(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定する方法であって、
（ａ）ＬＡＬ反応性物質を含む水性試料を検出試薬と接触させて、調製試料を形成するステップと、
（ｂ）調製試料の物理特性を測定して、調製試料に特徴的な１以上の試料測定値を得るステップであって、物理特性が光学特性であるステップと、
（ｃ）曲線あてはめを使用して、試料測定値及び既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を含む溶液の物理特性の１以上の基準測定値で明らかになる相関に基づいて、水性試料が将来の指定された時間に有するＬＡＬ反応性物質の濃度を予測し、履歴データ及び／又は基準測定値を用いて、試料測定値の品質を検証するステップと
を含む方法。
【請求項２】
物理特性が透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度からなる群から選択される光学特性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
物理特性が試料測定値の反応速度論及び品質からなる群から選択される非線形特性であり、試料測定値の品質が非線形特性を用いて検証される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
１以上の反応がエンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
反応のカスケード開始の１以上の見かけの時間遅延を曲線あてはめステップにおける変数として含めるステップをさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定する方法であって、
（ａ）ＬＡＬ反応性物質を含む水性試料を検出試薬と接触させて、調製試料を形成するステップと、
（ｂ）調製試料の物理特性を測定して、調製試料に特徴的な２以上の試料測定値を得るステップであって、物理特性が光学特性であるステップと、
（ｃ）試料測定値及び既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を含む溶液の物理特性の３以上の基準測定値の非線形挙動で明らかになる相関に基づいて、水性試料が将来の指定された時間に有するＬＡＬ反応性物質の濃度を予測するステップと
を含む方法。
【請求項７】
物理特性が透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度からなる群から選択される光学特性である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
物理特性が非線形特性であり、非線形特性が検出試薬とＬＡＬ反応性物質との間の反応の既知の反応速度論に基づく、請求項６記載の方法。
【請求項９】
１以上の反応がエンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定するシステムであって、
（ａ）メモリと、
（ｂ）メモリに作動的に接続されたプロセッサであって、
（Ｉ）試料測定値を含む１以上の入力を受信するステップであって、試料測定値が、ＬＡＬ反応性物質を含む水性試料に特徴的な測定された物理特性であって、物理特性が光学特性であるステップと、
（ＩＩ）曲線あてはめを使用して、１以上の出力を生成するステップであって、出力が、試料測定値及び既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を含む溶液の物理特性の１以上の基準測定値で明らかになる相関に基づいて、水性試料が将来の指定された時間に有するＬＡＬ反応性物質の予測された濃度、並びに検証された試料測定値を含んでおり、試料測定値の品質が履歴データ及び／又は基準測定値を用いて検証されるステップと、
（ＩＩＩ）メモリ中に出力を報告及び／又は保存するステップと
を実行するようにプログラムされたプロセッサと
を含むシステム。
【請求項１１】
プロセッサに作動的に接続された光学読取装置をさらに含む、請求項１０記載のシステム。
【請求項１２】
物理特性が透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度からなる群から選択される光学特性である、請求項１０記載のシステム。
【請求項１３】
物理特性が非線形特性であり、非線形特性が反応速度論である、請求項１２記載のシステム。
【請求項１４】
１以上の反応がエンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１３記載のシステム。
【請求項１５】
プロセッサが、反応のカスケード開始の１以上の見かけの時間遅延を曲線あてはめステップにおける変数として含めるようにさらにプログラムされている、請求項１４記載のシステム。
【請求項１６】
水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定するシステムであって、
（ａ）メモリと、
（ｂ）メモリに作動的に接続されたプロセッサであって、
（Ｉ）２以上の試料測定値を含む１以上の入力を受信するステップであって、試料測定値が、ＬＡＬ反応性物質を含む水性試料に特徴的な測定された物理特性であって、物理特性が光学特性であるステップと、
（ＩＩ）既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を含む溶液の物理特性の３以上の基準測定値の非線形挙動で明らかになる相関を使用して、試料測定値に基づいて水性試料が将来の指定された時点で有するＬＡＬ反応性物質の予測された濃度を含む１以上の出力を作成するステップと、
（ＩＩＩ）メモリ中に出力を報告及び／又は保存するステップと
を実行するようにプログラムされたプロセッサと
を含むシステム。
【請求項１７】
プロセッサに作動的に接続された光学読取装置をさらに含む、請求項１６記載のシステム。
【請求項１８】
物理特性が透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度からなる群から選択される光学特性である、請求項１６記載のシステム。
【請求項１９】
物理特性が非線形特性であり、非線形特性が検出試薬とＬＡＬ反応性物質との間の反応の既知の反応速度論に基づく、請求項１８記載のシステム。
【請求項２０】
１以上の反応がエンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定する分野に関する。より具体的には、本発明は、ＬＡＬ反応性物質測定法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母及び真菌などの微生物汚染は、ヒトにおいて重病及び死さえ引き起こし得る。ヒトがグラム陰性細菌に感染すると、細菌は熱誘発細菌エントドキシン又はエンドトキシン分子を産生し得る。エンドトキシン分子は、微生物が存在しない場合でさえ、汚染源となり得る。エンドトキシン分子は、ヒトにとって危険で、毒素ショックをもたらし、又は致命的となり得る。
