(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のα(2,6)結合シアル酸糖鎖：
NeuAcまたはNeuGc(α2→6)がGalまたはGlc残基に付加されているシアル酸化糖鎖；
NeuAcまたはNeuGc(α2→6)がGal(β1→4)GlcまたはGlc(β1→4)Glc残基に付加されているシアル酸化糖鎖；
NeuAcまたはNeuGc(α2→6)がGal(β1→4)GlcNAcまたはGal(β1→3)GlcNAc残基に付加されているシアル酸化糖鎖；
NeuAcまたはNeuGc(α2→6)がGal(β1→3)[αFuc(1→4)]GlcNAc残基に付加されているシアル酸化糖鎖；および
NeuAcまたはNeuGc(α2→6)がGal(β1→4)[αFuc(1→3)]GlcNAcに付加されているシアル酸化糖鎖
を含む糖タンパク質に特異的に結合し、配列番号2、配列番号6または配列番号10により表わされるアミノ酸配列を含む、アミヒラタケ（Polyporus squamosus）由来イソレクチンPSL1bの活性組み換えレクチン。
【請求項２】
前記レクチンをコードするヌクレオチド配列が、配列番号1、配列番号5または配列番号9により表わされるヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の活性組み換えレクチン。
【請求項３】
請求項1に記載の活性組み換えレクチンをコードする配列番号1、配列番号5または配列番号9により表わされるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項3に記載の発現ベクターがトランスフェクトされた形質転換体。
【請求項５】
細菌または酵母である、請求項4に記載の形質転換体。
【請求項６】
前記細菌が、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、大腸菌（E. coli）、セレウス菌（B. cereus）、ネズミチフス菌（Salmonella typimurium）、ブタコレラ菌（Salmonella choleraesuis）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、およびリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）からなる群より選択される、請求項5に記載の形質転換体。
【請求項７】
酵母が、ピチア属（Pichia）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ヤローウィア属（Yallowia）、ハンセヌラ属（Hansenula）、およびカンジダ属（Candida）からなる群より選択される、請求項5に記載の形質転換体。
【請求項８】
以下のステップ：
(a) 請求項4〜7のいずれか1項に記載の形質転換体を培養するステップ；および
(b) ステップ(a)の培養生成物から、活性組み換えレクチンを分離および精製するステップ
を含む、α(2,6)結合のシアル酸糖鎖に特異的に結合する活性組み換えレクチンを調製するための方法。
【請求項９】
請求項8に記載の方法により調製される活性組み換えレクチンを含む、α(2,6)結合のシアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖を測定または検出するためのキット。
【請求項１０】
請求項8に記載の方法により調製される活性組み換えレクチンを含む、その表面上にα(2,6)結合のシアル酸糖鎖を含むシアル酸化糖鎖を有する細胞株、細菌、またはウイルスをモニタリング、測定、または定量化するためのキット。
【請求項１１】
以下のステップ：
(a) 試験サンプルを、請求項8に記載の方法により調製される活性組み換えレクチンと接触させるステップ；および
(b) 上記のレクチンに結合する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖を分析するステップ
を含む、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖を含むシアル酸化糖鎖の測定または定量化のための方法。
【請求項１２】
以下のステップ：
(a) 試験サンプルを、請求項8に記載の方法により調製される活性組み換えレクチンと接触させるステップ；および
(b) 上記のレクチンに結合する細胞株、細菌、またはウイルスを分析するステップ
を含む、シアル酸化糖鎖を有する細胞株、細菌、またはウイルスの測定または定量化のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミヒラタケ（Polyporus squamosus）に由来する、シアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンをコードする遺伝子、異種宿主にて該遺伝子を発現させることにより取得される活性レクチンタンパク質、該タンパク質を産生する組み換え形質転換体、およびシアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖をはじめとする生物学的材料を測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアル酸（ノイラミン酸；Neu5Ac）は、9個の炭素を有するα-ケトアルドン酸であり、これは、糖タンパク質、糖脂質、およびオリゴ糖などの糖鎖を含有する糖前駆体の非還元末端に見出される糖である。さらに、シアル酸は、糖コンジュゲートの末端に存在する糖である。現在までに、約80種類のシアル酸結合糖コンジュゲートが自然界で特定されている。シアル酸は、細胞での生物学的現象で重要な役割を果たす（例えば、細胞/細胞相互作用、細胞内シグナルを決定する前駆体としての機能、および糖タンパク質の安定化など）。特に、内在性シアル酸は、病原体の感染後に最初に認識される糖鎖のうちの1つとして知られる（Sasisekharan and Myette, 2003, Am. Sci. 91, 432；Vimr and Lichtensteiger, 2002, Trends Microbiol. 10, 254）。細胞表面上のシアル酸は、細胞保護のための莢膜の形態でポリオリゴ糖（poly-oligosaccharide）を形成する成分として知られ、または病原体自体においてさえも、免疫特権に関与する（Vimr et al., 2004, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 132）。シアル酸の化学構造は非常に複雑であり、2番目の炭素のアノマー部位に連結されたカルボキシル基ならびに3番目の炭素および6番目の炭素のデオキシに見出されるグリセロール構造から構成される。シアル酸を含有する糖鎖のシアロ糖コンジュゲート構造（sialoglycoconjugate structure）では、シアル酸は、α(2,3)、α(2,6)、α(2,8)、およびα(2,9)を介して他の糖に結合し、シアル酸糖のヒドロキシル残基は、O-アセチル、O-ホスフェート、O-サルフェート、O-メチル、およびN-グリコシル基を用いて置換されて、N-グリコリルノイラミン酸（NeuGc）を含む形質転換体などの、より複雑な化学構造の生成をもたらす。そのような複雑な化学構造を理由として、シアル酸を含有する糖鎖構造を正確に測定することは非常に困難である。質量分析計および核磁気共鳴分光計などに基づく進歩した新しい分析技術によって、シアル酸を含有する糖鎖の分析は、以前に比べて正確に成し遂げられる。しかしながら、生物学的サンプルの量の不足および分析用のサンプルの調製での複雑性などの解決すべき課題が未だにある（Cohen and Varki, 2010, OMICS 14, 455；Alley et al. 2013, Chem. Rev. 113, 2668）。
【０００３】
