(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担持体に担持される細胞の画像を撮像する撮像装置であって、
前記担持体に照明光を照射する照明部と、
光軸を前記担持体に向けて配置される撮像光学系を有し、前記照明光の照射を受ける前記担持体を透過する透過光を前記撮像光学系で受光して前記細胞を撮像する撮像部と、
前記撮像光学系の前側焦点位置を前記撮像光学系の光軸に沿った方向に変更する位置変更部と、
前記撮像光学系の前側焦点位置を設定する制御部と、を備え、
前記照明光の開口数が０．３以下であり、
前記制御部は、前記撮像光学系の前側焦点を前記担持体に担持される前記細胞から前記照明部側に離れた第１位置または前記撮像光学系側に離れた第２位置に位置させて前記撮像部に撮像を行わせて取得した原画像を前記細胞の画像とすることを特徴とする撮像装置。
【請求項２】
担持体に担持される細胞の画像を撮像する撮像装置であって、
前記担持体に照明光を照射する照明部と、
光軸を前記担持体に向けて配置される撮像光学系を有し、前記照明光の照射を受ける前記担持体を透過する透過光を前記撮像光学系で受光して前記細胞を撮像する撮像部と、
前記撮像光学系の前側焦点位置を前記撮像光学系の光軸に沿った方向に変更する位置変更部と、
前記撮像光学系の前側焦点位置を設定する制御部と、を備え、
前記照明光の開口数が０．３以下であり、
前記制御部は、前記撮像光学系の前側焦点を前記担持体に担持される前記細胞から前記照明部側に離れた第１位置および前記撮像光学系側に離れた第２位置にそれぞれ位置させて前記撮像部に撮像を行わせることで２つの原画像を取得し、前記２つの原画像の差分画像を前記細胞の画像とすることを特徴とする撮像装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載の撮像装置であって、
前記制御部は、
前記位置変更部による前記前側焦点位置の設定値を多段階に変更設定して各設定値で前記撮像部に撮像を行わせて複数の原画像を取得し、
前記原画像毎にコントラスト値を算出することで前記設定値に対する前記コントラスト値のプロファイルを取得し、
前記プロファイルにおける極小値を挟んで、前記照明部側の設定値を前記第１位置とするとともに前記撮像光学系側の設定値を前記第２位置とする撮像装置。
【請求項４】
請求項３に記載の撮像装置であって、
前記制御部は、前記プロファイルにおける前記照明部側の極大領域に対応する設定値を前記第１位置とする撮像装置。
【請求項５】
請求項３または４に記載の撮像装置であって、
前記制御部は、前記プロファイルにおける前記撮像光学系側の極大領域に対応する設定値を前記第２位置とする撮像装置。
【請求項６】
細胞を担持する担持体に照明光を照射する工程と、
前記照明光の照射を受ける前記担持体を透過する透過光を撮像光学系で受光して撮像部により前記細胞を撮像する工程とを備え、
前記照明光の開口数を０．３以下に設定し、
前記撮像光学系の前側焦点を前記担持体に担持される前記細胞から前記照明部側に離れた第１位置または前記撮像光学系側に離れた第２位置に位置させて前記撮像部により撮像された原画像を前記細胞の画像とすることを特徴とする撮像方法。
【請求項７】
細胞を担持する担持体に照明光を照射する工程と、
前記照明光の照射を受ける前記担持体を透過する透過光を撮像光学系で受光して撮像部により前記細胞を撮像する工程とを備え、
前記照明光の開口数を０．３以下に設定し、
前記撮像光学系の前側焦点を前記担持体に担持される前記細胞から前記照明部側に離れた第１位置および前記撮像光学系側に離れた第２位置にそれぞれ位置させて前記撮像部により２つの原画像を撮像し、
前記２つの原画像の差分画像を前記細胞の画像とすることを特徴とする撮像方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞を担持する担持体に照明光を照射し、担持体を透過する透過光を受光して細胞を撮像する撮像装置および撮像方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療や生物科学の実験においては、例えば、観察対象である細胞をＣＣＤカメラ等で撮像してデータ化し、該画像データに種々の画像処理技術を適用して観察や分析に供することが行われるようになってきている。従来、細胞の視認性を高めるために適宜の染料を用いた細胞の染色が行われてきたが、細胞に与えるダメージを抑えるために、無染色で撮像することが求められる場合がある。しかしながら、無染色の細胞の細胞質は無色透明に近いため、高品質の画像を得ることが難しい。特に透明容器などの担持体に担持された細胞を合焦位置として明視野撮像を行うと、高いコントラストの画像を得ることが難しい（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−０２０４９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、上記特許文献１では、無染色の細胞の細胞質は実質的に透明であるが、その内部に屈折率の違いを持っていることに着目し、焦点位置を上記合焦位置からずらすことでコントラストの向上を図っている。しかしながら、照明光との関係については全く考慮されていない。つまり、後で詳述するように、照明光の開口数（ＮＡ：numerical aperture）が大きくなると、十分なコントラストが得られない。
