(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病（ＡＤ）又は軽度認知障害（ＭＣＩ）の診断を支援するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、患者試料中のＰ０９４９３−３に対応する１つ又は複数のトロポミオシンアイソフォームの発現レベルを決定することを含む方法。
【請求項２】
さらに、患者試料中のＰ０９４９３−１に対応する１つ又は複数のトロポミオシンアイソフォームの発現レベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ又は複数のトロポミオシンアイソフォームの発現レベルが、対照値と比較して増加することが、ＡＤ又はＭＣＩであることを示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
軽度認知障害（ＭＣＩ）の診断を支援するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、患者試料中のＰ０９４９３−１に対応する１つ又は複数のトロポミオシンアイソフォームの発現レベルを決定することを含む方法。
【請求項５】
前記１つ又は複数のトロポミオシンアイソフォームの発現レベルが、対照値と比較して増加することが、ＭＣＩであることを示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記患者試料が、血液、血清、血漿、又は血小板試料である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
エキソン１ａを含まないＰ０９４９３−３及びＰ０９４９３−１の共通エピトープに結合する第１のプローブ、及びエキソン１ａに特異的に結合する第２のプローブを特徴とする、トロポミオシンアイソフォームＰ０９４９３−３及びＰ０９４９３−１に結合するプローブを含む、アルツハイマー病（ＡＤ）又は軽度認知障害（ＭＣＩ）の診断を支援するためのキット。
【請求項８】
前記プローブが抗体である、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、アルツハイマー病及び軽度認知障害関連トロポミオシンアイソフォームに関する。
【背景技術】
【０００２】
長寿化が進んでいるため、認知症に基づく疾患は、世界的に医療予算の主な健康関連負担になりつつあり、患者の介護者／家族のストレス要因として認識されている。アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も広くみられる神経変性病理であり、治療薬の特定並びに患者の治療及びスクリーニングのための診断法の向上が絶えず求められている。ミニメンタルステート検査等の心理試験は、一般的に良好なＡＤの予測因子であるが、明確なアルツハイマー病診断法は、依然として死後検査のみである。記憶障害は、老人に共通する現象である。重度記憶障害が主症状である場合、この状態は、軽度認知障害（ＭＣＩ）と呼ばれ、ＡＤのごく初期の段階とみなされることが多い。この段階での治療は、以後の治療よりも効果的である場合がある。ＭＣＩの患者が臨床ＡＤに進行する転換率は、３年以内で５０％であるとの記載がある（Karas et al. 2008）。診断医学では、タンパク質バイオマー
カーの使用が増加しつつある。ＡＤのタンパク質バイオマーカー、特に血液及び尿等の容易に接近可能な生体液体中に存在するＡＤのタンパク質バイオマーカーの特定は、現行診断法の望ましい有効な代替法である。トロポミオシンは、２つのα−ヘリックスで構成される繊維状分子である。トロポミオシンは、全ての細胞タイプに広く分布しており、筋フィラメントアクチン及びミオシンの短縮を制御している。哺乳動物では、４つの高度に保存された遺伝子の異なるスプライシングにより、４０個を超えるアイソフォームが生じる可能性がある（Schevzov et al. 2005）。更に、各アイソフォームは、程度は様々であるが、リン酸化及びグリコシル化を含む翻訳後修飾にかけられている場合がある。タンパク質分離及び特定で使用される最も一般的な分析技術のうちの２つは、２次元ゲル電気泳動（２−Ｄ  ＤＩＧＥ）及び２Ｄウエスタンブロットである。