(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物であって、テンバメクチンは下記の構造式で表される化合物であり、
【化１】
0006359696.tif 000016
式中、ＲはＣＨ３又はＣ２Ｈ５であり、ＲがＣＨ３の場合、上記化合物はテンバメクチンＡであり、ＲがＣ２Ｈ５の場合、上記化合物はテンバメクチンＢであり、テンバメクチンＡとテンバメクチンＢとの間の質量比は１：９である、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物。
【請求項２】
農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、請求項１に記載のテンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項３】
請求項２に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記農業及び林業における害虫は、レピドプテラ  プルテリダエ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ）、レピドプテラ  ノクツイダエ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、レピドプテラ  ラシオカムピダエ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）、レピドプテラ  ボレル（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  ｂｏｒｅｒ）、コレオプテラ  エラテリダエ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ  Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ）、及びチレンチダ  アフェレンコイダエ（Ｔｙｌｅｎｃｈｉｄａ  Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅａ）から選択される１以上であり、及び／又は、上記農業及び林業におけるダニは、ハダニである、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項４】
請求項３に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記害虫のレピドプテラ  プルテリダエ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ）は、プルテラ  キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）であり、及び／又は、上記害虫のレピドプテラ  ノクツイダエ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）は、スポドプテラ  エキシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、プロデニア  リツラ（Ｐｒｏｄｅｎｉａ  ｌｉｔｕｒａ）、ミチムナ  セパラテ  ウォーカー（Ｍｙｔｈｉｍｎａ  ｓｅｐａｒａｔｅ  Ｗａｌｋｅｒ）、ヘリコベルパ  アーミゲラ  ハブナー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ  Ｈｕｂｎｅｒ）、及びアグロティス  イプシロン（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）から選択される１以上であり、及び／又は、上記害虫のレピドプテラ  ラシオカムピダエ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）は、マツカレハであり、及び／又は、上記害虫のレピドプテラ  ボレル（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  ｂｏｒｅｒ）は、ニカメイガであり、及び／又は、上記害虫のコレオプテラ  エラテリダエ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ  Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ）は、ハリガネムシであり、及び／又は、上記害虫のチレンチダ  アフェレンコイダエ（Ｔｙｌｅｎｃｈｉｄａ  Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅａ）は、ブルサフェレンカス  キシロフィラス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ  ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）であり、及び／又は、上記農業及び林業におけるダニは、テトラニカス  シンナバリナス（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、テトラニカス  ウルティカエ  コシュ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ  Ｋｏｃｈ）、及びシトラスクモダニ（ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）から選択される１以上である、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項５】
請求項２に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記混合物の投与形態は、水和性顆粒剤、乳剤、水懸濁液、油懸濁液、マイクロエマルジョン、又は錠剤である、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項６】
請求項５に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記水和性顆粒剤又は上記錠剤は、請求項１に記載の混合物、賦形剤又は溶剤、及び界面活性剤を、０．５〜９０％：１０〜９５％：３〜２０％の重量比で含む、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項７】
請求項６に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記水和性顆粒剤又は上記錠剤は、請求項１に記載の混合物、賦形剤又は溶剤、及び界面活性剤を、０．５〜８７％：１０〜９５％：３〜２０％の重量比で含む、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項８】
請求項５に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記乳剤は、上記混合物、溶剤、及び界面活性剤を、０．５〜９０％：５〜８５％：２〜１５％の重量比で含む、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項９】
請求項５に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記水懸濁液又は上記油懸濁液は、上記混合物、水又は溶剤、及び界面活性剤を、０．５〜９０％：５〜８０％：５〜２０％の重量比で含む、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項１０】
請求項９に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記水懸濁液又は上記油懸濁液は、上記混合物、水又は溶剤、及び界面活性剤を、０．５〜９０％：１０〜８０％：５〜２０％の重量比で含む、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項１１】
請求項５に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記マイクロエマルジョンは、上記混合物、水又は溶剤、及び界面活性剤を、０．５〜５０％：４０〜９５％：４〜１５％の重量比で含む、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項１２】
請求項５に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記水和性顆粒剤は、上記混合物、賦形剤及び界面活性剤を、０．５〜６０％：３０〜９８％：１〜２５％の重量比で含み、上記錠剤は、上記混合物、賦形剤及び界面活性剤を、０．５〜９０％：８〜８５％：２〜２０％の重量比で含む、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記水和性顆粒剤は、上記混合物、賦形剤及び界面活性剤を、０．５〜６０％：３０〜９０％：４〜２０％の重量比で含み、上記錠剤は、上記混合物、賦形剤及び界面活性剤を、０．５〜９０％：１５〜８５％：２〜２０％の重量比で含む、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項１４】
請求項６〜７、１２〜１３のいずれか１項に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記賦形剤は、白色カーボンブラック、ベントナイト、及び珪藻土のうちの１つ、又はこれらのうちのいずれか２つ以上の混合物である、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項１５】
請求項６から１１のいずれか１項に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記溶剤は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、及びロジン油のうちの１つ、又はこれらのうちのいずれか２つ以上の混合物である、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項１６】
請求項６から１３のいずれか１項に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
上記界面活性剤は、ノニルフェノールポリオキシエチレンエタノール、オクチルフェノールポリオキシエチレンエタノール、ポリオキシエチレンステアリルエタノール、ポリオキシエチレンラウリルエタノール、ポリオキシエチレンロジンエステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルリン酸塩、脂肪アルコールポリオキシエチレンエーテルリン酸塩、アルキルフェノールポリオキシエチレンエーテル−ホルムアルデヒド凝縮物、カルシウムドデシルベンゼンスルホンサン塩、ドデシルトリメチル塩化アンモニウム、及びベタインから選択される１以上である、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【請求項１７】
