(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受入番号ＤＳＭ２５６１２でドイツ微生物細胞培養コレクション（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）（ＤＳＭＺ）に寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６から成る群から選択されるラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）株。
【請求項２】
請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ株を含む抗真菌組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ株、及びラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）株を少なくとも１種類含む抗真菌組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１種類のラクトバチルス・ラムノサス株が、受入番号ＤＳＭ２４６１６のラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１２６９７、及び受入番号ＤＳＭ２４６５２のラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１４２２６から成る群から選択される、請求項３に記載の抗真菌組成物。
【請求項５】
請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ株、又は請求項２〜４のいずれか１項に記載の抗真菌組成物を含む食料、飼料又は医薬製品。
【請求項６】
前記食料製品に抗真菌特性を付与するのに効果がある量の請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ株を含む、請求項５に記載の食料製品。
【請求項７】
前記食料製品が、果物及び果物由来の製品、野菜及び野菜由来の製品、穀物及び穀物由来の製品、乳製品、獣肉、鶏肉、及び水産物、並びにそれらの混合物から成る群から選択される、請求項５又は６に記載の食料製品。
【請求項８】
前記食料製品が乳製品であり、さらに、前記乳製品が、ヨーグルト若しくはサワークリームなどの中温性又は好熱性発酵乳製品である、請求項７に記載の食料製品。
【請求項９】
食料、飼料又は医薬製品の製造方法であって、製造の過程で、請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ株又は請求項２〜４のいずれか１項に記載の抗真菌組成物を、前記食料、飼料又は医薬製品に添加する工程、及びラクトバチルス・パラカゼイ株の濃度を一定に保つか又は増加するように、製造の過程で製造パラメーターを制御する工程を含む、前記製造方法。
【請求項１０】
前記ラクトバチルス・パラカゼイ株の濃度が、前記食料、飼料又は医薬製品に対して、少なくとも１ｘ１０6ｃｆｕ／ｇ又はそれぞれ少なくとも１ｘ１０6ｃｆｕ／ｍｌ、あるいは、前記食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、少なくとも１ｘ１０5ｃｆｕ／ｃｍ2である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の製造方法であって、
（ａ）前記食料、飼料又は医薬製品の製造の過程で、請求項２〜４のいずれか１項に記載の抗真菌組成物を、少なくとも１種類のラクトバチルス・ラムノサス株及び／又はラクトバチルス・パラカゼイ株が、前記食料、飼料又は医薬製品に対して、それぞれ少なくとも１ｘ１０6ｃｆｕ／ｇ又は少なくとも１ｘ１０6ｃｆｕ／ｍｌ、又は前記食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、少なくとも１ｘ１０5ｃｆｕ／ｃｍ2の濃度となるように添加する工程、並びに
（ｂ）少なくとも１種類のラクトバチルス・ラムノサス株及び／又はラクトバチルス・パラカゼイ株の濃度が、増加するか又は一定に保たれるように、前記製造の過程で製造パラメーターを制御する工程、
を含む、前記製造方法。
【請求項１２】
前記方法が、１つ以上の発酵工程を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ストレプトコッカス（streptococcus）、ラクトコッカス（Lactococcus）及びロイコノストック（Leuconostoc）から選択される属の少なくとも１種類の株を含むスターター培養物を用いて乳基質を発酵させる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
食料、飼料又は医薬製品を製造するための、請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ株又は請求項２〜４のいずれか１項に記載の抗真菌組成物の使用。
【請求項１５】
食料製品及び飼料製品中の酵母やカビの増殖を阻害するための、請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ株又は請求項２〜４のいずれか１項に記載の抗真菌組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物防除の分野に関し、特に、受入番号ＤＳＭ２５６１２のラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）ＣＨＣＣ１４６７６株に関する。更に、本発明は、前記菌株を含有する抗真菌組成物、前記菌株と少なくとも１種類のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）株を含有する抗真菌組成物、そのような抗真菌組成物を含有する食料、飼料及び医薬製品、そのような食料、飼料及び医薬製品を製造する方法、そのような食料、飼料及び医薬製品の酵母及びカビの含有量を低減する方法、並びに前記抗真菌組成物の使用に関係する。
【背景技術】
【０００２】
何年もの間、乳酸菌は、食品の保存期限を延長するために使用されてきた。発酵中、乳酸菌は、乳酸や他の有機酸を産生し、それによって食品のｐＨを下げて、病原菌、酵母及び真菌などの望ましくない微生物の増殖が起こり難くする。
更に、一部の乳酸菌はまた、抗微生物活性を有する代謝産物も産生する。
米国特許第ＵＳ２０１１／００４５１３４号は、発酵乳製品に抗菌特性を与えるためのラクトバチルス・パラカゼイの使用に関する。
【０００３】
欧州特許出願第ＥＰ１４４２１１３号は、生物防除に向けた使用のために抗微生物活性を有するプロピオニバクテリウム・ジェンセニイ（Propionibacterium jensenii）と、ラクトバチルス・パラカゼイといったラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）の混合物に向けられている。
しかしながら、単一株として又は他の生物防除株と組み合わせて改善された抗真菌効果を有する生物防除作用物質がそれでも必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の目的は、生物防除作用物質としての高い有効性を有する新規乳酸菌株の提供である。
本発明者らは、大規模なスクリーニングと研究によって、市販の工業用生物防除培養物と比較して、特定のラクトバチルス・パラカゼイ株が酵母及びカビに対して有意に高い効果を有することを見出した。
更に、本発明者らは、特定の群の乳酸菌が、他の群の乳酸菌と組み合わせたとき、有意な相乗的抗微生物効果を発揮することを見出した。組み合わせた二群の細菌の抗微生物効果は、驚くべきことに、前記二群の細菌の個別の効果の合計を上回る。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、スターター培養物ＹＦ−Ｌ９０１単独（上段）で、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（中段）と一緒に、及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６と一緒に発酵させた１．５％の脂肪を含むヨーグルト中のカビの増殖を示す。左から右にかけて：それぞれペニシリウム・ブレビコンパクツム（Penicillium brevicompactum）（Ｍ１）、ペニシリウム・コミューン（Penicillium commune）（Ｍ６）、アスペルギルス・ベルシコロル（Ｍ７）及びペニシリウム・グラブルム（Penicillium glabrum）（Ｍ８）の標的混入株は、本文中に示す濃度で添加された。これらのヨーグルトは、７±１℃で６１日間インキュベートされた。
【図２】図２は、スターター培養物ＹＦ−Ｌ９０１単独（基準）で、あるいは、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ培養物（HoldBac YM-B）と一緒に、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｃ培養物（HoldBac YM-C）と一緒に、又はラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６（１４６７６）と共に発酵させた１．５％の脂肪を含むヨーグルトに添加されたデバリオマイセス・ハンセニイ（Debaromyces hansenii）単離物の細胞数を示す。これらのヨーグルトは、７±１℃で保存され、好適な間隔で分析された。
【図３】図３は、スターター培養物単独で（基準、最初の写真）、Ｌｂ．パラカゼイ（Lb.paracasei）ＣＨＣＣ１４６７６と一緒に（２番目の写真）、Ｌｂ．ラムノサス（Lb.rhamnosus）ＣＨＣＣ５３６６と一緒に（３番目の写真）、又はＬｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサスＣＨＣＣ５３６６の組み合わせと一緒に（４番目の写真）発酵させた乳から調製したプレート上のカビの増殖を示す。プレートの左上から時計回りに左下にかけて：それぞれペニシリウム・ナルギオベンス（Penicillium nalgiovese）、ペニシリウム・コミューン、アスペルギルス・ベルシコロル（Aspergillus versicolor）及びペニシリウム・クルストスム（Penicillium crustosum）の標的混入株が、本文中に示す濃度で添加された。これらのプレートは、７±１℃で１２日間インキュベートされた。
【図４】図４は、スターター培養物単独（基準、最初の写真）、Ｌｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６と一緒に（２番目の写真）、Ｌｂ．ラムノサスＣＨＣＣ１４２２６（３番目の写真）と一緒に、又はＬｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサスＣＨＣＣ１４２２６の組み合わせと一緒に（４番目の写真）発酵させた乳から調製したプレート上のカビの増殖を示す。プレートの左上から時計回りに左下にかけて：それぞれペニシリウム・ナルギオベンス、ペニシリウム・コミューン、アスペルギルス・ベルシコロル、及びペニシリウム・クルストスムの標的混入株が、本文中に示す濃度で添加された。それらのプレートは、７±１℃で１２日間インキュベートされた。
