(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチドの処理のための装置であって、
−  電極のアレイ、
−  関心のあるヌクレオチドの複製を含む少なくとも１つのナノボールであり、前記ナノボールは電極に付着し、該電極は、あるサイズの前記ナノボールを２つ以上付着させることができないようなサイズを有する、ナノボール、及び、
−  前記アレイの電極に選択的に電位を印加して、前記ナノボールを引き寄せる並びに／又は前記ナノボールに含まれない他のヌクレオチドをはね返すように構成された処理回路、
を含む装置。
【請求項２】
ヌクレオチドの処理のための方法であって、
関心のあるヌクレオチドの複製を含む少なくとも１つのナノボールが、電極のアレイのうち１つの電極に付着し、該電極は、あるサイズの前記ナノボールを２つ以上付着させることができないようなサイズを有し、
前記アレイの電極に選択的に電位を印加して、前記ナノボールを引き寄せる並びに／又は前記ナノボールに含まれない他のヌクレオチドをはね返すステップを含む、方法。
【請求項３】
前記ナノボールの内径が、関連する電極の内径の４０％よりも大きい、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記電極のアレイが置かれる反応チャンバを有する容器を含む、請求項１に記載の装置であって、該容器が入口を有し、該入口に、少なくとも２つの異なる試薬リザーバを選択的に連結させることができる、装置。
【請求項５】
前記試薬リザーバは、異なる誘電特徴を有する溶液を含む、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記アレイの電極が、関心のあるヌクレオチドの複製を含む複数のナノボールに曝露され、前記ナノボールは、実質的に該ナノボールのうち１つのみが同時に１つの電極に付着することができるようにサイズを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記アレイの電極が、関心のあるヌクレオチドの複製を含む複数のナノボールに曝露され、前記電極は、個々に又は全体として扱って、表面に浮かぶ溶液から前記ナノボールを特異的に引き寄せることができる、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記ナノボールは、ローリングサークル増幅法によって生成される、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
電極の静電容量が測定されるか又は測定することができる、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
電極へのナノボールの結合が、前記電極での関連する静電容量の変化を介して検出されるか又は検出することができる、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
電極に付着するナノボールへのヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの添加が、前記電極での関連する静電容量の変化を介して検出されるか又は検出することができる、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
前記電極のアレイは、モノヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの異なる溶液に順次曝露される、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
核酸を配列決定するため、分子診断のため、生物学的サンプル分析のため、化学的サンプル分析のため、食物分析のため及び／又は法医学分析のための請求項１に記載の装置の使用。
【請求項１４】
前記ナノボールの内径が、関連する電極の内径の４０％よりも大きい、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アレイの電極が、関心のあるヌクレオチドの複製を含む複数のナノボールに曝露され、前記ナノボールは、実質的に該ナノボールのうち１つのみが同時に１つの電極に付着することができるようにサイズを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記アレイの電極が、関心のあるヌクレオチドの複製を含む複数のナノボールに曝露され、前記電極は、個々に又は全体として扱って、表面に浮かぶ溶液から前記ナノボールを特異的に引き寄せることができる、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ナノボールは、ローリングサークル増幅法によって生成される、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
