(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性材料からなる不織布からなる組織再生基材であって、
平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層と、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層との積層構造を有し、
前記平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層の、前記平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層とは反対側の面に、更に、平均繊維径が０．１〜０．７μｍの繊維が集合した層が積層されている
ことを特徴とする組織再生基材。
【請求項２】
平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層と、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層とは、半融解した生体吸収性材料からなる糸状体により接合されていることを特徴とする請求項１記載の組織再生基材。
【請求項３】
軟骨損傷部の治療においてマイクロフラクチャー術を行った際に、マイクロフラクチャーから浸潤する幹細胞成分を患部に留めて、関節液中に拡散してしまうのを防止するための基材であることを特徴とする請求項１又は２記載の組織再生基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の侵入性に優れるとともに、組織再生基材からの細胞の漏出を効果的に防止して、組織の再生を促進することができる組織再生基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の細胞工学技術の進展によって、ヒト細胞を含む数々の動物細胞の培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでいる。再生医療においては、細胞が増殖分化して三次元的な生体組織様の構造物を構築できるかがポイントであり、例えば、基材を患者の体内に移植し、周りの組織又は器官から細胞を基材中に侵入させ増殖分化させて組織又は器官を再生する方法が行われている。
【０００３】
具体的には例えば、損傷の程度が比較的軽度で局在的な場合の軟骨損傷部の治療方法として、マイクロフラクチャー術が行われる（例えば、特許文献１）。マイクロフラクチャー術では、損傷部の骨に穴（マイクロフラクチャー）を形成することにより、軟骨組織下の骨髄を刺激して幹細胞成分の浸潤を促す。該幹細胞成分が線維性軟骨に分化、成熟することにより軟骨損傷部が回復する。この際、浸潤する幹細胞成分を患部に留めて、関節液中に拡散してしまうのを防止する目的で、基材を患部に貼付することが行われる。
【０００４】
また、生体組織に生じた病巣を内視鏡下で切除する方法として、自動縫合器等を用いた切除術が行われている。肺、気管支、肝臓、消化管等の脆弱な組織や、病変によって脆弱化した組織に対して切除術を行う場合、縫合を行ったのみでは組織の断裂のおそれがあり、また、例えば肺の手術においては空気漏れが発生するおそれがある。そこで、縫合補強材を生体組織の切除部位に縫い合わせるということが行われている。
【０００５】
このような再生医療用の基材や縫合補強材として、例えば、特許文献２に開示されるような生体吸収性材料からなる不織布を用いることが提案されている。生体吸収性材料からなる不織布は、再生医療用の基材や縫合補強材として用いた場合には、その空隙部分に細胞が侵入して増殖し、早期に組織が再生されることが期待される。また、脆弱な組織の補強材として用いた場合には、組織の断裂を防止し、空気漏れの発生等を防止することができる。更に、一定期間経過後には分解して生体に吸収されることから、再手術により取り出す必要もないという優れた性能を有する。
しかしながら、実際には、従来の生体吸収性材料からなる不織布を用いても、期待したほどには組織の再生が促進されないことがあるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１２−５１３８３０号公報
【特許文献２】特開平５−３１５５６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
