(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡに結合する１０〜２０個のモノマーからなる立体的遮断（ｓｔｅｒｉｃ  ｂｌｏｃｋ）オリゴマーであって、
・ＢＮＡモノマーを含まない６〜１０個の連続したモノマーからなる低親和性領域と、
・少なくとも２５％のＢＮＡモノマーを含む、少なくとも４個のモノマーからなる高親和性領域であって、前記高親和性領域は、連続するモノマーからなるか、または前記低親和性領域に隣接する２つのサブ領域からなる高親和性領域と
からなり、
・前記オリゴマーは５個の連続したＤＮＡモノマーからなる領域を含まず、
・前記低親和性領域は、マイクロＲＮＡのシード配列のＲＮＡ相補体と塩基対を形成可能である、
オリゴマー。
【請求項２】
少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
前記オリゴマーの５’末端および前記オリゴマーの３’末端の両方がＢＮＡモノマーである、請求項１または２に記載のオリゴマー。
【請求項４】
１２〜１８個のモノマーからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項５】
前記マイクロＲＮＡがヒトマイクロＲＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相補的ＲＮＡに結合可能なオリゴマーおよびオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドは科学分野において、例えば細胞内ＲＮＡの検出および分析、または細胞内ＲＮＡの活性の調節のための研究開発において、試薬として有用である。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、治療薬としても開発されている。これらは典型的には、細胞内ＲＮＡに結合し、その活性を調節するようにも意図されている。細胞内ＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドは、本願ではアンチセンスオリゴヌクレオチドとも称される。
【０００３】
いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの標的ＲＮＡの不安定化を誘導することにより、例えば、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を活性化することにより、またはＲＩＳＣ経路を活性化することにより作用する。このようなオリゴヌクレオチドは一般的に、それぞれギャップマーおよびｓｉＲＮＡと呼ばれる。別の分類のオリゴヌクレオチドは立体的遮断剤（ｓｔｅｒｉｃ  ｂｌｏｃｋｅｒ）として作用し、したがって標的ＲＮＡが別の巨大分子と相互作用するのを阻害する。一例は、プレｍＲＮＡのスプライシングを調節するスプライススイッチングオリゴヌクレオチドである。別の例は、マイクロＲＮＡに結合して、そのマイクロＲＮＡが標的とするｍＲＮＡに結合するのを阻害するマイクロＲＮＡ阻害剤である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計、調製および使用についての完全な説明は非特許文献１に見られる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】スタンレー・クルック（Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｃｒｏｏｋｅ）編、「アンチセンスドラッグ技術、原理、戦略および応用（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、第２版
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
所与の標的ＲＮＡと相補的であり、よってその標的ＲＮＡに結合可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することは容易である。しかしながら、治療薬としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発しようとする際には、標的との相補性だけでは不十分である。アンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾して、より薬剤らしい特性、例えば、より高い効力、バイオアベイラビリティおよび生体内安定性を与える必要がある。さらに、多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドの問題点は、好ましくない影響をもたらす可能性があるオフターゲット結合、すなわち意図しないＲＮＡへの結合であることが分かっている。オフターゲット結合を最小限にするために、ＲＮＡトランスクリプトームにおいて１つしか存在しない配列を標的とすることが一般的に試みられている。それでもなお、アンチセンスオリゴヌクレオチドのオフターゲット結合は依然として問題となっている。本発明の目的の一つは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、オフターゲット結合の観点から新規かつ望ましい特性を有する立体的遮断オリゴヌクレオチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、
・低親和性領域、
・高親和性領域、
・高親和性領域中のモノマーは、低親和性領域に用いられるモノマーよりも、ＲＮＡと塩基対を形成したオリゴマーの融解温度（すなわち親和性）を上昇させ、上記融解温度の上昇は、同じ（塩基）配列のＤＮＡモノマーを代わりに使用した場合と比較したものであること