欧州特許第２２９３０７５号では、２−Ｄ  ＤＩＧＥを使用して、血小板試料中のＡＤバイオマーカー候補が特定されており、２つのトロポミオシンアイソフォームが強調されており、それらには、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０７９５１及びＮＣＢＩ／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＢＡＢ１４５５４／ＡＫ０２３３８５が割り当てられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、エキソン１ａ及び随意にエキソン９ｄが組み込まれているＭＣＩ及びＡＤ関連トロポミオシンアイソフォームを検出するための方法及びキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の態様によると、アルツハイマー病（ＡＤ）又は軽度認知障害（ＭＣＩ）の診断を支援するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、患者試料中のＰ０９４９３−３及び／又はＰ０９４９３−１に対応する１つ又は複数のトロポミオシンアイソフォームの発現レベルを決定することを含む方法を提供する。
【０００５】
本発明の第２の態様によると、エキソン１ａを含まないＰ０９４９３−３及びＰ０９４９３−１の共通エピトープに結合する第１のプローブ、及びエキソン１ａに特異的に結合する第２のプローブを特徴とする、トロポミオシンアイソフォームＰ０９４９３−３及びＰ０９４９３−１に結合するプローブを含むキットを提供する。
【０００６】
本発明の第３の態様によると、ＡＤ又はＭＣＩの治療に使用するための、１つ又は複数
のトロポミオシンアイソフォームＰ０９４９３−３及びＰ０９４９３−１の濃度レベルを変更する作用剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】エキソン１ａ及び９ｄに対する抗体のルテニウム染色を示す図である。
【図２】エキソン１ａに対する抗体の２Ｄウエスタンブロット評価を示す図である。
【図３】エキソン９ｄに対する抗体の２Ｄウエスタンブロット評価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
別様の指定がない限り、エキソン１ａ及び９ｄへの言及は、下記に示されているアミノ酸配列を指す。
エキソン１ａ：−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−（配列番号１）
エキソン９ｄ：−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−（配列番号２）
【０００９】
「患者」及び「被験者」という用語は、本明細書中では同義的に使用され、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、及びげっ歯動物等を含む、診断のレシピエントとなる任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。好ましくは、被験者又は患者は、ヒトである。
【００１０】
「薬物」及び「作用剤」という用語は、本明細書中では同義的に使用され、生体系に影響を及ぼす化学的又は生物学的物質を指す。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「トロポミオシンアイソフォーム」という用語は、異なる遺伝子スプライシング及び翻訳後修飾形態に由来するものを含む、トロポミオシンに基づくタンパク質を全て含む。図１、２、及び３のスポット２、３、及び４に対応する３つのトロポミオシン（tropomysosin）アイソフォームは、２Ｄ−ＷＢ及び質量分析データに基づき、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ；ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ）受入番号Ｐ０９４９３−３に帰属し、したがって、本明細書中では、Ｐ０９４９３−３への言及は、別様の記載がない限り、スポット２、３、及び４を意味する。本明細書中に記載のＰ０９４９３への言及は、Ｐ０９４９３−３（スポット２、３、及び４）及びＰ０９４９３−１を意味し、本明細書中でのＰ０９４９３−１への言及は、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢに記載の通りであり、スポット１に対応する。
【００１２】