電極の静電容量が測定されるか又は測定することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
電極へのナノボールの結合が、前記電極での関連する静電容量の変化を介して検出されるか又は検出することができる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
電極に付着するナノボールへのヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの添加が、前記電極での関連する静電容量の変化を介して検出されるか又は検出することができる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記電極のアレイは、モノヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの異なる溶液に順次曝露される、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にＤＮＡ／ＲＮＡのヌクレオチドの順を決定するための、ヌクレオチド配列の処理のための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、異なるＤＮＡプライマーで被覆された複数の電極を含むバイオセンサ装置を開示している。電極の静電容量がモニターされ、静電容量の変化は、複製されたＤＮＡプライマーにヌクレオチドが加えられたことが原因であるとすることが可能にされる。異なるモノヌクレオチドの溶液に電極を順次曝露することによって、どのヌクレオチドが現在添加されているかを制御することができる。１つの電極にて観察された添加を、１つの特定のタイプのプライマーに割り当てることが可能であるように、各電極は１つの種類のプライマーのみで被覆されることが重要である。特許文献１に記載される手順においては、利用可能な電極のうち約３７％のみを、この様式で、単一のタイプのプライマーで被覆することができ、残りの電極は、プライマーを全く含まないか、又は、２つ以上の異なるプライマーを並行して含み、独特の測定信号の解釈を可能にしない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／０４２３９９  Ａ１
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９，２２５−２３２（１９９８）
【非特許文献２】Ａｓｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａ  ｒｅｖｉｅｗ”，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１１，１１，１４２０−１４３０（２０１１）
【非特許文献３】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ”，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＩＳＳＮ：１４３３−７８５１，Ｖｏｌ：４７（３４）２００８，ｐａｇｅ：６３３０−６３３７（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
より効率的な、電極アレイを用いたヌクレオチド配列の処理を可能にする手段を提供することが有利である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この問題は、請求項１に記載の装置、請求項２に記載の方法、及び、請求項１５に記載の使用によって取り組まれる。好ましい実施形態は、従属請求項において開示される。
【０００７】
第１の態様によると、本発明の一実施形態は、ヌクレオチド配列の処理のための装置に関し、当該装置は、以下の構成要素：
−  電極のアレイ、
−  関心のあるヌクレオチド配列の複製を含む少なくとも１つのナノボール、
を含み、上記ナノボールは電極に付着し、その電極には、２つ以上のそのサイズのナノボールを一度に付着させることができない。
【０００８】
当該装置によって行われる処理は、例えば、配列の開裂又はヌクレオチドの鎖の複製等、関心があるヌクレオチド配列のいかなる種類の操作であってもよい。好ましい実施形態において、処理は、未知のヌクレオチドの配列を有するプライマーの、当該配列を決定することを目的とした段階的な複製を含む。この場合、当該装置は、バイオセンサとして構成されている。
【０００９】