からなるＲＮＡに結合可能なオリゴマーを提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のオリゴマーは、ｍＲＮＡや非コードＲＮＡのような標的ＲＮＡへの結合に有用であり、高親和性領域を介するよりも低親和性領域を介して、オフターゲット結合を生じる傾向が少ないという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａは、意図した標的（オンターゲット）に結合した典型的な立体的遮断オリゴマーを示す。コンセンサス配列は、他のＲＮＡと共通する配列であり、好ましくは細胞内分子、例えばマイクロＲＮＡの結合部位の一部である。コンセンサス配列に隣接する配設はユニーク１と表記されており、これはコンセンサス配列を共有するＲＮＡの間で異なる配列（本願では「特異性配列」とも称する）である。塩基対はオリゴマーと標的との間の線で示されている。オリゴマーは、相補的ＲＮＡに対する親和性を増強するモノマーアナログで均等に修飾され、これらの修飾の位置は、標的への太い（塩基対）線で示されている。オリゴマーは、例えばＢＮＡ／２’Ｏ−メチルＲＮＡオリゴマーであってもよく、その場合、親和性増強アナログはＢＮＡ（二環式核酸（ｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））である。例示したデザインは、オリゴマーの全長にわたって３つごとの位置の、または全ての位置の、あるいは他の繰り返しパターンの比較的均一な親和性を与える親和性増強アナログとしてもよい。Ｇ：Ｃ塩基対はＡ：Ｕ塩基対よりも強力であることは明らかである。しかしながら、簡潔性のため、そのような配列特異的な親和性の差異はこの例では考慮しない。図１Ｂは、意図した標的に結合した、図１ＡのオリゴマーＡと同じ配列であるが親和性増大修飾の分布が不均等である立体的遮断オリゴヌクレオチドを示す。このオリゴマーの相補的ＲＮＡに対する親和性は１Ａのオリゴマーと劇的には変わらない。選択されるモノマーに応じて、全体の親和性は高くも低くもなり得る。図１Ｃは、意図した標的に結合した、図１ＡのオリゴマーＡと同じ配列であるが親和性増大修飾の分布が不均等である更に別の立体的遮断オリゴヌクレオチドを示す。このオリゴマーの相補的ＲＮＡに対する親和性は１Ａまたは１Ｂのオリゴマーと劇的には変わらない。選択されるモノマーに応じて、全体の親和性は高くも低くもなり得る。理論的には、３つのオリゴマーは全て相補的ＲＮＡに対し同様の親和性を有し、したがって細胞や生物において使用した時に同様の効力を有すると予測される。しかしながら、これらは異なるオフターゲットプロファイルを有する（結合するオフターゲットのセットが異なる）。
【図２】図２は図１に示されたものと同じオリゴマーを示すが、意図した標的とコンセンサス配列を共有するオフターゲットに結合している。２Ａのオリゴマーはオフターゲットに対して中程度の親和性を有するのに対し、２Ｂのオリゴマーは、ＢＮＡのような親和性増大修飾の密度が低いことから分かるように、コンセンサス配列と相補的な領域が「低親和性領域」であるため、オフターゲットに対し低い親和性を有する。すなわち、Ｂオリゴマーはコンセンサス配列を含むオフターゲットに結合しにくい。他方、Ｃオリゴマーは「高親和性領域」を介することにより、コンセンサス配列を含むオフターゲットに結合しやすい。
【図３】図３は図１および２に示されたものと同じオリゴマーを示すが、コンセンサス配列を共有しないオフターゲットに結合している。オリゴマーＢは高親和性領域を介して結合するため、最も強く結合するのに対し、オリゴマーＣは低親和性領域を介するため、最も弱く結合することが分かる。すなわち、コンセンサス配列を共有するＲＮＡ標的に対するオリゴマーＢの特異性の向上は、特異性領域を含むＲＮＡ標的への特異性を低下させることで達成される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡや非コードＲＮＡを標的とするオリゴマーを提供する。
本発明の第１の態様は、１０〜４０個のモノマーからなるオリゴマーであって、
・低親和性領域、
・高親和性領域、
・高親和性領域中のモノマーは（全体として）、低親和性領域に用いられるモノマー（全体として）よりも、相補的ＲＮＡと塩基対を形成したオリゴマーの融解温度（すなわち親和性）を上昇させ、上記融解温度の上昇は、同じ（塩基）配列のＤＮＡモノマーを代わりに使用した場合と比較したものであること、
・および、低親和性領域または高親和性領域は５〜１２個の連続するモノマー、例えば５〜１０個、５〜９個、５〜８個、６〜１０個、７〜１０個、８〜１０個、６〜９個または６〜８個の連続するモノマーからなり、他の領域は連続しているか、または上記５〜１２個のモノマーの領域に隣接する２つのサブ領域からなること
を含む（より好ましくは、これらからなる）ＲＮＡに結合するオリゴマーである。
【００１０】
上記で「高親和性領域中のモノマーは…」および「低親和性領域に用いられるモノマー」と述べるとき、個々のモノマーではなく、その領域中のモノマー全体を指していることが理解されよう。したがって、高親和性領域中の個々のモノマーがそれぞれ、低親和性領域に用いられる個々のモノマーよりも融解温度を上昇させるという訳ではない。
【００１１】
好ましくは、高親和性領域中のモノマーは（全体として）、低親和性領域に用いられるモノマーよりも、ＲＮＡと塩基対を形成したオリゴマーの融解温度（すなわち親和性）を少なくとも５℃、例えば、低親和性領域に用いられるモノマーよりも少なくとも５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃上昇させる。上記融解温度の上昇は、同じ配列のＤＮＡモノマーを代わりに使用した場合と比較したものである。
【００１２】
ＲＮＡと塩基対を形成したオリゴマーの融解温度（本願ではｔｍまたはｔｍ値とも称される）について言及するとき、この温度は好ましくは、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０）中で、両方とも１．０μＭ濃度のオリゴマーおよび相補的ＲＮＡを用いて測定される。
【００１３】
