(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からトロホブラスト由来の間葉系幹細胞（Ｔ−ＭＳＣ）を生成する方法であって、
（ａ）ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣをトロホブラストに分化させるのに十分な１日〜５日間の第１の期間の間、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む培地中で、分化効率を増加させるためのＴＧＦβ阻害剤の存在下または非存在下、前記ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣを培養することと、
（ｂ）トロホブラスト細胞を単一細胞に解離させることと、
（ｃ）前記トロホブラスト細胞を、ゼラチン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、またはコラーゲンでコーティングしたプレート上に再播種することと、
（ｄ）拡張効率を増加させるために、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦを含有する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）成長培地中で、４日〜１０日間の第２の期間の間、前記トロホブラスト細胞を培養することと、を含む、方法。
【請求項２】
ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣからＴ−ＭＳＣを生成する方法であって、
（ａ）ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣをトロホブラストに分化させるために、ＢＭＰ４を含む培地中で、または分化効率を増加させるためのＴＧＦβ阻害剤と一緒に、前記ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣを１．５日〜５日間培養することと、
（ｂ）前記トロホブラストを単離することと、
（ｃ）前記単離したトロホブラストからトロホブラスト細胞を解離させることと、
（ｄ）前記トロホブラスト細胞をマトリゲルコーティングしたプレート上に再播種することと、
（ｅ）前記単一細胞の間葉系幹細胞への分化を誘導するのに十分な量の、血清、ＫＯＳＲを含有するＭＳＣ成長培地、または他の無血清培地中で４〜１０日間前記トロホブラスト細胞を培養することと、を含み、前記間葉系幹細胞の少なくとも約９０％がＣＤ７３を発現する、方法。
【請求項３】
前記ＴＧＦβ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３−０１、またはＡＬＫ５阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の第１のステップ前に、ｈＥＳＣが培養され、
（ｉ）マトリゲルコーティングしたプレート上で約８０％のコンフルエンシーまで培養するステップと、
（ｉｉ）解離させるステップと、
（ｉｉｉ）単離するステップと、
（ｉｖ）洗浄するステップと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＢＭＰ４の濃度が１〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＢＭＰ２の濃度が１００〜５００ｎｇ／ｍｌであり、ＢＭＰ７の濃度が１００〜５００ｎｇ／ｍｌであり、増殖および分化因子５（ＧＤＦ５）の濃度が１０〜５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法によって生成される、トロホブラスト由来のＭＳＣ（Ｔ−ＭＳＣ）。
【請求項７】
前記Ｔ−ＭＳＣが、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ９０＋である、請求項６に記載のＴ−ＭＳＣ。
【請求項８】
対象において、組織または臓器移植中の免疫拒否反応を予防または抑制するための、請求項１に記載の方法によって生成されるＴ−ＭＳＣ。
【請求項９】
前記Ｔ−ＭＳＣが、少なくとも約９０％のＣＤ７３＋である、請求項６に記載のＴ−ＭＳＣ。
【請求項１０】
自己免疫疾患を治療するための間葉系幹細胞（Ｔ−ＭＳＣ）を選択する方法であって、前記方法が、（ｉ）群１マーカーを発現する細胞を９５％超含有する、（ｉｉ）群２マーカーを発現する細胞を８０％超含有する、（ｉｉｉ）群３マーカーを発現する細胞を５％未満含有する、（ｉｖ）ＩＬ−１０およびＴＧＦβを発現する、（ｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−１２、およびＴＮＦαを発現する細胞を２％未満含有する、ならびに（ｖｉ）すべての群４マーカーを共発現する細胞を０．００１％未満含有する、特性を有するＴ−ＭＳＣを選択することを含み、群１マーカーが、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、およびＣＤ４４であり、群２マーカーが、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４９Ｅであり、群３マーカーが、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＳＳＥＡ４であり、群４マーカーが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０、およびＳＳＥＡ４である、方法。
【請求項１１】
前記細胞が、ＭＭＰ２およびＲＡＧＥを発現しない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔ−ＭＳＣ細胞が、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）によるＩＦＮγＲ１およびＩＦＮγＲ２の発現と比較して、ＩＦＮγＲ１およびＩＦＮγＲ２の低発現を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択されたＴ−ＭＳＣの特性が、ＣＤ７３を発現すること、およびＩＬ−６の低発現または非発現、の特性をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記選択されたＴ−ＭＳＣの特性が、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、およびＣＤ４４からの少なくとも１つの細胞マーカーを発現すること、ＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＣＤ４５から選択された少なくとも１つの細胞マーカーの低発現または非発現、ならびにＭＭＰ、ＲＡＧＥ、ＩＦＮγＲ１、ＩＦＮγＲ２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、およびＶＣＡＭ１からの少なくとも１つのマーカーの低発現または非発現、の特性をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔ−ＭＳＣが、照射にさらに供される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載のＴ−ＭＳＣの集団および薬学的に許容される担体を含む、薬学的調製物。
【請求項１７】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、炎症性、および／または先天性免疫関連疾患の治療に用いられる、請求項１０に記載の方法により選択されるＴ−ＭＳＣ。
【請求項１８】
請求項１０に記載のＴ−ＭＳＣおよび担体を含む、キット。
【請求項１９】
解凍試薬、免疫抑制エンハンサー、および抗ヒスタミンをさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記Ｔ−ＭＳＣをガンマ線照射で照射する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）Ｔ−ＭＳＣを分化するステップと、
（ｉｉ）前記Ｔ−ＭＳＣを誘導するステップと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法により生成されるＴ−ＭＳＣから、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、神経系列細胞、筋芽細胞、間質細胞、および線維芽細胞を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／６７０，１９２号および２０１２年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／６８４，５０９号に優先権を主張し、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に提供される開示は、概して、間葉系様幹細胞「ｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣ」または「Ｔ−ＭＳＣ」およびその幹細胞を生成する方法に関する。この方法は、胚性幹細胞がトロホブラストの中間分化を経て発育する条件下で胚性幹細胞を培養することと、ｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣまたはＴ−ＭＳＣにトロホブラストを分化することと、を含む。Ｔ−ＭＳＣ、Ｔ−ＭＳＣを含む溶液および薬学的組成物、Ｔ−ＭＳＣを作製する方法、疾患の治療および予防のためにＴ−ＭＳＣを使用する方法が本明細書に開示され、具体的には、Ｔ−ＭＳＣは、多発性硬化症および他の自己免疫疾患を治療するための免疫抑制剤として、組織の再生／修復での使用のために、ならびに血液脳関門および／または血液脊髄関門を横断する薬剤の送達のためにＴ−ＭＳＣを使用する方法に使用される。また、免疫系を調節する、個人の自己抗原に対する免疫応答を抑制する、損傷した中枢神経系を修復するために、Ｔ−ＭＳＣを使用する方法も本明細書に開示される。修飾された遺伝子発現を通じて改善された免疫抑制機能を有する修飾されたＴ−ＭＳＣを提供する方法と同様に、免疫調節で用いるためにＴ−ＭＳＣを含む組成物が本明細書に開示される。
【背景技術】
【０００３】
ヒト間葉系幹／間質細胞（ＭＳＣ）は、免疫系制御および組織修復に広く使用されている。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、高品質のヒトＭＳＣを発生させるための信頼できる源として使用することができる。ＭＳＣにｈＥＳＣを分化するための多くの方法が存在する。しかしながら、現行の方法では、高純度のＭＳＣを高収率で生成するのに十分な様式でそのような分化を行うことができない。
【０００４】
骨髄、臍帯、および脂肪組織等の成体マウスまたはヒト組織由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、多能性、すなわち、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、神経系列細胞、筋芽細胞、間質細胞、および線維芽細胞等を含む様々な成熟細胞系統を発生させることが可能である。これらの技術は、よく特徴付けられ、特許権を有する。例えば、Ｃａｐｌａｎらの米国特許第５，４８６，３５９号（ヒト間葉系幹細胞）を参照されたい。
【０００５】
しかしながら、現在利用できる成体組織由来のＭＳＣは、いくつかの潜在的な問題がある。第一に、骨髄等のドナー組織の限定された源および異なる品質は、ＭＳＣの研究および適用を制限し、大規模な臨床用途の医療用品としてＭＳＣの標準化を阻む。第二に、成体組織から得られたＭＳＣは、高度に混合した細胞集団であり、細胞のごく一部のみが強い免疫抑制効果を有する。臨床用途のために十分な細胞数を得るために、インビトロ拡張が必要であり、これにより、ＭＳＣの免疫抑制および帰巣能力を低下させることができる（Ｊａｖａｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。第三に、悪性転化（Ｗｏｎｇ，２０１１）およびドナーからの感染性病原体の潜在的伝播を含む成体由来のＭＳＣの使用に関する安全性の問題がある。
【０００６】
これらの潜在的な問題を克服するために、科学者らは、様々な方法によってｈＥＳＣからＭＳＣを得ようと試みている。これらの方法は、マウスＯＰ９細胞株を用いた共培養、または複数のサイトカインおよび化学物質を厳選し、使用することを含む（Ｂａｒｂｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。近年、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤ＳＢ４３１５４２は、ｈＥＳＣをＭＳＣに分化するために使用し、これは手順を簡便化し、効率性を向上させる（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）が、その収率および純度は、非常に低い（下述の比較試験を参照のこと）。２０１０年に、発明者らおよびＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、多くの高価なサイトカインおよびメチルセルロース培地の使用を含む、血管芽細胞からＭＳＣを得る別の方法を開発したが、この方法を使用する派生効率も低い。
【０００７】
ｈＥＳＣをＭＳＣに分化するための現在知られている方法はそれぞれ、１つ以上の重篤な欠点および弱点を有すると特徴付けられる：ＯＰ９間質細胞を用いて共培養したｈＥＳＣからのＭＳＣの分化は、多大な時間を要する、低収率、低純度の細胞を生成する、ならびに動物支持細胞および未定義の培養条件を使用することの不利点を有する（Ｂａｒｂｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ｈＥＳＣによって形成された再播種した胚様体周辺に増生した細胞からの分化は、多大な時間を要する、低収率の細胞を生成する、未定義の培養条件を使用する、および高価な方法であることの不利点を有する（Ｏｌｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。コラーゲンでコーティングしたプレート上で培養されたｈＥＳＣからの分化は、非常に低い収率、未定義の培養条件、および多大な時間を要するという不利点を有する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤で処置されたｈＥＳＣによる分化は、低純度の細胞（我々の試験による）、低い細胞収率、多大な時間を要する方法、および生成された細胞の低い免疫抑制効果を含む不利点を有する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。したがって、様々な疾患のための治療および予防として使用するために、ＭＳＣの制限のない、安全で高度に安定した、効率的かつ一貫した源が必要である。
【０００８】
多発性硬化症（ＭＳ）は、末梢性免疫細胞の損傷した血液脳関門（ＢＢＢ）または血液脊髄関門（ＢＳＣＢ）を通過する中枢神経系（ＣＮＳ）への浸潤によって引き起こされる慢性自己免疫疾患であり、これは、神経軸索周辺のミエリン鞘の炎症を引き起こし、軸索の脱髄および瘢痕化を引き起こす（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ（２００７））。米国多発性硬化症協会によると、Ａｖｏｎｅｘ（ＩＦＮβ−１ａ）、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（ＩＦＮβ−１ｂ）、Ｇｉｌｅｎｙａ（スフィンゴシン１−リン酸受容体調節薬）、酢酸グラチラマー（またはコポリマー１）、およびＴｙｓａｂｒｉ（ヒト化抗−α−インテグリン抗体）を含む、ＭＳの治療のための７０超のＦＤＡで承認された医薬品がある。しかしながら、これらは、一時的な緩和のみを提供し、感染症の増加、心臓発作、脳卒中、進行性多巣性白質脳症、不整脈、疼痛、鬱病、疲労、黄斑浮腫、および勃起不全を含む重篤な副作用と関連している（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏ（２０１２）、Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２））。
【０００９】
間葉系間質／幹細胞（ＭＳＣ）の翻訳は、それらの免疫調節および神経再生効果（Ａｕｌｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９））ならびに血液脳関門を修復するための潜在的能力（Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）、Ｍｅｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２））による潜在的に魅力的な療法として現れる。ＭＳＣは、多能性を意味し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、およびニューロンを含む様々な細胞系統を発生させることができる。それらは、羊膜、臍帯、骨髄、および脂肪等の胎児、新生児、および成体組織に由来し得る。ＭＳＣは、これらの細胞が複数かつ潜在的な相助作用治療的要因の担体として機能し得、メディエーターの分泌および細胞−細胞接触を通じて局所効果を発揮するために損傷組織へ遊走することができるため、現行の薬物療法を上回るいくつかの独自の利点を有する（Ｕｃｃｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｋｏｐ（２０１０ａ））。重要なことには、ＭＳＣは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に罹患しているマウス、ＭＳのよく認識された動物モデル（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ａ、Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）、Ｍｏｒａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）、Ｐｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）、Ｚａｐｐｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））、ならびに臨床試験におけるＭＳ患者（Ｃｏｎｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）、Ｋａｒｕｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）、Ｍｏｈｙｅｄｄｉｎ  Ｂｏｎａｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）、Ｙａｍｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０））の処置において効果的であることが見出されている。マウスおよびヒト骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）の両方に問題が見られない異種発生により、ＥＡＥマウスの疾患の進行を弱めることができる（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８ａ）、Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）、Ｍｏｒａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）、Ｐｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）、Ｚａｐｐｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））。しかしながら、異なる報告においてＢＭ−ＭＳＣにより処置されたＥＡＥマウスにおいて、変動する効果が報告された（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８ａ）、Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）、Ｚａｐｐｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））。疾患の処置におけるＢＭ−ＭＳＣの有効性は、疑わしい。
【００１０】
これらの疾患およびその他の疾患のための治療および予防薬として使用するために、ＭＳＣの制限のない、安全で高度に安定した、効率的かつ一貫した源が強く必要である。これらの必要を満たす高効率の分化方法によって、ｈＥＳＣに由来するｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣが、本明細書に開示される。また、他の方法によって分化されたＢＭ−ＭＳＣおよび他のｈＥＳ−ＭＳＣと比較して、ｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣにおいて異なった形で発現されるいくつかの重要な要因が特定される場合の、マイクロアレイ分析および他の分析も、本明細書に開示される。
【発明の概要】
【００１１】
トロホブラスト導入の中間ステップを通じて間葉系様幹細胞をｈＥＳＣから得る方法が、本明細書に開示される。この方法によって得られるＭＳＣは、「ｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣ」または「Ｔ−ＭＳＣ」と称される。Ｔ−ＭＳＣは、脂肪細胞、筋芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、間質細胞が含まれるが、これらに限定されない細胞または細胞系統、Ｔ−ＭＳＣ由来の細胞もしくは細胞系統、または「Ｔ−ＭＳＣ由来の系統」もしくは「Ｔ−ＭＳＣ−ＤＬ」と称される、細胞または細胞系統に分化され得る。
【００１２】
免疫抑制の特性を有するＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬを含む組成物を含む組成物が、本明細書に開示される。免疫応答を調節するためのそれらの能力に基づいて選択されたＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの集団、ならびに免疫調節の特性を有する組成物が、本明細書に開示される。本明細書に開示される、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、骨髄由来のＭＳＣと比較してより高度な免疫抑制活性を有する。
【００１３】
高純度および高収率のＴ−ＭＳＣを効率よく生成するための方法が、本明細書に開示される。本方法は、以前に報告されたものよりも比較的少ないステップかつ分化因子をあまり必要としない特性を有する。
【００１４】
トロホブラストの中間分化を通じて間葉系様幹細胞を得るためのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を使用する方法が、本明細書に開示される。トロホブラスト由来のＭＳＣは、ｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣまたはＴ−ＭＳＣと称される。Ｔ−ＭＳＣは、免疫系を調節するために使用することができる。例えば、Ｔ−ＭＳＣは、中枢神経系中の免疫細胞によって生じた損傷を防ぐことによって多発性硬化症を治療する際に有効である。
【００１５】
本明細書に開示される方法によって生成されるヒト胚由来の間葉系幹細胞が、本明細書に開示される。
【００１６】
Ｔ−ＭＳＣのＴ−ＭＳＣ−ＤＬへの分化を誘導する方法が、本明細書に開示される。
【００１７】
また、哺乳動物および特にヒト対象において、多発性硬化症および他の自己免疫疾患を治療するためのＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの適用も、本明細書に開示される。
【００１８】
例えば、組織または臓器移植中、免疫拒否反応の予防または抑制のために、免疫調節で用いる細胞生成物のＴ−ＭＳＣを提供することは、開示された本発明のさらなる目的である。免疫応答を軽減または抑制する方法の別の特定の実施形態において、免疫応答は、移植片対宿主疾患である。別の特定の実施形態において、免疫応答は、自己免疫疾患、例えば、糖尿病、紅斑性狼瘡、またはリウマチ性関節炎である。
【００１９】
疾患の治療で用いる細胞生成物のＴ−ＭＳＣ−ＤＬを提供することは、開示された本発明のさらなる目的である。
【００２０】
本明細書に提供されるできるだけ多くの幹細胞を使用することができる方法が、免疫応答の検出可能な抑制をもたらすために必要とされる。例えば、複数の免疫細胞を接触させるために使用される本明細書に提供される多数の幹細胞は、１×１０５個のＴ−ＭＳＣ、１×１０６個のＴ−ＭＳＣ、１×１０７個のＴ−ＭＳＣ、１×１０８個のＴ−ＭＳＣ、またはそれ以上を含むことができる。
【００２１】
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、ｈＥＳＣからＭＳＣを得る（本明細書では、生成するとも称する）ための新規のプロセスである。本方法は、
ａ．少なくとも１つの増殖因子の存在下でトロホブラストに分化させるために胚性幹細胞の分化を誘導するのに十分な量の無血清培地中でヒト胚性幹細胞を含む細胞培養物を培養するステップであって、一実施形態において、トロホブラストへの分化の期間は、約２〜５日であり、一実施形態において、この培地は、分化効率を増加させるために、ＴＧＦβ阻害剤（すなわち、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３−０１、またはＡＬＫ５阻害剤等）の存在または非存在下でＢＭＰ４を含む、ステップと、
ｂ．少なくとも１つの増殖因子を、トロホブラストを含む培養物に添加して、無血清培地中で培養を継続するステップであって、この増殖因子は、トロホブラストを拡張させるのに十分な量であり、一実施形態において、この培地は、ＢＭＰ４を含む、ステップ（このステップは任意である）と、
ｃ．トロホブラストを単離し、このトロホブラストをゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンまたはマトリゲルでコーティングしたプレート上に再播種し、プレＴ−ＭＳＣを通じてトロホブラストをＴ−ＭＳＣに分化するのに十分な量の血清含有または無血清培地中で培養するステップと、を含み、一実施形態において、単離されたトロホブラストは、Ｔ−ＭＳＣを生成するために、４〜１０日間培養して、得られたＴ−ＭＳＣのうちの少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、成体ＭＳＣに対して細胞表面マーカーを発現し、一実施形態において、この培地は、拡張効率を増加させるために、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦを含む。
【００２２】
特定の実施形態において、ｈＥＳＣ由来のトロホブラストは、Ｔｒｏｐ−２を発現するが、ＣＤ７３を発現しない。
【００２３】
特定の実施形態において、プレＴ−ＭＳＣは、Ｔｒｏｐ−２および／またはＣＤ７３を発現する。
【００２４】
特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋を発現する。ｈＥＳＣを高純度のＭＳＣに分化することが、開示される本方法の目的である。好ましい実施形態において、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％よりも高い純度を有するＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋のＴ−ＭＳＣが、生成される。
【００２５】
高純度を有する多数のＴ−ＭＳＣは、高パーセンテージのＭＳＣが成体ＭＳＣに対する細胞表面マーカーを発現するという観察によって示される。これらのＭＳＣは、他の方法によって得られたＭＳＣよりもインビトロおよびインビボの両方でより高い免疫抑制効果を有する。この現在開示されている方法によって得られたＭＳＣは、ｈＥＳ−トロホブラスト由来のＭＳＣと称され、より簡潔には、本明細書では、Ｔ−ＭＳＣと称される。
【００２６】
ある特定の実施形態において、血清含有培地は、ウシ胎仔血清またはヒトＡＢ血清、Ｌ−グルタミンを含有し、無血清培地は、ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する。
【００２７】
ある特定の実施形態において、１ｇｙ〜２００ｇｙの範囲に及ぶガンマ放射線で得られたＴ−ＭＳＣを照射するさらなるステップがある。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態において、Ｔ−ＭＳＣを発生させ、拡張させるための方法により、少なくとも１０，０００個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５０，０００個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１００，０００個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５００，０００個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０６個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０６個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０７個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０７個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０８個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０８個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０９個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０９個のＴ−ＭＳＣ、または少なくとも１×１０１０個のＴ−ＭＳＣを得る。これらの方法により、１０，０００〜１００億個のＴ−ＭＳＣを含み得る細胞溶液を得る。ある特定の実施形態において、得られたヒト胚間葉系幹細胞のうちの少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、１つ以上のｈＥＳ−ＭＳＣ分化マーカーを発現する。ある特定の実施形態において、マーカーは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５である。
【００２９】
一実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、ＥＡＥマウスの疾患スコアを著しく減じ、脱髄の減少、Ｔ細胞の浸潤、およびミクログリア応答が同時に起こる。さらに、Ｔ−ＭＳＣは、骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）と比較して、インビボおよびインビトロでさらに強力な免疫抑制活性を有する。また、Ｔ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとの間で異なって発現する重要なタンパク質／分子も、本明細書に提供される。タンパク質／分子マーカーの発現レベルを測定することによって改善された免疫抑制活性を有するＴ−ＭＳＣを特定する方法が、本明細書に提供される。また、Ｔ−ＭＳＣの免疫抑制活性を改善するための遺伝的修飾の方法も開示される。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１０，０００個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５０，０００Ｔ−ＭＳＣ、少なくとも１００，０００個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５００，０００個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０６個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０６個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０７個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０７個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０８個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０８個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０９個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０９個のＴ−ＭＳＣ、または少なくとも１×１０１０個のＴ−ＭＳＣを含むＴ−ＭＳＣを含む溶液である。
【００３１】
ある特定の実施形態において、培養体積は、少なくとも１０，０００個の細胞に対して２ｍｌから、少なくとも１００，０００個の細胞に対して１０ｍｌ、少なくとも１，０００，０００個の細胞に対して１００ｍｌ、少なくとも１０，０００，０００個の細胞に対して１０００ｍｌ、５×１０８個の細胞に対して培地の４０００ｍｌまでである。
【００３２】
これらの溶液は、対象に注入することができる。これらの溶液は、冷凍することができる。これらの溶液は、Ｔ−ＭＳＣの投与によって治療することができる疾患のための医薬の製造のために使用することができる。
【００３３】
本発明はまた、患者への注入に好適なＴ−ＭＳＣ溶液を製造するための方法も提供し、この方法は、前述の段落に記載される細胞の溶液を単離するステップと、細胞を患者への注入に好適な溶液に入れるステップとを含む。本方法はまた、冷凍するのに好適なＴ−ＭＳＣ溶液を製造するための方法も提供し、この方法は、前述の段落に記載される細胞を単離するステップと、冷凍するのに好適な溶液に入れるステップとを含む。
【００３４】
