(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のアセトヒドロキシ酸シンターゼ酵素（ＡＬＳ）阻害剤に対して抵抗性である突然変異テンサイ植物を産生するための方法であって、
−  テンサイ植物から単離された気孔孔辺細胞からプロトプラストを得る工程；
−  該プロトプラストのインビトロ培養液に、インビトロ培養細胞の９９％超に対して致死的である濃度で１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群）を含む組成物を適用する工程；及び
−  該インビトロ培養細胞の生き延びた細胞からテンサイ植物を再生する工程
を含み、該気孔孔辺細胞プロトプラストは、テンサイ植物へのその再生能について予め選択され、該予め選択されたプロトプラストは、１０％を超える、分裂し、及び生存可能なカルスへと再生する確率（成長しているプロトプラストの数：培養液に入れたプロトプラストの総数）を有し、該プロトプラストによって得られたカルスは、１０％を超える、シュートを発生する能力（シュートを産生しているカルスの下部：カルスの総数）を有し、該ＡＬＳ阻害剤（群）は２０００００００個を超える該プロトプラストに適用される、前記方法。
【請求項２】
テンサイ植物へと再生することのできる気孔孔辺細胞プロトプラストを選択する工程は、種々の遺伝子型のテンサイ植物から気孔孔辺細胞プロトプラストを単離し、該プロトプラストをインビトロ培養液に入れた場合に成長している該プロトプラストの比率を各遺伝子型について測定するサブ工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
生き延びたインビトロ培養細胞から再生した植物のゲノムをシークエンスする工程をさらに含む、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
ＡＬＳ遺伝子の突然変異を同定するためにＡＬＳ遺伝子をシークエンスする工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ＡＬＳ遺伝子に突然変異を有する再生されたテンサイ植物を選択する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
再生されたテンサイ植物が、ＡＬＳ遺伝子においてグリシン１１２、アラニン１１３、メチオニン１１５、アルギニン１３３、バリン１８７、アルギニン１９０、アラニン１９６、フェニルアラニン１９７、リジン２４７、メチオニン３４６、ヒスチジン３４７、アルギニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、メチオニン５６５、バリン５６６、フェニルアラニン５７３、セリン６４８、及びグリシン６４９からなる群より選択されたアミノ酸をコードする位置に１つ又はいくつかの突然変異（群）を有する、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
再生されたテンサイ植物が、ＡＬＳ遺伝子においてプロリン１８８をコードする位置に１つの突然変異、並びに、ＡＬＳ遺伝子においてグリシン１１２、アラニン１１３、メチオニン１１５、アルギニン１３３、バリン１８７、アルギニン１９０、アラニン１９６、フェニルアラニン１９７、リジン２４７、メチオニン３４６、ヒスチジン３４７、アルギニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、メチオニン５６５、バリン５６６、トリプトファン５６９、フェニルアラニン５７３、セリン６４８、及びグリシン６４９をコードする位置に１つ以上の突然変異（群）を有する、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
再生されたテンサイ植物が、ＡＬＳ遺伝子においてトリプトファン５６９をコードする位置に１つの突然変異、並びに、ＡＬＳ遺伝子においてグリシン１１２、アラニン１１３、メチオニン１１５、アルギニン１３３、バリン１８７、プロリン１８８、アルギニン１９０、アラニン１９６、フェニルアラニン１９７、リジン２４７、メチオニン３４６、ヒスチジン３４７、アルギニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、メチオニン５６５、バリン５６６、フェニルアラニン５７３、セリン６４８、及びグリシン６４９をコードする位置に１つ以上の突然変異（群）を有する、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
再生されたテンサイ植物が、ＡＬＳ遺伝子において１つ以上の突然変異（群）を有し、１つ以上の該突然変異が、アラニン１１３、プロリン１８８、アラニン１９６、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、トリプトファン５６９、セリン６４８、及びグリシン６４９からなる群より選択され、該アラニン１１３が、バリン又はトレオニンに突然変異し、該プロリン１８８がトレオニン、アルギニン、ロイシン、グルタミン、又はアラニンに突然変異し、該アラニン１９６がバリンに突然変異し、該アスパラギン酸３７１がグルタミン酸に突然変異し、該アルギニン３７２がヒスチジンに突然変異し、該トリプトファン５６９がグリシンに突然変異し、該セリン６４８がトレオニンに突然変異し、該グリシン６４９がアスパラギン酸に突然変異している、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
再生されたテンサイ植物が、ＡＬＳ遺伝子においてプロリン１８８をコードする位置に１つの突然変異、及び、ＡＬＳ遺伝子においてトリプトファン５６９をコードする位置に１つの突然変異を有する、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群）を含む組成物がインビトロ培養細胞の少なくとも９９％に対して致死的である濃度を推定する予備工程を含む、請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群）が５０００００００個を超える気孔孔辺細胞プロトプラストのインビトロ培養液に適用される、請求項１〜１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群）を含む組成物がホラムスルフロンを含む、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
ホラムスルフロンが１０−９mol/lから１０−６mol/lの範囲の濃度で適用される、請求項１０の方法。
【請求項１５】
１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群）を含む組成物がエトキシスルフロンを含む、請求項１〜１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
除草剤に対して抵抗性である突然変異テンサイ植物を産生するための方法であって、
−  テンサイ植物から単離された気孔孔辺細胞からプロトプラストを得る工程；
−  該プロトプラストのインビトロ培養液に、インビトロ培養細胞の９９％超に対して致死的である濃度で該除草剤を含む組成物を適用する工程；
−  該インビトロ培養細胞の生き延びた細胞からテンサイ植物を再生する工程；及び
−  該除草剤によって標的にされたペプチドをコードする遺伝子に突然変異を有する再生されたテンサイ植物を選択する工程
を含み、該気孔孔辺細胞プロトプラストは、テンサイ植物へのその再生能について予め選択され、該予め選択されたプロトプラストは、１０％を超える、分裂し、及び生存可能なカルスへと再生する確率（成長しているプロトプラストの数：培養液に入れたプロトプラストの総数）を有し、該プロトプラストによって得られたカルスは、１０％を超える、シュートを発生する能力（シュートを産生しているカルスの下部：カルスの総数）を有し、該除草剤は２０００００００個を超える該プロトプラストに適用される、前記方法。
【請求項１７】
該除草剤が、４−ＨＰＰＤ阻害剤、カロテノイド生合成阻害剤、ＥＰＳＰシンターゼ阻害剤、光化学系ＩＩ阻害剤、光化学系Ｉ阻害剤、細胞分裂阻害剤、微小管会合阻害剤、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤、細胞壁合成阻害剤、グルタミンシンテターゼ阻害剤、及び合成オーキシンからなる群より選択される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
ＡＬＳ遺伝子の一方の対立遺伝子上に配列番号３を、ＡＬＳ遺伝子の第二の対立遺伝子上に配列番号５を含む、突然変異テンサイ植物。
【請求項１９】
ＮＣＩＭＢ４２０５０で寄託された種子によって得ることのできる請求項１８記載の突然変異テンサイ植物。
【請求項２０】
請求項１８又は１９の突然変異植物から単離された気孔孔辺細胞プロトプラスト。
【請求項２１】
