(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病に罹患していない対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクを予測するために、あるいは、糖尿病に罹患していない対象のメタボリックシンドロームの発症の指標とするために、体液中のプロニューロテンシン１−１１７を検出する方法であって：
・前記対象から得た体液中のプロニューロテンシン１−１１７のレベルを測定する工程；
を含み、ここで前記対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクと、前記プロニューロテンシン１−１１７のレベルとが相関しており、前記プロニューロテンシン１−１１７のレベルが閾値と比較して高い場合、糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患する高いリスクの予測となり、又は前記プロニューロテンシン１−１１７のレベルが閾値と比較して高い場合、糖尿病に罹患していない対象のメタボリックシンドロームの発症の指標となる、前記方法。
【請求項２】
前記対象が、前糖尿病に罹患していない（非ＩＦＧ）対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロニューロテンシン１−１１７の空腹時レベルを測定する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、６．１ｍｍｏｌ／ｌ未満だが、５．４ｍｍｏｌ／ｌより高い空腹時血糖を有する糖尿病に罹患していない対象である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、５．４ｍｍｏｌ／ｌと同等又はそれ未満の空腹時血糖を有する糖尿病に罹患していない対象である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、ＩＩ型糖尿病を発症するリスクを判定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
年齢、性別、収縮期血圧、拡張期血圧、抗高血圧療法（ＡＨＴ）、ボディーマスインデックス、胴囲、ウエスト−ヒップ比、現在の喫煙者、糖尿病遺伝、及び心血管疾患（ＣＶＤ）の既往歴を含む群から選択される少なくとも１つの臨床パラメーターがさらに測定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、脳脊髄液サンプル、唾液サンプル及び尿サンプル又は前述のサンプルのいずれかの抽出物を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
プロニューロテンシン１−１１７のレベルが、診断アッセイによって測定される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記診断アッセイが免疫学的アッセイである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、糖尿病に罹患していない対象において、糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクを観察するために、又はメタボリックシンドロームの一連の治療を観察するために複数回実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記観察が、与えられた予防的及び／又は治療的対策に対する前記対象の応答を評価するために実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象をリスク群に階層化するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実施するためのポイントオブケアデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の内容は、糖尿病に罹患していない対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクを予測する方法、あるいは糖尿病に罹患していない対象のメタボリックシンドロームを診断する方法であって、以下のステップ：
・前記対象から得た体液中のプロニューロテンシン又は少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片のレベルを測定し、そして
・前記対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクと、前記プロニューロテンシン又はその断片のレベルとを、高いレベルが、糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患する高いリスクの予測となるか、又は高いレベルが、糖尿病に罹患していない対象のメタボリックシンドロームの診断に相関するように関連付けること、
を含む前記方法である。
【０００２】
「高いレベル」という用語は、特定の閾値レベルを上回るレベルを意味する。
ニューロテンシンは、プレプロニューロテンシン前駆体由来の１３アミノ酸神経ペプチドであって、安定した１１７アミノ酸ペプチドであるプロニューロテンシン（Ｐ−ＮＴ）と一緒に化学量論的に放出され、そして、その成熟ホルモンは、３種類の異なった受容体、Ｇタンパク質共役受容体であるニューロテンシン受容体１と２（Ｎｔｓｒ１とＮｔｓｒ２）及び非Ｇタンパク質共役受容体であり、且つ、Ｓｏｒｔｉｌｌｉｎ−１（ＳＯＲＴ１）としても知られているニューロテンシン受容体３（Ｎｔｓｒ３）に結合する。
【０００３】
