(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝細胞様細胞を生産する方法であって、  
（ｉ）ヒト非肝臓細胞においてFOXAポリペプチドおよびHNFポリペプチドからなるポリペプチドを強制発現させること、および
（ｉｉ）前記ヒト非肝臓細胞を培地中で所定の期間培養して、前記ヒト非肝臓細胞の次世代やさらに後の世代の細胞を収穫することにより、ヒト肝細胞様細胞を生産することを含み、
前記HNFポリペプチドはHNF4AおよびHNF1であり、前記FOXAポリペプチドはFOXA3であり、前記HNF1はNHF1AまたはHNF1Bであり、
前記ヒト非肝臓細胞は、線維芽細胞または成体脂肪組織由来の間葉系幹細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記方法はさらに、前記ヒト非肝臓細胞または子孫細胞の一種または多種の細胞増殖を促進すること、又は、前記一種または多種の細胞のアポトーシスや老化を抑制することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記した細胞増殖の促進は、前記ヒト非肝臓細胞または子孫細胞の一種または多種においてSV40 large T抗原を強制発現させることで行われること、並びに
前記したアポトーシスや老化の抑制は、前記ヒト非肝臓細胞または子孫細胞の一種または多種におけるＲｂファミリー遺伝子の発現または活性を低下させることで行われることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記SV40 large T抗原の強制発現は、制御可能な方式で行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記所定の期間は１〜２０日間であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法はさらに、前記ヒト非肝臓細胞においてC/EBPβ、KLF4およびPROX1からなる群から選ばれる一種または多種の追加のポリペプチドを強制発現させることを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）異種HNFポリペプチドおよび前記HNFポリペプチドをコードする第１異種核酸からなる第１群から選ばれる第１物質と、および
（ｉｉ）異種FOXAポリペプチドおよび前記FOXAポリペプチドをコードする第２異種核酸からなる第２群から選ばれる第２物質と、を導入されるヒト非肝臓細胞から生産されるヒト肝細胞様細胞である培養組換え細胞であって、
前記HNFポリペプチドはHNF4AおよびHNF1であり、前記FOXAポリペプチドはFOXA3であり、前記HNF1はHNF1AまたはHNF1Bであり、
前記第１物質及び前記第２物質が導入される前記ヒト非肝臓細胞は、線維芽細胞または成体脂肪組織由来の間葉系幹細胞であることを特徴とする培養組換え細胞。
【請求項８】
前記細胞は、C/EBPβ、KLF4およびPROX1からなる群から選ばれる追加の異種ポリペプチドおよび前記追加の異種ポリペプチドをコードする追加の異種核酸、からなる群から選ばれる追加の試薬を含有することを特徴とする、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
（ｉ）前記細胞はさらに、異種SV40 large T抗原または前記SV40 large T抗原をコードする異種核酸を含有すること、
（ｉｉ）前記細胞はRB null、または所定のレベルより低いレベルでRbファミリー遺伝子を発現すること、或いは
（ｉｉｉ）前記細胞はさらに、Rbファミリー遺伝子の発現または活性を抑制する試薬を含有し、前記試薬はsiRNAまたはdsRNAであることを特徴とする、請求項７〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を用いて得られる、請求項７に記載の培養組換え細胞。
【請求項１１】
前記細胞は一種または多種の肝臓機能遺伝子に対して陽性である、又は成熟肝臓機能の一種または多種を発揮することを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記細胞は胆汁中排泄を行うことを特徴とする、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記細胞は３−メチルコラントレン、フェノバルビタール、リファンピシン、フェナセチン、クマリン、デキストロメトルファン、およびテストステロンおよびジクロフェナクからなる群から選ばれる一種または多種の化合物を代謝することができることを特徴とする、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞は正常の核型を有し、又は免疫不全マウスに移植した後、腫瘍を形成させないことを特徴とする、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項７〜１４のいずれか１項に記載の細胞および薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
前記細胞はマイクロカプセルにカプセル化されたことを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記細胞はアルギン酸−ポリ（Ｌ）リジン−アルギン酸（ＡＰＡ）を含有するマイクロカプセルにカプセル化されたことを特徴とする、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
肝細胞または肝細胞様細胞を収容するように設計した貯蔵チャンバーと；
前記貯蔵チャンバーに収容される、請求項７〜１４のいずれか1項に記載の細胞または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物と； 
前記チャンバーおよび細胞と流体的に連絡される入口と、および
前記チャンバーおよび細胞と流体的に連絡される出口と、
を含むバイオ人工肝補助装置。
【請求項１９】
検体の毒性、発癌性または生体内変化活性を評価する方法であって、
検体を請求項７〜１４のいずれか１項に記載の細胞と接触させることと、
前記細胞の代謝活性または生存性のレベルを調査することを含み、
前記レベルは前記検体の毒性、発癌性または生体内変化活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項２０】
（ｉ）HNFポリペプチドおよび前記HNFポリペプチドをコードする第１核酸からなる第１群から選ばれる第１物質と、および
（ｉｉ）FOXAポリペプチドおよび前記FOXAポリペプチドをコードする第２核酸からなる第２群から選ばれる第２物質を含有する組成物であって、
前記HNFポリペプチドはHNF4AおよびHNF1であり、前記FOXAポリペプチドはFOXA3であり、前記HNF1はHNF1AまたはHNF1Bであることを特徴とする、ヒト肝細胞様細胞を発生させるための組成物。
【請求項２１】
前記組成物はさらに、追加のポリペプチド、前記追加のポリペプチドをコードする追加の核酸、およびRbファミリー遺伝子の発現を低減させるsiRNAまたはdsRNAの化合物からなる群から選ばれる追加の物質を含有し、前記追加のポリペプチドはSV40 large T抗原、C/EBPβ、KLF4およびPROX1からなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項２０又は請求項２１に記載の組成物を含むキット。
【請求項２３】
請求項７〜１４のいずれか１項に記載の培養細胞、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項１８に記載のバイオ人工装置の、個体の肝機能を改善するための薬品の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年２月８日に出願された中国特許出願第２０１３１００５０７９６．７号の優先権を主張する。参照による引用によって、その開示内容の全体を本明細書に取り入れる。
本発明は、肝細胞様細胞、関連組成物、および肝機能の改善と多種の肝障害の治療に有用な関連方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、グリコーゲン貯蔵、脂質代謝、血漿タンパク質分泌および生体異物解毒のような多数の生理的プロセスを調節するための中枢臓器である。肝代謝疾患や劇症肝不全のような肝疾患は世界中で大量の死亡の原因となっている。現在のところ、肝移植は終末期にあるそれらの疾患の唯一の治療手段である。さらに、ヒト初代培養肝細胞（ＰＨＨ）移植は最近、臓器移植の代案として臨床上で評価されている。一方、肝臓を急性肝不全から回復させるために、機能的肝細胞を含有する肝補助装置が開発された（Carpentierら, 2009, Gut 58, 1690-1702.）。治療応用の他に、肝細胞はＣ型肝炎ウイルス感染およびヒト化動物モデルのような疾患モデリングのために、並びに薬物代謝および薬物動態、例えば薬物候補の肝胆道処分（hepatobiliary disposition）の解析のために広く用いられる（非
特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、肝臓器官および機能的肝細胞に対する需要は、死体肝および生体ドナー由来の肝組織の供給を遥かに超えている。それらの需要を満たすため、代用肝細胞が生産される。よって、ヒト肝細胞または肝細胞様細胞に対する需要がある。
【０００３】
細胞運命を転換するために、系列特異的な転写因子の過剰発現が適用される。リプログラミングによる直接的な細胞系列転換は、再生医療や個別化疾患モデリングの用途に用いられるドナー器官非依存性細胞の生産を促進する。いくつかの研究では、マウス線維芽細胞が他の細胞型へ成功に転換されたのに対し、ヒト細胞が系列のリプログラミングに抵抗性を有することはよく知られている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。例えば、神経性細胞（ｉＮ）への分化転換はヒト細胞において証明されたが、ヒトｉＮのインビボ機能、特に治療的処置におけるその応用はいまだに全く解明されていない。最近、ヒト線維芽細胞の運命を心臓にリプログラミングしようとする研究があるが、それらの細胞には成熟の心機能が欠けている（非特許文献４）。さらに、分化転換された細胞の増殖停止で、インビボ測定および生物医学的応用のためのそれらの大量の増幅は妨げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Azumaら, 2007, Nat Biotechnol 25, 903-910
【非特許文献２】Gomez-Lechonら, 2004, Current drug metabolism5, 443-462
【非特許文献３】Lazaroら, 2007, Am J Pathol 170, 478-489
【非特許文献４】Namら, 2013, Proc Natl Acad Sci U S A110, 5588-5593
【非特許文献５】Pangら, 2011, Nature 476, 220-223
【非特許文献６】Qiangら, 2011, Cell 146, 359-371
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ヒト肝細胞様細胞を生産する新規な方法、関連細胞、および関連方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の態様は、ヒト肝細胞様細胞を生産する方法を提供する。その方法は、ヒト非肝臓細胞またはその子孫細胞においてFOXAポリペプチドおよびHNFポリペプチドを（
例えば核酸トランスフェクション、ウイルス感染およびタンパク質形質導入により）強制発現させることと、前記細胞を培地中で所定の期間で（例えば１〜２０日間、２〜１４日間または１０〜１４日間程度）培養して、それらの次世代やさらに後の世代の細胞を収穫することを含むことより、ヒト肝細胞様細胞を生産する。前記HNFポリペプチドはHNF4A、HNF1AまたはHNF1Bであってもよく；前記FOXAポリペプチドはFOXA1、FOXA2またはFOXA3で
あってもよい。
ある実施形態において、前記FOXAポリペプチドはFOXA3であって、前記HNFポリペプチドはHNF4AまたはHNF1Aであってもよい。この場合、前記方法は、（ｉ）前記FOXA3ポリペプ
チドおよび前記HNF1Aポリペプチド、或いは（ｉｉ）前記FOXA3ポリペプチドおよび前記HNF4Aポリペプチドを前記ヒト非肝臓細胞において強制発現させることを含む。
他の実施形態において、前記方法は、前記FOXA3ポリペプチド、前記HNF4Aポリペプチド、並びに前記HNF1Aポリペプチド及び／又はHNF1Bポリペプチドを前記ヒト非肝臓細胞において強制発現させることを含む。
【０００７】
前記ヒト非肝臓細胞は任意の適切な体細胞であってもよい。このような細胞の例として、線維芽細胞、上皮細胞、血球、神経細胞、胚細胞、または個体の非肝臓組織や器官から由来する細胞が挙げられる。
好ましい実施形態において、前記方法はさらに、前記ヒト非肝臓細胞またはその次世代やさらに後の世代の細胞の細胞増殖を促進すること、或いはそれらのアポトーシスや細胞老化を抑制することを含む。前記促進ステップは、前記ヒト非肝臓細胞またはその次世代やさらに後の世代の細胞においてSV40 large T抗原を強制発現させることで行われることができる。前記抑制ステップは、前記ヒト非肝臓細胞またはその次世代やさらに後の世代の細胞におけるＲｂファミリー遺伝子の発現または活性を低下させることで行われることができる。前記SV40 large T抗原の強制発現、あるいはRbファミリー遺伝子の発現／活性の低減は、制御可能な方式で行われることが好ましい。他の実施形態において、前記方法はさらに、前記ヒト非肝臓細胞またはその子孫においてC/EBPβ、GATA4、HHEX、KLF4およびPROX1からなる群から選ばれる一種または多種の追加のポリペプチドを強制発現させる
ことを含む。
【０００８】
本発明の第二の態様は、培養組換え細胞を提供する。前記細胞は（ｉ）異種HNFポリペ
プチドおよび前記HNFポリペプチドをコードする第１異種核酸からなる第１群から選ばれ
る第１物質と、（ｉｉ）異種FOXAポリペプチドおよび前記FOXAポリペプチドをコードする第２異種核酸からなる第２群から選ばれる第２物質と、を含有する。前記HNFポリペプチ
ドはHNF4A、HNF1AまたはHNF1Bであってもよい。前記FOXAポリペプチドはFOXA1、FOXA2ま
たはFOXA3であってもよい。前記細胞はさらに、追加の異種ポリペプチドおよび前記追加
のポリペプチドをコードする追加の異種核酸からなる群から選ばれる追加の物質を含有してもよい。前記追加の異種ポリペプチドはC/EBPβ、GATA4、HHEX、KLF4およびPROX1から
なる群から選ばれるものであってもよい。ある実施形態において、前記細胞はさらに、異種SV40 large T抗原または前記SV40 large T抗原をコードする異種核酸を含有する。他の実施形態において、前記細胞はRB ヌル、或いは所定のレベルより低いレベルでRbファミ
リー遺伝子を発現する。さらに他の実施形態において、前記細胞は、Rbファミリー遺伝子の発現または活性を抑制する物質（例えばsiRNAや関連dsRNA）を含有してもよい。
【０００９】
本発明の第三の態様は、前記方法を用いて得られる培養肝細胞様細胞を提供する。前記細胞は一種または多種の肝臓機能遺伝子に対して陽性である、及び／又はここに記載の成熟肝臓機能の一種または多種を発揮する。例えば、前記細胞は胆汁中排泄を行うこと、或いは３−メチルコラントレン、フェノバルビタール、リファンピシン、フェナセチン、ク
マリン、デキストロメトルファン、テストステロンおよびジクロフェナクからなる群から選ばれる一種または多種の化合物を代謝することができる。通常、前記細胞は正常の核型を有すること、及び／又は免疫不全マウスに移植した後、腫瘍を形成させないことができる。
前記細胞は医薬組成物の製造に用いることができる。したがって、本発明は、前記細胞と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物のため、前記細胞はマイクロカプセルに、例えばアルギン酸−ポリ（Ｌ）リジン−アルギン酸（ＡＰＡ）を含有するマイクロカプセルにカプセル化されてもよい。
【００１０】
本発明は、前記細胞または医薬組成物を含有するバイオ人工肝装置も提供する。前記装置は体外装置であっても、植え込み可能／植え込み型装置であってもよい。前記バイオ人工装置は、前記細胞に埋め込まれるバイオリアクターを含み、正常肝臓のある機能を発揮することができる。例えば、前記装置は脂質および血漿リポタンパク質の合成、炭水化物ホメオスタシスの調節、血清アルブミンおよび凝固因子の生成、及び／又は解毒を含む代謝機能を発揮することができる。当該装置は肝不全を有する人を補助するために用いることができる。一つの実施形態において、前記装置は、肝細胞または肝細胞様細胞を収容するために配置される貯蔵チャンバーと、前記貯蔵チャンバーにある多数の前記細胞または組成物と、前記チャンバーおよび細胞と流体的に連絡される入口と、および前記チャンバーおよび細胞と流体的に連絡される出口と、を含んでもよい。
本発明の他の方面は、その必要がある個体の肝機能を改善する方法を提供する。該方法は前記個体に前記細胞または前記医薬組成物を投与することを含む、或いは前記個体に前記体外装置または植え込み可能／植え込み型装置を連結または植え込むことを含む。前記個体は代謝性肝疾患または肝不全を有する患者であってもよい。好ましい実施形態において、前記細胞は前記個体にとって自己由来のもの、即ち前記個体の非肝臓細胞から調製されたものである。
【００１１】
本発明のさらに他の態様は、検体の毒性、発癌性または生体内変化活性を評価する方法を提供する。該方法は検体を前記細胞と接触させることと、前記細胞の代謝活性または生存性のレベルを調査することと、を含む。前記レベルは前記検体の毒性、発癌性または生体内変化活性を示す。
本発明のさらなる態様は、HNFポリペプチドおよび前記HNFポリペプチドをコードする第１核酸からなる第１群から選ばれる第１物質と、FOXAポリペプチドおよび前記FOXAポリペプチドをコードする第２核酸からなる第２群から選ばれる第２物質と、を含有する組成物を提供する。前記HNFポリペプチドはHNF4A、HNF1AまたはHNF1Bであってもよい。前記FOXAポリペプチドはFOXA1、FOXA2またはFOXA3であってもよい。前記組成物はさらに、追加の
ポリペプチド、前記追加のポリペプチドをコードする追加の核酸、およびRbファミリー遺伝子の発現を低減させる化合物（例えばsiRNAや関連dsRNA）からなる群から選ばれる追加の物質を含有してもよい。前記追加のポリペプチドはSV40 large T抗原、C/EBPβ、GATA4、HHEX、KLF4およびPROX1からなる群から選ばれるものであってもよい。前記組成物を含
むキットも提供する。
本発明のさらなる態様は、前記細胞、組成物または装置の、個体の肝機能を改善するための使用であって、薬品の製造における前記細胞または組成物の使用を含む使用を提供する。
【００１２】
以下の明細書により、一つまたは複数の実施形態を詳細に説明する。本発明の他の技術特徴、目的および利点は明細書および請求の範囲から分かる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）〜（Ｅ）はヒト胎児線維芽細胞から肝細胞様細胞への誘導を示す図および写真のセットである：（Ａ）ヒト肝細胞様（ｈｉＨｅｐ）細胞を誘導するための実験計画；（Ｂ）FOXA3、HNF1A、HNF4Aで誘導されたヒト胎児肢線維芽細胞（ＨＦＦ１）における肝臓遺伝子発現；（Ｃ）代表的な上皮形態を示すｈｉＨｅｐ細胞；（Ｄ）ｈｉＨｅｐ細胞を誘導する際に徐々に増加する肝臓遺伝子発現；（Ｅ）誘導してから２週間、ｈｉＨｅｐ細胞における原線維芽細胞特異的遺伝子の発現が抑制された。スケールバー：１００μｍ。データは平均値±標準偏差（mean±SD）で示す。
【図２】（Ａ）〜（Ｉ）はｈｉＨｅｐ細胞が肝臓の遺伝子発現パターンおよび成熟の機能を取得することを示す図および写真のセットである：（Ａ）成熟肝臓タンパク質のアルブミン（ＡＬＢ）とα−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）の共発現。（Ｂ）フローサイトメトリーにより定量されたＡＬＢとＡＡＴダブルポジティブ細胞は、ｈｉＨｅｐの転換効率を確定するために用いられる。２日間培養したＰＨＨは陽性コントロールとして用いられる。（Ｃ），（Ｄ）肝臓へ転換する際に増加するＡＬＢ（Ｃ）およびＡＡＴ（Ｄ）の分泌。（Ｅ）ＨＦＦｓ、ＰＨＨｓ、分別されていないｈｉＨｅｐ細胞およびＨｅｐＧ２細胞のｃＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイル解析。（Ｆ）過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色により確認した、ｈｉＨｅｐ細胞によるグリコーゲン貯蔵（マゼンタ）。（Ｇ）ｈｉＨｅｐ細胞における、蛍光プローブ１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩ−ａｃ−ＬＤＬ）で標識化されたアセチル化低比重リポタンパク質の摂取（赤）。（Ｈ）ｈｉＨｅｐ細胞におけるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の取り込み（緑）。（Ｉ）オイル赤Ｏ染色で示されるｈｉＨｅｐ細胞における脂肪蓄積。スケールバー：１００μｍ。データは平均値±標準偏差で示す。
【図３】（Ａ）〜（Ｉ）はヒト胎児および成体の線維芽細胞からｈｉＨｅｐ細胞を生産することを示す図および写真のセットである：（Ａ）FOXA3、HNF1A、HNF4Aの過剰発現により得られる、上皮様形態を表現する他の胎児線維芽細胞株ＨＦＦ２由来ｈｉＨｅｐ細胞。（Ｂ）ｑ−ＰＣＲにより確定した、肝臓遺伝子を発現するＨＦＦ２由来ｈｉＨｅｐ細胞。（Ｃ），（Ｄ）ＰＡＳ染色（Ｃ）およびａｃ−ＬＤＬ摂取（Ｄ）により確定した、グリコーゲン貯蔵を含む肝臓機能を表現するＨＦＦ２由来ｈｉＨｅｐ細胞。（Ｅ）上皮様形態を表現するヒト成体線維芽細胞（ＨＡＦ）由来ｈｉＨｅｐ細胞。（Ｆ）ｑ−ＰＣＲにより測定した、ＨＡＦ由来ｈｉＨｅｐ細胞における３ＴＦで誘導された肝臓遺伝子発現。（Ｇ），（Ｈ）ＰＡＳ染色（Ｇ）およびａｃ−ＬＤＬ摂取（Ｈ）により確定した、グリコーゲン貯蔵を含む肝臓機能を表現するＨＡＦ由来ｈｉＨｅｐ細胞。（Ｉ）ＨＡＦを肝臓に誘導してから１２日間後、免疫蛍光染色により確定したように、細胞のうちの１０％はＡＬＢとＡＡＴを共に発現している。スケールバー：１００μｍ。データは平均値±標準偏差で示す。
【図４】（Ａ）〜（Ｆ）ｈｉＨｅｐ細胞はシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性および胆汁中排泄能を有することを示す図のセットである。（Ａ）ｑ−ＰＣＲにより確定した、２日間培養され且つ誘導物質処理前のＰＨＨおよびｈｉＨｅｐ細胞におけるＣＹＰ遺伝子のｍＲＮＡレベル。データはＰＨＨに正規化された。（Ｂ）ｑ−ＰＣＲにより測定した、（Ａ）と同様な期間で培養されたｈｉＨｅｐおよびＰＨＨ細胞における解毒関連核内受容体の発現レベル。データはＰＨＨに正規化された。（Ｃ）ｑ−ＰＣＲにより測定した、誘導されたＣＹＰ酵素のｍＲＮＡレベル。CYP1A2は３−メチルコラントレンで誘導された。CYP2A6、CYP2C8およびCYP2C9はリファンピシンで誘導された。CYP2B6およびCYP3A4はフェノバルビタールで誘導された。ｈｉＨｅｐおよびＰＨＨ細胞の誘導倍数はそれぞれ、誘導物質処理無しの細胞のレベルに正規化された。（Ｄ）ｈｉＨｅｐ細胞のＣＹＰ代謝活性。Ｕ．Ｄ．＝検出不能。（Ｅ）ｑ−ＰＣＲにより測定した、ｈｉＨｅｐ細胞における薬物輸送体遺伝子の発現。データはＰＨＨに正規化された。（Ｆ）ｈｉＨｅｐ細胞が［Ｄ−ペン２，５］−エンケファリン水和物（ＤＰＤＰＥ）、Ｄ８−タウロコール酸（Ｄ８−ＴＣＡ）およびコリルリシルフルオレセイン（ＣＬＦ）のクリアランスにより測定した胆汁中排泄能を示す。サンドイッチ培養されたＰＨＨは陽性コントロールとして用いられる。＊：Ｐ＜０．０５、ｔ−検定。データは平均値±標準偏差で示す。
【図５】（Ａ）〜（Ｊ）はｈｉＨｅｐ細胞の増幅を示す図および写真のセットである：（Ａ）ｈｉＨｅｐ細胞の増殖は停止している。p53、p21またはRbのノックダウンはｈｉＨｅｐ細胞の増幅に極小の効果しか有しないが、SV40 large T抗原はｈｉＨｅｐ細胞に増殖能を付与する。（Ｂ）ＡＬＢとＡＡＴ（上のパネル）およびＡＳＧＰＲ１とＺＯ−１（下のパネル）の共免疫染色により示したように、増幅可能なｈｉＨｅｐＬＴ細胞は代表的な上皮形態を示し、且つ成熟肝細胞に特異的な肝臓タンパク質を発現する。（Ｃ）ｑ−ＰＣＲにより確定したように、初期継代（３代目）と長期継代（１０代目）のｈｉＨｅｐＬＴは同様な肝臓遺伝子発現レベルを示す。（Ｄ）全ゲノム発現解析により示したように、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞の発現パターンは、ｈｉＨｅｐ細胞とＰＨＨを合併したものである。（Ｅ）〜（Ｇ）初期継代と長期継代のｈｉＨｅｐＬＴ細胞は同等のグリコーゲン蓄積（ＰＡＳ染色）（Ｅ）、ＤｉＩ−ａｃ−ＬＤＬ摂取（Ｆ）およびＡＬＢ分泌（Ｇ）を示す。（Ｈ）１０代目のｈｉＨｅｐＬＴ細胞のＣＹＰ代謝活性。（Ｉ）ｑ−ＰＣＲにより示したように、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞は高いレベルで薬物輸送体遺伝子を発現する。（Ｊ）１０代目のｈｉＨｅｐＬＴ細胞はｈｉＨｅｐ細胞と同等の胆汁中排泄能を示す。スケールバー：１００μｍ。データは平均値±標準偏差で示す。
