(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
造影剤で処置された物体の特徴を画像化により定量化する方法であって、
（ａ）ある期間にわたって前記物体の複数の画像シグナルを画像化システムから受信すること、
（ｂ）前記物体の地点に対応する前記複数の画像シグナルの各々のシグナル強度をデータ処理システムで測定すること、及び
（ｃ）前記物体の前記地点での測定シグナル強度を、前記データ処理システムで、第１及び第２の指数項を含む双指数関数にカーブフィッティングし、前記第１の指数項が、遊離している前記造影剤の濃度の経時的な減少を表わし、前記第２の指数項が、前記物体に保持されている前記造影剤の濃度の経時的な減少を表わすことを含む方法。
【請求項２】
前記物体の少なくとも一部の前記定量化された特徴を含む画像を生成するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ある期間にわたって前記物体の前記複数の画像シグナルを取り込むことを更に含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の画像シグナルが、前記造影剤の濃度が、前記シグナル強度の減衰及び／又は飽和が著しい地点未満になってから取り込まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｄ）前記物体の目的領域の各地点について、ステップ（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すステップ、及び
（ｅ）前記定量化された特徴を平均するステップを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ｄ）前記物体の目的領域の各地点について、ステップ（ｂ）を繰り返すステップ、及び
（ｅ）前記目的領域の各地点の、特定の時点での前記シグナル強度を平均するステップ、及び
（ｆ）前記平均シグナル強度に対してステップ（ｃ）を実施するステップを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ある期間にわたって取り込まれた前記複数の画像シグナルが、複数の画像である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の画像シグナルの各々で測定された前記シグナル強度が、前記物体の前記地点に対応する前記画像の各々のピクセルの強度である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ビデオ密度測定法を使用して前記画像が処理される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記双指数関数が、
Ｉ（ｔ）＝Ａｆｅ−λｆｔ＋Ａｒｅ−λｒｔ
を含み、
式中Ｉが、造影剤の濃度を表わす前記検出シグナル強度であり、Ａｆが、前記消失相における前記遊離造影剤の最大濃度を表わし、Ａｒが、前記消失相における前記保持造影剤の最大濃度を表わし、λｒが、前記保持造影剤の消失速度定数であり、λｆが、前記遊離造影剤の消失速度定数であり、ｔが、造影剤投与終了後の時間である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記双指数関数式が、定数、スケール係数、係数、指数項を含むリストから選択される１つ又は複数の成分を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記保持造影剤の最大濃度Ａｒの特徴を、前記データ処理システムで定量化することを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記保持造影剤の消失速度定数λｒの特徴を、前記データ処理システムで定量化することを更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記保持造影剤の半減期の特徴を、前記データ処理システムで定量化することを更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記保持造影剤の濃度Ａｒｅ−λｒｔの特徴を、前記データ処理システムで定量化することを更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記保持造影剤の曲線下面積の特徴を、前記データ処理システムで定量化することを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記遊離造影剤の消失速度定数λｆの特徴を、前記データ処理システムで定量化することを更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記遊離造影剤の半減期の特徴を、前記データ処理システムで定量化することを更に含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記遊離造影剤の最大濃度Ａｆの特徴を、前記データ処理システムで定量化することを更に含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記遊離造影剤の濃度Ａｆｅ−λｆｔの特徴を、前記データ処理システムで定量化することを更に含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記遊離造影剤の曲線下面積の特徴を、前記データ処理システムで定量化することを更に含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記データ処理システムで、２つの目的領域のＡｆ又はＡＵＣｆの比率を取ることにより組織の微小血管容積を定量化することを更に含み、分母が、血液プール領域に位置する前記目的領域のＡｆ又はＡＵＣｆである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記造影剤が、分子結合要素を有するか又は有していない複数のマイクロバブルである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
画像化が、超音波（ＵＳ）画像化である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
画像化が、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
造影剤で処置された物体の特徴を画像化により定量化するシステムであって、
ある期間にわたって取り込んだ前記物体の複数の画像シグナルを受信し、
前記物体の地点に対応する前記複数の画像シグナルの各々のシグナル強度を測定し、及び
前記物体の前記地点での前記測定シグナル強度を、第１及び第２の指数項を含む双指数関数にカーブフィッティングし、前記第１の指数項が、遊離している前記造影剤の濃度の経時的な減少を表わし、第２の指数項が、前記物体に保持されている前記造影剤の濃度の経時的な減少を表わすように構成されているデータ処理システムを備えるシステム。
【請求項２７】
前記期間にわたって前記物体の前記複数の画像シグナルを取り込むように構成された画像化システムを更に備える、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
画像化を使用して、造影剤で処置された物体の特徴を定量化するための装置であって、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成されたデータ処理システムを備える装置。
【請求項２９】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法を実施するようにコンピュータに指令するための使用に実行可能なコンピュータ読取り可能なコードを含むコンピュータプログラム。
【請求項３０】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法を実施するようにコンピュータに指令するための使用に実行可能なコンピュータ読取り可能なコードを含むコンピュータ読取り可能な媒体。
【請求項３１】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法を実施するようにコンピュータに指令するための使用に実行可能なコンピュータ読取り可能なコードを含む非一時的なコンピュータ読取り可能な媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
造影剤で処置した物体の特徴を定量化する方法が開示されている。より詳しくは、造影剤が、対象体に導入されている微粒子を標的とすることを含む定量化が開示されるが、それに限定されるものではない。
【背景技術】
【０００２】
造影剤は、画像化により検出可能な微粒子である。用語「画像化」は、画像化デバイスを使用した検出を指し、その例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：超音波（ultrasound）又は超音波（ultrasonic）（ＵＳ）画像法、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、シンチグラフィー、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、Ｘ線画像法／蛍光透視法、蛍光画像法、生物発光画像法、顕微鏡検査法、視覚的方法、又はこれらの多重様式変化型。
【０００３】
（造影）画像化に好適な造影剤は、提案された画像診断法の性質に依存し、逆も成り立つ。例えば、マイクロバブル等のガス含有微粒子は、ＵＳ画像法の造影剤として使用することができる。放射性核種（例えば、テクネチウム−９９ｍ、タリウム−２０１、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、ガリウム−６７、インジウム−１１１、フッ素−１８、炭素−１１、窒素−１３、酸素−１５、ルビジウム−８２）を含有する微粒子は、シンチグラフィー、ＳＰＥＣＴ、又はＰＥＴの造影剤として使用することができる。常磁性、超常磁性、又は超超常磁性材料（例えば、ガドリニウム（Ｇｄ）、酸化鉄、鉄、白金、マンガン）を含有する微粒子は、ＭＲＩの造影剤として使用することができる。放射線不透過性材料（例えば、ヨウ素、バリウム、金属）を含有する微粒子は、ＣＴ又はＸ線画像法／蛍光透視法に使用することができる。フルオロフォア又は蛍光染料（例えば、フルオレセイン−５−イソチオシアナート、ローダミン、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩ）、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＯ））は、蛍光画像法／顕微鏡検査法に使用することができる。酵素基質（例えば、ルシフェラーゼの基質）を含有する微粒子は、生物発光画像法に使用することができる。造影剤は、複数の画像診断法により検出可能であってもよい。例えば、常磁性材料を有する／有していないマイクロバブルは、ＵＳ画像法、ＭＲＩ、及び顕微鏡検査法により検出することができる。
【０００４】
用語「画像シグナル」は、画像化の受信シグナルを指し、造影剤の受信シグナル、又は造影剤＋別の要素（例えば、組織又は血液）の受信シグナルを表わすと特定される。受信シグナルには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：未加工の高周波又はフロントデータ、コーディング又は処理の前／後のデータ、画像ピクセルデータ（又は画像）、又は顕微鏡で視覚的に観察される微粒子の数／密度／濃度。
