(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性肺疾患を治療するための医薬の製造における、カルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストの使用であって、ここで、前記炎症性肺疾患は喘息、気管支炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択され、さらに、前記アンタゴニストがカルシリティックであり、エアロゾル、粉末またはミストとして提供される、使用。
【請求項２】
前記カルシリティックが、カルシウム感知受容体（ＣａＳＲ）活性を抑制、ブロックまたは低減する能力を特徴とする、前記炎症性肺疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１に記載のカルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストの使用。
【請求項３】
前記カルシリティックが、小分子またはアンタゴニスト抗体である、前記炎症性肺疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１または２に記載のカルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストの使用。
【請求項４】
前記カルシリティックが、ＮＰＳ８９６３６；ＮＰＳ２１４３（別名、ＳＢ−２６２４７０）；ＳＢ−７５１６８９（Ｒｏｎａｃａｌｅｒｅｔ）（ＧＳＫ）；ＡＴＦ９３６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＳＢ−４２３５６２およびＳＢ−４２３５５７（ＧＳＫ）；ＮＰＳＰ７９０；ＮＰＳＰ７９５；ＮＰＳ  Ｒ−５６８；ＪＴＴ−３０５；Ｃａｌｈｅｘ２３１；ＮＰＳ５３５７４；およびＡＸＴ９１４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）からなる群から選択される、前記炎症性肺疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１から３のいずれか一項に記載のカルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストの使用。
【請求項５】
前記カルシリティックが、ＮＰＳ８９６３６  （Ｓ）−４’−シアノ−３’−３−［２−（４−エチル−２−フルオロフェニル）−１，１−ジメチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロポキシ−ビフェニル−４−カルボン酸、ＮＰＳ２１４３，  ３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−２−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオニック  エチル  エステル；３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−２−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオン酸；３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−２−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオン酸  イソプロピル  エステル；３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−２−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオン酸  ２−エトキシ  エチル  エステル；３｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−２−イル−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオン酸  ２−メトキシ−１−メチル−エチル  エステル；３−（４−シアノ−３−｛（Ｒ）−３−［１，１−ジメチル−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−エチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロポキシ｝−フェニル）−プロピオン酸；３−（４−シアノ−３−｛（Ｒ）−３−［１，１−ジメチル−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−エチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロポキシ｝−フェニル）−プロピオン酸  エチル  エステル；３−（３−シアノ−４−｛（Ｒ）−３−［１，１−ジメチル−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−エチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロポキシ｝−フェニル）−プロピオン酸；３−（３−シアノ−４−｛（Ｒ）−３−［１，１−ジメチル−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−エチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロポキシ｝−フェニル）−プロピオン酸  エチル  エステル；３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−５−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオン酸；および３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−５−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオネート  エチル  エステル、およびこれらの薬学的に許容される塩および複合物からなる群から選択される、前記炎症性肺疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１から３のいずれか一項に記載のカルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストの使用。
【請求項６】
前記アンタゴニストが、経口投与のための製剤として提供される、前記炎症性肺疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１から５のいずれか一項に記載のカルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストの使用。
【請求項７】
前記炎症性肺疾患が、喘息またはＣＯＰＤである、前記炎症性肺疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１から６のいずれか一項に記載のカルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストの使用。
【請求項８】
炎症性肺疾患を治療するための併用治療剤であって、カルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストと、少なくとも一の他の治療剤とを含み、ここで、前記アンタゴニストがカルシリティックであり、エアロゾル、粉末またはミストとして提供されるものであり、前記炎症性肺疾患は喘息、気管支炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される、併用治療剤。
【請求項９】
前記少なくとも一の他の治療剤が、炎症性肺疾患を治療するための薬剤である、請求項８に記載の併用治療剤。
【請求項１０】
前記少なくとも一の他の治療剤が、喘息、気管支炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される炎症性肺疾患を治療するための薬剤である、請求項９に記載の併用治療剤。
【請求項１１】
炎症性肺疾患を治療するための、少なくとも一の治療剤を具備する噴霧器または吸入器であって、前記炎症性肺疾患は喘息、気管支炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択され、さらに、前記治療剤が、カルシリティックであり、エアロゾル、粉末またはミストとして提供されるカルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストである、噴霧器または吸入器。
【請求項１２】
前記炎症性肺疾患を治療するための、請求項８から１０のいずれか一項に記載の併用治療剤を具備する噴霧器または吸入器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）だけでない炎症性肺疾患を治療するための治療法、前記治療法を伴う治療方法、前記治療法と少なくとも一つの他の薬剤を含む併用療法、およびこれを含む噴霧器または吸入器に関する。本発明は、医療分野および獣医学分野への適用される。
【背景技術】
【０００２】
炎症性肺疾患は、典型的には慢性性質のものであり、病的状態が増し、最終的には死に至る可能性がある。これらには、限定するものではないが、喘息、気管支炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む広範な疾患が含まれる。
【０００３】
このグループのうち、喘息は英国では１２人中１人に罹患し、５４０万人の人が現在治療を受けている。英国はヨーロッパの中で若年層での喘息の罹患率が最も高い国の一つであり、喘息症状を訴える小児の数はここ３０年間で６倍にも上昇している。これは喘息により毎日３人が亡くなっている計算となる。喘息には年間およそ１０億ポンドの国民健康保険がかかっており、毎年少なくとも１００万就業日が喘息のために失われている。
【０００４】
また、現在の喘息薬物療法は多くの患者の疾患をコントロールするために十分ではあるが、彼らのうちのかなりの数は十分に応答せず、症状や既存の治療法の望ましくない影響に悩まされ続けている。実際、喘息治療のコストのかなり大きな割合（全体のおよそ１０％）は、積極的治療にもかかわらず現在の治療により症状があまりコントロールされない患者に対するものである。
