(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ、すなわち、
ａ）対象物またはサンプルを発光共役オリゴチオフェンに接触させるステップと、
ｂ）前記発光共役オリゴチオフェンの少なくとも１つの検出シグナルを検出するステップと、
ｃ）前記検出された検出シグナルに基づいて、前記対象物上または前記サンプル中の１種または複数種の炭水化物の存在、正体、および／または量を決定するステップと、
を含むことを特徴とする、１種以上の炭水化物の検出、同定、および／または定量のための方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記発光共役オリゴチオフェンが五量体〜十五量体の発光共役オリゴチオフェンであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記発光共役オリゴチオフェンが五量体または七量体の発光共役オリゴチオフェンであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２または３に記載の方法において、前記発光共役オリゴチオフェンが１つ以上の官能性側鎖を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記官能性側鎖が、アミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖、多糖、核酸、およびそれらの誘導体さらには組合せから選択されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、前記七量体の発光共役オリゴチオフェンが、ｈ−ＦＴＡＡまたはｈ−ＨＴＡＡであり、かつ前記五量体の発光共役オリゴチオフェンが、ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、ｐＨＴＡ−Ｌｙｓ、ｐＨＴＥＡ、ｐＨＴＩｍ、ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、およびｐＨＴＡ−Ｇｌｕの何れかであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、前記検出シグナルが蛍光シグナルや比色シグナルなどの光シグナルまたは伝導率などの電気シグナルであることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法において、前記発光共役オリゴチオフェンが少なくとも２種の異なる炭水化物を識別可能であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の方法において、前記炭水化物の少なくとも１種が不溶性炭水化物であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記不溶性炭水化物が、セルロース、キチン、β−グルカン、アルギネート、アミロース、およびグリコーゲン、またはそれらの組合せの何れかであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法において、前記炭水化物の少なくとも１種が可溶性炭水化物であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記可溶性炭水化物が、グルコース、セルロビオース、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ、またはそれらの組合せの何れかであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２の何れか１項に記載の方法において、前記炭水化物の少なくとも１種が、構造炭水化物、貯蔵炭水化物、グリコアミノグリカン、炭水化物変換の中間生成物、および／または代謝基質であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法において、少なくともステップａ）および／またはステップｂ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ  ｓｉｔｕで行われることを特徴とする方法。
【請求項１５】
１種以上の炭水化物の検出、同定、および／または定量のためであることを特徴とする発光共役オリゴチオフェンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭水化物の検出および炭水化物形成または炭水化物変換のモニタリングのための発光共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭水化物は、多くの場合、高分子であり、構成単糖の正体、単量体ユニットの数、および各単糖に結合する共有結合の炭素位置に従って、命名、グループ分け、およびクラス分けされる。
【０００３】
現在、炭水化物の検出、同定、および定量のための広範にわたる方法が知られており、すべての工業にわたり適用されている。しかしながら、これらの方法のうち、正確な分子を同定するのに十分な分解能を有するものはほとんどない。これは、同一のサブユニットの小さなグループで構成された大きな高分子である多糖の化学構造の固有の性質に起因する。この繰返し性の結果として、炭水化物は、通常、プローブによる容易な検出のための特異なエピトープや結合表面を提示しない。特異なエピトープの欠如および検出の難しさは、一次アミノ酸配列に加えて複数のレベルの構造コンフォメーションおよび特異な品質を有するタンパク質とは対照的である。タンパク質とは対照的に、抗体ベースの検出系は、炭水化物に使用した場合、ほとんど有効でない。
【０００４】
炭水化物の同定は、通常、間接的手段により行われ、可溶性炭水化物に偏っている。たとえば、初期単量体化ステップにより、炭水化物の正体が露出されうる。続いて、同定ステップで、各単量体および存在する各単量体のパーセントが同定される。次いで、得られた単量体情報が決定ステップにフィードバックされ、元の炭水化物の正体が決定される。
【０００５】
炭水化物の分析のための他の一般的な技術では、クロマトグラフィー（たとえば、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー）と、多量体または単量体の電気泳動または質量分析による詳細な化学分析と、の組合せが使用される。多くの場合、質量分析は、分析前に混合物を精製する先行分離ステップとの組合せで使用される。それに加えて、多糖鎖の単量体化は、多くの場合、より大きな炭水化物の分析の要件である。きわめて正確ではあるが、以上の方法の単独使用および／または逐次使用は、低速で厄介でありうるうえに、かなりの専門技術を必要とする（Ｚｉｄｋｏｖａ  ＪおよびＣｈｍｅｌｉｋ  Ｊ，Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（２００１），３６（４）：４１７−２１）。
【０００６】
天然では、炭水化物は、タンパク質と同程度にユビキタスである。それらは両方とも、接着、シグナリング、および多くの生物学的相互作用で、代謝の基質として、構造高分子として、およびリガンド／標的として、機能する。医薬品産業さらには他の産業環境では、炭水化物は、市場にいくつかの高収益の製品をもたらす。これらの製品は、薬剤から食品および栄養補助剤さらには「グリーン」材料用の新しい多量体に至るまで多岐にわたる。炭水化物の同定および定量のための簡単で感度の高い方法は、これらの環境で高い有用性が予想される。
【０００７】
国際公開第２０１０／０４４７４４Ａ１号パンフレットには、アミロイドまたは凝集形態のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに使用するための新規なチオフェン化合物が開示されている。この文書には、そのようなタンパク質に結合してその検出を可能にするランダム重合ポリチオフェンさらには規定の長さのオリゴ体チオフェンが開示されている。開示されたオリゴチオフェン化合物は、たとえば、アルツハイマー病および凝集タンパク質またはミスフォールドタンパク質が関与する他の疾患の診断に有用である。
【０００８】
Ａｓｌｕｎｄ，Ａ  ｅｔ  ａｌ（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００９），４（８）：６７３−６８４）には、タンパク質凝集体の選択的同定のための五量体発光共役オリゴチオフェンが開示されている。開示されたＬＣＯは、プリオン病やアルツハイマー病などのタンパク質凝集疾患の研究のための研究ツールとして利用可能である。
【０００９】
Ｋｌｉｎｇｓｔｅｄｔ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１１），９：８３５６−８３７０）には、異なる長さの発光共役オリゴチオフェンのライブラリーさらにはそれらの合成方法が開示されている。開示された発光共役オリゴチオフェンは、タンパク質凝集体の選択的同定に有用である。それらは、タンパク質凝集疾患の研究を促進し、そのような疾患の新規な診断ツールの開発にも利用可能であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の一般的な目的は、炭水化物の検出および分析に使用可能な分子プローブならびにそのような分子プローブの利用方法を提供することである。本発明の他の目的は、異なる炭水化物を識別可能なプローブおよび方法を提供することである。分析の範囲は、定量、純度決定、ならびに合成の速度および効率の追跡を含む。これに対する包括的な目的は、生体関連炭水化物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｓｉｔｕ検出ならびに分析のためのプローブを提供することである。本発明のさらに他の目的は、炭水化物の合成、最終生成物／基質の正体の検証および分析、ならびに純度の分析を追跡するプローブおよび方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらの目的は、添付の特許請求の範囲に記載の分子プローブおよび方法により達成される。
【００１２】
本発明は、１種以上の炭水化物の検出、同定、および／または定量のための発光共役オリゴチオフェンの使用に関する。
