(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物であって、
【化１】
0006262246.tif 000040
Ｒ１がＣ１２−Ｃ１４アルキルである化合物。
【請求項２】
請求項１記載の化合物において、Ｒ１がＣ１２アルキルである化合物。
【請求項３】
請求項１記載の化合物において、Ｒ１がＣ１４アルキルである化合物。
【請求項４】
請求項１記載の化合物において、式Ｉの化合物が
【化２】
0006262246.tif 000041
である化合物。
【請求項５】
請求項１記載の化合物において、式Ｉの化合物が
【化３】
0006262246.tif 000042
である化合物。
【請求項６】
薬学的組成物であって、
ＲがＣ１２−Ｃ１４アルキルである式ＩＡの化合物と、
【化５】
0006262246.tif 000043
薬学的に許容される担体または希釈剤と、
を有する薬学的組成物。
【請求項７】
請求項６記載の薬学的組成物において、ＲがＣ１２アルキルである薬学的組成物。
【請求項８】
請求項６記載の薬学的組成物において、ＲがＣ１４アルキルである薬学的組成物。
【請求項９】
式ＩＡの化合物を有するナノ粒子であって、
【化６】
0006262246.tif 000044
ＲがＣ１２−Ｃ１４アルキルであるナノ粒子。
【請求項１０】
請求項９記載のナノ粒子であって、さらに、ヒト血清アルブミンを有するナノ粒子。
【請求項１１】
請求項９または１０記載のナノ粒子であって、さらに、ポリ乳酸−グリコール酸を有するナノ粒子。
【請求項１２】
請求項９または１０記載のナノ粒子であって、さらに、ポリエチレングリコールを有するナノ粒子。
【請求項１３】
請求項９または１０記載のナノ粒子であって、さらに、ポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）およびポリオキシエチレン乳酸共重合体を有するナノ粒子。
【請求項１４】
請求項１０記載のナノ粒子において、前記ヒト血清アルブミンはジアルデヒドと架橋するものであるナノ粒子。
【請求項１５】
請求項１４記載のナノ粒子において、前記ジアルデヒドがグルタルアルデヒドであるナノ粒子。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれか１つに記載のナノ粒子を有する凍結乾燥組成物。
【請求項１７】
請求項１６記載の凍結乾燥組成物であって、さらに、１若しくはそれ以上のマンニトール、トレハロース、スクロース、またはＮａＣｌを有する凍結乾燥組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願書類の相互参照
本出願書類は、２０１２年１１月１２日に提出された米国仮出願第６１／７２５，２１３号および２０１３年３月１２日に提出された米国仮出願第６１／７７６，９５１号の利益を請求するものであり、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、癌治療に用いるベンダムスチンのエステルおよびアミドに関する。
【背景技術】
【０００３】
ベンダムスチン，４−［５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチルベンズイミダゾール−２−イル］ブタン酸：
【化１】
0006262246.tif 000002
【０００４】
は、ＲＩＢＯＭＵＳＴＩＮおよびＴＲＥＡＮＤＡの商標名で塩酸塩として販売されており、慢性リンパ性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫などの血液癌の治療に奏功している化合物である。これらの製剤は静脈内注射される。
【０００５】
しかし、固形腫瘍の治療でのベンダムスチンの利用は、前記化合物が水性環境で化学的に不安定であるため、限られている。実際、ベンダムスチンはｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期がわずか約６〜１０分であることが報告されている。その結果、ベンダムスチンの循環血液中濃度は、ベンダムスチンが循環系の外にある腫瘍に到達できるだけの十分な時間、維持されない。ベンダムスチンの循環時間を延長する方法が必要である。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  米国特許出願公開第２０１４／００４５９５０号明細書
（特許文献２）  米国特許出願公開第２０１４／０１２１３８３号明細書
（特許文献３）  米国特許出願公開第２０１５／０２７４６７５号明細書
（特許文献４）  米国特許出願公開第２０１６／００１６９１２号明細書
（特許文献５）  米国特許第７，７５８，８９１号明細書
（特許文献６）  米国特許第７，８２０，７８８号明細書
（特許文献７）  米国特許第７，９２３，５３６号明細書
（特許文献８）  米国特許第８，０３４，３７５号明細書
（特許文献９）  米国特許第８，１３８，２２９号明細書
（特許文献１０）  米国特許第８，２６８，３４８号明細書
（特許文献１１）  米国特許第８，３１４，１５６号明細書
（特許文献１２）  米国特許第８，３４４，００６号明細書
（特許文献１３）  米国特許第８，４３６，１９０号明細書
（特許文献１４）  米国特許第８，４４５，５２４号明細書
（特許文献１５）  米国特許第８，４６１，３５０号明細書
（特許文献１６）  米国特許第８，４８１，７５１号明細書
（特許文献１７）  米国特許第８，６０９，８６３号明細書
（特許文献１８）  米国特許第８，６６９，２７９号明細書
（特許文献１９）  米国特許第８，７９１，２７０号明細書
（特許文献２０）  米国特許第８，８０９，５４９号明細書
（特許文献２１）  米国特許第８，８５３，２６０号明細書
（特許文献２２）  米国特許第８，８８３，８３６号明細書
（特許文献２３）  米国特許第８，８９５，７５６号明細書
（特許文献２４）  米国特許第９，１４９，４６４号明細書
（特許文献２５）  米国特許第９，１５０，５１７号明細書
（特許文献２６）  米国再発行特許発明第４１，８８４号明細書
（特許文献２７）  中国特許出願公開第１０１９６６１５８号明細書
（特許文献２８）  中国特許出願公開第１０２２８１８７１号明細書
（特許文献２９）  国際公開第２０１０／０３６７０２号
（特許文献３０）  国際公開第２０１０／０４２５６８号
（特許文献３１）  国際公開第２０１０／０６３４９３号
（特許文献３２）  国際公開第２０１１／１５１０８７号
（特許文献３３）  国際公開第２０１２／０５９９３５号
（特許文献３４）  国際公開第２０１２／１５４８６１号
（特許文献３５）  国際公開第２０１２／１５８７７６号
（特許文献３６）  国際公開第２０１３／１８９８４７号
（特許文献３７）  欧州特許出願公開第２４６８７１６号明細書
（非特許文献）
（非特許文献１）  ＡＢＲＡＸＡＮＥ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｉｎｓｅｒｔ，Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１４，２４  ｐａｇｅｓ．
（非特許文献２）  ＤＵＢＢＥＬＭＡＮ，Ａ−Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ  ｉｎ  Ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ［１４Ｃ］Ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ"，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．７，（２０１２），ｐｐ．１２９７−１３０７．
（非特許文献３）  Ｅｎｇｌｉｓｈ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＮ  １０１９６６１５８（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ），２０１１．
（非特許文献４）  Ｈａｇｅｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００９，２  ｐａｇｅｓ  ２６９−２７９．
（非特許文献５）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  Ｐａｔｅｎｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０６２３４７，
ｍａｉｌ  ｄａｔｅ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ３１，２０１４，９  ｐａｇｅｓ．
（非特許文献６）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  Ｐａｔｅｎｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６９５５０（１０９８８５−０１６０），ｍａｉｌ  ｄａｔｅ  Ｍａｙ  ２１，２０１５，６  ｐａｇｅｓ．
（非特許文献７）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｗｒｉｔｔｅｎ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０６２３４７，
ｍａｉｌ  ｄａｔｅ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １０，２０１３，１４  ｐａｇｅｓ．
（非特許文献８）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｗｒｉｔｔｅｎ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６９５５０（１０９８８５−０１６０），ｍａｉｌ  ｄａｔｅ  Ｊａｎｕａｒｙ  ２，２０１４，８  ｐａｇｅｓ．
（非特許文献９）  Ｒａｕｔｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｍａｒｃｈ  ２００８，７（３），ｐａｇｅｓ  ２５５−２７０．
（非特許文献１０）  Ｒａｕｔｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｍａｒｃｈ  ２００８，７（３），ｐａｇｅｓ  ２５５−２７０．
（非特許文献１１）  ＳＣＵＴＡＲＵ，Ａｎａ  Ｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｍｅｌｐｈａｌａｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ"，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．５，（２０１１），ｐｐ．１６０４−１６１５．
（非特許文献１２）  ＳＣＵＴＡＲＵ，Ａｎａ  Ｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−Ｌｏｓｔ  Ｄｒｕｇｓ  Ｍｅｌｐｈａｌａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｓｅｔ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ"，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１０，（２０１０），ｐｐ．１７２８−１７４３．
（非特許文献１３）  ＴＲＥＡＮＤＡ  ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ，Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｍａｒｃｈ  ２０１５，７  ｐａｇｅｓ．
（非特許文献１４）  Ｗｒｉｔｔｅｎ  Ｏｐｉｎｉｏｎ，Ｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．１１２０１５０３５６０Ｔ  ｄａｔｅｄ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ８，２０１６．（１０９８８５−０１７８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は式Ｉの化合物に関し、
【化２】
0006262246.tif 000003
【０００７】
式中、Ｒ１はＣ６−Ｃ２４アルキルまたはポリエチレングリコール、またはその薬学的に許容される塩の形態である。式Ｉの化合物を固形および非固形癌腫瘍の治療に利用する方法についても説明される。
【０００８】
また、本発明は式ＩＡの化合物の使用にも関し、
【化３】
0006262246.tif 000004
【０００９】
式中、Ｒ１はＣ６−Ｃ２４アルキルまたはポリエチレングリコール、または固形および非固形癌腫瘍の治療に利用するための、その薬学的に許容される塩の形態である。
【００１０】
本発明はさらに化合物ＩＩＩに関し、
【化４】
0006262246.tif 000005
【００１１】
式中、Ｒ２はＣ１−Ｃ２４アルキレンであり、Ｒ３は−ＣＯＯＣ１−３アルキルであるか、またはＲ２−Ｒ３はＣ１−Ｃ２４アルキルであるか、またはその薬学的に許容される塩の形態である。式ＩＩの化合物を固形および非固形癌腫瘍の治療に利用する方法。
【００１２】
式ＩまたはＩＡの化合物を含むナノ粒子、およびこれらのナノ粒子を有する凍結乾燥組成物も本発明の範囲に入る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、３％ＤＭＳＯ、３０％Ｓｏｌｕｔｏｌ、１００μＬに溶解し、ＣＤ−１マウスに３ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した場合の本発明の特定の実施形態での血漿中濃度を示す。
【図２】図２は、ベンダムスチン塩酸塩および本発明の特定の実施形態がＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を有するマウスの腫瘍容積に対する効果を示す。
【図３】図３は、本発明の特定の実施形態によりＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍Ｓ９を治療後、経時的に観察されたベンダムスチンの量を示している。
【図４】図４は、本発明の特定の実施形態によりＨ４６０非小細胞肺腫瘍Ｓ９を治療後、経時的に観察されたベンダムスチンの量を示している。
【図５】図５は、異なる製剤を用い、ラットに本発明の一実施形態を投与後のラット血漿中のベンダムスチン濃度を示している。
【図６】図６は、異なる製剤を用い、ラットに本発明の一実施形態を投与後のラット血漿中の前記実施形態の濃度を示している。
【図７】図７は、本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１４エステルのナノ粒子のＣｒｙｏ−ＴＥＭ画像を示している。
【図８】図８は、ラットに３０ｍｇ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇのベンダムスチンＣ１２エステルを静脈内投与後、（液剤およびナノ粒子製剤としての）ベンダムスチンおよび本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１２エステルの血漿中濃度を示している。
【図９】図９は、ラットに３０ｍｇ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇのベンダムスチンＣ１２エステルを静脈内投与後、（液剤およびナノ粒子製剤としての）ベンダムスチンおよび本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１２エステルの血中濃度を示している。
【図１０】図１０は、ラットに３０ｍｇ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇのベンダムスチンＣ１２エステルを静脈内投与後、（液剤およびナノ粒子製剤としての）ベンダムスチンおよび本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１２エステルの脳内濃度を示している。
【図１１】図１１は、ラットに３０ｍｇ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇのベンダムスチンＣ１２エステルを静脈内投与後、（液剤およびナノ粒子製剤としての）ベンダムスチンおよび本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１２エステルの肝臓濃度を示している。
【図１２】図１２は、ラットに３０ｍｇ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇのベンダムスチンＣ１２エステルを静脈内投与後、（液剤およびナノ粒子製剤としての）ベンダムスチンおよび本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１２エステルの肺濃度を示している。
【図１３】図１３は、ラットに３０ｍｇ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇのベンダムスチンＣ１２エステルを静脈内投与後、（液剤およびナノ粒子製剤としての）ベンダムスチンおよび本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１２エステルの脾臓濃度を示している。
【図１４】図１４は、ラットに３０ｍｇ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇのベンダムスチンＣ１２エステルを静脈内投与後、（液剤およびナノ粒子製剤としての）ベンダムスチンおよび本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１２エステルの腎臓濃度を示している。
【図１５】図１５は、ラットに３０ｍｇ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇを静脈内投与後、（液体製剤としての）本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１２エステル投与後のラット血漿、血液、および臓器中のベンダムスチン濃度を示している。
【図１６】図１６は、（液体製剤として）ラットに３０ｍｇ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇのベンダムスチンＣ１２エステルを静脈内投与後、本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１２エステルのラット血漿、血液、および臓器中濃度を示している。