第１の態様によると、本発明は、軽度認知障害（ＭＣＩ）及び／又はアルツハイマー病（ＡＤ）の診断を支援するための方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ患者試料中で、１つ又は複数のＰ０９４９３及び／又はそれらの翻訳後類似体の発現レベルを検出及び測定することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、検出及び測定されるトロポミオシンアイソフォームは、１つ又は複数のＰ０９４９３−３（スポット２、３、及び４）に対応する。本明細書で使用される場合、「発現のレベル」又は「発現レベル」は、特定のタンパク質又はそのタンパク質をコードするｍＲＮＡの量を指す。Ｐ０９４９３は、ＭＣＩ及びＡＤの他のバイオマーカーと共に使用して、ＡＤ又はＭＣＩ検査の診断能力を向上させることができる。タンパク質バイオマーカーは、単独で使用されるものではない。当業者であれば、ＭＣＩ又はＡＤの診断にＰ０９４９３を使用する場合、診断には、身体的検査及びＭＭＳＥ等の認知検査を使用して患者を臨床的に評価することも含まれ、患者のＡＤ又はＭＣＩへの分類を支援することになることを認識するだろう。Ｐ０９４９３と共に使
用されるバイオマーカーの診断能力（例えば、ＲＯＣ曲線分析並びに感度及び特異性により評価される）次第では、生化学的バイオマーカー試験は、ＡＤ又はＭＣＩを診断するために使用される主診断ツールとなり得る可能性がある。検出しようとするトロポミオシンアイソフォームは、エキソン１ａ及び随意にエキソン９ｄを含み、トロポミオシンアイソフォームＰ０９４９３−３は、エキソン１ａ及び９ｄを含むが、トロポミオシンアイソフォームＰ０９４９３−１には、エキソン１ａが組み込まれているが、エキソン９ｄは組み込まれていない。検出及び測定しようとするトロポミオシンアイソフォームは、好ましくは、患者の血液試料に由来する血小板に由来する。ＭＣＩ及びＡＤ患者では、Ｐ０９４９３は、対照値と比較して、著しい濃度増加を示すことが示されている。
【００１３】
好ましくは、対照値は、健常被験者から得た試料（好ましくは、血小板試料）に由来するＰ０９４９３の濃度である。或いは、対照は、基準値であってもよい。ＡＤであると予期される患者及び健常対照の測定しようとする血小板は、好ましくは、欧州特許第１８９１４４５号に記載の方法を使用して取り出される。この文献には、血液試料に由来する非活性化血小板の抽出をもたらす方法が記載されている。また、対照データは、ＭＣＩ／ＡＤの発症前にＭＣＩ／ＡＤ患者自身から採取した試料の値であってもよい。そのようなバイオマーカー診断法では、以前に導出され保管されている対照データセットを利用することが、一般的に行われている。好ましい実施形態では、１つ又は複数のトロポミオシンアイソフォームの発現レベルが対照値と比較して増加することは、ＡＤ又はＭＣＩであることを示す。本発明の方法は、随意に、ＡＤ又はＭＣＩである診断された（又は、本発明の方法が、ＡＤ又はＭＣＩである可能性が高いことを示す）患者を、Ｐ０９４９３の濃度レベルを変更する作用剤で治療することを更に含んでいてもよい。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、ＭＣＩ及びＡＤ診断に使用するための、エキソン１ａを特異的に認識する第１のプローブと、エキソン１ａを含まないＰ０９４９３−３及びＰ０９４９３−１の共通エピトープを特異的に認識する第２のプローブとを含むキットを提供する。ＡＤ又はＭＣＩを診断するために、第２のプローブは、エキソン９ｄに特異的であってもよい。具体的には、試験の検出範囲内では、プローブは、実質的にＰ０９４９３のみを検出し、つまり、Ｐ０９４９３以外のタンパク質がプローブに結合したとしても、それは低レベルであり、診断結果の完全性に影響を及ぼさないことを示唆する。プローブは、好ましくは抗体である。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン可変ドメイン（ＶHＳ及びＶLＳ）、より具体的には、相補性決定領域（ＣＤＲ）の結合特性により決定される、標的のエピトープを特異的に認識する免疫グロブリンを指す。多くの潜在的な抗体形態が当技術分野で知られている。それらには、限定ではないが、複数の完全なモノクローナル抗体又は完全なモノクローナル抗体を含むポリクローナル抗体混合物、抗体断片（例えば、Fab、Ｆab’、及びＦr断片、並びに直鎖抗体単鎖抗体、及び抗体断片を含む多重特異的抗体）、単鎖可変断片（ｓｃＦVＳ）、多重特異的抗体、キメラ抗体