【００１３】
本発明の一態様では、以下のステップ、すなわち、
−  対象物またはサンプルを発光共役オリゴチオフェンに接触させるステップと、
−  発光共役オリゴチオフェンの少なくとも１つの検出シグナルを検出するステップと、
−  前記検出された検出シグナルに基づいて、前記対象物上または前記サンプル中の１種または複数種の炭水化物の存在、正体、および／または量を決定するステップと、
を含む、１種以上の炭水化物の検出、同定、および／または定量のための方法が提供される。
【００１４】
発光共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）は、五量体〜十五量体の発光共役オリゴチオフェンでありうる。好ましくは、発光共役オリゴチオフェンは、五量体または七量体の発光共役オリゴチオフェンである。一実施形態では、発光共役オリゴチオフェンは、１種以上の官能性側鎖、たとえば、アミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖、多糖、核酸、ならびにそれらの誘導体さらには組合せを含む。本明細書に開示されているのは、例示的な七量体発光共役オリゴチオフェンのｈ−ＦＴＡＡおよびｈ−ＨＴＡＡ、ならびに例示的な五量体発光共役オリゴチオフェンのｐ−ＨＴＡ−Ｌｙｓ、ｐ−ＨＴＥＡ、ｐ−ＨＴＩｍ、ｐ−ＨＴＡ−Ｔｙｒ、ｐ−ＨＴＡ−Ａｒｇ、ｐ−ＨＴＡ−Ａｓｐ、およびｐ−ＨＴＡ−Ｇｌｕである。
【００１５】
一実施形態では、検出シグナルは、蛍光シグナルや比色シグナルなどの光シグナルまたは伝導率などの電気シグナルである。
【００１６】
有利な実施形態では、発光共役オリゴチオフェンは、少なくとも２種の異なる炭水化物を識別可能であり、対象物上またはサンプル中の異なる炭水化物の同定および／または定量を可能にする。
【００１７】
発光共役オリゴチオフェンは、少なくとも１種の不溶性炭水化物、たとえば、セルロース、キチン、β−グルカン、アルギネート、アミロース、およびグリコーゲン、またはそれらの組合せを標的としうる。
【００１８】
他の選択肢としてまたは追加として、発光共役オリゴチオフェンは、少なくとも１種の可溶性炭水化物、たとえば、グルコース、セルロビオース、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ、またはそれらの組合せを標的としうる。
【００１９】
接触および／または検出のステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで行われうる。
【００２０】
本発明の一態様では、ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびｐＨＴＡ−Ｌｙｓから選択される新規な発光共役オリゴチオフェン化合物が提供される。これらの化合物はすべて、本開示に係る方法に有用である。
【００２１】
次に、例として、添付の図面を参照しながら、本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Ａ）本開示に係る五量体発光共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）の例示的な実施形態、およびＢ）本開示に係る七量体発光共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）の例示的な実施形態を示している。
【図２】図２は、Ａ）６ウェルプレートのウェル内に設置された傾斜ガラスカバースリップを用いて空気−液体界面で行われるバイオフィルム形成のための装置の概略図、Ｂ）サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）（Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ））３９３４ｗｔおよび既知の表現型のアイソジェニック突然変異株（ΔｂｓｃＡ、ΔｃｓｇＡ、およびΔｃｓｇＤ）のバイオフィルムプロファイルの検証のためのコンゴーレッドアッセイ、Ｃ〜Ｄ）Ｃ）ｈ−ＦＴＡＡ染色およびＤ）ｈ−ＨＴＡＡ染色により示される空気−液体界面に位置するＳ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）３９３４ｗｔおよびアイソジェニック突然変異株のバイオフィルムモルフォロジーを示している。同一のスライドの蛍光共焦点分析（左側）および位相差分析（右側）が並置して示されている。
【図３】図３は、Ａ〜Ｂ）Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）３９３４ｗｔおよびアイソジェニック突然変異株の未処理バイオフィルム培養物（洗浄ステップ未実施）のスペクトル研究を示している。発光を５４５ｎｍで読み取ったときのｗｔ（＿）、ΔｂｓｃＡ（＿  ＿）、ΔｃｓｇＡ（．．．．．．）およびΔｃｓｇＤ（＿  ．）の２４時間未処理培養物中のＡ）ｈ−ＨＴＡＡおよびＢ）ｈ−ＦＴＡＡの励起スペクトル、Ｃ〜Ｄ）未処理（洗浄ステップ未実施）Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）３９３４ｗｔおよびアイソジェニック突然変異株のスペクトル研究。Ｃ）４０５ｎｍおよびＤ）５００ｎｍで励起したときのｗｔ（＿）、ΔｂｓｃＡ（＿  ＿）、ΔｃｓｇＡ（．．．．．．）およびΔｃｓｇＤ（＿  ．）の２４時間培養物中のｈ−ＦＴＡＡの発光スペクトル。
【図４】図４は、３μｇ／ｍｌのｈ−ＦＴＡＡと混合したときの６．２５ｍｇ／ｍｌ（＿）、３．１２５ｍｇ／ｍｌ（＿  ＿）、１．５６ｍｇ／ｍｌ（．．．．．．）、および０．７８ｍｇ／ｍｌ（＿  ．）の純粋不溶性微結晶セルロース懸濁液の励起スペクトルのスペクトル研究を示している。
【図５】図５は、９６ウェルプレート中のＳ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）３９３４ｗｔならびにアイソジェニック突然変異株ΔｂｓｃＡ、ΔｃｓｇＡ、およびΔｃｓｇＤの細菌増殖およびバイオフィルム形成のリアルタイム追跡を示している。Ａ）４８時間にわたるｗｔバイオフィルム培養のＯＤ６００（．．．．．．）とＧＦＰシグナル（＿）との比較、Ｂ）ＯＤ６００とＧＦＰシグナルとの相関、Ｃ〜Ｆ）ＧＦＰと比較したｈ−ＦＴＡＡの使用によるＣ）Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）３９３４ｗｔ、Ｄ）ΔｃｓｇＤ、Ｅ）ΔｃｓｇＡ、およびＦ）ΔｂｓｃＡのバイオフィルム形成のリアルタイム追跡。ＧＦＰ（＿）カーリー（＿  ＿）およびセルロース（．．．．．．）のシグナルが示されている。カーリーは、４０５ｎｍの励起波長および５５６の発光波長を用いて検出され、セルロースは、５００ｎｍの励起波長および６００ｎｍの発光波長を用いて検出される。
【図６】図６は、β−１，３，−グルカンの純粋不溶性粉末炭水化物懸濁液に対する五量体ＬＣＯの分光蛍光測定スクリーンを示している。３μＭの各プローブを不溶性炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。ここに示される希釈液の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ（＿  ．）、５ｍｇ／ｍｌ（．．．．．．）、２．５ｍｇ／ｍｌ（＿  ＿）、および０ｍｇ／ｍｌ（＿）である。発光を５４５ｎｍで読み取ったときの３００〜５００ｎｍの波長に対するプローブの励起スペクトルを分析した。組合せは次のとおりである。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するβ−１，３，−グルカン。
【図７】図７は、五量体ＬＣＯの蛍光強度と、アッセイ時に存在するβ−１，３，−グルカンの純粋不溶性粉末炭水化物懸濁液の濃度と、の相関分析を示している。３μＭの各プローブを不溶性炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。それぞれのプローブを各プローブに特異な波長（図に明記）で励起し、発光を５４５ｎｍで読み取った。組合せは次のように示される。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するβ−１，３，−グルカン。［β−１，３−グルカン］によるシグナルの平均増加（＿）および当てはめ回帰直線（＿  ＿）が示されている。
【図８】図８は、セルロースの純粋不溶性微結晶炭水化物懸濁液に対する五量体ＬＣＯの分光蛍光測定スクリーンを示している。３μＭの各プローブを不溶性炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。ここに示される希釈液の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ（＿  ．）、５ｍｇ／ｍｌ（．．．．．．）、２．５ｍｇ／ｍｌ（＿  ＿）、および０ｍｇ／ｍｌ（＿）である。発光を５４５ｎｍで読み取ったときの３００〜５００ｎｍの波長に対するプローブの励起スペクトルを分析した。組合せは次のとおりである。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するセルロース。
【図９】図９は、五量体ＬＣＯの蛍光強度と、アッセイ時に存在するセルロースの純粋不溶性微結晶炭水化物懸濁液の濃度と、の相関分析を示している。３μＭの各プローブを不溶性炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。それぞれのプローブを各プローブに特異な波長（図に明記）で励起し、発光を５４５ｎｍで読み取った。組合せは次のように示される。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するセルロース。［セルロース］によるシグナルの平均増加（＿）および当てはめ回帰直線（＿  ＿）が示されている。
