(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞、組織、またはオルガノイド体を培養するための培養システムであって、
近位端と、遠位端とを有する栄養モジュールであって、
近位端に配された第１のガス透過膜、
第１のガス透過膜に取り付けられたガスポート、および
遠位端の第１の密封可能な開口部を含む、栄養モジュール、
複数の入口／出口ポートが配された第２のガス透過膜を含む近位端と、調整システムおよび半透膜を含む遠位端とを有し、栄養モジュール中の第１のガス透過膜と流体接続している成長モジュール、
内部に栄養モジュールを収容するのに十分な直径の開いた近位端を有する無作為化アダプターであって、栄養モジュールの遠位端は、栄養モジュールに流体接続された成長モジュールの重力ベクトルが連続的に無作為化されるように、無作為化アダプターを含む無作為化機構に電気的に接続するのに適している、無作為化アダプター、
内部に少なくとも成長モジュールを収容するのに十分な直径を有し、正方形、卵形、または、円筒状のスキャフォールドに巻かれた導電ワイヤを含む取り外し可能な、口の開いた、円筒状の電磁チャンバー、および
波形発生器、増幅器、およびアンテナを含む電気変換装置であって、該電気変換装置は、パルス時間変動電磁電流を、０．０１ガウスから５０００ガウスの電界強度で電磁チャンバーに電気的に接続された交互イオン磁気共鳴周波数場を生成するために、２５６Ｈｚにまで及ぶ各々の高調波間隔を含む、１０、１４、１５、１６および３２Ｈｚの基本間隔で交互イオン磁気共鳴周波数に変換する電気変換装置
を備える、培養システム。
【請求項２】
導電ワイヤは、１インチごとに５回から５００回、スキャフォールドのまわりに巻かれた銅線または強磁性ワイヤである、請求項１に記載の培養システム。
【請求項３】
哺乳動物の細胞または組織を成長させるための培養方法であって、
前記方法は、
請求項１に記載の培養システムを含む交互イオン磁気共鳴培養装置の成長モジュールに哺乳動物の細胞または組織を導入する工程と、
無作為化アダプターで成長モジュールの重力ベクトルを連続的に無作為化する工程と、
培養の間に電磁装置を有する成長モジュールの周囲で、交互イオン磁気共鳴周波数場を発生させる工程を含む、方法。
【請求項４】
栄養モジュールは、ガスポートが配された第１のガス透過膜を含む近位端を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
成長モジュールは、
複数の入口／出口ポートが配された第２のガス透過膜を含む近位端と、
調節システムおよび半透膜を含む遠位端とを有する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
交互イオン磁気共鳴周波数場での培養は、細胞または組織のイオン輸送または転写機構を制御することによって、修飾、成長、分化、脱分化、遺伝子発現の変化、転写事象の変化、または、細胞の再生の１つ以上をもたらす、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
交互イオン磁気共鳴周波数場での培養は、哺乳動物の細胞のイオン輸送を変化させ、それによって、感染と、哺乳動物のウイルスのエピトープの発現が可能となる、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物の細胞または組織は、ウイルス感染または細菌感染している、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この国際特許出願は、２０１２年４月９日に出願され、放棄された米国仮特許出願第６１／６８６，６９０／号の優先権の利益を、特許法第１１９条（ｅ）項の下で主張するものであり、この文献全体が引用することで本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は一般に生物物理学、生物電気機械学技術、生物工学、組織工学、および細胞再生の分野に関する。具体的には、本発明は、哺乳動物の組織などの生体細胞や生体組織の成長を促進するまたは制御するための交互イオン磁気共鳴（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｉｏｎｉｃ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＡＩＭＲ）複数チャンバー式培養装置に関する。
【０００３】
（関連技術の詳細）
バイオリアクターが開発される前、細胞培養は重力にさらされたシステムに限定されており、複雑な多細胞の生物の自然な三次元（３Ｄ）環境とは異なり、ほとんどの研究室での培養は、平らな二次元（２Ｄ）の１つの細胞の厚みの標本を作製するものであった。したがって、ほとんどの研究室での実験には、特有の制限があり、細胞が自然環境下で互いにどのように相互作用するのかを理解する厳密に一次元の図を用いていた。
【０００４】
バイオリアクターの開発によって、これらの装置のほとんどは、細胞と流体媒体懸濁液を混合するために成長チャンバーの底に撹拌装置を備えた垂直態様構造を使用した「撹拌タンク」バイオリアクターであった。水平に回転するバイオリアクターは、流体媒体が水平軸の周りを回転することで、内部撹拌装置の壁効果と羽根車の衝撃を最小化して、細胞に対するレイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）とコリオリの力の全体的な効果を低下させる「クリノスタット原理（ｃｌｉｎｏｓｔａｔ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ）」を用いることによって、重力により生じる沈澱とせん断の効果を最小化するまたは中和する方法を提供した。
【０００５】
回転バイオリアクターで成長した細胞を流体媒体に懸濁し、容器の表面から離れるように連続的に回転させることで、細胞を互いに付着させて成長させた。この種の懸濁細胞培養は、自然発生する組織および多次元の形態の成長力学に似ており、より現実的な三次元の細胞間接触のシグナル伝達を促進した。これらの３Ｄ細胞を誘導して、あたかも複雑な生物の中で成長したかのように細胞成分を調節および作成し、ならびに、細胞外マトリックス分子、タンパク質、繊維、および他の細胞成分を含む複雑なマトリックスを作成した。これらの前述のプロセスは、ヒト哺乳類生理学における自己調節および自己規制能力を導く。複雑な生物の内部で、これらの成分はしばしば細胞に近隣の環境を知らせ、その外部環境に対する一連の特定の反応を引き起こした。細胞は成長するか、または、停止した。このことが、細胞が第２の制御因子の生成にどのように反応したかを決定した。
【０００６】
典型的な回転バイオリアクターは、横方向の端壁と端壁内のエンドキャップを備えた外部のチューブ状の筐体を有していた。外部のチューブ状の筐体は、入出力シャフト部材上で支持され、独立した駆動機構によって回転駆動された。入力シャフト上で回転式に支持されて出力シャフトにつながれた中心のチューブ状のフィルター部材は、外部のチューブ状の筐体内で同軸に配された。内部と外部のチューブ状部材の間の環状の空間は、細胞培養チャンバーを定義した。
【０００７】
２人のブレード部材を水平軸のまわりに位置付け、細胞培養チャンバーに沿って縦に伸ばした。ブレード部材は、一方の端部に、出力シャフト上で回転式に支持された径方向アームを、もう一方の端部に、入力シャフトにつながれた径方向アームを備えていた。入力シャフトは、内部と外部のチューブ状部材およびブレード部材を通常同じ角速度および方向で駆動することでこれらの部材間で相対運動が生じない、独立した駆動手段によって回転駆動された。したがって、細胞培養チャンバー内の流体中の粒子を求めるために、クリノスタット運動を実現することができる。
【０００８】
しかしながら、既存のバイオリアクターは過剰に複雑なシステムであり、調製時間、維持、再利用できない部品の処分の支出に関して、作動させるのにコストがかかる。例えば、既存のバイオリアクターでは、細胞サンプルや他の必要とされる最初の成分を、実験の準備の際に培養システムに組み立てなければならない。実験の最後には、実験中に成長した細胞および／または組織培養物を抽出するために、培養システムの重要な部分を取り外す必要がある。さらに、培養システム機構が回転式の流体継手を含んでいるため、流体継手の密封部で漏れが徐々に進行することもある。最後に、既存のバイオリアクターで回転を生み出すモーターは、システムと一体化しており、システムの複雑さの一因となっており、システムの維持および操作を困難なものとしている。したがって、必要とされているのは、既存のバイオリアクターの欠点のいくつかまたはすべてを軽減または克服する培養システムおよび方法である。
【０００９】
特許文献１と特許文献２は、培養物中で成長した細胞の増殖を刺激する方法で、時間とともに変動する電磁力（ＴＶＥＭＦ）の使用を開示している。特許文献３では、Ｇｏｏｄｗｉｎらは、動物の肢を処置するためのＴＶＥＭＦスリーブの使用を開示している。この技術の商用利用は、培養システムの設計に２つの手法を与えた。第１の手法は、培養システム内でのバッフルまたはプレートの使用であって、時間とともに変動する電磁電流がプレート全体に流されることで、培養チャンバー内で時間とともに変動する電磁力を誘発するものである。第２の手法は、回転式の培養システムチャンバーのまわりに巻かれて付いているコイルの使用であって、時間とともに変動する電磁電流がコイルに流されることで、培養チャンバー内で時間とともに変動する電磁力を作り出すものである。
【００１０】
回転式の培養システムチャンバーの文脈でＴＶＥＭＦを利用する既存の培養システム設計にはいくつかの制限がある。最初に、既存のＴＶＥＭＦ培養システムは、培養チャンバーユニットに永久に付いている電磁装置を備えており、これは、使い捨てのモジュールを使用することを考慮しておらず、本発明の自給性能を提供するものでもない。その代わりに、既存のシステムは、培養サイクル中に成長媒体の周期的かつ頻繁な手動での交換を必要とする。さらに、細胞培養物の増殖の目的が多くの例において、組織回復またはヒトの疾患の処置のために人体に再導入される細胞および組織を利用することであるため、培養システムチャンバーは、食品医薬品局（ＦＤＡ）の厳格な基準を満たさなければならない。ＥＭＦ誘発装置が培養チャンバーに取り込まれる場合、それによって製造と滅菌のプロセスは著しく複雑なものとなり、使用された培養システムチャンバーと共にＥＭＦ誘発日常的な処分を必要とすることになる。このため、ＦＤＡに承認されるために、装備と培養プロセスのコストが著しく増えることになる。
【００１１】
既存の培養システムの別の制限は、交互イオン磁気共鳴と比較して、培養細胞に対する同じ刺激効果または生理的効果を引き起こさないＴＶＥＭＦを利用しているということである。ＴＶＥＭＦは、哺乳類生物の成長、進化、および維持に固有の増殖、分化、組織回復、および関連する細胞機構の調整に大きな役割を果たす、特定のイオン種および膜チャネルシステムを刺激することができない。さらなる制限は、既存の培養システムが、媒体を成長チャンバーに送るまたは成長チャンバーから出すために、与えられたバッチまたは培地潅流システムに依存しているということである。これらの方法論の各々は、自然発生する生理的システムの生理的パラメータおよび恒常性パラメータに似たパラメータを提供することができない。
【００１２】
したがって、組織および／またはオルガノイド体（ｏｒｇａｎｏｉｄ  ｂｏｄｙ）を含む細胞の三次元培養中に、交互イオン磁気共鳴場を利用する培養システムへのニーズが当該技術分野で認識されている。とりわけ、先行技術には、あらかじめ殺菌した使い捨てモジュールと取り外し可能な交互イオン磁気共鳴チャンバーとを利用する培養装置を含む、交互イオン磁気共鳴システムが欠けている。本発明はこの長年のニーズと先行技術分野における要望を満たすものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第６，４８５，９６３号
【特許文献２】米国特許第６，６７３，５９７号
【特許文献３】米国特許第７，１７９，２１７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は細胞を成長させる培養装置を対象としている。培養装置は、生育環境に細胞を含有する手段と、生育環境で重力ベクトルを連続的に無作為化する手段を含む。
【００１５】
本発明は細胞を成長させる培養システムも対象としている。培養システムは、本明細書に記載される培養装置、内部に成長モジュールを収容する長さの直径を有する近位端を備えた開口チャンバー、および、パルス時間変動電磁電流（ＰＴＶＥＣ）をパルス交互イオン磁気共鳴（ＡＩＭＲ）周波数場（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｆｉｅｌｄ）に変換する変換装置と電気通信した導電材料を含む電磁装置を含んでいる。本発明はさらに、約６．５Ｈｚに及ぶ１以上の様式の間隔で、かつ、約７．８Ｈｚから約５９．９Ｈｚに及ぶ、重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数を生成するように構成された調節装置を含む関連する培養システムを対象としている。
