(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の薬学上重要な物質が装填された赤血球を調製するための方法であって、以下の工程：
ａ）第１の低張溶液を用いて赤血球を膨潤させる工程であって、前記第１の低張溶液が赤血球を２５０〜２００ｍＯｓｍ／Ｋｇの間の重量オスモル濃度に至らせる工程と、
ｂ）工程ａ）で得られた赤血球を、前記第１の低張溶液より低張な第２の低張溶液を用いて、溶解に到達することなく、さらに膨潤させる工程であって、前記第２の低張溶液が、赤血球を２００〜１７０ｍＯｓｍ／Ｋｇの間の重量オスモル濃度に至らせる工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた赤血球を濃縮する工程と、
ｄ）濃縮された赤血球を、１種以上の薬学上重要な物質を含んでなる溶解溶液と接触して置く工程と、および続いて、
ｅ）前記１種以上の薬学上重要な物質が装填された赤血球の集団を得るためにシーリング溶液を添加する工程と
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記第２の低張溶液の添加前に前記第１の低張溶液の少なくとも一部が除去される追加の工程を、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記濃縮工程（ｃ）が、血液濾過、血液透析または遠心分離によって行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）の溶解溶液が、赤血球を１５０〜１１０ｍＯｓｍ／Ｋｇの間の重量オスモル濃度に至らせる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｅ）のシーリング溶液が、３００〜５０００ｍＯｓｍ／ｋｇの高張溶液である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記薬学上重要な物質が、以下の薬学上重要な物質：ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、以下から選択される薬学上重要な物質：オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体；以下から選択される薬学上重要な物質：ホルモン、免疫抑制薬、抗腫瘍薬、コルチコステロイド、グルココルチコイド、抗レトロウイルス性抗炎症薬、サイトカイン、毒素、免疫活性を有する物質；診断のための造影剤；以下から選択される粒子およびナノ粒子：金属含有ナノ粒子、磁性ナノ粒子、超常磁性粒子（ＳＰＩＯ）、複合ナノ粒子活性分子、から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記薬学上重要な物質が、６−メルカプトプリン、フルダラビンリン酸エステル、アジドチミジンリン酸エステル、ジデオキシシチジン、デオキシアデノシン、グルタチオン、ビスホスホネート類、プレドニゾロン、プレドニゾロンリン酸エステル、デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸エステル、ベタメタゾン、ベタメタゾンリン酸エステル、デフラザコルト、チミジンホスホリラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、インドシアニングリーン、超常磁性粒子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって得られる、１種以上の薬学上重要な物質が装填された赤血球であって、アネキシンＶアッセイを用いて測定された、赤血球によって産生されたホスファチジルセリンのパーセンテージが、１０％未満であり、１０６赤血球につき産生されたラクテートの量が、０．１００ｎｍｏｌ／ｈより多い、赤血球。
【請求項９】
前記１種以上の薬学上重要な物質が、以下の薬学上重要な物質：ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、以下から選択される薬学上重要な物質：オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体；以下から選択される薬学上重要な物質：ホルモン、免疫抑制薬、抗腫瘍薬、コルチコステロイド、グルココルチコイド、抗レトロウイルス性抗炎症薬、サイトカイン、毒素、免疫活性を有する物質；診断のための造影剤；以下から選択される粒子およびナノ粒子：金属含有ナノ粒子、磁性ナノ粒子、超常磁性粒子（ＳＰＩＯ）、複合ナノ粒子活性分子、から選択される、請求項８に記載の赤血球。
【請求項１０】
前記薬学上重要な物質が、６−メルカプトプリン、フルダラビンリン酸エステル、アジドチミジンリン酸エステル、ジデオキシシチジン、デオキシアデノシン、グルタチオン、ビスホスホネート類、プレドニゾロン、プレドニゾロンリン酸エステル、デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸エステル、ベタメタゾン、ベタメタゾンリン酸エステル、デフラザコルト、チミジンホスホリラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、インドシアニングリーン、超常磁性粒子から選択される、請求項９に記載の赤血球。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の赤血球と、１種以上の薬学上許容される賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１２】
治療的処置における使用のための、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の赤血球または請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記薬学上重要な物質が、プレドニゾロン、プレドニゾロンリン酸エステル、デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸エステル、ベタメタゾン、ベタメタゾンリン酸エステル、デフラザコルトから選択される、治療的処置における使用のための、請求項１２に記載の赤血球または組成物。
【請求項１４】
前記薬学上重要な物質が、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウムおよびベタメタゾンリン酸エステルナトリウムから選択される、治療的処置における使用のための、請求項１２または１３に記載の赤血球または組成物。
【請求項１５】
毛細血管拡張性運動失調症の治療における使用のための、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の赤血球または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、１種以上の有効成分が装填された赤血球を調製するための方法、そのようにして得られた装填赤血球および前記装填赤血球を含んでなる医薬組成物に関する。
【０００２】