好ましい実施形態において、高親和性領域中のモノマーは、低親和性領域中のモノマーよりも、平均して（１モノマー当たりの）融解温度を上昇させる。すなわち、低親和性領域および高親和性領域のｔｍの上昇は、低親和性領域および高親和性領域中のモノマーの数でそれぞれ割られる。低親和性領域のｔｍの上昇はマイナスである場合があることに留意されたい。これは、同じ配列のＤＮＡモノマーを代わりに使用した時と比較してｔｍが低下した場合に該当する。
【００１４】
好ましくは、高親和性領域中のモノマーは、低親和性領域中のモノマーよりも、平均して（１モノマー当たりの）融解温度を少なくとも２℃、例えば３、４、５、６、７または８℃上昇させる。
【００１５】
オリゴマーは典型的にはオリゴヌクレオチドであり、好ましくは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＢＮＡ（特に、ＥＮＡおよびＬＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルおよびそのアナログ、例えばアミノ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、Ｓ−ｃＭＯＥ（２’，４’−拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ＭＯＥ）、Ｒ−ｃＭＯＥ、ｃＥｔ（２’，４’−拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）エチル）、モルホリノ、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ＦＡＮＡ、ＰＮＡ、ＣＥＮＡ、２’ＭＯＥ、２’Ｆ、２’Ｏ−メチル）のような２’，４’−二環式核酸（２’４’−ＢＮＡ））のうちから選択される少なくとも２つの異なる種類のモノマーを含む。
【００１６】
高親和性領域は２’，４’−二環式核酸（２’４’−ＢＮＡ）を含むことが特に好ましい。
別の実施形態において、低親和性領域は、好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ、モルホリノ、ホスホルアミデート、ＦＡＮＡ、ＰＮＡ、ＵＮＡ、２’ＭＯＥ、２’Ｆおよび２’Ｏ−メチルのうちから選択される、２種類のモノマーのみを含む。
【００１７】
別の実施形態において、低親和性領域は、好ましくはモルホリノ、ホスホルアミデート、ＦＡＮＡ、ＰＮＡ、ＵＮＡ、２’ＭＯＥ、２’Ｆおよび２’Ｏ−メチルのうちから選択される、１種類のモノマーのみを含む。
【００１８】
当業者には既知のように、モノマーが異なれば、一般にｔｍに対する効果も異なる。例えば、ＢＮＡのｔｍに対する効果は強く、２’修飾の効果は穏やかである。例えばＵＮＡのようないくつかの修飾は、ｔｍの低下すなわちマイナスの効果すら有する。
【００１９】
この文脈で用いられているように、２’，４’−二環式核酸は、本願ではｔｍに対し強い効果を有するモノマーに分類される。モルホリノモノマー、ホスホルアミデートモノマー、ＦＡＮＡモノマー、ＰＮＡモノマー、ＣＥＮＡモノマー、２’ＭＯＥモノマー、２’Ｆモノマー、２’Ｏ−メチルモノマーは、本願ではｔｍに対し穏やかな効果を有するモノマーに分類される。ｔｍを低下させるモノマーは、例えばＵＮＡ（アンロックド核酸）である。ＤＮＡモノマーおよびＲＮＡモノマーは、本願ではｔｍに関して中立的なモノマーとして分類される（ＤＮＡモノマーは基準モノマーである）。
【００２０】
好ましい実施形態において、低親和性領域では、ｔｍに対し強い効果および／または穏やかな効果を有するモノマーの密度（親和性増大モノマーの数／所与の領域中のモノマーの総数）が、高親和性領域におけるよりも低い。この特徴は通常、例えばオリゴマー内の低親和性領域を特定することにより、本発明のオリゴマーを容易に特定するために利用することができる。
【００２１】
したがって、高親和性／および又は穏やかなモノマーが均等に分布したオリゴマーは、低親和性領域を含まないため、本発明の範囲には含まれないことになる。また、均等な分布から僅かに偏ったオリゴマーも本発明の範囲には含まれない。これは、僅かな偏りは、（オリゴヌクレオチドの融解温度で表される）親和性がそのオリゴマーの残りの部分と実質的に異なるような低親和性の領域を生じるには十分でないためである。
【００２２】
多くの実施形態において、オリゴマーは１つ以上のホスホロチオエート結合を含む。オリゴマーは、例えばホスホロチオエート結合で完全に修飾されてもよいし、例えば各端部において１つ、２つまたは３つのホスホロチオエート結合で修飾されてもよい。ホスホロチオエート結合は一般に融解温度を低下させる。しかしながら、これは２’４’ＢＮＡモノマーを使用することにより防ぐことができる。よって、高親和性領域はホスホロチオエート結合を十分に含むことができる。
【００２３】
オリゴマーの長さおよび親和性
相補的ＲＮＡに対するオリゴマーの全体的な親和性（融解温度によって表される）は、そのオリゴマーの長さおよび親和性増大（場合によっては低下）モノマーの含有量に依存する。本発明の目的は、意図した標的に対する十分な親和性を有し、かつ、意図した標的に対し、同一の配列（つまり共通配列）を共有する他の標的に対するよりも向上した選択性および／または効力を発揮するように、オリゴマーを設計することにある。
【００２４】
オリゴマーの長さは、好ましくは１０〜４０モノマーである。他の実施形態では、この長さは１０〜３５モノマー、１０〜３０モノマー、１０〜２５モノマーである。さらに好ましくは、オリゴマーの長さは１０〜２０モノマー、例えば１１〜１９モノマーまたは１２〜１８モノマーである。
【００２５】