【００１６】
本発明は、所望の対象にパルス交互イオン磁気共鳴を送達するように構成された、交互イオン磁気共鳴（ＡＩＭＲ）電磁装置をさらに対象としている。交互イオン磁気共鳴電磁装置は、正方形、卵形、または、円筒状のスキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）に巻かれた導電材料を含む、取り外し可能な、口の開いた、実質的に円筒状または矩形のチャンバーと、パルス時間変動電磁電流（ＰＴＶＥＣ）を、該チャンバーに電気的に接続されたパルス交互イオン磁気共鳴（ＡＩＭＲ）周波数場に変換する電気変換装置とを含んでいる。交互イオン磁気共鳴電磁装置は、約６．５Ｈｚに及ぶ１以上の様式の間隔で、かつ、約７．８Ｈｚから約５９．９Ｈｚの範囲の、重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数を生成する調節装置を含む。
【００１７】
本発明は、細胞、組織、またはオルガノイド体を培養するための培養システムをさらに対象としている。培養システムは、栄養モジュール、成長モジュール、無作為化アダプター（ｒａｎｄｏｍｉｚｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ）、取り外し可能な口の開いた実質的に円筒状の電磁チャンバー、電気変換装置、および、調節装置を含む。栄養モジュールは、ガスポートが配された第１のガス透過膜を含む近位端と、第１の密封可能な開口部を含む遠位端とを有する。成長モジュールは、複数の入口／出口ポートが配された第２のガス透過膜を含む近位端と、調整（ｂａｆｆｌｉｎｇ）システムおよび半透膜を含む遠位端とを有し、成長モジュールは、栄養モジュール中の第１のガス透過膜と流体接続している。無作為化アダプターは、内部に栄養モジュールを収容するのに十分な直径の口の開いた近位端を有しており、栄養モジュールの遠位端は、栄養モジュールに流体接続された成長モジュールの重力ベクトルが連続的に無作為化されるように、無作為化アダプターを含む無作為化機構に電気的に接続するのに適している。取り外し可能な、口の開いた、実質的に円筒状の電磁チャンバーは、内部に少なくとも成長モジュールを収容するのに十分な直径を有しており、正方形、卵形、または、円筒状のスキャフォールドに巻かれた導電ワイヤを含む。電気変換装置は、パルス時間変動電磁電流を、約０．０１ガウスから約５０００ガウスの電界強度で電磁チャンバーに電気的に接続されたパルス交互イオン磁気共鳴周波数場に変換する。調節装置は、約６．５Ｈｚに及ぶ１以上の様式の間隔で、かつ、約７．８Ｈｚから約５９．９Ｈｚの範囲の、重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数を生成する。
【００１８】
本発明は細胞を培養するための方法をさらに対象としている。方法は、成長モジュールと栄養モジュールを有する培養ユニットに細胞を導入する工程、成長モジュールの重力ベクトルを連続的に無作為化する工程、および、細胞を培養する間に、成長モジュールに、パルス交互イオン磁気共鳴場を適用する工程を含む。本発明は、細胞を培養するための関連する方法をさらに対象としており、方法は、約６．５Ｈｚに及ぶ１以上の様式の間隔で、かつ、約７．８Ｈｚから約５９．９Ｈｚの範囲の、重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数を生成するために、交互イオン磁気共鳴場を調節する工程をさらに含む。
【００１９】
本発明は、哺乳動物の細胞または組織を成長させる培養方法をさらに対象としている。方法は、交互イオン磁気共鳴培養装置に哺乳動物の細胞または組織を導入する工程を含む。交互イオン磁気共鳴培養装置は、近位端と密封可能な遠位端を有し、栄養培地を含む栄養モジュール、近位端と遠位端を有し、細胞または組織を含み、栄養培地で満たされ、観察可能なガスを取り除くために密封される成長モジュールであって、成長モジュールの遠位端が栄養モジュールの近位端に流体密封された成長モジュール、無作為化機構に電気的に接続され、栄養モジュールを内部に含む無作為化アダプター、および、パルス交互イオン磁気共鳴場を生成するために導電性ワイヤを含む電磁チャンバーを備える。成長モジュールの重力ベクトルは、無作為化アダプターで連続的に無作為化され、パルス交互イオン磁気共鳴場は、培養の間に成長モジュールの周囲で生じる。本発明は、約６．５Ｈｚに及ぶ１以上の様式の間隔で、かつ、約７．８Ｈｚから約５９．９Ｈｚの範囲の、重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数を生成するために、交互イオン磁気共鳴場を調節する工程をさらに含む、細胞を培養するための関連する方法を対象としている。
【００２０】
本発明は、本明細書に記載の方法によって生成される培養細胞または培養組織の組織様集合体を含むモデルをさらに対象としている。
【００２１】
本発明の他のさらなる態様、特徴、および利点は、開示目的で与えられた本発明の現在のところ好ましい実施形態の以下の記載から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明の上で列挙された特徴、長所、目的とそれ以外のことが明らかになり、達成され、詳細に理解されるように、上記で簡潔に要約された本発明の具体的な記載と特定の実施形態は添付の図面で例証されている。これらの図は明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図面は本発明の好ましい実施形態を例証しているものであり、したがって、その範囲に限定するものとみなされてはならないことに留意する。
【００２３】
【図１Ａ】培養ユニット、無作為化アダプター、および取り外し可能な調整可能な交互イオン磁気共鳴モジュールを含む培養装置の組み立てられていない主な部品の概略図である。
【図１Ｂ】培養ユニット、無作為化アダプター、および取り外し可能な調整可能な交互イオン磁気共鳴モジュールを含む培養装置の部分的に組み立てられた主な部品の概略図である。
【図１Ｃ】培養ユニット、無作為化アダプター、および取り外し可能な調整可能な交互イオン磁気共鳴モジュールを含む培養装置の組み立てられた主な部品の概略図である。
【図２Ａ】成長モジュールの正面図である。
【図２Ｂ】成長モジュールの背面図である。
【図３】培養ユニットを形成するために、成長モジュールの栄養モジュールとの組み立てを例証する。
【図４】交互イオン磁気共鳴を用いて成長したＨＢＴＣ細胞の培養細胞の生存率パラメータを例証する。成長モジュールサンプルは、栄養モジュール内の培地の毎週の変更よりも前に採取され、グルコース利用と培養物のｐＨ対時間の測定が行われた。
【図５】２０日の成長期にわたって交互イオン磁気共鳴にさらしたＨＢＴＣ細胞とさらさなかったＨＢＴＣ細胞に関する細胞成長および組織集合の曲線である。
【図６Ａ】交互イオン磁気共鳴培養装置で成長させたＨＢＴＣ細胞のカルシウムとカリウムのイオン輸送顕微鏡写真である。図６Ａは、交互イオン磁気共鳴にさらして（左）、および、さらされず（右）に単独で成長させたＨＢＴＣ細胞のカルシウムイオン染色を描いている。
【図６Ｂ】交互イオン磁気共鳴培養装置で成長させたＨＢＴＣ細胞のカルシウムとカリウムのイオン輸送顕微鏡写真である。図６Ｂは、交互イオン磁気共鳴にさらした（左）、および、さらさなかった（右）ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅマイクロキャリアと、Ｆｕｒａ２ＡＭで処理したマイクロキャリア対照上で成長させたＨＢＴＣ細胞のカルシウムイオン染色を描く。
【図６Ｃ】交互イオン磁気共鳴培養装置で成長させたＨＢＴＣ細胞のカルシウムとカリウムのイオン輸送顕微鏡写真である。図６Ｃは、交互イオン磁気共鳴にさらした（左）、および、さらさなかった（右）ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅマイクロキャリア上で成長させたＨＢＴＣ細胞のカリウムイオン染色を描く。
【図６Ｄ】交互イオン磁気共鳴培養装置で成長させたＨＢＴＣ細胞のカルシウムとカリウムのイオン輸送顕微鏡写真である。図６Ｄは、交互イオン磁気共鳴にさらされたＨＢＴＣ細胞（上）、電場なしで成長させたＨＢＴＣ細胞（中央）、および、制御マイクロキャリア対照のみにさらされたでＨＢＴＣ細胞（下）のカリウムイオン染色を描く。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書で使用されているように、用語「１つ（「ａ」または「ａｎ」）」は、請求項および／または明細書で用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に使用されるとき、「１つ（ｏｎｅ）」を指すこともあるが、「１以上」、「少なくとも１つ」、および、「２以上」の意味とも一致している。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の１つ以上の要素、方法工程、および／または、方法からなる、または、本質的になることもある。本明細書に記載の任意の装置または方法は、本明細書に記載の他の装置または方法に関して実行することができることが企図される。
【００２５】
本明細書で使用されているように、本開示は代替物と「および／または」のみを指す定義を支持しているが、請求項における用語「または（ｏｒ）」は、代替物のみを指す、あるいは、代替物は相互に排他的であると明示されていない限り、「および／または」を指す。
【００２６】
本明細書で使用されているように、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は数値を指しており、例えば、明示されているかどうかにかかわらず、全ての数字、分数、および割合を含んでいる。用語「約」は一般に、列挙された値と同等である（例えば、同じ機能または結果を有する）と当業者がみなす数値範囲（例えば、列挙された値の＋／−５〜１０％）を指す。幾つかの例においては、用語「約」は、最も近い有効数字まで四捨五入された数値を含んでもよい。
【００２７】
本明細書で使用されているように、「近位」および「遠位」との用語は、それぞれ、成長モジュールから近いまたは遠い、部品、またはその一部あるいは範囲を指す。成長モジュールそれ自体に関して、近位はガス膜を含む側を指し、遠位は、栄養モジュールに係合するバッフルを含む側を指す。
【００２８】
本明細書で使用されているように、用語「動物」は哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００２９】
本発明の１つの実施形態では、細胞を成長させるための培養装置が提供され、該装置は、生育環境に細胞を含有するための手段と、生育環境で重力ベクトルを連続的に無作為化するための手段を含んでいる。この実施形態では、細胞を含有するための手段は、栄養モジュールと、流体接触した成長モジュールであって、内部に前記細胞が含まれる成長モジュールとを含む培養ユニットであってもよい。１つの態様では、栄養モジュールは、内部に成長モジュールを収容する長さの直径を有する近位端を有する開口本体と、第１の密封可能な開口部を含む遠位端とを備えてもよい。この態様では、栄養モジュールの近位端は、ガスポートが配された第１のガス透過膜を含む。別の態様では、成長モジュールは、複数の入口／出口ポートが配された第２のガス透過膜を含む近位端を有する本体と、第１のガス透過膜と流体接触した、調節システムおよび半透膜を含む遠位端を備えてもよい。
【００３０】
さらに、本発明のこの実施形態およびその態様において、生育環境で重力ベクトルを連続的に無作為化するための手段は、内部に培養ユニットを収容するのに十分な長さの直径の開いた近位端を有する無作為化アダプターを含んでもよく、栄養モジュールの前記遠位端は、アダプターを含む無作為化機構と電気的に接続するのに適している。
【００３１】
すべての実施形態において、栄養モジュールと成長モジュールの一方または両方が使い捨てである。一般に、装置を含む材料は滅菌されてもよい。加えて、細胞は、ウイルス感染または細菌感染した細胞、組織、またはオルガノイド体を含んでもよい。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、上記したような培養装置、内部に成長モジュールを収容するための長さの直径を備えた近位端を有する開口したチャンバー、および、パルス時間変動電磁電流（ＰＴＶＥＣ）を、パルス交互イオン磁気共鳴（ＡＩＭＲ）周波数場に変換する変換装置と電気接続した導電材料を含む電磁装置を備えた、細胞を成長させるための培養システムが提供される。
【００３３】
