(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の核酸ポリマーの存在を検出する方法であって、
ａ）核酸ポリマーを含有していると思われる試料を、式（ＩＩ）の化合物およびオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成物と接触させること；そして
ｂ）前記試料中の前記化合物の存在または該化合物の量を検出すること；
を含み、式（ＩＩ）の化合物が、蛍光共鳴エネルギー移動におけるアクセプター色素として使用され、前記式（ＩＩ）の化合物が、以下に示すとおりである：
0006367307.tif 000015
Ｒ1はそれぞれ独立してＨ、Ｃ1-4アルキル、スルホネートまたはハロから選択され；
Ｒ3およびＲ4は独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、１個以上のヘテロ原子で中断されたＣ1-4アルキル、Ｌ-ＲまたはＬ-ＣSから選択され；
Ｒ6-9は独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ2Ｈ、ＳＯ3Ｈ、Ｌ-ＣＯ2Ｈ、Ｌ-ＳＯ3Ｈ、Ｌ-ＲまたはＬ-ＣSであり；
Ｒ10はアルコキシ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ2Ｈ、ＳＯ3Ｈ、ＳＯ2Ｎ（ＲN）2、ＣＯＮ（ＲN）2、Ｌ-ＣＯ2Ｈ、Ｌ-ＳＯ3Ｈ、Ｌ-ＲまたはＬ-ＣSであり；
ＲNはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｌ-ＲおよびＬ-ＣSから選択され；
Ｌは、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン化物基、または炭素‐炭素単結合、炭素‐炭素二重結合、炭素‐炭素三重結合もしくは芳香族炭素‐炭素結合のいずれかの組合せを結合部が含有するように、１〜１６個の非水素原子を有する、直鎖または分岐、環式または複素環式の、飽和または不飽和である共有結合部であり；
Ｒは反応基であり；または
ＣSは複合化物質であり；
Ｒ3およびＲ4、またはＲ3およびＲ1、またはＲ4およびＲ1の１つ以上が共に環を形成してもよく；ならびに
Ｒ6-9の１つ以上が共に環を形成してもよい、
前記方法。
【請求項２】
２以上の核酸ポリマーが単一反応において検出される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の化合物：
0006367307.tif 000016
から成る群より選択される化合物。
【請求項４】
試料における核酸ポリマーの存在を検出する方法に使用されるキットであって、
蛍光共鳴エネルギー移動におけるアクセプター色素としての式（ＩＩ）の化合物、少なくとも１つの遺伝子座特異性プライマー、および核酸ポリマーの存在を検出する方法におけるキットの使用説明書を含み、式（ＩＩ）の前記化合物が、以下に示すとおりである：
0006367307.tif 000017
式中、
Ｒ1はそれぞれ独立してＨ、Ｃ1-4アルキル、スルホネートまたはハロから選択され；
Ｒ3およびＲ4は独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、１個以上のヘテロ原子で中断されたＣ1-4アルキル、Ｌ-ＲまたはＬ-ＣSから選択され；
Ｒ6-9は独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ2Ｈ、ＳＯ3Ｈ、Ｌ-ＣＯ2Ｈ、Ｌ‐ＳＯ3Ｈ、Ｌ‐ＲまたはＬ‐ＣSであり；
Ｒ10はアルコキシ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ2Ｈ、ＳＯ3Ｈ、ＳＯ2Ｎ（ＲN）2、ＣＯＮ（ＲN）2、Ｌ-ＣＯ2Ｈ、Ｌ-ＳＯ3Ｈ、Ｌ-ＲまたはＬ‐ＣSであり；
ＲNはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｌ‐ＲおよびＬ-ＣSから選択され；
Ｌは、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン化物基、または炭素‐炭素単結合、炭素‐炭素二重結合、炭素‐炭素三重結合もしくは芳香族炭素‐炭素結合のいずれかの組合せを結合部が含有するように、１〜１６個の非水素原子を有する、直鎖または分岐、環式または複素環式の、飽和または不飽和である共有結合部であり；
Ｒは反応基であり；または
ＣSは複合化物質であり；
Ｒ3およびＲ4、またはＲ3およびＲ1、またはＲ4およびＲ1の１つ以上が共に環を形成してもよく；ならびに
Ｒ6-9の１つ以上が共に環を形成してもよい、
前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願に係る請求項は、２０１３年３月１５日に提出した米国仮特許出願第６１／７８９，１９９号に基づく優先権を享受するものであり、該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
蛍光色素は生物学的研究および医療診断において幅広く使用されている。蛍光色素は従来技術より安価で毒性が低く、かつ一般的に十分な感度で検出されうるため、従来技術より優れた傾向にある。識別可能な色範囲を有する蛍光色素の多様性により、複数の生物学的標的を同時に検出することが可能な多重分析の実施がより実用的になっている。
【０００３】
新しい装置および新しい生物学的利用の需要の増加を満たすため、色素の特性においてさらなる改良が必要とされている。特に、最も効果的に信号を検出するための色素波長の微調整や、さらなる色を提供することを可能にする新しい戦略が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
いくつかの態様においては、本発明は試料中の核酸ポリマーの存在を検出する方法を提供し、この方法は、核酸ポリマーを含有していると思われる試料を、式（Ｉ）の化合物およびオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成物と接触させること；ならびに試料中の化合物の存在または化合物の量を検出することを含み、式（Ｉ）の化合物はＥＴカセット中の成分である。
【０００５】
他の態様においては、本発明は試料中の核酸ポリマーの存在を検出する方法を提供し、この方法は、核酸ポリマーを含有していると思われる試料を、式（ＩＩ）の化合物およびオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成物と接触させること；ならびに試料中の化合物の存在または化合物の量を検出することを含み、式（ＩＩ）の化合物はＥＴカセット中の成分である。
【０００６】
いくつかの態様においては、本発明は以下の化合物からなる群より選択される化合物を提供する。
【化１】
0006367307.tif 000002
【０００７】
他の態様においては、本発明はＥＴカセット中の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、１つ以上の遺伝子座特異的プライマーおよび使用説明書を含むキットを提供する。
【０００８】
いくつかの態様においては、本発明は試料中の核酸ポリマーの存在を検出する方法を提供し、この方法は、核酸ポリマーを含有していると思われる試料を、本発明の化合物およびオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成物と接触させること；ならびに試料中の化合物の存在または化合物の量を検出することを含む。
【０００９】
いくつかの態様においては、本発明は例えば薬剤標的等の関心ある標的への結合をモニターする方法を提供し、この方法は関心ある標的を含む融合タンパク質を含む試料を、本明細書において記載される色素と結合した小さな分子または生体分子と接触させること；および関心ある標的と結合した小さな分子の結合を検出することを含む。いくつかの態様においては、融合タンパク質は関心ある標的に融合したルシフェラーゼタンパク質を含む。他の態様においては、融合タンパク質は関心ある標的に融合した蛍光タンパク質を含む。いくつかの態様においては、結合を生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）により検出し、融合タンパク質はルシフェラーゼタンパク質を含む。いくつかの態様においては、結合を蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により検出し、融合タンパク質は蛍光タンパク質を含む。いくつかの態様においては、試料が融合タンパク質を発現する細胞を含む。
【００１０】
他の態様においては、本発明は、本発明の化合物または本発明の標識された小分子もしくは生体分子を含むキットを提供する。いくつかの態様においては、キットは薬剤または薬剤化合物等の、標識された生体分子または標識された小分子を含む。いくつかの態様においては、キットは関心あるタンパク質または標的を含む融合タンパク質を発現している細胞をさらに含む。他の態様においては、キットは関心あるタンパク質または標的を含む融合タンパク質を発現するためのベクターをさらに含む。
【００１１】
本発明の他の態様は、詳細な明細書の記載および添付の図を考察することにより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は優れたＱ値０．９９を有するＰＢＩ−４６８６でのスペクトル較正実行を示す。
【図２】図２はＰＢＩ−４６８６でのスペクトル較正実行を示し、ドナーＪＯＥ（緑色）における増加がＰＢＩ−４６８６（橙色）で干渉されている。
【図３】図３はＰＢＩ−４６８８でのスペクトル較正実行を示し、ほんのわずかなＪＯＥ（緑色）がＰＢＩ−４６８８（橙色）に干渉しているが、よりわずかな６‐ＦＡＭ（青色）がＰＢＩ−４６８８（橙色）に干渉している。
【図４】図４は、０．９９超のＱ値を有するＰＢＩ−４６８８と、ＪＯＥおよび６‐ＦＡＭドナー色素の両方ならびに３ヌクレオチドスペーサーを有したオリゴでのスペクトル較正実行を示す。
【図５】図５は、Ｇ５色素セットでの３５００ｘＬスペクトル較正からの、様々な色素で標識したアンプリコンの生データ画像（上部パネル）を示す。スペクトル較正における橙色ピークは６ＦＡＭ＋ＰＢＩ−４６８８であり、下部パネルにおいては接写画像である。このピークは通常、ＣＣ５色素標識アンプリコンにより表される。
【図６】図６は、水およびＥＤＴＡに緩衝液交換されたＤｙｏｍｉｃｓ４８５ｘＬ  Ｃ６  ＳＥ−ＴＴ−ＰＢＩ−４６８８ｄＵ  ＰＢＩ  ＡＭオリゴヌクレオチドからのアンプリコンを示す。
【図７】図７は、水およびＥＤＴＡに緩衝液交換された６ＦＡＭ  Ｃ６  ＡＭ−ＴＴ−ＰＢＩ−４６８８ｄＹ  ＰＢＩ  ＡＭ（超高純度）オリゴヌクレオチドからのアンプリコンを示す。
【図８】図８は、水およびＥＤＴＡに緩衝液交換されたＤｙｏｍｉｃｓ４８５ｘＬ  Ｃ６  ＳＥ−ＴＴ−ＰＢＩ−４７７０  ｄＵ  ＰＢＩ  ＡＭオリゴヌクレオチドからのアンプリコンを示す。
【図９】図９は、Ｓｉ‐ローダミンＰＢＩ−４６８８色素の異なるドナー色素吸光スペクトルおよび発光スペクトルの重なりを示す。
【図１０】図１０は本発明の化合物への合成経路を示す。
【図１１】図１１は本発明の化合物への合成経路を示す。
【図１２】図１２は水性緩衝液中のＳｉ‐／Ｇｅ‐色素の吸光および発光スペクトル特性を示す。
【図１３】図１３は本発明の方法において有用な化合物を示す。
【図１４】図１４は、２日の光退色後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）のピーク高さが約３０％減少したことを示す。
【図１５】図１５は、２日の光退色後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）がフルオレセインチャネルにおいて低い雑音対信号を示したことを示す。
【図１６】図１６は、２日の光退色後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）がＪＯＥチャネルにおいて低い雑音対信号を示したことを示す。
【図１７】図１７は、２日の光退色後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）ではＥＴ−ＴＭＲチャネルにおいて約４％の黒色が橙色となったことを示す。
【図１８】図１８は、２日の光退色後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）がＥＴ−ＣＸＲチャネルにおいて低い雑音対信号を示したことを示す。
【図１９】図１９は、２日の光退色後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）がＥＴ−ＴＯＭチャネルにおいて約１０％裏抜けしたことを示す。
【図２０】図２０は、２日の光退色後、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）のピーク高さが約３０％減少したことを示す。
【図２１】図２１は、２日の光退色後、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）がフルオレセインチャネルにおいて低い雑音対信号を示したことを示す。
【図２２】図２２は、２日の光退色後、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）がＪＯＥチャネルにおいて低い雑音対信号を示したことを示す。
【図２３】図２３は、２日の光退色後、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）ではＥＴ−ＴＭＲチャネルにおいて約１７％の黒色が橙色となったことを示す。
【図２４】図２４は、２日の光退色後、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）がＥＴ−ＣＸＲチャネルにおいて低い雑音対信号を示したことを示す。
【図２５】図２５は、２日の光退色後、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈または無希釈）がＥＴ−ＴＯＭチャネルにおいて約７％裏抜けしたことを示す。
【図２６】図２６は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈）のピーク高さに有意な減少がなかったことを示す。
【図２７】図２７は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈）では約２％の黒色が橙色となったことを示す。
【図２８】図２８は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈）が約３％裏抜けしたことを示す。
【図２９】図２９は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（無希釈）のピーク高さに有意な減少がなかったことを示す。
【図３０】図３０は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（無希釈）では約２％の黒色が橙色となったことを示す。
【図３１】図３１は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（無希釈）が約３％裏抜けしたことを示す。
【図３２】図３２は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈）のピーク高さに有意な減少がなかったことを示す。
【図３３】図３３は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈）ではそれぞれ約２％または３％の黒色が橙色となったことを示す。
【図３４】図３４は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、有意でない量の６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（希釈）が裏抜けしたことを示す。
【図３５】図３５は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（無希釈）のピーク高さに有意な減少がなかったことを示す。
【図３６】図３６は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（無希釈）では約２％の黒色が橙色となったことを示す。
【図３７】図３７は、１または１０回の凍結−融解サイクル後、有意でない量の６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ（無希釈）が裏抜けしたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のいずれの実施形態も詳細に説明される前に、本発明の利用において、以下の明細において記載されるかまたは以下の図において示される構成要素の構築および組合せの詳細に、本発明が限定されるものではないことが理解される必要がある。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法で実行または実施されることが可能である。
【００１４】
