(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織中に存在する単細胞を溶解させる方法であって、
a）細胞を組織から同定する段階；
b）界面活性剤を含有する溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間と接触させる段階；
c）溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間内に、ある期間にわたって行き渡らせる段階であって、該細胞が該細胞の内側から溶解される、段階；および
d）ライセートを収集する段階
を含み、ここで、該組織はヒト体内の組織でない、方法。
【請求項２】
組織固定および組織離解なしで行われる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞が器官型培養物の中にある、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ライセートが、吸引チャンネルを用いてライセートを吸引することによって収集される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
吸引チャンネルが吸引用屈曲マイクロピペットである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
収集されたライセートがニトロセルロースパッドにさらに適用される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
標準物質もニトロセルロースパッドに適用される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
ライセートが分析方法を用いて評価される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
分析方法が質量分析法、タンパク質マイクロアレイ、RT-qPCR、RNA-Seq、およびMALDI-MSからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
細胞が生きた固形組織の一部である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
組織中に存在する細胞を分析する方法であって
a）細胞を組織から同定する段階；
b）界面活性剤を含有する溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間と接触させる段階；
c）溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間内に、ある期間にわたって行き渡らせる段階であって、該細胞が該細胞の内側から溶解される、段階；
d）ライセートを収集する段階；
e）収集されたライセートを固体支持体に適用する段階；および
f）収集されたライセートを、分析方法を用いて評価する段階
を含み、ここで、該組織はヒト体内の組織でない、方法。
【請求項１３】
同定された細胞の細胞外膜が、ライセートを収集する前はインタクトまたはほとんどインタクトである、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
同定された細胞の細胞外膜が、ライセートを収集する前はインタクトまたはほとんどインタクトである、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
組織と、該組織中に存在する、細胞内空間を有する細胞と、該組織中に存在する溶解バッファーとを含む組成物であって、該溶解バッファーの全てまたはほとんどが該細胞内空間に収まる、組成物であり、さらにここで、該組織はヒト体内の組織でない。
【請求項１６】
溶解バッファーが界面活性剤を含む、請求項15記載の組成物。
【請求項１７】
界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
組織と、該組織中に存在する少なくとも2個の細胞と、該組織中に存在する溶解バッファーとを含む組成物であって、該少なくとも2個の細胞のそれぞれが細胞内空間を有し、該溶解バッファーの全てまたはほとんどが該少なくとも2個の細胞の該細胞内空間に収まる、組成物であり、さらにここで、該組織はヒト体内の組織でない。
【請求項１９】
溶解バッファーが界面活性剤を含む、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項19記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与されたRC1HG005354号の下で、政府の援助を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年9月13日に提出された米国仮出願第61／700,517号、および2012年11月21日に提出された米国仮出願第61／729,127号に対する優先権を主張し、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
過去50年間にわたって、生物学研究は主として、細胞株および解離された細胞培養物に対して行われてきたが、その理由は、これらの実験系が研究室環境で取り扱いやすく、研究用の材料が大量に得られることにある。この傾向が、大量の生物材料を必要とし、細胞株および解離された細胞培養物に対して直ちに適用しうる数多くの分析方法の開発につながってきた。例えば、ウエスタンブロット法、質量分析法およびライセートマイクロアレイはすべて、これらの方法の分析能力を最大限に利用するために比較的大量の生物材料を必要とする。大量の生物材料は通常、解離された多数の細胞を培養皿の中で同時に溶解させることによって得られる。この継続的な傾向の結果として、固形組織中の単細胞のサンプリングおよび分析のための方法の開発はかなり遅れている。
【０００４】
現行の分析方法の能力を利用して、それらを単細胞に対して適用しうる可能性のある1つのやり方は、固形組織サンプルを、組織離解によって、解離された培養物または細胞懸濁液へと単純化することである。組織離解は、コラゲナーゼ、トリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼおよび／またはプロナーゼを固形組織サンプルに対して溶液中で数時間適用し、時にはその後に、離解された組織サンプルのすり砕きを行うことによって達成される（Waymouth, 1974 In Vitro. 10: 97-111（非特許文献1）；Engelholm et al., 1985 S.A., Spang-Thomsen, M., Brunner, N., Nohr, I. and Vindelov, L.L. (1985) Br J Cancer. 51(1): 93-98（非特許文献2）；Pallavicini, 1987 Techniques in cell cycle analysis. 139-162（非特許文献3））。このようにして、ヒト固形腫瘍を、フローサイトメトリーによる分析のための細胞懸濁液へと単純化することができる（Dalerba et al., 2011, Nat. Biotechnol. 29: 1120-1127（非特許文献4））。齧歯動物の脳組織を、解離された神経培養物へと単純化し、そこから単一のニューロンをRT-qPCR分析用にサンプリングすることができる（Morris et al., s2011, J. Vis. Exp. 50: pii: 2634. doi: 10.3791/2634（非特許文献5））。しかし、細胞の位置に関する情報は組織離解後には失われる。また、固形組織の離解によって、組織サンプルのすべての細胞が分散するとは限らない。固形組織の離解は多くのネイティブ細胞を死滅させる可能性が高い上、ある特定の細胞集団が他のものよりも多く選択される可能性もある。組織離解の細胞収量は細胞型によって異なる。組織1gは細胞およそ1×109個を含有するが、一方、組織離解手順の典型的な収量は細胞1×108個／gである（Pallavicini, 1987 Techniques in cell cycle analysis. 139-162（非特許文献3））。さらに、組織離解を生き延びた細胞は、細胞外マトリックスがないこと、および培養皿または細胞懸濁液の中での細胞環境の変化が原因で、その細胞型特異的な生化学的性質および機能性を失っている。例えば、癌性組織および3Dモデルにおける細胞分裂速度は、2D細胞株で観察される細胞分裂速度とは異なる（Fischbach et al., 2007 Nat Methods .4(10): 855-860（非特許文献6））。2Dで培養された細胞によって形成される腫瘍の悪性度は、3Dで培養された細胞によって形成される腫瘍の悪性度よりも低い（Fischbach et al., 2007 Nat Methods 4(10): 855-860）。また、固形組織の細胞外マトリックスが癌において決定的な役割を果たすこともよく知られている（Bissell et al., 2001 Nat Rev Cancer 1(1):46-54（非特許文献7）；Hanahan et al., 2000 Cell. 100(1): 57-70（非特許文献8））。したがって、解離された細胞培養物および細胞懸濁液は、元の固形組織と同等ではない。
【０００５】
現行のほとんどの固形組織研究方法は固定を必要とする。レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション法と、免疫標識に基づくすべての方法（免疫蛍光法、FACS、FISHなど）はいずれも、固定を必要とする（Gutstein et al., 2007, Expert Rev. Proteomics 4:627-637（非特許文献9）；Espina et al., 2006, Nat. Protoc. 1:586-603（非特許文献10）；Mouledous et al., 2002, J. Biomol. Tech. 13:258-264（非特許文献11）；Brandtzaeg and Rognum, 1984, Histochem. Cell Biol. 81:213-219（非特許文献12）；Micheva and Smith, 2007, Neuron 55:25-36（非特許文献13））。後者は、組織構造の全域にわたっての、さらには細胞内での基質の空間分布に関して、有用な情報を提供することができる。しかし、問題は、固定組織によって何を行えるかではなく、固定組織が元の固定前組織を表しているか否かである。固定組織が元の組織サンプルを表していないのであれば、固定組織に基づく研究はすべて、情報的価値がないことになる。固定プロセスが最初に文書に記載されたのは100年以上前のことである（Fish, 1896, Transactions of the American Microscopical Society, 17:319-330（非特許文献14））。アルデヒドおよびアルコールに基づく固定のプロセスは十分には解明されていないが、元のサンプルの分子的保持を損なわせ、その結果、単細胞間に真にネイティブな違いがあるか否かをわかりにくくすることが知られている（Schnell et al., 2012, Nat. Meth. 9: 152-158（非特許文献15）；Mouledous et al., 2002, J. Biomol. Techniques 13:258-264（非特許文献11）；Melan and Sluder, 1992, J. Cell Sci. 101:731-743（非特許文献16）；Holtfreter and Cohen, 1990, Cytometry 11:676-685（非特許文献17）；Tanaka et al., 2010, Nat. Methods 7:865-866（非特許文献18）；Collaud et al., 2010, J. Biomol. Tech. 21:25-28（非特許文献19））。汎用的な固定プロトコールは存在せず、具体的なそれぞれの固定プロトコールは、ある特定の細胞型、ある特定の分子クラス、およびある分子クラスの中のある特定の分子のみに合わせて調整される（Schnell et al., 2012, Nat. Meth. 9:152-158（非特許文献15）；Mouledous et al., 2002, J. Biomol. Techniques 13:258-264（非特許文献11）；Melan and Sluder, 1992, J. Cell Sci. 101:731-743（非特許文献16）；Holtfreter and Cohen, 1990, Cytometry 11:676-685（非特許文献17））。
【０００６】
生物サンプルの分子的保持に対する一般的な固定プロトコールおよび透過処理プロトコールの影響を検討する目的で、Schnellらは、サイトゾル可溶性GFPを293T細胞およびMDCK細胞において発現させた（Schnell et al., 2012, Nat. Meth. 9:152-158（非特許文献15））。予想された通り、アルデヒドに基づく固定はタンパク質架橋および抗原遮蔽を招いた。GFP発現細胞内の多数のGFP分子には、適用した特異的GFP抗体が到達することができず、このことはこれらのGFP発現細胞の高度の透過処理後も同じであった。アルデヒドに基づく同じ固定プロトコールは、アルデヒドに基づく固定を適用する前に画像化した同じセットのMDCK細胞と比較して、固定されたMDCK細胞におけるGFPタンパク質の空間的再分布を招いた。MDCK細胞とは対照的に、アルデヒドに基づく同じ固定プロトコールによって293T細胞を固定した後には、GFPの空間的再分布は全く観察されなかった。これらの観察所見は、分子的保持に対するアルデヒドに基づく固定の影響が、細胞型依存的であることを示している。アルデヒドで固定された各単細胞内の細胞内タンパク質に到達するために必要な透過処理プロセスも、固定されたすべての単細胞からのGFPの高度の抽出を招いた（Schnell et al., 2012, Nat. Meth. 9:152-158（非特許文献15））。同様に、アルコールに基づく固定によっても、すべての単細胞からほとんどのGFPタンパク質が抽出され、このことは蛍光および電子顕微鏡検査によって確かめられた（Schnell et al, 2012, Nat. Meth. 9:152-158（非特許文献15））。重要なこととして、Schnellらによる研究では、GFPを小胞体に標的指向させた場合、適用したGFP抗体が特異的であってGFPを正しく検出したにもかかわらず、所与の単細胞のセットにおける単細胞間のGFP数量の真の違いを、固定および透過処理後の同じ単細胞のセットの抗体染色によっては再現することができなかった。
【０００７】
Melan and Sluderによる別の厳密な研究において、著者らは、サイズおよび電荷の異なるいくつかのタンパク質をフルオレセイン-5-イソチオシアネート（FITC）で標識し、続いてこれらの標識タンパク質をHeLa細胞、3T3細胞、PtK1細胞およびCHO細胞に投入した（Melan and Sluder, 1992, J. Cell Sci. 101:731-743（非特許文献16））。彼らは、アルデヒドに基づく固定および透過処理によって引き起こされるタンパク質抽出の程度が、具体的なタンパク質種および具体的な細胞型の両方に依存することを観察した（Melan and Sluder, 1992, J. Cell Sci. 101:731-743（非特許文献16））。これらの観察所見は、アルデヒドおよびアルコールに基づく固定ならびに透過処理が、ネイティブな分子の分析可能性を、細胞型および分子に依存する予測不能な様式で低下させることを立証している。分子的保持に対する固定および透過処理の影響を検討したそのほかの研究の結果からも、アルデヒドおよびアルコールに基づく固定ならびに透過処理が、元のサンプルの分子的保持を、細胞型および分子に依存する予測不能な様式で損なわせることが実証されている（Schnell et al., 2012, Nat. Meth. 9:152-158；Mouledous et al., 2002, J. Biomol. Techniques 13:258-264；Melan and Sluder, 1992, J. Cell Sci. 101:731-743（非特許文献16）；Holtfreter and Cohen, 1990, Cytometry 11:676-685（非特許文献17））。
【０００８】
固定に基づくすべての方法の第2の大きな制約は、標準曲線を作成することが困難であり、往々にして不可能であることである。標準曲線は、記録されたシグナルを数量に対してマッピングするものであり、同時並行的漸増系列（concurrent titration series）によって作成することができる。標準曲線は、あらゆる研究分野において、あらゆる分析測定の基盤となる。種々の親和性に基づくプローブ、例えば抗体などは、通常、異なる解離定数（KD）を有し、それ故にそれらの各々の標準曲線も異なる勾配を有する。シグナルに大きな違いがあっても、基礎となる標準曲線の勾配によっては、それが数量のわずかな違いの結果であることもあれば、大きな違いの結果であることもあるため、対応する標準曲線の知識がなければ無意味である（図1）。標準曲線はまた、シグナルを、標的とする分子の対応する絶対値数に対してマッピングしうることから絶対値測定も可能にし、さらに、単細胞内での低い基質濃度での親和性に基づくプローブの非線形的挙動の補正も可能にする。標準曲線は、複数の異なる実験からのデータポイントをまとめてプールするために必要であるが、これは技術の進展および実験手順の相違を、対応する標準曲線によって補正しうるためである。
【０００９】
重要なこととして、標準曲線は実際の測定と同時並行的でなければならず、未知のサンプルにおいて測定される関心対象の数量と同じ実験条件を経なければならないことを指摘しておく。固定されたサンプルでは、標準曲線を作成することは困難であるかまたは不可能である。例えば、固定に基づく固形組織法、例えば免疫蛍光法およびアレイトモグラフィー（Micheva and Smith, 2007, Neuron 55:25-36（非特許文献13））では、同時標準曲線の作成を行えない。固定されたサンプルでは、シグナルを見てとることだけはできるが、基礎となる数量および／または数量の違いは一般に決定不能である。
【００１０】
固定に基づく方法にはすべて、通常、元のサンプルの予測不能な分子修飾、および標準曲線の欠如という難点がある。これらの2つの大きな制約の結果として、さらにほとんどの固形組織法が固定に基づくという事実の結果として、固形組織の単細胞におけるネイティブタンパク質の数量を測定すること、またはそれを多重様式で行うことは今日まで不可能であった。また、固形組織の単細胞における代謝産物の数量を測定すること、または固形組織の単細胞における転写物を確実に多重化することも不可能であった。固形組織の単細胞における複数の分子クラス（タンパク質、転写物、代謝産物）にわたっての多重化も不可能である。
【００１１】
生物学では、情報的価値のある定性的観察を行うために、真の数量または数量の違いを測定する必要はないことが示唆されているが、現実には、単なる「シグナル」とは対照的な、正しい数量および数量の違いが、正しい定性的観察を行うためには不可欠である。図1および2は、任意の集団測定（単細胞、組織サンプルまたは患者）における部分集団の有無に関して正確な定性的観察を行う目的に、親和性に基づくプローブの同時並行的標準曲線を有することの重要性を実証している。集団全体にわたる関心対象の数量の、隠れた真の分布が同じであるならば、勾配の小さい線形的な標準曲線では、この分布はより狭く見えると考えられる。対照的に、勾配の大きい線形的な標準曲線では、この同じ隠れた真の分布はより幅広く見えると考えられる。KD値が異なり、それ故に標準曲線の勾配も異なる2種類の親和性に基づくプローブ（例えば、抗体）が、数量の点で同じ隠れた真の分布を有するならば、関心対象の数量の基礎となる真の分布は同じであるものの、2つのプローブのKD値が異なることのみに起因して、観察される分布には上記の違いが記録される。したがって、集団内に異なる数量がどの程度幅広く、またはどの程度狭く分布しているかという定性的観察は、対応する標準曲線の知識がなければ不可能である。
【００１２】
単細胞レベルでは、諸数量の数多くのタンパク質、転写物または代謝産物が少数ずつ存在し、その結果、対応する親和性に基づくプローブの標準曲線の非線形性がもたらされる可能性がある。固定により誘導される標的分子の抽出および修飾の差異も、標準曲線の非線形性をもたらす可能性がある。図2は、基礎となる未知の標準曲線が非線形的である場合に、集団測定において、部分集団の有無に関して偽定性的な観察がどのようにして起こりうるかを示している。以上を総合すると、適用される親和性に基づくプローブの同時並行的標準曲線を知らなければ、観察された定性的観察所見が正確であるか否かを知ることはできない。同時並行的標準曲線がないことが、多くの生物学的測定の再現性のなさおよび相互不一致の主な原因であることはほぼ疑いない。
【００１３】
多重化が限られることが、光学的方法の主な制約である。光スペクトルが限られると数十のシグナルを同時に分離することは不可能になり、そのため、単細胞における多変量分子機構をライブイメージング法によって測定することは困難になる。ライブイメージング法はすべて、画像化される生細胞のネイティブなシステムを本来的に擾乱させる細胞内蛍光性プローブに基づく。例えば、生きた単細胞内のタンパク質を画像化するための1つの一般的なアプローチは、GFP誘導体を関心対象のタンパク質と融合させて、その後にその結果生じた融合したタンパク質を発現させることを必要とする。この手順は、大規模な哺乳動物固形組織では現実的でない。GFP誘導体と関心対象のタンパク質との融合は、関心対象のタンパク質の機能と細胞のネイティブな状態をいずれも変化させる恐れがある（Sigal et al., 2006, Nat. Methods 3:525-531（非特許文献20）；Landgraf et al., 2012, Nat. Methods 9:480-482（非特許文献21）；Schnell et al., 2012, Nat. Methods, 3:825-831（非特許文献22））。そのような融合タンパク質の過剰発現およびそれらの二量体化はよくみられる。GFP融合タンパク質の拡散係数および速度論的パラメーターも変化する可能性が高い。このため、融合したGFPは、ネイティブタンパク質の存在量および活性をそのまま伝えるわけではない。蛍光性細胞内イオンセンサーは、細胞内蛍光性プローブが、画像化される細胞のネイティブなシステムをどのように擾乱させるかの別の例である（Yasuda et al., 2004, Sci STKE. 219: pl5（非特許文献23））。蛍光性細胞内イオンセンサーはキレート剤であり、それ故に、各々のイオン（例えばCa2+）のネイティブな濃度を変化させることによって細胞のネイティブなシステムを擾乱させる。
【００１４】
生きた固形組織に由来する単細胞構成要素を検討する方法であって、単細胞の構成要素を分析的に定められた状態または天然の状態に保持させる方法に対して、当技術分野において需要がある。本発明は、当技術分野におけるこのかなえられていない需要に応える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Waymouth, 1974 In Vitro. 10: 97-111
【非特許文献２】Engelholm et al., 1985 S.A., Spang-Thomsen, M., Brunner, N., Nohr, I. and Vindelov, L.L. (1985) Br J Cancer. 51(1): 93-98
【非特許文献３】Pallavicini, 1987 Techniques in cell cycle analysis. 139-162
【非特許文献４】Dalerba et al., 2011, Nat. Biotechnol. 29: 1120-1127
【非特許文献５】Morris et al., s2011, J. Vis. Exp. 50: pii: 2634. doi: 10.3791/2634
【非特許文献６】Fischbach et al., 2007 Nat Methods .4(10): 855-860
【非特許文献７】Bissell et al., 2001 Nat Rev Cancer 1(1):46-54
【非特許文献８】Hanahan et al., 2000 Cell. 100(1): 57-70
【非特許文献９】Gutstein et al., 2007, Expert Rev. Proteomics 4:627-637
【非特許文献１０】Espina et al., 2006, Nat. Protoc. 1:586-603
【非特許文献１１】Mouledous et al., 2002, J. Biomol. Tech. 13:258-264
【非特許文献１２】Brandtzaeg and Rognum, 1984, Histochem. Cell Biol. 81:213-219
【非特許文献１３】Micheva and Smith, 2007, Neuron 55:25-36
【非特許文献１４】Fish, 1896, Transactions of the American Microscopical Society, 17:319-330
【非特許文献１５】Schnell et al., 2012, Nat. Meth. 9: 152-158
【非特許文献１６】Melan and Sluder, 1992, J. Cell Sci. 101:731-743
【非特許文献１７】Holtfreter and Cohen, 1990, Cytometry 11:676-685
【非特許文献１８】Tanaka et al., 2010, Nat. Methods 7:865-866
【非特許文献１９】Collaud et al., 2010, J. Biomol. Tech. 21:25-28
【非特許文献２０】Sigal et al., 2006, Nat. Methods 3:525-531
【非特許文献２１】Landgraf et al., 2012, Nat. Methods 9:480-482
【非特許文献２２】Schnell et al., 2012, Nat. Methods, 3:825-831
【非特許文献２３】Yasuda et al., 2004, Sci STKE. 219: pl5