シアル酸糖鎖の複雑な構造を測定するために、糖鎖に選択的に結合するタンパク質であるレクチンを用いることにより糖鎖構造を測定するための技術が開発中である（Vanderschaeghe et al., 2010, Biol. Chem. 391, 149；Hsu and Mahal, 2009, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 427）。微生物から高等動物までの広範囲の生物で見出されるレクチンは、糖鎖に結合することができるタンパク質の1種であり、糖鎖に特異的に結合することにより、タンパク質の品質管理、宿主・病原体相互作用、細胞間コミュニケーション、炎症、免疫応答、癌の進行、および発生をはじめとする種々の生命現象に関与する（Lam and Ng, 2011. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 45）。レクチンは、酵素活性も抗体様特性も示さない、多価タンパク質である。レクチンは、19世紀後半に、ロシア人科学者Sillmarkにより、トウゴマ（Ricinus communis）から最初に単離された。その後、コンカナバリンA（Concanavlain A）（ConA）をはじめとする40種類のレクチンが特定され、研究され、かつ様々な分野で用いられてきた。これまでに特定されたそれらのレクチンは、種々の天然物質から分離および精製され、シアル酸の基本モノマー（Neu5Ac、ノイラミン酸）、ガラクトース（Gal）、N-アセチルグルコサミン（N-GlcNAc）、フコース（Fuc）、マンノース（Man）、およびグルコース（Glc）を測定するために用いられる（Lehmann et al., 2006, Cell. Mol. Life Sci. 63, 1331；Singh et al., 2010 Crit. Rev. Biotechnol. 30, 99；Kajiwara et al., 2010, Microbes Environ. 25, 152）。
【０００４】
しかしながら、αおよびβ結合を有する糖コンジュゲートの構造の多様性ならびに糖鎖または側鎖修飾での考えられるモノマーの組み合わせの多様性により、数百または数千種類の異なる糖鎖構造が理論的には考えられるが、特定されているレクチンの数は、そのような多様な糖鎖を測定するのには全く足りていない。特に、イヌエンジュ（Maackia amurensis）（MAA）、セイヨウニワトコ（Sambucus nigra）（SNA）、およびアメリカカブトガニ（Limulus polyphemus）レクチンは、シアル酸（Neu5Ac）糖鎖を測定するために用いることができるが、このレクチンはα2,3、α2,6、およびα2,8結合（シアル酸糖鎖の化学的特異性）を正確に区別することができなかった。それに加えて、レクチンは、シアル酸に結合するGalおよびGalNAcを特異的に認識し、これにより、非特異的結合性に起因する非特異的シグナルをもたらす。したがって、新規なシアル酸特異的レクチンを開発することが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sasisekharan and Myette, 2003, Am. Sci. 91, 432
【非特許文献２】Vimr and Lichtensteiger, 2002, Trends Microbiol. 10, 254
【非特許文献３】Vimr et al., 2004, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 132
【非特許文献４】Cohen and Varki, 2010, OMICS 14, 455
【非特許文献５】Alley et al. 2013, Chem. Rev. 113, 2668
【非特許文献６】Vanderschaeghe et al., 2010, Biol. Chem. 391, 149
【非特許文献７】Hsu and Mahal, 2009, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 427
【非特許文献８】Lam and Ng, 2011. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 45
【非特許文献９】Lehmann et al., 2006, Cell. Mol. Life Sci. 63, 1331
【非特許文献１０】Singh et al., 2010 Crit. Rev. Biotechnol. 30, 99
【非特許文献１１】Kajiwara et al., 2010, Microbes Environ. 25, 152
【非特許文献１２】Mo et al., 2000, J. Biol. Chem. 275, 10623
【非特許文献１３】Tateno et al. 2004, Biochem. J. 382, 667
【非特許文献１４】Kadirvelraj et al., 2011, Glycobiology 21, 973
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明のレクチンは、β-ガラクトシル- SynsorbカラムおよびDEAE-Sephacelイオン交換カラムを用いてアミヒラタケ（Polyporus squamosus）子実体から分離および精製され、これは約28kDaであり、Neu5Ac-α(2,6)-Gal-β(1,4)-Glc/GlcNAc糖鎖に特異的に結合した（Mo et al., 2000, J. Biol. Chem. 275, 10623）。対応するレクチンの部分アミノ酸配列に基づいて構築された縮重プライマーを用いるRACE（rapid amplification of cDNA ends）によりアミヒラタケから得られたcDNA配列は、それぞれ858bpおよび876bpの長さの配列を有する2種類のイソレクチンPSL1aおよびPSL1bをコードするタンパク質であった。これらは、理論上は、31.04kDaおよび31.998kDaのサイズのタンパク質であることが予測される（Tateno et al. 2004, Biochem. J. 382, 667）。PSL1aレクチンをコードするヌクレオチド配列は、大腸菌で発現され、活性な組み換えタンパク質として単離/精製されて、その特性が開示されている。最近、PSL1aレクチンの三次元タンパク質構造が、ヒト型インフルエンザ受容体Neu5Acα(2,6)Galβ(1,4)GlcNAcとして特定された（Tateno et al. 2004, Biochem. J. 382, 667；Kadirvelraj et al., 2011, Glycobiology 21, 973）。しかしながら、PSL1bレクチンをコードするヌクレオチド配列の特性は未だ特定されておらず、これはこのレクチンが大腸菌で不活性なタンパク質として生成されるからである（Tateno et al. 2004, Biochem. J. 382, 667）。
【０００７】
本発明者らは、シアル酸に特異的に結合する活性組み換えタンパク質として、異種宿主からアミヒラタケ由来イソレクチンPSL1bを取得しようと試みた。結果として、本発明者らは、イソレクチンPSL1bレクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを化学的に合成し、ようやく、大腸菌および酵母などの異種宿主系から新規な活性組み換えレクチンタンパク質を取得した。本発明者らはさらに、構築された新規組み換えレクチンタンパク質を、シアル酸糖鎖および糖鎖化合物を含有する糖タンパク質、糖脂質、ならびにオリゴ糖などの様々な糖鎖構造を有するタンパク質を測定するために、微生物をモニタリングするために、および糖鎖により媒介される種々の生命現象を説明するために用いることができることを確認し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明の目的は、α(2,6)結合を有するシアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンを提供することである。大腸菌または酵母から活性な組み換えレクチンタンパク質を取得するために、本発明は、化学的に合成された上記のレクチンタンパク質をコードする、配列番号1により表わされるポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