本発明はまた、前記赤血球を含んでなる医薬組成物、および、それらの治療応用、特に、毛細血管拡張性運動失調症の治療におけるそれらの治療応用を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
従来の技術水準
赤血球(red blood cells)（erythrocytesとしても知られている）は、従来の技術水準において、有効成分を運搬し、循環中へ放出しかつ／または標的部位に効率的に向けることができる薬物担体に含まれる。赤血球を薬物担体として使用する利点は、主として、有効成分が、数日または数週間の期間、とにかく経口もしくは静脈内投与用処方物またはリポソームもしくは他の薬物担体により媒介される持続放出システムを使用したときの通常の場合よりもずっと長い期間、循環中に保持され得るという事実にある。さらに、一度、これらの担体が、有効成分を運搬する任務を果たすと、それらは、肝臓および脾臓中の天然赤血球を排除するための生理学的経路を介して循環から除去される。
【０００４】
生物医学的および臨床目的で、有効成分または造影剤をヒトまたは哺乳類の赤血球に封入するために、数多くの方法が提示されている。
【０００５】
具体的には、特許ＥＰ０８８２４４８号明細書に、望ましい薬理学的効果を得るのに十分な濃度で、薬物を赤血球に封入するための方法が初めて記載された。上述の先行特許に記載された方法は、一連の作業工程を含み、それらの工程は以下のように要約することができる：
・赤血球を膨潤させる、第１の工程、
・目的有効成分を細胞内空間内へ通過させるのに十分な大きさの、前記赤血球の膜の孔の開口を可能にするように、膨潤した赤血球を溶解する、第２の工程、
・溶解した赤血球の濃縮工程、
・前記赤血球を前記有効成分と接触させ、その後、前記赤血球中に前記有効成分を捕捉するために、前記赤血球の閉鎖／再シーリングを行う、封入工程。
【０００６】
前述の方法により、薬物担体として使用するのに好適な、有効成分が装填された赤血球を得ることが可能になった。現在、当分野の専門家にとって、薬物を赤血球に封入するための最も効果的な参照方法は上記のものである。
【０００７】
しかしながら、この方法を用いる際、上記した特許（ＥＰ０８８２４４８号明細書）において定義された作業条件での溶解した赤血球の濃縮工程において、これらの溶解した赤血球は機械的ストレスを受け、それにより、装填赤血球を再構成する次の工程が少し難しくなり得ることが観察されている。
【０００８】
有効成分を赤血球に封入するための様々な公知技術のうち、特許ＥＰ１７７３４５２−Ｂ１明細書において記載されたものは、患者の浸透圧脆弱性（または赤血球浸透圧抵抗）が変動することから有効成分の封入において再現性を得るために、方法パラメーター、例えば、溶解溶液の流速の変化およびその重量オスモル濃度の調整などの補正を提供する。
【０００９】
本発明の範囲は、薬学上重要な物質を赤血球に封入するための改善された方法を得るために、ＥＰ０８８２４４８号明細書において記載された方法を用いて達成された既に満足が得られている結果をさらに改善することである。
【発明の概要】
【００１０】
本出願は、１種以上の薬学上重要な物質が装填された赤血球を調製するための方法に関し、その方法は、公知の技術水準において記載した同様な方法と比較して、いくつかの側面において改善されていると思われる。
【００１１】
具体的には、この方法は、赤血球の濃縮工程が行われた後に、薬学上活性な分子を赤血球に封入することを可能にするために必要な細胞溶解工程が行われることを特徴とする一連の作業工程を含む。より正確には、この溶解工程は、封入される物質を含んでなる溶液との接触工程中に行われる。
【００１２】
本発明の方法は、出発赤血球が、適当な低張溶液の使用により、溶解することなく、後に２つの細胞膨潤工程を経ることを提供する。実際には、これらの工程は、従来技術の同様な方法による膨潤工程および溶解工程に取って代わる。
【００１３】
従って、本発明の対象は、１種以上の薬学上重要な物質、例えば、有効成分などが装填された赤血球を調製するための方法であり、その方法は、
ａ）第１の低張溶液を用いて赤血球を膨潤させる工程と、
ｂ）工程ａ）で得られた赤血球を、前記第１の溶液より低張な第２の低張溶液を用いて、溶解に到達することなく、さらに膨潤させる工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた赤血球を濃縮する工程と、
ｄ）このようにして濃縮された赤血球を、１種以上の薬学上重要な物質を含んでなる溶解溶液と接触して置く工程と、続いて、
ｅ）前記薬学上重要な物質が装填された赤血球)の集団を得るためにシーリング溶液を添加する工程と
を含んでなる。
【００１４】
有利には、本方法は、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に、前記第２の低張溶液の添加前に前記第１の低張溶液が少なくとも部分的に除去される中間工程（ａ２）を含んでなり得る。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、上記方法を用いて得ることが可能な、１種以上の有効成分が装填された赤血球の集団および上に定義した装填赤血球の集団を含んでなる医薬組成物である。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、上記方法によって得られる、１種以上の有効成分が装填された赤血球を含んでなる医薬組成物、ならびに疾患、例えば、毛細血管拡張性運動失調症の治療における使用のための、前記赤血球および組成物である。
【００１７】
本発明は、事前に溶血誘導を受けずに膨潤工程および濃縮工程だけが施された赤血球に有効成分を封入することが可能であるという驚くべき発見に基づいている。実際には、孔の開口（溶血）は、濃縮後に、目的物質を含有する同じ溶液を用いて、効果的に得ることができる。新規な方法は、これまでのものよりもずっと効果的であり、天然赤血球（前記処理を受けていない）に非常に類似した最終産物（少なくとも１種の薬学上活性な物質を含有する赤血球）を生成する。
【００１８】
発明によって提供される利点
この新規な方法によって導入される作業の変更によって、赤血球の原形質膜をより良く保存すること、およびより高い濃度を達成することの両方が可能になり、それによって、ずっと高い封入効率が提供される。
【００１９】
本発明の方法では、目的物質の封入は、公知の技術水準において記載した方法よりも良好な収率で行われ、治療上活性な物質のより多い量を封入することが可能になる。具体的には、この方法の発明者らは、同じレベルの有効成分の封入を達成するために、本発明の方法では、ＥＰ０８８２４４８号明細書において記載されている標準的な方法で現在使用されている量よりも著しく低い出発有効成分量を使用することが可能であることを示した。具体的には、実験項にも記載するように、例えば、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウムを、約１１ｍｇまで封入するためには、処理を行う赤血球の同量を用いて、従来技術の方法では、約５００ｍｇの出発薬物が必要であるが、本明細書に記載する方法で必要なのは６２．５ｍｇだけである。
【００２０】
