(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６を有するＮ末端のＧＭ−ＣＳＦと、１個のセリン残基からなるリンカーと、配列番号３を有するＣ末端のＩＬ−４とを含むことを特徴とするコンジュゲート。
【請求項２】
請求項１に記載のコンジュゲートにおいて、アジュバント、サイトカイン、共刺激分子、抗原、タンパク質、および糖タンパク質から選択される群の１つまたは複数にさらにコンジュゲートされることを特徴とするコンジュゲート。
【請求項３】
請求項２に記載のコンジュゲートにおいて、前記抗原がウイルス抗原または腫瘍関連抗原であることを特徴とするコンジュゲート。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか一項に記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
請求項１乃至３の何れか一項に記載のコンジュゲートおよび抗原を、アジュバンドと組み合わせて含むことを特徴とするワクチン。
【請求項６】
請求項５に記載のワクチンにおいて、前記抗原がＧＭ−ＣＳＦポリペプチドにコンジュゲートされていることを特徴とするワクチン。
【請求項７】
癌治療または癌予防用医薬の製造のための、請求項１乃至３の何れか一項に記載のコンジュゲートで活性化された自己血液細胞の使用。
【請求項８】
請求項７に記載の使用において、前記医薬が、アジュバントをさらに含むことを特徴とする使用。
【請求項９】
請求項１乃至３の何れか一項に記載のコンジュゲートの使用方法であって、前記コンジュゲートが、末梢血液細胞との混合のために使用されることを特徴とする使用方法。
【請求項１０】
癌治療または癌予防用医薬の製造のための、請求項１乃至３の何れか一項に記載のコンジュゲートと混合された末梢血液細胞の使用。
【請求項１１】
請求項１０に記載の使用において、前記末梢血液細胞が前記被験体に由来することを特徴とする使用。
【請求項１２】
配列番号６を有するＮ末端のＧＭ−ＣＳＦと、１個のセリン残基からなるリンカーと、配列番号３を有するＣ末端のＩＬ−４とを含むコンジュゲートをコードすることを特徴とする単離核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を含むことを特徴とする組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１３年１０月２３日に提出された３７１Ｕ．Ｓ．Ｃに基づく５番目の国際特許出願であるＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６６２６１であり、２０１２年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／７１７，１２９号明細書の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
癌は、無制御に増殖する癌細胞を免疫系が適切に除去しない結果として発生すると思われる。癌細胞を認識し排除するように免疫系を刺激することは、治療的処置のための有望な戦略になっている。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）は、癌細胞に対する免疫系を刺激すると考えられている組換えヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）を含有し、転移性腎細胞癌（転移性ＲＣＣ）を有する成人の治療に適応となっている。重篤な有害事象が、推奨用量でのこの治療に付随するのが通例である。したがって、方法の改善を見出す必要がある。
【０００３】
サイトカイン顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、樹状細胞（ＤＣ）による抗原提示および共刺激を増強することにより、適応免疫系を増強する。その免疫刺激機能により、ＧＭ−ＣＳＦは、癌に対する宿主免疫系を増強し、また化学療法後に患者の白血球数を増加させるために用いられている。Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（商標）は、ＦＤＡに認可された自己細胞癌免疫療法である。被験体の末梢血白血球を白血球搬出法によって収集する。これらの濃縮された単球を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＰＡＰ−ＧＭ−ＣＳＦ）にコンジュゲートされた前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）と共にインキュベートする。ＧＭ−ＣＳＦは、ＤＣ前駆体上の受容体に標的抗原を誘導すると考えられており、ＤＣ前駆体は、次いで、ＰＡＰを発現する細胞に対してＴ細胞を活性化するのに十分な状況をもたらすように、その細胞表面上にＰＡＰを提示する。活性化されたＰＡＰ提示ＤＣを被験体に投与して、癌増殖を遅延させる免疫応答を誘発させる。この戦略は、被験体の細胞の単離および増殖を必要とし、典型的には、治療により、被験体から癌または腫瘍が完全に取り除かれるとは限らない。したがって、方法の改善を見出す必要がある。
【０００４】
インターロイキン４（ＩＬ−４）は、γ鎖サイトカインである。それは、Ｂリンパ球による抗体クラススイッチを活性化し誘発するシグナルとして機能し、ナイーブヘルパーＴリンパ球を活性Ｔリンパ球に変換し、その後その集団を拡大増殖させる。米国特許第６，８３８，０８１号明細書は、ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦの組合せを投与することにより、前駆細胞からの抗原提示細胞の発生が増強されることを報告する。また、米国特許出願公開第２００４／００７２２９９号明細書およびＨｉｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＮＴＩＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ２４：１６０９−１６１６（２００４）も参照されたい。
【０００５】
ＧＩＦＴフソカインは、ＧＭ−ＣＳＦと共通γ鎖インターロイキンの融合導入遺伝子に由来する融合タンパク質であり、宿主免疫応答の抑制または増強の何れかを行うことができる。Ｓｔａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００４，９，Ｓ１３３−Ｓ１３３は、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−２融合体（ＧＩＦＴ２）を開示している。また、Ｐｅｎａｆｕｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９，６９（２３）：９０２０−８；Ｒａｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００９，１５（９）：１０３８−４５；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，Ｃａｎｃｅｒ，１９９１，６７（１０  Ｓｕｐｐｌ）：２７０５−７；国際公開第２００５／００５３５７９号パンフレット；国際公開第２００５／０２６８２０号パンフレット；国際公開第２００８／００１４６１２号パンフレット；ならびに米国特許第７，３２３，５４９号明細書；同第７，２１７，４２１号明細書；同第６，６１７，１３５号明細書；および同第５，１０８，９１０号明細書も参照されたい。
【発明の概要】
【０００６】
特定の実施形態では、本開示は、ＧＭ−ＣＳＦのポリペプチドとポリペプチドＩＬ−４を含むコンジュゲートに関する。典型的には、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４は、リンカー、例えばポリペプチドにより連結される。特定の実施形態では、本開示は、これらのポリペプチドコンジュゲートをコードする単離核酸、ポリペプチドコンジュゲートをコードする核酸を含むベクター、ならびに感染性ウイルス粒子などのこれらのベクターおよびそのような核酸を含む宿主細胞を含むタンパク質発現系に関する。
【０００７】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるコンジュゲートおよびベクター、ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるコンジュゲートおよびベクター、ならびに抗原および場合によってはアジュバントを含むワクチンに関する。典型的には、抗原は、生弱毒ウイルス、死滅ウイルス、ウイルス様粒子、ビロソーム、癌細胞、表面抗原を有する脂質二重層構造に含有され、抗原は、典型的には、ウイルスのタンパク質もしくは糖タンパク質、細菌もしくは細菌抗原、または腫瘍関連抗原である。特定の実施形態では、抗原は、樹状細胞マーカーにコンジュゲートされている。
【０００８】
特定の実施形態では、本開示は、活性化された正常Ｂ細胞がケモカインＣＣＬ３を産生するか、またはＩＮＦ−ガンマのレベルを上昇させることができるような条件下で、本明細書のコンジュゲートをＢ細胞と混合する方法を企図する。特定の実施形態では、このＢ細胞は慢性リンパ性白血病Ｂ細胞である。特定の実施形態では、この混合はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞は、癌を効果的に治療または予防する量で、例えばＢ細胞の入手元である被験体に投与される。
【０００９】
特定の実施形態では、本開示は、ウイルス、細菌、または寄生虫の感染を治療または予防する方法であって、本明細書に開示されるコンジュゲートまたはベクターを含む医薬組成物の有効量を、場合によっては抗原と、また場合によってはアジュバントと併用して投与することを含む方法に関する。特定の実施形態では、被験体は、慢性ウイルス感染などのウイルス感染の症状の恐れがあるかもしくはその症状を示しているか、またはウイルス感染と診断されている。
【００１０】
特定の実施形態では、本開示は、ウイルス感染を治療または予防する方法であって、本明細書に開示されるコンジュゲートを含むワクチンの有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１１】
特定の実施形態では、被験体は、亜型Ｈ１Ｎ１を含むインフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、ロタウイルスＤ、ロタウイルスＥ、ＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトアデノウイルス型（ＨＡｄＶ−１〜５５）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、および５９、パルボウイルスＢ１９、伝染性軟属腫ウイルス、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）、ＢＫウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、コクサッキーＡウイルス、ノロウイルス、風疹ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、黄熱病ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、牛疫ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスリンパ球向性ウイルス、ロゼオロウイルス、またはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と診断されている。
【００１２】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるコンジュゲートまたはベクターを、アバカビル、アシクロビル、アシクロビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリゲン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビル、シドホビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドキスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インターフェロンＩＩＩ型、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩ型、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル、オセルタミビル、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、ラルテグラビル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン（ｐｙｒａｍｉｄｉｎｅ）、サキナビル、スタブジン、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン（ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）、ザルシタビン、ザナミビル、および／またはジドブジンなどの他の抗ウイルス剤と併用して投与することに関する。
【００１３】
特定の実施形態では、本開示は、癌を治療または予防する方法であって、本明細書に開示されるコンジュゲートまたはベクターを含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１４】
特定の実施形態では、本開示は、癌を治療または予防する方法であって、本明細書に開示されるコンジュゲートと併用して、ＧＭ−ＣＳＦにコンジュゲートされた癌抗原で活性化された自己血液細胞を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１５】
特定の実施形態では、本開示は、末梢血液細胞を活性化する方法であって、ＣＤ５４の発現増大が起こるような条件下で、腫瘍関連抗原／癌マーカーを含む本明細書に開示されるコンジュゲートと末梢血液細胞を混合することを含む方法に関する。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ５４の発現増大が起こるような条件下で、腫瘍関連抗原／癌マーカーを含む、本明細書に開示されるコンジュゲートと末梢血液細胞を混合することによって生成される生成物に関する。特定の実施形態では、本開示は、癌を治療または予防する方法であって、本明細書に開示されるコンジュゲートと末梢血液細胞を混合することによって作製される生成物の有効量を、末梢血液細胞の入手元である被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１６】
特定の実施形態では、本開示は、単離された骨髄および／または骨髄幹細胞を含む組成物を作製する方法であって、本明細書に開示されるコンジュゲートおよび組成物、例えば、ＧＩＦＴ４、Ｂ細胞と組み合わせたＧＩＦＴ４、またはＧＩＦＴ４を用い、場合によってはＢ細胞と組み合わせて活性化された単離細胞を被験体に投与することを含む方法。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるコンジュゲートおよび組成物を投与することを含む、照射誘発骨髄機能不全の治療または予防に関する。
【００１７】
特定の実施形態では、本開示は、骨髄および／または骨髄幹細胞の生成を増大させる方法であって、本明細書に開示されるコンジュゲートの有効量を被験体に投与することを含む方法に関する。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるコンジュゲートを投与された被験体から骨髄および／または骨髄幹細胞を単離する工程によって作製される生成物に関する。
【００１８】
特定の実施形態では、本開示は、骨髄幹細胞の生成を増大させる方法であって、Ｂ細胞と併用して、本明細書に開示されるコンジュゲートの有効量を、Ｂ細胞が欠損した被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１９】
特定の実施形態では、被験体は、Ｂ細胞免疫不全、Ｂ細胞発生／免疫グロブリン生成の欠損、過度／無制御のＢ細胞増殖、白血病、慢性リンパ球性白血病、リンパ腫、濾胞性非ホジキンリンパ腫、びまん性大型Ｂ細胞性リンパ腫、またはループスと診断されている。
【００２０】
特定の実施形態では、本開示は、Ｂ細胞と併用して、本明細書に開示されるコンジュゲートを投与された被験体から骨髄および／または骨髄幹細胞を単離する工程によって作製される生成物に関する。
【００２１】
特定の実施形態では、本開示は、単離された骨髄細胞および／または骨髄幹細胞ならびに本明細書に開示されるコンジュゲート、例えばＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートを含む組成物に関する。特定の実施形態では、骨髄細胞および／または骨髄幹細胞は、骨髄細胞および／または骨髄幹細胞の増殖が増大するような条件下で、コンジュゲートを予め投与された被験体から得られる。
【００２２】
特定の実施形態では、本開示は、骨髄機能不全を治療または予防する方法であって、本明細書に開示されるコンジュゲートと骨髄細胞を混合することによって作製される生成物の有効量を被験体に投与することを含む方法に関する。特定の実施形態では、骨髄機能不全は照射が原因である。特定の実施形態では、本明細書に開示されるコンジュゲートと骨髄細胞を混合することによって作製される生成物は、本明細書に開示されるコンジュゲートと併用して、被験体に投与される。特定の実施形態では、コンジュゲートはＧＩＦＴ４である。特定の実施形態では、骨髄細胞は被験体から得たものである。
【００２３】
特定の実施形態では、本開示は、癌を治療または予防する方法であって、本明細書に開示されるコンジュゲートと骨髄細胞を混合することによって作製される生成物の有効量を、被験体に投与することを含む方法に関する。特定の実施形態では、本明細書に開示されるコンジュゲートと骨髄細胞を混合することによって作製される生成物は、本明細書に開示されるコンジュゲートと併用して、被験体に投与される。特定の実施形態では、コンジュゲートはＧＩＦＴ４である。特定の実施形態では、骨髄細胞は被験体から得たものである。
【００２４】
一部の実施形態では、本開示は、癌を治療または予防する方法であって、本明細書に開示されるコンジュゲートまたはベクターを含む医薬組成物を、癌と診断されたかまたは癌の症状を示すかもしくは癌のリスクがある被験体に投与することを含む方法に関し、ここで、癌は、白血病またはリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性単球性白血病（ＡＭＯＬ）、ホジキンリンパ腫、ならびに非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫）などの血液悪性腫瘍である。他の企図される癌としては、子宮頸部、卵巣、結腸、乳房、胃、肺、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、頭部、頸部、および腎臓の癌が挙げられる。
【００２５】
本明細書に開示される任意の癌管理方法の範囲内で、コンジュゲートまたはベクターは、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ドセタキセル、シスプラチン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフール、ラルチトレキセド、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソール、タキソテール、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、カンプトテシン、ボルテゾミブ、アナグレリド、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、イドキシフェン（ｉｏｄｏｘｙｆｅｎｅ）、フルベストラント、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、シプロテロン、ゴセレリン、リュープロレリン、ブセレリン、メゲストロール、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール（ｖｏｒａｚｏｌｅ）、エキセメスタン、フィナステリド、マリマスタット、トラスツズマブ、セツキシマブ、ダサチニブ、イマチニブ、ベバシズマブ、コンブレタスタチン、サリドマイド、および／もしくはレナリドミド、またはそれらの組合せなどの抗ガン剤と併用して投与することができる。特定の実施形態では、プロロイキン（組換えヒトＩＬ−２）および／またはインターフェロンアルファとの併用療法が企図される。
【００２６】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるコンジュゲートをコードする核酸を含むベクターを、それを必要とする被験体に投与することを含む遺伝子治療に関する。特定の実施形態では、核酸は、その自然状態から単離および／もしくは精製されたものか、またはｃＤＮＡなどの非天然形態に翻訳されたものである。
【００２７】
特定の実施形態では、本開示は、粒子、例えば、細胞、リポソーム、ミセル、小胞、二重層構造、ビロソーム、およびウイルス様粒子の表面に、本明細書に開示されるコンジュゲートを組み込むことを企図する。コンジュゲートは、親油性部分、例えば脂肪酸およびＧＰＩに連結することができる。一例では、本開示は、ＧＰＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、および場合によっては抗原、アジュバント、または他のポリペプチドを含むＧＰＩアンカーコンジュゲートを企図する。これらの粒子が、他の表面ポリペプチド、抗原、ならびにＢ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、および／またはＩＬ−２などの共刺激分子を含有し得ることを企図する。これらの粒子が、本明細書に開示されるコンジュゲートについて言及されるすべての用途において使用できることを企図する。
【００２８】
特定の実施形態の範囲内では、本明細書に開示されるコンジュゲートはいずれも、さらにアジュバント、サイトカイン、共刺激分子、抗原、タンパク質、または糖タンパク質にコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、抗原はウイルスタンパク質または癌マーカーである。
【００２９】
特定の実施形態では、癌マーカーは、ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、（ＰＳＭＡ）前立腺特異的膜抗原、早期前立腺癌抗原−２（ＥＰＣＡ−２）、ＡＫＡＰ−４（Ａキナーゼ［ＰＲＫＡ］アンカータンパク質４）、ＮＧＥＰ（前立腺発現新規遺伝子）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＨＥＲ−２、ＢＣＬ−２、ＭＡＧＥ抗原（ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ａ３、およびＭＡＧＥ−Ａ４など）、ＥＲＫ５、Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体１、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ−１２５、癌胎児性抗原、ＣＤ２０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、メラノーマ関連抗原（ＴＡ−９０）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、上皮膜タンパク質（ＥＭＰ−１、−２、および−３）、ＨＭＢ−４５抗原、ＭＡＲＴ−１（メランＡ）、Ｓ１００Ａ１、およびＳ１００Ｂ、またはそれらのフラグメントもしくは変異形態から選択される。
【００３０】
特定の実施形態では、ウイルス抗原は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ；サイトメガロウイルスの糖タンパク質ｇＢ、ｐ２８、ｐ３８、ｐ５０、ｐ５２、ｐ６５、およびｐ１５０；ボレリアのｐ４１；ＨＩＶのｎｅｆ、インテグラーゼ、ｇａｇ、プロテアーゼ、ｔａｔ、ｅｎｖ、ｐ３１、ｐ１７、ｐ２４、ｐ３１、ｐ５５、ｐ６６、ｇｐ３２、ｇｐ３６、ｇｐ３９、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、およびｇｐ１６０；ＳＩＶのｐ５５；ＨＢＶのコア、表面抗原、およびオーストラリア抗原；ＨＣＶのコアヌクレオカプシド、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５；デングのｅｎｖおよびＮＳ１；ＥＢＶの早期抗原、ｐ１８、ｐ２３、ｇｐ１２５、核抗原（ＥＢＮＡ）−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｂ、ＥＢＮＡ−３Ｃ、ＥＢＮＡリーダータンパク質（ＥＢＮＡ−ＬＰ）、潜在性膜タンパク質（ＬＭＰ）−１、ＬＭＰ−２Ａ、およびＬＭＰ−２Ｂ；ならびに単純ヘルペスウイルスのｇＤおよびｇＧ、またはそれらのフラグメントもしくは変異形態から選択される。
【００３１】
特定の実施形態では、アジュバントまたはサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、ＩＦＮ−アルファ、フラジェリン、非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチド、リポ多糖、リピドＡ、および熱安定性抗原（ＨＳＡ）から選択される。
【００３２】
特定の実施形態では、本開示は、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、または腹腔内（ＩＰ）投与による、本明細書に開示されるコンジュゲートを含む医薬品の投与を企図する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａは、ＧＩＦＴ４タンパク質（配列番号７）を説明する図である。マウスＧＩＦＴ４タンパク質−ＧＭ−ＣＳＦアミノ酸（配列番号１）、リンカーＳ、およびＩＬ−４アミノ酸（配列番号２）のアミノ酸配列を示している。図１Ｂは、ＧＩＦＴ４タンパク質の予測される三次元構造を示している。図１Ｃは、抗マウスＧＭ−ＣＳＦ抗体および抗マウスＩＬ−４抗体の両方によるウエスタンブロットにより検出された、２９３Ｔ細胞により発現されたインタクトなＧＩＦＴ４タンパク質（５０ＫＤａ）を示している。図１Ｄは、ＧＭ−ＣＳＦ応答性のＪＡＷＳＩＩ細胞を、ＧＩＦＴ４または組換えＧＭ−ＣＳＦもしくはＩＬ−４で７２時間処理したデータを示している。対照として培地を用いた。細胞増殖はＭＴＴアッセイにより分析した。図１Ｅは、ＩＬ−４応答性のＣＴ．ｈ４Ｓ細胞を処理した場合のデータを示している。
【図２】図２Ａは、ＧＩＦＴ４処理Ｂ細胞の表現型に関するデータを示す図である。ＧＩＦＴ４刺激によるＢ細胞増殖の誘導。細胞を４日間培養した。組換えＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の併用を対照として用いた。図２Ｂは、細胞をＣＦＳＥ色素で標識したデータを示している。細胞分裂周期が個々のピークとして示された。図２Ｃは、無処理Ｂ細胞（灰色）または抗体アイソタイプ対照（黒線）と比較した、ＧＩＦＴ４処理Ｂ細胞（黒色）の表面マーカーのデータを示している。図２Ｄは、ＧＩＦＴ４の存在下における（黒色）、抗マウスＩｇＭ抗体によるＢＣＲ架橋後の共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６のダウン、ならびにＢ細胞におけるＩｇＭからＩｇＧへの免疫グロブリンスイッチを示すデータを表している。組換えＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の併用（灰色）を対照として用いた。黒線のみは抗体アイソタイプ対照である。
【図３】図３Ａは、ＧＩＦＴ４活性化Ｂ細胞のセクレトームに関するデータを示す図である。ウエスタンブロットにより検出された、ＧＩＦＴ４刺激（２０分間）により活性化されたＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、およびＳＴＡＴ６のリン酸化。図３Ｂは、ＧＩＦＴ４処理Ｂ細胞によるサイトカインおよびケモカインの分泌のデータを示している；サイトカイン濃度はルミネックスアッセイにより分析した。図３Ｃは、ＧＩＦＴ４処理Ｂ細胞によるサイトカインおよびケモカインの分泌のデータを示している；サイトカイン濃度はルミネックスアッセイにより分析した。図３Ｄは、ＦＡＣＳによりプロファイリングされたＧＭ−ＣＳＦ＋自然応答アクチベーター（ＩＲＡ、＃４２）Ｂ細胞の誘導を示している。図３Ｅは、計算されたＧＭ−ＣＳＦ産生Ｂ細胞のパーセントを示している。データは、３つの独立した実験からのものである。
