(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Ｖｅｒｏ細胞とＣＨＯ−Ｋ１細胞の混合物に一式の発現ベクターを遺伝子導入して、感染性インフルエンザウイルスのシードを生成する工程と、
ｂ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞を感染性インフルエンザウイルスの前記シードで感染させる工程と
を含む、感染性インフルエンザウイルスの産生方法。
【請求項２】
前記一式の発現ベクターが、
−  少なくともインフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡタンパク質をコードしている１つまたはそれ以上のｍＲＮＡの発現を可能にする発現ベクターと、
−  インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡ、または対応するｃＲＮＡの１つまたはそれ以上の発現を可能にする発現ベクターとを含み、
ここで前記一式の発現ベクターの発現によって、（ｉ）該インフルエンザｖＲＮＡを含有しているリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成、および（ｉｉ）前記遺伝子導入細胞中での感染性インフルエンザウイルスの生成が可能になる、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡタンパク質をコードしているｍＲＮＡの１つまたはそれ以上の発現を可能にする前記発現ベクターが、異なる４つの一方向性プラスミドを含み、各プラスミドは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰインフルエンザタンパク質から選択される４種の別個のタンパク質の１つをコードしているｍＲＮＡに相補的な１つまたはそれ以上のｃＤＮＡを含有し、ここで前記１つまたはそれ以上のｃＤＮＡはＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合するプロモーターの制御下にあり、そして
（ｉｉ）インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡ、または対応するｃＲＮＡの発現を可能にする前記発現ベクターが、異なる８つの一方向性プラスミドを含み、各プラスミドは、前記ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡインフルエンザｖＲＮＡから選択される８つの別個のｖＲＮＡの
１つ、または対応するｃＲＮＡに相補的な１つまたはそれ以上のｃＤＮＡを含有し、ここで前記１つまたはそれ以上のｃＤＮＡはＲＮＡポリメラーゼＩまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーターの制御下にある、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉｉ）項の各プラスミドが、センス鎖の５’から３’に、
ａ）ＲＮＡポリメラーゼＩまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーターと；
ｂ）センス鎖の５’から３’に、
−  認識配列の外側に切断部位を有し、粘着末端を生じる、第１の制限酵素の逆方向相補的認識配列；
−  認識配列の内側に切断部位を有する第２の制限酵素の制限部位；
−  認識配列の内側に切断部位を有する第３の制限酵素の制限部位；および
−  認識配列の外側に切断部位を有し、粘着末端を生じる、前記第１の制限酵素の認識配列を含み、
前記第２および第３の制限酵素は異なる、組換えカセットと；
ｃ）
−  該プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩに結合するとき、前記ターミネーター配列は、肝炎デルタリボザイム配列であり；
−  該プロモーターがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに結合するとき、前記ターミネーター配列は、Ｔ７ポリメラーゼターミネーター配列である、
ターミネーター配列と
を含むベクターに、前記ｃＤＮＡ配列をクローン化することによって得たものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが、配列番号：１の配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記一式の発現ベクターが、異なる８つの双方向性プラスミドを含み、各プラスミドは、２つのプロモーターの制御下にある、前記ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡインフルエンザｖＲＮＡから選択される８つの別個のｖＲＮＡの１つに相補的なｃＤＮＡを含有しており、前記第１のプロモーターは、ポリメラーゼＩに結合し、前記第２のプロモーターは、ポリメラーゼＩＩに結合し、
ここで前記一式の発現ベクターの発現によって、（ｉ）該インフルエンザｖＲＮＡを含有しているリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成、および（ｉｉ）前記遺伝子導入細胞中での感染性インフルエンザウイルスの生成が可能になる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
産生される感染性インフルエンザウイルスが、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルスである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
産生される感染性インフルエンザウイルスが、再集合体感染性インフルエンザウイルスであり、その遺伝物質は、少なくとも２種のドナーウイルスの遺伝物質を組み合わせた結果として得られる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ドナーウイルスが、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（Ａ／ＰＲ／８／３４）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、またはＢ／パナマ／４５／９０のうちの１つである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
産生される感染性インフルエンザウイルスがキメラウイルスである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記キメラウイルスが、キメラインフルエンザＨＡおよび／またはＮＡ  ｖＲＮＡを含有している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
キメラインフルエンザＨＡ  ｖＲＮＡおよび／またはＮＡ  ｖＲＮＡが、季節性または汎流行性ウイルスからのＨＡ  ｖＲＮＡの１つもしくはそれ以上のドメインまたはＮＡ  ｖＲＮＡの１つもしくはそれ以上のドメインと、別のドナーウイルスからのＨＡ  ｖＲＮＡの１つもしくはそれ以上のドメインまたはＮＡ  ｖＲＮＡの１つもしくはそれ以上のドメインとを含み、前記季節性または汎流行性インフルエンザウイルスからのＨＡ  ｖＲＮＡの少なくとも１つのドメインは、ＨＡの抗原性外部ドメインをコードしているｍＲＮＡの領域に相補的であり、前記季節性または汎流行性インフルエンザウイルスからのＮＡ  ｖＲＮＡの少なくとも１つのドメインは、前記季節性または汎流行性インフルエンザウイルスからのＮＡの抗原性外部ドメインをコードしているｍＲＮＡの領域に相補的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記季節性または汎流行性ウイルスからのＨＡ  ｖＲＮＡの少なくとも１つのドメインが、前記季節性または汎流行性インフルエンザウイルスからのＨＡ１および／またはＨＡ２である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法を、無血清培地または無動物成分条件において完全に実行する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によってインフルエンザウイルスを産生する工程と；
ｂ）感染性インフルエンザウイルスを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で増加させた後収穫する工程と、
ｃ）収穫した感染性インフルエンザウイルスを精製する工程と、
ｄ）精製したウイルスを薬学的に許容される担体と混合する工程と
を含む、インフルエンザワクチン組成物の調製方法。
【請求項１６】
精製したウイルスを不活化する工程をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項２〜６のいずれか１項で定義したとおりの一式の発現ベクターを含むＣＨＯ−Ｋ１細胞を含む、Ｖｅｒｏ細胞とＣＨＯ−Ｋ１細胞の混合物。
【請求項１８】
Ｖｅｒｏ細胞とＣＨＯ−Ｋ１細胞の混合物から再集合体ＲＮＡウイルスを逆遺伝学によって産生する方法におけるベクターの使用であって、
前記ベクターは、
センス鎖の５’から３’に、
−  ＲＮＡポリメラーゼＩまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーターと；
−  センス鎖の５’から３’に、
−  認識配列の外側に切断部位を有し、粘着末端を生じる、第１の制限酵素の逆方向相補的認識配列；
−  認識配列の内側に切断部位を有する第２の制限酵素の制限部位；
−  認識配列の内側に切断部位を有する第３の制限酵素の制限部位；および
−  認識配列の外側に切断部位を有し、粘着末端を生じる、前記第１の制限酵素の認識配列を含み、
前記第２および第３の制限酵素は異なる、組換えカセットと；
−  該プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩに結合するとき、前記ターミネーター配列
は、肝炎デルタリボザイム配列であり、
−  該プロモーターがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに結合するとき、前記ターミネーター配列は、Ｔ７ポリメラーゼターミネーター配列である、
ターミネーター配列と
を含むベクターである、前記使用。
【請求項１９】
前記プロモーターが、げっ歯類ＲＮＡポリメラーゼＩまたはヒトＲＮＡポリメラーゼＩに結合する、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
組換えカセットの前記第１の制限酵素が、ＢｂｓＩまたはＳａｐＩであり、組換えカセットの前記第２および第３の制限酵素が、ＮｏｔＩおよびＳｂｆＩからなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記組換えカセットが、配列番号：２の配列からなる、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記ベクターが、配列番号：１の配列を含む、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
インフルエンザ発現ベクターを含むＣＨＯ−Ｋ１細胞を製造する方法であって、前記方法が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＶｅｒｏ細胞と混合する工程と、請求項２〜６のいずれか１項で定義された一式の発現ベクターを前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に形質導入する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に適当な一式の発現ベクターを遺伝子導入することにより生成した感染性インフルエンザウイルスのシードでＣＨＯ細胞を感染させる、インフルエンザの感染性ウイルスの産生方法に関する。本発明はまた、感染性ウイルスの産生方法、特に、本発明による方法において使用することのできる、組換えカセット、および前記組換えカセットを含むベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、動物およびヒトを冒して、公衆衛生および経済上の問題を引き起こす、一般に「フル（ｆｌｕ）」の名で呼ばれる、接触感染性の高い呼吸器疾患の原因因子である。インフルエンザウイルスは、一本鎖マイナスＲＮＡ分節からなる分節化したゲノムを有するエンベロープ型ＲＮＡウイルスである。インフルエンザウイルスは、３つの型：インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびインフルエンザＣウイルスを包含する。インフルエンザＡおよびＢウイルスは、毎年５万人を越える死をもたらすヒトインフルエンザ流行の原因である（非特許文献１）。インフルエンザＡウイルスは、ヒトおよび広範な種類の動物（鳥、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなど）の両方に感染し、最大の自然保有体は、野生の水鳥であるが、インフルエンザＢウイルスは、一部には、Ｂ／ＮＳ１タンパク質に他の種の生得免疫応答を打ち消す能力がないことが理由で、主にヒトに限定され（非特許文献２）、インフルエンザＣウイルスは、ヒトおよびブタから単離される。
【０００３】
Ａ型ウイルスは、球形または糸状の形状を有し、大きさは約８０〜１５０ｎｍである。脂質二重層からなるウイルスエンベロープは、宿主細胞の原形質膜由来である。宿主抗体にとっての主なターゲットである、表面糖タンパク質ＨＡ（ヘマグルチニン）およびＮＡ（ノイラミニダーゼ）から形成される針状体は、このエンベロープに挿入されている。同じく膜に埋め込まれているＭ２タンパク質は、主にウイルスの脱キャプシド（ｄｅｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）の際に機能するイオンチャネルである。マトリックスタンパク質Ｍ１は、脂質二重層、およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）と関連する、ウイルスの内側周辺に位置する。このタンパク質は、ＲＮＰの核−細胞質輸送において基本的な役割を有する。キャプシドにおいて、ｖＲＮＡ分節は、ウイルスゲノムの転写、複製、およびキャプシド形成に必要なシグナルを含有する非コード５’および３’末端を保有する。ＰＡ（ポリメラーゼ酸性）、ＰＢ１（ポリメラーゼ塩基性タンパク質１）、ＰＢ２（ポリメラーゼ塩基性タンパク質２）、ＮＰ（核タンパク質）、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ、およびＮＳ（非構造タンパク質）と呼ばれる、インフルエンザＡウイルスの８つのｖＲＮＡは、選択的スプライシングによって、１種またはそれ以上のタンパク質をコードする。ＰＡ分節は、ＰＡタンパク質をコードし；ＰＢ１分節は、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、およびＰＢ１−Ｎ４０タンパク質をコードし；ＮＰ分節は、ＮＰタンパク質をコードし；ＨＡ分節は、ＨＡタンパク質をコードし；ＮＡ分節は、ＮＡタンパク質をコードし；Ｍ分節は、Ｍ１およびＭ２タンパク質をコードし；ＮＳ分節は、非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２またはＮＥＰ（ｖＲＮＰの核輸送）をコードする。ｖＲＮＡは、１単量体あたり２４のヌクレオチドを結合するＮＰに巻き付けられており、ポリメラーゼ複合体がＲＮＡ分子の２つの末端に結合して、ヘアピン構造を形成している。この複合体は、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡからなる。ＲＮＡ、ＮＰ、およびポリメラーゼの組合せによって、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が形成される。
【０００４】
Ｂ型ウイルスは、ＮＡに加えて、タンパク質Ｍ２のようなＩＩＩ型構造を有する、ＮＢと呼ばれる糖タンパク質を有する。
【０００５】
Ｃ型ウイルスは、多官能性表面糖タンパク質「ヘマグルチニン−エステラーゼ融合タンパク質」（ＨＥＦ）１種類だけを有する。
【０００６】
したがって、Ａ型およびＢ型ウイルスのゲノムは、８つのウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含有しているが、インフルエンザウイルスＣ型のゲノムは、７つしか含有していない。
【０００７】
インフルエンザＡウイルスは、表面のウイルス糖タンパク質の性質に従って、別個の亜型、すなわち、現在は、ヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｈ１〜Ｈ１７）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）（Ｎ１〜Ｎ９）にも分けられる。
【０００８】
インフルエンザウイルスを孵化鶏卵において成長させることができたという、１９３６年のＢｕｒｎｅｔによる発見によって、その特性の研究が可能になり、不活化ワクチンの開発が可能になった（非特許文献３）。世界保健機関（ＷＨＯ）が述べているとおり、ワクチン接種は、感染の予防に最も有効な手段である。幸運なことに、７０年以上にわたり、安全で有効なワクチンが入手可能になっている。季節性インフルエンザワクチンは、抗原の改変のために１年に２回（北半球について１回および南半球について１回）更新される、異なるインフルエンザ型および亜型（Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、およびＢ）を含有する。このため、ＷＨＯは、世界インフルエンザサーベイランスネットワーク（ＧＩＳＮ）を連係して働かせて、インフルエンザウイルスの疫学をモニターしている。翌シーズンのワクチンに含めるウイルスが決定されたならば、ニューヨーク医科大学（ＮＹＭＣ、ＵＳ）、国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ、ＵＫ）、ＣＳＬグループ（オーストラリア）、および国立感染症研究所（ＮＭＤ、日本）のようなＷＨＯ協力センターによって、高成長シードウイルス株候補が準備されなければならない（非特許文献４）。次いで、ワクチン株が、製造業者によって、卵、ＭＤＣＫ、またはＶｅｒｏ細胞系において増幅される（非特許文献５）。現在、ＭＤＣＫ（非特許文献６）、Ｖｅｒｏ（非特許文献７）、およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（非特許文献８）が、規制上の要件を満たす３種の細胞系であり、インフルエンザＡおよびＢウイルスを首尾よく確実に複製させることが示されている。３種の細胞系はすべて、無血清培地において成長するように順応している（非特許文献９）。
【０００９】
インフルエンザウイルスの細胞への導入（感染の第１のステップ）は、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質と特定の細胞表面受容体の特異的相互作用を介して起こる。インフルエンザウイルスに特異的な宿主細胞膜受容体は、シアリルラクトサミン鎖（シアル酸［Ｓｉａ］α２−３／６ガラクトース［Ｇａｌ］β１−４／３Ｎ−アセチグルコサミン）の炭水化物構造でできている（非特許文献１０）。ヒトインフルエンザウイルスは、Ｓｉａ２−６Ｇａｌ結合を含有している細胞受容体に優先的に結合するのに対し、鳥ウイルスは、Ｓｉａ２−３Ｇａｌ受容体に優先的に結合する（非特許文献９）。２種のウイルスが同じ細胞に感染するとき、再集合体（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）と呼ばれる、異なる組合せのゲノムｖＲＮＡが生じる場合がある。この特性は、ターゲット循環ウイルスのＨＡおよびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質の抗原特性を、Ａ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）（Ｈ１Ｎ１）と呼ばれる、卵に順応させたウイルスの好都合な成長特性（内部遺伝子）と組み合わせる、インフルエンザＡワクチンの産生に使用されてきた。残念なことに、所望される高収量ウイルスを導き出すことにおける成功は、予測できない。加えて、一部の株は、検証されていない細胞系において単離されている場合、規制当局によって祖先ワクチン株として受理されないので、使用することができない（非特許文献１１）。インフルエンザＢ型ウイルスに関しては、ごく最近まで、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの成長特性を備えるＢウイルスは、特定されていなかった。したがって、流行性循環（または季節的）Ｂウイルスは、孵化鶏卵の感染にそのまま使用され、Ｂワクチン株の収量を向上させるのに、数回の継代が必要であった（非特許文献１２）。
【００１０】
１９９９年以来、感染性インフルエンザウイルスをすべてクローン化ウイルスｃＤＮＡから生成することを可能にする、プラスミドに基づいた逆遺伝学技術のおかげで、スピードおよび安全性に関してかなりの改善が実現された（非特許文献１３）。８つのｖＲＮＡ、ならびに、少なくとも、転写に必要となるポリメラーゼタンパク質複合体よび核タンパク質（ＮＰ）の発現を誘発し得る一式のプラスミドに基づく、異なる系が開発された。ポリメラーゼタンパク質複合体およびＮＰは、それぞれ、４つの追加プラスミドを遺伝子導入する、またはＲＮＡポリメラーゼＩ（ＰＯＬ１）およびＩＩ（ＰＯＬ２）を介したｖＲＮＡとｍＲＮＡ両方の合成を可能にする双方向性プロモーターを有するプラスミドを使用することにより、発現させることもできる（非特許文献１４）。遺伝子導入されるプラスミドの合計数は、戦略が一方向性であるか双方向性かに応じて１６（非特許文献１５）または１２（非特許文献１３）から８（非特許文献１６）まで、またプラスミドがいくつかのｖＲＮＡをコードする場合、３（非特許文献１７）から１（非特許文献１８）まで、様々となり得る。
【００１１】
現在の逆遺伝学系は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（非特許文献５）、ＣＥＰ（ニワトリ胚初代）細胞またはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）（非特許文献１８）、２９３Ｔ細胞単独（非特許文献１５）またはＭＤＣＫでさらに増幅させるもの（非特許文献１６；非特許文献１９）、Ｖｅｒｏ細胞単独（非特許文献１１；非特許文献１７）またはＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）でさらに増幅させるもの（非特許文献１３）、ＣＥＰ細胞またはＣＥＦ（非特許文献２０；非特許文献２１）の使用に基づく。
【００１２】
逆遺伝学法によるウイルスの産生に細胞系の混合物が使用されるとき、最も効率的に遺伝子導入することのできる細胞系が、感染性インフルエンザウイルスの生成を担うものとみなされ、他の細胞系は、感染性ウイルスの増加に寄与する。インフルエンザｖＲＮＡの産生を可能にするプラスミドでは、ヒトＲＮＡ  ＰＯＬ  Ｉプロモーターが一般に使用されるので、ヒトおよびサル細胞が、逆遺伝学系において遺伝子導入される細胞系として使用するのに最も適当な細胞系である。しかし、イヌまたはニワトリを起源とするＰＯＬ  Ｉプロモーターを、それぞれイヌまたは鳥細胞において使用することもできる（非特許文献２２；非特許文献２３）。一方、ウイルスタンパク質をコードするｍＲＮＡの産生を可能にするプラスミドは、通常、どんな真核細胞においても働き得るサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはβアクチンＰＯＬＩＩプロモーターを含有している（非特許文献１５；非特許文献１９）。
