して、濾過によって前に滅菌した上清を得て、保存した。一次ライブラリー増幅後、ＥＬＩＳＡプレート（ＰＢＳ中ＢＳＡ３％を用いて前にインキュベートおよびブロッキングした）上でＶＥＧＦ（ＰＢＳ中１μｇ）を用いて、得られたファージ抗体の４回の選択ラウンドを行ったので、１ウェル当たり５ｇ／ｍＬのサイトカインＶＥＧＦおよび３％ＢＳＡ５０μＬを接触させ、陰性対照に抗原として使用した。よって、サイトカインはプレートウェルの内側に固定化されたままであった。ファージ５０μＬを３７℃で１時間インキュベートした；１ウェル当たりＴｗｅｅｎ  ０．０５％−ＰＢＳ  １×を用いて、（それぞれ）５、１０、１５および２０回の激しい洗浄を４ラウンドのそれぞれについて行った；本発明者らは、選択されたファージがＶＥＧＦにより特異的であると予想する。その後、この時、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’の培養液中にある３および４ラウンドから得られたファーゴ（ｆａｇｏ）を使用した；インサートの存在をＰＣＲを通して検証し、次いで、ｖＮＡＲタンパク質の発現誘導を行い、その後、これを浸透圧ショックによって大腸菌の周辺質分画から抽出し、これらをニッケルとのアフィニティクロマトグラフィーによって精製した；ＥＬＩＳＡを行ってＶＥＧＦとの予想される親和性を測定した。プロセス全体の収率は最良ではなかったが、これは不溶性または非活性タンパク質の凝集体を含有する封入体形成のためであり得る（これらは周辺質抽出を行うことによって抽出することができない）、またはＥＬＩＳＡがその産生レベルを検出することができないためである。
【実施例２】
【０１６６】
抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の発現細胞の調製、その後の処理およびＥＬＩＳＡを通したｖＮＡＲ認識能力の特性評価
【０１６７】
その標的分子としてのＶＥＧＦについての選択されたクローンからの産物の発現および特異的認識を測定するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の培養液５０ｍＬを誘導し、Ｖ１３、Ｖ１９およびＶ３２Ｒを別々に含有するプラスミドｐＥＴ−２０ｂ（＋）（シグナルペプチドを有さない）ならびにｐＥＴ−２８ａ（＋）（シグナルペプチドを有する）によって改変した。得られたクローンを個別化し、陽性クローンをコロニーＰＣＲによって、およびアガロースゲル上での電気泳動分析を通して確認した。陽性クローンからの飽和培養液を、アンピシリン（ｐＥＴ２０ｂ＋のクローン）およびカナマイシン（ｐＥＴ２８ａ＋のクローン）も含有する選択的ＬＢ液体培地で調製し、これらから１５％グリセロール中ストックを得てそれらを−８０℃で保存した。
【０１６８】
本発明者らは、抗Ｈｉｓまたは抗ＨＡ抗体＋ペルオキシダーゼと結合した二次抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっておよび免疫ブロット法を通して対象となるタンパク質の過剰発現を試験し、特異的基質ＴＭＢを用いて明らかにした。
【０１６９】
他方で、本発明者らは続けて小規模（パイロット試験）でのタンパク質発現を評価し、次いで、パイロット試験で最適とみなした光学密度（０．６〜０．８）が得られるまで、３７℃の温度で抗生物質を含有するＬＢ培地中で、形質転換（陽性）ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌の培養液で開始して陽性の得られたクローンからの大規模でのタンパク質発現を評価した。０．８ｍＭの発現誘導因子ＩＰＴＧを添加し、最適条件の温度（３０℃）および時間（２０〜２２時間）での発現を維持した。本発明者らは続けて緩衝液および超音波処理によって、溶解からの培養液から得られた細胞ペレットから精製し、その後、封入体を不溶性分画から分離した；精製は、固定化金属によるアフィニティクロマトグラフィーを行うことを含み、対応する樹脂は６×Ｈｉｓと融合したタンパク質に対する親和性を有する。いったんタンパク質を可溶化したら、本発明者らは続けてオンカラムで上記方法によってフォールディングを行った。
【０１７０】
この手順を通して得られたｖＮＡＲタンパク質の機能性を評価するために、間接ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫ブロット法およびフローサイトメトリーを行った。
【０１７１】
ＥＬＩＳＡ試験を行うために、本発明者らは、プレートに５０μＬ、３００ｎｇ／ウェルの実験室で生成したｒｈＶＥＧＦ抗原（組換えヒト血管内皮増殖因子、バージョン１６５）を取り付け、また本発明者らは市販の同等の抗原（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（登録商標）の組換えヒトＶＥＧＦ１６５）を使用する。装飾は同一の結果２時間／３７℃または１２〜１６時間４℃で行った。アッセイの陰性対照抗原として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用し、抗原を用いない等しいウェルを使用した。吸着後、ウェルをＰＢＳ−５％スキムミルク１５０μｌを用いてブロッキング（４℃で１６時間または室温で２時間）し、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％で洗浄した；次いで、ＰＢＳ−５％スキムミルク中に希釈したｖＮＡＲ調製物１５０〜５０μｌをウェルに添加し（１ウェル当たりの添加したｖＮＡＲの量は０．１〜１５μｇの間に及んだ）、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、ウェルに保持されたｖＮＡＲ抗体を、ｖＮＡＲ：６ＨｉｓまたはＨＡと融合したタグを検出するための二次抗体で検出した。