(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タミバロテン（AM80）を含む、好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の重症度の軽減、または好中球減少症の予防の促進のための医薬組成物であって、それを必要とする哺乳類対象への投与用の医薬組成物であり、該好中球減少症が白血病に起因しない、医薬組成物。
【請求項２】
タミバロテン（AM80）を含む、癌化学療法によって誘発される好中球減少症を治療するための医薬組成物であって、それを必要とする哺乳類対象への投与用の医薬組成物であり、該癌化学療法が白血病の治療のために実施されたものではない、医薬組成物。
【請求項３】
化学療法剤と組み合わせて使用される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記化学療法剤とタミバロテン（AM80）を含む前記組成物の投与が、同時または逐次的である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
タミバロテン（AM80）の投与が、経静脈、筋肉内、腹腔内、経口または吸入経由の投与である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
タミバロテン（AM80）の有効量が、約０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日、０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日、０．５〜５ｍｇ／ｋｇ／日、１〜５ｍｇ／ｋｇ／日、または５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウスおよびラットからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
タミバロテン（AM80）の投与が対象において殺菌活性を有する好中球を誘導する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
好中球減少症が先天性好中球減少症である、または好中球減少症が急性細菌感染症もしくは化学療法に起因する、請求項１および５〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の重症度の軽減、好中球減少症の予防の促進、または癌化学療法によって誘発される好中球減少症の治療のための医薬キットであって、該好中球減少症が白血病に起因せず、該癌化学療法が白血病の治療のために実施されたものではなく、かつ該キットが
（ｉ）請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物と、
（ｉｉ）好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の重症度の軽減、好中球減少症の予防の促進、または癌化学療法によって誘発される好中球減少症の治療を必要とする哺乳類対象に、治療有効量の前記組成物を投与するための使用説明書と
を含む、医薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、それぞれ、米国国立衛生研究所により与えられた許可番号第ＣＡ１１１４４０号、第ＣＡ１２０５１２号および第ＣＡ１２０５１２−０２Ｓ１号に基づく政府の支援により行われた。政府は、本発明に対し一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、レチノイドアゴニスト、例えば、タミバロテンを投与することを含む、それを必要とする対象において、好中球減少症を治療、抑制、軽減、および／またはその予防を促進するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書で引用される全ての出版物は、それぞれ個別の出版物または特許出願が具体的かつ個別に、参照により援用されることが示された場合と同程度にその全体が参照により援用される。以下の説明は、本発明の理解に有用であると思われる情報を含む。これにより、本明細書で提供される情報のいずれかが特許を請求する本発明に対する先行技術であるということ、もしくはこれに関連するということ、または、明確にもしくは暗示的に参照されるいずれかの出版物が先行技術であるということを認めるものではない。
【０００４】
最も一般的な顆粒球である好中球は、主に病原体感染に対して防御を行い、循環白血球の最高７０％を占める。癌化学療法によって誘発される好中球減少症は、血流中の好中球の数が大きく減少することを特徴とする血液疾患である。ＨＳＣの顆粒球生成を促進することによる後天性および先天性好中球減少症の治療にＧ−ＣＳＦが最初に使用されてから２０年以上が経過している１、２。Ｇ−ＣＳＦの低治療指数、投与の有害作用、および悪性形質転換のリスク２のために、腫瘍学における化学療法により誘導された好中球減少症は、罹患率、死亡率、および医療費の主要な原因として残されたままである３、４。近年の研究により、ＰＢＮとは対照的に、ＣＤ３４＋細胞由来Ｇ−ＣＳＦにより誘導された好中球の殺菌機能不全は、分化プロセス初期の異常な顆粒球生成の異常に起因する成熟顆粒の欠如に関連していることが示されている５。従って、好中球減少症に対するさらに効果的な療法開発の成否は、顆粒球生成と好中球による免疫の発生との関係を明確化できるかどうかにかかっていると思われる。
【０００５】
レチノイドアゴニストＡｍ８０６−８は、ＲＡにより活性化される転写因子１１、１２であるレチノイン酸受容体アルファ（ＲＡＲα）６、９、１０に対し選択的に結合し、白血病性骨髄芽球およびＨＳＣの両方の顆粒球分化を調節する１３−１７ことによりオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）の副作用を回復させるように設計されている。天然型ビタミンＡのＲＡは、ボディープランの形成において重要な役割を果たし、多くのタイプの正常および悪性細胞の分化を誘導する１８−２０。現在まで、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）のＲＡ治療は、臨床腫瘍学において分化誘導療法で成功した最良の例２１であるが、ＲＡ療法に関連する副作用は、概して重篤であり、また、ＲＡ抵抗性はよく発生する事象である２２−２４。いくつかの研究により、ＲＡＲαがＡｍ８０によって誘発される顆粒球分化を調節することが示された２５−２７。さらに、Ａｍ８０は、ＡＰＬ患者の分化によって誘発される療法として使用されるＲＡまたは他のレチノイドより低い毒性で、約１０倍効率が高い７、８、２８。現在、Ａｍ８０は、ＡＰＬの治療のために日本で承認され７、８、米国およびヨーロッパにおいては、他のいくつかの癌／疾患のための臨床試験が行われている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｙｔｒｘ．ｃｏｍ／ｔａｍｉｂａｒｏｔｅｎｅ．ｈｔｍｌ；ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）。Ａｍ８０を使用して顆粒球分化を誘導にする手法が進歩したことにより、免疫発生の間に顆粒球生成から生じる好中球の殺菌力を高める手段として本発明者らがこの薬剤を試験することになった。本発明者らは、ＣＤ１８活性化に与えるＣＤ６６の差次的効果を媒介することによるＨＳＣ由来顆粒球生成の促進を介して、Ａｍ８０が好中球分化および免疫発生の誘導因子としてＧ−ＣＳＦより顕著に大きい活性を有すると想定されることについて本明細書で報告する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、それを必要とする対象において、好中球減少症、急性細菌感染症、癌化学療法によって誘発される好中球減少症および／または各種タイプの先天性好中球減少症を治療、抑制、および／またはその重症度を軽減するための方法を提供する。本方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、有効量のその組成物を対象に投与し、対象の好中球減少症を治療、抑制、および／またはその重症度を軽減することを含む。本方法は、本発明の組成物と一緒に追加の治療薬を同時に、または順次投与し、対象の好中球減少症、急性細菌感染症、癌化学療法によって誘発される好中球減少症および／または各種タイプの先天性好中球減少症を治療、抑制、および／またはその重症度を軽減することとをさらに含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。
【０００７】
また、本発明は、それを必要とする対象において、好中球減少症、急性細菌感染症、癌化学療法によって誘発される好中球減少症および／または各種タイプの先天性好中球減少症を治療、抑制、および／またはその重症度を軽減するための医薬組成物およびキットを提供する。本医薬組成物およびキットは、多量のレチノイドアゴニストを含む。一部の実施形態では、本レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。
[本発明1001]
（ｉ）レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、
（ｉｉ）治療有効量の前記組成物を、好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の重症度の軽減、または好中球減少症の予防の促進を必要とする哺乳類対象に投与することと
を含む方法。
[本発明1002]
それを必要とする対象において、癌化学療法によって誘発される好中球減少症を治療するための方法であって、
（ｉ）レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、
（ｉｉ）癌化学療法によって誘発される好中球減少症を治療するために治療有効量の前記組成物を前記対象に投与して、それにより、前記対象の癌化学療法によって誘発される好中球減少症を治療することと
を含む方法。
[本発明1003]
化学療法剤を投与することをさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記化学療法剤と前記レチノイドアゴニストを含む組成物とが、同時にまたは逐次的に投与される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
それを必要とする対象において、急性細菌感染症を治療するための方法であって、
（ｉ）レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、
（ｉｉ）抗細菌治療薬を含む組成物を提供することと、
（ｉｉｉ）前記対象の前記急性細菌感染症を治療するために、治療有効量のそれぞれの前記組成物を前記対象に投与し、それにより、前記対象の急性細菌感染症を治療することと
を含む方法。
[本発明1006]