【００１３】
ほとんどの場合、上述の逆遺伝学系において、細胞は通常、遺伝子導入の直前に、血清含有培地で培養して、異なる細胞型の活発な成長を確実にする。さらに、感染培地中に、ブタを起源とするトリプシンも使用して、感染後のウイルス増殖を維持する。十分なウイルスを得るために、最初の遺伝子導入工程の後に、卵または細胞での数回の増幅が必要となる場合もある。
【００１４】
汎流行性Ａ／Ｈ１Ｎ１（２００９）ウイルスによって、インフルエンザＡウイルスが集団の中で広まり得るスピードが実証され、逆遺伝学による再集合体産生を加速させる必要が明示された。すなわち、主な課題は、最小限の時間で多量の用量のワクチンが産生されて、理想的にはウイルスの拡散より速く、世界中に分配されるのを確実にすることである。
【００１５】
クローン化に使用される従来の手法には、制限酵素が必要となる。しかし、制限部位は、多くの場合、ｖＲＮＡに相補的な異なるインフルエンザｃＤＮＡに存在し、ベクター改変またはウイルスゲノム突然変異誘発の実行が必要となる。逆遺伝学目的で、ｖＲＮＡに相補的なインフルエンザｃＤＮＡをクローン化するために、簡略化された組換え手法が以前に開発されている（非特許文献２４；非特許文献２５）。相同組換えには、２つのＤＮＡ分子間の同一ＤＮＡ配列の領域における切断および再結合の過程が伴い、その結果として遺伝物質の新たな組合せが生じる（非特許文献２６）。以前に記載されているこうした組換えクローン化系は、ヒトＰＯＬＩプロモーターとターミネーターの間にインフルエンザＡ分節のコンセンサス５’（Ｕｎｉ１３）および３’（Ｕｎｉ１２）保存非コード末端を含む、２５ヌクレオチド組換えカセットに基づく。こうした系は、任意のインフルエンザＡゲノムの迅速かつ直接的なクローン化を可能にする。しかし、インフルエンザＢゲノムのｖＲＮＡ５’および３’非コード末端のヌクレオチド配列は、インフルエンザＡウイルスと異なるので、インフルエンザＢゲノムは、この組換えカセットに基づいてクローン化することができない。
【００１６】
したがって、ＲＮＡウイルスゲノム、詳細には、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣゲノムを、可能な限り速やかにかつ効率的にクローン化する万能な手法を開発することも求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｒｏｓｓｍａｎら、２０１１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４１１（２）：２２９〜２３６
【非特許文献２】Ｓｒｉｄｈａｒａｎら、２０１０、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８５（１１）：７８５２〜７８５６
【非特許文献３】Ｄｅ  Ｏｎａら、１９９５、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３３（７）：１９４８〜１９４９
【非特許文献４】Ｇｅｒｄｉｌら、２００３、Ｖａｃｃｉｎｅ、２１（１６）：１７７６〜１７７９
【非特許文献５】Ｋｏｕｄｓｔａａｌら、２００９、Ｖａｃｃｉｎｅ、２７（１９）：２５８８〜２５９３
【非特許文献６】Ｔｒｅｅら、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９（２５〜２６）：３４４４〜３４５０
【非特許文献７】Ｋｉｓｔｎｅｒら、１９９８、Ｖａｃｃｉｎｅ、１６（９〜１０）：９６０〜９６８
【非特許文献８】Ｐａｕら、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９（１７〜１９）：２７１６〜２７２１
【非特許文献９】Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、２０１１、Ｖａｃｃｉｎｅ、２９（４７）：８６６１〜８６６８
【非特許文献１０】Ｓｕｚｕｋｉら、２０１１、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、７０５：４４３〜４５２
【非特許文献１１】Ｎｉｃｏｌｓｏｎら、２００５、Ｖａｃｃｉｎｅ、２３（２２）：２９４３〜２９５２
【非特許文献１２】Ｉｗａｔｓｕｋｉ−Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、２００８、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ、１３５（１）：１６１−１６５
【非特許文献１３】Ｆｏｄｏｒら、１９９９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３（１１）：９６７９〜９６８２
【非特許文献１４】Ｊａｃｋｓｏｎら、２０１１、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、９２（第１部）：１〜１７
【非特許文献１５】Ｎｅｕｍａｎら、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６（１６）：９３４５〜９３５０
【非特許文献１６】Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２００２、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０（２５〜２６）：３１６５〜３１７０
【非特許文献１７】Ｎｅｕｍａｎｎら、２００５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０２（４６）：１６８２５〜１６８２９
【非特許文献１８】Ｚｈａｎｇら、２００９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８３（１８）：９２９６〜９３０３
【非特許文献１９】Ｓｃｈｉｃｋｌｉら、２００１、Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ、３５６（１４１６）：１９６５〜１９７３
【非特許文献２０】Ｌｅｇａｓｔｅｌｏｉｓら、２００７、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、１（３）：９５〜１０４
【非特許文献２１】Ｗｈｉｔｅｌｅｙら、２００７、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、１（４）：１５７〜１６６
【非特許文献２２】Ｍａｓｓｉｎら、２００５、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７９（２１）：１３８１１〜１３８１６
【非特許文献２３】Ｍｕｒａｋａｍｉら、２００８、８２（３）：１６０５〜１６０９
【非特許文献２４】Ｓｔｅｃｈら、２００８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、３６（２１）：ｅ１３９
【非特許文献２５】Ｗａｎｇら、２００８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５１（１）：７４〜７８
【非特許文献２６】Ｗａｔｔら、１９８５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、８２：４７６８〜４７７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、とりわけ、新たな循環インフルエンザウイルスが特定され、流行性または汎流行性インフルエンザの原因になり得るであろうとき、インフルエンザワクチンの産生を、最適化された安全な条件で推進および／または加速する、有用なツールおよび方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この趣旨で、本発明の主題は、再集合体またはキメラウイルスを含めた、多様な（ａ  ｌａｒｇｅ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ）感染性Ａ型およびＢ型ウイルス、詳細には、逆遺伝学によって生成されたウイルスを産生する新たな方法に関する。こうした方法によって、インフルエンザウイルスをより安全な条件で製造することがより容易になる。別の態様では、本発明は、逆遺伝学法の実施に有用なツールであることが証明された、Ａ型またはＢ型ウイルスからのどの型のインフルエンザＲＮＡ断片のクローン化も可能にする、万能組換えベクターを提供する。
【００２０】
定義
「プロモーター」または「プロモーター配列」とは、細胞中に存在するＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することのできるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は、その３’末端において、転写開始部位を境界とし、上記バックグラウンドで検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように、上流（５’方向）に伸長する。プロモーター内配列には、転写開始部位（たとえば、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって好都合に定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼへの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む、他の発現制御配列と動作的に関連付けられる場合もある。たとえば、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター（ヒトＲＮＡ  ＰＯＬＩプロモーター）は、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターであり、鳥ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターは、鳥ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターであり、またはＴ７ポリメラーゼプロモーターは、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーターである。
【００２１】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」とは、ＤＮＡ（たとえば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入して、宿主を形質転換させ、導入された配列の発現（たとえば、転写および翻訳）が促進されるようにすることのできる媒体を意味する。ベクターには、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、ファージミド、トランスポゾン、および人工染色体などが含まれ；これらについて、以下でより詳細に論述する。
【００２２】
ベクターは、典型的には外来ＤＮＡが挿入されている、微生物のＤＮＡを含む。ＤＮＡの一分節を別のＤＮＡ分節に挿入する一般的な手段には、ＤＮＡを制限部位と呼ばれる特定の部位（特定のヌクレオチド群）で切断（ｃｌｅａｖｅ）する、制限酵素と呼ばれる酵素の使用が伴う。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つまたはそれ以上の制限部位において挿入され、次いで、ベクターによって、宿主細胞に、伝達性ベクターＤＮＡと共に運搬される。発現ベクターなどの、挿入または加えられたＤＮＡを有するＤＮＡの分節または配列は、「ＤＮＡ構築物」と呼ぶこともできる。一般的な型のベクターは、「プラスミド」であり、プラスミドは、一般に、付加的（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、適切な宿主細胞に容易に導入することのできる、通常は細菌起源である二本鎖ＤＮＡの自己完結した分子である。プラスミドベクターは、多くの場合、コードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有し、外来ＤＮＡの挿入に適する１つまたはそれ以上の制限部位と、通常は終結配列とを有する。コードＤＮＡは、特定のタンパク質もしくは酵素の特定のアミノ酸配列またはウイルスのｖＲＮＡ分節をコードしているＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始、調節、または別な形で媒介もしくは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子からのものでも、または異なる遺伝子からのものでもよく、同じ生物または異なる生物いずれからのものでもよい。プラスミドおよび真菌ベクターを始めとする多数のベクターが、様々な真核生物および原核生物宿主における複製および／または発現について記載されている。非限定的な例として、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＲＳＥＴもしくはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、またはｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、ｐＶＡＸ１プラスミド（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、ＦＲ）および適当な多くの宿主細胞が挙げられ、本明細書で開示もしくは引用され、または別の形で関連業者に知られている方法を使用する。組換えクローニングベクターは、多くの場合、１つまたはそれ以上の複製系、宿主中での選択のための１つまたはそれ以上のマーカー、たとえば、抗生物質耐性、および１つまたはそれ以上の発現カセットを含む。組換えクローニングベクターは、Ｐｅｕｂｅｚら、２０１０、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、９：６５に記載の系などの、無抗生物質の選択系を収容してもよい。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「プライマー」とは、オリゴヌクレオチドの機能を指す。プライマーは、典型的にはターゲット配列とのハイブリッド形成後にオリゴヌクレオチドを伸長させることによりターゲット配列を増幅するのに使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００２４】
「ＲＮＡポリメラーゼＩＩ」とは、真核生物において、ＤＮＡのｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体への転写を触媒する酵素を意味する。
【００２５】
「ＲＮＡポリメラーゼＩ」とは、真核生物において、ＤＮＡのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはｒＲＮＡ前駆体への転写を触媒する酵素を意味する。
【００２６】
用語「一方向性プラスミド」とは、１つの転写カセットだけを含有しているＤＮＡプラスミドを意味し、転写カセットが、ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するポリメラーゼプロモーターを含有する場合、前記ＤＮＡのｒＲＮＡへの転写を可能にし、または転写カセットがＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合するポリメラーゼプロモーターを含有する場合、前記ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を可能にする。たとえば、このようなプラスミドとして、Ｎｅｕｍａｎら、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６（１６）：９３４５〜９３５０、およびＵＳ２００９／０２４６８３０またはＵＳ２０１１／０１４３４２４に記載のものが挙げられる。
【００２７】
用語「双方向性プラスミド」とは、２つの転写カセットを含有しているＤＮＡプラスミドを意味し、第１の転写カセットがＲＮＡポリメラーゼＩに結合するポリメラーゼプロモーターを含有し、第２の転写カセットがＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合するポリメラーゼプロモーターを含有しているので、前記ＤＮＡのｒＲＮＡおよびｍＲＮＡへの転写を可能にする。たとえば、このようなプラスミドとして、Ｈｏｆｆｍａｎら、２０００、ＰＮＡＳ、９７（１１）：６１０８〜６１１３およびＷＯ０１／８３７９４に記載のものが挙げられる。
【００２８】
用語「インフルエンザウイルス」とは、オルトミクソウイルス科の基準種を意味する。本発明によるインフルエンザウイルスは、上記したとおりである。
【００２９】
本発明によるインフルエンザウイルスは、インフルエンザＡまたはＢウイルスであることが好ましい。インフルエンザＡまたはＢウイルスは、どの株のウイルスでもよい。詳細には、インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、およびＨ１０Ｎ７ウイルスからなる群から選択される。
【００３０】
「季節性または汎流行性ウイルス」とは、ヒトなどの感染宿主から単離された、インフルエンザウイルスの臨床分離株を意味する。
【００３１】
「感染性インフルエンザウイルス」とは、許容細胞に入って複製し得るインフルエンザウイルスを意味する。ウイルスが感染性であるかを決定する方法は、当業者によく知られている。たとえば、ウイルスが感染性であるかの決定は、ＴＣＩＤ５０検定を使用して実行することができる。ＴＣＩＤ５０は、許容細胞（ＭＤＣＫ細胞など）に対してサンプルの漸増希釈物を導入し、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ統計的方法を使用して、許容細胞の５０％を感染させる終点希釈度を決定することにより、サンプル（たとえば、感染細胞培養上清または感染尿膜腔液）中の感染性ウイルスの量を評価する方法である。
【００３２】
一部の実施形態では、前記感染性インフルエンザウイルスは、再集合体インフルエンザウイルス、キメラインフルエンザウイルス、または弱毒インフルエンザウイルスでよい。好ましくは、前記感染性インフルエンザウイルスは、再集合体インフルエンザウイルスである。さらに好ましくは、前記感染性インフルエンザウイルスは、再集合体キメラインフルエンザウイルスである。
【００３３】
「許容細胞」とは、インフルエンザウイルスが前記細胞に浸透し、新たな感染性ウイルスの産生まで、その完全な複製サイクルを実現するのを可能にする、細胞の意味である。高度許容細胞は、インフルエンザウイルスが盛んに複製し、多量の感染性ウイルスが産生される細胞である。
【００３４】
用語「再集合体ウイルス」とは、少なくとも２種のドナーウイルスの遺伝物質を組み合わせた結果として得られる遺伝物質を含有しているウイルスを意味する。再集合体ウイルスをインフルエンザワクチンの調製に使用するとき、その遺伝物質は通常、少なくとも季節性または汎流行性ウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含有しているが、他の遺伝子（バックボーン遺伝子）は、インフルエンザワクチンの製造に使用する産生基質（孵化鶏卵の尿膜腔または許容細胞系など）において容易に成長し得る、および／またはヒトに対してより弱い病原体になるもしくは病原体でなくなり得るその能力を理由に選択された、他の１種または数種のドナーウイルスからのものである。バックボーン遺伝子の「提供者」として寄与するドナーウイルスの例としては、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（Ａ／ＰＲ／８／３４）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、および／またはＢ／パナマ／４５／９０ウイルスが挙げられる。
【００３５】
用語「キメラウイルス」とは、キメラタンパク質をコードしているキメラ遺伝子を含有しているウイルスを意味する。「キメラ遺伝子および／またはタンパク質」とは、前記遺伝子またはタンパク質が、少なくとも２種の異なるドナーウイルスに由来する、少なくとも２部分の遺伝子または２部分のタンパク質を適宜組み合わせて得られたものであることを意味する。たとえば、インフルエンザウイルスＡまたはＢ型の場合では、前記キメラ遺伝子および／またはタンパク質は、キメラＨＡおよび／またはキメラＮＡ  ｖＲＮＡまたはタンパク質でよい。
【００３６】
用語「弱毒ウイルス」とは、許容細胞中で複製するが、動物またはヒトにおいて複製し得る能力が一部または完全にさえ失われているウイルスを意味する。したがって、弱毒ウイルスの毒性は、ヒトおよび動物において強力に低減され、または完全に欠如さえしている。弱毒ウイルスによる感染と関連する臨床症状は、動物またはヒトにおいて低減され、または完全に不在でさえある。弱毒ウイルスの例は、当業界でよく知られている。弱毒ウイルスは、たとえば、野生型ウイルスから、（たとえば、異なる培養基質上、またはその最適複製温度より低い温度での）連続継代、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、遺伝子操作によって調製することができる。本発明において有用な弱毒ウイルスは、ワクチン接種された個体の大半において、副作用を生じない、または強度の弱い副作用しか生じないが、対象において防御免疫応答を誘発し得るその能力を保持することができる。
【００３７】
用語「不活化ウイルス」とは、有意ないかなる程度にも、許容細胞に入って複製することが不能であるウイルスを意味する。ウイルスは、当業者によく知られているいくつかの手段によって不活化することができる。ウイルスを不活化する方法の例としては、遺伝子操作、化学的もしくは物理的処理、または放射線処理（ホルムアルデヒド、ベータプロピオラクトン、界面活性剤、典型的にはＸ線または紫外線放射の形での熱または電磁放射を含める）が挙げられる。本発明の枠内で、有用な不活化インフルエンザウイルスは、対象において防御免疫応答を誘発する能力を保持しているものである。
【００３８】