請求項２に記載の農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用であって、
その使用形態が、噴霧又は散布である、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における、テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０１４年５月１０日提出の中国特許出願ＣＮ２０１４１００８５４３１．２、及び２０１４年６月１６日提出の中国特許出願ＣＮ２０１４１０２０８６６０．９の優先権を主張する。上記中国特許出願は、参照によりそれらのすべてがここに組み込まれる。
【０００２】
〔技術分野〕
本発明は、マクロライド化合物の分野、特に十六員環マクロライド化合物、及びその用途に関する。
【０００３】
〔背景技術〕
十六員環マクロライド化合物は、ストレプトマイセスにより生産され、高い活性及び広いスペクトルを有し、及び農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するために広く用いられる。そのような化合物は、アベルメクチン、エマメクチン安息香酸塩、及びミルベマイシン等といった、多数の殺虫剤製品に開発されており、及びより大きい市場シェアを占める。そのような化合物は、自然な環境において土壌に固く結合し、かつ、洗い流すこと及び浸透させることが難しい。上記化合物は、光の下で、又は土壌微生物により、速やかに不活性な化合物に分解され得る。上記化合物の分子断片は、最終的に分解され、そして植物及び微生物により、残留毒性のない炭素源として利用される。そのような化合物は、すでに農業及び獣医学の用途において高度に効果的な生物学的殺虫剤となっている。
【０００４】
そのような化合物の性質の優れた理解のために、国内及び外国において、それらのホモログについての包括的な研究が行われている。研究者は、より高い活性を有する新規の化合物を獲得するために、化学合成、又は生産する株を遺伝子改変により変異することによって、分子構造の変更を試みている。分子構造の変更により、数千の化合物がすでに合成されており、イベルメクチン、エマメクチン、ドラメクチン、及びセラメクチン等を含むそれらのいくつかは、現在商業的に利用可能である。変更された化合物は、それらの親化合物のいくつかの欠点を克服しており、かつ予防及び防除の幅、殺虫剤としての活性及びヒト、動物及び環境に対する毒性という点において、さらに改善している。しかしながら、そのような化合物の活性は、まだ現状の要求を満たすことができない。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明は、十六員環マクロライド化合物、及びその利用を提供する。
【０００６】
本発明の技術的解決法は、以下により達成される：
十六員環マクロライド化合物は、下記の構造式で表される化合物であり、式中、ＲはＣＨ３又はＣ２Ｈ５である。
【０００７】
【化１】
0006359696.tif 000002
【０００８】
十六員環マクロライド化合物は、遺伝子改変バクテリアＭＡ２２０の発酵培養液から単離することが可能であり、又は、人工合成により得ることができる。
【０００９】
遺伝子改変バクテリアＭＡ２２０は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、ＡＴＣＣアクセス番号３１２６７で寄託された、ストレプトマイセス  アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０と呼ばれるアベルメクチン産生細胞株の２段階の遺伝子改変により得られる。
【００１０】
第一段階：ストレプトマイセス  アベルミティリス  ＭＡ−４６８０のａｖｅＤ遺伝子の不活性化。ストレプトマイセス  アベルミティリス  ＭＡ−４６８０の４４２位から５２２位のａｖｅＤ遺伝子の塩基を、新たな８１塩基対の配列（例えば、Ｇｕｓｔ  Ｂ，Ｋｉｅｓｅｒ  Ｔ，Ｃｈａｔｅｒ  ＫＦ．２００２．ＲＥＤＩＲＥＣＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３  （２），Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈに記載された方法によって得た、新たな８１塩基対配列）により置換し、ａｖｅＤ遺伝子変異を有する組み換えプラスミドを、ＰＣＲ標的技術を用いて構築する。この組み換えプラスミドで、ストレプトマイセス  アベルミティリス  ＭＡ−４６８０を形質転換する。経過後、ａｖｅＤ遺伝子が不活性化した遺伝子改変バクテリアであるストレプトマイセス  アベルミティリスＡＤ２８を選別して取り出す。
【００１１】
第２段階：特に、ストレプトマイセス  アベルミティリス  ＡＤ２８のａｖｅＡＩ遺伝子が、ストレプトマイセス  ミルベミシニカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｌｂｅｍｙｃｉｎｉｃｕｓ）（菌株番号ＨＳ０２３）のｍｉｌＡＩ遺伝子により置換された、遺伝子改変バクテリアＭＡ２２０を得る。ストレプトマイセス  ミルベミシニカスは、中国一般培養微生物保存センター（ＣＧＭＣＣ：Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、住所：北京市朝陽区北辰西路番号１、中国科学院微生物研究所）に、２０１３年６月１８日付で、ＣＧＭＣＣアクセス番号７６７７で寄託されている。
【００１２】
遺伝子改変バクテリアＭＡ２２０の発酵培養液は、当該技術分野における通常のものであり、遺伝子改変バクテリアＭＡ２２０を発酵培地において培養した後得られる。好ましくは、発酵培養液を、以下の工程を含み方法により調製する：発酵培地に遺伝子改変バクテリアＭＡ２２０を播種し、２５〜３０℃で５〜１０日間培養する。より好ましくは、遺伝子改変バクテリアＭＡ２２０の単一コロニーを種培地に播種し、２８℃、２５０ｒｐｍで４０時間培養し、その後、培地を６％の播種量で発酵培地に播種し、２８℃、２５０ｒｐｍで８日間培養し、発酵培養液を得る。種培地は、当該技術分野における通常のものであり、以下の成分を好ましくは含む：コーンスターチ  ２．５％、大豆粕粉  ０．８％、落花生粕  １％、イースト粉  ０．９５％、及びＣｏＣｌ２  ０．００３％、ｐＨ７．２〜７．４。発酵培地は、当該技術分野における通常のものであり、以下の成分を好ましくは含む：コーンスターチ１４％、アミラーゼ０．００３％、大豆粕粉  ２．０％、イースト粉  １％、沸石粉  ０．２％、ＭｎＳＯ４  ０．００２４％、Ｎａ２ＭｏＯ４  ０．００２４％、及びＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．００２％、ｐＨ７．２〜７．４。
【００１３】
単離及び精製方法を以下に示す：遺伝子改変バクテリアＭＡ２２０の発酵培養液を、１００〜２００メッシュのフィルターを通してろ過し、残渣をエタノールで抽出し、特定の量に濃縮した後、溶液をＥｔＯＡｃで抽出し、濃縮抽出物をシリカカラム及びＲＰ−１８カラムに連続して通し、結果物として化合物を得る。
【００１４】
農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するための化学物質の調製における十六員環マクロライド化合物の使用
好ましい実施形態において、十六員環マクロライド化合物は、ＲがＣＨ３の場合、テンバメクチンＡ（ＴＥＶＡ）であり、ＲがＣ２Ｈ５の場合、テンバメクチンＢ（ＴＥＶＢ）である。十六員環マクロライド化合物は、好ましくは、テンバメクチンＢ、テンバメクチンＡ、又はテンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの混合物であり、テンバメクチンＡとテンバメクチンＢとの間の質量比は、１：９、９：１、２：８、８：２、３：７、７：３、４：６、６：４又は５：５である。
【００１５】
好ましい実施形態において、農業及び林業における害虫は、通常、レピドプテラ  プルテリダエ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ）、レピドプテラ  ノクツイダエ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、レピドプテラ  ラシオカムピダエ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）、レピドプテラ  ボレル（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  ｂｏｒｅｒ）、コレオプテラ  エラテリダエ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ  Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ）、及びチレンチダ  アフェレンコイダエ（Ｔｙｌｅｎｃｈｉｄａ  Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅａ）から選択される１以上である。これらのうち、レピドプテラ  プルテリダエの害虫は、通常、プルテラ  キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）である。レピドプテラ  ノクツイダエは、通常、スポドプテラ  エキシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、プロデニア  リツラ（Ｐｒｏｄｅｎｉａ  ｌｉｔｕｒａ）、ミチムナ  セパラテ  ウォーカー（Ｍｙｔｈｉｍｎａ  ｓｅｐａｒａｔｅ  Ｗａｌｋｅｒ）、ヘリコベルパ  アーミゲラ  ハブナー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ  Ｈｕｂｎｅｒ）、及びアグロティス  イプシロン（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）から選択される１以上である。レピドプテラ  ラシオカムピダエは、通常、マツカレハである。レピドプテラ  ボレルは、通常、ニカメイガである。コレオプテラ  エラテリダエは、通常、ハリガネムシである。チレンチダ  アフェレンコイダエは、通常、ブルサフェレンカス  キシロフィラス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ  ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）である。農業及び林業におけるダニは、例えば、テトラニカス  シンナバリナス（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、テトラニカス  ウルティカエ  コシュ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ  Ｋｏｃｈ）、及びシトラスクモダニ（ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）の１以上である。
