(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質とコンジュゲートしている糖を含むグリココンジュゲートを作製する方法であって、
ａ）糖を、１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）と、有機溶媒中で反応させて、活性化糖を生成するステップと、
ｂ）前記活性化糖を、シスタミンもしくはシステアミンまたはその塩と反応させて、チオール化糖を生成するステップと、
ｃ）前記チオール化糖を還元剤と反応させて、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
ｄ）前記活性化チオール化糖を、１つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、
ｅ）前記チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）前記活性化担体タンパク質のコンジュゲートされていないα−ハロアセトアミド基をキャップすることができる第一のキャッピング試薬、および／または（ｉｉ）コンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル残基をキャップすることができる第二のキャッピング試薬と反応させるステップと
を含み、それにより、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートが生成される、方法。
【請求項２】
前記キャッピングステップｅ）が、前記チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）第一のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、および／または（ｉｉ）第二のキャッピング試薬としてのヨードアセトアミドと反応させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トリアゾールまたはイミダゾールと糖を調合して、調合された糖を提供するステップをさらに含み、前記調合された糖は、ステップａ）の前に、凍結され、凍結乾燥され、有機溶媒中で再構成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｃ）において生成されたチオール化糖の精製をさらに含み、前記精製ステップは透析濾過を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
ステップｃ）における前記還元剤が、トリス（−２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはメルカプトエタノールである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記担体タンパク質が、活性化ブロモ酢酸誘導体により活性化される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ブロモ酢酸誘導体が、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＢＡＡＮＳ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
透析濾過による前記ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの精製をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）における前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリル、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、またはそれらの混合物からなる群から選択される極性非プロトン性溶媒である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２から４の間である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．４から１．７の間である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖が、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する莢膜多糖である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記莢膜多糖が、肺炎球菌（Ｐｎ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記莢膜多糖がＰｎ血清型３３Ｆ莢膜多糖である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記莢膜多糖がＰｎ血清型２２Ｆ莢膜多糖である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記莢膜多糖がＰｎ血清型１０Ａ莢膜多糖である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記莢膜多糖がＰｎ血清型１１Ａ莢膜多糖である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する莢膜多糖である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記莢膜多糖が、髄膜炎菌（Ｍｎ）血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法によって生成される、グリココンジュゲート。
【請求項２２】
請求項２１に記載のグリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含む、免疫原性組成物。
【請求項２３】
ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質とコンジュゲートしている細菌莢膜多糖を含むグリココンジュゲートであって、前記多糖はカルバメート結合を介して前記ｅＴＥＣスペーサーと共有結合しており、前記担体タンパク質はアミド結合を介して前記ｅＴＥＣスペーサーと共有結合している、グリココンジュゲート。
【請求項２４】
前記莢膜多糖が肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する、請求項２３に記載のグリココンジュゲート。
【請求項２５】
前記莢膜多糖が、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される、請求項２４に記載のグリココンジュゲート。
【請求項２６】
前記莢膜多糖がＰｎ血清型３３Ｆ莢膜多糖である、請求項２５に記載のグリココンジュゲート。
【請求項２７】
前記莢膜多糖がＰｎ血清型２２Ｆ莢膜多糖である、請求項２５に記載のグリココンジュゲート。
【請求項２８】
前記莢膜多糖がＰｎ血清型１０Ａ莢膜多糖である、請求項２５に記載のグリココンジュゲート。
【請求項２９】
前記莢膜多糖がＰｎ血清型１１Ａ莢膜多糖である、請求項２５に記載のグリココンジュゲート。
【請求項３０】
前記莢膜多糖が髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する、請求項２３に記載のグリココンジュゲート。
【請求項３１】
前記莢膜多糖が、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される、請求項３０に記載のグリココンジュゲート。
【請求項３２】
前記多糖が、１０ｋＤａから２，０００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項２３から３１のいずれか一項に記載のグリココンジュゲート。
【請求項３３】
前記多糖が、５０ｋＤａから２，０００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項３２に記載のグリココンジュゲート。
【請求項３４】
５０ｋＤａから２０，０００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項２３から３３のいずれか一項に記載のグリココンジュゲート。
【請求項３５】
５００ｋＤａから１０，０００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項３４に記載のグリココンジュゲート。
【請求項３６】
前記多糖が、７５〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する、請求項２３から３５のいずれか一項に記載のグリココンジュゲート。
【請求項３７】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項２３から３６のいずれか一項に記載のグリココンジュゲート。
【請求項３８】
前記ＣＲＭ１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して前記多糖と共有結合している２から２０個のリジン残基を含む、請求項３７に記載のグリココンジュゲート。
【請求項３９】
前記ＣＲＭ１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して前記多糖と共有結合している４から１６個のリジン残基を含む、請求項３７に記載のグリココンジュゲート。
【請求項４０】
前記糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が０．２から４の間である、請求項２３から３９のいずれか一項に記載のグリココンジュゲート。
【請求項４１】
前記糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が０．４から１．７の間である、請求項４０に記載のグリココンジュゲート。
【請求項４２】
ＣＲＭ１９７と糖との間の少なくとも１つの結合が、前記糖の２５の糖繰り返し単位ごとに出現する、請求項３７に記載のグリココンジュゲート。
【請求項４３】
ＣＲＭ１９７と糖との間の少なくとも１つの結合が、前記糖の１５の糖繰り返し単位ごとに出現する、請求項３７に記載のグリココンジュゲート。
【請求項４４】
ＣＲＭ１９７と糖との間の少なくとも１つの結合が、前記糖の１０の糖繰り返し単位ごとに出現する、請求項３７に記載のグリココンジュゲート。
【請求項４５】
ＣＲＭ１９７と糖との間の少なくとも１つの結合が、前記糖の４つの糖繰り返し単位ごとに出現する、請求項３７に記載のグリココンジュゲート。
【請求項４６】
糖の総量と比較して１５％未満の遊離糖を含む、請求項２３から４５のいずれか一項に記載のグリココンジュゲート。
【請求項４７】
３５％以上のグリココンジュゲートが０．３以下のＫｄを有する、請求項２３から４６のいずれか一項に記載のグリココンジュゲート。
【請求項４８】
請求項２３から４７のいずれか一項に記載のグリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含む、免疫原性組成物。
【請求項４９】
追加の抗原をさらに含む、請求項４８に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
前記追加の抗原が、タンパク質抗原、または肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来する莢膜多糖のグリココンジュゲートを含む、請求項４９に記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
前記追加の抗原が、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖のグリココンジュゲートを含む、請求項５０に記載の免疫原性組成物。
【請求項５２】
前記追加の抗原が、タンパク質抗原、または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する莢膜多糖のグリココンジュゲートを含む、請求項４９に記載の免疫原性組成物。
【請求項５３】
前記追加の抗原が、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖のグリココンジュゲートを含む、請求項５２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５４】
アジュバントをさらに含む、請求項４８から５３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５５】
前記アジュバントがアルミニウムベースのアジュバントである、請求項５４に記載の免疫原性組成物。
【請求項５６】
前記アルミニウムベースのアジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項５５に記載の免疫原性組成物。
【請求項５７】
対象において、細菌性の感染症、疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させる方法に使用するための請求項４８から５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５８】
前記感染症、疾患または状態が、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細菌に関連し、前記グリココンジュゲートが、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖を含む、請求項５７に記載の免疫原性組成物。
【請求項５９】
前記感染症、疾患または状態が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に関連し、前記グリココンジュゲートが、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖を含む、請求項５７に記載の免疫原性組成物。
【請求項６０】
対象において、保護免疫応答を誘導する方法に使用するための、請求項４８から５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６１】
前記細菌莢膜多糖が、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖である、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６２】
前記細菌莢膜多糖が、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖である、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６３】
医薬として使用するための、請求項４８から５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６４】
ワクチンとして使用するための、請求項４８から５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６５】
細菌性の感染症、疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させる医薬の製造のための、請求項４８から５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしている糖を含むグリココンジュゲート、そのようなグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物、ならびにそのようなグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物の調製および使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫抗原性の低い分子を「担体」分子とコンジュゲートさせることによってこれらの分子の免疫原性を増大させるためのアプローチは、数十年にわたってうまく利用されてきた（例えば、Ｇｏｅｂｅｌら（１９３９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６９：５３を参照）。例えば、この「担体効果」を活用することによってより有効な免疫原性組成物を作り出すために、精製された莢膜ポリマーを担体タンパク質とコンジュゲートさせた、多くの免疫原性組成物について記述されている。（Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら（１９８４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：５８２〜５９１）。コンジュゲーションは、遊離多糖により免疫化された場合に幼児において通常観察される不十分な抗体応答を回避することも示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８５）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１０７：３４６；Ｉｎｓｅｌら（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：２９４）。
【０００３】
コンジュゲートは、ホモ二官能性、ヘテロ二官能性またはゼロ長架橋剤等の種々の架橋またはカップリング試薬を使用して作り出すことに成功してきた。多くの方法は、糖、タンパク質およびペプチド等の免疫原性分子を、ペプチドまたはタンパク質担体とカップリングさせるために現在利用可能なものである。ほとんどの方法は、アミン、アミド、ウレタン、イソチオ尿素もしくはジスルフィド結合、またはいくつかの事例においてチオエーテルを作り出す。反応性部位を担体および／または免疫原性分子上の反応性アミノ酸分子の側鎖に導入する架橋またはカップリング試薬の使用の不利点は、反応性部位が、中和されていなければ、任意の不要な分子と、インビトロ（故にコンジュゲートの官能性または安定性に潜在的に悪影響を及ぼす）またはインビボ（故に調製物により免疫化された人または動物において有害事象の潜在的リスクを招く）のいずれかで自由に反応することである。そのような過剰な反応性部位は、種々の公知の化学反応を利用してこれらの部位を不活性化するように反応するまたは「キャップされる」ことができるが、これらの反応はコンジュゲートの官能性に対し他の点で破壊的となる可能性がある。これは、反応性部位を担体分子に導入することによってコンジュゲートを作り出そうと試みる場合に特に問題となる可能性があり、その理由は、サイズが大きくなり構造が（免疫原性分子と比べて）複雑になるにつれて、化学的処理の破壊的効果を受けやすくなり得るからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
故に、担体の官能性が保存されており、コンジュゲートが所望の免疫応答を引き出す能力を保持しているような、適切にキャップされた担体タンパク質コンジュゲートを調製するための新たな方法が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、本明細書においては（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーと称される二価のヘテロ二官能性リンカーを介して担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしている糖を含むグリココンジュゲートを作製する方法を対象とする。ｅＴＥＣスペーサーは、７個の線形原子（すなわち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）を包含し、糖と担体タンパク質との間に安定なチオエーテルおよびアミド結合を提供する。本発明は、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲート、それらを含む免疫原性組成物、ならびにそのようなグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物の使用のための方法をさらに提供する。
【０００６】
一態様において、本発明は、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質とコンジュゲートしている糖を含むグリココンジュゲートであって、糖はカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーと共有結合しており、担体タンパク質はアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーと共有結合している、グリココンジュゲートを提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、糖は、細菌に、特に病原性細菌に由来する莢膜多糖等の多糖である。他の実施形態において、糖は、オリゴ糖または単糖である。
【０００８】
本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、一般式（Ｉ）：
【０００９】
【化１】
0006291495.tif 000002
［式中、ｅＴＥＣスペーサーを含む原子は、中央のボックス内に含まれている］
によって表され得る。
【００１０】
本発明のグリココンジュゲートに組み込まれる担体タンパク質は、本明細書においてさらに記述されるまたは当業者に公知である通り、そのような目的に概して好適な担体タンパク質の群から選択される。特定の実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
【００１１】
別の態様において、本発明は、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質とコンジュゲートしている糖を含むグリココンジュゲートを作製する方法であって、ａ）糖を、炭酸誘導体と、有機溶媒中で反応させて、活性化糖を生成するステップと、ｂ）活性化糖を、シスタミンもしくはシステアミンまたはその塩と反応させて、チオール化糖を生成するステップと、ｃ）チオール化糖を還元剤と反応させて、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化糖を、１つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質のコンジュゲートされていないα−ハロアセトアミド基をキャップすることができる第一のキャッピング試薬、および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖のコンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル残基をキャップすることができる第二のキャッピング試薬と反応させるステップとを含み、それにより、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートが生成される、方法を提供する。
【００１２】
多くの実施形態において、炭酸誘導体は１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ：１，１’−ｃａｒｂｏｎｙｌ−ｄｉ−（１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｅ））または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：１，１’−ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ）である。好ましくは、炭酸誘導体はＣＤＴであり、有機溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）等の極性非プロトン性溶媒である。好ましい実施形態において、チオール化糖は、活性化糖と、二官能性対称チオアルキルアミン試薬、シスタミンまたはその塩との反応によって生成される。代替として、チオール化糖は、活性化糖とシステアミンまたはその塩との反応によって形成され得る。本発明の方法によって生成されるｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、一般式（Ｉ）によって表され得る。
【００１３】