【０００５】
よって、患者の生活の質を改善するため、そして喘息管理費用を低減するために、新規に同定される分子メカニズムを標的とする新規の治療薬が開発されるために、発病過程をよりよく理解する差し迫った需要がある。
【０００６】
喘息は、気管支痙攣、気管支過敏性（ＢＨＲ）、炎症および気道組織修復により過度に気道が閉塞する特徴がある。喘息性の気道平滑筋が様々な特異的および非特異的な刺激物に対して過剰に反応することによる現象であるＢＨＲは、基本的な病態生理学的特徴である。ＢＨＲの主要な特徴の全体像はあるが、根本的な原因は未だよく理解されていない。喘息患者では、ポリカチオンの血漿中濃度が著しく増加している。実際、ポリアルギニン、ポリ−Ｌ−リジン、スペルミンおよび好酸球由来のカチオン性タンパク質（ＥＣＰ）などのポリカチオンは、喘息の重症度のマーカーであり、疾患の病因に直接的に寄与し得るという証拠がある。喘息性気道粘膜におけるポリカチオンの増加と喘息のＢＨＲ／気道組織修復との関連は長く明らかにされており、正電荷によるものとされてきたが、上昇したポリカチオンとＢＨＲとを関連づける正確な分子メカニズムは説明できないままである。
【０００７】
しかしながら、本明細書中では、本発明者らは、細胞外カルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）が、喘息におけるポリカチオンとＢＨＲ／気道組織修復との関連を提供し、それが喘息治療のための重要な新規の分子標的であることを、初めて示す。
【０００８】
ＣａＳＲは、無機イオンの代謝に重要な役割を果たす、多面的なＧプロテイン共役受容体である（最近のレビューについては（１）を参照のこと）。細胞外Ｃａ２＋（Ｃａ２＋Ｏ）はこの受容体の生理的リガンドであるが、ＣａＳＲは、限定するものではないが、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リジンおよびスペルミンなどの喘息に関与するものを含む多くのポリカチオンによっても活性化される（２）。ＣａＳＲシグナル伝達により主に細胞内Ｃａ２＋（Ｃａ２＋ｉ）の動員が生じ（１）、次に気道平滑筋では、収縮性の刺激に対して細胞の包括的な収縮性応答が調節されるだけでなく、これら細胞の寿命、遊走および分泌性質に影響を与える。
【０００９】
本発明者らは、ＣａＳＲがヒトおよびマウスの気道平滑筋（ＡＳＭ）細胞において発現し、ここでＥＣＰを含むポリカチオンによって活性化されること、そして、これらの効果は、限定するものではないが、「カルシリティック（calcilytic）」と称されるＣａＳＲのネガティブアロステリック調節因子などのアンタゴニストによってブロックされることをここに示す。カルシリティックはポリカチオンによって引き起こされる気管支収縮を予防し、マウス小葉内気管支において軽度の気管支拡張薬として働く。さらに、本発明者らは、噴霧したカルシリティックはポリカチオンが引き起こすＢＨＲまたはインビボでの意識下マウスにおける卵白アルブミン感作（喘息の一般的な実験モデル）後のＢＨＲを軽減することを示す。最後に、カルシリティックは、喘息およびＣＯＰＤの２種類の哺乳動物種、つまり卵白アルブミン感作／卵白アルブミン抗原負荷マウスおよびリポ多糖類処置したモルモットにおける炎症性細胞浸潤を低減する。これらのデータは、ＣａＳＲが炎症性肺疾患、特に喘息およびＣＯＰＤの新規の標的であることを示すものである。
【００１０】
とりわけ、カルシリティックはヒトの使用に安全であり、既に骨粗鬆症治療の第ＩＩ相臨床試験の段階にある。
【００１１】
近年の研究に基づき、本発明者らは、カルシリティックがポリカチオン誘導性の気道過敏反応を低減することや気管支拡張薬として働くので、局所送達性のカルシリティックを用いて炎症性肺疾患、特に喘息およびＣＯＰＤにおける気道平滑筋の機能異常を抑制ないし逆転させることができることをここに示唆する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の第一の態様によると、炎症性肺疾患を治療するためのカルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストの使用が提供される。
【００１３】
本発明の第二の態様によると、炎症性肺疾患を治療するための医薬の製造におけるカルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストの使用が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書中のアンタゴニストなる用語への言及には、ＣａＳＲに結合してＣａＳＲの活性を抑制する分子、例えばＣａＳＲの活性部位に可逆的ないしは不可逆的に結合する作用剤、またはＣａＳＲのアロステリック部位に可逆的ないしは不可逆的に結合することによってＣａＳＲに結合してＣａＳＲの活性を抑制する分子への言及を包含する。本発明に用いるアンタゴニストは、ＣａＳＲに対して必須の阻害活性を有する小分子またはアンタゴニスト抗体であってよい。
【００１５】
本発明の好適な実施形態では、前記アンタゴニストは、「カルシリティック」と称される、ＣａＳＲのネガティブアロステリック調節因子である。
【００１６】
カルシリティックは当業者に十分に知られており、カルシウム感知受容体（ＣａＳＲ）活性を抑制、ブロックまたは低減する化合物である。例えば、カルシリティックは、ＣａＳＲのＣａ２＋ｉ流動能、イノシトール−１，４，５−三リン酸塩の形成を増加する能力、またはサイクリックＡＭＰの形成を低減する能力、またはＭＡＰＫの活性化を増加する能力、またはＰｌ３キナーゼの活性化を増加する能力、またはＲｈｏキナーゼの活性化を増加する能力を、部分的ないしは完全に、可逆的にないしは不可逆的にブロックしうる。本発明に用いるカルシリティック化合物は、ＣａＳＲに対して必須の阻害活性を有する小分子またはアンタゴニスト抗体であってよい。
【００１７】
本発明に用いられるカルシリティック化合物には、ＮＰＳ８９６３６  （Ｓ）−４’−シアノ−３’−３−［２−（４−エチル−２−フルオロフェニル）−１，１−ジメチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロポキシ−ビフェニル−４−カルボン酸および構造的に関連のないカルシリティックであるＮＰＳ２１４３（ＳＢ２６２４７０として知られ、市販されている）、ならびに米国特許第７８２９５９４号において開示されるもの、すなわち、３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−２−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオニック  エチル  エステル；
３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−２−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオン酸；
３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−２−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオン酸  イソプロピル  エステル；
３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−２−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオン酸  ２−エトキシ  エチル  エステル；
３｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−２−イル−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオン酸  ２−メトキシ−１−メチル−エチル  エステル；
３−（４−シアノ−３−｛（Ｒ）−３−［１，１−ジメチル−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−エチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロポキシ｝−フェニル）−プロピオン酸；
３−（４−シアノ−３−｛（Ｒ）−３−［１，１−ジメチル−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−エチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロポキシ｝−フェニル）−プロピオン酸  エチル  エステル；
３−（３−シアノ−４−｛（Ｒ）−３−［１，１−ジメチル−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−エチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロポキシ｝−フェニル）−プロピオン酸；
３−（３−シアノ−４−｛（Ｒ）−３−［１，１−ジメチル−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−エチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロポキシ｝−フェニル）−プロピオン酸  エチル  エステル；
３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−５−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオン酸；および