組織再生基材を構成する不織布については、細胞の侵入性を確保するために５〜３０μｍ程度の平均孔径であることが好適であることが知られている。本発明者は、鋭意検討の結果、このような従来の組織再生基材は、細胞の侵入性の点では優れているものの、侵入した細胞の一部が組織再生基材を通過して、組織再生基材の外に漏出してしまうことがあることを見出した。例えば、マイクロフラクチャー術の基材として従来の不織布を用いた場合、骨面保護により患者の痛みの軽減には寄与する。しかしながら、幹細胞成分の一部が組織再生基材の外に漏出してしまうことにより、実際に患部に留まる幹細胞成分の濃度が不足するため、期待したほどには組織の再生が促進されないものと考えられた。一方、細胞の漏出を防止するために不織布の平均孔径を小さくした場合には、細胞の侵入性が損なわれて、組織再生を促進することができない。
【０００８】
本発明は、上記現状に鑑み、細胞の侵入性に優れるとともに、組織再生基材からの細胞の漏出を効果的に防止して、組織の再生を促進することができる組織再生基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、生体吸収性材料からなる不織布からなる組織再生基材であって、平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層と、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層との積層構造を有する組織再生基材である。
以下に本発明を詳述する。
【００１０】
本発明者は、鋭意検討の結果、平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層（以下、「細胞侵入層」ともいう。）に対して、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層（以下、「細胞漏出防止層」ともいう。）を積層した積層構造を有する組織再生基材は、優れた細胞侵入性を維持したまま、細胞が組織再生基材の外に漏出してしまうことを防止して、組織の再生を促進することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
ここで、上記細胞漏出防止層も一定範囲の平均孔径を有する不織布からなる層であることが重要である。単に体液や血液等に含まれる浮遊細胞の漏出を防止するだけであれば、例えば生体吸収性材料からなるフィルムを積層することによっても同様の効果を発揮することができる。しかしながら、フィルムを積層した場合には、組織の再生を促進する効果が充分に得られない。本願発明の優れた効果は、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層を細胞漏出防止層とすることによりはじめて発揮される。
これは、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層は、体液や血液等に浮遊している細胞をほとんど通過させることがない一方、体液はスムーズに通過させることができる。一方、細胞漏出防止層の孔径が当該孔径であれば、細胞侵入層から細胞漏出防止層への接着細胞の侵入を促すとともに、細胞侵入層において増殖する細胞への栄養の供給が充分となるためではないかと考えられる。また、体液の浸潤により発生した応力を緩和できることから、組織再生基材の患部への密着性も保てるものと考えられる。
【００１２】
上記細胞侵入層は、体液や血液等に含まれる浮遊細胞の捕捉、および接着後の細胞や周囲組織からの侵入する細胞増殖の足場となり、組織の再生を促進する役割を有する。
上記細胞侵入層は、生体吸収性材料からなる不織布からなる。
上記細胞侵入層を構成する生体吸収性材料としては、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ−ε−カプロラクトン、ラクチド−グリコリド酸共重合体、グリコリド−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体、ポリジオキサノン、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニン等の合成高分子や、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体等の多糖類や、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、フィブリン等のタンパク質等の天然高分子等が挙げられる。これらの生体吸収性材料は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１３】