より短い長さを採用する場合、オリゴマーの親和性を高めるモノマーを高密度で使用することが必要である。特に好ましいのは、親和性に対し強い効果を有する２’，４’−二環式核酸（２’４’−ＢＮＡ）である。したがって、好ましい実施形態において、モノマーの少なくとも３０％が、例えばＬＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルおよびそのアナログ、例えばアミノ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、Ｓ−ｃＭＯＥ（２’，４’−拘束ＭＯＥ）、Ｒ−ｃＭＯＥ、ｃＥｔ（２’，４’−拘束エチル）のうちから選択される２’４’−ＢＮＡモノマーである。より好ましくは、少なくとも３５％、例えば少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％または６０％が２’４’−ＢＮＡモノマーである。
【００２６】
ＲＮＡと塩基対を形成したオリゴマーの融解温度は、好ましくは少なくとも６０℃であるべきである。他の実施形態において、オリゴマーのｔｍは少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃または少なくとも９５℃であることが好ましい。
【００２７】
さらに好ましくは、ｔｍは少なくとも７５℃、例えば８０℃、８５℃、９０℃または９５℃である。
一実施形態において、低親和性領域は高親和性領域よりも短い。別の実施形態において、低親和性領域は高親和性領域よりも長い。
【００２８】
低親和性領域および高親和性領域
上述したように、低親和性領域では、ｔｍに対し強い効果および／または穏やかな効果を有するモノマーの密度が高親和性領域におけるよりも低いことが好ましい。
【００２９】
オリゴマーが２’４’−ＢＮＡモノマーを含むとき、これらの密度は例えば高親和性領域において１００％（完全修飾）、５０％（１個の他のモノマーにつき１個のＢＮＡのミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）、例えば１つおきの位置に１個のＢＮＡモノマー）、３３％（２個の他のモノマーにつき（例えば２つおきの位置に）１個のＢＮＡ）、２５％等である。ＢＮＡは、高親和性領域に必ずしも均等に分散されている必要はない。いずれにせよ、低親和性領域は２’４’−ＢＮＡモノマーの低い密度により容易に特定される。高親和性領域が２’４’ＢＮＡモノマーを含むとき、これは典型的には４個の非ＢＮＡモノマーにつき少なくとも１個のＢＮＡを含み、かつ典型的には４個または５個の連続した非ＢＮＡモノマーを含まない。
【００３０】
高親和性領域中の２’４’−ＢＮＡモノマーの量は、そのオリゴマーの低親和性領域中よりも好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは３、４または５倍多い。
好ましい実施形態において、低親和性領域は、２’４’−ＢＮＡ、ＰＮＡ、２’ＭＯＥおよび２’Ｆのうちから選択されるいずれの親和性増強モノマーも含まない。
【００３１】
より好ましくは、低親和性領域は２’４’−ＢＮＡモノマーを全く含まない。
別の実施形態において、低親和性領域は、２’４’ＢＮＡモノマーではない少なくとも５個の連続するモノマー、例えば６個または７個の連続するモノマーを含む。
【００３２】
さらに別の実施形態において、低親和性領域は、ＤＮＡモノマーではない少なくとも５個の連続するモノマー、例えば６個または７個の連続するモノマーを含む。
さらに別の実施形態において、低親和性領域の５’末端および低親和性領域の３’末端はいずれもＢＮＡモノマーではない。さらに好ましくは、低親和性領域の５’末端の２個のモノマーおよびそのモノマーの５’末端の２個のモノマーはいずれもＢＮＡモノマーではない。この特徴は、本発明のオリゴマー内の低親和性領域を決定するのにさらに役立つ。
【００３３】
好ましくは、相補的ＲＮＡに対する低親和性領域の融解温度は７０℃未満、例えば６５、６０、５５、５０、４５、４０および３５℃未満である。本実施形態における融解温度は、低親和性領域に相当する長さの短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＲＮＡに対するｔｍを測定することにより決定してもよく、すなわち、そこでは短縮型ＲＮＡはオリゴマーの高親和性領域と塩基対を形成できない。相補的ＲＮＡに対する低親和性領域の融解温度は、６０℃未満、例えば５５、５０、４５、４０および３５℃未満であることがさらに好ましい。
【００３４】
好ましくは、低親和性領域は連続しており、かつ５〜１２個のモノマー、例えば５〜１０個、５〜９個、５〜８個、６〜１０個、７〜１０個、８〜１０個、６〜９個または６〜８個の連続するモノマーからなる。より好ましくは、６〜１０個の連続するモノマーからなる低親和性領域である。すなわち、好ましい実施形態において、オリゴマーの低親和性領域は、６〜１０個のモノマーの領域にわたってＢＮＡモノマーがないか、または１個だけある領域として特定することができる。ここで、オリゴマーの残りの部分におけるＢＮＡモノマーの密度はＢＮＡモノマーの密度が高く、したがってオリゴマーの残りの部分は高親和性領域である。
【００３５】
使用および利点−選択性
本発明のオリゴマーは、ｍＲＮＡや非コードＲＮＡのような標的ＲＮＡへの結合に有用であり、高親和性領域を介するよりも低親和性領域を介して、オフターゲット結合を生じる傾向が少ないという利点を有する。
【００３６】
例えば、（ｍＲＮＡや非コードＲＮＡのようなＲＮＡ標的内の）１０〜４０個のモノマーからなる２つのＲＮＡ配列であって、１つの領域では同一配列であり、隣接する領域では、５〜１０個のヌクレオチドの長さにわたって例えば１個、２個または３個のヌクレオチドによって配列が異なる２つのＲＮＡ配列を考える。異なる領域は「特異性領域」と称される場合があり、同一領域は「共通領域」と称される場合がある。共通配列を共有し、隣接する特異性領域において異なる複数の標的ＲＮＡが存在することが好都合であり得る。
【００３７】
他の標的（オフターゲット）に対して１つのＲＮＡ配列（意図した標的、本願ではオンターゲットとも称する）に選択的に結合するオリゴマーを設計することが目的である場合、オリゴマーは意図した標的と相補的であるべきことは明らかである。しかしながら、本発明よりも前には、オリゴマーの高親和性領域が（意図した）オンターゲットの特異性領域と相補的であり、低親和性領域が（オフターゲットとオンターゲットとの間で共通する）共通領域と相補的であるような高親和性領域および低親和性を含むオリゴマーを設計し使用することは、自明ではなかった。これにより、ｔｍで表される低親和性により、共通領域を介したオフターゲット結合を最低限にしながら、意図した標的への高親和性が依然として維持される。