３−｛４−シアノ−３−［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（２−インダン−５−イル−１，１−ジメチル−エチルアミノ）−プロポキシ］−フェニル｝−プロピオネート  エチル  エステル、およびこれらの薬学的に許容される塩および複合物、および例えば欧州特許および公開公報第６３７，２３７号、第７２４，５６１号、第９０１，４５９号、第９７３，７３０号、第１，２５８，４７１号、第１，４６６，８８８号、第１，５０９，５１８号、国際公開公報ＷＯ９７／３７９６７、ＷＯ９９／５１５６９、ＷＯ０１／０８６７３、ＷＯ０４／０１７９０８、ＷＯ０４／０４１７５５、ＷＯ０４／０４７７５１、ＷＯ０５／０３０７４６、ＷＯ０５／０３０７４９、ＷＯ０５０７７８８６、ＷＯ０５０７７８９２、ＷＯ０５１０８３７６、ＷＯ０６０４１９６８、ＷＯ０６０４２００７、ＷＯ０６０６６０７０、ＷＯ０７０６２３７０、ＷＯ０７０４４７９６、ＷＯ０９１１４０９８、米国特許第６，３９５，９１９号、第６，４３２，６５６号、第６，５２１，６６７号、第６，７５０，２５５号、第６，８１８，６６０号、第６，８６４，２６７号、第６，９０８，９３５号、第６，９１６，９５６号、第６，９３９，８９５号、第７，０８４，１６７号、第７，１０９，２３８号、第７，１５７，４９８号、第７，２０２，２６１号、第７，２０５，３２２号、第７，２１１，６８５号、第７，２６５，１４５号、および米国特許出願公開番号２００２／００９９２２０、２００４／０００９９８０、２００４／００１４７２３、２００４／０１９２７４１および２００５／００３２８５０に開示されるものも包含される。特に好ましいカルシリティックは、ＮＰＳ８９６３６またはＮＰＳ２１４３およびＳＢ−７５１６８９（Ｒｏｎａｃａｌｅｒｅｔ）（ＧＳＫ）；ＡＴＦ９３６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＳＢ−４２３５６２およびその経口投与可能な前駆物質ＳＢ−４２３５５７（ＧＳＫ）；および、ＮＰＳＰ７９０およびＮＰＳＰ７９５、ＮＰＳ  Ｒ−５６８、ＪＴＴ−３０５、Ｃａｌｈｅｘ２３１（クロロフェニルカルボキシアミド、化合物７ｎとしても知られ、およびＮ１−アリールスルホニル−Ｎ２−［１−（１−ナフチル）エチル］−トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサンのＮ１位が置換された誘導体である、化合物７ｄ，７ｅ、７ｅ、７ｍ）、ＮＰＳ５３５７４（および置換された３Ｈ−キナゾリン−４−オン類である化合物５ａ、ｂ、ｄ−ｋ、ｍ−ｔ）、ＡＴＦ９３６およびＡＸＴ９１４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。
【００１８】
具体的には、本発明者らは、ＣａＳＲがヒトおよびマウスの気道平滑筋（ＡＳＭ）細胞において発現し、そこでＥＣＰを含むポリカチオンによって活性化されること、そして、これらの効果は、「カルシリティック（calcilytic）」と称されるＣａＳＲのネガティブアロステリック調節因子によってブロックされることをここに示す。
【００１９】
さらに、本発明者らは、噴霧状カルシリティックが意識下マウスでの卵白アルブミン感作（喘息研究のための承認された実験モデル）後の、またはポリカチオンによって誘導されたＢＨＲを軽減するので、ＣａＳＲは喘息治療の新規の標的となることを示す。
【００２０】
したがって、本発明の好適な実施形態では、前記カルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストはエアロゾルまたはミストとしての投与用、理想的には噴霧器または吸入器、限定するものではないが特に定量吸入器または乾燥粉末吸入器による使用のために製剤化される。
【００２１】
単独、または他の治療法と組み合わせたカルシリティックは、様々な方法で、例えば加圧定量吸入器で、乾燥粉末吸入器で、噴霧器ないし少量液体吸入器によって送達される溶液で、または吸入に適する気化製剤で、吸入により投与されうる。カルシリティックは標準的な抗喘息治療法と同時に他の症状の治療のために経口投与されているが、局所適用が最適な利益／リスク比となる可能性が高い。
【００２２】
噴霧剤とともにカルシリティックを、単独または他の治療薬と組み合わせて含有する加圧定量加圧定量吸入器（ｐＭＤＩ）は、例えば、ＨＦＡ１３４ａまたはＨＦＡ２２７などの噴霧剤中の分散型または溶液型で、カルシリティックを、単独ないしは、エアロゾル性能を改善するための賦形剤、例えば共溶媒（例えば、エタノール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール）、界面活性剤（例えばオレイン酸）、または安定剤およびｐＨ調整剤のような他の賦形剤（例えば、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウム、塩酸）と組み合わせて、含有するように製剤化されてよい。カルシリティックがｐＭＤＩ中の分散体として存在する場合には、好適な物理的および／または化学的な方法を用いて、エアロゾル化の際の空気力学的粒子サイズを、呼吸気道に送達するために適するように、典型的には１０μｍ未満、好ましくは５μｍ未満としてよい。
【００２３】
カルシリティックを単独または他の治療薬と組み合わせて含有する乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）は、例えば、カルシリティックを小粒子として単独、またはエアロゾル化を促すためのラクトースまたはスクロースなどのキャリア粒子と組み合わせて含有するように製剤化されてよい。好適な物理的および／または化学的な方法を用いて、ＤＰＩからのエアロゾル化の際の空気力学的粒子サイズを、呼吸気道に送達するために適するように、典型的には１０μｍ未満、好ましくは５μｍ未満としてよい。
【００２４】
単独または他の治療薬と組み合わせたカルシリティックの噴霧器および少量液体吸入器調製物は、例えば、水媒体中の分散型または溶液型で、カルシリティックを、単独ないしは、エアロゾル性能を改善するための賦形剤、例えば共溶媒（例えば、エタノール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール）、界面活性剤（例えばオレイン酸）、または安定剤およびｐＨ調整剤のような他の賦形剤（例えば、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウム、塩酸）と組み合わせて、含有するように製剤化されてよい。単独または他の治療薬と組み合わせたカルシリティックが噴霧器および少量液体吸入器中に分散体として存在する場合には、好適な物理的および／または化学的な方法を用いて、エアロゾル化の際の空気力学的粒子サイズを、呼吸気道に送達するために適するように、典型的には１０μｍ未満、好ましくは５μｍ未満としてよい。
【００２５】
吸入に適する、単独または他の治療薬と組み合わせた気化製剤は、例えば、カルシリティックを高温に短時間、典型的には１秒未満加熱することによって、単独またはエアロゾル性能を改善するための賦形剤（例えばプロピレングリコール、エタノール）と組み合わせて製剤化されてよい。用いられる方法により、エアロゾル化の際の空気力学的粒子サイズを、呼吸気道に送達するために適するように、典型的には１０μｍ未満、好ましくは５μｍ未満としてよい。
【００２６】
前述のように、より好ましくは、前記アンタゴニストは、単独または他の治療薬と組み合わせて、例えば、カルシリティックを粉末の形態または溶液ないしは懸濁液の液滴の形態に分散させたエアロゾルまたはスプレーを用いることにより、鼻、気管支または口腔からの投与により気道の治療に用いられてよい。粉末分散性質を持つ薬学的組成物は、通常、活性成分に加えて、室温以下の沸点を有する液体噴霧剤、さらに必要であれば補助剤、例えば液体ないしは固体の非イオン性またはアニオン性界面活性剤および／または希釈剤とを含有する。薬学的に活性な成分が溶液中にある薬学的組成物は、これに加え、好適な噴霧剤、さらに必要であれば他の溶媒および／または安定化剤を含有する。噴霧器の代わりに、圧縮空気も用いられてよく、このために必要であれば好適な圧縮および膨張装置を用いて製造されうる。
【００２７】
本発明による薬学的組成物は、本発明のカルシリティックを単独または他の治療薬と組み合わせて担体と集めることによって調製されうる。一般に、製剤は、カルシリティックを単独または他の治療薬と組み合わせて、液体担体または微細に分割された固形担体、またはその両方と、均一かつ密接に集めることによって調製される。
【００２８】
しかしながら、本発明のさらに好適な実施形態では、前記カルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストは経口投与用に製剤化される。
【００２９】
本発明の経口投与用の製剤は、それぞれ所定量のカルシリティックを含有するカプセル剤、サシェ剤または錠剤などの個別用量単位、粉末または顆粒、水溶液または非水溶液中に活性剤を含む溶液または懸濁液、または水中油型液体乳化物ないしは油中水型液体乳化物、またはボーラス剤などとして提示されうる。
【００３０】
経口投与用の組成物（例えば錠剤およびカプセル剤）の「許容される担体」なる用語には、一般的な賦形剤などのビヒクル、例えば結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびデンプン；充填剤および担体、例えばコーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸；および潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムおよび他の金属ステアリン酸塩、グリセロールステアレート、ステアリン酸、シリコーン液、タルク、ワックス、油およびコロイド状シリカが包含される。ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香料等の風味剤を使用することもできる。剤形を容易に識別するための着色剤を添加することも望ましい。錠剤は、当分野でよく知られる方法によってコーティングされてもよい。
【００３１】
錠剤は、場合により１または複数の補助成分とともに、圧縮または成型することにより製造されてよい。圧縮錠剤は、場合により結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と混合した、粉末または顆粒のような流動形態に活性成分を好適な機械で圧縮することにより調製されてよい。成型錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を好適な機械で成型することにより製造されてよい。これらの錠剤は場合により被覆または刻み目をつけてよく、活性成分の遅延放出性または徐放性を与えるように製剤化してもよい。
【００３２】