上記生体吸収性材料のなかでも、ポリグリコリドが好適である。ポリグリコリドを用いた場合には、特に細胞の侵入性に優れ、正常な組織の再生を行うことができる。ポリグリコリドは、例えば繊維状にして３７℃の生理食塩水中に浸漬した場合に、引張強度が浸漬前の１／２になるまでの期間が約１４日である。このような分解性を有することにより、細胞が増殖して組織が再生する時期に基材が徐々に分解吸収されることとなり、基材内部まで再生した組織が構築され、その結果として良質な再生組織が構築されるものと考えられる。更に、生体内に埋入後数日間で炎症系の細胞が消失することから、組織の癒着を引き起こしにくいという優れた効果をも発揮できる。
【００１４】
なお、本明細書においてポリグリコリドは、ポリグリコール酸等のグリコリドの重合体を意味するが、本発明の効果を阻害しない範囲で、ラクチド、ε−カプロラクトン、炭酸トリメチレン等の他の生体吸収性の成分との共重合体としてもよい。また、本発明の効果を阻害しない範囲で、ポリラクチド等の他の生体吸収性材料との混合物としてもよい。
上記ポリグリコリドがラクチド、ε−カプロラクトン、炭酸トリメチレン等の他の生体吸収性の成分との共重合体である場合、該共重合体におけるグリコリド成分の配合量の好ましい下限は６０モル％である。グリコリド成分の配合量を６０モル％以上とすることにより、細胞の侵入性に優れ、かつ、正常な組織の再生を行うという本発明の優れた効果を特に発揮することができる。
上記ポリグリコリドとポリラクチド等の他の生体吸収性材料との混合物を用いる場合、該混合物におけるポリグリコリドの配合量の好ましい下限は５０モル％である。ポリグリコリドの配合量を５０モル％以上とすることにより、細胞の侵入性に優れ、かつ、正常な組織の再生を行うという本発明の優れた効果を特に発揮することができる。
【００１５】
上記生体吸収性材料がポリグリコリドである場合、該ポリグリコリドの重量平均分子量の好ましい下限は３００００、好ましい上限は４０００００である。上記ポリグリコリドの重量平均分子量が３００００未満であると、強度が不足して充分な組織補強効果が得られないことがあり、４０００００を超えると、生体内における分解速度が遅くなり、異物反応を起こすことがある。上記ポリグリコリドの重量平均分子量のより好ましい下限は５００００、より好ましい上限は３０００００である。
【００１６】
上記生体吸収性材料がポリグリコリドである場合、当該ポリグリコリドの分子量の代替指標としてメルトフローレートを用いてもよい。該ポリグリコリドのメルトフローレートの好ましい下限は０．１ｇ／１０分、好ましい上限は１００ｇ／１０分である。この範囲内であると、ポリグリコリドからなる不織布を作製することが容易となる。ポリグリコリドのメルトフローレートのより好ましい下限は１ｇ／１０分、より好ましい上限は５０ｇ／１０分である。
なお、メルトフローレートの測定条件は、ポリグリコリドを２４０℃、１０分間、シリンダー内で保持して溶融した後、荷重４ｋｇｆの条件で測定した値を意味する。
【００１７】
上記細胞侵入層を構成する不織布は、平均孔径の下限が２０μｍ、上限が５０μｍである。上記細胞侵入層がこのような平均孔径を満たす場合に、細胞の侵入性に優れ、かつ、正常な組織の再生に好適な組織再生基材を提供できる。不織布中の孔径が２０〜５０μｍの孔には、細胞が容易に侵入することができ、細胞侵入層中で増殖、分化して組織を形成することができる。これに対して、平均孔径が２０μｍ未満であると、血液等に含まれる浮遊細胞が効率よく侵入することができず、平均孔径が５０μｍを超えると、浮遊細胞の侵入は可能であるものの、細胞間の距離が離れすぎるため、細胞侵入層に接着した細胞や、周囲組織から侵入してくる細胞が充分に増殖、分化することができない。上記細胞侵入層を構成する不織布の平均孔径の好ましい下限は２２μｍ、好ましい上限は４０μｍであり、より好ましい下限は２４μｍ、より好ましい上限は３０μｍである。
なお、本明細書において不織布の平均孔径は、バブルポイント法により測定された平均孔径を意味する。
【００１８】
