(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号CGMCC NO. 7294である、アクチノプラーネス属(Actinoplanes sp.) HS-16-20細菌株。
【請求項２】
フィダキソマイシン又はフィダキソマイシンを含む医薬組成物を製造するための請求項1に記載のアクチノプラーネス属HS-16-20細菌株の使用。
【請求項３】
請求項1に記載のアクチノプラーネス属HS-16-20を、同化可能な炭素源及び/又は窒素源を含む栄養培地中で好気性発酵を行う工程を備える、フィダキソマイシンの製造方法。
【請求項４】
前記同化可能な炭素源が、蔗糖、ブドウ糖、果糖、ラムノース、ラフィノース、キシロース、アラビノース、工業用糖蜜、ラクトース、ガラクトース、麦芽糖、トレハロース、キシラン、デキストリン、澱粉、ソルビトール、サリシン、イノシトール、マンニトール、グリセロール、グリシン、イヌリンからなる群から１つ以上選択される、請求項3に記載の製造方法。
【請求項５】
前記同化可能な窒素源が、牛肉エキス、酵母エキス、酵母エッセンス、酵母粉、ペプトン、トリプトン、グルテンミール、綿実ケーキ粉、ピーナッツミール、大豆ミール、コーンスティープ粉末、ふすま、尿素、アンモニウム塩、硝酸塩からなる群から１つ以上選択される、請求項3に記載の製造方法。
【請求項６】
前記好気性発酵が、温度20℃-40℃、pH6.0-8.0で、144-240時間実施される、請求項3〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記好気性発酵が、温度25℃-30℃、pHは7.0で実施される、請求項6に記載の製造方法。
【請求項８】
前記好気性発酵が、通気量0.5-1.0vvmで実施される、請求項3〜7のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記好気性発酵が液内発酵で実施される、請求項3〜8のいずれか1項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、出願日が2013年10月16日である中国の特許出願CN201310501389.3の優先権を主張する。本願は前述の中国特許出願の全部を引用する。
【０００２】
本発明は、微生物工学分野に関し、特にアクチノプラーネス属株、及びそのフィダキソマイシン(Fidaxomicin)調製における使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
クロストリジウムディフィシルによる下痢、大腸炎、及び他の腸疾患は、高病原性と高死亡率の特性がある。2003年には、クロストリジウムディフィシルはカナダの複数の州に感染症の流行を起こした。2008年10月まで、高病原性と高死亡率を有するクロストリジウムディフィシルリボソーム027型は、少なくともアメリカの40の州の病院に感染症の流行を起こした。北米に027型を発見した直後、ヨーロッパでは17ヵ国で、クロストリジウムディフィシルの爆発流行が相次いで発生した。ヨーロッパでは、クロストリジウムディフィシルは必須監視の病原体に分類されていて、欧州疾病予防管理センター（ECDC）の指導の下で、それぞれ2002年、2005年、2008年に、三回の全ヨーロッパでの疫学的調査を行った。クロストリジウムディフィシルに係る下痢(CDAD)を治療することは、長年の間重要な研究課題であり、CDADを治療する新薬を捜すことは、薬剤の研究者の重要な任務である。
【０００４】
