(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴリンパ球表面に発現する抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体蛋白質をコードする核酸であって、前記抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体蛋白質は、ＧＰＣ３のＣ末端エピトープを特異的認識する一本鎖抗体ｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）を含む細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとがこの順で連結してなるものを含み、前記キメラ抗原受容体蛋白質は、配列番号２２〜２５のうちの一つの配列を有することを特徴とする、核酸。
【請求項２】
配列番号１８〜２１のうちの一つの配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４】
前記ベクターはレンチウイルスプラスミドｐＷＰＴ−ｅＧＦＰであって、且つ配列番号２７〜３０のうちの一つの核酸配列を有することを特徴とする、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３または４に記載のベクターを含むウイルス。
【請求項６】
請求項１または２に記載の核酸、または請求項３または４に記載のベクター、または請求項５に記載のウイルスが形質導入されたことを特徴とする、遺伝子修飾Ｔリンパ球。
【請求項７】
配列番号１８〜２１のうちの一つの核酸でコードされて発現するキメラ抗原受容体をその表面に発現していることを特徴とする、遺伝子改変Ｔリンパ球。
【請求項８】
アミノ酸配列が配列番号２２〜２５から選ばれるものを有するキメラ抗原受容体をその表面に発現していることを特徴とする、遺伝子改変Ｔリンパ球。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍の細胞治療分野に関し、より具体的には、ＧＰＣ３を特異的に発現する上皮由来腫瘍の遺伝子改変Ｔリンパ球治療分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリピカン−３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３、ＧＰＣ３；ＤＧＳＸ、ＧＴＲ２−２、ＭＸＲ７、ＯＣＩ−５、ＳＤＹＳ、ＳＧＢ、ＳＧＢＳまたはＳＧＢＳ１ともいう）は細胞表面蛋白質であり、ヘパラン硫酸プロテオグリカンファミリーに属する。ＧＰＣ３遺伝子は７０−ｋＤａ程度の前駆体コア蛋白質をコードして生成させ、当該前駆体蛋白質はフーリン（ｆｕｒｉｎ）にスプライシングされることで、４０−ｋＤａ程度の可溶性の血液に進入可能なアミノ基末端（Ｎ末端）ペプチドと、２つのヘパラン硫酸（ＨＳ）糖鎖を含有する３０−ｋＤａ程度の膜結合性カルボキシ基末端（Ｃ末端）ペプチドとを生成する。ＧＰＣ３蛋白質はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーにより細胞膜に付着する。
【０００３】
ＧＰＣ３は、胎児の肝臓に高度に発現するが、正常成人の肝組織に発現しないものの、肝細胞肝癌においてその発現が回復し、肝癌の発生・進展と密切に関連し、肝癌発生の初期に検出率が高いだけでなく、肝癌の進展に従い、その検出率も相応的に高くなる。一方、ＧＰＣ３の発現は、肝臓腺癌、胆管細胞癌、肝転移癌および１２種の一般的な固形腫瘍ならびに２１種の非肝癌細胞系のいずれかでも検出されない。さらに、ＧＰＣ３は、例えば黒色腫、卵巣明細胞癌、卵黄嚢腫瘍、神経芽細胞腫等の腫瘍に発現する。ＧＰＣ３は、肝細胞肝癌、黒色腫等の腫瘍における特異的な高発現を考慮して、腫瘍の免疫療法の標的候補の一つとして見做される。
【０００４】
抗ＧＰＣ３抗体による肝癌検出および抗ＧＰＣ３抗体による抗体依存性（ＡＤＣＣ）または補体依存性（ＣＤＣ）細胞傷害の研究方案は既に報告された。一般的には、治療に用いられる抗体はＧＰＣ３蛋白質のＣ末端を認識する。しかしながら、抗体療法には、抗体の生体内血液循環で半減期があるという制限があり、一般的には、半減期がほとんど２３日間以内である。したがって、腫瘍の抗体療法のために、連続投与及び／又は投与量の増加が必要となり、それにより、患者の治療コストが高騰し、ある場合には治療を終了せざるを得ない。また、治療用抗体は異種蛋白質として、生体内でアレルギー反応および当該治療用抗体に対する中和抗−抗体が発生するリスクがある。
【０００５】
Ｔリンパ球の腫瘍免疫応答における作用は重視されつつある。Ｔリンパ球による養子免疫療法は一部の腫瘍においてある程度の効果が得られ、且つ当該免疫療法は抗体療法の上記欠陥を解消できるものの、大部分の腫瘍に対する治療効果はまだ満足できない[Grupp SAら, Adoptive cellular therapy. Curr Top Microbiol Immunol.,.2011;344:149-72.]。近年、ＣＴＬの標的細胞に対する認識特異性がＴリンパ球受容体（T Cell Receptor, ＴＣＲ）に依存するという発見に基づき、人々は腫瘍細胞関連抗原に対する抗体のｓｃＦｖをＴリンパ球受容体のＣＤ３ζやＦｃεＲＩγ等の細胞内シグナル活性化モチーフと融合させてキメラ抗原受容体（Chimeric antigen receptor, ＣＡＲ）とし、且つそれをレンチウイルス感染等の手段によりＴリンパ球表面に遺伝子修飾する。このようなＣＡＲ  Ｔリンパ球は、主要組織適合性複合体（Major Histocompatibility Complex, ＭＨＣ）非拘束性の形態でTリンパ球を選択的に腫瘍細胞にターゲッティングし、且つ腫瘍を特異的に殺傷することができる。ＣＡＲ  Ｔリンパ球は、腫瘍の免疫療法分野における新規な免疫療法策である[Schmitz Mら. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of Cancer. J Biomed Biotechnol, 2010, doi:10.1155/2010/956304.]。
【０００６】
キメラ抗原受容体は、細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含む。通常、細胞外ドメインは腫瘍関連抗原を認識できるｓｃＦｖを含み、膜貫通ドメインとしては、ＣＤ８、ＣＤ２８等の分子の膜貫通ドメインが用いられ、細胞内シグナルドメインとしては、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγ、および共刺激シグナル分子ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４等の細胞内シグナルドメインが用いられる。
【０００７】
細胞内シグナルドメインがＩＴＡＭのみを含むものは第１世代のＣＡＲ  Ｔリンパ球であり、それにおけるキメラ抗原受容体の各部分は、ｓｃＦｖ−ＴＭ−ＩＴＡＭの形態で連結している。このようなＣＡＲ  Ｔは、抗腫瘍の細胞傷害効果を引き起こすことができるが、サイトカインの分泌が少なく、且つ生体内で長続きの抗腫瘍効果を引き起こすことができない[Zhang T.ら, Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways, Can Res 2007, 67(22):11029-11036.]。
【０００８】
その後開発した第２世代のＣＡＲ  Ｔリンパ球には、ＣＤ２８またはＣＤ１３７（４−１ＢＢともいう）の細胞内シグナルドメインが加えられ、それにおけるキメラ抗原受容体の各部分は、ｓｃＦｖ−ＴＭ−ＣＤ２８  −ＩＴＡＭまたはｓｃＦｖ−ＴＭ−／ＣＤ１３７−ＩＴＡＭの形態で連結している。細胞内シグナルドメインによるＢ７／ＣＤ２８または４−１ＢＢＬ／ＣＤ１３７共刺激作用は、Ｔリンパ球の連続増殖を引き起こし、且つＴリンパ球からのＩＬ−２やＩＦＮ−γ等のサイトカインの分泌レベルを向上させるとともに、ＣＡＲ  Ｔの生体内での生存周期と抗腫瘍効果を向上させることができる[Dotti G.ら, CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest,2011,121(5):1822-1826.]。
【０００９】
近年で開発した第３世代のＣＡＲ  Ｔリンパ球において、キメラ抗原受容体の各部分はｓｃＦｖ−ＴＭ−ＣＤ２８−ＣＤ１３７−ＩＴＡＭまたはｓｃＦｖ−ＴＭ−ＣＤ２８−ＣＤ１３４−ＩＴＡＭの形態で連結しており、ＣＡＲ  Ｔの生体内における生存周期とその抗腫瘍効果はさらに向上した[Carpenito C.ら, Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains. PNAS, 2009, 106(9): 3360-3365.]。
【００１０】
ＣＡＲ  Ｔリンパ球は腫瘍の免疫療法において将来性があるが、潜在のリスクも考慮する必要がある。一例を挙げると、ある正常組織がＣＡＲに認識される特異的抗原を低発現することにより、ＣＡＲ  Ｔリンパ球は相応の抗原を発現する正常組織を損傷する恐れがある。例えば、腎細胞癌患者の腫瘍細胞に発現する抗原である炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）は、臨床に用いられるＣＡＲ  Ｔリンパ球養子療法の最初のケースであり、ＣＡＲ含有細胞のオフターゲット効果を報告した最初のケースでもある。患者にＣＡＲ  Ｔリンパ球を複数回導入すると、２〜４級肝毒性が示された。その原因は、肝胆管上皮細胞にＣＡＩＸが低発現するからであり、元の臨床試験は中止せざるを得ないとともに、患者に対する治療効果の評価も一切取り消された[Stoter G.ら, Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX: first clinical experience. J clin oncol, 2006, 24（13）: e20-e22.; Ngo MC.ら, Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer. Human Molecular Genetics, 2011, R1-R7]。また、ＣＡＲにおける過剰の共刺激シグナルがエフェクター細胞の活性化に必要な閾値を低下させることにより、遺伝子修飾Ｔリンパ球は低レベルの抗原または抗原による惹起のない条件下でも活性化される恐れがあり、それで大量のサイトカインが放出され、いわゆる「サイトカインストーム」が引き起こされる可能性がある。このようなシグナル漏れ（singnal leakage）は標的細胞傷害性の喪失を引き起こすことにより、非特異的な組織損傷が生じる。例えば、Ｈｅｒ２に対する第３世代のＣＡＲを用いて肝と肺転移のある進行大腸癌患者を臨床治療する過程において、正常肺組織にＨｅｒ２が低発現するため、いわゆる「サイトカインストーム」が引き起こされ、患者はその原因で急死した[Morgan RA.ら, Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2. Molecular Therapy, 2010, 18 (4): 843-851.]。
【００１１】
したがって、本分野において、上記欠陥を解消するＧＰＣ３キメラ抗原受容体蛋白質をコードするリンパ球による腫瘍治療方案は切望されている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の第一は、Ｔリンパ球表面に発現するＧＰＣ３キメラ抗原受容体蛋白質をコードする核酸に関し、それが発現するキメラ抗原受容体蛋白質により、当該受容体を発現するＴリンパ球は、ＧＰＣ３高発現腫瘍細胞に対して高度に特異的な細胞傷害作用を有する。前記ＧＰＣ３キメラ抗原受容体蛋白質は、ＧＰＣ３のＣ末端エピトープを特異的認識する一本鎖抗体ｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）を含む細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとがこの順で連結してなるものを含む。前記キメラ抗原受容体蛋白質の細胞外結合ドメインはＣＤ８ヒンジドメインを介してＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインと連結し、膜貫通ドメインの次は細胞内シグナルドメインである。