さらに、この実施形態に関して、細胞を育てるための培養システムは、約６．５Ｈｚに及ぶ１以上の様式の間隔で、かつ、約７．８Ｈｚから約５９．９Ｈｚの範囲の、重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数を生成するように構成された調節装置を含む。このさらなる実施形態では、生成された重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数は、約１０、１４、１５、１６、または３２Ｈｚである。さらに、生成された交互イオン磁気共鳴周波数の１つ以上は、約８〜１４Ｈｚの間で変動してもよい。
【００３４】
両方の実施形態において、代表的な導電材料は、限定されないが、１インチごとに約５回から約５００回、非導電性または導電性のコアのまわりに巻かれた銅線または強磁性ワイヤを含む。代表的な電気変換装置は、限定されないが、ランダム波形発生器、増幅器、アンテナ、または他の伝達装置を含んでいる。同様に、交互イオン磁気共鳴場は、約０．０１ガウスから約５０００ガウスの磁界強度を有してもよい。
【００３５】
本発明のさらに別の実施形態では、所望の対象にパルス交互イオン磁気共鳴を送達するように構成された交互イオン磁気共鳴電磁装置が提供され、該装置は、正方形、卵形、または、円筒状のスキャフォールドに巻かれた導電材料を含む、取り外し可能な、口の開いた、実質的に円筒状または矩形のチャンバーと、パルス時間変動電磁電流（ＰＴＶＥＣ）を、該チャンバーに電気的に接続されたパルス交互イオン磁気共鳴（ＡＩＭＲ）周波数場に変換する電気変換装置と、約６．５Ｈｚに及ぶ１以上の様式の間隔で、かつ、約７．８Ｈｚから約５９．９Ｈｚの範囲の、重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数を生成する調節装置を含む。
【００３６】
この実施形態では、交互イオン磁気共鳴周波数は、約８Ｈｚから約１４Ｈｚまで変動してもよい。同様に、この実施形態では、導電材料は、１インチごとに約５回から約５００回、非導電性または導電性のコアのまわりに巻かれた銅線または強磁性ワイヤであってもよい。加えて、所望の代表的な対象は、限定されないが、動物、ヒト、植物、付属肢（ａｐｐｅｎｄａｇｅ）、肢、臓器、組織、培養物、または細胞成長装置を含んでいる。さらに、交互イオン磁気共鳴場は、約０．０１ガウスから約１０，０００ガウスの磁界強度を有してもよい。
【００３７】
本発明のさらに別の実施形態では、細胞、組織、またはオルガノイド体を培養するための培養システムが提供され、該システムは、ガスポートが配された第１のガス透過膜を含む近位端と、第１の密封可能な開口部を含む遠位端とを有する栄養モジュール、複数の入口／出口ポートが配された第２のガス透過膜を含む近位端と、調整（ｂａｆｆｌｉｎｇ）システムおよび半透膜を含む遠位端とを有し、栄養モジュール中の第１のガス透過膜と流体接続している成長モジュール、内部に栄養モジュールを収容するのに十分な直径の開いた近位端を有する無作為化アダプターであって、栄養モジュールの遠位端は、栄養モジュールに流体接続された成長モジュールの重力ベクトルが連続的に無作為化されるように、無作為化アダプターを含む無作為化機構に電気的に接続するのに適している、無作為化アダプター、内部に少なくとも成長モジュールを収容するのに十分な直径を有し、正方形、卵形、または、円筒状のスキャフォールドに巻かれた導電ワイヤを含む取り外し可能な、口の開いた、実質的に円筒状の電磁チャンバー、パルス時間変動電磁電流を、約０．０１ガウスから約５０００ガウスの電界強度で電磁チャンバーに電気的に接続されたパルス交互イオン磁気共鳴周波数場に変換する電気変換装置、および、約６．５Ｈｚに及ぶ１以上の様式の間隔で、かつ、約７．８Ｈｚから約５９．９Ｈｚの範囲の、重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数を生成する調節装置を備えている。
【００３８】
本発明のさらに別の実施形態では、細胞を培養するための方法が提供され、該方法は、成長モジュールと栄養モジュールを有する培養ユニットに細胞を導入する工程、成長モジュールの重力ベクトルを連続的に無作為化する工程、および、細胞を培養する間、成長モジュールにパルス交互イオン磁気共鳴場を適用する工程を含む。さらに、この実施形態について、該方法は、約６．５Ｈｚに及ぶ１以上の様式の間隔で、かつ、約７．８Ｈｚから約５９．９Ｈｚの範囲の、重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数を生成するために、交互イオン磁気共鳴場を調節する工程を含む。とりわけ、生成された重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数は、約１０、１４、１５、１６、または３２Ｈｚである。
【００３９】
両方の実施形態の１つの態様では、導入する工程は、成長モジュールに細胞を入れる工程、成長モジュールを成長培地で満たす工程、観察可能なガスを取り除くために成長モジュールを密封する工程、栄養モジュールに成長モジュールを取り付ける工程、および、栄養モジュールに新鮮な成長培地を加える工程を含んでもよい。両方の実施形態の別の態様では、無作為化する工程は、無作為化アダプターに、培養ユニットを含む栄養モジュールを置く工程、無作為化アダプターを含む無作為化機構によって重力ベクトルを無作為化する工程を含んでもよい。さらに別の態様において、適用する工程は、電磁チャンバーに培養ユニットを含む成長モジュールを置く工程、および、電磁チャンバーでパルス交互イオン磁気共鳴場を生成する工程を含んでもよい。
【００４０】
すべての実施形態およびその態様において、栄養モジュールは、内部に成長モジュールを収容するための長さの直径を備えた近位端を有する開口本体と、近位端を含む、ガスポートが配された第１のガス透過膜と、および、第１の密封可能な開口部を含む遠位端を備えてもよい。同様に、成長モジュールは、複数の入口／出口ポートが配された第２のガス透過膜を含む近位端を有する本体と、バッフルシステム、および、第１のガス透過膜と流体接触した半透膜を含む遠位端とを含んでもよい。特に、成長モジュールと栄養モジュールは使い捨てである。加えて、パルス交互イオン磁気共鳴場は、細胞内のイオン輸送または転写機構の制御によって、修飾、成長、分化、脱分化、遺伝子発現の変化、転写事象の変化、または、細胞の再生の１つ以上をもたらすこともある。さらに、交互イオン磁気共鳴場は、哺乳動物の細胞のイオン輸送を変化させ、それによって、感染と哺乳動物のウイルスのエピトープの発現が可能となることもある。またさらに、細胞は、組織、オルガノイド体、ウイルス感染細胞、または、細菌感染細胞を含んでもよい。
【００４１】
本発明のさらに別の実施形態では、哺乳動物の細胞または組織を成長させるための培養方法が提供され、該方法は、交互イオン磁気共鳴培養装置に哺乳動物の細胞または組織を導入する工程であって、該交互イオン磁気共鳴培養装置は、近位端と密封可能な遠位端を有し、栄養培地を含む栄養モジュールと、近位端と遠位端を有し、細胞または組織を含み、栄養培地で満たされ、観察可能なガスを取り除くために密封される成長モジュールであって、成長モジュールの遠位端が栄養モジュールの近位端に流体密封された成長モジュール、無作為化機構に電気的に接続され、栄養モジュールを内部に含む無作為化アダプター、および、パルス交互イオン磁気共鳴場を生成するために導電性ワイヤを含む電磁チャンバーを備えている、工程と、無作為化アダプターで成長モジュールの重力ベクトルを連続的に無作為化する工程と、培養の間に成長モジュールの周囲でパルス交互イオン磁気共鳴場を発生させる工程とを含む。この実施形態にさらに関して、該方法は、上記のとおり、交互イオン磁気共鳴場を調節する工程をさらに含む。
【００４２】
両方の実施形態において、栄養モジュールは、ガスポートが配された、近位端を含む第１のガス透過膜を含んでもよい。同様に、成長モジュールは、近位端を含む、複数の入口／出口ポートが配された第２のガス透過膜と、第１のガス透過膜と流体接触した遠位端を含む、調節システムおよび半透膜を含んでもよい。特に、成長モジュールおよび／または栄養モジュールは使い捨てであってもよく、交互イオン磁気共鳴培養装置を含む材料は滅菌されてもよい。加えて、パルス交互イオン磁気共鳴場での培養は、細胞または組織のイオン輸送または転写機構を制御することによって、修飾、成長、分化、脱分化、遺伝子発現の変化、転写事象の変化、または、細胞の再生の１つ以上をもたらす。さらに、交互イオン磁気共鳴場での培養は、哺乳動物の細胞のイオン輸送を変化させ、それによって、感染と、哺乳動物のウイルスのエピトープの発現が可能となる。特に、哺乳動物の細胞または組織は、ウイルス感染または細菌感染している。
【００４３】
本発明のさらに別の実施形態では、以前に記載されたような方法によって生成された培養哺乳動物細胞または組織の組織様集合体を含むモデルが提供される。
【００４４】
本発明は、交互イオン磁気共鳴場における適応可能な培養システム中での哺乳動物の細胞、組織、またはオルガノイドの構造の短期的または長期的な増殖、成長、濃縮、調節、修飾、および／または凝集のための、装置、システム、モデル、および方法を提供する。交互イオン磁気共鳴場は、細胞挙動および遺伝子進化に影響を及ぼすと考えられている世界的な概日周期を模倣する特定の生体電磁気的に適切な周波数を含む。特に、本明細書で提供される交互イオン磁気共鳴チャンバーで生成されたような交互イオン磁気共鳴場は、哺乳動物の細胞が地球ベースの生物系に晒される自然環境を一部模倣している。
【００４５】
一般に、培養システムは、使い捨ての自給式成長モジュールを備えた、重力を無作為化する、多相培養システムと、随意に使い捨ての培養ユニットを含む栄養および成長モジュールと、培養ユニットの外部に適用する際に培養ユニットの内容物に交互イオン磁気共鳴場を送達するのに適した、取り外し可能な電磁チャンバーまたは電磁ユニットとを含む。ＰＥＭＦとＴＶＥＭＦを使用する既存の培養システムは、システム内で培養された細胞の細胞成長速度を増加させることが分かっている。交互イオン磁気共鳴培養システムは、これらのシステムに大きな改良を加えたものであり、代わりに、交互イオン磁気共鳴装置の使用を取り入れており、この装置は、細胞の再生を誘発し、細胞忠実度を高め、細胞の転写を調節し、および、特定の細胞の分化および脱分化プロセスを導くのに役立つ重要な生理的な遺伝子の選択的な制御を誘発する。
【００４６】
本明細書に記載されるように、生成された交互イオン磁気共鳴場は、自然に作られるよりも高い精度で、雷放電によって励起される地球規模の電磁周波数であるシューマン共振を模倣する一連の制御された共振波形を生成する。交互イオン磁気共鳴によって生じる共振波形を改変するまたは加速させることで、特定の細胞系の生理反応を特異的に制御するまたは誘発することができ、すなわち、パルス放射は生細胞の特定のイオン種の振動を優先的に生じさせる。それぞれの細胞型は、総イオン量およびイオン種に基づいて、別の細胞型とは異なる一定の共振パターンに反応する能力を備えている。さらに、それぞれの生理反応は、限定されないが、ゲノムの、プロテオームの、トランスクリプトームの、および、メタボロームの発現の刺激または減少、膜を通るイオンの流れの変化、遺伝子複製の変化といった、異なる細胞の制御機構の誘発を含んでもよい。
【００４７】
したがって、交互イオン磁気共鳴培養システム、装置、および、使用方法は、転写因子を含む様々な遺伝子の発現と制御を刺激してゲノムの活性を変え、動植物の成長、進化、および、分化、脱分化、細胞維持、炎症、および、老化に関連する機構の制御において、イオン濃度、膜輸送、および他の重要な経路の制御に関与する細胞輸送タンパク質のような既存の細胞タンパク質の修飾された出力をもたらすことができる。遺伝子の発現と制御を刺激するための交互イオン磁気共鳴培養システム、装置、および方法の使用は、実際的な商用用途と、細胞レベルと生理学的レベルで進化の生物学的プロセスの文脈における初期条件を再度作り出すことに焦点を当てる調査に関連する用途の両方に適したものである。
【００４８】
交互イオン磁気共鳴培養システムおよび装置は、清潔さと細胞種の二次汚染の回避について明記したＦＤＡの厳格な条件を順守する準備の整った使い捨て部品を使用することの容易さおよび便利も提供する。使い捨ての培養ユニットを使用することで、ＦＤＡの厳格な条件を容易に満たすことができるシステムの製造および使用が容易になる。他の使い捨ての医療装置が使用されるのとほぼ同じように、当業者がすぐに使用できるよう、部品を製造して無菌のパックで包むことができる。本発明の交互イオン磁気共鳴チャンバーは、イオン磁気共鳴（ＩＭＲ）装置の選択的な再使用を容易にし、医療目的での細胞および組織の培養に関連するコストを最小限に抑えることに貢献する。
【００４９】
