(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）複数のイミタンス関数および／またはその成分が、第１のシステムについての所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを比較し、ついで、電気化学的試験に使用するためのイミタンス関数またはその成分を選択する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において選択された前記イミタンス関数またはその成分についての少なくとも１つの値を決定するために、第２のシステムについての電気化学的試験工程を行い、ついで、選択された前記イミタンス関数と前記所望のパラメータとの間の定量的関係を使用することにより、所望のパラメータの値を決定する工程を含む、
電気化学的試験法。
【請求項２】
前記方法が、前記比較工程（ｉ）の前に、前記第１のシステムについて、前記複数のイミタンス関数および／またはその成分が、前記所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを決定する工程、ならびに、前記選択されたイミタンス関数と前記所望のパラメータとの間の前記定量的関係を決定する工程を含む、請求項１の電気化学的試験法。
【請求項３】
前記第１のシステムが、前記第２のシステムについての前記所望のパラメータを較正するのに適したシステムを提供する、請求項１または請求項２の電気化学的試験法。
【請求項４】
前記所望のパラメータが、キャリア媒体中における標的種の濃度である、請求項１から３のいずれか一項に記載の電気化学的試験法。
【請求項５】
前記イミタンス関数が、複素インピーダンス伝達関数、複素アドミタンス関数、複素係数伝達関数、複素誘電率伝達関数、複素キャパシタンス伝達関数、複素コンダクタンス伝達関数およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の電気化学的試験法。
【請求項６】
前記方法が、前記比較工程（ｉ）の前に、前記第１のシステムについての前記複数のイミタンス関数を決定する工程、各前記イミタンス関数についての少なくとも１つの成分を導出する工程を含み、および、前記比較工程（ｉ）において、各前記イミタンス関数の少なくとも１つの成分が、前記第１のシステムについての前記所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを比較する工程を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の電気化学的試験法。
【請求項７】
前記各イミタンス関数の少なくとも１つの成分が、前記イミタンス関数の実数部、前記イミタンス関数の虚数部、前記イミタンス関数の大きさおよび前記イミタンス関数の位相から選択される、請求項６記載の電気化学的試験法。
【請求項８】
前記方法が、前記第１のシステムについての第１のイミタンス関数を決定する工程、ついで、前記第１のシステムについて、前記第１のイミタンス関数から１つ以上の第２のイミタンス関数を生成する工程、ならびに、ついで、前記第１および１つ以上の第２のイミタンス関数および／またはそれらの成分が、前記所望のパラメータによってどのように変動するかを決定する工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の電気化学的試験法。
【請求項９】
前記第１のシステムについての前記第１のイミタンス関数から、前記１つ以上の第２のイミタンス関数を生成する工程が、位相ベクトル分析を使用する工程を含む、請求項８記載の電気化学的試験法。
【請求項１０】
前記方法が、前記第１のシステムについての第１のイミタンス関数を決定する工程であって、前記第１のイミタンス関数が、インピーダンス・イミタンス関数である工程、前記第１のシステムについての前記インピーダンス・イミタンス関数以外の１つ以上の第２のイミタンス関数を決定する工程、ならびに、ついで、前記第１および１つ以上の第２のイミタンス関数ならびに／またはそれらの成分が、前記所望のパラメータによってどのように変動するかを決定する工程を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の電気化学的試験法。
【請求項１１】
前記比較工程が、（ｉ）前記所望のパラメータにおける変化による前記イミタンス関数および／もしくはその成分の変動の大きさを比較する工程、ならびに／または、（ｉｉ）前記所望のパラメータとの前記イミタンス関数および／もしくはその成分の変動の相関を比較する工程を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の電気化学的試験法。
【請求項１２】
前記決定工程が、前記第１のシステムにおけるキャリア媒体中での種の濃度または前記第１のシステムにおける前記キャリア媒体中での種の濃度の対数のいずれかに対して、各前記イミタンス関数の成分をプロットする工程を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の電気化学的試験法。
【請求項１３】
前記電気化学的試験に使用するために前記イミタンス関数またはその成分を選択する工程が、（ｉ）前記所望のパラメータにおける変化量による最も高い変動を有するイミタンス関数を選択する工程；（ｉｉ）前記所望のパラメータによる最も高い相関を有するイミタンス関数を選択する工程；（ｉｉｉ）予め選択された閾値を上回る、前記所望のパラメータにおける変化量による変動を有するイミタンス関数を選択する工程、および／または、（ｉｖ）予め選択された閾値を上回る、前記所望のパラメータとの相関を有するイミタンス関数を選択する工程；または、それらの組み合わせから選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の電気化学的試験法。
【請求項１４】
前記第１および／または前記第２のシステムが、標的種を含むキャリア媒体、および、キャリア媒体と接触している作用電極を含み、場合により、前記所望のパラメータが、前記キャリア媒体中の標的種の濃度である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の電気化学的試験法。
【請求項１５】
前記作用電極が、その表面上に、前記標的種に結合するプローブ部分を有する、請求項１４記載の電気化学的試験法。
【請求項１６】
前記複数のイミタンス関数の比、または同じもしくは異なる前記複数のイミタンス関数の成分の比が、前記工程（ｉ）において、前記工程（ｉｉ）の前記電気化学的試験において使用するために選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の電気化学的試験法。
【請求項１７】
種々の前記イミタンス関数、それらの成分、またはそれらの比が、前記方法の前記工程（ｉ）において選択され、前記工程（ｉｉ）において、前記所望のパラメータの種々の範囲に使用される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の電気化学的試験法。
【請求項１８】
コンピュータプログラムであって、前記プログラムが、
複数のイミタンス関数および／またはその成分が、第１のシステムについての所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを比較する工程、および、ついで、イミタンス関数またはその成分を選択する工程を含む方法を実行する、
コンピュータプログラム。
【請求項１９】
前記比較工程が、（ｉ）前記所望のパラメータにおける変化による前記イミタンス関数および／もしくはその成分の変動の大きさを比較する工程、ならびに／または、（ｉｉ）前記所望のパラメータと前記イミタンス関数および／または関数の変動との相関を比較する工程を含む、請求項１７記載のコンピュータプログラム。
【請求項２０】
電気化学的試験に使用するために前記イミタンス関数またはその成分を選択する前記工程が、（ｉ）前記所望のパラメータの変化量よる最も高い変動を有するイミタンス関数を選択する工程；（ｉｉ）前記所望のパラメータとの最も高い相関を有するイミタンス関数を選択する工程；（ｉｉｉ）予め選択された閾値を上回る、前記所望のパラメータにおける変化量による変動を有するイミタンス関数を選択する工程、および／または、（ｉｖ）予め選択された閾値を上回る、前記所望のパラメータとの相関を有するイミタンス関数を選択する工程；または、それらの組み合わせから選択され得る、請求項１８または請求項１９記載のコンピュータプログラム。
【請求項２１】
前記比較工程の前に、前記プログラムが、第１のシステムについての第１のイミタンス関数から、前記第１のシステムについての１つ以上の第２のイミタンス関数を生成し、ならびに、ついで、前記第１のイミタンス関数および１つ以上の第２のイミタンス関数ならびに／またはそれらの成分が、前記所望のパラメータによってどのように変動するかを決定する、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のコンピュータプログラム。
【請求項２２】
電気化学的試験法に使用するための装置であって、前記装置が、請求項１から１７のいずれか一項に記載の電気化学的方法を行うのに適合している、
装置。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
生物学的サンプル中のタンパク質バイオマーカーの検出および定量化は、プロテオミクス、薬剤設計、疾患の予後および治療展開の中心に位置する。実行可能なタンパク質マイクロアレイの生成は、依然として困難である。現在の抗体ベースのシステム光学マイクロアレイは、通常、固定化された抗体に抗原が結合し、二次標識化抗体の使用により検出されるサンドイッチアッセイに基づいている。この方法は、感度はあるが、面倒であり、所望の抗原毎に特異的に標識化された二次抗体を必要とする。標識化プロトコルは、潜在的に不安定であり、時間がかかる場合もあり、高いバックグラウンドシグナルをもたらす場合がある。プラズモン共鳴または水晶振動子マイクロバランス（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ、ＱＣＭ）に基づく標識を含まない検出アッセイは、例えば、典型的にｎＭ検出限界を提供するが、洗練された非常に高価な装置部品の使用が必要となる。
【０００２】
電気化学的原理を使用する他の技術も、アッセイ用に開発されてきた。電極上に受容性の生体分子（典型的には、抗体、核酸またはペプチド）を制御可能に固定化し、標的タンパク質の結合事象を、測定可能な電気信号に変換することにより、アッセイが生成される。これを行う最も感度があり効果的な手段の１つは、インピーダンスによる方法である。この方法は、サポート電極への正弦波電圧の印加および得られた電流の測定によって行う。それは、非常に感度を有し得るが、インピーダンスの測定は、１つの界面の電気的パラメータのみのものであり、さらに、一般的には、「仮想等価回路」の適用によってのみ解釈される。各種の仮想等価回路が存在するが、（例えば、作用電極の表面における）電気化学的界面を近似するのに使用される。通常、最も適切な仮想等価回路が、データを正確に解釈するのに選択または考案されなければならない。これを成功させるには、適切な電気化学的界面における電気化学のかなりの程度の知識が必要である。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の目的は、理想的には、従来技術の方法における改善のための代替手段を提供することである。例えば、インピーダンスデータを使用するが、仮想等価回路を使用してデータを解釈する必要をなくし、溶液中の生体分子の濃度を非常に正確に算出することが可能であることが望ましいであろう。
【０００４】
本発明は、第１の態様において、
（ｉ）複数のイミタンス関数および／またはその成分が、第１のシステムについての所望のパラメータの変化によってどのように変動するかを比較し、ついで、電気化学的試験に使用するためのイミタンス関数またはその成分を選択する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において選択されたイミタンス関数またはその成分についての少なくとも１つの値を決定するために、第２のシステムについての電気化学的試験工程を行い、ついで、選択されたイミタンス関数と特定のパラメータとの間の定量的関係を使用することにより、所望のパラメータの値を決定する工程を含む、電気化学的試験法を提供する。電気化学的試験工程は、電気化学的アッセイを含んでもよいし、または、同アッセイでもよい。