【０００５】
用語「シグナル強度」は、画像シグナルの強度又は強さを指し、以下のもの等どの（それらに限定されないが）類似の用語と同義的に使用することができる：シグナル振幅、シグナルの強さ、シグナルパワー（例えば、シグナル電圧の二乗、シグナル音響強度）、シグナルデシベル（ｄＢ）、シグナルビデオ強度、シグナルビデオ密度（例えば、グレースケール又はカラースケールの画像のピクセル強度）、又は顕微鏡で視覚的に観察される微粒子の数／密度／濃度。必要に応じて、画像ビデオ密度（例えば、ピクセル強度）は、好適な関数（例えば、逆対数関数を使用する展開）を使用して、実質的に線形化することができる。
【０００６】
分子結合要素を含む造影剤は、目的分子（標的分子）を検出するために、分子画像化用の１つ又は複数の適切な画像診断法に使用することができる。例えば、ＵＳ分子画像化は、標的マイクロバブルを造影剤として使用して達成するこことができる。マイクロバブルは、ガスを封入したシェルで形成されている。シェルは、脂質、タンパク質、又はポリマーで作製することができる。マイクロバブルは、ＵＳ画像での輝点として現われるシグナルを生成する音響場内で振動し、それによりＵＳコントラスト増強を達成する。マイクロバブルは、十分に小さく、むしろ赤血球細胞が流れるように、妨げられることなく微小血管を流れる。標的化マイクロバブルは、検出しようとする目的分子に結合する分子結合要素を含有するシェルを有する。したがって、例えば、標的化マイクロバブルは、血流に導入されると血液と共に循環し、目的分子に及び目的分子周辺に結合及び蓄積し、ＵＳ画像法を使用して検出可能である。非標的化マイクロバブルも、ＵＳ分子画像法を使用して画像化することができる。
【０００７】
目的分子（標的分子、標的化分子、又は分子標的）は、これらに限定されないが、以下のものであってもよい：分子、タンパク質、受容体、粒子、又は細胞（人工の／移植された材料上に存在するもの、例えば、冠状動脈ステント、人工心臓弁、又は遮断デバイスに塗布されている金属、ポリマー、又は薬物）。目的分子は、細胞の表面に存在していてもよい。目的分子は、ｄｅ−ｎｏｖｏで存在していてもよく、又は対象体若しくは系に人為的に導入されていてもよい。
【０００８】
用語「造影剤」、「微粒子」、「標的化微粒子」、「マイクロバブル」、又は「標的化マイクロバブル」は、同義的に使用することができる。
【０００９】
「標的化マイクロバブル造影超音波検査法」（標的化ＭＣＵ）は、標的化マイクロバブルが対象体又は系に導入され、上記マイクロバブルが、ＵＳデバイスを使用して画像化される技術に与えられる名称である。好適なデバイスの例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：Ｓｉｅｍｅｎｓ社製Ａｃｕｓｏｎ  Ｓｅｑｕｏｉａ５１２超音波システム（例えば、コントラストパルスシーケンス（ＣＰＳ、ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｐｕｌｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）画像化モードを使用する）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ社製ＨＤＩ５０００超音波システム（例えば、パルスインバージョン画像化モードを使用する）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ社製Ｓｏｎｏｓ５５００超音波システム（例えば、パワーモジュレーション画像化モードを使用する）、又はＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ  ７７０（例えば、線形画像化モードを使用する）、又はＶｅｖｏ  ２１００（例えば、非線形画像化モードを使用する）。
【００１０】
マイクロバブル投与後の短期間の間、マイクロバブル集団の一部は、目的分子に付着することになり、それらは保持マイクロバブルと呼ばれるが、なかには遊離したままのものがあり、それらは遊離マイクロバブルと呼ばれる。保持マイクロバブルは、目的分子（複数可）への付着により組織又は系（例えば、フローチャンバー系）に保持又は蓄積されたマイクロバブルである。また、保持マイクロバブルは、これらに限定されないが、非特異的付着又は細胞取込みを含む他の機序により、組織又は系に保持されてもよい。遊離マイクロバブルは、組織又は系で自由に循環するマイクロバブルである。保持マイクロバブル及び遊離マイクロバブルは両方とも、消失により経時的に数が減少する。
【００１１】
標的化ＭＣＵは、マイクロバブルを導入した後、ある時間が経過し、体内又は系内の遊離マイクロバブルが、消失により比較的低いレベルに減少した後（例えば、遊離マイクロバブルに起因するシグナルが低くなったか、わずかになったか、最小限になったか、又は検出不能になった際に）、保持マイクロバブルシグナル強度を測定することにより、目的分子（標的分子）の濃度を決定するために使用されている。しかしながら、本発明者は、この画像シグナル分析法は、低濃度の検出、並びに標的分子濃度の小さな変化の検出が劣
ることにより明らかなように、感度が不足し、定量化の度合いが低いことを見出した。さらに、この画像シグナル解析法は、不正確であり、整合性を欠き、ばらつきが大きい傾向がある。代替的な画像シグナル分析法は、マイクロバブルの濃度が高いか又は中程度である場合、マイクロバブル超音波シグナルの減衰及び／又は飽和が問題となり、標的分子濃度を決定するためのシグナル分析が非常に困難に又は不正確になる。これらの問題は、シグナル減衰及び／又は飽和がいずれも生じないか最小限に抑えられるように、体内又は系に投与されるマイクロバブルの数を減らすことにより、ある程度軽減することができるが、本発明者は、これにより、検出することできる標的分子の数、並びに標的分子濃度の定量化の精度及び度合いが低減されることを見出した。
【００１２】
上記は、ヒト応用に向けた標的化ＭＣＵの開発を制限する主な障害である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、ロバストで、高度に定量的であり、したがって、特に標的化ＭＣＵ用の、ヒト被験者並びに動物の造影画像法（分子画像法）に好適な画像シグナル分析法の提供を試みることである。本方法は、これらに限定されないが、以下のものを含む、１つ又は複数の利点を有していてもよい：分子標的の定量化の感度、精度、及び度合いがより高いこと；よりロバストで、再現性が高く、より高用量の造影剤（例えば、標的化ＭＣＵでの標的化マイクロバブル）を使用することができ、ボーラスとして投与できる（持続点滴も使用することができる）こと；保持造影剤又は遊離造影剤の半減期等の、他の有用な物理的特性が同時に得られること；組織微小血管容積（tissue fractional vascular volume）も得られること。例えば、本方法は、より広範囲の標的分子濃度を定量
化することができ、並びに標的分子濃度のより小さな変化を検出することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の１つの態様によると、画像化を使用して、造影剤で処置された物体の特徴を定量化する方法であって、ある期間にわたって取り込まれた物体の複数の画像シグナルを画像化システムから受信すること；物体の地点に対応する複数の画像シグナルの各々のシグナル強度をデータ処理システムで測定すること；及び物体のその地点の測定シグナル強度を、データ処理システムで、第１及び第２の指数項を含む双指数関数にカーブフィッティングすることを含み、第１の指数項が、遊離している造影剤の濃度の経時的な減少を表わし、第２の指数項が、物体に保持されている造影剤の濃度の経時的な減少を表わす方法が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様によると、画像化を使用して、造影剤で処置された物体の特徴を定量化するためのシステムであって、ある期間にわたって取り込まれた物体の複数の画像シグナルを画像化システムから受信し；物体の地点に対応する画像シグナルの各々のシグナル強度を測定し；及び物体のその地点の測定シグナル強度を、第１及び第２の指数項を含む双指数関数にカーブフィッティングし、第１の指数項が、遊離している造影剤の濃度の経時的な減少を表わし、第２の指数項が、物体に保持されている造影剤の濃度の経時的な減少を表わすように構成されているデータ処理システムを備えるシステムが提供される。このシステムは、その期間にわたって物体の複数の画像シグナルを取り込むように構成された画像化システムを更に含んでいてもよい。
【００１６】
本発明の更に別の態様によると、画像化を使用して、造影剤で処置された物体の特徴を定量化するための装置であって、本明細書で開示された任意の好適な方法を実施するように構成されたデータ処理システムを備える装置が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様によると、本明細書で開示された、画像化を使用して物体の特徴を定
量化する任意の方法を実施するようにコンピュータに指令するための使用に実行可能なコンピュータ読取り可能なコードを含むコンピュータプログラムが提供される。
【００１８】
本発明の更なる態様によると、本明細書で開示された、画像化を使用して物体の特徴を定量化する任意の方法を実施するようにコンピュータに指令するための使用に実行可能なコンピュータ読取り可能なコードを含むコンピュータ読取り可能な媒体が提供される。
【００１９】
本発明の別の更なる態様によると、本明細書で開示された、画像化を使用して物体の特徴を定量化する任意の方法を実施するようにコンピュータに指令するための使用に実行可能なコンピュータプログラムコードを含む非一時的なコンピュータ読取り可能な媒体が提供される。
【００２０】
本発明の１つの態様では、画像化を使用して、造影剤で処置された物体の特徴を定量化する方法であって、
（ａ）ある期間にわたって物体の複数の画像シグナルを取り込むこと；
（ｂ）物体の地点に対応する複数の画像シグナルの各々のシグナル強度を測定すること；及び
（ｃ）物体のその地点の測定シグナル強度を、第１及び第２の指数項を含む双指数関数にカーブフィッティングし、第１の指数項が、物体に保持されている造影剤の濃度の経時的な減少を表わし、第２の指数項が、遊離している造影剤の濃度の経時的な減少を表わす方法が提供される。
【００２１】
カーブフィッティングされる測定シグナル強度は、造影剤の濃度が、シグナル強度の飽和及び／又は減衰が著しい地点未満になった後のシグナル強度であってもよい。
【００２２】
分析される画像シグナルは、記載されているような任意の好適な画像診断法のものであってもよい。１つの構成では、ＵＳ画像化（例えば、標的化ＭＣＵ）の画像シグナルが分析される。
【００２３】
ステップ（ａ）で取り込まれる好適な画像シグナルは、記載されているような任意の好適な画像シグナルであってもよい。１つの構成では、（複数の）画像が、（複数の）画像シグナルとして取り込まれる。
【００２４】
ステップ（ｂ）で測定される好適なシグナル強度は、記載されているような任意の好適なシグナル強度であってもよい。１つの構成では、画像ピクセル強度（ビデオ密度）が、シグナル強度として測定される。
【００２５】
目的地点又は領域でのシグナル強度は、ステップ（ｃ）を実施する前に、バックグラウンドシグナル及び／又はノイズを補正してもよい。これは、例えば、物体の同じ目的地点又は領域での造影剤投与前の画像シグナル強度を使用して、減算により実施してもよい。
【００２６】
