(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一の特定細胞型の細胞、並びに少なくとも一の混同される細胞型の細胞を含む微視的な多細胞組織試料において複数の細胞型を可視化する方法であって、前記少なくとも一の特定細胞型の細胞及び前記少なくとも一の混同される細胞型の細胞の両方が第２の細胞マーカーを含み、少なくとも一の混同される細胞型の細胞は少なくとも一の特定細胞型には存在しない第１の細胞マーカーも含み、
ａ）少なくとも一の混同される細胞型の細胞、並びに少なくとも一の特定細胞型の細胞を含むことが判明している微視的な多細胞組織試料を提供する工程；
ｂ）工程ａ）の微視的な多細胞組織試料を、混同される細胞上の細胞マーカーに特異的に結合することができるが、前記少なくとも一の特定細胞型の細胞上の細胞マーカーには結合できない少なくとも一の抗体様リガンドの第１のカクテルを用いてインキュベートする工程であって、試料は、混同される細胞上の前記細胞マーカーと前記リガンドとの特異的結合の形成に有利な条件下で第１のカクテルを用いてインキュベートされ、その結果前記細胞の前記細胞マーカーと前記リガンドとの複合体が形成される工程；
ｃ）工程ｂ）で形成された複合体を、第１の検出酵素にコンジュゲートしている第１の検出抗体様リガンドの調製物を用いてインキュベートする工程であって、前記第１の検出抗体様リガンドは、前記第１のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合することができ、インキュベーションは、前記第１の検出抗体様リガンドと前記第１のカクテルの抗体様リガンドとの特異的結合の形成に有利な条件下で実行され、その結果前記第１の検出抗体様リガンドと工程ｂ）で形成された複合体との複合体が形成される工程；
ｄ）前記第１の検出酵素のための基質を含む第１の基質調製物を、工程ｃ）で形成された複合体に添加し、結果として得られる混合物を、検出可能なポリマーの形成に有利な条件下でインキュベートすることにより、前記微視的な多細胞組織試料の混同される細胞の内部又は近傍に検出可能な蓄積ポリマーを得る工程；
ｅ）前記特定細胞型上の細胞マーカーに特異的に結合することができる第１の一次抗体様リガンドの調製物を添加し、結果として得られる混合物を、前記細胞マーカーと前記第１の一次抗体様リガンドとの複合体の形成に有利な条件下でインキュベートする工程；
ｆ）工程ｅ）の結果得られる混合物に、蛍光色素にコンジュゲートしている第１の二次抗体様リガンドであって、前記第１の一次抗体様リガンドに特異的に結合することができる第１の二次抗体様リガンドの調製物を添加し、結果として得られる混合物を、前記第１の一次抗体様リガンドと前記第１の二次抗体様リガンドとの特異的結合の形成に有利な条件下でインキュベートする工程；
ｇ）未結合の二次抗体様リガンドを、例えば洗浄工程により除去する工程；
ｈ）結合した一次及び二次抗体様リガンドの複合体を化学的に固定化する工程；
ｉ）結果として得られた試料の細胞を、少なくとも一の蛍光色素で標識された抗体様リガンド調製物のグループに曝す工程であって、前記少なくとも一の蛍光色素で標識された抗体様リガンド調製物の前記グループの各調製物は、対象となる特定細胞型に関連付けられた固有の細胞マーカーに特異的に結合することができ、且つ固有の蛍光シグナルを送出することができる固有の蛍光色素を有する工程；
ｊ）未結合の蛍光色素で標識されたリガンドを、例えば洗浄工程により除去する工程；並びに
ｋ）方法が進行する間に、前記少なくとも一の特定細胞型及び前記少なくとも一の混同される細胞型を、一又は複数の蛍光色素から得られる蛍光シグナルを検出することにより、及び前記少なくとも一の混同される細胞型の周囲に形成されたブロッキングポリマーを検出することにより、可視化する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程ｂ）において、少なくとも一の抗体様リガンドの第２のカクテルが第１のカクテルと一緒に使用され、第２のカクテルの抗体様リガンドは、前記第１のカクテルのリガンドよりも混同される細胞型の他の細胞マーカーに特異的に結合することができ、工程ｃ）において、第２の検出抗体様リガンドの調製物が使用され、第２の検出抗体様リガンドは第２のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合することができ、第２の検出酵素を有し、工程ｄ）において、前記第２の検出酵素のための基質を含む第２の基質調製物が添加され、その結果第２のカクテルに結合する混同される細胞の近傍にさらなるポリマーが蓄積され、工程ｋ）において、前記さらなるポリマーの蓄積が検出される、請求項１に記載の可視化する方法。
【請求項３】
工程ｃ）の後、且つ工程ｄ）の前に以下の工程：
１）工程ｃ）の結果得られる混合物を、前記第１のカクテルより他の混同される細胞型の他の細胞マーカーに特異的に結合することができる抗体様リガンドの第２のカクテルを用いて、第２のカクテルのリガンドの前記他の細胞マーカーへの結合を可能にする条件下でインキュベートする工程；並びに
２）工程１）の結果得られる混合物を、第２のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合できる第２の検出抗体様リガンドであって、第２の検出酵素を有する第２の検出抗体様リガンドを用いてインキュベートする工程；
が実行され、
工程ｄ）において、前記第２の検出酵素のための基質を含む第２の基質調製物が添加され、その結果第２のカクテルに結合する混同される細胞の近傍にさらなるポリマーが蓄積され、工程ｋ）において、前記さらなるポリマーの蓄積が検出される、
請求項１に記載の可視化する方法。
【請求項４】
工程１）及び２）が、抗体様リガンドの第３のカクテル、第３の検出抗体様リガンド、及び第３の検出酵素のための基質を含む第３の基質調製物を用いて反復され、第３のカクテルの前記抗体様リガンドは、前記第１及び第２のカクテルより他の混同される細胞型の他の細胞マーカーに特異的に結合することができ、前記第３の検出抗体様リガンドは、第３のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合することができ、且つ第３の検出酵素を有し、前記第３の基質調製物は前記第３の検出酵素のための基質を含み、工程ｋ）においてさらなるポリマーの蓄積が検出される、請求項３に記載の可視化する方法。
【請求項５】
工程１）及び２）が、抗体様リガンドの第４のカクテル、第４の検出抗体様リガンド、及び第４の検出酵素のための基質を含む第４の基質調製物を用いて反復され、第４のカクテルの前記抗体様リガンドは、前記第１、第２及び第３のカクテルより他の混同される細胞型の他の細胞マーカーに特異的に結合することができ、前記第４の検出抗体様リガンドは、第４のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合することができ、且つ第４の検出酵素を有し、前記第４の基質調製物は前記第４の検出酵素のための基質を含み、工程ｋ）においてさらなるポリマーの蓄積が検出される、請求項４に記載の可視化する方法。
【請求項６】
第１の基質調製物から形成される蓄積ポリマーの色は暗色及び／又は不透明であり、その後に形成される蓄積ポリマーの色は徐々に明度及び／又は透明度を上げる、請求項３から５のいずれか一項に記載の可視化する方法。
