(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗体重鎖をコードする各遺伝子が、クラススイッチ調節エレメントに作動可能に連結されている１以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子と、
（ｂ）１以上のヒト抗体軽鎖をコードする遺伝子と、
（ｃ）キメラＩｇＭ（μ）重鎖定常領域をコードする遺伝子であって、前記キメラＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子が有蹄動物ＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子をコードするＤＮＡによって置換されたヒトＩｇＭ重鎖定常領域の遺伝子を含む、前記キメラＩｇＭ（μ）重鎖定常領域をコードする遺伝子と、
を含むヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターであって、
前記１以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の少なくとも１つのクラススイッチ調節エレメントが、有蹄動物のクラススイッチ調節エレメントで置換されているＨＡＣベクター。
【請求項２】
前記１以上のヒト抗体重鎖がヒトＩｇＧ抗体重鎖を含む、請求項１に記載のＨＡＣベクター。
【請求項３】
前記ＩｇＧ重鎖がＩｇＧ１抗体重鎖を含む、請求項２に記載のＨＡＣベクター。
【請求項４】
前記１以上のヒト抗体重鎖がヒトＩｇＡ抗体重鎖を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項５】
前記１以上のヒト抗体重鎖がヒトＩｇＭ抗体重鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項６】
前記１以上のヒト抗体重鎖が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥおよびＩｇＤヒト抗体重鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項７】
前記キメラＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子が、定常領域（ＣＨ）ドメインであるＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびＣＨ４ドメイン、膜貫通ドメイン（ＴＭ）である、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードし、かつ
（ａ）前記ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子中の前記ＣＨ１ドメイン、前記ＣＨ２ドメイン、前記ＣＨ３ドメイン、前記ＣＨ４ドメイン、前記ＴＭ１ドメイン、および前記ＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡが、前記有蹄動物ＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子中の前記ＣＨ１ドメイン、前記ＣＨ２ドメイン、前記ＣＨ３ドメイン、前記ＣＨ４ドメイン、前記ＴＭ１ドメイン、および前記ＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡによってそれぞれ置換されているか、または
（ｂ）前記ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子中の前記ＣＨ２ドメイン、前記ＣＨ３ドメイン、前記ＣＨ４ドメイン、前記ＴＭ１ドメイン、および前記ＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡが、前記有蹄動物ＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子中の前記ＣＨ２ドメイン、前記ＣＨ３ドメイン、前記ＣＨ４ドメイン、前記ＴＭ１ドメイン、および前記ＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡによってそれぞれ置換されている、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項８】
前記キメラＩｇＭ重鎖定常領域が、ヒト−ウシキメラＩｇＭ重鎖定常領域である、請求項７に記載のＨＡＣベクター。
【請求項９】
前記１以上のヒト抗体重鎖がヒトＩｇＧ抗体重鎖を含み、前記ヒトＩｇＧ抗体重鎖定常領域の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが、有蹄動物のＩｇＧ抗体重鎖定常領域の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインで置換されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１０】
前記ヒトＩｇＧ抗体重鎖がヒトＩｇＧ１抗体重鎖を含む、請求項９に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１１】
前記有蹄動物のＩｇＧ抗体重鎖定常領域が、ウシのＩｇＧ抗体重鎖定常領域を含む、請求項９〜１０のいずれか一項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１２】
前記有蹄動物のクラススイッチ調節エレメントが、Ｉγ−Ｓγクラススイッチ調節エレメントを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１３】
前記Ｉγ−Ｓγクラススイッチ調節エレメントがＩγ１−Ｓγ１を含む、請求項１２に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１４】
前記１以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の各クラススイッチ調節エレメントが、有蹄動物のクラススイッチ調節エレメントで置換されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１５】
前記有蹄動物のクラススイッチ調節エレメントが、ウシのクラススイッチ調節エレメントである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１６】
前記ＨＡＣベクターが、ＶｐｒｅＢ１、ＶｐｒｅＢ３およびλ５ヒト抗体代替軽鎖からなる群から選択されるヒト抗体代替軽鎖をコードする１以上の遺伝子を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１７】
さらに、前記１以上のヒト抗体重鎖をコードする１以上の遺伝子と作動可能に連結されている有蹄動物のエンハンサーを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１８】
前記エンハンサーが３’Ｅαエンハンサーを含む、請求項１７に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載のＨＡＣベクターを有するトランスジェニック有蹄動物。
【請求項２０】
前記トランスジェニック有蹄動物がトランスジェニックウシである、請求項１９に記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項２１】
（ａ）前記有蹄動物の血清または血漿中に標的抗原に特異的なヒト抗体を産生および蓄積するために、請求項１９〜２０のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物に標的抗原を投与することと、
（ｂ）前記有蹄動物の血清または血漿から前記標的抗原に特異的なヒト抗体を回収することと、
を含む、ヒト抗体を産生する方法。
【請求項２２】
前記回収が、
（ｉ）前記トランスジェニック有蹄動物からリンパ球を単離することと、
（ｉｉ）前記リンパ球からヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することと、
（ｉｉｉ）前記標的抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体を前記ハイブリドーマから回収することと、
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記トランスジェニック有蹄動物のリンパ球が、前記トランスジェニック有蹄動物のリンパ節から単離される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記トランスジェニック有蹄動物が前記標的抗原で過免疫される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１２年８月３日出願の米国仮特許出願第６１／６７９，２８８号の優先権を主張し、同出願の開示が参照により援用される。
【０００２】
本明細書と共に提出される配列表は、参照によりその全体が援用される。
【背景技術】
【０００３】
静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）としても知られるヒト抗体は、特定抗原の免疫の有無を問わず献血されたヒト血漿から得られ、長年にわたり治療に使用されている。しかし、ヒト血漿由来のＩＶＩＧは、主に、チェックできていないヒト集団からの自発的な献血という性質により、かなりの課題および制限も伴う。特に、ヒトの免疫寛容により、癌細胞などのヒトから生じた抗原に対するヒト血漿由来のＩＶＩＧを確実に生成することは困難である。したがって、ヒト抗体を得るための改良されたシステムが必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
第一の態様において、本発明は、
（ａ）抗体重鎖をコードする各遺伝子が、クラススイッチ調節エレメントに作動可能に連結されている１以上のヒト抗体重鎖と、
（ｂ）１以上のヒト抗体軽鎖と、
（ｃ）１以上のヒト抗体代替軽鎖、および／または有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域と、
をコードする遺伝子を含むヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターを提供し、１以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の少なくとも１つのクラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている。
【０００５】
一実施形態において、１以上のヒト抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ抗体重鎖を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ重鎖はＩｇＧ１抗体重鎖を含む。さらなる実施形態において、１以上のヒト抗体重鎖は、ヒトＩｇＡ抗体重鎖を含む。別の実施形態において、１以上のヒト抗体重鎖は、ヒトＩｇＭ抗体重鎖を含む。さらなる実施形態において、１以上のヒト抗体重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥおよびＩｇＤのヒト抗体重鎖を含む。
【０００６】
一実施形態において、ＨＡＣベクターは、有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子を含み、この有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＭ重鎖可変領域を有するキメラとして発現する。別の実施形態において、この有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域は、ウシ由来のＩｇＭ重鎖定常領域である。
【０００７】
さらなる実施形態において、１以上のヒト抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ抗体重鎖定常領域の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが、有蹄動物に由来するＩｇＧ抗体重鎖定常領域の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインで置換されているヒトＩｇＧ抗体重鎖を含む。別の実施形態において、ヒトＩｇＧ抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１抗体重鎖を含む。さらなる実施形態において、有蹄動物に由来するＩｇＧ抗体重鎖定常領域は、ウシ由来のＩｇＧ抗体重鎖定常領域を含む。
【０００８】
一実施形態において、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントは、Ιγ−Ｓγクラススイッチ調節エレメントを含む。別の実施形態において、Ιγ−Ｓγクラススイッチ調節エレメントはΙγ１−Ｓγ１を含む。さらなる実施形態において、１以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の各クラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている。別の実施形態において、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントは、ウシ由来のクラススイッチ調節エレメントである。
【０００９】
一実施形態において、ＨＡＣベクターは、ＶｐｒｅＢ１、ＶｐｒｅＢ３およびλ５ヒト抗体代替軽鎖からなる群から選択されるヒト抗体代替軽鎖をコードする１以上の遺伝子を含む。
【００１０】
別の実施形態において、このＨＡＣは、さらに１以上のヒト抗体重鎖をコードする１以上の遺伝子に作動可能に連結されている有蹄動物に由来するエンハンサーを含む。一実施形態において、エンハンサーは３’Ｅαエンハンサーを含む。
【００１１】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合せに係るＨＡＣベクターを含むトランスジェニック有蹄動物を提供する。一実施形態において、このトランスジェニック有蹄動物は、トランスジェニックウシである。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、ゲノムに組み込まれ、
（ａ）抗体重鎖をコードする各遺伝子が、クラススイッチ調節エレメントに作動可能に連結されている１以上のヒト抗体重鎖と、
（ｂ）１以上のヒト抗体軽鎖と、
（ｃ）１以上のヒト抗体代替軽鎖、および／または有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域と、
をコードする遺伝子を含むトランスジェニック有蹄動物を提供し、１以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の少なくとも１つのクラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている。
【００１３】
本発明の第３の態様の当該トランスジェニック有蹄動物は、本発明の第１の態様のＨＡＣについて記載したような遺伝子、クラススイッチ調節エレメントおよび／またはエンハンサーの任意の実施形態または実施形態の組み合せを含んでもよいが、これらの遺伝子、クラススイッチ調節エレメント、および／またはエンハンサーは、そのゲノムに組み込まれている。
【００１４】
第４の態様において、本発明は、
（ａ）有蹄動物の血清または血漿中に標的抗原に特異的なヒト抗体を産生および蓄積するために、本発明の第２および第３の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのトランスジェニック有蹄動物に標的抗原を投与することと、
（ｂ）有蹄動物の血清または血漿から標的抗原に特異的なヒト抗体を回収することと、
を含む、ヒト抗体を産生する方法を提供する。
【００１５】
一実施形態において、この回収は、
（ｉ）トランスジェニック有蹄動物からリンパ球を単離することと、
（ｉｉ）このリンパ球からヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することと、
（ｉｉｉ）この標的抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体をこのハイブリドーマから回収することと、
を含む。
【００１６】
さらなる実施形態において、トランスジェニック有蹄動物のリンパ球は、トランスジェニック有蹄動物のリンパ節から単離される。さらなる実施形態において、トランスジェニック有蹄動物は標的抗原で過免疫される。
【００１７】
第５の態様において、本発明は、本発明の第４の態様の任意の実施形態、または実施形態の組み合わせの方法により産生されたヒト抗体を含む組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ウシＩＧＬＪ−ＩＧＬＣ遺伝子クラスターの構造およびそのクラスター欠失手法を示す。（Ａ）ウシＩＧＬＪ−ＩＧＬＣ遺伝子クラスターのゲノム構成。（Ｂ）ターゲティングベクターの構造およびクラスター欠失手法。プラスミドｐＣλ１ＣＡＧｚｅｏＰｕｒｏｌｏｘＰＤＴは、それぞれ長腕および短腕としての９．９ｋｂおよび３．１ｋｂのゲノムＤＮＡ、ｌｏｘＰ配列、ＣＡＧプロモーター駆動ゼオシン耐性遺伝子（ｚｅｏ）、ＤＴ−Ａならびにプロモーターのないピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ）で構成されるＩＧＬＪ１遺伝子の５’方向外側にｌｏｘＰ部位を配置するための第１のノックアウト（ＫＯ）ベクターであった。プラスミドｐＣλ５ＣＡＧｌｏｘＰｎｅｏＤＴは、それぞれ長腕および短腕としての８．７ｋｂおよび１．５ｋｂのゲノムＤＮＡ、ｌｏｘＰ配列、ニワトリβ−アクチンプロモーター駆動ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ＤＴ−Ａ、ＳＶ４０ポリＡならびにＣＡＧプロモーターで構成されるＩＧＬＣ５遺伝子の３’方向外側に別のｌｏｘＰ部位を配置するための第２のＫＯベクターであった。この第２のＫＯベクターは、クラスターを欠失させるためにＣｒｅ発現プラスミドと同時トランスフェクトされ、ＣＡＧプロモーター駆動ｐｕｒｏ遺伝子を再構成する。
【図２】オスおよびメスのウシのＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−ＩＧＬ−／−（トリプルノックアウト、「ＴＫＯ」）細胞株の作製を示す。（Ａ）ＴＫＯ細胞株を樹立するための育種系統。オスの細胞株６９３９およびメスの細胞株３４２７を順次標的化し、育種の最初のラウンドでそれぞれＩＧＨＭ−／＋ＩＧＨＭＬ１−／−およびＩＧＨＭ−／−動物を得、オスとメスの両方のＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／＋細胞株を作製した。これらの細胞をクラスター欠失に供して、育種の第２のラウンドでＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／＋ＩＧＬ−／＋動物を作製し、オスおよびメスのＴＫＯ細胞株を樹立した。（Ｂ）オスおよびメスのＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／＋細胞株の作製。細胞株６９３９由来のオスの細胞株ＩＧＨＭ−／＋ＩＧＨＭＬ１−／−において、２つのＩＧＨＭＬ１アレルのＵおよびｕ、ならびに１つのＩＧＨＭアレルＡＹを、それぞれターゲティングベクターｐＢＣμΔＮＫＯｎｅｏ、ｐＢＣμΔＫＯｐｕｒｏおよびｐｂＣμＡＹＫＯｂｓｒによりノックアウトした。細胞株３４２７由来のメスの細胞株ＩＧＨＭ−／−において、２つのＩＧＨＭアレルの１０ＡＹおよび７ＡＹＪを、それぞれターゲティングベクターｐｂＣμＡＹＫＯｂｓｒおよびｐｂＣμ７ＡＹＪＫＯｈｙｇによりノックアウトした。オスのＩＧＨＭ−／＋ＩＧＨＭＬ１−／−およびメスのＩＧＨＭ−／−動物間の育種後、各胎仔をゲノムＰＣＲ（ＡＹＫＯｂｓｒ−Ｆ２Ｒ２、ａｙＫＯｈｙｇ−Ｆ２Ｒ２、Ｎｅｏ−Ｆ２Ｒ２またはＰｕｒｏ−Ｆ２Ｒ２）に供し、遺伝子型ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／＋を識別し、オスおよびメスのそれぞれの細胞株Ｊ４８１およびＨ４１２を樹立した。Ｈ４１２についてＡＹＫＯｂｓｒ−Ｆ２Ｒ２を用いたゲノムＰＣＲにおいて、アレルＡＹおよび１０ＡＹの両方が破壊されたことを確認するために配列解析を行った。（Ｃ）細胞株Ｊ４８１におけるターゲティングベクターｐＣλ１ＣＡＧｚｅｏＰｕｒｏｌｏｘＰＤＴによるＩＧＬＪ１遺伝子の５’方向外側へのｌｏｘＰ配列の組み込み。相同組み換えの発生を、陽性ＰＣＲとしてＣＬ１ｐｕｒｏ−Ｆ２Ｆ２を用いて、ゲノムＰＣＲにより確認した。さらに、Ｒ−Ｆ２×Ｒ−Ｒ１を用いて、野生型アレルからのみ増幅することができる陰性ＰＣＲを行い、相同組み換えを再確認した。Ｊ４８１は、アレルＡおよびＤの両方から増幅されるので、二重ピーク（アレルＤについてはＴおよびアレルＤについてはＧ）を示す。コロニー２７は「Ｇ」のみを示し、アレルＡが特異的にノックアウトされたことが示され、コロニー２２は「Ｔ」のみを示し、アレルＤが特異的にノックアウトされたことが示された。コロニー２７から、ＣＬ１ｐｕｒｏ−Ｆ２Ｒ２を用いて陽性であった胎仔細胞株Ｋ６５５−１を樹立した。（Ｄ）細胞株Ｋ６５５−１におけるターゲティングベクターｐＣλ５（Ａ）ＣＡＧｌｏｘＰｎｅｏＤＴによるＩＧＬＣ５遺伝子の３’方向外側へのｌｏｘＰ配列の組み込み。相同組み換えの発生を、陽性ＰＣＲとしてＣＬ５ＣＡＧ−Ｆ２Ｆ２を用いて、ゲノムＰＣＲにより確認した。さらに、クラスター欠失により得られたＣＡＧプロモーター駆動ｐｕｒｏ遺伝子の再構成も、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３Ｒ３を用いたゲノムＰＣＲにより確認した。���胞株Ｇ０５４を用いて、育種用の子ウシを作製した。（Ｅ）オスおよびメスのＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−ＩＧＬ−／−（ＴＫＯ）細胞株の作製。オスおよびメスのＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／＋ＩＧＬ−／＋動物を、育種の第２ラウンドに供した。各胎仔を、（ＩＧＬＣ遺伝子を増幅するために）Ｌ００１−Ｆ１×Ｌ００２×Ｒ２、（ＩＧＨＭまたはＩＧＨＭＬ１定常領域を増幅するために）ＢＣμ−ｆ２ｒ２、（標的化ＩＧＨＭまたはＩＧＨＭＬ１遺伝子を増幅するために）クラスター欠失特異的ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３Ｒ３およびＢＣμＫＯ−Ｆ１４Ｒ１４を用いる一連のゲノムＰＣＲにより調べた。表に示すように５頭の胎仔の細胞株Ｅ０２４Ａ−２、Ａ５９６Ａ−１、Ａ３３２Ａ、Ｃ９７０およびＡ１１４Ａの遺伝子型を同定し、ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−ＩＧＬ−／−であることが証明された。
【図３】ＫｃＨＡＣΔおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターの概念ならびに構成を示す。（Ａ）ＫｃＨＡＣΔおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターの構造。ＫｃＨＡＣΔベクターは、元のκＨＡＣに由来し、ｈＩＧＨＭ遺伝子定常領域の一部のＣＨ１からＴＭドメインが、ウシ由来の配列でウシ化されている。この修飾のため、ＫｃＨＡＣΔベクターは、ｐｒｅＢ／Ｂ細胞表面上でウシ化キメラＩｇＭ｛ｃＩｇＭ（ＣＨ１）｝タンパク質を発現する。ウシ化ＣＨ１ドメインを介して、ｃＩｇＭ（ＣＨ１）は、ウシ代替軽鎖（ｂＳＬＣ）／軽鎖（ｂＬＣ）と良好なペアを組む。さらに、ウシ化ＴＭ１−ＴＭ２ドメインは、良好なｐｒｅＢＣＲ／ＢＣＲシグナル伝達のためのウシＩｇ−α／β複合体（ｂＩｇ−α／β）とより効率的に相互作用する。ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターは、ヒトＩＧＬ全体および代替軽鎖（ｈＶＰＲＥＢ１およびｈＩＧＬＬ１）遺伝子座を含む、３つの異なるヒト染色体（ｈＣｈｒ）断片のｈＣｈｒ１４（１４Ｄ）、ｈＣｈｒ２およびｈＣｈｒ２２で構成されている。このベクターでは、ｈＩＧＨＭ遺伝子定常領域の一部のＣＨ２からＴＭドメインが、ｃＩｇＭ（ＣＨ２）タンパク質を発現するようにウシ化されている。ｐｒｅＢ細胞段階において、このｃＩｇＭ（ＣＨ２）は、ヒトｐｒｅＢＣＲを模倣するためにヒト代替軽鎖（ｈＳＬＣ、ｈＶＰＲＥＢ１／ｈＩＧＬＬ１）と優先的にペアを組むが、ウシ化ＴＭ１−ＴＭ２ドメインは、ｐｒｅＢＣＲシグナル伝達のためにｂＩｇ−α／βと良好に相互作用する。（Ｂ）ニワトリＤＴ４０細胞におけるｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターの構築。ｈＣｈｒ２２断片をｈＣｈｒ２断片に移動させたＳＬＫＨ断片を含むＤＴ４０クローンのＳＬＫＨ１８を、ｃＩｇＭ（ＣＨ２）−ウシ化１４Ｄベクターを保持する別のＤＴ４０クローンのＣＨ２Ｄ４と融合し、ＤＴ４０ハイブリッドクローンｃＫＳＬＤ２２を作製した。２つのｈＣｈｒ断片の存在を、ヒトＣＯＴ１  ＤＮＡ蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって確認した。Ｃｒｅ発現プラスミドを導入することによって、２つのｈＣｈｒ断片間の染色体転座を誘導し、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターを作製した。３色−ＦＩＳＨは、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクター上にｈＩＧＨ、ｈＩＧＫおよびｈＩＧＬ遺伝子座の存在を示す。（Ｃ）ニワトリＤＴ４０細胞におけるＫｃＨＡＣΔベクターの構築。
【図４】κＨＡＣ、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔおよびＫｃＨＡＣ  ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−ダブルノックアウト（ＤＫＯ）子ウシの特性評価を示す。（Ａ）新生児段階における一連のＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の代表的なフローサイトメトリー分析。ＩｇＭ検出のために、抗ｈＩｇＭまたは抗ｂＩｇＭ抗体を、それぞれκＨＡＣおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ子ウシまたはＫｃＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシのために使用した。左のパネルから右のパネルに向かって、ＰＢＭＣを、ＩｇＭ単独、ＩｇＭ／ｂＣＤ２１、ＩｇＭ／ｂＩｇλ、ＩｇＭ／ｂＩｇκおよびＩｇＭ／ｈＩｇκについて染色した。各太字の番号は、Ｑ１（ＩｇＭ単独）またはＱ２（ＩｇＭ／ｂＣＤ２１、ＩｇＭ／ｂＩｇλ、ＩｇＭ／ｂＩｇκおよびＩｇＭ／ｈＩｇκ）の中の細胞の割合を表している。ＮＡ；適用されない（その時点で、抗ｂＩｇκ抗体が利用できなかったため）。（Ｂ、Ｃ）生後５〜６ヶ月の時点での一連のＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシにおける（Ｂ）全ｈＩｇＧ（μｇ／ｍｌ）および（Ｃ）完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ（μｇ／ｍｌ）の血清濃度。ｎは、各遺伝子型について分析した動物の個体数。各遺伝子型について、最小値、第一四分位数、中央値、第三四分位数および最大値を計算し、各グラフにプロットした。子ウシ４６８の値を破線の円で示した。（Ｄ、Ｅ）生後５〜６ヶ月の時点での一連のＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシにおける血清中の（Ｄ）全ｈＩｇＧに対する完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ（％）および（Ｅ）ｈＩｇＧ１／ｈＩｇＧ２比。ｎは、各遺伝子型について分析した動物の個体数。各遺伝子型について、最小値、第一四分位数、中央値、第三四分位数および最大値を計算し、左のグラフにプロットした。
【図５】ｉｓＨＡＣ（ｉｓＫｃＨＡＣΔ）およびｉｓｔＨＡＣの構成を示す。ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔまたはＫｃＨＡＣΔベクターのいずれかにおいて、ｈＩλ１−ｈＳλ１クラススイッチ調節エレメントをウシ化して、それぞれｉｓＨＡＣまたはｉｓＫｃＨＡＣΔベクターを構築した。ｉｓｔＨＡＣベクターは、ｈＩＧＨＧ１遺伝子の膜貫通／細胞質ドメインもウシ化されたｉｓＨＡＣベクターに由来する。
【図６】ｉｓＨＡＣ／ＴＫＯ、ｉｓｔＨＡＣ／ＴＫＯおよびｉｓＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ子ウシの特性評価を示す。（Ａ）ＨＡＣ／ＴＫＯ子ウシにおけるｂＩＧＬ発現の欠如。新生時段階の５頭のＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ子ウシ（子ウシ１〜５）からのＰＢＭＣをＲＴ−ＰＣＲに供し、ｂＩＧＬ発現の欠如を確認した。ｂＩｇＬ−Ｌｄ−Ｆ１×ｂＩｇＬ−Ｃ−ＲおよびＬ００３−Ｆ２×Ｌ００４−Ｒ２のプライマーペアは、それぞれＶＪ−再配列ｂＩＧＬおよび定常領域ＩＧＬＣ（ｂＣλ）遺伝子を増幅するためのものである。プライマーペアのｂＩｇκ−ＦＲは、ＶＪ再配列ｂＩＧＫ遺伝子を増幅するためのものである。Ｎは陰性対照であり、Ｐは陽性対照である。（Ｂ）新生児段階における一連のＨＡＣ／ＴＫＯ子ウシからのＰＢＭＣの代表的なフローサイトメトリー分析。ＩｇＭ検出のために、抗ｈＩｇＭまたは抗ｂＩｇＭ抗体を、それぞれｉｓＨＡＣ、ｉｓｔＨＡＣおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＴＫＯ子ウシのために、またはｉｓＫｃＨＡＣΔおよびＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ子ウシのために使用した。左のパネルから右のパネルに向かって、ＰＢＭＣを、ＩｇＭ単独、ＩｇＭ／ｂＣＤ２１、ＩｇＭ／ｂＩｇλ、ＩｇＭ／ｂＩｇκおよびＩｇＭ／ｈＩｇκについて染色した。各太字の番号は、Ｑ１（ＩｇＭ単独）またはＱ２（ＩｇＭ／ｂＣＤ２１、ＩｇＭ／ｂＩｇλ、ＩｇＭ／ｂＩｇκおよびＩｇＭ／ｈＩｇκ）の中の細胞の割合を表す。（Ｃ）生後５〜６ヶ月の時点の一連のＨＡＣ／ＴＫＯおよびＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシにおける全ｈＩｇＧ（ｇ／ｌ）の血清濃度の箱ひげ図（Ｂｏｘ−ｗｈｉｓｋｅｒ  ｐｌｏｔ）。Ａ、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＴＫＯ（ｎ＝８）；Ｂ、ｉｓＨＡＣ／ＴＫＯ（ｎ＝１２）；Ｃ、ｉｓｔＨＡＣ／ＴＫＯ（ｎ＝８）；Ｄ、ＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ（ｎ＝８）；Ｅ、ｉｓＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ（ｎ＝１２）；Ｆ、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ（ｎ＝３３）；Ｇ、ＫｃＨＡＣ／ＤＫＯ（ｎ＝１２）；Ｈ、κＨＡＣ／ＤＫＯ（ｎ＝８）。ドットは異常値を表す。子ウシ４６８の値を矢印で示した。各遺伝子型について、最小値、第一四分位数、中央値、第三四分位数および最大値を計算し、各グラフにプロットした。（Ｄ）パネルは、各ペアの比較における９５％ファミリーワイズ（ｆａｍｉｌｙ−ｗｉｓｅ）の信頼水準を示す。（Ｅ）生後５〜６ヶ月の時点の一連のＨＡＣ／ＴＫＯおよびＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシにおける完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ（ｇ／ｌ）の血清濃度の箱ひげ図。Ａ、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＴＫＯ（ｎ＝８）；Ｂ、ｉｓＨＡＣ／ＴＫＯ（ｎ＝１２）；Ｃ、ｉｓｔＨＡＣ／ＴＫＯ（ｎ＝８）；Ｄ、ＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ（ｎ＝８）；Ｅ、ｉｓＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ（ｎ＝１２）；Ｆ、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ（ｎ＝３３）；Ｇ、ＫｃＨＡＣ／ＤＫＯ（ｎ＝１２）；Ｈ、κＨＡＣ／ＤＫＯ（ｎ＝８）。ドットは異常値を表す。子ウシ４６８の値を矢印で示した。各遺伝子型について、最小値、第一四分位数、中央値、第三四分位数および最大値を計算し、各グラフにプロットした。（Ｆ）パネルは、各ペアの比較における９５％ファミリーワイズの信頼水準を示す。（Ｇ）生後５〜６ヶ月の時点の一連のＨＡＣ／ＴＫＯおよびＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシにおける血清中の全ｈＩｇＧに対する完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ（％）の���ひげ図。ドットは異常値を表す。子ウシ４６８の値を矢印で示した。各遺伝子型について、最小値、第一四分位数、中央値、第三四分位数および最大値を計算し、各グラフにプロットした。（Ｈ）パネルは、各ペアの比較における９５％ファミリーワイズの信頼水準を示す。ｎは、各遺伝子型について分析した動物の個体数である。（Ｉ）生後５〜６ヶ月の時点での一連のＨＡＣ／ＴＫＯおよびＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシにおけるｈＩｇＧ１／ｈＩｇＧ２比の箱ひげ図。ドットは異常値を表す。Ａ、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＴＫＯ（ｎ＝８）；Ｂ、ｉｓＨＡＣ／ＴＫＯ（ｎ＝１２）；Ｃ、ｉｓｔＨＡＣ／ＴＫＯ（ｎ＝８）；Ｄ、ＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ（ｎ＝８）；Ｅ、ｉｓＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ（ｎ＝１２）；Ｆ、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ（ｎ＝３３）；Ｇ、ＫｃＨＡＣ／ＤＫＯ（ｎ＝１２）；Ｈ、κＨＡＣ／ＤＫＯ（ｎ＝８）。各遺伝子型について、最小値、第一四分位数、中央値、第三四分位数および最大値を計算し、左のグラフにプロットした。（Ｊ）パネルは、ｈＩｇＧ１−優性の割合の差の各ペアの比較における９５％ファミリーワイズの信頼水準を示す。（Ｋ）表は、各遺伝子型の実際の値を示す。（Ｌ）ヒト口腔扁平上皮癌の２回の予防接種（Ｖ２）後の一連のＨＡＣ／ＴＫＯおよびＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシにおける抗ヒト癌ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ応答。太字の矩形領域の割合は、Ｖ２後９〜１０日目における各動物の血清由来のｈＩｇＧおよびｈＩｇκで２重陽性であるヒト癌細胞の割合を示し、血清希釈率は１：１２８０である。「Ｖ１Ｄ０」としてラベルした分離パネルは、Ｖ１後０日目（Ｖ１Ｄ０）におけるｉｓｔＨＡＣ／ＴＫＯ子ウシ２の血清で染色したヒト癌細胞のフローサイトメトリーの結果であり、血清希釈率は１：１２８０である。
【図７】κＨＡＣ／ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−（ＤＫＯ）胎仔および子ウシ４６８由来の線維芽細胞上の比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）分析を示す。子ウシ４６８を作製した細胞株に存在するκＨＡＣベクターに関するＣＧＨ分析を用いた子ウシ４６８のより広範な分析は、いくつかの明確な構造変化を示した。Ａ２５４−２は、子ウシ４６８を作製した胎仔の線維芽細胞株である。Ａ２５４−２、Ｇ８２７−１、Ｋ４３９−１およびＫ４３９−２を、ＣＨＯ細胞株κＣ１−１からＤＫＯ細胞株へのκＨＡＣベクターの独立したＭＭＣＴイベントを介して作製した。胎仔細胞株Ｋ４３９−１からのＤＮＡを基準として使用した。Ａ２５４−２および子ウシ４６８のみが、ｈＣｈｒ１４上の３’Ｅα２領域周辺に明確なＣＧＨパターンを示した（破線の円）。
【図８】ウシＩＩＧＬＪ２−ＩＧＬＣ２およびＩＧＬＪ３−ＩＧＬＣ３遺伝子間のＤＮＡ配列のアラインメントを示す。（Ａ）ウシＩＧＬＪ２−ＩＧＬＣ２およびＩＧＬＪ３−ＩＧＬＣ３遺伝子間のイントロンＤＮＡ配列アラインメント。「ＪＬ２−ＣＬ２」（配列番号１４７）および「ＪＬ３−ＣＬ３」（配列番号１４８）は、それぞれＩＧＬＪ２−ＩＧＬＣ２およびＩＧＬＪ３−ＩＧＬＣ３遺伝子のイントロン配列に対応する。（Ｂ）ウシＩＧＬＣ２およびＩＧＬＣ３遺伝子間の３’ＵＴＲ  ＤＮＡ配列アラインメント。「ｂＣＬ２」（配列番号１４９）および「ｂＣＬ３」（配列番号１５０）は、それぞれＩＧＬＣ２およびＩＧＬＣ３遺伝子の３’ＵＴＲ配列に対応する。
【図９】ｂＣｈｒ２１上のウシＩＧＨ遺伝子クラスターの推定構造を示す。ＢＡＣクローン２２７−Ａ１６は、ＩＧＨ可変領域の一部およびＩＧＨＭＬ１からＣγ１領域を含むように思われた。ＢＡＣクローン５１７−Ｂ２２は、ＩＧＨＭからＣα領域をカバーするように思われた。ＢＡＣクローン３８２−Ｆ１９は、Ｃγ２から３’Ｅα領域を含むように思われる。３つのＢＡＣクローンコンティグのサイズは、約３８０ｋｂ長であると推定される。
【図１０】ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−ＩＧＬ−／−（ＴＫＯ）細胞株の遺伝子型を示す。ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−（ＤＫＯ）遺伝子型を確認するために、ＫＯカセットの存在が増幅を阻害するので、ＢＣμ−ｆ２ｒ２を用いた陰性ＰＣＲを行った。陽性ＰＣＲとしては、ＢＣμＫＯ−Ｆ１４Ｒ１４を用いて行った。ＩＧＬ−／−遺伝子型には、Ｌ００１−Ｆ×Ｌ００２−Ｒを用いた陰性ＰＣＲを行い、ＩＧＬＣ遺伝子の非存在を確認した。同時に、クラスター欠失に特異的なＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３Ｒ３を用いた陽性ＰＣＲを行った。
【図１１】ヒト、ウシおよびマウスの（Ａ）ＩｇＭ（ヒト配列番号１５１、ウシ配列番号１５２およびマウス配列番号１５３）、（Ｂ）ＶｐｒｅＢｌ（ヒト配列番号１５４、ウシ配列番号１５５およびマウス配列番号１５６）、（Ｃ）λ５（ヒト配列番号１５７、ウシ配列番号１５８およびマウス配列番号１５９）、（Ｄ）Ｉｇ−α（ヒト配列番号１６０、ウシ配列番号１６１およびマウス配列番号１６２）および（Ｅ）Ｉｇ−β（ヒト配列番号１６３、ウシ配列番号１６４およびマウス配列番号１６５）アミノ酸配列アラインメントを示す。それぞれの割合は相同性を示す。ｈはヒト、ｂはウシ、ｍはマウスを示す。網掛けのアミノ酸は、ヒトとは異なるアミノ酸を示す。
【図１２】ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔおよびＫｃＨＡＣΔベクターの遺伝子型解析、ならびにｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ子ウシの特性評価を示す。（Ａ）ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターの遺伝子型解析のための大規模ゲノムＰＣＲ。各ゲノムＰＣＲプライマーペアの位置は、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクター構造に関連して示されている。（Ｂ）ＫｃＨＡＣΔベクターの遺伝子型解析のための大規模ゲノムＰＣＲ。各ゲノムＰＣＲプライマーペアの位置は、ＫｃＨＡＣΔベクター構造に関連して示されている。（Ｃ）ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ、ＫｃＨＡＣΔまたはＫｃＨＡＣベクターのいずれかを含むＣＨＯクローンに関するＣＧＨ分析。上のパネルでは、ＣＨＯクローン（ｃＫＳＬＤＣ６、１５、２３）を含むｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを、κＨＡＣを含むκＣ１−１およびＫｃＨＡＣベクターを含むＫＣＦ４と比較した。ＳＣ２０ベースのＨＡＣ、κＨＡＣおよびＫｃＨＡＣに固有の３’Ｅα２領域（破線の円）周辺におけるＤＮＡの潜在的ないくつかの増幅を除き、全てのＨＡＣ間で明らかな構造上の違いは無かった。ｃＫＳＬＤＣ１５からのＤＮＡを基準として使用した。下のパネルは、ＫｃＨＡＣΔベクターを含む３種類の異なるＣＨＯクローン間のＣＧＨパターンを示しており、ＫＣＤＣ１からのＤＮＡを基準として使用した。３種類の細胞株のうちＫｃＨＡＣΔの明らかな構造上の違いはなかった。（Ｄ）ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ子ウシにおけるヒトＩＧＬ、ＶＰＲＥＢ１およびＩＧＬＬ１遺伝子の転写。新生児の段階での３頭のｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ子ウシ（子ウシ１〜３）からのＰＢＭＣをＲＴ−ＰＣＲに供し、ヒトＩＧＬ、ＶＰＲＥＢ１およびＩＧＬＬ１遺伝子の発現を確認した。Ｎは陰性対照、Ｐは陽性対照を示す。
【図１３】ウシおよびヒトの間でのＩｇＧ１クラススイッチ調節ならびに分泌に関連する配列のアラインメントを示す。（Ａ）Ｉγ１のＤＮＡ配列のアラインメント（ヒトＩγ１  配列番号１６６、ウシＩγ１  配列番号１６７）、Ｉγ２（ヒトＩγ２  配列番号１６８、ウシＩγ２  配列番号１６９）およびＩγ３（ヒトＩγ３  配列番号１７０、ウシＩγ３  配列番号１７１）、ヒトおよびウシの間のＥＣＳ（進化的に保存された配列）エレメント。網掛けのヌクレオチド塩基は、ヒトＩγ１配列とは異なるものを示す。ＫＢ３（κＢ３）、ＫＢ４（κＢ４）、ＫＢ５（κＢ５）、ＩＳＲＥ（インターフェロン刺激性応答エレメント）、Ｃ−ＥＢＰ（ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質）、ＢＳＡＰ（Ｂ細胞系統特異的活性化タンパク質）およびＧＡＳ（ガンマインターフェロン活性部位）を長方形で示す。（Ｂ）ヒトおよびウシのＳγ１配列間のドットプロットアライメント。（Ｃ）ヒト（配列番号１７２）およびウシ（配列番号１７３）の間のＩｇＧ１膜貫通／細胞質ドメインのアミノ酸配列アラインメント。網掛けのアミノ酸は、ヒトとは異なるものを示す。
【図１４】生後５〜６ヶ月の時点での一連のＨＡＣ／ＴＫＯ子ウシの完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκの血清濃度（ｇ／Ｌ）を示す。ｎは、それぞれの遺伝子型について分析した動物の個体数を示す。それぞれの遺伝子型について、使用したＴＫＯ細胞株に基づいて、個々の値をプロットした。
【図１５】生後５〜６ヶ月の時点での一連のＨＡＣ／ＴＫＯおよびＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシの血清中の全ｈＩｇＧに対する完全ｈＩｇＧ／ｂＩｇκ（％）を示す。ｎは、それぞれの遺伝子型について分析した動物の個体数を示す。それぞれの遺伝子型について、最小値、第一四分位数、中央値、第三四分位数および最大値を計算し、左のグラフにプロットした。
【図１６】ヒト口腔扁平上皮癌の２回の予防接種（Ｖ２）後の一連のＨＡＣ／ＴＫＯおよびＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシにおける抗ヒト癌ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ反応を示す。示された血清希釈率でのＶ２後９〜１０日目における各免疫動物のｈＩｇＧ／ｈＩｇκ二重陽性ヒト癌細胞の割合をプロットした。