上記バブルポイント法による不織布の孔径分布の測定について説明する。
バブルポイント法とは、測定対象となる膜をよく濡らす液体を予め膜の細孔内に吸収させておき、図１に示したような器具に設置し、膜の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定し、液体の表面張力とバブルポイントとの関係式から孔径分布を推算する（図２）方法である。
具体的には、測定対象となる不織布に湿潤液（例えば、フッ素系溶媒、商品名Ｐｏｒｏｆｉｌ（商標））を吸収させた後、図１に示したような器具（例えば、日本ベル社製、Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ  ３Ｇ）に試験片寸法が直径２５ｍｍの円状になるように設置した後、不織布の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定する。
なお、図２に記載された細孔径を算出する式において、γは浸潤液の表面張力を表し、θは不織布素材上の浸潤液の接触角を表し、ΔＰはバブルポイント圧を表す。
【００１９】
上記細胞侵入層を構成する不織布の平均繊維径は特に限定されないが、好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は５０μｍである。上記不織布の平均繊維径がこの範囲にある場合には、平均孔径を上記規定の範囲に調整することが容易となる。上記不織布の平均繊維径のより好ましい下限は１５μｍ、より好ましい上限は４０μｍである。
【００２０】
上記細胞侵入層の厚さは特に限定されないが、好ましい下限は４００μｍ、好ましい上限は１．５ｍｍである。上記細胞侵入層の厚さが４００μｍ未満であると、強度が不足して脆弱な組織の補強には用いることができないことがあり、１．５ｍｍを超えると、取り扱い性に劣る。上記細胞侵入層の厚さのより好ましい下限は４５０μｍ、より好ましい上限は１．２ｍｍである。
【００２１】
上記細胞漏出防止層は、体液や血液等に含まれる浮遊細胞が組織再生基材の外に漏出してしまうことを防止するとともに、体液はスムーズに通過させることにより、上記細胞侵入層への細胞の侵入を促し、上記細胞侵入層において増殖する細胞への栄養の供給を確保する役割を有する。また、細胞侵入層で増殖した細胞が細胞漏出防止層内部へも侵入することができ、当該細胞漏出防止層のみが脱落することも防ぐことができる。
上記細胞漏出防止層は、生体吸収性材料からなる不織布からなる。
上記細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料としては、上記細胞侵入層に用いるものと同様の生体吸収性材料を用いることができる。上記細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料は、上記細胞侵入層を構成する生体吸収性材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００２２】
上記細胞漏出防止層を構成する不織布は、平均孔径の下限が５μｍ、上限が２０μｍである。上記細胞漏出防止層がこのような平均孔径を満たす場合に、組織再生基材からの体液や血液等に含まれる浮遊細胞の漏出を防止することができるとともに、体液をスムーズに通過させることができ、上記細胞侵入層への細胞の侵入を促し、上記細胞侵入層において増殖する細胞への栄養の供給を確保することができる。さらに、細胞侵入層で増殖した細胞が細胞漏出防止層内部へも侵入することができ、当該細胞漏出防止層のみが脱落することも防ぐことができる。上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均孔径が２０μｍを超えると、組織再生基材からの細胞の漏出を充分に防止することができない。上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均孔径が５μｍ未満であると、上記細胞侵入層への細胞の侵入性が低下したり、上記細胞侵入層中の細胞への栄養の供給が不充分となったりして、充分に組織の再生を促進できないことがある。上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均孔径の好ましい下限は６μｍ、好ましい上限は１８μｍであり、より好ましい下限は７μｍ、より好ましい上限は１６μｍである。
【００２３】