さらに、この方法は、前記物質の初期量に比例した目的物質の量の赤血球への封入に再現性と信頼性があることが証明されている。これらの特性により異なる用量の臨床的使用が可能になり、これによって、処理中に添加する有効成分の量のみを変化させることにより異なる臨床的必要性に相応した用量を投与することが可能になる。
【００２１】
封入効率の向上は、低分子量を有する活性分子（例えば、実施例１に示すデキサメタゾンリン酸エステルナトリウム）だけでなく、高分子量を有する分子でも示された。実施例５で報告するように、分子量が１１０ｋＤａ（５５ｋＤａの酵母ヘキソキナーゼ−Ｈｋ−のダイマー）または６０ｋＤａ（チミジンホスホリラーゼ）のタンパク質は、効果的に封入された。
【００２２】
一連の作業工程の変更によって、本発明の方法によって得られた装填赤血球の集団に関連する生理学的パラメーターにも大幅な改善が得られた。具体的には、実施例に示すように、本明細書に記載する方法を用いて装填された赤血球は、未処理の赤血球のものと全く同等な、パラメーター、例えば、平均細胞容積および細胞生存能力（代謝）などを有する。全体としては、実験データにより、新規な方法は、従来技術と比較して、出発赤血球の細胞サイズおよび細胞含有物をより良く保存することができ、それによって、生理学的観点から未処理の赤血球の集団により著しく類似した装填赤血球の集団を得ることが可能になることが示されている。
【００２３】
本発明によりまたは従来技術（ＥＰ０８８２４４８号明細書）の類似方法を用いて装填された赤血球の集団について行った比較実験では、例えば、赤血球の平均細胞容積（ＭＣＶ）はそれぞれ、約８６フェムトリットル（本発明）と約７１フェムトリットル（従来技術）であり、その場合、未処理の赤血球のＭＣＶ値は８０〜９７フェムトリットルの間であることなどが示された。加えて、本明細書の方法および従来の技術水準において記載したものに供した赤血球で測定した平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）の量はそれぞれ、約２１．２ピコグラム（正常に非常に近い）と約１４ピコグラム（従来技術）であり、その場合、未処理の赤血球の値は、通常、２７．６〜３３．３の間で変動することが見出された。
【００２４】
本方法を用いて装填された赤血球と未処理の赤血球との間のより良い共通性も細胞生存能力（代謝）増加が観察されたことによって確認される。具体的には、以下にさらに詳細に記載するように、本発明により処理された赤血球の生存能力は、代謝能増加および老化マーカーの存在減少の両面で著しく優れている。以下により詳細に述べるように、より高い細胞生存能力（より高い代謝およびより少ない老化マーカー）に関連するデータから、本明細書に記載する方法により、実際に、従来技術の方法を用いて得られた赤血球よりも長い半減期を有する装填赤血球の集団を生産し得ると明言することが可能である。従って、本発明に従う赤血球の集団は、封入された物質の輸送および／または従来技術において記載されている方法により装填された赤血球によって可能である期間よりも長い期間でのそれらの放出を可能にするということになる。
【００２５】
記載した技術的解決法によって、本方法は患者の赤血球の様々な浸透圧脆弱性（実施例７に示すとおりである）および初期ヘマトクリット（実施例８に示すとおりである）の両方と無関係であるため、本発明はまた、ＥＰ１７７３４５２−Ｂ１明細書において記載されている方法の限界を克服することが可能であり、また、患者ごとに方法パラメーターの補正を行わずに活性物質の再現性のある封入を得ることが可能である。
【００２６】
本発明の赤血球について上記した有利な特性、特に、赤血球内に封入される薬剤の最大量およびそれらのより長い半減期によって、前記赤血球は様々な疾患、例えば、毛細血管拡張性運動失調症の治療において効果的なものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、従来技術の方法（ＥＰ０８８２４４８号明細書）と比較した、本明細書に記載する方法の模式図である。
【図２】図２は、重量オスモル濃度に基づいた総遊離ヘモグロビンの測定によって評価した、２個体についての赤血球浸透圧抵抗(the globular osmotic resistance)（ＲＧＯ）に関するグラフである。ＲＧＯは、５０％溶血、すなわち、遊離ヘモグロビンの５０％が観察される重量オスモル濃度としても表される。
【図３】ＢＯ２０１０Ａ０００２５５号明細書に記載されているような医療装置と組み合わせて使用する場合の本発明の方法の実施に好適なキットの説明図である。
【図４】図中のグラフは、従来技術に示された手順（ＥＰ０８８２４４８号明細書）（旧手順）および本発明による手順（新規手順）の両方により作製された赤血球を用いて治療した、毛細血管拡張性運動失調症に罹患している患者４名（０２−０１、０２−０２、０２，０５、０２，０８）についてのコンパッショネート研究（compassionate study）の結果を示している。
【発明の具体的説明】
【００２８】
用語解説
当技術分野の代表的ないくつかの専門用語を以下に説明する。
【００２９】
本発明の目的において、「赤血球の膨潤」という表現は、主に水の侵入によって引き起こされる内圧の増加に起因する、赤血球の容積および球形の増加を意味し、細胞膜の孔の異常な開口またはそれらの不可逆的破損のいずれの現象も起こらない。通常、本特許において理解される膨潤は、細胞物質の流出を意味するものではない。
【００３０】
本発明の目的において、特定の技術分野での、用語「溶解」または「溶血」または「部分溶解」とは、細胞内外の物質の両方向への自由な通過を結果として生じる細胞膜の孔の可逆的開口を意味する。従って、溶解は、一時的かつ可逆的な透過化の現象であり、細胞膜の完全かつ不可逆的な破裂を伴わない。
【００３１】
従って、用語「溶解した赤血球」とは、その原形質膜が、細胞膜の完全性が回復するように再閉鎖され得る孔を備えている赤血球を指すということになる。
【００３２】
本明細書の目的において、「（再）シーリング溶液」という表現は、主に水の流出を介して、赤血球の原形質膜中の孔を閉鎖することができる使用された溶液を意味する。この溶液は、前記孔の開口により１または複数の薬学上重要な物質を赤血球内に封入することを可能にする。
【００３３】
本明細書において、「装填された赤血球」という表現は、１種以上の目的物質の不定量を封入している赤血球(erythrocytes)（red blood cellsとも呼ばれる）を意味する。
【００３４】
本発明の目的において、「シーリングした赤血球」という表現は、溶解した赤血球とは異なり、未処理の赤血球のものと同等の（と共通する）原形質膜透過性を備えている赤血球を指す。
【００３５】
本発明の方法を実施するために、出発赤血球は、個体の血液サンプルからの赤血球の採取および単離によって得られ得る。出発サンプルは、好ましくは、その凝固を防ぐために、抗凝固薬、例えば、ヘパリンなどで処理される。
【００３６】
場合により、赤血球は、本発明による処理を行う前に、単離し、生理食塩溶液で１回以上の洗浄を行って、夾雑物、例えば、血漿、血小板、リンパ球などが全く存在しないかまたはごくわずかな濃度でしか存在しない出発赤血球の集団を得ることができる。
【００３７】
工程（ａ）：
