(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エストロゲン受容体（ＥＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｋｉ−６７、およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の各々用に少なくとも２つの異なる視野（ＦＯＶ）を、被験者から得られた乳癌サンプルにおいて選択するステップであって、前記サンプルが、ＥＲ、ＨＥＲ２、Ｋｉ−６７、およびＰＲの各々用の抗体が検出可能に標識される、ステップと、
前記選択したＦＯＶの各々において、ＥＲ、ＨＥＲ２、Ｋｉ−６７、およびＰＲタンパク質発現を測定するステップと、
免疫組織化学（ＩＨＣ）複合スコアＩＨＣ４を判定するステップであって、前記免疫組織化学複合スコアは、４つの測定されたマーカ、ＥＲ、ＨＥＲ２、Ｋｉ−６７、およびＰＲに基づく予知スコアである、ステップと、
前記選択したＦＯＶの各々において、ＥＲおよびＰＲタンパク質異質性を測定するステップと、
ＥＲおよびＰＲの各々に対してタンパク質異質性スコアを判定するステップであって、前記タンパク質異質性スコアは、異なるＦＯＶにおける特定のバイオマーカのタンパク質発現異質性の量の指示である、ステップと、
前記タンパク質異質性スコアおよび前記ＩＨＣ複合スコアを組み合わせることによって、出力予知スコアを生成するステップと、
前記出力予知スコアが閾値を満たす場合に、前記サンプルにおける乳癌が進行性である可能性が高いと判定し、前記出力予知スコアが閾値を満たさない場合に、前記サンプルにおける乳癌は進行性でありそうにないと判定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記乳癌サンプルが早期乳癌サンプルである、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、前記早期乳癌サンプルが、ＨＥＲ２陰性、ＥＲ陽性、およびリンパ節陰性である、方法。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか一項記載の方法であって、更に、ＥＲ、ＨＥＲ２、Ｋｉ−６７、およびＰＲの各々に対して検出可能に標識された前記乳癌サンプルのディジタル化画像を得るステップを含む、方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか一項記載の方法において、ＥＲ、ＨＥＲ２、Ｋｉ−６７、およびＰＲタンパク質発現を測定するステップが、
ＥＲ、Ｋｉ−６７、およびＰＲの各々に対する陽性百分率と、
ＨＥＲ２に対する等級スコアと、
ＥＲに対するＨ−スコアと、
を判定するステップを含む、方法。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか一項記載の方法において、ＩＨＣ複合スコアを判定するステップが、
ＩＨＣ４ ＝ ９４．７ × ｛−０．１００ＥＲ１０ − ０．０７９ＰＲ１０ ＋ ０．５８６ＨＥＲ２ ＋ ０．２４０Ｉｎ（１ ＋ １０ × Ｋｉ６７）｝
の式を適用するステップを含み、ＥＲ１０がＥＲに対するＨ−スコアであり、ＰＲ１０がＰＲに対する調節した陽性百分率スコアであり、ＨＥＲ２がＨＥＲ２に対する等級スコアであり、Ｋｉ６７がＫｉ−６７に対する陽性百分率である、方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項記載の方法において、ＥＲ、ＨＥＲ２、Ｋｉ−６７、およびＰＲタンパク質異質性を測定するステップが、ＥＲ、ＨＥＲ２、Ｋｉ−６７、およびＰＲの各々に対する可変性メトリック（ＶＭ）を判定するステップを含み、ここで、
ＶＭ ＝ ＳＴＤ（ＰＰ(ＦＳ１)，ＰＰ(ＦＳ２), ....ＰＰ(ＦＳＮ))
であり、ＰＰ（ＦＳ）が、各視野ＦＳに対する陽性百分率である、方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、ＥＲおよびＰＲの各々に対してタンパク質異質性スコアを判定するステップが、次の式
【数１】
0006405319.tif 000014
を使用するステップを含み、ここでα＝［０，１］であり、Ｓは平均陽性百分率スライド・スコアである、方法。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか一項記載の方法において、ＨＥＲ２に対するタンパク質異質性スコアを判定するステップが、次の式
【数２】
0006405319.tif 000015
を使用するステップを含み、Ｐが各視野の等級スコアである、方法。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか一項記載の方法において、出力予知スコアを生成するステップが、
出力予知スコア ＝ 免疫組織化学複合係数 × ＩＨＣ４ ＋ 異質性係数 × 複合異質性スコア
の式を使用するステップを含み、前記複合異質性スコアが、（ＥＲ異質性スコア＋ＰＲ異質性スコア）の二乗根に等しい、方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、
前記免疫組織化学複合係数が０．０３１１４に等しく、前記異質性係数が１．９５１１９に等しい、方法。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか一項記載の方法において、前記ステップの１つ以上が、適切にプログラミングされたコンピュータによって実行される、方法。
【請求項１３】
請求項１から１２までのいずれか一項記載の方法において、乳癌サンプルにおいて少なくとも２つの異なるＦＯＶを選択する前記ステップが、病理医によって実行される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、早期乳癌のような、乳癌を予知するための画像分析に関する。
研究契約に参加する当事者
Ventana Medical Systems, Inc.,（ベンタナ・メディカス・システムズ社）、Cleveland Clinic（クリーブランド・クリニック）、およびthe University of Melbourne（メルボルン大学）は、本明細書において開示する発明を管理する研究契約に参加する当事者である。
【背景技術】
【０００２】
局所的（早期、切除可能な）乳癌があり治療のための手術を受けた患者は、局所的な癌再発または離れた部位における癌再発という根本的な危険性があり、再発する人々は、高い死亡率を示す。危険の大きさに依存して、異なる処置の選択肢が存在する。このため、癌再発の危険性が低い患者または高い患者を信頼性高く識別する検定(assay)が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、危険が高い患者と危険が低い患者との間で信頼性高く判別し、患者の処置選択肢を決定するときに考慮すべき追加情報を医療供給者に提供することができる技術も必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本願は、乳癌予知のためのコンピュータ実装方法を提供する。例えば、この方法は、 バイオマーカ用の抗体で検出可能に標識された乳癌サンプルを描写する表示画像内における複数のディジタル視野間においてバイオマーカに対して測定したタンパク質異質性と、被験者に対する免疫組織化学複合スコアとに少なくとも部分的に基づいて、乳癌再発予知スコアを生成するステップと、乳癌再発予知スコアに基づいて、被験者に対する乳癌再発予知の指示を出力するステップとを含むことができる。これらの方法に基づいて、開示した方法を計算システムに実行させるコンピュータ実行可能命令を含む１つ以上の非一時的なコンピュータ読み取り可能媒体も提供される。
【０００５】
また、コンピュータ実装方法も提供される。一例では、このような方法は、被験者からの乳癌サンプルにおけるそれぞれのバイオマーカに対するタンパク質発現を描写する複数のスライド画像を受け取るように動作可能なスライド画像処理ツールを含む。このスライド画像処理ツールは、更に、スライド画像内における視野を更に受け取るように動作可能であり、このスライド画像処理ツールは、スライド画像およびスライド画像内における視野に基づいて、免疫組織化学複合スコアを計算するように動作可能であり、このスライド画像処理ツールは、スライド画像およびスライド画像内における視野の選択に基づいて、１つ以上の異質性スコアを計算するように動作可能であり、免疫組織化学複合スコアおよび１つ以上の異質性スコアを入力として受け入れ、被験者において癌が再発する可能性が高いか否かの指示を出力するように動作可能な予知ツールを含む。
【０００６】
また、本開示は、乳癌再生予知の指示を表示するステップを含むことができる、コンピュータ実装方法も提供する。このような方法は、免疫組織化学複合スコアと異質性スコアとを組み合わせて乳癌再発予知スコアを求めるステップと、乳癌再発予知スコアに基づいて、乳癌再発予知の指示を表示するステップとを含むことができる。
【０００７】
コンピュータ実装方法が提供され、この方法は、バイオマーカ用の抗体で検出可能に標識された乳癌サンプルを描写する表示画像内において複数のディジタル視野を受け取るステップと、ディジタル視野においてバイオマーカに対するタンパク質発現を測定するステップと、複数のディジタル視野間において、バイオマーカに対して測定したタンパク質発現の異質性を測定するステップと、バイオマーカに対して測定したタンパク質異質性を出力するステップとを含む。
【０００８】
被験者に対する免疫組織化学複合スコアを計算するステップを含むコンピュータ実装方法が提供される。この方法は、複数のバイオマーカ用に、それぞれのバイオマーカ抗体で検出可能に標識された乳癌サンプルを描写するそれぞれの画像内における複数のディジタル視野を受け取るステップと、複数のバイオマーカに対して陽性百分率を測定するステップと、免疫組織化学複合スコアを計算するステップであって、免疫組織化学複合スコアの計算が、１つのバイオマーカに対する陽性百分率を、第２バイオマーカに対する陽性百分率と組み合わせることを含む、ステップと、免疫組織化学複合スコアを出力するステップを含む。
【０００９】
コンピュータ実装方法が提供され、ＥＲ用の抗体で検出可能に標識された乳癌サンプルを描写する画像において、ＥＲ用に複数のディジタル視野を受け取るステップと、ＥＲ用の抗体で検出可能に標識された乳癌サンプルを描写する画像において、ＰＲ用に複数のディジタル視野を受け取るステップと、ＥＲ用の抗体で検出可能に標識された乳癌サンプルを描写する画像において、Ｋｉ−６７用に複数のディジタル視野を受け取るステップと、ＥＲ用の抗体で検出可能に標識された乳癌サンプルを描写する画像において、ＨＥＲ２用に複数のディジタル視野を受け取るステップと、ＥＲ用のディジタル視野に基づいて、ＥＲに対するＨ−スコアを計算するステップと、ＰＲ用のディジタル視野に基づいて、ＰＲに対する陽性百分率を計算するステップと、Ｋｉ−６７用のディジタル視野に基づいて、Ｋｉ−６７に対する陽性百分率を計算するステップと、ＨＥＲ２用のディジタル視野に基づいて、ＨＥＲ２に対する等級スコアを計算するステップと、ＥＲに対するＨ−スコア、ＰＲに対する陽性百分率、Ｋｉ−６７に対する陽性百分率、およびＨＥＲ２に対する等級スコアを組み合わせて、免疫組織化学複合スコアを求めるステップを含む。
【００１０】
被験者において乳癌を予知する(prognosing)または予告する(prognosticating)方法が提供される。ある例では、このような方法は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｋｉ−６７、およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の各々用に少なくとも２つの異なる視野（ＦＯＶ）を、被験者から得られた乳癌サンプルにおいて選択するステップであって、これらのサンプルが、ＥＲ、ＨＥＲ２、Ｋｉ−６７、およびＰＲの各々用の抗体が検出可能に標識される、ステップと、選択したＦＯＶの各々において、ＥＲ、ＨＥＲ２、Ｋｉ−６７、およびＰＲタンパク質発現を測定するステップと、免疫組織化学（ＩＨＣ）複合スコアを判定するステップと、選択したＦＯＶの各々において、ＥＲおよびＰＲタンパク質異質性を測定するステップと、ＥＲおよびＰＲの各々に対してタンパク質異質性スコアを判定するステップと、タンパク質異質性スコアおよびＩＨＣ複合スコアを組み合わせることによって、出力予知スコアを生成するステップと、出力予知スコアが閾値と一致する場合、被験者における乳癌が進行性である可能性が高いと判定し、出力予知スコアが閾値に一致しない場合、被験者における乳癌は進行性でありそうにないと判定するステップを含む。
【００１１】
バイオマーカ用の抗体で検出可能に標識された被験者からの乳癌サンプルの画像におけるディジタル視野を受け取り、このバイオマーカに対するタンパク質異質性を測定するために処理することができる。
【００１２】
異質性測定値を免疫組織化学複合スコアと組み合わせて、乳癌再発予知スコアを生成することができる。
このようなスコアは、免疫組織化学複合スコア単独よりも多い情報を提供することができる。
【００１３】
画像上における視野の選択を容易にするために、ディジタル病理医ワークフローをサポートすることができる。
本開示の以上のならびに他の目的および特徴は、添付図面を参照しながら進める以下の詳細な説明から一層明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本明細書において説明する技術を実行するためのシステム例のブロック図である。
【図２】図２は、乳癌再発予知スコアを生成するために使用される異なるタンパク質について、スライドの画像がどのように染色したかを示すブロック図である。
【図３】図３は、特許請求する方法の全体像を示す模式図である。
【図４Ａ】図４Ａは、視野におけるアノテーション例を示す画像である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、視野におけるアノテーション例を示す画像である。
【図５】図５は、特許請求する方法の全体像を示す模式図である。
【図６】図６は、胸部組織サンプルの免疫組織化学（ＩＨＣ）画像を得るステップ例を示す模式図である。
【図７】図７は、視野においてタンパク質発現を判定または測定するステップ例を示す模式図である。
【図８】図８は、タンパク質異質性を判定または測定するステップ例を示す模式図である。
【図９】図９は、本明細書において説明する乳癌予知技術を実現するシステム例のブロック図である。
【図１０】図１０は、本明細書において説明する乳癌予知技術を実現するコンピュータ実装方法例のフローチャートである。
【図１１】図１１は、スライドにおいて核を識別するコンピュータ実装方法例のフローチャートである。
【図１２】図１２は、視野採点(field-of-vide scoring)のためのシステム例のブロック図である。
【図１３】図１３は、視野採点のための他のシステム例のブロック図である。
【図１４】図１４は、真の陽性染色核を判定するためのクラシファイア(classifier)の一例のブロック図である。
【図１５】図１５は、真の陽性染色核を判定するための多段階クラシファイアの一例のブロック図である。
【図１６】図１６は、ＨＥＲ２等級スコア(binned HER2 score)を判定する方法例のフローチャートである。
【図１７】図１７は、本明細書において説明する乳癌予知技術を実現する異質性ツール(heterogeneity tool)を含むシステム例のブロック図である。
【図１８】図１８は、それぞれのバイオマーカに対して異質性スコアを判定することによって、本明細書において説明する乳癌予知技術を実現するコンピュータ実装方法例のフローチャートである。
【図１９】図１９は、バイオマーカに対して異質性スコアを計算するために異なるエンジンを含むシステム例のブロック図である。
【図２０】図２０は、本明細書において説明する乳癌予知技術において使用するための、異質性スコアを計算するためのコンピュータ実装方法例のフローチャートである。
【図２１】図２１は、画像内部においてディジタル視野を示すユーザ・インターフェースの一例のスクリーンショットである。
【図２２】図２２は、ディジタル病理学者ワークフロー方法の一例のフローチャートである。
【図２３】図２３は、説明する実施形態を実現することができる計算システム例のブロック図である。
【図２４】図２４は、乳癌サンプルを、進行性が強い（悪化）または弱い（悪化せず）ものとして分類する、開示する方法の能力を示すグラフである。該グラフに示される事例は、アルゴリズムを作成するために使用されたのと同じ事例である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
略語および用語
用語および方法についての以下の説明は、本開示をより良く説明するため、そして本開示の実施において当業者を導くために設けられる。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明らかに判断できない限り、１つよりも多いことに言及するものとする。例えば、「抗体を含む」(comprising an antibody)は、１つまたは複数の抗体を含み、「少なくとも１つの抗体を含む」という句と同等であると見なされる。「または」(or)という用語は、文脈上そうでないことが明らかに示されない限り、述べられた代替要素の１つの要素、または２つ以上の要素の組み合わせに言及するものとする。本明細書において使用される場合、「含む」(comprises)は「含む」(includes)を意味するものとする。つまり、「ＡまたはＢを含む」(comprising A or B)は、追加の要素を除外せずに「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含む」(including A, B, or A and B)ことを意味する。本明細書において言及されるGenBankアクセッション番号の日付けは、早い方では少なくとも２０１２年１２月２８日には入手可能な連番(sequences)である。
【００１６】
別段説明されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術の当業者に共通して理解されるのと同じ意味を有するものとする。本開示の実施または検査において、本明細書において説明するものと同様または同等の方法および材料を使用することができるが、適した方法および材料については以下で説明する。その材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定することを意図していない。
【００１７】
抗体：免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的にアクティブな部分、即ち、特定的に抗原（ＥＲ、ＰＲ、Ｋｉ−６７またはＨＥＲ２等）と結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子。抗体の例は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、およびヒト化抗体を含む。
【００１８】
自然に発生する抗体（ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＤ等）は、４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（Ｈ）、および軽鎖（Ｌ）を含み、ジスルフィド結合によって相互接続される。本明細書において使用する場合、抗体という用語は、細胞内に１つ以上の抗体鎖をエンコードするヌクレオチドの発現によって生成される組換え抗体も含む（例えば、米国特許第４，７４５，０５５号、米国特許第４，４４４，４８７号、ＷＯ８８／０３５６５、ＥＰ２５６，６５４、ＥＰ１２０，６９４、ＥＰ１２５，０２３、 Faoulkner et al, Nature 298:286, 1982、Morrison, J. Immunol. 123:793, 1979、Morrison et al, Ann Rev. Immunol 2:239, 1984を参照）。
【００１９】