【図５】図５は、スターター培養物のみで発酵させた乳（左のカップ）、又はラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の存在下で発酵させた乳（右のカップ）から調製したギリシャヨーグルト上のムコール亜種（Mucor ssp.）の増殖を示す。
【図６】図６は、スターター培養物のみ（Ｒ、すなわち、基準）、スターター培養物とＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（ＹＭ−Ｂ）、スターター培養物とラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６（５３６６）、又はスターター培養物とラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６（５３６６＋１４６７６）の組み合わせで発酵させた乳から調製したギリシャヨーグルト上のカビ、リゾプス・ストロニファー（Rhizopus stolonifer）の増殖を示す。
【図７】図７は、スターター培養物のみ（上段）；スターター培養物及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（中段）；又はスターター培養物とラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１２６９７（下段）の組み合わせで発酵させた乳から作製したサワークリーム上でのペニシリウム・ブレビコンパクツム（Ｍ１）、ペニシリウム・コミューン（Ｍ６）、アスペルギルス・ベルシコロル（Ｍ７）、及びペニシリウム・グラブルム（Ｍ８）の増殖を示す。
【図８】図８は、スターター培養物のみ（基準）；スターター培養物とＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（ＹＭ−Ｂ）；又はスターター培養物、ラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１２６９７（１２６９７＋１４６７６）で発酵させた乳から作製したサワークリーム中のＤ．ハンセニイの増殖を示す。
【図９】図９は、スターター培養物のみ（基準）；スターター培養物とＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（ＹＭ−Ｂ）；又はスターター培養物、ラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６（５３６６＋１４６７６）で発酵させた乳から作製した白い塩漬けチーズ上でのサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の増殖を示す。
【図１０】図１０は、スターター培養物のみ（基準）；スターター培養物とＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（ＹＭ−Ｂ）；又はスターター培養物、ラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６（５３６６＋１４６７６）で発酵させた乳から作製した白い塩漬けチーズ上でのクリベロマイセス・マルキシアヌス（Klyveromyces maxianus）の増殖を示す。
【図１１】図１１は、スターター培養物のみ（Ｒ、すなわち、基準）；スターター培養物とＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（ＹＭ−Ｂ）；又はスターター培養物、ラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６（５３６６＋１４６７６）で発酵させた乳から作製した白い塩漬けチーズ上でのペニシリウム・コミューンの増殖を示す。
【図１２】図１２は、スターター培養物のみ（Ｒ、すなわち、基準）、スターター培養物とＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（ＹＭ−Ｂ）、スターター培養物とラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６（５３６６）、又はスターター培養物とラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６（５３６６＋１４６７６）の組み合わせで発酵させた乳から調製される１．５％の脂肪を含むヨーグルト中でのカビ、ペニシリウム・パネウム（Penicillium paneum）の増殖を示す。
【図１３】図１３は、スターター培養物のみ（最上段）、スターター培養物とＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（２段目）、スターター培養物とラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６（３段目）、又はスターター培養物とラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の組み合わせ（最下段）で発酵させた乳から調製される１．５％の脂肪を含むヨーグルト中のカビ、ペニシリウム・クルストスムの増殖を示す。標的混入株が、１００個の胞子／カップの濃度で添加され、そして、それらのヨーグルトは、７±１℃（左の列）、１２±１℃（中央の列）又は２２±１℃（右の列）で３６日間インキュベートされた。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
定義
本明細書中で使用されたとき、「乳酸菌（lactic acid bacterium）」という用語は、糖の発酵において主に生産される酸として乳酸を含む酸を生産する、グラム陽性微小好気性又は嫌気性細菌を指す。産業上最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス亜種（Lactococcus spp.）、ストレプトコッカス亜種（Streptococcus spp.）、ラクトバチルス亜種（Lactobacillus spp.）、ロイコノストック亜種（Leuconostoc spp.）、シュードロイコノストック亜種（Pseudoleuconostoc spp.）、ペディオコッカス亜種（Pediococcus spp.）、ブレビバクテリウム亜種（Brevibacterium spp.）、エンテロコッカス亜種（Enterococcus spp.）を含む目である「ラクトバチルス目（Lactobacillales）」に属する。これらは、単独で、又は他の乳酸菌と組み合わせて、食品用培養物としてしばしば使用される。
【０００７】
「食料（food）」という用語は、チーズを含むことにもなっている。「チーズ（cheese）」という用語は、以下のタイプのチーズ：カッテージ、フェタ、チェダー、パルメザン、モッツァレラ、エメンタール、ダンボ、ゴーダ、エダム、フェタタイプ、ブルーチーズ、塩漬けチーズ、カマンベール及びブリーチーズなどのハード、セミハード及びソフトチーズを含めたあらゆるチーズを包含すると理解される。当業者は、凝塊をチーズにどのように変換するか知っており、方法は、文献中に見られる、例えば、Kosikowski, F. V., and V. V. Mistry, "Cheese and Fermented Milk Foods", 1997, 3rd Ed. F. V. Kosikowski, L. L. C. Westport, CTを参照のこと。本明細書中に使用されるとき、１．７％（ｗ／ｗ）未満のＮａＣＩ濃度を有するチーズは、「低塩チーズ（low-salt cheese）」と称される。
【０００８】
ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）及びストレプトコッカス属（Streptococcus sp.）から成る属の細菌を含めた乳酸菌は、発酵乳製品若しくはチーズなどの酪農製品の生産のために発酵容器やバット内でそのままインキュベーションすることを意図した、バルクスターター繁殖（bulk starter propagation）のための冷凍若しくは凍結乾燥培養物、又はいわゆるダイレクトバットセット（Direct Vat Set）（ＤＶＳ）培養物のいずれかとして通常、酪農業界に供給される。そのような乳酸菌培養物は、一般に、「スターター培養物（starter culture）」又は「スターター（starter）」と称される。
【０００９】
本明細書中、「中温菌（mesophile）」という用語は、中程度の温度（１５℃〜４０℃）で最も繁殖する微生物を指す。産業上最も有用な中温性細菌は、ラクトコッカス亜種及びロイコノストック亜種を含む。本明細書中、「中温発酵（mesophilic fermentation）」という用語は、約２２℃〜約３５℃の間の温度での発酵を指す。「中温発酵乳製品（mesophilic fermented milk product）」という用語は、中温性スターター培養物の中温発酵により調製された発酵乳製品を指し、そのような発酵乳製品として、バターミルク、サワーミルク、カルチャードミルク、スメタナ、サワークリーム及びフレッシュチーズ、例えばクアーク、トバログ及びクリームチーズが挙げられる。
【００１０】
本明細書中、「好熱菌（thermophile）」という用語は、４３℃超の温度で最も繁殖する微生物を指す。産業上最も有用な好熱性細菌として、ストレプトコッカス亜種及びラクトバチルス亜種が挙げられる。本明細書中、「好熱発酵（thermophilic fermentation）」という用語は、約３５℃を上回る温度、例えば約３５℃〜約４５℃での発酵を指す。「好熱発酵乳製品（thermophilic fermented milk product）」という用語は、好熱性スターター培養物の好熱発酵により調製された発酵乳製品を指し、そのような発酵乳製品として、セットヨーグルト、スタードヨーグルト及び飲用ヨーグルトが挙げられる。
【００１１】
「乳（milk）」という用語は、任意の哺乳類、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー又はラクダなどを搾乳して得た乳分泌物として理解されるべきである。好ましい態様において、乳は、牛乳である。また、乳は、植物材料から作製したタンパク質／脂肪溶液、例えば豆乳も含む。
【００１２】
「乳基質（milk substrate）」という用語は、本発明の方法に係る発酵に供され得る任意の生乳／加工乳材料を指す。従って、有用な乳基質は、これだけに限定されるものではないが、タンパク質を含有する任意の乳又は乳様製品の溶液／懸濁物、例えば全乳又は低脂肪乳、スキムミルク、バターミルク、還元乳粉、練乳、粉乳、ホエイ、ホエイ透過物、ラクトース、ラクトースの結晶化からの母液、ホエイタンパク質濃縮物、又はクリームを含む。明らかに、乳基質は任意の哺乳類由来であってもよく、例えば実質的に純粋な哺乳類の乳、又は還元乳粉である。
【００１３】
発酵の前に、当該技術分野で公知の方法に従い乳基質は均質化又は殺菌されてもよい。
本明細書中、「均質化（homogenizing）」という用語は、可溶性懸濁物又は乳液を取得するための激しい混合を意味する。均質化が発酵の前に実施される場合、それは、乳脂肪が乳から分離しない程度に小さなサイズに分散するように実施されるべきである。これは、乳を高圧で小さなオリフィスを通して押し出すことにより達成され得る。