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、組織中に存在する単細胞を溶解させる方法を提供する。1つの態様において、本方法は、a）細胞を組織から同定する段階；b）界面活性剤を含有する溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間と接触させる段階；c）溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間内に、ある期間にわたって行き渡らせる段階であって、該細胞が該細胞の内側から溶解される段階；およびd）ライセートを収集する段階であって、公知のやり方で天然の状態にマッピングされる分析的に定められかつ分析的に利用可能な状態で保持されている細胞構成要素を、該ライセートが含む段階、を含む。
【００１７】
1つの態様において、本方法は組織固定および組織離解なしで行われる。
【００１８】
1つの態様において、単離された細胞は器官型培養物の中にある。
【００１９】
1つの態様において、ライセートは、吸引チャンネルを用いてライセートを吸引することによって収集される。
【００２０】
1つの態様において、吸引チャンネルは吸引用屈曲マイクロピペットである。
【００２１】
1つの態様において、収集されたライセートはニトロセルロースパッドに対してさらに適用される。
【００２２】
1つの態様においては、標準物質もニトロセルロースパッドに対して適用される。
【００２３】
1つの態様において、ライセートは分析方法を用いて評価される。
【００２４】
1つの態様において、分析方法は、質量分析法、タンパク質マイクロアレイ、RT-qPCR、RNA-Seq、およびMALDI-MSからなる群より選択される。
【００２５】
1つの態様において、細胞は生きた固形組織の一部である。
【００２６】
1つの態様において、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムである。
【００２７】
本発明はまた、組織中に存在する細胞を分析する方法も提供する。1つの態様において、本方法は、a）細胞を組織から同定する段階；b）界面活性剤を含有する溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間と接触させる段階；c）溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間内に、ある期間にわたって行き渡らせる段階であって、該細胞が該細胞の内側から溶解される段階；d）ライセートを収集する段階であって、公知のやり方で天然の状態にマッピングされる分析的に定められかつ分析的に利用可能な状態で保持されている細胞構成要素を、該ライセートが含む段階；e）収集されたライセートを固体支持体に対して適用する段階；およびf）収集されたライセートを、分析方法を用いて評価する段階、を含む。
[本発明1001]
組織中に存在する単細胞を溶解させる方法であって、
a）細胞を組織から同定する段階；
b）界面活性剤を含有する溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間と接触させる段階；
c）溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間内に、ある期間にわたって行き渡らせる段階であって、該細胞が該細胞の内側から溶解される、段階；および
d）ライセートを収集する段階であって、公知のやり方で天然の状態にマッピングされる分析的に定められかつ分析的に利用可能な状態で保持されている細胞構成要素を、該ライセートが含む、段階
を含む、方法。
[本発明1002]
組織固定および組織離解なしで行われる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
単離された細胞が器官型培養物の中にある、本発明1001の方法。
[本発明1004]
ライセートが、吸引チャンネルを用いてライセートを吸引することによって収集される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
吸引チャンネルが吸引用屈曲マイクロピペットである、本発明1004の方法。
[本発明1006]
収集されたライセートがニトロセルロースパッドにさらに適用される、本発明1001の方法。
[本発明1007]
標準物質もニトロセルロースパッドに適用される、本発明1006の方法。
[本発明1008]
ライセートが分析方法を用いて評価される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
分析方法が質量分析法、タンパク質マイクロアレイ、RT-qPCR、RNA-Seq、およびMALDI-MSからなる群より選択される、本発明1008の方法。
[本発明1010]
細胞が生きた固形組織の一部である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、本発明1001の方法。
[本発明1012]
組織中に存在する細胞を分析する方法であって
a）細胞を組織から同定する段階；
b）界面活性剤を含有する溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間と接触させる段階；
c）溶解バッファーを、同定された細胞の細胞内空間内に、ある期間にわたって行き渡らせる段階であって、該細胞が該細胞の内側から溶解される、段階；
d）ライセートを収集する段階であって、公知のやり方で天然の状態にマッピングされる分析的に定められかつ分析的に利用可能な状態で保持されている細胞構成要素を、該ライセートが含む、段階；
e）収集されたライセートを固体支持体に適用する段階；および
f）収集されたライセートを、分析方法を用いて評価する段階
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図面とあわせて読むと、さらによく理解されるであろう。本発明を例示する目的で、図面中には現時点で好ましい態様が示されている。しかし、本発明は、図面中に示された態様の正確な配置および手段に限定されないことが理解されるべきである。
【図１】種々の勾配を持つ線形的な標準曲線を描写している一連のグラフである。隠れた真の分布は一番下の列に示されている。上の列における分布は、中央の列における標準曲線を、一番下の列における隠れた真の分布に対して適用することによって得られた。親和性に基づくプローブ、例えば抗体などのKD値が異なると、プローブ濃度が同じであっても、それらの標準曲線は異なる勾配を持つことになる。標準曲線のすぐ隣の矢印は、シグナルの同じ違いが、基礎となる標準曲線の勾配に応じて、大きな数量の違いとしてマッピングされることもあれば、小さな数量の違いとしてマッピングされることもあることを指し示している。
【図２】種々の非線形的な標準曲線を描写している一連のグラフである。隠れた真の分布は一番下の列に示されている。上の列における分布は、中央の列における標準曲線を、一番下の列における隠れた真の分布に対して適用することによって得られた。標準曲線の非線形性は、親和性に基づくプローブの基質が単細胞内に極めて少量存在する場合に現れた（左側からみて1つ目のケース）。低い抗原濃度では、二価抗体は、ライセートマイクロアレイ測定では抗原結合部位によって結合される密接して配置された抗原を見いだせず、その結果、左側からみて1つ目のケースに表示された非線形性シナリオを招く可能性がある。また、固定および透過処理によっても、本明細書中の他所で考察しているように、基質の利用可能性が変化し、非線形性が誘導された可能性が高い。
【図３】制約を解決するための戦略を描写している略図である。このプラットフォームは、新たなサンプリング法（インサイドアウト溶解）、固形組織の単細胞内のネイティブタンパク質を測定するための新たな分析方法（単細胞ライセートマイクロアレイ）、ならびに固形組織の単細胞におけるネイティブな転写物および代謝産物の定量に適合する分析戦略のセットからなる。このプラットフォームにより、固形組織中の単細胞のサンプリングおよび分析のための現行の方法の制約が解決された。
【図４】図4A〜4Bで構成される図4は、器官型培養物を描写している。図4Aは、器官型培養の方法を図示したものである。組織の切離切片が多孔性膜上で培養されている。組織切片は、下方の膜から毛管作用によって栄養分を取り込んだ（Stoppini et al.,1991, J Neurosci Methods. 37(2): 173-182より）。図4Bは、マウス海馬の器官型培養が成功した一例を描写している写真である（GAD67-GFP系統、出生後第6日＋インビトロで14日）。
【図５】SDSの相図を描写している説明図である。SDS溶液はpH 7.4に保たれ、0.1M NaClおよび0.05Mリン酸ナトリウムを含有した。臨界ミセル温度はCMTと表記されている。SDSの臨界ミセル濃度はCMCと表記されている（Helenius and Simons, 1975, Biochim Biophys. Acta 415:29-79より）。
【図６】界面活性剤に基づく溶解の単純化モデルを描写している説明図である。膜可溶化を誘導するためには、CMC値よりも高い濃度が必要な可能性がある。また、膜可溶化の程度は、膜の組成および膜に組み込まれた界面活性剤モノマーの数に依存する。
【図７】生きた固形組織中の単細胞のインサイドアウト溶解を描写している説明図である。上の図は、インサイドアウト溶解の概念をまとめている。下のフレームでは、SDS含有溶解バッファーをSR101と混合した。吸引は適用しなかった。マウス海馬の器官型培養物が表示されている（GAD67-GFP系統、出生後第6日＋インビトロで7日）。いずれの場合にも、溶解バッファーの送達は、人力を投入することなくロボット制御によって実現した。下から2つ目の細胞は表面積が小さく、適用された溶解バッファーは隣接する暗色細胞に、その中に流れ込むことによって入ったことが観察された。送達の単細胞分解能は、他のいずれの場合にも正確であった（図32も参照されたい）。右下のフレームは、上の細胞（4つ目の細胞）への溶解バッファーの送達の開始も示している。
【図８】可溶性タンパク質の急速な変性を描写している説明図である。これは図7におけるものと同じ実験である。GFP蛍光は、SDS含有溶解バッファーが各標的細胞の細胞内空間に入るとすぐに減少した。GFP蛍光のこの減少中に、SR101色素は標的細胞の幾何学的境界の内部に厳密に保たれており（細胞2を例外として）、このことは膜障壁が溶解バッファーの送達時点からGFP蛍光消失時点までインタクトであったことを意味する。吸引は適用しなかった。このため、GFP蛍光の減少は細胞内GFPの変性を表している。ここで、溶解バッファーの送達は人力を投入することなくすべてロボット制御によって行った。それぞれの場合に適用した溶解バッファーの量は同じであった。第2の細胞（SR101を溶解バッファーと混合）の線は、第1の細胞への送達が開始した時点で出っ張りを示しているが、これは対物レンズの下にある送達用ピペットの蛍光のためである。溶解バッファーの流れは組織表面に対して垂直であった。
【図９】培養海馬切片（GAD67-GFP、P4＋5DIV）の種々の領域のセットにおける、完全に自動化された逐次的な溶解バッファー送達を描写している一連の写真である。溶解バッファーを、3つの異なる海馬領域内の細胞15個に対して、完全に自動化された様式で200秒の期間内に送達した（自動化された溶解バッファーの送達は、画像化の開始から40秒後に誘発させた）。画像化される区域は、その区域内での切片表面の平坦性を確保する目的で、隔壁によって制限した。各領域について、3種の画像を表示している：1）溶解プロセスを誘発する前に取得した画像、2）画像分割後の同じ画像、3）溶解バッファー送達プロセスの時点でその特定領域において取得した画像。
【図１０】溶解バッファー送達中の細胞膜の増大を描写している一連の写真である。LBは溶解バッファーのことである。SDSを、溶解バッファーの限局的な流れによって単細胞に対して送達した。GFPは変性し、各標的細胞の膜が同時に増大した。Alexa 555色素は、GFP変性中および膜の増大中に、標的細胞の幾何学的境界の内部にとどまった。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、このことは、膜障壁が、溶解バッファーの送達時点から、GFP変性の時相全体にわたって、膜の高度な増大時点までインタクトであったことを示唆する。図32も参照されたい。
【図１１】標的細胞の膜の部分的かつ緩徐な可溶化を描写している写真である。より少量のSDS含有溶解バッファーを、その後のライセート取り込みを行わずに（吸引なしで）適用した。SR101色素は、30分間（上の画像）または11分間（下の画像）の待機時間後に、単細胞の幾何学的境界よりも外に緩徐に拡散したことが観察された。残った蛍光性領域は、部分的膜可溶化の後の膜パッチと推定される。上の画像は、GAD67-GFP切片（P4＋4DIV）において20倍対物レンズで取得した。下の画像は、GAD67-GFP切片（P4＋6DIV）において40倍対物レンズで取得した。
【図１２】生きた固形組織におけるインサイドアウト溶解による単細胞膜の完全かつ急速な可溶化を描写している一連の写真である。矢印は、GINマウスの海馬器官型切片におけるGFP発現性標的細胞（ソマトスタチン介在ニューロン）を示している。最初に、少量の溶解バッファー（ここではAlexa 555Dを可視化のために用いた）を適用したところ、細胞膜はインタクトであったが、これはおそらく、適用された溶解バッファーの限局的進入点が封止されたためであろう。膜が内側から完全に可溶化されるまで、溶解バッファーをさらに連続して適用した。ライセートは、垂直に同時毛管作用による吸引によって取り込まれた。送達用マイクロピペットは屈曲せず、溶解バッファーの送達は垂直ではなくある角度で行われた。
【図１３】図13A〜13Bで構成される図13は、ガラスにマウントした（glass-mounted）ニトロセルロースパッド上への単細胞ライセートのプリンティングを描写している。図13Aは、単細胞ライセートのタンパク質をニトロセルロース上の20〜60μmスポット内で濃化する方法を描写している一連の画像である。右側のフレームは、溶媒拡延の程度を示している。しかし、単細胞ライセート区分のタンパク質は、プリンティングのために用いられるマイクロピペットの真下の非常に小さな領域内で濃化された。同じマイクロピペットを、インサイドアウト溶解における毛管作用による吸引のためにも用いた。図13Bは、同じ単一のGFP発現性ソマトスタチン介在ニューロン（GINマウスの器官型海馬切片）からの、およそ50μmのスポットを描写している一連の画像である。スポットは、ニトロセルロースパッド上に隣り合わせてプリントした（スポット毎に10個の付着物）。対応するベースラインスポットも、同じニトロセルロースパッド上にプリントした（スポット毎に10個の付着物）。抗体インキュベーションの前にはシグナルは全くなかった。予想された通り、抗体インキュベーション後にはライセートスポットでのみシグナルがみられた。低解像度フレームにおけるバーは42μmである。
【図１４】インサイドアウト溶解の検証を描写している一連の説明図である。GINマウスの同じ切片中で、2つの細胞を溶解させた。1つの細胞はGFPを発現し（ソマトスタチン介在ニューロン）、もう1つの細胞はGFPを発現しなかった（CA3錐体ニューロン）。同時並行の陰性対照は陰性であった。同時並行の陽性対照は陽性であった。各単細胞のライセート区分全体を、それぞれ3つずつのライセートスポットとしてプリントした。各単細胞のライセートスポットは、予想されたシグナル分布を示した。ベースラインスポットは陰性であった。これらの結果は、この実験において各細胞のライセート区分が3つの下位区分に細分されたことから、単細胞ライセートの下位区分の使用に成功したことを実証している。
【図１５】本発明の細胞サンプリングおよびプリンティングの設備を描写している一連の画像である。
【図１６】ライセートマイクロアレイの形式における抗体の2つの考えられるカテゴリーを描写している説明図である。ウエスタンブロット法とは対照的に、ライセートマイクロアレイではタンパク質はサイズによっては分離されない。その結果として、最適な結合確率を有し（左側から2つ目のケース）、それ故に交差反応性が一様に低い抗体が必要になる。このカテゴリーにある抗体のセットがひとたび検証されれば、分析用タンパク質測定を、未知のサンプルにおいてライセートマイクロアレイで実現することができる。
【図１７】ライセートマイクロアレイの分析上の厳密性とランタニド標識の多重化能を組み合わせた単細胞ライセートマイクロアレイを描写している一連のグラフである。
【図１８】さらなる抗体検証を描写している一連の写真である。17種のヒト細胞株にわたってライセートマイクロアレイにおけるシグナル分布をウエスタンブロット法における対応するシグナル分布と比較することによって、ライセートマイクロアレイに関してあらかじめ検証された各pan特異的抗体は、GINマウス海馬の平均的ライセートに対して行ったウエスタンブロット法において単一の顕性バンドをもたらした。GINマウスは、後の実験に用いたGINマウスと同じ齢数のものであった。PKCδ、PKCα、PAK1およびβ-カテニンのブロットにおける第2のバンドは、β-アクチン一次抗体に対する二次抗体の蛍光によるものであった。
【図１９】図19A〜19Cで構成される図19は、単細胞ライセートマイクロアレイのデータを描写している。上の区画において、a555はAlexa 555のことである。図19Aは、単細胞ライセートマイクロアレイのデータを描写している一連のグラフである。図19Bは、単細胞ライセートマイクロアレイのデータを描写している一連のグラフである。図19Cは、単細胞ライセートマイクロアレイのデータを描写している一連のグラフである。得られた単細胞ライセートおよびそれらのベースラインを、本明細書中の他所に記載したようにニトロセルロースパッド上にプリントしたが、下位区分は行わなかった。積算値を図20に描写している。
【図２０】図19における測定の積算LA-ICP-MS計数値を描写している説明図である。細胞1〜4では、ベースラインスポットの時間積算強度（170番目のフレームから370番目のフレームまで）を、単細胞ライセートスポットの時間積算強度（170番目のフレームから370番目のフレームまで）から差し引いた。細胞5および6では、ベースラインのプリンティングが完全には成功しておらず、積算装置ノイズのみを、ベースラインスポットおよびライセートスポットの両方にわたる総積算強度から差し引いた。すべての単細胞にわたっての各チャンネルにおける最大値に、値1.0を割り当てた。平均的海馬ライセートの漸増系列上の1つのスポットの測定も含めている。
【図２１】標準曲線を明らかにした同時並行的PKCδおよびPKCα漸増系列を描写している一連のグラフである。PKCδおよびPKCαの漸増系列を、ガラスにマウントした同じニトロセルロースパッド上にプリントし、その上に図19中の単細胞ライセートもプリントして測定した。漸増系列はすべて、高精度Aushon Arrayerによってプリントした。この線は、単細胞ライセートスポットにおけるPKCδおよびPKCαの記録シグナルが収まったダイナミックレンジを描いている（図19との比較で）。標準曲線の非線形性のために、いかなる単細胞測定においても、そのような同時並行的標準物質を含めることが必要になる（図2）。
【図２２】図22A〜22Bで構成される図22は、GFP漸増系列および測定による結果を描写している。図22Aは、高精度Aushon Arrayer 2470によってプリントされた同一の漸増系列（同じ4つのスポット）を描写している一連のグラフであり、各GFP抗体について勾配の異なる2つの標準曲線を明らかにしている。両方のGFP抗体を、合計8種の抗体混合物として同時に適用した。ランタニド結合体化手順は各GFP抗体に関して同じであり、かついずれのGFP抗体の濃度もインキュベーション手順において同じであったことから、勾配のこの違いは、2種のGFP抗体の対応するKD値の違いをパラメーターとして表示していると考えられる。図22Bは、図19のサンプリングを行ったすべての単細胞にわたる、インビボGFP蛍光と単細胞ライセートマイクロアレイにおける測定GFPレベルとの間のほぼ完全な相関を描写している一連のグラフである。2つの暗色CA3ニューロンが、最も下にある2つのデータポイントによって表されている。4つのGFP発現性ソマトスタチン介在ニューロンは、他の4つのデータポイントによって表されている。図22AにおけるGFP漸増系列は、図22Bにおける単細胞ライセートと同じニトロセルロースパッド上にプリントされた。この場合も、漸増系列はすべて、高精度Aushon Arrayer 2470によってプリントされた。すべての単細胞ライセートおよび対応するベースラインが、下位区分を行うことなく、本明細書中の他所に記載したようにプリントされた。
【図２３−１】Bayes Netトポロジーを描写している一連の説明図である。複雑度が徐々に増している8種のBayes Netトポロジー、および対応する公式的数学表現を描写している。
【図２３−２】Bayes Netトポロジーを描写している一連の説明図である。複雑度が徐々に増している8種のBayes Netトポロジー、および対応する公式的数学表現を描写している。
【図２４】最適なLearner（Bayes Netトポロジー＋MLパラメーター推定）の選択を描写しているグラフである。112個のデータポイントからなる次元数10のデータセットに対して各Learnerによる10倍交差検証を実行することによって、最適なLearnerをLearnerのセットから選択した。10回の交差検証の実行のそれぞれにおいて、訓練セットをLearner関数への入力として用い、その結果得られたBayes Netモデルを用いて、試験セットおよび訓練セットにおける分類精度を算出した。この手順を10回の交差検証の実行を通じて行い、平均した癌分類精度を図中に表示している。10倍交差検証を、各Learnerを用いて行った。最適なLearnerはAXL＋MET＋AKTであった。最も単純なトポロジーのNaive Bayesは良好な成績であったが、AXL＋MET＋AKTよりもかなり劣っていた。Bayes Netトポロジーの複雑度をAXL＋MET＋AKTの複雑度よりも高めたところ、仮説空間の拡張は最適以下となり、それ故に過剰適合となった。
【図２５】条件付けの追加が、どのようにして、より優れた試験セットの分類を導くかを描写している一連のグラフである。Met.pデータのより優れた分離は、AxlおよびCancer確率変数に対する条件付けによって達成された。Axlに対する条件付けがない場合、Met.pの分布は癌＝真および癌＝偽の両方とも同様であった。Axlに対する条件付けの追加は、Axl＝高、癌＝偽という条件付けを行った場合とAxl＝高、癌＝真という条件付けを行った場合で、Met.pの異なる条件付き分布を導いた。この相違により、図24におけるMET＋AKTモデルと比較して、AXL＋MET＋AKTモデルにわたってより優れた平均分類精度が可能になった。線は、データの二値化のために用いた中央値である。
【図２６】インサイドアウト溶解に関する枠組みおよび界面活性剤濃度間の関係を描写している説明図である。界面活性剤の頭部基電荷および炭化水素鎖長とCMCおよびミセルサイズとの間の関係は他の生物物理学研究において確立されており、本発明者らのインサイドアウト溶解モデルのパラメーター化のための基盤となる。
【図２７】タンパク質変性／細胞均質化および膜障壁の破壊と、その後のライセート取り込みの経時的推移を描写している一連のグラフである。
【図２８】細胞体および近位樹状突起からのライセート取り込みを描写している一連のグラフである。
【図２９】自動化実験設備における、溶解産物（ライセート）の取り込みとニトロセルロースパッド上へのライセートの付着との間の高速切り換えを描写している写真である。
【図３０】溶解可視化手順と分析手順との分離を描写している一連の写真である。シグナル検出のために光学的方法を用いる場合には、単細胞分解能を確保し、かつ細胞形態を記録する（標的細胞が蛍光性でない場合）ために必要なインサイドアウト溶解（サンプリング）の可視化は、光学的シグナル検出と干渉すべきではない。ニトロセルロース上へのライセートのプリンティング後に洗い流すことができる色素を同定する目的で、種々の蛍光性色素（SR101、Alexa 568デキストラン（MW 10,000）、Alexa 555（MW 10,000））を試みた。いずれの色素についても、インサイドアウト溶解のために十分な可視化能が得られた。種々の色素を、溶解バッファー（Tris・HCl（50mM）、SDS（2％）、グリセロール（5％）、NaF（1mM））と混合した。また、7.4M尿素も色素含有溶解バッファーに添加した。別の場合には、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を各色素と混合した。全体として、この例からは、上記のAlexa色素とは対照的に、SR101は、ニトロセルロースから洗い流すことが困難であるため、光学的溶解後シグナル検出のためには不適であることが実証された。シグナル検出を非光学的方法（LA-ICP-MSなど）によって実現する場合には、サンプリング可視化のために用いられる蛍光性色素を洗い流せるかどうかは問題にならないはずである。
【図３１】細胞における限局的進入点の証拠を描写している一連の写真である。これらの画像は、インサイドアウト溶解後の残留色素分子（溶解バッファー）および残留膜断片を可視化するために、極めて高度の露出を用いて獲得した。
【図３２】インサイドアウト溶解の溶解バッファー送達の段階で、隣接する2つの暗色細胞がいかにして可視的な影響を受けないかを描写している一連の写真である。左側の画像は、切片（GAD67-GFP系統、出生後第6日＋インビトロで7日）におけるGFP分布の詳細を捉える目的で、インサイドアウト溶解の前に高度露出を用いて取得した。右側の2つの画像は、図7および8に示された第1の細胞のインサイドアウト溶解プロセスと同じ時点に対応する。右側の上の画像はGFPフレームである。右側の下の画像はSR101フレームであり、標的細胞に対するSR101含有性溶解バッファーの送達を示している。右側の下の画像の左上の隅にある明るい背景部分は、送達用マイクロピペットによる蛍光である。2つの暗色細胞（矢印）は、標的GFP発現性ニューロンの細胞体の隣および尖端樹状突起の隣に観察される。限局的な溶解バッファー送達点は文字Dによって表されている。SR101色素は標的細胞の幾何学的境界内に厳密に含まれ、膜の高度な増大後にも隣接する2つの暗色細胞内には入らなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、固形組織から単細胞ライセートをサンプリングして評価する能力を提供するための、溶解技術および分析技術ならびに分析戦略の開発に関する。1つの態様において、本発明は、異なる分析方法と連携させることによって、単細胞ライセートの入手およびライセートの分析を可能にするサンプリング手順を含む。好ましくは、分析方法はライセートの形式に基づく。例えば、分析方法には、固体支持体法（例えば、マイクロアレイ、MALDI）、非固体支持体法（例えば、qPCR、またはサンプルの直接導入を伴う他の質量分析様式）などが非限定的に含まれる。
【００３０】