また、抗体という用語は、自然に発生した抗体または組み替え抗体の抗体結合断片も含む。抗体という用語に含まれる結合断片の具体的な、非限定的例は、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、および単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。Ｆｂは、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を形成するためにパパイン酵素による抗体全体の消化によって生成される、または遺伝子工学によって同等に生成される、抗体分子の一価抗原結合断片を含有する断片である。Ｆａｂ’は、ペプシンによって抗体全体を処理し、続いて還元によって完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を形成することによって得られる抗体分子の断片である。抗体分子毎に、２つのＦａｂ’断片が得られる。（Ｆａｂ’）２は、酵素ペプシンによって抗体全体を処理し、続いて還元を行わないことによって、または遺伝子工学によって同等に得られる抗体の断片である。（ＦＡｂ’）２は、ジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ’断片の二重体である。Ｆｖは、軽鎖の可変領域、および２つの鎖で表現される重鎖の可変領域を含有する、遺伝子工学で作られた断片である。単鎖抗体（「ＳＣＡ」：signle chain antibody）は、軽鎖の可変領域、遺伝子的に溶融された単鎖分子として適したポリペプチド・リンカによってリンクされた、重鎖の可変領域を含有する、遺伝子工学で作られた分子である。これらの断片を作る方法は、当技術分野における型どおりの手順である。
【００２０】
結合親和性：ＥＲ，ＰＲ，Ｋｉ−６７，ＨＥＲ２ペプチド用の抗体の親和性というような、抗体の抗原に対する親和性。抗体親和性を判定する方法は、当技術分野では周知であり、Frankel et al., Mol. Immunol., 16: 101-106, 1979に記載された スキャッチャード(Scatchard)法の変更による計算、抗原／抗体解離速度による測定、または競合放射免疫検定法による計算を含む。高い結合親和性は、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１．５×１０−８、少なくとも約２．０×１０−８、少なくとも約２．５×１０−８、少なくとも約３．０×１０−８、少なくとも約３．５×１０−８、少なくとも約４．０×１０−８、少なくとも約４．５×１０−８、または少なくとも約５．０×１０−８Ｍとすることができる。
【００２１】
乳癌：上皮（癌腫）、間質（肉腫）胸部組織、その付近、またはそれを含む腫瘍のような、胸部のあらゆる腫瘍を含む。転移していない腺管癌（ＤＣＩＳ）は、導管の非侵襲的腫瘍性状態である。小葉癌は、侵襲的疾病ではないが、癌が発現するかもしれないという指標である。胸部の湿潤（悪性）癌は、段階（Ｉ，ＩＩＡ，ＩＩＢ，ＩＩＩＡ，ＩＩＩＢ，ＩＶ）に分割することができる。例えば、Bonadonna et al, (eds), Textbook of Breast Cancer: A clinical Guide the Therapy（乳癌の教科書：臨床的手引き、療法）、3rd; London, Tayloy & Francis, 2006を参照のこと。ＤＣＩＳは、侵襲的でないので、段階０の乳癌と呼ばれることもある。侵襲的乳癌の例は、癌ＮＯＳ（それ以外に指定されない）、小葉癌、管状腺癌／くし状腺癌、粘液性（コロイド）癌腫、骨髄癌、乳頭状癌、および化生性癌を含む。胸部肉腫の例に、仮葉腫瘍(phyllodes tumor)がある。
【００２２】
早期乳癌は、段階ＩまたはＩＩのものである。胸部組織サンプル、例えば、ＥＲ陽性、リンパ節陰性、および、ある例では、ＨＥＲ２陰性も早期乳癌として特徴付けられることもある。
【００２３】
乳癌に対する治療例は、外科手術（例えば、腫瘍の一部または全部の除去）、ホルモン遮断療法（例えば、タモキシフェン）、放射線、シクロホスホアミドおよびドキソルビシン（アドリアマイシン）、タキサン（例えば、ドセタケセル）、ならびにトラツズマブ(trastuzumab)（ハーセプチン）またはパーツズマブ(pertuzumab)のようなモノクロナール抗体、あるいはその組み合わせを含む。例の中には、開示する方法が、一層進行性の腫瘍を有すると識別された者のような被験者に対するこれらの療法の１つ以上を管理することを含むものもある。
【００２４】
対照(Control)：実験または検査サンプル（胸部サンプル等）との比較に使用されるサンプルまたは標準。実施形態の中には、対照が、正常な胸部サンプルまたは複数のサンプルというような、健康な患者（または複数の患者）から得られた正常なサンプルである場合もある。実施形態の中には、対照が、正常な胸部組織のような、乳癌と診断された患者から得られた非腫瘍組織サンプルである場合もある。実施形態の中には、対照が、ＥＲ＋, ＰＲ＋，Ｋ−６７＋，ＨＥＲ２−であると分かっているサンプルのような、既知の早期乳癌サンプル（または複数のサンプル）である場合もある。
【００２５】
実施形態の中には、対照が、過去の対照あるいは標準的基準値または値の範囲（既知の乳癌、正常な胸部サンプル、良性の胸部サンプル、上皮、または基質等）である場合もある。実施形態の中には、対照が、既知の正常な胸部サンプルまたは既知の早期乳癌サンプルというような、複数の患者サンプルから得られた平均値（または値の平均範囲）を表す標準値である場合もある。
【００２６】
対照サンプルは、対照を染色するために使用することができる。このような手法は、サンプルの信号対ノイズ比を識別することに関連することができる。
接触：ある薬剤を他の薬剤に近接させることによって、これらの薬剤に相互作用させること。例えば、生物サンプルを収容した顕微鏡スライドまたは他の表面に抗体を載せることによって、サンプルにおいて、抗体によって特定的に認識されるタンパク質の検出を可能にすることができる。
【００２７】
検出：薬剤が存在するかまたは不在か判定することであり、パターンを判定することも含むことができる。例の中には、これが更に定量化も含むことができる場合もある。例えば、個々のタンパク質（例えば、Ｋｉ−６７，ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２）に対して特定的な抗体の使用により、乳癌組織を含有するサンプルのような、サンプルにおけるタンパク質の検出が可能になる。特定的な例では、検出可能な標識（標的が存在する場合の信号の増大等）からの放出信号が検出される。
【００２８】
検出は一括で行うことができるので、巨視的な数の分子を同時に観察することができる。また、検出は、顕微鏡を使用して、更にこのような技法を、背景ノイズを低減するための全内部反射として使用して、ひとつひとつの分子からの信号の識別を含むことができる。
【００２９】
エストロゲン受容体（ＥＲ）：細胞間受容体の核ホルモン族のメンバーは、１７Ｐ−エストラジオル(17P-estradiol)によって活性化される。エストロゲン受容体は、乳癌の事例の約７０％において過剰発現され、「ＥＲ陽性」（ＥＲ＋）と呼ばれる。
【００３０】
Ｈ−スコア：強く染色された細胞を、弱く染色された細胞よりも大きく重み付けするタンパク質発現の指示。例えば、Ｈ−スコアは、弱く染色する細胞の百分率（例えば、１＋）、中位に染色する細胞の百分率（例えば、２＋）、更に強く染色する細胞の百分率（例えば、３＋）を示すことができる（例えば、Cuzick et al., J. Clin. Oncol. 29:4273-8, 2011を参照のこと。この論文をここで引用したことにより、その内容が本願にも含まれるものとする）（また、www.pathogenesys.com/html/semi-quantitative_ihc.htmlも参照のこと）。Ｈ−スコア計算技法の例については、本明細書において説明する。
【００３１】
異質性スコア：乳癌サンプルにおいて染色するＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲというようなサンプルにおけるバイオマーカのタンパク質発現異質性の量の指示。異質性スコアは、１つのＦＯＶが他のＦＯＶとは、同じマーカに対してどのように異なるかについて尺度を提示する。
【００３２】
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）：ＥｒｂＢタンパク質族のメンバーであり、人の染色体１７の長腕に位置する癌原遺伝子である(17ql12-ql2)。乳癌の約２５〜３０％は、ＨＥＲ２／ニュー遺伝子の増幅、またはそのタンパク質生成物の過剰発現を有し、「ＨＥＲ２陽性」と呼ばれる（ＨＥＲ２＋）。ＨＥＲ２＋の患者は、モノクロナール抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）を、乳癌のための治療として受けることができ、例の中には、モノクロナール抗体ペルツズマルと組み合わせて使用されることもある。乳癌におけるＨＥＲ２の過剰発現は、疾病の再発および悪化予知と関連付けられている。
【００３３】
免疫組織化学（ＩＨＣ）複合スコア：ＩＨＣマーカの数に基づく予知スコアであり、マーカの数は１よりも多い。ＩＨＣ４は、乳癌サンプルにおける４つの被測定ＩＨＣマーカ、即ち、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲに基づくそのようなスコアの１つである（例えば、Cuzick et al., J. Clin. Oncol. 29:4273-8, 2011、および Barton et al, Br. J. Cancer 1-6, April 24, 2012を参照のこと、双方の論文をここで引用したことにより、その内容が本願にも含まれるものとする）。一例では、ＩＨＣ４スコアは、例えば、次の式を使用して計算される。
ＩＨＣ４ ＝ ９４．７ × ｛−０．１００ＥＲ１０ ― ０．０７９ＰＲ１０ ＋ ０．５８６ＨＥＲ２ ＋ ０．２４０Ｉｎ（１＋１０ × Ｋｉ６７）｝
当業者にとって、他のＩＨＣ複合スコア（例えば、ＩＨＣ３，ＩＨＣ５等）も可能であることが認められる。
【００３４】
Ｋｉ−６７：細胞増殖およびリボソームＲＮＡに関連する核タンパク質。抗原Ｋｉ−６７の不活性化は、リボゾームＲＮＡ合成の抑制に至る。Ｋｉ−６７は、例えば、増殖のマーカとして使用される。
【００３５】
標識(Label)：例えば、分光測光、流動細胞分析法、または顕微鏡検査（光学顕微鏡検査等）による検出が可能な薬剤。例えば、１つ以上の標識を抗体に付着することによって、標的タンパク質の検出を可能にすることができる。標識の例は、放射性同位元素、蛍光体、リガンド、化学発光剤、酵素、およびその組み合わせを含む。一例では、標識は量子ドットである。
【００３６】
正常な細胞または組織：腫瘍のない、悪性でない細胞および組織。
出力予知スコア：被験者に対するＩＨＣ複合（例えば、ＩＨＣ４）スコアおよび異質性スコアを組み合わせて重み付けした結果。これから、乳癌予知を判定することができる。
【００３７】
プロゲステロン受容体（ＰＲまたはＰｇＲ）：プロゲステロンを特定して結合する細胞間ステロイド受容体。プロゲステロン受容体は、「ＰＲ陽性」（ＰＲ＋）と呼ばれる、ある乳癌事例において過剰発現される。
【００３８】
予知：追加の療法がないときに疾病（例えば、早期乳癌）を発症する被験者が起こり得る結果を判定するプロセス。一例では、開示する方法は、閾値よりも高い出力予知スコアが検出された場合、早期乳癌の一層進行した形態の予知を可能にする。対照的に、閾値よりも低い出力予知スコアが検出された場合、早期乳癌の進行性の弱い形態が予知される。例えば、予知は、余命（例えば、１年、３年、または５年後の生存の可能性）というような将来の事象を予測すること、乳癌の再発があり得ること（局所的または転移）（例えば、１年、３年、または５年後）を予測することに関係することができる。同様の「予告する」(prognosticate)という用語も本明細書では使用される。
【００３９】
定量化：実際の量または相対的な量のいずれであれ、数値量として表現すること。
サンプル：例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、タンパク質、またはその組み合わせを含有し、被験者から得られる生体試料。例は、微細針吸引生検、組織生検、外科手術標本、および生検素材を含むが、これらに限定されるのではない。一例では、サンプルは、針生検、乳腺腫瘤摘出、および乳房切除の間に得られるような、胸部組織を含む。
【００４０】
癌の病期分類：乳癌のような癌は、元の（原発）腫瘍の程度および身体内における拡散の程度に基づいて、癌の程度または重症度を記述するために、病期分類することができる。乳癌は、ＴＮＭシステム（AJCC Staging Manualを参照のこと）にしたがって、病期分類することができ、Ｔは腫瘍のサイズ、および近隣の組織に侵入しているか否か記述し、Ｎは含まれるあらゆるリンパ節を記述し、Ｍは転移（ある身体部分から他への癌の拡散）を記述する。
【００４１】
病期は、次の通りである。病期０−上皮内癌、病期Ｉ−腫瘍（Ｔ）は腋窩リンパ節（Ｎ）を含まない。病期ＩＩＡ−Ｔ ２〜５ｃｍ、Ｎ陰性、またはＴ＜２ｃｍ、およびＮ陽性、病期ＩＩＢ−Ｔ＞５ｃｍ、Ｎ陰性、またはＴ ２〜５ｃｍ、およびＮ陽性（＜４つの腋窩リンパ節）。病期ＩＩＩＡ−Ｔ＞５ｃｍ、Ｎ陽性、またはＴは２〜５ｃｍで４つ以上の腋窩リンパ節がある。病期ＩＩＩＢ−Ｔは胸壁または皮膚に入り込んでおり、１０箇所よりも多い腋窩リンパ節Ｎに拡散している可能性がある。病期ＩＩＩＣ−Ｔは１０箇所よりも少ない腋窩リンパ節Ｎ、１つ以上の鎖骨上または鎖骨下Ｎ、または内部乳Ｎ(internal mammary N)を有する。病期ＩＶ−遠隔転移（Ｍ）。
【００４２】
被験者：生きている多細胞脊椎有機体、人および、獣医被験者(veterinary subject)のような人以外を含む分類。特定的な例では、被験者は、早期乳癌のような、乳癌であった者、または乳癌であったことが疑われる者である。
【００４３】
標的分子：乳癌マーカのような、検出または測定が望まれる生体分子。標的分子の例は、ＥＲ、ＰＲ、Ｋｉ−６７、およびＨＥＲ２を含む。
次にとって十分な条件下：所望の活動を許す任意の環境を記述するために使用される句。例は、サンプルにおいて１つ以上の標的分子（例えば、ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７）の検出を可能にする程十分に抗体を乳癌サンプルと接触させることを含み、サンプルにおける１つ以上の標的分子の定量化を含むことができる。
【００４４】
乳癌予知システム例
図１は、本明細書において説明する技術を実行するためのシステム例のブロック図である。この例では、スライド・スキャナ（例えば、Ventana Medical Systems, Inc.の iScan Coreo等）のような画像取得デバイス１０が、本明細書において説明するように用意されたスライド５を受け入れ、本明細書において説明するような分析のためにスライド５の画像を生成するように動作可能である。実際には、本明細書において説明するように、複数のスライドが使用される。
【００４５】
計算システム２０は、１つ以上の入力デバイス２３、１つ以上のディスプレイ２４、および１つ以上のコンピュータ２１を含むことができ、コンピュータ２１は、本明細書において説明するように、画像処理アプリケーションまたはプラットフォームを実行することができる。
【００４６】
走査画像のようなデータは、例えば、リモートにあるサーバ１２に、および／またはコンピュータ２１内部に格納することができる。画像取得は、画像処理とは別々にすることができる（例えば、異なるシステムにおいて、異なる人物によって等）。
【００４７】
実施態様の中には、クラウド・ベースまたはサービスとしてのソフトウェアのシナリオを実施できる場合もあり、画像処理アプリケーション２２は、部分的にまたは全体的にコンピュータ２１の外部に常駐する（例えば、サーバ１２または１つ以上の他のサーバにて）。
【００４８】
乳癌予知方法例
本明細書では、乳癌、例えば、早期乳癌を、免疫組織化学（ＩＨＣ）複合スコア（ＩＨＣ４等）スコアおよび／または異質性スコアを得ることに基づいて予知できることを示す。これら２つのスコアが組み合わされ重み付けされ、出力予知スコアが得られる。得られた出力予知スコアは、患者の乳癌を予知するために使用することができる。例えば、出力予知スコアが閾値よりも高い場合、これは乳癌の進行性が強いことまたは乳癌が再発する可能性が高いことを示し、一方閾値よりも低い出力予知スコアは、乳癌の進行性が弱く再発する可能性が低いことを示す。これによって、臨床医および患者は、より適切な処置および監視判断を行うことが可能になる。例えば、出力予知は、適切な療法を判断するときに有益であり得る（例えば、監視、乳房切除、乳腺腫瘤摘出術、または乳腺腫瘤摘出術と化学療法の組み合わせの中から選択する）。
【００４９】
本明細書において提供するのは、被験者における早期乳癌のような乳癌を予知する方法である。例では、乳癌は、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）、プロゲステロン受容体陽性（ＰＲ＋）、およびヒト上皮成長因子受容体２陰性（ＨＥＲ２−）、またはヒト上皮成長因子受容体２陽性（ＨＥＲ２＋）であることが知られている。例えば、本方法は、可能性がある癌の進行性、または癌が再発する可能性、例えば、癌が５年以内に再発する可能性を判定するために使用することができる。
【００５０】
本明細書における技術は、被験者から採取された、乳癌組織がある１つ以上のスライドの画像上で指示された視野に基づいて、ＩＨＣ複合スコアおよび異質性スコアを生成することができる。次いで、これらのスコアを組み合わせて、本明細書において説明するような、予知スコアを生成することができる。本明細書において説明するようなＩＨＣ複合スコアまたは異質性スコアに到達する前に、種々の中間計算値および／またはスコアを生成することができる。
【００５１】
一方法例では、乳癌組織サンプルが被験者から採取される。例では、乳癌サンプルは、ＨＥＲ２陰性（例えば、本明細書において説明するように、２＋未満のＩＨＣ染色）、および／またはＦＩＳＨ増幅、ＥＲ陽性、および／またはリンパ節陰性であるもののような、早期乳癌サンプルである。したがって、ＨＥＲ陰性サンプルは、（１）２＋未満である染色というような、何らかのＩＨＣ染色、または１より大きいＨ−スコアを示すもの、または（２）ＦＩＳＨ分析によって示されるように増幅されたものであることができるが、臨床医または病理医がいずれにせよＨＥＲ２陰性であったと結論付けたものである。あるいは、サンプルがＨＥＲ２陽性であってもよい。
【００５２】
ＦＩＳＨに加えて、色素生成原位置ハイブリッド形成法（ＣＩＳＨ：chromogenic in situ hybridization）、二重色素生成原位置ハイブリッド形成法（ＤＩＳＨ：dual color chromonogenic in situ hybridization）等のような、他のタイプの原位置ハイブリッド形成法（ＩＳＨ：in situ hybridization）を使用することもできる。
【００５３】
図２は、異なるタンパク質に対して染色されたスライドの画像３２，３４，３６，３８が、乳癌再発予知スコア５８を生成するためにどのように使用されるかを示すブロック図である。異なるスライドが示されるが、本明細書において説明する組織マイクロアレイ手法を採用すると、その結果スライド数を減らすことができる。例えば、１つのスライドが複数の異なる組織区間を含むことができ、その各々を異なるタンパク質について分析することができる。他の例では、１つの組織区間を複数のタンパク質について分析することができる。サンプル、例えば、組織ブロックが、区間、例えば４つの区間に分割される。これらの区間はサンプルからの隣接する区間、または連続区間であってもなくてもよい。対象のバイオマークに特定的な薬剤、例えば、プローブまたはステイン(stain)が各区間に塗布される。一例では、エストロゲン受容体ＥＲに特定的な薬剤が１つの区間に塗布され、ＰＲに特定的な薬剤が他の区間に塗布される等である。薬剤の例は、抗体およびアプタマーを含む。このように、サンプルには、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲの各々を特定的な抗体で検出可能に標識することができる。次いで、本明細書において説明するように、サンプル区間の画像３２，３４，３６，３８が取得される。画像３２，３４，３６，３８から、ＥＲに対するＨ−スコア４１、ＰＲに対する陽性百分率(percent positivity)４２、Ｋｉ−６７に対する陽性百分率４３、およびＨＥＲ２に対する等級スコア(binned score)４４が計算される。等級スコア４４は、二進スコア（例えば、０または１）４５に変換することができる。次いで、本明細書において説明するように、これらのスコアが組み合わされてＩＨＣ４スコア５５を生成する。