交互イオン磁気共鳴培養システムは培養ユニットを備え、培養ユニットは、あらかじめ殺菌された、使い捨ての自給式成長モジュールとあらかじめ殺菌された使い捨ての栄養モジュール、除去可能で交換可能な交互イオン磁気共鳴電磁チャンバー、および、無作為化アダプターなどの、成長モジュールと栄養モジュールの重力ベクトルを連続的に無作為化するための手段を含んでいる。あらかじめ殺菌された使い捨ての部品は、面倒な取り扱い、コスト、既知の培養システムならびにＥＭＦおよびＴＶＥＭＦ設計におけるＩＭＲ場の不適切な送達に関連した困難を最小限に抑える。あるいは、成長モジュールと栄養モジュールは、再使用可能な材料を含んでもよく、交互イオン磁気共鳴チャンバーは使い捨てであってもよい。
【００５０】
無作為化アダプターは培養システムを水平位置に保持し、それによって、基本的に円筒状の培養システムがその中央の放射軸のまわりを時計回りにおよび／または反時計回りに水平に回転するまたは移動することで、反応器の壁部に細胞が付着するのを最小限に抑えることができる。無作為化アダプターは、固定された栄養モジュール内に配される電磁装置に合わせて、または、栄養モジュールと電磁装置と一緒に、固定された栄養モジュールと固定された電磁装置の内部で、成長モジュールまたは培養システムのみで、重力ベクトルを連続的に無作為化するための無作為化装置または機構を含む。
【００５１】
連続的に無作為化された培養システムは、振動のような安定しているが一貫した中断である連続的な重力の無作為化によって有効にされた三次元の生育環境をもたらす。最小の乱流の無作為化は、培養システムの壁への真核細胞の付着を妨害し、一方で、細胞同士の自己付着を促す。無作為化アダプターは、チャンバーの壁に対する細胞の付着を最小限に抑えるのに十分な少なくとも成長モジュールの回転または振動を提供する。異なる細胞タイプには異なる付着因子があり、したがって、培養される細胞の種類に依存して、最適な回転速度は変わる。細胞がチャンバー内部で増殖してますます集中し、それによってチャンバーの壁との相互作用が増すため、付着因子はますます重要になる。そのため、細胞の密度が培養システムで長期間増加するにつれ、チャンバーの回転または振動の速度はしばしば上がる。その結果として、連続的に無作為化された重力ベクトル装置は、０．０１〜６０ｒｐｍの範囲、好ましくは、２〜４０のｒｐｍの範囲で、成長チャンバーの回転速度を提供することができる可変設定を最適に含む。振動タイプの装置を用いるシステムでは、周期的な振動は、連続した周波数から、３０秒ごとにまたは半時間ごとに振動する周波数までの範囲のこともある。
【００５２】
無作為化アダプターは、典型的な組織培養ローラーボトル機構に似た、培養システムが置かれる外部ローラーの簡単なシステムであってもよい。あるいは、ファンベルト様の接続機構のシステムまたは直接駆動部を用いる外部電動機によって、回転を行うことができる。無作為化機構は、培養システム全体、または、培養ユニット、または、成長モジュール単独を、体系的に回転させてもよい。回転装置の種類は、付属の成長モジュールのキャップに組み入れられたスピンドルに堅く取り付けられ、栄養モジュールのキャップ内で無菌の液密式アダプターを通って伸張する、滑車のようなホイールなどの構成部品上に必要とされるアダプターの種類を規定する。
【００５３】
成長モジュールは、少量の培地と、細胞および／または組織、ならびに、随意に、目立った空隙なくモジュールを完全に満たす培養マトリックス材料を含む。成長モジュールは、細胞培養チャンバーと周囲の栄養モジュール内の余分な栄養が豊富な培地との間でのガス、栄養、および、廃棄物の拡散を容易にするために、壁の１つに組み込まれた一体的な半透過性分子膜を有する。成長モジュールの分子膜は、好ましくは、２０００−１２５００ＭＷのカットオフ範囲で、１００−５００，０００ＭＷの閾値を除外することができる拡散性の浸透膜を含む。浸透性の半透性膜は、一般に親水性の組成物からできているが、親水性組成物（例えば、ニトロセルロース、ポリスルホン、ポリアセテート、または、他の同様の複合物でコーティングされたより構造的な複合物を含んでもよい。潅流系とは異なり、半透性膜系は、成長モジュールから貴重な生体分子を損なうことなく、栄養物と廃棄物の輸送を容易にする。これらの生体分子を維持することで、哺乳動物のオルガノイドの発生反復の正確さと忠実度が高められる。さらに、特定の膜排除カットオフは、貴重な細胞プロテオミクスの産生を増強する手段を提供する。この増強は、時間、手間、および、精製コストを節約する。成長モジュールは固定化のための手段も含む。
【００５４】
栄養モジュールは使い捨てであってもよく、成長モジュールに付いているまたは成長モジュールを囲む媒体リザーバとして役立つ。栄養モジュールは、一方の端部に少なくとも１つの密封可能な開口部を有し、これは、適切なキャップ、例えば、ねじ蓋、スナップ式の蓋、王冠式の蓋、波形の蓋、スライド式の蓋で密封可能であり、内部に適切な大きさの成長モジュールを挿入することができるほどの大きさで設計されている。キャップは、例えば、単一方向または双方向に振動または回転して、成長モジュールまたは培養システムに連続的な無作為化した動きを送達することができる外部の運動装置を接続するためのアダプターを有してもよい。好ましくは、培養システム全体が、栄養モジュールの壁によって、システム全体の重力ベクトルをゆっくり無作為化する双方向のモーター装置に取り付けられる。
【００５５】
栄養モジュールは、培養細胞に対して新鮮な材料の連続的に分散して与え、半透膜またはガス透過膜が付けられたガスポートまたはガス交換ベントとともに適合している。成長モジュール内の組織によって生成された二酸化炭素とアンモニアは、栄養モジュールから拡散し、大気、すなわち、１５９ｍｍのＨｇの酸素は、ガスポートのガス透過膜を介して栄養モジュールに拡散する。ガス透過膜は、透析膜、薄いガス透過性のシリコーン膜、または、同様の材料であってもよい。ガスポートは便宜上栄養モジュールキャップに組み込まれてもよく、あるいは、外部環境に対する別の開口部として、栄養モジュールの壁に配されてもよい。栄養モジュールは、ガス透過膜の外部に位置する混合装置を含んでいる。
【００５６】
これらのプロセスは、ヒトまたは哺乳動物の身体で見られるように、培養物中で恒常的な生理学的状態を維持する。栄養モジュールは、新鮮な培地からの栄養物と酸素を、成長モジュール、および、システムから取り除かれる成長モジュールからの廃棄生成物とガスに効率的な交換を実現するのに十分な量の培地に加えて、十分な量の成長モジュールを収容するのに十分に大きい。
【００５７】
成長モジュールは使い捨てであってもよく、および／または、内部モジュールは、限定されないが、球体またはバッグなどの任意の形状でもよいが、一般には、円筒状の容器である。成長モジュールは、一方の端部に密封可能な開口部を有し、これは、容易な組み立て、注射、接種、および採取のための１つ以上のポートを有することもある適切な無菌の液密のキャップ（例えば、ねじ蓋、スナップ式蓋、王冠式の蓋）を取り付けられ密封されている。無菌の液密のキャップは、成長モジュールの回転を可能にする、液密の無作為化アダプターに装入する成長モジュールキャップを提供する。成長モジュールは、調節システムがチャンバーを通って培地の周期的または連続的に交換するために、入口ポートと出口ポートとともに適合してもよく、および、調節システムが設けられてもよく、このシステムは、浸透膜にわたって新鮮な培地と栄養物のゆっくりとした連続的な流れを効率的に誘導することで、モジュール間の栄養物の輸送に対する制御を可能にし、より制御された恒常的な環境を維持するのに役立つ。このような調節システムは、新鮮な培地の使用を合理化し、培養実験の経過中に必要とされる培地の総量を減らす能力を有する。
【００５８】
成長モジュールの１つの壁は、成長モジュールの範囲内で細胞および／または組織を含む半透過性で親水性の透析膜を少なくとも一部含み、栄養培地が入った区画内に新鮮な培地を用いて、ガス、栄養物、および、代謝廃棄物の自由な分散を可能にする。成長モジュール内の別の壁は、疎水性であり、かつ、成長モジュール内の固有の溶解ガス係数を制御する、ガス透過膜を含む。
【００５９】
透析膜は、小分子の輸送には十分に大きいが、成長モジュール内で無傷細胞を保持するには十分に小さいポアを備えた任意の材料であってもよい。透析膜は、成長モジュールから栄養モジュールまでの炭酸水素ナトリウムの形態のガスおよび溶質の両方として、培地に溶解した二酸化炭素の効率的な輸送と、バイオリアクターへの酸素の輸送を提供する、ガス透過性のシリコーン組成物またはポリエチレン型の材料を含んでもよい。透析膜は、取り扱い、セットアップ、および、採取の間に、および、モジュール内で培地を移動させるまたは回転させることに由来する損傷を防ぐための培養段階の間に、機械的な損傷から透析膜を保護する、追加の支援または膜安定化剤でコーティングされてもよい。
【００６０】
二酸化炭素と酸素の輸送を許可することに加えて、透析膜は、栄養モジュール中の新鮮な培地から成長モジュールまでの、糖、アミノ酸、ビタミン、イオンなどの他の可溶化した栄養物の拡散と、成長モジュールから栄養モジュールまでの酸性化合物、例えば、乳酸、毒ガス（例えば、二酸化炭素）、有毒な溶質（例えばアンモニウムイオン）、および、他の低分子量生成物といった代謝副産物の輸送を許可するのに十分なポアサイズを有するように選択される。しかしながら、ポアサイズは、細胞と高分子量細胞生成物（分泌されたタンパク質、抗体、糖タンパク質、大きな核酸など）の栄養モジュールへの輸送を防ぐために十分に小さくなければならない。
【００６１】
成長モジュールは、より大きな栄養モジュールの内部で配されてもよい。成長モジュールは、細胞／組織および培地が充填されてもよく、栄養モジュールに挿入する前に密封されてもよく、あるいは、空のまま挿入され、栄養モジュール内部で組み立てられ、その後、栄養モジュールの内部にいる間に充填され密封されてもよい。成長モジュールを取り除き、かつ、それを別の栄養モジュールに移す能力によって、汚染の危険と時間と効率の損失が最小限に抑えられ、培養細胞／組織のその後の処理が容易になる。
【００６２】
培養ユニットの１つの非限定的な例において、３５ｍｌまたは５０ｍｌの容量の成長モジュールは、スナップ式または他の接続機構または手段によって、４５０ｍｌの栄養モジュールに適合する。外部の栄養モジュールは、数日間またはそれ以上にわたって、小さな成長モジュールの内部での細胞成長を支援するために十分な培地を保持する。培養ユニットの別の非限定的な例では、栄養モジュールは成長モジュールよりも著しくかつ実質的に大きく、それによって、培地が入っている区画の容量は、成長モジュールの容量を１００，０００倍も上回る。例えば、１つまたは複数の小さな１−５ｃｃの成長モジュールは、１００リットルの栄養モジュール（２５−３０ガロンの細菌発酵タンクに似ている）では完全に沈んでもよく、あるいは、より小型の１−５ｃｃの成長モジュールの多数のタンデムユニットを含む１つ以上のロッドは、細長い円筒状の栄養モジュールに沈んでもよい。これは、培地の周期的な手動による交換の際に助けとなる。
【００６３】
好ましくは、成長モジュールの２−５０倍の容量を有する大きな栄養モジュールが使用される。大きな栄養モジュールを用いれば、モジュールに連続的に新鮮な培地を供給する必要がなく、周期的に間隔を置いて培地を手動で交換することが可能である。そのため、大きな栄養モジュールを備える培養ユニットは、培地交換のための入口ポートと出口ポートを備えている必要はないが、随意に、培地を取り扱う際の便宜上、１以上のポートのセットを備えていてもよい。培地の周期的な手動による交換を必要とする培養ユニットは、好ましくは成長モジュールの１０倍よりも大きな栄養モジュール容量を有する。
【００６４】
成長モジュールと栄養モジュールは、必要に応じて再利用するために制御条件下でオートクレーブ処理することができる使い捨ての生体適合性ポリカーボネートベースの材料で作られてもよく、あるいは、ガラスまたはステンレス鋼またはポリカーボネート／プラスチックなどの耐久性により優れた部品で作られてもよい。透析膜を含む成長モジュールは、放射型の滅菌に一層適しており、事前に包装されたブリスターのような製造および殺菌にとって有利である。栄養モジュールは再利用することができ、ポリカーボネート、あるいは、ガラスやステンレス鋼のようなより安定した材料で作られてもよい。
【００６５】
交互イオン磁気共鳴チャンバーは、成長モジュール内の培養細胞／組織、オルガノイド体などに、パルス交互イオン磁気共鳴場を送達するように構成された電磁調節装置を含む。電磁装置は、電極または電極のセット、あるいは、システムのニーズに応じて容易に交換することができる取り外し可能なチャンバーを含んでもよい。好ましくは、交互イオン磁気共鳴チャンバーは、内部で培養システム全体または成長チャンバーのみを取り囲む、これに合う、あるいは、これを収容する、容易に取り外し可能なチャンバーである。取り外し可能なチャンバーの形態において、チャンバーは、培養ユニットの直径よりも大きくなるように設計されたコイルを保持する、スリップオン式のチャンバーである。チャンバーは、パルス電磁電流に接続されると、チャンバーの内側部分と囲まれた培養装置との内部で約０．００１乃至約１０，０００ガウスの範囲の電磁力を生成する、円筒形状または矩形形状で巻かれた比較的堅い導電材料（例えば、ワイヤー）で作られている。