【００１４】
本明細書中、「殺菌（pasteurizing）」とは、生きた生物、例えば微生物を減少又は死滅させるために乳基質を処理することを意味する。好ましくは、殺菌は、一定時間、特定の温度で乳基質を維持することにより達成される。当該特定の温度は、通常加熱により達成される。殺菌温度及び時間は、特定の細菌、例えば有害な細菌を死滅又は不活性化するように選択され得る。急速冷却工程が続いてもよい。
【００１５】
本発明における「発酵（fermentation）」は、微生物の作用により炭水化物がアルコール又は酸に変換されることを意味する。好ましくは、本発明の方法は、ラクトースを乳酸に変換することを含む。
【００１６】
乳製品の生産に使用される発酵プロセスは周知であり、当業者は、温度、酸素量、微生物の量及び特性、並びに処理時間などの適切な処理条件をどのように選択するかを心得ている。自明であるが、発酵条件は、本発明の達成を支持するように、すなわち、固体（チーズなど）又は液状（例えば発酵乳製品）の乳製品を得るように選択される。
【００１７】
本発明の組成物は、例えば、食料、飼料、及び医薬製品上、並びにヒト及び動物で、真菌、細菌、及びその混合物から選択される望ましくない微生物を阻害できるという利点を提供する。酵母やカビなどの真菌の増殖の予防及び／又は阻害が特に構想される。そのため、好ましい実施形態において、「抗微生物性（antimicrobial）」という用語は、「抗真菌性（antifungal）」と理解されるべきである。
【００１８】
本明細書中、「望ましくない微生物（unwanted microorganism）」とは、病原性の、及び／又は食料、飼料若しくは医薬製品を劣化させる、細菌及び真菌、例えば酵母などの微生物を指す。本発明の組成物は、例えば、食料、飼料、及び医薬製品上、並びにヒト及び動物の、真菌、細菌、及びその混合物から選択される望ましくない微生物を阻害できる利点を提供する。酵母やカビなどの真菌の増殖の予防及び／又は阻害が、特に構想される。
【００１９】
酵母やカビに関して「阻害する（to inhibit）」及び「阻害すべき（to be inhibiting）」という用語は、例えば、本発明による菌株を添加した食料製品中、及び／又は食料製品表面上の酵母やカビの増殖又は数若しくは密度が、そのような菌株を添加していない食料製品中、及び／又は食料製品表面上よりも少ないことを意味する。
【００２０】
本明細書において、「突然変異株（mutant）」という用語は、遺伝子操作、放射線照射及び／又は化学処理などの手段により作製された、本発明の株に由来する株として理解されるべきである。突然変異株は、機能的に同等の突然変異、例えば親株と比較して実質的に同一、又は改善された特徴を有する（例えば、抗真菌特性）突然変異株である。そのような突然変異株は、本発明の一部である。特に、「突然変異株（mutant）」という用語は、エタンメタンスルホン酸（ＥＭＳ）又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＮＴＧ）などの化学変異原やＵＶ光などによる処理を含む通常使用される任意の突然変異形成処理に本発明の株を供することにより取得された株、又は自然発生した突然変異株を指す。突然変異株は、複数の突然変異形成処理（１つの処理は、スクリーニング／選択工程が続く突然変異形成処理として理解されるべきである）に供されたものでもよいが、好ましくは、２０以下、又は１０以下又は５以下の処理（又はスクリーニング／選択工程）が実施されるのが望ましい。好ましい突然変異株において、親株と比較して、細菌ゲノム中のヌクレオチドの５％未満、又は１％未満、又は０．１％未満が、別のヌクレオチドに変化し、又は欠失している。
【００２１】
本願の記載における「当該」、「前記」、「１つの」という用語、及びこれらの類似語（特に特許請求の範囲）は、他の言及が無い限り、又は明確に否定していない限り、単数及び複数の両方を包含すると想定される。「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含有する（including）」、及び「包含する（containing）」という用語は、他に言及が無い限り、非限定的用語（すなわち、「含むがそれに限定されない（including, but not limited to）」を意味する）として理解されるべきである。本明細書中の数値範囲の記載は、他に言及が無い限り、単に当該範囲内の各個別の数値を個別に参照する簡単な方法と見なされることが意図され、各個別の数値は、それらが個別に本明細書中に記載されているかのように本明細書中に包含される。本明細書中に記載される全ての方法は、本記載中に他の言及が無い限り、又は明確に否定されていない限り、任意の適切な順番で実施され得る。本明細書中の任意の及び全ての例実施例、又は例示的用語（「例えば（such as）」など）は、本発明をより良く明示することのみを意図しており、他の言及が無い限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいずれの用語も、本発明の実施に必須の明示されていない要素であることを示唆するものとして解釈されるべきではない。
【００２２】
本発明の実施及び態様
本発明者らは、酵母及びカビなどの広範囲の微生物に対して最も効果的な単一の株又は２つの株の組み合わせを見つけるために、２００株のラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラカゼイ及びラクトバチルス・ラムノサスの候補をスクリーニングした。
【００２３】
スクリーニングは、可能な限り中温性発酵乳製品を模倣した乳ベースの培地を用いたモデルアッセイにおいて行われ、当該培地に、スターター培養物を、生物防御株の候補と共に、又は単独で添加し、そしてそれを、中温性発酵乳製品において採用される条件下で発酵させた。標的の微生物は、中温性発酵乳製品から単離された。Danisco A/S, Denmarｋから入手可能なＨＯＬＤＢＡＣ（商標）培養物、並びに乳酸菌及びプロピオン酸細菌のいずれも含有する完全ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｃから単離した乳酸菌を、ベンチマークとして使用した。
【００２４】
モデルアッセイは、欧州特許出願第ＥＰ１１１６１６０９．０号に説明されている。
ラクトバチルス・パラカゼイ及びラクトバチルス・ラムノサスの中から１７個の候補が、２５℃で試験したとき、ベンチマークの乳酸菌と同等に、又はより顕著に、１２個の指標のカビを阻害した。
【００２５】
ラクトバチルス・パラカゼイのうちの１株であるGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２５６１２で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６をヨーグルト上で試験したとき、市販の生物防除培養物に比べて、酵母やカビの阻害において有意に良好であることを示した。
酵母やカビに対する菌株の阻害効果は、以下の実施例に記載のように、適切な保存期間中、適切な温度で発酵乳製品を保存することによって判定され得る。
【００２６】
一般に、この方法が実施されるべき適切な温度は、具体的な食料、飼料又は医薬製品が通常保存及び／又は製造される温度に依存する。製品が通常保存される温度は、５℃〜２６℃、好ましくは約８℃である。
【００２７】
温度での保存期間は、食料、飼料又は医薬製品が、普通に保存されている時間に依存する（保存可能期間）。保存期間は、通常、５〜６５日、好ましくは７〜６０日、より好ましくは７〜２８日であり、さらにより好ましくは、保存期間は、約２１日であり、そしてより好ましくは、６０日まで又はそれ以上である。
【００２８】
従って、本発明の第一の態様は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures（ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２５６１２で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６及びそれら由来の突然変異株から成る群から選択されるラクトバチルス・パラカゼイ株に関する。
【００２９】
これにより、前記の寄託された菌株とは別に、本発明はまた、この菌株由来の突然変異株、すなわち、スターター材料として寄託されたＣＨＣＣ１４６７６株を使用して得られる突然変異株をも想定する。突然変異株は、例えば遺伝子操作、放射線照射、ＵＶ照射、化学処理、及び／又はゲノムに変化を誘導する任意の方法を使用して、寄託された菌株から誘導されてもよい。本発明の突然変異は、特定の細菌又は真菌、好ましくはカビの増殖を阻害又は予防し得る。当該突然変異は、例えば、カビ、Ｐ．ブレビコンパクツム、Ｐ．コミューン、Ａ．ベルシコロル、Ｄ．ハンセニイ又はＰ．グラブラムのうちの１種類を使用する実施例１に記載のアッセイで判定したとき、親株と比較して、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％以上の抗真菌活性を有する。
【００３０】
スターター材料として寄託された菌株を使用することによって、熟練した読者が、本明細書中に記載した関連特徴及び利点を有する更なる突然変異株又は誘導体を、従来の突然変異誘発又は再分離技術によって日常的に得ることができることは、当業者にとって明白である。従って、第一の態様の「それらに由来する突然変異株（mutant strains derived thereof）」という用語は、スターター材料として寄託された株を使用することによって得られる突然変異株に関する。
【００３１】
第二の態様は、本発明の第一の態様によるラクトバチルス・パラカゼイ株の少なくとも１種類、好ましくはラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６を含有する抗真菌組成物に関する。
【００３２】
ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６を、様々なラクトバチルス・ラムノサス株と組み合わせて試験しているとき、総細胞濃度が同じときであっても、菌株のいずれか単独に比べて、これらの組み合わせが更に優れていることを思いがけなく見出した。一実施形態において、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６とラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ５３６６の組み合わせに関する。別の実施形態において、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６とラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ１４２２６の組み合わせに関する。更に別の実施形態において、本発明はラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６とラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ１２６９７の組み合わせに関する。これらの組み合わせは、Danisco, Denmark製のベンチマーク培養物、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｃよりも効果的であるように見えた。