本発明の別の目的は、上記のポリヌクレオチドから転写および翻訳される、配列番号2により表わされるポリペプチドを提供することである。
本発明の目的はまた、上記のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することである。
本発明の目的はさらに、上記の発現ベクターがトランスフェクトされた形質転換体を提供することである。
【００１０】
本発明の目的はまた、α(2,6)結合を有するシアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンを調製するための方法を提供することである。
本発明の目的はまた、上記の形質転換体から組み換えレクチンタンパク質を精製するための方法を提供することである。
また、本発明は、シアル酸糖鎖を含有する糖タンパク質を測定する目的で、レクチンブロッティングのために組み換えレクチンを用いる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明は、α(2,6)シアル酸に特異的に結合するレクチンをコードする、配列番号1により表わされるヌクレオチド配列を含む（から構成される）ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号2により表わされるアミノ酸配列を含む（から構成される）ポリペプチドも提供する。
【００１２】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。
本発明はまた、上記の発現ベクターによりトランスフェクトされた形質転換体も提供する。
本発明はまた、上記の発現ベクターによりトランスフェクトされた細菌形質転換体も提供する。
【００１３】
本発明はまた、以下のステップ：
(a) 上記の細菌形質転換体を培養するステップ；および
(b) ステップ(a)の培養生成物から、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンを分離および精製するステップ
を含む、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンを調製するための方法も提供する。
本発明はまた、上記の方法により調製される、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンも提供する。
【００１４】
本発明はまた、配列番号5により表わされるヌクレオチド配列を含む（から構成される）ポリヌクレオチドも提供する。
本発明はまた、配列番号6により表わされるアミノ酸配列を含む（から構成される）ポリペプチドも提供する。
本発明はまた、上記の発現ベクターがトランスフェクトされた酵母形質転換体も提供する。
【００１５】
本発明はまた、以下のステップ：
(a) 酵母形質転換体を培養するステップ；および
(b) ステップ(a)の培養生成物から、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンを分離および精製するステップ
を含む、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンを調製するための方法も提供する。
本発明はまた、上記の方法により調製される、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンも提供する。
【００１６】
本発明はまた、配列番号9により表わされるヌクレオチド配列を含む（から構成される）ポリヌクレオチドも提供する。
本発明はまた、配列番号10により表わされるアミノ酸配列を含む（から構成される）ポリペプチドも提供する。
【００１７】
本発明はまた、α(2,6)シアル酸糖鎖に特異的に結合する組み換えレクチンPSL1bタンパク質を産生することができる、受託番号KCTC12507BPの下に寄託されている組み換え大腸菌株も提供する。
本発明はまた、α(2,6)シアル酸糖鎖に特異的に結合する組み換えレクチンPSL1bタンパク質を産生することができる、受託番号KCTC12500BPの下に寄託されている組み換え酵母（ピチア・パストリス）菌株も提供する。
【００１８】
本発明はまた、以下のステップ：
(a) 上記菌株を培養するステップ；および
(b) ステップ(a)の培養生成物から、組み換えレクチンを分離および精製するステップ
を含む、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンを調製するための方法も提供する。
本発明はまた、上記の方法により調製される、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンも提供する。
【００１９】
本発明はまた、本発明の組み換えレクチンを用いる、α(2,6)シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖の測定または定量化のためのキットも提供する。
【００２０】
本発明はまた、本発明の組み換えレクチンを用いる、その表面上にα(2,6)シアル酸を含むシアル酸糖鎖を有する細胞株、細菌、またはウイルスのモニタリング、測定または定量化のためのキットも提供する。
【００２１】
本発明はまた、以下のステップ：
(a) 試験サンプルを本発明の組み換えレクチンに接触させるステップ；および
(b) 上記レクチンに結合する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖を分析するステップ
を含む、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖を含むシアル酸化コンジュゲートの測定または定量化のための方法も提供する。
【００２２】
本発明はまた、以下のステップ：
(a) 試験サンプルを本発明の組み換えレクチンに接触させるステップ；および
(b) 上記レクチンに結合する細胞、細菌、またはウイルスを分析するステップ
を含む、シアル酸糖鎖を有する細胞株、細菌、またはウイルスの測定または定量化のための方法も提供する。
【００２３】
本発明はまた、本発明の組み換えレクチンを用いる、α(2,6)シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖の測定または定量化のためのキットの使用も提供する。
【００２４】
本発明はまた、本発明の組み換えレクチンを用いる、その表面上にα(2,6)シアル酸を含むシアル酸糖鎖を有する細胞株、細菌、またはウイルスのモニタリング、測定または定量化のためのキットの使用も提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、α(2,6)シアル酸糖鎖を含有する糖タンパク質に特異的に結合する、アミヒラタケ由来イソレクチンPSL1bの活性組み換えレクチンタンパク質に関する。本発明は、大腸菌PSL1b株（受託番号：KCTC12507BP）またはピチア・パストリスPSL1b株（受託番号：KCTC12500BP）から、シアル酸糖鎖に特異的に結合するアミヒラタケ由来PSL1b組み換えレクチンを生成させる方法、およびそれにより生成されたレクチンを提供する。本発明の組み換えレクチンは、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖の測定のために、ならびにシアル酸糖鎖を有する細胞株、細菌、およびウイルスの測定もしくは検出のための組成物またはキットの活性成分として、有効に用いることができる。
本発明の好ましい実施形態の応用は、添付の図面を参照して最もよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】大腸菌で化学的に合成された、アミヒラタケ由来の、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンPSL1bを発現するプラスミドpET-PSL1b 8xHisを示す模式図である。