【図１０】図１０は、キチンの純粋不溶性粉末炭水化物懸濁液に対する五量体ＬＣＯの分光蛍光測定スクリーンを示している。３μＭの各プローブを不溶性炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。ここに示される希釈液の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ（＿  ．）、５ｍｇ／ｍｌ（．．．．．．）、２．５ｍｇ／ｍｌ（＿  ＿）、および０ｍｇ／ｍｌ（＿）である。発光を５４５ｎｍで読み取ったときの３００〜５００ｎｍの波長に対するプローブの励起スペクトルを分析した。組合せは次のとおりである。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するキチン。
【図１１】図１１は、五量体ＬＣＯの蛍光強度と、アッセイ時に存在するキチンの純粋不溶性粉末炭水化物懸濁液の濃度と、の相関分析を示している。３μＭの各プローブを不溶性炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。それぞれのプローブを各プローブに特異な波長（図に明記）で励起し、発光を５４５ｎｍで読み取った。組合せは次のように示される。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するキチン。［キチン］によるシグナルの平均増加（＿）および当てはめ回帰直線（＿  ＿）が示されている。
【図１２】図１２は、ナトリウムアルギネートの純粋不溶性粉末炭水化物懸濁液に対する五量体ＬＣＯの分光蛍光測定スクリーンを示している。３μＭの各プローブを不溶性炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。ここに示される希釈液の濃度は、５ｍｇ／ｍｌ（＿  ．）、２．５ｍｇ／ｍｌ（．．．．．．）、１．２５ｍｇ／ｍｌ（＿  ＿）、および０ｍｇ／ｍｌ（＿）である。発光を５４５ｎｍで読み取ったときの３００〜５００ｎｍの波長に対するプローブの励起スペクトルを分析した。組合せは次のとおりである。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するナトリウムアルギネート。
【図１３】図１３は、五量体ＬＣＯの蛍光強度と、アッセイ時に存在するナトリウムアルギネートの純粋不溶性粉末炭水化物懸濁液の濃度と、の相関分析を示している。３μＭの各プローブを不溶性炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。それぞれのプローブを各プローブに特異な波長（図に明記）で励起し、発光を５４５ｎｍで読み取った。組合せは次のように示される。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するナトリウムアルギネート。［ナトリウムアルギネート］によるシグナルの平均増加（＿）および当てはめ回帰直線（＿  ＿）が示されている。
【図１４】図１４は、グルコースの純粋炭水化物溶液に対する五量体ＬＣＯの分光蛍光測定スクリーンを示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。ここに示される希釈液の濃度は、５ｍｇ／ｍｌ（＿  ．）、２．５ｍｇ／ｍｌ（．．．．．．）、１．２５ｍｇ／ｍｌ（＿  ＿）、および０ｍｇ／ｍｌ（＿）である。発光を５４５ｎｍで読み取ったときの３００〜５００ｎｍの波長に対するプローブの励起スペクトルを分析した。組合せは次のとおりである。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するグルコース。
【図１５】図１５は、五量体ＬＣＯの蛍光強度と、アッセイ時に存在するグルコースの純粋炭水化物溶液の濃度と、の相関分析を示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。それぞれのプローブを各プローブに特異な波長（図に明記）で励起し、発光を５４５ｎｍで読み取った。組合せは次のように示される。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するグルコース。［グルコース］によるシグナルの平均増加（＿）および当てはめ回帰直線（＿  ＿）が示されている。
【図１６】図１６は、アミロースの純粋炭水化物懸濁液に対する五量体ＬＣＯの分光蛍光測定スクリーンを示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。ここに示される希釈液の濃度は、５ｍｇ／ｍｌ（＿  ．）、２．５ｍｇ／ｍｌ（．．．．．．）、１．２５ｍｇ／ｍｌ（＿  ＿）、および０ｍｇ／ｍｌ（＿）である。発光を５４５ｎｍで読み取ったときの３００〜５００ｎｍの波長に対するプローブの励起スペクトルを分析した。組合せは次のとおりである。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するアミロース。
【図１７】図１７は、五量体ＬＣＯの蛍光強度と、アッセイ時に存在するアミロースの純粋炭水化物懸濁液の濃度と、の相関分析を示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。それぞれのプローブを各プローブに特異な波長（図に明記）で励起し、発光を５４５ｎｍで読み取った。組合せは次のように示される。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するアミロース。［アミロース］によるシグナルの平均増加（＿）および当てはめ回帰直線（＿  ＿）が示されている。
【図１８】図１８は、グリコーゲンの純粋炭水化物懸濁液に対する五量体ＬＣＯの分光蛍光測定スクリーンを示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。ここに示される希釈液の濃度は、５ｍｇ／ｍｌ（＿  ．）、２．５ｍｇ／ｍｌ（．．．．．．）、１．２５ｍｇ／ｍｌ（＿  ＿）、および０ｍｇ／ｍｌ（＿）である。発光を５４５ｎｍで読み取ったときの３００〜５００ｎｍの波長に対するプローブの励起スペクトルを分析した。組合せは次のとおりである。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するグリコーゲン。
【図１９】図１９は、五量体ＬＣＯの蛍光強度と、アッセイ時に存在するグリコーゲンの純粋炭水化物懸濁液の濃度と、の相関分析を示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。それぞれのプローブを各プローブに特異な波長（図に明記）で励起し、発光を５４５ｎｍで読み取った。組合せは次のように示される。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するグリコーゲン。［グリコーゲン］によるシグナルの平均増加（＿）および当てはめ回帰直線（＿  ＿）が示されている。
【図２０】図２０は、セルロビオースの純粋炭水化物溶液に対する五量体ＬＣＯの分光蛍光測定スクリーンを示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。ここに示される希釈液の濃度は、５ｍｇ／ｍｌ（＿  ．）、２．５ｍｇ／ｍｌ（．．．．．．）、１．２５ｍｇ／ｍｌ（＿  ＿）、および０ｍｇ／ｍｌ（＿）である。発光を５４５ｎｍで読み取ったときの３００〜５００ｎｍの波長に対するプローブの励起スペクトルを分析した。組合せは次のとおりである。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するセルロビオース。
【図２１】図２１は、五量体ＬＣＯの蛍光強度と、アッセイ時に存在するセルロビオースの純粋炭水化物溶液の濃度と、の相関分析を示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。それぞれのプローブを各プローブに特異な波長（図に明記）で励起し、発光を５４５ｎｍで読み取った。組合せは次のように示される。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するセルロビオース。［セルロビオース］によるシグナルの平均増加（＿）および当てはめ回帰直線（＿  ＿）が示されている。
【図２２】図２２は、ヘパリンの純粋炭水化物溶液に対する五量体ＬＣＯの分光蛍光測定スクリーンを示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。ここに示される希釈液の濃度は、５ｍｇ／ｍｌ（＿  ．）、２．５ｍｇ／ｍｌ（．．．．．．）、１．２５ｍｇ／ｍｌ（＿  ＿）、および０ｍｇ／ｍｌ（＿）である。発光を５４５ｎｍで読み取ったときの３００〜５００ｎｍの波長に対するプローブの励起スペクトルを分析した。組合せは次のとおりである。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するヘパリン。
【図２３】図２３は、五量体ＬＣＯの蛍光強度と、アッセイ時に存在するヘパリンの純粋炭水化物溶液の濃度と、の相関分析を示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。それぞれのプローブを各プローブに特異な波長（図に明記）で励起し、発光を５４５ｎｍで読み取った。組合せは次のように示される。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するヘパリン。［ヘパリン］によるシグナルの平均増加（＿）および当てはめ回帰直線（＿  ＿）が示されている。
【図２４】図２４は、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳ（Ａ））の純粋炭水化物溶液に対する五量体ＬＣＯの分光蛍光測定スクリーンを示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。ここに示される希釈液の濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌ（＿  ．）、０．２５ｍｇ／ｍｌ（．．．．．．）、０．１２５ｍｇ／ｍｌ（＿  ＿）、および０ｍｇ／ｍｌ（＿）である。発光を５４５ｎｍで読み取ったときの３００〜５００ｎｍの波長に対するプローブの励起スペクトルを分析した。組合せは次のとおりである。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するＣＳ（Ａ）。