【００１６】
好ましい実施形態において、化学物質の投与形態は、水和性顆粒剤、乳剤、水懸濁液、油懸濁液、マイクロエマルジョン、又は錠剤である。
【００１７】
好ましい実施形態において、水和性顆粒剤又は錠剤は、上記化合物、賦形剤又は溶剤、及び界面活性剤を、０．５〜９０％：１０〜９５％：３〜２０％、好ましくは０．５〜８７％：１０〜９５％：３〜２０％の重量比で含む。
【００１８】
好ましい実施形態において、乳剤は、上記化合物、溶剤、及び界面活性剤を、０．５〜９０％：５〜８５％：２〜１５％の重量比で含む。
【００１９】
好ましい実施形態において、水懸濁液又は油懸濁液は、上記化合物、水又は溶剤、及び界面活性剤を、０．５〜９０％：５〜８０％：５〜２０％、好ましくは０．５〜９０％：１０〜８０％：５〜２０％の重量比で含む。
【００２０】
好ましい実施形態において、マイクロエマルジョンは、上記化合物、水又は溶剤、及び界面活性剤を、０．５〜５０％：４０〜９５％：４〜１５％の重量比で含む。
【００２１】
好ましい実施形態において、水和性顆粒剤は、上記化合物、賦形剤及び界面活性剤を、０．５〜６０％：３０〜９８％：１〜２５％、好ましくは０．５〜６０％：３０〜９０％：４〜２０％の重量比で含む。
【００２２】
好ましい実施形態において、錠剤は、上記化合物、賦形剤及び界面活性剤を、０．５〜９０％：８〜８５％：２〜２０％、好ましくは０．５〜９０％：１５〜８５％：２〜２０％の重量比で含む。
【００２３】
好ましい実施形態において、賦形剤は、白色カーボンブラック、ベントナイト、及び珪藻土のうちの１つ、又はこれらのうちのいずれか２つ以上の混合物であり、溶剤は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、及びロジン油のうちの１つ、又はこれらのうちのいずれか２つ以上の混合物であり、界面活性剤は、ノニルフェノールポリオキシエチレンエタノール、オクチルフェノールポリオキシエチレンエタノール、ポリオキシエチレンステアリルエタノール、ポリオキシエチレンラウリルエタノール、ポリオキシエチレンロジンエステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルリン酸塩、脂肪アルコールポリオキシエチレンエーテルリン酸塩、アルキルフェノールポリオキシエチレンエーテル−ホルムアルデヒド凝縮物、カルシウムドデシルベンゼンスルホンサン塩、ドデシルトリメチル塩化アンモニウム、及びベタインから選択される１以上である。
【００２４】
好ましい実施形態において、その使用形態は、噴霧又は散布である。
【００２５】
〔有益な効果〕
本発明の水和性顆粒剤、乳剤、水懸濁液、油懸濁液、マイクロエマルジョン、又は錠剤は、テトラニカス  シンナバリナス、テトラニカス  ウルティカエ  コシュ、及びシトラスクモダニ、プルテラ  キシロステラ、スポドプテラ  エキシグア、プロデニア  リツラ、ヘリコベルパ  アーミゲラ  ハブナー、アグロティス  イプシロン、ハリガネムシ、ミチムナ  セパラテ  ウォーカー、マツカレハ、ブルサフェレンカス  キシロフィラス、ニカメイガ等のような、農業及び林業における害虫又はダニを予防及び防除するために効果的に用いられ得る。
【００２６】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の実施形態、又は先行技術における技術的解決法をより明確に記述するために、実施形態又は先行技術において必要な図を以下で簡単に説明する。下のこれらの図は、本発明のいくつかの実施形態を明示するのみであることは明らかであり、他の図はこれらの図に基づき、通常の当業者の何らの創作業務なしに得ることが可能である。
【００２７】
図１は、ＲがＣＨ３である本発明の化合物を示す質量分析スペクトル図である。
【００２８】
図２は、ＲがＣＨ３であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【００２９】
図３は、ＲがＣＨ３であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル図である。
【００３０】
図４は、ＲがＣＨ３であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示すＤＥＰＴ１３５スペクトル図である。
【００３１】
図５は、ＲがＣ２Ｈ５である本発明の化合物を示す質量分析スペクトル図である。
【００３２】
図６は、ＲがＣ２Ｈ５であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【００３３】
図７は、ＲがＣ２Ｈ５であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル図である。
【００３４】
図８は、ＲがＣ２Ｈ５であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示すＤＥＰＴ１３５スペクトル図である。
【００３５】
図９は、組換えプラスミドｐＵＡｍＴ１４の物理的地図である。
【００３６】
図１０は、組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ｋａｖｅＤの物理的地図である。
【００３７】
図１１は、原株ストレプトマイセス  アベルミティリスＭＡ−４６８０のａｖｅＤ遺伝子の不活性化の工程を示す。
【００３８】
図１２は、発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムであり、Ａは原株ＭＡ−４６８０の発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムであり、Ｂは遺伝子改変細菌ＡＤ２０の発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００３９】
図１３は、組換えプラスミドｐＭＡ１３ａａｄＭＡＤの構築工程を示す。
【００４０】
図１４は、原株ＨＳ０２３から３−２２＃株へのゲノム変異の概念図を示す。
【００４１】
図１５は、組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１５ＡＡ１Ｕの構築工程を示す。
【００４２】
図１６は、ａｖｅＡＩ遺伝子の上流の断片の、３−２２＃株のゲノムへの挿入を示す概念図である。
【００４３】
図１７は、組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＡＭＡの構築工程を示す。
【００４４】
図１８は、遺伝子改変細菌ＡＤ２８からＭＡ２０へのゲノム変異を示す。
【００４５】
図１９は、遺伝子改変細菌ＭＡ２２０、及び遺伝子改変細菌ＡＤ２８の発酵産物の間の比較を示し、Ａは遺伝子改変細菌ＭＡ２２０の発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムであり、Ｂは遺伝子改変細菌ＡＤ２８の発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００４６】
〔発明を実施するための形態〕
本発明の実施例における実施形態を、十分かつ明確に以下で記載する。以下で記載する実施例は、本発明の全てではなく、それらのほんの一部であることは明白である。本発明の実施例に基づき、当該技術分野の通常の知識を有するものにより何らの創作業務なしに得られる、他のすべての実施例が、本発明の保護範囲に含まれる。
【００４７】
実施例１．組換えストレプトマイセス  アベルミティリス株ＭＡ２２０の構築
１．ストレプトマイセス  アベルミティリス及びストレプトマイセス  ミルベミシニカスからのゲノムＤＮＡの抽出：
ａ）ストレプトマイセス  アベルミティリスＭＡ−４６８０（ＡＴＣＣ番号３１２６７）及びストレプトマイセス  ミルベミシニカスＨＳ０２３（ＣＧＭＣＣ番号７６７７）の胞子を、３０ｍｌのＴＳＢ培地（トリプチックソイブロス、ＢＤ会社、カタログ番号２１１８２２）にそれぞれ播き、３０℃、２２０ｒｐｍで３０〜４８時間インキュベートした。
【００４８】
ｂ）菌糸体を遠心分離により回収し、滅菌水で２回洗浄し、菌糸体の４倍量のリゾチーム溶液（１０．３％  スクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、及び４ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム）中に添加して懸濁し、水槽中において、３７℃で、１〜２時間維持した。
【００４９】
ｃ）１０％ＳＤＳ溶液を１：１（ｖ／ｖ）の比で加え、その後に２０ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ溶液を最終濃度１００μｇ／ｍｌで加え、そして混合物を水槽中において、３７℃で、３０分〜１時間維持した。
【００５０】
ｄ）等量のフェノール‐クロロホルム溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１、ｐＨ８．０）を加えることにより、混合物を２回抽出した。
【００５１】
ｅ）上清に、１／１０量の３Ｍ  ＮａＡｃ−ＨＡｃ溶液（ｐＨ５．３）及び等量のイソアミルアルコールを加え、ゲノムＤＮＡを１２０００ｒｐｍで、５分間の遠心分離により回収した。
【００５２】
ｆ）沈殿物を、７０％エタノールで２回洗浄し、室温で乾燥させ、２０μｇ／ｍｌのＲＮＡ分解酵素を含む１０ｍＭ  Ｔｉｒｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ  ８．０）中に溶解し、ゲノムＤＮＡ溶液を得た。
【００５３】
２．ベクターｐＵＡｍＴ１４の構築：
プラスミドｐＩＪ７７３（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｎｏｒｗｉｃｈ，  ＵＫから入手した；  以下を参照、Ｇｕｓｔ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｎｅｅｄｅｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｓｏｉｌ  ｏｄｏｒ  ｇｅｏｓｍｉｎ．  （２００３）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００（４）：  １５４１−１５４６；  ａｎｄ  Ｇｕｓｔ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＥＤＩＲＥＣＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ．  Ｎｏｒｗｉｃｈ：  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ．  （２００２））を、取扱い説明書に従い、ＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ）及びＢｓｔＢＩ（ＴａＫａＲａ）により消化した。遺伝子ａａｃ（３）ＩＶ及びｏｒｉＴを含む１２７１塩基対の断片を、電気泳動により回収した。続いて、ＢＫＬキット（ＴａＫａＲａ）を用いて、取扱い説明書に従い平滑末端化を行い、結果として断片１を得た。ベクターｐＵＣ１９を、取扱い説明書に従い、ＤｒａＩ（ＴａＫａＲａ）及びＳｓｐＩ（ＴａＫａＲａ）により消化した。１７４８塩基対の断片を、電気泳動により回収し、結果として断片２を得た。断片１及び断片２を連結し（ＴａＫａＲａのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて、取扱い説明書に従って行った、以下同じ）、組換えプラスミドｐＵＡｍＴ１４を得た。ｐＵＡｍＴ１４の概念図を図９に示した。