用語「逆遺伝学」とは、感染性の再集合体ウイルスまたは弱毒ウイルスをその相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から産生する分子法を意味する。こうした方法は、異なるインフルエンザウイルス間でｖＲＮＡを再集合させて再集合体インフルエンザウイルスを産生するのに非常に有利である。逆遺伝学法は、当業者によく知られている。逆遺伝学法は、上記したもの、たとえば、Ｎｅｕｍａｎら、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６（１６）：９３４５〜９３５０；Ｎｅｕｍａｎｎら、２００５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０２（４６）：１６８２５〜１６８２９；Ｚｈａｎｇら、２００９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８３（１８）：９２９６〜９３０３；Ｍａｓｓｉｎら、２００５、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７９（２１）：１３８１１〜１３８１６；Ｍｕｒａｋａｍｉら、２００８、８２（３）：１６０５〜１６０９に記載のプラスミド；および／またはＮｅｕｍａｎら、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６（１６）：９３４５〜９３５０；Ｎｅｕｍａｎｎら、２００５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０２（４６）：１６８２５〜１６８２９；Ｚｈａｎｇら、２００９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８３（１８）：９２９６〜９３０３；Ｍａｓｓｉｎら、２００５、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７９（２１）：１３８１１〜１３８１６；Ｍｕｒａｋａｍｉら、２００８、８２（３）：１６０５〜１６０９；Ｋｏｕｄｓｔａａｌら、２００９、Ｖａｃｃｉｎｅ、２７（１９）：２５８８〜２５９３；Ｓｃｈｉｃｋｌｉら、２００１、Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ、３５６（１４１６）：１９６５〜１９７３；Ｎｉｃｏｌｓｏｎら、２００５、Ｖａｃｃｉｎｅ、２３（２２）：２９４３〜２９５２；Ｌｅｇａｓｔｅｌｏｉｓら、２００７、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、１（３）：９５〜１０４；Ｗｈｉｔｅｌｅｙら、２００７、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、１（４）：１５７〜１６６に記載の細胞を使用する方法でよい。
【００３９】
好ましくは、前記方法は、次のものでよい：
（ｉ）１６プラスミド法、たとえば、ポリアミン誘導体（Ｔｒａｎｓ  ＩＴ−ＬＴ１）を使用して、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターの制御下にある、１つのインフルエンザｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡをそれぞれが含有している８つのプラスミドと、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ、およびＮＳ  ｍＲＮＡの１つに相補的なｃＤＮＡをそれぞれが含有している８つのプラスミドとを細胞に遺伝子導入することによってインフルエンザウイルスを産生する、Ｎｅｕｍａｎら、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６（１６）：９３４５〜９３５０、およびＵＳ２００９／０２４６８３０またはＵＳ２０１１／０１４３４２４に記載の方法。詳細には、細胞は、ヒト腎臓胚性接着細胞（２９３Ｔ細胞系）である；
（ｉｉ）１２プラスミド法、たとえば、第１の細胞型に、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター（肝炎デルタリボザイム）の制御下にある、１つのインフルエンザｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡをそれぞれが含有している８つのプラスミドと、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある、ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２  ｍＲＮＡの１つに相補的なｃＤＮＡをそれぞれが含有している４つのプラスミドとを遺伝子導入し、第２の細胞型においてウイルスをさらに増幅することによってインフルエンザウイルスを産生する、Ｆｏｄｏｒら、１９９９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３（１１）：９６７９〜９６８２、およびＵＳ２００４／０１４２００３、ＵＳ２０１２／００５８５３８に記載の方法。詳細には、前記第１の細胞型は、Ｖｅｒｏ細胞であり、前記第２の細胞型は、ＭＤＢＫである；
（ｉｉｉ）１３プラスミド法、たとえば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼターミネーターの制御下にある、１つのインフルエンザｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡをそれぞれが含有している８つのプラスミドと、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの制御下にある、ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２  ｍＲＮＡｓの１つに相補的なｃＤＮＡをそれぞれが含有している４つのプラスミドと、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの制御下にある、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよび核局在化シグナルをコードしているｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを含有している１つのプラスミドとを細胞に遺伝子導入することによってインフルエンザウイルスを産生する、Ｄｅ  Ｗｉｔら、２００７、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８８：１２８１〜１２８７に記載の方法。詳細には、遺伝子導入細胞は、Ｖｅｒｏ、２９３Ｔ、またはＱＴ６（ウズラからの線維肉腫細胞系）細胞である。
（ｉｖ）８プラスミド法、たとえば、各プラスミドによって、ｍＲＮＡおよびｖＲＮＡの両方が発現し得る、Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２０００、ＰＮＡＳ、９７（１１）：６１０８〜６１１３およびＷＯ０１／８３７９４に記載の方法。すなわち、各プラスミドは、１つのインフルエンザｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ、および前述の場合のような１つに代えて、２つの転写カセットを含有している。８つのインフルエンザウイルスｖＲＮＡのそれぞれに相補的なｃＤＮＡが、ポリメラーゼＩターミネーターとポリメラーゼＩプロモーターの間に挿入されている。このポリメラーゼＩ転写単位には、ポリメラーゼＩＩプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが隣接している。第１の転写カセットによって、ｃＤＮＡのｖＲＮＡの形での転写が可能になる。第２の転写カセットによって、ｃＤＮＡのｍＲＮＡの形での転写が可能になり、次いでｍＲＮＡは、細胞機構を使用してウイルスタンパク質に翻訳される。ＰｏｌＩ−ＰｏｌＩＩ系とも呼ばれる、この二重カセット系が転写に活用されて、同じプラスミドのｃＤＮＡが、ｖＲＮＡの形とｍＲＮＡの形の両方で転写される。ｃＤＮＡは、遺伝子導入細胞のレベルで、ｖＲＮＡおよび１つまたはそれ以上のウイルスタンパク質の発現によって顕在化する。詳細には、接着性ＭＤＣＫ細胞および２９３Ｔ細胞の共培養、ならびに遺伝子導入剤として、ポリアミン誘導体（Ｔｒａｎｓ  ＩＴ−ＬＴ１）を使用する。
（ｖ）３プラスミド法、たとえば、それぞれＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびポリメラーゼＩターミネーターの制御下にある、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ、およびＮＳ  ｖＲＮＡに相補的な８つのｃＤＮＡを含有している１つのプラスミドと、第１のものがＰＢ２、ＰＢ１、およびＰＡ  ｍＲＮＡのいずれか１つに相補的な３つのｃＤＮＡを含有しており、第２のものがＮＰ  ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを含有している、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある２つのプラスミドとを細胞に遺伝子導入することによってインフルエンザウイルスを産生する、Ｎｅｕｍａｎｎら、２００５、ＰＮＡＳ、１０２（４６）：１６８２５〜１６８２９に記載の方法。詳細には、遺伝子導入細胞は、２９３ＴまたはＶｅｒｏである。
（ｖｉ）１プラスミド法、たとえば、ネズミポリメラーゼＩターミネーターおよびニワトリＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターの制御下にある、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ、およびＮＳ  ｖＲＮＡに相補的な８つのｃＤＮＡを含有しており、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰ  ｃＤＮＡの間にポリメラーゼＩＩプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを有する、１つのプラスミドを細胞に遺伝子導入することによってインフルエンザウイルスを産生する、Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８３（１８）：９２９６〜９３０３に記載の方法。詳細には、遺伝子導入細胞は、ＣＥＦ細胞である。
（ｖｉｉ）異なる２種の細胞系を使用するＷＯ２００５／０６２８２０に記載の方法：第１の工程において、ＰｏｌＩ−ＰｏｌＩＩ系（ＰｏＩ／ＰｏＩＩ）を有する８つの双方向性プラスミドを細胞に遺伝子導入し、次いで第２の工程において、インフルエンザウイルスの産生を増幅するために、遺伝子導入細胞を、インフルエンザウイルスに対して非常に許容性である別の細胞系からの細胞と共に培養する。詳細には、第１の工程における前記遺伝子導入細胞は、Ｖｅｒｏ細胞であり、第２の工程における前記他の細胞系は、ニワトリ胚細胞由来の系統であるＣＥＫまたはＣＥＦ細胞系である。
【００４０】
「インフルエンザウイルスタンパク質」とは、Ａ型インフルエンザについては、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、およびＮＳ２／ＮＥＰタンパク質、Ｂ型インフルエンザについては、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、ＮＢ、Ｍ１、ＢＭ２、ＮＳ１、およびＮＳ２／ＮＥＰタンパク質、またはＣ型インフルエンザについては、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＨＥＦ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ１’、ＣＭ２、ＮＳ１、およびＮＳ２／ＮＥＰを意味する。
【００４１】
「リボ核タンパク質複合体の形成に必要なインフルエンザウイルスタンパク質」とは、Ａ、Ｂ、またはＣ型インフルエンザウイルスについて、タンパク質ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰを意味する。
【００４２】
「ｖＲＮＡ」とは、リボ核タンパク質複合体に封入されている、インフルエンザウイルスのマイナスセンスウイルスＲＮＡを意味する。インフルエンザウイルスがＡ型またはＢ型であるとき、前記ｖＲＮＡは、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ、およびＮＳ  ｖＲＮＡである。インフルエンザウイルスがＣ型であるとき、前記ｖＲＮＡは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＨＥＦ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ  ｖＲＮＡである。
【００４３】
「ｃＲＮＡ」とは、ｖＲＮＡに相補的である、プラスセンスＲＮＡ中間体を意味する。一度核に入ると、入ってくるマイナスセンスウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、プライマー依存的な機序によって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと転写される。こうしたｍＲＮＡ産物は、ｖＲＮＡ鋳型の不完全な複製物であり、ｖＲＮＡとは異なり、キャッピングおよびポリアデニル化されている。複製は、２工程の過程を経て生じる。相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）と呼ばれる、ＲＮＡの全長プラスセンス複製物がまず作製され、次には鋳型として使用されて、より多くのｖＲＮＡを産生する。
【００４４】
組換えカセット、ベクター、およびこれらの使用
本発明の意図は、マイナス一本鎖ＲＮＡウイルスのｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを発現ベクターにクローン化するのに使用することのできる新規の組換えカセットを提供することである。すなわち、前記組換えカセットは、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスのｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡをクローン化するのに特に有用である。
【００４５】
したがって、本発明は、センス鎖の５’から３’に、
−  認識配列の外側に切断部位（ｃｕｔｔｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を有し、粘着末端を生じる、第１の制限酵素の逆方向相補的認識配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）；
−  認識配列の内側に切断部位を有する第２の制限酵素の制限部位；
−  認識配列の内側に切断部位を有する第３の制限酵素の制限部位；および
−  認識配列の外側に切断部位を有し、粘着末端を生じる、前記第１の制限酵素の認識配列
を含み、またはこれらからなり、
前記第２と第３の制限酵素は異なる、組換えカセットに関する。
【００４６】
「制限酵素」とは、認識部位に結合し、次いで、その認識配列に対して一定の場所でＤＮＡ鎖を切断するエンドヌクレアーゼを意味する（ＩＩ型制限酵素）。「認識配列」とは、制限酵素がＤＮＡバックボーンを切る前に結合する特定のヌクレオチド配列である。認識配列は、一般に、長さが４〜８塩基対であり、多くの場合、回文構造である−すなわち、５’−３’方向に読むとき、後からでも前からでも同じに読め、認識配列は、多くの場合、ＤＮＡの両方の鎖で同じである。「切断部位」とは、制限酵素によって切られる特定のヌクレオチド配列である。一部の場合では、切断点は、回文構造の制限部位の対称軸上に正確に存在して、平滑末端を有する産物を与える。一部の制限ヌクレアーゼは、「付着末端」または「粘着末端」として知られる、各断片の２つの末端に短い一本鎖の尾部が残る、ずれのある切れ目を生じる。
【００４７】
認識配列に対する切断の場所は、酵素に応じて決まる。たとえば、ＳａｐＩまたはＢｂｓＩ酵素（ＩＩＳ型制限酵素）について、切断部位は、認識配列の外側である：
【表１】
0006335167.tif 000002
【００４８】
本明細書で使用するとき、「制限部位」は、好ましくは、制限酵素の認識配列からなり、かつ前記酵素の切断部位を含有している、ヌクレオチド配列を意味する。
【００４９】
一部の実施形態では、認識配列の外側に切断部位を有する前記第１の制限酵素は、ＢｂｓＩ、ＳａｐＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＢｓａＩ、またはＢｓｍＢ１でよい。
【００５０】
好ましくは、前記第１の制限酵素は、ＢｂｓＩまたはＳａｐＩである。したがって、第１の制限酵素がＢｂｓＩであるとき、前記逆方向相補的認識配列は、配列５’−ＧＴＣＴＴＣ−３’からなり、前記ＢｂｓＩ認識配列は、配列５’−ＧＡＡＧＡＣ−３’からなる。第１の制限酵素がＳａｐＩであるとき、前記逆方向相補的認識配列は、配列５’−ＧＡＡＧＡＧＣ−３’からなり、前記ＳａｐＩ認識配列は、配列５’−ＧＣＴＣＴＴＣ−３’からなる。
【００５１】
第２および第３の制限部位がウイルスゲノム中に存在するリスクを最小限に抑えるために、前記制限部位は、長いヌクレオチド配列を有することが好ましい。一部の実施形態では、前記第２および第３の制限酵素の制限部位は、少なくとも、または正確に、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である。好ましくは、前記第２および第３の制限酵素の制限部位は、少なくとも、または正確に、７または８ヌクレオチド長である。
【００５２】
一部の実施形態では、前記第２および第３の制限酵素は、ＮｏｔＩおよびＳｂｆＩからなる群から選択される。さらに好ましくは、前記第２の制限酵素は、ＮｏｔＩであり、前記第３の制限酵素は、ＳｂｆＩである。
【００５３】
したがって、第２または第３の制限酵素の制限部位は、配列５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’または配列５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧ−３’からなるものでよい。好ましくは、第２の制限酵素の制限部位は、配列５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’からなり、第３の制限酵素の制限部位は、配列５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧ−３’からなる。
【００５４】
組換えカセットは、第１の制限酵素の前記逆方向相補的認識配列と第２の制限酵素の前記制限部位の間；および／または第２の制限酵素の前記制限部位と第３の制限酵素の前記制限部位の間に、追加ヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、前記追加ヌクレオチドは、１本の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０ヌクレオチドからなるものでよい。一部の実施形態では、前記追加ヌクレオチドは、１本の多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０ヌクレオチドからなる。
【００５５】
したがって、前記組換えカセットは、少なくとも、または正確に、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０ヌクレオチド長である。好ましくは、前記組換えカセットは、少なくとも、または正確に、２８または３０ヌクレオチド長である。
【００５６】
好ましくは、前記組換えカセットは、配列５’−ＧＴＣＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号：２）からなる。
【００５７】
前記組換えカセットは、二本鎖核酸であり、上記した配列は、核酸のコード鎖に対応することを理解する必要がある。
【００５８】
本発明はまた、センス鎖の５’から３’に、
−  ＲＮＡポリメラーゼＩまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター、
−  本発明による組換えカセット、
−  ターミネーター配列
を含み、
−  プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩに結合するとき、前記ターミネーター配列は、肝炎デルタリボザイム配列であり、
−  プロモーターがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに結合するとき、前記ターミネーター配列は、Ｔ７ポリメラーゼターミネーター配列である
と理解される、ベクターに関する。
【００５９】
「ターミネーター配列」とは、転写のためのＤＮＡ上の遺伝子またはオペロンの末端の印となる配列を意味する。前記肝炎デルタリボザイム配列は、配列番号：３の配列を含む、またはそれからなる。前記Ｔ７ポリメラーゼターミネーター配列は、配列番号：４の配列を含む、またはそれからなる。
【００６０】
一部の実施形態では、前記プロモーターは、げっ歯類ＲＮＡポリメラーゼＩまたはヒトＲＮＡポリメラーゼＩに結合する。好ましくは、前記プロモーターは、マウスまたはハムスターＲＮＡポリメラーゼＩに結合する。
【００６１】
一部の実施形態では、げっ歯類ＲＮＡポリメラーゼＩに結合する前記プロモーターは、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７の配列を含む、またはそれからなる。
【００６２】
一部の実施形態では、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩに結合する前記プロモーターは、配列番号：８の配列を含む、またはそれからなる。
【００６３】
好ましくは、前記ベクターは、センス鎖の５’から３’に、
−  ヒトＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーター、
−  配列番号：２の配列の組換えカセット、
−  配列番号：３の配列の肝炎デルタリボザイム配列
を含む。
【００６４】
より好ましくは、前記ベクターは、配列番号：１の配列を含む。
【００６５】
さらに好ましくは、前記ベクターは、センス鎖の５’から３’に、
−  げっ歯類ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーター、
−  配列番号：２の配列の組換えカセット、
−  配列番号：３の配列の肝炎デルタリボザイム配列
を含む。
【００６６】
さらに好ましくは、前記ベクターは、センス鎖の５’から３’に、
−  配列番号：９の配列のＴ７ポリメラーゼに結合するプロモーター、
−  配列番号：２の配列の組換えカセット、
−  配列番号：４の配列のＴ７ポリメラーゼターミネーター
を含む。
【００６７】
本発明によるベクターにおいて、前記組換えカセットには、ＲＮＡポリメラーゼＩまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーターが先行し、ターミネーター配列が直後に続く。
【００６８】
一部の実施形態では、前記ベクターは、カナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子も含んでよい。したがって、前記ベクターは、配列番号：１０の配列を含む、またはそれからなり、すなわち、前記ベクターは、いわゆる万能ｐＳＰ−ｆｌｕプラスミドである。
【００６９】
一部の実施形態では、本発明によるベクターは、いかなる抗生物質耐性遺伝子も含まないが、Ｐｅｕｂｅｚら、２０１０、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、９：６５に記載の系などの無抗生物質選択系を含む。
【００７０】
本発明によるベクターは、マイナス一本鎖ＲＮＡウイルス、特に、感染性マイナス一本鎖ＲＮＡウイルスを逆遺伝学によって産生する方法において使用することができる。詳細には、前記ベクターは、ｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡに使用することができる。
【００７１】
たとえば、前記マイナス一本鎖ＲＮＡウイルスは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスなどのアレナウイルス科；インフルエンザウイルス、イサウイルス、ソゴトウイルスなどのオルトミクソウイルス科；麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、牛疫ウイルス、イヌジステンパーウイルスなどのパラミクソウイルス科；カリフォルニア脳炎ウイルスやハンタウイルスなどのブニヤウイルス科；狂犬病ウイルスなどのラブドウイルス科；エボラウイルスやマールブルグウイルスなどのフィロウイルス科；ボルナ病ウイルスなどのボルナウイルス科のウイルスでよい。