本発明のさらに別の実施形態は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、またはこれらの組み合わせを含む細胞マーカータンパク質のうちの１つ以上を発現するＴ−ＭＳＣである。さらなる実施形態において、ヒト胚間葉系幹細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４５、またはこれらの組み合わせを含む１つ以上の細胞マーカータンパク質を発現しないか、または低レベルで発現する。さらなる実施形態において、ヒト胚間葉系幹細胞は、ＭＭＰ２、ＲＡＧＥ、ＩＦＮγＲ１、ＩＦＮγＲ２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＶＣＡＭ１、またはこれらの組み合わせを含む１つ以上のプロ炎症性タンパク質を発現しないか、または低レベルで発現する。ある特定の実施形態において、ヒト胚間葉系幹細胞は、骨髄由来のＭＳＣと比較して、上記のマーカーレベルの少なくとも半分を発現した。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、およびＣＤ４４を含む細胞マーカータンパク質のうちの１つ以上を発現するＴ−ＭＳＣを含む細胞培養物である。さらなる実施形態において、細胞培養物中のＴ−ＭＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＣＤ４５を含む１つ以上の細胞マーカータンパク質を発現しないか、または低レベルで発現する。さらなる実施形態において、細胞培養物中のＴ−ＭＳＣは、ＭＭＰ２、ＲＡＧＥ、ＩＦＮγＲ１、ＩＦＮγＲ２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−６、およびＶＣＡＭ１を含む１つ以上のプロ炎症性タンパク質を発現しないか、または低レベルで発現する。
【００３６】
ある特定の実施形態において、細胞培養物は、少なくとも１×１０６個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０７個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０８個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０９個のＴ−ＭＳＣ、または少なくとも１×１０１０個のＴ−ＭＳＣを含む。
【００３７】
さらなる実施形態において、細胞培養物中のＴ−ＭＳＣの少なくとも約９０％が、ＣＤ７３タンパク質を発現し、Ｔ−ＭＳＣの少なくとも９０％超が、ＣＤ７３タンパク質を発現し、Ｔ−ＭＳＣの少なくとも約９５％が、ＣＤ７３タンパク質を発現するか、またはＴ−ＭＳＣの９５％超が、ＣＤ７３タンパク質を発現する。さらなる実施形態において、細胞培養物中のＴ−ＭＳＣの少なくとも約９６％が、ＣＤ７３タンパク質を発現し、Ｔ−ＭＳＣの少なくとも９７％超が、ＣＤ７３タンパク質を発現し、Ｔ−ＭＳＣの少なくとも約９８％が、ＣＤ７３タンパク質を発現するか、または、Ｔ−ＭＳＣの９９％超が、ＣＤ７３タンパク質を発現する。
【００３８】
さらなる実施形態において、細胞培養物中のＴ−ＭＳＣの少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％が、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、およびＣＤ２９からなる群から選択された少なくとも１つの細胞マーカータンパク質を発現する。
【００３９】
さらなる実施形態において、細胞培養物中のＴ−ＭＳＣの少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９９％が、発現しないか、またはＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＣＤ４５を含む低レベルの少なくとも１つの細胞マーカーを発現する。
【００４０】
さらなる実施形態において、細胞培養物中のＴ−ＭＳＣの少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％が、ＭＭＰ２、ＲＡＧＥ、ＩＦＮγＲ１、ＩＦＮγＲ２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−６、およびＶＣＡＭ１を含む少なくとも１つのプロ炎症性タンパク質を発現しないか、または低レベルで発現する。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、高レベルのＣＤ２４、ＴＧＦβ２、またはその両方を発現する。
【００４１】
本明細書に記載のＴ−ＭＳＣまたは細胞培養物のある特定の実施形態において、細胞は、ガンマ放射線を使用して照射される。
【００４２】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載のＴ−ＭＳＣまたは細胞培養物のうちのいずれか１つおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的調製物である。
【００４３】
本発明のなおさらなる実施形態は、本明細書に記載のＴ−ＭＳＣまたは細胞培養物のうちのいずれか１つを含む冷凍保存された調製物である。
【００４４】
Ｔ細胞関連自己免疫疾患の治療または予防を必要とする対象に、それを治療または予防する方法が、本明細書に提供され、本方法は、治療有効量の前述の段落に記載されるＴ−ＭＳＣを含む溶液、細胞培養物、または薬学的調製物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。Ｔ細胞関連自己免疫疾患としては、クローン病、炎症性腸疾患、移植片対宿主疾患、全身性紅斑性狼瘡、およびリウマチ性関節炎、Ｔ細胞媒介性遅延型過敏症（ＩＶ型過敏症）、すなわち、１型糖尿病、ＭＳ、ＲＡ、橋本甲状線炎、クローン病、接触性皮膚炎、強皮症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
ある特定の実施形態において、対象は、好ましくは、哺乳動物または鳥類であり、最も好ましくは、ヒトである。ある特定の実施形態において、溶液、細胞培養物、または薬学的調製物は、照射されたまたは照射されていないＴ−ＭＳＣを含む。
【００４６】
ある特定の実施形態において、疾患を治療または予防するための方法は、疾患の治療または予防のための１つ以上の治療剤を用いた併用療法を含む。
【００４７】
他のある特定の実施形態において、本発明は、多発性硬化症の治療または予防を必要とする対象に、それを治療または予防するための方法を提供し、本方法は、治療有効量の前述の段落に記載されるＴ−ＭＳＣを含む溶液、細胞培養物、または薬学的調製物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。多発性硬化症は、再発／寛解型多発性硬化症、進行／再発型多発性硬化症、一次多発性硬化症、または二次多発性硬化症であり得る。対象は、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくはヒトである。溶液、細胞培養物、または薬学的調製物は、照射されたまたは照射されていないＴ−ＭＳＣを含み得る。
【００４８】
本方法は、フィンゴリモド、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ＩＦＮβ−１ａ、ＩＦＮ−１ｂ、グリアトリアマーアセテート、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、クラドリビン、シクロスポリン、ミトキサントロン、およびスルファサラジンが含まれるが、これらに限定されない、対象へのさらなる治療剤の投与をさらに含むことができる。さらに別の実施形態において、これらの治療剤のうちの１つ以上が、中枢神経系への治療剤の送達のために、血液脳および／または血液脊髄関門を横断するために、Ｔ−ＭＳＣに結合し得る。
【００４９】
血液脳関門および／または血液脊髄関門を通って薬剤を送達する方法が、本明細書に提供され、本方法は、Ｔ−ＭＳＣに本薬剤を結合またはコンジュゲートして、複合体を形成するステップと、ヒト胚間葉系幹細胞−薬剤の複合体を、それを必要とする対象に投与するステップとを含み、Ｔ−ＭＳＣが血液脳関門および／または前記血液脊髄関門を横断することができ、この薬剤は、疾患または損傷の治療、予防、または診断を必要とする対象において、治療、予防、または診断のためのものである。Ｔ−ＭＳＣは、単一細胞、細胞培養物、溶液、または薬学的調製物の形態であり得る。薬剤には、薬物、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
さらなる実施形態は、血液脳関門および／または血液脊髄関門を横断するための、Ｔ−ＭＳＣ、およびコンジュゲート剤または接着剤を含む送達系である。
【００５１】
本明細書に記載の方法は、多くの利点を有する。トロホブラストの中間段階によってｈＥＳＣを分化することが開示される方法の目的であり、この方法は、すべての既存の方法とは異なり、以下の利点をもたらす。
【００５２】
自己免疫疾患を治療するための臨床グレードのＴ−ＭＳＣを選択する方法が本明細書に提供され、Ｔ−ＭＳＣは、（ｉ）群１マーカーを発現する細胞を９５％超含有する、（ｉｉ）群２マーカーを発現する細胞を８０％超含有する、（ｉｉｉ）群３マーカーを発現する細胞を５％未満含有する、（ｉｖ）ＩＬ−１０およびＴＧＦβを発現する、（ｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−１２、およびＴＮＦαを発現する細胞を２％未満含有する、ならびに（ｖｉ）すべての群４マーカーを共発現する細胞を０．００１％未満含有する、特性を有し、群１マーカーは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、およびＣＤ４４であり、群２マーカーは、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４９Ｅであり、群３マーカーは、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＳＳＥＡ４であり、群４マーカーは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０、およびＳＳＥＡ４である。
【００５３】
Ｔ−ＭＳＣを修飾して、（ｉ）群１マーカーを発現する細胞を９５％超含有する、（ｉｉ）群２マーカーを発現する細胞を８０％超含有する、（ｉｉｉ）群３マーカーを発現する細胞を５％未満含有する、（ｉｖ）ＩＬ−１０およびＴＧＦβを発現する、（ｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−１２、およびＴＮＦαを発現する細胞を２％未満含有する、ならびに（ｖｉ）すべての群４マーカーを共発現する細胞を０．００１％未満含有する、特性を有する修飾されたＭＳＣの集団を生成する方法が、本明細書に提供され、群１マーカーは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、およびＣＤ４４であり、群２マーカーは、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４９Ｅであり、群３マーカーは、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＳＳＥＡ４であり、群４マーカーは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０、およびＳＳＥＡ４である。
【００５４】
記載されるＴ−ＭＳＣから分泌される１つ以上の生体分子を含む、馴化培地、馴化培地の濃縮物、細胞溶解物、またはその他の誘導体が本明細書に提供される。
【００５５】
骨髄造血幹細胞の拡張および臍帯造血幹細胞の拡張のための支持細胞として、本明細書に記載されるＴ−ＭＳＣを使用する方法が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、開示される方法に適したＴ−ＭＳＣは、Ｓｔｒｏ３を発現する。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、骨髄造血幹細胞および／または臍帯造血幹細胞と共培養される。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、間葉系間質細胞である。本明細書に記載されるＴ−ＭＳＣと骨髄造血幹細胞との共培養が、本明細書に提供される。本明細書に記載されるＴ−ＭＳＣと臍帯造血幹細胞との共培養が、本明細書に提供される。
【００５６】
また、本明細書に記載されるＴ−ＭＳＣを含むキットも開示される。ある特定の実施形態において、このキットは、Ｔ−ＭＳＣおよび細胞送達担体を含む。
【００５７】
一態様において、免疫応答を抑制または低下させる方法が、本明細書に提供され、本方法は、免疫応答を検出可能に抑制するのにＴ−ＭＳＣには十分な時間、複数の免疫細胞を複数のＴ−ＭＳＣと接触させることを含み、Ｔ−ＭＳＣは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞の増殖および／または分化を検出可能に抑制する。別の特定の実施形態において、この接触は、インビトロで行われる。別の特定の実施形態において、この接触は、インビボで行われる。さらに特定の実施形態において、インビボでの接触は、哺乳動物の対象、例えば、ヒト対象において行われる。別のさらに特定の実施形態において、この接触は、Ｔ−ＭＳＣを静脈内で、筋肉注射で、または対象における臓器（例えば、膵臓）に投与することを含む。
【００５８】
免疫応答を調節する（例えば、抑制する）ためのそれらの能力に基づいて選択されたＴ−ＭＳＣを含む細胞集団を生成する方法が、本明細書に提供される。一実施形態において、例えば、本発明は、Ｔ−ＭＳＣ集団を選択する方法を提供し、本方法は、（ａ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて複数のＴ−ＭＳＣをアッセイすることと、（ｂ）複数のＴ−ＭＳＣがＭＬＲ（混合リンパ球反応）においてＣＤ４＋またはＣＤ８＋のＴ細胞増殖を検出可能に抑制する場合、複数のＴ−ＭＳＣを選択することと、を含み、Ｔ−ＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４４を発現する。一実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＣＤ４５を発現しないか、または低レベルで発現する。一実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、ＭＭＰ２、ＲＡＧＥ、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ−１２Ａ、ＩＬ−６、およびＶＣＡＭ１を発現しないか、または低レベルで発現する。
【００５９】
Ｔ−ＭＳＣを、脂肪細胞、筋芽細胞、神経系列細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、および間質細胞が含まれるが、これらに限定されない、複数の他の細胞系列に分化するための方法が、本明細書に提供される。
【００６０】
組織再生および／または組織修復のために、Ｔ−ＭＳＣおよびその分化した細胞生成物を使用するための方法が本明細書に提供され、本方法は、関節の再生、腱再生、結合組織の再生、神経系列細胞の再生、脂肪組織の再生、骨の再生、皮膚の再生、筋肉の再生、軟骨の再生、平滑筋の再生、心筋の再生、上皮組織の再生、靱帯の再生等が含まれるが、これらに限定されない、組織再生を促進するのに十分な量のＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ由来の他の細胞系列を投与することを含む。
【００６１】
特定の実施形態において、Ｔ細胞およびＴ−ＭＳＣは、例えば、約２０：１、１５：１、１０：１、５：１、２：２、１：１、１：２、１：５、１：１０、または１：２０、好ましくは１０：１の比率でＭＬＲ中に存在する。
【００６２】
高収率のプロセスによって多数のＭＳＣを効率よく生成することは、開示される方法のさらなる目的である。開示される方法は、開始時のｈＥＳＣの数と比較して、約１０倍多い数のＭＳＣを生成することができる。ｈＥＳＣがトロホブラスト段階を通じて分化する場合、細胞消失がほとんどないのに対して、他の方法は、通常、初期分化ステップ中、９０％超の開始時の細胞消失を有し、本明細書に開示される方法よりもはるかに低い細胞収率を得た。
【００６３】
比較的短時間でＭＳＣを生成することができる方法を提供することが、開示される方法の目的である。本明細書に開示される全プロセスは、６〜１４日以内に完了させることができ、これは、開始時のｈＥＳ株に応じて異なる。
【００６４】
低費用である方法を提供することが、開示される方法の目的である。本明細書に記載される分化方法のみが、非常に少量の培養培地を必要とし、本方法のみが、１つのサイトカイン−ＢＭＰ４を必要とし、これは低用量で開示される方法において使用される。
【００６５】
低費用である方法を提供することが、開示される方法の目的である。本明細書に記載される分化方法のみが、非常に少量の培養培地を必要とし、本方法のみが、１つのサイトカイン−ＢＭＰ４および／またはＴＧＦβ阻害剤（すなわち、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３−０１、またはＡＬＫ５阻害剤等）を必要とする。
【００６６】
高収率である方法を提供することが、開示される方法の目的である。本明細書に記載される分化方法は、３０日以内に１×１０５個のｈＥＳＣから１〜５×１０１０個のＴ−ＭＳＣ細胞を生成することができるのに対して、他の方法は、３０日以内に最大１×１０８個のＭＳＣ細胞しか生成することができない。
【００６７】
免疫抑制の高い有効性を有するＭＳＣを提供することが、開示される方法のさらなる目的である。Ｔ−ＭＳＣは、骨髄（ＢＭ）または他の源由来のＭＳＣよりも高い免疫抑制効果を有し、Ｔ−ＭＳＣは、他の方法によるｈＥＳＣ由来のＭＳＣよりも高い免疫抑制効果を有する。
【００６８】
特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、Ｔ−ＭＳＣの非存在下で、ＭＬＲにおけるＴ細胞の増殖と比較して、ＭＬＲにおけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋のＴ細胞の増殖を少なくとも５０％、７０％、９０％、または９５％抑制する。
【００６９】
別の特定の実施形態において、前述の組成物のうちのいずれも、マトリックスを含む。さらに特定の実施形態において、マトリックスは、三次元足場である。別のさらに特定の実施形態において、マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン、またはビトロネクチンを含む。別のさらに特定の実施形態において、マトリックスは、生体材料である。別のさらに特定の実施形態において、マトリックスは、細胞外タンパク質を含む。別のさらに特定の実施形態において、マトリックスは、合成化合物を含む。別のさらに特定の実施形態において、マトリックスは、生物活性化合物を含む。別のさらに特定の実施形態において、生物活性化合物は、成長因子、サイトカイン、抗体、または５，０００ダルトン未満の有機分子である。
【００７０】
本発明は、凍結保存した幹細胞集団、例えば、Ｔ−ＭＳＣを含む細胞集団をさらに提供し、細胞集団は、免疫調節され、このことは、本明細書に記載される。例えば、本発明は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞の増殖および／または分化を検出可能に抑制するものとして特定されるＴ−ＭＳＣ集団を提供し、これらの細胞は凍結保存され、この集団を容器内に入れる。
【００７１】
前述の凍結保存された集団のうちのいずれかの特定の実施形態において、この容器は、袋である。様々な特定の実施形態において、この集団は、ほぼ、少なくとも、または多くても１×１０６個の幹細胞、５×１０６個の幹細胞、１×１０７個の幹細胞、５×１０７個の幹細胞、１×１０８個の幹細胞、５×１０８個の幹細胞、１×１０９個の幹細胞、５×１０９個の幹細胞、または１×１０１０個の幹細胞を含む。前述の凍結保存された集団のうちのいずれかの他の特定の実施形態において、幹細胞は、ほぼ、少なくとも、または５回以下、１０回以下、１５回以下、または２０回以下継代培養した。前述の凍結保存された集団のうちのいずれかの別の特定の実施形態において、幹細胞は、容器内で拡張する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】（Ａ）トロホブラストおよびプレＴ−ＭＳＣの段階によってｈＥＳＣのＴ−ＭＳＣへの分化のためのプロトコルのフローチャート。それぞれの分化段階と関連する重要なバイオマーカーを示す。（Ｂ）ＭＳＣ収率および品質について様々なＭＳＣを発生するプロトコルの比較：ｈＥＳＣを３つのプロトコルに分化した。１）Ｔ−ＭＳＣ：トロホブラストの分化培地中で３日間、続いて、ＭＳＣ成長培地中で８〜１０日間。２）ＳＢ−ＭＳＣ：ＳＢ４３１５４２で補充した分化培地中で３〜１０日間、続いて、ＭＳＣ成長培地中で１２日間。３）ＨＢ−ＭＳＣ：ｈＥＳＣを、血管芽細胞の中間段階によってＭＳＣに分化し、ｈＥＳＣを無血清培地中で１０〜１３日間血管芽細胞に分化し、続いて、ＭＳＣ成長培地中で１２日間分化した。１０日目、２０日目、および３０日目の異なる培養物中のＭＳＣ総数（何百万個の細胞）、続いて、分化手順の開始を示す。ＭＳＣ純度は、ＣＤ７３＋細胞比率のＦＡＣＳ分析によって決定された。．
【図２】Ｔ−ＭＳＣに分化するプロセス中におけるｈＥＳＣの培養物中の様々な時点で、形態変化を観察した。（Ａ）２日目：トロホブラスト、（Ｂ）５日目：プレＭＳＣ（中胚葉細胞）、および（Ｃ）９日目：ＭＳＣ。
【図３】ｈＥＳＣのＴ−ＭＳＣへの分化時の様々な時点でのトロホブラストマーカーＴｒｏｐ−２（Ｔｒｐ−２）およびＭＳＣマーカーＣＤ７３を発現する細胞の比率の分析。（Ａ）２日目：トロホブラスト、（Ｂ）５日目：プレＭＳＣ（中胚葉細胞）、および（Ｃ）９日目：ＭＳＣ。
【図４】分化から１１日後のＴ−ＭＳＣの表面マーカー発現プロファイル。（Ａ）Ｔｒｐ２は、トロホブラストに対するマーカーであり、（Ｂ）ＣＤ３１は、内皮細胞に対するマーカーであり、（Ｃ）ＣＤ３４は、造血幹細胞に対するマーカーである。（Ｄ〜Ｈ）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ２９は、ＭＳＣに対するマーカーである。
【図５】Ｔ−ＭＳＣのインビトロでの免疫抑制機能。ＢＭ−ＭＳＣ（Ｇ〜Ｌ）またはＴ−ＭＳＣ（Ｍ〜Ｒ）を、１０：１の比率で、ＣＦＳＥ標識マウスリンパ球と混合した。細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体と一緒に、０．３または１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体で刺激した。細胞増殖を、ＦＡＣＳ分析によるＣＦＳＥ希釈によって示した。（Ａ〜Ｆ）ＢＭ−ＭＳＣを含まずに培養されたＴ細胞またはＴ−ＭＳＣ（標識対照）を示す。
【図６】Ｔ−ＭＳＣは、ＥＡＥマウスモデルの疾患スコアを減じる：ＥＡＥを、ＭＯＧ３５−５５＋アジュバントおよび百日咳毒素を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発した。Ｔ−ＭＳＣ、ＢＭ−ＭＳＣ、またはＳＢ４３１５４２方法を用いてｈＥＳＣから得られＭＳＣ（ｈＥＳ−ＭＳＣ（ＳＢ））を、ＥＡＥ誘発から６日後、マウスの腹膜内に注入した。疾患スコア（疾患なし０から重篤な疾患である４まで）を、ＭＳＣ注入から２７日間記録した。
【図７】（Ａ）骨細胞、（Ｂ）軟骨細胞、および（Ｃ）脂肪細胞に分化するためのＴ−ＭＳＣの多能性の決定。
【図８】ｈＥＳ−ＨＢ−ＭＳＣ（ｈＥＳ血管芽細胞（ｈｅｍａｇｉｏｂｌａｓｔ）由来のＭＳＣ）とＴ−ＭＳＣ（ｈＥＳトロホブラスト由来のＭＳＣ）およびＢＭ−ＭＳＣ（成体骨髄由来のＭＳＣ）を比較するための遺伝子発現分析。遺伝子発現を、正規化し、任意の発現単位として示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
５．１  定義
本明細書で使用される用語は、通常、本発明の文脈内およびそれぞれの用語が使用される特定の文脈内で、当該技術分野におけるその通常の意味を有する。ある特定の用語は、本発明の方法およびそれらの使用方法を説明する際に実施者にさらなるガイダンスを提供するために、以下または本明細書中の別の場所で議論される。さらに、同じものが、１つを超える方法で述べられ得ることが認識されるであろう。それ故に、代替の言語および同義語は、本明細書で議論される用語のうちの任意の１つ以上のために使用され得るか、または用語が本明細書で詳述または議論されるかに関わらず、その中に置かれる特別な意味はない。ある特定の用語に関する同義語が提供される。１つ以上の同義語の詳述は、他の同義語の使用を除外しない。本明細書で議論される任意の用語の例を含む本明細書中のあらゆる場所にある例の使用は、説明のみのものであり、本発明のまたは任意の例示の用語の範囲および意味を全く制限しない。同様に、本発明は、その好ましい実施形態に制限されない。
【００７４】
ｈＥＳＣという用語は、胚、内細胞塊、割球、または細胞株から生成された多能性幹細胞を包含するヒト胚性幹細胞を意味する。
【００７５】
本明細書で使用される「ｈＥＳ−ＭＳＣ」またはｈＥＳ−ＭＳＣ」または「ヒト胚性間葉系幹細胞」または間葉系幹細胞由来のヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳ−ＭＳＣ集団」という用語は、任意の方法を使用するヒト胚性幹細胞由来または誘導多能性幹細胞（「ｉＰＳＣ」）由来の、間葉系様幹細胞、間葉系様間質細胞、間葉系幹細胞、または間葉系間質細胞を意味する。本明細書で使用されるｈＥＳ−ＭＳＣは、ｈＥＳ−ＭＳＣの個々の細胞、細胞株、バッチ、ロット、または集団を含む。
【００７６】
「Ｔ−ＭＳＣ」という用語は、細胞がトロホブラスト様形態を有するＴｒｏｐ−２を発現するトロホブラストの中間段階を通じてヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＭＳＣまたは間葉系幹／間質細胞を指す。「ｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣ」という用語は、ｈＥＳＣから分化したＴ−ＭＳＣを指す。「ｉＰＳ−Ｔ−ＭＳＣ」および「ｉＴ−ＭＳＣ」という用語は、ｉＰＳＣから分化したＴ−ＭＳＣを指す。本明細書に使用される「Ｔ−ＭＳＣ」という用語は、トロホブラストを指さない。細胞が幹細胞の少なくとも１つの属性、例えば、少なくとも１つの他の細胞型等に分化する能力を保持する場合、細胞は、「幹細胞」であると考えられる。これらの細胞は、１つ以上のマーカーの発現または発現の欠如が含まれるが、これらに限定されない、多くの構造的および機能的特性に基づいて記載することができる。ｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣおよびｉＴ−ＭＳＣの両方を含むＴ−ＭＳＣは、多能性であり、他の細胞型および細胞系統を生じさせるために分化することができる。
【００７７】
「ｈＥＳ−ＨＢ−ＭＳＣ」および「ＨＢ−ＭＳＣ」という用語は、血管芽細胞または血管コロニーを形成する中間ステップによるｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを含むヒト多能性幹細胞に由来する間葉系幹細胞である。
【００７８】
本明細書で使用する「臨床グレードＴ−ＭＳＣ」という用語は、ヒト、鳥類、または他の哺乳動物のための臨床用途での使用に適している特性を含むＴ−ＭＳＣを意味する。本明細書で使用する臨床グレードＴ−ＭＳＣは、ＭＳＣの個々の細胞、細胞株、バッチ、ロット、または集団を含む。
【００７９】
本明細書で使用する「Ｔ−ＭＳＣ集団」という用語は、治療での使用に適している特性を有する細胞および治療での使用に適している特性を有さない細胞を含むＴ−ＭＳＣ細胞の集団を意味する。
【００８０】
本明細書で使用する「Ｔ−ＭＳＣ由来の系統」またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬという用語は、脂肪細胞、筋芽細胞、神経系列細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、および間質細胞が含まれるが、これらに限定されない、Ｔ−ＭＳＣから分化された細胞または細胞系統を意味する。
【００８１】
本明細書で使用する「治療有効量」という語句は、対象において臨床的に有意な状態の改善をもたらす、または疾患に関連する１つ以上の症状を遅延するもしくは最小限に抑えるもしくは緩和する、または対象において生理機能の所望の有利な変化を生じるのに十分な量を意味するものである。
【００８２】
「治療する」、「治療」のような用語は、疾患の症状のうちの少なくとも１つを遅延させる、緩和する、寛解させる、もしくは軽減する、またはその発症後の疾患を逆転させるための手段を指す。
【００８３】
「予防する」、「予防」のような語句は、疾患が発症するのを予防する、または疾患の程度を最小限に抑える、または発症の経過を遅延するために、明らかな疾患の発症前の行為を指す。
【００８４】
本明細書で使用される「対象」という用語は、鳥類および哺乳動物等の免疫系を有する動物を意味する。哺乳動物には、イヌ、ネコ、齧歯動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、および霊長類が含まれる。鳥類には、家禽、鳴禽、および猛禽が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本発明は、獣医学において、例えば、ペット動物、家畜、動物園の実験動物、および野生動物を治療するために使用することができる。本発明は、ヒト医学適用のために特に望ましい。
【００８５】
「それを必要とする」という用語は、多発性硬化症および他のＴ細胞関連自己免疫疾患、または中枢神経系もしくは血液脳関門もしくは血液脊髄関門に関連する疾患が含まれるが、これらに限定されない疾患に罹患している、またはその疾患に発症する危険性があることが知られているまたはその疑いがある対象であり得る。
【００８６】
治療を必要とする対象は、疾患に既に発症しているものであり得る。予防を必要とする対象は、疾患の危険因子を有するものであり得る。
【００８７】
本明細書で使用される「薬剤」は、効果をもたらす、または効果をもたらすことができる物質を意味し、化学物質、医薬品、薬物、生物製剤、小分子、抗体、核酸、ペプチド、およびタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
本明細書で使用される幹細胞は、そのマーカーが検出可能である場合、特定のマーカーに対して「陽性」である。例えば、Ｔ−ＭＳＣは、例えば、ＣＤ７３が（例えば、アイソタイプ対照と比較して）バックグラウンドよりも検出可能に多い量のＴ−ＭＳＣにおいて検出可能であるため、ＣＤ７３に対して陽性である。また、そのマーカーが、その細胞と少なくとも１つの他の細胞型を区別するために使用することができる場合、または、存在するもしくは細胞によって発現する場合に、その細胞を選択または単離するために使用することができる場合に、細胞はマーカーに対して陽性である。
【００８９】
本明細書で使用される「免疫調節」および「免疫調節の」とは、免疫応答の検出可能な変化を生じること、またはそれを生じる能力を有すること、および免疫応答の検出可能な変化を生じる能力を意味する。
【００９０】
本明細書で使用される「免疫抑制」および「免疫抑制の」とは、免疫応答の検出可能な減少を生じること、またはそれを生じる能力を有すること、および免疫応答の検出可能な抑制を生じる能力を意味する。
【００９１】
本発明は、間葉系幹細胞ＭＳＣがｈＥＳＣ由来のトロホブラストから分化することができ、トロホブラスト由来のＭＳＣ（Ｔ−ＭＳＣ）が組織修復および免疫調節のために使用することができるという最初の発見に基づいている。開示された方法から生成されたこれらのＴ−ＭＳＣはすべて、Ｔ細胞増殖および分化をインビトロで著しく阻害し、疾患スコアをインビボで減じたのに対して、骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）がＴ細胞増殖および分化をインビトロで部分的に減少し得るが、ＢＭ−ＭＳＣは、インビボで全く効果がなかった。本明細書に開示されるＴ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、驚くほどに高い免疫抑制活性を有する。本明細書に開示される方法は、高効率であり、低価格かつ高純度である多くのＴ−ＭＳＣを生成することができる。本明細書に開示される方法は、バッチからバッチの変動がほとんどなく、高度に再現可能であり、臨床的必要性を満たすように容易に調節可能である。
【００９２】
したがって、本発明は、ヒト胚性幹細胞からインビトロで間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法を提供することによって上記の問題を克服する。本明細書に開示される方法によってｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣを生成する能力は、多発性硬化症および他の自己免疫疾患の治療および予防を含む、様々な治療的適応に使用することができる細胞の生成を可能にする。さらに、本明細書に記載される方法によって生成されるｈＥＳ−ＭＳＣは、血液脳関門（ＢＢＢ）および血液脊髄関門（ＢＳＣＢ）を横断する能力を有し、薬物送達を含む様々な治療的適用にそれらを使用することが可能である。本発明の方法は、工業規模で使用することができる多数のｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣの生成を可能にするという点においてさらなる実用性を提供する。
【００９３】
５．２  Ｔ−ＭＳＣを得るためのトロホブラストによる胚性幹細胞の分化
胚性幹細胞（ｈＥＳ）由来のトロホブラストから間葉系様幹細胞（ＭＳＣ）を発生させ、拡張させるための方法が、本明細書に開示される。これらの得られた細胞は、Ｔ−ＭＳＣと表記される。これらのＴ−ＭＳＣは、単離および／または精製され得る。
【００９４】
ＭＳＣ様細胞は、様々な方法（Ｂａｒｂｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）、Ｏｌｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）、Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９））によってヒト胚性幹細胞から得られている。しかしながら、これらの方法のすべては、収率および純度を制限し、様々な質の細胞をもたらす共培養および手選別する手順を含む。
【００９５】
ｈＥＳＣは低レベルのＭＨＣ抗原を発現するが、ｈＥＳＣから分化した多くの細胞型が、これらの抗原（Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｄｒｕｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｄｒｕｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）の発現を増加させ、そのため、患者に移植される場合、分化した細胞の免疫拒否反応に対して大きな懸念を生じることが見出されている。対照的に、ＭＳＣは、低レベルの共刺激分子および主要なＭＨＣ抗原を発現し、自己免疫疾患（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ、Ｇｒｉｎｎｅｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｒａｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ａ、Ｒａｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ｂ、Ｔｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を治療するための同種または異種移植モデルにおいて使用されている。成体組織由来のＭＳＣのように、Ｔ−ＭＳＣは、低レベルの共刺激分子およびＭＨＣ抗原を発現し、免疫抑制効果を発揮するための長期生着を必要とせず、そのため、ＭＳＣとレシピエントとの間にＭＨＣ抗原の不一致による免疫拒否反応に対する懸念がない。ある特定のｈＥＳＣ株が、大規模、かつ絶え間のない供給であり、品質管理が容易な、ＭＳおよび他のＴ細胞に基づいた自己免疫疾患に罹患している患者を治療するための潜在的療法として産業生産に好適であるＴ−ＭＳＣを発生させるのに十分である。