2011年、アメリカFDAは、Optimer製薬会社に対し、マクロライド系薬剤であるフィダキソマイシン(Fidaxomicin)、商品名Dificidの製造を承認し、当該薬剤は、クロストリジウムディフィシルに係る下痢(CDAD)の治療に用いる。フィダキソマイシンはR-チアクミシンBである。1986年に、Robertなどは、米国特許4918174において、ダクチロスポランギウム(Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis NRRL 18085)が発酵してグラム陽性菌を効果的に抑制する抗生物質であるチアクミシン(Tiacumicin)を産生すること、及びそのチアクミシンの構造を初めて開示した。リピアルマイシン(Lipiarmycins)は、Tiacumicinに密接に関連する化合物であり、リピアルマイシン(Lipiarmycins)A3とB3とはそれぞれチアクミシン(Tiacumicins)BとCと同じである(J.Antibiotics、1988、308-315.)。米国特許3978211には、リピアルマイシン(Lipiarmycins)及び生産菌であるアクチノプラネス・デカネンシス(Actinoplanes deccanensis A/10655 ATCC 21983)が開示されている。J.Antimicrobial Chemotherapy 2008, 62,713-719には、Lipiarmycin A3の生産菌Catellatospora sp. Bp3323- 81が開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のTiacumicin及びLipiarmycinの生産菌は、所望生成物(Tiacumicin及びLipiarmycin)の力価が低い、産量の信頼性が低い、不安定である、生産コストが高いなどの欠点を有するので、フィダキソマイシン(Fidaxomicin)の新しいい効率的な生産菌種を捜す作業は、まだ継続している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、フィダキソマイシンを生産する能力を有する、寄託番号がCGMCC NO.7294である、新しいアクチノプラーネスHS-16-20(Actinoplanes sp. HS-16-20)を提供することを、目的の一つとする。
【０００７】
また、本発明は、フィダキソマイシン又はその類似物の生産に、或いはフィダキソマイシンを含む医薬組成物の生産に使用できる、アクチノプラーネスHS-16-20(CGMCC NO.7294)(Actinoplanes sp. HS-16-20)を提供することを、他の目的とする。
【０００８】
また、本発明は、アクチノプラーネスHS-16-20(CGMCC NO.7294)を採用して、フィダキソマイシン又はその類似物を調製する方法を提供する。その方法は、アクチノプラーネスHS-16-20(CGMCC NO.7294)を採用して、同化可能な炭素源及び/又は窒素源を含む栄養培地中で好気性発酵を行うプロセスを備える。
【０００９】
好ましくは、上記同化可能な炭素源は、蔗糖、ブドウ糖、果糖、ラムノース、ラフィノース、キシロース、アラビノース、工業用糖蜜、ラクトース、ガラクトース、麦芽糖、トレハロース、キシラン、デキストリン、澱粉、ソルビトール、サリシン、イノシトール、マンニトール、グリセロール、グリシン、イヌリンからなる群から選択される一種又は複種である。
【００１０】
好ましくは、上記同化可能な窒素源は、牛肉エキス、酵母エキス、酵母エッセンス、酵母粉、ペプトン、トリプトン、グルテンミール、綿実ケーキ粉、ピーナッツミール、大豆ミール、コーンスティープ粉末、ふすま、尿素、アンモニウム塩、硝酸塩からなる群から選択される一種又は複種である。
【００１１】
好ましくは、前記好気性発酵の温度は20℃-40℃であるが、25℃-30℃であることが好ましい、pHは6.0-8.0であるが、7.0であることが好ましい、時間は144-240時間であり、通気量は0.5-1.0vvmである。
【００１２】
好ましくは、前記好気性発酵のやり方は液内発酵である。
【００１３】
また、本発明は、フィダキソマイシンを単離精製する方法を提供する。その方法は、発酵液を、抽出、濃縮、カラムクロマトグラフィー等により精製する工程によって、その化合物を調製する。
【００１４】
フィダキソマイシンは、以下：
HPLCカラム：5μm、4.6×250nmのC18カラム；、
移動相A相：0.05%リン酸(v/v)；
移動相B相：90%アセトニトリル(v/v)で；
流速：1.00ml/min；
