(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重鎖キメラ抗原受容体（CAR）であって、少なくとも以下：
‐  少なくとも一つの細胞外リガンド結合ドメインを含む一つの膜貫通ポリペプチド、ここで、少なくとも一つの細胞外リガンド結合ドメインは細胞表面分子と相互作用する単鎖抗体断片（scFv）である、および、
‐  少なくとも一つのシグナル伝達ドメインを含む一つの膜貫通ポリペプチド、
を含み、
多重鎖キメラ抗原受容体のシグナル伝達ドメインが、細胞外リガンド結合ドメインを保有するものとは異なるポリペプチド上に存在する、多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項２】
少なくとも一つの膜貫通ポリペプチドが、Fc受容体の一部を含む、請求項１に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３】
当該Fc受容体の一部が（a）FcεRIα鎖、（b）FcεRIβ鎖および（c）FcεRIγ鎖からなる群より選択される、請求項２に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項４】
当該Fc受容体の一部がFcεRIα鎖の一部である、請求項３に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項５】
FcεRIα鎖の一部およびFcεRIβ鎖の一部を、当該FcεRI鎖が一緒に二量体化して二量体キメラ抗原受容体を形成するように含む、請求項３または４に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項６】
FcεRIα鎖の一部およびFcεRIγ鎖の一部を、当該FcεRI鎖が一緒に三量体化して三量体キメラ抗原受容体を形成するように含む、請求項３または４に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項７】
FcεRIα鎖の一部、FcεRIβ鎖の一部、およびFcεRIγ鎖の一部を、当該FcεRI鎖が一緒に四量体化して四量体キメラ抗原受容体を形成するように含む、請求項３または４に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項８】
細胞外リガンド結合ドメインが、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項９】
当該膜貫通ポリペプチドがさらにストーク領域を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１０】
当該シグナル伝達ドメインが、TCRζ鎖、FCεRβ鎖、FCεRIγ鎖、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ITAM）からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１１】
当該ＣＡＲが共刺激ドメインを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１２】
さらにCD28、OX40、ICOS、CD137およびCD８からなる群より選択される共刺激分子を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１３】
配列番号202〜204および配列番号206〜213からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多重鎖CARを構成する膜貫通ポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
（a）免疫細胞を提供する工程；
（b）当該細胞の表面で少なくとも一つの、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を発現させる工程、
を含む、免疫細胞を操作する方法。
【請求項１７】
（a）免疫細胞を提供する工程；
（b）当該細胞に少なくとも一つの、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を構成する少なくとも一つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する工程、
（c）当該細胞中に当該ポリヌクレオチドを発現させる工程、
を含む、請求項１６に記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項１８】
（a）免疫細胞を提供する工程；
（b）当該細胞の表面で、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体の集団を発現させる工程、
を含む、請求項１６に記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項１９】
（a）免疫細胞を提供する工程；
（b）当該細胞に、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドを導入する工程、
（c）当該細胞中に当該ポリヌクレオチドを発現させる工程、
を含む、請求項１７に記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項２０】
さらに、
（d）当該免疫細胞中でTCRα、TCRβ、CD52、GR、および免疫チェックポイントからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を不活性化させる工程、
を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法から得られる、単離された免疫細胞。
【請求項２２】
少なくとも一つの、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を含む、単離された免疫細胞。
【請求項２３】
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球またはヘルパーTリンパ球に由来する、請求項２１または２２に記載された、単離された免疫細胞。
【請求項２４】
医薬としての用途のための、請求項２１から２３のいずれか一項に記載された、単離された免疫細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体（CAR）に関する。CARはリガンド結合ドメインの特性を利用して、選択された目標に向かって免疫細胞の特異性と反応性を回復（redirect)することができる。特に、本発明は、細胞外リガンド結合およびシグナル伝達ドメインが、その機能を向上させるために異なった膜貫通ポリペプチドに分離された多重鎖キメラ抗原受容体に関する。一度組み立てた本発明の多重鎖CARを構成する異なった膜貫通ポリペプチドは、標的中の1つまたはいくつかのリガンド（複数可）に結合し、それらが発現される免疫細胞および免疫応答の活性化を誘導することができる。また、本発明は、その表面に前記多重鎖CARを発現するような膜貫通ポリペプチド及び単離された細胞をコードする、免疫療法のためのポリヌクレオチド、ベクターに関する。また、本発明は、その表面に、多重鎖CARを発現する免疫細胞を操作するための方法に関する。本発明は、癌およびウイルス感染症を治療するための効率的な養子免疫療法戦略への道を開くものである。
【背景技術】
【０００２】
エクスビボで生成された自己抗原特異的T細胞の移動を含む養子免疫療法は、ウイルス感染および癌を治療するための有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の拡大または遺伝子工学を介してT細胞を回復することによって生成することができる（Park、Rosenbergら、2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の移動は、移植に関連するウイルス感染および稀ウイルス関連悪性腫瘍の治療に使用される十分に確立された手順である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および転送は、黒色腫を治療するのに成功したことが示されている。
【０００３】
T細胞における新規な特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CARs）の遺伝的伝達を介して生成された（Jena、Dottiら2010）。CARは、単一の融合分子の1つ以上のシグナル伝達ドメインに関連付けられている標的部分からなる合成受容体である。一般的には、CARの結合部分は、光と柔軟なリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の可変フラグメントを含む、単鎖抗体（scFv）の抗原結合ドメインからなる。レセプターまたはリガンドドメインに基づいた結合部分も成功裡に使用されている。第一世代のCARのためのシグナル伝達ドメインはCD3zetaの細胞質ドメインまたはFc受容体γ鎖に由来する。第一世代のCARがT細胞の細胞傷害性を成功裏に回復することが示されているが、それらは、インビボで長期の膨張および抗腫瘍活性を提供することができなかった。CD28、OX-40（CD134）、および4-1BB（CD137）などの共刺激分子からのシグナル伝達ドメインが、生存性を増強し、CARで改変されたＴ細胞の増殖を増加させるために、単独で（第二世代）または組み合わせ（第三世代）て追加された。CARは成功裏にT細胞を、リンパ腫および固形腫瘍を含む種々の悪性腫瘍からの腫瘍細胞の表面で発現される抗原に対して回復させた（Jena、Dottiら2010）。
【０００４】
現在のCARのアーキテクチャは、関連するすべてのドメインが単一のポリペプチドの中に含まれているデザイン（米国7,741,465）に基づいて構築されている。このデザインは、シグナル伝達ドメインのシリアル追記を必要とするので、形質膜から遠位である、それらの天然膜近傍位置から、いくつかのドメインを移動する必要がある。それにもかかわらず、リガンドとシグナル伝達ドメインがそれらの通常の膜近傍位置に分離している（すなわち、その内側の細胞膜に隣接している）アーキテクチャは、より望ましいであろうし、共刺激ドメインの改善された機能を可能にすると思われる。IgEに対する高親和性受容体（FcεRI）が、このようなアーキテクチャを与えることができ得るであろう。実際に、肥満細胞および好塩基球上に存在するFcεRIは、リガンド結合αサブユニット、βサブユニットと2つのシグナル伝達のガンマサブユニットのホモ二量体からなる四量体複合体である（Metzger、Alcarazら1986）。FcεRIαドメインは、IgEに結合する2つのIg様ドメイン、膜貫通ドメインおよび短い細胞質テールを含む細胞外ドメインからなる。βサブユニットには、アミノ末端およびカルボキシ末端細胞質尾部を分離する4つの膜貫通セグメントが含まれている。γ鎖は、本質的に、膜貫通領域、および1つの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ITAM）を含む細胞質尾部からなる（Cambier 1995）。
【０００５】
養子免疫療法を使用した患者の治療のための現在のプロトコルは、自己細胞転送に基づいている。このアプローチでは、Tリンパ球が患者から回収され、ex vivoで遺伝子的に修飾されまたは選択され、必要に応じて細胞数を増幅するために、in vitroで培養され、最終的に患者に注入される。リンパ球の注入に加えて、ホストは、例えばプリコンディショニング（放射線療法または化学療法を含む）及びリンパ球の増殖因子（例えばIL-2）の投与のような、T細胞の移植または免疫応答への参加をサポートする他の方法で操作することができる。各患者は、患者自身のリンパ球（すなわち自家療法）を使用した、個別に製作された治療を受ける。
【０００６】
自家療法は実用化のためにはかなりの技術的および理論的なハードルに直面しており、彼らの世代は高価な専用施設や専門要員を必要とし、それらは、患者の診断後短時間で生成する必要があり、多くの場合、患者の前処理は、劣化した免疫機能をもたらした患者のリンパ球は機能的に不十分で非常に少数で存在するであろう。これらのハードルのため、各患者の自家細胞調製は事実上新製品であり、有効性と安全性に大幅な変動がもたらされる。理想的には、同種異系治療細胞が事前に製造され得、詳細に特徴づけられ、患者にすぐに投与することができる、標準化された治療を使用したい。同種異系により、細胞は同じ種に属する個体から得られるが、遺伝的に類似していないことを意味する。しかし、同種異系細胞の使用は、現在、多くの欠点を有する。免疫適格宿主において同種異系細胞は急速に拒否される、対ホスト移植片拒絶（HvG）と呼ばれるプロセスがあり、これは、実質的に移植された細胞の有効性を制限する。免疫不適格ホストでは、同種細胞は生着することができるが、それらの内因性のTCR特異性は宿主組織を異物として認識し、その結果、深刻な組織の損傷や死につながる可能性のある移植片対宿主病（GvHD）になる。効果的に同種異系細胞を使用するために、これらの問題の両方を克服しなければならない。
【０００７】
免疫適格宿主では、同種異系細胞は宿主免疫系によって急速に拒絶される。非照射血液製剤中に存在する同種異系白血球は5〜6日まで持続することが実証されている（Boni、Muranskiら2008）。したがって、同種異系細胞の拒絶を防止するためには、宿主の免疫系を効果的に抑制されなければならない。グルココルチコイドステロイド（Glucocorticoidsteroids）は広く免疫抑制のために治療的に使用されている（CoutinhoとChapman 2011）。このクラスのステロイドホルモンは、T細胞の細胞質ゾルに存在するグルココルチコイド受容体（GR）に結合して核への転座をもたらし、免疫学的プロセスに関与する多数の遺伝子の発現を調節する特定のDNAモチーフに結合する。T細胞のグルココルチコイドステロイドでの処置Tによりサイトカイン産生レベルが減少してT細胞アネルギーをもたらし、T細胞活性化に干渉する。また、CAMPATH1-Hとして知られるアレムツズマブは、12アミノ酸のグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）に連結された糖タンパク質であるCD52を標的とするヒト化モノクローナル抗体である（WaldmannとHale、 2005）。顆粒球および骨髄前駆体に存在しないながら、CD52はTおよびBリンパ球で高レベルで、および単球上で低レベルで発現される。CD52に対するヒト化モノクローナル抗体アレムツズマブを用いた治療は、循環するリンパ球および単球の急速な枯渇を誘導することが示されている。これは、しばしばT細胞リンパ腫の治療で使用されており、特定の例では移植コンディショニングレジメンの一部として使用されている。しかし、養子免疫療法の場合には免疫抑制剤の使用はまた、導入された治療用T細胞に有害な影響を有するであろう。したがって、これらの条件で、養子免疫療法のアプローチを効果的に使用するために、導入された細胞は、免疫抑制治療に耐性である必要がある。
【０００８】
一方、T細胞受容体（TCR）は、抗原の提示に応答したT細胞の活性化に関与する細胞表面受容体である。TCRは、一般に、ヘテロ二量体を形成するために集合し、CD3-伝達サブユニットと会合して細胞表面上に存在するT細胞受容体複合体を形成する二つの鎖、αおよびβからなる。TCRのαおよびβ鎖のそれぞれは、免疫グロブリン様N末端可変（V）および定常（C）領域、疎水性膜貫通ドメイン、および短い細胞質ドメインからなる。免疫グロブリン分子については、α鎖およびβ鎖の可変領域は、T細胞集団内の抗原特異性の大きな多様性を生成する、V（D）J組換えによって生成される。しかし、無傷の抗原を認識する免疫グロブリンとは対照的に、T細胞は、T細胞による抗原認識に余分な次元を導入するMHC分子に関連して処理されたペプチド断片によって活性化され、MHC制限として知られている。T細胞受容体を介したドナーとレシピエントの間のMHC格差の認識は、T細胞の増殖およびGVHDの潜在的な発展につながる。TCRの通常の表面発現は、複合体の7つのすべてのコンポーネントの協調合成およびアセンブリに依存することが示されている（AshwellとKlusner 1990）。TCRαまたはTCRβの不活性化は、したがって、同種抗原の認識およびGVHDを防止するT細胞の表面からのTCRの除去をもたらすことができる。しかし、TCRの破壊はCD3シグナル伝達構成要素の除去の結果となり、さらなるT細胞増殖の手段を変更する。
【０００９】
T細胞媒介性免疫は、免疫応答を微調整する、共刺激および阻害シグナルをとの間のバランスによって調節される複数の連続工程を含む。免疫チェックポイントとも称される抑制性シグナルは、自己寛容の維持に重要であり、また免疫介在性の付随的な組織損傷を制限する。免疫チェックポイントタンパク質の発現は、腫瘍によって調節解除することができる。これらの阻害経路組み入れる腫瘍の能力は、免疫抵抗の重要なメカニズムを表し、免疫療法の成功を制限します。治療的T細胞免疫応答を活性化する有望なアプローチの一つは、これらの免疫チェックポイントの遮断である（Pardoll、2012）。免疫チェックポイントは、癌における機能的な細胞性免疫の活性化に対する重要な障壁を表し、CTLA4およびプログラム死1（PD-1）を含む、T細胞上の阻害性リガンドの特異的なアンタゴニスト抗体は、臨床で評価されている標的化剤の例である。
【００１０】
細胞傷害-Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4;またCD152としても知られる）はT細胞活性化の振幅を下方制御し、アンタゴニストCTLA4抗体（イピリムマブ）での治療は、メラノーマ患者の生存利益を示した（Robert とMateus 2011）。プログラム細胞死タンパク質1（PD1またはPDCD1、CD279としても知られている）は、免疫療法のための別の非常に有望な標的を表す（PardollとDrake 2012; Pardoll 2012）。CTLA-4とは対照的に、PD1は、感染に対する炎症反応の際に末梢組織でのT細胞エフェクター機能を制限し、自己免疫を制限する。PD1抗体を用いた最初の臨床試験は、腫瘍退縮のいくつかのケースを示している（Brahmer、Drakeら2010）。複数の追加的な免疫チェックポイントタンパク質は最近の研究に基づいた治療障害のための有望な標的を表す。
【００１１】
正常T細胞において、T細胞受容体は未成熟胸腺細胞によって発現されるプレT細胞受容体（PTCR）から発し、二重陰性（CD4- CD8-）ステージから二重陽性(CD4+ CD8+)へのT細胞の発達のために重要である。TCRβ座の生産的な再構成に成功するプレT細胞は不変プレTα鎖及びCD3シグナル伝達成分と対になってプレTCR複合体を形成するための機能的TCRβ鎖を発現する。細胞表面でのプレTCRの発現は、T細胞の発達の拡大を誘導し、TCRβ遺伝子座の対立遺伝子排除を強制し、その結果TCRα座における再編成を誘導する工程である、ベータ選択をトリガするために必要である、（von Boehmer 2005 ）。生産的なTCRα再編成と、成熟したTCRを形成するためのTCRαによるpＴαの置換の後、胸腺細胞は、胸腺上皮細胞上に発現する自己ペプチドMHC複合体の結合時におけるは正またはTCRα/βの選択と称される、選択の第2段階を受ける。したがって、成熟したT細胞はそれらのTCRを介して抗原/ MHC複合体を認識し、応答する。 TCR活性化の最も直接的な結果は、T細胞のクローン増殖、細胞表面上での活性化マーカーの上方制御が、および細胞毒性またはサイトカイン分泌の誘導を含む複数のイベントをもたらす関連するCD3サブユニットを介したシグナル伝達経路の開始である。
【００１２】
なぜなら胸腺発達中のプレTαとのペアリングを介したTCRβ鎖の選択の性質により、TCRαが不活性化されたT細胞において、pTα導入遺伝子の異種導入はプレTCRの形成をもたらすことができる。このpTCRは、MHC非依存性であるようにしてT細胞の活性化または刺激する手段として機能することができ、したがって例えばTCRα不活化に続くα/βT細胞の継続的な拡大を可能にする。重要なことは、pTCR複合体は、関連するCD3サブユニットの面でTCRと同様の生化学的組成を表示することである(Carrasco, Ramiro ら、2001)。また、TCRとは対照的に、プレTCRシグナル伝達は、リガンド非依存性事象によって部分的に起こり得る。pTCR細胞外ドメインの結晶構造は、PTCRシグナル伝達の可能性のあるリガンド-非依存性のための構造的基礎を提供した。pTCRは２つのpTα-TCRβヘテロ二量体が関連付けられるhead-to-tail 型二量体を形成することが示されている(Pang, Berry ら 2010)。
【００１３】
悪性または感染した細胞を標的とすることができる治療グレードの設計された免疫細胞の開発の文脈では、発明者は、自然のものに近く、あらゆる細胞外の単一または多重特異性リガンド結合ドメインを使用してそのように動作する可能性が高いであろう、改善されたCARアーキテクチャのために模索してきた。
【００１４】
その結果、彼らは「多重鎖CAR」と称する、本発明の異なるポリペプチドサブユニットを含む新世代のCARを設計した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】（米国特許第7,741,465号）
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】（Park、Rosenbergら、2011）
【非特許文献２】（Jena、Dottiら2010）
【非特許文献３】（Cambier 1995）
【非特許文献４】（Boni、Muranskiら2008）
【非特許文献５】（CoutinhoとChapman 2011）
【非特許文献６】（WaldmannとHale、 2005）
【非特許文献７】（AshwellとKlusner 1990）
【非特許文献８】（Pardoll、2012）
【非特許文献９】（Robert とMateus 2011）
【非特許文献１０】（PardollとDrake 2012;）
【非特許文献１１】Pardoll 2012
【非特許文献１２】（Brahmer、Drakeら2010）
【非特許文献１３】（von Boehmer 2005 ）
【非特許文献１４】(Carrasco, Ramiro ら、2001)
【非特許文献１５】(Pang, Berry ら 2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
先行技術では、キメラ抗原受容体（CAR）はシグナル伝達ドメインのシリアル追記を必要とする単一の融合分子として存在する。しかし、それらの天然の膜近傍位置からのシグナル伝達ドメインを除去すると、その機能を妨害する。したがって、この欠点を克服するために、本発明者らは、すべての関連するシグナル伝達ドメインの膜近傍位置を可能にする、いわゆる多重鎖CARを設計することに成功した。多重鎖CARシグナル伝達ドメインは、それらが膜近傍の位置に着座するように、異なるポリペプチド鎖上に配置される。例えば、多重鎖CARは、scFvなどの細胞外リガンド結合ドメインで、FcεRIα鎖の高親和性IgE結合ドメインを置換することにより由来することができ、FcεRIのβおよび/またはγ鎖のNおよび/またはC末端尾部は正常膜近傍位置にシグナル伝達ドメインを配置するために使用される。膜近傍の位置に残ったシグナル伝達ドメインが、免疫細胞応答を活性化する一方で、細胞外リガンド結合ドメインは、細胞標的に向けたT細胞の特異性を回復する役割を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
膜近傍位置におけるシグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインを保有するものとは異なるポリペプチド（単数または複数）に存在するという事実は、CARのためのより柔軟なアーキテクチャを提供する。従って、付加的なシグナル伝達ドメインまたは共刺激ドメインは、CARのリガンド結合ドメインとその受容体との間に求められる相互作用の強さに応じて、CARに追加または削除することができる。CARのアーキテクチャにおけるこの柔軟性は、追加の細胞外リガンド結合ドメイン（複数可）を導入することを可能にする。これは、第二のリガンド結合ドメインを第一のリガンド結合ドメインを保有するポリペプチドに融合させることによって、または追加の細胞外リガンド結合ドメインを導入することによって、行うことができる。この第二のリガンド結合ドメインが異なる特異性を持っている場合、これは、二重特異的多鎖CARを形成し、付加的なものがあれば、多重特異性多重鎖CARを形成する。これらは、それらの表面に存在する二つ以上の異なる受容体を担持する特定の細胞またはウイルスを標的化する観点から特に有利である。これはこのような多重鎖CARの、前記細胞またはウイルスに向けた特異性を向上させる。もう一方で、シグナル伝達ドメインの数は、異なる結合ドメインに対するそれぞれのシグナルの変調を可能にすることができる。また、CARを構成する各組換えポリペプチドは、CARの活性をさらに調節するために異なる発現レベルで独立して発現させることができる。
【００１９】
本発明は、この新しいCARアーキテクチャ、それをコードする組換えポリヌクレオチド、免疫細胞がいかなる性質及び目的であろうと、特定の細胞認識のために免疫細胞を操作する方法、に対して描かれている。
【００２０】
本発明はさらに、免疫療法の目的のためにこのような免疫細胞をより好ましいものにするための方法を提供する。
【００２１】
例えば、免疫細胞は、さらに、初代細胞におけるTCRαまたはβ遺伝子を不活性化することによっておよび/または異なる免疫抑制のための標的をコードする遺伝子の不活性化、特にCD52およびGR（グルココルチコイド受容体）、を結合することによって、さらに前記免疫抑制剤の耐性細胞を選択することによって、非アロ反応性の、および/または免疫抑制剤に耐性であるように設計することができる。
【００２２】
遺伝的に改変された免疫細胞の上記の概念に加えて、本発明はまた、細胞中にプレTαを過渡的に発現させ、それによって機能的なα/βTCR不存在下で機能的CD3複合体を復元するることによって、例えば、TCRαが不活性化されたときの増殖を可能にするように設計されている実施形態に関する。
【００２３】
遺伝的に非常に活性な改変免疫細胞を操作するために、本発明はまた、免疫チェックポイントがPD1およびCTLA-4のような遺伝子の発現の欠如によってブロックされる方法も提供する。
【００２４】
本出願は、特に医薬として使用されるT細胞、さらに特定すると、生体にそのような免疫細胞を投与することによって癌を治療または予防するための、操作された免疫細胞をさらに開示する。
【００２５】
図や表の簡単な説明
前述の特徴に加えて、本発明はさらに、以下の説明から、ならびに添付の図面に明らかになる他の特徴を含む。本発明のより完全な理解と付随する利点の多くは、以下の詳細な説明と併せて以下の図面を参照することによって容易に得られ、またそれはより深く理解されるようになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図1は、T細胞と抗原提示細胞との間の通常の関係の模式図である。
