(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３〜１３のアミノ酸配列で表される、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに特異的に結合する非抗体ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、ホモまたはヘテロ二量体またはホモまたはヘテロ三量体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１４〜２４のうちいずれか一つの配列で表されるものである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または４に記載ポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５に記載の組換えベクターが導入された形質転換細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドを含むＨｏｔ−Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ組成物。
【請求項８】
請求項７に記載のＰＣＲ組成物または請求項１に記載のポリペプチドを使用することを特徴とするｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ方法。
【請求項９】
請求項７に記載のＰＣＲ組成物または請求項１に記載のポリペプチドをポリヌクレオチド鋳型及びＰＣＲに使用される成分と混合する段階；及び前記混合物をＰＣＲが可能な条件下で反応させる段階を含む、Ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチドのＨｏｔ−ｓｔａｒｔ  ＰＣＲへの使用。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドのＨｏｔ−ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ組成物の製造への使用。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項７に記載のＰＣＲ組成物を含むＨｏｔ−ｓｔａｒｔ  ＰＣＲキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列増幅技術分野である。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）は、特定核酸を増幅する方法で、生物学、生化学及び医学分野で最も広く使用される方法の一つである（非特許文献１）。ＰＣＲは、変性、プライマー結合及び伸長で構成される三つの段階を一サイクルにして複数のサイクルで繰り返され、各段階はそれに適した温度で行われる。ＰＣＲに最も広く使用される酵素は、Thermus aquaticus由来のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであり、高い温度で熱安定により、効率的かつ安定したＰＣＲを可能にする。
【０００３】
しかし、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、常温での活性によりＰＣＲの変性段階が完全に終わる前にプライマーが鋳型核酸に結合したり、またはプライマー間の二量体形成をした場合、このような鋳型から非特異的増幅反応を可能にして、これにより遺伝子増幅の効率性と正確性が大きく落ちる短所がある。
【０００４】
このような望まない核酸の増幅を防止するため開発されたのが特定温度に到達するまでＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを不活性化状態で維持するか、またはプライマーの伸長を抑制するＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ技術である(非特許文献２)。
【０００５】
初期にはポリメラーゼを除いたＰＣＲに必要な残りの成分だけを変性温度である９５℃まで予熱した後、ポリメラーゼを追加する技術が使用されたが、追加の処理過程により不具合をもたらす問題点があった(非特許文献３)。他の方法は、ワックスまたはビーズを利用してポリメラーゼを反応前までに物理的に隔離する技術である。しかし、これも追加の処理過程及びワックスの再凝結などによる不便をもたらし反応の効率が落ちる問題点があった（非特許文献４)。その後、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性を化学的に抑制する技術が開発されたが、製造過程が複雑で再活性化まで１０分以上の時間を要し、これによりＤＮＡが切断される問題点があった(非特許文献５)。またＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを抗体を介して不活性化させる技術が開発された。免疫グロブリン基盤のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを特異的に認識する抗体は、低い温度では酵素に結合してこれの活性を抑制してＰＣＲ過程で温度が上昇するにつれ酵素から分離してその結果ポリメラーゼが活性化する(非特許文献６)。このような中和抗体は簡便ながらも効果が良い方法であるが、生産単価が高く、生産過程がわずらわしくて大きい分子量により凝集体を形成する問題点がある。
【０００６】
特許文献１は、ナノアルカエウム・エクウィタンス由来のＮｅｑ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体製造及びこれを利用したｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ応用に関するもので、高温で発生するトランス・スプライシングを利用したＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ技術を開示している。
【０００７】
しかし、依然として既存の方法を代替できる、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合してこれの活性を中和できる新しい物質の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１４８８１１０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Yamamoto,Y.Clin.Diagn.Lab.Immunol.2002,9(3),508-514
【非特許文献２】Paul,N.;Shum,J.;Le,T.MethodsMol.Biol.2010,630,301-318
【非特許文献３】D’ Aquila,R.T.; Bechtel,L.J.; Videler,J.a;Eron,J.J.;Gorczyca,P.; Kaplan,J.C.Nucleic Acids Res.1991,19 (13),3749.
【非特許文献４】Hebert,B.;Bergeron,J.;Potworowski,E.F.;Tijssen,P.Molecularand cellular probes.1993,pp 249-252.
【非特許文献５】Moretti,T.;Koons,B.;Budowle,B.Biotechniques1998,25 (4),716-722.
【非特許文献６】Scalice,E.R.;Sharkey,D.J.;Daiss,J.L.J.Immunol.Methods1994,172(2),147-163
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本願は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用したＰＣＲで発生し得る非特異的増幅をＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合するポリペプチドを利用して効果的に抑制して、核酸増幅の効率性と正確性を高めることができる技術を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一様態において本願は、インターナリンＢタンパク質のＮ−末端；ＶＬＲ（Variable Lymphocyte Receptor）タンパク質の変形された繰り返しモジュール；及びＶＬＲタンパク質のＣ−末端が融合した、配列番号１のアミノ酸配列で表されて、前記アミノ酸配列で４５番残基はＱ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｖ、またはＮ；４７番残基はＩ、Ｔ、Ｋ、Ａ、またはＱ；４９番残基はＮ、Ｈ、Ｌ、ＭまたはＩ；６７番残基はＹ、Ｒ、ＡまたはＫ；６９番残基はＡまたはＫ；７２番残基はＧまたはＡ；９１番残基はＩ、またはＳ；９３番残基はＴまたはＷ；９４番残基はＧまたはＬ；１１５番残基はＶまたはＳ；１１７番残基はＶまたはＨ；そして１１８番残基はＥまたはＷである、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに選択的に結合するポリペプチドを提供する。
【００１２】
一実現例において本願に係るＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに選択的に結合するポリペプチドは、４５番残基はＱ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｖ、またはＮ；４７番残基はＩ、Ｔ、Ｋ、Ａ、またはＱ；４９番残基はＮ、Ｈ、Ｌ、ＭまたはＩ；６７番残基はＹ、Ｒ、ＡまたはＫ；６９番残基はＡまたはＫ；７２番残基はＧまたはＡ；９１番残基はＳ；９３番残基はＷ；９４番残基はＬ；１１５番残基はＳ；１１７番残基はＨ；及び１１８番残基はＷであるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに選択的に結合するポリペプチドを提供する。