多くの実施形態において、第一のキャッピング試薬はＮ−アセチル−Ｌ−システインであり、これは、担体タンパク質のリジン残基上のコンジュゲートされていないα−ハロアセトアミド基と反応して、チオエーテル結合を介して活性化リジン残基と共有結合しているＳ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ：Ｓ−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）残基を形成する。他の実施形態において、第二のキャッピング試薬はヨードアセトアミド（ＩＡＡ：ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）であり、これは、活性化チオール化糖のコンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル基と反応して、キャップされたチオアセトアミドを提供する。高頻度で、ステップｅ）は、第一のキャッピング試薬および第二のキャッピング試薬の両方でキャップすることを含む。ある特定の実施形態において、ステップｅ）は、第一のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システインおよび第二のキャッピング試薬としてのＩＡＡでキャップすることを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、キャッピングステップｅ）は、第一および／または第二のキャッピング試薬との反応の後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰまたはメルカプトエタノールとの反応をさらに含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ステップｄ）は、活性化チオール化糖を活性化担体タンパク質と反応させる前に、１つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を提供することをさらに含む。多くの実施形態において、活性化担体タンパク質は、１つまたは複数のα−ブロモアセトアミド基を含む。
【００１６】
別の態様において、本発明は、本明細書において開示されている方法のいずれかに従って生成される、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質とコンジュゲートしている糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを提供する。
【００１７】
本発明の態様、特に本明細書において記述されている方法および組成物の実施形態のそれぞれについて、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、細菌莢膜多糖、特に病原性細菌に由来する莢膜多糖である糖を含む。
【００１８】
いくつかのそのような実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する肺炎球菌（Ｐｎ：ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）莢膜多糖を含む。特定の実施形態において、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００１９】
他のそのような実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する髄膜炎菌（Ｍｎ：ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）莢膜多糖を含む。特定の実施形態において、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００２０】
特に好ましい実施形態において、糖は、ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７と共有結合によりコンジュゲートしている、ＰｎまたはＭｎ莢膜多糖等の細菌莢膜多糖である。
【００２１】
本明細書において記述されている組成物および方法は、様々な用途において有用である。例えば、本発明のグリココンジュゲートは、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む免疫原性組成物の生成において使用され得る。そのような免疫原性組成物を使用して、例えば肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）等の病原性細菌による細菌感染症からレシピエントを保護することができる。
【００２２】
故に、別の態様において、本発明は、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含み、グリココンジュゲートは、本明細書において記述されている通り、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしている糖を含む、免疫原性組成物を提供する。
【００２３】
多くの実施形態において、免疫原性組成物は、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含み、グリココンジュゲートは細菌莢膜多糖を含む。
【００２４】
いくつかのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するＰｎ莢膜多糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む。いくつかの特定の実施形態において、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００２５】
他のそのような実施形態において、免疫原性組成物は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む。いくつかの特定の実施形態において、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００２６】
好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７と共有結合によりコンジュゲートしている、ＰｎまたはＭｎ莢膜多糖等の細菌莢膜多糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、免疫原性組成物はアジュバントを含む。いくつかのそのような実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである。一実施形態において、本明細書において記述されている免疫原性組成物は、アジュバントリン酸アルミニウムを含む。
【００２８】
別の態様において、本発明は、対象において、細菌性の感染症、疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させる方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物を投与するステップを含み、前記免疫原性組成物が、細菌莢膜多糖等の細菌性抗原を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む、方法を提供する。
【００２９】
一実施形態において、感染症、疾患または状態は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細菌に関連し、グリココンジュゲートは、Ｐｎ莢膜多糖を含む。別の実施形態において、感染症、疾患または状態は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に関連し、グリココンジュゲートは、Ｍｎ莢膜多糖を含む。
【００３０】
他の態様において、本発明は、病原性細菌に対する免疫応答を誘導するための方法、病原性細菌によって引き起こされた疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させるための方法、ならびに、病原性細菌によって引き起こされた感染症、疾患または状態の少なくとも１つの症状の重症度を低減させる方法であって、各々の場合において、対象に、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含む免疫学的に有効な量の免疫原性組成物を投与することによるものであり、グリココンジュゲートが、病原性細菌に由来する細菌莢膜多糖等の細菌性抗原を含む、方法を提供する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含む免疫学的に有効な量の免疫原性組成物を投与するステップを含み、グリココンジュゲートが、細菌莢膜多糖等の細菌性抗原を含む、方法を提供する。好ましい実施形態において、方法は、本明細書においてさらに記述される通り、対象において保護免疫応答を生成するステップを伴う。
【００３２】
別の態様において、本発明は、本明細書においてさらに記述される通り、対象において保護免疫応答を生じさせるために、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む免疫学的に有効な量の免疫原性組成物を対象に投与する方法を提供する。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲート、またはそのようなグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物に応答して生じる抗体を提供する。そのような抗体は、細菌検出および血清型決定等の研究および臨床検査室アッセイにおいて使用され得、対象に受動免疫を付与するために使用されてよい。
【００３４】
また別の態様において、本発明は、細菌感染症、例えば肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）による感染症の予防、治療または改善において使用するための、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、細菌感染症、例えば肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）による感染症の予防、治療または改善用の薬剤の調製のための、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む免疫原性組成物の使用を提供する。
【００３６】
上述した治療的および／または予防的な方法および使用のある特定の好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質と共有結合している細菌莢膜多糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む。本明細書において記述されている方法および使用の多くの実施形態において、細菌莢膜多糖は、Ｐｎ莢膜多糖またはＭｎ莢膜多糖である。いくつかのそのような実施形態において、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。他のそのような実施形態において、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００３７】
ある特定の好ましい実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。特に好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７と共有結合によりコンジュゲートしている、ＰｎまたはＭｎ莢膜多糖等の細菌莢膜多糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＣＲＭ１９７と共有結合によりコンジュゲートしている多糖を含むグリココンジュゲートについて、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの調製のための一般的スキームを示す図である。
【図２】肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆ（Ｐｎ−３３Ｆ）莢膜多糖の繰り返し多糖構造を示す図である。
【図３】肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ（Ｐｎ−２２Ｆ）莢膜多糖の繰り返し多糖構造を示す図である。
【図４】肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ（Ｐｎ−１０Ａ）莢膜多糖の繰り返し多糖構造を示す図である。
【図５】肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａ（Ｐｎ−１１Ａ）莢膜多糖の繰り返し多糖構造を示す図である。
【図６】ｅＴＥＣリンカー（Ａ）ならびに潜在的なキャップされたおよびキャップされていない遊離スルフヒドリル部位（Ｂ）を組み込んだＰｎ−３３Ｆグリココンジュゲートの代表的構造を示す図である。
【図７】ＣＲＭ１９７とのＰｎ−３３Ｆグリココンジュゲートの調製において使用される活性化（Ａ）およびコンジュゲーション（Ｂ）プロセスの代表的なプロセスフロー図を示す図である。
【図８】活性化ステップにおいて使用されるＣＤＴのモル当量の関数としてのＰｎ−３３Ｆ莢膜多糖のチオール化レベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の好ましい実施形態の下記の詳細な説明および本明細書に包含される実施例を参照することにより、本発明をより容易に理解することができる。特に定義しない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において記述されているものと同様または同等である任意の方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することができるが、ある特定の好ましい方法および材料が本明細書において記述されている。実施形態について記述し、本発明を特許請求する際には、ある特定の術語を、以下に提示する定義に従って使用する。
【００４０】
本明細書において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段の指示がない限り、複数の参照物を包含する。故に、例えば、「その方法」への言及は、１つもしくは複数の方法、および／または本明細書において記述されている種類のステップを包含し、「ｅＴＥＣスペーサー」への言及は、本開示を読んで当業者に明らかとなる通り、１つまたは複数のｅＴＥＣスペーサーを指す。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「約」は、定められた濃度範囲、時間枠、分子量、温度またはｐＨ等の値の、統計的に有意な範囲内であることを意味する。そのような範囲は、指示されている値または範囲の一桁以内、典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、さらにより典型的には５％以内であってよい。時に、そのような範囲は、所与の値または範囲の測定および／または決定に使用される標準的な方法に典型的な実験誤差以内であってよい。用語「約」によって網羅される許容偏差は、研究中の特定の系によって決まることになり、当業者であれば容易に分かり得る。本願内で範囲が記載されている場合にはいつでも、該範囲内のすべての整数も、本発明の実施形態として企図されている。
【００４２】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語は、米国特許法におけるものに帰属する意味を有し得、例えば、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「包含される」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味し得ることに留意されたい。そのような用語は、任意の他の原料を除外することなく、特定の原料または原料のセットの包含を指す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」等の用語は、米国特許法におけるものに帰属する意味を有し、例えば、本発明の新規または基本的な特徴から逸脱しない追加の原料またはステップの包含を可能にする、すなわち、本発明の新規または基本的な特徴から逸脱する追加の列挙されていない原料またはステップを除外する。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、米国特許法におけるものに属する意味を有する、すなわち、これらの用語はクローズエンドである。したがって、これらの用語は、特定の原料または原料のセットの包含および他のすべての原料の除外を指す。
【００４３】
用語「糖」は、本明細書において使用される場合、多糖、オリゴ糖または単糖を指し得る。高頻度で、糖への言及は、細菌莢膜多糖、特に、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）等の病原性細菌に由来する莢膜多糖を指す。
【００４４】
用語「コンジュゲート」または「グリココンジュゲート」は、担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしている糖を指すために、本明細書において交換可能に使用されている。本発明のグリココンジュゲートは、時に、本明細書において「ｅＴＥＣ結合」グリココンジュゲートと称され、これは、少なくとも１つのｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしている糖を含む。本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートおよびそれらを含む免疫原性組成物は、若干量の遊離糖を含有し得る。
【００４５】
用語「遊離糖」は、本明細書において使用される場合、担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしていない糖、または、高い糖／タンパク質比（＞５：１）で付着している極めて少ない担体タンパク質と共有結合により付着しているが、それにもかかわらずグリココンジュゲート組成物中に存在する糖を意味する。遊離糖は、コンジュゲートしている糖−担体タンパク質グリココンジュゲートと、非共有結合により会合していてよい（すなわち、それと非共有結合している、それに吸着している、またはその中にもしくはそれとともに取り込まれている）。用語「遊離多糖」および「遊離莢膜多糖」は、本明細書において、糖がそれぞれ多糖または莢膜多糖であるグリココンジュゲートと同じ意味を伝えるために使用され得る。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「コンジュゲートさせること（ｔｏ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」、「コンジュゲートしている」および「コンジュゲートさせること（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）」は、糖、例えば細菌莢膜多糖が、担体分子または担体タンパク質と共有結合により付着するプロセスを指す。本発明の方法において、糖は、少なくとも１つのｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしている。コンジュゲーションは、以下に記述する方法に従って、または当技術分野において公知である他のプロセスによって実施することができる。担体タンパク質とのコンジュゲーションは、細菌莢膜多糖の免疫原性を強化する。
【００４７】
グリココンジュゲート
本発明は、１つまたは複数のｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしている糖を含むグリココンジュゲートであって、糖はカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーと共有結合によりコンジュゲートしており、担体タンパク質はアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーと共有結合によりコンジュゲートしている、グリココンジュゲートに関する。
【００４８】
１つまたは複数のｅＴＥＣスペーサーの存在に加えて、本発明のグリココンジュゲートの新規特色は、糖および得られたｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの分子量プロフィール、担体タンパク質当たりのコンジュゲートしているリジンとｅＴＥＣスペーサーを介して多糖と共有結合しているリジンの数との比、糖の繰り返し単位の関数としての担体タンパク質と糖との間の共有結合の数、ならびに糖の総量と比較した遊離糖の相対量を包含する。
【００４９】
本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、一般式（Ｉ）：
【００５０】
【化２】
0006291495.tif 000003
によって表され得る。
【００５１】
ｅＴＥＣスペーサーは、７個の線形原子（すなわち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）を包含し、糖と担体タンパク質との間に安定なチオエーテルおよびアミド結合を提供する。ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの合成は、糖とカルバメート結合を形成してチオール化糖を提供する、糖の活性化ヒドロキシル基とチオアルキルアミン試薬、例えば、シスタミンもしくはシステインアミンまたはその塩のアミノ基との反応を伴う。１つまたは複数の遊離スルフヒドリル基の発生は、還元剤との反応により活性化チオール化糖を提供することによって遂行される。活性化チオール化糖の遊離スルフヒドリル基と、アミン含有残基上に１つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を有する活性化担体タンパク質との反応は、チオエーテル結合を作り出してコンジュゲートを形成し、ここで、担体タンパク質は、アミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーと付着している。
【００５２】
本発明のグリココンジュゲートにおいて、糖は、多糖、オリゴ糖または単糖であってよく、担体タンパク質は、本明細書においてさらに記述されるまたは当業者に公知の通りの任意の好適な担体から選択され得る。多くの実施形態において、糖は細菌莢膜多糖である。いくつかのそのような実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
【００５３】
いくつかのそのような実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するＰｎ莢膜多糖を含む。特定の実施形態において、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。他の実施形態において、莢膜多糖は、Ｐｎ血清型１０Ａ、１１Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。１つのそのような実施形態において、莢膜多糖はＰｎ−３３Ｆ莢膜多糖である。別のそのような実施形態において、莢膜多糖はＰｎ−２２Ｆ莢膜多糖である。別のそのような実施形態において、莢膜多糖はＰｎ−１０Ａ莢膜多糖である。また別のそのような実施形態において、莢膜多糖はＰｎ−１１Ａ莢膜多糖である。
【００５４】
他の実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖を含む。特定の実施形態において、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。１つのそのような実施形態において、莢膜多糖はＭｎ−Ａ莢膜多糖である。別のそのような実施形態において、莢膜多糖はＭｎ−Ｃ莢膜多糖である。別のそのような実施形態において、莢膜多糖はＭｎ−Ｗ１３５莢膜多糖である。また別のそのような実施形態において、莢膜多糖はＭｎ−Ｙ莢膜多糖である。
【００５５】
特に好ましい実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７と共有結合によりコンジュゲートしている、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ莢膜多糖、またはＭｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５もしくはＹ莢膜多糖等の、ＰｎまたはＭｎ細菌莢膜多糖を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしている糖を含み、糖は、１０ｋＤａから２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他のそのような実施形態において、糖は、５０ｋＤａから２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。さらなるそのような実施形態において、糖は、５０ｋＤａから１，７５０ｋＤａの間、５０ｋＤａから１，５００ｋＤａの間、５０ｋＤａから１，２５０ｋＤａの間、５０ｋＤａから１，０００ｋＤａの間、５０ｋＤａから７５０ｋＤａの間、５０ｋＤａから５００ｋＤａの間、１００ｋＤａから２，０００ｋＤａの間、１００ｋＤａから１，７５０ｋＤａの間、１００ｋＤａから１，５００ｋＤａの間、１００ｋＤａから１，２５０ｋＤａの間、１００ｋＤａから１，０００ｋＤａの間、１００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、１００ｋＤａから５００ｋＤａの間、２００ｋＤａから２，０００ｋＤａの間、２００ｋＤａから１，７５０ｋＤａの間、２００ｋＤａから１，５００ｋＤａの間、２００ｋＤａから１，２５０ｋＤａの間、２００ｋＤａから１，０００ｋＤａの間、２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、または２００ｋＤａから５００ｋＤａの間の分子量を有する。いくつかのそのような実施形態において、糖は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ莢膜多糖、またはＭｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５もしくはＹ莢膜多糖等の細菌莢膜多糖であり、ここで、莢膜多糖は、記述されている通りの分子量範囲のいずれか内にある分子量を有する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、５０ｋＤａから２０，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他の実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、５００ｋＤａから１０，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他の実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、２００ｋＤａから１０，０００ｋＤａの間の分子量を有する。さらに他の実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａから３，０００ｋＤａの間の分子量を有する。