【図１７】１４Ｄベクターの構築を示す。（Ａ）１４Ｄベクター構築の流れ。第１のｌｏｘ５１１をインタクトなｈＣｈｒ１４上のＡＬ５１２３５５に組み込み、Ｉ３５５−２を作製した。次いで、第２のｌｏｘ５１１をＡＬ３９１１５６にセットし、Ｉ１５６−１０を作製した。Ｃｒｅの導入は、染色体上の大きなＤＮＡ欠失を引き起こし、Ｄ８を作製した。１４Ｄ１は、ＲＮＲ２遺伝子座にｌｏｘＰを組み込むことによって構築した。その後、ｃＩｇＭ（ＣＨ１）またはｃＩｇＭ（ＣＨ２）のウシ化によりＣＨ１Ｄ２またはＣＨ２Ｄ４を作製し、それぞれ、ＫｃＨＡＣΔまたはｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクター構築のために使用した。（Ｂ）１４Ｄベクター構築の詳細な方法。ターゲティングベクターｐＳＣ３５５ＣＡＧｌｏｘ５１１ｈｉｓＤＤＴは、それぞれ長腕および短腕としての８．２ｋｂおよび２．０ｋｂのゲノムＤＮＡ、ＣＡＧプロモーター、ｌｏｘ５１１、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ニワトリβ−アクチンプロモーター駆動ｈｉｓＤ遺伝子およびＤＴ−Ａ遺伝子からなり、これを使用して、ＩＧＨＡ２遺伝子座に対して約３００ｋｂセントロメアのＡＬ５１２３５５にｌｏｘ５１１配列を組み込んだ。別のターゲティングベクターのｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）ｈｙｇｐｕｒｏｌｏｘ５１１ＤＴは、それぞれ長腕および短腕としての８．２ｋｂおよび１．８ｋｂのゲノムＤＮＡ、プロモーターのないｐｕｒｏ遺伝子、ｌｏｘ５１１、ニワトリβ−アクチンプロモーター駆動ｈｙｇ遺伝子およびＤＴ−Ａ遺伝子で構成され、これを使用して、ＡＬ３９１１５６にｌｏｘ５１１配列を組み込んだ。Ｃｒｅの導入は、２つのｌｏｘ５１１部位の間に大きなＤＮＡ欠失（約８５Ｍｂ）を引き起こし、１４Ｄを作製した。この大きな欠失の結果、ＣＡＧプロモーター駆動ｐｕｒｏ遺伝子が再構成され、ピューロマイシンで選択した。ピューロマイシン耐性細胞を、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３Ｒ３を用いたゲノムＰＣＲに供し、分子レベルでの欠失を確認した。これらの細胞は、欠失によりハイグロマイシンＢまたはヒスチジノールにも感受性を示した。（Ｃ）ＣＨ１ＤおよびＣＨ２ＤのためのＩｇＭウシ化。ウシ化ベクターｐＣＨ１ＣＡＧｚｅｏ（Ｒ）ＤＴ（Ｆ）は、それぞれ長腕および短腕としての７．４ｋｂおよび１．７ｋｂのヒトゲノムＤＮＡ、ｌｏｘＰ導入ＣＡＧプロモーター駆動ｚｅｏ遺伝子カセットがＣＨ４およびＴＭ１イントロンの間に組み込まれている、ＣＨ１からＴＭ２ドメインをカバーする６ｋｂのウシＩＧＨＭ定常領域ゲノムＤＮＡ、ならびにＤＴ−Ａ遺伝子を含む。相同組み換え後、ｈＩＧＨＭ定常領域の一部であるＣＨ１からＴＭ２ドメインは、ＣＨ１Ｄ上でウシ化された。別のウシ化ベクターｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏＤＴ（Ｆ）は、それぞれ長腕および短腕としての７．２ｋｂおよび１．７ｋｂのヒトゲノムＤＮＡ、ｌｏｘＰ導入ＣＡＧプロモーター駆動ｚｅｏ遺伝子カセットがＣＨ４およびＴＭ１イントロンの間に組み込まれている、ＣＨ２からＴＭ２ドメインをカバーする５．４ｋｂのウシＩＧＨＭ定常領域ゲノムＤＮＡ、ならびにＤＴ−Ａ遺伝子を含む。相同組み換え後、ｈＩＧＨＭ定常領域の一部であるＣＨ２からＴＭ２ドメインは、ＣＨ２Ｄ上でウシ化された。（Ｄ）それぞれの標的化事象の遺伝子型解析���ＡＬ５１２３５５において、ＫＯカセットの存在によって妨げられる３５５Ｎ−ＦＲを用いた陰性ＰＣＲと共に、ＳＣ３５５ＫＯ−Ｆ２Ｒ２を、相同組み換えに特異的な陽性ＰＣＲとして使用した。ＡＬ３９１１５６において、ＫＯカセットの存在によって妨げられる１４ＣＥＮ（Ｎ）−Ｆ２Ｒ２を用いた陰性ＰＣＲと共に、１４ＣＥＮＫＯ−Ｆ３Ｒ３を、相同組み換えに特異的な陽性ＰＣＲとして使用した。ＣＨ１Ｄの改変（例えば、ｃＩｇＭ（ＣＨ１）ウシ化）には、ヒト配列およびウシ配列間の結合配列を調べるためのＣＨ１  ５’−ＦＲおよびｃＨＡＣ３’−ＦＲと共に、ｃＨＡＣ−Ｆ３Ｆ３を、相同組み換えに特異的な陽性ＰＣＲとして使用した。同様に、ＣＨ２Ｄの改変（例えば、ｃＩｇＭ（ＣＨ２）ウシ化）には、ヒト配列およびウシ配列の間の結合配列を調べるためのＣＨ２  ５’−ＦＲおよびｃＨＡＣ３’−ＦＲと共に、ｃＨＡＣ−Ｆ３Ｆ３を、相同組み換えに特異的な陽性ＰＣＲとして使用した。（Ｅ）インタクトなｈＣｈｒ１４および短縮されたｈＣｈｒ１４断片間のヒトＣＯＴ−１  ＦＩＳＨ。
【図１８】ｈＣｈｒ２断片の改変を示す。（Ａ）クローンκＺ７の作製。クローンκＴＬ１をターゲティングベクターｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏＣＤ８Ａでトランスフェクションし、ｐｕｒｏカセットをｚｅｏカセットで置換した。標的化事象を、ＣＤ８ＡＫＯ−Ｆ２Ｒ２を用いてゲノムＰＣＲにより確認した。（Ｂ）クローンＫ５３を作製するためのｈＣｈｒ２断片の切断。相同アームとしての７．４ｋｂのゲノムＤＮＡ、プロモーターのないｐｕｒｏ遺伝子、ｌｏｘ２２７２、ニワトリβ−アクチンプロモーター駆動ｈｉｓＤ遺伝子およびヒトテロメア反復配列（ＴＥＬ）で構成されているターゲティングベクターｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏｌｏｘ２２７２Ｆ９Ｒ９でクローンκＴＬ１をトランスフェクションし、ｈＣｈｒ２断片を切断し、ＡＣ１０４１３４にｌｏｘ２２７２を組み込んだ。
【図１９】ｈＣｈｒ２２断片の改変を示す。（Ａ）クローンＳＴＬ５４の作製。クローン５２−１８に保持されているインタクトなｈＣｈｒ２２を、標的切断ベクターｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏＳＬＦＲによってＡＰ０００３５０で切断し、ＳＴ１３を作製した。その後、ｌｏｘ２２７２配列を、ターゲティングベクターｐ５５３ＣＡＧｌｏｘ２２７２ｂｓｒＤＴによってＡＰ０００５５３に組み込み、ＳＴＬ５４を作製した。（Ｂ）ＡＰ０００３５０でのｈＣｈｒ２２の切断。遺伝子座ＡＰ０００３５０は、ｈＶＰＲＥＢ３遺伝子座に対して約７０ｋｂテロメア側に位置している。切断ベクターｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏＳＬＦＲは、相同アームとしての７．４ｋｂのゲノムＤＮＡ、ＣＡＧプロモーター駆動ｚｅｏ遺伝子およびヒトテロメア反復配列（ＴＥＬ）からなる。相同組み換え後、ｈＣｈｒ２２をＡＰ０００３５０で切断した。（Ｃ）ＡＰ０００５５３でのｌｏｘ２２７２部位の組み込み。ターゲティングベクターｐ５５３ＣＡＧｌｏｘ２２７２ｂｓｒＤＴは、長腕および短腕としての６．９ｋｂおよび２．８ｋｂのゲノムＤＮＡ、ＣＡＧプロモーター、ｌｏｘ２２７２、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ニワトリβ−アクチンプロモーター駆動ｂｓｒ遺伝子ならびにＤＴ−Ａ遺伝子を含む。ＫＯカセットの存在によって妨げられる５５３−Ｆ４Ｒ４を用いた陰性ＰＣＲと共に、５５３ＫＯ−Ｆ３Ｒ３を相同組み換えに特異的な陽性ＰＣＲとして使用した。
【図２０】ＳＬＫＨ断片の構築を示す。（Ａ）ＳＬＫＨ断片の作製の流れ。２種類のＤＴ４０クローンのＫ５３およびＳＴＬ５４を全細胞融合に供し、ＤＴ４０ハイブリッドクローンＳＬＫ２を作製した。次いで、Ｃｒｅリコンビナーゼを導入して、ＳＬＫＨ断片を構築する２つのｈＣｈｒ断片間の染色体転座を誘導した。染色体転座の結果として、ＣＡＧプロモーター駆動ｐｕｒｏ遺伝子を再構成し、ピューロマイシンで選択した。さらに、転座の発生を、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３Ｒ３を用いてゲノムＰＣＲにより確認した。ＤＴ４０ハイブリッドクローンのＳＬＫＨ６から、ＳＬＫＨ断片をＭＭＣＴによってプレーンなＤＴ４０細胞に移し、ＳＬＫＤ１８を作製した。（Ｂ）ＳＬＫ２、ＳＬＫＨ６およびＳＬＫＤ１８上のマルチカラーＦＩＳＨ。ＳＬＫ２は、ヒトＣＯＴ−１プローブで単に染色し、より長いｈＣｈｒ２断片およびより短いｈＣｈｒ２２断片の存在を確認した。ＳＬＫＨ６およびＳＬＫＤ１８については、２色ＦＩＳＨを行った。ＳＬＫＨ６では、２つの相互に転位したｈＣｈｒ断片が見られ、長い方はＳＬＫＨ断片であった。ＳＬＫＤ１８では、単一ＳＬＫＨ断片が存在していた。
【図２１】ＣＨ２Ｄ上での染色体反転の発生を示す。ＲＮＲ２遺伝子座のｌｏｘＰおよび欠失結合部位ＡＰ３９１１５６１／ＡＰ５１２３５５のｌｏｘ５１１の間でのリーキーな組み換えにより、ＣＡＧプロモーター駆動ＧＦＰ遺伝子も再構成する反転が生じ、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターからのＰＧＫプロモーター駆動ＧＦＰ遺伝子より高いＧＦＰ発現を引き起こした。この反転を、ＳＴＯＰｐｕｒｏ−Ｆ２Ｒ２およびＧＦＰ２×ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３を用いてゲノムＰＣＲにより確認した。
【図２２】ｉｓＨＡＣおよびｉｓＫｃＨＡＣΔベクターの構築を示す。（Ａ）ｉｓＨＡＣおよびｉｓＫｃＨＡＣΔベクター構築の流れ。ウシ化ベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｓＨＡＣは、それぞれ長腕および短腕としての１０．５ｋｂおよび２ｋｂのゲノムＤＮＡ、ウシＩγ１−Ｓγ１をカバーする９．７ｋｂのウシゲノムＤＮＡ、ヒトの対応する６．８ｋｂのＩγ１−Ｓγ１領域を置換するためのその周辺領域、ＦＲＴ配列が隣接するニワトリβ−アクチンプロモーター駆動ｎｅｏ遺伝子ならびにＤＴ−Ａ遺伝子からなるＢＡＣベース（骨格がｐＣＣ１ＢＡＣベクターである）ベクターである。標的ウシ化後、ｎｅｏカセットをＦＬＰ導入によって除去する。（Ｂ）ターゲティングベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｓＨＡＣの詳細情報。短腕および長腕のための２ｋｂのＡｆｅ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ断片および１０．５ｋのＡｐａ  Ｉ−Ｈｐａ  Ｉ断片を、ヒトＩγ１−Ｓγ１領域周辺のプローブを使用してスクリーニングすることにより、それぞれ、κＨＡＣを含むＣＨＯ細胞から構築されたλファージゲノムライブラリー由来のクローンｈ１０およびクローンｈ１８／ｈ２０から得た。９．７ｋｂ断片（５’末端からＢｓｕ３６  Ｉ）を、λファージウシゲノムライブラリー由来のクローンｂ４２から得た。（Ｃ）ウシ化Ιγ１−Ｓγ１領域の遺伝子型解析。基本的には、示したように、５セットのゲノムＰＣＲを行った。ｉｓｃｏｎｔ１−Ｆ１／Ｒ１は、相同組み換えに特異的な陽性ＰＣＲである。ｉｓｃｏｎｔ１−Ｆ１×ｈＩｇＧ１−Ｒ１０は、ｎｅｏカセットの存在によって妨げられる陰性ＰＣＲである。ｉｓＨＡＣ−Ｓｗ−ｄｉｇ−Ｆ５／Ｒ３およびｉｓＨＡＣ−ＴＭ−ｄｉｇ−Ｆ３／Ｒ２は、それらの対応する領域の構造的な完全性を調べるためのものであり、それぞれをＢａｍ ＨＩ＋Ｐｖｕ ＩＩおよびＡｇｅ  Ｉ、Ｓｍａ ＩまたはＰｖｕ  ＩＩで消化した。ｂＮｅｏ ５’−Ｒ×ｂＩｇＧ１−５’−ｓｅｑ−Ｒ６は、ＦＲＴ配列の存在を確認するためのものである。（Ｄ）ｎｅｏカセットのＦＬＰ−ＦＲＴ欠失後の遺伝子型解析。（Ｅ）ｉｓＨＡＣベクターの遺伝子型解析のための大規模ゲノムＰＣＲ。各ゲノムＰＣＲプライマーペアの位置を、ｉｓＨＡＣベクター構造に関連して示す。（Ｆ）ｉｓＨＡＣベクターを含む３種類の異なるＣＨＯクローン間のＣＧＨ分析。ｉｓＣ１−１３３のＤＮＡを基準として使用した。３種類の細胞株間においてｉｓＨＡＣの明らかな構造上の違いはなかった。（Ｇ）ｉｓＫｃＨＡＣΔベクターの遺伝子型解析のための大規模ゲノムＰＣＲ。各ゲノムＰＣＲプライマーペアの位置をｉｓＫｃＨＡＣΔベクター構造に関連して示す。（Ｈ）ｉｓＫｃＨＡＣΔベクターを含む３種類の異なるＣＨＯクローン間のＣＧＨ分析。ｉｓＫＣＤＣ１５−８からのＤＮＡを基準として使用した。３種類の細胞株間においてｉｓＫｃＨＡＣΔの明らかな構造上の違いはなかった。
【図２３】ｉｓｔＨＡＣベクターの構築を示す。（Ａ）ｉｓｔＨＡＣベクター構築の流れ。ａｔｔＰ配列を、ターゲティングベクターｐｈＩγ１ＦＲＴＣＡＧａｔｔＰｈｉｓＤＤＴおよびｐｈγ１ＴＭＮｅｏａｔｔＰＤＴによって、それぞれｈＩγ１エクソン１の５’側およびｈＩＧＨＧ１ ＴＭ２の３’側に組み込む。次いで、置換ベクターｐＢＡＣ−ｉｓｔＨＡＣをφＣ３１リコンビナーゼで導入し、ａｔｔＰ／ａｔｔＢ組み換えを引き起こし、隣接領域を置換した。置換が成功すると、再構成されるＣＡＧプロモーター駆動ＤｓＲｅｄ遺伝子が、選別のための赤色蛍光を発する。最後に、ＤｓＲｅｄカセットを、ＦＬＰ発現により除去する。（Ｂ）ｈＩＧＨＧ１ ＴＭ２の３’側でのａｔｔＰ配列の組み込み。ターゲティングベクターｐｈγ１ＴＭＮｅｏａｔｔＰＤＴは、長腕および短腕としての６．３ｋｂおよび１．２ｋｂのゲノムＤＮＡ、ニワトリβ−アクチンプロモーター駆動ｎｅｏ遺伝子、ａｔｔＰならびにＤＴ−Ａ遺伝子からなる。ｈｇ１ＴＭｎｅｏａｔｔＰ−Ｆ１／Ｒ１を、ＫＯカセットの存在によって妨げられるｈＩｇＧｌ−Ｆ２５／Ｒ２３およびｈｇ１ＴＭｎｅｇ−Ｆ３／Ｒ３を用いる陰性ＰＣＲと共に、相同組み換えに特異的な陽性ＰＣＲとして使用した。Ｓｍａ ＩまたはＡｇｅ  Ｉ消化後のｈＩｇＧ１ＴＭ−ｄｉｇ−Ｆ１／Ｒ２を、対応する領域の構造的な完全性を調べるために使用した。（Ｃ）ｈＩγ１エクソン１の５’側でのａｔｔＰ配列の組み込み。ターゲティングベクターｐｈＩγ１ＦＲＴＣＡＧａｔｔＰｈｉｓＤＤＴは、長腕および短腕としての９．６ｋｂおよび１．８ｋｂのゲノムＤＮＡ、ニワトリβ−アクチンプロモーター駆動ｈｉｓＤ遺伝子、ａｔｔＰ、ＣＡＧプロモーター、ＦＲＴならびにＤＴ−Ａ遺伝子を含む。ｈｇ１ＦＲＴＣＡＧａｔｔＰｈｉｓＤ−Ｆ１／Ｒ１を、ＫＯカセットの存在によって妨げられるｉｓｃｏｎｔ１−Ｆ１×ｈＩｇＧ１−Ｒ１０を用いた陰性ＰＣＲと共に、相同組み換えに特異的な陽性ＰＣＲとして使用した。（Ｄ）ａｔｔＰ−ａｔｔＢ組み換えによって媒介される大きなＤＮＡ置換。置換ベクターｐＢＡＣｉｓｔＨＡＣは、１８．１ｋｂのキメラゲノムＤＮＡ（ｂＩγ１−ｂＳγ１＋ｈＩＧＨＧ１のＣＨ１からＣＨ３＋ｂＩＧＨＧ１のＴＭ１−ＴＭ２）、プロモーターのないＤｓＲｅｄ、ＦＲＴおよび隣接する２つのａｔｔＢ配列で構成されている。ΦＣ３１発現によるＤＮＡ置換を、ＤｓＲｅｄ発現ならびにＣＡＧＤｓＲｅｄ−Ｆ２／Ｒ２およびｂＩｇＧ１−３’−ＳｅｑＦ３×ｈＩｇＧ１−Ｒ１５を用いたゲノムＰＣＲにより確認し、それぞれａｔｔＲおよびａｔｔＬの生成を調べた。（Ｅ）ＤｓＲｅｄカセットのＦＬＰ−ＦＲＴ欠失後の遺伝子型解析。（Ｆ）ｉｓｔＨＡＣベクターの遺伝子型解析のための大規模ゲノムＰＣＲ。各ゲノムＰＣＲプライマーペアの位置を、ｉｓｔＨＡＣベクター構造に関して示す。（Ｇ）ｉｓｔＨＡＣベクターを含む３種類の異なるＣＨＯクローン間のＣＧＨ分析。ｉｓｔＣ１−６からのＤＮＡを基準として使用した。３種類の細胞株間でｉｓｔＨＡＣの明らかな構造上の違いはなかった。
【図２４】推定ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクター配列に基づいて、ＣＧＨ用のプローブ設計を示す。ｈＣｈｒ１４、ｈＣｈｒ２およびｈＣｈｒ２２断片配列については、ＡＢ０１９４３７〜ＡＬ５１２３５５、ＡＣ１１３６１２〜ＡＣ１０４１３４、およびＡＰ０００５５３〜ＡＰ０００３５０を、それぞれアセンブルし、人工「ＮＮＮ．．．Ｎ」で結合し、推定ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクター配列として４，９３２，０３０ｂｐのＤＮＡ配列を作製した。
【図２５】ＴｃウシＢ細胞における２つのレベルでの種間不適合性のモデルを示す。１つは、ｐｒｅＢＣＲ／ＢＣＲ構造（例えば、ヒトＩｇＭおよびウシ代替／オーソドックス軽鎖間の対形成、ヒトＩｇＭ／ＩｇＧ１およびウシＩｇ−α／β間の相互作用）などのタンパク質−タンパク質相互作用である。もう１つは、ヒトＩγ１−Ｓγ１  ＤＮＡ配列およびウシのサイトカイン／活性化因子誘導性ウシＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ−タンパク質相互作用である。前者は、ＫｃＨＡＣ（Δ）およびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔによって（ｉｓＨＡＣ、ｉｓｔＨＡＣおよびｉｓＫｃＨＡＣΔによっても）対処される。後者は、ｉｓＨＡＣ、ｉｓｔＨＡＣおよびｉｓＫｃＨＡＣΔによって対処される。
【図２６】ウシ（配列番号１８２）、ウマ（配列番号１８５）およびブタ（配列番号１８６）のＩγ１−Ｓγ１の分析結果を示す。（Ａ）ウシおよびブタのＩγ１−Ｓγ１間の比較は、ウシおよびブタのＩγ１領域（楕円形）間で若干の相同性があることを示し、（Ｂ）に潜在的ＥＣＳを丸で示す。（Ｃ）ウシおよびウマのＩγ１−Ｓγ１間の比較は、ウシおよびウマのＩγ１領域（楕円形）間で若干の相同性があることを示す。（Ｄ）ウマおよびブタのＩγ１−Ｓγ１間の比較は、ウマおよびブタのＩγ１領域（楕円形）間で若干の相同性があることを示す。
【図２７】Ｉγ１領域のＥＣＳがよく保存されていることを示す。（Ａ）ヒト（配列番１６６）、ウシ（配列番号１８７）、ブタ（配列番号１８９）およびウマ（配列番号１８８）におけるΙγ１のＥＣＳの多重配列アラインメント。（Ｂ）有蹄動物におけるΙγ１のＥＣＳの多重配列アラインメント。
【図２８】有蹄動物におけるＩｇＭの多重配列アラインメントを示す。ヒツジ（配列番号１７４）、ウシ（配列番号１５２）、ブタ（配列番号１７５）およびウマ（配列番号１７６）。
【図２９】ウシＩｇ重鎖３’エンハンサーによるＨＡＣのウシ化を示す。（Ａ）ヒト、ウシおよびマウス３’Ｅ−αエンハンサー間の構造上の保存。（Ｂ）ＨＡＣ上の３’Ｅ−α１のウシ化のために使用したウシ３’Ｅを含む領域を示す。（Ｃ）ＨＡＣ上の３’α１のウシ化のために使用したウシゲノム断片。（Ｄ）μ−ＨＡＣの構造を示す。（Ｅ）ＨＡＣの構造的完全性をａｔｔＰ／ａｔｔＢの組み換え後に確認した。
【図３０】有蹄動物およびヒトにおけるＩｇＧ１のアミノ酸配列の多重配列アラインメントを示す。ウシ（配列番号１９６）、ウマ（配列番号１９７）、ブタ（配列番号１９８）およびヒト（配列番号１９９）。
【図３１】ヒト−ウシキメラＩｇＭ抗体（ＣＨ−ＴＭ２ウシ化ＩｇＭ）−ｃＩｇＭ（ＣＨ２）配列（配列番号２００）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
引用される全ての引用文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。特に明記しない限り、本願において利用される技術は、分子クローニング：実験室マニュアル（サムブルックら、１９８９、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス）、遺伝子発現技術（酵素学の方法、１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ（編）、１９９１、アカデミックプレス社、カリフォルニア州サンディエゴ）、酵素学の方法の中の「タンパク質精製ガイド」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ（編）、（１９９０）アカデミックプレス社）；ＰＣＲプロトコル：方法および応用へのガイド（Ｉｎｎｉｓら、１９９０、アカデミックプレス社、カリフォルニア州サンディエゴ）、動物細胞培養：基本技術のマニュアル、第２版、（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７、Ｌｉｓｓ社、ニューヨーク州ニューヨーク）、遺伝子導入および発現プロトコル、１０９〜１２８ページ、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ（編）、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ社、ニュージャージー州クリフトン）、ならびにＡｍｂｉｏｎ社の１９９８カタログ（Ａｍｂｉｏｎ社、テキサス州オースティン）などのいくつかの周知の引用文献のいずれかに見出すことができる。
【００２０】
文脈が特に明確に示さない限り、本明細書で使用される単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数の指示対象を含む。本明細書で使用される「および」は、特に明記しない限り、「または」と互換的に使用される。
【００２１】
文脈が特に明確に示さない限り、本発明の任意の態様の全ての実施形態は、組み合わせて使用することができる。
【００２２】
文脈が特に明確に要求しない限り、本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、排他的または網羅的な意味とは対照的に包括的な意味、すなわち、「〜を含むが、これらに限定されない」という意味で解釈されるべきである。単数または複数で使用される単語も、それぞれ、複数および単数を含む。さらに、「本明細書」、「上記」、「下記」および類似の意味の用語は、本願において使用される場合に、本願の任意の特定の部分ではなく、本願全体を指す。
【００２３】
本開示の実施形態の説明は、網羅的でもなければ、本開示を開示される正確な形態に限定するものでもない。本開示の特定の実施形態および例は、例示の目的のために本明細書に記載されているが、当業者が認識するように、様々な同等の変更が本開示の範囲内で可能である。
【００２４】
第一の態様において、本発明は、
（ａ）抗体重鎖をコードする各遺伝子が、クラススイッチ調節エレメントに作動可能に連結されている１以上のヒト抗体重鎖と、
（ｂ）１以上のヒト抗体軽鎖と、
（ｃ）１以上のヒト抗体代替軽鎖、および／または有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域と、
をコードする遺伝子を含むヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターを提供し、１以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の少なくとも１つのクラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている。
【００２５】
本発明のＨＡＣベクターは、例えば、本発明の方法について記載したように、トランスジェニック動物による完全なヒト抗体の大規模生産のために使用することができる。以下の実施例に示すように、ＨＡＣベクターを用いて、以前のＨＡＣと比較して、有蹄動物において予想外に高レベルの抗原特異的ポリクローナル抗体を産生することができる。
【００２６】
本発明において、「ＨＡＣベクター」という用語は、少なくともヒト染色体由来のセントロメア配列、テロメア配列、および複製起点を含むベクターを意味し、所与の用途に望まれる任意の他の配列を含んでもよい。宿主細胞に存在する場合には、ＨＡＣベクターは、宿主細胞の核内染色体とは独立して存在する。任意の適切な方法を用いて、以下の実施例に記載のものを含むがこれらに限定されないＨＡＣベクターを調製し、そのＨＡＣに目的の核酸を挿入することができる。ＨＡＣベクターは、当業者に知られているように、二本鎖のＤＮＡベクターである。
【００２７】