処理されるヌクレオチド配列は、例えば、生のサンプル（バクテリア、ウイルス、ゲノムＤＮＡ等）；精製されたゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ等の精製されたサンプル；増幅反応の1つ又は複数の産物；（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又はその類似体、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、バクテリア人工染色体等の）核酸及び関連する化合物等、生物学的な分子化合物；を含んでもよい（が、それらに限定されない）。
【００１０】
「アレイ」という用語は、複数の要素（ここでは電極）の任意の一次元、二次元又は三次元配置を意味するものとする。典型的に、電極アレイは、二次元且つ好ましくは平面でもあり、さらに、電極は、例えば格子又はマトリクスのパターン等、規則的なパターンで配置される。
【００１１】
アレイの電極は、一般に、全て個々に設計されてもよい。しかし、好ましくは、全ての電極又は全ての電極のうち少なくともサブグループが、形状、サイズ及び／又は材料において同じであるか若しくは類似している。電極は導電性であるとし、さらに、所与の電位に設定することが可能であるとする。最も好ましくは、電極のサブグループ又は単一電極でさえも、個々に処理可能であってもよく、すなわち、所望の電位が個々に供給され得る。
【００１２】
「ナノボール」という用語は、一般的に、典型的には約１ｎｍから約１０００ｎｍ、好ましくは約５０ｎｍから約５００ｎｍに及ぶ内径を持つコンパクトな、例えば（ほぼ）球形を有する大分子又は複合体を意味する。ここで及び以下において、物体の「内径」という用語は、その物体内に完全に内接させることができる最大の幾何学的な球体の直径として定義されるものとする。
【００１３】
くだんのナノボールは、ここでは、関心のあるヌクレオチド配列の複製を含むものとする。これらの複製は、（例えば、枝分かれ分子、及び／又は、関心のある配列の複製間に異なる組成のスペーサー要素を有した分子等）他の構成も可能であるけれども、典型的には、連続的な直線のヌクレオチドの鎖において縦に並んで配置される。この縦列反復構造は、ＤＮＡの一本鎖の性質と共に、ナノボールの折り畳み構造を誘発する。
【００１４】
関連する電極へのナノボールの付着は、いかなる適切な作用によっても達成することができる。ナノボールは、例えば、電極の表面に共役結合させてもよく、及び／又は、当該表面上に提供されるあるプライマーに付着させてもよく、及び／又は、疎水性若しくは静電気的相互作用を介して非共有結合させてもよい。
【００１５】
電極表面は、ナノボールの付着を可能にするために化学的に改変することができる。そのような改変は、荷電分子又はポリマーを用いる場合、任意で、その改変が、拡散とは関係なく表面と接触した時に迅速にもたらされるように、電極に適切な電荷を印加することによって支持する及び／又は改善することができ、さらに、均一の薄い層において適用することができる。
【００１６】
上記の種類の装置は、関心のあるヌクレオチド配列の多数の複製を、１つの電極に容易に関連づけることができるという利点を有し、それは、関心のあるヌクレオチド配列の多数の複製が、たった１つのナノボールの付着を用いて添加されるためである。同時に、別のヌクレオチド配列の複製を含み得るいかなる他のナノボールも、同じ電極に付着することはできないということが保証される。これは、自動的に、それぞれの電極が１つの特定の関心のあるヌクレオチド配列のみの専用にされるということを確実にする。この自動的な配列と電極との関連の一意性のため、実質的にアレイの全ての電極にナノボールを提供することが可能であり、従って、処理目的のために全部のアレイが活用される。
【００１７】
単一のナノボールのみが１つの電極に付着する装置が本発明によって含まれるけれども、典型的には、複数のナノボールがあり、複数のナノボールのそれぞれが、複数の電極のうち異なる１つの電極に付着している。上記のように、ナノボールはアレイの各電極に付着するということが最も好ましい。さらに、複数のナノボールのうち、（第１の電極に付着する）少なくとも１つの第１のナノボールは、関心のある第１のヌクレオチド配列の複製を含むということ、及び、（第２の電極に付着する）少なくとも１つの第２のナノボールは、関心のある第２の異なるヌクレオチド配列の複製を含むということが好ましい。このように、関連づけられる電極は、関心のある異なるヌクレオチド配列の処理の専用にされる。全ての付着したナノボールが、関心のある異なる配列の複製を含む場合、電極のアレイは、各電極が別の配列の専用にされるため、最適に活用される。
【００１８】
第２の態様によると、本発明は、ヌクレオチド配列の処理のための方法の一実施形態に関し、関心のある特定のヌクレオチド配列の複製を含む少なくとも１つのナノボールが、電極のアレイのうち１つの電極に付着し、その電極には、１つのそのサイズのナノボールのみが付着することができる。
【００１９】
当該方法及び装置は、同じ発明概念、すなわち、電極と、複製されたヌクレオチド配列のナノボールとの一致という発明概念の異なる具現化である。これらの具現化の１つに対して提供される説明及び定義は、従って、他の具現化に対しても有効である。