【００１３】
他の実現例において本願に係るＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに選択的に結合するポリペプチドは、４５番残基はＱ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｖ、またはＮ；４７番残基はＩ、Ｔ、Ｋ、Ａ、またはＱ；４９番残基はＮ、Ｈ、Ｌ、ＭまたはＩ；６７番残基はＲ；６９番残基はＫ；７２番残基はＡ；９１番残基はＳ；９３番残基はＷ；９４番残基はＬ；１１５番残基はＳ；１１７番残基はＨ；及び１１８番残基はＷであるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに選択的に結合するポリペプチドを提供する。
【００１４】
さらに他の実現例において本願に係るポリペプチドは、配列番号３〜１３のうちいずれか一つのアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の残基のうち４５番、４７番、４９番、６７番、６９番、７２番、９１番、９３番、９４番、１１５番、１１７番、及び１１８番残基のうちの一つ以上が表１の保存的置換残基で置き換えられたアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【００１５】
他の様態で本願に係るポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の次の残基で保存的置換が起きたもので、前記アミノ酸配列で４５番残基はＳ、Ｔ、Ａ、またはＮ；４７番残基はＫ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、またはＮ；４８番残基はＡ、Ｓ、Ｇ、またはＴ；４９番残基はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、またはＦ；６７番残基はＲ、Ｋ、Ｑ、またはＨ；６９番残基はＫ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、またはＮ；７２番残基はＡ、Ｓ、Ｇ、またはＴ；９１番残基はＳ、Ｔ、Ａ、またはＮ；９３番残基はＷ、Ｙ、またはＦ；９４番残基はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、またはＦ；１１５番残基はＳ、Ｔ、Ａ、またはＮ；１１７番残基はＨ、Ｎ、Ｑ、またはＹ；１１８番残基はＷ、Ｙ、または、Ｆである。
【００１６】
一実現例において本願に係るポリペプチドは、ホモまたはヘテロダイマー、または三つのホモまたはヘテロトライマーを形成するものである、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに選択的に結合するポリペプチド。
【００１７】
他の様態で本願はさらに本願に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供して、前記ポリヌクレオチドの配列は、例えば配列番号１４〜２４で表されることができる。
【００１８】
他の様態で本願はさらに本願に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクター、または前記ベクターが導入された形質転換された細胞を提供する。
【００１９】
本願はさらに本願に開示された一つ以上のポリペプチドをＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲに使用する用途を提供する。
【００２０】
本願はさらに、本願に開示された一つ以上のポリペプチドをＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ組成物の製造に使用する用途を提供する
【００２１】
また他の様態において本願は、本願に係るポリペプチドを含むＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ用ＰＣＲ組成物、キットまたはＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ方法を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本願に係るポリペプチドは、生産が容易であるだけでなく、ＰＣＲが開始される前まではＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに高い親和力で結合してその活性を抑制して、変性過程で反応物の温度が９５℃に到達するとポリメラーゼから効果的に分離されて、ＰＣＲ開始前の低い温度で発生し得る非特異的な増幅現象を防止できて、低費用かつ高効率で特異性が高いＰＣＲ反応を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本願に係るポリペプチドのスクリーニングのために使用されたＲｅｐｅｂｏｄｙ−ＶＬＲ４の例示的構造を図式的に示したもので、スクリーニングのために突然変異が導入されたモジュールを表示した。順に一番目の段階で最も高い結合力を示したｒ−Ｇ６クローンは二番目の段階のライブラリー製作のための鋳型で使用され、二番目の選別段階で最も高い結合力を示したｒ−Ｇ６Ｅ１クローンは三番目の段階のライブラリー製作のための鋳型で使用される方式で計３回のライブラリーを製作した。一番目のライブラリーは、ＬＲＲＶ２とＬＲＲＶ３の凹領域に突然変異を導入し、二番目のライブラリーは、ＬＲＲＶ１に、三番目のライブラリーは、ＬＲＲ１に突然変異を導入した。各ライブラリーを使用して段階別に選別したクローンの名称は図の下方に表示されている。
【図２】前記図１の一番目のライブラリーを使用して選別したクローン中最も高い結合力を示すクローンであるｒ−Ｇ６をＥＬＩＳＡを介してＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに対する特異的な結合の有無を確認した結果である。クローンｒ−Ｇ６はＢＳＡには結合しないがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに対しては特異的に結合することを確認することができる。この時、競争者としていれたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合して活性を阻害すると知られる抗体（JumpStart antibody;Sigma Aldrich）によってＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＥＬＩＳＡ信号が減少したことから、クローンｒ−Ｇ６が前記抗体と類似の抗原決定部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）を有することを示す。
【図３】図１に記載された方式で製作されたライブラリーを利用して段階別にファージディスプレイのバイオパニングを行った結果得られたすべてのクローンで変化したアミノ酸配列及びその解離定数をＩＴＣで測定した結果を示したものである。一番目の段階で最も高い結合力を示すｒ−Ｇ６クローンは、二番目の段階のライブラリー製作のための鋳型で使用され、二番目の選別段階で最も高い結合力を示したｒ−Ｇ６Ｅ１クローンは三番目の段階のライブラリー製作のための鋳型で使用された。
【図４】３段階ラウンドで選別されたｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８クローンのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ結合特異配るファージＥＬＩＳＡ実験を介して分析した結果である。
【図５】各ラウンドで選別されたリピボディクローンのタンパク質melting temperatureをＣＤ（Circular dichroism）分析器を介して測定した結果である。
【図６】各ラウンドで選別されたリピボディクローンに対してＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性抑制効果を分析した結果である。
【図７】３段階ラウンドで選別されたｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８リピボディクローンによって不活性化されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが迅速に再活性化されることを示す実験結果で、既存の抗体及び化学的に変形されたポリメラーゼを比較群として使用した。
【図８】本願で選別されたリピボディクローンを利用したＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ効果をｂｌｏｃｋ  ＰＣＲで確認した結果である。
【図９】本願で選別されたリピボディクローンのＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ効果をリアルタイムＰＣＲで確認した結果である。