【００７２】
好ましくは、前記マイナス一本鎖ＲＮＡウイルスは、再集合体ウイルスおよび／またはキメラウイルスでよい。これらのウイルスを、弱毒ウイルスまたは不活化ウイルスにすることもできる。
【００７３】
特に好ましい実施形態では、前記マイナス一本鎖ＲＮＡウイルスは、インフルエンザウイルスである。
【００７４】
逆遺伝学によってマイナス一本鎖ＲＮＡウイルスを産生する方法は、当業者によく知られている。たとえば、前記方法は、Ｐａｔｔｎａｉｋら、１９９２、Ｃｅｌｌ、６９（６）：１０１１〜１０２０に記載のとおりのＶＳＶウイルス；Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ、１３（１８）：４１９５〜４２０３に記載のとおりの狂犬病ウイルス；Ｒａｄｅｃｋｅら、１９９５、ＥＭＢＯ  Ｊ、１４（２３）：５７７３〜５７８４に記載のとおりの麻疹ウイルス；Ｇａｒｃｉｎら、１９９５、ＥＭＢＯ  Ｊ、１４（２４）：６０８７〜６０９４に記載のとおりのセンダイウイルス；ＨｏｆｆｍａｎおよびＢａｎｅｒｊｅｅ、１９９７、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７１（６）：４２７２〜４２７７ならびにＤｕｒｂｉｎら、１９９７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３５（２）：３２３〜３３２に記載のとおりのパラインフルエンザ３型ウイルス；Ｈｅら、１９９７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３７（２）：２４９〜２６０に記載のとおりのＳＶ５ウイルス；ＢａｒｏｎおよびＢａｒｒｅｔｔ、１９９７、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７１（２）：１２６５〜１２７１に記載のとおりの牛疫ウイルス；Ｊｉｎら、１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５１（１）：２０６〜０１４に記載のとおりのＲＳＶウイルス；Ｐｅｅｔｅｒｓら、１９９９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３（６）：５００１〜５００９に記載のとおりのニューカッスルウイルス；Ｎｅｕｍａｎｎら、２００２、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７６（１）：４０６〜４１０に記載のとおりのエボラウイルス；Ｋａｗａｎｏら、２００１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２８４（１）：９９〜１１２に記載のとおりのパラインフルエンザ２型ウイルス；Ｈｅｒｆｓｔら、２００４、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７８（１５）：８２６４〜８２７０に記載のとおりのメタニューモウイルス；ＢｒｉｄｇｅｎおよびＥｌｌｉｏｔｔ、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９３（２６）：１５４００〜１５４０４に記載のとおりのブニヤムウェラウイルスの産生方法である。
【００７５】
好ましくは、逆遺伝学によってマイナス一本鎖ＲＮＡウイルスを産生する前記方法は、上記したとおり、インフルエンザウイルスを産生する方法である。より好ましくは、インフルエンザウイルスを産生する前記方法は、Ｎｅｕｍａｎら、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６（１６）：９３４５〜９３５０、ＵＳ２００９／０２４６８３０、ＵＳ２０１１／０１４３４２４、Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２００２、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０（２５〜２６）：３１６５〜３１７０、ＷＯ０１／８３７９４、Ｆｏｄｏｒら、１９９９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３（１１）：９６７９〜９６８２、ＵＳ２００４／０１４２００３、ＵＳ２０１２／００５８５３８、Ｄｅ  Ｗｉｔら、２００７、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８８：１２８１〜１２８７、ＷＯ２００５／０６２８２０に記載の方法、または本発明による方法でよい。本発明による方法において前記ベクターを使用することがさらに好ましい。
【００７６】
本発明によるベクターは、ｖＲＮＡウイルスに相補的なｃＤＮＡを１つまたはそれ以上の前記ベクターにクローン化した後に、前記方法において使用することができる。
【００７７】
クローン化戦略
本発明の文脈において、クローン化戦略には、本発明によるベクターと、クローン化されるｃＤＮＡ配列間での相同組換えが必要となる。
【００７８】
したがって、本発明は、ＲＮＡウイルスのｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡをクローン化する方法であって、
（ｉ）本発明によるベクターのプロモーター配列からのヌクレオチドを含有している順方向プライマー、および本発明によるベクターのターミネーターからのヌクレオチドを含有している逆方向プライマーを使用しての、ウイルスのウイルスＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）によって、ＲＮＡウイルスのｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを産生する工程、
（ｉｉ）組換えカセットの第１の制限酵素を使用して、本発明によるベクターを直線化する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で得たｃＤＮＡと、工程（ｉｉ）で得た直線化されたベクターとを、前記ｃＤＮＡと前記ベクター間の相同組換えが可能になる条件で接触させる工程
を含む方法をさらに提供する。
【００７９】
工程（ｉ）において、逆転写は、当業者によく知られている方法によって実行することができる。逆転写は、実施例の第１．８節に記載のとおりに実行することが好ましい。
【００８０】
一部の実施形態では、前記逆方向プライマーは、その５’側に、本発明によるベクターのターミネーター配列からの少なくとも１７ヌクレオチドを含む。好ましくは、前記逆方向プライマーは、その５’側に、肝炎デルタリボザイム配列からの少なくとも１７ヌクレオチドを含む。さらに好ましくは、逆方向プライマーは、その５’側に、配列５’−ＣＴＧＧＧＡＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣＣ−３’（配列番号：１１）を含む。前記逆方向プライマーは、ターミネーター配列からのヌクレオチドに対して３’に、逆転写されるｖＲＮＡに相補的なヌクレオチドをさらに含む。
【００８１】
一部の実施形態では、前記順方向プライマーは、その５’側に、本発明によるベクターのプロモーター配列からの少なくとも１７ヌクレオチドを含む。好ましくは、前記順方向プライマーは、その５’側に、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターからの少なくとも１７ヌクレオチドを含む。さらに好ましくは、前記順方向プライマーは、その５’側に、配列５’−ＴＧＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＴＴＡＴＴ−３’（配列番号：１２）を含む。前記順方向プライマーは、プロモーター配列からのヌクレオチドに対して３’に、逆転写されるｖＲＮＡに相補的なヌクレオチドをさらに含む。
【００８２】
工程（ｉｉ）は、当業者によく知られている方法によって実行することができる。工程（ｉｉ）は、実施例の第１．８節に記載のとおりに実行することが好ましい。
【００８３】
工程（ｉｉｉ）は、当業者によく知られている方法によって実行することができる。工程（ｉｉｉ）は、実施例の第１．８節に記載のとおりに実行することが好ましい。
【００８４】
工程（ｉｉ）において前記順方向および逆方向プライマーを使用しているために、得られるｃＤＮＡは、センス鎖の５’から３’に、ヒトポリメラーゼＩに結合するプロモーターからのヌクレオチド配列、ウイルスのｖＲＮＡをコードしているｃＤＮＡ、および肝炎デルタリボザイム配列からのヌクレオチド配列を含む。したがって、工程（ｉｉｉ）において、工程（ｉ）で得られたｃＤＮＡは、本発明によるベクターにアンチセンスでクローン化される。
【００８５】
一部の実施形態では、前記クローン化戦略は、工程（ｉ）で得られたｃＤＮＡを含有していないベクターを排除することからなる工程（ｉｖ）をさらに含む。工程（ｉｖ）は、工程（ｉｉｉ）において、得られたｃＤＮＡと接触させてあるベクターを、「組換えカセット、ベクター、および使用」の節に記載の第２および第３の制限酵素で消化することによって、たとえば、組換えカセットにＮｏｔＩおよびＳｂｆＩ制限部位を含めた場合、適当な条件でＮｏｔＩおよびＳｂｆＩ酵素を使用することによって、実行することができる。前記の適当な条件は、当業者によく知られている。
【００８６】
本発明によるベクターの特色のおかげで、このクローン化戦略を実施して、Ａ型ならびにＢ型インフルエンザウイルスからのｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを挿入することができる。本発明によるベクターは、Ａ型とＢ型両方のインフルエンザウイルスからのｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡのクローン化を可能にするので、先行技術より改良されたツールとなる。
【００８７】
感染性インフルエンザウイルスの産生方法
高い収量のインフルエンザ産生を維持するために、細胞は、その表面上にＳｉａ２−６ＧａｌまたはＳｉａ２−３Ｇａｌ受容体を発現させなければならない。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、Ｓｉａ２−６Ｇａｌ受容体を発現させず、Ｓｉａ２−３Ｇａｌ受容体を不十分にしか発現させないが（細胞の３０％で発現される）、意外にも、分子生物学によって、特に、適当な一式の発現ベクターによって逆遺伝学法により生成されたインフルエンザウイルスの産生には、ＣＨＯ細胞系のサブクローンであるＣＨＯ−Ｋ１細胞系が、非常に効率のよい細胞系であることが見出された。
【００８８】
したがって、本発明は、感染性インフルエンザウイルスを生成し得る一式の発現ベクターを使用する逆遺伝学によって得た感染性インフルエンザウイルスのシードでＣＨＯ細胞を感染させることによりウイルスの増殖（増幅）を実現させることによる、感染性インフルエンザウイルスの産生方法に関するものであり、したがって、感染性インフルエンザウイルスの産生方法は、細胞に前記の一式の発現ベクターを遺伝子導入することによる予備的な工程を含む。遺伝子導入細胞を含有している培地の上清は、感染性となり、収穫し、感染性シードとして使用して、別々の集団のＣＨＯ細胞を感染させることができる。別法として、遺伝子導入工程後、遺伝子導入細胞にＣＨＯ細胞をその場で加えて、インフルエンザウイルスの増殖を可能にすることもできる。
【００８９】
したがって、本発明の主題は、
ａ）細胞に一式の発現ベクターを遺伝子導入して、感染性インフルエンザウイルスのシードを生成する工程、
ｂ）ＣＨＯ細胞を感染性インフルエンザウイルスの前記シードで感染させる工程
を含む、またはこれらからなる、感染性インフルエンザウイルスの産生方法（「逆遺伝学法」）である。
【００９０】
本発明による方法において、感染性インフルエンザウイルスのシードは、前記感染性ウイルスを生成し得る一式の発現ベクターを細胞に遺伝子導入することにより得る。
【００９１】
通常、ＣＨＯ細胞を感染させる工程ｂ）は、前記感染性ウイルスを生成し得る一式の発現ベクターを遺伝子導入した細胞（「遺伝子導入細胞」）にＣＨＯ細胞を加え、それによって、生成された感染性ウイルスの増殖を可能にすることにより実行する。ＣＨＯ細胞を感染させる工程ｂ）は、工程ａ）で生成した感染性インフルエンザウイルスのシードをＣＨＯ細胞に加えることによっても実行することができるはずである。
【００９２】
感染性インフルエンザウイルスの前記シードによるＣＨＯ細胞の感染が、感染性インフルエンザウイルスの増殖を可能にする、当業者によく知られている培養条件下で行われることは、十分に理解される。感染性インフルエンザウイルスの増殖は、ＣＨＯ細胞集団または他のいずれかの高度許容細胞集団を連続して感染させる、または孵化鶏卵の尿膜腔を感染させることにより、さらに増幅させることができる。
【００９３】
感染性インフルエンザウイルスの産生は、当業者によく知られている条件で、ＣＨＯ細胞を感染性インフルエンザウイルスの前記シードでｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染させることにより実現される。たとえば、前記感染は、３２℃〜３８℃、またはより普通には３４℃〜３７℃の間を含む温度にて、５％〜１０％ＣＯ２で実行することができる。特定の例として、感染は、約３５℃にて約８％ＣＯ２で実施することができる。一般に、トリプシン、またはセリンプロテアーゼ活性を有する酵素を培地に加えて、ウイルスが細胞に入って複製するのを可能にし、ＣＨＯ細胞を介したインフルエンザウイルスの伝播を確実にする。
【００９４】
特に好ましい実施形態では、感染性インフルエンザウイルスのシードによるＣＨＯ細胞の感染は、無血清培地である感染培地において実行する。感染性インフルエンザウイルスを産生する前記方法は、完全に血清不在で実行することが好ましい。
【００９５】
本発明による方法は、ヘルパーウイルス不在で実施することが好ましいが、これは、適当な一式の発現ベクターのみの使用で、逆遺伝学による感染性インフルエンザウイルスの生成を可能にするのに十分であるという意味である。
【００９６】
使用する発現ベクターの構造上の特色に従って、遺伝子導入工程に使用する細胞または細胞系は、ＣＨＯ細胞系、ＣＨＯ細胞系と別の細胞系の混合物、またはＣＨＯ細胞系でない細胞系を含む、またはそれからなるものでよい。
【００９７】
本発明による方法が、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターの制御下にあるｖＲＮＡ産生のためのプラスミドを含む一式の発現ベクターを使用する逆遺伝学によって実施されるとき、遺伝子導入に使用する細胞は、霊長類起源の細胞、または好ましくは、霊長類起源の細胞とＣＨＯ細胞の混合物であることが好ましい。霊長類起源の細胞は、たとえば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、２９３Ｔ細胞、またはＶｅｒｏ細胞でよい。典型的には、遺伝子導入に使用する細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、または好ましくは、Ｖｅｒｏ細胞とＣＨＯ細胞の混合物である。
【００９８】
同じように、ＲＮＡ産生のためのプラスミドが、イヌまたは鳥ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターを含有しているとき（Ｍａｓｓｉｎら、２００５、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７９（２１）：１３８１１〜１３８１６；Ｍｕｒａｋａｍｉら、２００８、８２（３）：１６０５〜１６０９）、遺伝子導入に使用する細胞は、それぞれ、ＭＤＣＫ細胞などのイヌ起源の細胞（もしくは好ましくは、イヌ起源の細胞とＣＨＯ細胞の混合物）またはＣＥＦ細胞やＣＥＰ細胞などのニワトリ細胞（もしくは好ましくは、ニワトリ起源の細胞とＣＨＯ細胞の混合物）であることが好ましい。
【００９９】
最後に、ｖＲＮＡ産生のためのプラスミドが、ハムスターまたはマウスＲＮＡポリメラーゼＩなどのげっ歯類ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターを含有しているとき、遺伝子導入工程は、ＣＨＯ細胞だけを使用して実施することができる。その場合では、ＣＨＯ細胞は、遺伝子導入および感染の両方の工程に使用される唯一の型の細胞である。したがって、適当な一式の発現ベクターからの感染性インフルエンザウイルスの産生に、ＣＨＯ細胞の使用だけが含まれていればよく、これにより、インフルエンザウイルス産生工程が簡略化される。１種の細胞系だけしか培養する必要がない。
【０１００】
別法として、Ｄｅ  Ｗｉｔら、２００７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、８８（第４部）：１２８４〜１２８７に記載されているように、適当な一式の発現ベクターが、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターの制御下にあるｖＲＮＡ産生のためのプラスミドと、Ｔ７ポリメラーゼをコードしている追加のタンパク質発現プラスミドとを含むときも、ＣＨＯ細胞は、遺伝子導入および感染の両方の工程に使用され、感染性インフルエンザウイルスの産生を確実にする、唯一の型の細胞とすることができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、遺伝子導入に使用する細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞またはＶｅｒｏ細胞とＣＨＯ細胞の混合物）は、インフルエンザＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰタンパク質を安定して発現させる組換え細胞にすることができ、組換え細胞に組み入れる一式のベクターは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡを発現し得る一式の発現ベクターである。
【０１０２】
したがって、一部の実施形態では、工程ａ）における前記細胞は、Ｖｅｒｏ細胞またはＶｅｒｏ細胞とＣＨＯ細胞の混合物を含む、またはそれからなる。
【０１０３】
一部の実施形態では、工程ａ）における前記細胞はまた、ＣＨＯ細胞を含む、またはそれからなる。
【０１０４】
本発明により使用する細胞系は、ＣＨＯ細胞系である。ＣＨＯ細胞系は、工業用のタンパク質産生に一般に使用され、多くのＣＨＯ細胞系が当業者に知られている。たとえば、そのようなＣＨＯ細胞系として、たとえば、ＡＴＣＣカタログにおいてＣＣＬ−６１またはＣＣＬ−９６１８の番号で入手可能なＣＨＯ−Ｋ１細胞系、ＣＨＯ  ＤＰ−１２細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１２４４４および１２４４５）、およびＣＨＯ１−１５細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９６０６）が挙げられる。一実施形態によれば、本発明の目的で使用する細胞系は、その表面にＳｉａ２−６Ｇａｌ受容体を発現させないが、Ｓｉａ２−３Ｇａｌ受容体を不十分に発現させる結果、５０％未満の細胞集団が、ジゴキシゲニン標識イヌエンジュアグルチニンの存在下で蛍光性となる、ＣＨＯ細胞系である。本発明の目的で使用する細胞系は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系、詳細には、ＡＴＣＣにおいてＣＣＬ−６１の番号で参照される細胞系であることが好ましい。さらに好ましくは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系、たとえば、ＡＴＣＣにおいてＣＣＬ−６１の番号で参照されるＣＨＯ−Ｋ１細胞系は、細胞の懸濁液の形である。たとえば、そのような細胞の懸濁液は、細胞系を無血清培地で培養して得ることができる。
【０１０５】
本発明による方法を実施するのに霊長類細胞系をＣＨＯ細胞系と組み合わせて使用するとき、ＡＴＣＣカタログにおいてＣＣＬ−８１、ＣＲＬ−１５８６、ＣＲＬ−１５８７、またはＣＣＬ−８１．５の番号で入手可能なＶｅｒｏ細胞系は、規制当局に承認されて久しいので、好ましい。好ましい２９３−Ｔ細胞系としては、ＡＴＣＣカタログにおいてＣＲＬ−１１２６８の番号で入手可能な系統が挙げられる。
【０１０６】
ＣＨＯおよび遺伝子導入細胞、詳細にはＶｅｒｏ細胞は、ＧＬＰ（優良試験所基準）／ＧＭＰ（優良医薬品製造基準）の規制または国家の管理当局の要件に従って培養することが好ましい。たとえば、前記細胞は、履歴記録、すなわち、細胞の起源、その開発方法、産生のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養年数制限の情報によって特定することができる。前記細胞は、培養可能な細菌、マイコプラズマ、真菌、内在性ウイルスを含まないものにすることもできる。ワクチン生産のための細胞培養および細胞培養を支えるために使用する材料についての検討事項に関する手引きは、ｗｈｏ  ｅｘｐｅｒｔ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ、第４７次報告、ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＷＨＯ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｓｅｒｉｅｓ、１９９８、８７８：１９〜５２）、ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ（ＵＳ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ［２０１０年２月］）、欧州薬局方、第５版の第５．２．３節、または欧州医薬品庁刊行のｎｏｔｅ  ｆｏｒ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｏｎ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ｃｐｍｐ／ｉｃｈ／２９４／９５）において見ることができる。
【０１０７】
ＣＨＯおよび遺伝子導入細胞、詳細にはＶｅｒｏ細胞は、無血清培地および／または無動物成分条件での培養に順応させることが好ましい。
【０１０８】
無血清培地での培養に対する細胞の順応は、細胞が無血清培地で首尾よく生存し、増殖し得るまで、漸減する血清量を含有した培地で漸進性に細胞を継代することにより、当業者の手で容易に実現することができる。
【０１０９】
Ｖｅｒｏ細胞またはＶｅｒｏ細胞とＣＨＯ細胞の混合物を遺伝子導入に使用するとき、接着性であるＶｅｒｏ細胞は、遺伝子導入の前に、たとえばトリプシンでの処理によって、その支持体から引き離して、遺伝子導入の効能を向上させることが好ましい。したがって、遺伝子導入は、細胞の懸濁液に対して実行することが好ましい。しかし、細胞は、方法の過程で接着性になることもある。別法として、その主題が参照により本明細書に組み入れられるＵＳ２００９／０２０３１１２に記載されているような、懸濁液中での成長に順応させたＶｅｒｏ細胞系を使用してもよい。
【０１１０】