【０００３】
特定の産業、特に製薬、医療機器及び食品産業の製造業者は、その製品が微生物もエンドトキシン汚染も含まないことを確実にするために特定の基準を満たさなければならない。これらの産業は、米国食品医薬品局又は環境保護庁によって設定されているものなどの種々の安全性基準を満たすためにエンドトキシンの存在についての頻繁で、正確かつ高感度の試験を要する。
【０００４】
現在、カブトガニの血球溶解物を用いて、試験している試料中又は上のエンドトキシンの存在を検出する種々のアッセイが開発されている。血球溶解物がエンドトキシンに暴露すると、凝固が起こる。血球溶解物は、リムルス属（Ｌｉｍｕｌｕｓ）、タキプレウス属（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ）及びカルキノスコルピウス属（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ）の種を含む種々のカブトガニ種の血リンパから産生されるアメボサイト溶解物である。一般的に使用されるアメボサイト溶解物は、リムルス属の種の血リンパから産生され、リムルスアメボサイトライセート（「ＬＡＬ」）と呼ばれる。
【０００５】
ＬＡＬを使用する日常的なアッセイには、ゲルクロット法（ｇｅｌ  ｃｌｏｔ  ａｓｓａｙ）、エンドポイント比濁法（ｅｎｄ  ｐｏｉｎｔ  ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）、カイネティック比濁法（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）、エンドポイント発色法及びカイネティック発色法が含まれる。これらのアッセイ及び使用される基準についてのさらなる情報は、米国薬局方（「ＵＳＰ」）第８５章「細菌エンドトキシン試験法」（「ＢＥＴ」）、日本薬局方４．０１「細菌エンドトキシン試験法」、欧州薬局方２．６．１４「細菌エンドトキシン」及び他の同等の国の薬局方に見出され得る。さらなる国際的に調和した薬局方情報は、ＩＣＨ  Ｑ４Ｂ  附属書１４「細菌エンドトキシン試験法総則」に見出され得る。医療機器のエンドトキシン試験については、情報がＵＳＰ第１６１章「輸液及び注入アセンブリ並びに同様の医療機器」及びＡＮＳＩ／ＡＡＭＩ  ＳＴ７２「細菌エンドトキシン−試験法、日常的モニタリング及びバッチ試験の代替法」に見出され得る。
【０００６】
典型的な発色及び比濁ＢＥＴ法はウェルプレートで行われ、吸光度の測定が２４、９６及び３８４ウェルプレートを実行するよう設計されたプレートリーダーによって行われている。これら全ての場合で、カイネティック法は、指定された開始光学濃度（吸光度）に達するために要する時間の測定を要求する。そのため、吸光度値が、単一プレートで試験されている全ての試料及び基準について定期的間隔で測定される。反応が進行するにつれて、光学濃度（「ＯＤ」）が時間とともに増加するが、実際の測定が正確な指定された開始光学濃度に等しいと予想することは不可能である。試料の光学濃度が指定された開始値に達し、これを通過した時を計算するために、連続測定でのデータにデータ分析が要求される。このような分析は、典型的には指定された開始値未満及び超の測定値による２つの連続的なタイムスタンプ付きデータポイント間の単純な線形補間、又は指定された開始値の近くの大きな塊のデータポイントにわたる線形もしくは非線形曲線あてはめのいずれかを伴う。開始ＯＤに達するために要する時間はエンドトキシン濃度と逆相関するので、結果として低レベルのエンドトキシンの試験は必然的に長いアッセイ時間を要する。これは、典型的にはＬＡＬ試薬の製造業者及び種類に応じて、ブランク（陰性対照）から識別される０．００５ＥＵ／ｍＬを測定するために１時間以上となる。
【０００７】
比濁法は、通常発色基質と併せて同等のＬＡＬ試薬を用いた発色法よりも長い時間を要する。４０５ｎｍに吸光度ピークを有する発色基質を組み込んだ発色法は、エンドポイントモード又はカイネティックモードで行われ得る。発色法では、４０５ｎｍで測定される光学濃度の時間依存性が、通常「初期遅延時間（ｌａｇ  ｔｉｍｅ）」と呼ばれる、ＯＤが０に近いままである実質的な初期間を示す。初期遅延時間に、ＯＤが上昇し始める期間、すなわち「初期勾配（ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｌｏｐｅ）」が続く。エンドトキシン濃度が上昇するにつれて初期遅延時間は短くなる一方で、ＯＤ応答の初期勾配はエンドトキシン濃度とともに増加する。エンドポイントモードは、エンドトキシンレベルと指定された時間で達成される４０５ｎｍでのＯＤを相関させる。カイネティックモードは、エンドトキシンレベルと、典型的にはＯＤ＝０．２として定義される４０５ｎｍでの指定された開始ＯＤを達成するために要する時間を相関させる。ブランク対照と、０．００５ＥＵ／ｍＬ又は０．００１ＥＵ／ｍＬの所望の検出下限との間の分解能を得るために、エンドポイント法とカイネティック法の両方が、典型的には６０分超の長い実行時間を有する。
【０００８】
そのため、アッセイ結果が迅速に得られることを要する場合、アッセイの早期の時点でエンドトキシン濃度と確かに相関するデータ分析方法を有することが望ましい。よって、アッセイの早期の時点でエンドトキシン濃度を推定するためのいくつかの方法が開発されている。
【０００９】
１つの方法は、現在行われている静的光散乱法よりも迅速に比濁法からの結果を得る動的光散乱法である。別の方法は、アッセイ時間とエンドトキシン濃度を相関させるために時間関数差分法及び多系列差分法と併せて比濁法のために光散乱測定を使用する装置を使用する。別の方法は、エンドトキシン濃度と、比濁法で検出される散乱光の初期増加速度の相関を使用する。これら全ての方法が所与の試料のエンドトキシン濃度を得るために要する時間を減少させ得るが、これらの方法全てが相関又は線形予測法に頼っている。またこれらの方法は使用者がデータを摘要要件又は基準と相関させることを可能にしない。さらに、これらの方法のいずれも、測定における異常を使用者に警告することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−２１２１２０号公報
【発明の概要】
【００１１】