【０００５】
本発明は、第２の態様において、複数のイミタンス関数および／またはその成分が、第１のシステムについての所望のパラメータの変化によってどのように変動するかを比較する工程、および、ついで、イミタンス関数を選択する工程を含む方法に使用するための、コンピュータプログラムを提供する。
【０００６】
本発明は、第３の態様において、電気化学的試験法に使用するための装置であって、装置が、第１の態様に基づく電気化学的方法を行うのに適合している、装置を提供する。
【０００７】
本発明者らは、電気化学的試験を行う場合、種々のイミタンス関数およびそれらの成分が、所望のパラメータが変化する場合に、異なる度合いに変動することを見出した。さらに、彼らは、標準的な電気化学的インピーダンス分光（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＥＩＳ）技術とは対照的に、所望のシステムをモデル化する試みにおいて、等価回路モデルを使用する必要がないことを見出した。種々のイミタンス関数またはそれらの成分は、所望のパラメータ（またはその対数）に対して、単純にプロットすることができ、所望のパラメータの範囲にわたる変動が決定され得る。本発明者らは、彼らが、イミタンス関数のライブラリを容易に生成するために、種々のイミタンス関数間の関係を使用し得ること、ならびに、それらが、所望のパラメータによってどのように変動し、ついで、試験法にそれを使用するかも見出した。方法は、種々の範囲のパラメータについての種々のイミタンス関数を使用することにより、アッセイの線形および／または動的範囲を拡張させることもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、伝達関数の定義の模式図を示す。関数Ｈ（ｓ）は、線形時不変システム（Ｌｉｎｅａｒ  Ｔｉｍｅ−ｉｎｖａｒｉａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＬＴＩＳ）に適用される。
【図２】図２は、複素イミタンス関数（中央）のセットおよびイミタンス関数成分のサブセット（右）を生成するために、信号がどのように処理され得るかを模式的に示す。
【図３】図３は、ＣＲＰ（Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）標的の種々の濃度における、調製された抗ＣＲＰ抗体界面の、重ねて表示したＮｙｑｕｉｓｔデータプロットを示す。
【図４】図４Ａ（左）は、界面Ｉについての対数目盛における、標的の濃度に対してプロットされたＲｃｔを示す（３つの独立したインピーダンスデータセットから取得した平均値のフィッティングから取得した値；エラーバーは、等価回路モデルに対するインピーダンスの適合に関連するエラーを表わす。）。図４Ｂ（右）は、対数の標的濃度によるインピーダンスの実数部の分散を示す；データは、１Ｈｚのサンプリング周波数で取得し、ＲｃｔおよびＺ’が最も相関される。
【図５】図５Ａ（左）は、代わりのＣＲＰ結合界面についての対数目盛における、標的の濃度に対してプロットされたＲｃｔを示す（３つの独立したインピーダンスデータセットから取得した平均値のフィッティングから取得した値；エラーバーは、等価回路モデルに対するインピーダンスの適合に関連するエラーを表わす。）。図５Ｂ（右）は、対数の標的濃度によるインピーダンスの実数部の分散を示す；データは、０．１Ｈｚのサンプリング周波数で取得し、ＲｃｔおよびＺ’が最も相関される。
【図６】図６Ａは、受容性界面についてのＣＲＰ濃度によるキャパシタンス・イミタンス関数の実数部の分散を示す；データは、１Ｈｚのサンプリング周波数で取得し、ＲｃｔおよびＺ’は、図８に示されるように、最も相関される。図６Ｂは、対数標的（ＣＲＰ）濃度に対するＹ”の検量線を示す。変動は、同じ標的の濃度範囲にわたって、〜４５％である。
【図７】図７は、１Ｈｚでの標的濃度の関数として、アプタマー界面についての位相変化を示す。
【図８】図８Ａは、種々の濃度の標的におけるＣＲＰ受容性界面の、重ねて表示したＢｏｄｅ複素インピーダンスプロットを示す。ここでは、（検量線から生じ得る）最適なサンプリング周波数は、１Ｈｚである。図８Ｂは、種々のＣＲＰ受容性界面の、重ねて表示したＢｏｄｅ複素インピーダンスプロットを示す。ここでは、最適なサンプリング周波数は、０．１Ｈｚである（右）。
【図９】図９は、標的濃度に対するＣ”／Ｃ’比関数の最大値の線形の検量線を示す。ピアソン係数の線形従属は、＞９８％である。Ｃ”／Ｃ’の比が物量単位を有さず、この関係の物理的解釈がその使用において不要であることにも留意されたい。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂはそれぞれ、無視してよい電位依存を示すＳＡＭ被覆された金電極上での電気活性を有するタンパク質フィルムのＢｏｄｅ複素インピーダンスの実数および虚数のダイアグラムにおける重ねて表示した電位エネルギーを示す。
【図１１】図１１は、電気化学的電位エネルギーの関数として、アズリン電気活性を有するタンパク質フィルムの、重ねて表示したＢｏｄｅ複素容量性（実数成分、左、虚数、右）ダイアグラムを示す（すなわち、飽和カロメル参照電極（Ｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｃａｌｏｍｅｌ  Ｒｅｆｗｅｒｅｎｓｅ、ＳＣＥ）に対して、−１００ｍＶから２５０ｍＶ）。
【図１２】図１２は、電気化学的に活性なタンパク質フィルムについての電位に対する酸化還元キャパシタンス（Ｃｒ）のプロットを示す。ここでは、プロットは、便宜上、ゼロに中心を置く。
【図１３】図１３は、本願明細書に記載のコンピュータプログラムの実施形態を模式的に説明する。
【図１４】図１４は、本願明細書に記載のコンピュータプログラムの更なる実施形態を模式的に説明する。
【図１５】図１５は、５０％血清に添加されたアルファシヌクレイン自己抗体に対するＭ”／Ｃ”のプロットを示す。このグラフは、以下の実施例３に記載された、行われた実験から生じる。
【図１６】図１６は、５０％血清に添加されたアルファシヌクレイン自己抗体に対するＺ”／Ｃ”、Ｍ”／Ｃ”およびＭ”／Ｙ”の組み合わせのプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
イミタンスおよび伝達関数
まず、イミタンスおよび伝達関数が、説明されるであろう。
【００１０】
本願におけるイミタンス関数は、電気化学的伝達関数である。特に断らない限り、イミタンス関数は、その実数部および虚数部の組み合わせであり、複素イミタンス関数とも呼ばれる。イミタンス関数の成分は、イミタンス関数の実数部、イミタンス関数の虚数部、イミタンス関数の大きさおよびイミタンス関数の位相を含み得る。イミタンス関数は、作用電極と対電極との間に、可変の、典型的には、正弦波の電圧または電流のいずれかを印加し、ついで、応答、すなわち、電流または電圧それぞれいずれかを測定することにより生成される。イミタンス関数は、印加された電圧もしくは電流と、得られた電流もしくは電圧それぞれとの関係を表わす。印加された電圧または電流は、所定の周波数により変動し、得られた電流または電圧は、典型的には、同じ周波数を有するが、異なる位相を有する。印加された電圧または電流と、得られた電流または電圧との間のこの位相差のために、関係は、複素数項、すなわち、実数部（または成分）および虚数部または成分で表現され得る。これは、伝達関数を参照して、以下により詳細に説明される。
【００１１】
伝達関数（Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ＴＦ）は、典型的には、信号処理、伝達理論および制御理論の分野内において、単入力−単出力フィルタ等のシステムの分析に使用されてきた。伝達関数は、線形時不変システム（ＬＴＩＳ）の入力と出力との間の関係における空間周波数または時間周波数に関する、数式的表現である。光学画像化装置については、例えば、それは、点拡がり関数（ゆえに、空間周波数の関数）のフーリエ変換、すなわち、視野内の点被写体による強度分布である。
【００１２】
線形性は、時間の周波数領域への変換を可能にする数学的制約であり、システムにおける摂動が、非常に小さくなければならず、応答の時不変性を意味する。時不変性の制約は、摂動中におけるシステムの定常状態の特性が維持されるべきである事実に関連する。実際に、線形性制約の適用を確保するために、小さな振動摂動（すなわち、可変電圧または電流）が、通常、信号取得中に使用される。
【００１３】
プロセスまたはシステムの伝達関数は、その動的挙動の特性である。フィンガプリントとしてのシステムの動的挙動を得るために、すなわち、（入力信号と出力信号との間の比における線形性により保証される）定常状態においてシステムを維持するのに、制約が課されなければならない。
【００１４】
図１は、伝達関数の定義を模式的に示す。この図において、Ｘ（ｓ）は、入力信号を表わす。Ｙ（ｓ）は、出力信号を表わす。Ｈ（ｓ）は、Ｙ（ｓ）を与えるためにＸ（ｓ）に適用される伝達関数である。Ｈ（ｓ）は、線形時不変システムにわたって適用される。
【００１５】
連続時間の入力信号ｘ（ｔ）および出力ｙ（ｔ）についてのその最もシンプルな形式において、伝達関数は、出力Ｙ（ｓ）に対する入力Ｘ（ｓ）のラプラス変換Ｌ｛｝の線形マッピングである。したがって、
【００１６】
【数１】
0006426081.tif 000002
【００１７】
である。Ｈ（ｓ）は、ＬＴＩＳの伝達関数であり、
【００１８】
【数２】
0006426081.tif 000003
【００１９】
である。
【００２０】
【数３】
0006426081.tif 000004
【００２１】
【数４】
0006426081.tif 000005
【００２２】
群遅れ（すなわち、伝達関数により導かれた正弦波曲線の包絡線の遅れの周波数依存量）が、角周波数ωに関する位相シフトの導関数を算出することにより見出される。
【００２３】
【数５】
0006426081.tif 000006
【００２４】
【数６】
0006426081.tif 000007
【００２５】
インピーダンス信号分析
【００２６】
【数７】
0006426081.tif 000008
【００２７】
【数８】
0006426081.tif 000009
【００２８】
Ｚ＊（ω）複素関数は、２つの構造成分に分解することができる。
【００２９】
【数９】
0006426081.tif 000010
【００３０】
Ｚ’およびＺ”はそれぞれ、インピーダンス伝達関数の実数部および虚数部（または実数成分および虚数成分）である。｜Ｚ｜は、絶対値として知られており、Ｚ’およびＺ”に数学的に関連する（｜Ｚ｜２＝Ｚ’＋Ｚ”）。
【００３１】
これらの項（Ｚ’およびＺ”）は、Ｎｙｑｕｉｓｔ線図に図として関連づけることができる。標準的なインピーダンス分析（電気化学的インピーダンス分光法（ＥＩＳ）としても公知）は、Ｚ”、Ｚ’、｜Ｚ｜の項のセットおよび関連する位相φを、これらの項のＮｙｑｕｉｓｔ線図またはＢｏｄｅ表現を使用して、報告する。φは、φ＝ｔａｎ−１（Ｚ”／Ｚ’）により、Ｚ’およびＺ”に数学的に関連づけられる。
【００３２】
実施形態では、印加されたａｃ電位の振幅、典型的には正弦波の形状における振幅は、１ｍＶから１００ｍＶの値でもよい。定常状態の電位は、任意の所望の電位でもよく、当業者により選択され得る。実施形態では、定常状態の電位は、（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して）少なくとも０．１Ｖの大きさを有し、負または正の電位であり得る。
【００３３】
従来技術の方法では、等価回路のアプローチを使用して、物理的な意味が導出したフィッティング項、例えば、キャパシタンスおよび抵抗（仮想「等価回路」の成分）に備わるように、データセットが、適合および処理されることがある。典型的には、これらの従来技術の方法では、解かれるのは、これらの項または関数（すなわち、Ｚ”、Ｚ’、｜Ｚ｜、φおよび回路成分）のみである。１フィッティングプロセス自体も、非常に不確実であり得る（例えば、Ｊ．Ｒ．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，ＩＭＰＥＤＡＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ：ＯＬＤ  ＰＲＯＢＬＭＳ  ＡＮＤ  ＮＥＷ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＳ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．３５，１０，ｐｐ．１４８３−１４９２，１９９０を参照のこと。同文献は、その内容全体が参照により本願明細書に組み込まれる。）。