【図２５】図２５は、五量体ＬＣＯの蛍光強度と、アッセイ時に存在するＣＳ（Ａ）の純粋炭水化物溶液の濃度と、の相関分析を示している。３μＭの各プローブを炭水化物の二倍段階希釈液に適用した。それぞれのプローブを各プローブに特異な波長（図に明記）で励起し、発光を５４５ｎｍで読み取った。組合せは次のように示される。Ａ）ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、Ｂ）ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、Ｃ）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、Ｄ）ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、Ｅ）ｐＨＴＥＡ、Ｆ）ｐＨＴＩｍ、Ｇ）ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびＨ）ｐＨＴＡ−Ｌｙｓに対するＣＳ（Ａ）。［クロンドロイチン硫酸Ａ］によるシグナルの平均増加（＿）および当てはめ回帰直線（＿  ＿）が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、炭水化物の検出、同定、および分析に使用するための分子プローブいわゆる発光共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）に関する。
【００２４】
特定のＬＣＯプローブは、本開示でプロトタイププローブにより例示されるように、１種または複数種の異なる炭水化物を標的としてそれに結合する。ＬＣＯが標的炭水化物に暴露されてそれと相互作用した場合、ＬＣＯ分子は、特異な幾何学的変化を受け、その変化は、検出シグナルとして検出可能な標的特異的出力シグナルにより反映される。出力シグナルは、たとえば、分光蛍光測定シグナル、比色シグナル、電気伝導性変化、または異なるシグナルの組合せとして検出されうる。幾何学的変化は、たとえば、放出蛍光シグナルの増加もしくは減少および／またはピーク発光の励起波長（λｍａｘ）のシフトをもたらしうる。一選択肢では、幾何学的変化は、ＬＣＯまたはそれに結合された伝導性ポリマーの伝導率の測定可能な変化をもたらしうる。
【００２５】
各結合標的により生成されるＬＣＯの個別の標的特異的検出シグナルのプロファイリングにより、特異的炭水化物の同定および定量が可能である。本開示のプロトタイプＬＣＯの多くは、異なる炭水化物に対する二重または多重の感受性を有し、各標的炭水化物に特異的な検出シグナルを生成することによりそれらを識別可能である。
【００２６】
本開示のＬＣＯ検出シグナルの分析は、主に、分光蛍光測定読取りで構成され、これに関しては、ピーク発光の励起波長（λｍａｘ）さらには放出蛍光の強度がとくに興味深い。標的結合ＬＣＯの励起スペクトルおよび発光スペクトルが含まれる。励起スペクトルでは、ある波長範囲内のレーザーによりサンプル中のＬＣＯを励起したときの特異的波長で放出される蛍光の強度の検出が必要とされる。発光スペクトルでは、規定の波長でサンプル中のＬＣＯを励起したときの特定の範囲内の異なる波長の発光の強度の検出が必要とされる。
【００２７】
本開示のプロトタイプＬＣＯは、生体関連検出範囲内で炭水化物に対する感受性を示す。これは、構造炭水化物（たとえば、β−１，３−グルカン、セルロース、キチン、およびナトリウムアルギネート）、代謝基質および代謝中間体（α−Ｄ−グルコースおよびセルロビオース）、貯蔵炭水化物（アミロースおよびグリコーゲン）、ならびにグリコアミノグリカン（ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸Ａ）を含む。
【００２８】
発光共役オリゴチオフェン
共役オリゴチオフェンは、硫黄ヘテロ環チオフェンのオリゴ体化から生じる。電子は、その共役骨格に沿って非局在化され、このオリゴ体に伝導性および／または光学的性質を付与する。共役オリゴチオフェンは、ドーピングにより電子を共役π軌道に追加したりまたはそれから除去したりしたときに伝導性になりうる。標的へのＬＣＯプローブの結合は、静電相互作用により駆動される。また、このオリゴ体と標的分子との相互作用は、その骨格構造の捩れを引き起こして、電子歪みおよびその光学的性質の劇的変化をもたらしうる。したがって、オリゴチオフェンは、対応する特異なオリゴ体骨格関連シグナルにより個別に同定可能な広範にわたる結合標的を有する。
【００２９】
本発明に係るＬＣＯは、コア成分の固有機能を改善するために側基を追加可能なコアオリゴチオフェンで構成される。コア成分は、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、または十一量体、十二量体、十三量体、十四量体、もしくは十五量体のオリゴチオフェン、すなわち、５〜１５個の単量体チオフェンからなる多量体チオフェンからなる。好ましくは、成分は、より多くの側基を保持可能であることから奇数の単量体からなる。偶数のＬＣＯもまた、炭水化物を標的として検出シグナルを生成するが、追加しうる側基の数が制限される。
【００３０】
異なる性質を有する多種多様な側基をコア成分に結合することが可能である。たとえば、側基は、陰イオン性、陽イオン性、または双性イオン性の官能基を有しうる。側基は、たとえば、アミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖、多糖、核酸、またはそれらの組合せおよび誘導体から誘導されうる。側基は、その標的化合物に対するその親和性を増加させる、かつＬＣＯをその標的化合物に結合させて複合体の形成を可能にする、分子性を有するＬＣＯを提供する。たとえば、負荷電または正荷電の側基は、ＬＣＯと標的とのイオン結合を可能にする。イオン性官能基または他の側基官能基は、追加としてまたは他の選択肢として、ＬＣＯとその標的化合物との水素結合または他の形態の非共有結合を可能にしうる。
【００３１】
本発明で使用されるプロトタイプＬＣＯは、図１Ａおよび１Ｂにそれぞれ示される五量体（すなわち、五量体オリゴチオフェンコア成分を有する）および七量体（すなわち、七量体オリゴチオフェンコア成分を有する）の形態である。五量体の形態の例としては、ｐＨＴＥＡ（ペンタ水素チオフェンエタノールアミン）、ｐＨＴＩｍ（ペンタ水素チオフェンイミダゾール）、ｐＨＴＡ−Ｌｙｓ（ペンタ水素チオフェン酢酸リシン）、ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ（ペンタ水素チオフェン酢酸チロシン）ｐＨＴＡ−Ａｒｇ（ペンタ水素チオフェン酢酸アルギニン）、ｐＨＴＡ−Ａｓｐ（ペンタ水素チオフェン酢酸アスパラギン酸）、ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ（ペンタ水素チオフェン酢酸ヒスチジン）、およびｐＨＴＡ−Ｇｌｕ（ペンタ水素チオフェン酢酸グルタミン酸）が挙げられる。七量体の形態の例としては、ｈ−ＨＴＡＡ（ヘプタ水素チオフェン酢酸）およびｈＦＴＡＡ（ヘプタギ酸チオフェン酢酸）が挙げられる。
【００３２】
一態様では、発明は、ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、ｐＨＴＡ−Ｇｌｕ、およびｐＨＴＡ−Ｌｙｓから選択される新規な化合物を含む。
【００３３】
本開示に係るＬＣＯは、非細胞傷害性の状態で炭水化物を標的とするように設計される。プロトタイプＬＣＯプローブのそれぞれは、炭水化物のカテゴリーに関連付けられる高分子に対する広範な親和性を有する。それらは、電荷、疎水性、ジオメトリー、構造、ならびに／または水素供与体および水素受容体の性質により関連付け可能である。異なるプローブ−炭水化物ペアは、特異な分光蛍光測定シグネチャーを有するので、それを介して、ペアをまたはＬＣＯが既知の場合には炭水化物を同定することが可能である。
【００３４】
本発明に係るＬＣＯのいくつかは、１種の特異的炭水化物を標的として検出シグナルを生成するが、他の炭水化物に対しては生成しない。そのようなＬＣＯは、単一の特異的炭水化物の検出および同定を可能にする。本発明に係る他のＬＣＯは、いくつかの異なる炭水化物を標的として、特異的検出シグナル、たとえば、各標的に特異的な励起／発光スペクトルを生成する。後者の場合、それぞれの炭水化物標的に対するＬＣＯの特異なスペクトルシグネチャーは、結合成分の同定を可能にする。したがって、そのようなＬＣＯは、単一のＬＣＯを用いて、いくつかの異なる炭水化物の二重または多重の検出および識別を可能にする。さらに他のＬＣＯは、複数の炭水化物を標的として、すべての標的炭水化物に対して同一または類似の検出シグナルを生成する。そのようなＬＣＯは、炭水化物の存在の検出および決定を可能にするが、異なる炭水化物の識別も同定も可能にしない。
【００３５】
選択された側基をコアＬＣＯに追加して、特定の標的に対するその感受性を向上させたりまたは異なる標的を識別するその能力を向上させたりすることが可能である。側基さらにはコア成分の他の修飾もまた、他の官能基を追加するために使用可能である。
【００３６】
一実施形態では、ＬＣＯは、プローブがその標的炭水化物に結合したときに電子シグナルが直接的または間接的に誘起されるように設計される。電子シグナルは、ＬＣＯ多量体自体に由来しうるか、またはＬＣＯの幾何学的変化を電気シグナルに変換する結合された伝導性の有機材料または無機材料でありうる。前記実施形態では、炭水化物に結合するプローブは、たとえば、電気検出器またはハンドヘルドデバイスにより、電子読取り情報に変換される。それに加えて、そのような検出器またはデバイスは、たとえば、炭水化物の量が規定の閾値に達したときに、炭水化物の存在をユーザーに警告するように構成されうる。特定例として、そのような警告システムは、たとえば、バイオフィルム中の炭水化物成分の検出によりバイオフィルムの存在に注意を払うように使用されうる。血中グルコース検出器とほぼ同様に、そのような検出器デバイスもまた、炭水化物の不在、存在、または圧倒的存在を示唆するように使用されうる。用途としては、適正製造規範（ＧＭＰ）のためにまたは品質保証のために、血液、食品、患者の健康、または製造パイプラインをモニターすることが挙げられる。