【請求項７】
工程ｅ）〜ｋ）に使用される抗体様リガンド調製物の複数の対は、各々が、複数の特定細胞型の中から対象となる一の特定細胞型を検出するために使用され、且つ
対象となる特定細胞型に関連付けられた固有の細胞マーカーに特異的に結合できるリガンドを含む特定の一次抗体様リガンド調製物と；
前記特定の一次抗体様リガンドに特異的に結合できるリガンドを含む特定の二次抗体様リガンド調製物であって、二次抗体様リガンドが、固有の蛍光シグナルを送出することができる蛍光色素に共有結合している二次抗体様リガンド調製物と
を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の可視化する方法。
【請求項８】
検出酵素が、アルカリホスファターゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼといったペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｄ）において添加される基質が、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ベタゾイドＤＡＢ、Ｄｅｅｐ  Ｓｐａｃｅ  Ｂｌａｃｋ、Ｂａｊｏｒａｎ  Ｐｕｒｐｌｅ、Ｗａｒｐ  Ｒｅｄ、Ｆｅｒａｎｇｉ  Ｂｌｕｅ、バルカンファーストレッド、及びＶｉｎａ  ｇｒｅｅｎからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光色素が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０（登録商標）、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５（登録商標）といったＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ蛍光色素の群；Ｃｙ２（商標）、及びＣｙ７（商標）といったＣｙ蛍光色素；ＤｙＬｉｇｈｔ３５０（商標）、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８（商標）、ＤｙＬｉｇｈｔ５５５（商標）、Ｄｙｌｉｇｈｔ７５０（商標）といったＤｙＬｉｇｈｔ蛍光色素；ＴＲＩＴＣ、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）からなる群より選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
可視化工程ｋ）は、試料の一又は複数の画像を取得することにより実行される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
取得された画像は既知の原理によりデジタル化され、複合画像に合成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
混同される細胞及び特定細胞型を表すマーカーを含む少なくとも４つの異なる細胞マーカー又は非細胞構造が検出され、好ましくは少なくとも５つの異なる細胞マーカーが検出される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法を実行するための部品の入ったキットであって：
ａ）混同される細胞上の細胞マーカーに特異的に結合することができる少なくとも一の抗体様リガンドのカクテル；
ｂ）前記カクテルの抗体様リガンドに結合できる検出抗体様リガンド調製物であって、調製物の抗体様リガンドが検出酵素に共有結合している検出抗体様リガンド調製物；
ｃ）検出抗体様リガンドの検出酵素により触媒される反応に参画させるのに適した基質調製物；
ｄ）特定細胞型の細胞マーカーに特異的に結合する少なくとも一の一次抗体様リガンド調製物；
ｅ）共有結合した蛍光色素を含む少なくとも一の二次抗体様リガンド調製物であって、二次抗体様リガンド調製物の抗体様リガンドは一次抗体様調製物の抗体様リガンドに特異的に結合する、二次抗体様リガンド調製物；
ｆ）ｄ）及びｅ）の調整物を試料に化学的に固定化するための調製物；並びに
ｇ）少なくとも一の蛍光色素で標識された抗体様リガンド調製物のグループであって、前記少なくとも一の蛍光色素で標識された抗体様リガンド調製物のグループの各調製物が、特定細胞型に関連付けられた固有の細胞マーカーに特異的に結合できる、抗体様リガンド調製物のグループ
を含むキット。
【請求項１５】
ｈ）混同される細胞上の細胞マーカーに特異的に結合できる少なくとも一の抗体様リガンドの第２のカクテルであって、少なくとも一のリガンドが、ａ）のカクテルが結合するものより他の細胞マーカーに結合する、第２のカクテル；並びに
ｉ）第２のカクテルの抗体様リガンドに結合できる第２の検出抗体様リガンド調製物であって、検出酵素がｂ）の調製物の酵素とは異なる、第２の検出抗体様リガンド調製物
をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、免疫組織化学の分野、並びにコンピューターによる画像解析の分野に関する。特に、本出願は、組織学的組織試料から情報を抽出し、この情報をコンピューターによる画像解析に使用する方法を提供するものである。具体的には、本出願は、微視的な多細胞組織試料中の複数の細胞型を可視化する方法を提供する。本出願は、この方法を実行するための部品からなるキットも提供する。
【背景技術】
【０００２】
組織学的組織試料の分析は、診断目的、例えば、乳がんを診断するための乳房組織試料の分析や、研究目的、例えば、ぜんそく、アテローム性動脈硬化、又は炎症性大腸炎のような炎症状態における炎症性細胞型を研究するために、広く使用されている。
【０００３】
マーカー分子（即ち、抗原、典型的にはタンパク質）が抗原特異抗体により検出される免疫組織化学（ＩＨＣ）は、組織切片中の細胞を同定するために広く使用される。いくつかの細胞型の場合、同定は、単一の細胞特異性抗原の検出により行うことができる。しかしながら、組織細胞の免疫組織化学的同定の分野における大きな問題は、一のマーカー分子だけでは多数の細胞が同定できないという事実である。一の細胞型のための同定マーカーの一候補は、他の複数の細胞型上にも存在する可能性があり、このため適切な同定が不可能となっている。したがって、細胞特異性的なマーカーが利用できない細胞型の信頼性のある同定には、混同される細胞型を同定及び除外するための発見手段が必須である。理想的には、適切な同定の後、活性化マーカーを可視化するさらなるなＩＨＣ染色を用いて、又は遺伝子発現を可視化するためのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術により、同定された細胞の活性化ステータスを調査することが望ましい。
【０００４】
任意の疾患組織は、通常、細胞集団の変成した成分に関連付けられる。例えば、ぜんそくにおける炎症を起こした気道には、上皮細胞、腺細胞、血管細胞、神経などの、気道に結合した構造的細胞の変成成分が存在する。加えて、複数の種類の免疫細胞（即ち、白血球）が、炎症を起こした気道に入り込む。実際、多くの疾患において、組織中の病理学的（即ち、破壊的）変化は、一の細胞型によってのみ引き起こされているのではなく、複数の細胞型間の複合的相互作用により引き起こされている。したがって、疾患組織試料を調査するとき、多くの場合、複数の細胞集団及び組織構造を同時に可視化すること、又は、侵入するウイルス又は細胞外マトリックス成分のような非細胞構造と一緒に細胞集団を可視化することが望ましい。