【００６６】
好ましくは、交互イオン磁気共鳴チャンバーの導電性ワイヤは、１インチ当たり約１０個のコイルで電磁性の透過性ポリマーの周りに巻かれた導電性の強磁性材料で作られている。コイルは、培養システムの組み立ておよび分解の間の取り扱いを容易にし、かつ、使用の前後に洗浄しやすくする、滑らかな導電材料で作られた薄い可撓性を有する容器に入れることができる。同様に、交互イオン磁気共鳴場は、約０．０１乃至約１００００ｍＡのＲＭＳレベル、好ましくは、いくつかの細胞系に関して約１乃至約５，０００ｍＡまでの範囲で、伝導体を通ったパルス時間変動電流を生成する装置によって生成されてもよい。
【００６７】
交互イオン磁気共鳴プロトコル／信号は、多くの他の製造業者の中で、Ｔｅｋｔｒｏｎｉｃｓによって製造されたユニット（例えば、ＡＦＧ３０２１Ｂ、ＡＦＧ３０２２Ｂ、ＡＦＧ３１０１、ＡＦＧ３１０２、ＡＦＧ３２５１、ＡＦＧ３２５２のモデル）、および、Ａｇｉｌｅｎｔよって製造されたユニット（例えば、３３２２０Ａ、３３２５０Ａ、および、３３２２０Ａ−ＨＯ１）といった無作為の／任意の波形または波形発生器と一般に呼ばれる多くの市販の装置によって生成可能である。波形発生器は、特定の時間間隔にわたって所望の周波数で所望の一連のパルスを生成するようにプログラムされている。その後、この信号は、直接、または、増幅器を通って、出力または伝達装置に接続され、磁場の強度を強くする／制御する、または、必要に応じて高める。あるいは、「信号または波形プロトコル」は、カスタム設計されたコンピューターチップにプログラムされ、それが、伝達装置の所望の磁場の強度を生成する電源によって励起された後に、一連の所望の信号がチップから伝達装置に発せられる。
【００６８】
交互イオン磁気共鳴場は、多変磁場（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｎｔ）であってもよく、伝導体内の多変電流、または、固定された伝導体間の多変電圧によって誘発されてもよい。例えば、培養物は、時間とともに変動する電流が通る伝導体の近くに置かれる。あるいは、培養物は、時間とともに変動する電圧が印加される平行な板の間に置かれる。両方の場合、交互イオン磁気共鳴は、細胞培養の領域内に生じる。
【００６９】
複数の方法を用いて、所定の時間領域内に、デルタ波または方形波のような交互イオン磁気共鳴信号、フーリエ曲線、または信号の組み合わせを生成することができる。例えば、培養物を保持する特定のチャンバーに電磁（ＥＭ）場を集中させるために、導電性の電流通過（電流）電極のアレイを配置することができる。交互イオン磁気共鳴を適用することで、チャンバーの内部である形状のまたはカスタム設計された基質で生じ得る組織の成長を増強することができる。電磁場は、導電性基質または基質層を通って電流波形を直接導くこと、あるいは、外部の電極、例えば、プレート、アンテナ、コイル、またはチャンバーから、または、培地に隣接した、および、培地のすぐそばではあるが培地から離れた電極セットから、電磁場を突出させることによるなどの様々な手段によって生じてもよく、その結果、電磁場の相対的な強度が成長チャンバー内部で効果的になる。例えば、金属導体の対向する角の間で伝導された約１００ミリアンペア（ｍｉｌｌｉａｍｐｓ）の電流は、板材表面から数センチメートル広がった刺激性交互イオン磁気共鳴を生成する。
【００７０】
とりわけ、交互イオン磁気共鳴場が、培地（例えば、ワイヤ、電極、コイル、同様の伝達装置）の外部にある、または、該培地と直接接触した伝導性のアンテナを介して生じる場合、磁場は、培養細胞と培地から距離を置いて近接しており、毎秒およそ１０−３００サイクル（Ｈｚ）の好ましい基本周波数を有するデルタまたは方形波の形をした変動電位によって有利に生成された交互イオン磁気共鳴信号を運ぶ。とりわけ、１０、１４、１５、１６、または３２Ｈｚの基本間隔で１つ以上の重複するまたは変動する交互イオン磁気共鳴周波数と、随意に、約８〜１４Ｈｚ（四捨五入値）の間で変動する共鳴が生成され、アンテナまたは伝達装置を通ることができる。基本的な間隔は、２５６Ｈｚまでに及び、かつ、ほぼ時間平均で０．０１−１００００ｍＡの方形波の形状で前述の基本周波数のすべての高調波を無限に組み込む、それぞれの高調波間隔を含んでいる。
【００７１】
好ましくは、二次元または三次元の指向性アンテナが利用されてもよく、従来の二次元または三次元の組織培養物に適用されてもよい。二次元培養は、実際の微小重力状態において、または、微小重力の物理的な条件をシミュレートする連続的に無作為化された重力ベクトル容器技術によって、および／または、従来の三次元マトリックスベースの培養物において実現されてもよい。電磁場、好ましくは、交互イオン磁気共鳴場は、正確な周波数、持続時間、および、適切な持続時間のための場の強度のパルス電磁場を、指向性装置に通すことによって、アンテナまたはコイルの近くで実現される。
【００７２】
培養システムの使用中、周波数の範囲と振動する電磁場の強度は、組織、細胞、または遺伝子などの所望の培養された材料の所望の刺激を実現するために選択され得るパラメータである。生成された最終的な磁場は、０．００１〜１００００ガウスの範囲であり得るが、培養システムのチャンバーのシリンダーと成長モジュールの中心領域内の好ましい範囲は、約０．０１〜約５，０００ガウスの範囲である。
【００７３】
したがって、本発明は、限定されないが、動物、好ましくは、哺乳動物の細胞、組織、オルガノイド体などの培養材料の三次元成長のための方法を提供する。培養材料は、交互イオン磁気共鳴場の存在下で、成長モジュールに導入され、栄養モジュールによって提供される栄養が豊富な培地で成長する。成長の間、培養ユニットの重力ベクトルは無作為化されることで、三次元の成長が促される。これはシステム内での代謝交換の効率を最大限に高め、同時に、成長モジュールと栄養モジュールに貴重な生体分子を蓄積させる。したがって、細胞成長の速度の上昇、迅速な分化、細胞忠実度の上昇、および、細胞の分化の配向に関与する選択的な生理的遺伝子の誘発または抑制を与えるように操作することが可能な、より一層制御した細胞成長培養システムが有効である。
【００７４】
例えば、培養材料内の遺伝子の発現とタンパク質の活性を調節するために、特定の培養材料が選択され、条件が設定されてもよい。交互イオン磁気共鳴場は、転写因子を含む様々な遺伝子の発現と調節を刺激し、ゲノムの活性を変化させる。これは、既存の細胞タンパク質、例えば、イオン濃度の調節、動物や植物において成長、進化、分化、脱分化、細胞維持、および、加齢に関連する機構を調節する際の膜輸送と他の重要な経路に関与する細胞輸送タンパク質の出力の修飾をもたらす。本明細書で提供される方法およびプロセスによって細胞の分化／脱分化を調節することで、より迅速な治癒と寿命延長組成物および用途の開発が促進されることもある。
【００７５】
三次元の組織成長を促進することなく、増殖のみの目的で、基質に細胞を付着させることが望ましいシステムでは、生体適合性材料からなる平らな二次元の電極表面上で細胞を直接成長させることができる。このような状況において、いくつかの培養細胞は、細胞の付着を容易にするために培養ユニットに組み込むことができる、支持電極材料、コーティング、または導電性チャネルに実際に引き寄せられてもよい。例えば、交互イオン磁気共鳴場は、交互イオン磁気共鳴プロトコルをチャネルに沿って置かれた伝導体に通すことにより、チャネルの領域で誘導される。
【００７６】
いくつかのシステムでは、マイクロキャリア球体またはビーズが培地に含まれ懸濁されることで、ビーズへの細胞の付着が誘発される。これらのシステムにおける細胞増殖について、培養システムの成長モジュールは、約２〜６０ｒｐｍの範囲で無作為化に晒されるのが好ましく、交互イオン磁気共鳴は、約０．００１〜１０，０００ガウス、好ましくは、約０．０１〜３０００ガウスの範囲のＲＭＳレベルを有する伝導体を通過した時間変動電流によって生成される。
【００７７】
特に、本発明は、細胞、組織などの培養材料中のウイルス複製および増殖の遺伝子ならびに遺伝子産物をアップレギュレートまたは増加させる方法を提供する。交互イオン磁気共鳴培養システムで成長した、所望のウイルスに感染した培養材料は、ウイルスに関連した遺伝子、とりわけ、複製と増殖に関連した遺伝子のアップレギュレーションを引き起こす。非限定的な例において、このようなモデルおよびシステムは、ワクチン生産用ビリオンの大量生産、ウイルスゲノム順応生成物の同定、長期培養中のウイルスゲノムの変化の追跡、複製の阻止を目標とした抗ウイルス剤または抗菌剤の開発、および、ウイルス感染または細菌感染した細胞にのみ由来するヒト細胞により生成されたタンパク質の採取に役に立つ。これに応じて、本明細書で提供される方法は、細菌に関連する遺伝子をアップレギュレートするために、所望の細菌に感染した、または、所望の細菌によって成長した培養材料に適用可能である。培養システムを含む培地からタンパク質または他の生成物を同定する方法は、当該技術分野では周知であるように、特定の化合物、タンパク質、核酸などに基づいた抗ウイルス剤および抗菌剤の開発のための方法である。
【００７８】
さらに、本発明は、細胞の３次元組織様の集合体（ＴＬＡ）のモデルを提供する。組織様の集合体は、少なくとも３か月、好ましくは６か月以上安定しており、対応する２次元の組織／細胞、または、インビボで得られた組織／細胞と特徴を共有している。細胞は、交互イオン磁気共鳴場で、または、交互イオン磁気共鳴場なしで成長することもある。あるいは、モデルは、ウイルスまたは細菌、特に病原体に感染した細胞様集合体を含んでもよい。これらの組織様集合体も少なくとも３か月間安定したままである。さらに、ウイルスまたは細菌のゲノムは、感染症期間の間を通して安定したままである。このようなモデルは、限定されないが、ウイルスまたは細菌に関連するまたは誘発された遺伝子および／または遺伝子産物のアップレギュレーション、ならびに／あるいは、ウイルスまたは細菌の適応する機構に関する研究に有用である。
【００７９】
交互イオン磁気共鳴培養システムの好ましい実施形態が図で描かれ、以下に説明されている。しかしながら、この参照はいかなる方法でも本発明を限定することを目的とはしていない。本明細書で詳細に記載された実施形態と変更形態は、添付の請求項とその同等物によって解釈されるものとする。
【００８０】
図１Ａの組み立てられていない図で示されるように、交互イオン磁気共鳴培養装置（１００）は、無作為化アダプター（１１０）、培養ユニット（１２０）、および、ＡＩＭＲチャンバー（１５０）を含む。無作為化アダプターは、内部に培養ユニットを収容するのに十分な直径を有する、開いた円形の近位端（１１２）と、無作為化機構（１１６）と電気通信した遠位端（１１４）を備えている。培養ユニットは、近位端に成長モジュール（１３０）と、培養ユニットの遠位端に栄養モジュール（１４０）を備え、栄養モジュールには、成長モジュールが嵌合し、栄養モジュールの近位端（１４１）を含むへり、縁、または先端（１４１ａ）に対して固定または締め付け手段（１３８ａ）によって固定される。成長モジュールと栄養モジュールは、実質的に円筒状の本体を含むように本明細書で示されているが、栄養モジュールが成長モジュールを安全かつ機能的に収容し、内部に栄養培地を収容することができ、および、成長モジュールが、成長させる培養材料を内部に安全かつ機能的に含み、栄養培地とガスを受け取りかつ交換することができる限り、モジュールは他の形状を有してもよい。
【００８１】
成長モジュール（１３０）は、ガス膜（１３２）と、ガス膜を通って配された入口および出口ポート（１３３ａ、ｂ、ｃ）とを含む、正面または近位壁（１３１）を有する（図２Ａ参照）。成長モジュールの後壁または遠位壁は調節手段またはシステム（１３６）を含み、これは栄養モジュールの近位端（１４１）に取り付けられると流体連通する（図２Ｂを参照）。栄養モジュールの近位端（１４１）は、半透過またはガス透過膜（１４６）が取り付けられたガスポートまたはガス交換ベント（１４５）を含む（図３を参照）。栄養モジュールの遠位端（１４２）は、無作為化機構と係合するのに適した、栄養モジュールの開口部（１４４）を覆うキャップ（１４３）を含む。随意に、栄養モジュールは、モジュール表面にエッチングされたまたは配された、培地容量を示すための手段（１４７）を含んでもよい。ＩＭＲチャンバー（１５０）は、培養ユニットを滑らせるまたは培養ユニットに適合するのに十分な直径を備えた円形の近位（１５１）または遠位（１５３）の端部を有し、および、その外部の周りに配された電磁装置（１５５）（この例では、コイル）と、電磁装置と電気通信したパルス時間変動電磁電流（ＰＴＶＥＣ）を生成するための手段または装置（１５７）とを備えている。
【００８２】