上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均繊維径は特に限定されないが、好ましい下限は０．７μｍ、好ましい上限は７μｍである。上記不織布の平均繊維径がこの範囲にある場合には、平均孔径を上記規定の範囲に調整することが容易となる。上記不織布の平均繊維径のより好ましい下限は０．９μｍ、より好ましい上限は５．０μｍである。
【００２４】
上記細胞漏出防止層の厚さは特に限定されないが、好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は１５０μｍである。上記細胞漏出防止層の厚さが１０μｍ未満であると、組織再生基材からの細胞の漏出を充分に防止できないことがあり、１５０μｍを超えると、上記細胞侵入層への細胞の侵入性が低下したり、上記細胞侵入層中の細胞への栄養の供給が不充分となったりして、充分に組織の再生を促進できないことがある。上記細胞漏出防止層の厚さのより好ましい下限は３０μｍ、より好ましい上限は１００μｍである。
【００２５】
本発明の組織再生基材は、上記細胞漏出防止層の上記細胞侵入層側とは反対側の面に、更に、平均繊維径が０．１〜０．７μｍの繊維が集合した層（以下、「微細繊維集合体層」ともいう。）が積層されていてもよい。このような微細繊維集合体層を積層することにより、組織再生基材からの細胞の漏出をよりいっそう防止することができる。
【００２６】
上記微細繊維集合体層を構成する生体吸収性材料としては、上記細胞侵入層や細胞漏出防止層に用いるものと同様の生体吸収性材料を用いることができる。上記微細繊維集合体層を構成する生体吸収性材料は、上記細胞侵入層や細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００２７】
上記微細繊維集合体層を構成する繊維の平均繊維径の好ましい下限は０．２μｍ、好ましい上限は０．６５μｍである。上記微細繊維集合体層の繊維がこの範囲にある場合に、上記細胞侵入層への細胞の侵入性や上記細胞侵入層中の細胞への栄養の供給性に影響することなく、組織再生基材からの細胞の漏出をよりいっそう防止することができる。上記微細繊維集合体層の繊維の平均繊維径のより好ましい下限は０．３μｍ、より好ましい上限は０．６μｍである。
【００２８】
上記微細繊維集合体層の厚さは特に限定されないが、好ましい下限は１．０μｍ、好ましい上限は１００μｍである。上記微細繊維集合体層の厚さが１．０μｍ未満であると、組織再生基材からの細胞の漏出を防止する効果が得られないことがあり、１００μｍを超えると、上記細胞侵入層への細胞の侵入性が低下したり、上記細胞侵入層中の細胞への栄養の供給が不充分となったりして、充分に組織の再生を促進できないことがある。上記微細繊維集合体層の厚さのより好ましい下限は１．５μｍ、より好ましい上限は８０μｍである。
【００２９】
本発明の組織再生基材を製造する方法は特に限定されず、例えば、上記細胞侵入層と、上記細胞漏出防止層とを別々に調製したうえで、得られた細胞侵入層と細胞漏出防止層とを積層し、接合する方法が挙げられる。
不織布を調整する方法は特に限定されず、例えば、エレクトロスピニングデポジション法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、スパンボンド法、フラッシュ紡糸法、水流交絡法、エアレイド法、サーマルボンド法、レジンボンド法、湿式法等の従来公知の方法を用いることができる。なかでも、上記細胞侵入層の調製にはニードルパンチ法が好適であり、上記細胞漏出防止層の調製にはメルトブロー法が好適である。
【００３０】
上記細胞侵入層と細胞漏出防止層とを接合する方法としては、医療用接着剤を用いて貼り合わせる方法や、細胞侵入層又は細胞漏出防止層の表面の一部を溶剤で溶解してから貼り合わせる方法等が考えられる。しかしながら、これらの方法で細胞侵入層と細胞漏出防止層とを接合した場合、接合面において各層の孔が塞がれてしまい、体液のスムーズな通過を妨げて、細胞侵入層における細胞への栄養の供給を阻害してしまうことがある。
本発明者らは、鋭意検討の結果、半融解した生体吸収性材料からなる糸状体を用いて細胞侵入層と細胞漏出防止層とを接合することにより、接合面において塞孔することなく、細胞侵入層と細胞漏出防止層とを強固に接合できることを見出した。
【００３１】