本発明の第２の態様では、コンピュータ又は画像化デバイスの中央処理装置（ＣＰＵ）で実行して、造影剤の濃度及び消失特徴を表わす画像シグナル（電気シグナル）を、開示されているように分析及び変換する方法であり、より詳しくは、この方法は、保持造影剤の濃度及び消失特徴を遊離造影剤の濃度及び消失特徴と区別して、これらに限定されないが、以下のものを含む有用な結果の取得を可能にする：画像化した組織中の標的分子の濃度／発現レベル、組織微小血管容積、組織／物体／対象体中の保持造影剤又は遊離造影剤の半減期。これらは、例えば、臨床意思決定に（例えば、目的分子の濃度／発現レベルは、診断、予後、及び／又は疾患進行／解消の評価に使用することができる）、又は造影剤の薬物動態プロファイルの評価に（例えば、造影剤半減期は、造影剤の適切な／安全な用
量を評価するために使用することができる）適用することができる。
【００２７】
言及されているように、本発明の実施形態は、分子標的のより高度の定量化を含む、幾つかの利点を有する。疾患のタイプ、重症度、及び病期が異なれば、様々な組み合わせの分子が様々な濃度で発現され得るため、本発明の実施形態は、ＵＳ分子画像法等の分子画像法の定量化の度合いを増加させる、よりロバストな方法を提供する。
【００２８】
複数の画像シグナルは、造影剤の濃度が、シグナル強度の減衰及び／又は飽和が著しい地点未満になってから、取り込むことができる。
【００２９】
双指数関数は、以下の式を含んでいてもよい：
Ｉ（ｔ）＝Ａｆｅ−λｆｔ＋Ａｒｅ−λｒｔ
式中Ｉは、造影剤の濃度を表わす検出シグナル強度であり、Ａｆは、消失相における遊離造影剤の最大濃度を表わし、Ａｒは、消失相における保持造影剤の最大濃度を表わし、λｒは、保持造影剤の消失速度定数であり、λｆは、遊離造影剤の消失速度定数であり、ｔは、造影剤投与終了後の時間である。
【００３０】
造影剤は、複数のマイクロバブルであってもよいが、他のタイプの造影剤も好適である。画像シグナルを処理することにより、上記で示した問題を引き起こす画像シグナル飽和及び／又は減衰を起こさずに、多数のマイクロバブルを使用することが可能になる。双指数関数は、保持マイクロバブルのシグナルと、自由循環マイクロバブルのシグナルとの分離を可能にする。画像は、事象後に処理することができ、これは、後処理を遠隔的に使用することができることを意味する。
【００３１】
複数の超音波画像は、マイクロバブルの濃度が、シグナル強度の飽和及び／又は減衰が生じるか又は著しくなる地点未満になってから、ステップ（ａ）で取り込むことができる。
【００３２】
以下の特徴の少なくとも１つを定量化することができる：消失相における遊離造影剤の濃度（Ａｆｅ−λｆｔ）及びその最大値（Ａｆ）、消失相における保持造影剤の濃度（Ａｒｅ−λｒｔ）及びその最大値（Ａｒ）、消失相における遊離造影剤の曲線下面積（ＡＵＣ）（ＡＵＣｆ＝Ａｆ／λｆ）又は保持造影剤の曲線下面積（ＡＵＣ）（ＡＵＣｒ＝Ａｒ／λｒ）、保持造影剤の消失速度定数（λｒ）又は遊離造影剤の消失速度定数（λｆ）、及び保持造影剤の半減期（Ｌｎ２／λｒ）又は遊離造影剤の半減期（Ｌｎ２／λｆ）。また、組織の微小血管容積は、２つの目的領域での遊離造影剤の最大濃度（Ａｆ）又は曲線下面積（ＡＵＣｆ）の比を取ることにより得ることができ、分母は、付近の血管又は心臓腔等の血液プール領域に位置する目的領域での遊離造影剤の最大濃度（Ａｆ）又は曲線下面積（ＡＵＣｆ）である。
【００３３】
１つの構成によると、本方法は、
（ｄ）物体の目的領域の各地点について、ステップ（ｂ）＆（ｃ）を繰り返すステップ、及び
（ｅ）定量化された特徴を平均するステップを更に含んでいてもよい。
【００３４】
別の構成によると、本方法は、
（ｄ）物体の目的領域の各地点について、ステップ（ｂ）を繰り返すステップ、及び
（ｅ）目的領域の各地点の、特定の時点でのシグナル強度を平均するステップ、及び
（ｆ）平均シグナル強度に対してステップ（ｃ）を実施するステップを更に含んでいてもよい。
【００３５】
ビデオ密度測定法を使用して、画像、例えば、ＵＳ、ＭＲＩ、又はＰＥＴ造影画像法の画像を処理することができる。
【００３６】
１つの構成によると、本方法は、
（ｄ）物体の少なくとも一部の各地点について、ステップ（ｂ）＆（ｃ）を繰り返すステップ、及び
（ｅ）物体の地点の定量化された特徴に基づいて、物体の造影剤の濃度の画像を作成するステップを更に含んでいてもよい。
【００３７】
１つの構成によると、本方法は、
（ｄ）物体の少なくとも一部の各地点について、ステップ（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すステップ、及び
（ｅ）物体の少なくとも一部の定量化された特徴を含む画像を作成するステップを更に含んでいてもよい。
【００３８】
１つの構成によると、双指数関数式は、定数（複数可）、スケール係数（複数可）、係数（複数可）、又は指数項（複数可）等の（これらに限定されないが）、追加成分（複数可）を更に含んでいてもよい。これは、バックグラウンドシグナル、システムノイズ、又は造影剤の細胞内部移行等（これらに限定されないが）の要因を考慮するために使用することができる。例えば、追加の指数項を、後者に使用してもよいが、前者２つのうちの１つ又は両方に定数を使用してもよい。したがって、双指数関数は、定数（Ｋ）を含んでいてもよい。例えば、,
Ｉ（ｔ）＝Ａｆ’ｅ−λｆｔ＋Ａｒ’ｅ−λｒｔ＋Ｋ
【００３９】
Ａｒ及びＡｆは、それぞれ、Ａｒ＝Ａｒ’−Ｋ［Ａｒ’／（Ａｆ’＋Ａｒ’）］及びＡｆ＝Ａｆ’−Ｋ［Ａｆ’／（Ａｆ’＋Ａｒ’）］を使用して得ることができる。
【００４０】
１つの構成では、標的化ＭＣＵの複数の画像は（画像シグナルとして）、ステップ（ａ）で取り込むことができ、画像ピクセル強度は（シグナル強度として）、ステップ（ｂ）で測定される。
【００４１】
造影剤は、ボーラス又は点滴として投与することができる。本発明の１つの態様は、シグナル飽和及び／又は減衰を引き起こす高用量（標的分子発現レベル／濃度を正確に／再現性高く定量化するための造影剤−標的分子間結合を飽和させる）の使用を可能にすることができる。ボーラス投与の場合、これは、最大数秒にわたって投与することができる。点滴としての投与する場合、造影剤は、造影剤−標的分子間結合又は造影剤保持を飽和させるのに十分な期間（例えば数分）にわたって持続点滴として投与することができる。その後、点滴は停止される。その後、造影剤シグナル強度は、減少し始めることになり、その後、記載されているものと同じ様式で、複数の画像シグナルを取り込み、処理することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
これから、例として図面を参照して本発明を説明するものとする。
【図１】保持マイクロバブル、遊離マイクロバブル、並びに遊離及び保持マイクロバブルの超音波（ＵＳ）時間−シグナル強度曲線を示すグラフである。
【図２】保持マイクロバブル、遊離マイクロバブル、並びに遊離及び保持マイクロバブルの組み合わせの、片対数形式の超音波時間−シグナル強度曲線を示すグラフである。
【図３】マウス心臓の凍結切片免疫組織化学検査を示す図である。リポポリサッカリド（ＬＰＳ）で前処理した６時間後のマウスの代表的な例。倍率２００×。低倍率（低ｍａｇ）４０×。
【図４ａ】マウス心臓でのＥ−セレクチン（Ｅｓｅｌ）の経時的発現を示す一連のグラフである。（ａ）Ｅｓｅｌ  ｍＲＮＡ。各データポイントは、１匹の動物を表わす。最良フィッティングの指数曲線±９５％信頼区間（ＣＩ）が示されている。
【図４ｂ】マウス心臓でのＥ−セレクチン（Ｅｓｅｌ）の経時的発現を示す一連のグラフである。（ｂ）Ｅｓｅｌ細胞表面タンパク質。各データポイントは、それぞれ、ＬＰＳＴｉｍｅ３、５、８、２４時間における５匹、５匹、４匹、５匹のマウスの平均±９５％ＣＩを表わす。最良フィッティングの指数曲線±９５％ＣＩが示されている。
【図４ｃ】マウス心臓でのＥ−セレクチン（Ｅｓｅｌ）の経時的発現を示す一連のグラフである。（ｃ）Ｅｓｅｌ  ｍＲＮＡ対Ｅｓｅｌ細胞表面タンパク質。
【図５ａ】マウス心臓でのＥｓｅｌ発現のリアルタイムＵＳ分子画像化のグラフ及び画像を含む図である。（ａ）それぞれＬＰＳで前処置した（１）野生型（ＷＴ）及び（２）Ｅｓｅｌノックアウト（ＫＯ）マウスの拡張末期胸骨傍短軸（ＰＳＡ）視野の連続１４ＭＨｚコントラストパルスシーケンス（ＣＰＳ）心臓画像。それぞれの動物の左心室（ＬＶ）腔（目的領域（ＲＯＩ）Ｃの）及び心筋（ＲＯＩ  Ｍの）のＴＩＣが、すぐ下に示されている。各データポイントは、バックグラウンドを差し引いた平均シグナル強度（Ｉ）±ＳＤを示す。時間シグナル強度曲線（ＴＩＣ）の示唆されたボーラス（Ｂ）、分布（Ｄ）、及び消失相（Ｅ）が示されている。
【図５ｂ】マウス心臓でのＥｓｅｌ発現のリアルタイムＵＳ分子画像化のグラフ及び画像を含む図である。（ｂ）バブル投与＞２０分後の１４ＭＨｚ及び７ＭＨｚ  ＣＰＳの、ＰＳＡ視野、傍胸骨長軸（ＰＬＡ）視野、及び頂端４房（Ａ４Ｃ）視野（自由循環バブルが、血液プール（ＬＶ腔）から除去された際の）。動物、ゲイン、及びメカニカルインデックス（ＭＩ）は、両周波数とも同じだった。矢印は、中央前壁中隔壁を示す。バブル投与前の基線画像は、図６に示されている。
【図６】図５ｂの幾つかの基線画像（マイクロバブル投与前）を含む図である。
【図７ａ】ＵＳ画像化の定量分析を示す一連のグラフ及び表である。ピアソンｒ：（ａ）ＷＴ＝−０．７８、ＫＯ＝−０．０５；（ｂ）ＷＴ＝−０．８７、ＫＯ＝−０．０８；（ｃ）ＷＴ＝０．７９、ＫＯ＝０．４３；（ｄ）ＷＴ＝０．８１、ＫＯ＝該当無；（ｅ）ＷＴ＝０．８４、ＫＯ＝該当無；（ｆ）ＷＴ＝０．６７、ＫＯ＝０．１６。（ｇ）では、Ｒ２＝０．７７（指数フィッティング）又は０．８７（シグモイドフィッティング）。黒抜き円＝ＷＴ、白抜き円＝Ｅｓｅｌ  ＫＯ。エラーバーは、ＳＤを表わす。†音響的に有効なバブルのｉｎ  ｖｉｖｏでの群平均半減期は、個々の動物のＬｎ２／λから計算した。これは、Ｌｎ２／群平均λとは等しくないことが予想される。
【図７ｂ】ＵＳ画像化の定量分析を示す一連のグラフ及び表である。ピアソンｒ：（ａ）ＷＴ＝−０．７８、ＫＯ＝−０．０５；（ｂ）ＷＴ＝−０．８７、ＫＯ＝−０．０８；（ｃ）ＷＴ＝０．７９、ＫＯ＝０．４３；（ｄ）ＷＴ＝０．８１、ＫＯ＝該当無；（ｅ）ＷＴ＝０．８４、ＫＯ＝該当無；（ｆ）ＷＴ＝０．６７、ＫＯ＝０．１６。（ｇ）では、Ｒ２＝０．７７（指数フィッティング）又は０．８７（シグモイドフィッティング）。黒抜き円＝ＷＴ、白抜き円＝Ｅｓｅｌ  ＫＯ。エラーバーは、ＳＤを表わす。†音響的に有効なバブルのｉｎ  ｖｉｖｏでの群平均半減期は、個々の動物のＬｎ２／λから計算した。これは、Ｌｎ２／群平均λとは等しくないことが予想される。
【図７ｃ】ＵＳ画像化の定量分析を示す一連のグラフ及び表である。ピアソンｒ：（ａ）ＷＴ＝−０．７８、ＫＯ＝−０．０５；（ｂ）ＷＴ＝−０．８７、ＫＯ＝−０．０８；（ｃ）ＷＴ＝０．７９、ＫＯ＝０．４３；（ｄ）ＷＴ＝０．８１、ＫＯ＝該当無；（ｅ）ＷＴ＝０．８４、ＫＯ＝該当無；（ｆ）ＷＴ＝０．６７、ＫＯ＝０．１６。（ｇ）では、Ｒ２＝０．７７（指数フィッティング）又は０．８７（シグモイドフィッティング）。黒抜き円＝ＷＴ、白抜き円＝Ｅｓｅｌ  ＫＯ。エラーバーは、ＳＤを表わす。†音響的に有効なバブルのｉｎ  ｖｉｖｏでの群平均半減期は、個々の動物のＬｎ２／λから計算した。これは、Ｌｎ２／群平均λとは等しくないことが予想される。
【図７ｄ】ＵＳ画像化の定量分析を示す一連のグラフ及び表である。ピアソンｒ：（ａ）ＷＴ＝−０．７８、ＫＯ＝−０．０５；（ｂ）ＷＴ＝−０．８７、ＫＯ＝−０．０８；（ｃ）ＷＴ＝０．７９、ＫＯ＝０．４３；（ｄ）ＷＴ＝０．８１、ＫＯ＝該当無；（ｅ）ＷＴ＝０．８４、ＫＯ＝該当無；（ｆ）ＷＴ＝０．６７、ＫＯ＝０．１６。（ｇ）では、Ｒ２＝０．７７（指数フィッティング）又は０．８７（シグモイドフィッティング）。黒抜き円＝ＷＴ、白抜き円＝Ｅｓｅｌ  ＫＯ。エラーバーは、ＳＤを表わす。†音響的に有効なバブルのｉｎ  ｖｉｖｏでの群平均半減期は、個々の動物のＬｎ２／λから計算した。これは、Ｌｎ２／群平均λとは等しくないことが予想される。