【００３４】
ＥＩＳの上記の状況に基づく任意の知覚技術は、これらの制約に関連し、多くの場合、所定のハードウェア構成および仮想の結果の両方に関連する。
【００３５】
【数１０】
0006426081.tif 000011
【００３６】
本発明者らは、イミタンス関数のライブラリ全体およびそれらの関係が、実際に、等価回路フィッティングを用いる必要なく導出され得る（以下を参照のこと。）ことを見出した。彼らは、非常に特異的な界面変化に対して、一部のイミタンス関数が他のものより感度があることを見出した。このようなライブラリの取得および処理において、かなり有利であり、それは、１つのサンプリング関数に結び付けられること、および、従うべき最良の関数またはデータを適合する回路についての何か仮定しなければならないことを防止する。
【００３７】
イミタンス関数の決定
本発明において、イミタンス関数は、例えば、複素インピーダンス伝達関数（Ｚ＊と呼ばれる場合もある。）、複素アドミタンス関数（Ｙ＊と呼ばれる場合もある。）、複素伝達関数（Ｍ＊と呼ばれる場合もある。）、複素誘電率伝達関数（ε＊と呼ばれる場合もある。）、複素キャパシタンス伝達関数（Ｃ＊と呼ばれる場合もある。）、複素コンダクタンス伝達関数（σ＊と呼ばれる場合もある。）およびそれらの組み合わせから選択され得る。
【００３８】
インピーダンス・イミタンス関数およびその成分は、上記のように生成され得る。他のインピーダンス関数は、個々に決定され得る。すなわち、所望のシステム（例えば、本願明細書において、第１のシステムと呼ばれる。）における実験により、または、好ましくは、第１のイミタンス関数を決定し、ついで、第１のイミタンス関数から１つ以上の更なるイミタンス関数を生成することにより、直接取得され得る。これは、所望のパラメータ、例えば、溶液中における標的種の濃度についての、複数の既知の値について行われ得る。このことから、所望のパラメータによる複数のイミタンス関数およびその成分における変動が決定され得る。ついで、変動の性質が、比較されることができ、最も適切なイミタンス関数またはイミタンス関数成分が、所望のパラメータが既知でないが決定される必要がある試験工程において使用されるのに選択される。
【００３９】
【数１１】
0006426081.tif 000012
【００４０】
実施形態では、方法は、第１のシステムについての第１のイミタンス関数を決定する工程、ついで、第１のシステムについての第１のイミタンス関数から、例えば、位相ベクトル分析を使用して、１つ以上の第２のイミタンス関数を生成する工程、ならびに、ついで、第１および１つ以上の第２のイミタンス関数が、所望のパラメータによってどのように変動するかを決定または比較する工程を含んでもよい。システムについての第１のイミタンス関数の決定は、印加された可変電位または電流の分析から取得されることができ、印加された可変電位または電流と、得られた可変電流または電位の間のそれぞれの関係のその後の分析は、任意の従来の装置またはハードウェア、例えば、電気的インピーダンス分光計を使用して行われ得る。ついで、周波数応答分析（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＦＲＡ）が、第１のイミタンス関数を生成するのに使用され得る。この第１のイミタンス関数から、１つ以上の第２のイミタンス関数が、例えば、以下の表Ｉに示される関係を使用する、第１のイミタンス関数における数学的位相ベクトル分析を行うコンピュータプログラムを使用して生成され得る。
【００４１】
実施形態では、方法は、第１のシステムについての第１のイミタンス関数を決定する工程、ついで、第１のシステムについての第１のイミタンス関数から、例えば、位相ベクトル分析を使用して、１つ以上の第２のイミタンス関数を生成する工程、第１のアドミタンス関数についての少なくとも１つの成分および各１つ以上の第２のイミタンス関数についての少なくとも１つの成分を導出する工程、ならびに、ついで、第１のアドミタンス関数についての少なくとも１つの成分および各１つ以上の第２のイミタンス関数についての少なくとも１つの成分が、所望のパラメータによってどのように変動するかを決定または比較する工程、ならびに、場合により、電気化学的試験に使用するための成分を選択する工程を含んでもよい。電気化学的試験は、電気化学的アッセイ、例えば、キャリア媒体中の種の濃度を測定するアッセイでもよい。
【００４２】
実施形態では、方法は、第１のシステムについての第１のイミタンス関数を決定する工程であって、第１のイミタンス関数が、インピーダンス・イミタンス関数である工程、ついで、インピーダンス関数以外の１つ以上の第１のシステムについての第２のイミタンス関数を、例えば、位相ベクトル分析を使用して、第１のイミタンス関数から生成する工程、ならびに、ついで、第１および１つ以上の第２のイミタンス関数ならびに／またはそれらの成分が、所望のパラメータによってどのように変動するかを決定する工程、ならびに、場合により、電気化学的試験に使用するための成分を選択する工程を含んでもよい。
【００４３】
実施形態では、方法は、第１のシステムについての第１のイミタンス関数を決定する工程であって、第１のイミタンス関数が、複素インピーダンス（Ｚ＊）伝達関数である工程、ついで、複素アドミタンス関数（Ｙ＊と呼ばれる場合もある。）、複素係数伝達関数（Ｍ＊と呼ばれる場合もある。）、複素誘電率伝達関数（ε＊と呼ばれる場合もある。）、複素キャパシタンス伝達関数（Ｃ＊と呼ばれる場合もある。）、複素コンダクタンス伝達関数（σ＊と呼ばれる場合もある。）から選択される第１のシステムについての１つ以上の第２のイミタンス関数を、例えば、位相ベクトル分析を使用して生成する工程、ならびに、ついで、第１および１つ以上の第２のイミタンス関数ならびに／またはそれらの成分が、所望のパラメータによってどのように変動するかを決定する工程、ならびに、場合により、電気化学的試験に使用するための成分を選択する工程を含んでもよい。
【００４４】
本発明者らは、第１のイミタンス関数から、位相ベクトル分析を使用して、複数の他のイミタンス関数を生成し得ることを見出した。位相ベクトル分析は、任意の適切な計算手段、例えば、コンピュータプログラムを使用して行われ得る。種々のイミタンス関数間の位相ベクトルの関係は、以下の表Ｉに与えられる。
【００４５】
イミタンス関数の表（またはマトリクス）の内１つの関数が取得される場合、他のいずれの関数も、「イミタンス・マトリクス」において、以下に表にされた数学的操作により、容易に取得され得る。例えば、Ｚ＊は、測定中の周波数Ｚ＊（ｓ）の関数である。複素関数、Ｚ＊（ｓ）＝Ｚ’＋ｊＺ”は、各ωのサンプリング周波数についてのＺ’およびＺ”の表を生成する市販のＥＩＳ装置から取得され得る。これは、３つの列のデータ：ωｉ・・・ωｆ（第１の列）、Ｚ’ｉ・・・Ｚ’ｆ（第１の列）およびＺ”ｉ・・・Ｚ”ｆを含む表（またはＡＳＣＩＩファイル）を与える。ｉは、初期周波数であり、ｆは、最終的な周波数であり、ｉ−ｆは、実験における周波数範囲である。これらの列番号は、表に示される関係を使用して、表にされた他の関数を生成するために、数学的に容易に処理され得る。
【００４６】
【表１】
0006426081.tif 000013
【００４７】
ｓ＝ｊωおよびφ＝ｓＣｅ、Ｃｅ＝ε０ｘおよびｘ＝Ａ／ｌ。Ａは、（実験的に決定される）電極の有効面積であり、ｌは、（実験的に決定されるか、または、仮想される）電極被覆膜／単層の厚みであり、ε０は、自由空間の誘電率、８．８５４×１０−１２Ｆ／ｍである。このため、ｘは、幾何学的パラメータである。
【００４８】
上記表において、Ｚ＊は、複素インピーダンス伝達関数を示し、Ｍ＊は、係数伝達関数を示し、ε＊は、複素誘電率伝達関数を示し、Ｃ＊は、複素キャパシタンス伝達関数を示し、σ＊は、複素コンダクタンス伝達関数を示す。
【００４９】
【数１２】
0006426081.tif 000014
【００５０】
本発明者らは、表Ｉに示されるイミタンス関数は数学的に関連するが、作用電極表面での界面事象により誘導される際に分析された電流信号（または電位信号）における変化は、（実施例において説明されるように）一部は劇的に影響され、他は最少に影響され得ることを見出した。例えば、複素キャパシタンス関数は、全体的に異なる意味を有し、（同時に取得される）複素インピーダンス関数に対して、潜在的に異なる感度領域を有する。システムの１つまたは他の物理的局面のアクセスは、位相シフトおよび絶対値により決まる。言い換えれば、全ての関数および関連する物理的意味は、電圧／出力電流の位相シフトおよび絶対値の分析から導かれ得る。
【００５１】
一般的には、各イミタンス関数について上記のように、決定され得る成分のサブセット、すなわち、虚数部および実数部、絶対値ならびに関連する位相が存在するであろう。例えば、複素キャパシタンス・イミタンス関数Ｃ＊は、その虚数成分Ｃ”、その実数成分Ｃ’、絶対値｜Ｃ｜および関連する位相φに分解され得る。
【００５２】
本発明者らは、典型的に、特定の範囲にわたる所望のパラメータにおける変化に対して他のものより感度のある、１つのイミタンス関数またはイミタンス関数成分が存在することを見出した。所望のパラメータについての特定の範囲にわたって、１つの特定のイミタンス関数またはその成分が、最も感度があるが、他の範囲については、他のイミタンス関数またはその成分が、より感度がある場合がある。可変電位または電流を印加する作用電極の表面が、例えば、標的分子（検体とも呼ばれる）に特異的な１つ以上のプローブ分子を有するバイオセンサである場合、複数のイミタンス関数は、種々の濃度での標的分子に対するその露出の関数として生成され得る。種々の濃度にわたる種々のイミタンス関数およびその成分の変動が比較されることができ、最も適切、例えば、濃度における変動に対して最も感度があるか、または、同変動と最も高い相関を有する、イミタンス関数が選択され得る。イミタンス関数、その成分および所望のパラメータによるその比較の生成ならびに、最も適切なイミタンス関数の選択は、例えば、この方法を行い得るソフトウェアを含む装置において自動的に行われてもよい。
【００５３】
本発明者らは、作用電極（例えば、センサ界面でもよい。）での界面についての情報が、標準的な方式のインピーダンス分析よりも相当多くの取得され得ることを見出した。
【００５４】
本発明者らは、可変電位または電流それぞれの関数としての変調された電流または電位の測定が、所望のシステム（例えば、本願明細書において第１のシステムと呼ばれる）についての、成分のサブセットをそれぞれ有するイミタンス関数のライブラリ全体を生成するのに使用され得ることを見出した。任意の所定の電極における変化に対するこれらおよびその応答（例えば、認識事象）の物理的解釈は、以下の実施例において説明されるであろう。本発明者らは、この方法が自動化に適していることを見出した。したがって、装置は、所望のシステム（例えば、本願明細書に記載の第１のシステム）について、イミタンス関数および／またはその成分の決定、イミタンス関数および／またはその成分と所望のパラメータの変動との比較、ならびに、所望のパラメータが第２のシステムにおいて未知であるその後の電気化学的試験に使用するのに最も適切なイミタンス関数またはイミタンス関数成分の選択を実行し得る。第１のシステムは、典型的には、第２のシステムに適した較正システムを提供する。
【００５５】
方法は、
（ｉ）第１のシステムについての複数のイミタンス関数を決定し、複数のイミタンス関数および／またはその成分が、第１のシステムについての所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを決定または比較し、ついで、電気化学的試験に使用するためのイミタンス関数またはその成分を選択する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において選択されたイミタンス関数またはその成分についての少なくとも１つの値を決定するために、第２のシステムについての電気化学的試験工程を行い、ついで、選択されたイミタンス関数と特定のパラメータとの間の定量的関係を使用することにより、所望のパラメータの値を決定する工程を含み得る。
【００５６】