本発明のＨＡＣベクターは、ヒト抗体重鎖をコードする１以上の遺伝子を含む。任意のヒト抗体重鎖またはヒト抗体重鎖の組み合わせは、ＨＡＣ上の１以上の核酸によってコードされてもよい。様々な実施形態において、ヒト抗体重鎖のＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥおよびＩｇＤのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、または全９種類は、１以上のコピー数でＨＡＣ上にコードされていてもよい。一実施形態において、ＨＡＣは、単独で、または１、２、３、４、５、６、７、または他の８種類のヒト抗体鎖をコードする遺伝子と組み合わせて、ヒトＩｇＭ抗体重鎖をコードする遺伝子を含む。好ましい一実施形態において、ＨＡＣは、少なくともヒトＩｇＧ１抗体重鎖をコードする遺伝子を含む。この実施形態において、ＨＡＣが、ヒトＩｇＭ抗体重鎖をコードする遺伝子または有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域（ウシ重鎖定常領域など）をコードするようにキメラ化されたヒトＩｇＭ抗体重鎖をコードする遺伝子を含むことがさらに好ましい。別の実施形態において、ＨＡＣは、少なくともヒトＩｇＡ抗体重鎖をコードする遺伝子を含む。この実施形態において、ＨＡＣが、ヒトＩｇＭ抗体重鎖をコードする遺伝子または有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域（ウシ重鎖定常領域など）をコードするようにキメラ化されたヒトＩｇＭ抗体重鎖をコードする遺伝子を含むことがさらに好ましい。別の好ましい実施形態において、ＨＡＣは、全９種類の抗体重鎖をコードする遺伝子を含み、ヒトＩｇＭ抗体重鎖をコードする遺伝子は、有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域をコードするようにキメラ化されていることがより好ましい。別の実施形態において、ＨＡＣは、ヒト抗体重鎖をコードするヒト染色体１４の一部を含んでもよい。ヒト抗体重鎖の可変領域遺伝子および定常領域遺伝子はクラスターを形成し、ヒト重鎖遺伝子座は、ヒト１４番染色体上の１４ｑ３２に位置している。一実施形態において、ＨＡＣに挿入されたヒト１４番染色体の領域は、ヒト１４番染色体の１４ｑ３２領域のヒト抗体重鎖の可変領域および定常領域を含む。
【００２８】
本発明のＨＡＣベクターにおいて、ヒト抗体重鎖をコードする核酸の少なくとも１つのクラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている。このクラススイッチ調節エレメントは、抗体重鎖定常領域の５’側にある核酸を指す。各重鎖定常領域遺伝子は、独自のスイッチ領域と作動可能に連結されており（すなわち、その制御下にあり）、独自のＩ−エクソンとも結合している。クラススイッチ調節エレメントは、クラススイッチ組み換えを調節し、Ｉｇ重鎖のアイソタイプを決定する。各重鎖アイソタイプの生殖系列転写は、Ｉ−エクソンのちょうど５’側に位置するプロモーター／エンハンサーエレメントによって駆動され、それらのエレメントはサイトカインまたは他の活性化因子応答性である。クラススイッチの単純なモデルにおいて、特定の活性化因子および／またはサイトカインは、そのクラススイッチ調節エレメント（すなわち、活性化因子／サイトカイン応答性プロモーターおよび／またはエンハンサー）の各重鎖アイソタイプの生殖系列転写を誘導する。クラススイッチは、各Ｉｇ重鎖（ＩＧＨ）遺伝子座に関連するスイッチ領域からのＩ−エクソンの転写によって先行される。各重鎖定常領域遺伝子は、それ自身のスイッチ領域に連結されている。
【００２９】
任意の適切な有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントを使用することができる。本明細書で使用する「有蹄動物」は、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、シマウマ、シカ、オウシ、ヤギ、ヒツジ、およびカモシカを含むがこれらに限定されない任意の適切な有蹄動物であってよい。例えば、以下に記載するヒト重鎖遺伝子アイソタイプは、
ＩｇＭ：Ｉμ−Ｓμ
ＩｇＧ１：Ｉγ１−Ｓγ１
ＩｇＧ２：Ｉγ２−Ｓγ２
ＩｇＧ３：Ｉγ３−Ｓγ３
ＩｇＧ４：Ｉγ４−Ｓγ４
ＩｇＡ１：Ｉα１−Ｓα１
ＩｇＡ２：Ｉα２−Ｓα２
ＩｇＥ：Ｉε−Ｓε
のクラススイッチ調節エレメントを有する。
【００３０】
様々な実施形態において、ＨＡＣ上のヒト抗体重鎖遺伝子のうちの１、１以上、または全ては、有蹄動物のＩμ−Ｓμ、Ｉγ−Ｓγ、Ｉα−Ｓα、またはＩε−Ｓεのクラススイッチ調節エレメントを含むがこれらに限定されない有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されているクラススイッチ調節エレメントを有する。一実施形態において、（配列番号１８３の中のものなどの）ＨＡＣ上のヒトＩｇＧ１重鎖をコードする核酸のＩγ１−Ｓγ１ヒトクラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物のＩγ１−Ｓγ１クラススイッチ調節エレメントで置換される。代表的な有蹄動物のＩγ１−Ｓγ１クラススイッチ調節エレメントには、ウシＩｇＧ１のＩγ１−Ｓγ１クラススイッチ調節エレメント（配列番号１８２）、ウマＩγ１−Ｓγ１クラススイッチ調節エレメント（配列番号１８５）、およびブタのＩγ１−Ｓγ１クラススイッチ調節エレメント（配列番号１８６）が含まれる。しかし、対応する重鎖アイソタイプの有蹄動物クラススイッチ調節エレメントでヒトクラススイッチ調節エレメントを置換する必要はない。したがって、例えば、ＨＡＣ上のヒトＩｇＧ３重鎖をコードする核酸のＩγ３−Ｓγ３ヒトクラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物Ｉγ１−Ｓγ１クラススイッチ調節エレメントで置換することができる。本明細書の教示に基づいて当業者に明らかであるように、任意のこのような組み合せは、本発明のＨＡＣに使用することができる。
【００３１】
別の実施形態において、ＨＡＣは、ＨＡＣ上の１以上のヒト抗体重鎖定常領域をコードする核酸と関連するエンハンサーエレメントを置換するための少なくとも１つの有蹄動物エンハンサーエレメントを含む。ヒト抗体重鎖遺伝子に関連する２つの３’エンハンサー領域（アルファ１およびアルファ２）がある。エンハンサーエレメントは、重鎖定常領域の３’側にあり、クラススイッチを調節するのにも役立つ。３’Ｅαエンハンサーを含むがこれに限定されない任意の適切な有蹄動物エンハンサーを使用することができる。使用することができる３’Ｅαエンハンサーの非限定的な例としては、３’Ｅα、３’Ｅα１、および３’Ｅα２が挙げられる。ＨＡＣに使用でき、ヒトエンハンサーを置換することができるウシの代表的な３’Ｅαエンハンサーエレメントには、ウシＨＳ３エンハンサー（配列番号１９０）、ウシＨＳ１２エンハンサー（配列番号１９１）、およびウシエンハンサーＨＳ４が含まれるがこれらに限定されない。この実施形態は、ＨＡＣが、ヒト１４番染色体の１４ｑ３２領域のヒト抗体重鎖の可変領域および定常領域を含む実施形態において特に好ましい。
【００３２】
本発明のＨＡＣベクターは、ヒト抗体軽鎖をコードする１以上の遺伝子を含んでもよい。任意の適切なヒト抗体軽鎖をコードする遺伝子は、本発明のＨＡＣベクター中で使用することができる。ヒト抗体軽鎖は、２種類の遺伝子、すなわち、カッパ／κ鎖遺伝子およびラムダ／λ鎖遺伝子を含む。一実施形態において、ＨＡＣは、１以上のコピー数でカッパおよびラムダの両方をコードする遺伝子を含む。カッパ鎖の可変領域および定常領域は、ヒト２番染色体の２ｐ１１．２−２ｐ１２に位置しており、ラムダ鎖は、ヒト２２番染色体の２２ｑ１１．２に位置するクラスターを形成する。したがって、一実施形態において、本発明のＨＡＣベクターは、２ｐ１１．２−２ｐ１２領域のカッパ鎖遺伝子クラスターを含むヒト２番染色体断片を含む。別の実施形態において、本発明のＨＡＣベクターは、２２ｑ１１．２領域のラムダ鎖遺伝子クラスターを含むヒト２２番染色体断片を含む。
【００３３】
別の実施形態において、ＨＡＣベクターは、ヒト抗体代替軽鎖をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。ヒト抗体代替軽鎖をコードする遺伝子は、ｐｒｅ−Ｂ細胞受容体（ｐｒｅＢＣＲ）を構成するヒトｐｒｏ−Ｂ細胞において遺伝子再構成により産生される抗体重鎖に関連付けられた仮想抗体軽鎖をコードする遺伝子を指す。ＶｐｒｅＢ１（配列番号１５４）、ＶｐｒｅＢ３（配列番号１７８）およびλ５（ＩｇＬＬ１としても知られる、配列番号１５７）ヒト抗体代替軽鎖、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の適切なヒト抗体代替軽鎖をコードする遺伝子を使用することができる。ＶｐｒｅＢ遺伝子およびλ５遺伝子は、ヒト２２番染色体の２２ｑ１１．２のヒト抗体ラムダ鎖遺伝子座内に位置している。したがって、一実施形態において、ＨＡＣは、ＶｐｒｅＢ遺伝子およびλ５遺伝子を含むヒト２２番染色体の２２ｑ１１．２領域を含んでもよい。本発明のヒトＶｐｒｅＢ遺伝子は、ＶｐｒｅＢ１遺伝子（配列番号１５４）およびＶｐｒｅＢ３遺伝子（配列番号１７８）のいずれかまたは両方を提供し、一実施形態において、ＶｐｒｅＢ１遺伝子およびＶｐｒｅＢ３遺伝子の両方を提供する。
【００３４】
さらに別の実施形態において、ＨＡＣベクターは、有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子を含む。この実施形態において、ＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＭ抗体重鎖可変領域を有するキメラとして発現する。ウシＩｇＭ（配列番号１５２）、ウマＩｇＭ（配列番号１７６）、ヒツジＩｇＭ（配列番号１７４）、およびブタＩｇＭ（配列番号１７５）を含むがこれらに限定されない任意の適切な有蹄動物ＩｇＭ重鎖抗体の定常領域をコードする核酸を使用することができる。一実施形態において、キメラＩｇＭは、配列番号２００の配列を含む。ＩｇＭ重鎖分子を介するｐｒｅ−ＢＣＲ／ＢＣＲシグナル伝達は、Ｂ細胞膜分子のＩｇ−α／Ｉｇ−βと相互作用し、細胞内でのシグナル伝達を引き起こすことによって、Ｂ細胞の増殖および発達を促進する。ＩｇＭの膜貫通領域および／または他の定常領域は、シグナル伝達のためのＩｇ−α／Ｉｇ−βとの相互作用に重要な役割を担うと考えられる。ＩｇＭ重鎖定常領域の例としては、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４などの定常領域ドメイン、ならびにＴＭ１およびＴＭ２などのＢ細胞の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする核酸を含む。本発明のヒト人工染色体ベクターに含まれる有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域をコードする核酸は、上記のＩｇＭ重鎖定常領域中の領域が、Ｂ細胞受容体のシグナルまたはＢ細胞増殖／発達を十分に誘導し得る範囲内にあるかぎり、特に限定されるものではない。一実施形態において、有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域をコードする核酸は、有蹄動物に由来する膜貫通および細胞質のＴＭ１ドメインならびにＴＭ２ドメインを提供し、他の実施形態において、有蹄動物に由来するＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメイン、およびＴＭ２ドメインまたは有蹄動物に由来するＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメイン、およびＴＭ２ドメインをコードする。
【００３５】
一実施形態において、ウシのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子は、ウシ内因性ＩｇＭ重鎖遺伝子が位置するＩＧＨＭ領域に含まれるウシＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子（ＩＧＨＭ由来）、またはＩＧＨＭＬ１領域中のウシＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子（ＩＧＨＭＬ１由来）である。別の実施形態において、ウシＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子は、ＩＧＨＭ領域に含まれる。
【００３６】
さらなる実施形態において、ＨＡＣは、ヒト重鎖（例えば、ＩｇＧ１重鎖などのヒトＩｇＧ重鎖）をコードする遺伝子を含むヒト抗体重鎖をコードする遺伝子を含み、ヒト重鎖遺伝子の定常領域の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、有蹄動物に由来する重鎖（例えば、ＩｇＧ１重鎖などの有蹄動物ＩｇＧ重鎖）定常領域遺伝子の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインで置換されている。一実施形態において、（ウシなどの）有蹄動物に由来する（ＩｇＧ１などの）ＩｇＧ重鎖定常領域の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをコードする遺伝子を用いて、ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子の対応する領域を置換する。別の実施形態において、（ウシなどの）有蹄動物に由来する（ＩｇＧ１などの）ＩｇＧ重鎖定常領域のＴＭ１およびＴＭ２ドメインをコードする遺伝子を用いて、ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子の対応する領域を置換する。別の実施形態において、（ウシなどの）有蹄動物に由来する（ＩｇＧ１などの）ＩｇＧ重鎖定常領域のＣＨ１−ＣＨ４ドメインならびに／またはＴＭ１およびＴＭ２ドメインの１以上をコードする遺伝子を用いて、ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子の対応する領域を置換する。
【００３７】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合せに従って、ＨＡＣベクターを含むトランスジェニック有蹄動物を提供する。本発明のＨＡＣベクターを含むトランスジェニック有蹄動物は、本発明のヒト人工染色体ベクターが導入された動物を指す。本発明のＨＡＣを有するトランスジェニック有蹄動物は、その動物が、ヒト人工染色体断片をその細胞に導入することのできるトランスジェニック有蹄動物であるかぎり、特に限定されるものではなく、任意の非ヒト動物、例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタなどの有蹄動物を使用してもよい。一態様において、このトランスジェニック有蹄動物はウシある。本発明のＨＡＣベクターを有するトランスジェニック有蹄動物は、本明細書に記載のものなどの任意の適切な技術を用いて、例えば、宿主動物の卵母細胞に本発明のＨＡＣベクターを導入することによって作製することができる。本発明のＨＡＣベクターは、例えば、マイクロセル融合法によって宿主有蹄動物に由来する体細胞に導入してもよい。その後、ＨＡＣベクターを有する動物は、細胞の核またはクロマチン凝集体を卵母細胞に移植し、この卵母細胞またはこの卵母細胞から形成される胚を出産させる宿主動物の子宮に移植することによって作製することができる。上記の方法で作製した動物が本発明のヒト人工染色体ベクターを有するか否かは、Ｋｕｒｏｉｗａら（Ｋｕｒｏｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，１０８６−１０９０，２０００およびＫｕｒｏｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０，８８９−８９４）の方法により確認することができる。
【００３８】
第３の態様において、本発明は、ゲノムに導入され、
（ａ）抗体重鎖をコードする各遺伝子が、クラススイッチ調節エレメントに作動可能に連結されている１以上のヒト抗体重鎖と、
（ｂ）１以上のヒト抗体軽鎖と、
（ｃ）１以上のヒト抗体代替軽鎖、および／または有蹄動物に由来するＩｇＭ重鎖定常領域と、
をコードする遺伝子を含むトランスジェニック有蹄動物を提供し、１以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の少なくとも１つのクラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている。
【００３９】
この第３の態様において、ＨＡＣについて本明細書に記載したように、トランスジェニック有蹄動物は、核酸の任意の実施形態または実施形態の組み合せを含んでもよいが、核酸は、ＨＡＣ中に存在するというよりも、有蹄動物の染色体に組み込まれている。
【００４０】
第４の態様において、本発明は、ヒト抗体を産生する方法であって、（ａ）本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのトランスジェニック有蹄動物に標的抗原を投与し、有蹄動物の血清または血漿中に標的抗原に特異的なヒト抗体を産生および蓄積させることと、（ｂ）この有蹄動物の血清または血漿からこの標的抗原に特異的なヒト抗体を回収することと、を含む方法を提供する。一実施形態において、抗体を回収することは、（ｉ）トランスジェニック有蹄動物からリンパ球を単離することと、（ｉｉ）このリンパ球からヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することと、（ｉｉｉ）この標的抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体をこのハイブリドーマから回収することと、を含む。別の実施形態において、このトランスジェニック有蹄動物のリンパ球は、このトランスジェニック有蹄動物のリンパ節から単離される。さらなる実施形態において、このトランスジェニック有蹄動物を標的抗原で過免疫する。
【００４１】
標的抗原に特異的なヒト抗体は、本発明のＨＡＣベクターを有するトランスジェニック有蹄動物を所望の標的抗原で免疫し、トランスジェニック有蹄動物の血清中で標的抗原特異的ヒト抗体を産生させ、この標的抗原特異的ヒト抗体をトランスジェニック有蹄動物の血清から回収することによって生成することができる。本発明のＨＡＣベクターを有するトランスジェニック有蹄動物を免疫化するための標的抗原は、特に限定されないが、例としては、腫瘍関連抗原、アレルギーまたは炎症に関連する抗原、循環器疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、神経変性疾患に関連する抗原、およびウイルスまたは細菌感染に関連する抗原が挙げられる。
【００４２】
腫瘍関連抗原の例としては、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５８、ＣＤ１６０、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ２２７、アドレノメデュリン、アンジオポエチン関連タンパク質４（ＡＲＰ４）、オーロラ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−ＤＣ、インテグリン、骨髄間質抗原２（ＢＳＴ２）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、カドヘリン、ｃｃ−ケモカイン受容体（ＣＣＲ）４、ＣＣＲ７、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、システインリッチ線維芽細胞増殖因子受容体１（ＣＦＲ−１）、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｙｃ、コラーゲン、ＣＴＡ、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、ＣＴＬＡ−４、サイトケラチン−１８、ＤＦ３、Ｅ−カセリン（ｃａｔｈｅｒｉｎ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３）、ＥＧＦＲ４（ＨＥＲ４）、エンドグリン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、エフリン、エフリン受容体（Ｅｐｈ）、ＥｐｈＡ２、エンドセリアーゼ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｓｅ）−２（ＥＴ２）、ＦＡＭ３Ｄ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体ホモログ１（ＦｃＲＨ１）、フェリチン、線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）、ＦＧＦ８受容体、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、葉酸受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体４（ＦＺＤ−４）、Ｇ２５０、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ガングリオシド（ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、およびＧＭ３など）、グロボＨ、ｇｐ７５、ｇｐ８８、ＧＰＲ−９−６、ヘパラナーゼＩ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＨＧＦ受容体、ＨＬＡ抗原（ＨＬＡ−ＤＲなど）、ＨＭ１．２４、ヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ）、ｈＲＳ７、熱ショックタンパク質９０（ｈｓｐ９０）、イディオタイプエピトープ、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ受容体（ＩＧＦＲ）、インターロイキン（ＩＬ−６、およびＩＬ−１５など）、インターロイキン受容体（ＩＬ−６Ｒ、およびＩＬ−１５Ｒなど）、インテグリン、免疫受容体転座関連−４（ＩＲＴＡ−４）、カリクレイン１、ＫＤＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＳ１／４、ランプ１、ランプ２、ラミニン５、ルイスｙ、シアリルルイスｘ、リンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）、ＬＵＮＸ、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、メソセリン、ＭＩＣＡ、ミューラー阻害物質ＩＩ型受容体（ＭＩＳＩＩＲ）、ムチン、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、Ｎｅｃｌ−５、ノッチ１、オステオポンチン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ受容体、血���板因子４（ＰＦ−４）、ホスファチジルセリン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質／ペプチド（ＰＴＨｒＰ）、ＮＦ−κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、ヒアルロン酸を介した運動性受容体（ＲＨＡＭＭ）、ＲＯＢＯ１、ＳＡＲＴ３、セマフォリン４Ｂ（ＳＥＭＡ４Ｂ）、分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）、ＳＭ５−１、スフィンゴシン−１−リン酸塩、腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、ＴＧＦ−β、Ｔｈｙ−１、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２受容体、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン１（ＴＩＭ−１）、ヒト組織因子（ｈＴＦ）、Ｔｎ抗原、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、トムセン−フリーデンライヒ抗原（ＴＦ抗原）、ＴＮＦ受容体、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＲＡＩＬ受容体（ＤＲ４、およびＤＲＳ）、システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２（ＡＳＣＴ２）、ｔｒｋＣ、ＴＲＯＰ−２、ＴＷＥＡＫ受容体Ｆｎ１４、ＩＶ型コラゲナーゼ、ウロキナーゼ受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３）、ビメンチン、ならびにＶＬＡ−４が挙げられる。