１つ以上のさらなる遺伝形質の導入のための請求項２０のプロトプラストの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、除草剤、例えばアセトヒドロキシ酸シンターゼ酵素（ＡＬＳ）阻害剤に対して抵抗性であるテンサイ植物を生成する方法に関する。
【０００２】
本発明はさらに、この方法によって得られる植物に関する。
【０００３】
テンサイは、温帯及び亜熱帯地域において重要な農業作物である。
【０００４】
現代の農業においては、雑草の増殖を管理するために除草剤が広く使用されている。
【０００５】
ＡＬＳ阻害剤などの除草剤（群）に対して抵抗性のテンサイ植物の生育は、トランスジェニックアプローチを使用することによって行なわれ得る。
【０００６】
実際に、除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子を有する外来ＤＮＡの導入は、テンサイを含む様々な農作物で成功して実施されている。
【０００７】
国際公開公報第９５／１０１７８号は、除草剤ビアラホスに対するトランスジェニックにより誘導された抵抗性を開示する。抵抗性をコードする遺伝子が、テンサイの孔辺細胞のプロトプラストに導入され、その後、これらのプロトプラストはテンサイ植物へと再生される。そうした植物はさらに、化学物質のホスフィノトリシン及びその誘導体のグルホシネートに対して抵抗性である。形質転換されなかった植物はビアラホスに対する抵抗性を獲得しなかった。
【０００８】
最善の場合では、８３０００個のプロトプラストから２８個の形質転換されたカルスが再生され、最悪の場合でも１９００００個のプロトプラストから１個のカルスが再生された。続いて、これらのカルスのいくつかは体細胞胚形成を示し得、テンサイ小植物を１％の効率で再生し得、特徴が非常に有益と認められたのは３０％以下であった。
【０００９】
胚などのテンサイ器官から及び／又はリーフディスクから得られた外植片からのカルスのより直接的な形質転換に非常に依拠する、このアプローチは当技術分野においてそれにも関わらず一般的に使用されていない。
【００１０】
ＤＮＡベクター及び／又は外来遺伝子の挿入に依拠することなく、テンサイ作物などの除草剤抵抗性植物を生育する重要な必要性が依然として存在する。
【００１１】
一方で、ＡＬＳ阻害剤などの除草剤（群）に対するテンサイ抵抗性植物の生育は、理論的には、天然の抵抗性遺伝子を含むテンサイ植物との古典的な交配を介して行なわれ得る。しかしながら、このようなアプローチは時間がかかり、出願人の知る限りでは、天然のＡＬＳ阻害剤抵抗性植物が、様々な雑草種をはじめとするテンサイ以外の種に関しては少なくとも記述されているという事実にも関わらず成功しなかった。特に二重突然変異体（すなわち、同じＡＬＳ遺伝子に２つの突然変異を有する植物）は自然には非常に起こりにくいようである。
【００１２】
特許出願国際公開公報第９８／０２５２７号は、いくつかのＡＬＳ阻害剤、例えばスルホニル尿素除草剤などに対して抵抗性であるテンサイ植物の製造法を開示し、これは、B.vulgarisの外植片から得られたカルスをスルホニル尿素に曝し、この除草剤の存在下で成長することのできる僅かな自発的突然変異体から植物を再生する工程を含む。
【００１３】
この方法により、ＡＬＳ遺伝子に突然変異を有する植物が得られ、コードされているＡＬＳ酵素の１８８位（シロイナズナＡＬＳ酵素の１９７位に相当する）のプロリンが、セリンによって置換されている。しかしながら、この突然変異体は、商業的に使用されていない。なぜなら、好ましい現代的なスルホニル尿素ＡＬＳ除草剤（例えばホラムスルフロン）を用いての処理は、野外試験において必要な用量率で幾分の植物毒性を示すからである。
【００１４】
特許出願国際公開公報第２０１２／０４９２６８号は、B.vulgarisの外植片から得られたカルスがホラムスルフロンに曝されることを除いて同じ方法に依拠し、よって、ホラムスルフロンを含むいくつかのＡＬＳ阻害剤に対して抵抗性のテンサイ植物が得られる。
【００１５】
この方法により、ＡＬＳ遺伝子に突然変異を有する植物が得られ、コードされているＡＬＳ酵素の５６９位（シロイナズナＡＬＳ酵素の５７４位に相当する）のトリプトファンがロイシンによって置換されている。
【００１６】
このホモ接合体５６９／５６９突然変異体の野外試験は、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン（別のＡＬＳ阻害剤）、並びに種々のＡＬＳ阻害剤の混合物に対して良好な抵抗性を示した。
【００１７】
これらのどちらの公開された方法も、胚などの個々の外植片からカルスを単離する十分に確立された工程の恩恵を受ける。しかしながら、これは（ｉ）多数の新鮮な胚を単離すること、（ｉｉ）寒天で固めた培養培地上でのその反復培養、及び（ｉｉｉ）形態学的な選択アプローチを使用した再生可能なカルスの選択、を必要とする時間のかかるアプローチである。
【００１８】
テンサイに遺伝形質を導入するための他の戦略が開発され、これは出発物質として葉肉プロトプラスト（これは気孔孔辺細胞プロトプラストとは異なる）に依拠する（Krens et al., 1990, Theor. appl. Genet., vol 79, pages 390-396）。Gurel et al. 2008, Critical reviews in Plant Science, 27, 108-140は、テンサイについてのバイオテクノロジーの応用を開示している。７つの異なるインビトロ培養技術が開示されている。その中には、形質転換の目的のための気孔孔辺細胞からの、又は黄化胚軸外植片に由来する脆弱なカルスからのいずれかからのプロトプラストの培養があり、後者がはるかにより効率的である。しかしながら、プロトプラストを使用したこのアプローチは、大きな困難を伴う。Hall et al. 1997, J. Exp. Botany, 48, 255-263は、外来ＤＮＡを用いて形質転換実験を実施するために、５０００００個の気孔孔辺細胞プロトプラストの培養液を使用した。形質転換効率は２％より高かった。他方で、インビトロ植物培養液は、気孔の不完全を伴うことが報告され、これは対応する細胞の問題、及び、非常に多量の気孔孔辺細胞プロトプラスト、例えば突然変異事象を含む方法を実施するために必要とされる量の産生を指摘する。
【００１９】
発明の要約
広い態様において、本発明は、
−  テンサイ植物から単離された気孔孔辺細胞からプロトプラストを得る工程；
−  これらのプロトプラストのインビトロ培養液に、インビトロ培養細胞の９９％超に対して致死的である濃度でこの除草剤を含む組成物を適用する工程；及び
−  これらのインビトロ培養細胞の生き延びた細胞からテンサイ植物を再生する工程、
−  この除草剤によって標的化されたペプチド（群）をコードする遺伝子に突然変異を有する再生されたテンサイ植物をおそらく選択する工程
を含む、除草剤に対して抵抗性である突然変異テンサイ植物を産生するための方法を開示し、これらの気孔孔辺細胞プロトプラストは、テンサイ植物へのその再生能について予め選択され、この除草剤は２０００００００個を超えるこれらのプロトプラストに適用される。
【００２０】
本発明の方法に使用される除草剤は、ＡＬＳ遺伝子を標的にしない除草剤であってもよい。
【００２１】
好ましい除草剤（ＡＬＳを標的にしない）は、
−  ４−ＨＰＰＤ阻害剤（例えばメソトリオン、イソキサフルトール、ピラスルホトール、ベンゾビシクロン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラゾキシフェン、テンボトリオン、トプラメゾン、スルコトリオン（sulcotrione）、及びスルコトリオン（sulcotrion）、カロテノイド生合成阻害剤（例えばフルルタモン、フルリドン、フルロクロリドン、ベフルブタミド、ノルフルラゾン、ピコリナフェン、及びジフルフェニカン）；
−  ＥＰＳＰシンターゼ阻害剤（例えばグリホサート又はグリホサートトリメシウム塩）；
−  光化学系ＩＩ阻害剤（例えばフェニル−カルバメート（例えばフェンメジファム又はデスメジファム）、ピリダジノン（例えばクロロリダゾン＝ピラゾン）、トリアジン（例えばシアナジン、レムタール（remtal）、エグリナジンエチル、プログリナジンエチル、アメトリン、アトラジン、デスメトリン、ジメタメトリン、プロメトン、プロメトリン、プロパジン、シマジン、シメトリン、テルブメトン、テルブチラジン、テルブトリン、メトプロチン（methoprotyn））、トリアジノン（例えばメタミトロン、メトリブジン、ヘキサジノン、メトリブジン）、ウラシル（ブロマシル、レナシル、テルバシル）、尿素（ジメフロン、イソプロツロン、リニュロン、モノリニュロン、エチジムロン、メタベンズチアズロン、テブチウロン、ジウロン、フェニュロン、ネブロン、シデュロン、イソウロン、クロロブロムロン、クロロトルロン、クロロクスロン、フルオメツロン、メトブロムロン、メトクスロン、チアザフルロン、モヌロン、シクルロン、モノリヌロン）、又はアミカルバゾン、ソラン、プロパニル、ベンタゾン、ブロモキシニル、アイオキシニル、ブロモフェノキシム、ピリデート、ピリダフォル；
