(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病性創傷の予防及び／又は治療で局所投与により使用するための、濃度２００〜４８００μＭのアセチルサリチル酸又はその塩を含む医薬組成物。
【請求項２】
濃度が２００〜２９００μＭであることを特徴とする、請求項１に記載の、その使用のための医薬組成物。
【請求項３】
濃度が３００〜２０００μＭであることを特徴とする、請求項１又は２のいずれか一項に記載の、その使用のための医薬組成物。
【請求項４】
アセチルサリチル酸リジン及びアセチルサリチル酸ナトリウムから選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、その使用のための医薬組成物。
【請求項５】
ドレッシング材、マイクロカプセル、マイクロファイバー、ナノファイバー、溶液及びスプレーから選択される組成物に含ませることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の、その使用のための医薬組成物。
【請求項６】
糖尿病性創傷の慢性化を治療するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の、その使用のための医薬組成物。
【請求項７】
炎症の消散を加速させるための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の、その使用のための医薬組成物。
【請求項８】
脂質、超酸素添加油又はこれらの誘導体の１種を更に含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の、その使用のための医薬組成物。
【請求項９】
前記脂質又はその誘導体がオメガ−３若しくはオメガ−６脂肪酸又はこれら２種の組み合わせであることを特徴とする、請求項８に記載の、その使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
糖尿病性創傷のための、濃度が２００〜４８００μＭであるアセチルサリチル酸又はその塩を含む局所投与用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、糖尿病性創傷を予防及び／又は治療するための濃度２００〜４８００μＭでのアセチルサリチル酸の新規な局所使用から成る。
【背景技術】
【０００２】
創傷の治癒は自然な生理病理学的プロセスであり、ヒト及び動物の組織は自らの修復及び再生プロセスにより局所的な病変を修復することができる。
【０００３】
自然な創傷の治癒は主に、３つの主要な時系列のシーケンスに沿って起きる。各シーケンスは特定の細胞活動を特徴とし、また修復プロセスの進行を集合的に管理及びサポートする数多くの制御シグナル（正負両方）により制御される。したがって、以下の：
・炎症期、
・増殖期（肉芽形成期及び上皮化期を含む）及び
・リモデリング期
に分けられる。
【０００４】
炎症期である第１期は、血管が破れる（主にフィブリン及びフィブロネクチンから構成され且つ一時的なマトリックスを構築する血餅の形成（血液凝固）の引き金となる事象）と同時に始まる。このマトリックスが部分的に病変部を埋め、ダメージを受けた領域内での、創傷の清浄化を確実にするために動員された炎症細胞の遊走を可能にする。マトリックス中に存在する血小板も、治癒プロセスに関わる細胞の動員を可能にする因子（例えば、サイトカイン及び／又は増殖因子）を放出する。この時期は、病変部位での、生物を外来性の微生物から守り且つ創傷を浄化又は清浄化する多数の炎症細胞（多形核細胞、マクロファージ）の浸潤及び活性化を特徴とする。
【０００５】
第２期は、肉芽組織の発達に対応する。まず、繊維芽細胞の遊走及び増殖による外傷部でのコロニー形成が観察される。次に、健常な血管からの内皮細胞の遊走により、ダメージを受けた組織での血管新生又は血管形成が可能になる。肉芽組織において、繊維芽細胞は活性化され、アクチンマイクロフィラメントにより付与される強い収縮特性を有する筋線維芽細胞に分化するため、創傷の収縮が可能となる。マイクロフィラメントはα−平滑筋アクチンというタンパク質を介して発現する。これらの筋線維芽細胞は、病変の治癒につながる肉芽組織の形成及び収縮において重要な役割を果たす。次に、創傷の縁からケラチノサイトが遊走してきて分化し、表皮の再構築につながる。
【０００６】
肉芽組織が発達するこの時期は、病変の炎症の全体的な状態が和らぎ、多形核好中球が徐々に消滅し、「修復」マクロファージを含めたマクロファージが登場してから始まる。炎症期から増殖／修復期へのこの移行は、炎症の消散期として知られる。
【０００７】