【００４３】
アレルギーまたはフレアに関連する抗原の例としては、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＴＮＦ、ＴＮＦ受容体、ＣＣＲ４、ケモカイン、およびケモカイン受容体などが挙げられる。循環器疾患に関連する抗原の例としては、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ受容体、血液凝固因子、およびＩｇＥなどが挙げられる。ウイルスまたは細菌感染に関連する抗原の例としては、ｇｐ１２０、ＣＤ４、ＣＣＲ５、ベロ毒素、炭疽菌防御抗原、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、狂犬病抗原、および水痘帯状疱疹抗原などが挙げられる。その他の例としては、Ｔ細胞表面膜タンパク質混合物、Ｒｈ（Ｄ）抗原、ガラガラヘビ毒、およびジゴキシンなどが挙げられる。
【００４４】
トランスジェニック有蹄動物に、例えば、完全フロイントアジュバントまたは水酸化アルミニウムゲルなどの適切なアジュバント、および百日咳菌ワクチンと共に標的抗原を皮下、静脈内、または腹腔内投与することにより免疫を行う。一実施形態において、免疫は、抗原に対する保護力価を動物に単に与えることを上回る予防接種を指す過免疫を含む。例えば、保護力価が１：１２０である場合、免疫の受動伝達に保護力価を与えるために、これらの力価を生物学的治療薬の生成中に希釈することができるように１：１０，２４０まで動物に過免疫することができる。本発明のＨＡＣベクターを有するトランスジェニック有蹄動物に標的抗原を投与する形態の例としては、ペプチド、タンパク質、細菌、ウイルス、細胞、および生体組織片などが挙げられる。標的抗原が部分ペプチドである場合には、コンジュゲートは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体タンパク質を用いて生成され、免疫原として使用される。最初の投与後１〜４週間ごとに、標的抗原を１〜１０回投与する。各投与から１〜１４日後に、血清中の抗体価を測定するために、血液を動物から採取する。
【００４５】
血清中に含まれる標的抗原特異的なヒト抗体を検出および測定するための方法の例としては、酵素結合免疫吸着アッセイによる結合アッセイなどが挙げられる。血清中のヒト抗体の結合量は、抗原を発現する細胞と共にヒト抗体を含む血清をインキュベートし、次いで、ヒト抗体を特異的に認識する抗体を用いることによって測定してもよい。
【００４６】
さらに、これらの方法に加えて、抗体は、当該分野で公知の方法に従って、抗体の標的抗原を同定することによって選択してもよい。血清からヒト抗体を回収する方法の例としては、プロテインＡ担体、プロテインＧ担体、またはヒト免疫グロブリンに特異的な抗体が担持された担体上にヒト抗体を吸着させることによって精製する方法が挙げられる。ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、および限外濾過などのタンパク質の精製に使用される方法を組み合わせてもよい。
【００４７】
上記の方法によって産生されるヒト抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。様々な種類の抗体を調製および利用する方法は、当業者によく知られており、本発明を実施するのに適する（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）参照）。ハイブリドーマの調製方法の例は、以下の工程を含む：（１）標的抗原でトランスジェニック有蹄動物を免疫する工程、（２）このトランスジェニック有蹄動物から（すなわち、リンパ節から）抗体産生細胞を回収する工程、（３）抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合する工程、（４）上記工程で得られた融合細胞から、標的抗原と反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択する工程、（５）選択したハイブリドーマから、標的抗原と反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択する工程。
【００４８】
実施例
方法
全ての動物の処置は、Ｈｅｍａｔｅｃｈのガイドラインを遵守して実施され、プロトコルは施設内動物管理使用委員会によって承認された。
【００４９】
ゲノムライブラリー
ゲノムＤＮＡを、κＨＡＣベクター（κＣ１−１）を含むＣＨＯ細胞またはウシ線維芽細胞株６９３９および３４２７のいずれかから抽出し、それぞれκＨＡＣまたはウシゲノムライブラリーを構築した。各λファージベースのゲノムライブラリーは、カスタムライブラリー構築サービス（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ株式会社）を介してλＦＩＸ ＩＩベクターを用いて構築した。ライブラリースクリーニングおよびλファージＤＮＡ抽出／精製を先に報告された５ように行った。ウシのゲノムＢＡＣライブラリー（ＣＨＯＲＩ−２４０）を、小児病院オークランド研究所から購入し、取扱説明書に従ってスクリーニングを行った。
【００５０】
ターゲティングベクターの構築
各ベクターの構築を、以下に記載のいくつかの変更を加えて、先に報告された５、１２、２０、２１ように行った。
【００５１】
ｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏｌｏｘ２２７２Ｆ９Ｒ９
相同アームのためのゲノムＤＮＡ断片を、１０秒間９８℃および９分間６８℃の４０サイクルで、ＰＣＲプライマーペアのｋＤ−Ｆ９およびｋＤ−Ｒ９を用いることによって増幅した。このＰＣＲ産物を、プラスミドｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏｌｏｘ２２７２のＢａｍ  ＨＩ部位にサブクローニングし、以下のように構築した。オリゴＤＮＡを含む改変ｌｏｘ２２７２（オリゴＤＮＡペア１；下記の表１参照）を、アニーリング後、プラスミドｐＰＵＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＨｉｎｄ  ＩＩＩにクローニングし、プラスミドｐＰＵＲｌｏｘ２２７２を作製した。一方、別のプラスミドｐＴＥＬ’ｈｉｓＤＰｍを、前述のプラスミドｐＴＥＬｐｕｒｏを改変することによって構築し、その際、ｐｕｒｏ遺伝子はｈｉｓＤ遺伝子で置換され、Ｅｃｏ  ＲＩ部位はＳｒｆ  Ｉで置換され、Ｓｐｅ Ｉ部位はＰｍｅ  Ｉ部位に変換された。次いで、ｐＰＵＲｌｏｘ２２７２からのＢａｍ  ＨＩ断片を、平滑化した後、ｐＴＥＬ’ｈｉｓＤＰｍのＰｍｅ  Ｉ部位にクローニングし、ｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏｌｏｘ２２７２Ｆ９Ｒ９を作製した。
【００５２】
ｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏＳＬＦ２Ｒ２
プラスミドｐＴＥＬｐｕｒｏを、さらにＥｃｏ  ＲＩ部位をＳｒｆ  Ｉ、次いで、Ｐｍｅ  Ｉに変換し、ｐｕｒｏ遺伝子をＣＡＧｚｅｏ遺伝子｛ｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏ（Ｓｒ）Ｐｍ｝に置換することによって改変した。一方、相同アームのためのゲノムＤＮＡ断片を、ＰＣＲプライマーペアのＳＬ−Ｆ２およびＳＬ−Ｒ２を用いて、１０秒間９８℃および９分間６８℃の４０サイクルで増幅した。このＰＣＲ産物を、プラスミドｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏ（Ｓｒ）ＰｍのＢａｍ  ＨＩ部位にサブクローニングし、ｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏＳＬＦ２Ｒ２を作製した。
【００５３】
ｐ５５３ＣＡＧｌｏｘ２２７２ＢｓｒＤＴ
ＨＣＦ２遺伝子の相同性アームの配列をＡＰ０００５５３の配列で置換することによって前述のターゲティングベクターｐＨＣＦ２１ｏｘＰＨｙｇを改変し、これを、ＰＣＲプライマーペアの５５３−Ｆ３および５５３−Ｒ３を用いて、１０秒間９８℃および１５分間６８℃の４０サイクルで増幅し、ｐ５５３１ｏｘＰＨｙｇ（Ｆ）を作製した。このプラスミドを、Ｎｏｔ  Ｉで消化し、自己連結させ、その後、Ｓｒｆ  Ｉ部位にＤＴ−Ａ断片をクローニングした。一方、ｐＤＲＩＶＥ−ＣＡＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を以下のように改変した。ｌａｃＺ断片（Ｂｓｒ  ＧＩ−Ｅｃｏ  ＲＩ）を、アニーリング後に、ｌｏｘＰ配列を含むオリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡペア２、下記表１参照）で置換し、次いで、Ｓｄａ  Ｉ−Ｓｗａ  Ｉ断片をＰｓｔ  Ｉ／Ｓｍａ  Ｉで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングし、ｐＣＡＧｌｏｘＰを作製した。ｌｏｘＰ配列を、さらに、２つのオリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡペア３、下記表１参照）をアニーリングした後に生成したｌｏｘ２２７２含有配列で置換した。次いで、ｂｓｒ遺伝子をＳｐｅ  Ｉ部位に付加し、ｐＣＡＧｌｏｘＰ２２７２ｂｓｒを作製した。最後に、Ｎｏｔ  Ｉ−Ｋｐｎ  Ｉ断片（ＣＡＧ−ｌｏｘ２２７２−ポリＡ−ｂｓｒ）をＮｏｔ  Ｉ部位にクローニングし、ｐ５５３ＣＡＧｌｏｘ２２７２ＢｓｒＤＴを得た。
【００５４】
ｐＳＣ３５５ＣＡＧｌｏｘ５１１ｈｉｓＤＤＴ
相同アームのためのゲノムＤＮＡ断片を、ＰＣＲプライマーペア、ＳＣ３５５−Ｆ３およびＳＣ３５５−Ｒ３を用いて、１０秒間９８℃および１５分間６８℃の４０サイクルで増幅した。このＰＣＲ産物を、Ｋｐｎ  Ｉ部位をＳｒｆ  Ｉ部位に変換したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｐｅ  Ｉ部位にサブクローニングし、ｐＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３を作製した。ｌｏｘＰ配列を、２つのオリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡペア４、下記の表１参照）をアニーリングした後に生成したｌｏｘ５１１含有配列とさらに置換することによって、pＣＡＧｌｏｘＰプラスミドを同様に改変した。次いで、ｈｉｓＤ遺伝子をＳｐｅ  Ｉ部位に付加し、ｐＣＡＧｌｏｘ５１１ｈｉｓＤを作製した。Ｎｏｔ  Ｉ−Ｋｐｎ  Ｉ断片（ＣＡＧ−ｌｏｘ５１１−ポリＡ−ｈｉｓＤ）をｐＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３のＥｃｏ  ＲＶ部位にクローニングした。最後に、ＤＴ−ＡカセットをＮｏｔ  Ｉにサブクローニングし、ｐＳＣ３５５ＣＡＧｌｏｘ５１１ｈｉｓＤＤＴを得た。
【００５５】
ｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）ｈｙｇｐｕｒｏｌｏｘ５１１ＤＴ
相同アームのためのゲノムＤＮＡ断片を、ＰＣＲプライマーペアの１４ＣＥＮ−Ｆおよび１４ＣＥＮ−Ｒを用いて、１０秒間９８℃および１５分間６８℃の４０サイクルで増幅した。このＰＣＲ産物を、Ｋｐｎ  Ｉ部位をＰｍｅ  Ｉ部位に変換したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍ  ＨＩ部位にサブクローニングし、ｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）を作製した。この改変ｌｏｘ５１１含有オリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡペア５、下記表１参照）を、アニーリング後に、プラスミドｐＰＵＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＰＵＲｌｏｘ５１１を作製した。ｐＰＵＲｌｏｘ５１１のＢａｍ  ＨＩ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＢａｍ  ＨＩ部位にクローニングし、ｈｙｇ遺伝子をＥｃｏＲＶにクローニングした後、ｐＨｙｇＰｕｒｏｌｏｘ５１１を作製した。Ｎｏｔ  Ｉ−Ｋｐｎ  Ｉ断片を、ｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）のＨｐａ  Ｉ部位にクローニングした。最後に、ＤＴ−Ａカセットを、Ｐｍｅ  Ｉにサブクローニングし、ｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）ｈｙｇｐｕｒｏｌｏｘ５１１ＤＴを得た。
【００５６】
ｐＲＮＲ２ｌｏｘＰｂｓｒＤＴ
単にＤＴ−Ａカセットを付加することによって、前述のベクターｐＲＮＲ２ｌｏｘＰｂｓｒ（Ｒｅｆ．２０）を改変し、ｐＲＮＲ２ｌｏｘＰｂｓｒＤＴを構築した。
【００５７】
ｐＣＨ１ＣＡＧｚｅｏ（Ｒ）ＤＴ（Ｆ）
ゲノムλファージライブラリーを、カスタムライブラリー構築サービス（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ社）を介してλＦＩＸ ＩＩベクターを用いてκＨＡＣを含むＣＨＯ細胞から構築した。このゲノムライブラリーを、ＰＣＲペアのｈＣμ−ＦＲを用いて増幅したＰＣＲ産物であるプローブを用いてｈＩＧＨＭ定常領域についてスクリーニングし、次いで、クローン＃１、＃４、および＃７を単離した。クローン＃４から、１．７ｋｂのＰｍｌ  Ｉ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｍａ  Ｉ部位にサブクローニングし、ｐＣＨ１Ｓ（Ｆ）を作製した。Ｓａｌ  Ｉ−ウシＩＧＨＭゲノム断片がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたプラスミドｐＢＣμＡＹ３７−９５からの１ｋｂのＳａｃ  Ｉ−Ｐｍｌ  Ｉ断片を、ｐＣＨ１Ｓ（Ｆ）のＰｓｔ  Ｉ部位にサブクローニングし、ｐＣＨ１ＳＳＰ（Ｆ）を作製した。上記クローン＃１からの７．４ｋｂのＳｍａ  Ｉ−Ｅｃｏ  ＲＩ断片を、Ｅｃｏ  ＲＶ／Ｅｃｏ  ＲＩで消化したｐＣＨ１ＳＳＰ（Ｆ）にクローニングし、ｐＣＨ１ＳＬを作製した。一方、プラスミドｐＢＣμＡＹ３７−９５から、３．５ｋｂのＳａｃ  I断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、次いで、ｌｏｘＰ導入ＣＡＧｚｅｏ（ＣＡＧｚｅｏ断片をｐＢＳ２４６（Ｇｉｂｃｏ社）のＥｃｏ  ＲＶ部位にサブクローニングした）のＸｈｏ  Ｉ断片を、Ｖａｎ９１  Ｉ部位にクローニングし、ｐｍＡＹＳａｚｅｏ（Ｆ）を作製した。ｐｍＡＹＳａｚｅｏ（Ｆ）からのＳａｃ  Ｉ断片を、さらにｐＣＨ１ＳＬの平滑末端のＥｃｏ  ＲＩ部位にサブクローニングし、ｐＣＨ１ｚｅｏ（Ｆ）を作製した。最終ステップとして、ＤＴ−Ａカセットを、ｐＣＨ１ｚｅｏ（Ｆ）のＮｏｔ  Ｉ部位にサブクローニングし、ｐＣＨ１ＣＡＧｚｅｏ（Ｒ）ＤＴ（Ｆ）を得た。
【００５８】
ｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏＤＴ
アニーリングしたオリゴＤＮＡ対のＳｅＳｐを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの平滑末端のＰｓｔ  Ｉ部位にクローニングした。ｐＢＣμＡＹ３７−９５から、２ｋｂのＳｐｈ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ断片を、Ｓｐｈ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ部位にサブクローニングし、ｐｍＡＹＳｐＢを作製した。同様に、ｐＢＣμＡＹ３７−９５からの２ｋｂのＢａｍ  ＨＩ−Ｐｍｌ  Ｉ断片を、（元のＳｐｅ  Ｉ部位を変換した）Ｂａｍ  ＨＩ−Ｐｍｅ  Ｉ部位にサブクローニングし、ｐｍＡＹＳｐＢＰｍｌを作製した。上記のクローン＃１からの０．６ｋｂのＥｃｏ  ＲＩ−Ｓｅｘ  ＡＩ断片を、ｐｍＡＹＳｐＢＰｍｌのＥｃｏ  ＲＩ−Ｓｅｘ  ＡＩ部位にサブクローニングし、ｐＲＩＳｅを作製した。次いで、ｌｏｘＰ導入ＣＡＧｚｅｏを、ｐＲＩＳｅのＶａｎ９１  Ｉ部位にサブクローニングし、ｐＲＩＳｅＣＡＧｚｅｏ（Ｒ）を作製し、そのＮｏｔ  Ｉ部位をＥｃｏ  ＲＩ部位に変換し、ｐＲＩＳｅＣＡＧｚｅｏＥを作製した。一方、上記のクローン＃４からの１．７ｋｂのＰｍｌ Ｉ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｍａ  Ｉ部位にサブクローニングし、そのＥｃｏ  ＲＶ部位をＭｌｕ  Ｉ部位に変換して、ｐＣＨ２Ｓ（Ｆ）を作製した。上記クローン＃１からの６．６ｋｂのＭｌｕ  Ｉ−Ｅｃｏ  ＲＩ断片を、ｐＣＨ２（Ｆ）のＭｌｕ  Ｉ−Ｅｃｏ  ＲＩにクローニングし、ｐＣＨ２ＬＳを作製した。次いで、ｐＲＩＳｅＣＡＧｚｅｏＥからのＥｃｏ  ＲＩ断片をｐＣＨ２ＬＳのＥｃｏ  ＲＩ部位にサブクローニングし、ｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏ（Ｆ）を作製した。最終ステップとして、ＤＴ−ＡカセットをｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏ（Ｆ）のＮｏｔ  Ｉ部位にサブクローニングし、ｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏＤＴを得た。
【００５９】
ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｓＨＡＣ
κＨＡＣを含むＣＨＯ細胞から構築されるゲノムλファージライブラリーをスクリーニングし、ＰＣＲペアのｇ１（ｇ２）−ＦＲを用いて増幅したＰＣＲ産物であるプローブを用いることによって、ヒトＩγ１−ＳγＩ領域、続いてｈＩＧＨＧ１定常領域をカバーするゲノムＤＮＡ断片を単離し、次いで、クローン＃ｈ１０および＃ｈ１８／ｈ２０を同定した。クローン＃ｈ１０から、２ｋｂのＡｆｅ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ断片を短腕として使用するために回収し、１０．５ｋｂのＡｐａ  Ｉ−Ｈｐａ  Ｉ断片を、長腕のためにクローン＃ｈ１８／ｈ２０から得た。一方、ウシゲノムλファージライブラリーをスクリーニングして、ＰＣＲペアのｂＩｇＧ１−ＦＲを用いて増幅したＰＣＲ産物であるプローブを用いることによって、ウシＩγ１−ＳγＩ領域、続いてｂＩＧＨＧ１定常領域をカバーするゲノムＤＮＡ断片を単離し、次いで、クローン＃ｂ４２を同定し、その９．７ｋｂ断片（５’末端からＢｓｕ３６ I）を、６．８ｋｂのヒトＩγ１−ＳγＩ領域を置換するためにアセンブルした。Ｂｓｕ３６ Ｉ−Ａｐａ  Ｉリンカーを用いて、ウシＩγ１−ＳγＩ領域の３’末端およびｈＩＧＨＧ１定常領域の５’末端を結合させた。図２２Ｂに示すように、ＦＲＴおよびＤＴ−Ａ遺伝子が隣接するｎｅｏ遺伝子を挿入した。上記の全てのアセンブルを、ＢＡＣベースの骨格を有するベクターｐＣＣ１ＢＡＣ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）上で行った。
【００６０】
ｐｈＩγ１ＦＲＴＣＡＧａｔｔＰｈｉｓＤＤＴ
クローンｈ１０からの１１．４ｋｂのＫｐｎ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉゲノム断片を、クローン＃ｈ１０から単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ベクターにサブクローニングした。次いで、ＦＲＴ−ＣＡＧプロモーター−ａｔｔＰ−ポリＡ−ｈｉｓＤカセットを、Ｋｐｎ  Ｉ部位から１．８ｋｂ下流にある５’Ｂａｍ  ＨＩ部位に挿入した。最後に、ＤＴ−Ａ遺伝子をＮｏｔ  Ｉ部位にクローニングした。
【００６１】
ｐｈγ１ＴＭＮｅｏａｔｔＰＤＴ
クローンｈ２０からの７．５ｋｂのＳａｃ  ＩＩゲノム断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ベクターにサブクローニングした。次に、ｎｅｏ−ａｔｔＰカセットをＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入し、その後、Ｎｏｔ  Ｉ部位にＤＴ−Ａ遺伝子をクローニングした。
【００６２】
