(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）カフェインと、（ｂ）クリルオイルとを含有する内臓脂肪分解促進剤。
【請求項２】
（ａ）カフェインと（ｂ）クリルオイルの含有質量比（ａ／ｂ）が、１／５〜５／１である請求項１記載の内臓脂肪分解促進剤。
【請求項３】
内臓脂肪分解促進剤が、内臓脂肪分解促進用の医薬、医薬部外品、化粧品又は機能性食品組成物である請求項１又は２記載の内臓脂肪分解促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体脂肪減少促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的に肥満者数は増加傾向にあり、肥満は心臓への負担増加、膝・腰等の関節に対する負担増加、生活習慣病の原因等、様々な悪影響を及ぼす。また、肥満の原因は中性脂肪であり、中性脂肪が過剰に蓄積し、脂肪細胞が増加・肥大することで理想体型を超えて体が大きくなり、外見的にも問題となる。その肥満を改善させるためには、中性脂肪を分解する必要がある。
【０００３】
中性脂肪、特に体脂肪の蓄積を抑制したり、分解する作用を有する成分、例えばカフェインが報告されており（非特許文献１〜４）、分岐アミノ酸等のアミノ酸類、各種の植物抽出物を配合したサプリメントや飲食品が販売されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biochimica et Biophysica Acta, General Subjects, 496(2), 458-74 (1977)
【非特許文献２】日本薬理学雑誌, 74, 459-466 (1978)
【非特許文献３】J Appl Physiol 115, 260-267 (2013)
【非特許文献４】Toxicology In Vitro, 27(6), 1830-1837 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の体脂肪燃焼促進剤等は、その効果が十分でない等の問題がある。
従って、本発明は、体脂肪、特に皮下脂肪と内臓脂肪の両者を減少させる効果を有する体脂肪減少促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、種々の動物由来の成分の皮下脂肪及び内臓脂肪に対する作用を検討してきたところ、カフェインと構成脂肪酸としてω３不飽和脂肪酸を含むリン脂質との組み合わせが、同様に構成脂肪酸としてω３不飽和脂肪酸を含むトリグリセリドである魚油に比べて格別顕著に優れた皮下脂肪や内臓脂肪の分解を促進し、皮下脂肪細胞や内臓脂肪細胞への分化を抑制し、体脂肪減少促進剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
〔１〕（ａ）カフェインと、（ｂ）構成脂肪酸としてω３不飽和脂肪酸を含むリン脂質とを含有する体脂肪減少促進剤。
〔２〕体脂肪が、皮下脂肪及び／又は内臓脂肪である〔１〕記載の体脂肪減少促進剤。
〔３〕体脂肪減少促進が、皮下脂肪及び／又は内臓脂肪の分解促進、あるいは皮下脂肪細胞及び／又は内臓脂肪細胞の分化抑制である〔１〕又は〔２〕記載の体脂肪減少促進剤。
〔４〕（ｂ）構成脂肪酸としてω３不飽和脂肪酸を含むリン脂質が、クリルオイル由来である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の体脂肪減少促進剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の体脂肪減少促進剤によれば、皮下脂肪及び／又は内臓脂肪が減少し、また皮下脂肪細胞及び／又は内臓脂肪細胞への分化が抑制されるため、皮下及び内臓の脂肪の蓄積が抑制され、肥満が改善される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】皮下脂肪分解促進作用を示す図である。
【図２】内臓脂肪分解促進作用を示す図である。
【図３】皮下脂肪細胞への分化抑制作用を示す図である。
【図４】内臓脂肪細胞への分化抑制作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の体脂肪減少促進剤の有効成分は、（ａ）カフェインと、（ｂ）構成脂肪酸としてω３不飽和脂肪酸を含むリン脂質との２成分である。
【００１１】
（ａ）カフェインは、化学名１，３，７−トリメチルキサンチンであり、コーヒー等に含まれる成分である。コーヒー豆から抽出することもできるが、公知の合成法により製造することもできる。カフェインは、中枢神経興奮作用、強心作用などを有し、脂肪燃焼効果を有することが知られているが、（ｂ）のリン脂質との併用により作用がどのように変化するのかは知られていない。
【００１２】
（ｂ）構成脂肪酸としてω３不飽和脂肪酸を含むリン脂質としては、ω３高度不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、リノレン酸、α−リノレン酸を構成脂肪酸とするリン脂質が挙げられる。