驚くべきことに、ＬＡＬとエンドトキシンの反応の反応速度論を監視することにより、使用者が、試料中に存在し得る任意のエンドトキシンの濃度を予想することに加えて、試料分析において異常が存在するかどうかを検証又は評価することが可能になることが発見された。遅延時間、初期勾配、経時的な吸光度の勾配の変化率、及び時間に対して測定される吸光度の最大勾配等などのいくつかのＯＤ応答が、所与の試料中のエンドトキシン濃度とよく相関する。さらに、閾値吸光度に達するのに要する時間がエンドトキシン濃度と相関するカイネティック法については、驚くべきことに、吸光度データを回収すると、動的基準で開始時間の予想が可能であることが発見された。これにより、エンドトキシン濃度を、指定された吸光度閾値に達するのに要する実際の時間よりも早く計算することが可能になる。このような予想に使用する戦略は、較正に使用するエンドトキシン基準の濃度範囲に依存する。したがって、低エンドトキシン濃度でさえ、高感度かつ迅速な方法が開示される。本方法を、比濁法及び発色法を含む任意の光度測定法と共に使用することができる。
【００１２】
一実施形態では、水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定する方法が開示される。本方法は、水性試料を検出試薬と接触させて、調製試料を形成するステップを含み得る。調製試料の物理特性を測定して、調製試料に特徴的な１以上の試料測定値を得ることができる。次いで、曲線あてはめを使用して、試料測定値及び既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を中に含む溶液の物理特性の１以上の基準測定値の間で明らかになる相関に基づいて、水性試料が将来の指定された時間に有するＬＡＬ反応性物質の濃度を予測することができる。履歴データ及び／又は基準測定値を用いて、試料測定値の品質を検証することができる。
【００１３】
別の実施形態では、物理特性が光学特性であり得る。適当な光学特性には、それだけに限らないが、透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度が含まれる。
【００１４】
さらに別の実施形態では、物理特性が反応速度論などの非線形特性であり得る。非線形特性を用いて、試料測定値の品質を検証することができる。反応速度論の種類には、それだけに限らないが、エンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せが含まれる。別の実施形態では、本方法が、反応のカスケード開始の１以上の見かけの時間遅延を変数として曲線あてはめステップに含めるステップをさらに含み得る。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、水性試料を検出試薬と接触させて調製試料を形成するステップを含む、水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定する方法が開示される。調製試料の物理特性を測定して、調製試料に特徴的な２以上の試料測定値を得ることができる。水性試料が将来の指定された時間に有するＬＡＬ反応性物質の濃度を予測することができる。予測された濃度は、試料測定値及び既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を中に含む溶液の物理特性の３以上の基準測定値の非線形挙動間で明らかになる相関に基づき得る。
【００１６】
別の実施形態では、物理特性が光学特性であり得る。適当な光学特性には、それだけに限らないが、透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度が含まれる。
【００１７】
さらに別の実施形態では、物理特性が検出試薬とＬＡＬ反応性物質との間の反応の既知の反応速度論に基づく非線形特性であり得る。適当な反応には、それだけに限らないが、エンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せが含まれる。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定するシステムが開示される。システムは、メモリと、メモリに作動的に接続されたプロセッサとを含み得る。プロセッサは、試料測定値を含む１以上の入力を受信するようプログラムされ得る。試料測定値は、水性試料に特徴的な測定された物理特性であり得る。プロセッサはまた、曲線あてはめを使用して１以上の出力を生成するようプログラムされ得る。出力は、試料測定値及び相関に基づいて、水性試料が将来の指定された時間に有するＬＡＬ反応性物質の予測された濃度を含み得る。相関は、既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を中に含む溶液の物理特性の１以上の基準測定値間で明らかになり得る。出力はまた、試料測定値の品質が検証された、検証された試料測定値を含み得る。履歴データ及び／又は基準測定値を用いて、品質を検証することができる。プロセッサはまた、メモリ中に出力を報告及び／又は保存するようプログラムされ得る。さらに別の実施形態では、システムが、プロセッサに作動的に接続された光学読取装置をさらに含み得る。
【００１９】
システムの別の実施形態では、物理特性が光学特性であり得る。適当な光学特性には、それだけに限らないが、透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度が含まれる。
【００２０】
さらに別の実施形態では、物理特性が反応速度論などの非線形特性であり得る。適当な反応には、それだけに限らないが、エンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せが含まれる。別の実施形態では、プロセッサが、反応のカスケード開始の１以上の見かけの時間遅延を変数として曲線あてはめステップに含めるようさらにプログラムされ得る。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定するシステムが開示される。システムは、メモリと、メモリに作動的に接続されたプロセッサとを含み得る。プロセッサは、１以上の入力を受信するようプログラムされ得る。入力は、水性試料に特徴的な測定された物理特性である２以上の試料測定値を含み得る。プロセッサは、既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を中に含む溶液の物理特性の３以上の基準測定値の非線形挙動間で明らかになる相関を使用して１以上の出力を作成し得る。出力は、水性試料が将来の指定された時間に有し得るＬＡＬ反応性物質の予測された濃度を含み得る。プロセッサはまた、メモリ中に出力を報告及び／又は保存するようプログラムされ得る。さらに別の実施形態では、システムが、プロセッサに作動的に接続された光学読取装置をさらに含み得る。
【００２２】
別の実施形態では、物理特性が光学特性であり得る。適当な光学特性には、それだけに限らないが、透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度が含まれる。