いくつかの実施形態においては、本発明は、新しいクラスのフルオロフォアの新規用途を提供する。このフルオロフォアは、中心酸素架橋原子がケイ素またはゲルマニウムで置き換えられたローダミン系構造である。これらの色素は、調節可能な吸収波長および発光波長と共に、高い吸光係数および高い量子収率を有する（図１２を参照のこと）。新規Ｓｉ‐ローダミン誘導体の一般構造を例示的に以下に示す。
【化２】
0006367307.tif 000003
【００１５】
これらのフルオロフォアの重要な特徴は、キサンテン環のＳｉにおけるジ‐イソプロピルの存在であり、これが電気泳動キャピラリーマトリックスにおいてＥＴカセットのエネルギー移動（ＥＴ）効率を改良し、結果としてアンプリコンの信号が装置較正に合格し、色素安定性も改良して標識オリゴを適度に長い時間、水性緩衝液中にとどまらせる（図３〜８を参照のこと）。
【００１６】
特に、本発明はマルチプレックスＰＣＲを使用した短いタンデム反復（ＳＴＲｓ）のＤＮＡタイピングまたはＤＮＡ分析におけるシリカ／ゲルマニウム色素の新規用途を提供する。調節可能な吸収波長および発光波長を有するこれらの高効率エネルギー移動シリカ／ゲルマニウムアクセプター色素は異なるドナー色素と適合性であり、マルチプレックスＳＴＲ分析システムおよびキットにおいて、最小限のレーザー励起源を用いて所望の色チャネルで使用される大変有望な利点を有する（図３〜８を参照のこと）。
【００１７】
Fosterエネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、アクセプターの電子エネルギーギャップと共鳴するドナーにおいて電子コヒーレンスより光学的に誘導される電子励起の非放射移動を指す。ＦＲＥＴ効率は以下の物理パラメータに依存する：（１）ドナー発光スペクトルとアクセプター吸収スペクトルの、スペクトルの重なり；（２）ドナー発光双極子モーメントとアクセプター吸収双極子モーメントの相対配向；および（３）ドナーとアクセプター間の距離（図１１を参照のこと）。
【００１８】
ＴＭＲ、ＲＯＸおよび米国特許出願第１３／６８２，５８９号において開示されるもの等の、他の公知の蛍光色素と比較して、シリカ色素およびゲルマニウム色素の吸収スペクトルはＦＡＭまたはＪＯＥの発光スペクトルとの重なりがかなり少ないが、本発明のシリカ色素およびゲルマニウム色素を含む、標識された関心あるプライマーからのアンプリコン信号は、他のＦＡＭ／ＪＯＥ−色素ＥＴカセットよりもかなり明るい（図３および９を参照のこと）。
【００１９】
ドナー発光双極子モーメントとアクセプター吸収双極子モーメントの相対配向は、通常、同じ種類の分子間でエネルギー移動が効率的であることを示す。しかしながら、本発明のシリカ／ゲルマニウム色素は、アクセプター色素として、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＣＣ３およびＤｙｏｍｉｃｓ４８５Ｌ等の異なるドナー色素と適合性であることが見出された（図３および８を参照のこと）。
【００２０】
色素標識の多重性の増加は短いオリゴプライマーを可能にし、従って、分析時間をより速くし、損傷した（断片化した）ＤＮＡ試料の分析を改善する。ＳＴＲ分析装置は固定の発光レーザー（またはダイオード）を有するので、多重色素の数の増加は、安定かつ効率的なＥＴ対の同定により制限される。本発明のシリカ／ゲルマニウム色素の頑強なＥＴアクセプター特性は、多重性能が増加したＳＴＲ分析システムおよびキットを作成する能力を改良する。
【００２１】
定義
本明細書において使用される場合、以下の用語および表現は指定の意味を有する。本発明の化合物は非対称的に置換された炭素原子を含有し、光学活性形態またはラセミ形態で単離されてもよいことが理解されるであろう。光学活性形態の調製方法は当業者に周知であり、例えばラセミ形態の分割による方法や光学活性出発物質からの合成による方法等である。構造の全てのキラル形態、ジアステレオ異性形態、ラセミ形態、および全ての幾何異性形態が本発明の一部である。
【００２２】
ラジカル、置換基および範囲に対する以下に挙げる特定値は、単に説明のためのものであり、ラジカルおよび置換基に対する他の既定値または規定範囲内の他の値を除外するものではない。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「置換（substituted）」という用語は、「置換」を使用した表現で指定される基において、指定の原子の通常の原子価が超過しない限り、かつ置換の結果安定な化合物となる限り、１つ以上（例えば、１、２、３、４または５つ；いくつかの実施形態においては１、２または３つ；および他の実施形態においては１または２つ）の水素が、指定の基（複数可）から選択される基または当業者に公知の好適な基で置換されることを示すことが意図される。好適な指定の基には、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、複素環スルフィニル、複素環スルホニル、リン酸基、硫酸基、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシル（アルキル）アミンおよびシアノが含まれる。さらに、好適な指定の基には、例えば‐Ｘ、‐Ｒ、‐Ｏ‐、‐ＯＲ、‐ＳＲ、‐Ｓ‐、‐ＮＲ2、‐ＮＲ3、＝ＮＲ、‐ＣＸ3、‐ＣＮ、‐ＯＣＮ、‐ＳＣＮ、
‐Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、‐ＮＣＳ、‐ＮＯ、‐ＮＯ2、＝Ｎ2、‐Ｎ3、ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、‐Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、‐Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ、‐Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ‐、‐Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、‐Ｓ（＝Ｏ）2Ｒ、‐ＯＳ（＝Ｏ）2ＯＲ、‐Ｓ（＝Ｏ）2ＮＲ、‐Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、‐ＯＰ（＝Ｏ）Ｏ2ＲＲ、‐Ｐ（＝Ｏ）Ｏ2ＲＲ、‐Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ）2、‐Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、‐Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、‐Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、‐Ｃ（Ｓ）Ｒ、‐Ｃ（Ｏ）ＯＲ、‐Ｃ（Ｏ）Ｏ、‐Ｃ（Ｓ）ＯＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＳＲ、‐Ｃ（Ｓ）ＳＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、‐Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、‐Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲが含まれることができ、Ｘはそれぞれ独立してハロゲン（「ハロ」）：Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；Ｒはそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、保護基またはプロドラッグ部である。当業者に容易に理解されるであろうとおり、置換基がオキソ（＝Ｏ）またはチオキソ（＝Ｓ）等である場合、置換される原子上の２つの水素原子が置き換えられる。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「アルキル」という用語は、例えば１〜３０個、しばしば１〜１２個、または１〜約６個の炭素原子を有する分岐、直鎖または環式炭化水素を指す。例としては、メチル、エチル、１‐プロピル、２‐プロピル、１‐ブチル、２‐メチル‐１‐プロピル、２‐ブチル、２‐メチル‐２‐プロピル（ｔ‐ブチル）、１‐ペンチル、２‐ペンチル、３‐ペンチル、２‐メチル‐２‐ブチル、３‐メチル‐２‐ブチル、３‐メチル‐１‐ブチル、２‐メチル‐１‐ブチル、１‐ヘキシル、２‐ヘキシル、３‐ヘキシル、２‐メチル‐２‐ペンチル、３‐メチル‐２‐ペンチル、４‐メチル‐２‐ペンチル、３‐メチル‐３‐ペンチル、２‐メチル‐３‐ペンチル、２，３‐ジメチル‐２‐ブチル、３，３‐ジメチル‐２‐ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。アルキルは非置換または置換であることができる。アルキルは任意に、部分的または全体的に不飽和であることもできる。このように、アルキル基の記載にはアルケニル基およびアルキニル基の両方が含まれる。上記のとおり、および上で例を挙げたとおり、アルキルは１価の炭化水素ラジカルであることができ、または２価の炭化水素ラジカル（すなわちアルキレン）であることができる。
【００２５】
「アルケニル」という用語は、モノラジカルの、分岐または直鎖の、部分的に不飽和の炭化水素鎖（すなわち炭素‐炭素、ｓｐ2  ２重結合）を指す。いくつかの実施形態においては、アルケニル基は２〜１０個の炭素原子、または２〜６個の炭素原子を有することができる。他の実施形態においては、アルケニル基は２〜４個の炭素原子を有する。例としては、エチレンまたはビニル、アリル、シクロペンテニル、５‐ヘキセニル等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。アルケニルは非置換であるかまたは置換されることができる。
【００２６】
「アルキニル」という用語は、完全な不飽和点（すなわち炭素‐炭素、ｓｐ  ３重結合）を有する、モノラジカルの、分岐または直鎖の炭化水素鎖を指す。いくつかの実施形態においては、アルキニル基は２〜１０個の炭素原子、または２〜６個の炭素原子を有することができる。他の実施形態においては、アルキニル基は２〜４個の炭素原子を有することができる。この用語の例としては、エチニル、１‐プロピニル、２‐プロピニル、１‐ブチニル、２‐ブチニル、３‐ブチニル、１‐ヘキシニル、２‐ヘキシニル、３‐ヘキシニル、１‐オクチニル等の基が挙げられる。アルキニルは非置換であるかまたは置換されることができる。
【００２７】
「シクロアルキル」という用語は、１つの環式環または複数の縮合環を有する、３〜１０個の炭素原子の環式アルキル基を指す。このようなシクロアルキル基には、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等の単一環構造、またはアダマンタニル等の多環構造が含まれる。シクロアルキルは非置換であるかまたは置換されることができる。シクロアルキル基は１価または２価であることができ、アルキル基に対して上で記載したように、任意に置換されることができる。シクロアルキル基は１つ以上の不飽和部位を任意に含むことができ、例えばシクロアルキル基は１つ以上の炭素‐炭素２重結合を含むことができ、例えばシクロヘキセン、１，３‐シクロヘキサジエン、１，４‐シクロヘキサジエン等である。
【００２８】
「アルコキシ」という用語は、アルキル‐Ｏ‐基を指し、アルキルは本明細書において規定されるとおりである。いくつかの実施形態においては、アルコキシ基には例えばメトキシ、エトキシ、ｎ‐プロポキシ、ｉｓｏ‐プロポキシ、ｎ‐ブトキシ、ｔｅｒｔ‐ブトキシ、ｓｅｃ‐ブトキシ、ｎ‐ペントキシ、ｎ‐ヘキソキシ、１，２‐ジメチルブトキシ等が含まれる。アルコキシは非置換であるかまたは置換されることができる。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「アリール」または「Ａｒ」は、もとの芳香環系の１つの炭素原子から１つの水素原子を除くことにより誘導される芳香族炭化水素基を指す。ラジカルは、もとの環系の飽和炭素原子または不飽和炭素原子において存在することができる。アリール基は６〜３０個の炭素原子を有することができる。アリール基は単一環を有するか（例えばフェニル）、または複数の縮合環（condensed ring）（縮合環（fused ring））を有することができ、ここで１つ以上の環が芳香族である（例えばナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニルまたはアントリル）。典型的なアリール基としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル等から誘導されるラジカルが挙げられるがこれらに限定されるものではない。アリールは非置換であるかまたは任意に置換されることができ、上でアルキル基に対して記載されたとおりである。
【００３０】
「ハロ」という用語はフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。同様に、「ハロゲン」という用語はフッ素、塩素、臭素およびヨウ素を指す。
【００３１】
「ハロアルキル」という用語は、本明細書において規定される１つ以上のハロ基で置換された本明細書で規定されるアルキルを指し、１つ以上のハロ基は同じであるかまたは異なってもよい。いくつかの実施形態においては、ハロアルキルは１、２、３、４または５個のハロ基で置換されることができる。他の実施形態においては、ハロアルキルは１、２または３個のハロ基で置換されることができる。ハロアルキルという用語には、パーフルオロ‐アルキル基も含まれる。代表的なハロアルキル基の例としては、トリフルオロメチル、３‐フルオロドデシル、１２，１２，１２‐トリフルオロドデシル、２‐ブロモオクチル、３‐ブロモ‐６‐クロロへプチル、１Ｈ，１Ｈ‐パーフルオロオクチル等が挙げられる。ハロアルキルは、アルキル基に対して上で記載したように、任意に置換されることができる。
【００３２】
「ヘテロアリール」という用語は、１、２または３個の芳香環を含有し、芳香環に１個以上の窒素、酸素または硫黄原子を含有する単環式、二環式または三環式環系として本明細書において規定され、非置換であるか、または「置換」の規定において上記の通り、例えば１個以上の、特には１〜３個の置換基で置換されることができる。典型的なヘテロアリール基は、１個以上のヘテロ原子に加え、２〜２０個の炭素原子を含有する。ヘテロアリール基の例としては、２Ｈ‐ピロリル、３Ｈ‐インドリル、４Ｈ‐キノリジニル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β‐カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンノリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル（imidizolyl）、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサゾリル、ペリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリルおよびキサンテニルが挙げられるがこれらに限定されるものではない。いくつかの実施形態においては、「ヘテロアリール」という用語は、炭素、ならびに非過酸化物酸素、硫黄およびＮ（Ｚ）から独立して選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含む５または６個の環原子を含有する単環式芳香環を指し、Ｚは存在しないかまたはＨ、Ｏ、アルキル、アリールもしくは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアリールである。他の実施形態においては、ヘテロアリールは、それらから誘導される約８〜１０個の環原子のオルト‐縮合二環式複素環を指し、特にベンズ‐誘導体またはそれらにプロピレン、トリメチレンもしくはテトラメチレンジラジカルが縮合することにより誘導されるものである。
【００３３】
「複素環」という用語は、酸素、窒素および硫黄の群より選択される１個以上のヘテロ原子を含有する、飽和または部分的に不飽和の環系を指し、「置換」という用語について本明細書において規定されるとおり１個以上の基で任意に置換される。複素環は、１個以上のヘテロ原子を含有する単環式、二環式または三環式基であることができる。複素環基は、環に結合したオキソ基（＝Ｏ）またはチオキソ基（＝Ｓ）も含有することができる。複素環基の非限定的な例としては、１，３−ジヒドロベンゾフラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキサン、１，４−ジチアン、２Ｈ−ピラン、２−ピラゾリン、４Ｈ−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジンおよびチオモルホリンが挙げられる。
【００３４】