【図２】酵母で化学的に合成された、アミヒラタケ由来の、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンPSL1bを発現するプラスミドpPICZα-PSL1b 8xHisを示す模式図である。
【図３】SDS-PAGEにより確認される、大腸菌で産生された組み換えレクチンを示す図である。
【図４】SDS-PAGEにより確認される、酵母で産生された組み換えレクチンを示す図である。
【図５】組み換えレクチンPSL1bを用いることによる、α(2,6)-シアリルトランスフェラーゼにより媒介されてアシアロフェチュイン（asialofetuin）にシアル酸を付加されたシアル酸化糖タンパク質のα(2,6)シアル酸糖鎖の測定を表わすレクチンブロッティングの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書中、以下では、本発明を詳細に説明する。
本発明は、α(2,6)シアル酸に特異的に結合するレクチンをコードする、配列番号1により表わされるヌクレオチド配列を含む（から構成される）ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号2により表わされるアミノ酸配列を含む（から構成される）ポリペプチドも提供する。
【００２８】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。
本発明はまた、上記の発現ベクターによりトランスフェクトされた形質転換体も提供する。
本発明はまた、上記の発現ベクターによりトランスフェクトされた細菌形質転換体も提供する。
【００２９】
上記の細菌は、好ましくは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、大腸菌（E. coli）、セレウス菌（B. cereus）、ネズミチフス菌（Salmonella typimurium）、ブタコレラ菌（Salmonella choleraesuis）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、およびリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）からなる群より選択され、とりわけ、大腸菌がより好ましい。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らは、アミヒラタケ由来組み換えレクチンタンパク質を生成させるために、米国国立生物工学情報センター（NCBI、登録番号AB120707）により提供される問い合わせ配列を用いることにより、遺伝子配列候補をスクリーニングした。本発明者らによりスクリーニングされた配列に基づいて、コドン最適化およびRNA二次元構造最適化を介して、44.7％のグアニンおよびシトシンを含有する879bpのポリヌクレオチドを、異種宿主系での標的遺伝子の至適発現を誘導するために、DNA 2.0 Co（米国）にて化学的に合成した。本発明で合成されたポリヌクレオチド配列ならびに転写および翻訳により該ポリヌクレオチドから生成されるポリペプチドは、それぞれ、配列番号1および配列番号2により表わされる。アミヒラタケ由来レクチンPSL1bをコードする野生型遺伝子と化学的に合成された遺伝子との変化（表1を参照されたい）およびコドンでの変化（表2を参照されたい）を提示した。上記で確認されたポリヌクレオチド遺伝子情報に基づいて、配列番号3および配列番号4により表わされるプライマーを、大腸菌発現ベクター中にレクチンタンパク質をクローニングするために構築した（表3を参照されたい）。大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RILを、その遺伝子配列が組み換えPSL1bタンパク質をその中で生成させるために特定された組み換えプラスミドpET-PSL1b 8xHis（図1を参照されたい）を用いてトランスフェクトした。本発明の組み換えレクチンPSL1bを発現する組み換え菌株大腸菌PSL1bは、2013年11月1日に韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology；KRIBB）韓国生命工学研究院遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures；KCTC）に寄託された（KCTC12507BP）。上記で特定されたポリヌクレオチド遺伝子情報に基づいて、配列番号7および配列番号8により表わされるプライマーを、酵母発現ベクター中にレクチンタンパク質をクローニングするために構築した（表4を参照されたい）。ピチア・パストリスX-33を、その遺伝子配列が組み換えレクチンPSL1bをその中で生成させるために特定された組み換えプラスミドpPICZα-PSL1b 8xHis（図2を参照されたい）を用いてトランスフェクトした。本発明の組み換えレクチンPSL1bを発現する組み換え菌株ピチア・パストリスPSL1bは、2013年10月7日に韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology；KRIBB）韓国生命工学研究院遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures；KCTC）に寄託された（KCTC12500BP）。本発明の組み換え大腸菌を培養した後、標的細胞を、遠心分離により培養培地から取得した。収集された細胞から組み換えレクチンを分離するために、HisTrapTM FFカラムクロマトグラフィーを行なった。結果として、組み換えレクチンが溶出された。上記で溶出された組み換えレクチンを精製するために、Superose 12カラムクロマトグラフィーを行ない、結果として、種々のサイズのタンパク質が溶出された。溶出されたタンパク質を、Amicon(登録商標)Ultra Centrifugal filter 10Kを用いて濃縮した。上記で得られた粗精製酵素溶液は、SDS-PAGEおよびそれに続くクーマシーブリリアントブルー染色に進んだ。精製されたレクチンタンパク質の純度およびサイズを、Precision Plus ProteinTM Standards（Bio-Rad, USA）を標準タンパク質として用いて分析した。結果として、大腸菌から分離された精製組���換えPSL1bタンパク質のサイズは、約32kDaであることが確認された（図3を参照されたい）。さらに、酵母から組み換えレクチンを精製するために、上記の本発明の方法により構築された、トランスフェクトされた組み換え酵母菌株を培養し、培養溶液を回収した。酵母培養溶液から、酵母細胞と培養培地とを分離するために、遠心分離を行なった。沈殿物を除去し、上清を取得した。上記の粗精製酵素溶液から組み換えレクチンを精製するために、HisTrapTM FFカラムクロマトグラフィーを行なった。結果として、組み換えレクチンが溶出された。溶出されたタンパク質を、Amicon(登録商標)Ultra Centrifugal filter 10Kを用いて濃縮した。上記で得られた粗精製酵素溶液は、SDS-PAGEおよびそれに続くクーマシーブリリアントブルー染色に進んだ。精製されたレクチンタンパク質の純度およびサイズを、Precision Plus ProteinTM Standards（Bio-Rad, USA）を標準タンパク質として用いて分析した。結果として、酵母から分離および精製された組み換えPSL1bタンパク質のサイズは約40kDaであり、これは大腸菌から分離されたタンパク質のものよりも若干大きかった。サイズの増大は、対応するレクチン配列に含まれる潜在的な3箇所のN-コンジュゲート化グリコシル化によるものであることが予測される（図4を参照されたい）。上記で分離されたタンパク質の選択的結合性を調査するために、レクチンブロッティングを行なった。結果として、レクチンブロットシグナルが、N結合糖鎖Neu5Ac α(2,6) Galβ(1,4)GlcNAcの基本構造およびO結合糖鎖Neu5Acα(2,6)Galβ(1,3)の糖鎖を含有するフェチュイン[GalNA, Neu5Acα(2,6)Galβ(1,3) [Neu5Acα(2,6)Galβ(1,4)GalNAβ(1,6)]で観察された。しかしながら、レクチンブロットシグナルは、陰性対照である非シアル酸化フェチュインGalβ(1,4)GlcNAcの非シアル酸化N糖鎖およびGalβ(1,3) [Galβ(1,4)GalNA β(1,6)]の糖鎖を含有するタンパク質、ならびにα(2,3)シアル酸を含有するフェチュイン（ウシ血清フェチュイン）（図5を参照されたい）のいずれでも観察されなかった。