【００３３】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures（ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２５６１２で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６又はそれら由来の突然変異株と、少なくとも１種類のラクトバチルス・ラムノサス株を含有する抗微生物組成物、より好ましくは抗真菌組成物に関する。好ましくは、前記の少なくとも１種類のラクトバチルス・ラムノサス株は、受入番号ＤＳＭ２４６１６のラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ１２６９７、受入番号ＤＳＭ２４６５２のラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ１４２２６、受入番号ＤＳＭ２３０３５のラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ５３６６、及びこれらの寄託菌株に由来する突然変異株から成る群から選択される。
【００３４】
これにより、一態様において、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６又はそれら由来の突然変異株、及びラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ１４２２６又はそれら由来の突然変異株を含有する抗微生物組成物、より好ましくは抗真菌組成物を提供する。もう一つの態様において、本発明は、少なくともラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６又はそれら由来の突然変異株、及びラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ５３６６又はそれら由来の突然変異株を含有する抗微生物組成物、より好ましくは抗真菌組成物を提供する。更にもう１つの態様において、本発明は、少なくともラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６又はそれら由来の突然変異株、及びラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ１２６９７又はそれら由来の突然変異株を含有する抗微生物組成物、より好ましくは抗真菌組成物を提供する。好ましくは、本発明の組成物中のラクトバチルス・パラカゼイ株とラクトバチルス・ラムノサス株の組み合わせは、それらの抗微生物活性及び／又は抗真菌活性に関して相乗的に作用する。
【００３５】
典型的には、前記抗真菌組成物は、凍結、乾燥、又は凍結乾燥濃縮物などの濃縮形態の細菌を含有し、典型的には、生細胞の濃度は、組成物１ｇあたり１０4〜１０12ｃｆｕ（コロニー形成単位）であり、例えば１０4ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０5ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０6ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０7ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０8ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０9ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０10ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０11ｃｆｕ／ｇ以上である。従って、本発明の組成物は、好ましくは、凍結、乾燥又は凍結乾燥の形態で、例えばダイレクトバットセット（ＤＶＳ）培養物として存在する。しかしながら、本明細書中で使用されるとき、組成物は、当該凍結、乾燥又は凍結乾燥細胞濃縮物を、水又はＰＢＳなどの液体媒体中に懸濁することにより取得される液体であってもよい。本発明の組成物が懸濁物である場合、生細胞の濃度は、組成物１ｍｌあたり１０4〜１０12ｃｆｕ（コロニー形成単位）であり、例えば１０4ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０5ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０6ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０7ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０8ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０9ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０10ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０11ｃｆｕ／ｍｌ以上である。
【００３６】
前記組成物は、更なる成分として、凍結保護剤及び／又は公知の添加物、例えば酵母抽出物、糖類及びビタミン、例えばビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｋ又はビタミンＢ類のビタミンなどの栄養素を含有し得る。本発明の組成物に追加され得る適切な凍結保護剤は、マンニトール、ソルビトール、トリポリリン酸ナトリウム、キシリトール、グリセロール、ラフィノース、マルトデキストリン、エリスリトール、スレイトール、トレハロース、グルコース及びフルクトースなどの、微生物の凍結耐性を改善する成分である。他の添加物として、炭水化物、香料、無機物、酵素（例えばレンネット、ラクターゼ及び／又はホスホリパーゼ）が挙げられる。
【００３７】
ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６及びラクトバチルス・ラムノサス株を含有する本発明の組成物において、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６とラクトバチルス・ラムノサス株の比率、例えばラクトバチルス・パラカゼイ株とラクトバチルス・ラムノサス株の濃度又は個数の比率は、好ましくは１：１００〜１００：１、好ましくは１：１０〜１０：１である。
【００３８】
本発明の抗真菌組成物は、微生物分解及び／又は酵母及びカビによるコンタミネーションを受けやすい任意の食料、飼料及び医薬製品に使用され得る。これらは、これだけに限定されるものではないが、乾燥品を含む果物及び野菜、穀物及び穀物由来の製品、乳製品、獣肉、鶏肉及び海産物が含まれる。特に好ましい態様において、前記組成物は、乳製品及び／又は獣肉及び鶏肉に使用される。好ましい態様において、本発明の組成物は、ヨーグルト、トバログ、サワークリーム、クリームチーズ、白い塩漬けチーズなどの乳製品に調製において添加物として使用される。
【００３９】
特に好ましい態様において、本発明の組成物は、酵母及びカビなどの真菌に対して使用される。これは、当該組成物が、乳業のプロセス、特に乳発酵プロセスにおいてコンタミネーションを引き起こす、真菌の増殖を阻害及び／又は防止するのに使用されることを意味する。本発明の組成物は、酵母、例えば、クリベロマイセス（例えばＫ．マルキシアヌス（K.marxianus）、Ｋ．ラクティス（K.lactis））、ピキア（Pichia）（例えばＰ．フェルメンタンス（P.fermentans））、ヤロウィア（Yarrowia）（例えばＹ．リポリティカ（Y.lipolytica））、カンジダ（Candida）（例えばＣ．サケ（C.sake））などの属の酵母；又はカビ、例えば、ペニシリウム（Penicillium）（例えばＰ．ナルギオベンス（P.nalgiovense）、Ｐ．コミューン、Ｐ．クルストスム、Ｐ．ブレビコンパクツム、Ｐ．グラブラム）、ムコール亜種、クラジオスポリウム亜種（Cladiosporium ssp.）、アスペルギルス（例えばＡ．ベルシコロル）、デバリオマイセス（例えばＤ．ハンセニイ）などの属のカビの増殖を阻害及び／又は防止するのに使用され得る。クリベロマイセス・マルキシアヌス、ヤロウィア・リポリチカ、ペニシリウム・ナルギオベンス、クラジオスポリウム亜種、ペニシリウム・コミューン、ムコール亜種、ペニシリウム・ブレビコンパクツム、アスペルギルス・ベルシコロル、ペニシリウム・クルストスム、クリベロマイセス・ラクティス、及び／又はデバリオマイセス・ハンセニイの増殖の阻害及び／又は防止に、本発明の組成物を使用するのが特に好ましい。
【００４０】
本発明の第二の態様による抗真菌組成物はまた、医薬製品、好ましくは、病原性酵母などの病原性真菌の感染を処置するための医薬製品として使用されてもよい。
第三の態様において、本発明は、本発明の第一の態様によるラクトバチルス・パラカゼイ株を含有する食料、飼料又は医薬製品、あるいは、本発明の第二の態様による抗真菌組成物に向けられる。
好ましい実施形態において、前記の食料、飼料又は医薬製品は、食料製品である。
【００４１】
より好ましい態様において、そのような食料製品は、果物及び果物由来の製品、野菜及び野菜由来の製品、穀物及び穀物由来の製品、乳製品、獣肉、鶏肉及び海産物並びにそれらの混合物からなる群から選択される。
【００４２】
より一層好ましい態様において、前記食料製品は、乳製品であり、好ましくは、中温又は好熱発酵乳製品、例えばフレッシュチーズ、ヨーグルト、サワークリーム又はトバログである。
他の好ましい態様において、前記食料製品は、獣肉又は鶏肉である。
【００４３】
好ましい実施形態において、前記の食料、飼料又は医薬製品は、医薬製品である。
好ましくは、前記医薬製品は、本発明の第二の態様の抗真菌組成物を、病原性微生物を阻害し、当該病原性微生物に関連する症状を緩和するために、ヒト又は動物に投与するのに有用な製品である。そのような症状の例として、酵母感染に関連する症状が挙げられる。そのような態様において、前記医薬製品は、抗真菌組成物を含有する単位投与剤形であってもよい。好ましくは、当該単位投与剤形は、カプセル又は錠剤であってもよい。しかしながら、当該単位投与剤形は、粘膜又は皮膚への適用に適するものでもよく、その場合、ペースト、クリーム、軟膏などの形態である。
【００４４】
本発明の第四の態様は、本発明の第三の態様による食料、飼料又は医薬製品を製造する方法に関し、当該方法は、当該食料、飼料又は医薬製品を製造する過程で、第一の態様による少なくとも１種類のラクトバチルス・パラカゼイ株、又は本発明の第二の態様による抗真菌組成物を添加する工程を含む。好ましくは、前記方法はまた、前記少なくとも１種類のラクトバチルス・パラカゼイ株の濃度を一定に維持するか又は増加するように、製造過程で、製造パラメーターを制御するステップをも含む。
【００４５】