ニューロテンシンは、小腸から末梢部に放出され、並びに視床下部から中枢部に放出される。ニューロテンシンの末梢分泌は、食物摂取、特に脂肪によって刺激され、消化管運動、並びに膵液分泌及び胆汁分泌を調整することが知られている。興味深いことに、ニューロテンシンは、ラットにおける中枢（脳室内）及び末梢（腹腔内）注射の後に、急性的に食物摂取を低減させたので、食欲抑制ホルモンとして食欲制御に関係し、そして、その効果は、ニューロテンシン１受容体（Ｎｔｓｒ１）を通して主に媒介されるようである。
【０００４】
正常体重ヒト対象と比較した肥満では、食後血漿ニューロテンシン濃度は、液状脂肪食の後に低下し（Ｗｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９２，  Ｒｅｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ；  Ｐｌａｓｍａ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｈａｍ  ｆｅｅｄｉｎｇ  （ＭＳＦ）  ａｎｄ  ａ  ｌｉｑｕｉｄ  ｔｅｓｔ  ｍｅａｌ）、ニューロテンシン分泌の調整が、肥満では乱されていることを示唆した。しかしながら、ニューロテンシンが肥満の程度に相関しているのか、そして、どのように相関しているのか、大規模な研究が全く調査されていない。興味深いことに、Ｐ−ＮＴは、肥満のＩＩ型糖尿病患者の大部分で正常血糖につながることが示されている手術である胃バイパス（Ｒｏｕｘ−ｅｎ−Ｙ）後に有意に増加するが、ニューロテンシンが通常、糖尿病の発症に関わるかどうか知られていない。さらに、Ｎｔｓｒ３（ＳＯＲＴ１）遺伝子の変異型は、ヒトで知られている最も一般的な冠動脈障害感受性遺伝子の１つなので、ニューロテンシン系は、冠動脈障害や心筋梗塞の発症に関与した。
【０００５】
肥満と癌との機構的なつながりは大部分が未知であるが、しかしながら、支配的な理論の１つは、過剰な脂肪沈着が末梢組織におけるアンドロゲンの高い芳香族化をもたらし、そしてそれが、高い循環エストロゲンレベルをもたらすというものである。加えて、肥満の顕著な特徴の１つである高インスリン血症が、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）の肝臓での産生を阻害し、これによりエストロゲンとアンドロゲンの両方の生物学的に利用可能レベルを増強することが示され、肥満が、それを通じて乳癌や前立腺癌などの癌の性ホルモン駆動形態の一般的な形態のリスクを高め得る形を示唆した。興味深いことに、ニューロテンシンとＮｔｓｒ１発現の両方が悪性乳管癌腫においてよく見られ、そして、ＮＴＳＲ１の実験的な薬理学的遮断又はＲＮＡサイレンシングが、マウスにおける腫瘍増殖を低減する。
【０００６】
乳癌細胞におけるニューロテンシン受容体１（ＮＴＳＲ１）の発現レベルは、乳癌に罹患している対象の予後を判断するために使用された（ＵＳ２０１１／０３０５６３３）。さらに、同じ著者らによって、おそらく肝臓による急速なクリアランスにより、循環ニューロテンシンと、膵臓、前立腺、又は髄様甲状腺腫瘍の病期との明らかな相関が、現在、説明されていないことが記載されている。興味深いことに、浸潤性乳管癌を患っている一連の５１人の患者において、すべての腫瘍のうちの９１％がニューロテンシン受容体１（ＮＴＳＲ１）に関して陽性であったが、すべての腫瘍のうちの３１％だけが前記組織中でニューロテンシンに関して陽性であることがわかった（Ｓｏｕａｚｅ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００６；  ６６：  （１２）  ｐａｇｅｓ  ６２４３−６２４９）。
【０００７】
癌の増殖、特に肺癌、膵臓癌、及び結腸癌にニューロテンシンとニューロテンシン受容体が関与するいくつかの徴候が存在する（Ｃａｒｒａｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．；  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２７  （２００６）  ２４４５−２４６０）。膵臓癌を患っている患者の血清のＮＴレベルが有意に上昇することが報告された（Ｐｉｃｈｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９９；  １９；  １４４５−５０）。興味深いことに、このグループは、膵臓癌において両方の前立腺に対する疾患の進行によりＮＴレベルが低下することを見出した。それとは対照的に、Ｍｅｇｇｉａｔｏら；Ｔｕｍｏｒｉ  １９９６；  ８２；  ５９２−５；は、血漿ＮＴレベルが、膵臓癌では正常であったが、膵炎と診断された場合には、高かったことを見出した。
糖尿病の予測のためのコペプチンの使用は、Ｅｎｈｏｒｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２０１０；  １２１  ：２１０２−２１０８によって報告された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の対象は、糖尿病に罹患していない対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクを予測するための、あるいは、糖尿病に罹患していない対象のメタボリックシンドロームを診断するためのＮＴの予測及び診断能力を調査することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この問題に対処するために、我々は、前記スウェーデンの前向きコホート研究（Ｍａｌｍｏ  Ｄｉｅｔ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ）における空腹時血漿中のプロニューロテンシンの安定な断片を評価して、１５年間の経過観察中の糖尿病発症に対して、このバイオマーカーの基準濃度を関連付けた。
【００１０】