【図７ｅ】ＵＳ画像化の定量分析を示す一連のグラフ及び表である。ピアソンｒ：（ａ）ＷＴ＝−０．７８、ＫＯ＝−０．０５；（ｂ）ＷＴ＝−０．８７、ＫＯ＝−０．０８；（ｃ）ＷＴ＝０．７９、ＫＯ＝０．４３；（ｄ）ＷＴ＝０．８１、ＫＯ＝該当無；（ｅ）ＷＴ＝０．８４、ＫＯ＝該当無；（ｆ）ＷＴ＝０．６７、ＫＯ＝０．１６。（ｇ）では、Ｒ２＝０．７７（指数フィッティング）又は０．８７（シグモイドフィッティング）。黒抜き円＝ＷＴ、白抜き円＝Ｅｓｅｌ  ＫＯ。エラーバーは、ＳＤを表わす。†音響的に有効なバブルのｉｎ  ｖｉｖｏでの群平均半減期は、個々の動物のＬｎ２／λから計算した。これは、Ｌｎ２／群平均λとは等しくないことが予想される。
【図７ｆ】ＵＳ画像化の定量分析を示す一連のグラフ及び表である。ピアソンｒ：（ａ）ＷＴ＝−０．７８、ＫＯ＝−０．０５；（ｂ）ＷＴ＝−０．８７、ＫＯ＝−０．０８；（ｃ）ＷＴ＝０．７９、ＫＯ＝０．４３；（ｄ）ＷＴ＝０．８１、ＫＯ＝該当無；（ｅ）ＷＴ＝０．８４、ＫＯ＝該当無；（ｆ）ＷＴ＝０．６７、ＫＯ＝０．１６。（ｇ）では、Ｒ２＝０．７７（指数フィッティング）又は０．８７（シグモイドフィッティング）。黒抜き円＝ＷＴ、白抜き円＝Ｅｓｅｌ  ＫＯ。エラーバーは、ＳＤを表わす。†音響的に有効なバブルのｉｎ  ｖｉｖｏでの群平均半減期は、個々の動物のＬｎ２／λから計算した。これは、Ｌｎ２／群平均λとは等しくないことが予想される。
【図７ｇ】ＵＳ画像化の定量分析を示す一連のグラフ及び表である。ピアソンｒ：（ａ）ＷＴ＝−０．７８、ＫＯ＝−０．０５；（ｂ）ＷＴ＝−０．８７、ＫＯ＝−０．０８；（ｃ）ＷＴ＝０．７９、ＫＯ＝０．４３；（ｄ）ＷＴ＝０．８１、ＫＯ＝該当無；（ｅ）ＷＴ＝０．８４、ＫＯ＝該当無；（ｆ）ＷＴ＝０．６７、ＫＯ＝０．１６。（ｇ）では、Ｒ２＝０．７７（指数フィッティング）又は０．８７（シグモイドフィッティング）。黒抜き円＝ＷＴ、白抜き円＝Ｅｓｅｌ  ＫＯ。エラーバーは、ＳＤを表わす。†音響的に有効なバブルのｉｎ  ｖｉｖｏでの群平均半減期は、個々の動物のＬｎ２／λから計算した。これは、Ｌｎ２／群平均λとは等しくないことが予想される。
【図７】ＵＳ画像化の定量分析を示す一連のグラフ及び表である。ピアソンｒ：（ａ）ＷＴ＝−０．７８、ＫＯ＝−０．０５；（ｂ）ＷＴ＝−０．８７、ＫＯ＝−０．０８；（ｃ）ＷＴ＝０．７９、ＫＯ＝０．４３；（ｄ）ＷＴ＝０．８１、ＫＯ＝該当無；（ｅ）ＷＴ＝０．８４、ＫＯ＝該当無；（ｆ）ＷＴ＝０．６７、ＫＯ＝０．１６。（ｇ）では、Ｒ２＝０．７７（指数フィッティング）又は０．８７（シグモイドフィッティング）。黒抜き円＝ＷＴ、白抜き円＝Ｅｓｅｌ  ＫＯ。エラーバーは、ＳＤを表わす。†音響的に有効なバブルのｉｎ  ｖｉｖｏでの群平均半減期は、個々の動物のＬｎ２／λから計算した。これは、Ｌｎ２／群平均λとは等しくないことが予想される。
【図８】本明細書に記載のように、画像化を使用して物体の特徴を定量化する方法の実施に使用されるシステムを例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
体内の器官を非侵略的に画像化するためのＵＳスキャナーの使用は周知である。また、標的化マイクロバブルを静脈内（ｉｖ）に導入することにより得られる画像を高画質化することは公知である。マイクロバブルは、ＵＳ画像化装置が検出可能な造影剤であり、マイクロバブルのシェルは、「標的化マイクロバブル造影超音波検査法」（標的化ＭＣＵ）と呼ばれるプロセスで画像化しようとする組織又は器官の目的分子（標的分子）に付着するように設計されている。
【００４４】
本発明の１つの実施形態では、標的化マイクロバブルを造影剤として使用し、それらの
検出にＵＳ画像法を使用する。標的化マイクロバブルを体内に導入して標的分子に付着させ、目的領域の画像を、ある期間にわたって間隔をおいて収集する。目的領域（ＲＯＩ）の地点は選択することができ、その地点に対応するＵＳ画像の各々のピクセルを特定することができ、それらのピクセルのバブルＵＳシグナル強度を測定し、双指数関数にカーブフィッティングする。双指数関数は、２つの指数項を含み、その１つは、標的分子に付着した保持標的化マイクロバブルの消失と関連し、他方は、付着せず、自由に循環する遊離標的化マイクロバブルの消失と関連する。曲線が特定されれば、標的化マイクロバブル及び標的化マイクロバブルが付着した標的分子の種々の特徴を特定することができる。
【００４５】
このプロセスを、目的領域内の幾つかの地点の種々の特徴を得るために、同じ画像の目的領域の幾つかの他の地点について繰り返す。その後、その目的領域の特徴の非常に正確な定量化を得るために、それら種々の特徴の値を平均してもよい。
【００４６】
例えば、１つの重要な特徴は、保持マイクロバブルの濃度であってもよく、それは、保持マイクロバブルの濃度により、目的領域の標的分子の濃度又は発現レベルが定量化されるためである。目的領域における標的分子の濃度は、例えば、疾患の存在又は範囲を示すことができる。
【００４７】
別の特徴は、遊離及び／又は保持マイクロバブルの半減期であってもよい。これらは、画像に示されている目的の地点又は領域の測定シグナル強度が最も良くフィッティングされる曲線を特定することにより、同じように決定することができる。
【００４８】
このようにして、目的の地点又は領域の重要な特徴を定量化することができる。これは、他の目的の地点又は領域でも実施することができる。
【００４９】
また、定量化された目的地点の各々の特定の特徴で構成された画像を生成することが有用である場合がある。
【００５０】
上記で言及した双指数曲線の意義を理解することが重要である。マイクロバブルが体内／系に導入された直後は、それらマイクロバブルの少数割合が標的分子に付着するが、多くは未付着のままであろう。遊離マイクロバブルの濃度は、非常に迅速に減少する。濃度は、肝臓及び脾臓での食作用、血中でのガス拡散による収縮を含む、幾つかの異なる消失機序により減少する。この消失は、図１及び２に、非常に明白に示されている。図１では、遊離マイクロバブルの消失は、保持マイクロバブルの消失よりも迅速である。図２では、遊離バブルの消失速度定数は、保持バブルの消失速度定数よりもより急な傾きを有する実質的な直線である。
【００５１】
消失相におけるマイクロバブルの濃度は、以下の双指数関数により規定することができる：
マイクロバブルの濃度（ｔ）＝Ａｆｅ−λｆｔ＋Ａｒ−λｒｔ
式中、Ａｆは、消失相における遊離マイクロバブルの最大濃度であり、Ａｒは、消失相における保持マイクロバブルの最大濃度であり、λｆは、遊離マイクロバブルの消失速度定数であり、λｒは、保持マイクロバブルの消失速度定数である。
【００５２】
無論、特定の地点についてＵＳ画像で検出される濃度は、マイクロバブルの実際の濃度に対応することが予想されるだろう。上述のように、マイクロバブルの検出濃度は、高濃度又は中程度の濃度では、シグナルが飽和及び／又は減衰されるため、不正確になる（過小評価される）。しかしながら、正確に再現性の高く分子標的を定量化するために、比較的高用量の標的化マイクロバブルが（バブル−分子標的間結合を飽和させるために）必要である。シグナル強度のカーブフィッティングは、飽和及び／又は減衰が低いか又はもは
や要因ではない地点後に対して実施してもよい。これは、マイクロバブルを体内に導入して数分間待機してから、画像化して、シグナル強度値をカーブフィッティングに使用してもよいことを意味する。例えば、図１に示されている曲線を見ると、画像シグナルは、マイクロバブルを体内にボーラス投与してから約２〜６分後にＵＳ画像化して得ることができる。この地点以降のシグナル強度をカーブフィッティングすることは、保持マイクロバブルの指数関数が、初期（最大）濃度Ａｒに逆外挿されるという効果を有する。これは、遊離マイクロバブルにも当てはまる。このようにして、従来技術の欠点が克服される。
【００５３】
下記は、本発明の１つの実施形態を、造影剤で処置されたマウスの心臓の特徴の定量化に適用する方法の例である。無論、この方法は、マウスの他の組織又は器官、又は実際に、ヒトを含む、他の動物の組織又は器官の特徴の定量化に適用することができる。
【００５４】
実施例
この例では、炎症反応を刺激して、マイクロバブルが付着するＥ−セレクション（E-selection）（Ｅｓｅｌ）を心臓で発現させた。まず、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）を野
生型（ＷＴ）マウスに注射して、全身性炎症を誘導した。心臓の炎症反応は、Ｅｓｅｌ（炎症中に活性化内皮で発現される内皮接着分子）を発現することだった。Ｅｓｅｌ分子（標的分子）に付着するマイクロバブルを心血管系に導入した。Ｅｓｅｌに付着したバブルが心臓に蓄積することにより、本発明の１つの態様を使用して超音波（ＵＳ）画像から心臓を定量的に分析（例えば、内皮活性化又は炎症の度合いを示すＥｓｅｌ濃度又は発現レベルについて）することが可能になった。
【００５５】
実験の詳細
抗体
ＭＥＳ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、マウスＥｓｅｌに対するラットＩｇＧ２ａ，κ、及びそのＦ（ａｂ’）２断片（ＭＥＳ−１Ｆ（ａｂ’）２）は、Ｄ  Ｂｒｏｗｎ博士（ＵＣＢ  Ｃｅｌｌｔｅｃｈ社、英国）から提供された。Ｆ（ａｂ’）２１つ当たり２つのチオール基を含有する還元型ＭＥＳ−１Ｆ（ａｂ’）２を、Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）還元により調製した。ＭＥＣ１３．３ｍＡｂ、マウスＰＥＣＡＭ−１に対するラットＩｇＧ２ａ，κ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）。ラットＩｇＧ２ａ，κアイソタイプ陰性対照ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）。ラットＩｇＧ２ａに対するビオチン化ウサギｍＡｂ（二次抗体）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。
【００５６】
Ｅｓｅｌ標的化マイクロバブルの調製
マレイミド官能化脂質シェルオクタフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）マイクロバブルを、７５：９：１４：２のモル比の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ：Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社、アラバマ州）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社）、モノステアラートポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ４０ステアラート；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、及び蛍光染料１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）のガス飽和水性懸濁液を、Ｃ３Ｆ８の存在下で超音波処理することにより調製した。１バブル当たりおよそ４．３３８×１０６個のＴＣＥＰ還元ＭＥＳ−１Ｆ（ａｂ’）２分子を、Ｃ３Ｆ８雰囲気下で一定に穏やかに撹拌しながら中性ｐＨ付近にて３０分間４℃でインキュベートした。過剰なＮ‐エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加して、一切の未反応チオールを反応停止させることにより、反応を終了させた。マイクロバブルを、マイクロバブル結合前後に４℃のＣ３Ｆ８雰囲気下での遠心浮選の複数サイクルを使用して、冷却脱気生理食塩水で洗浄し