ｐＢＡＣ−ｉｓｔＨＡＣ
ウシＴＭ１−ＴＭ２ドメインを含む７．３ｋｂのＢｍｇ ＢＩ−Ｓｐｈ  Ｉウシゲノム断片をクローン＃ｂ６６から入手し、その５’部分を、リンカーｐＮｓｉＩ−ｂＧ１−ｈＧ１−ＢｍｇＢＩによって、ｉｓＨＡＣからの９．５ｋｂのウシＩγ１−ＳγＩ断片（＃ｂ４２由来）および１．６ｋｂのｈＩＧＨＧ１遺伝子（＃ｈ１０由来）の３’部分と結合させた。ａｔｔＢ−ＤｓＲｅｄ−ＦＲＴカセットを９．５ｋｂのウシＩγ１−ＳγＩ断片（＃ｂ４２由来）の５’側に挿入し、別のａｔｔＢ配列を、クローン＃ｂ６６から得られたウシＴＭ１／ＴＭ２ドメインを含む７．３ｋｂのＢｍｇ ＢＩ−Ｓｐｈ Ｉウシゲノム断片の３’側に入れた。上記の全てのアセンブルをＢＡＣベースの骨格を有するベクターｐＣＣ１ＢＡＣ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）上で行った。
【００６３】
ｐＣλ１ＣＡＧｚｅｏＰｕｒｏｌｏｘＰＤＴ
プライマーペアのｂＣＬＲ−ＦＲによって増幅したプローブを用いて、ＩＧＬＪ１−ＩＧＬＣ１遺伝子の５’側をカバーするいくつかのλファージクローンを同定した。１３ｋｂのＮｄｅ Ｉ−Ｈｉｎ ｄＩＩＩゲノム断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ベクターにサブクローニングし、ＣＡＧｚｅｏ／ｌｏｘＰ／プロモーターレスｐｕｒｏカセットをゲノム断片に存在するＡｆｅ  Ｉ部位に挿入した。最後に、ＤＴ−Ａ遺伝子をＮｏｔ  Ｉ部位に挿入した。このベクターをアレルＡおよびＢから構築した。
【００６４】
ｐＣλ５ＣＡＧｌｏｘＰｎｅｏＤＴ
プライマーペアのｂＣＬＬ−ＦＲによって増幅したプローブを用いて、ＩＧＬＪ５−ＩＧＬＣ５遺伝子の３’側をカバーするいくつかのλファージクローンを同定した。１０ｋｂのＳａｃ ＩＩ−Ｎｓｉ Ｉゲノム断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ベクターにサブクローニングし、ＣＡＧプロモーター／ｌｏｘＰ／ポリＡ／ｎｅｏカセットをゲノム断片に存在するＨｉｎ ｄＩＩＩ部位に挿入した。最後に、ＤＴ−Ａ遺伝子をＮｏｔ  Ｉ部位に挿入した。このベクターを、アレルＡおよびＢから構築した。
【００６５】
ニワトリＤＴ４０細胞内でのヒト１４番染色体断片の改変
構造が定義されたｈＣｈｒ１４ベクターを使用し、できるだけ多くの無関係のヒト遺伝子を除去するために、インタクトなｈＣｈｒ１４を改変し、その後、ＩｇＭをウシ化した（図１７Ａ）。インタクトなｈＣｈｒ１４を保持するニワトリＤＴ４０細胞を、ターゲティングベクターｐＳＣ３５５ＣＡＧｌｏｘ５１１ｈｉｓＤＤＴを用いてエレクトロポレーションし、ｈＩＧＨ遺伝子座に対して約３００ｋｂセントロメア側にある遺伝子座ＡＬ５１２３５５にｌｏｘ５１１およびＣＡＧプロモーターを組み込んだ。コロニーをヒスチジノールで選択し、ゲノムＰＣＲスクリーニングに供し、陽性ＰＣＲとしてプライマーＳＣ３５５ＫＯ−Ｆ２／Ｒ２を用い、陰性ＰＣＲとしてプライマー３５５Ｎ−Ｆ／Ｒも用いて、相同組み換えの発生を確認した（図１７Ｄ）。クローンＩ３５５−２を良好な標的化クローンとして同定した。
【００６６】
Ｉ３５５−２を、ターゲティングベクターｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）ｈｙｇｐｕｒｏｌｏｘ５１１ＤＴでトランスフェクションし、ＡＬ５１２３５５に対して約８５Ｍｂセントロメア側にある遺伝子座ＡＬ３９１１５６に別のｌｏｘ５１１およびプロモーターのないｐｕｒｏ遺伝子を組み込んだ。コロニーをハイグロマイシンＢで選択し、ＰＣＲスクリーニングに供し、陽性ＰＣＲとしてプライマー１４ＣＥＮＫＯ−Ｆ３／Ｒ３（下記表１参照）を用い、陰性ＰＣＲとしてプライマー１４ＣＥＮ（Ｎ）−Ｆ２／Ｒ２（下記表１参照）も用いて相同組み換えの発生を確認した（図１７Ｄ）。クローンＩ１５６−１０を良好な標的化クローンとして同定した。
【００６７】
Ｉ１５６−１０を、一方が遺伝子座ＡＬ５１２３５５で、他方がＡＬ３９１１５６である２つのｌｏｘ５１１部位間での部位特異的組み換えを媒介するためにＣｒｅ発現プラスミドでトランスフェクションし、それらの間の約８５Ｍｂの配列を欠失させ、ｈＣｈｒ１４を１０６Ｍｂから約２１Ｍｂまで短くした。ピューロマイシン耐性が、組み換え部位で再構成されたＣＡＧプロモーターｌｏｘ５１１−ｐｕｒｏカセットによって付与されるので、大きな欠失が生じた細胞をピューロマイシンで選択した。このカセットの再構成を、ｂＩＧＬクラスター欠失の欄に記載のように、プライマーＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３／Ｒ３（下記表１参照）を用いてＰＣＲによって確認した。ｈｉｓＤおよびｈｙｇカセットの両方がこの８５Ｍｂの欠失の結果として除去されるので、ヒスチジノールおよびハイグロマイシンＢ感受性も確認した（図１７Ｂ）。最後に、プローブとしてヒトＣＯＴ−１ ＤＮＡを用いる蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により、ｈＣｈｒ１４の短縮を確認した（図１７Ｅ）。クローンＤ８を良好な短縮クローンとして同定した。連続して、クローンＤ８をターゲティングベクターｐＲＮＲ２１ｏｘＰｂｓｒＤＴで改変し、先に報告された２１、２２ように、ＲＮＲ２遺伝子座にｌｏｘＰ配列およびＧＦＰ遺伝子を組み込んだ。クローン１４Ｄ１を、最終ＩｇＭウシ化ステップのために選択した（ＣＨ１ＤおよびＣＨ２Ｄ）。
【００６８】
クローン１４Ｄ１を、最終的にターゲティングベクターｐＣＨ１ＣＡＧｚｅｏ（Ｒ）ＤＴ（Ｆ）でウシ化し、ｈＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ１ドメインからＴＭ２ドメインをウシのＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ１ドメインからＴＭ２ドメインで置換し、ｃＩｇＭ（ＣＨ１）タンパク質を作製した。コロニーをゼオシンで選択し、ゲノムＰＣＲスクリーニングに供し、陽性ＰＣＲとしてプライマー（下記表１参照）ｃＨＡＣ−Ｆ３／Ｒ３を用いて相同組み換えの発生を確認し、またプライマーＣＨ１ ５’−Ｆ／ＲおよびｃＨＡＣ ３’−Ｆ／Ｒを用いて、ヒトおよびウシ間の結合配列が正確であることを確認した（図１７Ｄ）。クローンＣＨ１Ｄ２を、ＫｃＨＡＣΔ構築物のためのＣＨ１Ｄ断片を保持する陽性クローンとして同定した。同様に、クローン１４Ｄ１をターゲティングベクターｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏＤＴ（Ｆ）でウシ化し、ｈＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ２ドメインからＴＭ２ドメインをウシのＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ２ドメインからＴＭ２ドメインで置換し、ｃＩｇＭ（ＣＨ２）タンパク質を作製し、次いで、クローンＣＨ２Ｄ４をｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ構築物のために選択した。
【００６９】
ニワトリＤＴ４０細胞内でのヒト２番染色体断片の改変
κＴＬ１は、ｈＩＧＫ遺伝子座をカバーするｈＣｈｒ２断片を含むＤＴ４０クローンである。ゼオシン選択は、通常、後の工程でウシ線維芽細胞においてより良好に動作するため、この細胞株を、ベクターｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏＣＤ８Ａでトランスフェクションし、ＰＧＫｐｕｒｏカセットをＣＡＧｚｅｏで単純置換した。ゼオシン選択後、相同組み換えに特異的なＣＤ８ＡＫＯ−Ｆ２Ｒ２（図１８Ａ）を用いてゲノムＰＣＲを行い、クローンκＺ７を同定して、そのピューロマイシン感受性を確認し、その後、ＣＨ１Ｄ２を用いたＫｃＨＡＣΔ構築のために用いた。
【００７０】
一方、κＴＬ１もターゲティングベクターｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏｌｏｘ２２７２Ｆ９Ｒ９でエレクトロポレーションし、ｈＣｈｒ２断片を切断し、ｈＩＧＫ定常領域Ｃκ遺伝子のＩＧＫＣに対して約３００ｋｂテロメア側にある遺伝子座ＡＣ１０４１３４にｌｏｘ２２７２およびプロモーターのないｐｕｒｏ遺伝子を組み込んだ。切断が成功すると、ＣＤ８Ａ遺伝子座のｐｕｒｏカセットが欠失するので、コロニーをヒスチジノールで選択し、次いで、ピューロマイシン感受性を確認した。ゲノムＤＮＡをピューロマイシン感受性コロニーから抽出し、κＴＬ１に存在するが標的クローンには存在しないＦＡＢＰ１遺伝子座を増幅するプライマーのＦＡＢＰ１−Ｆを用いたＰＣＲスクリーニングに供した（図１８Ｂ）。クローンＫ５３を同定し、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ構築のために使用した。
【００７１】
ニワトリＤＴ４０細胞におけるヒト２２番染色体断片の改変
概要を図１９Ａに示す。インタクトなｈＣｈｒ２２を保持するＤＴ４０細胞株の５２−１８を、ターゲティングベクターｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏＳＬＦＲでエレクトロポレーションし、ｈＣｈｒ２２がΔΔＨＡＣベクターのために切断されるＡＰ０００３４４遺伝子座に対して約４５０ｋｂテロメア側であるＡＰ０００３５０遺伝子座においてｈＣｈｒ２２を切断した（図１９Ｂ）。コロニーをゼオシンで選択し、それらのゲノムＤＮＡを、５２−１８に存在するが標的クローンに存在しないＡＰ０００３５０遺伝子座を増幅するプライマー（下記表１参照）３５０Ｔ−ＦＲを用いるＰＣＲスクリーニングに供した。クローンＳＴ１３を、切断が成功したクローンとして同定した。
【００７２】
ＳＴ１３をターゲティングベクターｐ５５３ＣＡＧｌｏｘ２２７２ｂｓｒＤＴで改変し、遺伝子座ＡＰ０００５５３にｌｏｘ２２７２およびＣＡＧプロモーターを組み込んだ。コロニーをブラストサイジンＳで選択し、ＰＣＲスクリーニングに供し、陽性ＰＣＲとしてプライマー５５３ＫＯ−ＦＲを用い、陰性ＰＣＲとしてプライマー５５３−Ｆ４Ｒ４も用いて相同組み換えの発生を確認した（図１９Ｃ）。クローンＳＴＬ５４を標的化が成功したクローンとして同定した。
【００７３】
ニワトリＤＴ４０細胞内でＳＬＫＨ断片を作製するための、ヒト２２番染色体断片のヒト２番染色体断片への転座
ＳＬＫＨ断片を、染色体クローニングシステムを用いて、ＤＴ４０ハイブリッド細胞内で構築した（図２０Ａ）。ｈｙｇカセットを有するｈＣｈｒ２２断片を保持するクローンＫ５３およびｂｓｒカセットを有するｈＣｈｒ２断片を保持するクローンＳＴＬ５４を融合（全細胞融合、ＷＣＦ）して、ＤＴ４０ハイブリッド細胞を作製した。コロニーをハイグロマイシンＢおよびブラストサイジンＳで維持し、両方のｈＣｈｒ断片を保持する細胞を選択し、ｈＣｈｒ２断片については以下のプライマー（下記表１参照）のＩＧＫＣ−Ｆ／Ｒ、ＩＧＫＶ−Ｆ／Ｒ、ＲＰＩＡ−Ｆ／Ｒ、ＥＩＦ２ＡＫ３−Ｆ／Ｒおよびｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｆ／Ｒを用い、ｈＣｈｒ２２断片については別のプライマーセットの５５３Ｐ−Ｆ／Ｒ、ｈＶｐｒｅＢ１−Ｆ／Ｒ、ｈＶｐｒｅＢ３−Ｆ／Ｒ、ＩｇＬ−Ｆ／Ｒ、３４４−Ｆ／Ｒ、ｈＬ５−Ｆ／Ｒ、３５０Ｐ−Ｆ／Ｒおよび５５３ＫＯ−Ｆ／Ｒを用いてゲノムＰＣＲにより確認した。プローブとしてヒトＣＯＴ−１ ＤＮＡを用いたＦＩＳＨにより、２つのヒト染色体断片の存在を確認した（図２０Ｂ）。クローンＳＬＫ２を陽性クローンとして同定した。ＳＬＫ２を、一方がｈＣｈｒ２断片上の遺伝子座ＡＣ１０４１３４に存在し、もう一方がｈＣｈｒ２２断片上の遺伝子座ＡＰ０００５５３に存在する２つｌｏｘ２２７２部位間の部位特異的組み換えを媒介するためのＣｒｅ発現プラスミドでトランスフェクションした。ピューロマイシン耐性が転座部位におけるＣＡＧプロモーター−ｌｏｘ２２７２−ｐｕｒｏカセットの再構成によって付与されるので、組み換え体をピューロマイシンによって選択した。これも、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３Ｒ３を用いるゲノムＰＣＲにより確認し、その後、ＰＣＲ産物の直接配列決定を行った。ＳＬＫＨ６を、ＳＬＫＨ断片を保持する、転座に成功したクローンとして同定した（図２０Ａ、２０Ｂ）。
【００７４】
ＳＬＫＨ断片を、ＭＭＣＴによりＤＴ４０ハイブリッド細胞株ＳＬＫＨ６からプレーンＤＴ４０細胞に移した。ＤＴ４０細胞へのＳＬＫＨ断片の移動の成功により、ｂｓｒカセットの損失を引き起こすので、選択をピューロマイシンで行い、次いで、コロニーをブラストサイジンＳ感受性について調べた（図２０Ａ）。ブラストサイジンＳ感受性およびピューロマイシン耐性コロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、ＳＬＫＨ断片保持をＰＣＲプライマー（下記表１参照）のＩＧＫＣ−Ｆ／Ｒ、ＩＧＫＶ−Ｆ／Ｒ、ＲＰＩＡ−Ｆ／Ｒ、ＥＩＦ２ＡＫ３−Ｆ／Ｒ、ｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｆ／Ｒ、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３／Ｒ３、５５３Ｐ−Ｆ／Ｒ、ｈＶｐｒｅＢ１−Ｆ／Ｒ、ｈＶｐｒｅＢ３-Ｆ／Ｒ、ＩｇＬ−Ｆ／Ｒ、３４４−Ｆ／Ｒ、ｈＬ５−Ｆ／Ｒ、３５０Ｐ−Ｆ／Ｒ、および５５３ＫＯ−Ｆ／Ｒによって確認した。ローダミンで直接標識したｈＣｈｒ２塗布プローブおよびフルオレセインで直接標識したｈＣｈｒ２２塗布プローブを用いる２色ＦＩＳＨにより、ＳＬＫＨ断片の存在を確認した（図２０Ｂ）。ＳＬＫＤ１８を陽性クローンと同定した。
【００７５】
ニワトリＤＴ４０細胞内でのｃＫＳＬ−ＨＡＣΔおよびＫｃＨＡＣΔベクターの構築
図３Ｂに概説するように、染色体クローニングシステムを用いて、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターをＤＴ４０ハイブリッド細胞内で構築した。ｈＣｈｒ２２断片と転座させたｈＣｈｒ２断片を含み、ｈｙｇカセットを有するＳＬＫＤ１８、ならびにｂｓｒカセットを有するｈＣｈｒ１４断片（１４Ｄ）およびｃＩｇＭ（ＣＨ２）−ウシ化ｈＩＧＨ遺伝子座を含むＣＨ２Ｄ４を融合させ、ＤＴ４０ハイブリッドクローンｃＫＳＬＤ２２を作製し、ハイグロマイシンＢおよびブラストサイジンＳで選択した。ｈＣｈｒ２２については第１のＰＣＲプライマーセット（下記表１参照）の５５３Ｐ−Ｆ／Ｒ、ｈＶｐｒｅＢ１−Ｆ／Ｒ、ｈＶｐｒｅＢ３−Ｆ／Ｒ、ＩｇＬ−Ｆ／Ｒ、３４４−Ｆ／Ｒ、ｈＬ５−Ｆ／Ｒ、３５０Ｐ−Ｆ／Ｒ、および５５３ＫＯ−Ｆ／Ｒを用い、ｈＣｈｒ２については、第２のプライマーセットのＩＧＫＣ−Ｆ／Ｒ、ＩＧＫＶ−Ｆ／Ｒ、ＲＰＩＡ−Ｆ／Ｒ、ＥＩＦ２ＡＫ３−Ｆ／Ｒ、ｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｆ／Ｒ、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３／Ｒ３（ｈＣｈｒ２とｈＣｈｒ２２間の接合部）を用い、ｈＣｈｒ１４については第３のプライマーセット（下記表１参照）のＲＮＲ２−１×ＳＴＯＰ−３、ＶＨ３−Ｆ／Ｒ、ｇ１（ｇ２）−Ｆ／Ｒ、１４ＣＥＮＫＯ−Ｆ３／Ｒ３、ＣＨ２ ５’−Ｆ／Ｒ、ｃＨＡＣ−Ｆ３／Ｒ３およびＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３ＫＯ−Ｆ／２Ｒ２を用いて大規模ゲノムＰＣＲを行った。さらに、ヒトＣＯＴ−１ ＤＮＡを用いたＦＩＳＨにより、２つのヒト染色体断片の存在も確認した。
【００７６】
一方がＳＬＫＨ断片上のＣＯＳ１３８遺伝子座にあり、もう一方がＣＨ２Ｄ断片上のＲＮＲ２遺伝子座にある２つのｌｏｘＰ部位間での部位特異的組み換えを媒介し、ｃＩｇＭ（ＣＨ２）ドメイン内のｌｏｘＰ導入ＣＡＧプロモーター−ｚｅｏカセットを欠失させるために、ｃＫＳＬＤ２２をＣｒｅ発現プラスミドでエレクトロポレーションした。ＧＦＰ発現が、転座部位でのＰＧＫプロモーター−ｌｏｘＰ−ＧＦＰカセットの再構成によって付与されるので、組み換え体をＧＦＰ陽性細胞の選別により濃縮した。選別を２回行い、異なる発現レベルを有する２つの異なるＧＦＰ陽性集団をもたらした。より低いＧＦＰ集団は、ＰＣＲプライマー（下記表１参照）のＰＧＫ２×ＧＦＰ２によって決定された、転座に成功したｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを含み、ＰＣＲプライマーＣｒｅＣＡＧｚｅｏ−Ｆ３／Ｒ３を用いて、ｃＩｇＭ（ＣＨ２）部位におけるＣＡＧプロモーターｚｅｏカセット欠失を確認した。より高いＧＦＰ集団は、リーキーなＣｒｅ媒介組み換えによって、ＲＮＲ２遺伝子座のｌｏｘＰおよび遺伝子座ＡＬ５１２３５５／ＡＬ３９１１５６のｌｏｘ５１１の間に反転されたＣＨ２Ｄ断片を含んでおり、このことは、ＰＣＲプライマー（下記表１参照）のＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３×ＧＦＰ２およびＳＴＯＰｐｕｒｏ−Ｆ２×ＳＴＯＰｐｕｒｏ−Ｒ、およびその後の直接配列決定によって確認された（図２１）。ｃＫＳＬＤＨ２２（２Ｌ）を、最終的にｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを保持するＤＴ４０ハイブリッド細胞株として同定し、大規模なゲノムＰＣＲおよび３色ＦＩＳＨに供した（図１２Ａ）。図３Ｃに概説するように、ＫｃＨＡＣΔベクターを、ＤＴ４０細胞内で同様に構築した。クローンＫＣＤＨ１を、大規模ゲノムＰＣＲおよび２色ＦＩＳＨに供した（図１２Ｂ）。同様に、ｈＣｈｒ２断片（κＴＬ１）を、ウシ化ｃＩｇＭ（ＣＨ１）を有するＳＣ２０断片に移動させたＫｃＨＡＣも構築した。
【００７７】
ニワトリＤＴ４０細胞内でのｉｓＨＡＣおよびｉｓＫｃＨＡＣΔベクターの構築
ｉｓＨＡＣ（ｉｓＫｃＨＡＣΔ）構築の概略を図２２Ａに示す。ターゲティングベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｓＨＡＣを構築し（図２２Ｂ）、これを用いて、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔまたはＫｃＨＡＣΔ上のＩγ１−ＳγＩ領域をウシ化した。ｃＫＳＬＤＨ２２（２Ｌ）からＭＭＣＴによって得られたｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを保持するニワトリＤＴ４０細胞株のクローンｃＫＳＬＤＤ１を、ターゲティングベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｓＨＡＣでエレクトロポレーションした。コロニーをＧ４１８で選択し、それらのゲノムＤＮＡを、プライマーのｉｓｃｏｎｔ１−Ｆ１Ｒ１を用いてＰＣＲスクリーニングに供し、相同組み換えの発生を確認した。さらに、追加の診断ＰＣＲも行い、構造的完全性を確認した（図２２Ｃ）。１種類のクローンｉｓ１−１１を、ＦＬＰ発現プラスミドの導入によって、その後のｎｅｏカセット欠失のために選択した。このｉｓ１−１１を、ＦＬＰ発現プラスミドおよびＤｓＲｅｄ発現プラスミドで同時トランスフェクションした。ＤｓＲｅｄ陽性細胞を選別し、単コロニー分離に供した。ｎｅｏカセットがＦＲＴ−ＦＬＰ組み換えによって欠失したＧ４１８感受性コロニーを、ｉｓｃｏｎｔ１−Ｆ３／Ｒ６（下記表１参照）を含むゲノムＰＣＲについて試験した（図２２Ｄ）。最後に、ｉｓＨ１１−Ｓ２およびｉｓＨ９−３を選択し、次いで、それらをＣＨＯ細胞に移して、それぞれマスター細胞バンクｉｓＣ１−１３３、ｉｓＣ１０−２およびｉｓＣ１０−１８を樹立し、大規模ゲノムＰＣＲおよびＣＧＨを行って、構造的完全性を確認した（図２２Ｅ、２２Ｆ）。ｉｓＫｃＨＡＣΔをＤＴ４０細胞で構築し、ｉｓＨＡＣと同様に、２種類のクローンのｉｓＫＣＤＨ１７、ｉｓＫＣＤＨ３０を選択し、次いで、ＣＨＯ細胞に移して、それぞれマスター細胞バンクのｉｓＫＣＤＣ８およびｉｓＫＣＤＣ３８を樹立し、大規模ゲノムＰＣＲおよびＣＧＨを行って、構造的完全性を確認した（図２２Ｇ、２２Ｈ）。
【００７８】
ニワトリＤＴ４０細胞内でのｉｓｔＨＡＣベクターの構築
ｉｓｔＨＡＣの構築スキームを図２３Ａに示す。クローンｃＫＳＬＤＤ１を、順次、２つのターゲティングベクターｐｈλ１ＴＭＮｅｏａｔｔＰＤＴ（図２３Ｂ）およびｐｈＩγ１ＦＲＴＣＡＧａｔｔＰｈｉｓＤＤＴ（図２３Ｃ）で標的化し、それぞれｈＩＧＨＧ１ ＴＭ２ドメインの３’側およびヒトＩγ１領域の５’側にａｔｔＰ配列を組み込み、２種類のクローンｉｓｔ１−５およびｉｓｔ１−２１を作製した。大きなＤＮＡ置換を引き起こすために、それらをｐＢＡＣ−ｉｓｔＨＡＣおよびφＣ３１−発現ベクターと共に同時エレクトロポレーションした。図２３Ｄに示すように、ａｔｔＰおよびａｔｔＢ間の予想される組み換えは、フローサイトメトリーによって検出することができるＣＡＧプロモーター−ＤｓＲｅｄ遺伝子発現を再構成させるはずである。したがって、ＤｓＲｅｄ陽性細胞を選別した。ＤｓＲｅｄ陽性細胞の純度が９５％を上回るまで、この選別プロセスを２〜３回繰り返した。その後、細胞を単コロニー単離に供し、３種類の診断ゲノムＰＣＲ（下記表１参照）のＣＡＧＤｓＲｅｄ−Ｆ２／Ｒ２（陽性）、ｂＩｇＧ１−３’−ＳｅｑＦ３×ｈＩｇＧ１−Ｒ１５（陽性）およびｂＩｇＧ１−３’−ＳｅｑＦ３×ａｔｔＰＰｕｒｏ−Ｒ３（陰性）によって調べた。結果として、ｉｓｔ１−５からｉｓｔＨ５−Ｓ１６およびｉｓｔ１−２１からｉｓｔＨ２１Ｈ−Ｓ１０を選択した。
【００７９】
２種類のクローンのｉｓｔＨ５−Ｓ１６およびｉｓｔＨ２１Ｈ−Ｓ１０を、最終的にＦＬＰ発現ベクターでトランスフェクションした。図２３Ｅに示すように、ＦＬＰ発現により、フローサイトメトリーによって検出することができるＣＡＧ−ＤｓＲｅｄ遺伝子発現の除去が生じるはずである。したがって、ＤｓＲｅｄ陰性細胞を選別し、その結果ＤｓＲｅｄ−陰性細胞の純度が９５％を上回った。その後、細胞を、単コロニー単離に供し、３種類の診断ゲノムＰＣＲ（下記表１参照）のＣＡＧＤｓＲｅｄ−Ｆ２／Ｒ２（陰性）、ｂＩｇＧ１−３’−ＳｅｑＦ３×ｈＩｇＧ１−Ｒ１５（陽性）およびｈＩｇＧ１−Ｆ１０×ｂＩｇＧ１−５’−Ｓｅｑ−Ｒ１０（陽性）によって調べた。結果として、ｉｓｔＨ５−Ｓ１６からｉｓｔＨＤ１６ＬおよびｉｓｔＨ２１Ｈ−Ｓ１０からｉｓｔＨＤ１０Ｌを選択し、次いで、ＣＨＯ細胞に移し、それぞれマスター細胞バンクのｉｓｔＣ１−４９およびｉｓｔＣ１−６を樹立して、大規模ゲノムＰＣＲおよびＣＧＨを行い、構造的完全性を調べた（図２３Ｆ、２３Ｇ）。
【００８０】
ＨＡＣベクター構築のためのニワトリＤＴ４０細胞のトランスフェクション