治癒プロセスの第３期は、機能性組織の再構築をゴールとしたリモデリングを中心とした段階であるため、新たに形成された組織は元々の組織の最初の特徴及び特性を持つようになる。細胞外マトリックスの一部はプロテアーゼ（本質的にマトリックスメタロプロテアーゼ及びエラスターゼ）により消化され、細胞外マトリックスの再編成が観察される。肉芽組織内で優勢なタイプＩＩＩコラーゲンは、真皮の主要マトリックス成分であるタイプＩコラーゲンに徐々に置き換えられる。成熟期の最後に、繊維芽細胞、筋線維芽細胞及び血管細胞の増殖及び／又は活性は低下する。次に、余分な細胞はアポトーシスを経て死滅し、それに伴って細胞外マトリックスのリモデリングが行われる。
【０００８】
それでもなお、一部のタイプの創傷は正常に治癒せず、治癒プロセスにおける３つの重要な段階が、確立されている望み得る最良の生理化学的及び生物学的条件にも関わらず異常に行われる。実際、創傷が治癒する速度及び質は内因性及び外因性の要素に左右される。そのため、この修復プロセスは
・創傷の原因、
・創傷の状態及び位置、
・特定の感染病原体、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）若しくは緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の存在により引き起こされる感染症の有無、
・既存の病的状況（例えば、糖尿病、免疫不全、静脈不全等）の有無、
・外部環境又は
・治癒障害をこうむりやすくする若しくはしない遺伝因子
に応じて異常に長引き得る。
【０００９】
創傷には慢性創傷、例えば静脈性潰瘍、褥瘡又は糖尿病患者に特徴的な創傷、より具体的には糖尿病性足部創傷がある。
【００１０】
治療がなされているか否かに関係なく、創傷が現れてから６週間後に治癒が見られない場合に慢性創傷であると定義される。糖尿病性創傷は、慢性創傷とは別の特別なタイプであると特徴付けられる。
【００１１】
実際、これらの糖尿病性創傷が治癒しない主な原因は、グルコースのバイオアベイラビリティの上昇に関連している。グルコースのバイオアベイラビリティの上昇は数々の生理学的及び代謝の変化、例えば皮膚の肥厚又はニューロパチー及び動脈症につながる著しい酸化ストレスをもたらす。動脈症及びニューロパチーは慢性化の２つの主要な危険因子であるため、糖尿病性創傷、より具体的には糖尿病性足部創傷の治癒を遅らせる。最もよく知られている他のタイプの慢性創傷、例えば褥瘡又は静脈性、動脈性若しくは混合型の潰瘍の病理は異なる。例えば、静脈不全は静脈性潰瘍の形成、慢性化と結果的な治癒の遅延の原因である。次に、褥瘡は、皮膚組織が過剰に且つ長期間にわたって圧迫、擦れることで起きる虚血と再潅流との繰り返し後に生じる創傷である。
【００１２】
創傷に苦しむ全ての糖尿病患者がこのようにして合併症に曝され、合併症は患者の罹患率及び死亡率の原因となることが極めて多い。このタイプの患者において、正しい治癒シーケンスは、幾つかの主な問題点により阻害される。治癒における最初の遅れは炎症期から起き、炎症期から増殖期への移行が阻害される。これは炎症の消散における問題とされる。炎症期は治癒に不可欠な時期であるが、一時的でなくてはならない。炎症の消散は、治癒の残りの時期を開始させる条件となる極めて重要な地点である。この力学的事象は、炎症細胞（多形核好中球）の消滅及びマクロファージの登場を伴う。その後、走化性及び血管形成性の抗炎症性メディエータが産生され、これがとりわけ肉芽形成期における重要な細胞である繊維芽細胞の遊走及び分化を可能にする。
【００１３】
この炎症期が阻害されると、上記の患者の場合のように、炎症期の異常な長期化が引き起こされ、創傷が慢性化し、続く治癒段階の全てが遅れてしまう。
【００１４】
最終的に、とりわけ上皮化中の創傷閉鎖期が遅れる又は、多くの場合、始まりさえしない。
【００１５】
アスピリンすなわちアセチルサリチル酸が多種多様な症状又は病的状態に効果的な治療薬であると考えられていることは長きにわたって知られている。その最も広く知られている作用機序は、疼痛の軽減又は解熱を目的とした昔から知られている活性である。循環器疾患の発症に対するその予防作用（抗血栓作用）から低用量でも使用されている。
【００１６】
実際、アスピリンの凝集阻害特性は、血管での血餅形成と効果的に戦うことを可能にする。しかしながら、この活性は、この物質の本当の有効性がわかりにくい一次予防としてより最初の血管疾患が起きてからの予防措置とのからみでより有益であると考えられる。
【００１７】
上で挙げた各ケースにおいて、アスピリンは経口投与される。アスピリンの外用経路での適用も存在している。実際、アスピリンの外用での適用には、肥厚性瘢痕に対する、とりわけこれらの瘢痕の外見を改善する有益な作用があることも知られている（Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．，２０１２  Ｎｏｖ  ５（印刷物に先行したＥｐｕｂ）。カナダ、ブリティッシュコロンビア州、バンクーバーにあるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＣｏｌｕｍｂｉａのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙに所属するＲａｈｍａｎｉ−Ｎｅｉｓｈａｂｏｏｒ  Ｅ、Ｊａｌｌｉｌｉ  Ｒ、Ｈａｒｔｗｅｌｌ  Ｒ、Ｌｅｕｎｇ  Ｖ、Ｃａｒｒ  Ｎ、Ｇｈａｈａｒｙ  Ａによる非特許文献１を参照のこと）。