前記レチノイドアゴニストを含む前記組成物と、前記抗細菌治療薬を含む前記組成物とが、同時にまたは逐次的に投与される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記レチノイドアゴニストが、経静脈、筋肉内、腹膜内、経口または吸入経由で投与される、本発明1001、1002または1005のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記有効量の前記レチノイドアゴニストが、約0．1〜0．5ｍｇ／ｋｇ／日、0．5〜5ｍｇ／ｋｇ／日、5〜10ｍｇ／ｋｇ／日、10〜20ｍｇ／ｋｇ／日、20〜50ｍｇ／ｋｇ／日、50〜100ｍｇ／ｋｇ／日、100〜200ｍｇ／ｋｇ／日、200〜300ｍｇ／ｋｇ／日、300〜400ｍｇ／ｋｇ／日、400〜500ｍｇ／ｋｇ／日、500〜600ｍｇ／ｋｇ／日、600〜700ｍｇ／ｋｇ／日、700〜800ｍｇ／ｋｇ／日、800〜900ｍｇ／ｋｇ／日、または900〜1000ｍｇ／ｋｇ／日である、本発明1001、1002または1005のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウスおよびラットからなる群より選択される、本発明1001、1002または1005のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記レチノイドアゴニストが、タミバロテン（ＡＭ80）、ＣＨ55、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−01115）またはこれらの組み合わせの内のいずれか1つまたは複数である、本発明1001、1002または1005のいずれかの方法。
[本発明1011]
（ｉ）一定量のレチノイドアゴニストを含む組成物と、
（ｉｉ）好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の重症度の軽減、好中球減少症の予防の促進、癌化学療法によって誘発される好中球減少症の治療、または急性細菌感染症の治療を必要とする哺乳類対象に、治療有効量の前記組成物を投与するための使用説明書と
を含むキット。
[本発明1012]
レチノイドアゴニストを特定するための方法であって、
（ｉ）ＣＤ34＋細胞を目的の分子と接触させることと、
（ｉｉ）ＣＤ34＋細胞および前記目的の分子を抗原とさらに接触させて免疫応答を刺激することと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）における前記接触がラクトフェリン、ＬＬ−37またはこれらの組み合わせの分泌の増加を引き起こすか否かを評価することと
を含み、分泌の増加は、前記目的の分子がレチノイドアゴニストであることを示す、
方法。
【０００８】
例示的な実施形態を参照図面に図示する。本明細書で開示される実施形態および図面は、限定するものではなく、例示であると見なされるべきであると意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の各種実施形態により、Ａｍ８０が、Ｇ−ＣＳＦより効果的に好中球分化を促進することを示す一方で、Ｇ−ＣＳＦと類似の低い毒性を示すことを表す図である。（Ａ）は、６日目対９または１２日目のＧ−ＣＳＦで処理したＣＤ３４＋細胞中のより低い単球誘導に関連した良好な顆粒球誘導を示す。（ＢとＣ）は、濃度を下げたＡｍ８０（２．５ｎＭ）はＧ−ＣＳＦより効果的な顆粒球分化の誘導を引き起こすこと（パネルＢ）、また、より低い細胞傷害性（パネルＣ）を示す。（Ｄ）顆粒球分化に対し最適であることが明らかになった条件下での、Ａｍ８０およびＧ−ＣＳＦの全体比較を示す。
【図２】本発明の各種実施形態による、Ａｍ８０によって誘導される好中球（ＡＩＮ）が、Ｇ−ＣＳＦによって誘導される好中球（ＧＩＮ）より効果的に顆粒を産生および分泌することを示す図である。（Ａ）大腸菌刺激時のラクトフェリンの効果的な分泌に対するＡＩＮとＧＩＮの比較を示す。（Ｂ）ＬＬ−３７のより大きな産生と脱顆粒に対するＡＩＮとＧＩＮの効果の比較を示す。（Ｃ）大腸菌刺激時の、ＧＩＮとＡＩＮ両方における細胞内のＭＭＰ９の存在量の増加および不充分な脱顆粒を示す。
【図３】本発明の各種実施形態による、抗ＣＤ１５抗体による無選別および選別ＡＩＮの両方が、無選別および選別ＧＩＮよりも高い細菌の排除能力を示す図である。（Ａ）単球の定量を示す（ＧＩＮ）。（Ｂ）帯状核／分葉核好中球の定量を示す（ＧＩＮ対ＡＩＮ）。（ＣとＤ）細胞内細菌の排除に与える無選別および選別ＧＩＮならびにＡＩＮの効果の比較を示す。排除効率は、感染後に細胞内区画から回収した生菌の数から決定した。
【図４】本発明の各種実施形態による、ＡＩＮがＧＩＮより顕著に高い食作用および殺菌活性を有することを示す図である。（Ａ〜Ｄ）細胞外細菌（パネルＡ）、食菌された細菌（パネルＢ）、回収細胞内細菌（パネルＣ）、および死菌（パネルＤ）の数より判定した食作用および殺菌活性を示す。４５分にわたる実験で１．２６±０．０１倍の細菌数の増加が認められた。＊：ＧＩＮ対ＡＩＮ、少なくともＰ＜０．０３。（Ｅ）感染後の細胞外細菌、およびＧＩＮ、ＡＩＮおよびヒト末梢血好中球（ＰＢＮ）中のインサイチュー死菌の両方の定量を示す。＊：ＧＩＮ対ＡＩＮまたはＰＢＮ、少なくともＰ＜０．００３。
【図５】本発明の各種実施形態による、ＡＴＲＡ（ＲＡ）ならびに新規合成レチノイドアゴニストＡｍ８０、ＣＨ５５、およびＩＴ−ＹＡ０１１１５（ＩＴ−ＹＡ）の構造を示す図である。
【図６】本発明の各種実施形態による、Ａｍ８０が、Ｇ−ＣＳＦおよび他のレチノイド化合物より効果的にＣＤ３４＋細胞の顆粒球形態学的分化を誘導にすることを示す図である（Ａ〜Ｂ）。顆粒球分化の誘導に対するＧ−ＣＳＦより高いＲＡの効率（パネルＡ）は、顕著な細胞死と関連していた（パネルＢ）。ＣＤ３４＋細胞の顆粒球へのＧ−ＣＳＦによる分化誘導のより低い効率は、１２日目のより高い単球誘導と関連していた（パネルＡ）。（Ｃ〜Ｄ）Ａｍ８０（１０ｎＭ）は、顆粒球分化の誘導に関しＲＡおよびＣＨ５５と比較して類似の効率であった（パネルＡ、Ｃ）が、一方、Ｇ−ＣＳＦまたはＩＴ−ＹＡまたはＣＨ５５より少ない単球誘導を示し（パネルＡ、Ｃ）、また、ＲＡおよびＣＨ５５より低い割合の細胞死を示した（パネルＢ、Ｄ）。
【図７】本発明の各種実施形態による、Ｇ−ＣＳＦで処理した場合に比べて、ＡＭ８０が好中球減少症マウスでの競合的な好中球回復を誘導にすることを示す図である。（Ａ）ＣＰＡ投与後３日目に測定される異なる用量のＡｍ８０およびＧ−ＣＳＦによる好中球回復の分析用実験計画の図である。（Ｂ）末梢血（ＰＢ）を３日目に安楽死させた対照マウスから回収し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（１．０８４）を使用してＰＢ好中球を精製した。（Ｃ）３日目に異なる用量のＡｍ８０またはＧ−ＣＳＦで処理した好中球減少症マウス由来白血球（ＷＢＣ）と好中球回復の分析を行った結果を示す。
【図８Ａ】本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でＡｍ８０により動員された好中球が、Ｇ−ＣＳＦの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図８Ａでは、Ｇ−ＣＳＦは、５日目に、Ａｍ８０またはビヒクルで処理されたマウスに比べて著しく加速度的好中球回復を誘導したことを示す。
【図８Ｂ】本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でＡｍ８０により動員された好中球が、Ｇ−ＣＳＦの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図８Ｂでは、５日目のＰＢ好中球の分析を示す。＊Ｇ−ＣＳＦ対Ａｍ８０、Ｐ＜１．２×１０−６；Ｇ−ＣＳＦ対対照、Ｐ＜４．０×１０−５；Ｇ−ＣＳＦ対ビヒクル、Ｐ＜８．２×１０−８；Ａｍ８０対ビヒクル、Ｐ＜１．３×１０−６；Ａｍ８０対対照、Ｐ＜０．０１６。
【図８Ｃ】本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でＡｍ８０により動員された好中球が、Ｇ−ＣＳＦの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図８Ｃでは、異なるマウスのＰＢから単離された好中球の食作用および殺菌活性は、単離好中球を黄色ブドウ球菌に対しインビトロで暴露した後の細胞外細菌、食菌された細菌、および死菌の数により表される。＊細胞外：ＡＩＮ対ＧＩＮ、Ｐ＜０．０４３；ＡＩＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜１．１×１０−４；ＭＰＢＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜３．７×１０−４；ＧＩＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．０４９。＊食作用：ＡＩＮ対ＧＩＮ、Ｐ＜０．０２６；ＡＩＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．０２；ＭＰＢＮ対ＧＩＮ、Ｐ＜０．０４２；ＭＰＢＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．００３；ＧＩＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．００９。＊殺菌：ＡＩＮ対ＧＩＮ、Ｐ＜０．０２６；ＡＩＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．００５；ＭＰＢＮ対ＧＩＮ、Ｐ＜０．０１５；ＭＰＢＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．００３；ＧＩＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．００９。
【図８Ｄ】本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でＡｍ８０により動員された好中球が、Ｇ−ＣＳＦの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図８Ｄでは、ＷＢＣおよび好中球の加速度的回復は、Ｇ−ＣＳＦまたはＡｍ８０またはビヒクルによる９６時間の刺激後、７日目に終わったことを示す。
【図８Ｅ】本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でＡｍ８０により動員された好中球が、Ｇ−ＣＳＦの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図８Ｅでは、９日目のＰＢ好中球の分析を示す。＊Ｇ−ＣＳＦ対対照、Ｐ＜０．００５；Ａｍ８０対対照、Ｐ＜３．９×１０−４；Ａｍ８０対ビヒクル、Ｐ＜０．０３；ビヒクル対対照、Ｐ＜０．０３。
【図８Ｆ】本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でＡｍ８０により動員された好中球が、Ｇ−ＣＳＦの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図８Ｆでは、加速度的好中球回復の停止４８時間後としての９日目に、ＡＩＮはＧＩＮよりも顕著に高い食作用および殺菌活性を有することを示す。＊細胞外の：ＡＩＮ対ＧＩＮ、Ｐ＜０．０２；ＡＩＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．００７；ＭＰＢＮ対ＧＩＮ、Ｐ＜０．０４；ＭＰＢＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．０２。＊食作用：ＡＩＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．０３４；ＭＰＢＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．０４３。＊殺菌：ＡＩＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．０３４；ＭＰＢＮ対Ｃ−ＭＰＢＮ、Ｐ＜０．０４３。