【００５８】
さらなる実施形態において、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、２００ｋＤａから２０，０００ｋＤａの間、２００ｋＤａから１５，０００ｋＤａの間、２００ｋＤａから１０，０００ｋＤａの間、２００ｋＤａから７，５００ｋＤａの間、２００ｋＤａから５，０００ｋＤａの間、２００ｋＤａから３，０００ｋＤａの間、２００ｋＤａから１，０００ｋＤａの間、５００ｋＤａから２０，０００ｋＤａの間、５００ｋＤａから１５，０００ｋＤａの間、５００ｋＤａから１２，５００ｋＤａの間、５００ｋＤａから１０，０００ｋＤａの間、５００ｋＤａから７，５００ｋＤａの間、５００ｋＤａから６，０００ｋＤａの間、５００ｋＤａから５，０００ｋＤａの間、５００ｋＤａから４，０００ｋＤａの間、５００ｋＤａから３，０００ｋＤａの間、５００ｋＤａから２，０００ｋＤａの間、５００ｋＤａから１，５００ｋＤａの間、５００ｋＤａから１，０００ｋＤａの間、７５０ｋＤａから２０，０００ｋＤａの間、７５０ｋＤから１５，０００ｋＤａの間、７５０ｋＤａから１２，５００ｋＤａの間、７５０ｋＤａから１０，０００ｋＤａの間、７５０ｋＤａから７，５００ｋＤａの間、７５０ｋＤａから６，０００ｋＤａの間、７５０ｋＤａから５，０００ｋＤａの間、７５０ｋＤａから４，０００ｋＤａの間、７５０ｋＤａから３，０００ｋＤａの間、７５０ｋＤａから２，０００ｋＤａの間、７５０ｋＤａから１，５００ｋＤａの間、１，０００ｋＤａから１５，０００ｋＤａの間、１，０００ｋＤａから１２，５００ｋＤａの間、１，０００ｋＤａから１０，０００ｋＤａの間、１，０００ｋＤａから７，５００ｋＤａの間、１，０００ｋＤａから６，０００ｋＤａの間、１，０００ｋＤａから５，０００ｋＤａの間、１，０００ｋＤａから４，０００ｋＤａの間、１，０００ｋＤａから２，５００ｋＤａの間、２，０００ｋＤａから１５，０００ｋＤａの間、２，０００ｋＤａから１２，５００ｋＤａの間、２，０００ｋＤａから１０，０００ｋＤａの間、２，０００ｋＤａから７，５００ｋＤａの間、２，０００ｋＤａから６，０００ｋＤａの間、２，０００ｋＤａから５，０００ｋＤａの間、２，０００ｋＤａから４，０００ｋＤａの間、または２，０００ｋＤａから３，０００ｋＤａの間の分子量を有する。
【００５９】
本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを特徴付けるための別の手法は、ｅＴＥＣスペーサーを介して糖とコンジュゲートする、担体タンパク質中のリジン残基の数によるものであり、これは、コンジュゲートしているリジンの範囲として特徴付けることができる。
【００６０】
多くの実施形態において、担体タンパク質は、担体タンパク質上のリジン残基の１つまたは複数のε−アミノ基とのアミド結合を介して、ｅＴＥＣスペーサーと共有結合によりコンジュゲートしている。いくつかのそのような実施形態において、担体タンパク質は、糖と共有結合によりコンジュゲートしている２から２０個のリジン残基を含む。他のそのような実施形態において、担体タンパク質は、糖と共有結合によりコンジュゲートしている４から１６個のリジン残基を含む。
【００６１】
好ましい実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７を含み、これは３９のリジン残基を含有する。いくつかのそのような実施形態において、ＣＲＭ１９７は、糖と共有結合している３９個のうち、４から１６個のリジン残基を含み得る。このパラメーターを表現するための別の手法は、ＣＲＭ１９７リジンの約１０％から約４１％が糖と共有結合していることである。別のそのような実施形態において、ＣＲＭ１９７は、糖と共有結合している３９個のうち、２から２０個のリジン残基を含み得る。このパラメーターを表現するための別の手法は、ＣＲＭ１９７リジンの約５％から約５０％が糖と共有結合していることである。
【００６２】
本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを、糖対担体タンパク質の比（重量／重量）によって特徴付けることもできる。いくつかの実施形態において、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．２から４の間である。他の実施形態において、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、１．０から２．５の間である。さらなる実施形態において、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．４から１．７の間である。いくつかのそのような実施形態において、糖は細菌莢膜多糖であり、かつ／または担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
【００６３】
グリココンジュゲートを、糖の繰り返し単位の関数としての、担体タンパク質と糖との間の共有結合の数によって特徴付けることもできる。一実施形態において、本発明のグリココンジュゲートは、多糖の４つの糖繰り返し単位ごとに、担体タンパク質と多糖との間に少なくとも１つの共有結合を含む。別の実施形態において、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１０の糖繰り返し単位ごとに少なくとも１回出現する。別の実施形態において、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１５の糖繰り返し単位ごとに少なくとも１回出現する。さらなる実施形態において、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の２５の糖繰り返し単位ごとに少なくとも１回出現する。
【００６４】
多くの実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７と多糖との間のｅＴＥＣスペーサーを経由する共有結合は、多糖の４、１０、１５または２５の糖繰り返し単位ごとに少なくとも１回出現する。
【００６５】
コンジュゲーション中に考慮すべき重要事項は、糖エピトープの一部を形成し得る、Ｏ−アシル、ホスフェートまたはグリセロールリン酸側鎖等の個々の成分の潜在的に感受性の高い非糖置換基官能基の保持を可能にする条件の開発である。
【００６６】
一実施形態において、グリココンジュゲートは、１０〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する糖を含む。いくつかのそのような実施形態において、糖は、５０〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する。他のそのような実施形態において、糖は、７５〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する。さらなる実施形態において、糖は、７０％以上（≧７０％）のＯ−アセチル化度を有する。
【００６７】
本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしていないが、それにもかかわらずグリココンジュゲート組成物中に存在する遊離糖を含有し得る。遊離糖は、グリココンジュゲートと、非共有結合により会合して（すなわち、非共有結合して、吸着して、またはその中にもしくはそれとともに取り込まれて）いてよい。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、糖の総量に対して、約４５％未満の遊離糖、約４０％未満の遊離糖、約３５％未満の遊離糖、約３０％未満の遊離糖、約２５％未満の遊離糖、約２０％未満の遊離糖、約１５％未満の遊離糖、約１０％未満の遊離糖、または約５％未満の遊離糖を含む。好ましくは、グリココンジュゲートは、１５％未満の遊離糖、より好ましくは１０％未満の遊離糖、なお一層好ましくは５％未満の遊離糖を含む。
【００６９】
ある特定の好ましい実施形態において、本発明は、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしている、莢膜多糖、好ましくはＰｎまたはＭｎ莢膜多糖を含み、下記の特色の１つまたは複数を単独でまたは組み合わせて有する、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを提供する：多糖は５０ｋＤａから２，０００ｋＤａの間の分子量を有する；グリココンジュゲートは５００ｋＤａから１０，０００ＫＤａの間の分子量を有する；担体タンパク質は糖と共有結合している２から２０個のリジン残基を有する；糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は０．２から４の間である；グリココンジュゲートは、多糖の４、１０、１５または２５の糖繰り返し単位ごとに、担体タンパク質と多糖との間に少なくとも１つの共有結合を含む；糖は、７５〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する；コンジュゲートは、全多糖に対して約１５％未満の遊離多糖を含む；担体タンパク質はＣＲＭ１９７である；莢膜多糖は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ莢膜多糖から選択され、または莢膜多糖は、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５もしくはＹ莢膜多糖から選択される。
【００７０】
ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを、それらの分子サイズ分布（Ｋｄ）によって特徴付けることもできる。コンジュゲートの分子サイズは、高圧液体クロマトグラフィーシステム（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用するセファロースＣＬ−４Ｂ固定相サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）充填剤によって決定される。Ｋｄ決定のために、クロマトグラフィーカラムを最初に較正して、空隙容積または全排除容積を表すＶ０、および、粒子間容積としても公知である、試料中の最小分子が溶離する容積、Ｖｉを決定する。すべてのＳＥＣ分離は、Ｖ０とＶｉとの間で起こる。収集された各画分についてのＫｄ値は、下記の式Ｋｄ＝（Ｖｅ−Ｖｉ）／（Ｖｉ−Ｖ０）［式中、Ｖｅは化合物の保持容積を表す］によって決定される。０．３以下を溶離する％画分（主要ピーク）は、コンジュゲートＫｄ（分子サイズ分布）を定義する。いくつかの実施形態において、本発明は、３５％以上の分子サイズ分布（Ｋｄ）を有するｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを提供する。他の実施形態において、本発明は、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の分子サイズ分布（Ｋｄ）を有するｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを提供する。
【００７１】
本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、遊離スルフヒドリル残基を含有し得る。いくつかの場合において、本明細書において提供されている方法によって形成された活性化チオール化糖は、多数の遊離スルフヒドリル残基を含有することになり、そのうちいくつかは、コンジュゲーションステップ中に担体タンパク質との共有結合によるコンジュゲーションを受けない場合がある。そのような残留遊離スルフヒドリル残基は、潜在的に反応性の官能基をキャップするために、チオール反応性キャッピング試薬、例えばヨードアセトアミド（ＩＡＡ）との反応によりキャップされる。他のチオール反応性キャッピング試薬、例えばマレイミド含有試薬等も企図されている。
【００７２】
加えて、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、残留するコンジュゲートされていない担体タンパク質を含有していてよく、これは、キャッピングプロセスステップ中に修飾を受けた活性化担体タンパク質を包含し得る。
【００７３】
本発明のグリココンジュゲートは、免疫原性組成物の生成において、例えば肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）等の病原性細菌による細菌感染症からレシピエントを保護するために使用され得る。故に、別の態様において、本発明は、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含み、グリココンジュゲートが、本明細書において記述されている通り、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしている糖を含む、免疫原性組成物を提供する。
【００７４】
多くの実施形態において、免疫原性組成物は、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含み、グリココンジュゲートは細菌莢膜多糖を含む。
【００７５】
いくつかのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するＰｎ莢膜多糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む。いくつかの特定の実施形態において、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００７６】
他のそのような実施形態において、免疫原性組成物は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む。いくつかの特定の実施形態において、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００７７】
特に好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７と共有結合によりコンジュゲートしている、ＰｎまたはＭｎ莢膜多糖等の細菌莢膜多糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、免疫原性組成物はアジュバントを含む。いくつかのそのような実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである。一実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバントリン酸アルミニウムを含む。
【００７９】
本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートおよびそれらを含む免疫原性組成物は、若干量の遊離糖を含有し得る。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、多糖の総量と比較して、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満の遊離多糖を含む。好ましくは、免疫原性組成物は、１５％未満の遊離糖、より好ましくは１０％未満の遊離糖、なお一層好ましくは（ｐｒｅｆｅｒａｂｌｅ）５％未満の遊離糖を含む。
【００８０】
別の態様において、本発明のグリココンジュゲートまたは免疫原性組成物を使用して、動物効能モデルにおいて細菌を死滅させることによってまたはオプソニン食作用死滅アッセイを経由してのいずれかで測定された際に機能的である抗体を生じさせることができる。細菌莢膜多糖を含む本発明のグリココンジュゲートは、そのような細菌莢膜多糖に対する抗体の生成において使用され得る。そのような抗体は、その後、細菌検出および血清型決定等の研究および臨床検査室アッセイにおいて使用され得る。そのような抗体は、対象に受動免疫を付与するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、細菌性多糖に対して生成された抗体は、動物効能モデルまたはオプソニン食作用死滅アッセイのいずれかにおいて機能的である。
【００８１】
本明細書において記述されているｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、対象において、細菌性の感染症、疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させるための種々の治療的または予防的方法においても使用され得る。特に、病原性細菌由来の細菌莢膜多糖等の細菌性抗原を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、病原性細菌によって引き起こされた、対象における細菌性の感染症、疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させるために使用され得る。
【００８２】
故に、一態様において、本発明は、対象において、細菌性の感染症、疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させる方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物を投与するステップを含み、前記免疫原性組成物が、細菌莢膜多糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む、方法を提供する。
【００８３】
一実施形態において、感染症、疾患または状態は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細菌に関連し、グリココンジュゲートは、Ｐｎ莢膜多糖を含む。いくつかのそのような実施形態において、感染症、疾患または状態は、肺炎、副鼻腔炎、中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、膿胸、結膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、乳様突起炎、蜂巣炎、軟部組織感染症および脳膿瘍からなる群から選択される。
【００８４】
別の実施形態において、感染症、疾患または状態は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に関連し、グリココンジュゲートは、Ｍｎ莢膜多糖を含む。いくつかのそのような実施形態において、感染症、疾患または状態は、髄膜炎、髄膜炎菌血症、菌血症および敗血症からなる群から選択される。
【００８５】
別の態様において、本発明は、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含む免疫学的に有効な量の免疫原性組成物を投与するステップを含み、グリココンジュゲートが細菌莢膜多糖を含む、方法を提供する。
【００８６】
また別の態様において、本発明は、対象において、病原性細菌によって引き起こされた疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させるための方法であって、対象に、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含む免疫学的に有効な量の免疫原性組成物を投与するステップを含み、グリココンジュゲートが細菌莢膜多糖を含む、方法を提供する。
【００８７】
別の態様において、本発明は、病原性細菌による感染症によって引き起こされた、疾患または状態の少なくとも１つの症状の重症度を低減させるための方法であって、対象に、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含む免疫学的に有効な量の免疫原性組成物を投与するステップを含み、グリココンジュゲートが、細菌莢膜多糖、例えばＰｎまたはＭｎ莢膜多糖を含む、方法を提供する。
【００８８】
別の態様において、本発明は、本明細書においてさらに記述される通り、対象において保護免疫応答を生じさせるために、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む免疫学的に有効な量の免疫原性組成物を対象に投与する方法を提供する。
【００８９】
また別の態様において、本発明は、細菌感染症、例えば肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）による感染症の予防、治療または改善において使用するための、本明細書において記述されている通りの、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
【００９０】
別の態様において、本発明は、細菌感染症、例えば肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）による感染症の予防、治療または改善用の薬剤の調製のための、本明細書において記述されている通りの、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む免疫原性組成物の使用を提供する。
【００９１】
上述した治療的および／または予防的方法および使用において、免疫原性組成物は、高頻度で、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質と共有結合している細菌莢膜多糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む。方法の、および本明細書において記述されている多くの実施形態において、細菌莢膜多糖はＰｎ莢膜多糖またはＭｎ莢膜多糖である。いくつかのそのような実施形態において、莢膜多糖は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。他のそのような実施形態において、莢膜多糖は、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００９２】
ある特定の好ましい実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。特に好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７と共有結合によりコンジュゲートしている、ＰｎまたはＭｎ莢膜多糖等の細菌莢膜多糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む。
【００９３】
加えて、本発明は、対象において、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に対する免疫応答を誘導するための方法、対象において、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌によって引き起こされた感染症、疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させるための方法、ならびに、対象において、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）による感染症によって引き起こされた、感染症、疾患または状態の少なくとも１つの症状の重症度を低減させるための方法であって、各々の場合において、対象に、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体または賦形剤とを含む免疫学的に有効な量の免疫原性組成物を投与することによるものであり、グリココンジュゲートが、それぞれ肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する細菌莢膜多糖を含む、方法を提供する。
【００９４】
糖
糖は、多糖、オリゴ糖および単糖を包含し得る。多くの実施形態において、糖は、多糖、特に細菌莢膜多糖である。莢膜多糖は、当業者に公知である標準的な技術によって調製される。
【００９５】