【００１３】
本発明にかかる核酸配列は、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡ形態はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成したＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であってもよい。ＤＮＡはコード鎖または非コード鎖であってもよい。本発明にかかるキメラ抗原受容体蛋白質のアミノ酸配列をコードする核酸コドンは補同義コドンであってもよく、つまり、同一のアミノ酸配列をコードする複数種の補同義核酸配列はいずれも本発明の範囲内に含まれる。相応のアミノ酸をコードする補同義核酸コドンは本分野で公知である。さらに、本発明は、本発明と同様なアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはポリペプチドの断片、類似物および誘導体をコードする前記ポリヌクレオチドの変異体に関する。当該ポリヌクレオチドの変異体は、天然発生の対立遺伝子変異体または非天然発生変異体であってもよい。それらのヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体を含む。本分野で知られるように、対立遺伝子変異体とは、一つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入であってもよいが、それでコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させないポリヌクレオチドの代替形態である。
【００１４】
さらに、本発明は、前記配列とハイブリダイズし、且つ二つの配列の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％または少なくとも９５％の相同性があるポリヌクレオチドに関する。特に、本発明はストリンジェントな条件下で本発明にかかるポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、（１）低いイオン強度と高い温度下におけるハイブリダイゼーションと溶離、例えば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃；或いは（２）ハイブリダイゼーションのときに変性剤が添加されること、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％仔牛血清／０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ、４２℃等；或いは（３）二本の配列の間の相同性が少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上である場合のみにハイブリダイゼーションを行うことを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドでコードされるポリペプチドは、配列番号２２〜２５のうちの一つで示される成熟ポリペプチドと同様な生物学的機能と活性を有する。
【００１５】
ヒトＧＰＣ３のＣ末端エピトープを特異的認識するモノクロナール抗体は例えば中国特許文献ＣＮ１０１１８６６５０Ａ中外製薬株式会社）で開示されており、また、文献Advances in Liver Cancer Antibody Therapies: A Focus on Glypican-3 and Mesothelin,BioDrugs. 2011 October 1; 25(5): 275-284により、Ｃ末端エピトープを特異的認識する他の既知のモノクロナール抗体であって、ＧＰＣ３に対するそれらの抗原決定基がＣ末端５２４〜５６３位のアミノ酸残基に位置するＧＣ３３とｈＧＣ３３もそれぞれ報告されており、それらとともに、ＧＰＣ３−Ｃ０２や１Ｇ１２等のモノクロナール抗体も開示された。それらの開示されたモノクロナール抗体は、本発明にかかる核酸でコードされるキメラ抗原受容体蛋白質における一本鎖抗体部分の調製に用いることができる。ＧＰＣ３のＣ末端エピトープを認識する他のモノクロナール抗体も適切な形態で本発明に適用することができる。
【００１６】
一本鎖抗体ｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）は、前記開示されたＧＰＣ３モノクロナール抗体の配列に基づいて遺伝子工学方法または化学合成方法で調製することができる。本発明に使用される用語の「一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）断片」とは、リンカー（linker）を介して連結する重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む組換え蛋白質であって、それらの二つのドメインがリンカーで連結することにより、最終に抗原結合部位を形成する抗体断片を指す。通常、ｓｃＦｖのサイズは完全抗体の１／６である。一本鎖抗体は、一本のヌクレオチド鎖でコードされる一本のアミノ酸鎖配列であることが好ましい。本発明に使用される一本鎖抗体は、例えばアミノ酸の欠失、挿入、置換、付加及び／又は組換えのような本分野で既知の常用技術、及び／又は他の修飾方法を単独でまたは組み合わせて用いて、さらに修飾することができる。一つの抗体のアミノ酸配列に基づき、そのＤＮＡ配列にこのような修飾を導入する方法は、当業者にとって公知のもので、例えばSambrook、分子クローニング： 実験マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.を参照する。前述の修飾は核酸レベルで行うことが好ましい。さらに、前記一本鎖抗体はその誘導体を含んでもよい。本発明において、「抗体の誘導体」は、例えばファージディスプレイ技術で前記抗体の誘導体を得る場合、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステムに使用される表面プラズモン共鳴技術で、ＧＰＣ３抗原エピトープと結合するファージ抗体の効率を向上させることができる（Schier，ヒト抗体ハイブリドーマ7（1996），97-105；Malmborg,免疫学方法雑誌183(1995)，7-13）。さらに、例えばＷＯ  ８９／０９６２２に記載されたキメラ抗体の生成方法、ＥＰ−Ａ１０２３９４００およびＷＯ９０／０７８６１に記載されたヒト化抗体の生成方法、ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２およびＷＯ９６／３３７３５に記載されたマウスにおけるヒト抗体のような異種抗体の生成方法によって生成する抗体の誘導体を含む。
【００１７】
本発明における用語の「特異的認識」とは、本発明にかかる二重特異性抗体が目的抗原以外の任意のポリペプチドと交差反応しない或いはほとんど交差反応しないことを意味する。その特異性の度合いは、免疫ブロット、免疫アフィニティークロマトグラフィー、フローサイトメトリー等を含む免疫学的技術により判断できるが、それらに限定されるものではない。本発明において、特異的認識はフローサイトメトリーにより確定することが好ましく、具体的な場合には、特異的認識の基準は当業者がよく知られる本分野の常識により判断できる。
【００１８】
キメラ抗原受容体の膜貫通ドメインは、ＣＤ８やＣＤ２８等の蛋白質の膜貫通ドメインから選ばれるものであってもよい。ＣＤ８やＣＤ２８はＴリンパ球の表面の天然マーカーである。ヒトＣＤ８蛋白質はαとβまたはγとδの二本の鎖からなるヘテロ二量体である。本発明の一つの実施形態において、膜貫通ドメインはＣＤ８αまたはＣＤ２８の膜貫通ドメインから選ばれるものである。また、ＣＤ８αヒンジドメイン（hinge）は柔軟な領域であるため、ＣＤ８またはＣＤ２８は膜貫通ドメインおよびヒンジドメインとともに、キメラ抗原受容体ＣＡＲの標的認識ドメインｓｃＦｖと細胞内シグナルドメインとの連結に用いられる。
【００１９】
細胞内シグナルドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４蛋白質の細胞内シグナルドメインおよびそれらの組み合わせから選ばれるものであってもよい。ＣＤ３分子は五つのサブユニットからなり、そのうち、ＣＤ３ζサブユニット（ＣＤ３  ｚｅｔａともいう；単にＺと記す）は３つのＩＴＡＭモチーフを含有し、当該モチーフはＴＣＲ−ＣＤ３複合体における重要なシグナル伝達ドメインである。ＣＤ３δＺ（以下、単にＤＺと記す）はＩＴＡＭモチーフを持たないように短く切断されたＣＤ３ζ配列であり、本発明の実施においては通常陰性コントロールの構築に用いられる。ＦｃεＲＩγは主に肥満細胞および好塩基球の表面に分布し、一つのＩＴＡＭモチーフを含有し、構造、分布および機能上でＣＤ３ζと類似する。また、前記のように、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４は共刺激シグナル分子であり、それぞれのリガンドと結合すると、その細胞内シグナル領域による共刺激作用は、Ｔリンパ球の連続増殖を引き起こし、且つＴリンパ球からのＩＬ−２やＩＦＮ−γ等のサイトカインの分泌レベルを向上させるとともに、ＣＡＲ  Ｔリンパ球の生体内での生存周期と抗腫瘍効果を向上させることができる。
【００２０】
本発明にかかる核酸でコードされるＧＰＣ３キメラ抗原受容体蛋白質は、
ｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）−ＣＤ８−ＣＤ３ζ、
ｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）−ＣＤ８−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ、
ｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）−ＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ３ζ、
ｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）−ＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ、
の順で連結してなるキメラ抗原受容体蛋白質、およびそれらの組み合わせから選ばれるものであってもよく、ただし、関連するキメラ抗原受容体蛋白質におけるＣＤ２８ａはＣＤ２８分子の膜貫通ドメインを示し、ＣＤ２８ｂはＣＤ２８分子の細胞内シグナルドメインを示す。前記各種のＧＰＣ３標的キメラ抗原受容体はｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）−ＣＡＲと総称する。
【００２１】
本発明の一つの実施形態において、本発明にかかる核酸は配列番号１８〜２１に記載の配列を有する。本発明のもう一つの実施形態において、本発明にかかる核酸は配列番号２２〜２５のうちの一つの配列を有するキメラ抗原受容体蛋白質をコードする核酸である。
【００２２】