方法は、第１のシステムについての複数のイミタンス関数を決定する工程、各イミタンス関数についての少なくとも１つの成分を導出する工程、および、各イミタンス関数についての少なくとも１つの成分が、第１のシステムについての所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを比較する工程、および、ついで、電気化学的試験に使用され得る、イミタンス関数の１つの成分を選択する工程を含んでもよい。
【００５７】
実施形態では、方法は、複数のイミタンス関数および／またはその成分が、第１のシステムについての所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを比較する工程、および、ついで、電気化学的試験に使用するためのイミタンス関数またはその成分を選択する工程を含んでもよい。
【００５８】
実施形態では、方法は、第１のシステムについての第１のイミタンス関数を決定する工程であって、第１のイミタンス関数が、インピーダンス・イミタンス関数である工程、第１のシステムについてのインピーダンス・イミタンス関数以外の１つ以上の第２のイミタンス関数を決定する工程、ならびに、ついで、第１および１つ以上の第２のイミタンス関数および／またはそれらの成分が、所望のパラメータによってどのように変動するかを決定する工程、ならびに、場合により、電気化学的試験に使用するためのイミタンス関数またはその成分を選択する工程を含んでもよい。
【００５９】
好ましくは、複数のイミタンス関数を決定する工程は、電位または電流の複数の印加された周波数において行われ、イミタンス関数および／またはその成分を、所望のパラメータと比較する工程は、印加された各周波数のそれぞれにおいて行われる。その場合、方法は、所定の基準に基づくその後の電気化学的試験において、イミタンス関数またはイミタンス関数成分と共に使用するための周波数を選択する工程を含む。例えば、周波数およびイミタンス関数またはイミタンス関数成分は、それらが共に、所望のパラメータによる、イミタンス関数および／もしくはその成分における最も大きい変動、ならびに／または、所望のパラメータとのイミタンス関数および／もしくはその成分の変動における最も大きい相関を提供するように、選択され得る。
【００６０】
実施形態では、比較工程は、（ｉ）所望のパラメータにおける変化によるイミタンス関数および／もしくはその成分の変動度合いを決定または比較する工程、ならびに／または、（ｉｉ）所望のパラメータにおける変化とのイミタンス関数および／もしくは関数の変動の相関を決定または比較する工程を含む。
【００６１】
実施形態では、決定工程は、第１のシステムにおけるキャリア媒体中での種の濃度または第１のシステムにおけるキャリア媒体中での種の濃度の対数のいずれかに対して、各イミタンス関数の成分をプロットする工程を含む。
【００６２】
実施形態では、電気化学的試験に使用するためのイミタンス関数またはその成分を選択する工程は、（ｉ）所望のパラメータによる変化量によって最も高い変動を有するイミタンス関数を選択する工程；（ｉｉ）所望のパラメータとの最も高い相関を有するイミタンス関数を選択する工程；（ｉｉｉ）予め選択された閾値を上回る、所望のパラメータにおける変化量による変動を有するイミタンス関数を選択する工程、および／または、（ｉｖ）予め選択された閾値を上回る、所望のパラメータとの相関を有するイミタンス関数を選択する工程；または、それらの組み合わせから選択される。
【００６３】
実施形態では、方法は、所望のパラメータについての複数の値にわたって、第１のシステムに交流電位または交流電流を印加する工程、出力交流電流または出力交流電位それぞれに関する応答をそれぞれモニターする工程、ならびに、印加された交流電位または交流電流それぞれと、出力交流電流または出力交流電位との間の関係を使用して、所望のパラメータの各値についての複数のイミタンス関数および／またはその成分を算出する工程を含む。
【００６４】
交流電位および／または交流電圧の周波数は、１ｍＨｚから１ＭＨｚの範囲でもよい。
【００６５】
電気化学的試験法は、コンピュータ実行法でもよい。この場合、方法は、コンピュータを使用して行われる。コンピュータは、電気化学的試験を行うための装置、例えば、電気化学的インピーダンス分光計を制御し得る。コンピュータは、本願明細書に記載のように、決定工程、比較工程および選択工程を自動的に行い得る。
【００６６】
好ましくは、決定工程および／または比較工程において、方法は、仮想等価回路を使用しない。好ましくは、方法は、標的種を検出するための標識を含まない方法である。
【００６７】
態様では、本発明は、方法を行うための装置を実行および／または制御するためのコンピュータプログラムを提供する。
【００６８】
態様では、本発明は、コンピュータプログラムであって、プログラムが、
複数のイミタンス関数および／またはその成分が、第１のシステムについての所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを比較する工程、ならびに、ついで、イミタンス関数を選択する工程を含む方法を実行するプログラムを提供する。比較工程は、本願明細書に記載の通りでもよい。比較工程は、（ｉ）所望のパラメータにおける変化によるイミタンス関数および／もしくはその成分の変動度合いを比較する工程、ならびに／または、（ｉｉ）所望のパラメータとのイミタンス関数および／または関数の変動の相関を比較する工程を含んでもよい。電気化学試験に使用するためにイミタンス関数またはその成分を選択する工程は、所定の基準、例えば、（ｉ）所望のパラメータにおける変化量による最も高い変動を有するイミタンス関数を選択する工程；（ｉｉ）所望のパラメータとの最も高い相関を有するイミタンス関数を選択する工程；（ｉｉｉ）予め選択された閾値を上回る、所望のパラメータにおける変化量による変動を有するイミタンス関数を選択する工程、および／または、（ｉｖ）予め選択された閾値を上回る、所望のパラメータとの相関を有するイミタンス関数を選択する工程から選択される基準から選択され得る。
【００６９】
場合により、比較工程の前に、プログラムは、第１のシステムについての第１のイミタンス関数から、第１のシステムについての１つ以上の第２のイミタンス関数を生成し、ならびに、ついで、第１および１つ以上の第２のイミタンス関数および／またはそれらの成分が、所望のパラメータによってどのように変動するかを決定する。それは、例えば、上記表Ｉに与えられたイミタンス関数間の関係を参照して、上記のように行われてもよい。第１のイミタンス関数は、複素インピーダンス・イミタンス関数でもよく、第２のイミタンス関数は、複素アドミタンス関数、複素係数伝達関数、複素誘電率伝達関数、複素キャパシタンス伝達関数、複素コンダクタンス伝達関数およびそれらの組み合わせ（例えば、実施形態では、その実数成分および虚数成分の組み合わせ）から選択される。
【００７０】
コンピュータプログラムは、さらに、比較工程に基づいて選択されたイミタンス関数またはその成分についての少なくとも１つの値を決定するために、第２のシステムについての電気化学的試験工程を行い、ついで、選択されたイミタンス関数と所望のパラメータとの間の定量的関係を使用することにより、所望のパラメータの値を決定するための装置を制御するのに適合され得る。装置は、本願明細書に記載の通りでもよい。
【００７１】
コンピュータプログラムは、適切な媒体、例えば、他のハードウェアと共にまたは同ハードウェアの一部として供給される光学保存媒体または固体媒体上に保存／配置されてもよいが、他の方式、例えば、インターネットを介して、または、他の有線もしくは無線の遠距離通信システムにも配置されてもよい。
【００７２】
コンピュータプログラムの実施形態は、図１３に模式的に説明される。工程１３０１において、プログラムは、複数のイミタンス関数および／またはその成分が、第１のシステムについての所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを比較する。その後の工程１３０２において、プログラムは、イミタンス関数またはその成分を選択する。
【００７３】
コンピュータプログラムの更なる実施形態は、図１４に模式的に説明される。工程１４０１において、プログラムは、複数のイミタンス関数および／またはその成分が、第１のシステムについての所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを比較する。その後の工程１４０２において、プログラムは、イミタンス関数またはその成分を選択する。この実施形態では、プログラムは、工程１４０１の前に工程１４０３を含む。工程１４０３は、第１のシステムについての第１のイミタンス関数から、第１のシステムについての１つ以上の第２のイミタンス関数を生成し、ならびに、ついで、第１および１つ以上の第２のイミタンス関数ならびに／またはそれらの成分が、所望のパラメータによってどのように変動するかを決定する。
【００７４】
本発明は、さらに、電気化学的試験法に使用するための装置を提供する。装置は、本願明細書に記載の電気化学的方法を行うのに適合し、および／または、本願明細書に記載のコンピュータプログラムを実行するのに適合している。装置は、電気化学的インピーダンス分光計を含んでもよい。実施形態では、装置は、少なくとも１つのイミタンス関数、好ましくは、複素インピーダンス関数を測定可能な電気化学的インピーダンス分光計を含む。装置は、好ましくは、（ｉ）複数のイミタンス関数および／またはその成分が、第１のシステムについての所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを比較し、ついで、電気化学的試験に使用するためのイミタンス関数またはその成分を選択する；および（ｉｉ）工程（ｉ）において選択されたイミタンス関数またはその成分についての少なくとも１つの値を決定するために、第２のシステムについての電気化学的試験工程を行い、ついで、選択されたイミタンス関数と所望のパラメータとの間の定量的関係を使用することにより、所望のパラメータの値を決定するのに適合している。工程（ｉ）における比較および選択は、装置により自動的に行われてもよい。装置は、第２のシステムについての電気化学的試験工程を、自動的に行うのに適合していてもよい。装置は、さらに、比較工程（ｉ）の前に、第１のシステムについて、複数のインピーダンス関数および／またはそれらの成分が、所望のパラメータにおける変化によってどのように変動するかを決定する工程、および、選択されたイミタンス関数と所望のパラメータとの間の定量的関係を決定する工程を行うのに適合していてもよい。装置は、比較工程（ｉ）の前に、第１のシステムについての第１のイミタンス関数を決定する工程、および、ついで、第１のシステムについての第１のイミタンス関数から、例えば、位相ベクトル分析を使用して、１つ以上の第２のイミタンス関数を生成する工程、ならびに、ついで、第１および１つ以上の第２のイミタンス関数が、所望のパラメータによってどのように変動するかを決定する工程を行うのに適合していてもよい。実施形態では、第１のイミタンス関数は、複素インピーダンス関数であり、１つ以上の第２のイミタンス関数は、複素アドミタンス関数、複素係数伝達関数、複素誘電率伝達関数、複素キャパシタンス伝達関数、複素コンダクタンス伝達関数およびそれらの組み合わせ（例えば、それらの実数成分および虚数成分の組み合わせ）から選択される。
【００７５】
決定工程は、イミタンス関数、例えば、第１のイミタンス関数を取得するために、第１のシステムの電気化学的データの直接的な測定を含んでもよい。
【００７６】
装置が電気化学的インピーダンス分光計を含む場合、電気化学的インピーダンス分光計は、標準的な設計のものでもよい。電気化学的インピーダンス分光計は、作用電極、対電極および、必要に応じて、参照電極を含み得る。電気化学的インピーダンス分光計は、好ましくは、作用電極と対電極との間における電位を印加し、制御し、変動させるための手段、および、得られた電流を測定するための手段を含む。電気化学的インピーダンス分光計は、好ましくは、電位の制御および得られた電流の測定用のポテンシオスタットを含む。電気化学的インピーダンス分光計は、好ましくは、印加された電位および得られた電流から、インピーダンスデータを算出するための手段を含む。電気化学的インピーダンス分光計は、作用電極の電子移動抵抗を算出するための手段を含んでもよい。
【００７７】
特定の用途のためのイミタンス関数のスクリーニングおよび最適化