本発明の1つの利点は、溶解プロトコールが、すべての細胞分子を、公知のやり方で天然の状態にマッピングされる分析的に定められかつ分析的に利用可能な状態に保全し、それにより、細胞分子のより正確でかつ高度に多重的な測定を、それらが細胞内に存在する形で可能にすることである。1つの態様において、本発明は、単細胞からの細胞分子を分析するための方法であって、1）単細胞を溶解させる段階（例えば、溶解段階）、2）ライセートを固体支持体に対して適用する段階（例えば、プリンティング段階）、および3）ライセートを所望の技術を用いて分析する段階（例えば、分析段階）を含む方法を提供する。
【００３１】
本発明の方法はまた、公知のやり方で細胞内の天然の状態にマッピングされる分析的に定められかつ分析的に利用可能な分子の状態を保全した上での、固形組織中に埋め込まれた単細胞からのライセートの単離も可能にし、それ故に、組織サンプル中の標的単細胞の、質量分析法、ライセートマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、RT-qPCR、RNA-Seq、LA-ICP-MS、MALDI-MSなどを非限定的に含む分析方法を用いて評価しうる形式への転換も可能にする。
【００３２】
1つの態様において、本発明は、1）界面活性剤を含有する溶解バッファーの、細胞膜における限局的進入点を経由しての、標的細胞の細胞内空間への進入を容易にすること、2）溶解バッファーが細胞内空間全体に行き渡ることを可能にすること、3）標的細胞を内側から溶解させ、それ故に生きた組織の複雑な環境内であらゆる形状の標的細胞の溶解に関して考えられる最も高度な単細胞分解能を提供すること、を含む、「インサイドアウト溶解」プラットフォームを提供する。この溶解技術の重点は、先行技術の方法と比較してより優れた空間分解能を可能にする、溶解プロセスの通常とは異なる方向性にある。本発明の「インサイドアウト溶解」法は、ライセートの中の単細胞の天然の状態を公知のやり方で保持し、それを続いて種々の分析方法を用いて検討することができる。本発明の方法はまた、界面活性剤に基づく溶解の技術的利点を取り入れることにより、RNA転写物、タンパク質および代謝産物も保持する。
【００３３】
したがって、本明細書に記載の本発明は、細胞内の分子を、細胞内のそれらの天然の状態に公知のやり方でマッピングされる分析的に定められかつ分析的に利用可能な状態に保持しながら、固形組織に由来する単細胞を溶解させるための新たな方法に関する。本方法は、標的細胞を内側から溶解させ、それ故に生きた組織の複雑な環境内であらゆる形状の標的細胞の溶解に関して考えられる最も高度な単細胞分解能を提供し、かつライセートを収集する、溶解段階を含む。1つの態様において、標的細胞は器官型培養物の中に包含される。1つの態様において、ライセートは、吸引チャンネルを用いて系からライセートを吸引することによって収集される。1つの態様において、本方法は、ライセートを固体支持体（例えば、ガラスにマウントしたニトロセルロースパッド）に対して適用する段階を含むプリンティング方法を含む。1つの態様において、本方法は、プリントされたライセートを分析測定を用いて評価する段階を含む。
【００３４】
本明細書に記載の本発明はまた、本明細書に開示された溶解方法の産物を分析する、多重分析プラットフォームのための新たな分析方法にも関する。1つの態様において、本方法は、ネイティブタンパク質の多重化分析測定のための分析方法を含む。1つの態様において、本方法は、抗体の混合物を、固体支持体（例えば、ニトロセルロース）上にプリントされるかまたは他の様式でスポット化されたライセートに対して適用する段階を含む。別の態様において、抗体はランタニド金属と結合体化される。別の態様において、本方法は、単細胞ライセートにおける転写物および代謝産物の多重測定に適合する分析戦略のセットを含む。
【００３５】
本発明はまた、タンパク質、転写物および／または代謝産物を一度に測定するための方法も提供する。同時並行的標準曲線をすべての測定において決定し、そのシグナルを、評価されるタンパク質、転写物および／または代謝産物の対応する数量に対してマッピングすることができる。
【００３６】
定義
別に定める場合を除き、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または同等のあらゆる方法および材料を本発明の実施または検査に用いうるが、好ましい方法および材料が記載されている。
【００３７】
本明細書で用いる場合、以下の用語はそれぞれ、この項においてそれに付随している意味を有する。
【００３８】
冠詞「1つの（a）」および「1つの（an）」は、本明細書において、その冠詞の1つまたは複数の（すなわち、少なくとも1つの）文法的目的語を指して用いられる。一例を挙げると、「1つの要素（an element）」は1つの要素または複数の要素を意味する。
【００３９】
「約」は、量、継続時間などの測定可能な値に言及して本明細書で用いられる場合、所定の値から±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、さらになお好ましくは±0.1％のばらつきを範囲に含むことを意味しており、これはそのようなばらつきは開示された方法を行うのに適切であるためである。
【００４０】
「異常な」という用語は、生物、組織、細胞またはそれらの構成要素に関連して用いられる場合、少なくとも1つの観察可能または検出可能な特徴（例えば、年齢、治療、時刻など）の点で、「正常な」（予想される）各々の特徴を呈する生物、組織、細胞またはそれらの構成要素とは異なる、そのような生物、組織、細胞またはそれらの構成要素のことを指す。1つの細胞型または組織型にとって正常であるかまたは予想される特徴は、異なる細胞型または組織型にとっては異常であることがある。
【００４１】
「分析物」とは、本明細書で用いる場合、分析を受ける任意の物質または化学成分のことを指す。例えば、「分析物」は、それらの複合体および断片イオンを含む、任意の原子および／または分子を指すことができる。この用語は単一の構成要素を指してもよく、または構成要素のセットを指してもよい。生体分子／高分子の場合、そのような分析物には以下のものが非限定的に含まれる：ポリペプチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、抗体、DNA、RNA、糖質、ステロイド、および脂質、ならびにそれらの任意の検出可能部分、例えば、免疫学的検出可能断片。
【００４２】
「アッセイ」、「アッセイすること」または類似の用語は、例えば、存在、欠如、数量、程度、速度論、動力学、またはリガンド候補化合物もしくはウイルス粒子もしくは病原体といった外因性刺激による刺激を受けた際の細胞の応答のタイプを判定するための分析のことを指す。
【００４３】
「バイオセンサー」または類似の用語は、生物学的構成要素を物理化学的検出器構成要素と組み合わせた、分析物の検出のためのデバイスのことを指す。バイオセンサーは典型的には3つの部分からなる：生物学的構成要素または要素（組織、微生物、病原体、細胞、またはそれらの組み合わせなど）、検出器要素（光学的、圧電的、電気化学的、温度測定的、または磁気的といった物理化学的様式で作動する）、および両方の構成要素に付随する変換器。生物学的構成要素または要素は、例えば、生きた細胞、病原体、またはそれらの組み合わせである。諸態様において、光学的バイオセンサーは、生きた細胞、病原体、またはそれらの組み合わせにおける分子認識イベントまたは分子刺激イベントを、定量化しうるシグナルに変換するための光学的変換器を含みうる。
【００４４】
「細胞」または類似の用語は、半透性膜によって外側が囲まれ、任意で1つまたは複数の核およびさまざまな他のオルガネラを含み、単独でまたは他の類似の塊と相互作用して生命の基本的機能のすべてを遂行することができ、独立して機能する生命体の最小構造単位を形成する、合成細胞構築物、細胞モデル系、および類似の人工細胞システムを含む、原形質の小さな、通常は微視的な塊のことを指す。
【００４５】
「細胞システム」または類似の用語は、互いに相互作用して、そうすることで生物学的または生理学的または病態生理学的機能を遂行する、複数の種類の細胞（または単一の種類の細胞の分化形態）の集成物のことを指す。そのような細胞システムには、器官、組織、幹細胞、分化細胞、または類似のものが含まれる。
【００４６】
本明細書で用いる場合、「細胞成分」という用語は、例えば典型的には生物学的実験で当業者によって測定される、個々の遺伝子、タンパク質、mRNA、RNA、および／または他のあらゆるさまざまな細胞構成要素もしくはタンパク質活性、タンパク質修飾（例えば、リン酸化）の度合いを含む。
【００４７】
「疾患」とは、動物が恒常性を維持することができず、その疾患が改善しなければ動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態のことである。
【００４８】
対照的に、動物における「障害」とは、動物が恒常性を維持することはできるが、動物の健康状態が、障害がない場合で考えられるよりも不都合である健康状態のことである。治療されないままであっても、障害は必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
【００４９】
疾患または障害は、疾患または障害の症状の重症度、そのような症状が患者によって経験される頻度、またはその両方が低下するならば「改善している」。
【００５０】
化合物の「有効量」または「治療的有効量」とは、化合物が投与される対象に対して有益な効果をもたらすのに十分な、化合物の量のことである。送達媒体の「有効量」とは、化合物と有効に結合するかまたは化合物を送達するのに十分な量のことである。
【００５１】
本明細書で用いる場合、「使用説明用の材料」には、本明細書中に挙げたさまざまな疾患または障害の改善を生じさせるためのキット中の本発明の化合物、組成物、ベクターまたは送達システムの有用性を伝えるために用いうる、刊行物、記録、流れ図、または他の任意の表現媒体が含まれる。任意でまたは代替的に、使用説明用の材料は、哺乳動物の細胞または組織における疾患または障害を改善させる、1つまたは複数の方法を記載することもできる。本発明のキットの使用説明用の材料は、例えば、本発明の同定された化合物、組成物、ベクター、もしくは送達システムを含有する容器に固定することもでき、または同定された化合物、組成物、ベクター、もしくは送達システムを含有する容器と一緒に出荷することもできる。または、使用説明用の材料と化合物が受取人によって共同で用いられることを意図して、使用説明用の材料を容器とは別々に出荷することもできる。
【００５２】
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は本明細書において互換的に用いられ、本明細書に記載の方法の適用対象となる、任意の動物、またはインビトロもしくはインサイチューの別を問わないその細胞のことを指す。ある非限定的な態様において、患者、対象または個体はヒトである。
【００５３】
「治療的」処置とは、病態の徴候を呈する対象に対して、そのような徴候を減じさせるかまたは消失させる目的で与えられる処置のことである。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「疾患または障害を治療すること」とは、疾患または障害の症状が患者によって経験される頻度を低下させることを意味する。疾患および障害は、本明細書において互換的に用いられる。
【００５５】
「治療的有効量」という語句は、本明細書で用いる場合、疾患または病状を、そのような疾患の症状を改善することを含め、予防または治療する（その発生を遅らせるかもしくは防止する、その進行を防止する、それを阻害する、減少させる、または好転させる）のに十分であるかまたは有効な量のことを指す。
【００５６】
範囲：本開示の全体を通じて、本発明のさまざまな局面を、範囲形式で提示することができる。範囲形式による記載は、単に便宜上および簡潔さのためであって、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定とみなされるべきではないことが理解されるべきである。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内にあるすべての可能な部分的範囲とともに、個々の数値も具体的に開示されていると考慮されるべきである。例えば、1から6までなどの範囲の記載は、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までなどの部分的範囲とともに、その範囲内にある個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6も、具体的に開示されていると考慮されるべきである。これは範囲の幅広さとは関係なく適用される。
【００５７】
説明
ポストゲノム時代における最大の課題の1つは、複雑な生きた組織から、および複雑な組織全般から得られた単細胞ライセート中の転写物、代謝産物、タンパク質、ならびに種々のタンパク質の翻訳後修飾状態を、高い空間的および時間的分解能で確実に分析することのできる方法の開発である。
【００５８】
本発明は、すべての細胞分子を、公知のやり方で天然の状態にマッピングされる分析的に定められかつ分析的に利用可能な状態に保持しながら、生きた固形組織からの単細胞ライセートのサンプリングおよび評価を行う能力を提供するための、マイクロ溶解技術および分析技術ならびに分析戦略の開発に関する。1つの態様において、本発明は、単細胞からの細胞分子を分析するための方法であって、1）単細胞を溶解させる段階（例えば、サンプリング）、2）ライセートを固体支持体に対して適用する段階（例えば、プリンティング）、および3）ライセートを所望の技術を用いて分析する段階、を含む方法を提供する。
【００５９】
したがって、本発明は、生理学的に意味のある複雑な生きた組織に由来する単細胞ライセートに対するプロテオミクス研究を可能にする組成物および方法を提供する。しかし、本発明はプロテオミクス研究のみに限定されるとみなされるべきではない。そうではなくて、単細胞ライセートは、核酸、ポリペプチドおよびあらゆる代謝産物を評価するためのあらゆるアッセイに用いることができる。すなわち、単細胞ライセートが得られ、本発明による固体支持体上にプリントされた後に、「標識-標識検出法」のペア、例えば「ランタニド標識-LA-ICP-MS検出」ペアを用いることによって、サンプル細分化を伴わずに1つの単一スポット中でのタンパク質の多重化が行われる。場合によっては、本発明の方法は、細胞に基づくアッセイ、タンパク質に基づくアッセイ、およびDNAに基づくアッセイの使用を含む。1つの態様において、そのような技術が本発明のライセートを分析するために適用される場合には、それから得られた結果は、単細胞内に表されている細胞構成要素の天然の状態を描写している。
【００６０】
1つの態様において、本発明は、公知のやり方で天然の状態にマッピングされる分析的に定められかつ分析的に利用可能な状態で保持されているすべてのクラスの分子の細胞分子を含む、生きた固形組織中にある単細胞を溶解させたライセートを提供する「インサイドアウト溶解」方法を含む。細胞または組織を可溶化／解離溶液中に浸漬させ従って当技術分野の方法の可溶化／解離プロセスの方向性が外側からである、当技術分野における一般的なやり方とは、本発明の「インサイドアウト溶解」方法は逆である。本発明のインサイドアウト溶解法のより詳細な考察については、本明細書中の他所で考察している。
【００６１】
別の態様において、本発明は、単細胞ライセート中に存在するネイティブタンパク質の多重化分析測定のための分析方法を提供する。この方法を本明細書では「単細胞ライセートマイクロアレイ」と称する。本発明の単細胞ライセートマイクロアレイ法のより詳細な考察は、本明細書中の他所にある。1つの態様において、本方法は、単細胞ライセートにおける転写物および代謝産物の多重測定に適合する分析戦略のセットを提供する。
【００６２】
溶解段階
本発明は、本明細書において単細胞ライセートと称する、単細胞由来のライセートを得るための方法を提供する。1つの態様において、単細胞ライセートは小体積（例えば、約10nl）である。単細胞のライセート形式を、ライセートの形式に基づく種々の分析方法と連携させることによって利用することができる。
【００６３】
1つの態様において、本発明は、組織、好ましくは固形組織、より好ましくは生きた固形組織中に埋め込まれている単細胞を溶解させる方法を提供する。1つの態様において、本発明は、ライセートをあらゆる所望の分析方法を用いてさらに分析することができる、組織サンプル由来の単細胞を溶解させるための「インサイドアウト溶解」プラットフォームを提供する。例えば、単細胞を本発明の「インサイドアウト溶解」法に従って溶解させ、その後に固体支持体上へのライセートのプリンティングまたは他の様式でのスポット化を行って、プリントされたライセートを所望のプロトコールを用いて分析する。
【００６４】
1つの態様において、本発明の溶解法は、界面活性剤に基づく単細胞溶解バッファーを使用する。界面活性剤に基づく溶解バッファーを用いることが固定方法を上回る利点の1つは、ライセート中のタンパク質の状態が分析的に定められることである。例えば、SDS溶解バッファーはタンパク質を変性させてそれらの活性を失活させるが、一方、NP40はタンパク質を変性させない。いずれの場合にも、タンパク質の状態は判明しているが、これは分子に及ぼす溶解バッファーの影響が判明しており、そのために（固定方法とは異なって）状態が分析的に定められるためである。また、本発明の溶解プロトコールを用いて、すべての分子が分析的に利用可能となる（固定方法とは異なって）。
【００６５】
界面活性剤は両親媒性分子であり、このことはそれらが脂肪族または芳香族の特徴を有する非極性「尾部」と、極性「頭部」との両方を含有することを意味する。極性頭部基のイオン的特徴は、界面活性剤を広く分類するための基盤となる；それらはイオン性であってもよく（陰イオン性または陽イオン性のいずれかに荷電）、非イオン性（非荷電）または両性イオン性（正荷電基および負荷電基の両方を有するが正味の荷電はゼロ）であってもよい。いずれにしても、界面活性剤分子は、膜タンパク質の抽出および可溶化を含め、非水溶性疎水性化合物の水性媒質中への分散（混和）を可能にする。ミセル毎の界面活性剤モノマーの数（凝集数）、およびそれを上回るとミセルが形成される界面活性剤濃度の範囲（臨界ミセル濃度、CMCと呼ばれる）は、それぞれの特定の界面活性剤に関して特異的な特性である。
【００６６】
1つの態様において、溶解方法は、以下の一続きのイベントを含む：1）界面活性剤を含有する溶解バッファーが、細胞膜における限局的進入点を経由して、標的細胞の細胞内空間に入る、2）溶解バッファーが細胞内空間全体に行き渡る、3）および標的細胞を内側から溶解させ、それ故に生きた組織の複雑な環境内であらゆる形状の標的細胞の溶解に関して考えられる最も高度な単細胞分解能を可能にする。
【００６７】
したがって、本明細書に記載の本発明は、すべての細胞分子を、公知のやり方で天然の状態にマッピングされる分析的に定められかつ分析的に利用可能な状態に保持しながら、固形組織に由来する単細胞を溶解させるための新たな方法を提供する。本方法は、界面活性剤を含有する溶解バッファーを、細胞膜における限局的進入点を経由して、システム内の標的細胞の細胞内空間に添加する段階、溶解バッファーを、標的細胞の細胞内空間全体にわたり、ある期間にわたって行き渡らせる段階であって、標的細胞を内側から溶解させ、それ故に生きた組織の複雑な環境内であらゆる形状の標的細胞の溶解に関して考えられる最も高度な単細胞分解能を提供する段階、およびライセートを収集する段階を含む、溶解段階を含む。1つの態様において、標的細胞は、器官型培養物の中に包含される。
【００６８】
1つの態様において、界面活性剤を含有する溶解バッファーの限局的な定方向流を、生組織中の標的細胞の細胞体に対して適用する。好ましくは、用いられる界面活性剤の濃度は、その臨界ミセル濃度（CMC）値を上回る。この特性により、適用された溶解バッファーが、組織中の隣接細胞に漏れ出さずに細胞内空間に入ることが可能になる。細胞の内側では、界面活性剤はそのCMC値よりも低い濃度値に希釈されて、溶解バッファーがインタクトな細胞内空間に蓄積して、その複雑な周囲組織に影響を及ぼすことなく、標的細胞の複雑な形状の全体を通じて拡散および／または流動することが可能になる。ひとたび十分な溶解バッファーが標的細胞の内側に蓄積し、界面活性剤濃度がその臨界値に再び近づくと、細胞膜は内側から溶解され、ライセートが直ちに希釈されて、近傍の吸引チャンネルによって取り込まれる。1つの態様においては、標的細胞の膜障壁がひとたび破壊された際に他の細胞に影響を及ぼさないように、ライセートが直ちに希釈されることが好ましい。このように、インサイドアウト溶解方法は、複雑な固形組織中のあらゆる形状の単一の生細胞を、すべてのクラスの分子が保持されている混在型ライセート溶液に変換することができる。
【００６９】
1つの態様において、得られる単細胞ライセートの体積はおよそ1〜500nL、好ましくは2〜250nL、より好ましくは3〜100nL、より好ましくは4〜50nL、および最も好ましくは5〜10nLである。
【００７０】
1つの態様において、界面活性剤に基づく単細胞溶解バッファーは、N-オクチル-β-D-グルコピラノシド、N-オクチル-β-D-マルトシド、ZWITTERGENT 3.14、デオキシコール酸塩；n-ドデカノイルスクロース；n-ドデシル-β-D-グルコピラノシド；n-ドデシル-β-D-マルトシド；n-オクチル-β-D-グルコピラノシド；n-オクチル-β-D-マルトピラノシド；n-オクチル-β-D-チオグルコピラノシド；n-デカノイルスクロース；n-デシル-β-D-マルトピラノシド；n-デシル-β-D-チオマルトシド；n-ヘプチル-β-D-グルコピラノシド；n-ヘプチル-β-D-チオグルコピラノシド；n-ヘキシル-β-D-グルコピラノシド；n-ノニル-β-D-グルコピラノシド；n-オクタノイルスクロース；n-オクチル-β-D-グルコピラノシド；n-ウンデシル-β-D-マルトシド；APO-10；APO-12；Big CHAP；Big CHAP、デオキシ（Deoxy）；BRIJ（登録商標）35；C12E5；C12E6；C12E8；C12E9；シクロヘキシル-n-エチル-β-D-マルトシド；シクロヘキシル-n-ヘキシル-β-D-マルトシド；シクロヘキシル-n-メチル-β-D-マルトシド；ジギトニン；ELUGENT（商標）；GENAPOL（登録商標）C-100；GENAPOL（登録商標）X-080；GENAPOL（登録商標）X-100；HECAMEG；MEGA-10；MEGA-8；MEGA-9；NOGA；NP-40；PLURONIC（登録商標）F-127；TRITON（登録商標）X-100；TRITON（登録商標）X-114；TWEEN（登録商標）20；またはTWEEN（登録商標）80を非限定的に含む、1つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含む。さらに、BATC、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ケノデオキシコール酸、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、グリコリトコール酸、ラウロイルサルコシン、タウロケノデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデヒドロコール酸、タウロリトコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、およびTOPPAを非限定的に含むイオン性界面活性剤を、本発明の方法とともに用いることもできる。また、アミドスルホベタイン、CHAPS、CHAPSO、カルボキシベタイン、およびメチルベタインを非限定的に含む両性イオン性界面活性剤を、本発明の組成物および方法とともに用いることもできる。例えば、SDS、N-ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、アルキル-アリールスルホネート、長鎖（脂肪）アルコールスルフェート、オレフィンスルフェートおよびスルホネート、αオレフィンスルフェートおよびスルホネート、硫酸化モノグリセリド、硫酸化エーテル、スルホスクシネート、アルカンスルホネート、リン酸エステル、アルキルイセチオネート、ならびにスクロースエステルを非限定的に含むイオン性界面活性剤を、本発明の組成物および方法とともに用いることもできる。
【００７１】
一般に、あらゆる適した液体を、本発明の溶解バッファーにおける溶媒として用いうる。液体は有機性でも無機性でもよく、純粋な液体でも液体の混合物でも液体中にある物質の溶液でもよく、溶媒の特性を向上させるさらなる物質を含有してもよい。身体サンプルの細胞構成要素を完全または部分的に可溶化するのに適するあらゆる液体を、本明細書中で用いられる溶解バッファーと見なすことができる。
【００７２】
1つの態様において、溶媒は、サンプル中に存在する可能性のある細胞、細胞片、核酸、ポリペプチド、脂質および他の生体分子が可溶化されるように設計される。本発明のさらなる態様において、身体サンプルの特定の構成要素の差異を伴う溶解が確実に行われ、他の構成要素は溶解されないままであるように、溶媒を設計することもできる。
【００７３】
場合によっては、本発明の溶媒緩衝液は、サンプル中の構成要素の分解を防ぐ1つまたは複数の作用物質を含む。そのような構成要素には、例えば、プロテイナーゼ阻害薬、RNアーゼ阻害薬、DNアーゼ阻害薬、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）阻害薬といった酵素阻害薬が含まれうる。プロテイナーゼ阻害薬には、例えば、セリンプロテイナーゼの阻害薬、システインプロテイナーゼの阻害薬、アスパラギン酸プロテイナーゼの阻害薬、酸性プロテイナーゼの阻害薬、アルカリ性プロテイナーゼの阻害薬または中性プロテイナーゼの阻害薬が含まれうる。好ましくは、溶解バッファーは、不可逆性および可逆性のプロテアーゼ阻害薬、ホスファターゼ阻害薬およびRNアーゼ阻害薬の混合物を含む。
【００７４】
加えて、1つまたは複数の酵素、例えばザイモリアーゼ、リティカーゼ、リゾチームもしくはリゾスタフィンなど；1つもしくは複数の無機塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、もしくは塩化リチウムなど；1つもしくは複数の酸および／もしくは塩基もしくは緩衝剤（例えば、pHを上昇もしくは低下させるため）；または細胞膜および／もしくは細胞壁の完全性の途絶を補助しうる（すなわち、それを溶解させるか、もしくはそこでの細孔の形成を引き起こす）他の任意の化合物もしくは酵素（例えば、ポリミキシンB）を用いることもできる。
【００７５】