上に示すように、本方法は、最初に第１の低張溶液の使用により赤血球の集団を膨潤させる工程ａ）を含んでなる。
【００３８】
本発明の１つの実施形態では、第１の低張溶液は、２３０〜１５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度、例えば、１８０ｍＯｓｍ／ｋｇの好ましい重量オスモル濃度を有する。いかなる場合でも、第１の溶液の重量オスモル濃度および容量は、この第１の溶液との接触によって赤血球が２５０〜２００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度に到達するようなものである。具体的には、第１の低張溶液は、例えば、５容量の生理食塩溶液と３容量の滅菌蒸留水と混合することによって得ることができる。限定されない例として、工程（ａ）は、室温で約５分間、約３〜７％の濃度（ヘマトクリット）で第１の溶液約３００ｍＬ中に赤血球を維持して行うことができる。
【００３９】
場合により、工程ａ）に続いて、膨潤した赤血球から第１の低張溶液を少なくとも部分的に除去する工程を行い得る。そのような除去は、例えば、処理した赤血球をゆるやかに遠心分離し、上清を分離することによって、得ることができる。
【００４０】
工程（ｂ）：
上記のように得られた膨潤赤血球は、次いで、第２の低張溶液の使用によるさらなる膨潤に供する（工程ｂ）。第２の溶液は、第１の溶液より低張であることを特徴とする。第２の溶液の張性は、赤血球をさらに膨潤させるが、細胞内物質の流出が結果として起こる原因となるそれらの溶解を引き起こさないように選択される。低張条件は、赤血球の次の濃縮工程を考慮して過度の細胞脆弱性の誘導を回避するように制御される。第２の低張溶液の重量オスモル濃度値は、実験室で実験的に決定され、本方法では一定である。第２の溶液の重量オスモル濃度は、赤血球の膨潤状態を誘導するが、このことがそれらの表面の孔の開口をもたらすことによって細胞含有物の初期流出および赤血球の過度の脆弱性を引き起こすことがないようなものである。
【００４１】
第２の低張溶液は、８０〜１７０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度を有する。好ましい実施形態では、第２の溶液の重量オスモル濃度は約１２０ｍＯｓｍ／ｋｇである。いかなる場合でも、第２の溶液の重量オスモル濃度および容量は、この第２の溶液との接触によって赤血球が２００〜１７０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度に到達するようなものである。
【００４２】
具体的には、第２の低張溶液は、例えば、５容量の生理食塩溶液と７容量の滅菌蒸留水とを混合することによって得ることができる。
【００４３】
例として、工程（ｂ）は、室温で約５分間、約８〜１５％の濃度（ヘマトクリット）で第２の溶液約６４ｍＬ中に赤血球を維持して行うことができる。
【００４４】
工程（ｃ）：
上記工程ａ）および工程ｂ）から得られた膨潤赤血球は、次いで、濃縮工程ｃ）に供する。赤血球のサンプルの濃縮に好適な任意の公知技術、例えば、血液濾過、遠心分離または透析を、膨潤赤血球を濃縮するために使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、濃縮は、血液濾過によって行われる。
【００４５】
具体的には、血液濾過では、懸濁液量を減らして、膨潤赤血球を濃縮するために、当技術分野の専門家に公知の任意の血液濃縮フィルター（あるいは透析液フィルター）を使用して、細胞部分をそれが懸濁されている液体から分離することができる。一般的には、血液濃縮フィルターの容量が低いほど（例えば、新生児または小児用サイズ）、到達することができる血液濃縮のレベルは高くなる。
【００４６】
血液濃縮は、好ましくは、室温で１５〜３５分の間で変動する時間の間行われる。一般的には、工程ｃ）の終了時に得られた赤血球の濃度（ヘマトクリット）は、３０％を超え、例えば、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％である。この濃縮工程では、赤血球の懸濁液の重量オスモル濃度は、ほぼ一定であり、前の工程ｂ）で使用される第２の低張溶液との接触後に得られた重量オスモル濃度と比べて、数ｍＯｓｍ／ｋｇ単位だけ変動する。
【００４７】
濃縮工程は、膨潤させたがそれらの構造が本質的に変わらない、すなわち、溶解していない赤血球で行われるため、本明細書に記載する方法は、もはや薬物担体として効果的に使用することができない程度に不可逆的に損傷した赤血球を得る危険性を大幅に減少させる。実際には、本方法の最適な目的は、出発集団の生理学的特性にできる限り近く、さらに効率的にかつ長期間担体の役割を果たすことができる特性を有する、装填され、「再構成された」赤血球の集団を得ることである。
【００４８】
工程（ｄ）：
このようにして濃縮された赤血球は、次いで、１種以上の薬学上重要な物質を含んでなる低張溶解溶液と接触させて置く（工程ｄ）。この溶液の特性は、赤血球の重量オスモル濃度を、それらの一時的溶解、すなわち、細胞膜中の孔の可逆的開口を引き起こす程度に低下させるということである。有効成分を含有する溶液は、例えば、低い重量オスモル濃度の水溶液であり得る。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、溶解溶液は、１０〜１００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度を有する。いかなる場合でも、溶解溶液の重量オスモル濃度および容量は、溶解溶液との接触によって赤血球が１５０〜１１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度に到達するようなものである。
【００５０】
この溶液は、低張であることに加えて、封入しようとする１または複数の目的物質を含有する。従って、赤血球の原形質膜の透過処理は、細胞内でのそれらの拡散に有利に働く。
【００５１】
例として、工程（ｄ）は、室温で約１０分間、３０〜６５％の濃度（ヘマトクリット）で活性物質を含有する溶解溶液と接触して赤血球を維持して行うことができる。
【００５２】
工程（ｅ）：
１または複数の目的分子を赤血球内に封入するために、シーリング溶液を使用して、処理した赤血球のパラメーターを生理学的状態にできる限り近くに回復させる。シーリング溶液は、３００〜５０００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度の高張溶液である。
【００５３】
本発明の特定の実施形態では、使用されるシーリング溶液は、ホスフェート−イノシン−グルコース−ピルベート−アデニン(Phosphate-Inosine-Glucose-Pyruvate-Adenine)（ＰＩＧＰＡ）の溶液である。従って、例えば、赤血球により利用される蒸留水および無機物または他の栄養素で構成される任意の高張溶液を用いて同様の閉鎖効果を得ることが可能である。しかしながら、ＰＩＧＰＡ高張溶液は、細胞が、失った含有物だけでなく細胞の代謝機能の一部も回復させる支援をする栄養素を含んでなるため、ＰＩＧＰＡ高張溶液が好ましい。この点において、孔の再シーリングに有利に働き、正常な膜構造が回復する（再アニーリング）。