本発明の第二は、前記Ｔリンパ球表面に発現するキメラ抗原受容体蛋白質をコードする核酸を含むベクターを含む。一つの具体的な実施形態において、本発明に使用されるベクターはレンチウイルスプラスミドベクターｐＷＰＴ−ｅＧＦＰである。当該プラスミドは第３世代の自己不活性型レンチウイルスベクターシステムに属し、当該システムは、蛋白質Ｇａｇ／Ｐｏｌをコードし、Ｒｅｖ蛋白質をコードするパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２と、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質をコードするエンベローププラスミドＰＭＤ２．Ｇと、空ベクターｐＰＷＴ−ｅＧＦＰとの合計で三つのプラスミドを含み、目的核酸配列、即ちＣＡＲをコードする核酸配列の組換え・導入に用いることができる。空ベクターｐＰＷＴ−ｅＧＦＰ（それ自身は次の試験におけるｍｏｃｋである）において、伸長因子−１α（elongation factor−１α、ＥＦ−１α）プロモーターにより強化型緑色蛍光蛋白質（enhanced green fluorescent protein、ｅＧＦＰ）の発現を調節・制御する。ＣＡＲをコードする目的核酸配列を含む組み換え発現ベクターｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲは、口蹄疫ウイルス（foot-and-mouth disease virus、ＦＭＤＶ）由来のリボソーム跳躍配列（ribosomal skipping sequence 2A）（単にＦ２Ａと記す）によりｅＧＦＰとＣＡＲの共発現を実現する。一つの具体的な実施形態において、本発明にかかるベクターは配列番号２７〜３０のうちの一つのような核酸配列を有する。
【００２３】
本発明の第三は、前記ベクターを含むウイルスを含む。本発明にかかるウイルスは、感染力を持つパッケージング済みのウイルスも含むが、感染力を持つウイルスのパッケージングに必要な成分を含有する未パッケージングのウイルスも含む。本分野で既知のＴリンパ球を形質導入する他のウイルスおよびそれと対応するプラスミドベクターも本発明に用いることができる。
【００２４】
本発明の一つの実施形態において、前記ウイルスは前記ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲ組換えベクターを含む（即ちｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）−ＣＡＲを含有する）レンチウイルスである。
【００２５】
本発明の第四は、本発明にかかる核酸、または本発明にかかる前記核酸を含む前記組換えプラスミド、または前記プラスミドを含むウイルスが形質導入された遺伝子改変Ｔリンパ球を含む。非ウイルスおよびウイルスによる形質導入方法を含む本分野で常用の核酸形質導入方法はいずれも本発明に適用することができる。非ウイルスによる形質導入方法は、エレクトロポレーション法とトランスポゾン法を含む。Ａｍａｘａ社が最近開発したnucleofector核内トランスフェクターによれば、外来遺伝子を直接に細胞核に導入し、目的遺伝子の効率的な形質導入を実現することができる。また、眠れる森の美女トランスポゾンシステム（Sleeping Beauty system）またはPiggyBacトランスポゾン等のトランスポゾンシステムによる形質導入効率は、通常のエレクトロポレーションより大きく向上しており、nucleofectorトランスフェクターと眠れる森の美女トランスポゾンシステムの併用は既に報告されており[Davies JK.ら, Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010, 70(10): OF1-10.]、当該方法は高い形質導入効率を有するだけでなく、目的遺伝子の部位特異的組込みも実現できる。本発明の一つの実施形態において、キメラ抗原受容体遺伝子修飾Ｔリンパ球を実現する形質導入方法は、レトロウイルスやレンチウイルスのようなウイルスに基づく形質導入方法である。当該方法には、形質導入効率が高く、外来遺伝子が安定に発現でき、且つ体外培養Ｔリンパ球が臨床適用可能な数に至る時間を短縮できる等の利点がある。当該遺伝子改変Ｔリンパ球の表面では、形質導入された核酸は転写、翻訳によりその表面に発現している。各種の異なる培養腫瘍細胞に対してインビトロ細胞傷害性試験を行うことで、本発明にかかるキメラ抗原受容体が表面に発現している遺伝子改変Ｔリンパ球は、高度に特異的な腫瘍細胞殺傷効果（細胞傷害性ともいう）を有することが証明された。よって、本発明にかかるキメラ抗原受容体蛋白質をコードする核酸と、当該核酸を含むプラスミドと、当該プラスミドを含むウイルスと、および前記核酸、プラスミドまたはウイルスが形質導入された遺伝子改変Ｔリンパ球は、腫瘍の免疫療法に効率的に用いることができる。
【００２６】
一つの実施形態において、本発明にかかるＴリンパ球は、配列番号１８〜２１のうちの一つの核酸でコードされて発現するキメラ抗原受容体がその表面に発現している。もう一つの実施形態において、本発明にかかる遺伝子改変Ｔリンパ球は、アミノ酸配列が配列番号２２〜２５から選ばれる一つであるキメラ抗原受容体がその表面に発現している。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は例示としての本発明にかかるＣＡＲをコードする配列を含むレンチウイルスベクターｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲの構造の概念図を示す。
【００２８】
【図２】図２は例示としてのレンチウイルスベクターに含まれる本発明にかかるＣＡＲの異なるドメインの間の連結関係の概念図を示し、ただし、ｅＧＦＰおよびｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）特異的キメラ抗原受容体はリボソーム跳躍配列Ｆ２Ａを介して連結している。
【００２９】
【図３】図３はＭｌｕＩとＳａｌＩ二重酵素切断によって実施例１のレンチウイルスプラスミドを同定する核酸電気泳動パターンを示す。ただし、Ｍ１はDS2000分子量マーカーであり（広州東盛生物科技株式会社）；Ｍ２はＨｉｎｄ  ＩＩＩマーカーである（広州東盛生物科技株式会社）。レーン１〜５はそれぞれ  １：  ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＧＰＣ３−δＺ；  ２：  ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＧＰＣ３−Ｚ；  ３：  ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＧＰＣ３−ＢＢＺ；  ４：  ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＧＰＣ３−２８Ｚ；  ５：  ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ；  である。
【００３０】
【図４】図４は本発明の実施例２において、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）がウイルスに感染された後、細胞が発現するｅＧＦＰのフローサイトメトリーによる検出結果を示す。
【００３１】
【図５】図５は本発明の実施例２における異なるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ＋）を発現するＣＴＬ細胞のインビトロでの生長状況を示す。図中、ウイルスに感染されてから１４日目、異なるキメラ抗原受容体を発現するＣＴＬ細胞はインビトロで２００倍増幅したことが示される。
【００３２】
【図６】図６Ａはフローサイトメーターによる各肝細胞肝癌細胞系におけるＧＰＣ３の発現レベルの検出を示し、細胞におけるＧＰＣ３の発現は平均蛍光強度（Mean Fluorescence Intensity、ＭＦＩ）で表わす；図６Ｂは前記各細胞系におけるＧＰＣ３の発現レベルのウエスタンブロット結果を示し、ただし、ＧＡＰＤＨは内在性ローディングコントロールである。
【００３３】
【図７】図７ＡはＧＰＣ３標的ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いてＨｕｈ−７異種移植片を治療した後、各群における無腫瘍マウスの経時的な百分率を示す；図７Ｂは群ごとに６匹のマウスを致死させた後、それぞれの体内における腫瘍の体積のサイズを示す。
【００３４】
【図８】図８Ａは実施例５の各群のマウスにおける残留腫瘍の体積の比較結果を示す；図８Ｂは実施例５の各群のマウスにおける残留腫瘍の重量の比較結果を示す；図８ＣはＴリンパ球を養子移入してから１週間後で測定した実施例５の各群のマウスの末梢血におけるＴ細胞生存数を示す；図８Ｄは実施例５の各群のマウスを致死させた後で示された腫瘍の状況を示す；図８Ｅは実施例５におけるＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球による治療後のマウスの腫瘍消滅状況（Ｍｏｃｋ群と比較する）を示す。
【００３５】
【図９】図９は実施例５において養子移入されたＴ細胞が各群のマウスの異種移植片組織で集まることの免疫組織化学染色の結果を示す。
【００３６】
【図１０】図１０Ａは実施例６の各群のマウスの異種移植片体積を示す。図１０Ｂは、試験が終了した後、実施例６の各群のマウスから腫瘍組織を取り出して秤量した結果を示す。図１０Ｃは実施例６の各群のマウスの腫瘍組織を示す；図１０Ｄは、Ｔ細胞の最後の養子移入から１週間後、実施例６の各群のマウスの末梢血におけるＴ細胞数を測定した結果を示す。
【００３７】
【図１１】図１１Ａと１１Ｂはそれぞれ、実施例７の各群のマウスの腫瘍の生物的蛍光強度と腫瘍の実際のイメージング画像を示す。図１１ＣとＤはそれぞれ、実施例７の各群のマウスの腹部の担腫瘍状況（インビトロ）と見られる腫瘍を解剖した状況を示す。図１１Ｅは、Ｔ細胞の最後の養子移入から１週間後、各群のマウスの末梢血におけるＴ細胞数を測定した結果を示す。図１１Ｆは、Ｔ細胞の最後の養子移入から１週間後、各群のマウスの末梢血におけるＣＡＲ陽性Ｔ細胞数を測定した結果を示す。図１１Ｇは実施例７の各群のマウスの腫瘍接種後の経時的な生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いるもので、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例において、具体的な条件が明記されていない実験方法は、通常の条件、例えばSambrookら、「分子クローニング： 実験マニュアル、（New York：Cold Spring Harbor laboratory Press，1989）」に記載の条件に従うが、実施例において試薬メーカーの取扱説明書があると明記されている場合、取扱説明書に薦められる条件に従って行う。
【実施例１】
【００３９】
実施例１．本発明にかかる核酸でコードされるキメラ抗原受容体蛋白質を発現するレンチウイルスプラスミドの構築およびウイルスのパッケージング
下表１では、本発明で例示されるキメラ抗原受容体の各部分の連結順番が説明され、それらの連結は図２にも示される。
【表１】
0006426713.tif 000002
【００４０】
１．核酸断片の増幅
（１）  ｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）配列の増幅
ｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）配列の増幅は、本ラボラトリーで構築された一本鎖二重特異性抗体ヌクレオチドＧＰＣ３／ＣＤ３を鋳型とし、鋳型の配列は中国特許出願２０１２１０４８０３２６．ｘにおける配列番号９を参照する。増幅に用いられるプライマー対はフォワードプライマー５’−ｇａｔｇｔｔｇｔｇａｔｇａｃｔｃａｇｔｃｔｃ−３’（配列番号１）とリバースプライマー５’−ｇｃｇｃｔｇｇｃｇｔｃｇｔｇｇｔｔｇａｇｇａｇａｃｇｇｔｇａｃｃａｇ−３’（配列番号２）であり、ｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）の増幅に用いられた；目的増幅バンドのサイズはいずれも７４６ｂｐであった。ＰＣＲ増幅条件は、初期変性：９４℃、４ｍｉｎ；変性：９４℃、４０ｓ；アニーリング：５８℃、４０ｓ；伸長：６８℃、４０ｓ；２５サイクルを行い、そして最終伸長：６８℃、１０ｍｉｎであった。セファロース電気泳動により、ＰＣＲ増幅バンドは想定の断片サイズに一致することが確認した。