【００３７】
本明細書に開示されるＬＣＯは、さまざまな媒体、センサー、デバイス、または製品で使用するために提供されうる。たとえば、本開示に係るＬＣＯは、液状添加剤として含まれうる。プローブはまた、表面上に印刷可能であるか、または液体もしくはエアロゾルのスプレー中に構成可能である。
【００３８】
ＬＣＯの合成手順は、Ｋｌｉｎｇｓｔｅｄｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ，Ｃｈｅｍ（２０１１），９：８３５６−８３７０、Ａｓｌｕｎｄ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００９），４：６７３−６８４、Ａｓｌｕｎｄ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（２００７），１８：１８６０−１８６８）、および国際公開第２０１０／０４４７４４号パンフレットに記載されている。それらの教示を考慮して、当業者であれば、本発明に従って使用しうるさまざまなＬＣＯを調製しうる。
【００３９】
１種以上の炭水化物を検出、同定、および／または定量する方法
本発明は、以下のステップ、すなわち、
−  対象物またはサンプルを発光共役オリゴチオフェンに接触させるステップと、
−  発光共役オリゴチオフェンの少なくとも１つの検出シグナルを検出するステップと、
−  前記検出された検出シグナルに基づいて、前記対象物上または前記サンプル中の１種または複数種の炭水化物の存在、正体、および／または量を決定するステップと、
を含む、１種以上の炭水化物の検出、同定、および／または定量のための方法を提供する。
【００４０】
本明細書では、「炭水化物の検出、同定、および／または定量」という表現は、１種以上の炭水化物の存在、正体、および／または量を分析する任意のタイプの行為を含む。そのような行為としては、サンプル中の未知の炭水化物の同定、サンプル中の１種または複数種の炭水化物の存在または不在の決定、調製物中の既知の炭水化物の定量、炭水化物の製造時の基質から生成物への炭水化物変換の追跡、エンドタイム研究またはリアルタイム研究を用いた生物学的サンプル中または生物学的もしくは非生物学的表面上の炭水化物の位置および正体の決定が挙げられるが、これらに限定されるものではない。たとえば、細胞表面上の糖タンパク質または炭水化物の存在を同定または定量することが可能である。新しい「グリーン」炭水化物系材料の製造時、そのような材料中に存在する炭水化物の正体および純度を評価または検証することが可能である。また、炭水化物系材料の半減期または分解時間を評価することも可能である。同様に、分子薬剤または生物薬剤または医薬品の製造時、そのような薬剤または医薬調製物中に存在する炭水化物の正体および純度を評価または検証することが可能である。
【００４１】
接触される対象物またはサンプルは、表面上または内部の炭水化物の存在、正体、または量を評価するにことが望ましい任意の種類の対象物またはサンプルでありうる。サンプルは、たとえば、炭水化物製造プロセスまたは炭水化物抽出プロセスからのサンプルなどの化学的または生物学的なサンプルでありうる。サンプルはまた、ヒトもしくは動物の患者中のもしくはそれら由来の組織もしくは血液のサンプル、または天然由来のもしくは廃水処理プラントなどの産業由来の水サンプルでありうる。患者由来の組織サンプル中／上の炭水化物のモニタリングまたは検出は、患者から入手した単離されたサンプル中／上の炭水化物のモニタリングまたは検出さらにはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕでの組織サンプルのモニタリングまたは検出を含む。対象物は、たとえば、ベンチ、テーブル、流し台、壁、床、配管、または病院、家庭環境、もしくは工場の調度品もしくは任意の他の内装備品の表面などの環境表面でありうる。それはまた、医療デバイスなどのデバイス、設備、装置、工具、スポーツ用品もしくは他のタイプの用品、または任意の他のデバイスでありうる。したがって、ＬＣＯのその標的への結合は、溶液中または表面上で検出可能である。すなわち、本方法は、固体アッセイおよび液体アッセイの両方で使用可能である。本発明の特定の利点は、洗浄ステップが必要とされないことであり、炭水化物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｓｉｔｕで未処理の生物学的な培養物中またはサンプル中で直接検出されうる。これは、たとえば、対象物上またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ  ｓｉｔｕサンプル中での炭水化物の挙動および／または形成のリアルタイム研究を可能にする。１種の炭水化物に特異な特定のシグナルを追跡することにより、上記の用途を時間発展研究に拡張すれば、その生成の時間動態を決定することが可能である。
【００４２】
炭水化物は、純粋形態もしくは比較的純粋形態で、すなわち、主に炭水化物を含むサンプル中で、分析されうるか、またはより複雑な形態で、すなわち、組織サンプル中や生物学的サンプル中などのより複雑な混合物中に炭水化物が存在する場合に、検出されうる。
【００４３】
本発明に係る方法は、可溶性および不溶性の炭水化物の検出、同定、および／または定量に同等に適用可能である。それは、他の使いやすい方法が今まで利用できなかった不溶性炭水化物の分析にとくに有用である。分析されうる炭水化物としては、任意のサイズの炭水化物、すなわち、単糖さらにはオリゴ糖およびより大きな多糖が挙げられる。炭水化物は、他の化合物から単離されうるか、または他の化合物との混合物の状態で存在しうるか、または他の分子もしくは構造に分子間結合もしくは共有結合されうる。分析されうる炭水化物の例としては、本明細書に示される炭水化物、すなわち、β−１，３−グルカン、セルロース、キチン、ナトリウムアルギネート、α−Ｄ−グルコース、セルロビオース、アミロース、グリコーゲン、ヘパリン、およびコンドロイチン硫酸Ａが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
本発明に係る方法の発光共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）は、チオフェンのホモオリゴ体を含む本明細書に定義される任意のＬＣＯである。共役オリゴチオフェンは、五量体〜十五量体の共役オリゴチオフェン、好ましくは五量体〜七量体の共役オリゴチオフェンでありうる。ＬＣＯはまた、１個以上の官能性側基、たとえば、アミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖、多糖、核酸、もしくは他の陰イオン性側基、陽イオン性側基、または双性イオン性側基から誘導される側基を含みうる。本発明に係る方法で使用可能な七量体共役オリゴチオフェンの例としては、ｈ−ＦＴＡＡまたはｈ−ＨＴＡＡが挙げられる。本発明に係る方法で使用可能な五量体共役オリゴチオフェンの実施例としては、ｐＨＴＡ−Ｈｉｓ、ｐＨＴＡ−Ｌｙｓ、ｐＨＴＥＡ、ｐＨＴＩｍ、ｐＨＴＡ−Ｔｙｒ、ｐＨＴＡ−Ａｒｇ、ｐＨＴＡ−Ａｓｐ、およびｐＨＴＡ−Ｇｌｕが挙げられる。
【００４５】
炭水化物へのＬＣＯの結合は、ＬＣＯ骨格のコンフォメーション変化をもたらし、結果的にＬＣＯの鎖内および鎖間のプロセスを変化させる。このコンフォメーション変化は、ＬＣＯの検出シグナルとして、たとえば、蛍光測定シグナルなどの光シグナルまたは伝導率などの電気シグナルとして検出可能である。蛍光測定シグナルは、蛍光イメージングにより、たとえば、蛍光共焦点顕微鏡法を用いて、検出可能である。他の選択肢として、蛍光測定シグナルは、蛍光分光法により、励起および発光スペクトルを介して、ならびに／または続いて、使用されるＬＣＯおよび／もしくは決定される炭水化物に依存する所定の単一の励起・発光セットを介して、検出されうる。
【００４６】
本開示は、概念実証として、蛍光分光法により検出される分光蛍光測定シグナルを提示する。励起および発光スペクトルならびに／または続いて所定の単一の励起および発光を用いて、炭水化物へのＬＣＯの検出感度を実証する。典型的には、励起波長は、３００〜５００ｎｍの範囲内にあり、発光波長は、５００〜７００ｎｍの範囲内にある。次いで、励起および発光スペクトルの分析結果は、関連する単一の励起・発光セットの選択に供給される。各結合炭水化物は、ＬＣＯ骨格の異なる捩れを誘起して、各結合炭水化物に特異なスペクトルシグネチャーをもたらす。これらの特異なスペクトルシグネチャーおよびシグナル強度を用いて化合物を識別することが可能であり、したがって、所与のサンプル中、液体中、または表面上のそれらの正体および量を決定することが可能である。
【００４７】
プローブの蛍光性は、それが呈する視覚色に直接影響を及ぼす。これは、結果的に、検出パラメーターでありうる。検出シグナル（任意の性質の）が擬似色により表される間接比色法もまた、ＬＣＯ−標的結合を表す手段として機能しうる。
【００４８】
他の選択肢の実施形態では、ＬＣＯのコンフォメーション変化つまりＬＣＯのその標的への結合は、物理的パラメーターのモニタリング偏差を対象とする方法により検出可能である。これは、非排他的に、光学的性質（ＦＲＥＴ、蛍光クエンチング、吸収、測色、屈折率）、材料の性質（量、粘弾性、厚さ、または他の性質）、および電子的性質（材料の伝導率、イオンの放出または取込み、電子の放出または取込み、抵抗）を含みうる。
【００４９】
実験室環境では、ＬＣＯのその炭水化物標的への結合は、蛍光測定シグナリングを介して好適に検出される。蛍光測定検出のための方法およびデバイスは、当技術分野で周知であり、蛍光に基づく顕微鏡法、たとえば、蛍光共焦点顕微鏡法、蛍光測定プレートリーダーを含む。そのような方法およびデバイスは、溶液中、培養物中、または組織サンプル中の炭水化物の検出に好適である。
【００５０】
他の環境では、たとえば、産業環境または病院環境では、蛍光検出のために当技術分野で公知のハンドヘルド装置がより好適でありうる。そのような小型デバイスはまた、重量を最小限に抑えることが好ましい環境、たとえば、航空輸送産業または環境調和型車両に有用でありうる。
【００５１】