【図２】図2は、本発明の遺伝的に改変された治療用T細胞と患者の腫瘍細胞の模式図である。
【図３】図3は、多重鎖CARの模式図である。
【図４】図4は、多重鎖CARの異なるバージョンの模式図である。A. FcεRI受容体の概略図。B〜C．scFvおよび、FcεRIα鎖の膜貫通ドメインに融合されたCD8のストーク領域を含む多重鎖CARの異なるバージョン（csml〜csmlO）。少なくとも一つ41BB、CD28および/またはCD3ゼータドメインは、FcεRIα、βおよび/またはγ鎖に融合させることができる。
【図５】図5は、免疫療法のためのヒト同種異系細胞を操作する方法の一例の模式図である。
【図６】図6は、補体またはコントロールと抗CD52抗体（CAMPATH1-H）で処理した後の生きているCD52陽性またはCD52陰性細胞のミリリットルあたりの細胞数濃度を示す図である。
【図７】図7は、前方側方散乱（FSC）分布の比較を表し、TCR陽性およびTCR陰性細胞、またはCD52陽性およびCD52陰性細胞の間の、および対照として非活性化細胞との間の、細胞の大きさの指標を表す。
【図８】図8は、目標のCD52とTCRα不活性化T細胞上のCD107aの発現（脱顆粒のマーカー）のフローサイトメトリー分析を表す。（A）CD107の発現は、CD52 + TCRαβ+細胞（最初のカラム）、CD52- TCRαβ-細胞（第2カラム）、CD52- TCRαβ+細胞（第3列）及びCD52 + TCRαβ-細胞（第4カラム）上で、ダウディ細胞とインキュベートの前（A）と後（B）で分析された。 C）さらにCARでトランスフェクトし、ダウディ細胞とインキュベートしたT細胞のフローサイトメトリー分析を表す。 D）はCARでトランスフェクトしたが、Daudi細胞とインキュベートしていないT細胞のフローサイトメトリー分析を表す。E）は、CARでトランスフェクトし、PMA /イオノマイシンで処理されたT細胞（陽性対照）のフローサイトメトリー分析を表す。
【図９Ａ】図9Aおよび9Bは、CD52のディープシークエンシング解析とTRAC TALEヌクレアーゼの潜在的なオフサイト（off-site）標的を示す図である。出現順に、それぞれ、配列番号149から165として「左半分標的」配列を、及び配列番号166から182として「右半標的」配列を、開示している。
【図９Ｂ】図9Aおよび9Bは、CD52のディープシークエンシング解析とTRAC TALEヌクレアーゼの潜在的なオフサイト（off-site）標的を示す図である。出現順に、それぞれ、配列番号149から165として「左半分標的」配列を、及び配列番号166から182として「右半標的」配列を、開示している。
【図１０】図10は、T7エンドヌクレアーゼアッセイによるPDCD1およびCTLA-4ゲノム遺伝子座の分析を示す図である。
【図１１】図11は、プレTα構築物のいくつかの例の模式図である。
【図１２】図12は、TCRα不活性化されたJurkat細胞における形質導入効率（％BFP+細胞）とFL、Δ18、Δ48pTα構築物（CD3表面発現％）の活性のフローサイトメトリー分析を表す。
【図１３】図13は、pＴαタンパク質（プレTCRa）のためのレンチウイルス構築物をコードの模式図。
【図１４Ａ】図14Aは実験プロトコルを表す。
【図１４Ｂ】図14BはBFP-2A-pＴαΔ48（ΚΟ/Δ48）または対照BFPレンチウイルスベクター（KO / BFP）で精製の前と後に形質導入したTCRα不活性化T細胞（KO）上でのTCRα/β、CD3及びBFP発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１４Ｃ】図14CはBFP-2A-pＴαΔ48レンチウイルスベクターで形質導入した（BFPpos）かしていない（BFPneg）精製されたTCRα不活性化細胞上のTCRα/βおよびCD3発現のフローサイトメトリー分析を表す。NEPは、TRAK TALE-ヌクレアーゼとの非エレクトロポレーション細胞を表す。
【図１５】図15：A-B．BFP-2A-PTα-Δ48レンチウイルスベクター（pΤα-Δ48）、BFP-2A-pTα-Δ48.41BBレンチウイルスベクター（pΤα-Δ48.BB）またはコントロールBFPベクター（BFP）で形質導入した非エレクトロポレーション細胞（NEP）及びTCRα不活性化細胞（KO）上でそれぞれ抗CD3 / CD28ビーズで再活性化した24及び48時間後の初期活性化マーカーCD69（A）、後期活性化マーカーCD25（B）の発現のフローサイトメトリー分析を表す。pΤα-Δ48ヒストグラムはpΤα-Δ48を発現しているTCR不活化細胞（BFP +細胞）で検出された信号に対応しており、一方、KOヒストグラムはpΤα-Δ48（BFP-細胞）pΤα-Δ48を発現しないTCRα不活性化された細胞に対応している。pTα-Δ48.ΒΒヒストグラムはpTα-Δ48.41ΒΒ（BFP +細胞）を発現するTCR不活性化された細胞で検出された信号に対応しており、一方でKOヒストグラムはpTα-Δ48.41ΒΒ（BFP-細胞）を発現しないTCRα不活性化された細胞に対応している。NEP（非エレクトロポレーション）のヒストグラムは、非操作の細胞中で検出された信号に対応している。C. BFP-2A-pTα-Δ48のレンチウイルスベクター、BFP-2A- pTα-Δ48.41BBレンチウイルスベクター（pTα-Δ48.BB）または対照BFPベクター（BFP）で形質導入された非エレクトロポレーション細胞（NEP）及びTCRα不活性化細胞（KO）上でそれぞれ抗CD3/CD28ビーズで再活性化した72時間後の再活性化後の細胞の大きさのフローサイトメトリー分析を示す図である。各グラフの上部に示された値は、各集団の蛍光の幾何平均に対応する。
【図１６】図16は、異なる時点（x軸）で抗CD3 / CD28ビーズと一緒にIL2またはIL2で維持されたpＴα-Δ48（pTaΔ48）または対照BFPベクター（BFP）で形質導入されたTCRα不活化細胞（KO）の細胞増殖分析を表す。BFP +細胞の数は、各条件について異なる時点で推定され、これらの細胞の誘導倍率（y軸）は、再活性化後2日目に得られた値について推定された。結果は、二つの独立したドナーから得られる。第二のドナーについて、細胞増殖もpＴα-Δ48.41BB（pTa-Δ48）及び全長pTα-（pTa-FL）で形質導入した細胞について決定した。
【図１７】図17は、5つの異なるCytopulseプログラムでエレクトロポレーションしたPBMC上でのGFP陽性細胞のフローサイトメトリー分析。A. NEP、EP＃1（GFP）とEP＃2（GFP）; B. EP＃3（pUC）、EP＃4（GFP）とEP＃5（GFP）。上側の線は、キュベットあたり3×106細胞のトランスフェクションに対応しており、下の線はキュベットあたり6×106細胞のトランスフェクションに対応している。
【図１８】図18は、生存色素（eFluor-450）を用いた、精製したT細胞の死亡率と、GFP mRNA、 GFP DNA及び対照pUC DNAと一緒にエレクトロポレーションした後の生存集団の中のGFP陽性細胞のフローサイトメトリー分析を表す。 図18： NTおよびNEP。 B. EP（DNAなし）とGFP DNA; C. pUC DNAとGFP mRNA。 NEPは、エレクトロポレーション緩衝液中で維持したが、エレクトロポレーションされなかった細胞に対応し、およびNTは、培養培地中で維持した、エレクトロポレーションしていない細胞に対応する。
【図１８−１】図18は、生存色素（eFluor-450）を用いた、精製したT細胞の死亡率と、GFP mRNA、 GFP DNA及び対照pUC DNAと一緒にエレクトロポレーションした後の生存集団の中のGFP陽性細胞のフローサイトメトリー分析を表す。 図１８−１：EP（DNAなし）とGFP DNA;および pUC DNAとGFP mRNA。
【図１９】図19は、TRAC TALEヌクレアーゼmRNAエレクトロポレーション（上）後のヒト初代T細胞上のTCRα/βおよびCD3発現のフローサイトメトリー分析。
【図２０】図20：A.単鎖CARをコードするmRNAと一緒にまたはなしで T細胞をエレクトロポレーションした後の、CARの発現（抗F（ab'）2）のフローサイトメトリー分析。B. ダウディ細胞と共培養しエレクトロポレーションしたT細胞上のCD107aの発現（脱顆粒のマーカー）のフローサイトメトリー分析。
【図２１】図21：A.多重鎖CARをコードするmRNAを表す。 B. 多鎖CARをコードするポリシストロン性mRNAと一緒にまたはなしでエレクトロポレーションした後の生存T細胞上でのCARの発現（抗F（ab'）2）のフローサイトメトリー分析。C. ダウディ細胞と共培養しエレクトロポレーションしたT細胞上のCD107aの発現（脱顆粒のマーカー）のフローサイトメトリー分析。
【図２２】図22は、ポリシストロン性mRNAのエレクトロポレーション後のヒトT細胞における多重鎖CARの発現を表す。
【図２３】図23は、マルチサブユニットCARsの発現は、3鎖α、β、γの発現によって調整されることを示す。
【図２４】図24は、過渡的に多重鎖CARを発現するヒトT細胞の標的細胞との共培養の後の脱顆粒を示す。
【図２５】図25：過渡的に多重鎖CARを発現するヒトT細胞の標的細胞との共培養後のサイトカイン分泌を示す。
【図２６】図26は、ヒトT細胞は過渡的に多重鎖CARの溶解標的細胞を発現することを表す。
【００２７】
表1：ヒトGR遺伝子におけるTALE-ヌクレアーゼ標的部位のGR TALE-ヌクレアーゼおよび配列の説明。
表2：酵母中でのGR TALE-ヌクレアーゼの切断活性。値は、0と1の間に含まれている。最大値は1である。
表3：293細胞における内因性TALEヌクレアーゼ標的部位における標的突然変異誘発の割合。
表4：初代Tリンパ球における内因性TALEヌクレアーゼ標的部位における標的突然変異誘発の割合。
表5：ヒトの対応する遺伝子におけるTALE-ヌクレアーゼ標的部位のCD52、TRAC及びTRBC TALE-ヌクレアーゼ並びに配列の説明。
表6：TRAC及びCD52 TALE-ヌクレアーゼのための追加の標的配列。
表7： CD52_T02、TRAC_T01、TRBC_T01とTRBC_T02ターゲットを標的とするTALEヌクレアーゼについてのインデルの割合。
表8：対応するTALEヌクレアーゼ発現ポリヌクレオチドのトランスフェクション後のCD52-陰性、TCR-陰性およびCD52 / TCR-二重陰性Tリンパ球の割合。
表9：TRBC TALE-ヌクレアーゼ発現ポリヌクレオチドのトランスフェクション後のTCR陰性Tリンパ球の割合。
表10： CTLA4とPDCD1 TALE-ヌクレアーゼおよびヒトの対応する遺伝子におけるTALE-ヌクレアーゼ標的部位の配列の説明。
表11：pＴα構築物のサブセットの説明。
表12：Jurkat TCRα不活性化された細胞内の異なるpＴα構築物の活性。活性は異なるプレTα構築物でトランスフェクトしたJurkat TCRα不活性化細胞上のCD3発現のフローサイトメトリー分析により測定した。
表13：PBMC由来T細胞におけるエレクトロポレーションのために必要な最小電圧を決定するために使用される異なるcytopulseプログラム。
表14：精製されたT細胞をエレクトロポレーションするために使用されるCytopulseプログラム。
表15：多重鎖CARのバージョンのFcR鎖組成物の説明。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書に具体的に定義しない限り、使用される全ての技術的および科学的用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。
【００２９】
本明細書に記載のものと類似または同等のすべての方法および材料は、本明細書に記載されている適切な方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができる。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、特に断りのない限り、限定することを意図するものではない。
【００３０】
本発明の実施は、特に示さない限り、当該技術分野の技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技術を使用するであろう。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds. -in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed. ); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes l-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照。
【００３１】
多重鎖キメラ抗原受容体（CAR）
本発明は、特に、免疫療法に使用する免疫細胞に適合多重鎖キメラ抗原受容体（CAR）にも関する。
【００３２】
本発明の多重鎖CARは一般的には、少なくとも、以下：
- 少なくとも一つの細胞外リガンド結合ドメインを含む1つの膜貫通ポリペプチド;および
- 少なくとも一つのシグナル伝達ドメインを含む1つの膜貫通ポリペプチド；を、前記ポリペプチドは一緒に組み立てられて多重鎖キメラ抗原受容体を形成するためにるように、含む。
【００３３】
本明細書で使用する用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、リガンドに結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドと定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択することができる。このようなリガンドとして作用することができる細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌および寄生虫感染、自己免疫疾患および癌細胞に関連するものが挙げられる。具体的には、細胞外リガンド結合ドメインは、標的抗原に対する抗体由来の抗原結合ドメインを含むことができる。非限定的な例として、標的の抗原は、ErbB2（HER2 / neu）、癌胎児性抗原（CEA）などの腫瘍関連表面抗原、上皮細胞接着分子（EpCAM）、上皮成長因子受容体（EGFR）、EGFR変異体III（EGFRvlll）、CD19、CD20、CD30、CD40、ジシアロガングリオシドGD2、乳管上皮ムチン、gp36、TAG-72、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、B-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、腸のカルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ、プロスターゼ特異的抗原（PSA）、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、prostein、PSMA、surviving 及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1（PCTA-1）、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン成長因子（IGF1）-l、IGF-II、IGF-I受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエキストラドメインA（EDA）、エキストラドメインB（EDB）およびテネイシンCのA1ドメイン（TnC A1）と線維芽細胞関連タンパク質（fap); CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）のような系統特異的または組織特異的抗原、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子、BCMA（CD269、TNFRSF 17）、または（例えば、HIV gp120のような）HIV特異的抗原などのウイルス特異的表面抗原; EBV特異的抗原、CMV特異的抗原、HPV特異的抗原、ラッセウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原、並びにこれらの表面マーカーいずれかの誘導体もしくは変異体であってもよい。
【００３４】
細胞外リガンド結合ドメインはまた、標的の抗原に結合しているペプチド、標的の抗原に結合している抗体に結合しているペプチドまたはタンパク質、非限定的な例として、標的上の受容体に結合している増殖因子、サイトカイン、またはホルモン等のペプチドもしくはタンパク質、非限定的な例として、標的上のペプチドまたはタンパク質リガンドに結合している増殖因子受容体、サイトカイン受容体、またはホルモン受容体等の受容体に由来するドメインを含んでもよい。好ましくは、標的は、細胞またはウイルスである。好ましい実施形態では、当該細胞外リガンド結合ドメインは、柔軟なリンカーによって連結された標的抗原に特異的なモノクローナル抗体の軽（VL）及び重（VH）可変フラグメントを含む単鎖抗体断片（scFv）である。好ましい実施形態では、前記scFvは、抗CD19 scFVであり、好ましくはscFV-4G7である(Peipp et al., J Immunol Methods. 2004 Feb 15;285(2):265-80) (VH: 配列番号: 193 and VL: 配列番号: 194, scFV: 配列番号: 195)。
【００３５】
scFvの以外の結合ドメインは、非限定的な例として、ラクダ科動物単一ドメイン抗体フラグメントまたは血管内皮増殖因子ポリペプチド、インテグリン結合ペプチド、ヘレグリンまたはIL-13ムテイン、結合抗体ドメイン、抗体の超可変ループ又はCDRのような受容体リガンド等のリンパ球の予め定義された標的化のために使用することができる。
【００３６】
好ましい実施形態では、貫通ポリペプチドはさらに細胞外リガンド結合ドメインおよび前記膜貫通ドメインとの間にストーク領域を含む。ここで使用される用語「ストーク領域」は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインをリンクするように機能する任意のオリゴ - 又はポリペプチドを意味する。特に、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインのためのより多くの柔軟性とアクセスを提供するために使用される。ストーク領域は、最大300個のアミノ酸、好ましくは10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸を含んでもよい。ストーク領域は、CD8、CD4またはCD28の細胞外領域の全部または一部のような、または抗体の定常領域の全てまたは一部のような、天然に存在する分子の全部または一部に由来することができる。あるいはストーク領域は、天然のストーク配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成ストーク配列であってもよい。好ましい実施形態では、ストーク領域はヒトCD8α鎖の一部である（例えばNP_001139345.1）（配列番号196）。
【００３７】
免疫細胞における多重鎖CARの発現は、選択的に定義された、それぞれ腫瘍関連表面抗原を担持する悪性細胞またはウイルス特異的表面抗原を担持するウイルスに感染した細胞、または系統特異的もしくは組織特異的な表面抗原を有する標的細胞を含むがこれらに限定されない標的を排除する改変された細胞という結果になる。
【００３８】
標的抗原の下方制御または変異は、一般に、癌細胞において観察され、抗原を損失した回避変異体を作成する。したがって、腫瘍エスケープをオフセットし、免疫細胞をより標的に特異的にするために、多重鎖CARはいくつかの細胞外リガンド結合ドメインを含むことができ、目標中で同時に異なる要素に結合し、それによって免疫細胞の活性化および機能を増強する。一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチドでタンデムに配置することができ、および任意選択のリンカーによって分離することができる。別の実施形態では、異なる細胞外リガンド結合ドメインを、多重鎖CARを構成する別の膜貫通ポリペプチド上に配置することができる。別の実施形態において、本発明は、それぞれ異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖CARの集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を提供し、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖CARの集団を該細胞の表面で発現させることを含む免疫細胞の操作方法に関する。別の特定の実施形態において、本発明は、免疫細胞を操作する方法に関する。免疫細胞を提供し、該細胞内に、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖CARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。特定の実施形態では、免疫細胞を操作する方法は、異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合しているFcεRIα鎖の複数の部分およびシグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIβおよび/またはγ鎖の少なくとも一部をその細胞表面で発現する工程を包含する。より特定の実施形態において、該方法は、該細胞中に、少なくとも1つのポリヌクレオチドを導入することを含み、該ポリヌクレオチドは  シグナル伝達ドメインと異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合されたいくつかのFcεRIα鎖に融合されたFcsRIβおよび/またはガンマ鎖の一部をコードする。多重鎖のCARの集団とは、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも2つの、3つ、4つ、5つ、6つまたはそれ以上の多重鎖CARを意味する。多重鎖のCARの集団とは、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも2つの、3つ、4つ、5つ、6つまたはそれ以上の多重鎖CARを意味する。本発明に係る異なった細胞外リガンド結合ドメ
インは、好ましくは、同時に標的中で異なる要素に結合することができ、それによって免疫細胞の活性化および機能を増強する。
【００３９】
また、本発明は、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖CARの集団を含む単離された免疫細胞に関する。
【００４０】
本発明の多重鎖CARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞および免疫応答の活性化をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合後の細胞内シグナル伝達を担っている。つまり、シグナル伝達ドメインは、多重鎖CARを発現する免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担っている。例えば、T細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であることができる。従って、用語「シグナル伝達ドメイン」は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、特化された機能を実行するために、細胞を指示するタンパク質の部分をいう。
【００４１】
多重鎖CARで使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例としては、抗原と受容体の関与後のシグナル伝達を開始するために一致して作用するFc受容体またはT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体又は変異体および同じ機能的能力としての任意の合成配列であることができる。シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナル配列の2つの異なるクラスを含み、抗原依存性の一次活性化を開始するものと、二次または共刺激シグナルを提供するために、抗原非依存的に作用するものを含む。主要な細胞質シグナル配列は、ITAMの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含むことができる。 ITAMは、Syk / ZAP70クラスチロシンキナーゼのための結合部位として作用する受容体の様々な細胞質内テールで見つかった良く定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明で使用されるITAMの例としては、非限定的な例として、TCRzeta、FcRgamma、FcRbeta、FcRepsilon、CD3gamma、CD3delta、CD3epsilon、CD5、CD22、CD79a、CD79b及びCD66dに由来するものを挙げることができる。好ましい実施形態では、多重鎖CARのシグナル伝達ドメインはCD3zetaシグナル伝達ドメイン、または、FcεRIのβまたはγ鎖の細胞質内ドメインを含むことができる。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明の多重鎖CARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率的な免疫応答が必要とされる抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」は、T細胞上の同族の共刺激分子に結合する抗原提示細胞上の分子であって、それによって、例えば、ペプチドを負荷したMHC分子とTCR / CD3複合体の結合によって提供される主シグナルに加えて、シグナルを提供し、T細胞応答を媒介し、増殖活性、分化などを含むことが挙げられるが、これらに限定されない。共刺激リガンドはCD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体とB7-H3と特異的に結合するリガンドを結合するアゴニストまたは抗体を含むことができるがこれらに限定されるものではない。共刺激リガンドはまた、とりわけ、これらに限定さなどはないが、特にCD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、特異的にCD83と結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を包含する。