【００３１】
したがって、本発明は、α(2,6)結合シアル酸糖鎖を含有する糖タンパク質に特異的に結合するアミヒラタケ由来イソレクチンPSL1bの活性組み換えレクチンタンパク質に関する。本発明は、大腸菌PSL1b株（受託番号：KCTC12507BP）またはピチア・パストリスPSL1b株（受託番号：KCTC12500BP）から、シアル酸糖鎖に特異的に結合するアミヒラタケ由来PSL1b組み換えレクチンを生成させる方法、およびそれにより生成されたレクチンを提供する。本発明の組み換えレクチンは、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖の測定のために、ならびにシアル酸糖鎖を有する細胞株、細菌、およびウイルスの測定もしくは検出のための組成物またはキットの活性成分として、有効に用いることができる。
【００３２】
本発明はまた、以下のステップ：
(a) 本発明の細菌形質転換体を培養するステップ；および
(b) ステップ(a)の培養生成物から組み換えレクチンを分離および精製するステップ
を含む、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンを調製するための方法も提供する。
【００３３】
本発明はまた、以下のステップ：
(a) 上記の細菌形質転換体を培養するステップ；および
(b) ステップ(a)の培養生成物から組み換えレクチンを分離および精製するステップ
を含む、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンを調製するための方法も提供する。
【００３４】
本発明はまた、上記の方法により調製される、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンも提供する。
【００３５】
本発明はまた、配列番号5により表わされるヌクレオチド配列を含む（から構成される）ポリヌクレオチドも提供する。
本発明はまた、配列番号6により表わされるアミノ酸配列を含む（から構成される）ポリペプチドも提供する。
上記のポリペプチドは、好ましくは、アミノ酸配列全体のC末端に8個のヒスチジン残基を含むが、常にそれに限定されるものではない。
【００３６】
本発明はまた、上記の発現ベクターを用いてトランスフェクトされた酵母形質転換体も提供する。
【００３７】
本明細書中の酵母は、好ましくは、ピチア属（Pichia）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ヤローウィア属（Yallowia）、ハンセヌラ属（Hansenula）、およびカンジダ属（Candida）からなる群より選択され、ピチア属がより好ましい。
【００３８】
本発明はまた、以下のステップ：
(a) 上記の酵母形質転換体を培養するステップ；および
(b) ステップ(a)の培養生成物から組み換えレクチンを分離および精製するステップ
を含む、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンを調製するための方法も提供する。
【００３９】
本発明はまた、上記の方法により調製される、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンも提供する。
【００４０】
本発明はまた、配列番号9により表わされるヌクレオチド配列を含む（から構成される）ポリヌクレオチドも提供する。
本発明はまた、配列番号10により表わされるアミノ酸配列を含む（から構成される）ポリペプチドも提供する。
上記のポリペプチドは、好ましくは、アミノ酸配列全体のN末端に、分泌発現のためのシグナル配列を含むが、常にそれに限定されるものではない。
【００４１】
本発明はまた、α(2,6)シアル酸糖鎖に特異的に結合する組み換えレクチンPSL1bタンパク質を産生することができる、受託番号KCTC12507BPの下に寄託されている組み換え大腸菌株も提供する。
【００４２】
本発明はまた、α(2,6)シアル酸糖鎖に特異的に結合する組み換えレクチンPSL1bタンパク質を産生することができる、受託番号KCTC12500BPの下に寄託されている組み換え酵母（ピチア・パストリス）菌株も提供する。
【００４３】
本発明はまた、以下のステップ：
(a) 上記菌株を培養するステップ；および
(b) ステップ(a)の培養生成物から、組み換えレクチンを分離および精製するステップ
を含む、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンを調製するための方法も提供する。
【００４４】
本発明はまた、上記の方法により調製される、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えレクチンも提供する。
【００４５】
本発明はまた、以下の糖鎖構造：
NeuAcまたはNeuGc(α2→6)がGalまたはGlc残基に付加されているシアル酸化糖鎖（sialylated sugar chain）；
NeuAcまたはNeuGc(α2→6)がGal(β1→4)GlcまたはGlc(β1→4)Glc残基に付加されているシアル酸化糖鎖；
NeuAcまたはNeuGc(α2→6)がGal(β1→4)GlcNacまたはGal(β1→3)GlcNac残基に付加されているシアル酸化糖鎖；
NeuAcまたはNeuGc(α2→6)がGal(β1→3)[αFuc(1→4)]GlcNac残基に付加されているシアル酸化糖鎖；および
NeuAcまたはNeuGc(α2→6)がGal(β1→4)[αFuc(1→3)]GlcNacに付加されているシアル酸化糖鎖
からなる群より選択される糖鎖構造に特異的に結合するレクチンも提供する。
【００４６】
本発明はまた、本発明の組み換えレクチンを用いる、α(2,6)シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖の測定または定量化のためのキットも提供する。
【００４７】
本発明はまた、α(2,6)シアル酸糖鎖に特異的に結合し、かつ30kDa〜60kDaのサイズを有する、本発明の方法により分離および精製された組み換えレクチンPSL1bタンパク質も提供する。
【００４８】
本発明はまた、本発明の組み換えレクチンを用いる、その表面上にα(2,6)シアル酸を含むシアル酸糖鎖を有する細胞株、細菌、またはウイルスのモニタリング、測定または定量化のためのキットも提供する。
【００４９】
本発明はまた、本発明の組み換えレクチンを用いる、α(2,6)シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖の測定または定量化のためのキットの使用も提供する。
【００５０】
本発明はまた、本発明の組み換えレクチンを用いる、その表面上にα(2,6)シアル酸を含むシアル酸糖鎖を有する細胞株、細菌、またはウイルスのモニタリング、測定または定量化のためのキットの使用も提供する。
【００５１】
本発明はまた、以下のステップ：
(a) 試験サンプルを本発明の組み換えレクチンに接触させるステップ；および
(b) 上記レクチンに結合する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖を分析するステップ
を含む、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖を含む（から構成される）シアル酸化コンジュゲートの測定または定量化のための方法も提供する。
【００５２】
本発明はまた、以下のステップ：
(a) 試験サンプルを本発明の組み換えレクチンに接触させるステップ；および
(b) 上記レクチンに結合する細胞、細菌、またはウイルスを分析するステップ
を含む、シアル酸糖鎖を有する細胞株、細菌、またはウイルスの測定または定量化のための方法も提供する。