上記細胞侵入層と細胞漏出防止層とを接合するための生体吸収性材料からなる糸状体（以下、「接合用糸」ともいう。）を構成する生体吸収性材料としては、上記細胞侵入層に用いるものと同様の生体吸収性材料を用いることができるが、上記細胞侵入層と細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料よりも融点の低いものを選択する。これにより、上記細胞侵入層と細胞漏出防止層の構造に影響することなく、加熱により接合糸を半溶融させて、細胞侵入層と細胞漏出防止層を接合することができる。
ここで上記接合用糸を構成する生体吸収性材料の融点は、上記細胞侵入層及び細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料の融点（細胞侵入層と細胞漏出防止層とが異なる生体吸収性材料により構成されている場合には、低い方の融点）よりも５０℃以上低いことが好ましく、７５℃以上低いことがより好ましい。融点の差を５０℃以上とすることにより、細胞侵入層と細胞漏出防止層を接合する際の加熱による細胞侵入層と細胞漏出防止層への影響を最小限に抑えることができる。例えば、上記細胞侵入層及び細胞漏出防止層がポリグリコリド（融点約２４０℃）からなる場合には、上記接合用糸を構成する生体吸収性材料としてポリ−ε−カプロラクトン（融点約６０℃）やポリジオキサノン（融点約１１０℃）を選択することができる。
【００３２】
上記接合用糸は、モノフィラメント糸であっても、マルチフィラメント糸であってもよい。
上記接合用糸の平均繊維径の好ましい下限は５μｍ、好ましい上限は５０μｍである。上記接合用糸の平均繊維径が５μｍ未満であると、細胞侵入層及び細胞漏出防止層との接合が弱くなって剥離してしまうことがあり、５０μｍを超えると、細胞侵入層と細胞漏出防止層との接合面で各層の孔を塞いで体液のスムーズな通過を妨げてしまうことがある。上記接合用糸の平均繊維径のより好ましい下限は１０μｍ、より好ましい上限は４５μｍである。
【００３３】
図３に、上記接合用糸を用いた細胞侵入層と細胞漏出防止層との接合方法の一例を示す模式図を示した。
図３の接合用糸を用いた細胞侵入層と細胞漏出防止層との接合方法では、まず、細胞侵入層１の表面に、接合用糸２を平行に配置する（図３（ａ））。
接合用糸２の配置方法は、細胞侵入層１の表面に略均一な配置であれば特に限定されず、例えば、図４（ア）のように接合用糸２を互い違いにメッシュ状に配置してもよいし、図４（イ）のように１本の接合用糸２を蛇行して配置してもよい。更に接合用糸を予めメッシュ状に編んだものを配置してもよい。
【００３４】
細胞侵入層１上の接合用糸２の配置密度は特に限定されないが、好ましい下限は０．００８ｇ／ｃｍ２、好ましい上限は０．０２ｇ／ｃｍ２である。上記接合用糸の配置密度が０．００８ｇ／ｃｍ２未満であると、細胞侵入層及び細胞漏出防止層との接合が弱くなって剥離してしまうことがあり、０．０２ｇ／ｃｍ２を超えると、細胞侵入層と細胞漏出防止層との接合面で各層の孔を塞いで体液のスムーズな通過を妨げてしまうことがある。上記接合用糸の配置密度のより好ましい下限は０．０１ｇ／ｃｍ２、より好ましい上限は０．０１８ｇ／ｃｍ２である。
【００３５】
なお、図３では、接合用糸２は細胞侵入層１の表面に配置されているが、細胞漏出防止層３の表面に配置してもよい。ただし、接合用糸２を半溶融させる際に接合用糸２が若干収縮することから、該収縮により層が変形するのを防止するために、より厚い層（通常は細胞侵入層）に接合用糸を配置することが好ましい。
【００３６】
図３の接合用糸を用いた細胞侵入層と細胞漏出防止層との接合方法では、次いで、加熱により細胞侵入層１上に配置された接合用糸２を半融解する（図３（ｂ））。ここで半融解とは、加熱により溶融させるものの、接合用糸の形状を半ば保っている状態を意味する。接合用糸を完全に融解させてしまうと、細胞漏出防止層の孔に融解した接合用糸が染み込んでしまい、細胞侵入層と細胞漏出防止層とを接合できないことがある。
上記加熱の方法は特に限定されないが、例えば、ヒートガンを用いれば、接合用糸の状態を確認しながら加熱することができる。
【００３７】
図３の接合用糸を用いた細胞侵入層と細胞漏出防止層との接合方法では、次いで、半融解した接合用糸２を介して、細胞侵入層１に細胞漏出防止層３を積層する（図３（ｃ））。そして、再度加熱しながら細胞侵入層１と細胞漏出防止層３と圧着することにより接合される（図３（ｄ））。