【０００５】
この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、細胞を担持する担持体に照明光を照射するとともに担持体を透過する透過光を受光して、上記細胞の輪郭が明瞭な画像を撮像することができる撮像装置および撮像方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明の第１態様は、担持体に担持される細胞の画像を撮像する撮像装置であって、  担持体に照明光を照射する照明部と、光軸を担持体に向けて配置される撮像光学系を有し、照明光の照射を受ける担持体を透過する透過光を撮像光学系で受光して細胞を撮像する撮像部と、撮像光学系の前側焦点位置を撮像光学系の光軸に沿った方向に変更する位置変更部と、撮像光学系の前側焦点位置を設定する制御部と、を備え、照明光の開口数が０．３以下であり、制御部は、撮像光学系の前側焦点を担持体に担持される細胞から照明部側に離れた第１位置または撮像光学系側に離れた第２位置に位置させて撮像部に撮像を行わせて取得した原画像を細胞の画像とすることを特徴としている。
また、この発明の第２態様は、担持体に担持される細胞の画像を撮像する撮像装置であって、担持体に照明光を照射する照明部と、光軸を担持体に向けて配置される撮像光学系を有し、照明光の照射を受ける担持体を透過する透過光を撮像光学系で受光して細胞を撮像する撮像部と、撮像光学系の前側焦点位置を撮像光学系の光軸に沿った方向に変更する位置変更部と、撮像光学系の前側焦点位置を設定する制御部と、を備え、照明光の開口数が０．３以下であり、制御部は、撮像光学系の前側焦点を担持体に担持される細胞から照明部側に離れた第１位置および撮像光学系側に離れた第２位置にそれぞれ位置させて撮像部に撮像を行わせることで２つの原画像を取得し、２つの原画像の差分画像を細胞の画像とすることを特徴としている。
【０００７】
この発明の第３態様は、撮像方法であって、細胞を担持する担持体に照明光を照射する工程と、照明光の照射を受ける担持体を透過する透過光を撮像光学系で受光して撮像部により細胞を撮像する工程とを備え、照明光の開口数を０．３以下に設定し、撮像光学系の前側焦点を担持体に担持される細胞から照明部側に離れた第１位置または撮像光学系側に離れた第２位置に位置させて撮像部により撮像された原画像を細胞の画像とすることを特徴としている。
この発明の第４態様は、撮像方法であって、細胞を担持する担持体に照明光を照射する工程と、照明光の照射を受ける担持体を透過する透過光を撮像光学系で受光して撮像部により細胞を撮像する工程とを備え、照明光の開口数を０．３以下に設定し、撮像光学系の前側焦点を担持体に担持される細胞から照明部側に離れた第１位置および撮像光学系側に離れた第２位置にそれぞれ位置させて撮像部により２つの原画像を撮像し、２つの原画像の差分画像を細胞の画像とすることを特徴としている。
【発明の効果】
【０００８】
上記のように、本発明によれば、細胞を担持する担持体に照明光を照射し、その担持体を透過する透過光を受光して細胞を撮像するため、照明光の開口数（ＮＡ）が撮像される画像のコントラストに大きな影響を与える。具体的な影響内容は後で図７や図８を参照しつつ詳述するが、照明光の開口数（ＮＡ）を０．３以下に設定することでコントラスト値を高めて細胞の輪郭が明瞭な画像を撮像することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明にかかる撮像装置の概略構成を示す図である。
【図２Ａ】撮像時の対物レンズの焦点と細胞との位置関係を模式的に示す図である。
【図２Ｂ】焦点位置と画像のコントラスト値との関係を示す図である。
【図３】対物レンズの焦点位置による画像の変化を説明するための図である。
【図４】差分画像を作成するための処理を示すフローチャートである。
【図５Ａ】差分画像を作成するための画像処理の第１実施形態を示すフローチャートである。
【図５Ｂ】差分画像を作成するための画像処理の第２実施形態を示すフローチャートである。
【図６】第２実施形態における差分画像作成処理をより詳しく説明する図である。
【図７】照明光の開口数（ＮＡ）が画像のコントラスト値に与える影響の一例を示す図である。