【図４】図４Ａは、ＧＩＦＴ４による、ｉｎ  ｖｉｖｏでのメラノーマ腫瘍増殖の抑制に関するデータを示す図である。ＧＩＦＴ４で処置されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾腫。組換えＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の投与を対照として用いた。図４Ｂは、脾臓それぞれについて脾細胞を単離してカウントしたデータを示している。Ｂ細胞およびＴ細胞をＦＡＣＳ解析によりプロファイリングした。脾臓の全Ｂ細胞またはＴ細胞を計算した。図４Ｃは、Ｂ１６Ｆ０メラノーマ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに皮下移植したデータを示している。５日目に、静脈内注射によりＧＩＦＴ４タンパク質でマウスを処置した；ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４とを投与したマウスまたは無処置マウスを対照として用いた。図４Ｄは、ＧＩＦＴ４発現Ｂ１６Ｆ０メラノーマ細胞を、Ｂ６マウスに皮下移植したデータを示している。Ｂ１６Ｆ０−ＧＭＣＳＦメラノーマ細胞とＢ１６Ｆ０−ＩＬ−４メラノーマ細胞の混合物、または野生型Ｂ１６Ｆ０細胞を対照細胞として用いた。腫瘍サイズを測定した。各処置群は５匹のマウスとした；データは、３つの独立した実験からのものである。
【図５】図５Ａは、ＧＩＦＴ４により誘発されたＢ細胞依存性殺腫瘍活性に関するデータを示す図である。Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４メラノーマ細胞を、Ｒａｇ１ノックアウトマウス、または野生型Ｂ６マウスに皮下移植した。適応免疫がない状態では、メラノーマ腫瘍の急速な増殖が観察された。図５Ｂは、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞欠損マウスのデータを示している。図５Ｃは、ＧＩＦＴ４で、個々のサイトカインで、またはサイトカインの併用で刺激したＢ細胞とＴ細胞を共培養したデータを示している。培養上清中のＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡキットで測定した。図５Ｄは、Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４腫瘍細胞を、ＩＦＮ−γ−／−マウス、ＩＬ−１０−／−マウス、ＩＬ−１２−／−マウス、または野生型マウスに皮下注射したデータを示している。各群は５匹のマウスとした；データは、３つの独立した実験からのものである。
【図６】図６Ａは、ＧＩＦＴ４により増強された抗原メラノーマ特異的抗体産生に関するデータを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＯＶＡ投与のタイムスケジュール。ＧＩＦＴ４タンパク質、または組換えＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の組合せを補給されたマウスにＯＶＡを注射した。サイトカイン処置を受けないマウスをブランク対照として用いた。図６Ｂは、マウスから脾臓を摘出し、脾細胞からＢ細胞を精製した。５０，０００個のＢ細胞当たりのＯＶＡ特異的ＩｇＧ分泌細胞を、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより測定したデータを示している。図６Ｃは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（灰色）またはＢ細胞欠損マウス（灰色線）を、Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４細胞で免疫処置したデータを示している。ＰＢＳ処置マウスを対照として用いた（黒線）。マウスからの血清を、Ｂ１６Ｆ０メラノーマ細胞のＦＡＣＳ分析のための一次抗体として用い、次いで、ＰＥコンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体とインキュベートした。図６Ｄは、各群のマウスからの血清で処理されたＢ１６Ｆ０メラノーマ細胞の平均蛍光強度に関するデータを示している。各群は５匹のマウスとした；データは、３つの独立した実験からのものである。図６Ｅは、ＦｃγＲ−／−、Ｂ細胞欠損μＭＴ、または野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４メラノーマ細胞を移植したデータを示している。腫瘍増殖をモニターし測定した。各群は５匹のマウスとした；データは、３つの独立した実験からのものである。
【図７】図７Ａは、養子移入Ｂ細胞によるメラノーマ腫瘍増殖の抑制に関するデータを示す図である。免疫処置したマウスまたは免疫処置していない対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、Ｂ１６Ｆ０メラノーマ細胞を３０日目にチャレンジし、腫瘍増殖をモニターし測定した。図７Ｂは、Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４腫瘍細胞を移植したμＭＴマウスに、免疫処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離したＢ細胞を養子移入したデータを示している。Ｂ細胞移入を受けないマウスを対照として用いた。各処置群は５匹のマウスとした；データは、３つの独立した実験からのものである。
【図８】図８Ａは、ＧＩＦＴ４刺激による脾細胞増殖の誘導に関するデータを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離した脾細胞を、ＧＩＦＴ４または組換えＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の併用で５日間処理した。脾細胞が増殖してクラスターとして凝集した。図８Ｂは、細胞を回収して、マウスＢ細胞およびＴ細胞に対する典型的な抗体である抗マウスＢ２２０抗体および抗ＣＤ３抗体によるＦＡＣＳに供したデータを示している。
【図９】図９Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＲＡ様細胞のＧＩＦＴ４誘発増殖に関するデータを示す図である。ＧＩＦＴ４で処置したか、またはＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の併用で処置したマウスからの精製脾臓Ｂ細胞をＧＭ−ＣＳＦの細胞内染色に供した後、ＦＡＣＳを行った。図９Ｂは、計算されたＧＭ−ＣＳＦ産生Ｂ細胞のパーセントを示している。データは、２つの独立した実験からのものである。
【図１０】図１０は、ＣＬＬ細胞に対するＧＩＦＴ４免疫機能について提案されたモデルを示す図である。ＧＩＦＴ４は、白血病性Ｂ細胞を抗ＣＬＬエフェクターおよびヘルパーに再プログラムすることによる強力な抗ＣＬＬ免疫機能を有しており、抗ＣＬＬエフェクターおよびヘルパーは、ＩＦＮ−γ、ＮＫ、およびＴ細胞、ならびにＮＫＴ細胞の増殖を促進する。
【図１１】図１１Ａは、ヒトＧＩＦＴ４タンパク質（配列番号８）を示す図である。ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶ  ＡＣＳＩＳＡＰＡＲＳ  ＰＳＰＳＴＱＰＷＥＨＶＮＡＩ  ＱＥＡＲＲＬＬＮ  ＬＳＲＤＴＡＡＥＭＮ  ＥＴＶＥＶＩＳＥ  ＭＦＤＬＱＥＰＴＣ  ＬＱＴＲＬＥＬＹＫＱＧＬ  ＲＧＳＬＴＫＬＫＧＰＬＴＭＭＡＳＨ  ＹＫＱＨＣＰＰＴＰＥＴＳＣＡＴＱ  ＴＩＴＦＥＳＦ  ＫＥＮＬＫＤＦＬＬＶＩＰＦＤＣＷＥＰＶＱＥ（配列番号６）、Ｓリンカー、およびＩＬ−４のヒトアイソフォーム１（配列番号３）のポリペプチドを示す図である。図１１Ｂは、ヒトＧＩＦＴ４タンパク質の３Ｄ構造を示している。図１１Ｃは、遺伝子改変２９３Ｔ−ＧＩＦＴ４細胞により発現されるＧＩＦＴ４タンパク質を、ウエスタンブロットにより検出したデータを示している。図１１Ｄは、ＧＩＦＴ４がＩＬ−４シグナル伝達の強力な生物学的シグナル伝達活性を有しており、ＩＬ−４レスポンダーであるＣＴ．ｈ４Ｓ細胞の増殖を誘導することを示している。
【図１２】図１２Ａは、ヒトＧＩＦＴ４タンパク質によるＣＬＬ−Ｂ細胞の活性化に関するデータを示す図である。精製ＣＬＬ  Ｂ細胞を、ヒトＧＩＦＴ４タンパク質、またはＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の併用で刺激した。図１２Ｂは、ＧＩＦＴ４が、ＣＬＬ  Ｂ細胞のＳＴＡＴ５の過剰リン酸化を誘発するが、ＳＴＡＴ１、３、および６の過剰リン酸化を誘発しないことを表すデータを示している。
【図１３】図１３Ａは、ＧＩＦＴ４変換ＣＬＬ  Ｂ細胞が独自の表面マーカーおよびセクレトームを有することに関するデータを示す図である。ＧＩＦＴ４は白血病性Ｂ細胞を抗原提示細胞に再プログラムする。抗原提示細胞は、ＣＤ５＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ２３＋、ＣＤ４０＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＭＨＣ  Ｉ／ＩＩ＋であるが、ＣＤ１２４ｌｏｗである。図１３Ｂは、ＧＩＦＴ４処理ＣＬＬ  Ｂ細胞が、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＣＡＭ１、およびＩＬ−２を大量に分泌することを示すデータである。
【図１４】図１４Ａは、ＧＩＦＴ４により再プログラムされたＣＬＬ  Ｂ細胞が、自己ＮＫおよびＴ細胞免疫応答をプライミングすることを示唆するデータを示す図である。ＣＤ５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、ＣＬＬ細胞の主要成分であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ１６＋ＮＫ細胞は、マイナー集団である（上段）。ＧＩＦＴ４処理は、ＮＫおよびＴ細胞ならびにＣＤ３＋ＣＤ１６＋ＮＫＴ細胞の増殖を強固に推進した（中段）。これらの細胞は大量のＩＦＮ−γを産生する（下段）。図１４Ｂは、ＩＦＮ−γに関するデータを示している。図１４Ｃは、患者由来の初代自己ＣＬＬ細胞とＧＩＦＴ４処理ＣＬＬ細胞を共培養すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、初代ｐＣＬＬ細胞の死滅がもたらされるデータを示している。
【図１５】図１５Ａは、ＧＩＦＴ４処理により、Ｂ６マウス（Ｌｉｎ−ＳＣＡ−１＋ＣＤ１１７＋）において骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）が増加することを示唆するデータを示す図である。ＧＩＦＴ４（２０ｎｇ／日）または対照サイトカインをＢ６マウスに６日間注射した。骨髄細胞を単離して、系統マーカーおよび幹細胞マーカーによるＦＡＣＳ分析に供した。大腿骨当たりのＢＭＳＣの数を計算した。実験は３回繰り返し、各群５匹のマウスとした。図１５Ｂは、Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ＣＫｉｔ＋である表面マーカーのデータを示している。
【図１６】図１６は、μＭＴマウスにおいて、Ｂ細胞欠損がＢＭＳＣの増加を抑止することを示唆するデータを示す図である。ＧＩＦＴ４（２０ｎｇ／日）または対照サイトカインをμＭＴ  Ｂ細胞欠損マウスに６日間注射した。骨髄細胞を単離して、系統マーカーおよび幹細胞マーカーによるＦＡＣＳ分析に供した（図１５を参照のこと）。大腿骨当たりのＢＭＳＣの数を計算した。実験は２回繰り返し、各群５匹のマウスとした。
【図１７】図１７は、Ｂ細胞の養子移入がＧＩＦＴ４処置後のμＭＴマウスにおけるＢＭＳＣ増殖を促進することを示唆するデータを示す図である。μＭＴ  Ｂ細胞欠損マウスへのＢ細胞（２×１０７細胞／マウス）の養子移入を、６日間のＧＩＦＴ４処置と併用した。骨髄細胞を単離して、系統マーカーおよび幹細胞マーカーによるＦＡＣＳ分析に供した（図１５を参照のこと）。大腿骨当たりのＢＭＳＣの数を計算した。実験は２回繰り返し、各群５匹のマウスとした。
【図１８】図１８は、ＧＩＦＴ４でプログラムされたＢＭＳＣがナイーブマウス由来のＢＭＳＣと同様の機能を有することを示唆するデータを示す図である。Ｂ６マウスに、１１Ｇｙ（５．５＋５．５Ｇｙ、３時間間隔）を照射し、次いでｍＧＩＦＴ４処置マウスまたはナイーブマウスから精製したＢＭＳＣをｉ．ｖ．注射した。マウスの体重減少および生存期間をモニターした。実験は２回繰り返し、各群５匹のマウスとした。
【図１９】図１９は、ＧＩＦＴ４とＢ細胞を送達すると、照射を原因とする骨髄機能不全が寛解することを示唆するデータを示す図である。Ｂ６マウスに、１１Ｇｙ（５．５＋５．５Ｇｙ、３時間間隔）を照射し、次いでｍＧＩＦＴ４（２０ｎｇ／マウス／日を６日間）、またはそれに加えてＢ細胞（２×１０６細胞／マウス）をｉ．ｖ．注射した。処置を受けないマウスを対照として用いた。マウス体重減少および生存期間をモニターした。実験は２回繰り返し、各群５匹のマウスとした。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
共通γ鎖インターロイキンサイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１が含まれ、リンパ球の活性化および分化において重要な役割がある。ＩＬ−２は、Ｔ細胞に対する強力な免疫調節特性を有しており、進行した腎臓癌および転移性メラノーマの患者を治療するために用いる最初のインターロイキン免疫療法剤として、ＦＤＡから承認されている。不運にも、ＩＬ−２免疫療法は、種々の化学療法剤と併用しても、癌患者の生存期間の顕著な改善を示していない。加えて、ＩＬ−２は、毛細血管漏出による、多くの場合重篤な、時として致死的な副作用を示すことが多い。
【００３５】
ＧＩＦＴ２は、腫瘍キラーＮＫ細胞の誘導を介して抗腫瘍活性を示す。ＧＩＦＴ２は殺腫瘍性樹状細胞に影響を及ぼす。これに対して、ＧＩＦＴ１５（ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１５に由来する）には、多発性硬化症における炎症性応答を抑止する免疫抑制機能がある。ここでは、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４に由来するフソカイン（ＧＩＦＴ４）が、癌免疫療法剤であることが示される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで樹状細胞に分化するように単球を誘導するＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とは機能的に異なって、ＧＩＦＴ４は、適応Ｂ細胞免疫応答およびその結果として生ずるＴ細胞免疫を直接誘発する。
【００３６】
ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＬ−４  フソカイン（ＧＩＦＴ４）
図１に、ＧＭ−ＣＳＦ配列およびマウスＩＬ−４配列を含む本開示の実施形態を提示し、図１１にヒト配列を提示する。特定の実施形態では、本開示は、アミノ酸配列がＭＧＬＴＳＱＬＬＰＰ  ＬＦＦＬＬＡＣＡＧＮ  ＦＶＨＧＨＫＣＤＩＴ  ＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳ  ＬＴＥＱＫＴＬＣＴＥ  ＬＴＶＴＤＩＦＡＡＳ  ＫＮＴＴＥＫＥＴＦＣ  ＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹ  ＳＨＨＥＫＤＴＲＣＬ  ＧＡＴＡＱＱＦＨＲＨ  ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬ  ＤＲＮＬＷＧＬＡＧＬ  ＮＳＣＰＶＫＥＡＮＱ  ＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬ  ＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫ  ＣＳＳ（配列番号３）であるアイソフォーム１、またはアミノ酸配列がＭＧＬＴＳＱＬＬＰＰ  ＬＦＦＬＬＡＣＡＧＮ  ＦＶＨＧＨＫＣＤＩＴ  ＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳ  ＬＴＥＱＫＮＴＴＥＫ  ＥＴＦＣＲＡＡＴＶＬ  ＲＱＦＹＳＨＨＥＫＤ  ＴＲＣＬＧＡＴＡＱＱ  ＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦ  ＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧ  ＬＡＧＬＮＳＣＰＶＫ  ＥＡＮＱＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬＫＴＩＭＲＥ  ＫＹＳＫＣＳＳ（配列番号４）であるアイソフォーム２などの組換えヒト形態のフソカインを企図する。アイソフォーム２は、変異体１に比較して、５’領域のインフレームエキソンを欠いており、その結果アイソフォーム１に比較して内部領域を欠くアイソフォーム（２）が得られる。
【００３７】
本開示は、リンカーアミノ酸を含む、ＧＭ−ＣＳＦ実体およびＩＬ−４実体それぞれまたはその両方のプロセシング前の完全長形態、ならびにプロセシングされた成熟形態、それらのフラグメント、および対立遺伝子変異体および非天然変異体を含めた変異体を含む融合タンパク質を包含する。集団中に存在し得る、ＧＭ−ＣＳＦ実体およびＩＬ−４実体の天然対立遺伝子変異体に加えて、当業者はさらに、ランダムなまたは標的化した突然変異誘発をもたらす古典的技術または組換え技術を用いる突然変異によって、変化（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸の１つまたは複数の欠失、付加、および／または置換）を導入することができることを認識するであろう。本開示で使用される適切な変異体は、典型的には、対応する天然サイトカインのアミノ酸配列と高度に相同性があるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、本開示の融合タンパク質で使用される変異体サイトカインのアミノ酸配列は、対応する天然配列、例えば配列番号３または４に対して、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、典型的には少なくとも約９５％、より典型的には少なくとも約９７％、さらにより典型的には少なくとも約９９％同一である。特定の実施形態では、このような天然配列は、ヒトＧＭ−ＣＳＦおよび／またはヒトＩＬ−４の配列である。
【００３８】
アミノ酸配列間または核酸配列間のパーセント同一性は、当業者に公知の標準的方法を用いて決定することができる。例えば、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントを決定するために、最適な比較を目的として配列をアライメントする。次いで、対応するアミノ酸位置にあるアミノ酸残基を比較する。最適なアライメントのために、アミノ酸配列の一方または両方にギャップ導入することができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められている場合に、これらの配列はその位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数であり、最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さが考慮される。２つの配列間の配列比較およびパーセント同一性および類似性の決定は、数学アルゴリズムを用いて行うことができる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８８，Ｅｄ  Ｌｅｓｋ  Ａ  Ｍ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，１９９３，Ｅｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．Ｗ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，１９９４，Ｅｄｓ  Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ｈ．Ｇ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，１９９１，Ｅｄｓ  Ｇｒｉｓｋｏｖ  Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。さらに、アミノ酸配列間および核酸配列間のパーセント同一性を決定するための種々のコンピュータプログラムが入手可能であり、例えば、ＧＣＧ（商標）プログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）、ＤＮＡｓｉｓ（商標）プログラム（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｂｒｕｎｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、またはＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）プログラム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．から入手可能）がある。
【００３９】
本開示で使用されるＧＭ−ＣＳＦ実体およびＩＬ−４実体の適切な変異体は、生物学的に活性であり、対応するポリペプチドに関して本明細書に記載される活性の少なくとも１つを保持する。典型的には、ポリペプチドの所与の機能は、例えば、変異体が細胞傷害性の減弱または生物活性の増強を示すように、ある程度正または負の影響を受けることがあるが、治療効果（例えば、抗腫瘍活性、腫瘍に誘導される免疫エネルギーのバイパス）は維持される。所与の機能にとって必須のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発など、当技術分野で公知の方法により同定することができる。相手／基質（例えば、受容体）を結合するために重要なアミノ酸も、結晶化、核磁気共鳴、および／または光親和性標識などの構造分析により決定することができる。得られる変異体について、上記に記載されるアッセイなどで生物活性を試験することができる。
【００４０】
例えば、あるクラスの機能的な変異体では、１つまたは複数のアミノ酸残基が保存的に置換される。「保存的なアミノ酸置換」とは、天然ポリペプチド中のアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当技術分野で定義されている。典型的には、置換は、相互の置き換えが、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの間；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの間；または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの間である場合に保存的と見なされる。あるいは、別の実施形態では、突然変異は、飽和突然変異誘発などによって、サイトカインコード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができ、結果として生ずる突然変異体を、本明細書に記載されるように、その生物活性についてスクリーニングして、少なくとも治療活性を保持する突然変異体を同定することができる。
【００４１】
本開示の融合タンパク質では、ＧＭ−ＣＳＦ実体とＩＬ−４実体を直接融合させることができるが、典型的には、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の連結のためにリンカーを用いる。リンカーの目的は、ＧＭ−ＣＳＦ実体およびＩＬ−４実体のそれぞれの正確な形成、フォールディング、および／または機能化を可能にすることである。この目的を達成するために、リンカーは十分な柔軟性と十分な長さをもつべきである。典型的には、翻訳の停止を促し、それによってＧＭ−ＣＳＦ実体およびＩＬ−４実体の独立したフォールディングを促すようにリンカーのコード配列を選択することができる。当業者は、本開示に従って適切なリンカーを設計することができるであろう。しかしながら、本開示は、用いるリンカー配列の形態、サイズ、または数により限定されるものではない。選択したリンカー配列の複数コピーをＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の間に挿入してもよい。リンカー配列に対する唯一の必要条件は、融合タンパク質の個々の実体のフォールディングおよび／または機能化を、逆にそれが機能的に妨害しないことである。例えば、適切なリンカーは、１〜５個または５〜５０個のアミノ酸長であり、グリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アラニン、およびプロリンなどのアミノ酸を含み得る（例えば、Ｗｉｅｄｅｒｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｃｅｌｌ  ５４，８４１；Ｄｅｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，８５２；Ｓｔｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．２，１５８２；Ａｕｍａｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２６２，８２を参照のこと）。セリンおよびグリシン残基を含む反復配列が本開示の文脈では典型的である。適切なリンカーの具体例は、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＳ）（配列番号５）の２または３以上（例えば、最大８以上）のコピーからなる。本開示がこれらの特定のリンカーの使用に限定されるものではないことは明らかであろう。
【００４２】
本開示にはさらに、配列番号１〜６に列挙された任意のアミノ酸配列の全部または一部に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％相同であるか、または一層良好な１００％相同（同一）であるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、または代替的にそれからなる融合タンパク質が含まれる。
【００４３】
本開示の文脈では、タンパク質は、そのタンパク質が列挙されたアミノ酸配列以外のいかなるアミノ酸も含有しない場合に、そのアミノ酸配列「からなる」。タンパク質は、アミノ酸配列が、ほんの少数の追加のアミノ酸残基、典型的には約１〜約５０個程度の追加の残基を伴って存在する場合に、そのアミノ酸配列「から本質的になる」。タンパク質は、アミノ酸配列がそのタンパク質の最終（すなわち、成熟）アミノ酸配列の少なくとも一部である場合に、そのアミノ酸配列を「含む」。このようなタンパク質は、数個から最大数百個の追加のアミノ酸残基を有し得る。このような追加のアミノ酸残基は、融合体に含有される実体のそれぞれもしくは両方と、または異種のアミノ酸／ペプチド配列（それぞれの実体に関して異種）と天然に結合していることがある。このような追加のアミノ酸残基は、前駆体から成熟形態への融合タンパク質のプロセシングにおいて役割を果たす可能性があり、タンパク質輸送を容易にするか、タンパク質半減期を延長または短縮するか、あるいはとりわけ、アッセイまたは産生のために、融合タンパク質の操作を容易にする可能性がある。典型的には、本開示の融合タンパク質は、宿主細胞または生物における分泌を促進するために、ＮＨ２末端にシグナルペプチドを含む。例えば、内因性シグナルペプチド（すなわち、前記融合体のＮＨ２末端に存在するサイトカイン中に天然に存在する）を使用することができ、または代替的に適切な異種（問題のサイトカインに関して）シグナルペプチド配列を、融合体のＮＨ２末端に存在するサイトカイン実体に付加するか、もしくは内因性のものの代わりに挿入することができる。
【００４４】
本開示の文脈では、本開示の融合タンパク質は、任意の起源、すなわち任意のヒトまたは動物源（イヌ、鳥類、ウシ、マウス、ヒツジ、ネコ、ブタ等）のサイトカイン実体を含み得る。「キメラ」融合タンパク質も本開示により包含されるが（例えば、一方のサイトカイン実体がヒト起源であり、他方が動物源由来である）、典型的には、各実体は同じ起源である（例えば両方ともヒト由来）。
【００４５】
本開示の融合タンパク質は、標準的技術により作製することができる。本開示の融合タンパク質に含まれるサイトカインのそれぞれのポリペプチド配列およびＤＮＡ配列は、組換え技術または化学合成技術による、その発現を得るための方法と同様に、当技術分野で公開されている。別の実施形態では、融合体をコードするＤＮＡ配列は、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む従来の技術によって合成することができる。次いで、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ベクター中に構築し、宿主細胞または生物における融合タンパク質の発現を制御することができる調節領域に作動可能に連結することができる。例えば、ウイルスベクターまたはプラスミド中にＤＮＡ配列をクローニングするための技術は、当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，２００１，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．）。本開示の融合タンパク質は、それを発現するように形質転換された細胞から精製することができる。
【００４６】