経口投与に好適な他の製剤には、通常スクロースおよびアカシアゴムまたはトラガカントゴムなどの矯味基剤中にカルシリティックを単独または他の治療剤を組み合わせて含んでなるトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアゴムなどの不活性基剤にカルシリティックを含んでなる香錠；および好適な液体担体にカルシリティックを含んでなる口中洗浄剤が包含される。
【００３３】
経口組成物は、本発明のカルシリティックと担体とを合わせることによって調製されてよい。一般に、製剤は、カルシリティックを、液体担体または微細な固形担体ないしはこの両方と均一かつ密接に関連させ、次いで必要であれば生成物を成形することによって調製される。本発明は、カルシリティックを経口投与のために薬学的または獣医学的に許容可能な担体またはビヒクルと併せる、または関連させることを含む、薬学的組成物に関する。
【００３４】
本発明のさらに好適な実施形態では、前記カルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストは、炎症性肺疾患、喘息、気管支炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む一覧から選択される疾患を治療するために用いられる。
【００３５】
最も好ましくは、前記カルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストは、単独または他の治療薬と組み合わされて、喘息および／またはＣＯＰＤを治療するために用いられる。
【００３６】
本発明のさらに好適な態様では、前記カルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストを個体に投与することを含む、炎症性肺疾患を治療するための方法が提供される。
【００３７】
本発明の方法では、好ましくは、前記カルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストは、単独または他の治療薬と組み合わされて、エアロゾルまたはミストとして投与するため、理想的には噴霧器または吸入器による使用のために製剤化されてよい。
【００３８】
本発明のさらに好適な方法では、前記カルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストは、炎症性肺疾患、喘息、気管支炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む一覧から選択される疾患を治療するために用いられる。
【００３９】
最も好ましくは、前記カルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストは、単独または他の治療薬と組み合わされて、喘息および／またはＣＯＰＤを治療するために用いられる。
【００４０】
本発明の更なる態様によると、ここに記載のカルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストと少なくとも一の他の治療薬とを含有してなる炎症性肺疾患を治療するための併用療法が提供される。
【００４１】
好適な実施形態では、前記少なくとも一の他の治療薬は、炎症性肺疾患を治療するための薬剤であって、理想的には抗喘息および／または抗ＣＯＰＤである。
【００４２】
本発明の更なる態様によると、炎症性肺疾患を治療するための少なくとも一の治療薬を含有してなる噴霧器または吸入器であって、前記治療薬はここに記載されるカルシウム／カチオン感知受容体（ＣａＳＲ）アンタゴニストである、噴霧器または吸入器が提供される。
【００４３】
好適な実施態様では、前記噴霧器または吸入器はここに記載される併用治療薬を含有する。
【００４４】
さらに好ましくは、前記噴霧器または吸入器は、喘息、気管支炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む群から選択される炎症性肺疾患を治療するために用いられる。理想的には、前記噴霧器または吸入器は喘息および／またはＣＯＰＤを治療するために用いられる。
【００４５】
ここに記載の発明は、哺乳動物、より具体的にはヒトでの使用のためのものであるが、本発明は、獣医学的用途、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、有蹄動物、霊長類動物に関する使用、または炎症性肺疾患を発症する任意の動物に関する使用も有する。
【００４６】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」なる言葉、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの言葉の変化形は、「含むが、限定されない」ことを意味し、他の部分、付加物、成分、整数または工程を排除するものではない。本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、複数形を含む。特に、不定冠詞が用いられる場合、本明細書は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数性だけでなく複数性も企図するものと理解されるべきである。
【００４７】
本明細書に引用された任意の特許または特許出願を含むすべての参考文献は、参照により本明細書に援用されている。いかなる参考文献も先行技術を構成するということを認めるものではない。さらに、その先行技術のいずれも、当技術分野における共通した一般的な知識の一部を構成するということを認めるものではない。
【００４８】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して記載される場合がある。
【００４９】
本発明の他の特徴は、以下の例から明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、（添付の特許請求の範囲および図面を含む）本明細書に開示された特徴の任意の新規な１つ、または任意の新規な組合せにまで及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または実施例に関連して記載される特徴、整数、特質、化合物または化学的部分は、本明細書に記載された任意の他の態様、実施形態または実施例に、それらと適合しないことがない限り、適用できることは理解されているはずである。
【００５０】
さらに、他の記述がない限り、本明細書に開示される任意の特徴は、同じまたは類似した目的を果たす代替の特徴に置き換えられてもよい。
【００５１】
本発明を、以下の表および図面を参照としてのみ用いて実施例により記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】i）ポリカチオンは、細胞内Ｃａ２＋のＣａＳＲ依存性の増加を引き起こす。ii）ＥＣＰはヒトＣａＳＲの新規のアゴニストである。iii）２つの構造的に無関係なカルシリティックであるＮＰＳ８９６３６とＮＰＳ２１４３は、ポリカチオン依存性のＣａＳＲ活性化を妨げる。ヒトＣａＳＲを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ−ＣａＳＲ）または空のベクターを形質移入したＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ−０）を、４μＭのｆｕｒａ−２ＡＭとロードし、３００ｎＭのポリ−Ｌ−アルギニン（ポリ−Ｌ−Ａｒｇ、Ａ）、１ｍＭのスペルミン（Ｂ）または１０μｇ／ｍｌの好酸球カチオンタンパク質（ＥＣＰ、Ｃ）に、１００ｎＭのカルシリティックＮＰＳ８９６３６の存在下または非存在下で曝した。構造的に無関係なカルシリティックＮＰＳ２１４３もスペルミン誘導性ＣａＳＲ活性化を抑制する（Ｄ）。ムック形質移入細胞（ＨＥＫ−０）における応答は最小であり、アゴニストによって引き起こされたものとは有意に相違した。これら３つのアゴニストによって引き起こされたＣａ２＋ｉ放出（ピーク／ベースライン蛍光発光比、Ｆ／Ｆ０として測定）はＮＰＳ８９６３６によって有意に低減された。ただし、喘息被検体におけるＥＣＰ血清濃度はおよそ３０μｇ／ｍｌと見られる。ｎ＝１２１〜４８７細胞、３〜９回の実験。データは平均±ＳＥＭである。相違が有意な場合にはバーの上に表す。
【図２】ＣａＳＲはヒトおよびマウスの気道に免疫局在する。Ａ）平滑筋（矢印）および上皮の両方において免疫反応を示す、ポリクローナルＣａＳＲ抗体（明るい色調）にて染色したヒト気道生検由来の凍結切片。Ｌ＝気道内腔。バー＝５０ｍｍ。Ｂ）およびＣ）スプリットオープンマウスの小葉外気管支におけるＣａＳＲ免疫染色（Ｃ）はカルポニン（Ｂ）と共局在化する。Ｄ）離れて移動する小葉間気管支移植片と平滑筋細胞を表す透過明色画像。Ｅ）ＣａＳＲ免疫反応を示す気道平滑筋（ＡＳＭ）細胞の代表的な領域（明るい色調）。細胞は１０日間培養し、パラホルムアルデヒド固定し、カルポニンに対する抗体を用いて平滑筋として同定した。Ｆ）ヒト気道平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）は平滑筋細胞マーカー（平滑筋アクチン）および抗ＣａＳＲ抗体にて染色した。倍率：２０倍。
【図３】Ａ）Ｂ）ＣａＳＲはヒト気道平滑筋においてＣａ２＋Ｏおよびポリカチオンにより活性化されうる。増加した［Ｃａ２＋］Ｏ（Ａ、ｎ＝７）またはスペルミン（Ｂ、ｎ＝３５；平均±ＳＥＭ）に曝した場合に、Ｆｕｒａ−２ＡＭを負荷したヒトＡＳＭ細胞は［Ｃａ２＋］ｉ（Ｆ／Ｆ０）の上昇を示す。Ｃ）１０μｇ／ｍｌのＥＣＰおよび１μＭのブラジキニン（ＢＫ）によって引き起こされる［Ｃａ２＋］ｉの代表的な上昇曲線を示す。５ｍＭ［Ｃａ２＋］Ｏの存在下（ＣａＳＲについて飽和、Ａを参照のこと）では、ＥＣＰに対する応答は除去されるが、ＢＫに対する応答は除去されない。これはＥＣＰによるＣａＳＲ活性化と一致している。Ｄ）「ドミナントネガティブな」ＣａＳＲ（ＣａＳＲ  ＤＮ）の移入により、ヒトＡＳＭ細胞における［Ｃａ２＋］ｉのスペルミン依存的な増加が抑制される。この影響はＭＯＣＫ移入細胞では観察されない。