【００２３】
さらに別の実施形態では、物理特性が非線形特性であり得る。非線形特性は、検出試薬とＬＡＬ反応性物質との間の反応の既知の反応速度論に基づき得る。適当な反応には、それだけに限らないが、エンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】種々のエンドトキシン濃度での初期遅延時間及び初期勾配が示された本発明の実施形態を示す図である。
【図２】ブランク水の発色カイネティックＬＡＬ法からのデータストリームのチャートである。
【図３】ブランク水の予測開始時間を示す図である。
【図４】中断を含むデータストリームを示す図である。
【図５】正常及び異常データストリームについてのピアソンのｒを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書中のいくつかの頻繁に使用される用語は以下の通り定義され得る。以下の定義は、本発明の理解を助けることを意図したものであって、本発明を本明細書で使用される用語に限定することを意図していない。「予想する」又は「予測する」とは、ある量が将来の指定された時間に有する大きさを評価することを意味する。予測は、それだけに限らないが、データを、情報が維持され、かつ適当な予想が将来の時間のデータの挙動に関してなされ得るようにデータを処理する任意の線形又は非線形法を含む、当業者に知られている任意の方法によって達成され得る。予測法には、それだけに限らないが、曲線あてはめ及び外挿、並びにこれらの組合せが含まれる。
【００２６】
「曲線あてはめ」とは、所与のデータ又は所与のデータセットに最も近接接近する曲線を計算することを意味する。曲線あてはめの適当な方法には、それだけに限らないが、データをあてはめるための関数を使用すること、使用する反応系の既知の反応速度論に基づく関数を使用すること、データをあてはめるための検出力曲線（ｐｏｗｅｒ  ｃｕｒｖｅ）を使用すること、時間オフセットを有する検出力曲線を使用すること、データをフィルタリングしてノイズ又は標本化効果を排除すること、データを変換すること（例えば、対数への変換）、最小二乗法を使用すること、最終あてはめに対するポイントの重要度がデータポイントの重みに基づくように各データポイントと重みを関連付けること、データが得られたポイントのデータに含まれる情報に基づいてデータポイントの重みを計算すること、履歴データに基づいて重みを計算すること、データストリームの一部を選択すること、データから導き出される値を曲線あてはめすること（例えば、データの勾配又は二次導関数の曲線あてはめ）、及びこれらの組合せが含まれる。
【００２７】
「外挿」とは、関数の値が分かっている全てのポイントより大きい又は小さいポイントで関数を推定することを意味する。外挿の適当な方法には、それだけに限らないが、分析が既知の関数に基づくパラメトリック手段を用いること、非パラメトリック手段を用いること、限定されたデータ系列の回帰から値を導き出すこと、限定されたデータ系列の曲率又は他の動的挙動から値を導き出すこと、データの任意の変換から値を導き出すこと、全ての論理的及び数学的変換を含めること、並びにこれらの組合せが含まれる。
【００２８】
「発色開始時間」は、指定されたスペクトルの光吸収又は光学濃度が指定された量変化するのにかかる時間間隔である。「発色光学濃度」は、一定時間後の指定されたスペクトルの吸収である。「発色光学濃度発達率」は、経時的な吸収の最大変化である。「比濁開始時間」は、指定されたスペクトルの光散乱の量又は光散乱による見かけの光学濃度変化が指定された量変化するのにかかる時間間隔である。「比濁レベル」は、一定時間後の指定されたスペクトルの光散乱の量又は光散乱による見かけの光学濃度変化である。「比濁発達率」は、経時的な光散乱の量の最大変化又は光散乱による最大の見かけの光学濃度変化である。
【００２９】
反応が完了する前にとったデータからＬＡＬとエンドトキシンの反応の結果を予想することは、速度論的挙動に基づく。これは、同様に、その化学経路、直前のステップによって活性化された酵素のカスケードに基づく。結果は、検出力関数、すなわち遅延を含む検出力関数によって厳密に近似される。このような分析を使用してデータストリームが正常反応からのものであるかどうか、又は気泡形成などのいくらかの異常が起こっており、アッセイを拒否すべきかどうかを決定することもできる。
【００３０】
ＬＡＬ試薬は、酵素前駆体、活性化すると酵素になるタンパク質、関連因子及び阻害剤の混合物である。各ロットは、回収されたカブトガニ集団の変化、及び調製の差異のために固有である。主要成分は、エンドトキシンによって活性化され、酵素活性化Ｃ因子になるＣ因子であり、これが今度はＢ因子を活性化する。活性化Ｂ因子がプレ凝固酵素（Ｐｒｅ−Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）を活性化し、これが今度はコアグロゲンの凝固（比濁法について）又は発色（発色法について）を引き起こす。
【００３１】
酵素カスケードの速度論は、Ｈｅｍｋｅｒ及びＨｅｍｋｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｂ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１７３、４１１〜４２０（１９６９）による「Ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」に論じられている。オープンカスケード、活性化酵素が安定であるものについては、最も単純なモデルは、生成物が時間の検出力関数として形成されるものである。
【００３２】
［Ｐ］＝ａｔb＋［Ｐ0］
（Ｐはカスケード生成物（発色指示薬又は凝固したコアグロゲン）であり、Ｐ０は初期レベルであり、ｔは反応時間であり、かつａ及びｂは定数である）。
【００３３】
実際には、反応速度論はより複雑である。Ｃ因子の活性化は、エンドトキシンと複数活性化部位の結合によるものであり得、ここでは中間結合が構造及びその後の結合親和性を変化させる。このアロステリック調節は、それ自体が比較的短期間にわたって活性化Ｃ因子によるエンドトキシンの置換として単純にモデル化され得るＣ因子の活性化を遅延させる。全プロセスを、この転移が起こるのにかかった平均時間にほぼ等しい遅延としてモデル化することができる。この第１のステップからのエンドトキシン濃度の「増幅」はないが、後のステップで産生される酵素が全て連鎖反応として急速に増加する。
【００３４】