【００４１】
（２）  キメラ抗原受容体の他の部分の核酸配列
ＧＰＣ３キメラ抗原受容体蛋白質のｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）以外の他の部分の核酸配列はそれぞれ、中国特許出願番号２０１３１０１０８５３２．２で開示された配列番号１〜４の配列を鋳型として、ＰＣＲ手段により得られた。具体的には、以下の各種のＧＰＣ３キメラ抗原受容体蛋白質のｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）以外のＣＡＲ部分のうち、ＣＤ８−ＣＤ３ζ（Ｚ）およびＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ（２８ＢＢＺ）はそれぞれｓｃＦｖ（ＥＦＧＲ）−ＣＤ８−ＣＤ３ζ（中国特許出願２０１３１０１０８５３２．２における配列番号１）とｓｃＦｖ（ＥＦＧＲ）−ＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ（中国特許出願２０１３１０１０８５３２．２における配列番号２）を鋳型として、フォワードプライマー５’−ａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇｃｃｇｃｇａｃｃａｃ−３’（配列番号３）とリバースプライマー５’−ｇａｇｇｔｃｇａｃｃｔａｇｃｇａｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃａｔｇｔｇａａｇ−３’（配列番号４）を用いて増幅し、ＰＣＲ増幅条件は、初期変性：９４℃、４ｍｉｎ；変性：９４℃、４０ｓ；アニーリング：６０℃、４０ｓ；伸長：６８℃、４０ｓ；２５サイクルを行い、そして最終伸長：６８℃、１０ｍｉｎであった。目的バンドはそれぞれ５４９ｂｐと８１６ｂｐであり、セファロース電気泳動により、ＰＣＲ増幅バンドは想定の断片サイズに一致することが確認した。
【００４２】
また、ＣＤ８−ＣＤ３  ｄｅｌｔａζ（ｄｅｌｔａ  Ｚ、単にδＺと記す）、ＣＤ８−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ（ＢＢＺ）およびＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ３ζ（２８Ｚ）はそれぞれ以下の手段により得られた。
【００４３】
Ａ）  １×１０７健常人末梢血単核球（上海市血液センターから提供する）に１ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えて細胞を溶解し、フェノール・クロロホルム法により全ＲＮＡを抽出し、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩTM逆転写キット（ｐｒｏｍａｇａ社）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。以上で調製したｃＤＮＡを鋳型として、それぞれ
（ｉ）  フォワードプライマー５’−ｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇ−３’（配列番号５）とリバースプライマー５’−ｇｇｔｇａｔａａｃｃａｇｔｇａｃａｇｇａｇ−３’（配列番号６）を用いて増幅し、ＣＤ８αヒンジドメイン−膜貫通ドメインを得、ＰＣＲ増幅条件は、初期変性：９４℃、４ｍｉｎ；変性：９４℃、３０ｓ；アニーリング：５８℃、３０ｓ；伸長：６８℃、３０ｓ；２５サイクルを行い、そして最終伸長：６８℃、１０ｍｉｎであった。バンドの理論的なサイズは１９８ｂｐであり、セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
（ｉｉ）  フォワードプライマー５’−ｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇ−３’（配列番号５）とリバースプライマー５’−ｇａｇｇｔｃｇａｃｃｔａｃｇｃｇｇｇｇｇｃｇｔｃｔｇｃｇｃｔｃｃｔｇｃｔｇａａｃｔｔｃａｃｔｃｔｇｇｔｇａｔａａｃｃａｇｔｇ−３’（配列番号７）を用いて増幅し、ＣＤ８αヒンジドメイン−膜貫通ドメイン−ｄｅｌｔａ  Ｚ（即ちＣＤ８−ＣＤ３  ｄｅｌｔａζ）を得、ＰＣＲ増幅条件は上記と同様であった。バンドの理論的なサイズは２６１ｂｐであり、セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
（ｉｉｉ）  フォワードプライマー５’−ｔｔｔｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｔｇｇ−３’（配列番号８）とリバースプライマー５’−ｇｃｔｇａａｃｔｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｃｇａｔａｇｇｃｔｇｃｇａａｇ−３’（配列番号９）を用いて増幅し、ＣＤ２８膜貫通ドメイン−細胞内シグナルドメイン断片を得、ＰＣＲ増幅条件は上記と同様であった。バンドの理論的なサイズは２１９ｂｐであり、セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
（ｉｉｉｉ）  フォワードプライマー５’−ａａａｃｇｇｇｇｃａｇａａａｇａａａｃｔｃ−３’（配列番号１０）とリバースプライマー５’−ｃａｇｔｔｃａｃａｔｃｃｔｃｃｔｔｃ−３’（配列番号１１）を用いて増幅し、ＣＤ１３７細胞内ドメインを得、ＰＣＲ増幅条件は上記と同様であった。バンドの理論的なサイズは１２６ｂｐであり、セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
（ｉｉｉｉｉ）  フォワードプライマー５’−ｃａｃｔｇｇｔｔａｔｃａｃｃａｇａｇｔｇａａｇｔｔｃａｇｃａｇｇａｇｃ−３’（配列番号１２）とリバースプライマー５’−ｇａｇｇｔｃｇａｃｃｔａｇｃｇａｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃａｔｇ−３’（配列番号１３）を用いて増幅し、ＣＤ３  ｚｅｔａシグナルドメインを得、ＰＣＲ増幅条件は上記と同様であった。バンドの理論的なサイズは３３９ｂｐであり、セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
【００４４】
Ｂ）  核酸断片のライゲーション
（ｉ）  フォワードプライマー５’−ａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇｃｃｇ−３’（配列番号１４）とリバースプライマー５’−ｃａｃｃｃａｇａａａａｔａａｔａａａｇ−３’（配列番号１５）を用いてライゲーションし、ＣＤ８αヒンジドメイン−ＣＤ２８膜貫通ドメインを得、ライゲーション条件は：ＣＤ８αヒンジドメイン（５０ｎｇ）＋ＣＤ２８膜貫通ドメイン（５０ｎｇ）初期変性：９４℃、４ｍｉｎ；変性：９４℃、３０ｓ；アニーリング：６０℃、３０ｓ；伸長：６８℃、３０ｓ、５サイクルを行い、そして最終伸長：６８℃、１０ｍｉｎであり、ＤＮＡポリメラーゼおよびフォワード／リバースプライマーを補充した後、２５サイクルのＰＣＲ増幅を行い、増幅条件は、初期変性：９４℃、４ｍｉｎ；変性：９４℃、３０ｓ；アニーリング：６０℃、３０ｓ；伸長：６８℃、３０ｓ、２５サイクルを行い、そして最終伸長：６８℃、１０ｍｉｎであった。理論的なサイズは２１６ｂｐである。セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
（ｉｉ）  フォワードプライマー５’−ａａａｃｇｇｇｇｃａｇａａａｇａａａｃｔｃ−３’（配列番号１０）とリバースプライマー５’−ｇａｇｇｔｃｇａｃｃｔａｇｃｇａｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃａｔｇ−３’（配列番号１３）を用いてライゲーションして増幅し、ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ、即ちＢＢＺを得、ライゲーションおよびＰＣＲ増幅条件は上記と同様であった。バンドの理論的なサイズは４７８ｂｐであり、セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
（ｉｉｉ）  フォワードプライマー５’−ｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇ−３’（配列番号５）とリバースプライマー５’−ｇａｇｇｔｃｇａｃｃｔａｇｃｇａｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃａｔｇ−３’（配列番号１３）を用いてＣＤ８αヒンジドメイン−膜貫通ドメインをＢＢＺとライゲーションし、且つＰＣＲを行い、目的断片としてのＣＤ８αヒンジドメイン−膜貫通ドメイン−ＢＢＺ細胞内ドメイン、即ちＣＤ８−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζを得、ライゲーションおよびＰＣＲ増幅条件は上記と同様であった。理論的なサイズは６９１ｂｐである。セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
（ｉｉｉｉ）  フォワードプライマー５’−ｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇ−３’（配列番号５）とリバースプライマー５’−ｇａｇｇｔｃｇａｃｃｔａｇｃｇａｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃａｔｇ−３’（配列番号１３）を用いてＣＤ８αヒンジドメイン−ＣＤ２８膜貫通ドメイン−細胞内ドメインとＺを上記と同様にライゲーションし、且つＰＣＲ増幅を行い、目的断片としてのＣＤ８αヒンジドメイン−ＣＤ２８膜貫通ドメイン−２８Ｚ細胞内ドメイン、即ちＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ３ζを得、ライゲーションおよびＰＣＲ増幅条件は上記と同様であった。バンドの理論的なサイズは７０６ｂｐであり、セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
【００４５】
（３）  ３’末端にＦ２ＡおよびＣＤ８αシグナルペプチドを有するｅＧＦＰ核酸断片の獲得
フォワードプライマー５’−ｃｔｔａｃｇｃｇｔｃｃｔａｇｃｇｃｔａｃｃｇｇｔｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇ−３’（配列番号１６）とリバースプライマー５’−ｃｇｇｃｃｔｇｇｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｃａｇ−３’（配列番号１７）を用いてレンチウイルスベクターにおける３’末端にＦ２ＡおよびＣＤ８αシグナルペプチドを有するｅＧＦＰ核酸断片を増幅し、中国特許出願２０１３１０１０８５３２．２で開示されたｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−８０６−Ｚを鋳型として、ＰＣＲ増幅条件は、初期変性：９４℃、４ｍｉｎ；変性：９４℃、４０ｓ；アニーリング：５６℃、４０ｓ；伸長：６８℃、５０ｓ、２５サイクルを行い、そして最終伸長：６８℃、１０ｍｉｎであり、理論的なサイズは８８３ｂｐであり、セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
【００４６】
２．核酸断片のライゲーション