【０００５】
組織中の細胞内含有物に関する情報は、連続的に切断されたセクションにおいてその時点で一の細胞型を染色することにより得ることができる。このアプローチにより、組織試料中の複数の細胞型の含有物をうまく見積もることができるが、分析される細胞型間の空間的関係（即ち、物理的関係）に関する詳細な情報は得られない。細胞間のクロストークの大部分は、密接でときに直接的な物理的接触を要するので、これは大きな欠点である。したがって、同じセクション内部の複数の細胞集団を可視化することが望ましい。
【０００６】
現在利用可能なＩＨＣ技術により、複数の色素原又は複数の免疫蛍光技術を用いて一セクション内で最大３種の細胞を染色することが可能である。しかしながら、一般的な手順では、主要な検出抗体の適切な組み合わせがないことに起因して、同時に２種類の細胞しか検出できないことが多い。
【０００７】
一組織セクションにおいて可視化できるマーカーの数を増加させるために、国際公開第２０１０／１１５０８９号に開示されているＳＩＭＰＬＥ技術、及びＭＥＬＣ技術（Schubert et al., Nature Biotechnology v. 24, pp. 1270-1278）のような新規の方法論的アプローチが開発された。パワフルではあるが、これら新規種類の技術は、主に共局在化の研究のために開発されたものであり、組織破壊的手順、即ち検出基の破壊を伴う手順か、又は検出分子標識された一次抗体の依存を伴う。後者の制限は、二次抗体の使用による染色感受性の従来的な増幅を除外し、従来的な組織切片中の多数の共通細胞マーカーの検出に対するこのようなアプローチの感受性を必要以上に低下させてしまう。更に、上記技術は主に共局在化研究のために開発されたものであるので、他の従来的な免疫組織化学的プロトコールと同様に、多数の同定マーカーが時に非対象細胞型上にも存在しうるという問題に対処していない。
【０００８】
単一の特異的マーカーが存在しない細胞型を適切に検出するための一アプローチは、事前のＩＨＣ検出及び検出色素原におけるカプセル化により混同される細胞型を除外することである。Andersson et al., Thorax 2009; vol. 64, pp. 297 - 305において、「the On Line Supplementary data」は、粘膜マスト細胞（ＭＣＴ、トリプターゼ陽性）及び結合組織マスト細胞（ＭＣＴＣ、キマーゼ及びトリプターゼ陽性）が、第１のＩＨＣ工程で茶色の色素原ＤＡＢによりキマーゼを検出し、第２の工程で赤色の色素原である新フクシンにより残りのキマーゼ陰性ＭＣｔ細胞を検出する二工程式手順により分離された、一のアプローチを開示している。組織切片中のＭＣｔ及びＭＣＴｃ集団を同定するために有用であるものの、主な欠点は、検出色素原により引き起こされる不透明な染色及び立体障害により、色素原にプセル化された細胞を更に調査することができないことである。したがって、試料中の複数の細胞マーカーの可視化を可能にする改良された柔軟な可視化方法に対する需要が存在する。特に、初回可視化後、後続の工程において特定の試料の対象細胞修理のさらなる細胞マーカーを検出することを可能にする非組織破壊的可視化方法に対する需要が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
上述の問題は、少なくとも一の特定の細胞型の細胞と少なくとも一の混同される細胞型の細胞とを含む微視的な多細胞組織試料において、複数の細胞型を可視化する方法を提供することにより本発明により解決される。この方法では、前記少なくとも一の特定細胞型の細胞及び前記少なくとも一の混同される細胞型の細胞の両方は第２の細胞マーカーを含み、少なくとも一の混同される細胞型の細胞は、少なくとも一の特定細胞型の細胞中には存在しない第１の細胞マーカーも含む。この方法は、
試料の細胞を、第１の細胞マーカーに特異的に結合する第１の分子検出手段であって、検出酵素を有する第１の分子検出手段に曝す工程；
前記第１の分子検出手段上の前記検出酵素により触媒される反応により、第１の細胞マーカーを有する混同される細胞の内部又は周囲にブロッキングポリマーを生成する工程；
試料の細胞を、蛍光色素を含む第２の分子検出手段に曝す工程であって、前記第２の分子検出手段は前記第２の細胞マーカーに特異的に結合する、曝す工程；
試料の細胞に結合していない第２の分子検出手段を除去する工程；並びに
方法が進行する間に、前記少なくとも特定細胞型及び前記少なくとも一の混同される細胞型を、第２の分子検出手段の蛍光色素から得られる蛍光シグナルを検出することにより、及び前記少なくとも一の混同される細胞型の周囲に形成されているブロッキングポリマーを検出することにより、可視化する工程
を含む。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、現在の需要と技術的限界を前提に、罹患している可能性のある組織中の細胞集団の、有意に改善された情報を提供する可視化方法を提供する。したがって、本発明は、対象の細胞集団が：１）適切に同定され；２）続いて例えば活性化マーカーについて染色され；且つ３）同じ組織切片中の他の細胞集団及び非細胞構造と一緒に可視化される新規の方法論的アプローチを提供する。理想的には、これら基準は別として、このような技術のいずれかが、試料の大きな切片全体を分析すること、及びマーキングされた個々の細胞について、組織中のそれらの空間座標、大きさ、及び形状パラメータなどの詳細情報を提供することができなければならない。
【００１１】
したがって、第１の態様において、且つその最も広い意味において、本発明は、少なくとも一の特定の細胞型の細胞と少なくとも一の混同される細胞型の細胞とを含む微視的な多細胞組織試料において、複数の細胞型を可視化する方法を提供し、この方法では、前記少なくとも一の特定細胞型の細胞及び前記少なくとも一の混同される細胞型の細胞の両方は第２の細胞マーカーを含み、少なくとも一の混同される細胞型の細胞は、少なくとも一の特定細胞型の細胞中には存在しない第１の細胞マーカーも含み、この方法は、
試料の細胞を、第１の細胞マーカーに特異的に結合する第１の分子検出手段であって、検出酵素を有する第１の分子検出手段に曝す工程；
前記第１の分子検出手段上の検出酵素により触媒される反応により、第１の細胞マーカーを有する混同される細胞の内部又は周囲にブロッキングポリマーを生成する工程；
試料の細胞を、蛍光色素を含む第２の分子検出手段に曝す工程であって、前記第２の分子検出手段は前記第２の細胞マーカーに特異的に結合する、曝す工程；
試料の細胞に結合していない第２の分子検出手段を除去する工程；並びに
方法が進行する間に、前記少なくとも一の特定細胞型及び前記少なくとも一の混同される細胞型を、第２の分子検出手段の蛍光色素から得られる蛍光シグナルを検出することにより、及び前記少なくとも一の混同される細胞型の周囲に形成されているブロッキングポリマーを検出することにより、可視化する工程
を含む。
【００１２】