ＬＡＬ活性化への２つの経路が存在する。１つの経路はエンドトキシン経路であり、３つのカスケードステップを有する。したがって、エンドトキシン経路の反応速度論は、ほぼ３次検出力関数となる。第２の経路はＧ因子を通したグルカン経路である。グルカン経路は１つのカスケードステップのみを有し、反応速度論は一次関数に近くなる。多くの試料では、検出可能なグルカンが存在せず、反応速度論はエンドトキシン経路のもの、すなわち高次の検出力関数となる。より複雑な試料では、両経路が活性化され、速度論がより複雑になり得る。その速度論サインによって両者の活性を分離することが可能であるが、これを行う産業的に許容される手段は、経路の１つを化学的に阻害することによる。
【００３５】
しかしながら、驚くべきことに、エンドトキシンとグルカンの速度論サインの両方を監視することを用いてどの挙動が「正常」であり、また光路中の粒子の移動又は気泡の成長などの他の因子によって何か引き起こされ得るかを決定することができることが発見された。これにより、使用者が、試料中に存在し得る任意のエンドトキシン又はグルカンの濃度を予想することに加えて、データを検証する又は試料分析において異常が存在するかどうかを評価することが可能になる。
【００３６】
本明細書で使用される「検証する」とは、分析の品質を実証、確認、又は分析の確実性もしくは分析の進行を確立することを意味する。分析及び／又は試料測定値の適合性を検証する場合、２以上の陽性対照（較正範囲の中央でＬＡＬ反応性物質が添加された試料）、３つの陰性対照（ブランク）、及び任意の他のパラメータが製造業者又は摘要によって指定された摘要法が使用され得る。陽性製品対照スパイク（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｐｉｋｅ）は、摘要要件（５０％〜２００％の間のスパイク収率）、陰性対照（最低レベルとブランクとの間の差、ブランクはより低い応答レベルを有する）、及び製造業者の仕様書（例えば、０．００５ＥＵ／ｍＬ試料とブランクとの間の差、又は特定の基準についての開始時間限界）を満たさなければならない。これらの分析が成功である場合、これらはシステム及び試薬が仕様通り働いていることを検証しており、試料測定値が「検証されて」いる。データストリームを検証することは、データストリームの挙動が履歴測定値データ又は検出試薬とＬＡＬ反応性物質との間の反応の既知の反応速度論に基づいて予想された挙動に統計学的に一致することを意味する。これは、データストリームがＬＡＬ反応に基づく分析チャンバーの変化によって作成されており、気泡などのある異常に基づくチャンバー又は光路の変化によって作成されているのではないことを示している。究極的には、この差別化自体は、それだけに限らないが、試料臨界光学特性ブランク読取、混合試料／試薬／任意のＬＡＬ反応性物質、初期光学読取、臨界光学特性の変化のなめらかさ及び変化率、理論的予想変化への適合の密接度、データのノイズレベルでの予想などを含む、その動作を確認するための異なる試薬及びロット並びに誘発された異常での多重試験によって検証されるだろう。試験結果が不正確であるように思われる場合、ＬＡＬ反応性物質測定結果を作成することなく、試験プロセスを停止し、エラーメッセージを送ることができる。同様に、試験結果が出力として現れる場合、試験結果及び／又は試料測定値は「検証されて」いる。
【００３７】
同様に驚くべきことに、経時的な吸光度、開始時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度などのいくつかのＯＤ応答が、所与の試料中のエンドトキシン濃度とよく相関することが発見された。したがって、低エンドトキシン濃度でさえ、高感度かつ迅速な方法が開示される。本方法を、比濁法及び発色法を含む任意の光度測定法と共に使用することができる。
【００３８】
一実施形態では、水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定する方法が開示される。本方法は、水性試料を検出試薬と接触させて、調製試料を形成するステップを含み得る。調製試料の物理特性を測定して、調製試料に特徴的な１以上の試料測定値を得ることができる。次いで、曲線あてはめを使用して、試料測定値及び既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を中に含む溶液の物理特性の１以上の基準測定値の間で明らかになる相関に基づいて、水性試料が将来の指定された時間に有するＬＡＬ反応性物質の濃度を予測することができる。履歴データ及び／又は基準測定値を用いて、試料測定値の品質を検証することができる。
【００３９】
別の実施形態では、物理特性が光学特性であり得る。適当な光学特性には、それだけに限らないが、透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度が含まれる。
【００４０】
さらに別の実施形態では、物理特性が反応速度論などの非線形特性であり得る。非線形特性を用いて、試料測定値品質を検証することができる。反応速度論の種類には、それだけに限らないが、エンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せが含まれる。別の実施形態では、本方法が、反応のカスケード開始の１以上の見かけの時間遅延を変数として曲線あてはめステップに含めるステップをさらに含み得る。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、水性試料を検出試薬と接触させて調製試料を形成するステップを含む、水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定する方法が開示される。調製試料の物理特性を測定して、調製試料に特徴的な２以上の試料測定値を得ることができる。水性試料が将来の指定された時間に有するＬＡＬ反応性物質の濃度を予測することができる。予測された濃度は、試料測定値及び既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を中に含む溶液の物理特性の３以上の基準測定値の非線形挙動間で明らかになる相関に基づき得る。
【００４２】
別の実施形態では、物理特性が光学特性であり得る。適当な光学特性には、それだけに限らないが、透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度が含まれる。
【００４３】
さらに別の実施形態では、物理特性が検出試薬とＬＡＬ反応性物質との間の反応の既知の反応速度論に基づく非線形特性であり得る。適当な反応には、それだけに限らないが、エンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せが含まれる。
【００４４】