【図１７】図１７は、ラットに３０ｍｇ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇを静脈内投与後、（ナノ粒子製剤として）本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１２エステルの投与後のラット血漿、血液、臓器中のベンダムスチン濃度を示している。
【図１８】図１８は、（ナノ粒子製剤として）ラットに３０ｍｇ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇのベンダムスチンＣ１２エステルを静脈内投与後、本発明の一実施形態であるベンダムスチンＣ１２エステルのラット血漿、血液、および臓器中濃度を示している。
【図１９】図１９は、ラットに３０ｍｇ−ｅｑ／ｋｇで１ｍＬ／ｋｇを静脈内投与後、本発明の一実施形態であるベンダムスチンＰＥＧ−２０００エステルおよびベンダムスチンＰＥＧ−５０００エステル投与後のラット血漿中のベンダムスチン濃度を示している。ＴＲＥＡＮＤＡと比較している。
【図２０】図２０は、３ｍｇ／ｋｇ、３％ＤＭＳＯ、３０％Ｓｏｌｕｔｏｌで本発明の実施形態を静脈内投与した後のＣＤ−１マウスの血漿中ベンダムスチン濃度を示している。
【図２１】図２１は、５２，０００倍の倍率で本発明の代表的なナノ粒子の実施形態を示している。サンプル中に、周囲緩衝液よりも均一に濃く見える球形粒子（最も左の矢印）、背景の小さな粒子（最も右の矢印）が観察される。挿入像は、最も左の矢印で示した２つの粒子を拡大して示している。左画像の横線の距離は２８ｎｍ、右挿入像の横線の距離は４３ｎｍである。スケールバー：２００ｎｍ。
【図２２】図２２は、５２，０００倍の倍率で本発明の代表的なナノ粒子の実施形態を示している。サンプル中に、周囲緩衝液よりも均一に濃く見える球形粒子（最も左の矢印）、背景の小さな粒子（最も右の矢印）が観察される。挿入像は、最も左の矢印で示した２つの粒子を拡大して示している。左画像の横線の距離は２８ｎｍ、右挿入像の横線の距離は４３ｎｍである。スケールバー：２００ｎｍ。
【図２３】図２３は、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、ベンダムスチン、およびベンダムスチンＣ１２エステルナノ粒子投与後の腫瘍容積を示している。
【図２４】図２４は、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、ベンダムスチン、およびベンダムスチンＣ１２エステルナノ粒子投与後の体重測定値を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ベンダムスチンのカルボン酸構造をＣ１−Ｃ２４アルキルエステル基、ポリエチレングリコールエステル基、またはＣ１−Ｃ２４アルキルアミド基に変換することで、ベンダムスチンの循環時間が長くなることが発見された。いかなる特定の理論に縛られることも望まないが、エステルまたはアミド構造は前記ベンダムスチン分子の溶解性を低下させ、水性環境への保護作用が得られると推定される。時間とともに前記エステルまたはアミド構造は加水分解され、前記活性ベンダムスチン分子のカルボン酸構造が露出する。全体的な結果として、時間とともにベンダムスチンが形成される。
【００１５】
前記エステル／アミド構造の炭素数を変化させることで、得られたベンダムスチン誘導体の親油性を変化させることができる。親油性の上昇は、前記エステル／アミドの安定性向上、およびベンダムスチンの血中循環時間延長と関連していた。
【００１６】
本発明の範囲内で、式ＩＡの化合物は
【化５】
0006262246.tif 000006
【００１７】
であり、式中、ＲはＣ１−Ｃ２４アルキルまたはポリエチレングリコール、またはその薬学的に許容される塩の形態である。式ＩＡの化合物は、患者において、固形または非固形癌腫瘍の治療に有用である。
【００１８】
本発明の化合物は、式ＩＡの化合物、またはその薬学的に許容される塩の形態、および薬学的に許容される担体または希釈剤を有する薬学的組成物に製剤化することができる。本発明の好適な薬学的組成物では、ＲがＣ１０−Ｃ２４アルキルである。好ましくは、ＲはＣ１０アルキルである。また好ましくは、ＲはＣ１２アルキルである。他の好適な実施形態には、ＲがＣ１４アルキルのものが含まれる。ＲがＣ１６アルキルの組成物も好ましい。
【００１９】
本発明の他の実施形態には、式ＩＡの化合物を有するナノ粒子を含む。
【００２０】
また、患者において固形または非固形癌腫瘍を治療する方法であって、式ＩＡの化合物を前記患者に投与する工程を有する方法も、本発明の範囲内である。好適な固形または非固形腫瘍には、慢性リンパ球性白血病、ホジキン病、無痛性非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫）、侵攻型非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、乳癌または肺癌（小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）など）を含む。例えば、肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、精巣癌、黒色腫、神経膠芽細胞腫、大腸癌、頭部および頸部癌、卵巣癌、および前立腺癌など、他の固形および非固形癌腫瘍も本発明の化合物および組成物を投与することを想定している。例えば、乳癌、膵癌、および胃癌など、他の固形および非固形癌腫瘍も本発明の化合物を投与可能であると想定している。
【００２１】
本発明の好適な化合物は、式Ｉの化合物：
【化６】
0006262246.tif 000007
【００２２】
であり、式中、ＲはＣ６−Ｃ２４アルキルまたはポリエチレングリコール、またはその薬学的に許容される塩の形態である。式Ｉの化合物は、患者において、固形または非固形癌腫瘍の治療に有用である。
【００２３】
好適な実施形態において、Ｒ１はＣ８−Ｃ２４アルキルである。他の実施形態において、Ｒ１はＣ１０−Ｃ２４アルキルである。さらに他の実施形態において、Ｒ１はＣ１２−Ｃ２４アルキルである。またさらに他の実施形態において、Ｒ１はＣ１４−Ｃ２４アルキルである。Ｒ１がＣ１６−Ｃ２４アルキルである式Ｉの化合物も好ましい。他の実施形態において、Ｒ１はＣ１８−Ｃ２４アルキルである。
【００２４】
他の実施形態において、Ｒ１はＣ１０アルキルである。さらに他の実施形態において、Ｒ１はＣ１２アルキルである。またさらに他の実施形態において、Ｒ１はＣ１４アルキルである。他の実施形態において、Ｒ１はＣ１６アルキルである。
【００２５】
また、式Ｉの化合物および薬学的に許容される担体または希釈剤を有する薬学的組成物も本発明の範囲内である。
【００２６】
本発明の他の実施形態には、式Ｉの化合物を有するナノ粒子を含む。
【００２７】
患者に式Ｉの化合物を投与する工程を有する、癌を治療する方法も本発明の範囲内である。固形腫瘍が関与する癌、および固形腫瘍が関与しない癌を含む多数の癌が、そのような治療が可能であると考えられる。これらの癌には、慢性リンパ球性白血病、ホジキン病、無痛性非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫）、侵攻型非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、乳癌または肺癌（小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）など）を含む。本発明の化合物および組成物を投与可能であると想定しているさらなる癌は、固形腫瘍があることで特徴付けられる癌であり、肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、精巣癌、黒色腫、神経膠芽細胞腫、大腸癌、頭部および頸部癌、卵巣癌、および前立腺癌を含む。例えば、乳癌、膵癌、および胃癌など、他の固形および非固形癌腫瘍も本発明の化合物を投与可能であると想定している。
【００２８】
本発明の特に好ましい化合物には以下の化合物を含む：
【化７】
0006262246.tif 000008
0006262246.tif 000009
0006262246.tif 000010
【００２９】
また、式ＩＩの化合物：
【化８】
0006262246.tif 000011
【００３０】
も本発明の範囲内であり、式中、Ｒ２はＣ１−Ｃ２４アルキレンであり、Ｒ３は−ＣＯＯＣ１−３アルキルであるか、またはＲ２−Ｒ３はＣ１−Ｃ２４アルキルであるか、またはその薬学的に許容される塩の形態である。式ＩＩの化合物は、患者において、固形または非固形癌腫瘍の治療に有用である。
【００３１】
式ＩＩの化合物の好適な実施形態では、Ｒ２−Ｒ３はＣ８−Ｃ２４アルキルである。他の実施形態において、Ｒ２−Ｒ３はＣ１０−Ｃ２４アルキルである。またさらに他の実施形態において、Ｒ２−Ｒ３はＣ１２−Ｃ２４アルキルである。さらに他の実施形態において、Ｒ２−Ｒ３はＣ１４−Ｃ２４アルキルである。Ｒ２−Ｒ３がＣ１６−Ｃ２４アルキルである場合も好ましい。他の実施形態において、Ｒ２−Ｒ３はＣ１８−Ｃ２４アルキルである。
【００３２】
好ましくは、式ＩＩの化合物のＲ２−Ｒ３はＣ１０アルキルである。また好ましくは、Ｒ２−Ｒ３はＣ１２アルキルである。他の実施形態において、Ｒ２−Ｒ３はＣ１４アルキルである。さらに他の実施形態において、Ｒ２−Ｒ３はＣ１６アルキルである。
【００３３】
他の実施形態において、Ｒ２はＣ２アルキレン、Ｒ３は−ＣＯＯＣＨ３である。
【００３４】
式ＩＩの好ましい化合物は、以下のものを含む。
【００３５】
【化９】
0006262246.tif 000012
【００３６】
また、式ＩＩの化合物および薬学的に許容される担体または希釈剤を有する薬学的組成物も本発明の範囲内である。
【００３７】
本発明の他の実施形態には、式ＩＩの化合物を有するナノ粒子を含む。
【００３８】
本発明の一実施形態では、本発明の化合物および組成物を用い、例えばアルキル化剤など、１もしくはそれ以上の化学療法剤に耐性を示す患者を治療する。患者が耐性を生じる可能性がある典型的なアルキル化剤には、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン、スルホン酸アルキル、トリアゼン、ピペラジン、およびニトロソウレアを含む。患者が耐性を生じる可能性がある様々なタイプの化学療法剤のより具体的な例を以下に示す。これらの薬物の１もしくはそれ以上に耐性を持つ患者は、本発明の化合物および組成物を用いた治療の利益を受けるだろう。
【００３９】
ナイトロジェンマスタード
Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）の商標名で販売されているメクロレタミンは、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫の治療に、また乳癌および肺癌の待機的療法として注射投与され、菌状息肉症（皮膚Ｔ細胞性リンパ腫）の皮膚病変の局所治療として投与される。
【００４０】
Ｉｆｅｘ（登録商標）の商標名で販売されているイホスファミドは、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫、および再発精巣癌および胚細胞腫瘍、肉腫、肺癌、膀胱癌、頭頸部癌、および子宮頸癌の治療に使用される。
【００４１】
メルファランはＡｌｋｅｒａｎ（登録商標）の商標名で販売されている化学療法剤であり、Ｌ−ＰＡＭまたはフェニルアラニン・マスタードとも呼ばれる。多発性骨髄腫、卵巣癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、および乳癌の治療に用いられる。
【００４２】
クロランブシルはＬｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）の商標名で販売され、慢性リンパ性白血病、リンパ肉腫を含む悪性リンパ腫、巨大濾胞性リンパ腫、およびホジキン病の治療に最も広く利用されている。また、非ホジキンリンパ腫、乳癌、卵巣癌および精巣癌、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、血小板血症、および絨毛癌の治療に奏功している。
【００４３】
シクロホスファミドはＣｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標）として販売され、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、乳癌、精巣癌、子宮内膜癌、卵巣癌、および肺癌の治療に用いられる。
【００４４】
ニトロソウレア
ストレプトゾシンはＺａｎｏｓａｒ（登録商標）の商標名で販売され、膵島細胞膵癌の治療に用いられる。
【００４５】
カルムスチンはＢｉＣＮＵ（登録商標）またはＢＣＮＵとしても知られ、何らかの脳腫瘍、神経膠芽細胞腫、脳幹神経膠腫、髄芽腫、星細胞腫、脳室上衣細胞腫、および転移性脳腫瘍に使用される。多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、肺癌、大腸癌の治療にも使用される。
【００４６】
ロムスチンはＣＣＮＵまたはＣｅｅＮＵ（登録商標）としても知られ、原発性および転移性脳腫瘍、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫の治療に用いられ、黒色腫、肺癌、および大腸癌にも使用されてきた。
【００４７】
スルホン酸アルキル
ブスルファンはＢｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）およびＭｙｌｅｒａｎ（登録商標）の商標名で販売され、慢性骨髄性白血病の治療に使用される。
【００４８】
トリアジン
ダカルバジンはＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）の商標名で販売され、転移性悪性黒色腫、ホジキン病、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、島細胞癌、および甲状腺髄様癌の治療に使用される。
【００４９】
テモゾロマイドはＴｅｍｏｄａｒ（登録商標）の商標名で販売され、特殊なタイプの脳腫瘍、退形成星細胞腫、および多形性膠芽腫の治療に使用される。
【００５０】
エチレンイミン
チオテパはＴｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）の商標名で知られ、乳癌、卵巣癌、ホジキン病、および非ホジキンリンパ腫の治療に用いられるアルキル化剤である。
【００５１】
アルトレタミンはＨｅｘａｌｅｎ（登録商標）の商標名で販売され、ヘキサメチルメラミンまたはＨＭＭとも呼ばれる。卵巣癌の治療に用いられる。
【００５２】
本明細書で使用するとおり、「Ｃ１−Ｃ２４アルキル」は直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素基を指し、１〜２４個の炭素原子を含む。代表的なアルキル基には、これに限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ドデシルなどを含む。本発明の範囲内では、「Ｃ１−Ｃ２４アルキル」が「シクロアルキル」も含み、これは単環式、二環式、三環式飽和炭化水素、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロブチル、ビシクロ［２．１．１］ヘキサン、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、アダマンチルなどを指す。
【００５３】
本明細書で使用するとおり、「ポリエチレングリコール」は「ＰＥＧ」とも呼ばれ、一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−またはＨ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＣＨ３のポリマーを指し、式中、ｎは４以上である。好適なＰＥＧは分子量の平均が約２００〜約５０００ダルトンであり、より好ましいＰＥＧは約２０００〜約５０００ダルトンである。
【００５４】
本明細書で使用するとおり、「薬学的に許容される担体または希釈剤」は、生理学的に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、充てん剤、分解防止剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指す。薬学的に許容される担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、トレハロースおよびスクロースなどの糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、糖とポリアルコールの混合物、および塩化ナトリウムの１もしくはそれ以上を含む。薬学的に許容される担体は、さらに湿潤剤または乳化剤などの補助剤、保存剤、および緩衝液を含んでもよい。
【００５５】
本明細書で使用するとおり、「薬学的組成物」は医学的または獣医学的使用において投与に適した組成物を指す。そのような化合物は、好ましくは１もしくはそれ以上の担体および／または希釈剤と併用した本発明の化合物を含む。そのような組成物は「製剤」とも呼ばれる。
【００５６】
本明細書で使用するとおり、「投与」は、本発明の化合物を患者に送達することのできる、当該分野内のすべての方法を指す。好適な投与方法には、局所投与、つまり、本発明の化合物を直接、前記化合物の作用が望ましい部位に投与すること、および全身投与を含む。投与方法の例には、これに限定されるものではないが、経口、腸内、舌下、唇下、皮下、経鼻、静脈内、動脈内、筋肉内、および腹腔内投与を含む。
【００５７】
本明細書で使用するとおり、「固形腫瘍」は組織の限局性腫瘤である悪性腫瘍を指す。固形癌腫瘍の例には、リンパ腫、肉腫、癌を含み、乳癌、脳腫瘍、骨癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌などを含む。
【００５８】
本明細書で使用するとおり、「非固形腫瘍癌」は最も一般的には血液癌、つまり血液の悪性癌を指す。非固形腫瘍癌の例には、慢性リンパ性白血病、ホジキン病、無痛性非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫）、多発性骨髄腫などを含む。
【００５９】
本明細書で使用するとおり、「ナノ粒子」は、Ｍａｌｖｅｒｎのゼータサイザーによる測定で平均径が約０．２μｍ以下、好ましくは約０．１μｍ以下の粒子を指す。
【００６０】
実験項