て、非組込み成分及び粒子断片を除去した。新しく調製したＥｓｅｌ標的化マイクロバブルを、直ちに２０〜５０μｌ等量に分割し、パラフィルム（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎ社）で蓋をして密封した後、液体窒素で瞬間冷凍して、使用まで−８０℃で保管した。後に解凍したＥｓｅｌ標的化マイクロバブルの濃度及びサイズは、それぞれ１〜３×１０９バブル／ｍｌ及び直径２．２（平均）±０．２（ＳＥＭ）μｍだった（バブルの９８．６％又は１００％は、直径がそれぞれ６μｍ又は１０μｍ未満だった）。Ｅｓｅｌ標的化マイクロバブルは、十分にエコー源性であり、安定しており、非特異的結合を欠如し、ｉｎ  ｖｉｖｏで即時有害効果を生じさせなかった。
【００５７】
動物
野生型（ＷＴ）マウス：成体雄Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊａｘ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社、英国）。Ｅｓｅｌノックアウト（ＫＯ）マウス：Ｃ５７Ｂｌ６バックグラウンドの成体雄Ｅｓｅｌ同型接合体ＫＯ、Ｋ  Ｎｏｒｍａｎ博士及びＰ  Ｈｅｌｌｅｗｅｌｌ教授（シェフィールド大学、英国）から寄贈されたマウスから組織内で繁殖させた。動物研究は全て、Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ１９８６に基づいて内務省から与えられたプロジェクトライセンス又は個人ライセンスに基づいて実施された。加えて、組織内倫理審査委員会から倫理的承認を得た。
【００５８】
リポポリサッカリド（ＬＰＳ）マウスモデル（実験的内毒血症）
大腸菌０１１１：Ｂ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）に由来する５０μｇのＬＰＳを生理食塩水で２００μｌ容積にして腹腔内に（ｉｐ）注射することにより、ＷＴ及びＥｓｅｌ  ＫＯマウスを前処置して、全身性炎症を誘導した。ｉｐ注射によるＬＰＳの全身性投与は、心臓及び腎臓を含む複数の器官におけるＥｓｅｌ発現の誘導を含む、全身性炎症をもたらした。
【００５９】
免疫組織化学検査
ＷＴ（ＬＰＳ前処置有／ＬＰＳ前処置無）マウス及びＥｓｅｌ  ＫＯ（ＬＰＳ前処置）マウスの回収したばかり心臓のアセトン固定凍結切片で免疫組織化学検査を実施した。１００μｌの１：１０００ウサギ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１時間（ｈ）室温（ｒｔ）にて非特異的結合部位をブロッキングした後、１００μｌの０．０１ｍｇ／ｍｌ一次抗体：ＭＥＳ−１（Ｅｓｅｌに対する）、ＭＥＣ１３．３（ＰＥＣＡＭ−１内皮マーカーに対する）、又はアイソタイプ陰性対照と共に、切片を、ｒｔで１時間インキュベートした。その後、各切片を、１００μｌの０．００５ｍｇ／ｍｌビオチン化二次抗体と共に、ｒｔで６０分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼを０．３％Ｈ２Ｏ２メタノールで２０〜３０分間ｒｔにてブロッキングした後、西洋ワサビペルオキシダーゼに基づく検出系Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、発色基質としての３，３’−ジアミノベンジジン溶液（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＤＡＢ錠剤、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）と共に使用した。変性ハリスヘマトキシリン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）及び１％ＮａＨＣＯ３を使用して切片を対比染色し、その後７０〜１００％エタノールで脱水し、Ｈｉｓｔｏｍｏｕｎｔ（ＶＷＲ）で乾燥及びマウントし、光学顕微鏡で検査した。ＬＰＳで前処置してから、組織を直ちに回収するために動物を犠牲にするまでの経過時間を、ＬＰＳＴｉｍｅと示した。
【００６０】
逆転写酵素−リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）。ＷＴマウスを、上述のようにＬＰＳで前処置した。ＬＰＳで前処置してから、組織を直ちに回収するために動物を犠牲にするまでの経過時間を、ＬＰＳＴｉｍｅと示した。回収したばかりの組織を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）で維持して、リボ核酸（ＲＮＡ）をｉｎ  ｓｉｔｕで保存した。その後、製造業者の説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、全ＲＮＡを抽出した。その後、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造業者の
説明書に従って使用して、一本鎖相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）合成を実施した。その後、Ｅｓｅｌ及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ−Ｉ（ＨＰＲＴ−Ｉ）のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ検出法を用いたリアルタイムｑＰＣＲを、製造業者の説明書に従って、ｉＣｙｃｌｅｒ（商標）（ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に配置した９６ウエルプレートで実施した。ＰＣＲ反応は全て、同じプレートの三重重複のウエルで実施した。プライマー配列は、以下の通りだった：Ｅｓｅｌ順方向プライマー  ５’−ＣＴＣＡＴＴＧＣＴＣＴＡＣＴＴＧＴＴＧＡＴＧ−３’、Ｅｓｅｌ逆方向プライマー  ５’−ＧＣＡＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＴＧ−３’、ＨＰＲＴ−Ｉ順方向プライマー  ５’−ＡＴＴＡＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧ−３’、ＨＰＲＴ−Ｉ逆方向プライマー  ５’−ＡＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＣＣＴＧＴＣＣＡＴ−３’。データ分析のために、閾値サイクル（Ｃｔ）を、ｉＣｙｃｌｅｒ（商標）ｉＱ光学システムソフトウェア  バージョン３．０ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用して、増幅プロットから決定した。Ｅｓｅｌ及びＨＰＲＴ−Ｉプライマー対のＰＣＲ効率の違いは≦５％であり（それぞれ、９３±４％及び９２±３％（平均±ＳＤ）；各々、ｎ＝４）、相対Ｃｔ法を使用し、以下の式を使用して、ＨＰＲＴ−Ｉメッセンジャー（ｍＲＮＡ）の量に対するＥｓｅｌメッセンジャー（ｍＲＮＡ）の量を評価した。
Ｅｓｅｌ  ｍＲＮＡ（％ＨＰＲＴ−Ｉ）＝２−ΔＣｔ
式中、ΔＣｔ＝ＣｔＥｓｅｌ−ＣｔＨＰＲＴ−Ｉであり、下付文字は、目的の遺伝子を指す。重複測定の平均を使用し、各動物についてＬＰＳＴｉｍｅに対してプロットした。
【００６１】
本方法の更なる詳細は、以下の通りである。マウス心臓に由来する全ＲＮＡの収率は、典型的には、分子等級（無ＲＮａｓｅ）のＨ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）中に約１ｍｇ／ｍｌを超える濃度で維持された組織１ｍｇ当たり、純粋なＲＮＡが約１μｇであった。１μｇの全ＲＮＡ、２μｌの１０×緩衝液ＲＴ、２μｌのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合物（各々５ｍＭの２’−デオキシアデノシン５’−三リン酸（ｄＡＴＰ）、２’−デオキシシチジン５’−三リン酸（ｄＣＴＰ）、２’−デオキシグアノシン５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）、２’−デオキシチミジン５’−三リン酸（ｄＴＴＰ）、１μ（４単位）のＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、２μｌ（１μｇ）オリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、及び全反応容積を２０μｌにするための分子等級Ｈ２Ｏ）を含む、一本鎖ｃＤＮＡ合成用のＲＴ反応混合物を、３７℃で１時間インキュベートした。光学級密閉用テープ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で覆った９６ウエル０．２ｍｌ薄壁ＰＣＲプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）の各ウエルの２５μｌ反応容積中で、ｑＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲ反応混合物は、５μｌのｃＤＮＡテンプレート（完了したＲＴ反応を水で１：５０に希釈）、それぞれの遺伝子の順方向及び逆方向プライマーの各々０．５μｌ（１０μＭ）（プライマー配列は本文を参照；プライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の特注）、６．５μｌの分子等級Ｈ２Ｏ、及び１２．５μｌのｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を含んでいた。ｑＰＣＲサイクル条件は、以下の通りだった：まず、９５℃で３分間の変性ステップ（最初の９０秒は、ウエル要因分析）；その後、９５℃で１５秒間、５６℃で１分間のサイクルを４０回；０．５℃ステップでの融解曲線分析（９５℃で１分間の変性、５６℃で１分間のリセット、その後６０℃で１０秒間のサイクルを、各サイクルで０．５℃ずつ上昇させて８０回）；４℃での最終冷却ステップ。各動物のＥｓｅｌ及びＨＰＲＴ−Ｉは、同じプレートで増幅させた。両プライマー対のｃＤＮＡテンプレートの代わりに分子等級Ｈ２Ｏを使用した無テンプレート陰性対照は、全てのプレートに含まれていた。データ分析には、異常な増幅プロット又は融解曲線を有するウエルを除外した。
【００６２】
超音波（ＵＳ）画像化
ＷＴ及びＥｓｅｌ  ＫＯマウスは全て、上述のように、ＬＰＳで前処置し、尾静脈カニューレを挿入し、キシラジン／ケタミン混合物で麻酔をかけた。その後、胸部、腹部、及び骨盤部の毛を剃り、動物を仰臥位で配置した。ＥＣＧ電極パッド（Ａｍｂｕ（登録商標
）Ｂｌｕｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐ、Ａｍｂｕ）を足に貼り、「小動物ＥＣＧフィルター」を備えるＵＳ機器（Ａｃｕｓｏｎ  Ｓｅｑｕｏｉａ（登録商標）５１２  ＵＳシステム、Ｓｉｅｍｅｎｓ社、カリフォルニア州）に接続した。温ゲル（超音波＆電気伝導用ゲル、Ｈｅｎｌｅｙｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ社）の層を、皮膚とＵＳ変換器（１５Ｌ８−ｓ直列配列変換器、設置面積２６ｍｍ、Ｓｉｅｍｅｎｓ社）との間に接続した。使用したＵＳ設定は、以下の通りだった：１４ＭＨｚ（Ｐ１４ＭＨｚ、空間分解能、約０．２ｍｍ）コントラストパルスシーケンス（ＣＰＳ）モード（マイクロバブル専用の非線形画像モード）、スキャナーで推定して０．２２〜０．２６の低メカニカルインデックス（ＭＩ）を生じさせる送信パワー  ９ｄＢ、ダイナミックレンジ  ５５ｄＢ、時間ゲイン  ０％、ＣＰＳゲイン