本開示はまた、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。本開示の文脈内では、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチドアナログを用いて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログのいずれも範囲内である（ヌクレオチドアナログの例として、米国特許第５，５２５，７１１号明細書および米国特許第４，７１１，９５５号明細書を参照のこと）。ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在する場合、ポリマー構築の前に施すことも、その後に施すことも可能である。ヌクレオチド配列はまた、非ヌクレオチドエレメントを介在させることができる。核酸分子は、標識成分との結合などによって、重合後にさらに修飾することができる。核酸、特にＤＮＡは、二本鎖または一本鎖とすることができるが、典型的には二本鎖ＤＮＡである。一本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）とすることも、非コード鎖（アンチセンス鎖）とすることも可能である。
【００４７】
本開示の核酸分子は、これに限定されるものではないが、融合タンパク質のみをコードする配列を含むが、追加の非コード配列、例えば転写、ｍＲＮＡのプロセシング（スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合、およびｍＲＮＡの安定性において役割を果たすイントロンならびに非コード５’および３’配列も含むことができる。例えば、本開示の核酸分子は、天然に隣接するか（すなわち、５’および３’末端にある配列）、またはＧＭ−ＣＳＦ実体およびＩＬ−４実体をコードするゲノムＤＮＡ内に存在する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。
【００４８】
典型的な実施形態によると、本開示は、配列番号１〜６に示す任意のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、典型的には少なくとも約９７％、より典型的には少なくとも約９９％相同であるか、またはより一層典型的には１００％相同である、融合タンパク質をコードするアミノ酸配列の全部または一部をコードするヌクレオチド配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、または代替的にそれからなる核酸分子を提供する。
【００４９】
別の実施形態では、本開示の核酸分子は、配列番号１〜６の何れかに示す融合タンパク質をコードする核酸配列の全部または一部の相補鎖である核酸分子を含む。本開示のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、ストリンジェント条件下で融合体をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それによって安定な二本鎖を形成することができるほど十分に相補的である核酸分子である。このようなストリンジェント条件は、当業者に公知である。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の非限定例は、約４５Ｃにおける、６倍塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーションと、その後の５０〜６５Ｃにおける、０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回または複数回の洗浄である。一実施形態では、本開示は、本開示の核酸分子に対するアンチセンス核酸に関する。アンチセンス核酸は、全コード鎖に、またはその一部のみに相補的にすることができる。
【００５０】
さらに別の実施形態では、本開示は、本開示の上記核酸分子の変異体、例えば上記に記載される融合タンパク質の変異体をコードする核酸分子を包含する。本開示により包含される変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的技術によって、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、および／または欠失をヌクレオチド配列に導入することによって作製することができる。突然変異誘発後、本明細書に記載されるように、変異核酸分子を組換え発現させることができ、得られるタンパク質の活性を、例えば本明細書に記載されるアッセイを用いて測定することができる。あるいは、特定の宿主細胞にとって優先的なコドン使用頻度になるように、本開示の核酸分子を改変することができる（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，２１１１−２１１８）。本開示はさらに、遺伝子コードの縮重により異なるが、例えば配列番号１〜６に示されるものの何れかと同じ融合タンパク質をコードする核酸分子を包含する。
【００５１】
本開示の別の実施形態は、本開示の核酸分子のフラグメント、例えば制限エンドヌクレアーゼおよびＰＣＲにより生成するフラグメントに関する。このようなフラグメントは、プローブ、プライマー、または融合タンパク質の免疫原性部分をコードするフラグメントとして用いることができる。
【００５２】
本開示の核酸分子は、本明細書に提供される配列情報を用いて作製することができる。ＧＭ−ＣＳＦ実体およびＩＬ−４実体のそれぞれをコードする核酸は、分子生物学技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１に記載されるもの）または当技術分野で利用可能な配列データに基づいた標準的ＰＣＲ増幅技術（本開示の融合タンパク質に関して上記に提供されるもの、または実施例部分に提供されるもの）によって、鋳型および適切なプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーとして、ｃＤＮＡまたは代替的にゲノムＤＮＡを用いてクローニングまたは増幅することができる。ＩＬ−４配列へのＧＭ−ＣＳＦ配列の融合は、以下の実施例に記載されるように、または従来の技術によって行うことができる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４をコードする配列は、直接またはペプチドリンカーをコードする配列を介して、インフレームで相互に連結することができる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする配列はまた、ＩＬ−４をコードする配列を含有するベクターに直接挿入することができ、その逆も可能である。あるいは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４をコードする配列のＰＣＲ増幅は、その後にアニーリングおよび再増幅を行って融合遺伝子配列を生成させることができる相補的なオーバーハングを生じさせるプライマーを用いて行なうことができる。
【００５３】
ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の融合サイトカインは、Ｂ細胞の殺腫瘍性エフェクターへの変換を誘発する
本明細書の試験から、ＧＩＦＴ４フソカインがナイーブＢ細胞を殺腫瘍性エフェクターに変換する強力な能力を有していることが示される。宿主のＢ細胞免疫機能に対するその潜在的な影響力を考慮すると、ＧＩＦＴ４フソカインは、例えばＢ細胞ベースの癌免疫療法を用いる多種多様な癌に対する免疫療法についての戦略を提示する。
【００５４】
特定の実施形態では、本開示は、癌免疫療法剤としてのフソカインＧＩＦＴ４（ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４に由来する）の使用を企図する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで樹状細胞に分化するように単球を誘導するＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とは機能的に異なって、ＧＩＦＴ４は、適応Ｂ細胞免疫応答およびその結果として生ずるＴ細胞免疫を直接誘発する。Ｇｌｕｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，１９９７，３：１８７−１９６を参照されたい。ＧＩＦＴ４フソカインは、腫瘍に対する強固なＢ細胞免疫を誘発する強力なアクチベーターである。ユニークなことには、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＶＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびケモカインＣＣＬ３などの一連の自然サイトカインを分泌するが、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γは分泌しない。プロＴｈ１サイトカインのＩＬ−１２、ＩＬ−１β、およびＩＬ−６は、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生を促進し、宿主の抗腫瘍免疫を増強する。ＧＩＦＴ４の親分子であるＩＬ−４の刺激のみでは、Ｂ細胞においてＳＴＳＴ６の強力なリン酸化が誘導されるが、他のＳＴＡＴのリン酸化はほとんど起こらないかまたはわずかである。しかしながら、ＧＩＦＴ４タンパク質は、Ｂ細胞と結合すると同時にＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、およびＳＴＡＴ６の過剰リン酸化を誘発する機能を獲得していることを示し、前者２つのＳＴＡＴは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１を含む、他のＩＬ−２共通γ鎖ファミリーメンバーに対する主要な下流シグナル伝達経路である。ＳＴＡＴ３のリン酸化は、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の産生に関連する。ＳＴＡＴリン酸化が正常なＢ細胞によるＣＣＬ３分泌をもたらすという報告はない；しかしながら、ＢＣＲ刺激は、ケモカインＣＣＬ３を産生するように白血病性Ｂ細胞を活性化する。Ｍｉｙａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，１０２：１２３６−１２４１を参照されたい。ＧＩＦＴ４タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦ成分とＩＬ−４成分の両方の機能的活性を保有するが、ＳＴＡＴのリン酸化がＧＩＦＴ４−Ｂ細胞によるＧＭ−ＣＳＦおよびＣＣＬ３の分泌をもたらす機序は不明のままである。
【００５５】
ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞は、表面マーカーＢ２２０、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩｇＭを発現するが、ＣＤ２３を発現しないユニークな表現型を有する。ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞は多量のＧＭ−ＣＳＦを分泌する。多量のＧＭ−ＣＳＦを分泌するＩＲＡ−Ｂ細胞と異なり（Ｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３５：５９７−６０１を参照のこと）、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞は、抗原提示細胞に典型的なマーカーであるＣＤ８０＋ＣＤ８６＋を示す。ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞の表現型はまた、Ｂ１細胞およびＢ２細胞とは異なっており、Ｂ１細胞はＢ２２０ｌｏｗであり、またＢ２細胞はＣＤ２３＋である。ＩＲＡ  Ｂ細胞と異なり、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞はまた、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＶＥＦＧ、および大量のＣＣＬ３を分泌するが、ＩＲＡ  Ｂ細胞によりユニークに産生されるＩＬ−３を分泌しない。本発明者らが知る限りでは、これは、活性化正常Ｂ細胞がケモカインＣＣＬ３を産生できるという最初の報告である。したがって、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞は、ＩＦＮ−γ媒介Ｔ細胞抗腫瘍免疫を増強し得る明確なサイトカイン分泌プロファイルを示すが、ＩＲＡ−Ｂ細胞と共通の表面マーカーも一部共有する。顕著なことには、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞は、ＢＣＲ架橋と同時に、ＩｇＭからＩｇＧにアイソタイプスイッチする可塑性を有し、ＩＬ−４および抗マウスＩｇＭ処理Ｂ細胞と類似している。したがって、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞は、種々の癌および可能性のある感染性病原体に対する自然エフェクターと適応レスポンダーの両方として機能することができるであろう。
【００５６】
ＧＩＦＴ４フソカインは、メラノーマのマウスモデルにおいて、これまでに記載されていないＢ細胞依存性抗腫瘍免疫を誘発する。Ｂ細胞は、Ｂ細胞のサイトカイン分泌、抗体産生、および細胞間相互作用を介する、宿主免疫の増強または抑制の何れかの免疫活性からなる２つの側面を有する、Ｂリンパ球の不均一なサブポピュレーションを含む。初期の研究から、Ｂ細胞は、ＩＬ−１０媒介経路を介するＴ細胞殺腫瘍活性の阻害によって、腫瘍に対する宿主免疫応答を抑制することがわかった。しかしながら、新たに出現した証拠では、Ｂ細胞は抗腫瘍免疫において重要な予防的役割を果たすことが示唆されている。本明細書に開示される試験から、ＧＩＦＴ４がＢ細胞により惹起される抗メラノーマ免疫応答を誘導することが実証された。
【００５７】
ＧＩＦＴ４タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで投与すると、ＧＭ−ＣＳＦ分泌ＩＲＡ様Ｂ細胞を含む、網羅的なＢ細胞の増殖がもたらされるが、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞はＩＬ−１０を産生しないので、ＩＬ−１０産生調節性Ｂ細胞は増殖しない。ＧＭ−ＣＳＦは、抗原活性化細胞傷害性Ｔ細胞の増殖を亢進することが示されており、またケモカインＣＣＬ３は、抗腫瘍免疫におけるＣＣＲ５＋Ｔ細胞の動員にとって重要であるので、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＣＬ３を産生するＧＩＦＴ４−Ｂ細胞が腫瘍に対するＴ細胞免疫を促進する強力な効力を有することが示唆される。加えて、ＶＥＧＦ産生Ｂ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで樹状細胞の遊走を促進する。ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞をＴ細胞と共培養すると、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生が顕著に増大し、それによって、ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞応答の大きさが増大することにより、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞が細胞性免疫に能動的に関与することがさらに確認される。正常なＴ細胞機能を保有するＢ細胞欠損マウスにおいてＢ１６Ｆ０メラノーマ腫瘍が強固に増殖することにより、ＧＩＦＴ４誘発抗腫瘍免疫がＢ細胞依存性であることが確認される。Ｂ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞に直接活動を起こさせ、持続的な抗腫瘍免疫を確立させる真の抗原提示細胞として作用できる事実は、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞が、腫瘍に対するＴ細胞免疫を誘発する樹状細胞のように機能することを強く示唆する。
【００５８】
抗原特異的抗体産生は、感染性病原体および癌に対するＢエフェクター細胞の重要な防護用武器である。ＩＬ−４は、抗原−ＢＣＲ連結反応に際して、記憶Ｂ細胞の生成および増殖に関与することが示されている；しかしながら、ＩＬ−４刺激は、形質細胞の数を増大させることができなかった。Ｃｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５９：３７５７−３７６６を参照されたい。ＴＬＲリガンドであるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよびＬＰＳは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで記憶Ｂ細胞を活性化し、形質細胞に分化させることができるが、ｉｎ  ｖｉｖｏではその能力が失われている。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＩＦＴ４刺激による抗原特異的形質細胞の劇的な増殖および抗原特異的抗体産生の増強は、ＧＩＦＴ４タンパク質がＢ細胞の抗腫瘍体液性応答に対する強力な刺激因子であることを示す。メラノーママウスモデルでは、ＧＩＦＴ４分泌Ｂ１６Ｆ０細胞の免疫処置は、免疫処置されたマウスにおいて腫瘍特異的抗体の分泌をもたらし、これによりＧＩＦＴ４が抗メラノーマ特異的抗体を誘導する強力なアジュバントであることが示唆される。Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４細胞で免疫処置されたＢ６マウスにおいてメラノーマ腫瘍増殖が完全に阻害されることにより、ＧＩＦＴ４が獲得抗腫瘍Ｂ細胞免疫を誘発することが示される。Ｆｃ受容体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害経路（ＡＤＣＣ）を介して腫瘍に対する細胞傷害性抗体の作用に実質的に寄与する。マウスがＦｃγ受容体を欠損するとＧＩＦＴ４分泌Ｂ１６Ｆ０腫瘍増殖が防止できなかったというデータから、ＧＩＦＴ４誘発Ｂ細胞抗メラノーマ免疫へのＡＤＣＣの関与がさらに明確になる。予め確立されたメラノーマモデルでは、腫瘍でプライミングされたＢ細胞の養子移入によりＢ細胞欠損マウスでのメラノーマ増殖が阻害されており、これにより、ＧＩＦＴ４の抗メラノーマ効果が適応Ｂ細胞活性に依存することがさらに確認される。
【００５９】
医薬組成物
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」という言葉は、薬務管理と適合する、あらゆる担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤等を含むことを意図する。
【００６０】
適切には、本開示の医薬組成物は、それをヒトまたは動物の生体に注射することによって送達するのに適した担体および／または希釈剤を含む。このような担体および／または希釈剤は、用いる投与量および濃度において無毒である。それは、単回投与もしくは複数回投与形態の何れかにおける非経口投与用組成物、または持続的または間欠的点滴による直接注入用組成物を製剤化するために通常用いられるものから選択される。それは、典型的には、等張、低張、または弱高張であり、糖、多価アルコール、および等張生理食塩水などにより提供される比較的低いイオン強度を有する。代表的な例としては、滅菌水、生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム）、静菌水、リンゲル液、グルコースまたはサッカロース溶液、ハンクス液、および他の生理学的平衡塩類水溶液が挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓの最新版を参照のこと）。本開示の組成物のｐＨは、ヒトまたは動物での使用に適するように、典型的には、生理学的ｐＨまたは弱塩基性のｐＨに（約ｐＨ８〜約ｐＨ９の間、特にｐＨ８．５が好ましい）、適切に調節または緩衝化される。適切な緩衝液としては、リン酸緩衝液（例えば、ＰＢＳ）、重炭酸緩衝液、および／またはトリス緩衝液が挙げられる。典型的な組成物は、１Ｍのサッカロース、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５４ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ８０、１０ｍＭのトリスｐＨ８．５で製剤化される。別の典型的な組成物は、１０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．２、および１５０ｍＭのＮａＣｌで製剤化される。
【００６１】
本開示の組成物は、種々の形態、例えば固体（例えば、粉末、凍結乾燥形態）または液体（例えば、水溶液）にすることができる。固体組成物の場合には、典型的な調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性薬剤と任意の所望の成分の予め滅菌濾過された溶液から、その粉末が得られる。このような溶液は、所望により、注射直前に滅菌水の添加によりすぐに再構成できる滅菌アンプル中に保存することができる。
【００６２】
噴霧用製剤またはエアロゾル用製剤もまた、本開示の一部を形成する。鼻腔内投与の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、適切な噴霧剤、例えば二酸化炭素またはネブライザーなどのガスを含有する圧力容器またはディスペンサーから、組成物の液滴、スプレー、または乾燥粉末形態を、治療される個体の鼻咽腔に投与することが挙げられる（例えば、国際公開第９５／１１６６４号パンフレットを参照のこと）。経口投与用の胃抵抗性カプセル剤および顆粒剤などの腸溶製剤、直腸または膣投与用の坐剤もまた、本開示の形態の一部を形成する。非経口投与のために、組成物はまた、粘膜の孔径を増大させる吸収促進剤を含むことができる。そのような吸収促進剤としては、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、ジメチル−β−サイクロデキストリン、ラウロイル−１−リゾホスファチジルコリン、および粘膜のリン脂質ドメインに構造類似性がある他の物質が挙げられる。
【００６３】
組成物はまた、例えば、製剤のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色、無菌性、安定性、溶解速度の変更または維持、ヒトまたは動物の生体への放出または吸収の変更または維持を含む、所望の薬学的または薬力学的特性を提供する他の薬学的に許容される賦形剤を含有することができる。例えば、ポリエチレングリコールなどのポリマーを、溶解性、安定性、半減期、および他の薬学的に有利な特性のうちの所望の特性を得るために用いることができる（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｇ．４，１６９−１７３；Ｂｕｒｎｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．５１，２１０−２１８）。安定化成分の代表的な例としては、ポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびそれらの組合せが挙げられる。プラスミドベースの組成物に特に適した他の安定化成分としては、ヒアルロニダーゼ（国際公開第９８／５３８５３号パンフレットに記載されるように、宿主細胞の細胞外マトリックスを不安定化すると考えられている）、クロロキン、プロトン性化合物、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、１−メチルＬ−２−ピロリドン、またはそれらの誘導体、非プロトン性化合物、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルフォラン、ジメチル−ホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、アセトニトリル（欧州特許第８９０  ３６２号明細書を参照のこと）、ヌクレアーゼ阻害剤、例えばアクチンＧ（国際公開第９９／５６７８４号パンフレット）、およびカチオン塩、例えばマグネシウム（Ｍｇ２＋）（欧州特許第９９８  ９４５号明細書）およびリチウム（Ｌｉ＋）（国際公開第０１／４７５６３号パンフレット）、ならびにそれらの任意の誘導体が挙げられる。本開示の組成物中のカチオン塩の量は、典型的には、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、さらにより典型的には、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である。粘性増強剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、およびデキストランが挙げられる。組成物はまた、特定の器官の血管障壁または膜を横切って浸透または輸送するのを促進する、当技術分野で公知の物質を含有することができる（例えば、トランスフェリンレセプターに対する抗体；Ｆｒｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，３７３−３７７）。ポリリジンとラクトースのゲル複合体（Ｍｉｄｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２１，８７１−８７８）、またはポロキサマー４０７（Ｐａｓｔｏｒｅ，１９９４，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０，１−５１７）は、動脈細胞への投与を容易にするために用いることができる。
【００６４】
本開示の組成物はまた、ヒトにおける全身用途または粘膜用途に適した１つまたは複数のアジュバントを含むことができる。有用なアジュバントの代表的な例としては、限定されるものではないが、ミョウバン、鉱油エマルジョン、例えばフロイント完全および不完全アジュバント、リポ多糖またはその誘導体（Ｒｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．，ＮＹ，ｐ４０７−４１９）、サポニン、例えばＱＳ２１（Ｓｕｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，４９３１−４９３９；国際公開第９８／５６４１５号パンフレット）、エスシン、ジギトニン、カスミソウまたはアカザキノアのサポニン、およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが挙げられる。あるいは、本開示の組成物は、キトサンまたは他のポリカチオン性ポリマーから構成される従来のワクチンビヒクル、ポリラクチドおよびポリラクチド−ｃｏ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリクス、多糖または化学修飾された多糖から構成される粒子、ならびに脂質ベースの粒子等と共に製剤化することができる。組成物はまた、コレステロールの存在下で製剤化して、リポソームなどの粒子構造を形成させることができる。
【００６５】
組成物は、特に動物またはヒトの生体における免疫応答を増強するために有効な量で患者に投与することができる。本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに十分な量を指す。例えば、免疫応答を増強するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、例えばそれによって癌患者に抗腫瘍応答の進展（例えば、組成物が注入された腫瘍および／または遠位の腫瘍のサイズの縮小または退縮）をもたらすのに必要な量とすることができよう。適切な投与量は、特定の活性薬剤の薬力学的特性、宿主生物の年齢、健康状態、および体重などの既知の要因；治療される病態、症状の性質および程度、併用治療の種類、治療の頻度、予防もしくは治療の必要性、および／または所望の効果に応じて異なり得る。投与量はまた、選択された特定の投与経路に応じて計算されることになる。治療にとって適切な投与量を決定するために必要な計算は、関連する状況を考慮して、専門家によりルーチン的にさらに精密化される。力価は従来の技術により決定することができる。ベクタープラスミドに基づいた組成物は、１μｇ〜１００ｍｇの間、有利には１０μｇ〜１０ｍｇの間、典型的には１００μｇ〜１ｍｇの間の用量の形態で製剤化することができる。タンパク質に基づいた組成物は、１０ｎｇ〜１００ｍｇの間の用量の形態で製剤化することができる。典型的な用量は、ｋｇ体重当たり約１μｇ〜約１０ｍｇの治療用タンパク質である。投与は、単回用量または特定の時間間隔後の１回または数回の反復用量で行うことができる。典型的な一実施形態では、本開示の組成物は、従来の注射器および注射針を用いる注射、または固体組成物の（国際公開第９９／２７９６１号パンフレット）の弾道送達のために設計された器具、または注射針のない圧力液体ジェット器具（米国特許第４，５９６，５５６号明細書；米国特許第５，９９３，４１２号明細書）により投与される。
【００６６】