−  光化学系Ｉ阻害剤（例えばジクワット又はパラコート（paraqua））；
−  細胞分裂阻害剤（例えば、カルベタミド、クロロプロファム、プロファム、ナプロアニリド、ジフェナミド、ナプロパミド、ブテナクロール、メタザクロール、ジエタチルエチル、アセトクロール、アラクロール、ブタクロール、モンサント社のプロパクロール、プロピソクロール、ジメタクロール、ジメテナミド、メトラクロール、プレチラクロール、Ｓ−メトラクロール、ペトキサミド、テニルクロール、アニロホス、カフェンストロール、インダノファン、ブロモブチド、ピペロホス、フルフェナセット、メフェナセット、フェントラザミド）；
−  微小管会合阻害剤（例えばプロピザミド＝プロナミド、テブタム、クロルタールジメチル＝ＤＣＰＡ、フルクロラリン、ペンジメタリン、ブトルアリン、ベネフィン＝ベンフルラリン、エタルフルラリン、オリザリン、トリフルラリン、プロジアミン、ジニトラミン、ブタミホス、ジチオピル、チアゾピル）、
−  プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤（例えばジフェニルエーテル（アシフルオルフェンナトリウム、ビフェノックス、エトキシフェンエチル、クロルニトロフェン、フルオログリコフェンエチル、オキシフルオルフェン、クロメトキシフェン、フロロジフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、ニトロフェン、アクロニフェン）、Ｎ−フェニルフタルイミド（シニドンエチル、フルミクロラックペンチル、フルミオキサジン、フルミクロラックペンチル）、オキサジアゾール（オキサジアルギル、オキサジアゾン）、オキサゾリジンジオン（ペントキサゾン）、フェニルピラゾール（フルアゾレート、フルアゾレート、ピラフルフェンエチル）、ピリミジンジオン（サフルフェナシル、ベンズフェンジゾン、ブタフェナシル）、チアジアゾール（チジアジミン、フルチアセットメチル）、トリアゾリノン（アザフェニジン、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン）、ピラクロニル、プロフルアゾール（profluazol）、フルフェンピルエチル）；
−  アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤（例えばアリールオキシフェノキシプロピオネート（例えばクロジナホッププロパルギル、シハロホップブチル、ジクロホップメチル、フェノキサプロップＰエチル、フルアジホップＰブチル、ハロキシホップエトチル、ハロキシホップメチル、ハロキシホップＰメチル、プロパキザホップ、キザロホップＰエチル、又はキザロホップＰテフリル）、シクロヘキサンジオン（例えばアロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、シクロキシジム、プロホキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、又はトラルコキシジム）又はフェニルピラゾリン（ピノキサデン））；
−  細胞壁合成阻害剤（例えばインダジフラム、イソキサベン、クロルチアミド、ジクロロベニル、キンクロラック、又はフルポキサム）；
−  グルタミンシンターゼ（シンテターゼ）阻害剤（グルホシネートアンモニウム又はビアラホス＝ビラナホス）、及び
−  合成オーキシン（例えばＴＢＡ、ジカンバ、クロラムベン、ベナゾリンエチル４、ジクロロプロップ−Ｐ、メコプロップ−Ｐ、２，４，５−Ｔ（Weedar）、２，４−Ｄ（Weedar）、２，４−ＤＢ（Butyrol）、ジクロロプロップ、ＭＣＰＢ、メコプロップ、ＭＣＰＡ−チオエチル、クロメプロップ、アグロキソン４、アミノピラリド、クロピラリド、フルロキシピル、ハロウキシフェンメチル、ピクロラム、トリクロピル、キンクロラック、又はキンメラック）
からなる群より選択され、より好ましくは、４−ＨＰＰＤ阻害剤、カロテノイド生合成阻害剤、ＥＰＳＰシンターゼ阻害剤、光化学系ＩＩ阻害剤、光化学系Ｉ阻害剤、微小管会合阻害剤、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤、及び合成オーキシンからなる群より選択される。
【００２２】
別の非常に好ましい除草剤はＡＬＳ阻害剤である。
【００２３】
それ故、本発明は、
−  テンサイ植物から単離された気孔孔辺細胞からプロトプラストを得る工程；
−  インビトロの該プロトプラスト培養液に、インビトロ培養細胞（の９９％超（好ましくは９９．９％超、又はさらには９９．９９％超））に対して致死的である（しかしいくつかの突然変異体は回避することのできる）濃度で１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群）を含む組成物を適用する工程；及び
−  該インビトロ培養細胞の生き延びた細胞からテンサイ植物を再生する工程
を含む、１つ以上のアセトヒドロキシ酸シンターゼ酵素（ＡＬＳ）阻害剤に対して抵抗性である突然変異テンサイ植物を産生するための方法に関し、
該気孔孔辺細胞プロトプラストは、テンサイ植物へのその再生能について予め選択され、及び／又は、該ＡＬＳ阻害剤（群）は、２００００００個を超える（好ましくは１０００００００個を超える、より好ましくは２０００００００個を超える、又はさらには５０００００００個を超える）該プロトプラストに適用される。
【００２４】
好ましくは、この方法は、種々の遺伝子型のテンサイ植物から気孔孔辺細胞プロトプラストを単離し、該プロトプラストが培養液に入れられた場合に成長している該プロトプラストの比率を各遺伝子型について測定するサブ工程を含む。
【００２５】
好ましくは、この方法はさらに、有利にはＡＬＳ遺伝子における突然変異を同定するために、及び／又は、ＡＬＳ遺伝子に１つ以上、好ましくは１つ、２つ又はそれ以上の突然変異を有する再生されたテンサイ植物を選択するために、生き延びたインビトロ培養細胞から再生された植物のゲノムをシークエンスする工程を含む。
【００２６】
有利には、ＡＬＳ遺伝子の、グリシン１１２、アラニン１１３、メチオニン１１５、アルギニン１３３、バリン１８７、アルギニン１９０、アラニン１９６、フェニルアラニン１９７、リジン２４７、メチオニン３４６、ヒスチジン３４７、アルギニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、メチオニン５６５、バリン５６６、フェニルアラニン５７３、セリン６４８、及びグリシン６４９からなる群より選択された、好ましくは、アラニン１９６、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、セリン６４８及びグリシン６４９からなる群より選択されたアミノ酸をコードする位置に１つ又はいくつかの突然変異（群）を有するテンサイが、本発明の方法によって得られる及び／又は選択される。１８８位のプロリン及び５６９位のトリプトファンの突然変異を有する別の好ましいテンサイ植物が、本発明の方法によって得られる及び／又は選択される。
【００２７】
好ましくは、２つ以上の突然変異を有するテンサイは、一方の対立遺伝子に２つの突然変異を有し、このことは、コードされたペプチドが、ＡＬＳ阻害剤に対する（特に、いくつかのＡＬＳ阻害剤を含む組成物に対する）抵抗性の相乗作用を起こす２つの突然変異を有することを意味する。最も好ましいテンサイの一例は、一方の対立遺伝子における１８８位にプロリン及び５６９位にトリプトファンの突然変異（及びおそらく第二の対立遺伝子において同じ突然変異；あるいは、第二の対立遺伝子は異なる突然変異を有する）を有するテンサイである。
【００２８】
あるいは、２つの突然変異を有するテンサイは、各対立遺伝子上に１つの突然変異を有する。
【００２９】
本発明の方法は、ＡＬＳ遺伝子においてプロリン１８８をコードする位置に１つの突然変異、及び、ＡＬＳ遺伝子においてグリシン１１２、アラニン１１３、メチオニン１１５、アルギニン１３３、バリン１８７、アルギニン１９０、アラニン１９６、フェニルアラニン１９７、リジン２４７、メチオニン３４６、ヒスチジン３４７、アルギニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、メチオニン５６５、バリン５６６、トリプトファン５６９（好ましくはグリシンへと突然変異）、フェニルアラニン５７３、セリン６４８、及びグリシン６４９をコードする位置に１つ以上の突然変異（群）を有するテンサイ植物の再生を可能とする。好ましいテンサイの一例は、１８８位にプロリンの突然変異、及び同じ対立遺伝子に別の突然変異（おそらくトリプトファン５６９又はＴｒｐ５６９Ｇｌｙではない）を有するテンサイである。
【００３０】
