(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均気孔径が１ｎｍ以上〜１００ｎｍ以下の気孔を有し、前記気孔を形成する気孔表面と外部表面とを含む多孔性シリカナノ粒子と、
前記多孔性シリカナノ粒子の前記気孔表面に結合し、ｉ）前記気孔表面に陰電荷又は陽電荷を付与する官能基、ｉｉ）生理活性物質に特異的に結合するリガンド及びｉｉｉ）前記官能基及び前記リガンドの組み合わせの少なくとも一つと、
前記多孔性シリカナノ粒子の前記気孔の内部に収容されるサイズを有し、前記官能基と前記リガンドの少なくとも一つに結合され、前記多孔性シリカナノ粒子の前記気孔に吸着またはロードされる生理活性物質と、を含み、
前記生理活性物質は、１３．７ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの前記サイズを有するタンパク質であることを特徴とする、生理活性物質伝達用組成物。
【請求項２】
前記生理活性物質は、４４ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの前記サイズを有するタンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質は、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、β−ガラクトシダーゼ、２６Ｓヒトプロテアソーム及びその組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ニッケル、ニッケル−ニトリロ三酢酸、グルタチオン、デキストリン、ビオチン又はストレプトアビジンを含むリガンドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記多孔性シリカナノ粒子の前記外部表面に結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチド及びアプタマーの少なくとも一つをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記タンパク質は、（ｉ）プロテアソームを含むタンパク質複合体、（ｉｉ）カスパーゼ（caspase）、キナーゼ（kinase）及びホスファターゼ（phosphatase）からなる群より選択される酵素、及び（ｉｉｉ）抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記タンパク質は、全身ホルモン、サイトカイン、成長因子及び細胞の分化と増殖を調節するタンパク質、治療過程に関連する調節因子及び傷を治療できる能力を有する成長因子、サイトカイン及びホルモンからなる群より選択されたものを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記タンパク質は、形質変換成長因子−βスーパーファミリー（ＴＧＦ−β）タンパク質または大食細胞−コロニー形成刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）である請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記生理活性物質は、薬物、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はビタミンを含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記多孔性シリカナノ粒子の前記外部表面に結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチド、及びアプタマーの少なくとも一つをさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１の組成物を目的の細胞内に導入する工程を含み、
前記組成物を目的の細胞内に導入する工程は、前記組成物を細胞培養液に加えて前記目的の細胞内に導入する工程を含む生理活性物質の伝達方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、生理活性物質又はタンパク質伝達用組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物伝達システムとは、薬物の副作用を最小限に抑え、効能及び効果を極大化し、必要な量の薬物、例えば、タンパク質、核酸又はその他の低分子などを効率よく伝達しようとする医薬技術を意味する。新薬開発に必要なコストと時間を低減する効果を有する前記技術は、最近になってナノテクノロジーと結合し、医薬系において新たな付加価値を創出する先端技術の一分野として位置づけられている。米国や日本などの技術先進国では、去る８０年代後半から、製薬会社などの企業を中心に新薬開発とともに薬物伝達システムの開発に全力を注いでいる。
【０００３】
これまでは、ウイルス遺伝子、組換えタンパク質、リポソーム（liposome）、陽イオン性高分子、並びに様々な形態のナノ粒子及びナノ物質が、動物細胞内への薬物伝達に使用されてきた。しかし、多くの陽イオン性リポソームと陽イオン性高分子は、細胞に強い毒性を示すため、臨床に適用するには不適なことが判明した。また、核酸の安定な細胞膜透過のために、核酸の主鎖を化学的に変形する方法も試みられた。しかし、この方法は、高コストで長時間がかかり、労働集約的な工程を必要とするため、臨床への適用には適していない。意味のある試みとして、量子ドット、磁性粒子又は金ナノ粒子を含む様々な形態のナノ粒子を用いる薬物伝達システム（drug delivery system、ＤＤＳ）が開発されている。その関連研究として、例えば「多孔性シリコン粒子を用いた画像診断薬物伝達体及びその製造方法（大韓民国公開特許第２０１０−０１１７４３３号）」などがある。しかし、これらの粒子は、細胞に毒性を示し、核酸などの生体高分子を導入するのに容易でない構造を有し、また細胞内への導入効率も低いという欠点があった。
【０００４】
細胞内におけるタンパク質の機能の研究またはタンパク質の細胞内伝達のためには、効率いいタンパク質伝達システムが必要となる。しかしながら、共通に陰電荷を帯びるＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸とは異なり、タンパク質は、共通の電荷を有しておらず、かつ不安定なため、容易に変性する特徴がある。このため、汎用的に適用できるタンパク質伝達システムが未だ開発されていない。現在開発されているタンパク質伝達システムは、タンパク質の活性維持が困難であり、複数のタンパク質に共通して適用しにくいため、使用に制約がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願の一具体例は、生理活性物質又はタンパク質伝達用組成物及びその用途に関するものである。
【０００６】
本願の一具体例は、タンパク質を多孔性シリカナノ粒子の気孔内に導入して目的の細胞内に伝達することができ、前記伝達過程における生体内の分解酵素による前記タンパク質の分解を抑制することができ、その表面に抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーが結合され、前記生体高分子の細胞内への導入を促進するか、又は特定の細胞への導入を選択的に誘導する多孔性シリカナノ粒子を含むタンパク質伝達用組成物、及び前記タンパク質伝達用組成物を用いた用途（例：薬剤学的に許容可能な用途）及びタンパク質の伝達方法を提供しようとする。
【０００７】
但し、本願が解決しようとする課題は、以上で言及した課題に制限されない。言及されていない他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解されるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願の一具体例は、生理活性物質又はタンパク質伝達用組成物及びその用途に関するものである。
【０００９】
本願の一具体例は、タンパク質を多孔性シリカナノ粒子の気孔内に導入して目的の細胞内に伝達することができ、前記伝達過程における生体内の分解酵素による前記タンパク質の分解を抑制することができ、その表面に抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーが結合され、前記生体高分子の細胞内への導入を促進するか、又は特定の細胞への導入を選択的に誘導する多孔性シリカナノ粒子を含むタンパク質伝達用組成物、及び前記タンパク質伝達用組成物を用いた用途（例：薬剤学的に許容可能な用途）及びタンパク質の伝達方法を提供する。
【００１０】
但し、本願が解決しようとする課題は、以上で言及した課題に制限されない。言及されていない他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解されるだろう。
【発明の効果】
【００１１】
本願の一具体例によると、高効率のタンパク質伝達用組成物又は生理活性物質伝達用組成物を提供することができる。本願の一具体例に係るタンパク質伝達用組成物又は生理活性物質伝達用組成物は、多孔性シリカナノ粒子の気孔の内部若しくは外部にタンパク質又は生理活性物質を導入することができる。これにより、タンパク質又は生理活性物質を細胞内に導入時、外部環境の影響がより少なくなり、前記タンパク質又は生理活性物質の構造を安定的に維持できるので、伝達効率が高い。また、前記多孔性シリカナノ粒子の表面（非制限的な例として、前記粒子の外部表面）に結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーをさらに含むことにより、細胞内への導入効率も大幅に向上する効果が得られるか、目的の細胞のみに選択的に導入される効果が得られる。
【００１２】
本願の一具体例によると、多孔性シリカナノ粒子を含む溶液と、前記タンパク質又は生理活性物質とを単純混合するだけで、前記のタンパク質又は生理活性物質を前記多孔性シリカナノ粒子の気孔内に導入することができる。つまり、化学的結合、架橋結合又は複雑な精製分離過程を必要としないため、簡単で費用効率的である。
【００１３】
本願の一具体例によると、前記シリカナノ粒子は、高い単分散特性を有し、生体適合性に優れ、細胞毒性を示さないので、疾病治療のために臨床的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本願の一具体例に係る表面改質されたシリカナノ粒子の例を示すものである。
【図２】図２は、本願の一具体例に係る薬物伝達用組成物及びその細胞内作用の模式図である。
【図３】図３は、本願の一実施例に係るタンパク質を含む多孔性シリカナノ粒子が導入された細胞の蛍光顕微鏡画像である。
【図４】図４は、本願の一実施例に係るタンパク質を含む多孔性シリカナノ粒子が導入された細胞の蛍光顕微鏡画像である。
【図５】図５は、本願の一実施例に係るタンパク質を含む多孔性シリカナノ粒子が導入された細胞を染色して示す画像である。
【図６】図６は、本願の一実施例に係るタンパク質を含む多孔性シリカナノ粒子が導入された細胞をＯＮＰＧ分析して示すグラフである。
【図７】図７は、本願の一実施例に係るタンパク質を含む多孔性シリカナノ粒子が導入された細胞における、タンパク質分解酵素の影響を分析して示すグラフである。
【図８】図８は、本願の一実施例に係るタンパク質を含む多孔性シリカナノ粒子が導入された細胞において、タンパク質が正常に機能するかどうかを分析して示すグラフである。
【図９】図９は、本願の一実施例に係るタンパク質を含む多孔性シリカナノ粒子が導入された細胞において、タンパク質が正常に機能するかどうかを分析して示すグラフである。
【図１０ａ】図１０ａは、本願の一実施例に係るＭＳＮＰＮの合成を示す模式図である。
【図１０ｂ】図１０ｂは、本願の一実施例に係るＴＡＭＲＡ−標識のＭＳＮＰＮの合成を示す模式図である。
【図１１】図１１は、本願の一実施例に係るプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの相互作用及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示すものである。
【図１２ａ】図１２ａは、本願の一実施例に係る精製されたプロテアソームの一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色を示すものである。
【図１２ｂ】図１２ｂは、本願の一実施例に係る精製されたプロテアソームのｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣにより視覚化した非変性ゲル分析結果を示すものである。
【図１２ｃ】図１２ｃは、本願の一実施例に係る精製されたプロテアソームのＣＰ及びＲＰサブユニットに対抗する様々な抗体を用いた免疫ブロットの分析結果を示すものである。
【図１３】図１３は、本願の一実施例に係るＭＳＮＰＮ、プロテアソーム、及びＭＳＮＰＮ−プロテアソームの複合体を用いたｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ加水分解分析を示すグラフである（ＲＦＵ：相対蛍光ユニット）。
【図１４】図１４は、本願の一実施例に係るプロテアソーム及びプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの（ａ）免疫ブロット、及び（ｂ）イミダゾール溶出の検定結果を示す画像である。
【図１５】図１５は、本願の一実施例に係るＭＳＮＰＮ及びプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの（ａ）透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像、及び（ｂ）ＤＬＳ（dynamic light scattering）分析結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本願の一実施例に係るプロテアソーム及びプロテアソーム−ＭＳＮＰＮのインビトロプロテアソーム分解分析の結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＩＢ画像である。
【図１７ａ】図１７ａは、本願の一実施例に係るＴＡＭＲＡ−標識されたＭＳＮＰＮ又はプロテアソーム−ＭＳＮＰＮで処理されたＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像である。
【図１７ｂ】図１７ｂは、本願の一実施例に係るＴＡＭＲＡ−標識されたＭＳＮＰＮ又はプロテアソーム−ＭＳＮＰＮで処理されたＨｅＬａ細胞のＴＥＭ画像である。矢印は、細胞質に局在化されたＭＳＮＰＮを示す。
【図１８】図１８は、本願の一実施例に係る（ａ）ＭＳＮＰＮ及び（ｂ）プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの濃度による細胞毒性を示すグラフである。
【図１９】図１９は、本願の一実施例に係るプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの様々なｐＨ条件下におけるｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ分析結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、本願の一実施例に係る（ａ）Ｄｏｘの処理期間、及び（ｂ）処理濃度による誘導可能なタウ細胞株の結果を示す画像である。
【図２１】図２１は、本願の一実施例に係るＤｏｘ、ＭＳＮＰＮ及びプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの誘導可能なタウ細胞株の処理時のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＩＢ画像及び定量分析の結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、本願の一実施例に係るＤｏｘ、ＭＳＮＰＮ及びプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの細胞処理時の、（ａ）外部プロテアソームによる翻訳後のタウ調節を示すグラフ、及び（ｂ）ＭＧ１３２処理細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＩＢ画像である。
【図２３】図２３は、本願の一実施例に係るタウ免疫染色及びＤＡＰＩカウンター染色を用いた顕微鏡蛍光分析画像である。
【図２４】図２４は、本願の一具体例に係る表面改質された多孔性シリカナノ粒子の合成模式図である。
【図２５】図２５は、本願の一実施例に係るタンパク質伝達用組成物の細胞内流入を示す画像である。
【図２６】図２６は、本願の一実施例に係るタンパク質伝達用組成物によるＲＮａｓｅ伝達及び機能的有効性に関する分析結果を示すものである。
【図２７】図２７は、本願の一実施例に係るタンパク質伝達用組成物によるＲＮａｓｅ伝達及びそれによる腫瘍サイズの減少を示すグラフである。