本発明の溶解法は、あらゆる単一の細胞型または複数の細胞型の混合物に対して適用することができる。本発明は、初代細胞、生検組織、正常細胞株および形質転換細胞株、形質導入細胞および培養細胞を含む、あらゆる細胞型とともに用いるのに適しており、これらのそれぞれは単一の細胞型もしくは細胞株であってもよく、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００７６】
好ましくは、単細胞は組織から単離される。組織はすべての供給源、特に哺乳動物に由来してよく、種に関しては、例えば、ヒト、サル、齧歯動物などであってよい。組織の出所は、心臓、肺、肝臓、脳、血管、リンパ節、脾臓、膵臓、甲状腺、食道、腸、胃、胸腺などであってよい。本発明は細胞型または組織型に限定されるべきではない。そうではなくて、本発明は、あらゆる細胞およびあらゆる組織に適用可能であるとみなされるべきである。また、組織工学によって設計および構築された人工構築3-D組織様構造も適用可能である。
【００７７】
例えば、本発明は、幹細胞および始原細胞、例えば胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経冠細胞など、内皮細胞、筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および骨格筋細胞、間葉細胞、上皮細胞；造血細胞、例えば、Th1 T細胞、Th2 T細胞、Th0 T細胞、細胞傷害性T細胞などのT細胞；B細胞、プレB細胞など；単球；樹状細胞；好中球を含むリンパ球；ならびにマクロファージ；ナチュラルキラー細胞；マスト細胞など；脂肪細胞、特定臓器、例えば胸腺、内分泌腺、膵臓、脳などにかかわる細胞、例えばニューロン、グリア、アストロサイト、デンドロサイトなど、ならびにそれらの遺伝的改変細胞を含む細胞型を検討するために有用である。
【００７８】
本発明のインサイドアウト溶解法は、本方法が組織固定／透過処理および組織離解を必要としないという点で、先行技術の方法を上回る利点を有する。
【００７９】
1つの態様において、インサイドアウト溶解は、本明細書中の他所に記載されているように、完全に自動化されている。別の態様において、インサイドアウト溶解は部分的に自動化された上で使用者により行われる。別の態様において、インサイドアウト溶解は完全に使用者により行われる。
【００８０】
プリンティング段階
溶解段階の後に、吸引チャンネルを用いてライセートを吸引することによってライセートを収集することができ、ライセートを続いて固体支持体上に適用して（すなわち、プリントするかまたはスポット化して）、ライセートを所望の技術を用いて評価することができる。プリンティングのための先行技術の方法（例えば、圧電駆動プリンティングおよび接触プリンティング）は、本発明の希釈ライセートに用いるのには適切でないが、これは先行技術の方法における溶媒面積が分析物面積とほぼ同じであり、それ故に単位時間当たりの溶媒蒸発がより少なくなるからである。また、先行技術の方法は小体積で用いるのにも適切でないが、これは先行技術の液滴送達プロセスが連続送達プロセスではないからである。液滴送達プロセスでは単位時間当たりの溶媒蒸発が少なくなり、それ故にサンプル全体をプリントするには同じスポット上への付着を繰り返すことによってより長い時間がかかり、その結果、小体積サンプルの大部分が固体支持体と接触する前に蒸発してしまう。すなわち、先行技術のプリンティング方法は、小体積（例えば、約5〜15nl、好ましくは約10nl）の希釈された単細胞ライセートのプリンティングのためには適切でない。
【００８１】
したがって、本発明は、小体積で用いるための新規プリンティングを提供する。1つの態様において、本発明のプリンティング方法の毛管構成要素は、必ずしも固体支持体と接触する必要はないが、連続送達が確実に行われるのに十分に近くになければならない。この方法は、本発明の希釈ライセートのためには適切であり、これは例えば、溶媒面積が分析物面積よりも10〜100倍大きく、その結果、固体支持体上へのライセートの連続送達中に、単位時間当たりでより多くの溶媒が蒸発によって除去されるからである。好ましくは、固体支持体は、溶媒と比較して分析物に対してより高い親和性を有する多孔性である。別の態様において、本発明のプリンティング方法の毛管構成要素は小体積のために適切であり、これは、各付着物への連続送達によって、より希釈されたサンプルが各付着物に付着し、それによって、より少ない付着が必要となり、このために固体支持体との接触前に蒸発するのは小体積サンプルのごくわずかな部分となるからである。したがって、本発明のプリンティング方法は、小体積（例えば、5〜15nl、好ましくは約10nl）の希釈単細胞ライセートのプリンティングのために適切である。
【００８２】
1つの態様において、本発明のプリンティング方法は、本発明の限られた分析物を含有する小体積の希釈された単細胞ライセートで用いるために適切である。1つの態様において、プリンティング方法は、多孔性固体支持体（例えば、ニトロセルロース）上での分析物の濃化を可能にする。好ましくは、濃化／プリンティング方法は、分析物に対してより高い親和性を有し、溶媒または非分析物に対する親和性はより低い、任意の多孔性固体支持体を用いることを含む。
【００８３】
1つの態様において、本発明は、細胞を含有する流体サンプルの少なくとも1つの細胞の細胞内内容物を分析のために放出させる方法を提供する。例えば、本発明のインサイドアウト溶解を用いて生成されたライセートを、分析のために基材上にスポット化することができる。1つの態様において、本発明は、細胞を含有する流体サンプルの少なくとも1つの細胞の輸送および溶解のためのマイクロ流体システムを提供する。
【００８４】
1つの態様においては、約10μmの開口部を有する慣例的なガラス製屈曲マイクロピペットを用いて単細胞ライセートを取り込む。場合によっては、開口部は約9μm、約8μm、約7μm、約6μm、約5μm、約4μm、約3μm、約2μm、約1μmである。1つの態様において、開口部は1.5μmまたはそれ未満である。
【００８５】
各単細胞のタンパク質内容物を分析するためには、そのようにして取り込まれた各単細胞ライセートを固体支持体上にプリントする。場合によっては、固体支持体は可動性材料（金属ゾルまたはラテックスもしくはガラス製のビーズなど）または不動性基材（グラスファイバー、セルロースストリップまたはニトロセルロース膜など）である。好ましくは、固体支持体はガラスにマウントしたニトロセルロースパッドである。
【００８６】
1つの態様において、本発明は、試験サンプル、希釈剤、試薬などの送達または収集のための1つまたは複数のリザーバーを提供する。本発明の実施に用いられるマイクロ流体デバイスおよびシステムは、ガラス、溶融シリカおよびさまざまなポリマー材料、例えばPDMS、またはそのような材料の組み合わせを含む種々の基材材料を用いて作ることができる。
【００８７】
本発明は、本発明の細胞ライセートが結びつけられる任意の表面を含み、ここで細胞ライセートまたはその画分は任意形状の所定の空間アレイに結びつけられる。
【００８８】
柔軟基材および剛性基材の両方を含む、種々の固体支持体または基材が、本発明の目的に適している。柔軟とは、支持体を破損させずに曲げること、折り畳むこと、または類似の操作を行うことができることを意味する。柔軟な固体支持体の例には、アクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ポリエステルフィルム、例えばポリエチレンテレフタレートなどが含まれる。また、ゲル、例えばコラーゲンゲル、マトリゲル、およびECMゲルなども含まれる。剛性支持体は容易には曲がらないものであり、これにはガラス、溶融シリカ、石英、プラスチック、例えばポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびそれらの配合物など；金属、例えば金、白金、銀など；その他が含まれる。
【００８９】
基材は、フィルター、ファイバー、膜、ビーズ、粒子、ディップスティック、シート、ロッドなどを含む種々の外形として形成することができる。通常は、平面的または平面三次元的な幾何学形状が好ましい。基材を製造するための材料は、ある程度非特異的な結合が好ましい特定の場合を除き、理想的には結合イベント中に低レベルの非特異的結合を示すべきである。
【００９０】
いくつかの態様において、固体支持体は多孔性であり、例えば、ニトロセルロース（純粋なニトロセルロースおよび修飾ニトロセルロースを含む）であってよい。ニトロセルロースはシートまたはストリップの形態にあってよい。そのようなシートまたはストリップの厚さは、幅広い範囲のなかで、例えば、約0.01から0.5mmまで、約0.02から0.45mmまで、約0.05から0.3mmまで、約0.075から0.25mmまで、約0.1から0.2mmまで、または約0.11から0.15mmまでとさまざまであってよい。そのようなシートまたはストリップの孔径も同様に、幅広い範囲のなかで、例えば、約0.025から15μmまで、またはより具体的には約0.1から3μmまでとさまざまであってよい；しかし、孔径は固体支持体の選択における制限要因ではないものとする。
【００９１】
1つの態様において、多孔性固体支持体材料の特性により、分析物分子の迅速結合が可能になる。場合によっては、多孔性固体支持体材料による分析物分子のこの急速結合は、多孔性固体支持体上の小さな（例えば、約5〜100μmの）密なスポットの幾何学的限局部の内部への分析物分子（例えば、タンパク質）の濃化のために用いられる。先行技術の方法は、多孔性固体支持体上の密なスポット中への単細胞ライセートのプリンティングを行えない（例えば、このスポットに由来するシグナルは固体支持体材料のノイズおよびバックグラウンドのレベルを有意に上回る）。本発明の1つの態様において、希釈されたライセートを固体支持体の同じスポット上に繰り返しスポット化して、その結果、溶媒は、分析物が多孔性固体支持体材料に対する急速結合によって保持される区域よりも数倍大きい区域に放射状に広がる。続いて溶媒は蒸発し、一方、分析物は多孔性固体支持体の小さな密なスポット中に保たれる。溶媒蒸発後に、同じスポット上への希釈されたライセートの付着を上記の様式で繰り返す。そのような濃化により、本明細書中の他所に記載されているように、多孔性固体支持体上の希釈単細胞ライセートの再濃縮が可能になる。小さな密なスポット中での分析物の再濃縮により、分析段階において記録された全シグナルに対する固体支持体物質の寄与は無視しうるようになる。この濃化プロセス、およびそれ故に多孔性固体支持体上の密なスポット中に単細胞ライセートをプリントしうることにより、単細胞ライセートからの分析物の分析（例えば、単細胞マイクロアレイ形式）が可能になる。
【００９２】
1つの態様において、本発明は標準曲線の使用を含む。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、標的を選別する場合には、所与の病的サンプル中の他のすべてのタンパク質と比較して最もアップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされるタンパク質を探すことが有用である。標準曲線の勾配は親和性に基づく種々のプローブ（抗体など）の間で異なるため、測定された「シグナル」はタンパク質標的の偽選別（false choice）をもたらす。対応する標準曲線をシグナルに適用することによって決定される測定された数量により、タンパク質標的の正しい選別が導かれる。このため、1つの分子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションが別の分子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションよりも有意であるか否かという定性的観察は、対応する標準曲線の知識がなければ不可能である。
【００９３】
1つの態様において、ライセートおよび標準曲線は、本明細書中の他所に記載されているように、固体支持体（例えば、ニトロセルロースパッド）上にプリントされる。
【００９４】
精製された組換えタンパク質および／または対照ライセートの標準曲線は、同じニトロセルロースパッド上の単細胞ライセートのプリントされたスポットに隣り合わせてプリントすることもでき、または別の固体支持体上にプリントすることもできる。この戦略により、多重測定の各次元に関して標準曲線の作成が可能になる。この戦略により、ノイズレベルを推定するため、および検出限界を決定するための、同じ固体支持体上でのいくつかの同一な標準曲線の作成が可能になる。この戦略により、単細胞ライセートから記録されたシグナルの同時並行的標準曲線上へのマッピングが可能になる。1つの態様において、標準曲線は従来のArrayerによってプリントされるが、これは標準曲線を多量の材料から作成しうるためである。したがって、いくつかの場合には、希釈された単細胞ライセートは本発明の新規プリンティング方法に従ってプリントされ、標準曲線は同じ固体支持体上に従来のやり方でプリントされる。この局面において、プリンティング手順は全体で2つのプリンティング方法を含み、従来のライセートマイクロアレイに用いられるプリンティング方法とは異なる。
【００９５】
1つの態様において、本発明の方法は、多重単細胞測定の各次元に関して単細胞のノイズレベルの決定を可能にする。この戦略により、多重測定の任意の測定された次元のシグナルが検出限界を上回ることの判定が可能になる。
【００９６】
適切な「標識-検出方法」ペア（例えば、本明細書中の他所で考察しているように、ランタニド標識とLA-ICP-MSは「標識-検出方法」ペアである）と組み合わせれば、この戦略により、本発明は限られた単細胞材料の多重化の目的での細分画を必要としないという点で、先行技術の方法の欠点が解消される。例えば、ランタニド標識とLA-ICP MSとの組み合わせにより、限られたサンプルの細分画の必要性がなくなる。これは、本発明の単細胞ライセートマイクロアレイでは、1つのスポットからの、この1つのスポット中に付着させた貴重なサンプルによる多くの抗体標識を、LA-ICP-MSによって読み取ることができるためである。この戦略はまた、本発明が組織固定／透過処理および組織離解を必要としないという点で、先行技術の方法の欠点も解消する。
【００９７】
同時に、この戦略は利点も取り入れている。すなわち、この戦略により、本明細書中の他所で考察しているように、同時並行的標準曲線のプリンティング、抗体プローブおよびマイクロアレイにおけるような他の親和性に基づくプローブの厳密な検証が可能になる。この戦略は、固体支持体に対して適用されるあらゆる標識-標識検出法のペアと組み合わせることができる。例えば、本明細書中の他所に記載されているように、抗体のランタニド標識とLA-ICP-MS検出とのペアを適用することができる。
【００９８】
1つの態様において、固体支持体には、MALDI分析のためのマトリックスをあらかじめプリントしておくことができる。
【００９９】
1つの態様において、固体支持体（例えば、ガラス）は、ライセートの適用の前に、他の分子実体をそれに対して共有結合性に連結させることによって調製される。そのような分子には以下のものが非限定的に含まれる：抗体、酵素、タンパク質ドメイン。
【０１００】
また、ライセートをさらなる分析のために流体中に放出させることもできる。ライセートを続いて、流体中に放出された後に分析方法によって分析することができる。ライセートは1つの流体の集まりとしてまとめてプールすることができる。例えば、分析物の総含有量を増やすために、ある細胞型の細胞からのライセートを1つの流体の集まりとしてまとめることができる（例えば、別の緩衝液中に）。多くのライセートを1つの流体の集まりとしてまとめてプールすることによって、サンプル要求条件がより高度である分析方法による分析を達成することができる。プールしたライセートを有する流体体積を蒸発によって濃化することもできる。
【０１０１】
ライセートは、固体支持体上への事前のプリンティングも、流体中にそれを事前に放出させることも行わずに、分析デバイス（例えば、質量分析器）に適用することができる。
【０１０２】
分析段階
本発明のインサイドアウト溶解法は、生きた固形組織から得られた単細胞ライセートの、高い時間的および空間的分解能でのサンプリングを容易にする。インサイドアウト溶解により、サンプリングした各単細胞における「完全な分子状態」の分析が可能になるが、これはライセートの形式により、任意のクラス内またはクラス間にわたる分子の分析が可能になるためである。混在型ライセートを、各部分が異なる方法によって分析されるように部分へと細分することができる。また、ライセート全体をただ1つの分析方法によって分析することもできる。または、ライセート全体を1つの方法によって分析し、続いて別の方法によって逐次的に分析することもできる。2種を上回る分析方法を同じライセートに対して逐次的に適用することもできる。
【０１０３】
1つの態様において、単細胞ライセート全体のネイティブタンパク質を多孔性固体支持体上の密なスポット中に濃化して（プリンティング段階で記載したように）、本明細書中の他所に記載されているように、単細胞ライセートマイクロアレイによって分析する。それぞれが1つの細胞に由来する複数の単細胞ライセートを、同じマイクロアレイ上で分析することができる。あらゆる先行技術の方法とは異なり、単細胞ライセートマイクロアレイにより、単細胞におけるネイティブタンパク質の多重測定が同時並行的標準曲線によって可能である。
【０１０４】
単細胞ライセートに関連して、ライセートはタンパク質の多重化の目的で単一のスポット中に保たれる。したがって、本発明は、一部には、「ランタニド標識-LA-ICP-MS検出」ペアを「標識-標識検出法」ペアとして用いることによって、サンプル細分化を伴わずに1つの単一スポットにおけるタンパク質を多重化するやり方の開発に基づく。
【０１０５】
1つの態様において、他の「標識-標識検出法」ペア（ランタニド-LA-ICP-MS以外）を、タンパク質または他の分子クラスの他の分子の検出のための単細胞ライセートマイクロアレイの形式に用いることができる。例えば、ヌクレオチド配列をランタニドキレート剤の代わりに抗体と結合体化させることができ、多重化をLA-ICP-MSの代わりにRT-qPCR反応によって達成することもできると考えられる。
【０１０６】
別の例では、mRNAをニトロセルロースと結合させて、タンパク質と同じ様式でニトロセルロース上の小さな密なスポット中に濃化させることもできる。mRNAの存在量を検出するのに、qPCR反応を実行することができる。
【０１０７】
1つの態様においては、単細胞ライセートのある区分のネイティブタンパク質を単細胞ライセートマイクロアレイによって分析する。単細胞ライセートの他の区分は別の方法によって分析する（例えば、転写物分析のためにはRT-qPCR、または代謝産物分析のためにはMALDI）か、または下位区分へとさらに細分する。このプロセスを、必要な数の下位区分が調製されるまで続けることができる。続いて、各下位区分を異なる分析方法によって分析する。ライセートの下位区分は、各下位区分が全ライセートを確実に表していることを確立する目的で同じ分析方法によって分析することができる。分析方法はより高感度になっており、分析方法の検出限界は改善されているため、1つの単細胞ライセートからさらに下位区分を作製して、異なる分析方法によって分析することができる。
【０１０８】
1つの態様において、本発明は、複数の分子クラスにわたる多重化を可能にする。例えば、本発明のライセートを細分することができる。この状況においては、1つの分子クラス内での多重化のみを目的として細分するのとは異なり、細分画に対して異なる分析方法を用いることを目的として細分することが好ましい。
【０１０９】
他の態様においては、ライセート形式との適合性のある他の任意の分析方法をライセートの分析のために用いることができる。加えて、ある細胞型の単細胞のライセートをある量の1つの液体としてプールし、続いて分析方法に対して適用することもできる。他の態様において、ある細胞型の単細胞のライセートをある量の1つの溶媒（例えば、緩衝液）としてプールして、分析物の濃度を溶媒蒸発によって高め、その後に分析方法に適用することもできる。ライセート形式との適合性のある分析方法には、以下のものが非限定的に含まれる：質量分析法、PCRに基づく方法、シークエンシングに基づく方法など。
【０１１０】
本発明の方法および組成物は、これらには限定されないものの、以下の属性の1つまたは複数を提供する：（1）サンプルおよび抗体の要求条件が少ない、（2）規模変更が可能であり、ロボット制御による自動化および多重化の適用対象となる。シグナル伝達タンパク質の発現および翻訳後修飾を単一の支持体上でプローブ検索して、特異なタンパク質に関する定量的発現データおよび一意的な修飾部位のリン酸化レベルを得ることができる。
【０１１１】
多重化されたタンパク質マイクロアレイプラットフォームのための方法およびキットが提供され、それらは細胞構成要素の同時モニタリングのために利用される。特に関心が持たれるのは、翻訳後修飾によって影響される構成要素、より具体的にはシグナル伝達経路構成要素である。マイクロアレイは、細胞が生組織に由来する単細胞ライセートを含む。
【０１１２】
本発明は、改変されたタンパク質翻訳後修飾（PTM）およびPTM改変状態の迅速かつ大規模な診断スクリーニングを可能にする。本方法は一部には、単細胞由来の濃縮された細胞抽出物または生体液サンプルを異なる分析検査に適用し、1つまたは複数の特定のPTM反応またはPTM改変反応を実施するためにそれらに適切に補給を行うことを伴う。具体的には、1つまたは複数のPTMまたはPTM改変を、続いて、修飾されたタンパク質を標識してアレイをスキャンすることによって検出する。
【０１１３】
共有結合性に修飾されたタンパク質、例えば、ポリユビキチン化された、ユビキチン化された、リン酸化された、グリコシル化された、SUMO化された（sumoylated）、アセチル化された、S-ニトロシル化もしくはニトロシル化された、シトルリン化もしくはデイミノ化された、NEDD化された（neddylated）、OClcNAc付加された、ADP-リボシル化された、メチル化された、ヒドロキシメチル化された、FAT10化された（fattenylated）、UFM1化された（ufmylated）、プレニル化された、ミリストイル化された、S-パルミトイル化された、チロシン硫酸化された、ホルミル化された、およびカルボキシル化されたタンパク質などは、ゲル電気泳動という標準的な生化学的手法によって同定することは困難であるが、これは修飾タンパク質のバンドがゲル全体に広がるためである。PTMの逆改変、例えば、脱ユビキチン（DUB）、脱リン酸、脱グリコシル、脱SUMO、脱アセチル、脱S-ニトロシルもしくは脱ニトロシル、脱シトルリンもしくは脱デイミノ、脱NEDD、OClcNAc除去、脱ADP-リボシル、脱メチル、脱ヒドロキシル、脱FAT10、脱UFM1、脱プレニル、脱ミリストイル、脱S-パルミトイル、脱チロシン硫酸、脱ホルミル、脱カルボキシル、および脱アミドなどを、そのような標準的な生化学的方法を用いて検出するために同定することも同様に困難である。対照的に、本明細書に記載の本方法を用いると、PTM反応またはPTM改変反応を固相アレイ上で直接的に行うことが可能であり、またはライセートマイクロアレイなどの多重形式の使用により、数千種ものタンパク質の同時分析も可能になる。したがって、本発明は、改変PTMまたはPTM改変状態を同定する上でのこれまでの障害を克服する。
【０１１４】
種々の質量分析システムを、単細胞ライセートを同定および／または定量するために本発明の方法に使用することができる。高い質量精度、高い感度および高い分解能を備える質量分析計には、イオントラップ型、三連四重極型、および飛行時間型、四重極飛行時間型の質量分析器、ならびにフーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析計（FT-ICR-MS）が非限定的に含まれる。質量分析器は典型的には、マトリックス支援レーザー脱離（MALDI）およびエレクトロスプレーイオン化（ESI）のイオン源を装備しているが、他のペプチドイオン化方法を用いることもできる。イオントラップMSでは、分析物をESIまたはMALDIによってイオン化し、続いてイオントラップに投入する。捕捉されたイオンを続いて、イオントラップからの選択的放出を受けて、MSによって別々に分析する。タンパク質は、例えば、MALDI-TOFまたはESI-TOFシステムによる一段式質量分析法によって分析することができる。質量分析法による分析の方法は当業者に周知である（例えば、Yates, J., 1998 Mass Spect 33:1-19；Kinter and Sherman, 2000 Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, John Wiley & Sons, New York；Aebersold and Goodlett, 2001 Chem. Rev. 101:269-295；Banez et al, 2005 Curr Opin Urol 15:151-156を参照）。高分解能タンパク質分離のためには、毛管逆相クロマトグラフィーを分離方法として利用する、液体クロマトグラフィーESI-MS／MSまたは自動化LC-MS／MSを用いることができる（Yates et al., 1999 Methods Mol. Biol. 112:553-569）。
【０１１５】
1つの態様において、アッセイ方法は質量分析法である。質量分析法には、GC／MS、LC／MS、LC／MS／MS、MALDI-TOF、LC-ESI-MS／MS、MALDI-MS、タンデムMS、TOF／TOF、TOF-MS、TOF-MS／MS、三連四重極MS、および三連四重極MS／MSが非限定的に含まれうる。
【０１１６】
別の態様において、単細胞ライセートを、ELISA、ウエスタンブロット法、およびラジオイムノアッセイなどの免疫親和性に基づくアッセイを用いて分析することもできる。この状況において有用な他の方法には、同位体標識アフィニティータグ（ICAT）とそれに続く多次元クロマトグラフィーおよびMS／MSが含まれる。
【０１１７】
1つの態様において、本発明の分析ステージのアッセイ構成要素は、ELISA、EIA、RIA、ラテラルフロー形式およびフロースルー形式などのイムノアッセイであってよい。
【０１１８】
1つの態様において、単細胞ライセートは、それをとりわけRT-qPCR、RNA-Seq、MALDI-MSに適用することによってアッセイすることができる。
【０１１９】
本発明の方法は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出することができ、それ故にPTMタンパク質レベルを同定するための検出可能シグナルを提供する任意の組成物または作用物質を用いる、PTMならびにタンパク質の発現レベルの検出および分析を含む。PTMおよびタンパク質発現レベルは、例えば、対照サンプルを基準として患者サンプルにおいて、タンパク質分子1つ当たりに結びついたある所与の化学基の平均数に変化があれば、タンパク質分子1つ当たりに結びついた1つもしくは複数の化学基の種類に変化があれば、または別個の修飾パターンを有するタンパク質分子の異なる混合物があれば、本明細書に記載の方法を用いて検出することができる。タンパク質のPTM状態の改変には、未修飾タンパク質から修飾タンパク質への移行およびその反対、ならびにタンパク質に付加された化学的部分の数または種類の変化が含まれる。対照サンプルまたはレベルを、本明細書では、対照患者、対照もしくは参照基準データ、または同じ患者から以前に得られたデータについて述べるために用いる。例えば、いくつかの態様において、対照サンプルは、試験サンプルにおいて検討される疾患に罹患していない対象から得られた生物サンプルから得られた、機能的な細胞抽出物である。