好ましい実施形態において、少なくとも１種類のラクトバチルス・パラカゼイ株の濃度は、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、少なくとも１ｘ１０5ｃｆｕ／ｇ又はそれぞれ少なくとも１ｘ１０5ｃｆｕ／ｍｌであるか、あるいは、食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、それぞれ少なくとも１ｘ１０5ｃｆｕ／ｃｍ2である。好ましくは、少なくとも１種類のラクトバチルス・パラカゼイ株の濃度は、食料、飼料又は医薬製品に対して、少なくとも５ｘ１０5ｃｆｕ／ｇ又はそれぞれ少なくとも５ｘ１０5ｃｆｕ／ｍｌであるか、あるいは、食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、それぞれ少なくとも５ｘ１０5ｃｆｕ／ｃｍ2などであり、例えば、食料、飼料又は医薬製品に対して、少なくとも１ｘ１０7ｃｆｕ／ｇ又はそれぞれ少なくとも１ｘ１０7ｃｆｕ／ｍｌ、あるいは食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、１ｘ１０5ｃｆｕ／ｃｍ2などであり、例えば、食料、飼料又は医薬製品に対して、少なくとも５ｘ１０7ｃｆｕ／ｇ又はそれぞれ少なくとも５ｘ１０7ｃｆｕ／ｍｌ、あるいは、食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、それぞれ少なくとも５ｘ１０5ｃｆｕ／ｃｍ2などである。
【００４６】
前記食料、飼料又は医薬製品が、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６又はそれら由来の突然変異株、及び少なくとも１種類のラクトバチルス・ラムノサス株を含有する組成物を添加することにより製造される場合、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６又はそれら由来の突然変異株の濃度、及び／又は少なくとも１種類のラクトバチルス・ラムノサス株の濃度は、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、それぞれ少なくとも１ｘ１０5ｃｆｕ／ｇ又はそれぞれ少なくとも１ｘ１０5ｃｆｕ／ｍｌ、あるいは、当該食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、それぞれ少なくとも１ｘ１０5ｃｆｕ／ｃｍ2である。好ましくは、当該ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６又はそれら由来の突然変異株の濃度、及び／又は少なくとも１種類のラクトバチルス・ラムノサス株の濃度は、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、それぞれ少なくとも５ｘ１０5ｃｆｕ／ｇ又はそれぞれ少なくとも５ｘ１０5ｃｆｕ／ｍｌ、あるいは、当該食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、それぞれ少なくとも５ｘ１０5ｃｆｕ／ｃｍ2である。さらなる実施形態において、当該ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６又はそれら由来の突然変異株の濃度、及び／又は少なくとも１種類のラクトバチルス・ラムノサス株の濃度は、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、それぞれ少なくとも１ｘ１０8ｃｆｕ／ｇ又はそれぞれ少なくとも１ｘ１０8ｃｆｕ／ｍｌ、あるいは、当該食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、それぞれ少なくとも１ｘ１０7ｃｆｕ／ｃｍ2である。
【００４７】
好ましい実施形態において、前記製造パラメーターは、当該製造の過程で、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６（又はそれら由来の突然変異株）と少なくとも１種類のラクトバチルス・ラムノサス株の濃度を増加するように、又は一定に維持するように制御される。
【００４８】
本発明の抗真菌組成物は、混合可能な食料、飼料又は医薬組成物と混合され、及び／又はそれらに適用されることにより最も簡便に使用されるが、固体の食料製品の表面、又はそのような製品の内部を、注射により処理するのも有効である。更に他の態様において、前記組成物は、マリネ、パン粉、シーズニングラブ（seasoning rub）、蜜、着色料混合物などとして適用されてもよく、重要な基準は、前記抗真菌組成物が、細菌による分解並びに酵母及びカビでコンタミネーションする表面上で利用可能となっていることである。尚も他の態様において、前記組成物は、食料の容器に当該組成物を適用し、そして当該容器を食料表面に適用して、食料表面と接触させてもよい。使用される適切な量は、処理される具体的な食料製品、及び食料表面への組成物の適用に使用される方法に依存し得るが、単純な実験により決定することが出来る。
【００４９】
非常に好ましい態様において、前記方法は、１つ以上の発酵工程を含んでもよく、そして前記少なくとも１種類のラクトバチルス・パラカゼイ株又は前記抗真菌組成物は、そのような１つ以上の発酵工程の前に、間に、又は後に、前記食料、飼料又は医薬製品に添加されてもよい。
【００５０】
好ましくは、前記方法は、本発明による少なくとも１種類のラクトバチルス・パラカゼイ株の抗真菌性活性の出現に十分な期間、本発明による少なくとも１種類のラクトバチルス・パラカゼイ株の存在下での乳基質などの基質の発酵を含む。この抗真菌性活性は、少なくとも１種類の菌株を用いて発酵させた製品中の酵母及び／又はカビの発生を阻害する効果を有する。
【００５１】
より一層好ましい実施形態において、前記方法は、ラクトバチルス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス及びロイコノストックから選択される属の１種類以上の株、例えばラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）の１種類以上の株、及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）の１種類以上の株、又は例えばラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis subsp.Lactis）の１種類以上の株、ロイコノストック・メセンテロイデス亜種クレモリス（Leuconostoc mesenteroides subsp.Cremoris）の１種類以上の株、及びラクトコッカス・ラクティス亜種ジアセチラクティス（Lactococcus lactis subsp.diacetylactis）の１種類以上の株を含有するスターター培養物を用いて乳基質を発酵させることを含む。
【００５２】
本発明の第五の態様は、本発明の第四の態様による方法で入手可能な食料製品に関する。
本発明の第六の態様は、食料、飼料又は医薬製品を調製するための、第一の態様によるラクトバチルス・パラカゼイ株、あるいは、第二の態様による抗真菌組成物の使用に向けられる。好ましくは、第一の態様によるラクトバチルス・パラカゼイ株又は第二の態様による抗真菌組成物の使用によって生産される食料製品は、カッテージ、フェタ、チェダーチーズ、パルメザン、モッツァレラ、エメンタール、ダンボ、ゴーダ、エダム、フェタタイプ、ブルーチーズ、塩漬けチーズ、カマンベールチーズ又はブリーチーズなどのチーズである。
【００５３】
本発明の最後の態様は、特に食料製品及び飼料製品中の、酵母やカビの増殖を阻害するための、第一の態様によるラクトバチルス・パラカゼイ株又は第二の態様による抗真菌組成物の使用に関する。
本発明の実施形態は、制限されることのない例示を用いて、以下に説明される。
【実施例】
【００５４】
実施例１：ラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６を用いたヨーグルトでのチャレンジ試験
ラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６を用いた場合の、Ｐ．ブレビコンパクツム、Ｐ．コミューン、Ａ．ベルシコロル及びＰ．グラブラムに対する阻害作用を視覚的に試験するために、脂肪分１．５％のヨーグルトを調製した。
【００５５】
均質化した乳（脂肪分１．５％）を、ウォーターバス中の１Ｌボトル中で、９５±１℃で５分間加熱処理し、そして急速に冷却した。市販のスターター培養物（Chr.Hansen A/S, Denmarｋから入手可能なF-DVS YF-L901）を０．０２％で播種した。当該乳に、更にＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（２０ＤＣＵ／１００Ｌ）又はラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６（１ｘ１０7ＣＦＵ／ｇ）を播種した。１つのボトルは、基準としてスターター培養物のみ播種した。
【００５６】
当該乳を、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで４３±１℃で発酵させた。得られたヨーグルトをカップに注ぎ（１００ｇ）、７±１℃で保存した。
【００５７】
ヨーグルトを調製した翌日、二重反復試験のヨーグルトカップに表面混入株として様々なカビを、ヨーグルトの表面上にスポットあたり胞子１００個となるように播種した。カビの増殖を、４５日間７℃±１℃での保存後に視覚的に評価した。
【００５８】
ヨーグルト試験の結果を、図１に示す。Ｐ．ブレビコンパクツム（Ｍ１）、Ｐ．コミューン（Ｍ６）、Ａ．ベルシコロル（Ｍ７）Ｐ．グラブラム（Ｍ８）は、スターター培養物ＹＦ−Ｌ９０１のみ（上段）、又はスターター培養物及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ培養物（中段）を用いて発酵させた乳から作製されたヨーグルト上で、活発に増殖したことを示す。対照的に、乳の発酵の過程でラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６が存在していた場合、試験された全てのカビにおいて、増殖の阻害が確認された。
【００５９】
実施例２：デバリオマイセス・ハンセニイに対するラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の阻害効果の定量的判定
ラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６を用いた場合の、デバリオマイセス・ハンセニイに対する阻害効果を定量的に試験するため、ヨーグルトを調製した。
【００６０】
均質化乳（１．５％ｗ／ｗ）を１Ｌボトル中のウォーターバスで、９５℃±１℃で、５分間熱処理し、そして急冷した。市販のスターター培養物（Chr.Hansen A/S, Denmarｋから入手可能なF-DVS YF-L901）を０．０２％で播種した。当該乳に、更に、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（２０ＤＣＵ／１００Ｌ）、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｃ（１０ＤＣＵ／１００Ｌ）又はラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６（１ｘ１０7ＣＦＵ／ｍｌ）を播種した。前記スターター培養物のみ播種された１つのボトルを、基準物とした。
【００６１】