本発明において、莢膜多糖は、例えば、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから調製され得る。一実施形態において、各肺炎球菌多糖血清型を、大豆ベースの培地中で成長させてよい。個々の多糖は、遠心分離、沈殿、限外濾過、および／またはカラムクロマトグラフィーを介して精製される。精製された多糖を活性化させて、ｅＴＥＣスペーサーと反応できるようにし、次いで、本明細書においてさらに記述される通り、本発明のグリココンジュゲートに組み込むことができる。
【００９６】
莢膜多糖の分子量は、免疫原性組成物における使用のために考慮すべき事項である。高分子量莢膜多糖は、抗原表面上に存在するエピトープのより高い価数により、ある特定の抗体免疫応答を誘導することができる。高分子量莢膜多糖の単離および精製は、本発明のコンジュゲート、組成物および方法における使用のために企図されている。
【００９７】
いくつかの実施形態において、糖は、１０ｋＤａから２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他のそのような実施形態において、糖は、５０ｋＤａから２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。さらなるそのような実施形態において、糖は、５０ｋＤａから１，７５０ｋＤａの間、５０ｋＤａから１，５００ｋＤａの間、５０ｋＤａから１，２５０ｋＤａの間、５０ｋＤａから１，０００ｋＤａの間、５０ｋＤａから７５０ｋＤａの間、５０ｋＤａから５００ｋＤａの間、１００ｋＤａから２，０００ｋＤａの間、１００ｋＤａから１，７５０ｋＤａの間、１００ｋＤａから１，５００ｋＤａの間、１００ｋＤａから１，２５０ｋＤａの間、１００ｋＤａから１，０００ｋＤａの間、１００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、１００ｋＤａから５００ｋＤａの間、２００ｋＤａから２，０００ｋＤａの間、２００ｋＤａから１，７５０ｋＤａの間、２００ｋＤａから１，５００ｋＤａの間、２００ｋＤａから１，２５０ｋＤａの間、２００ｋＤａから１，０００ｋＤａの間、２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、または２００ｋＤａから５００ｋＤａの間の分子量を有する。いくつかのそのような実施形態において、糖は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ莢膜多糖、またはＭｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５もしくはＹ莢膜多糖等の細菌莢膜多糖であり、莢膜多糖は、記述されている通りの分子量範囲の１つ内にある分子量を有する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本発明の糖は、Ｏ−アセチルされている。いくつかの実施形態において、グリココンジュゲートは、１０〜１００％の間、２０〜１００％の間、３０〜１００％の間、４０〜１００％の間、５０〜１００％の間、６０〜１００％の間、７０〜１００％の間、７５〜１００％の間、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％のＯ〜アセチル化度を有する糖を含む。他の実施形態において、Ｏ−アセチル化度は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、もしくは９０％以上、または約１００％である。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本発明の莢膜多糖、グリココンジュゲートまたは免疫原性組成物は、動物効能モデルにおける細菌の死滅、または抗体が細菌を死滅させることを実証するオプソニン食作用死滅アッセイによって測定された際に機能的である抗体を生じさせるために使用される。
【０１００】
莢膜多糖は、当業者に公知である単離手順を使用して、細菌から直接的に取得され得る。例えば、それぞれが参照によりその全体が説明されているのと同様に本明細書に組み込まれる、Ｆｏｕｒｎｉｅｒら（１９８４）、上記；Ｆｏｕｒｎｉｅｒら（１９８７）Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：５６１〜５６７；米国特許出願公開第２００７／０１４１０７７号；および国際特許出願公開第ＷＯ００／５６３５７号を参照されたい。加えて、莢膜多糖は、合成プロトコールを使用して生成され得る。その上、莢膜多糖は、同じく当業者に公知である遺伝子工学的手順を使用して、組換え技術によって生成され得る（それぞれが参照によりその全体が説明されているのと同様に本明細書に組み込まれる、Ｓａｕら（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３：２３９５〜２４０５；および米国特許第６，０２７，９２５号を参照）。
【０１０１】
本発明のグリココンジュゲートにおいて使用されるそれぞれの多糖を作製するために使用される肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の細菌株は、確立された培養株保存または臨床検体から取得され得る。
【０１０２】
担体タンパク質
本発明のグリココンジュゲートのもう１つの成分は、糖がコンジュゲートされる担体タンパク質である。用語「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」は、本明細書において交換可能に使用され得る。担体タンパク質は、好ましくは、非毒性かつ非反応原性（ｎｏｎ−ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）であり、十分な量および純度で取得可能なタンパク質である。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に対して修正可能でなくてはならない。本発明の新規グリココンジュゲートにおいて、担体タンパク質は、ｅＴＥＣスペーサーを介して糖と共有結合している。
【０１０３】
担体とのコンジュゲーションは、抗原、例えば細菌莢膜多糖等の細菌性抗原の免疫原性を強化することができる。抗原に好ましいタンパク質担体は、毒素、トキソイド、または破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびレンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来の毒素の任意の変異体交差反応性材料（ＣＲＭ：ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）である。一実施形態において、特に好ましい担体は、ＣＲＭ１９７タンパク質を生成するジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）株Ｃ７（β１９７）に由来するジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７のものである。この株は、ＡＴＣＣ受託番号５３２８１を有する。ＣＲＭ１９７を生成するための方法は、米国特許第５，６１４，３８２号において記述されており、これは、参照によりその全体が説明されているのと同様に本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
代替として、タンパク質担体または他の免疫原性タンパク質のフラグメントまたはエピトープを使用してよい。例えば、ハプテン性抗原を、細菌毒素、トキソイドまたはＣＲＭのＴ細胞エピトープとカップリングしてよい。例えば、参照によりその全体が説明されているのと同様に本明細書に組み込まれる、１９８８年２月１日に出願された米国特許出願第１５０，６８８号、表題「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ａ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｓ  ａ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆｏｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」を参照されたい。他の好適な担体タンパク質は、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願第ＷＯ２００４／０８３２５１号において記述されている通り）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａ等の不活性化細菌毒素を包含する。外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌付着タンパク質（ＰｓａＡ）またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ等の細菌外膜タンパク質を使用してもよい。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）等の他のタンパク質も、担体タンパク質として使用され得る。
【０１０５】
したがって、多くの実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を含み、莢膜多糖は、カルバメート結合を経由してｅＴＥＣスペーサーと共有結合しており、ＣＲＭ１９７は、タンパク質の活性化アミノ酸残基によって形成されたアミド結合を経由して、典型的には１つまたは複数のリジン残基のε−アミン基を介してｅＴＥＣスペーサーと共有結合している。
【０１０６】
糖とコンジュゲートされる担体タンパク質中のリジン残基の数は、コンジュゲートしているリジンの範囲として特徴付けることができる。例えば、免疫原性組成物のいくつかの実施形態において、ＣＲＭ１９７は、糖と共有結合している３９個のうち、４から１６個のリジン残基を含み得る。このパラメーターを表現するための別の手法は、ＣＲＭ１９７リジンの約１０％から約４１％が糖と共有結合していることである。他の実施形態において、ＣＲＭ１９７は、糖と共有結合している３９個のうち、２から２０個のリジン残基を含み得る。このパラメーターを表現するための別の手法は、ＣＲＭ１９７リジンの約５％から約５０％が糖と共有結合していることである。
【０１０７】
糖鎖と担体タンパク質上のリジンとの付着の頻度は、本発明のグリココンジュゲートを特徴付けるための別のパラメーターである。例えば、いくつかの実施形態において、多糖の４つの糖繰り返し単位ごとに、担体タンパク質と多糖との間に少なくとも１つの共有結合が出現する。別の実施形態において、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１０の糖繰り返し単位ごとに少なくとも１回出現する。別の実施形態において、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１５の糖繰り返し単位ごとに少なくとも１回出現する。さらなる実施形態において、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の２５の糖繰り返し単位ごとに少なくとも１回出現する。
【０１０８】
多くの実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７と多糖との間のｅＴＥＣスペーサーを経由する共有結合は、多糖の４、１０、１５または２５の糖繰り返し単位ごとに少なくとも１回出現する。いくつかのそのような実施形態において、多糖は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する細菌莢膜多糖である。
【０１０９】
他の実施形態において、コンジュゲートは、５から１０の糖繰り返し単位ごとに、２から７つの糖繰り返し単位ごとに、３から８つの糖繰り返し単位ごとに、４から９つの糖繰り返し単位ごとに、６から１１の糖繰り返し単位ごとに、７から１２の糖繰り返し単位ごとに、８から１３の糖繰り返し単位ごとに、９から１４の糖繰り返し単位ごとに、１０から１５の糖繰り返し単位ごとに、２から６つの糖繰り返し単位ごとに、３から７つの糖繰り返し単位ごとに、４から８つの糖繰り返し単位ごとに、６から１０の糖繰り返し単位ごとに、７から１１の糖繰り返し単位ごとに、８から１２の糖繰り返し単位ごとに、９から１３の糖繰り返し単位ごとに、１０から１４の糖繰り返し単位ごとに、１０から２０の糖繰り返し単位ごとに、または４から２５の糖繰り返し単位ごとに、担体タンパク質と糖との間に少なくとも１つの共有結合を含む。
【０１１０】
別の実施形態において、担体タンパク質と糖との間の少なくとも１つの結合は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５の糖繰り返し単位ごとに出現する。
【０１１１】
ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを作製するための方法
本発明は、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質と共有結合によりコンジュゲートしている糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを作製する方法を提供する。ｅＴＥＣスペーサーは、安定なチオエーテルおよびアミド結合を含む７個の線形原子（すなわち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）を含有し、糖と担体タンパク質とを共有結合させる役割を担う。ｅＴＥＣスペーサーの一端は、カルバメート結合を介して糖のヒドロキシル基と共有結合している。ｅＴＥＣスペーサーの他端は、アミド結合を介して、担体タンパク質のアミノ含有残基、典型的にはε−リジン残基と共有結合している。
【０１１２】
活性化担体タンパク質ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている多糖を含む本発明のグリココンジュゲートの調製への代表的な経路を、図１に示す。ｅＴＥＣスペーサープロセスを使用する潜在的な修飾部位を有する、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する代表的な細菌莢膜多糖、肺炎球菌血清型３３Ｆ、１０Ａ、１１Ａおよび２２Ｆ多糖の化学構造を、それぞれ図２、図３、図４および図５に示す。
【０１１３】
ｅＴＥＣリンカー化学を使用してＣＲＭ１９７と共有結合によりコンジュゲートしている肺炎球菌血清型３３Ｆ多糖を含む、本発明の代表的なｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの構造を、図６（Ａ）に示す。潜在的なキャップされたおよびキャップされていない遊離スルフヒドリル部位を、例証目的のために図６（Ｂ）に示す。多糖は、典型的には、多数のヒドロキシル基、およびカルバメート結合を経由してｅＴＥＣスペーサーが多糖繰り返し単位内の特定のヒドロキシルに付着している部位を含有し、したがって、変動し得る。
【０１１４】
一態様において、方法は、ａ）糖を、１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）等の炭酸誘導体と、有機溶媒中で反応させて、活性化糖を生成するステップと、ｂ）活性化糖を、シスタミンもしくはシステアミンまたはその塩と反応させて、チオール化糖を生成するステップと、ｃ）チオール化糖を還元剤と反応させて、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化糖を、１つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質のコンジュゲートされていないα−ハロアセトアミド基をキャップすることができる第一のキャッピング試薬、および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖のコンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル残基をキャップすることができる第二のキャッピング試薬と反応させるステップとを含み、それにより、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートが生成される。
【０１１５】
特に好ましい実施形態において、方法は、ａ）Ｐｎ−３３Ｆ莢膜多糖を、ＣＤＴまたはＣＤＩと、有機溶媒中で反応させて、活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を生成するステップと、ｂ）活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、シスタミンもしくはシステインアミンまたはその塩と反応させて、チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を生成するステップと、ｃ）チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を還元剤と反応させて、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、１つまたは複数のα−ブロモアセトアミド基を含む活性化ＣＲＭ１９７担体タンパク質と反応させて、チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質のコンジュゲートされていないα−ブロモアセトアミド基をキャップすることができる第一のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、および（ｉｉ）活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のコンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル残基をキャップすることができる第二のキャッピング試薬としてのヨードアセトアミドと反応させるステップとを含み、それにより、ｅＴＥＣ結合Ｐｎ−３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７グリココンジュゲートが生成される。
【０１１６】
多くの実施形態において、炭酸誘導体はＣＤＴまたはＣＤＩである。好ましくは、炭酸誘導体はＣＤＴであり、有機溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性非プロトン性溶媒である。活性化糖の凍結乾燥は、チオール化および／またはコンジュゲーションステップの前には必要とされない。
【０１１７】
好ましい実施形態において、チオール化糖は、活性化糖と、二官能性対称チオアルキルアミン試薬シスタミン、またはその塩との反応によって生成される。この試薬の潜在的な利点は、対称なシスタミンリンカーが、活性化糖の２つの分子と反応して、ジスルフィド結合を低減させながらシスタミンの分子当たり２個のチオール化糖の分子を形成できることである。代替として、チオール化糖は、活性化糖と、システアミン、またはその塩との反応によって形成され得る。本発明の方法によって生成されたｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、一般式（Ｉ）によって表され得る。
【０１１８】
ステップｃ）は、活性化糖が、遊離スルフヒドリル残基を含有するシステアミンまたはその塩と反応する場合は任意選択のものであることが、当業者には理解されるであろう。実際問題として、システアミンを含むチオール化糖を、ステップｃ）において還元剤と常法に従って反応させて、反応中に形成され得るあらゆる酸化ジスルフィド副産物を還元する。
【０１１９】
この態様のいくつかの実施形態において、ステップｄ）は、活性化チオール化糖を活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成する前に、１つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を提供することをさらに含む。多くの実施形態において、活性化担体タンパク質は、１つまたは複数のα−ブロモアセトアミド基を含む。
【０１２０】
チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートは、反応混合物中に存在する残留活性化反応基と反応することができる１つまたは複数のキャッピング試薬で処理され得る。そのような残留反応性基は、不完全なコンジュゲーションにより、または反応混合物中の成分の１つの過剰の存在から、未反応の糖または担体タンパク質成分上に存在し得る。その場合、キャッピングは、グリココンジュゲートの精製または単離を補助し得る。いくつかの事例において、残留活性化反応基は、グリココンジュゲート中に存在し得る。
【０１２１】
例えば、活性化担体タンパク質上の過剰なα−ハロアセトアミド基は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン等の低分子量チオールとの反応によってキャップすることができ、これは、完全なキャッピングを確実にするために過剰に使用され得る。Ｎ−アセチル−Ｌ−システインによるキャッピングも、キャップされた部位におけるシステイン残基からの独自のアミノ酸Ｓ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）の検出によってコンジュゲーション効率の確認を可能にし、これは、コンジュゲーション生成物の酸加水分解およびアミノ酸分析によって決定することができる。このアミノ酸の検出は、反応性ブロモアセトアミド基のキャッピング成功を確認するものであり、故に、それらの基はあらゆる望まない化学反応に利用不可能となる。共有原子価およびキャッピングの許容できるレベルは、ＣＭＣＡ／Ｌｙｓについては約１〜１５、ＣＭＣ／Ｌｙｓについては約０〜５の間である。同様に、過剰な遊離スルフヒドリル残基は、ヨードアセトアミド等の低分子量求電子試薬との反応によってキャップすることができる。ＣＭＣＡの一部は、担体タンパク質のハロアシル基とのコンジュゲーションに関与しなかったヨードアセトアミドによって直接的にキャップされた多糖チオールに由来するものであってよい。したがって、コンジュゲーション反応後試料（ヨードアセトアミドによるキャッピングの前）を、アミノ酸分析（ＣＭＣＡ）によって検査して、コンジュゲーションに直接的に関与したチオールの正確なレベルを決定する必要がある。１０〜１２個のチオールを含有するチオール化糖について、典型的には５〜６個のチオールが、多糖チオールとブロモアセチル化タンパク質との間のコンジュゲーションに直接的に関与すると決定され、４〜５個のチオールがヨードアセトアミドによってキャップされる。
【０１２２】
好ましい実施形態において、第一のキャッピング試薬はＮ−アセチル−Ｌ−システインであり、これは、担体タンパク質上のコンジュゲートされていないα−ハロアセトアミド基と反応する。他の実施形態において、第二のキャッピング試薬はヨードアセトアミド（ＩＡＡ）であり、これは、活性化チオール化糖のコンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル基と反応する。高頻度で、ステップｅ）は、第一のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システインおよび第二のキャッピング試薬としてのＩＡＡでキャップすることを含む。いくつかの実施形態において、キャッピングステップｅ）は、第一および／または第二のキャッピング試薬との反応の後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰまたはメルカプトエタノールとの反応をさらに含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、方法は、例えば、限外濾過／透析濾過によって、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを精製するステップをさらに含む。
【０１２４】
好ましい実施形態において、二官能性対称チオアルキルアミン試薬はシスタミンであるか、またはその塩が活性化糖と反応して、ジスルフィド部分を含有するチオール化糖またはその塩を提供する。
【０１２５】
そのようなチオール化糖誘導体と還元剤との反応は、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化多糖を生成する。そのような活性化チオール化糖は、例えば、限外濾過／透析濾過によって単離および精製され得る。代替として、活性化チオール化糖は、例えば、標準的なサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）法、または当技術分野において公知であるＤＥＡＥ等のイオン交換クロマトグラフ法によって、単離および精製され得る。
【０１２６】
シスタミンに由来するチオール化糖の事例において、還元剤との反応は、ジスルフィド結合を切断して、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を提供する。システアミンに由来するチオール化糖の事例において、還元剤との反応は任意選択であり、試薬または生成物の酸化によって形成されたジスルフィド結合を還元するために使用され得る。
【０１２７】