【００９６】
ヒトトロホブラストは、ヒト胚性幹細胞から発生させることができる。このような胚性幹細胞は、受精、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単性生殖、雄性発生、または他の生殖または無性生殖手段による生成とは関係なく、例えば、胚盤胞、播種したＩＣＭ、１つ以上の割球、または着床前段階の胚または胚様構造の他の部分から、またはこれらを使用して誘導される胚性幹細胞を含む。
【００９７】
追加的または代替的に、トロホブラストは、他の胚由来の細胞から発生させることができる。例えば、トロホブラストは、受精、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単性生殖、雄性発生、または他の生殖または無性生殖手段による生成とは関係なく、（必ずしも胚性幹細胞の派生ステップを経る必要はなく）播種した胚、ＩＣＭ、胚盤胞、１つ以上の割球、トロホブラスト幹細胞、胚細胞、または着床前段階の胚または胚様構造の他の部分から、またはこれらを使用して生成させることができる。同様に、トロホブラストは、胚由来の細胞から部分的に分化された細胞または細胞株を使用して発生させることができる。例えば、ヒト胚幹細胞株を使用して、発育可能性および可塑性に関して、トロホブラストよりもより発生的に原始的である細胞を生成し、このような胚幹細胞を使用して、トロホブラストを発生させ得る。
【００９８】
追加的または代替的に、トロホブラストは、臍帯、臍帯血、羊水、羊水幹細胞、および胎盤が含まれるが、これらに限定されない、他の出生前または周生期の源から発生させることができる。
【００９９】
ヒト胚性幹細胞は、この方法の出発材料であり得る。胚性幹細胞は、例えば、支持細胞の存在または非存在下で、当該技術分野で知られているいずれかの方法で培養され得る。
【０１００】
本明細書に記述される実施例において、Ｈ９（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得られる）（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、ＣＴ２（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｒｅから得られる（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０））、ならびにＥＳ０３−Ｅｎｖｙ（Ｅｎｖｙ、ＧＦＰ標識株、ＥＳ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから得られる）（Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））、ＥＳＩ−０１７、ＥＳＩ−０５３、ＥＳＩ−０４９、ＥＳＩ−０３５、およびＥＳＩ−０５１の８つのｈＥＳＣ細胞株が使用された。
【０１０１】
Ｔ−ＭＳＣを得るためのこの方法の第一のステップにおいて、ヒト胚性幹細胞は、ｂＦＧＦを含まない無血清培地中で小集団または単一細胞中で増殖される。次いで、細胞を再播種し、唯一のサイトカインとしてＢＭＰ４（１〜２００ｎｇ／ｍｌ）で短時間（２〜５日間）培養して、それらが典型的なトロホブラストマーカーＴｒｏｐ２／ＴＡＣＳＴＤ２（Ｔｒｐ２）を発現する場合、高度に均質なトロホブラスト集団を得る。ＴＧＦβ阻害剤（ＳＢ４３１５４２（１〜２０μＭ）、Ａ８３−０１（０．２〜５μＭ）またはＡＬＫ５阻害剤（１〜２０μＭ）、等）は、トロホブラストを形成する効率を増加させるために使用することができる。細胞は、２〜５日間で拡張し、トロホブラスト様形態を有するトロホブラスト細胞に分化し、ある特定の実施形態において、９０％超の細胞がＴｒｏｐ−２／ＴＡＣＳＴＤ２（Ｔｒｐ−２）を発現する（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。トロホブラストは、サイズによって単離され得るか、または例えば、免疫親和性カラムクロマトグラフィーによって抗体により精製され得る。
【０１０２】
一実施形態において、トロホブラスト細胞を消化して、ＴｒｙｐＬＥ、トリプシン、またはコラゲナーゼＢを用いて単一細胞を形成する。単一細胞を、２〜２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）もしくはヒトＡＢ血清（ＡＢＨＳ）を含有するアルファ−ＭＥＭ、２〜２０％のＦＢＳもしくはＡＢＨＳを含有するＤＭＥＭ高グルコース等の間葉系幹細胞の増殖のために最適化された培地中で再懸濁し、ＦＢＳを、５〜２０％のノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）もしくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、または任意の他の市販の無血清ＭＳＣ培養培地と置き換えることができる。ある特定の実施形態において、血清、ＫＯＳＲ、またはＢＳＡは、約５〜２０％の濃度で添加される。ある特定の実施形態において、ウシ胎仔血清が好ましい。ある特定の実施形態において、細胞は、約１０〜１０００個の細胞／ｃｍ２の密度で培養される。ある特定の実施形態において、細胞は、ゼラチン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンＩ等の組織の細胞外環境を模倣する環境中で培養される。ある特定の実施形態において、ＭＳＣ培養培地は、拡張効率を増加させるために、ＬＩＦ（２〜２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２〜１００ｎｇ／ｍｌ）、またはＰＤＧＦ（１〜５０ｎｇ／ｍｌ）を含む。
【０１０３】
約２４時間後、多くの細胞（５０〜９０％）を培養プレートに接着させ、約２〜３日後、プレＴ−ＭＳＣは、トロホブラストから分化し始め、細胞は、伸張し、透明な細胞の境界を形成した。ある特定の実施形態において、プレＴ−ＭＳＣは、ＣＤ７３およびＴｒｏｐ−２の両方を発現する。６〜１０日後、８０〜９０％超の細胞トロホブラストが、スピンドル様形態を有する間葉系様小細胞、ここでは、いわゆる、Ｔ−ＭＳＣに分化される。Ｔ−ＭＳＣはまた、ある特定のマーカー、例えば、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、およびＣＤ１６６等の発現によって、ならびにある特定のマーカー、例えば、ＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＣＤ４５等の非存在または低発現によって特定することもできる。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、ＨＯＸおよびＨＬＡ−Ｇを発現しない。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、高レベルのＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１２を発現するが、低レベルのＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、および他のＨＯＸファミリー遺伝子を発現する。Ｔ−ＭＳＣはまた、多能性であると特徴付けられ、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、ニューロン、筋芽細胞、間質細胞、および線維芽細胞に分化することができる。
【０１０４】
ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する複数の免疫抑制Ｔ−ＭＳＣを含む単離された細胞集団が、本明細書に提供される。
【０１０５】
本発明のさらなる実施形態において、Ｔ−ＭＳＣを照射するさらなるステップが行われる。この照射は、例えば、セシウム１３７ガンマ線照射、またはＸ線を用いた光子放射を含むが、これらに限定されない放射線を発する当該技術分野で知られている任意の方法の使用により達成され得る。投与されるべき好ましい量の放射線は、約５〜２００００ｇｙ、より好ましくは、約５０〜１００ｇｙ、最も好ましくは８０ｇｙである。
【０１０６】
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、ｈＥＳＣからＴ−ＭＳＣを得る（本明細書では、生成するとも称する）ための新規のプロセスである。本方法は、
ａ．少なくとも１つの増殖因子の存在下でトロホブラストに分化させるために胚性幹細胞の分化を誘導するのに十分な量の無血清培地中でヒト胚性幹細胞を含む細胞培養物を培養するステップであって、一実施形態において、トロホブラストへの分化の期間は、約２〜５日であり、一実施形態において、この培地は、分化効率を増加させるために、ＴＧＦβ阻害剤（すなわち、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３−０１、またはＡＬＫ５阻害剤等）の存在または非存在下でＢＭＰ４を含む、ステップと、
ｂ．少なくとも１つの増殖因子を、トロホブラストを含む培養物に添加して、無血清培地中で培養を継続するステップであって、この増殖因子は、トロホブラストを拡張するのに十分な量であり、一実施形態において、この培地は、ＢＭＰ４を含む、ステップ（このステップは任意である）と、
ｃ．トロホブラストを単離し、このトロホブラストをゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンまたはマトリゲルでコーティングしたプレート上に再播種し、プレＴ−ＭＳＣを通じてトロホブラストをＴ−ＭＳＣに分化するのに十分な量の血清含有または無血清培地中で培養するステップと、を含み、一実施形態において、単離されたトロホブラストは、Ｔ−ＭＳＣを生成するために、６〜１０日間培養して、得られたＴ−ＭＳＣのうちの少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が、成体ＭＳＣに対して細胞表面マーカーを発現し、一実施形態において、この培地は、拡張効率を増加させるために、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦを含み、
得られたＴ−ＭＳＣのうちの少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が、成体ＭＳＣに対して細胞表面マーカーを発現する。
【０１０７】
図１および２に示されるように、開示される方法は、小集団または単一細胞へのｈＥＳＣコロニーの分散から開始する。次いで、細胞を再播種し、唯一のサイトカインとしてＢＭＰ４およびＴＧＦβ阻害剤で短時間（２〜５日間）培養して、それらが典型的なトロホブラストマーカーＴｒｏｐ２／ＴＡＣＳＴＤ２（Ｔｒｐ２）を発現する場合、高度に均質なトロホブラスト集団を得る（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。次いで、トロホブラストを解離させ、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、マトリゲル、またはコラーゲンでコーティングした上に再播種し、ＭＳＣ成長培地中で４〜１０日間培養して、典型的なＭＳＣの形態と同様のスピンドル様細胞を発生させる。
【０１０８】
本明細書に開示される方法は、他の方法とは異なって、支持細胞、細胞の選別または手選別を必要としない。初期のトロホブラスト分化ステップは、ｂＦＧＦを含まない定義された無血清培地中で行われる。全プロトコルは、合計６〜１４日間で分化の２つのステップのみ必要として、高純度および高収率で、Ｔ−ＭＳＣを発生させる（図１）。これは、ｈＥＳＣからＭＳＣを得るために今までに報告された中で最短の分化プロトコルである。Ｔ−ＭＳＣの収率および純度は、今までに報告された方法を用いて達成されたものと比較して、非常に高い。３０日以内に、元のｈＥＳＣ数の５×１０５倍のＴ−ＭＳＣを得ることができ、ＣＤ７３＋細胞のパーセンテージが高く、ＭＳＣの典型的なマーカーである一方で、他の方法は、元のｈＥＳＣ数の１００倍未満しか産出することができず、ＣＤ７３＋細胞のパーセンテージが低い。Ｔ−ＭＳＣの派生物は、ＣＤ７３／Ｔｒｐ−２の二重陽性細胞の中間段階を含み、以後、プレＴ−ＭＳＣと称される。ＢＭＰ４＋ＴＧＦβ阻害剤での処置から２〜３日後、細胞は、まず、高パーセンテージでＴｒｐ−２を発現し、トロホブラストの均質な形態を示す（図２および３）。５〜６日後、細胞は、Ｔｒｐ−２およびＣＤ７３の両方を発現し、６〜１４日後、細胞は、もはやＴｒｐ２を発現しないが、ＣＤ７３（９８％超）、ＣＤ９０（９５％超）、ＣＤ１０５（９０％超）、ＣＤ４４（９５％超）、ＣＤ２９（８０％超）を含む高パーセンテージで典型的なＭＳＣ表面マーカーを発現し、細胞は、内皮マーカーＣＤ３１ならびに造血マーカーＣＤ３４およびＣＤ４５に対して陰性である（図３および４）。
【０１０９】
本明細書に開示される方法によって生成されたＴ−ＭＳＣは、下流のダウンストリーム骨形成、軟骨形成、および脂肪形成の系統に分化させることができる（図７）。したがって、Ｔ−ＭＳＣは、骨髄（ＢＭ）および他の源に由来したＭＳＣと表現型的および機能的に同様である。
【０１１０】
５．３  ヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞
骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）が、多くの動物モデルおよび臨床試験において自己免疫疾患を治療するために長年使用されてきたが、免疫抑制の有効性は、ＢＭ−ＭＳＣがある特定の自己免疫疾患を効率よく治療することができないことを示すいくつかの報告と一致しない（Ｔｙｎｄａｌｌ、２０１１）。データは、Ｔ細胞受容体を刺激した後のＴ細胞の増殖のそれらの阻害についてＢＭ−ＭＳＣおよびＴ−ＭＳＣの能力を比較するために、本明細書に提供される。図７に示されるように、ＢＭ−ＭＳＣは、低用量（０．３ｕｇ／ｍｌ）で抗ＣＤ３抗体によって誘導されるＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の増殖を阻害することができ、これは、Ｔ−ＭＳＣに相当する。しかしながら、抗ＣＤ３抗体濃度が、１ｕｇ／ｍｌまで増加した場合、ＢＭ−ＭＳＣは、Ｔ−ＭＳＣよりもＣＤ４およびＣＤ８の両方のＴ細胞の増殖を抑制する効力が弱い。ここで、ＣＦＳＥ希釈アッセイを使用して、Ｔ細胞の増殖を評価した：ＣＦＳＥシグナルの低下に伴うＴ細胞のパーセンテージの増加は、加速した増殖を示す。図５に示されるように、抗ＣＤ３抗体が１ｕｇ／ｍｌまで増加した場合、５９％のＣＤ４および４６％のＣＤ８のＴ細胞がＣＦＳＥシグナルの低下に伴って検出された。Ｔ−ＭＳＣは、ＣＤ４およびＣＤ８の両方のＴ細胞を１６％まで著しく減少させる一方、ＢＭ−ＭＳＣは、それぞれ、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞を３２％および３６％しか減少しなかった。
【０１１１】
Ｔ−ＭＳＣのインビトロでの免疫抑制活性と一致して、本明細書に開示される方法によって生成されたＴ−ＭＳＣは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症のマウスモデルを処置するのに有効であることが示された。図６に示されるように、Ｔ−ＭＳＣをＥＡＥ誘導から６日後に注入し、ＥＡＥマウスの疾患スコアは、ビヒクル注入対照と比較して、著しく低下した。
【０１１２】
開示された方法によって生成された細胞のさらなる特徴において、Ｔ−ＭＳＣはまた、ＢＭ−ＭＳＣ、およびＳＢ４３１５４２での処置によって派生したｈＥＳ−ＭＳＣよりもさらに強力な免疫抑制効果を示した（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）（図６）。いくつかの繰り返し実験において、ＢＭ−ＭＳＣは、一貫してＥＡＥマウスの疾患スコアを減じなかった。したがって、臨床的応用で用いる開示される方法によって生成されたＴ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣの置き換えは、骨髄穿刺のための危険な侵襲的手技を行う必要性を取り除き、ＢＭ寄付を待つ時間を軽減し、費用を削減し、患者１人あたりの基準でＢＭ−ＭＳＣを調製するためのバッチ対バッチの変化を減らす。
【０１１３】
簡潔に言えば、トロホブラストの中間段階によって、ｈＥＳＣから間葉系様細胞またはＭＳＣを発生させるための高効率の方法、および自己免疫疾患を治療するためのＴ−ＭＳＣの使用が、本明細書に開示される。マイクロアレイ分析は、Ｔ−ＭＳＣがＢＭ−ＭＳＣのものとは同一ではない遺伝子発現プロファイルを有し（データは示さず）、その両方が同じ下流の細胞系統に分化させることができることを示唆した（図７）。加えて、Ｔ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣよりもインビトロおよびインビボの両方でより強力な免疫抑制能力を有する。
【０１１４】
利用可能なデータは、開示される方法によって生成されたＴ−ＭＳＣが従来の成体由来のＭＳＣとは異なることを示唆している。Ｔ細胞の増殖のそれらの強力な阻害により、ＢＭ−ＭＳＣよりもはるかに高い有効性を有するＴ−ＭＳＣが多発性硬化症を治療するために使用され得る。潜在的な安全性の懸念に対処するために、Ｔ−ＭＳＣを、免疫不全ＳＣＩＤベージュ色マウスに注入した。マウスにおいて、腫瘍または奇形腫の形成は観察されなかった。
【０１１５】
本発明のＴ−ＭＳＣは特有であり、様々な治療法および他の使用を有する。したがって、本発明は、薬学的調製物、およびＴ−ＭＳＣを含む組成物を含む様々な調製物を含む。
【０１１６】
「Ｔ−ＭＳＣ」という用語は、細胞がトロホブラスト様形態を有するＴｒｏｐ−２を発現するトロホブラスト中間段階を通してヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から派生するＭＳＣまたは間葉系幹／間質細胞を指す。「ｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣ」という用語は、ｈＥＳＣから分化したＴ−ＭＳＣを指す。「ｉＰＳ−Ｔ−ＭＳＣ」および「ｉＴ−ＭＳＣ」という用語は、ｉＰＳＣから分化したＴ−ＭＳＣを指す。本明細書に使用される「Ｔ−ＭＳＣ」という用語は、トロホブラストを指さない。細胞が幹細胞の少なくとも１つの属性、例えば、少なくとも１つの他の細胞型等に分化する能力を保持する場合、細胞は、「幹細胞」であると考えられる。これらの細胞は、１つ以上のマーカーの発現または発現の欠如が含まれるが、これらに限定されない、多くの構造的および機能的特性に基づいて記載することができる。具体的には、Ｔ−ＭＳＣは、線維芽細胞の形態を有する小細胞体によって特徴付けられる。ｈＥＳ−Ｔ−ＭＳＣおよびｉＴ−ＭＳＣの両方を含むＴ−ＭＳＣは、多能性であり、他の細胞型および細胞系統を生じさせるように分化させることができる。「Ｔ−ＭＳＣ−ＤＬ」という用語は、Ｔ−ＭＳＣから分化したすべての細胞型および細胞系統を指す。
【０１１７】
本明細書に記載される分化方法は、今までに報告された中で最も短期間である、６〜１４日以内に、ｉＰＳ細胞からのＭＳＣの分化を達成することができる。したがって、これらのｉＴ−ＭＳＣは、急性心筋梗塞、急性心不全、急性脊髄損傷、急性放射線照射／火傷の処置等の非常に短期間でＭＳＣの発生を必要とする緊急状態下で患者に特異的なｉＰＳ系の療法のために使用することができる。
【０１１８】
１つ以上の細胞マーカーのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質のレベルで評価される場合に、発現または発現の欠如によって、Ｔ−ＭＳＣを特定するまたは特徴付けることができる。細胞表面マーカーＣＤ７３を発現するか、または細胞表面マーカー：ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、またはＣＤ１６６のうちの少なくとも１つ以上を発現する、あるいは細胞表面マーカー：ＣＤ３４、ＣＤ３１、またはＣＤ４５のうちの少なくとも１つも発現しない、または低レベルで発現する場合に、Ｔ−ＭＳＣを特定することができる。
【０１１９】
代替的または追加的に、１つ以上のプロ炎症性タンパク質、ＭＭＰ２、ＲＡＧＥ、ＩＦＮＧＲ２、ＴＮＦα、ＩＬ−１２Ａ、ＩＬ−６、およびＶＣＡＭ１のそれらの低レベルの発現に基づいて、Ｔ−ＭＳＣを特定するまたは特徴付けることができる。この遺伝子発現のプロファイルは、骨髄由来の間葉系幹細胞とは対照的である。具体的には、ＩＬ−６は、Ｔ−ＭＳＣ中よりもＢＭ−ＭＳＣ中ではるかに高く発現した。ＩＬ−６は、炎症の発症および解消を含む造血／免疫細胞と間質細胞との間のクロストークに関与する、多面的サイトカインである。
【０１２０】
Ｔ−ＭＳＣはまた、インビトロで刺激した後のＴ細胞の増殖を阻害するそれらに能力で特徴付けることができる。これらの特性は、インビトロで刺激した後のＴ細胞の増殖を阻害しないＢＭ−ＭＳＣとは対照的である。
【０１２１】
したがって、本明細書に記載されるＴ−ＭＳＣは、（１）脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、ニューロン、筋芽細胞、間質細胞、および線維芽細胞に分化する、（２）線維芽細胞様形態を有する、（３）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、および／もしくはＣＤ１６６を発現する、（４）ＣＤ３４、ＣＤ３１、および／もしくはＣＤ４５を低レベルで発現するか、または発現しない、（５）ＭＭＰ２、ＲＡＧＥ、ＩＦＮγＲ１、ＩＦＮγＲ２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−６、および／もしくはＶＣＡＭ１、特に、ＩＬ−６を低レベルで発現するか、または発現しない、（６）ＭＨＣ抗原ＨＬＡ−Ｇおよび／もしくはＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、ＨＬＡ−ＤＲおよび／もしくはＣＤ８０を低レベルで発現するか、または発現しない、ならびに（７）インビトロで刺激した後、Ｔ細胞の増殖を阻害する、特性のうちの少なくとも１つを有する。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または７つすべての特性を有する。
【０１２２】
ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、今までに報告されたＨＢ−ＭＳＣと区別することができ、Ｔ−ＭＳＣは、ＨＢ−ＭＳＣよりも少なくとも１倍高いレベルのＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ２、および／もしくはＣＸＣＬ１２を発現するが、ＨＢ−ＭＳＣと比較して、少なくとも半分のレベルのＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、および他のＨＯＸファミリー遺伝子を発現する。
【０１２３】
さらに、Ｔ−ＭＳＣは、血液脳関門（ＢＢＢ）および血液脊髄関門（ＢＳＣＢ）を横断する独特の能力を有し、それらを治療的および診断的適用に比類なく好適にする。本発明のＴ−ＭＳＣは、治療的および診断的薬剤の送達が含まれるが、これに限定されないＣＮＳにおける機能を実行するために、ＢＳＣＢを横断して、脊髄の血管の内外を遊走する能力を有する。これは、この能力を有さないＢＭ−ＭＳＣとは対照的である。
【０１２４】
本発明の別の実施形態は、照射されるＴ−ＭＳＣである。この実施形態は、照射に供される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または７つすべての特性を有する、上記の特性のうちの少なくとも１つを有するＴ−ＭＳＣを含み得る。
【０１２５】
別の実施形態において、細胞培養物は、Ｔ−ＭＳＣを含む。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、ニューロン、筋芽細胞、間質細胞、および線維芽細胞に分化させる。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣ細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、および／またはＣＤ１６６を発現する。ある特定の実施形態において、細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３１、および／もしくはＣＤ４５を低レベルで発現するか、またはそれらを発現しない。ある特定の他の実施形態において、細胞は、ＭＭＰ２、ＲＡＧＥ、ＩＦＮγＲ１、ＩＦＮγＲ２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−６、および／もしくはＶＣＡＭ１、特にＩＬ−６を低レベルで発現するか、またはそれらを発現しない。ある特定の他の実施形態において、細胞は、ＭＨＣ抗原ＨＬＡ−Ｇおよび／もしくはＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、ＨＬＡ−ＤＲおよび／もしくはＣＤ８０を低レベルで発現するか、またはそれらを発現しない。ある特定の他の実施形態において、細胞は、インビトロで刺激した後、Ｔ細胞の増殖を阻害する。ある特定の実施形態において、細胞は、血液脳関門および血液脊髄関門を横断することができる。ある特定の実施形態において、細胞は、照射される。
【０１２６】
別の態様において、Ｔ−ＭＳＣを含む薬学的調製物が、本明細書に開示される。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、ニューロン、筋芽細胞、間質細胞、および線維芽細胞に分化させることができる。ある特定の実施形態において、細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、および／またはＣＤ１６６を発現する。ある特定の実施形態において、細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３１、および／またはＣＤ４５を低レベルで発現するか、またはそれらを発現しない。ある特定の他の実施形態において、細胞は、ＭＭＰ２、ＲＡＧＥ、ＩＦＮγＲ１、ＩＦＮγＲ２、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、および／またはＶＣＡＭ１、特にＩＬ−６を低レベルで発現するか、またはそれらを発現しない。ある特定の他の実施形態において、細胞は、ＭＨＣ抗原ＨＬＡ−Ｇおよび／もしくはＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、ＨＬＡ−ＤＲおよび／もしくはＣＤ８０を低レベルで発現するか、またはそれらを発現しない。ある特定の他の実施形態において、細胞は、インビトロで刺激した後、Ｔ細胞の増殖を阻害する。ある特定の実施形態において、細胞は、血液脳関門および血液脊髄関門を横断することができる。ある特定の実施形態において、細胞は、照射される。任意の薬学的に許容される担体または賦形剤を用いて、薬学的調製物を調製することができる。
【０１２７】
ある特定の実施形態において、組成物または薬学的調製物は、少なくとも少なくとも１０，０００個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５０，０００個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１００，０００個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５００，０００個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０６個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０６個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０７個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０７個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０８個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０８個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも１×１０９個のＴ−ＭＳＣ、少なくとも５×１０９個のＴ−ＭＳＣ、または少なくとも１×１０１０個のＴ−ＭＳＣを含む。
【０１２８】
少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０回、またはそれ以上培養され、継代されるヒト胚性幹細胞株から直接得られ、単離されるＴ−ＭＳＣを含む複数のＴ−ＭＳＣ、またはこれらの組み合わせが、本明細書に提供される。
【０１２９】
ある特定の実施形態において、そこから部分的もしくは末端が分化されたＴ−ＭＳＣまたは細胞の凍結保存された調製物が、本明細書に提供される。
【０１３０】
ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣ、または照射されたＴ−ＭＳＣを含むＴ−ＭＳＣの組成物もしくは調製物の治療的使用が、本明細書に提供される。そのような細胞および調製物は、記載される状態または疾患のうちのいずれかの治療、ならびに血液脳関門および血液脊髄関門を横断する薬剤の送達系において使用することができる。
【０１３１】
ある特定の実施形態において、本発明は、トロホブラスト、プレＴ−ＭＳＣ、またはそこから部分的もしくは末端が分化されたＴ−ＭＳＣ細胞の凍結保存した調製物を提供する。
【０１３２】
ある特定の実施形態において、本発明は、Ｔ−ＭＳＣ、または照射されたＴ−ＭＳＣを含むＴ−ＭＳＣの組成物もしくは調製物の治療的使用を提供する。そのような細胞および調製物は、本明細書を通じて詳細される状態または疾患のうちのいずれかの治療、ならびに血液脳関門および血液脊髄関門を横断する薬剤の送達系において使用することができる。
【０１３３】
５．４  Ｔ−ＭＳＣ集団の選択および生成
療法で用いる臨床グレードである高度に免疫抑制性のあるＴ−ＭＳＣのバイオマーカープロファイルを特定することによって高度に免疫抑制性のあるＴ−ＭＳＣを特定する方法が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、臨床グレードのＴ−ＭＳＣは、（ｉ）群１マーカーを発現する細胞を９５％超含有する、（ｉｉ）群２マーカーを発現する細胞を８０％超含有する、（ｉｉｉ）群３マーカーを発現する細胞を５％未満含有する、（ｉｖ）ＩＬ−１０およびＴＧＦβを発現する、（ｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−１２、およびＴＮＦαを発現する細胞を２％未満含有する、ならびに（ｖｉ）すべての群４マーカーを共発現する細胞を０．００１％未満含有する、特性を有し、群１マーカーは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、およびＣＤ４４であり、群２マーカーは、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４９Ｅであり、群３マーカーは、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＳＳＥＡ４であり、群４マーカーは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０、およびＳＳＥＡ４である。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、本方法は、抗炎症性因子（「ＡＩＦ」）およびプロ炎症性因子（「ＰＩＦ」）をコードするマーカーの分化発現を測定することを含む。ある特定の実施形態において、ＡＩＦは、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ２である。ある特定の実施形態において、ＰＩＦは、上方調節される。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、上記のマーカーの少なくとも１．５倍発現する。ある特定の実施形態において、ＰＩＦは、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＣＣＬ２、ＶＣＡＭ１、ＲＡＧＥ、ＭＭＰ２である。ある特定の実施形態において、ＰＩＦは、下方調節される。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、上記のマーカーの少なくとも半分発現する。別の実施形態において、高度に免疫抑制性のあるＴ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、ＩＬ−６＋細胞のより低い比率を有する。ある特定の実施形態において、高度に免疫抑制性のあるＴ−ＭＳＣは、５％未満、４％、３％、２％、または１％のＩＬ−６陽性細胞を有する。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、低レベルのＩＬ１２、ＴＮＦα、ＲＡＧＥ、および他のＰＩＦを発現する。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、高レベルのＴＧＦβ２およびＩＬ−１０を発現し得る。ある特定の実施形態において、マーカーの発現が、ＢＭ−ＭＳＣの発現と比較される。
【０１３５】