【００５４】
３．ストレプトマイセス  アベルミティリスのａｖｅＤ遺伝子を不活性化するための組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ｋａｖｅＤの構築：
コスミド６−９（引用文献４を参照：  Ｘｉａ  Ｈａｉｙａｎｇ，  Ｈｕａｎｇ  Ｊｕｎ，  Ｈｕ  Ｍｉｎｊｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｄｅｒｅｄ  ｃｏｓｍｉｄ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ，  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ２００９，  ３４（７）：４０３−４０５）に存在するＤＮＡ断片は、ストレプトマイセス  アベルミティリスＭＡ−４６８０のゲノムの１１２４９９２−１１６７３０４の塩基位置の断片だった。遺伝子ａｖｅＤの位置４４２−５２１の断片（配列番号１）を、ＰＣＲターゲティングを用いてノックアウトし、かつ抵抗遺伝子ボックスをＦＬＰリコンビナーゼにより取り除き、結果として８１塩基対の配列が新しい配列（配列番号２）に置換された組換えプラスミド６−９ｋａｖｅＤを得た。引用文献に記載された方法に実質的に従って、ＰＣＲターゲティングを行った（以下、参照  Ｇｕｓｔ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｎｅｅｄｅｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｓｏｉｌ  ｏｄｏｒ  ｇｅｏｓｍｉｎ．  （２００３）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００（４）：  １５４１−１５４６；  ａｎｄ  Ｇｕｓｔ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＥＤＩＲＥＣＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ．  Ｎｏｒｗｉｃｈ：  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ．  （２００２））。具体的な手順は、以下の通りである。
【００５５】
ａ）ＰＣＲプライマーの設計：５’末端の３９塩基対が、遺伝子ａｖｅＤの４０３−４４１の位置の配列と同一であり、かつ３’末端の２０塩基対が鋳型抵抗性遺伝子ボックスの“左腕”として用いられる、プライマーａｖｅＤ５９（配列番号３）を設計した。５’末端の３９塩基対が、遺伝子ａｖｅＤの５２２−５６０の位置の配列と逆相補的であり、かつ３’末端の２０塩基対が鋳型抵抗性遺伝子ボックスの”右腕”として用いられる、プライマーａｖｅＤ５８（配列番号４）を設計した（“左腕”及び“右腕”は定常配列である、以下参照  Ｇｕｓｔ  Ｂ，  Ｋｉｓｅｒ  Ｔ，  Ｃｈａｔｅｒ  Ｋ  Ｆ．  ＲＥＤＩＲＥＣＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ．  Ｎｏｒｗｉｃｈ：  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ．  ２００２，  Ｐａｇｅ  ６）。
【００５６】
ｂ）抵抗遺伝子ボックスのＰＣＲ増幅：プラスミドｐＩＪ７７３を鋳型として用いてＰＣＲ増幅を行った。ＴａＫａＲａのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲ増幅に用いた。
【００５７】
反応のために、以下の溶液を準備した：
プライマーａｖｅＤ５９  （２５  μＭ）                ０．５μｌ
プライマーａｖｅＤ５８  （２５  μＭ）                ０．５μｌ
プラスミドｐＩＪ７７３                              ２μｌ（約１０ｎｇ）
５  ×  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲバッファー                １０μｌ
ｄＮＴＰｓ  （各２．５  ｍＭ）                        ４μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）  ０．５μｌ
再蒸留水                                              ３４μｌ
ＰＣＲの手順：
９４℃、２分、
（９８℃×１０秒、５０℃×４５秒、７２℃×１分３０秒）×１０サイクル、
（９８℃×１０秒、６８℃×１分３０秒）×１５サイククル、
７２℃×２分、１６℃×１分。
【００５８】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、バンドをゲルから切り取ることにより、約１．４ｋｂの標的断片を回収した。ゲルリカバリーキット（ＴａＫａＲａ）を用いて、取扱い説明書に従って、回収を行った。
【００５９】
ｃ）ライブラリープラスミドの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０への形質転換：大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０のシングルコロニーを、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む１０ｍｌのＬＢ培地（トリプトン  １．０％、  イースト粉  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、及びグルコース  ０．１％）に播き、３０℃で２５０ｒｐｍ、一晩（１４〜１８時間、以下同様）培養した。一晩培養した１００μｌ細菌懸濁液を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１０ｍｌのＳＯＢ培地（トリプトン  ２．０％、イースト粉  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．０５％、１０ｍｌの２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ溶液を１Ｌの培地に加え、使用前に５ｍｌの滅菌した２ｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を１Ｌの培地に加えた）に播き、３０℃、２５０ｒｐｍで３〜４時間、ＯＤ６００が０．４辺りに到達するまで培養した。細菌を４０００ｒｐｍで５分、４℃の遠心分離により回収し、事前に氷冷した１０ｍｌの１０％グリセロールで２回洗浄した。沈殿物を事前に氷冷した１００μｌの１０％グリセロールで懸濁し、すなわち、電気的形質転換のためのコンピテントセルとした。５０μｌのコンピテントセル懸濁液に対し、約１００ｎｇ（２〜３μｌ）のライブラリープラスミドであるコスミド６−９を加えた。事前に氷冷した０．２ｃｍキュベット内で、電気的形質転換を行った。電気パルスのための変数は、以下の通りだった：２００Ω、２５μＦ、及び２．５ｋＶ。電気パルスの持続時間は、４．５から４．９ｍｓであった。電気パルスの後に、事前に氷冷した１ｍｌのＬＢ培地を直ちに懸濁液に加え、シェーカー上において、３０℃で１時間培養した。５０μｌの電気的形質転換した懸濁液を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート（１．５％寒天粉を含むＬＢ培地）上に広げ、３０℃で一晩インキュベートし、シングルコロニーを得た。
【００６０】
ｄ）ライブラリープラスミドのＰＣＲターゲティング：ライブラリープラスミドであるコスミド６−９を含む大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０のシングルコロニーを、無作為に取り出し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、及び２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１０ｍｌのＬＢ培地に播き、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。一晩培養した細菌懸濁液１００μｌを、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、及び１０ｍＭのＬ−アラビノースを含む１０ｍｌのＳＯＢ培地に播き、３０℃、２５０ｒｐｍで培養した。電気的形質転換のためのコンピテントセルを、工程ｃ）の方法に従って準備した。５０μｌのコンピテントセル懸濁液に対し、工程ｂ）で得た約１００  ｎｇ（２〜３μｌ）のＰＣＲ産物回収懸濁液を加えた。事前に氷冷した０．２ｃｍのキュベット内で電気パルスを行った。電気パルスの変数は、以下の通りだった：２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ。電気パルスの持続時間は、４．５〜４．９ｍｓであった。事前に氷冷した１ｍｌのＬＢ培地を直ちに懸濁液に加え、シェーカー上において３７℃で１時間培養した。簡単な遠心分離の後、ほとんどの上清を捨て、沈殿物を残った上清に懸濁した。すべての懸濁液を１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、及び５０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含むＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩インキュベートした。シングルコロニーを取り出し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、及び５０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含む３ｍｌのＬＢ培地に播き、３７℃、２５０ｒｐｍで約６時間培養した。プラスミドを、Ａｘｙｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅ  Ｋｉｔを用いて、取扱い説明書に従って抽出した。制限エンドヌクレアーゼを用いた消化検出により、正しいプラスミドを選別し、結果として組換えプラスミド６−９ｄａｖｅＤを得た。
【００６１】