図１Ｂは、培養ユニットが無作為化アダプター内でどのように収容されるかを例証している。培養ユニット（１２０）を含む栄養モジュール（１４０）の遠位端（１４２）は、無作為化するユニット（１１０）の近位端（１１２）内に配され、無作為化機構（１１６）（図示せず）と電気的に係合する。これにより、成長ユニット（１３０）は覆われないままで、交互イオン磁気共鳴場を収容するために利用することができるようになる。図１Ｃに示されるように組み立てられると、ＡＩＭＲチャンバー（１５０）の近位端（１５１）は、特に、少なくとも成長モジュール（１３０）が電磁装置（１５５）によって生成された交互イオン磁気共鳴場を受け取るために交互イオン磁気共鳴チャンバー内に配置されるように、栄養モジュールの近位端（１４１）の周りに配される。パルスセンサー（１５９）は電磁装置上に配置される。
【００８３】
図１Ａ−１Ｃをさらに参照すると、図２Ａは成長モジュール（１３０）の正面図である。成長モジュールの正面または近位側（１３１）は、その表面にわたって配されたガス膜（１３２）を含む。ガス膜は、表面積を増加させるために膜表面全体に放射状に配された、一般に（１３４ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）によって表わされる複数の突出部を備え、および、膜を通して配され、成長モジュール内部に含まれる培養液と流体連通した（１３３ａ、ｂ、ｃ）で表される複数の入口／出口ポートを有している。
【００８４】
図２Ｂは成長モジュール（１３０）の背面図である。背面または遠位側（１３５）は、内部に配された調節システム（１３６）と、遠位側の少なくとも一部を含む半透過性の透析膜（１３７）とを含む。入口／出口ポート（１３３ａ、ｂ、ｃ）とガスポート（１４５）とを含むガス透過膜（１３２）および（１４６）は、成長モジュールと栄養モジュールの両方の培養液と流体連通する。成長モジュールの外部縁は、そこから延びる、（１３８ａ、ｂ、ｃ、ｄ）によって表わされた複数の第１の固定または締め付け手段または部品を備え、これは、栄養モジュールの近位端（１４１）を含む、へり、縁、または先端（１４１ａ）で栄養モジュールに成長モジュールを固定する。成長モジュールの外部縁も、第１の固定手段の間に配された、スナップ、クリップ、または、クランプなどの、栄養モジュールに成長モジュールを固定または締め付けるための、一般に（１３９ａ、ｂ、ｃ、ｄ）で表わされる複数の第２の手段を備えている。第１と第２の固定手段の組み合わせは、モジュール間の水密密封を形成する。
【００８５】
図２Ａ−２Ｂをさらに参照すると、図３は、成長モジュール（１３０）が栄養モジュール（１４０）にどのように締め付けられるか、または、固定されるかを例証している。ガスポートまたはベント（１４５）とガス透過膜（１４６）に対するその配置が描かれている。モジュールを一緒に締め付けると、成長モジュールの調節システム（１３６）と半透過性の透析膜（１３７）が、栄養モジュールのガスポート（１４５）とガス透過膜（１４６）に流体接触することが分かる。締め付け手段（１３８ａ、ｂ、ｃ、ｄ）は、隆起した面どりした先端（１３９ａ、ｂ、ｃ、ｄ）を含み、これは、（１６０ａ、ｂ）に沿って、栄養モジュールの縁（１４１ａ）上を摺動するまたはスナップで留めることで、内部で成長モジュールを固定することができる。
【００８６】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証する目的で与えられ、いかなる方法でも本発明を限定することを意図したものではない。
【００８７】
実施例１
＜交互イオン磁気共鳴培養システムの準備＞
＜培養物／培地に対する細胞の準備＞
無菌条件下で、播種機による培養（ｓｅｅｄｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）を、５０ｍｌの細胞培養フラスコにおよそ１ｘ１０５−５ｘ１０６細胞／ｍｌを含有している、約３５乃至５０ｍｌのヒトまたは哺乳動物の細胞懸濁液とともに開始する。
【００８８】
高濃度環境において細胞を成長させる条件には、４ｇ／ｌでの最の小濃度グルコース、および標準培地で見られるようなＮａＨＣＯ３などの十分なバッファー成分（３．７ｇ／ｌ）を有する高品質培地の使用が必要であり、これは一般に、標準培養条件下で２−１０週までの期間、緩衝能を提供する。培養システムが高密度の成長を可能にするため、バッファーは、一般に、１週当たり１回または２回変えられる。栄養モジュール中の培地は、色がサーモンピンクから黄色がかったピンクに変わり始めるとすぐに、取り替えられるべきである。成長モジュールの内の高密度の成長により、培地は、一旦臨界質量が達成されると、黄色がかった色を維持する傾向がある。
【００８９】
血清濃度は、真核細胞が高密度で成長させられるときに、しばしば重要であり、細胞型に依存して０−８０％に接近する、静置培養中で通常は使用されるレベルに最小限に維持されるべきである。細胞が、分泌分子、例えば抗体の産生のために培養されるときに、血清濃度は、成長モジュールの内部で５−３０％であるはずである。栄養モジュール中の血清濃度は、しばしば減少させられ得るが、個々の細胞型とともに試験されるべきである。血清の使用が、培養システムの環境下で泡立ちの問題を引き起こしかねないため、消泡剤が使用され得る。血清なしで成長され得る細胞型は、バイオリアクターにおける成長前に、そのような成長に適応させるべきである。
【００９０】
ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫなどの付着細胞は、一般に、懸濁液中で最初に成長し、その後凝集体として成長する。幾つかの付着細胞型は、細胞の大きな凝集体を最小限にするために、および細胞表面（分泌）領域を最適化するために、マイクロキャリア型のビーズの存在下で成長させられると、分泌された産物をより効果的に生成する。
【００９１】
＜培養システムの準備＞
培養システムは、成長モジュールより約１０倍大きな再利用可能な栄養モジュール内で、ポリカーボネートで作られた、あらかじめ殺菌した使い捨ての成長モジュールに付着することによって又はそれを滑らせる（ｓｌｉｐｐｉｎｇ）ことによって、無菌条件下で、好ましくは無菌箱に集められる。成長モジュールは、無菌のブリスターパックにあらかじめ包まれたあらかじめ殺菌した使い捨てのユニットとして提供され、無菌のキャップがあらかじめ装備されている。それは、成長モジュールを保持するために内部ガイドが装備された無菌の栄養モジュールへ挿入され、それによって成長モジュールは、特別に設計された開口部において液密シールによって適所にしっかりとはめられる。栄養モジュールは、排除された空気を放出するために構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）中に放出される、栄養モジュール中の培地の定期的交換のための個別の培地開口部を有している。再利用可能な／使い捨ての栄養モジュールは、ポリカーボネートで構成され、構築前にオートクレーブバッグ内で３０分間、最大の１２１°Ｃにオートクレーブすることによって殺菌されるか、またはガンマ線滅菌され得る。
【００９２】
＜培養システムの充填＞
充填する工程は、すべての機器、および構築後にシステムにおいて圧縮およびガスの膨張または収縮を最小限にするために、培養温度で平衡化された溶液によって行われる。播種機による培養物／細胞懸濁液は、排除された空気の放出を可能にするように処理する成長モジュールキャップ中の注入ポートを通って、シリンジまたはピペットによって３５ｍｌの成長モジュールへと導入される。この成長モジュールキャップは、注射器接種および空気除去のためのゴム引きのセプタムキャップを含む、スナップキャップを有する２つのポートを有する。１つのポートは、シリンジによる充填を容易にするＬｕｅｒ Ｌｏｃｋアダプターを有し、一方でもう１つのポートは、空気を充填の間に逃がすために開かれている。成長モジュールは、播種機による培養物および適切な培地によって完全に充填されており、成長モジュールから空気はすべて取り除かれている。ポートは密封され、空気の最後の痕跡（ｔｒａｃｅｓ）が、ゴム引きのスナップキャップへの針を備える空のシリンジの挿入によって取り除かれ、空気がすべて引き出される。
【００９３】
栄養モジュールは、入口ポートを通る約４５０−５００ｍｌの培養液で、ほぼ満杯の容量まで充填され、一方で、栄養モジュール中でガス透過性のシリコーン膜を通して気圧が取り除かれる。小さな気室は、ガスポートを通るガスの交換を提供するために維持される。入口ポートは、しっかりと密封されている。
【００９４】
＜電磁室の適用＞
一旦、モジュールが、構築、充填、および密封されると、栄養モジュールの直径に合わせられた、除去可能な電磁室は、図１Ｃ遠位の端部（ｅｎｄ ｄｉｓｔａｌ）から、充填キャップおよびポートを有する端部までユニット全体の上を滑る。電磁室上の可撓性の旋回式コードアダプターによって、ユニット全体が、拍動性の電磁場を生成するために電流を提供する電気コードからの干渉なしで回転することができる。電磁室は、培養システムのグロースチャンバーおよびその内容物に、時変電磁力（矩形波／デルタ波、フーリエ曲線）を与える。
【００９５】
＜重力ベクトル無作為化装置の適用＞
構築された培養システムは、特定の細胞培養物に適応させた温度（この場合３５−３７°Ｃである）に設定された、および約５ｒｐｍでヒトのハイブリドーマ細胞を回転させるように設定された、インキュベーターチャンバー内の重力ベクトル無作為化装置上に置かれる。培養システムは、漏出および他の問題のためにモニタリングされ、最初のサンプルが得られるまで重力ベクトルを連続的に無作為化しながらインキュベートされる。異なる哺乳動物細胞型は、異なる無作為化速度を必要とする。例えば、ネズミのハイブリドーマ細胞は、一般に、５乃至２０ｒｐｍで成長させられるが、一方でヒトの及びトランスフェクトされた細胞は、約１０乃至１００ｒｐｍのわずかに速い回転速度で成長する。これらの細胞株は、現在の培養システムが、従来の細胞培養方法に適応させられ得る任意の細胞型または組織の成長に適合可能となるように意図されるため、本発明に限定するようには意図されない。
【００９６】
＜サンプルの取得および採取＞
サンプルは、培養された物質の成長および発達を評価するために、培養システムから定期的に得られる。サンプルを得る前に、培養システムは、インキュベーターから得られ、連続的に無作為化された重力ベクトル装置から取り除かれ、および電磁室が取り除かれる。すべての工程は、細胞の沈澱を最小限にするために迅速に行われる。その後、培養システムは、汚染を最小限にするために拭き取られ、無菌箱に移動される。無菌箱の内部で、蓄えられた圧力は、栄養モジュール中のメディアポートをゆっくり開くことによって放出される。その後、成長モジュールは、Ｌｕｅｒ Ｌｏｃｋアダプターを有する注入ポートを開くことによってサンプリングされ得る。取り除かれた容量は、新鮮な培地の等しい容量と交換され、電磁室が、解放され、電磁室によって再構築され、および封じ直され、インキュベーターチャンバーの連続的に無作為化された重力ベクトル装置上でリセットされる。
【００９７】
＜栄養モジュール中の培地の変更＞
使用済みの培地の新鮮な培地との交換は、１週間で約１−２回行われるべきであり、サンプル得るのと同じ方法で培養システムの分解を必要とするが、成長モジュールは開かれていないままである。代わりに、栄養モジュール注入キャップが取り除かれ、使用された培地は、無菌箱中の内容物を慎重に汲み出すことによって空にされる。約３５０乃至４００ｍｌの新鮮な培地（３７°Ｃ）は、栄養モジュールへと注がれ、以前のように再構築される。モジュールまたは培地の汚染を最小限にするために注意が払われる。
【００９８】
＜細胞培養密度＞
ハイブリドーマ細胞などの高密度細胞の成長は、より多くの酸素、より多くの栄養素、および廃棄物のより頻繁な除去を必要とし、それ故、継続的なフロー設計の栄養モジュールに、より好適に適合される。例えば、３５−５０ｍｌの成長モジュール中の約１０７細胞／ｍｌのハイブリドーマ細胞の酸素要求量は、約１．７５ｍｇ／ｈｒである。幾つかの細胞株は、高密度に成長しないが（２×１０７細胞／ｍｌ未満）、培地の定期的な変更または継続的なフロー栄養モジュールとともに、分泌された産物の産生および採取のために、培養システムにおいてより長期間の間培養され得る。
【００９９】
＜分泌された細胞産物の産生＞
モノクローナル抗体、サイトカイン、炎症促進性分子、バイオ分子マーカーおよび他のすべての可溶性の生化学的産物などの、細胞産物は、細胞が、培養される細胞の個々の特性に依存する重要な細胞密度まで培養されると、培養システムで産生され得る。ハイブリドーマ細胞は、典型的に、２４時間の期間で、細胞当たり４×１０７から７×１０８の抗体分子を産生する。
【０１００】
＜組織様集合体（ＴＬＡ）のゲノム分析＞