【００２０】
以下において、上記の装置にも方法にも関する種々の好ましい実施形態が記載される。
【００２１】
１つの好ましい実施形態において、ナノボールの内径は、関連づけられる電極の内径の約４０％よりも大きい。従って、ナノボールが、他のナノボールの付着をブロックするために電極の全領域を覆うということは必要ではない。
【００２２】
原則として、１つ又は複数の電極に対するナノボールのサイズに上限はない。従って、ナノボールは、電極よりも大きくあってもよく、特に、多数の（例えば４つの）電極を覆っていてもよく、多数の電極のうちそれぞれが、従って、同じ信号を与えるであろう。
【００２３】
一般に、当該装置の電極は、その環境に曝露され得るか又はある媒体内に浸漬され得る外表面上に配置されてもよい。好ましい実施形態によると、当該装置は反応チャンバを有する容器を含み、反応チャンバは関心のある媒体で満たすことができ、さらに、反応チャンバには、（典型的にはチャンバの底面上に）電極が置かれる。
【００２４】
上述の容器は、好ましくは、少なくとも２つの異なる試薬リザーバを選択的に連結させることができる入口を含んでもよい。従って、電極に隣接する媒体は、制御可能に変えることができる。例えば、ポリメラーゼによる複製される鎖へのヌクレオチドの取り込みが観察される（「合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」）とする場合に、試薬リザーバは、純なモノヌクレオチドの溶液を含んでもよい。リガーゼによる複製される鎖へのオリゴヌクレオチドの取り込みが観察される（「核酸連結によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）」）とする場合に、試薬リザーバは、純なオリゴヌクレオチドの溶液を含んでもよい。アデノシンヌクレオチドを有する試薬供給源が、例えば、入口に連結される場合に、容器は、電極に隣接するこれらのヌクレオチドを媒体に提供することになり、電極でのアデノシンヌクレオチドの取り込みの観察を可能にしている。このアプローチに関するさらなる詳細は、参照により本明細書に援用する特許文献１において見つけることができる。
【００２５】
好ましくは、上述の試薬リザーバは、電極によって感知することができる異なる誘電性特徴を有した媒体（例えば緩衝液、緩衝液成分等）を含んでもよい。従って、電極が現在曝露されている媒体を推測することができる。
【００２６】
当該装置の電極は、特に、電極の静電容量の測定を可能にする処理回路に連結されてもよい。電極の静電容量は、新たなヌクレオチドが、電極に付着したナノボール内に取り込まれる場合に変わるため、この取り込みステップを、容量測定によってモニターすることができる。電極の（周囲の媒体に対する）静電容量は、例えば、（好ましくは高周波）負荷に対するその応答（振幅、位相）を介して測定することができる。別の手順は、電極に対する異なる電圧の反復した印加を含んでもよく、この方法で運ばれる電荷の総量が決定される。電極の静電容量を測定するための可能な手順のさらなる詳細は、特許文献１において見つけることができる。
【００２７】
当該方法の好ましい実施形態において、アレイの電極は、関心のあるヌクレオチド配列の複製を含む複数のナノボールに曝露され、上記ナノボールは、複数のナノボールのうち１つのナノボールのみが一度に電極に付着することができるようなサイズを有する。ナノボールのそれぞれは、典型的には、関心のある単一のヌクレオチド配列のみの複製を含んで、その配列に独特に関連づけられる。さらに、複数のナノボールのうち異なるナノボールが、好ましくは、関心のある異なるヌクレオチド配列の複製を含んでもよい（すなわち、第１のナノボールは、関心のある第１の配列を含み、第２のナノボールは、関心のある第２の異なる配列を含む等である）。電極のアレイをそのようなナノボールの反応混液に曝露させることによって、各電極は最終的には関心のある（最大でも）１つの特定のヌクレオチド配列に関連づけられるということが自動的に確実にされ、測定結果の独特の解釈を可能にしている。
【００２８】
当該方法の別の実施形態において、アレイの電極は、関心のあるヌクレオチド配列の複製を含む複数のナノボールに曝露され、上記電極は個々に又は全体として扱って、表面に浮かぶ溶液から上記ナノボールを特異的に引き寄せることができる。このようにして、電極へのナノボールの付着は、制御された方法で行うことができる。
【００２９】