臨床グレードのＴ−ＭＳＣ集団のための適格性の手順が、本明細書に提供される。特異的マーカーの発現は、治療的使用に好適であるかどうかを判定するために、Ｔ−ＭＳＣ集団において測定される。マーカーには、例えば、（１）ＭＳＣ特異的マーカー（セット１）：ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、およびＣＤ４４、（２）ＭＳＣ特異的マーカー（セット２）：ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４９Ｅ、ＳＣＡ−１、およびＳＴＲＯ−１、（３）造血幹／前駆体マーカー：ＣＤ４５およびＣＤ３４、および内皮細胞マーカーＣＤ３１、（４）免疫原性マーカー：ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６、（５）サイトカイン：ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２、ならびに（６）多能性マーカー：ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０、およびＳＳＥＡ−４が含まれる。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣ集団は、少なくとも１つの群１マーカーを発現する細胞を９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超含有する。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣ集団は、少なくとも１つの群２マーカーを発現する細胞を８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％超含有する。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣ集団は、少なくとも１つの群３マーカーを発現する細胞を０．１％、０．０８％、０．０５％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％未満含有する。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣ集団は、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦβを発現する細胞を８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％超含有する。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣ集団は、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２を発現する細胞を５％、４％、３％、２％、１％未満含有する。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣ集団は、少なくとも１つの群６マーカーを発現する細胞を０．００１％未満含有する。臨床グレードのＴ−ＭＳＣは、陽性対照として臨床前グレードのＴ−ＭＳＣと比較される。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、多色フローサイトメトリー分析および／または免疫蛍光を通して特徴付けられる。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣ集団は、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦ、ＣＸＣＬ５、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、またはこれらの組み合わせを発現する。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣ集団はまた、（１）内毒素および残留サイトカイン／成長因子等の外因性物質の存在、ならびに／または（２）ゲノム異常（染色体分析および全ゲノム配列決定による）に対して分析され得る。
【０１３６】
臨床グレードのＴ−ＭＳＣ集団のための別の適格性の手順が、本明細書に提供される。より良好な再生の潜在的および免疫抑制機能を有するＴ−ＭＳＣは、より低レベルＣＤ９を発現し得、１〜２継代のＴ−ＭＳＣのＣＤ９発現レベルが、基礎レベルとして記録され、ある特定の継代および手順後、ＣＤ９発現レベルが２倍増加する場合、細胞が継代のために停止され得る。
【０１３７】
Ｔ−ＭＳＣの発現プロファイルを判定するための方法は、当該技術分野で知られており、これには、フローサイトメトリー、多重マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＴ、ノーザンブロット、またはウエスタンブロットが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ＭＳＣの発現プロファイルは、サイトメトリービーズアレイベースの多重サイトカイン分析、ｌｕｍｉｎｅｘシステムベースの多重サイトカイン分析、マイクロアレイＲＮＡ−ｓｅｑ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、Ｅｌｉｓｐｏｔ  Ｅｌｉｓａ、Ｅｌｉｓａサイトカインアレイ、フローサイトメトリールシフェラーゼレポーターシステム、蛍光発光レポーターシステム、組織学染色法、および免疫蛍光染色法によって判定される。
【０１３８】
５．４．１  核酸バイオマーカーを検出する方法
特定の実施形態において、バイオマーカープロファイルにおけるバイオマーカーは、核酸である。そのようなバイオマーカーおよびバイオマーカープロファイルの対応する特性は、例えば、１つ以上のマーカーの発現生成物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を検出することによって生成され得る。特定の実施形態において、バイオマーカープロファイルにおけるバイオマーカーおよび対応する特性は、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護アッセイ、およびノーザンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない当該技術分野で当業者によく知られている任意の方法を用いて、本明細書に開示されるマーカーから発現した１つ以上の核酸を検出および／または分析することによって得られる。
【０１３９】
ある特定の実施形態において、本発明の方法および組成物によって検出および／または分析される核酸には、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、ｍＲＮＡスプライスされた変異体を含む発現されたＲＮＡ分子、ならびに調節ＲＮＡ、ｃＲＮＡ分子（例えば、インビトロで転写されるｃＤＮＡ分子から調製されたＲＮＡ分子）等のＲＮＡ分子、およびそれらの特徴的断片が含まれる。
【０１４０】
特定の実施形態において、核酸は、細胞培養物中に存在する、または細胞培養物から単離されるか、または部分的に単離される核酸からインビトロで調製され、このことは、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）において、一般的に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
５．４．１．１  核酸アレイ
ある特定の実施形態において、核酸アレイを使用して、本明細書で記載されるマーカーのうちの任意の１つ以上の発現を検出することによって、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特徴を発生させる。本発明の一実施形態において、ｃＤＮＡマイクロアレイ等のマイクロアレイを使用して、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特徴値を決定する。ｃＤＮＡマイクロアレイ分析の例示的な方法は、以下に、および実施例において記載されている。
【０１４２】
ある特定の実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特徴値は、生体試料中に存在するｍＲＮＡ転写物の核酸配列を表すまたは対応する、１つ以上のプローブスポットを含むマイクロアレイのアレイ検出可能標識核酸（例えば、試料から合成された蛍光標識ｃＤＮＡ）にハイブリダイズすることによって得られる。
【０１４３】
核酸アレイ、例えばマイクロアレイを、多くの方法で製作することができ、それらのいくつかは本明細書に以下に記載されている。好ましくは、アレイは、再現可能であり、所与のアレイの複数の複製を製作することが可能であり、マイクロアレイからの結果は互いに比較可能である。好ましくは、アレイは、結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件下で安定的である物質から作製される。当業者は、アレイ上のプローブスポットに試験プローブをハイブリダイズさせるのに好適な支持物、基材、または担体について知っているだろうし、または日常的な実験作業を使用することによりそれを確認することができるであろう。
【０１４４】
使用されるアレイ、例えばマイクロアレイは、１つ以上の試験プローブを含むことができる。いくつかの実施形態において、そのような試験プローブの各々は、検出されるＲＮＡまたはＤＮＡのサブ配列に相補的である核酸配列を含む。各プローブは、典型的には、異なる核酸配列を有し、アレイの固体表面上の各プローブの位置は、通常既知であるか、または決定することができる。本発明により有用なアレイは、例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ｃＤＮＡベースのアレイ、ＳＮＰアレイ、スプライスされた変異体アレイ、および本明細書に記載されるマーカーの発現の定性的、定量的、または半定量的測定を提供することができる任意の他のアレイを含むことができる。いくつかのタイプのマイクロアレイは、アドレス可能なアレイである。より具体的には、いくつかのマイクロアレイは、位置的にアドレス可能なアレイである。いくつかの実施形態において、アレイの各プローブは、固体支持体上の既定の所定位置に位置しており、そのため、各プローブの同一性（例えば、配列）は、アレイ上（例えば、支持体または表面上）のその位置から決定することができる。いくつかの実施形態において、アレイは、オーダーアレイである。マイクロアレイは、Ｄｒａｇｈｉｃｉ，２００３，Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ／ＣＲＣにおいて一般的に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
５．４．１．２  ＲＴ−ＰＣＲ
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるマーカーのうちの１つ以上の発現レベルのバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特徴値を決定するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせて逆転写（ＲＴ）を使用して、試料からＲＮＡを増幅することによって、この測定値を測定する。本実施形態によると、逆転写は、定量的であっても、半定量的であってもよい。本明細書で教示されるＲＴ−ＰＣＲ法は、上記のマイクロアレイ法とともに使用してもよい。例えば、バルクＰＣＲ反応を実施してもよく、ＰＣＲ生成物を分解し、マイクロアレイ上のプローブスポットとして使用してもよい。
【０１４６】
全ＲＮＡまたはｍＲＮＡをテンプレートとして使用し、マーカー（複数を含む）の転写部分に特異的なプライマーを、逆転写を開始するために使用する。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するための方法は、よく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、上記に記載されている。プライマー設計は、公開されているか、またはＧｅｎＢａｎｋ等の任意の公的に利用可能な配列データベースから入手可能な既知のヌクレオチド配列に基づいて達成することができる。例えば、プライマーは、本明細書に記載されるマーカーのいずれのためにも設計され得る。さらに、プライマー設計は、市販のソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  １．０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ等）を使用することによって達成され得る。逆転写の生成物は、その後、ＰＣＲ用のテンプレートとして使用される。
【０１４７】
ＰＣＲは、対象となる標的配列を増幅する耐熱性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される複数のサイクルのＤＮＡ複製を使用することによって、特定の核酸配列を迅速に増幅するための方法を提供する。ＰＣＲは、増幅されるべき核酸、増幅されるべき配列を隣接する２つの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩、緩衝液、および塩の存在が必要である。ＰＣＲ法は、当該技術分野でよく知られている。ＰＣＲは、例えば、Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５に記載されるように実施され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
ＰＣＲは、テンプレートＤＮＡまたはｃＤＮＡ（少なくとも１０ｆｇ、より有用には、１〜１０００ｎｇ）、および少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施することができる。典型的な反応混合物には、以下のものが含まれる：２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの１０Ｍ  ＰＣＲ緩衝液１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、０．４μｌの１．２５Ｍ  ｄＮＴＰ、０．１５μｌ（または２．５ユニット）のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、および全体積を２５μｌにするための脱イオン水。鉱油で被覆し、プログラム可能な熱サイクラーを使用してＰＣＲを実施する。
【０１４９】
本来定量的である定量的ＲＴ−ＰＣＲ（「ＱＲＴ−ＰＣＲ」）は、マーカー発現レベルの定量的測定を提供するために実施することもできる。ＱＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写およびＰＣＲを２段階で実施することができるか、またはＰＣＲと組み合わせた逆転写を同時に実施することができる。例えば、Ｔａｑｍａｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）によって提供されるような市販のキットの技術のうちの１つが、転写物に特異的なアンチセンスプローブを用いて実施される。このプローブは、ＰＣＲ生成物（例えば、遺伝子由来の核酸断片）に特異的であり、消光剤および蛍光性レポータープローブをオリゴヌクレオチドの５’末端に複合体化させて調製する。異なる蛍光マーカーは、異なるレポーターに結合されており、１つの反応で２つの生成物の測定を可能にする。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが活性化される場合に、それは、その５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によりテンプレートに結合したプローブの蛍光レポーターを引き剥がす。消光剤の非存在下で、レポーターは、これより蛍光を発する。レポーターの色変化は、各特異的生成物の量に比例しており、蛍光光度計で測定され、したがって、各色の量が測定され、ＰＣＲ生成物が定量化される。ＰＣＲ反応は、多数の個体に由来する試料が同時に処理および測定されるように、９６ウェルプレートで実施される。Ｔａｑｍａｎ系は、ゲル電気泳動を必要としないというさらなる利点を有し、標準曲線とともに使用される場合、定量化を可能にする。
【０１５０】
ＰＣＲ生成物を定量的に検出するために有用な第２の技法は、市販のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ  Ｃａｌｉｆ．）等の挿入染料（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｙｅ）を使用することである。ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲ段階中にＰＣＲ生成物に組み込まれ、ＰＣＲ生成物の量に比例した蛍光をもたらすＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎを使用して実施される。
【０１５１】
ＴａｑｍａｎおよびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ系は両方とも、ＲＮＡの逆転写後に使用することができる。逆転写は、ＰＣＲステップと同じ反応混合物中で実施され得る（一段階プロトコル）か、または逆転写は、ＰＣＲを使用して増幅前に最初に実施され得る（二段階プロトコル）。加えて、蛍光分子および消光分子を有するプローブを使用するＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（登録商標）を含む、ｍＲＮＡ発現生成物を定量的に測定するための他の系が知られており、このプローブは、ヘアピン形態である場合には、蛍光分子が消光され、ハイブリダイズされる場合には、蛍光が増加して、遺伝子発現の定量的測定をもたらす。
【０１５２】
５．４．１．３  ノーザンブロットアッセイ
当業者に知られている任意のハイブリダイゼーション技術は、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特徴値を得るために使用することができる。他の特定の実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特徴値は、（特定のＲＮＡ分子を検出し、定量化するために、ノーザンブロット分析によって得ることができる。標準的なノーザンブロット分析は、当業者に知られている従来のノーザンハイブリダイゼーション技術に従って、ＲＮＡ転写産物の大きさを確定する、あるいはスプライスされたＲＮＡ転写産物、および試料中の本明細書に記載される相対量の１つ以上の遺伝子（特に、ｍＲＮＡ）を特定するために、使用することができる。ノーザンブロット法では、ＲＮＡ試料は、まず、変性条件下で、アガロースゲル中で電気泳動法によって大きさごとに分離される。次いで、ＲＮＡを膜に移し、架橋し、標識プローブとハイブリダイズさせる。ランダムプライムド（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）、ニック翻訳、またはＰＣＲによって生成されたＤＮＡプローブ、インビトロ転写ＲＮＡプローブ、およびオリゴヌクレオチドを含む、非同位体または高比活性放射性標識プローブを使用することができる。加えて、部分的にしか相同でない配列（例えば、異なる種由来のｃＤＮＡまたはエキソンを含み得るまたはゲノムＤＮＡ断片）をプローブとして使用してもよい。標識プローブ、例えば、完全長、一本鎖ＤＮＡ、あるいはそのＤＮＡ配列の断片のいずれかを含む放射性標識ｃＤＮＡが、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００個の連続ヌクレオチドの長さであり得る。このプローブは、当業者に知られている多くの異なる方法のうちのいずれかによって標識化することができる。これらの研究に最も一般的に使用される標識は、放射性元素、酵素、紫外線等に曝露される場合に蛍光を発する化学物質である。多くの蛍光物質が知られており、標識として使用され得る。これらには、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＡＭＣＡブルー、およびＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗが含まれるが、これらに限定されない。放射性標識は、現在利用可能な計数方法のうちのいずれかによって検出することができる。同位体の限定されない例には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅが含まれる。酵素標識は同様に有用であり、現在利用されている比色計法、分光光度計法、蛍光分光光度計法、電流測定法、または気体定量法の技術のうちのいずれかによって検出することができる。この酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等の架橋分子との反応によって選択された粒子に共役される。当業者に知られている任意の酵素を使用することができる。そのような酵素の例には、ペルオキシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、およびアルカリ性ホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，８５０，７５２号、および同第４，０１６，０４３号は、代替的な材料および方法の開示に関す��例として参照される。
【０１５３】
５．４．２  タンパク質を検出する方法
本発明の特定の実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特定値は、タンパク質を検出することにより、例えば、本明細書に記載される１つ以上のマーカーの発現生成物（例えば、核酸またはタンパク質）、またはそのようなタンパク質の翻訳後修飾された形態、またはそうでなければ修飾された形態、またはプロセシングされた形態を検出することにより得ることができる。特定の実施形態において、バイオマーカープロファイルは、タンパク質マイクロアレイ分析法、免疫組織化学法、および質量分析法が含まれるが、これらに限定されない、タンパク質を検出するための当業者に知られている任意の方法を使用して、１つ以上のタンパク質および／またはその特徴的断片を検出および／または分析することによって生成される。
【０１５４】
細胞培養物中に存在するタンパク質または対象となるタンパク質の量を決定するために、標準的技術が使用され得る。例えば、試料中に存在するタンパク質または対象となるタンパク質の量を決定するために、例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、免疫細胞化学等の、例えばイムノアッセイを使用する、標準的技術が使用され得る。対象となるタンパク質を検出するための１つの例示的な薬剤は、対象となるタンパク質に特異的に結合可能な抗体、好ましくは直接的または間接的のいずれかで検出可能に標識された抗体である。
【０１５５】
そのような検出方法のために、必要に応じて、分析されるべき細胞培養物からのタンパク質は、当業者によく知られている技術を使用して容易に単離することができる。タンパク質単離法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）に記載されるもの等であり得、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
ある特定の実施形態において、タンパク質または対象となるタンパク質の検出方法は、タンパク質に特異的な抗体との相互作用によるそれらの検出を含む。例えば、抗体は、対象となるタンパク質を対象とする。抗体は、当業者によく知られている標準的技術を使用して発生させることができる。特定の実施形態において、抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルであり得る。例えば、無傷抗体、または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。
【０１５７】
例えば、対象となるタンパク質に特異的な抗体または抗体断片が、タンパク質の存在を定量的または定性的に検出するために使用され得る。これは、例えば、免疫蛍光技術によって達成することができる。加えて、抗体（またはその断片）は、対象となるタンパク質のインサイチュー検出法のために免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法等において、組織学的に使用することができる。インサイチュー検出法は、患者から生体試料（例えば、生検標本）を取り出し、対象となるタンパク質を対象とする標的抗体をそれに適用することによって達成され得る。抗体（または断片）は、好ましくは、抗体（または断片）を生体試料で覆うことによって適用される。そのような手法を使用することによって、特定の試料中の対象となるタンパク質の存在だけでなく、その配置もまた決定することが可能である。そのようなインサイチュー検出法を達成するために、広く様々なよく知られている組織学的方法（染色手法等）を使用することができる。
【０１５８】
対象となるタンパク質のイムノアッセイは、典型的には、対象となるタンパク質を特定することができる検出可能に標識された抗体の試料をインキュベートすることと、当該技術分野でよく知られている多くの技術のうちのいずれかによって結合抗体を検出することとを含む。下記により詳細に議論されるように、「標識された」という用語は、例えば、カップリング（すなわち、物理的に結合）することを介する抗体の直接標識化を指すことができ、また、直接標識された別の試薬との反応による抗体の間接標識化を指すことができる。間接標識化の例には、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出が含まれる。
【０１５９】
試料を、ニトロセルロース等の固相支持体もしくは担体、または細胞、細胞粒子、もしくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固体支持体と接触させ、固定化することができる。次いで、この支持体を好適な緩衝液で洗浄し、続いて、検出可能に標識された指紋遺伝子に特異的な抗体で処理することができる。次いで、固相支持体を再度洗浄して、非抗体を除去することができる。次いで、固体支持体上に結合した標識の量を、従来の方法によって検出することができる。
【０１６０】
「固体支持体または担体」とは、抗原または抗体を結合することができる任意の支持体が意図される。よく知られている支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、ならびに磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、本発明の目的のために、ある程度の可溶性または不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、結合される分子が抗原または抗体に結合することができる限り、実質的にあらゆる可能な構造構成を有し得る。したがって、支持体の構成は、ビーズのような球状、または試験管の内表面もしくは竿の害表面のようなシリンダー状であり得る。代替的に、その表面は、シート、試験紙等の平面であり得る。好ましい支持体は、ポリスチレンビーズを含む。当業者は、抗体または抗原を結合する多くの他の好適な担体を知っているだろうし、または日常的な実験作業を使用することによりそれを確認することができるあろう。
【０１６１】
対象となるタンパク質に特異的な抗体を検出可能に標識化することができる方法のうちの１つは、酵素にそれを結合し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）において使用するものである（Ｖｏｌｌｅｒ，１９７８，“Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．、Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，１９８１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３、Ｍａｇｇｉｏ  （ｅｄ．），１９８０，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．、Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９８１，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ、これらのそれぞれは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。抗体と結合する酵素は、例えば、分光光度計法、蛍光光度計法、または可視的手段によって検出され得る化学的部分を生成するような方法で、適切な基質、好ましくは発色性基質と反応する。抗体を検出可能に標識化するために使用することができる酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸塩、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。検出は、酵素に対する発色基質を使用する比色分析法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製された標準物と比較して、基質の酵素反応の程度を可視的に比較することにより達成され得る。
【０１６２】
検出はまた、様々な他の免疫測定法のうちのいずれかを使用して達成され得る。例えば、抗体または抗体断片を放射活性に標識化することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を通じて、対象となるタンパク質を検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８６，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙを参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈ）は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターを使用した方法により、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。
【０１６３】
蛍光化合物により抗体を標識化することも可能である。蛍光標識された抗体が適切な波長の光に曝露されると、蛍光によりその存在が検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、およびフルオレサミンである。
【０１６４】
抗体はまた、１５２Ｅｕまたは他のランタニド系列のような蛍光発光金属を使用して検出可能に標識化することもできる。これらの金属を、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエツレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属キレート群の使用により抗体に結合させることができる。
【０１６５】
抗体はまた、それを化学発光化合物とカップリングさせることによって検出可能に標識化することもできる。次いで、化学発光タグ化された抗体の存在は、化学反応の経過で生じる発光の存在を検出することによって決定される。特定の有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【０１６６】
同様に、生物発光化合物は、本発明の抗体を標識化するために使用することができる。生物発光は、触媒タンパク質により化学発光反応の効率が増大される生態系において見出される化学発光の１つの型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識化の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
【０１６７】
別の実施形態において、アプタマー等の抗体以外の特異的な結合分子は、バイオマーカーと結合するために使用され得る。さらに別の実施形態において、バイオマーカープロファイルは、感染性薬剤（例えば、リポ多糖類またはウイルスタンパク質）またはその成分の測定可能な態様を含み得る。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、タンパク質チップアッセイ（例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）はバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特徴値を測定するために使用される。また、例えば、Ｌｉｎ，２００４，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１−９、Ｌｉ，２００４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  １７１，１７８２−１７８７、Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，２００４，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，１６２５−１６３２、Ｐｒｉｅｔｏ，２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ＆  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２６，２３１５−２３２８、Ｃｏｏｍｂｅｓ，２００３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４９，１６１５−１６２３、Ｍｉａｎ，２００３，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３，１７２５−１７３７、Ｌｅｈｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＢＪＵ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ９２，２２３−２２５、およびＤｉａｍｏｎｄ，２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  １４，７６０−７６５も参照されたく、これらのそれぞれは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、ビーズアッセイは、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特徴値を測定するために使用される。１つのそのようなビーズアッセイは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）である。ＣＢＡは、複数の可溶性検体を同時に検出するために別々の蛍光強度を有する一連の粒子を使用する。ＣＢＡをフローサイトメトリーと合わせて、多重アッセイを作成する。例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎキットに具現化されるように、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＣＢＡシステムは、粒子ベースの免疫測定法における可溶性検体を測定するフローサイトメトリーによる増幅された蛍光検出の感受性を使用する。ＣＢＡ中の各ビーズは、特異的タンパク質に対して捕捉表面を提供し、ＥＬＩＳＡプレート中で個々にコーティングされたウェルと類似している。ＢＤ  ＣＢＡ捕捉ビーズ混合物は、懸濁液中にあり、少量の試料中の複数の検体の検出を可能にする。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、米国特許第５，９８１，１８０号（「’１８０特許」）（参照によりその全体が特に一般的方法論、ビーズ技術、システムハードウェア、および抗体検出のその教示について本明細書に組み込まれる）に記載される多重分析法が、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特徴値を測定するために使用される。この分析のためには、微小粒子のマトリックスが合成され、そのマトリックスは、微小粒子の異なるセットからなる。微小粒子の各セットは、微小粒子表面上に固定された異なる抗体捕獲試薬の何千もの分子を有することができ、２つの蛍光染料の異なる量を組み込むことによって色分けすることができる。２つの蛍光染料の比率により、微小粒子の各セットに対して異なる発光スペクトルを提供し、微小粒子セットを特定して、微小粒子の様々なセットのプールを行うことができる。米国特許第６，２６８，２２２号および同第６，５９９，３３１号はまた、参照によりそれらの全体、および特に多重分析のために微小粒子を標的化する様々な方法のこれらの教示について、本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