【００１８】
さらに、目的とする治癒促進作用とは相いれないようにも見えるその凝集阻害活性にも関わらず、アセチルサリチル酸又はアスピリン又はその誘導体が通常の創傷の治癒及び創傷痛に及ぼす正の作用も知られている。
【００１９】
実際、Ｋｉｍｂｅｒｌｙ  Ｃｌａｒｋ社の特許文献１には、細胞増殖、より具体的には繊維芽細胞及びケラチノサイトの増殖を刺激するための、アスピリンを含む組成物が記載されている。この組成物は、細胞増殖を刺激することで創傷治癒を改善する。この文書は、アスピリンの効果が濃度１０−５〜１０−６Ｍで用量依存的であり、最も効果的な用量が最も低い濃度であることを明らかにしている。記載の最終的な組成物は、濃度１μＭ〜５ｍＭのアスピリンを含む。細胞増殖、すなわち繊維芽細胞及びケラチノサイトの増殖の刺激並びにコラーゲン産生の刺激は治癒における重要なプロセスであり、増殖段階、またリモデリングの極めて遅い時期でも起きる。
【００２０】
一方、日本のＴｅｉｋｏｋｕ社の特許文献２には、とりわけ褥瘡を有するラットモデルで模した皮膚外傷を治療することを目的とした、局所適用するためのアスピリン系医薬製剤が記載されている。これらのモデルが健康な動物モデルであることは注目に値する。実際、この研究のどのラットも糖尿病タイプの代謝障害を有していない。この出願において、製剤の目的は、１つ以上の創傷を有する健康な動物において肉芽組織の形成速度、また表皮の回復速度を上昇させることである。そのため、この出願では、治癒の細胞プロセスをその最も遅い段階で回復させようとしている。
【００２１】
どの文献も治癒の第１段階、すなわち炎症期及び炎症の消散には関係していないが、それでも治癒プロセス全体を開始させることから、炎症期は極めて重要で欠くことのできない段階である。実際、糖尿病性創傷では、治癒プロセスの動力学において早期の治療又は介入を必要とする。
【００２２】
出願人が糖尿病性創傷では早い段階で効果的且つターゲットを定めた治療を行う必要が本当にあると気付いたのはこれらの理由からであった。
【００２３】
出願人は、本当に驚くべきことに、アスピリンの使用により、正常（遷延も悪化もしない）とも表現される制御された炎症期を立て直すことができ、また炎症の消散を加速させることができ、それによって糖尿病患者においてより早期での素早い創傷閉鎖を達成できることに気づくことができた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１５８１２５２号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０７８４９７５号明細書
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｒａｈｍａｎｉ−Ｎｅｉｓｈａｂｏｏｒ  Ｅ，Ｊａｌｌｉｌｉ  Ｒ，Ｈａｒｔｗｅｌｌ  Ｒ，Ｌｅｕｎｇ  Ｖ，Ｃａｒｒ  Ｎ，Ｇｈａｈａｒｙ  Ａ，“Ｔｏｐｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｉｌｍ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｅｍｕｌｇｅｌ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ａｎｄ  ａｃｅｔｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ／ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｓｃａｒｒｉｎｇ，”Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．，２０１２  Ｎｏｖ  ５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
したがって、本発明の主題は、糖尿病性創傷の予防及び／又は治療で使用するための、アセチルサリチル酸又はその塩の濃度２００〜４８００μＭでの局所使用である。
【００２７】
したがって、本発明の主題は、糖尿病性創傷の予防及び／又は治療で使用するための、濃度２００〜４８００μＭのアセチルサリチル酸又はその塩である。
【００２８】
本発明の別の主題は、糖尿病性創傷の予防及び／又は治療で使用するための、濃度が２００〜４８００μＭであるアセチルサリチル酸又はその塩を含む医薬組成物である。
【００２９】
用語「糖尿病性創傷」は、１型又は２型糖尿病を患った糖尿病患者で生じる、とりわけ下肢の創傷から選択される創傷を意味するものとし、好ましくは糖尿病性足部創傷である。
【００３０】