ｅ）抵抗遺伝子及びｏｒｉＴのＦＬＰによる除去：大腸菌ＤＨ５α／ＢＴ３４０を２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１０ｍｌのＬＢ培地に播き、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。電気的形質転換のためのコンピテントセルを、工程ｃ）の方法に従って準備した。５０μｌのコンピテントセル懸濁液に対し、工程ｄ）で得た約１００ｎｇ（１〜２μｌ）の組換えプラスミド６−９ｄａｖｅＤを加えた。事前に氷冷した０．２ｃｍのキュベット内で電気パルスを行った。電気パルスの変数は、以下の通りだった：２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ。電気パルスの持続時間は、４．５から４．９ｍｓであった。事前に氷冷した１ｍｌのＬＢ培地を直ちに加え、シェーカー上において、３０℃で１時間培養した。５０μｌの電気的形質転換した懸濁液を１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのアプラマイシン、及び２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上に広げ、３０℃で４８時間インキュベートし、シングルコロニーを得た。シングルコロニーを無作為に取り出し、抗生物質を含まないＬＢ培地上に画線培養してシングルコロニーを単離し、プレートを４２℃で一晩インキュベートし、細菌にＦＬＰリコンビナーゼを発現させ、かつその後プラスミドＢＴ３４０を失わせた。２０〜３０個のシングルコロニーを取り出し、５０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含むＬＢプレート上、及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢプレート上にそれぞれスポットし、３７℃で一晩インキュベートした。抵抗遺伝子ボックスを有さない標的クローンは、アプラマイシンに対し感受性であり、かつカナマイシンに対し非感受性であった。プラスミドを標的クローンから抽出した。制限エンドヌクレアーゼを用いた消化検出により、正しいプラスミドを選別し、結果的に組換えプラスミド６−９ｋａｖｅＤを得た。
【００６２】
組み換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ｋａｖｅＤの構築：組換えプラスミド６−９ｋａｖｅＤをＣｌａ  Ｉ（ＴａＫａＲａ）及びＢｓｔＢ  Ｉ（ＴａＫａＲａ）により、取扱い説明書に従って消化し、６９８４塩基対の断片を回収し、ＢｓｔＢ  Ｉで消化し、かつ脱リン酸化した（すなわち、１μｌのＦａｓｔＡＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を直接消化反応溶液に加え、３７℃の水浴内に５〜１０分維持した、以下同じ。）ベクターｐＵＡｍＴ１４に連結し、結果的に組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ｋａｖｅＤを得た。組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ｋａｖｅＤの物理的地図を図１０に示した。
【００６３】
４．の遺伝子ａｖｅＤの不活性化：
ａ）組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ｋａｖｅＤのストレプトマイセス  アベルミティリスＭＡ−４６８０への接合伝達による形質転換：工程３−ｃ）の方法に従って、大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）（３７℃でインキュベートし、培地中の抗生物質の最終濃度を以下の通りにした：クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ、及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌ）を用いて電気的形質転換のためのコンピテントセルを準備した。５０μｌのコンピテントセル懸濁液に対し、約１００ｎｇ（１〜２μｌ）の組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ｋａｖｅＤを加えた。事前に氷冷した０．２ｃｍのキュベット内で電気的形質転換を行った。電気パルスの変数は以下の通りであった：２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ。電気パルスの後、事前に氷冷した１ｍｌのＬＢ培地を直ちに懸濁液に加え、シェーカー上において３７℃で１時間培養した。電気的形質転換した５０μｌの懸濁液を、５０μｇ／ｍｌのアプラマイシン、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、及び２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに広げ、かつ３７℃で一晩インキュベートした。形質転換体を無作為に取り出し、かつ２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、及び５０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含む１０ｍｌのＬＢ培地に播き、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。一晩培養した１００μｌの細菌懸濁液を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、及び５０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含む新たな１０ｍｌのＬＢ培地に播き、及び３７℃、２５０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．４辺りに到達するまで培養した。細菌を１０ｍｌのＬＢ培地により２回洗浄し、１ｍｌのＬＢ培地に懸濁した。５００μｌの細菌懸濁液を、事前に５００μｌの２×ＹＴ培地（トリプトン  １．６％、イースト粉  １．０％、及びＮａＣｌ  ０．５％）に懸濁し、５０℃で１０分熱ショックを与えた約１０８個の細胞のストレプトマイセス  アベルミティリスＭＡ−４６８０胞子と混合した。簡単な遠心分離の後、ほとんどの上清を捨て、細胞を残った上清に懸濁した。懸濁液を１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＭＳプレート（ダイ粕パウダー２％、マンニトール  ２％、及び寒天粉  ２％）上に広げ、３０℃で１６〜２０時間インキュベートした。０．５ｍｇのナリジクス酸、及び１．２５ｍｇのアプラマイシンを含む滅菌水でプレート上を覆い、かつプレートをさらに３０℃で５日より長くインキュベートし、形質転換体を得た。
【００６４】
ｂ）遺伝子ａｖｅＤ不活性化変異体のスクリーニング：形質転換体を２０μｇ／ｍｌのナリジクス酸、及び２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含むＹＭＳプレート（イースト抽出物  ０．４％、可溶性デンプン  ０．４％、麦芽抽出物  １．０％、及び寒天粉  １．８％）上に継代培養し、さらに、抗生物質を含まないＹＭＳプレート上に２回継代培養し、分離したシングルコロニーを得た。シングルコロニーを２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含むＹＭＳ培地中、又は抗生物質を含まないＹＭＳ培地中でそれぞれインキュベートした後、アプラマイシン感受性の株を選別した。選別したアプラマイシン感受性の株のゲノムＤＮＡを本実施例の工程１の方法に従って抽出した。その後、プライマーａｖｅＤＦ（配列番号５）／ａｖｅＤＲ（配列番号６）及びａｖｅＤＦ（配列番号５）／ａｖｅＤＭ（配列番号７）をそれぞれ用いて、ｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、以下同じ）により、取扱い説明書に従ってＰＣＲ試験を行った。標的株では、前者のプライマーペアを用いて１０９４塩基対の配列を増幅することができ、後者を用いた場合はそのような配列はなかった。選別した株（ＡＤ２８と番号が付けられた）を、標的株としてさらなる遺伝子組換えに用いた。図１１は、原株ストレプトマイセス  アベルミティリスＭＡ−４６８０の遺伝子ａｖｅＤの不活性化の工程を示す。
【００６５】
５．遺伝子組み換え細菌ＡＤ２８の発酵による確認：ＡＤ２８のシングルコロニーを種培地（コーンスターチ  ２．５％、大豆粕粉  ０．８％、落花生粕  １％、イースト粉  ０．９５％、及び  ＣｏＣｌ２  ０．００３％、ｐＨ７．２〜７．４）に播き、２８℃、２５０ｒｐｍで４０時間培養した。種溶液を発酵培地（コーンスターチ  １４％、アミラーゼ  ０．００３％、大豆粕粉  ２．０％、イースト粉  １％、ゼオライト粉  ０．２％、ＭｎＳＯ４  ０．００２４％、Ｎａ２ＭｏＯ４  ０．００２４％、及びＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．００２％、ｐＨ７．２〜７．４）に６％の植え付け量で播き、２８℃、２５０ｒｐｍで８日間培養した。１ｍｌの発酵培養液に、４ｍｌの無水メタノールを充分浸るように加え、１時間超音波処理し、ろ過した。ろ過物を直接ＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ分析の条件は以下の通りであった。カラム  Ｃ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ２  ４．６×２５０×５（Ｄａｌｉａｎ  Ｅｌｉｔｅ）、移動相  メタノール：エタノール：水＝８１：７：１２、流速  １ｍｌ／分、吸収波長  ２４０ｎｍ。結果を表１２に示した。Ａは、原株ＭＡ−４６８０の発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムであり、Ｂは遺伝子組み換え細菌ＡＤ２８の発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。アベルメクチンＡは、遺伝子組み換え細菌ＡＤ２８では、もはや生産されていないことが示された。
【００６６】