【００４３】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これらに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答が媒介される、T細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激分子としては、これらにに限定されるものではないが、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体が含まれる。共刺激分子の例としては、CD27、CD28、CD8、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83などと特異的に結合するリガンドが含まれる。
【００４４】
別の特定の実施形態では、該シグナル伝達ドメインは、TNFR関連因子2（TRAF2）結合モチーフ、共刺激TNFR体ファミリーの細胞質尾部である。共刺激TNFRファミリーメンバーの細胞質尾部は、Xが任意のアミノ酸である、主要な保存されたモチーフ（P/S/A）X（Q/E）E）またはマイナーモチーフ（PXQXXD）、からなるTRAF2結合モチーフが含まれている。TRAFタンパク質は、受容体の三量化に応じて、多くのTNFRの細胞内尾に補充される。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明の多重鎖CARのシグナル伝達ドメインは、4-1BB（GenBank登録：AAA53133）及びCD28（NP_006130.1）からなる群から選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。特に、本発明の多重鎖CARのシグナル伝達ドメインは、配列番号200および配列番号201から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４６】
適切な膜貫通ポリペプチドの際立った特徴は、特に、リンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞等の、免疫細胞の表面で発現され、予め定義された標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を導くために一緒に相互作用する能力を有することである。本発明のマルチチェインCARの異なる膜貫通ポリペプチドは、標的リガンドとの結合後のシグナル伝達に関与して免疫応答を誘導するために一緒に相互作用する細胞外リガンド結合ドメインおよび/またはシグナル伝達ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然または合成源のいずれかから誘導することができる。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来することができる。非限定的な例としては、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γまたはδのようなT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体、IL2受容体P55（鎖）、P75（β鎖）またはγ鎖を構成するようなポリペプチド、Fc受容体のサブユニット鎖、特にフェイ受容体IIIまたはCDタンパク質であることができる。あるいは、膜貫通ドメインは、合成することができ、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含むことができる。好ましい実施形態では、FCEレセプター鎖またはその変異体から誘導される膜貫通ポリペプチドは特にFcεRIの一部（配列番号202）、β（配列番号203）および/またはγ鎖（配列番号204）またはその変種を含む。
【００４７】
「由来する」という用語は、Fcε受容体の配列の1つまたは複数のアミノ酸修飾を含むFcε受容体と等価であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。そのようなアミノ酸修飾（単数または複数）は、アミノ酸置換、欠失、付加、（単数または複数）またはそれらの修飾の任意の組合せを含むことができ、およびFc結合領域のFc受容体に対する相対的な生物学的活性を変化させることができる。一方、特定のFc受容体由来のFc結合領域は、実質的にFc受容体とのFc結合領域の相対的な生物学的活性を変化させない1つ以上のアミノ酸修飾を含むことができる。この種のアミノ酸修飾（単数または複数）は、典型的には、保存的アミノ酸置換を含むであろう。
【００４８】
特定の実施形態では、多重鎖CARは、FcεRI鎖に由来する膜貫通ポリペプチドを含む。さらに特定の実施形態において、FcεRI鎖は、細胞外ドメインが細胞外リガンド結合ドメイン、好ましくはscFV、より好ましくは、scFv-4G7（配列番号195、）で置換された鎖であるFcεRIα鎖である。
【００４９】
より特定の実施形態において、該多重鎖CARは、FcεRIα鎖の一部と、FcεRIβ鎖の一部またはそれらの変異体を含み、該FcεRI鎖は自発的に一緒に二量体化して二量体キメラ抗原状態を形成する。別の実施形態では、多重鎖キメラ抗原は、FcεRIα鎖の一部と、FcεRIγ鎖の一部またはそれらの変異体を含み、該FcεRIは一緒に三量化して自発的に三量体化してキメラ抗原受容体を形成し、別の実施形態では、多重鎖キメラ抗原受容体はFcεRIα鎖の一部と、FcεRIβ鎖の一部とFcεRIγ鎖の一部またはそれらの変異体を含み、FcεRI鎖が一緒に三量化して自発的に三量体化してキメラ抗原受容体を形成することができる。
【００５０】
言い換えれば、多重鎖CARは、以下のコンポーネント：
a）FcεRIα鎖の一部と細胞外リガンド結合ドメインを含む1つのポリペプチド、
b）FcεRIβ鎖の一部を含む一つのポリペプチド、および/または
c）FcεRIγ鎖の一部を含む一つのポリペプチド
の少なくとも2つを含み、それによって異なるポリペプチドが自然に一緒に多量体化して、二量体、三量体または四量体CARを形成する。
好ましい実施形態では、本発明の多重鎖CARは、配列番号202〜配列番号204からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部を含む。
【００５１】
本明細書で使用される用語「一部」は、より短いペプチドである分子の任意のサブセットを指す。あるいは、ポリペプチドのアミノ酸配列の機能的変異体は、ポリペプチドをコードするDNAの突然変異によって調製することができる。このような変異体もしくは機能的変異体は、アミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失、または挿入もしくは置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終構築物が、所望の活性を有する、特に、特定の抗標的細胞免疫活性を示すという条件で、最終構築物に到達するために行うことができる。宿主細胞内での本発明の多重鎖CARの機能は、特定の標的と結合する際の前記多鎖CARのシグナル伝達の潜在能力を実証するのに適したアッセイにおいて検出可能である。このようなアッセイは、当業者に利用可能である。例えば、このアッセイは、標的の結合で誘発され、シグナル伝達経路の検出を可能にする、例えば、カルシウムイオン放出の増加、細胞内のチロシンリン酸化、イノシトールリン酸代謝回転、の測定を含むアッセイであり、またはインターロイキン（IL）2、インターフェロンγ、GM-CSF、IL-3、IL-4の産生がこのようにもたらされることを含む。
【００５２】
非限定的な例として、多重鎖CARの異なるバージョンは、図4に示されている。より好ましい実施形態において、本発明の多重鎖CARは、配列番号206〜213からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、多重鎖CARは、配列番号206〜213からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％、97％または99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５３】
ポリヌクレオチド、ベクター
本発明はまた、ベクターは、本発明による上述の多重鎖CARをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は、多重鎖CARに含まれ得る、本明細書に開示される膜貫通ポリペプチドをコードするDNAおよびRNA分子を含むポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、上記の多重鎖CARを構成する少なくとも一つの膜貫通ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。より詳細には、本発明は上記の多重鎖CARを構成する膜貫通ポリペプチドをコードする2つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号214〜223からなる群より選択されるポリヌクレオチドに関連する。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号214〜223からなる群から選択される核酸配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％、97％または99％の配列同一性を有する。
【００５４】
ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば細菌宿主細胞に導入するためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、あるいは哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドまたはウイルスベクター）中にあってもよい。
【００５５】
特定の実施形態では、異なる核酸配列は、2Aペプチドをコードする配列等のリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む、１つのポリヌクレオチドまたはベクターに含まれ得る。ピコルナウイルスのアフトサブグループ（Aphthovirus subgroup）において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされる2つのアミノ酸間のペプチド結合を形成することなく、一つのコドンから次へとリボソーム「スキップ」を引き起こす（Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227- 4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)参照)。「コドン」とはリボソームによって一つのアミノ酸残基に翻訳されたmRNA（またはDNA分子のセンス鎖上）上の3つのヌクレオチドを意味する。したがって、2つのポリペプチドは、ポリペプチドが、フレーム内にある2Aオリゴペプチド配列によって分離されたmRNA内の単一の連続したオープンリーディングフレームから合成することができる。リボソームスキップ機構は当該技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされたいくつかのタンパク質の発現のために、いくつかのベクターによって使用されることが知られている。非限定的な例として、本発明では、細胞内に多鎖CARの異なるポリペプチドを発現するために2Aペプチドが使用されてきた。より好ましい実施形態では、本発明は、配列番号224〜232からなる群より選択されたポリヌクレオチドに関する。
【００５６】
宿主細胞の分泌経路にかかるFcεRなどの膜貫通ポリペプチドを向けるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる）は、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列に設けられている。分泌シグナル配列はFcεRのものであってもよいし、別の分泌タンパク質（例えば、t-PA）に由来するか、または新たに合成することができる。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に作動可能に結合されており、すなわち、2つの配列が正しいリーディングフレームで結合し、宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリペプチドを向けるように配置されている。ある分泌シグナル配列は、目的の核酸配列の他の場所に配置することができるが、分泌シグナル配列は一般的に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の5 'に位置している（例えば、Welchら、米国特許第5037743 ; Hollandら、米国特許第5143830を参照）。好ましい実施形態において、シグナルペプチドは、に、FcεRIα鎖（NP_001992.1）の１〜25の残基を含み、配列番号205のアミノ酸配列有する。
【００５７】
当業者は、遺伝コードの縮重を考慮すると、これらのポリヌクレオチド分子の間でかなりの配列変化が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は哺乳動物細胞における発現のために、好ましくはヒト細胞中での発現のために、コドン最適化されている。コドン最適化とは、目的の配列において、与えられた種の高発現遺伝子に一般にまれであるコドンを、このような種の高発現遺伝子において一般的に頻繁なコドンによって交換することを指し、そのようなコドンは、交換されたコドンのアミノ酸をコードしている。
【００５８】
好ましい実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号214〜223からなる群より選択される核酸配列を含む。本発明は、配列番号214〜222からなる群から選択される核酸配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％、97％99％の配列同一性をを有する核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００５９】
免疫細胞の操作方法
包含される特定の実施形態において、本発明は、免疫療法のために免疫細胞を調製する方法に関し、当該免疫細胞に多重鎖CARを含むポリペプチドを導入し、前記細胞を増殖させることを含む。特定の実施形態において、本発明は免疫細胞を操作する方法に関し、細胞を提供する工程と、少なくとも1つの上記多重鎖CARを上記細胞の表面で発現させる工程を含む。特定の実施形態において、本方法は、上記のように少なくとも1つの多重鎖CARを構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドで細胞を形質転換して、当該ポリヌクレオチドを当該細胞中で発現させることを含む。
【００６０】
別の実施形態において、本発明は、多重鎖CARを構成する異なるポリペプチドを前記細胞に導入し、該細胞を増殖させることを含む免疫療法用の細胞の調製方法に関する。好ましい実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、細胞中で安定に発現されることを考慮して、レンチウイルスベクターに含まれている。
【００６１】
別の実施形態では、該方法はさらに、TCRの一成分を発現する少なくとも一つの遺伝子、免疫抑制剤のための標的、HLA遺伝子および/またはPDCD1またはCTLA-4等の免疫チェックポイント遺伝子を不活性化することによって該細胞を遺伝的に改変する工程を含む。好ましい実施形態では、当該遺伝子はTCRα、TCRβ、CD52、GR、PD1およびCTLA-4からなる群から選択される。好ましい実施形態においては該方法はさらに、該T細胞に、該遺伝子のDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを導入することを含む。より好ましい実施形態ではレアカットエンドヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼである。本発明の好ましいTALEヌクレアーゼは、配列番号１〜６、配列番号37, 57〜60 (TCRα), 配列番号38または39 (TCRβ), および配列番号40, 配列番号61〜65 (CD52), 配列番号74〜78 (PD1 およびCTLA-4)からなる群より選択される標的配列を認識して切断するものである。
【００６２】
遺伝子の不活性化によって、目的の遺伝子が機能性タンパク質の形態で発現されないことが意図される。特定の実施形態では、本方法の遺伝的改変は、１つのレアカットエンドヌクレアーゼが一つの標的遺伝子の切断を特異的に触媒し、それによって、前記標的遺伝子を不活性化するような、1つのレアカットエンドヌクレアーゼの、提供された操作される細胞中での発現に依存している。レアカットエンドヌクレアーゼによって引き起こされた核酸鎖の切断は、一般的に、相同組換えまたは非相同末端結合（NHEJ）の別のメカニズムを介して修復される。しかし、NHEJはしばしば切断部位でDNA配列に変化をもたらすことになる不完全な修復プロセスである。メカニズムは、直接再ライゲーションを介した2つのDNA末端の再結合（CritchlowとJackson 1998）、または、いわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合（Ma、Kimら  2003）を含む。非相同末端結合（NHEJ）を介した修復は、しばしば小さな挿入または欠失をもたらし、特定の遺伝子ノックアウトを作成するために使用することができる。前記改変は、少なくとも一つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加であり得る。開裂誘導性の突然変異誘発事象、すなわちNHEJイベントに連続した突然変異誘発事象が発生した細胞は当技術分野で周知の方法によって同定および/または選択することができる。
【００６３】
他の実施形態では、本開示に記載された標的遺伝子を不活性化する能力を強化するために、突然変異誘発を増加させるために、追加の触媒ドメインを、レアカットエンドヌクレアーゼと一緒に、さらに、細胞に導入することができる。具体的には、追加の触媒ドメインは、DNA末端プロセシング酵素である。DNA末端プロセシング酵素の非限定的な例としては、5-3'エキソヌクレアーゼ、3-5'エキソヌクレアーゼ、5-3'アルカリ性エキソヌクレアーゼ、5 'フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、加水分解酵素およびテンプレート独立性のDNAポリメラーゼが含まれる。そのような触媒ドメインの非限定的な例は、hExol (EX01_HUMAN), 酵母 Exol (EX01_ YEAST), E.coli Exol, ヒト TREX2, マウスTREX1, ヒト TREX1, ウシ TREX1, ラットTREX1, TdT （末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ） ヒト DNA2, 酵母 DNA2 (DNA2_YEAST)からなる群から選択されるタンパク質ドメインのタンパク質ドメインまたは触媒的に活性な誘導体からなる。好ましい実施形態では、追加の触媒ドメインは、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、より好ましい実施形態において、追加の触媒ドメインは、TREXであり、より好ましくはTREX2触媒ドメインである（WO2012 / 058458）。別の好ましい実施形態において、触媒ドメインは、単鎖TREXポリペプチドによってコードされる。該追加の触媒ドメインは、任意選択的に、ペプチドリンカーによって本発明によるヌクレアーゼ融合タンパク質またはキメラタンパク質に融合されていてもよい。
【００６４】
エンドヌクレアーゼブレークは、相同組換えの割合を刺激することが知られている。したがって、他の実施形態では、方法の遺伝的改変工程は、配列と外因性核酸との間で相同組換えが生じるように、さらに細胞内に、標的核酸配列の一部に少なくとも相同な配列を含む外因性核酸を導入する工程を含む。特定の実施形態では、外因性核酸は、それぞれ、標的核酸配列の5 'および3'領域と相同である第一及び第二部分を含む。これらの実施形態では、該外因性核酸はまた、第1部分と第2部分との間に位置し、標的核酸配列の5'および3'領域と相同性を有しない第3部分を含む。標的核酸配列の切断に続いて、相同的組換え事象は、標的核酸配列と外因性核酸との間で刺激される。好ましくは、少なくとも50塩基対、好ましくは100bpを超える、より好ましくは200bpを超える塩基対の相同配列が該ドナー基質の中で用いられる。したがって、外因性核酸は、好ましくは200 bpから6000 bp、より好ましくは1000bpから2000bpである。実際に、共有された核酸の相同性は、ブレークの部位の上流及び下流の隣接する領域に位置し、導入される核酸配列は2つのアームの間に位置すべきである。
【００６５】
特に、該外因性核酸は、連続して当該切断の上流の配列との相同性のある第1の領域、TCRα、TCRβ、CD52、GR、免疫チェックポイント遺伝子からなる群から選択される標的遺伝子を不活性化する配列、および当該切断の下流の配列と相同性のある第2の領域を含む。当該ポリヌクレオチドの導入工程は、当該レアカットエンドヌクレアーゼの導入または発現と同時、前又は後、であってもよい。ブレークイベントが発生した標的核酸配列の位置に応じて、そのような外因性核酸を、遺伝子をノックアウトするために使用することができ、外因性核酸が該遺伝子のオープンリーディングフレーム内に位置する場合、または新しい配列または目的の遺伝子を導入することができる。そのような外因性核酸を使用した配列の挿入は、既存の標的遺伝子を改変するために使用することができ、前記遺伝子を修正または置換することによって（非限定的な例としてアレル交換）または標的遺伝子の発現を上方制御または下方制御することによって（非限定的な例として、プロモータースワップ）、前記標的遺伝子修正または置換が行われる。好ましい実施形態では、TCRα、TCRβ、CD52、GR、免疫チェックポイント遺伝子からなる群からの遺伝子の不活性化は、特定のTALE-ヌクレアーゼにより標的とされた正確なゲノム位置で行うことができ、ここで、特定TALEヌクレアーゼが開裂を触媒し、当該外因性核酸は、少なくとも相同性領域、及び、TCRα、TCRβ、CD52、GR、相同組換えにより一体化されている免疫チェックポイント遺伝子からなる群から選択される標的遺伝子を不活性化する配列を連続して含む。別の実施形態では、いくつかの遺伝子は、それぞれいくつかのTALEヌクレアーゼを用いること、及び、特定の遺伝子不活性化するための1つの定義された遺伝子およびいくつかの特定のポリヌクレオチドを標的とすることにより、連続的にまたは同時に、不活性化することができる。
【００６６】
付加的なゲノム改変工程により、TCRα、TCRβ、CD52、GR、免疫チェックポイント遺伝子からなる群から選択される別の遺伝子の不活性化を図ることができる。上記のように、付加的なゲノム改変工程は、以下：
（a）該細胞に、レアカットエンドヌクレアーゼが特異的に当該細胞のゲノムの一つの標的配列の切断を触媒するように、少なくとも1種の当該レアカットエンドヌクレアーゼを、当該細胞に導入する工程、
(b) 任意選択的に、該切断の上流の配列と相同性の第1の領域を含む外因性核酸、該細胞のゲノムに挿入される配列、及び該切断の下流の配列と相同性の第2の領域を該細胞に導入し、ここで、導入された外因性核酸が遺伝子を不活性化し、少なくとも一つの目的の組み換えタンパク質をコードする少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列を統合する、工程、
を含む不活性化工程とすることができる。別の実施形態では、該外因性のポリヌクレオチド配列は、TCRα、TCRβ、CD52、GR、免疫チェックポイント遺伝子からなる群より選択される遺伝子内に一体化される。
【００６７】
- 免疫抑制抵抗性T細胞：
特定の態様において、遺伝的改変細胞の工程の一つは以下を含む方法であってもよい：
（a）免疫抑制剤のための標的を発現する少なくとも一つの遺伝子を不活性化することによって、T細胞を改変する工程、及び
（b）任意選択的に該免疫抑制剤の存在下で前記細胞を増殖する工程。
免疫抑制剤は、作用のいくつかのメカニズムのいずれかによって免疫機能を抑制する物質である。言い換えると、免疫抑制剤は、免疫応答の程度および/または貪欲さ（voracity）を減少する能力によって示される化合物の役割である。非限定的な例として、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン2 α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素、コルチコステロイド又は免疫抑制代謝拮抗剤の阻害剤であってもよい。古典的な細胞傷害性免疫抑制剤は、DNA合成を阻害することによって作用する。他のものはT細胞の活性化を介して、またはヘルパー細胞の活性化を阻害することによって作用することができる。本発明による方法は、T細胞における免疫抑制剤の標的を不活性化することによって、免疫療法のためにT細胞に免疫抑制耐性を付与することができる。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、以下のような免疫抑制剤のための受容体であり得る：CD52、グルココルチコイド受容体（GR）、FKBPファミリー遺伝子メンバー及びサイクロフィリンファミリー遺伝子メンバー。
【００６８】
遺伝子の不活性化によって、目的の遺伝子が機能性タンパク質の形態で発現されないことが意図される。特定の実施形態では、本方法の遺伝的改変は１つのレアカットエンドヌクレアーゼが一つの標的遺伝子の切断を特異的に触媒し、それによって、前記標的遺伝子を不活性化するような、1つのレアカットエンドヌクレアーゼの、提供された操作される細胞中での発現に依存している。特定の実施形態では、細胞を操作する方法は、以下の工程の少なくとも1つを含むことを特徴とする。
(a)好ましくは、細胞培養物から、または血液試料から、T細胞を提供する工程と、
(b) 免疫抑制剤のための標的を発現する該T細胞中の遺伝子を選択する工程と、
(c)該T細胞にDNAを切断することによって、選択的に不活性化することができる、好ましくは二本鎖切断により該免疫抑制剤のための標的をコードする遺伝子をブレークする、レアカットエンドヌクレアーゼを導入する工程と、
(d)任意選択的に該免疫抑制剤の存在下で、当該細胞を増殖する工程。
より好ましい実施形態において、前記方法は以下の工程：
(a) 好ましくは、細胞培養物から、または血液試料から、T細胞を提供する工程と
(b) 免疫抑制剤のための標的を発現する該T細胞中の遺伝子を選択する工程と、