【図１０】本願に係るリピボディクローンを連続的に連結した形態のダイマー（ｄｉｍｅｒ）を利用したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性抑制効果を分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本願では、Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲで既存の抗体を代替できる、Ｔａｑポリメラーゼに特異的に結合する非抗体タンパク質骨格（non-antibody protein scaffold）のポリペプチドの開発に成功した。
【００２５】
本願に係るポリペプチドは、「リピボディ（ｒｅｐｅｂｏｄｙ）」と称し、これはインターナリンＢ（Internalin B）タンパク質のＮ−末端、ＶＲＬ（VariableLymphocyte Receptor；可変リンパ球受容体）の変形されたＬＲＲ（Leucine richrepeat）モジュール及びＶＲＬタンパク質のＣ−末端が融合したポリペプチドで、構造上窪んだ地域（Ｃｏｎｃａｖｅ）と膨らんだ地域（Ｃｏｎｖｅｘ）に分けられる。ここで、窪んだ地域は配列の多様性が高くタンパク質相互作用に重要な部位であり、膨らんだ地域は保存性が高い配列を基にタンパク質の全体構造を安定するように維持する役割を行う。モジュールは、複数を含み、特徴に応じてＬＲＲ１、ＬＲＲＶ１、ＬＲＲＶ２、ＬＲＲＶ３、ＬＲＲＶ４、ＬＲＲＶ５、及びＬＲＲＶｅのように区分され、前記モジュール中一つ以上が欠如され得る。リピボディの詳細な製造方法及び構造は、大韓民国登録特許第１３５６０７６号及び大韓民国登録特許第１５１７１９６号に記載されたものを参照することができる。
【００２６】
リピボディは、大きさが抗体の１／５程度で、大腸菌で大量生産され、動物実験結果、免疫原性が殆どない。また、熱及びｐＨ安定性が非常に優秀で、ターゲットに対する結合力をｐｉｃｏ−ｍｏｌｅ水準にまで非常に容易に増大させることができ、ターゲットに対する特異性が非常に卓越して抗体を代替できる代案として非常に有用である。
【００２７】
特に、リピボディに含まれた「ＬＲＲ（Leucine rich repeat）モジュール」は、ロイシンが一定の位置に繰り返される長さ２０〜３０個のアミノ酸で繰り返しパターンで「ＬｘｘＬｘｘＬｘＬｘｘＮ」を有していて、Ｌはアラニン、グリシン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン及びトリプトファンのような疏水性アミノ酸を、Ｎはアスパラギン、グルタミン、セリン、システインまたはスレオニンを、ｘは任意のアミノ酸を意味する。
【００２８】
本願では、図１に示したようにリピボディ構造に基づいてＬＲＲモジュールの特定アミノ酸に突然変異を導入して、結合力を増大させる方式で順次突然変異ライブラリー製作して、これからＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに特異的に結合してこれの活性を効果的に阻害できる非抗体骨格のポリペプチドを選別した。
【００２９】
本願に係るポリペプチドは、低い温度、特にＰＣＲ反応で開始変性（initial denaturation）反応が始まる前、または、非特異的プライマーアニーリングとこれによるＤＮＡ合成が可能な温度でプライマーアニーリング温度に応じて異なり得るが、例えば５０〜６０℃または５０℃以下ではＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合してこれの活性を阻害して、ＰＣＲ変性温度では変性されながら分離して、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを再活性化させる熱的安定性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抑制剤である。
【００３０】
本願では、より効率的なリピボディを発掘するために、ライブラリー構築に鋳型で使用されるリピボディの変性温度を低くしようとした。これのために、上述した参考文献に記載されたような既存のリピボディに含まれたモジュール中、特にＬＲＲＶ４モジュールが除去される。リピボディは、モジュールの個数が熱的安定性に影響を及ぼし、本願の目的に合う熱的安定性を有する抑制剤の開発のために１個のモジュールが欠如したリピボディを鋳型で使用してライブラリーを製作した。リピボディの凹（ｃｏｎｃａｖｅ）領域でライブラリーを生成して標的物質に特異的に結合するリピボディを選別する方式で順次的スクリーニングを介してリピボディと標的物質間のｉｎｔｅｒｆａｃｅ（結合部位）に存在する残基の間の相互作用の最適化を介して結合力の向上を図った。
【００３１】
また、本願では結合力をより向上させるために、３回にわたって順次突然変異を導入して一番目の段階で最も高い結合力をクローンを利用して二番目の段階のライブラリーを製作して、二番目の選別段階で最も高い結合力を示したクローンを利用して三番目の段階のライブラリーを製作した。
【００３２】
本願において一番目の段階では、凹領域ＬＲＲＶ２及びＬＲＲＶ３の配列番号１の残基を基準に９１、９３、９４、１１５、１１７及び１１８番残基に突然変異を誘発して、Ｔａｑポリメラーゼに特異的に結合するポリペプチドを選別した後、これを利用して凹領域ＬＲＲＶ１、及びＬＲＲ１領域に順次６７、６９、７１及び７２番残基に２次、そして４５、４７、４９及び５０番に３次突然変異を誘発して、Ｔａｑポリメラーゼに対する結合力が増加するポリペプチドを選別した。
【００３３】
そこで、一様態で本願は、インターナリンＢタンパク質のＮ−末端；ＶＬＲ（Variable Lymphocyte Receptor）タンパク質の変形された繰り返しモジュール；及びＶＬＲタンパク質のＣ−末端が融合した、配列番号１のアミノ酸配列で表されるポリペプチドに関し、前記配列で４５番残基はＱ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｖ、またはＮ；４７番残基はＩ、Ｔ、Ｋ、Ａ、またはＱ；４９番残基はＮ、Ｈ、Ｌ、ＭまたはＩ；６７番残基はＹ、Ｒ、ＡまたはＫ；６９番残基はＡまたはＫ；７２番残基はＧまたはＡ；９１番残基はＩ、またはＳ；９３番残基はＴまたはＷ；９４番残基はＧまたはＬ；１１５番残基はＶまたはＳ；１１７番残基はＶまたはＨ；及び１１８番残基はＥまたはＷである。
【００３４】
本願で「Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」は、熱親和性バクテリアであるThermus aquaticusから由来した酵素またはこれと同等の活性を示すその誘導体または変異体を含むもので、様々な会社から市販しているものを購入することができる。本願に係るポリペプチドが結合できる限り、突然変異が誘発された様々な形態及び／または由来のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが本願に含まれる。
【００３５】
上述した通り、本願に係るポリペプチドは、選別回数が増加するほど導入される突然変異の数が増加して、結合力が増加するが、各回数でＴａｑポリメラーゼに対する結合力を根拠に選別されるため、３回目はもちろん１次及び２次で選別された突然変異も本願の範囲に含まれるものである。
【００３６】
また、順次的方式で各回次で上述した残基の位置で人為的に突然変異を誘発を試みたもので、前記いずれの位置で必ずしも突然変異が誘発されるべきではなく、各回数で選別された突然変異リピボディも本願に含まれるものである。また、結合力を有する限り前記一つ以上の位置で突然変異が発生したポリペプチドが本願に含まれる。
【００３７】
本願に突然変異の位置は、当業者の自明でない努力により選別された。具体的に、一番目の段階の選別では、リピボディのＬＲＲＶ２、ＬＲＲＶ３の残基中で凹領域の中央に該当する位置に突然変異を誘発して初期選別されたリピボディ（Ｇ６）を鋳型として次の段階の選別では、最初にライブラリーを製作した二つのモジュールの両側にモジュールを一つずつ突然変異を追加的に与えて結合力を増大させたが、Ｃ−末端部位のモジュール部位の突然変異は除いた。したがって、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合するリピボディはＬＲＲＶ２のＮ−末端モジュールであるＬＲＲＶ１に二番目のライブラリーを与えて結合力が増大したクローン（Ｇ６Ｅ１）を発掘して、次にＬＲＲ１に三番目のライブラリーを与えて結合力がさらに増大したクローンである（Ｇ６Ｅ１Ｈ８）を発掘した。
【００３８】
特に、１回目の選別で最も結合力が優秀なポリペプチドを２回目の選別に使用して、２回目の選別で突然変異誘発に使用された残基中の一つ以上の残基で突然変異が発生されたポリペプチドが本願に含まれる。同様に２回目の選別で最も結合力が優秀なポリペプチドを３回目の選別に使用して、３回目の選別で突然変異誘発に使用された残基中の一つ以上の残基で突然変異が発生したポリペプチドが本願に含まれる。
【００３９】
したがって、他の様態で本願は下記の配列を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに選択的に結合するポリペプチドに関し、１次スクリーニングにより選別されたポリペプチドで９１番残基はＳ；９３番残基はＷ；９４番残基はＬ；１１５番残基はＳ；１１７番残基はＨ；及び１１８番残基はＷを有し、他の位置、すなわち６７番、６９番、７２番、４５番、４７番及び４９番残基は上述したような一つ以上の残基を有するポリペプチドである。
【００４０】
同様に、また他の様態において本願は、下記の配列を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに選択的に結合するポリペプチドに関し、１次スクリーニングにより選別されたポリペプチドで９１番残基はＳ；９３番残基はＷ；９４番残基はＬ；１１５番残基はＳ；１１７番残基はＨ；そして１１８番残基はＷ；そしてここに２次スクリーニングにより選別された６７番残基はＲ；６９番残基はＫ；７２番残基はＡであり、他の位置、すなわち４５番、４７番及び４９番残基は上述したような一つ以上の残基を有するポリペプチドである。