本発明の内容は、糖尿病に罹患していない対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクを予測する方法、あるいは、糖尿病に罹患していない対象のメタボリックシンドロームを診断する方法であって、以下のステップ：
・前記対象から得た体液中のプロニューロテンシン又は少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片のレベルを測定し、そして
・前記対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクと、前記プロニューロテンシン又はその断片のレベルとを、高いレベルが、糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患する高いリスクの予測となるか、又は高いレベルが、糖尿病に罹患していない対象のメタボリックシンドロームの診断に相関するように関連付けること、
を含む前記方法である。
【００１１】
本発明の内容は、糖尿病に罹患していない対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するを予測する方法、あるいは、糖尿病に罹患していない対象のメタボリックシンドロームを診断する方法であって、以下のステップ：
・前記対象から得た体液中のプロニューロテンシン１−１１７若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルを測定し、そして
・糖尿病に罹患していない対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクと、前記プロニューロテンシン１−１１７若しくはその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルとを、高いレベルが、糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患する高いリスクの予測となるか、又は高いレベルが、糖尿病に罹患していない対象のメタボリックシンドロームの診断に相関するように関連付けること、
を含む前記方法である。
【００１２】
「対象」という用語は、本明細書中で使用される場合、生きているヒト又はヒト以外の生物を指す。好ましくは、本明細書中では、対象はヒト対象である。本発明の具体的な実施形態において、前記対象は、女性の対象である。本発明の具体的な実施形態において、前記対象は、非ＩＦＧ（非前糖尿病）対象である。
本発明の一実施形態において、体液中のプロニューロテンシン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルは、プロニューロテンシン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドの空腹時レベルである。空腹時レベルとは、血液採取の１２時間前から食物摂取がないことを意味する。
【００１３】
糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクが予測される前記女性対象から得た体液中のプロニューロテンシン１−１１７若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルは、小腸から放出される。小腸からのニューロテンシンの放出は、食物摂取、特に脂肪によって刺激され、消化管運動及び膵液や胆汁分泌を調整することが知られている。プロニューロテンシン１−１１７及びその断片又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドは、ニューロテンシン及びプロニューロテンシン１−１１７とその断片又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドは、プロニューロテンシンから等モル量で放出されるので、放出されたニューロテンシンの代用マーカーとして使用される。
【００１４】
ニューロテンシン／プロニューロテンシン１−１１７若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドの末梢組織における分泌が、糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患することに対する女性対象の感受性について暗示していることは、本発明の驚くべき知見である。これにより、脂肪摂取の削減としての食事療法は、前記対象の前記リスクを軽減し得る。
前記対象から得た体液中のプロニューロテンシン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はＰＮＴ１−１１７含有ペプチドのレベルと、糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクとの相関は連続的である、すなわち、レベルが高ければ高いほど、リスクもより高い。
【００１５】
実用性のために、当業者は（単数若しくは複数の）閾値を使用してもよい。
これにより、「高いレベル」という用語は、閾値レベルを上回るレベルを意味し得る。
体液は、血液、血清、血漿、尿、ｃｓｆ、及び唾液を含む群から選択され得る。
本データは、プロニューロテンシン又はその断片、特にプロニューロテンシン１−１１７若しくはその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルと、特に糖尿病の既往歴のない対象における糖尿病との間に強い相関関係を示唆している。
本データはまた、プロニューロテンシン又はその断片、特にプロニューロテンシン１−１１７若しくはその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルと、心血管疾患及び／又は糖尿病の一般的なハイリスク群である高血圧患者における糖尿病との間にも強い相関関係を示唆している。
【００１６】