本開示の組成物は、ガラスまたはプラスチックからなるアンプル、ディスポーザブル注射器、または複数回用量バイアル中に封入することができる。あらゆる場合に、組成物は、滅菌状態でなければならず、また容易に注射可能（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）になる程流動的であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、また細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。滅菌注射用溶液は、上記に列挙した成分の１つまたは成分の組合せと共に、必要量の活性薬剤（例えば、融合タンパク質または感染性粒子）を組み込み、次いで濾過滅菌することにより調製することができる。
【００６７】
使用方法
本開示の医薬組成物は、遺伝子疾患、先天性疾患、および感染症（例えば、ウイルス感染および／または細菌感染）、癌、免疫不全症、および自己免疫疾患などの後天性疾患を含む、種々の疾患および病的状態を治療または予防する方法で用いることができる。したがって、本開示はまた、このような疾患、特に癌または感染症を治療または予防することを目的とする薬剤を調製するための、本開示の融合タンパク質、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞、または組成物の使用を包含する。
【００６８】
本開示の組成物は、特に、癌に関連した障害、病態、または疾患の予防的または治療的処置を意図するものである。「癌」という用語は、散在性または限局性腫瘍、転移、癌性ポリープ、および前癌病変（例えば、異形性）を含むいかなる癌性病態も、また望まれない細胞増殖に起因する疾患も包含する。種々の腫瘍を、本明細書に記載される方法による治療に対して選択することができる。一般には、固形腫瘍が典型的である。本開示の文脈で企図される癌としては、限定されるものではないが、膠芽腫、肉腫、メラノーマ、肥満細胞腫、癌腫、ならびに乳癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌（特にパピローマウイルスにより誘導されるもの）、肺癌（例えば、大細胞、小細胞、扁平上皮、および腺癌）、腎癌、膀胱癌、肝癌、結腸癌、肛門癌、膵臓癌、胃癌、消化器癌、口腔癌、喉頭癌、脳およびＣＮＳ癌、皮膚癌（例えば、メラノーマおよび非メラノーマ）、血液癌（リンパ腫、白血病、特に固体の塊で発症した場合）、骨癌、網膜芽細胞腫、および甲状腺癌が挙げられる。本開示の使用の典型的な一実施形態では、組成物は固形腫瘍の中にまたはその近傍に投与される。
【００６９】
特定の実施形態では、本開示は、自己免疫増強療法（ＡＩＥＴ）における本明細書に開示されるコンジュゲートの使用を企図する。ＡＩＥＴは、免疫細胞または癌細胞、例えばリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、樹状細胞（ＤＣ）を、被験体の体内から取り出し、それが活性化されて癌に対するその抵抗性が強化されるまで培養および処理し、次いでその細胞を体内に戻す治療方法である。免疫系の細胞、抗体、および器官は、腫瘍細胞に対して体内を保護し防御するように働く。特定の実施形態では、本開示は、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートと収集した細胞を混合して、細胞を活性化することを企図する。特定の実施形態では、本開示は、その細胞を被験体に投与して戻した時に、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートを投与することを企図する。
【００７０】
特定の実施形態では、本開示は、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートと併用して、シプロイセルＴ（ＰＲＯＶＥＮＧＥ）を投与することを企図する。ＰＲＯＶＥＮＧＥは、ＧＭ−ＣＳＦに連結された、前立腺癌組織で発現される抗原である前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）からなる組換えヒトタンパク質ＰＡＰ−ＧＭ−ＣＳＦとの培養期間中に活性化された、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む自己末梢血単核細胞からなる。特定の実施形態では、本開示は、ＰＡＰ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−４を含むコンジュゲートに関し、末梢血単核細胞中の抗原提示細胞の活性化における使用に関する。被験体の末梢血単核細胞は、注入前の標準的な白血球搬出手順によって得ることができる。培養期間中に、組換え抗原は抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合し、それによりプロセシングされ得る。組換え抗原は、ＰＡＰに免疫応答を向けさせると考えられる。注入される産物には、抗原提示細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびその他の細胞が含有されると考えられる。典型的には、各投与には、ＰＡＰ−ＧＭ−ＣＳＦまたはＰＡＰ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＬ−４で活性化された５０００万個を超える自己ＣＤ５４＋細胞が含有される。この効力は、典型的には、ＰＡＰ−ＧＭ−ＣＳＦまたはＰＡＰ−ＣＭ−ＣＳＦ−ＩＬ−４との培養後のＡＰＣ表面上にある、ＩＣＡＭ−１としても知られるＣＤ５４分子の発現増大を測定することにより評価される。ＣＤ５４は、ＡＰＣとＴ細胞の間の免疫相互作用に役割を果たす細胞表面分子であり、免疫細胞活性化のマーカーと見なされている。
【００７１】
特定の実施形態では、本開示は、癌を治療するための方法であって、ＰＳＡ、ＰＡＰなどの腫瘍関連抗原／癌マーカーをコードし、また場合によっては、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、白血球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３）から選択される他の共刺激分子をコードするベクターと併用して、本明細書に開示される任意のＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートを免疫アジュバントとして投与することを含む方法を企図する。癌の治療のために企図される他の実施形態は、本明細書に開示されるＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートをコードし、また場合によっては、腫瘍関連抗原／癌マーカーをさらにコードし、また場合によっては他の共刺激分子をコードするベクターの有効量を被験体に投与することを含む。ＰＲＯＳＴＶＡＣは、共刺激分子と、ワクチン標的としてのＰＳＡとをコードする組換えベクターである。プラスミドＤＮＡは、パッキング細胞株を用いて、ワクチニアウイルスまたは鶏痘ウイルスの何れかに組み込まれる。患者は、ワクチニア初回免疫処置された後、一連の鶏痘ベースの追加免疫を受ける。
【００７２】
特定の実施形態では、本開示は、癌を治療する方法であって、抗ＣＴＬＡ−４抗体と併用して、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートを投与することを含む方法に関する。抗ＣＴＬＡ−４抗体を、本明細書に開示される任意の方法と組み合わせて投与することを企図する。抗ＣＴＬＡ−４抗体は、Ｔ細胞表面上のＣＴＬＡ−４表面糖タンパク質に結合し、免疫自己調節を最小限に抑え、そして抗腫瘍活性を増強する可能性があると考えられている。抗原提示細胞上のＢ７分子と腫瘍特異的Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４との間の相互作用は阻害的である。したがって、ＣＴＬＡ−４の関与により、そのようなＴ細胞の増殖および機能が負に調節される。特定の条件下では、モノクローナル抗体（イピリムマブまたはトレミリムマブ（ｔｒｅｍｉｌｉｍｕｍａｂ））によるＣＴＬＡ−４の遮断は、Ｔ細胞機能を回復させる。
【００７３】
癌の治療のために企図される他の実施形態は、被験体由来の癌細胞の抽出物を利用し、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）に繋留された、Ｂ７−１およびＢ７−２などの共刺激分子を、場合によってはＧＰＩに繋留されたＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートと一緒に腫瘍細胞膜に組み込む方法と、免疫応答を誘発するために、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−７のコンジュゲートと併用して、この改変細胞を被験体に投与することを含む。例えば、ＭｃＨｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９９，５９（１０）：２４３３−７；Ｐｏｌｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，３８（１１）：８０３−１６；およびＮａｇａｒａｊａｎ  ＆  Ｓｅｌｖａｒａｊ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００２，６２（１０）：２８６９−７４を参照されたい。
【００７４】
他の病的な疾患および状態、特に真菌、細菌、原虫、およびウイルスなどの病原体による感染に関連する感染症もまた、本開示の文脈において企図される。ウイルス病原体の代表的な例としては、限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２）、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびＥ型肝炎ウイルス）、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）、パラミクソウイルス、コロナウイルス；呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）、インフルエンザウイルス、ならびに典型的にはヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ−６、１１、１６、１８、３１、３３）が挙げられる。細菌病原体の代表的な例としては、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））；ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（例えば、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂ．パラパータシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、およびＢ．ブロンキセプチカ（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ））、マイコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、癩菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ヨーネ菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ））；レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））；エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、腸管毒性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、腸管病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））；ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）（例えば、Ｖ．コレラ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ））；シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）（例えば、Ｓ．ソネイ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、Ｓ．フレキシネル（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉ））；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｓ．チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、Ｓ．パラチフィ（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓ．コレレスイス（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、腸炎菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ））；リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））；ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））；スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））；エンテロコッカス属（例えば、フェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、フェシウム菌（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ））、クロストリジウム属（例えば、Ｃ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））；バチルス属（例えば、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ））；コリネバクテリウム属（例えば、ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、およびクラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（例えば、トラコーマ病原体（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ））が挙げられる。寄生虫病原体の代表的な例としては、プラスモジウム属（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ））、トキソプラズマ属（例えば、トキソプラズマ原虫（Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ））、リーシュマニア属（Ｌｅｓｈｍａｎｉａ）（例えば、森林型熱帯リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ））、ニューモシスティス属（例えば、Ｐ．カリニ（Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ））、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）（例えば、膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ））、シソストーマ属（Ｓｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ）（例えば、Ｓ．マンソニ（Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ））が挙げられる。真菌の代表的な例としては、カンジダ属（例えば、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ））およびアスペルギルス属が挙げられる。
【００７５】
自己免疫疾患の例としては、以下に限定されるものではないが、多発性硬化症（ＭＳ）、強皮症、関節リウマチ、自己免疫性肝炎、真性糖尿病、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、多発性筋炎／皮膚筋炎、橋本病、自己免疫性血球減少症、シェーグレン症候群、血管炎症候群、および薬剤誘発性自己免疫疾患（例えば、薬剤誘発性エリテマトーデス）が挙げられる。
【００７６】
さらに、上記に記述されるように、本開示の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性粒子、宿主細胞、および／または組成物は、特定の抗原に対する、動物またはヒトの生体免疫応答を増強するアジュバントとして用いることができる。本開示のこの特定の使用を、例えば免疫療法を目的として、上記に定義される１つまたは複数の導入遺伝子または導入遺伝子産物と組み合わせて行うことができる。典型的には、活性薬剤（例えば、本開示の融合タンパク質、感染性粒子、または医薬組成物）は、１つまたは複数の導入遺伝子または導入遺伝子産物と組み合わせて投与される。したがって、典型的には、導入遺伝子産物（例えば、ウイルス抗原または自殺遺伝子産物）と融合タンパク質を組み合わせて含む組成物、ならびに導入遺伝子産物および融合タンパク質をコードするベクターまたはウイルス粒子も提供される。導入遺伝子および融合体をコードする核酸配列は、同じベクターから発現させても、同じ起源（例えば、アデノウイルスベクター）または異なる起源（例えば、特定の抗原をコードするＭＶＡベクターおよび融合タンパク質をコードするアデノウイルスベクター）を有し得る別々のベクターから発現させてもよい。融合タンパク質および導入遺伝子産物（またはそれらの各コードベクター）は、粘膜経路および／または全身経路を介して、宿主細胞または生物に同時にまたは逐次的に導入することができる。
【００７７】
併用療法
本明細書に開示される癌治療は、唯一の療法として適用することも、従来の外科手術または放射線療法、ホルモン療法、または化学療法を含むこともできる。そのような化学療法は、以下の抗腫瘍剤カテゴリの１つまたは複数を含む：
（ｉ）腫瘍内科学で使用される抗増殖性／抗悪性腫瘍薬およびそれらの組合せ、例えば、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、およびニトロソ尿素）；代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシルおよびゲムシタビンのようなフルオロピリミジン、テガフール、ラルチトレキセド、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素などの葉酸代謝拮抗剤）；抗腫瘍性抗生物質（例えば、アドリアマイシンのようなアントラサイクリン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシン）；有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンのようなビンカアルカロイド、ならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイド）；ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン、およびカンプトテシン）；ならびにプロテオソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ［Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）］）；ならびに薬剤アネグリリド（ａｎｅｇｒｉｌｉｄｅ）［Ａｇｒｙｌｉｎ（登録商標）］；ならびに薬剤アルファインターフェロン；
（ｉｉ）細胞増殖抑制剤、例えば、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、およびイドキシフェン（ｉｏｄｏｘｙｆｅｎｅ）、エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、抗アンドロゲン剤（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、および酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、リュープロレリン、およびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害薬（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール（ｖｏｒａｚｏｌｅ）、およびエキセメスタン）、ならびにフィナステリドなどの５α−レダクターゼ阻害剤；
（ｉｉｉ）癌細胞浸潤を阻害する薬剤（例えば、マリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤）；
（ｉｖ）増殖因子機能の阻害剤、例えば、そのような阻害剤には、増殖因子抗体、増殖因子受容体抗体、（例えば、抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブおよび抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体セツキシマブ）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、およびセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、例えば上皮増殖因子ファミリーの阻害剤、例えばＮ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ）、および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）などのＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、例えば血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤、および例えば肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤、例えばホスホチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤、および例えばマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１／２）の阻害剤、および例えばプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）の阻害剤、例えばダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）およびイマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標））などのＳｒｃチロシンキナーゼファミリーおよび／またはエーベルソン（ＡｂＩ）チロシンキナーゼファミリーの阻害剤；ならびにＳＴＡＴシグナル伝達を修飾する任意の薬剤；
（ｖ）血管新生阻害剤、例えば、血管内皮細胞増殖因子の効果を阻害するもの（例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ［Ａｖａｓｔｉｎ（商標）］）、および他の機序により作用する化合物（例えば、リノミド（ｌｉｎｏｍｉｄｅ）、インテグリンｏｃｖβ３機能の阻害剤、およびアンジオスタチン）；
（ｖｉ）コンブレタスタチンＡ４などの血管損傷剤；
（ｖｉｉ）アンチセンス療法、例えば、抗ＲＡＳアンチセンスなど、上記に列挙された標的に向けられたもの）；ならびに
（ｖｉｉｉ）免疫療法アプローチ、これには、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインによるトランスフェクションなど、被験体の腫瘍細胞の免疫原性を増大させるｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのアプローチ、Ｔ細胞エネルギーを低減するアプローチ、サイトカインをトランスフェクトされた樹状細胞などのトランスフェクトされた免疫細胞を用いるアプローチ、サイトカインをトランスフェクトされた腫瘍細胞株を用いるアプローチ、および抗イディオタイプの抗体を用いるアプローチ、および免疫調節薬サリドマイドおよびレナリドミド［Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標）］を用いるアプローチ。
【００７８】
併用療法はまた、第２の治療または化学療法剤の代替として、または補助として、放射線療法または外科手術と共に本開示の医薬組成物を使用することを企図する。
【００７９】
典型的な慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の化学療法計画としては、クロランブシルまたはシクロホスファミドとプレドニゾンまたはプレドニゾロンなどのコルチコステロイドとの併用化学療法が挙げられる。コルチコステロイドの使用には、免疫溶血性貧血症または免疫媒介血小板減少症などの関連自己免疫疾患の一部を抑制するさらなる利点がある。耐性の場合には、フルダラビン、ペントスタチン、またはクラドリビンなどのヌクレオシド薬による単剤治療が成功する可能性がある。患者は、同種異系骨髄移植または自己骨髄移植を考慮してもよい。特定の実施形態では、本開示は、クロラムブシル、シクロホスファミド、プレドニゾン、プレドニゾロン、フルダラビン、ペントスタチン、および／もしくはクラドリビン、またはそれらの組合せと併用して、本明細書に開示されるコンジュゲートを用いる併用治療を企図する。
【００８０】
急性リンパ芽球性白血病の治療は、典型的には、骨髄寛解をもたらす化学療法を含む。典型的なレジメンは、プレドニゾン、ビンクリスチン、およびアントラサイクリン薬、Ｌ−アスパラギナーゼ、またはシクロホスファミドを含む。他の選択肢には、ｔプレドニゾン（ｔｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびビンクリスチンが含まれる。いかなる残存する白血病も排除する強化療法または増強療法は、メトトレキセートおよび６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）などの代謝拮抗薬を含むことができる。特定の実施形態では、本開示は、ＣＯＰ、ＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＨＯＰ、イマチニブ、アレムツズマブ、ビンクリスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、またはシクロホスファミド、メトトレキセート、および／または６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）と組み合わせて、本明細書に開示されるコンジュゲートを用いる併用療法を企図する。ＣＯＰは、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾンまたはプレドニゾロン、ならびに場合によってはヒドロキシダウノルビシン（ＣＨＯＰ）および場合によってはリツキシマブ（Ｒ−ＣＨＯＰ）からなる、リンパ腫の治療に用いられる化学療法レジメンを指す。
【００８１】
一部の実施形態では、本開示は、第２の抗ウイルス剤と併用して、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートを投与することによる、ウイルス感染の治療に関する。さらなる実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートは、以下の薬剤の１つまたは複数と併用して投与される：アバカビル、アシクロビル、アシクロビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリゲン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビル、シドホビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドキスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インターフェロンＩＩＩ型、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩ型、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル、オセルタミビル（タミフル）、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、ラルテグラビル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン（ｐｙｒａｍｉｄｉｎｅ）、サキナビル、スタブジン、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル（バルトレックス）、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン（ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）、ザルシタビン、ザナミビル（リレンザ）、および／またはジドブジン（ＡＺＴ）。
【００８２】