本発明は、ＣＰＵと、主記憶装置と、Ｉ／Ｏリソースと、ユーザーインターフェース、例えば、モニター、手動キーボード、マウス及びプリンターとを含むコンピュータで実行可能である。場合により、モニターはタッチスクリーンであり得る。コンピュータはハンドヘルドデバイスであり得る。したがって、水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定するシステムも開示される。コンピュータは光学読取装置に作動的に接続され得る。ある実施形態では、光学読取装置（図示せず）が固定された光学部品を含む。固定された光学部品は、低コストＬＥＤ及びフォトダイオードを含み得る。読取装置は、光学測定値の正確度を増加させるためにバンドパスフィルタを含むことができる。読取装置はまた、光学ノイズを減少させ、環境光を拒否し、かつ迷光を拒否するよう調節又は電子工学的に切断され得る。読取装置はまた、監視ポイントの行列が各行又は列について単一部品を有し、低部品コストへの時間多重化読取スキームを使用することができるように多重化光学部品を含むこともできる。窓、暗視野、開口、レンズ、反射板又は拡散板などの光学部品をマイクロ流体カートリッジ自体に組み込んで光路の一部を提供する又はシステムの安定性もしくは感度を増加させることもできる。
【００４５】
適当な読取装置は、それだけに限らないが、透過、吸収、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、濁度、散乱光、化学発光及び蛍光を含む種々の光学検知法及び測定値を使用又は行うことができる。
【００４６】
検知される光は、単一波長、もしくはスペクトルバンド、又は複数波長もしくはバンドのものであり得る。複数光バンドを使用してシグナルを増加させる又は干渉及びノイズを減少させることができる。例えば、複数周波数で光学濃度の変化を監視することにより、不安定な試料の色の干渉を減少させることができるだろう。ラマン分光法、磁気共鳴及び表面プラズモン共鳴などのより複雑な光学法、並びに静電容量、粘度、磁性、音波抵抗及び音波屈折などの非光学法を含む、使用される検知法は、流体の変化を離れて検知することができる。
【００４７】
本発明の別の実施形態では、水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定するシステムが開示される。システムは、メモリと、メモリに作動的に接続されたプロセッサとを含み得る。プロセッサは、試料測定値を含む１以上の入力を受信するようプログラムされ得る。試料測定値は、水性試料に特徴的な測定された物理特性であり得る。プロセッサはまた、曲線あてはめを使用して１以上の出力を生成するようプログラムされ得る。出力は、試料測定値及び相関に基づいて、水性試料が将来の指定された時間に有するＬＡＬ反応性物質の予測された濃度を含み得る。相関は、既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を中に含む溶液の物理特性の１以上の基準測定値間で明らかになり得る。出力はまた、検証された試料測定値を含み得る。履歴データ及び／又は基準測定値を用いて、試料測定値の品質を検証することができる。プロセッサはまた、メモリ中に出力を報告及び／又は保存するようプログラムされ得る。報告は上記モニター上の視覚表示であり得る。報告はまた、上記のプリンターからのプリントアウトであり得る。さらに別の実施形態では、システムが、プロセッサに作動的に接続された光学読取装置をさらに含み得る。光学読取装置は、１以上の試料測定値及び／又は１以上の基準測定値を含む入力をプロセッサに提供することができる。
【００４８】
システムの別の実施形態では、物理特性が光学特性であり得る。適当な光学特性には、それだけに限らないが、透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度が含まれる。
【００４９】
さらに別の実施形態では、物理特性が反応速度論などの非線形特性であり得る。適当な反応には、それだけに限らないが、エンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せが含まれる。別の実施形態では、プロセッサが、反応のカスケード開始の１以上の見かけの時間遅延を変数として曲線あてはめステップに含めるようさらにプログラムされ得る。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を測定するシステムが開示される。システムは、メモリと、メモリに作動的に接続されたプロセッサとを含み得る。プロセッサは、１以上の入力を受信するようプログラムされ得る。入力は、水性試料に特徴的な測定された物理特性である２以上の試料測定値を含み得る。プロセッサは、既知の濃度のＬＡＬ反応性物質を中に含む溶液の物理特性の３以上の基準測定値の非線形挙動間で明らかになる相関を使用して１以上の出力を作成し得る。出力は、水性試料が将来の指定された時間に有し得るＬＡＬ反応性物質の予測された濃度を含み得る。プロセッサはまた、メモリ中に出力を報告及び／又は保存するようプログラムされ得る。さらに別の実施形態では、システムが、プロセッサに作動的に接続された光学読取装置をさらに含み得る。
【００５１】
別の実施形態では、物理特性が光学特性であり得る。適当な光学特性には、それだけに限らないが、透過率、吸光度、濁度、光散乱、光学濃度、色、色値、色相、スペクトル、化学発光、蛍光、経時的な吸光度の磁気共鳴、吸光度の一定の変化までの時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度が含まれる。
【００５２】
さらに別の実施形態では、物理特性が非線形特性であり得る。非線形特性は、検出試薬とＬＡＬ反応性物質との間の反応の既知の反応速度論に基づき得る。適当な反応には、それだけに限らないが、エンドトキシン反応、グルカン反応及びこれらの組合せが含まれる。
【００５３】
本明細書に開示される方法は、統計学的相関、試料測定値を既知のエンドトキシン濃度と相関させる統計学的に有効な手段を示す開放型の方法、又はこれらの測定値から導き出される因子を使用して、未知であるエンドトキシン濃度を予測する。このような測定値には、開始時間、経時的な吸光度の最大勾配、及び一定時間後の吸光度などの測定値が含まれ得る。さらなる測定値又は因子には、それだけに限らないが、時間対光学濃度、時間対フィルタリングした光学濃度（フィルタ−種々の方法を使用してシグナル、この場合、経時的な光学濃度への変動又はノイズの効果を減少させること、最も単純なのは平均化及び「データスムージング」（デジタルフィルタ、セグメント回帰、及び外れ値拒否を含む）の方法）、応答の勾配、フィルタリングした応答の勾配、応答の二次導関数、フィルタリングした応答の二次導関数、応答の高次導関数、フィルタリングした応答の高次導関数、応答の曲率（その最も単純な形では、種々の導関数の関係）、フィルタリングした応答の曲率、応答に曲線あてはめされた式からの因子（例えば、単純回帰、切片による）、フィルタリングした応答にあてはめられた式からの因子、導出値のゆがみ、積分和又はベクトル積などの他のデータストリーム因子、割り当てられた重みに基づいて応答に曲線あてはめされた式からの因子、及びこれらの組合せが含まれ得る。前述のように、データセット又は各データポイントは、最終的なあてはめに対するポイントの重要度がデータポイントの重みに基づくように重みを割り当てられ得る。重みは、それだけに限らないが、重要度、変動、情報フロー及び実証的検定を含む因子に基づいて割り当てられ得る。