上記のように、本発明者らは、本発明の方法が装置上で自動化され得ることを見出した。したがって、所望のパラメータにおける変動についての最も適切なイミタンス関数またはイミタンス関数成分は、所望のシステム、例えば、本願明細書に記載の第１のシステムについて自動的に選択される。その後、このイミタンス関数は、選択されたイミタンス関数またはイミタンス関数成分の測定された値から、所望のパラメータについての値を決定するために、第２のシステムに使用される。方法は、広く適用可能であり、任意のＬＴＩ（Ｌｉｎｅａｒ  Ｔｉｍｅ−ｉｎｖａｒｉａｎｔ、線形時不変）感知または応答性表面をモニターするための、個々または多重化周波数応答プラットホーム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ、ＭＦＲＰ）に使用され得る。上記の複数のイミタンス関数は、所望のシステムについての任意の所定の初期電流−電圧データセットから、自動的に生成され得る。この関数について、虚数、実数、絶対値および位相が記録され得る。これは全て、ユーザの介入なしに（表面もしくは作用電極または最適な関数についての従来の仮定、または等価回路によらずに）、計算におけるプラグアンドプレイ概念に類似する方法において進行し得る。好ましくは、所定のシステムおよび所望のパラメータの変動についての方法を行う装置について、ソフトウェアが、（すなわち、複数の）イミタンス関数のライブラリを生成および／または比較し、所定の基準、例えば、所望のパラメータにおける変動に対して最も高い感度、および／または、所望のパラメータにおける変動との最も高い相関に基づいて選択される、イミタンス関数に対して装置を、自動的に較正するであろう。
【００７８】
最も適切なイミタンス関数、イミタンス関数成分またはこのような成分の組み合わせが、システムについての方法において選択された時点で、分析の周波数が最適化されるであろう。このため、その後のデータ取得が、非常により速くなるであろう（最適な周波数で取得される特定のデータのみが収集されるであろうためである。）。すなわち、全周波数領域のデータの要求は、較正およびイミタンス関数分析についての第１のスクリーニングにおいてのみ必要となる。本発明者らは、本願明細書に記載の方法および関連する態様を、優れたものでありで、現在の電気分析的手法における改善を表わすと考える。本発明者らは、方法が疾患マーカー検出に使用され得ると考える。この場合、受容性アプタマーまたは抗体が、例えば、種々の化学的手段により、作用電極上に固定化され、顕著に可変性の化学的および物理的組成の標的を検出するのに使用される。作用電極でのその後の界面変化は、容量性、インピーダンス、電流、位相、電荷移動抵抗または実際に、任意の他のイミタンス関数（もしくは成分またはそれらの組み合わせ）であり得る。典型的には、従来技術の方法、例えば、標準的な電気化学的インピーダンス分光法では、これらのパラメータの１つのみが、多くの場合、１つの周波数のみにおいて、優れた電気化学的知識を必要とするユーザによってアッセイされてきた。多くの場合、このアプローチは、失敗するか、または、１つの特定の表面形式／標的のみに限定される。最も感度のあるパラメータが、チップ表面において使用される表面化学および認識化学を非常に反映することが公知である。このため、単独のアプローチは、多くの状況において有効ではなさそうであるか、または、特に（種々の受容体による異なる方法において機能化された電極の配列を使用して、）複数のマーカーを多重化フォーマットにおいて同時に検出することを求めた場合に少なくとも最適化されそうにない。
【００７９】
本発明者らは、本方法および関連する態様が、多くの分野にわたってかなり強力な用途を有することと考える。方法は、例えば、生物学的標的分子の標識を含まない検出（免疫アッセイ）および基礎的な生物電気化学（および、このため、潜在的に酵素システムのバイオセンシング）に使用され得る。
【００８０】
本願におけるシステムという用語は、イミタンス関数を生成するために、電気化学的データを取得するのに使用される作用電極周囲の物理的環境を示す。好ましい実施形態では、第１のシステムは、第２のシステムについての所望のパラメータを較正するのに適したシステムを提供する。例えば、第１および第２のシステムは、制限されず、同じか、もしくは、実質的に同じタイプの電極、電極上に固定化されたプローブ部分から選択される１つ以上の共通性を有し得る。この場合、プローブ部分および／または電極は、実質的に同じか、もしくは、同じタイプのものであり、実質的に同じか、もしくは、同じタイプの標的種は、場合により、実質的に同じか、もしくは、同じタイプのキャリア媒体中に存在し得る。実施形態では、第１および第２のシステムの全てまたは実質的に全ての態様は、第１および第２のシステムについての所望のパラメータ、例えば、標的種の濃度における可能性のある差を除いて同じである。
【００８１】
実施形態では、第１および／または第２のシステムは、標的種を含むキャリア媒体および、キャリア媒体と接触している作用電極を含む。場合により、所望のパラメータは、キャリア媒体中の標的種の濃度である。作用電極は、その表面上に、標的種に結合するプローブ部分を有してもよい。
【００８２】
キャリア媒体は、気体状、液体状または固体状であり得る。
【００８３】
キャリア媒体は、液体状であることができ、標的種は、キャリア媒体中に懸濁および／または溶解され得る。標的種は、制限されず、タンパク質、ポリペプチド、抗体、ナノ粒子、薬物、毒物、有害ガス、有害化学物質、爆発物、ウイルス粒子、細胞、多細胞生物、サイトカインおよびケモカイン、生殖母細胞、小器官、脂質、核酸配列、オリゴ糖、代謝経路の化学中間体ならびに高分子から選択され得る。好ましい実施形態では、標的種は、生体分子、より適切には生体高分子、最も適切にはポリペプチドを含むか、生体分子、より適切には生体高分子、最も適切にはポリペプチドを主成分とするか、または、生体分子、より適切には生体高分子、最も適切にはポリペプチドからなる。
【００８４】
標的種がタンパク質である場合、タンパク質は、制限されず、天然のタンパク質、変性タンパク質、タンパク質フラグメントおよび原核生物的または真核生物的に発現されたタンパク質から選択され得る。タンパク質は、当該分野におけるその通常の意味を有し得る。最も好ましくは、「タンパク質」は、ポリペプチド分子を意味する。このようなポリペプチドは、グリコシル化；リン酸化等の修飾または他のこのような修飾を含んでもよい。
【００８５】
標的種が抗体である場合、抗体は、クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの１つ以上から選択され得る。
【００８６】
標的種がナノ粒子である場合、ナノ粒子は、制限されず、絶縁性、金属性または半導体性のナノ粒子の１つ以上から選択され得る。
【００８７】
標的種が薬物である場合、薬物は、制限されず、アルコール（例えば、エタノール）、アンフェタミン、硝酸アミル、ヘロイン、ケタミン、アナボリックステロイド、ＬＳＤ、溶剤、大麻、コカイン（例えば、塩酸コカインまたは「ｃｏｋｅ」）、タバコ、トランキライザー、クラック（すなわち、コカイン遊離塩基）、エクスタシーおよび／またはガンマヒドロキシ酪酸（ｇａｍｍｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ、ＧＨＢ）から選択され得る。または、一部の実施形態では、薬物は、医薬品でもよい。
【００８８】
標的種は、候補薬物、例えば、本発明を使用して特定の活性または特性について試験またはスクリーニングされ得る化学的または生物学的成分でもよい。
【００８９】
標的種が毒物である場合、毒物は、制限されず、動物、植物または細菌由来の１つ以上の毒物から選択され得る。
【００９０】
標的種がウイルス粒子である場合、ウイルス粒子は、制限されず、１つ以上の、ゲノムを含むウイルス粒子およびゲノムを含まないウイルス粒子から選択され得る。
【００９１】
標的種が細胞である場合、細胞は、制限されず、多能性前駆細胞、ヒトの細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マスト細胞、食細胞、好中球、好酸球、マクロファージ、内皮細胞）、ガン細胞（例えば、肝臓、頚骨、膵臓、大腸、前立腺、表皮、脳、乳房、肺、精巣、腎臓、膀胱のガンに由来するもの）、非ヒト由来の単細胞生物、藻類、菌類、細菌、植物細胞、虫卵、マラリア原虫およびマイコプラズマの１つ以上から選択され得る。
【００９２】
標的種が小器官である場合、小器官は、制限されず、核、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、リソソーム、食胞、細胞内膜、細胞外膜、細胞骨格、核膜、クロマチン、核マトリクスおよびクロロプラストの１つ以上から選択され得る。
【００９３】
標的種が脂質である場合、脂質は、制限されず、シグナル伝達脂質、構造脂質、リン脂質、糖脂質および脂肪酸の１つ以上から選択され得る。
【００９４】
標的種が核酸配列である場合、核酸配列は、制限されず、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｔＲＮＡの１つ以上から選択され得る。
【００９５】
標的種がオリゴ糖である場合、オリゴ糖は、制限されず、ヒト、動物、植物、菌類または細菌由来のオリゴ糖の１つ以上から選択され得る。
【００９６】
好ましい実施形態では、標的種は、タンパク質である。本発明の方法および他の態様が、タンパク質の検出または特定に使用されてもよい。
【００９７】
標的種は、特定の疾患を表示する、任意の抗原または検体でもよい。標的は、例えば、アンジオテンシンＩ変換酵素（ぺプチジル−ジペプチダーゼＡ）１；アディポネクチン；前進性グリコシル化終末産物特異的受容体；アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質；アンギオゲニン、リボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ  Ａファミリー，５；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；アポリポタンパク質Ｂ（例えば、Ａｇ（ｘ）抗原）；アポリポタンパク質Ｅ；ＢＣＬ２−関連Ｘタンパク質；Ｂ細胞  ＣＬＬ／リンパ腫２；補体Ｃ３；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２；ＣＤ１４，可溶性；ＣＤ４０，可溶性；ｃｄｋ５；Ｃ反応性タンパク質、ペントラキシン関連；カテプシンＢ；ジペプチジルペプチダーゼＩＶ；表皮成長因子；エンドグリン；Ｆａｓ；フィブリノゲン；フェリチン；成長ホルモン１；アラニンアミノトランスフェラーゼ；肝細胞成長因子；ハプトグロビン；ヒートショック７０ｋＤａタンパク質１Ｂ；細胞内接着分子１；インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）；インスリン様成長因子１受容体；インスリン様成長因子結合タンパク質１；インスリン様成長因子結合タンパク質２；インスリン様成長因子結合タンパク質３；インターロイキン１８；インターロイキン２受容体，アルファ；インターロイキン２受容体，ベータ；インターロイキン６（インターフェロン，ベータ２）；インターロイキン６受容体；インターロイキン６シグナルトランスデューサ（ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体）；インターロイキン８；アクチビンＡ；レプチン（肥満ホモログ、マウス）；プラスミノーゲンアクチベータ，組織；プロオピオメラノコルチン（アドレノコルチコトロピン／ベータ−リポトロピン／アルファ−メラノサイト刺激ホルモン／ベータ−メラノサイト刺激ホルモン／ベータ−エンドルフィン）；プロインスリン；レジスチン；セレクチンｅ（内皮接着分子１）；セレクチンＰ（顆粒膜タンパク質１４０ｋＤａ，抗原ＣＤ６２）；セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＥ（ネキシン、プラスミノーゲンアクチベータ阻害剤１型），メンバー１；血清／糖質コルチコイド調節キナーゼ；性ホルモン結合グロブリン；形質転換成長因子，ベータ１（カムラチ−エンゲルマン病）；ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤２；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー，メンバー１Ｂ；血管細胞接着分子１（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １、ＶＣＡＭ−１）；血管内皮成長因子；因子ＩＩ、因子Ｖ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＸＩ、因子ＸＩＩ、Ｆ／フィブリン分解産物、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体、フィブリノゲン、プラスミノーゲン、プロトロンビンおよびフォン・ヴィルブランド因子等から選択され得る。糖尿病に有用なマーカーは、例えば、Ｃ反応性タンパク質、グルコース；インスリン；ＴＲＩＧ；ＧＰＴ；ＨＳＰＡ１  Ｂ；ＩＧＦＢＰ２；ＬＥＰ；ＡＤＩＰＯＱ；ＣＣＬ２；ＥＮＧ；ＨＰ；ＩＬ２ＲＡ；ＳＣｐ；ＳＨＢＧ；およびＴＩＭＰ２を含む。