５．４．３  その他の検出方法の使用
いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特徴値を決定するために、試料内のバイオマーカーのサブセットのみが分析されるように、分離法が使用され得る。例えば、試料中で分析されるバイオマーカーは、試料内の核酸バイオマーカーのみを得るように分画された細胞抽出物からのｍＲＮＡ種であり得るか、またはクロマトグラフ技術によって分画される試料内のタンパク質の全成分の一分画からのものであり得る。
【０１７２】
バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特徴値はまた、例えば、下記に記載される以下の方法のうちの１つ以上の使用によって得ることができる。例えば、方法には、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、例えば、エレクトロスプレイイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ（ｎは、ゼロよりも大きい整数である）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン上での脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）、四極子飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）、気圧化学イオン化質量分析法（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）ｎ、気圧光イオン化質量分析法（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−（ＭＳ）ｎ等の質量分析法が含まれ得る。他の質量分析法は、とりわけ、四極子、フーリエ変換質量分析法（ＦＴＭＳ）、およびイオントラップを含み得る。他の好適な方法は、化学抽出分配する、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性（逆相）液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、または薄層、気体もしくは液体クロマトグラフィー、またはこれらの任意の組み合わせ等の他のクロマトグラフィーを含み得る。一実施形態において、生体試料は、分離法の適用の前に分画してもよい。
【０１７３】
一実施形態において、バイオマーカーがイオン化され、入射レーザー放射によって固定支持体から蒸発されるタンパク質またはタンパク質断片であり、その特徴値が質量スペクトルプロファイル中のこれらの断片を閉めるピークの存在または非存在であるバイオマーカープロファイル中の特徴値を決定するために、レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法が使用される。様々なレーザー脱離／イオン化技術は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｇｕｔｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：１２５２−６２およびＷｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：２４３−２４６を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１７４】
レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法は、相対的に短時間で大量の情報を生成することができる。生体試料を、試料中のバイオマーカーのすべてまたはそのサブセットを結合する多様な支持体のうちの１つに適用させる。細胞溶解物または試料を、事前の精製または分画の有無にかかわらず、０．５μＬ程度の少量で、これらの表面に直接適用させる。これらの溶解物または試料は、支持体表面上に適用する前に濃縮または希釈することができる。次いで、レーザー脱離／イオン化は、わずか３時間で試料（複数を含む）の質量スペクトルを発生させるために使用される。
【０１７５】
５．４．４  データ分析アルゴリズム
Ｔ−ＭＳＣのバイオマーカー発現プロファイルは、臨床グレードＴ−ＭＳＣと非臨床グレードＴ−ＭＳＣを区別することができる因子である。臨床グレードＴ−ＭＳＣと非臨床グレードＴ−ＭＳＣを区別する決定規則または複数の決定規則を開発するために、これらのバイオマーカーおよびそれらの対応する特徴の同一性（例えば、発現レベル）が使用され得る。決定規則または複数の決定規則を構築するための特定のデータ分析アルゴリズムは、臨床グレードＴ−ＭＳＣと非臨床グレードＴ−ＭＳＣを区別することができる。一旦これらの例示的なデータ分析アルゴリズムまたは当該技術分野で知られている他の技術を使用して決定規則が構築されると、２つ以上の表現型の分類（例えば、臨床グレードまたは非臨床グレードＴ−ＭＳＣ）のうちの１つにＴ−ＭＳＣを分類するために、決定規則を使用することができる。これは、決定規則を細胞培養物から得られたバイオマーカープロファイルに適用することによって達成される。したがって、そのような決定規則は、Ｔ−ＭＳＣの質を画定する場合に、非常に大きな値を有する。
【０１７６】
ある特定の実施形態において、対照集団中の細胞培養物から得られたバイオマーカープロファイルと比較して、試験細胞培養物からのバイオマーカープロファイルを評価するための方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、対照集団ならびに試験細胞培養物から得られた各バイオマーカープロファイルは、複数の異なるバイオマーカーの各々の特徴を含む。いくつかの実施形態において、この比較は、（ｉ）対照集団からのバイオマーカープロファイルを使用して決定規則を開発し、（ｉｉ）試験細胞培養物からのバイオマーカープロファイルに決定規則を適用することによって達成される。このように、本発明のいくつかの実施形態において適用される決定規則は、試験細胞培養物が臨床グレードまたは非臨床グレードであるかどうかを決定するために使用される。ある特定の実施形態において、対照集団は、臨床グレードＴ−ＭＳＣである。他の実施形態において、対照集団は、ＢＭ−ＭＳＣである。
【０１７７】
本発明のいくつかの実施形態において、決定規則の適用の結果が、試験細胞培養物が臨床グレードＴ−ＭＳＣであることを示す場合には、試験細胞培養物は治療のために使用される。決定規則の適用の結果が、試験細胞培養物が非臨床グレードＴ−ＭＳＣであることを示す場合には、試験細胞培養物は治療のために使用されない。
【０１７８】
５．５  Ｔ−ＭＳＣの修飾
改善された免疫抑制機能を有する修飾されたＭＳＣの集団を生成するために間葉系幹細胞を修飾する方法が、本明細書に提供される。ＭＳＣは、（ｉ）群１マーカーを発現する細胞を９５％超含有する、（ｉｉ）群２マーカーを発現する細胞を８０％超含有する、（ｉｉｉ）群３マーカーを発現する細胞を５％未満含有する、（ｉｖ）ＩＬ−１０およびＴＧＦβを発現する、（ｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−１２、およびＴＮＦαを発現する細胞を２％未満含有する、ならびに（ｖｉ）すべての群４マーカーを共発現する細胞を０．００１％未満含有する、特性を有し、群１マーカーは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、およびＣＤ４４であり、群２マーカーは、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ４９Ｅであり、群３マーカーは、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＳＳＥＡ４であり、群４マーカーは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０、およびＳＳＥＡ４である。
【０１７９】
ＡＩＦの発現を増加させることによってＴ−ＭＳＣの免疫抑制機能を増加させる方法が、本明細書に提供される。一実施形態において、本方法は、ＰＩＦの発現を減少させることを含む。一実施形態において、本方法は、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＴＮＦα、ＲＡＧＥ、およびＴ−ＭＳＣ中の他のＰＩＦの発現を減少させることを含む。一実施形態において、本方法は、Ｔ−ＭＳＣ中のＴＧＦβおよびＩＬ−１０の発現を増加させることを含む。
【０１８０】
ある特定の実施形態において、本方法は、当該技術分野で知られているＴ−ＭＳＣの遺伝的および後成的修飾を含む。ある特定の実施形態において、遺伝的修飾または後成的調節としては、ノックアウト、短ヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）、マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）、非コードＲＮＡ（「ｎｃＲＮＡ」）、モルフォリノオリゴ（ｍｏｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏ）、デコイＲＮＡ、ＤＮＡメチル化制御、ヒストンメチル化制御、翻訳阻害、および／または抗体ブロッキングが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ＭＳＣは、トランスポゾン、トール様受容体リガンド、または小分子を通して修飾される。
【０１８１】
ある特定の実施形態において、小分子は、ＩＬ−６シグナル伝達のシグナル伝達経路成分のうちのいずれかを標的とするために使用される。ある特定の実施形態において、標的としては、ｇｐ１３０、ＳＴＡＴ３、カテプシンＳ、ＮＦカッパＢ、ＩＲＦ５が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、プロスタグランジンＥ２経路の活性化によって、フォルスコリン、コレラ毒素、β１およびβ２アドレナリン受容体アゴニストが含まれるが、これらに限定されないｃＡＭＰアゴニストにより細胞内環状ＡＭＰレベルを増加させることによって、ＮＦ−κＢ  Ｒｅｌ−Ｂ経路の阻害によって、アポトーシス細胞によりＴ−ＭＳＣを処理することによって、ホスファチジルセリンによる処理によって、酪酸塩による処理によって、トリプトリドまたはトリプテリジウムウィルフォルディからの抽出物または合成形態またはトリプトリド（すなわち、ミンネリド（Ｍｉｎｎｅｌｉｄｅ））による処理によって、Ｔ−ＭＳＣ中のＩＬ−１２の発現が減少する。
【０１８２】
ある特定の実施形態において、ＭＳＣは、組み換えＤＮＡの技術分野で知られている方法を使用して、ある特定のマーカーを発現させるために修飾され得る。ある特定の実施形態において、ＭＳＣは、マーカーをコードする核酸配列を使用するトランスフェクションによって修飾され得る。マーカーを、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター中に挿入することができる。また、必要な転写および翻訳要素が存在し得る。調節領域およびエンハンサー要素は、天然および合成の両方の様々な源であり得る。様々な宿主ベクター系がマーカーを発現するために使用され得る。宿主ベクター系としては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳動物細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、酵母ベクターを含有する酵母等の微生物、またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡにより形質転換した細菌、および選択可能なマーカーを用いた形質転換により生成された安定した細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの発現要素は、それらの強さおよび特異性によって異なる。使用した宿主ベクター系に応じて、多くの好適な転写および翻訳要素のうちのいずれか１つを使用することができる。
【０１８３】
一旦適切なマーカーをコードするベクターが合成されると、ＭＳＣは、対象となるベクターで形質転換されるか、またはトランスフェクトされる。
【０１８４】
対象となる核酸配列をＭＳＣに導入する標準的な方法を使用することができる。形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルスの中にパッケージングすること、宿主細胞をウイルスで形質導入すること、およびポリヌクレオチドの直接摂取によるような、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の既知の方法によるものであり得る。直接摂取による哺乳動物の形質転換（すなわち、トランスフェクション）は、Ｇｒａｈａｍ  ＆  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７８，Ｖｉｒｏｌ．５２：５４６のリン酸カルシウム沈殿法またはその様々な既知の修正法を使用して実施され得る。組換えポリヌクレオチドを細胞、特に、哺乳動物細胞に導入するための他の方法には、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、電気穿孔法、リポソーム内でのポリヌクレオチド（複数を含む）の封入、およびポリヌクレオチドの核への直接微量注入が含まれる。そのような方法は、当業者にはよく知られている。
【０１８５】
好ましい実施形態において、対象となる構築物を含有する安定した細胞株は、ハイスループットスクリーニングのために生成される。そのような安定した細胞株は、選択可能なマーカーを含む構築物を導入することによって生成され得、これにより、細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させてから、選択培地上で細胞を増殖させることができる。組み換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に組み込んで巣を形成するように増殖させることを可能にし、それによって、クローン化し、細胞株に拡張させることができる。
【０１８６】
多くの選択系を使用することができ、これには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２６）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９８０，  Ｃｅｌｌ  ２２：８１７）遺伝子が含まれるが、これらに限定されず、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７、Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）の遺伝子の選択の基礎として使用することもできる。
【０１８７】
５．６  幹細胞収集組成物
幹細胞収集組成物は、幹細胞の収集および／または培養のために適した任意の生理的に許容される溶液、例えば、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス溶液、修正クレブス溶液、イーグル溶液、０．９％  ＮａＣｌ等）、培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭ等）等を含むことができる。
【０１８８】
幹細胞収集組成物は、幹細胞を保存する、すなわち、収集時から培養時において、幹細胞が死滅するのを妨げる、または幹細胞の死滅を遅延させる、死滅する細胞の集団における幹細胞の数を減少させる等の傾向がある、１つ以上の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤またはＪＮＫ阻害剤）、血管拡張剤（例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシンもしくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤等）、壊死阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバミン酸塩、もしくはクロナゼパム）、ＴＮＦ−α阻害剤、および／または酸素運搬ペルフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミド等）であり得る。
【０１８９】
幹細胞収集組成物は、例えば、金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ＲＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅ等の１つ以上の組織分解酵素を含むことができる。そのような酵素としては、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ、ヒストリチクム菌由来のコラゲナーゼ等）；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、ＬＩＢＥＲＡＳＥ、ヒアルロニダーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
幹細胞収集組成物は、殺菌的または細菌静的に有効な量の抗生物質を含むことができる。ある特定の非限定的な実施形態において、抗生物質は、マクロライド（例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル（ｃｅｆｐｒｏｚｉｌ）、セファクロル、セフィキシム、もしくはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ）、またはキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン、もしくはノルフロキサシン（ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ））、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等である。特定の実施形態において、抗生物質は、グラム（＋）および／またはグラム（−）細菌、例えば、緑膿菌、黄色ブドウ球菌等に対して活性である。
【０１９１】
また、幹細胞収集組成物は、以下の化合物のうちの１つ以上を含むこともできる：アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）；マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；一実施形態において、内皮完全性および細胞生存能を維持するために十分な量で存在する２０，０００ダルトンを超える分子量の巨大分子（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌ、または約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在する、合成または天然に存在するコロイド、デキストランもしくはポリエチレングリコール等の多糖体）；抗酸化剤（例えば、約２５μＭ〜約１００μＭで存在する、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣ、もしくはビタミンＥ）；還元剤（例えば、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在する、Ｎ−アセチルシステイン）；細胞へのカルシウム流入を防止する薬剤（例えば、約２μＭ〜約２５μＭで存在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）；一実施形態において、残留する血液の凝固を防止するのを補助するために十分な量で存在する抗凝固剤（例えば、約１０００単位／１〜約１００，０００単位／ｌの濃度で存在するヘパリンもしくはヒルジン）；またはアミロライド含有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭで存在する、アミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド、もしくはイソブチルアミロライド）。
【０１９２】
５．７  Ｔ−ＭＳＣを用いた免疫調節
免疫細胞（複数を含む）を複数のＴ−ＭＳＣまたはｉＴ−ＭＳＣと接触させることによる１つの免疫細胞または複数の免疫細胞の活性の調整（例えば、細胞増殖の減少、細胞生存の減少、炎症の部位への細胞遊走の障害、炎症を促進するもしくは長引かせる細胞の能力の低下、または健常な組織もしくは器官の恒常性の回復を促進する細胞機能の向上）が、本明細書に提供される。一実施形態において、免疫応答を調整する方法は、Ｔ−ＭＳＣまたはｉＴ−ＭＳＣが免疫応答を検出可能に抑制するのに十分な時間、複数の免疫細胞を複数のＴ−ＭＳＣまたはｉＴ−ＭＳＣと接触させることを含み、Ｔ−ＭＳＣまたはｉＴ−ＭＳＣは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖を抑制する。
【０１９３】
ＢＭ−ＭＳＣまたは他の成体組織由来のＭＳＣが、多くの自己免疫疾患を治療するために使用されているため、ＢＭ−ＭＳＣはまた、炎症ならびに秘密の増殖および保護因子を抑えることによって組織を修復し、損傷組織を置換するために使用される。実施例において後で示されるように、Ｔ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣに対して卓越した免疫抑制機能を有し、そのため、Ｔ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣによって現在標的とされるすべての領域および疾患に使用することができる。
【０１９４】
免疫調節のために使用されるＴ−ＭＳＣまたはｉＰＳ−ＭＳＣは、それぞれ、胚性幹細胞株または誘導多能性幹細胞株に由来し得るか、またはそれから得られ得る。免疫調節のために使用されるＴ−ＭＳＣまたはｉＰＳ−ＭＳＣはまた、活性が調節されるべき免疫細胞と同じ種から、または活性が調節されるべき免疫細胞のものと異なる種に由来し得る。
【０１９５】
本方法の文脈において、「免疫細胞」は、免疫系の任意の細胞、特に、Ｔ細胞およびＮＫ（ナチュラルキラー）細胞を意味する。したがって、本方法の様々な実施形態において、Ｔ−ＭＳＣを、複数の免疫細胞と接触させ、複数の免疫細胞が、複数のＴ細胞（例えば、複数のＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞）ならびに／またはナチュラルキラー細胞であるか、またはこれらを含む。本方法の文脈において、「免疫応答」は、通常免疫細胞によって認知される刺激に対する免疫細胞による任意の反応、例えば、抗原の存在に対する反応であり得る。様々な実施形態において、免疫応答は、輸血もしくは移植片に存在する抗原等の外来抗原に対して、または自己免疫疾患のように自己抗原に対して反応するＴ細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の増殖であり得る。免疫応答はまた、移植片に含まれるＴ細胞の増殖であり得る。また、免疫応答は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の任意の活性、樹状細胞の成熟等であり得る。また、免疫応答は、免疫細胞の１つ以上のクラスの活性の局部的、組織、または臓器特異的、または全身的作用であることができ、例えば、免疫応答は、移植片対宿主病、炎症、炎症関連瘢痕組織の形成、自己免疫性状態（例えば、リウマチ様関節炎、Ｉ型糖尿病、エリテマトーデス等）等であり得る。
【０１９６】
この文脈において、「接触」は、Ｔ−ＭＳＣおよび免疫細胞を、単一の容器（例えば、培養皿、フラスコ、バイアル等）内、またはインビボ、例えば、同じ個体（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において一緒にすることを含む。好ましい実施形態において、この接触は、免疫細胞の免疫機能の変化が検出可能である十分な時間、および十分な数のＴ−ＭＳＣおよび免疫細胞との接触である。より好ましくは、様々な実施形態において、この接触は、Ｔ−ＭＳＣの非存在下での免疫機能と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで免疫機能（例えば、抗原に応答するＴ細胞増殖）を抑制するのに十分である。インビボの文脈におけるそのような抑制は、インビトロアッセイにおいて決定することができ、すなわち、インビトロアッセイにおける抑制の程度は、レシピエント個体における特定数のＴ−ＭＳＣおよび多数の免疫細胞に関して、個体における抑制の程度を推定することができる。
【０１９７】
ある特定の実施形態において、本発明は、免疫応答、または複数の１つ以上のタイプの免疫細胞をインビトロで調整するためにＴ−ＭＳＣを使用する方法を提供する。Ｔ−ＭＳＣおよび複数の免疫細胞の接触には、複数のＴ−ＭＳＣの少なくとも一部が複数の免疫細胞の少なくとも一部と相互作用するように、同じ物理的空間でＴ−ＭＳＣと免疫細胞を合わせることと、共通の培地を用い、分離された物理的空間においてＴ−ＭＳＣおよび免疫細胞を維持することとを含むことができるか、またはＴ−ＭＳＣもしくは免疫細胞の１つもしくは培養液からの培地を他のタイプの細胞と接触させること（例えば、Ｔ−ＭＳＣの培養液から培養培地を得て、培地中の単離された免疫細胞を再懸濁すること）を含むことができる。特定の例において、接触は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）である。
【０１９８】
そのような接触は、例えば、特定の複数のＴ−ＭＳＣが免疫調節、例えば、免疫抑制される範囲を決定するように設計される実験的設定において行われ得る。そのような実験的設定は、例えば、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）または退行アッセイであり得る。ＭＬＲおよび退行アッセイを行うための手順は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ，“Ｔｈｅ  Ｍｉｘｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，”  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２７（５）：８７９−８９０（１９６８）、Ｌａｃｅｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｔｏ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＥＢＶ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ  Ｃ．Ｂ−１７  Ｓｃｉｄ／Ｓｃｉｄ  Ｍｉｃｅ，”  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１２１５−１２２８（１９９６）を参照のこと。好ましい実施形態において、複数のＴ−ＭＳＣを複数の免疫細胞（例えば、リンパ球、例えば、ＣＤ３＋  ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋  Ｔリンパ球）と接触させるＭＬＲが行われる。
【０１９９】
ＭＬＲは、複数のＴ−ＭＳＣの免疫抑制の能力を決定するために使用することができる。例えば、複数のＴ−ＭＳＣは、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、およびＴ−ＭＳＣを約１０：１：２の比率で合わせることを含むＭＬＲにおいて試験することができ、Ｔ細胞を、例えば、娘細胞に分配される、例えばＣＦＳＥ等の色素で染色し、このＴ細胞を約６日間増殖させる。Ｔ−ＭＳＣの存在下、６日間でＴ細胞増殖が、ＤＣの存在およびＴ−ＭＳＣの非存在におけるＴ細胞増殖と比較して、検出可能に減少する場合、複数のＴ−ＭＳＣは、免疫抑制性である。そのようなＭＬＲにおいて、Ｔ−ＭＳＣは、解凍されるか、または培養から収集される。約１０，０００個のＴ−ＭＳＣを、１００μｌの培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、抗生物質、および５％のプールしたヒト血清）中に再懸濁し、ウェルの底面に２時間接着させる。ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、全末梢血単核細胞Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気ビーズから単離する。細胞をＣＦＳＥ染色し、合計１００，０００個のＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞単独、ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または同量のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）をウェルあたりに添加する。ウェルの体積を２００μｌにして、ＭＬＲを進行させる。
【０２００】
したがって、一実施形態において、本発明は、免疫応答を抑制する方法を提供し、本方法は、Ｔ−ＭＳＣが混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞の増殖を検出可能に抑制するのに十分な時間、複数の免疫細胞を複数のＴ−ＭＳＣと接触させることを含む。
【０２０１】
異なる胚性幹細胞株から得られたＴ−ＭＳＣの集団は、免疫細胞の活性を調整するそれらの能力が異なり得る、例えば、Ｔ細胞活性もしくは増殖またはＮＫ細胞活性を抑制するそれらの能力は異なる得る。したがって、使用前に、免疫抑制に対するＴ−ＭＳＣの特定の集団の能力を決定することが望ましい。そのような能力は、例えば、ＭＬＲまたは退行アッセイにおいて幹細胞集団の試料を試験することによって決定することができる。一実施形態において、ＭＬＲは、試料を用いて行い、Ｔ−ＭＳＣに起因するアッセイにおいて免疫抑制の程度を決定する。次いで、この免疫抑制の程度は、試料採取した幹細胞集団に起因し得る。したがって、ＭＬＲは、免疫機能を抑制するＴ−ＭＳＣの特定の集団の絶対的および相対的能力を決定する方法として使用することができる。ＭＬＲのパラメーターは、より多くのデータを提供するように、または免疫抑制するＴ−ＭＳＣの試料の能力を最良に決定するように変更することができる。例えば、Ｔ−ＭＳＣによる免疫抑制がアッセイに存在するＴ−ＭＳＣの数に比例して増加するようであるため、ＭＬＲは、一実施形態において、幹細胞の２倍以上の数、例えば、反応あたり１×１０３、３×１０３、１×１０４、および／または３×１０４個のＴ−ＭＳＣで行うことができる。アッセイにおけるＴ細胞の数と相対的なＴ−ＭＳＣの数も変更することもできる。例えば、アッセイにおけるＴ−ＭＳＣおよびＴ細胞は、例えば、約１０：１〜約１：１０、好ましくは約１：５の任意の比で存在することができるが、相対的により多くの数のＴ−ＭＳＣまたはＴ細胞を使用することができる。
【０２０２】
本発明はまた、免疫応答、または複数の１つ以上のタイプの免疫細胞をインビボで調整するためにＴ−ＭＳＣを使用する方法を提供する。Ｔ−ＭＳＣおよび免疫細胞は、例えば、複数のＴ−ＭＳＣのレシピエントである個体において接触させることができる。接触が個体において行われる場合、一実施形態において、この接触は、外因性Ｔ−ＭＳＣ（すなわち、個体に由来しないＴ−ＭＳＣ）と、個体に対して内因性の複数の免疫細胞との間である。特定の実施形態において、個体内の免疫細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、および／またはＮＫ細胞である。
【０２０３】
Ｔ−ＭＳＣを用いたそのような免疫抑制は、不適当な、もしくは望ましくない免疫応答によって生じた、または悪化した、または関連した、任意の状態に関して有利であろう。Ｔ−ＭＳＣを媒介した免疫調節、例えば免疫抑制は、例えば、それ自体の組織のうちの１つ以上に対する個体の免疫系によって生じる不適当な免疫応答の抑制に有用であろう。したがって、様々な実施形態において、本発明は、免疫応答を抑制する方法を提供し、この免疫応答は、自己免疫疾患、例えば、紅斑性狼瘡、糖尿病、リウマチ性関節炎、または多発性硬化症である。
【０２０４】
複数のＴ−ＭＳＣの、免疫細胞の１つ以上のタイプの複数との接触は、レシピエント個体に対する１つ以上のタイプの組織の移植術または移植の状況において、または補助として、インビボにおいて行うことができる。そのような組織は、例えば、骨髄もしくは血液、器官、特定組織（例えば、皮膚移植）、複合組織同種移植片（すなわち、２つ以上の異なるタイプの組織を含む移植片）等であってもよい。この点に関しては、Ｔ−ＭＳＣは、レシピエント個体内に、移植された組織もしくは移植片、または両方に含まれる１つ以上の免疫細胞の１つ以上の免疫応答を抑制するために使用することができる。接触は、移植術もしくは移植の前、その間、および／またはその後に行うことができる。例えば、Ｔ−ＭＳＣは、移植または移植術の時に投与することができる。また、Ｔ−ＭＳＣは、または代替的に、移植または移植術の前、例えば、移植または移植術の約１、２、３、４、５、６、または７日前に投与することもできる。また、Ｔ−ＭＳＣは、または代替的に、移植または移植術の後に、例えば、移植または移植術の約１、２、３、４、５、６、または７日後に移植または移植術のレシピエントに投与することもできる。好ましくは、複数のＴ細胞は、レシピエント個体または移植された組織もしくは移植片のいずれかによる免疫応答の任意の検出可能な徴候または症状、例えば、移植片対宿主病の検出可能な徴候もしくは症状または検出可能な炎症が検出可能になる前に、複数のＴ−ＭＳＣと接触される。
【０２０５】
別の実施形態において、個体内の接触は、主に、外因性Ｔ−ＭＳＣと外因性前駆細胞または幹細胞、例えば、免疫細胞に分化する外因性前駆細胞または幹細胞との間である。例えば、癌療法に対する補助として部分的または完全な免疫破壊または骨髄抑制を受けている個体には、幹または前駆細胞のうちの１つ以上の他のタイプと組み合わせてＴ−ＭＳＣを受けさせることができる。例えば、Ｔ−ＭＳＣは、複数のＣＤ３４＋細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞と組み合わせることができる。そのようなＣＤ３４＋細胞は、例えば、末梢血、臍帯血、胎盤血、または骨髄等の組織源からのＣＤ３４＋細胞であり得る。ＣＤ３４＋細胞は、そのような組織源から単離することができるか、または組織源全体（例えば、臍帯血もしくは骨髄の単位）もしくは組織源から部分的に精製された調製物（例えば、臍帯血からの白血球）をＴ−ＭＳＣと組み合わせることができる。
【０２０６】