当該（ｂ）リン脂質は、純粋なものを使用してもよいし、当該（ｂ）リン脂質を含有する天然脂質を用いてもよい。（ｂ）リン脂質を含有する天然脂質としては、例えばオキアミ由来油、特に南極オキアミ由来油（クリルオイル）が好ましい。オキアミ由来油には、ω３高度不飽和脂肪酸含有リン脂質が３５〜７０質量％含まれるので、これを用いるのが好ましい。これらのオキアミ由来油は市販品を使用することができる。
【００１３】
本発明の体脂肪減少促進剤は、体脂肪減少促進効果の点から、（ａ）成分と（ｂ）成分の含有質量比（ａ／ｂ）が１／１００〜１００／１であるのが好ましく、１／５０〜５０／１であるのがより好ましく、１／２０〜２０／１であるのがさらに好ましく、１／１０〜１０／１であるのがさらに好ましく、１／５〜５／１であるのがさらに好ましい。
【００１４】
（ａ）カフェインと（ｂ）リン脂質とを含有する組成物は、後記実施例に示すように、皮下脂肪分解促進作用、内臓脂肪分解促進作用、皮下脂肪細胞への分化抑制作用、内臓脂肪細胞への分化抑制作用を有することから、皮下脂肪及び内臓脂肪を含む体脂肪減少促進剤として有用である。本発明の体脂肪減少促進剤を摂取すれば、皮下脂肪及び内臓脂肪の分解が促進され、皮下脂肪細胞及び内臓脂肪細胞への分化成熟が抑制されるので、肥満が予防又は改善され、肥満に伴う種々の生活習慣病が予防又は改善される。
【００１５】
本発明の体脂肪減少促進剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品及び機能性食品に配合して使用することができる。また、その投与形態は、経口投与又は経皮投与が好ましい。
【００１６】
本発明の体脂肪減少促進剤を、医薬品、医薬部外品、化粧品、機能性食品として使用する場合には、（ａ）成分及び（ｂ）成分の混合物をそのまま使用することができるが、効果を損なわない範囲において、例えば、セルロース及びその誘導体、デンプン及びその誘導体、天然及び合成高分子等の乳糖、賦形剤、ステアリン酸及びその塩類、天然及び合成ワックス等の滑沢剤、糖類、酸味剤、香料等の種々の担体を配合することができる。また、本発明の医薬品、医薬部外品、化粧品又は機能性食品は、投与方法、投与経路に応じて散剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤等の剤型とすることができる。
【００１７】
また、本発明の体脂肪減少促進剤には、体脂肪減少に寄与する他の成分、例えばガルシニアエキス、ギムネマ、カプサイシン、コロハ種子エキス、難消化性デキストリン、その他食物繊維等を配合することができる。
【００１８】
本発明の体脂肪減少促進剤中には（ａ）成分及び（ｂ）成分を合計で１〜１００質量％、さらに５〜８０質量％、さらに１０〜７０質量％含有するのが好ましい。また、本発明の体脂肪減少促進剤の摂取量は、（ａ）成分及び（ｂ）成分合計で１日当たり、１０〜５０，０００mgが好ましく、さらに１００〜５，０００mgが好ましい。
【実施例】
【００１９】
次に実施例を挙げてさらに本発明を詳細に説明する。
【００２０】
実施例１（脂肪分解促進作用）
（１）培地調製
増殖培地はPGM-2 bullet kitに付属のPreadipocyte Basal Medium-2（５００mL）に、PGM-2 bullet kit に付属のFBS, L-glutamine, GA-1000 SingleQuatsを全量添加し、１０％ FBS, ２mM L-glutamine,５０μg/mL Gentamicin, ３７ng/mL Amphotericin-Bの終濃度となるように作成した。
分化培地は２００mLの増殖培地に、PGM-2 bullet kit に付属のinsulin, dexamethasone, indomethacin, isobutyl-methylxanthineを全量添加して作成した。
【００２１】
（２）サンプル調製
分化培地を用いて、それぞれ目的のサンプル終濃度となるよう調製した。カフェイン、フィッシュオイル含有培地は０．４５μｍのフィルターで滅菌して試験に用いた。クリルオイル含有培地はフィルターを透過しなかったため、クリーンベンチで無菌的に調製し、フィルター滅菌せずに試験に用いた。クリルオイルおよびフィッシュオイルは溶媒を用いず培地に直接添加して懸濁し、エマルジョンの状態で試験を行った。
陰性対照としてサンプル無添加分化培地を用いた。陽性対照として、１０μM Isoprotetenol含有培地を用いた（下記注）。１０μM Isoprotetenol含有培地は、Adipolysis Assay Kit付属のIsoprotetenol Solutionを分化培地に1/1000添加してフィルター滅菌して調製した。
（注）Isoproterenolはアドレナリンβレセプターのアゴニストとして機能する。アドレナリンが脂肪細胞のβレセプターに結合すると、プロテインキナーゼＡが活性化され、このプロテインキナーゼＡが、ホルモン感受性リパーゼを活性化する。このホルモン感受性リパーゼは、中性脂肪を遊離脂肪酸と遊離グリセロールに変換する。このようなメカニズムによって、Isoproterenolは中性脂肪の分解を促進する。
【００２２】
（３）ヒト前駆脂肪細胞の前培養
ヒト前駆脂肪細胞（皮下脂肪および内臓脂肪）は、増殖培地を用いてＴ−７５フラスコに起眠し、８０％  コンフルエントになるまで培養した。培地交換は２日おきに行い０．２５％Trypsin/EDTAを用いて細胞を剥離し、細胞を回収して本試験に用いた。試験には購入後継代数２の細胞を用いた。
【００２３】