前記段落「（２）  キメラ抗原受容体の他の部分の核酸配列」で増幅して得られた断片ＣＤ８−ＣＤ３ζ、ＣＤ８−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ、ＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ３ζ、ＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζと、等モル量の前記段落「（３）  キメラ抗原受容体の他の部分の核酸配列」で増幅して得られた３’末端にＦ２ＡおよびＣＤ８αシグナルペプチドを有するｅＧＦＰ核酸断片（質量は約５０ｎｇである）と、等モル量のｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）（質量は約５０ｎｇである）との三つの断片をそれぞれ、図２に示すパターンでライゲーションし、且つＰＣＲを行い、ライゲーション条件は：初期変性：９４℃、４ｍｉｎ；変性：９４℃、４０ｓ；アニーリング：６０℃、４０ｓ；伸長：６８℃、１４０ｓ、５サイクルを行い、そして最終伸長：６８℃、１０ｍｉｎであり、ＤＮＡポリメラーゼおよびフォワードプライマー５’−ｃｔｔａｃｇｃｇｔｃｃｔａｇｃｇｃｔａｃｃｇｇｔｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇ−３’（配列番号１６）とリバースプライマー５’−ｇａｇｇｔｃｇａｃｃｔａｇｃｇａｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃａｔｇ−３’（配列番号１３）を補充した後、２５サイクルのＰＣＲ増幅を行い、増幅条件は、初期変性：９４℃、４ｍｉｎ；変性：９４℃、４０ｓ；アニーリング：６０℃、４０ｓ；伸長：６８℃、１４０ｓ、２５サイクルを行い、そして最終伸長：６８℃、１０ｍｉｎであった。増幅して得られたｅＧＦＰ−ＧＰＣ３−Ｚ、ｅＧＦＰ−ＧＰＣ３−ＢＢＺ、ｅＧＦＰ−ＧＰＣ３−２８ＺおよびｅＧＦＰ−ＧＰＣ３−２８ＢＢＺの理論的なサイズはそれぞれ２１６１ｂｐ、２２７８ｂｐ、２３０２ｂｐおよび２４２８ｂｐである。セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
【００４７】
上記と同様な試験条件下で、フォワードプライマー５’−ｇａｔｇｔｔｇｔｇａｔｇａｃｔｃａｇｔｃｔｃ−３’（配列番号１）とリバースプライマー５’−ｇａｇｇｔｃｇａｃｃｔａｇｃｇａｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃａｔｇ−３’（配列番号１３）を用いて、３’末端にＦ２ＡおよびＣＤ８αシグナルペプチドを有するｅＧＦＰ核酸断片（質量は約５０ｎｇである）を添加しないまま、ＧＰＣ３キメラ抗原受容体蛋白質をコードする核酸ＧＰＣ３−Ｚ（配列番号１８）、ＧＰＣ３−ＢＢＺ（配列番号１９）、ＧＰＣ３−２８Ｚ（配列番号２０）およびＧＰＣ３−２８ＢＢＺ（配列番号２１）配列を得ることができ、前記各核酸配列はそれぞれ、ＧＰＣ３−Ｚ（配列番号２２）、ＧＰＣ３−ＢＢＺ（配列番号２３）、ＧＰＣ３−２８Ｚ（配列番号２４）およびＧＰＣ３−２８ＢＢＺ（配列番号２５）のアミノ酸配列を有するＧＰＣ３キメラ抗原受容体蛋白質をコードする。
【００４８】
また、前記段落「（２）  キメラ抗原受容体の他の部分の核酸配列」で増幅して得られた断片であるＣＤ８−ＣＤ３ｄｅｌｔａζ断片と、等モル量の前記段落「（３）  キメラ抗原受容体の他の部分の核酸配列」で増幅して得られた断片と、等モル量のｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）とをそれぞれ、フォワードプライマー５’−ｃｔｔａｃｇｃｇｔｃｃｔａｇｃｇｃｔａｃｃｇｇｔｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇ−３’（配列番号１６）とリバースプライマー５’−ｇａｇｇｔｃｇａｃｃｔａｃｇｃｇｇｇｇｇｃｇｔｃｔｇｃｇｃｔｃｃｔｇｃｔｇａａｃｔｔｃａｃｔｃｔｇｇｔｇａｔａａｃｃａｇｔｇ−３’（配列番号７）を用いて、上記と同様な条件でライゲーションし、且つＰＣＲを行い、ｅＧＦＰ−ＧＰＣ３−δＺ（配列番号３１）を増幅して得た。理論的なサイズは１８５８ｂｐであり、セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
【００４９】
２−１．無関連コントロール２Ｄ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターの構築（即ちｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−２Ｄ３−２８ＢＢＺ）
Ａ．抗ＥＧＦＲの新規異性体ＥＧＦＲｖＡの細胞内ドメインポリペプチド（ＷＴＥ）の２Ｄ３一本鎖抗体核酸断片の獲得
抗ＷＴＥポリペプチドのハイブリドーマ２Ｄ３細胞株（上海鋭勁生物科技株式会社で調製する）ｍＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて逆転写し、ファーストストランドｃＤＮＡを合成した。ファーストストランドｃＤＮＡを鋳型として、Ｈｅａｖｙ  Ｐｒｉｍｅｒｓ、Ｌｉｇｈｔ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  Ｍｉｘをプライマー（プライマーは上海鋭勁生物科技株式会社から購入する）として、ＶＨ、ＶＬ遺伝子をそれぞれ増幅し、ＰＣＲ条件は：９４℃で４ｍｉｎ初期変性し、９４℃で４０ｓ変性し、５５℃で４０ｓアニーリングし、６８℃で４０ｓ伸長し、３０サイクルを行った後、６８℃で７ｍｉｎ伸長した。セファロース電気泳動によりＰＣＲ産物を検出し、ゲル抽出キットでＶＨ、ＶＬ断片をそれぞれ回収した。
【００５０】
さらにＶＨ、ＶＬ断片を互いに鋳型として、Ｌｉｎｋｅｒ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘをプライマー（プライマーは上海鋭勁生物科技株式会社から購入する）として、オーバーラップＰＣＲ法によりＶＨとＶＬ断片をライゲーションしてｓｃＦｖとなり、ＰＣＲ条件は：９４℃で１ｍｉｎ変性し、６３℃で４ｍｉｎアニーリング・伸長し、合計で７サイクルを行った。７サイクルの後、５０μｌの反応系にＬｉｎｋｅｒ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ、ポリメラーゼバッファーおよび再蒸留水を追加し、ＰＣＲを続いた。ＰＣＲ条件は：９４℃で４ｍｉｎ初期変性し、９４℃で４０ｓ変性し、５８℃で４０ｓアニーリングし、６８℃で１ｍｉｎ伸長し、３０サイクルを行った後、６８℃で７ｍｉｎ伸長した。セファロース電気泳動によりＰＣＲ産物を検出し、ゲル抽出キットでｓｃＦｖ断片を回収した。
【００５１】
Ｂ．抗ＷＴＥポリペプチド２Ｄ３一本鎖抗体の発現および活性測定
Ｓｆｉ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉで前記工程におけるｓｃＦｖ断片とｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から購入する）を二重酵素切断し、ゲル抽出によって酵素断片を回収し、１６℃で一晩ライゲーションした後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ２１５１に形質転換し、翌日、形質転換プレートから２０個の単一クローンを引き出して３０℃で培養し、ＯＤ６００が０．４〜０．６になるまで培養した時点で、最終濃度０．０５ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧを加えて発現を一晩（１８ｈ）誘導した。遠心して上清を取り、培養上清における可溶性ｓｃＦｖの発現状況をＥＬＩＳＡで解析した。具体的には、抗原ＷＴＥ−ＢＳＡ（上海鋭勁生物科技株式会社で調製する）によってそれぞれ５０ｎｇ／ウェル（１ｎｇ／μｌ、５０μｌ／ウェル）で９６ウェルプレートを覆い、３７℃で２ｈインキュベートし、５％ＰＢＳ脱脂粉乳（光明乳業株式会社）によって３７℃で２ｈブロッキングし、０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、前記で誘導発現した培養上清を一つのウェルにつき５０μｌで９６ウェルプレートに入れ、３７℃で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、ＨＲＰ標識ａｎｔｉ−Ｅ  ｔａｇ抗体（上海鋭勁生物科技株式会社から購入する）を１：１０００で希釈し、５０μｌ／ウェルで３７℃で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、１：１０００で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社から購入する）を加え、３７℃で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄し、ＡＢＴＳ発色液を１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で遮光下で１０ｍｉｎ発色させた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｄｅｌ  ６８０マイクロプレートリーダーを用いて、波長４０５ｎｍで吸光度値を測定し、陰性コントロールウェルの吸光度値より２倍以上高いものを陽性とした。ＯＤ値が最も高いクローン２Ｄ３−３を取って塩基配列を決定した後、本出願に適用される無関連コントロールＣＡＲに用いられる一本鎖抗体２Ｄ３としてのプラスミドｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ  ２Ｄ３−３  ｓｃＦｖを抽出し、且つそれと、前記段落「（２）  キメラ抗原受容体の他の部分の核酸配列」で増幅して得られた断片ＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζと、等モル量の前記段落「（３）  キメラ抗原受容体の他の部分の核酸配列」で増幅して得られた３’末端にＦ２ＡおよびＣＤ８αシグナルペプチドを有するｅＧＦＰ核酸断片（質量は約５０ｎｇである）との三つの断片をそれぞれ、図２に示すパターンでライゲーションし、且つＰＣＲを行い、ライゲーション条件は：初期変性：９４℃、４ｍｉｎ；変性：９４℃、４０ｓ；アニーリング：６０℃、４０ｓ；伸長：６８℃、１４０ｓ、５サイクルを行い、そして最終伸長：６８℃、１０ｍｉｎであり、ＤＮＡポリメラーゼおよびフォワードプライマー５’−ｃｔｔａｃｇｃｇｔｃｃｔａｇｃｇｃｔａｃｃｇｇｔｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇ−３’（配列番号１６）とリバースプライマー５’−ｇａｇｇｔｃｇａｃｃｔａｇｃｇａｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃａｔｇ−３’（配列番号１３）を補充した後、２５サイクルのＰＣＲ増幅を行い、増幅条��は、初期変性：９４℃、４ｍｉｎ；変性：９４℃、４０ｓ；アニーリング：６０℃、４０ｓ；伸長：６８℃、１４０ｓ、２５サイクルを行い、そして最終伸長：６８℃、１０ｍｉｎであった。増幅して得られたｅＧＦＰ−２Ｄ３−２８ＢＢＺの理論的なサイズは２４４３ｂｐである。セファロース電気泳動により、増幅産物は理論的なサイズに一致することが確認した。
【００５２】
３．レンチウイルスプラスミドベクターの構築
例示としての本発明にかかるレンチウイルスプラスミドベクターの構築に用いられるベクター系は、第３世代の自己不活性型レンチウイルスベクターシステムに属し、当該システムは、蛋白質Ｇａｇ／Ｐｏｌをコードし、Ｒｅｖ蛋白質をコードするパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２と、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質をコードするエンベローププラスミドＰＭＤ２．Ｇと、空ベクターｐＰＷＴ−ｅＧＦＰに基づき、目的遺伝子ＣＡＲをコードする組換え発現ベクターとの合計で三つのプラスミドを含む。
【００５３】