４−｛５−［ビス−（２−クロロ−エチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−酪酸メチルエステル（ベンダムスチンＣ１エステル）の調製：
方法Ａ：１Ｌの三つ口丸底フラスコにオーバーヘッドスターラー、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）下の冷却管、温度コントローラー付き熱電温度計を取り付け、４−（５−アミノ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−酪酸メチルエステル（１０．２ｇ、４１．２ｍｍｏｌ、１．０当量）およびクロロ酢酸（８１．９ｇ、８６６ｍｍｏｌ）、および２０ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を入れた。スラリーを水道水浴で攪拌し、全ての固体を溶解させた。ボラン−ＴＨＦ（２８８ｍＬ、２８８ｍｍｏｌ）を２５分かけて別の漏斗からゆっくりと加えた。ＢＨ３−ＴＨＦを加え終わったら、得られた反応液を室温で１．５時間攪拌し、続いて４５分間、加熱マントルにより５８℃に加熱した。前記反応液を冷却し、一晩室温に置いてから、メタノール（１０ｍＬ）でクエンチした。得られた溶液をロータリーエバポレーターで留去することにより重量を約１／３に濃縮し、氷水浴中、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ８〜９に中和した。固体を減圧ろ過により回収し、水（２００ｍＬ）で洗い、希釈した炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で２０分間、再スラリー化した。ろ過後、室温で一晩、室内用真空装置を用いて乾燥させ、黄褐色固体（９．６ｇ、収率６３％、純度９３Ａ％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．３２（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．９２（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．７０（ｂｒ  ｓ、８Ｈ）、３．６６（ｓ、３Ｈ）、３．５９（ｓ、３Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４８（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ、ＤＭＳＯと部分的に重複）、２．０１（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）；ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）３７２（Ｍ＋１）、ｍｐ６０〜６３℃、分解。
【００６１】
方法Ｂ：加熱マントル、熱電温度計、冷却管、窒素注入口／排出口、およびオーバーヘッドスターラーを取り付けた２Ｌの三つ口ガラス容器に、ベンダムスチン塩酸塩（５０．０ｇ、１２６．７ｍｍｏｌ、１．０当量）、メタノール（５００ｍＬ）、およびメタンスルホン酸（２．４７ｍＬ、３８．１ｍｍｏｌ）を入れた。前記反応混合物を加熱環流し、１時間６５℃で攪拌した。前記反応液を４０℃に冷却し、減圧濃縮した。濃縮した残渣に水（５００ｍＬ）を加え、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（１５０ｍＬ）を用いて前記混合物を１．５時間でｐＨ６に中和した。前記生成物をろ取し、水（１５０ｍＬ）で洗い、４０℃で減圧乾燥し、白色粉末状固体４４．２ｇが得られ（収率９４％）、純度はＨＰＬＣで９８．４Ａ％であった。
【００６２】
４−｛５−［ビス−（２−クロロ−エチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−酪酸エチルエステル（ベンダムスチンＣ２エステル）の調製：
方法Ａ：加熱マントル、熱電温度計、冷却管、窒素注入口／排出口、オーバーヘッドスターラーを取り付けた１Ｌの三つ口ガラス容器に、ベンダムスチン塩酸塩（３０．０ｇ、７６ｍｍｏｌ、１．０当量）、エタノール（３００ｍＬ）、およびメタンスルホン酸（１．４８ｍＬ、２２．８ｍｍｏｌ）を入れた。前記反応混合物を１時間７０℃で加熱した。前記反応液を４０℃に冷却し、減圧濃縮した。濃縮した残渣に水（３００ｍＬ）を加え、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（１１５ｍＬ）を用いて前記混合物を１．５時間でｐＨ６に中和した。前記生成物をろ取し、水（１００ｍＬ）で洗い、４０℃で減圧乾燥すると、白色固体２８．６ｇが得られ（収率９７％）、純度はＨＰＬＣで９９．２Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．３２（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．９２（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．０４（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．１２Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０（ｂｒ  ｓ、８Ｈ）、３．６６（ｓ、３Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４５（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ、ＤＭＳＯと部分的に重複）、２．００（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．１８（ｔ、Ｊ＝７．１２Ｈｚ、３Ｈ）。
【００６３】
方法Ｂ：加熱マントル、熱電温度計、冷却管、窒素注入口／排出口、およびオーバーヘッドスターラーを取り付けた５００ｍＬの三つ口ガラスフラスコに、４−（５−アミノ−１−メチル−１Ｈ−ベンイミダゾール−２−イル）−酪酸エチルエステル（６．４ｇ、１．０当量）、クロロ酢酸（４２．５ｇ）、およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１３ｍＬ）を入れた。得られた混合物を水浴中、室温で１．５時間攪拌した。ボラン−ＴＨＦ（１５０ｍＬ）を２０分かけて加えた。入れ終わったら、反応混合物を５５〜５８℃に加熱し、１．５時間攪拌した。ＨＰＬＣによる工程分析では、望みの生成物が９４Ａ％であることを示していた。前記反応物を室温に冷却し、次の段階の加水分解まで短縮し、ベンダムスチンを作成した。
【００６４】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−酪酸ブチルエステル（ベンダムスチンＣ４エステル）の調製：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコにオーバーヘッドスターラー、熱電温度計、温度コントローラーを取り付けて、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）とし、１０．０ｇ（２５．３４ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、１．９ｇ（２．３５ｍＬ、２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）の１−ブタノール、５．３ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１００ｍＬのＭＤＣ、および０．３１ｇ（２．５４ｍｍｏｌ、０．１当量）のＤＭＡＰを入れた。前記反応液を室温で一晩攪拌し、工程分析は反応が終了したことを示していた。固体は減圧ろ取し、２５ｍＬのＭＤＣで洗った。ろ液を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×１００ｍＬ）、ＤＩ水（１×１００ｍＬ）、および食塩水（１×１００ｍＬ）で洗ってから硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し、減圧乾固すると、茶色の油状物質が得られた。前記油状物質を２５ｍＬのＭＤＣですりつぶし、固体不純物を減圧ろ過により取り除き、２５ｍＬのＭＤＣで洗った。前記ろ液を濃縮して減圧乾固し、透明な淡褐色の油状物質として生成物９．５ｇ（２２．８ｍｍｏｌ、９０％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９４．５Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．１７（ｄ、Ｊ＝８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、Ｊ＝２．３２Ｈｚ、１Ｈ）、６．７７（ｄｄ、Ｊ＝２．３６、８．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５（ｔ、Ｊ＝６．７６Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｍ、４Ｈ）、３．６９（ｓ、３Ｈ）、３．６３（ｍ、４Ｈ）、２．９１（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４９（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．１８（ｍ、２Ｈ）、１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．３２（ｍ、２Ｈ）、０．８９（ｔ、Ｊ＝４．５６Ｈｚ、３Ｈ）。
【００６５】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−酪酸ヘキシルエステル（ベンダムスチンＣ６エステル）の調製：
方法Ａ：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコにオーバーヘッドスターラー、熱電温度計、温度コントローラーを取り付けて、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）とし、１０．０ｇ（２５．３４ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、２．６２ｇ（３．２２ｍＬ、２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）の１−ヘキサノール、５．３ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１００ｍＬのＭＤＣ、および０．３１ｇ（２．５４ｍｍｏｌ、０．１当量）のＤＭＡＰを入れた。前記反応液を室温で一晩攪拌し、この時点で工程分析は前記反応が終了したことを示していた。固体は減圧ろ取し、２５ｍＬのＭＤＣで洗った。ろ液を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×１００ｍＬ）、ＤＩ水（１×１００ｍＬ）、および食塩水（１×１００ｍＬ）で洗ってから硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し、減圧乾固すると茶色の油状物質が得られた。前記油状物質を２５ｍＬのＭＤＣですりつぶし、固体不純物を減圧ろ過により取り除き、２５ｍＬのＭＤＣで洗った。前記ろ液を濃縮して減圧乾固し、透明な淡褐色の油状物質として生成物８．９１ｇ（２０．１ｍｍｏｌ、７９％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９１．９Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．１７（ｄ、Ｊ＝８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、Ｊ＝２．３２Ｈｚ、１Ｈ）、６．７７（ｄｄ、Ｊ＝２．３６、８．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５（ｔ、Ｊ＝６．７６Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｍ、４Ｈ）、３．６９（ｓ、３Ｈ）、３．６３（ｍ、４Ｈ）、２．９１（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４９（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．１８（ｍ、２Ｈ）、１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．３２（ｍ、６Ｈ）、０．８９（ｔ、Ｊ＝４．５６Ｈｚ、３Ｈ）。
【００６６】
方法Ｂ：オーバーヘッドスターラー、熱電温度計、および窒素注入口／排出口を取り付けた１Ｌの四つ口丸底フラスコに、３０ｇ（７６．０ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩および３００ｍＬのジクロロメタンを入れた。攪拌を開始し、１０．６ｍＬ（７．６９ｇ、７６．０ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンをシリンジで加えてから、室温で１５分間攪拌し、この後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、２１．８６ｇ、１１４ｍｍｏｌ）およびｎ−ヘキシルアルコール（９．５７ｍＬ、７．８４ｇ、７６．８ｍｍｏｌ）を加えた。２０分間攪拌後、混濁した白色反応混合物が透明な溶液となった。室温で２２．５時間、３０℃で１時間、ＨＰＬＣ分析により反応が終了するまで攪拌を続けた。ＤＩ水（３００ｍＬ）を加えて前記反応液をクエンチし、ｐＨを１Ｎ  ＨＣｌにより６に調整した。相分離し、水相をジクロロメタン（１００ｍＬ）で抽出してから、有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過および濃縮して減圧乾固した後、透明な黄色油状物質が得られ、これをカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中酢酸エチル２５〜５０％）により精製した。合計１６．５ｇ（３７．３ｍｍｏｌ、４９．１％）を濃い黄色油状物質として回収し、ＨＰＬＣによる純度は９９．１Ａ％であった。
【００６７】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−酪酸オクチルエステル（ベンダムスチンＣ８エステル）の調製：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコにオーバーヘッドスターラー、熱電温度計、温度コントローラーを取り付けて、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）とし、１０．０ｇ（２５．３４ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、３．３３ｇ（４．０３ｍＬ、２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）の１−オクタノール、５．３ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１００ｍＬのＭＤＣ、および０．３１ｇ（２．５４ｍｍｏｌ、０．１当量）のＤＭＡＰを入れた。前記反応液を室温で一晩攪拌し、この時点で工程分析は反応が終了したことを示していた。固体は減圧ろ取し、２５ｍＬのＭＤＣで洗った。ろ液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×１００ｍＬ）、ＤＩ水（１×１００ｍＬ）、および食塩水（１×１００ｍＬ）で洗ってから硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し、減圧乾固すると、茶色の油状物質が得られた。前記油状物質を２５ｍＬのＭＤＣですりつぶし、固体不純物を減圧ろ過により取り除き、５ｍＬのＭＤＣで洗った。前記ろ液を濃縮して減圧乾固し、透明な淡褐色の油状物質として生成物９．７ｇ（２０．５ｍｍｏｌ、８１％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９１．９Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．１７（ｄ、Ｊ＝８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、Ｊ＝２．２８Ｈｚ、１Ｈ）、６．７７（ｄｄ、Ｊ＝２．４、８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｍ、４Ｈ）、３．６９（ｓ、３Ｈ）、３．６３（ｍ、４Ｈ）、２．９１（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４９（ｔ、Ｊ＝７．１２Ｈｚ、２Ｈ）、２．１８（ｍ、２Ｈ）、１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．３２（ｍ、６Ｈ）、０．８９（ｔ、Ｊ＝６．７２Ｈｚ、３Ｈ）。
【００６８】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−酪酸デシルエステル（ベンダムスチンＣ１０エステル）の調製：