本明細書の開示において、用語「分子検出手段」は、特定の細胞マーカーに特異結合できる第１の部分と、検出可能な反応を生成することができる第２の部分とを含む二機能性アグリゲート又はコンジュゲートに関する。本発明では、多数の異なる種類の分子検出手段を使用することができ、例えば、免疫組織化学に使用するのに適したこのような分子検出手段は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び酵素組織学法である。
【００１３】
典型的には、特定の細胞マーカーに特異結合できる前記第１の部分は、抗体若しくはその断片、又はＤＮＡ分子若しくはＲＮＡ分子といった核酸分子、又はＰＮＡのような核酸誘導体である。典型的には、検出可能な反応を生成できる前記第２の部分は、ブロッキングポリマーの形成を触媒することができる酵素、又は適切な励起光により誘導されると何らかの種類の検出可能な蛍光シグナル、典型的には蛍光色素を生成することができる化合物である。
【００１４】
分子検出手段は、その最も単純な実施態様では、酵素又は蛍光色素といった第２の部分が結合している抗体又は核酸分子といった第１の部分からなっていてよい。代替的に、適切な分子検出手段は、第１のエンティティ、典型的には特定の細胞マーカーに特異的に結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体、第２のエンティティ、典型的には第１のエンティティに特異的に結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体、及び第２のエンティティに結合した第３のエンティティを含む複合体でもよく、この場合前記第３のエンティティは、ブロッキングポリマーの形成を触媒できる酵素、又は適切な励起光によって誘導されると、何らかの種類の検出可能な蛍光シグナル、典型的には蛍光色素を生成できる化合物である。
【００１５】
本明細書の開示において、「化学的に固定化する」とは、分子検出手段を、分子検出手段が特異的に結合した試料に共有結合させることにより、分子検出手段が洗い流されることを防ぐための方法に関する。典型的には、架橋結合分子が試料並びに分子検出手段と反応する。当業者であれば、適切な架橋分子及び方法に詳しい。
【００１６】
本明細書の開示において、用語「可視化」は、ブロッキング及び他の色原体ポリマー、並びに蛍光シグナルが明瞭に見える少なくとも一の試料画像を生み出すことに関する。典型的には、可視化は、二工程で実行され、まず染色された色原体の明視野顕微鏡画像を生成する。好ましくは、画像はデジタル写真である。次に、波長特異的なフィルターを用いて画像が捕捉される免疫蛍光顕微鏡検査法により、各検出蛍光色素が可視化される。ここではまた、取得される画像は、好ましくは、限定されないが、デジタル画像である。各マーカーについて、画像のデジタルスティッチングによる隣接又は重複する組織エリアの画像の組合せにより、分析エリアの解像度を上げることができる。当業者であれば、このような技術を認知している。複合画像の生成に使用される画像は、いくつかの実施態様では、本発明の可視化方法を実行するときにいつでも取得することができる。コンピューターによる画像解析を使用して、デジタル写真からの情報は、各マーカーについて生データを抽出するために使用される。典型的には、切片の陽性マーカーエリアは、その特異的な色及び強度値によって検出及びセグメント化される。陽性細胞がセグメント化されたら、ｘ、ｙ座標、形状、及び強度の情報は、既知の方法により、コンピューターによる画像解析のフィールド内において容易に抽出することができる。セグメント化された細胞は、分析された全マーカーに関するデータを合成することにより分析対象細胞に関する情報がこれまでにないような詳細にわたって提示される、新規種類の対話型複合画像を生成するためにも使用される。典型的には、マーカーデータは、背景組織構造を表示するテンプレート画像中にペーストされる。当業者であれば、生成されたマーカーエリアに関する生データを使用して、分析される活性化マーカーを発現する対象の細胞集団の割合、並びに可視化された細胞の空間的関係を計算することができることを理解するであろう。
【００１７】
第１の態様の好ましい実施態様では、本発明は、微視的な多細胞組織試料中の複数の細胞型を可視化する方法を提供する。この方法は：
ａ）少なくとも一の混同される細胞型の細胞と、少なくとも一の特定細胞型の細胞とを含むことが判明している微視的な多細胞組織試料を提供する工程；
ｂ）工程ａ）の微視的な多細胞組織試料を、混同される細胞上の細胞マーカーに特異的に結合することができるが前記少なくとも一の特定細胞型の細胞の細胞マーカーには結合できない少なくとも一の抗体様リガンドの第１のカクテルを用いてインキュベートする工程であって、試料は、混同される細胞上の前記細胞マーカーと前記リガンドとの特異結合の形成に有利な条件下で第１のカクテルを用いてインキュベートされ、その結果前記細胞マーカーと前記リガンドとの複合体が形成される工程；
ｃ）工程ｂ）で形成された複合体を、第１の検出酵素にコンジュゲートしている第１の検出抗体様リガンドの調製液を用いてインキュベートする工程であって、前記第１の検出抗体様リガンドは、前記第１のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合することができ、インキュベーションは、前記第１の検出抗体様リガンドと前記第１のカクテルの抗体様リガンドとの特異結合の形成に有利な条件下で実行され、その結果前記第１の検出抗体様リガンドと工程ｂ）で形成された複合体との複合体が形成される工程；
ｄ）前記第１の検出酵素の基質を含む第１の基質調製物を、工程ｃ）で形成された複合体に添加し、結果として得られる混合物を、検出可能なポリマーの形成に有利な条件下でインキュベートすることにより、前記微視的な多細胞組織試料の混同される細胞の内部又は近傍に検出可能な蓄積ポリマーを得る工程；
ｅ）前記特定細胞型上の細胞マーカーに特異的に結合することができる第１の一次抗体様リガンドの調整物を添加し、結果として得られる混合物を、前記細胞マーカーと前記一次抗体様リガンドとの複合体の形成に有利な条件下でインキュベートする工程；
ｆ）蛍光色素にコンジュゲートしている第１の二次抗体様リガンドであって、前記第１の一次抗体様リガンドに特異的に結合することができる第１の二次抗体様リガンドの調整物を、工程ｅ）の結果得られる混合物に添加し、結果として得られる混合物を、前記第１の一次抗体様リガンドと前記第１の二次抗体様リガンドとの特異結合の形成に有利な条件下でインキュベートする工程；
ｇ）未結合の二次抗体様リガンドを、例えば洗浄工程により除去する工程；並びに
ｈ）方法が進行する間に、前記少なくとも一の特定細胞型及び前記少なくとも一の混同される細胞型を、一又は複数の蛍光色素から得られる蛍光シグナルを検出することにより、及び前記少なくとも一の混同される細胞型の周囲に形成されたブロッキングポリマーを検出することにより、可視化する工程
を含む。
【００１８】
本明細書の開示において、用語「微視的な多細胞組織試料」は、顕微鏡に基づく可視化技術により検査できる多数の細胞を含む任意の組織学的組織試料に関し、この場合、試料の細胞は細胞の細胞マーカーを特異的リガンドに曝すことにより検査できる。
【００１９】
本明細書の開示において、用語「細胞型」及び「特定細胞型」は、その最も広い意味において、微視的な多細胞組織試料中の任意の細胞型に関する。しかしながら、「特定細胞型」は、典型的には、組織試料中に存在しうるがその実質的な部分を構成しない細胞型である。
【００２０】