【００５４】
ＥＲに対する異質性スコア５１は、ＥＲに対する陽性百分率判定４７を拠り所とし、ＰＲに対する異質性スコア５２は、ＰＲに対する陽性百分率判定４２を拠り所とする。異質性スコア５１，５２は、本明細書において説明するように、組み合わせて、複合異質性スコア５４を生成することができる。
【００５５】
次に、ＩＨＣ４スコア５５および複合異質性スコア５４を組み合わせて、乳癌再発予知スコア５８を生成することができる。
図３は、方法例の全体像を示す。この方法は、例えば、ＰＲおよびＫｉ−６７の各々に対する陽性百分率、ＨＥＲ２に対する等級スコア（例えば、強度を表す典型的な０から３までの目盛り上。０は陰性染色に指定され、３は非常に強く染色されたサンプルに指定される）、そしてＥＲに対するＨ−スコアを判定または測定することによって、ＥＲ，Ｋｉ−６７，ＰＲ，ＨＥＲ１１２の各々に対して測定した発現(expression)によって、ＩＨＣ４スコアを判定するステップを含む。また、この方法は、少なくともＥＲおよびＰＲに対して、そしてある例ではＫｉ−６７およびＨＥＲ２  １１４に対しても異質性スコアを判定するステップも含む。得られたＩＨＣ４スコア１１２および異質性スコア１１４を組み合わせて（１１６）、出力予知スコア１１８を生成する。この出力予知スコアに基づいて、乳癌を予知する（１２０）。
【００５６】
一例では、各スライドが走査され、本明細書において説明するシステムのいずれかを使用して、各スライドのディジタル画像が生成される。ＩＨＣ複合スコアは、これらのスライドに基づいて、コンピュータ実装方法によって生成され、異質性スコアは、スライド毎（または、ＥＲ分析のための組織区間を含む領域というような、分析されるスライドの区間毎）に生成される。例示の一実施形態では、情報を取り込むために４つのバイオマーカが利用されるので、ＩＨＣ複合スコアを「ＩＨＣ４スコア」と呼ぶ。ＩＨＣ４スコアは、本明細書において説明するように、異質性スコアと組み合わせて、乳癌再発予知スコアを生成することができる。
【００５７】
一例では、ＩＨＣ４スコアを計算するために、本方法は、薬剤（抗体等）で標識された乳癌サンプルからの１つ以上のスライド上の組織区間の各々の画像において、ＥＲ組織区間スライド画像、ＨＥＲ２組織区間スライド画像、Ｋｉ−６７組織区間スライド画像、およびＰＲ組織区間スライド画像の各々に少なくとも２つの異なる視野（ＦＯＶ）を選択する。本発明の例示の実施形態では、ＩＨＣ４スコアを計算するために、スライドまたは区間毎に、３つのＦＯＶが選択される。腫瘍領域が視野として選択される。
【００５８】
図４Ａは、ＨＩＣ複合スコアを計算するためのスライド画像のそれぞれにおいて（例えば、病理医によって）視野（ＦＯＶ）１８１Ａ，１８１Ｂ，１８１Ｃが選択される基になる１組のスライド画像１８０よびアノテーション(annotations)の例を示す。図示のように、アノテーションは、バイオマーカ毎に、視野間に関係がなく、独立であることが可能である。これらの例では、視野は矩形である。しかしながら、本明細書において説明するように、他の技法を使用することができる（例えば、視野は他の既知の形状または不規則な形状にすることができる）。ある例では、視野は、対象の解剖学的領域（例えば、内分泌腺）のような、対象エリアである。一例では、視野はスライド全体または組織区間全体である。
【００５９】
視野に基づいて、ＩＨＣ複合スコアが計算される。ＩＨＣ複合スコアに対するコンポーネントを計算するとき、特定のバイオマーカに対して視野を一緒に取り込むことができる（例えば、組み合わせるおよび／または集合的に考慮する）。例えば、Ｈ−スコア、陽性百分率、およびＨＥＲ２等級スコアは、一緒に取り込まれたそれぞれの組の視野に基づくことができる（例えば、ＥＲに対するＨ−スコアは、視野において観察された細胞に基づく）。他の技法も可能である（例えば、スコアを平均する、あるスコアに投票する等）。
【００６０】
例えば、ＩＨＣ複合スコアは、ドーセット(Dowsett)のＩＨＣ４式またはその変形を使用して計算することができる。
ＩＨＣ４ ＝ ９４．７ × ｛−０．１００ＥＲ１０ − ０，０７９ＰＲ１０ ＋ ０．５８６ＨＥＲ２ ＋ ０．２４０Ｉｎ（１ ＋ １０ × Ｋｉ６７）｝
ここで、ＥＲ１０はＥＲに対するＨ−スコア／３０であり、ＰＲ１０は陽性に染色した細胞の百分率（細胞の百分率に対して１０％の上限を課する）を１０で除算して、０から１０の範囲の変数を生成することによって得られる。ＨＥＲ２は、二進ＨＥＲ２スコア（例えば、２＋未満の場合０，その他の場合１）であり、Ｋｉ６７はＫｉ−６７に対する陽性百分率である。実際には、ＥＲ１０は、式に示されるように、Ｈ−スコアを３０で除算することによって、０から１０の範囲に調整される。
【００６１】
視野の一部では、陽性に染色された核は、各視野において陰性に染色された（例えば、染色されない）核から区別される。次いで、ＰＲおよびＫｉ−６７のスライドについて、陽性百分率が１つのスライドにおいて以下のように計算される（例えば、スライドのディジタル画像における各視野内で陽性に染色された細胞（例えば、悪性細胞）の核の総数が合計され、ディジタル画像の視野の各々からの陽性および陰性に染色された核の総数で除算される）。
【００６２】
陽性百分率＝陽性に染色された細胞の数／（陽性に染色された細胞の数＋陰性に染色された細胞の数）
例示の実施形態では、陽性百分率は、手作業で（例えば、ディジタル画像を使用せずに、画像分析を使用して、または種々の他の画像分析方法で）判定される。
【００６３】
例示の実施形態では、核が検出され、本明細書において説明する核識別技法によって、陽性染色核または陰性染色核に分類される。例えば、陰性に染色された細胞は、例えば、リンパ球および間質組織から区別することができる。このような技法は、汎用の色閾値を使用するよりも優れている可能性がある。
【００６４】
加えて、例えば、ＥＲスライド（または組織区間）に対するＨ−スコア（個々のスライドに対する染色細胞の強度および染色細胞の数を反映する）が計算される。このようなスコアは、集合的に一緒に取り込まれたＦＯＶに基づくことができる。実施形態例では、数値目盛り（例えば、０−３００）がＨ−スコアに使用される。陽性に染色された細胞（例えば、視野内において）に対して、強度が判定される。このような強度は、アルゴリズムによって判定され、閾値と比較され、ビン番号を指定することができる。このようなビン番号は、例えば、０，１，２，３とすることができる。その結果、各ビンには核（即ち、細胞）の個数が得られる。ビンにおける個数(bin count)は、Ｈ−スコアを計算するために使用することができる。
【００６５】
核をビンニングする中間ステップは、後に異質性スコアを計算するときに再使用することができる。必要に応じて（例えば、ＥＲに対する異質性スコアのために）、陽性の（例えば、茶色）強度（例えば、１，２，３）を集計して、陽性に染色された核の総数を判定することができる。
【００６６】
ＨＥＲ２に対する二進スコアの計算は、ＨＥＲ２のスライドに対する等級スコア（細胞膜染色の完全性、および染色された細胞膜の強度に関係する）を判定すること（例えば、視野に基づいて）を含むことができる。組み合わせたＦＯＶに対する等級スコアは、本明細書において説明するように、０，１，２，３である。０または１は陰性と見なされ（二進スコアでは０）、２または３は陽性と見なされる（二進スコアでは１）。このように、ＨＥＲ２に対して二進スコアが計算される。あるいは、ＦＯＶに対するスコアを組み合わせて（例えば、平均する、平均して丸める等）、ＨＥＲ２に対する総合スコアを判定することもできる。
【００６７】
次に、前述した陽性百分率、Ｈ−スコア、および二進スコアを利用することによって、ＩＨＣ４スコアを判定することができる。選択されたＦＯＶの各々において、これらの判定を行うときに補助するために、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲタンパク質発現を検出または測定することができる。例えば、タンパク質の発現は、Ｋｉ−６７およびＰＲの各々に対する陽性百分率、ＨＥＲ２に対する染色強度等級スコア、およびＥＲに対するＨ−スコアを判定または測定するために、試験または測定することができる。この情報に基づいて、先の式にしたがって、免疫組織化学（ＩＨＣ）複合スコアを判定または計算することができる。
【００６８】
サンプルに対する集合的ＩＨＣ（例えば、ＩＨＣ４）複合スコアを別にして、異質性、例えば、タンパク質発現異質性も、それぞれのバイオマーカ（例えば、ＥＲ，ＰＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ６７）に対して計算することができる。異質性の判定では、ＩＨＣ複合（例えば、ＩＨＣ４）スコアの既に存在する値に、予知値を加算する。例示の実施形態では、異質性、例えば、領域異質性がバイオマーカ（例えば、ＥＲ，ＰＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ６７）毎に判定される。図４Ｂは、視野１８６Ａ，１８６Ｂ，１８６Ｃが、異質性スコアを計算するためにスライド画像のそれぞれにおいて選択される（例えば、病理医によって）基になるアノテーションを示す、１組のスライド画像例１８５である。図示のように、アノテーションは、バイオマーカ毎に視野間に関係がなく、独立であることができる。ＩＨＣ複合スコアに使用したものとは異なる１組のアノテーションを、異質性に使用することができる。場合によっては、ＩＨＣ複合スコアに使用されたＦＯＶと異質性スコアに使用されたＦＯＶとの間に部分的な重複がある可能性がある（例えば、１つのバイオマーカに対するこれらのスコアの間で、１つの視野を共有することができる）。
【００６９】
例示の実施形態では、異質性は、種々の腫瘍が、例えば、互いに基準からどのように異なるか測定するために、スライド（または組織区間）に対して判定される。例示の実施形態では、病理医が１つのスライド（または組織区間）にある数の視野を選択する。一実施形態では、病理医が、例えば、異なる陽性百分率を有する腫瘍領域を各々が含む、３つの視野を選択する。
【００７０】
ＥＲおよびＰＲタンパク質異質性は、示されたＦＯＶを使用して測定または検出される。例えば、タンパク質異質性を測定するには、ＥＲ、およびＰＲの各々について可変性メトリック（ＶＭ：variability metric)を判定することを含むことができ、ＶＭ ＝ ＳＴＤ(ＰＰ(ＦＳ１)，ＰＰ(ＦＳ２), . .. ＰＰ(ＦＳＮ))である。ＰＰ（ＦＳ）は、各ＦＯＶ，ＦＳ（例えば、ＥＲプローブに特定的な薬剤、ＰＲに特定的な薬剤等と接触した組織サンプルのディジタル画像の視野）に対する陽性百分率である。可変性メトリックに基づいて、ＥＲおよびＰＲの各々に対する異質性スコアが判定または計算される。例えば、ＥＲおよびＰＲの各々に対する異質性スコアは、本明細書において説明するように、以下の式を使用して計算することができる。ここで、α＝[０，１]（例えば、０から１の範囲の値をトル数値）は正規化係数であり、Ｓは平均陽性百分率スライド・スコアである。
【００７１】
【数１】
0006405319.tif 000002
【００７２】
Ｋｉ−６７に対する異質性を計算する実施形態は、ＥＲおよびＰＲに使用した式と同じまたは同様の式を使用することができる。ＨＥＲ２に対するタンパク質異質性スコアは、実施形態の中には有用である場合もあり、以下の式を使用して計算することができる。
【００７３】
【数２】
0006405319.tif 000003
【００７４】
ここで、Ｐ（ＦＳ）は、視野ＦＳ毎のＨＥＲ２等級スコア（例えば、本明細書において説明するように判定される）。視野毎の等級スコアが等しい場合（例えば、Ｐ（ＦＳ１）＝Ｐ（ＦＳ２）＝Ｐ（ＦＳＮ））は、Ｈ＝０となる。つまり、Ｈはどのように異なるタンパク質発現が、バイオマーカに対する異なる視野内にあるかを示す。
【００７５】
例示の実施形態では、これらの異質性スコアの内少なくとも１つが、出力予知スコアを判定するために利用される。一実施形態では、スライドのそれぞれに対して得られた異質性スコア、およびＩＨＣ複合スコアが組み合わせされ、重み付けされることによって、出力予知スコアを生成する。例示の実施形態では、出力予知スコアは、係数または百分率（Ｐ１）にＩＨＣ複合スコアを乗算し、複合異質性スコアの係数または百分率（Ｐ２）を乗算した値であり、Ｐ１およびＰ２は０よりも大きい。例えば、出力予知スコア（ＰＳ）は、以下の式を使用することによって計算することができる。
ＰＳ ＝ ０．０３１１４ × ＩＨＣ４ ＋ １．９５１１９×複合異質性スコア
ここで、複合異質性スコアは、二乗根（ＥＲ異質性スコア＋ＰＲ異質性スコア）である。得られた出力予知スコアは、乳癌を有する患者の予知を判定するために使用される。例えば、本方法は、出力予知スコアがある閾値よりも高い場合、被験者における乳癌が進行性であるまたは再発する（例えば、５年以内に）可能性が高いことを予知することができ、また出力予知スコアが閾値よりも低い場合、被験者における乳癌は進行性であるまたは再発する可能性が低いことを予知することができる。
【００７６】
ある例の中には、本方法が、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲの各々に対して検出可能に標識された乳癌サンプル（例えば、１つ以上の顕微鏡スライド上にあるもの）のディジタル化画像を得るステップを含むことができるものもある。例えば、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲの各々に対して、１つ以上のディジタル化画像を得ることができる。ある例の中は、本方法は、更に、再発の可能性が更に高いと予知された被験者を選択するステップ、例えば、より攻撃的な療法のために患者を選択するステップも含むものもある。
【００７７】
図５は、本技術による方法の一特定実施形態の更なる詳細を示す。また、この方法は、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｈｉ−６７，ＰＲを検出するために染色された乳癌サンプルの画像（ディジタル画像等）を取得または入手するステップ１０８も含むことができる。ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲの各々に対して少なくとも２つのＦＯＶを選択し（１１０）、例えばディジタル画像上で選択して印を付ける。しかしながら、選択されるＦＯＶの数は異なってもよい（例えば、２，３，４，５，６，７，８，９，１０通りのＦＯＶがあってもよい）。ＦＯＶを選択した（１１０）後、本方法は、各ＦＯＶにおいてＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲ発現を検出または測定するステップ１１１を含む。この情報に基づいて、例えば、ＰＲおよびＫｉ−６７の各々に対する陽性百分率、ＨＥＲ２に対する等級スコア（例えば、強度を表すために典型的な０〜３の目盛り上。ここで０は陰性染色に指定され、３は非常に強く染色したサンプルに指定される）に基づく二進スコア、およびＥＲに対するＨ−スコアを判定または測定することによって、ＥＲ，Ｋｉ−６７，ＰＲ，ＨＥＲ２の各々に対する発現によって、ＩＨＣ（例えば、ＩＨＣ４）スコアを判定する（１１２）。また、本方法は、ＥＲおよびＰＲの各々に対して、そしてある例ではＫｉ−６７およびＨＥＲ２に対しても、タンパク質異質性を検出または測定するステップ１１３も含む。この情報に基づいて、少なくともＥＲおよびＰＲに対する異質性スコア、そしてある例ではＫｉ−６７およびＨＥＲ２に対する異質性スコアも判定する（１１４）。結果的に得られたＩＨＣ４スコア１１２および異質性スコア１１４を組み合わせて、出力予知スコアを生成する（１１８）。出力予知スコアに基づいて、乳癌を予知する（１２０）。
【００７８】
図６は、本明細書において提供する方法を使用して分析される胸部組織サンプルのＩＨＣ画像を入手または取得する方法例の詳細を示す。サンプルを入手し染色する方法は、当技術分野における型どおりの手順である。例えば、本方法は、患者２１０から、例えば、乳房生検から胸部組織を入手するステップを含むことができる。次いで、得られた組織は、例えば、ホルマリンおよびパラフィンを使用して、固定し埋め込む（２１２）。次に、固定され埋め込まれた組織は、薄切りにするまたは区分し、基板２１４上に載せる、例えば、１つ以上のガラス製の顕微鏡スライド上に載せることができる。ある例では、１つのスライドが、少なくとも２つまたは少なくとも４つの区間というように、複数の組織区間を含む。これらの組織区間は、次に、適切な抗体（または他の特定的な結合剤）によって培養し、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲタンパク質を標識することができる。例えば、少なくとも１つの胸部組織区間をＥＲ特定抗体で標識することができ、他の胸部組織区間をＨＥＲ２特定抗体で標識することができ、他の胸部組織区間をＰＲ特定抗体で標識することができ、他の胸部組織区間をＫｉ−６７特定抗体で標識することができる（２１６）。しかしながら、このように標識されたタンパク質が、例えば、別々に標識された副抗体を使用することによって区別可能である限り、１つの組織区間を１つよりも多い抗体（または他の特定結合剤）で標識することができることが当業者にとって認められる。組織区間を標識した後、画像を入手することができる。例えば、ＥＲ特定抗体で標識された胸部組織区間の１つ以上の画像を入手することができ、ＨＥＲ２特定抗体で標識された胸部組織区間の１つ以上の画像を入手することができ、ＰＲ特定抗体で標識された胸部組織区間の１つ以上の画像を入手することができ、Ｋｉ−６７特定抗体で標識された胸部組織区間の１つ以上の画像を入手することができる（２１８）。
【００７９】
図７は、各ＦＯＶにおいてタンパク質発現を検出するときに測定または判定することができるパラメータについての詳細を示す。このような値は、ＩＨＣ（例えば、ＩＨＣ４）スコアを計算するために使用することができる。図５において注記したように、ＦＯＶを選択した（１１０）後、本方法は、各ＦＯＶにおいてＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲ発現を検出または測定するステップ１１１を含む。図７に示すように、各ＦＯＶにおいてタンパク質発現を検出するには、ＰＲおよびＫｉ−６７の各々に対して陽性百分率を判定または測定するステップ４１０、本明細書において説明したようにＨＥＲ２に対する等級スコアを判定または測定するステップ４１２、そしてＥＲ４１４に対してＨースコアを判定または測定するステップ４１４を含むことができる。これらのスコアは、本明細書において説明したように、組み合わせて免疫組織化学スコアを求めることができる。組み合わせは、ＨＥＲ２に対する等級スコアをＨＥＲ２に対する二進スコアに変換することを含むことができる。
【００８０】
図８は、各ＦＯＶにおいてタンパク質異質性を測定するときに測定または判定することができるパラメータについての詳細を示す。このような値は、異質性スコアを計算するために使用することができる。図５において注記したように、本方法は、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲの各々に対してタンパク質異質性を検出または測定するステップ１１３を含むことができる。図８に示すように、タンパク質異質性を検出するには、各ＦＯＶにおいて陽性百分率の可変性(variability)を判定または測定し、少なくともＥＲおよびＰＲに対して（そして、ある例ではＫｉ−６７に対しても）値を正規化するステップ５１０を含むことができる。例えば、ＥＲおよびＰＲ（そして、ある例ではＫｉ−６７）の各々に対する可変性メトリック（ＶＭ）が計算される。ここで、ＶＭ ＝ ＳＴＤ(ＰＰ(ＦＳ１), ＰＰ(ＦＳ２),....ＰＰ(ＦＳＮ))であり、ＰＰ(ＦＳ)は、視野ＦＳ毎の陽性百分率である。図８に示すように、ＨＥＲ２に対するタンパク質異質性を測定するには、ＨＥＲ２に対するＦＯＶ毎の等級スコア、および等級スコア間のばらつきを判定または測定するステップ５１２を含むことができる（例えば、先の４１２において判定された等級スコアを使用するが、少なくとも１つの他のＦＯＶを組み込む）。
【００８１】
本技術を実現するシステム例
図９は、本明細書において説明した乳癌予知技術を実現するシステム例９００のブロック図である。この例では、スライド画像処理ツール９２０が複数のスライド画像９１２および複数の視野９１４を入力として受け入れることができる。ツール９０２は、癌が被験者において再発する可能性があるか否かの指示９９０を出力する。本明細書において説明したように、このような指示９９０は出力予知スコアに基づくことができる。