空ベクターｐＰＷＴ−ｅＧＦＰにおいて、伸長因子−１α（elongation factor−１α、ＥＦ−１α）プロモーターにより強化型緑色蛍光蛋白質（enhanced green fluorescent protein、ｅＧＦＰ）の発現を調節・制御するが、目的遺伝子ＣＡＲをコードする組換え発現ベクターにおいて、口蹄疫ウイルス由来のリボソーム跳躍配列（foot and mouth disease virus、ＦＭＤＶ、ribosomal skipping sequence、Ｆ２Ａ）によりｅＧＦＰと目的遺伝子ＣＡＲの共発現を実現する。Ｆ２Ａは口蹄疫ウイルスの２Ａ（「自己切断ポリペプチド２Ａ」ともいう）から由来のコア配列であり、２Ａの「自己切断」機能を有し、上流と下流の遺伝子の共発現を実現できる。２Ａは、スプライシングの効率が高く、上流・下流遺伝子の発現のバランスが良く、およびそれ自身の配列が短いという利点により、遺伝子治療用のマルチシストロン性ベクターの構築に有効で実行可能な策略を提供した。特に、キメラ抗原受容体遺伝子修飾Ｔリンパ球による免疫療法において、当該配列を用いて目的遺伝子とＧＦＰまたはｅＧＦＰの共発現を実現することが一般的であり、ＧＦＰまたはｅＧＦＰを検出することで、ＣＡＲの発現を間接に検出できる。
【００５４】
本実施例では、Ｆ２Ａを介して連結するｅＧＦＰと特異性ＣＡＲを共発現するレンチウイルス発現ベクターが構築され、ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲと総称する。前記工程２で得られた目的遺伝子ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲをＭｌｕＩとＳａｌＩ制限酵素で二重酵素切断し、同様に二重酵素切断されたｐＷＰＴベクターにライゲーションすることで、各キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターを構築した。構築されたベクターは、ＭｌｕＩとＳａｌＩ酵素切断により同定され（図３）且つ塩基配列が正確に決定されると、レンチウイルスのパッケージングに適用できる。前記のように、ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲは一本のｍＲＮＡに転写されるが、最終にｅＧＦＰと抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体という二本のペプチド鎖に翻訳され、そのうち、抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体はＣＤ８αシグナルペプチドの導きによって細胞膜に局在化する。陰性コントロールとしてのｅＧＦＰ−ＧＰＣ３−δＺは、レンチウイルスプラスミドベクターに挿入すると、細胞膜表面に短く切断されたδＺを含有するＧＰＣ３キメラ抗原受容体（ＧＰＣ３−δＺ）を発現し、そのアミノ酸配列は配列番号３２である。
【００５５】
得られた各目的ＣＡＲを含有するベクターの全核酸配列は、ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＧＰＣ３−δＺ（配列番号２６）；ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＧＰＣ３−Ｚ（配列番号２７）；ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＧＰＣ３−ＢＢＺ（配列番号２８）；ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＧＰＣ３−２８Ｚ（配列番号２９）；ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ（配列番号３０）である。
【００５６】
４．プラスミドで２９３Ｔをトランスフェクトし、レンチウイルスをパッケージングする
６〜１０代目まで培養した２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１１２６８）を１０ｃｍ培養ディッシュに６×１０６の密度で接種し、３７℃、５％  ＣＯ２で一晩培養し、トランスフェクションに用いた。培地は１０％牛胎児血清（ＰＡＡ社）含有ＤＭＥＭ（ＰＡＡ社）であり、翌日、トランスフェクションの約２時間前に、培地を無血清ＤＭＥＭに変更した。
【００５７】
トランスフェクションのステップは以下の通りであった。
４．１  ２０μｇの空プラスミドｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ（ｍｏｃｋコントロール）または２０μｇの各目的遺伝子プラスミドｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲをそれぞれ、１５μｇのパッケージングプラスミドＰＡＸ２および６μｇのエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇとともに５００μＬ  ＭｉｌｌＱ水中に溶解させ、均一に混合し、
４．２  ６２μＬ  ２．５Ｍ  ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ社）を滴下し、１２００ｒｐｍ／ｍｉｎで均一に渦流混合し、
４．３  最後に５００μＬ  ２×ＨｅＢＳ（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ、１２ｍＭグルコース、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ社）、ｐＨ７．０５、０．２２μＭ濾過除菌）を滴下し、１２００ｒｐｍ／ｍｉｎで１０ｓ均一に渦流混合し、
４．４  直ちに培養ディッシュに滴下し、軽く振とうして均一にし、３７℃、５％  ＣＯ２で４〜６ｈ培養した後、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭに変更した。
【００５８】
トランスフェクションの次の日にトランスフェクション効率（即ち緑色蛍光を示した細胞の割合）を調査し、〜８０％の陽性トランスフェクション効率の場合はトランスフェクション実験成功とした。トランスフェクションから４８ｈまたは７２ｈ後、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてウイルスを濾過して収集し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  Ｌ−１００ＸＰ超遠心機を用いて２８０００ｒｐｍ、４℃で２時間遠心し、遠心上清を捨て、遠心で得られた沈殿を原液体積の１／１０〜１／５０のＱｕａｎｔｕｍ  ００７培地（ＰＡＡ社）で再懸濁させ、１００μＬ／チューブで分注し、−８０℃で凍結保存し、ウイルスがＴリンパ球を滴定または感染することを待った。
【００５９】
５．ｍｏｃｋまたはｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲがパッケージングされたレンチウイルスの力価を測定する
１日目、１×１０５／ｍＬの２９３Ｔ細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェル培養プレートに接種し、３７℃、５％  ＣＯ２で培養し、培地は１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭにした。２日目、５０μＬ／ウェルの培養上清を捨て、最終濃度６μｇ／ｍＬのポリブレンを含有する新鮮な前記培地を５０μＬ／ウェルで追加し、３７℃、５％  ＣＯ２で３０ｍｉｎインキュベートした。ウイルス原液を１０μＬ／ウェルで、またはウイルス濃縮液を１μＬ／ウェルで加え，５倍に希釈し、勾配を４つにし、重複ウェルを２つにし、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。感染から４８ｈ後、フローサイトメーターによりｅＧＦＰを検出し、陽性率が５〜２０％になる細胞数を好ましく選出し、力価（Ｕ／ｍＬ）＝陽性率×希釈倍数×１００×１０４で力価を算出した。リン酸カルシウムトランスフェクション法でパッケージングされた前記ｍｏｃｋ（即ち空ベクター）コントロールおよび各ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲを含むウイルスの力価はいずれも約０．５〜２×１０６Ｕ／ｍＬのレベルであり、濃縮してから測定されたウイルスの力価は約２×１０７Ｕ／ｍＬであった。
【００６０】
実施例２．組換えレンチウイルスでＣＴＬ細胞を感染する
健常人末梢血から密度勾配遠心法によりヒト末梢血単核球（上海市血液センターから提供する）を獲得し、末梢血単核球からＣＴＬ細胞磁気ビーズ（Stem Cell Technologies）ネガティブ分離方法によりＣＴＬを獲得し、分離されたＣＴＬ細胞について、フローサイトメトリーによりＣＴＬ細胞の純度を測定し、ＣＴＬ細胞の陽性率≧９５％のものを好ましく選出し、次の操作に進めた。Ｑｕａｎｔｕｍ  ００７リンパ球培地液（ＰＡＡ社）を約１×１０６／ｍＬの密度で加えて培養し、且つ細胞：磁気ビーズの比率が１：１になるように抗ＣＤ３およびＣＤ２８抗体で共に覆われた磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と、最終濃度１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２（上海華新生物高技術株式会社）とを加え、２４ｈ刺激培養した。そして、ＭＯＩ≒５で前記レンチウイルスを用いてＣＴＬ細胞を感染した。感染された細胞を一日おきに５×１０５／ｍＬの密度で継代するとともに、リンパ球培地に最終濃度１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２を追加した。
【００６１】
感染されたＣＴＬ細胞について、培養の８日目にフローサイトメトリーにより各異なるキメラ抗原受容体の発現を検出し、ｅＧＦＰがＣＡＲと共発現することから、ｅＧＦＰが検出された陽性細胞はキメラ抗原受容体を発現する陽性細胞（図４）であった。感染されないＴリンパ球を陰性コントロールとして、異なるキメラ抗原受容体を発現するウイルス感染ＣＴＬ細胞の陽性率は下表に示す。当該陽性率の結果から、レンチウイルス感染方法により、ある程度の陽性率を有するＣＡＲ＋ＣＴＬ細胞が得られることは分かった。
【表２】
0006426713.tif 000003
【００６２】
ＣＴＬ細胞は、異なるキメラ抗原受容体がパッケージングされたウイルスにそれぞれ感染された後、細胞密度５×１０５／ｍｌで一日おきに継代培養し、カウントし、且つ継代した細胞培地にＩＬ−２を（最終濃度が１００Ｕ／ｍｌになるように）追加し、培養の１４日目に約２０〜４０倍増幅した（図５を参照）ことから、異なるキメラ抗原受容体を発現するＣＴＬ細胞はインビトロである程度の数に増幅することができ、次のインビトロ傷害性試験およびインビボ試験に保障を与えることが分かった。
【００６３】
実施例３．キメラ抗原受容体を発現する細胞のインビトロ傷害性効果試験
インビトロ傷害性試験に使用される標的細胞は、下表３に示す肝細胞癌細胞系であり、エフェクター細胞は、実施例２で検証され、インビトロで１２日間培養され、ＦＡＣＳによるキメラ抗原受容体発現検出における陽性細胞であり、キメラ抗原受容体陽性（ＣＡＲ＋）ＣＴＬと記す。
【表３】
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【００６４】
フローサイトメーターおよびウエスタンブロットで肝細胞肝癌細胞系ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５およびＳＫ−ＨＥＰ−１におけるＧＰＣ３の発現レベルを検出し、フローサイトメトリーの結果は図６Ａに示し、細胞におけるＧＰＣ３の発現は平均蛍光強度（Mean Fluorescence Intensity、ＭＦＩ）で表わす。また、ウエスタンブロット方法により各細胞系におけるＧＰＣ３の発現レベルをさらに検証した結果は図６Ｂに示し、ただし、ＧＡＰＤＨは内在性ローディングコントロールである。結果から分かるように、ＧＰＣ３は４種の肝細胞肝癌細胞系ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７、Ｈｅｐ３ＢおよびＰＬＣ／ＰＲＦ／５において異なるレベルで発現しているが、ＳＫ−ＨＥＰ−１においてはＧＰＣ３の発現が検出されなかった。