【００９８】
標的は、糖尿病をモニターするのに関連する標的でもよい。実施形態では、標的は、グルコース、インスリン、インターロイキン２受容体アルファ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ、ＩＬ２−ＲＡ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および糖化ヘモグロビン（ｇｌｙｃａｔｅｄ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、ＨｂＡｌｃ）から選択され得る。標的がグルコースである場合、プローブ部分は、例えば、ＧＤＨ−ＦＡＤアッセイの分子認識素子またはグルコース／ガラクトース結合タンパク質（ｇｌｕｃｏｓｅｓｕｒａｓｓｈｕｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、「ＧＧＢＰ」）から選択され得る（Ｓｃｈｏｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ  ２０８：２４７−２５３（１９８７））。標的がＩＬ−２ＲＡである場合、プローブ部分は、ＩＬ−２ＲＡに特異的なモノクローナル抗体を含んでもよいし、または、同抗体からなってもよい。
【００９９】
キャリア媒体は、例えば、ヒトまたは動物の対象から収集された体液サンプルを含んでもよい。体液サンプル中に存在し得る標的種は、代謝産物、例えば、グルコース、ラクトース、尿酸、アスコルビン酸、カテコールアミン、例えば、ノルエピネフリン、エピネフリンおよびドパミン、０２、イオン、例えば、ナトリウムおよびカリウム、ヒトの細胞全体、病原体、例えば、細菌、菌類、寄生虫およびウイルス粒子、金属イオン、例えば、亜鉛ならびにタンパク質バイオマーカー、例えば、炎症性サイトカインから選択され得る。
【０１００】
プローブ部分は、制限されず、生体高分子、アプタマー、ペプチドアプタマー、別の改変足場タンパク質の文脈において表わされる認識試薬、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、化学成分、潜在的な治療効果の化学成分、オリゴ糖、ペプチド、タンパク質および抗体の１つ以上から選択され得る。好ましくは、プローブ部分は、抗体、核酸およびペプチドの１つ以上から選択される。好ましくは、プローブ部分は、標的種に選択的に結合する。
【０１０１】
プローブ部分が抗体を含む場合、抗体は、クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの１つ以上から選択され得る。抗体は、好ましくは、標的種に選択的に結合する。
【０１０２】
実施形態では、第１および／または第２のシステムは、その上に固定化されたプローブ部分を有する作用電極を含む。実施形態では、第１および／または第２のシステムは、その上に固定化されたプローブ部分を有する複数の電極を含む。第１および／または第２のシステムのそれぞれは、複数の電極を含んでもよく、複数の電極は、配列されていてもよい。複数の電極のそれぞれは、好ましくは、個々にアドレス可能である。「個々にアドレス可能」とは、当該分野において公知の用語であり、配列の各電極または電極構造が、単独で、すなわち、配列の他の電極を同時に接続する必要なく、外部装置に電気的に接続され得ることを意味する。実施形態では、配列は、複数の標的種を検出可能でもよい。例えば、配列は、複数の電極を含み、それらのそれぞれが、その上にプローブ分子を有する。この場合、複数の電極の少なくとも２つ上のプローブ分子は、互いに異なる標的種に結合可能である。
【０１０３】
第１および／または第２のシステムのそれぞれは、配列した複数の電極を含んでもよい。好ましくは、配列は、少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１，０００個、より好ましくは少なくとも１０，０００個の電極を含み、それらのそれぞれは、個々にアドレス可能でもよい。
【０１０４】
場合により、第１のシステムにおいて、複数の作用電極が、それぞれ既知の濃度の標的種を含むキャリア媒体と接触して存在する。キャリア媒体が、各作用電極について同じであるが、各キャリア媒体中の標的種の濃度が、各作用電極について異なり、イミタンス関数および／またはその成分が、印加された電位または電流の予め選択された周波数において、各電極について決定される。これは、標的種の濃度における変動による、イミタンス関数および／またはその成分の変動の比較を可能にする。これは、標的種の濃度における変動による、イミタンス関数および／またはその成分の変動の比較を可能にするために、印加された電位または電流についての複数の周波数について行われ得る。
【０１０５】
本発明の方法および他の態様は、任意のスケールの電極に適用可能である。一部の実施形態では、小型電極の配列に特に有益である。一部の実施形態では、第１および／または第２のシステムは、５０μｍ以下、より好ましくは２０μｍ以下、より好ましくは１μｍ以下、より好ましくは５００ｎｍ以下、より好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは５０ｎｍ以下の直径（最も大きい寸法）を有する電極を含む。本文脈における直径は、電極が製作公差または他の検討事項により幾何学的に認識された形状が常に想定されない場合があるために、最も大きい寸法を示し得る。このため、非対称もしくはフィンガー形状または他の形状の電極について、「直径」は、「幅」または「最も大きい寸法」、適切には、電極が位置する基材面と平行な最も大きい寸法を意味すると解釈され得る。
【０１０６】
本発明の方法は、電極が密に間隔を置いた電極構造または電極配列構造に適用され得る。具体的には、電極間の最小距離（間隔）は、好ましくは１００μｍ未満、好ましくは５０μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、より好ましくは１μｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満、より好ましくは５０ｎｍ未満である。
【０１０７】
方法は、高密度の電極を有する電極構造または電極配列構造、例えば、制限されず、好ましくは１０個／ｃｍ２以上、より好ましくは１００個／ｃｍ２以上、より好ましくは１０００個／ｃｍ２以上、より好ましくは１００００個／ｃｍ２を超える電極密度を有する電極構造または電極配列構造に適用され得る。
【０１０８】
例えば、第１および／または第２のシステムにおいて、本願明細書における方法に使用される電極は、電気導電性の材料から形成される。好ましくは、これらの材料は、金属であるが、例えば、非金属、例えば、カーボンまたは半導体材料であることができる。金、銀、プラチナ、銅またはアルミニウム、特に金が好ましい。
【０１０９】
第１および第２のシステムは、典型的には、対電極および作用電極を含むであろう。作用電極は、対電極と同じまたは異なる種類の材料でもよい。参照電極も、第１および／または第２のシステムに存在してもよい。作用電極と対電極との間に印加される電位および作用電極と対電極との間でモニターされる電流は、当業者に理解されるであろうように、ポテンシオスタットにより印加および制御され得る。
【０１１０】
本発明の態様は、これから、下記の非限定的な実施例および添付の図面を参照して記載されるであろう。
【実施例１】
【０１１１】
（免疫アッセイ用途：生物的機能化されたトランスデューサ表面および疾患マーカーの標識を含まない検出）
伝統的なインピーダンス分光法アプローチ対イミタンス関数アプローチ
上記のように、臨床的に重要な標的分子の高感度検出は、電極表面上での適切な受容体の固定化、および、標的結合の関数としてのこの界面の電気的または電気化学的特徴をその後に図示することにより達成され得る。本発明者らは、ここで、一部のイミタンス関数が非常に感受性であることができ、標的のプローブを較正可能であるだけでなく、探知するための最良の関数が構造化された受容性界面および標的に非常に依存することを示す。
【０１１２】
特定（例えば、臨床的に重要な）標的に対する受容性界面を、表面化学と生物学的受容体（最も多くの場合、抗体またはアプタマー）の組み合わせを規定することにより生成し得る。ついで、ＥＩＳ分析において、ついで、このような界面のインピーダンス特性を、検量線の生成における標的濃度の関数としてスクリーニングする。本発明者らは、これから、このようなデータを評価する標準的な手段（すなわち、等価回路の使用による）が、不要であり、本質的に限界があるだけでなく、サンプリングしたイミタンス関数が基礎的な関数Ｚ＊の実数部である場合でも劣っていることも示すことにより開始する。
【０１１３】
全ての化学薬品を、特に断らない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＨＳ−Ｃ１１Ｈ２２−（ＥＧ）３−ＯＣＨ２−ＣＯＯＨを、Ｐｒｏｃｈｉｍｉａ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ、Ｐｏｌａｎｄから購入した。ＣＲＰを、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから購入した。抗ＣＲＰ（単一クローン性、ヤギ）抗体を、ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃからとした。新鮮に（機械的および電気化学的に）洗浄したＡｕ電極を、２００μｌのエタノールにおける２．５ｍＭ  チオール（ＨＳ−Ｃ１１Ｈ２２−（ＥＧ）３−ＯＣＨ２−ＣＯＯＨ）の溶液に浸漬し、１６時間機能させた。ついで、電極を、純粋なエタノール、ついで、脱イオン水において洗浄し、窒素下において乾燥させた。抗体の固定化を、標準的なＥＤＣ／ＮＨＳバイオコンジュゲーション化学；０．４Ｍ  ＥＤＣおよび０．１Ｍ  ＮＨＳの溶液を調製し、チオール上の末端カルボキシル基を活性化させている電極に３０分間付加させることにより達成した。ついで、表面を、１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４における１０μＭの抗体に浸漬し、１時間放置した。最終的に残ったＮＨＳエステルを、１Ｍ  エタノールアミン溶液により、５分間不活性化し、表面を、脱イオン水（１８．２Ｍオーム）において、徹底的に洗浄した。
【０１１４】
ＧＰＥＳおよびＦＲＡプログラムにより制御されるＦＲＡ２インピーダンスモジュールを備えるＡｕｔｏｌａｂ  モデルＰＧＳＴＡＴ１２ポテンシオスタットを、電気化学的測定に使用した。３つ電極設定を、全ての測定に使用した。設定は、直径１．６ｍｍの金の作用電極（面積０．０２ｃｍ−２）、プラチナメッシュの対電極およびＡｇ／ＡｇＣｌ／３Ｍ  ＫＣｌの参照電極からなる。ＥＩＳおよびＣＶ（サイクリックボルタンメトリ）測定を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４の支持電解質を含む、１ｍＭ  ［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−製の電解質中で記録した。ＣＶを、１００ｍＶｓ−１のスキャン速度で、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−０．１Ｖと０．５Ｖの間で行った。ＥＩＳ測定を、１ｍＭ  ［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−を含むＰＢＳ溶液中で、０．２５Ｖの固定電位において、５０ｍＨｚから１０ｋＨｚの周波数範囲で行った。使用した参照電極に対するプローブの形式的な還元電位を、ブランク電極におけるＣＶにより決定した。全ての測定を、三回反復で行った。
【０１１５】