【図８Ｇ】本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でＡｍ８０により動員された好中球が、Ｇ−ＣＳＦの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図８Ｇでは、好中球減少症マウスに対し、Ａｍ８０がＧ−ＣＳＦより大きな殺菌力を示す十分に効果的な好中球を誘導にすることを表すインビボデータである。実験のために、２０匹のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスを無作為に４群に分けた。０日目に、２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＰＡ）の単回腹腔内注射投与を行った。ＣＰＡ注射の４時間後、Ａｍ８０またはＧ−ＣＳＦまたはビヒクルを投与し、これを、３日間続けた。ＣＰＡ注射後、４８〜６０時間マウス好中球減少症が誘導された。３×１０７黄色ブドウ球菌の腹腔内注射の１６時間後、３日目に実験を行った。腹腔内（パネルＧ−ｉ）およびＰＢ（パネルＧ−ｉｉ）の生存細胞外細菌の数を判定することにより精製好中球の殺菌活性を分析した。３ｍｌのＰＢＳ洗浄腹水、および、同様に約１．５ｍｌの全血漿についても、生菌の数を計数した。腹腔内生菌のＰ値：Ａｍ８０対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜２．４×１０−８；対照対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜４．７×１０−９；ビヒクル対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜８．３×１０−３；Ａｍ８０対ビヒクル、Ｐ＜３．１×１０−９；Ａｍ８０対対照、Ｐ＜０．０３８。＊パネルＧ−ｉｉｉの合計生存細胞外細菌：Ａｍ８０対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜１．９×１０−６；対照対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜９．４×１０−９；ビヒクル対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜６．５×１０−４；Ａｍ８０対ビヒクル、Ｐ＜６．８×１０−７；対照対Ａｍ８０、Ｐ＜３．８×１０−５。生菌の倍数変化をパネルＧ−ｉｖに示した。対照群の生菌を１倍の規準として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本明細書に引用される全ての文献は、完全に記述されているかのように、参照によりその全体が援用される。特段の断りのない限り、本明細書で使用される技術的、科学的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  ２００１）；Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５ｔｈ  ｅｄ．、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  ２００１）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ  ２００１）は、当業者にとって、本願で使用される多くの用語に対する一般的指標となろう。
【００１１】
当業者であれば、本発明の実施に使用可能な本明細書に記載したものに類似または均等な多くの方法および材料を理解するであろう。事実、本発明は、記載の方法および材料に限定されるものではない。本発明の目的のために、以下の用語が定義される。
【００１２】
「有益な結果」は、限定するものではないが、疾患状態の重症度を減らすまたは軽減すること、疾患状態の悪化を抑制すること、疾患状態を治療すること、疾患状態の進展を防ぐこと、患者の疾患状態の発症の確率を減らすこと、および患者の寿命または余命を延長させることを含んでもよい。
【００１３】
本明細書で使用される「哺乳動物」は、限定するものではないが、ヒトならびにチンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種などの非ヒト霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）；イヌおよびネコなどの愛玩動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）；マウスなどのげっ歯類、ラットおよびモルモットを含む実験動物、などの哺乳綱のいずれかのメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢または性別を意味しない。従って、成人（成体）および新生児（新生仔）対象、ならびに胎児（胎仔）は、男性（雄）または女性（雌）に関わらず、この用語の範囲内に含まれることが意図されている。
【００１４】
本明細書で使用される「好中球減少症」は、血液中の異常に低レベルの好中球を意味する。好中球減少症は、白血球の産生の減少に起因する（例えば、限定するものではないが、骨髄を冒す治療薬、骨髄を冒す遺伝性／先天性障害、再生不良性貧血、癌、放射線療法、ビタミンＢ１２、葉酸または銅欠乏、および／または殺虫剤への暴露などに起因する）場合がある。また、好中球減少症は、白血球の破壊に起因する（例えば、限定するものではないが、急性細菌感染症、特定の自己免疫疾患、化学療法治療、および／または治療薬に起因する）場合もある。また、好中球減少症は、白血球の隔離、および／または遊走に起因する（例えば、限定するものではないが、血液透析、マラリア、および／または細菌感染などの原因で）場合もある。フレカイニド、フェニトイン、インドメタシン、プロピルチオウラシル、カルビマゾール、クロルプロマジン、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）、クロザピン、チクロジピン（ｔｉｃｌｏｄｉｐｉｎｅ）などの特定の薬物も、好中球減少症を発生させる場合がある。本発明の方法および組成物を使用して、上記のいずれかが原因の好中球減少症の治療、抑制、重症度の軽減、および／または予防促進を行うことができる。また、本発明の方法および組成物を使用して、好中球減少症の治療、抑制、症状の軽減、および／または予防促進を行うことにより、上記のいずれかが原因の好中球減少症から生じた疾患状態の治療、抑制、重症度の軽減、および／または予防促進を行うことができる。
【００１５】
本明細書で使用される「治療（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療処置および予防または予防処置の両方を意味し、この場合の目的は、標的の病的状態を防ぐかもしくは遅らせる（減らす）、病的状態を防ぐ、有益な結果を追究するかもしくはそれを得る、または治療が最終的に成功しない場合であっても、個々の状態の進展の確率を減らすことである。治療を必要とする対象には、既にその状態にある対象、ならびに、状態になる傾向のある対象、または状態が防止されるべき対象が含まれる。
【００１６】
本明細書で使用される「治療有効量」は、好中球減少症の哺乳類対象に対し有益な結果を実現できる量を意味する。治療有効量は、個別基準に基づき決定でき、少なくとも一部は、哺乳動物の生理的な特性、デリバリーシステムの型または使用される治療技術および疾患の進行に対する投与時間の考慮に基づくであろう。
【００１７】
ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）の顆粒球生成を促進するための組換え型顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の治療上の使用に関する進歩にも関わらず、好中球減少症は、最も重症の癌化学療法合併症の１つとして残されたままである。本発明者らは、基本的なＣＤ３４＋造血細胞の顆粒球分化を誘導にするエクスビボモデルを使用して、新規レチノイドアゴニストであるＡｍ８０（タミバロテン）が、好中球分化と免疫発生を連携して働かせる点に関しＧ−ＣＳＦより強力であることを発見した。顆粒産生、大腸菌感染、および殺菌の機能分析およびインサイチュー画像処理により、ヒト末梢血好中球（ＰＢＮ）と同様に、Ａｍ８０によって誘導される好中球（ＡＩＮ）は、Ｇ−ＣＳＦによって誘発される好中球（ＧＩＮ）より大きな殺菌活性を有することが示された。ＰＢＮと類似であるが、ＧＩＮとは対照的に、ＡＩＮによる強化された殺菌力は、ＣＤ６６抗原とインテグリンβ２サブユニットＣＤ１８のより大きな同時発現に関連していた。抗ＣＤ１８抗体は、ＡＩＮのＡｍ８０によって誘発される殺菌活性を常に中和した。従って、ＡＩＮは、Ｇ−ＣＳＦに比べて、おそらく、ＣＤ６６とＣＤ１８の機能的相互作用を連携して働かせて顆粒球生成の間に好中球免疫の発生を強化することによるなどの、好中球分化および殺菌活性を促進するためのより有効性の高い手段を提供しているように思われる。本明細書中のこれらの知見は、対費用効果の高い治療選択肢としてＡｍ８０を使うことによる好中球減少症に対する新規治療を開発するための分子論的根拠を提供する。
【００１８】
従って、本発明は、それを必要とする哺乳類対象において、好中球減少症を治療するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、対象の好中球減少症を治療することとを含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれかの１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、その類似体および／または塩である。
【００１９】
さらに、本発明は、それを必要とする哺乳類対象において、好中球減少症重症度を軽減するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、対象の好中球減少症の重症度を軽減するとことを含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、その類似体、および／または塩である。
【００２０】
また、本発明は、それを必要とする哺乳類対象において、好中球減少症を抑制するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、対象の好中球減少症を抑制することとを含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、その類似体、および／または塩である。
【００２１】
さらに、本発明は、それを必要とする対象において、好中球減少症の予防を促進するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、対象の好中球減少症の予防を推進することとを含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、その類似体、および／または塩である。