用語「アセチルサリチル酸の塩」は、医薬的に許容可能なカチオンを有するアセチルサリチル酸の塩を意味するものとし、好ましくはアセチルサリチル酸リジン又はアセチルサリチル酸ナトリウムである。
【００３１】
本発明の文脈内において、用語「有効量」は、創傷１つあたり７．２ｘ１０−３〜０．１７３ｍｇ、好ましくは損傷１つあたり７．２ｘ１０−３〜０．１０４４ｍｇ、より好ましくは創傷１つあたり１．０８ｘ１０−２〜７．２ｘ１０−２ｍｇのアセチルサリチル酸又はその塩の量を意味するものとする。アセチルサリチル酸又はその塩のこの量は、創傷に直接接触させて適用する量である。創傷は、約１ｃｍ２の表面積を有するものとして定義し得る。それでもなお、アセチルサリチル酸又はその塩の有効量は多数のパラメータ、例えば創傷のサイズ、治療対象である個体（ヒト又は動物）の体重、年齢、性別、感受性及び糖尿病の型に応じて変化する。それゆえに、最適有効量は、治療対象における専門家により関連すると判断されたパラメータに応じて決定されなくてはならない。
【００３２】
用語「慢性化（ｃｈｒｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、創傷の治癒の遅れを意味するものとする。
【００３３】
糖尿病性創傷を「治療する」という用語は、創傷の治癒及び閉鎖を意味するものとする。
【００３４】
糖尿病性創傷を「予防する」という用語は、創傷の治癒の遅れ又は慢性化を予防することを意味するものとする。
【００３５】
アセチルサリチル酸又はその塩は、本発明において、有効濃度で使用される。実際、２００μＭ未満、例えば１００μＭ未満の濃度で使用した場合、アセチルサリチル酸又はその塩は、糖尿病性創傷の治癒速度の加速に効果を有さない。
【００３６】
同様に、５０００μＭ以上の濃度では、アセチルサリチル酸は糖尿病性創傷の治癒の加速にもはや有益な作用を及ぼさず、創傷中に存在する一部の細胞、例えばマクロファージの生存率に悪影響を与えさえする。
【００３７】
好ましい実施形態において、アセチルサリチル酸又はその塩は、濃度２００〜２９００μＭで使用される。
【００３８】
より一層好ましい実施形態において、アセチルサリチル酸又はその塩は、濃度３００〜２０００μＭで使用される。
【００３９】
好ましくは、アセチルサリチル酸又はその塩の定義された濃度は、創傷と接触させて適用する濃度である。
【００４０】
好ましくは、アセチルサリチル酸又はその塩は、糖尿病性創傷の慢性化を治療するために使用される。特に、アセチルサリチル酸又はその塩は、「制御された」（遷延も悪化もしない）炎症期の回復、炎症期の消散の加速及びその結果としての創傷閉鎖の動態の加速を可能にする。
【００４１】
好ましくは、本発明のアセチルサリチル酸又はその塩を、生理学的に許容可能な媒体中で処方することで医薬組成物を得る。用語「生理学的に許容可能な媒体」は、皮膚、創傷、粘膜及び外皮に適合性がある媒体を意味するものとする。
【００４２】
好ましくは、アセチルサリチル酸又はその塩を、脂質又は超酸素添加油（ｈｙｐｅｒｏｘｙｇｅｎａｔｅｄ  ｏｉｌ）又はこれらの誘導体の１種と組み合わせる。脂質又は超酸素添加油は、アセチルサリチル酸又はその塩を既に含む医薬組成物に配合し得て、あるいはアセチルサリチル酸又はその塩とは独立して投与し得る。好ましくは、脂質はオメガ−３若しくはオメガ−６脂肪酸又はこれら２種の組み合わせである。
【００４３】
用語「オメガ−３」は、α−リノレン酸、エイコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸から成る非限定的なリストから選択される任意の化合物を意味するものとする。
【００４４】
用語「オメガ−６」は、リノール酸、γ−リノール酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、ドコサテトラエン酸又はドコサペンタエン酸から成る非限定的なリストから選択される任意の化合物を意味するものとする。
【００４５】
用語「超酸素添加」油は植物由来の任意の超酸素添加油を意味するものとし、紫外線分光測光法によるこの油の定義はファクターＥ２７０に関して１０〜２０、ファクターＥ２３２に関して８〜６０である。
【００４６】
好ましくは、植物由来の超酸素添加油は、１キログラムあたりのミリ当量として表される過酸化度３０〜３００及び酸化グリセリド含有量５〜４０を有する。
【００４７】
さらに好ましくは、植物由来の超酸素添加油は、１キログラムあたりのミリ当量として表される過酸化度５０〜１５０を有する。
【００４８】
好ましい一実施形態において、植物由来の超酸素添加油は、トウモロコシ油、甘扁桃油、ベニバナ油、ヘーゼルナッツ油、落花生油、オリーブ油、菜種油、大豆油、マツヨイグサ油、ヒマワリ油、ブドウ種油、ゴマ油及びこれらの混合物から成る群から選択され、好ましくはトウモロコシ油である。
【００４９】