検出波長：250nm；
プログラム：0-20min：5%-100%B相、20-21min：100%B相、21-22min：100%-5%B相；
注入量：10μl；
の条件でHPLC検出を行う。
【００１５】
本発明で採用したフィダキソマイシン産生菌は、アクチノプラーネスHS-16-20(CGMCC NO.7294)である。
【００１６】
本発明のアクチノプラーネスHS-16-20(CGMCC NO.7294)の微生物菌種は、2013年3月11日に、中国微生物菌種保藏管理委員会普通微生物中心に(アドレス：北京朝陽区北辰西路第1院、中国科学院微生物学研究所)寄託番号はCGMCC NO.7294で保存され、分類名称はアクチノプラーネスActinoplanes属であり、登録され、生存が保証されている。
【００１７】
本発明のアクチノプラーネスHS-16-20の主な生物学的特性は、コロニーの色がオレンジであり、コロニーの形が円形であり、表面にはしわの突起があり、直径が中型(約6mm)であり、コロニーがやや湿潤であり、菌糸と培地との結合が緩やかであるため、容易に拾うことが出来る。
【００１８】
本発明は、アクチノプラーネスHS-16-20の形態学および分子レベルの特性を説明する。既知のチアクミシン及びチアクマイシンの産生菌と形態学および分子レベルで比較することによって、アクチノプラーネスHS-16-20がアクチノプラーネスに属すが、既知のチアクミシン及びチアクマイシン産生菌であるDactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis NRRL 18085及びActinoplanes deccanensis A/10655 ATCC 21983、Catellatospora sp. Bp3323- 81と異なって、完全に新しい菌種であることを、認定できる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のアクチノプラーネスHS-16-20は、従来技術のフィダキソマイシン産生菌と比較して、以下の利点がある。
【００２０】
本発明のアクチノプラーネスHS-16-20は発酵単位が向上する。本発明のアクチノプラーネスHS-16-20は、フィダキソマイシン又はその類似物の産量が、元の菌種より大幅に向上し、工業生産の実現に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図1は本発明に係る実施例8で取得したフィダキソマイシン純品のHPLCスペクトログラムである。
【図２】図2は本発明に係る実施例8で取得したフィダキソマイシン純品のESI/MSスペクトログラムである。
【図３】図3は本発明に係る実施例8で取得したフィダキソマイシン純品の1H-NMRスペクトログラムである。
【図４】図4は本発明に係る実施例8で取得したフィダキソマイシン純品の13C-NMRスペクトログラムである。
【実施例】
【００２２】
下記の実施例において、培地液のpH値を調整するための試薬は、すべて本分野で従来使用されるNaOH溶液又は塩酸である。
【００２３】
下記の実施例には、各培地は、すべて水で定容される。各培地は、前記調合指図書に基づいて原料を計量して、各原料を十分に混合して、水を必要な体積まで追加して、NaOH溶液又は塩酸によって必要なpH値に調整される。
【００２４】
本発明に使用する培地の調合指図を以下に示す。
【００２５】
ISP1培地（g/L）：グリセリン10.0、アスパラギン1.0、K2HPO4 1.0、微量元素溶液1.0ml、寒天15.0、pH 7.0-7.4。ここで、前記微量元素溶液の構成（g/L）は、FeSO4.7H2O 0.1、MnCl2.4H2O 0.1、ZnSO4.7H2O 0.1である。
ISP2培地（g/L）：酵母エッセンス末4.0、麦芽エキス末10.0、ブドウ糖4.0、寒天15.0、pH 7.3。
ISP3培地（g/L）：燕麦寒天72.5、寒天2.5、微量元素溶液1.0ml、pH 7.0-7.4。ここで、前記微量元素溶液の構成（g/L）は、FeSO4.7H2O 0.1、MnCl2.4H2O 0.1、ZnSO4.7H2O 0.1である。