、ヒト化抗体、及び標的の所与のエピトープの認識に必要なドメインを含む融合タンパク質が含まれる。好ましくは、本発明の状況における抗体への言及は、モノクローナル抗体を指す。また、抗体は、放射性核種、フルオロフォア、又は色素を含むが、これらに限定されない、診断効果のある種々のリポーター部分に結合されていてもよい。また、抗体への言及は、短鎖可変断片及び「完全」抗体の他のサブ構造変異体を含む。当業者であれば、本発明の方法及びキットに応用される抗体には、エキソン１ａ及び随意に９ｄを認識することが必要とされることを認識するだろう。そのような認識は、完全なエキソンアミノ酸配列又はエキソン配列のサブセットを認識する各エキソン特異的抗体を含むことができる。例えば、抗体により認識されるエキソン１ａのサブセットは、７個のアミノ酸しか含んでいなくても、依然としてエキソン１ａに特異的である場合がある。本発明で使用するのに好適な他のプローブは、アプタマー、分子インプリンティングポリマー等の、Ｐ０９
４９３を認識可能な分子である。
【００１６】
本発明の第３の態様は、Ｐ０９４９３の濃度レベルを変更する作用剤の使用に関する。そのような使用は、ＭＣＩ及びＡＤの症状を緩和又は抑制するための療法として意図されている。
【００１７】
また、本発明は、ＭＣＩ及び／又はＡＤを治療するための方法であって、（ｉ）患者試料中のＰ０９４９３−３及び／又はＰ０９４９３−１に対応する１つ又は複数のトロポミオシンアイソフォームの発現レベルが、対照と比較して増加しているか否かを決定すること；及び（ｉｉ）Ｐ０９４９３の濃度レベルを変更する作用剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
本明細書中で参照されている全ての刊行物の内容は、参照により組み込まれる。
【００１９】
本発明は、添付の図面を参照し、以下の非限定的な例により説明される。
【実施例】
【００２０】
方法
治験母集団
アルツハイマー患者：４７人のＡＤ患者が治験に登録した。ＣＥＲＡＤ（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｔｏ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ａ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）の神経心理学的テストバッテリーを、血液採取した日に実施した。患者はいずれも、ＡＤ関連薬物治療、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤又はメマンチンでの治療を受けていなかった。更に、認知症患者は、Ｍａｏ−Ｂ発現に影響を及ぼした可能性がある一貫した慢性抗精神病薬治療を受けなかった。認知障害の他の原因（例えば、脳卒中又は腫瘍）を除外するために、患者は全て、代わりにコンピュータ断層撮影を受けた２人の患者（閉所恐怖症、金属移植片）を除いて、脳の構造的画像走査（磁気共鳴画像法）を受けた。ＣＥＲＡＤ診断基準（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｒａｄ．ｍｃ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／Ａｓｓｅｓｍｅｎｔ．ｈｔｍ／）、例えば、病歴、脳画像化、及び神経心理学的ＣＥＲＡＤテストバッテリーに基づき、以下の診断を実施した：４７人のＡＤ（９人は剖検で確認）。神経病理学的な死後検査を、合計１３人の患者で実施した。患者は、血液試料採取の１０〜１８か月後に死亡した。臨床的にＡＤの疑いがある４７人の患者のうちの９人では、神経病理学的に臨床診断を確認し、１３例の血管性認知症（ＶＤ）症例のうちの４例は、混合型認知症（ＡＤ及びＶＤ）の神経病理学的基準を満たしていた。神経病理学的検査は、ヘマトキシリン／エオシン染色、改良型ビールショースキー含侵法（modified Bielschowsky impregnation）、及びタウタンパク質（抗体ＡＴ−８、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社、ヘント、ベルギー）、β−アミロイド（クローン４Ｇ８、Ｓｉｇｎｅｔ  Ｌａｂｓ社、デダム、マサチューセッツ州）、及びα−シヌクレイン（モノクローナル及びポリクローナル抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、テメキュラ、カリフォルニア州）の免疫組織化学法を含む、標準的プロトコールに従った。神経病理学的診断は、ＣＥＲＡＤスコアを含む、ＡＤの確立されている死後コンセンサス診断基準により実施した。ＡＤ症例は、ＣＥＲＡＤ  Ｃ及びＢｒａａｋステージＶ／ＶＩに特徴的な神経病理を示し、したがって、ＮＩＡ−レーガン研究所「認知症」診断基準によりＡＤの可能性が高いことを満たしていた。対照：ＡＤの対照群は、神経変性疾患又は認知障害の徴候のない、年齢及び性別を一致させた４９人の被験者）だった。被験者は全て、経験を積んだ心理学者により面接検査を受け、神経心理学的検査（ＭＭＳＥ）を実施した。本発明者らの治験に含まれた個人は全て非喫煙者だった。軽度認知障害は、Petersen et al（１９９９年及び２００４年）に従って定義した。