【０１２０】
したがって、いくつかの態様において、バックグラウンドまたは対照との反応と比較した、固相アレイからのシグナルの増加は、PTMまたはタンパク質発現レベルの増加を指し示すものである。「増加した」、「増加」、または「強化する」という用語はすべて、本明細書において、統計学的に有意な量での増加を一般に意味して用いられる；誤解を避けるために、「増加した」、「増加」、または「強化する」という用語は、参照基準レベルと比較して、少なくとも約10％の、少なくとも約15％の、少なくとも約20％の、少なくとも約25％の、少なくとも約30％の、少なくとも約35％の、少なくとも約40％の、少なくとも約45％の、少なくとも約50％の、少なくとも約55％の、少なくとも約60％の、少なくとも約65％の、少なくとも約70％の、少なくとも約75％の、少なくとも約80％の、少なくとも約85％の、少なくとも約90％の、少なくとも約95％の、もしくは100％自体を含む最大で100％までの増加、または対照サンプルもしくはレベルと比較して、少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、もしくは少なくとも約7倍、もしくは少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、もしくは10倍もしくはそれを上回るあらゆる増加を意味するものとする。
【実施例】
【０１２１】
実験例
以下の実験例を参照することによって、本発明についてさらに詳細に説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供されるものであり、別に指定のある場合を除き、限定的であることは意図していない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるとは全くみなされるべきではなく、そうではなくて、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意かつすべての変更も範囲に含むとみなされるべきである。
【０１２２】
それ以上の説明がなくても、当業者は、前記の説明および以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製して利用し、請求される方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、このため、本発明の好ましい態様を具体的に指摘したものであり、本開示のそれ以外の部分を限定するものとは全くみなされるべきでない。
【０１２３】
実施例1：固形組織における単細胞サンプリング
本明細書に提示された結果は、高い時間的および空間的分解能を有する複雑な生きた固形組織から単細胞ライセートを得ることを可能にする新規サンプリング方法の開発に成功したことを実証している。
【０１２４】
界面活性剤を含有する溶解バッファーの限局的な定方向流を、生組織中の標的細胞の細胞体に対して適用した（図7、26および31）。流れの直径は細胞体の直径よりも小さかった。界面活性剤の濃度はその臨界ミセル濃度（CMC）値を上回った。これらの2つの特性により、適用された溶解バッファーが、組織中の隣接細胞に漏れ出さずに細胞内空間に入ることが可能になった。細胞の内側では、界面活性剤がそのCMC値よりも低い濃度に希釈されて、溶解バッファーがインタクトな細胞内空間に蓄積して、その複雑な周囲組織に影響を及ぼすことなく、標的細胞の複雑な形状の全体を通じて拡散および／または流動することが可能になった。ひとたび十分な溶解バッファーが標的細胞の内側に蓄積し、界面活性剤濃度がその臨界値に再び近づくと、細胞膜は内側から溶解され、ライセートが希釈されて（「インサイドアウト溶解」）、近傍の吸引チャンネルによって直ちに取り込まれる。得られた単細胞ライセートの推定体積はおよそ5〜10nLである。溶解バッファーは、不可逆性および可逆性のプロテアーゼ阻害薬、ホスファターゼ阻害薬およびRNアーゼ阻害薬の混合物を含有する。ひとたび溶解バッファーが細胞内空間に入ると、それは細胞内構成要素と混合して均質化される。10〜20秒以内に、かつ完璧な空間的分解能で、インサイドアウト溶解方法は、複雑な固形組織中のあらゆる形状の単一の生細胞を、すべてのクラスの分子が保持されている混在型ライセート溶液に変換させる（図7）。
【０１２５】
これらの実験に使用した材料および方法について、以下に説明する。
【０１２６】
材料および方法
画像化設備
サンプリング設備は、HamamatsuOrca-R2カメラ、および励起チャンネルおよび発光チャンネルの両方用に2つの高速フィルターホイール（Sutter Instrument Company）を追加したOlympus BX51WI蛍光顕微鏡を基盤として構築した。フィルターホイールはいずれも、Lambda 10-3コントローラー（Sutter Instrument Company）によって制御した。励起チャンネルにおける光路は、SmartShutter（商標）（Sutter Instrument Companyから入手）によって制御した。画像化プロセスはMicromanagerソフトウェアによって制御した。
【０１２７】
以下の水浸対物レンズを用いた：Olympus 10倍（UMPLFLN 10XW、NA 0.3、作動距離3.5mm）、20倍（UMPLFLN 20XW、NA 0.5、作動距離3.5mm）および40倍（LUMPLFLN 40XW、NA 0.8、作動距離3.3mm）。これらの対物レンズを選んだのは、許容作動距離によって高開口数が得られることが理由であった。画像化設備をTMC空気圧テーブル上にマウントし、振動を避けるためにしっかりと固定した。
【０１２８】
動物および器官型培養物
動物手順はすべて、Harvard Medical School（HMS）の規則に準拠しており、実効下にある動物プロトコールの下で行った。GINマウスはJackson研究所から購入した。GAD67-GFPマウスはMurthy研究室（Harvard University）から入手した。GINマウスをほとんどの実験に用いた。海馬器官型培養のための標準的なプロトコールを用いた（Stoppini et al, 1991 J Neurosci Methods. 37(2): 173-182）。マウス新生仔（出生後第5日または第6日）を低体温下においた上で断頭処置を行った。続いて、6.5g／Lグルコースを加えたGey平衡塩類溶液中で海馬を切離した。海馬の300μm厚切片を、組織切片作製機を用いることによって得た。得られた海馬切片を続いて、直ちにMilliporeインサート（Milliporeから入手；高さ0.4μm、30mm親水性PTFE）に移し、以下の条件下でインキュベーター内で培養した：5％ CO2、37℃。培養基には非働化ウマ血清を含有させ、以下のようにして調製した：50ml MEM 2×、120mg Tris、910μLの7.5％ NaHCO3溶液、50ml非働化ウマ血清、50ml 1×HBSSおよびddH2O（総体積200mlとなるまで添加）。単細胞を溶解させる10時間前に海馬切片から血清を除去した。海馬切片は1カ月を上回る期間にわたって順調に培養され、形態学的特徴および組織構成上の特徴が極めて良好に保持された。
【０１２９】
インサイドアウト溶解プロセス中に生組織を維持するための特製記録チャンバーは、Sylgard（登録商標）184（Dow Corning Corporation）からキャスト成形した。生きた器官型切片を伴うMilliporeインサートを、このチャンバーに容易に出し入れすることができた。組織切片には、加温したHBSS溶液による灌流を行った。灌流はインサイドアウト溶解プロセスの最中および直後には中断した。
【０１３０】
インサイドアウト溶解のセットアップ
マイクロピペットを、フィラメント付きのホウケイ酸ガラス管（Sutter Instrument Company；外径：1.0mm、内径：0.78mm）から、P-1000マイクロピペットプラー（Sutter Instrument Company）を用いて引っ張り作製した。マイクロピペットの仕様変更は、マイクロフォージ（Narishige MF-900）を活用して達成した。
【０１３１】
溶解バッファーは、本明細書中の他所に記載されているように調製した。送達用マイクロピペットに装填する前に、阻害薬の混合物（Halt（商標）Protease Inhibitor Cocktail 3X、Halt（商標）Phosphatase Inhibitor Cocktail 3X）を溶解バッファーに添加し、溶解バッファーを氷上に保った。AlexaD555（MW 10,000）はInvitrogenから購入した。SR101はSigmaから購入した。
【０１３２】
3つのMP-285および1つのMP-225マイクロマニピュレーターからなるセットをSutter Instrumentから入手し、2つの相互接続されたMPC-200コントローラー（Sutter Instrument Company）の基盤に対して組み込んだ。続いて、マスター側のMPC-200コントローラーを、USBポートを経由し、かつUSBポート制御用の適切なC++ライブラリーを経由して、Microsoft Visual Studio中のGUIとインターフェース接続した。マニピュレーターはすべて、インサイドアウト溶解手順とプリンティング手順との迅速な切り換えを数秒以内に完了できるようなやり方で配置および配列した（図29）。圧力コントローラーはMicroData Instrumentから入手し、パラレルポートおよびパラレルポート制御のための適切なC++ライブラリーを通じてGUIとインターフェース接続した。
【０１３３】
記録チャンバーは1つのMP-285マニピュレーター上に配置した。ニトロセルロースパッド付きのスライドグラスはすべて、GraceBioLabsから入手した。ニトロセルロースパッド付きのスライドグラスを、別のMP-285マニピュレーターと結びつけた。送達用マイクロピペットをMP-225マニピュレーターにマウントし、吸引／プリンティング用マイクロピペットを第3のMP-285マニピュレーターにマウントした。インサイドアウト溶解の完了後に記録チャンバーからニトロセルローススライドに迅速に切り換えられるように、一連の移動を前もってプログラミングしておいた。取り込み用マイクロピペットを記録チャンバーから迅速に引っ込め、プリンティングの直前にそれをニトロセルロースパッドの数μm上方に配置するように、一連の移動を前もってプログラミングしておいた。プリンティングは手動で実施したが、自動化することもできる。これらの移動はすべて数秒以内に完了した。1つの細胞に対するインサイドアウト溶解プロセスを画像化する際には、40倍対物レンズを用いた。数個の細胞に対する自動化版のインサイドアウト溶解を画像化する際には、20倍対物レンズを用いた。ニトロセルロース上への単細胞ライセートのプリンティングのため、および組織切片全体の全体像の画像化のためには、10倍対物レンズを用いた。用いたマイクロマニピュレーターのμm以下の分解能およびプログラミング性により、本明細書中の他所に記載されているように、単細胞溶解および単細胞ライセートのプリンティングを再現性のある様式で行うことができた。
【０１３４】
同時並行的漸増系列のプリンティング
ニトロセルローススライドをGraceBioLabsから入手した。ニトロセルローススライド上で単細胞ライセートに隣り合わせて漸増系列をプリントする目的で、2470 Aushon ArrayerをAushon Biosystemsから入手した。GFPタンパク質はMilliporeから入手した（14-392）。PKCδおよびPKCαはInvitrogenから入手した（P2287、P2227）。精製タンパク質はすべて、単細胞溶解に用いるのと同じSDS含有緩衝液中に希釈し、ニトロセルロースパッド上に1：2希釈系列としてプリントし、その後に同じニトロセルロースパッド上への単細胞ライセートのプリンティングを行った。漸増系列のプリントされた各200μmスポットの内部でタンパク質が均質な分布に達するように、高精度Aushon Arrayerの環境でスポット毎に8回付着させた。
【０１３５】
抗体
Seveckaらによって記載された、プリントされたライセートを伴うニトロセルローススライドの洗浄のため、およびその後の抗体インキュベーションのためのプロトコールを用いた（Sevecka and MacBeath, 2006, Nat. Methods 9:152-158；Sevecka et al., 2011, Mol. Cell Proteomics 10:M110.005363）。プリントされたニトロセルローススライド（図30）の洗浄のため、およびその後の抗体インキュベーションのためのプロトコールは、Seveckaらによって記載された通りに用いた（Sevecka et al., 2011, Mol Cell Proteomics. 10(4): M110.005363；Sevecka and MacBeath, 2006, Nat Methods. 3(10):825-831）。ニトロセルローススライドをまずPBST中で短時間洗浄し、続いてTris緩衝液（pH 9）中で48時間洗浄した。続いてスライドを、LiCorによって提供されたブロッキング溶液（Odyssey Blocking Buffer）である5％ BSA／PBST中にて4℃で1時間ブロックした。次にスライドを一次抗体とともにインキュベートした。β-アクチン一次抗体（A1978、Sigma）およびGFP一次抗体（2956、Cell Signalling Technology）を、5％ BSA／PBSTまたはOdyssey Blocking Buffer（LiCor）中にて1：1000で、4℃で24時間インキュベートした。その後に、二次抗体（抗ウサギ680および抗マウス800）を1：1000で、4℃で12〜24時間適用した。続いて、ニトロセルローススライドをPBST中で数回素早く洗浄した上で、LiCor Odysseyスキャナー（LiCor）でスキャンした。
【０１３６】
実験の結果について以下に説明する。
【０１３７】
界面活性剤に基づく溶解
本発明のサンプリング方法は、生きた固形組織に対して適用可能である。すなわち、本発明のサンプリング方法は離解プロセスを用いずに済み、さまざまな固定プロトコールによるアーチファクトおよびバイアスがない。このサンプリング方法はまた、界面活性剤に基づく溶解の技術的利点を取り入れることにより、転写物、タンパク質および代謝産物も保持する（表1）。
【０１３８】
（表1）固定と界面活性剤に基づく溶解との比較
0006317353.tif 000002
【０１３９】
混在型ライセートの形式にあること、および標的細胞のすべての分子が保持されることから、均質な希釈されたライセートの下位区分に対してRT-qPCR（またはRNA-Seq）、LA-ICP-MSおよびMALDI-MSを適用することにより、サンプリングした各単細胞における「完全な分子状態」の測定が可能になる（図3）。
【０１４０】
維持可能な生組織サンプルの必要性は、生命科学の他のあらゆる分野よりも、神経科学においてより切実なものとなっている。組織という状況が失われるために、解離された神経培養物ではニューロンの形態とニューロンの機能との間の関係を研究することが困難であった。また、解離した神経培養物では、多くのニューロン細胞型の分子的および形態学的な発生の経時的推移を研究することも難題となっている。維持可能な生組織システムに対するこの切実な必要性が理由となって、神経科学においては器官型培養物が開発され、広く採用されており、その後、そのような生組織システムの必要性は基礎生物学研究の他の領域でも生まれている。
【０１４１】
齧歯動物脳領域の器官型培養物は、インキュベーター内で数カ月間にわたって維持可能である。関心対象のマウス脳領域を最適化された手順で迅速に切離して切片化した後に、採取した切片を専用ディッシュ内の多孔性膜上で培養することができる（Stoppini et al., 1991, J. Neurosci. Methods 37:173-182）。そのような設備の一例は図4Aに表示されている。この設備では、培地は組織切片を取り囲んでおらず、下方の多孔性膜から組織切片の毛管作用によって取り込まれる。培地は血清をベースとしてもよく、または無血清であってもよい。海馬、皮質、視床および小脳をこの様式で順調に培養することができる（Gahwiler et al., 1997, Trends Neurosci. 20:471-477；Banker and Goslin, 1998, Culturing Nerve Cells, second edition）。
【０１４２】
齧歯動物脳領域の器官型培養物の発生および付随する分子的／形態的変化の経時的推移は、インビボでの（生きた齧歯動物における）発生および付随する分子／形態変化の経時的推移に類似している。例えば、インビボでの長期増強（LTP）の開始はラットでは出生後第2週の終わりに起こる（Muller et al., 1993, Brain Res. Dev. Brain Res. 71:93-100）。Mullerらによる研究では、8日齢ラットから調製した器官型海馬培養物は、2日齢ラットから調製した器官型海馬培養物よりもLTPの開始がはるかに早かった。しかし、いずれの場合にも、LTPの開始は、インビボでの出生後第12〜14日という時点と同等な時点で起こった（Muller et al., 1993, Brain Res. Dev. Brain Res. 71:93-100）。この観察所見は、分子発生の自然経過が器官型培養物において保持されていることを示唆する。この観察所見は、器官型培養物における分子発生の経過が調製手順の結果ではないという理論に一致する。種々の齢数のラットの器官型培養物および急性脳切片における電気生理学的および形態学的な比較測定による評価では、器官型海馬培養物におけるシナプス形成の経時的推移も、インビボでのシナプス形成の経時的推移に類似している（Gahwiler et al., 1997, Trends Neurosci. 20:471-477；Muller et al., 1993, Brain Res. Dev. Brain Res. 71:93-100）。Mullerらによる同じ研究では、器官型培養物における海馬の種々の領域内でのシナプス形成速度の空間分布は、インビボでのシナプス形成速度の空間分布と類似していた（Muller et al., 1993, Brain Res. Dev. Brain Res. 71:93-100）。
【０１４３】
ヒト結腸腫瘍、肺腫瘍および前立腺腫瘍の器官型培養物が最近確立され、最適化された（Vaira et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:8352-8356）。ヒト腫瘍の培養手順は齧歯動物脳組織のために用いられる上記の手順と同様である。Vairaは、培養ヒト腫瘍の空間的構成および形態が外植から5日後の器官型培養物で保持され、元の組織的構成と類似していることを示した。5日間のこの培養期間中に増殖性細胞およびアポトーシス性細胞の計数値はいずれも変化しなかった。Vairaはまた、薬理学的研究および分析研究をヒト腫瘍の器官型培養物で行えることも示した。さまざまなヒト腫瘍の培養の成功は、器官型培養の方法が一般的であり、ヒトおよび動物における種々の器官に適用しうることを実証している。
【０１４４】
界面活性剤は、分析的生化学的研究において細胞溶解のために広く用いられている。厳密な分析方法はすべて、サンプルのライセート形式を必要とする。表1は、界面活性剤に基づく細胞溶解の利点を細胞固定と比較してまとめている。界面活性剤／タンパク質相互作用のパラメーターおよび界面活性剤／膜相互作用のパラメーターを記載している生物物理学研究は数多く存在する（Helenius and Simons, 1975, Biochim. Biophys. Acta 415:29-79；Lichtenberg et al, 1983, Biochim. Biophys. Acta 737:285-304）。
【０１４５】
界面活性剤は、両親媒性脂質の分子クラスに属する。各界面活性剤モノマーは、極性領域（頭部）および非極性領域（尾部）を含む。後者は通常、アルキル鎖および／または芳香族基からなる。界面活性剤モノマーの尾部のサイズが、水とのその相互作用区域を決定づける。尾部の水との相互作用区域は、水中でのエントロピーの減少に起因する両親媒性界面活性剤の全体的疎水性を決定づける。一般に、疎水性の高い両親媒性脂質（リン脂質およびコレステロール）は水溶性でなく、一方、疎水性がより低い両親媒性脂質（界面活性剤）は可溶性であり、かつ臨界ミセル濃度（CMC）を有する。ある所与の界面活性剤の総濃度がそのCMC値に達すると、その溶液への余分な界面活性剤分子の添加はミセル形成のプロセスによって代償され、その結果、遊離界面活性剤モノマーの濃度はCMC値を超えない。界面活性剤のCMC値は、疎水性が高いと減少し、尾部領域の嵩が大きいと増加し、頭部領域の電荷によっても増加する。したがって、異なる界面活性剤は異なるCMC値を有する。ある所与の界面活性剤のCMC値およびミセル中の界面活性剤分子の数（凝集数）は、温度、イオン強度および溶液のpH値にも依存する。
【０１４６】
界面活性剤と生体膜との相互作用は、リポソームモデルを利用して詳細に研究されている（図6）。リポソームを有する溶液中で界面活性剤分子の総濃度がCMC値を上回って上昇すると、遊離界面活性剤モノマーの濃度はCMC値未満に保たれるが、これは余分な界面活性剤分子がリポソームのリン脂質二重層に組み込まれるためである。界面活性剤分子の総濃度がさらに上昇すると、リポソームのリン脂質二重層中の界面活性剤分子の数が飽和レベルに達し、その結果、混合ミセルの形成が引き起こされる。これらの混合ミセルは、リポソーム性リン脂質と界面活性剤分子を含有する。溶液中での界面活性剤分子の総濃度をさらに上昇させると、すべてのリポソームが混合ミセル中に可溶化される。このため、溶液中での界面活性剤の各濃度で、遊離モノマーとリン脂質二重層に組み込まれたモノマーとの間には平衡があり、リン脂質二重層に組み込まれた界面活性剤モノマーと混合ミセルの形成との間にも平衡がある。ミセル形成プロセスは急速である（速度定数が10s-1）。経験的に、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの界面活性剤の存在により、赤血球の膜面積が増大し、赤血球が浸透圧ショックから保護されることも示されている。
【０１４７】
ミセル形成は生体膜の可溶化のためには極めて重要であるが、界面活性剤と可溶性タンパク質との結合のためには特に重要ではない。界面活性剤はCMC値未満の濃度ではモノマーとして可溶性タンパク質と結合する。SDSなどのイオン性界面活性剤は一般に変性特性を有する。それらはまず、タンパク質表面上の疎水性パッチと結合し、それにより、タンパク質のアンフォールディングを開始する。続いてアンフォールディングのプロセスにより、より多くの疎水性パッチが曝露される。したがって、界面活性剤により誘導される変性の全体的プロセスは協同的である。可溶性タンパク質と結合した界面活性剤分子はミセル形成のためには利用されず、ミセルと結合した界面活性剤分子はタンパク質結合のためには利用されない。したがって、ミセル形成のプロセスとタンパク質結合のプロセスは競合的である。
【０１４８】
最も広範に研究されている界面活性剤はSDSである。SDSは、可溶性タンパク質を直線状ポリペプチド領域に変性させる陰イオン性界面活性剤であり、ほとんどのタンパク質と一定の結合比を有する。重要なこととして、SDSは、CMC値を上回る濃度であっても、極めて重要ないくつかのプロテアーゼを変性させない。SDSを細胞溶解のために用いる場合には、可逆性プロテアーゼおよび不可逆性プロテアーゼならびにキナーゼ／ホスファターゼ阻害薬の混合物を添加することが一般的である。SDSのCMC値は溶液の組成に応じて大きく異なる。純水中では、SDSのCMC値は8.2mMである。0.5M NaCl溶液中では、そのCMC値は0.52mMである。図5は、SDSの濃度-温度相図を表示している。この相図はまた、SDSが、生物学的温度（臨界ミセル温度を上回る）では結晶形態としては存在しないことも示している。
【０１４９】
インサイドアウト溶解の機序
以下の溶解バッファー製剤を用いた：Tris・HCl 50mM、SDS 2％、グリセロール5％、NaF 1mM、0.5mM AlexaD555（10,000）、HaltTM Protease Inhibitor Cocktail 3X、Halt（商標）Phosphatase Inhibitor Cocktail 3X。いくつかの初期実験では、スルホローダミン101（SR 101）をAlexa 555デキストランの代わりに用いた。サイトゾル可溶性GFPを海馬介在ニューロンの異なるサブセットで発現する2種のマウス系統を実験に用いた。これらのマウス系統は以下であった：GAD67-GFP（介在ニューロンと推定される広範なセット）、GIN（ソマトスタチン介在ニューロン）。実験はGAD67-GFPマウスまたはGINマウスのいずれかの器官型海馬切片で行った。
【０１５０】
インサイドアウト溶解プロセスは、顕微鏡に取り付けた高速フィルターホイールを利用して、GFPおよびAlexa 555蛍光強度のフレームを取得することによって画像化した。溶解バッファーの送達プロセスは、引張り作製したガラスマイクロピペットに種々の外形を持たせることによって最適化した。実験に用いた送達用ピペットの先端開口は0.7μmであった。溶解バッファーは、ある角度で、または上から（垂直な適用）標的細胞に添加した。後者の外形は、送達用マイクロピペットを注意深く精巧に作った上で、溶解バッファーの限局的な流れが組織切片の表面に対して垂直になるようにその先細部を曲げることによって達成された。場合によっては、送達用マイクロピペットの先端を、送達開始時に標的細胞の表面に触れるのを防ぐための取り組みも行った。
【０１５１】
単細胞ライセートの最終的取り込みを行った実験では、10μm開口部を有する慣例的なガラス製屈曲マイクロピペットを用いた。この吸引用マイクロピペットによって生じる流れのベクトルは組織切片の表面に対して垂直であった。吸引用マイクロピペットの開口部は、組織切片の表面よりも20μm上方で標的細胞の真上に配置した。吸引はガラスキャピラリーの毛管作用のみによって生じさせ、能動的な陰圧は適用しなかった。引張り作製したガラスマイクロピペットを用いたのは、それらが低コストであることと仕様変更が容易であることが理由である。