アレイの１つ又は複数の電極に付着する１つ又は複数のナノボールは、好ましくは、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））によって生成されてもよい。ＲＣＡは、環として形成されるヌクレオチド配列が鋳型として役立つ既知の手順であり、その鋳型から、配列の複製の連続した鎖が生成される。この手順の詳細は、（例えば、非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３等の）文献において見つけることができる。ＲＣＡによる１つの種類のナノボール（又は複数の異なるナノボール）の生成は、任意で、電極に隣接した体積内で、又は、別の容器内で発生してもよい。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、電位が、アレイの電極に選択的に印加されて、ナノボール及び／若しくは隣接する媒体の他の成分を引き寄せる並びに／又ははね返してもよい。被覆されていない電極のアレイが、例えば、ナノボールを含む媒体に初めて曝露される場合、適切な電位が電極に印加されて、ナノボールが所望の電極のサブグループにのみ付着することになるということを確実にしてもよい。他の電極は、例えば、参照目的又は別の媒体が提供され得る（例えば参照ヌクレオチド配列を有した）他のナノボールの後の付着のために、ナノボールがないまま残すことができる。従って、理論的には、特定の媒体からのナノボールを各単一の電極に選択的に提供することが可能である。
【００３１】
記載される装置及び方法の典型的な適用において、ナノボールが付着した電極の静電容量が、時間の経過に伴い測定され、さらに、好ましくはモニターされる。次に、静電容量における変化は、電極にて及び／又は付着したナノボールにおいて発生するプロセスに関する情報、特に、上記ナノボールにて現在複製されている鎖へのヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの取り込みに関する情報を提供することになる。さらに、静電容量の変化は、電極へのナノボールの結合を示すことができる。
【００３２】
すでに先に示されているように、電極のアレイは、モノヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの異なる溶液に順次曝露されてもよい。電極にて観察される反応は、従って、それぞれの瞬間に電極に隣接した溶液内にあるモノヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに独特に起因し得る。
【００３３】
本発明は、さらに、核酸を配列決定するため、分子診断のため、生物学的サンプル分析のため、化学的サンプル分析のため、食物分析のため及び／又は法医学分析のための上記の装置の使用に関する。
【００３４】
本発明の前記及び他の態様が、以下に記載の実施形態から明らかになり、さらに、以下に記載の実施形態を参考にして説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明によるバイオセンサ装置の一実施形態を概略的に例示した唯一の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
核酸シーケンシング技術は、急速に改善されており、従って、遺伝学、病理学及び腫瘍学における分子診断のための一般的に好まれる将来の方法になる。しかし、現在利用可能な技術はいずれも、コスト、忠実度及び使い易さという点で日常的な診断的使用に対する要求を満たしていない。多くの合成によるシーケンシング技術は、蛍光でラベルされた可逆性の終結ヌクレオチド（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を使用し、それらのヌクレオチドは、高価であり、さらに、通常のＤＮＡポリメラーゼには化学的によく知られていない。そのヌクレオチド自体ではなく新たなヌクレオチドの取り込み反応を測定する技術は、通常のポリメラーゼ及び通常のラベルされていないヌクレオチドを使用することができ、それは、かなりコストを下げ且つ忠実度を改善するという利点を有する。これの一例は、「４５４シーケンシング」（Ｒｏｃｈｅ）であり、ヌクレオチドの取り込みにて放出されるピロリン酸分子が、可視光を生成する酵素反応によって検出されるが、この酵素反応は、さらなるステップを要求し且つ高価である。別の例は、電極の静電容量がモニターされ、それが、静電容量の変化を、電極上の複製されるＤＮＡプライマーに対するヌクレオチドの添加が原因であるとすることを可能にする技術である（特許文献１）。この方法の不利な点は、電極のほとんどが、プライマーと電極との独特の関連が保証されることとする場合に使用することができないということである。
【００３７】
上記の問題に取り組むために、ここで、平らな（ナノ）電極表面上で読まれることになる分子の増幅されたクローンを置くこと、及び、これらのクローン上に構築される新たなヌクレオチドの容量性の変化を検出することによって、シーケンシングのための容量性の（バイオ）センサを使用することが提案される。この方法において、余分なヌクレオチドの添加の容量性の変化は、信号測定をより長い期間にわたって統合することができ、従って、強固な信号をおそらく与えるように、永続する変化である。さらに、１つの電極あたり１つのナノボールのみの付着を可能にするサイズを有する関心のある複製されるヌクレオチド配列のナノボールが使用される。