本発明の方法は、ＡＬＳ遺伝子においてトリプトファン５６９（好ましくはロイシンへと突然変異）をコードする位置に１つの突然変異、及び、ＡＬＳ遺伝子においてグリシン１１２、アラニン１１３、メチオニン１１５、アルギニン１３３、バリン１８７、プロリン１８８（好ましくはトレオニン、アルギニン、ロイシン、グルタミン、又はアラニンへと突然変異）、アルギニン１９０、アラニン１９６、フェニルアラニン１９７、リジン２４７、メチオニン３４６、ヒスチジン３４７、アルギニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、メチオニン５６５、バリン５６６、フェニルアラニン５７３、セリン６４８、及びグリシン６４９をコードする位置に１つ以上の突然変異（群）を有するテンサイ植物の産生を可能とする。好ましいテンサイの一例は、５６９位のトリプトファンの突然変異、及び同じ対立遺伝子に別の突然変異（おそらくプロリン１８８又はＰｒｏ１８８Ｓｅｒではない）を有するテンサイである。
【００３１】
本発明の方法は、ＡＬＳ遺伝子に１つ以上の突然変異（群）を有するテンサイ植物の再生を可能とし、１つ以上の該突然変異は、アラニン１１３、プロリン１８８、アラニン１９６、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、トリプトファン５６９、セリン６４８、及びグリシン６４９からなる群より選択され、該アラニン１１３は、バリン又はトレオニンへと突然変異し、該プロリン１８８はトレオニン、アルギニン、ロイシン、グルタミン、又はアラニンへと突然変異し、該アラニン１９６はバリンへと突然変異し、該アスパラギン酸３７１はグルタミン酸へと突然変異し、該アルギニン３７２はヒスチジンへと突然変異し、該トリプトファン５６９はグリシンへと突然変異し、該セリン６４８はトレオニンへと突然変異し、該グリシン６４９はアスパラギン酸へと突然変異している。
【００３２】
好ましくは、これらの特定の突然変異の２つ以上を有するテンサイは一方の対立遺伝子に２つの突然変異を有し、このことはコードされたペプチドが、ＡＬＳ阻害剤に対する（特にいくつかのＡＬＳ阻害剤を含む組成物に対する）抵抗性の相乗作用を起こす２つの突然変異を有することを意味する。
【００３３】
本発明の方法は、ＡＬＳ遺伝子においてプロリン１８８をコードする位置に１つの突然変異、及びＡＬＳ遺伝子においてトリプトファン５６９をコードする位置に１つの突然変異を有する、テンサイ植物の再生を可能とする。
【００３４】
有利には、この方法は、該組成物（１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群）を含む）が、インビトロ培養細胞の少なくとも９９％（好ましくは少なくとも９９．９％又はさらには９９．９９％）に対して致死的（しかしいくつかの突然変異体は回避することのできる）である１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群）の濃度を推定する予備工程を含む。
【００３５】
インビトロで培養されている気孔孔辺細胞プロトプラストに加えようとする組成物（該組成物はさらに、好ましくはスルホニル尿素ＡＬＳ阻害剤ではない別のクラスに由来する別のＡＬＳ阻害剤、例えばチエンカルバゾンメチルを含む）に存在する好ましいＡＬＳ阻害剤は、好ましくは１０−９mol/lから（より好ましくは）１０−６mol/lの濃度のホラムスルフロンである。
【００３６】
インビトロで培養されている気孔孔辺細胞プロトプラストに加えようとする組成物に存在する別の適切なＡＬＳ阻害剤は、エトキシスルフロンである（おそらくこの組成物はさらに他のＡＬＳ阻害剤を含む）。
【００３７】
本発明の関連した態様は、本発明の方法によって得ることのできる突然変異テンサイ植物、例えば、トリプトファン５６９及び／又はプロリン１８８に突然変異を有するテンサイである。
【００３８】
本発明の別の関連した態様は、配列番号３（又は配列番号４）及び／又は配列番号５（又は配列番号６）を含む突然変異テンサイ植物である。
【００３９】
本発明による好ましいテンサイ植物は、ＮＣＩＭＢ４２０５０又はＮＣＩＭＢ４２０５１下の寄託物に対応する。
【００４０】
本発明はまた、本発明の突然変異植物から得られた組織又は植物部分（例えば気孔孔辺細胞又は葉の一片）又は種子、並びに、別の遺伝形質の導入のためのその使用に関する。
【００４１】
本発明はまた、ＡＬＳ阻害剤に対する抵抗性ではない別の遺伝形質の導入のための、本発明において生育された（良好に再生している）気孔孔辺細胞プロトプラストの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、代表的な各株の初期表現型を示す。
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明者らは、気孔孔辺細胞プロトプラストからのテンサイ植物の再生は非常に困難で、起こる頻度が低く、かつ、当技術分野において通常使用されるような外植片から得られたカルスからの直接的な再生よりもより長く複雑な手順を必要とするという事実にも関わらず、テンサイの気孔孔辺細胞からのプロトプラストが、ＡＬＳ阻害剤などの除草剤に対する抵抗性を誘導するための良好な出発材料を示すことを発見した。
【００４４】
実際に、外植片からのカルス（カルス群）は、非分化（又は脱分化）細胞の塊であり、これは適切な培養条件下で分化（又は再分化）して、完全な機能的なテンサイ植物を再生するだろう。このような方法においては、大量の種子が収集され、その後、容易に滅菌され、よって外植片が大量に得られる。このような方法は、大部分の仕事を滅菌環境の困難さを伴わずに実施することを可能とするため簡便である。他方で、気孔孔辺細胞は、植物において詳細に明らかにされた組織を有し、植物組織からのその単離により個々の細胞（群）が得られ、その後、処理の後には個々のプロトプラストが得られる。本発明の方法において、小植物はインビトロで成長及び無菌条件下で維持されなければならず、その後、気孔孔辺細胞はこれらの小植物から単離され、プロトプラストが無菌条件を維持しつつ得られ、その後、これらの個々のプロトプラストはその細胞壁を再度産生し、最初にミクロカルスへと成長し、その後、テンサイ植物へと成長するように誘導される。テンサイの気孔孔辺細胞プロトプラストは、非常に脆弱であり、その適用範囲は狭められることが判明した：例えば、突然変異源の添加は、所望の遺伝形質の出現を支持するのではなく、多くの場合においてプロトプラストに対して致死的であることが判明した。別の言葉で言えば、突然変異を通して所望の遺伝形質を獲得したテンサイ植物を生育させるための出発材料として、気孔孔辺細胞プロトプラストを使用することに成功することは全くもって予想外であった。
【００４５】
さらに、本発明者らは、気孔孔辺細胞プロトプラストの分裂能は、テンサイ遺伝子型に非常に依存していることを発見した：大半の遺伝子型の気孔孔辺細胞プロトプラストは、非常に低い（ほぼ皆無の）分裂（成長）能を示すが、いくつかの特定の遺伝子型のプロトプラストはインビトロで成長する大きな能力を有する。
【００４６】
本発明者らは、非常に大量のこれらの気孔孔辺細胞プロトプラストの固体培地（ポリマー含有培地、例えばアルギネート又はアガロース様含有培地）上での培養、その後、培養材料（通常、再生カルスの形態の）をＡＬＳ阻害剤などの除草剤に曝すことにより、この除草剤分子に対して抵抗性であるいくつかの突然変異細胞が選択されることを同定した。添加される突然変異原がなければ、自発的な突然変異は非常に稀であることが知られ、該方法は、１つ以上のＡＬＳ阻害剤に対して所望の抵抗性を示す既存の突然変異植物の選択の際に、個体群内における遺伝的多様性を活用できないという事実にも関わらずである。
【００４７】
ＡＬＳ阻害剤などの除草剤に対する抵抗性を獲得したこれらの突然変異細胞のいくつかは、生存可能なテンサイ植物（群）へとさらに再生することができた。プロトプラストは実践で使用するのが非常に困難であるが、本発明の方法はそれにも関わらず、除草剤に対する抵抗性を獲得した安定な突然変異体を非常に迅速に生じた。
【００４８】
本発明の方法は、１つ又いくつかの突然変異、例えばＡＬＳ阻害剤などの除草剤の標的である酵素における１つ又はいくつかの突然変異（例えばＡＬＳ遺伝子の突然変異、該ＡＬＳ遺伝子は、シロイナズナＡＬＳの５７４位に相当する、ＡＬＳタンパク質の５６９位においてトリプトファンとは異なるアミノ酸を含有するＡＬＳタンパク質をコードする）を、おそらく、この遺伝子における少なくとも別の突然変異及び／又は他の遺伝子における他の突然変異に加えて含む、除草剤抵抗性（ＡＬＳ阻害剤抵抗性）テンサイ植物の産生を可能とする。
【００４９】
それ故、本発明の態様は、
−  テンサイ植物（ＡＬＳ阻害剤に対して感受性である）から単離された気孔孔辺細胞（からプロトプラスト）を得る工程；
−  これらのインビトロ培養細胞に、これらのインビトロ培養細胞に対して致死的である（（野生型）細胞の少なくとも９９％がＡＬＳ阻害剤によって死滅するが、いくつかの突然変異体は処理を回避することができる）濃度で１つ以上のＡＬＳ阻害剤を含む組成物を適用する工程；及び
生き延びた細胞からテンサイ植物を再生する工程
を含む、１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群）に対して抵抗性であるテンサイ植物（Beta vulgaris；従ってまた、ハマフダンソウ（Beta vulgaris maritima ssp））を産生するための方法である。