８、基本２Ｄゲイン  １５ｄＢ、カラーマップ  Ｍ：３（バブルシグナルは、加熱オブジェクトスケールで示され（「ＣＰＳコントラストのみ」の画像）、組織シグナルは、グレースケールで示された（「Ｂモード」画像））；ＴＥＱは使用しなかった。バブルを注射する前に、「領域拡張選択」（ＲＥＳ、ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；分解能が増強された拡大画像をもたらす）を行った及び行わなかった乳頭筋レベルの基線胸骨傍短軸芯（ＰＳＡ）視野、胸骨傍長軸（ＰＬＡ）視野、及び頂端４房（Ａ４Ｃ）視野を、３秒デジタルクリップとして記録した。その後、画像化は、自立クランプを使用して適所に固定された変換器を用いて、ＰＳＡ視野で維持した。その後、ストップウォッチを作動させ、高用量の１×１０８Ｅｓｅｌ標的化バブル（生理食塩水で１００μｌ容積にした）を、１０秒時に尾静脈カテーテルから、１〜２秒間にわたって急速ｉｖボーラスとして注入し、その後２０秒時に１００μｌ生理食塩水を１〜２秒間にわたって流した。連続ＵＳ超音波照射を、ストップウォッチの時間０から１分２３秒まで休止させずに適用し、その後休止させ、その後毎回３秒間のみ再開して、デジタル画像を取得した。幾つかの連続心臓周期を含む、心臓の３秒間デジタルクリップ（ＲＥＳ活性化）を、ストップウォッチで、１０秒時及び１３秒時に、その後２０秒から１分２０秒まで１０秒間隔で、その後２分２０秒から１０分２０秒まで１分間隔で、その後１２分２０秒から３０分２０秒まで２分間隔で、その後６０分２０秒まで５分間隔で記録した（左心室（ＬＶ）腔（中央血液プール）の粒子コントラスト増強が、もはや視認できなくなった場合は、画像取得はそれ以前に中止した）。ＰＳＡ視野の心臓及び周囲組織を含む、胸部の非拡大（非ＲＥＳ）画像を、約５分間隔で記録した。心臓の他の視野（ＰＬＡ及びＡ４Ｃ視野）を、終了時に取得した。また、幾つかの動物では、ＭＩ０．２２での７ＭＨｚ（Ｐ７ＭＨｚ、空間分解能  約０．４ｍｍ）ＣＰＳ画像化（ゲイン及び他の設定は、１４ＭＨｚ画像化と同じに維持した）を、１４ＭＨｚの画像研究の基線及び終了時に取得した。１４ＭＨｚＣＰＳ画像化から７ＭＨｚＣＰＳ画像化に切り替える際には、ＭＩが上昇して（最大約０．７）、意図しない粒子破壊が引き起こされることを回避するために、まず、送信パワーを−９ｄＢから−１９ｄＢへと低減させ、その後ＵＳ周波数を低減させた。動物は全て、１用量のみのバブルを受領し、以前のバブル投与の持ち越し効果（例えば、以前に投与されたＥｓｅｌ標的化バブルによるＥｓｅｌ結合部位のブロッキング）を回避した。画像化の終了時に動物を犠牲にし、上述のように、凍結切片免疫組織化学検査及びｑＲＴ−ＰＣＲ用に組織を直ちに回収した。
【００６３】
時間−シグナル強度曲線（ＴＩＣ）生成
ビデオ密度測定法を使用し、ＹＡＢＣＯ（著作権）ソフトウェア（ＬＬＣ  Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ社、バージニア州）をオフラインを用いて、粒子シグナル強度を測定した。ＰＳＡ視野の心臓の拡張終期画像フレーム（「ＣＰＳコントラストのみ」の画像）を選択してアラインメントし、アラインメントすることができなかったもの（例えば、大きな移動アーチファクトによる）を除外した。目的領域（ＲＯＩ）を、図５ａに示されているように、心筋層の中央前壁（Ｍ）及びＬＶ腔の隣接領域（Ｃ）に配置した。これらの領域は、全動物でＵＳ減衰による影響が一貫して最小又は最低限であったため選択された。ビデオ信号強度（ＶＩ）は、以下の式を使用して対数圧縮することにより「線形化」した：
【００６４】
【数１】
0006430958.tif 000002
式中、ｄＢは、ダイナミックレンジである（この研究では、５５ｄＢ）。線形化ＶＩ（Ｉ）は、任意の音響単位（ＡＵ）で表した。各時点での３秒間の記録期間内の幾つかの拡張終期画像フレームのＩを平均し、その後、対応する動物の基線画像（粒子投与前の画像）の平均Ｉを差し引くことにより、バックグラウンドノイズを補正した。それぞれ心筋層及びＬＶ腔のバックグラウンドを差し引いたＩを、バブル投与後の時間に対してプロットすることにより、心筋層（組織）及びＬＶ腔（中央血液プール）のＴＩＣを構築した。
【００６５】
ＵＳ画像化の定量分析
（１）双指数関数カーブフィッティング法。双指数関数式Ｉ（ｔ）＝Ａｆｅ−λｆｔ＋Ａｒｅ−λｒｔを、Ｐｒｉｓｍ５．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州）を使用して、反復非線形回帰最小二乗法により、心筋層のＴＩＣの消失相にカーブフィッティングした。そのシグナル強度が、線形音響範囲内に入った（バブル濃度が大きく低減し、シグナル飽和及び減衰が最小限になった際の）後期時点の連続データポイントのみを使用して、双指数関数をフィッティングした。この研究では、線形音響範囲は、Ｉ＝０〜５ＡＵとし、それは、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化と同じＵＳ設定を使用したビーカー中のバブル濃度対シグナル強度に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究から概算した。これにより、ｉｖバブルボーラス投与後の約２〜６分以降のフィッティングデータポイントがもたらされ、それらのデータポイントは、本質的に、標的部位でのＥｓｅｌに媒介される又は非特異的に媒介されるバブル蓄積が本質的に完了したＴＩＣの消失相の範囲に入る（図１）。シグナル飽和及び／又は減衰によりシグナル強度Ｉ＜５ＡＵを示すＴＩＣの初期部分のデータポイントは、フィッティングに使用しなかった。その結果生じたカーブフィッティングのパラメータ（Ａｆ、λｆ、Ａｒ、λｒ）を分析した。
【００６６】
（２）本発明の本実施例のＡｒと比較するために、単一の後期点分析に基づく従来技術による方法を使用した。上記のＴＩＣで得られた、バブル投与後２０分１０秒時の心筋層の、基線を差し引いたバブル強度シグナル（Ｒ２０）を分析に使用した。
【００６７】
ＵＳ分子画像化のＬＰＳＴｉｍｅは、ＬＰＳで前処置してから標的化バブルを投与するまでの経過期間とした。各動物の平均心拍数（ＨＲ）は、心臓画像化中の様々な時点で記録された全ＨＲから計算した。
【００６８】
統計
ピアソン相関、線形又は非線形回帰分析は、以下に示されているように実施した。テューキーの事後分析によるスチューデントｔ検定又はＡＮＯＶＡを使用して、有意性検定を行い、ｐ＜０．０５を有意として示した。
【００６９】
結果
Ｅｓｅｌ発現
凍結切片免疫組織化学検査は、ＬＰＳで前処置したＷＴマウス全ての心臓でＥｓｅｌが発現されたことを示した（ｎ＝３５、ＬＰＳＴｉｍｅ＝４〜９時間）。空間分布は、心筋層の全体にわたって本質的に均一だったが、後毛細管細静脈及び毛細管に限定されていた。Ｅｓｅｌは、陰性対照では検出可能ではなかった。ＬＰＳで処置しなかったＷＴマウス（ｎ＝５）、及びＬＰＳで前処置したＥｓｅｌ  ＫＯマウス（ｎ＝１０、ＬＰＳＴｉｍｅ＝４〜７時間）、図３。
【００７０】
ｑＲＴ−ＰＣＲによるＥｓｅｌ発現の定量化
ＲＴ−ｑＰＣＲは、心臓のＥｓｅｌ  ｍＲＮＡの濃度が、ＬＰＳ前処置の約３時間後に、時間と共に指数関数的に減少し、約９時間までには非常に低レベルに達したことを示した（ｎ＝４２、ＬＰＳＴｉｍｅ＝３．２〜１５．７時間）。図４ａ。この傾向は、同じ系統、性別、及び年齢のマウス、並びに同じ用量及び経路のＬＰＳ投与を使用して（ｎ＝１９）、Ｅｐｐｉｈｉｍｅｒら３によりｉｖ放射標識ｍＡｂを使用して決定された細胞表面Ｅｓｅｌタンパク濃度（放射活性／ｇ組織の注射用量％（ＩＤ％／ｇ組織）として表される）の傾向と類似していた。図４ｂ。
【００７１】
Ｅｓｅｌ  ｍＲＮＡ濃度対ＬＰＳＴｉｍｅ（ｍＲＮＡ（ＨＰＲＴ−Ｉ％）＝３６００ｅ−０．７ＬＰＳＴｉｍｅ（時間）、Ｒ２＝０．７５）及びＥｓｅｌ細胞表面タンパク濃度対ＬＰＳＴｉｍｅ（タンパク質（ＩＤ％／ｇ組織）＝１．２１ｅ−０．１３ＬＰＳＴｉｍｅ（時間）＋０．０７、Ｒ２＝０．８８）の最良フィッティングカーブから、共通の分母としてＬＰＳＴｉｍｅを使用して、Ｅｓｅｌ  ｍＲＮＡ濃度と細胞表面タンパク質との関係性を記述する実験式を、以下のように導き出すことができた。図４ｃ。
【００７２】
【数２】
0006430958.tif 000003
したがって、Ｅｓｅｌ細胞表面タンパク濃度は、このＬＰＳマウスモデルでは、心臓におけるそのｍＲＮＡ濃度から予測可能だった。この研究でＥｓｅｌ発現のＵＳ定量化に使用されたｍＲＮＡ濃度範囲又はタンパク濃度範囲（それぞれ、５５〜２３８％のＨＰＲＴ−Ｉ又は０．６３〜０．８０％のＩＤ／ｇ組織）内では、ｍＲＮＡ濃度と細胞表面タンパク質濃度との関係性は、ほぼ線形であり、ｍＲＮＡ濃度を、細胞表面タンパク濃度の代用量化詞として直接的に使用することが可能だった（後者は、標的化マイクロバブルの実際の標的である）。
【００７３】
超音波分子画像化
（１）動物。１５匹のＷＴマウス（週齢５．７（平均）±０．２（ＳＤ）週、範囲は５．１〜６．１週；体重１９．５（平均）±１．５（ＳＤ）ｇ、範囲は１７〜２２ｇ）及び８匹のＥｓｅｌ  ＫＯマウス（週齢７．９±３．２週、範囲は５〜１３．６週；体重２２．３±３．７ｇ、範囲は１７〜２８ｇ）を画像化した。ＬＰＳを注射してから標的粒子を投与するまでの経過期間（ＬＰＳＴｉｍｅ）は、ＷＴ群では３：２６〜５：５９時間であり、ＫＯ群では４：２７〜５：３９時間の範囲であった。
【００７４】
（２）心臓画像化。粒子投与前及び粒子投与後の両方に存在する非線形ＣＰＳアーチファクト（オレンジ色）を、ＷＴ動物及びＥｓｅｌ  ＫＯ動物で見ることができた。これらのアーチファクトは、小さく、心筋層の外部だった。図５ａ（フレーム０：１０）、図５ａ２（フレーム２０：２０）。ｉｖバブルボーラス投与の後、バブルシグナルは、４回の心拍動（約１秒）以内に右心腔で最初に検出され、シグナル強度は、急速に上昇した。その後、バブルが肺循環から戻ってくると共に、左心腔にバブルシグナル現れた。ＬＶ腔及び心筋層のバブルシグナル強度は、それぞれバブル投与後の６〜７回の心拍動（約１．５〜２秒）及び９〜１２回の心拍動（約２〜３秒）以内に頂点に達した。その後、シグナル強度は、心腔及び心筋層にて経時的に減少した。図５ａ。高バブル濃度による著しいＵＳ減衰が、バブルボーラス投与後の初期に生じ、ＵＳ経路の遠位に位置する心臓領域でのシグナルは大半が失われた（例えば、ＰＳＡ視野の心筋層及び隣接ＬＶ腔の５〜１０時の位置。図５ａ）。血液プール（ＬＶ腔）での循環バブル濃度が経時的に減少すると共に、減
衰は減少したが（フレーム０：３０と６：２０を比較されたい。図５ａ）、恐らくはＵＳ経路の近位に位置する上部を覆う骨、肺空気±保持バブルにより引き起こされる減衰のため、消失はしなかった（フレーム２０：２０、図５ａ１）。心筋層でのＥｓｅｌ発現をリアルタイムに視覚化した。これは、血液プール（ＬＶ腔）での自由循環バブルが経時的に減少及び消失したものの、ＷＴ心筋層ではバブルシグナル（保持バブルによる）が持続したことにより示されるＥｓｅｌが存在しないＫＯ心筋層では、バブルシグナルの持続性は、低くかった／最小限だった。これは、心筋層での非特異的バブル保持の度合いが低い／最小限であることと一致していていた。図５ａ〜ｂ。
【００７５】