【図４】スペルミンは、ＷＴマウスから単離した小葉内気管支のＡＣｈ誘発性収縮を亢進するが、平滑筋細胞からＣａＳＲを取り除いたマウス由来の小葉内気管支では収縮を誘発しない。Ａ）小葉内気管支は、野生型Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（３〜４か月齢）から切除し、ワイヤーミオグラフに配置し、１ｍＭ  Ｃａ２＋ｏを含む細胞外溶液の存在下で９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を通気した。次いでそれらを３００μＭのスペルミンの存在下（１５分間の前処理）または非存在下にて漸増濃度のアセチルコリン（ＡＣｈ）に曝した。データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝３とした。Ｂ）小葉内気管支は、野生型（ｓｍ２２α−Ｃｒｅ−／−／ｆｌｏｘｅｄ−ＣａＳＲ＋／＋）マウスおよびＣａＳＲノックアウト（ｓｍ２２α−Ｃｒｅ＋／＋／ｆｌｏｘｅｄ−ＣａＳＲ＋／＋）マウスから切除し、次いで（Ａ）に表すようにワイヤーミオグラフに配置した。気管支は最大量のおよそ５０％にまで予め収縮させ、次いで漸増濃度のスペルミンを溶液槽に添加した。収縮の割合（弛緩曲線の０からの上方偏向）または弛緩の割合（弛緩曲線の０からの下方偏向）は張力データから算出した。データは遺伝子型ごとに平均±ＳＥＭ、ｎ＝３とした。
【図５】カルシリティックはメタコリン負荷マウスにおけるポリカチオン誘発性ＢＨＲを防ぐ。意識下にあり拘束していないＢａｌｂＣマウスをプレチスモグラフィーチャンバー内で３０分間平衡にし、次いで噴霧状のＮＰＳ８９６３６（３μＭ、△）またはビヒクル（生理食塩中０．３％ＤＭＳＯ、◇）のいずれかで３０分間前処置し、その後噴霧状のポリ−Ｌ−アルギニン（３μＭ、□）にて処置するか、またはＮＰＳ８９６３６（△）にて１時間同時に処置した。処置後、動物をプレチスモグラフィーチャンバー（Ｂｕｘｃｏ、米国）に配置し、１０分間落ち着かせ、次いでメタコリン（ＭＣｈ、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ）を負荷した。いずれの処置もしていない動物から得た対メタコリン反応を黒の記号で表す。先の見積もりから、およそ１〜５％の噴霧状薬剤が肺上皮に達する。データはエンハンスドポーズ（Ｐｅｎｈ）±ＳＥＭ、ｎ＝３〜６の平均変化として表す。＊ナイーブからの有意な相違（ｐ＜０．０５）。
【図６】Ｃａ２＋ｏはＣａＳＲを活性化する。この影響はカルシリティックＮＰＳ８９６３６によって防がれうる。ヒトＣａＳＲ（ＨＥＫ−ＣａＳＲ）を安定して発現するかまたは空のベクター（ＨＥＫ−０）を形質移入したＨＥＫ２９３細胞に４μＭのｆｕｒａ−２ＡＭを負荷し、カルシリティックＮＰＳ８９６３６（１００ｎＭ）の存在下または非存在下で５ｍＭのＣａ２＋ｏに曝した。データは３つ以上の実験結果と１２１〜３８６細胞から得た。有意差はバーの上に表す。
【図７】ＣａＳＲアゴニスト、Ｃａ２＋ｏにより野生型マウス由来のマウス初代気道平滑筋細胞（ＭＡＳＭＣ）での［Ｃａ２＋］ｉが増加するが、これら細胞からＣａＳＲを欠失させたマウス由来のＭＡＳＭＣでは増加しない。マウス小葉間気管支から単離し（２〜６継代）、４μＭのｆｕｒａ−２ＡＭを負荷した単一細胞において細胞内カルシウム画像法を行った。ＷＴ＝ｓｍ２２α  Ｃｒｅ−マウスをＬｏｘＰ＋／＋  ＣａＳＲマウスと交配して得た、ＣａＳＲを発現する細胞。ＫＯ＝ｓｍ２２α  Ｃｒｅ＋マウスをＬｏｘＰ＋／＋  ＣａＳＲマウスと交配して得た、ＭＡＳＭＣのＣａＳＲが除去された細胞。結果は、ポジティブコントロールであるアセチルコリン（３μＭ  ＡＣｈ）に対する反応の％で表す。ＷＴ：５つの実験結果からの６〜１１細胞。ＫＯ：４つの実験結果からの２〜１１細胞。この図はノックアウト細胞の機能的ＣａＳＲ除去を示す。ゆえにこのマウスモデルは以降の図に記載される試験に好適である。
【図８】ＣａＳＲアゴニストであるスペルミンはＷＴ由来の小葉内気管支のＡＣｈ誘導性気道収縮を亢進するが、ＫＯマウスの気道収縮は亢進しない。ＷＴまたはＫＯマウスの肺左葉から二次／三次の小葉内気管支を切除し、ステンレススチールワイヤー（ｄ＝４０μｍ）を用いて小管ミオグラフに配置し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を通気したクレブス液に維持した。気管支は、３７℃に３０分間静置し、次いで２ｍＮの他動張力に達するように徐々に伸ばした。３０分の平衡時間の後、気管支の反応性を溶液槽に４０ｍＭのＫＣｌを添加して試験した。気管支は１５分間スペルミンとインキュベートし、次いで気管支収縮アセチルコリン（ＡＣｈ、１ｎＭ〜３０μｍｏｌ）を累積的に溶液槽に添加した。データは、コントロールの最大収縮に対して正規化した収縮の割合、平均±ＳＥＭ割合として表す。アステリスクは有意差を表す（＊ｐ＜０．０５）。この図と次の図は、ＣａＳＲアゴニストであるスペルミンとＣａ（次図）はそれらの標的を欠く細胞では気道過剰反応をもはや亢進しないことを示す。
【図９】ＣａＳＲアゴニストであるＣａ２＋ｏはＷＴ由来の小葉内気管支のＡＣｈ誘導性気道収縮を亢進するが、ＫＯマウスの気道収縮は亢進しない。ＷＴまたはＣａＳＲ  ＫＯマウスの肺左葉から二次／三次の小葉内気管支を切除し、ステンレススチールワイヤー（ｄ＝４０μｍ）を用いて小管ワイヤーミオグラフに配置し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を通気したクレブス液に置いた。気管支は、３７℃に３０分間静置し、次いで２ｍＮの他動張力に達するように徐々に伸ばした。３０分の平衡時間の後、気管支の反応性を溶液槽に４０ｍＭのＫＣｌを添加して試験し、気管支は１５分間２．５ｍＭのＣａ２＋ｏとインキュベートし、次いでアセチルコリン（ＡＣｈ、１ｎＭ〜３０μｍｏｌ）を累積的に溶液槽に添加した。アステリスクは有意差を表す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１０】ＣａＳＲアゴニストであるスペルミンはＷＴ由来のメタコリンにて予め収縮させた小葉内気管支の気管支収縮を亢進するが、ＫＯマウスの気管支収縮は亢進しない。ＷＴまたはＣａＳＲ ＫＯマウスの肺左葉から二次／三次の小葉内気管支を切除し、ステンレススチールワイヤー（ｄ＝４０μｍ）を用いて小管ミオグラフに配置し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を通気したクレブス液に置いた。気管支は、３７℃に３０分間静置し、次いで２ｍＮの他動張力に達するように徐々に伸ばした。３０分の平衡時間の後、気管支の反応性を溶液槽に４０ｍＭのＫＣｌを添加して試験した。気管支は、最大段階のおよそ５０％に達するようにＡＣｈ（１μｍｏｌ）にて予め収縮させ、その後漸増濃度のスペルミン（１０μｍｏｌ〜３ｍＭ）を累積的に溶液槽に添加した。データはベースラインからの割合変化を平均±ＳＥＭとして表し、ゼロから上向きの偏向は収縮を表し、弛緩曲線のゼロから下向きの偏向は弛緩を表す。
【図１１】カルシリティックＮＰＳ８９６３６はＷＴマウス由来のアセチルコリンにて予め収縮させた小葉内気管支に軽度の弛緩を引き起こす。ＷＴまたはＣａＳＲ  ＫＯマウスの肺左葉から二次／三次の小葉内気管支を切除し、小管ミオグラフに配置した。気管支は、２ｍＮの他動張力に達するように徐々に伸ばした。３０分の平衡時間の後、気管支の反応性を溶液槽に４０ｍＭのＫＣｌを添加して試験した。気管支は、最大段階のおよそ５０％に達するようにＡＣｈ（１μｍｏｌ）にて予め収縮させ、その後ＮＰＳ８９６３６（３００ｎＭまたは３ｍｍｏｌ）を溶液槽に添加した。データはベースラインからの割合変化を平均±ＳＥＭとして表す。
【図１２】カルシリティックＮＰＳ８９６３６はメタコリンを負荷したマウスでのポリ−Ｌ−アルギニン誘導性ＢＨＲを妨げる。雄ＢａｌｂＣマウス（およそ２５ｇ）は、試験開始の１週間前にＨａｒｌａｎから購入した。マウスは、試験の前の５日間毎日４０分間プレチスモグラフィーに置いて、プレチスモグラフィーシステム（Ｂｕｘｃｏ、米国）に順化させた。試験の当日、各マウスの体重を記録し、記録の前少なくとも１０分間マウスをチャンバーに順化させた。次いで呼吸活動を５分間記録し、エンハンスドポーズ（Ｐｅｎｈ）のベースライン値とした。その後マウスを、漸増濃度の生理食塩水に溶解した噴霧状メタコリン（アセチル−β−メチルコリン、ＭＣｈ、生理食塩水中０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ）に曝した。データはそれぞれのエアロゾル投与後３分間記録した。各ＭＣｈ濃度でのＰｅｎｈ値は平均化し、ベースラインＰｅｎｈ（処置前のＰｅｎｈ）の割合として表した。翌日、マウスを、噴霧状ポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＬＡ、３μｍｏｌ）、ＮＰＳ８９６３６（３μｍｏｌ）、ポリ−Ｌ−アルギニン＋ＮＰＳ８９６３６（いずれも３μｍｏｌ）、またはビヒクル（０．３％ＤＭＳＯ）にて肺機能測定前の１時間処置し、次いでメタコリン処置を上記のように繰り返した。各ＭＣｈ濃度でのＰｅｎｈ値は平均化し、その日のベースラインＰｅｎｈ（処置後のＰｅｎｈ）の割合として表した。データは、各処置によって生じたＰｅｎｈの割合変化（デルタＰｅｎｈ、％）（＝処置後のＰｅｎｈ−処置前のＰｅｎｈ×１００）として表す。ＭＣｈ：メタコリン。Ｎ＝１条件につきマウス５匹。ビヒクルコントロールからの統計的差＊ｐ＜０．０５または＊＊ｐ＜０．０１、ポリ−Ｌ−アルギニンによる処置からの統計的差＃ｐ＜０．０５または＃＃＃ｐ＜０．００１（ボンフェローニ事後検定による二元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図１３】カルシリティックＮＰＳ８９６３６はメタコリンを負荷したマウスでの卵白アルブミン誘導性ＢＨＲを妨げる。１００μｇ／マウスの卵白アルブミン（ＯＶＡ）および５０ｍｇ／マウスの水酸化アルミニウムを含むＰＢＳの腹腔内注射により０日目と５日目にマウスを感作した。最後の注射の１４日後に、同じ日に４時間あけて２回、ＰＢＳ中の０．５％ＯＶＡエアロゾルの吸入によりマウスを刺激した。最後のＯＶＡ曝露の１時間前および３時間後に、噴霧状ＮＰＳ８９６３６（３μｍｏｌ）またはビヒクル（０．３％ＤＭＳＯ）にてマウスを処置した。最後のＯＶＡ吸入負荷の前後２４時間、プレチスモグラフィーにてメタコリン負荷後のＢＨＲを測定した。メタコリン負荷の間、上記のようにプレチスモグラフィーによりＰｅｎｈを記録した（処置前Ｐｅｎｈ）。２４時間後、吸入による噴霧状ＮＰＳ８９６３６の存在下または非存在下（０．３％  ＤＭＳＯビヒクル）の０．５％噴霧状ＯＶＡ（ＰＢＳｗ／ｖ中）をマウスに与えた。この負荷プロトコールの時間経過は以下の通りである。２４時間：１時間ＯＶＡ；２７時間：１時間ＮＰＳ８９６３６（３μｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（０．３％）またはＰＢＳ（コントロール）の１つ；２８時間：１時間ＯＶＡ；３１時間：１時間ＮＰＳ８９６３６（３μｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（０．３％）またはＰＢＳ（コントロール）の１つ；３２時間：上記のようにメタコリン負荷の間プレチスモグラフィー（処置後のＰｅｎｈ）。データは、各処置によって生じたＰｅｎｈの割合変化（デルタＰｅｎｈ、％）（＝処置後のＰｅｎｈ−処置前のＰｅｎｈ×１００）として表す。Ｎ＝１条件につきマウス６匹。ビヒクルコントロールからの統計的差＊ｐ＜０．０５。