ヒスチジンタグ（抗６Ｈｉｓ）または抗ＨＡポリクローナル抗血清に対するモノクローナル抗体を、ＰＢＳ−５％スキムミルクに１：３０００〜１：１０００（１ウェル当たり５０μｌ）の間で希釈した希釈で使用した。プレートをインキュベートし、洗浄し、ペルオキシダーゼと結合していることが明らかにされている抗体（１ウェル当たり５０μｌ）を添加した：ポリクローナル抗ＨＡを含むウェル中ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清またはモノクローナル抗６Ｈｉｓを含むウェル中ウサギ抗マウスＩｇＧ抗血清。プレートを室温で３０〜４５分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ウェルに添加しているＴＭＢ１００μｌ、ペルオキシダーゼの基質で広範に洗浄した短時間のインキュベーションの後、３Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μｌをウェルに添加して反応を停止した。Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ｐｌｕｓ（Ｆｌｏｗ）分光光度計で、酸化したｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）の光学濃度を測定した（λ＝４５０ｎｍ）。
【０１７２】
１：１０００希釈のヒトＶＥＧＦ１６５アイソフォームを認識する市販の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ製のマウスの抗ＶＥＧＦモノクローナル、参照ａｂ１３１６）およびペルオキシダーゼウサギ抗マウスＩｇＧ抗血清と結合したものを陽性対照として使用した。
【０１７３】
図１３はＥＬＩＳＡアッセイの結果を示しており、ここではクローンＶ１９に対するクローンＶ３２ＲおよびＶ１３によるタンパク質発現増加が自明である。
【実施例３】
【０１７４】
細胞成分分画の単離
【０１７５】
これらの試験の標準的な手順は、３０℃または３７℃で１６〜２０時間、ＩＰＴＧ（０．８ｍＭ最終濃度）を用いて誘導することによって細菌培養液５００ｍｌで始める。次いで、培養液を細胞および培養培地の遠心分離によって処理する。細胞をショ糖によって媒介される温和な浸透圧ショックで処理して細胞外媒体、周辺質のタンパク質を得る；またはリゾチーム、洗剤および超音波処理で溶解して、これらを遠心分離によって分離した可溶性および不溶性細胞内成分から抽出する。各分画の評価を、本質的にＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の対象となるタンパク質の過剰発現の試験、引き続いてクーマシーブルー染色および血清学的方法、具体的には抗「タグ」モノクローナル抗体（抗Ｈｉｓまたは抗ＨＡ）およびペルオキシダーゼと結合した二次抗体を用いるウエスタンブロットによるその特異的検出によって行った。
【実施例４】
【０１７６】
抗ＶＥＧＦ  ｖＮＡＲのアミノ酸の決定
【０１７７】
実験室で、反応性クローンの精製したタンパク質を処理して配列を得て（Ｓｅｑｘｃｅｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＥＥＵＵ）、混合物をプライマーＯｍｐｓｅｑを用いて示される条件にしたがって調製し、ｐＣＯＭｂ３Ｘによりベクターはこのオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有し、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ  ７．２．２ソフトウェアを用いてＶＥＧＦについての特異的配列を得た；これらは、配列番号３、配列番号４（クローンＶ１９について）および配列番号５および配列番号６（クローンＶ３２Ｒについて）である配列リストに含まれる。
【実施例５】
【０１７８】
インサイツリフォールディング：オンカラムリフォールディング。
【０１７９】
対象となるタンパク質の細胞質分画は、大部分は封入体を形成しているのが見られ、抽出物の遠心分離によって、細菌溶解後に容易に単離される。対象となるタンパク質を、可溶化タンパク質を有することを要するオンカラムリフォールディングと呼ばれるＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅＭＲの独自の精製法によって回収する。そのため、タンパク質が封入体を形成した分画に塩化グアニジンを使用することが必要であった。
【０１８０】
オンカラムリフォールディング法を行うために、本発明者らは最初に全てｐＨ８．０の緩衝液の調製に進んだ。後に、本発明者らは１００ｍＭ  Ｌ−Ａｒｇ：結合緩衝液（ポートＡ１）：６Ｍグアニジン塩酸塩に基づく、可溶化緩衝液（ポートＡ２）：６Ｍ尿素に基づく、および溶出緩衝液（ポートＡ３）とリフォールディング緩衝液（ポートＢ）：共にＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ＮａＣｌ、イミダゾールおよび２−メルカプトエタノールを含有する、を添加した。全て、結合緩衝液中で、タンパク質、すなわち、ヒスチジンテールを欠いているものの非特異的結合を減らすよう作用し、その溶出にも参加するイミダゾールを含有している。
【０１８１】
本発明者らは、試料を結合緩衝液の組成に調整し、封入体をボルテックスして一晩結合緩衝液に希釈または再懸濁することによって、続いて試料（塩化グアニジンで前に可溶化したタンパク質）を調製した。
【０１８２】
本発明者らは、システムとクロマトグラフィーの調製を続ける：ＡＫＴＡ−プライム装置および選択されたカラム（Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  １ｍｌ  ＦＦ粗、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を装着した後、アプリケーションテンプレート、オンカラムリフォールディングＨｉｓ  Ｔｒａｐ法をシステムで選択した。緩衝液またはカラム中の緩衝液の交換を行った。クロマトグラフィーを行う前に、試料を０．４５ミクロンを通して濾過した。