「複素環」という用語には例として、Paquette, Leo A.；Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W.A. Benjamin、ニューヨーク、１９６８年)の特に１、３、４、６、７および９章；The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A Series of Monographs” (John Wiley & Sons、ニューヨーク、１９５０年〜現在)の特に１３、１４、１６、１９および２８巻；ならびにJ. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 5566において記載の複素環のモノラジカルが含まれることができるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態においては、「複素環」には本明細書において規定される「炭素環」が含まれ、１個以上（例えば、１、２、３または４個）の炭素原子がヘテロ原子（例えばＯ、ＮまたはＳ）で置換されている。
【００３５】
複素環の例としては、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄が酸化されたテトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、ピペリジニル、４‐ピペリドニル、ピロリジニル、２‐ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ‐１，２，５‐チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ‐１，５，２‐ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチイニル、２Ｈ‐ピロリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ‐インドリル、１Ｈ‐インダゾリル、プリニル、４Ｈ‐キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β‐カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソオキサゾリル、オキシインドリル、ベンズオキサゾリニル、イサチノイル（isatinoyl）およびビス‐テトラヒドロフラニルが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００３６】
例として、炭素で結合する複素環は、ピリジンの２、３、４、５もしくは６位、ピリダジンの３、４、５もしくは６位、ピリミジンの２、４、５もしくは６位、ピラジンの２、３、５もしくは６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロールまたはテトラヒドロピロールの２、３、４もしくは５位、オキサゾール、イミダゾールもしくはチアゾールの２、４もしくは５位、イソオキサゾール、ピラゾールもしくはイソチアゾールの３、４もしくは５位、アジリジンの２もしくは３位、アゼチジンの２、３もしくは４位、キノリンの２、３、４、５、６、７もしくは８位、またはイソキノリンの１、３、４、５、６、７もしくは８位で結合するがこれらに限定されるものではない。炭素で結合する複素環には、２‐ピリジル、３‐ピリジル、４‐ピリジル、５‐ピリジル、６‐ピリジル、３‐ピリダジニル、４‐ピリダジニル、５‐ピリダジニル、６‐ピリダジニル、２‐ピリミジニル、４‐ピリミジニル、５‐ピリミジニル、６‐ピリミジニル、２‐ピラジニル、３‐ピラジニル、５‐ピラジニル、６‐ピラジニル、２‐チアゾリル、４‐チアゾリル、５‐チアゾリル等が含まれる。
【００３７】
例として、窒素で結合する複素環は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２‐ピロリン、３‐ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２‐イミダゾリン、３‐イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２‐ピラゾリン、３‐ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ‐インダゾールの１位、イソインドールまたはイソインドリンの２位、モルホリンの４位、およびカルバゾールまたはβ‐カルボリンの９位で結合することができるがこれらに限定されるものではない。いくつかの実施形態においては、窒素で結合する複素環には１‐アジリジル、１‐アゼテジル（azetedyl）、１‐ピロリル、１‐イミダゾリル、１‐ピラゾリルおよび１‐ピペリジニルが含まれる。
【００３８】
「炭素環」という用語は、単環として３〜８個の炭素原子、二環として７〜１２個の炭素原子、多環として約３０個以下の炭素原子を有する飽和環、不飽和環または芳香環を指す。単環式炭素環は、典型的には３〜６個の環原子、より典型的には５または６個の環原子を有する。二環式炭素環は、例えばビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］もしくは［６，６］系として配列する７〜１２個の環原子を有するか、またはビシクロ［５，６］もしくは［６，６］系として配列する９もしくは１０個の環原子を有する。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１‐シクロペンタ‐１‐エニル、１‐シクロペンタ‐２‐エニル、１‐シクロペンタ‐３‐エニル、シクロヘキシル、１‐シクロヘキサ‐１‐エニル、１‐シクロヘキサ‐２‐エニル、１‐シクロヘキサ‐３‐エニル、フェニル、スピリル（spiryl）およびナフチルが挙げられる。アルキル基に対して上で記載したとおり、炭素環は任意に置換されることができる。
【００３９】
「アルカノイル」または「アルキルカルボニル」という用語は‐Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、Ｒは前で規定したとおりのアルキル基である。
【００４０】
「アシルオキシ」または「アルキルカルボキシ」という用語は‐Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、Ｒは前で規定したとおりのアルキル基である。アシルオキシ基の例としては、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシおよびペンタノイルオキシが挙げられるがこれらに限定されるものではない。上で規定したとおりの任意のアルキル基を使用して、アシルオキシ基を形成することができる。
【００４１】
「アルコキシカルボニル」という用語は‐Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（または「ＣＯＯＲ」）を指し、Ｒは前で規定したとおりのアルキル基である。
【００４２】
「アミノ」という用語は‐ＮＨ2を指す。アミノ基は、本明細書において「置換」という用語に対して記載されたとおり任意に置換されることができる。
【００４３】
「アルキルアミノ」という用語は‐ＮＲ2を指し、１つ以上のＲがアルキルであり、２番目のＲはアルキルまたは水素である。
【００４４】
「アシルアミノ」という用語はＮ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、Ｒはそれぞれ独立して水素、アルキルまたはアリールである。
【００４５】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、‐ＯＨにより置換されたアルキル基を指す。
【００４６】
「アルキルカルボン酸」という用語は‐ＣＯＯＨにより置換されたアルキル基を指す。
【００４７】
「中断された」という用語は、指定の各原子の通常の原子価が超過しない限り、かつ中断の結果安定な化合物となる限り、「中断された」という用語を使用した表現で指される特定の炭素鎖の隣り合う２つの炭素原子（およびそれらが結合する水素原子（例えばメチル（ＣＨ3）、メチレン（ＣＨ2）またはメチン（ＣＨ））間に他の基が挿入されることを示す。炭素鎖を中断することができる好適な基には、例えば１つ以上の非過酸化物オキシ（‐Ｏ‐）、チオ（‐Ｓ‐）、イミノ（‐Ｎ（Ｈ）‐）、メチレンジオキシ（‐ＯＣＨ2Ｏ‐）、カルボニル（‐Ｃ（＝Ｏ）‐）、カルボキシ（‐Ｃ（＝Ｏ）Ｏ‐）、カルボニルジオキシ（‐ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ‐）、カルボキシラト（‐ＯＣ（＝Ｏ）‐）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルフィニル（ＳＯ）およびスルホニル（ＳＯ2）が含まれる。アルキル基は１個以上（例えば１、２、３、４、５または約６個）の前述の好適な基により中断されることができる。中断の部位は、アルキル基の炭素原子とそのアルキル基が結合する炭素原子の間であることもできる。
【００４８】
「有効量」は一般的に、例えば反応を引き起こすのに十分な量等の、所望の効果を提供する量を意味する。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「接触させること（contacting）」は、触れさせること（touching）の行為、接触をさせる（making contact）ことの行為、または分子レベルでの近接を含む直接近接もしくは密接近接をもたらして、例えば溶液、細胞もしくは他の反応混合物中で、例えば化学反応や物理変化を引き起こす行為を指す。
【００５０】
「アミノ酸」という用語には、ＤまたはＬ形態の天然アミノ酸の残基、および非天然アミノ酸（例えば、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマ‐カルボキシグルタミン酸、馬尿酸、オクタヒドロインドール‐２‐カルボン酸、スタチン、１，２，３，４‐テトラヒドロイソキノリン‐３‐カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、アルファ‐メチルアラニン、パラ‐ベンゾリルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシンおよびｔｅｒｔ‐ブチルグリシン）が含まれる。この用語には、従来のアミノ保護基（例えばアセチルまたはベンゾイルカルボイル）を有する天然アミノ酸および非天然アミノ酸、ならびにカルボキシ末端で保護された天然アミノ酸および非天然アミノ酸（例えば、Ｃ1‐6アルキル、フェニルもしくはベンジルエステルもしくはアミド；またはアルファ‐メチルベンジルアミド）も含まれる。他の好適なアミノおよびカルボキシ保護基は当業者に公知である。（例えばGreene, T.W.; Wutz, P.G.M. Protecting Groups in Organic Synthesis、第２版、John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨーク（１９９１年）およびそこで参照されている参考文献を参照のこと）。
【００５１】
「ペプチド」という用語は、２〜３５個のアミノ酸残基またはペプチジル残基の配列を指す。配列は直鎖または環状であってもよい。例えば、環状ペプチドを調製することができ、または環状ペプチドは配列中の２つのシステイン残基間のジスルフィド架橋形成の結果であってもよい。好適に、ペプチドは３〜２０個、または５〜１５個のアミノ酸を含む。本明細書において具体的に記載されるペプチド配列は、アミノ末端を左、カルボキシ末端を右にして書かれている。
【００５２】
「反応基」という用語は、カルボン酸の活性化エステル、アミン、アルコール、ハロゲン化スルホニル、メルカプタン、ボロナート、ホスホラミダイト、イソシアナート、ハロアセトアミド、アルデヒド、アジド、アシルニトリル、光活性化可能な基またはハロゲン化アルキルを指す。
【００５３】
「複合化物質」という用語は共有結合的に結合した物質を指し、例えば表面（例えばビーズ、固体担体、樹脂、粒子またはアッセイプレート）、生物学的分子もしくは生体分子（例えばタンパク質、ヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むポリヌクレオチド、酵素の基質、抗体、ナノボディ、ポリペプチド、ポリペプチド系毒素、アミノ酸、脂質、炭水化物、ハプテン、金属キレート剤等のイオン錯体化剤、微粒子、合成ポリマーもしくは天然ポリマー、細胞、ウイルス、他の蛍光分子もしくは表面）、小分子（例えば薬剤、薬剤化合物）、または例えばクロロアルカンもしくはシアノベンゾチアゾール等の他の関心ある部分である。他の好適な複合化物質には、ランタニド錯体化グループ；ニッケル錯体化グループ；コバルト錯体化グループ；エチレンジアミン四酢酸；ニトリロ三酢酸；ヌクレオチド；酵素の基質；酵素の阻害剤、好ましくは酵素と共有結合を形成する不可逆性の酵素の阻害剤；受容体のアゴニスト；１０μＭ以上のＫＤで核酸に結合するリガンド；１０μＭ以上のＫＤでタンパク質に結合するリガンド；ＳＮＡＰ−タグの基質；ＣＬＩＰ−タグの基質；Ｈａｌｏ−タグの基質、ジヒドロ葉酸還元酵素に結合するリガンド；メトトレキサート；トリメトプリム；ビオチンリガーゼの基質；リンペプチド転移酵素の基質；リポ酸リガーゼの基質；ビオチン；ストレプトアビジン、アビジンまたはニュートラアビジンに結合するリガンド；酵素の補助因子；ホルモン；毒素；フルオロフォア；核酸ポリマー；ハプテン；抗原；薬剤；脂質；脂質アセンブリ；非生物有機ポリマー；ポリマー微粒子；動物細胞、植物細胞；細菌、酵母；ウイルス；および原生生物が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００５４】
「トレーサー」は、本発明の色素が、できる限りはリンカーにより、上で規定される物質に複合化した複合化物質の１種である。
【００５５】
「トレースなしリンカー（traceless linker）」または「自壊性（self-immolative）リンカー」という用語は、リンカーからの複合化物質の開裂の結果、色素からのリンカーの自発開裂が生じて非結合色素を放出するリンカーを指す。例示的なトレースなしリンカーには以下のものが含まれる。
【化３】
0006367307.tif 000004
当業者に認識されるであろうとおり、リンカーの長さおよび置換においてはさらなる変化が可能である。
【００５６】
「ＥＴカセット」という用語は、ドナーからアクセプターへ励起状態を移動させる任意の色素対を指す。
【００５７】
使用の方法
特に、本発明の色素を、他の近ＩＲ蛍光色素を使用するいずれの方法においても使用してよい。いくつかの例を以下で考察する。
【００５８】
本発明の色素は、幅広い種類の用途で、共有結合的に物質を標識することに対し効果的な手段を提供する。標識することにより、タンパク質、糖タンパク質、核酸および脂質等の生体分子ならびに薬剤もしくは薬剤化合物等の小分子、無機化合物またはそれらの任意の組合せに関わる相互作用を調べることを可能にする。相互作用を細胞がない生物系、細胞系または生体内において調べてもよい。様々な相互作用を分析することはしばしば、科学研究および開発、薬剤設計、スクリーニングおよび最適化、系統学的分類、個体の遺伝子型同定、親および法医学的同定、環境研究、診断、予後診断、ならびに／または疾患症状の治療の重要な部分である。
【００５９】
本発明のいくつかの態様においては、試料を同定するかまたは定量化できるよう、本発明の複合体を使用して試料を標識する。例えば、このような複合体を生物標的分析物の分析の一部として加えてもよく、または生物もしくは非生物流体において検出可能なトレーサー成分として加えてもよい。
【００６０】
試料を、例えば固体物質（有機または無機）からの洗液、細胞を培養している培地、細胞可溶化物、評価用に細胞を入れた緩衝溶液等の生体物質、または例えば血液、血漿、血清、尿等の生理学的供給源等から直接得てもよい。試料が細胞を含む場合、細胞は任意に微生物を含む単細胞であるか、または多細胞生物、胚、組織、バイオプシー、フィラメント、バイオフィルム等を含む、他の細胞と二次元もしくは３次元で結合した多細胞である。試料が細胞を含む場合、例えば細胞可溶化物等のように細胞を溶解してもよく、または細胞は細胞全体であってもよい。細胞は動物内にあってもよく、すなわち本発明の色素を生体内イメージングに使用してもよい。
【００６１】
代替的には、試料は固体であり、任意に塗抹標本もしくは掻爬検体、または濾過により液体もしくは蒸気から取り除かれた濃縮液である。本発明のいくつかの態様においては、試料を、尿、脳脊髄液、血液、リンパ液、組織ホモジネート、間質液、細胞抽出液、粘液、唾液、痰、便、生理学的分泌物または他の同様な液体等の、分離した生理学的液体または濾過されていない生理学的液体を含む生体液体から得る。あるいは、試料を土壌、水または空気等の環境供給源；廃棄物の流れ、水源、供給ラインもしくは製造ロットから取られたもの等の産業的供給源から得る。
【００６２】
他の実施形態においては、試料は、固体もしくは半固体マトリックスの上またはその中に存在する。本発明のいくつかの態様においては、マトリックスは膜である。他の態様においては、マトリックスは、核酸もしくはタンパク質の分離および特性評価に使用する電気泳動ゲル等の電気泳動ゲル、または電気泳動ゲルから膜へ移動させることにより調製されるブロットである。他の態様においては、マトリックスはケイ素チップまたはスライドガラスであり、分析中、関心ある分析物をチップまたはスライド上に固定化する（例えば、試料はマイクロアレイにタンパク質または核酸ポリマーを含む）。さらに他の態様においては、マトリックスはマイクロウェルプレートまたはマイクロ流体チップであり、試料を自動化方法、通常は薬剤スクリーニング等の様々なハイスループットスクリーニングの方法により分析する。