【図１４】カルシリティックＮＰＳ８９６３６はＯＶＡで感作したマウス由来の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）において検出される炎症性細胞の浸潤を減少させる。図１３に詳細に記載した、ＮＰＳ８９６３６（３μｍｏｌ）またはビヒクル（０．３％ＤＭＳＯ）の存在下でのＯＶＡ感作および噴霧プロトコール後２４時間に、マウスを屠殺し、洗浄にてＢＡＬＦを採取した。同日にＢＡＬＦ中の細胞を血球計数器を用いて計数した。差次的細胞計数のために、ＢＡＬＦを遠心により１０倍に濃縮し、最終溶液の１００μｌをサイトスピン３シャンドンスメアシステムに用いた。次いでスライドをメタノール中１．５％レーシュマン染色に６分間浸漬し、水で２回軽くすすぎ、一晩乾燥させ、１００倍液浸対物レンズを用いて細胞を計数した。データは平均±ＳＥＭとして表す。ビヒクルとカルシリティックとの有意差をｐ＜０．０５、ｎ＝１１で表す。
【図１５】カルシリティックＮＰＳ８９６３６はＬＰＳ誘発性ＣＯＰＤを持つモルモット由来の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）において検出される炎症性細胞の浸潤を減少させる。９回の刺激の間１日おきに、雄ダンキンハートレーモルモット（５００〜５５０ｇ）を、３０μｇ／ｍｌの噴霧状リポ多糖類（ＬＰＳ）を含む生理食塩水に１時間曝した。モルモットに、５回目の曝露後から９日間にわたり噴霧状の３μｍｏｌのＮＰＳ８９６３６（または０．３％ＤＭＳＯビヒクル）を３０分間、１日おきにＬＰＳ曝露前の３０分与えた。９回目の曝露の２４時間後にモルモットを屠殺し（１．５ｍｌのユータタル静注）、ＢＡＬＦを採取し、同日に図１４に記載の通りに細胞を計数した。データは平均±ＳＥＭとして表す。ビヒクルとカルシリティックとの有意差をｐ＜０．０５、ｎ＝６で表す。
【００５３】
表１。噴霧したカルシリティック処置後１時間、４時間または２４時間のＢａｌｂＣマウスにおいて血漿イオン化Ｃａ２＋の測定に有意な変化はない。ＢａｌｂＣマウスでの血漿イオン化Ｃａ２＋の参照値はおよそ０．８〜０．９ｍＭ。
(http://www.jimmunol.org/content/175/2/917.long#F6)
この表は、噴霧状カルシリティック処置は全身カルシウムレベルに影響しないことを示す。
【００５４】
表２。噴霧状カルシリティック処置の２４時間後のモルモットにおいては血漿イオン化Ｃａ２＋の測定値は有意な影響がない。
【実施例】
【００５５】
例示的カルシリティックの化学構造。
ＮＰＳ８９６３６
化学名：(S)-4'-シアノ-3'-[3-[2-(4-エチル-2-フルオロフェニル)-1,1-ジメチルエチルアミノ]-2-ヒドロキシ-プロポキシ]-ビフェニル-4-カルボン酸 hydrochloride
ロット番号：ＰＷＲ−Ｂ−０３９
物質の外観：白色固体
構造：
0006352926.tif 000002
【００５６】
ＮＰＳ２１４３
化学名：2-Chloro-6-[(2R)-3-[[1,1-ジメチル-2-(2-ナフタレンイル)エチル]amino-2-ヒドロキシプロポキシ]benzonitrile hydrochloride
0006352926.tif 000003
ＦＷ：４４５．３８
分子式：Ｃ２４Ｈ２５ＣｌＮＯ２・ＨＣｌ
【００５７】
材料および方法
組換えヒトＣａＳＲを発現するＨＥＫ２９３細胞におけるポリカチオンにより誘導された細胞内Ｃａ２＋（Ｃａ２＋ｉ）の測定とそれに対するカルシリティックの影響。
ヒトＣａＳＲを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ−ＣａＳＲ）または空のベクターを形質移入したＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ−０）を、４μＭのｆｕｒａ−２  ＡＭとロードし、３００ｎＭのポリ−Ｌ−アルギニン（ポリ−Ｌ−Ａｒｇ）、３００ｍＭ〜１ｍＭのスペルミン、１０μｇ／ｍｌの好酸球カチオンタンパク質（ＥＣＰ）または５ｍＭのＣａ２＋Ｏに、１００ｎＭのカルシリティックＮＰＳ８９６３６の存在下または非存在下で曝した。構造的に無関係なカルシリティックＮＰＳ２１４３の、ＨＥＫ−ＣａＳＲ内のスペルミン誘導性Ｃａ２＋ｉ動態に対する能力も試験した。Ｃａ２＋ｉ放出は、ピーク／ベースライン蛍光発光比（Ｆ／Ｆ０）として測定した。ただし、喘息被検体におけるＥＣＰ血清濃度は疾患重症度とともに増加し、およそ３０μｇ／ｍｌに達すると思われる。
【００５８】
ヒトおよびマウスの気道におけるＣａＳＲの発現。
ヒト気道について、新たに単離されパラホルムアルデヒドで固定した気管支生検を、異なる細胞種でのＣａＳＲの発現について調べた。免疫組織化学的分析は、我々が検証した抗ＣａＳＲ抗体を用いて行った（３）（図２Ａ）。Ｃ５７Ｂｌ６マウスからのマウス小葉内気管支は、縦に開き、３０分間パラホルムアルデヒド固定した。ＣａＳＲおよびカルパイン（ＡＳＭ細胞のマーカー）の免疫反応性は市販の抗体を用いて検出した。画像はオリンパスＢＸ４０顕微鏡を用いて得た。マウスＡＳＭ細胞は全マウスの肺から切除したマウス小葉間気管支の断片から移植した（１移植片につきおよそ２ｍｍ）。細胞を２％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、続いて市販の抗体を用いてカルパイン（ＡＳＭ細胞のマーカー、図示せず）について、およびＣａＳＲについて免疫染色した（４）。正常および喘息のボランティア（別に定義される試験対象患者基準（５））からのヒトＡＳＭ細胞を、発明者らの研究室で確立された所定のプロトコールに従って、健康および喘息患者ボランティアからファイバー気管支鏡検査で得られた気管支生検から移植した（６、７）。培養細胞は、必要に応じて増殖させ、初期継代での使用のために保存した（１−５）。
【００５９】
インビトロのヒトＡＳＭ細胞におけるポリカチオンの影響。
初代ヒト気道平滑筋細胞の細胞培養物を上記のプロトコールを用いて８０〜９０％のコンフルエンスにした後、内因性のＣａＳＲを、これら細胞を病態生理学上関連のある濃度のＥＣＰ（１〜１０μｇ／ｍｌ）、スペルミン（０．１〜３ｍＭ）およびＣａ２＋Ｏ（１〜５ｍＭ）に曝すことによって活性化し、細胞内Ca2+iシグナル伝達に対する影響を測定した（Ｃａ２＋感受性蛍光色素であるＦｕｒａ−２を用いた）。内因性のＣａＳＲ機能は、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して「ドミナントネガティブな」ＣａＳＲ，Ｒ１８５Ｑを形質移入することにより、ヒトＡＳＭ細胞において下方制御された（８）。
【００６０】
平滑筋細胞の標的ＣａＳＲを持つマウスから単離したＡＳＭに対するＣａ２＋Ｏの影響。
平滑筋からＣａＳＲ標的遺伝子を除去したマウスは、発明者らの研究室でｓｍ２２α ＣｒｅリコンビナーゼマウスをＬｏｘＰ ＣａＳＲ（ＬｏｘＰ部位がＣａＳＲのエクソン７に隣接している）と交配して作製した（９）。平滑筋２２α（ｓｍ２２α）プロモーターは、専ら内臓および血管の平滑筋のＣｒｅリコンビナーゼ発現を促すが、一部頭蓋縫合や胎児心臓での発現が見られることもある。このマウスは２０１０年１月以降カーディフで維持されている。発明者らの交配プログラムでは、ノックアウト（ＫＯ）マウスとしてｓｍ２２α−Ｃｒｅ＋／＋／ｆｌｏｘｅｄ−ＣａＳＲ＋／＋（平滑筋のＣａＳＲを欠く）と野生型（ＷＴ）であるコントロールマウスとしてｓｍ２２α−Ｃｒｅ−／−／ｆｌｏｘｅｄ−ＣａＳＲ＋／＋（平滑筋に完全長ＣａＳＲを発現する）とを用いる。ＷＴとＫＯマウスはいずれも繁殖力があり、成長可能であり、標準的な寿命を持つ。マウスのＡＳＭ細胞は、ＷＴまたはＫＯ全マウスの肺から切除したマウスの小葉間気管支の断片（１移植片につきおよそ２ｍｍ）から移植した。２〜４継代の細胞をｆｕｒａ−２ＡＭとともにロードし、Ｃａ２＋ｉ濃度のＣａ２＋Ｏ（１〜５ｍＭ）誘導性増加をポジティブコントロールであるアセチルコリン（ＡＣｈ）に対する最大反応の％で表す。ＷＴ：５つの実験結果からの６〜１１細胞。ＫＯ：４つの実験結果からの２〜１１細胞。
【００６１】
エクスビボのマウス小葉内気管支におけるアセチルコリン依存性収縮反応に対するＣａＳＲ活性化因子であるスペルミンまたはＣａ２＋Ｏの影響。
５〜６か月齢の野生型（ｓｍ２２α−Ｃｒｅ−／−／ｆｌｏｘｅｄ−ＣａＳＲ＋／＋）およびＣａＳＲノックアウト（ｓｍ２２α−Ｃｒｅ＋／＋／ｆｌｏｘｅｄ−ＣａＳＲ＋／＋）マウスの肺左葉から二次／三次の小葉内気管支を切除し（およそ２ｍｍ長）、既に記載されているように（１１）ステンレススチールワイヤー（ｄ＝４０μｍ）を用いて小管ワイヤーミオグラフ（Ｄａｎｉｓｈ  Ｍｙｏｔｅｃｈ）に配置し、１ｍＭのＣａ２＋を含む変更クレブス溶液に置き、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を通気した。気管支は、３７℃に３０分間静置し、次いで２ｍＮの他動張力に達するように徐々に伸ばした。３０分の平衡時間の後、気管支の反応性を溶液槽に４０ｍＭのＫＣｌを添加して試験した。次いで、それらを３００μＭのスペルミンの存在下（１５分間の前処理）または非存在下の漸増濃度のアセチルコリン（ＡＣｈ）に、あるいは２．５ｍＭの累積Ｃａ２＋Ｏに曝した。
【００６２】
ＷＴマウスと平滑筋の標的ＣａＳＲを欠損したマウス由来の小葉内気管支収縮に対するポリカチオンであるスペルミンの影響。
野生型（ｓｍ２２α−Ｃｒｅ−／−／ｆｌｏｘｅｄ−ＣａＳＲ＋／＋）およびＣａＳＲノックアウト（ｓｍ２２α−Ｃｒｅ＋／＋／ｆｌｏｘｅｄ−ＣａＳＲ＋／＋）マウスから小葉内気管支を切除し、既に記載されているように（１２）ミオグラフに配置した。漸増濃度のスペルミン（１０μＭ〜３ｍＭ）を溶液槽に添加し、張力データから収縮（０からの上方偏向）または弛緩（０からの下方偏向）を算出した。ＷＴ：ｎ＝６、ＫＯ：ｎ＝７。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【００６３】