本発明の方法において使用される還元剤は、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはメルカプトエタノールを包含する。しかしながら、任意の好適なジスルフィド還元剤を使用してよい。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、方法は、１つまたは複数のα−ハロアセトアミド基、好ましくは１つまたは複数のα−ブロモアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を提供するステップをさらに含む。
【０１２９】
活性化チオール化糖と、１つまたは複数のα−ハロアセトアミド部分を含む活性化担体タンパク質との反応は、活性化チオール化糖の１つまたは複数の遊離スルフヒドリル基による活性化担体タンパク質のα−ハロ基の求核置換をもたらし、ｅＴＥＣスペーサーのチオエーテル結合を形成する。
【０１３０】
担体タンパク質のα−ハロアセチル化アミノ酸残基は、典型的には、担体タンパク質の１つまたは複数のリジン残基のε−アミノ基と付着している。多くの実施形態において、担体タンパク質は、１つまたは複数のα−ブロモアセチル化アミノ酸残基を含有する。一実施形態において、担体タンパク質は、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＢＡＡＮＳ）等のブロモ酢酸試薬により活性化される。
【０１３１】
一実施形態において、方法は、１つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を提供するステップと、活性化チオール化多糖を活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化多糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップとを包含し、それにより、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質とコンジュゲートしている多糖を含むグリココンジュゲートが生成される。
【０１３２】
本明細書における方法のいくつかの好ましい実施形態において、細菌莢膜多糖は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するＰｎ莢膜多糖である。いくつかのそのような実施形態において、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。ある特定の好ましい実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。
【０１３３】
本明細書において提供されている方法の他の好ましい実施形態において、細菌莢膜多糖は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖である。いくつかのそのような実施形態において、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。ある特定の好ましい実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、莢膜多糖は、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。
【０１３４】
本明細書において提供されている方法のそれぞれのいくつかの実施形態において、糖を、イミダゾールまたはトリアゾールと調合し、次いで、ＣＤＴ等の炭酸誘導体と、約０．２％ｗ／ｖの水を含有する有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中で反応させて、活性化糖を生成した。活性化ステップにおける調合された糖の使用は、有機溶媒への糖の溶解性を増大させる。典型的には、糖を、多糖１グラム当たり１０グラムの１，２，４−トリアゾール添加剤と調合し、続いて周囲温度で混合して、調合された糖を生成した。
【０１３５】
故に、ある特定の実施形態において、方法は、活性化ステップａ）の前に、糖をトリアゾールまたはイミダゾールと調合して、調合された糖を得るステップをさらに含む。いくつかのそのような実施形態において、調合された糖は、シェルフリーズされ、凍結乾燥され、有機溶媒（ＤＭＳＯ等）中で再構成され、炭酸誘導体、例えばＣＤＴによる活性化の前に約０．２％ｗ／ｖの水が添加される。
【０１３６】
一実施形態において、チオール化糖反応混合物を、Ｎ−アセチル−リジンメチルエステルで処理して、任意の未反応の活性化糖をキャップしてもよい。いくつかのそのような実施形態において、キャップされたチオール化糖混合物を、限外濾過／透析濾過によって精製する。
【０１３７】
多くの実施形態において、チオール化糖を還元剤と反応させて、活性化チオール化糖を生成する。いくつかのそのような実施形態において、還元剤は、トリス（−２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはメルカプトエタノールである。いくつかのそのような実施形態において、活性化チオール化糖を、限外濾過／透析濾過によって精製する。
【０１３８】
一実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを生成する方法は、活性化チオール化糖および担体タンパク質の反応混合物のｐＨを、約５℃で約２０時間にわたって、約８から約９のｐＨに調整し維持するステップを含む。
【０１３９】
一実施形態において、本発明のグリココンジュゲートを生成する方法は、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、それが生成された後に単離するステップを含む。多くの実施形態において、グリココンジュゲートを、限外濾過／透析濾過によって単離する。
【０１４０】
別の実施形態において、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを生成する方法は、単離された糖−担体タンパク質コンジュゲートを、それが生成された後に単離するステップを含む。多くの実施形態において、グリココンジュゲートを、限外濾過／透析濾過によって単離する。
【０１４１】
また別の実施形態において、活性化糖を生成する方法は、有機溶媒中の糖およびＣＤＴを含む反応混合物の水濃度を、約０．１から０．４％の間に調整するステップを含む。一実施形態において、有機溶媒中の糖およびＣＤＴを含む反応混合物の水濃度を、約０．２％に調整する。
【０１４２】
一実施形態において、糖を活性化するステップは、多糖を、莢膜多糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する多糖の量の約５モル過剰である量のＣＤＴと、有機溶媒中で反応させるステップを含む。
【０１４３】
別の実施形態において、本発明のグリココンジュゲートを生成する方法は、糖を含む反応混合物の水濃度を決定するステップを含む。１つのそのような実施形態において、糖を活性化するために反応混合物に添加されるＣＤＴの量は、大まかに、有機溶媒中の糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する水の量と等モルであるＣＤＴの量で提供される。
【０１４４】
別の実施形態において、糖を活性化するために反応混合物に添加されるＣＤＴの量は、大まかに、有機溶媒中の糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する水の量と比較して、約０．５：１のモル比であるＣＤＴの量で提供される。一実施形態において、糖を活性化するために反応混合物に添加されるＣＤＴの量は、大まかに、有機溶媒中の糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する水の量と比較して、０．７５：１のモル比であるＣＤＴの量で提供される。
【０１４５】
一実施形態において、方法は、チオール化多糖を透析濾過によって単離するステップを含む。別の実施形態において、方法は、活性化チオール化多糖を透析濾過によって単離するステップを含む。
【０１４６】
一実施形態において、単離されたＰｎ莢膜多糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成する方法において使用される担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７を含む。別の実施形態において、単離されたＭｎ莢膜多糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成する方法において使用される担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．２から４の間である。他の実施形態において、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、１．０から２．５の間である。さらなる実施形態において、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．４から１．７の間である。他の実施形態において、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、約１：１である。いくつかのそのような実施形態において、糖は細菌莢膜多糖であり、活性化担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７の活性化（ブロモアセチル化）によって生じる。
【０１４８】
別の実施形態において、活性化糖を生成する方法は、有機溶媒の使用を含む。多くの実施形態において、有機溶媒は極性非プロトン性溶媒である。いくつかのそのような実施形態において、極性非プロトン性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリル、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、またはそれらの混合物からなる群から選択される。好ましい実施形態において、有機溶媒はＤＭＳＯである。
【０１４９】
多くの実施形態において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの単離は、限外濾過／透析濾過のステップを含む。
【０１５０】
一実施形態において、本発明のグリココンジュゲートを生成する方法において使用される糖は、約１０ｋＤａから約２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。別の実施形態において、本発明のグリココンジュゲートを生成する方法において使用される糖は、約５０ｋＤａから約２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。
【０１５１】
一実施形態において、莢膜多糖−担体タンパク質グリココンジュゲートを生成する方法において生成されたグリココンジュゲートは、約５０ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間のサイズを有する。別の実施形態において、莢膜多糖−担体タンパク質グリココンジュゲートを生成する方法において生成されたグリココンジュゲートは、約５００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間のサイズを有する。一実施形態において、莢膜多糖−担体タンパク質グリココンジュゲートを生成する方法において生成されたグリココンジュゲートは、約１，０００ｋＤａから約３，０００ｋＤａの間のサイズを有する。
【０１５２】
別の態様において、本発明は、本明細書において開示されている方法のいずれかによって生成された、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質とコンジュゲートしている糖を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを提供する。
【０１５３】
別の態様において、本発明は、本明細書において記述されている方法のいずれかによって生成された、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
【０１５４】
糖のＯ−アセチル化度は、当技術分野において公知である任意の方法によって、例えば、プロトンＮＭＲによって決定することができる（ＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒおよびＪｏｎｅｓ（１９９６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９６；８３〜９６、ＪｏｎｅｓおよびＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ（２００２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３０；１２３３〜１２４７、ＷＯ０５／０３３１４８またはＷＯ００／５６３５７）。別の一般に使用される方法は、Ｈｅｓｔｒｉｎ（１９４９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０；２４９〜２６１によって記述されている。また別の方法は、ＨＰＬＣ−イオン排除クロマトグラフィーに基づくものである。Ｏ−アセチル化度は、試料中に存在する遊離アセテートの量を評定し、その値を、弱塩基加水分解後の放出アセテートの量と比較することによって決定される。アセテートは、試料の他の成分から分割され、２１０ｎｍの紫外線（ＵＶ）検出で定量化される。別の方法は、ＨＰＬＣ−イオン排除クロマトグラフィーに基づくものである。Ｏ−アセチルは、試料中に存在する遊離アセテートの量を評定し、その値を、弱塩基加水分解後の放出アセテートの量と比較することによって決定される。アセテートは、試料の他の成分から分割され、２１０ｎｍの紫外線（ＵＶ）検出で定量化される。
【０１５５】
コンジュゲーション度は、アミノ酸分析によって決定した
ブロモアセチル活性化化学を使用して作り出した「ＩＡＡキャップ前」コンジュゲート試料の酸加水分解は、コンジュゲートしている部位におけるシスタミンからの酸に安定なＳ−カルボキシメチルシステアミン（ＣＭＣＡ）、およびキャップされた部位におけるシステインからの酸に安定なＳ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）の形成をもたらした。ブロモアセチル活性化化学を使用して作り出した「ＩＡＡキャップ後」コンジュゲート（最終）の酸加水分解は、コンジュゲートしている部位およびＩＡＡキャップされた部位におけるシスタミンからの酸に安定なＳ−カルボキシメチルシステアミン（ＣＭＣＡ）、ならびにキャップされた部位におけるシステインからの酸に安定なＳ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）の形成をもたらした。コンジュゲートされていないおよびキャップされていないリジンはすべて元のリジンに変換され、そのまま検出された。他のすべてのアミノ酸は、トリプトファンおよびシステインが加水分解条件によって破壊された以外は、元の遊離アミノ酸に加水分解された。アスパラギンおよびグルタミンは、それぞれアスパラギン酸およびグルタミン酸に変換された。
【０１５６】
各加水分解された試料および対照のアミノ酸を、イオン交換クロマトグラフィー、続いてＢｅｃｋｍａｎニンヒドリンＮｉｎＲＸ溶液との反応を使用して、１３５℃で分離した。次いで、誘導体化されたアミノ酸を、可視範囲内、５７０ｎｍおよび４４０ｎｍで検出した（表１を参照）。５００ピコモルの各アミノ酸を含有するアミノ酸の標準セット［Ｐｉｅｒｃｅアミノ酸標準物質Ｈ］を、分析の各セットについて試料および対照とともに実行した。Ｓ−カルボキシメチルシステイン［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］を標準物質に添加した。
【０１５７】
【表１】
0006291495.tif 000004
【０１５８】
リジンを、システインおよびシステアミンとのその共有結合による付着、ならびに予測される同様の加水分解に基づく評価のために選択した。次いで、得られたアミノ酸のモル数を、タンパク質のアミノ酸組成と比較し、ＣＭＣおよびＣＭＣＡについての値とともに報告した。ＣＭＣＡ値をコンジュゲーション度の評価に直接使用し、ＣＭＣ値をキャッピング度の評価に直接使用した。
【０１５９】
一実施形態において、グリココンジュゲートは、その分子サイズ分布（Ｋｄ）によって特徴付けられる。コンジュゲートの分子サイズは、高圧液体クロマトグラフィーシステム（ＨＰＬＣ）を使用するセファロースＣＬ−４Ｂ固定相サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）充填剤によって決定される。Ｋｄ決定のために、クロマトグラフィーカラムを最初に較正して、空隙容積または全排除容積を表すＶ０、および、粒子間容積としても公知である、試料中の最小分子が溶離する容積、Ｖｉを決定する。すべてのＳＥＣ分離は、Ｖ０とＶｉとの間で起こる。収集された各画分についてのＫｄ値は、下記の式Ｋｄ＝（Ｖｅ−Ｖｉ）／（Ｖｉ−Ｖ０）［式中、Ｖｅは化合物の保持容積を表す］によって決定される。０．３以下を溶離する％画分（主要ピーク）は、コンジュゲートＫｄ（分子サイズ分布）を定義する。
【０１６０】
免疫原性組成物
用語「免疫原性組成物」は、対象において免疫応答を引き出すために使用され得る抗原（例えば、微生物またはその成分）を含有する任意の医薬組成物に関する。
【０１６１】
本明細書において使用される場合、「免疫原性」は、細菌莢膜多糖、または細菌莢膜多糖を含むグリココンジュゲートもしくは免疫原性組成物等の抗原（または抗原のエピトープ）の、体液によってもしくは細胞によってのいずれかで、または両方によって媒介される、哺乳動物等の宿主対象において免疫応答を引き出す能力を意味する。
【０１６２】
グリココンジュゲートは、細胞表面においてＭＨＣ分子と会合している抗原の提示によって宿主を感作する役割を担い得る。加えて、抗原特異的Ｔ細胞または抗体を生じさせ、免疫化宿主の将来の保護を可能にすることができる。故に、グリココンジュゲートは、細菌による感染症に関連する１つまたは複数の病状から宿主を保護することができる、または莢膜多糖に関連する細菌の感染症による死から宿主を保護し得る。グリココンジュゲートを使用してポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作り出すこともでき、これを使用して対象に受動免疫を付与することができる。グリココンジュゲートを使用して、動物効能モデルにおいて細菌を死滅させることによってまたはオプソニン食作用死滅アッセイを経由してのいずれかで測定された際に機能的である抗体を作り出すこともできる。
【０１６３】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的と特異的結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、文脈上別段の指示がない限り、該用語は、無傷のポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、改変抗体（例えば、キメラ、エフェクター機能、安定性および他の生物学的活性を変更するようにヒト化および／または誘導体化されたもの）およびそのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、一本鎖（ＳｃＦｖ）ならびにサメおよびラクダ抗体を包含するドメイン抗体、ならびに抗体部分を含む融合タンパク質、多価抗体、多特異性抗体（例えば、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、二重特異性抗体）、および本明細書において記述されている通りの抗体フラグメント、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置も網羅することが意図されている。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはそのサブクラス）等の任意のクラスの抗体を包含し、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ヒトにおいては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分割され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれている。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置が周知である。
【０１６４】
「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部のみを含み、該部分は、好ましくは、無傷の抗体中に存在する場合、該部分と通常関連する機能の少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたはすべてを保持している。
【０１６５】
用語「抗原」は、概して、免疫原性組成物中の生体分子、通常はタンパク質、ペプチド、多糖もしくはコンジュゲート、または、対象に注入もしくは吸収される組成物を包含する、対象において、抗体もしくはＴ細胞応答または両方の生成を刺激することができる免疫原性物質を指す。免疫応答は、全分子に対して、または分子の種々の部分（例えば、エピトープまたはハプテン）に対して発生し得る。該用語は、個々の分子、または抗原分子の均一もしくは不均一集団を指すために使用され得る。抗原は、抗体、Ｔ細胞受容体、または具体的な体液性および／もしくは細胞性免疫の他の要素によって認識される。「抗原」は、すべての関連抗原エピトープも包含する。所与の抗原のエピトープは、当技術分野において周知であるいくつものエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．を参照されたい。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固体支持体上の多数のペプチド、タンパク質分子の部分に対応するペプチドを同時に合成し、ペプチドが支持体に付着しているままで、ペプチドを抗体と反応させることによって、決定することができる。そのような技術は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８〜４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５において記述されており、そのそれぞれは、参照によりその全体が説明されているのと同様に本明細書に組み込まれる。同様に、立体構造エピトープは、例えばＸ線結晶学および二次元核磁気共鳴によって等、アミノ酸の空間的立体構造を決定することによって同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、上記を参照されたい。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、タンパク質が免疫学的応答を引き出す能力を維持する限り、欠失、付加および置換等の天然配列への修飾を包含するタンパク質（概して自然界では保存的であるが、非保存的であってよい）を指すためにも使用され得る。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発を介して、もしくは特定の合成手順を介して、もしくは遺伝子工学的アプローチを介してのように意図的であってよく、または抗原を生成する宿主の突然変異を介して等、偶発的であってもよい。さらに、抗原は、微生物、例えば細菌から誘導、取得または単離されてもよいし、全生物であってもよい。同様に、核酸免疫化用途において等、抗原を発現しているオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、定義に包含される。合成抗原、例えば、ポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換えまたは合成的に誘導された抗原も包含される（Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７  ２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４２〜３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．���ｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７５：４０２  ４０８；Ｇａｒｄｎｅｒら（１９９８）第１２回Ｗｏｒｌｄ  ＡＩＤＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、１９９８年６月２８日から７月３日）。
【０１６６】