【００６３】
一般的に、検出可能な光学応答を得るように選択した条件下、上記の複合体を関心ある試料と組み合わせることにより色素複合体を使用する。次に、光学応答を誘発するよう選択した波長で試料を照射する。通常、光学応答を標準的な応答または予想される応答と比較することにより、詳細な試料の特性を決定する。
【００６４】
検出可能な光学応答は、観察または装置使用のいずれかにより検出可能な光学信号の変化または発生を意味する。通常、検出可能な応答は、強度、蛍光の励起波長もしくは発光波長分布、蛍光寿命、蛍光偏光、またはそれらの組合せにおける変化等の、蛍光における変化である。標識の程度および／または場所は、標準的な応答または予想される応答と比較して、試料が所定の特性を有するかどうか、かつ試料が所定の特性をどの程度有するかを示す。本発明のいくつかの色素は、わずかな蛍光発光しか示さないが、発色団色素としては依然として有用であってもよい。このような発色団は、ＦＲＥＴ用途においてエネルギーアクセプターとして有用であるか、または試料もしくは試料の一部に所望の色を単に与えるのに有用である。
【００６５】
生物学的用途では通常、当業者に一般的に公知の方法に従って調製した水性溶液、ほぼ水性溶液または水性−混和溶液において色素複合体を使用する。色素化合物の正確な濃度は実験条件および所望の結果に依存するが、通常約１ナノモル〜１ミリモル以上の範囲である。最適な濃度を、最小のバックグラウンド蛍光を有しながら満足いく結果が達成されるまでの系統的な変化により決定してもよい。
【００６６】
色素複合体を使用して、生物成分を含有する使用を標識してもよい。試料は成分の不均一混合物（インタクトな細胞、細胞抽出物、細胞可溶化物、バクテリア、ウイルス、細胞小器官およびそれらの混合物を含む）、または単一成分もしくは成分の均一グループ（例えば、天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸、核酸もしくは炭水化物ポリマー、または脂質膜複合体）を含んでもよい。色素は一般的に、使用の濃度範囲内で生細胞および他の生物成分に無毒である。
【００６７】
色素複合体を、色素複合体と関心ある試料成分の間の接触を促進する方法で、試料と組み合わせてもよい。通常、色素複合体または色素複合体を含有する溶液を単に試料に添加する。例えば１つ以上のスルホン酸部で置換した色素等の本発明の特定の色素は、生物細胞の膜に対しわずかな浸透性であるが、一度内部に入れば生細胞は通常よく保持される。電気穿孔、ショック処理または高細胞外ＡＴＰ等の原形質膜を浸透性にする処理を使用して、選択した色素複合体を細胞に導入してもよい。あるいは、選択した色素複合体を、例えば圧力微量注入、掻爬導入、パッチクランプ法または食作用により細胞内に物理的に挿入することができる。
【００６８】
脂肪族アミンまたはヒドラジン残基を取り込む色素を細胞に微量注入してもよく、この色素を、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド等のアルデヒド固定剤により所定の場所に固定することができる。この特性により、このような色素が神経細胞追跡等の細胞内用途に有用となる。
【００６９】
リン脂質等の親油性置換基を有する色素は、例えば膜構造のプローブとしての使用、またはリポソーム、リポタンパク、膜、プラスチック、親油性微粒子もしくは同様な物質中への取り込み；または追跡のため、脂質アセンブリに非共有結合的に取り込まれてもよい。親油性色素は膜構造の蛍光プローブとして有用である。
【００７０】
化学反応性の色素化合物は、幅広い種類の物質の対応する官能基に共有結合的に付着して、上記の色素複合体を形成してもよい。色素化合物を使用して細胞表面上、細胞膜内、細胞小器官等の細胞内区画内、または細胞質内の反応性部位を標識することにより、試料中のそれらの存在または量、接近しやすさ、活性または空間分布および時間分布を決定することを可能にする。光反応性色素を同様に使用して生物細胞の外膜の成分を光標識してもよく、または細胞用の光固定可能な極性トレーサーとして使用してもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態においては、クロロアルカン−標識色素をＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質と共に使用して、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質と関心あるタンパク質の間に融合タンパク質を生成させることにより、関心あるタンパク質を検出してもよい。一般的に、これらの融合タンパク質はＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質コンストラクトからの細胞により発現され、融合タンパク質をクロロアルカン−標識色素の使用により検出する。これによりタンパク質発現の検出を可能にし、またはタンパク質発現時間経過もしくはタンパク質局所化もしくはタンパク質移動の測定を可能にする。さらに、この蛍光標識を使用して、これらのタンパク質をゲル中で検出することができる。色素を、クチナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素／トリメトプリム  ＳＮＡＰ−タグ、Ｃｌｉｐタグ、アルキルシトシン転移酵素（米国特許出願第２０１２／０２３７９６１号を参照のこと、これは参照により本明細書に取り込まれる）、およびアシルキャリアータンパク質（米国特許出願第２０１０／０１７３３８４号を参照のこと、これは参照により本明細書に取り込まれる）等の他の直交標識システムにおいても使用してよい。さらに、ＨａｌｏＴａｇも、ヒュスゲン環化（クリック化学）、ヒドラゾンおよびオキシム形成、ならびにシュタウディンガーライゲーション等の他の標識化学に対し直交である。
【００７２】
任意に、標識後に試料を洗浄して残渣、過剰な色素化合物もしくは色素複合体、または非結合色素化合物もしくは色素複合体を除去する。試料を標識中、洗浄溶液、透過性にする溶液および／または固定化溶液、ならびにさらなる検出剤を含有する溶液を含む、１つ以上の他の溶液と任意に混合する。さらなる検出剤は通常、当業者に一般的に公知の方法に従って、特定の細胞成分、細胞内物質または細胞条件の存在に起因し、検出可能な応答を生じさせる。さらなる検出剤が対象色素化合物のスペクトル特性と異なるスペクトル特性を有するか、または対象色素化合物のスペクトル特性と異なるスペクトル特性を有する生成物を生じる場合、多色利用例が可能である。これはさらなる検出剤が標識色素のスペクトル特性と検出可能な程度に異なるスペクトル特性を有する色素または色素複合体である場合、特に有用である。
【００７３】
例えば顕微鏡観察および免疫蛍光測定法における抗体複合体の使用；または核酸ハイブリダイゼーション測定法、核酸増幅反応および核酸配列決定用のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド複合体（例えば米国特許第５，３３２，６６６号、同第５，１７１，５３４号および同第４，９９７，９２８号ならびにＷＯ９４／０５６８８）等の当業者に公知の方法に従って、色素複合体を使用する。本発明の複数の独立した色素の色素複合体は多色利用例での有用性を有する。
【００７４】
標識後または標識中の任意の時間において、検出可能な光学応答を与えるように選択した波長の光で試料を照射し、光学応答を検出する手段を用いて観測する。本発明の色素化合物を照射するのに有用な装置には、手で持つ紫外線ランプ、水銀アークランプ、キセノンランプ、レーザーおよびレーザーダイオードが含まれるがこれらに限定されるものではない。これらの照射源を、レーザー走査装置、蛍光マイクロプレート読取装置、標準蛍光光度計もしくは小型蛍光光度計、またはクロマトグラフィー検出器へ任意に組み込む。
【００７５】
光学応答を、目視検査または以下の任意の装置の使用により、任意に検出する：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー走査装置、蛍光光度計、光ダイオード、量子計数器、落射蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレート読取装置または光電子増倍管等の信号を増幅する手段。フローサイトメーターを使用して試料を測定する場合、試料の測定は、試料の蛍光応答に従って試料の一部を選別することを任意に含む。
【００７６】
例示的な使用方法
ｉ．核酸ポリマーの検出
いくつかの実施形態においては、例えばプローブまたはプライマーである色素オリゴヌクレオチド複合体と試料の混合物を、複合体中のオリゴヌクレオチドが試料中の核酸ポリマーと混合して、核酸ハイブリッド（複合体）を形成する（すなわちプローブ）のに十分な時間、または核酸合成を刺激する（すなわちプライマー）のに十分な時間インキュベートして、本発明の色素オリゴヌクレオチド複合体を、核酸ポリマーを含有するかまたは含有すると思われる試料と組み合わせ、これを検出してもよい。存在、場所、強度、励起および発光スペクトル、蛍光偏光、蛍光寿命および蛍光信号の他の物理特性を含む、標識した分子の特性を使用して、試料の態様または一部を検出、識別、選別、定量化、配列決定および／または分析することができる。本発明の色素複合体を、異なるスペクトル特性を有する同じクラスの色素を含む、１つ以上のさらなる試薬（例えば検出可能な程度に異なる蛍光剤）との組合せにおいて任意に使用する。
【００７７】
いくつかの実施形態においては、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｌａｎｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＩＬＳ）において本発明の色素を使用することができる。電気泳動により分離し、様々な蛍光検出装置を使用して検出したＤＮＡ断片の複製可能なサイズを、ＩＬＳを使用して帰属する。いくつかの実施形態においては、ＩＬＳは、サイズ範囲６０ｂｐ〜５００ｂｐの２〜２１ピークの二本鎖ＤＮＡからなる。いくつかの実施形態においては、６０〜２００ｂｐの断片を２０ｂｐ間隔で配置し、２００〜５００ｂｐの断片を２５塩基ごとに配置する。
【００７８】
通常、試料および目的の使用に適合する水性溶液または水性混和性溶液に色素複合体を溶解することにより、色素複合体を使用用に調製する。細胞形態または生理機能の最小摂動が望ましい生物試料では、それに応じて溶液を選択する。
【００７９】
水等の水性溶媒、緩衝食塩水（生存率識別用途では好ましくは非リン酸）、トリス（ヒドロキシメチル）‐アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液（好ましくはＥＤＴＡを含有）等の緩衝溶液、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、もしくはメタノールもしくはエタノール等の低級アルコール等の水混和性有機溶媒に色素複合体を直接溶解することにより、標識溶液を作製する。通常、色素複合体を、標識溶液で使用する濃度の約１００倍よりも大きい濃度であらかじめ有機溶媒（例えば１００％ＤＭＳＯ）に溶解し、次に水等の水性溶媒または緩衝液で1回以上希釈して、色素複合体が有効量で存在するようにする。
【００８０】
細胞試料用の標識溶液は、典型的には０．１ｎＭよりも大きく５０μＭ未満の濃度、より典型的には例えば０．５〜５μＭ等の、１ｎｍよりも大きく１０μＭ未満の濃度を有する。電気泳動ゲル用標識溶液は、典型的には０．１μｍよりも大きく１０μＭ未満の濃度、より典型的には約０．５〜２μＭ未満の濃度を有する。核酸と混合する前に色素をゲルに添加する場合についても同様である。溶液中の遊離の核酸の検出および定量化用の標識溶液は、通常０．１μＭ〜２μＭの濃度を有する。標識溶液の最適な濃度および組成を、試料の性質（物理的、生物学的、生化学的および生理学的特性を含む）、色素−試料相互作用の性質（核酸の場所への色素の輸送速度を含む）、ならびに実施する分析の性質により決定し、標準的な方法に従って決定することができる。
【００８１】
試料中の核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの混合物もしくはハイブリッドであってもよい。任意のＤＮＡが、任意に一本鎖、二本鎖、三本鎖または四本鎖ＤＮＡであり；任意のＲＮＡが、任意に一本鎖（「ｓｓ」）または二本鎖（［ｄｓ］）である。核酸は天然ポリマー（生物学的起源）または合成ポリマー（人工的に修飾または調製）であってもよい。核酸ポリマー（例えば、８個以上の塩基または塩基対を含有するもの）が核酸断片、オリゴヌクレオチド、または二次構造もしくは三次構造を有するより大きな核酸ポリマーとして存在してもよい。核酸は任意に、染色体等の凝縮相において存在する。核酸ポリマーは任意に、１つ以上の修飾塩基もしくはリンクを含有するか、または非共有結合的もしくは共有結合的に付着した標識を含有する。例えば、修飾塩基は、ｔＲＮＡにおけるΨ（プソイドウリジン）、５‐メチルシトシン、６‐メチルアミノプリン、６‐ジメチルアミノプリン、１‐メチルグアニン、２‐メチルアミノ‐６‐ヒドロキシプリン、２‐ジメチルアミノ‐６‐ヒドロキシプリン、５‐アミノ‐ＤＵ、ｉｓｏＣ、ｉｓｏＧもしくは他の公知の微量塩基（例えばDavidson、The Biochemistry Of The Nucleic Acids（１９７６年）を参照のこと）等の自然発生修飾塩基であることができ、または合成的に変化させて、モルホリン誘導ホスフェート（オレゴン州コーバリスのＡｎｔｉＶｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．）等の特異リンカーもしくはＮ‐（２‐アミノエチル）グリシン単位（Wittungら、Nature, 368:561 (1994)）等のペプチド核酸を含有するか、もしくは官能基が脂肪族アミン、カルボン酸、アルコール、チオールもしくはヒドラジンである単純な反応性官能基（＜１０炭素）を含有するか、もしくは蛍光標識もしくはイノシン、ブロモデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、２，４‐ジニトロフェニル等の他のハプテンを含有し、標識は最初、核酸（例えば、ＣＨＲＯＭＡＴＩＤＥ（商標）標識核酸、オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）上に付着するか、または核酸ポリマーの３’もしくは５’末端上に位置するか、または核酸に非共有結合的に付着したリガンド上に位置する。一次修飾塩基およびリンクを含有する核酸ポリマーに対する色素の感度は、結合様式での干渉により減少してもよい。色素のいくつかの実施形態は、特定の色素：塩基対比において、制限エンドヌクレアーゼ活性を除く非特異性ヌクレアーゼ活性を阻害してもよい。
【００８２】
核酸を含有する試料は任意に、生物構造体（すなわち、生命体もしくは生命体の分離単位）、溶液（生物構造体を含有する溶液を含む）、または固体もしくは半固体物質である。したがって、核酸は任意に、溶液中で遊離であるか、固体もしくは半固体物質中もしくはその上に固定されるか、生物構造体から抽出されるか（すなわち溶解した細胞、組織、生命体もしくは細胞小器官）、または生物構造体内に取り囲まれたままである。核酸を色素に結合させるために、核酸が生物構造体内に取り込まれていない場合であっても、核酸を水性環境に存在させて色素と接触させることが必要である。
【００８３】
核酸を含有する生物構造体は任意に細胞または組織であり、例えば核酸は、原核生物もしくは真核生物微生物、またはウイルス、ウイロイド、染色体もしくは細胞小器官として細胞内または間質空間に存在する。あるいは、生物構造体は組織または細胞に含有されていなくてもよく、ウイルスとして、もしくは微生物もしくは他の細胞としてのいずれかで存在するか、または親細胞から取り除かれた細胞成分（例えば、プラスミドもしくは染色体、またはミトコンドリアもしくは核もしくは他の細胞小器官）として存在する。通常、生物構造体は細胞小器官、染色体または細胞であり、任意に真核生物細胞内に含有される。真核生物細胞内に存在する細胞は通常、ウイルス、バクテリア、原生動物、マイコプラズマまたはマイコバクテリウム等の寄生体または他の感染病原体である。核酸が、生物構造体が細胞である生物構造体に含有される場合、細胞は生存細胞もしくは死細胞またはそれらの混合物であり、すなわち細胞膜の完全性は任意にインタクトであるか、または自然の（自己分解の）手段、機械的手段もしくは化学的手段、もしくは温度もしくは圧力における変化等の環境手段により破壊されている。あるいは、細胞は小疱形成を有するか、またはアポトーシスもしくは成長サイクルもしくは細胞分割を経る。
【００８４】
核酸が溶液中に存在する場合、試料溶液は１つの精製核酸もしくはオリゴヌクレオチド等の合成核酸を含むか、または細胞抽出物もしくはホモジネートもしくは他の生物液体等の粗製混合物、または生物学的供給源、産業的供給源もしくは環境供給源からの希釈溶液へと異なることができる。いくつかの場合においては、色素と組み合わせる前に、生体分子の混合物または溶液中の液体から核酸を分離すること望ましい。他のタンパク質または他の生物分子を有する一般的に粗製の混合物からの核酸の分離および精製には、数多くの技術が存在する。これらには、様々な担体もしくは溶液を使用するかまたは流れているストリーム中でのクロマトグラフィー技術、電気泳動技術のような手段が含まれる。あるいは、核酸の混合物をリボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼと処理してもよく、核酸ポリマーはヌクレアーゼ存在下で分解されず、対象色素を使用して分解生成物から識別することができる。