抗ウイルス剤としては、以下に限定されるものではないが、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、インテグラーゼ阻害剤、侵入阻害剤（融合阻害剤）、成熟阻害剤、および逆転写酵素阻害剤（抗レトロウイルス剤）が挙げられる。抗ウイルス剤の併用は、ウイルス複製に対する複数の障害を生み出す、すなわち、子孫の数を低く抑えたままで、かつ優れた突然変異の可能性を低減する。服用される薬剤の１つに抵抗性を伝達する変異が生じた場合、他の薬剤がその変異の複製を抑制し続ける。例えば、抗レトロウイルス剤は単剤では、長期間ＨＩＶ感染を抑制することが実証されていない。これらの薬剤は、典型的には、効果を持続させるために併用して服用される。その結果、標準治療は、抗レトロウイルス剤を併用して用いることである。
【００８３】
逆転写ウイルスは、逆転写、すなわちＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの形成を用いて複製する。レトロウイルスは、多くの場合、逆転写により生成されるＤＮＡを宿主ゲノムへ組み込む。レトロウイルスは、逆転写酵素を阻害する抗ウイルス薬に感受性がある。特定の実施形態では、本開示は、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートと、ヌクレオシドおよびヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）および／または非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）などのレトロウイルス剤とを投与することにより、ウイルス感染を治療する方法に関する。ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤の例としては、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン、エンテカビル、アプリシタビンが挙げられる。ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤の例としては、テノホビルおよびアデフォビルが挙げられる。非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤の例としては、エファビレンツ、ネビラピン、デラビルジン、およびエトラビリンが挙げられる。
【００８４】
特定の実施形態では、本開示は、抗ウイルス薬、例えば２’，３’−ジデオキシイノシンおよび細胞増殖抑制剤、例えばヒドロキシ尿素と併用して、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートを、場合によっては抗原と共に投与することにより、ウイルス感染を治療する方法に関する。
【００８５】
ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体は、特定のウイルスに対するオプソニン化作用および中和作用を有すると考えられている。ＨＩＶおよび肝炎などの特定のウイルスが免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の原因となるため、ウイルス感染に続いて発症したＩＴＰと診断された被験体に、ＩｇＧが投与されることがある。特定の実施形態では、本開示は、ウイルス感染を治療または予防する方法であって、免疫グロブリンと併用して、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートを投与することを含む方法に関する。ＩｇＧは、典型的には、望ましくないウイルス伝播のリスクを低減するためにスクリーニングされる、ヒト血漿の大規模プールから製造される。ＩｇＧ分子のＦｃおよびＦａｂの機能は通常保持される。治療用ＩｇＧとしては、Ｐｒｉｖｉｇｅｎ、Ｈｉｚｅｎｔｒａ、およびＷｉｎＲｈｏが挙げられる。ＷｉｎＲｈｏは、Ｒｈｏ（Ｄ）抗原（Ｄ抗原）の抗体を含有する免疫グロブリン（ＩｇＧ）画分である。これらの抗体は、ＩＴＰに罹患するＲｈｏ（Ｄ）ポジティブの被験体の血小板数を増加させることが示された。この機序は、Ｆｃ受容体の遮断をもたらし、そのため抗体被覆血小板が残されることになる、抗Ｒｈｏ（Ｄ）（抗Ｄ）被覆ＲＢＣ複合体の形成によると考えられている。
【００８６】
一部の実施形態では、本開示は、抗生物質と併用して、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のコンジュゲートを投与することにより、細菌感染を治療することに関する。さらなる実施形態では、被験体は、スルホンアミド、ジアミノピリミジン、キノロン、β‐ラクタム系抗生物質、セファロスポリン、テトラサイクリン、ノトリベンゼン（Ｎｏｔｒｉｂｅｎｚｅｎｅ）誘導体、アミノグリコシド、マクロライド系抗生物質、ポリペプチド系抗生物質、ニトロフラン誘導体、ニトロイミダゾール、ニコチン酸誘導体、ポリエン系抗生物質、イミダゾール誘導体または糖ペプチド、環状リポペプチド、グリシルシクリン、およびオキサゾリジノンからなる群から選択される抗生物質を同時投与される。さらなる実施形態では、これらの抗生物質としては、以下に限定されるものではないが、スルファジアジン、スルホン−［ダプソン（ＤＤＳ）およびパラアミノサリチル酸（ＰＡＳ）］、スルファニルアミド、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファピリジン、トリメトプリム、ピリメタミン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、シプロフラキシン、シノキサシン、エノキサシンガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、ペフロキサシン、スパルフロキサシン、トロバフロキサシン、ペニシリン（アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ヘタシリン、オキサシリン、メズロシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン）、セファロスポリン（セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファザフルール、セファゼドン、セファゾリン、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セフォニシド、セフォラニド、セフプロジル、セフロキシム、セフゾナム、セフメタゾール、セフォテタ（Ｃｅｆｏｔｅｔａ）、セフォキシチン、セフカペン、セフダロキシム（Ｃｅｆｄａｌｏｘｉｍｅ）、セフジニル、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォチアム、セフピミゾール、セフピラミド、セフポドキシム、セフテラム、セフチブテン、セフチオフル、セフチオレン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、セフェピム）、モクソラクタム（Ｍｏｘｏｌａｃｔａｍ）、カルバペネム（イミペネム、エルタペネム、メロペネム）、モノバクタム（アズトレオナム）、オキシテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、クロラムフェニコール、アミカシン、ゲンタマイシン、フラマイセチン、カナマイシン、ネオミシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン���ポリミキシンＢ、コリスチン、バシトラシン、チロトリシン  ノトリフラントイン（Ｎｏｔｒｉｆｕｒａｎｔｏｉｎ）、フラゾリドン、メトロニダゾール、チニダゾール、イソニアジド、ピラジナミド、エチオナミド、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、ハマイシン、ミコナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、リファンパシン（Ｒｉｆａｍｐａｃｉｎ）、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、コリスチン、ホスホマイシン、ロラカルベフ、メトロニダゾール、ニトロフラントイン、ポリミキシンＢ、硫酸ポリミキシンＢ、プロカイン、スペクチノマイシン、チニダゾール、トリメトプリム、ラモプラニン、テイコプラニン、バンコマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、および／またはニトロフラントインが挙げられる。
【００８７】
ベクター
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、発現ベクターと非発現ベクターの両方を指し、ウイルスベクター、および自律的自己複製環状プラスミドを含む非ウイルスベクターを含む。組換え微生物または細胞培養物が、「発現ベクター」の宿主として記載される場合、これは染色体外の環状ＤＮＡと宿主染色体に組み込まれたＤＮＡの両方を含む。本開示の典型的なベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、本開示の融合タンパク質をコードする、ベクター中の核酸分子が、宿主細胞中で転写され、必要な場合には翻訳されるように、位置的かつ連続的に方向づけられた、すなわち、他の必要なエレメントに作動可能に連結された複数の遺伝エレメントを含有する。
【００８８】
プラスミド起源であるかウイルス起源であるかにかかわらず、また組込み型ベクターであるか非組込み型ベクターであるかにかかわらず、いかなるタイプのベクターも本開示の文脈において用いることができる。このようなベクターは市販されているか、または文献に記載されている。遺伝子療法で使用されるベクター（すなわち、核酸分子を標的細胞に送達させることができる）、および組換え技術で使用される発現ベクター（すなわち、例えば培養宿主細胞中で本開示の核酸分子を発現させることができる）が、本開示の文脈では企図される。
【００８９】
本開示のベクターは、原核細胞もしくは真核細胞、またはその両方（シャトルベクター）において機能することができる。適切なベクターとしては、限定されるものではないが、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、またはＭＡＣなど）に由来するベクター、およびバキュロウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、泡沫状ウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクターが挙げられる。ベクターはまた、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝エレメントに由来するものなど、これらの供給源の組合せに由来するもの、例えばコスミドおよびファージミドであってもよい。ウイルスベクターは、複製コンピテントであっても、条件付き複製であっても、複製欠損であってもよい。ウイルス複製が欠損している場合には、この欠損を補完する機能を備える宿主細胞中で、複製は起こることになる。
【００９０】
適切なプラスミドの例としては、以下に限定されるものではないが、ｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ  ５７，１９３−２０１）、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ  ６９，３０１−３１５）、およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，６０−８９）に由来するものが挙げられる。プラスミドの形態が発現効率に影響を及ぼし得ることは周知であり、典型的には、ベクターの大きな割合がスーパーコイル形態である。酵母（例えば、Ｓ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））における発現用ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ  Ｊ．６，２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｃｅｌｌ  ３０，９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ  ５４，１１３−１２３）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。本開示のベクターはまた、培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）で発現されるバキュロウイルスに由来することもある。
【００９１】
本開示の典型的な実施形態によると、本明細書に記載される核酸分子は、哺乳動物発現ベクターを用いることにより発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，８４０）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ  Ｊ．６，１８７−１９５）が挙げられる。本明細書に記載される発現ベクターは、当業者に利用可能な周知のベクターのほんの一部の例として提供するものである。当業者は、本明細書に記載される核酸分子の維持、増殖、または発現に適した他のベクターについて承知しているであろう。
【００９２】
さらに、本開示のベクターはまた、トランスフェクトされた細胞を選択または同定するためのマーカー遺伝子（例えば、細胞栄養要求性の補完または抗生物質抵抗性による）、安定化エレメント（例えば、ｃｅｒ配列；Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｒａｔ，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３６，１０９７−１１０３）、組込みエレメント（例えば、ＬＴＲウイルス配列およびトランスポゾン）、および自己複製機能を提供し、細胞中のベクターのコピー数とは無関係にベクターが細胞中で安定に維持されることを可能にするエレメントを含むことができる。マーカーとしては、原核宿主細胞についてはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子、また真核宿主細胞についてはジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性が挙げられる。しかしながら、表現形質に対する選択を可能にするいかなるマーカーも有効である。自己複製機能は、ウイルスの複製起点を用い、その特定のウイルス起点により媒介される複製に必要とされる１つまたは複数のウイルス複製因子を与えることにより備えることができる（国際公開第９５／３２２９９号パンフレット）。複製起点および任意の複製因子は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトおよびウシのパピローマウイルス、およびパポーバウイルスＢＫを含む種々ウイルスから得ることができる。
【００９３】
本開示の典型的なベクターは、ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターであり、このベクターは、遺伝子療法用ベクターとして十分に実証された、いくつかの利点を有する。アデノウイルスゲノムは、ウイルスのサイクルを完了するのに必要な約３０を超える遺伝子を担持する、約３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡ分子からなる。初期遺伝子は、Ｅ３領域を例外としてウイルス複製にとって必須の４つの領域（Ｅ１〜Ｅ４）に分けられる（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９８６，Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ（Ｖｏｌ  ４）：ＤＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｂｏｔｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｇｌｏｄｚｉｃｋｅｒ  Ｓｈａｒｐ  Ｅｄｓ  ｐｐ  ３７−４７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６，２５０−２５７）。Ｅ３領域は、Ｅ３領域内に欠失がある天然の突然変異体またはハイブリッドウイルスが、培養細胞において、野生型ウイルスのように依然として複製するという観察に基づいて、ウイルス複製にとって必要ではないと考えられている（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，１９７３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１２，６４３−６５２）。Ｅ１遺伝子産物は、ウイルスゲノムの転写の調節を担うタンパク質をコードする。Ｅ２遺伝子産物は、ウイルスＤＮＡ合成の開始および鎖伸長に必要である。Ｅ３によりコードされるタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防止する（Ｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｉｎｇ，１９９１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８４，１−８）。Ｅ４領域によりコードされるタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子の発現およびスプライシング、ならびに宿主細胞シャットオフに関与する（Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６，２５０−２５７）。後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）は、その大半がウイルスカプシドを構成する構造タンパク質をコードする。それらは、初期転写単位と少なくとも一部分オーバーラップし、独自のプロモーター（ＭＬＰ、主要後期プロモーター）から転写される。加えて、アデノウイルスゲノムは、シス作用性５’および３’ＩＴＲ（逆方向末端反復配列）ならびにカプシド形成領域を両末端に保有する。ＩＴＲは、ＤＮＡ複製起点を内部に有し、一方カプシド形成領域は、感染性粒子中へのアデノウイルスＤＮＡのパッケージングに必要である。
【００９４】
本開示に従って使用されるアデノウイルスベクターは、典型的には、哺乳動物細胞に感染する。これは、ヒトまたは動物の供給源、特に、イヌ（例えば、ＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２；それぞれＧｅｎｂａｎｋ参照番号ＣＡＶ１ＧＥＮＯＭおよびＣＡＶ７７０８２、）、鳥類（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＡＶＥＤＳＤＮＡ）、ウシ（ＢＡＶ３など；Ｓｅｓｈｉｄｈａｒ  Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１３９４−１４０２）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＤＲＭＵＳＭＡＶ１）、ヒツジ、ネコ、ブタ、またはサルのアデノウイルス、または代替的にそれらのハイブリッドに由来し得る。アデノウイルス血清型１〜５１の任意の血清型を用いることができる。例えば、アデノウイルスは、亜群Ａ（例えば、血清型１２、１８、および３１）、亜群Ｂ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、および３５）、亜群Ｃ（例えば、血清型１、２、５、および６）、亜群Ｄ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、および４２〜４７）、亜群Ｅ（血清型４）、亜群Ｆ（血清型４０および４１）、または他の任意のアデノウイルス血清型のものにすることができる。しかしながら、ＢまたはＣ亜群のヒトアデノウイルス、特にアデノウイルス２（Ａｄ２）、５（Ａｄ５）、および３５（Ａｄ３５）が典型的である。一般的に言えば、列挙されたアデノウイルスの供給源として用いることができるアデノウイルスのストックは、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）または他の任意の供給源から現在入手可能である。さらに、このようなアデノウイルスは、それらの配列、構成、および生物学を記載する数多くの刊行物の主題となっており、そのため当業者はそれらを適用することができる。アデノウイルスベクター、アデノウイルスベクターを作製する方法、およびアデノウイルスベクターを用いる方法は、例えば、Ｃ群アデノウイルスベクターについては、米国特許第６，１３３，０２８号明細書、米国特許第６，０４０，１７４号明細書、米国特許第６，１１０，７３５号明細書、米国特許第６，３９９，５８７号明細書、国際公開第００／５０５７３号パンフレットおよび欧州特許第１０１６７１１号明細書に、また例えば非Ｃ群アデノウイルスベクターについては、米国特許第６，４９２，１６９号明細書および国際公開第０２／４０６６５号パンフレットに開示されている。
【００９５】
特定の実施形態では、本開示のアデノウイルスベクターは、複製コンピテントである。本明細書で使用される「複製コンピテント」という用語は、いかなるトランス相補性もない状態で宿主細胞中にて複製できるアデノウイルスベクターを指す。本開示の文脈では、この用語はまた、癌または過剰増殖の宿主細胞でより良好にまたは選択的に複製するように操作された複製選択的または条件付き複製のアデノウイルスベクターを包含する。このような複製コンピテントアデノウイルスベクターの例は、当技術分野で周知であり、当業者にとって容易に利用可能である（例えば、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｃｏｃｅｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１，２００９−２０２４；Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８，７４６−７５９；Ａｌｅｍａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，７２３−７２７を参照のこと）。
【００９６】
本開示による複製コンピテントアデノウイルスベクターは、野生型アデノウイルスゲノムであってもよく、またはそれから、例えば条件付き複製アデノウイルスベクターを作製することを目的として、ウイルスゲノムに改変を導入することにより誘導することもできる。そのような改変には、コード配列および／または調節配列中の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、および／または突然変異が含まれる。典型的な改変は、前記複製コンピテントアデノウイルスベクターを腫瘍または癌細胞中に特異的に存在する細胞活性に依存させるようにするものである。この点に関して、ｐ５３またはＲｂ結合による細胞周期の活性化を担う遺伝子など、腫瘍細胞中で不必要になるウイルス遺伝子を、完全にまたは部分的に欠失または突然変異させることができる。例示として、このような条件付き複製アデノウイルスベクターは、５５ｋＤａタンパク質をコードするアデノウイルスＭＢ遺伝子の完全な欠失により、またはｐ５３結合を抑止するＭＢ領域の完全な欠失により作製することができる（例えば、米国特許第５，８０１，０２９号明細書および米国特許第５，８４６，９４５号明細書を参照のこと）。これは、正常細胞における腫瘍抑制をウイルスが不活性化するのを防止するが、このことはウイルスが複製できないことを意味する。しかしながら、ウイルスは複製し、癌化によってｐ５３またはＲｂの発現を停止した細胞を溶解させることになる。別の例として、Ｅ１Ａ領域の完全な欠失により、アデノウイルスベクターを内因性またはＩＬ−６誘導のＥ１Ａ様活性に依存させる。場合によっては、Ｒｂへの結合を抑止するために、不活性化突然変異をＥ１Ａ領域に導入してもよい。Ｒｂ欠損突然変異／欠失は、典型的には、Ｅ１Ａ  ＣＲ１および／またはＣＲ２ドメイン内に導入される（例えば、国際公開第００／２４４０８号パンフレットを参照のこと）。第２の戦略では、場合によってはまたは第１のアプローチと組み合わせて、ウイルス遺伝子の転写を制御する天然ウイルスプロモーターを、組織または腫瘍特異的プロモーターで置き換えることができる。例示として、Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂ遺伝子の調節を、ＰＳＡ、カリクレイン、プロバシン、ＡＦＰ、ａ−フェトプロテイン、またはテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のプロモーターなどの腫瘍特異的プロモーター（例えば、米国特許第５，９９８，２０５号明細書、国際公開第９９／２５８６０号パンフレット、米国特許第５，６９８，４４３号明細書、および国際公開第００／４６３５５号パンフレットを参照のこと）またはＥ２Ｆ−１プロモーターなどの細胞周期特異的プロモーター（国際公開第００／１５８２０号パンフレットおよび国際公開第０１／３６６５０号パンフレット）の制御下に配置することができる。ＭＡ  ＣＲ２ドメイン内の８個のアミノ酸残基のＲｂ欠損欠失と、Ｅ１ＡおよびＥ４ウイルス遺伝子の両方の発現を制御するＥ２Ｆ−１プロモーターの使用を組み合わせたＯＮＹＸ−４１１と命名された代表的ベクターがこの文脈において典型的である。
【００９７】
特定の実施形態では、本開示のアデノウイルスベクターは複製欠損である。複製欠損アデノウイルスベクターは、当技術分野で公知であり、ウイルス複製にとって必須であるアデノウイルスゲノムの１つまたは複数の領域（例えば、Ｅ１、Ｅ２、もしくはＥ４、またはそれらの組合せ）が欠損し、そのため、トランス相補性（例えば、補完細胞またはヘルパーウイルスの何れかにより提供される）がない状態では増殖することができないものとして定義することができる。複製欠損表現型は、ウイルス複製にとって必須の１つまたは複数のウイルス遺伝子の機能を抑止するような改変をウイルスゲノムに導入することにより得られる。典型的な複製欠損ベクターはＥ１欠失であり、したがってＥ１機能が欠損している。このようなＥ１欠失アデノウイルスベクターとしては、米国特許第６，０６３，６２２号明細書；米国特許第６，０９３，５６７号明細書；国際公開第９４／２８１５２号パンフレット；国際公開第９８／５５６３９号パンフレット、および欧州特許第９７４  ６６８号明細書に記載されるものが挙げられる（これらの刊行物すべての開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。典型的なＥ１欠失は、ヒトアデノウイルス５型の配列を参照すると、ほぼヌクレオチド（ｎｔ）４５９〜３３２８または４５９〜３５１０に及ぶ（受託番号Ｍ７３２６０の下でＧｅｎｂａｎｋ、およびＣｈｒｏｂｏｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｖｉｒｏｌ．１８６，２８０−２８５に開示されている）。
【００９８】
さらに、ベクターのアデノウイルス骨格は、ウイルス抗原の残存する合成を消滅させ、かつ／または形質導入された細胞での核酸分子の長時間発現を改善するように、追加のウイルス領域に改変（例えば、欠失、挿入、または突然変異）を含むことができる（例えば、国際公開第９４／２８１５２号パンフレット；Ｌｕｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２，２０２２−２０３２；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１，６１５−６２３を参照のこと）。この文脈では、本開示は、Ｅ１、またはＥ１およびＥ２、またはＥ１およびＥ３、またはＥ１およびＥ４、またはＥ１およびＥ２およびＥ３、またはＥ１およびＥ２およびＥ４、またはＥ１およびＥ３およびＥ４、またはＥ１およびＥ２およびＥ３およびＥ４の機能を欠失するアデノウイルスベクターの使用を企図する。Ｅ２機能が欠損するアデノウイルスベクターは、Ｅ２領域の全部または一部（典型的には、Ｅ２Ａ内、または代替的にはＥ２Ｂ内もしくはＥ２ＡおよびＥ２Ｂ両方の領域内）を欠失しているものでもよく、あるいはＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）をコードする遺伝子の温度感受性突然変異などの１つまたは複数の突然変異を含む（Ｅｎｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０（１９７２），３２８−３３９）。アデノウイルスベクターはまた、Ｅ４領域の全部または一部を欠失しているものでもよい（例えば、欧州特許第９７４  ６６８号明細書および国際公開第００／１２７４１号パンフレットを参照のこと）。代表的なＥ４欠失は、ヒトアデノウイルス５型の配列を参照すると、ほぼ位置３２９９４〜位置３４９９８のヌクレオチドに及ぶ。加えて、必須ではないＥ３領域（例えば、Ａｄ５の位置２８５９７〜位置３０４６９）内の欠失は、クローニング能力を高める可能性があるが、宿主免疫系（Ｇｏｏｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０，５３−７１）および炎症反応（欧州特許第００  ４４０  ２６７．３号明細書）を回避することを可能にするｇｐ１９ｋ、１４．７Ｋ、および／またはＲＩＤをコードするＥ３配列を保持することは有利になる可能性がある。また、シス作用性配列を例外として初期遺伝子（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４）および後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５）を含むすべての機能遺伝子を欠失する最小（または減弱）アデノウイルスベクターを用いることも考えられる（例えば、Ｋｏｖｅｓｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，５８３−５８９；Ｙｅｈ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９７，ＦＡＳＥＢ  １１，６１５−６２３；国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；および国際公開第９４／２８１５２号パンフレットを参照のこと）。複製欠損アデノウイルスベクターは、必要な最小配列を考慮に入れて、当業者により容易に作製され得るものであり、これらの代表的な実施形態に限定されるものでもない。