本明細書の開示において、用語「混同される細胞」は、対象の特定の細胞型と同じ細胞マーカーにより部分的に特徴づけられ、対象の細胞型より組織試料中において多く又は少なく発生しうる細胞に関する。本発明によれば、特定の試料の混同される細胞は、蛍光検出を用いて、特定細胞型を検出する前に、ポリマー形成により検出することにより除外される。
【００２１】
本明細書の開示において、用語「調製物」は、特定成分を含有する組成物、典型的には緩衝水溶液に関する。
【００２２】
本明細書の開示において、用語「抗体様リガンド」は、抗体、抗体断片、又は抗体模倣物に関する。適切な抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であるが、「単一特異的」なポリクローナル抗血清も含みうる。適切な抗体断片には、限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｖ断片、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｏｄｉｅｓ）として知られる抗体重鎖可変ドメインの６１−残基サブドメイン（Pessi et al., Nature 362:367-369 (1993）、ここで言及したことによりその全体を本明細書に包含する）、並びにドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Holt et la., Trends Biotechnol. 21:484-90 (2003)、ここで言及したことによりその全体を本明細書に包含する）が含まれる。これら抗体断片の多くは、J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 98-118 (1984)（ここで言及したことによりその全体を本明細書に包含する）に記載されているような、タンパク質分解的断片化手順などの従来的な手順により作製することができる。適切な抗体模倣物には、限定されないが、１０番目のヒトフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインから得られるモノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）として知られるもの、（Koide et al., J. Mol. Biol. 284:1141-1151 (1998); Koide et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1253-1258 (2002)、ここで言及したことにより各々の全体を本明細書に包含する）、及びブドウ球菌プロテインＡの安定なαらせん状細菌性レセプタードメインＺから得られる、アフィボディとして知られるもの（Nord et al., Nat. Biotechnol. 15(8):772-777 (1997)、ここで言及したことによりその全体を本明細書に包含する）が含まれる。これら抗体模倣物のバリエーションを、これらポリペプチドの一又は複数のドメインを置換し、次いで修飾されたモノボディ又はアフィボディを対象のマーカータンパク質への結合に関する特異性についてスクリーニングすることによりつくり出すことができる。
【００２３】
本明細書の開示において、用語「細胞マーカー」は、細胞型に応じて、多くの場合その細胞型の細胞の表面上に、時には細胞内部にも、程度の差はあれ特異的に発生する特異的構造に関する。典型的には、細胞マーカーは、特定の標的分子に特異的に結合できるレセプターである。細胞マーカーは、タンパク質、糖タンパク質、又は炭水化物、核酸、脂質、又は別の種類の天然に発生する生物学的分子でありうる。当業者であれば、このような細胞マーカー、及びそれらが発生する細胞型について知っている。一又は複数のこのような細胞マーカーの存在は、細胞が特定の分類又は種類の細胞に属することを示しうる。
【００２４】
本明細書の開示において、用語「非細胞構造」は、組織切片の細胞外空間に発生する構造に関する。非細胞構造は、細胞外基質の成分（例えば、コラーゲン繊維、骨、及び髪）の成分、血漿タンパク質、アミリン、又は侵入する微生物のような外部からの物質（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、及び真菌）でありうる。
【００２５】
本明細書の開示において、用語「抗体様リガンドのカクテル」又は単に「カクテル」は、少なくとも一の抗体様リガンドを含む調製物に関する。カクテルの抗体様リガンドは、微視的な多細胞組織試料中に存在するとみなされる混同される細胞上の特異的細胞マーカーに特異結合することができる。更に、カクテルの抗体様リガンドは、カクテルのすべてのリガンドに特異的に結合できる単一のモノクローナル抗体を提供することを可能にする共通のエピトープを含む。
【００２６】
本明細書の開示において、用語「検出抗体様リガンド」は、検出酵素に共有結合した抗体様リガンドに関する。本明細書の開示において、用語「検出酵素」は、適切な条件下及び特定の基質の存在下で、不透明な及び／又は有色のポリマーの形成を触媒できる酵素に関する。適切な検出酵素の例は、アルカリホスファターゼ、及びペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼである。このような酵素のための適切な基質の例は、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ベタゾイドＤＡＢ、Ｄｅｅｐ  Ｓｐａｃｅ  Ｂｌａｃｋ，Ｂａｊｏｒａｎ  Ｐｕｒｐｌｅ，Ｗａｒｐ  Ｒｅｄ，Ｆｅｒｉｎｇｉ  Ｂｌｕｅ、バルカンファーストレッド、及びＶｉｎａ  ｇｒｅｅｎである。
【００２７】
検出酵素はまた、代替的実施態様において、二次抗体に直接結合するのではなく、検出シグナルを増幅するために広く使用される分子に結合しうる。このような増幅系の例は、ビオチン標識された二次抗体の使用、及びそれに続く、検出酵素で標識されたビオチン結合ストレプトアビジンを用いたインキュベーションである。他の共通検出系は、ＧＢＩラボによるＤａｋｏ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｉｎｋ−２  Ｓｙｓｔｅｍによる、ポリマーに基づく増幅技術であるＥＮＶｉｓｉｏｎＴＭ  ｓｙｓｔｅｍである。
【００２８】
本明細書の開示において、用語「一次抗体様リガンド」は、対象とする特定の細胞型に関連付けられた細胞マーカーに特異的に結合できる抗体様リガンドを指す。用語「二次抗体様リガンド」は、一次抗体様リガンドのエピトープに特異的に結合できる抗体様リガンドに関する。一次及び二次抗体様リガンドの一より多い対が使用される場合、特定の対の二次抗体様リガンドは、同じ対の一次抗体様リガンドにしか結合できない。本明細書の開示において、用語「検出基」は、特定の作用により誘発されると特定のシグナルを生成できる基に関する。典型的には、検出基は蛍光色素であり、ＵＶ光に露出された後に特定の波長の光を発することができる。一次及び二次抗体様リガンドの一より多い対が使用される場合、各特定の二次抗体様リガンドは、特定のシグナルを発することができる特定の検出基を有する。
【００２９】