【００８２】
スライドは、被験者からの乳癌サンプルにおけるそれぞれのバイオマーカに対するタンパク質発現を描写することができる（例えば、本明細書において説明したように、バイオマーカ用の抗体で検出可能に標識する）。
【００８３】
ツール９２０は、視野（ＦＯＶ）９１４の選択を受けるためのユーザ・インターフェースを提供することができ、またはこのような機能は他のツールまたはコンポーネントによって提供することもできる。
【００８４】
ＩＨＣ複合スコアは、スライド画像およびスライド画像内の視野に基づいて計算することができる（例えば、ツール９２０あるいは他のツールまたはコンポーネントによって）。
【００８５】
ツール９２０は、本明細書において説明したように、スライド画像およびスライド画像内の視野に基づいて、１つ以上の異質性スコア９２７を計算するように動作可能である。
スライド画像処理ツール９２０は、予知ツール９３０を含むことができる。予知ツール９３０は、計算されたＩＨＣ複合スコアおよび１つ以上の異質性スコア９２７を入力として受け入れ、癌がより進行性であり、それ故被験者において再発する可能性が更に高いか否かについての指示９９０を出力する。
【００８６】
実際のところ、システム９００のような、本明細書において示すシステムは、追加の機能、更に複雑な入力等を有し、更に複雑であることも可能である。例えば、追加の機能は、ＩＨＣ複合スコア、異質性スコア（１つまたは複数）、または双方を計算することができ、あるいはこのようなスコアは、他のソフトウェアによって提供することもできる。
【００８７】
システム９００、および本明細書において説明する他のシステムは、以下で説明する計算システム（例えば、処理ユニット、メモリ等）のように、本明細書において説明するハードウェア・コンポーネントの内任意のものと合わせて実現することができる。本明細書における例では、いずれも、入力、出力、およびツールを１つ以上のコンピュータ読み取り可能記憶媒体またはコンピュータ読み取り可能記憶デバイスに格納することができる。本明細書において説明した技術は、オペレーティング・システムまたはハードウェアの仕様(specifics)に対しては一般的(generic)とすることができ、説明した特徴を利用するために、種々の環境のいずれにおいても適用することができる。
【００８８】
本技術を実現するコンピュータ実装方法の例
図１０は、本明細書において説明した乳癌予知技術を実現するコンピュータ実装方法例１０００のフローチャートであり、例えば、図９に示したシステムにおいて実現することができる。
【００８９】
この方法は、処理のために受け取られた１つ以上のスライド入力画像に対して実行することができる。例えば、本明細書において説明したような、バイオマーカ用の抗体で検出可能に標識された被験者からの乳癌サンプルを描写するスライド画像を使用することができる。
【００９０】
１０１０において、画像内における複数のディジタル視野を受け取る。本明細書において説明したように、視野の指示は、表示された画像の選択によって（例えば、画像上で視野の輪郭を辿ることによって）、または画像内における境界の指示によって受け取ることができる。
【００９１】
１０１２において、本明細書において説明したように、ディジタル視野間でタンパク質異質性を測定する（例えば、所与のスライド画像の視野に対して領域間異質性を判定する）。たとえば、バイオマーカに対するタンパク質発現をそれぞれの視野に対して測定することができ、本明細書において説明したように、測定値を比較して可変性を求めることができる。実際には、複数のバイオマーカに対して異質性を測定することができる（例えば、異質性スコアとして）。ＥＲ、ＰＲ等（例えば、Ｋｉ−６７，ＨＥＲ２等）の内１つ以上を使用することができる。
【００９２】
第２バイオマーカに対してタンパク質異質性を測定するとき、被験者からの乳癌サンプルを描写する表示画像内部において、第２バイオマーカ用の抗体で検出可能に標識された複数の視野を受け取ることができる。第２バイオマーカに対するタンパク質異質性を測定することができる（例えば、第１とは別の異質性スコアとして）。
【００９３】
１０１６において、被験者に対するＩＨＣ複合スコアを受け取る。本明細書において説明したＩＨＣ複合スコアであればいずれでもサポートすることができる。ＩＨＣ複合スコアは、異質性分析に使用された同じサンプルに対して得ることができ、または同じ被験者からの異なるサンプルを使用することもできる。
【００９４】
１０１８において、複数のディジタル視野の中からのバイオマークに対して測定されたタンパク質異質性、および被験者に対する免疫組織化学複合スコアに少なくとも基づいて、出力予知スコアを生成する。本明細書において説明したように、ＩＨＣ複合スコアおよびそれぞれのバイオマーカに対する１つ以上の異質性スコアを生成し、出力予知スコアを計算するために使用することができる。
【００９５】
１０２０において、出力予知スコアに基づいて、予知の指示（例えば、被験者において癌がより進行性か否か、したがって再発する可能性が高いか否かの指示９９０）を出力する。例えば、本明細書において説明したような閾値を使用して、予知指示のカテゴリ間で選択することができ、肯定または結果なしを指示することができる等である。
【００９６】
方法１００および本明細書において説明する他のコンピュータ実装方法は、１つ以上のコンピュータ読み取り可能媒体（例えば、ストレージまたは他の有形媒体）に格納されたコンピュータ実行可能命令、または１つ以上のコンピュータ読み取り可能記憶デバイスに格納されたコンピュータ実行可能命令（例えば、計算システムに本方法を実行させる）によって実行することができる。
【００９７】
視野の受け取りの例
本明細書における例のいずれにおいても、視野は、画像内部におけるあるエリア（例えば、１組の画素、境界等）の格納された指示として、または画像（例えば、後の使用のためにその後格納される）を参照して（例えば、画像上で）病理医によって操作されるコンピュータ・システムによるアノテーション（例えば、図、トレース等）として受け取ることができる。
【００９８】
例えば、アノテーションは、異質性分析を実行するツールまたはソフトウェアに組み込まれた別のツールまたはソフトウェアによって実行することができる。
免疫組織化学複合スコアの例
本明細書における例のいずれにおいても、免疫組織複合スコアを異質性スコアと組み合わせて、乳癌再発予知スコアを求めることができる。例えば、本明細書において説明したＩＨＣ（例えば、ＩＨＣ４）スコア、または２つ以上のバイオマーカ、例えば、ＨＥＲ２，ＥＲ，ＰＲ，Ｋｉ−６７等を組み合わせた他の免疫組織化学複合スコアを使用することができる。このようなスコアは、本明細書において説明したように、病理医によって示される視野によって判定することができる。
【００９９】
異質性は、本明細書において説明したように、ＩＨＣ複合スコアを生成するために使用されるバイオマーカに対して分析し、ＩＨＣ複合スコアと組み合わせて、出力予知スコアを得ることができる。
【０１００】
画像例
本明細書における例のいずれにおいても、画像は、特定のバイオマーカ用の抗体で検出可能に標識された被験者からの乳癌サンプルを描写するディジタル画像とすることができる。実際には、このような画像は、このようなサンプルの１区間を描写する。異なる区間を異なるバイオマーカに使用することができる。
【０１０１】
本技術は、バイオマーカのそれぞれに対して複数の画像をサポートすることができる。実施態様は、１つの画像における多数のバイオマーカをサポートすることができる（例えば、多重化のシナリオにおいて）。
【０１０２】
格納されるとき、画像は画像データ、画素、または、例えば、色値、強度値、または双方を有するボクセルとして表すことができる。画像画素またはボクセルは、本明細書において説明したように処理することができる。例えば、画像内の視野を分析して、その視野内部における、所与のバイオマーカに対するタンパク質発現を定量化することができる。
【０１０３】
視野の例
本明細書における例のいずれにおいても、ディジタル視野は、画像内のエリア、またはそのようなエリアの指示とすることができ、ときとしてここでは単に「視野」と呼ばれることもある。このような視野は、病理医によって示される対象領域を含むことができる。ある実施態様では、視野がスライド全体となることができるように、スライドを他のスライドと比較することができる。しかしながら、視野は通例ディジタル画像全体よりは小さいので、視野は、通例、撮像された区間全体よりも小さいエリアに対応する。実際には、このようなディジタル視野は、基準画像（例えば、視野が得られた画像）を参照して、別個の画像として格納すること、または境界によって示すことができる（例えば、本来病理医によって描写され電子的に格納される）。境界内側の画像の部分は、視野内と見なされ、境界外側の画像の部分は視野外と見なされる。境界上の部分は、所望に応じて、内側または外側と見なすことができる。
【０１０４】
通例、ディジタル視野は、しかるべきプロトコルにしたがって病理医によって選択された画像内部の画素またはボクセルの連続領域である。あらゆる任意の形状（例えば、矩形、矩形以外、正方形、楕円形、円形、トレースされた形状等）または対象エリアをサポートすることができ、特定の形状を選択するためにツールを設けることができる（例えば、トレース・ツール、楕円ツール、円ツール、正方形ツール、矩形ツール等）。視野は、対象の解剖学的構造（グランド等）を含むことができる。
【０１０５】
免疫組織化学複合スコアおよび異質性スコアには、通例、異なる視野が選択される。しかしながら、これら２つの間で重複することも可能である。言い換えると、化学組織免疫複合スコアの視野を、異質性スコアに再使用することができ、その逆も可能である。
【０１０６】
視野を格納する、受け取る、または出力するとき、実際の視野データ自体の代わりに、ディジタル視野に対する参照を使用することができる。
視野選択の例
本明細書における例のいずれにおいても、視野は、目的に適したプロトコルにしたがって選択することができる。例えば、ＩＨＣ（例えば、ＩＨＣ４）スコアにおいて使用される視野では、プロトコルは、選択されたフィールド（例えば、２，３，４，５，６，７等）が腫瘍領域であり、腫瘍組織内部におけるバイオマーカのタンパク質発現を表す（例えば、同様の外観）ことを指定する。異質性スコアに使用される視野では、プロトコルは、腫瘍組織内部においてバイオマーカのタンパク質発現の異なる（例えば、異質な）レベルを表すフィールド（例えば、２，３，４，５，６，７等）が選択されることを指定する。場合によっては、１つのフィールドを双方の目的に使用することができる（例えば、異質フィールドの内１つがＩＨＣ複合スコアにおいて使用される）。
【０１０７】
選択するユーザ（例えば、病理医）に提示されるユーザ・インターフェースは、何の目的のために視野が選択されているのか示すことができ、更にプロトコルに関する指針を適宜与えることもできる。
【０１０８】
タンパク質異質性の例
本明細書における例のいずれにおいても、タンパク質異質性は、乳癌サンプルにおける乳癌バイオマーカＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲに対する染色パターンのような、組織化学的および分子的染色パターンに言及し、ときとしてここでは単に「異質性」と呼ばれることもある。例えば、異質性は、１つのサンプル内にある異なる位置におけるバイオマーカの可変性レベルと共に増大する。異質性は、総合(aggregated)臨床表現型（例えば、再発する可能性が高い腫瘍）と相関付けることができる腫瘍進行性および／または成長パターンの空間的ばらつきの指標となることができる。
【０１０９】
ここでは、ＥＲおよびＰＲタンパク質発現の生物学的異質性が、少数の早期乳癌患者の予測できない再発と相関付けられることを示す。
異質性は、複数の視野間において同じバイオマーカに対するタンパク質発現レベルがどのように異なるかを測定する可変性メトリックによって測定することができる（例えば、１つのバイオマーカに対する複数の視野内におけるタンパク質発現測定値の可変性）。つまり、領域間（例えば、ＦＯＶ間）異質性を使用することができる。
【０１１０】
領域間異質性（例えば、複数の視野間における異質性）の定量的尺度は、所与のバイオマーカ（例えば、ＥＲ，ＰＲ，Ｋｉ−６７等）に対する異なる視野におけるタンパク質発現測定値の偏差（例えば、標準偏差または分散の他のモーメント）、ＰＥ（陽性百分率）に基づいて計算することができる。このような測定値は、どれ位速くタンパク質発現測定値が別れるか（例えば、分散の拡散(spread of distribution)）定量化することができる。例えば、視野ＦＳにおける所与のバイオマーカに対するそれぞれのタンパク質発現測定値ＰＥ（ＦＳ１），ＰＥ（ＦＳ２），．．．，ＰＥ（ＦＳＮ）を有する１組の視野に対する異質性の計算例は、次のように計算することができる。
異質性の例（Ｈ） ＝ σ（ＰＥ（ＦＳ１），ＰＥ（ＦＳ２），．．．，ＰＥ（ＦＳＮ））
この値は、平均スライド・スコア（Ｓ）にしたがって正規化することができる。平均スライド・スコア（Ｓ）は、特定のスライドに対するタンパク質発現測定値の平均（例えば、ＰＥ（ＦＳ１），ＰＥ（ＦＳ２），．．．，ＰＥ（ＦＳＮ）の平均）とすることができる。平均スライド・スコア（Ｓ）が閾値（例えば、１０％等）よりも低い場合、代替値（例えば、５％）を平均スライド・スコアとして使用することができる。観察された偏差を平均スライド・スコアで除算することによって、正規化を行うことができる。
【０１１１】
等級分け計算を伴うバイオマーカ（例えば、ＨＥＲ２）では、視野の入れ替え(permutations)間におけるビンの相違の和を、異質性の測定値として使用することができる。つまり、当該マーカにについて、異なる視野に対する等級スコアの差を集計することによって、異質性を計算することができる。例えば、所与の等級分けされたバイオマーカに対してそれぞれのタンパク質発現等級スコア（例えば、０，１，２，３）Ｐ(ＦＳ１)，Ｐ(ＦＳ２）, . . .Ｐ(ＦＳＮ) を有する１組の視野（ｉおよびｊ）は、次のように計算することができる。
【０１１２】
【数３】
0006405319.tif 000004
【０１１３】
この例では、１つの視野が１つの等級スコアを有する。全ての等級スコアが等しい場合、このスコアは０になる。
本明細書において説明したように、関与するバイオマーカにしたがって、正規化を行うことができる。
【０１１４】
空間タンパク質異質性の例
本明細書における例のいずれにおいても、空間タンパク質異質性を測定することができる。このような異質性は、地理的、領域的、腺間、腺内等に分類することができる。
【０１１５】
例えば、地理的異質性は、地理的レベル、即ち、ある閾値距離（例えば、２インチ）よりも多く離れた２つの別個の組織ブロックにおけるタンパク質発現のばらつきを測定することによって測定することができる。
【０１１６】
領域的異質性は、領域的レベルで、即ち、同じ組織区間内において、例えば、０．２５インチないし２インチ離れたところ、そして異なる視野、例えば、少なくとも４倍の対物レンズ(4x objective)の距離だけ離れたところのタンパク質発現のばらつきを測定することによって、測定することができる。本明細書において説明した視野は、このような領域的異質性を測定するために使用することができる。
【０１１７】
腺間異質性は、腺間レベル、例えば、０．２５インチ未満だけ離れそして４倍の対物レンズ以内におけるタンパク質発現のばらつきを測定することによって、測定することができる。
【０１１８】
腺内異質性は、腺内レベルで、例えば、領域的および腺間カテゴリを２０倍の対物レンズで形成して、タンパク質発現のばらつきを測定することによって、測定することができる。
【０１１９】
代用異質性スコアの例
本明細書における例のいずれにおいても、標準偏差σ以外の可変性メトリック（ＶＭ）は、領域間タンパク質異質性を測定するために使用することができる。例えば、タンパク質発現測定値またはその最大値における領域間相違（例えば、２つよりも多い視野の場合）を使用することができる。例えば、所与のバイオマーカ用の視野ＦＳ１，ＦＳ２，ＦＳ３に対するそれぞれのタンパク質発現（ＰＥ）測定値を有する１組の視野に対する異質性計算の例は、次のように、絶対値（ＡＢＳ）関数を使用して計算することができる。
ＶＭ ＝ ＭＡＸ（ＡＢＳ（ＰＥ（ＦＳ１） − ＰＥ（ＦＳ２）），ＡＢＳ（ＰＥ（ＦＳ１） − ＰＥ（ＦＳ３）），ＡＢＳ（ＰＥ（ＦＳ２） − ＰＥ（ＦＳ３）））
このような計算は、可変性の範囲も考慮することができる。例えば、最少領域間相違を考慮に入れることができる。したがって、計算の一例は次のようにすることができる。
ＶＭａｄｊ＝ＶＭ−ＭＩＮ（ＡＢＳ（ ＰＥ（ＦＳ１） − ＰＥ（ＦＳ２）），ＡＢＳ（ＰＥ（ＦＳ１）− ＰＥ（ＦＳ３）），ＡＢＳ（ＰＥ（ＦＳ２）− ＰＥ（ＦＳ３）））
更に他の変形も可能である。
【０１２０】
異質性スコアの正規化の例
本明細書における例のいずれにおいても、正規化を異質性スコアに適用することができる（例えば、バイオマーカに対する異質性スコア）。例えば、正規化は、先に説明したように、観察された偏差を平均スライド・スコア（例えば、測定されたバイオマーカに対する）で除算することによって行うことができる。
【０１２１】
関与する所与のバイオマーカに基づいて、他の正規化を行うこともできる。例えば、所与のバイオマーカに対するタンパク質発現の異質性の過去の観察に基づいて、係数または他の正規化技法を使用することができる。
【０１２２】
したがって、可変性メトリックＶＭ（例えば、標準偏差等）およびＳ（例えば、平均陽性百分率スライド・スコア）に対する正規化係数α（例えば、０から１の範囲）を用いた異質性計算の一例は、次のようにすることができる。
【０１２３】
【数４】
0006405319.tif 000005
【０１２４】
バイオマーカ毎の正規化係数αは、特定のバイオマーカの異質性が予知スコアに対して及ぼす影響の差を考慮に入れることができる。異質性分析に対するデータが見られるので、このようなバイオマーカ毎の正規化係数を適応させることができる。
【０１２５】
一例では、αはＥＲおよびＰＲに対して１．０であり、Ｋｉ−６７に対して０．７５である。このような係数は、関与するバイオマーカ（１つまたは複数）に対して適した重みを決定する統計的方法（例えば、得られる予知スコアに基づいて患者を予知カテゴリに別けるため）によって決定することができる。
【０１２６】
タンパク質発現の測定例
本明細書における例のいずれにおいても、所与のバイオマーカに対するタンパク質発現は、そのタンパク質が発現された程度（例えば、１つの視野において、または複数の視野において集合的に）測定することによって、定量化することができる。１つの視野における染色細胞を参照すると、タンパク質発現は、視野において陽性に染色された細胞の百分率として表すことができる。例えば、視野ＦＳにおけるタンパク質発現の定量化ＰＰ（ＦＳ）は、陽性百分率を判定するために、次のように計算することができる。
ＰＰ（ＦＳ） ＝ （ＦＳにおける陽性染色細胞の個数）／（ＦＳにおける細胞の総個数）
このような場合、細胞の総個数は、陽性染色細胞の個数と陰性染色細胞の個数の和とすることができる。実際には、陽性染色細胞の個数を判定することができ、陰性染色細胞の個数を判定することができ、これら２つに基づいて、タンパク質発現を計算することができる。定量化は、陽性に染色された細胞の百分率を示すので、このような測定値は時として「視野」に対する「陽性百分率」（例えば、所与のバイオマーカに対する）とも呼ばれる。
【０１２７】
タンパク質発現を測定するためには、他の技法も使用することができる。
本明細書において説明したような等級スコアを、タンパク質発現（例えば、ＨＥＲ２に対する）を測定するために使用することができる。
【０１２８】
陽性百分率の判定例
本明細書における例のいずれにおいても、所与の視野に対する陽性百分率は、任意の数の技法によって判定することができる。本明細書において説明した技術は、陽性百分率を判定するための現在の技法および今後開発される技法を利用することができる。
【０１２９】
このような技法の中には、陽性染色細胞の細胞核を数え、陰性染色細胞の細胞核を数えるものがある。このような技術は、視野の間質およびリンパ球領域を除外することができる。望ましければ、核を数えるときに、スライド全体からの情報を使用することができる。
【０１３０】