【００２２】
本発明は、さらに、それを必要とする対象において、癌化学療法によって誘発される好中球減少症を治療、抑制、および／またはその重症度を軽減するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、癌化学療法によって誘発される好中球減少症の治療、抑制、および／または重症度の軽減を行うことを含む。方法は、化学療法剤を投与することとをさらに含む。一実施形態では、化学療法剤およびレチノイドアゴニストを含む組成物は、同時に投与される。別の実施形態では、化学療法剤およびレチノイドアゴニストを含む組成物は、逐次的に投与される。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、その類似体、および／または塩である。
【００２３】
化学療法剤の例には、限定するものではないが、アクチノマイシン、アリトレチノイン、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロランブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレザト、ミトキサントロン、オクレリズマブ、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツマブ、ペメトレキセド、リツキシマブ、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ロミデプシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、クラドリビン、クロファラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ペントスタチン、マイトマイシン、イキサベピロン、エストラムスチン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００２４】
また、本発明は、急性細菌感染症それを必要とする対象において治療、抑制、重症度の軽減、および／または予防の促進方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、抗細菌治療薬を含む組成物を提供することと、治療有効量のそれぞれの組成物を対象に投与し、対象の急性細菌感染症の治療、抑制、重症度の軽減、および／または予防の促進を行うこととを含む。一実施形態では、レチノイドアゴニストを含む組成物および抗細菌治療薬を含む組成物は、同時に投与される。別の実施形態では、レチノイドアゴニストを含む組成物および抗細菌治療薬を含む組成物は、逐次的に投与される。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、その類似体、および／または塩である。
【００２５】
さらに、本発明は、先天性好中球減少症（限定するものではないが、コストマン症候群、周期性好中球減少症またはチェディアック・東病を含む）それを必要とする哺乳類対象において、を治療、抑制、その重症度を軽減、および／または予防を促進するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、対象の先天性好中球減少症の治療、抑制、重症度の軽減、および／または予防促進を行うこととを含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、その類似体、および／または塩である。
【００２６】
一部の実施形態では、本明細書記載の組成物を必要とする哺乳類対象は、限定するものではないが、骨髄を冒す薬物療法（制癌剤、統合失調症治療薬、抗痙攣薬、など）、骨髄を冒す遺伝性および／または先天性の障害、放射線療法を受けている患者、ビタミンＢ１２欠乏、葉酸欠乏、またはこれらの組み合わせをなどが原因の白血球産生の減少した患者である。
【００２７】
さらなる実施形態では、本明細書記載の組成物を必要とする哺乳類対象は、限定するものではないが、急性細菌感染症、自己免疫障害（全身性エリテマトーデスなど）、スルホンアミド薬物の使用、またはこれらの組み合わせなどが原因で白血球の一定量が損傷を受けた、破壊された、および／または減少した対象である。
【００２８】
さらなる実施形態では、本明細書記載の組成物を必要とする哺乳類対象は、限定するものではないが、血液透析、マラリア、細菌感染、またはこれらの組み合わせが原因で白血球（好中球など）の隔離、および／または遊走が生じている対象である。
【００２９】
さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストを含む本発明の組成物は、限定するものではないが、化学療法剤、および／または放射線療法を含む他の治療薬と同時に、または逐次的に投与しても良い。化学療法剤、および／または放射線療法は、多くの場合、白血球の数を減らし、好中球減少症になる。本発明の組成物を化学療法剤、および／または放射線療法と同時または順次投与することにより、好中球減少症の抑制、および／または重症度の軽減が可能となる。さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストを含む本発明の組成物は、化学療法剤、および／または放射線療法の投与の前に、その間に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、その類似体、および／または塩である。
【００３０】
同様に、レチノイドアゴニストを含む組成物は、抗痙攣薬、および／または統合失調症治療薬と同時にまたは逐次的に投与して、前記薬剤の使用が原因の好中球減少症の抑制、および／または重症度の軽減を行うことができる。さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストを含む本発明の組成物は、抗痙攣薬、および／または統合失調症治療薬の投与の前、その間、またはその後に投与される。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、その類似体、および／または塩である。
【００３１】
さらに、レチノイドアゴニストを含む組成物は、急性細菌感染症、真菌感染症、および／または自己免疫疾患の治療に使用される治療薬と同時にまたは逐次的に投与して、細菌性および真菌感染症、および／または自己免疫疾患に起因して、および／または細菌感染、真菌感染症、および／または自己免疫疾患の治療に使用できる治療薬に起因して発生する可能性がある好中球減少症の抑制、および／または重症度の軽減を行うことができる。さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストを含む本発明の組成物は、急性細菌感染症、真菌感染症、および／または自己免疫疾患の治療に使用される治療薬の投与の前、その間、またはその後に投与される。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、その類似体、および／または塩である。
【００３２】
さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストは、経静脈、筋肉内、腹腔内、経口、または吸入経由で投与される。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテンである。
【００３３】
さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストの有効量は、約０．０１〜０．０５μｇ／ｋｇ／日、０．０５〜０．１μｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．５μｇ／ｋｇ／日、０．５〜５μｇ／ｋｇ／日、５〜１０μｇ／ｋｇ／日、１０〜２０μｇ／ｋｇ／日、２０〜５０μｇ／ｋｇ／日、５０〜１００μｇ／ｋｇ／日、１００〜１５０μｇ／ｋｇ／日、１５０〜２００μｇ／ｋｇ／日、２００〜２５０μｇ／ｋｇ／日、２５０〜３００μｇ／ｋｇ／日、３００〜３５０μｇ／ｋｇ／日、３５０〜４００μｇ／ｋｇ／日、４００〜５００μｇ／ｋｇ／日、５００〜６００μｇ／ｋｇ／日、６００〜７００μｇ／ｋｇ／日、７００〜８００μｇ／ｋｇ／日、８００〜９００μｇ／ｋｇ／日、９００〜１０００μｇ／ｋｇ／日、０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日、０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日、１〜５ｍｇ／ｋｇ／日、５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ／日、１５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、２０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ／日、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ／日、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、５００〜６００ｍｇ／ｋｇ／日、６００〜７００ｍｇ／ｋｇ／日、７００〜８００ｍｇ／ｋｇ／日、８００〜９００ｍｇ／ｋｇ／日、９００〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、その類似体、および／または塩である。レチノイドアゴニストの有効量の代表的投与量は、既知の治療化合物が使用されている製造者による推奨範囲、およびインビトロ応答または動物モデルでの応答によって当業者に示されたような推奨範囲であってもよい。このような投与量は、通常、当該生物活性を失うことなく、約１桁の範囲内の濃度または量まで減らすことができる。実際の投与量は、医師の判断、患者の状態、および、例えば、当該培養細胞または生検悪性腫瘍などの組織培養された生体組織試料のインビトロ応答性、または適切な動物モデルで観察された応答に基づく治療方法の有効性に依存する。さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストを含む本発明の組成物は、１日１回（ＳＩＤ／ＱＤ）、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、１日４回（ＱＩＤ）、またはそれ以上投与して、対象に有効量のレチノイドアゴニストを投与できる。ここで、有効量は、本明細書記載の内のいずれか１以上の用量である。
【００３４】
また、本発明は、レチノイドアゴニストを特定する方法を提供する。方法は、ＣＤ３４＋細胞を目的の分子と接触させ、さらに、ＣＤ３４＋細胞および目的の分子を抗原と接触させて免疫応答を刺激し、ＣＤ３４＋細胞、目的の分子と抗原との間の接触により、ラクトフェリン、ＬＬ−３７またはこれらの組み合わせの分泌の増加を生ずるかどうかを評価することを含む。一実施形態では、ラクトフェリン、ＬＬ−３７またはこれらの組み合わせの分泌の増加は、目的の分子がレチノイドアゴニストであることを示す。
【００３５】