当該乳を、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで、４３℃±１℃で発酵させた。作製されたヨーグルトをカップ（１００ｇ）に注ぎ、７℃±１℃で保存した。
【００６２】
ヨーグルトを調製した翌日、二重反復試験のヨーグルトカップに、２０ＣＦＵ／ｇとなるように、カップあたり１ｍｌの酵母を播種した。当該酵母を、ヨーグルト中に均一に分散させた。当該カップに蓋をして、７℃±１℃で保存し、適切な間隔でＤ．ハンセニイ（Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ）のコンタミネーションを解析した。解析は、１ｇのヨーグルト、更にペプトン加生理食塩水の適切な１倍希釈液を、酵母グルコースクロラムフェニコール（ＹＧＣ）寒天上に平板培養し、それを２５℃で５日間好気的にインキュベーションすることにより行った。
【００６３】
図２に示すように、Ｄ．ハンセニイの増殖は、発酵前にスターター培養物ＹＦ−Ｌ９０１と共にラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６が存在していた場合、阻害された。当該株は、市販の培養物ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｃよりも顕著に高度な阻害を引き起こした。
【００６４】
実施例３：Ｌｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサスＣＨＣＣ５３６６の単独及び組み合わせでの、様々なカビ混入株に対する阻害効果の半定量的判定
Ｌｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサスＣＨＣＣ５３６６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイを使用し、これはヨーグルトの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
【００６５】
均質化乳（１．５％ｗ／ｗ）を９５℃で５分間熱処理し、そして急冷した。市販のスターター培養物（Chr.Hansen A/S, Denmarｋから入手可能なF-DVS YC-350）を０．０２％で播種し、当該播種された乳を２２０ｍｌボトルに分注した。これらのボトルにＬｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６、Ｌｂ．ラムノサスＣＨＣＣ５３６６、及びそれらの２つの組み合わせを、合計で１ｘ１０7ＣＦＵ／ｍｌの濃度で播種した。前記スターター培養物のみ播種された１つのボトルを、基準物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、ｐＨ表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが全てのボトルに５％添加された。全てのボトルを４３±１℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が４０℃に達するまで加熱し、一度溶解させて６０℃に冷却した５％滅菌寒天溶液を４０ｍｌ添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをＬＡＦベンチで３０分間乾燥させた。
【００６６】
選択されたカビのペニシリウム・ナルギオベンス（１０ｘ）、ペニシリウム・コミューン（１００ｘ）、アスペルギルス・ベルシコロル（１００ｘ）及びペニシリウム・クルストスム（１００ｘ）の完全に出芽した胞子懸濁物を、前記プレート上に滴下した。これらのプレートを７℃でインキュベートし、適切な通常のインターバル後、カビの増殖を試験した。
【００６７】
寒天アッセイの結果を、図３に示す。試験された全てのカビは、スターター培養物（基準）のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート上で、極めて良好に増殖した。しかしながら、乳発酵の過程でＬｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６又はＬｂ．ラムノサスＣＨＣＣ５３６６が存在していたプレートは、全てのカビの増殖を強力に低減した。更に、Ｌｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサスＣＨＣＣ５３６６が乳発酵の過程で組み合わせて存在していたプレート上に滴下された、特に、ペニシリウム・コミューン、アスペルギルス・ベルシコロル及びペニシリウム・クルストスムの増殖は、更に強力な阻害が認められた。
【００６８】
実施例４：Ｌｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサスＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせ使用の、様々なカビの混入株に対する阻害効果の半定量的判定
Ｌｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサスＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはヨーグルトの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
【００６９】
均質化乳（１．５％ｗ／ｗ）を９５℃で５分間熱処理し、そして急冷した。市販のスターター培養物（Chr.Hansen A/S, Denmarｋから入手可能なF-DVS YoflexR Mild）を０．０２％で播種し、当該播種された乳を２２０ｍｌボトルに分注した。これらのボトルにＬｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６、Ｌｂ．ラムノサスＣＨＣＣ１４２２６、及びそれらの２つの組み合わせを、合計で１ｘ１０7ＣＦＵ／ｍｌの濃度で播種した。前記スターター培養物のみ播種された１つのボトルを、基準物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、ｐＨ表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが全てのボトルに５％添加された。全てのボトルを４３±１℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が４０℃に達するまで加熱し、一度溶解させて６０℃に冷却した５％滅菌寒天溶液を４０ｍｌ添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをＬＡＦベンチで３０分間乾燥させた。
【００７０】
選択されたカビのペニシリウム・ナルギオベンス（１０ｘ）、ペニシリウム・コミューン（１００ｘ）、アスペルギルス・ベルシコロル（１００ｘ）及びペニシリウム・クルストスム（１００ｘ）の完全に出芽した胞子懸濁物を、前記プレート上に滴下した。これらのプレートを７℃でインキュベートし、適切な通常のインターバル後、カビの増殖を試験した。
【００７１】
寒天アッセイの結果を、図４に示す。試験された全てのカビは、スターター培養物（基準）のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート上で、極めて良好に増殖した。しかしながら、乳発酵の過程でＬｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６又はＬｂ．ラムノサスＣＨＣＣ１４２２６が存在していたプレートは、全てのカビの増殖を強力に低減した。更に、Ｌｂ．パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサスＣＨＣＣ１４２２６が乳発酵の過程で組み合わせて存在していたプレート上に滴下された、ペニシリウム・コミューン、アスペルギルス・ベルシコロル及びペニシリウム・クルストスムの増殖は、更に強力な阻害が認められた。
【００７２】
実施例５：組み合わせた状態でラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６を用いた、ギリシャヨーグルトでのチャレンジ試験
組み合わせた状態のラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の、ムコール亜種に対する阻害効果を視覚的に試験するために、ギリシャヨーグルトを以下の通り実質的に調製した。
殺菌した脂肪分１．５％の乳に、市販のスターター培養物（Chr. Hansen A/S, Denmarｋから入手可能なF-DVS YF-L901）を０．０２％で播種した。１つのバッチには、基準としてスターター培養物のみ播種した。別のバッチには、更にラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ５３６６（５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇ）及びラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６（５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇ）の組み合わせを播種した。
【００７３】
当該乳を、最終的なｐＨ４．５５まで４３℃±１℃で発酵させた（６〜７時間）。それに続いて、ヨーグルトを、２バール（ｂａｒ）の背圧をかけて２５℃±１℃に冷やし、そして、６℃±１℃で保存した。
ヨーグルトを調製した翌日、二重反復試験のヨーグルトカップの表面混入株としてムコール亜種を、ヨーグルトの表面上のスポットあたり胞子１００個／スポットの標的植菌濃度で塗布することによって播種した。カビの増殖を、視覚的に１５日間２２℃±１℃での保存後に評価した。
【００７４】
ギリシャヨーグルト試験の結果を、図５に示す。ムコール亜種は、スターター培養物のみで発酵させた乳から作製したヨーグルト（左のカップ）で活発な増殖を示した。対照的に、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６が乳発酵中に存在していた場合（右のカップ）、ムコール亜種の増殖が阻害された。
【００７５】
実施例６：ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６とラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の組み合わせを用いた、ギリシャヨーグルトでの二回チャレンジ試験
ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６とラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の組み合わせの、黒パンカビ、リゾプス・ストロニファーに対する阻害効果を視覚的に試験するために、ギリシャヨーグルトを以下の通り実質的に調製した。
【００７６】