【００４１】
一実現例において、本願に係るＴａｑポリメラーゼに対する結合力を有するポリペプチドは、配列番号３〜配列番号１３で表される。
【００４２】
しかし、本願に係るペプチドは前記のような配列に限定されず、これの生物学的均等物（biological equivalents）を含むものである。生物学的均等物とは、本願に開示されたアミノ酸配列に追加的な変形を加えたが、本願に係るポリペプチドと実質的に同じ活性を有するもので、このような変形は、例えばアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び/または置換を含むものである。
【００４３】
一実現例においては、本願に係るＴａｑポリメラーゼに対する結合力を有するポリペプチドに保存的アミノ酸置換が起きたものを含む。
【００４４】
保存的アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）とは、特定ポリペプチドが有する活性に実質的に影響を及ぼすか減少させない置換を意味し、例えば、１〜１５個の保存的置換、１〜１２個、例えば１、２、５、７、９、１２、または１５個の保存的アミノ酸置換を含むことができる。
【００４５】
一実現例においては、本願に係る配列番号３〜配列番号１３で表されるポリペプチドで保存的置換が起きたもので、特に前記ポリペプチドの９１番、９３番、９４番、１１５番、１１７番、１１８番、６７番、６９番、７２番、４５番、４７番及び４９番残基中一つ以上に保存的置換が起きたものである。
【００４６】
他の実現例においては、配列番号３〜配列番号１３で表されるポリペプチドで保存的置換が起きたもので、特に前記ポリペプチドの９１番、９３番、９４番、１１５番、１１７番、１１８番、６７番、６９番、７２番、４５番、４７番及び４９番残基に付加して、こらら以外の一つ以上の残基で保存的置換が発生したものを含む。
【００４７】
また他の実現例においては、配列番号３〜配列番号１３で表されるポリペプチドで保存的置換が起きたもので、特に前記ポリペプチドの９１番、９３番、９４番、１１５番、１１７番、１１８番、６７番、６９番、７２番、４５番、４７番及び４９番残基以外の一つ以上の残基で保存的置換が発生したものを含む。
【００４８】
保存的アミノ酸置換は当業界に知られたものであって、例えばＢｌｏｓｕｍ（BLOcks SUbstitution Matrix）に基づいた表１に記載されたとおりであり、Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(Eds);及びHenikoff,S.;Henikoff,J.G.(1992)．「Amino AcidSubstitution Matrices from Protein Blocks」.PNAS89(22):10915-10919.doi:10.1073/pnas.89.22.10915;WO2009012175 A1等に記載されたのを参照することができる。
【００４９】
【表１】
0006426306.tif 000002
【００５０】
本願に係る実現例においては、配列番号３〜配列番号１３で表されるアミノ酸配列及び前記配列に保存的置換が起きた配列を含むものである。
【００５１】
特に、配列番号３〜１３で表されるアミノ酸配列で残基中４５番、４７番、４９番、６７番、６９番、７２番、９１番、９３番、９４番、１１５番、１１７番、及び１１８番残基中一つ以上で保存的置換が起きたものを含む。一例として、本願に係る配列番号１３のアミノ酸配列で表されるポリペプチドで、保存的置換を考慮して、４５番残基はＳ、Ｔ、Ａ、またはＮ；４７番残基はＫ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、またはＮ；４８番残基はＡ、Ｓ、Ｇ、またはＴ；４９番残基はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、またはＦ；６７番残基はＲ、Ｋ、Ｑ、またはＨ；６９番残基はＫ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、またはＮ；７２番残基はＡ、Ｓ、Ｇ、またはＴ；９１番残基はＳ、Ｔ、Ａ、またはＮ；９３番残基はＷ、Ｙ、またはＦ；９４番残基はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、またはＦ；１１５番残基はＳ、Ｔ、Ａ、またはＮ；１１７番残基はＨ，Ｎ、Ｑ、Ｒ、またはＹ；及び１１８番残基はＷ、Ｙ、または、Ｆであり得る。
【００５２】
さらに、上述したような生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本願に開示されたアミノ酸配列または後述するようにこれをコードするポリヌクレオチドは、本願に開示されたのと実質的同一性を有するものも含まれる。実質的同一性とは、本願に開示された配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインして、当業界で通常利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、さらに好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント法は当業界に公知されている。例えば、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.(1981)2:482; Needleman andWunsch,J.Mol.Bio.(1970)48:443; Pearson and Lipman,Methods inMol.Biol.(1988)24:307-31; Higgins and Sharp,Gene(1988)73:237-44; Higginsand Sharp,CABIOS(1989)5:151-3; Corpet et al.,Nuc.Acids Res.(1988)16:10881-90;Huang et al.,Comp.Appl.BioSci.(1992)8:155-65及びPearsonet al.,Meth.Mol.Biol.(1994)24:307-31に開示されている。NCBIBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.(1990)215:403-10)はＮＢＣＩなどで接近可能で、ｂｌａｓｔ，ｂｌａｓｔｐ，ｂｌａｓｍ，ｂｌａｓｔｘ，ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動されて利用することができる。ＢＬＳＡＴはwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLＡSＴ/で接続可能で、このプログラムを利用した配列相同性比較方法は、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLＡSＴ/blast_help.htmlで確認することができる。
【００５３】
他の側面で本願はさらに、上述した本願に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び前記組換えベクターが導入された細胞に関する。
【００５４】
一実現例において本願に係るポリヌクレオチドは、配列番号１４〜２４で表されるが、これに制限されず、アミノ酸コード配列の縮重変異（degeneracy）によって変形されたポリヌクレオチドをさらに含むものであり、上述したような実質的同一性を有するのを含むものである。
【００５５】
さらに本願に係るポリヌクレオチドＤＮＡまたはＲＮＡを含むものである。
【００５６】
本願に係るポリヌクレオチドは、様々な目的、例えば生産のために適切なベクターに導入されて使用できる。例えば、適した宿主内で目的タンパク質を発現させることができるように適した調節配列、例えば転写を開始することができるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列に作動可能に連結されて使用できる。このような本願に係るポリヌクレオチドが導入できるベクターまたはプラスミドは、宿主で複製可能なものであれば特に制限されず、具体的な目的に合わせて公知された任意のベクターが使用でき、天然、または組換えプラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａ等を使用することができ、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系ベクター、例えばｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＥＴ−２１ａ、ｐＥＴ−３２ａベクターなどを使用することができる。
【００５７】
本願に係るポリヌクレオチドを含むベクターは、適当な宿主内に導入されて使用できて、宿主ゲノムと関係なく複製されたり機能することができ、ゲノム自体に統合されることができる。
【００５８】