（３）脂肪細胞の分化誘導およびサンプル処理
前駆脂肪細胞を、増殖培地を用いて１０，０００cells/１００μL/wellで９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ2インキュベーター（５％ ＣＯ2、３７℃）内で２４時間培養した。培養後、１００％コンフルエントになっていることを確認し、２００μLの分化培地と交換し、ＣＯ2インキュベーターで１０日間培養して脂肪細胞へ分化誘導した。分化誘導後１０日目にサンプル含有分化培地に交換し、ＣＯ2インキュベーターで培養してサンプル処理した。培養終了時に位相差顕微鏡で細胞観察を行った後、培地を回収して−２０℃保存し、後日脂肪分解量を測定した。
【００２４】
（４）遊離グリセロール量定量（吸光法）
中性脂肪（トリグリセリド）は、加水分解により脂肪酸とグリセロールを生ずる。グリセロール濃度の測定により，生体内における脂質分解を評価することができる。グリセロールの定量は、基本的にAdipolysis Assay Kit（下記注）を用いた吸光法により行った。なお、培地やサンプルに含まれるグリセロールや、サンプルによる培地の着色の影響を補正するために、サンプル含有培地（ｎ＝３）についても測定を行い、その平均値をレファレンスとして、細胞処理を行った測定値から差し引いた。
（注）グリセロールを各種酵素で処理し、５４０nmの吸光度測定で検出可能なQuinoneimine dye を生ずる方法。
【００２５】
（５）統計解析
比較試験区間（無添加区vsサンプル添加区）では有意差検定を行った。検定はStudent’s t-testで両側検定を行いＰ＜０．０５（帰無仮説が５％未満）のものを図中に示した。グラフデータは平均値±標準誤差として示した。有意水準を記載する場合、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１とした。
【００２６】
（６）試薬
被験物質
・カフェイン（抽出物）（白鳥製薬株式会社）
・クリルオイル（清光薬品工業株式会社、ω３高度不飽和脂肪酸リン脂質41質量％含有）
・フィッシュオイル（日油株式会社、サンオメガDHA27）
（７）細胞
・ヒト前駆脂肪細胞（皮下脂肪） (Lonza, Cat. No. PT-5020, Lot. No. 0000279746, 38歳、アジア人種、女性、BMI=26)
・ヒト前駆脂肪細胞（内臓脂肪） (Lonza, Cat. No. PT-5005, Lot. No. 0000310955, 92歳、白色人種、女性、BMI=19)
・ヒト前駆脂肪細胞（内臓脂肪） (Lonza, Cat. No. PT-5005, Lot. No.8F3482, 46歳、白色人種、男性、BMI=26)
【００２７】
（８）結果
ｉ）皮下脂肪分解促進作用を図１に示す。
図１より、処理３時間後で、カフェイン及びクリルオイルを併用した場合、カフェイン及びクリルオイル単独で作用させた場合に比べて、顕著な皮下脂肪分解促進作用を示した。
【００２８】
ii）内臓脂肪分解促進作用を図２に示す。
図２より、処理２４時間及び４８時間後で、カフェイン及びクリルオイルを併用した場合、カフェイン及びクリルオイルを単独で作用させた場合に比べて、顕著な内臓脂肪分解促進作用を示した。
なお、Isoproterenolは、陽性対照サンプルである。
【００２９】
実施例２（脂肪細胞への分化抑制作用）
（１）培地調製、サンプル調製、ヒト前駆細胞の前培養、統計解析、試薬は実施例１と同様に行った。
【００３０】
（２）脂肪細胞の分化誘導およびサンプル処理
前駆脂肪細胞を、増殖培地を用いて１０，０００cells/１００μL／wellで９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）内で２４時間培養した。培養後、１００％コンフルエントになっていることを確認し、２００μＬのサンプル含有分化培地と交換し、ＣＯ2インキュベーターで培養して脂肪細胞への分化誘導を開始した。分化誘導後４日目と７日目に新しいサンプル含有分化培地に交換した。各種サンプル解析は分化誘導開始後４日目、７日目、１０日目にオイルレッド染色を行い、脂肪細胞分化率を経時的に解析した。各ｎ＝５で試験した。カフェインおよびクリルオイルの濃度効果解析は、１０日目にオイルレッド染色を行い、脂肪細胞分化率を解析した。各ｎ＝３で試験した。
【００３１】
（３）オイルレッド染色
オイルレッド溶液は、１５０mgのオイルレッドＯを５０mLの１００％  ２−プロパノールに溶解した後、脱イオン水を３３mL加え、ろ紙で濾過して調製した。オイルレッド染色は、以下のプロトコールで行い、染色後に位相差顕微鏡観察および定量化を行った。
【００３２】
（４）結果
（ｉ）皮下脂肪細胞への分化抑制作用を図３に示す。図３より、カフェイン及びクリルオイルを併用した場合、顕著な皮下脂肪細胞への分化抑制作用を示した。
【００３３】
（ii）内臓脂肪細胞への分化抑制作用を図４に示す。図４よりカフェイン及びクリルオイルを併用した場合、顕著な内臓脂肪細胞への分化抑制作用を示した。
なお、LiClは陽性対照である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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