【００５０】
この方法は、導入遺伝子の導入に対する代替法と見なすことができる（例えば国際公開公報第９５／１０１７８号に開示）。しかしながら、内因性遺伝子（群）の突然変異に基づいた方法は、トランスジェニックアプローチと比較するとより骨が折れる。実際に、トランスジェニック（突然変異）遺伝子の導入ははるかにより迅速で柔軟で予測可能である。
【００５１】
導入遺伝子により誘導された抵抗性がないということは、ＡＬＳ阻害剤（群）に対する獲得された抵抗性は、気孔孔辺細胞プロトプラストへの（又はその得られた細胞への）（外来）ＤＮＡ、例えば、ＡＬＳ阻害剤（群）に対する抵抗性を直接与えるタンパク質、例えばＡＬＳ阻害剤（群）の毒性を局所的に低減させるタンパク質（例えばＡＬＳ阻害剤（群）を分解する又はその細胞内濃度を減少させる酵素）、又はＡＬＳ阻害剤（群）に対して抵抗性であるＡＬＳタンパク質、例えば阻害剤（群）の存在下でさえ有意な活性及び機能性を維持するＡＬＳ突然変異酵素をコードする（外来）ＤＮＡのインビトロでの挿入によって直接引き起こされないという事実を指す。
【００５２】
しかしながら、本発明の方法によって得られた植物をさらにトランスジェニック植物と交雑して、子孫に別の遺伝形質を積み重ねることができる。本発明によって得られた植物（又はその一部）を、その後のトランスジェニック法にさらに使用して、別の遺伝形質（本発明の方法で得られた遺伝形質とは異なる）を導入することができる。
【００５３】
おそらく、この方法はさらに、突然変異原物質を、単離された気孔孔辺細胞プロトプラストの培養液に加える工程を含む。適切な突然変異原物質は、物理的（例えばＵＶ又はＸ線）曝露又は化学物質（例えば０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％又はさらには２．５％の例えばメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ））への曝露である。しかしながら、プロトプラスト生存能は、通常実施されるいくつかの突然変異誘発処理、例えば０．２％を超えるＥＭＳによる処理などによって有害な影響を受けることが示された。
【００５４】
あるいは、この方法は、突然変異原物質を添加する工程を含まない。
【００５５】
本発明の脈絡において、除草剤は好ましくは、所与の用量で適用された場合、雑草の駆除のために使用される任意の分子を指す。
【００５６】
本発明の方法に使用される（この除草剤に対して抵抗性であるテンサイ植物を生育させるために）好ましい除草剤は、１つのペプチドに対して特異的な公知の活性を有する（よって、対応する遺伝子における単一の突然変異は、この除草剤に対する抵抗性を付与することができる）。別の言葉で言えば、好ましい除草剤は１つのペプチド標的に対して特異的であり（通常、１つの植物酵素の活性を特異的に阻害する）、及び／又は、その標的ペプチドは公知である（標的遺伝子における突然変異について抵抗性テンサイが選別されるような位置にある）。
【００５７】
本発明の脈絡において、ＡＬＳ阻害剤は、ＡＬＳ遺伝子の機能を阻害する任意の分子を指す。
【００５８】
好ましくは、本発明において使用されるＡＬＳ阻害剤（群）は（実質的に）ＡＬＳ以外の他の（テンサイ）酵素を阻害しない。
【００５９】
有利には、ＡＬＳ阻害剤（群）は、本発明において、野生型ＡＬＳ酵素の機能の９０％超（９５％超、９９％超、９９．９％超）が阻害されるが、非関連酵素の機能に実質的に影響を及ぼさない濃度で選択及び使用される。
【００６０】
適切なＡＬＳ阻害剤（本発明を実施するための）は、スルホニル尿素除草剤、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤、イミダゾリノン除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、及びピリミジニル（チオ）ベンゾエート除草剤からなる群より選択される。有利には、除草剤組成物は、少なくとも１つのスルホニル尿素除草剤及び少なくとも１つのトリアゾロピリミジンを含む。好ましいＡＬＳ阻害剤（本発明を実施するための）は、ホラムスルフロン、アミドスルフロン、チエンカルバゾンメチル、エトキシスルフロン、及びその混合物（特に、チエンカルバゾンメチルと、ホラムスルフロン又はアミドスルフロンのいずれかとを含む組成物）であるが；しかしながら、再生されたテンサイ突然変異体は、有利には、いくつかのＡＬＳ阻害剤に対して抵抗性である。
【００６１】
他のＡＬＳ阻害剤（ＡＬＳ阻害剤の混合物を含む）も使用され得、当業者は、どの突然変異が所与のＡＬＳ阻害剤に対して強力な抵抗性を与えるのかを知っている（例えば、５６９位のトリプトファンの突然変異は、ホラムスルフロンに対する抵抗性に関連していることが知られている）；従って、本発明の方法の柔軟性及び効力から、当業者は、いくつかの突然変異を獲得し、従って、ＡＬＳ阻害剤（例えばＡＬＳ阻害剤の混合物）などの除草剤に対してより幅広い抵抗性を有するテンサイ植物を設計することができる。
【００６２】
より好ましくは、この方法は、気孔孔辺細胞プロトプラストが完全に機能的なテンサイ植物へと再生するその能力についてテンサイ植物遺伝子型（株）を選択する予備工程を含み、及び／又は、本発明の方法は、良好に再生しているテンサイ遺伝子型（株）から単離された気孔孔辺細胞プロトプラストに対して実施される。
【００６３】
適切な予備工程（その気孔孔辺細胞プロトプラストがテンサイ植物へと再生する能力についてテンサイ植物遺伝子型を選択する工程）は、その気孔孔辺細胞プロトプラストがテンサイ植物へと再生する能力について（はるかにより好ましくは、インビトロにおいて成長する及び／又はカルスを形成するその能力について）少なくとも１０個の異なるテンサイ植物遺伝子型（異なる遺伝子型バックグラウンドに由来）、好ましくは少なくとも１５個の異なる遺伝子型、又はさらには少なくとも３０個の異なる遺伝子型の比較（収率又は寄生虫感染に対する抵抗性などのその可能性ある有利な特徴とは独立して）、及び、本発明の方法を実施するための良好に再生している遺伝子型（株）の選択を含む。
【００６４】
本発明の脈絡において、良好に再生している気孔孔辺細胞プロトプラストは、分裂して及び／又は生存可能なテンサイカルスへと成長及び／又は再生する（適切な培養培地において、かつ、本発明の方法において適用しようとする毒性分子／除草剤などの外来性の選択圧がない中で成長させた場合）０．２５％を超える（成長しているプロトプラストの数：培養液に入れたプロトプラストの総数；成長数：全体数）、好ましくは１％を超える（成長数：全体数）、より好ましくは５％を超える（成長数：全体数）、さらにより好ましくは１０％を超える（成長数：全体数）、又はさらには２０％（成長数：全体数）若しくは５０％を超える（成長数：全体数）確率を有するプロトプラストを指す。
【００６５】
カルス（カルス群）は、未分化細胞の塊を指す。当技術分野において、カルスは、胚などの外植片から、又は葉若しくは子葉などの柔組織に由来する外植片から得ることができる。しかしながら、本発明の脈絡において、カルスは、（良好に再生している）気孔孔辺細胞プロトプラストの成長の結果である。有利には、これらの良好に再生しているプロトプラストによって得られたカルスは、１０％を超える（シュートを産生しているカルスの数：カルスの総数；シュート数：全体数）、好ましくは２０％を超える（シュート数：全体数）、又はさらには３０％を超える（シュート数：全体数）シュートを発生する能力を有する。
【００６６】
好ましくは、良好に再生しているテンサイ気孔孔辺細胞プロトプラストは、０．１％を超える（テンサイ植物：プロトプラストの総数）（より好ましくは１％を超える）生存可能なテンサイ植物への再生能を有するプロトプラストを指す。
【００６７】
また好ましくは、この方法において、除草剤（例えば１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群））を含む組成物が、２００００００個を超えるこれらの（良好に再生している）テンサイ気孔孔辺細胞プロトプラストのインビトロ培養液に適用される。
【００６８】
あるいは、又はより好ましくはプレ選択工程に加えて、除草剤（例えば１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群））を含む組成物が、５００００００個を超える、又はさらには１０００００００個、２０００００００個、又は５０００００００個を超えるこれらの（良好に再生している）テンサイ気孔孔辺細胞プロトプラストのインビトロ培養液に適用される。
【００６９】
好ましくは、１mlあたり少なくとも５００００個、例えば約１０００００個の（良好に再生している）気孔孔辺細胞プロトプラストを、ポリマー含有培地（例えばアルギネート又はアガロース含有培地）上で成長させた。
【００７０】