つまり、タンパク質異質性は、バイオマーカに関連付けられた画像のそれぞれの視野に対して陽性百分率測定値を判定することによって、判定することができる。ここでは、陽性百分率測定値は、それぞれの視野において、バイオマーカに対して陽性に染色された細胞の百分率を示す。次いで、本明細書において説明したように、陽性百分率測定値を比較することができる（例えば、可変性メトリックを生成するため）。
【０１３１】
また、陽性百分率の判定は、染色の強度を判定し、複数のビン（例えば、０，１，２，３）に対する核の個数を判定することも含むことができる。ビン０における核は陰性と見なすことができ、他のものは、陽性染色細胞として集計することができる。このようなビン情報を有することは、Ｈ−スコアを計算する等のような、他の目的に有用であることができる。
【０１３２】
陽性百分離判定の実施態様例：核識別
図１１は、スライドにおいて核を識別するコンピュータ実装方法例１１００のフローチャートである。この例では、方法１１００は、分析のために、視野の外側にあるスライドについての情報を使用することができる。
【０１３３】
１１１０において、本明細書において説明したように、染色された胸部組織区間のスライド・スキャンを受け取る。このようなスキャンは、第１倍率（たとえば、２０倍，４０倍等）および／または分解能で実行することができる。
【０１３４】
１１２０において、スライドの組織領域を識別する。スライド・スキャンは、ガラス背景および組織領域に分けることができる。このような分析は、第２倍率（例えば、１倍、２倍等）および／または分解能で実行することができる。
【０１３５】
１１３０において、組織領域に対して、優性色成分分析を実行することができる。例えば、優性色は、スライド内の組織領域から抽出することができる。このような分析は、第３倍率（例えば、５倍等）および／または分解能で実行することができる。
【０１３６】
１１４０において、多数の倍率からの色および模様の特徴を使用して、組織領域を異なる標識領域(labeled regions)にセグメント化するために、セグメント化を実行することができる。
【０１３７】
１１５０において、スライドおよび／または視野における核を検出し数える（例えば、これらが陽性に染色されているかまたは陰性に染色されているかにしたがって）。このようにして、採点を行うことができる。
【０１３８】
核を識別するための他の技法を使用することもできる。例えば、候補核の色区別（例えば、陽性の茶色と陰性の青との間）および形状（例えば、形態分析）を使用する任意の技法を使用して、核を識別することができる。このような技法では、形態後処理によって、間質細胞および浮遊小塊(stray blobs)を除外することができる。
【０１３９】
陽性百分率判定の実施態様例：ＦＯＶ採点
図１２は、視野採点のシステム例１２００のブロック図である。この例では、入力視野１２１０が示される。しかしながら、このような分析は、多数の視野、スライドの１つ以上のタイル、スライド全体、または任意の他の入力画像に対して実行することができる。
【０１４０】
ＦＯＶにおいて核を識別するために、核セグメント化（例えば、画像における核の識別）１２２０を実行することができる。核を識別するためには、任意の数の技法を使用することができる。
【０１４１】
次いで、識別した核を分類するために、核分類１２３０を実行することができる。この場合も、核を陽性染色または陰性染色に分類するためには、任意の数の技法を使用することができる。
【０１４２】
１２４０において、分類された核に対して採点を実行し、バイオマーカに対する陽性百分率を得ることができる。核を識別することによって、対応する細胞が識別される。分析が視野の外側のエリアに対して実行されても、採点は特定の視野に対して実行することができる。
【０１４３】
陽性百分率判定の実施態様例：ＦＯＶ採点
図１３は、視野採点の他のシステム例１３００のブロック図である。この例では、入力視野１３１０が示される。しかしながら、このような分析は、多数の視野、スライドの１つ以上のタイル、スライド全体、または任意の他の入力画像に対して実行することができる。
【０１４４】
核セグメント化（例えば、画像における核の識別）１３２０を実行することができる。１３２２において、本システムによって処理されたシードを突き止めるために、入力画像に対してシード検出を実行する。シードとは、候補核内にあり、細胞核の位置を検出するための開始点として役割を果たす点である。シード検出は、カーネルに基づく投票手順を使用して勾配画像(gradient image)上で動作するというような技法を使用することができる。１３２４において前景セグメント化を実行する。核領域に関連付けられた前景マスクを計算することができる。１３２６において、小塊セグメント化を実行する。前景セグメント化および小塊セグメント化は、画像間における全域的強度変動を利用することができる。核毎に小塊状表現を抽出することができる。
【０１４５】
核分類１３３０を実行することができる。１３３２において、特徴構築を実行する。１３３６において、訓練からのモデル１３３４を参照して、分類を実行する。このようなモデルは、関与するバイオマーカに特定的にすることができる。
【０１４６】
１３４０において、採点を実行し、バイオマーカに対する陽性百分率を得る。核を識別することによって、対応する細胞を識別する。分析が視野の外側の領域に対して実行されても、採点は特定の視野に対して実行することができる。
【０１４７】
陽性百分率判定の実施態様例：分類
図１４は、真に陽性染色された核を判定するクラシファイアの一例１４００のブロック図である。この例では、候補の核（例えば、入来する候補）がクラシファイア１４１０によって処理される。クラシファイア１４１０は、２つのクラス、陽性１４５１および陰性１４５２に分ける。入来する候補がいずれにも分類されないこと、前もって除外されること等があり得る。クラシファイアは、染色されていない細胞であると判定された細胞（例えば、核に関連付けられた）を陰性１４５２と判定することができる。一部の候補（例えば、間質組織、リンパ球等）は、陰性１４５２分類にも陽性１４５１分類にも含まれない非細胞である可能性がある。
【０１４８】
クラシファイアは、色特徴（例えば、平均、分散等）、組織背景色および状況(context)、形状（例えば、サイズ、離心率、延長）、形態、細胞密度等のような、特徴を使用することができる。
【０１４９】
陽性百分率判定の実施態様例：分類
図１５は、真に陽性染色された核を判定する多段階線形二進クラシファイアの一例１５００のブロック図である。この例では、候補核（例えば、入来する小塊）は、クラシファイア１５１０によって処理される。クラシファイア１５１０は２つの暫定クラスに別ける。
【０１５０】
１）茶色（真の陽性）で僅かにくずれた小塊、および
２）陰性（例えば、染色されない核）、リンパ球、および間質。
クラシファイア１５２０は、入来する候補を、間質１５５４ならびに陰性およびリンパ球に別ける。
【０１５１】
他のクラシファイア１５３０は、入来する候補を、陰性１５５２およびリンパ球１５５３に別ける。
更に他のクラシファイア１５４０は、入来する候補を茶色（真の陽性）１５５１および僅かに茶色のくずれた小塊１５５５に別ける。
【０１５２】
真の陽性１５５１および陰性１５５２の個数は、視野に対する陽性百分率を判定するために使用することができる。
これらのクラシファイアは、色特徴（例えば、平均、分散等）、組織背景色および状況、形状（例えば、サイズ、離心率、延長）、形態、細胞密度等のような、特徴を使用することができる。
【０１５３】
ＨＥＲ２等級スコアの判定例
本明細書における例のいずれにおいても、等級スコアをＨＥＲ２バイオマーカに対して生成することができる。ＩＨＣ複合スコアについては、ＨＥＲ２に対する視野は集合的に考えることができる（例えば、複数のディジタル視野上で集合的に分析を実行することができる）。異質性スコアについては、ＨＥＲ２バイオマーカに対する組織スライドの画像内にあるそれぞれの視野に対して等級スコアを生成することができる。実際には、このようなスコアは、核を包囲する細胞膜に対する染色の完全さを判定する。
【０１５４】
等級スコアは、本明細書において説明したように、ＨＥＲ２に対して（例えば、集合的に複数のＦＯＶに対してまたはそれぞれのＦＯＶに対して）１つの数値（例えば、０、１、２、または３）を含むことができる。
【０１５５】
ＨＥＲ２等級採点方法例
図１６は、ＨＥＲ２等級スコアを判定する方法例１６００のフローチャートであり、本明細書においてＨＥＲ２等級スコアが使用される例のいずれにでも使用することができる。このようなスコアは、本明細書において説明したように、複数の視野に対して集合的に、または別々の視野毎に生成することができる。
【０１５６】
方法１６００は、ＨＥＲ２について本明細書において説明したように、用意されアノテーションが付けられたスライドの所与の画像に対して実行することができる。１６１０において、画像内の組織をセグメント化する。例えば、間質エリアおよび非間質エリアを判定することができる。
【０１５７】
１６２０において、例えば、非間質（例えば、腺）領域において、本明細書で説明したように核を検出することができる。
１６３０において、核を染色または対比染色に分類する。
【０１５８】
１６４０において、画像（例えば、画像全体、ＦＯＶ等）における染色細胞膜を検出する。
１６５０において、それぞれの核を、それらの回りにある染色膜と関連付けることによって、細胞を採点する。核の周囲における染色膜の存在に基づいて、細胞を次のタイプの内１つに分類する。非染色（例えば、核の回りに染色膜が発見されない）、部分的染色（例えば、細胞の核が部分的に染色膜によって包囲される）、完全染色（例えば、核が染色膜によって完全に包囲される）。部分的または完全な染色を判定するための閾値として、パラメータを使用することができる。望まくは、このようなパラメータは、ユーザによって調節することができる（例えば、部分的と評価するために必要な百分率範囲(percentage surrounding)、完全と評価するために必要な百分率範囲）。例えば、包囲する染色膜が閾値量よりも多い（例えば、９０％）細胞は、「完全に」染色されたものと判定することができる。
【０１５９】
実際には、検出された細胞（例えば、検出された核に対応する）に対して、染料（例えば、茶色）色成分に対する画素強度（例えば、０から１００，２５５等のような最大値までの範囲を取る）に基づいて、染色完全性インディケータ（例えば、染色が完全か否か、完全さの度合い等を示す）および染色強度値を、細胞に指定することができる。次いで、このような情報を分析して、本明細書において説明したように、ＨＥＲ２を判定することができる。
【０１６０】
このように、ＨＥＲ２用のディジタル視野内に現れる複数の細胞について、それぞれの染色完全性インディケータおよび染色強度値を、判定することができる。次いで、本明細書において説明したように、染色完全性インディケータおよび染色強度値を、条件によって分析することができる。
【０１６１】
ＨＥＲ２用のディジタル視野内に現れる複数の核について、核のそれぞれを包囲する細胞膜の染色の強度を判定することができる。
１６６０において、視野における細胞のスコアに基づいて、視野を採点する（例えば、集合的にまたはそれぞれに）。例えば、以下の条件を使用することができる（例えば、視野がもっと高いスコアに該当する(qualify for)場合、それより低いスコアに対して処理を実行する必要はない）。
【０１６２】
【表１】
0006405319.tif 000006
【０１６３】
説明したように、膜中央強度を強い強度閾値と比較することができる。また、ＨＥＲ２用のディジタル視野に現れる複数の核に対して、核を包囲する細胞膜が完全に染色されたか否かも判定することができる。
【０１６４】
このように、ＨＥＲ２に対する視野等級採点を行うことができる。二進スコアが望まれる場合、等級スコアを判定する中間ステップを省略するか、またはプロセスに組み込むことができる。
【０１６５】
染色強度の例
本明細書における例のいずれにおいても、陽性染色（例えば、細胞膜の）を平均的な茶色っぽさ(average brownness)によって定量化することができる。例えば、膜上における平均的な茶色っぽさは、輝度スカラー値（例えば、０−２５５）によって判定することができる。輝度スカラー値は、膜領域のＲＧＢ画素値から計算することができる。ＲＧＢ値は、ＲＧＢ−Ｌ*ａ*ｂ*変換技法によって、輝度値（Ｌ）に変換することができる。Ｌ値は、０〜１００の目盛りから０〜２５５の目盛りに変換することができる。
【０１６６】
細胞に対する平均的な茶色っぽさは、膜の画素にわたってＬの平均を取ることによって計算することができる。平均的な茶色っぽさは、本明細書において説明したように、中央強度（例えば、細胞膜の）として使用することができる。
【０１６７】
核分類の例
本明細書における例のいずれにおいても、ＨＥＲ２等級スコアを計算する目的のために、核を分類することができる。例えば、画像からの核細胞における彩度、強度、ならびに赤および青色情報に基づいて、細胞を染色および対比染色に分類することができる。彩度および強度情報は、暗い灰色の細胞が、非染色の代わりに、染色に分類できるように、暗い灰色の細胞を区別するために使用することができる。
【０１６８】
例えば、以下の規則を使用することができる。
Ａ．染色百分率１ ＝ １００ * （Ｒ − Ｇ） ／ （Ｒ ＋ １）
Ｂ．染色百分率２ ＝ １００ * （Ｒ − Ｂ） ／ （Ｒ ＋ １）
Ｃ．染色百分率１＞画素レベル染色％、および染色百分率２＞画素レベル染色％である場合、画素＝染色となる。
【０１６９】
Ｄ．彩度＜４５、および強度＜１２８の場合、画素＝染色となる。
Ｅ．彩度＜１２８、および強度＜５５の場合、画素＝染色となる。
Ｆ．彩度＜２５５、および強度＜３０の場合、画素＝染色となる。
【０１７０】
Ｇ．強度＜＝２０の場合、画素＝染色となる。
この画素分類情報を使用すると、各核内における染色画素の百分率に基づいて、各核を染色または非染色に分類することができる。例えば、以下の規則を使用することができる。
【０１７１】
Ａ．細胞レベル閾値＞各核内における染色画素の百分率（％）の場合、細胞を染色に分類する。
Ｂ．それ以外の場合、非染色に分類する。
【０１７２】
次いで、サイズに基づいて、核物体(nuclei object)を除外することができる。
ＨＥＲ２等級スコア対照の例
ＨＥＲ２等級スコアが本明細書において説明したように判定されているか否か判定するために、４つの細胞株対照を使用することができる。本明細書において説明したように処理し染色したとき、細胞株は、以下の表に記載されるように染色するはずである。細胞株は、Ventana Medical Systems, Inc.からカタログ番号７８１−２９９１として入手可能である。
【０１７３】
【表２】
0006405319.tif 000007
【０１７４】
ＨＥＲ２遺伝子コピー＃は、PathVysion（Ｒ）ＨＥＲ２プローブを使用して決定されたPATHWAY HER-2 フォー・イン・ワン対照スライド(4 in 1 control slides )の３つのロットの平均として決定されたものである。
【０１７５】
ＨＥＲ２採点に関する追加情報は、Ventana Medical Systems, Inc.,から入手可能な "PATHWAY（R）anti-HER-2/neu (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody"（反ＨＥＲ−２／ニュー（４Ｂ５）うさぎモノクロナール一次抗体）Catalog Number 790-2991（カタログ番号７９０−２９９１）についての文書において見出すことができる。
【０１７６】
Ｈ−スコア計算の例
本明細書における例のいずれにおいても、Ｈ−スコアは、自動化技法によって１つまたは複数の視野から集合的に計算することができる。例えば、核を識別することができ、次いで細胞（例えば、これらの核に対応する）を４つのビン、０，１（弱い染色），２（適度な染色），３（強い染色）に分類する（例えば、等級分けする）ことができる。このような技法は、細胞または細胞のかたまり（例えば、小塊）の平均的な茶色っぽさを判定することによって遂行することができる。
【０１７７】
色成分（例えば、ＲＧＢ等）を検査することによって、平均的な茶色っぽさを閾値と比較して、細胞が非染色（０）、弱い染色（１＋）、適度な染色（２＋）、または強い染色（３＋）か判定することができる。ビンにおける細胞の個数を維持することができ、計数の終了時に、本明細書において説明したように、各ビンにおける細胞の百分率に基づいて、Ｈ−スコアを計算することができる。
【０１７８】
例えば、それぞれの染色強度（例えば、ゼロ強度に対するビンを含む）に関連付けられた複数のビンにおける細胞の個数を仮定して、これらのビン毎に、ビンにおける細胞の百分率（例えば、ビンにおける細胞の数を細胞の総数で除算するというような、細胞個数の百分率）とそのビンに関連付けられたそれぞれの強度レベルとの積を加算することによって、Ｈ−スコアを計算することができる。４つのビン０−３を有する構成では、Ｈ−スコアは０から３００までの範囲になる。このような構成における最大スコアは、細胞の全て（１００％）が強度３になる場合（例えば、０×０＋０×１＋０×２＋１００×３＝３００）に達せられる。つまり、百分率は、端数ではなく、整数として扱うことができる（例えば、５０％＝５０）。ビンに関連付けられた強度レベルは、強度指定の数値部分（例えば、２＋は２として扱われる）とすることができる。
【０１７９】
乳癌再発予知スコアの例  
本明細書における例のいずれにおいても、乳癌再発予知スコアは、１つ以上のバイオマーカに対するＩＨＣ複合スコアおよび異質性スコアに基づいて生成することができる。このような予知スコアは時として単に「出力予知スコア」とも呼ばれる。
【０１８０】
このスコアは、ＩＨＣ複合スコアおよび異質性スコアを組み合わせることによって生成することができる。例えば、異質性スコアを加算、乗算、またはそれ以外で組み合わせることができ、次いで異質性成分をスコアに形成する演算（例えば、二乗根、指数、係数等）を適用することができる。
【０１８１】
免疫組織化学複合スコアも同様に、免疫組織化学複合成分をスコアに形成するために調節する（例えば、二乗根、指数、係数等）ことができる。
次いで、これら２つの成分を組み合わせる（例えば、加算、乗算等）ことができる。
【０１８２】
出力予知スコアを計算するための１つの特定の技法は次の通りである。
【０１８３】
【数５】
0006405319.tif 000008
【０１８４】
ここで、ＦＩＨＣは免疫組織化学複合係数であり、ＦＨｅｔは異質性係数であり、ＨｅｔＥＲはＥＲに対する異質性スコアであり、ＨｅｔＰＲはＰＲに対する異質性スコアである。一実施態様では、ＦＩＨＣ＝０．０３１１４，ＦＨｅｔ＝１．９５１１９である。しかしながら、本技術は、所望に応じて、係数の調節をサポートすることができる。例えば、蓄積されたデータに照らし合わせて変更することができる（例えば、本明細書において説明したように患者をカテゴリに分割するため）適した係数を、統計的分析が示すことができる。
【０１８５】
予知の指示の例
本明細書における例のいずれにおいても、予知の指示は、出力予知スコア自体、閾値に基づくカテゴリ（例えば、赤、黄色、緑）等を含むことができる。この指示は、入力に基づいて、癌が再発すると予測されるか否か（またはどの位の可能性か）示す形式にすることができる。
【０１８６】
乳癌再発の指示は、乳癌再発予知スコアに対して格納された１つ以上の閾値に基づいて選択することができる（例えば、複数のカテゴリから）。例えば、スコアが閾値と一致した場合、第１指示（例えば、再発の予知）を選択することができる。スコアが閾値と一致しない場合、第２指示（例えば、非再発の予知）を選択することができる。
【０１８７】
このようなカテゴリは、時間成分等も含むことができる（例えば、５年以内に再発することが予期される）。
多数の指示をサポートすることができる（例えば、癌が１年以内に再発することが予期されるか否かについて１つのカテゴリ、癌が５年以内に再発することが予期されるか否かについての他のカテゴリ等）。
【０１８８】
撮像プラットフォームにおける実施態様例
本技術は単体でも実現することができるが、本明細書において説明した技術は、スライド画像データの分析においてユーザを補助する多機能ディジタル病理プラットフォームにおいても実現することができる。例えば、本技術は、Ventana Medical Systems, Inc.,のVirtuoso画像管理ソフトウェアまたは相当する解決手段に統合することができる。
【０１８９】
このようなプラットフォームは、本技術のフロント・エンドとして役割を果たすことができる。ディジタル病理プラットフォームを介してこれらについて収集されたスライド画像および情報（例えば、視野）は、本明細書において説明した技術への入力として使用することができる。