【００３８】
一方、ある程度のオフターゲット結合が許容されるか又は却って望ましい場合、オリゴマーの高親和性領域が共通領域と相補的であり、低親和性領域が特異性配列と相補的であるべきである。これにより、共通領域を介したオフターゲット結合が増加する。
【００３９】
本発明のオリゴマーは、均等に修飾された同じ配列のオリゴマーと比較して、必ずしも全体として細胞のトランスクリプトーム中のオフターゲットへの結合が少ないかまたは多い訳ではないことが理解されよう。しかしながら、同じ共通配列を共有するオフターゲットへのこれらの結合は少なくなる（低親和性領域が共通配列と相補的であるため）。潜在的には、これは高親和性領域を介したオフターゲット結合を増加させることで達成され得る。いずれにせよ、本発明のオリゴマーは、均等に修飾された同じ配列のオリゴマーとは異なるオフターゲットプロファイルを有する。
【００４０】
したがって、本発明のオリゴマーは、同じ配列および同様のｔｍ値の均等に修飾されたオリゴマーと比べて、関心のあるオフターゲットの間でオフターゲット結合が少なくなるように、または関心のあるオフターゲットの間でオフターゲット結合が多くなるように設計することができる。
【００４１】
オリゴマーは、その意図した標的と完全な相補性を有することが好ましいことは理解されよう。
以下、本発明のオリゴマーの非自明な特徴および使用についてさらに説明する。
【００４２】
本発明のオリゴマーの活性／メカニズム−立体的遮断
本発明のオリゴマーは、典型的には立体的遮断剤である。すなわち、標的ＲＮＡの分解を仲介することなく標的ＲＮＡに結合する。立体的遮断オリゴヌクレオチドは当分野において十分に説明されており、例えばスプライススイッチングオリゴヌクレオチドおよびマイクロＲＮＡ阻害剤として使用されている。当業者には既知であるように、大部分の人工ヌクレオチドモノマーはＲＮａｓｅ  Ｈをリクルートさせないため、多くのモノマーを立体的遮断オリゴヌクレオチドの設計に使用することができる。例えば「アンチセンスドラッグ技術、原理、戦略および応用（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、第２版、スタンレー・クルック編、第９３頁の２−Ｏ−Ｍｅ、２−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）、および２−Ｏ−アミノプロピル、ホスホルアミデート、およびメチルホスホン酸誘導体、ならびにロックド核酸（ＬＮＡ／２’４’−ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノベースのオリゴマーに関する記述を参照されたい。また、これらのモノマーの混合物もＲＮａｓｅ  Ｈをリクルートさせない。ＲＮａｓｅ  Ｈのリクルートは一般に少なくとも５個の連続するＤＮＡモノマーを必要とし、ほとんどの場合、６、７または８個の連続するモノマーが使われる。したがって、好ましい実施形態において、本発明のオリゴマーは連続するＤＮＡモノマー、例えば５、６、７または８個の連続するＤＮＡモノマーを含まない。
【００４３】
一実施形態において、オリゴマーはモルホリノモノマーを含まない。
別の実施形態において、オリゴマーはＦＡＮＡモノマーを含まない。
別の実施形態において、オリゴマーはＰＮＡモノマーを含まない。
【００４４】
別の実施形態において、オリゴマーはＣＥＮＡモノマーを含まない。
別の実施形態において、オリゴマーは２’ＭＯＥモノマーを含まない。
別の実施形態において、オリゴマーは２’Ｆモノマーを含まない。
【００４５】
別の実施形態において、オリゴマーは２’Ｏ−メチルモノマーを含まない。
さらに別の実施形態において、オリゴマーはホスホルアミデートモノマーを含まない。
好ましい標的ＲＮＡおよび配列
ＲＮＡ結合タンパク質およびＲＮＡ（例えばｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ）のような細胞内巨大分子の結合部位は、同じ細胞内巨大分子の他の結合部位との間で共通する配列をしばしば含む。そのような配列は本願においてコンセンサス配列と称される。上述したように、本発明の目的の一つは、意図した標的（ＲＮＡ）への標的化の点で、意図した標的と配列を共有する他のＲＮＡに対するよりも、向上した（または低下した）選択性を有するオリゴマーを提供することにある。好ましい実施形態において、共通配列はＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡの結合部位であり、また、共通配列はコンセンサス配列によって表されてもよい。
【００４６】
同じ（コンセンサス）配列を共有する他のＲＮＡへのオフターゲット結合を回避または減少させる方法の一つは、標的としてのコンセンサス配列を回避する、すなわち、オリゴマー内にコンセンサス領域と相補的である配列を含まないようにすることであってもよい。しかしそうすると、結合部位は完全には遮断されないため、オリゴマーが結合部位を遮断するように意図される場合、これはオリゴマーの活性を低下させ得る。ほとんどの場合、コンセンサス配列を隣接する配列（１つまたは複数）とともに標的とすることが望ましい。
【００４７】
選択性の向上したオリゴマーが最も好ましい。これらの実施形態において、低親和性領域は好ましくはコンセンサス配列と相補的である。低親和性領域の長さは、好ましくはコンセンサス配列の長さと同じであるか、または１、２、３または４モノマーだけ長い。低親和性領域の５’末端、低親和性領域の３’末端、またはこれら両方に追加のモノマーが付加されてもよい。
【００４８】