６．ストレプトマイセス  ミルベミシニカスの遺伝子ｍｉｌＡＩの下流断片を置換するための組換えプラスミドｐＭＡ１３ａａｄＭＡＤの構築：３２１２塩基対の標的断片３を、ストレプトマイセス  ミルベミシニカスＨＳ０２３のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、取扱い説明書に従って、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、以下、同じ）と共に、プライマーＭＡ１３Ｆ１（配列番号８）及びＭＡ１３Ｒ２（配列番号９）を用いたＰＣＲ反応により得た。組み換えプラスミドｐＵＡｍＴ１４のＳｍａ  Ｉによる消化の後に、ＦａｓｔＡＰにより脱リン酸化し、事前にＢＫＬキットで処理した断片３に連結し、結果として組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１３’を得た。ストレプトマイセス  ミルベミシニカスＨＳ０２３のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼと共に、プライマーＭＡ１ＤＦ３（配列番号１０）及びＭＡ１ＤＲ４（配列番号１１）を用いたＰＣＲ反応により３２６８塩基対の断片４を得た。組み換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１３’のＥｃｏＲＶ（ＴａＫａＲａ）による消化の後、ＦａｓｔＡＰにより脱リン酸化し、事前にＢＫＬキットにより処理した断片４に連結し、結果として組換えプラスミドｐＭＤ−ＭＡ１Ｄを得た。組み換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１３’をＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｓｉＩにより取扱い説明書（ＴａＫａＲａ）に従って消化し、かつゲルからバンドを切り出すことにより６１９９塩基対の断片を回収し、結果として断片５を得た。組換えプラスミドｐＭＤ−ＭＡ１ＤをＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｓｉＩにより消化し、かつゲルからバンドを切り出すことにより３２５８塩基対の断片を回収し、結果として断片６を得た。断片５及び断片６を連結し、組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１３Ｄを得た。鋳型としてストレプトマイセス  アベルミティリスＭＡ−４６８０のゲノムＤＮＡを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼと共に、プライマーＡＡ１ＤＦ９（配列番号１２）及びプライマーＡＡ１ＤＲ１０（配列番号１３）を用いたＰＣＲ反応により、３２６６  塩基対の断片７を得た。組み換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１３ＤをＮｓｉＩ（ＴａＫａＲａ）により取扱い説明書に従って消化した後回収し、ＢＫＬキットにより処理した。反応生成物をＦａｓｔＡＰにより脱リン酸化した後、ＢＫＬキットで処理した断片７に連結し、結果としてストレプトマイセス  ミルベミシニカスの遺伝子ｍｉｌＡＩの下流断片を置換するための組換えプラスミドｐＭＡ１３ａａｄＭＡＤを得た。構築工程を図１３に示した。
【００６７】
７．ストレプトマイセス  ミルベミシニカスの遺伝子ｍｉｌＡＩの下流断片の置換：工程４−ａ）で記述したとおりに、組換えプラスミドｐＭＡ１３ａａｄＭＡＤをストレプトマイセス  ミルベミシニカスＨＳ０２３に、接合伝達により形質転換した。形質転換体を、抗生物質を含まない継代培養により２回選別した後、シングルコロニーをつまようじにより取り出し、２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含むＹＭＳプレート上、及び抗生物質を含んでいないＹＭＳプレート上にそれぞれ播き、２８℃で５〜６日インキュベートした。アプラマイシンを含むＹＭＳ培地では生育しないが、アプラマイシンを含んでいないＹＭＳ培地で生育したシングルコロニーを、ＹＭＳ培地中での増幅培養のために選択した。一方、ゲノムＤＮＡを工程１の方法に従って抽出し、ｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに加えて、プライマーｍｉｌＤＦ１１（配列番号１４）及びｍｉｌＤＲ１２（配列番号１５）を用いてＰＣＲ試験を実行した。３８２５塩基対のＰＣＲ産物は標的株を示し、一方１４６７塩基対のＰＣＲ産物は復帰突然変異体を示唆した。スクリーニングの結果に基づき、３−２２＃株を遺伝子ｍｉｌＡＩの下流断片がうまく置換されたストレプトマイセス  ミルベミシニカスとして決定し、さらなる操作の標的株として用いた。原株ＨＳ０２３から３−２２＃株へのゲノム変異を示している概念図を図１４に示した。
【００６８】
８．ストレプトマイセス  アベルミティリスＡＤ２８の遺伝子ａｖｅＡＩの上流断片を、ストレプトマイセス  ミルベミシニカスの遺伝子ｍｉｌＡＩの上流に挿入するための組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１５ＡＡ１Ｕの構築：ストレプトマイセス  ミルベミシニカスＨＳ０２３のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼと共に、プライマーＭＡ１５Ｆ１３（配列番号１６）及びＭＡ１５Ｒ１４（配列番号１７）を用いてＰＣＲを行い、結果として３０９７塩基対断片を得た。得られた断片をＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより取扱い説明書（ＴａＫａＲａ）に従って消化し、及び同じ酵素により消化したプラスミドｐＵＡｍＴ１４に連結し、結果として組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１５を得た。ストレプトマイセス  アベルミティリスＡＤ２８のゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡの抽出の方法は、実施例の工程１で記述した同様である）を鋳型として用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼと共に、プライマーＡＡ１ＵＦ１５（配列番号１８）及びＡＡ１ＤＲ１６（配列番号１９）を用いてＰＣＲを行い、結果として３１０３塩基対の断片を得た。得られた断片をＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩにより取扱い説明書（ＴａＫａＲａ）に従って消化し、同じ酵素により消化した組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１５に連結し、結果として組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１５ＡＡ１Ｕを得た。構築工程を図１５に示した。
【００６９】
９．ストレプトマイセス  アベルミティリス遺伝子ａｖｅＡＩの上流断片の、ストレプトマイセス  ミルベミシニカスの遺伝子ｍｉｌＡＩ上流への挿入：工程４−ａ）で記述した方法に従って、工程８で得た組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１５ＡＡ１Ｕを、工程７の接合伝達で得た３−２２＃株に形質転換したところ、得られた形質転換体は標的株であった。遺伝子ａｖｅＡＩの上流断片の、３−２２＃株のゲノムへの挿入を示している概念図を、図１６に示した。
【００７０】
１０．ストレプトマイセス  ミルベミシニカスの遺伝子ｍｉｌＡＩを、ストレプトマイセス  アベルミティリスの遺伝子ａｖｅＡＩに置換するための、組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＡＭＡの構築：１つのシングルコロニーを、工程９で得た形質転換体から取り出し、２０μｇ／ｍｌのナリジクス酸、及び２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含むＴＳＢ培地に播き、ゲノムＤＮＡを工程１で記述した方法に従って抽出した。抽出したゲノムＤＮＡをＳｗａ  Ｉ（ＴａＫａＲａ）により、取扱い説明書に従って消化した。反応後、１／１０体積の３Ｍ  ＮａＡｃ−ＨＡｃ溶液（ｐＨ５．３）、及び同じ体積のイソアミルアルコールを加え、かつＤＮＡを１２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収した。沈殿物を７０％の含水エタノール溶液により２回洗浄し、室温で乾燥させ、２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｉｒｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に溶解し、回収溶液を得た。３マイクロリットルの回収溶液を、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルの形質転換に用いた（ＤＨ５αコンピテントセルの沈殿方法、及び電気的形質転換の手順は、培地が抗生物質を含まず、及びインキュベートの温度が３７℃であったこと以外は、工程３−ｃ）の記述と同様であった）。形質転換溶液を遠心分離してほとんどの上清を取り除き、沈殿物を残った溶液に再懸濁した。懸濁液のすべてを、２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含むＬＢプレート上に広げ、３７℃で１６時間インキュベートし、形質転換体を得た。形質転換体からのプラスミドの抽出後、ストレプトマイセス  ミルベミシニカスの遺伝子ｍｉｌＡＩを、ストレプトマイセス  アベルミティリスの遺伝子ａｖｅＡＩに置換するための、組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＡＭＡを得た。ｐＵＡｍＴ−ＡＭＡの構築工程を、図１７に示した。
【００７１】
１１．ストレプトマイセス  アベルミティリスの遺伝子ａｖｅＡＩの置換：組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＡＭＡを、工程４で得た株ＡＤ２８に、工程４−ａ）で記述した接合伝達の方法により形質転換した。形質転換体を、抗生物質を含まない継代培養により２回選別し、シングルコロニーをつまようじにより取り出し、２５μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含むＹＭＳプレート上、及び抗生物質を含まないＹＭＳプレート上にそれぞれ播き、２８℃で５〜６日インキュベートした。アプラマイシンを含むＹＭＳ培地では生育せず、抗生物質を含まないＹＭＳ培地で生育したシングルコロニーを、ＹＭＳ培地中での増幅培養のために選択した。一方、ゲノムＤＮＡを実施例の工程１の方法に従って抽出し、ｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに加えて、プライマーペア０２５Ａ１ＥＦ（配列番号２０）／０２６Ａ１ＥＲ（配列番号２１）及び０２７Ｍ１ＥＦ（配列番号２２）／０２８Ｍ１ＥＲ（配列番号２３）を用いたＰＣＲ試験を行った。うまく置換した遺伝子組み換え株では、プライマーペア０２５Ａ１ＥＦ（配列番号２０）／０２６Ａ１ＥＲ（配列番号２１）を用いた増幅により、２００５塩基対の標的断片が得られ、プライマー０２７Ｍ１ＥＦ（配列番号：２２）／０２８Ｍ１ＥＲ（配列番号：２３）では上記標的断片は得られなかった。上手く置換した遺伝子組み換え株ＭＡ２２０をさらなる実験に用いた。遺伝子組み換え細菌ＡＤ２８のＭＡ２２０へのゲノム変異を図１８に示した。
【００７２】
１２．遺伝子組み換え細菌ＭＡ２２０の発酵及びＨＰＬＣ分析：方法は実施例の工程５と同様である。ＨＰＬＣ分析の結果を図１９に示した：Ａは遺伝子組み換え細菌ＭＡ２２０の発酵産物を示しているＨＰＬＣクロマトグラフィであり、Ｂは遺伝子組み換え細菌ＡＤ２８の発酵産物を示しているＨＰＬＣクロマトグラフィである。明らかに２つの新たな化合物（保持時間は、それぞれ８．７７３及び１１．０６６分）が、遺伝子組み換え細菌ＭＡ２２０の発酵産物で発生したことが示された。