【図８】照明光の開口数（ＮＡ）が画像のコントラスト値に与える影響の他の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、この発明にかかる撮像装置の全体構成および動作、当該撮像装置により撮像された画像に対する画像処理方法を説明した後で、上記画像を明瞭に撮像するための具体的な構成について説明する。
【００１１】
図１は本発明にかかる撮像装置の概略構成を示す図である。この撮像装置１は、ウェルプレートＷＰの上面に形成されたウェルＷと称される窪部に注入された液体中の試料を撮像し、さらに所定の画像処理を施して画像を出力する装置である。以下、各図における方向を統一的に示すために、図１に示すようにＸＹＺ直交座標軸を設定する。ここでＸＹ平面が水平面、Ｚ軸が鉛直軸を表す。より詳しくは、（＋Ｚ）方向が鉛直上向き方向を表している。
【００１２】
ウェルプレートＷＰは、創薬や生物科学の分野において一般的に使用されているものであり、平板状のプレートの上面に、断面が略円形の筒状に形成され底面が透明で平坦なウェルＷが複数設けられている。１つのウェルプレートＷＰにおけるウェルＷの数は任意であるが、例えば９６個（１２×８のマトリクス配列）のものを用いることができる。各ウェルＷの直径および深さは代表的には数ｍｍ程度である。なお、この撮像装置１が対象とするウェルプレートのサイズやウェルの断面形状、配設数等はこれらに限定されるものではなく任意であり、例えば３８４穴のものであってもよい。
【００１３】
ウェルプレートＷＰの各ウェルＷには、培地としての液体が所定量注入され、この液体中において所定の培養条件で培養された細胞や細菌等が、この撮像装置１の撮像対象となる。培地は適宜の試薬が添加されたものでもよく、また液状でウェルＷに投入された後ゲル化するものであってもよい。常用される一般的な液量は、５０ないし２００マイクロリットル程度である。
【００１４】
撮像装置１は、試料を液体とともに各ウェルＷに担持するウェルプレートＷＰの下面周縁部に当接して、ウェルプレートＷＰを略水平姿勢に保持するホルダ１１と、ホルダ１１の上方に配置される照明部１２と、ホルダ１１の下方に配置される撮像部１３と、これら各部の動作を制御するＣＰＵ１４１を有する制御部１４とを備えている。
【００１５】
照明部１２は、ホルダ１１により保持されたウェルプレートＷＰに向けて照明光Ｌｉを出射する。照明光Ｌｉとしては例えば白色光を用いることができる。後述する無染色の細胞を撮像する目的においては、照明光Ｌｉは開口数（ＮＡ）の小さい照明光、例えば平行光であることが好ましい。照明部１２により、ウェルプレートＷＰに設けられたウェルＷ内の試料が上方から照明される。照明光Ｌｉの開口数（ＮＡ）については、例えば撮像光学系１３０の開口数以下とすることができる。なお、照明光Ｌｉの開口数（ＮＡ）については撮像した画像の明瞭化のために０．３以下とするのが望ましく、その理由については後で詳述する。
【００１６】
ホルダ１１により保持されたウェルプレートＷＰの下方に、撮像部１３が設けられる。撮像部１３では、ウェルプレートＷＰの直下位置に対物レンズ１３１が配置されている。対物レンズ１３１の光軸ＯＡは鉛直方向（Ｚ方向）に向けられており、対物レンズ１３１の光軸ＯＡに沿って上から下に向かって順に、開口絞り１３２、結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４がさらに設けられている。対物レンズ１３１、開口絞り１３２および結像レンズ１３３は、それぞれの中心が鉛直方向（Ｚ方向）に沿って一列に並ぶように配置されて、これらが一体として撮像光学系１３０を構成している。なお、この例では撮像部１３を構成する各部が鉛直方向に一列に配列されているが、反射鏡等により光路が折り返されていてもよい。
【００１７】
撮像部１３は、制御部１４に設けられたメカ駆動部１４６によりＸＹＺ方向に移動可能となっている。具体的には、メカ駆動部１４６が、ＣＰＵ１４１からの制御指令に基づき、撮像部１３を構成する対物レンズ１３１、開口絞り１３２、結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４を一体的にＸ方向およびＹ方向に移動させることにより、撮像部１３がウェルＷに対し水平方向に移動する。１つのウェルＷ内の撮像対象物が撮像されるときには、メカ駆動部１４６は、当該ウェルＷが撮像部１３の撮像視野に含まれるように、撮像部１３を水平方向に位置決めする。
【００１８】
また、メカ駆動部１４６は、撮像部１３をＺ方向に移動させることにより、撮像対象物に対する撮像部のフォーカス合わせを行う。具体的には、撮像対象物たる試料が存在するウェルＷの内底面に対物レンズ１３１の焦点が合うように、メカ駆動部１４６が、対物レンズ１３１、開口絞り１３２、結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４を一体的に上下動させる。