(c) 該T細胞を、DNAを切断することによって、好ましくは二本鎖切断により該免疫抑制剤のための標的をコードする遺伝子をブレークすることによって、選択的に不活性化することができる、レアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸で形質転換する工程と、
(d) 該T細胞中に該レアカットエンドヌクレアーゼを発現させる工程と、
(e) 任意選択的に該免疫抑制剤の存在下で、当該細胞を増殖する工程
を含む。
【００６９】
特定の実施形態では、該レアカットエンドヌクレアーゼは、CD52、GR、からなる群から選択される一つの遺伝子を特異的に標的とする。別の実施形態では、免疫抑制治療のための具体的な工程（b）の遺伝子はCD52であり、工程（d）又は（e）の免疫抑制治療はCD52抗原を標的とするヒト化抗体を含む。
【００７０】
別の実施形態では、免疫抑制治療のための具体的な工程（b）の遺伝子は、グルココルチコイド受容体（GR）であり、工程（d）又は（e）の免疫抑制治療はデキサメタゾンのようなコルチコステロイドを含む。
【００７１】
別の実施形態では、工程（b）の標的遺伝子は、免疫抑制治療のために具体的には、FKBPファミリー遺伝子メンバーまたはその変異体であり、工程（d）又は（e）の免疫抑制治療はタクロリムスまたはフジマイシン（fujimycin）として知られているFK506を含む。別の実施形態では、該FKBPファミリー遺伝子メンバーはFKBP12またはその変異体である。
【００７２】
別の実施形態では、工程（b）の遺伝子は、免疫治療のために具体的には、サイクロフィリンファミリー遺伝子メンバーまたはその変異体であり、工程（d）又は（e）の免疫抑制治療はシクロスポリンを含む。
【００７３】
別の実施形態では、該レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼであってもよい。好ましい実施形態では、該レアカットエンドヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼである。
本発明による好ましいTALEヌクレアーゼは、以下：
配列番号１〜６（GR）、及び
配列番号40、61〜65（CD52）
からなる群より選択される標的配列を認識及び切断するものである。
【００７４】
TALEヌクレアーゼは、配列番号1〜6及び配列番号40の標的配列を切断するために、それぞれ好ましくは、配列番号7〜18及び配列番号47〜48から選択されるポリペプチド配列を含む。
【００７５】
-       免疫療法のための高活性のT細胞
特定の態様において、細胞を遺伝的に改変する一つの特定の工程は、
(a) 少なくとも一つの免疫チェックポイント遺伝子を不活性化することによってT細胞を改変する工程と
(b) 前記細胞を増殖する工程、
を含む方法であってもよい。
【００７６】
T細胞媒介性免疫は、抗原特異的細胞のクローン選択、二次リンパ組織におけるそれらの活性化および増殖、抗原および炎症部位へのそれらの輸送、を伴う複数の順次の工程を含む、、、直接的エフェクター機能の実行、多数のエフェクター免疫細胞のための（サイトカイン及び膜のリガンドを介した）ヘルプの提供を含む。これらの各ステップは、応答を微調整する、刺激および阻害シグナルを相殺することによって調節される。なお、「免疫チェックポイント」がT細胞によって発現された分子のグループを意味することは、当業者によって理解されるであろう。これらの分子は、効果的にダウンモジュレートする「ブレーキ」として機能または免疫応答を阻害する。免疫チェックポイント分子としては、以下に限定されるものではないが、以下を含む：直接免疫細胞を阻害する、プログラム死1 (PD-1, としても知られている PDCD1またはCD279, アクセション番号: M_005018), 細胞傷害性T-リンパ球抗原4 (CTLA-4, CD152としても知られている, GenBank アクセション番号 AF414120.1), LAG 3 (CD223としても知られている, アクセション番号: NM_002286.5), Tim3 (HAVCR2としても知られている, GenBank アクセション番号: JX049979.1), BTLA (CD272としても知られている, アクセション番号: NM_181780.3), BY55 (CD160としても知られている, GenBank アクセション番号: CR541888.1), TIGIT (VSTM3としても知られている, アクセション番号: NM_173799), B7H5 (C10orf54としても知られている, マウスビスタ遺伝子のホモログ, アクセション番号: NM_022153.1), LAIR1 (CD305としても知られている, GenBank アクセション番号: CR542051.1), SIGLEC10 (GeneBank アクセション番号: AY358337.1), 2B4 (CD244としても知られている, アクセション番号: NM_001166664.1)。例えば、CTLA-4は、特定のCD4およびCD8 T細胞上に発現される細胞表面タンパク質である。抗原提示細胞上のそのリガンド（B7-1およびB7-2）によって係合されると、T細胞活性化およびエフェクター機能が阻害される。したがって、本発明は、免疫チェックポイント、特にPD1および/またはCTLA-4に関与する少なくとも1つのタンパク質を不活性化することにより、T細胞を遺伝的に改変することを含む、特に免疫療法のための、T細胞の操作方法に関する。
【００７７】
特定の実施形態では、細胞を操作する方法は、以下の工程の少なくとも1つを含むことを特徴とする：
(a) 好ましくは、細胞培養物から、または血液試料から、T細胞を提供する工程と
(b) 当該T細胞に、DNA切断によって、好ましくは、免疫チェックポイントタンパク質をコードする1つの遺伝子を二本鎖切断により、選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを導入する工程
(c) 前記細胞を増殖する工程。
【００７８】
より好ましい実施形態において、前記方法は以下：
(a) 好ましくは、細胞培養物から、または血液試料から、T細胞を提供する工程と
(b) 当該T細胞に、DNA切断によって、好ましくは、免疫チェックポイントタンパク質をコードする1つの遺伝子を二本鎖切断により、選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを導入する工程と、
(c) 当該レアカットエンドヌクレアーゼをT細胞中に発現する工程と、
(d) 前記細胞を増殖する工程、
を含む。
【００７９】
特定の実施形態では、当該レアカットエンドヌクレアーゼは、特異的にPD1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、TCRαおよびTCRβからなる群から選択される一つの遺伝子を標的とする。別の実施形態では、当該レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼであってもよい。好ましい実施形態では、当該アカットエンドヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼである。TALEヌクレアーゼにより、転写アクチベーター様エフェクター（TALE）由来のDNA結合ドメインと核酸標的配列を切断するための1つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を意図する(Boch, Schoize ら 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak ら 2010; Cermak, Doyle ら 2011; Geissler, Schoize ら 2011; Huang, Xiao ら 2011; Li, Huang ら 2011; Mahfouz, Li ら 2011; Miller, Tan ら 2011; Morbitzer, Romer ら 2011; Mussolino, Morbitzer ら 2011; Sander, Cade ら 2011; Tesson, Usal ら 2011; Weber, Gruetzner ら 2011; Zhang, Cong ら 2011; Deng, Yan ら 2012; Li, Piatek ら 2012; Mahfouz, Li ら 2012; Mak, Bradley ら 2012)。
【００８０】
本発明では、新規TALEヌクレアーゼは、養子免疫療法戦略のための関連遺伝子を正確に標的化するために設計されている。本発明による好ましいTALEヌクレアーゼは、以下配列番号 77、配列番号 78 (PD1)および 配列番号 74〜76 (CTLA-4)からなる群から選択される標的配列を認識及び切断するものである。本発明はまた、配列番号79〜88からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むTALEヌクレアーゼポリペプチドに関する。
【００８１】
本発明は、配列番号79〜88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％、97％99％の配列同一性をを有する核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。また、上記本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ベクターも、本発明の範囲に含まれる。この方法は、本開示で説明されているさまざまな方法のいずれかに関連付けることができる。
【００８２】
-非アロ反応性T細胞：
別の実施形態において、本発明は、同種免疫療法のために特に適切であり得る。この場合には、細胞を遺伝的に改変する工程のいずれかは、以下：
(a) T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1つの遺伝子を不活性化することにより、T細胞を改変する工程、
(b) 前記細胞を増殖する工程、
を含む方法であってもよい。
【００８３】
特定の実施形態では、本方法の遺伝的改変は１つのレアカットエンドヌクレアーゼが一つの標的遺伝子の切断を特異的に触媒し、それによって、前記標的遺伝子を不活性化するような、1つのレアカットエンドヌクレアーゼの、提供された操作される細胞中での発現に依存している。
【００８４】
特定の実施形態では、細胞を操作する方法は、以下の工程：
(a) 好ましくは、細胞培養物から、または血液試料から、T細胞を提供し；
当該T細胞に、DNA切断によって、好ましくは、T細胞受容体（TCR）をコードする少なくとも1つの遺伝子を二本鎖切断により、選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを導入する工程と、
(b) 前記細胞を増殖する工程、
の少なくとも1つを含む。
【００８５】
より好ましい実施形態において、前記方法は：
(a) 好ましくは、細胞培養物から、または血液試料から、T細胞を提供する工程と
(b) 該T細胞を、DNAを切断することによって、好ましくは二本鎖切断によりT細胞受容体（TCR）をコードする少なくとも1つの遺伝子をブレークすることによって、選択的に不活性化することができる、レアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸で形質転換する工程と、
(c) 該レアカットエンドヌクレアーゼを該T細胞中に発現する工程と、
(d)細胞表面上にTCRを発現しない形質転換されたT細胞をソーティングする工程と、
(e)当該細胞を増殖する工程
を含む。
【００８６】
別の実施形態では、当該レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼであってもよい。好ましい実施形態では、当該レアカットエンドヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼである。
本発明による好ましいTALEヌクレアーゼは、以下：
- 配列番号37、57〜60（TCRα）、
- 配列番号：38または39（TCRβ）、
からなる群より選択される標的配列を認識及び切断するものである。
配列番号37〜39のそれぞれの標的配列を切断するために、当該TALEヌクレアーゼは、好ましくは、配列番号41〜48、から選択されるポリペプチド配列を含むことを特徴とする。
【００８７】
-       プレTα
別の態様では、細胞を遺伝的に改変する別の工程は、pＴα（プレTCRαともいう）またはその機能的変異体を、前記T細胞に導入し、任意選択的にCD3複合体の刺激を介して、該細胞を増殖することを含む、TCRα欠損T細胞を増殖する方法であってもよい。好ましい実施形態では、方法は、以下：
a）CD3表面発現を支持するために、細胞を少なくともpＴαの断片をコードする核酸で形質転換する工程、
b）該細胞中に当該pＴαを発現させる工程、
c）任意選択的にCD3複合体の刺激を介して、前記細胞を増殖する工程
を含む。
【００８８】
本発明はまた、T細胞の増殖のための方法の工程を含む、免疫療法のためのT細胞を調製する方法に関する。
【００８９】
特定の実施形態では、pＴαポリヌクレオチド配列は、ランダムに、または他の相同組換えによって導入することができ、特に、挿入はTCRα遺伝子の不活性化に関連し得る。
【００９０】
本発明によれば、pＴαの異なる機能変異体が使用される。ペプチドの「機能的変異体」はペプチド全体またはそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する分子をいう。本発明のpＴαまたはその機能的変異体の「フラグメント」は、分子の任意のサブセット、すなわちより短いペプチドであることをいう。好適pＴαまたはその機能的変異体は、完全長pＴαまたはC末端切断pＴαバージョンであることができる。C末端切断pＴαはC末端に1つ以上の残基を欠いている。非限定的な例として、C末端切断pＴαバージョンは、タンパク質（配列番号107〜114）のC末端から18、48、62、78、92、110または114残基を欠く。さらに、ペプチドのアミノ酸配列変異体は、ペプチドをコードするDNAの突然変異によって調製することができる。このような機能的変種は、アミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失、または挿入もしくは置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを、最終構築物に到達させることができる、最終的な構築物は、特に機能的CD3複合体の回復である、所望の活性を保有することを条件とする。好ましい実施形態では、少なくとも1つの変異は、二量体化に影響を与えるために上記のような異なるpＴαバージョンに導入される。非限定的な例として、変異した残基はヒトpＴαタンパク質の少なくともW46R、D22A、K24A、R102AまたはR117Aまたは pＴαファミリーもしくはホモログメンバーでCLUSTALW法を用いて整列した位置であってもよい。好ましくは上記pＴαまたはその変異体は変異した残基W46R（配列番号123）または変異した残基D22A、K24A、R102AおよびR117A（配列番号124）を含む。特定の実施形態において、pＴαまたは変異体はまた、非限定的な例としてCD28、OX40、ICOS、CD27、CD137（4-1BB）、およびCD8（配列番号115〜120）などのシグナル伝達ドメインに融合している。上記のようにpＴαまたは変異体の細胞外ドメインはTCRαタンパク質TCRα（配列番号122）の、特に膜貫通および細胞内ドメインの断片に融合させることができる。 pＴα変異体はまたTCRα（配列番号121）の細胞内ドメインに融合させることができる。
【００９１】
別の実施形態では、当該pＴαバージョンは細胞外リガンド結合ドメインに融合され、より好ましくはpＴαまたはその機能的変異体は、結合標的抗原に特異的なモノクローナル抗体の光（VL）及び重（VH）の可変フラグメントを含む一本鎖抗体断片（scFV）に、柔軟なリンカーによって融合される。
【００９２】
非限定的な例として、pＴαまたはその機能的変異体のアミノ酸配列は、配列番号107〜124からなる群から選択される。いくつかの変動がこれらのポリペプチドが由来するゲノムデータから生じる可能性があるため、活性（機能的変異体）の有意な損失なしに、これらのポリペプチドに存在するアミノ酸の一部を置換する可能性を考慮して、本発明は、本特許出願において提供される配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％の同一性を共有する上記のポリペプチドのポリペプチドの変異体を包含する。
【００９３】
従って、本発明は、配列番号107〜124からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％、97％または99％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを含む。
【００９４】
TCRα欠損T細胞によって、機能的なTCRα鎖の発現を欠いている、単離されたT細胞を意味する。これは、様々な手段によって達成することができ、非限定的な例として、その細胞表面上に任意の機能的TCRαを発現しないようにT細胞を操作することにより、またはそれがその細胞表面上に非常に少ない機能的TCRα鎖を生成するようにT細胞を操作することによって、または突然変異または切断型のTCRα鎖を発現するようにT細胞を操作することによって達成することができる。
【００９５】
TCRα欠損細胞は、もはやCD3複合体を介して増殖することはできない。したがって、この問題を克服し、TCRα欠損細胞の増殖を可能にするために、pＴαまたはその機能的変異体を前記細胞中に導入して、機能的CD3複合体を復元する。好ましい実施形態では、該方法はさらに、該T細胞中に、T細胞受容体（TCR）の一成分をコードする一つの遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを導入することを含む。特定の実施形態では、当該rare-切断エンドヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼである。非限定的な例として、TALEヌクレアーゼは、配列番号37および配列番号57〜60からなる群から選択されるTCRαの遺伝子標的配列の一つに対して向けられる。好ましくは、TALEヌクレアーゼは、配列番号41および配列番号42からなる群から選択される。
【００９６】
またpＴαをコードする、特に上記の機能的変異体をコードするポリペプチドは本発明に包含される。好ましい実施形態において、本発明はCD28、OX40、ICOS、CD137、およびCD8などのシグナル伝達ドメインに融合されたpＴαまたはその機能的変異体に関する。より特定すると、本発明は、配列番号107〜124からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むpＴα機能的変異体にも関する。また、上述のpＴαまたはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチド、ベクターも本発明に包含される。
【００９７】
前記方法により得られる単離された細胞または感受性の細胞株も本発明の範囲に包含される。特に、当該単離された細胞または細胞株は、前記細胞にpＴαまたはCD3表面発現を支援するその機能的変異体を導入することによって得られる。好ましい実施形態において、当該単離された細胞または細胞株は、さらに、TCRα遺伝子を不活性化することにより遺伝的に改変されている。この遺伝子は、好ましくは、少なくとも1種のレアカットエンドヌクレアーゼによって不活性化される。好ましい実施形態ではレアカットエンドヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼである。
【００９８】
細胞を操作するために前記方法によって得られる感受性の単離された細胞または細胞株、特に、TCRα、TCRβ、CD52、GR、免疫チェックポイント遺伝子からなる群から選択される、少なくとも一つの遺伝子が不活性化されているT細胞も本発明の範囲に含まれる。
【００９９】
-       二重特異性抗体
さらなる実施形態によれば、前述のように、異なる方法により得られた操作されたT細胞は、さらに、二重特異性抗体を用いて露光することができる。ex vivoで患者に投与する前に、またはin vivoで患者への投与後に、当該T細胞は、二重特異性抗体にさらしてもよい。当該二重特異性抗体は、操作された細胞を標的抗原の近接にもたらすことを可能にする異なる抗原特性を有する2つの可変領域を含む。非限定的な例として、当該二重特異性抗体は、CD3などの腫瘍マーカー及びリンパ球抗原に対して方向づけられており、リダイレクト腫瘍に対する任意の循環T細胞を回復して活性化する能力を有する。
【０１００】
配送方法
上記異なる方法は、細胞内に、多重鎖CAR、pＴαまたはその機能的変異体、希少切断エンドヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、CARを、任意選択的にDNAエンドプロセシング酵素または外因性の核酸と一緒に導入することを含む。
【０１０１】
非限定的な例として、当該多重鎖CAR、pＴαまたはその機能的変異体、レアカットエンドヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼまたはCARは任意選択的にDNAエンドプロセシング酵素または外因性の核酸と一緒に、1つによってコードされた導入遺伝子として、又は異なる（複数の）プラスミドベクターとして導入することができる。異なる導入遺伝子は、2Aペプチドをコードする配列などのリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む1つのベクター中に含めることができる。ピコルナウイルスのアフトサブグループにおいて同定された2Aペプチドは、一つのコドンから次のコドンへと、そのコドンにコードされる2つのアミノ酸間のペプチド結合を形成することのないリボソーム「スキップ」を引き起こす(Donnelly ら, J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly ら, J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina ら, Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins ら, RNA 13: 803-810 (2007))。「コドン」とは一つのアミノ酸残基にリボソームによって翻訳されたmRNA（またはDNA分子のセンス鎖上）上の3つのヌクレオチドを意味する。したがって、2つのポリペプチドは、ポリペプチドがフレーム内にある2Aオリゴペプチド配列によって分離された場合、mRNA内の単一の連続したオープンリーディングフレームから合成することができる。リボソームスキップ機構は当該技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされるいくつかのタンパク質の発現のために、いくつかのベクターで使用されることが知られている。非限定的な例として、本発明では、2Aペプチドが細胞内にレアカットエンドヌクレアーゼおよびDNAエンドプロセシング酵素または多重鎖CARの異なるポリペプチドを発現するために使用されてきた。
【０１０２】
また、前記プラスミドベクターは当該ベクターを受けた細胞の同定および/または選択を可能にする選択マーカーも含むことができる。
【０１０３】
ポリペプチドは細胞内に前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの導入の結果として、細胞内でin situで合成することができる。また、ポリペプチドは、細胞外で生産された後、そこに導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を、動物細胞に導入する方法は当技術分野で知られており、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれる安定した形質転換方法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれない一過性形質転換法およびウイルス媒介法が含まれる。当該ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどにより細胞に導入してもよい。例えば、一過性形質転換法は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは微粒子銃が挙げられる。当該ポリヌクレオチドは、細胞内で発現される観点から、ベクター、より特にはプラスミドまたはウイルスに含まれてもよい。
【０１０４】
-       エレクトロポレーション
本発明の特定の実施形態において、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーションによって、細胞内に直接導入されるmRNAであってもよい。本発明者らは、T細胞中のmRNAエレクトロポレーションのための最適条件を決定した。
【０１０５】
本発明者は、パルス電界を使用することによって、細胞への物質の送達のために一過的に生細胞を透過性にすることを可能にするcytoPulse技術を使用した。PulseAgile（セレクティスプロパティ）エレクトロポレーション波形の使用に基づく技術は、パルス持続時間、強度の正確な制御、ならびにパルス間の間隔（米国特許6010613および国際PCT出願WO2004083379）を付与する。すべてのこれらのパラメータは、最小限の死亡率と高いトランスフェクション効率のための最良の条件を達成するために改変することができる。基本的には、最初の高電界パルスは、細孔形成を可能にし、後続の低電界パルスは細胞内にポリヌクレオチドを移動できるようにする。本発明の一態様では、本発明者は、T細胞中で異なる種類のタンパク質を表現させるためのエレクトロポレーションプロトコルの使用、T細胞へのmRNAの> 95％のトランスフェクション効率、およびの達成につながった手順を記載している。特に、本発明は、T細胞をRNAに接触させることを含む、T細胞を形質転換する方法に関し、T細胞に、
(a)パルス幅0.1ミリ秒及び工程（a）および（b）の間の電気パルス間隔0.2〜10ミリ秒、１センチメートル当たり2250〜3000 Vの電圧範囲の1つの電気パルスと、
(b)工程（b）の電気パルスおよび工程（c）の第一の電気パルスの間のパルス間隔が100ミリ秒で2250〜3000 Vの電圧範囲を有する1つの電気パルスと、
(c)0.2ミリ秒のパルス幅と4つの電気パルスの各々の間が2ミリ秒のパルス間隔である325 Vの電圧の4つの電気パルス、
からなるアジャイルパルスシーケンスを適用する。
【０１０６】
特定の実施形態において、T細胞を形質転換する方法は、T細胞をRNAに接触させることを含み、T細胞に
(a)パルス幅0.1ミリ秒及び工程（a）および（b）の間の電気パルス間隔0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10ミリ秒、１センチメートル当たり2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 または3000 Vの電圧の1つの電気パルスと、