【０１５２】
SDS含有溶解バッファーがGFP発現性標的細胞の細胞内空間に入ると、直ちにGFPの急速変性が観察された。いずれのマウス系統（GAD67-GFPおよびGIN）においても、GFPはサイトゾル全体を通じて自由に拡散した。しかも、そのサイズが比較的小さいことが理由で、GFPは核内にも入った。GFP蛍光は、SDS含有溶解バッファーが細胞内空間に入った直後にバックグラウンドレベルに減少した（図8、10、19、27および28）。これらの場合に、GFP蛍光は、Alexa 555デキストラン（またはSR101）分子が単細胞の幾何学的境界内に厳密に位置している際に減少し続けた。したがって、GFP変性は、膜障壁がインタクトなままである間に細胞内で起こったように思われた。GFP蛍光は、細胞膜が可溶化される前に消失した。図8は、同時吸引なしでの単細胞に対するSDS含有溶解バッファーの送達を示している（図9は、完全に自動化された逐次的マイクロ溶解手順における細胞の溶解を描写している）。図8に描写されたいずれの場合にも、GFP蛍光は溶解バッファーが標的細胞に入るのと同じ時点で、溶解バッファーが拡散／対流によって細胞内空間に完全に満たされる前に減少を始めた。これらの観察所見は、界面活性剤モノマーはCMC値未満の濃度であっても可溶性タンパク質と結合してそれを変性させることを示している生物物理学研究と一致しており、それについては本明細書中の他所で考察している。
【０１５３】
インサイドアウト溶解のいずれの場合にも、溶解バッファーが標的細胞の幾何学的境界内に蓄積すると、膜面積の視認しうる増加が観察された（図10）。この観察所見は、SDSモノマーが、それが飽和して混合ミセルの形成を引き起こす前に標的細胞のリン脂質二重層中に組み込まれることと一致した。膜面積のこの増加は同時に、増大中の細胞の内側でのGFP蛍光の減少も伴った。このことは、界面活性剤モノマーによるタンパク質結合と膜可溶化が競合的プロセスであるという考え方に一致する。
【０１５４】
重要なこととして、SR101分子またはAlexa 555デキストラン分子（10,000 MW）は、溶解バッファーをその細胞内空間に連続的に適用した場合に、標的細胞の幾何学的限局部から外には出ない。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、このことは膜増大の時相中に膜障壁がインタクトであったことを示唆する。細胞膜の可溶化は、Alexa 555色素が標的細胞の幾何学的限局部から離れることが観察されたことから、その初期の顕著な増大後に観察することができた（図12）。これらの観察所見は、界面活性剤による生体膜の可溶化プロセスを記載している諸研究と一致しており、それについては本明細書中の他所で考察している。
【０１５５】
場合によっては、溶解バッファー／可溶化溶液の流れは、初期には細く、適用チャンネルの開口部は約1.5μmまたはそれ未満であることが好ましい。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、適用チャンネルの開口部がより大きいほど、界面活性剤の流れを細胞の中心に向かわせて、限局的な細胞内供給源を作り出すことが困難になると考えられる。すると、界面活性剤が外膜に達し、核を可溶化する前に過度に早くそれを損なわせる可能性がより高くなる。
【０１５６】
界面活性剤に関する別の重要な特徴は、界面活性剤モノマーを内側からその中に組み込むと、細胞外膜のサイズが増加する（増大する）ことである。膜が増大しても、それは依然としてインタクトなままであり、細胞の内側と周囲組織との間のインタクトな障壁を依然として保持する。この特徴により、細胞の内側の有効容積が効果的に増加して、適用された液体の細胞内側への蓄積が可能になる。
【０１５７】
膜可溶化の種々の様式
次に、膜可溶化の種々の様式について検討した。本明細書中の他所で考察しているように、混合ミセル形成のプロセスは、急速であり、標的細胞の膜が界面活性剤モノマーによって飽和する膜部位で起こる。送達される溶解バッファーの総量は、標的細胞の膜を可溶化しようとする程度を決定する上で極めて重要なはずであると推論した。まず、能動的なライセート取り込みを伴わずに、より少量の溶解バッファーを単細胞に送達した。送達されたSR101色素は、上記の期間を通して、幾何学的な単細胞境界の外に出て、生組織の中または生組織の外へと緩徐に拡散したことが観察された。残された細胞は細胞膜のパッチに類似していた（図11）。この観察所見は、SDSに基づく溶解バッファーはその細胞内送達後に単細胞の膜を可溶化しうるという考え方と一致した。
【０１５８】
次の実験セットでは、十分な溶解バッファーを連続して適用すれば、標的細胞の膜が、連続送達の間のある時点でより急速に可溶化されるのではないかと推論した。図12は、最初により少量の溶解バッファーを標的細胞に適用したところ、即時的な可溶化は観察されなかった様子を示している。図12の後のフレームでは、同じ標的細胞に対してさらに溶解バッファーを連続して適用した後に、膜が急速に可溶化されたことが観察された。この可溶化プロセスの間に、Alexa 555デキストランは細胞の幾何学的境界から外に出て、近傍の毛管作用による吸引チャンネルによって最終的に取り込まれた（図12）。
【０１５９】
単細胞は種々の膜面積および種々の容積を有する。より小さな細胞では、内側から溶解させるのに必要な界面活性剤はより少ないはずである。重要なこととして、インサイドアウト溶解方法ではまず、界面活性剤に基づく溶解バッファーを標的細胞の細胞内空間に送達する。このため、インサイドアウト溶解方法は、混合ミセルの形成の前に起こる膜のリン脂質二重層への界面活性剤組み込みと並行して、可溶性タンパク質の変性および細胞内オルガネラの均質化を誘導する。標的細胞の細胞内可溶性タンパク質と細胞膜との間では界面活性剤モノマーをめぐって競合が起こる。このため、単細胞全体にわたってのタンパク質発現のレベルの違いも、細胞膜の完全かつ迅速な可溶化のために必要な溶解バッファーの量に影響を及ぼすと考えられる。
【０１６０】
いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、あらゆる可溶化および／または化学的解離プロセスは、この方法との適合性があるはずと考えられる。化学的な観点からは、解離は可溶化とは異なる。可溶化は通常、界面活性剤によって実現される。しかし、異なるPH値、塩、他の化学物質、および異なる濃度は、可溶化プロセス自体だけでなく分子間の分子相互作用にも影響を及ぼして、解離をもたらす可能性がある。例えば、尿素および他の変性性または還元性（DTT）物質を添加することが考えられる。厳密に言えば、これらの化学物質は解離反応を招き、続いて可溶化を容易にする。したがって、本発明は、細胞構成要素を直接的に解離および／または可溶化させるすべてのプロセス、ならびに前記の解離および可溶化プロセスを容易にするすべてのプロセスを範囲に含む。
【０１６１】
時には、細胞外膜を完全に可溶化することは望ましくない。そうではなくて、それをまず、細胞内構成要素を可溶化／解離させるための障壁として用い、続いて、その結果得られた液体を、全体的な膜障壁を依然としてインタクトまたはほとんどインタクトに保ちながら、膜の中の小さな開口部を経由して抽出することが望ましいこともある。ほとんどインタクトな全体的膜障壁の存在により、周辺組織中の他の可溶性分子による抽出物の混入が防止されると考えられる。組織内部の奥深くに位置する細胞の場合には、その結果得られた液体を収集時に厚い組織層を経由して移動させることははるかに困難であり、それは組織中の他の可溶性分子による混入も招くと考えられる。したがって、この代替的なサンプル収集戦略は、組織内部の奥深くにある単細胞のサンプリングのためにも好ましい可能性がある。
【０１６２】
細胞内構成要素が可溶化されて解離される際に、（少なくとも一時的に）インタクトな膜障壁が存在することは、本発明の根幹をなす。試薬の流入に起因する細胞内部の容積の増加に順応するために、界面活性剤を用いることができる。界面活性剤は、膜障壁を依然として維持しながら膜面積を増加させる。最終的に、外膜は可溶化されて解離されてもよく、またはそれが回収の間、ほとんどインタクトなままに保たれてもよい。
【０１６３】
単細胞分解能
本明細書中の他所で記載されているように、インサイドアウト溶解の単細胞分解能を蛍光画像化によって試験した。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、細胞膜の増大、およびAlexa 555色素またはSR101色素の標的細胞の幾何学的境界の内部への厳密な同時封じ込め（図8、10、12および32参照）により、標的細胞の膜障壁が溶解バッファーの送達時点から膜の視認しうる増大の時点までインタクトであったこと、および、単細胞分解能が溶解バッファーの送達時点からインサイドアウト溶解プロセスにおける膜の高度増大の時点までインタクトな膜障壁によって保持されたことが示唆された。Alexa 555色素またはSR101色素がGFP発現性標的細胞の細胞内空間をそれらの幾何学的境界内に厳密に満たすと、これらの細胞の内部のGFP蛍光レベルは即時的に低下した（図8、10、14および32）。図8および32に提示された実験では毛管による吸引は適用しなかった。GFP蛍光消失の時点で膜障壁はインタクトであったことから、GFP蛍光消失は細胞内GFP変性に起因する可能性が高いと考えられた。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、溶解バッファーの送達時点から膜の視認しうる増大の時点までという時間間隔内に、一部の界面活性剤モノマーがギャップ結合を経由して周辺細胞へと通過した可能性を完全に否定することはできない。しかし、Alexa 555（MW 10000）もSR101（MW 606）も、ギャップ結合を経由して周辺細胞に検出可能なレベルで通過することは認められなかった（図12および32）。
【０１６４】
膜可溶化の時点で、ライセートは垂直に同時毛管作用による吸引によって取り込まれた。本明細書中の他所で記載されているように、標的細胞の容積は、吸引チャンネル内への垂直な取り込みの間に、希釈されておよそ1000倍となる（数ピコリットルから5〜10ナノリットルまで）。単細胞分解能の主張においては、そのような急速かつ同時の希釈（最終的に1000倍）により、インサイドアウト溶解のこの最後の段階における周囲溶解がなくなった可能性が高い。
【０１６５】
ライセート取り込み（インサイドアウト溶解の最終ステージ）時における希釈された界面活性剤と標的細胞の周囲周辺との一過性接触（1〜4秒）が混入を招くか否かを検討するための実験を行うことができる。GAD67-GFP海馬の切片を入手し、GFP発現細胞によって取り囲まれた暗色細胞（GFPを発現しない）について検討する。この暗色細胞を溶解させて、得られたライセート中にGFPが存在しないか否かを判定するために測定することができる。
【０１６６】
単細胞ライセートのプリンティング
インサイドアウト溶解によってサンプリングを行った各単細胞のライセートを近傍の毛管作用による吸引チャンネルによって取り込んだが、これはそれ故に、組織切片の周囲のサンプル溶液（ハンクス緩衝塩類溶液（HBSS））中に希釈されている。各単細胞の取り込まれた希釈ライセートの体積はおよそ5〜10nLと推定された。この体積推定値は以下のようにして算出した：特製の吸引用屈曲マイクロピペットを、インサイドアウト溶解を誘発するまでそれが確実に空であるようにする目的で、溶解バッファーの送達時点まで陽圧下に保った。続いて陽圧を解除して、マイクロピペットの毛管作用によって垂直吸引を誘発させた。同時に、標的細胞のインサイドアウト溶解も同じく誘発させた。標的細胞のライセートが完全に取り込まれた後に、吸引用マイクロピペットをロボット制御によってサンプル溶液から数秒以内に抜去した。視認しうる取り込まれた体積を考慮し、吸引用マイクロピペットのおよその形状寸法を考慮した上で、5〜10nLという上述の上限が導き出された。
【０１６７】
各単細胞のタンパク質内容物を分析する目的で、取り込まれた各単細胞ライセートを、ガラスにマウントしたニトロセルロースパッド上にプリントした。極めて小さなスポット（20〜50μm）の境界内に、ニトロセルロース上の希釈された各単細胞ライセート（5〜10nL）のタンパク質を富化するための方法を開発した。この方法は、小さな区域内に適用された抽出物のタンパク質と急速に結合する一方で、溶媒がニトロセルロースの毛管作用によって放射状様式で自由に広がりニトロセルロース上のはるかに大きな区域から自然に蒸発するというニトロセルロースの生物物理学特性に基づく（図13A）。ライセートの全体積の画分を、ニトロセルロース上の同じスポットに対してこの様式で繰り返し適用することにより、各単細胞ライセートのタンパク質内容物が20〜50μmスポットの境界内部に富化される（図13）。単細胞ライセートがニトロセルロース上の小さな密なスポット中に濃縮されたため、ニトロセルロースによって生じるノイズは無視しうると予想された。
【０１６８】
生組織表面は細胞片を含むことがある。吸引プロトコールによっても、周辺培地（HBSS）および組織切片内部のすべての可溶性因子が収集された。このため、ニトロセルロース上への単細胞ライセートのプリンティング後に記録されたシグナルの特異性を確保するためのプロトコールを開発した。インサイドアウト溶解のすべての構成要素を標的細胞に配置した後に、その平衡陽圧を解除することによって毛管作用による吸引を誘発させた。1分後に、標的細胞のインサイドアウト溶解プロセスが誘発された。これらの2つの時間間隔での唯一の違いは、標的細胞に対する溶解バッファーの送達のみであった。標的細胞のライセートを取り込んだ後には、取り込まれた総体積の中に、ベースライン区分およびライセート区分という2つの区分が残った（図13B）。これらの2つの区分を続いて、同じニトロセルロースパッド上で隣り合う別々のスポットとしてプリントした。ライセートスポットはインサイドアウト溶解の結果を表し、ベースラインスポットは、ライセートスポットにおいて測定されたシグナルの原因となる可能性のある他のすべての因子を表している。このプロトコールをその後のすべての測定に用いた。
【０１６９】
1つのGFP発現性ソマトスタチン介在ニューロンのライセート区分を、同じニトロセルロースパッド上の3つの別々のスポットに細分した（図13B）。ベースライン区分も同じニトロセルロースパッド上の3つのスポットに細分した。各スポットは、ニトロセルロースにおける各付着物の間の放射状の溶媒拡延の視認しうる程度によって推定されるように、10個の視認上同一な付着物によって生成された。付着物の総体積は全スポットにわたっておよそ等しいと判断された。しかし、対応するGFPおよびβ-アクチンシグナルは、抗体インキュベーション後にライセートスポットのみで観察され、ベースラインスポットでは観察されなかった。図13Bにおけるこの例は、サンプリングした各単細胞のライセート区分がいくつかの下位区分に細分されたことを実証している。高いタンパク質シグナル密度はニトロセルロース上のはるかに小さいスポットの境界内でも達成され、そのため、ニトロセルロースパッド上の単細胞ライセート区分のただ1つの下位区分のみをタンパク質分析のためにプリントすること、および同じ単細胞ライセート区分の他の下位区分を他の分子クラスの分析のために用いることもさらに容易になった。
【０１７０】
インサイドアウト溶解の検証
GINマウスの同じ器官型海馬切片に由来する、2つの空間的に隔たった単細胞を溶解させた。1つの細胞はGFPを発現し（ソマトスタチン介在ニューロン）、もう1つの細胞はGFPを発現しなかった。これらの2つの細胞のライセート下位区分（各細胞につき3スポット、ライセート区分の全体をカバーする）および対応するベースライン下位区分（各細胞につき3スポット）を、本明細書中の他所に記載されているように、同じニトロセルロースパッド上にプリントした。次に、抗体特異性を評価するために陽性対照を添加した。精製組換えGFPの漸増曲線および同じ齢数のGINマウスの平均的海馬ライセートの漸増曲線を、Aushon Arrayerを利用して、単細胞ライセートスポットに隣り合わせて、さらに同じニトロセルロースパッド上の対応するベースラインスポットに隣り合わせてプリントした。
【０１７１】
2つの陰性対照もプリントした。第1の陰性対照を得るために、送達用マイクロピペットおよび吸引用マイクロピペットを、組織切片の非存在下で、HBSSを満たしたサンプルチャンバー中に隣り合わせて配置した。
【０１７２】
続いて、送達用ピペットからの溶解バッファーを吸引用マイクロピペットによって層流として取り込み、上述の単細胞ライセートと同じ様式で、同じニトロセルロースパッド上にプリントした（「組織なし、LB」、図14）。これは第1の陰性対照を表す。Alexa 555デキストランと混合したHBSSの流れを、インサイドアウト溶解のために通常用いるのと同じ環境下で、GINマウスの海馬切片における単細胞に対して適用したところ、溶解は全くみられなかった。取り込まれた溶液を、上述の単細胞ライセートと同じ様式で、同じニトロセルロースパッド上にプリントした（「組織、なしLB」、図14）。これは第2の陰性対照を表す。全体として、ベースラインスポットおよび上述の2つの陰性対照は、2つの単細胞のライセートスポットにおいて記録されたシグナルの原因となる可能性のある、考えられるすべての非特異的因子を包含していた。ベースラインスポットおよび2つの陰性対照によってカバーされた非特異的因子には、以下のものが含まれた：溶解バッファー（Tris・HCl 50mM、SDS 2％、グリセロール5％、NaF 1mM、0.5mM AlexaD555（10,000）、Halt（商標）Protease Inhibitor Cocktail 3X、Halt（商標）Phosphatase Inhibitor Cocktail 3X）、すべてのプリンティング用／手順用因子およびアーチファクト、対流因子、組織切片中の可溶性因子および組織表面上の細胞片。ベースラインスポットおよび陰性対照のセットによってカバーされなかった唯一のイベントは、生きた単細胞に対して溶解バッファーを適用するイベントであり、それはライセートスポットのみによってカバーされた（図14）。
【０１７３】
図14におけるデータは、陰性対照およびベースラインスポットが、バックグラウンドレベルを明らかに上回るGFPシグナルもβ-アクチンシグナルも生じなかったことを示している。陽性対照を対応する漸増曲線（同時並行的標準曲線）のスポットで測定したところ、シグナル強度はライセートスポットのシグナル強度の範囲内にあった。これらの陽性対照は、抗体が特異的であったことを示している（図14）。予想された通り、GIN-マウス海馬の全細胞を平均した後の平均的ライセートにおけるGFPレベルは無視しうる程度であった。図14におけるサンプリングしたGFP発現性単細胞は、図13に表示されたのと同じ細胞である。予想された通り、GFP発現細胞の3つのライセートスポットはGFPシグナルとβ-アクチンシグナルの両方を示したが、一方、暗色細胞（CA3ニューロン）から生成された3つのライセートスポットはβ-アクチンシグナルのみを示した。図14におけるAlexa 555の痕跡はサンプルのプリンティングの直後に測定され、ライセートスポットおよび主な陰性対照スポットでのみ観察されたが、ベースラインスポットでは観察されなかった。すべての陰性対照によって陰性結果が得られ、一方、すべての陽性対照によって陽性結果が得られたことからみて、ライセートスポットにおけるGFPシグナルおよびβ-アクチンシグナルは、生きた単細胞に対して溶解バッファーを適用するイベントのみに伴っていた可能性が高い。したがって、これらのシグナルは必然的に、海馬におけるインサイドアウト溶解によって溶解された単細胞から生じたものである。
【０１７４】
自動化およびスループット
インサイドアウト溶解方法をライセートプリンティング手順とインターフェース接続するために、高度の設備を最初から構築した（図15）。この設備により、すべての手順用構成要素の精密な位置決めが容易になり、これらの構成要素の迅速な協調的移動が可能になった。プログラム可能な素早い移動は、ニトロセルロース上でのインサイドアウト溶解方法からプリンティング手順への切り換えのために必要とされる。溶解およびプリンティングのプロセスにかかわる液体体積が小さく（およそ10nLのライセート＋およそ30nLのベースライン）、かつ開口部が小さい（10μm）ことから、最終的な単細胞ライセートの取り込みからわずか数秒以内にプリンティング手順に切り換えることが必要であった。重要なこととして、さらなる高度の自動化に向けた基幹施設も構築されている。Sutter Instrument Companyによって提供された基本コマンドライブラリーの上位にあるC++ライブラリーは、4つのロボットアームのμm以下の分解能でのあらゆる一連の動きをコードするように書かれた。このライブラリーは、溶解送達プロセスの完全自動化のために用いられた（図7および8）。ユーザーインターフェースも便利になるように構築した（図15）。
【０１７５】
溶解バッファーを急速に、そしていくつかの場合には完全に自動化された様式で送達した（図8）。溶解バッファーの現行の配合物が与えられると、細胞内GFP変性は溶解バッファー送達の開始後およそ10秒間までに完了した（図8）。膜可溶化後のライセートの取り込みにはおよそ10秒間を要した（図12）。したがって、プロセス全体では少なくとも10秒間を要し、最適化の後には最大20秒間を要すると考えられる。各初期組織サンプルから数十の器官型切片のために十分な材料が得られたことからみて、プロセス全体の並行化により、ある所与の組織サンプルに関して単細胞当たり2秒という有効スループットがもたらされる可能性があると考えられる。
【０１７６】
標的単細胞の全タンパク質の取り込み
単細胞ライセートをニトロセルロース上に完全に付着させた（図13および14）。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、図22は、本明細書中の他所に記載されているように、インビボGFP蛍光が、4つのGFP発現細胞および2つの暗色細胞のライセートのサンプリングおよび分析の後に記録されたGFPシグナルと完全に相関したことから、サイトゾル可溶性タンパク質が完全に取り込まれたことを示唆している。標的単細胞の全タンパク質が変性し、可溶化されて取り込まれたか否かを明らかにするための実験を行うことができる。すべての膜タンパク質、および膜タンパク質とクラスター化する全タンパク質がインサイドアウト溶解プロセスにおいて取り込まれたか否かを判定するための実験を行うことができる。より強力な変性剤、例えば尿素などを含有する異なる溶解バッファー配合物を、インサイドアウト溶解プロセスに利用することができる。
【０１７７】
実施例2：単細胞ライセートマイクロアレイ
単細胞ライセートおよびベースラインを、本明細書中の他所に記載されているように、ニトロセルロースパッド上にプリントした。高精度アレイヤーを用いて、精製された組換えタンパク質および／または対照ライセートの漸増系列を、同じニトロセルロースパッド上の単細胞ライセートのプリントされたスポットの隣にプリントした。ランタニド標識抗体の混合物を適用し、各スポットをニトロセルロース上からサンプリングして、ランタニドシグナルをLA-ICP-MS（レーザーアブレーション型のICP-MS）で検出した。
【０１７８】
この戦略により、ライセートマイクロアレイおよびCyTOFの欠点が解消された。すなわち、この戦略は、限られた単細胞材料の細分画を必要とせず、ニトロセルロースの自己蛍光がなくなり、その結果、単細胞測定に関するライセートマイクロアレイの制約を解消した。この戦略は組織固定／透過処理および組織離解を必要とせず、その結果、組織分析に関するCyTOFの制約を解消した。
【０１７９】
同時に、この戦略は2つの方法の利点も取り入れている。すなわち、この戦略により、本明細書中の他所で考察しているように、ライセートマイクロアレイにおけるような、同時並行的標準曲線のプリンティングおよび抗体プローブの厳密な検証が可能になった。同時に、この戦略はまた、ランタニド標識の多重化能も取り入れている。
【０１８０】
これらの実験に使用した材料および方法について以下に説明する。
【０１８１】
材料および方法
抗体の検証および結合体化
Cell Signaling Technologyの抗体はすべて、標準的な製剤および特製のBSA非含有製剤の両方として注文した。β-アクチン抗体はSigmaから入手し、GFP抗体はEpitomicsから入手し、これらは標準的なBSA非含有製剤として得られた。単細胞ライセートマイクロアレイにおけるタンパク質を測定するためには、BSA非含有抗体を、種々のランタニドを保有するポリマーと結合体化した。8種の抗体のすべてを、異なるランタニド標識と1対1の様式で結合体化させた。ポリマーおよびランタニドはDVS Sciencesから入手し、それらの結合体化プロトコールに従った。標準的なBSA含有製剤にあるCell Signaling Technologyの抗体を、ウエスタンブロット法のために用いた。
【０１８２】
GINマウスの平均的海馬ライセートを得るためには、同じマウスから2つの海馬サンプルを切離し、他のすべての手順に用いたのと同じSDS含有溶解バッファー200μLの中に素早く入れた。チューブは、溶解バッファー中に浸漬した海馬サンプルとともに4℃の低温室内に2時間保った。続いて、細胞外マトリックスおよびDNAを除去するために海馬平均的ライセートを濾過し、-80℃の冷凍器中で貯蔵した。平均的ライセートにおけるタンパク質の濃度はMicro BCA（商標）タンパク質アッセイによって測定し、3.1mg／ml前後であると推定された。単細胞ライセートマイクロアレイ実験に用いたpan特異的抗体は、ライセートマイクロアレイの形式での一般的使用に関してあらかじめ検証済みであったため、マウスにおけるこれらの抗体の特異性を確認するために平均的海馬ライセートに対してウエスタンブロット実験のみを実行した。NuPAGE（登録商標）SDS-PAGE Gel System（Life Technologies）を用いた。各平均的ライセートブロットを関心対象の一次抗体とともに、さらにβ-アクチン抗体とともにインキュベートした。ブロットを対応する蛍光標識二次抗体とともにインキュベートした後に、シグナル強度をLiCor Odysseyスキャナーで取得した。
【０１８３】
LA-ICP-MSによる検出
本明細書中の他所に記載された、インサイドアウト溶解手順、単細胞ライセートのためのプリンティング手順、漸増系列のためのプリンティング手順、および抗体インキュベーション手順を、単細胞ライセートマイクロアレイ実験に用いた。
【０１８４】