【００１９】
また、メカ駆動部１４６は、撮像部１３をＸＹ方向に移動させる際、照明部１２を撮像部１３と一体的にＸＹ方向に移動させる。すなわち、照明部１２は、その光中心が撮像光学系１３０の光軸ＯＡと略一致するように配置されており、対物レンズ１３１を含む撮像部１３がＸＹ方向に移動するとき、これと連動してＸＹ方向に移動する。これにより、どのウェルＷが撮像される場合でも照明条件を一定にして、撮像条件を良好に維持することができる。なお、ウェルプレートＷＰを固定し撮像部１３を移動させる構成に代えて、撮像部１３を固定しウェルプレートＷＰを移動させる構成であってもよい。
【００２０】
撮像部１３により、ウェルＷ内の試料が明視野撮像される。具体的には、照明部１２から出射されウェルＷの上方から液体に入射した光が撮像対象物を照明し、ウェルＷ底面から下方へ透過した光が対物レンズ１３１により集光され、開口絞り１３２、結像レンズ１３３を介して最終的に撮像デバイス１３４の受光面に撮像対象物の像が結像し、これが撮像デバイス１３４の受光素子１３４１により受光される。受光素子１３４１は二次元イメージセンサであり、その表面に結像した撮像対象物の二次元画像を電気信号に変換する。受光素子１３４１としては、例えばＣＣＤセンサまたはＣＭＯＳセンサを用いることができる。
【００２１】
受光素子１３４１から出力される画像信号は、制御部１４に送られる。すなわち、画像信号は制御部１４に設けられたＡＤコンバータ（Ａ／Ｄ）１４３に入力されてデジタル画像データに変換される。ＣＰＵ１４１は、受信した画像データに基づき適宜画像処理を実行する。制御部１４はさらに、画像データを記憶保存するための画像メモリ１４４と、ＣＰＵ１４１が実行すべきプログラムやＣＰＵ１４１により生成されるデータを記憶保存するためのメモリ１４５とを有しているが、これらは一体のものであってもよい。
【００２２】
その他に、制御部１４には、インターフェース（Ｉ／Ｆ）１４２が設けられている。インターフェース１４２は、ユーザからの操作入力を受け付けたり、ユーザへの処理結果等の情報提示を行うほか、通信回線を介して接続された外部装置との間でのデータ交換を行う。
【００２３】
次に、このように構成された撮像装置１の動作について説明する。撮像装置１では、ウェルプレートＷＰの各ウェルＷ内で培養された細胞、細菌、細胞集塊（スフェロイド）等の撮像を行うことが可能であり、撮像された画像を種々の観察、解析に供することができる。
【００２４】
ここでは、例えばウェルＷ内で培養される細胞の増殖状態を調べることを目的として、細胞を無染色で撮像し、その輪郭を特定して細胞の個数や大きさを観察するケースを考える。従来、無色透明に近い細胞を光学的に観察する目的で、細胞を適宜の染料で染色することが行われてきた。しかしながら、細胞を生きたまま観察すること、あるいは経時変化を調べること等を目的として、細胞にダメージを与えることなく撮像を行うことが必要な場合がある。このような場合、細胞を無染色で撮像する必要がある。
【００２５】
この撮像装置１のような明視野撮像においては、透明に近い細胞を高コントラストで撮像することが難しい。このような場合の撮像には例えば位相差顕微鏡を用いる方法が考えられるが、装置構成が複雑で高価である。上記のように細胞の輪郭を特定することができれば足りる用途においては、より簡単な装置構成で画像を取得することができるのが好ましい。この撮像装置１は、このような要望に応えることのできるものである。
【００２６】
図２Ａおよび図２Ｂは透明な細胞を明視野撮像する場合の問題を説明する図である。より詳しくは、図２Ａは撮像時の対物レンズ１３１の焦点Ｆと細胞Ｃとの位置関係を模式的に示す図であり、図２Ｂは焦点位置と画像のコントラスト値との関係を示す図である。図２Ａに示すように、対物レンズ１３１の焦点Ｆを光軸ＯＡ方向（この場合はＺ方向）に変化させながらほぼ透明な細胞Ｃを撮像する場合を考える。撮像対象である細胞ＣのＺ方向位置を符号Ｚｃ、対物レンズ１３１の焦点ＦのＺ方向位置を符号Ｚｆにより表す。Ｚ方向における対物レンズ１３１は、焦点位置Ｚｆよりも焦点距離ｆだけ下方に位置する。
【００２７】
図２Ｂに示すように、Ｚ方向の焦点位置Ｚｆが細胞Ｃの位置Ｚｃと略一致するときにコントラスト値が極小となり、その前後ではコントラスト値が高くなる。なお、このような知見については、例えば前記した特許文献１にも記載されている。以下の説明のために、図２Ｂに示す焦点位置に対するコントラスト値のプロファイルにおいて、極小値を挟む２つの極大値を与える焦点位置Ｚｆの値を符号Ｚａ、Ｚｂにより表す。
【００２８】
図３は対物レンズの焦点位置による画像の変化を説明するための図である。焦点位置の違いによる画像の相違について、以下の３つのケース、（ａ）Ｚｆ＞Ｚｃ、（ｂ）Ｚｆ＜Ｚｃ、（ｃ）Ｚｆ＝Ｚｃ、に分けて説明する。