【００６５】
各試験群および各コントロール群に以下の材料が含まれる。
各試験群：各標的細胞＋異なるキメラ抗原受容体を発現するＣＴＬ、
コントロール群１：標的細胞最大放出ＬＤＨ、
コントロール群２：標的細胞自発放出ＬＤＨ、
コントロール群３：エフェクター細胞自発放出ＬＤＨ。
検出方法：ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞傷害性検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて行った。当該方法は比色法に基づく検出方法であり、５１Ｃｒ放出法の代わりとして用いられる。ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）検出は乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量的に測定する。ＬＤＨは安定な細胞質酵素であり、細胞が溶解する時に放出され、その放出形態は放射性解析における５１Ｃｒの放出形態と殆ど同様である。培地上清中に放出されたＬＤＨは、３０分間カップリングする酵素反応によって検出することができ、酵素反応において、ＬＤＨは一種のテトラゾリド（ＩＮＴ）を赤色のホルマザン（formazan）に変換させることができる。生成される赤色の産物の量は溶解した細胞の数に比例する。具体的には、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞傷害性検出キットの取扱説明書を参照する。
【００６６】
エフェクター細胞対標的細胞比は場合によりそれぞれ３：１、１：１および１：３とし、標的細胞数は１００００／ウェル（５０μＬ  ２×１０５／ｍＬ）とし、異なるエフェクター細胞対標的細胞比でエフェクター細胞に対応した。各群ではいずれも重複ウェルを５つにし、５つの重複ウェルの平均値を取った。検出時点は１８時間目であった。
【００６７】
細胞傷害性の計算式は
【数１】
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である。
【００６８】
試験の結果から分かるように、
具体的には表４に示すように、本発明にかかるキメラ抗原受容体ＧＰＣ３−Ｚ  ＣＡＲ＋を発現するＣＴＬおよびＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ＋を発現するＣＴＬは、ＧＰＣ３陽性の肝細胞癌細胞系ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７、Ｈｅｐ３ＢおよびＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞のいずれにも非常に顕著な特異的な細胞傷害作用を表し、且つエフェクター細胞対標的細胞比勾配依存性、つまり、エフェクター細胞対標的細胞比が高いほど、細胞傷害作用が強いことを示すが、ＧＰＣ３陰性の肝細胞癌系ＳＫ−ＨＥＰ−１に対して特異的な細胞傷害作用を有しない。ただし、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺは、エフェクター細胞対標的細胞比が３：１である場合、ＧＰＣ３陽性肝癌細胞ＨｅｐＧ２に対する細胞傷害性が９７％と高く、ＧＰＣ３陽性肝癌細胞ＰＬＣ／ＰＲＦ／５に対する細胞傷害性が８４％と高い。
【００６９】
エフェクター細胞対標的細胞比依存性のデータにより、本発明にかかるＧＰＣ３標的キメラ抗原受容体を発現するＣＴＬの、ＧＰＣ３陽性肝癌細胞に対する特異的な細胞傷害作用はさらに明らかになる。
【００７０】
それに対して、ｍｏｃｋプラスミド（ＧＰＣ３−ＣＡＲを持っていない空プラスミドベクターｐＰＷＴ−ｅＧＦＰ）または無関連コントロールＣＡＲ  ２Ｄ３−２８ＢＢＺが形質導入されたウイルスにトランスフェクトされた空白コントロールとしてのＣＴＬは、前記５種の細胞に対する細胞傷害作用がいずれも非常に低く、ＧＰＣ３発現に対する不感受性を示す。また、短く切断された形態のＣＤ３ζを含有するＧＰＣ３−δＺが形質導入されたＣＴＬは、細胞内シグナルドメインがないので、ｍｏｃｋおよび２Ｄ３−２８ＢＢＺが形質導入されたＣＴＬ細胞と似ている傷害作用を有する。かくして、本発明にかかるＧＰＣ３標的キメラ抗原受容体（ＧＰＣ３−ＺおよびＧＰＣ３−２８ＢＢＺ）を発現するＣＴＬは、ＧＰＣ３陽性肝癌細胞に対する特異的な傷害作用を表し、且つ共刺激分子ＣＤ２８およびＣＤ１３７のシグナルドメインを発現して持っているＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、両者のシグナルドメインを持っていないＧＰＣ３−Ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞より強い傷害作用を有する。
【表４】
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【００７１】
実施例４  ＧＰＣ３標的ＣＡＲ  Ｔ細胞のＧＰＣ３高発現Ｈｕｈ−７異種移植片に対する早期治療試験
動物の群分け：１群あたり６〜７匹で、６〜８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス４０匹を無作為に６群に分け、試験群はそれぞれＧＰＣ３−Ｚ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球群、異なるエフェクター細胞対標的細胞比（１：１と１：２）のＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球群であり、コントロール群はそれぞれＧＰＣ３−δＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球群、ｍｏｃｋ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球コントロール群、および食塩水コントロール群であった。
【００７２】
接種：０日目、シクロホスファミドを２００ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射し、１日目、マウス右側腋部皮下に、Ｈｕｈ７細胞（２×１０６／匹）をそれぞれＧＰＣ３−Ｚ、Ｍｏｃｋ、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ（１：１と１：２）群のＣＡＲ  Ｔリンパ球およびＧＰＣ３−δＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球とエフェクター細胞の１：１の混合細胞とともに接種し、食塩水群はＨｕｈ７細胞（２×１０６／匹）のみを接種した。
【００７３】
試験結果に示されたように、ＧＰＣ３−ＺおよびＧＰＣ３−２８ＢＢＺを発現するＣＡＲ  Ｔリンパ球はＧＰＣ３陽性Ｈｕｈ−７細胞による腫瘍形成を特異的に抑制することができ、コントロール群のマウスにおける腫瘍が２０００ｍｍ３に生長したまで試験を終了し（異種移植片接種後２８日目）、ＧＰＣ３−Ｚ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群において、２／６のマウスには腫瘍の生長がないが、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群におけるエフェクター細胞対標的細胞比１：１と１：２群において、６匹のマウスにはいずれも腫瘍の生長がないが、Ｍｏｃｋ群、ＧＰＣ３−δＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球群および生理食塩水群のようなコントロール群は、マウスにおける腫瘍形成に影響を与えなかった（図７Ａ）。図７Ｂは１群あたり６匹のマウスを致死させた後で示されたそれぞれの生体内における腫瘍のサイズである。
【００７４】
実施例５  ＧＰＣ３標的ＣＡＲ  Ｔ細胞のＧＰＣ３高発現Ｈｕｈ−７皮下異種移植片に対する治療試験
腫瘍接種：対数増殖期にあり且つ良好に生長しているＨｕｈ−７細胞を収集し、生理食塩水で細胞密度を１×１０７／ｍｌに調整し、注射体積を２００μＬ（２×１０６／匹）にし、腫瘍接種の日を０日目とした。
【００７５】
Ｔ細胞の養子移入：マウスにおける腫瘍体積が２００〜３００ｍｍ３になった時点で、即ち腫瘍を接種してから１３日目に、シクロホスファミド（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、試験群とコントロール群はそれぞれ１４日目に８×１０６／匹で遺伝子修飾Ｔ細胞（陽性トランスフェクション効率は５０％程度である）または生理食塩水のみを尾静脈注射した。
【００７６】
群分け：１群あたり６匹で、６〜８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス３０匹を無作為に４群に分け、試験群は：ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群であり、コントロール群は：２Ｄ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球コントロール群、Ｍｏｃｋ遺伝子修飾ＣＡＲ  Ｔリンパ球コントロール群、および食塩水コントロール群であった。
【００７７】
Ｔ細胞を養子移入してから２週間後（２８日目）、コントロール群のマウスにおける腫瘍体積が２０００ｍｍ３に生長した時点で試験を終了した。ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群において、３／６匹のマウスにおける腫瘍は消滅し、マウスにおける残留腫瘍の体積（図８Ａ）と重量（図８Ｂ）は３つのコントロール群と比較すると、いずれも顕著な差異を有した（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図８Ｄはマウスを致死させた後で示された各群の腫瘍組織の状況である。図８ＥはＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球による治療後のマウスの腫瘍消滅状況（与Ｍｏｃｋ群と比較する）を示す。結果に示されたように、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球はＨｕｈ−７異種移植片の生長を顕著に抑制することができる。
【００７８】
また、Ｔリンパ球を養子移入してから１週間後でマウスの末梢血におけるＴ細胞生存数を測定したところ、図８Ｃに示すように、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療群のマウスの生体内におけるＴ細胞数は、ｍｏｃｋコントロールおよび２Ｄ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群より顕著に高かった（ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ｍｏｃｋ、Ｐ＝０．００１１；ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ２Ｄ３−２８ＢＢＺ、Ｐ＝０．００１９；２Ｄ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ｍｏｃｋ、Ｐ＝０．３５９）。図９Ｃに示された結果から分かるように、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球は生体内で良好に生存することができる。
【００７９】