【００５３】
本発明の大腸菌PSL1b株（受託番号：KCTC12507BP）またはピチア・パストリスPSL1b株（受託番号：KCTC12500BP）は、シアル酸糖鎖に特異的に結合するアミヒラタケ由来PSL1b組み換えレクチンを効率よく産生することができ、それにより、本発明の菌株は、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖を測定または検出するための組成物またはキットの活性成分として有効に用いることができる。
【００５４】
以下の実施例に示される通りの、本発明の実用的かつ現在好ましい実施形態は、例示的なものである。
【００５５】
しかしながら、当業者が、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲内に入る改変および改良を行なうことができることが理解されるであろう。
【実施例】
【００５６】
実施例1：アミヒラタケ由来組み換えレクチンタンパク質の生成のための遺伝子の合成
アミヒラタケ由来組み換えレクチンタンパク質を生成させるために、以下の実験を行なった。
【００５７】
詳細には、アミヒラタケ由来レクチンに関する遺伝子情報を、米国国立生物工学情報センター（NCBI、登録番号AB120707）の問い合わせ配列を用いて、類似の配列のすべてをスクリーニングすることにより取得した。本発明者らによりスクリーニングされた配列に基づいて、コドン最適化およびRNA二次元構造最適化を介して、44.7％のグアニンおよびシトシンを含有する879bpのポリヌクレオチドを、異種宿主系での標的遺伝子の至適発現を誘導するために、DNA 2.0 Co（米国）にて化学的に合成した。本発明で合成されたポリヌクレオチド配列ならびに転写および翻訳により該ポリヌクレオチドから生成されるポリペプチドは、それぞれ、配列番号1および配列番号2により表わされる。アミヒラタケ由来レクチンPSL1bをコードする野生型遺伝子と化学的に合成された遺伝子との物理的および化学的変化を表1に示す。コドン変化を表2に提示する。
【００５８】
【表１】
0006262345.tif 000002
【００５９】
【表２】
0006262345.tif 000003
【００６０】
実施例2：大腸菌からのアミヒラタケ由来組み換えレクチンタンパク質の生成のための形質転換体菌株のクローニングおよび構築
大腸菌からアミヒラタケ由来組み換えレクチンタンパク質を生成させるために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行なった。
【００６１】
詳細には、実施例1の方法により特定されたポリヌクレオチドの遺伝子情報に基づいて、大腸菌発現ベクターへの実施例1のレクチンタンパク質のクローニングのために、プライマーを構築した。表3に示される通り、構築されたプライマーは、配列番号3および配列番号4により表わされる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、化学的に合成されたポリヌクレオチドを鋳型として用いることにより行なった。前記レクチン遺伝子をコードする897ヌクレオチドの増幅のためのPCR条件は、以下の通りとした：94℃にて30秒間の変性、52℃にて30秒間のアニーリング、72℃にて1分20秒間の伸長、変性から伸長までを35サイクル。増幅された遺伝子を、DNA精製キット（QIAGEN PCR purification kit, Valencia, CA, USA）を用いて精製した。精製された遺伝子および大腸菌での対応する遺伝子のクローニングのためのベクターpET39b（Novagen, USA）を、適切な制限酵素を用いて処理し、制限酵素を用いて処理された遺伝子断片をアガロースゲル上で分離し、続いて上記と同じ精製キットを用いて精製した。精製された遺伝子断片をクローニングベクターpET39bとライゲーションし、大腸菌DH5αを、該ベクターを用いてトランスフェクトした。プラスミドを、トランスフェクトされた大腸菌から分離し、続いてDNA配列決定を行なった（Genotech, Daejeon, Korea）。上記の方法により調製された最終的な組み換えプラスミドは、「pET-PSL1b 8xHis」と命名された（図1）。発現ベクターへとクローニングされた遺伝子は909bp（配列番号5）であり、これは、大腸菌で産生される組み換えレクチンタンパク質をコードすることができ、配列番号6により表わされる合計302個のアミノ酸残基を含み、かつ、これにより組み換えレクチンタンパク質をIMACカラムを介して容易に分離することができるC末端での8個のヒスチジンを有するアミノ酸配列をコードした。その遺伝子配列が特定されている組み換えプラスミドpET-PSL1b 8xHisを、組み換えレクチンPSL1bタンパク質を産生させるために、大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RILに導入した。組み換えレクチンPSL1bを発現する組み換え菌株大腸菌PSL1bは、2013年11月1日に韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology；KRIBB）韓国生命工学研究院遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures；KCTC）に寄託された（KCTC12507BP）。
【００６２】
【表３】
0006262345.tif 000004
【００６３】
実施例3：酵母からのアミヒラタケ由来組み換えレクチンタンパク質の生成のための形質転換体菌株のクローニングおよび構築
酵母からアミヒラタケ由来組み換えレクチンタンパク質を生成させるために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行なった。
【００６４】
詳細には、実施例1の方法により特定されたポリヌクレオチドの遺伝子情報に基づいて、酵母発現ベクターへの実施例1のレクチンタンパク質のクローニングのために、プライマーを構築した。表4に示される通り、構築されたプライマーは、配列番号7および配列番号8により表わされる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、化学的に合成されたポリヌクレオチドを鋳型として用いることにより行なった。前記レクチン遺伝子をコードする915bpの増幅のためのPCR条件は、以下の通りとした：94℃にて30秒間の変性、52℃にて30秒間のアニーリング、72℃にて1分間の伸長、変性から伸長までを40サイクル。増幅された遺伝子を、DNA精製キット（QIAGEN PCR purification kit, Valencia, CA, USA）を用いて精製した。精製された遺伝子および酵母（ピチア・パストリス）での対応する遺伝子のクローニングのためのベクターpPICZα（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を、適切な制限酵素を用いて処理し、制限酵素を用いて処理された遺伝子断片をアガロースゲル上で分離し、続いて上記と同じ精製キットを用いて精製した。精製された遺伝子断片をクローニングベクターpPICZαとライゲーションし、大腸菌DH5αを、該ベクターを用いてトランスフェクトした。プラスミドを、トランスフェクトされた大腸菌から分離し、続いてDNA配列決定を行なった（Genotech, Daejeon, Korea）。上記の方法により調製された最終的な組み換えプラスミドは、「pPICZα-PSL1b 8xHis」と命名された（図2）。上記の発現ベクター中のクローニングを介して酵母（ピチア・パストリス）で産生される組み換えレクチンタンパク質をコードする1173bp長の配列（配列番号9）は、配列番号8により表わされる合計390個のアミノ酸残基を含み、N末端に89個のアミノ酸残基を含むシグナルペプチドを有し、かつ、これにより組み換えレクチンタンパク質を固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）カラムを介して容易に分離することができるC末端での8個のヒスチジンを有するアミノ酸配列（配列番号10）をコードした。その遺伝子配列が特定されている組み換えプラスミドpPICZα-PSL1b 8xHisを、組み換えレクチンPSL1bタンパク質を産生させるために、ピチア・パストリスX-33に導入した。組み換えレクチンPSL1bを発現する組み換え菌株ピチア・パストリスPSL1bは、2013年10月7日に韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology；KRIBB）韓国生命工学研究院遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures；KCTC）に寄託された（KCTC12500BP）。