体液中で測定され得るプロニューロテンシンの断片は、例えば以下のものであり得る。
配列番号１（プロニューロテンシン１−１４７）
【化１】
0006262669.tif 000002
【００１７】
配列番号２（プロニューロテンシン１−１２５（長いニューロメジンＮ））
【化２】
0006262669.tif 000003
【００１８】
配列番号３（ニューロメジンＮ：）
【化３】
0006262669.tif 000004
【００１９】
配列番号４（ニューロテンシン）
【化４】
0006262669.tif 000005
【００２０】
配列番号５（プロニューロテンシン１−１１７）
【化５】
0006262669.tif 000006
【００２１】
配列番号６（プロニューロテンシン１−１３２）
【化６】
0006262669.tif 000007
【００２２】
配列番号７：（プロニューロテンシン１−１２５）
【化７】
0006262669.tif 000008
【００２３】
配列番号８（プロニューロテンシン１２０−１４０）
【化８】
0006262669.tif 000009
【００２４】
配列番号９（プロニューロテンシン１２０−１４７）
【化９】
0006262669.tif 000010
【００２５】
配列番号１０（プロニューロテンシン１２８−１４７）
【化１０】
0006262669.tif 000011
【００２６】
本発明による方法のより具体的な実施形態において、プロニューロテンシン１−１１７のレベルが測定される。
具体的な実施形態において、プロニューロテンシン、特にプロニューロテンシン１−１１７若しくはその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルは、免疫学的アッセイで計測される。
より詳しく述べると、免疫学的アッセイは、Ｅｒｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２７  （２００６）  １７８７−１７９３に記載されているように使用される。
【００２７】
プロニューロテンシン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルを測定するのに有用である免疫学的アッセイは、実施例２の概要のステップを含み得る。すべての閾値及び値は、実施例２に従って使用される試験及び較正の観点から理解されるべきである。当業者は、閾値の絶対値が使用される較正によって影響を受けるであろうことを知っている可能性もある。このことは、本明細書中に与えられるすべての値及び閾値が、本明細書中で使用される較正に照らして理解されるべきであることを意味している（実施例２）。ヒトＰ−ＮＴ較正物質は、ＩＣＩ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙで入手可能である。あるいは、アッセイは、合成又は遺伝子組み換えＰ−ＮＴ１−１１７若しくはその断片によって較正されてもよい（Ｅｒｎｓｔ  ｅｔ．  ａｌ，  ２００６もまた参照のこと）。
【００２８】
本発明の方法に従って、糖尿病に罹患していない対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクを決定するため、あるいは糖尿病に罹患していない対象のメタボリックシンドロームを診断するための閾値は、７８ｐｍｏｌ／ｌ超のＰＮＴであり、好ましい閾値は１００ｐｍｏｌ／ｌ超、さらに好ましい閾値は１５０ｐｍｏｌ／ｌ超である。具体的な実施形態において、前記閾値は約１００ｐｍｏｌ／１である。これらの閾値は、先に触れた較正法に関係している。前記閾値を上回るプロＮＴ値は、対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患する高いリスクを有していることを意味する。
【００２９】
糖尿病の定義は、以下のとおりである：
医師による診断の履歴、抗糖尿病薬薬物療法をおこなっていること、又は基準検査において空腹時全血グルコース＞／＝６．１ｍｍｏｌ／ｌであること（これが血漿中では＝７．０ｍｍｏｌ／ｌであることに留意する）。
前糖尿病、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）：ＩＦＧ＝６．１〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース。
【００３０】
正常血圧／高血圧（ＨＢＰ）の定義は、以下のとおりである：
ＨＢＰ：収縮期ＢＰ＞／＝１４０ｍｍＨｇ若しくは拡張期ＢＰ＞／＝９０ｍｍＨｇ、又は降圧薬薬物療法をおこなっていること。
正常血圧（ＢＰ）の対象は、その他のすべての対象である、すなわち、収縮期ＢＰ＜１４０ｍｍＨｇ若しくは拡張期ＢＰ＜９０ｍｍＨｇを有するか、又は降圧薬薬物療法をおこなっていない対象である。
【００３１】
本発明による方法の具体的な実施形態において、前記対象は、６．１ｍｍｏｌ／ｌ未満だが、５．４ｍｍｏｌ／ｌより高い空腹時血糖を有する糖尿病に罹患していない対象である。
本発明による方法の具体的な実施形態において、前記対象は、５．４ｍｍｏｌ／ｌと同等又はそれ未満の空腹時血糖を有する糖尿病に罹患していない対象である。
本発明による方法の具体的な実施形態において、前記の対象がＩＩ型糖尿病を発症するリスクが、判定される。
【００３２】
本発明による方法の具体的な実施形態において、対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクの予測、あるいは、メタボリックシンドロームの診断は、さらに、空腹時血糖又は血漿グルコース、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール又はその副画分、ＬＤＬコレステロール又はその副画分、シスタチンＣ、インスリン、ＣＲＰ、バソプレッシン又はその前駆体若しくは断片、及びＢＮＰ又はその前駆体若しくはその断片を含む群から選択される少なくとも１つの検査パラメーター又は更なるマーカーのレベルをさらに測定し、使用することによって改善される。