マウス小葉内気管支に対するカルシリティックＮＰＳ８９６３６の影響。
ＷＴまたはＣａＳＲ  ＫＯマウスの肺左葉から二次／三次の小葉内気管支を切除し、ステンレススチールワイヤー（ｄ＝４０μｍ）を用いて小管ワイヤーミオグラフに配置し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を通気したクレブス溶液に置いた。気管支は、３７℃に３０分間静置し、次いで２ｍＮの他動張力に達するように徐々に伸ばした。３０分の平衡時間の後、気管支の反応性を溶液槽に４０ｍＭのＫＣｌを添加して試験した。気管支は、最大段階のおよそ５０％に達するようにＡＣｈ（１μｍｏｌ）にて予め収縮させ、その後ＮＰＳ８９６３６（３００ｎＭまたは３ｍｍｏｌ）を溶液槽に添加した。
【００６４】
インビボの意識下にあり拘束していないマウスの気管支過敏反応に対するポリカチオンおよびカルシリティックＮＰＳ８９６３６の影響。
プレチスモグラフィーにてベースラインの気道過敏反応を測定した。雄ＢａｌｂＣマウス（およそ２５ｇ）はＰｅｒｓｐｅｘチャンバー内に収容し、カルシリティックＮＰＳ８９６３６の存在下および非存在下でＣａＳＲ活性化因子（ポリ−Ｌ−アルギニン）のエアロゾルをＰｕｌｍｏｓｔａｒ噴霧器により伝達した。肺機能の非侵襲的測定は、拘束していない意識下にあるマウスにおいてメタコリン刺激前（ベースライン）および刺激後に気圧プレチスモグラフィー（Ｂｕｘｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。各試験の前には、試験前の５日間毎日４０分間プレチスモグラフィーチャンバー内にマウスを収容することによって設備に慣れさせ、ストレスを軽減した。気道の過敏反応を調査するために、吸入したメタコリン（１〜３０ｍｇ／ｍｌ）に対する気道機能の指標としてエンハンスドポーズ（Ｐｅｎｈ）（１２、１３）を測定した（発明者らは近年それがメタコリンによって引き起こされる気管支収縮を反映することを示した（１４））。メタコリン刺激への影響についてすべての薬剤もナイーブマウス単独において試験した。試験当日、各マウスの体重を記録し、記録の前少なくとも１０分間マウスをチャンバーに順化させた。次いで呼吸活動を５分間記録し、Ｐｅｎｈのベースライン値とした。その後マウスを、漸増濃度の生理食塩水に溶解した噴霧状メタコリン（ＭＣｈ、生理食塩水中０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ）に曝した。データはそれぞれのエアロゾル投与後３分間記録した。翌日、マウスを、噴霧状ポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＬＡ、３μＭ）、ＮＰＳ８９６３６（３μＭ）、ポリ−Ｌ−アルギニン＋ＮＰＳ８９６３６（いずれも３μｍｏｌ）、またはビヒクル（０．３％ＤＭＳＯ）にて肺機能測定前の１時間処置し、次いでメタコリン処置を上記のように繰り返した。発明者らは、噴霧状薬剤については１０％より少ない薬剤が実際に肺上皮に達すると予め想定した（事実、１〜５％であると思われる）。したがって、発明者らは、噴霧チャンバーに用いた薬剤の濃度は、肺上皮での有効濃度と期待される濃度よりもおよそ１０〜１００倍であると思われる。
各ＭＣｈ濃度でのＰｅｎｈ値は平均化し、その日のベースラインＰｅｎｈ（処置後のＰｅｎｈ）の割合として表した。データは、各処置によって生じたＰｅｎｈの割合変化（デルタＰｅｎｈ、％）（＝処置後のＰｅｎｈ−処置前のＰｅｎｈ）として表す。Ｎ＝１条件につきマウス５匹。
【００６５】
インビボの卵白アルブミン感作、卵白アルブミン負荷した、拘束していない意識下にある喘息モデルマウスにおける気管支過敏反応に対するカルシリティックＮＰＳ８９６３６の影響。
雄ＢａｌｂＣマウス（およそ２５ｇ）はＨａｒｌａｎから購入し、試験前１週間の間順化させた。その後、１００μｇ／マウスの卵白アルブミン（ＯＶＡ）および５０ｍｇ／マウスの水酸化アルミニウムを含むＰＢＳの腹腔内（ｉ.ｐ.）注射により０日目と５日目にマウスを感作した。最後の注射から１３日後に、上記のようにメタコリン負荷の間にプレチスモグラフィーによりＰｅｎｈを記録した（処置前Ｐｅｎｈ）。翌日、吸入により０．５％噴霧状ＯＶＡ（ＰＢＳｗ／ｖ中）と噴霧状ＮＰＳ８９６３６（または０．３％ＤＭＳＯビヒクル）をマウスに負荷した。この負荷プロトコールの時間経過は以下からなる。
０時間：１時間のＯＶＡ；
４時間：１時間のＮＰＳ８９６３６（３μＭ）、ＤＭＳＯ（０．３％）またはＰＢＳ（コントロール）の１つ；
５時間：１時間のＯＶＡ；
９時間：１時間のＮＰＳ８９６３６（３μＭ）、ＤＭＳＯ（０．３％）またはＰＢＳ（コントロール）の１つ；
２９時間：上記のようにメタコリン負荷の間プレチスモグラフィー（処置後のＰｅｎｈ）。
【００６６】
試験の最後に、頸動脈切開により血液を採取した。血液は２〜３時間凝集させ、４℃で３０００ｇにて１０分間遠心した。回収したサンプルはＣａ２＋Ｏの測定値について分析した（ウエールズの大学病院生化学部門により実施した）。
１ｍｌのＰＢＳを用いて３回気管支肺胞洗浄を行い、炎症性細胞の定量化のためにＢＡＬＦを回収した。左肺は４％中性緩衝ホルマリンにて２４時間灌流固定し、右肺はＲＮＡ／タンパク質分析のために保存した。データは、各処置によって生じたＰｅｎｈの割合変化（デルタＰｅｎｈ、％）（＝処置後のＰｅｎｈ−処置前のＰｅｎｈ）として表す。
【００６７】
ＬＰＳ処置したＣＯＰＤのモデルモルモットにおける炎症性細胞浸潤に対するカルシリティックＮＰＳ８９６３６の影響。
９回の刺激の間１日おきに、雄ダンキンハートレーモルモットを、３０μｇ／ｍｌの噴霧状リポ多糖類（ＬＰＳ）を含む生理食塩水に１時間曝した。モルモットに、５回目の曝露後から９日間にわたり薬剤／ビヒクル（３μｍｏｌのＮＰＳ８９６３６または０．３％ＤＭＳＯビヒクル）を３０分間、１日おきにＬＰＳ曝露前の３０分与えた。９回目の曝露の２４時間後にモルモットを屠殺し（１．５ｍｌのユータタル（静注））、気管支肺胞洗浄を行って、以下に記載のように総数および差次的細胞数を測定した。
【００６８】
ＯＶＡ感作マウスおよびＬＰＳ処置モルモットのＢＡＬＦ中の炎症細胞浸潤に対するカルシリティックＮＰＳ８９６３６の影響。
喘息モデルでは、ＯＶＡ感作マウスをペントバルビタールナトリウムの致死量摂取（ユータタル）により屠殺し、その後カニューレを用いて１ｍｌのＰＢＳを気管切開部を介して肺に注入した。この手順を３回繰り返し、３ｍｌの得られた気管支肺胞洗浄液をスピンダウンし、３００μｌのＰＢＳに再懸濁した。１００μｌを総細胞数の計数に用い、１００μｌを細胞スメアに用いて差次的細胞数の計数を行った。ＣＯＰＤモデルでは、モルモットをペントバルビタールナトリウムの致死量摂取により屠殺した。首を切開した。次いで、静脈内ポリプロピレンカニューレを用いて気管にカニューレを挿入した。カニューレを介して肺にＰＢＳ（１ｍｌ／１００ｇモルモット体重）を注入し、次いで３分後に回収した。この手順を繰り返し、回収した洗浄液を合わせた。ＢＡＬＦをＰＢＳにて１０倍に希釈し、１００μｌの最終溶液を差次的細胞数の計数に用いた。
総細胞数の計数のために、ＯＶＡ感作マウス由来の１００μｌの濃縮ＢＡＬＦまたはモルモット由来の１００μｌの希釈ＢＡＬＦを、１０００ｒｔ／分で７分間、サーモサイエンティフィック社のガラススライド（ＢＳ７０１１／２；０．８−１ｍｍ、７６×２６ｍｍ）とサーモサイエンティフィック社のフィルター紙（５９９１０２２；シャンドンフィルターカード）を用いたサイトスピン３シャンドン細胞スメアシステムに用いた。次いで、スライドをメタノール中１．５％レーシュマン染色に６分間浸した後、水で２回軽くすすいだ。スライドを一晩乾燥させ、１００倍液浸対物レンズを用いて細胞を計数した。
【００６９】
血漿イオン化Ｃａ２＋の測定
発明者らは、噴霧状カルシリティック処置後のＢａｌｂＣマウス（表１）またはモルモット（表２）のいずれも、血漿イオン化Ｃａ２＋のレベルは有意な影響を受けないことを示した。よって、この処置は動物に害はない。
【００７０】
統計的分析
特に明記しない限り、データは平均±ＳＥＭで表す。統計分析は、独立ｔ検定またはボンフェローニ事後検定によるＡＮＯＶＡを用いて行い、差はｐ＜０．０５のとき有意とみなした。
【００７１】
結果
ＣａＳＲは、鉱物イオン代謝に基礎的な役割を果たす、多面的なＧタンパク質共役受容体である（最近のレビューとして（１）を参照）。細胞外Ｃａ２＋（Ｃａ２＋Ｏ）はこのレセプターの生理的リガンドであるが、一方ＣａＳＲは、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リジンおよびスペルミンなどの喘息に関与するものを含む多くのポリカチオンによって活性化もされる（１）。ここで、発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞で異種性に発現するヒト組換えＣａＳＲがＣａ２＋Ｏ（図６）にだけでなくポリカチオンであるポリ−Ｌ−アルギニン（図１Ａ）およびスペルミン（図１Ｂ）に対しても応答することを確認した。さらに、発明者らは、ＥＣＰがＣａＳＲのアゴニストであることを最初に裏付けるものである（図１Ｃ）。これら応答の特異性は２つに見られた。一つは、空のベクターを安定して形質移入したＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ−０、ネガティブコントロール）はこれらアゴニストには応答しなかったことであり、二つには、すべてのポリカチオンに対する応答はカルシリティック化合物であるＮＰＳ８９６３６による処置によって完全に排除されたことである（図１Ａ−Ｃ）。さらに、構造的に関連しないカルシリティック化合物であるＮＰＳ２１４３はスペルミンによるＣａＳＲ活性化を妨げた（図１Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＥＣＰを含むポリカチオンはＣａＳＲを活性化し、それによりＣａ２＋ｉを流動することができることを示す。また、これらデーは、カルシリティックがＣａＳＲ活性化に対するポリカチオンの影響を妨げることができることを示す。これら実験のポジティブコントロールとして、ＨＥＫ２９３細胞で安定して発現されるＣａＳＲは、Ｃａ２＋ｉを増加することによって５ｍＭのＣａ２＋Ｏに応答した。この影響はｍｏｃｋ形質移入細胞には見られず、ＮＰＳ８９６３６によってブロックされた（図６）。