レチノイドアゴニストである化合物を特定するために採用されるアッセイには、限定するものではないが、マイクロアレイアッセイ、定量的ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、サザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、結合アッセイ、ゲル遅延度アッセイまたは酵母ツーハイブリッド法を用いたアッセイが含まれる。当業者であれば、当技術分野で既知の多数の技術を採用して、特定の薬剤／目的の分子がレチノイドアゴニストであるかどうかを容易に判定できる。
【００３６】
さまざまな実施形態において、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウスおよびラットからなる群より選択される。
【００３７】
医薬組成物
さまざまな実施形態において、本発明は、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせなどの治療有効量のレチノイドアゴニストと共に、薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。「薬学的に許容可能な賦形剤」は、全体として安全、非毒性、および好ましい医薬組成物の調製に有用な賦形剤で、獣医学への使用、ならびにヒト医薬品としての使用に許容可能な賦形剤を意味する。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合には、ガス状であってもよい。
【００３８】
さまざまな実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、どのような投与経路による送達用にも処方できる。「投与経路」は、限定するものではないが、エアロゾル、経鼻、経口、経粘膜、経皮、非経口または腸内を含む当技術分野で既知のいずれの投与経路の意味であってもよい。「非経口」は、眼窩内、点滴、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、鞘内、子宮内、経静脈、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜的、または経気管を含む、通常、注射に関連する投与経路を意味する。非経口経路では、組成物は、点滴または注射用溶液または懸濁液の形で、または凍結乾燥粉末あってもよい。非経口経路では、組成物は、点滴または注射用溶液または懸濁液の形であってよい。腸内経路では、医薬組成物は、錠剤、ゲルカプセル剤、糖衣錠、シロップ剤、懸濁液、溶液、粉剤、顆粒、乳剤、微小球もしくはナノ球体または徐放を可能とする脂質小胞もしくはポリマー小胞の形であってよい。
【００３９】
また、本発明に係る医薬組成物は、いずれかの薬学的に許容可能なキャリアを含んでもよい。本明細書で使用される「薬学的に許容可能なキャリア」は、１つの組織、器官、または身体の一部から、別の組織、器官、または身体の一部へ目的の化合物を保持または運ぶことに関与する薬学的に許容可能な材料、組成物、またはビヒクルを意味する。例えば、キャリアは、液体または固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくはカプセル化材料、またはこれらの組み合わせであってよい。キャリアの各成分は、他の製剤の成分と両立する必要があるという観点から「薬学的に許容可能」でなければならない。また、キャリアは、接触する可能性のある任意の組織または器官と接触した状態での使用に適するものでなければならない。これは、毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他のその治療効果より極度に大きい合併症のリスクを保持してはならないことを意味する。
【００４０】
また、本発明に係る医薬組成物は、経口投与用にカプセル化、錠剤化、または乳剤またはシロップ剤として調製できる。薬学的に許容可能な固体または液体キャリアを加えて、組成物の機能を高める、もしくは安定化でき、または、組成物の調製を容易にできる。液体キャリアには、シロップ、ピーナッツオイル、オリーブ油、グリセリン、食塩水、アルコールおよび水が含まれる。固体キャリアには、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、滑石、ペクチン、アラビアゴム、寒天またはゼラチンが含まれる。また、キャリアには、グリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートなどの徐放材料を、単独で、または、ろうと一緒に含有させてもよい。
【００４１】
製剤は、錠剤剤形用として、必要に応じ、粉砕、混合、造粒、および、圧縮成形、または、硬ゼラチンカプセル剤形用として、粉砕、混合および充填、などの従来の薬学技術により作製される。液体キャリアが使用される場合は、製剤は、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤または水性もしくは非水性懸濁液の形であろう。このような液体製剤は、直接口から、または軟ゼラチンカプセルに充填して投与できる。
【００４２】
本発明に係る医薬組成物は、治療有効量を投与できる。正確な治療有効量は、特定の対象の治療の効力の観点から最も効果的な結果が得られると思われる組成物の量である。この量は、限定するものではないが、治療化合物の特性（活性、薬物動態学、薬力学、およびバイオアベイラビリティを含む）、対象の生理学的条件（年齢、性別、疾患タイプおよび病期、全身健康状態、所与の投与量に対する応答性、および薬物療法のタイプを含む）、薬学的に許容可能なキャリアまたは製剤中のキャリアの性質、ならびに、投与経路、などの種々の因子に応じて変化するであろう。臨床的および薬理学的技術分野の熟練者なら、定常的実験、例えば、化合物投与に対する対象の応答のモニタリングおよび、それに応じて投与量を調節することにより、治療有効量を決定できるであろう。さらなる教示に関しては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ、ＵＳＡ）（２０００）を参照されたい。
【００４３】
本発明のキット
また、本発明は、好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の軽減または好中球減少症の予防の促進のためのキットを、それを必要とする対象に提供する。キットは、レチノイドアゴニストを含む組成物、ならびに対象の好中球減少症、急性細菌感染症、癌化学療法によって誘発される好中球減少症および／または各種タイプの先天性好中球減少症それを必要とする対象において治療、抑制、および／または重症度の軽減のための組成物の使用説明書を含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン（ＡＭ８０）である。
【００４４】
キットは、少なくとも１種の本発明の組成物を含む材料または成分の集まりである。従って、一部の実施形態では、キットは、上述の、タミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上などのレチノイドアゴニストを含む組成物を含む。
【００４５】
本発明のキットを構成する成分の明確な性質は、意図される目的に依存する。一実施形態では、キットは、特にヒト対象用として構成される。さらなる実施形態では、キットは、限定するものではないが、家畜、愛玩動物、および実験動物などの対象を治療する獣医学用途向けに構成される。
【００４６】
使用説明書がキット中に含まれてもよい。「使用説明書」は、通常、対象の好中球減少症の治療、重症度の軽減、抑制または防止を行うなどの所望の結果を得るために、キットの成分を使用する際に採用すべき技術を説明する明確な表現を含む。任意選択で、キットは、他の有用な構成、例えば、測定器具、希釈剤、緩衝剤、薬学的に許容可能なキャリア、シリンジ、または当業者であれば容易に認識するその他の有用な備品一式も含む。
【００４７】
その操作性および有用性を維持するための任意の便利で、適切な方法で保管されたキットへの組込み用材料または成分を開業医に提供できる。例えば、成分は、溶解、脱水、または凍結乾燥された形態であってもよい。それらは、室温、冷蔵温度、または凍結温度で提供できる。成分は、通常、適切な梱包材料中に収容される。本明細書で採用される語句の「梱包材料」は、本発明の組成物などのキットの内容物を収容するために使用される１以上の物理的構造物を意味する。梱包材料は、よく知られた方法、好ましくは、無菌の、混入物のない環境を与える方法で構築される。本明細書で使用される用語の「パッケージ」は、個別キット成分を保持できるガラス、プラスチック、紙、箔、などの適切な固体の基質または材料を意味する。従って、例えば、パッケージは、適切な量のタミバロテン（ＡＭ８０）、ＣＨ５５、ＩＴＹＡ（ＩＴ−ＹＡ−０１１１５）またはこれらの組み合わせの内のいずれか１以上などの本発明のレチノイドアゴニストを含む組成物を収容するために使用されるビンであってもよい。梱包材料は、通常、内容物および／またはキットの目的および／またはその成分を表示する外部ラベルを有する。
【実施例】
【００４８】
実施例１
細胞および細胞培養
正常なヒト原始臍帯血ＣＤ３４＋細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）から入手した。ＳｔｅｍＳｐａｎ無血清培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、メーカーのプロトコルに従って、ＣＤ３４＋細胞を６日間で約５０倍に増殖した２９。顆粒球生成を誘導にするために、２５ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ１７、２９を補充した骨髄培地を使用してＣＤ３４＋細胞を６〜１２日間培養した。顆粒球生成の間、ヒドロコルチゾンの添加およびエリスロポエチンの排除によりリンパ系および赤血球細胞をブロックした１７、２９。オールトランスレチノイン酸（ＲＡ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手し、レチノイドアゴニストＡｍ８０、ＣＨ５５、およびＩＴ−ＹＡ−０１１１５（ＩＴＹＡ）は、公益財団法人  乙卯研究所（東京）から入手した。各レチノイド化合物をエタノールに溶解した。この調査では、実験的に決定した条件（６日間の顆粒球誘導に２５ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ１７、２９または２．５ｎＭのＡｍ８０を使用（図１））を適用した。
【００４９】
ヒトＰＢＮ
Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｋｅｃｋ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＨＬＡ／ＵＳＣ）の臨床研究委員会により承認されたプロトコルに従い健康なボランティアから末梢静脈血液を採取した。それぞれ２０ｍｌの血液をＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）中に取り出し、室温で等容量のＨＢＳＳを使用して希釈した。希釈血液を１０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ  ｐｒｅｍｉｕｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の上に流し込み、４００×ｇで４０分遠心分離した。次に、集めたＰＢＮ−赤血球層を１５ｍＬの３％デキストランＴ５００（Ｓｉｇｍａ）と混合し、室温で２時間沈降させた。無菌水を使用して低浸透圧溶解により１８秒間赤血球を取り除き、その後、ＰＢＮリッチ層を遠心分離により集めた。集めたＰＢＮの純度は、ライト・ギムザ染色を用いた形態学的分析により測定して、９５％超であった。ＰＢＮ単離の完了直後の新しく精製されたＰＢＮをアッセイに用いた。