アセチルサリチル酸又はその塩及びこれらを含む医薬組成物を好ましくは局所投与、言い換えると外用経路で投与する。局所又は外用経路での投与は、有効成分、この場合はアセチルサリチル酸又はその塩が皮膚、創傷又は粘膜による吸収後に局所的に作用することを伴う。様々な剤形が存在し、例えば溶液、エマルション、クリーム、軟膏、ローション、パッチ、ゲル、ドレッシング材、マイクロカプセル、マイクロファイバー、スプレー、粉末又はナノファイバーである。
【００５０】
好ましくは、アセチルサリチル酸又はその塩を、ドレッシング材、マイクロカプセル、マイクロファイバー、ナノファイバー、溶液、ローション、ゲル、パッチ、エマルション、クリーム、軟膏、粉末及びスプレーから選択される（医薬）組成物に含める。
【００５１】
本発明の医薬組成物がエマルションの形態にある場合、エマルションは、少なくとも１つの水相及び／又は１つの油相並びに界面活性剤を含む。実際、慣用のエマルションは、２種の不混和性の液体の不安定な準均一系であり、２種の液体の一方がもう一方中に小さな液滴（ミセル）の形態で分散する。この分散物を界面活性剤の作用により安定させ、界面活性剤は、界面力の構造及び比を変化させることで界面張力エネルギーを低下させて分散物の安定性を上昇させる。
【００５２】
本発明の医薬組成物はゲル形態にもなり得て、この場合は１種以上のゲル化化合物を含む。
【００５３】
医薬組成物が溶液の形態にある場合、溶液は、アセチルサリチル酸又はその塩以外の、水性若しくは油性の溶液並びに任意で、アセチルサリチル酸若しくはその塩のための、１種以上の溶媒及び／又は浸透促進剤（ｐｒｏｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含む。
【００５４】
本発明の医薬組成物は不活性な添加剤又はこれらの添加剤の組み合わせも含み得て、例えば
・増粘剤又は乳化剤、
・ｐＨ調節剤、
・ＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂ遮断剤並びに
・酸化防止剤
である。
【００５５】
増粘剤又は乳化剤は、とりわけキサンタンガム又は界面活性剤類を含む化合物の非限定的なリストから選択し得る。
【００５６】
ｐＨ調節剤は、とりわけカーボネートを含む化合物の非限定的なリストから選択し得る。
【００５７】
ＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂ遮断剤は、化学物質系及びミネラル系の遮断剤を含む化合物の非限定的なリストから選択し得る。化学物質系遮断剤には、オクトクリレン、ベンゾフェノン、ドロメトリゾールトリシロキサン又はアボベンゾンがある。鉱物系遮断剤には、酸化亜鉛又は二酸化チタンがある。
【００５８】
酸化防止剤は、とりわけトコフェリルアセタート又はアスコルビン酸を含む化合物の非限定的なリストから選択し得る。
【００５９】
当然のことながら、当業者ならば、本発明に本質的に関係した有利な特性が意図した添加によって変化しない又は実質的に変化しないようにこれらの医薬組成物に添加する任意の化合物を注意深く選択する。
【００６０】
これらの添加剤は、組成物において、組成物の総重量に対して０．００１〜２０重量％で存在し得る。
【００６１】
ここで以下の実施例を、非限定的な実例として挙げる。
【００６２】
本発明の他の特徴及び利点は、例として挙げる、以下の図の凡例が言及するところの本発明の好ましい実施形態についての以下の説明を読むことでより明確になる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】「コントロール」用マウス及び糖尿病マウス（ＨＦＤ及びｄｂ／ｄｂ）における創傷閉鎖の動態。
【図２】「コントロール」用マウス、糖尿病マウス（ＨＦＤ及びｄｂ／ｄｂ）からの浸出液の評価及び滲出液中にある細胞の数量化。表の凡例は以下の通りである。滲出液の不在：−湿潤：±弱い滲出：＋中程度の滲出：＋＋強い滲出：＋＋＋
【図３】「コントロール」用マウス及び糖尿病マウス（ＨＦＤ）からの滲出液中にある多形核好中球及びマクロファージの総数の数量化。
【図４】「コントロール」用マウス及びアセチルサリチル酸で治療した糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）における創傷閉鎖の動態。
【図５】「コントロール」用マウス及びアセチルサリチル酸で治療した糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）における創傷閉鎖の動態
【図６】アセチルサリチル酸存在下でのインビトロでのマクロファージの生存率
【図７】「コントロール」用マウス及びアセチルサリチル酸で治療した糖尿病マウス（ＨＦＤ）の創傷への細胞浸潤の動態。
【実施例】
【００６４】
材料及び方法
ｄｂ／ｄｂマウス：
ホモ接合体ｄｂ／ｓｂマウスはレプチン受容体遺伝子に点突然変異を有し、レプチンはとりわけ満腹感を制御するホルモンである。ｄｂ／ｄｂマウスは、生後第３／４週間目から食欲過剰となり、同時に肥満になる。これらのマウスは、高血糖、インスリン抵抗性及び高トリグリセリド血症を特徴とし、これがこれらのマウスを遺伝子を原因とした糖尿病のモデルとしての第１選択としている。ｄｂ／ｄｂマウス用の「コントロール」群のマウスは、ヘテロ接合体ｄｂ／＋マウスである。