本発明による方法の枠内で、遺伝子導入は、当業者に知られているどんな方法によって実行してもよい。たとえば、遺伝子導入は、膜電気穿孔、核電気穿孔によって実行することができる。遺伝子導入（工程ａ））は、核電気穿孔によって実行することが好ましい。表現「核電気穿孔」とは、その強度が核孔の数および／またはその透過性を増大させるのに十分である１回またはそれ以上の電気ショックによって、核酸を遺伝子導入する方法を意味すると理解される。一般に、電気ショックの合計強度は、少なくとも２ｋＶ／ｃｍであり、ショックの合計継続時間は、少なくとも１０μｓである。懸濁液中での細胞の核電気穿孔は、その合計強度が少なくとも２ｋＶ／ｃｍであり、ショックの合計継続時間が少なくとも１０μｓである、１回またはそれ以上の電気ショックによって実行する。ショックの合計強度が２〜１０ｋＶ／ｃｍの間であり、ショックの合計継続時間が１０〜１０００μｓの間であることが好ましい。ショックの強度が２〜６ｋＶ／ｃｍの間であり、ショックの合計継続時間が１００〜６００μｓの間であることがさらにより好ましい。１つまたはそれ以上の休止期間によって中断されたいくつかの電気ショックを細胞に送達することが好ましい。その主題が参照により本明細書に組み入れられるＵＳ２００７／００５９８３４は、細胞に電気ショックを与えた後に休止期間を置く実際的な方式を記載している。電気ショックに続いて、強度が２．５Ａを越えない電流を、１〜５０ｍｓの間の期間、細胞に適用することも可能である。典型的には、遺伝子導入工程は、実施例の第１．９．節に詳述するとおりに実行し、すなわち、遺伝子導入は、Ｕ−０２３プログラムを使用する、Ｌｏｎｚａが市販するｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒなどの、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して実行する。
【０１１１】
遺伝子導入溶液は、細胞が電気ショックから防御されるように、また発現ベクターの核の方への拡散が妨げられないように選択する。その主題が参照により本明細書に組み入れられるＵＳ２００５／００６４５９６は、最適化された遺伝子導入溶液を記載している。そうした溶液は、その緩衝能が少なくとも２０ｍＭ  ｐＨ−１であり、２５℃の温度および７〜８の範囲のｐＨ変動にさらしたとき、イオン強度が少なくとも２００ｍＭである配合物である。こうした配合物中のＮａ＋およびＫ＋のモル濃度は、それぞれ、１００〜１５０ｍＭの間、および２〜６ｍＭの間であることが好ましい。こうした配合物は、一般に、Ｍｇ＋＋イオンも含有する。本発明の文脈において使用することのできる遺伝子導入媒質を、例として示す：
−  遺伝子導入溶液番号１：４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２０〜１６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）；
−  遺伝子導入溶液番号２：４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５〜２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１２０〜１６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）；
−  遺伝子導入溶液番号３：４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０〜１６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭのラクトビオン酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭのマンニトールまたは５〜１００ｍＭ
のコハク酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭの塩化ナトリウム；
−  遺伝子導入溶液番号４：４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５〜２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０〜１６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭのラクトビオン酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭのマンニトールまたは５〜１００ｍＭのコハク酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭの塩化ナトリウム；
−  遺伝子導入溶液番号５：４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８〜１２ｍＭのグルコース、０．３〜０．５ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、２０〜２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および５０〜１００ｍＭ  ｔｒｉｓ／ＨＣｌまたは３０〜５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）；
−  遺伝子導入溶液番号６：０．１〜３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０〜２００ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）、および／または１〜５０ｍＭのマンニトールおよび／または１〜５０ｍＭのコハク酸ナトリウム；ならびに
−  遺伝子導入溶液番号７：０．４２ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２；５．３６ｍＭ  ＫＣｌ；０．４１ｍＭ  ＭｇＳＯ４；１０３ｍＭ  ＮａＣｌ；２３．８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；５．６４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；１１．１ｍＭのｄ（＋）−グルコース；３．２５μＭのグルタチオン；２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．３；
−  リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）。
【０１１２】
電気穿孔溶液は、Ｌｏｎｚａが、Ａｍａｘａ（商標）Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  Ｖ−ＶＣＡ−１００３として参照されるキットの中に提供している、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖであることがさらに好ましい。
【０１１３】
遺伝子導入工程に引き続いて、１体積の遺伝子導入溶液に対して少なくとも５体積の培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）、好ましくは、１体積の遺伝子導入溶液に対して１０体積、さらに好ましくは１５体積の培養培地の比で、遺伝子導入細胞に培養培地を加える。培養培地は、ＣＨＯ細胞の培養に適する培地であることが好ましい。遺伝子導入工程の際にＶｅｒｏ細胞を使用するとき、ＣＨＯ細胞およびＶｅｒｏ細胞両方に適する培地、またはＣＨＯ細胞に適する培地とＶｅｒｏ細胞に適する培地の混合物を使用することもできる。
【０１１４】
詳細には、遺伝子導入は、実施例の第１．９節に記載のとおりに実行する。
【０１１５】
感染工程の際に使用する培地（感染培地）は、ＣＨＯ細胞の培養に適するどんな培地でもよい。一部の感染性インフルエンザウイルスが、トリプシンなしの感染培地においてＣＨＯ細胞中である程度増殖し得るとしても、感染培地は、トリプシン、またはセリンプロテアーゼ活性を有する酵素を含有し、またはそれが加えられて、ウイルスが細胞に入って複製するのを可能にし、他のＣＨＯ細胞を介したインフルエンザウイルスの伝播を確実にしてあることが非常に好ましい。実際に、ウイルスが細胞に入って複製し得るために、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンは、セリンプロテアーゼによって切断されなければならない。トリプシンは、合成起源のものであるか、または動物起源のいかなる産物も含まないことが好ましい。トリプシン、またはより一般には、セリンプロテアーゼ活性を有する任意の酵素、たとえば、プロナーゼ、スブチリシン、プラスミン、サーモリシンは、遺伝子組換えによって産生することができる。トリプシンは、詳細には、トランスジェニック植物（ＷＯ００／０５３８４）、酵母または細菌（ＷＯ０１／５５４２９）によって産生することができる。たとえば、ＧｉｂｃｏによってＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔの商品名で、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによってＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓの商品名で提供されている組換えトリプシンは、本発明の目的に適する。
【０１１６】
培養培地および感染培地を含めた、本発明の文脈で使用する培地は、動物起源の血清を含まないことが好ましく、好ましくは、動物起源のいかなるタンパク質も含まず、さらにより好ましくは、動物起源のいかなる成分も含まない。本発明の主題に適するといえる、動物起源の血清を含まない、および／または動物起源の原材料を含まない培地の例は、ＶＰ  ＳＦＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅｐｉｓｅｒｆ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、ＬＣ１７（Ｃａｍｂｒｅｘ）、Ｐｒｏ  ＣＨＯ５−ＣＤＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）、ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ−Ｕｔｉｌｉｔｙ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＨｙＱ  ＰＦ  Ｖｅｒｏ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ３２５  ＰＦ  ＣＨＯ無タンパク質培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ３０２無血清培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅｘｃｅｌｌ  ５２５、Ｅｘ  Ｃｅｌｌ（商標）ＣＤ  ＣＨＯ融合（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の名称で市販されている。したがって、（たとえば、動物起源のいかなる夾雑物または成分も含まない）無動物質培地を使用して、本発明による方法を実施することが可能である。詳細には、本発明の主題に適する培地は、ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓが製造するＥｘ  Ｃｅｌｌ（商標）ＣＤ  ＣＨＯ融合培地にＬ−グルタミンを補充したものである。ＣＨＯ細胞によって感染性インフルエンザウイルスを産生するには、この培地に、好ましくは動物起源のいかなる成分も含まないトリプシンまたはトリプシン誘導体を加える。
【０１１７】
一部の実施形態では、遺伝子導入を施す細胞の合計量は、たとえば、５０万、１００万、１５０万、２００万、２５０万、３００万、６００万、もしくはなお１０００万個の細胞、またはこれ以上である。
【０１１８】
別の実施形態では、遺伝子導入を施す細胞が、Ｖｅｒｏ細胞とＣＨＯ細胞の混合物であるとき、Ｖｅｒｏ細胞およびＣＨＯ細胞は、０．５：１〜２：１の範囲、たとえば、１：１、１．５：１、１：０．５、または１：１．５のＶｅｒｏ：ＣＨＯ比で存在する場合がある。典型的には、前記Ｖｅｒｏ：ＣＨＯ細胞比は、１：１である。たとえば、前記Ｖｅｒｏ：ＣＨＯ細胞比が１：１であるとき、各型の細胞の量は、たとえば、少なくとも５０万、１００万、１５０万、２００万、２５０万、３００万の細胞となる。
【０１１９】
一部の実施形態では、感染工程を実施するために、遺伝子導入工程の後に加えるＣＨＯ細胞の量は、たとえば、少なくとも５０万、１００万、１５０万、２００万、２５０万、３００万の細胞である。
【０１２０】
本発明の方法の一部の実施形態では、発現ベクターは、１つまたはそれ以上のインフルエンザタンパク質と１つまたはそれ以上のインフルエンザｖＲＮＡの両方の発現を可能にする発現ベクターを含み、前記発現ベクター一式の発現によって、（ｉ）前記ウイルスのｖＲＮＡを含有しているリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成、および（ｉｉ）前記遺伝子導入細胞中での前記ウイルス粒子の組立てが可能になると理解される。場合により、前記発現ベクター一式にヘルパーウイルスを加えてもよい。
【０１２１】
このようなベクターは、たとえば、ｍＲＮＡおよびｖＲＮＡ両方の発現を促進する双方向性プラスミドであり、各プラスミドは、
−  インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡの中から選択される８つのｖＲＮＡの１つまたはそれ以上、または対応するｃＲＮＡに相補的な１つまたはそれ以上のｃＤＮＡを含有しており、各ｃＤＮＡは、
−  ＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合し、その結果、対応するインフルエンザタンパク質の発現を可能にするプロモーター（ＰＯＬＩＩプロモーター）、
−  ＲＮＡポリメラーゼＩに結合し、その結果、対応するｖＲＮＡ、または前記の対応するｃＲＮＡの発現を可能にするプロモーター（ＰＯＬＩプロモーター）
の制御下にある。
【０１２２】
一部の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合するプロモーターは、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合するプロモーターであり、かつ／またはＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターは、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターである。
【０１２３】
一式の発現ベクターをＣＨＯ細胞に遺伝子導入する場合、ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターは、げっ歯類ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターであることが好ましい。げっ歯類ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターは、ハムスターまたはマウスＲＮＡポリメラーゼＩに結合することが好ましい。
【０１２４】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｖＲＮＡＳの両方、または対応するｃＲＮＡの発現を可能にする一式の発現ベクターは、１、２、３、４、５、５、６、７、８つの上で定義したとおりの双方向性プラスミドを含む。前記発現ベクターは、８つの双方向性プラスミドからなり、各プラスミドが、インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡの中から選択される８つのｖＲＮＡ、または対応するｃＲＮＡの１つに相補的なｃＤＮＡを含有していることが好ましい。好ましくは、前記発現ベクターは、Ｏｚａｗａら、２００７、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８１（１７）：９５５６〜９５５９に記載の８つのプラスミドからなる。
【０１２５】
一式の発現ベクターは、
−  １つまたはそれ以上のインフルエンザタンパク質をコードしている１つまたはそれ以上のｍＲＮＡだけの発現を可能にする発現ベクターと、
−  インフルエンザウイルスの１つまたはそれ以上のインフルエンザｖＲＮＡまたは対応するｃＲＮＡだけの発現を可能にする発現ベクターと
を含んでもよく、前記一式の発現ベクターの発現によって、（ｉ）前記ウイルスのｖＲＮＡを含有しているリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成、および（ｉｉ）前記遺伝子導入細胞中での前記ウイルス粒子の組立てが可能になると理解される。
【０１２６】
インフルエンザタンパク質だけの発現を誘発するベクターは、少なくとも、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰタンパク質の発現を誘発するものとするが、他のインフルエンザタンパク質（Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡタンパク質）の発現も誘発してもよい。好ましくは、前記発現ベクターは、一方向性プラスミドであり、各プラスミドが、少なくとも、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰタンパク質の群の中から選択される１つまたはそれ以上のタンパク質の発現を誘発する１つまたはそれ以上のｃＤＮＡを含有しており、各ｃＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合するプロモーターの制御下にある。したがって、前記発現ベクターは、実施例の第１．８節に記載のとおりに、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰタンパク質の１つに対応するｃＤＮＡがそれぞれクローン化された、Ｆｏｄｏｒら、１９９９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３（１１）：９６７９〜９６８２に記載のプラスミド、またはｐＶＡＸ１プラスミドを含んでよい。別法として、一式の発現ベクターは、各プラスミドが、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡタンパク質の中の１種の別個のウイルスタンパク質をコードしているｍＲＮＡに相補的な１つのｃＤＮＡを含有しており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合するプロモーターの制御下にある、８つの別個のプラスミドを含む。したがって、前記発現ベクターは、Ｎｅｕｍａｎｎら、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６（１６）：９３４５〜９３５０に記載の８つのプラスミドを含んでよい。
【０１２７】
１つまたはそれ以上のインフルエンザｖＲＮＡまたは対応するｃＲＮＡの発現を可能にするベクターは、インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡ、または対応するｃＲＮＡの発現を誘発するものとする。好ましくは、前記発現ベクターは、一方向性プラスミドであり、各プラスミドが、前記インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡの１つまたはそれ以上、または対応するｃＲＮＡに相補的な１つまたはそれ以上のｃＤＮＡを含有しており、各ｃＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターの制御下にある。前記発現ベクターは、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、または８つのプラスミドを含んでよい。さらに好ましくは、インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡ、または対応するｃＲＮＡの発現を可能にする前記発現ベクターは、各プラスミドが、８つのｖＲＮＡ  ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡの１つに相補的な１つのｃＤＮＡを含有しており、ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターの制御下にある、異なる８つのプラスミドを含む。したがって、前記一式の発現ベクターは、Ｎｅｕｍａｎｎら、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６（１６）：９３４５〜９３５０またはＦｏｄｏｒら、１９９９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３（１１）：９６７９〜９６８２に記載されている８つのプラスミドを含む。別の実施形態では、インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡ、または対応するｃＲＮＡの発現を可能にする一式の発現ベクターは、Ｎｅｕｍａｎｎら、２００５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０２（４６）：１６８２５〜１６８２９に記載のとおり、それぞれがＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびポリメラーゼターミネーターの制御下にある、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡに相補的な８つのｃＤＮＡを含有している、１つのプラスミドである。別の実施形態では、インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡ、または対応するｃＲＮＡの発現を可能にする一式の発現ベクターは、たとえば、２つの異なるプラスミドを含み、１つのプラスミドが、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターの制御下にある、それぞれがＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ  ｖＲＮＡのそれぞれに相補的である、６つのｃＤＮＡを含有しており、１つのプラスミドが、それぞれがＨＡおよびＮＡ  ｖＲＮＡのそれぞれに相補的であり、それぞれがＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターの制御下にある、２つのｃＤＮＡを含有している。ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターの制御下にある、８つのＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡ、または対応するｃＲＮＡの１つに相補的な、１つのｃＤＮＡを含有しているプラスミドは、前記ｃＤＮＡを、配列番号：２の配列を含むベクターにクローン化して得ることが好ましい。前記各プラスミドは、配列番号：１０の配列を含む、またはそれからなるベクター、すなわち、万能���ＳＰ−ｆｌｕプラスミドに、前記ｃＤＮＡをクローン化して得ることがさらに好ましい。
【０１２８】
特に好ましい実施形態では、一式の発現ベクターは、