【００８５】
本発明の色素の生存系に対して比較的低い毒性は、一般的に、色素自身により生じる損傷がほんのわずかであるかまたは損傷がない状態での生存試料における核酸の測定を可能にする。ゲル中のインタクトな細胞または試料での使用にはより浸透性の色素を使用してもよいが、いくつかの細胞は、例えば食作用または他の摂取等の細胞膜を横切った受動拡散以外の方法により、他の細胞には非浸透性であることが示されている色素を容易に取り込む。これらの色素を標準的なゲル系用途において使用することができる。色素の光安定性、毒性、結合親和性、量子収率および蛍光増強を、当業者に公知の標準的な方法に従って測定する。
【００８６】
いくつかの実施形態においては、プローブまたはプライマー等の色素オリゴヌクレオチド複合体を、生理学的試料における対立遺伝子同定用の方法およびキットにおいて使用する。いくつかの実施形態においては、適切な遺伝子座、プライマーおよび増幅プロトコルのセットを選択して、一実施形態においてはサイズが重なり合わないかまたはサイズが重なり合う異なる遺伝子座から対立遺伝子間で区別することを可能にする方法で標識した複数の共増幅複遺伝子座から、増幅対立遺伝子を産生させる。さらに、この方法は、単一増幅プロトコルを用いた使用に適合する短いタンデム反復（ＳＴＲ）遺伝子座の選択を考察する。遺伝子座組合せの試行錯誤により、プライマー対配列の選択により、およびプライマー濃度を調節して、含まれる全ての遺伝子座が増幅されてもよい平衡を同定することにより、成功の組合せを作成することができる。多重増幅反応工程において増幅されてもよい遺伝子座の数は、反応により同定可能な増幅対立遺伝子が生成するならば、２〜５０個、または１６、１７、１８、２１、２３もしくは２６等の２〜５０の間の任意の整数個であってもよい。いくつかの実施形態においては、増幅断片は５００ｂｐ未満の長さである。
【００８７】
本発明の方法において使用するプライマーの合成を、当業者の公知のオリゴヌクレオチド合成の標準的手順を使用して行うことができる。各遺伝子座に対し１個以上のプライマーが、異なる色素標識に共有結合的に付着する。
【００８８】
ＤＮＡの増幅に適合する任意のＤＮＡ調製方法を使用して、ゲノムＤＮＡの試料を本発明の方法における使用用に調製することができる。多くのこのような方法が当業者に公知である。分析する１つ以上のＤＮＡ試料がヒトゲノムＤＮＡである場合、組織、血液、精液、膣細胞、毛髪、唾液、尿、骨、頬試料、胎盤細胞または胎性細胞を含有する羊水、絨毛膜絨毛、および上で挙げた任意の試料の混合物から成る群より選択される試料からＤＮＡを調製してもよい。
【００８９】
ゲノムＤＮＡの試料を調製したら、多重増幅工程において標的遺伝子座を共増幅することができる。いくつかの異なる増幅方法の任意の１つを使用して、遺伝子座を増幅することができ、増幅方法にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写系増幅およびストランド置換増幅（strand displacement amplification）（ＳＤＡ）が含まれるがこれらに限定されるものではない。一実施形態においては、セット内の各遺伝子座に特異的なプライマー対を使用して、ＤＮＡ試料をＰＣＲ増幅に付す。
【００９０】
各遺伝子座に対して１つ以上のプライマーを色素標識に共有結合的に付着させることができ、色素標識の１つは本発明の色素を含む。例えばゲルまたはキャピラリー電気泳動により対立遺伝子を分離する際、１色で標識した各遺伝子座に対するプライマーを使用して増幅した対立遺伝子が、同じ色で標識したプライマーを使用して共増幅したセット中の他の遺伝子座の対立遺伝子と重なり合わないようにして、プライマーおよびそこに付着する色素を多重増幅反応における使用用に選択する。本発明における使用でプライマーへの付着に好適な蛍光標識は市販されている。例えばＰＥ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓからのフルオレセインおよびカルボキシ‐テトラメチルローダミン標識ならびにそれらの化学誘導体を参照のこと。いくつかの実施形態においては、４または５個以上の異なる標識を使用して、多重増幅反応において使用する異なるプライマーを標識する。多重反応を評価するためサイズマーカーが含まれる場合、サイズマーカーの調製に使用するプライマーを、反応において関心ある遺伝子座を増幅するのに使用するプライマーと異なる標識で標識してもよい。
【００９１】
多重増幅工程から増幅した対立遺伝子のセットを生成したら、増幅した対立遺伝子を評価する。この方法の評価工程を、いくつかの異なる手段の任意の１つにより達成することができる。電気泳動を使用して多重増幅反応の生成物を分離してもよく、例えばキャピラリー電気泳動または変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動である。ゲル調製ならびに電気泳動手順および評価工程における使用に好適な条件は当業者に公知である。変性ポリアクリルアミドゲルおよびキャピラリー電気泳動におけるＤＮＡ断片の分離は、主に断片サイズに基づいて行われる。
【００９２】
増幅した対立遺伝子を分離したら、次に対立遺伝子およびゲルまたはキャピラリー中の他の任意のＤＮＡ（例えばＤＮＡサイズマーカーまたは対立遺伝子ラダー）を可視化し、分析する。一実施形態においては、数多くの遺伝子座を含有する多重反応物の検出の方法は蛍光であり、多重反応における各遺伝子座に対するプライマーを、蛍光定量検出器を使用して標識生成物を検出することにより追跡する。
【００９３】
ｉｉ．他の用途
本発明の蛍光色素を、当業者に公知の他の技術において使用することができる。例えば、抗体染色、生細胞における有機金属触媒の研究、生物医学的イメージング、小分子の生体内検出、チオール反応性プローブ、ビオチンおよびハプテン誘導体、核酸およびタンパク質分析、細胞構造の探索（細胞骨格細胞、細胞小器官、脂質および膜を含み、ならびに細胞形態および液体の流れの蛍光トレーサーとして）ならびに細胞機能の探索（細胞生存率、細胞増殖、エンドサイトーシス、受容体、イオンチャネル、信号伝達、ＲＯＳ、様々な陽イオンおよび膜電位を含む）において色素を使用してもよい。
【００９４】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を使用した生物学的現象の検出にも色素を使用してよい。例えば、本発明の色素の様々な用途の記載については「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」(www.invitrogen.com)を参照のこと。いくつかの実施形態においては、本明細書において開示される色素をＢＲＥＴアクセプターとして使用することができる。本明細書において記載される色素がルシフェラーゼのエネルギー移動半径（例えば、通常は＜１０ｎｍ）以内に置かれ、正しい配向である場合は、無放射エネルギー移動が生じて、色素は垂直放射で光を放射するであろう。ルシフェラーゼの近接に色素を置くことに対する公知の方法は数多くあり、例えば小分子または量子ドット（Xia, ZおよびRao, J. 2009. Curr. Opin. Biotech 20: 37-44）であり、これらの方法は関心ある生物系についての知見を得ることを可能にする。
【００９５】
いくつかの実施形態においては、本明細書において開示される色素のＦＲＥＴおよびＢＲＥＴにおける用途を使用して、核酸、脂質、多糖、抗体、薬剤または薬剤化合物等の小分子等の任意の２つの関心ある物質の生物学的相互作用を確認することができる。いくつかの実施形態においては、タンパク質と小分子の相互作用が生細胞の内部で生じる。いくつかの実施形態においては、本明細書において開示される色素がトレーサー等の小分子と複合化し、分子／タンパク質相互作用が色素複合化により妨げられないような方法で、小分子が関心あるタンパク質と結合してもよい。関心あるタンパク質が上記のとおりルシフェラーゼ融合として発現される場合、タンパク質と小分子の相互作用を生細胞内部で測定することができる。このような分析を使用して、特定の小分子が結合してもよい他のタンパク質の数に関わらず、無差別の小分子の単一タンパク質のみとの結合も調査してよい。いくつかの実施形態においては、本発明の反応性色素を使用して、その場（in situ）でのタンパク質相互作用の定量化用に、タンパク質（複数可）またはペプチド（複数可）を標識してもよい。いくつかの態様においては、反応性シアノベンゾチアゾール（ＣＢＴ）標識化学（米国特許出願第２００９／０２６３８４３号を参照のこと、これは参照により本明細書に取り込まれる）を使用して、色素標識を関心ある標的タンパク質またはペプチドに付着しうる。ＣＢＴ標識化学は、標的タンパク質またはペプチド上に遊離のＮ‐末端システイン残基を必要とし、Ｎ‐末端システイン残基はその場で生成するか、または例えば部位−特異的タンパク質分解性開裂（例えばＣ‐末端標的タンパク質またはペプチドからの、ＨａｌｏＴａｇ等のＮ‐末端レポーターの開裂）により生化学様式で生成することができる。タンパク質分解が生じ、Ｎ‐末端システイン残基が生成したら、反応性ＣＢＴ標識法を使用して関心ある標的タンパク質またはペプチド上に単一色素標識を生成することができる。この方法を受容体リガンド（例えばサイトカインまたはペプチドリガンド）の部位−特異的標識にも使用しうる。色素標識したリガンドが、好適なエネルギードナー（例えば生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）用のルシフェラーゼまたはフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）用の短波長フルオロフォア）を用いて標識した細胞表面受容体に近接で結合した場合、励起状態ドナーと蛍光色素アクセプターの間でエネルギー移動が起こることができ、複合化色素からの発光が増加する。次に、エネルギー移動を利用して、関心あるドナーで標識した受容体と共にＣＢＴ色素を用いて標識したタンパク質／ペプチドの相互作用を定量化しうる。この標識方法は例えば精製したタンパク質もしくはペプチド等の精製した成分と適合性であってもよく、または細胞全体もしくは細胞可溶化物を含む、より複雑な試料において適合性であってもよい。さらに、この標識方法は、ＢＲＥＴ信号を生成するリガンド−受容体複合体の競合置換により、標識していないタンパク質／ペプチドの、関心ある受容体への親和性を試験するのに有用であり得る。
【００９６】
化合物
本発明の方法において有用な化合物には式（Ｉ）の化合物が含まれる。
【化４】
0006367307.tif 000005
式中、
ＺはＳｉ（Ｒ11）（Ｒ12）またはＧｅ（Ｒ11）（Ｒ12）であり；
Ｒ11およびＲ12はそれぞれ独立してＣ1-10直鎖アルキル、Ｃ1-10分岐アルキルもしくはＣ1-10環式アルキル、１個以上のヘテロ原子で中断されたＣ1-10アルキル、Ｃ6-10アリール、ヘテロアリールから選択されるか、またはＲ11およびＲ12が共に環を形成してもよく；
Ｘはそれぞれ独立してＯＲ2またはＮ（Ｒ3）（Ｒ4）から選択され；
Ｒ1はそれぞれ独立してＨ、Ｃ1-4アルキル、スルホネートまたはハロから選択され；
Ｒ2はＨ、Ｃ1-10アルキル、Ｌ‐ＲまたはＬ‐ＣSであり；
Ｒ3およびＲ4は独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、１個以上のヘテロ原子で中断されたＣ1-4アルキル、Ｃ6-10アリール、ペプチジル、ヘテロアリール、Ｌ‐ＲまたはＬ‐ＣSから選択され；
Ｒ6-10は独立して、Ｈ、ハロ、アルコキシ、アミノ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ2Ｈ、ＳＯ3Ｈ、Ｌ‐ＣＯ2Ｈ、Ｌ‐ＳＯ3Ｈ、Ｌ‐ＲまたはＬ‐ＣSから選択され；
Ｌは、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン化物基、または炭素‐炭素単結合、炭素‐炭素二重結合、炭素‐炭素三重結合もしくは芳香族炭素‐炭素結合のいずれかの組合せを結合部が含有するように、１〜１６個の非水素原子を有する、直鎖または分岐、環式または複素環式の、飽和または不飽和である共有結合部であり；
Ｒは反応基であり；または
ＣSは複合化物質であり；
Ｒ3およびＲ4、またはＲ3およびＲ1、またはＲ4およびＲ1の１つ以上が共に環を形成してもよく；ならびに
Ｒ6-10の１つ以上が共に環を形成してもよい。
【００９７】
いくつかの実施形態においては、化合物は式（ＩＩ）の化合物である。
【化５】
0006367307.tif 000006
式中、
Ｒ1はそれぞれ独立してＨ、Ｃ1-4アルキル、スルホネートまたはハロから選択され；
Ｒ3およびＲ4は独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、１個以上のヘテロ原子で中断されたＣ1-4アルキル、Ｌ‐ＲまたはＬ‐ＣSから選択され；
Ｒ6-9は独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ2Ｈ、ＳＯ3Ｈ、Ｌ‐ＣＯ2Ｈ、Ｌ‐ＳＯ3Ｈ、Ｌ‐ＲまたはＬ‐ＣSから選択され；
Ｒ10はアルコキシ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ2Ｈ、ＳＯ3Ｈ、ＳＯ2Ｎ（ＲN）2、ＣＯＮ（ＲN）2、Ｌ‐ＣＯ2Ｈ、Ｌ‐ＳＯ3Ｈ、Ｌ‐ＲまたはＬ‐ＣSから選択され；
ＲNはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｌ‐ＲおよびＬ‐ＣSから選択され；
Ｌは、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン化物基、または炭素‐炭素単結合、炭素‐炭素二重結合、炭素‐炭素三重結合もしくは芳香族炭素‐炭素結合の任意の組合せを結合部が含有するように１〜１６個の非水素原子を有する、直鎖または分岐、環式または複素環式の、飽和または不飽和である共有結合部であり；
Ｒは反応基であり；または
ＣSは複合化物質であり；
Ｒ3およびＲ4、またはＲ3およびＲ1、またはＲ4およびＲ1の１つ以上が共に環を形成してもよく；ならびに
Ｒ6-9の１つ以上が共に環を形成してもよい。
【００９８】
いくつかの実施形態においては、化合物は、以下の化合物からなる群より選択される。
【化６】
0006367307.tif 000007
【００９９】
本発明において有用なさらなる化合物を図１３に示す。
【０１００】
いくつかの実施形態においては、本発明は式（ＩＩＩ）の化合物を提供する。
【化７】
0006367307.tif 000008
式中、
ＺはＳｉ（Ｒ11）（Ｒ12）またはＧｅ（Ｒ11）（Ｒ12）であり；
Ｒ11およびＲ12はそれぞれ独立してＣ1-10直鎖アルキル、Ｃ1-10分岐アルキルもしくはＣ1-10環式アルキル、１個以上のヘテロ原子で中断されたＣ1-10アルキル、Ｃ6-10アリール、ヘテロアリールから選択されるか、またはＲ11およびＲ12が共に環を形成してもよく；ならびに
ｍおよびｎは独立して１〜３の整数である。
【０１０１】
いくつかの実施形態においては、本発明は式（ＩＶ）の化合物を提供する。
【化８】
0006367307.tif 000009
式中、
ＺはＳｉ（Ｒ11）（Ｒ12）またはＧｅ（Ｒ11）（Ｒ12）であり；
Ｒ11およびＲ12はそれぞれ独立してＣ1-10直鎖アルキル、Ｃ1-10分岐アルキルもしくはＣ1-10環式アルキル、１個以上のヘテロ原子で中断されたＣ1-10アルキル、Ｃ6-10アリール、ヘテロアリールから選択されるか、またはＲ11およびＲ12が共に環を形成してもよく；ならびに
ｐおよびｑは独立して１〜３の整数である。
【０１０２】
いくつかの実施形態においては、本発明は式（Ｖ）の化合物を提供する。
【化９】
0006367307.tif 000010
式中、
ＺはＳｉ（Ｒ11）（Ｒ12）またはＧｅ（Ｒ11）（Ｒ12）であり；
Ｒ11およびＲ12はそれぞれ独立してＣ1-10直鎖アルキル、Ｃ1-10分岐アルキルもしくはＣ1-10環式アルキル、１個以上のヘテロ原子で中断されたＣ1-10アルキル、Ｃ6-10アリール、ヘテロアリールから選択されるか、またはＲ11およびＲ12が共に環を形成してもよく；ならびに
ｎ、ｍ、ｐおよびｑは独立して１〜３の整数である。
【０１０３】
いくつかの実施形態においては、本発明の化合物はＥＴカセットの一部である。
【０１０４】
本発明の色素は、近赤外領域において蛍光性である。いくつかの実施形態においては、色素は約６５０〜約９００ナノメートル、または約７００〜約８００ナノメートルで蛍光を呈する。
【０１０５】
合成