Ｔ−ＭＳＣは、好ましくは、個体において免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の知られているか、もしくは予想される数に関して、約１０：１〜約１：１０、好ましくは約１：５の比で個体に投与される。しかしながら、非限定的な例において、複数のＴ−ＭＳＣを、約１０，０００：１、約１，０００：１、約１００：１、約１０：１、約１：１、約１：１０、約１：１００、約１：１，０００、または約１：１０，０００の比で個体に投与することができる。一般に、レシピエントキログラムあたり約１×１０５〜約１×１０８個のＴ−ＭＳＣ、好ましくはレシピエントキログラムあたり約１×１０６〜約１×１０７個のＴ−ＭＳＣを、免疫抑制をもたらすために投与することができる。様々な実施形態において、個体または対象に投与される複数のＴ−ＭＳＣは、少なくとも、約、１×１０５、３×１０５、１×１０６、３×１０６、１×１０７、３×１０７、１×１０８、３×１０８、１×１０９、３×１０９個もしくはそれ以下、またはそれより多いＴ−ＭＳＣを含む。
【０２０７】
また、Ｔ−ＭＳＣは、１つ以上の第２のタイプの幹細胞、例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞とともに投与することもできる。そのような第２の幹細胞は、個体に対して、例えば、約１：１０〜約１０：１の比でＴ−ＭＳＣとともに投与することができる。
【０２０８】
Ｔ−ＭＳＣおよび免疫細胞をインビボで接触させることを促進するために、Ｔ−ＭＳＣは、Ｔ−ＭＳＣおよび免疫細胞を互いに接触させるために十分な任意の経路によって個体に投与することができる。例えば、Ｔ−ＭＳＣは、個体に対して、例えば、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、または器官、例えば膵臓内に直接投与することができる。インビボの投与のために、Ｔ−ＭＳＣは、薬学的組成物として製剤化することができる。
【０２０９】
免疫抑制の方法は、特にインビボの状況において、１つ以上の免疫抑制剤の添加をさらに含むことができる。一実施形態において、複数のＴ−ＭＳＣを、個体においてインビボで複数の免疫細胞と接触させて、免疫抑制剤を含む組成物を個体に投与する。免疫抑制剤は、当該技術分野でよく知られており、例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル、またはその抗体断片もしくは誘導体）、抗ＩＬ−２受容体抗体（例えば、Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））もしくはダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））、抗Ｔ細胞受容体抗体（例えば、ムロモナブ−ＣＤ３）、アザチオプリン、副腎皮質ステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス、カルシニューリン阻害剤等を含む。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１αまたはＭＩＰ−１βに対する中和抗体である。
【０２１０】
５．８  Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの保存
Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、保存すること、すなわち、長期貯蔵を可能にする条件、または例えば、アポトーシスもしくは壊死による細胞死を阻害する条件下におくことができる。Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、例えば、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤を含む組成物を使用して調製することができる。一実施形態において、本発明は、幹細胞の集団を保存する方法を提供し、本方法は、幹細胞の集団をアポトーシスの阻害剤を含む幹細胞収集組成物と接触させることを含み、アポトーシスの阻害剤は、アポトーシスの阻害剤と接触しない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団におけるアポトーシスを低減または防止するのに十分な量および時間で存在する。特定の実施形態において、アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の特定の実施形態において、アポトーシスの阻害剤は、ＪＮＫ阻害剤である。さらに特定の実施形態において、ＪＮＫ阻害剤は、幹細胞の分化または増殖のいずれも調整しない。別の実施形態において、幹細胞収集組成物は、アポトーシスの阻害剤および酸素運搬ペルフルオロカーボンを別々の相に含む。別の実施形態において、幹細胞収集組成物は、アポトーシスの阻害剤および酸素運搬ペルフルオロカーボンを乳剤中に含む。別の実施形態において、幹細胞収集組成物は、さらに、乳化剤、例えば、レシチンを含む。別の実施形態において、アポトーシス阻害剤およびペルフルオロカーボンは、幹細胞を接触させる時に、約０℃〜約２５℃の間である。別のさらに特定の実施形態において、アポトーシス阻害剤およびペルフルオロカーボンは、幹細胞を接触させる時に、約２℃〜１０℃または約２℃〜約５℃の間である。別のさらに特定の実施形態において、接触は、幹細胞の集団の輸送の間に行われる。別のさらに特定の実施形態において、接触は、幹細胞の集団の凍結融解の間に行われる。
【０２１１】
別の実施形態において、本発明は、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの集団を保存する方法を提供し、本方法は、幹細胞の集団をアポトーシスの阻害剤および器官保存化合物と接触させることを含み、アポトーシスの阻害剤は、アポトーシスの阻害剤と接触しない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団におけるアポトーシスを低減、または防止するのに十分な量および時間で存在する。
【０２１２】
典型的には、、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの収集、濃縮、および単離の間に、低酸素症および機械的ストレスによる細胞ストレスを最小限に抑えるか、または除去することが好ましい。したがって、本方法の別の実施形態において、幹細胞または幹細胞の集団は、収集、濃縮、および単離の間に、保存の間の６時間未満の間、正常な血液酸素濃度未満である酸素の濃度である低酸素状態に曝露される。さらに特定の実施形態において、幹細胞の集団は、保存の間に、２時間未満の間、低酸素状態に曝露される。別のさらに特定の実施形態において、幹細胞の集団は、１時間もしくは３０分未満より少ない間、低酸素状態に曝露されるか、または収集、濃縮、もしくは単離の間に、低酸素状態に曝露されない。別の特定の実施形態において、幹細胞の集団は、収集、濃縮、または単離の間にせん断応力に曝露されない。
【０２１３】
Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、例えば、小さな容器、例えば、アンプル内の凍結保存培地に凍結保存することができる。好適な凍結保存培地には、例えば、成長培地または細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、Ｃ２６９５、Ｃ２６３９、もしくはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ）が含まれるが、これらに限定されない培養培地が含まれる。凍結保存培地は、好ましくは、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含む。凍結保存培地は、さらなる薬剤、例えば、メチルセルロースおよび／またはグリセロールを含んでもよい。Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、好ましくは、凍結保存の間に約１℃／分で冷却される。好ましい凍結保存温度は、約−８０℃〜約−１８０℃、好ましくは約−１２５℃〜約−１４０℃である。凍結保存された細胞は、使用のために解凍する前に、液体窒素に移すことができる。いくつかの実施形態において、例えば、一旦アンプルが約−９０℃に達したならば、それらを液体窒素貯蔵領域に移す。凍結保存された細胞は、好ましくは、約２５℃〜約４０℃の温度で、好ましくは約３７℃の温度に解凍される。
【０２１４】
５．９  凍結保存されたＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬ
本明細書に開示されるＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬが、保存すること、例えば、後で使用するために凍結保存することができる。幹細胞等の細胞の凍結保存のための方法は、当該技術分野でよく知られている。Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、個体に容易に投与可能な形態に調製することができる。例えば、医療用に適した容器内に含まれるＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬが、本明細書に提供される。そのような容器は、例えば、無菌のプラスチック袋、フラスコ、瓶、またはＴ−ＭＳＣおよび／もしくはＴ−ＭＳＣ−ＤＬが容易に分配することができる他の容器であり得る。例えば、容器は、血液バッグ、または、レシピエントに液体を静脈内投与するのに適した医学的に許容される他のプラスチックバッグであり得る。この容器は、好ましくは、合わせた幹細胞集団を凍結保存することができるものである。凍結保存されたＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、単一のドナーに、または複数のドナーに由来するＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬを含むことができる。Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、意図されたレシピエントに完全にＨＬＡ一致、または部分的にもしくは完全にＨＬＡミスマッチし得る。
【０２１５】
別の特定の実施形態において、この容器は、バッグ、フラスコ、または瓶である。さらに特定の実施形態において、このバッグは、無菌のプラスチックバッグである。さらに特定の実施形態において、このバッグは、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの静脈内投与を可能にする、または促進するのに適している。このバッグは、例えば、薬物の投与前または投与の間に、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬと１つ以上の他の溶液の混合を可能にする複数の内腔またはコンパートメントを含むことができる。別の特定の実施形態において、組成物は、合わせた幹細胞集団の凍結保存を促進する１つ以上の化合物を含む。別の特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、生理的に許容される水溶液内に含まれる。さらに特定の実施形態において、生理的に許容される水溶液は、０．９％  ＮａＣｌ溶液である。別の特定の実施形態において、ｈＥＳ−ＭＳＣは、幹細胞集団のレシピエントに対してＨＬＡ一致である。別の特定の実施形態において、合わせた幹細胞集団は、幹細胞集団のレシピエントに対して少なくとも部分的にＨＬＡミスマッチであるｈＥＳ−ＭＳＣを含む。
【０２１６】
５．１０  Ｔ−ＭＳＣの多系統への分化
Ｔ−ＭＳＣは、神経細胞系細胞もしくはニューロン、または脂肪細胞、または筋芽細胞、または線維芽細胞、または骨芽細胞もしくは軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）を含む様々な細胞系統に分化され得る。別途具体的な記載のない限り、Ｔ−ＭＳＣは、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、またはポリ（リシン）でコーティングした細胞培養プレート上に播種され得る。Ｔ−ＭＳＣは、ウシ血清ＦＢＳまたはＡＢＨＳを含む無血清培地または血清含有培地中で１×１０３個の細胞／ｃｍ２〜１×１０４個の細胞／ｃｍ２の濃度で播種され得る。上述の条件により播種されたＴ−ＭＳＣは、以下の方法のうちの１つによって分化され得る。
【０２１７】
一実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、１〜５０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２（任意に１０ｎｇ／ｍｌ）＋１〜５０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（任意に１０ｎｇ／ｍｌ）＋０．５〜５ｎｇ／ｍｌの血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）（任意に１ｎｇ／ｍｌ）を含む培地中で分化され得る。この培地を、２〜３日ごとに交換し、細胞を、２〜４週間後に収穫し、１×１０６個のＴ−ＭＳＣあたり０．５×１０６〜２×１０６個の神経細胞系細胞の期待収量を得る。
【０２１８】
別の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンでコーティングしたプレート上に播種することによって、神経細胞系細胞に分化され得る。Ｔ−ＭＳＣは、３つの段階で分化されよう。段階１：神経運命に対するｈＭＳＣを準備するために、１〜５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（任意に１０ｎｇ／ｍｌ）および１〜５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（任意に１０ｎｇ／ｍｌ）。段階２：中脳の仕様を開始するために、１０〜２００ｎｇ／ｍｌのソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（ＳＨＨ）（任意に１００ｎｇ／ｍｌ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−８（ヒト）（任意に１０ｎｇ／ｍｌ）および５０−５００μＭのＡＡＰ（任意に２００μＭ）。段階３：ドーパミン神経表現型に対して分化および成熟を誘発するために、５〜５００ｎｇ／ｍｌのグリア由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）（任意に５０ｎｇ／ｍｌ）および５０〜５００μＭのＡＡＰ（任意に２００μＭ）。各段階を、１週間適用し、接着した細胞を、各段階の間でトリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ／ディスパーゼで解離させることによって継代する。増殖因子は、毎日補充し、この培地は、２日ごとに交換する。期待収量は、１×１０６個のＴ−ＭＳＣあたり０．５×１０６〜４×１０６個の神経細胞系細胞である。
【０２１９】
別の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、０．２５×Ｂ−２７補給剤＋１０〜２００ｎｇ／ｍｌのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）（任意に１００ｎｇ／ｍｌ）＋１〜５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−８（マウス）（任意に１０ｎｇ／ｍｌ）＋１〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（任意に５０ｎｇ／ｍｌ）を含む神経基底培地（Ｇｉｂｃｏ）中で神経細胞系細胞に分化され得る。細胞は、６日後および１２日後に収穫される。培地は、この期間中入れ替えしない。期待収量は、１×１０６個のＴ−ＭＳＣあたり０．５×１０６〜４×１０６個の神経細胞系細胞である。
【０２２０】
別の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、２つの段階で神経細胞系細胞に分化され得る。段階１：Ｔ−ＭＳＣを、２ｍＭのグルタミン、１〜２０Ｕ／ｍｌ（任意に１２．５Ｕ／ｍｌ）のナイスタチン、Ｎ２補給剤、および２〜５０ｎｇ／ｍｌ（任意に２０ｎｇ／ｍｌ）の線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）、および１〜５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（任意に１０ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ）中で４８〜７２時間培養する。段階２：細胞を、神経基底培地＋Ｂ２７補給剤＋０．１〜１０ｍＭ（任意に１ｍＭ）のジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、および１０〜５００μＭ（任意に２００μＭ）アスコルビン酸＋１〜１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（任意に５０ｎｇ／ｍｌ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌのグリア由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ；任意に１０ｎｇ／ｍｌ）、０．２〜１０ｎｇ／ｍｌの形質転換増殖因子−β３（ＴＧＦ−β３、任意に２ｎｇ／ｍｌ）、および０．０５〜５μＭのオールトランスレチノイン酸（ＲＡ、任意に０．１μＭ）中で培養する。各段階を、１週間適用し、接着した細胞を、各段階の間でトリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ／ディスパーゼで解離させることによって継代する。培地を、２日ごとに交換し、期待収量は、１×１０６個のＴ−ＭＳＣあたり０．５×１０６〜４×１０６個の神経細胞系細胞である。
【０２２１】
別の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、骨形成分化を誘導するために培養され得る。Ｔ−ＭＳＣは、低グルコースＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ、１〜１５０ｕＭ（任意に８０μＭ）のアスコルビン酸２−リン酸塩、０．５−５μＭ（任意に１μＭ）のデキサメタゾン、および１〜１００ｍＭ（任意に２０ｍＭ）のベータ−グリセロリン酸塩中で培養される。培地は、２〜３日ごとに交換し、期待収量は、２週間後、１×１０６個のＴ−ＭＳＣあたり０．５×１０６〜４×１０６個の神経細胞系細胞である。
【０２２２】
別の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、脂肪生成分化を誘導するために培養され得る。Ｔ−ＭＳＣは、低グルコースＤＭＥＭ＋２０％のＦＣＳ、１〜１０μｇ／ｍｌ（任意に５μｇ／ｍｌ）のインスリン、０．５〜１０μＭ（任意に２μＭ）のデキサメタゾン、０．１〜１ｍＭ（任意に０．５ｍＭ）のイソブチルメチルキサンチン、および１〜１００μＭ（任意に６０μＭ）のインドメタシン中で培養される。培地は、２〜３日ごとに交換し、期待収量は、４週間後、１×１０６個のＴ−ＭＳＣあたり０．５×１０６〜４×１０６個の神経細胞系細胞である。
【０２２３】
別の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、軟骨細胞分化を誘導するために培養され得る。Ｔ−ＭＳＣは、０．５〜１０ｍＭ（任意に１ｍＭ）のピルビン酸ナトリウム、０．０５〜１ｍＭ（任意に０．１ｍＭ）のアスコルビン酸２−リン酸塩、０．０５〜１μＭ（任意に０．１μＭ）のデキサメタゾン、０．２〜２％（任意に１％）のＩＴＳ、および１〜５０ｎｇ／ｍｌ（任意に１０ｎｇ／ｍＬ）のＴＧＦ−β３を含む高グルコースＤＭＥＭ中、ペレット中で増殖される。培地は、２〜３日ごとに交換し、期待収量は、２０日後、１×１０６個のＴ−ＭＳＣあたり０．５×１０６〜４×１０６個の神経細胞系細胞である。
【０２２４】
別の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、筋原性分化を誘導するために培養され得る。Ｔ−ＭＳＣは、１０％のＦＢＳ、１〜２０μＭ（任意に１０μＭ）の５−アザシチジン、および１〜５０ｎｇ／ｍｌ（任意に１０ｎｇ／ｍｌ）の塩基性ＦＧＦを含む低グルコースＤＭＥＭ中で増殖される。２４時間後、筋原性誘導培地を、１０％のＦＢＳ＋１〜５０ｎｇ／ｍｌ（任意に１０ｎｇ／ｍｌ）の塩基性ＦＧＦを含むＤＭＥＭと置き換える。培地は、２〜３日ごとに交換し、期待収量は、２週間後、１×１０６個のＴ−ＭＳＣあたり０．５×１０６〜４×１０６個の神経細胞系細胞である。
【０２２５】
別の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、線維芽細胞分化を誘導するために培養され得る。Ｔ−ＭＳＣは、５０〜２００ｎｇ／ｍｌ（任意に１００ｎｇ／ｍｌ）の組換えヒト結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、および１〜１００μｇ／ｍｌ（任意に５０μｇ／ｍｌ）のアスコルビン酸を含むＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳで処理されたｈＭＳＣ中で増殖される。培地は、３〜４日ごとに交換し、期待収量は、４週間後、１×１０６個のＴ−ＭＳＣあたり０．５×１０６〜４×１０６個の神経細胞系細胞である。
【０２２６】
分化法を使用したＴ−ＭＳＣ由来のすべての細胞系統および細胞型が、含まれるが、これに限定されず、上記の方法は、期間中ずっと、Ｔ−ＭＳＣ−ＤＬと称される。
【０２２７】
５．１１  薬学的調製物
一実施形態において、治療有効量のＴ−ＭＳＣおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。
【０２２８】
薬学的組成物は、任意の数のＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬを含むことができる。例えば、様々な実施形態において、Ｔ−ＭＳＣの単一単位用量は、約、少なくとも、または１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１もしくはそれ以下、またはそれ以上のＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬを含み得る。
【０２２９】
本明細書に開示される薬学的組成物は、５０％またはそれ以上の生存細胞を含む細胞集団を含む（つまり、集団中の細胞の少なくとも５０％が機能的または生存している）。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも６０％が生存している。より好ましくは、薬学的組成物中の集団中の細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が生存している。
【０２３０】
本明細書に開示される薬学的組成物は、例えば、生着を促進する１つ以上の化合物（例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体、免疫抑制剤等）、アルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプン等の安定剤等を含むことができる。
【０２３１】
「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与されたときに、生理的に耐えられ、異常亢進および目まい等のアレルギーまたは類似の有害反応を一般的に生じない、そして、動物、より具体的には、ヒトに使用するために、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認される、または米国薬局もしくは他の一般に認識される薬局方に列挙される、分子の実体および組成物を指す。「担体」とは、治療剤が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の石油、動物、植物、もしくは合成由来のものを含む、水および油中の食塩溶液等の滅菌液であり得る。薬学的組成物を静脈内投与する場合、食塩溶液が、好ましい担体である。食塩溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、液体担体として、特に注射用溶液に使用することもできる。好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。所望により、組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。
【０２３２】
これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放製剤、カシェ剤、トローチ、ロゼンジ、分散剤、坐薬、軟膏、パップ（湿布）、ペースト、粉末、包帯剤、クリーム、硬膏、パッチ、エアロゾル、ゲル、患者への非経口投与に適した液体剤形、患者への非経口投与に適した液体剤形を提供するために再構成され得る滅菌固体（例えば、結晶または非晶質固体）の形態をとることができる。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するような好適な形態の担体とともに、好ましくは精製した形態で、治療有効量の化合物を含む。この製剤は、投与様式に適するものでなければならない。
【０２３３】
経口投与に適合する薬学的組成物は、カプセル剤、錠剤、粉末、顆粒、液剤、シロップ剤、懸濁液（非水性もしくは水性液体中）、または乳剤であり得る。錠剤または硬ゼラチンカプセル剤は、ラクトース、デンプンまたはそれらの誘導体、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ステアリン酸またはそれらの塩を含み得る。軟ゼラチンカプセル剤は、植物油、ワックス、脂肪、半固体、または液体ポリオールを含み得る。液剤およびシロップ剤は、水、ポリオール、および糖を含み得る。経口投与を目的とする活性物質は、胃腸管における活性物質の崩壊および／または吸収を遅延させる物質でコーティングし得るか、またはその物質と混合し得る。したがって、その持続放出を、数時間かけて達成させ得、必要な場合には、活性物質を胃内における分解から保護することができる。経口投与用の薬学的組成物は、特定のｐＨまたは酵素的条件による胃腸の特定の位置での活性物質の放出を促進するために製剤化され得る。
【０２３４】
経皮投与に適合する薬学的組成物は、レシピエントの表皮との密な接触を長時間維持することを目的として、別々のパッチとして提供され得る。
【０２３５】
鼻および肺投与に適合する薬学的組成物は、鼻を通して急速な吸入により投与することができる、粉末等の固体担体を含み得る。経鼻投与のための組成物は、スプレーまたは点鼻剤等の液体担体を含み得る。代替的に、肺への直接の吸入は、深い吸入またはマウスピースを通した導入により達成され得る。これらの組成物は、活性成分の水性または油性溶液を含み得る。吸入用組成物は、所定の用量の活性成分を提供するために構成され得る加圧エアロゾル、噴霧器、または吸入器が含まれるが、これらに限定されない、特別に適合させた装置において供給され得る。
【０２３６】
非経口投与に適合する薬学的組成物には、水性および非水性の無菌注射用溶液または懸濁液が含まれ、これらは、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および対象の血液と実質的に等張にする組成物を示す溶質を含み得る。そのような組成物中に存在し得る他の成分には、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、および植物油が含まれる。非経口投与に適合する組成物は、単回用量または複数回用量用の容器、例えば、密封したアンプルおよびバイアル中に存在し得、使用直前に、無菌担体の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管され得る。即時調製注射溶液および懸濁液は、無菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。本発明の非経口剤形を提供するために使用することができる好適なビヒクルは、当業者にはよく知られている。例には、注射用蒸留水ＵＳＰ、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸化リンガー注射液等の水性ビヒクル；エトリアルコール、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコール等の水混和性ビヒクル；ならびにトウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジル等の非水性ビヒクルが含まれる。
【０２３７】
治療有効量の選択は、当業者に知られているいくつかの要因を考慮して、専門家により決定される。そのような要因には、阻害剤の特定の形態、ならびに薬学的組成物の規制認可を得る際に一般的に使用される一般開発手続き（ｕｓｕａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）中に確立されるバイオアベイラビリティ、代謝、および半減期等のその薬物動態パラメーターが含まれる。用量を考慮する際のさらなる要因には、治療される状態もしくは疾患、または正常な個体において達成される利益、患者の体重、投与経路（投与が急性または慢性的であるかどうかに関わらず）、併用する薬剤、ならびに投与される薬剤の効力に影響を与えることがよく知られている他の要因が含まれる。したがって、正確な投薬量は、当業者の判断および各患者の状況に従って、ならびに標準的な臨床技術に従って決定されるべきである。
【０２３８】
ある特定の実施形態において、患者は、ｈＥＳ−ＭＳＣ治療における凍結保存成分に関連した任意の可能なＤＭＳＯの注入毒性を最小限に抑えるために、解熱剤および／または抗ヒスタミン剤（アセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミン塩酸塩）で治療される。
【０２３９】
５．１２  Ｔ−ＭＳＣ馴化培地および誘導体
本明細書に開示されるＴ−ＭＳＣは、免疫抑制のある馴化培地、すなわち、複数の１つ以上のタイプの免疫細胞への検出可能な免疫抑制効果を有する幹細胞によって分泌され、排出される１つ以上の生体分子を含む培地を生成するために使用することができる。様々な実施形態において、馴化培地は、Ｔ−ＭＳＣが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日、またはそれ以上の間、増殖している培地を含む。他の実施形態において、馴化培地には、Ｔ−ＭＳＣが、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のコンフルエンス、または１００％のコンフルエンスまで増殖した培地を含む。そのような馴化培地は、Ｔ−ＭＳＣの別の集団、または別の種類の幹細胞の培養を補助するために使用することができる。別の実施形態において、馴化培地には、Ｔ−ＭＳＣが成体細胞型に分化した培地を含む。別の実施形態において、本発明の馴化培地には、Ｔ−ＭＳＣおよび非Ｔ−ＭＳＣを培養した培地を含む。
【０２４０】
したがって、一実施形態において、本発明は、Ｔ−ＭＳＣの培養液からの培養培地、細胞溶解物、および／または他の誘導体を含む組成物を提供し、Ｔ−ＭＳＣは、（ａ）基質に付着し、（ｂ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、ＩＬ−１０、ＴＧＦｂ２、ＨＧＦを発現するが、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、および／またはＲＡＧＥを発現しない。別の特定の実施形態において、この組成物は、抗増殖剤、例えば、抗ＭＩＰ−１αまたは抗ＭＩＰ−１β抗体を含む。
【０２４１】
骨髄造血幹細胞、末梢血造血幹細胞、および臍帯造血幹細胞の拡張のための支持細胞として本明細書に記載されるＴ−ＭＳＣを使用する方法が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、開示される方法に適したＴ−ＭＳＣは、Ｓｔｒｏ−３、Ｓｔｒｏ−１、ＤＬ１、および／またはネスチンを発現する。また、Ｔ−ＭＳＣは、本明細書の項５．５に開示される方法を使用して、高レベルのＳｔｒｏ−３、Ｓｔｒｏ−１、ＤＬ１、ネスチン、またはＦｒｉｚｚｌｅを発現するように修飾され得るか、または遺伝子操作され得る。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、骨髄造血幹細胞、末梢血造血幹細胞、および／または臍帯造血幹細胞と共培養される。ある実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、間葉系間質細胞である。本明細書に開示されるＴ−ＭＳＣと骨髄造血幹細胞との共培養が、本明細書に提供される。本明細書に記載されるＴ−ＭＳＣと臍帯造血幹細胞との共培養が、本明細書に提供される。
【０２４２】
５．１３  Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ由来の系統を含むマトリックス
本発明は、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬを含むマトリックス、ヒドロゲル、足場等をさらに含む。Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、天然のマトリックス、例えば、生体材料上に播種することができる。ある特定の実施形態において、足場は、三次元印刷によって得られる。Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、例えば、注射に適したヒドロゲル溶液中に懸濁することができる。そのような組成物に適したヒドロゲルには、ＲＡＤ１６等の自己集合ペプチドを含む。一実施形態において、細胞を含むヒドロゲル溶液を、例えば、型において硬化させて、移植のためにその中に分散させた細胞を有するマトリックスを形成することができる。また、そのようなマトリックスにおけるＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、細胞が移植前に有糸分裂で拡張するように培養することができる。ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合、または水素結合によって架橋して、三次元開放格子構造を作製し、これが水分子を取り込んで、ゲルを形成する有機ポリマー（天然または合成）である。ヒドロゲル形成材料には、アルギン酸およびその塩等の多糖体、ペプチド、ポリホスファジン、およびポリアクリラート（これらはイオンによって架橋される）、またはポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロック共重合体等のブロックポリマー（それぞれ温度またはｐＨによって架橋される）を含む。いくつかの実施形態において、本発明のヒドロゲルまたはマトリックスは、生体分解性である。本発明のいくつかの実施形態において、製剤には、インサイチューで重合可能なゲルを含む（例えば、米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号、Ａｎｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，７８（１−３）：１９９−２０９（２００２）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４（２２）：３９６９−８０（２００３）を参照のこと。