【００３８】
本発明の組織再生基材が上記微細繊維集合体層を有する場合には、上記微細繊維集合体層は、例えば、上記細胞漏出防止層上にエレクトロスピニングデポジション法により微細繊維を吐出する方法や、メルトブロー法により微細繊維を吐出する方法等が挙げられる。
【００３９】
本発明の組織再生基材は、上記細胞侵入層と細胞漏出防止層との積層構造を有することから、組織の補強や組織再生の促進の足場として埋植したときに、細胞の捕捉性や侵入性に優れ、かつ、組織再生基材からの細胞の漏出を防止できることから、組織再生基材中における細胞の密度を高め、早期に組織が再生するのを促進することができる。
本発明の組織再生基材は、肺漏、気管支断端、膵液瘻、胆汁漏等の早期治癒することが望ましい部位に貼付することにより、脆弱な組織の補強及び組織再生を促す足場として有用であり、特に組織の動きの少ない気管支断端、膵液瘻、胆汁漏等の部位に添付した場合にその効果が顕著である。
また、特に軟骨損傷部の治療においてマイクロフラクチャー術を行った際に、マイクロフラクチャーから浸潤する幹細胞成分を患部に留めて、関節液中に拡散してしまうのを防止する基材として有用である。
【００４０】
本発明の組織再生基材は、手術後、脆弱な組織を覆うように貼付する。本発明の組織再生基材は、フィブリン糊等の医療用接着剤を用いなくとも、組織との密着を保つことができる。また、自動縫合器を使用する場合には、本発明の組織再生基材を組織に貼りつけた後に自動縫合器を用いて縫合操作を行うことにより、肺の空気漏れや種々の組織からの体液漏れを防止できる点でも有用である。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によれば、細胞の侵入性に優れるとともに、組織再生基材からの細胞の漏出を効果的に防止して、組織の再生を促進することができる組織再生基材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】バブルポイント法による不織布の孔径分布の測定方法を説明する模式図である。
【図２】バブルポイント法によって得られたデータから不織布の孔径分布を推算する方法を説明する模式図である。
【図３】接合用糸を用いた細胞侵入層と細胞漏出防止層との接合方法の一例を示す模式図である。
【図４】接合用糸を用いた細胞侵入層と細胞漏出防止層との接合方法における接合糸の配置方法の一例を示す模式図である。
【図５】実施例及び比較例における評価方法を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００４４】
（実施例１）
（１）細胞侵入層用不織布の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た筒編み布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約１６μｍ、厚さが約１．０ｍｍの細胞侵入層用の不織布を得た。
得られた不織布に、湿潤液としてフッ素系溶媒（商品名Ｐｏｒｏｆｉｌ（商標））を吸収させた後、日本ベル社製のＰｏｒｏｍｅｔｅｒ  ３Ｇに試験片寸法が直径２５ｍｍの円状になるように設置し、不織布の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定した。得られたバブルポイントをもとに不織布の孔径分布を示すグラフを得て、該グラフより平均孔径を算出したところ、２８μｍであった。
【００４５】
（２）細胞漏出防止層用不織布の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、メルトブロー法により、平均繊維径が約２μｍ、厚さが約８０μｍの細胞漏出防止層用の不織布を得た。得られた不織布について、バブルポイント法により平均孔径を測定したところ１２μｍであった。
【００４６】
（３）組織再生基材の製造
図３に示した方法により、細胞侵入層用不織布と細胞漏出防止層用不織布とを接合して組織再生基材を製造した。即ち、得られた細胞侵入層用不織布（縦５ｃｍ、横５ｃｍ）の表面に、接合用糸としてポリ−ε−カプロラクトンからなるモノフィラメント糸（平均繊維径２０μｍ）０．４ｇを平行に配置した。接合用糸が飛ばないようにガラスで押さえながら、ヒートガンを用いて加熱して、接合用糸を半融解させた。冷却した後、細胞漏出防止層用不織布を重ね、再度ヒートガンを用いて加熱しながら圧着して、細胞侵入層用不織布と細胞漏出防止層用不織布とを接合した。