【００５０】
細胞増殖および細胞死
文献１７、２９に記載されているように標準的血球計数器を用いた細胞計数により細胞増殖を測定した。簡単に説明すると、同数の細胞を３通り播種し、播種の７２時間後１３日まで細胞を計数した。トリパンブルー色素排除を使用して、培養液中の細胞増殖およびその関連細胞死を同時に測定した。
【００５１】
顆粒球分化の形態学的分析
文献１７、２９に記載のように、細胞懸濁液をマイクロスライド上に細胞遠沈し、続けて、メタノールにより固定した後、ライト・ギムザ染色（Ｓｉｇｍａ）により染色した。文献１７に記載のように、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡を使用して分化の形態学的指標を評価し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで画像のカラーバランス処理を行った。
【００５２】
透過電子顕微鏡観察
Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＣＨＬＡ／ＵＳＣのメンバーにより好中球および細菌感染の超微細構造調査が行われた。以下に手順の詳細を示す。
【００５３】
ウェスタンブロッティング
文献１５に記載のように、ウェスタンブロッティング（ＷＢ）を行った。ラクトフェリン抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ＭＭＰ−９（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＬＬ−３７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を分析に使用した。
【００５４】
脱顆粒分析
細胞に大腸菌ＤＨ５α（ＭＯＩ：５；細胞／細菌比率：１／５）を加えた場合と加えない場合について、無血清ＤＭＥＭ培地中、３７℃で３０分間インキュベートした。３，０００−ｒｐｍ、７分間の遠心分離により両方の細胞ペレットおよび上清を集めた。細胞ペレットを１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートし、続けて、細胞の収集、および細胞タンパク質の抽出を行った。上清を０．２２−μｍフィルター（Ｐａｌｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）で濾過し、３，０００ダルトンを超える質量のタンパク質を集めるように設計されたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心濾過機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して上清中のタンパク質を濃縮した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用してタンパク質の量を測定した２９。大腸菌刺激のある場合とない場合の顆粒タンパク質の量の変化の分析をＷＢによる分析と並行して行った。
【００５５】
食作用および殺菌アッセイ
それぞれ、５×１０５〜２×１０６の新しく精製されたＰＢＮ、ならびにエクスビボ誘導されたＧＩＮおよびＡＩＮを１．５−ｍｌのチューブ中の５００μｌの培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）に懸濁した。対数期大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（共同研究者から提供を受けた）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ；ＡＴＣＣ）と共に、ＭＯＩ：５または１０で、３７℃の温度下、１５、３０、および／または６０分間細胞をインキュベートした。他方、細胞が無い場合は、細菌を使用して増殖を測定した。それぞれの時点で、細胞のある場合とない場合の試料を１０００−ｒｐｍで遠心分離した。上清から細胞の存在下の細胞外細菌を集め、異なる稀釈度（２０μＬ毎の）で血液寒天培地に播種して数え上げた。細菌感染試料から集めた細胞ペレットを１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で１時間さらにインキュベートして細胞外細菌を死滅させた。その後、細胞を２回洗浄し、１００μＬの０．５％トリトンＸ−１００に溶解した。細胞ライセートから回収した生存細胞内細菌の異なる希釈度の一定量（それぞれ、２０μＬ）を血液寒天培地に播種した。文献５、３０に記載のようにして、各時点で、細胞外および生存細胞内細菌の数をＣＦＵ数により測定した。他方、食菌された菌および死菌の数は、好中球不含条件の当該細菌対照の数に対する細胞外および生存細胞内細菌の数に基づいて求めた５、３０。
【００５６】
ＣＤ１５＋好中球の磁気選別
０．５％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中懸濁細胞を磁気ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合させた抗ＣＤ１５抗体と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。その後、磁気選別機（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使い、メーカーのプロトコルに従ってＣＤ１５＋亜集団を精製した。
【００５７】
統計解析
必要に応じ、平均、標準偏差、および分布範囲を含む記述統計を算出し、スチューデント独立両側ｔ検定で解析した。０．０５以下のＰ値を統計的に有意であると見なした。
【００５８】
インサイチュー殺菌
細胞を大腸菌または黄色ブドウ球菌と共に１５分間、および／または６０分間インキュベートし、続けて、１，０００−ｒｐｍ、５分間の遠心分離で細胞を集めた。細胞ペレットを１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄後、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して４℃で２０分間透過処理した。細胞を再度洗浄し、細胞内生存および死細菌の標識のために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ＢａｃＬｉｇｈｔ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用してメーカーのプロトコルに従ってＰＢＳ中に再懸濁した。細胞をマイクロスライド上に遠心沈降させ、クリプトン／アルゴンレーザーの４８８および５６４ｎｍの波長を使用して共焦点顕微鏡下で検査した。無傷膜を有する蛍光染料ＳＹＴＯ９染色生細菌は、緑色に見え、一方、傷害膜を有する死細菌は、蛍光染料ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で赤色に染色された。
【００５９】
細菌感染の免疫蛍光法検出
ＧＩＮ、ＡＩＮ、およびＰＢＮを大腸菌または黄色ブドウ球菌と共にＭＯＩ：１０で、３７℃において、１５分間および６０分間インキュベートした。細胞を２％パラホルムアルデヒドを使用して室温で２０分間固定し、その後、５％正常ヤギ血清を含むＰＢＳで３０分間ブロッキングした。感染後に細胞表面に保持されている細菌のＯｍｐＡ抗原を遮断するために、最初に、細胞を抗ＯｍｐＡ抗体で１時間、室温でインキュベートし、続けて、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体と共に室温で３０分間インキュベートして、外部一次抗体部位を遮断した。徹底的に洗浄後、細胞を透過処理溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して２０分間透過処理した後、細胞内細菌標識用抗ＯｍｐＡ抗体と共に室温で１時間インキュベートした。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と共に３０分間の細胞のインキュベーション後、細胞をマイクロスライド上に遠心沈着させ、ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ退色防止溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を使用してマウントした。ＦＩＴＣ−染色細菌を共焦点顕微鏡で画像化した。
【００６０】
フローサイトメトリー解析
抗ヒトＣＤ６６−ＰＥ（ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、およびＣＤ６６ｅサブユニットを識別する）、ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ、ＣＤ１８−ＦＩＴＣ、およびＣＤ６６ｂ−ＰＥ抗体、ならびに、それらの対応するアイソタイプをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。抗ヒトＣＤ６６ａ−ＰＥおよびその対応するアイソタイプをＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から入手した。データを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン７．６．５；Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）で解析した。
【００６１】
実施例２
Ａｍ８０は、Ｇ−ＣＳＦより効果的に好中球分化を促進する
Ａｍ８０、ＣＨ５５、およびＩＴＹＡは、ヘテロ原子をＲＡ様構造に導入することにより合成されたレチノイドアゴニストの群である（図５）。これら全てのアゴニストが強力なレチノイド様活性を有することから、本発明者らが確立した方法１７、２９を使用して、ＣＤ３４＋細胞からの顆粒球生成の誘導の観点からこれらの化合物の効率をＧ−ＣＳＦおよびＲＡと比較した。本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦが、より大きい単球の誘導が伴うＣＤ３４＋細胞から顆粒球への形態学的分化の誘導においてＲＡよりも効果的ではなかったことを示した（図６Ａ）。しかし、Ｇ−ＣＳＦは、ＲＡに比べて、より大きな細胞増殖およびより低い比率の細胞死を誘導した（図６Ｂ）。他のレチノイドアゴニストの中で、６０％を超える単球を産生したＩＴＹＡ（５ｎＭ）とは対照的に、Ａｍ８０（１０ｎＭ）およびＣＨ５５（５ｎＭ）は、１３日目までに７５％を超える顆粒球分化を進めた（図６Ｃ）。Ａｍ８０およびＣＨ５５の両方ともＲＡ（図６Ｂ）と同様に細胞増殖を抑制したが（図６Ｄ）、Ａｍ８０処理に関連する細胞死比率は、ＣＨ５５またはＲＡで認められたものより低かった（図６Ｂ、６Ｄ）。同時に、これらのデータは、Ｇ−ＣＳＦの場合、顆粒球分化の誘導因子としての有効性がＲＡ、ＣＨ５５、およびＡｍ８０よりも有意に低く、一方、ＩＴＹＡは、主に、単球分化を誘導にすることを示す。Ａｍ８０、ＲＡ、およびＣＨ５５は、類似の有効性で顆粒球分化を推進するが、Ａｍ８０は、より低い比率の細胞死を誘導にする。