【００２９】
最初に、Ｚｆ＝Ｚｃであるケース（ｃ）について説明する。このケースは、対物レンズ１３１の焦点面ＦＰが細胞Ｃ上にある合焦状態に相当する。この場合、画像例に示すように、細胞Ｃの像は微細な構造まで鮮明であるが、濃淡の差が小さく、画像のコントラスト値が極小となる。画素ごとの輝度のヒストグラムを取ると、そのばらつきは小さい。このため、例えば画素値に基づく画像の二値化や細胞輪郭の抽出を自動的に行う用途には適していない。
【００３０】
ケース（ａ）は、対物レンズ１３１の焦点面ＦＰが細胞Ｃよりも（＋Ｚ）方向（上方）に位置する、つまり細胞Ｃが対物レンズ１３１の焦点距離ｆよりも対物レンズ１３１に近い位置にある場合に相当する。この場合、対物レンズ１３１は細胞Ｃを介して焦点面ＦＰを見ていることになる。また、ケース（ｂ）は、対物レンズ１３１の焦点面ＦＰが細胞Ｃよりも（−Ｚ）方向（下方）に位置する、つまり細胞Ｃが対物レンズ１３１の焦点距離ｆよりも遠い位置にある場合に相当する。これらの場合、透明な細胞Ｃによるレンズ作用のため、特に細胞Ｃの周縁部において輝度の変化が現れる。
【００３１】
すなわち、細胞Ｃが対物レンズ１３１の焦点距離ｆよりも近くにあるケース（ａ）では細胞Ｃの周縁部で輝度が高く（明るく）なる一方、細胞Ｃが対物レンズ１３１の焦点距離ｆよりも遠いケース（ｂ）では細胞Ｃの周縁部で輝度が低く（暗く）なる。このため、画素値のヒストグラムがケース（ａ）で高輝度側に広がり、ケース（ｂ）では低輝度側に広がる。このように、ケース（ａ）とケース（ｂ）とでは、細胞Ｃの周縁部において逆の輝度変化が現れる。なお、これらのケースでは、対物レンズ１３１の焦点Ｆが細胞Ｃに合っていないため、細胞Ｃの像の鮮明さはケース（ｃ）の画像よりも低下する。
【００３２】
ケース（ａ）における撮像で得られた画像と、ケース（ｂ）における撮像で得られた画像との間で画素単位の差分を求める。画素値の差分を各画素の新たな画素値とする差分画像では、ヒストグラムにおける輝度値の分布が広がり、画像のコントラスト値が大きくなる。特に輝度の差が大きい細胞Ｃの周縁部において明暗の差が強調される。したがって、差分画像は、細胞Ｃの内部構造については必ずしも鮮明でないものの、その輪郭部分を高いコントラストで示す画像となる。
【００３３】
差分画像の各画素の画素値Ｐｄは、ケース（ａ）およびケース（ｂ）における撮像でそれぞれ得られた画像の同一画素の画素値Ｐａ、Ｐｂと定数Ｋとを用いて次式：
Ｐｄ＝Ｐａ−Ｐｂ＋Ｋ
により表すことができる。定数Ｋは、画像の内容によって画素値Ｐｄが負の値となることを回避するためのオフセット値である。定数Ｋについては、予想される画素値の分布に基づき予め定めておいてもよく、画素値の差分（Ｐａ−Ｐｂ）の演算結果に応じて動的に定められてもよい。ただし１つの差分画像においては各画素に単一の定数Ｋが適用される。なお、上式において、画素値Ｐａ、Ｐｂの少なくとも一方に適宜の係数を乗じてもよい。
【００３４】
このように、細胞Ｃの輪郭が明瞭な画像を得るためには、焦点位置を互いに異ならせて撮像された２つの画像の差分画像を作成すればよい。ただし、輪郭を強調するという目的において、２つの画像は、焦点位置に対するコントラスト値のプロファイルにおいて極小値を取る焦点位置（Ｚｆ＝Ｚｃ）を挟む２つの焦点位置でそれぞれ撮像されたものである必要がある。また、輪郭強調効果を最大にするためには、図２Ｂに示されるプロファイルにおいてコントラスト値の極大値を取る２つの焦点位置Ｚａ、Ｚｂに近い焦点位置で２つの画像の撮像が行われることがより好ましい。以下、このような目的を達成するための具体的な処理の内容について説明する。
【００３５】
図４は差分画像を作成するための処理を示すフローチャートである。この処理は、ＣＰＵ１４１が例えばメモリ１４５に予め記憶された制御プログラムを実行し、該制御プログラムに基づき装置各部を制御することにより実現される。まず、撮像対象となる細胞が培養されるウェルＷを含むウェルプレートＷＰがホルダ１１にセットされる（ステップＳ１０１）。次いで撮像部１３が所定の初期位置に設定される（ステップＳ１０２）。撮像部１３の水平方向における初期位置は、撮像対象であるウェルＷの中心と撮像光学系１３０の光軸ＯＡとが一致する位置である。また鉛直方向における初期位置は、撮像部１３の鉛直方向における可変範囲のうちウェルプレートＷＰの底面に最も近い位置である。
【００３６】
次に、撮像部１３によりウェルＷを撮像して１つの原画像を取得し（ステップＳ１０３）、撮像部１３を所定の刻みで１ステップ下方へ移動させて（ステップＳ１０５）、再度撮像を行う（ステップＳ１０３）。このような撮像部１３の１ステップずつの移動と撮像とを、撮像部１３が撮像終了位置、すなわちその可変範囲において最も下方でウェルプレートＷＰの底面から最も離れた位置）に到達するまで繰り返す（ステップＳ１０４）。これにより、撮像光学系１３０の焦点位置を互いに鉛直方向に異ならせて撮像された複数の原画像が取得される。これらの原画像は画像メモリ１４４に記憶保存される。