本発明の化合物を様々な方法で合成してもよく、その方法には図１０および図１１において示される方法ならびに実施例において記載される方法が含まれる。一般的に、３‐ブロモ‐Ｎ，Ｎ‐ジアルキルアニリンとアルデヒドを酢酸中で反応させることにより、４，４’‐メチレンビス（３‐ブロモ‐Ｎ，Ｎ‐ジアルキルアニリン誘導体（化合物１ａ〜６ａ）を作製した。次にｓｅｃ‐ＢｕＬｉを用いて二臭化物化合物（化合物１ａ〜６ａ）をＴＨＦ中、−７８℃でリチオ化し、その後ジアルキルシリカジクロリドまたはジアルキルゲルマニウムジクロリドを添加してＳｉ‐またはＧｅ‐環縮合化合物１ｂ〜８ｂを得た。次に化合物１ｂ〜８ｂを過剰クロリニルにより酸化し、濃青色のキサンテン色素中間体を形成させた。単離せずに、キサンテン中間体を塩基性水性溶液中、さらなるクロリニルで処理し、重要な環縮合ケトン中間体１ｃ〜８ｃを得た。ｓｅｃ‐ＢｕＬｉを用いて４‐ブロモ‐３‐メチル安息香酸ｔ‐ブチルを乾燥ＴＨＦ中、‐７８℃でリチオ化し、次に環縮合ケトン１ｃ〜８ｃを反応させ、その後１Ｎ  ＨＣｌと処理して５‐カルボン酸Ｓｉ／Ｇｅローダミンのｔ‐ブチルエステル１ｄ〜８ｄを得た。ｔ‐ブチルエステル１ｄ〜８ｄをＴＦＡにより取り除き、ＨＰＬＣにより精製して最終化合物の５‐カルボン酸Ｓｉ‐／Ｇｅ‐ローダミンを得た。３‐ブロモ‐４‐メチル安息香酸ｔ‐ブチルを試薬として使用して同様な方法を使用することにより、６‐カルボン酸Ｓｉ‐／Ｇｅ‐ローダミンを作製した。ビス‐カルボン酸Ｓｉ‐／Ｇｅ‐ローダミンも、２，２’‐（２‐ブロモ‐１，４‐フェニレン）ビス（４，４‐ジメチル‐４，５‐ジヒドロオキサゾール）を試薬として使用して上記と同様な方法により作製し、オキサゾールまたはエステルの脱保護工程を２Ｎ  ＨＣｌ／ＣＡＮ中で還流するか、またはマイクロ波を用いて８０℃で行った。ＤＩＰＥＡ存在下、ＤＭＦ中でＴＳＴＵと反応させることにより、全てのＳｉ‐／Ｇｅ‐色素遊離酸を活性ＮＨＳエステルに変換した。
【０１０６】
当業者に理解されうるとおり、本明細書の式の化合物を合成する代替方法は当業者に明らかであろう。さらに、配列および順序を交替して様々な合成工程を行って所望の化合物を得てもよい。本明細書において記載される化合物の合成において有用な合成化学変換および保護基方法論（保護および脱保護）は当業者に公知であり、例えば、R. Larock、Comprehensive Organic Transformations、VCH Publishers（１９８９年）；T.W. GreeneおよびP.G.M. Wuts、Protective Groups in Organic Synthesis、第二版、John Wiley and Sons（１９９１年）；L. FieserおよびM. Fieser、Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis、John Wiley and Sons（１９９４年）；およびL. Paquette編、Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis、John Wiley and Sons（１９９５年）、ならびにそれらの続版において記載されているものである。
【０１０７】
標識される物質
簡潔に述べると、本発明の色素を、物質の組成の検出を可能にする標識剤として使用してもよい。本発明の色素を使用して幅広い範囲の物質を標識することができ、この物質にはポリペプチド、ポリペプチド系毒素、アミノ酸、ヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むポリヌクレオチド、脂質、炭水化物ならびに酵素基質等の生体分子が含まれるがこれらに限定されるものではない。さらに、この化合物を使用してハプテン、小分子、薬剤、薬剤化合物、金属キレート剤等のイオン錯化剤、微粒子、合成または天然ポリマー、細胞、ウイルス、他の蛍光分子または表面を標識してもよい。結果として得られる標識された物質を複合体またはトレーサーと呼んでもよい。
【０１０８】
いくつかの態様においては、色素をヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと複合化することができる。本発明の色素を、ホスホラミダイト、活性化エステルまたは反応性白金錯体による方法等、当業者に公知の任意の方法でヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと複合化してもよい。
【０１０９】
キット
本発明の一態様は、上記の本発明の任意の色素を使用して様々な分析法の実施を円滑化するキットの構築物である。本発明のキットは通常、色素−複合体の調製に有用な化学反応性標識として存在するか、もしくは複合化物質が特異性結合対メンバーである色素複合体として存在する本発明の着色色素もしくは蛍光色素、または例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、もしくは薬剤もしくは薬剤化合物等の小分子を含む。キットは任意に、通常水性溶液として存在する１つ以上の緩衝剤をさらに含む。本発明のキットは任意に、さらなる検出剤、結果として得られる標識された物質を精製する精製媒体、発光標準物質、酵素、酵素阻害剤、有機溶媒、例えば関心あるタンパク質もしくは標的に融合したルシフェラーゼもしくはＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を含む融合タンパク質等の融合タンパク質の発現のコンストラクト、融合タンパク質または本発明の分析法の実施用説明書をさらに含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態においては、本発明のキットは１つ以上の遺伝子座特異性プライマーを含む。いくつかの実施形態においては、本発明のキットは、本発明の色素を含む内部レーン標準（ＩＬＳ）を含む。使用説明書を任意に含んでもよい。他の光学キットは各特異性遺伝子座を対象とする対立遺伝子ラダー、増幅に対して十分な量の酵素、増幅を円滑化する増幅緩衝液、電気泳動のための増幅物質調製用添加液、テンプレート対照としてのゲノムＤＮＡ、分離媒体において予想される物質の移動を確実にするサイズマーカー、ならびに使用者を教育し、かつ使用における錯誤を制限するプロトコルおよびマニュアルを含んでもよい。工程の最適な感度等のいくつかの因子に依存して、キット内の様々な試薬の量も変化することができる。手動利用例において使用する試験キット、または自動化検出器もしくは分析器を用いて使用する試験キットを提供することも本発明の範囲内である。
【０１１１】
他の実施形態においては、キットは、例えば関心あるタンパク質または標的に融合したルシフェラーゼまたはＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を含む融合等の遺伝子融合用に遺伝子改変した細胞またはベクターも含む。
【０１１２】
以下の実施例は、上記の本発明を説明することを意図するものであり、本発明の範囲を狭めるものとして解釈されるべきではない。実施例は、本発明が実施されうる他の方法を提案してもよいことを、当業者は容易に認識するであろう。本発明の範囲から逸脱しない限り、変化および改変がなされてもよいことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１１３】
実施例１  ジイソプロピル‐Ｓｉ‐テトラメチルローダミン  ５‐ＣＯＯＨ（ＰＢＩ−４６８７）およびジイソプロピル‐Ｓｉ‐テトラメチルローダミン  ５‐ＳＥ（ＰＢＩ−４６８８）の合成。
【化１０】
0006367307.tif 000011
【０１１４】
４‐ブロモ‐３‐メチルベンゾイルクロリドの合成。
４‐ブロモ‐３‐メチル安息香酸（５．０ｇ、２３．２５ｍｍｏｌ）および塩化チオニル（５０ｍｌ）の混合物を５時間還流した。塩化チオニルの除去後、残渣を高真空下で乾燥し、さらなる精製なしで次の工程で使用した。
【０１１５】
４‐ブロモ‐３‐メチル安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成。
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の上記の４‐ブロモ‐３‐メチルベンゾイルクロリド残渣の溶液に、ＴＨＦ（６０ｍＬ）中のカリウムｔｅｒｔ‐ブトキシド（６．０ｇ、５３．５ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下、０℃で滴下した。混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。ヘプタンおよび酢酸エチルを溶離液として使用して、シリカカラムクロマトグラフィーにより化合物を精製し、９６％の収率を得た。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ2Ｃｌ2）：δ７．８８（ｓ、１Ｈ）、７．５３−７．７（ｍ、２Ｈ）、２．４２（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、１．５７（ｓ、９Ｈ、ＣＨ3）；ＭＳ（ｍ／ｅ）：［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］+に対する実測値２１５．０／２１７．０（１：１）、計算値２１５．９６／２１３．９６（１：１）、。
【０１１６】
３，７‐ビス（ジメチルアミノ）‐５，５‐ジイソプロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］シリノ‐１０（５Ｈ）‐オンの合成
無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の４，４’‐メチレン‐ビス（３‐ブロモ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアニリン）（６．０ｇ、１４．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、２．５Ｍのｓｅｃ‐ＢｕＬｉ（４４ｍｍｏｌ）を−７８℃で加え、混合物を３０分間撹拌した。同じ温度で、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のＳｉ（ｉ‐プロピル）2Ｃｌ2（５．３９ｇ、３０ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくり加えた。混合物を室温に温め、１時間撹拌した。反応を２Ｎ  ＨＣｌ（７ｍｌ）の添加により失活させ、混合物をＮａＨＣＯ3で中和し、ＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。残渣を塩化メチレン／アセトン（１５０ｍＬ／１５０ｍＬ）に溶解した。この溶液に十分なクロリニル（５当量）を加え、得られた混合物を一晩撹拌した。混合物をＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）で希釈し、ガラスウールを通して濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させた。ヘプタン／塩化メチレン／酢酸エチルを溶離液として使用して、シリカカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製し、淡黄色化合物を得た。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ2Ｃｌ2）：δ８．３０（ｄ、２Ｈ）、６．８−６．９０（ｍ、４Ｈ）、３．１０（ｓ、１２Ｈ、ＮＣＨ3）、１．４−１．６（ｍ、２Ｈ、ＳｉＣＨ）、１．０４（ｄ、１２Ｈ、ＣＨ3）；ＭＳ（ｍ／ｅ）：［Ｍ＋Ｈ］+に対する実測値３８１．３３、計算値３８０．２３、。
【０１１７】
ＰＢＩ−４６８７の合成。
４‐ブロモ‐３‐メチル安息香酸ｔｅｒｔ‐ブチル（０．３６ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（８ｍｌ）の溶液に、１．４Ｍのｓｅｃ‐ＢｕＬｉ（０．８４ｍｌ、１．１８ｍｍｏｌ）を窒素下、−７８℃で加え、混合物を３０分間撹拌した。同じ温度で、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した３，７‐ビス（ジメチルアミノ）‐５，５‐ジイソプロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］シリノ‐１０（５Ｈ）‐オン（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。混合物を室温に温め、１時間撹拌し、２Ｎ  ＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。ＴＨＦの除去後、５ｍＬの水を加え、混合物をＣＨ2Ｃｌ2で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。溶媒を除去後、塩化メチレン／メタノールを溶離液として使用して、シリカカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製した。得られた生成物を５０ｕｌのトリリソプロピルシラン存在下、２０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2／ＴＦＡ（１：１）に溶解し、１時間撹拌した。溶媒を除去し、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを溶出液として使用して、生成物をＨＰＬＣにより精製した。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：δ７．９９（ｓ、１Ｈ）、７．９２（ｄ、１Ｈ）、７．２−７．３（ｍ、３Ｈ）、６．８−７．０（ｍ、４Ｈ）、３．２８（ｓ、１２Ｈ、ＮＣＨ３）、２．４０（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、１．６７（ｍ、２Ｈ、ＣＨＳｉ）、１．０（ｄｄ、１２Ｈ、ＳｉＣＨ３）；ＭＳ（ｍ／ｅ）：Ｍ+に対する実測値４４９９．６、計算値４９９．２８。
【０１１８】
ＰＢＩ−４６８８の合成。
１０ｍｌの無水ＤＭＦ中のＰＢＩ−４６８７（６０ｍｇ、９７．７６ｕｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’‐テトラメチル‐Ｏ‐（Ｎ‐スクシンイミジル）ウロミウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ、５８．８６ｍｇ、１９５．５２ｕｍｏｌ）の溶液にＤＩＰＥＡ（６３．２ｍｇ、４８８．８ｕｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を酢酸で酸性化し、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを溶出液として使用して、生成物をＨＰＬＣにより精製した。ＭＳ（ｍ／ｅ）：実測値５９６．６、Ｍ+に対する計算値５９６．２９；６４７ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度９５．６％。
【０１１９】
実施例２  ジイソプロピル‐Ｓｉ‐テトラメチルローダミン  ６‐ＣＯＯＨ（ＰＢＩ−４７７０）およびジイソプロピル‐Ｓｉ‐テトラメチルローダミン  ６‐ＳＥ（ＰＢＩ−４７７１）の合成。
【化１１】
0006367307.tif 000012
【０１２０】
３‐ブロモ‐４‐メチルベンゾイルクロリドの合成。
４‐ブロモ‐３‐メチル安息香酸（１０．０ｇ、４６．５ｍｍｏｌ）および塩化チオニル（１００ｍｌ）の混合物を５時間還流した。塩化チオニルの除去後、残渣を高真空下で乾燥し、さらなる精製なしで次の工程で使用した。
【０１２１】
３‐ブロモ‐４‐メチル安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成。
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の上記の４‐ブロモ‐３‐メチルベンゾイルクロリド残渣の溶液に、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のカリウムｔｅｒｔ‐ブトキシド（１２．０、１０７ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下、０℃で滴下した。混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。ヘプタンおよび酢酸エチルを溶離液として使用して、シリカカラムクロマトグラフィーにより化合物を精製し、８２％の収率を得た。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ2Ｃｌ2）：δ８．１８（ｓ、１Ｈ）、７．８３（ｄ、１Ｈ）、７．３１（ｄ、１Ｈ）、２．４４（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、１．５９（ｓ、９Ｈ、ＣＨ3）；ＭＳ（ｍ／ｅ）：実測値２１５．０／２１７．０（１：１）、［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］+に対する計算値２１５．９６／２１３．９６（１：１）。
【０１２２】
ＰＢＩ−４７７０の合成。