【００６２】
１２日目のＧ−ＣＳＦ誘導による低レベルのＣＤ３４＋細胞の顆粒球への分化が、より高いレベルの単球誘導と関連していたために、Ｇ−ＣＳＦは、短期間でより効果的に顆粒球分化を誘導できる可能性がある。従って、ＣＤ３４＋細胞を６、９、および１２日間Ｇ−ＣＳＦで処理した。これらの細胞の形態学的分化の分析により、本発明者らは、９または１２日目に比べて、６日目の最低比率の単球誘導に伴うより効果的な顆粒球分化を認めた（図１Ａ）。この最適の６日誘導条件を使用して、ＣＤ３４＋細胞の顆粒球分化誘導能力に関して、Ｇ−ＣＳＦおよびＡｍ８０を比較した。１０ｎＭのＡｍ８０がより多くの細胞死を誘導したので（図６Ｃ）、この試験では、低減した濃度（２．５ｎＭまたは５ｎＭ）のＡｍ８０で置換した。結果は、Ａｍ８０の２．５ｎＭは、無視できる程度の単球誘導と共に、顆粒球分化を著しく誘導した（図１Ｂ）のみでなく、５ｎＭのＡｍ８０より少ない毒性である（図１Ｃ）ことを示した。従って、これらの結果は、Ｇ−ＣＳＦにおける６日目間の最適誘導期間は、Ａｍ８０（２．５ｎＭ）にも同様に適切であり、調査の残りの部分に対して、このような薬剤暴露時間および薬剤用量を適用するよう本発明者らに促していることを示す。
【００６３】
ＣＤ３４＋細胞の好中球分化を、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、および帯状核好中球段階から分葉核成熟好中球段階までについて解析した。ＣＤ３４＋細胞をＧ−ＣＳＦまたはＡｍ８０で６日間処理した。顆粒球の形態学的分析は、Ａｍ８０により好中球の逐次的成長が十分に誘導されたことを示した。対照的に、Ｇ−ＣＳＦは、帯状核および分葉核好中球よりも多くの骨髄芽球、ならびに前骨髄球および骨髄球を誘導した（図１Ｄ）。さらに、Ｇ−ＣＳＦは、常に、単球を誘導した（約１０％；図１Ａ、１Ｄ）。これらの結果は、類似の比率の細胞毒性でありながら、好中球の形態学的分化の誘導では、Ａｍ８０がＧ−ＣＳＦより効果的であることを示す。
【００６４】
顆粒の産生と分泌に関し、ＧＩＮよりＡＩＮがより効果的である
好中球分化の間、異なる病原体に対する最前線の防衛のために、顆粒タンパク質の異種集団が順次産生され、細胞中に貯蔵される３２、３３。本発明者らは、Ａｍ８０強化好中球成熟が顆粒産生の増加と関連しているかどうかを調査した。Ｇ−ＣＳＦおよびＡｍ８０によりＣＤ３４＋細胞から６日間誘導された好中球を、透過電子顕微鏡により解析した。超微細構造画像は、分葉核好中球レベルでは、ＧＩＮは、僅かの一次および二次様顆粒と共に、より低密度の無定形物質を含むことが多い種々の数の小胞を有していることを示した。対照的に、ＡＩＮ中に認められた小胞は、密な物質または無定形かつ密な物質で満たされていることが多かった。ＧＩＮに比べて、ＡＩＮは、ＰＢＮ中に認められるような、増加した数の一次および二次様顆粒を含んでいた。従って、データは、小胞形成および顆粒産生に関し、ＧＩＮとＡＩＮとの間で、顕著な違いを示している。
【００６５】
本発明者らは、Ａｍ８０誘導された顆粒球分化が実際に十分な顆粒産生と関連しているかどうかを検証し、細菌性刺激時のＡＩＮの脱顆粒能力を試験した。ＣＤ３４＋細胞をＧ−ＣＳＦまたはＡｍ８０で６日間処理した。その後、得られたＧＩＮおよびＡＩＮを大腸菌のある場合と無い場合について、３０分間インキュベートし、続けて、細胞ライセートおよび上清の両方からタンパク質を抽出した。顆粒産生および分泌のＷＢ分析は、強力で広範な抗微生物活性を有する二次顆粒のラクトフェリン３４、３５がＡＩＮ中に貯蔵され、細菌性刺激時に十分な量で培地中に分泌されたことを示した。対照的に、ラクトフェリンのレベルは、細菌性刺激に伴いＧＩＮ中で増加したが、ＧＩＮによるラクトフェリン分泌の効率は、ＡＩＮで認められるよりはるかに低かった（図２Ａ）。同様に、高レベルの二次顆粒ＬＬ−３７がＡＩＮ中で観察され、細菌性刺激時に、ＬＬ−３７顆粒が効果的に培地中に放出された。他方、ＧＩＮは、ＬＬ−３７産生および脱顆粒の両方の欠如を示した（図２Ｂ）。従って、ＡＩＮによりラクトフェリンおよびＬＬ−３７の両方が効率的に産生され、分泌されたが、ＧＩＮではそうではなかった。
【００６６】
大腸菌が存在しない場合であっても、ＧＩＮは、ＭＭＰ−９（三次顆粒）を培地中に分泌するが、この分泌は細菌性刺激により抑制された（図２Ｃ）。他方、大腸菌は、ＡＩＮ中のＭＭＰ−９発現を増強するが、細菌性刺激は、ＡＩＮのＭＭＰ−９の分泌誘導ができなかった（図２Ｃ）。これらの観察は、エクスビボ誘導ＧＩＮおよびＡＩＮでのＭＭＰ−９誘導または脱顆粒（または両方）における欠陥の存在の可能性を示している。
【００６７】
ＡＩＮはＧＩＮより有意に高い食作用および殺菌活性を有する
上記調査は、顆粒球の形態学的分化および顆粒産生／分泌の両方の促進に関し、Ａｍ８０がＧ−ＣＳＦより効果的であることを示す（図１、２）。本発明者らは、Ａｍ８０により誘導されたこのより高い好中球分化の程度が細菌感染に対するより強力な好中球免疫に繋がるのかどうかを明確化した。Ａｍ８０が、Ｇ−ＣＳＦよりも多くの帯状核型および分葉核型好中球を誘導にする（図１）ことから、ＧＩＮおよびＡＩＮから選別された帯状核および分葉核好中球が類似の殺菌活性を有するかどうかを試験した。好中球は、ＣＤ１５＋細胞３６であるから、ＧＩＮおよびＡＩＮを磁気ミクロビーズ結合抗ＣＤ１５抗体を使用して精製した。精製後、未選別ＧＩＮ中の帯状核／分葉核好中球比率は、選別ＡＩＮでの知見と同様に、選別ＧＩＮ中では２１％から６３％に増加した（図３Ｂ）。さらに、選別ＧＩＮ中の残留単球の比率は、約１％にすぎなかった（図３Ａ）。次に、新しく単離／精製された９５％超の分葉核好中球から構成されるＰＢＮと一緒に、これらの未選別および選別ＧＩＮおよびＡＩＮの対数期大腸菌を死滅させる能力を試験した（図３Ｂ）。注目すべことに、未選別ＧＩＮに比べて、ほんの僅かの生菌のみが、ＰＢＮおよび未選別ＡＩＮの細胞内の区画から回収されたことがＣＦＵ数から示された（図３Ｃ）。未選別ＧＩＮの場合と同様に、選別ＧＩＮもまた、細菌を死滅させる能力が選別ＡＩＮよりも有意に低い（図３Ｄ）。ＡＩＮの増強された細菌排除能は、特異的に大腸菌外膜を識別する抗ＯｍｐＡ抗体を使用して大腸菌のインサイチュー標識により確認された。これらの結果は、Ａｍ８０により誘導された顆粒球生成により生ずる好中球分化のレベルが細菌感染に有効な好中球免疫形成には不可欠であることを示す。この観察は、分葉核好中球形態を有するＧＩＮは、いまだ、低レベルの顆粒様分子状態を示し、より大きな数のより低い密度の無定形小胞を含むというデータにより裏付けられている。
【００６８】
細菌感染に対する生来の免疫は、好中球分化の間に発生する。この機能をＡＩＮとＧＩＮとの間で比較するために、ＣＤ３４＋細胞をＧ−ＣＳＦまたはＡｍ８０で６日間処理し、続けて、食作用と殺菌の分析を行った。以前記載の方法３１、３７を使用して、ＧＩＮ、ＡＩＮ、およびＰＢＮを対数期大腸菌と共にＭＯＩ：５で、または、好中球が無い場合は、細菌増殖をモニターするために大腸菌を使用して、１５または６０分間インキュベートした。細胞外細菌および回収生存細胞内細菌の両方を、好中球を細菌に暴露した試料中のＣＦＵ数により定量した。次に、好中球不含の条件の細菌の数から細胞外細菌のみ、または細胞外および細胞内細菌の両方の数をそれぞれ減算することにより、食菌された菌および死菌の数を計算した。ＰＢＮおよびＡＩＮの両試料で、細胞外細菌が有意に減少した（図４Ａ、４Ｂ）。ＰＢＮは、細菌を急速に１５分以内に死滅させ、ＰＢＮまたはＡＩＮ試料中には、６０分までに、僅かの生存細胞内細菌しか存在しなくなる（図４Ｃ）。対照的に、ＧＩＮは、感染の６０分までに細胞内細菌の実質的な排除障害を示し、より高レベルの細胞外細菌を残し、殺菌が不完全であった（図４Ａ〜Ｄ）。ＡＩＮがＧＩＮより大きな殺菌力を有することを確認するために、ＳＹＴＯ９蛍光染料標識生菌およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）蛍光染料標識死菌の両方の共焦点顕微鏡を使用してインサイチュー殺菌を試験した。結果は、ＡＩＮまたＰＢＮ試料中の観察の場合とは対照的に、ＧＩＮ試料中には、有意により多くの生存大腸菌が残され、はるかに少ない死細菌が認められることを示した。感染後の細胞外細菌、ならびにインサイチュー死細菌の両方の定量化により、ＡＩＮおよびＰＢＮの両方がＧＩＮより大きな殺菌活性を有することが確認された（図４Ｅ）。さらに、電子顕微鏡による大腸菌感染の超微細構造画像により、より低密度小胞を含むＧＩＮ中には、多数の無傷の／生存細菌が残され、一方、ＰＢＮと同様に、ＡＩＮ中ではほんの僅かの無傷の／生存細菌のみが特定され、その細胞質はいくつかの一次および二次様顆粒と共に密な小胞を含んでいることが示された。まとめると、これらのデータは、Ａｍ８０によって誘導される顆粒球分化が、細菌感染に対し増強された好中球の生来の免疫と関連することを示唆している。
【００６９】
実施例３
Ａｍ８０は、Ｇ−ＣＳＦに比べて競合的な好中球回復を誘導にする
実験用に、３０匹のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスを無作為に６群に分けた。異なる用量のＡｍ８０およびＧ−ＣＳＦを用いた好中球回復の分析用実験計画を図７Ａに示す。０日目に、２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＰＡ）の単回腹腔内注射投与を行って好中球減少症を誘導した。ＣＰＡ注射の４時間後から続けて３日間、Ａｍ８０またはＧ−ＣＳＦまたはビヒクルを投与した。ＣＰＡ注射の４８〜６０時間後、マウス好中球減少症が誘導された。３日目に実験を行った。３日目に安楽死対照マウスから末梢血（ＰＢ）を集め、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（１．０８４）を使用してＰＢ好中球を精製した。顆粒球の形態学分析（図７Ｂ）により分かるように、好中球の大部分をＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅの下位層で特定した。３日目の異なる用量のＡｍ８０またはＧ−ＣＳＦで処理された好中球減少症マウス由来の白血球（ＷＢＣ）および好中球回復の分析を図７Ｃに示す。５ｍｇ／ｋｇのＡｍ８０は、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅの下位層中に、２５０μｇのＧ−ＣＳＦに比べて競合的な好中球回復を示した。
【００７０】
実施例４
好中球減少症マウスでＡｍ８０により動員された好中球は、Ｇ−ＣＳＦの場合より大きな殺菌力を示す