【００２１】
治験計画の倫理的側面
プロトコールは、組織内倫理委員会により承認され、治験は、２０００年に改訂されたヘルシンキ宣言の原則に従って実施された。治験の目的及び手順を説明した後、各被験者又は後見人からインフォームドコンセントを得た。
【００２２】
試料の調製
血液は、抗凝血剤（血液との混合比１：９）として０．１２９ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを含有する減圧チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ社、クレムスミュンスター、オーストリア）の中に、血流を滞留させずに肘正中静脈から採取した。採取した最初のチューブは、静脈穿刺に由来するあらゆる組織汚染を回避するために廃棄した。差次的なヘモグラムを、ＭｉｃｒｏＤｉｆｆ  １８血液分析器（Ｃｏｕｌｔｅｒ
Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社、マイアミ、フロリダ州、米国）で実施した。血小板単離手順及びタンパク質沈殿は、以前に記載されている通りに実施した［３１］。手短かに言えば、４℃で一晩振とうすることにより、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を含有する変性２−Ｄ試料緩衝液に、ペレットを再溶解させた。１００×１０６個の血小板当たり７０マイクロリットルの試料緩衝液を使用した。再溶解した試料中のタンパク濃度は、標準タンパク質としてＢＳＡを用いたクーマシーブリリアントブルータンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）を使用して、三重反復で決定した。適切に希釈すれば、２−Ｄ試料緩衝液成分は、タンパク質アッセイに干渉しない。したがって、試料を、ＰＢＳで１：２０に希釈し、５％の２−Ｄ試料緩衝液をＢＳＡ標準物質に添加した。２Ｄ  ＤＩＧＥ分析用の内部標準は、同じ総タンパク量の各治験試料を貯留することにより構成した。一定分量の内部標準及び治験個人試料を、−８０℃で保管した。蛍光性シアニン色素（ＣｙＤｙｅｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）でのタンパク質標識を、電気泳動の前に、製造業者の指示書をわずかに変更して実施した。ＣｙＤｙｅ対タンパク質の比率は、タンパク質１μｇ当たり５ｐｍｏｌの色素に低減させた。内部標準をＣｙ２で標識し、試料を、Ｃｙ３又はＣｙ５で交互に標識した。リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の場合、全ＲＮＡを、以前に記載されているように、ゲルろ過した血小板から抽出した。
【００２３】
２Ｄ  ＤＩＧＥ電気泳動及びゲル画像分析
電気泳動及びゲル画像処理を、以前に記載されているように実施した。手短かに言えば、２４ｃｍ  ｐＨ４〜７  ９  ＩＰＧ−Ｄｒｙｓｔｒｉｐを、色素標識試料を含有する改良再水和溶液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、７０ｍＭ  ＤＴＴ、及び０．５％両性電解質ｐＨ４〜７）で受動的に再水和させた。その後、１色素標識タンパク質当たり２５μｇを、受動的再水和によりアプライした。等電点電気泳動を、３０ｋＶｈに達するまで実施した。第２の次元では、１１．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０℃にて、３５Ｖで１時間、５０Ｖで１．５時間、及び最後に１１０Ｖで１６．５時間）を実施し、ゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０画像化器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を使用して、１００μｍの解像度で走査した。