他の実施形態では、ＬＣＯまたはＬＣＯとの組合せは、たとえば、バイオセンサーセルの基材上にＬＣＯを固定することにより、バイオセンサーデバイスおよび／またはチップベースセンサーの能動部材として好適に実現される。ＬＣＯのコア成分に修飾可能な側基は、バイオセンサーで使用するためのＬＣＯプローブの機能適合化さらには基材へのプローブの固定を可能にする。基材の表面上にＬＣＯと標的炭水化物との複合体が形成され、複合体の形成により、検出シグナルに変換可能な物理的変化が誘起される。好適には、バイオセンサーデバイスは、前記基材の容器さらには検出手段を含む。一般的なバイオセンサーデバイスを説明すると、蛍光検出バイオセンサーは、たとえば、標的に結合されたＬＣＯを励起すべく励起エネルギーを生成するための内部または外部の光源と、励起時にＬＣＯにより発生された蛍光エネルギーを検出するための内部または外部の検出器と、を含む。
【００５２】
検出された検出シグナルに基づいて、炭水化物に関するいくつかタイプの情報を決定しうる。
【００５３】
本方法の一実施形態では、炭水化物が対象物上またはサンプル中に存在するか不在であるかが決定される。炭水化物の不在または存在の結論は、たとえば、分析される対象物またはサンプルから取得されるＬＣＯからの蛍光シグナル（たとえば、蛍光共焦点イメージングによりまたは蛍光分光法により決定される）と、炭水化物が欠如していることが分かっている陰性対照サンプルと、を比較することにより導かれる。陰性対照は、非結合ＬＣＯプローブのシグナル品質を規定する。これにより、前記非結合プローブのベースラインのピーク励起／発光波長およびシグナル強度が設定される。ピーク励起／発光波長のレッドシフトおよび／またはシグナル強度の同時増加または同時減少が検出された場合、分析されたサンプルは炭水化物を含むという結論が導かれる。ベースラインからのシグナルの性質の変化は、プローブ分子骨格の幾何学的変化に依存し、炭水化物へのＬＣＯの正の結合から生じる。この結合は、一般的には、ピーク励起／発光波長のレッドシフトおよび／またはシグナル強度の増加をもたらす。しかしながら、いくつかの場合、炭水化物へのＬＣＯの結合は、ＬＣＯからの蛍光シグナルのクエンチングをもたらしうる。
【００５４】
一実施形態では、対象物上またはサンプル中に存在する炭水化物の量が決定される。この目的では、既知量の特異的炭水化物を用いて波長を横切って選択されたＬＣＯの励起および発光の性質の校正曲線が作成される。次いで、炭水化物に特異的な単一の励起／発光セットを規定し、これに対して校正曲線を構築する。この校正曲線は、励起／発光検出シグナルと炭水化物量との関係を規定する。分析された対象物またはサンプルから取得された検出シグナルの強度を校正曲線と比較し、分析された対象物上または分析されたサンプル中の炭水化物の量に関する結論を導く。
【００５５】
他の実施形態では、対象物上またはサンプル中に存在する１種または複数種の炭水化物の正体が決定される。そのような実施形態では、異なる炭水化物を識別可能なＬＣＯを用いて対象物またはサンプルに接触させる。使用されるＬＣＯは、たとえば、１種の特異的炭水化物には結合するが他の炭水化物には結合しないことを知ることにより、選択されうる。サンプル中に存在する１種または複数種の炭水化物を同定するために、関連するＬＣＯのライブラリーから生成される一群のＬＣＯを適用しうる。他の選択肢として、使用されるＬＣＯは、複数のタイプの炭水化物に結合し、特異的検出シグナル、たとえば、各標的に特異的な励起／発光スペクトルを生成しうる。それぞれの炭水化物標的に対するＬＣＯの特異なシグネチャーは、結合成分の同定を可能にする。この実施形態でも、陰性対照を用いて非結合プローブのシグナルのベースライン品質を規定する。
【００５６】
既知の炭水化物（陽性対照）のスペクトルシグネチャーのライブラリーの作成に基づいて、未知サンプルをこのライブラリーと比較したときに特性ピークの不在が検出されれば、炭水化物の不在が示唆されるであろう。特定の炭水化物に対する単一の励起／発光セットの規定および後続の標準曲線の構築もまた、前記成分が不在であるかを結論付けるように機能するであろう。高分子物質のより大きなプールを同定するために、構造／電荷に基づいてきわめて異なる炭水化物に感受性である一群の異なるＬＣＯを使用することも可能である。
【００５７】
他の選択肢として、同定される炭水化物の検出は、ＬＣＯプロトタイプの漸進的改変により向上させることが可能である。この実施形態は、ピーク励起／発光およびシグナル強度が他のＬＣＯ−標的ペアに対して際立つように、特異的分子への結合を向上させるかおよび／または結合ＬＣＯの蛍光性を向上させるかのいずれかのために、プローブの官能性化学基の追加および／または除去を包含するであろう。
【００５８】
使用
炭水化物は、多くの領域内で有用であり、たとえば、薬剤、栄養補助剤、調味剤、および甘味剤、さらには材料として、種々の用途で利用される。したがって、ＬＣＯは、そのような用途の炭水化物化合物の製造および品質評価のためのインジケーターとして有用である。炭水化物の検出、同定、および定量におけるＬＣＯの使用は、主に、医薬品産業内および食品産業内で、さらには研究で、行われるであろう。
【００５９】
医薬品産業では、炭水化物は、製品の膨大なライブラリーを形成する。代表例のグループまたは製品は、炭水化物栄養補助剤、バイオ医薬製品、医療用生分解性材料、薬剤、さらにはフィルター、ポリマー、および表面である。重要な抗凝固剤であるヘパリンは、医薬用の周知の炭水化物である。同様に、ヘパリンに密接に関連する炭水化物であるコンドロイチン硫酸Ａは、健康補助食品として市販されている。ＧＭＰ規制では、製品の正体および純度を示す重要性が規定されている。本発明に係るＬＣＯ法は、安価で迅速な方法としてそのような目的に適用されうる。ＬＣＯはまた、重要な炭水化物の製造に対する合成効率を示すインジケーターとして使用されうる。
【００６０】
食品・飲料産業では、人工甘味剤は、砂糖代替品として、およびある程度、コスト削減手段として、一般に使用される。炭水化物系の調味剤および添加剤もまた、食品・飲料産業内でますます使用されるようになってきている。食品への添加およびその改変に関連する炭水化物の分析は、そのような分子が健康に及ぼす長期的影響が完全には理解されていないので、ますます重要になりうる。したがって、ＬＣＯは、特異的天然炭水化物の存在または本質的に炭水化物である置換分子の存在および正体の指標として有用でありうる。グルコース、アミロース、グリコーゲンなどの代謝的に重要な炭水化物の検出を本開示に示す。
【００６１】
既製食品およびパッケージ食品では、ＬＣＯは、前記食品にごく近接して配置されたとき、食品品質の変化を感知するインジケーターとして使用されうる。食品は、最初に製造されたときの元の品質から逸脱するので、この変化は、徐々に出現して／検出される状態になる炭水化物の存在の検出でありうる。
【００６２】
本明細書に開示されるＬＣＯおよび方法は、炭水化物の形成、分解、および炭水化物の特性を研究して理解を深めるための基礎研究で使用可能である。バイオ燃料へのセルロースの変換は、広範な研究の課題となっていた。セルロースは、プロセス時にセルロビオースおよびグルコースに変換される。これは、炭水化物の品質および量が関連する多種多様な状況を包含しうる。炭水化物基質が生成物に変換されるときに得られるＬＣＯ光学プロファイルの蛍光測定シフトは、先と同様に、合成方法の効率および形成された生成物の品質を分析するための安価で迅速な方法を提供可能である。ＬＣＯは、任意の検出可能な炭水化物の変換を追跡するために適用可能である。
【００６３】
ＬＣＯはさらに、細胞や糖タンパク質などの炭水化物含有生体物質の形成および／または挙動を分析するための生物学的研究で使用されうる。本発明に係るＬＣＯを用いて、そのような研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、または生存組織サンプル中ｉｎ  ｓｉｔｕで行われうる。
【００６４】
本開示のプローブは、微生物バイオフィルムの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中の構造炭水化物に感受性である。さまざまな微生物が、それらのＥＣＭ中のさまざまな存在可能な構造炭水化物を利用することが知られており、最もよく知られた炭水化物は、セルロース、β−１，３−グルカン、キチン、およびアルギネートである。バイオフィルムのモルフォロジーおよび量の炭水化物ベースの同定は、新規できわめて正確なバイオフィルム検出法でありうる。バイオフィルムのＥＣＭは、不溶性構造の不均一組織であるので、一群の異なるＬＣＯは、そのような不溶性構造の同定を可能にするであろう。さらに、異なる種の細菌から形成されるバイオフィルムの組成は、特異であると考えられるので、一群の異なるＬＣＯはまた、異なる細菌種の同定を可能にする。
【００６５】
植物産業および森林産業では、材料および製品（木材、パルプ、および紙）は、主に、炭水化物（不溶性構造炭水化物）である。異なる起源（たとえば、異なる樹木）に由来する木材、パルプ、および紙は、構成炭水化物のタイプ、量、および品質のプロファイリングにより検出されうる。炭水化物検出能を有するＬＣＯは、この目的にかなり役に立ちうる。同様に、木材、パルプおよび紙の品質は、ＬＣＯを用いて同定されうる。これは、ＬＣＯを適用して存在する炭水化物の純度を決定することを含みうる。
【実施例】
【００６６】
以下に実証されるように、驚くべきことに、バイオフィルムの研究中、アミロイドタンパク質だけでなく炭水化物をも標的とする本発明に係るＬＣＯの能力を見いだした。バイオフィルムは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に埋め込まれた微生物細胞の集団を含む不均一で複雑な３Ｄマトリックスである。ＥＣＭの十分に特徴付けられた２つの成分は、セルロースなどの構造多糖およびアミロイドタンパク質カーリーである。以下の実施例では、エンドポイント研究およびリアルタイム研究の両方で、バイオフィルムの炭水化物成分、哺乳動物の貯蔵炭水化物、炭水化物の代謝中間体、およびグリコソアミノグリカンを標的とし同定するＬＣＯの能力、さらにはバイオフィルムなどの複合構造およびより純粋な形態の炭水化物を検出、同定、および定量するＬＣＯの能力を実証する。
【００６７】
実施例１−バイオフィルム中の炭水化物成分の検出
研究目標：