先に報告された５，２０，２１ように、ＨＡＣベクター構築を行った。簡単に説明すると、各ｈＣｈｒ断片を含むＤＴ４０細胞を、各ターゲティングベクター約２５μｇでエレクトロポレーションした（５５０Ｖ、２５μＦ）。コロニーを、２週間、各薬剤；Ｇ４１８（２ｍｇ／ｍｌ）、ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（１．５ｍｇ／ｍｌ）、ブラストサイジンＳ（１５μｇ／ｍｌ）、ヒスチジノール（０．５ｍｇ／ｍｌ）、またはゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ）で選択し、示したように、それらのＤＮＡをＰＣＲスクリーニングに供した。
【００８１】
ウシＩＧＬＪ−ＩＧＬＣ遺伝子クラスターの欠失およびミクロセル媒介染色体移入（ＭＭＣＴ）のためのウシ線維芽細胞のトランスフェクション
先に報告された５、１２、２１ように、ウシ胎仔線維芽細胞を培養し、トランスフェクションした。簡単に説明すると、５５０Ｖおよび５０μＦにて、線維芽細胞を各ターゲティングベクター約３０μｇでエレクトロポレーションした。４８時間後、これらの細胞を適切な薬物；ゼオシン（０．４ｍｇ／ｍｌ）またはピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）の下で２週間選択し、耐性コロニーをピックアップして、レプリカプレートに移した。一方は、ゲノムＤＮＡ抽出のためのものであり、他方は胚クローニングのためのものであった。先に報告された５、２０、２１ように、各ＨＡＣベクターを用いてＭＭＣＴを行った。
【００８２】
ゲノムＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ分析
先に報告された５、１２、２０、２１ように、これらの分析を行った。全てのＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲルで泳動した。プライマー配列は下記表１から利用可能である。
【００８３】
【表１】
0006426606.tif 000002
0006426606.tif 000003
0006426606.tif 000004
0006426606.tif 000005
0006426606.tif 000006
【００８４】
ＣＧＨ分析
ＣＧＨ分析のためのアレイプローブを、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターの推定配列に基づいて、Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎが設計した（図２４を参照）。実験およびデータ分析をＲｏｃｈｅ ＮＩＭＢＬＥＧＥＮ（商標）が行った。
【００８５】
ＦＩＳＨ分析
先に報告された５、２０、２１ように、ヒトＣＯＴ−１ ＦＩＳＨおよびｈＣｈｒ特異的な多色ＦＩＳＨを行った。ｈＩＧＨ、ｈＩＧＫおよびｈＩＧＬ遺伝子座を特異的に染色するために、プローブを、それぞれＢＡＣクローンＲＰ１１−４１７Ｐ２４、ＲＰ１１−３１６Ｇ９およびＲＰ１１−２２Ｍ５由来のＤＮＡから合成した。
【００８６】
フローサイトメトリー分析
新生児トランスジェニック（Ｔｃ）子ウシにおけるＢ細胞の発生に関するフローサイトメトリー分析を、以下のように変更して、先に報告された５ように行った。ＴｃウシＢ細胞上の表面ｈＩｇＧを検出するために、ＡＦ４８８で直接標識したヤギ抗ｈＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。ＴｃウシＢ細胞上の表面ｈＩｇκまたはｈＩｇλを標識するために、ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で直接標識したマウス抗ｈＩｇκ抗体またはＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で直接標識したマウス抗ｈＩｇλ抗体を使用した。Ｂ細胞上の表面ｂＩｇλまたはｂＩｇκを標識するために、マウスモノクローナル抗ｂＩｇλ（インハウスクローン１３２Ｄ７）またはマウスモノクローナル抗ｂＩｇκ（インハウスクローン１３２Ｂ１０）、続いて、ゼノンマウスＩｇＧ１ＰＥ標識（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用した。染色を標準的なプロトコルによって行い、その後、ＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって分析した。
【００８７】
ＥＬＩＳＡ
先に報告された５ように、全ｈＩｇＧ ＥＬＩＳＡアッセイを行った。完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκまたはｈＩｇＧ／ｈＩｇλ検出のために、捕捉抗体としてアフィニティー精製されたヤギ抗ｈＩｇκまたはアフィニティー精製されたヤギ抗ｈＩｇλ（Ｂｅｔｈｙｌ社）および検出抗体としてヤギ抗ｈＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ社）を用いた。ｈＩｇＧ／ｂＩｇκ検出のために、捕捉抗体としてマウスモノクローナル抗ｂＩｇκ（インハウスクローン１３２Ｂ１０）および検出抗体としてマウス抗ｈＩｇＧ  Ｆｃγ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を使用した。ｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ２の検出のために、捕捉抗体としてマウス抗ｈＩｇＧ１ Ｆｃまたはマウス抗ｈＩｇＧ２ Ｆｃ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、および検出抗体としてマウス抗ｈＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いた。
【００８８】
ＨＡＣ／ＴＫＯおよびＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシへのヒト口腔扁平上皮癌の免疫
油中水型エマルジョンとしてのモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ ２５アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ社）＋免疫刺激剤としてのＱｕｉｌ Ａ（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ）で製剤化された、２×１０８細胞／用量のＸ線照射ヒト口腔扁平上皮癌（ＤＳＭＺ）抗原を、ＨＡＣ／ＴＫＯおよびＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシに免疫した。Ｔｃ子ウシを３週間の間隔で２回免疫した（初回免疫の３週間後に追加免疫を行った）。ワクチンを、頸部の筋肉内注射により投与した。先に報告された５ように、抗体価の分析のために、各免疫前（Ｖ１およびＶ２）ならびに各免疫後１０日および１４日の時点で血清試料を採取した。抗ヒト口腔扁平上皮癌の抗体価を、フローサイトメトリー分析により決定した。
【００８９】
フローサイトメトリーによるＴｃ動物の血清中の抗ヒト癌細胞ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ力価の測定
ヒト癌細胞で免疫したＴｃウシから採取した血清を、ヒト癌細胞を染色するための一次抗体として使用した。免疫前のＴｃウシ血清（Ｖ１Ｄ０）を陰性対照として使用した。ＡF４８８結合ヤギ抗ｈＩｇＧ  Ｆｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１：８０希釈し、ＰＥ結合マウス抗ｈＩｇκ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を１：８希釈して用い、結合したｈＩｇＧ／ｈＩｇκ抗体を検出した。このアッセイを、４％ウマ血清、０．１％アジ化ナトリウムおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを補充したＰＢＳ中で行った。ＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって測定し、結果を、染色したヒト癌細胞の割合（％）および平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。
【００９０】
体細胞核移植
先に報告された５，１２，２０，２１ように、クローン化した胎仔および子ウシを、クロマチン転送手順を用いて生成した。
【００９１】
結果
実施例１．ウシＩＧＬ遺伝子クラスターの欠失
１つの仮説は、ウシＩｇ軽鎖の不活性化が、ｂＩｇＨ破壊に加えて、ウシにおける完全ヒトＩｇＧの高い生産性を支持するというものである。ヒトおよびマウスとは異なり、ウシは、主にＩｇκを上回るＩｇλ軽鎖を発現するので、ｂＩＧＬ遺伝子が不活性化された。しかし、本発明者らがこの研究を始めた時には、ウシゲノム中のｂＩＧＬ遺伝子構造について公表された情報はほとんどなかったので、その周辺領域を含むｂＩＧＬ遺伝子配列を決定した。そのために、ウシＢＡＣ（細菌人工染色体）ゲノムライブラリーをスクリーニングし、次いで、ショットガンアプローチによって、１種類のＢＡＣクローンの完全な配列決定を行った。５つのＩＧＬＪ−ＩＧＬＣ遺伝子（ＩＧＬＪ１−ＩＧＬＣ１からＩＧＬＪ５−ＩＧＬＣ５）で構成される遺伝子クラスターを同定し、そのうちの３つ（ＩＧＬＪ２−ＩＧＬＣ２からＩＧＬＪ４−ＩＧＬＣ４）は、その推定アミノ酸配列から判断すると機能的であると思われた（図１Ａ）。ＩＧＬＪ１−ＩＧＬＣ１およびＩＧＬＪ５−ＩＧＬＣ５遺伝子の両方は、未熟な終止コドン変異を含み、疑遺伝子の可能性を示す。ＩＧＬＪ５−ＩＧＬＣ５遺伝子の約１３ｋｂ下流に、潜在的なエンハンサーエレメント３’Ｅλが見られ、ヒト３’Ｅλ（ＨＳＳ−３）エンハンサー配列と約６０％のＤＮＡ配列相同性を示した。Ｃｈｅｎらは、４つのＩＧＬＪ−ＩＧＬＣ遺伝子をウシで同定したことを報告した。本発明者らの分析において、ＩＧＬＪ２−ＩＧＬＣ２およびＩＧＬＪ３−ＩＧＬＣ３エクソン配列が同定されたが、イントロンおよび３’非翻訳領域（ＵＴＲ）などのそれらの周辺配列はわずかではあるが異なっており、ＩＧＬＪ２−ＩＧＬＣ２およびＩＧＬＪ３−ＩＧＬＣ３は異なる遺伝子であると結論付けた（図８Ａ、８Ｂ）。
【００９２】
ｂＩＧＬ遺伝子は遺伝子クラスターを形成するので、単一遺伝子構造の代わりに、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ媒介部位特異的組み換えを用いることによって、ＩＧＬＪ−ＩＧＬＣ遺伝子クラスター全体を欠失するために体細胞における新規システムを開発する計画を立てた（図１ｂ）。相同組み換えによって、各ｌｏｘＰ配列を、それぞれターゲティングベクターｐＣλ１ＣＡＧｚｅｏＰｕｒｏｌｏｘＰＤＴによってＩＧＬＪ１遺伝子の５’方向外側および別のターゲティングベクターｐＣλ５ＣＡＧｌｏｘＰｎｅｏＤＴによってＩＧＬＣ５遺伝子の３’方向外側に組み込み、その後、Ｃｒｅを導入した。このステップは、蓄積したエピジェネティックエラーのために動物の発生を損なわせ得る半接合性クラスター欠失のために、３ラウンドのトランスフェクションおよび体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を必要とした。したがって、Ｃｒｅ発現ベクターおよび第２のノックアウト（ＫＯ）ベクターを一緒にトランスフェクションすることによって、トランスフェクションおよびＳＣＮＴの数を減らす計画を立て、２ラウンドのトランスフェクション（第１のＫＯおよび、その後、第２のＫＯ＋Ｃｒｅ）によりクラスター欠失を完了することができた。本発明者らが知る限りでは、このような大きなＤＮＡ欠失（長さ２７ｋｂの欠失）は、これまで体細胞で達成されておらず、その実現可能性は不明だった。したがって、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ）はクラスター欠失が生じた時にのみ再構成することができ、細胞培養物中のピューロマイシンの存在下での選択を可能にすることができるような欠失のための強力な陽性選択を用いた。このクラスター欠失は、実用的効率で、２段階で行うことができる。トランスフェクションした５×１０６個の体細胞からの２１個のコロニー全ては、予想される欠失を示し、ウシ線維芽細胞において予想外に高効率の、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰに媒介される大きなＤＮＡ欠失（本研究では２７ｋｂ）および相同組み換えの第２の事象（第２のＫＯ）を示した。重要なことに、体細胞内で２段階の大きなＤＮＡ欠失を行うことにより、繁殖力のある健康なクローン動物を生じさせる細胞の能力が支持された。本発明者らの知る限りでは、これは、ＥＳ細胞を使用しない、体細胞内での複数の遺伝子の部位特異的な大きなＤＮＡ欠失の最初の報告であり、したがって、体細胞線維芽細胞が利用可能である非マウス種における一対一の単一遺伝子改変よりもダイナミックなゲノム工学の実行可能性を支持する。
【００９３】
実施例２．オスおよびメスのウシＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−ＩＧＬ−／−細胞株の樹立
体細胞における複数ラウンドの遺伝子改変、その後のＳＣＮＴは、潜在的に蓄積した不可逆的なエピジェネティックエラーのために、動物の発生を損なわせ得る。図２Ａにまとめたように、ＳＣＮＴのラウンド数を減らすために、逐次的遺伝子ターゲティングを動物育種と組み合わせた。
【００９４】
ＩＧＨＭＬ１遺伝子座はｂＣｈｒ１１にマッピングされたという報告が以前になされているが、本研究のデータにより、ＩＧＨＭおよびＩＧＨＭＬ１遺伝子座の両方が、予想外にもウシＣｈｒ２１に位置することが示された（図９）。そこで、この新しい驚くべき発見に基づいて本研究を行った。オスの初代ホルスタイン線維芽細胞株６９３９から始め、ＩＧＨＭおよびＩＧＨＭＬ１アレルをそれぞれＡＹ／ａｙおよびＵ／ｕと命名し（図２Ｂ）、ＩＧＨＭおよびＩＧＨＭＬ１遺伝子座をアレル特異的に順次ノックアウトし、それぞれアレルＵ、ｕおよびＡＹ用のターゲティングベクターｐＢＣμΔＮＫＯｎｅｏ、ｐＢＣμΔＫＯｐｕｒｏおよびｐｂＣμＡＹＫＯｂｓｒを用いることによって、ＩＧＨＭ−／＋ＩＧＨＭＬ１−／−細胞株を樹立した。ＩＧＨＭおよびＩＧＨＭＬ１アレルをそれぞれ１０ＡＹ／７ＡＹＪおよび８Ｕ／５ｕと命名し（図２Ｂ）、メスの初代ホルスタイン×ジャージ雑種（ＨｏＪｏ）の線維芽細胞株３４２７を用いて、アレル１０ＡＹおよび７ＡＹＪ用のターゲティングベクターｐｂＣμＡＹＫＯｂｓｒおよびｐｂＣμ７ＡＹＪＫＯｈｙｇを用いることによってＩＧＨＭ−／−細胞株を作製した。オスのＩＧＨＭ−／＋ＩＧＨＭＬ１−／−細胞株およびメスのＩＧＨＭ−／−細胞株のそれぞれからクローンウシを作製し、次いで、互いに約１８〜２０ヶ月齢まで飼育した。妊娠の約４０日目に、１８頭の胎仔を収集し、遺伝子型を決定した。７頭の胎仔（３９％）の遺伝子型は、ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／＋であった。全７頭の胎仔において、Ｕの位置にｎｅｏＫＯカセット、ＡＹの位置にｂｓｒカセットが常に連結しており、ＩＧＨＭおよびＩＧＨＭＬ１遺伝子座の両方が予想外にもウシＣｈｒ２１上に位置していることをデータによって裏付けられた。１種類のオスの細胞株Ｊ４８１およびメスの細胞株Ｈ４１２のそれぞれを、ｂＩＧＬ遺伝子クラスター欠失について選択した（図２Ｂ）。
【００９５】
図２Ｃに示すように、本発明者らがｂＩＧＬアレルをＡおよびＤと命名したオスの細胞株Ｊ４８１（ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／＋）を、アレルＡに特異的なｐＣλ１（Ａ）ＣＡＧｚｅｏＰｕｒｏｌｏｘＰＤＴベクターでトランスフェクションし、ゼオシン下で選択し、次いで、プライマーペアのＣＬ１ｐｕｒｏ−Ｆ２Ｒ２を用いるゲノムＰＣＲによって、相同組み換えの発生についてスクリーニングした。ＰＣＲ産物の配列を決定することにより陽性コロニー（１８％）を同定し、そのうちのいくつかを、さらに、ＰＣＲペアＲ−Ｒ１×Ｒ−Ｆ２を用いて別のゲノムＰＣＲに供し、その後、配列を決定した（図２Ｃ）。細胞株Ｊ４８１は、ｂＩＧＬ遺伝子座についてアレルＡおよびＤを含むため、このＰＣＲにより、２つのアレル間に１つの多型部位（アレルＡについてはＴ、アレルＤについてはＧ）が増幅される。例えば、コロニー２７では、Ｇのみが検出され、Ｒ−Ｒ１およびＲ−Ｆ２のプライマーアニーリング部位間へのＣＡＧｚｅｏ／ｌｏｘＰ／プロモーターレスピューロカセットの挿入により、アレルＡが破壊されたことを示す。コロニー２７をＳＣＮＴに使用し、４０日齢の胎仔を作製して、それらから細胞株Ｋ６５５−１ ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／＋ＩＧＬ１−／＋を樹立した。
【００９６】
その後、細胞株Ｋ６５５−１を、アレルＡ特異的ｐＣλ５（Ａ）ＣＡＧｌｏｘＰｎｅｏＤＴベクターおよびＣｒｅ発現プラスミドで同時トランスフェクションし、クラスター欠失を引き起こし、ピューロマイシンによって選択した。２１個のピューロマイシン耐性コロニーが得られ、図２Ｄに示すように、ＣＬ５ＣＡＧ−Ｆ２Ｒ２およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３Ｒ３を用いて２種類のゲノムＰＣＲに供した。前者は、ＩＧＬＣ５遺伝子の３’側に相同組み換えの発生を特定するためのものであり、後者は、クラスター欠失の発生を検出するためのものであった。配列決定解析により、全てのＰＣＲ産物が正しいことが確認された。二重陽性のコロニーをクローニングのために用い、細胞株Ｇ０５４ ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／＋ＩＧＬ−／＋を樹立し、さらにこれを用いて子ウシを作製した。同様に、本発明者らがｂＩＧＬアレルをＢおよびＣと命名したメスの細胞株Ｈ４１２（ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／＋）を、アレルＢ上での２段階のクラスター欠失に供して、子ウシを作製した。最後に、オスおよびメスのＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／＋ＩＧＬ−／＋動物を、互いに約１８〜２０ヶ月齢まで飼育した。妊娠約４０日に、５８頭の胎仔を回収し、遺伝子型を決定した。５頭の胎仔（８．６２％）の遺伝子型は、ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−ＩＧＬ−／−であり、次いで、５つのＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−ＩＧＬ−／−トリプルノックアウト（ＴＫＯ）細胞株を樹立した（図２Ｅおよび図１０）。
【００９７】
実施例３．ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔおよびＫｃＨＡＣΔベクターの構築
ウシにおける完全ｈＩｇＧの高生産を阻害し得る、ヒトおよびウシ間のいくつかの種不適合性がある可能性がある。そのような種不適合性の１つとして、ＩｇＭベースのｐｒｅＢＣＲ／ＢＣＲ機能を対処した。免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）クラスの中で、ＩｇＭ重鎖が発現する最初のものであり、最終的にＩｇＧを分泌させることはＢ細胞の発生に重要である。Ｔｃウシの状態で、ｈＩｇＭをウシＢ細胞表面上で発現させ、その後のＢ細胞の発生に重要であるｐｒｅＢＣＲ／ＢＣＲ媒介性シグナル伝達のために、ウシ代替軽鎖、続いて、正統なウシ軽鎖、およびウシＩｇ−α／Ｉｇ−β分子と相互作用させる。ウシ代替軽鎖、正統なウシ軽鎖およびウシＩｇ−α／Ｉｇ−β分子と相互作用するｈＩｇＭタンパク質に種不適合性がある可能性がある（図１１Ａ〜図１１Ｄ）。この仮説に対処するために、ＫｃＨＡＣΔおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔの２種類のＨＡＣベクターを構築した（図３Ａ）。ＫｃＨＡＣΔにおいて、このようなキメラＩｇＭ｛ｃＩｇＭ（ＣＨ１）｝タンパク質が、良好なｐｒｅＢＣＲ／ＢＣＲシグナル伝達のために、ウシ代替軽鎖、正統な軽鎖およびＩｇ−α／Ｉｇ−β分子と相互作用することができるように、ｈＩＧＨＭ定常領域遺伝子の一部（ＣＨ１〜ＴＭ２ドメイン）をウシ化した。ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔにおいて、良好なｐｒｅＢＣＲ／ＢＣＲシグナル伝達のために、このようなキメラＩｇＭ（「ｃＩｇＭ（ＣＨ２）」；配列番号２００）タンパク質が、ヒト代替軽鎖とペアを組み、ウシＩｇ−α／Ｉｇ−β分子とも相互作用することができるように、ｈＩＧＨＭ定常領域遺伝子の一部（ＣＨ２からＴＭ２ドメイン）を別にウシ化し、さらに、ヒト代替軽鎖ｈＶＰＲＥＢ１およびｈＩＧＬＬ１（マウスではλ５）遺伝子をｈＣｈｒ２２断片と共に導入した。ｈＩｇＭ、ｃＩｇＭ（ＣＨ１）およびｃＩｇＭ（ＣＨ２）タンパク質の可変領域および定常領域の種特異的な異なる配列により、各ＨＡＣベクターにおけるｐｒｅＢＣＲ／ＢＣＲ機能／シグナル伝達（例えば、それぞれκＨＡＣ、ＫｃＨＡＣΔ、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ）は、Ｂ細胞の発生運命、最終的には、ｈＩｇＧ産生プロファイルに別々に影響を与え得る。
【００９８】
定義されたヒト染色体領域を、部位特異的染色体転座によりクローン化（染色体クローニング）することができる開始ＨＡＣベクターとして、ｈＣｈｒ１４断片ＳＣ２０を使用した。ＳＣ２０は、マイクロセル媒介性染色体移入（ＭＭＣＴ）中に天然に存在する断片であり、したがって、その構造は定義されていなかった。構造が定義されたｈＣｈｒ１４ベクターを使用し、できるだけ多くの無関係なヒト遺伝子を除去するために、インタクトなｈＣｈｒ１４を改変し、その後、ＩｇＭをウシ化し、ＫｃＨＡＣΔおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターの構築のために、それぞれ新しいｈＣｈｒ１４ベースのベクターのＣＨ１Ｄ２およびＣＨ２Ｄ４を作製した。
【００９９】