方法Ａ：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに回転子、熱電温度計、および窒素注入口／排出口を取り付け、１０．０ｇ（２５．３ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、４．９ｍＬ（４．０８ｇ、２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のデシルアルコール、５．３ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１００ｍＬのジクロロメタン、および０．３１ｇ（２．５３ｍｍｏｌ、０．１当量）のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を入れた。前記反応混合物を室温で１８時間攪拌し、この時点でＨＰＬＣ分析は反応が終了したことを示していた。固体を減圧ろ過により取り除き、ろ液をＤＩ水（２×１００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム（１×１００ｍＬ）で洗ってから、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機相をろ過して乾燥剤を取り除いた後、濃縮により減圧乾固すると、低融点の白色固体として望みの生成物９．６ｇ（１９．２ｍｍｏｌ、７５．９％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９４．１Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．１７（ｄ、Ｊ＝８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、Ｊ＝２．３２Ｈｚ、１Ｈ）、６．７７（ｄｄ、Ｊ＝２．４、８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５（ｔ、Ｊ＝６．７６Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｍ、４Ｈ）、３．６９（ｓ、３Ｈ）、３．６３（ｍ、４Ｈ）、２．９１（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４９（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．１８（ｍ、２Ｈ）、１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．３２（ｍ、１４Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．６８Ｈｚ、３Ｈ）。
【００６９】
方法Ｂ：電磁回転子、熱電温度計、および窒素注入口／排出口を取り付けた２５０ｍＬの四つ口丸底フラスコに、１０ｇ（２５．３ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩および１００ｍＬのジクロロメタンを入れた。攪拌を開始し、３．５３ｍＬ（２．５６ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンをシリンジで加えてから、室温で１５分間攪拌し、この後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、７．２８ｇ、３８ｍｍｏｌ）およびｎ−デシルアルコール（４．８８ｍＬ、４．０４ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）を加えた。２０分間攪拌後、混濁した白色反応混合物が透明な溶液となった。室温で２０時間、ＨＰＬＣ分析により反応が終了するまで攪拌を続けた。ＤＩ水（１００ｍＬ）を加えて反応液をクエンチし、ｐＨを１Ｎ  ＨＣｌにより６〜７に調整した。相分離し、水相をジクロロメタン（２５ｍＬ）で抽出してから、有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過および濃縮して減圧乾固した後、透明な黄色油状物質が得られ、これをカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中酢酸エチル２０〜６０％）により精製した。合計１１．２ｇ（２２．４２ｍｍｏｌ、８８．６％）を高粘度の黄色油状物質として回収し、ＨＰＬＣによる純度は９８．９Ａ％であった。
【００７０】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−酪酸ドデシルエステル（ベンダムスチンＣ１２エステル）の調製：
方法Ａ：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコにオーバーヘッドスターラー、熱電温度計、温度コントローラーを取り付けて、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）とし、１０．０ｇ（２５．３４ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、４．７７ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）の１−ドデカノール、５．３ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１００ｍＬのＭＤＣ、および０．３１ｇ（２．５４ｍｍｏｌ、０．１当量）のＤＭＡＰを入れた。前記反応液を室温で一晩攪拌し、この時点で工程分析は反応が終了したことを示していた。固体は減圧ろ取し、２５ｍＬのＭＤＣで洗った。ろ液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×１００ｍＬ）、ＤＩ水（１×１００ｍＬ）、および食塩水（１×１００ｍＬ）で洗ってから、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し、減圧乾固すると、灰色がかった白色の半固体が得られた。この固体は２５ｍＬのＭＤＣで粉砕し、固体不純物を減圧ろ過により取り除き、５ｍＬのＭＤＣで洗った。ろ液を濃縮して減圧乾固し、灰色がかった白色の半固体として生成物１１．５３ｇ（２１．９ｍｍｏｌ、８６．４％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９３．７Ａ％であった。
【００７１】
方法Ｂ：熱電温度計、加熱器／冷却器、窒素注入口／排出口、滴下漏斗、および減圧ラインを取り付けた２０Ｌジャケット形円筒型ＣｈｅｍＧｌａｓｓ反応容器にベンダムスチンの遊離塩基（３７４ｇ、１．０４ｍｏｌ、１．０当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、３００ｇ、１．５７ｍｏｌ、１．５当量）、およびジクロロメタン（ＤＣＭ、３．７４Ｌ、容積１０倍）を入れた。攪拌しながら１−ドデカノール（２９２．１ｇ、１．５７ｍｏｌ、１．５当量）を加えた。前記反応混合物を２７℃に加熱してから、４時間攪拌した。前記反応液を冷却し、一晩２０℃とした。前記反応液を３．７５Ｌの水で洗い、相を分離した。水相を１．２Ｌのジクロロメタンで再抽出し、ジクロロメタン相を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過により乾燥剤を取り除いた後、ろ液を減圧濃縮すると、油状物質として粗生成物が得られた。同条件で３７４ｇのベンダムスチン遊離塩基を用い、この反応を別に行った。２つの反応で得られた粗生成物を合わせ、４４９４ｍＬのヘプタンと混合し、４０〜５０℃に加熱した。得られた溶液を室温までゆっくりと冷却させると、灰色がかった白色固体が沈殿した。スラリーを室温で一晩攪拌し、前記固体を１０℃で減圧ろ過により単離した。ウェットケーキ（ｗｅｔ  ｃａｋｅ）を１Ｌヘプタンで洗い、２０〜２２℃で一晩、２．５Ｌのヘプタンにより再スラリー化した。生成物をろ取し、１回５００ｍＬのヘプタンで２回洗った。２０〜２２℃で一晩ウェットケーキを乾燥させると、白色固体６５３ｇ（収率５９％）が得られ、ＨＰＬＣで９９．０Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．３２（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．９２（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｔ、Ｊ＝６．６４Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０（ｂｒ  ｓ、８Ｈ）、３．６５（ｓ、３Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４５（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ、ＤＭＳＯと部分的に重複）、２．０１（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．５４（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．２４（ｍ、１８Ｈ）、０．８５（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）。
【００７２】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝酪酸テトラデシルエステル（ベンダムスチンＣ１４エステル）の調製：
方法Ａ：５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに回転子、熱電温度計、および窒素注入口／排出口を取り付け、１０．０ｇ（２５．３ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、６．５ｇ（３０．４ｍＬ、１．２当量）のテトラデシルアルコール、６．３ｇ（３０．４ｍｍｏｌ、１．２当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１００ｍＬのジクロロメタン、および０．６２ｇ（５．１ｍｍｏｌ、０．２当量）のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を入れた。前記反応混合物を室温で２０時間攪拌し、この時点でＨＰＬＣ分析は反応が終了したことを示していた。固体を減圧ろ過により取り除き、前記ウェットケーキを５０ｍＬのジクロロメタンで洗ってから、ろ液を濃縮し、減圧乾固した。得られた淡橙色の油状物質を５０ｍＬのジクロロメタンですりつぶし、不要な固体を減圧ろ過により取り除いた。前記ろ液をもう一度濃縮、減圧乾固すると、１６．５ｇの半固体が得られ、これには１Ｈ  ＮＭＲによりテトラデカノールおよびＤＭＡＰが含まれることが示された。残渣を１５０ｇのシリカゲル６０、２３０〜４００メッシュを充填したクロマトグラフィーにかけ、１５００ｍＬのＭＤＣ、１０００ｍＬの０．５％メタノール／ＭＤＣ、および２０００ｍＬの１％メタノール／ＭＤＣで溶出し、１００〜１５０ｍＬの分画を回収した。望みの生成物を含む分画を合わせ、濃縮により減圧乾固した。残渣を３０ｍＬのＭＤＣで粉砕し、不要な固体をろ過により取り除いた。前記ろ液を減圧濃縮すると、淡紫色の固体として望みの生成物５．０ｇ（９．２ｍｍｏｌ、３６．４％）が得られ、純度は９５．０Ａ％であった。
【００７３】
方法Ｂ：熱電温度計、冷却管、窒素注入口／排出口、およびオーバーヘッドスターラーを取り付けた１５０ｍＬの三つ口ガラス容器に、ベンダムスチンの遊離塩基（１６．０ｇ、４４．６ｍｍｏｌ、１．０当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、９．４２ｇ、４９．２ｍｏｌ）、１−テトラデカノール（１０．６ｇ、４９．２ｍｍｏｌ）、およびジクロロメタン（１２０ｍＬ）を入れた。前記反応混合物を２７℃で一晩攪拌した。前記反応液を室温に冷却し、１００ｍＬの水で洗った。攪拌している間に１Ｍの塩酸水溶液を加え、水相のｐＨを調整してｐＨ３〜４とした。この相を分離した。水相を１００ｍＬのジクロロメタンで再抽出し、ジクロロメタン相を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過により乾燥剤を取り除いた後、ろ液を減圧濃縮すると、ろう状の黄色固体として生成物が得られた。前記固体を室温で一晩、８０ｍＬヘプタン中でスラリー化した。生成物をろ取、乾燥すると、白色固体２０．６ｇ（収率８３．４％）が得られ、純度は９７．２Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．３２（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．９８（ｔ、Ｊ＝６．６４Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０（ｂｒ  ｓ、８Ｈ）、３．６６（ｓ、３Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４５（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ、ＤＭＳＯと部分的に重複）、２．０１（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．５４（ｍ、２Ｈ）、１．２３（ｍ、１８Ｈ）、０．８５（ｔ、Ｊ＝７．１２Ｈｚ、３Ｈ）。
【００７４】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝酪酸ペンタデシルエステル（ベンダムスチンＣ１５エステル）の調製：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコにオーバーヘッドスターラー、熱電温度計、温度コントローラーを取り付けて、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）とし、１０．０ｇ（２５．３４ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、５．８５ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のペンタデカノール、５．３ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１００ｍＬのＭＤＣ、および０．３１ｇ（２．５４ｍｍｏｌ、０．１当量）のＤＭＡＰを入れた。前記反応液を室温で一晩攪拌し、この時点で工程分析は反応が終了したことを示していた。固体は減圧ろ過により取り除き、２５ｍＬのＭＤＣで洗った。ろ液を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×１００ｍＬ）、ＤＩ水（１×１００ｍＬ）、および食塩水（１×１００ｍＬ）で洗ってから硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し、減圧乾固すると灰色がかった白色固体が得られた。この固体は２５ｍＬのＭＤＣですりつぶし、固体不純物を減圧ろ過により取り除き、５ｍＬのＭＤＣで洗った。前記ろ液を濃縮して減圧乾固し、灰色がかった白色の固体として生成物１０．８ｇ（１９．０ｍｍｏｌ、７５％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９４．６Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．１７（ｄ、Ｊ＝８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、Ｊ＝２．３２Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄｄ、Ｊ＝２．４、８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｍ、４Ｈ）、３．６９（ｓ、３Ｈ）、３．６３（ｍ、４Ｈ）、２．９１（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４９（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．１８（ｍ、２Ｈ）、１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．３２（ｍ、２４Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．６８Ｈｚ、３Ｈ）。
【００７５】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝酪酸ヘキサデシルエステル（ベンダムスチンＣ１６エステル）の調製：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコにオーバーヘッドスターラー、熱電温度計、温度コントローラーを取り付けて、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）とし、１０．０ｇ（２５．３４ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、６．２ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のヘキサデカノール、５．３ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１００ｍＬのＭＤＣ、および０．３１ｇ（２．５４ｍｍｏｌ、０．１当量）のＤＭＡＰを入れた。前記反応液を室温で一晩攪拌し、この時点で工程分析は反応が終了したことを示していた。固体を減圧ろ過により取り除き、２５ｍＬのＭＤＣで洗った。ろ液を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×１００ｍＬ）、ＤＩ水（１×１００ｍＬ）、および食塩水（１×１００ｍＬ）で洗ってから硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し、減圧乾固すると、灰色がかった白色固体が得られた。この固体を２５ｍＬのＭＤＣで粉砕し、固体不純物を減圧ろ過により取り除き、５ｍＬのＭＤＣで洗った。前記ろ液を濃縮して減圧乾固し、灰色がかった白色の固体として生成物１３．１ｇ（２２．５ｍｍｏｌ、８８．８％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９４．０Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．１７（ｄ、Ｊ＝８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、Ｊ＝２．３２Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄｄ、Ｊ＝２．３６、８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｍ、４Ｈ）、３．６９（ｓ、３Ｈ）、３．６３（ｍ、４Ｈ）、２．９１（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４９（ｔ、Ｊ＝７．０８Ｈｚ、２Ｈ）、２．１８（ｍ、２Ｈ）、１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．３２（ｍ、２６Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．６８Ｈｚ、３Ｈ）。
【００７６】
４−｛５−［ビス−（２−クロロ−エチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−酪酸オレオイルエステル（ベンダムスチンＣ１８エステル）の調製：