【００６５】
ＨＦＤマウス
ＨＦＤマウスは誘発糖尿病のマウスモデルであり、生後８週間のＣ５７ＢＬ／６マウスで準備した。これらのマウスは１６週間にわたって高カロリー（高脂肪）食をとる。マウスは脂肪組織の増加に起因する大幅な体重増加を示し、また耐糖能障害及びインスリン抵抗性をもつようになる。ｄｂ／ｄｂマウスとは異なり、これらのマウスの糖尿病の状態は遺伝子を原因としたものではない。ＨＦＤマウス用の「コントロール」群のマウスは標準的な食餌をとるマウスであり、略語「ＮＣ」でも知られる。
【００６６】
全てのマウスを暗所での１２時間とそれに続く明所での１２時間に分けられた１日のサイクル、２２℃で飼育し、食物及び水には常時アクセスできる。マウスにおける糖尿病の確立を、糖代謝を評価できる２つの試験：ブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）及びインスリン感受性試験（ＩＰＩＳＴ）により確認する。
【００６７】
治癒動態のモニタリング
マウスをイソフルラン（ハロゲン化麻酔ガス）により麻酔する。マウスの背側部及び側腹部を剃毛し、消毒し、約１ｃｍ２を円形に切除する。筋組織の界面にある結合組織を筋膜にダメージを与えることなく除去する。皮膚を筋肉層（ｐａｎｎｉｃｕｌｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）まで完全に切除する。
【００６８】
このようにして作り出した創傷を、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  Ｕｒｇｏが出願の仏国特許出願公開第１１６２２９５号明細書及び仏国特許出願公開第１１６２３４４号明細書に記載されているようなデバイスで保護し、このデバイスは、創傷の保護並びに治癒動態の観察及び評価の両方を可能にし、また滲出液の採取を可能にする。
【００６９】
創傷の治癒プロセスを、損傷部形成から０〜３０日間にわたって観察する。各マウスについて、３〜５枚の超高解像度の標準化デジタル写真を撮影する。創傷閉鎖の割合は表面積の変化をベースとしており、同じマウスの同じ外傷について指定の時点で計算する。そのため、群内の３匹のマウスでの創傷治癒について計算した（百分率としての）平均値が独立して得られ、３つの独立した実験の３つの群から統計データを計算する。
【００７０】
滲出液からの細胞を、創傷が滲出液を分泌しなくなるまで、損傷部形成後１日目から回収する。多形核好中球の浸潤動態を確認するために、損傷部からの滲出液中の細胞をフローサイトメトリにより、膜受容体Ｌｙ６Ｇ、７／４（多形核細胞用）及びＦ４／８０（マクロファージ用）に関して免疫標識することで特徴付ける。全部で１００００の事象を各サンプルについて分析する。全結果を百分率の形態で示す。
【００７１】
得られた結果
結果を平均±ＳＥＭとして表す。ＳＥＭは平均からの標準偏差を意味する。真の個体群の平均に対するサンプルの平均からの偏差を表す。標準偏差をサンプルサイズの平方根で割ることで計算する。統計解析を多重比較法であるＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｄｕｎｎｅｔ試験にしたがって、各群につき少なくとも３匹の被験体（ｎ＝３）に関して行う。Ｐ＜０．０５（＊）は、統計学的に有意であると見なされる。
【００７２】
Ａ．治癒のモニタリング
創傷閉鎖の動態（図１Ａ、図１Ｂ）
「コントロール」用マウスにおいては、損傷部の完全な閉鎖が１４日後に観察される。その一方で、ＨＦＤマウスにおいては、この完全な閉鎖が１８日後にしか達成されず、すなわち事実上４日遅れる（図１Ａ）。
【００７３】
ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、創傷は、２６〜２８日目にやっと事実上完全に閉じ、すなわちそれぞれのコントロールに対して１０〜１２日治癒が遅れている（図１Ｂ）。
【００７４】
したがって、糖尿病マウス（ＨＦＤ及びｄｂ／ｄｂ）では創傷の閉鎖に有意な遅れがある。
【００７５】
顕微鏡による治癒の観察（滲出液＋肉芽組織）（図２）：
「コントロール」用マウスにおいては、皮膚損傷部の形成に続いて、創傷に徐々に現れる肉芽組織の定着が観察される。その広がりは均一ではないが、創傷の縁の様々な地点から発生し、５日後に創傷を完全に埋める。この組織は治癒が進むにつれて厚くなる。
【００７６】
糖尿病マウスでは、この肉芽組織の定着が、損傷部形成後２日目から正味の遅れを見せる。糖尿病マウスにおいて、損傷部は損傷部形成から７日後にしか完全に埋まらず、すなわち「コントロール」用マウスと比較して２日長い。
【００７７】