【０１９０】
このようなプラットフォームは、病理医に、事例、見本、および画像に対して任意の所望の順序で作業する柔軟性を許容することができる。スライド画像にはアノテーションを付けることができ、種々の他の機能も利用可能にすることができる。
【０１９１】
プラットフォームは、所望に応じて、薄いクライアント（例えば、サービスとしてのソフトウェア、クラウド・コンピューティング等）において実現することができる。
本技術を実現する異質性ツールを含むシステム例
図１７は、本明細書において説明した乳癌予知技術を実現する異質性ツール１７２０を含むシステム例１７００のブロック図である。この例では、異質性ツール１７２０は、それぞれのバイオマーカ用の複数のディジタル視野１７１１Ａ−Ｎ、１７１４Ａ−Ｎを入力として受け入れ、任意のノーマライザ(normalizer)１７２５の補助により、バイオマーカのそれぞれに対して異質性スコア１７３１，１７３４を出力する。
【０１９２】
図９の特徴について、所望に応じて、混在させるまたは組み込むことができる。
予知ツール１７４０は、異質性スコア１７３１，１７３４、およびＩＨＣ複合スコア１７５０を入力として受け入れ、予知閾値１７４５を参照して、被験者において癌が再発する可能性が高いか否かの指示１７９０を出力する。
【０１９３】
それぞれのバイオマーカに対する異質性スコアによって本技術を実現するコンピュータ実装方法の例
図１８は、それぞれのバイオマーカに対する異質性スコアを判定することによって、本明細書において説明した乳癌予知技術を実現するコンピュータ実装方法例１８００のフローチャートであり、例えば、図１７に示したシステムにおいて実現することができる。
【０１９４】
１８１０において、それぞれのバイオマーカ用に複数のディジタル視野を受け取る。
１８１２において、ディジタル視野に基づいて、バイオマーカのそれぞれに対する異質性スコアを判定する。
【０１９５】
１８１６において、ＩＨＣ複合スコアおよび異質性スコアを組み合わせて、予知スコアを得る。
１８１８において、予知スコアに基づいて、予知の指示（例えば、被験者において癌が再発する可能性が高いか否かの指示１７９０）を出力する。
【０１９６】
ＩＨＣ複合スコアの計算例
コンピュータ実装方法は、それぞれのバイオマーカ抗体で検出可能に標識された（例えば、本明細書において説明したように、複数のバイオマーカに対して）乳癌サンプルを描写するそれぞれの画像内におけるそれぞれの複数のディジタル視野を受け取ることによって、被験者に対する免疫組織化学複合スコアを計算することができる。
【０１９７】
次いで、本明細書において説明したように、複数のバイオマーカに対する陽性百分率を判定することができる。
次いで、免疫組織化学複合スコアを計算することができる。このような計算は、１つのバイオマーカに対する陽性百分率を第２バイオマーカに対する陽性百分率と組み合わせることを含むことができる。
【０１９８】
次いで、免疫組織化学複合スコアを出力することができる。
本明細書において説明したように、バイオマーカは、ＨＥＲ２を含むことができ、ＩＨＣ複合スコアの計算は、ＨＥＲ２スコア（例えば、等級分け、二進等）を含むことができる。
【０１９９】
バイオマーカの例
図１７の例では、領域的異質性を判定するために、バイオマーカＥＲおよびＰＲが使用される。実際には、バイオマーカの異なる組み合わせの異質性を計算し、ＩＨＣ複合スコアと組み合わせて予知スコアを生成することができる。
【０２００】
使用することができるバイオマーカは、ＩＨＣ複合スコアの一部として使用されるバイオマーカ（例えば、ＥＲ，ＰＲ，Ｋｉ−６７，ＨＥＲ２）の内１つ以上の組み合わせを含むことができる。本明細書における他の例のいずれも、適宜変更することができる（例えば、視野を得る、異質性スコアを計算するため等）。
【０２０１】
多重化の例
本明細書における例のいずれにおいても、多重化のシナリオにおいてバイオマーカを測定することができる。例えば、本明細書において説明したように、例えば、異なる標識がなされた副抗体を使用することによって、このように標識されたタンパク質が区別可能である限り、１つの組織区間を１つよりも多い抗体（２つの異なるバイオマーカに特定的な２つの抗体等）で標識することができる。
【０２０２】
組織マイクロアレイ技法の例
本明細書における例のいずれにおいても、組織染色を実施するために組織マイクロアレイ技法を適用することができる。例えば、複数の組織サンプルを１つの基板に付着させることができ、複数の染色剤（例えば、標識された抗体）をこれらのサンプルに適用することができる（例えば、組織サンプル毎に異なる薬剤）。次いで、本明細書において説明した技法は、本明細書において説明したように、１つ以上のスコアを判定するために使用することができる（例えば、検出可能に標識された組織サンプルの画像に基づいて）。
【０２０３】
閾値の例
本明細書における例のいずれにおいても、統計的評価によって閾値を導くことができる。例えば、訓練および検査を使用して切断点を決定し、危険性が高い患者および低い患者を最良に定める最適な切断点の妥当性を判断することができる。
【０２０４】
本技術を実装する示差エンジンを有するシステム例
図１９は、バイオマーカに対する異質性スコアを計算するための示差エンジン(difference engine)１９４０を含むシステム例１９００のブロック図である。所望に応じて、図９および／または図１７の特徴を組み込むまたは混在させることができる。
【０２０５】
この例では、視野アナライザ１９２０が視野１７１１Ａ−Ｎ（例えば、１つのバイオマーカに対する）を入力として受け入れ、視野のそれぞれに対する陽性百分率測定値１９３１Ａ〜Ｎを出力する。
【０２０６】
示差エンジン１９４０は、陽性百分率測定値１９３１Ａ−Ｎを入力として受け入れ、任意のノーマライザ１９４５の補助により、バイオマーカに対する異質性スコア１７３１を出力する。
【０２０７】
異質性スコアを計算するためのコンピュータ実装方法例
図２０は、本明細書において説明した乳癌予知技術において使用する異質性スコアを計算するためのコンピュータ実装方法例２０００のフローチャートであり、例えば、図１９に示したシステムにおいて実装することができる。
【０２０８】
２０１０において、所与のバイオマーカ用に複数のディジタル視野を受け取る。このような画像は、本明細書において説明したように、バイオマーカ用の抗体で検出可能に標識された被験者からの乳癌サンプルを描写することができる。
【０２０９】
２０１２において、ディジタル視野におけるこのバイオマーカに対するタンパク質発現を測定する。例えば、バイオマーカのそれぞれに対する陽性百分率測定値を受け取るか、または判定する。
【０２１０】
２０１６において、これら複数のディジタル視野間において、バイオマーカに対して測定したタンパク質発現の異質性を測定する。例えば、異なる視野（例えば、１つのバイオマーカに対する）に現れる陽性百分率測定値間の可変性として、異質性スコアを計算する。
【０２１１】
本明細書において説明したように、異質性スコアを調節するために、異質性スコア（例えば、暫定的異質性スコアまたは可変性メトリック）を正規化することができる。
２０２０において、バイオマーカに対する異質性スコアを出力する（例えば、本明細書において説明した技術において使用するため）。
【０２１２】
ユーザ・インターフェース例
図２１は、画像内においてディジタル視野を示すユーザ・インターフェース例２１００のスクリーンショットである。ユーザ・インターフェースは、入力を受け入れるためにユーザに提示されるウィンドウ、画面、ペイン等の形態を成すことができる（例えば、表示されたスライド画像上における視野の指示）。
【０２１３】
この例では、病理医が、異質性を目的とする特定のバイオマーカ（例えば、ＥＲ）用に、表示されたスライド上において３つの視野２１２０Ａ，２１２０Ｂ，２１２０Ｃを選択した。異なるバイオマーカには、独立した視野を選択することができる。異質性を目的として、そして免疫組織化学複合スコアを目的として、他の独立した視野も選択することができる。
【０２１４】
病理医のワークフロー例
図２２は、ディジタル病理医ワークフロー・コンピュータ実装方法例２２００のフローチャートである。画像上（例えば、内部）における視野の選択を容易にするために、ディジタル病理医ワークフローをサポートすることができる。
【０２１５】
２２１０において、ユーザ・インターフェースを介してＩＨＣ複合スコア用の視野を要求し、ＩＨＣ複合スコアを判定するために表示された複数のスライド（または組織）画像内において、ＩＨＣ複合スコア用に複数の視野を受け取る。このようなユーザ・インターフェースは、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲの各々用の抗体で検出可能に標識された被験者からの乳癌サンプルを描写する複数のスライド（または組織）画像を含むことができる。ＩＨＣ複合スコア用に複数の視野を受け取るステップは、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲの各々に複数の視野を受け取ることを含むことができる。例えば、一連のスライド（または組織区間）を提示することができ、病理医はそれぞれのスライド上で複数のフィールドを指示することができる（例えば、第１スライドに対するＦＯＶ、第２スライドに対するＦＯＶ等）（または組織区間毎に複数のフィールド）。このような指示は、表示された画面上でアノテーション（例えば、描写されたエリア）を受け取ることによって実施することができる。
【０２１６】
２２１２において、ユーザ・インターフェースを介して異質性スコアに対する視野を要求して、異質性スコアを判定するために表示された複数のスライド（または組織）画像内において、異質性スコア用に複数の視野を受け取る。このようなユーザ・インターフェースは、ＥＲおよびＰＲの各々用の抗体で検出可能に標識された被験者からの乳癌サンプルを描写する複数のスライド（または組織）画像を含むことができる。ＩＨＣ複合スコア用に複数の視野を受け取るステップは、ＥＲおよびＰＲの各々にというように、複数の視野バイオマーカを受け取ることを含むことができる。このように受け取ることは、表示された画像上でアノテーション（例えば、描写または識別されたエリア）を受け取ることによって実施することができる。
【０２１７】
２２１６において、ＩＨＣ複合スコア用の視野に対するタンパク質発現値を測定し、これからＩＨＣ複合スコアを計算する。
２２１８において、異質性スコア用の視野に対するタンパク質発現値を測定し、これから異質性スコアを計算する。それぞれの他のバイオマークに対する１つ以上の他の異質性スコアも同様に得ることができる。
【０２１８】
２２２０において、ＩＨＣ複合スコアおよび１つ以上の異質性スコアを組み合わせて、乳癌再発予知スコアを求める。
２２２２において、乳癌再発予知スコアに基づく乳癌再発予知の指示を表示する（例えば、見ている病理医による検討のため）。
【０２１９】
視野選択の例
本明細書における例のいずれにおいても、スライド全体を表すように、ＩＨＣ複合スコア用に視野を選択することができる。病理医に提示されるユーザ・インターフェースは、そのように指示することができる。
【０２２０】
本明細書における例のいずれにおいても、異質性スコア用の視野は、スライド上のある領域を表すように選択することができる（例えば、領域間の差を強調するためにそのように選択する）。病理医に提示されるユーザ・インターフェースは、そのように指示することができる。
【０２２１】
更なる説明の例
Ａ．生物学的サンプル
被験者から生物学的サンプルを得る方法は、当技術分野では周知である。例えば、胸部組織または胸部細胞を得る方法は型どおりの手順である。例えば、細胞物質を含有する腫瘍からのサンプルは、その腫瘍の全部または一部の外科的切除によって、腫瘍から微細針吸引液を収集することによって、そして当技術分野において周知である他の方法によって得ることができる。
【０２２２】
サンプルは、新鮮なまたは処理された事後収集物(post-collection)であってもよい。ある例では、処理済みサンプルが固定され（例えば、ホルマリン固定）および／またはワックス（例えば、パラフィン）で埋め込まれてもよい。実装細胞および組織調合物用の定着薬は、当技術分野では周知であり、限定ではなく、９５％アルコール・ブアンの定着薬、９５％アルコール定着薬、Ｂ５定着薬、ブアンの定着薬、ホルマリン定着薬、カルノフスキーの定着薬（グルタルアルデヒド）、ハートマンの定着薬、ホランドの定着薬、オースの溶液（重クロム酸塩定着薬）、ゼンカーの定着薬（例えば、Carson, Histotechology: A Self-Instructional Text（組織技術：自己指導教本）、Chicago:ASCP Press, 1997を参照）。このように、サンプルは、固定されたワックス埋め込み早期乳癌組織サンプルのような、固定されたワックス埋め込み乳癌組織サンプルとすることができる。ある例では、サンプルは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された胸部組織区間である。ある例では、サンプルは、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲに特定的な腫瘍抗体で標識された胸部組織区間であり、直接または間接に標識することができ（例えば、標識された副抗体によって）、ある例では、更にＨ＆Ｅで染色される。
【０２２３】
ある例では、サンプル（またはその断片）は固体の支持部上にある。固体の支持部は、生物学的サンプルを支え、サンプルにおける成分（例えば、タンパク質）の便利な検出を可能にする。支持部または基板の例には、顕微鏡スライド（例えば、ガラス製の顕微鏡スライドまたはプラスチック製の顕微鏡スライド）、カバーガラス（例えば、ガラス製のカバーガラスまたはプラスチック製のカバーガラス）、組織培養皿、マルチウェル・プレート、膜（例えば、ニトロセルロースまたはフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ））またはBIACORE（R）チップを含む。
【０２２４】
Ｂ．乳癌バイオマーク
１．エストロゲン受容体（ＥＲ）（ＯＭＩＭ：１３３４３０）
人エストロゲン受容体（ＥＲまたはＥＳＲ）は、α（ＥＳＲＩ）およびβ（ＥＳＲ２）と呼ばれる、２つの異なる形態を有する。ＥＲαは、乳癌細胞において見られる形態である。ＥＲαは、例えば、GenBank（R）から公に入手可能なシーケンスである（例えば、アクセッション番号 NP_001116214.1，NP_001116213.1，P03372.2（タンパク質），NM_000125.3，NM_001122741.1，NM_178850.2（ヌクレオチド））。
【０２２５】
エストロゲン受容体は、ホルモン結合、ＤＮＡ結合、および転写の活性化に重要な様々なドメインで構成された、リガンド活性化転写因子である。交互のスプライシングによって、様々なＥＳＲＩ  ｍＲＮＡ転写体が得られ、これらは主にその５’非翻訳領域において異なる。
【０２２６】
ＥＲ発現を検出するための抗体は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)、Thermo Scientific Pierce Antibodies (Rockford, IL)、GeneTex (Irvine, CA)、 ARP American Research Products、Ventana Medical Systems, Inc (Tucson, AZ) 、またはAbcam(Cambridge, MA) からというように、公に入手可能であり、例えば、Santa Cruz BiotechnologyからのCat. Nos. sc-71064, sc-73562およびsc-7207、Pierce AntibodiesからのMA1-310、Ventanaからの790-4325 (clone SP1、あるいはAbcamからのab2746、ab27614、またはab37438がある。
【０２２７】
２．人上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）（ＯＭＩＭ１６４８７０）
人ＨＥＲ２遺伝子は、染色体１７(17q21-q22)上に位置する。ＨＥＲ２シーケンスは、例えば、GenBank（R）から公に入手可能である（例えば、アクセッション番号 NP_001005862.1，P04626.1，NP_004439.2（タンパク質），NM_001005862.1，NM_001982.3（ヌクレオチド））。
【０２２８】
ＨＥＲ２の増幅または過剰発現は、ある種の進行性乳癌の病因および進展においてある役割を果たし、この疾病に対する療法の重要なバイオマーカおよび標的となる。
ＨＥＲ２発現を測定するための抗体は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)、Thermo Scientific Pierce Antibodies (Rockford, IL)、 GeneTex (Irvine, CA)、ARP American Research Products, Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, AZ) 、またはAbcam(Cambridge, MA)からというように、公に入手可能であり、例えば、Ventanaからの Cat. Nos. 790-2991（クローン４Ｂ５）、Santa Cruz Biotechnology からのsc-08、sc-81528、およびsc-136294 、ならびにAbcamからの ab2428、abl6901、またはab36728がある。
【０２２９】
３．Ｋｉ−６７（ＯＭＩＭ：１７６７４１）
人のＫｉ−６７遺伝子は、染色体１０上に位置する。Ｋｉ−６７シーケンスは、例えば、GenBank（登録商標）から公に入手可能である。（例えば、アクセッション番号 NP_001139438.1、P46013.2，NP_002408.3（タンパク質），NM_001040058.1，NM_001145966.1（ヌクレオチド））。
【０２３０】
Ｋｉ−６７は、所与の細胞集団の増殖分画を判定するために使用することができる。Ｋｉ−６７−陽性腫瘍細胞（Ｋｉ−６７標識インデックス）の分画は、多くの場合、乳癌のような癌の臨床経過と相関付けられる。したがって、Ｋｉ−６７は患者の生存および腫瘍の再発を予知するために使用することができる。
【０２３１】
Ｋｉ−６７発現を測定するための抗体は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)、Thermo Scientific Pierce Antibodies (Rockford, IL)、GeneTex (Irvine, CA)、ARP American Research Products、Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, AZ)、またはAbcam (Cambridge, MA)からというように、公に入手可能であり、例えば、VentanaからのCat. Nos. 790-4286（クローン３０−９）、Santa Cruz Biotechnologyからのsc-101861（クローンＭＩＢ−１），sc-15402，sc-23900，Abcamからのabl5580、abl6667，ab8191がある。
【０２３２】
４．プロゲステロン（ＰＲ）（ＯＭＩＭ：６０７３１１）
人のＰＲ遺伝子（核受容体サブファミリ３，グループＣ、メンバー３、ＮＲ３Ｃ３としても知られる）は、染色体１１ｑ２２に位置する。ＰＲシーケンスは、例えば、GenBank（登録商標）（例えば、アクセッション番号NP_000917.3，AAA60081.1．AAS00096.1（タンパク質），NM_001202474.1，NM_000926.4（ヌクレオチド））から公に入手可能である。
【０２３３】
ＰＲの増幅または過剰発現は、ある乳癌において示されている。
ＰＲ発現を測定するための抗体は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)、Thermo Scientific Pierce Antibodies (Rockford, IL)、GeneTex (Irvine, CA)、ARP American Research Products、Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, AZ)、またはAbeam (Cambridge, MA)からというように、公に入手可能であり、例えば、VentanaからのCat. Nos. 790-2223（クローンＩＥ２）、Santa Cruz Biotechnologyからのsc-810，sc-811，sc-539、およびAbcamからのab2765，ab2764，ab68195がある。