【００３８】
図１は、上記の一般原則の一実施形態に従って設計された装置又はバイオセンサ１００、及び、そのようなバイオセンサを用いて実行することができる方法を概略的に例示している。
【００３９】
示された実施形態において、バイオセンサ１００は、処理されることになる媒体（流体）で満たすことができる反応チャンバ１１１を有する容器１１０を含む。この目的のため、容器１１０には、入口１１２及び出口１１３が提供され、入口１１２を介して、媒体を供給することができ、出口１１３を介して、媒体を反応チャンバから除去することができる。
【００４０】
さらに、いくつか個々の試薬リザーバ１４１、１４２、１４３、１４４を有する試薬供給源１４０が提供され、関連する試薬を反応チャンバ１１１内に導入するために、これらのリザーバのそれぞれを入口１１２に選択的に連結することができる。これは、１つずつ異なる試薬を供給し且つその間に洗浄緩衝液を供給するためにマイクロ流体接続によって達成される。
【００４１】
バイオセンサ１００は、反応チャンバ１１１の底面上に（ｘ方向における伸展のみが可視である）二次元アレイで置かれる複数の電極１２０ａ、１２０ｂ…１２０ｅをさらに含む。電極の表面は、好ましくは、平面であり、改変又は被覆を可能にして、ＤＮＡ分子を付着させることができる基板を作るべきである。電極の数は、典型的には、約１００よりも多く、好ましくは約１０００よりも多い。電極は、異なる電位を個々に電極に印加することができる処理回路１３０に個々に連結される。さらに、処理回路１３０は、（周囲の媒体に対する）電極の静電容量を個々に測定することができることとする。これは、例えば、特許文献１に記載された方法を用いて達成されてもよい。
【００４２】
バイオセンサ１００は、以下の様式で、関心のあるヌクレオチド配列のシーケンシングに対して調製及び使用することができる。
【００４３】
第１のステップ（１）において、関心のあるヌクレオチド配列の複製を含むナノボールＮＢが生成される。この生成は、別の容器若しくは（示されているように）チューブ１０１において、又は、反応チャンバ１１１において発生してもよい。ナノボールは、特に、関心のあるヌクレオチド配列１、２の環状の鋳型から始まるローリングサークル増幅法（「ＲＣＡ」）によって生じてもよい（典型的には、アレイ内の電極の数ほどの多くの異なる鋳型が存在することになる）。ＲＣＡは、関心のある配列の縦列重複をもたらし、典型的には、１つの分子において関心のある配列の１００〜１００００コピーを含む大きな一本鎖ＤＮＡ分子が生じるクローン増幅法である。このプロセスの結果として、内径ｄを有するナノボールＮＢが生じ、そのそれぞれが、関心のある特定のヌクレオチド配列の複製を含む。これに関連して、ナノボールの「内径」は、ナノボール内に完全に内接させることができる（１つのナノボールに対して図においてグレーの影で示された）最大の球体の直径として定義される。示されたナノボールＮＢの内径ｄは、典型的には、約１００ｎｍから５００ｎｍに及ぶ。
【００４４】
調製手順の第２のステップにおいて、反応チャンバ１１１内の電極のアレイが、生成されたナノボールＮＢの反応混液に曝露される。これは、電極アレイの電極１２０ａ及び１２０ｂにて（２）で例示されている。電極は、この段階の間に、（ここでは陽電位に対して仮定される）ナノボールを引き寄せるか又は（ここでは陰電位に対して仮定される）ナノボールをはね返す異なる陽又は陰（又は中性）の電位を選択的に受けさせることができる。このように、選択された電極のサブグループへのナノボールの付着を制御することができる。さらに、電極の静電容量の変化は、任意で、このステップの間にモニターされてナノボールの付着を検出し、シーケンシング反応の間の「満たされた」電極の経過を追うことを可能にしてもよい。
【００４５】
ナノボールは通常全て、（典型的には陰である）同じサインのある電荷を保有するため、（緩衝液に応じて）互いに反発することになり、電極にわたってナノボールの間隔をあけることにおいてさらに寄与する。
【００４６】
例えばその内径ｄによって表されるナノボールＮＢの典型的なサイズは、電極１２０ａ〜１２０ｆのサイズに関連して選ばれ、後者のサイズは、例えば、（図における円形の電極に対して例示された）電極の内径ｗによって測定されてもよい。この関係は、１つ又は複数のナノボールのサイズが、２つ以上のナノボールを同時に単一の電極に付着させることができるということを本質的に不可能にするようにある（複数の結合は確信を持って除外されることはほとんどないため、「本質的に」は、９５％を超える、好ましくは９９％を超える確率を有して意味する）。電極の内径ｗに対する典型的な値は、約１００ｎｍから約２００ｎｍに及ぶ。電極間のピッチｐは、典型的には、約４００ｎｍから約８００ｎｍの範囲内にある。一般に、ピッチｐは、ナノボールの直径ｄよりも大きくあるべきである。