ISP4培地（g/L）：可溶性澱粉10.0、K2HPO4 1.0、MgSO4.7H2O 1.0、NaCl 1.0、（NH4）2SO4 2.0、CaCO3 2.0、微量元素溶液1.0ml、寒天15.0、pH 7.0-7.4。ここで、前記微量元素溶液の構成（g/L）は、FeSO4.7H2O 0.1、MnCl2.4H2O 0.1、ZnSO4.7H2O 0.1である。
ISP5培地（g/L）：ブドウ糖10.0、アスパラギン0.5、K2HPO4 0.5、寒天15.0、pH 7.0-7.4。
ISP9培地（g/L）：（NH4）2SO4 2.64、KH2PO4 2.38、K2HPO4 5.65、MgSO4.7H2O 1.00、CaCl2.2H2O 0.10、寒天15.00、微量元素溶液1ml。ここで、前記微量元素溶液の構成（g/L）は、CuSO4.5H2O 0.64、FeSO4.7H2O 0.11、MnCl2.4H2O 0.79、ZnSO4.7H2O 0.15である。
Gauserime 1合成寒天培地（g/L）：可溶性澱粉20.0、KNO3 1.0、K2HPO4 0.5、MgSO4.7H2O 0.5、NaCl 0.5、FeSO4.7H2O 0.01、pH 7.2-7.4。
リンゴ酸カルシウム寒天培地（g/L）：リンゴ酸カルシウム10.0、グリセリン10.0、K2HPO4 0.05、NH4Cl 0.5、寒天15.0、pH 7.2-7.4。
LB培地（g/L）：トリプトン10.0、NaCl 10.0、酵母エッセンス5.0、寒天15.0、pH 7.0。
YMS培地（g/L）：酵母エッセンス4.0、麦芽エキス10.0、ブドウ糖4.0、微液5ml。前記微液の構成（g/L）は、MgSO4.7H2O 80.0、CaCO3 20.0、FeSO4.7H2O 6.0、ZnSO4.7H2O 2.0、MnSO4.7H2O 2.0、CoCl3.6H2O 0.5、NaMoO4.2H2O 1.0である。
ツァペック培地（g/L）：蔗糖30.0、NaNO3 3.0、K2HPO4 1.0、MgSO4.7H2O 0.5、KCl 0.5、FeSO4.7H2O 0.01、寒天20.0、pH 6.0-6.5。
GYEA培地（g/L）：ブドウ糖 10.0、酵母エッセンス末10.0、pH 6.8。
【００２６】
本発明において比較のために使用される株の供給源を以下に示す。
【００２７】
Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis NRRL 18085：アメリカのNRRL（Agricultural Research Service Culture Collection）から購入した。    Actinoplanes deccanensis A/10655 ATCC 21983：アメリカのATCC（American type culture collection）から購入した。
Catellatospora sp. Bp3323- 81：スイスのNovartis社から購入した。
【００２８】
実施例1：菌種の供給源
アクチノプラーネスHS-16-20（Actinoplanes sp. HS-16-20 、CGMCC NO.7294）は、浙江省台州白雲山頂の土壌試料から分離した放線菌類である。
【００２９】
台州白雲山の区切る領域で、交差サンプリングを行った。ランダムで5個のサンプリング点を選び、毎点で土壌試料を10g取って、三角フラスコに入れて、均一に混合して10gを試料とし、90mL脱イオン水を有する三角フラスコ（フラスコに一つの磁気撹拌機を有する）に添加して、30 minワールプール攪拌して、それらを十分に混合して懸濁液である10-1菌液を調製した。平板塗布希釈法によって、上記懸濁液と滅菌水とを体積比1 : 9で希釈して、10-2、10-3、10-4、10-5の希釈倍の菌液を調製し、それらを0.1mL取って、IPS2培地平板の表面に滅菌塗り棒で軽く塗布して、室温で30 min静置して28℃のインキュベーターに置いた。