【００５４】
例として、シーリング溶液は、好ましくは、以下の組成を有する：３３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１．６０６Ｍ  ＫＣｌ、０．１９４Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  イノシン、５ｍＭ  アデニン、２０ｍＭ  ＡＴＰ、０．１Ｍ  グルコース、０．１Ｍ  ピルベート、および４ｍＭ  ＭｇＣｌ２。例として、約１５〜４０％の濃度（ヘマトクリット）の溶解赤血球約３５〜５５ｍＬの容量に対してシーリング溶液約３ｍＬを使用することができる。具体的には、シーリング溶液と赤血球との接触は、例えば、約３０分間、好ましくは、３７℃の温度で行うことができる。この段階において、赤血球懸濁液を生理学的レベルと少なくとも等しいかまたはそれを超える重量オスモル濃度にする。３７℃の温度は、必須ではないが、細胞内での代謝プロセスの迅速かつ最適な回復に寄与する。
【００５５】
赤血球中に、単独でまたは組み合わせて、封入される薬学上重要な物質は、要求される具体的な治療必要性に応じて公知のものから選択され得る。
【００５６】
本発明の１つの実施形態では、薬学上重要な化合物は、以下の群から選択される：ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質から選択される有効成分；オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体から選択される有効成分；ホルモン、免疫抑制薬、悪性細胞増殖の阻害薬、コルチコステロイド、グルココルチコイド、抗レトロウイルス性非ステロイド系抗炎症薬、サイトカイン、毒素、ワクチン接種作用を有する物質から選択される有効成分；診断のための造影剤；金属含有ナノ粒子、磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子(super-paramagnetic nanoparticles)（ＳＰＩＯ）、およびナノ粒子活性分子複合体から選択される粒子またはナノ粒子。
【００５７】
例えば、物質は、６−メルカプトプリン、フルダラビンリン酸エステル、リン酸化アジドチミジン、ジデオキシシトシン、ジデオキシイノシン、グルタチオン、ビスホスホネート類、プレドニゾロン、プレドニゾロンリン酸エステルナトリウム、デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、ベタメタゾン、ベタメタゾンリン酸エステルナトリウム、チミジンホスホリラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、インドシアニングリーン、および超常磁性粒子から選択することができる。好ましい活性物質は、デキサメタゾンおよびベタデキサメタゾン、さらに、リン酸エステル形態のもの、ならびにデフラザコルトであり、最も好ましい活性物質は、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウムである。本発明の１つの実施形態では、有効成分に、プロドラッグ、すなわち、生物活性成分の前駆体も含まれ得る。限定されない例として、このプロドラッグは、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム（またはデキサメタゾン２１−ホスフェート）であり得、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウムは、一度赤血球に封入され、患者に投与されると、内因性活性化（脱リン酸化）の機構を介して、デキサメタゾンと呼ばれる効力のある抗炎症薬に変換される。あるいは、内因性活性化の機構が存在しない場合には、プロドラッグから薬物への変換は、同じ赤血球中の適切な活性剤の共投与によって得ることができる。
【００５８】
本発明のさらなる目的は、上記の方法によって得ることが可能な、１種以上の薬学上重要な物質が装填された赤血球の集団である。
【００５９】
既に示したように、本発明の方法を用いて得られた赤血球の集団は、文献に記載されている方法を用いて得られた同様な集団よりも高い細胞生存能力（代謝および生存）を示す。具体的には、本発明により処理された赤血球は、アネキシンＶアッセイを用いて測定されたホスファチジルセリンのパーセンテージで評価された、天然赤血球のものに非常に類似した細胞半減期を有する。アネキシンＶアッセイは、検査技師による研究室での実施により行われ、文献において既に記載されている(Canonico B. et al. 2010)。従って、本明細書ではそれ以上の詳細を示していない。前記アッセイは、存在することが損傷および自然排除機構による促進細胞老化の指標であるホスファチジルセリンを原形質膜外面上に表示する赤血球のパーセンテージを評価する。一般的には、ホスファチジルセリンを露出している赤血球は、食作用を受け、外膜上にこのタンパク質のない赤血球よりも速く血流から排除される。従って、ホスファチジルセリンの露出がある赤血球のパーセンテージが低いほど、ヒト体内の循環に入る赤血球の半減期は予想通り長くなるということになる。半減期の増加は、医薬の放出時間の延長または血流による輸送時間の延長に反映される。本発明の方法を用いて装填された赤血球の集団では、ホスファチジルセリン露出の平均パーセンテージ１０％未満、例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％が認められ、一方、他の方法を用いて処理された赤血球におけるホスファチジルセリン露出の対応値は、２０〜４０％を超える可能性がある。これらの結果は、本発明の方法によって、ほぼ天然に近い予測可能な半減期を有することにより、最も一般的な薬理学的必要性に対応するのに十分な長い時間の間、血流により運搬しかつ／または封入された物質を放出する担体赤血球を得ることが可能であることを示している。
【００６０】
本明細書に記載する赤血球の集団の優れた生存能力は、得られた赤血球の代謝能の評価によっても確認される。代謝能の評価は、当分野の専門家に知られているように、その生存に必要な生化学的機能を保持する細胞の能力の指標である。赤血球は、エネルギー生産が、ラクテートが最終産物である解糖の生化学的経路に本質的に基づいている細胞である。本出願の目的を形成する赤血球の集団については、１０６赤血球につき産生されたラクテートの平均量は、０．１００ｎｍｏｌ／ｈより多い、すなわち、天然赤血球のものに非常に類似していることが示されている。
【００６１】
本出願の目的を形成する赤血球の集団に関する上記の生化学的／分子的特性は、この集団は、より高い生存能力と予想通りにより長い半減期を特徴としているため、有効成分の担体として、従来の技術水準において記載した赤血球の集団よりも効率的に使用することができることを示している。
【００６２】
本発明のさらなる目的は、本発明により得られた装填赤血球と薬理学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物である。
【００６３】