−  各プラスミドが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合するプロモーターの制御下にある、４種のウイルスＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰタンパク質の１つをコードしているｍＲＮＡに相補的な１つのｃＤＮＡを含有している、異なる４つのプラスミド、たとえば、実施例の第１．８節に記載のとおりに、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰをコードするｃＤＮＡがクローン化された、Ｆｏｄｏｒら、１９９９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３（１１）：９６７９〜９６８２に記載のプラスミドまたはｐＶＡＸ１プラスミドと、
−  各プラスミドが、ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターの制御下にある、８つのＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡ、または対応するｃＲＮＡの１つに相補的な１つのｃＤＮＡを含有しており、前記ｃＤＮＡを万能ｐＳＰ−ｆｌｕプラスミドなどの本発明によるベクターにクローン化することにより得たものである、異なる８つのプラスミドと
を含む。
【０１２９】
好ましくは、インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡを発現し得るベクターは、それぞれ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｃＤＮＡがクローン化されている、本発明によるベクターである。
【０１３０】
次いで、インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰタンパク質を発現し得るベクターは、たとえば、ｐＶＡＸ１プラスミド（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、ＦＲ）でよい。
【０１３１】
本発明の別の実施形態では、本発明の方法により産生される感染性インフルエンザウイルスは、季節性もしくは汎流行性インフルエンザウイルスなどの野生型インフルエンザウイルス、再集合体インフルエンザウイルス、キメラインフルエンザウイルス、またはさらに弱毒インフルエンザウイルスでもよい。
【０１３２】
本発明の方法により産生される前記感染性インフルエンザウイルスは、再集合体インフルエンザウイルスであることが好ましい。
【０１３３】
さらに好ましくは、前記感染性インフルエンザウイルスは、再集合体キメラインフルエンザウイルスである。
【０１３４】
産生される感染性インフルエンザウイルスは、Ａ株、Ｂ株、またはＣ株のどの亜型でもよい。ウイルスは、Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ａ／Ｈ５Ｎ１、Ａ／Ｈ７Ｎ１、またはＢ株などの、ヒトに感染するウイルス株にすることができる。Ａ／Ｈ５Ｎ１、Ａ／Ｈ５Ｎ２、Ａ／Ｈ５Ｎ８、Ａ／Ｈ５Ｎ９、Ａ／Ｈ７Ｎ１、Ａ／Ｈ７Ｎ３、Ａ／Ｈ７Ｎ７株などの、鳥に感染するウイルス株にすることもできる。ウマ（Ａ／Ｈ３Ｎ８株）、ブタ（Ａ／Ｈ１Ｎ１；Ａ／Ｈ３Ｎ２またはＡ／Ｈ１Ｎ２株）などに感染するウイルス株にすることもできる。
【０１３５】
産生される感染性インフルエンザウイルスは、ヒト季節性インフルエンザの原因であるものでもよい。詳細には、本発明による前記の産生されるインフルエンザウイルスは、Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、またはＢ株でよい。鳥インフルエンザの原因であるウイルスにすることもできる。
【０１３６】
本発明により産生される感染性インフルエンザウイルスは、汎流行性インフルエンザの原因であるものにできる。詳細には、前記産生されるインフルエンザウイルスは、たとえば、Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ５Ｎ１、またはＡ／Ｈ７Ｎ１株にすることができる。
【０１３７】
好ましくは、感染性インフルエンザウイルスは、再集合体感染性インフルエンザウイルスである、すなわち、少なくとも２種のドナーウイルス由来の遺伝物質を含有している。
【０１３８】
Ａ型インフルエンザワクチンの製造に有用なＡ型再集合体ウイルスの例は、それぞれ６つまたは５つのｖＲＮＡが、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のような、産生基質上で良好な成長能力を有するドナーウイルスからのものであり、抜けているｖＲＮＡが、季節性または汎流行性ウイルスからのＨＡ、ＮＡ分節、およびことによるとＰＢ１である、６：２型または５：３型のものである。再集合体は、６：２型のＨ１Ｎ１ウイルスであるとき、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスからの６つのｖＲＮＡ（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ  ＮＰ、Ｍ、ＮＳ）と、季節性または汎流行性ウイルスからのＨＡおよびＮＡ  ｖＲＮＡとを含んでよい。
【０１３９】
詳細には、６：２型のＡ型再集合体ウイルスの場合において、６つのｖＲＮＡ分節は、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルス由来でよく、配列番号：１３の配列のＰＡ  ｖＲＮＡ、配列番号：１４の配列のＰＢ１  ｖＲＮＡ、配列番号：１５の配列のＰＢ２  ｖＲＮＡ、配列番号：１６の配列のＮＰ  ｖＲＮＡ、配列番号：１７の配列のＭ  ｖＲＮＡ、配列番号：１８の配列のＮＳ  ｖＲＮＡを含む、またはこれらからなるものでよい。
【０１４０】
インフルエンザＢ型ワクチンの製造に有用なＢ型再集合体ウイルスは、たとえば、ＰＢ２およびＮＰ  ｖＲＮＡが、Ｂ／Ｌｅｅ／４０ウイルスからのものであり、ＰＡおよびＮＳ  ｖＲＮＡがＢ／パナマ／４５／９０ウイルスからのものであり、ＨＡ、ＮＡ、ＰＢ１、およびＭ  ｖＲＮＡが、Ｂ／Ｈｕｂｅｉ−Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５８／２０９と呼ばれる季節性Ｂウイルスからのものである、２：２：４型（ニューヨーク医科大学より提供）である。
【０１４１】
産生される感染性インフルエンザウイルスは、キメラインフルエンザウイルス、特に、キメラ再集合体インフルエンザウイルスでもよく、さらにより詳細には、前記キメラインフルエンザウイルスは、キメラインフルエンザＨＡおよび／またはＮＡ  ｖＲＮＡを含有している。
【０１４２】
一部の実施形態では、前記ＨＡまたはＮＡ  ｖＲＮＡは、キメラである。
【０１４３】
前記キメラインフルエンザＨＡまたはＮＡ  ｖＲＮＡは、キメラＨＡまたはＮＡタンパク質をコードしていることが好ましい。このＨＡまたはＮＡ  ｖＲＮＡは、ドナーウイルス（Ａ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）やＢ／Ｌｅｅ／４０など）からのＨＡ  ｖＲＮＡまたはＮＡ  ｖＲＮＡ断片の１つまたはそれ以上のドメインと、季節性または汎流行性インフルエンザウイルスからのＨＡまたはＮＡ  ｖＲＮＡの１つまたはそれ以上のドメインとを含む。詳細には、季節性または汎流行性ウイルスのＨＡ  ｖＲＮＡの前記ドメインは、ＨＡ１および／もしくはＨＡ２などのＨＡの抗原性外部ドメインをコードしているｍＲＮＡに相補的であり、または季節性もしくは汎流行性ウイルスのＮＡ  ｖＲＮＡの前記ドメインは、前記季節性または汎流行性ウイルスのＮＡの抗原性外部ドメインをコードしているｍＲＮＡに相補的である。
【０１４４】
たとえば、前記キメラＨＡ  ｖＲＮＡは、ドナーウイルス由来の２つのＮＣＲ（非コード領域）ドメイン、ＳＰ（シグナルペプチド）ドメイン、ＨＡ２ドメイン、ＴＭ（膜貫通）ドメイン、およびＣｙｔｏ（細胞質）ドメインを含有しているが、ＨＡ１ドメインは、季節性インフルエンザウイルスまたは汎流行性インフルエンザウイルス由来である。
【０１４５】
インフルエンザウイルスＡ型の場合では、キメラＨＡ  ｖＲＮＡは、ドナーＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスからの２つのＮＣＲ、ＳＰ、ＨＡ２、ＴＭ、およびＣｙｔｏドメイン、ならびに季節性または汎流行性インフルエンザＡ型ウイルスからのＨＡ１ドメインを含有していることが好ましい。
【０１４６】
インフルエンザウイルスＡ型の場合において、キメラＨＡ  ｖＲＮＡは、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ドナーウイルスからの、それぞれ配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、および２４の配列の、２つのＮＣＲ、ＳＰ、ＨＡ２、ＴＭ、およびＣｙｔｏドメイン、ならびに季節性または汎流行性インフルエンザＡ型ウイルスからのＨＡ１ドメインを含有していることがさらに好ましい。
【０１４７】
インフルエンザウイルスＢ型の場合では、キメラＨＡ  ｖＲＮＡは、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）やＢ／Ｌｅｅ／４０などのドナーウイルスからのＮＣＲ、ＳＰ、ＨＡ２、ＴＭ、Ｃｙｔｏドメイン、および季節性Ｂ型ウイルスからのＨＡ１ドメインを含有していることが好ましい。
【０１４８】
キメラＮＡ  ｖＲＮＡの場合では、ｖＲＮＡは、ドナーウイルス由来のＮＣＲ、ＴＭ、Ｃｙｔｏ、およびＳｔａｌｋドメインを含有しているが、外部ドメインと呼ばれるドメインは、季節性または汎流行性インフルエンザウイルス由来である。インフルエンザウイルスＡ型の場合では、キメラＮＡ  ｖＲＮＡは、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ドナーウイルスからのＮＣＲ、ＴＭ、Ｃｙｔｏ、およびＳｔａｌｋドメイン、ならびに季節性または汎流行性インフルエンザウイルスからの外部ドメインを含有していることが好ましい。インフルエンザウイルスＡ型の場合では、キメラＮＡ  ｖＲＮＡは、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ドナーウイルスからの、それぞれ配列番号：２５、２６、２７、２８、および２９の配列の、ＮＣＲ、ＴＭ、Ｓｔａｌｋ、およびＣｙｔｏドメイン、ならびに季節性または汎流行性ウイルスからの外部ドメインを含有していることがさらに好ましい。インフルエンザウイルスＢ型の場合では、キメラＮＡ  ｖＲＮＡは、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）やＢ／Ｌｅｅ／４０などのドナーウイルスからのＮＣＲ、ＴＭ、Ｓｔａｌｋ、およびＣｙｔｏドメイン、ならびに季節性Ｂ型ウイルスからの外部ドメインを含有していることが好ましい。
【０１４９】
宿主細胞
本発明はまた、上で定義したとおりの一式の発現ベクターを含むＣＨＯ細胞に関する。
【０１５０】
前記ＣＨＯ細胞および感染性インフルエンザウイルスは、上述のとおりである。
【０１５１】
したがって詳細には、前記ＣＨＯ細胞は、上述のとおりのＣＨＯ−Ｋ１細胞である。
【０１５２】
特定の実施形態では、前記一式の発現ベクターは、
（ｉ）インフルエンザＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰタンパク質を発現することができ、各プラスミドが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合するプロモーターの制御下にある、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰタンパク質の中から選択されるウイルスタンパク質の１つをコードしているｍＲＮＡに相補的な１つのｃＤＮＡを含有している、異なる４つのプラスミドを含む、発現ベクターと、
（ｉｉ）インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡ、または対応するｃＲＮＡを発現することができ、各プラスミドが、げっ歯類ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターの制御下にある、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡ  ｖＲＮＡの中から選択される８つのｖＲＮＡまたは対応するｃＲＮＡの１つに相補的な１つのｃＤＮＡを含有しており、前記ｃＤＮＡ配列を本発明によるベクターにクローン化して得たものである、異なる８つのプラスミドを含み、げっ歯類ＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターを含むと理解される、発現ベクターとを含む。
【０１５３】
インフルエンザＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰタンパク質を発現し得る前記発現ベクターは、実施例の第１．８節に記載のとおりに、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰの中から選択されるウイルスタンパク質の１つをコードしているｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡをそれぞれが含有している、Ｆｏｄｏｒら、１９９９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３（１１）：９６７９〜９６８２に記載のプラスミド、またはｐＶＡＸ１プラスミドを含むものでよい。
【０１５４】
本発明による前記ベクターは、ハムスターＲＮＡポリメラーゼＩに結合するプロモーターを含むことが好ましい。別法として、ｖＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを含有している８つのプラスミドのプロモーターは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。その場合では、一式の発現ベクターは、Ｄｅ  Ｗｉｔら、２００７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、８８（第４部）：１２８４〜１２８７に記載のとおり、Ｔ７ポリメラーゼをコードしているｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを含有した追加プラスミドを含有している（合計数は１３である）。
【０１５５】
本発明はまた、インフルエンザＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰタンパク質を安定して発現させる組換えＣＨＯ細胞に関する。特定の実施形態では、そのような組換えＣＨＯ細胞は、インフルエンザＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ  ｖＲＮＡを発現し得る一式の発現ベクターを含有していてもよい。
【０１５６】
前記組換えＣＨＯ細胞は、組換えＣＨＯ−Ｋ１細胞であることが好ましい。
【０１５７】
安定した細胞を樹立する方法は、当業者によく知られている。たとえば、前記方法は、Ｗａｎｇら、２０１２、Ｇｅｎｅｔ  Ｍｏｌ  Ｒｅｓ、１１（２）：１４４２〜１４４８、またはＬｉｕら、２０１１、Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｇｏｎｇ  Ｃｈｅｎｇ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ、２７（５）：７４７〜７５４に記載されている。
【０１５８】
医薬組成物の調製方法
本発明はまた、
ａ）以前に記載したとおりの本発明のいずれかの実施形態による方法によってインフルエンザウイルスを産生するステップと、
ｂ）感染性インフルエンザウイルスを、ＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ−Ｋ１細胞中で増加させた後、収穫するステップと、
ｃ）収穫した感染性インフルエンザウイルスを精製する工程と、
ｄ）場合により、精製したウイルスを不活化する工程と、
ｅ）精製したウイルスを薬学的に許容される担体と混合する工程と
を含む、インフルエンザワクチン組成物の調製方法に関する。
【０１５９】
精製は、短時間でよく、収穫した感染性ウイルスを一般に清澄化した後、遠心分離によってウイルスを濃縮する工程に限定してよい。精製は、たとえばスクロース密度勾配法（ＥＰ０７７６０３６２）によって実施される遠心分離工程によって補うことができる。ウイルスを精製するのに、クロマトグラフィー法を実施してもよい。こうして、精製された全ウイルスの懸濁液が得られ、それをさらに加工して、最終ワクチン組成物を得ることができる。精製されたウイルス懸濁液に、それに続く処理を施してもよい。こうして、インフルエンザウイルス派生製品が得られる。ウイルス懸濁液は、たとえば、断片化もしくは分割されたウイルス、ビロソームに基づくワクチン、またはインフルエンザウイルスヘマグルチニンを含有するサブユニットワクチンを製造するために、当業者によく知られている方法により、界面活性剤または脂質溶媒を使用して断片化することができる。精製されたウイルスから得られる、断片化または分割されたウイルス、インフルエンザウイルスヘマグルチニンを含有しているビロソーム、およびインフルエンザウイルスヘマグルチニンを含有するサブユニットワクチンは、インフルエンザウイルス派生製品であるとみなされる。
【０１６０】
最終ワクチン組成物は、全不活化インフルエンザウイルスまたは弱毒インフルエンザウイルスから構成される場合がある。
【０１６１】
ウイルス懸濁液の不活化は、β−プロピオラクトン（Ｅ．Ｂｕｄｏｗｓｋｙら、１９９１、Ｖａｃｃｉｎｅ、９：３１９〜３２５；１９９１、Ｖａｃｃｉｎｅ、９：３９８〜４０２；１９９３、Ｖａｃｃｉｎｅ、１１：３４３〜３４８）、エチレンイミンもしくは誘導体（Ｄ．Ｋｉｎｇ  １９９１、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．３５：５０５〜５１４）、またはホルモール（ＥＰ０７７６０３６２）を使用する従来の手段によって実施する。ウイルスの不活化は、精製工程の前または後に実施することができる。
【０１６２】
最終ワクチン組成物は、一般に、薬学的に許容される担体を用いて配合される。
【０１６３】
「薬学的に許容される担体」とは、活性薬剤の安定性、無菌性、および送達性を高めるために医薬およびワクチン配合物に対して一般に使用される、ヒトにおいていかなる二次的反応、たとえば、アレルギー反応も生じない、任意の溶媒、分散媒、チャージ（ｃｈａｒｇｅ）などを意味する。賦形剤は、選ばれた医薬形態、投与の方法および経路に基づき選択される。適当な賦形剤、および医薬配合物に関しての要件は、当分野における参考文献を代表する、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（第１９版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５））に記載されている。薬学的に許容される賦形剤の例は、水、リン酸緩衝食塩液、０．３％グリシン溶液である。
【０１６４】
不活化全ウイルスに基づくワクチン組成物は、１種またはそれ以上のアジュバントを含んでもよい。こうしたワクチンは、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウム、ミョウバンなどのアルミニウム塩が配合されてもよいし、または油中水もしくは水中油エマルションに配合してもよい。インフルエンザに対する体液性および／または細胞性応答を増大し得るどんなアジュバントを使用してもよい。非限定的なアジュバント配合物の例として、ＭＦ５９（登録商標）エマルション、リポソーム系配合物、およびＭＰＬ、コリネバクテリウム・パルバム、サポニン、リゾレシチン、プルロニック誘導体、またはこれらの組合せに基づく配合物が挙げられる。ＴＬＲ作動薬を使用することもできる。
【０１６５】
本発明による方法によって得られるワクチンは、インフルエンザに対するヒトおよび動物の防御において使用するためのものである。
【０１６６】
獣医学分野では、ワクチンは、鳥インフルエンザ予防分野において主に使用されるが、ウマ科の仲間、特にウマ、イヌ科の仲間、特にイヌ、ネコ科の仲間、特にネコ、ブタ科の仲間、特にブタ、イタチ科、特にミンクおよびフェレット、ならびに鳥の種、特に、雌鳥、カモ、シチメンチョウ、ウズラ、ホロホロチョウ、ガチョウ、およびダチョウにおけるインフルエンザ症状および／またはウイルス分泌の予防または軽減に使用することもできる。
【０１６７】
ヒトにおいて、ワクチンは、流行性インフルエンザおよび汎流行性インフルエンザ予防の分野で使用される。流行性インフルエンザには、流行の原因であるウイルスからのＨＡとの抗原的関連性が存在し、一部にしか有効でないとしても、ある特定の免疫が存在する、インフルエンザウイルスの１種（またはそれ以上）の株との接触（感染）またはそれによる免疫化によってすでに感作されているヒト集団は冒されないが、汎流行性インフルエンザには、この新たなウイルスのＨＡが、先行する循環ウイルスとの抗原的関連性をもたないまたはほとんどもたないために、新たなウイルスに感作されていないヒト集団が冒される。
【０１６８】
流行性インフルエンザワクチンは、すでに循環した先行ウイルスとの抗原的関連性を有する循環季節性インフルエンザウイルスによってもたらされる季節性インフルエンザ形態に対するヒト集団の防御を意図するものである。現在、流行性インフルエンザの原因であるインフルエンザウイルスは、Ａ型でＨ１Ｎ１もしくはＨ３Ｎ２亜型に属するか、またはＢ型である。
【０１６９】
汎流行性インフルエンザワクチンは、ＨＡに関して先行循環ウイルスとの抗原的関連性をもたない新たなインフルエンザウイルスである汎流行性インフルエンザウイルスによる感染に対するヒト集団の防御を意図するものである。現在、汎流行性インフルエンザの原因であるインフルエンザウイルスは、Ａ／Ｈ１Ｎ１ウイルスである。
【０１７０】
流行性または汎流行性インフルエンザワクチンは、生弱毒ワクチンまたは不活化ワクチンの形態でよいが、汎流行性インフルエンザの予防には不活化ワクチンが好ましい。ワクチンは、一価ワクチン（単一のインフルエンザウイルス株から調製されたワクチン）の形態でも、または多価ワクチン（いくつかのインフルエンザウイルス株から調製されたワクチン）の形態でもよい。流行性インフルエンザワクチンの組成物は、現在、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１ウイルスならびにＢ型ウイルスから調製された三価ワクチンの形態である。不活化ワクチンは、一般に、全ウイルス、断片化されたウイルス（分割されたウイルス）、もしくはビロソームの形態、またはＨＡを含有しているサブユニット形態であり、場合により、上で言及したものなどの、１種またはそれ以上のアジュバントを含有する。生弱毒ワクチンは、一般に、経口または経鼻投与されて、粘膜免疫の展開を促進するが、不活化ワクチンは、非経口（筋肉内もしくは皮下）、皮内、もしくはさらに粘膜（鼻腔内）投与することもでき、またはＷＯ０１／２２９９２に記載のとおり、異なる２つの投与経路を組み合わせて投与することさえできる。免疫化スキームは、一般に、注射、または注射に続いての追加免疫に備えるものである。投与するワクチン用量は、個体の年齢およびアジュバントの有無に応じて決まる。従来、ワクチン用量は、ワクチンに含有されている各ワクチン株のＨＡ  １５μｇと同等のものを含有する。この用量は、ワクチンにアジュバント添加するとき、およそ１〜２μｇのＨＡに減らしてもよく、または高齢の個体もしくは免疫不全に陥っている個体では３０μｇのＨＡもしくはさらにそれ以上に増やしてもよい。
【０１７１】