【００７３】
実施例２．テンバメクチンＡ及びＢの単離、精製及び構造決定
テンバメクチンと呼ばれる十六員環マクロライド化合物は、以下の一般式に示される構造を有している。
【００７４】
【化２】
0006359696.tif 000003
【００７５】
化合物は、ＲがＣＨ３の場合、テンバメクチンＡ（ＴＥＶＡ）であり、ＲがＣ２Ｈ５の場合、テンバメクチンＢ（ＴＥＶＢ）である。遺伝子改変バクテリアにより生成される代謝物中において、テンバメクチンＡとテンバメクチンＢとの比率は、８：２、７：３、又は９：１である。
【００７６】
調製方法：発酵培養液（例えば、実施例１の工程１２において得られた遺伝子改変バクテリアＭＡ２２０の発酵培養液）を、フィルタクロスにより濾過して、濾過ケーキを得た。濾過ケーキを、エタノールにより２回抽出し、エタノール抽出液を得た。エタノール抽出液を、減圧濃縮して乾燥させ、ＥｔＯＡｃにより抽出し、テンバメクチンＢ１及びＢ２を含む抽出物を得た。
【００７７】
抽出物を、シリカゲルと混合し、シリカゲルカラムに載せた。石油エーテル／アセトンの９０：１０、８０：２０、７０：３０及び６０：４０の比率の溶液を連続して用いて、カラムを勾配溶離した。画分を特定の間隔で回収し、ＴＬＣにより検出した。テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢを含む画分を得て、減圧濃縮して乾燥させた。
【００７８】
上記の画分を以下の条件における逆相クロマトグラフィにより分離した；
ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００セミ分取高圧液体クロマトグラフィ
カラム：ＺＯＲＢＡＸ．Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８（２５０ｍｍ＊９．４ｍｍ）
溶離液：メタノール／アセトニトリル／水＝４６：４６：８（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：１．５ｍＬ／分
検出波長：λ＝２４０  ｎｍ。
【００７９】
１７．１分の保持時間を有するピークを回収し、テンバメクチンＡを得た（構造決定のためのデータを特に図１〜４に示す）。２１．５分の保持時間を有するピークを回収し、テンバメクチンＢを得た（構造決定のためのデータを特に図５〜８に示す）。
【００８０】
構造決定：
テンバメクチンＡ及びＢの構造を、ＥＳＩ−ＭＳ、１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ及び２−Ｄ  ＮＭＲ等を含むスペクトル解析により特徴付けた。その物理化学特性は、以下の通りであった。
【００８１】
テンバメクチンＡ：Ｃ４５Ｈ６８Ｏ１４、白色粉末、融点１５３−１５５℃、比旋光度
【００８２】
【化３】
0006359696.tif 000004
【００８３】
ＵＶ  （ＥｔＯＨ）  λｍａｘｎｍ（ｌｏｇ  ε）：２４４（４．５５）；
ＩＲ（ＫＢｒ），Ｖｍａｘｃｍ−１：３４６４，２９３１，１７１８，１４５１，１３８１，１３４１，  １３０５，１１９８，１１２０，１０５１，９８７；
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）及び１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）のデータを表１に示す；ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ８５５［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＨＲＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ、実験値：８５５．４５５１［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値：Ｃ４５Ｈ６８Ｏ１４Ｎａ  ８５５．４５０１。
【００８４】
テンバメクチンＢ：Ｃ４６Ｈ７０Ｏ１４、白色粉末、融点１５３−１５５℃、
【００８５】
【化４】
0006359696.tif 000005
【００８６】
ＵＶ  （ＥｔＯＨ）  λｍａｘｎｍ（ｌｏｇ  ε）：２４４（４．６０）；ＩＲ（ＫＢｒ），Ｖｍａｘｃｍ−１：３４６３，２９３１，１７１７，１４５３，１３８０，１３４１，１３０３，１１９７，１１０６，１０５１，９８６；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）及び１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）のデータを表１に示す；
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ８６９［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＨＲＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ、実験値：８６９．４６８３［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値：Ｃ４６Ｈ７０Ｏ１４Ｎａ  ８６９．４６５８。
【００８７】
【表１】
0006359696.tif 000006
0006359696.tif 000007
【００８８】
実施例３．害虫及びダニに対するテンバメクチンの生物学的活性
（１）テトラニカス  シンナバリナスに対するテンバメクチンの実験的活性分析；
テンバメクチンの実験的活性を、試験害虫としてテトラニカス  シンナバリナスを用いて、さらに、ポジティブコントロールとしてアベルメクチンを用いて試験した。活性を、テンバメクチンとアベルメクチンとの間で比較した。
【００８９】
試験生物：テトラニカス  シンナバリナス：ソラマメの苗木に接種し、人工気候室［（２６±１）℃，ＲＨ（７０±５）％，Ｈ／Ｄ１４］の条件下で培養した。
【００９０】
試験試薬：９６％（ｗ／ｗ）アベルメクチン、９８％（ｗ／ｗ）テンバメクチン（ＴＥＶＡ：ＴＥＶＢ＝８：２）：１ｇの９６％（ｗ／ｗ）アベルメクチン及び９８％（ｗ／ｗ）テンバメクチンを量り、それぞれビーカーに添加した。９３ｇのメタノール及び６ｇの界面活性剤ノニルフェノールポリオキシエチレンエーテルをビーカーに加え、１００００ｍｇ／Ｌの濃度の調製物を得た。調製物を、試験用に、０．００５、０．０１、０．０２５及び０．０５ｍｇ／Ｌの一連の濃度に水で希釈した。
【００９１】
実験方法：リーフディスクディップ法を採用した。一貫した生理学的状態の実験室内で成育したダニの成虫を選択した。一貫した成長状態のソラマメの葉を選択した。２ｃｍのリーフディスクを、パンチャーを用いて準備した。リーフディスクを、裏側に羽根を有するプラスチック皿を上側に向けて、その中央に置いた脱脂綿上にリーフディスクを置いた。各皿に３つのリーフディスクを置いた。小さい毛筆を用いて、各リーフディスクに３０匹のダニの成虫を接種させた。適切な量の水を皿に加えた後、２６±１℃で載置し、実験室において以下の条件下でインキュベートした：照度３０００〜４５００ｌｘ、１４ｈ／ｄ、ＲＨ５０％〜７５％。２時間後のダニの成虫数を実体顕微鏡下で計測し、皿上の各リーフディスクのダニの数が２０匹未満にならないようにする。調整した試薬を、濃度０．００５、０．０１、０．０２５及び０．０５ｍｇ／Ｌでビーカーに入れた。ピンセットで葉を把持し、低濃度の試薬から高濃度の試薬へと５秒間連続して浸漬した。コントロールとして、メスのダニの成虫を蒸留水により処理した。各濃度で１回処理し、各処理を３回繰り返した。葉を空気乾燥させた後、処理したリーフディスクを、２６±１℃、明期が１４時間の人工気候室に載置し、２４時間インキュベートした。少量の水をペトリ皿に添加して湿度を保った。
【００９２】
ダニは、試薬に浸漬した直後は非常に活発であり、処置の５〜８時間後にその活動が低下し始めた。ダニを１２〜２４時間後までそのまま放置した。
【００９３】
死亡決定の基準：実験中、毛筆をダニに優しく接触させ、そのまま動かないものは死亡したとみなした。
【００９４】
実験結果を表２に示した。 
【００９５】
【表２】
0006359696.tif 000008
【００９６】
結果：テトラニカス  シンナバリナスに対するテンバメクチンのＬＣ５０は、０．００４９ｍｇ／Ｌであり、テトラニカス  シンナバリナスに対するアベルメクチンのＬＣ５０は、０．００８３ｍｇ／Ｌであり、テトラニカス  シンナバリナスに対するテンバメクチンの活性は、アベルメクチンの活性よりも高かった。
【００９７】
（２）ヘリコベルパ  アーミゲラ  ハブナー及びミチムナ  セパラテ  ウォーカーに対するテンバメクチンＡ及びＢの混合物（質量比９０：１０）の活性分析
テンバメクチンの活性を、試験害虫として、第３齢ヘリコベルパ  アーミゲラ  ハブナー及び第３齢ミチムナ  セパラテ  ウォーカーを用いて決定し、ミルベマイシン及びアベルメクチンをポジティブコントロールとして用いた。
【００９８】
試験生物；ヘリコベルパ  アーミゲラ  ハブナーの第３齢幼虫及びミチムナ  セパラテ  ウォーカーの第３齢幼虫
試験試薬：０．５％テンバメクチン乳剤、２％ミルベマイシン乳剤、０．５％アベルメクチン乳剤。試薬を、試験に使用する特定の濃度に水で希釈した（表３及び４に具体的に示す）。
【００９９】
０．５％テンバメクチン乳剤の調製：０．５ｇのテンバメクチン（質量比Ａ：Ｂ＝９０：１０）（１００％に変換）、５．０ｇのメタノールアルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルに、メタノールを添加し、１００ｇにした。
【０１００】
２％ミルベマイシン乳剤の調製：２．０ｇのミルベマイシン（１００％に変換）、５．０ｇのアルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルに、メタノールを添加し、１００ｇにした。
【０１０１】
０．５％アベルメクチン乳剤の調製：０．５ｇのアベルメクチン（１００％に変換）、５．０ｇのメタノールアルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルに、メタノールを添加し、１００ｇにした。
【０１０２】
実験方法：試薬を混合した飼料を害虫に与えた。試薬の胃毒性を試験害虫において試験した。
【０１０３】
結果：第３齢ヘリコベルパ  アーミゲラ  ハブナー及び第３齢ミチムナ  セパラテ  ウォーカーに対する試薬の活性を表３及び４に示した。
【０１０４】
【表３】
0006359696.tif 000009
【０１０５】
【表４】
0006359696.tif 000010
【０１０６】
結果は、ヘリコベルパ  アーミゲラ  ハブナー及びミチムナ  セパラテ  ウォーカーに対して、同濃度での活性は、テンバメクチンの方がミルベマイシンよりも高かったことを示した。
【０１０７】
（３）ブルサフェレンカス  キシロフィラスに対するテンバメクチンＡ及びＢの混合物（質量比９０：１０）の活性分析