【０１８３】
図４９は、リフォールディング緩衝液、方法の異なる段階および実行時間を用いて選択された方法によって適用された勾配の図を示している。溶出タンパク質を含有する分画を２８０ｎｍの吸光度によって検出する。
【実施例６】
【０１８４】
フローサイトメトリー
【０１８５】
Ｕ９３７細胞を、ｖＮＡＲ抗体とＶＥＧＦの反応性を分析するためのモデル細胞として使用した。前に固定および透過処理したある１００００００個の細胞を、ｖＮＡＲの調製および特異的活性にしたがって、異なる希釈で、室温において３０分間選択されたｖＮＡＲ抗体とインキュベートした。ＰＢＳ  ｐＨ７．４で数回洗浄した後、細胞を抗６×Ｈｉｓモノクローナル抗体とインキュベートし、引き続き適当に洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８と結合した抗体とインキュベートした。標識後、細胞をＰＢＳで洗浄し、最後に２５０μｌ体積のＰＢＳに再懸濁した。蛍光標識細胞をフローサイトメーターで定量化した。市販の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体および同複合二次抗体を陽性対照として使用した。細胞をその大きさ（前方散乱またはＦＳＣ：「前方角光散乱」）および複雑度（側方散乱またはＳＳＣ：「側角光散乱」）によって「ドットプロット」で同定した。蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の発光をＦＬ１検出器で回収した。蛍光強度の増幅検出器を、一次ｖＮＡＲ抗体で処理していないＵ９３７細胞（陰性対照）で１００〜１０１の間に調整した。
【実施例７】
【０１８６】
熱安定性
【０１８７】
異なる分割量のｖＮＡＲを調製し、異なる温度で数日間（３〜７日の間）インキュベートして短期熱安定性を評価した。典型的には、試験温度は３７℃（１時間）、室温、４℃、０℃、−２０℃および−８０℃とした。−２０℃および−８０℃での凍結は速く、エタノール−ドライアイス浴で行った。インキュベーション期間後、試料を遠心分離に供してその時に生成した凝集体を捨てた。−２０℃および−８０℃での凍結試料を遠心分離前に氷上で解凍した。これらの試料の上清を用いて変性１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。クーマシーブルーで染色した後、可溶性タンパク質の損失を、異なるインキュベーションでの凝集体の形成によって分析した。
【実施例８】
【０１８８】
質量分析
【０１８９】
質量分析による同一性分析のために、ｖＮＡＲ調製物を変性１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。クーマシーブルーで染色した後、ｖＮＡＲバンドをゲルから切り取り、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析によって分析した。このシステムは、酵素消化によって形成したペプチドの正確な質量を決定することによってタンパク質を同定することができる。さらに、このシステムは、タンデム型飛行時間（ＴＯＦ／ＴＯＦ）、対象となる分子イオンを単離および断片化し、タンパク質フラグメントのイオン質量の測定値を得る技術によってより正確にタンパク質を同定し、特徴付けることができる。ゲル小片を５０％アセトニトリルで洗浄した。次いで、ゲル小片を、暗所において、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中１０ｍＭ  ＤＴＴ、５５ｍＭヨードアセトアミド中に５６℃で４５分間置いた。重炭酸アンモニウムをゲルフラグメントトリプシンに添加し、これを３７℃で一晩インキュベートした。次いで、これを５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸に移し、ゲル小片のペプチドを５分間超音波処理によって抽出した。ペプチドを３３％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸１０μＬに再懸濁した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析の分析用に、ＡＢｉ４８００  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（商標）分光計を陽イオン反射器モードで使用した。イオン加速電圧は２０ｋＶとした。ペプチド中の質量フィンガープリンティングの同定のために、トリプシン処理したペプチドの質量マップをＢｉｏＴｏｏｌｓ（商標）ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）プログラムを通して移してＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）ソフトウェアを用いてスイスプロットを検索した。
【実施例９】
【０１９０】
エンドトキシン除去
【０１９１】
ｖＮＡＲ調製物中のエンドトキシンを除去するために、２つのツールを使用した：Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ：溶液中に存在するパイロジェンに結合し、これを除去するためのマトリックス上に固定化されたポリミキシンＢを用いたカラム。このクロマトグラフィー手法は使用するのが単純で、少量の試料の迅速な除去を提供する。異なるｖＮＡＲ試料を優れた結果でこれらのカラムに使用した。これらのカラムにｖＮＡＲ試料を装入し、溶出した後に回収した分画を変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質が存在するものを合わせ、電気泳動によって再度定量化した。概して、ｖＮＡＲ調製物はこの処理に許容性を示し、得られたタンパク質収率は主に回収したタンパク質の７５〜９０％の間である。