【００６５】
【表４】
0006262345.tif 000005
【００６６】
実施例4：大腸菌からの組み換えレクチンの精製
＜4-1＞組み換え大腸菌株培養
実施例2に記載された方法により構築された組み換え大腸菌を、抗生物質を含有するLB（Luria-Bertani）培地（トリプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、NaCl 10g/L）中で、37℃にて少なくとも10時間、前培養した。組み換え大腸菌の前培養溶液を、1/100体積でLB培地に接種し、続いて、OD600が0.6〜0.8に到達するまで、37℃で培養した。トランスシアリダーゼの発現を誘導するために、イソプロピル-βD-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度1.0mMでそこに添加し、その後、30℃にて6時間、さらに培養した。細胞を、遠心分離により培養溶液から収集した。
【００６７】
＜4-2＞HisTrapTM FFカラムクロマトグラフィーによる組み換えレクチンの分離
実施例＜4-1＞に記載された方法により取得された細胞から組み換えレクチンを分離するために、HisTrapTMFFカラムクロマトグラフィーを行なった。
詳細には、実施例＜4-1＞に記載されたのと同様に取得した細胞を、50mM Tris-HClバッファー（pH7.6）を用いて3回洗浄した。次に、細胞を、同じバッファー中での15分間の超音波処理により溶解させた。未溶解細胞および不溶性タンパク質を細胞溶解液から除去するために、10000rpmにて30分間、遠心分離を行なった。そこで沈殿した、生じた細胞残渣を除去した。細胞溶解液を、Amersham-Pharmacia FPLC system（GE-Healthcare, USA）を用いて、10mMイミダゾールおよび0.25M NaClを含有する50mM Tris-HClバッファー（pH8.0）を用いて平衡化したHisTrapTM FFカラム（0.7×2.5cm）にロードした。カラムを、細胞溶解液の体積の20倍体積の、同じバッファーを用いて洗浄した。組み換えレクチンを、500mMイミダゾールおよび0.25M NaClを含有する50mM Tris-HClバッファー（pH8.0）を用いて、イミダゾールの濃度を10mMから500mMに増大させることにより溶出させた。このとき、溶出速度は、1分間当たり1mL、分画チューブ当たり0.5mLであった。ピークを示した画分から溶出されたタンパク質を、Amicon(登録商標)Ultra Centrifugal filter 10Kを用いて濃縮した。
【００６８】
＜4-3＞Superose 12カラムクロマトグラフィーによる組み換えタンパク質の分離
より高純度で、実施例＜4-2＞に記載された方法によりHisTrapTM FFカラムを用いて分離された組み換えタンパク質を分離するために、Superose 12カラムクロマトグラフィーを行なった。
【００６９】
詳細には、実施例＜4-2＞に記載された方法により分離された組み換えタンパク質を、50mM Tris-HClバッファー（pH8.0）を用いて平衡化されたSuperose 12 カラム（1.0×30cm）（GE-Healthcare, USA）にロードした。タンパク質を、同じバッファー（1mL/分）を用いて、サイズに従って溶出させた。ピークを示した画分から溶出されたタンパク質を、Amicon(登録商標)Ultra Centrifugal filter 10Kを用いて濃縮した。
【００７０】
＜4-4＞SDS-PAGEによる組み換えレクチンタンパク質の確認
より高純度で、実施例＜4-3＞の方法により分離された組み換えタンパク質を確認するために、SDS-PAGEを行なった。
【００７１】
詳細には、実施例＜4-3＞の方法により取得された粗精製酵素溶液を、SDS-PAGEにより分離し、続いて、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色した。精製されたレクチンタンパク質の純度およびサイズを、Precision Plus ProteinTM Standards（Bio-Rad, USA）を標準タンパク質として用いて分析した。
【００７２】
結果として、図3に示される通り、大腸菌から分離および精製された組み換えPSL1bタンパク質のサイズは、約32kDaであることが確認された（図3）。
【００７３】
実施例5：酵母からの組み換えレクチンの精製
＜5-1＞組み換え酵母菌株培養
実施例3に記載された方法により構築された組み換え酵母菌株を、YPD培地（酵母抽出物10g/L、バクトペプトン20g/L、デキストロース20g/L）中で、30℃にて少なくとも24時間、前培養した。組み換え酵母菌株前培養溶液を、1：100（v/v）の比率で1.5Lの主培養培地中に接種した。主培養培地の組成は、以下の通りとした（1リットル当たり）：50mLグリセロール、833mL蒸留水、0.9g CaSO4、14.67g K2SO4、11.67g MgSO4・7H2O、9g (NH4)2SO4、167mLヘキサメタホスフェート溶液（1L蒸留水当たり、150gヘキサメタホスフェート）、および4mL微量元素溶液。主培養は、2リットルのジャーファーメンター（Jar fermentor, Kobiotech, Korea）にて行なった。酵母は、0.3vvmの通気速度、1,000rpm、pH4.8〜6.4、30℃にて培養した。pHは、10％(v/v)リン酸塩溶液およびアンモニア水を用いて、培養中に制御した。酵母細胞は、培養培地中のグリセロール含量が最大で5g/Lに達するまで培養した。次に、5mLのメタノールを、レクチンタンパク質の発現を誘導するために、そこに注入した。培地中のメタノール含量を、一定間隔でモニタリングした。1g/Lの等量のメタノールを添加した。最初のメタノール注入の48時間後に、培養溶液を回収した。
【００７４】
＜5-2＞酵母細胞と培地との分離
実施例＜5-1＞に記載された方法により調製された酵母培養溶液から、酵母細胞と培養培地とを分離するために、遠心分離を行なった。
【００７５】
詳細には、遠心分離は、A1000S-4Sローターを取り付けたSUPRA 22K遠心分離機（Hanil Science Inc., Korea）を用いて、4℃、7000rpmにて30分間行なった。沈殿した酵母細胞を除去し、上清を取得した。得られた上清を撹拌し、その間に、固相の硫酸アンモニウムを、濃度が80％（飽和濃度）に達するまでそこにゆっくりと加えた。硫酸アンモニウムを添加された上清を、4℃にて少なくとも12時間撹拌した。続いて、遠心分離を、4℃、7000rpmにて1時間行なった。上清を除去し、沈殿物を取得した。沈殿物を50mM Tris-HClバッファー（pH8.0）中に溶解させ、これを、Slide-A-Lyzer(登録商標)透析カセット（Thermo Scientific, Rockford, USA）にロードした。組み換えタンパク質を含有する粗精製酵素溶液を、5Lの上記と同じバッファー中で透析した。12時間の透析後、粗精製酵素溶液を、A500S-6Nローターを取り付けたSUPRA 22K遠心分離機（Hanil Science Inc., Korea）を用いて、4℃、12000rpmにて30分間、遠心分離した。沈殿物を除去し、上清を取得した。
【００７６】
＜5-3＞HisTrapTM FFカラムクロマトグラフィーによる組み換えレクチンの分離
実施例＜5-2＞に記載された方法により取得された粗精製酵素溶液から組み換えレクチンを分離するために、以下の実験を行なった。