方法Ａ：オーバーヘッドスターラー、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）下の冷却管、温度コントローラー付き加熱マントル、および熱電温度計を取り付けた２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに、１−オクタデカノール（５０ｇ、１８５ｍｍｏｌ、７．３当量）を入れた。前記固体を溶解するまで加熱してから、４−（５−アミノ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−酪酸（１０ｇ、２５．３ｍｍｏｌ、１．０当量）および硫酸（０．５ｍＬ）をゆっくりと加えた。得られたスラリーを７０℃で６時間攪拌してから、５６℃に冷却し、塩化メチレン（１５０ｍＬ）を加えた。前記反応混合物を室温に冷却し、水（１００ｍＬ）で洗った。相を分離した後、塩化メチレン（１００ｍＬ）で別の抽出を行った。有機相を合わせてＭｇＳＯ４で乾燥した。前記乾燥剤をろ過により取り除いた。ろ液を濃縮し、ＳＦＣ分離を行った。減圧下ＳＦＣ分画の溶媒を留去すると白色固体が得られ、室温で５日間、室内用真空装置を用いて乾燥させると、望みの生成物１．２ｇが得られ、収率は７．１％、純度は９５．４Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．１８（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．０９（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．７４（ｍ、７Ｈ）、３．６２（ｍ、４Ｈ）、２．９３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４９（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．２２（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、１．６０（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、１．２８（ｍ、３０Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ）；ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）６１０（Ｍ＋１）。
【００７７】
方法Ｂ：回転子および熱電温度計を取り付け、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）とした５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ベンダムスチン塩酸塩（５．０４ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）、１−オクタデカノール（４．１５ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、３．１７ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．３１ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）、および塩化メチレン（２５０ｍＬ）を入れた。得られたスラリーを室温で１６時間攪拌した。固体が生成し、ろ過により反応混合物から取り除いた。ろ液を水（１５０ｍＬ）で洗った。相分離後、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥した。乾燥剤をろ過により取り除き、ろ液を濃縮して、ＥｔＯＡｃとヘプタンの混合物によりＩＳＣＯクロマトグラフィー精製を行い、９９Ａ％の純度で白色固体５．６８ｇ（収率７３％）が得られた。
【００７８】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝酪酸ドコシルエステル（ベンダムスチンＣ２２エステル）の調製：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに回転子、熱電温度計、窒素注入口／排出口を取り付け、５．０ｇ（１２．７ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、４．２ｇ（１２．９ｍｍｏｌ、１．０１当量）のテトラデシルアルコール、２．７ｇ（１２．９ｍｍｏｌ、１．０１当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、５０ｍＬのジクロロメタン（ＭＤＣ）、および０．１６ｇ（１．２７ｍｍｏｌ、０．１当量）のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を入れた。前記反応混合物を室温で一晩攪拌し、この時点でＨＰＬＣ分析は反応が終了したことを示していた。固体を減圧ろ過により取り除き、ウェットケーキを５０ｍＬで洗った。別の精製方法を２種類開発した。ろ液をＤＩ水（２×１５０ｍＬ）で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮により減圧乾固した。得られたろう状の残渣を８０ｇのシリカゲル６０、２３０〜４００メッシュを充填したクロマトグラフィーにかけ、勾配の最初を１００％のＭＤＣとし、次に０．５％メタノール／ＭＤＣ、最後に１％メタノール／ＭＤＣで溶出し、１００〜１５０ｍＬの分画を回収した。望みの生成物を含む分画を合わせ、濃縮により減圧乾固した。残渣を２０ｍＬのＭＤＣで再度粉砕し、不要な固体をろ過により取り除いた。前記ろ液を減圧濃縮し、ろう状の白色固体として望みの生成物３．６５ｇ（５．５ｍｍｏｌ、４３．１％）が得られ、純度は９５．７Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．１７（ｄ、Ｊ＝８．７２Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、Ｊ＝２．２８Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄｄ、Ｊ＝２．３６、８．７２Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５（ｔ、Ｊ＝６．７６Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｍ、４Ｈ）、３．７０（ｓ、３Ｈ）、３．６３（ｍ、４Ｈ）、２．９１（ｔ、Ｊ＝７．４４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４９（ｔ、Ｊ＝７．０８Ｈｚ、２Ｈ）、２．１８（ｍ、２Ｈ）、１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．３２（ｍ、３８Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．６４Ｈｚ、３Ｈ）。
【００７９】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝酪酸２−ドデシルエステル（分岐ベンダムスチンＣ１２エステル）の調製：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコにオーバーヘッドスターラー、熱電温度計、温度コントローラーを取り付けて、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）とし、１０．０ｇ（２５．３４ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、４．７７ｇ（５．７５ｍＬ、２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）の２−ドデカノール、５．３ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１００ｍＬのＭＤＣ、および０．３１ｇ（２．５４ｍｍｏｌ、０．１当量）のＤＭＡＰを入れた。前記反応液を室温で一晩攪拌し、この時点で工程分析は反応が終了したことを示していた。固体は減圧ろ過により取り除き、２５ｍＬのＭＤＣで洗った。ろ液を２００ｍＬのＭＤＣで洗った後、４％重炭酸ナトリウム水溶液（１×５００ｍＬ）で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し、減圧乾固すると、灰色がかった白色固体が得られた。この固体は２５ｍＬのＭＤＣで粉砕し、固体不純物を減圧ろ過により取り除き、５ｍＬのＭＤＣで洗った。ろ液を濃縮して減圧乾固すると、粗生成物が得られ、これには、残った２−ドデカノールが含まれていることが１Ｈ  ＮＭＲにより示された。粗生成物を２３０〜４００メッシュ、１００ｇのシリカゲル６０を用いてクロマトグラフィーにかけ、最初に１Ｌのヘプタン、次に５００ｍＬの３：１ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、５００ｍＬの２：１ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、最後に５００ｍＬの１：１ヘプタン／ＥｔＯＡｃで溶出し、１００ｍＬの分画を回収した。生成物を含む分画を合わせ、濃縮して減圧乾固し、淡紫色の粘性油状物質として生成物５．３５ｇ（１０．１６ｍｍｏｌ、４０％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９９．５Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．３１（ｄ、Ｊ＝８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、６．９３（ｄ、Ｊ＝２．２８Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄｄ、Ｊ＝２．３６、８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、４．８（ｍ、１Ｈ）、３．７（ｓ、８Ｈ）、３．６５（ｓ、３Ｈ）、２．８２（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４２（ｔ、Ｊ＝７．３６Ｈｚ、２Ｈ）、２．００（ｍ、２Ｈ）、１．５０（ｍ、２Ｈ）、１．２５（ｓ、ｂ、１６Ｈ）、１．１４（ｄ、Ｊ＝６．２４、２Ｈ）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．６８Ｈｚ、３Ｈ）。
ベンダムスチンＣ１２エステルの調製
熱電温度計、加熱器／冷却器、窒素注入口、滴下漏斗、冷却管、および減圧ラインを取り付けた２０Ｌジャケット形円筒型ＣｈｅｍＧｌａｓｓ反応容器に、前処理したベンダムスチン塩酸塩４２８ｇ（１．１０ｍｍｏｌ）のスラリーを容積１０倍のトレースＧＣ分析用塩化メチレンに入れた。攪拌を１００ＲＰＭに設定し、前記ジャケットは２０℃に設定した。この混合物に滴下漏斗から１０分かけてジイソプロピルエチルアミン（２１３ｍｌ、１．１当量）を加えた。３４分間放置し、融解したドデカノール（２２７ｇ、１．１当量）を一度に加えた。１１分間放置し、この反応液にＥＤＣＩ（３２０．３ｇ、１．５当量）を加えた。得られた透明な黄色溶液を約２０℃で２３．５時間攪拌した。この時点で、ＩＰＣは出発原料が０．５４％残っていることを示していた。容積１０倍の水を加え、さらに１５分間前記反応液を攪拌した。下の有機相を排出し、５ミクロンのフィルターカートリッジでろ過し、前記フィルターカートリッジを容積１倍のトレースＧＣ分析用塩化メチレンで洗った。塩化メチレン溶液を減圧濃縮すると、粘性の黄色油状物質として粗生成物が得られた。容積５倍のろ過したｎ−ヘプタンを前記油状物質に加え、前記混合物を減圧濃縮し、残った塩化メチレンを取り除くと、固体粗生成物６１５ｇが得られ、収率は９２．９ｗｔ％、つまり９８．０％であった。最終純度は乾燥した状態で９８．４％であった。
【００８０】
ベンダムスチンＣ１２エステルの精製
粗ＣＥＰ−４０１２５（１１００ｇ  ＡＰＩ、粗生成物１２５０ｇ）をｎ−ヘプタン（容積６倍）に取り、熱電温度計、加熱器／冷却器、窒素注入口、冷却管、および減圧ラインを取り付けた２０Ｌジャケット形円筒型ＣｈｅｍＧｌａｓｓ反応容器に移した。前記スラリーを４０℃に加温し、すべての固体を溶解した。３２．６℃に達した時点で溶解が起こった。次に、前記反応混合物を２．５時間かけて１７．７℃に冷却し、この時点で生成物が沈殿した。前記反応混合物を２３℃に再加熱し、２６分かけて細かい粒子を溶解し、２時間かけて４℃に冷却した。固体を密封フィルターでろ過し、４．５時間かけて容積２倍の冷ｎ−ヘプタンで洗った。ＩＰＣは、０．２０％のドデカノールが残っていることを示していた。固体を３０℃で２４時間、重量が一定になるまで減圧乾燥すると、純度９８．３％でＣＥＰ−４０１２５  １０１８ｇが得られ、収率は９２．５％であった。
【００８１】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝酪酸５−デシルエステル（分岐ベンダムスチンＣ１０エステル）の調製：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコにオーバーヘッドスターラー、熱電温度計、温度コントローラーを取り付けて、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）とし、３．０ｇ（７．６ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、１．２１ｇ（７．７ｍｍｏｌ、１．０１当量）の５−デカノール、１．５９ｇ（７．７ｍｍｏｌ、１．０１当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、３０ｍＬの１，２−エチレンジクロライド（ＥＤＣ）、および０．１ｇ（０．７６ｍｍｏｌ、０．１当量）のＤＭＡＰを入れた。工程分析で反応が終了したことが示されるまで、前記反応液を７５℃で５日間攪拌した。固体は減圧ろ過により取り除き、５ｍＬのＥＤＣで洗った。ろ液を４％重炭酸ナトリウム水溶液（１×５０ｍＬ）で洗ってから、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮により減圧乾燥した。前記残渣を同条件で行った１０ｇの反応残渣と合わせ、一緒にクロマトグラフィーにかけた。２３０〜４００メッシュ、１００ｇのシリカゲル６０を用いてクロマトグラフィーを行い、最初に２Ｌのヘプタン、次に１Ｌの３：１ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、および１Ｌの２：１ヘプタン／ＥｔＯＡｃで溶出し、１００ｍＬの分画を回収した。生成物を含む分画を合わせ、濃縮して減圧乾固し、透明な黄色油状物質として生成物３．９７ｇ（７．９６ｍｍｏｌ、２４．２％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９９．４Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．３１（ｄ、Ｊ＝８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、６．９３（ｄ、Ｊ＝２．２８Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄｄ、Ｊ＝２．４０、８．８０Ｈｚ、１Ｈ）、４．８（ｍ、１Ｈ）、３．７（ｓ、８Ｈ）、３．６５（ｓ、３Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４４（ｔ、Ｊ＝７．３６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０２（ｍ、２Ｈ）、１．４８（ｍ、４Ｈ）、１．２５（ｓ、ｂ、１０Ｈ）、０．８４（ｍ、６Ｈ）。
【００８２】
４−｛５−［ビス−（クロロエチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝酪酸シクロヘキシルエステルの調製：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコにオーバーヘッドスターラー、熱電温度計、温度コントローラーを取り付けて、窒素雰囲気（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｗｅｅｐ）とし、１０ｇ（２５．３４ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、２．５６ｇ（２．７ｍＬ、２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のシクロヘキサノール、５．３ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、１．０１当量）のジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１００ｍＬのＭＤＣ、および０．３１ｇ（２．５４ｍｍｏｌ、０．１当量）のＤＭＡＰを入れた。工程分析で反応が終了したことが示されるまで、前記反応スラリーを室温で１８時間攪拌した。２つの新しい主生成物ピークを観察した。固体は減圧ろ過により取り除き、５ｍＬのＭＤＣで洗った。ろ液を４％重炭酸ナトリウム水溶液（２×１００ｍＬ）で洗ってから、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮により減圧乾固すると、黄色油状物質が得られ、多少固体が存在していた。１Ｈ  ＮＭＲ分析は、望みの生成物に加え、ＤＭＡＰおよびシクロヘキサノールがＤＣＣ副生成物とともに存在していることを示していた。残渣を５０ｍＬのＭＤＣでスラリー化し、残ったシクロヘキサノールを取り除いてから減圧濃縮し、クロマトグラフィーにかけた。２３０〜４００メッシュ、５０ｇのシリカゲル６０を用いてクロマトグラフィーを行い、１：１ヘプタン／ＥｔＯＡｃを用いて溶出し、１００ｍＬの分画を回収した。生成物を含む分画を合わせ、濃縮して減圧乾固し、灰色がかった白色固体として生成物３．１１ｇ（７．０６ｍｍｏｌ、２７．９％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９７．８Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．３１（ｄ、Ｊ＝８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、６．９３（ｄ、Ｊ＝２．２８Ｈｚ、１Ｈ）、６．７７（ｄｄ、Ｊ＝２．４０、８．８０Ｈｚ、１Ｈ）、４．６５（ｍ、１Ｈ）、３．７（ｓ、８Ｈ）、３．６５（ｓ、３Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４４（ｔ、Ｊ＝７．３６Ｈｚ、２Ｈ）、２．００（ｍ、２Ｈ）、１．７６（ｍ、４Ｈ）、１．６５（ｍ、２Ｈ）、１．３３（ｍ、ｂ、６Ｈ）。