「保護」免疫応答は、体液もしくは細胞のいずれかまたは両方で媒介されて、対象を感染症から保護する役割を担う、免疫応答を引き出す免疫原性組成物の能力を指す。提供される保護は、絶対的である必要はない、すなわち、対象の対照集団、例えばワクチンも免疫原性組成物も投与されていない感染動物と比較して統計的に有意な改善があれば、感染症は完全に予防または根絶される必要はない。保護は、感染症の症状の重症度またはその発症の速さを減じることに限定され得る。概して、「保護免疫応答」は、各抗原に対する若干レベルの測定可能な機能的抗体応答を包含する、対象の少なくとも５０％における特定の抗原に特異的な抗体レベルにおける増大の誘導を包含するであろう。特定の状況において、「保護免疫応答」は、抗体レベルにおける２倍の増大、または、各抗原に対する若干レベルの測定可能な機能的抗体応答を包含する、対象の少なくとも５０％における特定の抗原に特異的な抗体レベルにおける４倍の増大の誘導を包含し得る。ある特定の実施形態において、抗体をオプソニン化することは保護免疫応答と相関している。故に、保護免疫応答は、オプソニン化貪食作用アッセイ、例えば以下に記述するものにおいて細菌計数の減少パーセントを測定することによってアッセイされ得る。好ましくは、少なくとも１０％、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の細菌計数の減少がある。
【０１６７】
用語「免疫原性量」および「免疫学的に有効な量」は、本明細書において交換可能に使用され、細胞性（Ｔ細胞）もしくは体液性（Ｂ細胞または抗体）応答、または両方であってよい免疫応答を引き出すのに十分な抗原または免疫原性組成物の量を指し、ここで、そのような免疫応答は、当業者に公知である標準的なアッセイによって測定され得る。典型的には、免疫学的に有効な量は、対象において保護免疫応答を引き出すことになる。
【０１６８】
本発明の免疫原性組成物は、全身、皮膚もしくは粘膜経路を経由して免疫原性組成物を投与することを利用して、例えば肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌による細菌感染症の影響を受けやすい対象を保護するもしくは治療するために、予防的にもしくは治療的に使用され得るか、または別の対象に受動免疫を付与するために使用され得るポリクローナルもしくはモノクローナル抗体調製物を作り出すために使用され得る。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路を経由する；または、経口／消化、呼吸もしくは尿生殖路への粘膜投与を経由する注射を包含し得る。免疫原性組成物を使用して、動物効能モデルにおいて細菌を死滅させることによってまたはオプソニン食作用死滅アッセイを経由してのいずれかで測定された際に機能的である抗体を作り出すこともできる。
【０１６９】
特定の免疫原性組成物に最適な成分の量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって解明することができる。初回接種の後、対象は、適度に間隔をおいて１または数回のブースター免疫化を受けることができる。
【０１７０】
ある特定の実施形態において、免疫原性組成物は、１つまたは複数のアジュバントを含むことになる。本明細書において定義されている通り、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を強化する役割を担う物質である。故に、アジュバントは、多くの場合、免疫応答をブーストするために与えられ、当業者に周知である。組成物の有効性を強化するために好適なアジュバントは：
（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩（ミョウバン）；
（２）水中油型エマルション製剤（ムラミルペプチド（以下で定義する）または細菌細胞壁成分等の他の特定の免疫刺激剤を加えたまたは加えないもの）、例えば、
（ａ）モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）等のマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化された、５％スクアレン、０．５％ツイン８０、および０．５％スパン８５（種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含有していてもよい（必要ではないが、以下を参照））を含有するＭＦ５９（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４８３７号）、
（ｂ）１０％スクアレン、０．４％ツイン８０、５％プルロニックブロックポリマーＬｌ２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照）を含有し、サブミクロンエマルションに微小流動化したか、またはより大きい粒径のエマルションを作り出すためにボルテックスしたかいずれかのＳＡＦ、および
（ｃ）２％スクアレン、０．２％ツイン８０、ならびに、米国特許第４，９１２，０９４号（Ｃｏｒｉｘａ）において記述されている３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標）からなる群からの１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含有する、Ｒｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）
等；
（３）Ｑｕｉｌ  ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ．Ｍａｓｓ．）（米国特許第５，０５７，５４０号）等のサポニンアジュバントを使用してよい、またはそれらからＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）等の粒子を作り出してよい；
（４）Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号において記述されている、アミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もしくは類似体等の細菌性リポ多糖、合成脂質Ａ類似体；１つのそのようなＡＧＰは、５２９としても公知（以前はＲＣ５２９として公知）であり、水性形態としてまたは安定なエマルションとして製剤化される２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド等の合成ポリヌクレオチドである（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８等）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２等のサイトカイン；
（６）例えば、国際特許出願公開第ＷＯ００／１８４３４号に従って（ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照）、アミノ酸２９位のグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンによって置きかえられている、野生型もしくは突然変異型のいずれかのコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照）等の、細菌性ＡＤＰリボシル化毒素の解毒変異体；ならびに
（７）組成物の有効性を強化するための免疫刺激剤として作用する他の物質
を包含するがこれらに限定されない。
【０１７１】
ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）等を包含するがこれらに限定されない。
【０１７２】
ある特定の実施形態において、アジュバントは、アルミニウム塩等のアルミニウムベースのアジュバントである。特定の実施形態において、アルミニウムベースのアジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される。特定の実施形態において、アジュバントはリン酸アルミニウムである。
【０１７３】
免疫原性組成物は、薬学的に許容できる担体を含んでいてもよい。薬学的に許容できる担体は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を包含する対象において使用するための、連邦、州政府の規制機関もしくは他の規制機関によって承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方において収載されている担体を包含する。担体という用語は、医薬組成物とともに投与される賦形剤、添加剤またはビヒクルを指すために使用され得る。水、生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液は、特に注射溶液のための液体担体として用いられ得る。好適な医薬担体の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著において記述されている。製剤は、投与モードに適合すべきである。
【０１７４】
本発明の免疫原性組成物は、複数の莢膜多糖−タンパク質コンジュゲートに加えて、１つまたは複数の保存剤をさらに含み得る。ＦＤＡは、複数回用量（多回用量）バイアル内の生物学的製品が、わずかな例外を除いて保存剤を含有することを求めている。保存剤を含有するワクチン製品は、塩化ベンゼトニウム（炭疽）、２−フェノキシエタノール（ＤＴａＰ、ＨｅｐＡ、ライム、ポリオ（非経口））、フェノール（肺炎、腸チフス（非経口）、牛痘）およびチメロサール（ＤＴａＰ、ＤＴ、Ｔｄ、ＨｅｐＢ、Ｈｉｂ、インフルエンザ、ＪＥ、髄膜炎（Ｍｅｎｉｎｇ）、肺炎、狂犬病）を含有するワクチンを包含する。注射薬における使用が承認されている保存剤は、例えば、クロロブタノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、２−フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、フェノール、チメロサールおよび硝酸フェニル水銀を包含する。
【０１７５】
ある特定の実施形態において、非経口投与に適合する本発明の製剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート−８０（ツイン８０）、ポリソルベート−６０（ツイン６０）、ポリソルベート−４０（ツイン４０）およびポリソルベート−２０（ツイン２０）、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ３５、ならびにトリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＰ４０、スパン８５およびプルロニックシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、プルロニック１２１）等の他のものを包含するがこれらに限定されないポリオキシエチレンアルキルエーテルを包含するがこれらに限定されない１つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含み、好ましい成分は、約０．００１％から約２％までの濃度（最大約０．２５％が好ましい）のポリソルベート−８０、または約０．００１％から１％までの濃度（最大約０．５％が好ましい）のポリソルベート−４０である。
【０１７６】
包装および投薬形態
本発明の免疫原性組成物の対象への直接送達は、非経口投与によって（筋肉内に、腹腔内に、皮内に、皮下に、静脈内に、または組織の間質腔へ）；または、経口／消化、呼吸もしくは尿生殖路への粘膜投与を経由して；または、局所、経皮、鼻腔内、眼内、耳内、経肺もしくは他の粘膜投与によって遂行され得る。
【０１７７】
一実施形態において、非経口投与は、例えば、対象の大腿部または上腕への筋肉内注射によるものである。注射は、針（例えば、皮下注射針）を経由するものであってよいが、無針注射も代替として使用され得る。典型的な筋肉内用量は０．５ｍＬである。別の実施形態において、鼻腔内投与は、肺炎または中耳炎の治療に使用される（肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）の鼻咽頭保菌はより有効に予防され得るため、感染症をその最初期段階で軽減する）。
【０１７８】
本発明の組成物は、種々の形で、例えば注射用に液体の液剤または懸濁剤のいずれかとして、調製され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、経肺投与用の散剤またはスプレー剤として、例えば吸入器内に調製され得る。他の実施形態において、組成物は、坐剤もしくはペッサリーとして、または経鼻、耳内もしくは眼内投与用に、例えばスプレー剤、点滴薬、ゲル剤もしくは散剤として調製され得る。
【０１７９】
各免疫原性組成物用量中のグリココンジュゲートの量は、有意な有害作用なしに免疫保護応答を誘導する量として選択される。そのような量は、グリココンジュゲート中に存在する細菌の血清型に応じて変動し得る。概して、各用量は、０．１から１００μｇ、特に０．１から１０μｇ、より詳細には１から５μｇの多糖を含むことになる。
【０１８０】
本発明の特定の実施形態において、免疫原性組成物は、ｅＴＥＣリンカーを経由してＣＲＭ１９７と個々にコンジュゲートしているＰｎまたはＭｎ莢膜多糖の無菌液体製剤であり、ここで、各０．５ｍＬの用量は、０．１２５ｍｇの元素アルミニウム（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバントをさらに含有していてよい１〜５μｇの多糖；ならびに添加剤として塩化ナトリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝液を含有するように製剤化される。
【０１８１】
特定の免疫原性組成物に最適な成分の量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって解明することができる。初回接種の後、対象は、適度に間隔をおいて１または数回のブースター免疫化を受けることができる。
【０１８２】
本発明の免疫原性組成物を、単位用量または多回用量形態（例えば、２回用量、４回用量、またはそれ以上）で包装してよい。多回用量形態では、バイアルは、典型的にはプレフィルドシリンジよりも好ましいが、必ずしもそうとは限らない。好適な多回用量フォーマットは、用量当たり０．１から２ｍＬで容器当たり２から１０回用量を包含するがこれに限定されない。ある特定の実施形態において、用量は０．５ｍＬ用量である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願第ＷＯ２００７／１２７６６８号を参照されたい。
【０１８３】
組成物は、バイアルもしくは他の好適な貯蔵容器で提示されてもよいし、またはプレフィルド送達デバイス、例えば、針が同梱されていてもいなくてもよい、単一もしくは多重成分シリンジで提示されてもよい。シリンジは、典型的には単回用量の本発明の保存剤含有免疫原性組成物を含有するが必ずしもそうとは限らず、多回用量のプレフィルドシリンジも想定されている。同様に、バイアルは単回用量を包含し得るが、代替として複数回用量を包含してもよい。
【０１８４】
有効な投薬量体積は常法に従って確立され得るが、注射用の組成物の典型的な用量は、０．５ｍＬの体積を有する。ある特定の実施形態において、用量は、ヒト対象への投与用に製剤化される。ある特定の実施形態において、用量は、成人、未成年、青年、幼児、または乳児（すなわち、１歳未満）ヒト対象への投与用に製剤化され、好ましい実施形態において、注射によって投与され得る。
【０１８５】
本発明の液体免疫原性組成物は、凍結乾燥形態で提示される他の免疫原性組成物を再構成するのにも好適である。免疫原性組成物がそのような即時再構成に使用される場合、本発明は、２つ以上のバイアル、２つ以上の充填済みシリンジ、またはそれぞれの１つもしくは複数を加えたキットを提供し、シリンジの内容物は、注射の前にバイアルの内容物を再構成するために使用されるか、またはその逆である。
【０１８６】
また別の実施形態において、多回用量フォーマットの容器は、一般的な実験室用ガラス製品、フラスコ、ビーカー、メスシリンダー、発酵槽、バイオリアクター、管、パイプ、バッグ、ジャー、バイアル、バイアルクロージャー（例えば、ゴム栓、ネジ式キャップ）、アンプル、シリンジ、デュアルまたはマルチチャンバーシリンジ、シリンジ栓、シリンジプランジャー、ゴムクロージャー、プラスチッククロージャー、ガラスクロージャー、カートリッジおよび使い捨てペン等からなるがこれらに限定されない群の１つまたは複数から選択される。本発明の容器は、製造材料によって限定されず、ガラス、金属（例えば、鋼、ステンレス鋼、アルミニウム等）およびポリマー（例えば、熱可塑性プラスチック、エラストマー、熱可塑性エラストマー）等の材料を包含する。特定の実施形態において、該フォーマットの容器は、ブチル栓付きの５ｍＬのＳｃｈｏｔｔタイプ１ガラスバイアルである。当業者であれば、上記で説明したフォーマットは決して包括的なリストではなく、本発明に利用可能な様々なフォーマットに関する当業者への指針としての役割を担っているに過ぎないことが分かるであろう。本発明における使用が企図されている追加のフォーマットは、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐ．（Ｌｉｍａ、ＯＨ）、ＶＷＲ等の実験機器販売業者および製造業者からの出版カタログにおいて見つけることができる。
【０１８７】
免疫応答を誘導し、感染症から保護するための方法
本発明は、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートおよびそれらを含む免疫原性組成物を、予防的にまたは治療的にのいずれかで使用するための方法も包含する。例えば、本発明の一態様は、病原性細菌、例えば肺炎球菌または髄膜炎菌細菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、病原性細菌に由来する細菌莢膜多糖等の細菌性抗原を含む免疫学的に有効な量の本明細書において記述されている免疫原性組成物のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。本発明の一実施形態は、病原性細菌による感染症から対象を保護する方法、または、病原性細菌に関連する感染症疾患または状態を予防する、治療するもしくは改善させる方法、または、病原性細菌によって引き起こされた感染症に関連する少なくとも１つの症状の重症度を低減させる、もしくはその発症を遅延させる方法であって、各々の場合において、対象に、病原性細菌に由来する細菌莢膜多糖等の細菌性抗原を含む免疫学的に有効な量の本明細書において記述されている免疫原性組成物のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１８８】
本発明の一実施形態は、対象において、細菌性の感染症、疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させる方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物を投与するステップを含み、前記免疫原性組成物が、細菌莢膜多糖等の細菌性抗原を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む、方法を提供する。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、細菌性の感染症、疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させる方法は、ヒト、獣医学、動物、または農業的治療を含む。別の実施形態は、対象において、病原性細菌に関連する細菌性の感染症、疾患または状態を予防する、治療するまたは改善させる方法であって、本明細書において記述されている免疫原性組成物からポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を作り出すステップと、前記抗体調製物を使用して、対象に受動免疫を付与するステップとを含む、方法を提供する。本発明の一実施形態は、外科手術手技を受けている対象において細菌感染症を予防する方法であって、予防有効量の本明細書において記述されている免疫原性組成物を、外科手術手技の前に対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１９０】
前述の方法のそれぞれの好ましい実施形態において、病原性細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）細菌等の肺炎球菌または髄膜炎菌細菌である。いくつかのそのような実施形態において、細菌性抗原は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖である。他のそのような実施形態において、細菌性抗原は、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖である。
【０１９１】
抗原または免疫原性組成物に対する免疫応答は、対象における、関心対象の抗原または免疫原性組成物中に存在する分子に対する体液性および／または細胞媒介性免疫応答の発達によって特徴付けられる。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は抗体媒介性免疫応答であり、本発明の免疫原性組成物中の抗原に対して若干の親和性で認識および結合する抗体の誘導および発生を伴うのに対し、「細胞媒介性免疫応答」はＴ細胞および／または他の白血球によって媒介されるものである。「細胞媒介性免疫応答」は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ：ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、ＣＤ１または他の非古典的なＭＨＣ様分子のクラスＩまたはクラスＩＩ分子と会合している抗原エピトープの提示によって引き出される。これは、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞またはＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球細胞（「ＣＴＬ」：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ）を活性化する。ＣＴＬは、古典的または非古典的なＭＨＣによってコードされ、細胞の表面に発現されているタンパク質と会合して提示されているペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を、誘導し促進するのを支援する。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、機能を刺激し、ペプチドを表示している細胞またはそれらの表面上の古典的もしくは非古典的なＭＨＣ分子と会合している他の抗原に対する非特異的エフェクター細胞の活性に焦点を合わせるのを支援するように作用する。「細胞媒介性免疫応答」は、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを包含する他の白血球によって生成された他のそのような分子の生成も指す。細胞媒介性免疫学的応答を刺激する特定の抗原または組成物の能力は、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイによって、感作された対象における抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイすることによって、または抗原による再刺激に応答したＴ細胞によるサイトカイン産生の測定によって等、若干数のアッセイによって決定され得る。そのようなアッセイは、当技術分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４１８９〜４１９９；およびＤｏｅら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２３６９〜２３７６を参照されたい。
【０１９２】
本発明の免疫原性組成物および方法は、下記の１つまたは複数に有用となり得る：（ｉ）慣習的なワクチンのような感染もしくは再感染の予防、（ｉｉ）重症度の低減もしくは病状の解消、および／または（ｉｉｉ）問題の病原体もしくは障害の実質的なもしくは完全な解消。それ故、治療は、予防的に（感染前）または治療的に（感染後）実行され得る。本発明において、予防的治療は好ましいモードである。本発明の特定の実施形態によれば、宿主対象を、例えば肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）による細菌感染症に対して予防的にかつ／または治療的に免疫化することを包含し、治療する組成物および方法が提供される。本発明の方法は、対象に予防的および／または治療的免疫を付与するために有用である。本発明の方法は、対象において、生物医学研究用途のためにも実践され得る。
【０１９３】
本明細書において使用される場合、用語「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物を意味する。より詳細には、対象は、ヒト、家庭内動物および家畜、ならびに研究、動物園、スポーツ用および家庭用ペット等のペットコンパニオンアニマル、ならびにウシ、ヒツジ、フェレット、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ等を包含するがこれらに限定されない他の家畜化された動物を包含する、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましいコンパニオンアニマルは、イヌおよびネコである。好ましくは、対象はヒトである。
【０１９４】