【００５４】
さらに、データの品質は、経時的な応答への曲線あてはめによって評価され得る。適当な曲線あてはめ法には、前に列挙された方法が含まれる。
【００５５】
別の実施形態では、予想的様式でＬＡＬに基づくアッセイからのデータを分析する方法が開示される。予想は、時間に対する光学応答の動的線形勾配を監視することを含み得る。線形勾配は、アッセイの初めから現時点までの全てのデータポイントにわたって測定され得る。別の実施形態では、線形勾配は、現時点の前のより小さな数の連続データポイントにわたって測定され得る。選択される連続データポイントの数は、エンドトキシン検出の所望の範囲に基づいて変化し得る。別の実施形態では、少なくとも３個の連続データポイントを使用して勾配を測定することができる。さらに別の実施形態では、勾配が３個より多いが７個未満の連続データポイントで測定され得る。或いは、連続データポイントの数は７個より多い。
【００５６】
さらに別の実施形態では、測定される線形勾配を、経時的に測定される３個以上の連続データポイントの最新の収集セットに関して連続的に更新することができる。線形勾配の閾値がエンドトキシンレベルと相関し得る。線形勾配の閾値は、約０．００００１〜約０．００００５光学濃度単位／秒に及び得る。
【００５７】
勾配が事前設定された閾値に達した後、線形曲線あてはめ又は高次曲線あてはめアルゴリズムを生光学応答データに適用することができる。或いは、生応答が指定された開始値の一定割合に達した後、曲線あてはめアルゴリズムを生応答データに適用することができる。
【００５８】
閾値光学応答についての予想開始時間は、試料容器の幾何学に基づいて再定義することができる。例えば、閾値ＯＤ値は、典型的な９６ウェルプレート実験のカイネティック発色法については０．２に設定される。ＯＤ値は、例えば、マイクロ流体カートリッジを使用する場合などの他の幾何学については適当に再定義することができる。
【００５９】
線形又は高次関数を用いて生応答データをあてはめて、予想開始時間を計算することができる。別の実施形態では、予想開始時間を、時間とともに連続的に更新し、予想で収束についての適当な基準にしたがって報告することができる。さらに別の実施形態では、測定開始時間と同様に、予想開始時間がエンドトキシンレベルと相関し、応答の線形性についてチェックされる。さらに別の実施形態では、予想開始時間が、同じ試料の反復について計算される。予想開始時間を、同じ試料からの陽性スパイク回復実験の反復について計算することもできる。さらに別の実施形態では、予想開始時間が、較正に使用される基準の反復について計算される。予想開始時間を、対照スパイク回復実験について計算して、計算された較正式を検証することもできる。さらに別の実施形態では、動的線形勾配計算及び予想開始時間計算を使用して回収している光学応答データの品質を検証する。例えば、光学応答データの品質を検証することによって、データの異常を発見することができる。このような異常は、それだけに限らないが、インサイツでの気泡形成による光学応答データの不連続、読取装置光路による反応ウェルの誤整列、又は試料読取装置の断続的／組織的な機械誤動作を含む種々の状態によって引き起こされ得る。
【実施例】
【００６０】
相関法
以下の実施例は、ＬＡＬ測定試験の相関法を記載する。ＬＡＬ測定試験手順及びこれらの試験手順の結果も記載する。カイネティック発色法のように試料を調製した。この方法については、エンドトキシン水溶液を種々の濃度（０．００５エンドトキシン単位（「ＥＵ」／ｍｌ、０．０５ＥＵ／ｍｌ、０．５ＥＵ／ｍｌ及び５ＥＵ／ｍｌ）で調製した。いかなるエンドトキシンも含まない溶液、すなわちブランクも調製し、対照溶液として使用した。次いで、溶液を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、各エンドトキシン濃度及びブランクを、ＮａＯＨ及びデオキシコレートで洗浄した試料ホルダーに分配（３連で）した。
【００６１】
次いで、各試料の光学濃度、すなわち吸光度を、１時間にわたって分光計を用いて４０５ｎｍで測定した。開始時間、すなわち０．２の吸光度に達するのに要する各基準時間も測定した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １４２０マルチラベルカウンターを用いて測定値を記録した。いったん全ての測定値を収集及び記録したら、時間に伴う試料の吸光度変化をプロットした。
【００６２】
種々の濃度でのＯＤ応答の初期遅延時間及び初期勾配をプロットから得て、これを図１に示す。これらの初期遅延時間及び初期勾配は、所与の試料中のエンドトキシン濃度とよく相関し得る。したがって、これらの初期遅延時間及び初期勾配を用いて較正曲線を作成することができる。
【００６３】
試料を、較正曲線を作成するために使用する試料と同様に処理する場合、作成された較正曲線を使用して対象となる試料中のエンドトキシンの濃度を測定することができる。
【００６４】
予測及び検証
上に論じられるように、エンドトキシンとグルカンの両方の速度論サインを監視することにより、使用者が、試料中に存在し得る任意のエンドトキシン又はグルカンの濃度を予想することに加えて、試料分析において異常が存在するかどうかを検証又は評価することが可能になる。実際のカスケード反応も、酵素の各々を阻害する１つ又は複数の因子を有する。エンドトキシンカスケードは４ステップカスケードであり、グルカンカスケードは２ステップカスケードである。しかしながら、エンドトキシン反応とグルカン反応の両方が、その速度論に影響を及ぼす阻害因子を有する。カブトガニでは、閾値に達するまでこれらの因子が凝固を防止し、このことが、閾値が感度を制限するためにこれらの因子を分析システムにとって望ましくないものにしている。試薬の処理の一部は、製造業者及びロットによって変化するこれらの因子を除去することである。速度論への効果は、各反応の順序へのわずかな調整として最も単純にモデル化される。実際、反応速度論がモデルである検出力関数の挙動を利用する種々の数値技法を使用することができるので、正確な程度は問題でない。
【００６５】