(b)工程（b）の電気パルスおよび工程（c）の第一の電気パルスの間のパルス間隔が100ミリ秒で 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 または3000Vの電圧を有する1つの電気パルスと、
(c)0.2ミリ秒のパルス幅と4つの電気パルスの各々の間が2ミリ秒のパルス間隔である325 Vの電圧の4つの電気パルス、
からなるアジャイルパルスシーケンスを適用する。
【０１０７】
上述の値の範囲に含まれる任意の値は、本出願に開示されている。エレクトロポレーション培地は、当該分野で公知の任意の適切な媒体とすることができる。好ましくは、エレクトロポレーション培地は0.01〜1.0ミリジーメンスに及ぶ範囲内の導電性を有する。
【０１０８】
特定の実施形態では、非限定的な例として、当該RNAは、レアカットエンドヌクレアーゼ、ハーフTALEヌクレアーゼなどのレアカットエンドヌクレアーゼの一つのモノマー、多重鎖キメラ抗原受容体の少なくとも一つの成分、pＴαまたはその機能的変異体、外因性の核酸、一つの追加の触媒ドメインをコードする。
【０１０９】
改変されたT細胞
本発明はまた、細胞を操作するために前記方法によって得られる感受性の単離された細胞または細胞株にも関する。特に、単離された細胞は、上記のように少なくとも一つの多鎖CARを含む。別の実施形態において、当該単離された細胞は、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖CARの集団を含む。特に、当該単離された細胞は、少なくとも1つの多重鎖CARを構成するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含む。当該細胞はまた、CD52 GR、TCRα、TCRβ、HLA遺伝子、PD1およびCTLA-4のような免疫チェックポイント遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの不活性化遺伝子を含むことができるか、またはpＴα導入遺伝子を発現することができる。
【０１１０】
本発明の範囲には、単離された免疫細胞、好ましくは前述の方法のいずれかに従って得られたT細胞が含まれる。当該免疫細胞とは、先天的および/または適応性免疫応答の開始および/または実行に関与する造血起源の細胞を意味する。本発明の当該免疫細胞は、幹細胞に由来してもよい。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞であってもよく、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導された多能性幹細胞は、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、CD34+細胞である。当該単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球およびヘルパーTリンパ球からなる群から選択されるT細胞、であってもよい。別の実施形態では、当該細胞は、CD4 + Tリンパ球およびCD8+ Tリンパ球からなる群に由来してもよい。本発明の細胞の増殖及び遺伝的改変の前に、細胞の供給源は、非限定的な種々の方法を介して対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍からの組織を含む非限定的な多数の供給源から得ることができる。本発明の特定の実施形態において、利用可能であり、当業者に知られているT細胞株の任意の数を使用することができる。別の実施形態では、当該細胞は、健康なドナーに、癌と診断された患者に、または感染症と診断された患者に、由来することができる。別の実施形態では、当該細胞は、異なる表現型の特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。先に記載した方法に従って形質転換されたT細胞から得られた細胞株も本発明の範囲内に包含される。免疫抑制治療に抵抗性である改変された細胞と、上記の方法によって得られる感受性の改変された細胞は、本発明の範囲に包含される。
【０１１１】
別の実施形態では、本発明の単離された細胞は、CD52、GR、PDL、CTLA-4、LAG3、TIM3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIRl、SIGLEC10、2B4 HLA、TCRαおよびTCRβからなる群から選択される不活性化遺伝子を含み、および/またはCAR、多重鎖CARおよび/またはpＴα導入遺伝子を発現する。別の特定の実施形態では、単離された細胞は、多重鎖CARを構成する前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１１２】
別の実施形態において、本発明の単離された細胞は、CD52とGR、CD52とTCRα、CDR52とTCRβ、GRとTCRα、GRとTCRβ、TCRαとTCRβ、PDL及びTCRα、PD1とTCRβ、CTLA-4とTCRα、CTLA-4とTCRβ、LAG3とTCRα、LAG3とTCRβ、Tim3とTCRα、Tim3とTCRβ、BTLAとTCRα、BTLAとTCRβ、BY55及びTCRα、BY55とTCRβ、TIGITとTCRα、TIGITとTCRβ、B7H5とTCRα、B7H5とTCRβ、LAIR1とTCRα、LAIR1とTCRβ、SIGLEC10とTCRα、SIGLEC10とTCRβ、2B4とTCRα、2B4とTCRβからなる群から選択される2つの不活性化遺伝子を含み、および/またはCAR、多重鎖CARおよび/またはpＴα導入遺伝子を発現する。
【０１１３】
別の実施形態において、TCRは、TCRα遺伝子および/またはTCRβ遺伝子を不活性化することにより、本発明の細胞内で機能しない状態となる。上記の戦略は、より具体的にはGvHDを避けるために使用される。本発明の特定の態様におおける個体由来の改変された細胞を得る方法において、該細胞は、主要組織適合複合体シグナル伝達経路とは無関係に増殖することができる。この方法は以下のステップを含む：
(a) 前記個体から細胞を回収する工程
(b)TCRαまたはTCRβ遺伝子を不活性化することによって、前記細胞をex vivoで遺伝的に改変する工程、
(c)適切な条件下でin vitroで遺伝的に改変されたT細胞を培養して該細胞を増幅する工程。
【０１１４】
改変された細胞は主要組織適合複合体シグナル伝達経路から独立して増殖することができ、この方法によって得られる感受性であり、本発明の範囲に包含される。改変された細胞が宿主対移植片（HvG）拒絶反応及び移植片対宿主病（GvHD）に対して、それを必要とする患者を処置するために本発明の特定の態様において使用することができる；したがって、患者に、不活性化されたTCRαおよび/またはTCRβ遺伝子を含む改変された細胞の有効量を前記患者に投与することにより該患者を処理することを含む、移植片対宿主（HVG）拒絶反応及び移植片対宿主病（GvHD）に対して、それを必要とする患者を治療する方法が本発明の範囲内に含まれる。
【０１１５】
T細胞の活性化および増殖
T細胞の遺伝的改変の前か後に、通常例えば、米国特許6352694、6534055、6905680、6692964、5858358、6887466、6905681、7144575、7067318、7172869、7232566、7175843、5883223、6905874、6797514、6867041、および米国特許出願公開第20060121005に記載されている方法を用いて、T細胞を活性化し増殖することができる。T細胞は、in vitroまたはin vivoで増殖することができる。
【０１１６】
一般に、本発明のT細胞は、CD3 TCR複合体及びT細胞の活性化シグナルを生成するT細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させることによって増殖される。
【０１１７】
例えば、このようなカルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、またはフィトヘムアグルチニン（PHA）などの分裂促進レクチンのような化学物質を、T細胞の活性化信号を生成するために使用することができる。
【０１１８】
非限定的な例としては、T細胞集団は、抗CD3抗体またはその抗原結合フラグメント、または表面上に固定化された抗CD2抗体との接触により、またはプロテインキナーゼC活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と、カルシウムイオノフォアと連携して接触させることによってin vitroで刺激することができる。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+T細胞またはCD8+T細胞をのいずれかの増殖を刺激するためには、抗CD3抗体および抗CD28抗体が用いられる。例えば、各シグナルを与える薬剤は、溶液中にあってもよく、または表面に結合されていてもよい。当業者には容易に理解できるように、細胞に対する粒子の割合は、標的細胞に対する相対的な粒子サイズに依存してもよい。本発明のさらなる実施形態では、T細胞のような細胞は、薬剤被覆ビーズと結合され、、ビーズと細胞は続いて分離され、その後、細胞が培養される。代替実施形態では、培養前に、薬剤被覆ビーズおよび細胞を分離していないが、一緒に培養される。T細胞培養に適した条件は、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）インターロイキン-2（IL-2）、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、-10、 - 2、1L- 15、TGFpおよびTNF-または当業者に知られている任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存に必要な因子を含んでいてもよい適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640または、X-vivo 5、（ロンザ））を含む。細胞の増殖のための他の添加剤としては、界面活性剤、プラスマネート、ならびにN-アセチルシステインおよび2-メルカプトエタノール等の還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地にはRPMI1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo1、及びX-Vivo 20、オプティマイザ、追加のアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを含むことができ、無血清であるか、または適切な量の血清（または血漿）、または定義されたセットのホルモン、および/またはT細胞の成長および増殖に十分なサイトカインの量が補われている。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的な培養にのみ含まれ、患者に注入される細胞の培養物には含まれていない。標的細胞は、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば空気+ 5％CO2）のように、成長をサポートするのに必要な条件下で維持される。多様な刺激時間に曝露されたT細胞は、異なる特性を示すであろう。
別の特定の実施形態では、当該細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖することができた。例えば患者に当該細胞を投与した後に、前記細胞は、患者の血液中等のin vivoで増殖することができる。
【０１１９】
治療への応用
別の実施形態では、異なる方法または前述のように単離された細胞に由来する細胞系により得られた単離された細胞は、薬剤として使用することができる。別の実施形態では、当該薬剤はそれを必要とする患者における癌または感染症を治療するために用いることができる。別の実施形態では、本発明に記載の単離された細胞または当該単離された細胞に由来する細胞株は、治療を必要とする患者における癌、ウイルス感染または自己免疫疾患の治療のための医薬の製造に使用することができる。
【０１２０】
別の局面において、本発明は、それを必要とする患者を治療するための方法に依存し、該方法は以下の工程の少なくとも1つを含む：
(a) 前述の方法のいずれかによって得られる免疫細胞を提供する工程、
(b) 該患者に形質変換された免疫細胞を投与する工程。
【０１２１】
一実施形態では、本発明の当該T細胞は、インビボでのT細胞の増殖に耐えることができ、長時間量持続することができる。
【０１２２】
当該治療は、改善的、治癒的または予防的であってもよい。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法治療の一部のいずれであってもよい。自家により、患者を治療するために使用される細胞、細胞系または細胞集団が、前記患者またはヒト白血球抗原（HLA）の適合するドナーに由来することを意味する。同種異系によって、患者を処置するために使用される細胞または細胞集団が、前記患者からではなく、ドナー起源あることを意味する。
【０１２３】
本発明は典型的にドナーから得たT細胞の非アロ反応性細胞への形質転換を可能にする限り、同種免疫療法に特に適している。これは、標準的なプロトコルの下で行われ、必要に応じて何度でも再生することができる。得られた改変されたT細胞をプールし、一つまたはいくつかの患者に投与することができ、「既製」治療薬として利用できるようにされてもよい。
【０１２４】
開示された方法で使用することができる細胞は、前のセクションで説明されている。当該治療は、癌、ウイルス感染、自己免疫疾患または移植片対宿主病（GvHD）と診断された患者を治療するために使用することができる。処置され得る癌は、血管新生していない、またはまだ実質的に血管新生されていない腫瘍、ならびに血管新生腫瘍を含む。癌は、非固形腫瘍（例えば、血液学的腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫など）または固形腫瘍を含むことができる。本発明の多重鎖のCARで処理されるべき癌の種類としては、限定されないが、癌腫、芽細胞腫、肉腫、および特定の白血病又はリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、および悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫、および黒色腫。成人の腫瘍/癌および小児の腫瘍/癌も含まれている。
【０１２５】
これは、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法および放射線療法の群から選択される癌に対する一つ以上の治療剤と組み合わせて治療することができる。
【０１２６】
本発明の好ましい実施形態によれば、治療は免疫抑制療法を受けている患者に投与することができる。実際、本発明は、好ましくは、免疫抑制剤のレセプターをコードする遺伝子の不活性化により、少なくとも1種類の免疫抑制剤に耐性にされた細胞または細胞の集団に依存している。この態様では、免疫抑制治療は、患者内の本発明のT細胞の選択および増殖を助けるはずである。
【０１２７】
本発明による細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、注入または移植によるものを含む、任意の便利な方法で行うことができる。本明細書に記載の組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内またはリンパ内注射によって、または腹腔内に、投与することができる。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。
【０１２８】
細胞または細胞集団の投与は、104〜109細胞/kg体重、好ましくは105〜106細胞/kg体重のすべての整数値を含むこれらの範囲内の投与からなることができる。細胞または細胞集団は、1つまたはそれ以上の用量で投与することができる。別の実施形態では、細胞の有効量は、単回投与として投与される。別の実施形態では、細胞の有効量は、一定期間の複数の用量として投与される。投与のタイミングは管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナー等の任意の供給源から得ることができる。個々の必要性は変動するが、与えられた細胞型の特定の疾患または状態のための有効量の最適範囲の決定は当分野の技術内である。有効量は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。投与用量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、併用治療の種類、もしあれば、治療の頻度および所望の効果の性質に依存するであろう。
【０１２９】
別の実施形態では、これらの細胞を含む細胞または組成物の当該有効量は非経口的に投与される。該投与は静脈内投与であってもよい。該投与は、直接腫瘍内注射することによって行うことができる。
【０１３０】
本発明の特定の実施形態において、細胞は、抗ウイルス療法、シドフォビル、およびインターロイキン2のような薬剤での治療、シタラビン（またARA-Cとして知られている）またはMS患者のためのnataliziimab治療または乾癬患者のためのefaliztimab治療またはPML患者のための他の治療を含むがこれに限定されない、任意の数の関連する治療法と組み合わせて患者に投与される（例えば、前、同時または後に）。さらなる実施形態では、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸、およびFK506などの免疫抑制剤、抗体、またはCAM PATHなどの他のimmunoablative剤、抗CD3抗体または他の抗体治療、サイトキシン、fludaribine、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、mycoplienolic酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および放射線照射と組み合わせて用いることができる。これらの薬物は、いずれかのカルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリンおよびFK506）を阻害するか、または増殖因子に誘導されるシグナル伝達（ラパマイシン）であるP70S6キナーゼを阻害する(Liu ら., Cell 66:807-815, 1 1; Henderson ら., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer ら., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93)。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、フルダラビン等の化学療法剤、体外照射療法（XRT）、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを用いたT細胞除去療法を、骨髄移植と組み合わせて（例えば、前、同時または後に）患者に投与される。他の実施形態では、本発明の細胞組成物は、例えばCD20と反応する薬剤、リツキサンなどのB細胞除去療法後に投与される。例えば、一実施形態では、患者は、末梢血幹細胞移植に続いて高用量化学療法と標準的な治療を受けることができる。特定の実施形態では、移植後、患者は、増殖された本発明の免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態において、増殖細胞は手術の前または後に投与される。ここに記載された方法のいずれかによって得られる改変された細胞は、移植片対宿主（HVG）拒絶反応及び移植片宿主病（GvHD）に対してそれを必要とする患者を治療するために本発明の特定の態様において使用することができる。したがって、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子の不活性化を含む改変された細胞の有効量を前記患者に投与することにより当該患者を治療することを含む、移植片対宿主（HVG）拒絶反応及び移植片宿主病（GvHD）に対して、それを必要とする患者を治療する方法は、本発明の範囲内である。
【０１３１】
免疫療法のためのヒトの同種異系細胞を操作するための方法の例
本発明のより良い理解のために、免疫療法のためのヒト同種異系細胞を操作するための方法の一例を図5に示す。前記方法は以下の工程の一つまたはいくつかを組み合わせて含む：
1.細胞培養物から、または一個体の患者からの血液サンプルから、または血液銀行から、T細胞を提供し、該T細胞を抗CD3/C28アクチベータービーズを用いて活性化する工程。
ビーズは、T細胞の活性化および増殖のために必要とされる一次および共刺激シグナルを提供する。
【０１３２】
2. a）pＴαまたはその導入遺伝子の機能的変異体を該細胞に形質導入してCD3表面発現をサポートし、CD3複合体の刺激を介して細胞増殖を可能にする工程、
TCRの破壊は、TCR複合体の排除と同種反応性（GvHDを）除去することが期待されるが、CD3シグナル伝達コンポーネントの損失により、同種異系細胞の増殖が変更されるおそれがある。形質導入された細胞はpＴα鎖またはその機能的変異体を発現することが期待される。このpＴα鎖はTCRβ鎖およびCD3シグナル伝達成分と対になって、プレTCR複合体を形成し、したがって、機能的CD3複合体を復元し、不活化TCRα細胞の活性化または刺激をサポートする。pＴαレンチウイルスベクターを用いたT細胞の形質導入は、TCRα不活性化の前または後に実現することができる。
b）多重鎖CARでの形質導入は、標的細胞の表面で発現される抗原に対するT細胞を、リンパ腫および固形腫瘍を含む種々の悪性腫瘍から回復させることができる。共刺激ドメインの機能を改善するために、本発明者らは、前述のように、FcεRI由来の多重鎖CARを設計した。形質導入はTCRαおよびCD52遺伝子などの他の遺伝子の不活性化の前または後に実現することができる。
【０１３３】
3.非アロ反応性および免疫耐性T細胞を操作する工程
a）細胞の表面からのTCRを排除し、GvHDを回避するため、同種異系のTCRにより異物として宿主組織が認識されるのを防止するために、前記細胞におけるTCRαを非活性化することができる。 
b）移植されたT細胞に影響を与えることなく、移植片拒絶を防止するために、免疫抑制剤の標的をコードする一つの遺伝子を不活性化することもできる。この例では、免疫抑制剤の標的は、CD52であり、免疫抑制剤は、ヒト化モノクローナル抗CD52抗体である。
【０１３４】
これは、T細胞内のDSB事象のより高い頻度を可能にすることによるTALEヌクレアーゼの使用は、T細胞における上記二重不活性化を達成するために特に有利であることが本発明者らによって示されている。好ましくは、TCRαおよびCD52遺伝子は、当該遺伝子を標的にするTALEヌクレアーゼをコードするmRNAとT細胞をエレクトロポレーションすることによって不活性化される。mRNAの使用により形質転換効率が高くなることは、T細胞への害が少なく、T細胞の操作の過程において重要であることが本発明者らによって見出された。その後、不活性化されたT細胞は、磁気ビーズを使用してソートされる。例えば、CD52を発現するT細胞は、固体表面上に固定することによって除去され、そして不活性化された細胞はカラムを通過させる応力に露出されない。この穏やかな方法は、適切に操作されたT細胞の濃度を増加させる。
【０１３５】
4. 患者への投与の前に、またはCD3複合体の刺激を介して患者に投与した後で、操作されたT細胞をインビトロで増殖する工程。投与工程の前に、患者に、ヒト化モノクローナル抗CD52抗体、CAMPATH1-Hなどの免疫抑制治療を施すことができる。
【０１３６】
5. 任意選択的に、患者への投与の前にex vivoで、または操作された細胞を標的抗原に近接するようにもたらすために患者に投与した後にin vivoで、当該細胞を二重特異性抗体にさらす工程。
【０１３７】
その他の定義
- 特に断りのない限り、「a」、「an」、「the」、および「少なくとも1つ」は、交換可能に用いられ、一つまたは一つ以上を意味する。本明細書に指定されているポリペプチド配列内のアミノ酸残基は一文字コードにより、例えばQがGlnまたはグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
【０１３８】
- アミノ酸置換は1つのアミノ酸残基を別のもので置換することを意味し、例えば、ペプチド配列中のアルギニン残基をグルタミン残基で置換することは、アミノ酸置換である。
【０１３９】
- ヌクレオチドは、次のように指定されている：ヌクレオシドの塩基を表すために1文字コードを用いる：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについて、rはg又はa（プリンヌクレオチド）を表し、kはg又はtを表し、sは、g又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dは g、aまたはtを表し、vはg、aまたはcを表し、bはg、t又はcを表し、hは、a、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。
【０１４０】
本明細書において用いる場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生じた断片、およびライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片等のヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドを意味する。核酸分子は、天然に存在する（例えば、DNAおよびRNAのような）ヌクレオチド、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（天然に存在するヌクレオチドの、例えば、エナンチオマー形態）、またはその両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。改変されたヌクレオチドは、糖部分および/またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖改変は、例えば、1つ以上のヒドロキシル基がハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での置換が含まれ、または糖はエーテル又はエステルとして官能化することができる。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの立体的および電子的に類似の構造で置換することができる。塩基部分における改変の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または他のよく知られた複素環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結することができる。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。