コロニーを成長させた後、コロニーの色、透明度、コロニーの表面、縁の形状を観測して記録して、その特徴が一致しているかどうかを検査した。形態特徴が一致したコロニーを選んで点播操作を行い、且つ点播した平板を28℃のインキュベーターに置いて8日培養し、菌糸が成熟した後、1000株の初めに選別する菌種を選んで、無菌条件下で接種シャベルを用いて上記初めに選別する菌種を剥ぎ取り、それぞれ250mL三角フラスコ (毎フラスコに25mL播種培地を有する)に接種して、28℃条件で28時間振盪培養して、播種溶液を得た。播種溶液は、15-20%の移種量でそれぞれ250mL三角フラスコ (毎フラスコ20mL発酵培地を有する)に接種して、28℃条件で8日振盪培養して、発酵液中に存在するフィダキソマイシンの含有量をHPLCにより検出して、最も高収量の菌種、即ちアクチノプラーネスHS-16-20(Actinoplanes sp. HS-16-20)を選び出した。
【００３０】
実施例2：アクチノプラーネスHS-16-20(Actinoplanes sp. HS-16-20、CGMCC NO.7294)の形態学及び培養学の特徴
Manual of Systematic Identification of Common Bacteria, Molecular Cloning: A Laboratory Manual and Chinese Pharmacopoeia (2010 Edition)に従い、実験を行った。菌種の形態学及び培養学の特徴実験は、ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、Gauserime 1合成寒天培地、リンゴ酸カルシウム、LB、YMS、及びツァペック培地の10種の培地を採用して、28℃で7〜10日培養して、菌糸体の色及び色素状況を観察した。その結果を表1に示す。
【表１】
0006367957.tif 000002
【００３１】
実施例3：アクチノプラーネスHS-16-20(Actinoplanes sp. HS-16-20、CGMCC NO.7294)の生理生化学特徴
【００３２】
炭素源の使用：ISP9を基礎培地として、各炭素源の最終濃度は1.0%である。その結果は表2に示す。
【００３３】
無機窒素源の使用：ISP9を基礎培地として、硝酸カリウム及び硫酸アンモニウムの濃度は0.1%である。その結果は表2に示す。
【００３４】
分解試験及びNaClの耐性試験に採用する基礎培地はGYEA(pH6.8)であり、分解試験の結果は表3に示し、NaClの耐性試験の結果は、アクチノプラーネスHS-16-20(Actinoplanes sp. HS-16-20)がNaClに対する良好な耐性を示し、10%NaCl下でも尚も生存できた。
【００３５】
酸化酵素及びカタラーゼ試験、pH試験、温度試験において、YMS培地を採用した。それらの結果において、菌種は14℃〜45℃で成長し、最適成長温度が28℃であり、pH5.0−7.5で成長し、最適成長の範囲がpH6.5−7.0であった。酸化酵素及びカタラーゼ試験の結果は、表4に示す。
【００３６】
M.R、V-P、及びウレアーゼ試験は、Manual of Systematic Identification of Common Bacteriaに従い実施された。その結果は、表4に示す。
【００３７】
生理生化試験：温度実験の以外、全て28℃で7〜9日培養する。その結果は、表4に示す。
【表２】
0006367957.tif 000003
【表３】
0006367957.tif 000004
【表４】
0006367957.tif 000005
備考：表1-4において、 0：成長無し、1：成長が鈍い、2：成長が可能、3：良好な成長、4：最良の成長、＋：陽性、−：陰性。
【００３８】
実施例4：16SrDNAの配列分析及び菌種同定
試験ための菌種の新鮮菌体を収集し、溶液菌酵素法によって改善したPitcher法(Letters in Applied Microbiology, 1989, 8:151-156)を採用して全DNAテンプレートを抽出し、ユニバーサルプライマー(27Fと1495R)を採用して、16S rRNAの遺伝子増幅を行い、PCR産物を検出して精製して直接配列決定を行った。配列決定は、上海生物エンジニアリング技術株式会社で行った。配列決定した16S rDNA配列は、この菌種の分類学的地位を確認するために、BLASTを用いてGenBankデータベース中の関連の種、属の配列と相同配列と比較された。