ブルサフェレンカス  キシロフィラスは、マツの材線虫病の病原体であり、中国南部において、非常に多くのマツの死滅をもたらしている。テンバメクチン、アベルメクチン、イベルメクチン、ミルベマイシン及びエマメクチンベンゾアートを含む十六員環マクロライド化合物の実験活性を、試験害虫としてブルサフェレンカス  キシロフィラスを用いて試験し、ブルサフェレンカス  キシロフィラスに対するこれらの試薬間の活性の相違を比較した。
【０１０８】
試験試薬：０．５％アベルメクチン乳剤、０．５％テンバメクチン乳剤、０．５％イベルメクチン乳剤、２％ミルベマイシン乳剤、及び２．５％エマメクチンベンゾアート  マイクロエマルジョンを含む５つの試薬。
【０１０９】
実験方法：ディップ法を採用した。各試薬について、２、５、１０、２０及び５０ｍｇ／Ｌの５種類の濃度で試験した。各濃度について、３回繰り返した。
【０１１０】
結果：ブルサフェレンカス  キシロフィラスに対する各試薬の毒性を表５に示した。
【０１１１】
【表５】
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【０１１２】
試験した十六員環マクロライド化合物の中で、テンバメクチンが、ブルサフェレンカス  キシロフィラスに対する最も高い活性を示したことを、結果は示した。
【０１１３】
（４）活性におけるテンバメクチンＡとテンバメクチンＢとの比率の効果
テンバメクチンＡ及びテンバメクチンＢの比率の異なる混合物の活性を、試験害虫としてブルサフェレンカス  キシロフィラスを用いて試験し、改良、及びテンバメクチン生成バクテリアの発酵工程の基準を提供した。
【０１１４】
【表６】
0006359696.tif 000012
【０１１５】
表６に示すように、テンバメクチンＢの活性は、テンバメクチンＡの活性よりも高く、最も高い活性は、テンバメクチンＡ：テンバメクチンＢ＝１０：９０の場合に観察された。
【０１１６】
実施例４
屋外のシトラスクモダニに対するテンバメクチンＡ及びＢ（質量比９０：１０）の阻害及び防除効果
シトラスクモダニ（例えば、パノニカス  シトリＭｃＧｒｅｇｏｒ）は、かんきつ類に対する主要な害虫の１つである。シトラスクモダニは、体が小さく、繁殖が早く、及び多様に発生するというような特性を有し、かんきつ類の深刻な被害の原因になり得る。テンバメクチンの２％水和性顆粒剤を準備し、シトラスクモダニの阻害及び防除を試験し、屋外におけるその効果を決定した。
【０１１７】
試験試薬：２％テンバメクチン水和性顆粒剤（テンバメクチン、エタノール及びアルキルフェノールポリオキシエチレンエーテル  ホルムアルデヒド凝縮物）、及び２％アベルメクチン乳剤
実験日時：５月初旬のカンキツ類の果実が若い段階
実験設計：試薬を２０００倍、４０００倍及び８０００倍に希釈し、それぞれ１０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ及び２．５ｍｇ／Ｌの濃度にした。各濃度において、３回繰り返した。１０本のカンキツ類の木を、１つの小領域に無作為に配置した。コントロールとして水を用いた１０本のカンキツ類の木をテストした。５０ｋｇの試薬を各濃度で噴霧した。雨の降らない晴れた日に、続けて２４時間試薬を投与した。
【０１１８】
データ分析：各小領域において５本の木を調べた。各木に対して、木の東、西、南、北、及び中央に位置する２本の枝を調査した。各枝について、５枚の葉っぱに対して生存しているダニの数を計測した。生存しているダニの数は、投与前、投与３日後、５日後、７日後及び１４日後のそれぞれにおいて計測し、ダニ集団の減少率を算出した。屋外における阻害及び防除効果を結果に基づいて決定した。
【０１１９】
結果：屋外におけるシトラスクモダニに対するテンバメクチンの阻害及び防除効果を、表７に示した。
【０１２０】
【表７】
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【０１２１】
シトラスクモダニに対するテンバメクチンの阻害及び防除効果が優れており、アベルメクチンの効果よりも良いことが、屋外の実験で証明されている。同一カラム内で異なる文字が付されている結果は、５％レベルの有意差を示している。
実施例５：屋外のスポドプテラ  エキシグアに対するテンバメクチンＡ及びＢの混合物（質量比９０：１０）の阻害及び防除効果
スポドプテラ  エキシグアは、野菜の主要な害虫であり、阻害及び防除することが困難である。屋外における阻害及び防除試験のために、テンバメクチンを、５％マイクロエマルジョンとして準備した。
【０１２２】
試薬：５％テンバメクチンマイクロエマルジョン（質量比５％：４０％：４０％：１５％のテンバメクチン、エタノール、イソプロパノール及び脂肪アルコールポリオキシエチレンエーテルリン酸塩）、２％アベルメクチン乳剤。
【０１２３】
実験方法：阻害及び防除の対象：スポドプテラ  エキシグア；穀物：Ｊｉｎｇｆｅｎｇ  １。３ｇ．ａｉ．／ｈｍ２、６ｇ．ａｉ．／ｈｍ２を含む４つの処置を行った。投与領域を３０ｍ２とした。各処置を４回繰り返し、水をコントロールとして用いた。従来の方法で、葉の溝の表及び裏に、投与量９００ｇ／ｈｍ２で試薬を均一に噴霧した。晴れた日に投与した。
【０１２４】
データ調査及び分析：スポドプテラ  エキシグアの基準量を投与前に決定した。屋外における阻害及び防除効果を投与３日後及び１０日後に検出した。各小領域において、５か所でサンプリングし、１か所当たり５本について、スポドプテラ  エキシグアの数を調査した。阻害及び防除効果を、生存害虫数及び害虫の減少率に基づいて決定した。
【０１２５】
害虫の減少率＝（投与前の害虫数−投与後の害虫数）／投与前の害虫数×１００％
阻害及び防除効果＝（処理群の害虫の減少率−コントロール群の害虫の減少率）／（１−コントロールの害虫の減少率）×１００％
結果：結果を表８に示した。
【０１２６】
【表８】
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【０１２７】
同一カラム内で異なる文字が付されている結果は、５％レベルの有意差を示している。
【０１２８】
実施例６：プルテラ  キシロステラに対するテンバメクチンＡ及びＢの混合物（質量比９０：１０）の阻害及び防除効果
試験試薬：５％テンバメクチン懸濁液（質量比５％：９０％：５％のテンバメクチン、パイン油エステル及び界面活性剤（ポリオキシエチレンラウリルエーテル））、４．５％高活性シペルメチリン乳剤（Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｒｅｄ  Ｓｕｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）。
実験方法：水をコントロールとして用いて、キャベツ畑において実験を行った。領域を２０ｍ２とし、無作為に配置した。４回繰り返した。各処置において、９００ｋｇ／ｈｍ２の投与量で、ＭＡＴＡＢＩ  ｋｎａｐｓａｃｋ  ｓｐｒａｙｅｒを用いて噴霧する方法で投与を行った。サンプルを５か所から採取し、１か所当たり４本調査した。各領域において、２０本試験した。基準の数を投与前に決定した。生存している害虫の数を投与後に検出し、害虫の減少率を決定した。
【０１２９】
訂正済みの阻害及び防除効果％＝（コントロール群の害虫減少率−処置群の害虫減少率）／コントロール群の害虫減少率
分散分析を結果において行い、異なる処置間の効果の差の有意性をダンカンテストにより決定した。
【０１３０】
実験結果を表９に示した。
【０１３１】
【表９】
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【０１３２】
同一カラム内で異なる文字が付されている結果は、５％レベルの有意差を示している。
【０１３３】
屋外におけるプルテラ  キシロステラに対するテンバメクチンの阻害及び防除効果が優れていることが、屋外の実験により証明されている。
【０１３４】
上述した例は、本発明の好ましい例に過ぎず、本発明の範囲を限定する意図はない。本発明の精神及び範囲内で行われるいずれの変更、同等物の置換、及び改良も、本発明の保護範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】ＲがＣＨ３である本発明の化合物を示す質量分析スペクトル図である。
【図２】ＲがＣＨ３であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図３】ＲがＣＨ３であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図４】ＲがＣＨ３であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示すＤＥＰＴ１３５スペクトル図である。
【図５】ＲがＣ２Ｈ５である本発明の化合物を示す質量分析計スペクトル図である。
【図６】ＲがＣ２Ｈ５であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図７】ＲがＣ２Ｈ５であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図８】ＲがＣ２Ｈ５であり、ＣＤＣｌ３に溶かされた、本発明の化合物を示すＤＥＰＴ１３５スペクトル図である。
【図９】組換えプラスミドｐＵＡｍＴ１４の物理的地図である。
【図１０】組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ｋａｖｅＤの物理的地図である。
【図１１】原株ストレプトマイセス  アベルミティリスＭＡ−４６８０のａｖｅＤ遺伝子の不活性化の工程を示す。
【図１２】発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムであり、Ａは原株ＭＡ−４６８０の発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムであり、Ｂは遺伝子改変細菌ＡＤ２０の発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１３】組換えプラスミドｐＭＡ１３ａａｄＭＡＤの構築工程を示す。
【図１４】原株ＨＳ０２３から３−２２＃株へのゲノム変異の概念図を示す。
【図１５】組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＭＡ１５ＡＡ１Ｕの構築工程を示す。
【図１６】ａｖｅＡＩ遺伝子の上流の断片の、３−２２＃株のゲノムへの挿入を示す概念図である。
【図１７】組換えプラスミドｐＵＡｍＴ−ＡＭＡの構築工程を示す。
【図１８】遺伝子改変細菌ＡＤ２８からＭＡ２０へのゲノム変異を示す。
【図１９】遺伝子改変細菌ＭＡ２２０、及び遺伝子改変細菌ＡＤ２８の発酵産物の間の比較を示し、Ａは遺伝子改変細菌ＭＡ２２０の発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムであり、Ｂは遺伝子改変細菌ＡＤ２８の発酵培養液を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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