本明細書に記載する組成物は、赤血球の投与に好適でありかつ薬理学上重要な標的部位に到達するために適当な組成物である。従って、これらは、好ましくは、生理学的溶液、さらに、例えば、水性懸濁液（グルコースを含む）または従来技術に記載したとおりに処方されたもの中の非経口投与用の組成物である。限定されない例として、防腐剤、安定剤、糖および無機物等と合わせた水または緩衝液は、薬理学上許容される賦形剤として使用することができる。そのような組成物はまた、保存のために凍結乾燥形態である場合があり、使用前に好適な担体により再構成される。
【００６４】
本出願の方法は、異なる溶液を取り扱い、流量、重量オスモル濃度および容量を制御する血液濾過に好適な任意の公知の装置を用いて行い得る。好ましくは、装置および方法は、例えば、レッドセルローダー(Red Cell Loader)と呼ばれる医療用電気装置を使用することによって、好適なプログラムに基づいて自動操作される。
【００６５】
以前のイタリア特許出願ＢＯ２０１０Ａ０００２５５号明細書に記載されている装置と組み合わせて使用される、特許請求の範囲に従う方法を行うためのキットの例を、図３に示している。キットは以下の番号の構造要素を含む：
（１）低張溶液１用スパイクコネクター
（２）低張溶液２用スパイクコネクター
（３）注入用生理食塩溶液２リットルバッグ（洗浄）用スパイクコネクター
（４）廃棄バッグ用コネクター
（５）患者血液５０ｍＬ投入（５０ｍＬシリンジ）用ルアーコネクター
（６）最終回収バッグ
（７）廃棄バッグ
（８）移送バッグ
（９）レッドセルローダー側（機械の右側、スタンドポール側）のポンプ用コネクター
（１０）リザーバー（限外濾過液用）
（１１）血液濃縮フィルター
（１２）ボウル（血液分離および洗浄用のレーサムボウル）
（１３）貫通可能ポイント（薬物およびＰＩＧＰＡシーリング溶液の投入用）。
【００６６】
有効成分の好適な封入可能な薬剤による治療を必要とするいかなるタイプの疾患も、本発明の赤血球で有利に治療し得る。前記疾患の例は、デキサメタゾン、好ましくは、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウムで治療される毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴ）である。
【００６７】
ＡＴは、ＡＴＭ遺伝子の突然変異によって引き起こされる稀な遺伝性の常染色体劣性病変であり、罹患率は１：４０，０００／１：３００．０００である。ＡＴは、小脳の進行性神経変性を引き起こし、それにより進行性運動失調症（運動性崩壊）を引き起こす。ＡＴは、２歳頃に明らかになり、その変性はかなり速く、通常、１０代の頃には車椅子に拘束された状態に至る。主な神経症状は小脳性構音障害、ディスメトリアおよび眼球運動の協調運動障害であり、さらにそれらに錐体外路症状、例えば、舞踏病または動作緩慢などが蓄積し得る。患者は、感染症に非常にかかりやすく、通常、２０歳以降に、重度の肺合併症または白血病の発症により死亡する。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例における総ての実験詳細によって本発明を下に記載するが、それらは単に説明するものであり、本発明について限定するものではない。
【００６９】
実施例１：赤血球に装填するための方法
赤血球に装填するための方法を、下記に詳述するように、特許出願（ＩＴ）ＢＯ２０１０Ａ  ０００２５５号明細書およびＵ．Ｓ．６１／３７３，０１８号明細書に記載されている装置を用いて行った。
【００７０】
５６００ｒｐｍで回転する「レーサムボウル」型遠心システムを用いて全血５０ｍＬから分離した赤血球を、生理食塩溶液７５０ｍＬを用いて洗浄速度２２５ｍＬ／分で洗浄し、移送バッグに入れる。
【００７１】
重量オスモル濃度２００ｍＯｓｍ／ｋｇを有する第１の低張溶液の３００ｍＬ量を移送バッグに加え、これを、その後、撹拌プレート上で室温にて５分間インキュベートする。次いで、第１の低張溶液を、容量が約８０ｍＬに到達するまで遠心分離（ボウル）により除去する。
【００７２】
このようにして濃縮された赤血球を移送バッグに戻し入れ、これに、次いで、重量オスモル濃度１８０ｍＯｓｍ／ｋｇを有する第２の低張溶液６４ｍＬを加える。
【００７３】
その後、移送バッグをプレート上で撹拌下、室温で５分間インキュベートする。インキュベーション後、赤血球を、血液濃縮フィルターを用いて濃縮し、限外濾過液約８０ｍＬをリザーバーに収集し、これに、真空ポンプを用いてわずかな負圧を印加する。このようにして濃縮された赤血球を、その後、回収し、移送バッグへ移す。目的薬物、この実施例では、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム（２５ｍｇ／ｍＬ）を、注入用溶液を得るために水約１１ｍＬと予め混合し（調製物は重量オスモル濃度約２０ｍＯｓｍ／ｋｇを有する）、移送バッグへの注入により濃縮した赤血球に加えた。この作業は５分以内に行わなければならない。その後、移送バッグの内容物をプレート上で撹拌下、室温で１０分間インキュベートする。次いで、シーリング溶液（重量オスモル濃度３８００ｍＯｓｍ／ｋｇを有する）３ｍＬ量を加える。この添加は５分以内に行わなければならない。移送バッグを撹拌プレート上で３７℃±２で３０分間インキュベートする。次いで、赤血球をボウルに入れ、生理食塩溶液１１００ｍＬを用いて流速２２５ｍＬ／分で十分に洗浄する。最後に、このようにして得られた装填赤血球を最終回収バッグへ移す。本方法の合計時間は約１時間３０分である。
【００７４】
実施例２：封入の有効性
本発明に記載する方法は、表１に示されるように、公知の方法（方法１）と比べてほぼ１０倍以上高い、有効成分（この実施例では、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム）の封入効率（導入）を提供する。
【００７５】
具体的には、全血５０ｍＬを出発材料として使用した。上記方法の有効成分装填段階（工程ｄ）中に、公知の方法（すなわち、ＥＰ０８８２４４８号明細書によるもの）については、ＤＳＰ（デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム）２５ｍｇ／ｍＬを２０ｍＬ加え、本発明の方法（方法２）においては、注入用水１１ｍＬとともに同じＤＳＰ溶液を２．５ｍＬだけ加える。
【００７６】
方法１または２に従って装填した赤血球中のＤＳＰ含有量の分析は、煮沸し、水およびメタノールで希釈することにより赤血球の内側から有効成分を抽出した後、ＨＰＬＣ装置を使用して行った。結果を表１に報告する。
【００７７】
【表１】
0006367314.tif 000002
【００７８】
実施例３：赤血球中でのラクテート産生
健常ドナー由来全血のバッグを使用した。ドナーの赤血球の初期の一部を未処理のサンプルとして使用した。全血５０ｍＬ量を、本発明の方法を用いて処理した。本方法の終了時に、処理した赤血球の３０ｍＬを収集し、遠心分離によりヘマトクリット４０％にした。次いで、各サンプルにグルコースを加え、これらを３７℃で３時間インキュベートし、３０分ごとに上清中のラクテートの蓄積（解糖経路によるグルコースのラクテートへの変換）を分析する。分析は、血液ガス分析装置を使用することによって行った。
【００７９】