【図２８ａ】図２８ａは、本願の一実施例に係るタンパク質伝達用組成物による抗体の伝達を評価するためのマウスモデル画像である。
【図２８ｂ】図２８ｂは、本願の一実施例に係るタンパク質伝達用組成物による抗体の伝達を評価するための蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下では、添付の図面を参照して、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本願の具体例及び実施例を詳細に説明する。
【００１６】
但し、本願は、ここで説明する具体例及び実施例に限定されず、様々な形態で具現することができる。また、図面においては、本発明を明確に説明するために、説明と関係ない部分を省略しており、明細書全体を通じて類似している部分には類似の符号を付した。
【００１７】
本願の明細書全体において、ある部材が他の部材の「上に」位置しているという場合、これは、ある部材が他の部材に接している場合のみならず、両部材の間にまた他の部材が存在する場合も含む。
【００１８】
本願の明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」という場合、これは、特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除くのではなく、他の構成要素をさらに含み得ることを意味する。本願の明細書全体で使用される程度の用語「約」、「実質的に」などは、言及された意味に固有の製造及び物質許容誤差が提示される場合、その数値でまたはその数値に近接した意味として使用され、本願の理解を助けるために、適確であるか絶対的な数値が言及された開示内容を非良心的な侵害者が不当に利用することを防止するために使用される。また、本願の明細書全体において、「〜（する）段階」又は「〜の段階」は、「〜のための段階」を意味していない。
【００１９】
本願の明細書全体において、マーカッシュ形式の表現に含まれた「これらの組み合わせ」という用語は、マーカッシュ形式の表現に記載された構成要素からなる群より選択される１つ以上の混合または組み合わせを意味するものであり、前記構成要素からなる群より選択される１つ以上を含むことを意味する。
【００２０】
本願の明細書全体において、「Ａ及び／又はＢ」の記載は、「Ａ又はＢ、若しくはＡ及びＢ」を意味する。
【００２１】
本願の明細書全体において、「生理活性物質（bioactive agent）」とは、投与後に、授与者（動物対象）に物理的、生理的、精神的、生化学的、生物学的、或いは他の身体機能に陽性的又は陰性的な方式で影響を与えるいなかる薬剤でも含むものを意味する。
【００２２】
例えば、前記「生理活性物質」は、薬物、タンパク質、ペプチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド（plasmid）ＤＮＡ、小分子（small molecules）、抗体、ウイルス、微生物、体細胞核、細胞小器官、ミトコンドリア、酵素、補助栄養剤、ビタミン、天然物、抽出物、又は他の活性薬剤を含むことができるが、これらに限定されない。前記生理活性物質は、タンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、内因性リガンド、神経伝達物質、ホルモン、オータコイド（autacoid）、サイトカイン（cytokine）、抗ウイルス剤、抗がん剤、抗生物質、酸素エンハンサー、酸素含有剤、抗てんかん剤及び抗炎症薬物からなる群より選択される。例えば、前記の生理活性物質は、カルシトニン、シクロスポリン、インシュリン、オキシトシン、チロシン、エンケファリン、チロトロピン放出ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン、アラキドン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、アンジオテンシン、キニン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、エイコサノイド、バソプレシン及びバソプレシン類似体、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキン、インターフェロン、ＴＧＦ−ベータ（beta）、ＢＭＰ、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子阻害剤及びメラニン細胞−刺激ホルモンからなる群より選択できる。生理活性物質は、アルツハイマー拮抗剤又はワクチンを含むことができる。アルツハイマー病を治療するための生理活性物質は、メマンチン塩酸塩（memantine hydrochloride，Ｍｅｒｚ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＡｘｕｒａ（登録商標））、ドネペジル塩酸塩（donepezil hydrochloride，Ｅｉｓａｉ Ｃｏ. Ｌｔｄ．のＡｒｉｃｅｐｔ（登録商標））、リバスチグミン酒石酸塩（rivastigmine tartrate，ＮｏｖａｔｉｓのＥｘｅｌｏｎ（登録商標））、ガランタミン塩酸塩（galantamine hydrochloride，Ｊｏｈｎｓｏｎ＆ＪｏｈｎｓｏｎのＲｅｍｉｎｙｌ（登録商標））、又はタクリン塩酸塩（tacrine hydrochloride，Ｐａｒｋｅ ＤａｖｉｓのＣｏｇｎｅｘ（登録商標））を含むことができる。生理活性物質は、薬剤学的に有効量を有するコンドロイチン硫酸塩、ヒアルロン酸、成長因子及びタンパク質からなる群より選択される。
【００２３】
例えば、前記の生理活性物質は、インシュリン又はインシュリン類似体を含む。インシュリン増感剤、インシュリン分泌促進剤、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２類似体、ジペプチジルペプチダーゼ４の阻害剤（ＤＰＰ−４阻害剤）、エキセナチド（exenatide）、リラグルチド（liraglutide）、アルビグルチド（albiglutide）、またはタスポグルチド（taspoglutide）、α−グルコシダーゼ阻害剤、アミリン類似体、ナトリウム・グルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２、sodium−glucose co−transporter type 2）阻害剤、ベンフルオレックス（benfluorex）、及びトルレスタット（tolrestat）からなる群より選択される。他の実施例では、インシュリン含有ナノ粒子は、微量の亜鉛又はカルシウムを含むか、腸溶皮が施される。一実施例では、生理活性薬剤は、非インシュリンエキセナチド、非インシュリンプラムリンチド（pramlintide）、インシュリン、インシュリン類似体、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるものを含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
例えば、前記の生理活性物質はまた、オキシトシン、バソプレシン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、プロラクチン、ルリベリン（luliberin）又は黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン分泌因子、ソマトスタチン、グルカゴン、インターフェロン、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロイン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドルフィン、アンジオテンシン、レニン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、アルデステロン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、エストラジオール、エストロゲン、プロゲステロン、テストロテロン、チロキシン（tyroxine）、及びこれらの合成類似体、変形体、及び薬物学的活性断片、モノクローナル抗体、及び可溶性ワクチンからなる群より選択できる。成長ホルモン（ＧＨ）は、ヒト又は他の動物において成長及び細胞再生を刺激するペプチドホルモンである。これは、脳下垂体前葉の側面翼部位内で成長刺激細胞により合成、貯蔵及び分泌される１９１−アミノ酸の単鎖ポリペプチドホルモンである。
【００２５】
例えば、前記の生理活性物質は、細胞毒性薬物、抗ウイルス薬、抗新生物薬、抗炎症薬、抗生物質、鎮痛剤薬物、ＣＮＳで作用する薬物、プロトンポンプ阻害剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、カルシウム拮抗剤、ヒスタミン受容体拮抗剤、コレステロール生合成阻害剤、糖尿病治療剤、アルツハイマー病治療剤、免疫抑制剤、合成抗菌剤、抗腫瘍剤またはそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される。活性薬物部分は、プリンのような抗代謝物質マスカレード（masquerade）、シスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、オキサリプラチン（oxaliplatin）、メクロレタミン（mechlorethamine）、シクロホスファミド、クロラムブシル（chlorambucil）、イホスファミド（ifosfamide）、ビンクリスチン（vincristine）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビノレルビン（vinorelbine）、ビンデシン（vindesine）、ポドフィロトキシン（podophyllotoxin）、エトポシド（etoposide）、テニポシド（teniposide）、ドセタキセル（docetaxel）又はパクリタキセル（paclitaxel）を含むことができる。
【００２６】
本願の明細書全体において、「タンパク質」とは、標的特異的なタンパク質のみならず、免疫グロブリン、糖タンパク質、抗体、ポリペプチド、酵素又はペプチドなどを含むものと理解されるべきである。対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、ヘモグロビン、血清タンパク質、例えば、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸを含む血液因子；免疫グロブリン、サイトカイン、例えばインターロイキン、すなわち、ＩＬ−１ないしＩＬ−１３、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、レクチン、糖結合タンパク質、糖タンパク質、ＳＵＭＯタンパク質、好ましくはインターフェロン、下記にさらに詳細に記載されたようなレクチン、顆粒球コロニー刺激因子をはじめとするコロニー刺激因子、血小板由来成長因子及びホスホリパーゼ（phospholipase）活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）が含まれるが、これらに限定されない。一般的な生物学的又は治療的対象の他のタンパク質には、インシュリン、血管新生誘導因子、例えばＶＥＧＦ、エリスロポエチン（erythropoietin）、植物タンパク質、例えばレクチン（lectin）及びリシン（ricin）、腫瘍壊死因子及び関連タンパク質、成長因子、例えば形質転換成長因子、例えばＴＧＦαまたはＴＧＦβ及び表皮成長因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性生殖腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化剤などが含まれる。タンパク質部分は、免疫グロブリン、糖タンパク質、抗体、ポリペプチド、酵素、ペプチド、インターフェロン（ＩＮＦ）、インターロイキン、ホルモン、ソマトメジン（somatomedin）、エリスロポエチン（erythropoietin）、色素性ホルモン（pigmentary hormone）、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン（prolactin）、絨毛性生殖腺刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン又は組織プラスミノーゲン活性化剤からなる群より選択される。
【００２７】
タンパク質の例としては、蛍光タンパク質、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）、カスパーゼ−３、リパーゼ、フォトリアーゼ（photolyase）、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、ボツリヌス毒素（botulinium toxin）、単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（thyamidine kinase from herpes simplex virus、ＨＳＶ−ＴＫ）、カスパーゼ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、尿酸オキシダーゼ（urate oxidase）、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ（hexosaminidase）、又はマウス（murine）抗ＣＤ３抗体などを含むことができる。
【００２８】
以下、本願の具体例を詳細に説明したが、本願はこれに限定されない。
【００２９】
本願の一局面では、平均気孔径が約１ｎｍ以上〜約１００ｎｍ以下の気孔を有する多孔性シリカナノ粒子、及び前記多孔性シリカナノ粒子の気孔の内部または外部表面に結合され、表面陰電荷又は陽電荷を付与する官能基若しくはタンパク質に特異的に結合するリガンドを含むタンパク質伝達用組成物を提供することができる。
【００３０】
従来の多孔性シリカナノ粒子は、気孔の平均直径が数ｎｍに過ぎないため、タンパク質のような生体高分子が、前記気孔内部に十分に浸透できない短所があった。これに対して、本願の一具体例に係る多孔性シリカナノ粒子は、従来の薬物伝達のための多孔性シリカナノ粒子に比べて、気孔の平均直径がさらに拡張されているだけでなく、気孔の内部または外部表面の表面陰電荷、陽電荷又はタンパク質に特異的に結合するリガンドにタンパク質が吸着又はロードされる。このため、生理活性物質又はタンパク質をさらに容易に前記気孔の内部または外部に含ませることができる。また、本願の一具体例に係る多孔性シリカナノ粒子は、拡張されたサイズの気孔を有するだけでなく、前記粒子の外面と内面の全体に拡張された気孔が形成されており、前記粒子内部の奥深くにも前記の拡張された気孔が形成されている。このため、生理活性物質又はタンパク質をさらに容易に前記粒子の外面と内面の気孔に含ませることができる。
【００３１】
本願の一具体例において、前記タンパク質に特異的に結合するリガンドは、ニッケル、ニッケル−ＮＴＡ（nitrilotriacetic acid）、グルタチオン、デキストリン、ビオチンまたはストレプトアビジンを含むものであってもよいが、これらに限定されない。
【００３２】
本願の一具体例において、前記タンパク質伝達用組成物は、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔表面に結合されたリガンドに前記タンパク質のタグ（tag）が結合することにより、前記多孔性シリカナノ粒子内に吸着又はロードされた前記タンパク質をさらに含むものであってもよいが、これに限定されない。
【００３３】
本願の一具体例において、前記表面陰電荷または陽電荷を付与するリガンドとタンパク質との静電相互作用により、前記タンパク質が前記シリカ粒子の気孔内に吸着又はロード（loading）される前記タンパク質伝達用組成物をさらに含むものであってもよいが、これに限定されない。
【００３４】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子は、気孔の内部または外部表面が陰イオン及び／又は陽イオンを帯びるように表面改質したものであってもよいが、これに限定されない。これにより、前記タンパク質は、陰イオン及び／又は陽イオンを帯びる前記多孔性シリカナノ粒子の気孔の内部または外部表面との静電相互作用により、前記気孔内に吸着又はロード（loading）されるものであってもよいが、これに限定されない。前記多孔性シリカナノ粒子の気孔の内部または外部表面が陰イオン及び／又は陽イオンを帯びるように表面改質することは、吸着又はロードしようとするタンパク質のｐＩ値によって調節できるが、これに限定されない。
【００３５】
