(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種の流体をアレイ内にスポッティングするためのスポッター装置であって、
複数のリザーバであって、各リザーバがその該当する流体を保持している複数のリザーバと、
前記アレイと同じ形態で設けられた複数のオリフィスを有するプリントヘッドと、
複数のチューブであって、各チューブは、前記チューブの第１の端におけるリザーバから前記チューブの前記第２の端における前記プリントヘッドの位置に流体連通をもたらすように構成されている複数のチューブと、
前記オリフィスに複数の滴を形成するために、流体を前記リザーバから前記チューブを通して前記プリントヘッドに送り出すためのポンプと、
前記アレイ及び前記プリントヘッドを接触させるために前記アレイを受け且つ位置決めするプラットフォームであって、各滴がその該当するアレイウエルに移送されるようになっている、プラットフォームと、
前記プリントヘッドに視覚的に接触するように位置決めされたカメラであって、前記カメラは、滴形成の前に同時に前記複数のオリフィスの全ての画像、滴移送の前に同時に前記複数の滴の全ての画像、または前記アレイへの滴移送後に同時に前記プリントヘッドの前記複数のオリフィスの全ての画像の１つまたは複数をもたらすように操作可能になっている、カメラと、
を備えている、スポッター装置。
【請求項２】
前記リザーバの上方に設けられた支持体と、
複数のストローであって、各ストローは、その該当するチューブの第１の端に接続されており、各ストローは、その該当するチューブの前記第１の端から前記支持体を通ってリザーバ内に延出するようになっており、各ストローは、前記ストローをその該当するリザーバの底に付勢するために、前記支持体の上方に位置する錘を有している複数のストローと、
をさらに含んでいる、請求項１に記載のスポッター装置。
【請求項３】
前記リザーバを取り外すとき、前記錘は、前記支持体上に置かれている、請求項２に記載のスポッター装置。
【請求項４】
前記ストローは、剛性または半剛性であり、前記チューブは、エラストマーである、請求項２に記載のスポッター装置。
【請求項５】
前記ポンプは、全てのチューブを同時に送り出すように構成されたポンプをさらに含んでいる、請求項１に記載のスポッター装置。
【請求項６】
前記ポンプは、オフセットポンプヘッドが設けられた蠕動ポンプである、請求項５に記載のスポッター装置。
【請求項７】
前記複数のチューブの各チューブの前記第２の端が前記プリントヘッド上の該当する位置に取り付けられて前記プリントヘッド上にオリフィスをもたらし、前記ポンプの作動が前記リザーバから流体を移動させ、その結果、各オリフィスに流体の滴が生じるようになっている、請求項５に記載のスポッター装置。
【請求項８】
前記アレイは、前記第２の形態で設けられた複数のウエルを備えている、請求項７に記載のスポッター装置。
【請求項９】
ＣＰＵをさらに備えており、前記ＣＰＵは、前記画像を解析するように構成されたソフトウエアを有しており、前記ソフトウエアは、各滴が所定の基準を満たすかどうかを決定するように操作可能になっている、請求項１に記載のスポッター装置。
【請求項１０】
前記滴を照明する光源をさらに備えている、請求項１に記載のスポッター装置。
【請求項１１】
前記光源は、高入射光源である、請求項１０に記載のスポッター装置。
【請求項１２】
各オリフィスは、滑らかな平坦面に研磨された端を有しており、前記端は、前記光源からの光をその該当する滴に反射するように構成されている、請求項１０に記載のスポッター装置。
【請求項１３】
前記リザーバの各々内の前記流体は、前記滴の撮像を助長する蛍光染料を含んでいる、請求項１に記載のスポッター装置。
【請求項１４】
チューブに流体連通する任意の予選択されたリザーバが、流体を前記予選択されたリザーバから前記プリントヘッド上の任意の位置に供給すべく設定されるように、前記チューブは、前記プリントヘッドに取外し可能に接続されるようになっている、請求項１に記載のスポッター装置。
【請求項１５】
前記複数のリザーバは、９６個ウエル付きプレート内のウエルである、請求項１に記載のスポッター装置。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか１つに記載のスポッター装置を用いて複数のウエルを有するアレイをプリントするための方法であって、
流体を前記複数のリザーバから前記プリントヘッド上の前記複数のオリフィスに同時に送り出し、前記アレイと同じ形態を有する複数の滴を前記プリントヘッド上に形成するステップと、
滴形成の前に前記カメラで前記プリントヘッドの画像を捕捉するステップであって、前記カメラは、前記複数のオリフィスの全てを同時に撮像するために前記プリントヘッドの下に配置されている、ステップと、
前記アレイを前記滴に接触させるステップと、
各滴をその該当するウエル内に同時に移送するステップと、
を含んでいる、方法。
【請求項１７】
前記アレイを前記滴に接触させる前に、前記滴を撮像し、前記複数の滴の全ての概算体積が所定の上側閾値及び下側閾値の範囲内であるかどうかを決定するステップ
をさらに含んでいる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
もし１つまたは複数の滴が前記所定の上側閾値を超えたり前記所定の下側閾値よりも低いと決定されたなら、前記アレイは、廃棄されるようになっている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
もし前記滴の１つまたは複数が前記所定の上側閾値を超えたり前記所定の下側閾値よりも低いと決定されたなら、吸取材料が前記滴に接触するように移動され、前記送出ステップおよび前記撮像ステップが繰り返されるようになっている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
１種または複数種の液体を予選択された配列の複数のウエルに送達するためのシステムであって、
複数のチューブであって、各チューブは、リザーバに流体連通する第１の端およびオリフィスで終端する第２の端を有している複数のチューブと、
複数の前記リザーバと、
各オリフィスの位置が前記予選択された配列の複数のウエルの１つに対応すべく、各オリフィスを所定位置に移動可能に保持するように操作可能なプリントヘッドと、
複数のストローであって、各ストローは、第１の端を第２の端に接続する中空開口を有しており、前記第１の端は、対応するチューブの前記第１の端に流体接続されており、前記第２の端は、対応するリザーバの底部分に取外し可能に接触するようになっている、複数のストローと、
所定量の流体を各ストローの前記第２の端からその対応するチューブを通してその対応するオリフィスの外に付勢するように操作可能な計量装置と、
前記アレイ及び前記プリントヘッドを接触させるために前記アレイを受け且つ位置決めするプラットフォームであって、各滴がその該当するアレイウエルに移送されるようになっている、プラットフォームと、
前記プリントヘッドに視覚的に接触するように位置決めされたカメラであって、前記カメラは、滴形成の前に同時に前記複数のオリフィスの全ての画像＊１、滴移送の前に同時に前記複数の滴の全ての画像、または前記アレイへの滴移送後に同時に前記プリントヘッドの前記複数のオリフィスの全ての画像の１つまたは複数をもたらすように操作可能になっている、カメラと、
を備えている、システム。
【請求項２１】
前記計量装置は、前記複数のチューブの前記第１の端と前記第２の端との間に配置されている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
複数のウエルのアレイをさらに備えており、各ウエルは、前記予選択された量の液体を対応するオリフィスから受けるように操作可能になっている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２３】
ウエルの数が、リザーバの数を超えている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２４】
各リザーバは、予選択された量の液体を保持するように操作可能な底部を備えており、１つまたは複数のストローを受けるように構成された上部をさらに備えている、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
各チューブと流体連通する１つまたは複数の弁をさらに備えており、前記１つまたは複数の弁は、各チューブを通る流体の移動を停止するように操作可能になっている、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
各オリフィスは、内腔および外面を備えており、前記オリフィスは、表面張力が失われるまで、その外面に隣接して予選択された量の前記流体の滴を保持するように、寸法決めされ、かつ形作られている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２７】
予選択された配列の複数のウエルは、移動可能なプラットホーム上に取外し可能に保持されるようになっており、前記移動可能なプラットホームは、前記プリントヘッドに対して第１の位置および第２の位置を有しており、
前記第１の位置は、前記複数のウエルの各々が前記対応するオリフィスによって保持された前記滴と接触するように、前記プリントヘッドに極めて近接しており、
前記第２の位置は、任意のウエルと対応するオリフィスによって保持された任意の滴との間に接触が生じないように、前記プリントヘッドから遠くに離れている、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記第１の位置において、任意のウエルが任意のオリフィスに接触しないようになっている、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
前記計量装置は、蠕動ポンプである、請求項２０に記載のシステム。
【請求項３０】
２つ以上のオリフィスの前記位置が、前記予選択された配列の複数のウエルの単一ウエルに対応するようになっている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項３１】
コンピュータ装置をさらに備えており、
前記コンピュータ装置は、前記ウエルのアレイへの移送の前または後のいずれかにおいて、前記プリントヘッドにおける滴の配列を許容するかまたは排除するように、前記カメラと連動している、請求項２０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記撮像システムは、各滴の大きさを決定するようになっており、各滴は、前記大きさを基準と比較することによって、許容されるかまたは排除されるようになっている、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記大きさは、半径である、請求項３２に記載のシステム
【請求項３４】
プリントヘッドから前記ウエルのアレイへの流体の移送を助長するように構成された脱イオン装置をさらに備えている、請求項２０に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［政府の利益］
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＡＩ０６１６１１の下に政府支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
米国、カナダ、および西ヨーロッパにおいて、感染症は、死亡者数の略７％を占めており、その一方、発展途上国では、感染症は、死亡者数の４０％超を占めている。感染症は、種々の臨床症状をもたらす。よく見られる徴候は、熱、肺炎、髄膜炎、下痢、および血液含有下痢である。これらの身体的徴候は、一部の病原菌を暗示するが、他の病原菌を病原因子として見逃すことになる。従って、種々の潜在的な原因因子がとどまっており、確実な診断のために、多くの場合、種々のアッセイを行う必要がある。病原菌を診断するための伝統的な微生物学技術は、数日または数週間掛かる場合があり、適当な治療過程が遅れる場合がある。
【０００３】
近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、感染性因子の迅速な分析を行うための１つの選択肢になってきている。ＰＣＲは、感染性因子を分析するための迅速、高感度、かつ特効性のある手段である。診断の主要な手段としてＰＣＲを用いる際の課題は、多様な原因生物が存在すること、およびいくつかの病原学的標本に存在する生物の数が少ないことである。可能性のある原因生物ごとに、その殆どが陰性になることが予想されるにも関わらず、ＰＣＲアッセイのために大きなパネルを用いることは、多くの場合、非実用的である。病原菌の核酸が低濃度であり、十分な反応鋳型を充分に収集するために多量の試料が必要となる場合に、問題が悪化する。場合によっては、可能性のある全ての病原因子をアッセイするための試料が不十分になることもある。１つの解決策は、「多重化ＰＣＲ」を行うことである。多重化ＰＣＲでは、単一の反応によって、試料が多数の標的に対して同時にアッセイされる。多重化ＰＣＲは、いくつかのシステムによってその価値が認められているが、高レベルの多重反応におけるローバスト性に関する欠点および複数の産物の明瞭な分析の困難さが存在する。これらの問題を解決するために、アッセイは、その後、多重二次ＰＣＲに分割されるとよい。一次産物内において二次反応をネスティングすることによって、ローバスト性が向上する。しかし、このさらなる処理は、高価になる場合があり、汚染または他の問題を引き起こす可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、生物学的分析を行うために材料を処理する際の種々の課題に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様では、複数の流体をアレイ内にスポッティングするためのスポッター装置が記載されている。このスポッター装置は、第１の形態で設けられた複数のリザーバであって、各リザーバがその該当する流体を保持している複数のリザーバと、第２の形態で設けられた複数の位置を有するプリントヘッドであって、第２の形態は、第１の形態と異なっているプリントヘッドと、複数のチューブであって、各チューブは、チューブの第１の端におけるリザーバからチューブの第２の端におけるプリントヘッドの位置に流体連通をもたらすように構成されている複数のチューブと、流体をリザーバからチューブを通してプリントヘッドに送り出すためのポンプと、を備えている。スポッター装置の構成、ポンプ、プリントヘッド、および他の構成部品の種々の特徴が、本明細書に記載されている。
【０００６】
本発明の他の態様では、ある形態にある複数のウエルを有するアレイをプリントするための方法が提供されている。この方法は、流体を複数のリザーバからプリントヘッド上の複数の位置に同時に送り出し、アレイと同じ形態を有する複数の滴をプリントヘッド上に形成するステップと、アレイを滴に接触するように移動させるステップと、各滴をその該当するウエル内に同時に移送するステップと、を含んでいる。このような方法によって製造されるアレイも開示されている。
【０００７】
さらに他の態様では、１種または複数種の液体を予選択された配列の複数のウエルに送達するためのシステムが提供されている。このシステムは、複数のチューブであって、各チューブは、リザーバに流体連通する第１の端およびオリフィスで終端する第２の端を有している複数のチューブと、複数のリザーバであって、互いに対して所定の形態で設けられている複数の前記リザーバと、各オリフィスの位置が予選択された配列の複数のウエルの１つに対応するように、各オリフィスを所定位置に移動可能に保持すべく操作可能なプリントヘッドと、複数のストローであって、各ストローは、第１の端を第２の端に接続する中空開口を有しており、第１の端は、対応するチューブの第１の端に流体接続されており、第２の端は、対応するリザーバの底部分に取外し可能に接触するようになっている複数のストローと、所定量の流体を各ストローの第２の端からその対応するチューブを通してその対応するオリフィスの外に付勢するように操作可能な計量装置と、を備えている。
【０００８】
本発明の付加的な特徴は、ここに記載されている本発明を実施する最良の形態を具体化する好ましい実施形態の以下の詳細な説明を検討すれば、当業者に明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施形態による可撓性ポーチを示す図である。
【図２】図１による可撓性ポーチの細胞溶解区域の一実施形態を示す図である。
【図２ａ】図２に示されている細胞溶解区域に対応するブラダーの一部の実施形態を示す図である。
【図２ｂ】代替的な渦流機構を有する、図１による可撓性ポーチの細胞溶解区域の実施形態を示す図である。
【図３】図１による可撓性ポーチの核酸調製区域の実施形態を示す図である。
【図４】図１による可撓性ポーチの第１段階増幅区域の実施形態を示す図である。
【図５】ポーチの代替的実施形態を示すことを除けば、図１と同様の図である。
【図５ａ】図５のポーチの取付具の断面図である。
【図５ｂ】図５のポーチの一部の拡大図である。
【図６】ポーチの他の代替的実施形態の斜視図である。
【図６ａ】図６のポーチの取付具の断面図である。
【図７】図６のポーチと共に用いられる例示的なブラダー構成部品を示す図である。
【図８】図６のポーチを含む、図６のポーチと共に用いられる機器の分解斜視図である。
【図９】図６のポーチが影で示されている、図７のブラダー構成部品を含む図８の機器の部分断面図である。
【図１０】図６のピンチ弁用の種々のブラダーおよびポーチを含む、図８の機器の部分断面図である。
【図１１】図５のポーチにおいて溶解され、かつ増幅された試料の第２段階増幅から得られた増幅曲線である。
【数１】
0006367183.tif 000002
【図１２】第２段階高密度アレイを有するポーチを示すことを除けば、図６と同様の図である。
【図１３】図８の機器の構成部品の修正を示す図である（支持部材は、図１２のポーチと共に用いられるように構成されたモータを備えている）。
【図１４】図１２の第２段階高密度アレイの分解斜視図である。
【図１５】第２段階高密度アレイの作製中の図１２の第２段階高密度アレイの底面図である。
【図１６】異なる配列のウエルを有することを除けば、図１４および図１５に示されているものと同様の部分的に作製された高密度アレイを示す図である。
【図１７】詳細な下部を示すために配置アームが取り外されている、スポッターの斜視図である。
【図１８】配置アームが示されていることを除けば、図１７と同様の図である。
【図１９】図１８のスポッターの一部の右側面図である。
【図２０】図１７の線２０−２０に沿った断面図である。
【図２１】図１７の線２１−２１に沿った断面図である。
【図２２】９６個の十分な滴を示す、図１７のプリントヘッドの底面図である。
【図２３】７６個の滴しか示されていないことを除けば、図２２と同様の図である。
【図２４】配置アームの詳細を示す、図１８のスポッターの右側面図である。
【図２５】配置アームがアレイをプリントヘッドに接触するまで移動させたことを除けば、図２４と同様の図である。
【図２６】スポッターシステムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書に記載されている内蔵型核酸分析ポーチは、例示的に、単一の閉鎖システム内において、試料を種々の生物学的物質、例えば、抗原および核酸配列の存在についてアッセイするために用いられるとよい。一実施形態では、ポーチは、多数の病原菌のアッセイに用いられる。例示的には、任意選択的に使い捨て可能なポーチにおいて、種々のステップ、例えば、核酸調製、大量の一次多重ＰＣＲ、一次増幅産物の希釈、および二次ＰＣＲ、これに加えて、実時間検出および／または増幅後分析、例えば、融解曲線分析を行うことができる。しかし、病原菌検出は、１つの例示的な使用法であり、ポーチは、他の核酸分析または他の物質、例えば、制限されるものではないが、ペプチド、毒素および小分子の検出に用いられてもよいことを理解されたい。さらに、種々のステップが本発明のポーチ内において行われてもよいが、いくつかの使用において、これらのステップの１つまたは複数が省略されてもよく、それに応じて、ポーチ構成が変更されてもよいことを理解されたい。
【００１１】
ＰＣＲは、本明細書の実施例に用いられる増幅方法であるが、プライマーを用いるどのような増幅方法も適切に用いられることを理解されたい。このような適切な手順の例として、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列基増幅（ＮＡＳＢＡ）、カスケードローリングサークル増幅（ＣＲＣＡ）、ＤＮＡのループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、等温キメラプライマー核酸増幅（ＩＣＡＮ）、ターゲット基ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、などが挙げられる。従って、ＰＣＲという用語が用いられる場合、他の代替的な増幅方法を含むことを理解されたい。プロトコルは、それに応じて調整される必要があることを理解されたい。
【００１２】
図１は、例示的な内蔵型核酸分析ポーチ１０を示している。ポーチ１０は、細胞溶解区域２０、核酸調製区域４０、第１段階増幅区域６０，および第２段階増幅区域８０を有している。核酸を含む試料は、試料注入ポート１２を介して、ポーチ１０内に導かれる。ポーチ１０は、種々の通路および種々の大きさのブリスターを備えており、試料がシステムを通って流れるように配置されている。試料は、種々の区域を通り抜け、それに応じて処理されることになる。
【００１３】
試料処理は、ポーチ１０内に配置された種々のブリスター内において行われる。試料を処理区域内に移動させるために、かつ試料を処理区域間で移動させるために、種々のチャネルが設けられている。その一方、流体および試薬を試料に送達するために、また試料からこのような流体および試薬を取り出すために、他のチャネルが設けられている。ポーチ１０内の液体は、例示的には、圧力、例えば、以下に述べる空圧によってブリスター間を移動するようになっているが、ポーチ内において材料を移動させる他の方法も考えられる。
【００１４】
他の容器が用いられてもよいが、例示的に、ポーチ１０は、２層の可撓性プラスチックフィルムまたは他の可撓性材料、例えば、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリル酸、およびこれらの混合物から形成されている。これらの材料は、当技術分野において周知のどのようなプロセス、例えば、押出成形、プラズマ蒸着、およびラミネート加工によって、作製可能である。金属箔またはアルミニウムが積層されたプラスチックが用いられてもよい。ブリスターおよびチャネルを形成するように互いに封止することができる他のバリア材料も、当技術分野において周知である。もしプラスチックフィルムが用いられるなら、これらの層は、例示的に、熱融着によって一緒に接合されるとよい。例示的に、この材料は、低い核酸接合力を有している。