殺菌した脂肪分１．５％の乳に、市販のスターター培養物（Chr. Hansen A/S, Denmarｋから入手可能なF-DVS YF-L901）を０．０２％で播種した。当該乳に、更にＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（１０ＤＣＵ／１００ｌ）、ラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ５３６６（１ｘ１０7ＣＦＵ／ｇ）、又はラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ５３６６（５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇ）とラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６（５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇ）の組み合わせを播種した。１つのバッチを基準として使用し、スターター培養物のみを播種した。
【００７７】
当該乳を、最終的なｐＨ４．５５まで４３℃±１℃で発酵させた（６〜７時間）。それに続いて、ヨーグルトを、２バールの背圧をかけて２５℃±１℃に冷やし、そして、６℃±１℃で保存した。
ヨーグルトを調製した翌日、二重反復試験のヨーグルトのカップの表面混入株としてリゾプス・ストロニファーを、ヨーグルトの表面上のスポットあたり胞子１００個／スポットの目標混入濃度で塗布することによって播種した。カビの増殖を、視覚的に４２日間７℃±１℃で保存後に評価した。
【００７８】
ギリシャヨーグルト試験の結果を、図６に示す。リゾプス・ストロニファーは、スターター培養物のみ（「Ｒ」、すなわち、基準）又はスターター培養物とＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ培養物（ＹＭ−Ｂ）で発酵させた乳から作製したヨーグルトで活発な増殖を示した。しかしながら、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６（５３６６）が存在していた場合、リゾプス・ストロニファーの増殖は有意に阻害された。乳発酵の過程でラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６とラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６が両方存在した場合（５３６６＋１４６７６）、リゾプス・ストロニファーの増殖は、ほぼ完全に阻害された。
【００７９】
実施例７：組み合わせた状態でラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１２６９７を用いた、サワークリームでのチャレンジ試験
ラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１２６９７の組み合わせの、異なったカビの増殖に対する阻害効果を視覚的に試験するために、サワークリームを以下の通り実質的に調製した。
【００８０】
殺菌した高脂肪乳に、市販のヘテロ発酵型スターター培養物（Chr. Hansen A/S, Denmarkから入手可能なF-DVS DSG-2000）を０．０１％で播種した。当該乳に、更にＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（１０ＤＣＵ／１００Ｌ）又はラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６（２．５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇ）及びラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１２６９７（２．５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇ）の組み合わせを播種した。１つのバッチを基準として使用し、スターター培養物のみを播種した。
【００８１】
当該乳を、４．６０±０．０５のｐＨに達するまで２８℃±１℃で発酵させ、サワークリームが後処理された。当該サワークリームを撹拌して、２０℃±１℃に冷まし、７℃±１℃で保存した。
サワークリームを調製した翌日、二重反復試験のサワークリームカップの表面混入株として異なったカビを、サワークリームの表面上のスポットあたり胞子１００個／スポットの目標混入濃度で塗布することによって播種した。カビの増殖を、視覚的に６１日間７℃±１℃での保存後に評価した。
【００８２】
サワークリーム試験の結果を、図７に示す。ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Ｍ１）、ペニシリウム・コミューン（Ｍ６）、アスペルギルス・ベルシコロル（Ｍ７）、及びペニシリウム・グラブラム（Ｍ８）は、スターター培養物のみ（上段）又はスターター培養物及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（中段）で発酵させた乳から作製したサワークリームで活発な増殖を示した。対照的に、乳発酵の過程でラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６とラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１２６９７が存在していた場合（下段）、試験されたカビの全てで増殖が阻害された。
【００８３】
実施例８：サワークリーム中のデバリオマイセス・ハンセニイに対するラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１２６９７の組み合わせの阻害効果の定量的判定
ラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６とラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１２６９７の組み合わせの、デバリオマイセス・ハンセニイに対する阻害効果を定量的に試験するために、サワークリームを以下の通り実質的に調製した。
【００８４】
殺菌した高脂肪乳に、市販のヘテロ発酵型スターター培養物（Chr. Hansen A/S, Denmarkから入手可能なF-DVS DSG-2000）を０．０１％で播種した。当該乳に、更にＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（１０ＤＣＵ／１００Ｌ）又はラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６（２．５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇ）及びラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１２６９７（２．５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇ）の組み合わせを播種した。１つのバッチを基準として使用し、スターター培養物のみを播種した。
当該乳を、４．６０±０．０５のｐＨに達するまで２８℃±１℃で発酵させ、サワークリームが後処理された。当該サワークリームを撹拌して、２０℃±１℃に冷まし、７℃±１℃で保存した。
【００８５】
サワークリームを調製した翌日、二重反復試験のサワークリームカップに、２０ＣＦＵ／ｇとなるように、カップあたり１ｍｌの酵母を播種した。当該酵母を、サワークリーム中に均一に分散させた。当該カップに蓋をして、７℃で保存し、適切な間隔でＤ．ハンセニイの混入が解析された。解析は、１ｇのサワークリーム、更にペプトン加生理食塩水中への適切な１倍希釈液を、酵母グルコースクロラムフェニコール（ＹＧＣ）寒天上に平板培養し、それを２５℃で５日間好気的にインキュベーションすることにより行った。
【００８６】
図８に示すように、Ｄ．ハンセニイの増殖は、発酵前にスターター培養物ＤＳＧ−２０００と共に播種されていた場合、ラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６及びラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ１２６９７の組み合わせの存在下で、阻害された。当該菌株は、市販の培養物ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂよりも有意に高い阻害を引き起こした。
【００８７】
実施例９：組み合わせた状態でラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６を用いた白い塩漬けチーズ上のチャレンジ試験
組み合わせた状態でラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の、サッカロミセス・セレビシエに対する阻害効果を定量的に試験するために、白い塩漬けチーズを調製した。
【００８８】
殺菌し、そして、標準化した乳に、市販のスターター培養物（Chr. Hansen A/S, Denmarkから入手可能なFD-DVS SafeIT-1）を乳１０００ｌあたり４０Ｕで播種した。当該乳に、更にＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（１０ＤＣＵ／１００Ｉ）又はラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ５３６６（５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇ）及びラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６（５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇ）の組み合わせを播種した。１つのバッチを基準として使用し、スターター培養物のみを播種した。
【００８９】
当該乳を、切り分ける前に、１０００ｌあたり２２０ｍｌのＣｈｙ−Ｍａｘ（Chr. Hansen A/S, Denmarkから入手）を使用して、３６℃±１℃で９０分間、レネット処理した。ｐＨ６．０にて、カードを、流し型内にポンプで流し込み、排液が４．８−４．７の最終的なｐＨになるまで放置した（２０〜２４時間）。当該チーズは、冷塩水（８％）の入った缶に入れ、５℃±１℃で保存した。
【００９０】
白い塩漬けチーズを調製した翌日、当該缶に、酵母を２０ＣＦＵ／ｍｌを目標に二重反復で播種した。当該酵母を、塩水中に均一に分散させた。当該カップを、蓋をして７℃±１°Ｃで４０日間保存し、そして、１０ｇを、ペプトン加生理食塩水中に作製した１倍希釈液を酵母グルコースクロラムフェニコール（ＹＧＣ）寒天上に平板培養し、それに続いて、それを２５℃で５日間好気的にインキュベーションすることによって、サッカロミセス・セレビシエ混入レベルに関して、好適な間隔で分析した。
【００９１】
図９に示すように、スターター培養物ＳａｆｅＩＴ−１と一緒に播種された場合、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の組み合わせの存在下、サッカロミセス・セレビシエの増殖が阻害された。当該菌株は、市販の培養物、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂよりも有意に高い阻害を引き起こした。
【００９２】
実施例１０：組み合わせた状態でラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６とラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６を用いた、白い塩漬けチーズでの二回チャレンジ試験