Thermo Electron X-Series ICP-MS（ICP-MS）およびNew Wave 213nm UV Laser（LA）を、シグナル検出およびスポットサンプリングのために用いた。LA-ICP-MS計測機器の感度および安定性はいずれも、ニトロセルロースパッド上の関心対象のスポットのサンプリングの前に最適化した。通常、LA-ICP-MSの感度はアルゴン流に依存する。アルゴン流は、アルゴンイオン化を介して強い振動磁場によって生成される誘導結合プラズマを持続させるために必須である。アルゴン流はまた、イオン化された元素を質量分析器に投入する前に、原子化およびイオン化のためにサンプルをプラズマ中に導入するためにも用いられる。このように、アルゴン流の最適化は高感度を達成するために極めて重要である。計測機器のスイッチを入れた後に、高感度を達成するために標準的な塩類溶液を用いてICP-MSにおいてアルゴン流を最適化した。その後に、計測機器をレーザーアブレーションモードに切り換えた。レーザーアブレーションを行った全スポットの直径は80μmであった。レーザー強度は、各ニトロセルロースパッドの下方のガラス基部のサンプリングが最小限に抑えられるように最適化した。
【０１８５】
実験の結果について以下に説明する。
【０１８６】
多重測定
ライセートマイクロアレイおよびランタニド標識／CyTOFの利点を1つのプラットフォームに組み合わせ、欠点をなくすことにより、固形組織の単細胞におけるネイティブタンパク質の多重分析測定を行うことができる（表2）。このプラットフォームは単細胞ライセートマイクロアレイと称することができる（図17）。
【０１８７】
（表２）単細胞ライセートマイクロアレイは、固形組織の単細胞におけるネイティブタンパク質の多重分析用タンパク質測定を可能にする。白：欠点、グレー：利点。
0006317353.tif 000003
【０１８８】
ライセートマイクロアレイ技術（逆相ライセートアレイとも称する）は、2001年に最初に報告された（Paweletz et al., 2001, Oncogene 20:1981-1989）。ガラスにマウントしたニトロセルロースパッド上に小さなライセートスポットをロボット制御によって高いシグナル密度でプリントすること（直径ほぼ200μm）、およびこれらのニトロセルロースパッドを検証済みの抗体でプローブ検索することにより、サンプルおよび生理的条件の広範なセットにわたり、高度に多重なタンパク質測定において高い感度および少ないサンプル要求条件が達成される。対照ライセートおよび／または精製された標的タンパク質の漸増曲線を、同じニトロセルロースパッド上に未知のサンプルに隣り合わせてプリントすることができる。これらの同時並行的漸増曲線により、各抗体プローブに関する標準曲線が明らかになる。したがって、ライセートマイクロアレイは低基質レベルでのシグナル非線形性を補償し、記録されたシグナルの違いを対応する数量の違いに対してマッピングすることを可能にする。
【０１８９】
ライセートマイクロアレイの規模変更性に対する主な障害は、さまざまなライセートにわたる交差反応性が一様に低い利用可能な抗体の数にある。ほとんどの抗体は非特異的抗原と交差反応する。ウエスタンブロット法とは対照的に、ライセートマイクロアレイでは交差反応性シグナル構成要素を、タンパク質のサイズ分離によって特異的シグナル構成要素と分離することができない。ライセートマイクロアレイでは、あらゆる所与のライセートスポットが元のサンプルのすべてのタンパク質の均質な混合物を含有し、それ故にあらゆる交差反応性シグナルが、各ライセートスポットにおける記録された総シグナルの原因になる可能性があると考えられる。以下の例は、抗体の交差反応性がどのようにしてライセートマイクロアレイ測定における特異的シグナル構成要素を不明瞭にしうるかを実証している。
P（Ab結合｜標的）＝0.99
｜P（Ab結合｜非標的1）＝0.01
P（Ab結合｜非標的2）＝0.05
標的数＝1000
非標的1の数＝70,000
非標的2の数＝29,000
であれば、
P（Ab結合）＝0.0314
E（＃総Ab結合）＝3140
E（＃特異的Ab結合）＝990
となる。
【０１９０】
上記の例は、スポット化されたタンパク質の均質な混合物において所与の抗体および比較的少数の標的が与えられた場合に、交差反応性シグナル構成要素（2150）が、特異的シグナル構成要素（990）の少なくとも2倍であることを示している。この例はまた、抗体交差反応性を3種のパラメーターによってパラメーター化しうることも実証している：1）全混合物における標的タンパク質の割合、2）混合物におけるさまざまな非標的タンパク質の分布、ならびに3）標的および非標的に対する所与の抗体の固有結合確率。多くの極めて重要なキナーゼおよびホスファターゼは低コピー数（単細胞内に100〜1000個）で存在する。非標的タンパク質の分布も、1つの細胞型の中でも細胞によってさまざまである上、細胞型によってもさまざまである。ライセートマイクロアレイの目的は、未知のサンプルにおける極めて重要なタンパク質のレベルを測定することである。したがって、抗体の結合確率は、ライセートマイクロアレイにおける抗体の交差反応性を最小限に抑えるために最適化しうる唯一のパラメーターである。最適な結合確率を備える抗体を同定するためには、高度のスクリーニング試験が必要である。
【０１９１】
Seveckaは、pan特異的抗体に対するスクリーニング試験のセットを設計した（Sevecka et al., 2011, Mol. Cell Proteomics 10: M110.005363）。それぞれの試験抗体に関して、それらの第1の試験では、17種の異なるヒト細胞株のすべてのライセートにわたってウエスタンブロット法において正しいサイズの単一の顕性バンドの存在が必要とされ、一方、それらの第2の試験では、ウエスタンブロット法で測定された標的レベルが、同じ17種のヒト細胞株にわたってライセートマイクロアレイにおける対応するレベルと高度に相関（＞0.75）することも必要とされた。各細胞株は種々のレベルの標的抗原を発現し、おそらくは種々のレベルの非標的タンパク質も発現すると考えられる。ある所与の抗体の結合確率が最適であれば、それは複数の異なる細胞株にわたって特異的であると考えられるが、これは交差反応性構成要素の細胞株依存性のばらつきが異なる標的レベルの正確な検出に影響を及ぼさないと考えられるためである。このことはウエスタンブロット法とライセートマイクロアレイとの間の高い相関をもたらすと考えられる。ある所与の抗体の結合確率が低ければ、細胞株依存性の違いおよび交差反応性構成要素のノイズがライセートマイクロアレイにおける真の標的レベルを覆い隠して、低い相関をもたらすと考えられる（図16）。Seveckaらによる第2の試験は、17件の独立ベルヌーイ試行列に等しいが、これはすべての別個の細胞株をベルヌーイ試行とみなすことができ、試験抗体をバイアスコイン（biased coin）とみなすことができるためである。17回の独立試行の後に17件またはおよそ17件の「良好な」アウトカムが得られれば、この特定の抗体（コイン）はいかなる他の細胞状況（将来の試行）においても特異的である（バイアスあり＝優れた結合確率）と考えられる確率が高く、それ故に未知の細胞型にわたる正確な測定を行うために用いることができる。Seveckaらによって試験された129件のpan特異的抗体のうち10％はこれらの2つの試験に合格した。この選択された抗体セットは一般に、ライセートマイクロアレイの形式で未知のサンプル中のタンパク質を測定するために有効である。
【０１９２】
ライセートマイクロアレイは単細胞測定のためには適切ではない。ライセートマイクロアレイの多重化能は元の均質なサンプルのその細分画への細分化、およびこれらの細分画の、複数の空間的に隔たったニトロセルロースパッド上へのプリンティング、および異なる抗体を用いる各パッドのその後のインキュベーションに基づく。単細胞の場合には、元のタンパク質材料は極めて限られており、タンパク質の多重化のみの目的で細分すべきではない。ライセートマイクロアレイにおけるシグナル取得は、蛍光標識された二次抗体のスキャニングによって達成される。この環境において、少量の単細胞材料を分析しようとする場合には、ニトロセルロースの自己蛍光が手に負えないほど高いこともある。ニトロセルロースの自己蛍光は、ライセートマイクロアレイが単細胞測定のために適切ではない、別の理由である。
【０１９３】
原子質量分析法によって金属標識プローブを検出するという可能性は、2002年に最初に報告された（Quinn et al., 2002, J. Anal. At Spectrom 17:892-896）。種々の希少金属標識を、親和性に基づく種々のプローブと1対1様式で結合体化することにより、既存の希少金属元素は数多いことから、あらゆるプローブに基づく測定の多重化能を著しく高めることができる。プローブ検索したサンプルを5,000〜10,000℃のプラズマに通して処理すると（誘導結合プラズマ質量分析法、ICP-MS）、このサンプルのすべての分子は、質量分析モジュールに入る前に原子化され、イオン化される。希少金属はほとんどの生体システムには意味のあるレベルでは存在しないため、希少金属の測定された計数値は、プローブ検索したサンプル中に存在する各々の標識プローブのレベルに対応することになる。例えば、抗体を、ランタニドキレート剤を含有するポリマーと結合体化させることができる。これらのランタニド標識抗体は、タンパク質の高度に多重な検出を可能にする。ランタニド標識は、DVS SciencesによるCyTOF／Mass Cytometry計測機器に関連して開発され、商品化されている（Bendall et al., 2011）。この計測機器はフローサイトメトリーをエミュレートしている。このため、CyTOFも、固形組織中の単細胞を分析することに関してフローサイトメトリーと同じ制約を有する（表2）。
【０１９４】
抗体検証およびランタニド標識
本明細書中の他所に記載されているようなライセートマイクロアレイにおける一般的使用に関して、Seveckaらによって以前に検証されたpan特異的抗体のセットを、単細胞ライセートマイクロアレイの開発のために入手した。17種の異なるヒト細胞株に対して試験した129種のpan特異的抗体から、Seveckaらは、ライセートマイクロアレイにおける分析研究のための高い一般的特異性を有する12種の抗体を同定することができた（Sevecka et al., 2011, Mol Cell Proteomics 10:M110.005363）。これらの12種の抗体のサブセットを、単細胞ライセートマイクロアレイの開発のために用いた。マウス海馬の器官型培養物における単細胞のサンプリングのためにインサイドアウト溶解方法を用いようとしたため、選択されたサブセットにおける各抗体はマウスにおいて抗原性であることも必要であった。キナーゼを標的抗原として選択したが、これはそれらが細胞シグナル伝達において極めて重要な役割を果たしていること、および単細胞におけるそれらの相対的存在量が少ないと予想されたことが理由であった。単細胞ライセートマイクロアレイによるこれらのキナーゼの測定が成功すれば、この方法の感度の高さが確認されたことになるであろう。FAK、PKCδ、PKCαおよびPAK1を標的キナーゼ抗原として選択した。β-カテニンに対する検証済みの抗体も含めた。GINマウスの器官型海馬培養物において希少なGFP標識ソマトスタチン介在ニューロンを溶解させようとすることから、2つのGFP特異的抗体を抗体の全セットに加えた。これらのGFP特異的抗体のうち1つは、本明細書中の他所に記載されているような、インサイドアウト溶解の検証に用いたのと同じ抗体であった。
【０１９５】
キナーゼおよびβ-カテニンに対する選択された抗体は17種のヒト細胞株に対して以前に検証されており、本明細書中の他所で考察しているように、いかなる未知の状況でもうまく働くと予想されたことから、マウスにおけるそれらの特異性の簡易な確認で十分であると推察した。ウエスタンブロット実験を、6日齢GINマウスの海馬の平均的ライセートに対して行った。これらの抗体はすべて、正しいサイズの明らかな顕性バンドを有し、それ故にマウス抗原に対するそれらの特異性が確かめられた（図18）。GFP抗体については独立して検証は行わず、特異的であると考えたが、これは後の実験において確認された。
【０１９６】
次に、選択された抗体のセットの精製されたBSA非含有製剤を、その後のランタニド結合体化のために入手した。ランタニド結合体化は、入手したランタニドポリマーの製造元（DVS Sciences）によって提供されたプロトコールに従って行った。抗体および対応するランタニド標識のリストは表3に提示されている。
【０１９７】
（表３）ライセートマイクロアレイに関して以前に検証され、続いてウエスタンブロット法によって確認された、選択された抗体セットのランタニド標識
0006317353.tif 000004
【０１９８】
単細胞ライセートマイクロアレイによるネイティブタンパク質の多重分析タンパク質測定
GINマウスの生きた器官型海馬培養物（出生後第5日＋インビトロで7日）の2つの切片から、4つのGFP発現性ソマトスタチン介在ニューロンをサンプリングした。同じ海馬切片のCA3領域から、CA3錐体ニューロンと推定されるものも2つ、サンプリングした。これらの6つの単細胞ライセートおよびそれらの対応するベースラインスポットを、ガラスにマウントした同じニトロセルロースパッド上にプリントした。各単細胞ライセートに関して、本明細書中の他所に記載されているように、ライセート区分全体を有する1つのスポットと、ベースライン区分を有する1つのスポットをそれぞれプリントした。各単細胞ライセートに関して、本明細書中の他所に記載されているように、ライセート区分全体を有する1つのスポット（30個の付着物）と、ベースライン区分を有する1つのスポット（31〜32個の付着物）をプリントした。各細胞に関して、ライセートスポットにおける液体の付着量は、対応するベースラインスポットにおける液体の付着量とおよそ等しかった。すべてのインビボGFP強度も、画像化設備の同じ環境下で、単細胞溶解の前に記録した。画像化されてサンプリングされた細胞はすべて、2つの海馬切片の表面近くにあったため、光散乱はこれらの細胞のインビボGFP蛍光の記録強度に対して有意な影響を及ぼさなかったはずである。サンプリングしたCA3錐体ニューロンは、画像化設備の検出感度ではGFPを発現しなかった。
【０１９９】
次に、精製された組換えPKCα、PKCδおよびGFPの漸増系列を、同じニトロセルロースパッド上に、プリントした単細胞ライセートの隣、およびそれらのベースラインの隣に、高精度Aushon Arrayerを用いてプリントした。GINマウスの平均的海馬ライセートの漸増系列も、組換えタンパク質のこれらの漸増系列の隣にプリントした。すべてのスポットには、プリントしたすべてのスポットの目視座標をその後の洗浄段階および抗体インキュベーション段階を通じて維持する目的で、ニトロセルロースパッド上で、プリントしたスポットの隣に10μm大の刻み目を入れることによって目印を付けた。
【０２００】
洗浄段階および抗体インキュベーション段階の同じセットを、Seveckaによって記載された通りに（Sevecka et al., 2011, Mol Cell Proteomics 10:M110.005363）、プリントされた、ガラスにマウントしたニトロセルロースパッドに対して適用した。1つの異なる実験セットでは、以下の濃度の8種のランタニド標識抗体により、単細胞ライセートによって生成された対応するシグナルが、LA-ICP-MS検出器の感度範囲で生じたことが明らかになった：結合体化β-アクチン抗体に関しては0.66μg／ml、他のすべての結合体化抗体に関しては3.3μg／ml。抗体インキュベーション後に、プリントされた単細胞ライセートのスポット、それらのベースラインのスポット、およびプリントされたすべての漸増系列のスポットを、調整および較正済みのLA-ICP-MS計測機器を利用して、単回の取得実行でサンプリングした。レーザー強度を調節すること、ならびに85Rbおよび88Srの痕跡を記録することによって、ニトロセルロースパッドのガラス基部はレーザーアブレーションによって有意な程度にはサンプリングされなかったことが保証された。有意な量のガラス（85Rbおよび88Srの痕跡によって指し示される）およびニトロセルロース（視認しうるごく小さなニトロセルロース穴によって指し示される）のサンプリングによって、ランタニド痕跡が検出されないことを確認するために、高いレーザー強度の対照パルスも、ニトロセルロースパッドのブランク領域に対して適用した。このように、洗浄および抗体インキュベーションの後に、ガラスおよびニトロセルロース単独ではランタニドの検出は導かれなかった。
【０２０１】
LA-ICP-MSによって得られた測定値を図19に提示している。図19Aの上の最初の区画において、それぞれの列は、サンプリングした各細胞のインサイドアウト溶解プロセスの3つの時点（「前」、「溶解」、「後」）を表している。各細胞に関して、溶解プロセスの選択された3つの時点は、予想された通り、細胞内空間がSDS含有溶解バッファーによって満たされた後にはGFPがその蛍光を失ったことを示している。各列における最後の時点（「後」）からは、標的細胞の内容物が同時毛管作用による吸引チャンネルによって最終的に取り込まれたことが示された。図19の他の区画では、各スポットのサンプリングのために以下のLA-ICP-MSサンプリング手順を用いた。LA-ICP-MS計測機器による、ニトロセルロースパッド上の各スポットのサンプリング手順には、3分間を要した（図19における時間軸は、サンプリング手順においてLA-ICP-MS検出器によって記録されたタイムフレームの数字である）。各サンプリング手順の最初の区間では、レーザーアブレーションの前のノイズデータを取得することによって計測機器ノイズを測定した。続いて、一連のレーザーパルスをニトロセルロースパッド上のスポット部位に適用した。この一連の高速レーザーパルスは、60秒の持続時間にわたって適用した。各サンプリング手順における残りの時間は、最も後にサンプリングしたスポットから連続して測定された要素の計数値が計測機器のノイズレベルに復帰するのを待つことに費やした。各スポットに対してこのサンプリング手順を用いて、単細胞ライセート、ベースラインおよび漸増系列のすべてのスポットを、上記のニトロセルロースパッド上でサンプリングした。
【０２０２】
HBSS溶液、組織片および／または可溶性組織因子を含有するベースラインスポットは、ほとんどの場合に低シグナルを示した（細胞1〜4；細胞には左から右、そして上から下の順に番号を付した）。最後の2つのソマトスタチン介在ニューロン（細胞5および細胞6）のベースラインスポットからは、顕著なβ-アクチンシグナルが示され、対応するライセートスポットにおけるβ-アクチンシグナルは比較的低かった。他の4つの細胞（細胞1〜4）のベースラインスポットでは、8つのチャンネルすべてにわたって、計測機器のノイズレベルを著しく上回るシグナルは生じなかった。各ベースラインスポットにおいてプリントされた体積は、本明細書中の他所に記載されているように、各ライセートスポットにおいてプリントされた体積よりも多いか、またはおよそ等しかった。最初の4つの細胞（細胞1〜4）の各ベースラインスポットは、インサイドアウト溶解から、プリンティング手順および／またはシグナル検出手順から生じる可能性のある手順ノイズの考えられるすべての源を包含していた。手順ノイズのこれらの源には以下のものが含まれた：HBSS溶液、組織片、組織中の可溶性因子、プリンティングプロセス、インキュベーション／洗浄の段階、およびLA-ICP-MSノイズ。このため、最初の4細胞のライセートスポットにおいて、レーザー発火時に記録されたあらゆるシグナルの違いは、上述の手順ノイズ源のいずれのサブセットから生じたものでもなかった。したがって、最初の4つの細胞（細胞1〜4）のライセートスポットにおけるシグナルレベルは、ベースライン構成要素の非特異的シグナルレベルに起因するものではなかった。最初の4つの細胞のライセートスポットにおけるシグナル、およびそれらの間のシグナルの違いは、プリントされた単細胞ライセートに対する抗体結合の違いによって生じた。
【０２０３】
8つの次元すべてにわたって記録されたシグナルの調査により、各次元の内部の単細胞間でシグナルに有意な違いがあることが示唆された（図19）。これらの違いは手順ノイズ源に由来するものではなかった。これらのシグナルの違いはタンパク質数量の違いを表している可能性が高いと考えられたが、これは図14におけるデータから、溶解バッファーの構成要素は抗体結合に対して何ら検出可能な影響を及ぼさないことが示されたためである。キナーゼ抗体およびβ-カテニン抗体はすべて、17種の異なる細胞株という状況でライセートマイクロアレイの形式において検証済みであることからみて、これらの抗体はいかなる細胞型においても交差反応性が極めて低い構成要素を有する。図21は、同じニトロセルロースパッド上での精製されたPKCδおよびPKCαの同時並行的漸増系列から得られた予想されたシグナルを描写しており、このパッド上には単細胞ライセートおよびそれらの対応するベースラインもプリントされ、サンプリングされた（図19）。PKCδおよびPKCαの同時並行的漸増系列を見ることにより（図21）、ランタニド標識は検証済みの抗体の特異性に影響を及ぼさないことが観察された。8つの次元（チャンネル）のそれぞれの内部において単細胞間で測定されたシグナルの違いは、このため、これらのライセートスポットにおける標的タンパク質の対応する数量の違いに起因する可能性が高いと考えられる。
【０２０４】
サンプリングしたソマトスタチン介在ニューロンおよびCA3ニューロンのインビボGFP蛍光レベルは、インサイドアウト溶解の前に画像化設備の同じ環境下で記録されたことから、記録されたインビボGFP蛍光レベルを、サンプリングした同じ6つの単細胞にわたる対応する測定値と比較した。図22Bは、インサイドアウト溶解の前に記録されたインビボGFP蛍光と、単細胞ライセートマイクロアレイにおいて2種類のGFP抗体により同時にプローブ検索した対応する単細胞ライセートにおける測定されたGFPレベルとの間のほぼ完全な相関を示している。これはインサイドアウト溶解方法のさらなる検証となった。本明細書中の他所で記載されているように、しかもいかなる特定の理論にも拘束されないが、この高い相関値は、インサイドアウト溶解方法の間に、最も可溶性の高いタンパク質が単細胞から取り込まれた可能性を示唆する。GFP漸増系列の4つのスポットをサンプリングして、2つのGFP抗体のそれぞれについて同時並行的標準曲線を得た。各GFP抗体に対する結合体化手順がインキュベーション手順において同じであったこと、および2つの抗体の濃度が同じであったことから、図22Aにおける同じ漸増系列の同じ4つのスポットに由来するGFP標準曲線の勾配の違いは、これらの2つのGFP抗体の間のKD値の対応する違いに起因した可能性が高い。
【０２０５】
β-アクチンの組み込みレベルは、1つの事例を除き、サンプリングを行ったすべての単細胞にわたって同程度であった（図20）。第2のソマトスタチン介在ニューロン（図20における細胞4）のβ-アクチンレベルは、他の細胞のものよりも有意に低かった。この結果は、この同じ細胞の溶解前インビボ蛍光と完全に相関した、単細胞ライセートマイクロアレイにおいて測定されたGFPの高いレベルに影響を及ぼさなかった。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、1つの説明は、インサイドアウト溶解手順に用いた現行の溶解バッファーが、アクチンネットワークの可溶化のためには最適でないというものである。このことは、溶解バッファーの配合を変えることによって、または溶解手順をさらに最適化することによって、解決することができる。代替的な説明は、β-アクチンのレベルが単細胞毎に異なり、正規化のために用いることはできないというものである。今後の測定では、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）を代替的な正規化抗原として用いうる可能性がある。
【０２０６】
いくつかの標準曲線は、単細胞測定のために妥当なシグナル範囲内で非線形的であった（図21および22）。PKCδ、PKCαおよびGFP漸増系列（図21および22）を、各抗原の調製した希釈サンプルから、高精度Aushon Arrayer 2470によってプリントした。調製した各希釈サンプルから、漸増系列の各スポット上に、Aushon Arrayerによって8つずつの付着物をプリントしており、それ故、漸増系列の内部でスポット中に付着した抗原の量の間の違いは、この抗原の対応する希釈サンプル間の濃度の違いを表していると予想された（Aushon Arrayerプリンティングの例については、Sevecka et al., 2011を参照されたい）。Aushonはプリンティングノイズの数値を公表していないが、現行の環境では無視しうる程度であると予想される。スポット当たりの付着物の数が多いこと（8）により、プリントされた各スポットの内部でのライセート分布が均一であることも保証された。LA-ICP-MSサンプリング手順におけるレーザーアブレーションの間に、漸増系列のプリントされた各スポットの内部でサブスポットをサンプリングした。漸増系列のレーザーアブレーションサンプリングのすべてにおいて、初期スポットの内部でのサブスポットの位置は、同じに保たれた。
【０２０７】
いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、これらの実験パラメーターは、PKCδおよびGFPの標準曲線における低い抗原濃度での非線形性の出現（図21および22）が、Aushon Arrayerによるプリンティングの誤差に主として起因せず、LA-ICP-MSによるサンプリング手順に伴うスポット部位の誤差に主として起因するのでもないことを示唆する。シグナルの単調性および線形性は、すべての標準曲線において高い抗原濃度（図21および22におけるx軸高値）では減少しており、このことも、プリンティングおよびピペッティングの誤差が低い抗原濃度での非線形性の出現の主な原因ではないことを意味する。同じLA-ICP-MS実行時に同じニトロセルロースパッドから入手した、各標準曲線の最後のデータポイントにおけるシグナルレベルは、計測機器ノイズレベルを有意に上回り、4つのベースラインスポットにわたってノイズを上回った（細胞1〜4、図19）。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、これらの実験パラメーターは、Aushon Arrayerによるプリンティングのノイズ、ピペッティングのノイズ、およびLA-ICP-MSによるサンプリング手順のノイズが、PKCδおよびGFPの標準曲線における低い抗原濃度での非線形性の出現の主な原因ではなかったことを示唆する（図21および22）。非線形性は、抗体分子がニトロセルロース上の希釈された抗原と結合する確率および／または結合したままに保たれる確率の低下によって生じた可能性が高い。これらの抗体は二価であったため、上記の確率の低下は、抗体の結合部位が、低い抗原濃度ではニトロセルロース上の近傍の抗原によって飽和しなかったという事実と関連している可能性がある。単細胞ライセートマイクロアレイはこれらの非線形性の補正を行うことができ、それ故に単細胞集団にわたっての数量分布の正確な測定が可能である（図1および2）。
【０２０８】
実施例3：ヒト固形組織における複数の分子クラスにわたる多重化