【０１４１】
-「二本鎖破断の上流の配列に相同性の第１の領域、該細胞のゲノムに挿入される配列、及び二本鎖破断の下流の配列と相同性の第2の領域を順次含むポリヌクレオチド」によってin situでDNA標的の5'および3'に相同性の第1および第2の部分を含むDNA構築物またはマトリックスを意味することを意図する。DNA構築物はまた、in situで対応するDNA配列といくらかの相同性を含むか、または代替的に、in situでのDNAの標的の5'および3'領域と相同性を有しない第1及び第2の部分との間に位置する第3部分を含む。DNA標的の切断に続いて、相同的組換え事象は、関心のある遺伝子座に含まれる標的遺伝子を含むゲノムとこのマトリックスの間で刺激され、ここでDNA標的を含むゲノム配列は、前記マトリックスの第3の部分及び前記マトリックスの第1及び第2の部分の可変部で置換されている。
【０１４２】
- 「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的DNA配列」、「核酸標的配列」、「標的配列」、または「プロセシング部位」により本発明のレアカットエンドヌクレアーゼにより標的化及び処理することができるポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、特定のDNAの場所、非限定的な例として好ましくは細胞内のゲノム位置について、また、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾンのような遺伝物質の本体に独立して存在することができる遺伝物質の一部又はミトコンドリア等の細胞小器官内を指す。TALEヌクレアーゼ標的の非限定的な例として、標的ゲノム配列は、一般的に15塩基対のスペーサーによって分離された2つの17-bpの長さの配列（いわゆる半標的）からなる。各半標的は、EF1-αプロモーターまたはT7プロモーターの制御下で、プラスミドにコードされている、非限定的な例として表1、5、6及び10に記載されているTALE-ヌクレアーゼの繰り返しによって認識される。表1、5、6及び10に記載されているように、核酸標的配列は、当該標的の一本鎖の5'から3'配列により定義される。
【０１４３】
- キメラ抗原受容体（CAR）により、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）のための抗体ベースの特異性を、T細胞受容体を活性化する細胞内ドメインに結合させ、特定の抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子を意図する。一般的に、CARはT細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖（scFvFcζ）の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した細胞外一本鎖抗体（scFvFc）から構成され、T細胞で発現された場合、モノクローナル抗体の特異性に基づく抗原認識を回復させる能力を有する。本発明で使用されるCARの一例は、CD19抗原に対して方向づけられたCARであり、非限定的な例として、配列番号73のアミノ酸配列を含むことができる。
【０１４４】
- 「送達ベクター」または「輸送ベクター」によって、細胞を接触させる（すなわち、「接触させる」）又は細胞内部または細胞内区画（すなわち、「導入」）に薬剤/化学物質および本発明で必要とされる化学物質や分子（タンパク質または核酸）を送達するために、本発明に使用することができる任意の送達ベクターを意図する。それは、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル（超音波造影剤）、ナノ粒子、エマルジョンまたは他の適切なトランスファーベクターを含むが、それらに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、巨大分子（遺伝子、タンパク質）または他のそのようなプラスミドのようなベクター、Diatosによって開発されたペプチドの送達を可能にする。これらの場合には、送達ベクターは、分子担体である。「送達ベクター」または「輸送ベクター」はまた、トランスフェクションを実行するための送達方法をも意図している。
【０１４５】
- 用語「ベクター」または「ベクター（複数）」は、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。本発明において、「ベクター」としては、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、またはを染色体、非染色体、半合成又は合成の核酸から成っていてもよい線状又は環状DNAまたはRNA分子を含むが、それに限定されるものではない。好ましいベクターは、それらが連結されている核酸の自律複製（エピソームベクター）及び/又は発現が可能なものである（発現ベクター）。多数の適切なベクターが当業者知られおよび市販されている。
【０１４６】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば麻疹及びセンダイ）などのマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルス及びアルファウイルスなどのプラス鎖RNAウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン - バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘及びカナリア痘）を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えばノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV- BLV群、レンチウイルス、スプマウイルスが含まれる(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, ら, Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
【０１４７】
- 「レンチウイルスベクター」とは、その比較的大きなパッケージング能力、低下した免疫原性及び安定に高効率に異なる細胞型の広い範囲に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために非常に有望であるHIVベースのレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、通常、プロデューサー細胞へ3つ（パッケージ、エンベロープおよび転送）以上のプラスミドの一過的なトランスフェクション後に生成される。HIVのように、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の、細胞表面上の受容体との相互作用を介して標的細胞に入る。入るに当たり、ウイルスRNAは、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写産物は、感染細胞のDNA中のウイルス組込みのための基質である二本鎖直鎖状ウイルスDNAである。「組込みレンチウイルスベクター（またはLV）」とは、非限定的例として、標的細胞のゲノムに組み込むことができる、そのようなベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはNILV）」によって、ウイルスインテグラーゼの作用を介して標的細胞のゲノムに組み込まれない、効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【０１４８】
- 送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーション又はエレクトロポレーションまたはこれらの技術の派生技術などの任意の細胞透過化技術に関連させまたは結合することができる。
【０１４９】
- 細胞または細胞によって、インビトロ培養のためのこれらの生物に由来する任意の真核生物の生細胞、初代細胞および細胞株を意図している。
【０１５０】
- 「初代細胞」または「初代細胞（複数）」によって、生体組織（すなわち生検材料）から直接採取され、in vitroでの成長のために確立された細胞を意図し、それは非常に少数の集団倍加しか受けず、、連続腫瘍形成または人工的不死化細胞株と比較して、それらが由来する組織の主要機能成分や特性のより代表的なものである。
【０１５１】
細胞株は、非限定的な例として、CHO-K1細胞；HEK293細胞; Caco2細胞；U2-OS細胞; NIH 3T3細胞; NSO細胞; SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞; K-562細胞、U-937細胞;MRC5細胞; IMR90細胞;ジャーカット細胞; HepG2細胞; HeLa細胞;HT-1080細胞; HCT-116細胞;Hu-h7細胞; Huvec細胞;Molt4細胞からなる群から選択することができる。
【０１５２】
すべてのこれらの細胞株は、目的の遺伝子またはタンパク質を産生し、発現し、定量し、検出し、研究するために細胞株モデルを提供するために、本発明の方法によって修飾することができる。これらのモデルはまた、非限定的な例として、研究および製造などの化学、バイオ燃料、治療薬および農学など様々な分野で、関心の生物学的に活性な分子をスクリーニングするために用いることができる。
【０１５３】
- 「変異」により最大1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50またはそれ以上のポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）又はポリペプチド配列内のヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図している。突然変異は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響を与えることができる。また、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造/安定性に影響を及ぼし得る。
【０１５４】
- 「変異体（複数可）」とは、繰り返しバリアント、変異体、DNA結合変異体、TALE-ヌクレアーゼ変異体、親分子のアミノ酸配列における少なくとも一つの残基の突然変異又は置換によって得られたポリペプチド変異体を意図する。
【０１５５】
- 「機能的変異体」により、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性変異体を意図している。このような変異体は、その親タンパク質またはタンパク質ドメインまたは追加の特性、と比較して同一の活性またはより高いまたはより低い活性を有することができる。
【０１５６】
- 「遺伝子」とは、特定のタンパク質またはタンパク質のセグメントをコードする、染色体に沿って直線状に配列されたDNAのセグメントからなる遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、典型的には、プロモーター、5 '非翻訳領域、一つ以上のコード配列（エクソン）、任意選択的に3'非翻訳領域であるイントロンを含む。遺伝子はさらに、ターミネーター、エンハンサーおよび/またはサイレンサーを含んでもよい。
【０１５７】
- 本明細書で使用する用語「遺伝子座」とは、染色体上のDNA配列（例えば遺伝子の）の特定の物理的な位置である。用語「遺伝子座」とは、染色体上のレアカットエンドヌクレアーゼの標的配列の特定の物理的な位置であってもよい。そのような遺伝子座は、本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼによって認識および/または切断される標的配列を含むことができる。本発明の関心対象の遺伝子座は、細胞の遺伝物質（すなわち染色体内の）の本体内に存在する核酸配列だけでなく、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾンのような遺伝物質の本体から独立して存在することができる遺伝物質の一部、またはミトコンドリアのような細胞小器官の中で存在することができる遺伝物質の一部をも適格なものとすると理解される。
【０１５８】
- 用語「エンドヌクレアーゼ」は、DNAまたはRNA分子内、好ましくはDNA分子内の核酸の間の結合の加水分解（切断）を触媒し得る酵素の任意の野生型または変異体を意味する。エンドヌクレアーゼはその配列とは無関係には、DNAまたはRNA分子を切断せず、さらに、「標的配列」または「標的部位」と呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列でDNAまたはRNA分子を認識して切断する。エンドヌクレアーゼは、典型的には、長さが12より大きい塩基対（bp）、より好ましくは、14から55塩基対のポリヌクレオチド認識部位を有する場合は、レアカットエンドヌクレアーゼとして分類することができる。レアカットエンドヌクレアーゼは定義された遺伝子座では、DNA二本鎖切断（DSB）を誘導することによって大幅にHRを増やす(Rouet, Smih ら、 1994; Choulika, Perrin ら、1995; Pingoud and Silva 2007)。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えばホーミングエンドヌクレアーゼ(Paques および Duchateau 2007)、FokＩのような制限酵素の触媒ドメインとジンクフィンガードメインの融合から得ることができるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）(Porteus and Carroll 2005)または化学エンドヌクレアーゼ(Eisenschmidt, Lanio ら、2005; Arimondo, Thomasら、 2006)であってもよい。化学的エンドヌクレアーゼは、化学的またはペプチド性切断装置が、特定の標的配列を認識する核酸のポリマーまたは他のDNAのいずれかに結合体化され、それによって特定の配列を切断活性の標的とする。化学エンドヌクレアーゼはまた、特定のDNA配列に結合することが知られているオルトフェナントロリン、DNA切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFOは）の接合体ような合成ヌクレアーゼを包含する(Kalish および Glazer 2005)。このような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明に係る用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。
【０１５９】
レアカットエンドヌクレアーゼはまた、例えばFokＩ触媒ドメインおよびキサントモナス属の植物病原体の感染プロセスで使用されるタンパク質のファミリーである転写アクチベーター様エフェクター（TALE）に由来するＤＮＡ結合ドメインを用いたキメラヌクレアーゼの新たなクラスであるTALEヌクレアーゼであってもよい(Boch, Scholze ら、 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak ら、 2010; Li, Huang ら、)。FokＩベースTALEヌクレアーゼ（TALEヌクレアーゼ）の機能的なレイアウトは、本質的に、TALEドメインで置き換えられているジンクフィンガーDNA結合ドメイン、ZFNである。このように、TALE-ヌクレアーゼによるDNA切断は、非特異的な中心領域に隣接する2つのDNA認識領域を必要とする。本発明のレアカットエンドヌクレアーゼは、TALE-ヌクレアーゼに由来することができる。
【０１６０】
レアカットエンドヌクレアーゼはまた、メガヌクレアーゼの名でも知られているホーミングエンドヌクレアーゼであることができる。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当該技術分野でよく知られている(Stoddard 2005)。ホーミングエンドヌクレアーゼは、DNA標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖切断を生成する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、長さ12〜45塩基対（bp）の範囲の、通常長さ14〜40塩基対の範囲のDNA標的部位を認識し、高度に特異的である。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ（配列番号127として開示されている「LAGLIDADF」）、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY-YIGエンドヌクレアーゼに対応することができる。本発明に係る好適なホーミングエンドヌクレアーゼは、I-CreIの変異体であってもよい。
【０１６１】
- 「TALEヌクレアーゼ」（TALEN）により、転写アクチベーター様エフェクター（TALE）と核酸標的配列を切断するための一つのヌクレアーゼ触媒ドメインに通常由来する結合ドメインからなる融合タンパク質を意図する。触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、エンドヌクレアーゼ活性を有するドメインであり、例えばl-Tevl, ColE7, NucA およびFok-Iなどである。特定の実施形態では、TALEドメインは、例えばI-CreIおよび I-OnuIまたはその機能的変異体のようなメガヌクレアーゼに融合させることができる。より好ましい実施形態において、ヌクレアーゼは、単量体TALEヌクレアーゼである。単量体TALE-ヌクレアーゼは、I-TevIの触媒ドメインと操作されたTALリピートの融合物としてWO2012138927に記載されている、特異的認識および切断のために二量体化を必要としないTALEヌクレアーゼである。転写アクチベーター様エフェクター（TALE）は、複数の繰り返し配列を含む細菌種キサントモナス由来のタンパク質であり、各繰り返しは、位置12及び13に、核酸標的化配列のそれぞれの核酸配列に特異的な2残基（RVD:repeat variable diresidues）を含む。類似するモジュールベースパー・ベース核酸結合特性（MBBBD）との結合ドメインはまた、別の細菌種において出願人が最近発見した新しいモジュラータンパク質に由来することができる。新しいモジュラータンパク質はTALリピートよりも多くの配列可変性を表示するという利点がある。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するRVD（複数）は、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A,C,GまたはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG, Tを認識するためのIG, Gを認識するためのNK, Cを認識するためのHA , Cを認識するためのND , Cを認識するためのHI , Gを認識するためのHN , Gを認識するためのNA , G またはA を認識するためのSN  およびTを認識するためのYG , Aを認識するためのTL , A またはGを認識するためのVT およびAを認識するためのSWである。 他の実施態様において、重要なアミノ酸12および13は、ヌクレオチドA、T、C及びGに対する特異性を調節するために、特にこの特異性を増強するために、他のアミノ酸残基に向けて突然変異させることができる。TALEヌクレアーゼは、既に遺伝子標的化及び遺伝子改変を刺激するために既に記載され使用されている(Boch, Scholze ら、 2009; Moscou およびBogdanove 2009; Christian, Cermakら、2010; Li, Huang ら)。操作されたTAL-ヌクレアーゼはTALEN（登録商標）の下で市販されている(Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France)。
【０１６２】
- 用語「切断」は、ポリヌクレオチドの共有結合のバックボーンの破損をいう。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含む様々な方法によって開始され得るが、これらに限定されない。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、2つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こり得る。二本鎖DNA、RNA、またはDNA / RNAハイブリッドの切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの結果となり得る。
【０１６３】
- 「融合タンパク質」とは、本来別々のタンパク質またはその一部をコードする2つ以上の遺伝子を接合することからなる技術分野でよく知られているプロセスの結果を意味し、「融合遺伝子」の翻訳は結果としてと元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を持つ単一のポリペプチドになる。
【０１６４】
- 「同一性」は、2つの核酸分子またはポリペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、比較の目的のために整列され得る各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、分子はその位置で同一である。核酸またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一又は一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能なFASTAまたはBLASTを含む、種々のアラインメントアルゴリズム及び/又はプログラムを、二つの配列間の同一性を計算するために、例えばデフォルト設定で、使用することができる。例えば、本明細書に記載される特定のポリペプチドに少なくとも70％、85％、90％、95％、98％または99％の同一性を有し、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、ならびにかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが考えられる。
【０１６５】
- 「類似性」は、2つ以上のポリペプチドのアミノ酸配列の間の関係を記述する。BLASTPはまた、BLOSUM45、BLOSUM62又はBLOSUM80などの類似性マトリクスを用いて参照アミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％の配列類似性を有するアミノ酸配列を同定するために使用され得る。特に断りのない限り類似性スコアは、BLOSUM62の使用に基づく。BLASTPを使用する場合、パーセント類似性は、BLASTPの陽性スコアに基づいており、配列同一性パーセントは、BLASTP同一性スコアに基づいている。BLASTP「同一性」は、同一である高スコア配列対の全残基の数および割合を示す。およびBLASTP「陽性」とは、アラインメントスコアが正の値であり、互いに類似している残基の数および割合を示している。本明細書中に開示されるアミノ酸配列と、これらの程度の同一性もしくは類似性、または任意の中間程度の類似性の同一性を有するアミノ酸配列は、本開示によって企図され、包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードを使用して推定されており、従来の手段によって得ることができる。例えば、pＴαの機能的変異体は、配列番号107のアミノ酸配列に対して70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％の配列類似性を有することができる。そのような機能的変異体をコードするポリヌクレオチドは、遺伝コードを使用してそのアミノ酸配列を逆翻訳することにより生成される。
【０１６６】
- 「シグナル伝達ドメイン」または「共刺激リガンド」は、T細胞上の同族の共刺激分子を特異的に結合する抗原提示細胞上の分子をいい、それによって、例えば、ペプチドを負荷したMHC分子とTCR/CD3複合体の結合によって提供される主信号に加えて、増殖活性、分化等を含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介する信号を提供する。共刺激リガンドはCD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体および特異的にB7-H3と結合するリガンドを含めることができるが、これらに限定されるものではない。共刺激リガンドはまたとりわけ、これらに限定はされないが、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、特異的にCD83と結合するリガンド等の、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を含む。
【０１６７】
「共刺激分子」は、特異的に共刺激リガンドと結合するT細胞上の同族の結合パートナーをいい、それによって、これに限定されないが、増殖等の、前記細胞による共刺激応答を媒介する。共刺激分子は、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１６８】
本明細書で使用する「共刺激シグナル」とは、T細胞の増殖および/または重要な分子の上方制御または下方制御につながるようなTCR/CD3連結などの一次シグナルと組み合わせられるシグナルをいう。
【０１６９】
- 「二重特異性抗体」は、単一抗体分子内に2つの異なる抗原に対する結合部位を有する抗体を指す。標準的な抗体構造に加えて他の分子は、二つの結合特異性で構成することができることは、当業者は理解するであろう。さらに、二重特異性抗体による抗原との結合は、同時または連続的であってもよいことが理解されるであろう。二重特異性抗体は、化学技術(Kranz et al.1981 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5807参照)、「ポリドーマ」技術(米国特許第 4,474,893号)、または全てがそれ自体知られている組換えDNA技術によって製造することができる。非限定的な例として、それぞれの結合ドメインは、抗体の重鎖（「VHまたはH領域」）からの少なくとも一つの可変領域を含み、第1の結合ドメインのVH領域は、特異的にCD3などのリンパ球マーカーに結合し、かつ第2の結合ドメインのVH領域は、腫瘍抗原に特異的に結合する。