【図６】（Ａ）〜（Ｉ）はｈｉＨｅｐ細胞の代謝性肝疾患に対する治療効果を示す図および写真のセットである：（Ａ）Fah-/-Rag2-/-マウス（Ｆ／Ｒ）の肝臓へのｈｉＨｅｐＬＴ細胞移植の概要図。（Ｂ）ＮＴＢＣ撤去後、細胞を受け入れなかった、或いは1×107個のＨＦＦ１（ＨＦＦ−Ｆ／Ｒ）、ｈｉＨｅｐＬＴ（ｈｉＨｅｐＬＴ−Ｆ／Ｒ）または1×106個のＰＨＨ（ＰＨＨ−Ｆ／Ｒ）を受け入れたＦ／Ｒマウスのカプランマイヤー生存曲線。（Ｃ），（Ｄ）瀕死コントロールＦ／Ｒマウス（ｎ＝３）、生存ｈｉＨｅｐＬＴ−Ｆ／Ｒマウス（ｎ＝５）および生存ＰＨＨ−Ｆ／Ｒマウス（ｎ＝３）におけるＡＬＴ（Ｃ）とＡＳＴ（Ｄ）の血清レベル。（Ｅ）ＥＬＩＳＡにより確定した、生存ｈｉＨｅｐＬＴ−Ｆ／ＲおよびＰＨＨ−Ｆ／Ｒマウスの血清におけるヒトＡＬＢレベル。（Ｆ）連続切片のヒトＦａｈとＡＡＴの免疫染色により確定した、Ｆ／Ｒ肝臓におけるｈｉＨｅｐＬＴ細胞の組み込み。（Ｇ）ｈｉＨｅｐＬＴ再増殖Ｆ／Ｒ肝臓から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲによりヒト特異的Ａｌｕ配列を解析した。（Ｈ），（Ｉ）肝臓の連続切片からレーザーキャプチャーマイクロダイセクションによりＦａｈ−陽性ｈｉＨｅｐＬＴ細胞を収集した。ｈｉＨｅｐＬＴ再増殖結節（ｈｉＨｅｐＬＴ再増殖）および培養ｈｉＨｅｐＬＴ細胞（ｈｉＨｅｐＬＴ培養）における上記遺伝子のｍＲＮＡレベルは、ｑ−ＰＣＲにより測定した。データは培養ｈｉＨｅｐＬＴ細胞（Ｈ）に正規化された。ＡＦＰのｍＲＮＡレベルはＨｅｐＧ２細胞（Ｉ）に正規化された。＊：Ｐ＜０．０５、（Ｂ）はログランク検定とし、（Ｃ）−（Ｅ）はｔ−検定として。スケールバー：１００μｍ。データは平均値±標準偏差で示す。
【図７】（Ａ）〜（Ｆ）はカプセル化ｈｉＨｅｐＬＴ細胞で急性肝不全を救うことを示す図および写真のセットである：（Ａ）カプセル化ｈｉＨｅｐＬＴ細胞の、急性肝不全マウスの治療における使用の概要図。（Ｂ）カプランマイヤー生存曲線。（Ｃ），（Ｄ）カプセル化ｈｉＨｅｐＬＴとＰＨＨ細胞移植前（０日）および移植後（４日と７日）のCon A処理マウスにおけるＡＬＴ（Ｃ）とＡＳＴ（Ｄ）の血清レベル。（Ｅ，Ｆ）ｈｉＨｅｐＬＴ細胞移植前（０日）および移植後（４日と７日）のCon A処理マウス由来の肝臓（Ｅ、新鮮分離した肝臓の拡大図）および肝臓切片（Ｆ、Ｈ＆Ｅ染色）。＊：Ｐ＜０．０５、Ｂはログランク検定とした。
【図８】（Ａ）〜（Ｍ）はヒトｈｉＨｅｐ細胞誘導用の因子の同定を示す図および写真のセットである：（Ａ），（Ｂ）肝芽細胞のマーカー遺伝子の発現。（Ｃ）ヒトFOXA3、HNF1AおよびGATA4はレンチウイルス感染によりＨＦＦ１において発現されている。（Ｄ），（Ｅ）８つの転写因子（８ＴＦ，Ｄ）および６つの転写因子（６ＴＦ，Ｅ）から単一の因子を撤去することの、肝臓遺伝子発現に対する影響。（Ｆ）〜（Ｉ）ＨＦＦ１におけるFOXA3、HNF1B、HNF4A、PROX1およびC/EBPβ（まとめて５ＴＦと記す）の組み合わせで誘導された肝臓への転換。５ＴＦで誘発された肝臓遺伝子発現（Ｆ）、グリコーゲン貯蔵（Ｇ、ＰＡＳ染色で示す）、アセチル化ＬＤＬ摂取（Ｈ、赤色蛍光）およびＡＬＢ分泌（Ｉ）。スケールバー：１００μｍ。データは５ＴＦに正規化された。（Ｊ）FOXA3、HNF1BおよびHNF4Aは肝臓への転換にとって重要である。（Ｋ）HNF1Bの代わりにHNF1AをFOXA3およびHNF4Aと組み合わせて使用することで、ＨＦＦ１におけるＡＬＢ発現は顕著に向上した。（Ｌ）ｑ−ＰＣＲにより確定した、８ＴＦ、６ＴＦ、５ＴＦおよび３ＴＦで誘導された肝臓遺伝子発現。（Ｍ）ALBおよびAATプロモーターにより、ｈｉＨｅｐ細胞は増加したH3K9Acレベルを示す。
【図９】（Ａ）〜（Ｅ）は非肝芽細胞由来のｈｉＨｅｐ細胞を示す図および写真のセットである：（Ａ）D133-EpCAM-胎児線維芽細胞はフローサイトメトリーにより選別、確認した。（Ｂ）〜（Ｅ）CD133-EpCAM-細胞は３ＴＦの異所性発現によりｈｉＨｅｐ細胞へ転換した。（Ｂ）CD133-EpCAM- ＨＦＦ由来ｈｉＨｅｐ細胞は上皮様形態を表現した。（Ｃ）CD133-EpCAM- ＨＦＦ細胞における肝臓遺伝子発現が３ＴＦで誘導されたことは、ｑ−ＰＣＲにより確定した。データはｈｉＨｅｐ細胞に正規化された。（Ｄ），（Ｅ）ＰＡＳ染色（Ｄ）およびａｃ−ＬＤＬ摂取（Ｅ）により確定したように、CD133-EpCAM-ＨＦＦ由来ｈｉＨｅｐ細胞がグリコーゲン貯蔵を含む肝臓機能を表現する。スケールバー：１００μｍ。
【図１０】（Ａ）〜（Ｊ）はヒト成体細胞からｈｉＨｅｐＬＴ細胞への誘導を示す図および写真のセットである：（Ａ），（Ｂ）ｈｉＨｅｐ細胞（Ａ）およびｈｉＨｅｐＬＴ細胞（Ｂ）における細胞周期制御因子をｑ−ＰＣＲにより解析した。データはＨＦＦ細胞に正規化された。（Ｃ）ＰＡＳ染色およびａｃ−ＬＤＬ摂取により確定した、上皮様形態を示し且つグリコーゲン貯蔵を含む肝臓機能を有するＨＡＦ由来ｈｉＨｅｐＬＴ細胞。（Ｄ）ＨＡＦ由来ｈｉＨｅｐＬＴ細胞における肝臓遺伝子発現。データはＨＡＦ由来ｈｉＨｅｐＬＴ細胞に正規化された。（Ｅ）ＡＬＢとＡＡＴタンパク質を共に生成するＨＡＦ由来ｈｉＨｅｐＬＴ細胞。（Ｆ）〜（Ｊ）ｈｉＨｅｐ細胞は成体脂肪組織由来の間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣｓ）（Ｆ）から生産され、且つ肝臓遺伝子（Ｇ）を発現する。データはＡＤ−ＭＳＣ由来ｈｉＨｅｐ細胞に正規化された。（Ｈ）〜（Ｊ）ＭＳＣ−ｈｉＨｅｐ細胞はＡＬＢとＡＡＴ分泌（Ｈ）、ＣＹＰ活性（Ｉ）および胆汁中排泄（Ｊ）も示す。スケールバー：１００μｍ。
【図１１】（Ａ）〜（Ｉ）は増幅可能なｈｉＨｅｐ細胞が安定にリプログラミングされた且つ肝芽細胞でなくなったことを示す図および写真のセットである：（Ａ），（Ｂ）ｈｉＨｅｐＬＴ細胞は安定に転換した肝細胞様細胞である。（Ａ）３０日間培養したｈｉＨｅｐＬＴ細胞における異所性転写因子の発現レベルは劇的に低減した。データは２日目に正規化された。（Ｂ）３０日間培養したｈｉＨｅｐＬＴ細胞において、内因性FOXA3、HNF1AおよびHNF4Aは誘導された。（Ｃ）ｈｉＨｅｐＬＴ細胞における肝芽細胞マーカー遺伝子の発現レベルをｑ−ＰＣＲにより確定した。データはＨｅｐＧ２に正規化された。（Ｄ）免疫蛍光染色により、肝芽細胞において濃縮するタンパク質であるＥｐＣＡＭは、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞において検出されていない。スケールバー：５０μｍ。（Ｅ），（Ｆ）ｈｉＨｅｐＬＴ細胞におけるＡＦＰ発現。（Ｅ）ｑ−ＰＣＲにより低レベルのＡＦＰ  ｍＲＮＡが検出された。データはＨｅｐＧ２に正規化され、表に示す。（Ｆ）ｈｉＨｅｐＬＴにおいて、免疫蛍光染色によりＡＦＰタンパク質が検出されていない。スケールバー：１００μｍ。（Ｇ）肝細胞系列への転換過程における上記遺伝子の発現。データはＨＦＦに正規化された。（Ｈ）ｑ−ＰＣＲにより、胆管細胞において濃縮された遺伝子はｈｉＨｅｐＬＴ細胞において発現していない。データは肝臓に正規化された。（Ｉ）肝臓内皮前駆細胞株ＬＥＰＣは三次元培養システムにおいて、３日間で胆管枝構造を形成した（矢印）が、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞は分枝構造を形成することができなかった。
【図１２】Fah-/-Rag2-/-マウスへのｈｉＨｅｐＬＴ細胞移植を示す図および写真のセットである：（Ａ）体重曲線。（Ｂ）ｈｉＨｅｐＬＴ細胞を受け入れたＦ／Ｒマウス由来の肝臓の連続切片におけるヒトＦａｈおよびヒトＡＡＴの免疫染色。（Ｃ）Ｆ／Ｒマウスの肝機能の改善は、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞の組み込みの百分率に関連するそうである。（Ｄ）ｈｉＨｅｐＬＴ細胞移植から９週間後のＦ／Ｒ肝臓の連続切片を、Ｆａｈ、ＨｅｐＰａｒ−１およびＫｉ６７抗体で染色する。Fah+ ｈｉＨｅｐ細胞はＨｅｐＰａｒ−１染色でも陽性であるが、Ｋｉ６７染色では陰性である。（Ｅ）再増殖ｈｉＨｅｐ細胞と受容者マウス肝細胞の間の細胞融合はＦａｈ（緑）とマウスアルブミン（赤）の共染色により排除される。Ｆａｈ特異的抗体はｈｉＨｅｐ細胞を染色するが、マウスアルブミン特異的抗体はマウス肝細胞を染色する。（Ｆ）再増殖ｈｉＨｅｐＬＴ細胞結節におけるSV40 LTの発現。（Ｇ）１０代目のｈｉＨｅｐＬＴ細胞の核型。（Ｈ）ｈｉＨｅｐＬＴ細胞は移植から２ヵ月後で腫瘍を形成していない。スケールバー：１００μｍ。
【図１３】（Ａ）〜（Ｃ）はカプセル化ｈｉＨｅｐＬＴ細胞で急性肝不全を救うことを示す図および写真のセットである：（Ａ）ｈｉＨｅｐＬＴ細胞は３５０μｍのＡＰＡマイクロカプセルにカプセル化された。（Ｂ）ｈｉＨｅｐＬＴ細胞の移植後、受容者マウスの血清ＡＬＢレベルを毎日測定する。（Ｃ）急性肝不全を持ち、且つカプセル化ＨＦＦまたはｈｉＨｅｐＬＴを受け入れて３日間生存したマウスの血清ＡＬＴとＡＳＴレベル。
【図１４】（Ａ）〜（Ｆ）は、増殖性ｈｉＨｅｐ細胞がsiRNAでＲＢファミリー遺伝子（p130、RB1およびp107）の発現を抑制することで得られる、ということを示す写真のセットである。
【図１５】（Ａ）〜（Ｂ）は、増殖性ｈｉＨｅｐ細胞がsiRNAでＲＢファミリー遺伝子（p130、RB1およびp107）の発現を抑制することで得られる、ということを示す他の写真のセットである。
【図１６】ｈｉＨｅｐ細胞がFOXA3およびHNF1を強制発現させることで得られる、ということを示す図である。
【図１７】（Ａ）〜（Ｆ）は、ｈｉＨｅｐ細胞がFOXA3およびHNF4Aを強制発現させることで得られる、ということを示す図、および写真のセットである：（Ａ），（Ｂ）形態、（Ｃ）発現プロファイル、および（Ｄ）〜（Ｆ）ＡＬＢ、ＤＡＰＩ染色およびmerge。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明、少なくともその一部は、ヒト非肝臓細胞（例えば、成体線維芽細胞）が、２つや３つだけの異種転写因子の強制発現で肝細胞様細胞に転換することができる、という意外な発見に基づくものである。
マウス線維芽細胞が所定の転写因子により肝細胞系列へ直接に転換できることは既に証明された（Huangら, 2011, Nature 475, 386-389；およびSekiyaら, 2011, Nature 475, 390-393）。しかしながら、それらの知見をヒト細胞に転用することは、生物医学的応用
および医薬的応用のために乗り越えなければならないチャレンジである（Cherryら, 2012, Cell 148, 1110-1122；Tiscorniaら, 2011, Nat Med 17, 1570-1576；およびVierbuchenら, 2011,  Nat Biotechnol 29, 892-907）。
ここに記載されるように、ヒトから誘導される肝細胞様（ｈｉＨｅｐ）細胞は、マウス細胞用の因子と異なっているが、FOXA3、HNF1AおよびHNF4Aを強制発現させることで、ヒ
ト胎児線維芽細胞（ＨＦＦ）、成体線維芽細胞（ＨＡＦ）および成体脂肪組織由来の間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ）のようなヒト非肝臓細胞から効率的に生産することができる。ここに記載されるように、ｈｉＨｅｐ細胞は成熟肝臓機能、具体的にはシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性および薬物化合物の胆汁中排泄能を示す。特に、ｈｉＨｅｐ細胞の治療効果は、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）欠損による代謝性肝疾患およびコンカナバリンＡ（Con A）による急性肝不全において既に証明されており、それは分化転
換したヒト細胞のインビボでの初めての治療的検討であった。それらの結果から、ｈｉＨｅｐ細胞が細胞治療、疾患モデリングおよび薬物発見に適用できることが明らかになる。
【００１５】
ｉＨｅｐ細胞とは、下記した成熟肝実質細胞の特徴的な特性を一種または多種を発揮する細胞を指す。ｉＨｅｐ細胞は、下記特性のうちの少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つまたは五つ以上の特性を発揮してもよい：ピルビン酸塩を単一炭素源として利用する能力；第１相生体内変化能（例えばエトキシレゾルフィン、ペントキシレゾルフィン、テストステロン）；第２相生体内変化能（例えば１−クロロ−２，４−ニトロベンゼン、１，２−ジクロロ−４−ニトロベンゼン、７−クロロ−４−ニトロベンゼン−２−オキサ−１，３−ジアゾール、エストラジオール、エストロゲン）、シトクロムＰ４５０タンパク
質および遺伝子発現の存在；第１相と第２相生体内変化酵素（例えばβ−ナフトフラボン、フェノバルビタール、メチルコラントレン）の誘導性；アルブミン分泌、尿素製造、グリコーゲン貯蔵、内因性ＡＬＢとＡＦＰとγ−グルタミルトランスフェラーゼと肝細胞核因子（HNF）1αとHNF 1βとHNF 3αとHNF 3βとHNF 4とHNF-6とアンチトリプシンとＣＸ
３２とＭＲＰ２とＣ／ＥＢＰαとトランスチレチンとＣＫ−１８とＣＦＴＲから選ばれる一種または多種の発現の存在；多角形形態。一つの特定の実施形態において、本発明のｉＨｅｐ細胞は、あるＣＹＰ遺伝子が誘導されていない、且つCK19およびAfpが発現向上し
た成熟肝細胞に接近する発現プロファイルおよび肝臓機能を示す。前記ｉＨｅｐ細胞は肝細胞と同一のものではない。本発明のｉＨｅｐ細胞は遺伝的に安定で、且つ腫瘍形成の傾向がない。それらは疾患モデリング、移植および組織工学に用いることができる。
【００１６】
以上で説明したように、ヒト肝細胞または肝細胞様細胞に対する需要はまだ満たされていない。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）から肝細胞または肝細胞様細胞への分化は最近開発された。それらのｈＥＳＣｓ由来細胞はヒト肝細胞の代表的な形態および表現型を示すが、患者に適合的な肝細胞または肝細胞様細胞としてのそれらの使用は、入手であるｈＥＳＣ細胞株の数に制限される。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生産に成功したことにより、ｉＰＳＣｓが肝内胚葉に分化した場合、患者自身の細胞から肝細胞を製造することが可能となる。また、ｈＥＳＣやｉＰＳＣ由来の細胞のいずれかにも、インビボで奇形腫を形成する未分化の多能性幹細胞に汚染される恐れがある。インビトロでの増殖性および多系列分化能を示す複能性間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、インビトロで適切な肝臓遺伝子発現および機能的属性を有する肝細胞様細胞に分化することができる。しかしながら、ＭＳＣ由来の肝細胞様細胞の応用は、その低い効率および誘導された分化細胞の混在によって制限される。
ここに記載されるように、胎児線維芽細胞、成体線維芽細胞および脂肪組織由来の間葉系幹細胞のようなヒト非肝臓細胞を転換して内因性肝細胞様（ｉＨｅｐ）細胞を誘導することは、FOXA3、HNF1AおよびHNF4Aのような転写因子の過剰発現、並びにSV 40 large T抗原の強制発現もしくは一種または多種のＲＢファミリー遺伝子の不活性化により実現される。線維芽細胞由来の上皮細胞コロニーは形質導入された転写因子の強制発現の後で誘導され、またｉＨｅｐ細胞が得られ、且つ増幅しやすい、ということは見出された。系列転換後、外因性転写因子の発現は抑制されるので、ｉＨｅｐ細胞は後成的に安定になるそうである。特に、成熟肝細胞に接近する発現プロファイルを有するｉＨｅｐ細胞は、インビトロでグリコーゲン貯蔵、アルブミン分泌、低比重リポタンパク質の輸送および薬物動態の代謝のような複数の肝臓機能を示す。系列マーカーの厳密な解析により、線維芽細胞は成熟肝細胞にしか転換しておらず、肝前駆細胞や他の細胞系列に転換していない。
【００１７】
（本発明に用いられる転写因子および他の因子）
本発明において、多種の転写因子はｉＨｅｐ細胞を生産するために用いることができる。それらの例として、肝細胞核因子（HNF）１または４サブファミリー（例えばHNF1Α、HNF1BおよびHNF4Α）の転写因子、並びにフォークヘッドボックスＡタンパク質（FOXA）ファミリー（例えばFOXA1、FOXA2およびFOXA3）の転写因子が挙げられる。それらの転写因
子および他の典型的な因子は下表１に示される。ｉＨｅｐ細胞を増幅するために強制発現または抑制されるSV 40 large T抗原およびＲＢファミリー遺伝子を含む他の因子の例も
、下表に示される。他種のホモログ（例えば他種の動物）も用いることができる。例えば参照により取り入れられるＷＯ２０１２０５８８６８を参考する。
【００１８】
表１. ヒト線維芽細胞の肝細胞への転換に用いられるヒト転写因子および他の因子
【表１】
0006426627.tif 000002
【００１９】
FOXA3 （SEQ ID NO： 1）
MLGSVKMEAHDLAEWSYYPEAGEVYSPVTPVPTMAPLNSYMTLNPLSSPYPPGGLPASPLPSGPLAPPAPAAPLGPTFPGLGVSGGSSSSGYGAPGPGLVHGKEMPKGYRRPLAHAKPPYSYISLITMAIQQAPGKMLTLSEIYQWIMDLFPYYRENQQRWQNSIRHSLSFNDCFVKVARSPDKPGKGSYWALHPSSGNMFENGCYLRRQKRFKLEEKVKKGGSGAATTTRNGTGSAASTTTPAATVTSPPQPPPPAPEPEAQGGEDVGALDCGSPASSTPYFTGLELPGELKLDAPYNFNHPFSINNLMSEQTPAPPKLDVGFGGYGAEGGEPGVYYQGLYSRSLLNAS
HNF1B （SEQ ID NO： 2） 
MVSKLTSLQQELLSALLSSGVTKEVLVQALEELLPSPNFGVKLETLPLSPGSGAEPDTKPVFHTLTNGHAKGRLSGDEGSEDGDDYDTPPILKELQALNTEEAAEQRAEVDRMLSEDPWRAAKMIKGYMQQHNIPQREVVDVTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREILRQFNQTVQSSGNMTDKSSQDQLLFLFPEFSQQSHGPGQSDDACSEPTNKKMRRNRFKWGPASQQILYQAYDRQKNPSKEEREALVEECNRAECLQRGVSPSKAHGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRQKLAMDAYSSNQTHSLNPLLSHGSPHHQPSSSPPNKLSGVRYSQQGNNEITSSSTISHHGNSAMVTSQSVLQQVSPASLDPGHNLLSPDGKMISVSGGGLPPVSTLTNIHSLSHHNPQQSQNLIMTPLSGVMAIAQSLNTSQAQSVPVINSVAGSLAALQPVQFSQQLHSPHQQPLMQQSPGSHMAQQPFMAAVTQLQNSHMYAHKQEPPQYSHTSRFPSAMVVTDTSSISTLTNMSSSKQCPLQAW
GATA4 （SEQ ID NO： 3） 
MYQSLAMAANHGPPPGAYEAGGPGAFMHGAGAASSPVYVPTPRVPSSVLGLSYLQGGGAGSASGGASGGSSGGAASGAGPGTQQGSPGWSQAGADGAAYTPPPVSPRFSFPGTTGSLAAAAAAAAAREAAAYSSGGGAAGAGLAGREQYGRAGFAGSYSSPYPAYMADVGASWAAAAAASAGPFDSPVLHSLPGRANPAARHPNLDMFDDFSEGRECVNCGAMSTPLWRRDGTGHYLCNACGLYHKMNGINRPLIKPQRRLSASRRVGLSCANCQTTTTTLWRRNAEGEPVCNACGLYMKLHGVPRPLAMRKEGIQTRKRKPKNLNKSKTPAAPSGSESLPPASGASSNSSNATTSSSEEMRPIKTEPGLSSHYGHSSSVSQTFSVSAMSGHGPSIHPVLSALKLSPQGYASPVSQSPQTSSKQDSWNSLVLADSHGDIITA
HNF4A（SEQ ID NO： 4） 
MRLSKTLVDMDMADYSAALDPAYTTLEFENVQVLTMGNDTSPSEGTNLNAPNSLGVSALCAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHMYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLKKCFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLPSINALLQAEVLSRQITSPVSGINGDIRAKKIASIADVCESMKEQLLVLVEWAKYIPAFCELPLDDQVALLRAHAGEHLLLGATKRSMVFKDVLLLGNDYIVPRHCPELAEMSRVSIRILDELVLPFQELQIDDNEYAYLKAIIFFDPDAKGLSDPGKIKRLRSQVQVSLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSITWQMIEQIQFIKLFGMAKIDNLLQEMLLGGSPSDAPHAHHPLHPHLMQEHMGTNVIVANTMPTHLSNGQMCEWPRPRGQAATPETPQPSPPGGSGSEPYKLLPGAVATIVKPLSAIPQPTITKQEVI
【００２０】
C/EBPs （SEQ ID NO： 5） 
MQRLVAWDPACLPLPPPPPAFKSMEVANFYYEADCLAAAYGGKAAPAAPPAARPGPRPPAGELGSIGDHERAIDFSPYLEPLGAPQAPAPATATDTFEAAPPAPAPAPASSGQHHDFLSDLFSDDYGGKNCKKPAEYGYVSLGRLGAAKGALHPGCFAPLHPPPPPPPPPAELKAEPGFEPADCKRKEEAGAPGGGAGMAAGFPYALRAYLGYQAVPSGSSGSLSTSSSSSPPGTPSPADAKAPPTACYAGAAPAPSQVKSKAKKTVDKHSDEYKIRRERNNIAVRKSRDKAKMRNLETQHKVLELTAENERLQKKVEQLSRELSTLRNLFKQLPEPLLASSGHC
HHEX （SEQ ID NO： 6） 
MQYPHPGPAAGAVGVPLYAPTPLLQPAHPTPFYIEDILGRGPAAPTPAPTLPSPNSSFTSLVSPYRTPVYEPTPIHPAFSHHSAAALAAAYGPGGFGGPLYPFPRTVNDYTHALLRHDPLGKPLLWSPFLQRPLHKRKGGQVRFSNDQTIELEKKFETQKYLSPPERKRLAKMLQLSERQVKTWFQNRRAKWRRLKQENPQSNKKEELESLDSSCDQRQDLPSEQNKGASLDSSQCSPSPASQEDLESEISEDSDQEVDIEGDKSYFNAG
PROX1 （SEQ ID NO： 7） 
MPDHDSTALLSRQTKRRRVDIGVKRTVGTASAFFAKARATFFSAMNPQGSEQDVEYSVVQHADGEKSNVLRKLLKRANSYEDAMMPFPGATIISQLLKNNMNKNGGTEPSFQASGLSSTGSEVHQEDICSNSSRDSPPECLSPFGRPTMSQFDMDRLCDEHLRAKRARVENIIRGMSHSPSVALRGNENEREMAPQSVSPRESYRENKRKQKLPQQQQQSFQQLVSARKEQKREERRQLKQQLEDMQKQLRQLQEKFYQIYDSTDSENDEDGNLSEDSMRSEILDARAQDSVGRSDNEMCELDPGQFIDRARALIREQEMAENKPKREGNNKERDHGPNSLQPEGKHLAETLKQELNTAMSQVVDTVVKVFSAKPSRQVPQVFPPLQIPQARFAVNGENHNFHTANQRLQCFGDVIIPNPLDTFGNVQMASSTDQTEALPLVVRKNSSDQSASGPAAGGHHQPLHQSPLSATTGFTTSTFRHPFPLPLMAYPFQSPLGAPSGSFSGKDRASPESLDLTRDTTSLRTKMSSHHLSHHPCSPAHPPSTAEGLSLSLIKSECGDLQDMSEISPYSGSAMQEGLSPNHLKKAKLMFFYTRYPSSNMLKTYFSDVKFNRCITSQLIKWFSNFREFYYIQMEKYARQAINDGVTSTEELSITRDCELYRALNMHYNKANDFEVPERFLEVAQITLREFFNAIIAGKDVDPSWKKAIYKVICKLDSEVPEIFKSPNCLQELLHE
KLF4（SEQ ID NO： 8）
MRQPPGESDMAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVLPGRPYDLAAATVATDLESGGAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHPPESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAGNDPGVAPGGTGGGLLYGRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLSAPGSEYGSPSVISVSKGSPDGSHPVVVAPYNGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPAAHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQVPPLHYQELMPPGSCMPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKRHF
【００２１】
HNF1A（SEQ ID NO： 9）
MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLAMDTYSGPPPGPGPGPALPAHSSPGLPPPALSPSKVHGVRYGQPATSETAEVPSSSGGPLVTVSTPLHQVSPTGLEPSHSLLSTEAKLVSAAGGPLPPVSTLTALHSLEQTSPGLNQQPQNLIMASLPGVMTIGPGEPASLGPTFTNTGASTLVIGLASTQAQSVPVINSMGSSLTTLQPVQFSQPLHPSYQQPLMPPVQSHVTQSPFMATMAQLQSPHALYSHKPEVAQYTHTGLLPQTMLITDTTNLSALASLTPTKQVFTSDTEASSESGLHTPASQATTLHVPSQDPAGIQHLQPAHRLSASPTVSSSSLVLYQSSDSSNGQSHLLPSNHSVIETFISTQMASSSQ
SV40 large T/Gene ID： 1489531 （SEQ ID NO： 10）
MDKVLNREESLQLMDLLGLERSAWGNIPLMRKAYLKKCKEFHPDKGGDEEKMKKMNTLYKKMEDGVKYAHQPDFGGFWDATEIPTYGTDEWEQWWNAFNEENLFCSEEMPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVEDPKDFPSELLSFLSHAVFSNRTLACFAIYTTKEKAALLYKKIMEKYSVTFISRHNSYNHNILFFLTPHRHRVSAINNYAQKLCTFSFLICKGVNKEYLMYSALTRDPFSVIEESLPGGLKEHDFNPEEAEETKQVSWKLVTEYAMETKCDDVLLLLGMYLEFQYSFEMCLKCIKKEQPSHYKYHEKHYANAAIFADSKNQKTICQQAVDTVLAKKRVDSLQLTREQMLTNRFNDLLDRMDIMFGSTGSADIEEWMAGVAWLHCLLPKMDSVVYDFLKCMVYNIPKKRYWLFKGPIDSGKTTLAAALLELCGGKALNVNLPLDRLNFELGVAIDQFLVVFEDVKGTGGESRDLPSGQGINNLDNLRDYLDGSVKVNLEKKHLNKRTQIFPPGIVTMNEYSVPKTLQARFVKQIDFRPKDYLKHCLERSEFLLEKRIIQSGIALLLMLIWYRPVAEFAQSIQSRIVEWKERLDKEFSLSVYQKMKFNVAMGIGVLDWLRNSDDDDEDSQENADKNEDGGEKNMEDSGHETGIDSQSQGSFQAPQSSQSVHDHNQPYHICRGFTCFKKPPTPPPEPET
RBファミリー遺伝子p130 （SEQ ID NO： 11）
MPSGGDQSPPPPPPPPAAAASDEEEEDDGEAEDAAPPAESPTPQIQQRFDELCSRLNMDEAARAEAWDSYRSMSESYTLEGNDLHWLACALYVACRKSVPTVSKGTVEGNYVSLTRILKCSEQSLIEFFNKMKKWEDMANLPPHFRERTERLERNFTVSAVIFKKYEPIFQDIFKYPQEEQPRQQRGRKQRRQPCTVSEIFHFCWVLFIYAKGNFPMISDDLVNSYHLLLCALDLVYGNALQCSNRKELVNPNFKGLSEDFHAKDSKPSSDPPCIIEKLCSLHDGLVLEAKGIKEHFWKPYIRKLYEKKLLKGKEENLTGFLEPGNFGESFKAINKAYEEYVLSVGNLDERIFLGEDAEEEIGTLSRCLNAGSGTETAERVQMKNILQQHFDKSKALRISTPLTGVRYIKENSPCVTPVSTATHSLSRLHTMLTGLRNAPSEKLEQILRTCSRDPTQAIANRLKEMFEIYSQHFQPDEDFSNCAKEIASKHFRFAEMLYYKVLESVIEQEQKRLGDMDLSGILEQDAFHRSLLACCLEVVTFSYKPPGNFPFITEIFDVPLYHFYKVIEVFIRAEDGLCREVVKHLNQIEEQILDHLAWKPESPLWEKIRDNENRVPTCEEVMPPQNLERADEICIAGSPLTPRRVTEVRADTGGLGRSITSPTTLYDRYSSPPASTTRRRLFVENDSPSDGGTPGRMPPQPLVNAVPVQNVSGETVSVTPVPGQTLVTMATATVTANNGQTVTIPVQGIANENGGITFFPVQVNVGGQAQAVTGSIQPLSAQALAGSLSSQQVTGTTLQVPGQVAIQQISPGGQQQKQGQSVTSSSNRPRKTSSLSLFFRKVYHLAAVRLRDLCAKLDISDELRKKIWTCFEFSIIQCPELMMDRHLDQLLMCAIYVMAKVTKEDKSFQNIMRCYRTQPQARSQVYRSVLIKGKRKRRNSGSSDSRSHQNSPTELNKDRTSRDSSPVMRSSSTLPVPQPSSAPPTPTRLTGANSDMEEEERGDLIQFYNNIYIKQIKTFAMKYSQANMDAPPLSPYPFVRTGSPRRIQLSQNHPVYISPHKNETMLSPREKIFYYFSNSPSKRLREINSMIRTGETPTKKRGILLEDGSESPAKRICPENHSALLRRLQDVANDRGSH
【００２２】
RBファミリー遺伝子RB1 （SEQ ID NO： 12）
MPPKTPRKTAATAAAAAAEPPAPPPPPPPEEDPEQDSGPEDLPLVRLEFEETEEPDFTALCQKLKIPDHVRERAWLTWEKVSSVDGVLGGYIQKKKELWGICIFIAAVDLDEMSFTFTELQKNIEISVHKFFNLLKEIDTSTKVDNAMSRLLKKYDVLFALFSKLERTCELIYLTQPSSSISTEINSALVLKVSWITFLLAKGEVLQMEDDLVISFQLMLCVLDYFIKLSPPMLLKEPYKTAVIPINGSPRTPRRGQNRSARIAKQLENDTRIIEVLCKEHECNIDEVKNVYFKNFIPFMNSLGLVTSNGLPEVENLSKRYEEIYLKNKDLDARLFLDHDKTLQTDSIDSFETQRTPRKSNLDEEVNVIPPHTPVRTVMNTIQQLMMILNSASDQPSENLISYFNNCTVNPKESILKRVKDIGYIFKEKFAKAVGQGCVEIGSQRYKLGVRLYYRVMESMLKSEEERLSIQNFSKLLNDNIFHMSLLACALEVVMATYSRSTSQNLDSGTDLSFPWILNVLNLKAFDFYKVIESFIKAEGNLTREMIKHLERCEHRIMESLAWLSDSPLFDLIKQSKDREGPTDHLESACPLNLPLQNNHTAADMYLSPVRSPKKKGSTTRVNSTANAETQATSAFQTQKPLKSTSLSLFYKKVYRLAYLRLNTLCERLLSEHPELEHIIWTLFQHTLQNEYELMRDRHLDQIMMCSMYGICKVKNIDLKFKIIVTAYKDLPHAVQETFKRVLIKEEEYDSIIVFYNSVFMQRLKTNILQYASTRPPTLSPIPHIPRSPYKFPSSPLRIPGGNIYISPLKSPYKISEGLPTPTKMTPRSRILVSIGESFGTSEKFQKINQMVCNSDRVLKRSAEGSNPPKPLKKLRFDIEGSDEADGSKHLPGESKFQQKLAEMTSTRTRMQKQKMNDSMDTSNKEEK
RBファミリー遺伝子p107 （SEQ ID NO： 13）
MFEDKPHAEGAAVVAAAGEALQALCQELNLDEGSAAEALDDFTAIRGNYSLEGEVTHWLACSLYVACRKSIIPTVGKGIMEGNCVSLTRILRSAKLSLIQFFSKMKKWMDMSNLPQEFRERIERLERNFEVSTVIFKKYEPIFLDIFQNPYEEPPKLPRSRKQRRIPCSVKDLFNFCWTLFVYTKGNFRMIGDDLVNSYHLLLCCLDLIFANAIMCPNRQDLLNPSFKGLPSDFHTADFTASEEPPCIIAVLCELHDGLLVEAKGIKEHYFKPYISKLFDRKILKGECLLDLSSFTDNSKAVNKEYEEYVLTVGDFDERIFLGADAEEEIGTPRKFTRDTPLGKLTAQANVEYNLQQHFEKKRSFAPSTPLTGRRYLREKEAVITPVASATQSVSRLQSIVAGLKNAPSDQLINIFESCVRNPVENIMKILKGIGETFCQHYTQSTDEQPGSHIDFAVNRLKLAEILYYKILETVMVQETRRLHGMDMSVLLEQDIFHRSLMACCLEIVLFAYSSPRTFPWIIEVLNLQPFYFYKVIEVVIRSEEGLSRDMVKHLNSIEEQILESLAWSHDSALWEALQVSANKVPTCEEVIFPNNFETGNGGNVQGHLPLMPMSPLMHPRVKEVRTDSGSLRRDMQPLS
PISVHERYSSPTAGSAKRRLFGEDPPKEMLMDKIITEGTKLKIAPSSSITAENVSILPGQTLLTMATAPVTGTTGHKVTIPLHGVANDAGEITLIPLSMNTNQESKVKSPVSLTAHSLIGASPKQTNLTKAQEVHSTGINRPKRTGSLALFYRKVYHLASVRLRDLCLKLDVSNELRRKIWTCFEFTLVHCPDLMKDRHLDQLLLCAFYIMAKVTKEERTFQEIMKSYRNQPQANSHVYRSVLLKSIPREVVAYNKNINDDFEMIDCDLEDATKTPDCSSGPVKEERGDLIKFYNTIYVGRVKSFALKYDLANQDHMMDAPPLSPFPHIKQQPGSPRRISQQHSIYISPHKNGSGLTPRSALLYKFNGSPSKSLKDINNMIRQGEQRTKKRVIAIDSDAESPAKRVCQENDDVLLKRLQDVVSERANH 
【００２３】
HNF1サブファミリーのメンバーは、POU-ホメオドメインを含有し、且つホモ二量体としてＤＮＡに結合する転写因子である。そのうち、HNF1Αは肝臓において高発現され、複数の肝特異的遺伝子の発現の調節に関与する。HNF4サブファミリーのメンバーは核内受容体であり、ホモ二量体またはＲＸＲヘテロ二量体としてＤＮＡに結合する。転写因子であるHNF4Αはホモ二量体としてＤＮＡに結合し、HNF1Αを含む複数の遺伝子の発現を制御する。当該転写因子は肝臓、腎臓および腸の発生において役割を果たす。当該遺伝子の選択的スプライシングにより、多種の転写バリアントが生成する。
フォークヘッドボックスタンパク質は、細胞の成長、増殖、分化および寿命に関与する遺伝子の発現の調節において重要な役割を果たす遺伝子ファミリーである。多数のフォークヘッドボックスタンパク質は胚発生にとって重要である。それらはヘリックスターンヘリックス類タンパク質のサブグループである。それらのタンパク質の決定的な特徴は、ＤＮＡに結合するモチーフを形成する８０〜１００個のアミノ酸配列であるフォークヘッドボックスにある。当該フォークヘッドモチーフは、ドメインのタンパク質構造におけるループの蝶様の形のため、ウィングドヘリックスとしても知られる。それぞれHnf3α、βおよびγとして知られるFOXA1、FOXA2およびFOXA3はＤＮＡ結合タンパク質のフォークヘッ
ド類のメンバーである。それらはアルブミンおよびトランスチレチンのような肝特異的転写産物の転写活性因子であり、クロマチンと相互作用するものでもある。
【００２４】
ここで用いられるように、特定の転写因子ポリペプチド（例えばHnfポリペプチドやFoxaポリペプチド）とは、特定の転写因子ファミリー（例えば上記ファミリーの一つ）のメ
ンバーを指し、相応の上記転写因子、それらのホモログ、それらの配列を有するポリペプチド、およびそれらの転写因子の機能を実質的に保留した変異体型を含む。
ここに記載されるように、非肝臓細胞（例えば成体線維芽細胞）をｉＨｅｐ細胞に転換するためには、上記転写因子ファミリーまたはサブファミリーのうちの二つや三つのメンバーの強制発現は十分である。よって、本発明によれば、非肝臓細胞をｉＨｅｐ細胞に転換することにより、肝疾患のモデリングおよび解明、薬物の効果と毒性に対する試験、および細胞補充療法に用いられる細胞源を無限に供給することができる物質を提供する。
前記因子のポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸はいずれも本発明の実施に用いることができる。大量のポリペプチド製品が用いられる場合、充分に精製または分離されたポリペプチドは好ましい。用語の「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換的に用いられて、重合体におけるアミノ酸残基の配列を意味する。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、２０種類の標準天然アミノ酸に加えて、希アミノ酸および合成アミノ酸類似物から構成される。それらは鎖長や翻訳後修飾（例えばグリコシル化やリン酸化）を問わず、任意のアミノ酸鎖であってもよい。
本発明にかかるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えまたは合成により製造した前記転写因子のいずれかの融合体またはキメラ体を含み、該転写因子のＤＮＡ部位と結合する特定のドメインや部分を有し、且つ該転写因子の目的遺伝子の発現を調節する。当該用語は、（原核細胞における発現のための）Ｎ末端メチオニンが付加したポリペプチドも含む。
【００２５】
本発明は一種または多種の前記配列および異種配列を含有する融合タンパク質を含む。「キメラ」または「融合」とは、異種由来のアミノ酸配列を、それらのコーディングヌクレオチド配列のインフレーム結合により一つのポリペプチド鎖に組み合わせることを指す
。当該用語は内部融合、即ち異種由来の配列をポリペプチド鎖に挿入すること、並びにその一つの末端に融合することを明示的に含む。異種ポリペプチド、核酸または遺伝子は、外来種から由来するもの、或いは同種から由来する場合、その元々の形態を実質的に修飾したものである。二つの融合したドメインまたは配列は、それらが天然タンパク質または核酸において互いに隣接しない限り、互いに異種となる。
用語の「異種」は相対的な用語で、核酸の部分に対して用いられる場合、当該核酸は自然で互いに同種の関係に属しない二種以上の部分配列を含む、ということを指す。一例を挙げると、組換えにより製造した核酸は典型的に、新規な機能性核酸を作るように合成で整えた無関係の遺伝子から由来する二種以上の配列、例えば一つの源から由来するプロモーターと、もう一つの源から由来するコード領域と、を有する。これで、本文において、この二種の核酸は互いに異種となる。細胞に添加した場合、当該組換え核酸は、当該細胞の内因性遺伝子に対しても異種となる。したがって、染色体において、異種核酸とは、染色体に組み込まれた外来の（非天然の）核酸、または外来の（非天然の）染色体外核酸を含む。それに対し、染色体の天然転位部分は、当該突然変異細胞にとって自己由来の内因性核酸配列を含むので、本特許出願の本文において異種とみなされない。
【００２６】
「分離」または「精製」ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質とは、それらと自然に伴う他のタンパク質、脂質および核酸から分離されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。前記ポリペプチド／タンパク質は、精製製品の乾燥重量の少なくとも１０％（即ち１０％〜１００％の間のいずれかの百分率、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および９９％）を構成する。純度は任意の適切な標準方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ解析により測定することができる。本発明に記載の分離ポリペプチド／タンパク質は、天然源から精製することもでき、ＤＮＡ組換え技術または化学的方法により製造することもできる。
「組換え」ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質とは、ＤＮＡ組換え技術により製造される、即ち所要のペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構築物で形質転換された細胞から製造されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。「合成」ペプチド／ポリペプチド／タンパク質とは、化学的合成により製造されるペプチド／ポリペプチド／タンパク質を指す。用語の「組換え」は、例えば細胞、核酸、タンパク質またはベクターに対して用いられる場合、当該細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸またはタンパク質の導入、或いは自己由来の核酸またはタンパク質の改変により修飾されたこと、もしくは当該細胞がこのように修飾された細胞から由来するものであることを示す。
「過剰発現」とは、ホスト細胞に導入されたＤＮＡでコードされるＲＮＡまたはポリペプチドまたはタンパク質の発現について、当該ＲＮＡまたはポリペプチドまたはタンパク質が通常ホスト細胞に存在しないこと、或いは当該ＲＮＡまたはポリペプチドまたはタンパク質が前記ホスト細胞において、当該ＲＮＡまたはポリペプチドまたはタンパク質をコードする内因性遺伝子から正常に発現するものよりも高いレベルで存在することを指す。因子の過剰発現または強制発現は、核酸トランスフェクション、ウイルス感染およびタンパク質形質導入を含む本分野で公知の多種の技術を用いて行うことができるが、それらに限定されるものではない。
【００２７】
前記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質のいずれかのアミノ酸組成物は、それらの因子としての機能、例えばＤＮＡ部位に結合して相応の目的遺伝子の発現を促進または抑制する能力を損しない範囲内で変更することができる。例えば、１個または複数個の保存アミノ酸の置換を含むことができる。「保存アミノ酸の置換」とは、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置換することを指す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは本分野で確定されている。それらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシ
ン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、前記因子（例えばSEQ ID NOs：１〜１３）の一つにおいて非必須アミノ酸残基と予測されるものは、同一の側鎖ファミリーにある他のアミノ酸残基で置換されることが好ましい。また、突然変異は、飽和変異法のような方法により前記配列の全体または一部に無作為に導入することができ、得られる突然変異体は、相応のＤＮＡ部位に結合して相応の細胞応答を引き起こす能力に基づいてスクリーニングし、下記実施例に記載の活性を保留した突然変異体を同定することができる。
本発明にかかるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の機能的等価物とは、当該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のポリペプチド誘導体、例えば一つまたは複数の点突然変異、挿入、欠失、切断を有するタンパク質、融合タンパク質またはそれらの組み合わせを指す。一つの前記因子の機能は実質的に保留される。本発明にかかる分離ポリペプチドは、SEQ ID NOs：１〜１３の一つ、その機能的等価物または断片を含有する。通常、前記機能的等価物は、SEQ ID NOs：１〜１３の一つと少なくとも７５％（例えば７５％〜１００％の間のいずれかの数値、例えば７５％、８０％、８５％、９０％、９５％および９９％を含む）同一である。
【００２８】
本発明にかかるポリペプチドは、タンパク質形質導入により対象細胞に導入することができる。前記ポリペプチドは組換えポリペプチドとして得られることができる。一例を挙げると、組換えポリペプチドを製造するために、それをコードする核酸を、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、6x-HisエピトープタグまたはM13 Gene 3タンパク質のような融合パートナーをコードする他の核酸と接続することができる。得られる融合核酸は適切なホスト細胞において、本分野で公知の方法により分離可能な融合タンパク質を発現する。分離した融合タンパク質は、例えば酵素消化によりさらに処理し、融合パートナーを除去し、本発明にかかる組換えポリペプチドを得ることができる。また、本発明にかかるペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、化学的合成することができる（例えばCreighton, “Proteins： Structures and Molecular Principles,” W.H. Freeman & Co., NY, 1983を参照）。追加ガイダンスとして、当業者はAusubelら（Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed. 1987 & 1995）、Sambrookら（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）、およびchemical synthesis Gait, M.J. Ed. （Oligoヌクレオチド Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984）を参考してもよい。
前記ポリペプチドは転写因子として機能するので、例えば結合や融合により、核移行シグナル（ＮＬＳ）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列およびそれらの類似物を含む一種または多種のアミノ酸配列と接続することができる。この場合、本発明にかかる下記組成物は輸送増強剤を含んでもよい。一例を挙げると、転写因子または関連する治療用ポリペプチドを細胞に輸送する及び／又は細胞膜を透過させて細胞核に入らせるために、前記組成物はＭＳＭのような透過増強剤を含んでもよい。そして、当該転写因子は目的遺伝子の転写を調節する機能を果たすことにより、ｉＨｅｐ細胞の誘導を実現する。当該転写因子はそのまま、またはＮＬＳ、ＣＰＰ及び／又は他のドメインとの融合体として輸送してもよい。例えばTachikawaら PNAS （2004） vol. 101, no. 42：15225-15230, US 20090156503を参照する。
通常、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は３０個未満のアミノ酸からなり、正味の正電荷を持つ。ＣＰＰｓはインビトロとインビボで、エンドサイトーシスまたは受容体／エネルギー非依存的の方式により生存動物細胞に内在化する。完全にタンパク質由来のＣＰＰｓからキメラＣＰＰｓ、ひいては完全に合成するＣＰＰｓまで、各種の由来の複数の種類のＣＰＰｓがある。ＣＰＰｓの例は本分野で公知である。例えばU.S.出願番号20090099066
と20100279918を参照する。ＣＰＰｓが外因性タンパク質を各種の細胞に輸送できること
はよく知られる。
【００２９】
細胞に輸送する前記因子はＮＬＳ及び／又はＣＰＰを含む融合タンパク質であってもよいが、場合によって、ＮＬＳ及び／又はＣＰＰを透過増強剤として含まないタンパク質は、生物活性物質を必要により直接に細胞に、及び／又は細胞膜を透過して細胞質に、及び／又は細胞核に輸送する機能を発揮することができる。例えば、他の分子と結合または融合していない生物活性タンパク質を細胞に輸送する必要がある場合はある。この場合、生物活性タンパク質はいずれも直接に前記透過増強剤と伴って輸送することができる。
全ての天然形態、遺伝子工学形態および化学的合成形態の前記転写因子または他の因子は、ここに記載の発明の実施に用いることができる。ＤＮＡ組換え技術で得られるポリペプチドは、天然型（例えばSEQ ID NOs：１〜１３の一つ）と同様なアミノ酸配列を有してもよく、或いはそれらの機能的等価物であってもよい。それらは化学的修飾型も含む。化学的修飾ポリペプチドの例として、配座変化、側鎖の付加または消去が発生したポリペプチド、およびポリエチレングリコールのような化合物が結合したポリペプチドが挙げられる。標準方法または下記実施例に記載の方法或いは本分野で公知の他の方法により一旦精製および試験を行った後、前記ポリペプチドを適切な組成物に含有させてもよい。
前記因子を発現させるために、本発明は前記ポリペプチドのいずれかをコードする核酸を提供する。ヌクレオチド配列を分離及び／又は精製することが好ましい。核酸とは、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、それらに限定されない）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ、それに限定されない）、或いはＤＮＡまたはＲＮＡ類似物を指す。ＤＮＡまたはＲＮＡ類似物はヌクレオチド類似物から合成することができる。核酸分子は一本鎖または二本鎖であってもよい。「分離核酸」は任意の天然核酸または任意の天然ゲノム核酸の断片の構造と異なる構造の核酸である。よって、当該用語は、例えば（ａ）天然ゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、この天然ゲノムＤＮＡ分子が天然に存在する生物体のゲノムの分子の当該部分と隣接する二本のコード配列とは同時に隣接していないＤＮＡ；（ｂ）得られる分子がいずれの天然ベクターまたはゲノムＤＮＡとも同様にならないように、ベクター或いは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で製造した断片、または制限断片のような単独の分子；および（ｄ）雑種遺伝子、即ち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列；に当てはまる。