本発明者らは、ＣＰＡ注射後３日目に、対照マウスに比べて、全実験マウスでＷＢＣおよび好中球の両方の極度の減少が生じたことに気付いた（図８Ａ）。その後５日目に、急いで２日続けてＧ−ＣＳＦまたはＡｍ８０またはビヒクルの注射を行い、Ａｍ８０に比べて、Ｇ−ＣＳＦにより極めて加速度的な好中球回復が誘導される一方、ビヒクル群の好中球数も同様に、ほぼ対照値に戻った（図８Ａ〜Ｂ）。ＧＩＮ試料で示されるように、これらの好中球を異なる群のマウスのＰＢ（全体中の２０マウス）から精製し、黄色ブドウ球菌感染に対するインビトロ殺菌活性の解析用に使用した。本発明者らは、ビヒクルで処理されたＣ−ＭＰＢＮから単離された好中球よりも、ＭＰＢＮ、ＡＩＮ、またはＧＩＮによって細胞外細菌が大きく除去され、また、ＡＩＮは、細菌除去に関しＧＩＮおよびＣ−ＭＰＢＮの両方よりより極めて効果的であることを見出した（図８Ｃ）。ＭＰＢＮと同様に、ＡＩＮは、ＧＩＮまたはＣ−ＭＰＢＮより有意に多くの細菌を食菌し、死滅させた。加速度的好中球回復は、７日目に終わったので（図８Ｄ）、本発明者らは、９日目に異なるマウスのＰＢ由来の好中球を精製して（図８Ｅ）加速度的好中球回復の停止後のそれらの殺菌活性を比較した。結果は、ＭＰＢＮおよびＡＩＮの両方がまだＣ−ＭＰＢＮより有意に高い殺菌力を示し、一方、ＧＩＮとＣ−ＭＰＢＮとの間で食作用または殺菌における差が認められないことを示した（図８Ｆ）。これらの知見は、好中球回復の初期段階で、Ｇ−ＣＳＦがＡｍ８０より顕著に多くの好中球を誘導できる場合であっても、ＭＰＢＮと同様に、好中球減少症マウス中でＡｍ８０に動員された好中球は、黄色ブドウ球菌感染に対し、Ｇ−ＣＳＦより有意に高い有効性を示すことを実証する。さらに、Ｃ−ＭＰＢＮ数は、好中球回復の後期に対照値より有意に高いレベルに達するが、Ｃ−ＭＰＢＮの殺菌活性は、ＭＰＢＮまたはＡＩＮより有意に低いままである。
【００７１】
文献３１、３２に記載のように、単回用量のＣＰＡにより誘導された好中球減少症マウスモデルを使用して、本発明者らは、Ａｍ８０によりインビボで動員された好中球が実際に、Ｇ−ＣＳＦに比べて、細菌感染に対しエクスビボモデルで観察されたのと同じ大きな好中球免疫を有するかどうかを試験した。（図８Ａ〜Ｆ）。インビボ実験用として、２０匹のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスを無作為に４群に分けた。０日目に２００ｍｇ／Ｋｇの量のＣＰＡを投与した。２５０μｇ／ＫｇのＧ−ＣＳＦ、または５ｍｇ／ＫｇのＡｍ８０を０、１および２日目に投与した。３×１０７黄色ブドウ球菌の腹腔内接種の１６時間後の対数増殖相で、腹腔中（図８Ｇ−ｉ）およびＰＢ中（図８Ｇ−ｉｉ）の生存細胞外細菌の数を測定することにより、精製好中球の殺菌活性を解析した。３ｍｌのＰＢＳ洗浄腹水、ならびに推定１．５ｍｌの全血漿を使用して生菌の数を計数した。腹腔中生菌のＰ値：Ａｍ８０対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜２．４Ｅ−８；対照対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜４．７Ｅ−９；ビヒクル対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜８．３Ｅ−３；Ａｍ８０対ビヒクル、Ｐ＜３．１Ｅ−９；Ａｍ８０対対照、Ｐ＜０．０３８。図８Ａ−ｉｉｉは、図８Ｇ−ｉおよび８Ｇ−ｉｉからの合計生存細胞外細菌を示す。Ａｍ８０対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜１．９Ｅ−６；対照対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜９．４Ｅ−９；ビヒクル対Ｇ−ＣＳＦ、Ｐ＜６．５Ｅ−４；Ａｍ８０対ビヒクル、Ｐ＜６．８Ｅ−７；対照対Ａｍ８０、Ｐ＜３．８Ｅ−５。図８Ｇ−ｉｖは、図８Ｇ−ｉｉｉからの生菌の倍数変化を示す。対照群中の生菌を１倍の規準として使用した。
【００７２】
文献３１、３２に記載のように、単回用量のＣＰＡにより誘導された好中球減少症マウスモデルを使用して、本発明者らは、Ａｍ８０によりインビボで動員された好中球が、実際に、Ｇ−ＣＳＦに比べて、細菌感染に対し、インビボモデル（図８Ａ）で観察されたのとおなじ強力な好中球免疫を有するかどうかを試験した。本発明者らは、ＣＰＡ注射後３日目に、対照マウスに比べて、全実験マウスでＷＢＣおよび好中球の両方の極度の減少が生じたことに気付いた（図８Ｂ）。その後５日目に、急いで２日続けてＧ−ＣＳＦまたはＡｍ８０またはビヒクルの注射を行い、Ａｍ８０に比べて、Ｇ−ＣＳＦにより極めて加速度的な好中球回復が誘導され、一方、ビヒクル群の好中球数も同様に、ほぼ対照値に戻った（図８Ｂ〜Ｃ）。ＧＩＮ試料で示されるように、これらの好中球を異なるマウスのＰＢから精製し、黄色ブドウ球菌感染に対するインビトロ殺菌活性の解析用に使用した。本発明者らは、ビヒクルで処理されたＣ−ＭＰＢＮから単離された好中球よりも、ＭＰＢＮ、ＡＩＮ、またはＧＩＮによって細胞外細菌が大きく除去され、また、ＡＩＮは、細菌除去に関しＧＩＮおよびＣ−ＭＰＢＮの両方よりより極めて効果的であることを見出した（図８Ｄ）。ＭＰＢＮと同様に、ＡＩＮは、ＧＩＮまたはＣ−ＭＰＢＮより有意に多くの細菌を食菌し、死滅させた。加速度的好中球回復は、７日目に終わったので（図８Ｅ）、本発明者らは、９日目に異なるマウスのＰＢ由来の好中球を精製して（図８Ｆ）加速度的好中球回復の停止後のそれらの殺菌活性を比較した。結果は、ＭＰＢＮおよびＡＩＮの両方がまだＣ−ＭＰＢＮより有意に高い殺菌力を示し、一方、ＧＩＮとＣ−ＭＰＢＮとの間で食作用または殺菌における差が認められないことを示した（図８Ｇ）。これらの知見は、好中球回復の初期段階で、Ｇ−ＣＳＦがＡｍ８０より顕著に多くの好中球を誘導できる場合であっても、ＭＰＢＮと同様に、好中球減少症マウス中でＡｍ８０に動員された好中球は、黄色ブドウ球菌感染に対し、Ｇ−ＣＳＦより有意に高い有効性を示すことを実証する。さらに、Ｃ−ＭＰＢＮ数は、好中球回復の後期に対照値より有意に高いレベルに達するが、Ｃ−ＭＰＢＮの殺菌活性は、ＭＰＢＮまたはＡＩＮより有意に低いままである。
【００７３】
本明細書の調査は、ＣＤ３４＋細胞のＡｍ８０処理によりエクスビボおよびインビボ生成された好中球は、より大きな分化成熟度を示すのみならず、細菌感染に対しＧ−ＣＳＦより高い有効性も有することを示している。これは、ＣＤ６６のＣＤ１８との機能的相互作用を連携して働かせて顆粒球生成から生ずる好中球生来の免疫の発生を強化することによると思われる。さらにこのような調節機構の特定により、レチノイド媒介顆粒球生成および好中球分化に対する新しい洞察が得られるであろう。これは、さらには、好中球減少症に対する効果的な治療を開発するための、ならびに、好中球減少症の持続期間を減らすための、対費用効果の高い治療分子としてＡｍ８０を利用した輸血治療用のエクスビボ生成顆粒球のための説得力のある分子学的基礎を与えるであろう。
【００７４】
参考文献
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【００７５】
上述の種々の方法および技術は、本願を実施する多くの方法を提供する。むろん、記載した全ての目的または利点が必ずしも本明細書記載のいずれかの特定の実施形態により達成できるわけではないことは理解されたい。従って、例えば、当業者であれば、方法により、本明細書で教示された、または示唆された他の目的または利点を達成することを必ずしも必要とせずに、本明細書で教示の１つの利点または一群の利点を達成または最適化するように行うことができることが理解するであろう。種々の選択肢が本明細書で述べられている。いくつかの好ましい実施形態では、特に、ある特徴、別の特徴、またはいくつかの特徴が含まれる一方で、他の実施形態では、特に、ある特徴、別の特徴、またはいくつかの特徴が除外され、また一方で、他の実施形態では、ある特徴、別の特徴、またはいくつかの特徴を包含することにより特定の特徴が弱められていることを理解されたい。
【００７６】
さらに、当業者であれば、異なる実施形態からの種々の特徴の適用性についても理解できるであろう。同様に、上記で考察した種々の要素、特徴、およびステップ、ならびに、それぞれのこのような要素、特徴またはステップに対する他の既知の均等物の種々の組み合わせが当業者により採用され、本明細書記載の原理に基づく方法が実行できる。様々な実施形態においては、種々の要素、特徴、およびステップの内で、いくつかが特に包含され、また、他のものが特に除外されることがあるであろう。
【００７７】
本願が特定の実施形態および実施例に照らして開示されてきたが、当業者であれば、本願の実施形態が、具体的に開示された実施形態を超えて他の代替実施形態および／または用途、ならびにその変形物および均等物に展開できることを理解するであろう。
【００７８】
一部の実施形態では、本願の特定の実施形態の記載に関連して（特に、特定の次の請求項に関連して）使用される用語の「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の言及は、単数形および複数形の両方を包含すると解釈できる。本明細書における値の記載の範囲は、その範囲内に入るそれぞれ別々の値を個別に参照する省略表現法として機能することを意図しているに過ぎない。本明細書で特に指示がない限り、それぞれの個別値は、あたかもそれが個別に本明細書中に記述されているかのように明細書中に組み込まれる。本明細書で特に指示がない限り、または別の理由で文脈と明確に矛楯することがない限り、全ての本明細書記載の方法は、任意の適切な順番で実行できる。本明細書の特定の実施形態に関連して用いられるいずれかのおよび全ての例、または代表を意味する用語（例えば、「ｓｕｃｈ  ａｓ」）の使用は、本願をより良く解明する意図によるものに過ぎず、別に請求される本願の範囲に制限を課すものではない。明細書中のどの用語も、本願の実施に必須のいずれかの非請求要素を示すものと解釈されるべきではない。
【００７９】
本願の好ましい実施形態は、本明細書に記載されており、これには、本発明者らに既知の、本願を実行するための最良の形態が含まれる。これらの好ましい実施形態に対する変更は、前出の記載を読めば当業者には明らかになるであろう。当業者であれば、必要に応じてこのような変更を採用して、本明細書で具体的に記載の方法とは別の方法で本願を実施できることは考慮されている。従って、本願の多くの実施形態は、適用法で認められている本明細書に添付の請求項に記載の主題の全ての変形物および均等物を含む。さらに、本明細書で特に指示がない限り、または別の理由で文脈と明確に矛楯することがない限り、その全ての可能な変形における上述の要素のいずれかの組み合わせは、本願に包含される。
【００８０】
本明細書で参照された全ての特許、特許出願、特許出願公報、および、論文、本、仕様書、出版物、文書、種々資料などの他の資料は、上述の資料、本文書と一致しない、または矛盾する上述の資料のいずれか、または、本文書と関連する現時点のまたは以後の時点の請求項の最も広範な範囲に関して限定する作用をする可能性のある上述の資料のいずれかに関連するいずれかの審査履歴を除いて、その参照によりその全体が本願において本明細書に援用される。例えば、組み込まれた資料に関連するいずれかの説明、定義、および／または用語の使用と本文書に関連するそれらとの間に何らかの不一致または矛盾が存在する場合は、本文書中の説明、定義、および／または用語の使用が優先されるものとする。
【００８１】
最後に、本明細書で開示の出願の実施形態は、本願の実施形態の原理の例示となるものであることを理解されたい。採用可能な他の変形は、本願の範囲内に入る可能性がある。従って、例えば、限定するものではないが、本願の実施形態の別の構成を、本明細書の教示に従って利用可能である。従って、本願の実施形態は、図示および記載された通りの形態に正確に限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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