【００８３】
４−｛５−［ビス−（２−クロロ−エチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝酪酸ＰＥＧ−２０００エステル（ベンダムスチンＰＥＧ−２０００エステル）の調製：回転子、熱電温度計、冷却管、および窒素注入口／排出口を取り付けた１００ｍＬの三つ口ガラス容器に、ベンダムスチン塩酸塩（２．０ｇ、５．１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびジクロロメタン（３０ｍＬ）を入れた。トリエチルアミン（０．７１ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を２２℃で前記スラリーに加え、２０分間攪拌した。メトキシポリエチレングリコール２０００（ＰＥＧ−ＯＭｅ−２０００、１２．２ｇ、６．１ｍｍｏｌ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、１．５ｇ、７．６ｍｏｌ）を加えた。前記反応混合物を２２℃で５．５時間攪拌し、この時点でＰＥＧ−ＯＭｅ−２０００（１．０ｇ）を加えた後、週末にかけて３日間攪拌した。水（２０ｍＬ）を加え、１Ｍ塩酸を加えてｐＨをｐＨ５〜６に調整した。相をゆっくりと分離した。水相を２０ｍＬのジクロロメタンで再抽出し、ジクロロメタン相を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過により乾燥剤を取り除いた後、ろ液を減圧濃縮すると、ろう状固体として生成物が得られた。前記固体を室温、１０ｍＬヘプタン中でスラリー化した。前記生成物をろ取し、３０℃で減圧乾燥すると、白色粉末状固体１１．７ｇが得られ（収率９９％）、純度はＨＰＬＣで９７．９Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．３２（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．９２（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．１２（ｔ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０（ｍ、１２Ｈ）、３．６０（ｍ、３Ｈ）、３．５１（ｍ、２２４Ｈ）、３．４３（ｍ、４Ｈ）、３．３２（ｍ、５８Ｈ）、２．８４（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４５（２Ｈ、ＤＭＳＯと部分的に重複）、２．０１（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）。
【００８４】
４−｛５−［ビス−（２−クロロ−エチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝酪酸ＰＥＧ−５０００エステル（ベンダムスチンＰＥＧ−５０００エステル）の調製：回転子、熱電温度計、冷却管、および窒素注入口／排出口を取り付けた５０ｍＬの三つ口ガラス容器に、ベンダムスチン塩酸塩（０．５ｇ、１．２７ｍｍｏｌ、１．０当量）およびジクロロメタン（１５ｍＬ）を入れた。トリエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．２８ｍｍｏｌ）を２２℃で前記スラリーに加え、メトキシポリエチレングリコール５０００（ＰＥＧ−ＯＭｅ−５０００、６．３３ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、０．３６ｇ、１．８８ｍｏｌ）とともに２０分間攪拌した。前記反応混合物を２２℃で一晩攪拌した。水（２０ｍＬ）を加え、１Ｍ塩酸を加えてｐＨをｐＨ３〜４に調整した。相をゆっくりと分離した。水相を１０ｍＬのジクロロメタンで再抽出した。ジクロロメタン相を合わせて食塩水（２０ｍＬ）で洗い、ＭｇＳＯ４で乾燥した。ろ過により乾燥剤を取り除いた後、ろ液を減圧濃縮すると、ろう状固体として生成物が得られた。前記固体を室温、２０ｍＬヘプタン中でスラリー化した。前記生成物をろ取し、３０℃で減圧乾燥すると、白色粉末状固体５．２４ｇが得られ（収率７７％）、純度はＨＰＬＣで９９Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．３８（ｄ、Ｊ＝１２Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．８２（ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１２（ｔ、Ｊ＝４．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｂｒ  ｓ、８Ｈ）、３．６８（ｍ、５Ｈ）、３．５９（ｍ、３Ｈ）、３．５１（ｍ、４３６Ｈ）、３．４２（ｍ、３Ｈ）、３．３１（ｍ、２８Ｈ）、２．８８（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４５（ｔ、２Ｈ、ＤＭＳＯと部分的に重複）、２．０１（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）。
【００８５】
ベンダムスチンメチルエステルエステル交換の一般的手順
回転子、熱電温度計、ディーン・スターク・トラップ付き冷却管、および窒素注入口／排出口を取り付けた５０ｍＬの三つ口ガラス容器に、ベンダムスチンメチルエステル（０．５ｇ、１．２７ｍｍｏｌ、１．０当量）、触媒（０．０５〜１．４当量）、適切な溶媒（容積５〜１５倍）および過剰のドデカノール（５〜１０当量）を入れた。得られた反応混合物を加熱環流し、ＨＰＬＣでモニターした。様々な条件の結果を以下にまとめる。
【００８６】
【表１】
0006262246.tif 000013
【００８７】
ベンダムスチン塩酸アミドの調製
４−｛５−［ビス−（２−クロロ−エチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−Ｎ−デシル−ブトリアミド（ベンダムスチンＣ１０アミド）：回転子、熱電温度計、冷却槽、６０ｍＬ均圧滴下漏斗、および窒素注入口／排出口を取り付けた２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに、１０．０ｇ（２５．３ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、１０．６ｇ（２７．８ｍｍｏｌ）のＨＡＴＵ、および１００ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を入れた。この黄色溶液を攪拌し、４．４１ｍＬ（３．２７ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を加えた。２７．１℃まで発熱が認められ、溶液は濃黄色となった。前記反応液を６．６℃に冷却し、６．２ｍＬ（４．５９ｇ、３５．５ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡ溶液、５．１１ｍＬ（４．１ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）のデシルアミンを２０ｍＬのＤＭＦに入れた溶液を２．７〜７．６℃で１３分かけて１滴ずつ加えた。加え終わったら、前記反応液を１０℃未満で１．５時間攪拌し、この時点で工程分析は反応が終了したことを示していた。この反応液を２００ｍＬのＤＩ水にクエンチし、酢酸エチル（２×１７５ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、１０％リン酸水素ナトリウム（１×２００ｍＬ）、８％重炭酸ナトリウム水溶液（１×２００ｍＬ）、および食塩水（１Ｘ２００ｍＬ）で洗ってから、濃縮して減圧乾固すると、粘着性のある白色固体が得られた。この固体をヘプタン（７５ｍＬ）で粉砕すると、流動性を有する固体となり、これを減圧ろ過により単離した。ウェットケーキを２５℃で一晩、減圧乾燥機で乾燥させると、白色固体として１３．３３ｇ（２５．３ｍｍｏｌ、１００％）の望みの生成物が得られ、ＨＰＬＣ純度は９８．０１Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．７２（ｓ、ｂ、１Ｈ）、７．３３（ｄ、Ｊ＝８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｄ、Ｊ＝２．２８Ｈｚ、１Ｈ）、６．８０（ｄｄ、Ｊ＝、２．３６、８．８Ｈｚ）、３．７（ｓ、８Ｈ）、３．６６（ｓ、３Ｈ）、３．０１（ｑ、Ｊ＝６．８、１２．６８、２Ｈ）、２．７９（ｔ、Ｊ＝７．４４Ｈｚ、２Ｈ）、２．１８（ｔ、Ｊ＝７．３６Ｈｚ、２Ｈ）、１．９５（ｍ、２Ｈ）、１．３６（ｍ、２Ｈ）、１．２２（ｓ、ｂ、１４）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．６８Ｈｚ、３Ｈ）。
【００８８】
４−｛５−［ビス−（２−クロロ−エチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−Ｎ−テトラデシル−ブトリルアミド（ベンダムスチンＣ１４アミド）：回転子、熱電温度計、冷却槽、６０ｍＬ均圧滴下漏斗、および窒素注入口／排出口を取り付けた２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに、１０．０ｇ（２５．３ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、１０．６ｇ（２７．８ｍｍｏｌ）のＨＡＴＵ、および１００ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を入れた。この黄色溶液を攪拌し、４．４１ｍＬ（３．２７ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を加えた。２７．１℃まで発熱が認められ、溶液は濃黄色となった。前記反応液を３．３℃に冷却し、６．２ｍＬ（４．５９ｇ、３５．５ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡ溶液、５．７５ｇｆ（２５．６ｍｍｏｌ）のテトラデシルアミンを４０ｍＬのＤＭＦに入れた溶液を１０℃未満で６分かけて１滴ずつ加えた。加え終わった時点で反応液は非常に濃く、攪拌が困難であった。オーバーヘッドスターラーおよび熱電温度計を取り付けた５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに移し、室温で３時間攪拌し、この時点で工程分析は反応が終了したことを示していた。この反応液を４００ｍＬのＤＩ水にクエンチし、酢酸エチル（２×３００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、１０％リン酸水素ナトリウム（１×３００ｍＬ）、８％重炭酸ナトリウム水溶液（１×３００ｍＬ）、および食塩水（１Ｘ２００ｍＬ）で洗ってから、硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、濃縮して減圧乾固した。残渣を２３０〜４００メッシュ、１００ｇのシリカゲル６０を用いてクロマトグラフィーで精製し、１％ＭｅＯＨ／ＭＤＣ（２Ｌ）、２．５％ＭｅＯＨ／ＭＤＣ（１Ｌ）、および５％ＭｅＯＨ／ＭＤＣ（１Ｌ）で溶出して約１００ｍＬの分画を回収した。生成物を含む分画を合わせ、濃縮して減圧乾固し、白色固体として望みの生成物７．８６ｇ（１４．６ｍｍｏｌ、５７．６％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９７．３Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．７２（ｓ、ｂ、１Ｈ）、７．３３（ｄ、Ｊ＝８．７６Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｄ、Ｊ＝２．２８Ｈｚ、１Ｈ）、６．８０（ｄｄ、Ｊ＝２．３６、８．８４Ｈｚ）、３．７１（ｓ、８Ｈ）、３．７０（ｓ、３Ｈ）、３．０１（ｑ、Ｊ＝６．８、１２．６８、２Ｈ）、２．７９（ｔ、Ｊ＝７．４４Ｈｚ、２Ｈ）、２．１８（ｔ、Ｊ＝７．３６Ｈｚ、２Ｈ）、１．９７（ｍ、２Ｈ）、１．３６（ｍ、２Ｈ）、１．２８（ｓ、ｂ、１４）、０．８４（ｔ、Ｊ＝７．０４Ｈｚ、３Ｈ）。
【００８９】
４−｛５−［ビス−（２−クロロ−エチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−Ｎ−オクタデシル−ブトリルアミド（ベンダムスチンＣ１８アミド）：回転子、熱電温度計、冷却槽、６０ｍＬ均圧滴下漏斗、および窒素注入口／排出口を取り付けた２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに、１０．０ｇ（２５．３ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、１０．６ｇ（２７．８ｍｍｏｌ）のＨＡＴＵ、および１００ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を入れた。この黄色溶液を攪拌し、４．４１ｍＬ（３．２７ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を加えた。２７．１℃まで発熱が認められ、前記溶液は濃黄色となった。前記反応液を２．０℃に冷却し、６．２ｍＬ（４．５９ｇ、３５．５ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡ懸濁液、７．６５ｇ（２５．６ｍｍｏｌ）のオクタデシルアミンを０ｍＬのＤＭＦに入れた溶液をピペットで加えた。加え終わった時点で反応液は非常に濃く、攪拌が困難であった。室温まで加温し、電磁回転子をオーバーヘッドスターラーに交換した。前記反応液を室温で一晩攪拌し、この後、工程分析は反応が終了したことを示していた。この反応液を３００ｍＬのＤＩ水にクエンチし、ジクロロメタン（２×１５０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、１０％リン酸水素ナトリウム（１×３００ｍＬ）、８％重炭酸ナトリウム水溶液（１×３００ｍＬ）、および食塩水（１×２００ｍＬ）で洗ってから、硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、濃縮して減圧乾固した。残渣を２３０〜４００メッシュ、１００ｇのシリカゲル６０を用いてクロマトグラフィーで精製し、１％ＭｅＯＨ／ＭＤＣ（２Ｌ）、２．５％ＭｅＯＨ／ＭＤＣ（１Ｌ）、および５％ＭｅＯＨ／ＭＤＣ（１Ｌ）で溶出して約１００ｍＬの分画を回収した。生成物を含む分画を合わせ、濃縮して減圧乾固し、白色固体として望みの生成物５．１１ｇ（８．３８ｍｍｏｌ、３３％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９０．９Ａ％であった。主な不純物は、出発原料のアミン中の不純物から生じたＣ−１６アミドであることが示された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．７２（ｓ、ｂ、１Ｈ）、７．３３（ｄ、Ｊ＝８．８４Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｄ、Ｊ＝２．２２Ｈｚ、１Ｈ）、６．８０（ｄｄ、Ｊ＝２．３６、８．８４Ｈｚ）、３．７１（ｓ、８Ｈ）、３．７０（ｓ、３Ｈ）、３．０１（ｑ、Ｊ＝６．８、１２．６８、２Ｈ）、２．７９（ｔ、Ｊ＝７．４４Ｈｚ、２Ｈ）、２．１８（ｔ、Ｊ＝７．３６Ｈｚ、２Ｈ）、１．９７（ｍ、２Ｈ）、１．３６（ｍ、２Ｈ）、１．２８（ｓ、ｂ、３０Ｈ）、０．８５（ｔ、Ｊ＝６．３２Ｈｚ、３Ｈ）。
【００９０】
（Ｓ）−２−（４−｛５−［ビス−（２−クロロ−エチル）−アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−ブチルアミノ）−プロピオン酸メチルエステル：回転子、熱電温度計、冷却槽、滴下漏斗、および窒素注入口／排出口を取り付けた２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに、１０ｇ（２５．３ｍｍｏｌ）のベンダムスチン塩酸塩、１０．６ｇ（２７．８ｍｍｏｌ）のＨＡＴＵ、および１００ｍＬのＤＭＦを入れた。前記反応液を１．９℃に冷却し、８．８ｍＬ（６．５４ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを２分かけて加えた。反応液は９℃まで発熱し、橙色になった。３．５７ｇ（２５．６ｍｍｏｌ）のＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩および６．２ｍＬ（４．５７ｇ、３５．４ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを２０ｍＬのＤＭＦに入れた溶液を４．９〜５．７℃で１０分かけて１滴ずつ加えた。前記反応液を１時間かけてゆっくりと室温まで加温し、３時間攪拌し、この時点で工程分析は反応が終了したことを示していた。前記反応液を４００ｍＬの１：１酢酸エチル／ＤＩ水にクエンチした。相を分離し、有機相を１０％リン酸水素ナトリウム（１×２００ｍＬ）、８％重炭酸ナトリウム水溶液（１×２００ｍＬ）、および食塩水（１×２００ｍＬ）で洗ってから、硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、濃縮して減圧乾固した。残渣を２３０〜４００メッシュ、１００ｇのシリカゲル６０を用いてクロマトグラフィーで精製し、１％ＭｅＯＨ／ＭＤＣ（３Ｌ）、２．５％ＭｅＯＨ／ＭＤＣ（１Ｌ）、および５％ＭｅＯＨ／ＭＤＣ（１Ｌ）で溶出して約１００ｍＬの分画を回収した。生成物を含む分画を合わせ、濃縮して減圧乾固し、白色固体として望みの生成物７．１ｇ（１６．０ｍｍｏｌ、６３．３％）が得られ、ＨＰＬＣ純度は９７．４Ａ％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．２５（ｄ、Ｊ＝６．９２Ｈｚ、１Ｈ）、７．４０（ｄ、Ｊ＝８．８４Ｈｚ、１Ｈ）、６．９２（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．８６（ｄｄ、Ｊ＝２．３２、８．８８Ｈｚ）、４．２５（ｑ、１Ｈ）、３．７２（ｓ、８Ｈ）、３．７１（ｓ、３Ｈ）、３．６２（ｓ、３Ｈ）、２．８７（ｔ、Ｊ＝７．４８Ｈｚ、２Ｈ）、２．２５（ｔ、Ｊ＝７．５２Ｈｚ、２Ｈ）、１．９９（ｍ、２Ｈ）、１．２６（ｄ、Ｊ＝７．３２Ｈｚ、３Ｈ）。
【００９１】
本発明のベンダムスチンエステル製剤の溶液を調製する一般的手順： 