【００７２】
ポリカチオン、特にＥＣＰは長年、ＢＨＲの病態生理および喘息の気道リモデリングに顕著に貢献することが示唆されているが、そのメカニズムは曖昧なままであった。発明者らは、そうなるメカニズムはＡＳＭおよび／または気管支上皮細胞でのＣａＳＲの機能的発現によるものと考えた。
【００７３】
発明者らは、ＣａＳＲがマウスおよびヒトの両方の気道内で機能的に発現されることをここに示した。ヒトボランティア由来の気管支生検では、ＣａＳＲ免疫応答は平滑筋層内に局在し、その他気道の上皮にも発現が見られた（図２Ａ）。ＣａＳＲおよびカルポニンについて免疫染色したマウスの小葉外気管支の切開像に置いても同様な結果が得られた（図２ＢおよびＣ）。移植したマウス小葉間気管支から移動する細胞では（図２Ｄ）、ＣａＳＲ免疫応答も存在し（図２Ｅ）、カルポニンと共局在していた（図示せず）。このことから、ＣａＳＲタンパク質はマウスＡＳＭ細胞内に発現していることが示唆される。さらに、ＣａＳＲは一次ヒトＡＳＭに発現している（図２Ｆ）。したがって、ＣａＳＲは、ヒトおよびマウスの気道の平滑筋および上皮の両方に存在する。
【００７４】
ＣａＳＲ活性化により初めに細胞内Ｃａ２＋（Ｃａ２＋ｉ）が流動するが、ＣａＳＲが介する下流のシグナル伝達事象もこれら細胞の寿命、流動および分泌特性を制御する。Ｐｌ３Ｋ、ＭＡＰＫ、Ｒｈｏキナーゼの活性化とｃＡＭＰ産生の抑制を伴うこれら経路は喘息やＣＯＰＤに重要である。重要なことには、ＡＳＭ細胞でのＣａ２＋ｉの流動により喘息でのその異常な機能に特徴的な変化、つまりＢＨＲ、炎症およびリモデリングサイトカインの増殖、移動および分泌が生じる。
【００７５】
ＣａＳＲはＡＳＭ細胞で発現されるが、発明者らの最初の発見により、気道上皮細胞でも発現されることが示されたことは注記すべきことである（図２）。喘息では、上皮細胞の損傷は特徴的であり、ポリアミンの存在は上皮ＣａＳＲを直接活性化しうる。よって、ヒト気道上皮細胞でのＣａＳＲの過剰な活性化は、喘息の病態、特に気道リモデリングや上皮透過性に関して直接的な役割もする可能性がある。
【００７６】
Ｃａ２＋Ｏ、スペルミンおよびＥＣＰによる活性化によって示されるように、ＡＳＭ細胞はＣａＳＲを機能的なレベルで発現する（図３）。実際、Ｃａ２＋Ｏ（図３Ａ）およびポリカチオンであるスペルミン（図３Ｂ）およびＥＣＰ（図３Ｃ）はすべて、ヒトＡＳＭ細胞でのＣａ２＋ｉ増加を引き起こすことができる。ＣａＳＲがこれらの応答に関与していることは、以下の結果により裏付けられている。i）ヒトＡＳＭ細胞のＥＣＰによるＣａＳＲ活性化は、ＣａＳＲ活性化の閾値未満のＣａ２＋Ｏ濃度（すなわち０．５ｍＭ）の存在下で検出されうるが、ＣａＳＲを完全に飽和するＣａ２＋Ｏ濃度（すなわち５ｍＭ、図３Ｃ）では観察されない。ii）高濃度のＣａ２＋Ｏによるこの影響は、別のＣａ２＋ｉ流動剤であるブラジキニンがＣａ２＋ｉを誘発するのを妨げないので、Ｃａ２＋ｉ貯蔵が存続していることを裏付ける。iii）ヒトＡＳＭ細胞の「ドミナントネガティブな」ＣａＳＲの導入は、ポリカチオンであるスペルミンおよびＥＣＰによって誘発されるＣａＳＲが介するＣａ２＋ｉ流動を妨げる（図３Ｄ）。まとめると、これら所見は、ＣａＳＲがヒトＡＳＭ細胞で機能的に発現され、そこでＣａ２＋ｉの放出を誘導することにより増加するポリカチオン濃度に応答することを強く示唆する。
【００７７】
単離したマウス小葉内気管支に行った筋運動試験では、スペルミンは、アセチルコリンが介する収縮への応答を増加する（図４Ａ）。これは、このポリカチオンによるＣａＳＲ活性化により生理的な収縮反応が増感することが示される。重要なことには、平滑筋からＣａＳＲを除去すると、エクスビボでのマウス小葉内気管支でのスペルミン誘発性収縮が完全に取り除かれる（図４Ｂ）。まとめると、これらの所見から、ポリカチオンによるＣａＳＲ活性化は気管支収縮を引き起こし、よって喘息の症状に直接寄与しうることが示唆される。
【００７８】
この結果はさらに、図７〜１１のデータによっても裏付けられている。図７では、野生型マウスから単離した気道平滑筋細胞においてＣａＳＲアゴニストであるＣａ２＋Ｏを用いるとＣａ２＋ｉ濃度が増加すること、そしてこの効果は、平滑筋からＣａＳＲが除去されたマウスから単離された細胞では観察されなかったことが示される。同様に、ＣａＳＲアゴニストであるスペルミン（図８）およびＣａ２＋Ｏ（図９）は、野生型マウス由来の小葉内気管支におけるＡＣｈに誘導される収縮を亢進するが（図８Ａおよび９Ａ）、これらの効果はＣａＳＲノックアウトマウスから単離した気管支では観察されない（図８Ｂおよび９Ｂ）。図１０は、ＣａＳＲアゴニストであるスペルミンが野生型マウスの小葉内気管支における気管支収縮を直接誘導するが、ノックアウトマウスの小葉内気管支の収縮は誘導しないことを示す。このことは、スペルミン誘導性気管支収縮はＣａＳＲ活性化によるものであったことを示唆する。最後に、ＣａＳＲアンタゴニストまたはカルシリティックを用いた場合、野生型マウスにおいて小葉内気管支の弛緩が観察された（図１１）。よって、これらのデータは、ポリカチオンによるＣａＳＲ活性化が気管支収縮を引き起こすことを裏付けており、さらに、カルシリティックによりＣａＳＲをブロックすると軽度の気管支拡張が誘導されるので、ＣａＳＲが収縮の気道音（tonic airway tone）に寄与することが示唆される。
【００７９】
気道のＣａＳＲを活性化することによりポリカチオンがＢＨＲを誘導するという仮説を直接的に試験するために、発明者らは、全身プレチスモグラフィーにより意識下の拘束していないマウスの気管支収縮を測定した。発明者らのデータは、噴霧状ポリ−Ｌ−アルギニンが気管支収縮因子であるメタコリンの急性投与への応答を顕著に亢進したことを示す（図５）。ポリカチオン誘導性ＢＨＲを仲介する際のＣａＳＲの関与を確実に検証するために、ポリ−Ｌ−アルギニン誘導性ＢＨＲに対するカルシリティック噴霧投与の影響を試験した。注目すべきことに、発明者らの結果は、メタコリンを急性負荷したマウスでは、ポリ−Ｌ−アルギニン誘導性増加気道反応性はＮＰＳ８９６３６によって完全に抑制されたことを示す（図５）。
【００８０】
この結論は図１２のデータに裏付けられている。図１２は、メタコリン負荷マウスでは、カルシリティックＮＰＳ８９６３６がポリカチオン（ポリ−Ｌ−アルギニン）誘導性気管支ＢＨＲを抑制したことを示す。
【００８１】
炎症性気道疾患のＣａＳＲ活性化の役割を調べるために、２つのインビボモデルを用いた。図１２は、ＯＶＡ感作、ＯＶＡ負荷マウスである喘息の標準的な齧歯類モデルを用いて得たデータを示す。このモデルを用いて、発明者らは、ＮＰＳ８９６３６がメタコリン誘導性ＢＨＲを完全に取り除くことを示す（最大およびおよそ３０ｍｇ／ｍｌ）。重要なことに、ＮＰＳ８９６３６は、これらマウスの肺へのＯＶＡ誘導性炎症性細胞の浸潤も低減した（図１４）。炎症性肺疾患の二つ目の哺乳動物モデルとして、発明者らは、ＣＯＰＤの確立したモデルであるＬＰＳ処置モルモットを用いた。モルモットをカルシリティックＮＰＳ８９６３６にて処置した場合、発明者らは、この第二の哺乳動物種において、特にリンパ球および好中球の炎症細胞浸潤の低減を観察した。ゆえに、これらのデータは、気管支肺胞洗浄液中の細胞に特徴付けられる炎症性反応が、ＣａＳＲアンタゴニストによる処置により寛解されるという仮説を裏付けるものである。さらに、ステロイドとは無関係に働いて喘息／ＣＯＰＤの炎症を低減する薬剤が非常に有益であることは注目に値する。
【００８２】
結論
これらのデータは以下のことを示す。１）ＣａＳＲはヒト、マウスおよびモルモット（すなわち哺乳動物）の気道（平滑筋および気管支上皮）において発現されること、２）インビトロの哺乳動物発現システムおよびインビトロのヒトＡＳＭ細胞では、ＥＣＰおよび他のポリカチオンはＣａＳＲの活性化を介して［Ｃａ２＋］ｉの増加を誘発するが、この効果はカルシリティックによって抑制されうること、３）スペルミンおよびＣａ２＋Ｏは、アセチルコリンに対して野生型マウスのエクスビボのマウス小葉内気管支の収縮を亢進するが、平滑筋からＣａＳＲを除去したマウスでは亢進しないこと、４）カルシリティックＮＰＳ８９６３６は、マウス小葉内気管支の軽度の気管支拡張を生じさせること、５）メタコリンを急性負荷したマウスでは、ポリ−Ｌ−アルギニンがインビボで気道の過剰反応を増加するが、この効果は、噴霧状カルシリティックによって抑制されること、６）喘息のマウスモデル（ＯＶＡ感作、ＯＶＡ負荷）では、カルシリティックＮＰＳ８９６３６は、メタコリンにより誘導されるＢＨＲおよび肺への炎症性細胞浸潤を低減すること、７）ＣＯＰＤのモルモットモデル（ＬＰＳ処置）では、カルシリティックＮＰＳ８９６３６は、肺への炎症性細胞、特にリンパ球および好中球の数も低減すること。
【００８３】
まとめると、これらの所見から、喘息患者、ＣＯＰＤ患者および炎症性肺疾患を有する哺乳動物の気道においてポリカチオンによってＣａＳＲが不適切に活性化されると、ＢＨＲや気道リモデリング（修復）が誘発されるので、ＣａＳＲは、喘息やＣＯＰＤなどの炎症性肺疾患の治療の新規のターゲットであることが示唆される。
【００８４】
発明者らのプロジェクトにより、薬剤であるカルシリティックの使用に関して科学的根拠が付与される。このカルシリティックは、代替治療または現行の治療剤との併用としてヒトでの安全性が既に確立されており、喘息および／またはＣＯＰＤなどの肺疾患の症状を緩和するものである。さらに、発明者らの新規の治療は、気道の平滑筋が様々な薬学的および刺激性の物質に対して過剰反応している、喘息／ＣＯＰＤの臨床状況を反映するものである。喘息およびＣＯＰＤを治療するためのカルシリティックの使用は、気管支拡張剤として既存の薬剤の代替／付加となるだけでなく、気道の過剰反応を標的として、疾患の安定性を改善し、入院を減らし、長期的に気道の炎症やリモデリングを抑制することとなる。
【００８５】
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【００８６】
【表１】
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【表２】
0006352926.tif 000005
【図１】
0006352926.tif 000006
【図２】
0006352926.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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