ＵＳ経路の近位に位置する上部を覆う骨、肺空気±保持バブルが引き起こすＵＳ減衰は、画像化スキャン面に応じて、心筋層のある部分に影響を及ぼした。これにより、ＷＴ動物では、Ｅｓｅｌの標的化バブルシグナルの擬似的喪失が引き起こされた（例えば、１４ＭＨｚのＣＰＳ画像化での、ＰＳＡ視野におけるＬＶの中央後壁、中央下壁、中央中隔後部壁、及び中央前壁中隔壁（それぞれ５〜１０時の位置から左回り）には、保持バブルシグナルの喪失アーチファクト存在した）。しかしながら、スキャン面を変化させて、上部を覆う実体の相対位置を変更することにより（例えば、ＰＳＡ視野からＰＬＡ又はＡ４Ｃ視野へと）、又はＵＳ周波数を下げてその貫通深さを増加させることにより（例えば、１４ＭＨｚから７ＭＨｚへと）、こうした減衰効果を克服し、保持バブルシグナルを良好に回収することができた。図５ｂ。このように、ＷＴ心筋層でのＥｓｅｌの全域発現が、ＵＳ画像化で実証された。これは、免疫組織化学検査データと一致している。
【００７６】
上記の状況では、分子標的のＵＳ検出は、ＵＳ経路の近位に位置する上部を覆う骨／空気及び保持バブルによる後期遠位減衰により制限を受けた。しかしながら、より低い周波数のＵＳ（より大きな貫通深さ）又は異なる画像化角度を使用することにより、そのような減衰を克服することができることを見出した。より低い周波数のＵＳ（例えば、３〜７ＭＨｚ）及び多重面画像化の使用が標準であり、変換器の設置面積が、身体サイズと比べて非常に小さい（最適なプローブ位置／角度を達成し、上部を覆う骨／空気を回避するのがより容易にある）ヒト画像化の観点からは、こうした減衰問題は、それほど重要ではない／著しくはない可能性が高い。しかしながら、機器の減衰補正アルゴリズムの精密化により、減衰アーチファクトを更に最小限に抑えることができる。
【００７７】
（３）有害効果。Ｅｓｅｌ標的化バブルに起因する死亡又は著しい有害事象は、観察されなかった。局所壁運動異常を呈する局所心筋潅流の喪失を引き起こす、心筋層での著しいバブル投与血管内閉塞は検出されなかった。
【００７８】
心筋層（組織）及びＬＶ腔（中央血液プール）の超音波ＴＩＣ
別個の特徴を有する３つの相が、標的バブルのｉｖボーラス投与後のＴＩＣから識別可能だった。図５ａ。
【００７９】
（１）ボーラス相（Ｂ）：数秒間継続し、バブルシグナル強度の初期急速上昇が、ボーラス注入の数秒以内に（バブル濃度が増加すると共に）頂点に、又は飽和に、及び／又は減衰レベルに達することを特徴とする。
【００８０】
（２）分布相（Ｄ）：最大１〜２分間継続し（少数回の循環サイクルで終了する）、バブルが混合により希釈され、組織に分布すると共に、バブルシグナル強度が短期間で急速に減少することを特徴とする。高バブル濃度は、シグナル飽和及び／又は減衰をもたらし、再循環ピークを不明瞭にする。バブル濃度が時間と共に更に減少すると共に頻繁に観察されたのは、減衰の減少と共にバブルシグナル強度が逆説的に増加し、バブル投与の０．５〜１分以内に第２のより低いピークが生じたことであった（図５ａの挿入図の矢印）。
【００８１】
（３）消失相（Ｅ）：数分間継続し、バブルシグナル強度が長期間にわたってゆっくりと減少することを特徴とする。ＬＶ腔のバブルシグナル強度（中央血液プールでの自由循環バブルの濃度を表わす）は、Ｅｓｅｌ  ＫＯ動物よりもＷＴでより早く検出不能になった。両群とも、バブル投与の２０分後には、本質的に検出不能だった。心筋層では、ＷＴ動物のバブルシグナル強度は、ＫＯのバブルシグナル強度よりもゆっくりと減少し、ＬＶ腔のバブルシグナルが消失した後も持続した（自由循環バブルの減衰と比較して、心筋層での保持バブル（Ｅｓｅｌに付着したバブル）はよりゆっくりと減衰したため）。ＫＯ動物では、心筋層のバブルシグナルは、検出可能な程度の非特異的バブル保持が存在した場合以外は、ＬＶ腔でのバブルシグナルが消失する前に検出不能になった（心臓の微少脈管容積又は相対的心筋血液量（ｒＭＢＶ）≦２４％から予想されるように）。
【００８２】
ＵＳ画像化の定量分析
（１）動物。１２匹のＷＴマウス（週齢５．７（平均）±０．３（ＳＤ）週、範囲は５．１〜６．１週；体重１９．７（平均）±１．４（ＳＤ）ｇ、範囲は１８〜２２ｇ）、及び８匹のＥｓｅｌ  ＫＯマウス（週齢７．９±３．２週、範囲は５〜１３．６週；体重２２．３±３．７ｇ、範囲は１７〜２８ｇ）を画像化した。ＬＰＳＴｉｍｅは、ＷＴ群では３：５３〜５：５９時間、ＫＯ群では４：２７〜５：３９時間の範囲だった。３匹のＷＴ動物を、ここでの定量分析から除外した。その理由は、以下の通りである：（ｉ）マイクロバブル投与過誤（１匹の動物）；（ｉｉ）Ｅｓｅｌ発現レベルに関する不確実性（２匹の動物）；及び（ｉｉｉ）これら３匹の動物のうちの１匹は、恐らくは激しい減衰アーチファクトのため、ＴＩＣを適切に定量化することができなかった。
【００８３】
（２）Ｅｓｅｌ発現の音響的定量化
ａ．単一の後期時点分析に基づく従来技術による方法。ＷＴ群及びＥｓｅｌ  ＫＯ群は両方とも、約１０８個のバブルをｉｖボーラスで投与した約２０分後には、血液プール（ＬＶ腔）における自由循環バブルのシグナルが存在しなかった／最小限であった。したがって、保持バブルのみのＩを表すために、バブル投与後の２０分１０秒時のバックグラウンドを差し引いた心筋層のＩ（Ｒ２０）を使用した。それは、残留自由循環バブルの濃度（ＬＶ腔のシグナル強度）が中央血液プールでは低いため、この時点までには、残留自由循環バブルからのシグナル寄与を一切無視することができると考えられたためである。例えば、ＬＶ腔での０．１ＡＵは、ｒＭＢＶ（血液である心筋層の％）が≦５〜２４％であると仮定すると、心筋層での寄与は、わずかに０．００５〜０．０２４ＡＵに過ぎないだろう。Ｒ２０は、ＫＯ動物（０．０６±０．０３、−０．０１〜０．２４、ｎ＝８）よりも、ＷＴ動物（０．４６±０．１６（ＳＥＭ）、範囲は０．０１〜１．６１、ｎ＝１２）において有意に高かった。ｐ＜０．０５（図７表）。Ｒ２０は、ＷＴではＬＰＳＴｉｍｅと強く相関したが（ｒ＝−０．７８、ｐ＜０．０５、ｎ＝１２）、ＫＯマウスでは相関しなかった（ｒ＝−０．０５、ｐ＝０．９、ｎ＝８）。図７ａ。また、Ｒ２０は、Ｅｓｅｌ
ｍＲＮＡの濃度と強く相関した（ｒ＝０．８１、ｐ＜０．００５、ｎ＝１２）。図７ｄ。しかしながら、低標的分子（Ｅｓｅｌ）濃度では、Ｒ２０は、ＷＴ群とＫＯ群との間でかなりの重複を示し、標的分子濃度との相関性は不良だった。Ｒ２０は、低標的分子濃度では、感度が欠如し、定量化の度合いが低い。
【００８４】
この従来技術による方法は、濃度の低い標的分子の検出が不良であり、並びに標的分子濃度の小さな変化の検出が不良である。また、この従来技術による方法は、標的分子濃度がより低いか、又は使用する時点が後期である場合、過小評価の傾向がある。任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明者は、この１つの理由が、上記方法では、保持バブルの半減期の違いを考慮することができないためである可能性があることを見出した。保持バブルの半減期は、最大保持バブル濃度が減少すると共に、又は標的分子濃度が減少すると共に減少した（下記のλｒ対Ａｒを参照）。また、ＵＳ超音波照射が増加すると共に減少することが予想されるだろう（ＵＳ媒介性バブル収縮の増加により）。標的
分子濃度は、自然の疾患状態では低い場合があり、ＵＳ照射量の変動は実際によくあるため、これらは重要な検討事項である。更に、この方法は、曖昧さを生じる傾向があり、同じ対象体における単一の後期時点での保持バブルシグナル強度の値（Ｒ値）は、測定のために選択した時点が変更されれば（例えば、バブル投与の２０分後対３０分後）、変わることになる。要約すると、従来技術による方法は、定量化の度合いがより低く、正確性がより低く、再現性がより低く、曖昧さを生じる傾向がより高い。
【００８５】
ｂ．双指数関数カーブフィッティング法。心筋層の消失相ＴＩＣは、ＷＴ動物（Ｒ２＝０．８８、ｎ＝１２）及びＥｓｅｌ  ＫＯ動物（Ｒ２＝０．８７、ｎ＝８）両方とも、I
（ｔ）＝Ａｆｅ−λｆｔ＋Ａｒｅ−λｒｔに対して良好にフィッティングした。図７表。カーブフィッティングが良好だったことは、双指数関数が、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察された標的バブルの消失相ＴＩＣを良好に予測したことを示唆した。心筋層での最大保持バブルシグナル強度Ａｒは、Ｅｓｅｌ  ＫＯ動物（０．４±０．１、０〜１、ｎ＝８）動物よりもＷＴ動物（２．３±０．４（ＳＥＭ）、範囲は０．８〜４．２、ｎ＝１２）において有意に高かった。ｐ＜０．００５。ＫＯのＡｒ値が低いことは、非特異的バブル保持の度合いがわずかであったことを示唆した。Ａｒは、ＷＴではＬＰＳＴｉｍｅと強く相関したが（ｒ＝−０．８７、ｐ＜０．０００５、ｎ＝１２）、ＫＯマウスでは相関しなかった（ｒ＝−０．０８、ｐ＝０．８６、ｎ＝８）。図７ｂ。図７ｅは、図４ａの曲線を使用してＬＰＳＴｉｍｅをＥｓｅｌ  ｍＲＮＡの濃度に変換することにより、Ａｒが、Ｅｓｅｌ  ｍＲＮＡの濃度と強く相関し（ｒ＝０．８４、ｐ＜０．００１、ｎ＝１２）、この範囲での後者は、細胞表面Ｅｓｅｌタンパク質（マイクロバブルの実際の標的）の濃度とほぼ線形に関連していた。低標的分子（Ｅｓｅｌ）濃度でも、Ａｒは、ＷＴ群とＫＯ群との間の重複が最小限であることを示し、標的分子濃度との良好な相関性を維持した。
【００８６】
Ａｒは、より感度が高く、定量化が度合いが高いため、従来技術よりも有利である。Ａｒは、より低い濃度の標的分子を検出することができ、並びに標的分子濃度のより小さな変化を検出することができる。Ａｒは、誤差を生じる傾向がより少ない。任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明者は、この１つの理由が、この方法により、保持バブルの半減期の違いを考慮することができるためである可能性があることを見出した。保持バブルの半減期は、上述のように、保持バブルの種類、標的分子濃度、並びにＵＳ照射量の度合いによって様々である。標的分子濃度は、自然の疾患状態では低い場合があり、ＵＳ照射量の変動は実際によくあるため、これらは重要な検討事項である。更に、この方法は、曖昧さを生じさせる傾向が少なく、各データセットの双指数関数カーブフィッティングによるＡｒには、１つの値しか存在しない。要約すると、この方法の利点は、定量化の度合いがより高く、より正確であり、より再現性が高く、よりロバストであり、曖昧さが少ないことである。また、この方法は、より標準化しやすい。同時に、保持バブル半減期又は自由循環バブル半減期等の他の有用な物理的特性を、同時に得ることができる。
【００８７】
（３）更なる特徴の音響的定量化（双指数関数カーブフィッティング法による）
ａ．自由循環バブル。ＷＴ動物及びＫＯ動物の心筋層の消失相における自由循環バブルの消失速度定数（λf）は、本質的に同じだった。ｐ＝０．６３（図７表）。λfは、ＨＲと強く相関した（図７ｃ）。これは、ＨＲ媒介性の心拍出量増加（一回拍出量×ＨＲ）により自由循環バブルのクリアランスが増加し、単位時間当たりより多くのバブルを、音響場、細網内皮系（例えば、肝臓及び脾臓）、及びバブル消失の主な部位である肺に送達することと一致する。音響的に有効な自由循環バブルのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期（Ｌｎ２／λｆ）は、ＷＴ動物（ｎ＝１２）及びＫＯ動物（ｎ＝８）では、約２（平均）±１（ＳＤ）分であり、範囲は、１〜５分だった。消失相における心筋層の自由循環バブルの最大濃度（Ａｆ）を表わす最大シグナル強度は、ＫＯ動物よりもＷＴ動物でより低かったが、これは統計的有意差に達しなかった。図７表。Ａｆは、ＷＴ動物ではＬＰＳＴｉｍｅの減
少と共に減少したが、ＫＯ動物では減少しなかった。図７ｆ。これは、標的媒介性バブル保持が増加すると共に、自由循環バブル濃度が減少したことと一致した。
【００８８】