【００４７】
上記のサイズ関係は、ナノボールのサイズを所与の電極のサイズに適応させることによって（例えば、適切な時点にてＲＣＡを停止することによって）、所定のナノボールのサイズに適合するサイズを有する電極を製造することによって、又は、両方のアプローチの組合せ（電極のサイズもナノボールのサイズも調整すること）によって実現することができる。第１の選択肢に関して、以下の推定を行うことができる。約１０から１０００ｎｔ（ヌクレオチド）の鋳型の１００倍から１００００倍の増幅によって、約５００００から約５０００００ヌクレオチドのナノボールが生じる。例えば約１〜１００ｎｔ／秒等の既知の速度を有するポリメラーゼを使用することによって、ナノボールサイズを好ましい値まで調整する選択肢が与えられる。
【００４８】
電極１２０ｃにて（３）で例示された、当該手順の任意の第３のステップにおいて、電極の引力ポテンシャルが使用されて、選択された電極表面での付着したナノボールをさらに結合させ且つ平らにし、従って、これらの電極によって生成される容量性信号を改善してもよい。この目的を達成するために、電極の引力ポテンシャルは、任意で、前のステップと比較して増やされてもよい。
【００４９】
電極１２０ｄにて（４）で例示された、当該手順の任意の第４のステップにおいて、反発する電位を電極に印加して、結合していない邪魔な成分Ｘ（「ゴミ」、例えばヌクレオチド又はプライマー等）を電極から除去してもよい。このように、関心のあるナノボールへのヌクレオチドの取り込みに関連しない反応からのノイズを減らすことができる。
【００５０】
この後で、バイオセンサ１００の調製は達成され、さらに、実際の測定、すなわち、電極上の異なるナノボールＮＢによって多数のコピーにおいて含まれる関心のあるヌクレオチド配列１、２のシーケンシングを始めることができる。これは、電極１２０ｅにて（５）で例示されている。
【００５１】
シーケンシング手順の間、反応チャンバ１１１は、試薬リザーバ１４１〜１４４からの試薬媒体で順次満たされる。これらのリザーバのそれぞれは、異なる試薬、例えばモノヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ及びＣのうちの異なる１つを含む（或いは、オリゴヌクレオチドの溶液を使用することができる）。特定のモノヌクレオチド、例えばアデノシンＡを有する溶液が反応チャンバ１１１を満たす場合、特定の電極にて観察される静電容量のいかなる変化も、電極上の関連するナノボールＮＢにおいて複製される鎖へのそのモノヌクレオチドＡの取り込みに独特に起因させることができる。
【００５２】
新たな試薬溶液が反応チャンバ１１１内に導入される前に、（第４のステップにおいて先に示されているように）反発ポテンシャルを電極に印加して、シーケンシング反応の間に取り込まれていない自由なヌクレオチドをはね返すことができる。
【００５３】
単一の分子への単一のヌクレオチドの添加は、検出可能な電極での容量変化をほとんど与えない。頑強さに対して、組み込んだヌクレオチドあたりの検出可能な信号を得るために、同じ分子のクローンを必要とし、その全てに、同じヌクレオチドが添加される。これらのクローンは、例えばローリングサークル増幅法を用いて生成されたナノボールによって上記のアプローチにおいて提供される。ＲＣＡは、大きな自由度の生化学的設計を与え、例えば別のチューブ内の溶液において増幅反応を行う。後に、これらのＤＮＡのナノボールを、バイオセンサ表面上に堆積させ、且つ、表面との特異的又は非特異的相互作用によって付着したまま保持することができる。或いは、第１のプライマーを表面に直接付着させることができ、次に、増幅を行うことができる。
【００５４】
ローリングサークル増幅法に対して鋳型として役立つ円形のＤＮＡは、異なる方法で作ることができる。一例において、ＤＮＡのランダムフラグメントの末端が共に連結され、円を形成する。ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）の使用は、加えて、ターゲットシーケンシングを用いた適用を可能にする。ＲＣＡは、特定の配列のみが増幅されるように、特定のプライマー（セレクター技術）に基づき得る。或いは、ゲノムワイドＲＣＡのクローンを、特定のクローンのみが配列決定されるように、単離のために磁気ビーズ上又は直接バイオセンサ表面上で配列特異的プローブとハイブリッド形成させることができる。また、多数のフラグメントを共に連結させて、１つの円を形成することができる。別の例において、円形のウイルスゲノムを鋳型として直接使用することができる。ＲＣＡ分子を、増幅中又は増幅後に、特異的に修正して、センサ表面への結合のために結合部位を作ることができる。
【００５５】