無水ＴＨＦ（８ｍＬ）中の４‐ブロモ‐３‐メチル安息香酸ｔｅｒｔ‐ブチル（０．３６ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）の溶液に、１．４Ｍのｓｅｃ‐ＢｕＬｉ（０．９４ｍｌ、１．３１ｍｍｏｌ）を窒素下、−７８℃で加え、混合物を３０分間撹拌した。同じ温度で、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した３，７‐ビス（ジメチルアミノ）‐５，５‐ジイソプロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］シリノ‐１０（５Ｈ）‐オン（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。混合物を室温に温め、１時間撹拌し、２Ｎ  ＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。ＴＨＦの除去後、５ｍＬの水を加え、混合物をＣＨ2Ｃｌ2で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。溶媒を除去後、さらなる精製なし、残渣を５０ｕｌのトリリソプロピルシラン存在下、２０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2／ＴＦＡ（１：１）に溶解し、１時間撹拌した。溶媒を除去し、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを溶出液として使用して、生成物をＨＰＬＣにより精製した。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：δ８．０（ｓ、ｂｒ、１Ｈ）、７．８０（ｄ、ｂｒ、１Ｈ）、７．４−７．６（ｍ、２Ｈ）、７．２（ｓ、１Ｈ）、６．８−７．０（ｍ、４Ｈ）、３．２５（ｓ、１２Ｈ、ＮＣＨ3）、２．４０（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、１．６７（ｍ、２Ｈ、ＣＨＳｉ）、１．０（ｄｄ、１２Ｈ、ＳｉＣＨ3）；ＭＳ（ｍ／ｅ）：Ｍ+に対する実測値４９９．６、計算値４９９．２８。
【０１２３】
ＰＢＩ−４７７１の合成。
１０ｍｌの無水ＤＭＦ中のＰＢＩ−４６７７（１５０ｍｇ、０．２４４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’‐テトラメチル‐Ｏ‐（Ｎ‐スクシンイミジル）ウロミウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ、１４７ｍｇ、０．４８８ｍｍｏｌ）の溶液にＤＩＰＥＡ（１５８ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を酢酸で酸性化し、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを溶出液として使用して、生成物をＨＰＬＣにより精製した。ＭＳ（ｍ／ｅ）：実測値５９６．６、Ｍ+に対する計算値５９６．２９；６４７ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度９０．５％。
【０１２４】
実施例３  ジメチルル‐Ｇｅ‐テトラメチルローダミン  ５‐ＣＯＯＨ（ＰＢＩ−４９１１）およびジメチル‐Ｇｅ‐テトラメチルローダミン  ５‐ＣＯＯＨ（ＰＢＩ−４９１２）の合成。
【化１２】
0006367307.tif 000013
【０１２５】
３，７‐ビス（ジメチルアミノ）‐５，５‐ジイソプロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］ゲルミノ‐１０（５Ｈ）‐オンの合成
無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の４，４’‐メチレンビス（３‐ブロモ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアニリン）（２．０ｇ、４．８５ｍｍｏｌ）の溶液に、１．４Ｍのｓｅｃ‐ＢｕＬｉ（１２．１３ｍｍｏｌ）を−７８℃で加え、混合物を３０分間撹拌した。同じ温度で、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のＧｅＭｅ2Ｃｌ2（１．２６ｇ、７．２８ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくり加えた。混合物を室温に温め、１時間撹拌した。反応を２Ｎ  ＨＣｌ（７ｍｌ）の添加により失活させ、混合物をＮａＨＣＯ3で中和し、ＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。この溶液に十分なクロリニル（５当量）を加え、得られた混合物を２時間撹拌した。アセトン／飽和ＮａＨＣＯ3（５０ｍL／１００ｍL）を加え、混合物を一晩攪拌した。混合物をＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）で希釈し、ガラスウールを通して濾過し、濾液を塩化メチレンで３回抽出し、乾燥するまで蒸発させた。ヘプタン／塩化メチレン／酢酸エチルを溶離液として使用して、シリカカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製し、淡黄色化合物を得た。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ2Ｃｌ2）：δ８．３２（ｄ、２Ｈ）、６．７−６．９０（ｍ、４Ｈ）、３．２０（ｓ、１２Ｈ、ＮＣＨ3）、０．６（ｄ、６Ｈ、ＣＨ3）；ＭＳ（ｍ／ｅ）：［Ｍ＋Ｈ］+に対する実測値３７１．０、計算値３７０．１１、。
【０１２６】
ＰＢＩ−４９１１の合成。
無水ＴＨＦ（８ｍＬ）中の４‐ブロモ‐３‐メチル安息香酸ｔｅｒｔ‐ブチル（０．３６ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）の溶液に、１．４Ｍのｓｅｃ‐ＢｕＬｉ（０．８４ｍｌ、１．１８ｍｍｏｌ）を窒素下、−７８℃で加え、混合物を３０分間撹拌した。同じ温度で、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した３，７‐ビス（ジメチルアミノ）‐５，５‐ジイソプロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］ゲルミノ‐１０（５Ｈ）‐オン（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。混合物を室温に温め、１時間撹拌し、２Ｎ  ＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。ＴＨＦの除去後、５ｍＬの水を加え、混合物をＣＨ2Ｃｌ2で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。溶媒を除去後、塩化メチレン／メタノールを溶離液として使用して、シリカカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製した。得られた生成物を５０ｕｌのトリリソプロピルシラン存在下、２０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2／ＴＦＡ（１：１）に溶解し、１時間撹拌した。溶媒を除去し、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを溶出液として使用して、生成物をＨＰＬＣにより精製した。ＭＳ（ｍ／ｅ）：Ｍ+に対する実測値４８７．８、計算値４８８．１９、。
【０１２７】
ＰＢＩ−４９１２の合成。
１０ｍｌの無水ＤＭＦ中のＰＢＩ−４９１１（６０ｍｇ、９７．７６ｕｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’‐テトラメチル‐Ｏ‐（Ｎ‐スクシンイミジル）ウロミウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ、５８．８６ｍｇ、１９５．５２ｕｍｏｌ）の溶液にＤＩＰＥＡ（６３．２ｍｇ、４８８．８ｕｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を酢酸で酸性化し、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを溶出液として使用して、生成物をＨＰＬＣにより精製した。ＭＳ（ｍ／ｅ）：Ｍ+に対する計算値５８５．２６、実測値５８６．４；６４７ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度９５．６％。
【０１２８】
実施例４  オリゴヌクレオチドに複合化しているＳｉ‐キサンテン色素Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミジルエステルの使用の基本手順
Ａ．１μモルスケール
ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ製５’アミノ修飾因子Ｃ６  ＴＦＡアミダイトまたはＰＢＩ製Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵアミダイトを使用して、ＡＢＩ  ３９４  ＤＮＡ合成機（１μモル）で５’‐アミノ標識または内部アミノ‐デオキシウリジンオリゴヌクレオチドを合成した。濃水酸化アンモニウム中、６０℃で一晩脱保護し、アミノ標識オリゴヌクレオチドを得た。得られたオリゴヌクレオチドを乾燥するまで蒸発させ、１ｍｌの２Ｍ  ＮａＣｌに再溶解し（対イオン交換のため行った）、ＮＡＰ−１０分子ふるいカートリッジ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩した。脱塩後、オリゴヌクレオチドを乾燥するまで蒸発させ、その後２００μｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５に再溶解させた。スクシンイミジルエステル色素（ＰＢＩ−４６８８）を２０μｌ／ｍｇの濃度でＤＭＦに溶解した。色素／ＤＭＦ溶液の２つの２０μｌ一定分量を３０分間隔で溶解したオリゴヌクレオチドに加えた。二度目の添加後、反応物を１時間混合した。１時間後、水で１ｍｌに希釈し、ＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩した。アセトニトリル／０．１Ｍ  ＴＥＡＡ緩衝液系を使用して、Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラムで、逆相ＨＰＬＣによりＮＡＰ−１０溶出液を精製した。ＨＰＬＣで精製したオリゴヌクレオチドを乾燥するまで蒸発させ、０．０１Ｍ  炭酸水素トリエチルアンモニウムに再溶解し、ＮＡＰ−１０カラムで脱塩した。最終脱塩工程後、オリゴヌクレオチドを乾燥するまで蒸発させた。
【０１２９】
Ｂ．１００μモルスケール
ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ製５’アミノ修飾因子Ｃ６  ＴＦＡアミダイトまたはＰＢＩ製Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵアミダイトを使用して、ＡＫＴＡ  ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（１００μモル）ＤＮＡ合成機で５’‐アミノ標識または内部アミノ‐デオキシウリジンオリゴヌクレオチドを合成した。濃水酸化アンモニウム中、６０℃で一晩脱保護し、５’‐アミノヘキシル標識オリゴヌクレオチドを得た。得られたオリゴヌクレオチドを乾燥するまで蒸発させ、７５ｍｌの２Ｍ  ＮａＣｌに再溶解し、５００ｍｌ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩した。脱塩後、オリゴヌクレオチドを乾燥するまで蒸発させ、その後５０ｍｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５に再溶解させた。スクシンイミジルエステル色素（ＰＢＩ−４６８８）を２０μｌ／ｍｇの濃度でＤＭＦに溶解した。２４００μｌの色素／ＤＭＦ溶液を、溶解したオリゴヌクレオチドに滴下した。反応物を１時間混合した。色素複合化オリゴヌクレオチドを酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５溶液で中和し、２倍量のエタノールから沈殿させた。沈殿したオリゴヌクレオチドを９０００ｒｐｍで６０分遠心分離した。上澄み液を静かに注ぎ出して廃棄した。得られた固体を７０ｍｌの水に溶解し、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。オリゴヌクレオチドを濃縮し、接線流限外濾過を使用して脱塩し、その後乾燥するまで蒸発させた。
【０１３０】
実施例４  本発明の色素を使用したＳＴＲｓのマルチプレックスＰＣＲ用内部レーン標準
本発明の実施形態の展開中に実験を行い、ＳＴＲｓ（短いタンデム反復）のマルチプレックスＰＣＲにおいて使用する内部レーン標準において使用可能性がある、例示的色素ＰＢＩ−４６８６およびＰＢＩ−４６８８のエネルギー移動特性を測定した。
【０１３１】
色素ＰＢＩ−４６８６およびＰＢＩ−４６８８を使用して、ＪＯＥまたは６−ＦＡＭドナー色素と共に使用するためのエネルギー移動（ＥＴ）オリゴとして、オリゴヌクレオチド（オリゴ）を作製した。オリゴを３ヌクレオチドスペーサー（ＪＯＥおよび６−ＦＡＭドナー色素）または５ヌクレオチドスペーサー（ＪＯＥドナー）のいずれかと共に作製した。
【０１３２】
次に、オリゴを増幅反応において使用した。これをＡＢＩ３５００装置のＡＮＹＤＹＥ色素セットまたはＡＢＩ３５００もしくは３１３０装置のＧ５色素セットに設置したスペクトル較正において使用することができる。
【０１３３】
各反応で、以下の増幅反応条件を使用した：
Ｎａｎｏｐｕｒｅ水：９０．５ｕｌ
２５ＸＳＳＢ緩衝液：４．０ｕｌ
１００ｕＭ  標識オリゴ：１．０ｕｌ
１００ｕＭ  非標識オリゴ：１．０ｕｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／ｕｌ）：３．０ｕｌ。
【０１３４】
反応混合物をボルテックスで撹拌し、９６−ウェルプレートのウェルに分注した。次に５０ｎｇ／μｌ（０．５ｕｌ）のプラスミドＤＮＡを各ウェルに添加した。各ウェルは異なる標識オリゴおよびプラスミドサイズを含有した。ＡＢＩ３５００装置でのスペクトル較正を実行する際、各色素は特定のサイズ範囲内および色素順でなければならない（例えば図５を参照のこと）。したがって、本発明の全ての色素が同じサイズを有するであろうが、他の色素−標識オリゴ（色）の全てが別のサイズを有するであろう。合格のＱ値を得るために、スペクトル較正では全色素色が特定の順でなければならない。さらに、プラスミドを別に添加して、ＣＥ装置での色素の精密評価用のサイズ範囲を得る。
【０１３５】
以下の通り、反応を２段階増幅で実行した：
‐１サイクル：９８℃で２分間；
‐１０サイクル：９４℃で３０秒間；
７０℃で２．５分間；
‐２０サイクル：９０℃で３０秒間；
６６℃で２分間；
７０℃で２．５分間；および
‐１サイクル：６０℃で６０分間。
【０１３６】
増幅反応後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍｌ遠心フィルターを使用して、以下の通り反応物を洗浄した：各反応物の１００ｕｌを分離フィルターに加え；フィルターに蓋をし、標準固定角度ローターに設置し、１４，０００ｇで１０分間遠心分離し；１００ｕｌのＴＥ−４を各フィルターに添加し、フィルターを微量遠心管から取り除き、新しい微量遠心環に上下逆にして設置し；フィルターを２０００ｘｇで数分間回転させ；試料を回収した。
【０１３７】
次に、ＡＢＩ３５００ｘＬ装置に設置してスペクトル較正を実行するための試料を調製した。試料を以下の通り調製した：
１）装置の乾燥機を６０℃で３０分間予熱した；
２）装置上のＡＮＹＤＹＥ色素セットを使用したが、較正ピーク順序を偏光した。開始点を８００に変更した；
３）実験において６−ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＥＴ−ＴＭＲ、ＥＴ−ＲＯＸおよびＥＴ−−ＰＢＩ−３８８５が定数であった；ＥＴおよび非−ＥＴ  ＰＢＩ−４６８６またはＰＢＩ−４６８８が変数であった；
４）５００ｕｌのＨｉ  Ｄｉホルムアミドを含有する６個の異なる引上蓋式の管に、以下のものを加えた：
ａ）３．０ｕｌ  希釈６−ＦＡＭアンプリコン；
ｂ）５．０ｕｌ  希釈ＪＯＥアンプリコン；
ｃ）５．０ｕｌ  希釈ＥＴ−ＴＭＲアンプリコン；
ｄ）２．０ｕｌ  希釈ＥＴ−ＲＯＸアンプリコン；および
ｅ）５．０ｕｌ  希釈ＥＴ−ＰＢＩ−３８８５アンプリコン。
【０１３８】
変数ＥＴまたは非ＥＴ  ＰＢＩ−４６８６またはＰＢＩ−４６８８の１つの１０ｕｌを、６つの異なる管の１つに添加し、各変数に対して繰り返した。すなわち、６つの管のそれぞれが異なる変数ＥＴまたは非ＥＴ色素を有する。試料をボルテックスで撹拌し、９６−ウェルプレートの２４個のウェルに１５ｕｌ添加した。プレートを回転させ、スペクトル較正を実行した。
【０１３９】