生成した複素インピーダンスデータ（Ｚ＊）を処理して、Ｚ＊＝１／ｊωＣ＊、Ｃ”＝φＺ’およびＣ’＝φＺ”に基づくキャパシタンスの虚数部を取得した。この場合、φ＝（ω｜Ｚ｜２）−１および｜Ｚ｜は、Ｚ＊の絶対値である。キャパシタンスのスペクトルを、電荷移動抵抗における単層パラメータの影響、すなわち、電荷移動プロセスに対するＳＡＭの容量性の寄与の影響を決定するのに使用した。複素インピーダンスおよびキャパシタンスを表わすのにおいて、溶液抵抗Ｒｓの影響を無視した。その後のインピーダンス分析内において、ＳＡＭ被覆電極の界面キャパシタンスを、２つの直列キャパシタンス、単層のもの（Ｃｍ）および二重層のもの（Ｃｄｌ）によりモデル化した。この場合、Ｃｄｌ≫Ｃｍ（分析においてＣｍが優位であることを意味する。）。さらに、単層は、（ＤｅｂｙｅまたはＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅ公式論における）ＲｔおよびＣｔの寄与で構成される関連する極性項によって構成される。この充電プロセスおよびその関連するタイムスケールは、周波数領域において複素キャパシタンスの状態に直接分解される。図５を使用した等価回路モデル内でのその考察は、界面のより正確な分析を提供する。
【０１１６】
各測定間において、電極を、全ての非共有結合の相互作用を除去するために、ｐＨ２．５での１Ｍ  グリシン／ＨＣｌ溶液または０．６％ＥｔＯＨを含むＨ２Ｏにおける６ｍＭ  ＮａＯＨにより再生し、ＰＢＳで洗浄した。ＢＳＡを、界面が非特異的なタンパク質に対して受容性でないことを確認するために、ネガティブコントロールとして使用した。図３は、ＣＲＰ標的の種々の濃度における、調製された抗ＣＲＰ抗体界面について重ねて表示したＮｙｑｕｉｓｔデータプロットを示す。プロットは、複素インピーダンスＺ＊が、濃度および周波数の範囲にわたって、標的に応答することを示す。ここで示された全ての値は、３種類の電極にわたる測定から取得された平均値である。具体的には、図３は、臨床的に重要な標的であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の結合に対する、受容性界面の応答を示す。想定通りに、標的の結合は、インピーダンスの増加に関連することが証明される。Ｚ’またはＺ”成分の変化に対する度合いは、実験的なサンプリング周波数に依存する。
【０１１７】
図４Ａ（左）は、界面Ｉについての対数目盛における、標的の濃度に対してプロットされた電荷移動抵抗Ｒｃｔを示す（３つの独立したインピーダンスデータセットから取得した平均値のフィッティングから取得した値；エラーバーは、等価回路モデルに対するインピーダンスの適合に関連するエラーを表わす。）。図４Ｂ（右）は、ｌｏｇ標的濃度によるインピーダンスの実数部の分散を示す；（１Ｈｚのサンプリング周波数で取得したデータ、ＲｃｔおよびＺ’が最も相関される。）。両パラメータは、標的濃度の関数として、良好な依存性を提供可能であるが、Ｚ’は、１０％以下のエラーで、フィッティング手法を必要とすることなく取得される。ピアソン係数の線形従属は、両方の場合において、＞９６％であり、この周波数でのインピーダンスの実数部については、９８％である。関数の変動は、２５０ｎＭ  ＣＲＰ標的範囲にわたって、〜２５％である。
【０１１８】
サンプリングされたＺ＊に対する標準的な「Ｒａｎｄｌｅｓ」等価回路フィッティングの適用により、図４Ａに示されるように、標的ＣＲＰの存在の関数として、電荷移動抵抗Ｒｃｔの決定が可能となる。Ｒｃｔが標的に対する十分な応答を示し、検量線の生成に使用され得ることが証明されるが、その線形フィッティングは、著しい（〜１０％）エラーに関連する。明らかに、同等の検量線が、いずれかのイミタンス関数から、同じ生データを用いて生成され得る。図４Ｂ（右）において、検量線は、（事前の「等価回路」の適用の仮定なしに取得した）Ｚ’について表わされる。古典的に取得したＲｃｔパラメータよりも正確に、標的の存在を特に探知している。
【０１１９】
複素関数Ｚ＊およびそれ由来の実数成分Ｚ’をサンプリングし、これらのアッセイにおける等価回路の使用に用いない利点を、図５における異なる受容性表面によるＣＲＰ結合アッセイに再度示す。仮定の等価回路の適用から導出されるＲｃｔのフィッティングは、再度より高いフィッティングエラーに関連した。
【０１２０】
図５Ａ（左）は、代わりのＣＲＰ結合界面についての対数目盛における、標的の濃度に対してプロットされたＲｃｔを示す（３つの独立したインピーダンスデータセットから取得した平均値のフィッティングから取得した値；エラーバーは、等価回路モデルに対するインピーダンスの適合に関連するエラーを表わす。）。図５Ｂ（右）は、対数標的濃度によるインピーダンスの実数部の分散を示す；０．１Ｈｚのサンプリング周波数で取得したデータ、ＲｃｔおよびＺ’が最も相関される）。両パラメータの依存性は、１０％以内に相当する。ピアソン係数の線形従属は、両方の場合において、＞９６％であり、この周波数でのインピーダンスの実数部については、９８％である。関数の変動は、２５０ｎＭ  ＣＲＰ標的範囲にわたって、〜５０％である。
【０１２１】
イミタンス関数のより広い範囲にこの方法論を拡張することにおいて、本発明者らは、任意の所定の界面について、一部の関数が、他のものより特定の界面変化（例えば、標的分子の結合）を非常に良好に伝えることを見出した。Ｚ’関数により較正可能であることが以前に示されたＣＲＰ受容性界面において、例えば、我々は、Ｃ’関数が任意の感受性または較正可能な方法で、被検体について伝えないことを観察する。例えば、特定の結合事象により導かれる表面または変化についての以前の仮定によらない生データの位相ベクトル処理を使用する方法であるために、その用途は、使用される特定の界面（電極、表面化学、生物化学等）と無関係である。
【０１２２】
図６は、受容性界面についてのＣＲＰ濃度によるキャパシタンスの実数部の分散を説明する；１Ｈｚのサンプリング周波数で取得したデータ、ＲｃｔおよびＺ’は、図８に示されるように、最も相関される。関数の変動は、２５０ｎＭ  ＣＲＰ標的範囲にわたって、〜１４％である。対数標的濃度に対するＹ”の検量線。変動は、同じ標的濃度範囲にわたって、〜４５％である。
【０１２３】
一方、Ｙ＊複素関数の虚数項は、非常に高い応答性を有することが観察される（図６）。
【０１２４】
イミタンス関数の範囲にわたる感度のまとめを、同じ標的について調製された２種類の受容性界面（一方は、抗体に基づき、他方はペプチドアプタマーに基づく）について、以下の表ＩＩおよびＩＩＩに示す。関数性能および受容性被膜の両方による変動は、顕著なものである。
【０１２５】
【表２】
0006426081.tif 000015
【０１２６】
【表３】
0006426081.tif 000016
【０１２７】
最終的に、印加されたＶおよび測定されたＶとの間の位相オフセットが、良好な感知関数として機能し得ることが、別の方法の（Ｚ＊関数およびその後の等価回路分析のみに基づく）完全に標準的なＥＩＳアッセイによって、以前から示唆されてきた（Ｋｏ  Ｆｅｒｒｉｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．米国特許出願公開第２０１０／０２３４２３４号）。われわれがここで例示している受容性界面についてはこのケースではなく、実際に、（〜７％）位相変動が、サンプリングし得る多くの他のイミタンス関数の応答性による大きさにおいて、（より較正可能な方法において）大きく上回ることが証明される。
【０１２８】
図７は、１Ｈｚでの標的濃度の関数として、アプタマー界面についての相変化を説明する。
【０１２９】
まとめると、イミタンス関数の範囲をサンプリングする能力が、作用電極での界面変化を感度的にサンプリングする当業者の能力を最大化するのに強力であることが明らかである。一部は、高感度に所望の変化を探索し、一方、再現可能で較正可能な方法において、他のものは、実際には、界面の非常に広い範囲にわたって、この能力を全く発現しない。
【０１３０】
ここで、我々は、種々の受容体または標的に対して、一部は、他のものよりかなり感度があることを示す、より多くのイミタンス関数プロットを潜在的に追加し得る。
【０１３１】
分析範囲の拡張
種々のイミタンス関数が、適切に調製された界面において、種々のレベルの感受性により、標的結合プロセスに応答するであろう。それは、例えば、１つ関数が、較正可能な方法において非常に低いレベルの標的に応答し始め、ついで、飽和し、その後、反応しなくなる場合であり得る。この時点で、（より高いレベルの標的濃度における）更なる標的結合が、種々のイミタンス関数を使用して、潜在的にサンプリングされてもよい。この方法において、実験の分析範囲は拡張される。
【０１３２】
実験手法がＡＣ電圧トレースの印加において構築されるため、電圧印加の周波数は、別の非常に調節可能な実験的パラメータを形成する。我々は、サンプリング周波数が、その関数応答の度合いに対して重大な影響を有することを、以下に示す。
【０１３３】
実施形態では、種々のイミタンス関数、それらの成分またはそれらの比は、方法の工程（ｉ）において選択され、工程（ｉｉ）において、所望のパラメータの種々の範囲について使用される。
【０１３４】
比関数の使用
同じまたは異なるイミタンス関数内における実数部および虚数部の任意の比は、アッセイ表面の物理的サイズまたは面積、すなわち、強度的性質に無関係の関数を構成する。これにおける有意は、比分析的関数が製作変動（例えば、複数の単独のアッセイ電極または電極アレイの製造において本質的なもの）にほとんど無関係であるべきであるという事実である。これは、バッチ間の分散および変動係数を、劇的に低下させ得る。
【０１３５】
したがって、方法の実施形態では、イミタンス関数または同じもしくは異なるイミタンス関数の成分の比が、工程（ｉ）において、工程（ｉｉ）の電気化学的試験に使用するために選択される。場合により、比は、同じイミタンス関数の実数部および虚数部または、異なるイミタンス関数の成分、例えば、実数部および虚数部である。場合により、同じまたは異なるイミタンス関数は、複素インピーダンス伝達関数、複素アドミタンス関数、複素係数伝達関数、複素誘電率伝達関数、複素キャパシタンス伝達関数、複素コンダクタンス伝達関数から選択される。
【０１３６】
自動周波数最適化
上記のように、サンプリング周波数に対する任意の１つのイミタンス関数の応答は、Ｂｏｄｅプロットにまとめられ得る。図８に証明されるように、最適なサンプリング周波数は、使用されるイミタンス関数だけでなく、界面の特定の構成および化学的特徴によっても決まる。図８Ａにおいて、例えば、１Ｈｚが、Ｚ’に基づく検量線の構築における、一部の被覆電極に結合した標的を探索するのに最良の周波数であることが証明される。同じ標的に対して同等に、選択的に反応性を有するが、異なる受容体で調製された界面において、最適な周波数は、０．１Ｈｚである（図８Ｂ）。
【０１３７】
図８Ａは、異なる濃度の標的における、ＣＲＰ受容性界面を重ねて表示したＢｏｄｅ複素インピーダンスプロットを示す。ここでは、（検量線が生じ得る）最適なサンプリング周波数は、１Ｈｚである。異なるＣＲＰ応答性界面について、最適な周波数は、０．１Ｈｚである（右）。
【０１３８】
最適なサンプリング周波数は、自動化ソフトウェア手法による、イミタンス関数、界面および標的の任意の結合について取得され得る。これが一旦確立されれば、分析は、その特定の（最適化された）周波数で行われることのみを必要とする。
【０１３９】
イミタンス関数成分間の関係の使用
上記概説された方法は、表Ｉに列記された関数のマトリクスにのみに限定されるものではなく、イミタンス関数または導出された実数項および虚数項のほとんど「無制限」の組み合わせに当てはめることもできる。例えば、Ｃ＊伝達関数の実数および虚数（示さず）の成分は、前に言及したように知覚界面において、特異的なＣＲＰ標的にほとんど反応しないことが示されるが、ｔａｎδ関数として公知のＣ”とＣ’との（表ＩＩおよびＩＩＩ）の組み合わせは、効果的で、選択的に使用され得る（図９を参照のこと。）。この方法における関数比の使用において、標的濃度が対数的方法と対照的に、直線的に描かれることが、さらに顕著である。
【０１４０】
図９は、標的濃度に対するＣ”／Ｃ’比関数の最大値の線形な検量線を示す。ピアソン係数の線形従属は、＞９８％である。Ｃ”／Ｃ’の比が物理単位を有さず、この関係の物理的解釈がその使用において不要であることにも留意されたい。関数の変動は、２５０ｎＭ  ＣＲＰ標的範囲にわたって〜１２％である。
【０１４１】