【００１５】
蛍光モニタリングを用いる実施形態では、操作波長における吸光度および自己蛍光が充分に低いプラスチックフィルムが好ましい。このような材料は、種々のプラスチック、種々の可塑剤、および組成比、ならびに種々のフィルム厚みを試すことによって、特定されるとよい。アルミニウムまたは他の箔が積層されたプラスチックの場合、蛍光検出装置によって読み取られるポーチの部分は、箔が存在しないようになっているとよい。例えば、もしポーチ１０の第２段階増幅区域８０のブリスター８２内において蛍光がモニターされるなら、ブリスター８２の一方または両方の層は、箔が存在しないようになっているとよい。ＰＣＲの実施例において、約０．００４８インチ（０．１２１９ｍｍ）厚みのポリエステル（Ｍｙｌａｒ、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）、デラウエア州ウィルミントン）および０．００１〜０．００３インチ（０．０２５〜０．０７６ｍｍ）厚みのポリプロピレンフィルムから構成されたフィルムラミネートが良好である。例示的に、ポーチ１０は、入射光の略８０％〜９０％を透過することができる透明な材料から製造されている。
【００１６】
例示的実施形態では、材料は、圧力、例えば、空圧をブリスターおよびチャネルに印加することによって、ブリスター間を移動するようになっている。従って、空圧を用いる実施形態では、ポーチ材料は、例示的に、空圧が所望の効果をもたらすのに充分な可撓性を有している。本明細書に用いられる「可撓性（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）」という用語は、ポーチの材料の物理的特性を記述するために用いられている。本明細書において、「可撓性」という用語は、亀裂、破断、ヒビ割れ、などを生じることなく、空圧のレベルによって容易に変形可能な特性として定義されている。例えば、薄いプラスチックシート、例えば、ＳｅｒａｎＴＭラップおよびＺｉｐｌｏｃ(登録商標)バッグ、ならびに薄い金属箔、例えば、アルミニウム箔は、可撓性を有している。しかし、空圧を用いる実施形態においても、ブリスターおよびチャネルの一部の領域しか可撓性を必要としない場合がある。さらに、ブリスターおよびチャネルが容易に変形可能である限り、ブリスターおよび通路の一方しか可撓性を必要としない場合がある。ポーチ１０の他の領域は、剛性材料から作製されていてもよく、または剛性材料によって補強されていてもよい。
【００１７】
例示的には、プラスチックフィルムがポーチ１０に用いられている。金属、例えば、アルミニウムまたは他の適切な材料のシートが、隆起面のパターンを有する型を形成するように、圧延加工または切削加工されるとよい。例示的には１９５℃の作動温度で調整される空圧プレス（例えば、Ａ−５３０２―ＰＤＳ、Janesville Tool Inc.、ウィスコンシン州ミルトン）内に装着されると、この空気プレスが印刷機のように機能し、型がプラスチックフィルムと接触している箇所のみ、プラスチックフィルムの密封表面を融解することになる。ポーチ１０が形成されるとき、種々の成分、（例示的にはフィルム上にスポッティングされ、乾燥される）ＰＣＲプライマー、抗原結合物質、磁気ビーズ、および珪酸ジルコニウムビーズが、種々のブリスター内に密封されるとよい。試料処理用の試薬は、密封前に、フィルム上に一緒にまたは個別にスポッティングされるとよい。一実施形態では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）がポリメラーゼおよびプライマーとは別にフィルム上にスポッティングされ、水性試料によって反応が水和されるまで、ポリメラーゼの活性を本質的に排除するようになっている。水性試料が水和の前に加熱される場合、正確なホットスタートＰＣＲのための条件が満たされ、ホットスタート用の高価な化学成分の必要性が低下または排除されることになる。この別々のスポッティングは、図５ｂに関して、以下にさらに詳細に説明するが、このようなスポッティングは、本明細書に記載されている実施形態のいずれに用いられてもよいことを理解されたい。
【００１８】
ポーチ１０内の材料を移動させるために空圧が用いられる場合、一実施形態では、「ブラダー（ｂｌａｄｄｅｒ）」が用いられるとよい。ブラダーアセンブリ７１０（この一部が図２aに示されている）は、ポーチを製造するためのプロセスと同様のプロセスによって作製されるとよいが、ブラダーアセンブリ７１０内の個々のブリスターは、ブラダーアセンブリ７１０内の個々のブリスターが圧縮ガス源によって加圧されることを可能にする空圧取付具（例えば、取付具７２４ａ）を含んでいるとよい。ブラダーアセンブリは、圧縮ガスを受けるものであり、複数回使用できるようになっているので、ポーチよりも強い材料または厚い材料から作製されているとよい。代替的に、ブラダーは、ガスケット、シール、弁、およびピストンと一緒に固定された一連のプレートから形成されていてもよい。他の構成も本発明の範囲内にある。
【００１９】
ポーチ１０が機器内に配置されると、空圧ブラダーアセンブリ７１０がポーチ１０の１つの面に押し付けられ、これによって、特定のブラダーが膨張すると、その圧力がポーチ１０内の対応するブリスターから液体を押し出すことになる。ポーチ１０のブリスターの多くに対応する空圧ブラダーに加えて、ブラダーアセンブリは、ポーチ１０の種々のチャネルに対応する付加的な空圧アクチュエータ、例えば、ブラダーまたは空圧によって駆動されるピストンを有していてもよい。これらの付加的な空圧アクチュエータは、作動されると、ピンチ弁を形成し、対応するチャンネルを締付けることによって閉鎖する。ポーチ１０の特定のブリスター内に液体を閉じ込めるために、ピンチ弁空圧アクチュエータは、ブリスターに通じるチャンネルの全体にわたって膨張し、これによって、アクチュエータがピンチ弁として機能し、該チャネルを締付けることによって閉鎖する。例示的に、互いに異なるブリスター内の２つの液体の量を混合するために、連結チャンネルを封止しているピンチ弁空圧アクチュエータが減圧され、該ブリスターに面する空圧ブラダーが交互に加圧され、これによって、ブリスターに接続されたチャネルを通して液体を往復させ、その結果、液体が混合されることになる。ピンチ弁空圧アクチュエータは、種々の形状および種々の大きさを有することができ、２つ以上のチャネルを同時に締め付けるように構成されていてもよい。このような例示的なピンチ弁は、ピンチ弁１６として、図１に示されている。ピンチ弁１６は、全ての注入ポートを閉鎖するのに用いられるとよい。本明細書では、空圧アクチュエータが検討されているが、ポーチに圧力を供給する他の方法、例えば、リニアステッパモータまたはモータ駆動カムのような種々の電気機械アクチュエータ、空圧力、流体圧、または電磁気力によって駆動される剛性パドル、ローラ、ロッカーアーム、場合によっては、コックバネも考えられることを理解されたい。さらに、チャネルの軸と直交する方向に圧力を印加する方法に加えて、可逆的または非可逆的にチャネルを閉鎖する種々の方法もある。これらの例として、チャネルを横切ってバッグを捻る方法、熱融着する方法、アクチュエータを回転させる方法、および蝶弁およびボール弁のようなチャネル内に封入された種々の物理的弁を用いる方法が挙げられる。加えて、小型のペルチェ素子または他の温度調整器が、チャネルに隣接して配置され、流体を凍結させるのに充分な温度に設定され、シールを効果的に形成するようになっていてもよい。また、図１の設計は、ブリスターおよびチャネルの各々の上に配置されたアクチュエータ要素によって特徴付けられる自動機器に適合されているが、アクチュエータが静止した状態に維持され、ポーチが一次元または二次元的に移行する構成も考えられる。この場合、処理ステーションのいくつか、例えば、試料破壊、核酸捕捉、第１段階ＰＣＲおよび第２段階ＰＣＲ、ならびに免疫アッセイおよび免疫ＰＣＲのようなポーチの他の用途に対して、わずかな数のアクチュエータしか用いられないようにすることができる。チャネルおよびブリスターに作用するローラは、ポーチがステーション間を移行する構成では、特に有用であることが分かっている。従って、空圧アクチュエータが、ここに開示されている実施形態において用いられているが、「空圧アクチュエータ」という用語が本明細書に用いられる場合、ポーチおよび機器の構成に応じて、圧力をもたらす他のアクチュエータおよび他の方法が用いられてもよいことを理解されたい。
【００２０】
図１を参照すると、核酸抽出および多重ＰＣＲ用に構成された例示的な試料ポーチ１０が準備される。試料は、取付具９０の試料注入ポート１２を介してポーチ１０内に入るようになっている。注入ポート１２は、脆弱シール、一方向弁、または他の入口ポートであるとよい。ポーチ１０内の真空が試料をポーチ１０内に引き込むために用いられるとよい。注射器または他の圧力が試料をポーチ１０内に押し込むために用いられてもよいし、または試料を注入ポート１２を介してポーチ１０内に導く他の手段が用いられてもよい。試料は、チャネル１４を介して、細胞溶解区域２０の３ローブ式ブリスター２２内に移動し、該３ローブ式ブリスターにおいて、試料内の細胞が溶解される。試料が３ローブ式ブリスター２２に入ると、ピンチ弁１６が閉鎖される。すでに閉じられているピンチ弁３６に加えて、ピンチ弁１６が閉じられることによって、試料が３ローブ式ブリスター２２内に密封される。細胞溶解は、全ての試料に必ずしも必要ではないことを理解されたい。このような試料の場合、細胞溶解区域は、省略されてもよいし、または試料が次の区域に直接移動するようになっていてもよい。しかし、多くの試料では、細胞溶解は、必要である。一実施形態では、細胞の溶解にビーズ粉砕（ｂｅａｄ−ｍｉｌｌｉｎｇ）が用いられている。
【００２１】
珪酸ジルコニウム（ＺＳ）ビーズ３４のような溶解用粒子の存在下で試料を振動または渦撹拌するビーズ粉砕は、溶解物を形成するのに効果的な方法である。本明細書に用いられる「溶解（ｌｙｓｅ）」、「溶解する（ｌｙｓｉｎｇ）」および「溶解物（ｌｙｓａｔｅ）」のような用語は、細胞を破裂させることに制限されず、ウイルスのような非細胞粒子の破壊も含むことを理解されたい。図２は、細胞溶解区域２０の一実施形態を示している。ここでは、集束流が高速ビーズ衝突をもたらし、これによって、溶解物を生じるようになっている。例示的には、３ローブ式ブリスター２２の２つの下側ローブ２４，２６が、チャネル３０を介して互いに接続されており、上側ローブ２８が、チャネル３０の反対側３１において、下側ローブ２４，２６に接続されている。図２ａは、ポーチ１０の細胞溶解区域２０に接触することになるブラダーアセンブリ７１０の対応部分を示している。ポーチ１０が機器内に配置されると、ブラダーアセンブリ７１０の対応する空圧ブラダー７２４，７２６，７２８が、それぞれ、ポーチ１０のローブ２４，２６，２８に隣接する。「隣接（ａｄｊａｃｅｎｔ）」という用語は、ポーチ内のブリスターまたはチャネルとその対応する空圧アクチュエータとの関係に関して用いられる場合、ポーチが機器内に配置されたときのブリスターまたはチャネルと対応する空圧アクチュエータとの関係を指すことと理解されたい。一実施態様では、下側ローブ２４，２６に隣接する２つの下側空圧ブラダー７２４，７２６の空圧取付具７２４ａ，７２６ａは、一緒に組み込まれている。空圧取付具７２４ａ，７２６ａと、上側ローブ２８に隣接する上側空圧ブラダー７２８の空圧取付具７２８ａとは、複動式空圧シリンダーを駆動させるように構成された電気作動式弁の対向側に組み込まれている。このように構成されていることによって、上側空圧ブラダー７２８および２つの下側空圧ブラダー７２４，７２６との間に圧力が交互に加えられる。弁が交互に切り換えられると、ポーチ１０内の液体は、チャネル３０内の狭い連結部３２を通って、下側ローブ２４，２６と上側ローブ２８との間を移動することになる。２つの下側ローブ２４，２６が同時に加圧されると、流れが集束し、上側ローブ２８内に流れ込む。ローブの幾何学的形状にもよるが、連結部３２におけるビーズ３４の衝突速度は、少なくとも約１２ｍ/秒であるとよく、これによって、高衝撃の衝突をもたらし、その結果、細胞溶解をもたらすことになる。例示的な３ローブ式システムは、大きさおよび空気ガスの消費を最小限に抑えながら、良好な細胞破壊および良好な構造堅牢性を可能にとする。ＺＳビーズが溶解粒子として用いられているが、この選択は、単なる例示にすぎず、他の物質および別の形状の粒子が用いられてもよいことを理解されたい。また、細胞溶解区域２０の他の構成も本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【００２２】
３ローブ式ブリスターが細胞溶解のために用いられているが、他の多重ローブ式構成も本発明の範囲内にあることを理解されたい。例えば、例示的にクローバ葉のパターンを有する４ローブ式ブリスターが用いられてもよく、この場合、両側のブリスターが同時加圧され、溶解粒子を互いに向かう方に押し出し、次いで、他の２つのローブに対して偏らせ、この後、一緒に加圧されるようになっている。このような４ローブ式ブリスターは、両方向において高速衝撃をもたらすという利点がある。さらに、単一ローブ式ブリスターを用いることも考えられる。この場合、溶解粒子が単一ローブ式ブリスターの１つの部分から他の部分に迅速に移動することができる。例えば、空圧アクチュエータを用いて、単一ローブ式ブリスターのある領域を閉じ、これによって、残りの領域内に多重ローブ式ブリスターを一時的に形成することができる。他の作動方法、例えば、装置のローブに作用するモータ、空圧、流体圧、または電磁気によって駆動されるパドルが用いられてもよい。例えば、もし再循環手段が上側ローブと下側ローブとの間に設けられており、アクチュエータが蠕動ポンプ作用をもたらすなら、ローラまたは回転パドルを用いて、流体を図２の連結部３２の位置において一緒に移動させることができる。他の構成も本発明の範囲内にある。
【００２３】
単一ローブ式溶解ブリスター内において、多重ローブ式ブリスターを一時的に形成することなく、溶解をもたらすため充分迅速に試料および溶解粒子を移動させることも可能である。このような１つの代替的実施形態では、図２ｂに示されているように、電動モータ１９に取り付けられた回転ブレードまたはパドル２１によってポーチに衝撃を与えることによって、渦巻きが形成されるとよい。ブレード２１は、溶解ブリスターにおいてポーチに衝撃を与えてもよいし、または溶解ブリスター近傍、例えば、溶解ブリスターに隣接するエッジ１７においてポーチに衝撃を与えてもよい。このような実施形態では、溶解ブリスターは、１つまたは複数のブリスターを備えているとよい。図１２は、このような１つの溶解ブリスター５２２を備える実施形態を示している。図１３は、ブレード２１を備えるビーズ撹拌モータ１９を示している。このモータ１９は、図８に示されている機器８００の第２の支持部材８０４の第１の側８１１に取り付けられるとよい。しかし、モータ１９は、機器８００の第１の支持部材８０２または他の構造部に取り付けられてもよいことを理解されたい。
【００２４】
図２ａは、空圧取付具７１６ａを有する空圧プラダー７１６および空圧取付具７３６ａを有する空圧プラダー７３６を示している。ポーチ１０がプラダーアセンブリ７１０に接触して配置されると、ブラダー７１６は、チャネル１２と真っ直ぐに並び、ピンチ弁１６をもたらすことになる。同様に、プラダー７３６は、チャネル３８と真っ直ぐに並び、ピンチ弁３６をもたらすことになる。空圧プラダー７１６，７３６の作動によって、ピンチ弁１６，３６が開閉する。プラダーアセンブリ７１０の細胞溶解区域に隣接する部分しか示されていないが、プラダーアセンブリ７１０は、同様の配置の空圧プラダーを備えており、ポーチ１０の残りの区域の全体にわたって流体の移動を制御するようになっていることを理解されたい。
【００２５】
他の従来技術の機器が、密封された可撓性容器内におけるＰＣＲを示唆している。例えば、米国特許第６，６４５，７５８号、米国特許第６，７８０，６１７号、および同時係属中の米国特許出願第１０/４７８，４５３号を参照されたい。これらの開示内容は、参照することによって、ここに含まれるものとする。しかし、密封されたＰＣＲ容器内に細胞溶解区域を含むことによって、特に生体有害物質を含む試料が試験される場合に使い易さおよび安全性を改良することができる。本明細書に示されている実施形態では、細胞溶解からの廃棄物ならびに他の全てのステップからの廃棄物が、密封されたポーチ内に残留する。しかし、ポーチの内容物は、さらなる試験のために除去されてもよいことを理解されたい。
【００２６】
いったん細胞が溶解されると、ピンチ弁３６が開き、溶解物は、チャネル３８を通って図３において最も良く示されている核酸調製区域４０に移動し、この後、ピンチ弁３６が閉じ、試料が核酸調製区域４０内に密閉される。図３に示されている実施形態では、核酸の精製は、ビーズ粉砕された材料を取り出し、シリカ基磁気ビーズ５６への親和性結合によって、ビーズをエタノールによって洗浄し、核酸を水または他の流体によって溶出し、細胞溶解物から核酸を溶離させることによって、行なわれる。核酸抽出に必要な個々の成分は、例示的には、ブリスター４４，４６，４８内に配置されており、これらのブリスターが、試薬の混合を可能にするために、チャネル４５，４７，４９によって互いに接続されている。溶解物は、チャネル３８からブリスター４４に入る。ブリスター４４は、磁気ビーズ５６および適切な結合緩衝液、例えば、１−２−３ＴＭ試料調製キット（Idaho Technology、ユタ州ソルトトレークシティー）のような高塩緩衝液を含んでいるとよく、またはこれらの成分のいずれかまたは両方が、ブリスター４４に連結された１つまたは複数のチャネルを通して後で供給されてもよい。核酸がビーズ上５６に捕捉され、次いで、ピンチ弁５３が開くと、溶解物およびビーズ５６は、ブリスター４４，５８に交互に加えられる弱い圧力によって混合され、その後、例示的にはプラダーアセンブリ７１０の対応する空圧プラダーによって供給される空圧を介して、ブリスター５８に移動することになる。磁気ビーズ５６は、機器内においてブリスター５８に隣接して配置された格納式磁石５０によってブリスター５８内に捕捉され、廃棄物は、廃棄物リザーバに移動されてもよいし、またはブリスター５８に圧力を印加することによって、ブリスター４４に戻されてもよい。次いで、ピンチ弁５３が閉鎖される。ピンチ弁５５が開くと、磁気ビーズ５６は、ブリスター４６から供給されるエタノール、イソプロパノール、または他の有機または無機洗浄溶液によって洗浄されることになる。任意選択的に、磁石５０が後退され、これによって、ブリスター４６，５８に交互の圧力を加えることによって、ビーズが洗浄されてもよい。ビーズ５６は、磁石５０によって再び捕捉される。溶解物の非核酸部分は、ビーズ５６から洗い流され、ブリスター４６に戻され、ピンチ弁５５によって該ブリスター内に保留されてもよいし、または他のチャネルを介して廃棄物チャンバに洗い流されてもよい。磁気ビーズが洗浄されると、ピンチ弁５７が開き、水（例えば、緩衝用水）または他の核酸溶離液が、ブリスター４８から放出される。ここでも、磁石５０が後退され、これによって、例示的にブリスター４８，５８に交互に圧力を加えることによって、水およびビーズ５６を最大限に混合することができる。磁石５０が再び展開され、ビーズ５６を収集する。ピンチ弁５９が開き、溶離された核酸は、チャネル５２を介して第１段階増幅区域６０に移動する。次いで、ピンチ弁５９が閉鎖され、これによって、試料が第１段階増幅区域６０内に保留されることになる。
【００２７】
図３に示され、かつ前述された核酸構成区域４０の構成は、単なる例示にすぎず、種々の他の設定が本開示の範囲内において可能であることを理解されたい。
【００２８】
本明細書において用いられるエタノール、水、および他の流体は、種々の方法によってブリスターに供給されるとよい。流体は、ブリスター内に貯蔵されていてもよい。この場合、ブリスターのネックが、種々のピンチ弁または脆弱部によって締付けられており、試料調製シーケンスの適切な時間に開けられるようになっているとよい。代替的に、流体は、図５のポーチ１１０に示されているように、ポーチのリザーバ内に貯蔵され、または図６のポーチ２１０に関して説明するような取付具内に貯蔵され、必要に応じて、チャネルを介して供給されるようになっていてもよい。さらに他の実施形態では、流体は、特にエタノール注入ポート４１，８８およびプランジャー６７，６８，６９に関連して図１に示されている外部供給源から導入されてもよい。例示的に、米国特許第８，４０９，５０８号におけるように、例えば、より剛性の材料のプランジャー６７，６８，６９が取付具９０内に挿入され、該プランジャーの作動時に一定量の流体を供給するようになっていてもよい。なお、この文献の内容は、参照することによって、ここに含まれるものとする。代替的に、プランジャーが軟質材料であってもよく、取付具が剛性材料であってもよい。流体の一定量は、プランジャーごとに同じであってもよいし、または異なっていてもよい。最後に、さらに他の実施形態では、ポーチは、１つまたは複数のブリスター内に貯蔵された一定量の流体を含んでいてもよく、この場合、例示的に、ブリスター内の小さい密封ポーチに設けられたブリスター内に含まれ、これによって、ブリスター内にブリスターを効果的に形成することができる。適切な時期に、例えば、空圧によって密封ポーチが破裂され、これによって、流体がポーチのブリスター内に放出されることになる。機器は、もし流体の通過が一方向弁によって厳密に調整され、作動中に機器が汚染されるのを防ぐようになっていたなら、機器と取付具またはポーチ材料との間の液体接触によって試薬の一部または全てを供給するように構成されていてもよい。さらに、多くの場合、望ましくは、ポーチまたは取付具は、汚染ＤＮＡがポーチから漏れないように、作動後に密封されるとよい。試薬を必要に応じて供給する種々の手段、例えば、注射器ポンプ、および流体を取付具またはポーチに一時的に接触させる種々の手段、例えば、棘付き取付具またはＯリングシールが知られている。流体を適切なブリスターに導くこれらの方法は、いずれも、特定の用途における必要性に応じて、本明細書において検討されるポーチの実施形態のいずれに用いられてもよいことを理解されたい。
【００２９】
前述したように、ネステッドＰＣＲは、２段階で行われる標的増幅を含んでいる。第１段階では、標的は、例示的には、ゲノム鋳型または逆転写鋳型から増幅される。第１段階増幅は、必要に応じて、例えば、プラトー期前に終了するようになっている。二次反応では、第１段階の増幅産物（ａｍｐｌｉｃｏｎ）が希釈されるとよく、二次増幅は、同一のプライマーを用いるか、または例示的に第１段階産物のプライマーの内側に相補的結合するネステッドプライマーを用いるようなっている。ネステッドＰＣＲの利点として、ａ）初期反応産物が二次反応における高忠実度を確実にする均質かつ特異的な鋳型を形成する点、これによって、比較的低効率の第１段階反応であっても、健全な第２段階反応をもたらすのに十分な鋳型をもたらす点、ｂ）異なるネステッドプライマーが用いられ、元の増幅鋳型（例えば、ゲノムＤＮＡまたは逆転写産物）が二次増幅におけるその意義が低減される程度まで希釈されるので、第１段階反応による非特異性産物が第２段階反応に著しく干渉しない点、およびｃ）ネステッドＰＣＲが高次反応の多重化を可能にする点が挙げられる。第１段階反応は、いくつかの固有の増幅産物のためのプライマーを含むことができる。これらの産物は、第２段階反応において特定される。しかし、第１段階の多重性および第２段階の単一性は、単なる例示にすぎず、他の構成も可能であることを理解されたい。例えば、第１段階は、単一対のプライマーを用いて種々の異なる関連増幅産物を増幅し、第２段階は、例えば、融解曲線分析を用いて、増幅産物間の差を標的化するために用いられてもよい