【００３３】
本発明による方法の具体的な実施形態において、さらに、年齢、性別、収縮期血圧、拡張期血圧、抗高血圧療法（ＡＨＴ）、ボディーマスインデックス、胴囲、ウエスト−ヒップ比、現在の喫煙者、糖尿病遺伝、及び心血管疾患（ＣＶＤ）の既往歴を含む群から選択される少なくとも１つの臨床パラメーターが、測定される。
【００３４】
本発明の更なる実施形態は、先の請求項に従い、糖尿病に罹患していない対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクを予測する方法、あるいは、糖尿病に罹患していない対象のメタボリックシンドロームを診断する方法であって、前記のプロニューロテンシン又はその断片のレベルは単独で、又は他の予測に有用な検査パラメーター又は臨床のパラメーターと組み合せて、以下の選択肢から選択され得る方法によって、対象が糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクの予測のため、又はメタボリックシンドロームの診断のために使用される：
【００３５】
−見掛けが健康そうな対象集団における所定のサンプル一式のプロニューロテンシン若しくはその断片、又はニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルの中央値との比較、
−見掛けが健康そうな対象集団における所定のサンプル一式のプロニューロテンシン若しくはその断片、又はニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルの変位値との比較、
−コックス比例ハザード解析に基づく計算、又はＮＲＩ（純再分類指数）若しくはＩＤＩ（統合判別指数）などのＲｉｓｋ指数計算を使用することによる計算。
【００３６】
本発明の一実施形態において、サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、脳脊髄液サンプル、唾液サンプル及び尿サンプル又は前述のサンプルのいずれかの抽出物を含む群から選択される。本発明による方法の具体的な実施形態において、プロニューロテンシン若しくはその断片、又は少なくとも５アミノ酸の長さを有するプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルは、診断アッセイ、好ましくは免疫学的アッセイによって測定される。
【００３７】
本発明による方法の具体的な実施形態において、前記方法は、糖尿病に罹患していない対象において、糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームに罹患するリスクを観察するために、又はメタボリックシンドロームの一連の治療を観察するために複数回実施される。
本発明による方法の具体的な実施形態において、前記観察は、与えられた予防的及び／又は治療的対策に対する前記対象の応答を評価するために実施される。
本発明による方法の具体的な実施形態において、前記方法は、前記対象をリスク群に階層化するために使用される。
本発明による方法を実施するためのポイントオブケアデバイスもまた、本発明によって包含される。
【００３８】
本発明による方法を実施するためのアッセイ及び／又はキットもまた、本発明によって包含される。
本発明の内容はまた、対象の糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームの予防又は治療における使用のための、ニューロテンシン又はニューロテンシン受容体に対する結合剤である。
本発明の一実施形態において、結合剤は、ニューロテンシンの生理活性を７０％以下に低減する。
【００３９】
本発明によると、ニューロテンシンに対する結合剤は、抗体、例えばＩｇＧ、典型的な完全長免疫グロブリン、又は、例えばＦａｂミニボディ、一本鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価のＦａｂ抗体、例えばＦａｂ−Ｖ５Ｓｘ２を含めたＦａｂ断片を、これだけに限定されることなく含む、例えば化学的に結合された抗体のような重鎖及び／又は軽鎖のＦ可変ドメインを少なくとも含む抗体断片（断片抗原結合）；ＣＨ３ドメインで二量化された二価のＦａｂ（ミニ抗体）；例えばｄＨＬＸドメインの二量体化を介して異種のドメインを用いた多量体化により形成された二価のＦａｂ又は多価のＦａｂ、例えばＦａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳｘ２；Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、多量体化した多価及び／又は多特異性ｓｃＦｖ断片、二価及び／又は二重特異性ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ））、三官能性抗体、例えばＧと別のクラスからの多価抗体；単一ドメイン抗体、例えばラクダ科の動物又は魚類の免疫グロブリンから得られたナノボディから成る群から選択される。
【００４０】