好ましいコンセンサス配列は、所与のマイクロＲＮＡのｍＲＮＡ内のマイクロＲＮＡ結合部位であり、これらは概してマイクロＲＮＡの２〜７番目の位置（いわゆるシード配列）に対する相補性を共有するが、この領域外の配列は異なる。すなわちこの例では、結合部位のコンセンサス配列はマイクロＲＮＡのシード配列と相補的な配列である。
【００４９】
別の好ましいコンセンサス配列は、典型的にはシード配列以外で異なっているマイクロＲＮＡファミリーの間で共通するシード配列である。
したがって、好ましい実施形態において、本発明のオリゴマーは、配列番号１〜２０４２のいずれかの１〜７、２〜７、１〜８または２〜８番目の位置と相補的なＲＮＡ配列に結合可能な低親和性領域、または、配列番号１〜２０４２のいずれかの１〜７、２〜７、１〜８または２〜８番目の位置を含むＲＮＡ配列に結合可能な低親和性領域を含む。ただし、これらの位置は５’末端から数えたものである。コンセンサス配列に結合可能な領域は、アンチコンセンサス配列と称される場合があり、したがってオリゴマーの低親和性領域に含まれるか、またはオリゴマーの低親和性領域と同一である。この実施形態において、同じファミリーの他のマイクロＲＮＡに対して１つのマイクロＲＮＡを標的とする時、または同じマイクロＲＮＡの他の結合部位に対して１つのマイクロＲＮＡ結合部位を標的とする時、オリゴマーは選択性を向上させる。
【００５０】
同様に、オリゴマーは選択性を低下させるためにも使用され得る。この実施形態において、本発明のオリゴマーは、配列番号１〜２０４２のいずれかの１〜７、２〜７、１〜８または２〜８番目の位置と相補的なＲＮＡ配列に結合可能な高親和性領域、または、配列番号１〜２０４２のいずれかの１〜７、２〜７、１〜８または２〜８番目の位置を含むＲＮＡ配列に結合可能な低親和性領域を含む。ただし、これらの位置は５’末端から数えたものである。
【００５１】
選択性の向上したオリゴマーが最も好ましい。
【００５２】
【表１−１】
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【００５３】
【表１−２】
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【００５４】
【表１−３】
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【００５５】
【表１−４】
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【００５６】
【表１−５】
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【００５７】
【表１−６】
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【００５８】
【表１−７】
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【００５９】
【表１−８】
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【００６０】
【表１−９】
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【００６１】
【表１−１０】
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【００６２】
【表１−１１】
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【００６３】
【表１−１２】
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【００６４】
【表１−１３】
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【００６５】
【表１−１４】
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【００６６】
【表１−１５】
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【００６７】
【表１−１６】
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【００６８】
【表１−１７】
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【００６９】
【表１−１８】
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【００７０】
【表１−１９】
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【００７１】
【表１−２０】
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【００７２】
【表１−２１】
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【００７３】
【表１−２２】
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【００７４】
【表１−２３】
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【００７５】
【表１−２４】
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【００７６】
【表１−２５】
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【００７７】
【表１−２６】
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【００７８】
【表１−２７】
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【００７９】