組み合わせた状態でのラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６とラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の、クリベロマイセス・マルキシアヌスに対する阻害効果の定量的に試験するために、缶に酵母混入株としてクリベロマイセス・マルキシアヌスを播種したことを除いて、白い塩漬けチーズを実施例１に記載の通り調製した。
【００９３】
図１０に示すように、スターター培養物ＳａｆｅＩＴ−１と一緒に播種された場合、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６とラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の組み合わせの存在下、クリベロマイセス・マルキシアヌスの増殖が阻害された。当該菌株は、市販の培養物ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂよりも有意に高い阻害を引き起こした。
【００９４】
実施例１１：組み合わせた状態でラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６とラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６を用いた、白い塩漬けチーズでの三回チャレンジ試験
組み合わせた状態でのラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６とラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の、Ｐ．コミューンに対する阻害効果を視覚的に試験するために、白い塩漬けチーズを、実施例１に記載の通り調製した。
【００９５】
白い塩漬けチーズを調製した７日後、当該チーズを塩水から取り出し、そして、胞子１００個／スポットを目標にチーズの表面上の三点に、表面混入株としてＰ．コミューンを、二重反復試験のチーズ上に播種した。２つの異なったＰ．コミューン単離物の増殖を、視覚的に７℃±１℃で１２日間、それに続いて１２℃±１℃で１６日間の保存後に評価した。
【００９６】
白い塩漬け試験の結果を、図１１に示す。２個のＰ．コミューン単離物は、スターター培養物のみ（左側）を播種した乳から作製した白い塩漬けチーズ上で活発な増殖を示した。対照的に、チーズ生産の過程で、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６が存在していた場合（右側）、Ｐ．コミューンの増殖は強く阻害された。
【００９７】
実施例１２：ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びＣＨＣＣ１４６７６を用いた、ペニシリウム・パネウムに対するヨーグルト上でのチャレンジ試験
ラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ５３６６のみ、又はラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６と組み合わせて、カビＰ．パネウムに対する阻害効果を視覚的に試験するために、１．５％の脂肪分を含有するヨーグルトを調製した。
【００９８】
均質化した乳（脂肪分１．５％）を、ウォーターバス中の１Ｌボトル中で、９５±１℃で５分間加熱処理し、そして急速に冷却した。市販のスターター培養物（Chr.Hansen A/S, Denmarkから入手可能なF-DVS YF-L901）を、０．０２％で播種した。当該乳に、更にＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（２０ＤＣＵ／１００Ｌ）、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６（１ｘ１０7ＣＦＵ／ｍｌ）のみ、又はラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６（５ｘ１０6ＣＦＵ／ｍｌ）及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６（５ｘ１０6ＣＦＵ／ｍｌ）の組み合わせを播種した。１つのボトルは、基準としてスターター培養物のみ播種した。
【００９９】
当該乳を、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで４３±１℃で発酵させた。得られたヨーグルトをカップに注ぎ（１００ｇ）、７±１℃で保存した。
【０１００】
ヨーグルトを調製した翌日、二重反復試験のヨーグルトカップに表面混入株として様々なカビを、ヨーグルトの表面上にスポットあたり胞子１００個となるように播種した。カビの増殖は、７℃±１℃で２８日間保存後に視覚的に評価した。
【０１０１】
ヨーグルト試験の結果を、図１２に示す。Ｐ．パネウムは、スターター培養物ＹＦ−Ｌ９０１のみ、又はスターター培養物及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ培養物で発酵させた乳から作製したヨーグルト上で活発な増殖を示した。対照的に、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６が乳発酵の過程で存在していた場合、Ｐ．パネウムの増殖は強く低減され、そして、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６とラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の組み合わせは、Ｐ．パネウムの更に強い増殖阻害を引き起こした。
【０１０２】
実施例１３：異なった保存温度におけるラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６及びＣＨＣＣ１４６７６を用いた、ヨーグルト上でのチャレンジ試験
異なった保存温度において、ラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ５３６６のみ、又はラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６と組み合わせて、カビＰ．クルストスムに対する阻害効果を視覚的に試験するために、１．５％の脂肪分を含有するヨーグルトを調製した。
【０１０３】
均質化した乳（脂肪分１．５％）を、ウォーターバス中の１Ｌボトル中で、９５±１℃で５分間加熱処理し、そして急速に冷却した。市販のスターター培養物（Chr.Hansen A/S, Denmarkから入手可能なF-DVS YF-L901）を、０．０２％で播種した。当該乳に、更にＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ（２０ＤＣＵ／１００Ｌ）、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６（１ｘ１０7ＣＦＵ／ｍｌ）のみ、又はラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６（５ｘ１０6ＣＦＵ／ｍｌ）及びラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６（５ｘ１０6ＣＦＵ／ｍｌ）の組み合わせを播種した。１つのボトルは、基準としてスターター培養物のみ播種した。
【０１０４】
当該乳を、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで４３±１℃で発酵させた。得られたヨーグルトをカップに注ぎ（１００ｇ）、７±１℃で保存した。
【０１０５】
ヨーグルトを調製した翌日、二重反復試験のヨーグルトカップに表面混入株としてペニシリウム・クルストスムを、ヨーグルトの表面上にスポットあたり胞子１００個となるように播種した。カビの増殖は、７℃±１℃、１２℃±１℃又は２２℃±１℃で３６日間保存後に視覚的に評価した。
【０１０６】
ヨーグルト試験の結果を、図１３に示す。Ｐ．クルストスムは、スターター培養物ＹＦ−Ｌ９０１のみ、又はスターター培養物及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ培養物で発酵させた乳から作製したヨーグルト上で、すべての保存温度にて活発な増殖を示した。対照的に、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６のみ、又はラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６との組み合わせが乳発酵の過程で存在していた場合、Ｐ．クルストスムの増殖は、７℃±１℃及び１２℃±１℃で３６日間保存の両方で完全に予防された。２２℃±１℃での保存において、Ｐ．クルストスムの増殖は、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６の存在下で、強く低減され、そして、ラクトバチルス・ラムノサスＣＨＣＣ５３６６とラクトバチルス・パラカゼイＣＨＣＣ１４６７６の組み合わせの存在下で、更に強かった。
【０１０７】
寄託とエキスパートソリューション
出願人は、下記の寄託された微生物の試料が、当該特許が登録査定を受けるまでに、必ず当業者に利用可能となっているべきことを要求する。
【０１０８】
ラクトバチルス・パラカゼイ株ＣＨＣＣ１４６７６は、２０１２年２月２日付で、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受入番号：ＤＳＭ２５６１２で寄託された。
【０１０９】
ラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ５３６６は、２００９年１０月１４日付で、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受入番号：ＤＳＭ２３０３５で寄託された。
【０１１０】
ラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ１２６９７は、２０１１年３月１日付で、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受入番号：ＤＳＭ２４６１６で寄託された。
【０１１１】
ラクトバチルス・ラムノサス株ＣＨＣＣ１４２２６は、２０１１年３月１５日付で、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受入番号：ＤＳＭ２４６５２で寄託された。
以上の寄託は、特許手続を目的とする微生物の寄託の国際的承認についてのブダペスト条約に従い行われた。
【０１１２】
参考文献
ＵＳ２０１１／００４５１３４
ＥＰ１４４２１１３
ＥＰ１１１６１６０９．０
Kosikowski, F.V. and Mistry, V.V., "Cheese and Fermented Milk Foods", 1997, 3rd Ed. F.V. Kosikowski, L.L.C. Westport, CT
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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