図３Ｂに概説するように、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターを、ニワトリＤＴ４０細胞内で構築した（方法の欄も参照されたい）。全ｈＩＧＬおよび代替軽鎖ｈＶＰＲＥＢ１／ｈＩＧＬＬ１遺伝子座をカバーするｈＣｈｒ２２断片を、ｈＩＧＫ遺伝子座を有するｈＣｈｒ２断片に転座させることによって、ＳＬＫＨ断片を含むクローンＳＬＫＤ１８を作製し、ｈＣｈｒ１４断片（１４Ｄ）を含むクローンＣＨ２Ｄ４とｃＩｇＭ（ＣＨ２）−ウシ化ｈＩＧＨ遺伝子座とを融合し、ＤＴ４０ハイブリッドクローンｃＫＳＬＤ２２を作製した。一方がＳＬＫＨ断片上のＣｏｓ １３８遺伝子座およびもう一方がＣＨ２Ｄ断片上のＲＮＲ２遺伝子座である２つのｌｏｘＰ部位間で部位特異的組み換えを媒介し、ｃＩｇＭ（ＣＨ２）ドメイン内のｌｏｘＰ導入ＣＡＧプロモーターｚｅｏカセットも欠失させるために、Ｃｒｅ発現プラスミドを導入した。ＧＦＰ発現が、転座部位でのＰＧＫプロモーター−ｌｏｘＰ−ＧＦＰカセットの再構成によって付与されるので、組み換え体をＧＦＰ陽性細胞の選別により濃縮した。これが、構造的に定義された、３つの異なる染色体断片（例えば、ｈＣｈｒ２、ｈＣｈｒ１４およびｈＣｈｒ２２）で構成される人工染色体の構築の最初の報告である。
【０１００】
図３Ｃに概説するように、ＫｃＨＡＣΔベクターを、同様にＤＴ４０細胞内で構築した（方法の欄も参照されたい）。同様に、ｈＣｈｒ２断片（κＴＬ１）をウシ化ＩｇＭ｛ｃＩｇＭ（ＣＨ１）｝配列を有するＳＣ２０断片に転座させたＫｃＨＡＣベクターを構築した。
【０１０１】
実施例４．一連のＨＡＣ／ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−（ＤＫＯ）カセットにおけるヒトＩｇＧ産生
ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ、ＫｃＨＡＣΔおよびＫｃＨＡＣベクターを、ＭＭＣＴによりチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に移して、それぞれＣＨＯベースのマスター細胞バンクｃＫＳＬＤＣ６、１５、２３、ＫＣＤＣ１５およびＣＫＦ４を樹立し、大規模ゲノムＰＣＲおよびＣＧＨにより確認した（図１２Ａ−１２Ｃ）。次いで、３種類のＨＡＣベクターのｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ、ＫｃＨＡＣおよびκＨＡＣを、このＣＨＯ細胞株から、育種して得たＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−（ＤＫＯ）細胞株へ移し、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ、ＫｃＨＡＣ／ＤＫＯおよびκＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシを作製した。ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔおよびＫｃＨＡＣベクターの目的は、Ｂ細胞の発生のためのＩｇＭ媒介性ｐｒｅＢＣＲ／ＢＣＲ機能におけるヒトおよびウシ間の種不適合性を解決することであり、したがって、Ｂ細胞の発生プロファイルを、新生児段階でのこれらの動物の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において調べた（図４Ａ）。ＫｃＨＡＣ／ＤＫＯ動物におけるＩｇＭ検出のために、そのウシ化ＣＨ１ドメインにより抗ｂＩｇＭ抗体を用いたが、抗ｈＩｇＭ抗体は、なおｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターからのｃＩｇＭ（ＣＨ２）タンパク質を認識することができる。κＨＡＣ／ＤＫＯ動物と比較すると、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯおよびＫｃＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシの両方は、より高い割合のＩｇＭ単一陽性細胞およびＩｇＭ／ＣＤ２１二重陽性Ｂ細胞を示した。驚くべきことに、ＩｇＭ／ｂＩｇλ、ＩｇＭ／ｂＩｇκおよびＩｇＭ／ｈＩｇκ二重陽性Ｂ細胞は、ＫｃＨＡＣ／ＤＫＯ動物でのみ検出された。ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ子ウシでは、ｈＩｇＭ／ｂＩｇλ、ｈＩｇＭ／ｂＩｇκ、ｈＩｇＭ／ｈＩｇκまたはｈＩｇＭ／ｈＩｇλ二重陽性Ｂ細胞のいずれも、これらの転写物はＲＴ−ＰＣＲでは検出されたが、ｈＩｇＭ／ＣＤ２１二重陽性Ｂ細胞の割合が増加したにもかかわらず、フローサイトメトリーでは検出できなかった（図１２Ｄ）。
【０１０２】
約５〜６ヶ月齢の時点で、ｈＩｇκ／λまたはｂＩｇλ／κのいずれかとペアになった血清中の全ｈＩｇＧ、ならびに完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκの濃度を測定した（図４Ｂ）。子ウシ４６８を除くκＨＡＣ／ＤＫＯ動物と比較して、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターと共に全ｈＩｇＧの血清濃度は大幅に増加し、特にほとんどがｈＩｇＧ１優勢であった（ｈＩｇＧ１／ｈＩｇＧ２比が１をうわまわった）が、ＫｃＨＡＣ／ＤＫＯ動物は、かなり高いｈＩｇＧ２優勢を示した（図４Ｃ）。ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ子ウシは、ＫｃＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシよりも実質的に多量の全ｈＩｇＧを産生し、完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκの割合はより低いように思われ（図４Ｂ、４Ｃ）、完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇλは完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκの５〜１０％であった。
【０１０３】
これらのデータは、ＩｇＭのｐｒｅＢＣＲ／ＢＣＲ機能における潜在的な種不適合性を示唆しており、ヒト代替軽鎖の有無に関わらず、別々にウシ化されたｃＩｇＭ（ＣＨ１）およびｃＩｇＭ（ＣＨ２）タンパク質間でＢ細胞発生およびｈＩｇＧ産生プロファイルにかなりの違いをもたらした。これは、最終的に完全ｈＩｇＧ産生プロファイルに影響を与えるＩｇＭのｐｒｅＢＣＲ／ＢＣＲ機能における種不適合性の新たな証拠である。
【０１０４】
実施例５．ｉｓＨＡＣ、ｉｓｔＨＡＣおよびｉｓＫｃＨＡＣΔベクターの構築
次の方法は、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔおよびＫｃＨＡＣΔベクター上のｈＩＧＨＧ１遺伝子クラススイッチ調節エレメントの直接的なウシ化により、ｈＩｇＧ、特にｈＩｇＧ１へのクラススイッチの効率を直接変えることであった。ｈＩＧＨＧ１遺伝子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインも、ウシの環境下で、潜在的に良好なｈＩｇＧ１ ＢＣＲ媒介性シグナル伝達のためにウシ化した。
【０１０５】
ＩｇＧサブクラスのクラススイッチ組み換えの決定は、生殖細胞の転写物と呼ばれる各免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）遺伝子座に関連したスイッチ領域（ＳＨ）からの転写が先行する。各ＩＧＨ定常領域（ＣＨ）遺伝子は、独自のＩＨエクソンとも関連している独自のＳＨ領域と連結している。生殖細胞系列転写物ＩＨ−ＳＨ−ＣＨ（最終的にはスプライシングされてＩＨ−ＣＨに成熟する）は、ＩＨエクソンのちょうど５’側に位置するプロモーター／エンハンサーエレメントによって促進され、これらのエレメントは、サイトカインまたは他の活性化因子応答性である。クラススイッチの単純なモデルでは、特定の活性化因子および／またはサイトカインは、その活性化因子／サイトカイン応答性ＩＨプロモーター／エンハンサーからの生殖細胞系列転写物を誘導する。３’Ｅαエレメントは、さらにＩＨ−ＳＨ−ＣＨ配列の転写を増強する。この転写は、別のＳＨ領域との融合を引き起こし、クラススイッチを引き起こす酵素の活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）によって標的化することができるように、スイッチ領域を緩める。例えば、ｈＩＧＨＧ１遺伝子と連結した（ヒトＩｇＧ１由来の）ｈＩγ１−ｈＳγ１調節エレメントは、種特異的な配列の違いにより、ｈＩｇＧ１へのクラススイッチを効率的に誘導するために、このようなウシ活性化因子／サイトカイン誘導性タンパク質と若干不適合であるという仮説を立てた（図１３Ａ、図１３Ｂ）。このことは、多くのＴｃウシはｈＩｇＧ２優勢を示したが、ｈＩｇＧ１がヒトにおける主要なサブクラスであることによるものであり得る。
【０１０６】
上記の仮説に基づき、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクター上のｈＣγ１（ヒト重鎖ＩｇＧ１）領域の上流にｂＩγ１−ｂＳγ１配列を有するｉｓＨＡＣベクターを構築するために、ｈＩγ１−ｈＳγ１クラススイッチ調節エレメントをｂＩＧＨＧ１遺伝子のクラススイッチ調節エレメントでウシ化した（図５、方法の欄も参照されたい）。さらに、ｉｓＨＡＣ上のｈＩＧＨＧ１遺伝子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを、ｂＩＧＨＧ１遺伝子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインでさらにウシ化して、種特異的配列の違いと考えられるｉｓｔＨＡＣ（図１３Ｃ）を作製した（図５、方法の欄も参照されたい）。ＤＫＯの背景に見られるように、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔおよびＫｃＨＡＣΔベクターは、潜在的に機能的な違いを有する可能性があるので、これらの２種類のＨＡＣが、ｂＩＧＬ発現を欠くＴＫＯ背景においてどのように作用するのかは不確かであり、ＫｃＨＡＣΔベクターもウシ化して、ＫｃＨＡＣΔ上のｈＣγ１領域の上流にｂＩγ１−ｂＳγ１配列を有するｉｓＫｃＨＡＣΔベクターを構築した（図５、方法の欄も参照されたい）。
【０１０７】
実施例６．一連のＨＡＣ／ＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−ＩＧＬ−／−（ＴＫＯ）ウシ内でのヒトＩｇＧ産生
ｉｓＨＡＣ、ｉｓｔＨＡＣ、ｉｓＫｃＨＡＣΔ、ＫｃＨＡＣΔおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔベクターを、ＭＭＣＴによりＣＨＯマスター細胞バンクからＩＧＨＭ−／−ＩＧＨＭＬ１−／−ＩＧＬ−／−（ＴＫＯ）細胞株に移し、一連のＨＡＣ／ＴＫＯ子ウシを作製した。妊娠２７０日目の分娩効率は、移植されたレシピエントのうちの約７％であり、そのうちの６０〜７０％が誕生後少なくとも５〜６ヶ月まで生き残った（表２）。最初に、ｂＩＧＬが発現していないことを、新生児の段階でＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図６Ａ）。その後、Ｂ細胞発生におけるｂＩＧＬ発現の除去の影響に対処するために、新生児の段階でＨＡＣ／ＴＫＯ子ウシの５種類の遺伝子型についてフローサイトメトリーを行った（図６Ｂ）。ＤＫＯ背景と比較して、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔシリーズ（例えば、ｉｓＨＡＣ、ｉｓｔＨＡＣおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔそれ自体）において、ｈＩｇＭ／ｈＩｇκ（またはｈＩｇＭ／ｂＩｇκ）二重陽性Ｂ細胞の割合が増加したことを除いて、ｈＩｇＭ単一陽性Ｂ細胞およびｈＩｇＭ／ＣＤ２１二重陽性Ｂ細胞の割合は低いように思われ、ｈＩｇＧ／ｈＩｇλ二重陽性Ｂ細胞は検出できなかった。逆に、ｂＩｇＭ単一陽性Ｂ細胞およびｂＩｇＭ／ＣＤ２１二重陽性Ｂ細胞の割合は、ＫｃＨＡＣΔシリーズ（例えば、ｉｓＫｃＨＡＣΔおよびＫｃＨＡＣΔそれ自体）において、ＤＫＯ背景のものとかなり類似しているように思われ、ｂＩｇＭ／ｈＩｇκ（またはｂＩｇＭ／ｂＩｇκ）二重陽性Ｂ細胞の割合は実質的に増加した。
【０１０８】
【表２】
0006426606.tif 000007
【０１０９】
【表３】
0006426606.tif 000008
【０１１０】
【表４】
0006426606.tif 000009
【０１１１】
【表５】
0006426606.tif 000010
【０１１２】
ｉｓＨＡＣ、ｉｓｔＨＡＣおよびｉｓＫｃＨＡＣΔベクター構築のための理論的根拠は、ウシの生理的条件下で、ｈＩＧＨＧ１遺伝子クラススイッチ調節エレメントをウシ化することにより、ｈＩｇＧ、特にｈＩｇＧ１へのクラススイッチの効率を直接変えることだったので、完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκの血清濃度およびｈＩｇＧサブクラス分布を、約５〜６ヶ月齢の一連のＨＡＣ／ＴＫＯ子ウシにおいて測定した（図６Ｃ〜６Ｈ、図１４）。全体的に、５種類のＨＡＣ／ＴＫＯ遺伝子型において、完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκの濃度および割合の両方は、以前のユニークな子ウシ４６８を含むＨＡＣ／ＤＫＯ動物のものと比較して大幅に増加し、したがって、ｂＩＧＬクラスター欠失は、完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκの高産生に驚くほど効果的であることが証明された。完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇλは、ｈＩｇＧ／ｈＩｇκの約５％であり、残りはキメラｈＩｇＧ／ｂＩｇκであった（図１５）。驚くべきことに、ｉｓＨＡＣ／ＴＫＯ、特にｉｓｔＨＡＣ／ＴＫＯ子ウシは、元のｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＴＫＯ動物と比較して、全ｈＩｇＧおよび完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ産生の両方を大幅に増加させた（図６Ｅおよび表４）。特に注目すべきことは、ｈＩｇＧ１／ｈＩｇＧ２比は、ｉｓＨＡＣ／ＴＫＯおよびｉｓｔＨＡＣ／ＴＫＯ子ウシの両方において大幅に増加したが、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＴＫＯ動物は、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ動物においてｈＩｇＧ１優勢からｈＩｇＧ２優勢に変わった（図６Ｉ）。この観察は、一貫してｉｓＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ、ＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯおよびＫｃＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシとの比較においても見られ（図６Ｃ〜６Ｆ）、完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ産生が、元のＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯおよびＫｃＨＡＣ／ＤＫＯ子ウシにおけるｈＩｇＧ２優勢からｉｓＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ動物におけるｈＩｇＧ１優勢への転換に伴って実質的に増加した。
【０１１３】
これらのデータから、Ｉγ１−Ｓγ１クラススイッチ調節エレメントは種特異的に制御されていることが示された。ウシ化Ｉγ１−Ｓγ１配列の効果は特に興味深い。ヒト肝細胞のｈＣｈｒ２１から観察される転写因子結合部位、転写開始のランドマーク、および結果的に生じる遺伝子発現の実質的に全ては、マウス肝細胞核のｈＣｈｒ２１全体にわたって再現されたと報告されている。このことは、ヒト特異的な遺伝子発現プロファイルが、非ヒト種の状況下でさえ、単にヒトＤＮＡ一次配列によって提供され得ることを意味する。この考えをＴｃウシ状況に適用すると、ウシ化していないＨＡＣは、ウシの環境中のｈＩｇＧ１優勢などのヒト様ｈＩｇＧ発現プロファイルを提供するのに十分であるはずだったが、そうではなかった。したがって、驚くべきことに、ｈＩγ１−ｈＳγ１配列のウシ化が、Ｔｃウシ状況においてｈＩｇＧ２優勢からｈＩｇＧ１優勢への十分な転換を引き起こしたという発見は、２種間のＩｇＧ１クラススイッチ調節における種不適合性を示唆している。クラススイッチを含む免疫グロブリン遺伝子の構成および多様化は、種間で明確に進化していると考えられているので、このような種不適合性に対処することは、一般的に、非ヒト種においてヒト抗体を発現するのに有用であろう。完全ｈＩｇＧ血清濃度に対する種特異的効果は、別にウシ化されたｃＩｇＭタンパク質｛ｃＩｇＭ（ＣＨ１）対ｃＩｇＭ（ＣＨ２）｝間で異なるように思われる。ｃＩｇＭ（ＣＨ１）背景のＩγ１−Ｓγ１エレメントのウシ化は、これを著しく改善した（すなわち、ｉｓＫｃＨＡＣΔ対ＫｃＨＡＣΔ）が、ｃＩｇＭ（ＣＨ２）背景においては改善しなかった（すなわち、ｉｓＨＡＣ対ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ）。ｃＩｇＭ（ＣＨ２）背景において、さらに、ＩｇＧ１膜貫通／細胞質ドメインのウシ化は、完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ産生を著しく改善するのに必要であった（すなわち、ｉｓＨＡＣ対ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ）。ｃＩｇＭ（ＣＨ１）およびｃＩｇＭ（ＣＨ２）背景の両方において、ウシ化Ｉγ１−Ｓγ１配列は、ｈＩｇＧ１サブクラス優勢を大幅に変更した。
【０１１４】
最後に、このような複合染色体工学を受けたＨＡＣ／ＴＫＯ子ウシが、抗原免疫に応答して完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκポリクローナル抗体を機能的に産生することを示すために、いくつかのＨＡＣ／ＴＫＯ動物をヒト口腔扁平上皮癌で過免疫し、ＨＡＣ／ＤＫＯ遺伝子型のｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯと比較して、抗原特異的な完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ免疫応答を調べた。全てのＨＡＣ／ＴＫＯ免疫子ウシは、堅牢な抗ヒト癌の完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκ応答を開始したが（ｈＩｇＧおよびｈＩｇκの両方について２８．４５〜８０．３６％陽性）、２頭のｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＤＫＯ動物は、ｈＩｇＧおよびｈＩｇκの両方について０．７３〜１．５４％のみ陽性であり、ｈＩｇＧ応答のみを示した（図６Ｌ、図１６）。このデータは、ＨＡＣ／ＴＫＯ遺伝子型が、抗原特異的な完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκポリクローナル抗体の高生産性に重要であることを示しており、これはさらにウシ化したＨＡＣベクターのｉｓｔＨＡＣおよびｉｓＫｃＨＡＣΔにより増強された。
【０１１５】
本発明は、大規模農場の動物種の血清中で大量の（新規遺伝子型、すなわちｉｓＨＡＣ／ＴＫＯ、ｉｓｔＨＡＣ／ＴＫＯおよびｉｓＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯにおいて平均値／中央値が５ｇ／ｌを上回る）完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκを産生することができる。完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκのこの血清濃度は、本発明者らの知る限りでは、完全ｈＩｇＧを産生する任意の他のトランスジェニックマウス系で最も高く（典型的には約０．５ｇ／ｌ）、健康なヒトの濃度に最も近い。さらに、ｉｓＨＡＣ／ＴＫＯ、ｉｓｔＨＡＣ／ＴＫＯおよびｉｓＫｃＨＡＣΔ／ＴＫＯ子ウシで産生されたｈＩｇＧサブクラスは、健康なヒトの主要なサブクラスであり、開発中および市販されている治療用ｈＩｇＧ組み換え抗体のサブクラスでもあるｈＩｇＧ１優勢になるように調節することができる。重要なことは、試験した全てのＨＡＣ／ＴＫＯ子ウシが、免疫したヒト由来の抗原に対する完全ｈＩｇＧ／ｈＩｇκポリクローナル抗体を機能的に産生したことであり、これは、ヒト免疫寛容が原因で従来のヒト血漿由来のＩＶＩＧによって達成することが困難であった。これは、複合ヒト染色体工学、ならびに内因性ウシ染色体工学（部位特異的、大きなＤＮＡの欠失）を通じて、いくつかの主要な構成要素（ｐｒｅＢＣＲ／ＢＣＲ機構およびＩγ１−Ｓγ１調節エレメント）の潜在的な種不適合性に対処する新たな方法を使用して達成された。いくつかの調節エレメントのＤＮＡ配列がヒトとはかなり異なっている場合に、種不適合性のこの新しい概念は、トランスジェニック動物における複雑に調節されたヒト遺伝子の高発現についても考慮され得る。重要なことには、この複合染色体工学は、ＥＳ細胞を使用する必要性を軽減するために体細胞で行われた。
【０１１６】
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３１．Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．＆ Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．Ｍａｒｇｉｎａｌ−ｚｏｎｅ Ｂ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２，３２３−３３５（２００２）．
３２．Ｓｉｂｅｒ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｒｕｍ ＩｇＧ２ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３０３，１７８（１９９０）．
３３．Ｓｈａｃｋｅｌｆｏｒｄ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｂｃｌａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｔｏ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５，３９０−３９５（１９８５）．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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