本発明の第１の態様の一実施態様では、工程ｂ）において少なくとも一の抗体様リガンドの第２のカクテルが第１のカクテルと一緒に使用され、工程ｃ）において、第２の検出抗体様リガンド調製物が使用される。第２のカクテルの抗体様リガンドは、第１のカクテルのリガンドより、混同される細胞型の他の細胞マーカーに特異的に結合できる。第２の検出抗体様リガンドは、第２のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合できる。第２の検出抗体様リガンドは第２の検出酵素を有し、工程ｄ）において、前記第２の検出酵素の基質を含む第２の基質調製物が添加され、その結果、第２のカクテルに結合する混同される細胞の近傍に、さらなるポリマーが蓄積する。工程ｈ）において、さらなるポリマーの蓄積が検出される。
【００３０】
本発明の第１の態様の別の実施態様では、工程ｃ）の後、且つ工程ｄ）の前に以下の工程：
１）工程ｃ）の結果得られる混合物を、前記第１のカクテルより他の混同される細胞型の他の細胞マーカーに特異的に結合することができる抗体様リガンドの第２のカクテルを用いて、第２のカクテルのリガンドを前記他の細胞マーカーに結合させることができる条件下でインキュベートする工程；並びに
２）工程１）の結果得られる混合物を、第２のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合できる第２の検出抗体様リガンドであって、第２の検出酵素を有する第２の検出抗体様リガンドを用いてインキュベートする工程；
が実行され、
工程ｄ）において、前記第２の検出酵素の基質を含む第２の基質調製物が添加され、その結果第２のカクテルに結合する混同される細胞の近傍にさらなるポリマーが蓄積され、工程ｈ）において、前記さらなるポリマーの蓄積が検出される。
【００３１】
好ましくは、工程１）及び２）が、抗体様リガンドの第３のカクテル、第３の検出抗体様リガンド、及び前記第３の検出酵素のための基質を含む第３の基質調製物を用いて反復され、第３のカクテルの前記抗体様リガンドは、前記第１及び第２のカクテルより他の混同される細胞型の他の細胞マーカーに特異的に結合することができ、前記第３の検出抗体様リガンドは、第３のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合することができ、且つ第３の検出酵素を有し、前記第３の基質調製物は前記第３の検出酵素のための基質を含み、工程ｈ）において前記さらなるポリマーの蓄積が検出される。
【００３２】
好ましくは、工程１）及び２）が、抗体様リガンドの第４のカクテル、第４の検出抗体様リガンド、及び前記第４の検出酵素のための基質を含む第４の基質調製物を用いて反復され、第４のカクテルの前記抗体様リガンドは、前記第１、第２及び第３のカクテルより他の混同される細胞型の他の細胞マーカーに特異的に結合することができ、前記第４の検出抗体様リガンドは、第４のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合することができ、且つ第４の検出酵素を有し、前記第４の基質調製物は前記第４の検出酵素のための基質を含み、工程ｈ）において前記さらなるポリマーの蓄積が検出される。
【００３３】
好ましくは、第１の基質調製物から形成された蓄積ポリマーの色は暗色及び／又は不透明で、その後形成される蓄積ポリマーの色は徐々に明度及び／又は透明度を増す。
【００３４】
好ましい実施態様では、工程ｅ）〜ｈ）において、各々が複数の特定細胞型の中から対象となる一の特定細胞型を検出するために使用される、抗体様リガンド調製物の複数の対が使用され、各対は、
対象となる特定細胞型に関連付けられた固有の細胞マーカーに特異的に結合できるリガンドを含む特定の一次抗体様リガンド調製物と；
前記特定の一次抗体様リガンドに特異的に結合できるリガンドを含む特定の二次抗体様リガンド調製物であって、二次抗体様リガンドが、固有の蛍光シグナルを送出することができる蛍光色素に共有結合している二次抗体様リガンド調製物と
を含む。
【００３５】
好ましい実施態様では、工程ｇ）の後、且つ工程ｈ）の前に以下の工程：
ａａ）結合した一次及び二次抗体様リガンドの複合体を化学的に固定化する工程；
ｂｂ）結果として得られた試料の細胞を、少なくとも一の蛍光色素で標識された抗体様リガンド調製物のグループに曝す工程であって、前記少なくとも一の蛍光色素で標識された抗体様リガンド調製物の前記グループの各調製液は、対象となる特定細胞型に関連付けられた固有の細胞マーカーに特異的に結合することができ、且つ固有の蛍光シグナルを送出することができる固有の蛍光色素を有する工程；並びに
ｃｃ）蛍光色素で標識された未結合のリガンドを、例えば洗浄工程により除去する工程
が実行される。
【００３６】
本発明の第１の態様の好ましい実施態様では、検出酵素は、アルカリホスファターゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼからなる群より選択される。
【００３７】
好ましくは、工程ｄ）において添加される基質が、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ベタゾイドＤＡＢ、Ｄｅｅｐ  Ｓｐａｃｅ  Ｂｌａｃｋ、Ｂａｊｏｒａｎ  Ｐｕｒｐｌｅ、Ｗａｒｐ  Ｒｅｄ、Ｆｅｒａｎｇｉ  Ｂｌｕｅ、バルカンファーストレッド、及びＶｉｎａ  ｇｒｅｅｎからなる群より選択される。
【００３８】
好ましくは、検出基は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ蛍光色素の群の蛍光色素、例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０（登録商標）、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５（登録商標）；Ｃｙ蛍光色素、例えばＣｙ２（商標）、及びＣｙ７（商標）；ＤｙＬｉｇｈｔ蛍光色素、例えばＤｙＬｉｇｈｔ３５０（商標）、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８（商標）、ＤｙＬｉｇｈｔ５５５（商標）、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０（商標）；ＴＲＩＴＣ、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）といった蛍光色素である。
【００３９】
本発明の第１の態様の一実施態様では、可視化工程ｈ）は、試料の一又は複数の画像を取得することにより実行される。
【００４０】
好ましくは、取得された画像は既知の原理に従ってデジタル化され、複合画像に合成される。
【００４１】
好ましくは、混同される細胞及び特定細胞型を表すマーカーを含む少なくとも４の異なる細胞マーカー又は非細胞構造が検出され、更に好ましくは、少なくとも５の異なる細胞マーカーが検出される。
【００４２】
第２の態様では、本発明は、第１の態様による方法を実行するための部品の入ったキットであって、
ａ）混同される細胞上の細胞マーカーに特異的に結合することができる少なくとも一の抗体様リガンドのカクテル；
ｂ）前記カクテルの抗体様リガンドに結合できる検出抗体様リガンド調製物；
ｃ）検出抗体様リガンドの検出酵素により触媒される反応に参画させるのに適した基質調製物；
ｄ）特定細胞型の細胞マーカーに特異的に結合する少なくとも一の一次抗体様リガンド調製物；