【００３０】
図１を参照すると、核酸試料は、チャネル５２を介して第１段階増幅区域６０に入り、ブリスター６１に送られる。ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポメラーゼ）と、ｄＮＴＰと、プライマー、例えば、多重増幅用の複数対のプライマーと、を含むＰＣＲ混合物が、ブリスター６１に供給されるとよく、または前述したように、種々の手段を介してブリスター６１内に導かれるとよい。代替的に、乾燥試薬が、ポーチ１０の組立時にブリスター６１の箇所にスポティングされていてもよい。この場合、水または緩衝液が、例えば、図１に示されているように、プランジャー６８を介してブリスター６１に導かれるとよい。図４に最もよく示されているように、試料は、ピンチ弁５９,７２によってブリスター６１内に保留され、例えば、機器内に配置されてブリスター６１と接触するように構成されたヒートブロックまたはペルチェ素子によって、２つ以上の温度間において熱サイクリングされる。しかし、当技術分野において知られているようなブリスター６１内に含まれた試料を加熱および冷却する他の手段も、本発明の範囲内にあることを理解されたい。熱サイクリングのための代替的な加熱/冷却装置の非制限的な例として、ブラダー内に空気循環ブリスターを設け、ブリスター６１に隣接する空圧ブリスター内の空気が２つ以上の温度間で循環されるようになっている例、（参照することによってここに含まれることになる）米国特許出願第１０/４７８,４５３号におけるように、例えば、複数の空圧プレスを用いて試料をブリスター６１内の温度区域に移動させる例、またはポーチ１０を軸上に平行移動させるかまたはポーチ１０に回転具を設け、ポーチ１０を回転させることによって、内容物を一定温度の熱区域間で移動させる例が挙げられる。
【００３１】
病原菌からの核酸は、多くの場合、宿主のかなりの量の核酸と共単離している。これらの宿主由来の核酸は、多くの場合、プライマーと相互作用し、望ましくない産物を増幅させ、その結果、プライマー、ｄＮＴＰおよびポリメラーゼの活性を消耗させ、所望の供給源産物を欠乏させる可能性がある。病原菌由来の核酸は、概して、少量であり、望ましくない産物が生じると、潜在的な問題をもたらすことになる。区域６０の第１段階反応におけるサイクルの数は、特異的な産物を最大にし、非特異的な産物を最小にするように最適化されるとよい。サイクルの最適な数は、約１０から約３０サイクルの間にあり、例示的には、約１５から約２０サイクルの間にあると予想されるが、サイクルの数は、特定の標的、宿主、およびプライマー配列に応じて変化することを理解されたい。
【００３２】
第１段階の多重増幅に続いて、第１段階増幅産物は、二次反応部位への流体移送の前に、例示的には、不完全ＰＣＲマスターミックスによって希釈されるようになっている。
【００３３】
図４は、試料を３ステップで希釈するための例示的実施形態を示している。第１のステップでは、ピンチ弁７２が開き、ブリスター６１内の試料をブリスター６２からの同量の水または緩衝液と混合させることによって、試料の倍数希釈が行われる。水または緩衝液は、前述したように、ブリスター６２およびブリスター６４，６６に供給されるようになっている。ブリスター６１，６２間を往復するようにその流体を圧迫することによって、充分な混合が行われる。前述したように。混合は、プラダー７１０内においてブリスター６１，６２に隣接して位置する空圧プラダーによって行われるとよい。空圧ブラダーは、交互に加圧され、これによって、流体を往復させる。混合中、ピンチ弁７４は、隣接するブリスター内への流体の流入を防止するものである。混合が終了すると、希釈された試料は、領域７０内に捕捉され、ピンチ弁７２が閉じることによって、領域７０内に密封される。ピンチ弁７４が開き、ブリスター６３，６４の一方または両方に供給される水または緩衝液によって、試料は、さらに希釈される。前述したように、流体をブリスター６３，６４間を往復するように圧迫することによって、混合が行われる。続いて、ピンチ弁７４が閉じ、さらに希釈された試料が領域７１内に密封される。最後の希釈は、例示的には、ブリスター６５，６６の一方または両方に供給される緩衝液または水を用いて、前述したように混合することによって行われる。例示的には、この最後の希釈は、不完全ＰＣＲマスターミックス（例えば、プライマーを除く全てのＰＣＲ試薬を包む）を流体として用いて、行われる。第２段階増幅の前のブリスター６６の内容物を任意選択的に加熱することによって、高価な抗体または酵素を必要としないホットスタート増幅の利点を得ることができる。しかし、水または他の緩衝液が最後の希釈に用いられ、追加的なＰＣＲ成分が第２段階増幅領域８０内に供給されてもよいことを理解されたい。例示的実施形態では、３段階の希釈が用いられているが、適切なレベルの希釈をもたらすために、どのような数の希釈段が用いられてもよいことを理解されたい。また、領域７０，７１内に捕捉される試料の量を調整することによって、希釈の量が制御されてもよく、この場合、領域７０，７１に捕捉される試料の量が少ないほど、希釈される量が大きくなり、またはピンチ弁７２，７４および／またはピンチ弁７４,７６を繰返し開閉することによって領域７０および／または領域７１に捕捉される追加の部分を用いて、希釈の量を減少させてもよいことを理解されたい。約１０−２から約１０−５の希釈が、多くの用途に対して適当であることが予想される。
【００３４】
二次ＰＣＴ反応の成功は、多重第１段階反応によって生成された鋳型に依存する。典型的には、ＰＣＲは、高純度のＤＮＡを用いて行われる。フェノール抽出キットまたは市販のＤＮＡ抽出キットなどを用いる方法によって、高純度のＤＮＡが得られる。ポーチ１０を通って処理される試料は、低純度調製を補うための調整を行なう必要がある。ＰＣＲは、障害物となる可能性がある生物学的試料の成分によって阻害されることがある。例示的には、ホットスタートＰＣＲ、高濃度のＴａｑポリメラーゼ酵素、ＭｇＣｌ２濃度の調整、プライマー濃度の調整、および（ＤＭＳＯ，ＲＭＳＯ、またはグリセロールのような）免疫補助剤が、低核酸純度を補うために用いられるとよい。純度の問題は、その多くが第１段階増幅に関連する傾向があるが、第２段階増幅においても同様の調整が行われるとよいことを理解されたい。
【００３５】
例示的実施形態では、希釈および第２段階の試料調製は、ポーチの第１段階のＰＣＲ部分のブリスターおよびチャネルにおいて少量の増幅試料を保持することによって達成されるようになっているが、これらのプロセスは、他の方法によって行われてもよいことを理解されたい。このような１つの例示的な実施例では、予め増幅した試料を部材内、例えば、平行移動するかまたは回転する部材内の小さい空洞内に捕捉し、試料の一定量を第１段階ＰＣＲ試薬から第２段階ＰＣＲ試薬に移動させるようになっていてもよい。予め増幅した試料の１μＬの部分を１００μＬの新鮮なＰＣＲ試薬と混合させると、濃度が１００倍低下する。この希釈は、単なる例示にすぎず、他の量および他の希釈レベルも可能であることを理解されたい。このアプローチは、第１段階増幅産物を剛性取付具内に押し込み、図１のプランジャー６８，６９の１つと接触させることによって、達成することができる。このような実施形態では、プランジャーは、試料のいくらかを隣接する希釈緩衝液または第２段階ＰＣＲ緩衝液に接触させるように、構成されているとよい。同様に、摺動要素を用いて、第１および第２段階間の密封性を維持し、かつ増幅した試料を剛性取付具９０内に含有させながら、少量の第１段階増幅産物を第２段階反応混合物に接触させてもよい。
【００３６】
第１段階ＰＣＲおよび希釈に続いて、チャネル７８が、試料を二次ネステッドＰＣＲのための複数の低容積ブリスター８２に移動させる。例示的な一実施形態では、第２段階ブリスターに供給される乾燥プライマーは、入ってくる水性物質によって再懸濁され、反応混合物をもたらすことになる。任意選択的に、二重鎖核酸を検出するために用いられる蛍光染料、例えば、ＬＣＧｒｅｅｎ(登録商標)Ｐｌｕｓ（Idaho Technology，ユタ州ソルトレークシティ）が、各ブリスターに供給されてもよいし、または一連の希釈の終了時に供給された不完全ＰＣＲマスターミックスに付加されてもよい。しかし、ＬＣＧｒｅｅｎ(登録商標)Ｐｌｕｓは、単なる例示にすぎず、当技術分野において知られている他の染料が用いられてもよいことを理解されたい。任意選択的な他の態様では、各特異的増幅産物用に設定されている蛍光標識された乾燥オリゴヌクレオチド・プローブが、それぞれ、乾燥プライマーと共に第２段階ブリスターにそれぞれ供給されてもよい。さらに、ポーチ１０は、汚染を低減するために、全ての反応および操作を含むように設計されているが、場合によっては、さらなる分析を行うために、増幅産物を各ブリスター８２から除去することが望ましいこともある。当技術分野において知られている第２段階の増幅産物を検出するための他の手段も、本発明の範囲内にある。いったん試料がブリスター８２に移送されると、ピンチ弁８４，８６が作動し、ブリスター８２を封鎖する。ここで、各ブリスター８２は、特定の標的の増幅に必要な全ての試薬を収容している。例示的に、各ブリスターは、固有対のプライマーを含んでいるとよく、または複数のブリスター８２は、複数の複製増幅をもたらすために同一プライマーを含んでいてもよい。
【００３７】
本明細書に開示されている実施形態は、第２段階増幅のためのブリスターを用いており、これらのブリスターは、可撓性部分の残りと同一または同様のプラスチックフィルムから形成されていることに留意されたい。しかし、多くの実施形態では、第２段階ブリスターの内容物は、第２段階ブリスターから取り出されることがない。従って、第２段階反応が可撓性ブリスター内において行われる必要がない。第２段階反応は、ブリスターに流体接続された複数の剛性チャンバ、半剛性チャンバ、または可撓性チャンバ内において行われてもよいことを理解されたい。この実施例では、チャンバは、チャンバに接続された可撓性チャネルに圧力を加えることによって、または他の方法によって、例示的には、熱融着によって、または一方向弁を用いることによって、密封されるとよい。本明細書において検討される種々の実施形態は、廃棄物を収集することのみを目的として設けられたブリスターを備えている。廃棄物は、決して取り出されないので、剛性チャンバ、半剛性チャンバ、または可撓性チャンバ内に収集することができる。
【００３８】
第１段階増幅に用いられたプライマーと同じプライマーを用いて、第２段階増幅を行うことは、本発明の範囲内にある（米国特許第６，６０５，４５1号を参照されたい）。しかし、多くの場合、第１段階産物に内在するプライマーを第２段階反応のプライマーにすることが有利であり、これによって、第１段階プライマー結合部位と第２段階プライマー結合部位との間の重なりをなくすかまたは最小限に抑えることができる。第１段階産物の希釈によって、第２段階反応への元の鋳型ＤＮＡおよび第１段階試薬の寄与の大部分が排除される。さらに、ネステッド増幅を強めるために、例えば、第１段階において用いられた温度よりも高い温度Ｔｍを有する第２段階プライマーが用いられてもよい。プライマーは、著しいヘアピン形状、ヘテロ／ホモ二量体、および望ましくない雑種形成を避けるように設計されているとよい。ネステッドフォーマットのために、第２段階プライマーは、単一ステップによってゲノムＤＮＡの標的を増幅させるのに用いられるプライマーよりもはるかに有害な相互作用に対して耐性がある。任意選択的に、ホットスタートが第２段階増幅に用いられてもよい。
【００３９】
もし蛍光染料が、例えば、当技術分野において知られているｄｓＤＡＮ結合染料としてまたは蛍光性プローブの一部として、第２段階増幅に含まれたなら、設けられた光学素子を用いて、１つまたは複数の試料の増幅を監視することができる。任意選択的に、各試料が陽性であるかまたは陰性であるかを判定するために、増幅曲線の形状の解析が行われてもよい。試料を判定する例示的な方法が、米国特許第６，７３０，５０１号において検討されている。この文献の内容は、参照することによってここに含まれるものとする。代替的に、交差閾値を利用する方法が用いられてもよい。コンピュータが、機器外または機器内に設けられるとよい。コンピュータは、この方法を実施するように、かつ第２段階の増幅の有無に基づいて試料が陽性であるかまたは陰性であるかを判定するように、構成されるとよい。また、コンピュータは、増幅曲線（例えば、交差閾値）の特性パラメータを標準曲線または作動中の他の増幅曲線と比較することによって、開始鋳型濃度に関する定量情報をもたらすようになっているとよい。しかし、各試料を判定するために、当技術分野において知られている他の方法が用いられてもよいことを理解されたい。他の解析が、蛍光性情報に基づいて行われてもよい。このような１つの非制限的な実施例として、増幅産物の適切な融解特性（例えば、Ｔｍ、融解プロファイル形状）を示すために融解曲線解析を用いることが挙げられる。設けられた光学素子は、全てのブリスター８２の画像を一度に捕捉するように構成されてもよく、または個々の光学素子が各ブリスターに対して設けられてもよい。他の構成も本発明の範囲内にある。
【００４０】
図５は、代替的なポーチ１１０を示している。この実施形態では、種々の試薬が取付具１９０を介してポーチ１１０内に装填されるようになっている。図５ａは、複数のプランジャー１６８の１つを有する取付具１９０の断面を示している。図５ａは、図５の実施形態に示されている入口チャネル１１５ａを通る断面を示しているが、１２個の入口チャンネル（入口１１５ａ−１１５ｌ）が設けられており、これらの各々が、取付具１９０内において用いられるそれ自体のプランジャー１６８を有しているとよい。しかし、この特定の構成では、入口チャネル１１５ｃ，１１５ｆ，１１５ｉは、用いられていない。１２個の入口チャネルを有する構成は、単なる例示にすぎず、どのような数の入口チャネルおよび関連するプランジャーが用いられてもよいことを理解されたい。この例示的実施形態では、取付具１９０の任意選択的な真空ポート１４２が、取付具１９０の第１の表面１９４を通ってチャンバ１９２に連通するように形成されている。任意選択的な真空ポート１４２は、真空または真空チャンバ（図示せず）に連通するように設けられているとよく、ポーチ１１０内から空気を引出し、チャンバ１９２および種々のブリスターならびにポーチ１１０のチャンバ内に真空をもたらすようになっている。次いで、プランジャー１６８が、真空ポート１４２を封鎖するために、チャンバ１９２内に充分深く挿入される。チャンバ１９２は、使用時に所望量の流体をチャンバ１９２内に引き込むために。例示的には、所定の真空下に設けられている。チャンバ１９２の調製に関する付加的な情報は、（すでに参照することによってここに含まれている）米国特許第８，４０９，５０８に見出すことができる。
【００４１】
例示的な取付具１９０は、取付具１９０の第２の表面１９５に形成された注入ポート１４１をさらに備えている。例示的に、注入ポート１４１は、図５ａに示されているように、真空ポート１４２よりもポーチ１１０のプラスチックフィルム部分の近くに配置されている。従って、プランジャー１６８は、注入ポート１４１を介してチャンバ１９２内へのアクセスを可能にしながら、真空ポート１４２を封鎖するために十分遠くに挿入されることになる。図示されているように、プラスチックフィルム１１７の第１の表面１１９は、注入ポート１４１を介するチャンバ１９２と周囲空気との連通を阻止するための貫通可能なシール１３９を備えている。しかし、第２の表面１１９は、任意選択的に、注入ポート１４１まで延在していなくてもよいし、他の種々のシールが用いられてもよいことを理解されたい。さらに、もしシールの他の箇所、例えば、取付具１９０の第１の表面１９４上の箇所が望まれるなら、注入ポート１４１は、取付具１９０上の該位置にチャネルを備えていてもよい。（すでに参照することによってここに含まれている）米国特許出願第１０／５１２，２５５号は、シールが注入ポートから遠く離れて配置されており、チャネルを介してチャンバに接続されている種々の構成を示している。また、米国特許第８，４０９，５０８号は、チャネルが単一シールを多数のチャンバに接続している種々の構成を開示している。シール位置の変更ならびに多数のチャンバに対する単一の注入ポートの接続は、本発明の範囲内にある。任意選択的に、シール１３９は、脆弱であり、カニューレ(図示せず)の挿入時に破られるとよく、これによって、流体試料がカニューレ内からチャンバ１９２内に引き込まれるかまたは押し出されることが可能になる。
【００４２】
ポーチアセンブリ１１０の例示的なプランジャー１６８は、円筒形状であり、略５ｍｍの直径を有しており、チャンバ１９２内に圧入されているとよい。プランジャー１６８は、第１の端部１７３および反対側の第２の端部１７５を備えている。図５ａに示されているように、プランジャー１６８のノッチ１６９が、第２の端部１７５に形成されている。使用時に、第２の端部１７５は、チャンバ１９２内の途中まで挿入され、このとき、ノッチ１６９が注入ポート１４１と真っ直ぐに並ぶことになる。これによって、プランジャー１６８が（ノッチが存在しないならプランジャー１６８が注入ポート１４１を塞ぐほど）深く挿入されても、流体試料は、チャンバ１９２内に引き込まれるかまたは注入されることが可能になる。
【００４３】
例示的には、流体は、挿入先端を有する注射器付きの容器（図示せず）内に含まれている。注射器の挿入先端は、注入ポート１４１内に挿入され、シール１３９を突き刺すようになっている。脱気されたポーチアセンブリ１１０を用いる場合、シール１３９が突き刺されると、周囲空気圧に対するチャンバ１９２内の負圧によって、流体が容器から吸引される。この流体は、ポート１４１を通ってチャンバ１９２を満たす。この時点で、通常、流体は、ポーチ１１０のプラスチックフィルム部分１１７内に流れない。最後に、プランジャー１６８がチャンバ１９２内に挿入され、プランジャー１６８の第２の端部１７５がチャンバ１９２の底部１９１に接近すると、プランジャー１６８が一定量の試薬または試料をプラスチックフィルム部分１１７内に押し込むことになる。図示されているように、プランジャー１６８は、完全に挿入されたときに、第２の端部１７５がチャンバ１９２の底部１９１に完全に当接しないように、構成されている。残余の空間は、気泡を捕捉するのに有用であり、これによって、プラスチックフィルム部分１１７に入る気泡の数を減少させることができる。しかし、いくつかの実施形態では、プランジャー１６８が完全に挿入されたとき、第２の端部１７５が底部１９１に当接することが望ましい場合もある。図５に示されている実施形態では、入口チャネル１１５ａ，１１５ｂ，１１５ｄ，１１５ｅ，１１５ｇ，１１５ｈ，１１５ｊ，１１５ｋ，１１５ｌの全てが、反応区域またはリザーバブリスターに繋がっている。入口チャネル１１５ａに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試料が３ローブ式ブリスター１２２内に押し込まれ、入口チャネル１１５ｂに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０１に押し込まれ、入口チャネル１１５ｄに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０２に押し込まれ、入口チャネル１１５ｅに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０３に押し込まれ、入口チャネル１１５ｇに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０４に押し込まれ、入口チャネル１１５ｈに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０５に押し込まれ、入口チャネル１１５ｊに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０６に押し込まれ、入口チャネル１１５ｋに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０７に押し込まれ、入口チャネル１１５ｌに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０８に押し込まれる。
【００４４】
図５ａの実施形態に示されているように、ノッチ１６９を備えるプランジャー設計が用いられる場合、プランジャー１６８は、押し下げられる前に、回転されとよい。これによって、ノッチ１６９を位置ずれさせ、注入ポート１４１をチャンバ１９２との連通から閉じ、チャンバ１９２の内容部を密封することができる。これは、流体が注入ポート１４１を通って周囲雰囲気に逆流する可能性を最小に抑えるように作用し、プランジャーの完全な挿入を遅らせることが望ましいとき、特に有用である。図示されているように、前述のノッチ１６９がプランジャー１６８に対して設けられているが、他の手段、例えば、チャンバ１９２の底に向かうプランジャー１６８の押下げ、熱融着、一方向弁、または自己密封型ポートによって、流体試料をチャンバ１９２内に分注した直後に注入ポート１４１を閉じる構成も、本開示の範囲内にある。密封方法として熱融着を用いる場合、シールバーを機器内に設け、ポーチが機器内に挿入されたとき、全てのチャンバを熱融着するようになっているとよい。
【００４５】
例示的な方法では、ユーザーは、試料を入口チャネル１１５ａに付随する注入ポート１４１に注入し、水を他の種々の注入ポートに注入する。水は、入口チャネル１１５ｂ，１１５ｄ，１１５ｅ，１１５ｇ，１１５ｈ，１１５ｊ，１１５ｋ，１１５ｌの各々に付随するチャンバ１９２内において予め凍結乾燥された試料を再水和する。水は、１つの単一シールを通って注入され、以下の図６に示されるように、チャネルを介してチャンバの各々に分配されてもよいし、またはチャンバの各々に独立して注入されてもよい。代替的に、乾燥した試料を再水和するために水を注入する以外に、溶解試薬、核酸抽出試薬、およびＰＣＲ試薬などの湿式試薬が、取付具１９０の適切なチャンバ１９２内に注入されてもよい。
【００４６】
入口チャネル１１５ａに付随するプランジャー１６８が作動すると、試料は、チャネル１１４を介して３ローブ式ブリスター１２２に直接押し込まれる。ユーザーは、残りのプランジャー１６８を押し、取付具１９０のチャンバ１９２の各々から内容物をリザーバブリスター１０１〜１０８に押し込む。この時点で、ポーチ１１０は、処理のために機器内に装填されている。図８に示されている機器８００は、図６のポーチ２１０用に構成されているが、機器８００のブラダー構成の修正によって、機器８００をポーチ１１０，５１０または他の構成のポーチに用いられるように適合させることができることを理解されたい。
【００４７】