試験が終了した時、各群のＨｕｈ−７異種移植片組織について組織切片を行い、且つ抗ヒトＣＤ３ｅ抗体を用いて免疫染色し、免疫組織化学染色の結果は図９に示す。結果に示されたように、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療群のマウス皮下の異種移植片部位におけるヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞は、２Ｄ３−２８ＢＢＺおよびｍｏｃｋ  Ｔ細胞が形質導入される治療群より顕著に多いが、食塩水群ではヒトＴ細胞が検出されなかったことから、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は腫瘍部位で集まり、その腫瘍細胞殺傷機能を発揮できることが示唆される。
【００８０】
前記結果から分かるように、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はＧＰＣ３高発現Ｈｕｈ−７皮下異種移植片を一部的に消滅することができる。
【００８１】
実施例６  ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＧＰＣ３低発現ＰＬＣ／ＰＲＦ／５皮下異種移植片に対する治療試験
腫瘍接種：対数増殖期にあり且つ良好に生長しているＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を収集し、生理食塩水で細胞密度を２．５×１０７／ｍＬに調整し、注射体積を２００μＬ（５×１０６／匹）にし、腫瘍接種の日を０日目とした。
【００８２】
Ｔ細胞の養子移入：マウスにおける腫瘍体積が１５０ｍｍ３になった時点で、即ち２１日目に、シクロホスファミド（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、２２日目および３０日目に、試験群とコントロール群はそれぞれ８×１０６／匹で遺伝子修飾Ｔ細胞（陽性トランスフェクション効率は５０％程度である）または生理食塩水のみを尾静脈注射した。
【００８３】
群分け：１群あたり６匹で、６〜８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス３０匹を無作為に５群に分け、試験群は：ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群であり、コントロール群は：２Ｄ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球コントロール群、Ｍｏｃｋ遺伝子修飾ＣＡＲ  Ｔリンパ球コントロール群、および食塩水コントロール群であった。
【００８４】
マウスにおける腫瘍平均体積が１５０ｍｍ３になった時点で（２１日目）、養子移入されたＴ細胞によりマウスを無作為に４群に分け、且つ２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを腹腔内注射し、２２日目および３０日目に、それぞれ８×１０６のＧＰＣ３−２８ＢＢＺ、２Ｄ３−２８ＢＢＺまたはｍｏｃｋ遺伝子修飾Ｔリンパ球（陽性率はそれぞれ５０％である）、或いは生理食塩水のみを尾静脈を介して養子移入し、治療を行った。４６日目に、コントロール群のマウスにおける腫瘍平均体積が１５００ｍｍ３に生長した時点で試験を終了した。
【００８５】
図１０Ａは腫瘍生長曲線を示し、４６日目に、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群のマウスにおける異種移植片の体積は各コントロール群より顕著に小さかった（＊Ｐ＜０．０５）。図１０Ｂは試験が終了した時に腫瘍組織を取り出して秤量した結果を示し、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群における異種移植片はコントロール群における異種移植片と比較すると、腫瘍重量もコントロール群より顕著に低かった（ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  食塩水、Ｐ＝０．０３３２；ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ｍｏｃｋ、Ｐ＝０．０２１１；ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ２Ｄ３−２８ＢＢＺ、Ｐ＝０．０２１１）。図１０Ｃは試験が終了して致死されたマウスに示された各群の腫瘍組織の状況であり、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群はＧＰＣ３低発現ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞に対して顕著な抑制作用を有することを示す。
【００８６】
マウスの生体内におけるＴ細胞の生存状況を測定するために、最後にＴ細胞を養子移入してから１週間後で、マウスの末梢血におけるＴ細胞の数を測定した。結果は図１０Ｄに示すように、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群のマウスの生体内におけるＴ細胞数はコントロール群より顕著に高いことが見出された（ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ｍｏｃｋ、Ｐ＝０．００４；ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ２Ｄ３−２８ＢＢＺ、Ｐ＝０．００９７；２Ｄ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ｍｏｃｋ、Ｐ＝０．０８０４）から、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球は生体内で良好に生存できることが示唆される。
【００８７】
前記結果の組み合わせから分かるように、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球はＧＰＣ３低発現ＰＬＣ／ＰＲＦ／５異種移植片の生長を顕著に抑制することができる。
【００８８】
実施例７  ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の肝臓部位におけるＧＰＣ３陽性Ｈｕｈ−７異種移植片に対する消滅効果試験
腫瘍接種：対数増殖期にある良好なＨｕｈ−７（Ｌｕｃ＋）を収集し、生理食塩水で細胞密度を１×１０８／ｍｌに調整し、２５μＬの細胞懸濁液を２５μＬのｍｅｔｒｉｇｅｌマトリックスゲルと（氷上で）混合し、無菌クリーンベンチ中で開腹術を行い、細胞をそれぞれ均一に混合し、４０匹の６〜８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの肝臓右葉に（２．５×１０６／匹で）接種し、腫瘍接種の日を０日目とした。
【００８９】
群分け：マウスに対する腫瘍接種の日から毎週にイメージングし、２週間後でシクロホスファミド（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、１群あたり７匹で無作為に４群に分け、試験群は：ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群であり、コントロール群は：２Ｄ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球コントロール群、Ｍｏｃｋ遺伝子修飾ＣＡＲ  Ｔリンパ球コントロール群、および食塩水コントロール群であった。
【００９０】
Ｔリンパ球の養子移入：腫瘍接種から１４日目および２１日目に、５×１０６／匹で遺伝子修飾Ｔリンパ球（陽性トランスフェクション効率は５０％程度で、注射体積は２００μＬである）または２００μＬ生理食塩水のみをマウスに尾静脈注射した。
【００９１】
遺伝子改変Ｔリンパ球を初めて移入して治療を行ってから１週目に、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群のマウスにおける腫瘍はコントロール群より顕著に小さく、且つ次の２週目と３週目にイメージングした結果、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群のマウスにおける腫瘍はコントロール群より顕著に小さく（図１１Ａおよび図１１Ｂ）、遺伝子改変Ｔリンパ球を初めて移入してから１週間後、３つのコントロール群、即ち２Ｄ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群、ｍｏｃｋ  Ｔ細胞治療群および生理食塩水群のマウスの腹部は顕著に膨らんできたが、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群のマウスの腹部は正常であり（図１１Ｃ）、マウスを解剖すると、コントロール群のマウスの肝臓部位では巨大な腫瘍が占拠しているが、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群のマウスの肝臓部位では腫瘍の生長が発見されなかったことは分かった（図１１Ｄ）。Ｔリンパ球を最後にマウスに移入してから１週間後、マウスの眼窩から採血し、移入したＴ細胞のマウスの生体内での生存状況を測定し、その結果に示されたように、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球治療群のマウスの生体内におけるリンパ球は、コントロール群ｍｏｃｋおよび２Ｄ３−２８ＢＢＺ群より多く（ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ｍｏｃｋ、Ｐ＝０．００１２；ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ２Ｄ３−２８ＢＢＺ、Ｐ＝０．０１５６；２Ｄ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ｍｏｃｋ、Ｐ＝０．３５５；図１１Ｅ）、末梢血において、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞についても、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療群が最も高かった（ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ｍｏｃｋ、Ｐ＝０．００１２；ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ２Ｄ３−２８ＢＢＺ、Ｐ＝０．００１５；２Ｄ３−２８ＢＢＺ  ｖｓ  ｍｏｃｋ、Ｐ＝０．２２；図１１Ｆ）。試験を４週間続けた後、コントロール群の動物は続々と死亡した。コントロール群のメディアン生存期間はそれぞれ、ｍｏｃｋコントロール群が３４日間で、２Ｄ３−２８ＢＢＺコントロール群が３９日間で、生理食塩水群が３３日間であった（図１１Ｇ）が、この時点で、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療群のマウスは依然として良好に生存しており、腹部は膨らんでいなかった。
【００９２】
かくして、ＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はＨｕｈ−７肝同所性異種移植片に対して顕著な治療効果を有し、且つＧＰＣ３−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はＨｕｈ−７同所性異種移植片担持マウスの生体内で良好に生存できる。
【００９３】
本特許出願で保護されるＧＰＣ３標的キメラ抗原受容体遺伝子修飾Ｔ細胞は、ＧＰＣ３陽性肝癌細胞を特異的に認識して殺傷することができるが、ＧＰＣ３陰性肝癌細胞に対する作用がなく、潜在の臨床応用の価値がある。
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【配列表】
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