ＲＣＡを用いて生成された全てのクローンのコピーが１つの分子内にあるように、クローンを操作することができる。バイオセンサに関して、電極上に陽又は陰の電圧を加えることによってナノボールを引き寄せる又ははね返すことができる。ナノボールは、電極と類似のサイズ（典型的には１００〜３００ｎｍ）を有するように調整することができるため、非常に効率的な表面の充填を得ることができ、実質的には全ての電極を満たすが、そのサイズのために、いずれも２つ以上のナノボールを有さない。これは、平均で電極の約１／３のみが使用される以前に記載された方法と比較して大きな改善である。記載される方法を用いると、光学的なシーケンシングに対して可能であるよりも２５倍のポテンシャル密度を得ることができ、それは、単一の実行において同時に読むことができる配列の数に関連する。加えて、ナノボールを、表面上のより平らな構造内に引き寄せることができ、容量測定が可能であるアクティブハイト（ａｃｔｉｖｅ  ｈｅｉｇｈｔ）に適合する。計算によって、十分な速度でのナノボールの電気的移動が、覆われていない電極表面にて電気分解を引き起こさない電圧（１Ｖまで）を用いて可能であるということが示される。特に、典型的なサイズ（２００ｎｍ）及び電荷（１０５ｎｔ、１０５電子電荷に相当）を有するナノボールに対して、１Ｖ及び−１Ｖを電極に印加する場合に、約０．２ｍ／ｓの移動速度が達成され、それは、５０μｍ位のチャンバの高さに対して十分である。
【００５６】
特定の電極又は電極の列に電圧を印加することによって、ナノボールを特定の場所に導くことができる。そのようなものとして、例えば、センサ上の空間順位を作ることができ、事前情報を保つ且つそれをシーケンシング分析において使用することを可能にする。例えば、対照配列の特定の位置を有する、異なるサンプルを同時に測定する、又は、特定の電極を空のまま保持して対照信号を提供することができる。反発する電圧を使用することは、シーケンシング反応において取り込まれていない自由なヌクレオチドをはね返すことに寄与し、その結果、洗浄を改善することができる。
【００５７】
記載される手順において、試薬流体が、例えばプラグ流れの様式において、センサ表面上を順次流される（すなわち、個々の試薬が連続流れで順次供給される場合に、その化学特性によって、又は、マイクロ流体システムの設計及びサイズによって分けられたまま保持される）。異なる流体の区別可能な特徴（例えば、誘電特性）を与えることによって、読み出しにおいて、シーケンシングプロセスの全てのステップに従うことができ、さらに、１つのヌクレオチド添加の信号特性を正確に定めることができる。
【００５８】
要約すると、ヌクレオチド配列の処理のための方法及び装置に関する本発明の一実施形態が記載されてきた。当該装置は、電極のアレイを含み、関心のあるヌクレオチド配列の複製を含む少なくとも１つのナノボールが電極に付着し、その電極には、１つのそのサイズのナノボールのみが同時に付着することができる。このように、関心のあるヌクレオチド配列に対する電極の独特の関連性を達成することができる。ナノボールは、好ましくは、ローリングサークル増幅法によって生成される。電極に対する引力のある及び／又は反発する電位の印加を使用して、ナノボールの付着を制御することができる。電極の静電容量における変化の測定を使用して、異なる溶液によって順次提供されるモノヌクレオチドの、電極にてナノボール内で複製される鎖への取り込みを検出及びモニターすることができる。本発明は、例えば健康管理、腫瘍学及び病理学の分野において等、例えば、診断学に対する核酸変異の検出に対して適用することができる。
【００５９】
本発明は、図面及び上記の説明において詳細に例示及び記述されてきたけれども、そのような例示及び記述は、例示的又は例証的であり、拘束性はないと考慮されることになる。本発明は、開示された実施形態に限定されない。開示された実施形態に対する他の変化は、請求された発明を実行する際に、図面、明細書、及び付随の特許請求の範囲の調査から当業者により理解する及びもたらすことができる。特許請求の範囲において、「含む」という用語は、他の要素又はステップを除外せず、不定冠詞はその複数形を除外しない。１つのプロセッサ又は他のユニットは、特許請求の範囲において列挙されたいくつかの項目の機能を満たすことができる。特定の手段が互いに異なる従属項において記載されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを役立つよう使用することができないと示しているわけではない。コンピュータプログラムは、他のハードウェアと共に若しくはその一部として供給される、光記憶媒体又は固体記憶媒体等、適したメディア上に記憶／分散させてもよいが、インターネット又は他の有線若しくは無線の通信システムを介して等、他の形状で分散させてもよい。特許請求の範囲におけるいかなる参照番号も、その範囲を限定するとして解釈されるべきではない。
【図１】
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