おそらく、これらの（良好に再生している）テンサイ気孔孔辺細胞プロトプラストを、除草剤（例えば１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群）、例えばホラムスルフロン及びおそらくチエンカルバゾンメチル）を含む組成物の適用前に、少なくとも約１週間（好ましくは約３週間、及び／又は４週間未満）ポリマー（アルギネート）含有培地上で成長させる。
【００７１】
好ましくは、この方法はさらに、ＡＬＳ阻害剤を含まない培地上での、突然変異気孔孔辺細胞の成長と、野生型気孔孔辺細胞（及び／又はナイーブ及び／又はまだ除草剤で処理されていない）の成長とを比較する工程、及びおそらく、対応する野生型細胞の成長の少なくとも７５％、好ましくは該成長の少なくとも９０％を維持する突然変異体（群）を選択する工程を含む。
【００７２】
好ましくは、又は加えて、この方法はさらに、ＡＬＳ阻害剤を全く含まない温室アッセイ及び農学的な条件における、突然変異細胞から再生されたテンサイの成長及び／又は収率と、野生型（及び／又はナイーブ及び／又はまだＡＬＳ阻害剤によって処理されていない）テンサイの成長及び／又は収率とを比較する工程、及びおそらく、野生型テンサイの成長及び／又は収率の少なくとも７５％、好ましくは該成長及び／又は収率の少なくとも９０％を維持するＡＬＳ阻害剤抵抗性突然変異体（群）テンサイ植物を選択する工程を含む。
【００７３】
好ましくは、この方法はさらに、生き延びたプロトプラストから再生された植物をシークエンスする工程、及び／又は、除草剤（例えば１つ以上のＡＬＳ阻害剤（群））に対する抵抗性に関連した（関連し得る）１つ又はいくつかの突然変異（群）を同定する工程を含む。
【００７４】
本発明の脈絡において、「突然変異」という用語は好ましくは、対応するアミノ酸における１つの変化を引き起こす、除草剤（例えばＡＬＳタンパク質）によって標的にされるペプチドをコードするヌクレオチド配列における１つの（１つの単一の）変化を指し、よって、得られた植物は、ＡＬＳ阻害剤などの除草剤に対して幾分の抵抗性を獲得する。別の言葉で言えば、本発明の脈絡において、「突然変異」は好ましくは、除草剤（ＡＬＳ阻害剤）に対する幾分の抵抗性を可能とする「点突然変異」に等しいと理解される。従って、「いくつかの突然変異」は好ましくは、本発明において、複数の点突然変異（の積み重ね）を指し、各々の点突然変異は、コードアミノ酸の変化を引き起こして、除草剤（例えばＡＬＳ阻害剤及び／又はＡＬＳ阻害剤ではない除草剤）に対する幾分の抵抗性を与える。それ故、好ましくは、本発明の脈絡において、「突然変異」は、コードタンパク質を改変しないヌクレオチド配列における変化も（例えばコーディングトリプレットの第３アミノ酸の変化など）、除草剤（例えばＡＬＳ阻害剤）抵抗性に関連していないアミノ酸の変化も、ヌクレオチド配列における複数の同時変化も含まない。
【００７５】
有利には、（１つ以上の）ＡＬＳ阻害剤（群）に対する抵抗性に関連した突然変異（群）（好ましくはＡＬＳ遺伝子における１つ又は２つの突然変異（群））のこの同定工程は、この突然変異上に及ぶオリゴヌクレオチドプライマーの開発と連関される。
【００７６】
有利には、ＡＬＳ遺伝子における突然変異（群）のこの同定工程の後に、野生型によって及び突然変異ＡＬＳ遺伝子によってコードされるタンパク質の（インビトロにおける）酵素活性の測定が行なわれる。
【００７７】
好ましくは、野生型ＡＬＳ酵素及び突然変異ＡＬＳ酵素のこれらの酵素的測定は、１つ以上のＡＬＳ阻害剤の存在下で（阻害曲線を得るために１つ又はいくつかの濃度で）実施される。
【００７８】
おそらく、野生型酵素及び突然変異酵素のこれらの酵素的測定は、ＡＬＳ阻害剤の非存在下で（さらに）実施される（突然変異酵素の酵素活性を比較するために；好ましくは、ＡＬＳ阻害剤の非存在下で、突然変異酵素は、野生型酵素の活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はさらには少なくとも９９％を維持する）。
【００７９】
好ましくは、本発明の方法は、１つ以上のＡＬＳ阻害剤を種々の濃度で含む組成物を比較する工程、及び、ＡＬＳ阻害剤及び／又はこの組成物内の特定の処方のＡＬＳ阻害剤が、テンサイ植物から単離された気孔孔辺細胞プロトプラストのインビトロ培養液（例えば、少なくとも１週間、アルギネート上で成長させた気孔孔辺細胞プロトプラスト）に対して致死的である濃度を推定する工程を含む。
【００８０】
例えば、（１つ以上の）ＡＬＳ阻害剤（群）が、テンサイ植物から単離された気孔孔辺細胞プロトプラストに対して致死的である濃度を推定するこの工程は、野生型テンサイ植物（及び／又はナイーブ及び／又はＡＬＳ阻害剤によってまだ処理されていない）から単離された気孔孔辺細胞プロトプラストのインビトロ培養液上で実施される。
【００８１】
本発明の脈絡において、（１つ以上の）ＡＬＳ阻害剤（群）を含む組成物の致死的濃度は、培養細胞の少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．９％、より好ましくは少なくとも９９．９９％を死滅させるに十分な（しかしいくつかの突然変異体はこの処理から回避することができる）濃度を指す。
【００８２】
あるいは、又はさらに、（１つ以上の）ＡＬＳ阻害剤（群）が、テンサイ植物から単離された気孔孔辺細胞プロトプラストのインビトロ培養液に対して致死的である濃度を推定するこの工程は、突然変異気孔孔辺細胞のインビトロ培養液上で（ＡＬＳ遺伝子において突然変異を獲得し、ＡＬＳ阻害剤（群）に対して抵抗性である細胞上で）（さらに）実施される。
【００８３】
ナイーブ細胞及び突然変異細胞に対するＡＬＳ阻害剤（ＡＬＳ阻害剤を含む組成物における）の致死的濃度の比較は、有利には、１つの比率として表現される（又はいくつかの比率として、試験された１つのＡＬＳ阻害剤あたり１つの比率として）。
【００８４】
好ましくは、１つのＡＬＳ阻害剤に対して、ナイーブ細胞（群）に対する致死的濃度は、突然変異細胞（群）に対する致死的濃度よりも５０倍低く、より好ましくはナイーブ細胞（群）に対する致死的濃度は、突然変異細胞（群）に対する致死的濃度よりも２００倍低く、さらにより好ましくはナイーブ細胞（群）に対する致死的濃度は、突然変異細胞（群）に対する致死的濃度よりも１０００倍低い。
【００８５】
除草剤（本発明の方法において使用される）は、少なくとも１つのＡＬＳ阻害剤、例えばホラムスルフロンを含む（阻害剤の）混合物であり得る。
【００８６】
おそらく、本発明の方法に使用されるＡＬＳ阻害剤は、スルホニル尿素（例えばホラムスルフロン）などのＡＬＳ阻害剤と、ヨードスルフロン、アミドスルフロン及びチエンカルバゾンメチルからなる群より選択された別のＡＬＳ阻害剤との混合物である。
【００８７】
好ましくは、本発明の方法に使用されるＡＬＳ阻害剤は、ホラムスルフロン、例えば、アルギネート含有培地上で１週令（又は３週令）のインビトロプロトプラスト培養液（より特定すると、これらの培養されたプロトプラストから再生されたカルスを含むインビトロ培養液）に適用されたホラムスルフロンであり（又はこれを含み）、インビトロ細胞培養中に１０−９〜１０−６mol/l（又は１０−９〜１０−６mol/l）の濃度で維持される。
【００８８】
本発明の関連した態様は、この方法によって得ることのできる突然変異テンサイ植物である（例えば、この方法が１つ以上の除草剤（ＡＬＳ阻害剤ではない）の使用又は１つ以上のＡＬＳ阻害剤の使用を含むか、或いは、１つのＡＬＳ阻害剤とＡＬＳ阻害剤ではない１つの除草剤の使用を含む場合）。
【００８９】
それ故、本発明の１つの態様は、ＡＬＳ遺伝子においてグリシン１１２、アラニン１１３、メチオニン１１５、アルギニン１３３、バリン１８７、アルギニン１９０、アラニン１９６、フェニルアラニン１９７、リジン２４７、メチオニン３４６、ヒスチジン３４７、アルギニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、メチオニン５６５、バリン５６６、フェニルアラニン５７３、セリン６４８、及びグリシン６４９からなる群より選択されたアミノ酸をコードする位置に１つ又はいくつかの突然変異（群）を有するテンサイ（本発明の方法によって得ることのできる）である。
【００９０】
好ましいテンサイ（本発明の方法によって得ることのできる）は、ＡＬＳ遺伝子においてアラニン１１３（例えばバリン又はトレオニンへと突然変異）、プロリン１８８（トレオニン、アルギニン、ロイシン、グルタミン、又はアラニンへと突然変異）、アラニン１９６（例えばバリンへと突然変異）、アスパラギン酸３７１（例えばグルタミン酸へと突然変異）、アルギニン３７２（例えばヒスチジンへと突然変異）、トリプトファン５６９（グリシンへと突然変異）、セリン６４８（例えばトレオニンへと突然変異）、及びグリシン６４９（例えばアスパラギン酸へと突然変異）からなる群より選択されたアミノ酸をコードする位置に１つ又はいくつかの突然変異（群）を有する。
【００９１】
本発明の関連した態様は、ＡＬＳ遺伝子における突然変異（コードされているＡＬＳ酵素における５６９位（シロイナズナＡＬＳ酵素の５７４位に相当）のトリプトファンが別のアミノ酸（例えばロイシン）によって置換されている）、及びおそらく別の（１つ又はいくつかの）突然変異、好ましくはＡＬＳ遺伝子における別の（１つ又はいくつかの）突然変異、例えばＡＬＳ遺伝子におけるさらなるアミノ酸置換を引き起こす突然変異を含む、突然変異テンサイ植物（又は突然変異テンサイ植物細胞、例えばテンサイから単離された突然変異気孔孔辺細胞）である。