これらの単純化モデルを使用して、関数がアッセイの早期解決に適合し、データストリームがＬＡＬ反応によって作成されているのであって、ある異常又は誤差によって作成されているのではないことを検証し、応答が統計学的に類似であるかどうかを決定するよう指定することができる。モデルを複雑にすることによって、モデルが常に実際の挙動をよく表すようにすることができるが、限定されたセットの変数を用いた単純なモデルの利点がモデルをこのような数値分析にとって好ましいものにする。
【００６６】
実施例−開始時間予測のための検出力曲線関数
発色又は比濁カイネティック法のいずれについても、光学濃度を経時的に測定する。エンドトキシンレベルの測定基準として使用する開始時間は、ＬＡＬ反応の光学濃度又は光吸収が指定された量変化した時間である。通常、この時間は、このレベルを超過した測定ポイント間の補間によって計算される。反応がまだエンドポイントに達していないが、その初期状態から、背景ノイズと区別可能なほど十分な変化を示した場合、その結果を検出力関数にあてはめて、開始時間を含む将来の性能を予測することができる。
【００６７】
将来の反応性能を予測することは、応答が最新の記録値に対するノイズのために正規分散よりも大きいポイントからのデータの部分をとって、光学応答の変化及び時間を対数に変換することによって行うことができる。検出力関数は、ログ−ログ変換後に線形であるので、結果としてこれらのデータへの最良線形あてはめを用いてこれらを適合させることができる。最終結果にとっての重要度を含む、いくつかのスキームに基づいて、これらのデータのあてはめに重みを与えることができる。
【００６８】
図２は３０秒毎に測定した吸収値についての、３．１ｍｍ経路長を有する１０μＬセル中のブランク水の発色カイネティックＬＡＬ法からのデータストリームのチャートである。エンドトキシンレベルの較正及び計算に使用する開始時間は、光学濃度の変化が０．１吸収単位に達するのにかかる時間とした。約４５００秒（７５分）でこの閾値を超える。データはいくぶんノイズが多い（ｎｏｉｓｙ）ので、異なる補間法はわずかに異なる解答を与え、４５１４秒がその平均値である。
【００６９】
時間と吸収の変化の両方のログ値の線形回帰を用いて最後の２０個のデータポイント（１０分の読取）を検出力曲線にあてはめて、適合曲線が閾値に達するポイントを求めることによって、予測開始時間を予測することができる。得られた予測開始時間を図３に示す。
【００７０】
また、図３に示される実線は、４５１４秒開始時間閾値±１．０％を表し、誤差帯を形成する。予測開始時間（ひし形記号による線）は、３０００秒後に誤差帯内にある。２以上の連続する読取について０．９９９超のピアソンの積率相関係数（「ピアソンのｒ」）を用いると、予測開始は、分析の３３００秒で誤差帯に入る。したがって、分析時間を１２００秒、すなわち２０分超減らす。さらに、誘発される誤差は、並列して実行される同一ブランク試験の正規変動（典型的には２％超）未満であり、正規の又はブランク水分析にとって十分に正確な解答となる。
【００７１】
実施例−遅延を有する検出力曲線
エンドポイント予測のために検出力関数を用いることの単純であるがより正確なバリエーションは、エンドトキシンレベルのＣ因子活性への移行によるカスケード開始の見かけの時間遅延、及びカスケードステップ遅延を含めることである。全てのロットが異なるので、一定の時間遅延の使用は、変化し得るものより望ましくない。
【００７２】
この方法は、時間遅延が追加の変数である式をあてはめることを伴う。これは、分析を実質的に複雑にし、代数的に解くことができない式をもたらす。より単純な方法は、離散時間遅延オフセットデータストリームを計算し、ピアソンのｒ及び残差（これらは範囲にわたって最も均一に分布している）のバランスを用いて最良適合を有するものがどれかを決定することである。
【００７３】
上記の同じデータセットを、時間遅延又は０、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０及び２４０秒のログ変換前の実際の時間から減じられた時間で試験することができる。１２００秒の時間後、ピアソンのｒと残差バランスの両方を用いた最良適合が１２０秒の遅延オフセットで達成される。４５３０秒で丸められた開始時間値について２６１０秒でピアソンのｒ値基準が満たされる。これは１９２０秒、すなわち３２分の減少である。
【００７４】
９０又は１５０秒の遅延を用いる場合、結果はわずかに正確でないが、類似である。この理由のために、密接に間隔をあけられた遅延時間を試験することは必要ではなく、３０秒などの粗い間隔が適当であることが分かった。「最良」遅延時間を見出すことは、シグナルを維持しながらノイズを有効に減らす代表的かつ安定な適合を得ることほど重要ではない。
【００７５】
実施例−データストリーム検証
関数がデータストリームを十分に記載する場合、新たなデータポイントは適合関数を解答に収束させる。解答が収束しない場合には、関数はデータを十分に記載していない。このことを、データストリームの妥当性についてチェックする単純な方法の１つとして使用することができる。
【００７６】
例えば、光学濃度の変化と時間の両方がログに変換され、単純な検出力関数にあてはめられた場合、勾配の連続解答と切片との間の差は経時的に小さくなるはずである。勾配と切片解答が小さくなら（収束し）ない場合、データストリームが非カスケード効果によって破損していた。履歴データから収束に限界を設けることができ、統計学的にありそうにない様式でこのような限界を超える場合に、正当な理由によってアッセイを拒否することができる。
【００７７】
データストリームを検証するために、異常を上に示されるのと同じデータに加えた。異常は、粒子、気泡又はある他の現象が光路を破壊した同様のセルにおける異なるアッセイからの実際の光学的異常であった。中断がないと、２０ポイントの適合（１０分）についてのデータストリームのピアソンのｒは、時間が進むにつれて１．００に収束する。中断があると、これは、図４のデータストリームに示されるように直ちに逸脱し始める。したがって、１．００というピアソンのｒの限界値を設定して、正しい反応速度論に相当するデータと異常に相当するデータを区別することができる。図５に示されるように「正常」及び「異常」データストリーム中に見られ得る。
【００７８】
本明細書は、ベストモードを含む、実施例を用いて本発明を開示し、また当業者が、任意の装置又はシステムを製造及び使用し、任意の組み込まれた方法を行うことを含めて本発明を実施することを可能にもしている。本発明の特許性のある範囲は、請求項によって定義され、当業者の心に浮かぶ他の実施例を含み得る。このような他の実施例は、請求項の文字通りの言語と異ならない構造的要素を有する場合、又は請求項の文字通りの言語との実態のない差異を含む同等の構造的要素を含む場合には、請求項の範囲に入ることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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