【００７７】
詳細には、粗精製酵素溶液を、Amersham-Pharmacia FPLC system（GE-Healthcare, USA）を用いて、10mMイミダゾールおよび0.25M NaClを含有する50mM Tris-HClバッファー（pH8.0）を用いて平衡化したHisTrapTM FFカラム（0.7×2.5cm）にロードした。カラムを、溶液の体積の20倍体積の、同じバッファーを用いて洗浄した。組み換えレクチンを、500mMイミダゾールおよび0.25M NaClを含有する50mM Tris-HClバッファー（pH8.0）を用いて、イミダゾールの濃度を10mMから500mMに増大させることにより溶出させた。このとき、溶出速度は、1分間当たり1mL、分画チューブ当たり0.5mLであった。ピークを示した画分から溶出されたタンパク質を、Amicon(登録商標)Ultra Centrifugal filter 10Kを用いて濃縮した。
【００７８】
＜5-4＞SDS-PAGEによる組み換えレクチンタンパク質の確認
実施例＜5-3＞の方法により取得された粗精製酵素溶液を確認するために、SDS-PAGEを行なった。
【００７９】
詳細には、実施例＜5-3＞の方法により取得された粗精製酵素溶液を、SDS-PAGEにより分離し、続いて、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色した。精製されたレクチンタンパク質の純度およびサイズを、Precision Plus ProteinTM Standards（Bio-Rad, USA）を標準タンパク質として用いて分析した。
【００８０】
結果として、図4に示される通り、上記の酵母から分離および精製された組み換えPSL1bタンパク質のサイズは約40kDaであり、これは大腸菌から分離および精製された組み換えPSL1bタンパク質のサイズよりも若干大きかった。サイズの差異は、対応するレクチン配列中に含まれる潜在的な3箇所のN結合グリコシル化によるものであることが推測された。
【００８１】
実施例6：レクチンブロッティングによるシアル酸糖鎖を含有する糖タンパク質の測定
実施例＜5-4＞の方法により分離されたタンパク質の選択的結合力を調べるために、レクチンブロッティングを行なった。
【００８２】
詳細には、レクチンブロッティングは、α(2,6)-シアリルトランスフェラーゼの存在下で、シアル酸糖鎖を付加されていない非シアル酸化糖タンパク質とCMP-N-アセチルノイラミン酸（CMP-Neu5Ac）との間の反応によりシアル酸化が達成された糖タンパク質を用いて行なった。in vitroシアル酸化のために、α(2,6)-シアリルトランスフェラーゼを発現する細胞抽出物を、PBS（リン酸緩衝生理食塩液）中の、1mg/mLのシアル酸受容体非シアル酸化フェチュイン、0.5mg/mLのシアル酸供与体CMP-Neu5Ac、10mM MnCl2、1％Triton X-100、および0.02単位のTEV（タバコEtchウイルス）プロテアーゼと混合し、続いて、25℃にて6〜12時間反応させた。上記のin vitroシアル酸化により合成されたシアル酸化型非シアル酸化フェチュインのシアル酸結合性をレクチンブロッティングにより調べて、シアル酸の付加を確認した。非シアル酸化フェチュインおよびシアル酸化フェチュインをそれぞれ含有する各タンパク質溶液を5×Laemmliバッファーと混合し、これを次に、10分間加熱した。タンパク質を、8％SDS-PAGE電気泳動により分離した。SDS-PAGEゲル上で分離されたタンパク質を、Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell（Bio-Rad, USA）を用いて、15Vにて1時間、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。3％ウシ血清アルブミン（BSA）、PBST、および0.5％Tweenを含有するPBS（リン酸生理食塩液バッファー）をそこに加え、続いて、1時間ブロッキングした。次に、メンブレンを、上記で調製した1mg/mLのビオチンコンジュゲート化組み換えレクチンタンパク質を含有する3％BSA-PBSにロードし、続いて、室温にて4時間インキュベート（culture）した。組み換えレクチンタンパク質のビオチン化コンジュゲーションは、Antibody Biotinylation Kit（Genomine, Korea）を用いて行なった。メンブレンおよびレクチンをインキュベートした後、メンブレンをPBSTを用いて10分間、6回洗浄し、続いて0.2mg/mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート化抗ビオチン抗体（1：500、Sigma-Aldrich）と1時間反応させた。メンブレンを、上記と同様にPBSTを用いて10分間、6回洗浄した。最後に、シアル酸化タンパク質を、ECLキット（GE Healthcare, USA）により確認した。
【００８３】
結果として、図5に示される通り、レクチンブロットシグナルが、N結合糖鎖Neu5Ac α(2,6) Galβ(1,4)GlcNAcの基本構造およびO結合糖鎖Neu5Acα(2,6)Galβ(1,3)の糖鎖を含有するフェチュイン[GalNA, Neu5Acα(2,6)Galβ(1,3) [Neu5Acα(2,6)Galβ(1,4)GalNAβ(1,6)]で観察された。しかしながら、レクチンブロットシグナルは、陰性対照である非シアル酸化フェチュインGalβ(1,4)GlcNAcの非シアル酸化N糖鎖およびGalβ(1,3) [Galβ(1,4)GalNA β(1,6)]の糖鎖を含有するタンパク質、ならびにα(2,3)シアル酸を含有するフェチュイン（ウシ血清フェチュイン）では観察されなかった（図5）。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明は、α(2,6)シアル酸に特異的に結合する組み換えタンパク質としてPSL1bレクチンを生成させる目的で、以下のステップ：PSL1bレクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを合成するステップ；および異種宿主に合成ポリヌクレオチド遺伝子を導入し、組み換え菌株大腸菌PSL1b（KCTC12507B）およびピチア・パストリスPSL1b（KCTC12500BP）を構築するするステップを含む、活性タンパク質として組み換えレクチンを生成させ、分離し、かつ精製するための方法に関する。本発明の組み換えタンパク質は、シアル酸糖鎖に特異的に結合する組み換えレクチンを含有する、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、糖前駆体、またはオリゴ糖を測定または検出するための組成物またはキットの活性成分として、あるいはシアル酸糖鎖に特異的に結合する組み換えレクチンを含有する、シアル酸糖鎖を有する細胞株、細菌、およびウイルスを測定または検出するための組成物またはキットとして、有効に用いることができる。
【００８５】
受託番号
受託機関：韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology）
受託番号：KCTC12507BP
受託日：20131101
受託機関：韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology）
受託番号：KCTC12500BP
受託日：20131007
【００８６】
当業者は、上述の説明に開示された構想および具体的実施形態を、本発明の同じ目的を実行するための他の実施形態を改変または設計する基礎として用いることができることを理解するであろう。当業者はまた、そのような同等の実施形態が、添付の特許請求の範囲に説明される通りの本発明の精神および範囲から逸脱しないことを理解するであろう。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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