【００３９】
菌種HS-16-20(CGMCC NO.7294) 16S rDNA配列と、GenBank中の関連の配列ととのBLAST比較のの結果は表5 (表に相同性が高い菌種のみを表示する)に示す。
【表５】
0006367957.tif 000006
【００４０】
菌種HS-16-20(CGMCC NO.7294)は、16S rDNA領域の配列決定によって、アクチノプラーネス(Actinoplanes sp.)と高い相同性があることが認められ、相同性は最高で99%に達した。同時に、菌種HS-16-20 (CGMCC NO.7294)に対して外観上の特徴試験を行って、その菌種がアクチノプラーネス(Actinoplanes sp.)に分類する関連パラメータに非常に近いことが見出された。従って、菌種HS-16-20(CGMCC NO.7294)はアクチノプラーネス(Actinoplanes sp.)菌種として分類された。
【００４１】
アクチノプラーネスHS-16-20(CGMCC NO.7294)と他のチアクミシン及びチアクマイシン産生菌との間の比較
US4918174の記載によると、チアクミシン産生菌であるDactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis NRRL 18085菌種は、リンゴ酸カルシウム培地中で成長するが、ツァペック蔗糖培地中で成長し難く、基質菌糸がオレンジ色であり、気菌糸がない。その生理的及び生化学的特徴は、ゼラチン液化が陰性(-)であり、澱粉加水分解が陽性(+)であり、牛乳凝固が陰性(-)であり、牛乳ペプトンが陽性(+)であり、硫化水素の生成が陽性(+)であり、硝酸塩還元が陽性(+)である。それに対して、アクチノプラーネスHS-16-20は、ツァペック培地中で成長し、気菌糸があり、牛乳ペプトンが陰性(-)であり、硫化水素の生成が陰性(-)である。
【００４２】
US3978211に記載されているチアクマイシン産生菌Actinoplanes deccanensis A/10655 ATCC 21983は、リンゴ酸カルシウム培地及びツァペック蔗糖培地中で成長し難く、培地に応じてコロニーの色は淡黄色からオレンジ色へ変化し、気菌糸がない。その生理的及び生化学的特徴は、ゼラチン液化が陽性(+)であり、澱粉加水分解が陽性(+)であり、牛乳凝固が陰性(-)であり、牛乳ペプトンが陰性(-)であり、硫化水素の生成が陰性(-)であり、硝酸塩還元が陽性(+)である。それに対して、アクチノプラーネスHS-16-20は、リンゴ酸カルシウム培地及びツァペック蔗糖培地中で成長し、様々な培地中で気菌糸を有し、ゼラチン液化が陰性(-)である。
【００４３】
Antimicrobial Chemotherapy 2008, 62,713-719及びJournal of Northwest A&F University (Natural Science Edition) 2007,35(10),213-218に記載されているチアクマイシン産生菌であるCatellatospora sp.は、Gauserime 1合成寒天培地中で成長し（他の培地に関する成長状況は記載されていない）、基質菌糸が断線しない、寒天表面に単一又は塊の短い胞子鎖を生じ、気菌糸がない。その生理的及び生化学的特徴は、澱粉加水分解が陽性(+)であり、牛乳凝固が陰性(-)であり、牛乳ペプトンが陽性(+)であり、硫化水素の生成が陰性(-)である。それに対して、アクチノプラーネスHS-16-20はGauserime 1合成寒天培地中で気菌糸を生じ、牛乳ペプトンが陰性(-)である。
【００４４】