【００３７】
撮像対象となる細胞Ｃのサイズは一般的に数μｍないし数十μｍ程度であり、これに対応する撮像部１３の移動は、１ステップ当たり例えば２μｍないし１０μｍ程度とすることができる。
【００３８】
こうして得られた原画像の各々について、ＣＰＵ１４１は画像のコントラスト値を算出する（ステップＳ１０６）。コントラスト値の算出方法としてはいくつかの方法が知られているが、各原画像において同一方法を用いる限りにおいて、任意のものを適用することができる。例えば、原画像中の最も高輝度の画素の画素値と最も低輝度の画素の画素値との差を以って当該原画像のコントラスト値とすることができる。なお、後で説明する図７および図８中の「コントラスト値」も同様である。
【００３９】
続いて、撮像された複数の原画像から抽出される２つの原画像に基づき、ＣＰＵ１４１が所定の画像処理により差分画像を作成する（ステップＳ１０７）。この差分画像作成方法について、互いに異なる原理に基づく２つの実施形態があり、それらについては後で説明する。作成された差分画像は細胞Ｃの輪郭が強調されたものであり、これが画像メモリ１４４に記憶保存され、必要に応じてインターフェース１４２を介して出力画像として出力される（ステップＳ１０８）。画像の出力の態様としては、インターフェース１４２の一部として設けられたディスプレイに差分画像が表示されるものであってもよく、また外部装置や外部記憶媒体に対し差分画像の画像データが出力されるものであってもよい。
【００４０】
図５Ａおよび図５Ｂは差分画像作成の２つの態様を示すフローチャートである。より具体的には、図５Ａは差分画像を作成するための画像処理の第１実施形態を示し、図５Ｂは差分画像を作成するための画像処理の第２実施形態を示す。これらの実施形態では、上記のようにして算出された各原画像のコントラスト値を、当該原画像が撮像されたときの焦点位置の設定値に沿って配列した仮想的なプロファイルにおける極大値または極小値に基づいて差分画像の基となる原画像が抽出される。なお、プロファイルにおける極大値または極小値を何らかの方法で求めることができれば足り、実際にプロファイルを作成するための処理を要するものではない。
【００４１】
図５Ａに示す第１実施形態の処理では、プロファイルにおけるコントラスト値の２つの極大値を検出する（ステップＳ２０１）。極大値については、例えばプロファイルにおいて、焦点位置の設定値の変化に伴ってコントラスト値が増加する局面から減少する局面に変化する点を求めることにより検出可能である。そして、これらの極大値を与える２つの焦点位置の設定値を求める（ステップＳ２０２）。これらの２つの設定値が、図２Ｂにおいて符号Ｚａ、Ｚｂにおいて極大値に近い値となるはずである。
【００４２】
このようにして求められた２つの極大値にそれぞれ対応する２つの原画像を抽出し、それらの原画像間で画素ごとに画素値の差分を求め、オフセット値としての定数Ｋを加算することで、差分画像を構成する各画素の画素値が求められる（ステップＳ２０３）。求められた画素値を有する画素を所定の配置で配列し画像を再構成することで（ステップＳ２０４）、差分画像が得られる。
【００４３】
なお、上記のようにプロファイルにおけるコントラスト値の極大値はその後の演算には用いられない。したがって、厳密にはステップＳ２０１のコントラスト値の極大値を求める処理は必ずしも必要なく、極大値に対応する焦点位置の設定値がわかればよい。
【００４４】
このように、この実施形態では、焦点位置の設定値を多段階に変更しながら撮像された複数の原画像のうち、焦点位置の設定値に対する画像のコントラスト値のプロファイルにおける２つの極大値に対応する２つの原画像に基づいて差分画像が作成される。この場合、撮像された原画像から直接コントラスト値を求め、プロファイルにおける２つの山部分を見つけてその極大値を求めればよいので、細胞Ｃに対する撮像光学系１３０の合焦位置を知る必要はない。また、撮像済みの原画像から差分画像を作成するので、合焦位置を特定した上でさらに画像を取得する必要もない。そのため、処理が簡単である。
【００４５】
なお、焦点位置を離散的に変更して撮像を行っているため、検出された極大値は必ずしも図２Ｂに示す位置Ｚａ、Ｚｂに対応するコントラスト値とは一致しない。しかしながら、細胞の輪郭を明瞭に示した画像を得るという目的においては、差分画像の作成に用いられる２つの原画像が、プロファイルにおいて極小値を挟む２つの山部分からそれぞれ抽出されたものであればよい。そのため、焦点位置の刻みが極端に大きい設定となっていない限り、検出された極大値が実際の極大値と一致している否かは問題とならない。すなわち、上記の方法で十分な輪郭強調効果を得ることが可能である。
【００４６】