【０１７０】
- 本明細書で使用される用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、リガンドに結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドと定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択することができる。このようなリガンドとして作用することができる細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌および寄生虫感染、自己免疫疾患および癌細胞に関連するものが挙げられる。
【０１７１】
このようなリガンドとして作用することができる細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌および寄生虫感染、自己免疫疾患および癌細胞に関連するものが挙げられる。使用される用語「対象」または「患者」は、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全てのメンバーを含む。
【０１７２】
本発明の上記の記載は、当分野のいかなる当業者もそれを作りそして使うことができるように、その作製及び使用のやり方及び方法を提供し、特にこの有効化は、元の記述の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために特に提供される。
【０１７３】
数値限界または範囲がここに記載されている場合は、端点が含まれる。また、数値の限界または範囲内のすべての値および部分範囲は、具体的に明示的に書かれたかのように、含まれている。
【０１７４】
上記の説明は、本発明を作成および使用する当業者ができるようにするために提示され、特定の用途およびその要件の文脈で提供される。好ましい実施形態に対する様々な変更は当業者には容易に明らかであり、本明細書中で定義された一般的な原理は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の実施形態および用途に適用することができる。したがって、本発明は、示された実施形態に限定されるものではなく、ここに開示された原理及び特徴と一致する最も広い範囲が与えられるべきである。
【０１７５】
本発明を一般的に説明してきたが、更なる理解は、例示のみの目的で本明細書に提供され、特記しない限り限定することを意図するものではない特定の実施例を参照することによって得ることができる。
【実施例】
【０１７６】
実施例1：ヒトGR遺伝子を切断するTALE-ヌクレアーゼ
ヒトのGR遺伝子のエクソンを標的にする6つのヘテロ二量TALE-ヌクレアーゼを設計し、製造した。以下の表1は、各TALEヌクレアーゼによって切断される標的配列を示す。GR TALEヌクレアーゼは、それぞれが、15塩基対のスペーサーによって分離された2つの17-bpの長さの配列（いわゆる半標的）から成るGR標的配列に結合して切断するように操作された反復配列を含む、2つの独立した部分（いわゆる半TALEヌクレアーゼ）で構成されている。
【０１７７】
【表１】
0006352920.tif 000002
【０１７８】
N末端、C末端ドメインおよび反復のアミノ酸配列は、AvrBs3 TALE（GenBank登録：X16130.1参照）に基づいている。C末端およびN末端ドメインは二つのBsmBI制限部位によって分離されている。所望の配列（配列番号1〜6）を標的とする反復配列（配列番号7〜18）は、連続した制限/ライゲーション/洗浄ステップからなる固体支持体法（国際PCT出願WO2013/017950）を用いて合成した。簡単に説明すると、（ジ-リピートをコードする）最初のブロックは、ビオチン/ストレプトアビジン相互作用を介して固体支持体上に固定化し、第2ブロック（トリリピート）は、最初のブロックにライゲーションし、SfaNI消化後に第3ブロック（トリリピート）を結合させた。プロセスは、所望の反復配列を得るまでとトリ- またはジ- リピートブロックを使用して繰り返した。次いで、生成物をE. coli中で増幅するための古典的なpAPGlOクローニングプラスミド中にクローニングし、配列決定した。このようにして得られた繰り返し配列配列は受け入れプラスミドのためのタイプIIS制限酵素BsmBIおよび挿入された反復配列用のためのBbvIとSfaNIを使用して、酵母発現TALEベクターにサブクローン化した。FokI制限酵素の触媒ドメインに融合されたTALE由来のDNA結合ドメインを含む半TALEヌクレアーゼをコードするDNAは、大腸菌で増幅して標準的なミニプレップ法により回収し、挿入物の完全性を評価するために配列決定した。
【０１７９】
酵母におけるGR物語-ヌクレアーゼの活性：
以前に記載した、配列番号１〜６をもたらす、15 bpsのスペーサによって分離された、DNA鎖上に対向する2つのTALE標的配列を含む標的上での我々の酵母SSAアッセイで、6つのGR-TALE-ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を、37℃と30℃で試験した(国際特許出願WO 2004/067736およびEpinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006)。TALEヌクレアーゼDNA標的配列を含むすべての酵母標的レポータープラスミドは、以前に記載されたように構築した(国際特許出願WO 2004/067736およびEpinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006)。酵母における、標的上の個々のクローンのTALEヌクレアーゼ切断活性のレベルは表2に示されている。
【０１８０】
【表２】
0006352920.tif 000003
【０１８１】
HEK293細胞におけるGR TALE-ヌクレアーゼの活性：
pEF1αロングプロモーターの制御下で、制限酵素消化を用いて各TALEヌクレアーゼ構築物を哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。
【０１８２】
百万個のHEK293cellsをトランスフェクションの1日前に播種した。細胞は、GR遺伝子における目的のゲノム配列を認識する、GRex2、 GRex3T2、GRex3T4、GRex5Tl、GRex5T2またはGRex5T3 TALEヌクレアーゼの左と右半分をコードする2つのプラスミドのそれぞれの2.5μgで、EF1αプロモーターの制御下で製造業者の説明書に従ってリポフェクタミンの25μL（Invitrogen）を用いて同時トランスフェクトした。対照として、細胞を、EF1αプロモーターの制御下で、T細胞受容体α定常鎖領域（TRAC_T01）標的部位((TRAC_T01-L 及び -R TALE-ヌクレアーゼ (配列番号41 および配列番号42, TRAC_T01 標的部位 (配列番号37))を標的とするTALEヌクレアーゼの左右の半分をコードする2つのプラスミドのそれぞれの2.5μgで同時トランスフェクトした。GRコード配列における、TALE-ヌクレアーゼによって生成された二本鎖切断は、エラーが発生しやすいメカニズムである、非相同末端結合（NHEJ）を誘導する。TALEヌクレアーゼの活性は、標的ゲノム遺伝子座における挿入または欠失の頻度によって測定した。
【０１８３】
2または7日後にトランスフェクション後の細胞を回収し、以下の複合プライマーを用いて抽出したゲノムDNA上で遺伝子座特異的PCRを行った：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3 '（フォワードアダプター配列、配列番号126） - 10N（TAG） - GRエクソン2に特異的なフォワード配列：5'-GGTTCATTTAACAAGCTGCC-3 '（配列番号127、配列番号31として開示された複合プライマー）、GRエキソン3のために：5'GCATTCTGACTATGAAGTGA-3'（配列番号 128; 配列番号32として開示された複合プライマー）、およびGRエキソン5のために：5'-TCAGCAGGCCACTACAGGAGTCTCACAAG-3 '（配列番号129、配列番号33として開示された複合プライマー）およびリバース複合プライマー5' CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-3 '（リバースアダプター配列、配列番号130）） - GRエキソン2のための遺伝子座特異的リバース配列：5'-AGCCAGTGAGGGTGAAGACG-3'（配列番号131、配列番号34として開示された複合プライマー）、GRエキソン3のために：5'GGGCTTTGCATATAATGGAA-3 '（配列番号132、配列番号35として開示された複合プライマー）、およびGRエキソン5のための：5'-CTGACTCTCCCCTTCATAGTCCCCAGAAC-3'（配列番号133、配列番号36として開示された複合プライマー）。
【０１８４】
PCR産物を、454配列決定システム（454ライフサイエンス）により配列決定した。約10,000個の配列がPCR産物ごとに取得され、その後、部位特異的挿入または欠失事象の存在について分析した。表3は、試料中の配列の総数のうちTALEヌクレアーゼ標的部位での挿入または欠失を示す配列の割合を示す。表3にはGRex2、GRex3T2とGRex3T4の代表的な実験の結果が記載されている。
試験した全ての場合において、変異誘発の％は、第7日目に、第2日のトランスフェクション後の試料のものと比較して同様であった。突然変異誘発性の事象の性質も分析され、挿入に比べて、全ての場合において欠失の大部分が明らかにされた。
【０１８５】
【表３】
0006352920.tif 000004
【０１８６】
初代Tリンパ球中のGR TALE-ヌクレアーゼの活性：
各TALEヌクレアーゼ構築物はT7プロモーターの制御下で発現ベクターに制限酵素消化を用いてサブクローニングした。
【０１８７】
GRゲノム配列を切断するTALEヌクレアーゼをコードするmRNAをT7プロモーターの下流のコード配列を担持する各プラスミドから合成した。末梢血から単離したTリンパ球を抗CD3/CD28活性化ビーズ（ライフ・テクノロジー）を用いて5日間活性化し、500万個の細胞をCytoLVT-P装置（BTX-ハーバード機器）を使用して半TALEヌクレアーゼの両方をコードする2つの mRNAの各々10μgのエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。CD52遺伝子(CD52_T02-L および-R TALEN (配列番号55および56) 標的配列 CD52_T02 配列番号40)を標的とするハーフTALEヌクレアーゼの両方をコードする2つの mRNAの各々10μgでトランスフェクトしたT細胞を標的として用いた。
【０１８８】
トランスフェクションの3日および7日後、ゲノムDNAをトランスフェクトした細胞から単離し、遺伝子座特異的PCRを、以前に記載されたプライマーを用いて行った。PCR産物を、454配列決定システム（454ライフサイエンス）により配列決定した。PCR産物ごとに約10,000個の配列を取得し、その後、部位特異的挿入または欠失事象の存在について分析した。結果を表4に示す。
【０１８９】
【表４】
0006352920.tif 000005
【０１９０】
実施例2：ヒトCD52遺伝子を切断TALEヌクレアーゼ、ヒトT細胞受容体α定常鎖（TRAC）およびヒトT細胞受容体β定常鎖1及び2（TRBC）
実施例1で説明したように、それぞれCD52、TRAC及びTRBC遺伝子を標的とするヘテロ二量体TALEヌクレアーゼを設計し、製造した。標的ゲノム配列は、11または15-bpのスペーサーによって分離された2つの17-bpの長さの配列（いわゆる半標的）で構成されている。各半標的は表5に記載されている半TALE-ヌクレアーゼの反復によって認識されている。ヒトゲノムは、2つの機能的T細胞受容体β鎖（TRBCl及びTRBC2）を含有する。α/βTリンパ球の開発中に、これら二つの定常鎖の一方が各細胞中で選択され、TCR-βの可変領域にスプライシングされて機能的完全長β鎖を形成する。前記2つのTRBCの標的は、対応するTALEヌクレアーゼが同時にTRBClとTRBC2の両方を切断するようにTRBClとTRBC2の間で保存された配列中において選ばれた。
【０１９１】
【表５】
0006352920.tif 000006
【０１９２】
TRACおよびCD52遺伝子における他の標的配列を設計し、表６に記載されている。
【０１９３】
【表６】
0006352920.tif 000007
【０１９４】
HEK293細胞におけるCD52-TALEヌクレアーゼ、TRAC-TALEヌクレアーゼとTRBC-TALEヌクレアーゼの活性
各TALEヌクレアーゼ構築物をpEF1αロングプロモーターの制御下で、哺乳動物発現ベクターに制限酵素消化を用いてサブクローニングした。百万個のHEK293細胞を、トランスフェクションの1日前に播種した。細胞は、CD52遺伝子の関心のあるゲノム配列中の二つの半標的を認識するTALEヌクレアーゼをコードする2つのプラスミドのそれぞれ2.5g、T細胞受容体α定常鎖領域（TRAC）またはEFL-αプロモーターの制御下のT細胞受容体β定常鎖領域（TRBC）、リポフェクタミン（Invitrogen）25μLを用いて製造者の指示に従って5gの対照pUCベクター（pCLS0003）と、同時トランスフェクトした。CD52またはTRACのコード配列においてTALE-ヌクレアーゼによって生成された二本鎖切断は、エラーが発生しやすいメカニズムであり、非相同末端結合（NHEJ）により生細胞で修復される。生細胞中TALE-ヌクレアーゼの活性は、標的ゲノム遺伝子座における挿入または欠失の頻度によって測定される。トランスフェクションの48時間後、ゲノムDNAをトランスフェクトした細胞から単離し、遺伝子座特異的PCRを、以下の合成プライマーを用いて行った：5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG（フォワードアダプター配列、配列番号126） - 10N（TAG） - CD52のための遺伝子特異的なフォワード配列：5'-CAGATCTGCAGAAAGGAAGC-3 '（配列番号134、配列番号66として開示された複合プライマー：66）、TRAC用：5'- ATCACTGGCATCTGGACTCCA-3'（配列番号135；配列番号67として開示された複合プライマー）、TRBC1用：5'-AGAGCCCCTACCAGAACCAGAC-3 '（配列番号136；配列番号68として開示された複合プライマー）、又はTRBC2用：5'- GGACCTAGTAACATAATTGTGC-3'（配列番号137 ; 配列番号69として開示された複合プライマー）、及びリバース複合プライマー5'CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG（リバースアダプター配列、配列番号130） - CD52のための内因性遺伝子座特異的リバース配列：5'-CCTGTTGGAGTCCATCTGCTG-3 '（配列番号138；配列番号70として開示された複合プライマー）、TRAC用：5'- CCTCATGTCTAGCACAGTTT-3 '（配列番号139；配列番号71として開示された複合プライマー）、TRBC1及びTRBC2用：5 ' - ACCAGCTCAGCTCCACGTGGT-3'（配列番号140;配列番号72として開示された複合プライマー）。PCR産物を、454配列決定システム（454ライフサイエンス）により配列決定した。PCR産物ごとに約10,000個の配列を取得し、その後、部位特異的挿入または欠失事象の存在について分析した。結果を表7に示す。
【０１９５】
【表７】
0006352920.tif 000008
【０１９６】
初代Tリンパ球におけるCD52-TALEヌクレアーゼ、TRBC-TALEヌクレアーゼおよびTRAC-TALEヌクレアーゼの活性
各TALEヌクレアーゼ構築物はT7プロモーターの制御下で、哺乳動物発現ベクターに制限酵素消化を用いてサブクローニングした。
【０１９７】
CD52 TRAC及びTRBCゲノム配列を切断するmRNAをコードするTALEヌクレアーゼは、T7プロモーターの下流にコード配列を有するプラスミドから合成した。末梢血から単離したTリンパ球を抗CD3/CD28活性化ビーズ（ライフ・テクノロジー）を用いて5日間活性化し、5百万個の細胞を、CytoLVT-P装置を使用して、半TALEヌクレアーゼ（または対照として非コードのmRNA）の両方をコードする2つのmRNAのそれぞれ10μgのエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。NHEJにより誘導された挿入および欠失の結果として、CD52および/またはTRACのコード配列は、非機能性遺伝子で得られた細胞の画分中のフレームの外になる。エレクトロポレーションの5日後、細胞は、その細胞表面でのCD52またはTCRの存在をフローサイトメトリーによって蛍光色素結合抗CD52または抗TCR抗体で標識した。末梢血から展開したすべてのTリンパ球は通常CD52及びTCRを発現するので、CD52陰性またはTCR陰性細胞の割合は、TALEヌクレアーゼ活性の直接的尺度である。表8には代表的な実験の結果が記載されている。表9は、TRBC TALE -ヌクレアーゼの効率をテストした代表的な実験の結果を示している。
【０１９８】
【表８】
0006352920.tif 000009
【０１９９】
【表９】
0006352920.tif 000010
【０２００】
標的CD52遺伝子を有するT細胞の機能解析
CD52遺伝子の不活性化の目的は、Tリンパ球を抗CD52抗体媒介性免疫抑制に耐性にすることである。前の段落で説明したように、Tリンパ球は、CD52を切断するTALEヌクレアーゼをコードするmRNAでトランスフェクトした。トランスフェクション7日後、細胞を、30％のウサギ補体（セダレーン）有りまたは無しで50μg/mlの抗CD52モノクローナル抗体（または対照としてラットIgG）で処理した。37℃で2時間のインキュベーション後、細胞を蛍光生存色素（eBioscience社）と一緒に蛍光標識抗CD52抗体で標識し、生細胞中でCD52陽性およびCD52陰性細胞の頻度を測定するためにフローサイトメトリーによって分析した。図6は代表的な実験の結果を示しており、CD52-陰性細胞は、媒介補完された抗CD52抗体の毒性に完全に耐性であることが実証された。
【０２０１】
標的TRAC遺伝子を有するT細胞の機能解析
TRAC遺伝子不活性化の目的は、Tリンパ球をT細胞受容体刺激に応答しないようにすることである。前の段落で説明したように、Tリンパ球は、TRACまたはCD52を切断するTALEヌクレアーゼをコードするmRNAでトランスフェクトした。トランスフェクション16日後、細胞を最大5mg/mlのフィトヘマグルチニン（PHA、シグマアルドリッチ）、T細胞受容体を介して作用するT細胞マイトジェンで処理した。機能的なT細胞受容体を有する細胞は、PHA処理後にサイズが増大するはずである。インキュベーションの3日後、細胞を蛍光標識抗CD52または抗TCR抗体で標識し、TCR陽性およびTCR陰性細胞との間、またはCD52陽性およびCD52陰性の間の細胞の大きさの分布を比較するために、フローサイトメトリーによって分析した。図7は、TCR陽性細胞はPHA処理後にサイズが有意に増大した一方で、TCR陰性細胞は、未処理の細胞と同じ大きさを有し、これはTRACの不活性化が、それらをTCRシグナル伝達に対して非応答性にすることを示している。これとは対照的に、CD52陽性とCD52陰性は同程度のサイズに増加した。
【０２０２】
標的化CD52およびTRAC遺伝子を有するT細胞の機能解析
キメラ抗原受容体（CAR）を備える場合、ゲノム操作が抗腫瘍活性を提示するT細胞の能力に影響を及ぼさいことを確認するために、我々は、CD52-TALEヌクレアーゼとTRAC-TALEヌクレアーゼで標的化されたT細胞を、抗CD19 CAR（配列番号73）をコードするRNAの10μgでトランスフェクトした。 24時間後、T細胞を、Daudi細胞を発現しているCD19で4時間インキュベートした。CD107aの細胞表面上方制御、Tリンパ球による細胞傷害性顆粒放出（脱顆粒と呼ばれる）のマーカーをフローサイトメトリーによって測定した(Betts, Brenchley ら、 2003)。結果は図8に含まれ、CD52陰性/TCαβ陰性細胞とCD52陽性/ TCαβ陽性細胞は、PMA/イオノマイシン（陽性対照）またはCD19 + Daudi細胞に応答して脱顆粒する同じ能力を有することを示している。CD107の上方制御は、CD19+の存在に依存する。これらのデータは、ゲノム操作は制御された抗腫瘍応答をマウントするT細胞の能力に悪影響を与えないことを示唆している。
【０２０３】
初代Tリンパ球におけるCD52-TALEヌクレアーゼとTRAC-TALEヌクレアーゼのゲノム安全性
我々の構築物がヌクレアーゼサブユニットを含むので、重要な問題は、複数のTALEヌクレアーゼトランスフェクションは、遺伝毒性、および半TALE-ヌクレアーゼの誤対合による「近いマッチ」の標的配列でのオフターゲット切断をもたらすことができるかどうかである。細胞ゲノムの完全性に対するTRAC- TALEヌクレアーゼおよびCD52-TALEヌクレアーゼの影響を推定するために、我々は、オフサイト切断の可能性を提示した、ヒトゲノムにおける配列を列挙した。このリストを生成するために、我々は元の半標的に比べて最大4置換を有するゲノム中のすべての配列を同定し、その後互いに9から30塩基対のスペーサーでhead to head 方向で潜在的な半標的のペアを特定した。この分析は、潜在的に、1つのCD52半TALEヌクレアーゼと1つのTRAC半TALEヌクレアーゼによって形成された1つの半TALEヌクレアーゼ分子のホモダイマーまたはヘテロダイマーの標的とされたサイトが含まれていた。我々は個々の置換のコストと置換の位置（半標的の3 '末端の塩基について、ミスマッチがより良好に容認される）を考慮に入れて特異性データに基づいて潜在的なオフサイト標的を決めた。私たちは、切断の可能性の推定を反映したスコアで173のユニークな配列を得た。私たちは、15のトップスコアを選択し、CD52とTRAC TALEヌクレアーゼで同時にトランスフェクトされたT細胞におけるこれらの遺伝子座で見出される変異の頻度を深く配列決定することによって分析し、CD52陰性、TCRαβ陰性として磁気分離によって精製した。結果を図9に示す。挿入/欠失の最高頻度は7xl0-4である。これらの結果は、推定上のオフサイト標的を、意図された標的よりも少なくとも600倍の変異されにくさにしている。したがって、本研究で用いたTALE-ヌクレアーゼ試薬は、極めて特異的であるらしい。
【０２０４】
実施例3：ヒトCTLA4遺伝子とヒトPDCDl遺伝子を切断するTALE-ヌクレアーゼ
実施例1で説明したように、それぞれPDCDl及びCTLA4遺伝子を標的とするヘテロ二量体TALEヌクレアーゼを設計し、製造した。標的ゲノム配列は、11または15-BPのスペーサーによって分離された2つの17-bp長のシーケンス（半標的と呼ばれる）で構成されている。各半標的は表10にリストされている半TALE-ヌクレアーゼの反復によって認識される。
【０２０５】
【表１０】
0006352920.tif 000011
【０２０６】
HEK293細胞におけるCTLA4-TALEヌクレアーゼとPDCDl-TALEヌクレアーゼの活性
各TALEヌクレアーゼ構築物をpEF1αロングプロモーターの制御下で、哺乳動物発現ベクターに制限酵素消化を用いてサブクローニングした。百万個のHEK293細胞を、トランスフェクションの1日前に播種した。細胞は、PDCDlおよびCTLA-4遺伝子の関心のあるゲノム配列中の二つの半標的を認識するTALEヌクレアーゼをコードする2つのプラスミドのそれぞれ2.5g、リポフェクタミン（Invitrogen）25μLを用いて製造者の指示に従って5gの対照pUCベクター（pCLS0003）と、同時トランスフェクトした。PDCDlまたはCTLA-4コード配列においてTALE-ヌクレアーゼによって生成された二本鎖切断は、エラーが発生しやすいメカニズムであり、加入非相同末端（NHEJ）により生細胞で修復される。生細胞中のTALEヌクレアーゼの活性は、標的ゲノム遺伝子座における挿入または欠失の頻度によって測定される。トランスフェクションの48時間後、ゲノムDNAは、トランスフェクトされた細胞から単離し、遺伝子座特異的PCRは、以下の合成プライマーを用いて行った：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG（フォワードアダプター配列、配列番号126） - 10N（TAG） - CTLA4_T01ための遺伝子座特異的なフォワード配列：5'CTCTACTTCCTGAAGACCTG -3 '（配列番号141；配列番号99として開示された複合プライマー）、CTLA4_T03/T04用：5'-ACAGTTGAGAGATGGAGGGG-3'（配列番号142；配列番号100として開示された複合プライマー） 、PDCD1_T01用：5'-CCACAGAGGTAGGTGCCGC-3 '（配列番号143；配列番号101として開示された複合プライマー）またはPDCD1_T03用：5'- GACAGAGATGCCGGTCACCA-3'（配列番号144；配列番号102として開示された複合プライマー）およびリバース複合プライマー5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG（リバースアダプター配列、配列番号130） - CTLA4_T01の内因性遺伝子座特異的リバース配列：5'-TGGAATACAGAGCCAGCCAA-3 '（配列番号145; 配列番号103として開示された複合プライマー）、CTLA4_T03/T04用：5'-GGTGCCCGTGCAGATGGAAT-3'（配列番号：146；配列番号104として開示された複合プライマー）、PDCD1_T01用：5'- GGCTCTGCAGTGGAGGCCAG-3' （配列番号147；配列番号105として開示された複合プライマー）またはPDCD1_T03用：5'-GGACAACGCCACCTTCACCT-3 '（配列番号148、配列番号106として開示された複合プライマー）。
【０２０７】
PCR産物を、T7エンドヌクレアーゼ分析によって分析した：簡潔には、PCR産物を変性および再アニーリングの後、T7エンドヌクレアーゼは、野生型および変異型の鎖からなるミスマッチDNAを消化する。消化産物を、次いで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。消化された生成物の存在は、TALEヌクレアーゼ活性により誘導される変異配列を示している。結果は図10に表示され、矢印が消化されたPCR産物を指している。それらはPDCD1_T1、PDCD1_T3、CTLA4_T1、CTLA4_T3およびCTLA4_T4 TALEヌクレアーゼは、すべてそれらの標的部位での変異原性ヌクレアーゼ活性を示すことを実証している。