例示的な一実施例では、プランジャー１６８が押し下げられた時点で、リザーバブリスター１０１は、イソプロパノール内にＤＮＡ結合磁気ビーズを収容しており、リザーバブリスター１０２は、第１の洗浄溶液を収容しており、リザーバブリスター１０３は、第２の洗浄溶液を収容しており、リザーババリスター１０４は、核酸溶離緩衝液を収容しており、リザーババリスター１０５は、多重化第１段階プライマーを含む第１段階ＰＣＲ試薬を収容しており、リザーババリスター１０６は、プライマーを含まない第２の段階ＰＣＲ試薬を収容しており、リザーババリスター１０７は、プライマーおよび鋳型を含まない陰性対照ＰＣＲ試薬を収容しており、リザーババリスター１０８は、鋳型を含む陽性対照ＰＣＲ試薬を収容している。しかし、これらの試薬は、単なる例示にすぎず、所望の反応および最適条件に応じて、他の試薬が用いられてもよいことを理解されたい。
【００４８】
いったんポーチ１１０が機器８００内に配置され、試料が３ローブ式ブリスター１２２に移動されたなら、試料は、ＺＳまたはセラミックビーズのような溶解粒子によって試料を撹拌することによって、破砕されるとよい。溶解粒子は、３ローブ式ブリスター１２２内に配置されていてもよいし、または試料と共に３ローブ式ブリスター１２２内に注入されてもよい。図５の３ローブ式ブリスター１２２は、図１の３ローブ式ブリスターと全く同じように作動され、２つの下側ローブ１２４，１２６が一緒に加圧され、圧力が上側ローブ１２８と２つの下側ローブ１２４，１２６と間で交互に加えられる。しかし、図示されているように、下側ローブ１２４，１２６は、下側ローブ２４，２６よりもかなり丸くなっており、これによって、チャネル１３へのビーズの流れを円滑にし、連結部３２に三角形の流れ分離部がなくても、高速衝突をもたらすことが可能である。３ローブ式ブリスターと同様に、図５の３ローブ式ブリスター１２２は、試料内の微生物、細胞、およびウイルス粒子を効果的に溶解または破砕することができる。約３〜４ｍｍ幅、例えば、約３．５ｍｍ幅のチャネル１３０は、溶解中、比較的ビーズが少なく、高速衝突を行うのに効果的であることが分かっている。
【００４９】
溶解後、核酸結合磁気ビーズは、リザーババリスター１０１に面して配置されたブラダーを加圧することによって、チャネル１３８を介して上側ローブ１２８内に注入される。磁気ビーズは、例示的には、溶解中よりも穏やかに３ローブ式ブリスター１２２の内容物と混合され、溶液が、例えば、約１分間保温され、これによって、核酸がビーズに結合することが可能になる。
【００５０】
次いで、溶液は、チャネル１４３を介して「８の字」状ブリスター１４４内に送り込まれ、該ブリスター１４４内において、ビーズが、機器内に収容されて例示的には空圧によって駆動される格納式磁石によって捕捉される。ビーズ捕捉プロセスは、ビーズ粉砕装置１２２の全てのローブ１２４，１２６，１２８を加圧することによって、開始される。これによって、３ローブ式ブリスター１２２の液体内容物の大部分がチャネル１４３を通してブリスター１４４内に押し込まれる。磁石は、ブリスター１４４の下側部分１４４ｂに接触され、試料は、数秒間保温され、これによって、磁石が溶液からビーズを捕捉することが可能になる。次いで、ブリスター１２２に隣接するブラダーが減圧されると共にブリスター部分１４４ａ，１４４ｂに隣接するブラダーが加圧され、液体がブリスター１２２内に押し戻される。単一パスによって全てのビーズが捕捉されないので、このプロセスは、最大１０回繰り返され、これによって、実質的に全てのビーズをブリスター１４４内に捕捉することができる。次いで、液体がブリスター１４４から押し出され、磁気ビーズおよび捕捉された核酸のみが残り、（それぞれ、リザーバブリスター１０２，１０３からチャネル１４５，１４７を介して）、洗浄試薬がブリスター１４４内に導かれ、２回の連続的洗浄が行われる。各洗浄において、洗浄試薬を収容するリザーバブリスターに面して配置されたブラダーが加圧され、これによって、その内容物がブリスター１４４内に押し込まれる。磁石が引き込まれ、次いで、ブリスター１４４の各ローブ１４４ａ，１４４ｂを覆う２つのブラダーの各々を交互に加圧することによって、磁気ビーズを含むペレットが破砕される。上側ローブ１４４ａが圧縮されると、液体内容物は、下側ローブ１４４ｂに押し込まれ、下側ローブ１４４ｂが圧縮されると、内容物は、上側ローブ１４４ａに押し込まれる。上側ローブ１４４ａと下側ローブ１４４ｂとの間でブリスター１４４内の溶液を撹拌することによって、磁気ビーズの不純物が効果的に洗浄される。この場合、不十分な撹拌と過剰な撹拌との間で均衡を取る必要がある。すなわち、不十分な撹拌では、ビーズのペレットが破砕されず、過剰な撹拌では、ビーズの表面から核酸が洗い流され、洗浄試薬と共に失われる可能性がある。各洗浄サイクル後に、磁気ビーズは、ブリスター１４４内に磁石を介して捕捉され、洗浄試薬は、例示的に、廃棄物容器として機能する３ローブ式ブリスター１２２内に押し込まれる。しかし、用いられたリザーバブリスターが廃棄物用容器として機能してもよいし、または他のブリスターが廃棄物容器として特別に設けられてもよいことを理解されたい。
【００５１】
次いで、核酸溶離緩衝液が、リザーババリスター１０４からチャネル１４９を介してブリスター１４４内に注入され、試料が再び撹拌され、磁石を用いることによって、磁気ビーズが再び捕捉される。ブリスター１４４内の流体混合物は、元の試料からの核酸を含んでいる。ブリスター１４４への圧力が、核酸試料をチャネル１５２を介して第１段階ＰＣＲブリスター１６１に移動させ、該ブリスター１６１において、試料は、多数のプライマーセットを含む第１段階ＰＣＲマスターミックスと混合される。ＰＣＲマスターミックスは、リザーバブリスター１０５からチャネル１６２を介して供給される。必要に応じて、試料および／または第１段階ＰＣＲマスターミックスは、混合の前に加熱されてもよく、この場合、ホットスタートの利点がもたらされる。任意選択的に、ＲＮＡ標的の逆転写のための成分が、第１段階ＰＣＲの前に供給されてもよい。代替的に、ＲＮＡ標的の同時逆転写を可能にするために、ＲＴ酵素、例えば、耐熱性ＲＴ酵素が第１段階ＰＣＲマスターミックに含まれていてもよい。本明細書に開示されている実施形態のいずれにおいても、ＲＴ酵素が第１段階ＰＣＲマスターミックスに含まれていてもよいことを理解されたい。以下に示されるように、図５のポーチ１１０は、最大１０個のプライマーセット用に構成されているが、この構成は、任意の数のプライマーセットを用いるように変更されてもよいことを理解されたい。ブリスター１６１に面して配置されたブラダーが低圧で加圧され、ブリスター１６１の内容物をブリスター１６１の他の面上の加熱／冷却素子、例えば、ペルチェ素子に密接触させる。ブリスター１６１への圧力は、加熱／冷却素子との良好な接触を確実にするのに充分に大きく、流体がブリスター１６１から押し出されないように十分に小さく設定されるべきである。加熱／冷却素子は、例示的には、約６０℃から約９５℃の間で温度サイクリングされる、例示的には、温度サイクリングは、約１５〜２０サイクルにわたって行われ、存在する１つまたは複数の核酸標的の増幅が生じることになる。また、例示的には、温度サイクリングは、プラトー期前に終了するようになっており、さらに対数期中または対数期前に終了するようになっているとよい。一実施例では、最小レベルの検出に達することなく、試料の所望の増幅産物を増やすことが望ましい。米国特許第６，６０５，４５１を参照されたい。この内容は、参照することによって、ここに含まれるものとする。
【００５２】
次いで、増幅された試料は、任意選択的に、試料の殆どをチャネル１５２を介してブリスター１４４に押し戻すことによって希釈され、ブリスター１６１内に少量（例えば、約１〜５％）の増幅された試料のみを残し、第２段階ＰＣＲマスターミックスがリザーバブリスター１０６からチャネル１６３を介して供給される。試料は、例示的には、チャネル１６３を介してブリスター１０６とブリスター１６１との間を往復移動させることによって、完全に混合される。必要に応じて、反応混合液は、第２段階増幅の前に、伸長温度を超える温度、例えば、少なくとも６０℃に加熱されてもよい。次いで、試料は、チャネル１６５を通って、第２段階増幅区域１８０の中心にある低容積ブリスター１８２のアレイ内に押し込まれる。１０個の例示的低容積ブリスター１８２の各々は、異なるプライマー対を含むことができる。このプライマー対は、第１段階増幅のプライマー対の１つと本質的に同じであるか、または短縮化された単一複製配列を増幅するための第１段階プライマー対内に「入れ子（ｎｅｓｔ）」にされるもののいずれかである。試料によって水和されたプライマーは、増幅混合物をもたらすことになる。また、陽性対照試料および陰性対照試料が、リザーバブリスター１０７，１０８の内容物をそれぞれ加圧し、標的ＤＮＡを含まないＰＣＲマスターミックスをリザーバブリスター１０７からチャネル１６６を介して送り出し、対照ＤＮＡを含むＰＣＲマスターミックスをリザーババリスター１０８からチャネル１６７を介して送り出すことによって、導かれる。図示されているように、５つの陽性対照ブリスター１８３および５つの陰性対照バリスター１８１が配置されており、これらは、２倍に多重化され、これによって、１０回の異なる第２段階増幅反応のために必要な対照をもたらすことになる。この構成は、単なる例示にすぎず、どのような数の第２段階ブリスターが設けられてもよいことを理解されたい。
【００５３】
例示的には、第２段階増幅に用いられるＰＣＲマスターミックスにはプライマーが不足しているが、それ以外は、完全である、しかし。「不完全な」ＰＣＲマスターミックスは、他のＰＣＲ成分も不足している場合もある。一実施例では、第２段階ＰＣＲマスターミックスは、水および緩衝液のみであり、任意選択的に希釈された第１段階ＰＣＲ増幅産物と混合されている。この混合物は、小容量ＰＣＲ反応ブリスターに移動されるが、これらのブリスターに残りの成分の全てが予め供給されている。必要に応じて、残りの成分の全ては、一緒に混合され、単一の混合物として小容量のＰＣＲ反応ブリスター内にスポッティングされているとよい。代替的に、図５ｂに示されているように、これらの成分の各々が、小容量ＰＣＲ反応ブリスター１８２の個別の領域にスポッティングされていてもよい。図５ｂに示されているように、４つの領域、例示的には、ｄＮＴＰがスポッティングされた領域１８２ａ、プライマーがスポッティングされた領域１８２ｂ、ポリメラーゼがスポッティングされた領域１８２ｃ、およびマグネシウム化合物がスポッティングされた領域１８２ｄが存在する。成分を別々にスポッティングし、これらの成分を水和する前に試料混合物を加熱することによって、非特異反応を最小限に抑えることができる。どのような組合せの成分がこのようにしてスポッティングされてもよいこと、および成分をブリスターの１つまたは複数の領域内にスポッティングするこの方法は、本発明のどの実施形態と共に用いられてもよいことを理解されたい。
【００５４】
小容量ＰＣＲ反応ブリスター１８１，１８２，１８３に繋がるチャネル１６５，１６６，１６７は、密封されている。熱サイクリングをもたらすために、空圧ブラダーが、アレイを加熱／冷却素子、例えば、ペルチェ素子に対して軽く加圧する。サイクリングパラメータは、第２段階熱サイクリングのために独立して設定されるとよい。反応は、励起光源、例えば、青色光（４５０〜４９０ｎｍ）をアレイ上に集束させ、得られる蛍光発光、例えば、５１０ｎｍを超える蛍光発光を撮像することによって、監視される。
【００５５】
上記実施例では、ピンチ弁は、検討されていない。しかし、試料をブリスターの１つに収容することが望ましい場合、その特定ブリスターに繋がるチャネルに面して配置された空圧アクチュエータが加圧され、これによって、ピンチ弁を形成し、チャネルを閉じるようになっていることを理解されたい。逆に、試料をブリスターの１つから移動させることが望ましい場合、適切な空圧アクチュエータが減圧され、これによって、試料をチャネル内に流すことが可能になる。
【００５６】
図５において前述したポーチは、試薬リザーバブリスター１０１〜１０８を備えており、ユーザーは、例示的には、ポーチ１１０を機器に挿入する前に、取付具１９０から試薬をポーチ１１０のプラスチックフィルム部分１１７の試薬リザーバブリスター１０１〜１０８内に注入するようになっている。種々のブリスターの内容物を互いに異なる温度に維持する能力を有する図５の試薬リザーバブリスターを用いると、有利である。しかし、いくつかの不利な点もある。オペレータが試薬を取付具１９０からリザーバブリスター１０１〜１０８に移動させることに関与しており、この操作が、多くの場合、機械の外側で行われ、従って、ピンチ弁が作動されないことによって、試薬が、リザーバブリスターから作動ブリスターに漏れることがある。リザーバブリスター内の試薬は、調製中および装填中に露出している。もしこれらのリザーバブリスターが加圧、狭窄、または軽い衝撃を受けた場合、試薬が通じているチャネルを通って漏れる可能性がある。試薬の損失が多い場合、反応が完全に失敗する可能性がある。さらに、操作中、リザーバブリスター１０１〜１０８から押し出される試薬の量にいくらかの変動が生じ、その結果、一貫性のない結果をもたらす可能性がある。取付具１９０への試薬の導入および取付具１９０から試薬リザーバブリスター１０１〜１０８への試薬の移動の自動化は、これらの問題の多くを解消する。この自動化は、本発明の範囲内にある。
【００５７】
図６のポーチ２１０は、直接噴射手法を用いることによって、これらの課題の多くに異なる方法で対処している。この手法では、機器自体が、例示的には、空圧ピストンを介してプランジャー２６８を移動させ、試薬が必要とされるとき、該試薬を種々の作動ブリスター内に押し込むようになっている、図５のリザーバブリスター１０１〜１０８に試薬を貯蔵するのと違って、図６の実施形態では、試薬は、取付具２９０の種々のチャンバ２９２内に導かれ、必要になるまでそこに保持される。適切な時間にピストン２６８の空圧操作によって、一定量の試薬が適切な反応ブリスターに導かれる。前述した課題の多くに対処することに加えて、ポーチ２１０は、より小さい形状を有しており、これによって、より小型の機器設計を可能とし、またより短いチャネルを有しており、これによって、より良好な流体流れを可能とし、チャネル内における試薬の損失を最小限に抑えることができる。
【００５８】
図６の例示的実施形態では、試験される試薬（１００μＬ）および溶解緩衝液（２００μＬ）を含む３００μＬの混合液が、注入ポート２４１ａ内に注入される。水もシール２３９ｂを介して取付具２９０内に注入され、最大１１個の異なる試薬を水和する。試薬は、各々、（斜線で示されている）チャネル２９３を介して、チャンバ２９２〜２９２ｌ内に乾燥形態で予め供給されている。これらの試薬の例として、凍結乾燥ＰＣＲ試薬、ＤＮＡ抽出試薬、洗浄溶液、免疫測定試薬、または他の化学物質が挙げられる。図６の実施形態では、試薬は、核酸抽出、第１段階多重化ＰＣＲ、多重化反応の希釈、第２段階ＰＣＲ試薬の調製、および対照反応に用いられるものである。図６に示されている実施形態では、注入される必要があるものは、ポート２４１ａの試料およびポート２４１ｂ内の水である。
【００５９】
図６に示されているように、シール２９３ｂを介して注入された水は、チャネル２９３を介して種々のチャンバに分配される。この実施形態では、試料および水だけがポーチ２１０内に注入される必要がある。しかし、水は、各チャンバ２９内に独立して注入されてもよいことを理解されたい。さらに種々のチャンバ２９２に乾燥試薬を供給し、水の注入時に水和するのと違って、特定の湿式試薬が、必要に応じて、各チャンバ内に注入されてもよいことを理解されたい。加えて、チャンバ２９２の１つまたは複数にのみ水が供給され、必要な試薬が適切な反応ブリスター内に乾燥形態で供給されてもよいことを理解されたい。特定の反応の必要性によってなされる前述した形態の種々の組合せも、本発明の範囲内にある。
【００６０】
図６に示されているように、任意選択的な突出部２１３が、取付具２９０の底表面２９７に設けられている。図示されているように、突出部２１３は、それらの該当する入口チャネル２１５内に配置されている。しかし、他の構成も可能である。突出部２１３は、入口チャネル２１５を開けるように作用し、プランジャー２６８が押し下げられたときに、底表面２９７が入口チャネル２１５を締め付けるように他の平坦面と係合するのを防止し、これによって、プランジャー２６８の作動時の逆流の防止を助長する。このような突出部は、本発明による任意の種々のポーチのいずれに用いられてもよい。
【００６１】
水がポーチ内に注入され、取付具内の多数のチャンバ内の多数の乾燥試薬を水和する実施形態では、注入ポートと多くのチャンバとの間にチャネルを閉じる手段が設けられることが望まれる。もしチャネルが閉じていないと、各プランジャーの作動によって、その該当するチャンバの内容物の一部がチャネル内に押し戻され、近傍のチャンバに混入し、該チャンバ内に含まれる量および該チャンバから送られる量を変動させる可能性がある。このチャネルを閉じるいくつかの方法、例えば、前述したノッチ付きプランジャー２６８を回転させる方法、チャネルを横切ってプラスチックフィルムを熱融着し、これによって、チャネルを恒久的に閉じる方法、およびピンチ弁としてチャネルに圧力を印加する方法が用いられてきている。他の閉鎖具、例えば、取付具内に組み込まれた弁、例示的には、一方向弁が用いられてもよい。
【００６２】
流体がチャンバ２９２内に注入され、ポーチ２１０が機器内に装填された後、プランジャー２６８ａが、例示的には空圧ピストンの作動を介して、押し下げられ、試料の残り分をチャネル２１４を介して３ローブ式ブリスター２２０内に押し込む。図１および図５に示されている実施形態におけるように、３ローブ式ブリスター２２０のローブ２２４，２２６，２２８は、図７〜図９に示されているブラダーアセンブリ８１０の作動ブラダー８２４，８２６，８２８を介して、順次圧縮され、流体をローブの間の狭い連結部２３２内に押し込み、高速衝突をもたらし、これによって、試料をせん断し、核酸、例示的には、開けることが困難な胞子からの核酸、細菌、および菌類を遊離させる。細胞溶解は、適切な時間間隔、例えば、０．５〜１０分間にわたって継続する。
【００６３】
いったん細胞が充分に溶解したなら、プランジャー２６８ｂが作動され、チャンバ２９２ｂ内に貯蔵された核酸結合磁気ビーズがチャネル２３６を介して３ローブ式ブリスター２２０の上側ローブ２２８内に注入される。試料は、磁気ビーズと混合され、混合物が適切な時間間隔、例えば、約１０秒から約１０分間にわたって保温される。
【００６４】
試料およびビーズの混合物は、プラダー８２６の作用によってチャネル２３８を通ってブリスター２４４内に押し込まれ、次いで、プラダー８４４の作用によってチャネル２４３を通ってブリスター２４６内に押し込まれる。ブリスター２４６では、図８に示される機器８００においてブリスター２４４に隣接して配置された格納式磁石８５０が、溶液から磁気ビーズを捕捉し、ブリスター２４６の内側表面にペレットを形成する。次いで、ブリスター２４６に面して配置された空圧ブラダー８４６が、ブリスター２４６から液体を押し出し、ブリスター２４４を通して（ここでは廃棄物容器として用いられる）ブリスター２２２内に戻す。しかし、図５に関連して説明したように、他の廃棄物容器も本発明の範囲内にある。プランジャー２６８ｃ，２６８ｄ，２６８ｅの１つが作動され、洗浄溶液をチャネル２４５を介してブリスター２４４に供給し、次いで、洗浄溶液をチャネル２４３を介してブリスター２４６に供給する。任意選択的に、磁石８５０が後退され、磁気ビーズは、プラダー８４４，８４６を交互に加圧されることによって、磁気ビーズをチャネル２４３を介してブリスター２４４，２４６間で往復運動させることによって、洗浄される。いったん洗浄されたなら、磁気ビーズは、磁石８５０の作動によって、ブリスター２４６内に再び捕捉され、次いで、洗浄液がブリスター２２２に移動させられる。このプロセスは、核酸結合磁気ビーズから溶解緩衝液および試料破片を洗い流すために、必要に応じて、繰り返されるとよい。例示的には、三回の洗浄が行われ、各洗浄に、チャンバ２９２ｃ，２９２ｄ，２９２ｅの洗浄試薬が用いられる。しかし、より多くの回数またはより少ない回数の洗浄も本発明の範囲内にあることを理解されたい。より多くの洗浄が所望される場合、より多くのチャンバ２９２が設けられるとよい。代替的に、各チャンバ２９２がより大量の流体を保持し、プランジャーの作動によって、各作動時に該チャンバからわずかな比率の量しか押し出されないようになっていてもよい。
【００６５】
洗浄後、チャンバ２９２ｆに貯蔵された溶離緩衝液が、チャネル２４７を介してブリスター２４８に注入された後、磁石が後退される。溶液は、チャネル２５２を介してブリスター２４６，２４８間を循環し、ブリスター２４６内の磁気ビーズのペレットが壊され、捕捉された核酸がビーズから解離し、溶液に入ることが可能になる。磁石８５０が再び作動し、ブリスター２４６内の磁気ビーズを捕捉し、溶離された核酸溶液がブリスター２４８内に押し込まれる。
【００６６】
プランジャー２６８ｈが押し下げられ、チャンバ２９２ｈからの第１段階ＰＣＲマスターミックスがブリスター２４８内の核酸試料と混合される。任意選択的に、混合物は、ブラダー８４８，８６４の交互の作動によって、混合物をチャネル２５３を介してブリスター２４８，２６４間で往復させることによって、さらに混合される。数サイクルの混合の後、溶液がブリスター２６４内に収容され、該ブリスター２６４内において、第１段階多重ＰＣＲが行われる。必要に応じて、混合の前に、試料がブリスター２４６内に保持されている間に、例えば、第１段階ＰＣＲマスターミックスをブリスター２６４内に移動させ、該ブリスター２６５内において予熱されるかまたはブリスター２４８に隣接して設けられたヒータによって予熱される。前述したように、この予熱によって、ホットスタートＰＣＲの利点がもたらされる。図８に示されている機器８００は、試料を加熱および冷却するペルチェ素子に基づくサーマルサイクラー８８６，８８８によって、特徴付けられている。しかし、前述したように、他の加熱／冷却装置が用いられてもよいことを理解されたい。任意選択的に、ブリスター２４８，２６４間の混合は、ブリスター２４８，２６４の両方を加熱および冷却するように配置されたサーマルサイクラー８８６による温度サイクリング中も継続されるとよい。このような混合は、いくつかの実施形態において第１段階ＰＣＲ反応を改良することが分かっている。また、熱サイクリングは、２つ以上の異なるブリスターの温度を変化させることによって達成されてもよい。これは、最小のエネルギー消費を可能とし、熱サイクリング速度を最大限させることができる。例えば、ブリスター２４８の温度を９５℃に維持し、ブリスター２６４の温度を６５℃に維持し、試料をこれらのブリスター間で移動させることによって、効率的に熱を試料に伝達させ、迅速かつ正確な熱サイクリングを達成することができる。温度サイクリングは、例えば、１５〜２０サイクル行われるが、前述したように、用途によっては他のレベルの増幅が望ましい場合がある。以下に示されるように、第２段階増幅区域２８０は、１８通りの第２段階反応における増幅を検出するように構成されている。従って、１８種類の異なるプライマー対が、ブリスター２６４内のＰＣＲ反応に含まれるとよい。
【００６７】