一方、図５Ｂに示す第２実施形態の処理では、プロファイルにおけるコントラスト値の２つの極小値を検出する（ステップＳ３０１）。この場合も、極小値自体を求める必要はなく、極小値を与える焦点位置の設定値がわかればよい。こうして求められた焦点位置の設定値に対して、予め定められた所定距離だけ離れた２つの設定値を特定する。これらの２つの設定値に対応する２つの原画像から差分画像が作成される（ステップＳ３０２）。差分画像を求める処理（ステップＳ３０３、Ｓ３０４）は、第１実施形態（ステップＳ２０３、Ｓ２０４）と同じである。
【００４７】
図６は第２実施形態における差分画像作成処理をより詳しく説明する図である。この実施形態では、図６に示すように、焦点位置の設定値に対する画像のコントラスト値のプロファイルにおいて、極小値を与える設定値Ｚｍを求める。この値Ｚｍは図２Ｂに示す焦点位置Ｚｃの近傍位置であると推定されるが、両者が一致していなくても構わない。そして、この位置Ｚｍを基準として、（＋）方向および（−）方向にそれぞれ距離ΔＺだけ離れた位置に対応する２つの原画像が、差分画像の基になる原画像として用いられる。
【００４８】
本願発明者らの知見によれば、焦点位置に対するコントラスト値のプロファイルにおいて、極小値を与える焦点位置と極大値を与える焦点位置との距離は細胞Ｃの種類に依存しており、ウェルＷ内の細胞Ｃの種類が既知であればこの距離は概ね予測可能である。したがって、細胞Ｃの種類に応じて予めこの距離ΔＺを設定しておき、極小値に対応する焦点位置の設定値Ｚｍを求めれば、差分画像の作成に供される２つの原画像を直ちに選出することが可能である。
【００４９】
さらに、本願発明者らの知見では、プロファイルにおいて極小値を与える焦点位置と極大値を与える焦点位置との距離は、同じ細胞種であっても撮像光学系１３０の開口数（ＮＡ）によって異なる。したがって、撮像光学系１３０が例えば交換可能に構成されて開口数（ＮＡ）が変更されることがある場合には、開口数（ＮＡ）に応じて距離ΔＺが設定されることが好ましい。
【００５０】
例えば細胞種および撮像光学系１３０のＮＡと距離ΔＺとの関係を予め求めてテーブル化しておき、メモリ１４５に記憶保存しておくことができる。ステップＳ３０２の処理では、予め与えられた細胞種の情報および撮像光学系１３０の開口数（ＮＡ）からテーブルを参照して距離ΔＺを求め、極小値に対応する設定値Ｚｍからこの距離ΔＺだけ離れた２つの原画像を選出すればよい。
【００５１】
こうすることで、第１実施形態と同様に、プロファイルにおいて極小値を挟む２つの山部分から１つずつ原画像を選出することができる。これら２つの原画像の差分を取ることで、細胞の輪郭が明瞭となった差分画像が得られる。この場合にも、合焦位置を求める必要はなく、原画像から直接求められたコントラスト値に基づき、差分画像の基となる２つの原画像を簡単に選出することができる。
【００５２】
そして、これらのいずれの実施形態による方法であっても、一般的な明視野撮像で得られた原画像から差分画像を作成することが可能である。そのため、位相差観察光学系等の複雑な構成を必要とせず、比較的簡単な装置構成で、また簡単な処理により、細胞の輪郭が明瞭な画像を得ることができる。ただし、次に説明するように、図１に示す構成を有する撮像装置１では、明視野撮像で得られた原画像のコントラスト値は照明光Ｌｉの開口数（ＮＡ）と密接に関係している。したがって、上記画像処理によって細胞の輪郭を明瞭化するためには、まず照明光Ｌｉの開口数（ＮＡ）の適正化により原画像の明瞭化が必要である。以下、図７および図８を参照しつつ撮像装置１において画像を明瞭に撮像するための具体的な構成について説明する。
【００５３】
既述の通り撮像装置１では焦点位置の変化に応じてコントラスト値が変化するが、これは細胞Ｃと、当該細胞Ｃの周辺部とで屈折率が異なっていることに起因する。つまり、細胞Ｃに照明光Ｌｉが照射した場合、例えば図３中の「模式図」に示すように細胞Ｃの外縁部において照明光Ｌｉの一部がレンズ効果によって屈折する。ここで、照明光Ｌｉが平行光に近い、つまり照明光Ｌｉの開口数（ＮＡ）が小さい場合、次のような作用効果が得られる。すなわち、細胞Ｃがなければ取り込めた光が細胞Ｃのレンズ効果によって撮像光学系１３０を構成するレンズに入らず細胞輪郭が暗くなる、または細胞Ｃがなければ取り込めなかった光が細胞Ｃのレンズ効果によって撮像光学系１３０を構成するレンズに入り、細胞輪郭が明るく見える。このように照明の照射方向を整えることで細胞Ｃの輪郭を撮像することが明瞭に可能となる。
【００５４】
そこで、本願発明者は、照明光Ｌｉの開口数（ＮＡ）を多段階に変更しながら、開口数（ＮＡ）毎に図４に示すステップＳ１０１〜Ｓ１０６を実行して焦点位置に対するコントラスト値のプロファイルを取得し、開口数（ＮＡ）が撮像画像に与える影響を検証した。
【００５５】