共焦点分析を用いてプロトタイプＬＣＯ  ｈ−ＦＴＡＡがバイオフィルム中の炭水化物成分すなわちセルロースを検出可能であることを実証すること。
【００６８】
研究設計：
Ｉ．伝統的コンゴーレッドプレートアッセイを用いた既知のバイオフィルムモルフォロジーの確認
カーリーおよび／またはセルロースの産生に関連付けられるバイオフィルムモルフォロジーを検証するために、コンゴーレッド（４０μｇ／ｍＬ）およびクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０（２０μｇ／ｍＬ）が追加されたＬＢ寒天プレート（塩を用いない）上で、Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ｗｔ株３９３４ならびにアイソジェニック突然変異株ΔｂｓｃＡ（カーリー＋、セルロース−）、ΔｃｓｇＡ（カーリー−、セルロース＋）、およびΔｃｓｇＤ（カーリー−、セルロース−）を培養した。プレートを２８℃で４８時間培養した。
【００６９】
ＩＩ．バイオフィルムおよびバイオフィルムモルフォロジーの蛍光分析のためのＬＣＯアッセイ
ガラスカバースリップを６ウェルプレートのウェルに導入し（図２Ａに示される構成による）、バイオフィルム形成のための表面を提供した。これは、実験の終了時、顕微鏡分析のために容易に取出し可能であった。バイオフィルム実験の準備をするために、Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ｗｔ株３９３４ならびにアイソジェニック突然変異株ΔｂｓｃＡ、ΔｃｓｇＡ、およびΔｃｓｇＤの個別の培養物をフラスコ内のＬＢ培地中で一晩増殖させた。各培養物を新しいＬＢ中に１００倍希釈し、ＯＤ６００＝０．６になるまで振盪インキュベーター（２３０ｒｐｍ）中３７℃で培養した。塩を用いないＬＢ中に培養物を１０５ＣＦＵ／ｍｌの培養密度に希釈し、８ｍｌのアリコートでカバースリップ含有６ウェルプレート中に分配した。プレートを２８℃で４８時間培養した後、ガラスカバースリップを取り出し、ＰＢＳで２回洗浄し、その後、４ｍｌの４％ホルムアルデヒド中で１時間固定した。固定サンプルを２回洗浄し、次いで、それぞれｈ−ＦＴＡＡ（２μｇ／ｍＬ）、ｈ−ＨＴＡＡ（２μｇ／ｍＬ）、およびＰＢＳの溶液中に暗所で３０分間浸漬した。ＰＢＳは、陰性対照として機能し、自己蛍光レベルの評価に使用された。次いで、処理されたスライドをＰＢＳで２回洗浄し、蛍光に基づく共焦点レーザー走査型顕微鏡法分析のためにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）を用いて封入した。特定的には、液体空気界面に形成されたバイオフィルムのエッジを適切な蛍光フィルターを用いて可視化した。図２Ｃ〜Ｄでは、各スライドは、励起されたときにバイオフィルム結合ＬＣＯにより生成された蛍光を示す画像により表される（左側）。右側は、ＬＣＯ蛍光との位相差による細菌存在の光学検査のオーバーレイである。位相差は、表面上へのバイオフィルム付着の目視確認のための伝統的方法である。
【００７０】
結果：
株はすべて、コンゴーレッドアッセイで予想された形態型を示した（図２Ｂ）。各株の形態型の特性は、カーリーおよびセルロースの産生に関してそれらのバイオフィルム成形能に関連付けられ、この関係は、これまでに他のものにより報告されてきた。
【００７１】
ＬＣＯアッセイは、カーリー／セルロースのモルフォロジーを識別することが可能である（図２Ｃ〜Ｄ、図２Ｃはｈ−ＦＴＡＡに対する結果、図２Ｄはｈ−ＨＴＡＡに対する結果を示している）。ＬＣＯ（ｈ−ＨＴＡＡさらにはｈ−ＦＴＡＡ）からの蛍光シグナルは、位相差顕微鏡法により検証された可視細菌凝集体に一致する。カーリーが存在する場合（ｗｔおよびΔｂｓｃＡ）、形成されたバイオフィルムは大きく、離間したクラスターの形態をとる。セルロースのみが発現された場合（ΔｃｓｇＡ）、カバースリップ付着バイオフィルムの量は大幅に低減され、蛍光細胞の薄層のように見えた。ｈ−ＦＴＡＡは、セルロース＋およびカーリー−ΔｃｓｇＡにより生成された可視細菌凝集体に一致する蛍光シグナルを与えた。ΔｃｓｇＤは、カーリーおよびセルロースの発現の両方が欠如しており、検出可能なバイオフィルムを生成しなかった。
【００７２】
位相差顕微鏡法は、バイオフィルムモルフォロジーの表面特性を示す。バイオフィルムモルフォロジーに関して行われた光学観測は、バイオフィルム結合ＬＣＯの蛍光共焦点分析のものと一致した。
【００７３】
結論：
ＬＣＯプローブは、バイオフィルムに結合し、蛍光分析下でその可視化を可能にした。それに加えて、それらは、異なる細菌表現型に由来するバイオフィルムモルフォロジーの識別を可能にした。ＬＣＯプローブｈ−ＦＴＡＡは、セルロースを発現するがカーリーを発現しない株ΔｃｓｇＡの蛍光検出シグナルを生成することが示されたことから、ｈ−ＦＴＡＡは、カーリー以外の他の成分おそらくセルロースを検出可能であることが示唆される。
【００７４】
実施例２−ＬＣＯは、未洗浄培養物でさえも、バイオフィルム中のカーリー含有量およびセルロース含有量に基づいて、特異な「個別化」スペクトルシグネチャーを生成する。
【００７５】
研究目標：
各バイオフィルムでＬＣＯが有する特異なスペクトルシグネチャーを示すことにより、異なるカーリー含有量およびセルロース含有量を含むバイオフィルムモルフォロジーを識別するＬＣＯの能力を示すこと。
【００７６】
研究設計：
Ｉ．９６ウェルプレート中でのバイオフィルム増殖
臨床由来Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ｗｔ株３９３４ならびにアイソジェニック突然変異株（ΔｂｓｃＡ、ΔｃｓｇＡ、およびΔｃｓｇＤ）の新しい一晩培養物を新しいＬＢ中に接種し、ＯＤ６００＝０．６になるまで３７℃で培養した。それぞれの各培養物をＬＢ（塩を用いない）で１０５ＣＦＵ／ｍｌの細胞密度に希釈した後、３つの個別のフラスコ内に分注した。ｈ−ＦＴＡＡ（２μｇ／ｍＬ）およびｈ−ＨＴＡＡ（２μｇ／ｍＬ）をそれぞれフラスコの２つに添加し、一方、対照として使用されたＰＢＳを第３のフラスコに添加した。次いで、５０μｌの各培養物を９６ウェルプレートの個別のウェル内にトリプリケート方式で接種し、２８℃で４８時間インキュベートした。
【００７７】
ＩＩ．分光分析
インキュベーターからバイオフィルム培養物を取り出した後、処理ステップを実施せずにＬＣＯシグナルの検出を行った。Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘモノクロメーター式マルチモードマイクロプレートリーダーを用いてプレートを読み取った。３００〜５００ｎｍでサンプルを励起して５４５ｎｍで発光を検出することにより、ＬＣＯの励起スペクトルを収集した。サンプルを４０５ｎｍで励起したとき、５００〜７００ｎｍで発光シグナルを読み取ることにより、カーリー結合ＬＣＯに対する発光スペクトルを収集した。サンプルを５００ｎｍで励起したとき、５２０〜７００ｎｍで発光シグナルを読み取ることにより、セルロース結合ＬＣＯに対する発光スペクトルを収集した。
【００７８】
結果：
ｈ−ＨＴＡＡのスペクトルプロファイルは、異なるアイソジェニック突然変異株により形成されたバイオフィルムモルフォロジーを識別しなかった（図３Ａ）。ｈ−ＨＴＡＡの励起スペクトルパターンは、すべてのアイソジェニック株にわたり同一であった。一方、ｈ−ＦＴＡＡは、各株で励起ピークおよびショルダーの識別可能なスペクトルパターンを生成した（図３Ｂ）。ｈ−ＦＴＡＡをカーリーの存在下で３８０ｎｍで励起したとき（ｗｔおよびΔｂｓｃＡ）、特異な発光スパイク（励起ショルダー）が検出される。ｈ−ＦＴＡＡをカーリーの不在下で３８０ｎｍで励起したとき（ΔｃｓｇＡΔｃｓｇＤ）、その代わりに約３５５ｎｍの発光スパイク（励起ショルダー）が検出される。最後に、ｈ−ＦＴＡＡをセルロースの存在下で４８０ｎｍで励起したとき（ｗｔおよびΔｃｓｇＡ）、特異なピーク発光が検出される。
【００７９】
全体として、カーリー陽性株（ｗｔおよびΔｂｓｃＡ）中のｈ−ＦＴＡＡは、３６０ｎｍ〜４２５ｎｍで励起したとき、より強い発光を有していた。４２５ｎｍ未満でバイオフィルム結合ｈ−ＦＴＡＡを励起すると、ｈ−ＦＴＡＡ結合カーリーに対してより特異的なシグナル与え、一方、４８０ｎｍ超で励起すると、ｈ−ＦＴＡＡ結合セルロースに対してより特異的なシグナル与えることが、データから示唆される。
【００８０】
カーリーに対して４０５ｎｍおよびセルロースに対して５００ｎｍの励起波長をそれぞれ使用して、Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ｗｔ株およびアイソジェニック株の発光スペクトルを分析した。
【００８１】
４０５ｎｍで励起したとき（図３Ｃ）、カーリー陽性株（ｗｔおよびｂｓｃＡ）中のｈ−ＦＴＡＡは、カーリー陰性ΔｃｓｇＡおよびΔｃｓｇＤに対して約５５６ｎｍでより強い発光シグナル強度を有していた。ｗｔ、ΔｂｓｃＡ、およびΔｃｓｇＡとΔｃｓｇＤとの比較から、バイオフィルムが発現されたとき、５２５ｎｍから５５０〜５６０ｎｍへの発光ピークのレッドシフトが存在することが示唆される。
【００８２】
５００ｎｍの励起波長を用いると（図３Ｄ）、ｈ−ＦＴＡＡの発光は、セルロース陽性株ですべての波長にわたりより強く、５６０および６００ｎｍに発光の２つの顕著なピークを有する。６００ｎｍの特異な発光ピークは、セルロース陰性バイオフィルムからその存在を識別するセルロース特異的シグナルを形成した。
【００８３】
結論：
ＬＣＯ  ｈ−ＦＴＡＡは、各バイオフィルムモルフォロジーに特異なスペクトルシグネチャーを生成する。ｈ−ＦＴＡＡは、ＥＣＭ成分のカーリーおよびセルロースとの相互作用を介して生成される特異なスペクトルプロファイルに基づいてバイオフィルムを識別する。本方法は、生の培養物からのバイオフィルムの物理的分離を必要としない。ＬＣＯ  ｈ−ＨＴＡＡは、洗浄ステップを用いることなく異なる細菌表現型により形成された異なるバイオフィルム量を識別することができなかった。ｈ−ＨＴＡＡは、クリスタルバイオレットと類似の洗浄ステップを用いてバイオフィルム検出のための一般的なプローブとしてより良好に適用されうる。しかしながら、ｈ−ＨＴＡＡは、実験全体を通じて増殖培地中に存在しうる非殺細菌プローブであるという利点を有する。
【００８４】