糖尿病マウスにおいて、肉芽組織の定着は滲出現象を伴う。細胞及びメディエータを多く含むこの液体は、損傷部を形成するやいなや産生される。「コントロール」用マウスにおいて、その産生は、損傷部形成後３日目にピークに達する。
【００７８】
その一方で、糖尿病マウス（ＨＦＤ及びｄｂ／ｄｂ）は、損傷部形成後２日目から、体積の点でずっと多い滲出を示し、特に長く続く（図２）。
【００７９】
したがって、糖尿病マウスでは、肉芽組織の定着が有意に遅れ、より多く且つより長期間にわたる滲出を伴う。
【００８０】
Ｂ．滲出液中に存在する細胞集団の分析（図２、３Ａ、３Ｂ）
「コントロール」用マウスからの滲出液は概して少量であり、この滲出液における細胞浸潤は限定されている。滲出液における細胞浸潤は損傷部形成後２日目から５日目まで観察される。細胞浸潤のピークは、損傷部形成後３日目に観察される（図２）。
【００８１】
糖尿病マウスの滲出液における細胞浸潤の動態は、「コントロール」用マウスで観察されるものとは異なる。実際、損傷部形成後７日目まで続くより多い細胞浸潤が観察される（図２）。
【００８２】
時間の関数として観察される細胞浸潤における差は、糖尿病マウスでは多形核好中球が損傷形成部位に留まり続けることで説明がつく。実際、「コントロール」用マウスにおいて、多形核好中球は損傷部形成後５日目の終わりまでには消滅するのに、糖尿病マウスにおいて、この細胞集団は、損傷部形成後７日目まで留まり続ける（図３Ａ）。したがって、皮膚損傷部に浸潤する多形核好中球細胞の割合が「コントロール」群の場合より糖尿病群のほうがずっと高いことは明らかである。
【００８３】
糖尿病マウスはより多い細胞浸潤を示し、この細胞浸潤は損傷形成部位に多形核好中球が留まり続けることで引き起こされる。
【００８４】
「コントロール」用マウスにおいて、マクロファージは、損傷部形成後３日目から損傷形成部位に到着する。逆に言うと、糖尿病マウスにおいて、マクロファージの浸潤は、損傷部形成後３日目ではわずかに見られるに過ぎず、肉芽組織が定着を続ける間に増加しない（図３Ｂ）。
【００８５】
糖尿病マウスはより多い細胞浸潤を示し、これは
・損傷形成部位で多形核好中球が留まり続けること、
・マクロファージ動員における遅れ及び
・これらの多形核細胞が消滅しない
ことで説明がつく。
【００８６】
アセチルサリチル酸で治療したマウスで得られた結果
Ａ．様々な濃度のアセチルサリチル酸の存在下での糖尿病マウスにおける治癒動態のモニタリング
創傷閉鎖の動態（図４、図５、図６）
既に上で述べたように、マウスをイソフルランで麻酔する。マウスの背側部及び側腹部を剃毛し、消毒し、約１ｃｍ２を円形に切除する。筋組織の界面にある結合組織を筋膜にダメージを与えることなく除去する。皮膚を筋肉層まで完全に切除する。
【００８７】
その間に、アセチルサリチル酸の基準溶液を５ｍＭで用意する。この溶液は、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、２．９ｍＭ、４．８ｍＭ及び５ｍＭの濃度の溶液を調製するのに使用する。
【００８８】
アセチルサリチル酸濃度が１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、２．９ｍＭ、４．８ｍＭ及び５ｍＭの溶液を試験する。
【００８９】
精確さを期するために、アセチルサリチル酸濃度及び創傷での投与量についての参照表を作成する。以下を参照のこと。これら創傷での投与量は、本発明の特定の実施形態に対応する。
【００９０】
【表１】
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【００９１】
各溶液から５０〜５００μｌ取り出し、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  Ｕｒｇｏが出願の仏国特許出願公開第１１６２２９５号明細書及び仏国特許出願公開第１１６２３４４号明細書に記載されているようなデバイスを使用して創傷と接触させて適用する。
【００９２】
既定の濃度のアセチルサリチル酸を治癒部位へ接触させて適用することを損傷部形成後３日目から行うことは注目に値する。実際、「コントロール」用マウスと比較して糖尿病マウスにおいて治癒の遅れがでるのはこの期間である（図１Ａ、図１Ｂ）。加えて、糖尿病患者の治療において、治療対象である創傷は既に形成されてしまっているであろうし、治癒プロセスは炎症期で止まってしまうであろう。慢性創傷、より具体的には糖尿病性創傷を、出現した途端に治療することはない。また、炎症期は治癒に不可欠な時期であり、これは炎症期が、ダメージを受けた領域の、多形核好中球等の炎症細胞の浸潤による浄化及び清浄化を可能にするからである。したがって、効果的な治癒を開始させるために炎症をそのままにして、この時期を完全には妨害しないことが必要である。これが、アセチルサリチル酸での治療の開始を損傷部形成後３日目からしか提案しない理由である。
【００９３】
図４Ａ、図４Ｂは、ＮａＣｌ溶液（「コントロール」に対応）又は３００μＭ、１０００μＭ若しくは２０００μＭのアセチルサリチル酸溶液のいずれかを適用した後の糖尿病マウスの創傷治癒動態を示す。