【０２３４】
５．配列変異体
本明細書において示し、公に入手可能な特定のＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲに加えて、当業者は、このような配列の変異体が特定の被験者には存在し得ることを認めよう。例えば、特定の遺伝子またはタンパク質の多相性が存在する場合がある。加えて、配列は異なる有機体間でも変化する場合がある。特定的な例では、配列変異体は、その対応する天然配列の生物学的活動を保持する。例えば、特定の被験者内に存在するＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲ配列が、１から５または１から１０の保存アミノ酸置換のような、保存アミノ酸変化（非常に高く保存された置換、高く保存された置換、または保存された置換）を有する可能性がある。保存アミノ酸置換の例をテーブル１に示す。
【０２３５】
【表３】
0006405319.tif 000009
【０２３６】
実施形態の中には、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲ配列が、それぞれ、本明細書において言及されたGenBank（R）アクセッション番号に明記される配列に対して、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９５％、少なくとも９２％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、または少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチドまたはタンパク質配列というような、天然ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲ配列の配列変異体である場合もあり、得られた変異体は、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲ生物学的活動を保持する。「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列間（または２つのヌクレオチド配列間）の類似性を記述するために一般に使用される句である。配列同一性は、通例、同一性百分率に関して表現され、百分率が高い程、２つの配列は類似する。
【０２３７】
比較のためそして配列同一性を判定するための配列整合方法は、当技術分野では周知である。種々のプログラムおよび整合アルゴリズムが、以下の論文に記載されている。Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444, 1988、Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988、Higgins and Sharp, CABIOS, 5: 151-153, 1989、 Corpet et al., Nucleic Acids Research, 16: 10881-10890, 1988、Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8: 155-165, 1992、Pearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331, 1994、Tatiana et al, FEMS Microbiol. Lett., 174:247-250, 1999。 Altschul et al.は、配列整合方法および相同関係(homology)計算の詳細な検討を紹介する(J. Mol. Biol, 215:403-410, 1990)。
【０２３８】
The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLASTTM, Altschul et al, J. Mol. Biol, 215:403-410, 1990)は、National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) を含む様々なソースから、そしてインターネット上で、配列分析プログラム blastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxと関連付けて使用するために入手可能である。このプログラムを使用してどのようにして配列同一性を判定するかについての説明は、BLAST（R）のヘルプ・セクションにおいてインターネット上で入手可能である。
【０２３９】
約１５個よりも多いアミノ酸のアミノ酸配列の比較のために、デフォルト・パラメータに設定されたデフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用して、BLAST（商標）(Blastp)プログラムの「ＢＬＡＳＴ２配列」機能を採用する（ギャップを開くコスト［デフォルト＝５］、ギャップを広げるコスト［デフォルト＝２］、不一致に対する減点［デフォルト＝３］、一致に対する加点［デフォルト＝１］、期待値（Ｅ）［デフォルト＝１０．０］、ワード・サイズ［デフォルト＝３］、および概要の数（Ｖ）［デフォルト＝１００］）。短いペプチド（約１５個未満のアミノ酸）を整合するとき、この整合は、組成に基づく統計(composition-based statistics)を使用して、デフォルト・パラメータに設定されたＰＡＭ３０行列を採用するＢｌａｓｔ２配列機能「短いほぼ正確な一致の検索」を使用して実行されるとよい（期待閾値＝２００００、ワード・サイズ＝２、ギャップ・コスト：存在＝９および拡大＝１）。
【０２４０】
Ｃ．タンパク質の検出
特定的な例では、被験者から得られたサンプルが、乳癌サンプルのように、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲタンパク質を含有するか否か判定するために、このサンプルが分析される。つまり、サンプルにおけるＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲタンパク質の存在、例えば、定性的または定量的測定値を検出または測定するために、サンプルを分析することができる。また、タンパク質発現の異質性を判定するために、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲタンパク質の発現パターンも使用することができる。
【０２４１】
タンパク質検出方法は、型どおりの手順である。ある例では、サンプルにおけるＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲタンパク質の存在を検出するために、免疫測定法が使用される。一般に、免疫測定法は、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲのような、実質的に標的ペプチドだけに結合することができる１つ以上の特定の結合剤（抗体等）の使用を含む。このような結合剤は、タンパク質への結合の検出を可能にする、検出可能な標識（放射線同位元素識別、蛍光体、酵素等）を含むことができる。使用することができる免疫測定法の例は、ウェスタン・ブロット法、ＥＬＩＳＡ、蛍光体顕微鏡測定法、および流量血球計算を含むが、これらに限定されるのではない。特定的な免疫測定法は、免疫組織化学法である。
【０２４２】
一例では、具体的なの結合剤は、ポリクロナールまたはモノクロナール抗体、あるいはその断片である。ある例では、抗体はヒト化抗体である。ある例では、抗体はキメラ抗体である。望ましければ、抗体は、標的タンパク質／抗体複合体の検出、そして場合によっては定量化を可能にする、検出可能な標識を含むことができる。他の例では、抗体は、標識された適切な副抗体によって検出される。
【０２４３】
ある例では、ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７用の抗体は、Ventana Medical Systems, Inc. (Tuscon, AZ)から得られる。しかしながら、本明細書において提供する方法およびキットにおいて使用することができる他の抗体も、Novus Biologicals (Littleton, CO)、Santa Cruz biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA)、Abcam(Cambridge, MA)、およびInvitrogen (Carlsbad, CA)というような、他のソースから市販されていることが当業者にとって認められる。
【０２４４】
背景または対照標識上に検出可能な信号が存在するときは、サンプル内における標的ペプチド（例えば、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，およびＰＲタンパク質）の存在を示す。検査用乳癌サンプルのために得られた値は、ある値を表す基準値のような基準値、または予期される値の範囲と比較することができる。ある例では、基準は、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲタンパク質の既知量または期待量を有するサンプルである。
【０２４５】
ある例では、乳癌サンプルが得られ、処理されてＩＨＣを求める。例えば、サンプルは、固定され、例えば、ホルマリンおよびパラフィンで埋め込むことができる。次いで、ガラス製顕微鏡スライドのような、支持部上にサンプルを載せることができる。例えば、サンプルを薄切りにして一連の薄い区間とし、これらの区間を１つ以上の顕微鏡スライド上に載せることができる。ある例では、１つのスライドが多数の組織区間を含む。次いで、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲタンパク質に特定的な抗体で、乳癌サンプルの異なる区間を個々に標識することができる。即ち、１つの区間にはＥＲ−特定抗体で標識し、他の区間にはＨＥＲ２−特定抗体で標識する等とすることができる。ある例では、乳癌サンプルの１つの区間を、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，またはＰＲタンパク質の内２つ以上に特定的な抗体で標識することができる。即ち、１つの区間をＥＲ−特定抗体およびＨＥＲ２−特定抗体で標識することができ、異なる標識を使用することによって、抗体を区別することができる（各標識はＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲに特定的である）。例えば、スライドを染色し処理するために、Ventana Medical Systems, Inc.からのBenchMark ULTRAを使用することができる。
【０２４６】
ある例では、標識されたサンプルを含むスライドが、例えば、iScan Coreo (Ventana)を使用して、走査およびディジタル化される。このように、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，およびＰＲタンパク質の各々に対して（サンプルにおいて検出可能に標識されている）、少なくとも１つのディジタル画像を得ることができる。続いて、タンパク質（ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，およびＰＲタンパク質）毎に２つ以上の視野（ＦＯＶ）が、例えば、病理医によって選択され、アノテーションが付けられる。
【０２４７】
Ｄ．ＩＨＣ複合スコアの計算
ＩＨＣ複合（例えば、ＩＨＣ４）スコアを計算するために、検出可能に標識されたＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲ（例えば、１，２，３，４枚のスライドというような、１枚以上のスライド）を含む乳癌サンプルが使用される。一例では、乳癌サンプルには、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲの各々に特定的な主抗体で、更にしかるべく標識された副抗体（蛍光体、またはＤＩＧのような酵素で標識されたもの等）で標識することができる。一例では、ultraView Red ISH DIG検出キットが、製造業者の指示通りに（Ventana Medical Systems, Inc., Catalog # 760-505）使用される。
【０２４８】
標識された乳癌サンプルを含有する１枚以上のスライドの１つ以上のディジタル画像を、例えば、顕微鏡画像走査ソフトウェアを使用して得ることができる。１つ以上の標識された乳癌サンプル（またはそのディジタル画像）を含有する１枚以上のスライドは、例えば、病理医によって、その全体的な染色について評価される。例えば、染色における異質性の領域を、ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲの各々について検出することができる。領域的異質性が観察された場合、領域異質性を有する少なくとも１つのＦＯＶ（２，３，４，５，６，７，８，９，１０個のＦＯＶのような、スライド上における領域的異質性の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの異なるＦＯＶエリア等）が、互いに類似する少なくとも２つの他のＦＯＶ（２，３，４，５，６，７，８，９，１０個のＦＯＶのような、互いに類似するスライド上における少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの異なるＦＯＶエリア等）と共に、選択される。領域的異質性が観察されない場合、スライド上の２，３，４，５つのＦＯＶというような、スライド上の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの異なるＦＯＶというような、もっと少ないＦＯＶを選択することができる。
【０２４９】
ＰＲおよびＫｉ−６７タンパク質に対して選択されたＦＯＶ毎に、陽性百分率が判定される。つまり、４つのＦＯＶがＰＲに対して選択された場合、陽性％は、４つのＦＯＶの各々について判定される。陽性％を計算するために、ＦＯＶ内における腫瘍細胞の総数、およびＦＯＶにおいて染色された腫瘍細胞の総数（例えば、ＰＲ＋）が判定される。陽性％は、ＦＯＶにおいて染色された腫瘍細胞の総数を、ＦＯＶにおける腫瘍細胞の総数で除算した値である。特定のマーカ（例えば、ＰＲ）に対するＦＯＶ毎の陽性％の平均を取り、ＰＲおよびＫｉ−６７に対する陽性％が得られる。
【０２５０】
ＨＥＲ２に対するＦＯＶ毎に、等級スコア（０〜３の目盛り上）が判定される。例えば、ＦＯＶ毎に、当該ＦＯＶの評価に基づいて、０および３の間の等級スコアを染色に指定することができる。以下のように、ＨＥＲ２に対する核を包囲する膜の免疫染色を記述するために、例えば、テーブル２に示すように、四点目盛りを使用することができる。０は陰性、１は弱陽性、２は中陽性、３＋は強陽性。細胞質染色が未だ存在するかもしれないが、このような染色は判定に含まれる必要はない。
【０２５１】
【表４】
0006405319.tif 000010
【０２５２】
代わりに、ＨＥＲ２に対して二進スコア（０または１）を判定することができる（例えば、個々のＦＯＶまたは集合的に複数のＦＯＶに基づいて）。この場合、陽性結果（１）は、２または３の染色スコアに対応し、陰性結果（０）は０または１の染色スコアに対応する。これよりも高いまたは低い分解能も使用することができる。例えば、０，１，２，３を使用するシステムを使用することができる。内部では、ＨＥＲ２に対するスコアは、等級スコア（例えば、０，１，２，３）としてまたは二進値（例えば、０または１）として表すことができる（例えば、等級スコアに基づいて二進値が判定される）。
【０２５３】
ＥＲに対して選択されたＦＯＶについて、Ｈ−スコアが判定される（例えば、個々のＦＯＶまたは集合的に複数のＦＯＶについて）。ＥＲに対するＨ−スコアは、弱い染色を示す細胞の百分率を、中程度に染色した細胞の百分率の２倍に加算し、強く染色した細胞の百分率の３倍に加算し、３０で除算して、０−１０の間の変数（ＥＲ１０）に到達する。１よりも大きなＨ−スコアが陽性となる。ＲＰに対して陽性に染色した細胞の百分率（例えば、１０％を上限にする）を１０で除算して、０−１０の間の変数を得た（ＰＲ１０）。
【０２５４】
このように、４つのマーカの各々に対して病理医によってＦＯＶが識別された後、撮像アルゴリズムがスライド（ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲタンパク質を検出するために標識された乳癌サンプル等）からディジタル情報を抽出することができ、このディジタル画像をスコア構成要素（例えば、陽性％、等級（または二進）スコア、およびＨ−スコアの測定値）に変換する。以上で説明したマーカ毎のこれらのスコアは、ＩＨＣ複合スコアを生成するために使用される。ＩＨＣ複合スコアは、以下の式を使用して計算される。
ＩＨＣ４ ＝ ９４．７ × ｛−０．１００ＥＲ１０ − ０．０７９ＰＲ１０ ＋ ０．５８６ＨＥＲ２ ＋ ０．２４０Ｉｎ（１ ＋ １０ × Ｋｉ６７）｝
Ｅ．異質性スコアの計算
異質性とは、乳癌サンプルにおける乳癌バイオマーカＥＲ，ＨＥＲ−２，Ｋｉ−６７，ＰＲに対する染色パターンのような、組織化学的および分子染色パターンの空間的ばらつきを指す。異質性は、腫瘍の進行性および／または成長パターンの空間的ばらつきの指標となることができ、統合臨床表現型（例えば、再発する可能性が高い腫瘍）と相関付けることができる。ここでは、ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７タンパク質発現の生物学的異質性が、早期乳癌患者の一部(fraction)の予測不可能な再発と相関付けられることを示す。
【０２５５】
本方法は、４つのマーカの各々について、サンプルにおける領域的異質性を定量化することを含む。これは、選択されたＦＯＶからのスコアから計算される。このために、マーカ毎に、領域的異質性の定量的尺度が判定される。マーカが均質であるかまたは検出できない場合（例えば、ＨＥＲ２−）、その値は異質性スコアの計算から外される。タンパク質毎（ＥＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７，ＰＲタンパク質）に２つ以上の視野（ＦＯＶ）が、例えば、病理医によって、選択されアノテーションが付けられる。選択されたＦＯＶは、ＩＨＣ４スコアを計算するために選択されたＦＯＶと同じでも、または異なっても可能である。
【０２５６】
ある例では、複数のＦＯＶ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つ等）が選択され、例えば、２，３，４，５，６，７，８，９，１０個のＦＯＶが選択される。先に説明したように、領域的異質性を観察したことに応答して、領域的異質性を有する少なくとも１つのＦＯＶ（２，３，４，５，６，７，８，９，１０個のＦＯＶのような、スライド上で領域的異質性の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの異なるＦＯＶエリアというような）のような、もっと多くのＦＯＶが、互いに類似する少なくとも２つの他のＦＯＶ（２，３，４，５，６，７，８，９，１０個のＦＯＶのような、互いに類似するスライド上における少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの異なるＦＯＶエリア等）と共に選択されてもよい。領域的異質性を観察しなかったことに応答して、スライド上における２，３，４，５つのＦＯＶというような、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの異なるＦＯＶのように、もっと少ないＦＯＶが選択されてもよい。
【０２５７】
場合によっては、領域的異質性が存在しないことを結論的に確定する（例えば、確認または証明する）ために、追加のＦＯＶを選択することが望ましい場合もある。しかしながら、領域的異質性がないことが結論的に明白である場合、追加のＦＯＶを選択すると、不必要にリソースが広がる虞があり、したがって、もっと少ないＦＯＶが選択されればよい。
【０２５８】
一例では、異なる陽性％を有するＦＯＶが選択される。何故なら、これらのエリアは、異質性、例えば、領域的異質性を示すからである。