本願に係るポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターを含む細胞は、真核細胞及び原核細胞を含む。例えば、特にこれに制限されないが、大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウム等のバクテリア細胞；酵母細胞；ピキア・パストリス等の真菌類細胞；ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、ボウズメラノーマ細胞等の動物細胞；または植物細胞になり得る。本願に係るポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含み、宿主細胞内に導入されて発現のために様々な形態で導入されることができる。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自主的に発現するのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（Expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されることができる。前記発現カセットは、通常前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態であり得る。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。
【００５９】
他の側面で本願はさらに、本願に係る多数のポリペプチドで構成されたホモまたはヘテロダイマー、または三つのホモまたはヘテロトライマーに関する。
【００６０】
本願に係るダイマーまたはトライマーは、各単位体がＮ−＞Ｃ末端方向に、またはＮ末端またはＣ末端同士が向かい合う方向に連結されてもよいが、本願に係る効果を示す限り特定方向に制限されない。
【００６１】
本願に係るポリペプチドは、リンカーを介して連結されることができる。本願に係るポリペプチドの活性に影響を及ぼさない当業界に知られた様々なリンカーが本願に使用されることができる。例えば、Chichili et al.,PROTEIN SCIENCE 2013 VOL 22:153-167の記載を参考にすることができる。一実現例においては、ポリ−グリシンまたはグリシンが豊富なアミノ酸で構成されたリンカーが使用されて、例えばＧＧＧ、ＧＧＧＧＧ、ＧＧＳＳＧまたはＧＧＳＧＧなどが使用できるが、これに制限しない。
【００６２】
他の側面で本願はさらに（ａ）前記組換え細胞を培養して培養物を収得する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞または培養物から前記ポリペプチドを回収する段階を含むＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに特異的に結合するポリペプチドの生産方法に関する。
【００６３】
本発明において、前記組換え細胞を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知された回分培養法、連続培養法、流加培養法等によって行われることが好ましく、培養条件は特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を使用して適正ｐＨ（ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、最も好ましくはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素−含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができ、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃を維持することができ、約１０〜１６０時間培養することが好ましい。前記培養によって生産された前記ポリペプチドは、培地中に分泌されたり細胞内に残留することができる。
【００６４】
本発明で、使用される培養用培地は、炭素供給源としては糖及び炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例：大豆油、ひまわり油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例：グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例：酢酸）等を個別的に使用するかまたは混合して使用でき；窒素供給源としては、窒素−含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、とうもろこし浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）等を個別的に使用するかまたは混合して使用することができ；リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩等を個別的に使用するかまたは混合して使用できて；その他の金属塩（例：硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンといった必須成長−促進物質を含むことができる。
【００６５】
本発明の前記培養段階で生産されたポリペプチドを回収する方法は、培養方法、例えば灰分式、連続式または流加培養方等に応じて当該分野に公知の適した方法を利用して培養液から目的するポリペプチドを収集することができる。
【００６６】
他の側面で本願をさらに本願に係るポリペプチドまたはこれをコードする核酸（ポリヌクレオチド）の用途に関する。
【００６７】
本願に係るポリペプチドは、低温で例えば４℃〜５０℃でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合して、合成開始前まで酵素の活性を抑制して、合成の特異性を増加させる。
【００６８】
したがって、本願に係るポリペプチドまたはこれをコードする核酸は、本願に係るポリペプチドが特定温度でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合して、これの活性の阻害が必要な様々な用途に使用されることができる。
【００６９】
一実現例において本願に係るポリペプチドを有効性分として含有するＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ組成物に関する。本願に係る組成物は、本願に係るポリペプチド以外に、Ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋のような２価陽イオン、塩、緩衝液、保存剤及び／または添加剤のようなＰＣＲに必要な成分を追加で含むことができる。前記成分の中で塩の例としては、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、緩衝液の例としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｓｏｄｉｕｍ−／Ｐｏｔａｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、保存剤の例としては、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、添加剤の例としては、ＤＭＳＯが挙げられるが特にこれらに制限されない。具体的な使用目的や用途に応じてＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ組成物はさらに他の活性を有する酵素と共に使用され、例えば、Reverse Transcriptase、Uracil DNA glycosylase、Pfu DNA polymerase、dUTPase、Pyrophosphataseと共に使用されてもよく、この場合該当酵素の活性を現すために必要な組成物が追加で使用されてもよく、変更されてもよい。
【００７０】
他の実現例では、ポリペプチドまたはこれを含む組成物を利用したＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ方法に関する。本願に係る方法は、ＰＣＲ増幅に必要な成分、例えばフォワード及びリバースプライマー、及び鋳型を上述したような本願に係るポリペプチドまたはこれを含むＰＣＲ組成物と混合する段階；及び前記混合物をＰＣＲが可能な条件で反応する段階を含む。ＰＣＲが可能な条件は、例えば９５℃で約１分間反応した後、９５℃で１０秒間変性、６０℃で１５秒間ハイブリダイゼーション、７２℃で２０秒間合成の三段階を１サイクルにして合計４５サイクルで行われるが、このような条件で限定されるのではなく、当業者なら増幅される鋳型の特徴、プライマーの特徴、緩衝液の組成等を考慮して適切な条件を選択することができる。
【００７１】
他の実現例において本願はさらに、ポリペプチドまたはこれを含む組成物を利用したＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ用途に関し、これについては本願に記載されたのを参照することができる。
【００７２】
また他の実現例において本願はさらに、ポリペプチドまたはこれを含む組成物を利用したＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ組成物の製造用途に関し、これについては本願に記載されたのを参照することができる。
【００７３】
以下、本発明を下記の実施例によりさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００７４】
（実施例１：無作為的なファージライブラリーを介したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと特異的に結合するポリペプチド選別）
【００７５】
＜実施例１−１：タンパク質構造基盤のリピボディライブラリー構築＞
【００７６】