本願の一具体例において、前記タンパク質伝達用組成物は、前記多孔性シリカナノ粒子の表面に結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーをさらに含むものであってもよいが、これに限定されない。例えば、前記の抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーは、前記多孔性シリカナノ粒子の外部表面に結合されたものであってもよいが、これに限定されない。前記の抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーは、前記タンパク質が吸着又はロードされた前記組成物が標的細胞内に輸送されるようにする。
【００３６】
本願の一具体例において、前記タンパク質は、プロテアソームなどのタンパク質複合体、カスパーゼ（caspase）、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、キナーゼ（kinase）、ホスファターゼ（phosphatase）などの各種酵素、各種抗体等からなる群より選択されるものを含むことができるが、これらに限定されない。例えば、前記タンパク質は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カスパーゼ−３、リパーゼ、フォトリアーゼ（photolyase）、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、ボツリヌス毒素（botulinium toxin）、単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（thyamidine kinase from herpes simplex virus、ＨＳＶ−ＴＫ）、カスパーゼ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、尿酸オキシダーゼ（urate oxidase）、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ（hexosaminidase）、又はマウス（murine）抗ＣＤ３抗体などを含むものであってもよいが、これらに限定されない。
【００３７】
本願の一具体例において、前記タンパク質は、内因性リガンド、全身ホルモン、サイトカイン（cytokine）、ケモカイン（chemokine）、神経伝達物質、オータコイド（autacoid）、膜タンパク質、細胞質内タンパク質、核内タンパク質、受容体、酵素、血液中タンパク質、合成タンパク質、合成ペプチド、成長因子及び細胞の分化と増殖を調節する他のタンパク質のような正常な治療過程に関連する調節因子などと、このような傷を治療できる能力を有するものとして報告されている成長因子、神経伝達物質としては、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン、アセチルコリン、ギャバ、セロトニン、ヒスタミン、エンケファリン、ソマトスタチン、又はＳｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐなどのアミン系の伝達物質、ペプチド性の伝達物質等からなる群より選択されるものを含むことができるが、これらに限定されない。サイトカイン及びホルモンとしては、ペプチド性ホルモン、アミノ酸性ホルモン、ステロイド性ホルモン、形質変換成長因子−βスーパーファミリー（ＴＧＦ−β）タンパク質、大食細胞−コロニー形成刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、及びプロテアソームなどのタンパク質複合体、カスパーゼ、リボヌクレアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼなどの各種酵素、各種抗体等からなる群より選択されるものを含むことができるが、これらに限定されない。
【００３８】
本願の一具体例において、前記タンパク質は、原生動物、微生物、ウイルス、魚類、深海底生物、両生類、爬虫類、哺乳類、外界動植物の細胞に由来するものであってもよいが、これらに限定されない。
【００３９】
本願の一具体例において、前記組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本願の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されない。本願の薬剤学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。薬剤学的に許容される好ましい担体及び製剤は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995」に詳細に記載されている。
【００４０】
本願の一具体例において、前記薬剤学的組成物は、経口または非経口投与が可能であり、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などにより投与することができる。
【００４１】
本願の一具体例に係る薬剤学的組成物の適当な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの要因によって多様に処方することができる。本願の薬剤学的組成物の１日投与量は、例えば約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
【００４２】
本願の一具体例において、前記薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法に従い、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量の形態で製造するか、又は多容量容器内に入れて製造することができる。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤若しくは乳化液の形態であるか、或いはエキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤若しくは安定化剤をさらに含むことができる。
【００４３】
本願の他の局面では、平均気孔径が約１ｎｍ以上〜約１００ｎｍ以下の気孔を有する多孔性シリカナノ粒子、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔の内部または外部表面に結合され、表面陰電荷又は陽電荷を付与する官能基（リガンド）又はタンパク質に特異的に結合するリガンド、及び前記リガンドに結合された生理活性物質を含む生理活性物質伝達用組成物を提供する。
【００４４】
本願の一具体例において、前記生理活性物質に特異的に結合するリガンドは、ニッケル、ニッケル−ＮＴＡ、グルタチオン、デキストリン、ビオチン又はストレプトアビジンを含むものであってもよいが、これらに限定されない。
【００４５】
本願の一具体例において、前記生理活性物質は、静電相互作用により、前記気孔内に吸着又はロード（loading）されるものであってもよいが、これに限定されない。
【００４６】
本願の一具体例において、前記生理活性物質は、薬物、タンパク質、ペプチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、酵素、補助栄養剤、ビタミン、天然物又は抽出物を含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本願の一具体例において、前記生理活性物質伝達用組成物は、前記多孔性シリカナノ粒子の表面に結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーをさらに含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本願の一具体例では、前記生理活性物質伝達用組成物を目的の細胞内に導入することを含む生理活性物質の伝達方法を提供し、薬剤学的用途に使用することができる。
【００４９】
本願の一具体例において、本願の図１の多孔性シリカ粒子又は生理活性物質伝達用組成物を用いた疾患又は症状の予防または改善用の食品組成物を提供する。
【００５０】
本願の一具体例において、前記食品組成物は、特に限定されないが、健康機能性食品、栄養補助剤、栄養剤、ファーマフード（pharmafood）、健康食品、ニュートラシューティカル（nutraceutical）、デザイナーフードまたは食品添加物などのあらゆる形態の食品であってもよい。例えば、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがある。
【００５１】
本願の一具体例において、前記食品組成物は、食品製造時に通常添加される成分を含むが、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。前述の炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えばマルトース、スクロース、オリゴ糖など；及びポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。香味剤としては、天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど）］及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を用いることができる。
【００５２】
本願の一具体例において、前記食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン類、鉱物（電解質）、食餌成分、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、又は炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。例えば、本願の一具体例において、食品組成物がドリンク剤として製造される場合には、本願の有効成分に加えて、クエン酸、液状果糖、砂糖、ブドウ糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、又は各種の植物抽出液などをさらに含むことができる。
【００５３】
本願の一具体例では、本願の図１の多孔性シリカ粒子又は生理活性物質伝達用組成物を用いた関連疾患の予防または改善用の化粧料組成物（機能性の化粧料組成物）を提供する。
【００５４】
本願の一具体例において、前記化粧料組成物は、当業界で通常製造されるいずれの剤型にも製造することができる。有効成分に加えて、化粧品の製造に通常用いられる成分を含むが、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料などの通常の補助剤を含むことができる。
【００５５】
従来の多孔性シリカナノ粒子は、気孔の平均直径が数ｎｍに過ぎないため、タンパク質のような生体高分子が前記気孔の内部に十分に浸透できない欠点があった。これに対して、本願の一具体例に係る多孔性シリカナノ粒子は、従来の薬物伝達のための多孔性シリカナノ粒子と比較して、気孔の平均直径がさらに拡張されているだけでなく、気孔の内部または外部表面の表面陰電荷、陽電荷又はタンパク質に特異的に結合するリガンドにタンパク質が吸着又はロードされる。このため、生理活性物質又はタンパク質をさらに容易に前記気孔の内部または外部に含ませることができる。また、本願の一具体例に係る多孔性シリカナノ粒子は、拡張されたサイズの気孔を有するだけでなく、前記粒子の外面と内面の全体に拡張された気孔が形成されており、前記粒子内部の奥深くにも前記の拡張された気孔が形成されている。このため、生理活性物質又はタンパク質をさらに容易に前記粒子の外面と内面の気孔に含ませることができる。
【００５６】
本願の一具体例によると、前記多孔性シリカナノ粒子は、気孔の内部または外部に生理活性物質又はタンパク質が含まれているものであってもよいが、これに限定されない。
【００５７】
本願の一具体例によると、前記多孔性シリカナノ粒子は、表面改質されたものであってもよいが、これに限定されない。
【００５８】
本願の一具体例によると、前記多孔性シリカナノ粒子は、気孔の内部または外部表面が陰イオン及び／又は陽イオンを帯びるように表面改質したものであってもよいが、これに限定されない。これにより、前記生理活性物質は、陰イオン及び／又は陽イオンを帯びる前記多孔性シリカナノ粒子の気孔の内部または外部表面との静電相互作用により、前記気孔内に吸着又はロード（loading）されるものであってもよいが、これに限定されない。前記多孔性シリカナノ粒子の気孔の内部または外部表面が陰イオン及び／又は陽イオンを帯びるように表面改質することは、吸着又はロードしようとする生理活性物質のｐＩ値によって調節できるが、これに限定されない。
【００５９】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔の内部表面が改質されて陰イオンを帯びる場合（例えば、シラノール、ホスフェート、カルボキシレート等による表面改質の場合）、陽イオンを帯びる生機能性物質の吸着又はロード用に使用することができる。
【００６０】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔の内部表面が改質されて陽イオンを帯びる場合（例えば、アミン基、陽イオン性高分子等による表面改質の場合）、陰イオンを帯びる生機能性物質の吸着又はロード用に使用することができる。
【００６１】
本願の一具体例において、特定のタグと結合する物質又はリガンドにより前記多孔性シリカナノ粒子の気孔の内部表面が改質された場合（例えば、ニッケル−ＮＴＡ、グルタチオン、デキストリン、ストレプトアビジン又はアビジン等による表面改質の場合：これらは、それぞれｈｉｓ−タグ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ビオチン又はビオチンタグと結合することができる）、特定のタグが含まれている生理活性物質の吸着又はロード用に使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子の外部表面は、前述した気孔の内部表面の改質に使用された物質又はリガンドを用いて改質できるが、これに限定されない。
【００６３】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子の外部表面は、細胞透過性のペプチド（細胞内伝達効率の増加）、ポリエチレングリコール（粒子の外部表面への非選択的な生分子の吸着又はロードを防止すると共に、粒子の凝集現象を防止）、ホスファチジルエチルアミン、抗体、アプタマー又はリガンド等によって改質できるが、これらに限定されない。例えば、前記の抗体、アプタマー又はリガンド等は、前記生理活性物質又はタンパク質伝達用組成物が、特定の細胞又は特定の臓器に選択的に伝達されるようにすることができる。
【００６４】
本願の一具体例によると、前記多孔性シリカナノ粒子は、本願の図１に示すように、ニッケル、ニッケル−ＮＴＡ、グルタチオン又はビオチンにより表面改質されたものであってもよいが、これらに限定されない。前記生理活性物質内のタグが前記多孔性シリカナノ粒子の気孔に結合され、前記気孔内に効率よく担持することができる。たとえば、ニッケル又はニッケル−ＮＴＡで表面改質された多孔性シリカナノ粒子のニッケルが、生理活性物質のＨｉｓ−タグと非共有相互作用することで、前記生理活性物質を前記気孔内に吸着又はロードすることができる。ＧＳＴ−タグを有する生理活性物質の吸着又はロードのためには、グルタチオンで多孔性シリカナノ粒子を表面改質することができるが、これに限定されない。
【００６５】
本願の一具体例によると、拡張された気孔を有する多孔性シリカナノ粒子に吸着又はロードされた生理活性物質を含む生理活性物質伝達用組成物を提供できるが、これに限定されない。
【００６６】
本願の一具体例に係る多孔性シリカナノ粒子は、ナノ粒子の表面及び／又は気孔の内部が、陽電荷を帯びるように、または陰電荷を帯びるようにすることができるので、陽電荷を帯びるタンパク質と陰電荷を帯びる生理活性物質とを、すべて前記多孔性シリカナノ粒子の気孔内部に付着させることが可能である。また、本願の多孔性シリカナノ粒子は、気孔の平均直径が大きいため、サイズの大きい生理活性物質も収容可能である。つまり、生理活性物質の表面電荷と生理活性物質の大きさに関係なく、前記タンパク質を細胞内に容易に導入することが可能である。
【００６７】
例えば、前記多孔性シリカナノ粒子は、単分散（monodispersity）特性を有するものであってもよいが、これに限定されない。前記単分散特性は、分子量の分布範囲または粒子サイズの範囲が非常に狭い特性である。特にナノ物質の単分散は、ナノ粒子の大きさと関連して、体系的な薬物伝達システムの設計において必須である。前記単分散特性は、伝達用組成物の細胞内吸収及び／又は薬効を決定するにあたり、ナノ物質の形状及び／又は表面の化学的特性に加えて一つの要素となる。
【００６８】
例えば、前記多孔性シリカナノ粒子は、調節可能な気孔、粒子の大きさ、広い表面積、大きな気孔体積、表面機能化のし易さ、又は細胞毒性が少ないか無いことによる高い生体適合性を有するが、これらに限定されない。
【００６９】