【００９９】
本開示の核酸分子は、シス作用性配列を例外として、アデノウイルスゲノムの任意の位置に挿入することができる。典型的には、それは、欠失領域（Ｅ１、Ｅ３、および／またはＥ４）の代わりに挿入されるが、特に欠失Ｅ１領域が好ましい。加えて、発現カセットは、問題の領域の天然の転写方向に対してセンスの配向でもアンチセンスの配向でも配置することができる。
【０１００】
また、本開示の文脈では、レトロウイルスベクターも適している。レトロウイルスは、ウイルスＲＮＡゲノムを複製して感染細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる二本鎖ＤＮＡにするために、ウイルスにコードされた逆転写酵素を用いて複製する組込み型ウイルスの種類である。文献に記載されている数多くのベクターを、本開示の枠内で使用することができるが、特に、マウス白血病ウイルス、特にＭｏｌｏｎｅｙ（Ｇｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４１，２９）またはＦｒｉｅｎｄのＦＢ２９株（国際公開第９５／０１４４７号パンフレット）に由来するものが使用される。一般に、レトロウイルスベクターは、ウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖの全部または一部を欠失し、５’および３’ＬＴＲならびにカプシド形成配列を保持する。これらのエレメントは、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性を増大させるように改変することができる。そのような改変としては、ＶＬ３０などのレトロトランスポゾンの１つによるレトロウイルスカプシド形成配列の置換が挙げられる（米国特許第５，７４７，３２３号明細書）。本開示の核酸分子は、カプシド形成配列の下流に、典型的にはレトロウイルスゲノムに対して反対方向に挿入することができる。
【０１０１】
また、本開示の文脈では、ポックスウイルスベクターも適している。ポックスウイルスは、その大きなＤＮＡゲノムおよび複製の細胞質部位によって、上記ウイルスとは区別される、一群の複雑な外皮のウイルスである。ポックスウイルス科のいくつかのメンバーのゲノムがマッピングされ、配列決定されている。そのゲノムは、約２００種のタンパク質をコードする約２００ｋｂの二本鎖ＤＮＡであり、そのうちの約１００種がウイルス構築に関与する。本開示の文脈では、ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科の任意のメンバー、特に、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、およびワクシニアウイルスから得ることができるが、後者が典型的である。適切なワクシニアウイルスとしては、限定されるものではないが、コペンハーゲン株（Ｇｏｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌ．１７９，２４７−２６６  ａｎｄ  ５１７−５６３；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｖｉｒｏｌ．１９６，３８１−４０１）、ワイエス株、および改変アンカラ（ＭＶＡ）株（Ａｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｖｉｒｏｌ．２４４，３６５−３９６）が挙げられる。核酸分子を含むポックスウイルスを構築するための一般的な条件は、当技術分野で周知である（例えば、コペンハーゲンワクシニアウイルスについては、欧州特許第８３  ２８６号明細書；欧州特許第２０６  ９２０号明細書、またＭＶＡウイルスについては、Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，６−１４；Ｓｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１０８４７−１０８５１、米国特許第６，４４０，４２２号明細書を参照のこと）。本開示の核酸分子は、典型的には、その不活性化または欠失がウイルスの増殖および複製を顕著に損なわない非コードの遺伝子間領域または任意の遺伝子など、ポックスウイルスゲノム内の必須でない遺伝子座に挿入される。チミジンキナーゼ遺伝子は、コペンハーゲンワクシニアウイルスおける挿入に特に適している（Ｈｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，３４１１−３４１５；Ｗｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６，５３０−５３７）。ＭＶＡに関する限り、核酸分子の挿入は、ｅｘｃｉｓｉｏｎＩ〜ＶＩＩの何れか、典型的にはｅｘｃｉｓｉｏｎＨまたはＩＩＩ（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０３１−１０３８；Ｓｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｖａｃｃｉｎｅ  １２，１０３２−１０４０）、またはＤ４Ｒ遺伝子座で行うことができる。鶏痘ウイルスについては、チミジンキナーゼ遺伝子内の挿入も考慮することができるが、核酸分子は、典型的には、非コードの遺伝子間領域に導入される（例えば、欧州特許第３１４  ５６９号明細書および米国特許第５，１８０，６７５号明細書を参照のこと）。ヘルパーウイルスを介してまたはプロデューサー細胞株での発現によって、欠損機能がトランスで補充される場合には、必須のウイルス遺伝子座への挿入も想定することができる。適切なポックスウイルスベクターは、ＡＴＣＣ（鶏痘ＡＴＣＣ  ＶＲ−２５１、サルポックスＡＴＣＣ  ��Ｒ−２６７、豚痘ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６３、カナリア痘ＡＴＣＣ  ＶＲ−１１１、牛痘ＡＴＣＣ  ＶＲ−３０２）またはＩＣＴＶ（Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（コペンハーゲンウイルスコード５８．１．１．０．００１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７）などの公認されたコレクションから入手可能な野生型ポックスウイルスから容易に作製することができる。
【０１０２】
特定の実施形態では、本開示のベクターは、宿主細胞または生物におけるその発現に適した形態で、本開示の核酸分子を含むが、このことは、発現される核酸分子に作動可能に連結された、ベクター型および／または宿主細胞に基づいて選択された１つまたは複数の調節配列の制御下に、その核酸が配置されることを意味する。本明細書で使用される場合、「調節配列」という用語は、複製、複写、転写、スプライシング、翻訳、安定性、および／または宿主細胞または生物への核酸またはその派生物（すなわち、ｍＲＮＡ）の輸送を含む、核酸分子の機能的な調節を可能にするか、それに寄与するか、またはそれを調整する任意の配列を指す。本開示の文脈では、この用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすポリアデニル化シグナルおよびエレメント）を包含する。「作動可能に連結された」とは、核酸分子の発現（例えば、宿主細胞または生物中で）を可能にするような様式で、目的の核酸分子が調節配列に連結されていることを意味するように意図するものである。発現ベクターの設計は、形質変換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベル等の要因に依存し得ることは、当業者ならば認識されよう。
【０１０３】
調節配列は、多くのタイプの宿主細胞において核酸分子の構成的発現を指令するプロモーター、および特定の宿主細胞においてのみ（例えば、組織特異的調節配列）または特定の事象もしくは外来性因子に応答して（例えば、温度、栄養素添加、ホルモン、または他のリガンドによる）、核酸配列の発現を指令するプロモーターを含む。
【０１０４】
本開示の文脈において有用な適切な調節配列としては、以下に限定されるものではないが、バクテリオファージλ由来のレフトプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｌａｃ、ＴＲＰ、ＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時型初期プロモーターまたはエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｃｅｌｌ  ４１，５２１−５３０）、アデノウイルスの初期および後期プロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９，６２０−６２５；Ａｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ  ６０，６５−７４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびレトロウイルスの末端反復配列（例えば、ＭｏＭｕＬＶおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ）が挙げられる。ポックスウイルスベクターにおける、本開示の核酸分子の発現を駆動するのに有用な適切なプロモーターとしては、ワクシニアウイルスの７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１、またはＫ１Ｌのプロモーターが挙げられる。あるいは、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら（１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１０９４−１０９７）、Ｈａｍｍｏｎｄら（１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６６，１３５−１３８）およびＫｕｍａｒおよびＢｏｙｌｅ（１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７９，１５１−１５８）に記載されるものなどの合成プロモーターならびに初期と後期のポックスウイルスプロモーター間のキメラプロモーターを使用することもできる。
【０１０５】
誘導性プロモーターは外部から供給された化合物により調節され、これには、限定されるものではないが、亜鉛誘導性メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター（Ｍｃ  Ｉｖｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，８３８−８４８）、デキサメタゾン（デキセドリン）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際公開第９８／１００８８号パンフレット）、エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，３３４６−３３５１）、テトラサイクリン抑制性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，５５４７−５５５１）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，２５６５−２５７３）、ＲＵ４８６誘導性プロモーター（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，２３９−２４３およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４，４３２−４４１）、およびラパマイシン誘導性プロモーター（Ｍａｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００，２８６５−２８７２）が含まれる。
【０１０６】
本開示の文脈で使用される調節配列はまた、治療効果が所望される組織で核酸分子の発現を駆動するように組織特異的にすることができる。代表的な肝臓特異的調節配列としては、以下に限定されるものではないが、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（Ｌｕｓｋｅｙ，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，１８８１−１８９３）；ステロール調節エレメント１（ＳＲＥ−１；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，２３０６−２３１０）；アルブミン（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１，２６８−２７７）；ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，１３９６−１４０３）；ヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，４１３６−４１４２）；ヒトグルコキナーゼ（Ｔａｎｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．６，１０７０−１０８１）；コレステロール７−アルファヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ−７）（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４６８１−１４６８９）；アルファ−１アンチトリプシン（Ｃｉｌｉｂｅｒｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｃｅｌｌ  ４１，５３１−５４０）；インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１）（Ｂａｂａｊｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９６，４８０−４８６）；ヒトトランスフェリン（Ｍｅｎｄｅｌｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，５７１７−５７２１）；コラーゲンＩ型（Ｈｏｕｇｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４，８０８−８１４）およびＦＩＸ（米国特許第５，８１４，７１６号明細書）の遺伝子の調節配列が挙げられる。代表的な前立腺特異的調節配列としては、以下に限定されるものではないが、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）（Ｂａｌｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１７，１８８−１９４）；前立腺分泌タンパク質９４（ＰＳＰ９４）（Ｎｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８９，２４７−２４９）；前立腺特異的抗原複合体（Ｋａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７，１２７−１３５）；ヒト腺性カリクレイン（ｈｇｔ−１）（Ｌｉｌｊａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ  １１，１８８−１９１）の遺伝子の調節配列が挙げられる。代表的な膵臓特異的調節配列としては、以下に限定されるものではないが、膵炎関連タンパク質プロモーター（Ｄｕｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４４７０−１４４７５）；エラスターゼ１転写エンハンサー（Ｋｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７，７７４−７８６）；膵臓特異的アミラーゼおよびエラスターゼエンハンサー／プロモーター（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，４４２３−４４３０；Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．４，１３１６−１３２１）；膵臓コレステロールエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｆｏｎｔａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，７００８−７０１４）およびインスリン遺伝子プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，９１２−９１６）の調節配列が挙げられる。代表的な神経細胞特異的調節配列としては、以下に限定されるものではないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）（Ｆｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｅｕｒｏｎ  ５，１８７−１９７）および神経フィラメント（Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，５４７３−５４７７）の遺伝子プロモーターが挙げられる。脳における発現のための代表的な調節配列としては、これに限定されるものではないが、神経フィラメント重鎖（ＮＦ−Ｈ）プロモーター（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１３４４４−１３４５０）が挙げられる。代表的なリンパ系特異的調節配列としては、以下に限定されるものではないが、ヒトＣＧＬ１／グランザイムＢプロモーター（Ｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２４４３３−２４４３８）；末端デオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、リンパ球特異的チロシンプロテインキナーゼ（ｐ５６１ｃｋ）のプロモーター（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，５２２９−５２４３））；ヒトＣＤ２プロモーター／エンハンサー（Ｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＥＭＢＯ  Ｊ．９，３１２９−３１３６）、ヒトＮＫおよびＴ細胞特異的活性化（ＮＫＧ５）（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７，１０２−１０７）、Ｔ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９，ＥＭＢＯ  Ｊ．８，７２９−７３３）、および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｃｅｌｌ  ３３，７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３，Ｃｅｌｌ  ３３，７４１−７４８）のプロモーターが挙げられる。代表的な結腸特異的調節配列としては、以下に限定されるものではないが、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ（Ｔａｌａｍｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９１，５３−６０）；臓器特異的新生抗原（ＯＳＮ）、ｍｗ４０ｋＤａ（ｐ４０）（Ｉｌａｎｔｚｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７，１１９−１２８）；および結腸特異的抗原Ｐプロモーター（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  ７３，８６４−８７７）のプロモーターが挙げられる。乳腺および乳房細胞における発現のための代表的な調節配列としては、以下に限定されるものではないが、ヒトアルファ−ラクトアルブミン（Ｔｈｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．６１，７７３−７７５）およびミルク乳清（米国特許第４，８７３，３１６号明細書）のプロモーターが挙げられる。代表的な筋特異的調節配列としては、以下に限定されるものではないが、ＳＭ２２（国際公開第９８／１５５７５号パンフレット；国際公開第９７／３５９７４号パンフレット）、デスミン（国際公開第９６／２６２８４号パンフレット）、ミトコンドリアクレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）のプロモーター、および欧州特許第１３１０５６１号明細書に開示されているキメラプロモーターが挙げられる。代表的な肺特異的調節配列としては、以下に限定されるものではないが、ＣＦＴＲおよび界面活性物質のプロモーターが挙げられる。
【０１０７】
本開示で使用するのに適したさらなるプロモーターは、増殖性腫瘍細胞で優先的に発現される遺伝子から得ることができる。そのような遺伝子は、例えばディスプレイおよび比較ゲノムハイブリダイゼーションにより同定することができる（例えば、米国特許第５，７５９，７７６号明細書および同第５，７７６，６８３号明細書を参照のこと）。代表的な腫瘍特異的プロモーターとしては、以下に限定されるものではないが、乳癌および前立腺癌で過剰発現されるＭＵＣ−１遺伝子（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６，２７７５−２７８２）、結腸癌で過剰発現される癌胎児抗原（ＣＥＡ）コード遺伝子（Ｓｃｈｒｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０，２７３８−２７４８）、乳癌および膵癌で過剰発現されるＥＲＢ−２コード遺伝子（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １，１７０−１７５）、肝癌で過剰発現されるアルファ−フェトプロテイン遺伝子（Ｋａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，４６１−４６５）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）（国際公開第９９／２７１１３号パンフレット、国際公開第０２／０５３７６０号パンフレットおよびＨｏｒｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，８２６）、低酸素応答配列（ＨＲＥ）、自己分泌型細胞運動刺激因子受容体、Ｌプラスミン、およびヘキソキナーゼＩＩのプロモーターが挙げられる。
【０１０８】
当業者は、本開示の核酸分子の発現を制御する調節エレメントが、宿主細胞または生物における、転写および翻訳の適切な開始、調節、および／または終結のための追加のエレメントをさらに含み得ることを認識するであろう。そのような追加のエレメントとしては、以下に限定されるものではないが、非コードのエキソン／イントロン配列、輸送配列、分泌シグナル配列、核移行シグナル配列、ＩＲＥＳ、ｐｏｌｙＡ転写終結配列、三者間リーダー配列、複製または組込みに関与する配列が挙げられる。本開示の文脈で適切なイントロンの例示的な例としては、アルファまたはベータグロビン（すなわち、ウサギベータグロビン遺伝子の第２イントロン；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，３６９；Ｋａｒａｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，９７−１０４）、オボアルブミン、アポリポタンパク質、免疫グロブリン、第ＩＸ因子、および第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子から単離されるイントロン、ＳＶ４０  １６Ｓ／１９Ｓイントロン（Ｏｋａｙｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２８０−２８９）、ならびにマウス免疫グロビンに融合したヒトベータグロビンドナーからなるｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ、ｐＣＩ哺乳動物発現ベクターＥ１７３１）中のイントロンなどの合成イントロンが挙げられる。融合タンパク質の分泌が所望される場合には、適切な分泌シグナルがベクターに組み込まれる。シグナル配列は、融合タンパク質に対して内因性であっても、融合タンパク質に含まれる両方の実体に対して異種であってもよい。当業者ならば、発現ベクターに有用な数多くの調節配列について承知しているであろう。
【０１０９】
加えて、本開示のベクターは、１つまたは複数の導入遺伝子をさらに含むことができる（すなわち、宿主細胞または生物における本開示の核酸分子と一緒に発現される目的遺伝子）。望ましくは、導入遺伝子の発現は、本開示のベクターが対象とする疾患または疾病状態に対して治療的または予防的活性を有している。適切な導入遺伝子としては、限定されるものではないが、（ｉ）腫瘍増殖阻害因子および／または（ｉｉ）それに対する免疫応答が所望される少なくとも１つの特異的抗原をコードする遺伝子が挙げられる。本開示の典型的な形態では、導入遺伝子産物および融合タンパク質は、免疫応答の誘導において、または治療（例えば、抗腫瘍）効果の提供において相乗的に作用する。したがって、このような組合せは、疾患の免疫学的予防だけでなく、驚くべきことには、ウイルス、細菌、寄生虫の感染などの疾患の免疫療法にも、また癌などの慢性障害の免疫療法にも適している。
【０１１０】
腫瘍増殖阻害因子は、細胞増殖を直接阻害するか、または腫瘍細胞を死滅させることより作用する。腫瘍増殖阻害因子の代表的な例としては、毒素および自殺遺伝子が挙げられる。毒素の代表的な例としては、限定されるものではないが、リシン（Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４８，２６５−２７０）、ジフテリア毒素（Ｔｗｅｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，１０３９２−１０３９４）、コレラ毒素（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０６，５５１−５５７；Ｓａｎｃｈｅｚ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，４８１−４８５）、ゲロニン（Ｓｔｉｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，６９４７−６９５３）、抗ウイルスタンパク質（Ｂａｒｂｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０３，５５−５９；Ｉｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００，４１８−４２５）、トリチン、シゲラ毒素（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，４３６４−４３６８；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．２，１４７−１５３）、およびシュードモナス菌体外毒素Ａ（Ｃａｒｒｏｌｌ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｅｒ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，８７０７−８７１１）が挙げられる。
【０１１１】