代替的なホットスタート法では、ポーチ２１０が、プライマーをブリスターの１つ、例えば、ブリスター２６４内に設けるように、作製されている。一実施形態では、プライマーが別個に凍結乾燥され、製造中に、脆弱なペレットとしてブリスター２６４内に導入されている。第１段階ＰＣＲの前に、例えば、試料がブリスター２４６から溶出され、ブリスター２４に押し込まれ、プライマーペレットを再水和する。ブリスター２４８，２６４に隣接して配置されたペルチェ８８６が４８℃に加熱され、ＰＣＲマスターミックスがブリスター２４８内に押し込まれる。ある時間、例えば、１０秒間にわたって保持し、この間に２つのブリスターが４８℃に到達した後、ブリスター２４８，２６４間の混合を開始する。従って、成分が個別に４８℃に到達するまで、酵素およびｄＮＴＰがブリスター２４８に残り、試料およびプライマーの殆どがブリスター２６４に残る。しかし、４８℃の選択は、第１段階増幅および５０℃まで活性であるＡＭＶを用いたＲＴを同時に行う場合に用いるためであることを理解されたい。もしＲＴが必要でないなら、またはより耐熱性のＲＴ酵素が用いられるなら、プライマー融点または特定の第１段階増幅プロトコルの他の要因に依存して、２つのブリスター２４８，２６４の一方または両方を最大５８℃またはさらに高温に加熱してもよい。このホットスタート法は、本発明のどのような実施形態に用いられてもよいことを理解されたい。
【００６８】
代替的な実施形態では、第１段階ＰＣＲ反応の複雑性を軽減するために、ブリスター２４８が２つ以上のブリスターに分割されてもよい。多重反応の非特異性産物の数は、混合物内のプライマーの数の二乗（またはさらに高次の指数）として増加し、アレイの感度の低下は、投入試料の量の線形関数であると考えられる。従って、例えば、第１段階ＰＣＲを２つの反応に分割すると、各反応は、この実施形態の単一反応の量の半分であり、感度は１／２に低下し、非特異性反応の量および複雑さは、１／４になる。ブリスター２４８をより多くのブリスターに分割する場合、ブリスター２６４もブリスター２４８の数と等しい数のブリスターに分割されるとよい。各ブリスター２４８は、該当するチャネル２５３を介して、各ブリスター２６４に接続されることになる。各ブリスター２５４は、全てのプライマーのサブセットを含むペレットを含む。ブリスター２６４の試料は、各ブリスター２４８にわたって分割される。各ブリスター２６４は、全ての他のブリスターから密封されており、前述のように、ブリスター２４８，２６４の各対に対して、熱サイクリングが進行する。熱サイクリング後、試料は、再びブリスター２６６内において再結合されてもよいし、または第２段階ブリスターの個別のセットに個々に送られてもよい。
【００６９】
第１段階ＰＣＲが所望のサイクル数にわたって進行した後、図５の実施形態において説明したように、試料は、以下のように、すなわち、試料の殆どをブリスター２４８に押し戻し、わずかな量のみを残し、チャンバ２９２ｉから第２段階ＰＣＲマスターミックスを加えることによって、希釈されるとよい。代替的に、チャンバ２９２ｉからの希釈緩衝液が、チャネル２４９を介してブリスター２６６に移動され、次いで、流体をブリスター２６４，２６６間を往復移動させることによって、ブリスター２６４内の増幅された試料に混合されてもよい。混合の後、ブリスター２６４に残っている希釈された試料の一部は、廃棄物容器として機能する３ローブ式ブリスター２２２に押し戻される。必要に応じて、チャンバ２９２ｊ，２９２ｋからの希釈緩衝液を用いて、次いで、チャンバ２９２ｇからの第２段階ＰＣＲマスターミックスを希釈された増幅試料の一部または全てに添加することによって、希釈が数回繰り返されるとよい。希釈のレベルは、希釈ステップの回数を変更することによって、または希釈緩衝液または第２段階ＰＣＲマスターミックスとの混合の前に廃棄される試料の割合を変更することによって、調整されるとよいことを理解されたい。必要に応じて、試料と第２段階ＰＣＲマスターミックスとのこの混合物は、第２段階増幅のために第２段階ブリスター２８２に移動する前に、ブリスター２６４内において予熱されてもよい。前述したように、このような予熱は、第２段階ＰＣＲ混合物内のホットスタート成分（抗体、薬物、など）の必要性を排除することができる。
【００７０】
例示的な第２段階ＰＣＲマスターミックスは、不完全であり、プライマー対が欠けており、１８個の第２段階ブリスター２８２の各々には、特異性ＰＣＲプライマー対が予め装填されている。必要に応じて、第２段階ＰＣＲマスターミックスは、他の反応成分も欠けていることがあり、これらの成分も、第２段階ブリスター２８２内に予め装填されているとよい。前述の実施例において説明したように、各プライマー対は、第１段階ＰＣＲプライマー対と同じであってもよいし、または第１段階プライマー対内に入れ子(ｎｅｓｔ)になっていてもよい。ブリスター２６４から第２段階ブリスターへの試料の移動によって、ＰＣＲ反応混合物が完全なものになる。チャンバ２９２ｌからの対照試料も、チャネル２６７を介して対照ブリスター２８３に移動する。対照試料は、必要に応じて、陽性対照であってもよいし、または陰性対照であってもよい。例示的に、各ポーチは、プロセスの各ステップの操作を正当であると確認し、陽性結果が予め増幅された核酸の自己汚染の結果ではないことを実証する対照反応を含んでいる。しかし、これは、多くのプロトコルにおいて、特に高次の多重反応において、実際的ではない。適切な対照をもたらす１つの例示的な方法は、試料にパン酵母などの種を加えることが含まれている。該核酸は、他の核酸と共に酵母から抽出される。第１段階ＰＣＲ反応および第２段階ＰＣＲ反応は、酵母ゲノムからＤＮＡ標的および／またはＲＮＡ標的を増幅させる。例示的には、分割された前駆体ｍＲＮＡから導かれるｍＲＮＡ配列を用いて、プライマー配列をイントロンを跨ぐように配置することによって、ＲＮＡ特異的標的配列を生成することができる。参照標準に対する酵母コピー数の定量分析によって、システムの各成分が機能していることを実質的に確認することが可能である。多くの第２段階アッセイの各々に対する陰性対照反応は、より問題である。対照反応を平行してまたは独立して行うことが望ましい。
【００７１】
プラダーアセンブリ８１０のプラダー８８２の作動によって、試料がそれらの第２段階ブリスター２８２，２８３内に密封され、プラダー８８０の作動によって、第２段階ブリスター２８２，２８３に弱い圧力が加えられ、これによって、第２段階ブリスター２８２，２８３が加熱／冷却装置に接触させられる。第２段階増幅区域２８０に面して配置された窓８４７によって、ＰＣＲ中および反応産物のＤＮＡ融解曲線分析中のアレイを蛍光モニタリングすることが可能になる。
【００７２】
図６のポーチ２１０は、いくつかの非密封領域、例えば、非密封領域２５５および非密封領域２５６を有することに留意されたい。これらの非密封領域は、この例示的実施形態における反応のいずれにも関連しないブリスターを形成している。むしろ、これらの非密封領域は、作動ブリスターとチャネルとの間の空間に設けられている。いくつかの製造プロセスにおいて、全ての非使用空間が密封されたポーチと比較して、領域２５５，２５６のような非密封領域が設けられている場合の方が、漏れが少ないことが分かっている。これは、フィルム材料において問題になる皺が低減することによると推測される。このような非密封領域は、任意選択的に、どのようなポーチの実施形態に設けられてもよい。
【００７３】
図８は、ポーチ２１０と共に用いることができる例示的な機器８００を示している。機器８００は、支持部材８０２を備えている。支持部材８０２は、ケーシングの壁を形成するかまたはケーシング内に取付けられている。機器８００は、第２の支持部材８０４も備えている。第２の支持部材８０４は、任意選択的に支持部材８０２に対して移動可能になっており、これによって、ポーチ２１０の挿入および取出しが可能になる。移動可能な支持部材８０４は、軌道上に取付けられていてもよいし、または種々の方法によって支持部材８０２に対して移動するようになっていてもよい。例示的には、いったんポーチ２１０が機器８００内に挿入されたなら、蓋８０５がポーチ２１０を覆って嵌合されるようになっている。他の実施形態では、支持部材８０２，８０４は、ポーチ２１０が適所に配置された状態で、他の機械的手段または空圧によって互いに固定されるとよい。
【００７４】
例示的に、ブラダーアセンブリ８１０および空圧弁アセンブリ８０が移動可能な部材８０２上に取付けられており、ヒータ８８６，８８８が支持部材８０２上に取付けられている。しかし、この構成は、単なる例示にすぎず、他の構成も可能であることを理解されたい。ブラダーアセンブリ８１０および空圧弁アセンブリ８０８が移動可能な支持部材８０４に取り付けられているので、これらの空圧アクチュエータは、ポーチ２１０と接触して配置されるように、ポーチ２１０に向かって移動することができる。ポーチ２１０が機器８００内に挿入され、移動可能な支持部材８０４が支持部材８０２に向かって移動されると、ポーチ２１０の種々のブリスターは、ブラダーアセンブリ８１０の種々の空圧ブラダーおよび空圧弁アセンブリ８０８の種々の空圧ピストンに隣接して配置され、これによって、空圧アクチュエータの作動によって、ポーチ２１０のブリスターの１つまたは複数から液体を押し出すことができ、またはポーチ２１０の１つまたは複数のチャネルに対してピンチ弁を形成することができる。ポーチ２１０のブリスターおよびチャネルとブラダーアセンブリ８１０の空圧アクチュエータおよび空圧弁アセンブリ８０８との間の関係については、図９および図１０に関して以下にさらに詳細に検討する。
【００７５】
各空圧アクチュエータは、１つまたは複数の空圧取付具を有している。例えば、ブラダーアセンブリ８１０のブラダー８２４は、空圧取付具８２４ａを有しており、空圧ピストン８４３は、関連する空圧取付具８４３ａを有している。例示的実施形態では、ブラダーアセンブリ８１０の空圧取付具の各々は、移動可能な支持部材８０４の通路８１６を貫通しており、ホース８７８が各空圧取付具を弁８９９を介して圧縮空気源８９５に接続している。例示的実施形態では、通路８１６は、圧縮空気源８９５へのアクセスをもたらすのみならず、ブラダーがポーチ２１０のブリスターと適切に位置合わせされるように、ブラダーアセンブリ８１０の種々の構成部品を真っ直ぐに並べるのを助長する。
【００７６】
同様に、空圧弁アセンブリ８０８も、移動可能な支持部材８０４に取付けられている。しかし、他の構成も可能であることを理解されたい。例示的実施形態では、空圧弁アセンブリ８０８のピン８５８が移動可能な支持部材８０４の取付け開口８５９に取付けられ、空圧ピストン８４３，８５２，８５３，８６２は、移動可能な支持部材８０４の通路８１６を貫通し、ポーチ２１０に接触するようになっている。図示されているように、ブラダーアセンブリは、移動可能な支持部８０４の第１の側８１１に取付けらており、空圧弁アセンブリ８０８は、移動可能な支持部材８０４の第２の側８１２に取付けられている。しかし、空圧ピストン８４３，８５２，８５３，８６２は、通路８１６を貫通しているので、空圧弁アセンブリ８０８の空圧ピストンおよびブラダーアセンブリ８１０の空圧ブラダーは、協働して、ポーチ２１０の必要な空圧アクチュエータをもたらすように機能している。
【００７７】
前述したように、ブラダーアセンブリ８１０の空圧アクチュエータおよび空圧弁アセンブリ８０８の各々は、関連する空圧取付具を有している。図８においていくつかのホース８７８しか示されていないが、各空圧取付具は、ホース８７８を介して圧縮空気源８９５に接続されていることを理解されたい。圧縮ガス源８９５は、コンプレッサーであってもよいし、または代替的に二酸化炭素シリンダーのような圧縮ガスシリンダーであってもよい。圧縮ガスシリンダーは、もし携帯性が望まれるなら、特に有用である。圧縮ガスの他の源も本発明の範囲内にある。
【００７８】
機器８１０のいくつかの他の構成部品も  圧縮ガス源８９５に接続されている。支持部材８０２の第１の側８１３に取付けられている磁石８５０は、例示的に、ホース８７８を介する圧縮ガス源８９５からのガスを用いて、展開および後退するようになっている。しかし、磁石８５０を移動させる他の方法も、当技術分野において知られている。磁石８５０は、支持部材８０２の凹部８５１内に着座している。凹部８５１は、支持部材８０２を貫通する通路とすることができ、これによって、磁石８５０は、ポーチ２１０のブリスター２４６に接触することができることを理解されたい。しかし、支持部材８０２の材料に依存して、磁石８５０が展開したときに該磁石８５０がブリスター２４６に充分な磁場をもたらすのに充分に接近し、磁石８５０が後退したときに該磁石８５０がブリスター２４６に存在するどのような磁気ビーズにも著しい影響を与えない限り、凹部８５１は、支持部材８０２を通り抜ける必要がないことを理解されたい。格納式磁石８５０を参照しているが、電気磁石が用いられてもよく、この電磁石は、該電磁石を通る電流を制御することによって、作動および作動停止されるようになっていてもよいことを理解されたい。従って、本明細書では、磁石の引出しおよび後退について述べているが、これらの用語は、磁場を引き出す他の方法を含むように充分に広いことを理解されたい。空圧接続部は、空圧ホースまたは空圧空気マニホールドであってもよく、これによって、必要とされるホースまたは弁の数を減らすことができることを理解されたい。
【００７９】
支持体８０２に取付けられた空圧ピストンアレイ８６９の種々の空圧ピストン８６８も、ホース８７８を介して圧縮ガス源８９５に接続されている。空圧ピストン８６８を圧縮ガス源８９５に接続する２つのホース８７８しか示されていないが、空圧ピストン８６８の各々が圧縮ガス源８９５に接続されていることを理解されたい。１２個の空圧ピストン８６８が示されている。ポーチ２１０が機器８００内に挿入されると、１２個の空圧ピストン８６８が、それぞれ、ポーチ２１０の１２個のプランジャー２６８を作動するように配置される。蓋８０５がポーチ２１０を覆って閉じられると、蓋８０５のリップ８０６が取付具２９０を支持し、これによって、空圧ピストン８６８が作動するとき、蓋８０５は、取付具２９０を適所に保持することができる。取付具２９０の他の支持体も本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【００８０】
１対の加熱／冷却装置、例えば、ペルチェヒータが、支持体８０２の第２の側８１４に取付けられている。第１段階ＰＣＲのためにブリスター２６４の内容物を加熱および冷却するために、第１段階ヒータ８８６が配置されている。第２段階ＰＣＲのためにポーチ２１０の第２段階ブリスター２８２，２８３の内容物を加熱および冷却するために、第２段階ヒータ８８８が配置されている。しかし、これらのヒータは、他の加熱目的のために用いられてもよいこと、および特定の用途に対して、必要に応じて、他のヒータが含まれていてもよいことを理解されたい。
【００８１】
必要に応じて、試料が実際に特定のブリスター内に押し込まれたかどうかに関するフィードバックをもたらすために、フィードバック機構（図示せず）が機器８００内に含まれていてもよい。例示的なフィードバック機構の例として、温度または圧力センサ、または特に蛍光染料または着色染料が含まれている場合、光学検出器が挙げられる。このようなフィードバック機構は、例示的に、支持部材８０２，８０４のいずれかに取付けられるとよい。例えば、圧力センサがブリスター２６４の位置に隣接して支持体８０２に取付けられるとよい。試料が支持されながらブリスター２６４に移動したとき、もし圧力センサが押し下げられたなら、試料処理の継続が許容される。しかし、もし圧力センサが押し下げられなかったなら、試料処理が停止され、またはエラーメッセージがスクリーン８９２上に表示される。ブリスターのどのような組合せまたはブリスターの全てが、ポーチを通る試料の適切な移動に関するフィードバックをもたらすために、フィードバック機構を有しているとよい。
【００８２】
蛍光検出が望ましい場合、光学アレイ８９０が設けられるとよい。図８に示されているように、光学アレイ８９０は、光源８９８、例えば、フィルター付きＬＥＤ光源、フィルター付き白灯、またはレーザー照射、およびカメラ８９６を備えている。移動可能な支持体８０４の窓８４７が、ポーチ２１０の第２段階増幅区域２８０への光学アレイ８９０のアクセスを可能にしている。例示的には、カメラ８９６は、複数の光検出器を有しており、これらの光検出機の各々は、ポーチ２１０の第２段階ブリスター２８２，２８３に対応している。代替的に、カメラ８９６は、第２段階ブリスター２８２，２８３の全てを含む画像を取得し、この画像を第２段階ブリスター２８２，２８３の各々に対応する個別の視野に分割するようになっていてもよい。構成にもよるが、光学アレイ８９０は、静止していてもよいし、または１つまたは複数のモータに取付けられた可動体上に配置され、個々の第２段階ブリスター２８２，２８３からの信号を得るように移動するようになっていてもよい。他の構成も可能であることを理解されたい。
【００８３】
図示されているように、コンピュータ８９４が、圧縮空気源８９５の弁８９９を制御し、これによって、機器８００の空圧機構の全てを制御するようになっている。また、コンピュータ８９４は、ヒータ８８６，８８８および光学アレイ８９０も制御するようになっている。これらの構成要素の各々は、電気的に、例えば、ケーブル８９１を介して、互いに接続されている。しかし、他の物理的接続または無線接続も本発明の範囲内にある。コンピュータ８９４は、機器８９０内に収容されていてもよいし、または機器８９０の外部に配置されていてもよいことを理解されたい。さらに、コンピュータ８９４は、構成部品のいくつかまたは全てを制御する内蔵式回路基板を備えていてもよいし、光学アレイからのデータを受信し、かつ表示するために、外部コンピュータ、例えば、デスクトップ式またはラップトップ式ＰＣを備えていてもよい。情報および変数、例えば、温度、サイクル時間、などを入力するために、キーを備えるインターフェイス８９３、例えば、キーボード・インターフェイスが設けられているとよい。例示的には、ディスプレイ８９２も設けられている。ディスプレイ８９２は、例えば、ＬＥＤ、ＬＣＤ、または他のこのようなディスプレイであるとよい。
【００８４】
図９は、機器８００の操作中のブラダーアセンブリ８１０とポーチ２１０との関係を示している。ブラダーアセンブリは、サブアセンブリ８１５，８１７，８１８，８１９，８２２を備えている。ブラダーサブアセンブリ８１５のブラダー８０９が大きいので、ブラダーサブアセンブリ８１５は、例示的に、２つの空圧取付具８１５ａ，８１５ｂを有している。ブラダー８０９は、（図６に示されているように）ポーチ２１０のプラスチックフィルム部分２１７からチャンバ２９２を封鎖するために用いられる。プランジャー２６８の１つが押圧されると、空圧取付具８１５ａ，８１５ｂの一方または両方がブラダー８０９を萎縮させることができる。流体がチャンバ２９２の１つを通り抜けた後、ブラダー８０９は、再加圧され、チャネル２１４，２３６，２４５，２４７，２４９を密封する。例示されているブラダーサブアセンブリ８１５は、１つのブラダー８０９しか有していないが、他の構成、例えば、チャネル２１４，２３６，２４５，２４７，２４９の各々がそれ自体に関連するブラダーまたは空圧ピストンを有する構成も可能であることを理解されたい。ブラダーサブアセンブリ８２２は、例示的に、３つのブラダー８２４，８２６，８２８を備えている。前述したように、ブラダー８２４，８２４，８２８は、細胞溶解のために３ローブ式ブリスターを駆動するようになっている。図示されているように、ブラダー８２４，８２６，８２８は、対応するブリスター２２４，２２６，２２８よりもいくらか大きくなっている。膨張時に、ブラダーの表面がいくらかドーム状になるので、いくらか大きいブラダーを用いることによって、対応するブリスターの全面に対して良好な接触をもたらし、ブリスターのより均一な加圧および排気を可能にすることが分かっている。しかし、場合によっては、個々のブリスターの完全な排気が望まれることもあるが、望まれないこともあり、ブリスターの排気量を制御するために、より大きいまたはより小さい大きさのブラダーが用いられてもよい。ブラダーサブアセンブリ８１７は、４つのブラダーを有している。ブラダー８３６は、チャネル２３６のためのピンチ弁として機能し、ブラダー８４４，８４６，８６６は、それぞれ、ブリスター２４４，２４８，２６６に圧力をもたらすように構成されている。ブラダーサブアセンブリ８１８は、２つのブラダー８４６，８６４を有している。ブラダー８４６，８６４は、それぞれ、ブリスター２４６，２６４に圧力をもたらすように構成されている。最後に、ブラダーサブアセンブリ８１９は、第２段階増幅区域２８０を制御するものである。ブラダー８６５は、チャネル２６５，２６７用のピンチ弁として作用し、ブラダー８８２は、第２段階ブリスターをヒータ８８８に密接触するように押し込むために、第２段階ブリスター２８２，２８３に弱い圧力をもたらすようになっている。ブラダーアセンブリ８１０は、５つのサブアセンブリを備えているが、この構成は、単なる例示にすぎず、どのような数のサブアセンブリが設けられてもよいこと、およびブラダーアセンブリ８１０は、単一の一体化アセンブリとして設けられてもよいことを理解されたい。
【００８５】
図１０は、同様に、機器８００の操作中の空圧弁アセンブリ８０８とポーチ２１０との関係を示している。ブラダーではなく、空圧弁アセンブリ８０８が、４つの空圧ピストン８４２，８５２，８５３，８６２を有している。各々が圧縮空気によって駆動されるこれらの空圧ピストン８４２，８５２，８５３，８６２は、チャネル２４２，２５２，２５３，２６２に方向性のある圧力をもたらすことになる。ピストンは、その直径が適度に小さいので、ブラダーサブアセンブリ８１７とブラダーサブアセンブリ８１８との間に嵌合することによって、チャネル２４２，２５２，２５３，２６２のためのピンチ弁をもたらし、チャネル２４２，２５２，２５３，２６２を適度に短くすることができる。しかし、必要に応じて、空圧ピストン８４２，８５２，８５３，８６２は、ブラダーアセンブリ８１０に含まれるブラダーに置き換えられてもよく、これによって、空圧弁アセンブリの必要性をなくすことができる。ブラダーと空圧ピストンとの間のどのような組合せも本発明の範囲内にあることを理解されたい。また、当技術分野において知られているポーチ２１０のチャネルおよびブリスターに圧力を加える他の方法も本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【００８６】
図１２は、図６のポーチ２１０と同様のポーチ５１０を示している。入口チャネル５１５ａ〜５１５ｌを有する取付具５９０は、入口チャネル２１５ａ〜２１５ｌを有する取付具２９０と同様である。チャネル５３８，５４３，５５２，５５３，５６２，５６５をそれぞれ有するブリスター５４４，５４６，５４８，５６４，５６６は、ポーチ２１０のチャネル２３８，２４３，２５２，２５３，２６２，２６４をそれぞれ有するブリスター２４４，２４６，２４８，２６４，２６６と同様である。ポーチ２１０のチャネル２４５，２４７，２４９は、ポーチ５１０のチャネル５４５ａ〜５４５ｃ，５４７ａ〜５４７ｂ，５４８ａ〜５４８ｃとしていくらか再構成されており、ポーチ５１０のそれぞれのチャネルは、ポーチ２１０の対応するチャネルよりもいくらか短くなっている。しかし、このチャネル構成は、単なる例示にすぎないこと、および種々のチャネル構成が可能であることを理解されたい。
【００８７】