【実施例１０】
【０１９２】
インビトロでの血管形成の阻害の比較試験
【０１９３】
アッセイは、１４日間、ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）と共培養した、緑色蛍光タンパク質でトランスフェクトしたヒト臍静脈（ＨＵＶＥＣ）の内皮細胞の９６ウェルプレート中での培養からなった。陽性対照として、４ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを使用し、これは全プレートで広範な管形成およびネットワーク形成をもたらし、管長のレベルは約１３〜１４ｍｍ／ｍｍ２に達した。
【０１９４】
第１の陰性対照として、培養液を管形成に有利でないＶＥＧＦの非存在下に維持すると、わずか２〜３ｍｍ／ｍｍ２のレベルに達する。別の適用した陰性対照は、１００μＭスラミンを添加して達成する；この処理はＶＥＧＦ媒介血管形成を完全に阻害した。
【０１９５】
異なる濃度のｖＮＡＲ抗体を実験の４日、５日、７日、１０日および１２日目にウェルに添加する：４ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下でＶ１３（米国特許第８４９６９３３号明細書で前に記載されている）、Ｖ１９およびＶ３２Ｒ、ならびに基準抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（図５０参照）。各プレートを使用して２つの化合物を分析する。よって、濃度による４連が利用可能である。各処理の最後に１ウェル当たり６枚の像をとった。
【０１９６】
化合物に１４日間暴露した後、血管化過程の２つのパラメータを測定した：管長（図５１）および分岐点（図５２）。これらのパラメータからの結果を、４ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦのみ（陽性対照）を受けた細胞、および２０μＭスラミン＋ＶＥＧＦ（陰性対照）を受けた細胞と比較した。
【０１９７】
分析により、ＶＥＧＦが対照と比較して管形成および分岐点を刺激し、基準抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（Ａ）、Ｖ１３（Ｂ）、Ｖ３２Ｒ（Ｃ）およびＶ１９（Ｄ）が濃度依存的様式で管形成を阻害し、分岐点の形成も阻害することが示されている。
インビトロアッセイで血管形成過程を５０％阻害するのに要求される各抗体の濃度（ＩＣ５０）の分析を、非線形回帰モデルを用いて用量−反応曲線を構築することによって決定した。得られたデータを表６に示す；抗体の効力を、２つのパラメータの血管形成活性の５０％を中和するために要求される濃度（ｍｇ／ｍＬ）として表す：インビトロアッセイで測定した管長および分岐点。
【表６】
0006426198.tif 000007
【０１９８】
図５３、図５４、図５５および図５６は、Ｖ３２Ｒ、Ｖ１９およびＶ１３抗体、ならびに基準抗体の血管形成阻害効果を表す像を示している。
【０１９９】
この試験の主な結論は、全ての抗体が、濃度依存的様式で、血管の数および分岐点によって測定される血管形成過程の阻害効果を示すということである。５０％阻害するＶ３２ＲおよびＶ１９抗体の濃度は２０〜４０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。
【０２００】
参考文献
【０２０１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５ａ】
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【図３５ｂ】
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【図３５ｃ】
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【図３５ｄ】
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【図３５ｅ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０ａ】
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【図４０ｂ】
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【図４０ｃ】
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【図４０ｄ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６ａ】
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【図４６ｂ】
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【図４７】
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【図４８ａ】
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【図４８ｂ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【配列表】
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