【００３０】
本発明はここに記載のヌクレオチド配列の一種または多種を有する組換え構築物も提供する。前記構築物の例として、本発明にかかる核酸配列がフォワードまたはリバース方向で挿入されたプラスミドやウイルスベクターのようなベクターが挙げられる。一つの好ましい実施形態において、前記構築物はさらに、前記配列と作動可能に連結するプロモーターのような制御配列を含有する。大量の適切なベクターおよびプロモーターは当業者にとって公知のもので、且つ市販されている。原核および真核ホストにおける使用に適切なクローニングおよび発現ベクターはSambrookら（2001, Molecular Cloning： A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press）にも記載されている。
発現ベクターの例として、例えばシミアン-ウイルス４０（SV40）のような染色体、非
染色体および合成ＤＮＡ配列、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから由来のベクター、およびワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスと仮性狂犬病のようなウイルスＤＮＡが挙げられる。しかしながら、ホストにおいて複製・生存することが可能である限り、他のベクターはいずれも使用できる。適切な核酸配列は多種の方法によりベクターに挿入することができる。通常、前記ポリペプチドの一種をコードする核酸配列は、本分野で公知の方法により適切な制限酵素部位に挿入することができる。このような方法および関連するサブクローニング方法は当業者によく知られる。
前記発現ベクターにおける核酸配列は、ｍＲＮＡ合成を発生させるように、適切な転写制御配列（プロモーター）と作動可能に連結することが好ましい。このようなプロモータ
ーの例として、以下のものが挙げられる：レトロウイルスの長い末端反復（LTR）またはSV40プロモーター、E. coli lacまたはtrpプロモーター、ファージlambda PLプロモーター、および原核または真核細胞もしくはウイルスにおける遺伝子の発現を制御するものとして知られる他のプロモーター。前記発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有してもよい。前記ベクターは発現を増加させるための適切な配列を含んでもよい。さらに、前記発現ベクターは、 形質転換されたホスト細胞
の選択用の形質を提供するように、真核細胞培養の場合はジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、E. coliの場合はテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性のよう
な選択マーカー遺伝子の一種または多種を含有することが好ましい。
【００３１】
前記適切な核酸配列および適切なプロモーターや制御配列を含有するベクターは、適切なホストを形質転換し、トランスフェクトまたは感染させて、当該ホストに前記ポリペプチド（例えばSEQ ID NOs：１〜１３の一つ）を発現させるために用いることができる。適切な発現ホストの例として、細菌細胞（例えばE. coli、ストレプトマイセス、ネズミチ
フス菌）、真菌細胞（酵母）、昆虫細胞（例えばショウジョウバエおよびヨトウガ（Sf9
））、動物細胞（例えばＣＨＯ、ＣＯＳおよびＨＥＫ  ２９３）、アデノウイルス、および植物細胞が挙げられる。適切なホストの選択は当業者によく知られる。ある実施形態において、本発明は、前記ポリペプチドの一種をコードするヌクレオチド配列を有する発現ベクターで、ホスト細胞をトランスフェクトすることにより、前記ポリペプチドを製造する方法を提供する。そして、前記ホスト細胞は適切な条件下で培養することで、前記ポリペプチドを発現する。
以上で説明したように、本発明にかかる核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。用語の「ＲＮＡ」、「ＲＮＡ分子」および「リボ核酸分子」は互換的に用いられて、リボヌクレオチドの重合体を指す。用語の「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」または「デオキシリボ核酸分子」とは、デオキシリボヌクレオチドの重合体を指す。ＤＮＡおよびＲＮＡは天然に（例えばそれぞれＤＮＡ複製またはＤＮＡの転写により）合成することができる。ＲＮＡは転写後修飾されてもよい。ＤＮＡおよびＲＮＡは化学的に合成することもできる。ＤＮＡおよびＲＮＡは一本鎖（即ちそれぞれｓｓＲＮＡおよびｓｓＤＮＡ）であっても、または多本鎖（例えば二本鎖、即ちそれぞれｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）であってもよい。
【００３２】
（開始細胞）
ここに記載されるように、本発明は非肝臓細胞（即ち開始細胞）からｉＨｅｐ細胞を生産する方法を提供する。一つの例において、前記方法は、前記異種転写因子またはそれらをコードする核酸を開始細胞に導入することで、前記開始細胞に前記転写因子を過剰発現させることを含む。例えば図１Ａを参照する。そして、修飾された開始細胞は所定の期間、例えば１０〜１４日間で培養し、ｉＨｅｐ細胞を生産する。
個体または動物由来の多種の細胞は前記開始細胞として用いることができる。一例として、体細胞は前記開始細胞として用いることができる。ここで用いられるように、用語の「体細胞」とは、生殖細胞、着床前胚に存在するまたはそれから得られる細胞、またはそれらの細胞のインビトロ増殖から得られる細胞を除いた任意の細胞を指す。言い換えれば、体細胞とは、生殖系列細胞と反対に、生物体の身体を構成する任意の細胞を指す。哺乳動物において、生殖系列細胞（「配偶子」ともいう）は精子と卵子であって、受精過程において融合して接合子という細胞を製造するものであり、哺乳類胚全体が当該接合子から発生する。哺乳類身体における（精子と卵子、それらから製造した細胞（生殖母細胞）、および未分化の多能性胚性幹細胞以外の）他の細胞型はいずれも体細胞であり：内臓、皮膚、骨格、血液および結合組織はいずれも体細胞から構成される。ある実施形態において、前記体細胞は「非胚性体細胞」、即ち、胚に存在するまたはそれから得られるものではなく、且つそれらの細胞のインビトロ増殖から得られるものではない体細胞である。ある実施形態において、前記体細胞は「成体体細胞」、即ち、細胞胚や胎児以外の生物体に存
在するまたはそれから得られるもの、或いはそれらの細胞のインビトロ増殖から得られるものである。特に断らない限り、ここに記載の体細胞をリプログラミングするための組成物と方法は、インビボでもインビトロでも実施することができる（体細胞が個体に存在する場合はインビボで実施し、培地で維持される分離体細胞を用いる場合はインビトロで実施する）。当該用語は配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、受精卵または胞胚期の前の発生段階にある胚を含まない。
【００３３】
ある実施形態において、前記開始細胞は幹細胞である。ここに記載の方法に有用な幹細胞として、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来幹細胞、造血幹細胞、軟骨前駆細胞、上皮幹細胞、消化管幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、膵臓前駆細胞、毛包幹細胞、内皮前駆細胞および平滑筋前駆細胞が挙げられるが、それらに限定されるものではない。前記幹細胞は多能性または複能性であってもよい。ある実施形態において、前記幹細胞は成体、胎児または胚性肝細胞である。前記幹細胞はへそ、胎盤、羊水、絨毛膜絨毛、胚盤胞、骨髄、脂肪組織、脳、末梢血、血管、骨格筋および皮膚から分離することができる。
ある実施形態において、前記開始細胞は分化細胞である。その例として、線維芽細胞、上皮細胞、血液細胞、神経細胞、胚細胞、或いは個体の組織または器官から由来する細胞が挙げられる。それらの分化細胞と幹細胞の相違点は、分化細胞は通常に自己複製増殖を行わないのに対し、幹細胞は自己複製細胞分裂を行うことができ、無期限に表現型上および遺伝子上で同一の娘細胞を生み出し、無限に少なくとも一種の最終細胞型に分化することができる。
【００３４】
用語の「分化細胞」は、ここで定義されるように、その天然型が多能性を有しない任意の体細胞を含む。したがって、用語の「分化細胞」は、複能性細胞、或いは安定で非多能性の部分リプログラミング細胞、或いはここに記載のいずれかの組成物や方法を用いて生産した部分分化細胞のような部分分化細胞も含む。ある実施形態において、分化細胞は、非多能性の部分リプログラミング細胞のような安定な中間細胞である。大量の初代培養細胞を培地に置くことは、完全分化特性の部分喪失を引き起こすことができるので、注意すべきである。したがって、このような分化細胞または体細胞の簡易培養では、それらの細胞を非分化細胞（例えば未分化細胞）または多能性細胞に転換することがない。（安定で非多能性の部分リプログラミング細胞中間体を含む）分化細胞から多能性への移行には、培地に置かれる場合の分化特性の部分喪失を引き起こす刺激よりも強いリプログラミング刺激が必要である。リプログラミング細胞と、ある実施形態における部分リプログラミング細胞は、成長性を喪失することなく継代延長を行うことができるという特性も持っているのに対し、親細胞は比較的に低い成長性を有し、培地においては通常有限な分裂能力しか持っていない。ある実施形態において、用語の「分化細胞」とは、比較的に低く特殊化した細胞型（即ち増加した発生能）の細胞から（例えば未分化細胞またはリプログラミング細胞から）、細胞分化過程を経って由来する、比較的に高く特殊化した細胞型（即ち低下した発生能）の細胞も指す。
【００３５】
ここに互換的に用いられるように、用語の「増殖」および「増幅」とは、同じ型の細胞の分裂による数の増加を指す。用語の「分化」とは、細胞が特定の機能へ特殊化する発生過程、例えば細胞が元々の細胞型と異なる形態的特性及び／又は機能を一種または多種を取得することを指す。当該用語は、系列決定および終末分化過程を含む。分化は、例えば系列マーカーの存在または非存在を観察することで、当業者に公知の免疫組織化学または他の方法を用いて評価することができる。前駆細胞由来の分化子孫細胞は、幹細胞の源組織と同一の胚葉または組織に関連してもよいが、必ずしもそうではない。例えば、神経前駆細胞と筋前駆細胞は造血細胞に分化することができる。
分化細胞をｉＨｅｐ細胞へ転換させるために、分化細胞を増殖するようにリプログラミングする必要がある。これは、誘導多能性幹細胞のリプログラミングを阻害する細胞老化
経路の一種または多種のコンポーネント、例えばＲｂファミリー遺伝子の一種または多種を不活性化または抑制的調節することにより、SV 40 large T抗原のような細胞増殖を促
進するタンパク質を強制発現させる、ということで実現できる。
この目的のために、多種の手段が適用できる。一つの実施形態において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術またはアンチセンス技術を適用することができる。例えば、細胞老化経路のコンポーネントをコードする一種または多種の遺伝子を標的とする低分子干渉ＲＮＡをコードする核酸配列（例えばＲＮＡｉ物質）を調製し、その発現または活性を抑制することができる。
【００３６】
用語の「ＲＮＡｉ物質」とは、ＲＮＡ干渉を発生させるように、標的ＲＮＡと充分な配列相補性を持つＲＮＡまたはその類似物を指す。その例としても、ＲＮＡの製造に有用なＤＮＡが挙げられる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、標的分子（例えば標的遺伝子、タンパク質またはＲＮＡ）を抑制的調節する配列特異的なまたは配列選択的な過程を指す。一般的に、干渉ＲＮＡ（「ｉＲＮＡ」）は、特定のｍＲＮＡｓの接触分解を引き起こす二本鎖短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または一本鎖マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり、遺伝子発現の低減または抑制にも有用である。
用語の「短干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」（「低分子干渉ＲＮＡｓ」ともいう）とは、ＲＮＡ干渉を誘起または仲介させることができ、長さが約１０〜５０個のヌクレオチド、好ましくは約１５〜２５個のヌクレオチドの範囲、より好ましくは約１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４または２５個のヌクレオチドであり、その鎖が例えば１，２または３個の張り出しヌクレオチド（またはヌクレオチド類似物）からなる張り出し末端を選択的に有するＲＮＡ物質、好ましくは二本鎖物質を指す。天然ｓｉＲＮＡｓは長いｄｓＲＮＡ分子（例えば長さが＞２５のヌクレオチド）から細胞のＲＮＡｉ機構（例えばダイサーまたはそのホモログ）により生産される。
用語の「ｓｈＲＮＡ」とは、相補性配列の第１領域と第２領域からなるステム・ループ構造を有するＲＮＡ物質であって、相補性の度合いおよび領域の方向は領域の間で発生する塩基対合にとって充分であり、第１領域と第２領域はループ領域を介して連結し、前記ループはループ領域におけるヌクレオチド（またはヌクレオチド類似物）の間での塩基対合の不足によって発生したものであるＲＮＡ物質を指す。
【００３７】
用語の「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」とは、長さが約１０〜５０個のヌクレオチド、好ましくは約１５〜２５個のヌクレオチドの範囲、より好ましくは約１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４または２５個のヌクレオチドであり、ＲＮＡ干渉を発生または仲介させることができるＲＮＡ物質、好ましくは一本鎖物質を指す。天然ｍｉＲＮＡｓはステム・ループ前駆体ＲＮＡｓ（即ちｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ）からダイサーにより生産される。用語のマイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）は、天然ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ（または「ｍｉＲＮＡｓ」）は時間的な方式で（例えば発生の過程で）の発現が見られるという事実に基づき、用語の「低分子時間的ＲＮＡ」（または「ｓｔＲＮＡ」）と互換的に用いられる。
したがって、本発明は（例えば細胞における）ＲＮＡ分子の分解を特徴とするＲＮＡｉの利用を含む。分解は酵素的なＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に触媒される。ＲＮＡ物質がＲＮＡｉの発生にとって充分な標的ＲＮＡ配列（例えば細胞老化経路における前記遺伝子の一種または多種）との相補性を有する配列を持つとは、当該ＲＮＡ物質は標的ＲＮＡ配列と少なくとも５０％の相同性（例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性）を有し、これにより、それらは互いに充分に相補して雑種を作り、そしてＲＮＡｉ機構（例えばＲＩＳＣ複合体）または過程により標的ＲＮＡの崩壊を誘発する、ということを意味する。「ＲＮＡｉの発生にとって充分な標的ＲＮＡ配列との相補性を有する配列」を持つＲＮＡ物質とは、当該ＲＮＡ物質がＲＮＡｉ機構または過程により標的ＲＮＡの翻訳の抑制を充分に誘発できる配列を持つことも意味する。ＲＮＡ物質は、標的ＤＮＡ配列の発現を染色体上で抑制する
ように、標的ＤＮＡ配列でコードされる標的ＲＮＡと充分な相補性を有する配列を持つこともできる。言い換えれば、前記ＲＮＡ物質は、転写遺伝子サイレンシングを充分に誘導する、例えば標的ＤＮＡ配列にまたはその近傍にクロマチン構造変化を誘導するようなことにより標的ＤＮＡ配列にまたはその近傍に遺伝子発現を充分に低下させる、ような配列を持つ。
【００３８】
前記ポリヌクレオチドは、本分野で公知の高分子生分解性微粒子またはマイクロカプセル輸送装置を用いて、インビトロまたはインビボで細胞に輸送することができる。前記ポリヌクレオチドの取り込みを実現する他の方法は、標準方法で調製するリポソームを使用することである。前記ポリヌクレオチドは単独にそれらの輸送担体に含有させよもよく、または組織特異的抗体とともにそれらの輸送担体に含有させよもよい。また、静電気的または共有結合的な力によってポリ−Ｌ−リジンと接続するプラスミドまたは他のベクターからなる分子複合体は調製できる。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞における受容体と結合できるリガンドと結合する（Cristianoら, 1995, J. Mol. Med. 73：479）。また、組織
特異的ターゲッティングは、本分野で公知の組織特異的転写制御エレメントの使用により実現できる。裸ＤＮＡ（即ち輸送担体無し）の筋肉内、皮内または皮下の部位への輸送は、インビボでの発現を実現するための他の手段である
【００３９】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｓＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）分子は本分野で公知の方法で設計できる。あるＲＮＡのみを分解するために必要な配列特異性を充分に提供できる相同性を有するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｓＲＮＡ分子は、それらに限定されないが、AMBION, Inc.およびDHARMACON, Inc.のウェブサイトで維持される本分野で公知
のプログラムを用いて設計できる。ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｓＲＮＡ配列を最適化するために設計した複数の種の体系的テストは、当業者によって通常に実施することができる。短干渉核酸分子を設計する時の検討として、生物物理学的な検討、熱力学的な検討、構造上の検討、センス鎖における特定の部位の塩基選択性、および相同性が挙げられるが、それらに限定されるものではない。それらの検討は本分野で公知のものであり、且つ前記ＲＮＡ分子を設計するためのガイドラインが提供される。
本発明にかかるアンチセンスポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）は、任意のアンチセンスポリヌクレオチド誘導多能性幹細胞のリプログラミングを阻害し且つコンポーネントポリペプチドの発現を抑制できる細胞老化経路の、肝心なコンポーネントをコードするＤＮＡの配列と相補または一部相補する塩基配列を有する限り、任意のアンチセンスポリヌクレオチドであってもよい。前記塩基配列は前記ポリペプチドをコードするＤＮＡの相補配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％または９５％の相同性を有してもよい。それらのアンチセンスＤＮＡｓはＤＮＡ合成装置を用いて合成することができる。
【００４０】
本発明にかかるアンチセンスＤＮＡは、変更または修飾された糖質、塩基または結合を含有してもよい。前記アンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡｉ物質は、リポソーム、マイクロスフェアのような特定な形態で提供してもよく、或いは遺伝子療法に利用してもよく、或いは付着部分と組み合わせて提供してもよい。このような付着部分は、リン酸主鎖の荷電中和の役割を果たすポリリジンのようなポリカチオン、または細胞膜との相互作用を促進しもしくは核酸の取り込みを増加させる脂質（例えばリン脂質、コレステロールなど）のような疎水性部分を含んでもよい。付着する脂質の好ましい例はコレステロールまたはその誘導体（例えばクロロぎ酸コレステリル、コール酸など）である。それらの部分は核酸の３’または５’末端に付着してもよく、塩基、糖質または分子内ヌクレオシド結合を介して付着してもよい。他の部分は、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのようなヌクレアーゼによる分解を防止するための、核酸の３’または５’末端に特異的に位置するキャッピング基であってもよい。このようなキャッピング基として、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールのようなグリコールなどを含む本分野で公知のヒドロキシ保護基が挙げられるが、それらに限定されるものではない。前記アンチセンスＤＮＡの抑制
行為は、本発明にかかる細胞株または動物に基づく遺伝子発現システムを用いてインビボおよびインビトロで調査することができる。
前記ポリペプチドの一種または多種やＲＮＡｉ物質をコードする前記核酸は、インビトロまたはインビボで細胞輸送用ベクターにおいてクローンすることができる。インビボ用途の場合、前記輸送は特定の組織や器官（例えば肝臓）を標的とすることができる。標的化輸送は、全身投与後に特定の器官や組織を標的とするベクター（例えば器官ホーミングペプチド）の使用を含む。例えば、前記ベクターは、アビジンと肝特異的タンパク質に対するモノクロナール抗体の共有結合を有してもよい。
ある実施形態において、本発明は前記ｉＨｅｐ細胞をインビボで製造する方法を提供する。このような方法は、肝機能を促進する必要のあるヒトまたは非ヒト動物の細胞や組織に前記核酸配列を導入することで、その治療効果を達成する。前記核酸配列の輸送は、キメラウイルスまたはコロイド分散系のような組み換え発現ベクターを使用することで実現できる。前記核酸配列の治療輸送のために、標的化リポソームを使用することが好ましい。
【００４１】
ここに記載の遺伝子療法に利用できる多種のウイルスベクターとして、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、好ましくはレトロウイルスおよびレンチウイルスのようなＲＮＡウイルスが挙げられる。前記レトロウイルスベクターは、レンチウイルス或いはマウスまたはトリレトロウイルスの誘導体であることが好ましい。一つの外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例として、以下のものが挙げられるが、それらに限定されるものではない：モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（MuMTV）およびラウス肉腫ウイルス
（RSV）。大量の追加のレトロウイルスベクターに複数の遺伝子を組み込むことができる
。
組み換えレンチウイルスは、分裂や非分裂の哺乳動物細胞への遺伝子輸送に利点がある。HIV-1を基にしたレンチウイルスは、モロニー白血病ウイルス（MoMLV）を基にしたレトロウイルスシステムよりも広い範囲のホストを効率的に形質転換することができる。組み換えレンチウイルスの調製は、pLenti4／V5-DESTTM、pLenti6／V5-DESTTMまたはpLentiベクターをViraPowerTMと併用することで実現できる。
それらのベクターのいずれにも、形質転換細胞を同定および生産できるように、選択マーカーの遺伝子を導入または組み込むことができる。レトロウイルスベクターは、例えば糖質、糖脂質またはタンパク質を付着させることで、標的特異的にすることができる。好ましいターゲッティングは、標的において受容体を有する標的特異的抗体またはホルモンを用いることで至る。当業者に認識されているように、特定のポリヌクレオチド配列は、レトロウイルスゲノムに挿入し、またはウイルスエンベロープに付着することにより、レトロウイルスベクターの標的特異的輸送を実現することができる。
【００４２】
核酸輸送用の他の標的化システムはコロイド分散系である。コロイド分散系は、巨大分子複合体と、ナノカプセルと、マイクロスフェアと、ビーズと、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含有する脂質を基にしたシステムと、を含むものである。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームはインビトロおよびインビボで輸送担体として有用な人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび完全ビリオンは、水性内部にカプセル化し、生物学的活性形態で細胞に輸送することができる。リポソーム担体を用いる効率的な遺伝子導入方法は本分野で公知のものである。リポソームの組成は通常、リン脂質の組み合わせ、一般的にはステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質や他の脂質も用いてもよい。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
リポソームの製造に有用な脂質の例として、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドのようなホスファチジル化合物が挙げられる。代表
的なリン脂質として、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルグリセロホスホコリンが挙げられる。リポソームのターゲッティングは、本分野で公知のように、例えば器官特異性、細胞特異性および細胞小器官特異性によっても可能である。
インビボで使用する場合、可逆性輸送−発現システムを使用することが望ましい。そのため、Cre-loxPまたはFLP／FRTシステムおよび他の類似のシステムは一種または多種の前記核酸の可逆性輸送−発現システムとして適用することができる。WO2005／112620、WO2005／039643、U.S.出願20050130919、20030022375、20020022018、20030027335および20040216178を参照する。特に、US出願番号20100284990に記載の可逆性輸送−発現システムは、選択的または緊急な遮断を提供するために用いることができる。