ｂ．保持バブル。λｒをλｆと比較すると、保持バブルの半減期が、一般的に自由循環バブルの半減期よりも長い（≧２〜４×）ことが示された。これは、保持バブルシグナルの持続が、自由循環バブルシグナルの持続よりも長期間観察されたことと一致した。心筋層での音響的に有効な保持バブルの半減期（Ｌｎ２／λｒ）は、ＫＯ動物（ｎ＝８）での４±４分、範囲１〜１４分と比較して、ＷＴ（ｎ＝１２）では、約７（平均）±５（ＳＤ）分、範囲３〜１８分だった。
【００８９】
λｒ対Ａｒ。心筋層における保持バブルの消失速度定数（λｒ）は、Ａｒの増加と共に減少し、後者は、心筋層における保持バブルの最大濃度を表わしていた。図７ｇ。この関係性は、非線形であり、指数関数（λｒ＝０．４５ｅ−０．６４Ａｒ、Ｒ２＝０．７７）又はシグモイド関数（λｒ＝１／（１＋１０（０．２６Ａｒ＋０．３））、Ｒ２＝０．８７）に経験的にフィッティングすることができた。ｎ＝１２匹のＷＴ＆８匹のＫＯ。これは、最大保持バブル濃度が低いほど、保持バブルの半減期が短いことを示唆した（後者は、標的分子濃度と相関した。上記を参照）。言い換えると、消失相における保持バブルの場合、標的部位でのバブル蓄積が完了した当初の最大濃度（Ａｒ）が高ければ、その消失速度定数（λｒ）がより低くなるか、又はその半減期（半減期＝Ｌｎ２／λｒ）がより長くなる。この関係性は、非線形であると考えられた。任意の特定の理論に束縛されることは望まないが、本発明者は、この１つの理由が、保持バブル濃度が増加すると共に、隣り合うバブル間の距離が減少し、それにより、（ｉ）隣接バブル間の音響的相互作用が増加し、バブル集団から出て来るガスの正味拡散が低減されるような機械的応答が引き起こされ、及び／又は（ｉｉ）バブルを取り巻くガス飽和微小環境の増加により、バブルからのガス拡散の濃度勾配が低減されるためである可能性があること見出した。
【００９０】
ビデオ密度測定法を使用して、ＵＳ画像を処理する。上記には、幾つかの３秒間画像クリップをどのように取得及び記録するかが記載されており、それらを処理する際には、それら目的地点のシグナル強度を比較することができるように、各記録クリップの対応する画像をピクセル毎に、又は目的領域毎に比較する。マイクロバブルの数は、経時的に減少するため、目的地点の強度は、経時的に低減するだろう。目的地点が異なれば、分子標的の存在／非存在／濃度、流動特徴及び微粒子消失特徴、アーチファクト（例えば、アラインメント／運動／機器／減衰アーチファクト、それらは断続的であってもよく／断続的でなくともよい）に関する挙動が異なる場合がある。上述した双指数関数を使用して、画像で検出された強度をカーブフィッティングして、どの双指数関数曲線が各地点に最も良くフィッティングするかを特定することができる。曲線が判明すれば、目的地点のパラメータを得ることが可能である。Ａｒは、消失相における目的地点での最大保持バブル濃度を示す。このプロセスは、目的領域全域の複数の目的地点で繰り返すことができる。各目的地点について、一連の画像の各々のピクセルを比較し、その後カーブフィッティングをする。幾つかの地点をカーブフィッティングしたら、平均を取って、その目的領域のパラメータの値の正確な定量化を得ることができる。或いは、カーブフィッティングを行う前に平均を取って、複数の目的地点を有する目的領域に対応する特定の画像のピクセルの強度を平均し、その後各画像の平均強度値を比較してもよい。その後、その代わりに平均値をカーブフィッティングしてもよい。
【００９１】
心臓の特定の地点について、例えばバブル投与の約２〜６分後の≧３時点（例えば、バブル投与後の２、３、及び４分時点以上；又は４、５、及び６分時点以上；又は６、７、及び８分時点以上；又は７、８、及び９分時点以上）で得られた画像のその地点で測定された応答は、以下の双指数関数を含む曲線にフィッティングすることができる一連の値をもたらすことになることが理解される。
Ｉ（ｔ）＝Ａｆｅ−λｆｔ  ＋  Ａｒｅ−λｒｔ
【００９２】
この関数の部分：Ａｆｅ−λｆｔは、遊離マイクロバブルの消失を表わし、この関数の部分Ａｒｅ−λｒｔは、保持マイクロバブルの消失を表わす。双指数関数は、自由マイクロバブル及び保持マイクロバブルの消失を予測し、任意の時点における保持マイクロバブル及び／又遊離マイクロバブルの濃度の計算を可能にする。
【００９３】
目的領域の一連の地点での保持マイクロバブル又は遊離マイクロバブルの濃度が計算されれば、その目的領域にわたってそれらの濃度の変化を示す画像を生成することも可能である。更に、曲線から導き出すことができる他の特徴はいずれも、必要に応じて、画像にすることもできる。例えば、目的領域内の保持マイクロバブルの半減期の変化を示す画像を形成することができる。
【００９４】
複数の画像が収集され、収集された複数の画像にわたって比較を実施することが必要であるため、画像処理は後で実施されることが理解されるだろう。したがって、定量化は、後処理工程として実施する。
【００９５】
実施例
別の構成では、造影剤が、例えば、心臓腔又は血管の血液プールに保持されない場合でさえ、特徴を定量化することが可能である。例えば、、マイクロバブルを投与し、ＵＳ画像化を使用して、上述のように組織及び付近の血液プール（例えば、心臓腔又は血管）の複数の画像を得ることができる。組織及び付近の血液プールの目的地点を上述のように分析し、強度を、双指数関数式に対してカーブフィッティングすることができる。マイクロバブルが保持されない血液プールでは、保持マイクロバブルに関する双指数関数の指数項は、ゼロになるか又はゼロに近づくだろう。血液プールでの遊離マイクロバブルの特徴は、その対応する指数項から決定する。更に、組織内の遊離マイクロバブルの特徴及び血液プール内の遊離マイクロバブルの特徴を比較して、有用な情報を得ることができる。例えば、組織Ａｆ又は組織ＡＵＣｆの血液プールＡｆ又はＡＵＣｆに対する比率を分母として使用することにより、組織の微少血管容積の取得が可能になる。したがって、この方法を使用して重要な臨床特徴を得ることができる。具体的には、この独特の方法は、少量（つまり、非減衰／飽和性）のマイクロバブル用量を使用することが必要な従来技術による方法とは対照的に、高ボーラス用量のマイクロバブルを使用して、上述の問題を引き起こす画像シグナル飽和及び／又は減衰を起こさずに、組織微少血管容積を決定することを可能にする（保持マイクロバブル濃度が最小限である／低い／中程度である場合に最も良好に機能する）。また、この方法の使用は、品質管理及びデータ解釈の点で有利である。例えば、組織Ａｆ、ＡＵＣｆ、又はλｆが、血液プールのＡｆ、ＡＵＣｆ、又はλｆから予想外に逸脱することは、循環閉塞等の特定の疾患状態を注意喚起することができ、組織λｆ、血液プールλｆ、及び組織λｒ間の予想外の関連性は、ＵＳ設定、バブル、又は宿主の異常を注意喚起することができる。
【００９６】
実施例
別の構成では、定量化された特徴を、非標的化造影剤又は標的化造影剤で得ることができる（後者は、標的分子が存在しないことが知られている対象体に投与される）。こうした状況では、造影剤は（その性質に応じて）、非特異的な結合、非特異的な細胞取込み、機械的な閉塞、又は血流停止等の（これらに限定されないが）、非特異的機序により組織／系に保持される場合がある。その場合、この分析では、以前は保持（標的化）造影剤（上述のような）を表わしていた指数項を、非特異的に保持された造影剤を表わすために使用することができる。したがって、Ａｒは、組織／系の非特異的造影剤保持の度合いを表し、それを使用して、非特異的保持により組織／系に送達しようとする治療用物質を坦持する造影剤の用量を決定することができる。
【００９７】
図８には、本明細書に記載のように、画像化を使用して物体の特徴を定量化する方法の実施に使用されるシステム１００が例示されている。
【００９８】
システム１００は、画像化システム１１０及びデータ処理システム１２０を備える。画像化システム１１０は、超音波画像化システム又はＭＲＩシステム等のシステムであってもよく、物体１０を画像化するように構成されている。その後、画像化システム１１０は、取り込んだ画像をデータ処理システム１２０に送信する。データ処理システム１２０は、取り込んだ画像データを、通信ユニット１２１で受信し、通信ユニット１２１は、外部システムから受信したあらゆるデータをプロセッサ１２２に送信する。その後、プロセッサ１２２は、受信した画像データをメモリ１２３に格納する。その後、プロセッサ１２２は、本明細書全体にわたって考察されている種々のプロセス及び分析を実施することができる。その後、プロセッサ１２２により実施された処理の結果は、グラフィックスカード１２４に送信され、モニタ２０に表示される。また、データ処理システム１２０は、ユーザが、ユーザインタフェース３０を介してデータ処理システム１２０の操作を制御するための指示を受信するように構成されたユーザインタフェースモジュール１２５を備える。
【００９９】
上記システム１００は、幾つかの別個の要素を備えるように記載されているが、図８に示されている要素の全て又は要素のサブセットは、単一ユニット内に統合されていてもよいことが理解されるだろう。更に、システム１００の態様は、分散型要素であってもよいことも理解されるだろう。例えば、処理は、データ処理システムの分散型ネットワークにより実施されてもよい。加えて、処理は、クラウドコンピューティング環境で実施されてもよい。
【０１００】
また、上記に記載の種々の方法は、コンピュータプログラムにより実施してもよい。図８のシステムでは、コンピュータプログラムは、メモリ１２３に格納され、プロセッサ１２２により実行可能であってもよい。コンピュータプログラムは、データ処理システム１２０等の、コンピュータに指令して、上述の種々の方法の１つ又は複数の機能を実施するように構成されたコンピュータコードを含んでいてもよい。そのような方法を実施するためのコンピュータプログラム及び／又はコードは、コンピュータ読取り可能な媒体又はコンピュータプログラム製品で、コンピュータ等の装置に提供することができる。例えば、コンピュータ読取り可能な媒体は、例えば、インターネット上のコードをダウンロードするための、電子的システム、磁気的システム、光学的システム、電磁気的システム、赤外線システム、又は半導体システムであってもよく、又はデータ伝送用の複製媒体であってもよい。或いは、コンピュータ読取り可能な媒体は、半導体又はソリッドステートメモリ、磁気テープ、脱着式コンピューターディスケット、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、剛性磁気ディスク、並びにＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ／Ｗ、又はＤＶＤ等の光ディスク等の物理的なコンピュータ読取り可能な媒体の形態を取っていてもよい。
【図１】
0006430958.tif 000004
【図２】
0006430958.tif 000005
【図３】
0006430958.tif 000006
【図４ａ】
0006430958.tif 000007
【図４ｂ】
0006430958.tif 000008
【図４ｃ】
0006430958.tif 000009
【図５ａ】
0006430958.tif 000010
【図５ｂ】
0006430958.tif 000011
【図６】
0006430958.tif 000012
【図７】
0006430958.tif 000013
【図７ａ】
0006430958.tif 000014
【図７ｂ】
0006430958.tif 000015
【図７ｃ】
0006430958.tif 000016
【図７ｄ】
0006430958.tif 000017
【図７ｅ】
0006430958.tif 000018
【図７ｆ】
0006430958.tif 000019
【図７ｇ】
0006430958.tif 000020
【図８】
0006430958.tif 000021