本発明によると、ニューロテンシン受容体に対する結合剤は、抗体、例えばＩｇＧ、典型的な完全長免疫グロブリン、又は、例えばＦａｂミニボディ、一本鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価のＦａｂ抗体、例えばＦａｂ−Ｖ５Ｓｘ２を含めたＦａｂ断片を、これだけに限定されることなく含む、例えば化学的に結合された抗体のような重鎖及び／又は軽鎖のＦ可変ドメインを少なくとも含む抗体断片（断片抗原結合）；ＣＨ３ドメインで二量化された二価のＦａｂ（ミニ抗体）；例えばｄＨＬＸドメインの二量体化を介して異種のドメインを用いた多量体化により形成された二価のＦａｂ又は多価のＦａｂ、例えばＦａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳｘ２；Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、多量体化した多価及び／又は多特異性ｓｃＦｖ断片、二価及び／又は二重特異性ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー）、三官能性抗体、例えばＧと別のクラスからの多価抗体；単一ドメイン抗体、例えばラクダ科の動物又は魚類の免疫グロブリンから得られたナノボディ、あるいは、ペプチド拮抗薬、例えば［Ｄ−Ｔｒｐ１１］−ニューロテンシン、［Ｔｙｒ（Ｍｅ）１１］−ニューロテンシン（例えば、Ｑｕｉｒｏｎらによって記載された）、又は非ペプチド拮抗薬、例えばＬｅｖｏｃａｂａｓｔｉｎｅ、ＳＲ−４８６９２（ＮＴＳ１選択性）、ＳＲ−１４２９４８（非選択性）、ＳＲ−１４２９４８Ａ，ＣＰ９６３４５、［３Ｈ］ＳＲ−４８６９２、ＳＲ４８６９２、ＳＲ−４８５２７及びＳＲ−４９７１１、あるいは、結合剤足場、例えばテトラネクチンベースの非Ｉｇ足場（例えば、ＵＳ２０１０／００２８９９５に記載）、フィブロネクチン足場（ＥＰ１２６６０２５に記載）；リポカリンベースの足場（例えば、ＷＯ２０１１／１５４４２０に記載）；ユビキチン足場（例えば、ＷＯ２０１１／０７３２１４に記載）、移動足場（例えば、ＵＳ２００４／００２３３３４に記載）、プロテインＡ足場（例えば、ＥＰ２２３１８６０に記載）、アンキリン反復ベースの足場（例えば、ＷＯ２０１０／０６０７４８に記載）、マイクロタンパク質、好ましくはシスチンノット（ｋｎｏｔ）足場を形成するマイクロタンパク質（例えば、ＥＰ２３１４３０８に記載）、Ｆｙｎ  ＳＨ３ドメインベースの足場（例えば、ＷＯ２０１１／０２３６８５に記載）、ＥＧＦＲ−Ａドメインベースの足場（例えば、ＷＯ２００５／０４０２２９に記載）及びＫｕｎｉｔｚドメインベースの足場（例えば、ＥＰ１９４１８６７に記載）から成る群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】典型的なＰ−ＮＴ用量／シグナルカーブを示す。
【図２ａ】糖尿病予測のカプランマイヤー解析  中央値を使用した糖尿病を患っていないすべての対象のカットオフ（１０４．６ｐｍｏｌ／１）
【図２ｂ】糖尿病予測のカプランマイヤー解析  糖尿病及び前糖尿病（ＩＦＧ）を患っていないすべての対象、カットオフ（１０４．６ｐｍｏｌ／１）
【実施例】
【００４２】
実施例１
抗体の開発
免疫化のためのペプチド／複合体：
免疫化のためのペプチドを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）へのペプチドの結合のために、追加のＮ末端システイン残基を用いて合成した（ＪＰＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）。そのペプチドを、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｅｒｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｏｎｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによってＢＳＡに共有結合で連結した。カップリング手順を、Ｐｅｒｂｉｏのマニュアルに従って実施した。
【００４３】
標識抗体（ＬＡ）ペプチド（Ｐ−ＮＴ１−１９）：
【化１１】
0006262669.tif 000012
【００４４】
固相抗体（ＳＰＡ）ペプチド（Ｐ−ＮＴ４４−６２）：
【化１２】
0006262669.tif 000013
【００４５】
前記抗体を、以下の方法に従って作製した：
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０及び１４日目に１００μｇのペプチド−ＢＳＡ複合体（１００μｌの完全フロイントアジュバント中に乳化）、そして２１及び２８日目に５０μｇ（１００μｌの不完全フロイントアジュバンド中）で免疫した。
細胞融合実験を実施する３日前に、動物に、１回の腹腔内注射及び１回の静脈内注射として与えられる、１００μｌの生理食塩水中に溶解した５０μｇの複合体を与えた。
【００４６】
免疫したマウスからの脾細胞と、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞とを、３７℃にて３０分間、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールを用いて融合した。洗浄後に、その細胞を、９６ウェル細胞培養プレートに播種した。ハイブリッドクローンを、ＨＡＴ培地中での成長によって選択した［２０％のウシ胎仔血清及びＨＡＴサプリメントを補ったＲＰＭＩ１６４０培地］。２週間後に、ＨＡＴ培地を、３回の継代の間、ＨＴ培地に置き換え、それに続いて正常細胞培養培地に置き換えた。
【００４７】
融合の３週間後に、細胞培養上清を、抗原に特異的なＩｇＧ抗体について一次スクリーニングした。陽性の試験微量培養を、繁殖のために２４ウェルプレートに移した。再試験後に、選択した培養物をクローニングし、限界希釈を使用することで再びクローニングし、そして、アイソタイプを決定した。
【００４８】
（Ｌａｎｅ，  Ｒ．Ｄ．  “Ａ  ｓｈｏｒｔ−ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｆｕｓｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ８１  ：  ２２３−２２８；  （１９８５），  Ｚｉｅｇｌｅｒ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  “Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  （ＧＡＤ）  ｉｓ  ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｒａｔ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘａｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＧＡＤ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  ２８：  １１−１５，  （１９９６））