スポットの検出は、ＤｅＣｙｄｅｒソフトウェアモジュールＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｉｎ−ｇｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（バージョン６．００．２８；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を使用し、目標スポット数を２５００に設定して、ゲル画像上で実施した。各ゲルを、ＤｅＣｙｄｅｒモジュールＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（バージョン６．０１．０２）を使用して、適切なワークスペース及びグループに加え、マスターゲルと一致させた。ゲル画像分析手順は、以前により詳細に記載されていた。
【００２４】
タンパク質同定
タンパク質を、質量分析により同定した。後者のトリプシンによるタンパク質加水分解物の調製を、以前に記載されているように実施した。ペプチドを、Ｚｏｒｂａｘ  ３００
ＳＢ−Ｃ８（５μｍ、０．３ｍｍ×５ｍｍ）カラムに負荷し、１２分間で０．２％ギ酸及び３％アセトニトリルから０．２％ギ酸及び４５％アセトニトリルのグラジエントを使用し、２５０ｎｌ／分の流速で、Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ１８（５μｍ、７５ｍｍ×１５０ｍｍ）カラムを用いて、ナノフロー液体クロマトグラフィー（１１００シリーズＬＣシステム、Ａｇｉｌｅｎｔ社、パロアルト、カリフォルニア州）により分離した。ペプチドの同定は、直交ナノスプレーイオン源を装備したイオントラップ質量分析計（ＸＣＴ−Ｐｌｕｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いた、タンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）断片化解析により達成した。ＭＳ／ＭＳデータは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｉｌｌ  ＭＳプロテオミクスワークベンチソフトウェア（バージョンＡ．０３．０３、Ａｇｉｌｅｎｔ社）により解釈し、ヒトタンパク質のＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（バージョン１４．３、２０，３２８個のエントリーを含む）を検索し、１．５Ｄａの前駆体質量偏差、０．７Ｄａの産物質量許容誤差、及び７０％の最小一致ピーク強度（％ＳＰＩ）、及び１つの切断不検出を可能にした。以前の化学修飾により、システインのカルバミドメチレーションを、固定修飾として設定した。スコアが１３よりも高いペプチドの誤発見率は、一貫して１％未満であり、スコアが１３よりも高い２つ以上のペプチドで同定されたタンパク質の場合、９９．９％を超える良好な確実性をもたらす。
【００２５】
抗体産生
Ｎ末端システイン残基を介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合されたＨ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＮＨ２及びＨ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−ＯＨに対応するペプチド配列で、ヒツジを月１回で免疫した。その結果生じた免疫原を、ポリクローナル応答を生成するために、月１回で成体ヒツジに投与した。その後、リンパ球を回収し、ヘテロミエローマ細胞と融合した。その結果生じたハイブリドーマの上清を、マイクロタイタープレートを全長タンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用して、エキソン特異的抗体の存在についてスクリーニングした。陽性ハイブリドーマを、クローニングして安定化した。その結果生じたモノクローナルハイブリドーマにより産生された抗体を精製し、１次元及び２次元のウエスタンブロッティング（１Ｄ及び２Ｄ  ＷＢ）により特徴付け、バイオチップサンドイッチイムノアッセイの開発に使用した。このアッセイを、ＥＬＩＳＡイムノアッセイの原理（Fitzgerald et al 2005）
に基づくバイオチップアレイ技術を利用するＥｖｉｄｅｎｃｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ分析器に応用した。
【００２６】