未処理のＲＢＣ（赤血球）のラクテート産生は、本明細書に記載する方法を用いて得られたＲＢＣのラクテート産生と同等である。この結果は、表２に示されるように、本発明の目的を形成する本方法によって得られた赤血球が、未処理の赤血球（対照）のものに類似した効率で、グルコースをラクテートへ変換するそれらの主な代謝機能（解糖）を維持することができることを示している。
【００８０】
【表２】
0006367314.tif 000003
【００８１】
実施例４：装填赤血球の半減期
本明細書に記載する方法により装填した赤血球の推定半減期を、下記に詳述するように、細胞死（老化）のマーカーであることが知られている細胞表面上のアネキシンＶを測定することにより評価した。
【００８２】
具体的には、健常ドナー由来全血のバッグを使用した。ドナーの赤血球の初期の一部を未処理のサンプルとして使用した。全血５０ｍＬ量を、本発明の方法を用いて処理した。本方法の最終産物と未処理のサンプルからそれぞれ１０６量の赤血球を採取した。それらをアネキシンＶの反応緩衝液で希釈し、ＦＩＴＣ蛍光色素とコンジュゲートしたアネキシンＶ  ３μｌを添加し、フローサイトメトリーによる分析を行った。
【００８３】
下記表３に示されるように、未処理の対照での０．７５％から、本明細書に記載する方法を用いて得られた赤血球の６．２６％までのアネキシンＶの増加は、後者がまだ循環中に長時間残存する高い能力を有しているという事実を示している。輸血目的のための赤血球に基づく製品では、文献により、本明細書に記載する方法を用いて得た装填赤血球について得られたアネキシンＶ値に類似した値が報告されている(Relevy H. et al., 2008)。
【００８４】
【表３】
0006367314.tif 000004
【００８５】
実施例５：封入用量の変化
本発明の方法は、下記表４に示されるように、使用する薬物の初期用量を単に変化させることにより、非常に広範囲な治療域の、有効成分、例えば、ＤＳＰ（デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム）などの用量を封入することが可能である。具体的には、各実験および各ＤＳＰ初期量に対して、全血５０ｍＬを使用した。公知の方法（ＥＰ０８８２４４８号明細書）によるＤＳＰの装填については、ＤＳＰ  ２５ｍｇ／ｍＬを２０ｍＬ量加えた。
【００８６】
本明細書に記載する方法の場合、用量２５０、１２５、６２．５および５０についてはそれぞれ、ＤＰＳ  ２５ｍｇ／ｍＬの１０ｍＬ、５ｍＬ、２．５ｍＬおよび２ｍＬを、それぞれ注入用水１１ｍＬで予備混合して加えた。赤血球に封入されたＤＳＰの分析には、蒸留水での最初の１：１０希釈、タンパク質を変性させるためのサンプル煮沸工程、続いて、遠心分離および水とメタノールでの抽出が必要である。封入されたＤＳＰの分析は、ＨＰＬＣによって行った。結果を表４に報告する。
【００８７】
【表４】
0006367314.tif 000005
【００８８】
実施例６  高分子量の有効成分の封入
本明細書の方法はまた、高分子量のタンパク質、例えば、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）などの封入も可能であり、下記表５に示されるように、最初の製品の封入効率は１５％より高い。
【００８９】
具体的には、本明細書に記載する封入処理を行った健常ドナー由来全血の５０ｍＬを使用した。封入した有効成分はタンパク質ヘキソキナーゼであった。有効成分添加工程では、注入用水１４ｍＬに溶解したＨＫ  ２００ｍｇを加えた。
【００９０】
【表５】
0006367314.tif 000006
【００９１】
実施例７：赤血球への装填に対する赤血球浸透圧抵抗の影響
総ての個体は、固有の赤血球浸透圧抵抗（ＲＧＯ）を有し、赤血球浸透圧抵抗は装填処理の結果に影響を与える可能性がある。下記に示すデータは、異なる浸透力を有するドナーが非常に類似した薬物装填を維持することを示している。従って、本発明の方法は、表６のデータによって示されるように、類似の公知の方法について示されているものとは異なって、患者の初期ＲＧＯにより大きな影響を受けないことが証明されている。
【００９２】
異なる個体のＲＧＯに基づいた赤血球内への製品装填の変動性を決定するために、本発明において記載する方法を、５０ｍｇに相当するＤＳＰ（デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム）の初期用量で使用した。異なるＲＧＯを有する異なる５個体由来の全血５０ｍＬから合計５試験を行った。
【００９３】
各個体の赤血球浸透圧抵抗は、全血の一部を漸減濃度のＮａＣｌを含有する溶液で希釈することにより（８つの異なる重量オスモル濃度値）、各溶液中の遊離ヘモグロビンを測定し、重量オスモル濃度の関数として総遊離ヘモグロビンのグラフを作成することにより測定した（図１参照）。その後、ＲＧＯ値（溶血５０％または遊離ヘモグロビン５０％時点の重量オスモル濃度に相当する）を、得られた前記曲線の内挿によって得た。放出されたヘモグロビンを、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬を用いて分光光度計が示した値で定量した(Drabkin DL. Med Sci 1949)。最終赤血球中に装填されたＤＳＰ（デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム）の分析は、煮沸による溶解、水−メタノールでの抽出およびＨＰＬＣの後に行った。結果を表６に報告する。
【００９４】
【表６】
0006367314.tif 000007
【００９５】
上記表６に示されるように、本明細書に記載する方法において、異なる初期ＲＧＯ（１４１〜１５３ｍＯｓｍ／ｋｇ）を有する個体の赤血球中へのデキサメタゾンリン酸エステルナトリウム（ＤＳＰ）の装填は、薬理学上異なる効果があると想定することができるような変化を示さなかった（平均装填１０．０±０．４ｍｇ／バッグ）。個体のＲＧＯの変化と比較して、封入されるＤＳＰの変化は、これらの実施例に記載するように、薬理学的観点から無視できるほどのものである。
【００９６】
実施例８：赤血球への装填に対する初期ヘマトクリットの変化の影響
初期血液のヘマトクリットに基づいた赤血球への装填の変動性を決定するために、本発明において記載する方法を、６２．５ｍｇに相当するＤＳＰ（デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム）の初期用量で使用した。
【００９７】
異なる５個体に関して合計１０試験を行った（各ドナーについて、ヘマトクリット約４０％で１ヘマトクリット試験およびヘマトクリット約５０％で１試験）。各ドナーのヘマトクリットの標準化は、初期血液の遠心分離または希釈によって行った。最終赤血球中に装填されたＤＳＰの分析は、煮沸による溶解、水−メタノールでの抽出およびＨＰＬＣの後に行った。結果を表７に報告する。
【００９８】
【表７】
0006367314.tif 000008
【００９９】