リピボディは、自然界に存在するＬＲＲタンパク質と同様に保存されたロイシン配列を有するＬＲＲ繰り返し単位体（Repeat unit）が連続的に連結されて全体タンパク質構造を維持するモジュール性と全体的な構造が曲率によって窪んだ地域（Concave region）と膨らんだ地域（Convex region）で区別される構造的特徴を有し、前者は生体分子を認識するのに重要で後者は構造維持に重要である。窪んだ地域には、抗体の相補性決定地域（complementarity determining region，ＣＤＲ）のように超可変領域（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）が位置して、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介する。また、膨らんだ地域は、よく保存されている配列を基にＬＲＲの全体構造の維持するのに重要な役割をする。このようなリピボディのタンパク質構造を分析して下記のような方式で無作為的なライブラリーを設計した。
【００７７】
具体的に、設計されないカルボキシ末端のループ構造（C-term loop）による立体障害（Steric hinderance）から脱するため、Ｎ末端方向に位置した連続的な二つの変異モジュール（LRRV module ２と３）の窪んだ地域に位置する六つのアミノ酸残基９１、９３、９４、１１５、１１７、及び１１８番を選択した。その後、鋳型で配列番号２の配列を有するポリペプチドでモジュール（ＬＲＲＶ４）一つが除去されたのを使用して、前記選択した各アミノ酸をコードするコドンをＮＮＫ（Ｎ＝Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ）同義コドン（Degenerate codon）で置き換えて、残りの膨らんだ地域の塩基配列を潜在性突然変異（Silent mutation）を含むように構成するようにライブラリーを構築するための突然変異誘発プライマー（Mutagenic primer）を合成して使用した。
【００７８】
引き続き、前記プライマーを利用して二つのモジュールに対するオーバーラップポリメラーゼ連鎖反応（ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ）を行ってライブラリーＤＮＡ（配列番号２５）を収得して、これをファージミドｐＢＥＬ１１８Ｍ（Sang-Chul Leeet al.,「Design of a binding scaffold based on variablelymphocyte receptors of jawless vertebrates by module engineering,」 PNAS,2012,109(9),3299-3304.）に挿入して１次ライブラリーファージミドを確保した。引き続き前記確保されたライブラリーを電気穿孔法（electroporation）で大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入して組換え微生物を収得することによって、１．０ｘ１０８水準の合成的多様性を有するライブラリーを構築した。
【００７９】
＜実施例１−２：リピボディライブラリーのパニング過程を介したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと結合するポリペプチド選別＞
【００８０】
実施例１−１で構築したライブラリーを使用して、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合できるポリペプチドを選別して精製した。具体的にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと結合できる候補を選別するために、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを免疫チューブ（Immuno-tube）に１００μg/ｍｌの濃度で加えて、４℃で１２時間コートした。前記コートされた免疫チューブをＰＢＳで３回洗浄して、１％ＢＳＡと０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ溶液（ＴＰＢＳＡ）で４℃で２時間ブロッキング（Blocking）した。その後、前記精製されたファージを１０１２ｃｆｕ／ｍｌの濃度で前記コートされた免疫チューブに加えて、常温で２時間反応させた。反応が終了した後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ溶液（ＴＰＢＳ）で合計２分間５回ずつ及びＰＢＳで２回洗浄した。最後に、１ｍｌの０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）を前記免疫チューブに加えて、常温で１３分間反応させることによって、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと結合できるリピボディ候補を表面に発現させたファージを湧出させた。前記湧出液に６０ｕｌの１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えて中和させて、宿主細胞である１０ｍｌ大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ溶液（ＯＤ６００＝０．５）に加えた後、２ｘＹＴプレートに塗抹するバイオパニング（Ｂｉｏ−ｐａｎｎｉｎｇ）過程を同様に４回繰り返して行った。その結果、各パニング過程を介してＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと特異的に結合するファージが濃縮されることを確認した。前記結果は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと結合するライブラリーファージが特異的に増加することを意味することと分析された。
【００８１】
＜実施例１−３：１次選別されたリピボディのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに対する特異的な結合の有無確認及び配列分析＞
【００８２】
実施例１−２の方法を介して選別されたファージをＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＢＳＡがコートされた９６−ウェルプレートを利用してＥＬＩＳＡを次の通り行った。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＢＳＡをコートした９６−ウェルプレートをＴＰＢＳＡを利用して常温で１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇ過程を行う。リピボディがディスプレイされたファージをウェルに入れて１時間インキュベーションした後、ＴＰＢＳで３回洗浄過程を行う。次に、ＨＲＰ−conjugated anti-M13 monoclonal antibody(GE healthcare)を１：５，０００で希釈して常温で１時間処理して、ＴＢＳで４回ｗａｓｈｉｎｇ過程を行う。信号検出のためにＴＭＢ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ(Sigma aldrich)を処理して、ＴＭＢと同量の１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を処理した後に４５０ｎｍでの吸光度を測定した。ＢＳＡ対比Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの吸光度（ＯＤ４５０）が２０倍以上高いリピボディ候補を選別して、塩基配列確定してこれを根拠にアミノ酸配列を導き出して、同じアミノ酸配列を有するクローンを除いた。その結果、クローンｒ−Ｇ６だけがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに特異的に結合することを確認した。
【００８３】
ｒ−Ｇ６は９１番アミノ酸であるイソロイシンがセリンで置き換えられて、９３番アミノ酸であるスレオニンがトリプトファンで置き換えられて、９４番アミノ酸であるグリシンがロイシンで置き換えられて、１１５番アミノ酸であるバリンがセリンで置き換えられて、１１７番アミノ酸であるバリンがヒスチジンで置き換えられて、１１８番アミノ酸であるグルタミン酸がトリプトファンで置き換えられたことを確認した（配列番号３）。前記結果は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと結合するのに重要な役割を行う残基が存在することを示している。
【００８４】
＜実施例１−４：選別されたリピボディの抗原決定部位の確認＞
【００８５】
前記実施例１−３で確保したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合するリピボディの抗原決定部位を確認した。これは、抗原決定部位に応じてリピボディがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害できるか否かを判断することができるからである。
【００８６】
このような背景下、前記実施例１−３で確保したクローンｒ−Ｇ６に対して上述した通りＥＬＩＳＡを行った。結果は、図２に記載されている。その結果、クローンｒ−Ｇ６は、ＢＳＡには結合しないが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼには特異的に結合することを確認した。またＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをコートしたプレートで水溶性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（soluble Taq；ｓＴａｑ）を添加した結果、ＥＬＩＳＡの信号が減少することを介して再度水溶液上でも選別されたリピボディがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに効果的に結合することを確認した。最後に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合して活性を阻害すると知られている抗体（JumpStart Antibody,Sigma Aldrich）と競争的ＥＬＩＳＡを行った結果、クローンｒ−Ｇ６が該当抗体によって結合信号が減少すると確認されたため、クローンｒ−Ｇ６の抗原決定部位が従来の抗体と類似することを示しており、Ｔａｑポリメラーゼ活性阻害に効果的に使用できる可能性があることを示す。