組成物は、従来の皮下注射器、またはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）から市販されているものなどの安全注射器、またはジェットインジェクターを使用して投与することができる。皮内投与については、Ｍａｎｔｏｕｘ技術を使用して従来の皮下注射器を用いることができ、またはＢＤ  Ｓｏｌｕｖｉａ（商標）微量注入システム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）などの特殊化された皮内送達デバイスを用いてもよい。
【０１７２】
投与する組成物の体積は、投与方法に応じて決まる。皮下注射の場合では、体積は、一般に、０．１〜１．０ｍｌの間、好ましくはおよそ０．５ｍｌである。
【０１７３】
本出願全体を通して、種々の参考文献を引用する。こうした参考文献の開示は、参照によって本開示に組み入れる。
【０１７４】
本発明について、以下の図面および実施例によってさらに例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】ワクチン再集合体として使用できることになる組換えインフルエンザウイルスを迅速に生成するための能率化されたスキームの実例を示す図である。ｐＳＰ−ｆｌｕは、配列番号：１０の配列からなる万能ベクターに該当する。
【図２】万能ｐＳＰ−ｆｌｕプラスミドを使用するクローン化戦略を示す図である。カナマイシン耐性遺伝子の位置を白く示し、ＰＯＬ１プロモーターおよびリボザイムを黒く示す。プラスミドは、ＢｂｓＩで直線化し、端にプロモーターおよびリボザイムからの１７ヌクレオチドを含有しているウイルスｃＤＮＡと混合した後、コンピテント大腸菌を形質転換させた。ｃＤＮＡは、末端相補性領域内で環状プラスミドに再結合して、ＰＯＬ  Ｉプロモーターとリボザイムの間にウイルスゲノム分節が導入された。
【発明を実施するための形態】
【０１７６】
実施例
１．  材料および方法
１．１．  細胞
ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）の懸濁液は、１２５ｍＬのシェーカーフラスコ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））によって補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ  ＣＤ  ＣＨＯ融合培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、ＦＲ）で、撹拌しながら培養した。接着性ＭＤＣＫ細胞（ＣＣＬ−３４）およびＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−８１）は、組織培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において、それぞれ、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、または０．１％ポビドンＫ３０（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）によって補充したＶＰ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で培養した。ＣＥＰ細胞は、１０日齢の特定病原体除去（ＳＰＦ）ニワトリ胚（Ｖａｌｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉａ、Ｏｓｔｅｒｈｏｌｚ−Ｓｃｈａｒｍｂｅｃｋ、ＧＥ）から採取し、組織培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において、５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって補充したＤＭＥＭＦ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ（ＨＡＭ）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で培養した。すべての細胞培養物を、９５％空気および５％ＣＯ２の雰囲気中にて３７℃で保った。
【０１７７】
１．２．  受容体分析
異なる細胞型の表面におけるＳｉａ２−３ＧａｌおよびＳｉａ２−６Ｇａｌ残留物発現の分析を、ジゴキシゲニングリカン識別キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｎ、ＧＥ）を使用して実行した。２００万個の細胞を、１倍ＰＢＳ（Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、ＦＲ）中で２回、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する緩衝液ｐＨ７．５中で１回洗浄した。細胞を、ジゴキシゲニン標識レクチンである、Ｓｉａ２−６Ｇａｌ残留物に特異的なセイヨウニワトコアグルチニン（ＳＮＡ）（１／１０００）またはＳｉａ２−３Ｇａｌに特異的なイヌエンジュアグルチニン（ＭＡＡ）（１／３００）と共に室温で１時間インキュベートした。対照細胞は、レクチンなしでインキュベートした。細胞をＴＢＳ（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で２回洗浄し、室温（暗所）にて１時間、１／４０抗ジゴキシゲニン−フルオレセインＦａｂ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）で処理した。１倍ＰＢＳ（Ｅｕｒｏｂｉｏ）中で２回洗浄した後、Ｇｕａｖａキャピラリーサイトメーターにおいて細胞を緑色蛍光強度について分析した。
【０１７８】
１．３．  ウイルス
インフルエンザＢ／ブリスベン／６０／０８ウイルス、ならびに再集合体ワクチンウイルスＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ１１６、Ａ／ベトナム／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１）ｒｇ１４、およびＡ／カリフォルニア／０７／０９（Ｈ１Ｎ１）Ｘ１７９Ａを、ＮＩＢＳＣ（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から得た。ウイルスは、孵化鶏卵（Ｖａｌｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉａ）において繁殖させ、感染尿膜腔液から収穫した。
【０１７９】
１．４．  ウイルス感染
感染の４時間前に、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳ）において、細胞を、各細胞型に適した無血清培養培地に、最終体積を１ｍｌとして、１．６×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播いた。感染は、３５℃にて１時間、種々の感染多重度（ＭＯＩ）で実行した。ブタトリプシン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を含有する各細胞型に適した血清なしの無血清培養培地（２ｍｌ）を加え、細胞を８％ＣＯ２中にて３５℃で４日間インキュベートした。
【０１８０】
１．５．  赤血球凝集検定
ＨＡ検定は、Ｖ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において培養上清５０μｌを１倍ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で２倍に段階希釈することにより実行した。引き続いて、０．５％ニワトリ赤血球細胞（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ、Ａｌｂａ−ｌａ−Ｒｏｍａｉｎｅ、ＦＲ）５０μｌを各ウェルに加えた。プレートを４℃で１時間インキュベートし、各ウェルについて、赤血球凝集または赤血球凝集の欠如を視覚的に決定した。
【０１８１】
１．６．  ＴＣＩＤ５０検定
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、ＭＤＣＫ細胞を、１μｇ／ｍｌのブタトリプシン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）で補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））に、２．７×１０６細胞／ｃｍ２の密度で播いた。細胞を、１：１０の連続ウイルス希釈物５０μｌで感染させ、３５℃で４日間インキュベートした。次いで、こうした培養物からの上清を赤血球凝集検定において試験した。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの統計的方法に従って、ＴＣＩＤ５０力価を算出した（Ｄａｖｉｄ  Ｊｏｈｎ  Ｆｉｎｎｅｙ、１９５２、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｓａｙ、Ｈａｆｎｅｒ  ｅｄｉｔｏｒ）。
【０１８２】
１．７．  遺伝子導入効率
２００万個の細胞を２００×ｇで１０分間遠心分離し、室温でｃＧＭＰ（現行の優良医薬品製造基準）ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、ＣＨ）１００μｌに再懸濁し、ｐＧＦＰ（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）プラスミド１０μｇを加えた。ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）によって、異なるプログラムを使用して実行した。６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、各細胞型に最適な培地にて、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間、細胞をインキュベートした。Ｇｕａｖａキャピラリーサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳ）において、細胞を緑色蛍光強度について分析した。
【０１８３】
１．８．  プラスミドＤＮＡ
感染性Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのレスキューのための１２のプラスミドは、以前より、Ｆｏｄｏｒら、１９９９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３（１１）：９６７９〜９６８２に記載されている。以下で言及するとおりの多少の改変を加えて、同じ方法を適用した。
【０１８４】
Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（ＷＳＮ）ウイルスからのＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰタンパク質のコード領域を、ｐＶＡＸ１プラスミド（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、ＦＲ）に、ＣＭＶプロモーターとウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ−ポリＡ）部位の間においてクローン化した。ｐＶＡＸ１プラスミド（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、ウイルスＲＮＡ発現用に改変した。簡潔に述べると、直線化のためのＢｂｓＩ部位、ＮｏｔＩおよびＳｂｆＩ部位を含有しているリンカーによって隔てられたヒトＰＯＬ１プロモーターおよび肝炎デルタリボザイム配列に対応するＤＮＡ断片を、ｐＶＡＸ１プラスミドにクローン化し、ＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨ−ポリＡ部位を除去した。得られるプラスミドを「万能ｐＳＰ−ｆｌｕ」と名付けた。
【０１８５】
ウイルスＲＮＡは、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、ＦＲ）を用いて感染尿膜腔液から抽出し、ｖＲＮＡに相補的なゲノムｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩワンステップＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い、肝炎デルタリボザイムからの１７ヌクレオチド（５’−ｃｔｇｇｇａｃｃａｔｇｃｃｇｇｃｃ）（配列番号：１１）およびＰＯＬ１プロモーターからの１７ヌクレオチド（５’−ｔｇｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇｔｔａｔｔ）（配列番号：１２）をそれぞれ含有している一対のプライマーを使用して得た。
【０１８６】
温度サイクルパラメータは、６０分間４７℃、２分間９４℃、次いで４０サイクル（１５秒間９４℃、３０秒間６０℃、２分間７２℃）、さらに５分間７２℃とした。引き続いて、各断片をＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ抽出キット（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）で精製し、ＢｂｓＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳ）によって予め直線化された万能ｐＳＰ−ｆｌｕプラスミドに、Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ＰＣＲクローン化キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ、Ｓａｉｎｔ  Ｇｅｒｍａｉｎ  ｅｎ  Ｌａｙｅ、ＦＲ）を使用する相同組換えによってクローン化した。Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  Ｍａｘｉ  ＥＦキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、ＧＥ）を使用して、無エンドトキシンプラスミドＤＮＡ調製物を生成した。
【０１８７】
１．９．  逆遺伝学
１００万個のＶｅｒｏ細胞と１００万個のＣＨＯＫ１細胞を混合し、２００×ｇで１０分間遠心分離し、室温でｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖ（Ｌｏｎｚａ）１００μｌに再懸濁した。８つのｖＲＮＡ発現プラスミドそれぞれ１μｇと４つのタンパク質発現プラスミドそれぞれ０．５μｇの混合物を細胞に加え、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用い、Ｕ−０２３プログラムを使用して、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを実行した。細胞を、６ウェルプレートにおいて、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で補充したＥｘ−ｃｅｌｌ（商標）ＣＤ  ＣＨＯ融合培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）中でインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした後、組換えトリプシン（ＴｒｙＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で補充した同じ培地において２００万個のＣＨＯＫ１細胞を加え、回転台上において３５℃、８％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１８８】
１．１０．  阻害赤血球凝集検定（ＩＨＡ）
国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ）から購入したＡ／カリフォルニア／０７／０９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＨＡに特異的な血清を、コレラ菌のＲｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄｅｓｔｒｏｙｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ（ＲＤＥ、Ｓｉｇｍａ、１０ｍＵ／ｍＬ）によって３７℃で１８時間処理した。ＲＤＥを５６℃で１時間かけて不活化させた。次いで、ＲＤＥ処理した血清を、５％シチメンチョウ赤血球細胞（ＲＢＣ）と共に４℃で２時間インキュベートし、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、処理した血清の段階希釈物を、試験するウイルス４ＨＡＵと共に室温で１時間、次いで０．２５％ニワトリＲＢＣと共に４℃で１時間インキュベートした。ＩＨＡ力価は、ウイルスが媒介となるＲＢＣの赤血球凝集を阻害する、血清の最高希釈度によって決定される。
【０１８９】
２．  結果
２．１．  細胞成長
ＭＤＣＫ、ＣＨＯ−Ｋ１、Ｖｅｒｏ、およびＣＥＰ細胞について、ＣＨＯ−Ｋ１については懸濁液中で、または他の細胞型については接着として、各細胞型の最も適当な培地において成長を維持し得るその能力を評価した。１世代に必要な存続期間を推定することにより、集団倍加レベル（ｐｄｌ）を各細胞型について決定した。表１に見られるように、ＭＤＣＫおよびＣＨＯ−Ｋ１は、Ｖｅｒｏ細胞（３８時間）およびＣＥＰ細胞（４８時間）に比べて、短いｐｄｌ（それぞれ２３時間および１８時間）を示した。ＣＨＯ−Ｋ１およびＶｅｒｏ細胞系は、血清なしで培養されたことに留意することが重要である。
【０１９０】
【表２】
0006335167.tif 000003
【０１９１】
成長研究は、３７℃で６日間かけて実行し、１世代に必要な時間を推定することにより、集団倍加レベル（ｐｄｌ）を算出した。集団倍加レベル（ｐｄｌ）は、比Ｔ／Ｎから算出され、ここで、Ｔは、細胞培養の継続時間であり、Ｎは、次式Ｃｆ＝Ｃｉ×２Ｎ［式中、ＣｉおよびＣｆは、それぞれ、初期および最終細胞濃度である］から算出される細胞世代数である。値は、３つの独立した実験の平均および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。
【０１９２】
２．２．  インフルエンザ受容体
感染の際、鳥ウイルスならびに卵順応ヒトウイルス変異株は、Ｓｉａ２−３Ｇａｌ結合に主に結合するのに対し、ヒトから直接単離された臨床分離株は、Ｓｉａ２−６Ｇａｌ結合に優先的に結合する（Ｓｕｚｕｋｉら、２０１１、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、７０５：４４３〜４５２）。
【０１９３】
異なる細胞型の表面上にあるインフルエンザウイルス受容体の２つの型を検出するために、（Ｓｉａ２−３Ｇａｌ結合に特異的な）ＭＡＡレクチンおよび（Ｓｉａ２−６Ｇａｌ結合に特異的な）ＳＮＡレクチンを使用した。細胞は、ジゴキシゲニン標識レクチンである（Ｓｉａ２−６Ｇａｌに特異的な）セイヨウニワトコアグルチニン（ＳＮＡ）または（Ｓｉａ２−３Ｇａｌに特異的な）イヌエンジュアグルチニン（ＭＡＡ）と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞を抗ジゴキシゲニン−フルオレセインＦａｂ断片と共にインキュベートし、Ｇｕａｖａキャピラリーサイトメトリーシステムを使用して、蛍光強度について分析した。表２に示す値は、３つの独立した実験の平均および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。
【０１９４】
ＭＡＡおよびＳＮＡは、ＶｅｒｏおよびＭＤＣＫ細胞（８０％を上回る細胞）の表面に強力に結合しており、ＭＤＣＫおよびＶｅｒｏ細胞上で２種の受容体（Ｓｉａ２−３ＧａｌおよびＳｉａ２−６Ｇａｌ）が発現されたことが示された（表２）。さらに、ＭＡＡは、ＣＥＰ細胞の７３％に結合したのに対し、ＳＮＡは、ＣＥＰ細胞の２３％にしか結合せず、多数のＣＥＰ細胞がＳｉａ２−３Ｇａｌ受容体を発現させ、少数がＳｉａ２−６Ｇａｌを発現させたことが示された。ＣＥＰ細胞がヒト受容体よりはるかに多くの鳥受容体を発現させた理由は、ＣＥＰ細胞が鳥起源であることから説明できるはずである。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、Ｓｉａ２−６Ｇａｌ受容体を発現させず、Ｓｉａ２−３Ｇａｌ受容体を不十分にしか発現させない。
【０１９５】
【表３】
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【０１９６】
２．３．  ウイルス産生
インフルエンザウイルスの尿膜腔液を、事前順応なしで、試験する細胞系と直接接触させた。２種のインフルエンザＡ再集合体ウイルス（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ１１６およびＡ／ベトナム／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１）ｒｇ１４）ならびに１種のインフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブリスベン／６０／０８系統Ｂ／ビクトリア／２／８７）を試験した。種々のＭＯＩ（１０−１、１０−２、および１０−３）ならびにブタトリプシン濃度（０、１、２、５、および８μｇ／ｍＬ）を使用した。Ａ型インフルエンザウイルスについては感染から３日後、Ｂ型インフルエンザウイルスについては感染から４日後に、１０−１のＭＯＩおよび最も適当なトリプシン濃度で得られた結果を、各細胞型について示す（表３および表４を参照されたい）。
【０１９７】
【表４】
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【０１９８】
【表５】
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【０１９９】
Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ１１６およびＡ／ベトナム／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１）ｒｇ１４再集合体は、事前順応の必要なしに、試験した４種の細胞型において成長した。さらに、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ１１６再集合体ウイルスの最良の産生が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において観察され、最高のウイルス力価（＞１０７ＴＣＩＤ５０）が示された。Ａ／ベトナム／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１）ｒｇ１４再集合体ウイルスの産生は、すべての細胞型においてぴったりと同じであった（およそ１０３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）。
【０２００】
感染性Ｂ型ウイルスの産生に関しては、表４に示すとおり、Ｂ／ブリスベン／６０／０８ウイルスが、事前順応の必要なしに、３種の細胞系において十分に複製した。
【０２０１】
２．４．  感染性インフルエンザウイルスを逆遺伝学法によってレスキューすることによるウイルス産生
２．４．１．  細胞系が遺伝子導入を受け得る能力