【００４３】
（細胞転換）
開始細胞をｉＨｅｐ細胞へ転換させるために、開始細胞は細胞の成長を維持できる富栄養緩衝水溶液である培地において培養される。適切な培地として、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、DMEM／F-12, DMEM／F-15、Liebovitz L-15、RPMI 1640、
イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）およびOpti-MEM SFMが挙げられるが、それらに限定されるものではない。化学的に明確な培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）のような最小必須培地と、添加剤としてのヒト血清アルブミン、ヒトEx Cyteリポタンパク質
、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須および非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミンおよびマイトジェンとからなる。マイトジェンとは、細胞の細胞分裂を刺激する試薬を指す。試薬は、細胞に細胞分裂を始めさせ、有糸分裂を引き起こす化学品、一般的にはタンパク質のある形態であってもよい。一つの実施形態においては、WO96／39487に記載の無血清培地およびU.S.特許番号5486359に記載の「完全培地」である。一つの好ましい実施形態において、下記実施例に記載の培地を使用することができる。
開始細胞は培養および分化のために、付着性基板上に置かれる。通常、付着性基板は実質的に親水性の任意の基板であってもよい。付着性基板表面は表面塗布剤、例えば前記のような高分子表面または処理した高分子表面の塗布剤から形成される。一つの非制限的な例において、前記塗布剤は、例えばポリオルニチンまたはポリリジンのような適切なポリカチオンを含んでもよい。一例を挙げると、塗布剤は、一種または多種の細胞外マトリックス成分、例えばＥＣＭタンパク質のフィブリン、ラミニン、コラーゲン、好ましくはタイプIコラーゲン；グリコサミノグリカン、例えばヘパリン硫酸またはヘパラン硫酸、フ
ィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、アグリカン、アグリン、骨シアロタンパク質、軟骨基質タンパク質、フィブリノゲン、フィブリン、ムチン、エンタクチン、オステオポンチン、プラスミノゲン、リストリクチン（restrictin）、セルグリシン、SPARC／オステオネクチン、バーシカン、トロンボスポンジン１；或い
はカドヘリン、コネクシン、セレクチンを含む細胞接着分子；をそのまままたは多種の組み合わせとして含有してもよい。
【００４４】
一つの好ましい実施形態において、前記塗布剤はコラーゲン、例えばタイプIコラーゲ
ンを含有する。このような塗布剤は、コラーゲン、特にタイプIコラーゲンが肝細胞機能
、分化状態および肝臓遺伝子転写の維持に補助作用を示すため、分化プロトコルにおいて特に好ましい。
所定の期間で培養した後、培養細胞集団はｉＨｅｐ細胞を含む。前記培養細胞集団とは、前記のように得られる開始細胞集団の子孫、または前記細胞集団のごく一部の子孫を含むことは、理解すべきである。このような子孫は、非クローン系、即ち前記のように得られる開始細胞集団における複数の細胞または複数のコロニー由来の細胞の子孫を含有するものであってもよく；或いは、このような子孫は、クローン亜系、即ち前記開始細胞集団における単独の細胞または単独のコロニーから由来するものであってもよい。
また、前記培養細胞集団のサンプルを得て、そして肝細胞表現型を表示する一種または多種のマーカーを調査することにより、それらの状態を確認することができる。ここに記
載の方法により生産されるｉＨｅｐ細胞は、肝機能を表示する特徴的なマーカーを発現するはず。一例を挙げると、当該細胞は、炭水化物、タンパク質および脂質の代謝に関連する酵素および他のポリペプチドを発現すると予期される。一つの実施形態において、それらはグリコーゲン貯蔵、グルコース−６−ホスファターゼ活性、赤血球の分解、または血漿タンパク質合成に関連するポリペプチドを発現する。他の実施形態において、本発明にかかる細胞は尿素製造または胆汁の合成に関連するポリペプチドを発現する。さらに他の実施形態において、前記細胞は生体異物の解毒を担うシトクロムＰ４５０（CYP3A4）活性に関連するポリペプチドを発現する。また他の実施形態において、前記細胞は生理的解毒および尿素製造に機能を発揮するアルギナーゼＩを発現する。
本発明にかかる細胞における肝細胞表現型の発現は、ｍＲＮＡの解析により評価することができる。ある実施形態において、肝細胞様細胞において発現される肝心な酵素とタンパク質のｍＲＮＡｓは定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により評価される。また、ｉＨｅｐ細胞は、免疫検定（例えば免疫細胞化学検定またはウエスタンブロット）で肝細胞マーカー（例えば肝細胞において特徴的に発現するポリペプチド）の発現を解析、または特徴的な肝細胞代謝経路を解析することにより、肝細胞として特徴付けられる。有用なマーカーと経路の例は表２と３および下記実施例に記載される。
【００４５】
ｉＨｅｐ細胞の状態は、下記実施例に示されたように、それらの生物的機能を評価することでも確認できる。より具体的には、前記細胞はグリコーゲン果粒の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）機能的染色により、グリコーゲン貯蔵について（Thompson S W. in Selected Histochemical and Histopathological Methods, C. C. Tomas, Sprungfield, Ill., 1966； Sheehan D C. and Hrapchak, B B. in Theory and Practice of Histotechnology, 2nd Ed., Battelle memorial Institute, Columbus, Ohio, 1987））、比色測定により尿
素製造について（Miyoshiら, 1998, J Biomater Sci Polym Ed 9： 227-237）、フルオレセイン二酢酸微速度アッセイにより胆汁分泌について（Gebhartら, J. Cell Sci. 1982, 56233-244）、オイル赤Ｏ染色により脂質合成について、およびグリコーゲン合成につい
て（Passonneauら, 1974, Anal. Biochem. 60：405-415）評価することができる。
一旦肝細胞表現型が確認されたら、ｉＨｅｐ細胞はさらに下記実施例に記載の方法または本分野で公知の他の方法により精製または濃縮することができる。得られる精製または濃縮細胞集団は少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％のｉＨｅｐ細胞を含有する。当該細胞は下記の多種の用途に用いることができる。
【００４６】
下記実施例に記載されたように、機能的成熟のヒト肝細胞様細胞は線維芽細胞から直接に成功に生産された。当該結果は、ヒト細胞がリプログラミングに抵抗性を有し、且つ効率的なｈｉＨｅｐ誘導のための新規戦略を開発するように多重最適化が行われたことを示した。例えば、ｈｉＨｅｐ細胞はFOXA3、HNF1AおよびHNF4Aからなる因子セットによって
誘導された。興味深いことに、HNF4AはHNF1Aプロモーターを活性化し、且つHnf4aとFoxa1、2または3だけでは、マウスｉＨｅｐ細胞を充分に誘導できる、ということが知られる。しかしながら、HNF1Aの追加発現はヒト線維芽細胞の転換にとって必要である。これは、
ヒトとマウスの肝臓細胞における転写因子はいずれも肝臓遺伝子発現にとって必要であるが、それらの結合部位および調節は異なっている、という事実で一部解釈できる。
C／EBPβおよびGATA4の除去が肝臓遺伝子発現を促進することも見出された。ｈｉＨｅ
ｐ細胞の誘導過程において、外因性転写因子は細胞同一性の動的変化を引き起こす。当該過程は成熟肝細胞または肝臓発生における静的細胞同一性と異なる。肝臓への転換過程において、転写因子の特定の組み合わせは肝細胞と全く異なる調節ネットワークを形成するそうである。よって、肝臓への転換におけるC／EBPβおよびGATA4の役割は、ｈｉＨｅｐ
誘導用因子の特定に組み合わせによるものである可能性がある。
増殖停止は強制系列変換により生産する最終分化細胞の応用にとって主な障害である。一例を挙げると、従来、p19Arf不活性化はマウスｉＨｅｐ細胞を増幅させるために適用さ
れた（Huangら, （2011） Nature 475, 386-389.）。しかしながら、それはヒト細胞にとって充分ではない。これは、p53の不活性化だけでは、マウス線維芽細胞を不死化できる
が、ヒト細胞の増殖をインビトロで促進することにとって充分ではない、という両者の種の間の相違によるものみたいである。ここに記載されるように、ＬＴの発現がｈｉＨｅｐ細胞を増殖できるようにすることは見出された。ＡＬＢおよびＡＡＴ発現細胞の数は、それらの細胞の増殖過程における連続的な系列転換が原因であるかもしれないが、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞において増加した。
【００４７】
したがって、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞は、ｈｉＨｅｐ細胞の代謝性肝疾患および急性肝不全に対する治療効果を決定的に証明する機会を与える。さらに、Fah欠損マウスにおけるｈ
ｉＨｅｐ細胞の再増殖によれば、生物医学的研究用のヒト化動物モデルの開発のための新規戦略が与えられる。興味深いことに、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞は、マウスに移植後のｈｉＨｅｐＬＴ細胞における低いSV40 LTレベルにも一部的によるが、非腫瘍原性を示すそうで
ある。しかも、この知見は、SV40 LTだけでは哺乳動物細胞における腫瘍形成を充分に誘
導できないという従来の発見に一致している（Landら, Nature 304, 596-602）。ｈｉＨ
ｅｐ細胞におけるＬＴの発現は、インビトロ疾患モデリングおよび体外バイオ人工肝補助装置における応用のために考えられるものではないが（Carpentierら, （2009）, Gut 58, 1690-1702）、制御可能なＬＴ発現システムまたは他の安全なｈｉＨｅｐ細胞増幅手段
は、細胞補充療法のために開発すべきである。同様に、同様な理由で、Ｒｂファミリー遺伝子の不活性化も、制御可能な方式で行うべきである。
制御可能または誘導可能な遺伝子発現或いは抑制用の技術と方法は本分野で公知のものである。このような技術および方法の例として、誘導可能なプロモーターまたはエンハンサーを有する発現システム、Cre-LoxP、FLP／FRTに基づく制御可能なシステムなどが挙げられる。例えばWO2005／039643、WO2005／112620、US特許番号6576469、U.S.特許出願公
開番号200920080124379、20080241116、20080060099、20050130919、20030022375、20020022018および20040216178を参照する。遺伝子発現の制御可能または誘導可能な抑制また
は低減のために、前記ＲＮＡｉに基づくノックダウン技術が適用できる。CRISPR／Casシ
ステムに基づくシステムおよび方法も有用である。例えばWO 2013176772、Congら, （2012）, Science 339 （6121）： 819-823, Jinekら, （2012）, Science 337 （6096）： 816-821, Maliら, （2013）, Science 339 （6121）： 823-826, Gasiunasら, （2012）, Proc Natl Acad Sci U S A 109 （39）： E2579-E2586, およびChoら, （2013） Nature Biotechnology 31,230-232、Houら, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24；110（39
）：15644-9, Mojicaら, Microbiology. 2009 Mar；155（Pt 3）：733-40、およびhttp：／／www.addgene.org／CRISPR／を参照する。それらの参考文献の開示内容の全体を本明
細書に取り入れる。
【００４８】
（ｉＨｅｐ細胞の使用）
前記ｉＨｅｐ細胞、またはそれを含有する細胞集団、またはその子孫は、多種の用途に用いることができる。一つの例は、移植または植え込みにより、例えば肝代謝欠損、肝変性疾患または劇症肝不全、肝感染症などの疾患または肝代謝欠損を治療することである。他の例として、肝疾患および感染の機構を解明すること；細胞毒性化合物、発癌物質、突然変異原、成長／調節因子、医薬化合物などをインビトロでスクリーニングすること；物質（例えば新規または既知の薬物）の代謝、遺伝薬理学または毒性を評価すること；薬物及び／又は成長因子が採用する薬理学的機構を研究すること；患者における癌を診断および観察すること；遺伝子療法；および生物的活性製品の製造が挙げられる。さらなる例として、バイオ人工肝装置および肝補助装置の生産における使用が挙げられる。
ここで用いられる本発明にかかる細胞とは、一種または多種の前記異種転写因子が導入されたいずれかの開始細胞、並びにiHep細胞など、当該細胞の子孫およびその子孫を指す。ここで用いられる子孫は、親細胞、開始細胞または創始細胞から細胞分裂または他の細胞との細胞融合から由来する細胞を含む。
【００４９】
（肝疾患の治療）
本発明の一つの方面は、肝疾患または疾病を治療する方法を提供する。また、本発明はここに記載のｉＨｅｐ細胞（ヒトおよび非ヒト動物由来のｉＨｅｐ細胞を含む）またはその子孫の、このような肝疾患または疾病を治療するための薬品の製造における使用も提供する。
このような疾患は、肝臓組織に影響する障害、および肝細胞の生存性及び／又は機能に影響する疾病（例えば先天性欠損、疾患・疾病の効果、外傷の効果、毒性効果、ウイルス感染など）を含む。前記肝疾患または疾病の例として、遺伝性肝疾患（例えばアラジール症候群）、炭水化物代謝障害（例えばグリコーゲン貯蔵障害およびガラクトース血症、フルクトース血症）、アミノ酸代謝障害（例えばチロシン血症）、糖脂質および脂質代謝障害（例えばニーマン・ピック病、ハンター病、ハーラー病およびウォルマン病）、糖タンパク質代謝障害（例えばゴーシェ病）、金属貯蔵障害（例えばヘモクロマトーシスおよびウィルソン病）、ペルオキシソーム病（例えばツェルベルガー症候群およびミトコンドリア細胞症）；ビリルビン代謝の遺伝性障害（例えばクリグラー・ナジャール症候群、ジルベール症候群およびデュビン・ジョンソン症候群）、胆汁形成の遺伝性障害（例えば進行性家族性肝内胆汁うっ滞症）、胆汁酸生合成障害、タンパク質生合成とターゲッティング障害（α１−アンチトリプシン欠損症および嚢胞性線維症）、遺伝および環境要因の組み合わせに起因する急性肝不全が挙げられる。
前記治療方法は、このような治療が必要と判明した個体に、有効量のここに記載の細胞組成物または当該細胞組成物を治療するここに記載の組成物を投与することを含む。治療が必要な個体の判明は、個体または医療専門家の判断によってできるが、主観的でも（例えば見解）または客観的でも（例えば検査または診断方法によって測定可能）よい。それらの個体の「リスクあり」の決定は、診断検査或いは個体または医療供給者（例えば遺伝子検査、酵素またはタンパク質マーカー、家族歴など）の見解による客観的または主観的な決定手段によってもできる。ここに記載の組成物は、肝機能の低下に係わる可能性のある他のいずれかの障害の治療にも使用できる。
【００５０】
肝機能の復元に必要な細胞数は、完全にまたは一部的に、肝損傷の度合いおよびホストのサイズ、年齢と体重によって変化する。例えば、前記細胞は肝機能の復元に有効な量で投与される。有効量の決定は当業者の能力範囲内にある。有効な投与量は、肝機能の復元を検出するために設計した各種の異なるアッセイを用いて確定することができる。受容者の移植の進展は、肝機能検査として知られる血液検査を含むアッセイを用いて確定することができる。このような肝機能検査として、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノ基転移酵素、アスパラギン酸アミノ基転移酵素およびビリルビンのアッセイが挙げられる。さらに、受容者は、例えば黄疸、貧血症、白血球減少症、血小板減少症、心拍数増加および高レベルのインスリンのような肝疾患に通常関連する特徴の存在または消失について調査を受けることができる。さらにまた、超音波、コンピューター連動断層撮影（ＣＡＴ）および磁気共鳴（ＭＲ）のような画像検査は肝機能のアッセイに適用することができる。
ｉＨｅｐ細胞は、受容者ホストの肝臓に対する細胞の注射、肝病変部位または当該細胞が当該病変部位へ遷移できる部位における注射（例えば脾臓、門脈、肝パルプなどへの、例えば注射による投与）、または受容者ホストの肝臓に対する細胞の外科移植のような従来技術により投与することができる。例えばDhawanら, （2010）, Nature reviews Gastroenterology & hepatology7, 288-298を参照する。ある場合には、肝機能を復元するために、ｉＨｅｐ細胞を一回以上投与する必要がある。さらに、移植細胞を受け入れるように受容者の肝臓および血液を用意する及び／又は肝細胞の増殖を維持できる環境を作る目的で、G-CSFのような成長因子、またはホルモンおよびTGFβ1を移植前および後で受容者に
投与することができる。
【００５１】
「治療する」または「治療」とは、癒し、緩和し、和らげ、改善、発症を遅らせ、予防
しまたは好転させようとする障害、当該障害の症状、当該障害に続発する病状、または当該障害の傾向を有する個体に、化合物または試薬を投与することを指す。用語の「予防し」、「予防する」、「予防」、「予防処置」などとは、障害または疾病を有しないが、発症するリスクがあり、または発症しやすい個体における障害または疾病の発症の可能性を低減することを指す。
「個体」とは、ヒトおよび非ヒト動物を指す。一つの実施形態において、前記個体はヒトである。他の実施形態において、前記個体は非ヒト実験動物または疾患モデルとして適切な動物である。用語の「動物」は、ヒトを含む全ての脊椎動物を含む。胎芽期および胎児期を含む全ての発生段階にある単一の動物も含まれる。特に、用語の「脊椎動物」として、ヒト、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、イヌ類（例えば犬）、ネコ類（例えば猫）；ウマ類（例えば馬）、ウシ類（例えば牛）、ブタ類（例えば豚）、齧歯類（例えばマウスまたはラット）、モルモット、猫、ウサギ、並びに鳥のような鳥類、両生類、爬虫類などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。用語の「鳥類」とは、分類学での鳥綱のいずれかの種または亜種であり、ニワトリ（飼育鶏、ブロイラーおよび卵用鶏）、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、並びにオーストリッチ、エミューおよびヒクイドリのようなダチョウがあるが、それらに限定されるものではない。非ヒト動物の例は、全ての非ヒト脊椎動物、例えば非ヒト哺乳動物および前記非哺乳動物を含む。
前記細胞、方法、組成物および装置を個体（例えば肝不全の患者）の治療に用いる場合、個体または患者由来のｈｉＨｅｐ細胞は、個別化再生医療および疾患モデリングに有用な新規な機能性肝細胞を提示する。これはＨｅｐＧ２や他の肝細胞株では匹敵できない利点である。従来の研究では、ヒト誘導多能性肝細胞から肝細胞様細胞を成功に生産した（iPSCs, Jiら, （2012）, J Cell Biochem.）。ｉＰＳＣｓから肝細胞様細胞への誘導、または直接系列転換は、疾患モデリングおよび治療用途用の代用肝細胞を得るための二つの価値のある手段を提示する。
【００５２】
下記実施例の結果は、ｈｉＨｅｐ細胞が遺伝子発現、肝臓機能および治療効果の点でＰＨＨと顕著的に似ていることを示した；よって、ｈｉＨｅｐ細胞は、医薬的研究および細胞療法における代用肝細胞として使用する可能性がある。例えば、胆汁中排泄は、非分解性生体異物の解毒のための成熟肝細胞の大切な機能である（Panら, （2012）, J Pharm Sci 101, 1898-1908.）。ｈｉＨｅｐ細胞は重要な胆汁中排泄機能を持つので、それらの細胞は候補薬物の胆汁中排泄の評価に利用可能になる。
ｈｉＨｅｐ細胞の再増殖が約３０％のFah欠損マウスを救ったことは注意すべきである
。従来の研究によれば、初代マウス肝細胞の移植は通常、１００％近くの生存率をもたらすのに対し、ヒト初代肝細胞の移植後、通常３０％〜５０％の生存率が見られる、ということが示された（Heら, （2010）, Am J Pathol 177, 1311-1319.）。おもしろいことに
、再増殖効率に正規化された場合、ｈｉＨｅｐ移植マウスにおける血清アルブミンレベルはＰＨＨ移植マウスの１／２０〜１／３０しかなかった。よって、ｈｉＨｅｐ細胞または初代肝細胞がアルブミンの分泌を除き、他の治療効果ももつ可能性がある。
【００５３】
（バイオ人工肝臓）
当業者は、ヒト化動物モデルを生産するまたは肝障害または肝不全を有する患者に補助する装置を作るように、ｈｉＨｅｐを用いて良好な治療効果を得ることができる。例えば、カプセル化ｈｉＨｅｐ細胞は急性肝不全マウスを治療する能力を示すので、当該細胞は体外または植え込み可能なバイオ人工肝補助装置用の細胞源として用いることができる。例えばStrain （2002） Science 295 （5557）：1005-9； Carpentierら, （2009）, Gut
58, 1690-1702, Palakkanら, （2013）, Liver international ： official journal of
the International Association for the Study of the Liver 33, 666-676）を参照す
る。
バイオ人工肝臓は肝不全の患者を補助することに用いることができる。複数種のバイオ
人工肝臓は本分野で公知のものである。また、この装置の普通のタイプは、血漿分離器、再循環貯蔵器、ポンプ、木炭シリンダーフィルター、酸素付加装置／ヒーターおよびバイオリアクターを含む。血漿分離器は血液における血漿と細胞成分を分離する。細胞成分は貯蔵装置に残存し、後で血漿と再結合する。そして、血漿は、血漿の細菌を濾過し且つ肝細胞が扱わないことを行う木炭シリンダーフィルターにフィードスルーされる。そして、血漿は細胞含有バイオリアクターにフィードスルーされる。当該工程において、血漿と肝細胞は常に体温と酸素投与条件下で保管される。そして、新たに浄化した血漿は細胞成分と再結合し、患者に戻される。バイオ人工肝装置に用いられるバイオリアクターは各種のものであってもよい。最近のバイオリアクター装置は、中空糸、平板および単層、灌流床／スカフォールド、カプセルおよびサスペンションのいずれかである。例えばUS特許番号8486699およびUS出願番号20130344154, 20130095077, 20120111795, 20120009086, 20110195056, 20110125286, 20090311765, 20090291064および20050148073を参照する。
【００５４】
体外人工肝装置または植え込み可能な人工肝臓の開発における主なチャレンジは、肝細胞の平伏と維持および患者の安全である。見れば分かるように、時間、金および資源の制限のせいで、大量のヒト肝細胞を得ることは論理的に困難である。豚のような非ヒト動物由来の肝細胞はその代わりに使用できる。しかしながら、ウイルス感染のヒトへの伝染を可能にするせいで、このような代用には異論がある。さらに、バイオリアクターに用いられる材料および濾過工程は肝細胞の養育において入り交じった結果を示した。肝細胞は血漿と接触する場合、極大のストレスを受けているだけでなく、低濃度の酸素レベルにおいて元気ではないため、それらを得て且つそれらの生存を維持するには、いろいろな面倒を見なければならない。ここに記載のｈｉＨｅｐ細胞は、体外装置でも植え込み型装置でも、バイオ人工肝装置の需要に大量の供給源を提供する。
一つの例において、前記バイオ人工肝装置におけるバイオリアクターは、ｉＨｅｐ細胞を含有する貯蔵チャンバー、ポンプ組品、および前記チャンバーと流体的に連絡される入口と出口を含む。前記チャンバーは血液供給組品から供給される血液を収容することに適用できる。前記血液供給組品は、患者または他の特定の所望の位置に注入するために供給される血液を含んでもよい。供給される血液はバッグまたは他の血液容器から（例えば血漿分離器、再循環貯蔵器、ポンプ、木炭シリンダーフィルター、酸素付加装置／ヒーター）；心臓バイパスシステム、血液酸素付加装置、血液濾過組品、人工心臓などのような血液移送装置から；他の個体から；または患者から受け入れられる。
前記血液供給組品は入口を介して血液を貯蔵チャンバー供給する。前記貯蔵チャンバーは解毒のような肝機能を発揮するために、ｉＨｅｐ細胞をそれに収容する。前記貯蔵チャンバーおよびそれにおける細胞は受け入れた血液を処理する。そして、処理された血液は出口を介して患者の所望の位置に輸送するための輸送組品へ供給される。
前記装置および方法は肝障害または肝不全を有する患者を治療または補助するために用いることができる。体外循環のための血流特徴の決定に影響する要素は、患者に供給される血液の大量の臨床パラメータまたは変量の一種または多種、例えば患者のサイズ、供給される全循環の百分率、到達しようとする標的のサイズ、溶血、血液希釈、pO2、脈動性