図１２のポーチ５１０と図６のポーチ６との間には、２つの主な違いがある。第１に、３ローブ式ブリスター２２２が、溶解ブリスター５２２に置き換えられている。溶解ブリスター５２２は、図２ｂに示されているように、電動モータ１９に取付けられた回転ブレードまたはパドル２１を用いて、衝撃を介して渦を生じさせるように構成されている。この溶解方法は、空圧ピストンの交互圧力に依存しないので、単一ローブ式ブリスターのみが示されている。溶解ブリスター５２２が単一ブリスターしか有していないので、チャネル５１４，５３６の両方が溶解ブリスター５２２の単一ローブに繋がっている。溶解ブリスターは、本明細書に記載されているポーチの実施形態のいずれに用いられてもよいことを理解されたい。溶解アセンブリ５２２は、例示的には、ブリスター５２２用に構成された単一ブラダーを有するブラダーサブアセンブリ８２２のブラダー８２４，８２６，８２８に置き換えられるように修正されてもよいことをさらに理解されたい。逆に、前述の種々の他の実施形態において述べた３ローブ式ブリスターがポーチ５１０に用いられてもよい。溶解ブリスター５２２は、任意選択的な補強パッチ５２３を備えていてもよい。強化パッチ５２３は、例示的に、接着剤または積層によって溶解ブリスター５２２の外面に取付けられている。補強パッチ５２３は、パドル２１との繰返し接触によるポーチ５１０の引裂きを最小限に抑えるのを助長するものである。図１３は、第２の支持部材８０４に取付けられる電動モータ、例えば、マブチＲＣ-２８０ＳＡ-２８６５ ＤＣモータ（千葉、日本）を示している。一例示的実施形態では、このモータｈａ、５，０００〜２５，０００ｒｐｍ、さらに例示的には、１０，０００〜２０，０００ｒｐｍ、さらに一層例示的には、略１５，０００〜１８，０００ｒｐｍで回転する。マブチモータの場合、７．２Ｖで溶解に対して充分な回転数が得られることが分かっている。しかし、ブレード２１がポーチ５１０に衝撃を与える場合、実際の速度は、いくらか遅くなることを理解されたい。用いられるモータおよびパドルに依存して、他の電圧および速度が溶解に対して用いられてもよい。任意選択的に、制御された少量の空気が、溶解ブリスター５２２に隣接するブラダー内に供給されてもよい。いくつかの実施形態では、隣接するブラダーに１回または複数回にわたって少量の空気を部分的に充填することによって、溶解プロセス中に溶解スリスターを位置決めし、かつ支持するのを助長することができることが見出されている。代替的に、溶解中にポーチ５１０を保持するために、他の構造、例えば、ブリスター５２２を包囲する剛性または柔軟ガスケットまたは他の保持構造が用いられてもよい。
【００８８】
図１２のポーチ５１０と図６のポーチ２１０との間の第２の主な違いは、第２段階増幅区域２８０のブリスター２８１，２８２，２８３が、第２段階増幅区域５８０における高密度アレイ５８１に置き換えられている点にある。高密度アレイ５８１は、複数の第２段階ウエル５８２，例示的には、５０個以上のウエル、さらに例示的には、１２０個以上のウエルを備えている。さらにより多くの第２段階ウエル５８２，例示的には、約２００個、約４００個、さらに、約５００個以上の第２段階ウエル５８２を有する実施形態も本発明の範囲内にある。他の構成も本発明の範囲内にある。付加的な第２段階ウエルは、ウエル５８２をより小さくすることによって、または高密度アレイ５８１をより大きくすることによって、またはこれらを組み合わせることによって、追加されてもよい。第２段階ＰＣＲにおいて、ウエルの各々は、対のプライマーを含むようになっているとよい。１つまたは複数のウエルは、陽性対照（positive control）または陰性対照（negative control）のために用いられてもよいことを理解されたい。
【００８９】
ウエルがブリスター５６６内の希釈された第１段階増幅産物によって満たされたときのウエル間の交差汚染が、大きな問題になる可能性がある。交差汚染は、ポーチ２１０では、図９に示されているように、各第２段階ブリスターをチャネル２６５の個別の分岐を介して充填し、次いで、ブラダー８８２によって密封することによって、制御されるようになっている。流体がブリスター５８４のいくつかまたは全てを満たす高密度アレイ５８１においても、ウエル間の交差汚染は、制御されねばならない。一実施形態では、第２段階ＰＣＲプライマーは、各ウエルの内面に共有結合または非共有結合の形態で結合しており、これによって、ＰＣＲチップと全く同様に機能している。しかし、多くの実施形態では、ＰＣＲプライマーをウエルに拘束させることなく、ウエル間の交差汚染を制御することが望ましい。ウエル間の交差汚染の制御は、流体が、高密度アレイ５８１の第１の表面５８１ａを横切って流れることによって、ブリスター５６６からウエル５８２に移動する実施形態では、困難になる。
【００９０】
第２段階増幅区域５８０の満足のいく装填のためにいくつかの望ましい特徴について説明する。第１に、ブリスター５６６から流入する流体は、実質的に全てのウエル５８２を実質的に同一レベルで満たすことが望ましい。満たされなかったウエルは、誤った負信号を生じることになる。第２に、ウエル５８２を満たすプロセスは、ウエル内のプリマーを漏出させないことが望ましい。１つのウエルからのプライマーの損失は、該ウエル内のＰＣＲ反応の効率を制限し、近傍のウエルを汚染させる可能性がある。第３に、ウエル５８２が満たされ、ＰＣＲが開始した後、これらのウエルは、互いに完全に密封されることが望ましい。一つのウエルから他のウエルへの増幅産物の漏れは、第１のウエルの信号を低下させ、第２のウエルの信号を増大させ、これによって、第１のウエルにおける誤った負信号および第２のウエルにおける誤った正信号をもたらす可能性がある。さらに、制御の種類によっては、１つのウエハにおいて生じた増幅産物が他のウエルに進入してさらに増幅されないことが重要である。
【００９１】
この問題の解決策として、バリア層の使用が挙げられる。一実施例では、バリア層は、ウエルの迅速な装填および界面に触れていない流体からの迅速な密封を可能にするために設けられる物理的バリア層である。他の例では、化学的バリアと物理的バリアの組合せが用いられるが、この場合、物理的バリアがウエルを密封するために用いられ、次いで、化学的バリアが、例えば、加熱、徐放、または酵素消化によって、オリゴヌクレオチドプライマーをウエル溶液内に条件付きで放出するようになっている。ウエル深さまたは各ウエルに対するチャネル長さを用いて、ウエルからの試薬の放出を制御してもよい。高密度アレイ５８１を装填するための他の手段も可能である。
【００９２】
図１４は、物理的バリアを用いる第２段階５８０の例示的実施形態を示している。ポーチ５１０の第１の層５１８と第２の層５１９との間に挟まれているのは、ウエル５８２を有する高密度アレイ５８１である。貫通孔５８６を有する穿孔層５８５が、高密度アレイ５８１の片側に設けられている。穿孔層５８５は、物理的バリアとして作用するものである。第２の層５８７が、高密度アレイ５８１の反対側に設けられている。第２の層５８７は、ウエル５８２の底を形成している。例示的に、穿孔層５８５および第２の層５８７は、熱融着によって高密度アレイ５８１に封止されたプラスチックフィルムである。しかし、他の封止方法が用いられてもよいことを理解されたい。また、高密度アレイ５８１に用いられる材料ならびに穿孔層５８５および第２の層５８７に用いられる材料は、互いに対する適合性、封止方法に対する適合性、および用いられる化学反応に対する適合性を有するべきであることを理解されたい。ＰＣＲに用いられる場合、高密度アレイ５８１に用いることができると共に熱融着を行うこともできる適合性プラスチックの例として、ＰＥ、ＰＰ、Ｍｏｎｐｒｅｎｅ(登録商標)、および他のブロックコポリマーエラストマーが挙げられる。蛍光染料が化学検出に用いられる場合、高密度アレイ５８１が黒色材料または蛍光に対して比較的不透明な他の材料から形成され、層５７５，５８７の少なくとも１つが蛍光に対して比較的透明であると、１つのウエル５８２からその近傍のウエルへの信号漏れを最小限に抑えることができるので、望ましい。穿孔層５８５および第２の層５８７に対して、Ｍｙｌａｒ(登録商標)またはＰＥＴのような強靭なエンジニアリングプラスチックとＰＥ，ＰＰ，およびＤｕｐｏｎｔ Ｓｕｒｌｙｎ(登録商標)のような熱融着可能なプラスチック層との積層体が用いられるとよい。接着剤に基づくシステムの場合、ＰＥＴまたはポリカーボネートのような剛性エンジニアリングプラスチックを用いて、高密度アレイ５８１を形成し、次いで、穿孔層５８５および第２の層５８７として、ＰＣＲ適合性プラスチックのフィルムが用いられてもよい。例示的な一実施形態では、高密度アレイ５８１は、黒色ＰＥから作製され、複合ポリエチレン／ＰＥＴラミネート（またはＸｅｒｏｘ(登録商標) ＰＮ１０４７０２：熱ラミネートポーチ材料）が高密度アレイ５８１に熱融着される穿孔層５８５および第２の層５８７に対して用いられ、複合ポリプロピレン／ＰＥＴがポーチ５１０の第１および第２の層５１８，５１９に対して用いられるようになっている。
【００９３】
貫通孔は、ウエル５８２と一直線に並んでいることを理解されたい。また、貫通孔５８６は、力が作用しないなら、流体が容易に貫通孔５８６を通って流れないように充分小さいことを理解されたい。例示的な貫通孔は、０．００１〜０．１ｍｍ、例示的には、０．００５〜０．０２ｍｍ、さらに例示的には、約０．０１ｍｍであるとよい。例示的実施形態では、第２段階増幅区域５８０は、真空下にあり、これによって、流体がブリスター５６６に入るとき、真空が流体を貫通孔５８６を通って各ウエル５８２内に引き込むことになる。いったんウエル５８２が満たされると、流体をウエル５８２内に押し込むかまたはウエル５８２から押し出す力は、もはや存在しない。次いで、第２段階増幅区域５８０に隣接するブラダー（図示されていないが、ブラダー８８０／８８２と同様の位置にあるブラダー）が作動し、第１の層５１８を高密度アレイ５８１に対して押圧し、流体をウエル５８２内に密封する。ウエル５８２を密封するためにポーチ５１０の第１の層５１８が用いられているが、任意選択的な密封層が穿孔層５８５と第１の層５１８との間に設けられていてもよいことを理解されたい。
【００９４】
例示されている一実施例では、第２段階増幅区域５８０は、以下のように準備されるとよい。高密度アレイ５８１は、最初、プラスチックシート（例示的に、０．１〜１ｍｍ厚み）にウエル５８２のアレイを穿孔、成形、またはそれ以外の方法によって形成することによって、作製されるとよい。ウエルは、所望されるどのような規則的または不規則的なアレイを形成していてもよく、例示的には、０．０５〜２０μＬ、さらに例示的には、０．１〜４μＬの体積を有しているとよい。次いで、層５８５，５８７の１つが、例えば、熱または接着剤によって、高密度アレイ５８１の第１の表面５８１ａに積層される。図１５の例では、穿孔層５８５が第１の表面５８１ａに付着されている。次いで、試薬５８９，例示的には、アレイの固有の化学要素、例えば、ＰＣＲプライマー対が、ピペット操作に基づく手動によって、または自動的に（例示的に、ピンスポッター、ドットマトリックスプリンター、少量自動ピペット、またはマイクロ流体マイクロ接触スポッターのようなx／ｙ位置決め可能スポッターを用いて）ウエル内にスポッティングされる。試薬をスポティングする例示的な装置については、以下の実施例４において検討する。試薬５８９が各ウエル５８２内において乾燥した後、第２の層５８５または５８７がアレイ５８１の第２の表面５８１ｂに取付けられる。層５８５は、小径ニードルのアレイを用いて穿孔され、これによって、貫通孔が形成される。貫通孔５８６は、層５８５がアレイ５８１に固定される前または後のいずれに形成されてもよい。スポッティングは、穿孔の前または後の層５８５または層５８７のいずれに対して行われてもよいことを理解されたい。予め穿孔された孔を有するアレイのスポティングは、実質的に漏れず、穿孔に用いられるニードルがスポッティングされた試薬との接触によって汚染されないという利点をもたらすことが分かっている。代替的に、漏れの可能性を最小限に抑えるために、かつスポッティングされた試薬をアレイの最も遠い箇所に位置決めするために、試薬５８９を第２の層５８７にスポッティングし、アレイ５８１を層５８５によって密封し、次いで、層５８５を穿孔することが望ましい。代替的な実施例では、試薬は、ＧｅＳｉＭ社製Ａ０６０−３２４ Ｎａｎｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ  ２．１／Ｅ（グロッサークメンスドルフ、ドイツ）または実施例４において以下に検討するスポッターを用いて、第２の層５８７上にスポッティングされる。このようなスポッターを用いることによって、多重アレイを同時にスポッティングすることができる。
【００９５】
いったんスポッティングされ、かつ穿孔されたなら、アレイ５８１は、例えば、熱融着、接着剤、超音波溶着、機械的な閉鎖、またはポーチ５１０の内側のアレイ５８１をブリスター５８４内に密閉する他の手段によって、ポーチ５１０の層５１８および５１９の内側に配置され、適所に密封されることになる。ブリスター５８４は、チャネル５６５を介してブリスター５６６に流体接続していること、および流体は、チャネル５６５からブリスター５８４内に入って貫通孔５８６の全体にわたって流れることができることを理解されたい。例示的な一実施例では、ブリスター５８４が形成されるとき、脱気のための経路をもたらすことに注意が払われるべきである。これは、第２段階増幅区域５８０に隣接する第１の層５１８の内面に（フィルム材料にいくらか隆起したテクスチャのパターンを刻む）「ワッフル構造」によって、達成することができる。これによって、空気および液体が穿孔層５８５の表面に沿って流れることができ、液体が良好にウエル５８２の全てに到達し、かつ満たすことができる。次いで、ポーチ５１０は、真空チャンバ内に配置され、減圧される。例示的には、圧力が略０．３ミリバールに達すると、真空チャンバ内の空圧シリンダーが作動し、プランジャーを取付具５９０内に下向きに移動させ、チャネル５６７を密封し、これによって、密封ポーチの内側のアレイおよび真空チャンバから経路を遮断することができる。種々の入口チャネル５１５を密封するために、複数の他のプランジャーも取付具５９０内に押し込まれる。ポーチは、真空チャンバから取り出され、長期貯蔵するために、真空バッグ内に包装されるとよい。
【００９６】
ポーチ５１０は、ポーチ２１０と同じように用いられるとよい。アレイ５８１が真空に包装されているので、液体がブリスター５６６から第２段階増幅区域５８０に移動するとき、液体試料は、貫通孔５８６を通してウエル５８２内に引き込まれる。余分の液体は、アレイに面する空圧ブラダーを膨張させることによって押し出され、熱サイクリングが、前述したように、例えば、アレイの片側に押し付けられたペルチ素子を加熱および冷却することによって行われる。
【００９７】
前述したように、穿孔層５８５は、種々の適切な物理的または化学的バリアに置き換えられてもよい。化学的バリアを用いる一例示的実施形態では、穿孔層５８５が省略され、試薬５８９は、比較的緩慢に溶解するバッファー内においてウエル５８２内にスポッティングされるようになっている。例示的に、ＰＥＧ、Ｆｉｃｏｌｌ、またはポリソルベート２０のようなポリマー，またはサクロース、トレハロース、またはマニトールのような糖類を適切な濃度で含む試薬５８９は、第２段階ＰＣＲ反応と適合性があり、水またはＴｒｉｓ/ＥＤＴＡにおいてのみスポティングされるプライマーよりも緩慢に溶解するものである。これらのバッファーの１つにスポティングされたプライマーは、前述したように、ウエル５８２内において空気乾燥される（このような実施形態では、第２の層５８７は、スポッティングのために高密度アレイ５８１に取付けられることを理解されたい）。酵素試薬（例えば、ＰＣＲにおいて用いられる酵素および緩衝剤）の凍結乾燥において、同一ポリマーを用いて、安定化酵素を含有するオープンマトリックスを形成してもよい。従って、これらのバッファーにスポッティングされたプライマーは、ウエル５８２内の適所で凍結乾燥され、これによって、空気乾燥の場合よりも遅いが、より完全な再水和が得られることになる。ポーチ５１０が用いられるとき、ブリスター５６６からの流体は、真空または圧力によってウエル内に押し込まれ、プライマーミックスを溶解し始める。緩慢に溶解する緩衝材を適切に選択することによって、第２段階増幅区域５８０に隣接するブラダーが作動し、実質的な交差汚染が生じる前に、各ウエル５８２内の内容物が密封されることになる。
【００９８】
他の実施形態では、第２段階増幅区域５８０が所定温度を超える温度に加熱されるまで溶解しないマトリックスが用いられている。マトリックスのこのような一つの例は、低融点アガロース、例えば、ＧｅｎｅＰｕｒｅ  ＬｏｗＭｅｌｔアガロース（ISC Bioexpress）である。一例では、このアガロースの１．５％溶液は、６５℃で融解し、２４〜２８℃でゲル化する。スポッティング前に、試薬５８９が、例えば、５０℃に加熱し、すでに融解しているアガロースと混合され、その少量（例えば、１００〜５００ｎＬ）がウエル５８２内にスポッティングされるようになっている。スポティング中に混合物を液状に維持するために、このスポッティングは、アガロースの融点よりも高温に加熱されたキャビネット内で行われねばならない。代替的に、融解することなくアガロースの希釈溶液をピペット操作によって滴下することも可能である。アガロース／試薬の混合物がスポッティングされた後、高密度アレイ５８１が乾燥される。これは、単純な空気乾燥であってもよいし、またはプライマー／アガロース混合物が前述の糖およびポリマーを含有し、これによって試薬が凍結乾燥されるようになっていてもよい。ポーチ５１０がＰＣＲに用いられる場合、ブリスター５６６からの流体が高密度アレイ５８１内に移動するとき、第２段階増幅区域５８０が、例えば、５５℃に加熱されてもよい。この温度では、アガロースが融解しないので、プライマーは、溶液内に放出されない。いったん高密度アレイ５８１が充填されたなら、対応するブラダーが膨張され、ウエルを密封する。第１ＰＣＲサイクルの第１の変性ステップにおいて温度が６５℃を超えて上昇すると、プライマーを含有するアガロースが融解し、プライマーをマスターミックス内に放出する。例示的に、熱サイクリングは、６０℃（またはアガロースの他の融点）未満にならないため、アガロースは、熱サイクリング中にゲル化しない。さらに、図８の例示的な機器８００において、繰り返される温度サイクリングは、ポーチの片側に位置するヒータ８８８によってもたらされる。多くの場合、ウエル５８２内のＰＣＲ溶液を横切る温度勾配が存在し、これが流体の対流を生じさせ、プライマーの混合を促進すると考えられる。類似の実施形態において、ワックスが用いられてもよい。
【００９９】
さらなる実施形態では、プライマーは、条件付きでウエル５８１に結合されてもよく、この場合、ウエル５８１が充填された後、溶液内へのプライマーの放出が生じるようになっている。いかにプライマーがプラスチック支持体に付着されるかに応じて、熱（例えば、ＰＣＲ反応の第１のサイクル中の熱）、光（例えば、窓８４６を通って照射される光）、化学薬品（例えば、熱が加えられた状態でプライマーをウエルに連結するジスルフィド結合を還元するジチオスレイトール）、または酵素（例えば、プライマーを支持体に付着させる適切なペプチドリンカーを開裂するために用いられるプラスミノーゲン活性因子のような部位特異的プロテアーゼ）を用いて、プライマーを開裂させることができる。
【０１００】
さらに他の実施形態では、増幅の後、ＤＮアーゼが第２段階増幅区域５８０内に注入去れてもよく、これによって、汚染のいかなる潜在的なリスクもさらに最小限に抑えることができる。
【０１０１】
本明細書では、第２段階増幅区域５８０は、ＰＣＲと共に用いるものとして記載されていることを理解されたい。しかし、ポーチ５１０および第２段階増幅区域５８０の他の使用も、本発明の範囲内にある。さらに、第２段階増幅区域５８０は、核酸抽出および第１段階増幅区域と共に用いられもよいし、または単独で用いられてもよいことを理解されたい。最後に、第２段階増幅区域５８０は、本明細書に記載されているポーチの実施形態のいずれと共に用いられてもよいことを理解されたい。
【実施例１】
【０１０２】
［ネステッド多重ＰＣＲ］
（ポーチ１１０用に構成された）機器８００と同様の機器において、一組の反応を図５のポーチ１１０内で行った。細胞溶解および２段階核酸増幅の効果を示すために、５０μＬの対数期にあるS.cerevisaieおよびS.pombeの生きた保温菌の各々を１００μＬの健康なドナーの鼻喉頭吸引物と混合して試料を生成し、次いで、２００μＬの溶解緩衝液（６Ｍグアニジン−ＨＣＬ、１５％のＴｒｉｔｏｎＸ１００、３Ｍ酢酸ナトリウム）と混合した。次いで、溶解緩衝液内の４００μＬの試料の内、３００μＬをポーチ１１０のチャンバ１９２ａに注入した。
【０１０３】
ポーチ１１０は、３ローブ式ブリスター１２２内に０．２５ｇのＺＳビーズを密封するようにして、製造した。また、以下に検討する第２段階プライマーは、ポーチ１１０の製造中にブリスター１８１，１８２内にスポッティングした。ポーチ１１０は、以下のよう装填した。
【０１０４】
１１５ａ  前述した試料および溶解緩衝液
１１５ｂ  溶解緩衝液内の磁気ビーズ
１１５ｄ〜１１５ｅ  洗浄緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム）
１１５ｇ  溶離緩衝液（１０ｍＭトリス、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）
１１５ｈ  第１段階ＰＣＲ緩衝液
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ
０．３μＭ  プライマー：
Ｓｃ１：ＲＮＡおよびS．cerevisaieのＭＥＸ６７ｐに結合するＹＲＡ１核タンパク質の一部を増幅するように構成されたプライマー（このプライマーは、ｃＤＮＡ（Ｍ−ＭＬＶを介して逆転写したｍＲＮＡ）の増幅が１８０ｂpの増幅産物を生成するようにイントロンの全域で増幅するように構成されている）
Ｓｃ２：S.cerevisaieのＭＲＫ１グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）同族体のｃＤＮＡの１２１ｂｐ領域を増幅するように構成されたプライマー
Ｓｃ３：S.cerevisaieのＲＵＢ１ユビキチン様タンパク質のｃＤＮＡの２１３ｂｐ領域を増幅するように構成されたプライマー
Ｓｐ１：S.pombeのｓｕｃ１−サイクリン依存性タンパク質キナーゼ調節サブユニットのｃＤＮＡの２００ｂｐ領域を増幅するように構成されたプライマー。
Ｓｐ２：S.pombeのｓｅｃ１４−サイトゾル因子ファミリーのｃＤＮＡの１８０ｂｐ領域を増幅するように構成されたプライマー
３ｍＭのMgcl2含有ＰＣＲ緩衝液（ＢＳＡなし）
５０ユニットのＭ−ＭＬＶ
４．５ユニットのＴａｑ：抗体
１００ユニットのＲＮＡｓｅＯｕｔ
１１５ｊ〜１１５ｋ  第２段階ＰＣＲ緩衝液
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ
ＩＸＬＣ  Ｇｒｅｅｎ(登録商標)Ｐｌｕｓ (Idaho Technology)
２ｍＭのMgcl2含有ＰＣＲ緩衝液（ＢＳＡあり）
４．５ユニットのＴａｑ
１１５ｌ  第１段階増幅産物の試料を含む第２段階ＰＣＲ緩衝液
【０１０５】