ＧＴＳＦ−２、ＲＰＭＩ １６４０、Ｈａｍｓ Ｆ１０、ＭＥＭ Ａｌｆａ、Ｌ−１５、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍｓ Ｆ１２、Ｅａｒｌｓ ＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、または交互イオン磁気共鳴とともに又はそれなしで細胞型に適切な他の培地において成長した、細胞の組織様集合体からのＲＮＡを、３Ｄデバイスから取り除き、５０ｍｌのチューブに入れることによって採取した。培地を取り除き、組織様集合体を、無菌のＰＢＳによって３回洗浄した。洗浄後、組織様集合体を、−８０°Ｃで凍結させ、Ａｓｕｒａｇｅｎ Ｉｎｃへの移送のために保存した。サンプルを、ＲＮＡの消化およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ ２．０＋ヒトゲノムチップ上の遺伝子アレイチップの分析のためにＡｓｕｒａｇｅｎに送った。デジタルチップデータを、研究所に送り、Ｇｅｎｓｐｒｉｎｇソフトウェアにおける分析によって処理した。
【０１０１】
＜３Ｄ ＴＬＡ成長動態（３Ｄ ＴＬＡ ｇｒｏｗｔｈ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）およびグルコース消費＞
組織様集合体の代謝パラメータを、細胞発達特性をモニタリングする且つ組織の代謝状態をモニタリングするために、実験期間にわたって２４−４８時間ごとに測定した。グルコース消費を、製造業者の指示（１）に従って、ＥＣ８＋カートリッジを使用するｉＳｔａｔの臨床的な血液ガス測定装置（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）を使用して測定した。
【０１０２】
実施例２
＜交互イオン磁気共鳴培養システムＨＢＴＣ ＴＬＡ ３Ｄの細胞培養で成長させたＨＢＴＣ細胞の遺伝子誘発＞
線維芽細胞、間葉細胞および分泌細胞（ＨＢＴＣ）を含む細胞の培養物を、交互イオン磁気共鳴培養システムにおいて培養した。ヒトの気管支および気管の一次細胞（ＨＢＴＣ；線維芽細胞および間葉細胞）の混合物を、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を介して複数の組織ドナーの肺粘膜から得て、サプライヤー（Ｃａｍｂｒｅｘ）によって行なわれた標準的な外来ウイルスのパネル（例えば、ＨＩＶ、肝炎、疱疹）に関する調査によってウイルス汚染がないことが示された。細胞を、ヒトのフィブロネクチンでコーティングしたフラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）中で単層として最初に成長させ、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＧＴＳＦ−２培地で繁殖させた。米国特許出願第５，８４６，８０７号に最初は記載された、ＧＴＳＦ−２培地は、グルコース、ガラクトースおよびフルクトースを含む、三糖ベ−スの（ｔｒｉ−ｓｕｇａｒ−ｂａｓｅｄ）増殖培地である。米国特許出願第５，８４６，８０７号は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
単層を、一定の気圧且つ３７°Ｃで、９５％の空気および５％のＣＯ２とともに、Ｆｏｒｍａの加湿したＣＯ２インキュベーターにおいて成長させた。ＨＢＴＣ細胞を、３７°Ｃで１５分間、０．１％のトリプシンおよび０．１％のＥＤＴＡの溶液とともに酵素的解離を使用して継代した。適切な酵素によるインキュベーション後、細胞を、５０ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇの円錐形の遠心分離管に移し、１０分間８００ｇで遠心分離にかけた。ペレットにした細胞を、新鮮なＧＴＳＦ−２培地中に懸濁し、３０ｍｌの新鮮な増殖培地を使用して、Ｔ−７５フラスコへと希釈した。
【０１０４】
培養構築物を、ＨＢＴＣ（間葉）細胞によって接種し、数週間の間成長させた。ＨＢＴＣ細胞を、最初に、酵素消化によってＴ型フラスコから取り除き、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ）によって１回洗浄し、トリパンブルー色素排除（Ｇｉｂｃｏ）によって生存度に対してアッセイした。細胞を、培養構築物の接種前に、新鮮な増殖培地中の氷上で保持した。培養実験用の主要な接種物は、２×１０５細胞／ｍｌのＨＢＴＣ細胞を含み、これを、１２０ｍｍの直径を有する５ｍｇ／ｍｌのＣｙｔｏｄｅｘ−３（Ｔｙｐｅ Ｉ、コラーゲンでコーティングされたシクロデキストラン）マイクロキャリアによって、３５ｍｌの成長モジュールにおいて新鮮なＧＴＳＦ−２培地に加えた（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ， ＵＳＡ）。４５０ｍｌの栄養モジュールを、新鮮なＧＴＳＦ−２培地で充填し、上に記載されるように、培養構築物を密封した。
【０１０５】
簡潔に言うと、交互イオン磁気共鳴を、除去可能且つ調整可能な交互イオン磁気共鳴コイルを有する培養構築物を包含によって、培養ユニットに提供する。増加する周波数で、培養した細胞および培地を、２５６Ｈｚまで及ぶこれらの各々の高調波間隔（ｈａｒｍｏｎｉｃ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）を含む、且つ０．０１−５０００ｍＡの矩形波の形態で無限に対する前述の基本周波数のすべての高調波を組み込んでいる、１０、１４、１５、１６および３２Ｈｚの基本間隔で、交互イオン磁気共鳴信号に晒す。電磁気プロトコルを提供する交互イオン磁気共鳴チャンバーを、培養装置のまわりに置き、およそ５００ｍｓｅｃの間隔での一連の階段的な共鳴パルスを、培養構築物の外側に適用した。培養の構築物およびユニットを、継続的に無作為化した重力装置に接続し、鼻咽頭上皮のものを模倣する３５．０°Ｃでの一定の気圧を提供する、９４．５％の空気および５．５％のＣＯ２ととともに、Ｆｏｒｍａの加湿したＣＯ２インキュベーターにおいて成長させた。ＨＢＴＣ培養物を、培地を変更する前に、最小の２４時間の間成長させた。その後、新鮮な培地を、９６−１６８時間ごとに、栄養モジュール内で使用済みの培地の６５−１００％を取り替えることによって補充した。
【０１０６】
この時点で、培養実験用の培地は、１０％のウシ胎児血清を補足したＧＴＳＦ−２を含んだ。細胞が増殖するとともに、代謝要求量は増加し、新鮮な培地に、追加の１００ｍｇ／ｄｌのグルコースを慣例的に補足した。
【０１０７】
細胞発達特性を確立するために、培養物を、一般に２４−４８時間の時間点で、実験期間にわたって定期的にサンプリングした。グルコース利用（図５Ａ）およびｐＨ（図５Ｂ）のパラメータを、培養物の相対的な発達および衛生状態、および細胞の成長および生存度の率を測定するために、ｉＳｔａｔ（商標）の臨床的な血液ガス測定装置によって調査した。
【０１０８】
細胞を、図６Ａから図６Ｄに示されるように、モニタリングした。図６Ａは、カルシウム結合蛍光色素、Ｆｕｒａ−２ＡＭを注入したＴ型フラスコにおいて成長させた（２０日間にわたって成長を維持するために必要に応じて継代した）ＨＢＴＣ細胞の写真を示す。左側の細胞を、２０日間の成長期の全体にわたって、マルチバリアントの周波数電磁場（ｍｕｌｔｉ−ｖａｒｉａｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｆｉｅｌｄ）に晒した。右のパネルの細胞は、電磁場に晒さなかった。交互イオン磁気共鳴に晒すことによって、カルシウムイオンの細胞分布を変更した。図６Ｂは、２１日間、交互イオン磁気共鳴バイオリアクターにおいてｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅまたはＣｙｔｏｄｅｘ−３ママイクロキャリア上で成長させたＨＢＴＣ細胞を示す。上の左のパネルは、全体の成長期間にわたって、交互イオン磁気共鳴に晒した細胞を示し、右の細胞は、電磁場に晒さなかった。細胞の組織様集合体およびマイクロキャリアビーズ（組織様集合体）を、Ｆｕｒａ−２ＡＭによって処理した。示されるマイクロキャリアは、マイクロキャリアを単独で示す下のコントロールパネル中の写真によって証拠づけられるように、蛍光の背景レベルを保持するが、交互イオン磁気共鳴に晒した細胞は、背景レベルを超えるかなりの信号を放出する。矢印は、マイクロキャリアビーズの上にはないが、それに付けられた細胞のクラスターを示す。図６Ｃは、図６Ａで示される細胞に類似しており、ＨＢＴＣ細胞は、交互イオン磁気共鳴によって（左）、またはそれなしで（右）成長されるが、カリウム結合蛍光色素、ＰＢＦＩ−２ ＡＭが注入される。図６Ｄは、ＰＢＦＩ−ＡＭ（下部）によって処置されたマイクロキャリア単独の対照と比較した、交互イオン磁気共鳴によって（上部）、またはそれなしで（真中）のいずれかで、マイクロキャリアビーズの存在下で成長した細胞のカリウムイオン染色を示す。
【０１０９】
＜交互イオン磁気共鳴で成長したＨＢＴＣ ＴＬＡにおける遺伝子導入＞
交互イオン磁気共鳴培養システムで成長したＨＢＴＣ細胞は、様々な輸送および再生の遺伝子のための発現のレベルを含む、特定遺伝子のファミリー内の遺伝子のアップレギュレーションを実証している。表１は、交互イオン磁気共鳴場でアップレギュレートされた遺伝子をリストしており、磁気共鳴場なしで成長した細胞における遺伝子発現のレベルに対する倍率増加を提供する。
【０１１０】
【表１−１】
0006380994.tif 000002
【０１１１】
【表１−２】
0006380994.tif 000003
【０１１２】
【表１−３】
0006380994.tif 000004
【０１１３】
【表１−４】
0006380994.tif 000005
【０１１４】
実施例３
＜交互イオン磁気共鳴培養システムで成長したＮＨＮＰとＨＢＥの細胞の遺伝子導入＞
＜ＮＨＮＰ ＴＬＡ ３Ｄ細胞培養物＞
ＮＨＮＰ細胞を、Ｌｏｎｚａ （Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）から得て、５％のＣＯ２雰囲気（２−４）下の３７°Ｃで、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したグルコース、ガラクトースおよびフルクトースを含有している、特有の培地である、ＧＴＳＦ−２で繁殖させた。以前に記載したように（５）、ＮＨＮＰ細胞を、ヒトのフィブロネクチンでコーティングしたフラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）において単層として最初は成長させ、少なくとも５のドナーから貯蔵した。ＮＨＮＰ細胞培養を、膨張させ、製造業者の産生基準（Ｌｏｎｚａ）によってあらかじめ証明されたようなウイルスの汚染物質に対して試験し、液体窒素中で凍結保存した。３ｍｇ／ｍｌのＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）上への３ｘ１０５  ＮＨＮＰ細胞／ｍｌを、５５ｍｌの回転式の血管壁のバイオリアクター（ＲＷＶ； Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ）へと、または交互イオン磁気共鳴培養装置の培養ユニットへと播種することによって、三次元の（３Ｄ）ＮＨＮＰ ＴＬＡを産生し、５％のＣＯ２下の３７°Ｃで成長させた。細胞を、１０％のＦＢＳを含有しているＧＴＳＦ−２を再供給する前に、バイオリアクター中で４８時間ビーズに付着させた。ＴＬＡ培養物を正常なヒトの生理学的血液化学パラメータ（ｐＨ７．２および８０−１２０ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度）内に維持するために、２０−９０％の培地を、必要に応じて、４８時間ごとに新鮮なＧＴＳＦ２培地と取り替え、ＶＺＶ感染前に、効率的な組織様構築物の組織の成長および成熟を促進した。ｉＳｔａｔの携帯式の血液ガス測定装置（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）を使用して、すべての代謝測定を行った。フローサイトメトリー分析は、培養中の１８０日後に、ＮＨＮＰ ＴＬＡが、親のＮＨＮＰ（２Ｄ）細胞集団と比較可能なレベルで、神経細胞の前駆細胞マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５−Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＣＤ  ９０−Ｔｈｙ−１およびＣＤ４９ｆ−α６ Ｉｎｔｅｇｒｉｎを発現したことを確認した。
【０１１５】
＜ＨＢＥ ＴＬＡ ３Ｄ細胞培養物＞ヒトの気管支および気管からの間葉細胞（ＨＢＴＣ）を、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を介して３のドナーから得た。ＬＬＣ−ＭＫ２およびＢＥＡＳ−２Ｂの上皮細胞（６）を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、バッチ間の統一性を提供するために、一次細胞の代わりに使用した。ＢＥＡＳ−２ＢおよびＨＢＴＣの細胞を、ヒトのフィブロネクチンでコーティングしたフラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）中の７％のウシ胎児血清（７）を有するＧＴＳＦ−２培地中で維持した。ベロー、ＨＥｐ−２およびＬＬＣ−ＭＫ２の細胞を、２ｍＭの可欠アミノ酸、１００ユニットのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、および２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を補足した、イーグル変法の最少必須培地中で３７°Ｃで成長させた。