、質量流量、体積流量、温度、ヘモグロビ濃度およびｐＨを含む。前記装置は、血管造影またはガイディングカテーテル、動脈鞘、及び／又は血管造影と他の介入性心臓血管処置用の装置とあわせて使用することができる。当該システムは一つまたは複数の血管開口に関連する用途、即ち対側性または同側性処置に用いることができる。
【００５５】
（組織工学）
本発明によれば、組織工学器官、またはその一部、またはその特定の切片、並びに本発明にかかるｉＨｅｐ細胞またはその子孫を有する組織工学装置も提供する。組織工学肝臓によれば、機能不全の肝臓の機能を補足または代替するため、分化ｉＨｅｐ細胞を三次元ポリマースカフォールドに移植するという新規な療法を提供できる。組織工学器官は、細胞の成長を維持するための、三次元形状を有する生分解性の生物適合性スカフォールドと
ともに使用できる。
ポリマー製の三次元ポリマー−細胞スカフォールドの構築および肝細胞様細胞はWO／2003／076564およびU.S.特許番号5624840および5759830により実施できる。組織工学肝臓は天然または人造材料製のマトリックスまたはカフォールドに組み立てられるｉＨｅｐ細胞によって製造できる。例えば、細胞は、U.S.特許出願20050249816に記載の脱細胞化肝臓
スカフォールドへの接種に使用できる。使用できる人造材料は通常生分解性ポリマー、例えば細胞がポリマー支持システムの上層にある三次元組織培養システムである（U.S.特許番号5863531を参照）。ポリマースカフォールドの組み立てに適切な材料として、アルギ
ン酸−ポリ（Ｌ）リジン−アルギン酸（ＡＰＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ−Ｄ−乳酸（ＰＤＬＡ）、ポリグリコリド、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリジオキサノン、ポリグリコナート、ポリ乳酸−ポリエチレンオキシド共重合体、変性セルロース、コラーゲン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシプロピオン酸、ポリリン酸エステル、ポリ（α-ヒドロキシ
酸）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、分解性ポリウレタン、脂肪族ポリエステル、ポリアクリレート, ポリメタクリレート、アシル置換アセチルセルロース、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリビニルイミダゾール、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、テフロンTM、ナイロンシリコン、並びにポリ（スチレンブロックブタジエン）、ポリノルボルネン、ヒドロゲル、金属合金、およびスイッチセグメントであるオリゴ（ｓ−カプロラクトン）ジオール／物理加硫したオリゴ（ｐ−ジオキサノン）ジオールのような形状記憶素材が挙げられる。他の適切なポリマーはThe Polymer Handbook, 3rd edition （Wiley, N.Y., 1989）を参照して得ることができる。このような組織工
学肝臓は患者に植え込んで肝機能を復元させることができる。
【００５６】
本発明によれば、本発明にかかる肝細胞様細胞の、例えば肝補助装置のようなバイオリアクターの一部としての使用も提供される。さらに、本発明にかかるｉＨｅｐ細胞またはその子孫は、肝灌流または肝補助装置のような解毒装置の生体成分として用いることができる。具体的には、本発明にかかる細胞は、体外肝補助装置、例えば肝不全や肝機能不全を引き起こす肝障害を有する個体用のバイオ人工肝臓、の構築に用いることができる。このようなバイオ人工肝臓の使用は、個体の血液を当該バイオ人工肝臓に灌流することを含む。血液灌流プロトコルにおいて、個体の血液は抽出され、ｉＨｅｐ細胞培養物と接触するように通過する。そんな過程において、患者の血液に溶解したビリルビンのような分子は取り上げられて、肝細胞培養物によって代謝される。さらに、肝細胞様細胞は通常肝組織によって供給される因子を提供する。
代表的な肝補助装置は、堅くてプラスチックの外部ケーシングと、本発明にかかるｉＨｅｐ細胞またはその子孫が接種された中空の半透性メンブレンフィルターとを含む。ファイバーは、細胞の接着のために、コラーゲン、レクチン、ラミニンまたはフィブロネクチンによって被覆されてもよい。個体由来の体液は、本分野で公知の手段により解毒用の装置に灌流し、その後個体に戻すことができる。
【００５７】
（薬物試験およびスクリーニング）
本発明にかかるｉＨｅｐ細胞またはその子孫は、薬物試験および開発過程用のツールとして用いることもできる。例えば、当該細胞は、開発しようとする薬物による遺伝子発現パターンの変化を評価するために用いることができる。候補薬物による遺伝子発現パターンの変化は、肝臓に影響することを既知するコントロール薬物による変化と比較できる。これで、開発過程において、動物を使用することなく、肝臓に効果のある化合物を早期にスクリーニングすることが可能になり、時間と費用を節約できる。ある実施形態において、本発明にかかるｉＨｅｐ細胞またはその子孫は、U.S.特許番号7282366に記載の方法の
ようなハイスループット薬物スクリーニングに用いることができる。
本発明にかかるｉＨｅｐ細胞またはその子孫は、各種の目的化合物または組成物、例えば化学的、医薬的、化粧料的、殺生物的または生物的化合物、食品添加物または組成物、或いは生物的試薬の毒性を評価することに用いることもできる。分化細胞は生物体の肝臓に存在する細胞型とより一層似ているので、このような毒性アッセイにおいて、前記分化細胞を使用することが好ましいかもしれない。例えば、もし特定の化合物または組成物は細胞の生存性または細胞の代謝や機能の一つまたは複数の方面において有害効果を示すと、毒性があるまたは毒性がある可能性が考えられる。インビトロでの細胞の生存性は、ＭＴＴ（またはＭＴＴ派生方法）アッセイまたはＬＤＨ放出アッセイのような比色分析法、或いは例えば生／死アッセイ、CyQuant細胞増殖アッセイのようなfluorescence-based assays、或いはアポトーシスのアッセイを含む、本分野で公知の技術を用いて測定することができる。他の有用なアッセイとして、細胞の代謝や機能の特定の方面を測定するものが挙げられる。例えばAzumaら, （2007）, Nat Biotechnol 25, 903-910； Gomez-Lechonら, （2004）, Current drug metabolism 5, 443-462；およびLazaroら, （2007）, Am J Pathol 170, 478-489を参照する。
【００５８】
（発癌性評価）
本分野でよく知られるように、多種の化合物は、細菌や真菌のような受試生物体では突然変異原として機能しないが、マウスのような実験動物では腫瘍を引き起こす。この現象の原因の一つは代謝活性化である；即ち、ある化合物は肝臓（Ｐ４５０オキシダーゼ系および水酸化系）または他の組織における酵素により代謝的改変され、変異原性および発癌性を共に有する新規化合物が作られる。このような発癌物質を同定するために、受試生物体を代謝生成物に暴露する前に、受試化合物を肝抽出物または肝組織とともにインキュベートすることを含むスクリーニングアッセイが採用されている（Amesら, 1975, Mut. Res. 31：347-364； U.S.特許番号7026137）。本発明にかかるｉＨｅｐ細胞またはその子孫
は、従来のアッセイに記載の肝抽出物または肝組織の代わりに使用することができる。
よって、本発明によれば、生物体の肝臓に存在する細胞型と似ている本発明にかかる細胞を用いて、受試化合物または物質の発癌性を評価する方法およびアッセイも提供する。それらの細胞は遺伝毒性的および非遺伝毒性的な（即ちエピジェネティックな）発癌性のアッセイに用いることができる。例えば、細胞を受試試薬と接触させ、その後細胞の腫瘍性形質転換または遺伝的安定性を調査することができる。もし細胞の腫瘍性形質転換が誘導され、または当該腫瘍性形質転換を予測できる細胞の表現型変化が誘導され、または当該腫瘍性形質転換を引き起こす可能性のある遺伝子変化や代謝変化が誘導されると、当該試薬は発癌性があるまたは発癌性があるらしいと考えられる。
細胞の表現型変化の例として、形態転換、増殖増加、脱分化、接着非依存性、単層細胞成長の接触阻害の消失、または特定のマーカータンパク質の発現が挙げられるが、それらに限定されるものではない。細胞の遺伝子変化は、ＤＮＡ損傷、例えば染色体再編のような染色体異常、染色体数の改変（異数性）または核型異常、例えば点突然変異、欠失または挿入のような遺伝子突然変異を含むが、それらに限定されるものではない。それらの遺伝子変化を引き起こす物質は通常、突然変異性または突然変異原といわれる。したがって、本発明により提供される細胞は、突然変異原のアッセイ、即ち変異原性のアッセイにとても有用である。
変異原性試験の目的で、本発明にかかる細胞は遺伝子改変できる。例えば、細胞は細胞の特定の増殖抑制剤に対する感受性を増強するポリペプチドをコードする導入遺伝子を含有してもよい。その結果、当該導入遺伝子の発現を停止させることによって発生するある細胞の遺伝子改変は、当該細胞を前記抑制から解放することができる。そして、当該細胞を採点する方法により変異原性を評価できる。
【００５９】
（他の用途）
本発明にかかる細胞はさらに他の各種の用途に使用することができる。例えば、それらは一種または多種のタンパク質を肝臓において発現させることに用いることができる。
一つの例は、血友病および他の血液凝固障害を有する個体に有用な血液凝固因子である。最近、血液凝固因子の製品の大部分は献血される血液から由来するもので、肝炎を伝染する不利と危険性がある。本文のように肝細胞様細胞からインビトロで血液凝固因子を製造することは、肝炎または他の血液由来疾患を伝染するリスクを大幅に低減する。凝固因子を製造するために、本発明にかかる細胞を適切な条件下で培養することができる。培養肝細胞様細胞がコンフルエントに達した後、培地上清は例えばU.S.特許番号4789733およ
びKaneら, J. Biol. Chem., 256：1002-1007, 1981に記載の本分野で公知の方法により、収集および精製することができる。
初代肝細胞は多方面にわたる特性と機能を有する。ｉＨｅｐ細胞を初代肝細胞の完全な再現のために使用するには、特定の目的のためにインビトロでｉＨｅｐ細胞を改善することができる。例えば、ここに記載のｉＨｅｐ細胞は多数のCyp遺伝子を発現し、且つCyp1a、Cyp3aおよびCyp2c活性を取得する。薬物輸送体遺伝子を発現し、且つCyp活性を向上さ
せるようにｉＨｅｐ細胞をさらに最適化することにより、薬物発見の初期段階用の初代肝細胞の代案を得ることができる。おもしろいことに、発明者の予備データによれば、ここに記載されるように、マウスＥＳＣ由来の肝細胞様細胞はｉＨｅｐ細胞に比べてより未熟であることが示される。それにもかかわらず、ｉＨｅｐ細胞と他の代用肝細胞様細胞との広い比較が必要となり、これにより、特定の肝機能が望ましい場合、どの肝細胞様細胞を選択するか決定できる。
【００６０】
（組成物）
本発明のさらなる方面において、本発明はヒトｉＨｅｐ細胞、またはヒトを含む他の種から由来するｉＨｅｐ細胞、ここに記載の方法を用いて得られるまたは直接に得られるもの、または前記のものを含有する細胞集団、またはそれらの子孫を含む医薬組成物に関する。
用語の「医薬組成物」とは、活性物質（例えばここに記載の細胞または転写因子）と、インビボまたはエクスビボでの診断または治療用途に特に適切な組成物を製造するための不活性または活性担体と、の組み合わせを指す。「薬学的に許容される担体」は個体に投与された後、望ましくない生理的効果を引き起こさない。医薬組成物における担体は、活性成分と相溶性があり且つそれを安定化させることができる（例えばｉＨｅｐ細胞の生存を維持する）ためにも、「許容させる」ものでなければならない。一種または多種の可溶化剤は、活性試薬の輸送のために薬学的担体として応用することができる。薬学的に許容される担体の例として、生体適合性溶媒、アジュバント、添加物及び剤形として有用な組成物を達成するための希釈剤が挙げられるが、それらに限定されるものではない。他の担体の例として、コロイダル二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロースおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。さらなる適切な薬学的担体および希釈剤、並びにそれらの用途の薬学的必須品は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに記載されてい
る。
【００６１】
（キット）
本発明はｉＨｅｐ細胞を生産するためのキットおよびシステムを含む。そのため、一種または多種の前記因子、核酸（例えば発現ベクター、dsRNAs）、またはここに記載の方法に用いられる他の物質／成分はキットの形で提供できる。このようなキットにおいて、適量の一種または多種の成分は一つまたは複数の容器において提供される。
前記方法を実施するための試薬を含有するキットは、以下の一種または多種を含んでもよい：HNFポリペプチドおよび前記HNFポリペプチドをコードする核酸からなる第１群から選ばれる第１物質；並びにFOXAポリペプチドおよび前記FOXAポリペプチドをコードする核酸からなる第２群から選ばれる第２物質。前記HNFポリペプチドはHNF4A、HNF1AまたはHNF1Bであってもよい。前記FOXAポリペプチドはFOXA1、FOXA2またはFOXA3であってもよい。
前記キットはさらに、追加のポリペプチド、前記追加のポリペプチドをコードする核酸、およびＲｂファミリー遺伝子の発現を低減する化合物（例えばsiRNAまたは関連のdsRNA）
からなる群から選ばれる追加の試薬を含んでもよい。前記追加のポリペプチドSV40 large
T抗原、C／EBPβ、GATA4、HHEX、KLF4およいPROX1からなる群から選ばれるものであってもよい。
前記キットは、細胞培養、核酸トランスフェクション、ウイルス感染およびタンパク質形質導入用の追加の材料も含有してもよい。前記キットは肝臓マーカーまたは機能を検出するための試薬を含んでもよい。
前記キットの成分は各種の形態で提供してもよい。例えば、成分（例えばポリペプチドおよび核酸）は水溶液に懸濁されてもよく、或いは冷凍−乾燥もしくは凍結乾燥した粉末、ペレットまたはビーズであってもよい。後者の場合、前記成分は元に戻したとき、使用するための成分の完全の混合物を形成する。
【００６２】
キットまたはシステムは、少なくとも一つのアッセイにとって充分な量でここに記載の成分の組み合わせを含有してもよく、且つさらに当該成分を使用するための具体的な取扱説明書を含んでもよい。ある応用において、一種または多種のキット成分は、個々の、典型的には使い捨ての、チューブまたは等量の容器において、確定しておいた一回の使用量で提供してもよい。キットで供給される成分の量は、製品の標的市場にもよるが、任意の適切な量であってもよい。細胞培養、核酸トランスフェクション、ウイルス感染およびタンパク質形質導入の一般的ガイドラインは、例えばJoseph Sambrook and David W. Russell, Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001；およびFrederick M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2003において示される。
本発明のキットは、任意の数で本発明の実施に有用な追加の試薬または物質を含んでもよい。このような物質として、以下のものが挙げられるが、それらに限定されるものではない：細胞を処理するための試薬（緩衝液を含む）、二価カチオンキレート剤、または不要のヌクレアーゼを抑制する他の試薬、およびキットの成分が正確に機能していることを確認するためのコントロール細胞。前記キットは任意の温度で提供してもよい。例えば、タンパク質成分またはその複合体を液状で含有するキットの保管のために、０℃未満、好ましくは−２０℃以下で提供および維持すること、或いは凍結の状態にあることが好ましい。
前記成分を供給する容器は、供給形態を保持できるいずれかの従来の容器、例えばマイクロチューブ、アンプール、瓶、または流体素子、カートリッジ、ラテラルフローのような積分検査装置、または他の類似の装置であってもよい。前記キットは、標識したまたは標識していない核酸プローブ、または関連標的の検出に有用な抗体を含んでもよい。ある実施形態において、前記キットはさらに、ここに記載のいずれかの方法における成分を使用するための取扱説明書を含んでもよい。このようなキットおよびシステム用の代表的なパッキン材料として、各種の形状（例えばバイアル、マイクロタイタープレートウェル、マイクロアレイなど）のキット成分を支持する固体マトリックス（例えばガラス、プラスチック、紙、箔、微粒子など）が挙げられる。
【００６３】
ここに記載されるように、数値の範囲の数が提供される。本文において特に断らない限り、当該範囲の上限値と下限値の間にある全ての数値は、下限値の単位の十分の一の単位で具体的に開示されたと理解される。明記した範囲内にあるいずれかの明記した数値またはその間にある数値、および当該明記した範囲内にあるいずれかの他の明記したまたはその間にある数値の間にある全ての狭い範囲は、本発明に含まれる。それらの狭い範囲の上限値および下限値は独立に当該範囲に含まれてもまたは外されてもよく、明記した範囲において具体的に外された上限値および下限値を除き、その上限値および下限値のいずれか一つが前記狭い範囲内に入り、或いはいずれも前記狭い範囲内に入っていないまたは入っている全ての範囲も、本発明に含まれる。明記した範囲が上限値および下限値の一つまたは二つを含む場合、それらの含まれる上限値および下限値の一つまたは二つを外した範囲も、本発明に含まれる。
用語の「約」とは通常、記載される数のプラスまたはマイナス１０％を指す。例えば、「約２０」は１８〜２２の範囲を示し、「約１」は０．９〜１．１を意味することができる。「約」の他の意味は例えば四捨五入のような文面から分かり、例えば「約１」は０．５〜１．４も意味することができる。
ここで用いられるように、成分のいずれかのセットに関して用いる場合、用語の「接触」およびその変形は、接触しようとする成分を同じ混合物に混合する（例えば同じ区画または溶液に添加する）任意の工程を含み、記載される成分が実際に物理的に接触する必要がない。記載される成分は任意の順番または任意の組み合わせ（または亜組み合わせ）で接触することができ、且つ一種または多種の記載される成分が、他の記載される成分の添加よりも前でもよいが、混合物から順番に除去される場合を含んでもよい。例えば、「ＡをＢおよびＣと接触させる」とは、下記場合のいずれかまたは全てを含む：（ｉ）ＡをＣと接触させ、次にＢを混合物に添加する；（ｉｉ）ＡおよびＢを混合物に混合する；Ｂを当該混合物から除去し、次にＣを当該混合物に添加する；並びに（ｉｉｉ）ＡをＢとＣの混合物に添加する。「反応混合物を鋳型に接触させる」とは、下記場合のいずれかまたは全てを含む：（ｉ）鋳型を反応混合物の第１成分と接触させ、混合物にする；次に反応混合物の他の成分を任意の順番または任意の組み合わせで当該混合物に添加する；並びに（ｉｉ）反応混合物を鋳型と混合する前に形成する。
【実施例１】
【００６４】
（材料および方法）
特に断らない限り、本実施例では、下記実施例２〜８に用いられる材料および方法を説明する。
（分子クローニングおよびレンチウイルスの製造）
候補遺伝子が担持された修飾pWPIプラスミドをパッケージングプラスミドpsPAX2（Addgene）およびエンベローププラスミドpMD2.G（Addgene）とともに２９３ＦＴ細胞に導入し、ウイルスを製造した。
候補遺伝子のｃＤＮＡｓおよびSV40 large Tを修飾pWPIプラスミドにクローニングした。pWPIはAddgeneから得られ、且つ前記記載により修飾された。ｓｈＲＮＡ発現のために
、ヒトp53 shRNA（GACTCCAGTGGTAATCTAC, SEQ ID NO： 14）、ヒトRB1 shRNA（CAGAGATCGTGTATTGAGATT, SEQ ID NO： 15）、ヒトp21 shRNA （CGCTCTACATCTTCTGCCTTA, SEQ ID NO： 16）をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドをpLKO.1プラスミドに挿入した。次に、
構築したプラスミドをパッケージングプラスミドpsPAX2（Addgene）およびエンベロープ
プラスミドpMD2.G（Addgene）とともに２９３ＦＴ細胞に導入した。４８時間インキュベ
ートした後、レンチウイルス含有培地を収集し、０．４５μｍフィルタを通過させた。
（培地）
肝細胞維持培地（ＨＭＭ）は、0.544mg／L ZnCl2（Sinopharm）、0.75mg／L ZnSO4・7H2O（Sinopharm）、0.2mg／L CuSO4・5H2O（Sinopharm）、0.025mg／L MnSO4（Sinopharm
）、2g／Lウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）、2g／Lガラクトース（Sigma-Aldrich）、0.1g／Lオルニチン、0.03g／Lプロリン、0.61g／Lニコチンアミド、1Xインスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（Sigma-Aldrich）、40 ng／ml TGFα（Peprotech）、40 ng／ml EGF（Peprotech）、10μMデキサメタゾン、および1％ウシ胎児血清（Sigma-Aldrich）が添加したDMEM／F12（Hyclone）であった。ｈｉＨｅｐ CYP450誘導培地（HIM）は、75％ IMDM（Hyclone）、25％ Ham’s F12（Hyclone）、0.5x N2補足物、0.5x レチノイン酸無しB27補足物、0.1％ウシ血清アルブミン、50μg／mlアスコルビン酸、0.45 mMモノチオグリセロール、10ng／ml bFGF、40ng／ml EGF（Peprotech）、40ng／ml TGFα（Peprotech）、100μMジブチリル環状AMP（Sigma-Aldrich）、10μMデキサメタ
ゾン、6μg／mlビタミンK1（Sigma-Aldrich）、20ng／mlオンコスタチンM（Peprotech）
、1％ウシ胎児血清、1x MEM非必須アミノ酸溶液（Gibco）からなった。ヒト線維芽細胞培地（HFM）は、10％ウシ胎児血清、0.1 mM β-メルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、1x MEM非必須アミノ酸溶液（Gibco）、および4ng／ml bFGF（Peprotech）が添加したDMEM
／F12（Hyclone）であった。
【００６５】
（細胞培養）
初代ヒト肝細胞を実験に用いる前に、ＨＭＭにおいて３７℃、5％ ＣＯ２で維持した。二つの個体から由来する凍結保存ヒト肝細胞はCelsis In Vitro Technologies （Blatimore, MD）により提供され、一つの個体から由来する凍結保存ヒト肝細胞はInvitrogen Gibco （Carlsbad, CA）により提供される。凍結肝細胞は、生体異物の代謝および細胞毒性
の評価を含む多種の肝臓機能アッセイに有用であると示された（Hengstlerら, 2000, Drug Metabolism Reviews 32, 81-118； Li, 2007, Chemico-Biological Interactions 168,
16-29.； Liら, 1999, Chemico-Biological Interactions 121, 117-123.）。実験の過
程において、それらの細胞はＣＹＰ活性（Hewittら, 2007, Drug Metabolism Reviews 39, 159-234； Monostoryら, 2005, FEBS letters 579, 229-235； Roymansら, 2004, Biochemical Pharmacology 67, 427-437）、胆汁中排泄（Hartmanら, （2010） Canadian Journal Of Physiology And Pharmacology 88, 682-691； Marionら, 2012, Toxicology and
Applied Pharmacology 261, 1-9）、およびアルブミン分泌（Takebeら, 2013, Nature 499, 481-484）の点で公開の初代ヒト肝細胞と同等の結果を示した。
ヒト胎児線維芽細胞（ＨＦＦ）およびヒト成体線維芽細胞（ＨＡＦ）をＨＦＭにおいて３７℃、5％ＣＯ２で培養した。二つのＨＦＦｓ（ＨＦＦ１およびＨＦＦ２）は、国際和
平婦幼保健院により収集されるヒト胎児の肢から由来した。ＨＡＦは、上海仁済病院において収集されるヒト皮膚生検検体から製造した。約１ｍｍ３の組織を皿に置き、培地で２週間維持した。組織片から遷移し出した線維芽細胞を再接種し、実験のために増幅した。国際和平婦幼保健院と上海仁済病院の倫理委員会はヒトサンプルの収集と使用を承認した。インフォームド・コンセントは全ての個体から得られた。
三次元培養物における胆管分化のために、1x104個の細胞を1.6mLの1mg／ml新鮮に調製し
た中和コラーゲンゲル溶液を含有する400 μlの5x DMEM／F12培地に再懸濁し、35-mm皿に流した。ゲルが固化した後、細胞を10％ FBS、1x ITS、20ng／mL HGFが添加した1.5 mL DMEM／F12で培養した。胆分枝管は３日目で記録された。
【００６６】
（ｈｉＨｅｐ誘導および細胞培養）
ヒト線維芽細胞をコラーゲンＩで被覆された皿に接種し、上記遺伝子を担持したレンチウイルスで感染させた。ＨＦＦおよびＨＡＦをヒト線維芽細胞培地（ＨＦＭ）で培養した。ＨＦＦ１およびＨＦＦ２はヒト胎児の肢から由来した。ＨＡＦはヒト皮膚生検検体から由来した。初代ヒト肝細胞はInvitrogen Gibco （Carlsbad, CA）またはCelsis In Vitro