製造中、第２段階ネステッドプライマーを第２段階ブリスター１８１，１８２にスポッティングした。第２段階ＰＣＲ緩衝液によって再水和されたときに約０．３μＭの最終濃度をもたらす量の１つのプライマー対を、各ブリスターにスポッティングした。第２段階ネステッドプライマーは、以下の通りである。
【０１０６】
Ｓｃ１：第１段階増幅産物のＳｃ１のｃＤＮＡの８０ｂｐ断片を増幅するように構成されたプライマー
Ｓｃ２：第１段階増幅産物のＳｃ１のｃＤＮＡの１２１ｂｐ断片を増幅するように構成されたプライマー
Ｓｃ３：第１段階増幅産物のＳｃ１のｃＤＮＡの９３ｂｐ部分を増幅するように構成されたプライマー
Ｓｐ１：第１段階増幅産物のＳｃ１のｃＤＮＡの９９ｂｐ部分を増幅するように構成されたプライマー
Ｓｐ２：第１段階増幅産物のＳｃ１のｃＤＮＡの９６ｂｐ部分を増幅するように構成されたプライマー
【０１０７】
標的のいずれに対しても、第１段階プライマー対と第２段階プライマー対とは、重複されていない。プライマーの各対を１つの陰性対照ブリスター１８１および２つの第２段階ブリスター１８２にスポッティングし、２通りの第２段階増幅を行い、それぞれ、陰性対照を行った。
【０１０８】
装填後、入口チャネル１１５ａに付随するプランジャーの作動によって、試料を３ローブ式ブリスター１２２に移動させ、入口チャネル１１５ｂに付随するプランジャーの作動によって、磁気ビーズをリザーバ１０１に移動させ、入口チャネル１１５ｄ〜１１５ｅに付随するプランジャーの作動によって、洗浄緩衝液をリザーバ１０２，１０３に移動させ、入口チャネル１１５ｇに付随するプランジャーの作動によって、溶離緩衝液をリザーバ１０４に移動させ、入口チャネル１１５ｈに付随するプランジャーの作動によって、第１段階ＰＣＲ緩衝液をリザーバ１０５に移動させ、入口チャネル１１５ｊ〜１１５ｋに付随するプランジャーの作動によって、第２段階ＰＣＲ緩衝液をリザーバ１０６，１０７に移動させ、入口チャネル１１５ｌに付随するプランジャーの作動によって、陽性対照（予め調製された第１段増幅産物の試料を含む第２段階ＰＣＲ緩衝液）をリザーバ１０８に移動させた。この実施例では、ポーチ１１０を機器内に装入する前に、入口チャネル１１５ａ，１１５ｂに付随するプランジャーを押し下げた。必要に応じて、作動中に、他の全てのプランジャーを機器内において順次押し下げ、流体をリザーバ１０２〜１０８に移動させた。
【０１０９】
ポーチ１１０を機器内に配置した時点で、前述したように、ＺＳビーズの存在下で、１０分間の衝撃を行った。細胞溶解が完了した時点で、リザーバ１０１を圧縮し、核酸結合磁気ビーズをリザーバ１０１から３ローブ式ブリスター１２２に押し込み、３ローブ式ブリスター１２２において、ビーズを緩混合し、５分間保温した。
【０１１０】
次いで、試料／ビーズ混合物をブリスター１４４に移動させ、磁石の作動によって、磁気ビーズを捕捉した。磁石が展開した時点で、ブリスター１４４に隣接するプラダーを加圧し、流体を３ローブ式ブリスター１２２に戻した。次いで、前述したように、リザーバ１０２，１０３からの洗浄溶液を用いて、捕捉されたビーズを洗浄した。洗浄後、磁石の作動によって、ビーズをブリスター１４４内において再び捕捉し、リザーバ１０４内に貯蔵された溶離緩衝液をブリスター１４４に移動させ、２分間の保温の後、前述したように、ビーズから溶離した核酸をブリスター１６１に移動させた。
【０１１１】
ブリスター１６１において、核酸試料をリザーバ１０５からの第１段階ＰＣＲマスターミックスと混合した。次いで、試料を（Ｍ−ＭＬＶがｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換させるために）１０分間にわたって４０℃に維持し、次いで、試料を（Ｍ−ＭＬＶを不活性化し、Ｔａｑから抗体を除去するために）２分間にわたって９４℃に維持した。次いで、９４℃×１０秒および６５℃×２０秒の熱サイクリングを２０回行った。
【０１１２】
第１段階増幅に続いて、リザーバ１０６からの第１段階ＰＣＲマスターミックスを用いて、試料を約１０００倍に希釈した。次いで、試料を前述したように予め第２段階プライマーがスポッティングされたブリスター１８２に移動させた。第２段階ＰＣＲ緩衝液をリザーバ１８１から陰性対照ブリスター１８１に移動させ、陽性対照混合物をリザーバ１０８からブリスター１８３に移動させた。試料を９４℃で３０秒間変性させ、次いで、９４℃×５秒および６９℃×２０秒の熱サイクリングを４５回行うことによって、試料を増幅させた。
【０１１３】
図１１から分かるように、全ての標的増幅産物および陽性対照が増幅を示し、その一方陰性対照のいずれも増幅を示さなかった。各試料は、複製で実験された。これらの複製は、同様の増幅を示した（データは、示されていない）。
【０１１４】
S.cerevisaie標的および S.pombe標的は、単なる例示にすぎず、他の標本も本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【実施例２】
【０１１５】
［高密度ＰＣＲ］
上記の実施例は、図５のポーチ１１０を用いている。ポーチ１１０は、５個の陰性対照ブリスター１８１、５個の陽性対照ブリスター１８３、および１０個の低容積試料ブリスター１８２を有している。図６のポーチ２１０は、低容積試料ブリスター２８２の数を１８個に増加させている。しかし、図１２に示されているポーチ５１０の高密度アレイ５８１は、１２０個以上の第２段階ウエル５８２を有することができる。第２段階反応の数のこの増加は、ポーチおよびその装置の大きさを増加させることなく、幅広い潜在的な診断適用および人物同定適用を可能にする。以下、種々の実施例について説明する。
【０１１６】
一実施例では、一般的な呼吸器ウイルス用の標準的な市販免疫蛍光アッセイは、７つのウイルス、すなわち、アデノウイルス、ＰＩＶＩ，ＰＩＶ２，ＰＩＶ３，ＲＳＶ，インフルエンザＡ，およびインフルエンザＢを検出することができることが知られている。より完全なアッセイパネルは、例示的に、追加的な５つのウイルス、すなわち、コロナウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、ＢＯＣＡウイルス、ライノウイルス、および非ＨＲＶエンテロウイルス用のアッセイを含んでいる。アデノウイルスまたはＨＲＶのような高変動ウイルスの場合、ウイルス系統の枝の全てを標的とする多重プライマーを用いることが望ましい（例示的に、４つのアウタープライマーと４つのインナープライマーとからなる各セット）。他のウイルス、例えば、コロナウイルスの場合、１つの季節から他の季節にかけて変動しない４つの別個の系統（２２９Ｅ，ＮＬ６３，ＯＣ４３，ＨＫＵ１）があるが、これらも別々のプライマーセットが必要とされるほど分岐している。また、例示的な完全呼吸器ウイルス用のアッセイパネルは、ＳＡＲＳコロナウイルス、可能であれば、鳥インフルエンザＨＡおよびＮ派生型、ならびに可能であれば、他のものを標的にするだろう。最後に、呼吸器ウイルスのいくつかは、極めて高い配列変動率を示すので、このようなウイルスの各々に対して、２通り以上のネステッドＰＣＲアッセイを行い、これによって、プライマー下での配列変動による誤った陰性結果の機会を最小限に抑えると有益である。本明細書に記載されているプライマーセットの全てが含まれる場合、このような呼吸器ウイルス用アッセイパネルは、第２段階増幅において８０個以上の特異的増幅産物が生じさせることができる。高密度アレイ５８１は、単一ポーチ５１０内においてこのようなアッセイパネルを容易に収容することができる。
【０１１７】
ポーチ５１０の高密度アレイ５８１の第２の適用は、感染患者から単離された多剤耐性細菌の同一性および抗生物質耐性スペクトルを決定することである。現在の方法は、生物を保温し、個々の薬剤耐性プロフィールを実験的に試験するために数日かかる。結果を受け取る間、医師は、多くの場合、広域スペクトル抗生物質を投与するが、これによって、多剤耐性細菌が増加する。ＰＣＲプライマーは、抗生物質耐性の遺伝子決定基（抗生物質耐性遺伝子自体）を検出するために、開発されてきている。しかし、これらの遺伝子のいくつかには極めて多数の変異体があるため、耐性プロフィールを完全に決定するには、多数の増幅産物が必要である。Hujerらは、アシネトバクター属単離体に存在する耐性遺伝子を同定するための６２通りのアッセイを行うためのパネルを記載している。ここでも、高密度アレイ５８１は、このようなパネルを単一ポーチ内に容易に収容することが可能である。
【０１１８】
高密度アレイの有用性の第３の例は、人物同定、例えば、死体の法医学的同定および親子鑑定のための人物同定の分野にある。人物同定の市場の殆どは、短直列型反復配列（ＤＴＲ）を分析するシステムによって示されている。この分析は、一般的に、例えば、キャピラリー電気泳動を用いて、大きさごとに反復配列を分離する必要がある。この目的のために用いられる特別の実験室装置は、一般的に可搬型ではない。同定試験のために一塩基多型（ＳＮＰ）を用いることにますます関心が高まっている。何故なら、ＳＮＰを同定するための多数の技法があるが、これらの技法のいくつかは、現場使用に適しているからである。Sanchezらは、２つの個体が偶然によって適合する極めて低い確率（少なくとも５．０×１０−１９の平均適合確率）を協働によってもたらす５２個のウエルによって特徴付けられたＳＮＰを公表している。実際には、各遺伝子座を正確に分類するには、ＳＮＰごとに２つの増幅産物が必要である（例えば、Zhouらを参照されたい）。従って、１０４個の第２段階ウエル５８２を有する１つのポーチ５１０が、５２個のＳＮＰ遺伝子座の全てにおいて個体を完全に分類することができる。
【０１１９】
種々の診断適用のアッセイを１つのポーチ内において組み合わせることによって、コストおよびワークフローに関する利点が得られることを理解されたい。例えば、完全呼吸ウイルス用アッセイパネルが細菌同定用アッセイパネルに組み合わされてもよい。これらの組合せは、製造を簡素化する。何故なら、組み合わされるポーチの種類が少なくなるからである。また、このような組合せは、エンドユーザーの仕事を簡素化する。何故なら、診療所に貯蔵される必要がある特別なポーチの種類が少なくなり、また特別の臨床試料に対して誤ったポーチを用いる機会が減るからである。いくつかの適用に対して、これらの利点は、極めて多数のプライマー対を有するポーチを製造するコストの増大を埋め合わせることができる。従って、多数のアッセイパネルを収容するために、１００個以上の第２段ウエル５８２を含む１つのポーチを用いることができる。
【実施例３】
【０１２０】
［プロセス制御］
高度に多重化されたアッセイの制御は、特に品質が試験当たりのコストと競合しなければならない臨床診断設定において、問題になる場合がある。ポーチ５１０の高密度アレイ５８２は、単一処理においてアッセイされる診断標的の数が増加することによって、この問題が大きくなる可能性がある。以下、種々の形式の制御について検討する。
【０１２１】
例示的なプロセス制御は、試料をポーチ内に注入する前に、インタクトな生物、例えば、ＲＮＡ標的を含む生物を患者試料内に混合することを含んでいる。このような標的は、インタクトＲＮＡバクテリオファージ（ＭＳ２またはＱβ）、インタクト植物ＲＮＡウイルス（タバコモザイクウイルス）、またはインタクト酵母中に存在するｍＲＮＡとすることができる。ＲＮＡ標的に特異的なアウタープライマーが第１段階ＰＣＲ中に存在し、インナープライマーを含有するウエル５８２が、高密度アレイ中に配置されている。このウエル５８２内の増幅産物を検出することによって、プロセスのステップの全てが正しく機能していることが確認される。正しい特異的産物が生じたことを確認するために、第２段階増幅後の融解曲線が用いられてもよい。増幅曲線によって決定された交差点（Ｃｐ）を用いて、試薬の完全性の定量的測定値を得ることもできる。例えば、Ｃｐが同一ロットのプロセスの異なる時点における他のポーチＣｐと比較されてもよい。インタクト生物が用いられているが、もし溶解に対する試験が重要でないなら、精製された核酸または単離された核酸が用いられてもよいことを理解されたい。他の状況では、分析の後のステップのみを試験する制御を行うことが望ましい場合がある。例えば、天然または合成核酸鋳型を同族プライマーと共に、高密度アレイのウエル内にスパイキングすることによって、第２段階ＰＣＲ反応が試験されてもよいし、核酸鋳型を第１段階増幅混合物内の適切なプライマーと共に、第１段階ＰＣＲ内および第２段階増幅区域のウエル５８２内にスパイキングすることによって、第１段階ＰＣＲ反応および第２段階ＰＣＲ反応が一緒に試験されてもよい。
【０１２２】
前述したようなプロセス制御は、標的増幅産物に特異的なプライマーの完全性を試験するものではない。特異的プライマーの完全性を試験する陽性対照の一例として、核酸、例えば、合成ＲＮＡの混合物が用いられるが、これは、多くの場合、該混合物の安定性および可変性が良好に制御され、これらの混合物の配列が、環境汚染に起因して存在し得ないからである。倍混合物は、特定のポーチ内に存在するプライマーの各々に対して核酸を含んでいる。診断設定において、この陽性対照は、患者試料を試験するのに用いられたポーチのプロセス終了時に行われるとよい。該混合物は、例えば、患者試料に用いたものと同じロットからポーチに注入され、標的増幅産物の全てが陽性結果をもたらした場合、成功が確定される。陰性対照も同様に行うことができる。すなわち、患者試料を試験するのに用いたポーチのプロセス終了時に、水または緩衝液がポーチ内に注入され、標的増幅産物の全てが陰性結果をもたらした場合、成功が確定される。
【０１２３】
診断研究室における個々のワークフローおよびプロトコルを用いて、前述した制御ポーチが処理される前に、患者試料ポーチの処理の数を決定することができる。制御ポーチが処理される頻度とは無関係に、これらの制御は、時間が掛かり、システム全体のコストがかさむ。この理由から、ポーチ内において制御を行うことが有益である。高密度アレイ５８１の構造は、陰性対照への以下の新規アプローチを可能にする。この例では、核酸、例えば、合成増幅産物が、高密度アレイ５８１のウエル５８２ａに１つにスパイキングされる。この配列を増幅するプライマーは、このウエル５８２ａ内にスパイキングされると共に、アレイを横切って互いに離間された２つの他のウエル６８２ｂ，５８２ｃ内にスパイキングされる。例示的に、増幅産物配列およびプライマーは、人工的なものであり、用いられるプライマーのいずれも、偶然に別の標的を増幅しないように設計されている。
【０１２４】
清浄な非汚染ポーチ５１０が装置８００内で処理される場合、合成標的を含むウエル５８２ａは、増幅産物を生じ、その結果、陽性と判定されるだろう。対応するプライマーを含む２つの他のウエル５８２ａ，５８２ｂは、試料中のどのようなものも増幅せず、その結果、陰性と判定されるだろう。ポーチ５１０は、追加的な制御のためにさらに処理されてもよい。例示的に、この後、高密度アレイをヒータ８８８に対して保持するブラダー８８０／８８２が減圧され、ウエル５８２の内容物が混合される。例示的な一方法では、ウエル５８２の内容物は、以下のように混合される。すなわち、ヒータ８８８を用いて、短時間にわたって、高密度アレイの温度が緩衝液の沸点の上下の温度にサイクル処理される（例えば、８５℃×１０秒の処理の後に１０５℃×２０秒の処理を行うサイクリングが３回繰り返される）。高密度アレイ５８１のウエル５８２内に生じた蒸気の泡が、ウエル５８２の内容物を第２段階増幅区域のブリスター５８０内に押し出す。任意選択的に、第２段階増幅区域５８０の内容物は、ブラダーによって液体をポーチ５１０の一端から他端に移動させることによって、ポーチの残りの内容物に混合されるとよい。これらのステップの目的は、特異的汚染制御増幅産物をポーチの全体にわたって任意の特異的標的増幅産物と混合することにある。
【０１２５】
ポーチがこのように処理された後、ユーザーが誤ってポーチを開いた場合、特異的標的増幅産物および汚染制御増幅産物の両方が放出されることになる。もしこれらの核酸の微量が後のポーチプロセスに混入したなら、機器は、汚染事象を検出することになる。何故なら、合成増幅産物に特異的なプライマーしか含んでいないウエル５８２ｂ，５８２ｃが陽性と判定されるからである。機器内のソフトウエアは、ユーザーに警告し、処理の結果が疑わしいと注意喚起することになる。
【０１２６】
汚染を制御する他の方法では、処理の終了時に、第１段階ＰＣＲ反応および第２段階ＰＣＲ反応のＤＮＡ産物の実質的に全てを破壊するために、ＤＮＡ分解化学薬品またはＤＮＡ分解酵素が添加されてもよい。例示的に、これは、前述した汚染検出方法と同様の手法によって行われるとよい。すなわち、この方法は、第２段階アレイの内容物を局所的沸点を超える温度に加熱し、これによって、増幅された試料をアレイ８５１のウエル５８２から引き出し、加熱された液体を第１段階反応の希釈された内容物と混合し、ＤＮＡ分解物質の一定分量を、例えば、入口チャネル５１５ｋを通して、混合物を冷却しながらまたは冷却せずに添加し、ＰＣＲ反応において生じたＤＮＡの実質的に全てが破壊されるまでＤＮＡ分解反応を促すことによって、行われるとよい。これは、当技術分野において知られているように、ＤＮＡアーゼ、酸、または酸化剤を用いて行われてもよい。
【０１２７】
本明細書に記載されている汚染制御は、いずれも、単独で行われてもよいし、または任意の組合せで行われてもよいことを理解されたい。
【実施例４】
【０１２８】
［アレイ装填］
図１６は、高密度アレイの他の実施形態を示している。高密度アレイ６８１は、構成に関して、高密度アレイ５８１と同様である。この例示的実施形態では、高密度アレイ６８１は、円パターンに配置された１０２個の第２段階ウエル６８２を備えている。図示されているように、アレイ６８１は、アレイに取付けられた層６８７も備えている。層６８７は、前述の第２の層５８７と同様である。しかし、アレイ６８１は、穿孔層を備えていない。アレイ６８１は、この実施例のための例示的なアレイであるが、アレイ５８１および高密度アレイの他の構成も、本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【０１２９】
前述したような市販のスポッター、例えば、ＧｅＳｉＭ社製Ａ０６０−３２４ Ｎａｎｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ  ２.１／Ｅ（グロッサークメンスドルフ、ドイツ）が、高密度アレイ６８１を装填するのに用いられてもよい。代替的に、高密度アレイ６８１は、ｘ/ｙ位置決め可能なスポッター、例えば、ピンスポッター、ドット−マトリックスプリンター、少量自動化ピペット、またはマイクロ流体マイクロ接触スポッターを用いて、スポッティングされてもよい。
【０１３０】
図１７〜図１９は、例示的なスポッター６００を示している。スポッター６００は、基部６０１を備えている。基部６０１に取付けられているのは、ポンプアレイ６２０である。ポンプアレイ６２０に隣接して配置されているのは、装填アレイ６３０である。例示的な装填アレイ６３０は、９６個ウエル付きプレートを受け入れるように構成されているが、他のプレート構成、例えば、３８４個ウエル付きプレート、１５３６個ウエル付きプレート、および他の構成のプレートも本開示の範囲内にある。１つまたは複数のバイアルまたは他の構成のリザーバが流体をスポッティングするのに用いられてもよいことも理解されたい。図１９に最もよく示されているように、例示的な９６個ウエル付きプレート６３６が、装填プラットホーム６３５上に着座している。９６個ウエル付きプレート６３６は、多重アレイをスポッティングするためのより大きいリザーバをもたらすために、標準的なマイクロ滴定プレートよりもかなり高くなっている。しかし、図２０に示されているように、標準的な９６個ウエル付きプレートが用いられてもよい。装填プラットホーム６３５は、アーム６３４の作動によって、上下動するようになっているとよい。
【０１３１】
図１９では、下側位置にあるプレート６３６が示されている。この位置では、プレート６３６の上端６３３は、ストロー６４１の先端６４２に接触しておらず、かつ重なっておらず、これによって、プレート６３６の挿入および取外しが容易になる。図２０に示されている装填プラットホーム６３５は、上昇位置にある。複数のストロー６３８が、支持体６４０を通って、プレート６３６の各ウエル６３７内に延出している。ストロー６３８は、支持体６４０の上方から各ウエル６３７の底に延出するチュービングである。例示的な実施形態では、ストロー６３８は、２５ゲージのステンレス鋼である。しかし、アレイ６８１にスポッティングされる流体と適合するどのような材料が用いられてもよい。好ましくは、ストロー６３８の材料は、ストロー６３８がウエル６３７の底まで延びるために、剛性または半剛性になっているとよく、これによって、プレート６３６の実質的に全ての流体を利用することができる。可能な限り多くの流体を利用するのを助長するために、各ストロー６３８の先端６４２は、傾斜して切断され、ストロー６３８がウエル６３７に対して封鎖されるのを防ぐようになっている。例示的に、先端６４２は、３０〜６０°、さらに例示的には、４５°の角度で切断されているとよい。しかし、角度の選択は、ウエル６３７の形状に依存することを理解されたい。例えば、もしウエル６３７が平坦な底を有しているなら、３０°よりも著しく小さい角度が有用であるが、略円錐状のウエル６３７は、より大きい角度を必要とする。代替的に、先端６４２は、ノッチまたは溝を有していてもよいし、ウエル６３７に対する封鎖が問題になる構成では、ウエル６３７の底に適合しないどのような形状を有していてもよい。
【０１３２】
ストロー６３８の各々は、支持体６４０のその該当するオリフィス６４１を通って上方に延在している。例示的実施形態に示されているように、オリフィス６４１は、ウエル６３７と真っ直ぐに並ぶように構成されており、各オリフィス６４１は、該オリフィス内のストロー６３８の自由な運動を可能にするように寸法決めされている。錘６３９が、各ストロー６３８の上端に取付けられている。各錘６３９は、先端６４２をウエル６３７の底に向かって付勢している。図示されている実施形態では、円筒状の真鍮錘が用いられている。しかし、これは、単なる例示にすぎないこと、および他の形状および他の材料が用いられてもよいことを理解されたい。錘６３９は、望ましくは、オリフィス６４１よりも大きく寸法決めされている。これによって、錘６３９は、プレートが取り外されるとき、支持体６４０上に置かれ、次のプレートが適所に上昇したとき、各ストロー６３８を、該ストローがその該当するウエルに進入するように、適所に保持することができる。
【０１３３】
例示的実施形態では、各ストロー６３８は、その該当する錘６３９を貫通し、可撓性チューブ６４４に接続されている。しかし、ストロー６３８およびチューブ６４４は、錘６３９の直下または錘６３９内において互いに接続されてもよいこと、またはストロー６３８は、より剛性の材料からより可撓性の材料に組成が変更されてもよいことを理解されたい。例示的に、チューブ６４４は、エラストマー材料、例えば、シリコーンまたはポリウレタンであり、０．０１２インチの内径および０．０２５インチの外径を有している。しかし、特定の用途に依存して、他の寸法を有する種々の材料が用いられてもよいことを理解されたい。例示的に、可撓性チューブ６４４は、エラストマー材料であるが、亀裂または破断を生じることなく充分に可撓性のある他の材料も、本開示の範囲内にある。
【０１３４】