【表１−２８】
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【００８０】
【表１−２９】
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【００８１】
【表１−３０】
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【００８２】
【表１−３１】
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【００８３】
【表１−３２】
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【００８４】
【表１−３３】
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【００８５】
【表１−３４】
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【００８６】
【表１−３５】
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【００８７】
【表１−３６】
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【００８８】
【表１−３７】
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【００８９】
【表１−３８】
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【００９０】
【表１−３９】
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【００９１】
【表１−４０】
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【００９２】
【表１−４１】
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【００９３】
【表１−４２】
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【００９４】
【表１−４３】
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【００９５】
【表１−４４】
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【００９６】
【表１−４５】
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【００９７】
【表１−４６】
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【００９８】
【表１−４７】
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【００９９】
【表１−４８】
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【０１００】
【表１−４９】
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【０１０１】
【表１−５０】
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【０１０２】
【表１−５１】
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【０１０３】
【表１−５２】
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【０１０４】
【表１−５３】
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【０１０５】
【表１−５４】
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【０１０６】
【表１−５５】
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【０１０７】
【表１−５６】
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【０１０８】
【表１−５７】
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【０１０９】
【表１−５８】
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【０１１０】
【表１−５９】
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【０１１１】
【表１−６０】
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【０１１２】
【表１−６１】
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【０１１３】
一実施形態において、オリゴマーは、配列番号１０５１の２〜７番目の位置と相補的なＲＮＡ配列に結合可能な低親和性領域を含まない。
さらに別の実施形態において、オリゴマーは配列番号１〜２０４１のいずれにも（その全長にわたって）相補的ではない。
【０１１４】
本発明の特に好ましいオリゴマーは、１０〜２０モノマー長を有し、かつ
・少なくとも２５％のＢＮＡモノマーを含む高親和性領域
・２５％未満のＢＮＡモノマーを含む６〜１０個の連続したモノマーからなる低親和性領域であって、低親和性領域の５’末端の２個のモノマーおよび低親和性領域の３’末端の２個のモノマーが非ＢＮＡモノマーである低親和性領域
・およびオリゴマーは５個の連続したＤＮＡモノマーからなる領域を含まないこと