組成物中の特定のコンジュゲートの量は、概して、そのコンジュゲートに対してコンジュゲートしているものおよびコンジュゲートしていないもの両方の多糖の総量に基づいて算出される。例えば、２０％の遊離多糖を持つコンジュゲートは、１００μｇの多糖用量中に、約８０μｇのコンジュゲートしている多糖および約２０μｇのコンジュゲートしていない多糖を有することになる。コンジュゲートへのタンパク質貢献は、コンジュゲートの用量を算出する際には通常考慮されない。コンジュゲートまたは免疫原性組成物の免疫原性量は、細菌の血清型に応じて変動し得る。概して、各用量は、０．１から１００μｇ、特に０．１から１０μｇ、より詳細には１から１０μｇの多糖を含むことになる。免疫原性組成物中の異なる多糖成分の免疫原性量は多岐にわたっていてよく、それぞれが、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、または約１００μｇの任意の特定の多糖抗原を含み得る。
【０１９５】
用語「侵襲性疾患」は、疾患に関連する臨床兆候／症状がある場合の、通常無菌の部位からの細菌の単離を指す。通常無菌の身体部位は、血液、ＣＳＦ、胸膜液、心膜液、腹水、関節／滑液、骨、体内部位（リンパ節、脳、心臓、肝臓、脾臓、硝子体液、腎臓、膵臓、卵巣）または他の通常無菌の部位を包含する。侵襲性疾患を特徴付ける臨床状態は、菌血症、肺炎、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、敗血性ショック他を包含する。
【０１９６】
免疫原としての抗原の有効性は、増殖アッセイによって、Ｔ細胞のその特異的な標的細胞を溶解させる能力を測定するためのクロム放出アッセイ等の細胞溶解アッセイによって、または血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することによりＢ細胞活性のレベルを測定することによってのいずれかで、測定され得る。免疫応答は、抗原の投与後に誘導された抗原特異的抗体の血清レベルを測定することによって、より具体的には、そのようにして誘導された抗体の、特定の白血球のオプソニン食作用能力を強化する能力を、本明細書において記述されている通りに測定することによっても検出され得る。免疫応答の保護のレベルは、免疫化宿主に、投与された抗原を接種することによって測定され得る。例えば、免疫応答が所望される抗原が細菌であれば、免疫原性量の抗原によって誘導された保護のレベルは、動物への細菌細胞の接種後の生存率または死亡率を検出することによって測定される。一実施形態において、保護の量は、細菌感染症に関連する少なくとも１つの症状、例えば感染症に関連する発熱を測定することによって測定され得る。多抗原もしくは多成分ワクチンまたは免疫原性組成物中の抗原のそれぞれの量は、他の成分のそれぞれについて変動することになり、当業者に公知の方法によって決定され得る。そのような方法は、免疫原性および／またはインビボ効能を測定するための手順を包含するであろう。
【０１９７】
別の態様において、本発明は、本発明の莢膜多糖またはグリココンジュゲートと特異的にかつ選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。いくつかのそのような実施形態において、本発明は、Ｐｎ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ莢膜多糖またはそれらを含むグリココンジュゲートと特異的にかつ選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。他のそのような実施形態において、本発明は、Ｍｎ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５もしくはＹ莢膜多糖またはそれらを含むグリココンジュゲートと特異的にかつ選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。いくつかの実施形態において、抗体は、本発明の莢膜多糖またはグリココンジュゲートの対象への投与時に生じる。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の莢膜多糖またはグリココンジュゲートの１つまたは複数に対する精製または単離された抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、動物効能モデルにおいて細菌を死滅させることによってまたはオプソニン食作用死滅アッセイを経由してのいずれかで測定された際に機能的である。本発明の抗体または抗体組成物は、対象において、病原性細菌、例えば肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に関連する細菌性の感染症、疾患または状態を、治療するまたは予防する方法であって、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を作り出すステップと、前記抗体または抗体組成物を使用して、対象に受動免疫を付与するステップとを含む、方法において使用され得る。本発明の抗体は、診断法、例えば、莢膜多糖またはそのグリココンジュゲートの存在を検出するまたはそのレベルを定量化するためにも有用となり得る。例えば、本発明の抗体は、ＰｎもしくはＭｎ莢膜多糖またはそのグリココンジュゲートの存在を検出するまたはそのレベルを定量化するためにも有用となり得、ここで、グリココンジュゲートは、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質とコンジュゲートしている細菌莢膜多糖を含む。
【０１９８】
当技術分野において公知である数種のアッセイおよび動物モデルを使用して、本明細書において記述されている免疫原性組成物のいずれか１つの効能を評定してよい。例えば、Ｃｈｉａｖｏｌｉｎｉら（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００８）、２１（４）：６６６〜６８５）は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）疾患の動物モデルについて記述している。Ｇｏｒｒｉｎｇｅら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ、第６６巻（２００１）、第１７章、ＰｏｌｌａｒｄおよびＭａｉｄｅｎ編（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）は、髄膜炎菌性疾患の動物モデルについて記述している。
【０１９９】
オプソニン食作用活性（ＯＰＡ：Ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）アッセイ
ＯＰＡアッセイ手順は、Ｈｕら（Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１２（２）：２８７〜９５）によって既に記述された方法に基づき、下記の修正を加えたものであった。加熱不活性化した血清を、緩衝液中で２．５倍に連続希釈した。標的細菌をアッセイプレートに添加し、シェーカー上、２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、仔ウサギ相補体（３から４週齢、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、１２．５％最終濃度）および分化したＨＬ−６０細胞を、各ウェルに、およそ２００：１のエフェクター対標的比で添加した。アッセイプレートを、シェーカー上、３７℃で４５分間インキュベートした。反応を終了させるために、８０μＬの０．９％ＮａＣｌをすべてのウェルに添加し、混合し、１０−μＬアリコートを、２００μＬの水を含有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、マルチスクリーンＨＴＳ  ＨＶフィルタープレートのウェルに移した。液体を、真空下でプレートを介して濾過し、１５０μＬのハイソイ（ＨｙＳｏｙ）培地を各ウェルに添加し、濾過した。次いで、フィルタープレートを、３７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベートし、次いで脱染溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で固定した。次いで、プレートをクマシーブルーで染色し、一度脱染した。コロニーを、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＴＬ）ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）で撮像し列挙した。ＯＰＡ抗体力価を、免疫血清を含有しない対照ウェルと比較した場合の細菌コロニーの数における５０％低減点を網羅する２つの血清希釈物の逆数から補間した。
【０２００】
上記の開示は本発明について概して記述するものである。より完全な理解は、下記の具体例の参照によって得ることができる。これらの例は、例証目的でのみ記述され、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【０２０１】
（実施例１）
ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの調製の一般的プロセス
糖の活性化およびシスタミン二塩酸塩によるチオール化
糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）中で再構成する。溶液の水分含有量をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定し、０．１から０．４％、典型的には０．２％の水分含有量に到達するように調整する。
【０２０２】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中１００ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖を種々の量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル当量）で活性化し、反応を２３±２℃で１時間進めさせる。活性化レベルはＨＰＬＣによって決定することができる。シスタミン二塩酸塩を、無水ＤＭＳＯ中、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。活性化糖を１モル当量のシスタミン二塩酸塩と反応させる。代替として、活性化糖を１モル当量のシステアミン塩酸塩と反応させる。チオール化反応を２３±２℃で２１±２時間進めさせて、チオール化糖を生成する。チオール化レベルは添加されたＣＤＴ／ＣＤＩの量によって決定される。
【０２０３】
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０溶液の添加によってクエンチする。添加された四ホウ酸塩の量を決定するためおよび最終水分含有量を全水溶液の最大１〜２％に調整するために算出を実施する。
【０２０４】
活性化チオール化糖の還元および精製
チオール化糖反応混合物を、０．９％生理食塩水中の予冷した５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０への添加によって１０倍希釈し、５μｍのフィルターに通して濾過する。チオール化糖の透析濾過（ｄｉａｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を、４０倍ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）のＷＦＩに対して実施する。１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０による希釈後、残余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加する。この還元反応を５±３℃で２０±２時間進めさせる。活性化チオール化糖の精製は、好ましくは、予冷した１０ｍＭリン酸ナトリウム一塩基、ｐＨ４．３に対する限外濾過／透析濾過によって実施する。代替として、チオール化糖は標準的なサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）手順またはイオン交換クロマトグラフ法によって精製される。活性化チオール化糖残余分のアリコートを取り出して、糖濃度およびチオール含有物（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定する。
【０２０５】
活性化チオール化糖の代替的な還元および精製
上述した精製手順の代替として、活性化チオール化糖を以下の通りにも精製した。
【０２０６】
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５〜１０モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進めさせた。次いで、反応混合物を、０．９％生理食塩水中の予冷した５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０への添加によって５倍希釈し、５μｍのフィルターに通して濾過した。チオール化糖の透析濾過は、４０倍ダイアボリュームの予冷した１０ｍＭリン酸ナトリウム一塩基、ｐＨ４．３を使用して実施した。活性化チオール化糖残余分のアリコートを取り出して、糖濃度およびチオール含有物（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定した。
【０２０７】
ブロモアセチル化担体タンパク質の活性化および精製
担体タンパク質の遊離アミノ基を、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＢＡＡＮＳ）、ブロモアセチルブロミド、または別の好適な試薬等のブロモアセチル化剤との反応によってブロモアセチル化する（ｂｒｏｍｏａｃｔｅｙｌａｔｅ）。
【０２０８】
担体タンパク質（０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ８．０±０．２）を、活性化前、最初、８±３℃、約ｐＨ７で保つ。タンパク質溶液に、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＢＡＡＮＳ）をストックジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）として０．２５〜０．５  ＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／ｗ）の比で添加する。反応物を５±３℃で３０〜６０分間穏やかに混合する。得られたブロモアセチル化（活性化）タンパク質を、例えば、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）緩衝液を使用し、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜を使用する限外濾過／透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度を、ローリータンパク質アッセイによって推定する。
【０２０９】
活性化の程度は、抑制された電導度検出と併用したイオン交換液体クロマトグラフィー（イオンクロマトグラフィー）による全臭化物アッセイによって決定する。活性化ブロモアセチル化タンパク質上の結合した臭化物を、アッセイ試料調製物中のタンパク質から切断し、存在し得る任意の遊離臭化物とともに定量化する。タンパク質上の任意の残りの共有結合している臭化物を、アルカリ性２−メルカプトエタノール中で試料を加熱することによるイオン性臭化物への変換によって放出する。
【０２１０】
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７の活性化および精製
ＣＲＭ１９７を、１０ｍＭリン酸緩衝０．９％ＮａＣｌ  ｐＨ７（ＰＢＳ）で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで、１Ｍストック溶液を使用して０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ７．０を作製した。２０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯのＢＡＡＮＳストック溶液を使用して、ＢＡＡＮＳをＣＲＭ１９７：ＢＡＡＮＳ比１：０．３５（ｗ：ｗ）で添加した。反応混合物を、３℃から１１℃の間で３０分〜１時間インキュベートし、次いで、１０Ｋ  ＭＷＣＯ膜および１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を使用する限外濾過／透析濾過によって精製した。精製した活性化ＣＲＭ１９７を、ローリーアッセイによってアッセイしてタンパク質濃度を決定し、次いで、ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈した。スクロースを５％ｗｔ／体積まで抗凍結剤として添加し、活性化タンパク質を冷凍し、コンジュゲーションに必要となるまで−２５℃で貯蔵した。
【０２１１】
ＣＲＭ１９７のリジン残基のブロモアセチル化は非常に一貫性があり、利用可能な３９個のリジンのうち１５から２５個のリジンの活性化をもたらした。反応は、高収率の活性化タンパク質を生成した。
【０２１２】
活性化チオール化糖とブロモアセチル化担体タンパク質とのコンジュゲーション
コンジュゲーション反応を開始する前に、反応ベッセルを５℃に予め冷却する。その後、ブロモアセチル化担体タンパク質および活性化チオール化糖を添加し、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で混合する。糖／タンパク質投入比は０．９±０．１である。反応物のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨ溶液で８．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を５℃で２０±２時間進めさせる。
【０２１３】
残留反応性官能基のキャッピング
担体タンパク質上の未反応のブロモアセチル化残基を、キャッピング試薬としての２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと、５℃で３時間反応させることによってクエンチする。残留遊離スルフヒドリル基を、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）により、５℃で２０時間キャップする。
【０２１４】
ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの精製
コンジュゲーション反応（ＩＡＡキャップ後）混合物を、０．４５μｍのフィルターに通して濾過する。グリココンジュゲートの限外濾過／透析濾過を、５ｍＭスクシネート−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して実施する。次いで、グリココンジュゲート残余分を０．２μｍのフィルターに通して濾過する。グリココンジュゲートのアリコートをアッセイのために取り出す。残りのグリココンジュゲートを５℃で貯蔵する。
【０２１５】
（実施例２）
Ｐｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣコンジュゲートの精製
活性化プロセス
Ｐｎ３３Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−３３Ｆ多糖を５００ｍＭの１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と調合して、多糖１グラム当たり１０グラムのトリアゾールを取得した。混合物をドライアイス−エタノール浴中でシェルフリーズし、次いで凍結乾燥乾固した。凍結乾燥した３３Ｆ多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再構成した。凍結乾燥した３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の水分含有量をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。ＷＦＩを３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液に添加することによって水分含有量を調整して、０．２％の水分含有量に到達させた。
【０２１６】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。チオール化ステップの前に、Ｐｎ３３Ｆ多糖を種々の量のＣＤＴで活性化させた。ＣＤＴ活性化を２３±２℃で１時間行った。活性化レベルをＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決定した。四ホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応溶液中のあらゆる残留ＣＤＴをクエンチした。添加された四ホウ酸塩の量を決定するためおよび最終水分含有量を全水溶液の１．２％にするために算出を実施する。反応を２３±２℃で１時間進めさせた。
【０２１７】
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化
シスタミン−二塩酸塩を無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、１モル当量のシスタミン二塩酸塩を、活性化多糖反応溶液に添加した。反応を２３±２℃で２１±２時間進めさせた。チオール化糖溶液を、０．９％生理食塩水中の予冷した５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０への添加によって１０倍希釈した。希釈した反応溶液を、５μｍのフィルターに通して濾過した。チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の透析濾過は、注射用水（ＷＦＩ：Ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を使用する１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて行った。
【０２１８】
ＣＤＴのモル当量の関数としての活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化レベルを、図８に示す。
【０２１９】
活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の低減および精製
残余分に、１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０による希釈後、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５モル当量を添加した。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進めさせた。チオール化３３Ｆ多糖の透析濾過は、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて行った。透析濾過を、予冷した１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して実施した。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイ両方のために取り出した。
【０２２０】
活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の代替的な低減および精製
上述した精製手順の代替として、３３Ｆ活性化チオール化糖を以下の通りにも精製した。
【０２２１】
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進めさせた。次いで、反応混合物を、０．９％生理食塩水中の予冷した５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０への添加によって５倍希釈し、５μｍのフィルターに通して濾過した。チオール化糖の透析濾過は、４０倍ダイアボリュームの予冷した１０ｍＭリン酸ナトリウム一塩基、ｐＨ４．３を１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットとともに使用して実施した。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイ両方のために取り出した。活性化プロセスのフロー図を図７（Ａ）において提供する。
【０２２２】
コンジュゲーションプロセス
チオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、実施例１において記述されている通り、ブロモアセチル化によって別個に活性化させ、次いで、コンジュゲーション反応のために活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖と反応させた。コンジュゲーション反応を開始する前に、反応ベッセルを０℃に予め冷却した。ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化３３Ｆ多糖を、反応ベッセル内、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で一緒に混合した。糖／タンパク質投入比は０．９±０．１であった。反応物のｐＨを８．０〜９．０に調整した。コンジュゲーション反応を、５℃で２０±２時間進めさせた。