例えば、前記多孔性シリカナノ粒子は、刺激に反応するゲート開閉システムを有して調節可能な遅効性システム（controlled release system）に適用できるが、これに限定されない。例えば、前記多孔性シリカナノ粒子は、気孔に開閉可能なゲートを有することができ、外部の刺激により該ゲートの開閉が調節されるので、当該気孔上に含まれている薬物の解離要否、時期又は量などを調節できるが、これに限定されない。
【００７０】
例えば、前記多孔性シリカナノ粒子は、パラフィンキャップなどにより気孔を外部と遮断していてもよく、一定の温度以上、例えば、パラフィン溶融温度以上の刺激を受けると、前記パラフィンキャップが溶融して気孔が露出するものであってもよいが、これに限定されない。または、例えば、前記多孔性シリカナノ粒子は、普段は気孔の周囲に高分子が結合しており、気孔内の薬物などが外部に流出しないが、酵素などの刺激が与えられると、前記高分子が切断されて前記気孔が露出するものであってもよいが、これに限定されない。
【００７１】
例えば、前記の機能性タンパク質又はタンパク質薬物は、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔内に含まれていてもよいが、これに限定されない。前記タンパク質を前記多孔性シリカナノ粒子の気孔内に含めることにより、前記タンパク質は、外部のタンパク質分解酵素（protease）、又は血清タンパク質を含む細胞内外の環境から保護できるが、これに限定されない。このような外部分解酵素からの生分子保護機能は、薬物伝達体又は機能性高分子伝達体としての臨床的な意義を有する重要な要素の一つである。また、前記タンパク質は、前記の様々な分解酵素又は前記血清タンパク質を含む細胞内外の環境から保護するために、ロックド核酸（locked nucleic acid、ＬＮＡ）、Ｏ−メチル化、又はホスホロチオエート（phosphorothioate）核酸などのように、労働力、高コスト、長時間を要する化学的変形を必要としないので、製造が容易で経済的である。
【００７２】
例えば、前記多孔性シリカナノ粒子は、その位置を追跡するための蛍光染料を含むものであってもよいが、これに限定されない。例えば、前記多孔性シリカナノ粒子は、その表面に蛍光染料を含むものであってもよいが、これに限定されない。
【００７３】
例えば、前記多孔性シリカナノ粒子にタンパク質を吸着又はロードする過程は、前記多孔性シリカナノ粒子と前記タンパク質とを溶液中で単に混合することで吸着又はロードすることを含むことができるが、これに限定されない。例えば、前記多孔性シリカナノ粒子にタンパク質を吸着又はロードする過程は、表面改質された多孔性シリカナノ粒子と前記タンパク質とを、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）が含まれている溶液中に混合してインキュベートすることを含むことができるが、これに限定されない。この過程は、化学的結合、架橋結合、又は複雑な精製分離過程を必要としないため、簡単でコストが安く、効率よいモジュール方式により行うことができる。
【００７４】
例えば、前記多孔性シリカナノ粒子は、細胞に毒性を示さず、生体に優しいものを含むことができるが、これに限定されない。さらに、前記多孔性シリカナノ粒子は、薬物伝達効率の上昇及び／又は細胞内への導入のための、追加の表面処理を必要としないものであってもよいが、これに限定されない。
【００７５】
本願の一具体例によると、前記多孔性シリカナノ粒子の表面又は前記気孔内に陽電荷または陰電荷が形成されており、前記タンパク質は、前記陽電荷または陰電荷との静電相互作用により、前記気孔内に吸着又はロードするものであってもよいが、これに限定されない。
【００７６】
本願の一具体例によると、前記の抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーは、外部物質を細胞膜を介して細胞内に導入することを促進するペプチドをすべて含むが、これに限定されない。前記細胞透過性のペプチドは、前記ペプチド配列自体で細胞内部への導入を促進するものであってもよく、または他の物質、例えば、タンパク質の助けを受けて細胞内部への導入を促進するものであってもよいが、これらに限定されない。
【００７７】
例えば、前記細胞透過性のペプチドは、細胞膜に存在するタンパク質の助けを受けて外部物質の細胞内への導入を促進するものであってもよいが、これに限定されない。細胞の細胞膜（plasma membrane）は、外部の物質が細胞内に入ることを防止するために存在する。しかし、薬物又はレポーター（reporter）分子が細胞内で活性を示すためには、細胞内への導入が効率よく行われなければならない。したがって、短い鎖の分子である陽イオン性ペプチド（cationic peptide）を薬物伝達体に結合させることにより、小分子、核酸、抗体及び／又はナノ粒子などの薬物を細胞内に伝達することに応用することができる。
【００７８】
このような細胞透過性ペプチドの細胞導入のメカニズムは、明確に判明していないが、いくつかのメカニズムにより細胞透過がなされると知られている。例えば、エネルギー依存性エンドサイトーシス（energy dependent endocytosis）及びエネルギー非依存性直接移動（energy independent direct translocation）などがある。本願で使用可能な細胞透過性のペプチドは、前記二つのメカニズムのいずれかのメカニズムによって、前記多孔性シリカナノ粒子を細胞内に導入できるが、これらに限定されない。
【００７９】
例えば、前記細胞透過性のペプチドとして使用できるペプチドの種類は、下記の表１及び表２に示されているが、これらに限定されない。
【００８０】
【表１】
0006426288.tif 000002
【００８１】
【表２】
0006426288.tif 000003
【００８２】
前記に示されている細胞透過性ペプチドのアミノ酸配列は、前記細胞透過性ペプチドの活性が維持される限り、その配列の一部に変形が加わることもあるが、これに限定されない。
【００８３】
例えば、前記細胞透過性のペプチドは、ＭＰＡＰ、ＴＡＴ又はポリアルギニンを含むものであってもよいが、これらに限定されない。例えば、前記ＭＰＡＰは、ミリスチン酸（myristic acid）−ＡＲＲＲＲＲＲＲＣのアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記ＴＡＴは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲのアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記ポリアルギニンは、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（９個のアルギニン）のアミノ酸配列を有するものであってもよいが、これらに限定されない。
【００８４】
図２は、本願の一具体例に係るタンパク質薬物伝達用組成物の模式図である。
【００８５】
図２を参照すると、本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子は、小さいサイズとその粒子特性により、細胞により吸収（endocytosis）され得るため、吸着又はロードされたタンパク質薬物とともに細胞内へ導入することができる。
【００８６】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子は、アミン、カルボキシ基、ホスファチジルエチルアミン又はポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）により機能化したものであってもよいが、これに限定されない。前記ホスファチジルエチルアミン又はポリエチレングリコール化により前記多孔性シリカナノ粒子の表面にポリエチレングリコールを結合することができるが、これに限定されない。前記ホスファチジルエチルアミン又はポリエチレングリコール化により、前記多孔性シリカナノ粒子の凝集が防止されたり、他の生分子との非特異的結合が最小限に抑えられたり、気孔外のＲＮＡ吸着又はロードが減少するものであってもよいが、これらに限定されない。
【００８７】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子のサイズは、平均約０．１μｍ〜約１００μｍであってもよいが、これに限定されない。
【００８８】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔のサイズは、平均約１ｎｍ以上〜約１００ｎｍ以下であってもよいが、これに限定されない。例えば、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔のサイズは、平均約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約９０ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約９０ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約９０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約７０ｎｍ、または約３０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約７０ｎｍ、または約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約６０ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、または約３０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約４０ｎｍ、または約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約３０ｎｍ、または約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍであってもよいが、これらに限定されない。
【００８９】
従来の多孔性シリカナノ粒子は、気孔の平均直径が数ｎｍに過ぎないため、タンパク質のような生体高分子が前記気孔の内部に十分に浸透できない欠点があった。これに対して、本願の一具体例に係る多孔性シリカナノ粒子は、従来の薬物伝達のための多孔性シリカナノ粒子と比較して、気孔の平均直径がさらに拡張されている。このため、生理活性物質又はタンパク質をさらに容易に前記気孔の内部に含ませることができる。また、本願の一具体例に係る多孔性シリカナノ粒子は、拡張されたサイズの気孔を有するだけでなく、前記粒子の外面と内面の全体に拡張された気孔が形成されており、前記粒子内部の奥深くにも前記拡張された気孔が形成されている。このため、生理活性物質又はタンパク質をさらに容易に前記粒子の外面と内面の気孔に含ませることができる。
【００９０】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子は、多孔性シリカナノ粒子を形成する段階と、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔を拡張する段階とを含む方法により製造するものであってもよいが、これに限定されない。
【００９１】
例えば、前記多孔性シリカナノ粒子を形成する段階は、シリカ前駆体から多孔性シリカナノ粒子を形成することを含むことができるが、これに限定されない。例えば、前記シリカ前駆体から多孔性シリカナノ粒子を形成することは、前記シリカ前駆体を、界面活性剤を含む溶液と混合することをさらに含むことができるが、これに限定されない。例えば、前記界面活性剤を含む溶液は、アルコール、水及び水酸化ナトリウムをさらに含む溶液であってもよいが、これに限定されない。例えば、前記界面活性剤は、ＣＴＡＢ（cetyltrimethylammonium bromide）、ＴＭＡＢｒ（hexadecyltrimethylammonium bromide）、ＴＭＰｒＣｌ（hexadecyltrimethylpyridinium chloride）、又はＴＭＡＣｌ（tetramethylammonium chloride）を含むものであってもよいが、これらに限定されない。
【００９２】
例えば、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔を拡張する段階は、膨張剤を用いて行われることを含むことができるが、これに限定されない。例えば、前記膨張剤は、トリメチルベンゼン（trimethylbenzene、ＴＭＢ）、またはＮ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミン（N，N−dimethylhexadecylamine、ＤＭＨＡ）を含むものであってもよいが、これらに限定されない。
【００９３】
前記多孔性シリカナノ粒子は、製造方法が単純で大量合成が容易なものを含むことができるが、これに限定されない。例えば、前記多孔性シリカナノ粒子は、実験室の器具を用いる場合、前記製造方法により、１回の合成に少なくとも約１ｇ以上を製造できるが、これに限定されない。
【００９４】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔を拡張する段階は、前記多孔性シリカナノ粒子にトリ（Ｃ１−６アルキル）ベンゼンを処理して気孔を拡大させることを含むことができるが、これに限定されない。例えば、前記トリ（Ｃ１−６アルキル）ベンゼンは、トリメチルベンゼン、トリエチルベンゼン、トリプロピルベンゼン、トリブチルベンゼン、トリペンチルベンゼン又はトリヘキシルベンゼンを含むものであってもよいが、これらに限定されない。例えば、前記多孔性シリカナノ粒子にトリ（Ｃ１−６アルキル）ベンゼンを処理して気孔を拡張する段階は、前記多孔性シリカナノ粒子とトリ（Ｃ１−６アルキル）ベンゼンとが含まれている混合物を、約８０℃〜約２００℃の温度で加圧処理することを含むことができるが、これに限定されない。例えば、前記多孔性シリカナノ粒子にトリ（Ｃ１−６アルキル）ベンゼンを処理して気孔を拡張する段階は、前記多孔性シリカナノ粒子とトリ（Ｃ１−６アルキル）ベンゼンとが含まれている混合物を、約８０℃〜約２００℃、約８０℃〜約１６０℃、約８０℃〜約１２０℃、約１２０℃〜約２００℃、約１６０℃〜約２００℃、または約１２０℃〜約１６０℃の温度で加圧処理することを含むことができるが、これらに限定されない。
【００９５】
例えば、前記気孔を拡張する段階により、約５ｎｍ未満のサイズを有する気孔を、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約１００ｎｍのサイズを有する気孔に拡張することができるが、これらに限定されない。
【００９６】
本願の一具体例において、前記生理活性物質又はタンパク質伝達用組成物は、血管注射用の薬物、経口投与用の薬物、経皮投与用の薬物またはパッチ、局所投与用の薬物、化粧品、軟膏、食品、飲料、シャンプー、洗剤、白血病、透析、血液移植、血管移植、歯牙移植、インプラント植立、血管形成術、毛髪移植、組織移植、臓器移植、骨移植、核移植、細胞移植、生殖細胞移植、胚移植、動物複製、形質転換胚の作製、形質転換動物の生産、幹細胞の作製、品質改良植物の製作、異種間の核移植、異種間の臓器移植、誘導多能性幹細胞の作製、例えば、胚発生技術（microinjection、parthenogenesis、zygogenesis、nuclear transfer、blastomere transfer、blastomere fusion、ＩＶＦ、ＩＣＳＩなど）、細胞分化誘導技術、幹細胞治療剤、細胞治療剤、ホルモン剤、抗体治療剤、カプセル剤、シロップ、研究用試薬、環境汚染物質の浄化、生化学兵器、ダイエット用品、整形術（頭蓋顎顔面整形、両顎整形、胸部整形）などに適用できるが、これらに限定されない。
【００９７】
本願の一具体例において、前記生理活性物質又はタンパク質伝達用組成物は、自己免疫疾患（アトピー、皮膚のかゆみ、喘息、関節リウマチ）、固形癌、血液癌、脳疾患、心血管系疾患、循環器系疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患（胃腸管疾患、逆流性食道炎、消化性潰瘍、胃潰瘍）、炎症性疾患、脳神経疾患、慢性疾患、急性疾患、老人性疾患、難治性疾患、歯周病、口腔疾患、頭蓋顎顔面疾患、虚血性疾患、肝疾患、肺疾患、皮膚疾患、細菌性疾患、ウイルス性疾患、感染疾患、骨疾患（骨粗しょう症、骨折など）、関節炎疾患、脊椎疾患、アレルギー疾患、環境性疾患、飲酒疾患、代謝性疾患、過敏性疾患、腎臓疾患、甲状腺疾患、生殖器疾患、新生物性疾患、ＧＥＲＤ、自己免疫症状、糖尿病、遺伝的症状、ウイルス／バクテリア／寄生虫感染症、寄生虫症状、身体症状、プリオン病、養分欠乏、ビタミン／ミネラルの欠乏、ミトコンドリア疾患、事故、性媒介疾患、妊娠症状、母乳授乳症状、先天性奇形、男性／女性／乳幼児／小児／青少年症状、免疫疾患、バランス障害、痛み、全身障害、血液症状、血管症状、神経症状、筋肉症状、心臓症状、背中／首／脊髄症状、目症状、脳症状、精神症状、鼻症状、口症状、歯症状、足／脚／膝症状、上肢症状、肩症状、耳症状、肺症状、肝臓症状、腎臓症状、胆嚢症状、膵臓症状、消化器系症状、前立腺症状、男性生殖器症状、産科的症状、婦人科的症状、甲状腺障害、聴覚障害、美容施術、色素沈着、脱毛、発毛、除毛などに適用できるが、これらに限定されない。