本発明のベンダムスチンエステル原液をジメチルアセトアミド（「ＤＭＡ」）とＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ−１５の６０／４０（ｖ／ｖ）混合物に約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。溶解するまで混合物を室温で攪拌した。得られた原液は数ヵ月安定であり、これを０．９％食塩水で望みの濃度に希釈し、約２時間以内に投与した。
【００９２】
ベンダムスチンＣ１４エステル液剤：原液は、ＤＭＡとＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ−１５の６０／４０（ｖ／ｖ）混合物４ｍＬにベンダムスチンＣ１４エステル３２０．１ｍｇを溶解して調製した。溶解するまで混合物を約２時間攪拌した。投与前に、前記原液１．００ｍＬを除き、食塩水１６．２０ｍＬを加えて、室温で５分間攪拌することで、原液を希釈した。得られた製剤は３ｍｇ−ｅｑｕ／ｍＬベンダムスチンであった。
【００９３】
残ったエタノールを取り除くための前処理：
ベンダムスチン塩酸塩（２７７ｇ）を５Ｌの気化フラスコに入れた後、容積２倍のＤＩ水および容積５倍のアセトンを入れた。前記溶媒を、最大温度４０℃で５．５時間かけて減圧蒸留した。さらに容積５倍のアセトンを加え、得られたスラリーを大気圧でロータリーエバポレーターに入れ、３５℃で１５分回転させた。前記反応液を密閉した焼結ガラス漏斗でろ過し、得られた白色固体を容積２倍のアセトンで洗った。前記固体を乾燥トレイに移し、４０℃で重量が一定になるまで１７時間乾燥させてから、純度９９．８Ａ％で生成物２６６ｇ（９６．０％）を単離し、ＫＦは０．２６％であった。
【００９４】
本発明のベンダムスチンエステルのヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）ナノ粒子製剤を調製する一般的手順
ナノ粒子はジクロロメタンおよびＨＳＡを界面活性剤として用い、Ｏ／Ｗエマルジョンから形成した。油相は、約１２０ｍｇ／ｍＬの濃度で望みの量のベンダムスチンエステルをジクロロメタンに溶解して調製した。水相は容積５〜１５倍の水（ジクロロメタンを基準としてｗ／ｗ）に２〜４倍の量のＨＳＡ（ベンダムスチンエステルを基準としてｗ／ｗ）を溶解することで調製した。典型的には、前記水相に５〜１０％でマンニトールを加え、注射用等張液を作り、凍結乾燥後に薬学的に適した製剤を提供した。前記Ｏ／ＷエマルジョンはＩＫＡ携帯型ホモジェナイザーを強度中で約３０秒間用い、前記油相と前記水相を乳化することで形成した。前記ナノ粒子は、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）高圧ホモジェナイザー（約３０，０００ｐｓｉで５回）により粗Ｏ／Ｗエマルジョンを処理することで形成し、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎのゼータサイザー）により測定するとサイズ５０〜１００ｎｍの粒子を提供した。前記溶媒を減圧除去し、得られた濃縮物を凍結乾燥または凍結保存してから投与した。これらの製剤は良好な物理的および化学的安定性を示した。
【００９５】
凍結乾燥したナノ粒子を再溶解し、ｃｒｙｏ−Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ｃ−ＴＥＭ）を用いて分析した。前記ナノ粒子の大部分が、水に分散しやすい２０〜４０ｎｍの固体球であった。粒子の大部分が１２５ｎｍの範囲であった。粒子はすべて滑面であった。
【００９６】
ベンダムスチンＣ１２エステルＨＳＡナノ粒子：油相は６００ｍｇのベンダムスチンＣ１２エステルを５ｍＬのジクロロメタンに溶解して調製した。前記油相をＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒｅｘ携帯型ホモジェナイザーを用い、６０ｍＬの脱イオン（「ＤＩ」）水、２．４ｇのＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ［米国ミズーリ州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ］の凍結乾燥固体）、および６．６ｇのマンニトールを有する水相で乳化し、粗エマルジョンを得た。このエマルジョンを約３０，０００ｐｓｉでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍ−１１０Ｐ高圧ホモジェナイザーに５回通過させた。前記ジクロロメタンを得られたナノ粒子懸濁液からロータリーエバポレーターにより取り除き、得られた水性懸濁液をＤＩ水で希釈して総量を１００ｍＬとした。この懸濁液を次に３０ｍＬの血清バイアルに１０ｍＬずつ分け、凍結乾燥した。
【００９７】
ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）とベンダムスチンＣ１２エステルＨＳＡナノ粒子：油相は、３００ｍｇのベンダムスチンＣ１２エステルと５００ｍｇのＰＬＧＡ（５０／５０乳酸：グリコール酸、ＭＷ７，０００〜１７，０００、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐａｒｔ＃７１９８９７）を２．５ｍＬのジクロロメタンに溶解して調製した。前記油相をＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒｅｘ携帯型ホモジェナイザーを用い、３０ｍＬのＤＩ水、１．２ｇのＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの凍結乾燥固体）、および３．３ｇのマンニトールを有する水相で乳化し、粗エマルジョンを得た。このエマルジョンを約３０，０００ｐｓｉでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍ−１１０Ｐ高圧ホモジェナイザーに５回通過させた。前記ジクロロメタンを得られたナノ粒子懸濁液からロータリーエバポレーターにより取り除き、得られた水性懸濁液をＤＩ水で希釈して総量を５０ｍＬとした。得られたナノ粒子の粒子サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎのゼータサイザーで測定すると９０．５ｎｍ（Ｚａｖｇ）であった。この懸濁液を次に３０ｍＬの血清バイアルに１０ｍＬずつ分け、凍結乾燥した。
【００９８】
本発明のベンダムスチンエステルＰＥＧ化ナノ粒子製剤の調製：一連のナノ粒子製剤は文献（Ａｌｅｘｉｓ，  Ｆ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  ５，  （２００８），  ５０５−５１５）に報告されているＰＥＧコーティングを用いて調製し、「ステルス」コーティングを提供し、粒子が体内の免疫系を回避できるように支援した。ＨＳＡの代わりにＰＥＧベースの界面活性剤（ＰＥＧ−ポリ乳酸共重合体）を用いるか、生体共役反応を用いてＰＥＧを組み込み、ＨＳＡナノ粒子表面の遊離ＮＨ２基にＰＥＧ基を共有結合した。いずれの系もＰＫ研究で血漿中循環時間が延長していることを示した。
【００９９】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングを用いたベンダムスチンＣ１２エステルＨＳＡナノ粒子：油相は６００ｍｇのベンダムスチンＣ１２エステルを５ｍＬのジクロロメタンに溶解して調製した。前記油相をＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒｅｘ携帯型ホモジェナイザーを用い、６０ｍＬのＤＩ水、２．４ｇのＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの凍結乾燥固体）、および６．６ｇのマンニトールを有する水相で乳化し、粗エマルジョンを得た。このエマルジョンを約３０，０００ｐｓｉでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍ−１１０Ｐ高圧ホモジェナイザーに５回通過させた。前記ジクロロメタンを得られたナノ粒子懸濁液からロータリーエバポレーターにより取り除き、得られた水性懸濁液をＤＩ水で希釈して総量を５０ｍＬとした。次に、ナノ粒子の懸濁液を１００ｍＭのｐＨ８．５ホウ酸塩緩衝剤２００ｍＬに希釈し、得られたナノ粒子の粒子サイズおよびゼータ電位をＭａｌｖｅｒｎのゼータサイザーにより測定した。前記ナノ粒子の粒子サイズは７８．９ｎｍ（Ｚａｖｇ）であり、表面電荷は−１３．０ｍＶであった。懸濁液を攪拌し、１５０ｍｇのメトキシ−ＰＥＧ５，０００−ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（Ｌａｙｓａｎポリマー）を加えた。前記反応液を室温で約９０分間混合し、その粒子サイズおよびゼータ電位を再測定した。ナノ粒子のサイズは８３．６ｎｍ（Ｚａｖｇ）であることが分かり、ゼータ電位は−７．３５ｍＶであった。ナノ粒子の緩衝液を交換し、６．６％（ｗｔ／ｗｔ）マンニトール溶液および５０，０００ＭＷＣＯダイアフィルトレーションカートリッジを用いて濃縮した。この懸濁液を次に３０ｍＬの血清バイアルに１０ｍＬずつ分け、凍結乾燥した。
【０１００】
ベンダムスチンＣ１２エステルナノ粒子とポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）およびポリオキシエチレン乳酸共重合体（ＰＥＬＡ）界面活性剤：油相は、３００ｍｇのベンダムスチンＣ１２エステルと５００ｍｇのＰＬＧＡ（５０／５０乳酸：グリコール酸、ＭＷ７，０００〜１７，０００、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐａｒｔ＃  ７１９８９７）を２．５ｍＬのジクロロメタンに溶解して調製した。前記油相をＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒｅｘ携帯型ホモジェナイザーを用い、３０ｍＬのＤＩ水、０．６ｇのＰＥＧ−５，０００−ポリ乳酸１，０００共重合体（共重合体はＡ．  Ｌｕｃｋｅ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２１，  （２０００），  ２３６１−２３７０の方法により調製）、および３．３ｇのマンニトールを有する水相で乳化し、粗エマルジョンを得た。このエマルジョンを約３０，０００ｐｓｉでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍ−１１０Ｐ高圧ホモジェナイザーにより５分間処理した。前記ジクロロメタンを得られたナノ粒子懸濁液からロータリーエバポレーターにより取り除き、得られた水性懸濁液をＤＩ水で希釈して総量を５０ｍＬとした。得られたナノ粒子の粒子サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎのゼータサイザーで測定すると２４８．０ｎｍ（Ｚａｖｇ）であった。この懸濁液を次に３０ｍＬの血清バイアルに１０ｍＬずつ分け、凍結乾燥した。
【０１０１】
濃縮液中のベンダムスチンＣ１２エステルＨＳＡナノ粒子：油相は４．８ｇのベンダムスチンＣ１２エステルを１３．４ｍＬのジクロロメタンに溶解して調製した。前記油相をＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒｅｘ携帯型ホモジェナイザーを用い、１１１ｇの脱イオン（「ＤＩ」）水および９ｇのＨＳＡを有する水相で乳化し、粗エマルジョンを得た。このエマルジョンを約３０，０００ｐｓｉでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍ−１１０Ｐ高圧ホモジェナイザーに５回通過させた。１２ｇのＮａＣｌを加え、溶解するまで混合して、得られたナノエマルジョン濃縮液を安定化した。安定化は、例えば、他の塩、熱のコントロール、および／またはｐＨの調製など、当該分野で既知の他の方法でも達成することができる。例えば、グルタルアルデヒドとの架橋は凝集防止にも役立つ可能性がある。
【０１０２】
前記ジクロロメタンをロータリーエバポレーターにより得られたナノ粒子懸濁液から取り除いた。得られた水性懸濁液を１２ｇのスクロースおよびＤＩ水と混合し、総重量を４８０ｇとした。次に、この懸濁液を２０ｍＬの血清バイアルに７．５ｍＬずつ入れ、凍結乾燥した。
【０１０３】
ＨＳＡナノ粒子溶液は、時間とともにゆっくりと粒子サイズの増加を示した。一部の溶液では、動的光散乱で測定すると１２〜２４時間以内にサイズが約２００ｎｍに達した。ナノ粒子が凝集していたか、または前記製剤中の過剰なタンパク質が粒子表面に加わり、粒子サイズが大きくなったのかを判断するため、この増加の性質をｃ−ＴＥＭにより調査した。凍結乾燥したナノ粒子のバイアルを再溶解し、ｃ−ＴＥＭにより画像化した（図２１）。同じナノ粒子のバイアルを２４時間室温で放置してから、再度画像化した（図２２）。最初のサンプルには球形粒子が含まれ、サイズ分布は２５〜６０ｎｍであった。時間が経過したサンプルではサイズ分布が３５〜１３０ｎｍまで増加し、粒子が凝集した徴候はなかった。いずれのサンプルにも１〜３ｎｍの粒子集団が含まれ、これは「遊離」タンパク質と一致している。これらの結果は、「遊離」ＨＳＡが前記ナノ粒子の表面に加わり、溶液中では粒子サイズがゆっくりと増加することを示している。ｐＨの変更、浸透圧の変更、溶媒の追加、および過剰なタンパク質を取り除くためのダイアフィルトレーションを含め、この工程を緩和するための戦略をいくつか利用することができる。
【０１０４】
腫瘍細胞分離株を調製するプロトコール：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株皮下異種移植片（マトリゲル中細胞５×１０６個）を有するＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂ無胸腺ヌードマウスを殺処分し、腫瘍分離株を作成した。無菌の器具を用いて無菌的に作業を行い、安楽死させた動物から腫瘍を取り出した。腫瘍を５０ｍＬの無菌円錐管に入れ、５ｍＬのトリプシンを加えた。前記腫瘍を小さく切断し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、セルストレイナーを第２の５０ｍＬの無菌円錐管に取り付け、最初の円錐管の内容物を前記セルストレイナーに入れた。シリンジプランジャの平らな端部分を用いて組織をろ過器に通した。前記セルストレイナーをＦＢＳを含む培地５ｍＬで洗った。細胞を遠心沈殿し、上清を廃棄した。細胞をＰ／Ｓを含む完全培地２０ｍＬに再懸濁し、７５ｃｍのフラスコに入れた。このデータを表１に示す。
【０１０５】
ＭＴＳ細胞アッセイの一般的手順：ヒト癌細胞（２，０００細胞／ウェル）を望みの濃度の被験分子（０〜２００μＭ）と７２時間インキュベートした。次に細胞をＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）と１〜２時間インキュベートし、前記化合物の細胞増殖に対する作用を吸光度４９０ｎｍで測定することにより決定した。細胞増殖は適切な対照（プラセボ）の割合（％）として表した。このデータを用い、各化合物のＩＣ５０を計算した。報告するすべてのデータは、３つの独立した実験の平均±ＳＥである。このデータを表１に示す。
【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
前述の生物学的データも図１に示す。前述のエステル投与後のベンダムスチンの血漿中濃度を図２０に示す。
【０１０８】
腫瘍有効性
ヌードマウスＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍有効性試験の手順：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂ無胸腺ヌードマウスにマトリゲル中５×１０６個のヒト腫瘍細胞を皮下注射した。前記マウス集団の平均腫瘍サイズが約１５０ｍｍ３になるまで腫瘍容積をモニターした。次に、前記マウスを９投与群（以下に表をまとめる）のうち１群に無作為に割り付け、１群につきマウス１０匹の集団とした（ｎ＝１０）。試験１日目および２日目に、各製剤を尾静脈注射により１００μＬの固定用量で投与した。試験期間中３週間、３〜４日ごとにマウスの体重を量り、腫瘍容積を測定した。このデータを表２および図２に示す。
【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
ヌードマウスＨ４６０腫瘍有効性試験の手順：Ｈ４６０腫瘍細胞（大細胞肺癌）を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で、空気９５％、ＣＯ２５％とし、３７℃で培養した。８０〜９０％のコンフルエントに達した時点で、前記細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液により５〜１０分以内で分離し、新鮮培地で中和し、セルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ社、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ、Ａｕｔｏ  Ｔ４）により計数した。培地とマトリゲル（１：１の比）の混合溶液中に２×１０６細胞／１００ｕｌとし、各ｎｕ／ｎｕマウスの右後側腹部に注射した。移植を行ったマウスをモニターし、電気キャリパーで測定した。腫瘍サイズが約１５０ｍｍ３に達した時点で試験を開始した。以下の表につき、マウスは９群で測定、無作為化し、各群のマウスは１０匹とした。
【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
前記製剤は、化合物を製剤化後３０分以内に尾静脈注射により、１００μＬの用量で投与した。すべてのマウスの体重および腫瘍を週２回測定した。試験の最終日の時点で血漿、腫瘍、肺、肝臓、脾臓、左腎臓、脳、および脚を回収し、投与後２時間でさらに分析するため、急速凍結した。結果を表３に示す。
【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
薬物動態試験実験
ヌードマウス腫瘍有効性ＰＫ群の手順：腫瘍を有するマウスの一部に、サテライトＰＫ群として投与を行った。各群の投与は腫瘍有効性群の説明のとおり行ったが、ＰＫ群は安楽死させ、組織サンプルは２日目の投与後１、３、６時間で回収した。回収した組織には血液、肺、肝臓、および腫瘍を含めた。ＬＣ−ＭＳのプロトコール項に説明するとおり、サンプルのベンダムスチン塩酸塩および対応するエステル類似体を分析した。
【０１１５】