前記本発明に係るアクチノプラーネスHS-16-20(CGMCC NO.7294)の形態学、培養特徴、生理生化特徴、及びDNA配列同定結果を合わせて、菌種HS-16-20(CGMCC NO.7294)は、アクチノプラーネス属に属すが、既知のチアクミシン(Tiacumicin)及びチアクマイシン(Lipiarmycins)産生菌と異なるものであり、アクチノプラーネスHS-16-20(Actinoplanes sp. HS-16-20) (CGMCC NO.7294)は完全に新しい菌種である。
【００４５】
実施例5：フィダキソマイシンの調製
(1) 平板コロニーの調製及び培養
平板に採用されたISP2培地(g/L)：ブドウ糖4、酵母エッセンス4、麦芽エキス10、寒天15を、pH7.3の蒸留水1000mLで希釈した。圧力1.05kg/cm2で20分間オートクレーブにかけ、50-60℃まで冷却してから平板に注いだ。これに一掬い菌体を接種して28+1℃で8日培養して、菌糸を成熟させた。
【００４６】
(2) 播種溶液の調製及び培養
播種培地の構成(g/L)：蔗糖2、ソルビトール3、綿実ケーキ粉3、ピーナッツミール1.5、CaCO3 0.6、MgSO4.7H2O 0.3、pH 7.2。振盪フラスコの液量は25mL/250mLであり、121℃で30分間滅菌した。菌体の接種量は105-106 c.f.u./mLであり、培養温度が28±1℃であって、250 rpmの揺動床で28時間の振盪培養を行った。このとき、培養液はpHが6.8-7.0であり、菌糸濃度が25-30%(体積百分率)であった。
【００４７】
(3) 発酵液の調製及び培養
発酵培地の構成(g/L)：蔗糖 10、ソルビトール2、可溶性澱粉3、(NH4)2SO4 0.5、牛肉エキス2、ピーナッツミール1、 KH2PO4 0.04、pH7.0。振盪フラスコの液量は20mL/250mLであり、121℃で20分間滅菌した。種子液を15-20% (体積百分率)の接種量で接種した。28±1℃、250rpmの揺動床で8日の振盪培養を行い、発酵が終了した後、HPLC検出を行って、検出した発酵単位は5250μg/mLであった。
【００４８】
実施例6：フィダキソマイシンの調製
平板コロニーの調製及び種子液の調製は、実施例5を参照されたい。
【００４９】
発酵培地の構成(g/L)：マルトデキストリン6、可溶性澱粉8、乳糖2、大豆ミール1.5、グルテンミール 1、酵母粉1、 CaCO3 0.4、 KCl 0.2、MgCl2.7H2O 0.2、pH 7.0。振盪フラスコの液量は25mL/250mLであり、121℃で20分間滅菌した。播種溶液を20% (体積百分率)の接種量で接種した。30±1℃、250rpmの揺動床で8日の振盪培養を行い、発酵が終了した後、HPLC検出を行って、検出した発酵単位は3892μg/mLであった。
【００５０】
実施例7：フィダキソマイシンの調製
平板コロニーの調製及び種子液の調製は、実施例5を参照されたい。
【００５１】
発酵培地の構成(g/L)：工業用糖蜜8、果糖 2、グリセリン 3、麦芽糖 3 、ペプトン 1、トリプトン 1.5、酵母エキス 0.5、牛肉エキス0.5、 尿素 0.2、クエン酸トリアンモニウム0.5、MgSO4.7H2O 0.2、CaCl2 0.4、pH 7.0。振盪フラスコの液量は40mL/500mLであり、121℃で20分間滅菌した。播種溶液を10% (体積百分率)の接種量で接種した。30±1℃、250rpmの揺動床で9日の振盪培養を行い、発酵が終了した後、HPLC検出を行って、検出した発酵単位は3156μg/mLであった。
【００５２】
実施例8：フィダキソマイシンの調製及び単離精製
【００５３】
（1）播種槽中の播種溶液の調製
15L播種槽に10Lの播種培地(播種培地の割合は実施例5と同じである)を添加し、121℃条件で30分の蒸気滅菌により滅菌し、冷却後、100mL振盪フラスコの種子液を接種し、培養温度28+1℃、攪拌速度200rpm、通気量1vvmで、24時間培養した。そのとき、培養液はpHが6.8-7.0であり、菌糸濃度が25-30%(v/v)であった。
【００５４】
（2）発酵槽培地の調合及び培養