２次元ウエスタンブロット解析
２Ｄウエスタンブロット解析の場合、第１の次元では、ＴＣＡで沈殿させ、尿素／チオ尿素／ＣＨＡＰＳに再溶解した３０μｇの血小板タンパク質を、２４ｃｍ、ｐＨ４〜７のＩＰＧストリップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で、ＩＥＦにより分離した。第２の次元は、１３×１６ｃｍのゲルでＳＤＳ  ＰＡＧＥにより実施し、分離したタンパク質を、ニトロセルロース膜（Ｐａｌｌ社、イーストヒル、ニューヨーク州）に移した。膜上の全タンパク質を、ルテニウム−（ＩＩ）−Ｔｒｉｓ−（バソフェナントロリンジスルホナート）（ＲｕＢＰＳ）に基づく蛍光色素を使用して染色した。その後、０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中５％脱脂粉乳で、２時間、膜をブロックした。膜をインキュベートすることにより、ＡＤ関連トロポミオシンアイソフォームを検出した。ａ）抗ｌａエキソン検出の場合、ＨＲＰ標識抗ｌａエキソン抗体（１／１０００）、ｌ時間のインキュベーション、ルミノールＰＬＵＳ／ペルオキシドで検出、１０秒間の曝露；ｂ）抗９ｄエキソン検出の場合、ＨＲＰ標識抗９ｄエキソン抗体（１／１０００）、ｌ時間のインキュベーション、ルミノールＰＬＵＳ／ペルオキシドで検出、３０秒間〜１
分間の曝露。
【００２７】
結果
エキソン９ｄ特異的捕捉抗体を、バイオチップの表面に固定化するために選択し、エキソン１ａ特異的検出抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させて、アッセイトレーサを生成した。これらの免疫試薬を使用して発生したバイオチップイムノアッセイは、４つのＡＤ及びＭＣＩ関連Ｐ０９４９３トロポミオシンアイソフォームのうちの３つに特異性を示した。１Ｄ及び２Ｄウエスタンブロットにより、エキソン１ａ及び９ｄに対して生成された抗体は、スポット２、３、及び４に結合したことを確認した（図１）。また、ＡＤ及びＭＣＩ試料中の上方制御されたトロポミオシンアイソフォームの各々には、エキソン１ａが組み込まれていたことが見出された。質量分析により帰属された、スポット５、６、７、及び８（図１）に対応する４つの他のトロポミオシンアイソフォームは、いずれにもエキソン１ａが組み込まれておらず、ＡＤ及びＭＣＩ試料中で上方制御されなかった。アッセイ感度は、＜１０ｎｇ／ｍｌであり（測定範囲：０〜７００ｎｇ／ｍｌ）、分析内精度は、標準物質レベル濃度の＜１０％だった。適用した実験条件下では、スポット１、ｐＩ＝４．５及びＭＷ＝約３７ｋＤａを有し、スポット２は、ｐＩ＝４．５及びＭＷ＝約３７ｋＤａを有し、スポット３は、ｐＩ＝４．６及びＭＷ＝約３５ｋＤａを有し、スポット４は、ｐＩ＝４．５６及びＭＷ＝約３３ｋＤａを有していた。単離した血小板では、最大１２μｇ／ｍｌのレベルが検出された。表１（変化％の列）により、スポット１、２、３、及び４に対応するＰ０９４９３トロポミオシンアイソフォームは全て、単独で又は組み合わせて、ＡＤ及びＭＣＩ患者では対照と比較して上方制御されることが確認される。ｔ検定により、スポット２及び４つのスポット全ての組み合わせは、ＡＤ及びＭＣＩ患者では対照と比較して著しく上方制御されること（Ｐ＜０．０５）が強調されている。本治験の結果は、上方制御されたＰ０９４９３−３及びＰ０９４９３−１トロポミオシンアイソフォームの、ＡＤ又はＭＣＩの疑いがある患者のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料中での検出及び測定が、ＡＤ及びＭＣＩを予測することを示す。
【００２８】
参考文献
Karas et al (2008). Am. J. NeuroradioL, 29(5): 944-949
Schevzov G. et al (2005). J. Histochem. Cytochem., 53(5):557-570
Fitzgerald et al. (2005). Clin. Chem., 51(7): 1165-1176
Petersen et al (1999). Arch. Neurol, 56(3): 303-308
Petersen et al (2004). J. Intern. Med. 256(3): 183-194.
【００２９】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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