【００９８】
本願の他の局面では、下記を含むタンパク質の伝達方法を提供することができる。
【００９９】
平均気孔径が約１ｎｍ以上〜約１００ｎｍ以下の気孔を有する多孔性シリカナノ粒子；前記多孔性シリカナノ粒子の気孔の表面に結合され、表面陰電荷又は陽電荷を付与する官能基又はタンパク質に特異的に結合するリガンド；及び前記多孔性シリカナノ粒子の気孔内に吸着又はロードされたタンパク質を含むタンパク質伝達用組成物を目的の細胞内に導入すること。
【０１００】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子のサイズは、平均約０．１μｍ〜約１００μｍであってもよいが、これに限定されない。
【０１０１】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔のサイズは、平均約１ｎｍ以上〜約１００ｎｍ以下であってもよいが、これに限定されない。例えば、前記多孔性シリカナノ粒子の気孔のサイズは、平均約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約９０ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約９０ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約９０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約７０ｎｍ、または約３０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約７０ｎｍ、または約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約６０ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、または約３０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約４０ｎｍ、または約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約３０ｎｍ、または約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍであってもよいが、これらに限定されない。
【０１０２】
本願の一具体例において、前記タンパク質は、プロテアソームなどのタンパク質複合体、カスパーゼ、リボヌクレアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼなどの各種酵素、各種抗体等からなる群より選択されたものを含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
本願の一具体例において、前記タンパク質は、全身ホルモン、サイトカイン、成長因子及び細胞の分化と増殖を調節する他のタンパク質のような正常な治療過程に関連する調節因子などと、このような傷を治療できる能力を有するものとして報告されている成長因子、形質変換成長因子−βスーパーファミリー（ＴＧＦ−β）タンパク質、大食細胞−コロニー形成刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）のようなサイトカイン及びホルモン、並びにプロテアソームなどのタンパク質複合体、カスパーゼ、リボヌクレアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼなどの各種酵素、各種抗体等からなる群より選択されるものを含んでもよいが、これに限定されない。
【０１０４】
本願の一具体例において、前記タンパク質伝達用組成物を目的の細胞内に導入することは、前記タンパク質伝達用組成物を細胞培養液に添加して前記目的の細胞内に導入することを含んでもよいが、これに限定されない。
【０１０５】
本願の一具体例において、タンパク質伝達用組成物を目的の細胞内に導入することは、前記タンパク質伝達用組成物を血管内投与、経口投与、経皮投与又は注射による局所投与により、前記目的の細胞内に導入することであってもよいが、これらに限定されない。
【０１０６】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子は、その表面に結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーをさらに含むものであってもよいが、これらに限定されない。
【０１０７】
本願の一具体例において、前記多孔性シリカナノ粒子は、ニッケル、ニッケル−ＮＴＡ、グルタチオン、デキストリン、ビオチン又はストレプトアビジンにより表面改質したものであってもよいが、これらに限定されない。前記タンパク質内のタグが前記多孔性シリカナノ粒子の気孔に結合し、前記気孔内に効率よく担持することができる。たとえば、ニッケル又はニッケル−ＮＴＡにより表面改質した多孔性シリカナノ粒子のニッケルがタンパク質のＨｉｓ−タグと非共有相互作用することで、前記タンパク質を前記気孔内に吸着又はロードすることができる。ＧＳＴ−タグを有するタンパク質の吸着又はロードのためには、グルタチオンで多孔性シリカナノ粒子を表面改質することができ、また、ＭＢＰ−タグを有するタンパク質の吸着又はロードのためには、デキストリンで多孔性シリカナノ粒子を表面改質することができ、さらに、ビオチン−タグを有するタンパク質の吸着又はロードのためには、ストレプトアビジンで多孔性シリカナノ粒子を表面改質することができるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本願の一具体例に係る多孔性シリカナノ粒子は、ナノ粒子の表面及び／又は気孔の内部が、陽電荷を帯びるように、または陰電荷を帯びるようにすることができるので、陽電荷を帯びるタンパク質と陰電荷を帯びるタンパク質とを、すべて前記多孔性シリカナノ粒子の気孔内部に付着させることが可能である。また、本願の多孔性シリカナノ粒子は、気孔の平均直径が大きいため、サイズの大きいタンパク質も収容可能である。つまり、タンパク質の表面電荷とタンパク質の大きさに関係なく、前記タンパク質を細胞内に容易に導入することが可能である。
【０１０９】
本願の一具体例において、前記生理活性物質またはタンパク質などを含む薬物伝達用組成物が目的の細胞内に導入されることは、細胞の吸収作用によって行われてもよいが、これに限定されない（図２）。例えば、前記薬物伝達用組成物は、細胞質内又は核内に導入できるが、これに限定されない。
【０１１０】
例えば、前記の目的の細胞は、原核動物又は真核動物由来の細胞であってもよい。例えば、哺乳類細胞であっても、ヒト由来の細胞であってもよいが、これらに限定されない。例えば、前記細胞は、癌細胞、臓器の組織細胞を含むものであってもよいが、癌細胞、骨細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、肝細胞、脳細胞、血管細胞、免疫細胞、赤血球、白血球又はリンパ球細胞を含むものであってもよいが、これらに限定されない。
【０１１１】
本願の一具体例において、前記タンパク質薬物は、プロテアソームなどのタンパク質複合体、カスパーゼ、リボヌクレアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼなどの各種酵素、各種抗体等からなる群より選択されたものを含むものであってもよいが、これらに限定されない。
【０１１２】
本願の一具体例において、前記タンパク質伝達用組成物を目的の細胞内に導入することは、前記タンパク質伝達用組成物を細胞培養液に添加して前記目的の細胞内に導入することを含むことができるが、これに限定されない。
【０１１３】
本願の一具体例において、前記タンパク質伝達用組成物を目的の細胞内に導入することは、前記タンパク質伝達用組成物を血管内投与、経口投与、経皮投与又は注射による局所投与により、前記目的の細胞内に導入することを含むことができるが、これらに限定されない。
【０１１４】
例えば、前記血管内投与によると、循環器系を介して身体全体にタンパク質を伝達することが可能であるが、これに限定されない。例えば、前記経口投与によると、主に消化器系へのタンパク質の伝達が容易になり得るが、これに限定されない。
【０１１５】
例えば、前記経皮投与によると、皮膚を介してタンパク質を伝達することが可能であるが、これに限定されない。例えば、前記経皮投与の対象となる疾病には、アトピー、脱毛、色素沈着又は皮膚病などがあるが、これらに限定されない。
【０１１６】
例えば、前記の注射による局所投与は、眼、皮膚、粘膜又は局部的な腫瘍組織などの局所的かつ局部的な組織への適用が可能であるが、これらに限定されない。例えば、前記局部投与時には、高い生物学的適用可能性、目的の組織へのアクセシビリティ、及び／又は全身適用時に一般的に伴う副作用を低減することができる。例えば、前記局部投与の対象となる疾病には、視力減退、アトピー性皮膚炎、ハンチントン病、慢性の痛み又は多形膠芽腫などがあるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１１７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、下記の実施例は、単に説明を目的とするものであり、本願の範囲を限定しようとするものではない。
【０１１８】
［実施例］
製造例１：気孔拡張された多孔性シリカナノ粒子（mesoporous silica nanoparticle，ＭＳＮ）の合成
セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（cetyltrimethylammonium bromide，ＣＴＡＢ）３．９４ｇと１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液２．２８ｍＬとを、メタノールと水の混合溶液８００ｇ（メタノール：水＝０．４：０．６，ｗ／ｗ）に溶解した。次いで、得られた溶液を激しく攪拌しながら、テトラメトキシシラン（tetramethoxysilane，ＴＭＯＳ）１．３ｍＬを大気条件下で前記溶液に加えた。前記反応混合物を８時間攪拌した後、一晩熟成した。その結果として得られた白色沈殿物を遠心分離し、残っている界面活性剤を除去して精製し、エタノールと水をそれぞれ用いて５回ずつ洗浄した。前記のようにして製造された多孔性シリカナノ粒子を２０ｍＬのエタノールに懸濁し、４ｍＬの塩酸を加えた。次いで、前記懸濁液を一晩還流し、白色粉末を得た。前記生成された白色粉末をフィルターでろ過して分離し、エタノールで洗浄した。これにより、２ｎｍの気孔サイズを有する多孔性シリカナノ粒子を得た。
【０１１９】
拡張された気孔を有する多孔性シリカナノ粒子を準備するために、前記製造例により製造した多孔性シリカナノ粒子をエタノールで３０分間超音波処理して分散し、水とトリメチルベンゼン（trimethylbenzene，ＴＭＢ）を加えた（１：１の混合比（ｖ／ｖ）で合計２０ｍＬ）。その後、前記混合物を加圧処理機（autoclave）に入れ、１６０℃で４８時間維持した。これにより生成された白色粉末は、エタノールと水を用いて５回ずつ洗浄した。その後、前記のようにして製造された多孔性シリカナノ粒子を２Ｍエタノール性ＨＣｌに懸濁した後、１２０℃で２０時間加圧器で加熱することで、有機界面活性剤（ＣＴＡＢ）を除去した。次いで、得られた混合物をろ過し、エタノール及び水で１０回ずつ洗浄した。これにより、気孔が拡張されたＭＳＮ（図１１ａ及び図１１ｂの１）を得た。
【０１２０】
製造例２：Ｎｉ−ＮＴＡで改質されたシリカナノ粒子（ＭＳＮＰＮ）
前記製造例１と同様にして製造された、気孔が拡張されたＭＳＮの１００ｍｇを１０ｍＬのトルエンに懸濁し、アミン機能化のために３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）１ｍＬを加えた。前記懸濁液を一晩還流した後、フィルターを用いてろ過した。残余物をエタノールで１０回洗浄し、アミンにより機能化されたＭＳＮ（図１０ａ及び図１０ｂの２）を得た。前記アミン−機能化されたＭＳＮ３０ｍｇを、室温で１００ｍｇのＤＭＳＯ中の３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）［３，３’−dithiodipropionic acid di（N−hydroxysuccinimide ester），ＤＴＳＰ］と一晩反応した。反応混合物をＤＭＳＯで３回洗浄した後、１０ｍＬのＤＭＳＯ中のＮα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リジンハイドレート（アミノブチルＮＴＡ，６５ｍｇ）を加えた。この反応を室温で２４時間行った。次いで、エタノールと水で１０回ずつ洗浄し、ＮＴＡ−改質されたＭＳＮを得た。Ｎｉ２＋をＮＴＡ−改質されたＭＳＮに統合するために、前記ナノ粒子を１Ｍの水性ＮｉＳＯ４に分散した後、室温で２４時間攪拌し、エタノールと水で５回ずつ洗浄した。結果として生成された粉末（ＭＳＮＰＮ）（図１０ａの３）を真空下で乾燥し、ヌクレアーゼのない水に分散した。前記懸濁液を使用前まで４℃で保管した。
【０１２１】
製造例３：蛍光物質が結合されたシリカナノ粒子
製造例２と同様にして製造されたアミン−機能化されたＭＳＮ（図１０ａ及び図１０ｂの２）３０ｍｇをＤＭＳＯの１ｍＬに懸濁した。そして、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに含まれているＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N−hydroxysuccinimide，ＮＨＳ）エステルにより活性化したカルボキシテトラメチルローダミン（carboxytetramethylrhodamine、ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ）溶液１０μＬを懸濁液に加えた。前記溶液を室温で３時間攪拌した後、遠心分離して粉末（図１０ｂの４）状のＴＡＭＲＡ−結合されたＭＳＮを得た。前記製造例２のような工程により、前記ＴＡＭＲＡ−結合されたＭＳＮにＮｉ−ＮＴＡを導入し、ＴＡＭＲＡ−結合されたＭＳＮＰＮ（図１０ｂの５）を得た。
【０１２２】
実施例１：気孔拡張されたＭＳＮの表面特性の分析
ＭＳＮの表面積、気孔サイズ及び気孔体積の物理的特性を分析するために、窒素の吸着又はロードの実験を行った。窒素の吸着又はロードの等温線は、ＮＯＶＡ吸着装置により測定した。
【０１２３】
表面積は、Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）の方法により算出した。気孔サイズの分布は、Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｊｏｙｎｅｒ−Ｈａｌｅｎｄａ（ＢＪＨ）方法により算出した。その結果を下記表３に示す。
【０１２４】
【表３】
0006426288.tif 000004
【０１２５】
ニッケルモイアティー（moiety）を有する新規な多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮＰＮ）は、気孔拡張戦略を用いて、２５ｎｍ〜３０ｎｍの気孔サイズを有するように合成することにより、プロテアソームのＨｉｓタグとの非共有相互作用によって、プロテアソーム完全酵素分子を隠すことができる（図１１）。ＭＳＮＰＮの比較的広い表面積（３８８ｍ２／ｇ）及び気孔体積（１．４７ｍＬ／ｇ）はまた、それらの本来の形態にプロテアソームを吸着又はロード及び伝達するのに有利である。
【０１２６】
製造例４：表面が陰イオンを帯びるＭＳＮ
製造例１と同様にして製造された、気孔拡張された多孔性シリカナノ粒子を、水とエタノールを用いて数回洗浄することにより、表面が陰イオンを帯びる多孔性シリカナノ粒子を得た。
【０１２７】
製造例５：表面が陽イオンを帯びるＭＳＮ
製造例１と同様にして製造された、多孔性シリカナノ粒子をトルエンに懸濁し、アミン機能化のために３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）１ｍＬを加えた。洗浄後、陽イオンを帯びる多孔性シリカナノ粒子を得た。
【０１２８】
実施例２：気孔内にタンパク質を含む多孔性シリカナノ粒子の細胞内導入の実験
本実施例では、製造例４または製造例５と同様にして製造された、表面が陰イオンを帯びる及び／又は表面が陽イオンを帯びる多孔性シリカナノ粒子の気孔内にタンパク質を吸着又はロードし、前記多孔性シリカ粒子を細胞内に導入することにより、前記タンパク質を細胞内に導入した。具体的には、１ｘＰＢＳの条件下で蛍光（ＦＩＴＣ）表示されたウシ血清アルブミン（bovine serum albumin、ＢＳＡ）タンパク質と、多孔性シリカナノ粒子とを１:１０の重量比で混合した後、これを室温で３０分間インキュベートした。その後、前記混合物を細胞培養液に混合して処理することにより、前記タンパク質が吸着又はロードされた前記多孔性シリカナノ粒子を細胞内に導入した。前記処理時間を多様化して観察した後、処理が完了した細胞は、細胞培養液を新たに入れ替えた。図３には、蛍光表示されたウシ血清アルブミンを含む多孔性シリカナノ粒子を処理した細胞の蛍光顕微鏡画像が処理時間ごとに示されている。