発酵培地の構成は前記実施例5と同じであるが、1%PPGを消泡剤として添加した。発酵槽の体積は50Lであり、材料体積は35Lであり、pHは7.0であり、これを121℃で20分間蒸気滅菌した。冷却後、約3.5Lの播種溶液を接種し、発酵温度28+1℃、攪拌速度200-300rpm、通気量0.8-1.0vvmで、8日発酵して培養した。発酵槽を開け、菌糸の濃度を試験したところ、4855μg/mLであった。
【００５５】
(3) 発酵液の抽出
上記開けられた発酵槽の発酵液30Lをフレーム濾過し、濾過ケーキを30L無水エタノールに浸し、均一に攪拌して、室温で30min静置し、上澄の有機相を集め、混合して保存した。
【００５６】
(4) 有機相の濃縮及び樹脂カラムクロマトグラフィーによる精製
上記混合した有機相を、40℃水浴で、約15Lになるまで-0.1Mpa真空中で濃縮した。濃縮液を、4Lマクロポーラス樹脂HZ20によって吸着し、無水エタノールによって溶出し、溶出液を集め、乾燥まで真空中で濃縮して、72.8 g粗生成物を得た。
【００５７】
(5) 粗生成物の精製及び純品の構造同定
上記粗生成物を全てメタノールに溶解し、分取用カラム（その分取用カラムに120g 100メッシュ-200メッシュのC18逆相分取充填剤を添加する）に注入し、50%アセトニトリル(v/v)を溶出液として溶出し、分段に留分を回収した。ここで、クロマトグラフィー純度が99%より高く各不純物が0.1%より少ない留分を、主な留分として選択した。主な留分を乾燥して純度が99.7%の29.1gの純品を得た。得た純品をHPLCによって解析し、図1に示すHPLCスペクトログラムを得た。HPLC条件を以下に示す。HPLCカラムは5μm、4.6×250nmのC18カラムであり、移動相A相は0.05%リン酸(v/v)であり、移動相B相は90%アセトニトリル(v/v)であり、流速は1.00ml/minであり、検出波長は250nmであり、プログラムは、0-20min：5%-100%B相、20-21min：100%B相、21-22min：100%-5%B相であり、注入量は10μlである。得た純品は、MS解析により分子量1058.04と決定され、1H-NMR及13C-NMR解析によって、以下の構造を有するフィダキソマイシン(Fidaxomicin) として決定された：
【化１】
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【００５８】
実施例9：いくつかの菌種が生産したフィダキソマイシンの能力の比較
それぞれ上記実施例5の培地構成及び培養条件を採用して、本発明のアクチノプラーネスHS-16-20(CGMCC NO.7294)及び他のフィダキソマイシン産生菌を培養し、それらの力価を検出した。その結果を表6に示す。
【表６】
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【００５９】
前記四種の菌種の形態学、培養特徴、生理的及び生化学的特徴、並びにDNA配列同定結果を合わせて、それらの生産能力の違いは、それらの菌種特徴が異なることに起因する可能性があり、斯かる生産能力の違いは、本発明のActinoplanes sp. HS-16-20(CGMCC NO.7294)菌種が完全に新しい菌種であることを間接的に証明する。
【００６０】
上記各菌種を総合的に比較して、本発明のActinoplanes sp.HS-16-20(CGMCC NO.7294)はフィダキソマイシンを産生する能力が他の菌種より、大幅に向上しており、工業生産の実現に有利であるといえる。
【００６１】
なお、本発明の特定の実施形態を上記に説明したが、それらは例示を目的するものであり、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者であれば容易に理解し得る。従って、本願特許請求の範囲及びそれに相当する記載の範囲内で、本発明は、具体的に記載されたもの以外の態様で実施され得ることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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