【０２４３】
いくつかの実施形態において、このポリマーは、水、緩衝塩溶液、または水性アルコール溶液等の水溶液に少なくとも部分的に可溶性があり、荷電側基を有するか、またはその一価のイオン性塩である。陽イオンと反応することができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、およびスルホン化ポリスチレン等のスルホン化ポリマーである。また、アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーまたはポリマーとの反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーを使用することもできる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化された（好ましくはフッ素化された）アルコール基、フェノール性ＯＨ基、および酸性ＯＨ基である。
【０２４４】
Ｔ−ＭＳＣ、Ｔ−ＭＳＣ−ＤＬ、および／またはその共培養は、三次元フレームワークまたは足場上に播種し、インビボで移植することができる。そのようなフレームワークは、任意の１つ以上の増殖因子、細胞、薬物、または組織形成を刺激するか、またはそうでなければ、本発明の実施を増強するか、もしくは改善するその他の成分と組み合わせて移植することができる。
【０２４５】
本発明に使用することができる足場の例には、不織マット、多孔性発泡体、または自己集合ペプチドを含む。不織マットは、グリコール酸および乳酸の合成の吸収性コポリマー（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ，Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．）から成る繊維を使用して形成することができる。例えば、ポリ（ｓ−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから成り、フリーズドライまたは凍結乾燥（例えば、米国特許第６，３５５，６９９号）等のプロセスによって形成される発泡体を、足場としても使用することができる。
【０２４６】
また、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、モノ−、ジ−、トリ−、アルファ−トリ−、ベータ−トリ−、およびテトラ−リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、マグネシウムカルシウムホスフェート、ＢＩＯＧＬＡＳＳ（登録商標）等の生物活性ガラス、ならびにこれらの混合物を含むが、これらに限定されない、生物学的に許容されるセラミック材料上に播種または接触させることができる。現在市販の多孔性生体適合性セラミック材料には、ＳＵＲＧＩＢＯＮＥ（登録商標）（ＣａｎＭｅｄｉｃａ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｎａｄａ）、ＥＮＤＯＢＯＮ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｆｒａｎｃｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＣＥＲＯＳ（登録商標）（Ｍａｔｈｙｓ，ＡＧ，Ｂｅｔｔｌａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ならびにＨＥＡＬＯＳ（商標）（ＤｅＰｕｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｙｎｈａｍ，Ｍａｓｓ．）およびＶＩＴＯＳＳ（登録商標）、ＲＨＡＫＯＳＳ（商標）、およびＣＯＲＴＯＳＳ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｐａ．）等のミネラル化コラーゲン骨移植製品を含む。フレームワークは、天然および／または合成材料の混合物、混合または複合体であり得る。
【０２４７】
別の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくは混合物等の生体吸収性材料、またはヒアルロン酸から作製されるマルチフィラメント糸から成るフェルト上に播種または接触させることができる。
【０２４８】
Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、別の実施形態において、複合構造体であり得る発泡体足場を上に播種することができる。そのような発泡体足場は、修復、置換、または増大される本体の一部の特異的な構造のもの等の有用な形状に成形することができる。いくつかの実施形態において、フレームワークは、例えば、細胞の接着を増強するために、本発明の細胞の接種より前に、０．１Ｍ  酢酸で処理し、続いて、ポリリシン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベーションする。マトリックスの外面は、マトリックスを血漿コーティングすること、または１つ以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン４硫酸塩、コンドロイチン６硫酸塩、デルマタン硫酸塩、ケラチン硫酸塩等）、細胞マトリックス、および／もしくはゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、および植物ゴム等であるが、これらに限定されない他の材料の添加により、細胞の接着もしくは増殖、および組織の分化を改善するように修飾することができる。
【０２４９】
いくつかの実施形態において、足場は、それに非血栓形成性を与える材料を含むか、またはそれで処理される。また、これらの処理および材料は、内皮増殖、遊走、および細胞外マトリックス沈着を促進および持続し得る。これらの材料および処理の例には、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲン等の基底膜タンパク質、ＥＰＴＦＥ等の合成材料、ならびにＰＵＲＳＰＡＮ（商標）（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．）等のセグメント型ポリウレタンウレアシリコーンを含むが、これらに限定されない。また、足場は、ヘパリン等の抗血栓剤を含むことができ、足場は、幹細胞で播種する前に、表面荷電を変化させるために処理する（例えば、血漿でコーティングする）ことができる。
【０２５０】
５．１４  不死化したＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬ
哺乳動物Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、増殖促進タンパク質の生成および／または活性を外部因子によって関連付けられるように、増殖促進遺伝子、すなわち適切な条件下でトランスフェクト細胞の増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む任意の好適なベクターでのトランスフェクションによって条件付きで不死化することができる。好ましい実施形態において、増殖促進遺伝子は、ｖ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ポリオーマラージＴ抗原、Ｅ１ａアデノウイルス、またはヒト乳頭腫ウイルスのＥ７タンパク質等であるが、これらに限定されない、腫瘍遺伝子である。
【０２５１】
増殖促進タンパク質の外部調節は、外部から調節可能なプロモーター、例えば、その活性を、例えば、トランスフェクト細胞の温度または細胞と接触する培地の組成を修飾することによって制御することができるプロモーターの制御下に増殖促進遺伝子を置くことによって達成することができる。一実施形態において、テトラサイクリン（ｔｅｔ）で制御される遺伝子発現系を使用することができる（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１，１９９２、Ｈｏｓｈｉｍａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５１８−１５２３，１９９６を参照のこと）。Ｔｅｔの非存在下では、このベクター内のｔｅｔで制御されるトランス活性化因子（ｔＴＡ）は、ｔｅｔオペレーター配列に融合されたヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターであるｐｈＣＭＶ＊−１からの転写を強く活性化する。ｔＴＡは、大腸菌のトランスポゾン−１０由来のｔｅｔ耐性オペロンのリプレッサー（ｔｅｔＲ）と単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６の酸性ドメインとの融合タンパク質である。ｔｅｔの低く無毒な濃度（例えば、０．０１〜１．０μｇ／ｍＬ）では、ｔＴＡによるトランス活性化をほぼ完全に消滅させる。
【０２５２】
一実施形態において、ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、薬物耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。細菌ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）は、本発明に使用してもよい１つのそのようなマーカーである。ｎｅｏＲを有する細胞は、例えば、成長培地に対する１００〜２００μｇ／ｍＬのＧ４１８の添加等の当業者に知られている手段によって選択してもよい。
【０２５３】
トランスフェクションは、レトロウイルスの感染を含むが、これに限定されない、当業者に知られている様々な手段のいずれかによって達成することができる。一般に、細胞培養物は、ベクターのための産生細胞株から収集される馴化培地およびＮ２補充を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２との混合物とともにインキュベーションすることによってトランスフェクトしてもよい。例えば、上記のように調製された幹細胞培養物を、例えば、１体積の馴化培地と２体積のＮ２補充を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２における約２０時間のインキュベーションによって、インビトロにて５日後に感染させてもよい。次いで、選択可能なマーカーを有するトランスフェクト細胞を上記のように選択してもよい。
【０２５４】
トランスフェクション後、培養を、増殖可能な表面上で継代して、例えば、２４時間で細胞の少なくとも３０％を２倍にさせる。好ましくは、この基質は、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）および／またはラミニン（１０μｇ／ｍＬ）でコーティングした組織培養プラスチックからなるポリオルニチン／ラミニン基質、ポリリシン／ラミニン基質、またはフィブロネクチンで処理した表面である。次いで、培養物に、成長培地を３〜４日ごとに供給し、これには、１つ以上の増殖増強因子を補充しても、補充しなくてもよい。増殖増強因子は、培養が５０％未満コンフルエントである場合、成長培地に添加してもよい。
【０２５５】
条件付きで不死化したＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬ細胞株は、８０〜９５％コンフルエントのときに、トリプシン処理等によって、標準的な技術を使用して継代することができる。およそ第２０継代まで、いくつかの実施形態において、（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞に対するＧ４１８の添加によって）選択を維持することが有益である。細胞はまた、長期貯蔵のために液体窒素中で凍結させてもよい。
【０２５６】
クローン細胞株は、上記のように調製した条件付きで不死化したヒトＴ−ＭＳＣ細胞株から単離することができる。一般に、そのようなクローン細胞株は、例えば、限外希釈またはクローニング環を使用することによる、標準的な技術を使用して単離して、拡張させてもよい。クローン細胞株は、一般に、上記のように供給して、継代してもよい。
【０２５７】
条件付きで不死化したヒトＴ−ＭＳＣ細胞株は、クローンであってもよいが、必要ではなく、一般に、分化を促進する培養条件下で、増殖促進タンパク質の生成および／または活性を抑制することによって、分化するように誘導してもよい。例えば、増殖促進タンパク質をコードする遺伝子が、外部から調節可能なプロモーターの制御下である場合、条件、例えば、培地の温度または組成物を修正して、増殖を促進する遺伝子の転写を抑制してもよい。上で議論されたテトラサイクリンで制御される遺伝子発現系については、テトラサイクリンを添加して、増殖促進遺伝子の転写を抑制することによって、分化を達成することができる。一般に、分化を開始するためには、４〜５日間で１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンで十分である。さらに分化を促進するために、さらなる薬剤を成長培地に含めてもよい。
【０２５８】
５．１５  アッセイ
Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、幹細胞の増殖、拡張、および／または分化における培養条件、環境要因、分子（例えば、生体分子、小無機分子等）等の影響を、そのような条件に曝露されないＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬと比較して決定するためにアッセイで使用することができる。
【０２５９】
好ましい実施形態において、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬは、分子との接触による増殖、拡張、または分化の変化についてアッセイされる。一実施形態において、例えば、本発明は、複数のＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの増殖を調整する化合物を特定する方法を提供し、本方法は、複数のＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬを増殖可能な条件下でこの化合物と接触させることを含み、この化合物がこの化合物と接触されない複数のＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬと比較して、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの増殖の検出可能な変化を生じさせる場合、この化合物は、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの増殖を調整する化合物として特定される。特定の実施形態において、この化合物は、増殖の阻害剤として特定される。別の特定の実施形態において、この化合物は、増殖のエンハンサーとして特定される。
【０２６０】
別の実施形態において、本発明は、複数のＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの拡張を調整する化合物を特定する方法を提供し、本方法は、複数のＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬを拡張可能な条件下でこの化合物と接触させることを含み、この化合物がこの化合物と接触されない複数のＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬと比較して、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの拡張の検出可能な変化を生じさせる場合、この化合物は、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの拡張を調整する化合物として特定される。特定の実施形態において、化合物は、拡張の阻害剤として特定される。別の特定の実施形態において、化合物は、拡張のエンハンサーとして特定される。
【０２６１】
別の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの分化を調整する化合物を特定する方法が本明細書に開示され、本方法は、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬを分化可能な条件下でこの化合物と接触させることを含み、この化合物がこの化合物と接触されないＴ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬと比較して、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの分化の検出可能な変化を生じさせる場合、この化合物は、Ｔ−ＭＳＣおよび／またはＴ−ＭＳＣ−ＤＬの増殖を調整する化合物として特定される。特定の実施形態において、化合物は、分化の阻害剤として特定される。別の特定の実施形態において、化合物は、分化のエンハンサーとして特定される。
【０２６２】
５．１６  ヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の治療的使用
骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）は、多発性硬化症（ＭＳ）を含むＴ細胞関連自己免疫疾患のための細胞ベースの療法として使用されているが、制限される源、不安定な質、成体組織由来の細胞を使用することのバイオセーフティーな懸念により、治療補助剤としてのそれらの使用は制限される。
【０２６３】
本明細書に記載される胚性幹細胞から間葉系幹細胞を発生させるための新規の方法、および本方法から発生される新規のＴ−ＭＳＣは、Ｔ細胞関連自己免疫疾患、特に多発性硬化症のための新しい治療法を提供する。
【０２６４】
ある特定の実施形態において、ＥＡＥを発症する前のマウスに与えられたＴ−ＭＳＣは、これらの動物の疾患スコアを著しく減じた。スコアの減少は、中枢神経系において、脱髄の減少、Ｔ細胞の浸潤、およびミクログリア応答、ならびに免疫細胞増殖の抑制、インビトロでの分化が同時に起こった。
【０２６５】
ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣによる治療後、疾患発症後のＥＡＥマウスにおいて、疾患スコアの逐次的減少が、観察された。ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣは、疾患に対する予防と治療の両方の効果を有する。
【０２６６】
ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣの免疫抑制活性は、照射を受けたＴ−ＭＳＣとして疾患に対する予防効果の主要因であり、損傷したミエリンを置き換える可能性が低く、疾患スコアを減少させるのに有効であった。一実施形態において、照射は、Ｔ−ＭＳＣの生存期間を短縮しない。
【０２６７】
ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣの治療効果は、免疫抑制ならびに神経修復および再生を含む。
【０２６８】
ある特定の実施形態において、Ｔ−ＭＳＣで処置したＥＡＥマウスは、それらの中枢神経系の炎症性Ｔ細胞が非常に少なく、脊髄を浸潤するＴ細胞が少ない。Ｔ−ＭＳＣは、炎症性Ｔ細胞によって生じた損傷および症状を軽減することができ、それらをすべてのＴ細胞関連の自己免疫疾患の治療および予防に有用にする。また、Ｔ−ＭＳＣは、脱髄も減少させた。
【０２６９】
Ｔ−ＭＳＣの特性はすべて、骨髄由来の間葉系幹細胞を用いて得られた結果と好対照である。ＢＭ−ＭＳＣのみが、インビトロで低用量での抗ＣＤ３刺激に応答してマウスＴ細胞増殖を抑制し、Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞のＣＮＳへの浸潤も増強した。自己反応性エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞は、多発性硬化症、クローン病、およびリウマチ性関節炎を含むいくつかの自己免疫障害の病因と関連がある。これらのＣＤ４＋Ｔ細胞には、Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞を含む。ＥＡＥマウスにおけるヒトＢＭ−ＭＳＣのごく穏やかなまたは無視できるほど小さい影響がある（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８ａ、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５、Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。最近の報告では、ヒト臍帯由来のＭＳＣで処置したＥＡＥマウスにおいてわずかに３．５〜３．０の疾患スコアの減少を示した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。本明細書の結果およびこれらの研究からのものは、開示されるＴ−ＭＳＣの新規性および有用性を強調する。
【０２７０】
さらに、ＢＭ−ＭＳＣおよびＴ−ＭＳＣは、非常に類似した世界的な転写プロファイルを有するが、前および抗炎症性因子を特異的に発現する。それらの中で、ＩＬ−６は、Ｔ−ＭＳＣよりもＢＭ−ＭＳＣにおいてはるかに高いレベルで発現する。さらに、ＢＭ−ＭＳＣにおけるＩＬ−６発現は、インビトロでのＩＦＮγ刺激時に２倍であったが、Ｔ−ＭＳＣにおいては低いままであった。
【０２７１】
ＩＬ−６は、炎症の発症および解消を含む造血／免疫細胞と間質細胞との間のクロストークに関与する、多面的サイトカインである。ＩＬ−６は、Ｔｈ１７細胞の分化および機能を促進することができる（Ｄｏｎｇ，２００８）。ＭＳ患者からの血液中および脳組織中（Ｐａｔａｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ならびに高齢のヒトにおける血清中（Ｓｅｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）の単核細胞内のＩＬ−６のレベルが上昇する。Ｔ細胞プライミング時にＩＬ−６受容体αを欠いているマウスは、ＥＡＥに耐性を示す（Ｌｅｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＣＮＳにおけるＩＬ−６の部位特異的な生成は、ＥＡＥにおける炎症性応答を再標的化し、増強することができる（Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）が、ＩＬ−６中和抗体は、ＥＡＥマウスにおける症状を軽減させることができる（Ｇｉｊｂｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。したがって、ＩＬ−６は、ＭＳの処置に対して有望な治療標的になる。
【０２７２】
末梢のＴ細胞活性の免疫調節ならびに神経系細胞の再生および修復は、ＭＳおよびＥＡＥにおけるＭＳＣの治療効果の広く認識された様式である（Ａｌ  Ｊｕｍａｈ  ａｎｄ  Ａｂｕｍａｒｅｅ，２０１２、Ａｕｌｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｍｏｒａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。しかしながら、ＭＳにおける長期の機能的な神経再生および持続した疾患の緩解は、損傷した血液脳関門および血液脊髄関門の修復を必要とする（Ｃｏｒｒｅａｌｅ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａ，２００７、Ｍｉｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。言い換えれば、ＭＳは、炎症性のある神経変性の血管疾患であり、効果的な治療は、３つの要素すべてを標的とする必要がある。
【０２７３】
Ｔ−ＭＳＣの特性は、それらをＴ細胞関連自己免疫疾患、特に多発性硬化症の治療に比類なく好適にする。特に、Ｔ−ＭＳＣは、ＥＡＥマウスの疾患スコアを減少させることができるが、脱髄を減少させ、Ｔｈ１およびＴｈ１７の増殖も減少させて、低発現のＩＬ−６を有する。これらの後者の２つの特性は、それらをその他のＴ細胞関連自己免疫疾患を治療するのを好適にする。さらに、血液脳関門および血液脊髄関門を横断するＴ−ＭＳＣの能力は、多発性硬化症、および中枢神経系に関連するその他の自己免疫疾患の治療および予防法としてそれらを優れたものにする。
【０２７４】
本明細書に提供される一実施形態は、Ｔ細胞関連自己免疫疾患を治療または予防する方法であり、本方法は、Ｔ−ＭＳＣを含む治療有効量の溶液、細胞培養物、または薬学的調製物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。Ｔ細胞関連自己免疫疾患には、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、移植片対宿主病、全身性紅斑性狼瘡、およびリウマチ性関節炎を含むが、これらに限定されない。対象は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。溶液、細胞培養物、または薬学的調製物は、照射されたまたは照射されていないＴ−ＭＳＣを含み得る。溶液、細胞培養物、または薬学的調製物は、好ましくは、注射によって投与される。
【０２７５】
多発性硬化症は、４つのサブタイプ：再発／寛解型、二次進行型、一次進行型、および進行再発型に分類される。再発／寛解型のサブタイプは、予測不可能な再発、それに続いて、長期間の緩解を特徴とする。二次進行型ＭＳは、再発／寛解型ＭＳから始まり、緩解の期間のない進行性の低下を有する個体において起こる場合がある。一次進行型ＭＳは、それらの初期症状後に決して緩解することのない少数の個人を説明する。極めてまれなサブタイプである進行再発型を有する個人は、着実に神経減少を伴い、急性発作に悩まされる。
【０２７６】
多発性硬化症の治療または予防を必要とする対象に、多発性硬化症を治療または予防するための方法が、本明細書に提供され、本方法は、前述の段落に記載されるＴ−ＭＳＣを含む治療有効量の溶液、細胞培養物、または薬学的調製物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。多発性硬化症は、再発／寛解型多発性硬化症、進行／再発型多発性硬化症、一次多発性硬化症、または二次多発性硬化症であり得る。対象は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。溶液、細胞培養物、または薬学的調製物は、照射されたまたは照射されていないＴ−ＭＳＣを含み得る。溶液、細胞培養物、または薬学的調製物は、好ましくは、注射によって投与される。
【０２７７】
多発性硬化症は、足の感覚障害、視神経機能障害、錐体路障害、膀胱機能障害、大腸機能障害、性機能障害、運動失調、および複視の発作を含む、様々な症状が現れる。
【０２７８】
本発明のさらなる実施形態は、多発性硬化症を治療する方法であり、Ｔ−ＭＳＣを含む治療有効量の溶液、細胞培養物、または薬学的調製物を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、これらの症状のうちの少なくとも１つ、これらの症状のうちの少なくとも２つ、これらの症状のうちの少なくとも４つ、これらの症状のうちの少なくとも５つ、またはこれらの症状のすべての検出可能な改善がある。
【０２７９】
拡大能力障害状態尺度（ＥＤＳＳ）は、多発性硬化症に罹患している患者の臨床状態を評価するための最も一般的に使用される評定尺度である。それは、いくつかの別のパラメーター：体力、知覚、脳幹機能（言語および嚥下）、協調、視覚、認識、および腸／膀胱の自制に沿った障害を測定する。それは、ＭＳにおける障害の広く受け入れられている尺度であり、特に困難ではなく、行うのに時間を要しない。ＥＤＳＳは、８つの機能系（ＦＳ）における障害を定量化し、これらの各々における機能系スコア（ＦＳＳ）を神経学者が指定できるようにする（Ｋｕｒｔｚｋｅ  １９８３）。
【０２８０】
Ｋｕｒｔｚｋｅは、機能系を以下の通りに定義する：
・錐体
・小脳
・脳幹
・感覚
・腸および膀胱
・視覚
・大脳
・その他
【０２８１】
ＥＤＳＳのステップ１．０〜４．５は、十分に移動できる多発性硬化症に罹患している人々を指す。ＥＤＳＳのステップ５．０〜９．５は、歩行への障害によって定義される。各可能性のある結果の臨床的な意義は、以下の通りである：
・０．０：正常な神経学的検査
・１．０：障害なし、１つのＦＳの最小の徴候
・１．５：障害なし、７つのうちの２つのＦＳの最小の徴候
・２．０：７つのうちの１つのＦＳの最小の障害
・２．５：２つのＦＳの最小の障害
・３．０：十分に移動できるが、１つのＦＳの中等度の障害、または３つ〜４つのＦＳの軽度の障害。
・３．５：十分に移動できるが、１つのＦＳの中等度の障害および１つもしくは２つのＦＳの軽度の障害、または２つのＦＳの中等度の障害、または５つのＦＳの軽度の障害を伴う
・４．０：補助を伴わずに、相対的に重篤な障害にもかかわらず、１日約１２時間十分に移動。補助を伴わずに、５００メートル歩行可能。
・４．５：補助を伴わずに十分に移動、１日の多く、丸一日働くことができる、さもなければ、完全な活動にいくらかの制限を有するか、最小限の介助を必要とする場合がある。相対的に重篤な障害。補助を伴わずに、３００メートル歩行可能。
・５．０：補助を伴わずに、約２００メートル移動。障害は、丸一日の活動を妨げる。
・５．５：１００メートル移動、障害は、丸一日の活動を不可能にする。
・６．０：休憩を伴う、または伴わずに１００メートル歩行するのに断続的または片側の特定の補助（杖、松葉杖、または装具）が必要。
・６．５：休憩を伴わずに、２０メートル歩行するのに断続的な片側の補助（杖、松葉杖、または装具）が必要。
・７．０：補助を伴っても５メートルを越えて歩行することができない、本質的に車椅子に制限され、自分で回転して、単独で移動する、１日約１２時間車椅子で活動している。
・７．５：数歩以上進むことができない、車椅子に制限される、移動の際の補助が必要な場合がある、自分で回転するが、丸一日の活動には動力付車椅子が必要な場合がある。
・８．０：本質的にベッド、椅子、もしくは車椅子に制限されるが、１日の大半はベッドの外にいる、セルフケア機能を持つ、一般に腕の使用は有効。
・８．５：本質的１日の大半はベッドに制限される、腕の使用はいくらか有効で、いくらかのセルフケア機能を持つ。
・９．０：自分では何もできない患者、コミュニケーションをとり、食事をすることができる。
・９．５：コミュニケーションを有効にとること、または食べる／飲み込むことができない。
・１０．０：ＭＳによる死。
【０２８２】
多発性硬化症の治療を必要とする対象に、多発性硬化症を治療するための方法が、本明細書に提供され、本方法は、Ｔ−ＭＳＣを含む治療有効量の溶液、細胞培養物、または薬学的調製物を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、この対象は、少なくとも１ポイント、好ましくは少なくとも２ポイントの拡張障害状態尺度における改善を示す。
【０２８３】
フィンゴリモド、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ＩＦＮβ−１ａ、ＩＦＮ−１ｂ、グリアトリアマーアセテート、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、クラドリビン、シクロスポリン、ミトキサントロン、およびスルファサラジンが含まれるが、これらに限定されない、多発性硬化症を治療および予防するために使用される他の治療剤がある。
【０２８４】
したがって、本発明の方法は、フィンゴリモド、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ＩＦＮβ−１ａ、ＩＦＮ−１ｂ、グリアトリアマーアセテート、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、クラドリビン、シクロスポリン、ミトキサントロン、およびスルファサラジンが含まれるが、これらに限定されない、対象への１つ以上のさらなる治療剤の投与をさらに含むことができる。さらなる実施形態において、これらのさらなる治療剤は、Ｔ−ＭＳＣの前、その後、もしくはそれと同時に投与することができるか、またはＴ−ＭＳＣと共役させるか、もしくは付着させることができる。
【０２８５】
Ｔ細胞以外のＴ−ＭＳＣはまた、Ｂ細胞、樹状細胞、好中球、ＮＫ細胞、マクロファージにおける強力な抑制機能、ならびに他の炎症および免疫関連機能を有する。したがって、開示されるＴ−ＭＳＣによりすべて処置され得るＴ細胞、Ｂ細胞、炎症および／または先天性免疫関連自己免疫疾患には、円形脱毛症、強直性脊椎炎（Ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫内耳性疾患、自己免疫性リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病疱疹状皮膚炎、慢性疲労症候群免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病（Ｄｅｇｏ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋炎線維筋痛、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、ＩＩ型糖尿病、若年性関節炎、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（Ｐｏｌｙｇｌａｎｃｕｌａｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、または火傷、手術、損傷、およびアレルギーに関連する任意の急性もしくは慢性炎症が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８６】
Ｔ−ＭＳＣは、脂肪細胞、筋芽細胞、神経系列細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、および間質細胞が含まれるが、これらに限定されない、複数の細胞系列に分化することができる。Ｔ−ＭＳＣ（Ｔ−ＭＳＣ−ＤＬ）に由来するこれらの細胞は、複数の組織損傷を治療するために使用することができ、関節の治癒、腱の治癒、結合組織の治癒、神経系列組織および細胞の治癒、脂肪組織の治癒、骨の治癒、皮膚の治癒、その他の創傷の治癒、筋肉の治癒、軟骨の治癒、平滑筋の治癒、心筋の治癒、上皮組織の治癒、靱帯の治癒、間質修復等のような組織工学、組織修復、組織再生の目的で使用することができる。
【０２８７】