ＥＲ，Ｋｉ−６７，ＨＥＲ２，ＰＲタンパク質の各々について、異質性スコアが判定される。ある例では、例えば、サンプルがＨＥＲ２陰性である場合、ＨＥＲ２は判定されない（またはＨＥＲ２に対する異質性がないので、値は外れる）。ある例では、例えば、Ｋｉ−６７は判定されない（またはＫｉ−６７に対する異質性がないので、値は外れる）。
【０２５９】
ＥＲおよびＰＲマーカに対して（そして、ある例ではＨＥＲ２およびＫｉ−６７に対しても）異質性スコアは次のように計算される。選択されたＦＯＶにおける異質性領域から、陽性百分率スコアの可変性が計算される。例えば、マーカ毎に可変性メトリック（ＶＭ）を判定することができる。ここで、ＶＭは１つの選択されたＦＯＶが他のＦＯＶとは同じタンパク質に対してどのように異なるかの指示である。標準偏差を判定する等、これを計算できる方法は数多くある。一例では、ＥＲ，ＰＲ，Ｋｉ−６７（そして、ある例では、ＨＥＲ２も）に対するＶＭは、次のように計算される。
ＶＭ＝ＳＴＤ（ＰＰＦＳ１），ＰＰ（ＦＳ２），．．．，ＰＰ（ＦＳＮ））
ここで、ＰＰ（ＦＳ）は、視野ＦＳ毎の陽性百分率である。陽性百分率は、本明細書において説明したように計算することができる。次いで、マーカ（例えば、ＥＲおよびＰＲ）に対する異質性スコアは、次の式を使用して計算される。
【０２６０】
【数６】
0006405319.tif 000011
【０２６１】
ＨＥＲ２に対して、各ＦＯＶ，ＦＳ毎に等級スコアＰ（ＦＳ）が計算される（０から３までの目盛り。上記を参照のこと）。次いで、異質性スコアは、以下の式を使用して計算することができる。
【０２６２】
【数７】
0006405319.tif 000012
【０２６３】
ＦＯＶ毎に等級スコアが同じである場合、ＨＥＲ２に対する異質性スコアは０になる。
以下のテーブルは、本明細書において説明したように、領域的異質性を含む、異なるタイプの異質性を示す。
【０２６４】
【表５】
0006405319.tif 000013
【０２６５】
Ｆ．出力予知スコアの計算
出力予知スコアは、以上で説明したＩＨＣ複合スコアおよび異質性スコアから計算される。複合異質性スコアは、以下のように生成され、更に他のバイオマーカを含むように調節することができる。
複合異質性スコア ＝ 二乗根（ＥＲ異質性スコア ＋ ＰＲ異質性スコア）
ＩＨＣ複合スコアおよび複合異質性スコアは、双方の尺度の複合予測能力が最大になるように、統計分析方法（例えば、Ｃｏｘの比例ハザード・モデル）に入力される。例えば、このモデルは、１，３，５年のＰＦＳのような成果として進行のない生存（ＰＦＳ：progression-free survival）を判定するため、またはそれ以外で患者をカテゴリに分けるために使用することができる。
【０２６６】
この結果は、５年ＰＦＳの危険度を予測するスコアを生成する数学的な式となる。
出力予知スコア ＝ ０．０３１１４ × ＩＨＣ４ ＋ １，９５１１９ × 複合異質性スコア
このように、出力予知スコアは、高危険性スコア（例えば、５年以内に、局所再発または遠隔転移のように、早期乳癌が再発する可能性が高いことを示す）、または低危険性スコア（早期乳癌が再発しそうもないことを示す）のいずれかとなる。
【０２６７】
Ｇ．出力値および予知の出力
ＩＨＣ複合スコアの判定に続いて、異質性スコア、ならびに出力予知スコア、分析評価結果（出力予知スコア等）、発見、予知、予測、および／または処置の推奨が、通例、記録され、例えば、技師、外科医、および／または患者に伝えられる。ある種の実施形態では、このような情報を、患者および／または担当する外科医のような、当事者に伝えるためにコンピュータが使用される。乳癌の予知に基づいて、被験者に施される療法を変更することができる。
【０２６８】
一実施形態では、分析表が完了し予知が生成された後できるだけ早く、予知、予測、および／または出力値に基づく処置の推奨が、当事者に伝えられる。この結果および／または関連情報は、被験者を担当する外科医によって、被験者に伝えられてもよい。あるいは、筆記した報告を提出することによってというような筆記、電子メールのような電子形態の通信、または電話を含む任意の通信手段によって、当事者に直接伝えられてもよい。電子メール通信の場合のように、相応しくプログラミングされたコンピュータの使用によって、通信をやりやすくすることができる。ある種の実施形態では、予知検査の結果、および／または検査から引き出された結果および／または検査に基づく処置の推奨を含む通信は、電気通信分野に精通する当業者には馴染みがあるコンピュータ・ハードウェアおよびソフトウェアの組み合わせを使用して、自動的に生成し当事者に配信することもできる。健康管理指向の通信システムの一例が、米国特許第６，２８３，７６１号に記載されている。しかしながら、本開示は、この特定的な通信システムを利用する方法に限定されるのではない。
【０２６９】
本開示の方法のある種の実施形態では、サンプルの分析評価、乳癌の予知、および分析評価結果または予知の伝達は、様々な（例えば、外国の）管轄区域において実行されてもよい。
【０２７０】
Ｈ．フォローアップ療法
開示する方法は、更に、例えば、サンプルに早期乳癌が起こる可能性が高いと予知された場合、乳癌の処置のために被験者を選択するステップも含むことができる。あるいは、開示する方法は、更に、サンプルに早期乳癌が再発しそうもないと診断された場合、処置しない（例えば、単なる監視）被験者を選択するステップも含むことができる。
【０２７１】
ある実施形態では、開示する方法は、患者の予知に依存して以下のステップを含む。ａ）被験者に判定された予知が、早期乳癌が再発する可能性が高いということである場合、この被験者のために治療計画を処方するステップ（１つ以上の放射線療法および／または化学療法薬による処置、追加の外科手術、より頻繁な監視、あるいはその組み合わせ等）と、ｂ）被験者に判定され予知が、早期乳癌が再発しそうもないということである場合、この患者に治療計画を処方しないステップと、ｃ）被験者に判定された予知が、早期乳癌が再発する可能性が高いということである場合、被験者に治療（１つ以上の放射線療法および／または化学療法薬による処置、追加の外科手術、あるいはその組み合わせ等）を施すステップと、ｄ）被験者に判定された予知が、早期乳癌が再発しそうもないということである場合、被験者に治療計画を施さないステップ。代替実施形態では、この方法は、（ａ）−（ｄ）の１つ以上を推奨するステップを含むことができる。つまり、開示する方法は、更に、被験者に乳癌のための治療を行うステップも含むことができる。
【０２７２】
スコア構成要素例
本明細書における例のいずれにおいても、スコア構成要素は、１つ以上のバイオマーカに対する遺伝子の発現（例えば、陽性百分率等）、Ｈ−スコア、等級スコア、二進スコア等の測定値を指すことができる。
【０２７３】
構成要素は組み合わされるので、結果的に得られる成分は、複数のバイオマーカを表すことができる。
更なる説明例
ＩＨＣ計算および異質性測定では、手作業の顕微鏡測定法による採点の代わりに、スライドをディジタル化することができ、自動化された画像分析アルゴリズムが、病理医によって選択された視野（ＦＯＶ）に対して、陽性百分率、等級スコア（例えば、更に二進スコアに変換する）、およびＨ−スコアを計算することができる。
【０２７４】
以上で述べた４つのマーカに関連付けられた各ディジタル化スライドにおいて、病理医は、領域間強度および領域的異質性を定量化するために、特定の領域にアノテーションを付ける。領域毎に自動画像分析を使用して、陽性および陰性に染色された細胞の個数、陽性百分率、ならびに等級スコア（０，１＋，２＋，３＋）が計算される。
【０２７５】
領域間異質性を定量化するために、これらの領域スコアに基づく異質性メトリックを使用することができる。異質性スコアは、病理医によって選択されたＦＯＶにおける陰性および陽性（１＋，２＋，および３＋）細胞個数に基づく。異質性スコアは、選択されたＦＯＶ内におけるスコアのばらつきを捕らえる。病理医によってアノテーションが付けられたＦＯＶを使用し、スコアは、異なるＦＯＶからのスコアの標準偏差の正規化関数となる。選択される正規化パラメータは、マーカに依存し、一般に、領域間陽性百分率スコアは、全体的なスライドの陽性スコアが高い程、高い可変性を有するという事実を反映する。
計算システム例
図２３は、説明した様々な革新(innovation)を実現することができるのに適した計算システム２３００の一般化した例を示す。計算システム２３００は、使用範囲や機能に関して何ら限定を示唆することは意図していない。何故なら、本革新は様々な汎用または特殊目的計算システムにおいて実現できるからである。本明細書において説明する計算システムは、自動機能を実現するために使用することができる（例えば、プロセス、アクション等が、ここで説明する計算システムによって実行される）。
【０２７６】
図２３を参照すると、計算システム２３００は、１つ以上の処理ユニット２３１０，２３１５、およびメモリ２３２０，２３２５を含む。図２３において、この基本的な構成２３３０は破線内に含まれる。処理ユニット２３１０，２３１５は、コンピュータ実行命令を実行する。処理ユニットは、汎用中央演算装置（ＣＰＵ）、特定用途集積回路（ＡＳＩＣ）におけるプロセッサ、または任意の他のタイプのプロセッサとすることができる。マルチ処理システムでは、多数の処理ユニットが、処理パワーを増大するために、コンピュータ実行可能命令を実行する。例えば、図２３は、中央処理ユニット２３１０、更にグラフィクス処理ユニットまたは共処理ユニット２３１５を示す。有形メモリ２３２０，２３２５は、揮発性メモリ（例えば、レジスタ、キャッシュ、ＲＡＭ）、不揮発性メモリ（例えば、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュ・メモリ等）、または処理ユニット（１つまたは複数）によってアクセス可能な、これら２つの何らかの組み合わせであってもよい。メモリ２３２０，２３２５は、処理ユニット（１つまたは複数）による実行に適しており、本明細書において説明した１つ以上の革新を実現するコンピュータ実行可能命令の形態としたソフトウェア２３８０を格納する。
【０２７７】
計算システムは、追加の機構を有してもよい。例えば、計算システム２３００は、ストレージ２３４０、１つ以上の入力デバイス２３５０、１つ以上の出力デバイス２３６０、および１つ以上の通信接続２３７０を含む。バス、コントローラ、またはネットワークのような相互接続メカニズム（図示せず）は、計算システム２３００のコンポーネントを相互接続する。通例、オペレーティング・システム・ソフトウェア（図示せず）は、計算システム２３００において実行する他のソフトウェアのために動作環境を提供し、計算システム２３００のコンポーネントのアクティビティを調整する。
【０２７８】
有形ストレージ２３４０は、リムーバブルまたは非リムーバブルでもよく、磁気ディスク、磁気テープまたはカセット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、あるいは情報を一時的でない方法で格納するために使用することができ、更に計算システム２３００内でアクセスすることができる任意の他の媒体を含む。ストレージ２３４０は、本明細書において説明した１つ以上の革新を実現するソフトウェア２３８０の命令を格納する。
【０２７９】
入力デバイス（１つまたは複数）２３５０は、キーボード、マウス、ペン、またはトラックボールのようなタッチ入力デバイス、音声入力デバイス、走査デバイス、あるいは入力を計算システム２３００に供給する他のデバイスであってもよい。ビデオ・エンコーディング用には、入力デバイス（１つまたは複数）２３５０は、カメラ、ビデオ・カード、ＴＶチューナ・カード、あるいはアナログまたはディジタル形態でビデオ入力を受け入れる同様のデバイス、あるいはビデオ・サンプルを計算システム２３００に読み込むＣＤ−ＲＯＭまたはＣＤ−ＲＷであってもよい。出力デバイス（１つまたは複数）２３６０は、ディスプレイ、プリンタ、スピーカ、ＣＤ−ライタ、または計算システム２３００からの出力を供給する他のデバイスであってもよい。
【０２８０】
通信接続（１つまたは複数）２３７０は、通信媒体または他の計算エンティティを通じた通信を可能にする。通信媒体は、コンピュータ実行可能命令、オーディオまたはビデオ入力または出力、あるいは変調データ信号における他のデータというような情報を伝える。変調データ信号とは、当該信号において情報をエンコードするように、その特性の内１つ以上が設定されたまたは変化させられた信号である。一例として、そして限定ではなく、通信媒体は、電気、光、ＲＦ、または他の搬送波を使用することができる。
【０２８１】
本革新は、コンピュータ読み取り可能媒体という一般的なコンテキストで説明することができる。コンピュータ読み取り可能媒体は、計算環境内部でアクセスすることができる任意の入手可能な有形媒体である。一例として、そして限定ではなく、計算システム２３００では、コンピュータ読み取り可能媒体は、メモリ２３２０，２３２５、ストレージ２３４０、および以上の内任意のものの組み合わせを含む。
【０２８２】
本革新は、計算システムにおけるターゲットの実プロセッサまたは仮想プロセッサ上で実行されるプログラム・モジュールに含まれるような、コンピュータ実行可能命令という一般的なコンテキストで説明することができる。一般に、プログラム・モジュールは、ルーチン、プログラム、ライブラリ、オブジェクト、クラス、コンポーネント、データ構造等を含み、特定のタスクを実行するか、または特定の抽象データ型を実装する。プログラム・モジュールの機能は、種々の実施形態において所望通りに、プログラム・モジュール間で組み合わせてもまたは分割してもよい。プログラム・モジュールのコンピュータ実行可能命令は、ローカルまたは分散型計算システム内部で実行することもできる。
【０２８３】
本明細書では、「システム」および「デバイス」という用語は相互交換可能に使用される。そうでないことを文脈が明らかに示すのではなければ、いずれの用語も、計算システムまたは計算デバイスのタイプに対して何の限定も強制しない。一般に、計算システムまたは計算デバイスは、ローカルまたは分散型であることができ、特殊目的ハードウェアおよび／または汎用ハードウェアと、本明細書において説明した機能を実現するソフトウェアとの任意の組み合わせを含むことができる。
【０２８４】
紹介のために、詳細な説明では、計算システムにおけるコンピュータ動作を記述するために「判定する」および「使用する」というような用語を使用した。これらの用語は、コンピュータによって実行される動作の上位抽象化であり、人間によって行われる行為と混同すべきでない。これらの用語に対応する実際のコンピュータ動作は、実施態様に応じて異なる。
【０２８５】
コンピュータ読み取り可能媒体
本明細書におけるコンピュータ読み取り可能媒体はいずれも、非一時的（例えば、メモリ、磁気ストレージ、光ストレージ等）とすることができる。
【０２８６】
本明細書において説明した格納動作(storing action)はいずれも、１つ以上のコンピュータ読み取り可能媒体（例えば、コンピュータ読み取り可能記憶媒体または他の有形媒体）に格納することによって実現することができる。
【０２８７】
格納されると説明したものはいずれも、１つ以上のコンピュータ読み取り可能媒体（例えば、コンピュータ読み取り可能記憶媒体または他の有形媒体）に格納することができる。
【０２８８】
本明細書において説明した方法はいずれも、１つ以上のコンピュータ読み取り可能媒体（例えば、コンピュータ読み取り可能記憶媒体または他の有形媒体）における（例えば、エンコードされた）コンピュータ実行可能命令によって実現することができる。このような命令は、コンピュータに本方法を実行させることができる。本明細書において説明した技術は、種々のプログラミング言語で実現することができる。
【０２８９】
コンピュータ読み取り可能記憶デバイスにおける方法
本明細書において説明した方法はいずれも、１つ以上のコンピュータ読み取り可能記憶デバイス（例えば、メモリ、磁気ストレージ、光ストレージ等）に格納されたコンピュータ実行可能命令によって実現することができる。このような命令は、コンピュータに本方法を実行させることができる。
【０２９０】
早期乳癌再発危険性の実施態様および結果の例
この例は、早期乳癌再発の危険性を予測するために使用される方法について説明する。
約２０人の患者からの乳癌サンプルを、ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７で特定的な抗体で標識した。
【０２９１】
これら結果的に作られた標識されたサンプルを、顕微鏡スライド上において、ディジタル病理学によって撮像した。ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７の各々に対して３つのＦＯＶを選択した。細胞染色百分率（例えば、陽性百分率）およびＦＯＶ毎の強度を定量化するためにソフトウェアを使用した。こうして、陽性百分率を判定した。加えて、３つのＦＯＶに対する強度および細胞染色百分率の可変性に基づいて、異質性の３つの異なる尺度を判定した。
【０２９２】
ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７の各々に対してＦＯＶ毎に得られた細胞染色百分率および強度を平均した（例えば、ＥＲのＦＯＶを平均した）。この結果、ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７の各々に対して、細胞染色百分率値および強度値が得られた。これらの値を使用して、以下の式を用いて、ＩＨＣ４スコアを計算した。
ＩＨＣ４ ＝ ９４．７ × ｛−０．１００ＥＲ１０ − ０，７９ＰＲ１０ ＋ ０．５８６ＨＥＲ２ ＋ ０．２４０ Ｉｎ（１ ＋ １０ × Ｋｉ６７）｝
ＩＨＣ４スコアおよび１２個の異質性値（ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２，Ｋｉ−６７の各々のための３つのＦＯＶの各々に１つずつ）を使用して、遠隔再発までの時間をモデル化するコックスの比例ハザード・モデルを用いて、異質性尺度およびＩＨＣ４スコアの各々をモデル化した。３つの異質性尺度は非常に類似しており、したがって、４回の分析評価の各々に、最初の異質性尺度を使用した。
【０２９３】
５つの変数、ＩＨＣスコア、および分析評価（ＥＲ，ＰＲ，Ｋｉ−６７，ＨＥＲ２）毎に１つの異質性スコアを使用して、異質性スコアの各々によって別個にＩＨＣ４スコアをモデル化した（コックス・モデルを使用した）。
【０２９４】
その結果に基づいて、遠隔再発までの時間を判定するためには、ＰＲ異質性スコア尺度が最も有用であり、ＥＲは多少の予測力を追加すると判断した。
異質性スコアの単位(unit)が変わる毎に、遠隔再発の危険性において同じ増加が生ずるという仮定があるので、異質性スコアと危険性との関係が線形か否か判定する。データを変換し（二乗根、自然対数等を求める）、変換した変数をコックス・モデルに入力した。二乗根を選択したのは、これが予測能力を最も高めたからである。
【０２９５】
異質性測定の最後の修正は、ＥＲおよびＰＲに対する異質性スコア（ＨＥＴ）を求め、これらを加算して二乗根を求めることを必要とした。異質性スコア＝二乗根（ＨＥＴＰＲ＋ＨＥＴＥＲ）。結果的に得られたＨＥＴスコアおよびＩＨＣ４スコアをコックス比例ハザード・モデルに入力した。このモデルは２つの線形変数を取り込み、これら２つの最良の線形組み合わせを求めて、遠隔再発までの時間を予測する。
【０２９６】
結果的に得られた式は、次の通りである。
出力危険性スコア ＝ １．９５１１９×（二乗根（ＨＥＴＰＲ ＋ ＨＥＴＥＲ）） ＋ ０．０３１１４ × ＩＨＣ４  
図２４に示すように、この方法は、乳癌サンプルを高い進行性（悪化）または低い進行性（悪化せず）に正確に分類した。図２４に示す事例は、このアルゴリズムを作成するために使用した同じ事例である。
代替態様
いずれの例からの技術でも、他の例のいずれの１つ以上において説明した技術とでも組み合わせることができる。本開示の原理を応用することができる多くの可能な実施形態を考慮して、例示した実施形態は本開示の例に過ぎず、本開示の範囲を限定するように捕らえてはならないことは、認められてしかるべきである。逆に、本開示の範囲は、以下の請求項によって定められる。したがって、これらの請求項の範囲および主旨に該当する全てを、本発明として特許請求する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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