【０１１６】
３Ｄ ＨＢＥ組織様構築物の培養物を構築するために、単層培養からのＨＢＴＣ細胞を、３５°Ｃで、５５−ｍＬの回転式の血管壁（ＲＷＶ）（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ）へと、またはタイプＩのコラーゲンコーティングしたシクロデキストランマイクロキャリア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）である、４−５ｍｇ／ｍＬのＣｙｔｏｄｅｘ−３マイクロキャリアによって、交互イオン磁気共鳴培養装置の培養ユニットへと、２×１０５細胞／ｍＬで播種した。培養物を、培地が変更される前に、最小の４８時間の間成長させた。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、ＨＢＴＣＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリア集合体が形成された後の４から６日間に、２×１０５細胞／ｍＬで播種した。その後、培地のおよそ６５％を、２０から２４時間ごとに取り替えた。代謝要求量が増加するとともに、ＧＴＳＦ−２培地中のグルコース濃度を、２００ｍｇ／ｄＬに増加した。組織様構築物の培養物を、回転式の細胞培養システム（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ）を使用して１乃至２ｍｍまでの直径のＲＷＶ中に、または凝集体懸濁液に対する適切な回転率を有する３５°Ｃでの交互イオン磁気共鳴培養装置の培養ユニット中に成長させた。細胞数を、１０分間３７°Ｃで、２０００Ｕ／ｍＬのタイプＩコラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）によって組織様構築物を処理した後に測定した。ＴＬＡ中の上皮マーカーの発現レベルは、２Ｄ ＢＥＡＳ−２ＢおよびＨＢＴＣの細胞より正常なヒト肺におけるレベルに非常に類似している。
【０１１７】
＜交互イオン磁気共鳴に晒したＨＢＥおよびＮＨＮＰ ＴＬＡ＞
ヒトの気管支上皮の（ＨＢＥ）組織様構築物のサンプルのセットおよび正常なヒトの神経前駆細胞（ＮＨＮＰ）の組織様構築物のサンプル（各セットは少なくとも３の回転式の血管壁（ＲＷＶ）に含まれる）を、所定の特性を備える交互イオン磁気共鳴の刺激領域にさらした。特性は、約〜１０Ｈｚの周波数、約５００ｍｓの波長、約０．１Ｔ／ｓ（１．０ｋＧ／ｓ）から約０．５０Ｔ／ｓ（５．０ｋＧ／ｓ）の間の増加するスルーレート、約０．５０Ｔ／ｓ（５．０ｋＧ／ｓ）から約２．０Ｔ／ｓ（２０．０ｋＧ／ｓ）の間の低下するスルーレート、各バースト後の約１０％の滞留時間、２０％をちょうど又はおよそ引いた約８０％の負荷サイクル、および結果として生じる約１００μＴ（１．０Ｇ）のＢ−Ｆｉｅｌｄ強度（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）を有する、二相の方形波を実質的に含む。実験を、〜１０Ｈｚで行った。参考用のために、地球磁場の周波数は、７．８３Ｈｚであり、したがって、実験は、バックグラウンド磁場とはかなり異なっている基準を満たしている。露出は、約１５−９０日間または約３６０−２１６０時間の間継続された。遺伝子の倍率変化の分析を、実施例１に記載されるように、交互イオン磁気共鳴刺激領域に晒されたＨＢＥおよびＮＨＮＰ ＴＬＡｎｏサンプルに対して行った。
【０１１８】
＜交互イオン磁気共鳴で成長させたＨＢＥおよびＮＨＮＰ ＴＬＡにおける遺伝子導入＞
ＨＢＥおよびＮＨＮＰの組織様構築物は、略同一の条件下で交互イオン磁気共鳴場にさらされたときに異なって反応したが、予想外に、両方のセットにおいて、ウイルス関連およびウイルスの癌遺伝子は活性化され、それらの発現レベルはアップレギュレートされた。差別的に調節された遺伝子のほとんどは、複製および増殖を可能にする、ヒト細胞へと吸収または導入されるウイルスの能力に関連している。表２は、交互イオン磁気共鳴によって開始された、アップレギュレートされたウイルス遺伝子をリストする。
【０１１９】
【表２−１】
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【０１２０】
【表２−２】
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【０１２１】
実施例４
＜ウイルス感染の三次元ＴＬＡモデル＞
＜ＮＨＮＰ ＴＬＡのｖ６３Ｇ／７０Ｒ感染＞
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）を、５％のＣＯ２（８）下の３７°Ｃで、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（シグマ・オールドリッチ（セントルイス（ＭＯ）））を補足した、ダルベッコの最少必須培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）中のヒトのメラノーマ細胞（ＭｅＷｏ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ．）において繁殖させた。野生型および組換え型のウイルスを、１／５（９）の比率で感染細胞と非感染細胞との共存培養によってＭｅＷｏ細胞上で継代した。ＮＨＮＰ培養物の感染のためのＭｅＷｏ細胞を、ＶＺＶの採取前に２の継代上でＧＴＳＦ２培地に適応させた。
【０１２２】
ＴＬＡ培養物（１０）に対する任意の感染したＭｅＷｏ細胞の移動を回避するために、無細胞のＶＺＶを、ＮＨＮＰ ＴＬＡ感染に使用した。簡潔に言うと、感染細胞を、感染の９６時間後（ｐ．ｉ．）に採取し、網状赤血球標準バッファー（１０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中で再懸濁した。細胞を、Ｄｏｕｎｃｅ（タイプＡ）均質化（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ， Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ， ＩＬ）によって破壊し、１５分間９００ｘｇでの遠心分離によって浄化した。
【０１２３】
ＮＨＮＰ組織様構築物を、２０ｍｌのＧＴＳＦ−２において３０分間、室温での吸収による０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で無細胞のＶＺＶによってＲＷＶ中で感染させた。その後、ＲＷＶを、新鮮なＧＴＳＦ−２／１０％のＦＢＳで充填し、３７°Ｃでの５％ＣＯ２雰囲気下で、加湿したインキュベーターに移した。ｐ．ｉ．の２４時間毎に、培地の５５−６５％を、１０％のＦＢＳを含有している新鮮なＧＴＳＦ−２と交換した。サンプルを、〜７０日間およそ１日おきに収集し、二重にタグ付けしたｖ６３Ｇ／７０Ｒ組換え型を利用するウイルスゲノムのコピーを決定した。
【０１２４】
二重にタグ付けしたｖ６３Ｇ／７０Ｒは、感染の０から１８日後（ｄｐｉ）のＶＺＶゲノムのコピーのおよそ５０倍の増加によって証拠づけられるように、ＮＨＮＰ組織様構築物を効率的に感染することができた。感染の１８日後、ＶＺＶゲノムのコピー数は、一定のままであり、これは、ウイルスが、デノボウイルスＤＮＡの複製と分解の間の平衡を確立したことを示している。感染した又は非感染の３Ｄ ＮＨＮＰ組織様構築物およびＭｅＷｏ培養物の代謝活性をモニタリングするために、グルコースを活用した。ｖ６３Ｇ／７０Ｒによる感染前後に、ベースラインのグルコース消費率を確立するために、最初に、各培養物を３９日間維持した。感染後、細胞溶解のＶＺＶ複製の結果として起こり得る細胞死が、微視的に明らかであったため（データは示されず）、グルコース活用はＭｅＷｏ細胞で急速に減少した。対照的に、ＮＨＮＰ組織様構築物でのグルコース取込みは、ＶＺＶ感染に対する反応として変更されず、これは、限られた（もしあるならば）細胞溶解のＶＺＶ感染が生じた。２７ｄｐｉでのｖ６３Ｇ感染した組織様構築物の共焦分析は、明らかにしたＮＨＮＰを感染させた、前駆細胞の神経細胞マーカーのＮｅｓｔｉｎおよび成熟した神経細胞マーカーのβ Ｔｕｂｌｉｎ−ＩＩＩが、ＧＦＰと共定位したことを明らかにし、これは、ＶＺＶが、これらの細胞において持続感染を優先的に確立したことを示している。
【０１２５】
ｖ６３Ｇ／７０Ｒ感染したＮＨＮＰ組織様構築物におけるＧＦＰ／ＲＦＰ比率は、培養中に少なくとも６９日間不変のままであり、これは、ＶＺＶゲノムが、ＮＨＮＰ組織様構築物で安定して維持されることを示唆している。さらに、共焦点の顕微鏡法は、ＯＲＦ６３−ｅＧＦＰおよびＯＲＦ７０−ｍＲＦＰの両方が、ｖ６３Ｇ／７０Ｒ感染したＮＨＮＰ組織様構築物の培養物中で発現されることを確認した。安定したウイルスゲノムは、ＮＨＮＰ組織様構築物において長時間保存される。
【０１２６】
＜ＨＢＥ ＴＬＡのパラミクソウイルス感染症＞
組織様構築物を、外側表面上の細胞に対する１の有効なＭＯＩを達成するために、ｗｔＰＩＶ３および弱毒ＰＩＶ３ウイルスの両方によって０．１のＭＯＩで接種した。１時間の室温でのウイルス吸収後、ＨＢＥ ＴＬＡ培養物を、ＤＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）で３回洗浄し、培地を与えた。すべての大気泡を、細胞（７）の剪断力を除去する回転の前に、ＲＷＶから取り除いた。培地のおよそ６５％を、４８時間ごとに取り替えた。ウイルス滴定のために、サンプルを、０、２、４、６、８、および１０日目に収集した。ＨＢＥ組織様構築物において、ｗｔＰＩＶ３の複製は、感染の６日目までに７．５ｌｏｇ１０ ｐｆｕ／ｍＬに接近し、一方で、弱毒ウイルスは、６日目に最大の５．５ｌｏｇ１０ ｐｆｕ／ｍｌに複製した。弱毒ウイルスにおける減少した複製は、３Ｄ ＨＢＥ組織様構築物における層から層へのより遅い進行が原因であり得る。少なくとも２倍のサイトカイン、ケモキネスおよびコロニー刺激因子の増加した分泌は、インターロイキン−１、−４、−６、および−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１、およびＧ−ＣＳＦに対して見られた。
【０１２７】
以下の参考文献が本明細書で引用される：
１． Ｖｅｒｔｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ８：３５６−３６５ （２００９）
２． Ｌｅｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ ３３：３４４−３５１ （１９９７）
３． Ｇｏｏｄｗｉｎ， Ｔ．Ｊ． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，８４６，８０７ （１９９８）
４． Ｇｏｏｄｗｉｎ， Ｔ．Ｊ． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ， ５，８５８，７８３ （１９９７）
５． Ｇｏｏｄｗｉｎ， Ｔ．Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｉｍｅ−Ｖａｒｙｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｆｉｅｌｄｓ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｃｅｌｌｓ． ＮＡＳＡ Ｔｅｃｈ Ｐａｐｅｒ， ＴＰ−２００３−２１２０５４ （２００３）
６． Ｋｅ ｅｔ ａｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３８：６０−６６ （１９８８）
７． Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２０２：１８１−１９２ （１９９３）
８． Ｇｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ４３：１５−２７ （１９７９）
９． Ｃｏｈｒｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７２２８−７２３８ （２００２）
１０． Ｇｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９：１９９−２０３ （１９７８）
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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