【０１２９】
次に、蛍光表示されたＩｇＧタンパク質を同様な方法により多孔性シリカナノ粒子の気孔に吸着又はロードし、これを細胞内に導入した。導入した細胞の蛍光顕微鏡画像を図４に示す。
【０１３０】
図３及び図４から、蛍光表示されたＢＳＡ及びＩｇＧが効率よく細胞内に導入されていることを確認することができた。
【０１３１】
実施例３：β−ガラクトシダーゼの細胞内導入及びタンパク質分解酵素の影響の分析
本実施例では、β−ガラクトシダーゼ（ｐＩ＝４．８８）を、陽イオンを帯びる多孔性シリカナノ粒子の気孔内に吸着又はロードして細胞内に導入し、細胞内への導入効率及びタンパク質分解酵素の影響を分析した。
【０１３２】
まず、前記実施例２と同様な方法により、様々な濃度のβ−ガラクトシダーゼを多孔性シリカナノ粒子に吸着又はロードし、４時間の間、細胞に処理した後、新しい培地に入れ替えた。その後、４時間インキュベートした後、細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌを処理した後、顕微鏡で観察した。
【０１３３】
図５は、前記のＸ−ｇａｌ染色した細胞を顕微鏡で観察した画像であって、最上段からそれぞれ２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ及び２０ｎＭのβ−ガラクトシダーゼを吸着又はロードした多孔性シリカナノ粒子が導入された細胞の画像である。図６に示すように、β−ガラクトシダーゼの濃度に依存してＸ−ｇａｌ染色効率が増加しているので、前記多孔性シリカナノ粒子に吸着又はロードしたβ−ガラクトシダーゼが正常に細胞内に導入されていることを確認できる。
【０１３４】
次に、β−ガラクトシダーゼの単独、多孔性シリカナノ粒子の単独、及びβ−ガラクトシダーゼを吸着又はロードした多孔性シリカナノ粒子をそれぞれ細胞に４時間処理した。その後、新しい培地に入れ替え、さらに４時間インキュベートした。次いで、前記細胞にＯＮＰＧ（onitrophenyl−a−D−galactopyranoside）を処理し、それぞれの吸光度を測定してグラフに示した（図６参照）。図６に示すように、β−ガラクトシダーゼの単独または多孔性シリカナノ粒子の単独で処理した細胞の場合は、ＯＮＰＧ分析において吸光が示されなかったのに対して、β−ガラクトシダーゼを吸着又はロードした多孔性シリカナノ粒子で処理した細胞では、β−ガラクトシダーゼにより生成されるニトロフェノール（nitrophenol）の吸光が観察された。また、β−ガラクトシダーゼの濃度に依存して吸光度が増加した。したがって、β−ガラクトシダーゼを吸着又はロードした多孔性シリカナノ粒子が正常に細胞に導入されたこと、β−ガラクトシダーゼの単独では細胞内に導入できないこと、示された吸光度は、多孔性シリカナノ粒子に吸着又はロードされて細胞内に導入されたβ−ガラクトシダーゼによるものであることが確認された。
【０１３５】
次に、気孔が拡張された本願の多孔性シリカナノ粒子（Ｅｘ−ＭＳＮＰ）、及び気孔が拡張されていない、平均２ｎｍの気孔サイズを有する多孔性ナノ粒子（ＮＥ−ＭＳＮＰ）のそれぞれに、β−ガラクトシダーゼを吸着又はロードした。これらとβ−ガラクトシダーゼの単独をそれぞれキモトリプシン（chymotrypsin）処理（３７℃で１２時間）した後、ＯＮＰＧ分析を行った（図７参照）。図７に示すように、気孔が拡張されていない多孔性シリカナノ粒子にβ−ガラクトシダーゼを吸着又はロードした場合は、前記キモトリプシンによってβ−ガラクトシダーゼが分解されたのに対して、気孔が拡張された本願の多孔性シリカナノ粒子にβ−ガラクトシダーゼを吸着又はロードした場合は、前記β−ガラクトシダーゼが前記キモトリプシンから保護され、正常に吸光を示した。したがって、本願の多孔性シリカナノ粒子の気孔に吸着又はロードされた物質は、外部環境から保護され、安定的に細胞内に導入できることを確認した。
【０１３６】
実施例４：細胞内に導入されたタンパク質の機能の分析
本実施例では、多孔性シリカナノ粒子の気孔内に吸着又はロードして細胞内に導入したタンパク質が正常に機能するかどうかを分析してグラフに示した。タンパク質の導入のために、細胞株としてＨｅＬａ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を使用した。
【０１３７】
まず、前記記載された実施例２に基づいてＨＲＰ（horseradish peroxidase）タンパク質を陽イオンを帯びる多孔性シリカナノ粒子に吸着又はロードした後、これを細胞培養液とともにＨｅＬａ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に４時間処理した。その後、ＰＢＳを用いて前記細胞を２回洗浄し、ＩＡＡ（indole acetic acid）を処理した。次いで、毒性テストを行い、それぞれの細胞株にＨＲＰ−ＩＡＡの組み合わせが及ぼす影響を調べた。図８のグラフによると、ＨＲＰタンパク質の単独又は多孔性シリカナノ粒子の単独で処理した細胞の場合は、細胞毒性が示されなかったのに対して、ＨＲＰタンパク質が吸着又はロードされた多孔性シリカナノ粒子を処理した細胞の場合は、ＨＲＰタンパク質の活性により酵素反応が引き起こされ、ＩＡＡを活性種（reactive species）に変換させることで細胞毒性が示され、細胞生存率が低下することを確認した。
【０１３８】
次に、前記実施例２に基づいて、様々な濃度のＲＮａｓｅタンパク質を表面が陰イオンを帯びる多孔性シリカナノ粒子に吸着又はロードした後、これを細胞培養液とともに細胞に処理し、毒性テストを行った。その結果、多孔性シリカナノ粒子に吸着又はロードされたＲＮａｓｅタンパク質の濃度に依存して細胞毒性が示されることを確認した（図９参照）。
【０１３９】
製造例６：プロテアソーム−多孔性シリカナノ粒子の複合体の製造
様々なモル比で、精製されたプロテアソーム及び製造例２と同様にして製造したＭＳＮＰＮをＰＢＳに懸濁した後、室温で２時間２００ｒｐｍで水平的に振とうした。結果として生成されたプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体を３０００ｒｐｍで遠心分離し、３回洗浄した。前記複合体を細胞内伝達のために培養培地に再懸濁した。
【０１４０】
製造例７：２６Ｓヒトプロテアソームの親和性精製
ヒトプロテアソームをＨＴＢＨ−タグされたβ４サブユニットを有する安定なＨＥＫ２９３Ｔ細胞株から親和性精製した。前記細胞をプロテアーゼ阻害剤、５ｍＭのＡＴＰ及び１ｍＭのＤＴＴを含有する溶解バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５％ＮＰ−４０）内にＤｏｕｎｃｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｉｎｄｅｒｓ（Ｗｈｅａｔｏｎ）を用いて均質化した。溶解物を１０，０００×ｇで遠心分離し、澄んだ上層液をストレプトアビジンアガロース樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とともに４℃で５時間インキュベートした。その後、前記樹脂ビーズをＴＥＶプロテアーゼ含有の溶出バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、及び１ｍＭのＡＴＰ）内でインキュベートした。前記精製条件下において、プロテアソーム上で内因性Ｕｓｐ１４が発見された（図１２）。Ｈｉｓ−タグされたβ４サブユニットで親和−精製されたヒトプロテアソームは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue、ＣＢＢ）染色により分析した（図１２ａ）。
【０１４１】
活性ヒト２６Ｓプロテアソームは、Ｈｉｓ−及びビオチン−タグされたβ４サブユニットのすべてを安定して発現させるＨＥＫ２９３−誘導された細胞ラインから効果的に親和性精製された（図１２）。通常の方法により精製されたプロテアソームとは異なり、これらのプロテアソームは、顕著な量のＵＳＰ１４、ＲＰ上に緩く結合された脱ユビキチン化酵素及び内部プロテアソーム阻害剤を有していた。
【０１４２】
実施例５：透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）
ＴＥＭ画像は、１２０ｋＶでＬＩＢＲＡ１２０ ＥＦ−ＴＥＭ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により取得した。各ＭＳＮ懸濁液をＦｏｒｍｖａｒ−コートされた銅グリッド上に位置させ、蒸発された炭素フィルム（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰＡ、ＵＳＡ）で安定化した。前記グリッドを観察前に数時間室温で乾燥した。ＭＳＮＰＮ及びプロテアソーム−吸着又はロードされたＭＳＮＰＮのＴＥＭ画像を比較するために、各サンプルを前記グリッド上に位置させ、０．５％ウラニルアセテートで染色した。
【０１４３】
実施例６：ＭＳＮＰＮ上におけるプロテアソームの活性の測定
ＭＳＮＰＮ上に吸着又はロードされたプロテアソームの活性を測定するために、ＰＢＳ内において４℃で３０分間、１２μｇのナノ粒子溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）と２．４μｇのプロテアソームをインキュベートし、プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体を製造した。次いで、検定バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬのアルブミン、１ｍＭの新鮮なＡＴＰ、１ｍＭの新鮮なＤＴＴ）で最終体積が１００μＬになるように希釈した。その後、検定バッファ中の１０μｇのプロテアソーム及びプロテアソーム−ＭＳＮＰＮを、検定バッファ中の蛍光性基質ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣを含有する９６ウェルプレートに加えた。ＡＭＣ（ｅｘ３５５／ｅｍ４６０）の蛍光が結果として測定された。
【０１４４】
プロテアソーム−多孔性シリカナノ粒子の複合体は、結合されていないプロテアソームと類似したタンパク質分解活性を有していた。これは、これらがＭＳＮＰＮの気孔に結合していても、小さなペプチドタイトベースのレポーター（reporter）基質に全的にアクセスできることを示すことである（図１３）。
【０１４５】
実施例７：プロテアソーム−多孔性シリカナノ粒子の複合体の分析
実施例６と同様にしてプロテアソーム−多孔性シリカナノ粒子の複合体を製造する一方、プロテアソームを多孔性シリカナノ粒子とともに培養した。その後、培養サンプルをスピン・ダウンさせた。ペレット分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット（immunoblotting，ＩＢ）により分析した。比較のために、プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体と同じ量のプロテアソームを単独で投入した。
【０１４６】
プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体からの精製されたプロテアソームの分離を、イミダゾール（０．５Ｍ）の存在下での短い遠心分離後、免疫ブロットして評価した。様々な質量比で、ＭＳＮＰＮに精製されたプロテアソームを結合し、この混合物を遠心分離した（１，０００×ｇで５分）。上清液内の結合されていないプロテアソームは廃棄し、ペレットを２％β−メルカプトエタノールを含有する２×ＳＤＳ試料バッファーと混合するか、０．５Ｍのイミダゾールと１時間インキュベートした。免疫ブロットは、抗Ｈｉｓ抗体を用いて行った。
【０１４７】
様々な質量比で精製されたプロテアソームは、ＭＳＮＰＮに簡単に吸着又はロードされた。これは、１：５０の質量比（プロテアソーム／ナノ粒子）で、又は〜３７プロテアソーム完全酵素が単一のナノ粒子に荷電されたとき、飽和することが示された（図１４の（ａ））。プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体の形成は、単なる吸収又は静電結合の代わりに、非共有Ｈｉｓ−ニッケル相互作用により主に媒介された。０．５Ｍのイミダゾールとインキュベートしたとき、ＭＳＮＰＮに結合された前記プロテアソームは、過剰のイミダゾールによって上清液に効果的に放出された（図１４の（ｂ））。
【０１４８】
ＭＳＮＰＮ及びプロテアソーム−吸着又はロードされたＭＳＮＰのゼータ電位及び流体力学的サイズをＺｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用いて、ＤＬＳ（dynamic light scattering）分析により測定した。ナノ粒子の表面ゼータ電位は、プロテアソーム吸着又はロード後、−１２．６０ｍＶないし−６．３８ｍＶに順調に増加した。これは、粒子間で減少した静電反発及びプロテアソームとＭＳＮＰＮとの間での安定な複合体の形成を示すことである（下記表４）。ただし、複合体サイズ及び気孔サイズが僅かに減少したものと示されたが、ナノ粒子の顕微鏡特性は、プロテアソーム荷電の前後が類似していた（図１５の（ａ）、（ｂ）及び下記の表５）。したがって、精製されたプロテアソームは、非共有相互作用により新規な多孔性シリカナノ粒子上に効果的に吸着又はロードされた。
【０１４９】
【表４】
0006426288.tif 000005
【０１５０】
【表５】
0006426288.tif 000006
【０１５１】
実施例８：ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ加水分解分析
プロテアソーム、多孔性シリカナノ粒子及びプロテアソーム−多孔性シリカナノ粒子の複合体をｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ加水分解分析により測定した。
【０１５２】
実施例９：ｉｎ ｖｉｔｒｏプロテアソームの分解
プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体による分解を試験するために、より生理的に関連しているプロテアソーム基質であるポリユビキチン化したＳｉｃ１ＰＹ（Ｕｂ−Ｓｉｃ１）を用いて、インビトロ（in vitro）Ｕｂ−Ｓｉｃ１分解検定を行った。様々な時間の間、プロテアソーム又はＭＳＮＰＮ−プロテアソーム複合体との反応を、抗Ｔ１７及び抗ＵＳＰ１４抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＩＢで分析した。精製されたヒトプロテアソーム又はプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体（５ｎＭ）を、プロテアソーム検定バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭのＡＴＰ）内でポリユビキチン化したＳｉｃ１ＰＹ（Ｕｂ−Ｓｉｃ１ＰＹ；２０ｎＭ）と、様々な時間の間インキュベートした。サンプルを２×ＳＤＳサンプルバッファーと混合し、７５℃で１０分間沸かした後、抗Ｔ７抗原を用いて免疫ブロットした。ＵＳＰ１４を維持する前記精製されたプロテアソームがＵｂ−Ｓｉｃ１に用いられたとき、Ｕｂ−Ｓｉｃ１は、培養３０分内に完全に分解した（図１６）。本実施例において、ＭＳＮＰＮに結合された前記プロテアソームがＵｂ−Ｓｉｃ１を分解したが、プロテアソーム単独のものと非常に区別されるパターンをもって分解したことが判明した。特に、初期の時点でプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体は、プロテアソーム単独のものよりもさらに迅速にＵｂ−Ｓｉｃ１を分解し、またＵｂ−鎖トリミング効果は少ないものと観察された。これは、推測すると、前記複合体の形成過程の間に、プロテアソームからの内部ＵＳＰ１４の電位を反映する（図１６）。前記複合体内のＵＳＰ１４の不足により増加したプロテアソーム活性は、直接プロテアソーム伝達戦略に有利であり得る。
【０１５３】
実施例１０：ＭＳＮＰＮ処理細胞の透過電子顕微鏡の分析