【００４９】
モノクローナル抗体産生
抗体を、標準的な抗体製造法によって産生させ（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  ＡＴＬＡ  ２５，  １２１，  １９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−クロマトグラフィーによって精製した。抗体純度は、ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づき＞９５％であった。
【００５０】
実施例２
ヒトプロニューロテンシンの定量化のための免疫学的アッセイ
使用される技術は、Ａｋｒｉｄｉｎｉｕｍエステル標識に基づいたサンドイッチコートしたチューブの発光イムノアッセイであった。
【００５１】
化標識合物（トレーサー）：１００μｇ（１００μｌ）ＬＡ（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を、１０μｌのＡｋｒｉｄｉｎｉｕｍ  ＮＨＳ−エステル（アセトニトリル中に１ｍｇ／ｍｌ、ＩｎＶｅｎｔ  ＧｍｂＨ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＥＰ０３５３９７１）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。標識したＬＡを、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ４００−５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）によるゲル濾過ＨＰＬＣによって精製した。精製したＬＡを、（３００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＮａ−ＥＤＴＡ、５ｇ／ｌのウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）中に希釈した。終濃度は、２００μｌあたり約８００．０００相対発酵単位（ＲＬＵ）の標識化合物（約２０ｎｇの標識抗体）であった。アクリジニウムエステル化学発光を、ＡｕｔｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９５３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．  ＫＧ）を使用することによって評価した。
【００５２】
固相：ポリスチレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ，  Ａｕｓｔｒｉａ）を、ＳＰＡ（１．５μｇのＳＰＡ／０．３ｍｌの１００ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌのＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）で被覆した（室温にて１８時間）。５％のウシ血清アルブミンでブロッキングした後に、そのチューブを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、そして、真空乾燥水した。
【００５３】
較正：
Ｐ−ＮＴ含有ヒト血清の希釈物を使用して、アッセイを較正した。高いＰ−ＮＴ免疫反応性を有するヒト血清プール（ＩｎＶｅｎｔ  Ｄｉａｇｏｓｔｉｋａ，  Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ウマ血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）で希釈した（アッセイ基準物質）。
標準物質を、ヒトＰ−ＮＴ較正物資（ＩＣＩ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用によって較正した。あるいは、アッセイは、合成又は遺伝子組み換えＰ−ＮＴ１−１１７又はその断片によっても較正され得る（Ｅｒｎｓｔ  ｅｔ．  ａｌ，  ２００６もまた参照のこと）。
【００５４】
Ｐ−ＮＴ免疫学的アッセイ：
５０μｌのサンプル（又は較正物資）をＳＰＡコートチューブ内にピペットで計り取り、標識したＬＡ（２００μｌ）を加えた後に、そのチューブを１８〜２５℃で１６〜２２時間インキュベートした。洗浄液（２０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で５回（各１ｍｌ）洗浄することによって、結合していないトレーサーを取り除いた。
チューブに結合したＬＡを、ＬＢ９５３を使用することによって計測した。
図１には、典型的なＰ−ＮＴ用量／シグナルカーブを示す。
【００５５】
実施例３
集団調査