特異的抗原は、典型的には、所与の病原体（ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫）または非自己抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対して、特異的および／または非特異的な抗体および／または細胞媒介性免疫応答を惹起しやすい抗原である。典型的には、選択される抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質により細胞表面上に結合し、提示されるエピトープを含む。特異的抗原の代表的な例としては、限定されるものではないが：Ｂ型肝炎表面抗原の抗原が当技術分野で周知であり、とりわけ、欧州特許出願第４１４  ３７４号明細書；欧州特許出願第３０４  ５７８号明細書、および欧州特許出願第１９８  ４７４号明細書に記載発表されているＰｒｅＳ１、Ｐａｒｓ２  Ｓ抗原が挙げられる。コア（Ｃ）、外被糖タンパク質Ｅ１、Ｅ２、非構造的なポリペプチドＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４（ＮＳ４ａおよび／またはＮＳ４ｂ）、ＮＳ５（ＮＳ５ａおよび／またはＮＳ５ｂ）、またはそれらの任意の組合せ（例えば、ＮＳ３およびＮＳ４、ＮＳ３およびＮＳ４およびＮＳ５ｂ）からなる群から選択される任意の免疫原性抗原またはそのフラグメントを含むＣ型肝炎ウイルスの抗原。ＨＩＶ−１ウイルスの抗原、特にｇｐ１２０およびｇｐ１６０（国際公開第８７／０６２６０号パンフレットに記載される）。性器疣贅（ＨＰＶ  ６またはＨＰＶ  １１他）および子宮頸癌（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ  ３１、ＨＰＶ−３３他）に関連すると考えられているヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来する抗原。企図されるＨＰＶ抗原は、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、およびＬ２からなる群の中から個々にまたは組み合わせて選択される（例えば、国際公開第９４／００１５２号パンフレット、国際公開第９４／２０１３７号パンフレット、国際公開第９３／０２１８４号パンフレット、国際公開第９０／１０４５９号パンフレット、および国際公開第９２／１６６３６号パンフレットを参照のこと）。ＨＰＶ関連癌に対する抗腫瘍効果を達成するのに特に適した初期ＨＰＶ−１６  Ｅ６および／またはＥ７抗原（国際公開第９９／０３８８５号パンフレットに記載される）の膜アンカー型非腫瘍形成性変異体が、本開示の文脈では企図される。マラリアの原因となる寄生虫に由来する抗原。例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）由来の典型的な抗原としては、ＲＴＳ（国際公開第９３／１０１５２号パンフレット）およびＴＲＡＰ（国際公開第９０／０１４９６号パンフレット）が挙げられる。候補になる可能性のある他のマラリア原虫抗原は、熱帯熱マラリア原虫ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰＴ、ＲＡＰ２、セクエストリン、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７１２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０、および他のマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種におけるそれらのアナログである。
【０１１２】
他の適切な抗原としては、前立腺、乳房、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓、肝臓、膀胱、肉腫、またはメラノーマの癌に関連したものなど、腫瘍関連抗原が挙げられる。代表的な抗原としては、ＭＡＧＥ１、３およびＭＡＧＥ４または他のＭＡＧＥ抗原（国際公開第９９／４０１８８号パンフレット）、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ  Ｅｏｓ  １としても知られる）ＳＡＧＥおよびＨＡＧＥ（国際公開第９９／５３０６１号パンフレット）またはＧＡＧＥ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｗａｋａｍｉ，１９９６．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，ｐｐｓ  ６２８−６３６）が挙げられる。他の適切な腫瘍関連抗原としては、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡを含む、プロスターゼとして知られるものが挙げられる。プロスターゼのヌクレオチド配列および推定ポリペプチド配列およびホモログは、Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６，３１１４−３１１９）および国際公開第９８／１２３０２号パンフレット、国際公開第９８／２０１１７号パンフレット、および国際公開第００／０４１４９号パンフレットに開示されている。他の適切な腫瘍関連抗原としては、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、およびＭＵＣ−１など、乳癌に関連するものが挙げられる（例えば、国際公開第９２／０７０００号パンフレットを参照のこと）。
【０１１３】
本開示で使用される導入遺伝子は、構成的または誘導的様式の何れかで、選択された宿主細胞または生物においてその発現が可能になるように、適切な調節エレメントの制御下に配置される。そのような調節エレメントの選択は当業者が可能な範囲内である。それは、典型的には、本開示の融合タンパク質の発現に関して上記に記載される構成的、誘導的、腫瘍特異的、および組織特異的プロモーターからなる群から選択される。一例では、導入遺伝子は、高レベルの発現を確保するために、ＣＭＶプロモーターの制御下に配置される。
【０１１４】
本開示で使用される導入遺伝子は、ベクターの任意の位置に挿入することができる。一代替案によると、導入遺伝子は、典型的には、本開示の核酸分子に隣接せずに配置される。別の代替案によると、導入遺伝子は、２つの発現カセット間における転写の干渉を回避するために、核酸分子に関してアンチセンスの配向で配置することができる。例えば、アデノウイルスゲノムでは、導入遺伝子は、本開示の核酸分子とは異なる欠失領域（Ｅ１、Ｅ３、および／またはＥ４）に、または前記核酸分子と同じ欠失領域であるが相互にアンチセンスの配向で挿入することができる。
【０１１５】
本開示の核酸分子のベクター骨格への導入は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載される方法によるものなど、任意の種類のベクターに対して当技術分野で適切な任意の遺伝子工学戦略によって進めることができる。典型的には、アデノウイルスベクターに核酸分子を導入するために、融合体をコードする核酸分子を含む細菌性プラスミドを操作して、複製または構築に必要なアデノウイルスの遺伝子（例えば、Ｅ１）を置換核酸分子で置き換える。次いで、プラスミドをシャトルベクターとして用い、アデノウイルスゲノムの相補性部分を含有する第２のプラスミドと組み合わせ、２つのプラスミドにおけるアデノウイルス配列のオーバーラップによって、相同組換えが起こることを可能にする。組換えは、適切な哺乳動物宿主（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃｔ，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ７  “Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”；Ｅｄ  Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ，Ｃｌｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．に記載される２９３など）、またはさもなければ、酵母ＹＡＣクローンもしくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（国際公開第９６／１７０７０号パンフレットに記載される）で直接行うことができる。次いで、完成したアデノウイルスゲノムを、複製およびウイルスカプシド形成のために哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトする。
【０１１６】
本開示はまた、特定の標的細胞の優先的ターゲティングを可能にするように改変された本開示のベクターまたはその粒子を包含する。本開示の（ポリマーおよび脂質複合ベクターなど、ウイルス起源および非ウイルス起源の両方の）標的化ベクター／粒子の特徴は、細胞および表面に露出した成分を認識し結合することができるターゲティング部分がそれらの表面に存在することである。そのようなターゲティング部分としては、限定されるものではないが、化学コンジュゲート、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリシン、ＰＥＩ等）、ペプチド、ポリペプチド（例えば、国際公開第９４／４０９５８号パンフレットに記載されるＪＴＳ１）、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチン、抗体、およびそれらのフラグメントが挙げられる。それらは、典型的には、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原エピトープ、または腫瘍関連マーカーを認識し結合することができる。この点に関しては、アデノウイルスの細胞ターゲティングは、ウイルスの表面上に存在するカプシドポリペプチド（例えば、ファイバー、ペントン、および／またはｐＩＸ））をコードするウイルス遺伝子の遺伝子改変により行なうことができる。そのような改変の例は、文献（例えば、Ｗｉｃｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．７１，８２２１−８２２９；Ａｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌ．２２７，２３９−２４４；Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２，６６０−６６８；国際公開第９４／１０３２３号パンフレット、欧州特許第０２  ３６０２０４号明細書、および国際公開第０２／９６９３９号パンフレット）に記載されている。例示すると、アデノウイルスファイバーをコードする配列内にＥＧＦをコードする配列を挿入すると、ＥＧＦ受容体発現細胞をターゲティングすることが可能になる。ポックスウイルストロピズムの改変もまた、欧州特許第１  １４６  １２５号明細書に記載のように行うことができる。細胞特異的ターゲティングのための他の方法は、ウイルス粒子の表面にターゲティング部分を化学的にコンジュゲートすることにより達成することができる。
【０１１７】
特定の実施形態では、本開示は、本開示の上記核酸分子またはベクターを含む感染性ウイルス粒子に関する。
【０１１８】
本開示はまた、感染性ウイルス粒子を作製する方法であって、（ａ）適切な細胞株に本開示のウイルスベクターを導入するステップと、（ｂ）前記感染性ウイルス粒子の産生を可能にするような適切な条件下で前記細胞株を培養するステップと、（ｃ）前記細胞株の培養から産生される感染性ウイルス粒子を回収するステップと、（ｄ）場合によっては、前記回収された感染性ウイルス粒子を精製するステップとを含む方法に関する。
【０１１９】
本開示の核酸分子を含有するベクターは、当業者が容易に利用可能な周知の技術を用いて、増殖または発現のための適切な細胞株に導入することができる。これらの技術としては、以下に限定されるものではないが、細胞核への微量ＤＮＡの微量注入（Ｃａｐｅｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２，４７９−４８８）、ＣａＰＯ４媒介トランスフェクション（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２）、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６）、リポフェクション／リポソーム融合（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３−７４１７）、微粒子銃（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，９５６８−９５７２）、遺伝子銃、形質導入、感染（例えば、感染性ウイルス粒子による）、およびＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）に見出されるものなど他の技術が挙げられる。
【０１２０】
本開示のベクターに欠損がある場合は、感染性粒子は、通常、非機能性ウイルス遺伝子をトランスで補充する、補完細胞株中でまたはヘルパーウイルスの使用を介して産生される。例えば、アデノウイルスベクターの補完に適した細胞株としては、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６，５９−７２）、およびＥ１機能を補完するために通常用いられるＰＥＲ−Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９，１９０９−１９１７）が挙げられる。他の細胞株は、二重に欠損のあるアデノウイルスベクターを補完するように操作されている（Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，５５９−５６５；Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ，１９９５，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６，１５７５−１５８６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２，７７５−７８３；Ｌｕｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，２０２２−２０３３；国際公開第９４／２８１５２号パンフレットおよび国際公開第９７／０４１１９号パンフレット）。感染性ウイルス粒子は、培養上清からも、溶解後の細胞からも回収することができ、場合によっては標準的技術によってさらに精製される（例えば国際公開第９６／２７６７７号パンフレット、国際公開第９８／００５２４号パンフレット、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、国際公開第９８／２６０４８号パンフレット、国際公開第００／４０７０２号パンフレット、欧州特許第１０１６７００号明細書、および国際公開第００／５０５７３号パンフレットに記載されるクロマトグラフィー、塩化セシウム勾配における超遠心分離）。
【０１２１】
本開示はまた、本明細書に記載される、本開示の核酸分子、ベクター、または感染性ウイルス粒子を含む宿主細胞に関する。本開示の目的にとって、「宿主細胞」という用語は、組織、器官、または単離細胞において、特定の組織体に関する限定を何ら設けずに、幅広く理解されるべきである。このような細胞は、独自の細胞型からなるものでも、一群の異なる細胞型からなるものでもよく、培養細胞株、初代細胞、および増殖性細胞を包含する。
【０１２２】
したがって、宿主細胞としては、原核細胞、酵母などの下等真核細胞、ならびに昆虫細胞、植物、および高等真核細胞（例えば、脊椎動物細胞）などの他の真核細胞が挙げられるが、特に好ましくは、哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト）細胞である。適切な哺乳動物細胞としては、以下に限定されるものではないが、造血細胞（全能性幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージ、ＡＰＣ、樹状細胞、非ヒト細胞等）、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞（例えば、骨格筋、心筋、もしくは平滑筋）、または繊維芽細胞が挙げられる。典型的な宿主細胞としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＭＤＣＫ細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞株）、ＣＲＦＫ細胞（Ｃｒａｎｄｅｌｌネコ腎臓細胞株）、ＣＶ−１細胞（アフリカサル腎臓培養細胞株）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３株細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＶｅｒｏ細胞が挙げられる。宿主細胞はまた、上記に挙げたものなど本開示の複製欠損ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）の少なくとも１つの欠損機能を補完することができる補完細胞を包含する。
【０１２３】
本開示の宿主細胞は、本開示の２つ以上の核酸分子、ベクターまたは感染性ウイルス粒子を含有することができる。さらに、それは、導入遺伝子、例えば上記に記載される導入遺伝子をコードするベクターを追加して含むことができる。２つ以上の核酸分子、ベクター、または感染性ウイルス粒子を細胞に導入する場合、核酸分子、ベクター、または感染性ウイルス粒子は、独立して導入しても同時に導入してもよい。
【０１２４】
さらに、特定の実施形態によると、本開示の宿主細胞はさらに、カプセル封入することができる。細胞カプセル封入技術は、これまでに記載されている（Ｔｒｅｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＡＳＡＪＯ  Ｊ．３８，１７−２３；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７，８５１−８６０）。前記特定の実施形態によると、トランスフェクト真核宿主細胞または感染真核宿主細胞を、微孔性膜を形成する化合物でカプセル封入し、前記カプセル封入された細胞をさらにｉｎ  ｖｉｖｏで移植することができる。目的の細胞を含有するカプセルは、宿主細胞と移植細胞の接触を防止する一方、タンパク質および栄養素がカプセルの内部と外部の間を自由に通過できるような適切な分子量カットオフを有する中空の微孔性膜を用いて調製することができる（例えば、Ａｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ  Ｆａｓｅｒ  ＡＧ，Ｗｕｐｐｅｒｔａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｄｅｇｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７，２１３５−２１４６）。
【０１２５】
さらに、本開示のさらなる態様は、本開示のベクター、感染性ウイルス粒子、および／または宿主細胞を用いて融合タンパク質を組換えにより作製するための方法である。融合タンパク質を作製するための方法は、本開示のベクターまたは感染性ウイルス粒子を適切な宿主細胞に導入して、トランスフェクト宿主細胞または感染宿主細胞を作製することと、前記トランスフェクト宿主細胞または感染宿主細胞を宿主細胞の増殖に適した条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養することと、その後、前記培養物から前記融合タンパク質を回収することと、場合によっては、前記回収された融合タンパク質を精製することとを含む。当業者ならば、適切な宿主細胞における、本開示の融合タンパク質の発現に利用可能な数多くの発現系について熟知しているであろう。
【０１２６】
本開示の宿主細胞は、典型的には、本開示の１つまたは複数の核酸分子を含む１つまたは複数の組換え分子（例えば本開示のベクター）を宿主細胞にトランスフェクト／感染させることにより作製される。組換えＤＮＡ技術を使用して、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、核酸分子の転写効率、得られた転写物の翻訳効率、翻訳後修飾の効率、および適切な選択の使用を操作することによって、宿主細胞における核酸分子の発現を改善することができる。本開示の核酸分子の発現を増大させるのに有用な組換え技術としては、以下に限定されるものではないが、高コピー数ベクターの使用、ベクター安定配列の付加、１つまたは複数の転写調節配列（例えば、プロモーター、オペレータ、エンハンサー）の置換または改変、翻訳調節配列（例えば、リボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｍｏ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン使用頻度に対応させた本開示の核酸分子の改変、および転写物を不安定にする配列の欠失が挙げられる。
【０１２７】
本開示の宿主細胞は、従来の発酵バイオリアクター、フラスコ、およびペトリ皿で培養することができる。培養は、所与の宿主細胞にとって適切な温度、ｐＨ、および酸素含有量で行なうことができる。原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現に関する、公知の種々の方法を詳細に説明することは本明細書では行わない。一実施形態では、ベクターは、適切な調節エレメントに作動可能に連結された、融合体をコードする核酸分子を担持するプラスミドである。本開示の方法で使用される典型的な宿主細胞は、哺乳動物細胞株、酵母細胞、および細菌細胞である。
【０１２８】
融合タンパク質が産生細胞の外部に分泌されない場合、または完全には分泌されない場合、融合タンパク質は、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、溶解剤の使用を含む、標準的な破壊手順により細胞から回収することができる。分泌される場合は、融合タンパク質は培養培地から直接回収することができる。次いで、融合タンパク質を回収し、硫安沈澱、酸抽出、ゲル電気泳動、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、周知の精製方法により精製することができる。本開示の特定の融合タンパク質を精製するために使用される条件および技術は、合成方法、および正味電荷、分子量、疎水性、親水性などの因子に応じたものになるが、当業者には明らかであろう。また、本明細書に記載される融合タンパク質の組換え産生に使用される宿主細胞に応じて、融合タンパク質は種々のグルコシル化パターンを有することが可能であり、また非グルコシル化の状態であってもよい（例えば、細菌で産生される場合）ことは理解されよう。加えて、融合タンパク質は、宿主媒介工程の結果として、場合によっては開始メチオニンを含むことがある。
【０１２９】
本開示の融合タンパク質は、細胞物質が実質的に含まれない程度にまで「精製する」ことができる。精製レベルは使用目的に応じたものになる。重要な特徴は、相当量の他の成分が存在するとしても、調製物が融合タンパク質の所望の機能を発揮できることである。一部の用途では、「細胞物質を実質的に含まない」とは、約３０％未満（乾燥重量で）の他のタンパク質（すなわち、夾雑タンパク質）、典型的には約２０％未満の他のタンパク質、より典型的には約１０％未満の他のタンパク質、またはより一層典型的には約５％未満の他のタンパク質を含有する融合タンパク質の調製物を含む。融合タンパク質はまた、組換え産生される場合、培養培地を実質的に含まないことが可能である、すなわち、培養培地はタンパク質調製物量の約２０％未満になる。
【０１３０】
用語
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、共有結合、または生理的条件下で実質的に不可逆的な結合を付与する他の配置によって連結された分子実体を指す。例えば、２つのタンパク質、単離および／または精製ポリペプチド配列を、リンカーポリマー、例えばアミノ酸、ポリペプチド配列、エチレングリコールポリマーによって相互にコンジュゲートすることができる。１つのタンパク質をリガンドに連結し、第２のタンパク質を受容体に連結することにより、２つのタンパク質を相互にコンジュゲートすることができる（例えば、ストレプトアビジンとビオチンまたは抗体とエピトープ）。
【０１３１】
追加の処置と共に投与を記載するために使用される場合、本明細書で使用される「併用」という用語は、追加の処置の前、それと同時、もしくはその後に、またはそれらの組合せで、薬剤を投与することができることを意味する。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「被験体」とは、任意の動物、典型的にはヒト患者、家畜、または家庭内ペットを指す。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防すること」という用語は、再発、拡大、または発症の予防を含む。本開示を完全な予防に限定することを意図するものではない。一部の実施形態では、発症を遅延し、または重症度を低減する。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」という用語は、被験体（例えば、患者）を治癒させ、疾患を根絶させる場合に限定されるものではない。もっと正確に言えば、本開示の実施形態では、単に症状を軽減しかつ／または疾患進行を遅延させる治療も企図される。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」とは、タンパク質分子のアミノ酸配列を指す。「アミノ酸配列」は、タンパク質をコードする核酸配列から推定することができる。しかしながら、「ポリペプチド」または「タンパク質」などの用語は、アミノ酸配列を推定アミノ酸配列に限定することを意味するものではなく、非天然アミノ酸、推定アミノ酸配列の翻訳後修飾（例えば、アミノ酸の欠失、付加、およびグルコシル化などの修飾）、ならびに脂質部分の付加を含む。
【０１３６】
指定されたポリペプチドを「コードする核酸配列」という用語は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、すなわち換言すれば遺伝子産物をコードする核酸配列を指す。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、もしくはＲＮＡの形態で存在することができる。ＤＮＡ形態で存在する場合、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸は、一本鎖（すなわち、センス鎖）であっても、二本鎖であってもよい。例えばエンハンサー／プロモーター、スプライスジャンクション、ポリアデニル化シグナル等の適切な制御エレメントは、転写の適切な開始および／または一次ＲＮＡ転写産物の正確なプロセシングを可能にするために、必要に応じて、遺伝子のコード領域に隣接して配置させることができる。あるいは、本開示の発現ベクターで利用されるコード領域は、内因性のエンハンサー／プロモーター、スプライスジャンクション、介在配列、ポリアデニル化シグナル等を含有することも、または内因性および外因性の両方の制御エレメントの組合せを含有することもできる。
【０１３７】
核酸分子に関して言及される場合の「組換え体」という用語は、分子生物学技術によって相互に連結された核酸セグメントで構成される核酸分子を指す。タンパク質またはポリペプチドに関して言及される場合の「組換え体」という用語は、組換え核酸分子を用いて発現されるタンパク質分子を指す。
【０１３８】
「ウイルス様粒子」は、ビリオンタンパク質を含む粒子を指すが、ウイルスの遺伝物質、例えばウイルスＲＮＡを実質的に含まない。ウイルス様粒子は、異なるウイルスに由来するウイルスタンパク質を含有することができる。例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＨＡ／ＳＨＩＶ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００３，３１３（２）：５０２−１３を参照のこと。ウイルス様粒子は、脂質膜を含有することができ、ウイルスベクターを使用して発現させて粒子を生成させることにより、またはグルコシルホスファチジル−イノシトールアンカーにコンジュゲートされた抗原または他のポリペプチドとウイルス様粒子を混合することにより、その粒子表面上に種々の抗原を発現するように構築することができる。例えば、Ｓｋｏｕｎｔｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１（３）：１０８３−９４；Ｄｅｒｄａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００６，１０３（３５）１３１４４−１３１４９；Ｐｏｌｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１，３８：８０３−８１６を参照のこと。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」または「ａｎ」は、文脈により別に示唆されない限り、１つまたは複数を指す。
【実施例】
【０１４０】
ＧＩＦＴ４遺伝子およびタンパク質
マウスＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの遺伝子（ｃＤＮＡ）を、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ−Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入し、キメラ導入遺伝子およびＧＩＦＴ４融合タンパク質の両方の発現を可能にするフレームでバイシストロニックなＡＰ２レトロベクターにクローニングした。１個のアミノ酸（セリン、Ｓ）が、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のタンパク質配列間の架橋リンカーとして役立つ。マウスＧＩＦＴ４タンパク質の三次元構造を構築するために、ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の結晶構造を、ソフトウェアＰＲＯＳＰＥＣＴ  ｖ２（Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ）上でのホモロジーモデリングための鋳型として用いた。ＧＩＦＴ４をコードするレトロウイルスプラスミドを、製造業者の説明書に従って、２９３−ＧＰ２パッケージング細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）に導入した。ＧＩＦＴ４またはＧＭ−ＣＳＦもしくはＩＬ−４の遺伝子をコードする濃縮レトロ粒子を使用して、２９３Ｔ細胞またはＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を遺伝子改変した。２９３Ｔ−ＧＩＦＴ４細胞またはＢ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４細胞を、９６ウェルプレートのウェルにおけるポジティブ単細胞クローン選択からまとめてプールし、ＥＬＩＳＡによるＧＩＦＴ４タンパク質発現の検出により確認した。
【０１４１】
ＧＩＦＴ４はＢ細胞増殖を誘発する
ＧＩＦＴ４フソカインの免疫刺激作用を試験するために、親のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４のｃＤＮＡに由来するマウスＧＩＦＴ４のｃＤＮＡを、ＡＰ２レトロウイルスベクターにクローニングし、次いで２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。翻訳されたＧＩＦＴ４タンパク質の配列は、２８２個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖からなり（図１Ａ）、また予測された３Ｄ構造を示す（図１Ｂ）。ＡＰ２−ＧＩＦＴ４ベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞は、分子量が約５０ｋＤａの大量のＧＩＦＴ４タンパク質を安定して発現する（図１Ｃ）。ＧＩＦＴ４融合タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦレスポンダーＪＡＷＳＩＩ細胞（図１Ｄ）およびＩＬ−４依存性ＣＴ．ｈ４Ｓ細胞（図１Ｅ）の増殖を誘導する強力な生物活性を有する。
【０１４２】
ＧＩＦＴ４タンパク質の免疫機能を検討するために、脾細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスから単離し、ＧＩＦＴ４タンパク質を用いてその細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激し、その親分子のＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の併用と比較した。ＧＩＦＴ４は、脾細胞の増殖を誘発し（図９Ａ）、予想外にもそれはＢ細胞コンパートメントの脾細胞である（図９Ｂ）。これと一致して、ＧＩＦＴ４は、精製したＢ細胞の増殖を誘導する（図２Ａおよび２Ｂ）。ＧＩＦＴ４で処理した脾臓Ｂ細胞（ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞）の表現型を明確にするために、本発明者らは、表面マーカーのパネルを用いてＧＩＦＴ４−Ｂ細胞をプロファイリングした。ＦＡＣＳ分析から、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞がＢ２２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＭＨＣＩ／ＩＩ、ＩｇＭ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６を発現することが実証された（図２Ｃ）；後者の２つは、抗原提示細胞に対する共通マーカーである。抗マウスＩｇＭによるＢＣＲ架橋により、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞が、ＣＤ８０およびＣＤ８６のダウンレギュレーションと共に、細胞上の免疫グロブリン発現のアイソタイプをＩｇＭからＩｇＧにスイッチする可塑性を有することがさらに確認された（図２Ｄ）。
【０１４３】
ＧＩＦＴ４は抗腫瘍免疫を誘発する
Ｂ細胞によるサイトカイン分泌は、感染性病原体および腫瘍に対する自然免疫および適応免疫の両方に重要な役割を果たす。ＩＬ−４は、ＳＴＡＴ６のリン酸化を誘導するγ鎖ファミリーメンバーである。ＳＴＡＴシグナル伝達に対するＧＩＦＴ４の能力を試験するために、精製したマウスＢ細胞をＧＩＦＴ４タンパク質で刺激し、組換えＧＭ−ＳＣＦおよびＩＬ−４を個々にまたは併用して刺激した場合と比較した。ＧＩＦＴ４は、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、およびＳＴＡＴ６のリン酸化に関する機能を獲得させることができる（図３Ａ）。ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞によるサイトカイン産生を検査するために、ＧＩＦＴ４タンパク質で刺激した精製脾臓Ｂ細胞の培養上清を、サイトカインルミネックス分析に供した。セクレトームのプロファイルから、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２（図３Ｂ）、ＩＬ−５、ＶＥＧＦ、および大量のケモカインＣＣＬ３（図３Ｃ）を産生するが、ＩＬ−１０は検出不可能であり、ＩＦＮ−γはほとんど検出されず（図３Ｂ）、また他のサイトカインは低レベルであることが示された。さらに、細胞内サイトカイン染色により、ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞によるＧＭ−ＣＳＦ分泌が確認され（図３Ｄ）、その分泌量は、組換えＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を併用した対照処理のものと比較して１０倍超である（図３Ｅ）。ＧＭ−ＣＳＦ産生Ｂ細胞に対するＧＩＦＴ４タンパク質の効果をｉｎ  ｖｉｖｏで試験するために、ＧＩＦＴ４タンパク質を静脈内注射によりＢ５マウスに投与した。ＧＩＦＴ４処置の１週間後に、マウスは脾腫を発症した（図４Ａ）；ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を併用処置したマウスは、無処置マウスのように（図示せず）、正常な大きさの脾臓を示した（図４Ａ）。これらのマウスに由来する脾臓のＢ２２０＋細胞およびＣＤ３＋細胞のＦＡＣＳによるプロファイリングから、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４で処置したマウスと比較して、ＧＩＦＴ４処置マウスでは脾臓Ｂ細胞が強固に増殖することが実証された（図４Ｂ）；ＧＩＦＴ４処置マウスでは、Ｔ細胞増殖もわずかに見られた。さらに、ＧＩＦＴ４処置による、ＧＭ−ＣＳＦ分泌脾臓Ｂ細胞の誘導が、細胞内染色により確認された。ＧＩＦＴ４処置マウスにおけるＧＭ−ＣＳＦ＋Ｂ細胞のパーセントは、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４で処置したマウスのものよりも３０倍超高くなり（図１０Ｂ）、後者のマウスは、正常無処置マウスと同様であった。
【０１４４】
ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチンに対するサイトカインアジュバントとして企図される。ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞は、ＩＬ１２、ＩＬ−６、およびＩＬ−１βを分泌するが、それらは、Ｔｈ１  Ｔ細胞応答および必須の抗腫瘍サイトカインであるＩＦＮ−γの産生を増強する。したがって、ＧＩＦＴ４タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍免疫を誘発することができるであろう。これを試験するために、Ｂ１６Ｆ０メラノーマ細胞をＢ６マウスに皮下移植することにより、メラノーママウスモデルを確立した。腫瘍移植の５日後に、目に見える腫瘍がマウスに発生した。これらのマウスを、ＧＩＦＴ４タンパク質で、またはＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の併用で、または無処置対照群としてＰＢＳで処置した。２週間後、対照群のマウスまたはサイトカインを併用処置したマウスでは、大きなメラノーマ腫瘍が発生した（図４Ｃ）；これに対して、ＧＩＦＴ４処置により、腫瘍増殖は顕著に抑制された（図４Ｃ）。
【０１４５】
ＧＩＦＴ４タンパク質の抗腫瘍作用をさらに試験するために、ＧＩＦＴ４タンパク質（Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４細胞）またはＧＭ−ＣＳＦもしくはＩＬ−４サイトカインを個々に安定して発現する遺伝子改変Ｂ１６Ｆ０メラノーマ細胞株を作製した。腫瘍細胞を同系Ｂ６マウスに皮下注射した。２０日後、野生型Ｂ１６Ｆ０細胞またはＢ１６Ｆ０−ＧＭＣＳＦ細胞とＢ１６Ｆ０−ＩＬ４細胞の混合物（Ｂ１６Ｆ０−ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ４）を移植したマウスでは、実質的なメラノーマ腫瘍が発生した（図４Ｄ）；しかしながら、Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４細胞を移植したマウスでは、腫瘍増殖が劇的に阻害され、これにより、ＧＩＦＴ４発現がメラノーマ腫瘍増殖を顕著に抑制することが示された（図４Ｄ）。
【０１４６】
ＧＩＦＴ４に誘発された抗腫瘍免疫は、Ｂ細胞依存性である
抗腫瘍免疫は、自然免疫コンパートメントと適応免疫コンパートメントの２つのアームからなる。ＧＩＦＴ４タンパク質が適応アームを標的としているか否かを検査するために、機能的なＢ細胞およびＴ細胞を欠損するＲａｇ１−／−マウスにＢ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４細胞を移植した。Ｒａｇ１−／−マウスでは、メラノーマ腫瘍は急速に増殖した（図５Ａ）。Ｔ細胞は抗腫瘍免疫に役割を果たす。ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞欠損マウスでは、Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４腫瘍の増殖が観察された（図５Ｂ）。さらに、Ｂ細胞がＧＩＦＴ４誘発抗腫瘍応答おいて中心的役割を果たすか否かを試験するために、Ｂ細胞欠損μＭＴマウスにＢ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４細胞を移植した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｂ細胞に対するＧＩＦＴ４タンパク質の免疫機能と一致して、もっぱら機能的Ｂ細胞を欠損するμＭＴマウスでは、大きなサイズのメラノーマ腫瘍が発生した（図５Ｂ）。ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞は、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生を増強することができるＩＬ−１２、ＩＬ−６、およびＩＬ−１βを分泌する。ＧＩＦＴ４−Ｂ細胞がＴ細胞と相互作用して、抗腫瘍免疫を促進することができるかという仮説を試験するために、ＧＩＦＴ４タンパク質で、または個々のＧＭ−ＣＳＦもしくはＩＬ−４で、または組換えサイトカインを併用して刺激した精製Ｂ細胞とＴ細胞を共培養した。培養上清中のＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡにより定量すると、ＧＩＦＴ４刺激により、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生が強固に増大する一方（図５Ｃ）、組換えサイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４を個々に、または併用して使用した対照処置では、Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生に対して顕著な効果はないことがわかった。遺伝子ノックアウトマウスを用いると、ＩＬ−１０ではなく、ＩＬ−１２またはＩＦＮ−γを欠損したマウスでは、メラノーマ腫瘍増殖が抑制され得ないことが確認された（図５Ｄ）。
【０１４７】
腫瘍特異的抗体は、ＧＩＦＴ４誘発抗腫瘍免疫にとって重要である
Ｂ細胞免疫は、細胞性免疫応答および体液性免疫応答を含む。ＧＩＦＴ４がＢ細胞抗体応答を高めるか否かを試験するために、ＧＩＦＴ４タンパク質またはＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の混合物の存在下で、正常Ｂ６マウスをオボアルブミン（ＯＶＡ）で免疫処置した。ＯＶＡを含まない対照媒体を注射したマウスを対照として使用した（図６Ａ）。摘出した脾臓に由来するＯＶＡ特異的ＩｇＧ分泌Ｂ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析から、ＯＶＡとＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とによる処置と比較して、ＧＩＦＴ４とＯＶＡとの処置により、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原特異的抗体産生が顕著に増強されることが実証された（図６Ｂ）。対照マウスで抗原が投与されなかった場合には、脾臓に存在するＯＶＡ特異的ＩｇＧ分泌Ｂ細胞は検出できなかった。抗腫瘍特異的抗体を増加させる、アジュバントとしてのＧＩＦＴ４タンパク質の能力を検討するために、Ｂ６マウスまたはμＭＴ  Ｂ細胞欠損マウスをＢ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４メラノーマ細胞で免疫処置した。１か月後に、マウスから血清を採取した。免疫処置したマウスまたはナイーブＢ６マウスに由来する血清で処理したＢ１６Ｆ０細胞のフローサイトメトリー分析から、免疫処置したＢ６マウスに高力価の抗メラノーマ特異的抗体の存在が確認された（図６Ｃおよび６Ｄ）。Ｂ細胞欠損μＭＴマウスおよびナイーブＢ６マウスでは、血液循環中に抗Ｂ１６Ｆ０抗体を検出できない。抗メラノーマ抗体がＧＩＦＴ４誘発Ｂ細胞媒介抗腫瘍免疫に関与するか否かを試験するために、Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４メラノーマ細胞を、Ｂ６マウス、ＦｃγＲ−／−マウス、またはμＭＴマウスに皮下移植した。ＦｃγＲ−／−マウスは機能的ＩｇＧを欠損する。腫瘍増殖のモニタリングから、ＦｃγＲ−／−マウスおよびμＭＴ  Ｂ細胞欠損マウスでは、大きな腫瘍増殖が見られるが、野生型マウスでは見られないことが実証された（図６Ｅ）。Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４細胞の免疫処置がメラノーマに対する防御免疫を誘発し得るか否かを検討するために、免疫処置マウスまたは無処置マウスにＢ１６Ｆ０腫瘍細胞をチャレンジした。Ｂ１６−ＧＩＦＴ４細胞の免疫処置により、マウスにおけるメラノーマ腫瘍の発生が完全に防止された（図７Ａ）。これに対して、免疫処置を受けないマウスでは大きな腫瘍が発生した（図７Ａ）。免疫細胞の養子移入は癌細胞免疫療法のための有望なアプローチである。免疫処置したマウス由来のＧＩＦＴ４活性化Ｂ細胞により、Ｂ細胞欠損マウスに有効な抗腫瘍免疫が移行し得るか否かをさらに検討するために、Ｂ１６Ｆ０−ＧＩＦＴ４細胞をμＭＴマウスに移植した。目に見えるサイズのメラノーマ腫瘍がマウスに発生した場合に、免疫処置したマウスから精製した脾臓Ｂ細胞を、マウスに養子移入した。腫瘍サイズの測定から、免疫処置したマウス由来のＢ１６Ｆ０プライミングＢ細胞の養子移入により、Ｂ細胞欠損μＭＴマウスにおけるメラノーマ腫瘍増殖が顕著に阻害されることがわかった（図７Ｂ）。Ｂ細胞養子移入を受けなかったマウスでは、大きなサイズのメラノーマ腫瘍が発生した。
【０１４８】
ヒトＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４に由来する融合サイトカインは、白血病性Ｂ細胞を抗ＣＬＬエフェクターに再プログラムする
ヒトＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４に由来するフソカインＧＩＦＴ４を作製して、慢性リンパ性白血病Ｂ細胞（ＣＬＬ−Ｂ細胞）に対するその免疫機能を試験した。（図１１）ヒトＧＩＦＴ４タンパク質は、白血病性Ｂ細胞を抗ＣＬＬエフェクターおよびヘルパーに再プログラムする。（図１０）ＧＩＦＴ４は、もっぱらＳＴＡＴ５の過剰リン酸化を介してＣＬＬ  Ｂ細胞を活性化した。正常ヒトＢ細胞の増殖誘導と異なり、ＧＩＦＴ４はＣＬＬ  Ｂ細胞の増殖を誘発しなかった。（図１２）ＧＩＦＴ４変換ＣＬＬ  Ｂ細胞は、共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の発現をアップレギュレートし、抗原提示細胞のように挙動し、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＣＡＭ１、および大量のＩＬ−２を分泌した。（図１３）ＧＩＦＴ４−ＣＬＬ  Ｂ細胞はさらに、ＩＦＮ−γ産生自己細胞傷害性ＮＫおよびＴ細胞の増殖を推進した。共培養ＧＩＦＴ４処理ＣＬＬ細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで初代自己ＣＬＬ細胞の死滅を顕著に増大させた。（図１４）まとめると、これらのデータから、ＧＩＦＴ４は、白血病性Ｂ細胞を抗ＣＬＬヘルパー細胞に再プログラムすることにより、強力な抗ＣＬＬ免疫機能を有することが実証される。フソカインＧＩＦＴ４タンパク質およびＧＩＦＴ４変換ＣＬＬ−Ｂ細胞は、ＣＬＬ治療のための新規の免疫療法として役立つであろう。
【０１４９】
細胞培養
ＧＩＦＴ４分泌２９３Ｔ細胞もしくはＢ１６Ｆ０メラノーマ細胞株、またはトランスフェクトされていない細胞は、１０％のＦＢＳ（Ｗｉｓｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０Ｕ／ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質（Ｗｉｓｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｗｉｓｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｌｉｎ，ＣＡ）中で培養した。培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡアッセイおよびウエスタンブロットのために無菌遠心濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で濃縮した。２９３Ｔ−ＧＩＦＴ４細胞の濃縮培養上清はさらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために用いた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の脾細胞またはＢ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）によるネガティブセレクションにより脾細胞から精製したＢ細胞（１０５細胞／ウェル）を、２ｎｇ／ｍｌのＧＩＦＴ４タンパク質または組換えＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４対照タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）の存在下、完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で６日間培養した。あるいは、Ｂ細胞をＣＦＳＥ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識し、会社の説明書に従い、細胞増殖アッセイのために完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
【０１５０】
ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット
移入された２９３ＴまたはＢ１６Ｆ０メラノーマ腫瘍細胞により発現されたＧＩＦＴ４タンパク質の定量は、マウスＧＭ−ＳＣＦまたはＩＬ−４用のＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、会社の説明書に従って行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴリンパ球によるＩＦＮ−γ産生は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキットで測定した。インタクトなマウスＧＩＦＴ４タンパク質は、抗マウスＭＧ−ＳＣＦまたは抗ＩＬ−４特異的抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるウエスタンブロットにより分析した。Ｂ細胞におけるＧＩＦＴ４刺激により活性化されたＳＴＡＴリン酸化は、抗ｐＳＴＡＴ１、抗ｐＳＴＡＴ３、抗ｐＳＴＡＴ５、抗ｐＳＴＡＴ６、または抗ＳＴＡＴ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いるウエスタンブロットによりプロファイリングした。
【０１５１】
ＭＴＴアッセイ
ＧＩＦＴ４タンパク質のＩＬ−４またはＧＭ−ＣＳＦの融合コンパートメントの生物活性を測定するために、ＩＬ−４応答性ＣＴ．ｈ４Ｓ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡのＷｉｌｌｉａｍ  Ｐａｕｌ博士の研究室からの提供）およびＧＭ−ＣＳＦ応答性ＪＡＳＷＩＩ細胞を、９６ウェルプレートにウェル当たり５，０００個の細胞密度で播種し、２ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ−４サイトカインまたは１０ｎｇ／ｍｌの組換えＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）をそれぞれ添加した、またはＧＩＦＴ４タンパク質（ＣＴ．ｈ４Ｓ細胞に対しては２ｎｇ／ｍｌ、ＪＡＳＷＩＩ細胞に対しては１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
【０１５２】
７２時間の培養後、３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液２０μＬを加え、３７℃で４時間インキュベートした。細胞ペレットを無水ＤＭＳＯ（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）２００μＬに溶解し、マイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で５７０ｎｍの吸光度を読み取った。
【０１５３】
細胞フローサイトメトリー
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＩＦＴ４処理脾細胞を、ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＢ２２０抗体およびＰＥコンジュゲート抗マウスＣＤ３抗体で染色した。Ｂ細胞およびＴ細胞のプロファイルを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター上で細胞フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により分析した。脾細胞から精製したＧＩＦＴ４処理Ｂ細胞の表面マーカーを、Ｂ細胞表面マーカーのパネルを用いてフローサイトメトリーによりプロファイリングした（抗Ｂ２２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＩｇＭ、ＩｇＧ）（ＢＤ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。細胞内ＧＭ−ＣＳＦ染色のために、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）溶液でＢ細胞を固定し透過性にした後、ＧＭ−ＣＳＦ抗体染色を行った。あるいは、０、２、および４日目に、マウスＧＩＦＴ４タンパク質（２０ｎｇ）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈注射した。組換えマウスＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（２０ｎｇ）をタンパク質対照として使用した。６日目に処置マウスの脾臓から脾細胞を単離した。全Ｂ細胞およびＴ細胞を、抗Ｂ２２０抗体および抗ＣＤ３抗体（ＢＤ）を用いる細胞フローサイトメトリーによりプロファイリングし、脾臓当たりの細胞数を計算した。免疫処置マウスまたは対照マウスからの血清とメラノーマ細胞とをインキュベートした後、ＡＰＣコンジュゲートロバ抗マウス二次抗体（ＢＤ）の染色を行うことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＢ１６Ｆ０メラノーマ細胞に対する特異的抗体の産生をＦＡＣＳにより検討した。ＦＡＣＳデータをＦｌｏｗＪｏ  ９．１ソフトウェアで分析した。
【０１５４】
Ｂ細胞ＥＬＩＳｐｏｔ
ＧＩＦＴ４タンパク質（２０ｎｇ／マウス／時間）またはＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の組合せ（２０ｎｇ／マウス／時間）を添加したＯＶＡタンパク質（１０μｇ／マウス／時間）を、０日目および７日目にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに腹腔内注射により投与した。サイトカイン処置を受けなかったマウスをブランク対照（各群においてｎ＝５）として使用した。１４日目に、脾臓を摘出し、Ｂ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）によるネガティブセレクションにより脾細胞からＢ細胞を精製した。５０，０００個のＢ細胞当たりのＯＶＡ特異的ＩｇＧ分泌細胞の数を、製造業者が提供の説明書に従い、Ｂ細胞ＥＬＩＳｐｏｔキット（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）により分析した。
【０１５５】
ルミネックスアッセイ
５日目にＧＩＦＴ４処理Ｂ細胞の培養上清を収集し、製造業者の説明書に従い、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで実施されたマウス２６−ｐｌｅｘサイトカインポリスチレンビーズキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いるルミネックスアッセイに供した。サイトカインごとに、試料当たり１００ビーズを下限としてルミネックス２００機器で試料を読み取った。
【０１５６】
マウスメラノーマモデル
Ｂ１６Ｆ０メラノーマ細胞またはＧＩＦＴ４産生Ｂ１６Ｆ０メラノーマ細胞（１０６／マウス）を、同系Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスまたはＲａｇ１−／−マウス、ＣＤ４−／−マウス、ＣＤ８−／−マウス、μＭＴ（Ｂ細胞欠損）マウス、もしくはＦｃγＲ−／−（ＩｇＧ機能欠損）マウスに皮下移植した。あるいは、ＧＩＦＴ４分泌Ｂ１６Ｆ０細胞（１０６細胞／マウス）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに皮下免疫処置した。３０日後に、野生型Ｂ１６Ｆ０メラノーマ細胞（１０６／マウス）を免疫処置したマウスに移植した。免疫処置しなかったマウスを対照として使用した。加えて、免疫処置マウスまたは対照マウスから単離した１０００万個の脾細胞または５００万個の精製Ｂ細胞を、予め確立したＢ１６Ｆ０メラノーマを有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈内注射により養子移入した。ＧＩＦＴ４タンパク質の抗腫瘍作用を試験するために、予め確立したＢ１６Ｆ０腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、２日間隔で１００ｎｇ／日／マウスのマウスＧＩＦＴ４を３回投与した。加えて、免疫処置したマウス由来の精製脾臓Ｂ細胞（１０×１０６細胞／マウス）を、予め確立したＢ１６Ｆ０腫瘍を有するμＭＴマウスに養子移入した；細胞養子移入を受けなかったマウスを対照として使用した。腫瘍増殖をデジタルカリパスで測定した。用いたマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した雌性マウス（６〜８週齢）である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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