ＭＳＮＰＮ（８０μｇ／ｍＬ）が処理された細胞は、０．０５Ｍのカコジル酸ナトリウム（sodium cacodylate）バッファ（ｐＨ７．２）内で２％パラホルムアルデヒド及び２％グルタルアルデヒドで４℃で４時間固定された。前記サンプルを０．０５Ｍのカコジル酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、０．０５Ｍのカコジル酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．２）中の１％四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）で４℃で２時間後、固定した。その後、水で洗浄し、蒸留水中の０．５％ウラニルアセテートで一括染色した。次に、サンプルを３０％〜１００％の一連の等位エタノールで脱水した後、１００％の酸化プロピレンにより室温で１５分間２回脱水した。Ｓｐｕｒｒ樹脂（ＥＲＬ４２２１、ＤＥＲ（登録商標）７３６エポキシ樹脂、ＮＳＡ及びＤＭＡＥと混合される。）のシリーズを用いて浸透を行った。最終的に、試料をモールド内の新しい１００％Ｓｐｕｒｒ樹脂内に位置させ、７０℃で一晩重合体化した。超薄型セクション（ultrathin section）は、ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ ＭＴＸ（ＲＭＣ、ＵＳＡ）により用意された。セクションをＦｏｒｍｖａｒ−コートされた銅グリッドに吸着又はロードし、８０ｋＶでＴＥＭ（ＪＥＭ１０１０、ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）により観察した。
【０１５４】
実施例１１：細胞の培養
ＨＥＬＡ、ＨＥＫ２９３−ｐｒｅ１−ＨＴＢＨ、ＨＥＫ２９３−ｔｒｅｘ−ｈｔａｕ４０、及びｔａｕ−ＢｉＦＣを含む実施例で用いられた細胞は、４．５ｇ／ＬのＤ−グルコース及び補充剤として１０％ウシ血清培地（Fetal Bovine Serum、ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、及び１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium、ＤＭＥＭ）で培養した。細胞は、３７℃、５％のＣＯ２下で加湿インキュベーター内に維持された。プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体で処理される前日に、細胞をラウンドカバーグラス（φ２５ｍｍ、Ｎｏ．１、Ｄｅｃｋｇｌａｓｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上に接種した。前記複合体又はその対照を実験前にカバーグラス上の付着細胞に添加した後、インキュベーション時間後に培地を除去した。ＰＢＳで細胞を３回集中洗浄することで、結合されていないナノ粒子を除去後、蛍光画像を取得した。
【０１５５】
実施例１２：プロテアソームの細胞内内在化の評価
プロテアソームが細胞内に内在化することをＭＳＮＰＮが可能にするかどうかを測定するために、ＴＡＭＲＡ−標識されたＭＳＮＰＮ−プロテアソームの複合体（図１０ｂの５）を血清含有培養培地に加えた。その後、ＴＡＭＲＡ−標識されたＭＳＮＰＮ単独で、又はプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体（１:５０）で２４時間処理した。激しく洗浄後、ＨｅＬａ細胞を蛍光、共焦点及び透過電子顕微鏡により検査した（図１７ａ及び図１７ｂ）。複合体は、細胞質内で主に発見されたが、これはエンドサイトーシス小胞に蓄積されることを示す。様々な濃度及びモル比で、前記複合体は、培養後２時間内に細胞に進入し、９６時間以上（データは不記載）の間、サイトゾル（cytosol）内で維持された。ＭＳＮＰＮ又はプロテアソーム−ＭＳＮＰＮ複合体の細胞生存力に関する効果は、３００μｇ／ｍＬ未満の濃度において少し観察された（図１８）。
【０１５６】
実施例１３：エンドサイトーシス（endocytosis）阻害剤の存在下におけるＭＳＮＰＮの細胞吸収
細胞をゲニステイン、クロルプロマジン及びノコダゾールなどの様々なエンドサイトーシス阻害剤の存在下で、プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体により処理した後、蛍光顕微鏡及び流細胞分析器により測定した。ＨｅＬａ細胞を１２−ウェルプレートに接種し、インキュベーター内で培養した。２４時間後、細胞を３７℃で、又は無血清培地で４℃で１時間インキュベートしながら、クロルプロマジン（１０ｇ／ｍＬ）で処理することで、クラトリン依存のエンドサイトーシスを抑制し、ゲニステイン（２００Ｍ）を処理することで、カベオラ（caveolae）依存のエンドサイトーシスを抑制し、又はアミロライド（５０μＭ）及びノコダゾール（２０μＭ）を処理することで、マクロ飲作用（macropinocytosis）を阻害した。その後、細胞を２０ｇ／ｍＬのＭＳＮＰＮと同一の条件下で１時間インキュベートし、２ｍＬのＰＢＳにより３回洗浄した。ナノ粒子の吸収を定量するために、細胞をトリプシン化して収集し、４℃で遠心分離した後、冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を１％ＦＢＳを含有するＰＢＳに再懸濁し、ろ過した。蛍光強度を、アルゴンレーザーが備えられたＡｒｉａIII流細胞分析器（Becton Dickinson、ＵＳＡ）を用いて測定した。実験は３回行い、データは平均±ＳＤとして示した。
【０１５７】
複合体の細胞吸収は、エネルギー依存性であることが示され、カベオラ（caveolae）−及びクラスリン−媒介されたエンドサイトーシスの両方により処理された。しかし、クロルプロマジン（chlorpromazine、クラスリン分解抑制剤）は、ゲニステイン（genistein、カベオラ関連のチロシンキナーゼ）又はアミロライド（amiloride）及びノコダゾール（nocodazole、マクロ飲作用（macropinocytosis）の阻害剤）よりもさらにナノ粒子内在化を遅延させた。これは、コレステロールが豊富な脂質ラフト（raft）を、相対的に大きいＭＳＮＰＮを取り囲むことに活用できることを示すことである。
【０１５８】
前記結果は、プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体がエンドサイトーシス輸送により内在化されることを示す。輸送後、外部プロテアソームが活性化するかどうか、及び構造的に完全であるかどうかを試験するために、プロテアソームは、酸性ｐＨ類似（mimicking）エンドソームの条件で培養され、これらのタンパク質分解活性はモニタリングされた。プロテアソームの活性は、ｐＨ７．５よりもｐＨ５．５において約４倍低かった（図１９）。しかし、ｐＨが増加するにつれて、ｐＨ５．５にｐＨを下げることが、プロテアソーム活性の迅速な減少をもたらす一方、タンパク質分解活性は、正常のレベルに回復した。
【０１５９】
ｐＨ変化の前後における組成物及びプロテアソームの活性を、ネイティブＰＡＧＥにより測定した。精製されたプロテアソーム又は全細胞溶解物のサンプルを８５０ｖｏｌｔ−ｈｏｕｒｓで３．５％非変性ＰＡＧＥに溶解させ、プロテアソームを蛍光基質ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ）で視覚化した。ｐＨの変化後、プロテアソーム組成物又は同期（gating）の著しい変化は見られなかった。
【０１６０】
実施例１４：細胞内プロテアソームの活性
ＭＳＮＰＮ−媒介されたプロテアソームの伝達が細胞内の総プロテアソームの活性に影響するかどうかをテストした。ＨｅＬａ細胞を製造例６と同様にして製造したプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体により２４時間処理した。その後、細胞を１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、０．２％ＮＰ４Ｏ、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、及びプロテアーゼ阻害剤を含有する５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）内に溶解した。溶解物を２６Ｇ３／８”注射器を用いて均質化し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。結果として生成されたナノ粒子の存在しない上清液を、ＬＬＶＹ−ＡＭＣ加水分解活性の測定に用いた。プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体を含むペレットを検定バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬのアルブミン、１ｍＭのｆｒｅｓｈ ＡＴＰ、１ｍＭの新鮮なＤＴＴ）に再懸濁し、４０μＭのＬＬＶＹ−ＡＭＣを用いてプロテアソーム活性を測定した。前記測定は、２分間隔で３７サイクルが行われた。前記溶解物からＬＬＶＹ−ＡＭＣ加水分解活性からプロテアソーム活性が１０μＭのＭＧ１３２により阻害されることが確認された。
【０１６１】
プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体により処理された細胞の上清液におけるＬＬＶＹ−ＡＭＣ加水分解活性が、処理されていない細胞の活性と実質的に同一であった一方、著しく増加した活性が、内在化されたヒトプロテアソームを維持したプロテアソーム−伝達された細胞のペレット分画から観察された。ＭＳＮＰＮ−媒介されたプロテアソーム伝達により強化されたプロテアソーム活性は、先行研究で報告されているように、細胞に対して許容可能なものと示された（図１８の（ｂ））。ポリ−及び自由−ユビキチン又はＲＰ及びＣＰサブユニットの細胞レベルは、著しくは変化しなかった。
【０１６２】
実施例１５：プロテアソームによるタウタンパク質の分解
外部プロテアソームの伝達が生細胞（living cell）内におけるタンパク質の分解に影響を与えるかどうかを研究するために、ドキシサイクリン誘導（doxycycline induction、誘導可能なタウ細胞株）上で、ヒトタウの最長異性体（ｈｔａｕ４０）を発現させる、ＨＥＫ２９３−誘導された細胞株を使用した。タンパク質サンプルは、還元剤、β−メルカプトエタノール（βＭＥ）の存在及び不存在下で製造した。凝集されたタウタンパク質及びこれらの切断された形態は、表示された時間の間Ｄｏｘ処理（０．５μｇ／ｍＬ）後に誘導可能な細胞株から感知された。これらの細胞は、高容量−依存方式によりｈｔａｕ４０を発現させ、ＳＤＳ−抵抗性タウ凝集体の形成と一致する、培養２日後に徐々にタウ種を移動させた（図２０ａ及び図２０ｂ）。タウは、特に、タウ病及びアルツハイマー病（ＡＤ）の進行初期段階において、ユビキチン−プロテアソームシステムにより分解されるものと考えられる。
【０１６３】
誘導可能なタウ細胞株をＤｏｘ（０．５μｇ／ｍＬ、２４時間）、ＭＳＮＰＮ（５μｇ／ｍＬ）、及びプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体（５０μｇ／ｍＬ、モル比１:５０、２４時間）で処理したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＩＢで分析した。Ｈｉｓ ＩＢは、外部プロテアソームのβ４サブユニットのためのものである。様々な濃度のＤｏｘ（０、０．５、１、５及び１０ｎｇ／ｍＬ）、ＭＳＮＰＮ、及び／又はヒトプロテアソームにより処理した後、タウのレベルは、３回の独立した実験（ｎ＝３）からフィルム画像の密度計を用いて定量化した。ナノ粒子単独の処理では、効果が殆どなかったのに対し、精製されたプロテアソームがＭＳＮＰＮを通じて伝達されたとき、過発現されたタウのレベルは著しく減少した（図２１ａ及び図２１ｂ）。毒性を有し、かつ凝集性を有するものとして知られている、切断されたタウのレベルは、プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの処理により、また著しく減少した。タウの促進された分解は、伝達されたプロテアソームの量（０、５、１０、２５及び５０μｇ／ｍＬ、比１:５０）に依存的であった。
【０１６４】
外部プロテアソームによる翻訳後のタウ調節を確認するために、定量的なＲＴ−ＰＣＲは、タウ及びＧＡＰＤＨ（正規化のための調整）のためのプライマーを用いて行った。培養された細胞からの総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて準備した後、オン−カラムＤＮａｓｅ I処理とともに、ＲＮｅａｓｙ ミニ−カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて追加精製した。ｃＤＮＡサンプルをＡｃｃｕｐｏｗｅｒ（登録商標） ＲＴ−ｐｒｅ ｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を使用する逆転写から製造した。その後、希釈されたｃＤＮＡ、レポーター染料としてのＳＹＢＲ ｑＰＣＲマスター混合物（ＫＡＰＡ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）及び１０ｐｍｏｌｅの遺伝子特異プライマーとともに、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＲＧ ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、ＡＵ）を用いて、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。加熱サイクリング条件は、酵素活性化のために９５℃で３分、４０サイクル９５℃で１０秒間４０サイクル、５３℃で１５秒及び７２℃で３０秒を含めた。各ｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨレベルに正規化し、数値を３回の独立した実験の平均±ＳＤとしてプロットした。使用されたプライマー配列は、下記の通りである：Ｔａｕに対するフォワードプライマー（5’−aaggtgacctccaagtgtgg−3’）及びリバースプライマー（5’−gggacgtgggtgatattgtc−3’）；ＧＡＰＤＨに対するフォワードプライマー（5’−gagtcaacggatttggtcgt−3’）及びリバースプライマー（5’−gacaagcttcccgttctcag−3’）。
【０１６５】
タウｍＲＮＡのレベルは、前記条件下で類似していた。これは、外部プロテアソームが過発現されたタウの分解を直接加速化することを強く示すことである（図２２ａ）。伝達されたプロテアソームは、自己貪食流動又はＮｒｆ２及びｐ５３のような外部プロテアソーム基質のレベルに影響を及ぼさなかった。したがって、細胞に伝達された前記外部プロテアソームは、有害な非特異タンパク質の分解に関与する代わりに、過発現されたタウのようなＵＰＳに非正常に吸着又はロードを付与した、タンパク質基質をより効率よく分解することができる。今後の課題としては、プロテアソームの分解に関するそれらの異なる感度の根底をなす目標タンパク質の区別される特徴、例えば、タウの過リン酸化頻度及びＵｂ連結特異性を確認することが求められるだろう。
【０１６６】
ＭＳＮＰＮを使用するプロテアソームの伝達は、ＡＤの病理学的特徴であるタウ凝集体の形成を効果的に遅延させた（図２２ｂ）。前記効果は、自己貪食に依存的であり、おそらく可溶性タウタンパク質の加速化されたプロテアソームの分解が先行されただろう（図２１ａ及び図２３）。しかし、前記効果は、プロテアソーム阻害剤である１０μｇのＭＧ１３２により細胞を処理することで除去された。これは、可溶性タウとタウ凝集体との両方の著しい蓄積を招いた（図２２ｂ）。特に、プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの処理は、凝集されたハンチンチン（huntingtin）タンパク質のレベルを変更せず、これはプロテアソームにより処理されることが不可能であった。したがって、タンパク質レベルにおける外部プロテアソームの前記効果は、ＵＰＳ気質により制限された。
【０１６７】
実施例１６：タウオリゴマー化の定量
生細胞においてタウオリゴマー化を可視化及び定量化するために、生体分子の蛍光相補性（ＢｉＦＣ）を有するタウ細胞を活用した。ｈｔａｕ４０に独立して融合されたビーナス（Venus）タンパク質のＮ−末端部及びＣ−末端部の両方を本質的に発現するＨＥＫ２９３−誘導された安定な細胞株（Ｔａｕ−ＢｉＦＣ）を先行技術に基づいて製造した［Zhang, X., etal. The proteasome：A target of oxidative damage in cultured human retina pigment epithelial cells．IOVS49、3622−3630（2008）］。Ｔａｕ−ＢｉＦＣ細胞を１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルに接種し、ＤＭＳＯ又は３０ｎＭのオカダ酸（okadaic acid、ＯＡ）で２４時間培養してタウオリゴマー化の過程を促進した。蛍光画像を取得し、Ｏｐｅｒｅｔｔａ（PerkinElmer）で定量して分析した。
【０１６８】
ビーナスタンパク質のＮ−末端部及びＣ−末端部は、ｈｔａｕ４０に独立して融合された。これは、正常な条件下で基本の蛍光信号のみを示した。しかし、前記蛍光は、タウ過リン酸化の化学的誘導、例えば、オカダ酸により強く「ターン−オン（turned−on）」され、その結果としてタウオリゴマー化された。