【００９４】
３００μＭ、１０００μＭ及び２０００μＭのアセチルサリチル酸で治療した糖尿病マウスの治癒動態は「コントロール」用マウスのものとは完全に異なる。「コントロール」用糖尿病マウスにおいて創傷閉鎖は２６日後に完了するのに対して、３００μＭ及び１０００μＭのアセチルサリチル酸で治療した糖尿病マウスは、損傷部形成後約２０日目で創傷が閉じる。同様に、図４Ｂは、用量２０００μＭの場合の同じ結果を示す。
【００９５】
さらに、３００μＭ、１０００μＭ及び２０００μＭのアセチルサリチル酸溶液で治療した創傷の閉鎖速度の上昇が、治癒の早い時期（炎症期）、すなわち損傷部形成後３〜７日目での加速により達成されることを観察することができ、このことは図４で見てとれる。損傷部形成後３〜７日目での治癒のこの加速は、炎症の消散速度の加速と相関関係にある。そのため、上記のアセチルサリチル酸溶液を投与したマウスの治癒速度ひいては創傷閉鎖速度は、「コントロール」用マウスと比較して大幅に加速される。
【００９６】
要約すると、アセチルサリチル酸の３００μＭ、１０００μＭ及び２０００μＭ溶液の局所投与は制御された炎症期を回復させ且つ炎症の消散の極めてはっきりとした加速を誘起することで、「コントロール」用糖尿病マウスと比較して、（損傷部形成後約２０日目での）創傷閉鎖速度の上昇を可能にする。
【００９７】
図５は、ＮａＣｌ溶液（「コントロール」に対応）又は１００μＭ若しくは５０００μＭのアセチルサリチル酸溶液のいずれかを適用した後の糖尿病マウスの創傷治癒動態を示す。
【００９８】
「コントロール」用糖尿病マウス並びに１００μＭ及び５０００μＭのアセチルサリチル酸で治療した糖尿病マウスの治癒動態は同様であり、有意な差はない。そのような濃度のアセチルサリチル酸を創傷と接触させて導入しても、「コントロール」用糖尿病マウスと比較して、特には炎症期中及び肉芽組織の定着中に、治癒動態への効果は全く見られない。
【００９９】
要約すると、１００μＭ及び５０００μＭのアセチルサリチル酸溶液の糖尿病マウスの創傷への局所投与は、制御された炎症期の回復又は炎症の消散の加速に効果を示さず、したがって創傷閉鎖速度を上昇させることができない。
【０１００】
さらに、細胞生存率試験を、様々な濃度のアセチルサリチル酸についてマクロファージで行う（図６）。
【０１０１】
この分析方法は、マクロファージに分化させるためにＲＰＭＩ培地（Ｍ−ＣＳＦを１０ｎｇ／ｍｌで添加）で２４時間にわたって培養するヒト末梢血由来単核球の使用を含む。アセチルサリチル酸をこの培地に最終濃度１０００μＭ又は５０００μＭで添加する。
【０１０２】
細胞死亡率を、インキュベーションから７２時間後に、フローサイトメトリにより、ヨウ化プロピジウムの細胞質内への取り込みを測定することで分析する。
【０１０３】
インビトロで行うそのような細胞生存率試験の目的は、創傷で見られる細胞、好ましくは本ケースにおいてのマクロファージ（研究対象である損傷部の治癒におけるエフェクター細胞の１タイプであると見なされる）に対する投与量の有害度を確認することである。実際、そのような研究は、インビトロでの死亡率の基底レベルが高すぎることから、多形核好中球では行うことができない。
【０１０４】
図６は、インビトロで細胞に投与される用量５０００μＭのアセチルサリチル酸では７２時間の時点で細胞生存率が極めてはっきり低下することを示し、生存率は２０％低下し、したがって有害であると特徴付けることができる。
【０１０５】
逆に言うと、用量１０００μＭの適用に細胞毒性は見られない。
【０１０６】
したがって、創傷に投与する濃度５ｍＭの溶液は治癒動態（図５）に効果がなく、また治癒部位に存在する細胞に有害であると証明された（図６）。
【０１０７】
Ｂ．滲出液中に存在する細胞集団の分析（図７）
図７は、「コントロール」用糖尿病マウス又は１０００μＭのアセチルサリチル酸溶液を適用した糖尿病マウスで起きた細胞浸潤の動態を示す。
【０１０８】
損傷部形成後７日目に、アセチルサリチル酸での治療により、治療が施された糖尿病マウスの損傷部位に浸潤する細胞の数が有意に低下することは注目に値する。
【０１０９】
したがって、上記の全ての結果から、濃度１００〜４８００μＭのアスピリンをベースとした治療（損傷部形成後３日目から投与）は、糖尿病マウスにおいて、細胞浸潤を減少させ、制御された炎症期を回復させ、また炎症の消散を加速させることで最終的に創傷閉鎖速度を上昇させることができると結論付けることができる。
【０１１０】
したがって、アセチルサリチル酸は、炎症の消散過程において、そしてその結果として糖尿病を患っている個体の創傷閉鎖速度に関して非常に重要な役割を果たす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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