我々は、１９９１〜１９９４年のＭａｌｍｏ  Ｄｉｅｔ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ基準試験ベースの集団（人々の年齢５８±６歳、そして５９％が女性）の４３６２人の参加者からの空腹時血漿中のＰ−ＮＴを計測した。我々は、１２年を超える平均経過観察期間中の最初の事象の試験終点のそれぞれに対する、基準Ｐ−ＮＴ（対数変換Ｐ−ＮＴの標準偏差増大毎あたりのハザード比）を関連付けるために、多変数補正された（すべての従来の心疾患リスク因子、糖尿病リスク因子、そして、癌の分析において癌の遺伝も同様である）コックス比例ハザードモデルを使用した。終点は、Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，  ｔｈｅ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，  ｔｈｅ  Ｓｔｒｏｋｅ  ｉｎ  Ｍａｌｍｏ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙを通じて検索した。これらの登録簿を通じた終点の検索は、正当性が立証され、且つ、正確であることがわかっていた。
【００５６】
表１
全調査対象集団の臨床的特徴
記述統計学
【表１】
0006262669.tif 000014
【００５７】
表２
性別
【表２】
0006262669.tif 000015
【００５８】
表３
Ｑ＋日誌：アンケート又は日誌による基準での抗高血圧治療（Ｃ０２、Ｃ０３、Ｃ０７、Ｃ０８、Ｃ０９）
【表３】
0006262669.tif 000016
【００５９】
表４
ＤＩＡＢ  ＭＥＬＬ（ｆｂ＞６．０又はｐｏｓ  Ｑ  ＤＭ）
【表４】
0006262669.tif 000017
【００６０】
表５
現在の喫煙者０
【表５】
0006262669.tif 000018
【００６１】
表６
試験における女性の臨床的特徴
記述統計学
【表６】
0006262669.tif 000019
【００６２】
表７
Ｑ＋日誌：アンケート又は日誌による基準での抗高血圧治療（Ｃ０２、Ｃ０３、Ｃ０７、Ｃ０８、Ｃ０９）
【表７】
0006262669.tif 000020
【００６３】
表８
ＤＩＡＢ  ＭＥＬＬ（ｆｂ＞６．０又はｐｏｓ  Ｑ  ＤＭ）
【表８】
0006262669.tif 000021
【００６４】
表９
現在の喫煙者０
【表９】
0006262669.tif 000022
【００６５】
表１０
試験における男性の臨床的特徴
記述統計学
【表１０】
0006262669.tif 000023
【００６６】
表１１
Ｑ＋日誌：アンケート又は日誌による基準での抗高血圧治療（Ｃ０２、Ｃ０３、Ｃ０７、Ｃ０８、Ｃ０９）
【表１１】
0006262669.tif 000024
【００６７】
表１２
ＤＩＡＢ  ＭＥＬＬ（ｆｂ＞６．０又はｐｏｓ  Ｑ  ＤＭ）
【表１２】
0006262669.tif 000025
【００６８】
表１３
現在の喫煙者０
【表１３】
0006262669.tif 000026
【００６９】
表１４
全体のＰＮＴの四分位数：
ＰＮＴ（ｐｍｏｌ／１）
【表１４】
0006262669.tif 000027
【００７０】
表１５
女性のＰＮＴの四分位数：
ＰＮＴ（ｐｍｏｌ／１）
【表１５】
0006262669.tif 000028
【００７１】
表１６
男性のＰＮＴの四分位数：
ＰＮＴ（ｐｍｏｌ／１）
【表１６】
0006262669.tif 000029
【００７２】
Ｐ−ＮＴと糖尿病の予測
基準にて糖尿病に罹患していない対象の中で、１４２人が、１２．７±２．２年の平均経過観察期間の間に新たに発現した糖尿病を発症した。すべての糖尿病リスク因子（年齢、性別、抗高血圧療法、収縮期血圧、ボディーマスインデックス、胴囲、喫煙、心血管疾患の既往歴、及び空腹時の血糖、トリグリセリド、インスリン、ＨＤＬ、及びＬＤＬ濃度）の基準レベルの調節後、それぞれの標準偏差（ＳＤ）は、新たに発現する糖尿病のリスクに関して１．２８（１．０９−１．５０）（Ｐ＝０．００３）のハザード比（９５％の信頼区間）を与える基準Ｐ−ＮＴが上昇した。前糖尿病（空腹時血糖値の異常、ＩＦＧ）のない対象のサブグループでは、Ｐ−ＮＴに関して１ＳＤ上昇するにつき付随している糖尿病のハザード比はさらに上昇した：１．４８（１．１７−１．８６）（Ｐ＝０．００１）。
Ｐ−ＮＴは、新たに発現した糖尿病と独立に相関していた。
【００７３】
表１７  集団全体（男性及び女性）
【表１７】
0006262669.tif 000030
【００７４】
表１８
女性のみ
方程式ｂ中の変数
【表１８−１】
0006262669.tif 000031
【００７５】
方程式ｂ中の変数
【表１８−２】
0006262669.tif 000032
【００７６】
基準にて空腹時血糖異常及び糖尿病を患っていない対象の中で、６８人の対象が経過観察中に新たに発現した糖尿病を発症し、そして、糖尿病リスク因子の完全な調節後に、Ｐ−ＮＴに関する各ＳＤは、集団全体の新たに発現する糖尿病のリスクに関して１．４８（１．１７−１、８７）（Ｐ＝０．００１）、女性での１．４７（１．０８−２．００）（Ｐ＝０．０１４）、そして男性では１．５６（１．０８−２．２７）（Ｐ＝０．０１９）のハザード比に相関した。多変量コックス回帰モデルへのすべての糖尿病リスク因子の入力により、Ｐ−ＮＴに比べて、空腹時血糖の基準レベルだけが新たに出現する糖尿病と強い統計的関係を有していた。
【００７７】
図２：糖尿病予測のカプランマイヤー解析
２ａ）中央値を使用した糖尿病を患っていないすべての対象のカットオフ（１０４．６ｐｍｏｌ／１）
２ｂ）糖尿病及び前糖尿病（ＩＦＧ）を患っていないすべての対象、カットオフ（１０４．６ｐｍｏｌ／１）
【００７８】
サブグループの分析
方程式中に同じ変数を使用して、我々は、糖尿病の予測のために異なったサブグループを調査し、基準にて糖尿病を患っている対象は除外した。
【００７９】
表１９
【表１９】
0006262669.tif 000033
【００８０】
Ｐ−ＮＴは、糖尿病発症に関して有意に予測となる。Ｐ−ＮＴの予測力は、ＩＦＧ（前糖尿病）を患っていない対象でより強かった。
【図１】
0006262669.tif 000034
【図２ａ】
0006262669.tif 000035
【図２ｂ】
0006262669.tif 000036
【配列表】
0006262669000001.app