からなる。
【０１１５】
この実施形態において、高親和性領域および低親和性領域の異なる親和性（上述したとおり）は、低親和性領域中のＢＮＡモノマーの密度に比べて高親和性領域中のＢＮＡモノマーの密度が高いことによって確保される。
【０１１６】
高親和性領域は、好ましくは少なくとも４個のモノマー、より好ましくは少なくとも５、６、７または８個のモノマーからなる。
好ましくは、高親和性領域中のＢＮＡモノマーの密度は、低親和性領域中のＢＮＡモノマーの密度よりも少なくとも２倍高い。より好ましくは、上記密度は少なくとも３倍高く、例えば４倍または５倍高い。
【０１１７】
好ましい実施形態において、低親和性領域はＢＮＡモノマーを全く含まない。
高親和性領域は、好ましくは少なくとも３３％（高親和性領域中の３個のモノマーにつき１個のＢＮＡモノマー）、５０％（２個のモノマーにつき１個のＢＮＡ）、６７％（３個のモノマーにつき２個のＢＮＡ）、（４個のモノマーにつき３個のＢＮＡ）７５％または１００％のＢＮＡモノマーを含む。
【０１１８】
好ましくは、少なくとも１つのヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。別の実施形態において、全てのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。
関連する実施形態において、オリゴマー低親和性領域は８〜１０個の連続するモノマーからなり、オリゴマーの残りのモノマーはＢＮＡモノマーである。
【０１１９】
典型的には、オリゴマーの５’末端およびオリゴマーの３’末端の両方がＢＮＡモノマーである。
オリゴマーは１２〜１８個のモノマーまたは１３〜１７個のモノマーからなるものであってもよい。
【０１２０】
好ましくは、低親和性領域は、マイクロＲＮＡのシード配列と塩基対を形成可能であるか、またはマイクロＲＮＡのシード配列のＲＮＡ相補体と塩基対を形成可能である。ヒトマイクロＲＮＡが好ましい。
【０１２１】
［実施例］
実施例１
本実施例では、様々なオリゴマーについて、意図した標的への、ならびにオフターゲットＲＮＡへの親和性を測定した。最後に、コンセンサス配列からなる標的ＲＮＡへのオリゴマーの親和性を測定した。
【０１２２】
最初に使用した標的ＲＮＡは次のものであった：
【０１２３】
【化１】
0006352269.tif 000063
コンセンサス配列に下線を付している。
【０１２４】
この標的ＲＮＡと相補的なオリゴマーの配列：
【０１２５】
【化２】
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そして、互いに結合すると：
【０１２６】
【化３】
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最初に、下記のオリゴマーを使用した。低親和性領域に下線を付す：
【０１２７】
【化４】
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融解温度は、中程度の塩濃度すなわち１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０）で、両方とも１．０μＭ濃度のオリゴマーおよび相補的ＲＮＡを用いて、ならびに、低塩濃度すなわち１００ｍＭ  ＮａＣｌに代えて１０ｍＭ  ＮａＣｌで測定した。
【０１２８】
【表２】
0006352269.tif 000067
【０１２９】
高塩での測定値については、１２６ＨＣＶｔｍのみがｔｍ値の低さで際立っている。これは、親和性を低下させるＵＮＡモノマーの存在と一致している。
低塩での測定値については、ｔｍ値はＬＮＡモノマーの含有量と良く相関しており、ここでも、１個のＵＮＡモノマーが親和性を顕著に低下させることが分かる。
【０１３０】
次に、同じ標的ＲＮＡに対する別のオリゴマー配列（Ａｌｄｏ  Ａ）の親和性を測定した。このオリゴマーは標的ＲＮＡの同じコンセンサス配列と相補的であるが、この配列の残りの部分では異なる：
【０１３１】
【化５】
0006352269.tif 000068
これらの測定に使用したオリゴマーは次のものであった：
【０１３２】
【化６】
0006352269.tif 000069
【０１３３】
【表３】
0006352269.tif 000070
【０１３４】
この一連の測定において、ＨＣＶ標的は、オリゴマーの意図した標的とコンセンサス標的を共有するオフターゲットとみなすことができる。ここでも、融解温度はＬＮＡの含有量と全体的に相関する。さらに、相補的領域中のＬＮＡの含有量が増加すると親和性が高くなることが分かる。非相補的領域中のＬＮＡ密度が高くなると、融解温度は低下する。オリゴマー１３１を参照されたい。
【０１３５】
続いて、相補的な８ヌクレオチドのコンセンサスＲＮＡに対するオリゴマーの親和性を測定した。この８ヌクレオチドのコンセンサスＲＮＡに対するオリゴマーの親和性は、コンセンサス配列を含むがコンセンサス配列に隣接する領域ではオリゴマーと相補的でないオフターゲットに対するオリゴマーの親和性の指標と考えることができる。
【０１３６】
コンセンサスＲＮＡは次のものであった：
５’ＡＣＡＣＵＣＣＡ
【０１３７】
【表４】
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【０１３８】
示されているように、相補的領域中のＬＮＡ含有量を減らすことにより、より少ないオフターゲット結合（より特異的なオリゴマー）を設計可能である。
同じ設計原理を用いて、コンセンサス配列を含む他の標的配列に対するアンチセンスオリゴマーを設計すれば、概して特異性を向上させることができる。
【０１３９】
よって、上記の実験結果を含む本発明の教示は、特定の配列／標的に限定されるのではなく、一般に適用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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