感染性インフルエンザウイルスを生成し得る一式の発現ベクターによる遺伝子導入後に、異なる細胞型のウイルス産生能を試験することも重要である。第１の工程では、こうした異なる細胞型が遺伝子導入を受け得る、詳細には、動物起源の原材料の使用を伴わない材料による遺伝子導入を受け得る能力を試験することが重要である。Ａｍａｘａ（Ａｍａｘａ、Ｌｏｎｚａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって提供される、核を標的とするｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎ技術を細胞の遺伝子導入に使用し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現プラスミドを使用して、異なる細胞系の被遺伝子導入能を評価した。細胞をＶ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに再懸濁し、ｐＧＦＰプラスミドと共にインキュベートし、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒでｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎを施した。異なるプログラム（Ｕ−０２３、Ａ−０２４、Ｖ−００１、Ｔ−０３０、Ｌ−００５）を試験した。次いで、細胞を３７℃で１日インキュベートし、緑色蛍光細胞の百分率をＧｕａｖａサイトメトリーによって分析した。最適な遺伝子導入プログラムを用いて３つの独立した実験から算出したＧＦＰ発現細胞の百分率平均値および標準偏差を、表５に示す。
【０２０２】
【表６】
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【０２０３】
７０％を越える細胞がＧＦＰを発現させており、試験したすべての細胞系が、ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎによって遺伝子導入可能であることを示している。
【０２０４】
２．４．２．  インフルエンザｃＤＮＡクローン化工程の最適化
効率よくするために、通常は２種のＡ型ウイルスおよび１種のＢ型ウイルス由来の抗原性材料を含有するインフルエンザワクチンは、出現し、季節性インフルエンザまたは汎流行性インフルエンザの原因になる新たな循環ウイルスに応じて、毎年更新されなければならない。重要なことに、ＨＡおよびＮＡ抗原性材料は、新たな循環ウイルスの抗原性材料に対応するように更新されなければならない。逆遺伝学を実行するために、ＨＡおよびＮＡをコードする遺伝子は、毎年、または新たな循環ウイルスが特徴付けられたときに、ＰＯＬＩプロモーターの制御下にあるｖＲＮＡ発現プラスミドにクローン化しなければならない。内部Ａ／ＰＲ／８／３４ｖＲＮＡをコードしている他のｖＲＮＡプラスミドおよびタンパク質発現プラスミドは、通常１回しか構築されない。ｖＲＮＡ発現プラスミドにおけるクローン化工程は、未知のＨＡおよびＮＡ遺伝子に対して逆遺伝学を行うとき、非常に扱いに注意を要することになりかねないため、Ａ型およびＢ型ウイルスからの任意のインフルエンザ分節の組換えによるクローン化に使用することのできる万能逆遺伝学プラスミドが開発された。しかし、ｖＲＮＡ転写の正確な開始および停止のための要件が厳格であるために、組換え領域の選択は、劇的に制限される。したがって、ＰＯＬ１プロモーターの最後の１７ヌクレオチドおよび肝炎デルタリボザイムの最初の１７ヌクレオチドを含む、インフルエンザゲノムに特異的でない新たな組換えカセットを使用した。さらに、環状プラスミドを直線化するためのＢｂｓＩ、空のプラスミドを除外するためのＮｏｔＩおよびＳｂｆＩ部位を含む２８ヌクレオチドを、ＰＯＬ１プロモーターと肝炎デルタリボザイムの間に組み込んだ。「万能ｐＳＰ−ｆｌｕ」と名付けた、得られたプラスミドは、比較的小さく（２２０２ｐｂ）、カナマイシン耐性遺伝子を含有していた（図２）。クローン化用のインフルエンザｃＤＮＡを調製するために、ｖＲＮＡを逆転写して、組換え末端を含有しているｃＤＮＡとし、ＰＯＬ１プロモーターとリボザイムの間にクローン化した。この改良されたＲＮＡ産生プラスミドを使用して、インフルエンザＡおよびＢウイルスからのいくつかの遺伝子を、相同組換えによってクローン化した。陽性クローンの割合は、「容易な」クローン化については９０％を上回り、「困難な」クローン化については３０％であり、平均は、クローン化実験あたり１５０クローンであった。
【０２０５】
このように開発された万能ｐＳＰ−ｆｌｕプラスミドは、容易で迅速なインフルエンザゲノムクローニングのためのいくつかの改善点をもたらす。組換えカセットは、Ａ型およびＢ型ウイルスからのあらゆるインフルエンザＲＮＡ分節のクローン化に使用することができる。次に、直線化したベクターが、バックグラウンドコロニーを生成する空のプラスミドを含まなかったことを確実にするのは難しいため、万能ｐＳＰ−ｆｌｕプラスミドは、クローン化工程の後に、残存する空のプラスミドの除去に使用することのできる、３つの酵素部位（ＢｂｓＩ、ＳｂｆＩ、およびＮｏｔＩ）を含有している。切断点を認識部位の外側に含有しているＢｂｓＩ酵素による直線化によって、付着末端が生じ、プラスミドの再環状化が可能になった。
【０２０６】
２．４．３．  インフルエンザウイルスのレスキュー
逆遺伝学によって感染性インフルエンザウイルスをレスキューし得るその能力について、その良好な成長特性を根拠に、ＣＨＯ−Ｋ１およびＶｅｒｏ細胞系を試験した。
【０２０７】
逆遺伝学によるインフルエンザウイルスのレスキューに一般に使用されるブタトリプシンを、高度に精製され、動物起源の物質を含まない、Ｇｉｂｃｏの酵素（ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ）で差し替えた。最初の実験では、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスからのＨＡおよびＮＡ  ｖＲＮＡならびにＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスからの残りの６つのウイルス遺伝子（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ）を含有している再集合体ウイルスのレスキューを、１２のプラスミド（ヒトＰＯＬＩＩプロモーターの制御下でＰＢ１、ＰＢ２、ＮＡ、およびＮＰ  ｍＲＮＡの発現を可能にする４つのプラスミド、ならびにヒトＰＯＬＩプロモーターの制御下で８つのｖＲＮＡの発現を可能にする８つのプラスミド）のＶｅｒｏおよび／またはＣＨＯ−Ｋ１中へのｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎによって実行した。Ｖｅｒｏ細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞単独での遺伝子導入後には、ウイルス粒子が得られなかったが、Ｖｅｒｏ細胞をＣＨＯ−Ｋ１細胞と混合したとき、細胞混合物の上清における赤血球凝集検定によって、遺伝子導入から早くも２日後にウイルスが検出された。
【０２０８】
さらに、ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎを施したＶｅｒｏ／ＣＨＯ−Ｋ１の混合物において感染の徴候を可視化することは容易であった。実際に、４日間培養した後、プラスミドなしで遺伝子導入された細胞は、明らかに個別化されたのに対し、１２のプラスミドが遺伝子導入され、上清にウイルス粒子を排出する細胞は、凝集した。この技術を使用して、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの内部バックボーン（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ）を含有しており、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＣ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ１１６、Ａ／ソロモン諸島／０３／０６（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ１４５、Ａ／ベトナム／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１）ｒｇ１４、Ａ／ブリスベン／１０／０７ＩＶＲ−１４７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウルグアイ／７１６／０７（Ｈ３Ｎ２）Ｘ１７５Ｃ、およびＡ／ウィスコンシン／６７／０５（Ｈ３Ｎ２）Ｘ１６１ｂなどの異なるインフルエンザウイルスからのＨＡおよびＮＡタンパク質を発現させる、種々のインフルエンザウイルス再集合体ウイルスが、非常に急速にレスキューされた。
【０２０９】
得られた結果は、一つの実験から別の実験に大いに再現可能であり、大体の場合、遺伝子導入から５日後に、最適な力価が得られた。たとえば、Ａ／ベトナム／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１）ｒｇ１４からのＨＡおよびＮＡを含有している再集合体ウイルスは、Ｖｅｒｏ／ＣＨＯＫ１の混合物に３通りの異なるｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎプログラム（Ｕ−０２３、Ｕ−０２７、Ｆ−０１４）を使用して遺伝子導入された後、細胞培養上清中に、１２８ＨＡＵ／５０μｌという高い力価で産生された。上で挙げたＡ／Ｈ１Ｎ１またはＡ／Ｈ３Ｎ２ウイルスからのＨＡおよびＮＡを含有している他の再集合体ウイルスは、遺伝子導入から５日後に、同様の力価（２５６〜５１２ＨＡＵ／５０μｌにのぼる）に達した。対応するＴＣＩＤ５０力価は、４〜７ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの間で様々となった。
【０２１０】
この研究では、ヒトワクチン生産に使用するのに適する２種の細胞系、すなわちＶｅｒｏおよびＣＨＯ−Ｋ１を使用する、改良された逆遺伝学系について述べる。ウイルス感染研究によって示されたとおり、いくつかのＡ／Ｈ１Ｎ１およびＡ／Ｈ５Ｎ１ウイルスまたは再集合体ウイルスは、Ｖｅｒｏ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞の混合物を使用して容易に回収された。同じ方法において、Ａ／Ｈ３Ｎ２ウイルスもレスキューされ、この系が、いかなる汎流行性および季節性ウイルスの再集合体を産生するのにも使用できることが実証された。ウイルスは、Ｖｅｒｏ／ＣＨＯ−Ｋ１上清から直接回収され、遺伝子導入から早くも２日後に、ＨＡＵ検定によって滴定された。たとえば、ヒトまたは動物用ワクチン産生の枠内で、ウイルスが工業規模で産生されるものとするとき、上清をシードとして使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞のストックをさらに感染させることができる。
【０２１１】
さらに、実施例において示したとおり、ＶｅｒｏとＣＨＯ−Ｋ１の混合物を使用する逆遺伝学による感染性インフルエンザウイルスの生成、またはＣＨＯ−Ｋ１細胞を感染性ウイルスシードで直接感染させることによるウイルスの産生には、血清および／または動物起源の生物材料の使用が必要とならない。したがって、このように産生された感染性インフルエンザウイルスは、ウイルス、マイコプラズマ、およびプリオンのような外来物質が混入する可能性がもはや存在しないため、より安心である。さらに、遺伝子導入および／または感染工程の間に使用する培地に血清が無いため、精製過程が推進され、インフルエンザワクチン製造がより容易になる。本発明者らの知る限りでは、逆遺伝学によってインフルエンザウイルスをレスキューするための完全な無動物法が記載されるのは初めてである。
【０２１２】
３．  逆遺伝学によるキメラインフルエンザウイルスの産生
３．１．  ＨＡおよびＮＡキメラ遺伝子の構築
最初に、ソフトウェアＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩを使用して、キメラ構築物をコンピューター内で組立てた。ＨＡキメラ遺伝子Ａ／カリフォルニア／０７／０９−Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）は、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの非コード領域（ＮＣＲ）、シグナルペプチド（ＳＰ）、ＨＡ２ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、およびＣｙｔｏドメイン、ならびにＡ／カリフォルニア／０７／０９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスからのＨＡ１ドメインを含有している。
【０２１３】
ＮＡキメラ遺伝子Ａ／カリフォルニア／０７／０９−Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）は、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの非コード領域（ＮＣＲ）、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、Ｃｙｔｏドメイン、およびＳｔａｌｋ、ならびにＡ／カリフォルニア／０７／０９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスからの外部ドメインを含有している。
【０２１４】
これらの配列が決定されたなら、対応するＨＡおよびＨＡキメラ遺伝子を合成し、万能ｐＳＰ−ｆｌｕプラスミドにクローン化した。
【０２１５】
３．２．  逆遺伝学によるキメラインフルエンザウイルスの産生
逆遺伝学によるキメラインフルエンザウイルスの産生は、上記したとおり、すなわち、ウイルスタンパク質ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＡの発現用の４つのプラスミド、ならびにｖＲＮＡ  ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ、Ｍ、キメラＨＡ、およびキメラＮＡの発現用の８つのプラスミドを使用し、これらを、先に言及したとおりのｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎによってＣＨＯ−Ｋ１／Ｖｅｒｏ細胞の混合物に導入することにより実行した。産生されたウイルスは、２つのキメラ遺伝子を含有しているので、「二重キメラ」である。ウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスからのＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ、およびＭ遺伝子、Ａ／カリフォルニア／０７／０９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスからのＰＢ１遺伝子、ＨＡキメラ遺伝子Ａ／カリフォルニア／０７／０９−Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、およびＮＡキメラ遺伝子Ａ／カリフォルニア／０７／０９−Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を含有している。各逆遺伝学実験について、Ａ／ＮＣ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスを陽性対照として使用した。
【０２１６】
最初の実験では、使用するトリプシン濃度を決定した。試験したトリプシン濃度（１〜６ＵＳＰ／ｍｌ）の中で、３および４ＵＳＰ／ｍｌのトリプシン濃度だけで、キメラインフルエンザウイルスの産生が可能になった（表６）。後続の実験では、４ＵＳＰ／ｍｌの濃度が、ヘマグルチニン力価が少しばかり高かったため（３２ＨＡＵ／５０μｌに対して６４ＨＡＵ／５０μｌ）、３ＵＳＰ／ｍｌより若干良好であることが示された。
【０２１７】
【表７】
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【０２１８】
キメラ再集合体Ａ／カリフォルニア／０７／０９−Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）の産生は、再現可能であった。キメラウイルスは、細胞培養上清において、核穿孔後５日目から検出可能であり、核穿孔後８日または９日目に最適に産生された。
【０２１９】
キメラＨＡ遺伝子またはキメラＮＡ遺伝子のいずれかを含有している「単一キメラ」ウイルスも、キメラＨＡ  Ａ／カリフォルニア／０７／０９−Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）遺伝子およびＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスからのＮＡ遺伝子、またはキメラＮＡ  Ａ／カリフォルニア／０７／０９−Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）遺伝子およびＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスからのＨＡ遺伝子を使用する逆遺伝学によって、首尾よく産生された。
【０２２０】
３．３．  キメラウイルスによって産生されるＨＡタンパク質抗原性の評価
ＨＡキメラ遺伝子の使用によって、キメラウイルスによって発現されるＨＡタンパク質の抗原性が変化しなかったことを検証するために、本発明者らは、再集合体Ａ／カリフォルニア／０７／０９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスまたは３．２で得たような「二重キメラ」ウイルスのいずれかを試験ウイルスとして使用して、１．１０に記載のとおりの阻害赤血球凝集検定において得られた力価を比較した。阻害赤血球凝集検定における力価が高いほど、抗体によるＨＡ抗原の認識が強力であった。試験した２種のウイルスで得られたＩＨＡ力価は、１０２４０より高かったが、これは、二重キメラウイルスによって発現されたＨＡタンパク質の抗原性が、十分に保存され、Ａ／カリフォルニア／０７／０９（Ｈ１Ｎ１）再集合体のものと非常に似通っているまたは同一であることを示している。
【０２２１】
４．  細胞の２種の混合物：Ｖｅｒｏ／ＣＥＦおよびＶｅｒｏ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞における再集合体インフルエンザウイルスの産生の比較
１００万個のＶｅｒｏ細胞を室温でｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖ（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳのｖＲＮＡを発現する６つのｖＲＮＡ発現プラスミドそれぞれ１μｇ、Ａ／ベトナム／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）ウイルスのＮＡおよびＨＡのｖＲＮＡを発現する２つのｖＲＮＡ発現プラスミドそれぞれ１μｇ、およびＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰのｍＲＮＡを発現する４つのタンパク質発現プラスミドそれぞれ０．５μからなる混合物を細胞に加え、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用い、Ｖ−００１プログラムを使用して、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを実行した。６ウェルプレートにおいて、細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））１．５ｍｌ中でインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした後、ブタトリプシン（Ｓｉｇｍａ）で補充した同じ培地に、１００万個のＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）細胞を加え、回転台上において、３５℃、８％ＣＯ２でインキュベートした。赤血球凝集検定によってウイルス力価を測定するために、一定の間隔で、培養上清１００μｌを採取した。赤血球凝集検定の結果を以下の表７に示す。
【０２２２】
５０万個のＶｅｒｏ細胞と５０万個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を混合し、室温でｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖ（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳのｖＲＮＡを発現する６つのｖＲＮＡ発現プラスミドそれぞれ１μｇ、Ａ／ベトナム／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）ウイルスのＮＡおよびＨＡのｖＲＮＡを発現する２つのｖＲＮＡ発現プラスミドそれぞれ１μｇ、およびＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰのｍＲＮＡを発現する４つのタンパク質発現プラスミドそれぞれ０．５μｇからなる混合物を細胞に加え、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用い、Ｕ−０２３プログラムを使用して、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを実行した。６ウェルプレートにおいて、細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で補充したＥｘ−ｃｅｌｌ（商標）ＣＤ  ＣＨＯ融合培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）中でインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした後、ブタトリプシン（Ｓｉｇｍａ）で補充した同じ培地に、１００万個のＣＨＯＫ１細胞を加え、回転台上において３５℃、８％ＣＯ２でインキュベートした（そのとき、トリプシンの最終濃度は２μｇ／ｍｌである）。赤血球凝集検定によってウイルス力価を測定するために、一定の間隔で、培養上清１００μｌを採取した。赤血球凝集検定の結果を以下の表７に示す。
【０２２３】
【表８】
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【０２２４】
結果から、Ｖｅｒｏ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞系によって、遺伝子導入からわずか４日後に再集合体インフルエンザウイルスの産生が可能になるのに対し、Ｖｅｒｏ／ＣＥＦ系を使用すると、同じ量の再集合体インフルエンザウイルスの産生に少なくとも７日を要することが示される。Ｖｅｒｏ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞系では、多量の再集合体ウイルス（５１２ＵＨＡ／５０μｌ）の産生も可能になる。すなわち、結果は、再集合体インフルエンザウイルスの産生には、Ｖｅｒｏ／ＣＥＦ細胞系よりＶｅｒｏ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞系が効率的であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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