【００９２】
別の好ましいテンサイ植物は、ＡＬＳ遺伝子の５６９位においてトリプトファンからロイシンへの突然変異、及び、グリシン１１２、アラニン１１３、メチオニン１１５、アルギニン１３３、バリン１８７、アルギニン１９０、アラニン１９６、フェニルアラニン１９７、リジン２４７、メチオニン３４６、ヒスチジン３４７、アルギニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、メチオニン５６５、バリン５６６、フェニルアラニン５７３、セリン６４８、及びグリシン６４９からなる群より選択されたアミノ酸をコードする位置に１つ又はいくつかの突然変異（群）を有する。
【００９３】
好ましいテンサイ（本発明の方法によって得ることのできる）はＡＬＳ遺伝子の５６９位においてトリプトファンからロイシンへの突然変異という１つの突然変異、及び、アラニン１１３（例えばバリン又はトレオニンへの突然変異）、プロリン１８８（トレオニン、アルギニン、ロイシン、グルタミン又はアラニンへの突然変異）、アラニン１９６（例えばバリンへの突然変異）、アスパラギン酸３７１（例えばグルタミン酸への突然変異）、アルギニン３７２（例えばヒスチジンへの突然変異）、セリン６４８（例えばトレオニンへの突然変異）、及びグリシン６４９（例えばアスパラギン酸への突然変異）からなる群より選択されたアミノ酸をコードする位置に１つ又はいくつかの突然変異（群）を有する。
【００９４】
この突然変異テンサイ植物は、使用される１つ又はいくつかのＡＬＳ阻害剤（群）、例えばスルホニル尿素（例えばホラムスルフロン）、及び有利には、好ましくはヨードスルフロン、アミドスルフロン及びチエンカルバゾンメチルからなる群より選択された他のＡＬＳ阻害剤（群）に対して抵抗性である。
【００９５】
本発明の関連した態様は、ＡＬＳ遺伝子における突然変異を含む突然変異テンサイ植物（又は、突然変異テンサイ植物細胞、例えばテンサイから単離された突然変異気孔孔辺細胞）であり、コードされているＡＬＳ酵素における１８８位（シロイナズナＡＬＳ酵素の１９７位に相当）のプロリンが別のアミノ酸（例えばセリン）によって置換されている。
【００９６】
あるいは、好ましいテンサイ植物（本発明の方法によって得ることのできる）は、１８８位におけるプロリンからセリンへの突然変異、及び、ＡＬＳ遺伝子のグリシン１１２、アラニン１１３、メチオニン１１５、アルギニン１３３、バリン１８７、アルギニン１９０、アラニン１９６、フェニルアラニン１９７、リジン２４７、メチオニン３４６、ヒスチジン３４７、アルギニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３７１、アルギニン３７２、メチオニン５６５、バリン５６６、フェニルアラニン５７３、セリン６４８、及びグリシン６４９からなる群より選択されたアミノ酸をコードする位置に１つ又はいくつかの突然変異（群）を有する。
【００９７】
好ましいテンサイ（本発明の方法によって得ることのできる）は、ＡＬＳ遺伝子の１８８位に１つのプロリンからセリンへの突然変異、及び、ＡＬＳ遺伝子のアラニン１１３（例えばバリン又はトレオニンへと突然変異）、アスパラギン酸３７１（例えばグルタミン酸へと突然変異）、アルギニン３７２（例えばヒスチジンへと突然変異）、トリプトファン５６９（グリシンへと突然変異）、セリン６４８（例えばトレオニンへと突然変異）、及びグリシン６４９（例えばアスパラギン酸へと突然変異）をコードする位置に１つ以上の突然変異（群）を有する。
【００９８】
本発明の別の関連した態様は、ＡＬＳ酵素の５６９位にトリプトファンの突然変異、及び、ＡＬＳ酵素の１８８位のプロリンの突然変異、並びに、おそらく別の（１つ又はいくつかの）突然変異、好ましくはＡＬＳ遺伝子における別の（１つ又はいくつかの）突然変異を含む、突然変異テンサイ植物（又は、突然変異テンサイ植物細胞、例えばテンサイから単離された突然変異気孔孔辺細胞）である。
【００９９】
好ましくは、この突然変異テンサイ植物のＡＬＳ遺伝子（の一方の対立遺伝子）は、配列番号３又は配列番号５に相当する。
【０１００】
有利には、本発明の突然変異テンサイ植物は、配列番号３（一方の対立遺伝子における）及び配列番号５（第二の対立遺伝子における）を含む。
【０１０１】
おそらく、本発明の突然変異テンサイ植物は、配列番号３（一方の対立遺伝子における）及び配列番号１又は配列番号７のいずれか（第二の対立遺伝子における）を含む。
【０１０２】
本発明の別の関連した態様は、１つ以上の突然変異を網羅するヌクレオチドフラグメント（少なくとも２０又は少なくとも２５連続ヌクレオチドであるが、２００未満の連続ヌクレオチド、好ましくは５０未満の連続ヌクレオチドである）であり；おそらく、このフラグメントは、プライマー又はプローブ（例えば非ヌクレオチド部分によって又は放射能を使用してさらに標識されたヌクレオチドプローブ、又は、テンサイのＡＬＳ遺伝子に対して外来的な核酸配列を用いて標識されたプローブを含む）として使用するためのものである。
【０１０３】
本発明のさらに別の関連した態様は、毒性分子（除草剤）に対する抵抗性を有するテンサイ植物のマーカー支援選択のための突然変異上に及ぶこのヌクレオチドフラグメントの使用である。
【０１０４】
実施例
比較実施例
突然変異テンサイは、当技術分野において（例えば国際公開公報第９８／０２５２７号において）、野生型テンサイ由来の外植片であるカルスにＡＬＳ除草剤を添加すると成功して生成されたので、本発明者らはまず、国際公開公報第９８／０２５２７号の株から得られたテンサイ遺伝子型（株）を選択し、その気孔孔辺細胞からプロトプラストを単離した。
【０１０５】
数百万個のこれらのプロトプラスト（平均して約２００万から約５００万個、実験によっては１１００万個まで；合計すると、ＡＬＳ除草剤は、約１億５０００万個のプロトプラストに適用された）が国際公開公報第９５／１０１７８号のように単離され、アルギネートを含む培養培地に入れられ、１０−９から１０−６mol/lのホラムスルフロンを含むＭＳ培養培地を用いて処理された。
【０１０６】
本発明者らは、その後、国際公開公報第９５／１０１７８号に記載のプロトコールに従ってテンサイを再生し、ＡＬＳ阻害剤から生き延びたほんの僅かなカルスを観察した。しかしながら、１つの例外を除いて、これらの再生されたカルスのいずれも、テンサイ植物へと生育することができなかった。唯一の再生されたテンサイ植物は、（ホラムスルフロンの標的酵素をコードする）ＡＬＳ遺伝子における突然変異を全く示さなかった。
【０１０７】
それ故、このテンサイ株（その親株は、除草剤への（外植片に由来する）カルスの直接的な曝露に基づいて、この除草剤に対する、突然変異により誘導された抵抗性を獲得したことが示された）は、該方法が気孔孔辺細胞プロトプラストを含む場合、同じ目的に対して有用ではなかった。
【０１０８】
実施例１  良好に再生しているプロトプラストについてのテンサイ遺伝子型（株）の選択
本発明者らは、その後、気孔孔辺細胞プロトプラストからのその再生能についていくつかのテンサイ植物の遺伝子型を比較した。
【０１０９】
本発明者らは、約０．０１％（又はさらにはそれ未満）の再生能を有する遺伝子型、及び、０．１％を（はるかに）超える再生能を有するいくつかの遺伝子型を発見した。
【０１１０】
本発明者らはさらに、プロトプラストの成長（インビトロにおけるその成長能及び分裂能）、成長したカルスがシュートを形成する能力、及び成長しているカルスが植物を再生する割合との間の区別を確立した。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
気孔孔辺細胞プロトプラストが完全なテンサイ植物へと再生する能力を反映する数値が、概して、細胞株「Ｒｅｌ１」についてより高かった場合、この細胞株は、本発明を実施するのに十分なほど有用ではないと判断された。
【０１１３】
本発明者らはさらに、「成長している細胞の比率」パラメーターは、他のパラメーターよりも本発明を実施する際にはるかにより重要であると結論付けた。
【０１１４】
本発明者らは、インビトロで成長することのできる０．２５％を超える気孔孔辺細胞プロトプラストを有する遺伝子型を選択した。
【０１１５】
実施例２  除草剤によるプロトプラストの処理
本発明者らは、比較実施例と同じアプローチを適用したが、良好に成長している気孔孔辺細胞プロトプラストに依拠した（例えば、実施例１において同定；ＮＣＩＭＢ４２０５０又はＮＣＩＭＢ４２０５１として寄託された植物も、高い比率の成長している気孔孔辺細胞プロトプラストを有する他のテンサイ植物と同様に使用され得る）。
【０１１６】
合計して約６８００万個の良好に成長している気孔孔辺細胞プロトプラストを、１０−６Ｍ以下のホラムスルフロンを含むＡＬＳ除草剤組成物を用いて処理した。
【０１１７】
本発明者らは４６個のカルスを得た。