【０２０８】
実施例4：pＴαは、不活性化TCRαTリンパ球におけるCD3の表面発現を可能にする。
異なるプレTαのバージョンの説明：
ヒトpＴα遺伝子は、細胞外Ig様ドメイン、疎水性膜貫通ドメインおよび大きなC末端細胞質尾部を含む膜貫通糖タンパク質をコードする。ヒトpＴα糖タンパク質から誘導された異なるバージョンが設計されており、表11に記載され、図11に示されている。
【０２０９】
【表１１】
0006352920.tif 000012
【０２１０】
異なるプレTα構築物には以下が含まれる：
1）pＴα欠失変異体：異なる欠失が（114個のアミノ酸を含む）ヒトpＴαタンパク質の細胞内細胞質尾部で生成された（配列番号107）。試験した構築物には、完全長タンパク質のバージョン（FL）、および18、48、62、78、92、110および114アミノ酸がタンパク質のC末端から削除された変異体が含まれる（配列番号108〜114）。
2）細胞内活性化ドメインを含むpＴα変異：FLおよびΔ48変異体は、それらのC末端でCD8、CD28または41BBの細胞内活性化ドメインに融合した（配列番号115〜120）。
3）pＴα/TCRαキメラ変異体：コンストラクトのうちの１つで、TCRα細胞内ドメイン（IC）は、pＴαのテールレスバージョン（Δ114）に融合した（配列番号121）。第二の構築物も生成され、pＴα細胞外ドメインがTCRαからの膜貫通（TM）とICドメインに融合されている（配列番号122）。
4）pＴαの二量体変異体：いくつかの変異はプレTCR複合体のオリゴマー化/二量体化する能力を変化させることができるものとして文献に記載されている。これらの変異体は、プレTCRオリゴマー化により誘導されると思われる）構成的シグナル伝達を誘導することなく、細胞表面でプレTCR発現を可能にするために提案されている。変異はpＴαΔ48変異体に導入されており以下である：
- lxMUT：W46R（配列番号：123）
- 4xMUT：D22A、K24A、R102A、R117A（配列番号：124）
【０２１１】
TRAC不活性化ジャーカット細胞中の、異なるプレTα構築物の活性：
TCRα不活化細胞においてCD3表面発現を回復させる能力について異なるpＴα変異体をスクリーニングするために、細胞株が生成され、TCRα遺伝子はTRACを標的とするTALENを使用して破壊された。 Jurkat細胞（T細胞白血病細胞株）は、CytoPulseエレクトロポレーションを用いTALEN切断TRACをコードするプラスミドでトランスフェクトされ、KO細胞（TCRα/βNEG; CD3NEG）を、CD3磁気ビーズを用いたネガティブ選択により精製した。KO集団（JKT_KOx3細胞）を増幅し、異なるpＴα変異体のスクリーニングに用いた。スクリーニングは、100万個のJKT_KOx3細胞細胞を15μgの異なるpＴα変異体をコードするプラスミドでEF1αプロモーターの制御下でトランスフェクションし、続いてトランスフェクション48時間後のCD3細胞表面発現のフローサイトメトリーによって分析することによって実施した。図12は、トランスフェクション効率（BFP +細胞の％）の代表例であり、CD3+細胞の％に基づいた、JKT_KOx3細胞におけるFL、Δ18およびΔ48pＴα構築物の活性は、フローサイトメトリーによって決定した。異なる構築物からの結果は表12にグループ化されている。
【０２１２】
【表１２】
0006352920.tif 000013
【０２１３】
TCRα不活性化された初代Tリンパ球におけるpＴα-FLとpＴα-Δ48の活性：
TCRα不活性化Tリンパ球におけるCD3表面発現を誘導するpＴα-FLとpＴα-Δ48バージョンの能力を試験するために、pＴα-FLとpＴα-Δ48をコードする配列は、自己切断するT2Aペプチドが続く、SFFVプロモーター下で青色蛍光タンパク質（BFP）をコードする自己不活性化PLV-SFFV-BFP-2A-PCTRAレンチウイルスベクターにクローニングした（図13）。
【０２１４】
末梢血から単離したTリンパ球は、抗CD3/CD28活性化ビーズ（ライフテクノロジー）を用いて72時間活性化し、CytoLVT-S装置(BTX-Harvard Harbour)を用いて、4.5百万個の細胞をエレクトロポレーションによって10μgのTALEヌクレアーゼ標的化TCRα定常鎖領域（TRAC）をコードするmRNAでトランスフェクトした。エレクトロポレーション二日後、T細胞は、LV-SFFV-BFP-2A-pＴα-Δ48またはLV-SFFV-BFP-2A-対照レンチウイルスベクターのいずれかで形質導入した。CD3陰性とCD3low T細胞を抗CD3磁気ビーズ（ミルテニーバイオテク）を用いて精製した。この実験プロトコルは、図14Aに示されている。
【０２１５】
図14Bは、TCRα/β、CD3細胞表面発現、およびCD3ビーズで精製する前後にBFP-2A-pＴαΔ48（ΚΟ/Δ48）またはコントロールBFPレンチウイルスベクター（KO/BFP）のいずれかで形質導入したTCRα不活性化T細胞（KO）上のBFPの発現のフローサイトメトリー分析を表す。BFP-T2A-pＴα-Δ48ベクター（BFP +細胞）で形質導入したTCRα不活性化された細胞は、非形質導入細胞（BFP-細胞）と比較して、CD3の高いレベルを示している。対照BFPベクターで形質導入した細胞の間で差異は観察されなかった。これらの結果は、pＴαがTCRα不活化細胞の細胞表面でのCD3発現の回復を媒介することを示している。これとは対照的に、TCRα/β染色は、予想通り、pＴα-Δ48発現ベクターで形質導入した、またはしていない細胞では変わらなかった。
【０２１６】
pＴα媒介CD3の発現は、TCR欠損T細胞の活性化をサポートしている
細胞活性化シグナルを形質導入するpＴαの能力を決定するため、初期および後期活性化マーカーの発現をpＴα-Δ48とpＴα-Δ48.41BBで形質導入されたTCRα不活性化T細胞上で分析した。pＴα-Δ48およびpＴα-Δ48.41BBで形質導入されたTCRα不活性化T細胞は、前のセクションおよび図14Aに記載されるように初代ヒトT細胞から生成した。CD3を介するシグナル伝達を検出するために、細胞を、CD3ビーズでTCRα不活性化T細胞を精製した後3日間、抗CD3/CD28でコーティングしたビーズを使用して再活性化した（図14A）。
【０２１７】
細胞を、再活性化後それぞれ24時間後および48時間後に蛍光色素結合抗CD69（初期活性化マーカー）および抗CD25（後期活性化マーカー）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図15A-B）。図15A-Bに示すように、pＴα-Δ48（ΚΟ/pTα-Δ48）またはpＴα-Δ48.41BB（ΚΟ/pTα-Δ48.ΒΒ）を表現するTCRα不活性化された細胞は、TCRα/β発現細胞（NEP:非エレクトロポレーション細胞）において観察されたものと同様のレベルまで、活性化マーカーの上方制御を示した。T細胞活性化の他の指標は、しばしば「ブラスト」と呼ばれる細胞サイズの増加である。「ブラスト」を誘導するためのプレTCR複合体の容量は、抗CD3/CD28-ビーズを使用して再活性化の72時間後にセルサイズをフローサイトメトリー分析により測定した（図15C）。抗CD3/CD28ビーズでの刺激は、pＴα-Δ48またはpＴα-Δ48.41BBを発現する細胞対TCRα /β複合体を発現する細胞における細胞サイズの同等の増加を誘導した。まとめると、これらの結果は、プレTCR複合体は、その活性化マーカーの上方制御を媒介するメカニズムに効率的に結合するシグナルを伝達する能力があることを示唆している。
【０２１８】
pＴα媒介CD3発現は、刺激性の抗CD3/CD28抗体を用いたTCR欠損初代T細胞の増殖をサポートする
長期間細胞増殖をサポートするプレTCR複合体の能力を評価するために、前述のように生成された細胞の増殖を測定した。初期活性化の10日後、細胞をIL2で（非繰り返し）または抗CD3/CD28ビーズを有するIL2で（繰り返し）維持した。各条件について、細胞を計数し、BFP+の細胞数を推定するために異なる時点でフローサイトメトリーによって分析した。BFPまたはBFP-T2A-プレTCRα-Δ48ベクターで形質導入したTCRα不活化細胞（KO）の成長を比較し、これらの細胞の誘導倍率は、再活性化後2日目に得られた値について推定された。図16は、2つの独立したドナーを用いて得られた結果を示している。両方の場合において、pＴα-Δ48を発現するTCRα不活化細胞は、BFPコントロールベクターのみを発現するTCRα不活性化細胞よりも大きい増殖を示した。第二のドナーのために、pＴα-Δ48.41BBまたは全長pＴαを発現するTCRα不活性化細胞も含めたが、BFPコントロールベクターのみを発現するTCRα不活性化細胞よりも大きな増殖を示した。
【０２１９】
実施例5：Cytopulseテクノロジーを使用したT細胞中のmRNAトランスフェクションの最適化
最適化されたサイトパルス（cytopulse）プログラムの決定
実験の最初のセットは、細胞をトランスフェクトすることができた電圧範囲を測定するために非活性化PBMCに対して実施した。表13に記載されるように五つの異なるプログラムを試験した。
【０２２０】
【表１３】
0006352920.tif 000014
【０２２１】
3または6万個の細胞を、ＧＦＰをコードするプラスミド20μgおよび対照プラスミドpUCで0.4cmギャップキュベット（30または15xl06細胞/ml）で異なるサイトパルスプログラムを用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション24時間後、トランスフェクションの効率を決定するために、フローサイトメトリーによってエレクトロポレーションした細胞におけるＧＦＰの発現を分析した。図17に示すデータは、PBMC由来のT細胞中のプラスミドのエレクトロポレーションのために必要な最低限の電圧を示す。これらの結果は、Cytopulseプログラム3および4がT細胞の効率的な形質転換を可能にすることを示している（EP＃3、＃4）。
【０２２２】
活性化した精製されたT細胞のmRNAのエレクトロポレーション
T細胞の効率的なDNAのエレクトロポレーションを可能にする最良のCytopulseプログラムを決定した後、我々は、この方法は、mRNAエレクトロポレーションに適用可能であったかどうかを試験した。PHA/IL2で6日間予備活性化した5×106個の生成されたT細胞をcytoporationバッファT（BTX-ハーバード装置）に再懸濁し、GFPをコードするmRNA10μgと、またはGFPまたはpUCをコードするプラスミド20μgで0.4cmのキュベット中で前節において決定した好ましいCytopulseプログラムを用いてエレクトロポレーションした（表14）。
【０２２３】
【表１４】
0006352920.tif 000015
【０２２４】
トランスフェクション48時間後、細胞を生存色素（eFluor-450）で染色し、細胞生存率および生存GFP+細胞％を、フローサイトメトリー分析により決定した（図18）。図18に示すデータは、ここで決定した最適条件でのRNAのエレクトロポレーションは、毒性がなく、生細胞の95％以上のトランスフェクションを可能にすることを示している。合成では、データセット全体は、T細胞を効率的にDNAまたはRNAのいずれかでトランスフェクトすることができることを示している。特に、RNAのトランスフェクションは、細胞生存率に影響を及ぼさず、細胞集団中の目的のトランスフェクトされた遺伝子の均一な発現レベルを可能にする。効率的なトランスフェクションは、用いられた活性化方法（PHA/IL-2またはCD3/CD28でコーティングされたビーズ）にかかわらず、細胞活性化後の早期に達成することができる。本発明者らは、> 95％の効率で活性化後72時間から細胞をトランスフェクションすることに成功した。また、解凍および活性化後のT細胞の効率的なトランスフェクションは、同じエレクトロポレーションプロトコルを用いて得ることができる。
【０２２５】
TALEヌクレアーゼ機能的発現のための、初代ヒトT細胞中のmRNAエレクトロポレーション
mRNAエレクトロポレーションは、初代ヒトT細胞におけるGFPの効率的な発現を可能にすることを実証した後、我々は、この方法が、目的の他のタンパク質の発現に適用可能であったかどうかを試験した。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALE-ヌクレアーゼ）は、DNA切断ドメインとTAL DNA結合ドメインとの融合によって生成された部位特異的ヌクレアーゼである。それらは実質的に任意所望のDNA配列での二本鎖切断を誘発するので、強力なゲノム編集ツールである。これらの二本鎖切断は、エラーが発生しやすいDNA修復機構である非相同末端結合（NHEJ）を活性化させ潜在的に興味のある遺伝子の不活性化につながる。あるいは、適切な修復のテンプレートが同時に細胞に導入された場合、TALEヌクレアーゼ誘導DNA切断は、相同組換えによって修復することができ、したがって自由に遺伝子配列を改変する可能性を提供している。
【０２２６】
我々は、特にT細胞抗原受容体（TRAC）のα鎖に対するヒトコードする遺伝子内の配列を切断するように設計されたTALEヌクレアーゼを発現するためにmRNAエレクトロポレーションを使用した。このシーケンスで誘発される突然変異は、遺伝子の不活性化と細胞表面からTCRα錯体の損失をもたらすことが期待される。TRAC TALEヌクレアーゼRNAまたは対照としての非コードRNAは、Cytopulse技術を使用して活性化初代ヒトTリンパ球にトランスフェクトする。表14で説明したようにエレクトロポレーションシーケンスは、130 Vの4つのパルスに続いて1200 Vの2パルスで構成されていた。
【０２２７】
エレクトロポレーション7日後のTCR表面発現のフローサイトメトリー分析（図19、上のパネル）により、我々は、44％のT細胞がTCRαβの発現を失ったことを観察した。我々は、TRAC遺伝子座のPCR増幅によってトランスフェクトされた細胞のゲノムDNAを分析して、454ハイスループットシークエンシングを行った。配列決定された対立遺伝子（2153のうち727）の33％はTALEヌクレアーゼ切断部位での挿入または欠失を含んでいた。図19（下のパネル）は、突然変異した対立遺伝子の例を示している。
【０２２８】
これらのデータは、cytopulse技術を用いたmRNAのエレクトロポレーションにより、TRAC TALEヌクレアーゼの機能発現がもたらされたことを示している。
【０２２９】
抗CD19単鎖キメラ抗原受容体（CAR）をコードするモノシストロニックmRNAを有するT細胞のエレクトロポレーション：
5X106 個のT細胞を、抗CD3/CD28でコーティングしたビーズで数日間（3-5）予め活性化し、IL2はcytoporationバッファT中に再懸濁し、そして一本鎖CARをコードするmRNA（配列番号73）の10μgと一緒にまたはなしで0.4cmキュベットで、表14に記述されたプログラムを使用して、エレクトロポレーションした。
【０２３０】
エレクトロポレーションの24時間後、生細胞におけるCARの細胞表面発現を評価するために、細胞を固定可能な生存色素eFluor-780およびPE結合ヤギ抗マウスIgGのF（ab'）2断片で染色した。データは、図20に示されている。これは、前述のmonocitronic mRNAでエレクトロポレーションした生T細胞の大多数がその表面にCARを発現することを示している。
【０２３１】
エレクトロポレーション24時間後、T細胞を6時間のDaudi（CD19+）細胞と共培養し、その表面（ベッツ、Brenchleyら2003）で脱顆粒マーカーCD107aの発現を検出するため、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２３２】
図20に示すデータは、前述のモノシストロニックmRNAをエレクトロポレーションした細胞の大部分は、CD19を発現する標的細胞の存在下で脱顆粒することを示している。これらの結果は、エレクトロポレーションしたT細胞の表面で発現されるCARがアクティブであることを示している。
【０２３３】
抗CD19マルチサブキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリシストロン性mRNAを有するT細胞のエレクトロポレーション：
抗CD3/CD28でコーティングしたビーズで予め数日間（3-5）活性化した5×106個のT細胞とIL2を、cytoporationバッファーT中でエレクトロポレーションし、そしてmRNAなしで、または、多重鎖CARをコードする45μgのmRNA（配列番号226）と一緒に、0.4cmキュベット中で、表14に記載されたプログラムを使用してエレクトロポレーションした（図21Aおよび4B（csm4）））。
【０２３４】
エレクトロポレーションの24時間後、細胞を、固定可能な生存色素eFluor-780および生細胞におけるCARの細胞表面発現を評価するための特定のPE結合ヤギ抗マウスIgGのF（ab '）2断片で染色した。図21に示すデータは、前述のポリシストン性mRNAでエレクトロポレーションした生T細胞の大部分がその表面にCARを発現することを示している。
【０２３５】
エレクトロポレーションの24時間後、を投稿、T細胞をDaudi（CD19 <+>）と6時間共培養し、その表面に脱顆粒マーカーCD107aの発現を検出するためのフローサイトメトリーによって分析した。図21に示すデータは、前述の多シストロン性mRNAでエレクトロポレーションした細胞の大部分は、CD19を発現する標的細胞の存在下で脱顆粒することを示している。これらの結果は、エレクトロポレーションしたT細胞の表面で発現されるCARがアクティブであることを明らかに示している。
【０２３６】
実施例6：多重鎖CARs
多重鎖車のA.デザイン
CD19抗原を標的とする９つの多重鎖CARは、IgEへの高親和性受容体（FcεRI）に基づいて設計した。肥満細胞および好塩基球上に発現されたFcεRIは、アレルギー反応をトリガーする。それは、単一のαサブユニット（配列番号202）、単一のβサブユニット（配列番号203）と二つのジスルフィド結合されたγサブユニット（配列番号204）からなる四量体複合体である。αサブユニットには、IgE結合ドメインが含まれている。βおよびγサブユニットは、図4Aのシグナル伝達を媒介するITAM（配列番号198および配列番号199）を含有する。多重鎖CARは、図4B、C、および表15に記載されているように設計した。すべての多重鎖CARの中で、FcRα鎖の細胞外ドメインは削除されたと4G7scFvとCD8aヒンジ（配列番号：206）で置換された。多重鎖CARのcsm2、csm4、csm5、csm8とcsmlOでは、FcRβ鎖および/またはFcRγ鎖のITAMが削除された。多重鎖CARのcsm2、csm4、csm5、csm6、csm8、csm9とcsmlO、CD3ζ（配列番号：197）の3つのITAMをFcRβ鎖またはFcRγ鎖に追加した。多重鎖CARのcsm2、csm4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9とcsmlO、4-1BB細胞内ドメイン（配列番号：200）を、FcRα鎖、FcRβ鎖またはFcRγ鎖に追加した。多重鎖CAR csmlOでは、CD28細胞内ドメインを、FcRα鎖（配列番号201）に加えた。
【０２３７】
【表１５】
0006352920.tif 000016
【０２３８】
B.一過的に発現された多重鎖CARは、T細胞の活性化を誘発することができる
多重鎖のCARは、ポリシストロン性mRNAでのエレクトロポレーション後のヒトT細胞で発現させることができる。
T細胞は、mMESSAGE mMACHINEキットおよび鋳型として線状化プラスミドを使用して製造されたキャップ化およびポリアデニル化ポリシストン性mRNA（図21A）でエレクトロポレーションした。テンプレートとして使用したプラスミドはT7 RNAポリメラーゼプロモーター含有し、csm 1、csm 2、csm 4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9またはcsmlO（配列番号224〜232）をコードするポリシストロン性DNA配列が続いていた。
【０２３９】
ヒトT細胞へのポリシストロン性mRNAのエレクトロポレーションは、以下のプロトコルに従って、抗CD3/CD28でコーティングしたビーズで予め数日間（3-5）活性化した5×106個のT細胞とIL2を、cytoporationバッファーT中に再懸濁し、45μgのmRNAと一緒に、0.4cmキュベット中で、表14に記載されたPBMC3プログラムを使用してエレクトロポレーションした。
【０２４０】
エレクトロポレーションの24時間後、多重鎖のCARをコードするポリシストロン性mRNAを使用して操作されたヒトT細胞を、固定可能な生存色素eFluor-780およびPE結合ヤギ抗マウスIgGのF（ab '）2断片特異的で染色し、フローサイトメトリーで分析した。図22に示したデータは、ポリシストロンmRNAを用いて操作生きたT細胞はcsm1、csm 2、csm 4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9とcsmlO多重鎖CARを発現することを示している。
【０２４１】
FcεRIについての文献に記載されているように、マルチサブユニットのCARの発現は、3鎖の発現によって調整される。α鎖だけではα+γ鎖複合体よりも少なく発現しており、α+γ鎖複合体よりも発現しており、α+γ鎖複合体はα+β+γ鎖複合体よりも少なくな表現される（図２３）。
【０２４２】
一過多重鎖のCARを発現するヒトT細胞は、標的細胞との共培養の後に脱顆粒する
エレクトロポレーションの24時間後、多重鎖のCARをコードするポリシストロン性mRNAを使用して操作されたヒトT細胞を6時間標的（ダウディ）または対照（K562）細胞と共培養した。図24に示すデータは、多重鎖CAR  csm1、csm 2、csm 4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9とcsmlOを発現するヒトCD8+ T細胞はCD19を発現する標的細胞との共培養では脱顆粒するが、コントロール細胞との共培養では脱顆粒しない。
【０２４３】
一過多重鎖のCARを発現するヒトT細胞は、標的細胞との共培養に続いてサイトカインを分泌する
エレクトロポレーションの24時間後、多重鎖のCARをコードするポリシストロン性mRNAを使用して操作されたヒトT細胞を24時間、ターゲット（ダウディ）または対照（K562）細胞と共培養した。上清を回収し、T細胞によって産生されるサイトカインを定量化するためにTH1/TH2サイトカインサイトメトリックビーズアレイキットを用いて分析した。図25A-Cに示されたデータは、多重鎖車を発現するヒトT細胞がCSMLことを、CSM2、CSM4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9とcsmlOはCD19発現する標的細胞との共培養においてIFNγ、IL8およびIL5を生産示すが、対照細胞との共培養においては示さない。
【０２４４】
一過多重鎖のCAR標的細胞を発現するヒトT細胞は、標的細胞を溶解する
エレクトロポレーションの24時間後、多重鎖のCARをコードするポリシストロン性mRNAを使用して操作されたヒトT細胞は、4時間、標的（ダウディ）または対照（K562）細胞と共培養した。標的細胞は、次いで、それらの生存率を分析するためにフローサイトメトリーによって分析した。図26に示すデータは、多重鎖CAR  csm1、csm2、csm4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9およびcsmlOを発現する細胞は、CD19を発現する標的細胞を溶解するが、対照細胞は溶解しないことを示している。
【０２４５】
明細書中に引用されている参考文献のリスト
［参考文献］
0006352920.tif 000017
0006352920.tif 000018
0006352920.tif 000019
0006352920.tif 000020
【図１】
0006352920.tif 000021
【図２】
0006352920.tif 000022
【図３】
0006352920.tif 000023
【図４Ａ】
0006352920.tif 000024
【図４Ｂ】
0006352920.tif 000025
【図４Ｃ】
0006352920.tif 000026
【図５】
0006352920.tif 000027
【図６】
0006352920.tif 000028
【図７】
0006352920.tif 000029
【図８Ａ】
0006352920.tif 000030
【図８Ｂ】
0006352920.tif 000031
【図８Ｃ】
0006352920.tif 000032
【図８Ｄ】
0006352920.tif 000033
【図８Ｅ】
0006352920.tif 000034
【図９Ａ】
0006352920.tif 000035
【図９Ｂ】
0006352920.tif 000036
【図１０】
0006352920.tif 000037
【図１１】
0006352920.tif 000038
【図１２】
0006352920.tif 000039
【図１３】
0006352920.tif 000040
【図１４Ａ】
0006352920.tif 000041
【図１４Ｂ】
0006352920.tif 000042
【図１４Ｃ】
0006352920.tif 000043
【図１５Ａ】
0006352920.tif 000044
【図１５Ｂ】
0006352920.tif 000045
【図１５Ｃ】
0006352920.tif 000046
【図１６】
0006352920.tif 000047
【図１７】
0006352920.tif 000048
【図１７−１】
0006352920.tif 000049
【図１８】
0006352920.tif 000050
【図１８−１】
0006352920.tif 000051
【図１９】
0006352920.tif 000052
【図２０Ａ】
0006352920.tif 000053
【図２０Ｂ】
0006352920.tif 000054
【図２１Ａ】
0006352920.tif 000055
【図２１Ｂ】
0006352920.tif 000056
【図２１Ｃ】
0006352920.tif 000057
【図２２】
0006352920.tif 000058
【図２３】
0006352920.tif 000059
【図２４Ａ】
0006352920.tif 000060
【図２４Ｂ】
0006352920.tif 000061
【図２５Ａ】
0006352920.tif 000062
【図２５Ｂ】
0006352920.tif 000063
【図２５Ｃ】
0006352920.tif 000064
【図２６】
0006352920.tif 000065
【配列表】
0006352920000001.app