ＰＫ試験のＬＣ−ＭＳ実験プロトコール：内部標準を含むアセトニトリルでタンパク質を沈殿させた後、標準的なプロトコールに従い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／質量分析用に血漿および他の組織を調製した。前記サンプルにおいて、本発明のベンダムスチン塩酸塩およびベンダムスチンエステルとアルプレノロール（内部標準）をタンデム型質量分析と直結したＨＰＬＣにより分析した。リン酸ナトリウム緩衝液中で組織サンプルをホモジェナイズし、前記アッセイで得られた値を３倍し、処理時の希釈について補正した。
【０１１６】
ＰＫ試験の動物投与プロトコール：すべての実験で成獣（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、米国ニューヨーク州Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ｎ＝３または４／時点）を使用した。外側尾静脈からのＩＶ投与前、マウスまたはラットは一晩絶食しなかった。マウスでは１００μＬの固定用量、またはラットでは１ｍＬ／ｋｇの投与量でＩＶ投与を行った。マウスは断頭術により殺処分し、規定のサンプリング時間でヘパリン添加した試験管に体幹からの血液を回収した。採血では、透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓ（登録商標）制限管に各ラット（非麻酔）を入れ、規定のサンプリング時間で外側尾静脈からサンプル（約０．２５ｍＬ）を採血してヘパリン添加した試験管に入れた。（注意：投与前のサンプルは入手しなかった。）この手順の例外は最後のサンプリング時間であり、この時、ラットを断頭術により殺処分し、尾静脈から採血する代わりに体幹から採血した。血液サンプルは遠心分離により血漿を分離するまで、氷水に入れておいた。血漿分画を透明で乾燥した試験管に入れ、ドライアイスで凍結し、分析を待つ間、約−２０℃で保存した。脳全体および他の高度に環流した臓器（肝臓、肺、脾臓、腎臓、および心臓）を規定の時点で迅速に摘出し、ドライアイスで凍結した。すべての組織サンプルも分析を待つ間、約−２０℃で保存した。
【０１１７】
薬物動態学的分析：薬物動態学的分析の準備では、すべてのマウスおよびラットの血漿濃度データをＥｘｃｅｌスプレッドシートに入力した。平均薬物動態パラメーターは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）を用い、血漿濃度対時間データの非コンパートメント分析（ＧｉｂａｌｄｉおよびＰｅｒｒｉｅｒ、１９８２）により推定した。血漿からの終末排泄速度定数（β）は、片対数血漿濃度−時間曲線の終末部分の直線回帰により推定した。見かけの終末半減期（ｔ１／２）は０．６９３をβで割って計算した。単回投与後の時間ゼロから最終測定可能濃度の時間までの血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）は、直線台形公式により決定した。ゼロから無限大までの面積（ＡＵＣ０−∞）は、ＡＵＣ０−ｔと最終測定可能濃度から無限大まで外挿した面積（Ｃｌａｓｔ／β）の合計として計算した。ＡＵＣを計算する目的で、投与前の濃度はすべてゼロであると想定した。最後の定量サンプリング時間後の定量限界未満（ＢＬＱ）のすべての濃度は、ＡＵＣを計算する目的で空値とみなし、特定サンプリング時間の平均濃度の計算ではゼロとして処理した。
【０１１８】
薬物動態学的試験のデータを表４〜１７に示す。
【０１１９】
【表６】
0006262246.tif 000018
【０１２０】
表４のデータは図８にも示している。
【０１２１】
【表７】
0006262246.tif 000019
【０１２２】
表５のデータは図９にも示している。
【０１２３】
【表８】
0006262246.tif 000020
【０１２４】
表６のデータは図１０にも示している。
【０１２５】
【表９】
0006262246.tif 000021
【０１２６】
表７のデータは図１１にも示している。
【０１２７】
【表１０】
0006262246.tif 000022
【０１２８】
表８のデータは図１２にも示している。
【０１２９】
【表１１】
0006262246.tif 000023
【０１３０】
表９のデータは図１３にも示している。
【０１３１】
【表１２】
0006262246.tif 000024
【０１３２】
表１０のデータは図１４にも示している。
【０１３３】
【表１３】
0006262246.tif 000025
【０１３４】
表１１のデータは図１５にも示している。
【０１３５】
【表１４】
0006262246.tif 000026
【０１３６】
表１２のデータは図１６にも示している。
【０１３７】
【表１５】
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【０１３８】
表１３のデータは図１７にも示している。
【０１３９】
【表１６】
0006262246.tif 000028
【０１４０】
表１４のデータは図１８にも示している。
【０１４１】
【表１７】
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【０１４２】
表１５のデータは図５にも示している。
【０１４３】
【表１８】
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【０１４４】
表１６のデータは図６にも示している。
【０１４５】
【表１９】
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【０１４６】
本発明の別の実施形態であるベンダムスチンＣ１４エステルは、前述の方法によりナノ粒子静脈内投与製剤に製剤化し、ＣＤ−１マウスに投与した。マウス血漿中のベンダムスチン（ＢＭ１）およびベンダムスチンＣ１４エステルの量を決定した。これらの実験の結果を表１８にまとめる。
【０１４７】
【表２０】
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【０１４８】
ベンダムスチンのＰＥＧ化エステルについても検討した。ベンダムスチンのＰＥＧ−２０００およびＰＥＧ−５０００エステルに関するデータを以下の表１９および２０に示す。このデータは、図１９にも示している。
【０１４９】
【表２１】
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【０１５０】
【表２２】
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【０１５１】
ベンダムスチンエステルのＩｎ  Ｖｉｔｒｏ安定性に関する分析
腫瘍Ｓ９の前処理：乳癌（ＭＢ−２３１）または非小細胞肺癌（Ｈ４６０）を有するＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ無胸腺ヌードマウスを殺処分した。腫瘍を直ちに摘出し、氷冷した１．１５％  ＫＣｌですすいだ。腫瘍の重量を量り、切断し、細かく切った。細かく切った組織に４倍（ｖ／ｗ）の氷冷ＳＥＴ緩衝液（２５０ｍＭスクロース、５．４ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、および２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．４）を混合し、組織ホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートをきれいなポリカーボネート製超遠心分離管に移し、１０，０００ｇ、４℃で２０分間回転させた。超遠心分離管上部の液体を消毒綿で取り除き、小分けした上清（Ｓ９）を−８０℃の冷凍庫で保存した。
【０１５２】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーション：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を含むインキュベーション混合物、ＮＡＤＰＨ−（還元型ニコチンアミドアデノシン二リン酸）再生系、および１ｍｇ／ｍＬの腫瘍Ｓ９を３７℃の水浴で予め加温した。１μＬのベンダムスチンＣ６、Ｃ８、Ｃ１２、またはＣ１４エステルを別のインキュベーション混合物に加えて反応を開始し、各ベンダムスチンエステルの最終濃度を１０μＭとした。指定された時間に、インキュベーション混合物を１００μＬずつ取り、４００μＬの停止液（４または８μＭのチアガビン［ＩＳ］を０．１％ギ酸／アセトニトリル溶液に入れたもの）と混合した。すべてのサンプルをボルテックスで混合し、少なくとも１０分間氷上に置いてから、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１７Ｒ遠心分離機で１４０００ｒｐｍ×８分間遠心分離にかけ、タンパク質を沈殿させた。上清をＨＰＬＣバイアルに移し、タンデム型質量分析により検出する高速液体クロマトグラフィーによる分析用に１０μＬを注入した。
【０１５３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムはＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣおよびＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ４０００  ＭＳから成る。クロマトグラフィーはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ００Ｂ−４４４８−Ｂ０、Ｌｕｎａ  ＰＦＰ（２）カラム（５０×２ｍｍ、粒子サイズ５μｍ）で行った。移動相全体の流速は０．５ｍＬ／分であった。勾配は７０％の移動相Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液）および３０％の移動相Ｂ（１００％アセトニトリル）で始めた。この後、移動相Ｂの割合を０．５分以内に９５％まで直線的に増加させ、この割合で１．３分維持し、１分以内に最初の状態に再平衡化した。質量分析計を各ベンダムスチンエステルにそれぞれ最適な条件に調節し、４４２．２／３４０．１（Ｃ６）、４７０．２／３４０．１（Ｃ８）、５２６．３／３４０．１（Ｃ１２）、および５５４．３／３４０．１（Ｃ１４）の遷移をモニタリングした。
【０１５４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性試験のデータを図３および４に示す。
【０１５５】
電子顕微鏡実験
ｃ−ＴＥＭ試験用のサンプルの調製：サンプルは、前記サンプルに注射用水（ＷＦＩ）７．８ｍＬを加えて可溶化し、手で反転させて混合した。サンプルは約２〜５分で急速に溶解し、溶液中に溶解していない粒子は目視されなかった。サンプルは、４００メッシュの銅グリッドでカーボンコーティングした孔開（ｈｏｌｅｙ）カーボン膜により支持されているガラス固化体の氷で保存した。前記サンプルは無菌グリッドに未希釈のサンプル溶液を３μＬ滴下して調製し、ろ紙で拭き取り、直ちに液体エタン中でのガラス固化に移行した。グリッドは、画像化用の電子顕微鏡に移すまで、液体窒素で保存した。
【０１５６】
ｃ−ＴＥＭ画像化パラメーター：ＦＥＩ  Ｅａｇｌｅ  ４Ｋ×４Ｋ  ＣＣＤカメラを搭載したＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｔ１２電子顕微鏡を用い、１２０ＫｅＶで操作することで、電子顕微鏡検査を行った。−１７０℃未満の温度でグリッドを保持する低温保持装置を使用し、グリッドを電子顕微鏡に移した。グリッドの画像は複数のスケールで取得し、検体の全体的な分布を評価した。低倍率で画像化に適していると考えられる標的部位を特定した後、５２，０００×（０．２１ｎｍ／ピクセル）、および２１，０００×（０．５０ｎｍ／ピクセル）の基準倍率で高倍率画像を取得した。画像は−４μｍ（５２，０００×）および−５μｍ（２１，０００×）の基準不足焦点および電子線量約１０〜１５ｅ／Å２で取得した。
【０１５７】
電子顕微鏡検査の結果は図７に示す。
【０１５８】
ベンダムスチンエステルのＨＳＡナノ粒子製剤を用いた架橋実験
本発明のベンダムスチンおよびベンダムスチンエステルの循環時間は、ＨＳＡを基本としたナノ粒子製剤を用いて延長することができ、このような製剤では、ナノ粒子構造が形成した後にタンパク質構造が共有結合により架橋されている。例えば、Ｋ．  Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ３４７  （２００８）  １０９−１１７を参照。これにより、表面コーティングにより多くの構造ができ、ナノ粒子の内容物が急速に放出されるのを防ぐ。また、架橋剤にＰＥＧ基を導入することで、ナノ粒子の「ステルス」保護が可能となる。ＨＳＡナノ粒子の効率的なカプセル化と硬化は、市販のジアルデヒドであるグルタルアルデヒドを用いて証明した。適切なサイズのＰＥＧ構造は、例えば以下に示すとおり調製した三官能性ＰＥＧ架橋剤を用いて追加することができる。
【０１５９】
【化１０】
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【０１６０】
手順：ＨＳＡナノ粒子はＤＩ水で希釈し、ベンダムスチンＣ１４エステルの濃度を１．５ｍｇ／ｍＬとしたが、これはＨＳＡの濃度６ｍｇ／ｍＬに対応する。次に、得られたナノ粒子の懸濁液を、電磁回転子を装備した５つのガラスバイアルに１ｍＬずつ入れた。適切な量の５０％グルタルアルデヒド溶液を加え、各バイアルにふたをし、室温で一晩攪拌した。各サンプルをＮーメチルピロリドン（ＮＭＰ）と１：１０で希釈し、微小遠心により約２分間回転させ、ＨＳＡと架橋ＨＳＡナノ粒子を取り除いた。上清をＨＰＬＣにより分析し、ベンダムスチンＣ１４エステルの濃度（ピーク面積）を決定して、粒子のカプセル化を確認した。以下の表は、グルタルアルデヒドのμＬの関数として、カプセル化されなかったベンダムスチンＣ１４エステルの濃度を示している。
【０１６１】
【表２３】
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【０１６２】
この表は、３．３３μＬ／ｍｇ（ＨＳＡ）の比率でのグルタルアルデヒドの追加が、架橋ベンダムスチンエステルを含むナノ粒子系を生じるのに適していたことを示している。
【０１６３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ多発性骨髄腫モデル
材料と方法
ＲＰＭＩ  ８２２６（ヒト形質細胞腫、骨髄腫Ｂ細胞）ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１５５；
ＥＣＭゲル（マトリゲル）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ番号Ｅ１２７０、５ｍｌ
ＲＰＭＩ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、ロット：１１１０２３５）
Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ）３．５ｍｇ、バイアルに凍結乾燥、ロット番号ＢＩＺＳＣ００
ベンダムスチン（ロット番号ＴＤ−Ｄ０８１５、ＡＰＩロット番号０００３９Ｐ００１２）
ベンダムスチンＣ１２エステルナノ粒子（Ｃ１２ＮＰ）、ロット番号２８６１−２４２−２２、１７．６ｍｇ／バイアル
塩化ナトリウム
注射用水（ＤＥＭＯ  Ｓ．Ａ．）
被験動物
８０  ＣＢ．１７  ＳＣＩＤ雌マウス、４〜６週齢、１６〜２０グラム、Ｈａｒｌａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｃｅｎｔｅｒから入手
細胞の調製
細胞（ＡＴＣＣ由来）をＲＰＭＩ培地で培養した。細胞懸濁液を遠心分離、５０％マトリゲル／ＨＢＳＳに再懸濁し、最終濃度を７ｘ１０７細胞／ｍｌとした。前記懸濁液は、１００μＬの用量で麻酔したマウスの右側腹部に皮下注入した。
【０１６４】
化合物の調製
ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）は週に一度用意した。７ｍｌの生理食塩水を３．５ｍｇの粉末を含む最初のバイアルに加え、０．５ｍｇ／ｍｌとした。この溶液３ｍＬを２７ｍＬの生理食塩水に加え、濃度を０．０５ｍｇ／ｍｌとした。
【０１６５】
ベンダムスチンの調製：投与直前に１３．５ｍｇを３．６ｍｌの０．９％生理食塩水／５％マンニトール１：１混合液に溶解した。この溶液１．０５ｍｌを０．９５ｍｌの希釈液に加え、２ｍｇ／ｍｌの溶液とした。
【０１６６】
Ｃ１２ＮＰの調製：投与直前に１７．６２ｍｇを含むサンプルバイアルに３．１ｍｌのＳＷＦＩを加えた。この溶液１．０５ｍｌを０．９５ｍｌの希釈液に加え、２ｍｇ／ｍｌの溶液とした。
【０１６７】
実験デザイン
０日目、マウスに７×１０６個のＲＰＭＩ  ８２２６細胞／マウス（５０％マトリゲル／ＨＢＳＳ中）を皮下移植した。２１日目、最適な平均腫瘍容積（約１５０ｍｍ３）によりマウスを分類し、各群のマウスを９匹とした８群に割り当てた。
【０１６８】
【表２４】
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【０１６９】
ＳＣＩＤマウスの性質（すなわち、重度に免疫力が低下している）のため、このマウスはより脆弱／過敏性となっているため、ＮＵＤＥマウス（比較的免疫力を維持している）に使用されるＣ１２ＮＰの用量に抵抗性を示しにくいことに注意する。具体的には、ＳＣＩＤマウスに１００ｍｇ／ｋｇおよび７０ｍｇ／ｋｇを投与すると、許容できない抵抗性の問題が生じることが明らかとなった（つまり、体重減少が２０％以上）（データは図示せず）。これは（ヌードマウスとＳＣＩＤマウスの抵抗性の差）は系に関連した現象と考えられる。そのようなものとして、用量３７．５ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのＣ１２ＮＰを用いて試験を進めた。
【０１７０】
統計解析
腫瘍容積は、以下の方程式により計算した。
【０１７１】
【化１１】
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【０１７２】
体重増加および腫瘍容積進行は、一元配置分散分析の後にテューキーの事後比較を行って分析した。
【０１７３】
結果
投与への反応を図２３および２４にまとめている。Ｃ１２ＮＰ  ２０ｍｇ／ｋｇを除くすべての投与において、対照群と比較して有意に腫瘍成長が抑制された（表２１のデータ参照）。３７．５ｍｇ／ｋｇでは、ベンダムスチンとＣ１２ＮＰの有効性は同等であり、腫瘍の増殖が８１％および７０％抑制された。しかし、図２４に見ることができるとおり、Ｃ１２ＮＰ投与動物の体重減少が少ないことで測定されるとおり、Ｃ１２ＮＰの忍容性はベンダムスチンより優れていた。
【０１７４】
【表２５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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