【００８７】
（実施例２：モジュール基盤突然変異方法を利用したリピボディの結合力がより向上したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ選別）
【００８８】
引き続き結合力をより向上させるために、先行特許（大韓民国登録特許第１，３５６，０７６号）に記載された通りモジュール基盤親和力増大方法を利用してより高い水準の親和力を有するポリペプチドを選別した。
【００８９】
実施例１−３の結果で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに特異的に結合することが確認されたクローンであるｒ−Ｇ６のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに対する解離定数は１３４．４ｎＭであるが、より効果的にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性を十分に抑制できるポリペプチドを選別しようと追加的なライブラリーを構築した。
【００９０】
具体的に、最初のモジュール基盤親和力増大のためのライブラリーは、ＬＲＲＶ１モジュールに位置した６７、６９、７１、７２番合計四つのアミノ酸残基に突然変異を誘発して（図３）、合計５回のパニング過程を経て結合力が増大した三種類のクローン（配列番号４〜６）を確保して、等温熱量測定装置を利用して解離定数を測定した結果、三種類のクローン共にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに対する結合力が増大したことを確認した。
【００９１】
一方、さらに向上した結合力を示す突然変異体を開発するために、前記クローンのうち結合力が最も高いクローンｒ−Ｇ６Ｅ１を基本ポリペプチドとしてＬＲＲ１モジュールに位置する４５、４７、４８、４９番に該当する四つの残基に突然変異させた後（図３）、同様のパニング過程を経て七種類のクローン（配列番号７〜１３）を選別して、等温熱量測定装置を利用して解離定数を測定した結果、六種類のクローンがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに対して結合力が増大したことを確認して（図３）、クローンｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８がＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに対して１０．３ｎＭの最も高い結合力を示すことを確認した。
【００９２】
このような結果から本発明者等は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合力を有するリピボディを成功的に確保して、これはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに特異的な結合力を有するポリペプチドであることを確認した。
【００９３】
（実施例３：選別されたリピボディのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに対する結合特異度の確認）
【００９４】
前記実施例を介して選別されたリピボディがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにだけ特異的に結合するか否かをｐｈａｇｅ−ＥＬＩＳＡ手法を使用して確認した。実験方法は、実施例１−３と同様に進めて、リピボディが結合しない対照群タンパク質はｍＯｒａｎｇｅ蛍光タンパク質（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｈｉｓ−ｔａｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＢＳＡ（ＧｅｎＤＥＰＯＴ）を使用した。該当結果は、図４に示されていて選別されたリピボディｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８が対照群と比較してＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにだけ特異的に結合することを確認することができた。
【００９５】
（実施例４：選別されたリピボディの変性温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）の確認）
【００９６】
前記実施例を介して選別されたリピボディの熱安定性を確認するために、変性温度測定実験を行った。Ｊ−８１５  ＣＤ  spectrometer(Jasco,Japan)を利用して２２２ｎｍでのmolarellipticityを３０〜８０℃にわたって測定した。測定結果を基にThermal denaturationanalysis program(Jasco,Japan)を利用して変性温度を計算した。該当結果は、図５に示されていて各々ｒ−Ｇ６は、５９．９℃、ｒ−Ｇ６Ｅ１は、６５．４℃、ｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８は、６２℃の変性温度を有することを確認した。したがって、このような結果は、ＰＣＲ反応過程で温度が増加する場合、リピボディ自らのタンパク質変性によってＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの結合が解除されて、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは正確な伸長温度で合成を開始することができるようになることを示している。
【００９７】
（実施例５：本願に係るリピボディのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性阻害の確認）
【００９８】
引き続き前記実施例で選別されたリピボディが実際Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性阻害をするか否かを次の通り分析した。先ず２００ｎｇのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとリピボディｒ−Ｇ６、ｒ−Ｇ６Ｅ１、ｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８を様々な量（０．０５、０．２、１、５μｇ）で混合して４℃で１５分間静置してＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ−リピボディ複合体を形成した。このＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ−リピボディ複合体を５０μｌの反応液に１ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、１２．１５ｐｍｏｌの［３Ｈ］ｄＴＴＰ（０．１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、２ｍｇ／ｍｌのａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃａｌｆ  ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡが含まれるように混合した。この混合液を３７℃で３０分間反応させた後、１１Ｘ  ｓｔｏｐ  ｂｕｆｆｅｒ（１１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．２％  ＳＤＳ）を１Ｘで混合して反応を中止させた。最終的にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって生成された放射性ＤＮＡの量を液体シンチレーションカウンターで測定することによってリピボディによるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの抑制効率を計算した。
【００９９】
該当結果は図６に表示されていてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの結合力が高い順にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性抑制力も高いことを確認することができて、これは本願で開発されたポリペプチドがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性抑制を行ってＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲに効果的に使用できることを示している。
【０１００】
（実施例６：本願に係るリピボディを利用したＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ実行）
【０１０１】
＜実施例６−１：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合するリピボディを利用したｂｌｏｃｋ  ＰＣＲ実行＞