より具体的には、互いに異なる２種類の細胞Ｃについて上記検証を行い、図７の（ａ）欄および図８の（ａ）欄に示すように開口数（ＮＡ）毎の上記プロファイルを求めた。ここでは、開口数（ＮＡ）を「０．０２」、「０．０５」、「０．１０」、「０．２０」、「０．２９」、「０．３７」、「０．４３」の７段階に変更設定しながらプロファイル取得（ステップＳ１０１〜Ｓ１０６）を行った。
【００５６】
また、それらのプロファイルに基づいて、焦点位置Ｚｆ（図２Ａ）が細胞Ｃの位置Ｚｃ（図２Ａ）と略一致する、いわゆるジャストピント位置での開口数（ＮＡ）毎のコントラスト値を求めたものが図７の（ｂ）欄および図８の（ｂ）欄に示すグラフである。さらに、同プロファイルに基づいて、開口数（ＮＡ）毎の最大コントラスト値を求めたものが図７の（ｃ）欄および図８の（ｃ）欄に示すグラフである。
【００５７】
図７や図８に示すように、照明光Ｌｉの開口数（ＮＡ）が小さくなるにしたがってコントラスト値は大きくなるが、開口数（ＮＡ）を０．３以下に設定することでコントラス値の上昇比率は大きくなる。したがって、当該検証から、細胞Ｃの輪郭を撮像するには開口数（ＮＡ）が０．３以下となるように照明部１２を構成する必要がある。また、開口数（ＮＡ）が０．２以下となるように照明部１２を構成するのが好適であり、さらに言えば、開口数（ＮＡ）が０．１以下となるように照明部１２を構成するのが望ましい。
【００５８】
以上説明したように、上記実施形態においては、ウェルプレートＷＰが本発明の「担持体」の一例に相当している。また、メカ駆動部１４６が本発明の「位置変更部」として機能する一方、ＣＰＵ１４１が本発明の「制御部」としての機能を有している。
【００５９】
また、上記実施形態では、焦点位置Ｚｆが本発明の「前側焦点位置」に相当し、焦点位置Ｚａ、Ｚｂがそれぞれ本発明の「第１位置」および「第２位置」の一例に相当している。
【００６０】
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記各実施形態では、撮像光学系に開口絞りおよび結像レンズを設けているが、これらの少なくとも一方を用いない撮像光学系であっても、本発明を適用することで、上記実施形態と同様の作用効果を得ることが可能である。また上記実施形態では撮像光学系１３０の全体を上下動させて焦点位置を変化させているが、例えば撮像光学系を構成する複数のレンズ間の距離を変更して焦点位置を変化させる態様であってもよい。
【００６１】
また、上記第１実施形態ではプロファイルにおける２つの極大値に対応する２つの原画像を選出している。つまり、本発明の「第１位置」はプロファイルの照明側極大領域に対応する位置であるとともに、本発明の「第２位置」はプロファイルの撮像光学系側極大領域に対応する位置となっている。このように極大値を示す位置で撮像したときの原画像を用いている。一方、第２実施形態では極小値に対応する焦点位置Ｚｍから所定距離ΔＺだけ離れた位置に対応する２つの原画像を選出しており、極大値か否かを問わずに原画像を撮像している。
【００６２】
また、上記実施形態では、プロファイルにおいて極小値を挟む２つの山部分から１つずつ選出された原画像が選出しているが、一方の山部分から選出される原画像のみを用いてもよい。つまり、本発明の「第１位置」および「第２位置」の少なくとも一方の位置に撮像光学系の前側焦点を位置させて撮像した画像を用いてもよい。
【００６３】
また、上記した撮像装置１は、多数のウェルＷが設けられたウェルプレートＷＰを本発明の「担持体」として用いるものであるが、「担持体」の形状はこれに限定されず任意である。例えば、より大径で浅皿型の「ディッシュ」と呼ばれる容器内で培養された細胞や、スライドガラス上に担持された細胞を撮像する目的にも、本発明を適用することができる。
【００６４】
また、上記実施形態の撮像装置１は、細胞を撮像するための構成と画像処理のための構成とが一体化されたものであるが、これらが別体のユニットとして構成され相互に接続されたものであってもよい。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
この発明は、例えば医療・生物科学分野で用いられるウェルプレート上のウェルのような担持体に担持された細胞の撮像を必要とする分野に特に好適に適用することができるが、その応用分野は医療・生物科学分野に限定されない。
【符号の説明】
【００６６】
１  撮像装置
１２  照明部
１３  撮像部
１４  制御部
１４１  ＣＰＵ（制御部）
１３０  撮像光学系
１４６  メカ駆動部（位置変更部）
Ｃ  細胞
Ｗ  ウェル
ＷＰ  ウェルプレート（担持体）
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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