表７に報告したデータによって示されるように、異なる初期ヘマトクリット値（ヘマトクリット４０％〜５０％）を有する個体の赤血球中へのデキサメタゾンリン酸エステルナトリウムの装填は、非常に一定しており（１１．４１〜１１．１９ｍｇ／最終バッグ）、統計的有意性のある変化を示さず（対応のあるデータのスチューデントのｔ検定(t-Student test)でｐ＞０．０５）、本明細書に記載する方法パラメーターを変える必要はない。これらの実施例において記載する個体の高度に有意な変化である（対応のあるデータのスチューデントのｔ検定でｐ＜０．００１）初期ヘマトクリットの１０％変化と比較して、封入されるＤＳＰの変化は、薬理学的観点から無視できるほどのものである。
【０１００】
実施例９：従来技術および本発明の赤血球を用いたＡＴの治療：
臨床試験ＩＥＤＡＴ−０１
ＩＥＤＡＴ−０１（またはＩＥＤＡＴ）と呼ばれる臨床試験を、イタリアの２つの大学施設、ブレシア・ローマ市民病院(Brescia-Rome-Civil Hospital)およびラ・サピエンツァ大学(La Sapienza University)で行った。本試験に登録された毛細血管拡張性運動失調症を有する患者を、ＥＰ０８８２４４８号明細書（旧手順）による従来技術により作出した赤血球に封入されたデキサメタゾンリン酸エステルナトリウムで治療した。これは期間６ヶ月の前向きオープン試験であった。患者は療法ＥｒｙＤｅｘ、すなわち、患者自身の赤血球に封入されたデキサメタゾンリン酸エステルナトリウムを月１回の間隔で受けた
【０１０１】
合計２２名の患者が年齢４〜１９歳の間で登録された。このうち１８名は、６ヶ月間提供された治療を規則どおりに完了した。本試験の主要有効性評価項目は、評価尺度ＩＣＡＲＳ（「国際協調運動評価尺度（International Cooperative Ataxia Rating Scale）」）によって測定した。この評価尺度は、治療開始前に得られた値ＩＣＡＲＳ（ベースライン）と６ヶ月の治療期間の終了時に得られた値を比較して、神経症状の変化を評価するものである。本試験の主要評価項目の結果（ｐ＝０．０２）と副次的評価項目の結果は統計的に有意であった。これは、本試験を終了していない場合を含め、本試験に加わった２２名の患者総てを含むＩｎｔｅｎｔ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ（ＩＴＴ）解析対象集団、およびそうではなく６ヶ月の治療を完了した患者だけを考慮するＰｅｒ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＰＰ）解析対象の両方において示されている。
【０１０２】
安全性の観点から、治療は、本試験に加わった患者において良好な忍容性を示すことが見出される。
【０１０３】
ＩＣＡＲＳ
１９９７年にＴｒｏｕｉｌｌａｓによって開発された尺度ＩＣＡＲＳ（「国際協調運動評価尺度（International Ataxia Rating Scale）」）は、運動失調などの小脳機能障害（小脳）に関連する症候群の最も一般的な神経学的徴候を評価し、標準化するために、神経学者によって使用される最も頻度の高いツールである。ＩＣＡＲＳは、様々な介入的臨床試験において、特に、フリードリッヒ運動失調症で、評価項目測定基準として使用された。ＩＣＡＲＳは、以下の領域：姿勢異常および歩行異常；運動機能；眼球運動障害ならびに言語障害、に関連する４つの下位尺度に分かれた半定量的尺度である。最大合計スコアは１００点である（０点は健常な被験者に相当し、１００点は最重症度の患者状態に相当する）。
【０１０４】
旧手順および新規手順を用いたＩＥＤＡＴ、コンパッショネート研究および神経学的改善
ＩＥＤＡＴ試験を２２名の患者ＡＴにおいて行った。その目的は、尺度ＩＣＡＲＳを通じて患者の神経学的状態に与えるＥｒｙＤｅｘ治療（公知の手順により自己赤血球(red blood cells)に封入されたデキサメタゾンリン酸エステルナトリウム）の効果を測定することであった。
【０１０５】
ＩＥＤＡＴ試験に参加した４名の患者は、臨床試験実施計画書、いわゆる、「コンパッショネート使用(Compassionate Use)」により、本試験の終了後にＥｒｙＤｅｘによる治療を継続した。
【０１０６】
ＩＥＤＡＴ試験の間、手順によりデキサメタゾンリン酸エステルが装填された赤血球を使用した（ＥｒｙＤｅｘ旧手順、特許ＥＰ０８８２４４８号明細書に記載のとおりである）。コンパッショネート使用に加わった４名の患者は、旧手順を用いた治療ＥｒｙＤｅｘを継続し、その後（平均５回の治療後）、本出願により記載する手順によって得られるＥｒｙＤｅｘでの治療に進んだ（ＥｒｙＤｅｘ、新規手順）。この手順は、これまでの手順と比較して有意な改善をもたらす。
【０１０７】
下記表８は、旧手順による４名の患者ＡＴの治療が、コンパッショネート使用での５ヶ月の治療継続後に、ＩＣＡＲＳ試験のベースラインと比較して尺度ＩＣＡＲＳの３．２５点の改善をもたらしたことを示している。５．９％の改善率に対応するこの値は、臨床的観点から控えめな値であると判断されるはずである。実際に一般的には、ＩＣＡＲＳ尺度の改善１０％未満は、神経学者によって重要でないと考えられる。
【０１０８】
新規手順により得られるＥｒｙＤｅｘ治療への変更後に４名の患者において観察される利益は特に明白である。実際には、旧手順による治療後に観察されるＩＣＡＲＳの値と比較して、平均改善はＩＣＡＲＳ  ６．７５点（１３．１％）であった。新規手順は、赤血球の特定の特性の改善（患者の赤血球に非常に類似している）と、薬物の封入のより良好な再現性により、臨床的観点から神経学的に高い関連性がある改善を得ることができた。ＩＥＤＡＴ試験開始からコンパッショネート研究終了まで、ＥｒｙＤｅｘで治療した合計４名の患者は、ＩＣＡＲＳ値１０点、または１８．３％（下記表の最後の列）の平均改善を示した。このデータは、試験実施期間中にＥｒｙＤｅｘ治療を受けなかった、平均してＩＣＡＲＳ尺度で７点の悪化を示した患者ＡＴにおいて観察されたものと比較する際にもさらに重要なものである。
【０１０９】
【表８】
0006367314.tif 000009
【０１１０】
図４に示すグラフは、旧手順および新規手順（互いに連続する）による治療期間の両端における４名の患者のＩＣＡＲＳ値を示している。４名の患者のうち３名（患者０２−０２、０２−０５、０２−０８）に関する内挿直線の傾きは、新規手順による治療期間中に明らかに大きくなっている。大きくなった傾きは、新規手順の使用期間中に、患者の神経学的状態が旧手順による治療期間（なんと１つのケースで、患者０２−０２は、実に悪化を示している）よりも短期間で改善することを明らかに示している。新規手順を用いた場合に、１名の患者（０２−０１）でのみ改善の速度がより遅い。しかしながら、この患者は、先行する治療によって非常に顕著な改善を既に達成し、新規手順によって神経学的状態がさらに改善している。
【０１１１】
神経学的状態の漸進的改善は、高度な治療認容性に関連した、旧手順により得られるＥｒｙＤｅｘ治療にあまりまたは全く反応しなかった患者においても、新規手順によりおよび本発明により得られるＥｒｙＤｅｘ療法により、毛細血管拡張性運動失調症に罹患している患者にもたらされる大きな臨床的利益を示している。
【図１】
0006367314.tif 000010
【図２】
0006367314.tif 000011
【図３】
0006367314.tif 000012
【図４】
0006367314.tif 000013