【０１０２】
実施例１−３〜２−１の方法を介して選別されたリピボディ形態のポリペプチドを利用したＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ効果をｂｌｏｃｋ  ＰＣＲで特異度及び敏感度を向上させることができるか否かを確認した。これのためにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと選別された各リピボディポリペプチドを１：１０の割合で混合した後、反応バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ）に添加して２０μｌのリアルタイム定量ＰＣＲ混合溶液を製作した。ヒトｃＤＮＡを鋳型にしてＧＡＰＤＨ部位をｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡ−３'，ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧ−３’を使用して増幅した。反応条件は９５℃で１分間反応した後、９５℃で１０秒間変性、６０℃で１５秒間ハイブリダイゼーション、７２℃で２０秒間合成の三段階を１サイクルにして合計４５サイクルを繰り返した。増幅産物は、アガロースゲル電気泳動後ＥｔＢｒで染色して確認した。
【０１０３】
該当結果は、図８に表示されていて、鋳型の量が１ｐｇと大変少ない場合、上手く増幅されないＧＡＰＤＨターゲットバンドがリピボディｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８を使用してＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲを行う場合、抗体を使用した場合と匹敵するように効果的に増幅されることが確認された。特に、鋳型を全く入れない場合、抗体を使用した場合には非特異増幅バンドが一部現れるのを確認したが、本願に係るリピボディを使用した場合、全く増幅が起きず、これは本願に係るリピボディの優秀なＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ効果を示している。
【０１０４】
このような結果は、本願に係るリピボディはＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲでＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを効果的に抑制して、または変性温度以上では効果的に分離して非常に特異的な増幅反応に使用できることを示している。
【０１０５】
＜実施例６−２：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに結合するリピボディを利用したリアルタイムＰＣＲ実行＞
【０１０６】
実施例１−３〜２−１の方法を介して選別されたリピボディ形態のポリペプチドを利用してリアルタイムＰＣＲでＨｏｔ  ｓｔａｒｔ効果を発揮して特異度及び敏感度を向上させることができるか否かを確認した。実験方法は実施例６−１と同様に増幅産物をリアルタイムで分析するために、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を最終濃度０．５Ｘで添加した。鋳型ＤＮＡとしてはヒトｃＤＮＡを（ａ）では１００ｐｇ、（ｂ）では１０ｐｇ、（ｃ）では１ｐｇを使用し、（ｄ）では鋳型ＤＮＡを入れなかった。図９は、本願で選別されたクローンのＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ効果をｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲで確認した結果で、十分な量の鋳型ＤＮＡをいれた場合、Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ実現方式に関係なくいずれも目的としたｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｅａｋ（８５℃）を示す増幅産物が検出されたが、１ｐｇ以下の少ない量の鋳型ＤＮＡをいれた場合、結合力が多少低いリピボディを使用したかリピボディを使用しなかったＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの場合、非特異増幅産物（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｅａｋ；７５℃付近検出）が現れるのを確認することができた。これらの中でもリピボディｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８を使用した場合、最も特異度が高いことが分かった。
【０１０７】
＜実施例６−３：リピボディＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲの再活性化所要時間の測定＞
【０１０８】
最終選別されたリピボディｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８を利用してｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲでＨｏｔ  ｓｔａｒｔ効果を発揮するために必要とする最初活性化時間の長さを測定した。基本的な実験方法は実施例６−１と同様であるが増幅産物をリアルタイムで分析するために、ＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅ方式のｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。ヒトｃＤＮＡを鋳型にしてβ−Ａｃｔｉｎ部位をｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴ−３’、ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ；５’−ＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡ−３’、ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ；５’−FＡＭ−ＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＧＣ−ＴＡＭＡＭＡ−３’を使用して増幅して最初活性化時間を０．５、１、２、５、１０、１５分と多様に設定してＰＣＲを行った。対照群では化学的処理を介して製作されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（エンジノミックス、大韓民国）と抗体（ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を混合したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。該当実験結果は図７に示されていて、リピボディを使用した場合、抗体を使用した場合のように９５℃で０．５分以内にいずれも再活性化がよく起きてＨｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲに効果的に使用できることが分かる。
【０１０９】
（実施例７：リピボディｄｉｍｅｒのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性阻害の確認）
【０１１０】
リピボディを連続的に連結した形態、すなわちｄｉｍｅｒで製作する場合にもＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性を効果的に阻害できるか否かを確認するために次の通り分析した。これのために選別されたｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８遺伝子を三つのグリシンアミノ酸をリンカーとして使用して連続的に配置してｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒを製作した。該当タンパク質を大腸菌に導入してタンパク質で発現した後、カラムクロマトグラフィー手法を介して純粋分離／精製した。このように得られたリピボディｄｉｍｅｒと既に選別されたｒ−Ｇ６Ｅ１Ｈ８を使用して実施例５の方法を介してＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性抑制力を測定した。
【０１１１】
該当結果は、図１０に表示されている。同量（１μg）のリピボディーｍｏｎｏｍｅｒとｄｉｍｅｒを使用した時、各々、ｍｏｎｏｍｅｒは９０％、ｄｉｍｅｒは９４％の抑制効率を示すのを確認することができた。これにより、リピボディをｍｏｎｏｍｅｒだけでなくｄｉｍｅｒ形態で製作してもＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性を略同じかより高い効率で抑制することができることが分かった。
【０１１２】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な技術は単に好ましい実施様態であるのみであり、これによって本発明の範囲が制限されない点は明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されることが言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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