図１〜４はスペクトル較正実行の結果を示す。許容なスペクトル較正は、最低０．９５のＱ値を有する必要があり、０．９９に近いほど良い。ＰＢＩ−４６８６は０．９９の優れたＱ値を有したが（図１）、ＰＢＩ−４６８６橙色とドナーＪＯＥ緑色の干渉が増加した（図２）。ＰＢＩ−４６８８は、ＪＯＥと６−ＦＡＭドナー色素の両方および３ヌクレオチドスペーサーを有するオリゴと共に、０．９９超のＱ値を有した（図４）。ここでもＰＢＩ−４６８８橙色とほんのわずかなＪＯＥ緑色干渉があったが、ＰＢＩ−４６８８橙色と干渉する６−ＦＡＭ青色の干渉はさらにわずかであった（図３）。
【０１４０】
実施例５  本発明の色素を使用したＳＴＲｓのマルチプレックスＰＣＲ用内部レーン標準の安定性
本発明の実施形態の展開中に実験を行い、ＳＴＲｓ（短いタンデム反復）のマルチプレックスＰＣＲにおいて使用する内部レーン標準において使用可能性がある、例示的色素ＰＢＩ−４６８８の安定性を測定した。
【０１４１】
色素ＰＢＩ−４６８８を使用して、ＪＯＥまたは６−ＦＡＭドナー色素と共に使用するためのエネルギー移動（ＥＴ）オリゴとして、オリゴヌクレオチド（オリゴ）を作製した。オリゴを３ヌクレオチドスペーサー（ＪＯＥおよび６−ＦＡＭドナー色素）または５ヌクレオチドスペーサー（ＪＯＥドナー色素）のいずれかと共に作製した。
【０１４２】
各反応で、以下の増幅反応条件を使用した：
Ｎａｎｏｐｕｒｅ水：９１ｕｌ
２５×ＳＳＢ緩衝液：４．０ｕｌ
１００ｕＭ  標識オリゴ：１．０ｕｌ        
１００ｕＭ  非標識オリゴ：１．０ｕｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／ｕｌ）：２．５ｕｌ。
【０１４３】
反応混合物をボルテックスで撹拌し、９６−ウェルプレートのウェルに分注した。次に５０ｎｇ／μｌ（０．５ｕｌ）の可変プラスミドＤＮＡを各ウェルに添加した。各ウェルは異なるプラスミドサイズを含有した。プラスミドを別に添加して、ＣＥ装置での色素の精密評価用のサイズ範囲を得る。
【０１４４】
以下の通り、反応を２段階増幅で実行した：
‐１サイクル：９８℃で２分間；
‐１０サイクル：９７℃で１分間；
６６℃で２分間；
７２℃で１分間；
‐２０サイクル：９２℃で１分間；
６６℃で２分間；
７２℃で１分間；および
‐１サイクル：６０℃で６０分間。
【０１４５】
増幅反応後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍｌ遠心フィルターを使用して、以下の通り反応物を洗浄した：各反応物の１００ｕｌを分離フィルターに加え；フィルターに蓋をし、標準固定角度ローターに設置し、１４，０００ｇで１０分間遠心分離し；１０ｍＭ  ＭＯＰＳ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、または０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０のいずれかの１００ｕｌを各フィルターに添加し、フィルターを微量遠心管から取り除き、新しい微量遠心環に上下逆にして設置し；フィルターを２０００ｘｇで５分間回転させ；試料を回収した。
【０１４６】
次に増幅反応物を１０ｍＭ  ＭＯＰＳ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、または０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０のいずれか中で１：１００に希釈し、単一凍結／融解を実施した１セットの試料を除き、全試料を４℃で保管した。
【０１４７】
次に、１．２ｋＶ、１２秒注入を使用して、ＡＢＩ３５００ｘＬ装置に設置するための試料を調製した。製造業者のプロトコル（Pｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）に従って、色素セットＧ５を使用した。現在のＡＢＩ  ３１３０  ５−色素マトリックスキットを用いたスペクトル較正を、以前に装置で設定した。
【０１４８】
図５において、上部パネルは、Ｇ５色素セットでの３５００ｘＬスペクトル較正からの様々な色素標識アンプリコンの生データ画像を提供する。スペクトル較正における橙色ピークは６ＦＡＭ＋ＰＢＩ−４６８８であり、下部パネルにおいては接写画像である。このピークは通常、ＣＣ５色素標識アンプリコンにより表される。
【０１４９】
図６において、各パネルの上部画像は、水およびＥＤＴＡに緩衝液交換されたＤｙｏｍｉｃｓ４８５ｘＬ  Ｃ６  ＳＥ−ＴＴ−ＰＢＩ−４６８８ｄＵ  ＰＢＩ  ＡＭオリゴからのアンプリコンを橙色の下の紫色で示す。各パネルの下部画像は、ＭＯＰＳおよびＥＤＴＡに緩衝液交換されたＤｙｏｍｉｃｓ４８５ｘＬ  Ｃ６  ＳＥ−ＴＴ−ＰＢＩ−４６８８ｄＵ  ＰＢＩ  ＡＭオリゴからのアンプリコンを橙色の下の紫色で示す。上部パネルは下部パネルの接写画像である。下に紫色を有しない橙色のピークは、ＣＣ５  ＩＬＳ５００（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｌａｎｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からである。パーセント裏抜けおよびドナー色素を、ＡＮＹＤＹＥ色素セット（６色素）で評価した。
【０１５０】
図７において、各パネルの上部画像は、水およびＥＤＴＡに緩衝液交換された６ＦＡＭ  Ｃ６  ＡＭ−ＴＴ−ＰＢＩ−４６８８−ｄＵ  ＰＢＩ  ＡＭ（高純度）オリゴからのアンプリコンを橙色の下の青色で示す。各パネルの下部画像は、ＭＯＰＳおよびＥＤＴＡに緩衝液交換された６ＦＡＭ  Ｃ６  ＡＭ−ＴＴ−ＰＢＩ−４６８８−ｄＵ  ＰＢＩ  ＡＭ（高純度）オリゴからのアンプリコンを橙色の下の青色で示す。上部パネルは下部パネルの接写画像である。下に青色を有しない橙色のピークは、ＣＣ５  ＩＬＳ５００（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｌａｎｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からである。パーセント裏抜けおよびドナー色素を、ＡＮＹＤＹＥ色素セット（６色素）で評価した。
【０１５１】
図８において、各パネルの上部画像は、水およびＥＤＴＡに緩衝液交換されたＤｙｏｍｉｃｓ  ４８５ｘＬ  Ｃ６  ＳＥ−ＴＴ−ＰＢＩ−４７７０−ｄＵ  ＰＢＩ  ＡＭオリゴからのアンプリコンを橙色の下の紫色および赤色で示す。各パネルの下部画像は、ＭＰＯＳおよびＥＤＴＡに緩衝液交換されたＤｙｏｍｉｃｓ  ４８５ｘＬ  Ｃ６  ＳＥ−ＴＴ−ＰＢＩ−４７７０−ｄＵ  ＰＢＩ  ＡＭオリゴからのアンプリコンを橙色の下の紫色および赤色で示す。上部パネルは下部パネルの接写画像である。下に紫色および赤色を有しない橙色のピークは、ＣＣ５  ＩＬＳ５００（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｌａｎｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からである。パーセント裏抜けおよびドナー色素を、ＡＮＹＤＹＥ色素セット（６色素）で評価した。
【０１５２】
実施例６  色素の吸収および発光
Ｓｉ‐およびＧｅ‐色素をＤＭＳＯに溶解し、ＴＥ−４、ｐＨ７．５緩衝液で希釈した。吸収および発光スペクトルをそれぞれＢｅｃｋｍａｎ  Ｄｕ６４０分光光度計およびＨｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇで記録した。以下の式により励起波長における発光面積および吸収強度を補正後、〜６６０ｎｍ付近での最大発光での色素の蛍光量子収率を、量子収率ΦO０．４を有する標準物質としてＣｙ−５を使用することにより計算した。同様な吸収および発光スペクトルを有する標準色素を使用することにより、他の色素の量子収率を得た（図１２を参照のこと）。
【数１】
0006367307.tif 000014
【０１５３】
実施例７  本発明の色素を使用したＳＴＲｓのマルチプレックスＰＣＲ用内部レーン標準の安定性
本発明の実施形態の展開中に実験を行い、ＳＴＲｓ（短いタンデム反復）のマルチプレックスＰＣＲにおいて使用する内部レーン標準において使用可能性がある、例示的色素ＰＢＩ−４６８８（ＷＺ８８）の安定性を測定した。色素ＰＢＩ−４６８８を使用して、ＴＭＲまたはＣＣ３ドナー色素と共に使用するためのエネルギー移動（ＥＴ）オリゴとして、オリゴヌクレオチド（オリゴ）を作製した。オリゴを４ヌクレオチドスペーサー（ＴＴＴＴ）と共に作製し、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳおよびＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳを得た。
【０１５４】
それぞれの色素の完全性を並行して観測するため、２つのＩＬＳ試料を透明な管内で、窓の側の太陽の下、約２日間保管した。２セットの６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳおよびＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ試料を太陽に曝露した。各セットは、無希釈ＩＬＳ試料および希釈（ＴＥ−４中、１〜４０）ＩＬＳ試料から成った。３５００ＣＥ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に試料を置く前に、無希釈ＩＬＳ試料をＴＥ−４中で１〜４０に希釈した。対照を無希釈のまま、琥珀管内に入れて４℃で保管した。
【０１５５】
１μｌのＩＬＳ試料と１０μｌのホルムアミドを、９６ウェル分析プレートの各ウェルに添加した。次に試料を３分間熱変成させ、氷上にさらに３分間設置した。次に試料を３５００ＣＥに置き、分析した。
【０１５６】
図１４〜２５が示すとおり、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳが全体として、６ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳよりも高いピーク高さを有した。ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳおよび６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳは、透明管内で保管された場合、約２日間太陽のもとに置かれた後に約３０％のピーク高さの減少を示した。６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳは、黒色から橙色になる割合がより大きいように思われ、希釈試料の約９．３％から無希釈試料の約１６％にわたる範囲であった。ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳで黒色から橙色になる割合は、希釈試料の約２．０％から無希釈試料の約３．５％にわたる範囲であった。ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳは、６ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳよりも高い割合の紫色から橙色への裏抜けを示した。
【０１５７】
実施例８  本発明の色素を使用したＳＴＲｓのマルチプレックスＰＣＲ用内部レーン標準の安定性
本発明の実施形態の展開中に実験を行い、ＳＴＲｓ（短いタンデム反復）のマルチプレックスＰＣＲにおいて使用する内部レーン標準において使用可能性がある、例示的色素ＰＢＩ−４６８８（ＷＺ８８）の安定性を測定した。色素ＰＢＩ−４６８８を使用して、ＴＭＲまたはＣＣ３ドナー色素と共に使用するためのエネルギー移動（ＥＴ）オリゴとして、オリゴヌクレオチド（オリゴ）を作製した。オリゴを４ヌクレオチドスペーサー（ＴＴＴＴ）と共に作製し、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳおよびＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳを得た。
【０１５８】
それぞれの色素の完全性を並行して観察するため、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳおよびＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳを１または１０回の凍結（−２０℃）−融解（室温）サイクルに付した。
【０１５９】
２セットの６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳおよびＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳ試料を１または１０回の凍結（−２０℃）−融解（室温）サイクルに付した。各セットは、無希釈ＩＬＳ試料および希釈（ＴＥ−４中、１〜４０）ＩＬＳ試料から成った。３５００ＣＥに試料を置く前に、無希釈ＩＬＳ試料をＴＥ−４中で１〜４０に希釈した。試験した全試料を琥珀管内に入れた。対照を無希釈のまま、琥珀管内に入れて４℃で保管した。
【０１６０】
１μｌのＩＬＳ試料と１０μｌのホルムアミドを、９６ウェル分析プレートの各ウェルに添加した。次に試料を３分間熱変成させ、氷上にさらに３分間設置した。次に試料を３５００ＣＥに置き、分析した。
【０１６１】
図２６〜３７が示すとおり、ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳが全体として、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳよりも高いピーク高さを有した。ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳまたは６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳでは、１または１０回の凍結−融解サイクル後、ピーク高さに有意な減少はなかった。ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳの希釈試料および無希釈試料の両方で、１または１０回の凍結−融解サイクル後、約２％の黒色が橙色になることを示した。６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳでは、１または１０回の凍結−融解サイクル後、希釈試料でそれぞれ約２％または３％の黒色が橙色になることを示し、無希釈試料では、１または１０回の凍結−融解サイクル後、約２％の黒色が橙色になることを示した。ＣＣ３−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳは希釈および無希釈試料において、１または１０回の凍結−融解サイクル後、約２．７％の紫色から橙色への裏抜けを示し、６−ＴＭＲ−ＴＴＴＴ−ＷＺ８８  ＩＬＳは希釈または無希釈試料において、１または１０回の凍結−融解サイクル後、約２％の紫色から橙色への裏抜けを示した。
【０１６２】
本発明の様々な特徴および利点を以下の特許請求の範囲において記載する。
【図１】
0006367307.tif 000018
【図２】
0006367307.tif 000019
【図３】
0006367307.tif 000020
【図４】
0006367307.tif 000021
【図５】
0006367307.tif 000022
【図６】
0006367307.tif 000023
【図７】
0006367307.tif 000024
【図８】
0006367307.tif 000025
【図９】
0006367307.tif 000026
【図１０】
0006367307.tif 000027
【図１１】
0006367307.tif 000028
【図１２】
0006367307.tif 000029
【図１３】
0006367307.tif 000030
【図１４】
0006367307.tif 000031
【図１５】
0006367307.tif 000032
【図１６】
0006367307.tif 000033
【図１７】
0006367307.tif 000034
【図１８】
0006367307.tif 000035
【図１９】
0006367307.tif 000036
【図２０】
0006367307.tif 000037
【図２１】
0006367307.tif 000038
【図２２】
0006367307.tif 000039
【図２３】
0006367307.tif 000040
【図２４】
0006367307.tif 000041
【図２５】
0006367307.tif 000042
【図２６】
0006367307.tif 000043
【図２７】
0006367307.tif 000044
【図２８】
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【図２９】
0006367307.tif 000046
【図３０】
0006367307.tif 000047
【図３１】
0006367307.tif 000048
【図３２】
0006367307.tif 000049
【図３３】
0006367307.tif 000050
【図３４】
0006367307.tif 000051
【図３５】
0006367307.tif 000052
【図３６】
0006367307.tif 000053
【図３７】
0006367307.tif 000054