【０１６９】
タウ−ＢｉＦＣ細胞株を５０μｇ／ｍＬのＭＳＮＰＮ及びプロテアソーム−ＭＳＮＰＮで処理した後、定量化されたタウオリゴマーのレベルを比較した。数値は、全体〜１０，０００細胞を含む３回の独立した培養の平均（±ＳＤ）を示す。誘導可能なタウ細胞と一致する、プロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体で処理したタウ−ＢｉＦＣ細胞は、ＭＳＮＰＮ単独で処理した細胞に比べてタウの凝集が著しく少ないことが示された。前記結果は、ＭＳＮＰＮを使用する外部プロテアソームの直接伝達がタンパク質毒性の条件下でタウタンパク質の凝集過程を遅延できることを示す。
【０１７０】
実施例１７：細胞の生存及び還元ストレスの評価
Ｄｏｘによるタウ誘導下で、細胞の生存及びＲＯＳの誘導剤であるパラＲ（paraquat）による還元ストレスを測定するために、誘導可能なタウ細胞ラインは、２５０ｐｇ／ｍＬのＤｏｘ及び１ｍＭのパラＲで３時間の間事前培養された。その後、ＭＳＮＰＮまたはプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体で１２時間処理した。
【０１７１】
細胞生存力をＣＣＫ−８（cell counting kit−8）分析（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｊａｐａｎ）により測定した。ナノ粒子処理の２４時間前に、ＨｅＬａ細胞を９６ウェルセル培養プレートにウェル当たり１ｘ１０４細胞の密度で接種した。２４時間インキュベートした後、細胞を様々な濃度のＭＳＮＰＮ又はプロテアソーム−ＭＳＮＰＮの複合体で処理した。対照細胞を同一体積のＰＢＳで処理した。２４時間後、培地を除去し、１００ｍＬの無血清培地及び１０ｍＬのＣＣＫ−８溶液を各ウェルに加えた。前記細胞を２時間インキュベートした。４５０ｎｍ波長におけるホルマザン塩の光学密度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ, Ｉｎｃ.、ＵＳＡ）を用いて測定し、培地のバックグラウンド吸光を除外した。実験を３回繰り返し、データは、平均±ＳＤで示した。
【０１７２】
数値は、平均±ＳＤ（ｎ＝５）を示す（**表示、ｐ＜０．０１）。プロテアソームの伝達は、過発現されたタウ及びＲＯＳの誘導剤であるパラＲにより誘導された細胞毒性を著しく緩和させる。これは、前記方法を、細胞からのタンパク質の毒性及び酸化ストレスを軽減するのに使用できることを示す。 
【０１７３】
本実施例では、ヒトプロテアソームのような高分子量のタンパク質複合体を、化学的に改質された多孔性ナノ粒子を用いて細胞に直接に伝達できることを報告する。前記外部プロテアソームは、ＭＳＮＰＮに結合されたとき、及びこれらがエンドサイトーシスを介して細胞内に内在化した後に、これらの活性及び機能性を維持する。前記方法を用いる増加された細胞のプロテアソームは、細胞に許容可能であり、非特異タンパク質の分解をもたらすことはなかった。重要なことは、外部プロテアソームを有する細胞は、可溶性タウの促進された分解、タウ凝集体の遅延された蓄積、タウとＲＯＳにより媒介されたタンパク質の毒性のストレスに対して強化された抵抗性を示したことである。シリカナノ粒子が血液脳関門透過性になるために、非活性、非抗原性、及び改質可能でプロテアソーム生合成又はプロテアソーム活性のインサイト（in situ）調節は、まだ開発されていないことを考慮すると、前記現在の戦略は、ニューロンに蓄積された毒性の凝集性タンパク質に対する興味深い代案になり得る。多くの疾患が毒性の誤って折り畳まれた（misfolded）凝集性タンパク質により引き起こされるため、プロテアソームの伝達範囲は、神経変性の疾患に限定されない。従って、直接なプロテアソームの伝達は、タンパク質の毒性又は酸化ストレス下で、細胞にとって潜在的に有益な介入となり得る。
【０１７４】
製造例８．グルタチオン（Glutathione、ＧＳＨ）で表面改質された多孔性シリカナノ粒子の合成
グルタチオンで表面改質された多孔性シリカナノ粒子（ＧＳＨ−ＭＳＮ）の合成は、図２４に示すように行われる。まず、ｅｐ−ｔｕｂｅを用いて、気孔が拡張され、かつ陽電荷で表面改質された多孔性シリカ粒子５０ｍｇを１ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して十分に分散した。その後、平均分子量３１２．３７、スペーサーアーム（spacer arm）の長さが０．６８ｎｍであるスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）リンカー２０ｍｇをｅｐ−チューブに入れた。両物質が均一に混合しながら反応が起こるように、２４時間の間オービタルシェーカーを用いて常温で十分に反応させた。反応が終了すると、遠心分離機を用いて生成物質を沈め、反応せずに残っているＳＰＤＰを除去するためにＤＭＳＯとエタノールを用いて洗浄した。この過程を各溶液で３回繰り返し、最後エタノールで洗浄した後、遠心分離機を回し、得られた沈んだ生成物を１ｍＬの３次蒸留水に分散した。その後、平均分子量３０７．３３のグルタチオンを入れ、２４時間の間オービタルシェーカーを用いて常温で反応させた。遠心分離機を用いて生成物質を沈めた後、蒸留水とエタノールでそれぞれ５回以上洗浄した。その後、真空ポンプを用いて、残りの溶媒を完全に除去した。グルタチオンの定量は、上層液中に溶けているピリジン−２−チオンの吸光度（Ａ３４３ｎｍ）を紫外線−可視光線分光分析装置により測定することで分かる。以後の実施例への適用のために、合成された粒子は、蒸留水に分散して４℃で保管した。
【０１７５】
実施例１８．合成されたグルタチオンで表面改質された多孔性シリカナノ粒子へのタンパク質のロード及び細胞内導入の分析
合成されたナノ粒子の有効成分の効果的な伝達及び作用有無を分析するために、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S−transferase、ＧＳＴ）タグされたタンパク質をロードした。このために、ＧＳＴタグされたリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を用いて、製造例８のように、グルタチオンで表面改質された多孔性シリカナノ粒子の内部のＧＳＨとＲＮａｓｅのＧＳＴとのＧＳＨ−ＧＳＴ相互作用を用いてロードを試みた。ロード前後の紫外線−可視光線吸光分析法により粒子を分析した。ＧＳＴタグされたＲＮａｓｅをロードした粒子の場合、遠心分離後、上層液に溶解しているロードされていないＧＳＴタグされたＲＮａｓｅの吸光度を用いてタンパク質のローディング率を測定し、測定された吸光強度を基準とし、２７８ｎｍにおける吸光値と、従来に報告されている吸光係数（ε＝９，８００Ｍ−１ｃｍ−１）を用いたＢｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ式を用いて算出した。
【０１７６】
Ａ＝εｂｃ
［Ａ：測定された吸光強度、ε：吸光係数、ｂ：測定容器のパスの長さ（１ｃｍ）、ｃ：物質のモル濃度］
【０１７７】
紫外線−可視光線吸光分析法により得られた結果において、１０μｇのＧＳＨ−ＭＳＮ当たり４μｇのＧＳＴタグされたＲＮａｓｅをロードできることを確認した。本発明者は、目的に合う有効成分を多孔性シリカナノ粒子に成功的にロードすることにより、今後、細胞、動物及び人体のレベルにおける薬剤学的有効物質の伝達及び治療研究に適したレベルにおける伝達体としての役割が可能であると判断した。これを検証するために、グルタチオンで表面改質された多孔性シリカナノ粒子にＧＳＴタグされたＲＮａｓｅをロードし、細胞内導入の効率性を検証した。特定の蛍光フィルターを用いる蛍光顕微鏡により、ヒト細胞のレベルにおける細胞内導入を観察するために、ＲＮａｓｅに蛍光染料を導入してナノ粒子にロードした。５０，０００個のＴＨＰ−１細胞株を１２ウェル培養プレートに分注し、２４時間後にホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を入れて分化した。その後、４μｇのＧＳＴタグされたＦＡＭ−ＲＮａｓｅをＧＳＨ−ＭＳＮにロードし、血清のない細胞培地とともに４時間処理した。その後、１Ｘ ＰＢＳで残りの物質を２回洗浄し、血清を含む新しい培地に入れ替え、１２時間の間、５％ＣＯ２、３７℃の環境でさらに細胞成長を進めた。３５８ｎｍと４９２ｎｍにおいて蛍光フィルターを有する共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した。それぞれの蛍光は、細胞核の蛍光（３５８ｎｍ、青）、ＧＳＴタグされたＲＮａｓｅ蛍光（４９２ｎｍ、緑）を示す。図２５に示すように、タンパク質の強い緑色蛍光が、細胞核の周囲の細胞質において均等に観察された。特にＺ軸を１μｍで区画して観察したところ、確かに、細胞の外部表面ではなく、細胞質内に分布することを細胞蛍光画像により確認した。これにより、本発明者らが合成したナノ粒子は、外部物質の細胞内導入が困難であると知られている細胞株に対しても、タンパク質を始めとする薬剤学的有効物質の伝達及び治療研究に適したレベルにおける伝達体としての役割が可能なことを確認した。
【０１７８】
実施例１９．ヒト細胞レベルにおけるグルタチオンで表面改質された多孔性シリカナノ粒子を用いたタンパク質伝達の有効性の検証
合成されたＧＳＨ−ＭＳＮが有効物質であるタンパク質を正しくロードした状態で細胞内に導入後、細胞質に放出することにより、ＤＮＡやＲＮＡのような核酸の発現量の調節を検証しようとした。ロードされているＲＮａｓｅが効果的なロード及び安定な放出が可能な場合、標的する一本鎖核酸を分解することにより、核酸が持っている潜在的疾病を抑制する治療目的への適用が可能となる。この効能を検証するために、ＴＨＰ−１に細胞株で発現される特定のＲＮＡを標的とし、これを分解するＲＮａｓｅを候補タンパク質として定め、１Ｘ ＰＢＳ緩衝溶液と１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を行った。Ｅｐ−ｔｕｂｅでＲＮａｓｅ＠ＭＳＮを用意し、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を入れた後、３０分間、３７℃の環境で反応を進行した。その後、ゲル電気泳動によりＲＮＡの分解有無を確認した。図２６に示すように、ナノ粒子にロードされたＲＮａｓｅの機能が効果的に作動することを確認した。その後、細胞レベルにおける治療機能の潜在力を検証しようとした。５０，０００個のＴＨＰ−１細胞株を１２ウェル培養プレートに分注し、２４時間後にホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）を入れて分化した。その後、４μｇのＧＳＴタグされたＲＮａｓｅをＧＳＨ−ＭＳＮにロードし、血清のない細胞培地とともに４時間処理した。その後、１Ｘ ＰＢＳで残りの物質を２回洗浄し、血清を含む新しい培地に入れ替え、１２時間の間、５％ＣＯ２、３７℃の環境でさらに細胞成長を進めた。その後、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、特定のＲＮＡの発現量をゲル電気泳動により比較した。図２６は、本願の多孔性シリカナノ粒子をタンパク質伝達体として活用して特定のＲＮＡの発現を抑制するＲＮａｓｅ伝達と機能的な有効性を分析した結果を示すものである。（ａ）は、ｅｐ−ｔｕｂｅ段階におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮａｓｅ活性分析であり、ゲル電気泳動によるＲＮＡ分解有無を分析した結果を示す画像であり、（ｂ）は、ｑＲＴ−ＰＣＲによるＴＨＰ−１細胞株における特定のＲＮＡ発現量を分析したグラフである。図２６に示すように、ＭＳＮを用いるＲＮａｓｅの伝達では、約５〜６０％のＲＮＡ発現抑制効率が得られた。また、本発明者らが合成したナノ粒子は、外部物質の細胞内導入が比較的困難な細胞株に対しても、タンパク質を始めとする目的に合う薬剤学的有効物質の伝達及び治療研究に適したレベルにおける伝達体としての役割が可能なものと判断された。
【０１７９】
実施例２０．ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおけるＭＳＮを用いたタンパク質伝達の評価
前記細胞レベルにおける効果的なタンパク質伝達の結果をもとに、動物レベルにおける薬剤学的有効物質の伝達及び治療研究に適したレベルの伝達体としての役割が可能なことを検証しようとした。そのために、マウス（ラット）を実験対象とし、Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅ雄マウスを（株）オリエントバイオから購入し、ＲＮａｓｅ（シグマアルドリッチコリア社）を１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）の条件で陰イオンを有するＭＳＮに静電気的引力でロードして、マウスに注入しようとした。５週齢のマウスにＨｅＬａ細胞を植えて異種移植（xenograft）腫瘍を成長させ、ＲＮａｓｅ伝達による腫瘍治療の効果を観察した。滅菌された１ｘＰＢＳに３，０００，０００個のＨｅＬａを分散し、マウスに皮下投与した。７０ｍｍ３まで腫瘍が成長したとき、ＰＢＳ、ＭＳＮ及びＲＮａｓｅをロードしたＭＳＮをそれぞれマウスの腫瘍内に注射投与した。図２７に示すように、ＰＢＳ又はＭＳＮのみを注入したマウスでは、腫瘍の成長抑制効果が示されなかったが、ＲＮａｓｅをロードしたＭＳＮを注入したときに、腫瘍の大きさが約３倍〜約４倍減少したことを確認できる。前記動物実験の結果から、本願に係るＭＳＮは、薬剤学的有効物質の伝達及び治療研究に適したレベルの伝達体としての役割が可能なことを確認した。
【０１８０】
実施例２１．ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおけるＭＳＮを用いたタンパク質伝達の評価
前記細胞レベルにおける効果的なタンパク質伝達の結果をもとに、動物レベルにおける安定的かつ効果的なタンパク質伝達体としての役割が可能であるかを検証しようとした。そのために、マウス（ラット）を実験対象とし、Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅ雄マウスを（株）オリエントバイオから購入し、Ｃｙ５蛍光が接合された陽イオンを有するＭＳＮ（Ｃｙ５−ＭＳＮ）を準備した。ＦＩＴＣ蛍光染料が接合されたイムノグロブリンＧ（ＦＩＴＣ−ＩｇＧ、シグマアルドリッチコリア社）を１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）の条件で静電気的引力でロードして、マウスに注入しようとした。５週齢のマウスにＨｅＬａ細胞を植えて異種移植（xenograft）腫瘍を成長させた。その後、ＦＩＴＣ−ＩｇＧとＣｙ５−ＭＳＮの伝達による蛍光強度及び分布をＯｐｔｉｘ Ｍｘ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）装置により観察した。滅菌された１ｘＰＢＳに３，０００，０００個のＨｅＬａを分散し、マウスに皮下投与した。７０ｍｍ３まで腫瘍が成長したとき、ＰＢＳ、Ｃｙ５−ＭＳＮ、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ、ＦＩＴＣ−ＩｇＧがロードされたＣｙ５−ＭＳＮをマウス腫瘍内に注射投与した。図２８ａ及び２８ｂに示すように、ＭＳＮとＩｇＧは、腫瘍組織によく伝達された。ＭＳＮにロードしていない状態のＩｇＧは、ＭＳＮにロードしたＩｇＧと比較して、腫瘍に注入後、比較的早く蛍光信号が消えることを確認することができる。前記動物実験の結果から、本願に係るＭＳＮは、薬剤学的有効物質の高い安定性とその機能を効果的に維持することにより、治療研究に適したレベルにおける伝達体としての役割が可能なことを確認した。
【０１８１】
前述した本願の説明は、例示のためのものであり、本願の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本願の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能なことを理解できるだろう。したがって、前述の実施例は、すべての側面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。例えば、単一型として説明されている各構成要素は、分散して実施してもよく、同様に、分散されたものとして説明されている構成要素は、結合された形態で実施してもよい。
【０１８２】
本願の範囲は、前述の詳細な説明よりは後述の特許請求の範囲によって示される。また、特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその均等概念から導き出されるすべての変更又は変形された形態は、本願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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