ｅ）共有結合した蛍光色素を含む少なくとも一の二次抗体様リガンド調製物であって、二次抗体様リガンド調製物のリガンドは一次抗体様調製液の抗体様リガンドに特異的に結合する、二次抗体様リガンド調製物；
ｆ）随意で、ｄ）及びｅ）の調整物を試料に化学的に固定化するための調製液；並びに
ｇ）随意で、少なくとも一の蛍光色素標識抗体様リガンド調製物のグループであって、前記少なくとも一の蛍光色素標識抗体様リガンド調製物のグループの各調製液が、特定細胞型に関連付けられた固有の細胞マーカーに特異的に結合できる、抗体様リガンド調製物のグループ
の入ったキットを提供する。
【００４３】
好ましい実施態様では、キットは更に：
ｈ）混同される細胞上の細胞マーカーに特異的に結合できる少なくとも一の抗体様リガンドの第２のカクテルであって、少なくとも一のリガンドが、ａ）においてカクテルが結合するもの以外の細胞マーカーに結合する、第２のカクテル；並びに
ｉ）第２のカクテルの抗体様リガンドに結合できる第２の検出抗体様リガンド調製物であって、検出酵素がｂ）における調製液の酵素とは異なる、第２の検出抗体様リガンド調製物
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
ここで、添付図面を参照して本発明について説明する。
【図１】ａ〜ｃは、混同される細胞上の特定の細胞マーカーをブロックした後、細胞型の特異的マーカーとして特定の細胞マーカーを用いて対象の細胞型を検出する原理を図式的に開示している。
【図２】本発明による方法の更に詳細な例を開示しており、組織試料切片中において六つの異なる細胞型が検出され、対話型複合画像が作成されている。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明の基本原理
タンパク質は、対象のタンパク質に特異的に結合する抗体を使用する技術である免疫組織化学により、組織学的試料切片中において共通に且つ容易に検出される。結合した抗体は、有色の反応生成物（明視野ＩＨＣ）を生み出す酵素により、又はＵＶ光（免疫蛍光ＩＨＣ）に曝されると蛍光を生み出す分子により、可視化することができる。
【００４６】
異なる細胞型は、細胞特異的タンパク質（細胞マーカー）のＩＨＣ検出により検出することができる。既述のように、組織細胞の免疫組織化学的同定の分野における大きな問題は、一の細胞マーカーだけでは多数の細胞が同定できないという事実である。例えば、一の細胞型のための同定マーカーの一候補は、他の複数の細胞型上にも存在する可能性があり、このため適切な同定が不可能となっている。このような「他の細胞型」を、本明細書では「混同される細胞」と呼ぶ。
【００４７】
更に、同じ組織切片内部において多数のマーカー及びタンパク質（即ち、異なる細胞又はマーカー）を検出することが望ましいが、従来のＩＨＣ技術では、同じ切片に２（最大３）の異なるタンパク質を検出することしかできない。
【００４８】
既知の明視野及び蛍光ＩＨＣ染色プロトコールの進歩的な組み合わせ及び修正を通して、複合的ＩＨＣ染色により混同される細胞の特徴をすべて物理的に除外することにより、細胞同定の向上を達成する新規の方法が記載される。細胞同定を向上させる他に、本方法は、自動化された染色を一回実行するだけで、８の細胞集団の同時検出が可能である。対象とする細胞集団の同定及びさらなる検査に先立って混同される細胞を物理的に除外することの別の利点は、混同される細胞及び対象の細胞を検出するために使用される一次抗体を同じアイソタイプのものにすることができることである。方法は、高度に自動化することができ、大規模で時間効率的な高品質の複合的染色パターンの生成に適している。
【００４９】
方法は、一より多い細胞型に複数の細胞マーカーが見られるという事実、及びどんな特異的細胞マーカーによっても特徴付けることができない細胞型が存在するという事実を利用する方法を提供する。以下に示す表１は、本発明における使用に適している免疫細胞マーカー、及びそれらを発現する細胞のいくつかの例を列挙している。
【００５０】
0006277190.tif 000002
【００５１】
この原理を図１ａ〜１ｃに示す。図１ａは、混同される細胞型の一の細胞１と、対象の細胞型の一の細胞２とを含む組織試料を示している。混同される細胞１は、第１の細胞マーカー４と第２の細胞マーカー３とを有する。対象の細胞型の細胞２も第１の細胞マーカー５を有するが、第２の細胞マーカーは有さない。図１ｂでは、第１の分子検出手段６が第１の細胞マーカー３に結合していることが判明している。第１の分子検出手段が酵素７を含むことに注意されたい。図１ｃは、方法の最終検出工程を示している。第１の分子検出手段６の酵素７によって、混同される細胞１の第２の細胞マーカー４へのアクセスを防止するブロッキングポリマー８の形成が触媒されている。これに対し、対象の細胞型上の第２の細胞マーカー５は、ポリマー８によってブロックされていない。したがって、適切な光で励起された後に検出可能な経口シグナルを発する蛍光色素を含む第２の分子検出手段９は、対象の細胞型の第２の細胞マーカー５に結合しうる。その結果、第２の細胞マーカーが試料の対象の細胞型の細胞及び混同される細胞の両方に存在するという事実にも関わらず、第２の細胞マーカーを、対象の細胞型の特異的検出の基礎として使用することができる。第２の分子検出手段は、第２の細胞マーカーに特異的に結合する第１のエンティティ（典型的には抗体）、及び蛍光色素を含む第２のエンティティからなっている。第２のエンティティは、第１のエンティティに共有結合しうる。いくつかの実施態様では、第２のエンティティは、典型的には第１のエンティティに特異的に結合する抗体であり、これには蛍光色素が共有結合する。いくつかの実施態様では、第２の分子検出手段は、既に結合している第２の抗体に架橋させて、可能な後続の工程において添加される一次抗体へのそれらの解離及び拡散を防ぐために、試料に化学的に固定される。
【００５２】
本発明の更に複雑な実施態様が図２に示される。既知の明視野及び蛍光ＩＨＣ染色プロトコールの進歩的な組み合わせ及び修正を通して、図２は、すべての混同される細胞を効率的に除外することにより細胞同定を向上させることとは別に、一回の自動化されたＩＨＣプロトコールにおいて最大で八つの抗原（例えば、細胞集団）を同時に染色することができる本発明の一実施態様を開示している。図２の免疫組織学的工程はすべて、マーカー分子検出のための他の手段を用いて反復することができることに注目されたい。例えば、発色による検出を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、工程１Ａ及び１Ｂのいずれにも使用することができる。同様に、蛍光による検出を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、図２の工程２又は３４のいずれかに使用することができる。記載した実施態様は、高度に自動化することができ、大規模で時間効率的な高品質の複合的染色パターンの生成に適している。例えば白血球湿潤パターンの、このような種類の詳細な情報のいずれもが、基礎研究、薬剤検証、疾患表現型検査、及び臨床診断にわたる多数の重要な用途を有すると思われる。
【００５３】
マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、好中球、骨髄樹状細胞、上皮細胞及びマスト細胞を含有することが疑われる微視的な多細胞組織試料が分析される。細胞型に、例えば骨髄樹状細胞（例えば、ＣＤ１１ｃ）の候補マーカーである複数の細胞マーカーが含まれるため、マクロファージは混同される細胞とみなされる。第１の工程では、試料をマウス抗ＣＤ６８抗体に曝した後、ヤギ抗マウス抗体を酵素西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でマーキングする。マクロファージの存在は、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を伴う反応を酵素が触媒するとき、不透明なポリマーの形成により示される。同じ起源のさらなる一次抗体が別の細胞マーカーを検出するために使用される場合、ｐＨ、オスモル濃度、温度、洗浄剤、及び／又は変成剤の適切な組合わせを有する抗体剥離バッファー（Harlow & Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press.）を添加してもよい。このような溶離工程の非限定的な例は、スライドを、ｐＨ２の１０％ＳＤＳ中２５ｍＭのグリシン−ＨＣｌで１５分間インキュベートすることである。また、試料をマウス抗ＣＤ８抗体に曝した後、酵素アルカリホスファターゼ（ＡＰ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体に曝す。ファーストレッドを添加することによりＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を示す。ここでマクロファージがブロックされるので、マウス抗ＭＰＯ抗体を添加した後蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０でマーキングしたヤギ抗マウス抗体を添加することにより好中球を表示することが可能である。同様に、骨髄樹状細胞の存在を、ウサギ抗ＣＤ１１ｃ抗体の後、蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８でマーキングしたヤギ抗ウサギ抗体を添加することにより示すことができる。ここで、結合した抗体の化学的固定を、例えば３％の緩衝ホルムアルデヒド溶液に１５分間曝すことにより、実行することができる。化学的固定の目的は、既に結合された二次抗体に架橋させることにより、後続の工程において添加される一次抗体へのそれらの解離及び拡散を防ぐことである。結合された抗体の化学的固定の後は、蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０で直接標識されたマウス抗サイトケラチン抗体を添加することにより上皮細胞の存在を検出すること、及び蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５で直接標識されたマウス抗トリプターゼ抗体を添加することによりマスト細胞の存在を検出することが可能である。各染色後画像が取得され、最終的に対話型複合画像が取得される。
【実施例】
【００５４】
ここで、同定プロトコールの以下の実施例を参照し、本発明について更に記載する。
【００５５】
実施例１：組織幼若白血球の同定及び特徴づけのためのプロトコール（２型自然リンパ球系細胞とも呼ぶ）
背景：新種のＩＬ−１３生成及びＳＴ２レセプター発現自然エフェクター白血球である幼若白血球が、最近発見され（Neill et al.,Nature 2010 Apr 29;464(7293):1367-70）、アレルギー性及び感染性疾患の主要な制御因子として提案されている。結果として、新規の抗炎症性薬剤のための薬理学的標的として幼若白血球を更に調査することに、多大な医学的及び商業的関心が生じている。現在、幼若白血球に関する研究は、ヒト組織中の幼若白血球の適切な同定のための方法がないことにより阻まれている。しかしながら、この問題は、適切な除外と陽性の検出マーカーとを組み合わせる以下のプロトコールを用いることにより解決される。
【００５６】
0006277190.tif 000003
【００５７】
本発明のプロトコールを使用して、いずれの伝統的白血球集団にも属さなかった非茶色の（即ち、共通のＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球などの除外マーカーのない）細胞、但し白血球（ＣＤ−４５陽性により定義された）を同定した。ＩＬ−１３及びＳＴは、幼若白血球上に存在することが知られている分子である（他のいくつかの細胞上にも存在するが、これらは第１の工程で排除済みである）。したがって、組織中の幼若白血球は、ＩＬ−１３及びＳＴ２Ｌについて同時染色もする非伝統的ＣＤ４５＋白血球として同定された。幼若白血球のマーカーの発現パターンは、集中的調査の対象である。したがって、幼若白血球の検出は、同じ方法論の原理を用い、但しやはり混同される細胞上に存在する新規に発見された「マーカー」の他の組を用いても実行できることに注意されたい。同様に、本実施例のＩＬ−１３タンパク質の免疫組織学的検出は、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＩＬ−１３ｍＲＮＡ生成の可視化で置き換えてもよい。
【００５８】
実施例２：ＢＤＣＡ３＋及びＢＤＣＡ３−骨髄樹状細胞、それらの増殖ステータス、並びに侵入インフルエンザＡウイルスに対する空間的関係の同時同定のためのプロトコール
背景：免疫系に対する外来性物質の捕捉及び提示は、抗原提示樹状細胞により実行される。樹状細胞は、多数のサブタイプに存在し、マーカーがないためにその多くは組織切片中において検出することが困難である。例えば、それらの表面マーカーＣＤ１１ｃの発現により、骨髄樹状細胞を検出しようとする試みが行われている。しかしながら、この分子は、組織中の他の細胞型、例えば単球、マクロファージ、好中球、ＮＫ細胞、及びいくつかのＢリンパ球上に発現する。以下のプロトコールの一次除外工程においてこれら混同される細胞を除外した後、骨髄樹状細胞を検出するためにＣＤ１１ｃを安全に使用することができる。更に、プロトコールは、骨髄樹状細胞の二の主要なサブセット、即ちＢＤＣＡ３−陽性骨髄ＤＣ及びＢＤＣＡ３−陰性ＤＣを同定する能力（更には抗原源、例えば侵入ウイルスに対するそれらの詳細な空間的関係を可視化する能力）を有する。
【００５９】
0006277190.tif 000004
【００６０】
除外工程において、ＣＤ１１ｃを発現するすべての非骨髄ＤＣ細胞がさらなる分析から除外された。その後、骨髄ＤＣは、それらのＣＤ１１ｃ発現により安全に同定された。このように、技術的には、骨髄ＤＣは、ＣＤ６８−，ＣＤ１６３−，ＭＰＯ−，ＣＤ５７−，ＣＤ２０−，ＣＤ１１ｃ＋細胞として定義された。また、これら骨髄ＤＣは、このプロトコールを用いて、表面マーカーであるＢＤＣＡ−３の発現に基づいて二つの主要な骨髄ＤＣサブセットに分類された。このように、技術的には、プロトコールは、ＣＤ６８−，ＣＤ１６３−，ＭＰＯ−，ＣＤ５７−，ＣＤ２０−，ＣＤ１１ｃ＋  ＢＤＣＡ３−骨髄ＤＣｓ及びＣＤ１６３−，ＭＰＯ−，ＣＤ５７−，ＣＤ２０−，ＣＤ１１ｃ＋  ＢＤＣＡ３＋骨髄ＤＣと、侵入インフルエンザＡウイルスに対するそれらの正確な空間的関係を同時に可視化した。
【図１】
0006277190.tif 000005
【図２】
0006277190.tif 000006