図１７に最もよく示されているように、複数のチューブ６４４は、互いに平行になってポンプアレイ６２０を貫通し、プリントヘッド６６０まで延在している。図２１は、ポンプアレイ６２０の断面図を示している。第１の空圧シール６２３が装填アレイ６３０に近い側に配置されており、第２の空圧シール６２４がプリントヘッド６６０に近い側に配置されている。チューブ６４４は、上支持体６２１と底支持体６２２との間に挟まれている。底支持体は、３つの空圧要素を備えている。第１の空圧シール６２３および第２の空圧シール６２４は、チューブ６４４に対してピンチ弁として作用し、必要に応じて、チューブ６４４を開閉し、流体がウエル６３７からチューブ６４４を通ってプリントヘッド６６０に流れることを可能にする。蠕動ポンプ６２６は、ポンプヘッド６２５を備えている。ポンプヘッド６２５は、点線６３１によって示されているように、機械中心からいくらか位置ずれし、これによって、特にシール６２３が閉じ、シール６２４が開いたとき、流体をプリントヘッドの方向に押し出すことになる。任意選択的に、ポンプ６２６は、ポンプヘッド６２５が最初にチューブ６４４のシール６２３に近い部分に接触するように、ある角度（図示せず）で傾斜して設けられているとよく、これによって、流体をシール６２４に向かって押し出すことになる。開口６２７，６２８，６２９は、図１７に最もよく示されているチュービング６１２，６１３，６１４に接続されており、チュービング６１２，６１３，６１４は、圧縮ガス源６１６に接続されている。圧縮ガス源６１６は、コンプレッサーであってもよく、代替的に圧縮ガスシリンダーであってもよい。シールおよびポンプヘッドを圧縮ガス源によって移動する方向と反対方向に付勢するバネ（図示せず）が用いられるとよい。これによって、チュービングは、わずかな抗力によってその元の形状に回復することが可能になる。例示的実施形態において適切な量の流体を調節するために、略５０ｐｓｉ未満の力が必要である。例示的実施形態では、全てのチューブ６４４内の流体は、単一の蠕動ポンプ６２６によって同時に送り出され、これによって、略均一な量の流体を各チューブ６４４を通して移送させることができる。例示的実施形態では、チューブ６４４は、互いに平行に真っ直ぐ延びており、シール６２３，６２４およびポンプ６２６は、直線状に設けられている。しかし、他の構成も本開示の範囲内にある。
【０１３５】
チューブ６４４を通ってプリントヘッド６６０に移動する流体の量は、チューブ６４４の直径、ポンプヘッド６２５の幅、およびポンプ６２６によってチューブ６４４に印加される圧力の大きさによって、決定されることを理解されたい。これらのパラメータの調整は、本開示の範囲内にある。また、当技術分野において知られている他の手段、例えば、ローラ、流体圧ポンプ、電気機械ポプ、および他の計量装置によって、流体をチューブ６４４を通して送り出すことも、本開示の範囲内にある。
【０１３６】
プリントヘッド６６０は、高密度アレイ６８１の１０２個のウエル６８２と真っ直ぐに並ぶ１０２個の位置６６２を備えている。各チューブ６４４は、位置６６２の１つに接続されている。９６個ウエル付きプレート６３６は、９６個のウエル６３７の矩形配列であり、その一方、高密度アレイ６８１は、１０２個のウエル６８２の略円形配列である。チューブ６４４に対して可撓性管を用いることによって、単に特定のチューブ６４４をプリントヘッド６６０の特定位置に取り付けることによって、流体をプレート６３６のウエル６３７のいずれかから高密度アレイ６８１のウエル６８２のいずれかに移送するように構成することができる。図１７および図１８に示されているように、９６本のチューブ６４４が配置されており、プリントヘッド６６０上において６つの位置６６２が空になっている。流体がアレイ６８１に移送されるとき、図１８において６つの未充填ウエル６８２として示されているように、６つのウエル６８２は、空のままである。しかし、いくつのストロー６３８が単一錘６３９に取付けられ、これによって、プレート６３６の１つのウエル６３７がプリントヘッド６６０上の２つ以上の位置に給液するようになっていてもよいことを理解されたい。もし反応がアレイ６８１において２通りまたは３通りに行われるようになっているなら、プレート６３６の各ウエル６３７に２つまたは３つのストローを配置し、プレート６３６のより少ないウエル６３７を用いることが望ましいこともある。１０２個のウエルを有するプレートが、流体をストロー６３８を通して移送するために用いられてもよいことを理解されたい。再構成も本開示の範囲内にあり、もしスポッター６００が多数の異なるアレイ６８１に用いられるなら、再構成が望ましい。また、プリントヘッド６６０および対応するアレイ６８１の構成は、単なる例示にすぎず、プリントヘッドがアレイの一部または全てと略真っ直ぐに並んでいるなら、プリントヘッドおよびアレイの他の構成も本開示の範囲内にあることを理解されたい。例えば、図１５に示されているようなアレイ５８１と真っ直ぐに並ぶように配置されたプリントヘッドも、本開示の範囲内にある。また、極めて小さいウエルを有する極めて高密度のアレイの場合、プリントヘッド上において接触できないほど小さい滴を形成することは、実際的ではない。このような場合、２つ以上のプリントヘッドを用いて、各々をアレイの該当する部分を装填するように用いることが望ましい。
【０１３７】
図１９に最もよく示されているように、各チューブ６４４は、プリントヘッド６６０を貫通しており、これによって、各チューブは、プリントヘッド６６０の直下においてオリフィス６４５で終端している。例示的実施形態では、このオリフィス６４５を設けるために、金属管の小片が各チューブ６４４の端に設けられている。この金属管の小片は、例示的に、ストロー６３８に用いられているものと同じ金属管であり、プリントヘッド６６０を貫通していてもよいし、または貫通していなくてもよい。例示的に、オリフィス６４５の端６４３は、滑らかな平面に研磨されており、これによって、光を反射し、以下に述べるように、滴６９２の視覚化を助長するようになっている。例示的実施形態では、２５０μｍのオリフィスが用いられている。このオリフィスは、０．１〜１０．０μＬ、さらに例示的には、０．５〜１．０μＬの流体の滴を形成し、かつ支えるのに十分な表面張力をもたらすように寸法決めされている。しかし、これは、単なる例示にすぎず、他の大きさのオリフィスおよび滴も本開示の範囲内にある。図２７に示されている代替的実施形態では、各チューブ６４４ａは、プリントヘッド６６０ａで終端していてもよいし、またはプリントヘッド６６０ａ内で終端していてもよく、プリントヘッド６６０ａが、突起６７７ａを備えていてもよい。突起６７７ａは、例示的に、プリントヘッド本体と一体に形成されている。突起６７７aは、滴の視覚化を助長するために、黒色または他の色に塗装されているとよいが、金属被膜を備えていてもよい。オリフィス６４５ａは、流体の移送を助長する材料から形成されていてもよいし、または該材料によって被覆されていてもよい。例えば、もし流体が水性の場合、疎水性材料から作製されたプリントヘッドが用いられるとよい。一例示的実施形態では、プリントヘッド６６０ａは、Ｔｅｆｌｏｎ(登録商標)から作製されているとよく、または他の材料、例えば、Ｔｅｆｌｏｎ(登録商標)被膜を有するステンレス材料から作製されていてもよい。このような材料は、オリフィスがプリントヘッド自体に設けられている実施形態（図２７）に用いられてもよいし、またはプリントヘッド６６０への流体の移送を低減させるために、各チューブ６４４がプリントヘッド６６０を貫通している実施形態（図１９）に用いられてもよい。さらに、図２５に示されているように、静電効果を低減させ、プリントヘッド６６０から滴の移送を助長するために、脱イオン装置６８０が設けられてもよい。
【０１３８】
ポンプ６２６が作動すると、流体は、プレート６３６のウエル６３７から移動し、これによって、滴６９２が、チューブ６４４を介してウエル６３７に接続された各オリフィスに形成される。図１７に最もよく示されているように、例示的には光源およびカメラを備える撮像システムが設けられている。光源６７２が、滴６９２を照明するために設けられている。光源６７２は、例示的には、高入射光源であるが、他の構成も可能である。例示的には基部６０１の開口６６８の直下に取付けられたカメラ６７０が、滴６９２を撮像するようになっている。図２２は、（図２６に示されている）ディスプレイ６９５に表示されたプリントヘッド６６０の底面６６１の画面コピーである。この画面コピーは、チューブ６４４に取付けられた９６個のオリフィスの各々に付着した滴６９２を示している。プリントヘッド６６０上に１０２個の位置６６２があり、例示的な実施例では、ウエル６３７当たり１つのストロー６３８しか用いていないので、６つの位置６６２には、滴６９２が存在しておらず、６つのチューブオリフィス６４５を示している。残りの９６個のオリフィスは、それぞれの滴６９２によって暗くなっている。図２３は、空の位置６９１によって示されているように、２０個の滴が欠落し、さらに多い２０個のチューブオリフィスが露出している以外は、図２２と同様である。
【０１３９】
カメラ６７０は、プロセッサ６９４に接続されている（図２６参照）。プロセッサ６９４は、例えば、体積（４／３πｒ３）を概算し、許容できる体積範囲と比較することによって、全ての滴６９２が充分であるかどうかを決定するようにプログラム化されている。このプログラム化は、滴を不十分にする可能性がある泡の検出を含んでいるとよい。一例示的実施形態では、プロセッサは、以下のステップ、すなわち、
（１）滴形成の前にプリントヘッドの画像を取得する信号をカメラ６７０に送信するステップと、
（２）滴がプリントヘッド６６０上に存在していないことを確認するために、画像を検証するステップと、
（３）もし滴が存在していたなら、ソフトウエアが、ユーザーに注意を換気し、もし滴が存在していなければ、滴６９２を生成する信号をスポッターに送信するステップと、
（４）滴６９２を有するプリントヘッドの第２の画像を取得する信号をカメラ６７０に送信するステップと、
（５）滴６９２の適切な位置および大きさを確認するために、画像を検証するステップと、
（６）もし滴６９２がステップ（５）における検証において適格性を満たしていなかったなら、ソフトウエアが、ユーザーに注意を喚起し、もし適格性を満たしていたなら、アレイ６８１をプリントする信号をスポッター６００に送信するステップと、
（７）アレイ６８１がプリントされた後、ソフトウエアが、滴のないプリントヘッド６６０の第３の画像を取得する信号をカメラ６７０に送信するステップと、
（８）滴がプリントヘッド６６０上に存在していないことを確認するために、画像を検証するステップと、
（９）ソフトウエアが、ステップ（８）における検証の状態をユーザーに知らせるステップと、
を含むように、プログラム化されるとよい。
【０１４０】
ステップ２，５、８において滴の存在および不在を検証するために用いられる画像解析は、標準的な２値化閾値技術によるものである。
【０１４１】
ステップ５における滴形成の検証の一部として、一例示的実施形態では、画像は、各滴の位置および距離（単位：ピクセル）を決定するために解析される。ソフトウエアは、各滴の中心の位置がオリフィス６４１の中心の所定距離内にあることを検証する。次に、ソフトウエアは、滴の各々の半径を決定し、該半径が下側閾値よりも大きいことを検証し、これによって、各ウエルに存在するプライマーの量がＰＣＲ増幅に充分であることを確認し、該半径が上側閾値よりも少ないことを検証し、これによって、滴がアレイ６８１の標的ウエル６８２の外側に堆積しないことを確認する。下側および上側閾値は、用途において許容される滴に対応する流体の範囲を規定するものであり、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、または任意の他の百分率であってもよい。
【０１４２】
ステップ５における滴形成の代替的な検証として、滴は、撮像されるときにマスクを付されるとよい。具体的には、各滴に円形マスクが付されるとよい。標準として半径を用いるよりも、むしろマスクが用いられる。もし滴が完全にマスクの円を満たし、かつ該円を超えていないなら、滴は、検証において適格性を満たしたことになる。もし滴が半径を完全に満たしていないかまたは該円を超えていたなら、滴は、検証において適格性を満たしていないことになる。円ラインは、閾値をもたらすように選択される。厚い円ラインは、大きな範囲をもたらし、薄い円ラインは、小さい範囲をもたらすことになる。
【０１４３】
代替的に、画像の視覚的検査は、全ての滴６９２が充分であるかどうかを決定するために用いられるとよい。もし全ての滴６９２が充分であったなら、これらの滴は、アレイ６９１に移送されるとよい。視覚化を助長するために、望ましくは、流体内に着色染料または蛍光染料を含ませるとよい、代替的または付加的に、オリフィス６４１の端６４３は、光を反射し、視覚化を助長するために、滑らかに研磨されているとよい。もし蛍光染料がＰＣＲ検出に用いられるなら、望ましくは、この染料を視覚化するかまたはＰＣＲの蛍光と干渉しない視覚化をもたらす他の染料を用いるとよい。例えば、ＬＣＧｒｅｅｎ(登録商標)ＰｌｕｓがＰＣＲ検出に用いられるとよく、その一方、ＩＲＤｙｅ(登録商標)（Licor社、リンカーン、ネブラスカ州）が滴の視覚化に用いられるとよい。他の染料も当技術分野において知られている。任意選択的に、プリントヘッド６６０、アレイ６８１、またはこれらの両方は、各滴６９２から充分な量がプリントヘッド６６０から移送されたかどうかを決定するために、移送の前に視覚化されるとよい。
【０１４４】
もし滴６９２が、所定の標準を満たさなかったことによって不十分な場合、該滴は、前述したようにアレイ６８１に移送されてもよいが、このアレイ６８１は、廃棄されるとよい。代替的に、不十分な滴６９２は、拭い取りまたは他の手段によって、プリントヘッド６６０から除去されてもよい。
【０１４５】
他の構成部品がよく見えるように、配置アーム６５２は、図１７および図１９の手前側から省略されている。しかし、配置アームは、図１８、図２４および図２５に最もよく示されている。配置アーム６５２は、アレイ６８１を受け入れるためのプラットホーム６５３を備えている。アレイ６８１は、１つまたは複数、好ましくは、２つ以上の開口６５５を備えており、これらの開口を通って、位置合せピン６５４が延出するようになっている。開口６５５は、さらに確実な位置合せのために、位置合わせピン６５４にスナップ嵌合するように構成されていてもよい。代替的に、アレイ６８１を受け入れるための凹部が設けられてもよい。プラットホーム６５３上へのアレイ６８１の適切な配置のための他の方法も本開示の範囲内であることを理解されたい。もし滴が所定の基準を満たすことによって充分であると決定されたなら、配置アーム６５２が上方に移動し、これによって、アレイ６８１の各ウエル６８２が、その該当する滴６９２と接触して配置されることになる。いったん接触したなら、各滴６９２とその該当するオリフィス６４５との間の表面張力が失われ、滴６９２は、その該当するウエル６８２に移送される。次いで、充分な流体がプレート６３６のウエル６３７の各々に満たされているならば、配置アーム６５２が降下し、アレイ６８１が取り外され、プロセスが繰り返される、滴６９２が移送された後、アレイ６８１は、アレイ５８１に関して前述したように処理され、次の段階として、本明細書において説明したポーチのいずれかに用いられることになることを理解されたい。
【０１４６】
図２４および図２５は、１つの例示的な配置アーム６５２の詳細を示している。この実施例では、配置アーム６５２は、平坦な４バー機構６６４を備えている。この機構６６４において、カプラーリンク６５６がプラットホーム６５３を回転アーム６５９に接続している。カプラーリンク６５６は、取付点６４９において従動リンク６５８に連結されていると共に、取付点６４８において回転アーム６５９に連結されている。回転アーム６５９は、取付点６４７において上構造体６０５に取付けられており、従動リンク６５８は、取付点６５０において上構造体６０５に取付けられている。取付点６４７，６４８間の距離にわたって延存する短小リンク６６９が設けられている。上構造体６０５は、４バー機構の接地リンクとして機能している。例示的実施形態では、このリンクの長さは、高密度アレイ５８１がプリントヘッド６６０に接触する直前に垂直方向に移動する中関節曲線（ｃｏｕｐｌｅｒ  ｃｕｒｖｅ）に追従するように、選択されている。この垂直運動は、各滴６９２が、接触する直前の運動が垂直でない場合に生じ得る二次汚染を最小限に抑えながら、その該当するウエル６８２に接触するようになっていると、望ましい。また、この中関節曲線運動は、カメラ６７０の開口６６８がプリントヘッド６６０の直下に配置されているので、有益である。プラテン６６３が、回転接合点６４６においてカプラーリンク６５６に接合されている。回転接合点６４６は、アレイ６８１とプリントヘッド６６０との間に平坦な位置合わせをもたらすように、調整されるとよい。位置合せが設定された後、回転接合点６４６は、位置合せを継続させるために、固定されるとよい。図１９に示されているように、２つの同一の平坦な４バー機構６６４が、１つが上構造体６０５の片側に位置するように、設けられている。これらの４バー機構６６４は、図２５に示されているように、プリントヘッド６６０におけるアレイ６８１の適切な位置合せをもたらすように２つのドライバーリンク６５７を一緒に回転させる同期性が得られるように、係止されている。平坦な４バー機構６６４が単なる例示にすぎないこと、およびアレイをプリントヘッド６６０に配置する他の方法、例えば、他の手動および自動手段も本開示の範囲内にあることを理解されたい。
【０１４７】
プリントヘッド６６０は、ポンププレート６６７に取付けられており、ポンププレート６６７は、ポンプアレイ６２０に取付けられている。ポンププレート６６７は、ポンプアレイ６２０に対して移動可能であり、これによって、カメラ６７０に対して位置合せを行うことができるようになっている。代替的に、ポンププレート６６７は、ポンプアレイ６２０に対して多重取付け位置を備えていてもよく、これによって、横方向の位置決めを行うことができる。このような横方向位置決めによって、任意選択的に、プラテン６６３上に互いに隣接して着座した多数のアレイ６８１が単一のポンプアレイ６６０によって充填されることが可能になり、またはポンプヘッド６６０が、最初に１つの位置でプリントし、次に第２の位置でプリントすることによって、より大きいアレイをプリントすることが可能になる。
【０１４８】
図２４および図２５は、カメラ６７０のための例示的な構成を示している。この例示的実施形態では、カメラ６７０が水平に取付けられており、開口を通して受けた画像を反射するために、ミラー６７４が用いられている。しかし、他の構成、例えば、制限されるものではないが、ミラーの省略および開口６６８下におけるカメラ６７０の垂直取付けは、本発明の範囲内にあることを理解されたい。カメラ６７０を保護するために、底ケーシング６０４が設けられている。基部６０１の上方にある多くの構成部品を保護するために、上ケーシング（図示せず）が用いられてもよい。しかし、このような上ケーシングは、アレイ６８１およびプレート６３６の比較的容易な挿入および取外しを可能にするようになっていると好ましい。
【０１４９】
図２２および図２３に戻ると、複数のスタンドフ６７５、例えば、６つのスタンドオフ６７５がプリントヘッド６６０に作り付けられている。しかし、他の数のスタンドオフが用いられてもよい。層６８７がアレイ６８１に取付けられるとき、多くの場合、アレイ６８１がいくらか湾曲することが見出されている。スタンドオフ６７５は、ウエル６８２への滴６９２の移送中に、アレイ６８１をプラテン６６３に対して平坦に押すように機能するものである。
【０１５０】
図２６は、アレイをスポッティングするためのシステム６９８のブロック図である。システム６９８は、コンピュータ装置６９６を備えている。コンピュータ装置６９６は、１つまたは複数のプロセッサ６９４、メモリ（図示せず）、コンピュータ読取可能な媒体（図示せず）、１つまたは複数のＨＭＩ装置（例えば、入力−出力装置（図示せず）、ディスプレイ６９５、プリンター（図示せず）、など）、１つまたは複数の通信インターフェイス（図示せず）、などを備えているとよい。コンピュータ装置６９６は、スポッター６００に通信可能に連結されているとよく、スポッター６００は、圧縮ガス源６１６に連結されているとよい。コンピュータ装置は、システムの１つまたは複数の構成部品、例えば、ポンプアレイ６２０，配置アーム６５２、装填プラットホーム６３５、撮像システム６７６、または任意の組合せを制御するようになっているとよい。システムは、種々の構成部品が手動によって作動されるように構成されていてもよいことを理解されたい。
【０１５１】
スポッター６００は、全てのウエル６３７が洗浄溶液を含むプレート６３６を挿入し、全ての洗浄溶液がオリフィス６４１から出るまで、ポンプ６２６を作動されることによって、洗浄されるとよい。洗浄溶液を収集するために、容器がプリントヘッド６６０の下方に配置されるとよい。
【０１５２】
［参考文献］
【表１Ａ】
0006367183.tif 000003
【表１Ｂ】
0006367183.tif 000004
【表１Ｃ】
0006367183.tif 000005
【０１５３】
本発明を好ましい実施形態を参照して詳細に説明してきたが、変更形態および修正形態は、以下の請求項に記載され、かつ規定されている本発明の範囲および精神に含まれることになる。
【図１】
0006367183.tif 000006
【図２】
0006367183.tif 000007
【図２ａ】
0006367183.tif 000008
【図２ｂ】
0006367183.tif 000009
【図３】
0006367183.tif 000010
【図４】
0006367183.tif 000011
【図５】
0006367183.tif 000012
【図５ａ】
0006367183.tif 000013
【図５ｂ】
0006367183.tif 000014
【図６】
0006367183.tif 000015
【図６ａ】
0006367183.tif 000016
【図７】
0006367183.tif 000017
【図８】
0006367183.tif 000018
【図９】
0006367183.tif 000019
【図１０】
0006367183.tif 000020
【図１１】
0006367183.tif 000021
【図１２】
0006367183.tif 000022
【図１３】
0006367183.tif 000023
【図１４】
0006367183.tif 000024
【図１５】
0006367183.tif 000025
【図１６】
0006367183.tif 000026
【図１７】
0006367183.tif 000027
【図１８】
0006367183.tif 000028
【図１９】
0006367183.tif 000029
【図２０】
0006367183.tif 000030
【図２１】
0006367183.tif 000031
【図２２】
0006367183.tif 000032
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
0006367183.tif 000036
【図２７】
0006367183.tif 000037