まとめると、上記のイミタンス関数アプローチは、例えば、適切な受容性表面における標的の結合により生じるプローブ界面変化についての、広大で潜在的に（ソフトウェア）自動化された蓄積を、ユーザに提供する。生成した検量線のライブラリから、他のものより高感度であって、信頼でき、特定の濃度範囲により適したプローブが見出される場合があるであろう。イミタンス関数のライブラリのサンプリングを可能にすることにおいて、この提案は、エンドユーザの利益の代わりとしての事前の仮定なしに、電極表面を効果的にサンプリングする能力を教示する（および、このため、電極表面を感知する。）。
【実施例２】
【０１４２】
イミタンス関数を使用する新規な生物電気化学的分析
タンパク質および酵素の酸化還元活性部位により電子を交換する能力は、基礎的な生命維持プロセスを解明するだけでなく、酵素に基づいて導かれたバイオセンサの生成にも効果的に応用されてきた。グルコースのバイオセンサが、１つの具体的で非常に成功した例である。
【０１４３】
ここで、本発明者らは、複素キャパシタンス・イミタンス関数が、非常に高い精細な直下の電気化学的事象（すなわち、固定化した生体分子の表面とその下の電極表面との間の電子移動）にも使用され得ることを示す。これは、生体電子工学において特に効果的である。生体電子工学においては、（固定化されたタンパク質または酵素からの）ファラデー信号は小さく、標準的な電気化学的方法により解析するのは困難であり得る。このような界面において、固定化は、通常、介在する（支持する）自己組織化単分子膜上で行われる。タンパク質アズリンによりここで例示される方法論は、任意の表面に固定化された生体電気工学システムに等しく適用可能である。電極表面電位が一掃される場合のこの関数の大きさのスクリーニングにおいて、電気化学的半波の電位の決定、電子移動動力学および存在する分子密度の定量化に対して、直接的なアクセスを有する。
【０１４４】
１−ヘキサンチオール、１−オクタンチオール、１−デカンチオールおよび１−ドデンカンチオールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオールを、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｊａｐａｎから購入した。全て、更なる改質を行うことなく使用した。テトラブチルアンモニウム塩（過塩素酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩）、ＨＰＬＣ純エタノール、ジクロロメタンおよびアセトニトリルを、そのまま使用した（Ｓｉｇｍａ）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのアズリンは、Ｐｒｏｆ．Ｃａｎｔｅｒｓのグループ（Ｌｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＬ）により、親切に寄贈された。全ての溶液を、ＭｉｌｌｉＱ水（１８．２ＭΩ）で調製した。
【０１４５】
多結晶質の金のディスク電極（Ｇｏｌｄ  Ｄｉｓｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ、ＧＤＥ）（Ｃｙｐｒｅｓｓ  Ｇｏｌｄ、直径１ｍｍ）を、機械的および電気化学的研磨により洗浄し、ＨＰＬＣ純エタノールにおける１ｍＭ  チオール溶液に浸漬した（一晩、室温）。ついで、電極を、エタノールおよび水で洗浄し、窒素下において乾燥させた。（ヘキサンチオール、オクタンチオール、デカンチオール、ドデンカンチオール）の疎水性ＳＡＭ表面上へのアズリンの物理吸着を、ｐＨ７．０での２０ｍＭ  ＭＥＳバッファーにおける０．５ｍＭタンパク質の５μＬアリコートに、３０分間置くことにより取得した。ついで、そのように修飾した電極を、バッファーで十分洗浄し、分析用の電気化学的セルに浸漬させた。
【０１４６】
サイクリックボルタンメトリ（Ｃｙｃｌｉｃ  Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ、ＣＶ）およびインピーダンス測定を、ＡＤＣ７５０およびＦＲＡ（周波数応答分析）モジュールを備えるＡｏｕｔｌａｂポテンシオスタットＧＳＴＡＴ２０（Ｅｃｏｃｈｅｍｉｅ  ＮＬ）を使用して行った。サイクリックボルタンモグラムを、２つの方法間の比較の目的のためのみに取得した。単独のＣＶスイープも、ＥＩＳ分析の前にファラデーウインドウを予め規定するために行った（酸化還元電位は従来公知でない場合のみ必要とされる。）。インピーダンス実験についてのＡＣ周波数は、１０ｍＶの振幅を有する、１ＭＨｚから１０ｍＨｚの範囲であった。複素Ｚ＊（ω）（インピーダンス）関数を、物理的定義Ｚ＊（ω）＝１／ｊωＣ＊（ω）（ωは、角周波数である。）により、Ｃ＊（ω）（キャパシタンス）に変換した。ＣＶおよびＥＩＳスキャンを、ＧＤＥ、飽和カロメル参照電極（ＳＣＥ）および対電極としてプラチナゲージを含む、５ｍＬの１つの区画セルにおいて測定した。支持電解質として、２００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４およびＮａＯＨでｐＨ５．０に緩衝化された５ｍＭ  ＭＥＳを使用した。電気化学に使用される全ての溶液を、超純粋なアルゴンによるバブリングおよび実験を持続させるために電解質表面をパージすることにより脱酸素した。インピーダンスデータを、変調周波数を、０．１ｍＨｚから１０ＭＨｚの８０段階において変動させて、ＳＣＥに対して−２００ｍＶおよび９０ｍＶの固定電位を取得した。
【０１４７】
まず、我々は、このような生物工学的界面のインピーダンス応答が、電極電位に対して示強性であることを示す（図１０Ａおよび１０Ｂを参照のこと。）。図１０Ａは、Ｂｏｄｅ複素インピーダンスの実数におけるオーバーレイ電位エネルギーを示す。図１０Ｂは、無視してよい電位依存を示すＳＡＭ修飾された金電極上での電気活性を有するタンパク質フィルムの虚数ダイアグラムを示す。
【０１４８】
図１１Ａおよび１１Ｂは、電気化学的電位エネルギーの関数として、アズリン電気活性を有するタンパク質フィルムの、重ねて表示したＢｏｄｅ複素容量性（図１１Ａに実数成分、図１１Ｂに虚数成分）ダイアグラムを示す（すなわち、ＳＣＥ参照電極に対して、−１００ｍＶから２５０ｍＶ）。
【０１４９】
特に、複素イミタンス関数Ｃ＊（および、その後その実数および虚数の成分）を、電位の関数として分析する場合、サンプリング周波数の広い範囲にわたって、表面電位についての明白な変化が分解される（図１１）。ついで、インピーダンス由来の複素キャパシタンス・イミタンス関数は、電子移動のプロセスにおいて、高感度に報告する。電気化学が存在しない場合には、この依存性は消滅する。この方法における電気化学を研究するためのイミタンス関数Ｃ＊の使用は、前例がない。この「酸化還元キャパシタンス」（ここでは、Ｃｒと示す。）を、電極電位の関数としてより詳細に分析する場合、電気化学における報告に対する度合いは、明らかである（図１２）。電位におけるＧｕａｓｓｉａｎ依存性が、電気化学的な可逆性の電位でのＣｒ最大値により観察される。この曲線下の面積は、電極に配置される電気化学的に活性な材料の分量を直接的に報告する。
【０１５０】
図１２は、電気化学的に活性なタンパク質フィルムについての電位に対する酸化還元キャパシタンス（Ｃｒ）のプロットを示す。ここでは、プロットは、便宜上、ゼロに中心を置く。
【０１５１】
まとめると、本発明者らは、電気活性を有するフィルムと通じる新規な方法を示してきた。酸化還元タンパク質フィルムにより例示されるが（この場合、シグナル：ノイズの利点が特に有益である。）、方法は、任意の電気活性を有するフィルムに同様に適用可能であり、可逆性電位の容易な分解、電子移動動力学および分子被覆を可能にする。
【実施例３】
【０１５２】
線形範囲の拡張
本発明者らは、線形分析範囲、すなわち、アッセイにより提示された既存の範囲の拡張に大きな意義があると考える。彼らは、複数の解析関数の使用により、（一方が受容体−標的の結合親和力によって固定された）任意の所定の１つの受容性表面についての線形範囲を拡張する可能性を試験した。これを、（１つのＩＦおよび３つのＩＦそれぞれを使用して、）図１５および１６にそれぞれ説明する。
【０１５３】
図１５は、５０％血清に添加されたアルファシヌクレイン自己抗体に対するＭ”／Ｃ”のプロットを示す。
【０１５４】
図１６は、５０％血清に添加されたアルファシヌクレイン自己抗体に対するＺ”／Ｃ”、Ｍ”／Ｃ”およびＭ”／Ｙ”の組み合わせのプロットを示す。
【０１５５】
実施例３についての実験の詳細
受容性界面を、組換えヒトアルファ−シヌクレイン（Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、以前に記載されたように精製−Ｖ．Ｎ．Ｕｖｅｒｓｋｙ，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ，２００３，２１，２１１−２３４を参照のこと。）を含む、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）チオール  ＨＳ−Ｃ１１−（ＥＧ）３−ＯＣＨ２−ＣＯＯＨの自己組織化単分子膜（Ｐｒｏｃｈｉｍｉａ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ、Ｐｏｌａｎｄ）の共有結合修飾により生成した。共有結合修飾は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入）により達成された。超純水（１８．２ＭΩ／ｃｍ）を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステムから取得し、全体を通して使用した。Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭ）（ＰＢＳＴ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）を、ＰＢＳタブレット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、０．２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０を添加した水に溶解することにより調製し、０．２２μｍのメンブレンフィルタを使用してろ過した。全ての他の化学薬品を、分析グレードとした。電気化学的実験を、ＦＲＡ２モジュールを備えるＡｕｔｏｌａｂポテンシオスタット１２（Ｍｅｔｒｏｈｍ  Ａｕｔｏｌａｂ  Ｂ．Ｖ．）により行った。金のディスク作用電極（直径１．６ｍｍ、ＢＡＳｉ）、プラチナワイヤの対電極および銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ、１．０Ｍ  ＫＣｌで充填）の参照電極を備える従来の三電極システム（ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用した。全ての電位を、この参照電極に対して報告する。電気化学的インピーダンス分光（ＥＩＳ）スペクトルを、０．０５Ｈｚから１０ｋＨｚの周波数範囲において記録した。印加したサイン波電位の振幅を、０．２５Ｖでの直流電位設定による１０ｍＶとした（Ｅ０の酸化還元プローブを使用、１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−）。純粋なアルファ−シヌクレイン抗体を、広く、定量化した範囲（０．１ｎＭ−１２００ｎＭ）にわたって、５０％  希釈した（ＰＢＳＴ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）を含む）市販の血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。ついで、受容体修飾した電極を、さらに１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−を含むこれらの溶液において、室温で２０分間インキュベートした。ＥＩＳ応答を、同じインキュベーション溶液において記録した。界面選択性を最初に評価するために、ＢＳＡを使用し、同様に測定した。
【０１５６】
使用したバイオセンサを、０．５Ｍ  グリシン／ＨＣｌを含むフローセル（３ｍＬ／分の流量を有する容量１ｍＬ）を使用して、ＰＢＳＴ洗浄の前に１０分間再生した。Ｍ”、Ｃ”、Ｚ”およびＹ”の関数データを、先に詳細したように、生データから取得した。図１５および１６においてプロットされた全てのデータ点は、その標的濃度における３種類の受容体電極での繰り返しの平均である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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