【０２２３】
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応のブロモアセチル化残基を、２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと５℃で３時間反応させることによってキャップし、続いて、チオール化３３Ｆ−多糖の任意の残留遊離スルフヒドリル基を、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）により、５℃で２０時間キャップした。
【０２２４】
ｅＴＥＣ結合Ｐｎ−３３Ｆグリココンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍのフィルターに通して濾過した。３３Ｆグリココンジュゲートの透析濾過は、３００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて行った。透析濾過を、５ｍＭスクシネート−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して実施した。次いで、Ｐｎ−３３Ｆグリココンジュゲート３００Ｋ残余分を０．２２μｍのフィルターに通して濾過し、５℃で貯蔵した。
【０２２５】
コンジュゲーションプロセスのフロー図を図７（Ｂ）において提供する。
【０２２６】
結果
Ｐｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートの数個のバッチについての反応パラメーターおよび特徴付けデータを、表２に示す。シスタミン二塩酸塩によるＣＤＴ活性化−チオール化は、６３から９０％の糖収率および１％未満から１３％の遊離糖を有するグリココンジュゲートを作り出した。
【０２２７】
【表２】
0006291495.tif 000005
【０２２８】
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートのＯＰＡ力価
マウスにおけるＰｎ−３３Ｆ  ＯＰＡ力価を、標準的な条件下で決定した。４および７週間でのＯＰＡ力価（９５％ＣＩでのＧＭＴ）を表３に示し、これは、血清型３３Ｆ  Ｐｎグリココンジュゲートがネズミ免疫原性モデルにおいてＯＰＡ力価を引き出したことを実証している。
【０２２９】
【表３】
0006291495.tif 000006
【０２３０】
（実施例３）
Ｐｎ−２２Ｆ  ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス
Ｐｎ−２２Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−２２Ｆ多糖を５００ｍＭの１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と調合して、多糖１グラム当たり１０グラムのトリアゾールを取得した。混合物をドライアイス−エタノール浴中でシェルフリーズし、次いで凍結乾燥乾固した。凍結乾燥した２２Ｆ多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再構成した。凍結乾燥した２２Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の水分含有量をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。ＷＦＩをＰｎ−２２Ｆ／ＤＭＳＯ溶液に添加することによって水分含有量を調整して、０．２％の水分含有量に到達させた。
【０２３１】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。Ｐｎ−２２Ｆ多糖を種々の量のＣＤＴで活性化させ、続いて１モル当量のシスタミン二塩酸塩でチオール化した。ＣＤＴ活性化を２３±２℃で１時間行った。活性化レベルをＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決定した。四ホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応溶液中のあらゆる残留ＣＤＴをクエンチした。添加された四ホウ酸塩の量を決定するためおよび最終水分含有量を全水溶液の１．２％にするために算出を実施する。反応を２３±２℃で１時間進めさせた。
【０２３２】
活性化Ｐｎ−２２Ｆ多糖のチオール化
シスタミン−二塩酸塩を無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、反応溶液に添加した。反応を２３±２℃で２１±２時間進めさせた。チオール化糖溶液を、０．９％生理食塩水中の予冷した５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０への添加によって１０倍希釈した。希釈した反応溶液を、５μｍのフィルターに通して濾過した。チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖の透析濾過は、注射用水（ＷＦＩ）を使用する１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて行った。
【０２３３】
活性化チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖の還元および精製
残余分に、１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０による希釈後、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５〜１０モル当量を添加した。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進めさせた。チオール化２２Ｆ多糖の透析濾過は、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて行った。透析濾過を、予冷した１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して実施した。チオール化２２Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイ両方のために取り出した。
【０２３４】
Ｐｎ−２２Ｆ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートのコンジュゲーション、キャッピングおよび精製
活性化チオール化Ｐｎ２２Ｆ多糖と活性化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション、キャッピング、およびＰｎ−２２Ｆ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートの精製は、実施例２において記述されているプロセスに従って実施した。
【０２３５】
結果
ＣＲＭ１９７との代表的なＰｎ−２２Ｆ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートについての特徴付けおよびプロセスデータを、表４において提供する。
【０２３６】
【表４】
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【０２３７】
（実施例４）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−１０Ａ  ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
Ｐｎ−１０Ａ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートの調製
ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている肺炎球菌莢膜多糖血清型１０Ａ（Ｐｎ−１０Ａ）を含むグリココンジュゲートは、実施例２において記述されているプロセスに従って調製した。
【０２３８】
Ｐｎ−１０Ａ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートの特徴付け
ＣＲＭ１９７との代表的なＰｎ−１０Ａ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートについての特徴付けおよびプロセスデータを、表５において提供する。
【０２３９】
【表５】
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【０２４０】
Ｐｎ−１０Ａ  ＯＰＡ力価
マウスにおけるＣＲＭ１９７とのＰｎ−１０Ａ  ｅＴＥＣコンジュゲートに対するＯＰＡ力価を、標準的な条件下で決定した。用量の関数としてのＯＰＡ力価を、表６に示す。ＯＰＡ力価は、コンジュゲートについて、コンジュゲートされていない血清型１０Ａ多糖と比べて有意に高かった。
【０２４１】
【表６】
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【０２４２】
（実施例５）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−１１Ａ  ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
Ｐｎ−１１Ａ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートの調製
ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている肺炎球菌莢膜多糖血清型１１Ａ（Ｐｎ−１１Ａ）を含むグリココンジュゲートは、実施例２において記述されているプロセスに従って調製した。
【０２４３】
Ｐｎ−１１Ａ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートの特徴付け
ＣＲＭ１９７との代表的なＰｎ−１１Ａ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートについての特徴付けおよびプロセスデータを、表７において提供する。
【０２４４】
【表７】
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【０２４５】
Ｐｎ−１１Ａ  ＯＰＡ力価
マウスにおけるＣＲＭ１９７とのＰｎ−１１Ａ  ｅＴＥＣコンジュゲートに対するＯＰＡ力価を、標準的な条件下で決定した。用量の関数としてのＯＰＡ力価を、表８に示す。
【０２４６】
【表８】
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【０２４７】
（実施例６）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／水性コンジュゲートの調製
Ｐｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／水性グリココンジュゲートの調製
Ｐｎ−３３Ｆグリココンジュゲートは、水相中での還元的アミノ化（ＲＡＣ／水溶液）を使用して調製され、これは肺炎球菌コンジュゲートワクチンを生成するために成功裏に適用された（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１を参照）。このアプローチは、２つのステップを包含する。第一のステップは、隣接ジオールからアルデヒド官能基を作り出すための多糖の酸化である。第二のステップは、活性化多糖をＣＲＭ１９７のリジン（Ｌｙｓ）残基とコンジュゲートさせることである。
【０２４８】
簡潔に述べると、冷凍した多糖を解凍し、ｐＨ６．０のリン酸ナトリウム緩衝液中、異なる量の過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）の添加によって酸化を行った。活性化多糖の濃縮および透析濾過を行い、精製した活性化多糖を４℃で貯蔵した。活性化多糖をＣＲＭ１９７タンパク質と調合した。多糖およびＣＲＭ１９７を徹底的に混合した後、ボトルをドライアイス／エタノール浴に入れ、続いて多糖／ＣＲＭ１９７混合物の凍結乾燥を行った。凍結乾燥した混合物を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で再構成した。１．５モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの添加、ならびに２３℃で２０時間および３７℃で追加で４４時間のインキュベーションによって、コンジュゲーション反応を開始させた。反応物を１倍体積の０．９％生理食塩水で希釈し、２Ｍ当量の水素化ホウ素ナトリウムを使用して、２３℃で３時間キャップした。反応混合物を１倍体積の０．９％生理食塩水で希釈し、次いで、０．４５μｍのフィルターに通して濾過した後、精製した。コンジュゲートの濃縮および透析濾過は、１００Ｋ  ＭＷＣＯＵＦ膜カセットを使用して行った。
【０２４９】
数種のコンジュゲートは、上述したプロセスを使用し、異なるパラメーター（例えば、ｐＨ、反応温度および多糖の濃度）を変動させることによって取得した。
【０２５０】
典型的な多糖収率は、これらのコンジュゲートおよび２０００〜３５００ｋＤａの範囲内のコンジュゲート分子量を持つ遊離糖の１５％について、およそ５０％であった。
【０２５１】
しかしながら、野生型血清型３３Ｆ多糖は、５−ガラクトフラノシル残基のそのＣ２上にＯ−アセチル基を担持し、アセチル官能基の約８０％は、水相中での還元的アミノ化を使用するコンジュゲーションプロセス全体を通じて除去されることが分かった。５員環構造（５−ガラクトフラノシド）上のＯ−アセチル基は、水相プロセスにおける還元的アミノ化化学を使用して、容易に移動し除去され得ることが観察された。
【０２５２】
Ｐｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／水性グリココンジュゲート安定性の評価
上記のプロセスによって調製した代表的なＲＡＣ／水性コンジュゲートのアリコートを、ポリプロピレンチューブ内に分注した。これらのチューブを２５℃または３７℃のいずれかで貯蔵し、安定性を最大３．５か月間モニターした。各安定性時点において、％遊離糖レベルを評価した。両方の温度における安定性データを、表９にまとめる。表９に示す通り、％遊離糖レベルは、２５℃および３７℃において有意に増大した。貯蔵中の％遊離糖レベルの増大は、コンジュゲート中の多糖分解についての潜在的なインジケーターである。
【０２５３】
【表９】
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【０２５４】
血清型３３Ｆ多糖は、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応により成功裏に活性化され、その後、水性還元的アミノ化化学を活用してＣＲＭ１９７とコンジュゲートしたが、コンジュゲーション中にアセチル官能基（免疫原性のための重要な多糖エピトープ）を保存できないことと組み合わせた加速条件下での％遊離糖安定性結果は、ＲＡＣ／水性プロセスが血清型３３Ｆコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｏｎ）に最適なプロセスではないことを示唆するものであった。
【０２５５】
（実施例７）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートの調製
Ｐｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／ＤＭＳＯグリココンジュゲートの調製
ＲＡＣ／水性プロセスと比較すると、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化（ＲＡＣ／ＤＭＳＯ）を介して行われるコンジュゲーションは、概して、脱Ｏ−アセチル化の可能性が有意に低い。実施例６において記述されている、ＲＡＣ／水性プロセスを使用するＯ−アセチル官能基の保存に関連する接種の観点から、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを生成するために成功裏に適用されたＲＡＣ／ＤＭＳＯ溶媒を使用する代替的なアプローチ（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１を参照）が評価された。
【０２５６】
活性化多糖を、活性化多糖１グラム当たり２５グラムのスクロースの比で使用して、スクロース（ＷＦＩ中５０％ｗ／ｖ）と調合した。成分をよく混合した後、ドライアイス／エタノール浴中でシェルフリーズした。次いで、調合された混合物のシェルフリーズしたボトルを、凍結乾燥乾固した。
【０２５７】
凍結乾燥した活性化多糖をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再構成した。ＤＭＳＯを、凍結乾燥したＣＲＭ１９７に再構成のために添加した。再構成された活性化多糖を、再構成されたＣＲＭ１９７と、反応ベッセル内で合わせた。ＮａＣＮＢＨ３を反応混合物に添加することによってコンジュゲーションを開始させた。反応物を２３℃で２０時間インキュベートした。コンジュゲーション（キャッピング）反応の終了は、ＮａＢＨ４を添加することによって達成し、反応をもう３時間続けた。反応混合物を、４倍体積の５ｍＭスクシネート−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０緩衝液で希釈し、次いで、５μｍのフィルターに通して濾過した後、精製した。コンジュゲートの濃縮および透析濾過は、１００Ｋ  ＭＷＣＯ膜を使用して行った。透析濾過を、４０倍ダイアボリュームの５ｍＭスクシネート−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０緩衝液に対して実施した。残余分を０．４５および０．２２μｍのフィルターに通して濾過し、分析した。
【０２５８】
数種のコンジュゲートは、上述したプロセスを使用し、異なるパラメーター（例えば、糖−タンパク質投入比、反応濃度、シアノ水素化ホウ素ナトリウムのＭ当量、および水分含有量）を変動させることによって取得した。ＲＡＣ／ＤＭＳＯプロセスによって調製されたコンジュゲートから発生した全体的なデータは、ＲＡＣ／水性プロセスと比較して優れていることが実証され、良好なコンジュゲーション収率、低い％遊離糖（５％未満）およびより高いコンジュゲーション度を持つコンジュゲート（コンジュゲートしているリジン）を調製することが可能となった。加えて、ＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲーションプロセス全体を通じてアセチル官能基の８０％超を保存することが可能であった。
【０２５９】
Ｐｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／ＤＭＳＯグリココンジュゲート安定性の評価
上記のプロセスによって調製した代表的なＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートのアリコートを、ポリプロピレンチューブ内に分注し、これらを４℃または２５℃のいずれかで貯蔵し、遊離糖について安定性を３か月間モニターした。表１０に示す通り、４℃で貯蔵した試料は、３か月で４．８％の遊離糖増大を示した。しかしながら、２５℃で貯蔵した試料は、３か月での％遊離糖において１５．４％の増大を示した。ＲＡＣコンジュゲート中の％遊離糖の増大は、特に２５℃では、コンジュゲートの分解（ｄｅｇａｒａｄａｔｉｏｎ）に起因する。
【０２６０】
【表１０】
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【０２６１】
ＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートの別のロットの安定性も、４℃、２５℃および３７℃で研究した。アリコートをポリプロピレンチューブ内に分注し、％遊離糖における潜在的傾向についてモニターした。表１１に示す通り、４℃で貯蔵した試料は、２か月での％遊離糖において４．７％の増大を示した。遊離糖における増大は、２５℃および３７℃で有意に高くなり、コンジュゲートの潜在的な分解を指示していた。
【０２６２】
【表１１】
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【０２６３】
ＲＡＣ／ＤＭＳＯプロセスによって作り出されたコンジュゲートがＯ−アセチル基を保存したとしても、特に２５℃以上で観察される％遊離糖の増大は、この経路を使用する潜在的な不安定さを指示するものであった。このＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートの潜在的な不安定さの観察を考慮すると、ＲＡＣ／ＤＭＳＯは血清型３３Ｆコンジュゲーションに最適であるとは見られず、より安定なコンジュゲート（ｅＴＥＣコンジュゲート）を作り出すために代替的な化学経路が開発された。
【０２６４】
（実施例８）
追加のＰｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
追加のＰｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣコンジュゲートは、実施例２において記述されているプロセスを使用して作り出した。Ｐｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣグリココンジュゲートのこれらの追加のバッチについての反応パラメーターおよび特徴付けデータを、表１２に示す。
【０２６５】
【表１２】
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【０２６６】
上記および表１２に示す通り、数種のＰｎ３３Ｆコンジュゲートは、上記のｅＴＥＣコンジュゲーションを使用して取得した。ｅＴＥＣ化学は、高い収率、低い％遊離糖および高いコンジュゲーション度を持つコンジュゲート（コンジュゲートしているリジン）の調製を可能にした。加えて、ｅＴＥＣコンジュゲーションプロセスを使用して、アセチル官能基の８０％超を保存することが可能であった。
【０２６７】
（実施例９）
Ｐｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣグリココンジュゲート安定性の評価：％遊離糖傾向
コンジュゲートバッチ３３Ｆ−２Ｂ（表２を参照）のアリコートをポリプロピレンチューブ内に分注し、４℃、２５℃および３７℃でそれぞれ貯蔵し、％遊離糖における傾向についてモニターした。データ（％遊離糖）を表１３に示す。この表に示す通り、％遊離糖における有意な変化はなかった。
【０２６８】
【表１３】
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【０２６９】
別のコンジュゲートロット（バッチ３３Ｆ−３Ｃ）の安定性加速を、３７℃で最大１か月行った。表１４に示す通り、３７℃で最大１か月、％遊離糖への有意な変化はなかった。
【０２７０】
【表１４】
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【０２７１】
ｅＴＥＣコンジュゲートの安定性をさらに確認するために、４℃で貯蔵した追加のコンジュゲートバッチ（３３Ｆ−３Ｃおよび３３Ｆ−５Ｅ（表２および表１２を参照））を、％遊離糖における潜在的傾向について最大およそ１年間モニターした。表１５に示す通り、最大およそ１年間の長期間にわたって、４℃で貯蔵したコンジュゲートについて％遊離糖レベルにおける有意な変化はなかった。
【０２７２】
【表１５】
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【０２７３】
ＲＡＣ／水性およびＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートとは対照的に、３３Ｆ  ｅＴＥＣ化学によって作り出された血清型３３Ｆコンジュゲートは、種々の温度における遊離糖傾向（リアルタイムおよび加速）によってモニターした際に、顕著な分解なしに有意により安定であることが実証された。
【０２７４】
本明細書において言及されているすべての刊行物および特許出願は、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを指示している。すべての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が、具体的にかつ個々に参照により組み込まれることが指示されているのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７５】
前述の発明につて、理解の明確さを目的とした説明および例として多少詳しく記述してきたが、ある特定の変更および修正を添付の請求項の範囲内で実践してよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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