【０１１８】
いくつかの再生された植物は、標的遺伝子であるＡＬＳ遺伝子において突然変異を；各場合において、５６９位のトリプトファンについてのコドンの突然変異（Ｗ５６９Ｌ；シロイナズナの５７４位のトリプトファンに相当）を示している。この突然変異体のＡＬＳ遺伝子の２つの対立遺伝子は、配列番号３及び配列番号７によってコードされている。他の成長しているカルスをシークエンスし、ＡＬＳ遺伝子に突然変異（他の位置における突然変異を含む）を有するが、植物へと再生しなかった。
【０１１９】
本発明者らはそれ故、本発明の方法は、除草剤に対する抵抗性を引き起こす突然変異を生じた植物を生育させるのに非常に有用であると結論付ける。なぜなら、特に、この方法は、外来ＤＮＡの使用及び／又はＡＬＳ阻害剤に対する抵抗性を付与することが既知である遺伝子配列をコードするＤＮＡベクターの導入を含まず、僅か数か月でプラスの結果を生じたからである。
【０１２０】
本発明者らは、その後、この方法を繰り返し、突然変異源（０．０５％から０．２％のＥＭＳ）をプロトプラストにさらに適用して、突然変異の数を増加させた。
【０１２１】
実施例３  ＡＬＳ阻害剤によるテンサイの処理
本発明者らは、突然変異した配列番号３（この突然変異についてヘテロ接合型）を有する再生されたテンサイと、野生型（ナイーブ）テンサイの商業品種の挙動を比較した。（ヘテロ接合型）突然変異品種は、除草剤を有機化合物（２５ｇ/haの菜種油メチルエステル）と組み合わせてその効果を高めた場合にさえも、ホラムスルフロン（１２．５ｇ/ha；３回までの適用）に対する良好な抵抗性を示した。予想された通り、野生型（ナイーブ）植物は、最初の適用後さえも、ホラムスルフロンに対して非常に感受性であった。
【０１２２】
同じ実験を、アミドスルフロン（１５ｇ/ha）を使用して実施し、突然変異植物において同レベルの抵抗性を生じた。他方で、野生型（ナイーブ）植物は、特に有機化合物と組み合わせた場合、及び／又はアミドスルフロンの数回の適用後に、アミドスルフロンに対して非常に感受性であった。
【０１２３】
同じ実験をヨードスルフロン（３．５ｇ/ha）を使用して実施し、ヨードスルフロンを添加した場合に突然変異植物において良好なレベルの抵抗性を示したが、その抵抗性はヨードスルフロンを、有機化合物と一緒に適用する場合に下降した。予想された通り、野生型（ナイーブ）植物は、有機化合物を伴わずに１回適用した後でさえ、ヨードスルフロンに対して非常に感受性であった。
【０１２４】
同じ実験を７．５ｇ/haのチエンカルバゾンメチルを使用して実施し、突然変異植物においてヨードスルフロンとほぼ同じレベルの抵抗性を生じた。野生型（ナイーブ）植物は、試験された全ての濃度で有機化合物の添加に関わらず、チエンカルバゾンメチルに対して非常に感受性であった。
【０１２５】
本発明者らは、野生型と比較することにより、配列番号３（ブダペスト条約ＮＣＩＭＢ４２０５１で寄託）を含む突然変異テンサイ植物はホラムスルフロンに対する最善の抵抗性を与えると結論する。
【０１２６】
本発明者らはさらに、この（ヘテロ接合型）突然変異植物がさらに、他の化学分類に属する阻害剤に対するものを含む、他のＡＬＳ阻害剤に対する幾分かの（部分的ではあるが）抵抗性を獲得したと結論する。
【０１２７】
実施例４  ＡＬＳ阻害剤による、ＡＬＳ遺伝子にさらなる突然変異を有するテンサイの処理
【０１２８】
本発明者らは、その後、配列番号３及び配列番号５（２つの異なる対立遺伝子上の）を含む突然変異テンサイ植物を生育した。このような生じた二重突然変異体は、ブダペスト条約によるＮＣＩＭＢ４２０５０として寄託された。配列番号３及び配列番号５の両方を含む植物は、例えば、単一突然変異体ＮＣＩＭＢ４２０５１に適用されたその後の突然変異誘発工程を含む、いくつかの技術に依拠することによって生成され得る。
【０１２９】
本発明者らはその後、この二重突然変異体植物（一方の対立遺伝子のアミノ酸５６９における突然変異、及び他方の対立遺伝子のアミノ酸１８８における突然変異）と、単一突然変異体（５６９位における突然変異）テンサイの抵抗性を比較した。
【０１３０】
二重突然変異体植物株は、実施例３のように全ての抵抗性特徴を少なくとも維持し、また、有機化合物と共に組成物に入れられた場合にさえ、チエンカルバゾンメチルによる処置に対する及びアミドスルフロンによる処置に対する良好な抵抗性（野外散布に適応する）を獲得した。それ故、この二重突然変異体植物は、単一突然変異体植物（ＡＬＳ遺伝子における５６９位における）に帰する抵抗性との比較により、いくつかのＡＬＳ阻害剤に対する改善された、相乗的な抵抗性を示す。
【０１３１】
実施例５  温室試験：直接比較のための、ＡＬＳ阻害剤による種々のテンサイの処理
【０１３２】
本発明による配列番号３及び配列番号５（２つの異なる対立遺伝子上）を含む突然変異テンサイ植物（上記の実施例４に記載のような「Ａ株」）を、テンサイ植物（コードされているＡＬＳ酵素の５６９位のトリプトファンがロイシンによって置換されている「Ｂ株」）、国際公開公報第９８／０２５２７号に記載のテンサイ植物（コードされているＡＬＳ酵素の１８８位置のプロリンがセリンによって置換されている「Ｃ株」）、及び５６９位及び１８８位に突然変異を有さない伝統的な品種の（野生型）テンサイ植物（「ＷＴ株」）との直接比較のために、種々のＡＬＳ阻害剤を用いて処理した。
【０１３３】
４つの異なる記載されたテンサイ植物のいくつかの群の種子を温室に別々に蒔き、研究書「Entwicklungsstadien mono- und dikotyler Pflanzen”, 2ndedition, 2001, ed. Uwe Meier, Biologische Bundesanstalt fur Land und Forstwirtschaft」に従って、Beta vulgaris L. ssp. vulgarisについてＢＢＣＨ１４のステージまで（すなわち４つの葉（第二の対）が折り畳まれていない）成長させた。続いて、得られた別々の群のテンサイ植物を、各々個々に、表２で示された量（ｇ/ha）のＡＬＳ阻害剤（ＡＬＳ−ｉｎ）を用いて処理した。
【０１３４】
それぞれのＡＬＳ阻害剤を適用した後１４日目に、各テンサイ植物についての傷害（すなわち植物毒性）を、０％（すなわち傷害なし、植物毒性なし）から１００％（すなわち植物は完全に死滅した）までの尺度で格付けした。各植物群についての平均格付けも、表２に示されている。
【０１３５】
【表２】
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【０１３６】
さらに、各テンサイ植物の典型的な初期表現型を、チエンカルバゾンメチル及びホラムスルフロンを含む混合物を用いての処理後に検査した。代表的な各株の初期表現型を図１に示す（図１）。
【０１３７】
図１はまた、本発明によるテンサイ植物（「Ａ株」）がＡＬＳ阻害剤に対する改善された抵抗性を示し、すなわち、優れた成長及びより少ない植物毒性作用が他の初期表現型と比較して観察されたことを実証する。
【０１３８】
実施例６  野外試験：直接比較のための、ＡＬＳ阻害剤による種々のテンサイの処理
【０１３９】
【表３】
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【０１４０】
本発明者らは、雑草の破壊を可能とする用量で市販の組成物を試験した。
【０１４１】
感受性対照（すなわち、ＡＬＳ遺伝子において突然変異を全く有さないテンサイ）は、１つを除く全ての除草剤によって死滅した。本発明者らは、コントロールの（非処理）植物への小さな傷害を測定し、傷害は時に３５％又はさらには４０％にまで達した。これらの「傷害」はこの野外試験の農業条件を反映する。
【０１４２】
他方で、５６９（５７４）位にヘテロ接合体を有するテンサイ植物は、いくつかの除草剤組成物に対して部分的に抵抗性となった。両方の対立遺伝子上に５６９突然変異（５７４）を取り込み、従って（５６９／５６９）ホモ接合体である植物は、さらに増加した抵抗性を有する：僅か７つの除草剤組成物が中程度の毒性である（５％から３５％）。
【０１４３】
ＡＬＳ遺伝子の一方の対立遺伝子の５６９（５７４）位に突然変異、及びＡＬＳ遺伝子の第二の対立遺伝子の１８８（１９７）位に突然変異を取り込んだテンサイ植物もまた、改善された抵抗性を獲得した。なぜなら、９個の除草剤組成物が中程度に毒性であり、僅か３つが極めて毒性であるからである。驚くべきことに、ＡＬＳ阻害剤に対して強力な抵抗性を与える突然変異（５６９）がなく、弱い抵抗性しか与えない突然変異（１８８）が付加されたこのような植物は、３つの異なるこの野外試験の条件において、ホモ接合体（５６９／５６９）植物よりもさらにより良好な抵抗性を与える。
【０１４４】
【表４】
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【図１】
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【配列表】
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