【００４７】
（実施例２）
実施例１で得られた組織再生基材の細胞漏出防止層の表面に、静電紡糸装置を用いたエレクトロスピニングデポジション法により微細繊維を吐出して微細繊維集合体層を形成した。即ち、重量平均分子量が１８００００のポリグリコリドをＨＦＩＰに溶解して濃度６重量％のポリグリコリド溶液を調製した。得られたポリグリコリド溶液をシリンジに入れ、組織再生基材の細胞漏出防止層をターゲットとして、口径２７Ｇのノズルから吐出空気圧０．０４ＭＰａで静電気電位２０ｋＶの電圧のかかった電極間に吐出した。なお、一連の操作は、温度１８．５〜２１℃、湿度４５〜５１ＲＨ％の常温常圧下で行った。
形成された微細繊維集合体層について、走査型電子顕微鏡（日立ハイテクロジーズ社製、ＭｉｎｉｓｃｏｐｅＴＭ−１０００）を用いて観察したところ、その平均繊維径は約０．６μｍであった。
【００４８】
（実施例３）
実施例１で調製した細胞侵入層用不織布と細胞漏出防止層用不織布とを、医療用接着剤を用いて接合して組織再生基材を製造した。即ち、得られた細胞侵入層用不織布（縦５ｃｍ、横５ｃｍ）の表面に、医療用接着剤としてシアノアクリレート系接着剤（東亜合成社製、アロンアルファＡ「三共」）を図４（イ）のように塗布し、細胞漏出防止層用不織布を重ねて圧着して、細胞侵入層用不織布と細胞漏出防止層用不織布とを接合した。
【００４９】
（比較例１）
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た筒編み布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約１６μｍ、厚さが約１．０ｍｍの不織布を得、これを組織再生基材とした。なお、得られた不織布について、バブルポイント法により平均孔径を測定したところ２８μｍであった。
【００５０】
（比較例２）
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、メルトブロー法により、平均繊維径が約２μｍ、厚さが約８０μｍの不織布を得、これを組織再生基材とした。なお、得られた不織布について、バブルポイント法により平均孔径を測定したところ１２μｍであった。
【００５１】
（比較例３）
比較例１で得られた不織布の表面に、重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用いて加熱プレス成型により別途調製した厚さ１００μｍのポリグリコリドフィルムを、接合用糸（ポリ−ε−カプロラクトン、直径２０μｍ）を用いて実施例１と同様の方法で接合し、フィルム層を細胞漏出防止層として形成して、これを組織再生基材とした。
【００５２】
（評価）
図５に示した培養方法により、組織再生基材に細胞を播種し、その増殖を評価した。
即ち、シャーレ４上に、スポンジ状体５を配置し、培養液６をスポンジ状体５の表面が液状になるように注いだ。（これにより、培養液はスポンジ状体５からのみ供給される。）このスポンジ状体５の上に、実施例及び比較例で製造した組織再生基材７を配置した。なお、実施例及び比較例３では、細胞漏出防止層側を下にしてスポンジ状体５に接するようにした。
このような状態で配置した組織再生用基材７に、１×１０５個／ｃｍ２の播種密度となるように線維芽細胞を播種した。その後、１日毎に培養液６を交換しながら７日間培養した。７日間培養後に組織再生用基材７に含まれる細胞数を、ＭＴＴアッセイ法により計数し、比較例１の組織再生用基材に含まれる細胞数を１００として、他の実施例及び比較例の組織再生用基材に含まれる細胞数を表した。結果を表１に示した。
【００５３】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によれば、細胞の侵入性に優れるとともに、組織再生基材からの細胞の漏出を効果的に防止して、組織の再生を促進することができる組織再生基材を提供することができる。
【符号の説明】
【００５５】
１  細胞侵入層
２  接合用糸
３  細胞漏出防止層
４  シャーレ
５  スポンジ状体
６  培養液
７  組織再生基材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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