具体的には、Ｔ−ＭＳＣは、神経系列細胞に分化することができ、失書症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、失語症、失行症、くも膜炎、毛細血管拡張性運動失調症、注意欠陥多動性障害、聴覚処理障害、自閉症、アルコール依存症、アスペルガー症候群、双極性障害、ベル麻痺、上腕神経叢損傷、脳外傷、脳損傷、脳腫瘍、カナバン病、カプグラ（Ｃａｐｇｒａｓ）、灼熱痛、中枢痛症候群、橋中央ミエリン溶解、中心核ミオパシー、頭部障害、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、脳萎縮症、脳性巨人症、脳性麻痺、脳血管炎、頸髄狭窄症、シャルコーマリーツース病、キアリ奇形、舞踏病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、慢性疼痛、コフィンローリー症候群、昏睡、複合性局所疼痛症候群、圧迫性神経障害、先天性神経顔面神経対麻痺、皮質基底核変性、頭部動脈炎、頭蓋骨癒合症、クロイツフェルトヤコブ病、蓄積外傷疾患、クッシング症候群、巨大細胞性封入体症（ＣＩＢＤ）、サイトメガロウイルス感染、デンディーウォーカー症候群、ドゥモルシェ症候群、ドゥジュリーヌ−クルンプケ麻痺、デジェリンソッタス病、遅延睡眠期症候群、認知症、皮膚筋炎、発達性統合運動障害、糖尿病ニューロパシー、びまん性硬化症、ダウン症候群、ドラベ症候群、自律神経障害、計算力障害、書字障害、失読症、筋失調症、エンプティセラ症候群、脳炎、脳ヘルニア、脳三叉神経領域血管腫症、便失禁、てんかん、エルプ麻痺、肢端紅痛症、本態性振戦、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性痙性麻痺、熱性発作、フィッシャー症候群、フリートライヒ運動失調、線維筋痛、フォヴィル症候群、胎児性アルコール兆候、ゴーシェ病、ゲルストマン症候群、巨細胞性動脈炎、巨細胞封入疾患、球様細胞白質萎縮症、異所性灰白質、ギランバレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連ミエロパシー、ハレルフォルデンスパッツ病、頭部損傷、頭痛、片側顔面痙攣、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性多発神経炎性失調、耳帯状疱疹、帯状疱疹、ヒラヤマ症候群、全前脳症、ハンチントン病、水無脳症、水頭症、副腎皮質亢進症、低酸素症、免疫媒介性脳脊髄炎、封入体筋痛炎、色素失調症、乳児フィタン酸蓄積症、乳児レフサム病、乳児痙攣、炎症性ミオパシー、頭蓋内嚢、頭蓋内圧亢進、ジュベール症候群、Ｋａｒａｋ症候群、キーンズセイアー症候群、ケネディ病、キンスブルン症候群、クリッペルファイル症候群、クラッベ病、クーゲルベルクヴェランデル病、ラフォラ病、ランバートイートン無筋力症候群、ランドウクレフナー症候群、延髄外側（ワレンベルグ）症候群、学習障害、リー病、レノックスガストー症候群、レッシュナイハン症候群、大脳白質萎縮症、レヴィー小体認知症、脳回欠損、閉じ込め症候群、ルーゲーリッグ病（筋萎縮性側索硬化症を参照）、腰椎椎間板ヘルニア、腰部脊椎管狭窄症、ライム病−神経学的後遺症、マチャドジョセフ病（脊髄小脳失調症３型）、大脳症、大視症、巨大脳髄症、メルカーソンローゼンタール症候群、メニエール病、髄膜炎、メンケス病、異染性白質ジストロフィー、小頭症、小視症、片頭痛、ミラーフィッシャー症候群、軽度の脳卒中（一過性脳虚血発作）、ミソフォニア、ミトコンドリアミオパシー、メービウス症候群；単肢筋萎縮症；運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症を参照）、運動能力障害、モヤモヤ病、ムコ多糖症、多発梗塞性認知症、多病巣性運動ニューロパシー、多発性硬化症、多系統萎縮症、筋ジストロフィー、筋痛性脳脊髄炎、重症筋無力症、ミエリン破壊性びまん性硬化症、乳児のミオクローヌス脳障害、ミオクローヌス、ミオパシー、筋細管ミオパシー、先天性ミオトニー、ナルコレプシー、神経線維腫症、神経弛緩薬性悪性症候群、ＡＩＤＳの神経学的兆候、狼瘡の神経学的後遺症、神経ミオトニー、神経セロイドリポフスチン症、ニューロン遊走障害、神経症、ニーマンピック病、非２４時間睡眠覚醒症候群、非言語性学習障害、神経学的障害（Ｎａｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、オサリバンマクレオド症候群、後頭神経痛、潜在性脊椎閉鎖不全（Ｏｃｃｕｌｔ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｄｙｓｒａｐｈｉｓｍ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、オオタハラ症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌスミオクローヌス症候群、視神経炎、起立性低血圧症、耳硬化症、乱用症候群（ｏｖｅｒｕｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、反復視、感覚異常症、パーキンソン病、先天性パラミオトニア、腫瘍随伴症、発作性発作（ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ  ａｔｔａｃｋ）、パリーロンベルグ症候群、ペリツェウスメルツバッハー病、周期性麻痺、末梢ニューロパシー、広汎性発達障害、光性くしゃみ反射、フィタン酸蓄積症、ピック病、神経不足（ｐｉｎｃｈｅｄ  ｎｅｒｖｅ）、下垂体部腫瘍、ＰＭＧ、多発性ニューロパシー、ポリオ、多小回脳、多発性筋炎、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛（ＰＨＮ）、起立性低血圧、プラダーウィリー症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性片側顔面萎縮症、進行性多巣性白質脳症、進行性核上性麻痺、偽脳腫瘍、四肢麻痺、狂犬病、ラムゼイハント症候群Ｉ型、ラムゼイハント症候群ＩＩ型、ラムゼイハント症候群ＩＩＩ型（ラムゼイハント症候群を参照）、ラスムッセン脳炎、反射性神経血管性ジストロフィー、レフサム病、反復性ストレス損傷、下肢静止不能症候群、レトロウイルス関連ミエロパシー、レット症候群、ライ症候群、律動性運動障害、ロンベルク症候群、舞踏病、サンドホフ病、シルダー病［要曖昧さ回避］、裂脳症、感覚統合障害、中隔視神経異形成症、揺さぶられっ子症候群、帯状疱疹、シャイドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、くしゃみ症（Ｓｎａｔｉａｔｉｏｎ）、ソトス症候群、痙縮、二分脊椎、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症、分離脳、スティールリチャードソンオルスゼフスキー症候群、スティフ−パーソン症候群、脳卒中、スタージウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、脳表ヘモジデリン沈着症、シデナム舞踏病、失神、共感覚、脊髄空洞症、足根管症候群、遅発性ジスキネジー、遅発性ディスフェレニア（Ｔａｒｄｉｖｅ  ｄｙｓｐｈｒｅｎｉａ）、ターロブ嚢胞、テイサックス病、側頭動脈炎、破傷風、係留脊髄症候群、トムセン病、胸郭出口症候群、疼痛性チック、トッド麻痺、トゥレット症候群、中毒性脳症、一過性脳虚血発作、伝染性海綿状脳障害、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺、トリパノソーマ症、結節性硬化症、ウビ��オシス（Ｕｂｉｓｉｏｓｉｓ）、鋳型：単極性鬱病、フォンヒッペルリンドウ病（ＶＨＬ）、ビリウスク脳脊髄炎（ＶＥ）、ワレンベルグ症候群、ウェルドニッヒホフマン病、ウェスト症候群、むち打ち、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病が含まれるが、これらに限定されない、多くの神経疾患を治療するために使用することができる。
【０２８８】
５．１７  送達系としてのＴ−ＭＳＣの使用
本発明のＴ−ＭＳＣが血液脳関門および血液脊髄関門を横断する独特の能力を有することが示されているため、本発明のさらなる実施形態は、薬剤をＴ−ＭＳＣに接着または接合させて、複合体を形成することと、Ｔ−ＭＳＣ薬剤複合体を対象に投与することとにより、血液脳関門および／または血液脊髄関門を通じて薬剤を送達するためにＴ−ＭＳＣを使用する方法であり、Ｔ−ＭＳＣが血液脳関門および／または血液脊髄関門を横断し、薬剤を中枢神経系に送達する。Ｔ−ＭＳＣは、単一細胞、細胞培養物、溶液、または薬学的調製物の形態であり得る。薬剤には、薬物、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、および小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８９】
本発明のさらなる実施形態は、Ｔ−ＭＳＣおよびをＴ−ＭＳＣに接合または接着させる薬剤を含む、血液脳関門および／または血液脊髄関門を通じて薬剤を送達するための送達系である。
【０２９０】
血液脳関門および／または血液脊髄関門を通過する能力は、神経学的障害、多発性硬化症、癌、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、髄膜炎、脳炎、狂犬病、てんかん、認知症、ライム病、脳卒中、および筋萎縮性側索硬化症、ならびに脳および脊髄損傷が含まれるが、これらに限定されない、疾患の治療および予防に有用である。したがって、それを必要とする対象は、血液脳関門および／または血液脊髄関門に関与する疾患に罹患している、またはその疾患の危険性があり得る。したがって、本発明のさらなる実施形態は、薬剤をＴ−ＭＳＣに接着または接合させて、複合体を形成することと、Ｔ−ＭＳＣ薬剤複合体を、それを必要とする対象に投与することとにより、疾患または損傷を治療する方法であり、Ｔ−ＭＳＣが血液脳関門および／または血液脊髄関門を横断し、薬剤を中枢神経系に送達し、その薬剤が、対象の疾患または損傷の治療または予防薬として使用される。Ｔ−ＭＳＣは強力な遊走能力および浸潤能力を有するため、抗癌剤およびタンパク質を運搬する腫瘍／癌治療のための担体としても使用することができる。Ｔ−ＭＳＣは、単一細胞、細胞培養物、溶液、または薬学的調製物の形態であり得る。薬剤には、化学物質、薬物、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、非コードＲＮＡ、抗体、小分子、および／またはナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９１】
疾患の治療および予防に有用である薬剤には、抗体、抗ウイルス剤、抗真菌剤、ステロイド、化学療法薬、抗炎症薬、サイトカイン、および／または合成ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０２９２】
また、タンパク質およびペプチドは、Ｔ−ＭＳＣに接合するのに有用であり、これには、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、抗ベータアミロイドペプチド、組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、増殖因子／ホルモン、抗ＶＥＧＦペプチド、抗ＴＮＦペプチド、ＮＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−２、ＣＸ３ＣＬ１、ＧＣＶ、ＣＰＴ−１１、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−ＴＫ、カルボキシエステラーゼ、腫瘍溶解性ウイルス、ＴＳＰ−１、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳＬ、ＩＬ−１０、およびＴＧＦｂが含まれる。また、特定の受容体と結合し、これらの受容体を遮断するタンパク質およびペプチドも有用であり、Ｔ−ＭＳＣに接着させるために本発明によって企図される。
【０２９３】
また、治療的タンパク質およびペプチドをコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、血液脳関門および／または血液脊髄関門を横断して送達するためにＴ−ＭＳＣに接合させるのに有用であり得る。
【０２９４】
「抗体（複数を含む）」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖Ｆｖ抗体断片、Ｆａｂ断片、およびＦ（ａｂ’）２断片を含む。ポリクローナル抗体は、特定の抗原に対して特異的な抗体分子の異種集団であり、一方、モノクローナル抗体は、抗原内に含まれる特定のエピトープの同種集団である。モノクローナル抗体は、本発明において特に有用である。
【０２９５】
血液脳関門および／または血液脊髄関門の横断が有用である、任意の疾患に関連する経路において分子または分子の受容体の活性化、発現、および／または作用を遮断する任意の薬剤は、Ｔ−ＭＳＣに接着または接合され得る。そのような薬剤には、化学物質、植物化学物質、調剤、生物学的製剤、小有機分子、抗体、核酸、ペプチド、およびタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９６】
経路の阻害は、結合および活性化する経路内の標的分子の領域を模倣する「デコイ」分子を使用して引き起こされ得る。活性化分子は、標的分子の代わりにデコイ分子と結合し得、活性化を引き起こし得ない。
【０２９７】
阻害はまた、「支配的に干渉する」分子、または活性化分子の結合部分を保有するが、活性化ドメインを欠くようにその分子を切断するものの使用によって引き起こされ得る。これらの分子は、経路内の受容体と結合するが、効果がなく、受容体が活性化分子と結合するのを妨げる。そのようなデコイ分子および支配的に干渉する分子は、当該技術分野で知られている方法によって製造することができ、血液脳関門または血液脊髄関門を横断して送達するためにＴ−ＭＳＣに接着または接合することができる。
【０２９８】
血液脳および／または血液脊髄関門を横断する薬物を送達するための方法はまた、化学物質、抗体、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない、診断用薬にも有用である。診断のために有用であるようにそのような薬剤は、視覚化および／または定量化する手段を有さなければならない。そのような手段には、蛍光発光、バイオマーカー、染色、放射性アイソタイプ、および／またはナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９９】
そのような送達するための方法および送達系は、神経学的障害、多発性硬化症、癌、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、髄膜炎、脳炎、狂犬病、てんかん、認知症、ライム病、脳卒中、および筋萎縮性側索硬化症、ならびに脳および脊髄損傷の診断に有用であり得る。したがって、本発明のさらなる実施形態は、薬剤をＴ−ＭＳＣに接着または接合させて、複合体を形成することと、Ｔ−ＭＳＣ薬剤複合体を疾患が疑わしい対象に投与することとにより、疾患または損傷を診断する方法であり、Ｔ−ＭＳＣが血液脳関門および／または血液脊髄関門を横断し、薬剤を中枢神経系に送達する。Ｔ−ＭＳＣは、単一細胞、細胞培養物、溶液、または薬学的調製物の形態であり得る。薬剤には、薬物、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、および小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０３００】
どのような種類であろうと、治療、予防、または診断のためであろうとも、薬剤は、合成細胞外マトリックス、アルギン酸−ポリ−Ｌ−リシンの封入法および／または容器を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の方法によって、Ｔ−ＭＳＣに接合または接着され得る。
【０３０１】
ある特定の実施形態において、工業レベルの製造での大規模な生成が、本開示に含まれ、それらの方法は、当該技術分野でよく知られている。ある特定の実施形態において、大規模な生成には、Ｈｙｐｅｒ−ＳＴＡＣＫの２Ｄ培養系および／またはマイクロキャリアの３Ｄバイオリアクターの使用を含む。
【実施例】
【０３０２】
実施例１．Ｔ−ＭＳＣの派生
材料および方法
以下の試薬および材料は、下述の供給源から得られた：
特注のｍＴｅＳＲ１倍地：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．
ＢＭＰ４：Ｓｔｅｍｇｅｎｔまたはその他の販売会社
ＳＢ４３１５４２：Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌまたはその他の販売会社
Ａ８３−０１：Ｓｔｅｍｇｅｎｔまたはその他の販売会社
ＡＬＫ５阻害剤：Ｓｔｅｍｇｅｎｔまたはその他の販売会社
ＤＭＥＭ／Ｆ１２：ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
アルファ−ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
ウシ胎仔血清：ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはその他の販売会社
【０３０３】
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｒｅから得られたＣＴ２  ｈＥＳＣ株を、フィーダーとして照射を受けたマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）において２継代の間培養した。次いで、ｈＥＳＣを、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でコーティングしたプレート上で分裂し、ｍＴｅＳＲ１（Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中で培養した。ＥＳＩ−０１７、ＥＳＩ−０５１、ＥＳＩ−０５３、ＥＳＩ−０４９、およびＥＳＩ−３５ヒト胚性幹細胞は、ＢｉｏＴｉｍｅ，Ｉｎｃ．（ＣＡ）から購入した。
【０３０４】
Ｔ−ＭＳＣの派生
図１に示されるように、約８０％のコンフルエンシーで、マトリゲルコーティングしたプレート上でｈＥＳＣを、１ｍｇ／ｍｌのディスパーゼで５〜１０分間消化した。次いで、この細胞をｍＴＥＳＲ１培地で１回洗浄し、マトリゲルコーティングしたプレート上で小集団または単一細胞に分裂させ、ｍＴｅＳＲ１中で１２時間培養した。次いで、培養培地を、ＢＭＰ４（２〜１００ｎｇ／ｍｌ）、または任意にＡ８３−０１（０．１〜１μＭ）を含むトロホブラスト形成培地に置き換えた。４８〜７２時間培養した後、細胞は、ｈＥＳＣ様形態から、変化が少ない拡大した細胞サイズ、小核／細胞質ゾルの比、および拡散した細胞境界を特徴とするトロホブラスト様形態に変更した。細胞を、Ｔｒｙｐ−ＬＥで消化させ、ＭＳＣ成長培地（２０％  ウシ胎仔血清および非必須アミノ酸を含むアルファ−ＭＥＭ）で洗浄した。次いで、細胞を、５，０００個の細胞／ｃｍ２の密度でマトリゲルコーティングしたプレート上で播種した。培地は、２４時間後に交換し、３〜４日ごとに交換した。さらに６日後、細胞を、典型的なＭＳＣの形態と同様のスピンドル様細胞に分化した。２日目のトロホブラストの形態を図２Ａに示し、５日目のプレＴ−ＭＳＣの形態を図２Ｂに示し、Ｔ−ＭＳＣの形態を図２Ｃに示す。
【０３０５】
ＨＢ−ＭＳＣの派生
前述のように、ＣＴ２  ｈＥＳＣ細胞をＥＢ細胞に分化し、次いで、ＨＢが富化された（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７））。マトリゲルプレート上で５０〜８０％コンフルエントのｈＥＣ細胞を、ディスパーゼ（１ｍｇ／ｍｌ、５〜１０分間）で消化し、次いで、ＥＢ形成基底培地、ＨＰＧＭ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、またはＳＴＥＭＬＩＮＥ  Ｉ／ＩＩ造血幹細胞拡張培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、またはＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）、または１０％  ＦＢＳを含むＩＭＤＭ、または１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＤＭ／Ｆ１２で洗浄した。次いで、細胞を、約２〜３００万個の細胞／ｍｌの極低密度のプレート上で、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）で補充したＥＢ形成培地中で４８時間培養した。４８時間後、この培養培地の半分を、新たなＥＢ形成培地＋２５〜５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと入れ替えた。
【０３０６】
４日後、培地中で形成されたＥＢ細胞を収穫し、３７℃で２〜３分間、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で単一細胞に解離させた。細胞を洗浄し、ＥＢ形成基底培地中で１〜５００万個の細胞／ｍｌで再懸濁した。次いで、単一細胞再懸濁液を、血管芽細胞成長培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて１：１０で混合した。
【０３０７】
芽細胞成長培地（ＢＧＭ）は以下の通りに作製した：１００ｍｌの無血清メチルセルロースＣＦＵ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈ４４３６またはＨ４５３６）に、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、および５０ｎｇ／ｍｌになるまでＦＬＴ３−リガンド、２０〜５０ｎｇ／ｍｌになるまでｂＦＧＦ、１ｍｌのＥＸ−ＣＹＴＥ成長増強培地サプリメント、および１ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒａｐを添加し、よく混ぜ合わせる。
【０３０８】
この混合物をボルテックスし、１６Ｇ針を通過させることによって、超低プレート上で播種し、３７℃で５〜９日間、５％  ＣＯ２で培養した。
【０３０９】
次いで、単一細胞を、１）アルファ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１０〜２０％  ＦＢＳ、または２）１０〜２０％  ＫＯＳＲ  アルファ−ＭＥＭ、３）１０〜２０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ高グルコース、または４）１０〜２０％  ＫＯＳＲ  ＤＭＥＭ高グルコースを含むＭＳＣ培地中で再懸濁し、マトリゲル、ゼラチン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、またはコラーゲンＩのいずれかでコーティングしたプレート上で１００〜５，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で培養した。培地は、２４時間後に交換し、２〜４日ごとに新しくした。６〜１２日後、細胞は、典型的なＭＳＣと同様のスピンドル様細胞に徐々に分化した。
【０３１０】
ＳＢ４３１５４２によるＭＳＣの派生
この方法は、前に公開されていた（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０３１１】
結果
この方法は、優れた効率、収率、および純度を有するＴ−ＭＳＣを生成したことが見出された。図１の下パネルに示されるように、１０日目に、Ｔ−ＭＳＣは、既に、１０倍の細胞数の増加を有する９０％超の純度のＭＳＣを生成したのに対して、他の方法は、いかなるＭＳＣも有さないか、または非常に低い純度のＭＳＣしか有さなかった。２０日目に、Ｔ−ＭＳＣは、既に、９９％超の純度のＭＳＣにより３０００倍の拡張を有したのに対して、他の方法は、最大でも２０倍しか拡張しなかった。３０日目には、１０万個のｈＥＳＣは、５００億個のＴ−ＭＳＣを生成した、つまり、元のｈＥＳＣの５００，０００倍の拡張であったのに対して、他の方法は、最大でも３０００２０倍しか拡張しなかった。
【０３１２】
実施例２．Ｔ−ＭＳＣ細胞の特徴付け
実施例１において得られたＴ−ＭＳＣ細胞を、フローサイトメトリー免疫蛍光染色を用いてさらに分析した。
【０３１３】
材料および方法
Ｔ−ＭＳＣを特徴付けるために、フローサイトメトリー染色を使用した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中２％  ＢＳＡでブロックし、製造業者の取扱説明書に従って、様々な細胞表面マーカーＴｒｏｐ−２（Ｔｒｐ−２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−Ｇ（ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する抗体で染色した。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター上でデータを収集した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて、取得後の分析を行った。
【０３１４】
結果
２日目のトロホブラスト、５日目のプレＴ−ＭＳＣ、および９日目のＴ−ＭＳＣから得られた接着細胞をＣＤ７３およびＴｒｏｐ−２で染色した。トロホブラスト細胞は、高レベルのＴｒｏｐ−２（９５％超）のみを発現し、ＣＤ７３は１％未満であり（図３Ａ）、５日目に、プレＴ−ＭＳＣはＴｒｏｐ−２およびＣＤ７３の両方を発現する細胞を５０％超、ＣＤ７３のみを発現する細胞を４０％有し（図３Ｂ）、ｈＥＳＣ分化から９日目に、Ｔ−ＭＳＣは、Ｔｒｏｐ−２を発現する細胞を１％未満、ＣＤ７３のみ発現する細胞を９９％有した（図３Ｃ）。
【０３１５】
複数の細胞表面マーカーのＦＡＣＳ染色によるＴ−ＭＳＣのさらなる特徴付けは、Ｔ−ＭＳＣが３％未満のＴｒｏｐ−２、１％未満のＣＤ３１、ＣＤ３４、  ９９％超のＣＤ７３、９５％超のＣＤ９０、９０％超のＣＤ１０５、９９％超のＣＤ４４、および８０％超のＣＤ２９を発現することを示す（図４Ａ〜Ｈ）。
【０３１６】
実施例３．Ｔ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣよりもインビトロでのＴ細胞機能においてより強力な阻害を有する
インビトロでＴ細胞増殖を阻害し、続いて、抗原刺激するそれらの能力について、ｈＥｓ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣが比較された。
【０３１７】
材料および方法
ＢＭ−ＭＳＣの培養
ＢＭ−ＭＳＣは、ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）に由来するか、ＡｌｌＣｅｌｌｓ、Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ）およびＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＢＭＭＮＣから得られた。派生のために、ＢＭＭＮＣを解凍し、ＭＥＭ＋２０％  ＦＢＳ中で、組織培養用プラスチック皿上で播種した。細胞を収穫し、３，０００〜５，０００個の細胞／ｃｍ２で再播種した場合、接着細胞は、開始から４〜５日以内に出現し始め、約１０〜１２日目まで３日おきに供給した。
【０３１８】
Ｔ細胞増殖のためのインビトロアッセイは、マウス末梢リンパ節から単離されたリンパ球を使用して行われた。これらのリンパ球を、５μＭのカルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識化し、それらの娘細胞中のＣＦＳＥ希釈を３７℃で１０分間モニタリングすることによって、それらの増殖を追跡した。１０，０００個のＴ−ＭＳＣまたはＢＭ−ＭＳＣを、９６ウェルプレート中でウェルあたり１００，０００個のリンパ球と混合し、増殖のために、プレート結合抗ＣＤ３（０．３、１μｇ／ｍｌで）および可溶性抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ）で細胞を刺激した。細胞を刺激から３日後に収集し、続いて、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ）でＦＡＣＳ染色を行った。ＣＦＳＥ希釈はそれぞれ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞にゲートをかけた。
【０３１９】
結果
マウスリンパ球を用いたインビトロアッセイを使用して、マウスＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を０．３および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体で刺激した場合、Ｔ−ＭＳＣがマウスＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害したのに対して、Ｔ細胞を低用量、すなわち、０．３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体で刺激した場合、ＢＭ−ＭＳＣのみが増殖を阻害したことが見出された（図５）。
【０３２０】
実施例４．Ｔ−ＭＳＣは、ＥＡＥマウスの疾患スコアを減じる
ＢＭ−ＭＳＣが多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルの疾患の進行を減速させることができることを示すため、実施例１で得られたＴ−ＭＳＣを、ＥＡＥに罹患しているマウスに注入して、それらが同じ効果を有するかどうかを判定した。
【０３２１】
材料および方法
ＳＢ４３１５４２によるＭＳＣの派生：この方法から派生したＭＳＣは、ｈＥＳ−ＭＳＣ（ＳＢ）と称され、この方法は、既に公開されていた（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０３２２】
マウスＥＡＥモデルを、前述のように誘発した（Ｓｔｒｏｍｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｏｖｅｒｍａｎ，２００６）。製造業者のプロトコルに従い、Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）に記載されるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド３５−５５（ＭＯＧ３５−５５）、フロイントアジュバント、およびＥＡＥ誘発キット（Ｈｏｏｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，ＭＡ．（カタログ番号＃ＥＫ−０１１４））の中に含まれる百日咳毒素の混合物を皮下注射した。
【０３２３】
１０６個の細胞／マウスで、ＢＭ−ＭＳＣ、Ｔ−ＭＳＣ、もしくはｈＥＳ−ＭＳＣ（ＳＢ）、またはＰＢＳ（ビヒクル対照）を、免疫付与から６日目（発症前）または１８日目（発症後）に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注入した。この疾患スコアは、最大３１日間毎日マウスにおいてモニタリングされた。
【０３２４】
疾患スコアシステムは以下の通りである：
０：疾患の兆候なし、
１：尾の緊張喪失、
２：部分的な後肢麻痺、
３：完全な後肢麻痺、
４：前肢麻痺、
５：瀕死
（Ｓｔｒｏｍｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｏｖｅｒｍａｎ、２００６）。
【０３２５】
結果
図６に示されるように、Ｔ−ＭＳＣは、６日目または疾患の発症前に注入した場合に、毎日の疾患スコアを著しく減じ、これは、Ｔ−ＭＳＣの予防効果を示した。ＢＭ−ＭＳＣを注入されたマウスは、疾患スコアを減じず、ｈＥＳ−ＭＳＣ（ＳＢ）は、疾患スコアを減じる際に部分的な効果があったが、Ｔ−ＭＳＣほど良好ではなかった。
【０３２６】
実施例５．Ｔ−ＭＳＣの複数の系統分化
材料および方法
Ｔ−ＭＳＣの骨形成、軟骨形成、および脂質生成
製造業者の取扱説明書に従って、骨形成および軟骨形成のためにＳＴＥＭＰＲＯ骨形成および軟骨形成分化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ならびに脂質生成のためにＨｙｃｌｏｎｅ  ＡｄｖａｎｃｅＳＴＥＭ脂質生成分化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を使用した。
【０３２７】
結果
図７に示されるように、Ｔ−ＭＳＣは、中胚葉組織、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞の３つの系統のすべてに分化する際に良好な有効性を有した。したがって、Ｔ−ＭＳＣは、組織再生、組織工学、および組織修復のための源として使用することができる。
【０３２８】
実施例６．Ｔ−ＭＳＣは、ｈＥＳ−ＨＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣとは異なる
Ｔ−ＭＳＣ、ｈＥＳ−ＨＢ−ＭＳＣ、およびＢＭ−ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルを比較するために、マイクロアレイ分析が行われた。
【０３２９】
材料および方法
製造業者の取扱説明書に従って、マイクロアレイ分析について、２〜４継代でのｈＥＳ−ＭＳＣのＲＮＡ、または３継代でのＢＭ−ＭＳＣが、トリアゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて収穫された。ヒトＨＴ−１２  ｖ４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、細胞の遺伝子発現プロファイルを分析するために使用した。Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｖ２０１１．１を用いてデータを分析した。異なる源由来の２つのＢＭ−ＭＳＣ細胞株を使用し、Ｈ９およびＭＡ０９に由来する２つのｈＥＳ−ＭＳＣ細胞株を使用した。
【０３３０】
結果
図８に示されるように、いくつかの重要なサイトカイン、転写因子、細胞表面マーカーの総合的な発現プロファイルは、これらの３つの異なるＭＳＣの間で非常に異なる。Ｔ−ＭＳＣは、免疫抑制および組織再生において異なる役割を果たし得る。
【０３３１】
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【０３３２】
本開示は、好ましい実施形態を参照して説明されているが、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得、等価物がその要素に対して置換され得ることは、当業者によって理解されるであろう。さらに、本開示の本質的な範囲および精神から逸脱することなく、特定の使用、適用、製造条件、使用条件、組成物、媒体、大きさ、および／または材料に、この教示を適合させるように多くの修正がなされ得る。したがって、本開示は、特定の実施形態に限定されず、本明細書に記載されるように実施するための最良の形態を企図することが意図される。そのような修正はまた、添付の特許請求の範囲内に入ることも意図される。
【０３３３】
本明細書に引用されるすべての参照文献は、個々の出版物または特許または特許出願がそれぞれ、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれると具体的かつ個別に示される場合と同程度に、すべての目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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