実施例３：セルロース特異的スペクトルシグネチャーの検証
研究目標：
セルロースを標的としてスペクトルシグネチャーを与えるＬＣＯ  ｈ−ＦＴＡＡの能力を検証すること、およびセルロースの定量におけるその有用性を検証すること。
【００８５】
研究設計：
６．２５ｍｇ／ｍｌから０．０４８８までの純粋不溶性微結晶セルロース懸濁液の二倍段階希釈液を調製し、これにｈ−ＦＴＡＡを３μＭの濃度になるように添加した。１００μｌアリコートを９６ウェルプレート内に分配した。Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘモノクロメーター式マルチモードマイクロプレートリーダーを用いてプレートを読み取った。３００〜５００ｎｍでサンプルを励起して５４５ｎｍで発光を検出することにより、ＬＣＯの励起スペクトルを収集した。ここに示されるセルロース濃度は、６．２５ｍｇ／ｍｌ、３．１２５ｍｇ／ｍｌ、１．５６２５ｍｇ／ｍｌ、および０．７８１２５ｍｇ／ｍｌである。
【００８６】
結果：
純粋セルロースの存在下で、約４８０ｎｍでｈ−ＦＴＡＡを励起すると、５４５ｎｍで検出される発光ピークを与える（図４）。このシグナル強度は、セルロース濃度と比例して増加したことから、ｈ−ＦＴＡＡが実際にセルロースに結合することが検証される。
【００８７】
結論：
七量体ＬＣＯ  ｈ−ＦＴＡＡは、炭水化物セルロースの検出および定量に使用可能である。
【００８８】
実施例４−バイオフィルム形成のリアルタイム追跡
研究目標：
バイオフィルム形成のリアルタイム追跡でｈ−ＦＴＡＡの使用を実証して、培養物増殖との関連で時間に対するバイオフィルム相関ＲＦＵ（相対蛍光単位）の変化を示すこと。
【００８９】
研究設計：
ＯＤ６００での吸光度により測定される細菌培養物の濁度を用いて、培養物密度を規定する。ＧＦＰの発現は、細菌増殖および培養密度の直接表現を提供する。蛍光検出による培養密度のより直接的表現のためにｇｆｐ遺伝子を有するプラスミドＰ２７７７を用いて、Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）３９３４ｗｔならびにアイソジェニック突然変異株ΔｂｓｃＡ、ΔｃｓｇＡ、およびΔｃｓｇＤをトランスフォームした。各株の新しい一晩培養物を新しいＬＢ中に接種して、ＯＤ６００＝０．６になるように３７℃で培養した。培養物をＬＢ（塩を用いない）で１０５ＣＦＵ／ｍｌの細胞密度に希釈した後、２つの個別のフラスコ内に分注した。ｈ−ＦＴＡＡ（２μｇ／ｍＬ）を１つのフラスコに添加し、一方、対照として使用されたＰＢＳを第２のフラスコに添加した。５０μｌの各培養物混合物を４つの９６ウェルプレート上にトリプリケート方式で接種して２８℃で培養した。フルオロフォアの漂白を回避すべく４時間間隔で各プレートのスキャンを行うようにして、ＧＦＰ発現さらにはカーリー結合ｈ−ＦＴＡＡシグナル（励起４０５ｎｍ、発光５５６ｎｍ）およびセルロース結合ｈ−ＦＴＡＡシグナル（励起５００ｎｍ、発光６００ｎｍ）に関して、４８時間にわたり１時間ごとにタンデムにプレートを読み取った。４つのプレートからのＧＦＰおよびｈ−ＦＴＡＡのＲＦＵデータを単一のプロットで組み合わせて、時間に対してシグナルの１時間ごとの変化を可視化した。
【００９０】
結果：
バイオフィルム培養でＯＤ６００の吸光度に対してプロットされたＧＦＰシグナルの増加傾向の比較は、密接な相関を示した（図５Ａ）。ＧＦＰシグナルに対する吸光度のプロットが０．９４２３のＲ２値を与えたことから、２つのシグナルの密接な相関が示唆される（図５Ｂ）。このことから、ＧＦＰ発現は、細菌増殖をモニターする手段として使用可能であることが示唆された。
【００９１】
ＧＦＰ蛍光と平行してｈ−ＦＴＡＡシグナルを追跡することにより、バイオフィルム形成と培養増殖期と時間的関係が示される（図５Ｃ〜Ｆ）。Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ｗｔ株３９３４（図５Ｃ）では、ＧＦＰシグナルは、最初の６時間は一定に保持され（遅滞期）、その後、指数関数的に増加し（対数増殖期）、その後、１５時間でプラトーに達する（定常期）。これに関連して、カーリーおよびセルロースのシグナルは両方とも、最初の１６時間は一定保持され、次いで、２２時間後、プラトーまで増加する。バイオフィルム形成は、培養増殖の対数期後期の近傍で開始され、かつセルロースおよびカーリーの産生は、同時であることが、データから示唆される。
【００９２】
検出されたｈ−ＦＴＡＡシグナルは、ＧＦＰからの有意なブリードスルー蛍光を含有していない。平行アッセイでΔｃｓｇＤの蛍光プロファイルを４８時間にわたり１時間ごとに観測したところ、ＧＦＰシグナルの増加は、カーリーおよびセルロースのシグナルの増加を引き起こさなかった（図５Ｄ）。したがって、カーリーおよびセルロースの追跡で励起・発光セットで観測された傾向は、ＧＦＰの存在からのシグナルオーバーフローの結果ではなかった。
【００９３】
ΔｃｓｇＡ（図５Ｅ）の分析は、カーリー発現の不在下でバイオフィルム形成速度が変化することを示している。ピークセルロース発現の開始は、より早い段階で１３時間で行われ、より速い速度で１８時間でプラトーに達する。また、同一のバイオフィルム増殖期では、プラトーのＲＦＵ強度はｗｔよりも強い。このことから、セルロース発現は、カーリー不在に反応して増加しうることが示唆される。セルロース結合ｈ−ＦＴＡＡの広い発光プロファイルが原因で、実質的量のスピルオーバーがカーリー蛍光チャネル中で検出される。
【００９４】
ΔｂｓｃＡ（図５Ｆ）の分析は、セルロース発現の不在下でカーリー発現が図６Ｃに見られるＳ字状傾向にもはや従わないことを示している。カーリー産生は、全体を通じて漸増するように思われる。この場合もまた、カーリー結合ＬＣＯの広い発光スペクトルに起因して、ある程度のスピルオーバーがセルロース蛍光チャネル中で検出される。
【００９５】
セルロースがＥＣＭ中に存在しない場合、ΔｂｓｃＡ（図５Ｆ）の場合と同様に、ＥＣＭ形成の動態が変化する。ｗｔ（図５Ｃ）およびΔｃｓｇＡ（図５Ｅ）の培養物とは対照的に、培養増殖の対数期とＥＣＭ形成の誘導との間に明確な「時間差」は存在しなかった。カーリー産生は、全体を通じて漸増するように思われた。
【００９６】
結論：
ＬＣＯプローブｈ−ＦＴＡＡは、バイオフィルム形成のリアルタイム分析を可能にする。セルロースおよびカーリーに特異的なシグナルは、培養進行中、１時間おきに検出可能であった。経時的なシグナルの増加は、形成されるバイオフィルム量の増加を反映する。培養増殖（ＧＦＰシグナルにより表される）とｈ−ＦＴＡＡからのバイオフィルムシグナルとの比較から、バイオフィルム形成は、培養物が定常期に達したときに行われることが示唆され、これまでの研究と一致する。カーリーおよびセルロースの検出のために選択されるチャンネルは、ＧＦＰ蛍光からの有意なノイズを受けない。カーリー／セルロース結合ｈ−ＦＴＡＡの広い発光スペクトルは、ＧＦＰチャネル中にブリードする。しかしながら、これは、分析に影響を及ぼさない。
【００９７】
実施例５−構造炭水化物（たとえば、β−１，３−グルカン、セルロース、キチン、ナトリウムアルギネート）、代謝基質および代謝中間体（たとえば、α−Ｄ−グルコース、セルロビオース）、貯蔵炭水化物（たとえば、アミロース、グリコーゲン）、およびグリコアミノグリカン（たとえば、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ）に結合して識別するＬＣＯの能力の評価。
【００９８】
研究目標：
最大発光の励起波長（λｍａｘ）の変化およびシグナル強度と炭水化物濃度との相関を研究することにより、β−１，３−グルカン、セルロース、キチン、ナトリウムアルギネート、α−Ｄ−グルコース、セルロビオース、アミロース、グリコーゲン、ヘパリン、およびコンドロイチン硫酸Ａを識別する際の五量体ＬＣＯの使用を実証すること。
【００９９】
研究設計：
炭水化物懸濁液の段階希釈液をｄＨ２Ｏ中に調製した。β−１，３−グルカン、セルロース、およびキチンに対しては、１０〜０．０３９ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度を使用し、一方、ナトリウムアルギネート、グルコース、アミロース、グリコーゲン、セルロビオース、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａに対しては、５〜０．０１９ｍｇ／ｍｌを使用した。３μＭの各ＬＣＯプローブを各濃度の炭水化物の１ｍｌアリコートに添加し、その後、１００μｌを９６ウェルプレート中にトリプリケート方式で分配した。３００〜５００ｎｍでサンプルを励起して５４５ｎｍで発光を検出することにより、励起スペクトルを収集した。陰性対照に対してλｍａｘおよび／またはＲＦＵ強度の再現性のある変化が存在する場合、炭水化物の検出が結論付けられる。それぞれの図に明記されるように、３つの濃度さらには陰性対照からのデータが各炭水化物に対して示される。
【０１００】
炭水化物結合ＬＣＯの対応する蛍光シグナルに対して炭水化物の濃度をプロットすることにより、シグナル強度と炭水化物濃度との間の相関および傾向を示した。各ＬＣＯに対して選択される励起波長（５４５ｎｍで発光を検出）は、（１）λｍａｘまたは（２）最小バックグラウンドの影響を受ける励起波長のいずれかである。線形回帰分析を行って炭水化物濃度とＲＦＵとの関係を決定する。
【０１０１】
結果は、図６〜２５に示され、以下の表１〜１０にまとめられている。
0006317342.tif 000002
0006317342.tif 000003
0006317342.tif 000004
0006317342.tif 000005
【０１０２】
結論：
炭水化物へのＬＣＯの結合時の検出シグナル強度の変化（正もしくは負）および／またはλｍａｘのシフトに基づいて、以下に示されるように、炭水化物を特異的ＬＣＯにより検出および／または識別することが可能であるという結論が導かれる。
0006317342.tif 000006
【図１Ａ】
0006317342.tif 000007
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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