Technologies （Baltimore, MD）から購入した。施設内倫理委員会はヒトサンプルの収
集と使用を承認した。
ある場合には、５〜９代目のＨＦＦおよびＨＡＦをｈｉＨｅｐの製造に使用した。ｈｉＨｅｐ細胞を生産するために、1.75〜2x105個のヒト線維芽細胞をコラーゲンＩで被覆さ
れた6cm皿に接種した。一日後、細胞を4μg／mlのポリブレンが添加した上記ウイルス（
それぞれMOI=1）で２４時間感染させ、次にＨＦＭに変更してさらに２４時間感染させた
。次に、培地をＨＭＭに変更した。
マウスｉＨｅｐ細胞の誘導に比べて、原ヒト線維芽細胞はＨＦＭにおいて二倍の時間で、ＨＦＦの場合は約２４時間、ＨＡＦの場合は４８〜６０時間で維持すべきである。初期継代のヒト線維芽細胞のみを使用すべきである。レンチウイルス感染の前に、ヒト線維芽細胞をマウスｉＨｅｐ誘導の二倍の密度で、即ち6 cm皿にあたり1.75x105〜2x105個の細
胞の密度で再播種すべきである。感染後２４時間、培地を新鮮ＨＦＭに変更し、次に、感染後４８時間、培地をＨＭＭに変更すべきである。低い細胞密度やレンチウイルスとヒト線維芽細胞の長時間のインキュベーションは、肝臓へ転換する効率を劇的に低減した（表４）。
【００６７】
（ＰＣＲ）
大部分の実験において、全ＲＮＡはTrizol（Invitrogen）により細胞から分離された。ＰＨＨの場合、ｍＲＮＡは播種後２４時間培養されたＰＨＨから抽出された。メーカーの取扱説明書に準じて、1μg ＲＮＡをM-MLV逆転写酵素（Promega）によりｃＤＮＡに逆転
写した。ＰＣＲはHiFi Taqポリメラーゼ（TransGen）により行われた。定量リアルタイムＰＣＲはSYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）によりABI StepOnePlusリアルタイムＰＣＲシス
テム（Applied Biosystems）で行われた。全てのｑ−ＰＣＲデータは少なくとも２回繰り返した。ＰＣＲ産物は適切な融解曲線およびアガロースゲル電気泳動により確認された。プライマー配列は下表２に示す。
【００６８】
表２ プライマー
【表２】
0006426627.tif 000003
【００６９】
（表２の続葉１）
0006426627.tif 000004
【００７０】
（表２の続葉２）
0006426627.tif 000005
【００７１】
（表２の続葉３）
0006426627.tif 000006
【００７２】
（表２の続葉４）
0006426627.tif 000007
【００７３】
（ヒトアルブミンおよびα−１−アンチトリプシンＥＬＩＳＡ）
ヒトアルブミンおよびα−１−アンチトリプシンの分泌を確認するために、４８時間培養した後、細胞培地上清を収集した。ＰＨＨを１２ウェルプレートに１２時間播種し、次に、上清の収集までＨＭＭにおいて４８時間維持した。移植実験のために、動物血清を収集した。メーカーの取扱説明書に準じて、ヒトアルブミンおよびα−１−アンチトリプシンのレベルをヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量セット（Bethyl Laboratory）およびヒトα
−１−アンチトリプシンＥＬＩＳＡキット（Bethyl Laboratory）により測定した。血清
は、標準曲線の線形範囲に入る数値が得られるように、１０−〜１００００−倍の範囲内
で希釈された。
（免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー解析）
免疫蛍光染色のために、細胞を4％パラホルムアルデヒドにより室温で１５分固定し、
次に0.2％ TRITON X-100（Sigma）を含有するＰＢＳで１５分インキュベートした。次に
、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。3％ ＢＳＡ含有ＰＢＳにより室温で６０分ブロッキングした後、細胞を一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次に適切な蛍光共役二次抗体とともに室温で闇に６０分インキュベートした。核をＤＡＰＩ（Sigma）により染色した。一次および二次抗体は3％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈された。
免疫蛍光染色に用いられる抗体は下記のものであった：ヤギ抗ヒトアルブミン（Bethyl
Laboratories, 1：100）、ヤギ抗マウスアルブミン（Bethyl Laboratories, 1：200）、ウサギ抗ＦＡＨ（AbboMax, San Jose, CA, 1：1500）、ウサギ抗ヒトα−１−アンチトリプシン（NeoMarkers, 1：200）、マウス抗ヒトＺＯ１（Invitrogen, 1：500）、Ｃｙ３共役ロバ抗ヤギＩｇＧ（Jackson Lab, 1：1000）、ＦＩＴＣ共役ロバ抗ウサギＩｇＧ（Jackson Lab, 1：1000）、Ｃｙ５共役ロバ抗ウサギ（Jackson Lab, 1：500）、Ｃｙ５共役ロ
バ抗マウス（Jackson Lab, 1：1000）。
フローサイトメトリー解析のために、細胞を収穫し、0.1％ ＢＳＡ含有ＨＢＳＳ溶液（Sigma-Aldrich）で２回洗浄し、次に0.1％ ＢＳＡ含有ＨＢＳＳ溶液で希釈された抗体と
ともに４℃で闇に３０分インキュベートした。ＡＬＢおよびＡＡＴのフローサイトメトリー解析のために、細胞を0.3％ TRITON X-100で１５分透過性にされ、固定した後、ＡＬＢおよびＡＡＴ抗体とともに室温で２時間インキュベートした。次に、細胞を二次抗体とともに闇に室温で１時間インキュベートした。インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、Caliburフローサイトメーター（Becton Dickinson）により解析した。ＣＤ１３３−Ｅｐ
ＣＡＭ−ＨＦＦを選択するために、細胞をBD FACS Aria II（Becton Dickinson）により
分別した。FACSに用いられる抗体は下記のものであった：EpCAM-FITC（Miltenyi Biotec,
1：11）、CD133-PE（Miltenyi Biotec, 1：11）、マウス抗アルブミン（R&D, 2.5 μg／106 cells）、ウサギ抗ＡＡＴ（NeoMarkers, 1：200）。データはFlowJoソフトウェア（Tree Star）により解析された。
【００７４】
（マイクロアレイ解析）
メーカーの取扱説明書に準じて、全ＲＮＡｓをヒト全遺伝子発現マイクロアレイ（Agilent）とハイブリダイズした。データはGene-Spring（Agilent）を用いて正規化された。
元データは遺伝子発現Omnibusデータベース（GSE42643）から入手された。
より具体的には、１、２および６日間培養した二つのＨＦＦｓ、ＨｅｐＧ２、三つの初代ヒト肝細胞から抽出した全ＲＮＡｓ、三つの独立の実験から由来するｈｉＨｅｐ細胞、三つの独立の実験から由来する１０代目のｈｉＨｅｐＬＴ細胞を、メーカーの取扱説明書に準じて、ヒト全遺伝子発現マイクロアレイ（Agilent）とハイブリダイズした。データ
はGene-Spring（Agilent）を用いて正規化された。マイクロアレイハイブリダイゼーションおよび解析はShanghaiBio Cooperation（Shanghai, China）により行われた。発現変化のある遺伝子を濃縮するために、顕著な発現レベル変化のある遺伝子を、初代ヒト肝細胞、ｈｉＨｅｐ細胞またはｈｉＨｅｐＬＴ細胞において２．５倍の変化をさせることにより分別した。合計6,324個の遺伝子はさらなる解析のために残された。それらの遺伝子から
の発現データのクラスタリングは、ユークリッド距離を類似性計量アルゴリズムとして、平均連結法をクラスタリング方法として用いて、Cluster 3.0ソフトウェア（Stanford University）により行われた。クラスタリングヒートマップはTreeViewにより作成した。元データは登録番号：GSE42643で遺伝子発現Omnibusデータベース（GEO）にアップロードされた。
ＰＨＨおよびｈｉＨｅｐにおいてＨＦＦよりも顕著に濃縮した経路を同定するために、遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）はGSEA v2.0.1.2により行われた。全てのプローブセ
ットは解析のために用いられた。遺伝子セットはBIOCARTA、京都遺伝子ゲノム百科事典（KEGG）およびREACTOME経路データベースから集めた。ベン図のために、遺伝子をBIOCARTA
、KEGGおよびREACTOMEにより群分けた。ｈｉＨｅｐ細胞およびＰＨＨにおける発現レベルが２倍超え増加した遺伝子は、発現向上遺伝子としてカウントされた。次に、ｈｉＨｅｐ細胞およびＰＨＨにおける発現向上肝臓遺伝子はベン図にプロットされた。
【００７５】
（ChIPアッセイ）
ＨＦＦおよびｈｉＨｅｐ細胞を1％ホルムアルデヒドを用いて架橋させた。次に、溶解
物を超音波処理し、約５００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ＤＮＡを、H3K9Ac ChIPグレード抗体（Abcam）またはコントロールＩｇＧを用いて、４℃で一晩免疫沈降させた。ＡＬＢおよびＡＡＴプロモーターをｑ−ＰＣＲにより、SYBR Green（Takara）を用いて、ABI 7500 Fastsystemで増幅および定量した。増幅した断片の定量に比較サイクル閾値
法を採用し、各免疫沈降反応からの結果はそれぞれの入力に正規化された。プライマー配列は表２に示す。
（ＰＡＳ、ａｃ−ＬＤＬ、ＩＣＧおよびオイル赤Ｏ染色用のアッセイ）
メーカーの取扱説明書に準じて、細胞を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ,Sigma）およびＤｉＩ−ａｃ−ＬＤＬ（Invitrogen）により染色した。インドシアニングリーン（ＩＣＧ, Sigma）取り込みアッセイにために、細胞を1 mg／ml ＩＣＧを含有する培地に変更し、３７℃で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。オイル赤Ｏ染色のために、コンフルエントの細胞をＨＭＭで培養した。４日間後、細胞をＰＢＳ（Hyclone）で２回
洗浄し、4％ホルマリンで３０分固定し、ＰＢＳで洗浄し、その後１０分オイル赤Ｏ（Sigma-Aldrich）染色し、次にwashed twice by 70％エタノールで２回洗浄し、ヘマトキシリン（Sigma-Aldrich）で５分染色した。
【００７６】
（ＣＹＰ誘導および代謝アッセイ）
ＣＹＰ酵素活性の測定のために、細胞をある薬物の代謝用の異なる化合物で誘導した。代謝された化合物の測定のために、上清をLC-MS／MS（Agilent 1200 HPLCおよびABI 4000質量分析計）により収集した。
より具体的には、ＣＹＰ酵素誘導の測定のために、ｈｉＨｅｐ、ｈｉＨｅｐＬＴ、ＨＦＦおよびＰＨＨ細胞をＨＩＭで４８時間培養し、次に３−メチルコラントレン（25μM）
、リファンピシン（25μM）およびフェノバルビタールナトリウム（2mM）が添加したＨＩＭに変更してさらに４８時間培養した。化学的誘導物質に応答したＣＹＰ酵素誘導を測定するために、全ＲＮＡをｑ−ＰＣＲにより抽出した。誘導物質処理無しの細胞の全ＲＮＡを、CYP450遺伝子および核内受容体遺伝子の発現を測定するために用いた。
ＣＹＰ代謝活性の測定のために、ｈｉＨｅｐ、ｈｉＨｅｐＬＴ およびＨＦＦ細胞をＨ
ＩＭで４８時間培養し、次に25μM３−メチルコラントレン（フェナセチン代謝アッセイ
用）、25μMリファンピシン（クマリン代謝アッセイ用）および2mMフェノバルビタールナトリウム（デキストロメトルファン代謝アッセイ用）が添加したＨＩＭに変更して４８時間培養した。新鮮に解凍した初代ヒト肝細胞をそのまま陽性コントロールとして用いた。細胞を異なる濃度の基質とともに200μlのインキュベーション用培地で、３７℃で３時間インキュベートした。反応を停止させるために、800mlの冷メタノールを添加して遠心し
た。代謝された化合物の測定のために、上清をLC-MS／MS （Agilent 1200 HPLCおよびABI
4000質量分析計）により収集した。全細胞タンパク質量をデータの正規化に用いた。標
準曲線用の基質および代謝産物は市場から購入した。
【００７７】
（サンドイッチ培養および胆汁中排泄アッセイ）
サンドイッチ培養物を生産するために、1x105個のｈｉＨｅｐ細胞、初代ヒト肝細胞お
よびＨＦＦをコラーゲンＩで被覆された２４ウェルプレートに接種した。次に、200 μL
の1.5 mg／ml新鮮に調製した中和コラーゲンゲル溶液を細胞に流した。固化後、細胞を5
％ FBS、10 μM TCAおよび2 μM cAMPが添加したWilliams’ E培地でさらに４日間培養した。
胆汁中排泄インデックスを解析するために、細胞を１回洗浄し、次にＨＢＳＳ緩衝液ま
たはカルシウムフリーＨＢＳＳ緩衝液において３７℃でインキュベートした。インキュベーションから１０分後、緩衝液を吸い出し、細胞を受試化合物溶液（ＤＰＤＰＥ 5 μM；
ＣＬＦ 2.5 μM； Ｄ８−ＴＣＡ 5 μM, ＨＢＳＳ緩衝液で希釈された）とともに１０分インキュベートした。冷ＨＢＳＳ緩衝液で３回洗浄することで、累積取り込みを停止した。ＤＰＤＰＥおよびＤ８−ＴＣＡはLC／MS／MS （LCMS-8030； Shimadzu, Kyoto, Japan
）により解析された。ＣＬＦの量はSynergy 4マイクロプレートリーダー（Biotek, Winooski, USA）により492 nmおよび536 nmにおける蛍光を測定することで定量された。胆汁中排泄インデックス（ＢＥＩ）は： BEI=（AHBSS-AHBSS（Ca2+ free））／AHBSS×100％と
して計算した。
（マウス）
Fah-／- Rag2-／- （F／R）マウスを7.5mg／LのＮＴＢＣ含有水を飲ませることで維持
した。Fah-／- Rag2-／-マウスの遺伝的背景はC57Bl6／J x 129Svである。C57Bl6／Jマウスは南京大学のモデル動物研究センター（南京、江蘇、中国）から購入した。F／Rマウスは特定病原体除去管理で維持された。全ての動物実験は研究機関の規格に基づいて行われた。
【００７８】
（ｈｉＨｅｐＬＴ細胞のFah欠損マウスへの移植）
ＮＴＢＣ水を撤去した後、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞をF／Rマウスの脾内に移植した。移植後、体重を１週間２回で観察した。移植から９週間後、生存した受容者マウスを致死させ、血液および肝臓サンプルを収集した。
より具体的には、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞移植の６日間前に、F／Rマウスに飲ませる水におけるＮＴＢＣ濃度を最初の３日間で3.75mg／Lに低減し、次の３日間で完全に撤去した。200μLのＰＢＳにおける1x107個のｈｉＨｅｐＬＴ細胞をF／Rマウスの脾内に移植した。実験には新鮮なＰＨＨが用いられた。受容者マウスにおけるナチュラルキラー細胞を消滅するために、移植の前日、そして移植後から７日間おきに、抗マウスアシアロ−ＧＭ１を（一匹のマウスにつき200μL生理食塩水における40μgで）F／Rマウスに腹腔内注射した。
さらに、移植後、受容者マウスにFK506（Astellas）を１日間にあたり１グラム体重につ
き1μgの投与量で投与した。移植後、体重を１週間２回で観察した。移植から８〜１０週間後、生存した受容者マウスを致死させ、血液および肝臓サンプルを収集した。ＮＴＢＣを撤去してから体重が３０％減少した後、コントロールFah-／- Rag2-／-マウスの血液および肝臓サンプルを収集した。
（マイクロカプセル化細胞）
ＨＦＦｓ、ＨｅｐＧ２、ＰＨＨおよびｈｉＨｅｐＬＴ細胞を静電気drip技術によりＡＰＡマイクロカプセルに包装した。簡単にいえば、増殖している細胞を収穫し、1.5x107個
の細胞／mL（ＨＦＦ、ＨｅｐＧ２およびｈｉＨｅｐＬＴの場合）または0.5x107（ＰＨＨ
の場合）の最終細胞密度で、1.5％ （w／v）フィルター滅菌アルギン酸ナトリウム溶液（Sigma）含有生理食塩水に懸濁した。実験には新鮮なＰＨＨが用いられた。静電液滴生成
器を用いて、当該細胞懸濁液を0.4-mm針を通して100 mM CaCl2溶液に押し出し、アルギン酸カルシウムゲルビースを形成した。洗浄後、当該ゲルビーズを0.05％（w／v）ポリ−ｌ−リジン（ＰＬＬ）（分子量２１，９００、Sigma）とともにインキュベートし、表面全
面にアルギン酸−ポリ−ｌ−リジン膜を形成した。生理食塩水においてビーズを洗浄した後、それらを0.15％（w／v）のアルジネートに５分懸濁することで、アルジネートのさらなる被覆を行った。当該膜で包囲されたゲルビーズをさらに55mMクエン酸ナトリウムに懸濁し、アルジネートゲルコアを液化した。その結果、約350 μmの直径を有するＡＰＡマ
イクロカプセルが形成されることにより、100kD未満の分子量を有する化合物の浸透が実
現した。ＨＦＦｓ、ｈｅｐＧ２、ＰＨＨおよびｈｉＨｅｐＬＴ細胞を有するマイクロカプセルは移植までＨＭＭに保管された。
【００７９】
（コンカナバリンＡで誘導された急性肝不全マウスへのｈｉＨｅｐＬＴ細胞移植）
C57Bl6／JマウスにコンカナバリンＡ（Con A, Sigma-Aldrich）を１kg体重につき37.5 
mgの投与量で尾静脈を通して注射した。Con A処理により、数時間で重篤な肝炎が誘発さ
れ、それにより２４時間でほとんどのマウスに急性肝不全および死亡が引き起こされた。Con A処理から８時間後、1.5x107のカプセル化ＨＦＦｓまたはｈｉＨｅｐＬＴ細胞または0.5x107のＰＨＨを急性肝不全マウスに腹腔内注射した。マウスをCon A処理後の１日目で３時間おきに観察し、そして残りの１週間において１日に３回で観察した。生存したマウスから血液サンプルを２４時間おきに収集した。生存した動物を致死させてから、肝臓サンプルを収集した。全ての動物実験は研究機関の動物規格に基づいて行われた。
（組織学および免疫組織化学）
組織を4％中性ホルマリンで一晩固定した。病理学的評価のために、組織切片をヘマト
キシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学染色には、パラフィン切片（3-4 μm
厚）を用いた。スライドを3％H2O2で１５分処理し、1％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおける5％正常ヤギまたはウマ血清において２０分ブロッキングし、1％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおける上記抗体で一晩染色した。二次抗体をVectastain ABCキット（Vector Laboratories）に準じて
使用し、それからDAB染色（DAKO）を行った。下記抗体は免疫組織化学染色に用いられた
：ウサギ抗ＦＡＨ（AbboMax, San Jose, CA, 1：3000）、ウサギ抗ヒトＡＡＴ（NeoMarkers, 1：100）。
ホルマリン固定パラフィン埋め込み（FFPE）組織からＲＮＡを抽出するために、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）膜枠スライド（Leica）に設けられた八つの連続切片を
脱パラフィンおよび風乾した。一つ目の切片を抗Ｆａｈ抗体で染色し、再増殖Fah+結節を同定した。Ｆａｈ免疫染色の結果に基づき、下記七つの切片から、MMI CellCut Plus（Molecular Machines & Industries）により適切なレーザー強度および速度で結節含有Fah+
組織を顕微解剖した。顕微解剖後、スライドにおける残りの切片をさらに抗Fah抗体で染
色し、Fah+結節内にある組織のみが分離されたことを確認した。RNeasy FFPEキット（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを抽出するために、同一のFah+結節由来の顕微解剖組織を合併し
た。
【００８０】
（統計）
全てのデータは平均値+標準偏差として示された。大部分の統計的評価のために、片側
不対スチューデントt検定を行い、本研究における統計的確率を算出した。生存分析のた
めに、片側マンテル・コックス  ログランク検定を行った。統計計算は社会科学用統計プログラム（Statistical Program for Social Sciences）ソフトウェア（SPSS,IBM）を用
いて行った。全ての統計において、少なくとも３つの独立のサンプルまたは重複実験からのデータは使用された。
サンプルサイズを見積もるための統計計算は特に行わなかった。サンプルサイズは主に前の経験に基づいて選択された。サンプルサイズの詳細は図面の一覧（figure legends）で見られる。サンプルまたは動物には、分析から除外されたものはなかった。全ての動物は無作為に実験群またはコントロール群に群分けされた。本研究において、研究者は完全に群の割り付けを知らされていないものではなかった。異なる研究者でデータを検証した。
【実施例２】
【００８１】
（直接系列転換によるｈｉＨｅｐ細胞の生産）
マウス線維芽細胞はすでに誘導肝細胞様（ｉＨｅｐ）細胞に転換した。本実施例において、機能的成熟のヒトｉＨｅｐ細胞を誘導するために研究を行った。
一番目の初代ヒト胎児肢線維芽細胞（ＨＦＦ１）を生産し、ＨＦＦ１細胞に胎児肝芽細胞が含まれないことを証明した（図８ＡとＢ）。簡単にいえば、肝芽細胞のマーカー遺伝子の発現をＨＦＦ１においてｑ−ＰＣＲにより確定した。データはＨｅｐＧ２（図８Ａ）に正規化された。フローサイトメトリーで示されたように、ＨＦＦ１はCD133およびEpCAMに陰性であるが、人肝芽細胞腫細胞株ＨｅｐＧ２はEpCAMに陽性で、CD133に一部的に陽性であることは分かった（図８Ｂ）。
マウス細胞における知見（Huangら,（2011）Nature 475, 386-389）に基づき、ヒトFOXA3、HNF1AおよびGATA4を担持したレンチウイルスをＨＦＦ１細胞に導入した。しかしながら、定量ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）により測定したように、肝臓遺伝子の発現は誘導されなかった（図８Ｃ）ことから、ヒト細胞の肝臓への転換には異なるプロトコルが必要であることは示唆された。ｑ−ＰＣＲにより確定したように、ＡＬＢ、ＡＡＴ、トランスチレチン（ＴＴＲ）およびトランスフェリンのような肝臓遺伝子の発現レベルは形質導入から８日間後に検出不能でした。データは肝臓に正規化された。
よって、ｈｉＨｅｐ誘導にとって肝心な因子のために、デノボスクリーニングが設計された。図１Ａは、ｈｉＨｅｐ細胞の誘導のための実験デザインを示す。簡単にいえば、初代ヒト線維芽細胞を、ヒト肝臓転写因子を発現するレンチウイルスで感染した（表１）。感染から２日間後、培地をＨＭＭ培地に変更し、ｈｉＨｅｐ細胞を生産した。誘導から１０〜１４日間後、ｈｉＨｅｐ細胞を検討した。
最初に、パイオニア因子FOXA3とGATA4、肝特異的転写因子HNF1B、HNF4A、HHEX、PROX1
、C／EBPβ、およびリプログラミングにおける上皮間葉転換にとって重要な転写因子KLF4を含む８つのヒト転写因子（「８ＴＦ」、図１Ａおよび表１）を選択した。８ＴＦの発現後、ＨＦＦ１において、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン18（ＣＫ１８）、トランスチレチン（ＴＴＲ）およびトランスフェリンのような肝細胞特異的遺伝子のｍＲＮＡレベルが顕著に誘導されたことは分かった（図８Ｄ）。８ＴＦ（図８Ｄ）または６ＴＦ（図８Ｅ）による形質導入から１２日間後、ＨＦＦ１における上記肝臓遺伝子の発現レベルをｑ−ＰＣＲにより解析した。データは８ＴＦまたは６ＴＦに正規化された。
【００８２】
８ＴＦから一つまたは複数の因子を除去することにより、KLF4、HHEXおよびGATA4が肝
臓遺伝子発現に必要ではないことは分かった。FOXA3、HNF1BおよびHNF4Aが肝臓への転換
にとって重要であることも分かった（図８Ｅ−Ｊ）。そのため、５ＴＦから単一の因子を撤去することの、肝臓遺伝子発現に対する影響をｑ−ＰＣＲにより解析した。ＡＬＢ、ＣＫ１８およびＴＴＲの発現レベルに基づき、FOXA3、HNF1BおよびHNF4Aが肝臓への転換に
とって重要であることは分かった。データは５ＴＦに正規化された（図８Ｊ）。
おもしろいことに、HNF1Bの代わりにHNF1Aを使用することで、ＡＬＢ発現は劇的に向上した（図８Ｋ、データはFOXA3、HNF4AおよびHNF1Bグループに正規化された）。定量ＰＣ
Ｒ（ｑ−ＰＣＲ）により測定したように、FOXA3、HNF1AおよびHNF4A（まとめて“3TF”と記す）から単一の因子を除去することで、肝臓遺伝子の発現は低減した（図１Ｂ）。データは３ＴＦに正規化された。
特に、３ＴＦは転写因子の他の組み合わせよりも高いレベルの肝臓遺伝子発現を誘導した（図８Ｌ、データは８ＴＦに正規化された）。３ＴＦはＡＬＢおよびＡＡＴ遺伝子のプロモーター領域において増加したH3K9のアセチル化も引き起こしたことから、肝臓への転換過程におけるエピジェネティックリモデリングが示唆された（図８Ｍ）。そのため、クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイによりH3K9Acレベルを測定した。それらの３つの因子に基づき、線維芽細胞の培養条件、線維芽細胞の播種密度、ウイルス感染および肝細胞培地を最適化することにより、ｈｉＨｅｐ誘導を改善した。
３ＴＦで誘導されたｈｉＨｅｐ細胞は誘導から１２日間後、上皮形態を示した（図１Ｃ）。ｈｉＨｅｐ誘導過程において、例えばＡＬＢ、ＡＳＧＰＲ１およびトランスフェリンのような成熟肝細胞に特異的な遺伝子の発現は漸増したことから、肝臓への転換が漸進的に協調される過程であることは示唆された（図１Ｄ）。上記遺伝子の発現レベルをｑ−ＰＣＲにより解析した。４日目、データはＨＦＦ＋３ＴＦに正規化された。それに比べて、ｈｉＨｅｐ細胞における線維芽細胞特異的遺伝子の発現は劇的に低減した（図１Ｅ）。図１Ｅに示されたように、誘導から２週間後、ｈｉＨｅｐ細胞において、原線維芽細胞に特異的な遺伝子の発現は抑制された。前記アッセイにおいて、全てのデータはＨＦＦ１に正規化された。図１ＤとＥにおいて、２日間培養したＰＨＨはコントロールとして用いられた。図８および表１と４にも参照する。
【実施例３】
【００８３】
ｈｉＨｅｐ細胞は成熟肝細胞に特異的な遺伝子発現パターンおよび機能を有する
本実施例において、成熟肝臓タンパク質ＡＬＢおよびＡＡＴの共発現を調査するために試験を行った。さらに、ｈｉＨｅｐの転換効率を確定するために、フローサイトメトリーにより定量されたＡＬＢおよびＡＡＴダブルポジティブ細胞を用いた。２日間培養したＰＨＨは陽性コントロールとして用いられた。
免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーにより確定したように、約２０％の細胞はＡＬＢとＡＡＴを共に発現している（図２Ａと２Ｂ）ことから、効率的な転換であることは示唆された。しかも、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）により測定したように、ｈｉＨｅｐ細胞はＰＨＨに近いレベルで血漿タンパク質のＡＬＢおよびＡＡＴの優れた分泌能を示した（図２Ｃと２Ｄ）。
ｃＤＮＡマイクロアレイにより、ＨＦＦｓ、ＰＨＨｓ、分別されていないｈｉＨｅｐ細胞およびＨｅｐＧ２細胞の遺伝子発現プロファイル解析を実施した。階層クラスタリングにより、ｈｉＨｅｐ細胞がＰＨＨとともに群分けられることは示された。ＰＨＨを図２Ｅに示された日数で培養した。培養２日目のＰＨＨは培養６日目のＰＨＨに近く群分けられたことから、２日間またはそれ以上培養した後、ＰＨＨが遺伝子発現を比較的に安定したレベルで維持することは示唆された。最上部にあるクラスターツリーに示されたように、ヒト肝芽細胞腫細胞株ＨｅｐＧ２を取り入れることで、ｈｉＨｅｐ細胞の発現パターンがＰＨＨのほうに接近することは解明された。発現レベルは色で描かれた。
ゲノムワイド発現プロファイル解析により、ｈｉＨｅｐ細胞が培養ＰＨＨに近くクラスタリングされることは解明された（図２Ｅ）。発現プロファイリングによっても、肝臓への転換において、線維化遺伝子の発現が効率的に抑制されたことは示され、このことは公開されたｉＰＳ細胞の発現プロファイルに一致する（Sridharanら,（2009）, Cell 136, 364-377）。
ＧＳＥＡ解析により、ＰＨＨおよびｈｉＨｅｐ細胞のいずれにおいても、肝臓遺伝子発現が顕著に濃縮したことは解明された。前記解析によれば、脂質代謝、アミノ酸代謝、および第I相と第II相解毒に関与する経路を含む、ＰＨＨにおいて濃縮した経路は、ｈｉＨ
ｅｐ細胞において顕著に濃縮したことは示された（表３）。左側へのピークシフトにより、ＰＨＨまたはｈｉＨｅｐ細胞における上記肝臓遺伝子セットの濃縮は示された。それらのデータによれば、ＨＦＦが転写変化により全ゲノムレベルで肝臓への転換を行うことは示された。
【００８４】
より具体的には、下表３はＰＨＨおよびｈｉＨｅｐ細胞において濃縮した経路のＧＳＥＡ解析を示す。トップリストの経路は示される。正規化濃縮スコア（ＮＥＳ）は遺伝子セット濃縮結果を調査するための１次統計値である。ＮＥＳは、遺伝子セットを渡って解析結果を比較することに用いることができる。偽発見率（ＦＤＲ）は、所定のＮＥＳを有する遺伝子セットが偽陽性所見を示す推定確率である。通常、２５％のＦＤＲカットオフが適切である。
肝臓遺伝子の全身的の発現と一致して、ｈｉＨｅｐ細胞は、グリコーゲン貯蔵（図２Ｆ）、アセチル化低比重リポタンパク質（ac-LDL）摂取（図２Ｇ）、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）取り込み（図２Ｈ）および中性トリグリセライドと脂質の細胞質内蓄積（図２Ｉ）のような成熟肝細胞の複数の特徴的機能を発揮した。
３ＴＦで誘導された肝細胞系列への転換は、追加のＨＦＦ細胞株であるＨＦＦ２において確認された（図３Ａ−Ｄ）。ｑ−ＰＣＲのために、２日間培養したＰＨＨはコントロールとして用いられた。データはＨＦＦ２−ｈｉＨｅｐに正規化された。さらに、胎児細胞調製における肝芽細胞による汚染の可能性を排除するように、ｈｉＨｅｐ細胞がCD133-EpCAM-線維芽細胞から由来できることは証明された（図９）。
その上に、ヒト成体皮膚線維芽細胞（ＨＡＦ）から肝臓への転換を検討した。ＨＡＦｓにおいて、形態変化および肝臓遺伝子発現は３ＴＦによって誘導された（図３Ｅと３Ｆ）。ｑ−ＰＣＲのために、２日間培養したＰＨＨはコントロールとして用いられた。データ
はＨＡＦ−ｈｉＨｅｐに正規化された。ＨＡＦ由来ｈｉＨｅｐ細胞は、グリコーゲン蓄積およびａｃ−ＬＤＬ吸収（図３Ｇと３Ｈ）のような肝臓機能を示した。興味深いことに、１０％未満の細胞はＡＬＢおよびＡＡＴのいずれに対しても陽性であった（図３Ｉ）ことから、ＨＡＦから肝臓への転換がＨＦＦから肝臓への転換ほど効率的ではないことは示唆された。
【００８５】
表３ ＰＨＨおよびｈｉＨｅｐ細胞において濃縮した肝臓経路
【表３】
0006426627.tif 000008
【００８６】
（表３の続葉１）
0006426627.tif 000009
【実施例４】
【００８７】
（ｈｉＨｅｐ細胞の解毒および胆汁中排泄）
肝細胞のシトクロムＰ４５０（CYP450）酵素は薬物解毒に関与する主要な酵素である。それらの活性および特定の誘導物質に対する応答は薬理学において、掛け替えのない状態で薬物代謝および薬物―薬物相互作用を評価するために用いられる。興味深いことに、第１相および第２相薬物代謝遺伝子はＰＨＨおよびｈｉＨｅｐ細胞のいずれにおいても濃縮した（表３）。
次に、ｈｉＨｅｐ細胞がＣＹＰ誘導物質に応答できるかどうかを解析するために試験を行った。ＣＹＰ酵素の発現と誘導を測定するために、ｈｉＨｅｐおよびＰＨＨ細胞を４８時間培養し、その後化学誘導物質が添加した又は添加しない培地に変更してさらに４８時間培養した。
化学誘導物質を添加する前に、ｈｉＨｅｐ細胞は既に顕著なレベルで複数のCYP450酵素を発現していた（図４Ａ）。CYP450酵素および他の多数の薬物代謝酵素の転写活性は、AHR、CARおよびPXRを含む核内受容体によって仲介された。ｑ−ＰＣＲにより確定したよう
に、それらの核内受容体はｈｉＨｅｐ細胞において高度に発現されていた（図４Ｂ）。さらに、３−メチルコラントレン、フェノバルビタールまたはリファンピシン処理により、CYP1A2（AHR標的遺伝子）、CYP2A6（CAR標的遺伝子）、CYP2B6、CYP2C8およびCYP2C9（CARとPXRの標的遺伝子）のｍＲＮＡ発現レベルは顕著に誘導された。CARとPXRの標的遺伝子であるCYP3A4はフェノバルビタールにより、比較的に低いが顕著なレベルで誘導された（図４Ｃ）。
重要なことに、ＣＹＰ活性の他の試験において、ｈｉＨｅｐ細胞はフェナセチン、クマリンおよびデキストロメトルファンのＣＹＰ酵素依存性代謝を示した（図４Ｄ）。そのため、ｈｉＨｅｐ細胞においてＣＹＰ酵素を４８時間誘導した。新鮮に解凍した初代ヒト肝細胞をそのまま陽性コントロールとして用いた。フェナセチン（アセトアミノフェン、CYP1A2活性に対するアッセイ）、クマリン（７−ヒドロキシクマリン、CYP2A活性に対する
アッセイ）およびデキストロメトルファン（デキストロルファン、CYP2D6活性に対するアッセイ）の代謝産物を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法により確定した。
【００８８】
膜輸送体によって仲介される胆汁中排泄は、生体異物のクリアランスのための、肝細胞のもう一つの重要な機能である。胆汁中排泄による薬物クリアランスは、薬物候補の選択において厳密に評価される特性である。胆汁中排泄を評価するための代用インビトロモデルを同定するために、多大な努力が払われてきた（Liuら,（1999）, Drug Metab Dispos 27, 637-644, およびPanら, （2012）, J Pharm Sci 101, 1898-1908）。本実施例において、ｈｉＨｅｐ細胞における肝心な輸送体遺伝子の発現レベルが顕著に発現されたことは分かった（図４Ｅ）。重要なことに、ｈｉＨｅｐ細胞は、［Ｄ−ペン２，５］−エンケファリン水和物（ＤＰＤＰＥ）、Ｄ８−タウロコール酸（Ｄ８−ＴＣＡ）およびコリルリシルフルオレセイン（ＣＬＦ）のような多剤排出輸送体基質のクリアランスのための優れた胆汁中排泄インデックス（ＢＥＩ）を示した（図４Ｆ）ことから、薬物胆汁排泄クリアランスの評価におけるｈｉＨｅｐ細胞の潜在用途が示唆された。それらを踏まえ、我々のデータによれば、ｈｉＨｅｐ細胞が優れた成熟肝臓表現型および機能を有することは示された。
【実施例５】
【００８９】
（SV40 Large T抗原による機能性ｈｉＨｅｐ細胞の増幅）
インビボ機能的特性解析のために、ｈｉＨｅｐ細胞を大量に増幅する必要がある。しかしながら、ＨＦＦおよびＨＡＦ由来のｈｉＨｅｐ細胞はいずれも増殖が停止しており（図５Ａ）、それは、サイクリンＡとＢの発現の低減によって引き起こされたみたいである（図１０Ａ）。多数の戦略を取った結果、レンチウイルスによって仲介されるSV40 large T抗原（ＬＴ）の発現により、サイクリンＡとＢの発現の回復とともに、ｈｉＨｅｐ細胞を増殖させることができることは分かった（図５Ａと図１０Ｂ）。そのため、ＨＦＦ１細胞をSV40 large T抗原で（ＨＦＦ１＋ＬＴ）、その後３ＴＦの過剰発現で形質導入し、肝臓への転換を誘導した（ｈｉＨｅｐＬＴ）。ＬＴの発現があるｈｉＨｅｐ細胞（ｈｉＨｅｐＬＴ）は、代表的な上皮細胞形態を示し（図５Ｂ）、且つｈｉＨｅｐ細胞と同等のレベルで例えばＡＳＧＰＲ１やトランスフェリンなどの成熟肝臓遺伝子を発現した（図５ＢとＣ）。ｑ−ＰＣＲ解析のために、２日間培養したＰＨＨはコントロールとして用いられた。データはＰＨＨに正規化された。
発現プロファイル解析により、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞がｈｉＨｅｐ細胞およびＰＨＨとともにクラスタリングされることは解明された（図５Ｄ）。さらに、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞は、グリコーゲン蓄積、ａｃ−ＬＤＬ吸収、ＡＬＢ分泌、ＣＹＰ代謝および胆汁中排泄を含む成熟肝臓機能を取得した（図５Ｅ−Ｊ）。ＣＹＰ代謝アッセイのために、フェナセチンおよびクマリンの代謝産物を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法により確定した。デキストロメトルファンの代謝産物はｈｉＨｅｐＬＴ細胞において検出されなかった。
ｈｉＨｅｐ細胞に比べて、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞は同様な胆汁中排泄機能を示したが、ア
ルブミン分泌およびＣＹＰ活性が低下した（図５Ｇ−Ｊ）。特に、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞は数回継代した後、一定のレベルの肝臓遺伝子発現および機能を維持した（図５Ｃ−Ｆ）。同様に、ＨＡＦからｈｉＨｅｐＬＴ細胞を成功に誘導した（図１０Ｃ−Ｅ）。さらに、患者から容易に入手できる脂肪組織由来の間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ）からｈｉＨｅｐ細胞を生産した。ＡＤ−ＭＳＣｓ由来のｈｉＨｅｐ細胞は線維芽細胞由来のｈｉＨｅｐ細胞と同等の肝臓機能を有した（図１０Ｆ−Ｊ）。図１０Ｆ−Ｊに示すように、ＭＳＣ−ｈｉＨｅｐ細胞は上皮形態、グリコーゲン貯蔵およびａｃ−ＬＤＬ摂取を示した。フェナセチンおよびクマリンの代謝産物を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法により確定した。デキストロメトルファンの代謝産物は検出されなかった。胆汁中排泄能はＤＰＤＰＥ、Ｄ８−ＴＣＡおよびＣＬＦのクリアランスとして測定された。
【実施例６】
【００９０】
（ｈｉＨｅｐ細胞は安定に転換した成熟肝細胞様細胞であり、肝前駆細胞ではない）
本実施例において、多種の外因性および内因性因子または遺伝子の発現を調査した。外因性遺伝子の場合、３つの転写因子の全長ＣＤＳｓをレンチウイルスベクターにクローンした。次に、ベクターに位置付ける一つのプライマーと、ＣＤＳに位置付けるもう一つのプライマーを用いて、外因性遺伝子を特異的に検出した。内因性ｍＲＮＡｓの場合、当該ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置付けるプライマーを用いた。
特に増幅可能なｈｉＨｅｐ細胞において、外因性FOXA3、HNF1AおよびHNF4Aの発現は抑
制された（図１１Ａ）が、内因性因子は顕著に誘導された（図１１Ｂ）。それらのデータにより、ｈｉＨｅｐ細胞から肝臓運命への安定な転換が示唆された。図１１ＡとＢに示されたデータはＨＦＦに正規化された。
ｈｉＨｅｐＬＴ細胞は増殖中の細胞であり、EpCAM、DLK1、LGR5およびCYP3A7を含む肝
芽細胞マーカー遺伝子は検出不能または低レベルで発現された（図１１Ｃ−Ｄ）。ヒト肝臓細胞において見られるレベルより少し高いが、低レベルのα-フェトプロテイン（ＡＦ
Ｐ）ｍＲＮＡはｈｉＨｅｐＬＴにおいて検出された（図１１Ｅ）。ｈｉＨｅｐＬＴ細胞におけるＡＦＰタンパク質レベルは免疫蛍光染色により検出不能であった（図１１Ｆ）。さらに、TBX3およびSOX9を含む肝芽細胞マーカー遺伝子は肝細胞系列への転換の初期段階において誘導されなかった（図１１Ｇ）。重要なことに、胆管上皮マーカー遺伝子はｈｉＨｅｐＬＴ細胞において発現されず、且つｈｉＨｅｐＬＴ細胞は三次元構造で胆管を発生しなかった（図１１Ｈ−Ｉ）。それらの結果は、ｈｉＨｅｐ細胞における両能性肝前駆細胞の存在を大いに排除した。それらを踏まえ、我々の結果によれば、ｈｉＨｅｐ細胞が成熟肝細胞様細胞であり、肝芽細胞ではないことは示された。
【実施例７】
【００９１】
（ｈｉＨｅｐ細胞移植は改善Fah欠損で誘導された肝代謝疾患を改善する）
ｈｉＨｅｐＬＴ細胞の大量の増幅は、インビボでの肝臓機能の測定を可能にした。そのため、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞をフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ欠損（Fah-／-）マウスに移
植した。Fah-／-マウスはＮＴＢＣ供給で維持されたが、ＮＴＢＣ撤去かた４〜６週間後
で肝不全の原因で死亡した（Azumaら, （2007）, Nat Biotechnol 25, 903-910）。野生
型肝細胞は脾内移植後、肝臓を再生させ、Fah-／-マウスを救うことができたので、ｈｉ
Ｈｅｐ細胞のインビボ機能を検討するための有用なモデルを提供できた。
ヒト細胞に対する免疫応答を低減させるために、成熟ＴとＢ細胞が欠乏するFah-／-Rag2-／- （F／R）マウスをＮＫ細胞を消滅する抗マウスアシアロ−ＧＭ１抗体および免疫抑制薬FK506で追加処理した（図６Ａ）（Heら,（2010）,Am J Pathol 177, 1311-1319）。
簡単にいえば、細胞移植の前に、ＮＴＢＣを飲用水から撤去した。ナチュラルキラー細胞を消滅するために、細胞移植の前日、F／Rマウスを抗アシアロ−ＧＭ１抗体で前処理した。ＨＦＦ１（1×107個の細胞）、ｈｉＨｅｐＬＴ（1×107個の細胞）またはＰＨＨ（1×106個の細胞）をF／Rマウスの脾内に移植した。ドナー細胞の免疫拒絶を低減させるために、受容者マウスに抗マウスアシアロ−ＧＭ１を７日間おきに投与するとともに、免疫抑制
薬FK506を毎日投与した。動物を毎日観察し、且つ移植から９週間後で致死させた。その
期間において、移植細胞を受け入れなかった、並びにＨＦＦ、ＰＨＨおよびｈｉＨｅｐＬＴ細胞を受け入れたFah-／-Rag2-／- （F／R）マウスの体重を一週間につき測定した。異なる時点での体重は実験開始時の体重に正規化された。
移植細胞を受け入れなかった、並びにＨＦＦ細胞を移植したF／Rマウスは、それらの体重が減少し、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチルベンゾイル）−１，３−シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）の供給を除去してから約４週間で死亡した（図６Ｂ）のに対し、ＰＨＨの移植はF／Rマウスの寿命を延長した（図６Ｂ、８匹のマウスのうち、３匹が生存した）。特に、１５匹の受容者マウスのうち、５匹がｈｉＨｅｐＬＴ細胞の移植から９週間後でも生存した（図６Ｂ）。ＰＨＨおよびｈｉＨｅｐＬＴ細胞を移植したマウスは、最初の３週間でそれらの体重が減少したが、本実験の残りの期間でそれらの体重が再増加または安定した（図１２Ａ）。生存した受容者におけるＡＬＴとＡＳＴの血清レベルは顕著に低減した（図６Ｃと６Ｄ）ことから、肝機能が改善したことは示唆された。ｈｉＨｅｐＬＴ細胞を移植したマウスの血清において、ヒトＡＬＢも検出された（図６Ｅ）。
【００９２】
ヒトＦａｈおよびＡＡＴの免疫組織化学的染色により、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞が生存したマウスにおける肝実質の0.3〜4.2％を再増殖させたことは示された（図６Ｆ、１２Ｂと１２Ｃ）。再増殖したFah陽性細胞は、マウス肝細胞または非肝臓細胞ではなく、ヒト肝細
胞を特異的に標識する抗体であるＨｅｐＰａｒ−１で陽性に染色された（図１２Ｄ）。受容者肝臓におけるｈｉＨｅｐＬＴ細胞の生着を、ヒト特異的ＡｌｕのＤＮＡ配列のゲノムＰＣＲによりさらに確認した（図６Ｇ）。特に、ＦＡＨおよびマウスアルブミン特異的抗体を用いた免疫蛍光染色により確定したように、ｈｉＨｅｐ細胞はマウス肝細胞と融合しない（図１２Ｅ）。ヒト肝臓遺伝子発現を解析するために、再増殖したｈｉＨｅｐＬＴ細胞を顕微解剖した。培養ｈｉＨｅｐＬＴ細胞に比べて、再増殖ｈｉＨｅｐＬＴ細胞におけるヒトＡＬＢおよびＡＡＴのｍＲＮＡレベルは低下したのに対し、CYP3A4の発現は促進された（図６Ｈ）。特に、再増殖ｈｉＨｅｐＬＴ細胞におけるＡＦＰレベルはさらに低減した（図６Ｉ）ことから、ｈｉＨｅｐＬＴの遺伝子発現パターンがインビボ微小環境によりさらにリモデルされたことは示唆された。それらを踏まえ、我々のデータによれば、suggest that ｈｉＨｅｐＬＴ細胞がF／R肝臓を再生させ、Fah欠損によって引き起こされる肝機能障害を改善できることは示唆された。
本実験の設定において、SV40 LTはインビボ機能アッセイ用のｈｉＨｅｐ細胞を増幅す
るための戦略として適用されるものに過ぎなかった。それにもかかわらず、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞の腫瘍原性を検討した。興味深いことに、受容者F／Rマウスでは腫瘍が検出されなかった（データ未記載）。インビボで低下したSV40 LT発現（図１２Ｆ、ｑ−ＰＣＲによ
り解析され、培養ｈｉＨｅｐＬＴ細胞に正規化された）のせいか、Ｋｉ６７染色で示したように、再増殖したｈｉＨｅｐ結節は移植から９週間後で増殖していなかった（図１２Ｄ）。
さらにまた、１０代目のｈｉＨｅｐＬＴ細胞の核型を有糸分裂期間の染色体分析により解析した。継代後期のｈｉＨｅｐＬＴ細胞が正常の染色体数を維持したことは分かった（図１２Ｇ）。また、腫瘍形成を調査するために、ｈｉＨｅｐＬＴ（1×106）およびPLC／PRF／5（1×106）細胞をヌードマウスのわき腹領域の皮下に移植した。免疫不全マウスに
おいて、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞が移植後、腫瘍を形成しないことは分かった（図１２Ｈ）。
【実施例８】
【００９３】
（ｈｉＨｅｐ細胞はCon Aで誘導された劇症肝不全を改善した）
本実施例において、ｈｉＨｅｐ細胞が、肝臓を劇症肝炎から回復させるための補助にとって充分な肝臓機能を有するかどうかを確定するために試験を行った。そのために、野生型マウスにCon Aを注射し、１２〜２４時間内で劇症肝不全および動物の死亡を引き起こ
した（図７Ａと７Ｂ）。ｈｉＨｅｐ細胞の肝臓機能を証明するための実験モデルとして、ｈｉＨｅｐＬＴ細胞をＡＰＡマイクロカプセルにカプセル化し（図１３Ａ）、カプセル化
細胞を急性肝不全マウスに腹腔内注射した（図７Ａ）。従来の研究では、ＡＰＡカプセル化初代肝細胞の移植が、急性肝不全を有する動物の生存率を改善したことは示された（Meiら, （2009）. Cell Transplant 18, 101-110）。半透性ＡＰＡマイクロカプセルは、カプセル化細胞を受容者における免疫細胞から隔離するが、100 kD未満の分子の交換を許容する（Oriveら,（2004）, Trends Biotechnol 22, 87-92； Wangら,（2006） Hepatol Res 35, 96-103； Xieら, （2011）. J Control Release 152 Suppl 1, e246-248）。半透
性の確認として、ＡＰＡカプセル化ｈｉＨｅｐＬＴ細胞を腹腔内移植した後の受容者マウスの血清において、ヒトＡＬＢは簡単に検出された（図１３Ｂ）。
Con A処理から８時間後、カプセル化細胞を野生型マウスに腹腔内注射した（図７Ａ）
。より具体的には、C57Bl6／JマウスにCon Aを注射し、１２〜２４時間内でマウス全体に急性肝不全および死亡の原因となる劇症肝炎を引き起こした。Con A処理から８時間後、5×106個のカプセル化ＰＨＨ、或いは1.5×107個のＡＰＡカプセル化ＨＦＦ、ＨｅｐＧ２
またはｈｉＨｅｐＬＴ細胞を急性肝不全を有するマウスに腹腔内注射した。カプセル化ＨＦＦおよびＨｅｐＧ２を移植した群において、ほとんどの受容者はCon A処理後２４時間
で死亡した（ＨＦＦ群における１匹のマウスは３日目で死亡した、図７Ｂ）。ＰＨＨ処理により、急性肝不全を有するマウスの生存率は顕著に改善され、生存時間は顕著に延長された（図７Ｂ）。特に、カプセル化ｈｉＨｅｐＬＴ細胞処理により、１４匹のマウスのうち、５匹はCon Aで誘導された急性肝不全から完全に回復し（図７Ｂ）、且つCon A処理から４日間後で正常の血清ＡＬＴおよびＡＳＴレベルを示した（図７Ｃ、Ｄと１３Ｃ）。ＨｅｐＧ２細胞は従来のバイオ人工肝補助装置のモデルに用いられたからといって、ＨｅｐＧ２細胞はマウスにおいて急性肝不全に対する治療効果を示さないことから、ｈｉＨｅｐ細胞が次世代のバイオ人工肝補助装置の開発に期待できることは示唆された、ということは注目に値する。
【００９４】
組織学的解析により、カプセル化ｈｉＨｅｐＬＴ細胞がCon Aで誘導された肝損傷から
の回復を顕著に改善したことは解明された（図７Ｅと７Ｆ）。肝臓において、０日目ではCon Aで誘導された肝炎および出血が（図７Ｅおよび図７Ｆにおける矢印）、４日目では
残留の肝損傷が（図７Ｅおよび図７Ｆにおける矢印）、７日目では完全に回復した肝臓が見られた。それらの結果を踏まえ、インビボでのｈｉＨｅｐ細胞の肝臓機能は解明され、且つ代謝性肝疾患や急性肝不全のような肝損傷の治療におけるｈｉＨｅｐ細胞の治療効果の証拠を提供した。
上記結果によれば、機能的成熟のヒト肝細胞様細胞が線維芽細胞から直接に生産できることは証明された。さらに、当該結果は、マウス細胞と異なり、ヒト細胞がリプログラミングに抵抗性を有し、且つ効率的なｈｉＨｅｐ誘導のための新規戦略を開発するように多重最適化が行われたことを示した。上記実施例に記載の手順やプロトコルと、マウス細胞について、例えばHuangら, （2011） Nature 475, 386-389において開示された手順やプ
ロトコルとの比較は下表４に示される。
【００９５】
表４ ｈｉＨｅｐおよびマウスｉＨｅｐ誘導用のプロトコルの比較
【表４】
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【００９６】
簡単にいえば、実施例に記載のプロトコルにおいて、初期継代のヒト線維芽細胞の使用は重要である。細胞を良好な状況に維持するように、ヒト線維芽細胞培地を最適化するよう、気をつけるべきである。適切な細胞密度は、ｈｉＨｅｐ細胞の誘導にとって肝心である。レンチウイルスとの長期のインキュベーションは、ｈｉＨｅｐ細胞の誘導を顕著に低減するので、避けるべきである。成長因子およびＤｅｘの適切な濃度は、ｈｉＨｅｐ細胞の肝臓特徴の維持にとって重要である。p53またはp19Arfの不活性化だけでは、ｈｉＨｅ
ｐ細胞の増殖を改善できない。むしろ、SV40 large T抗原の過剰発現は採用できる。
さらに、増殖性ｈｉＨｅｐ細胞は、他のＲＢファミリー遺伝子（p130とp107）を単独で、或いはp130とRB1またはp107とRB1の組み合わせで、siRNAsにより抑制することによっても得られる、ということは見出された（図１４〜１５）。
前記プロトコルはより少ないＴＦｓで増殖性ｈｉＨｅｐ細胞を生産することにも用いられる。ｈｉＨｅｐ細胞がFOXA3とHNF1、またはFOXA3とHNF4Aを強制発現させることで成功
に得られる、ということは見出された。２ＴＦで誘導されたｈｉＨｅｐ細胞は誘導後、上皮形態を示した（図１７ＡとＢ）。ｑ−ＰＣＲおよび免疫蛍光染色により測定したように、例えばＡＬＢ、ＡＳＧＰＲ１およびトランスフェリンのような成熟肝細胞に特異的な遺伝子の発現は劇的に誘導された（図１６と１７）。図１６〜１７を参照する。
【００９７】
前記実施例および好ましい実施形態の説明は一例だけであり、クレームに記載の本発明を限定するものではない。クレームに示される本発明の範囲を逸脱しない限り、上述の技術特徴の各種の変更や組み合わせが可能である点は、当業者にとって明らかである。このような変更は本発明の範囲からの逸脱とみなされず、全て下記クレームの範囲内に含まれる。本文に引用される参考文献はいずれも、それらの全体をここに取り入れる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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