複数の分子クラスにわたる多重化を行うための実験を行うことができる。本明細書中の他所で記載されているように、このライセート形式はあらゆる厳密な分析方法と適合性がある。タンパク質、転写物および／または代謝産物の多重測定値は、図13および14に示されているように、サンプリングした単細胞のライセート区分をライセート下位区分に細分することによって同じ単細胞から得ることができる。単細胞ライセートマイクロアレイに対するサンプル要求条件をさらに軽減する目的で、プリントされる各ライセートスポットの直径を50μmから20μmに縮小させることができる。これにより、単細胞ライセートの全区分のうちより大きな下位区分を、転写物の分析（RT-qPCR）および／または代謝産物の分析（MALDI）のために維持しながら、より小さい20μmスポットのシグナル密度が50μmスポットのシグナル密度とおよそ等しくなることが保証されると考えられる。この環境において、LA-ICP-MSを伴うレーザーアブレーションの手順を、20μmライセートスポットにおける高いシグナル密度を最大限に活用するために調整することができ、この際、レーザーの直径を20μmに調整し、レーザーのエネルギーは、全スポットを1回または2回のみのレーザーパルスの範囲でサンプリングしうるように調整することができる。これらの2つの調整により、LA-ICP-MS計測機器の元素カウンターでわずか数秒という間隔で高いシグナル差が生じ、そのため、一続きのサンプリングで長い時間間隔にわたってシグナル曲線を積算することは不要になる。これは、LA-ICP-MS計測機器の固有ノイズ、およびレーザーアブレーションを行ったニトロセルロースによって生じるノイズに関して高いシグナル・ノイズ比をもたらす。したがって、単細胞ライセートの全区分のうち小さな下位区分だけで、同等な単細胞ライセートマイクロアレイ測定値を得ることができる。単細胞ライセートの全区分のうち他の下位区分は、転写物および／または代謝産物の分析のために用いることができる。また、細胞の内部でライセートを、吸引によるその取り込みの前および下位区分へのその細分の前に、より良く混合する目的で、サンプリング手順を最適化することもできる。
【０２０９】
単細胞ライセートの全区分の最初の下位区分を、単細胞ライセートマイクロアレイによる多重タンパク質測定のためにニトロセルロース上の20μmスポットに付着させた後に、単細胞全ライセートのうち残った下位区分の分析を、転写物をRT-qPCR反応で増幅することによって実現することができる。例えば、これはFluidigmプラットフォーム（Fluidigm Inc）の状況で行うことができる。また、代謝産物の多重分析をMALDIによって達成することもできる。Amantonicoらは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の単細胞のおよそ半分に等しい量のライセートにおけるADP、UTP、ATPおよびGTPの存在量を測定した（Amantonico et al., 2008, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47:5382-5385）。酵母の単細胞のサイズの中央値は82μm3である（Jorgensen et al., 2002, Science 297:395-400）。単一の哺乳動物COS-7細胞のサイズは2016±208μm3である（Bohil et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:12411-12416）。したがって、単細胞材料の量は哺乳動物細胞の場合にはかなり多いと予想され、それ故に、はるかにより高度な代謝産物多重化が可能であると考えられる。
【０２１０】
さらに、ヒト固形組織における単細胞分析を可能にするためのプラットフォームを用いることもできる。ヒト腫瘍の器官型培養物は、生検採取および切片化の後に1週間にわたって正常に発生することが示されている（Vaira et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:8352-8356）。本明細書に記載のサンプリングおよび分析の方法を、新たなカテゴリーの診断検査を明確にするために、単細胞薬理学を個別化するために、ならびに機構的バイオマーカーおよび薬物標的を迅速に同定するために、ヒト腫瘍の器官型培養物に用いることができる。
【０２１１】
標準曲線
漸増系列を二重反復物または三重反復物としてプリントすることによって標準曲線上の実際のエラーバーを導き出すための実験を行うことができる。上記の実験では漸増性二重反復物をプリントしたものの、同じLA-ICP-MS実行中には取得を行わなかったが、それは、Aushon Arrayerによるプリンティングのノイズ、ピペッティングのノイズ、およびLA-ICP-MSによるサンプリング手順のノイズが無視しうる程度であると仮定したためであった。また、日々の運転時のLA-ICP-MS調整のばらつきが、同じ漸増系列の二重反復物に由来するシグナルにどのような影響を及ぼすかを明らかにするための実験を行うこともできる。同じ漸増系列の二重反復物または三重反復物を同じニトロセルロースパッド上にプリントして、続いて複数の異なる日にLA-ICP-MSによってサンプリングすることができる。
【０２１２】
図19における4つのベースラインスポット（細胞1〜4）は、手順ノイズ源のすべてを包含していた。本明細書中の他所で記載されているように、これらの手順ノイズ源には以下のものが含まれた：HBSS溶液、組織片、組織中の可溶性因子、プリンティングプロセス、インキュベーション／洗浄の段階、LA-ICP-MSノイズ。しかし、これらの4つのベースラインスポットは、ニトロセルロースに対するタンパク質結合の確率的局面を測定していない可能性があり、その理由は、これらのベースラインスポットはタンパク質を大量には含まないように思われるためである。また、ニトロセルロース上の同濃度のタンパク質基質に対する同じ抗体濃度下での抗体結合に関して、何らかのさらなるノイズが存在する可能性もある。これらの2つのさらなるノイズ源を取り扱うための実験を行うことができる。平均組織ライセートの漸増曲線を、高精度Aushon Arrayerによって二重反復物または三重反復物としてプリントして、これらの二重反復物または三重反復物にわたって、8つの記録された次元（β-アクチン、β-カテニン、PKCα、PKCδ、PAK1、FAK、GFP2、GFP1）のそれぞれにおけるノイズを測定することができる。
【０２１３】
また、より優れた標準曲線を作成するための実験を行うこともできる。種々の既知の量の精製抗原を、関心対象の組織の、抗原を枯渇させた平均的ライセートに対して漸増することができる。そのような標準物質は検証済みの抗体の交差反応性構成要素を捕捉することができ、それは標準曲線の非線形性の原因である可能性がある。
【０２１４】
実施例4：Bayes Netによるデータ解析
最適なLearnerを選択するための試験（Bayes Netトポロジー＋固定MLサブルーチン）を関連データセットに対して実行した。同じ手順を、インサイドアウト溶解によって、および単細胞ライセートマイクロアレイによって可能になった単細胞測定の状況にも適用した。
【０２１５】
これらの実験に使用した材料および方法について以下に説明する。
【０２１６】
材料および方法
コードはPythonによって実装されており、Python 2.6上で実行した。
【０２１７】
112個のデータポイントからなる次元数10の癌データセットの各次元に対して、以下のように番号を付した：0‐Axl、1‐Met.p、2‐Stat3.p、3‐Akt.p、4‐cRaf.p、5‐Src.p、6‐Erk1.2.p、7‐S6.p1、8‐MAPK.p1、9‐癌診断。それぞれの有向非環式（directed acyclical）グラフを、Pythonにおけるタプルのリストとして表した：
NAIVE_BAYES_TUPLES ＝ map(tuple, [[9], [9,0], [9,1], [9,2], [9,3], [9,4], [9,5], [9,6], [9,7], [9,8]])
AXL_MET_AKT_BAYES_TUPLES ＝ map(tuple,[[9], [9,0], [9,0,1], [9,2], [9,3], [9,1,3,4], [9,5], [9,6], [9,7], [9,8]])
。
【０２１８】
各タプルを、辞書の辞書（dictionary of dictionaries）の第1の層におけるキーとして用いた。第1の層における各キーに関して考えられるすべての真／偽の指定タプルを、辞書の辞書の第2の層におけるキーとして用いた。続いて、第2の層の指定タプルを確率数値に対してマッピングした。Bayes Netクラスを、データインポートに関する関数、および最尤法によるパラメーター推定に関する関数といった必要な関数のすべてを組み入れるように作り出した。各Bayes Netトポロジーは上記の形式によって表され、それらをこのクラスにインポートすることができると考えられる。交差検証ルーチンもBayes Netクラスに実装した。このBayes Netクラスを用いて、15種のBayes Netトポロジーのすべてを10倍交差検証によって評価した。
【０２１９】
実験の結果について以下に説明する。
【０２２０】
Bayes Netトポロジー
高次元データセットにおいて、各データポイントは多重測定値の長いベクトルである。例えば、100件の異なるサンプルのそれぞれにおいて10種のタンパク質を測定することによって、100個のデータポイントからなる次元数10のデータセットが得られる。そのようなデータセットにおける各次元を確率変数とみなすことができる。すると、全データセットをすべての確率変数の同時確率分布によって公式的に表すことができる。好都合なグラフ表示がなければ、高次元データセットの同時確率分布を可視化すること、およびそれにおける多くの可能な条件付き独立性の仮定について推論することは困難である可能性がある。Bayes Netの基礎となる発想は、同時確率分布を有向非環式グラフによって表せるというものである（Pearl, 1982, Proceedings, AAAI-82）。そのようなグラフは可視化、解析および変更が容易である。Bayes Netにおける辺の方向を用いて、対応する同時確率分布の公式的数学表現を書き出すことができる（図23）。Bayes Netにおける確率変数は、そのすべての親確率変数に対して条件付きであれば、すべての非子孫確率変数に対して条件付き独立性である(Pearl, 1982, Proceedings, AAAI-82）。Bayes Netのトポロジーは、すべての条件付き独立性仮定を取り入れている。確率変数（頂点）の固定セットが与えられれば、条件付き独立性仮定の同じセットを異なるBayes Netトポロジー（辺）によって表すことができる（Pfeffer and Parkes, 2010, CS181 Lecture Notes, Harvard University）。このため、条件付き独立性仮定の同じセットを異なるBayes Netトポロジーに対してマッピングすることができる。
【０２２１】
高次元データセットの同時確率分布のグラフ表示は、計算機科学における標準的なグラフアルゴリズムが利用可能であることからも有用である。データの同時確率分布に関する多くの興味深い問題を、対応するグラフ問題へと単純化することができ、それ故に、大問題の事例に対するグラフアルゴリズムによって効率的に解決することができる。Bayes Netは対応する同時確率分布を表しているため、それをデータサンプリングのために生産的な様式で用いることもできる。
【０２２２】
データセットから、ある所与のBayes Netトポロジーのパラメーター値を学習するためには、標準的なやり方がある。Bayes Netのトポロジーが与えられれば、対応するパラメーター値を最尤法（ML）によって推定することができる。パラメーター値に関する事前分布が望ましい場合には、最大事後法（MAP）を用いることができる。Bayes Netに隠れた確率変数がある場合には、MLサブルーチンまたはMAPサブルーチンのいずれかを伴う期待値最大化（EM）アルゴリズムを用いて、その所与のデータセットからパラメーター値を学習することができる。これらの方法のすべてにより、適合するパラメーター値を推定することによって、ある所与のBayes Netのトポロジーをデータセットに対して適合させることができる。しかし、データセットに対するBayes Netの適合はパラメーター値がどの程度良好であるかに関する尺度としては優れたものではなく、学習しようとするデータセットにおける隠れた真の概念を捕捉するのは、この特定のBayes Netのトポロジーである。データセットは、隠れた真の概念によって生成されうるデータセットの分布からのサンプルである。1つの特定のデータセットにおけるパターンの過剰解釈を避けるために、過剰適合が最小限である最適なBayes Netを見つける。
【０２２３】
過剰適合の原因が、データセットにおけるノイズの存在にあることは一般的である。しかし、過剰適合が、ノイズを伴わない完全に決定論的な領域で起こることもある。決定論的領域では、過剰適合の主な原因は「次元の呪い」である（Pfeffer and Parkes, 2010, CS181 Lecture Notes, Harvard University；Bishop, 2006, Pattern Recognition and Machine Learning, Springer, First Edition）。「次元の呪い」は、非決定論的（ノイズの多い）領域における過剰適合の主な原因でもある。例えば、ゲノミクスでは、ノイズの多い数千もの特徴（次元）が、わずかな数のゲノム（データポイント）であっても記録される。わずかな数のデータポイントからなる高次元データセットが与えられた場合、データセットの多くの次元のいくつかにわたって興味深いパターンが出現するのは単に偶然によるものであり、サンプリングしたデータポイントの数が少ないことだけが原因である可能性が非常に高い。これらのパターンは偽性であり、学習しようとする隠れた真の概念を正確には表していない。そのような偽性パターンは、同じ隠れた真の概念からより多くのデータポイントをサンプリングすることによってなくすことができる。しかし、データは一般に、コンピュータ計算よりも費用がかかる。より多くのデータを取得することなく、測定のノイズおよび「次元の呪い」によって引き起こされる過剰適合を最小限に抑えることが好ましい。
【０２２４】
Bayes Netトポロジーは、パラメーター値を推定する前の仮説空間を表しており、分類などのさまざまな推論作業に用いうる十分に推定されたパラメーター値を有する最終的なBayes Netモデルとは区別されている。十分に推定されたパラメーター値を有する所与のBayes Netモデルの一般性を試験するための最良の方策は、同じ隠れた概念からサンプリングした独立データセットに対して、その予測の精度を評価することである。任意のデータセットが与えられれば、それを互いに素である2つのセット、すなわち訓練セットと試験セットに細分することができる。所与のBayes Netトポロジーのパラメーター値は、パラメーター推定ルーチン（ML、MAPまたはEM）を訓練セットに適用することによって決定することができる。学習されたBayes Netモデルの一般性は、その予測精度を、同じ隠れた概念から独立かつ全く同様にサンプリングされた試験セットに対して試験することにより、推定されたパラメーター値によって評価することができる。しかし、最初のBayes Netトポロジーが、隠れた真の概念の状況において、および／または所与のデータセットの状況において、過度に大きいかまたは過度に小さい仮説空間を表している可能性があるため、これによって過剰適合の問題を解決することはできない（Kearns and Vazirani, 1994, An Introduction to Computational Learning Theory, MIT Press）。過剰適合を最小限に抑えるためには、最適な仮説空間を表している最適なBayes Netトポロジーをまず選択しなければならない（Pfeffer and Parkes, 2010, CS181 Lecture Notes, Harvard University）。
【０２２５】
学習アルゴリズム（Learner）は、データセットを、十分に推定されたパラメーター値を有するモデルに対してマッピングする関数と定義される。1つの所与のLearnerにより、複数の異なるデータセットに対して複数の異なるモデルが生成される可能性が高いことは明らかである。Bayes Netの場合における学習アルゴリズムは、パラメーター推定方法（ML、MAPまたはEM）によって、およびこの特定のBayes Netのトポロジー（条件付き独立性仮定）によって定義される。MLなどの固定パラメーター推定法が与えられれば、Bayes Netトポロジーを変更することによって、異なるLearnerを生成することができる。複数の異なるBayes Netトポロジーを比較するという問題は、このようにして、最適なLearnerを選択するという問題に単純化される。最適なLearnerを選択するという問題は、機械学習の核心である。
【０２２６】
1つのアプローチは、各Learnerを1つの訓練セットに対して訓練させて、各Learnerによる出力である、学習したモデルを、独立かつ全く同様にサンプリングされた1つの試験セットに対して試験することである。その場合、その試験セットに対して最良の予測精度を有するモデルを出力するLearnerが、最適なLearnerである。しかし、データセットは確率変数でもある。1つの訓練セットおよび1つの試験セットのみからでは、最適でないLearnerが選択される可能性が高いと考えられる。このため、各Learnerの期待成績を推定して、独立かつ全く同様に（iid）サンプリングされた多くの訓練セットおよび試験セットペアにわたっての、その期待成績に基づいて、最適なLearnerを選択する。訓練および試験の上記のプロセスを、iidサンプリングを行った訓練セットおよび試験セットの多くのペアに対して各Learnerを用いて繰り返し、続いて各Learnerによるモデル出力の平均予測精度を、これらの訓練セットおよび試験セットのペアにわたって算出する。この手順により、各Learnerの期待成績の推定値が得られる。すべての試験セットにわたって最良の平均予測精度を有するモデルを出力するLearnerが、最適なLearnerである。
【０２２７】
限られたサイズのデータセットが与えられる場合には、交差検証が、その期待成績に基づいて最適なLearnerを選択するために適切な近似法である（Pfeffer and Parkes, 2010, CS181 Lecture Notes, Harvard University）。交差検証により、ただ1つのデータセットに対して最適なLearnerを選択することが可能になる。k倍交差検証では、データセットを、等しいサイズのk個のサブセットに細分する。このようにして、k iidサンプリングを行った試験セットを得て、それぞれをk倍交差検証のk回の実行のうち1回のみに用いる。k倍交差検証のk回の実行のそれぞれにおける訓練セットは、現在の試験セットを除外した他のk-1個のサブセットからなる。したがって、訓練セットはk倍交差検証のk回の実行にわたって重なり合っており、（試験セットとは対照的に）独立ではない。しかし、k倍交差検証は、限られたデータによるその期待成績に基づいて最適なLearnerを選択するための優れた近似法となる。最終的に、最適なLearnerを選択した後に、選択された最適なLearnerを全データセットに対して適用することによって、過剰適合が最小限となるように最終的な最適モデルを学習させることができる。重要なこととして、上記のLearner選択手順における最適なLearnerによる出力である、モデルの平均試験セット精度を、最終的な最適モデルの期待予測精度とみなすことはできない。これを行えるのは、Learner選択のためには用いなかった別の独立データセットに対してである。しかし、実際上は、最終的モデルの期待予測精度を実際に決定することなく、その最終的出力モデルを現実の用途に用いるのを始める前に、選択されたLearner（Bayes Netトポロジー＋ML）が最適なLearnerであることがわかれば、多くの場合は十分である。
【０２２８】
以上をまとめると、過剰適合の最小化は、最適な仮説空間を有する最適なLearner関数を選択することによって達成される。最適なLearnerによって定められる最適な仮説空間は、最終的モデルにおける過剰適合の程度を最小限に抑える。最適なLearnerによる出力である最終的モデルは一般的であり、かつ、過剰適合が最小限である隠れた真の概念を捕捉する。
【０２２９】
データセット
多重的タンパク質測定値のデータセットをライセートマイクロアレイによって取得した。56人のヒト患者に由来する急速冷凍ヒト組織サンプルをRIPA緩衝液中で溶解させた。腫瘍組織サンプルおよび隣接正常組織のサンプルを各患者から収集した。合計で56件の腫瘍組織のサンプルおよび56件の正常組織のサンプルが得られた。ほとんどの腫瘍は腺管癌として同定された（56件中48件）。112件のサンプルのそれぞれを、ガラスにマウントした100枚の異なるニトロセルロースパッド上に、Aushon Arrayerによってプリントした。続いて、これらのパッドのそれぞれを、ライセートマイクロアレイに関してあらかじめ検証された数千種の抗体からなる初期セットからの異なる一次抗体とともにインキュベートした。この検証済みの抗体のセットには、pan特異的抗体およびリン酸化部位特異的抗体が含まれた。各ニトロセルロースパッドを、正規化の目的で、検証済みのβ-アクチン抗体ともインキュベートした。対応する二次抗体とのその後のインキュベーションの後に、すべてのシグナル強度を記録して、1つのファイルにコンパイルした。
【０２３０】
最適なBayes Netトポロジー
上記のデータセットに関する第1の問題は、その高次元数（101：100種のタンパク質＋癌／正常表現型）、およびデータポイントが比較的少数であること（112）であった。そのような高次元数を考慮すれば、興味深いパターンが、癌の、隠れた真の概念を適正に表すのではなく、単に偶然に出現する可能性が高いと考えられた。最適なBayes Netトポロジーのデータ主導による選択を行うために、1つの特定のシグナル伝達経路のみに集中することによって次元の数を減らした。101の次元のうち、10が選択された：癌／正常表現型、Axl、Met.p、Src.p、cRaf.p、Akt.p、Stat3.p、Erk1.2.p、MAPK.p1およびS6.p1。この選択は、データセットの事前検査を行わずに行った。このようにして、112個のデータポイントのそれぞれの次元数を10に減らした。経験的に、次元数とデータポイント数とのそのような比は、意味のある結果を生じさせると予想された。
【０２３１】
112個のデータポイントからなる次元数10のデータセットが与えられた場合に、どの条件付き独立性仮定のセットにより、癌の、隠れた真の概念を捕捉するための仮説空間が最適化されるかを判定した。各次元における中央値をその二値化閾値として選ぶことによって、データセットを二値化した。15種の異なるBayes Netトポロジーを経験的に選んだ。各Bayes Netトポロジーは同じ10種のベルヌーイ確率変数からなったが、有向辺の異なるセットを有しており、それ故におそらく、異なる条件付き独立性仮定のセットを表すと考えられた（図23）。各ベルヌーイ確率変数は、データセットの1つの次元を表した：Axl、Met.p、Src.p、cRaf.p、Akt.p、Stat3.p、Erk1.2.p、MAPK.p1、S6.p1および癌／正常表現型（図23）。これらの15種の異なるBayes Netトポロジーはまた、各トポロジーにおける自由パラメーターの数を算定することによって決定される、異なる複雑度も有していた。データセットを均衡化したため、癌確率変数に関する事前分布は以下の通りであった：P（癌＝真）＝0.5、P（癌＝偽）＝0.5（図23）。
【０２３２】
Learner選択の手順を、10倍交差検証により、15種のBayes Netトポロジーに対して行った（ML手順はすべてのLearnerにおいて同じとした）。これらのトポロジーのうち8種が図23に表示されている。各Bayes Netトポロジーのパラメーター値を、10倍交差検証の各実行において、訓練セットに対して最尤法によって推定した。15種のBayes Netトポロジーのすべての確率変数はベルヌーイ確率変数であったため、最尤法は、訓練セットにおける対応する事例の単純な算定および正規化の手順へと単純化された（Bishop, 2006, Pattern Recognition and Machine Learning, Springer, First Edition）。パラメーター値が推定された、学習した各Bayes Netモデルが、癌の、隠れた真の概念をどの程度良好に捕捉するかを評価するために、予測精度の適切な尺度を試験セットに対して選んだ。癌表現型の分類精度は予測精度の適切な尺度であると判断された。10倍交差検証の10回の実行のそれぞれにおいて、所与のBayes Netトポロジーのパラメーター値を訓練セットに対して推定し、続いて、パラメーター値が推定されたBayes Netモデルを、癌表現型の期待値（真または偽）を癌表現型の実際の値と比較することによって、試験セットに対して試験した。形式的には、この分類作業は以下のように公式化することができる：
0006317353.tif 000005
。
【０２３３】
式中、エビデンスは、試験セットの現在考慮しているデータポイントにおけるタンパク質確率変数の現在のすべての指定を表し、θMLは10倍交差検証の各実行における訓練セットに対して最尤法によって推定されたパラメーターを表す。予想されるargmaxの結果が、試験セットの現在考慮しているデータポイントにおける癌表現型の実際の値と同じであれば、この事例をマッチとして解釈した。そうでなければ、ミスマッチとした。10倍交差検証の現在の実行の試験セットにおけるマッチおよびミスマッチの数を算定することにより、この試験セットにおける予測精度が得られた。10倍交差検証において、各Learnerについて合計10回ずつ予測精度を判定した。各Learner（Bayes Netトポロジー）の期待成績は、10種の試験セットのすべてにわたる出力モデルの正解率を平均することによって算出した。全体として、15種のトポロジーを10倍交差検証によって評価し、期待成績に関して15種の値を得た。
【０２３４】
図24は、図23に表示された8種のトポロジーに対して10倍交差検証を実行した結果を示している。これらの8種のトポロジーを実証のために選択したのは、それらの論理的進行が理由である。訓練セットに対する平均成績は、いずれのLearner（Bayes Netトポロジー）についても、一貫して、試験セットに対する平均成績よりも優れていることが見いだされた。この結果は、訓練セットにおけるデータが常に、初見の独立した試験セットにおけるデータよりも良好に適合するという出力モデルと一致する。驚いたことに、Naive Bayesトポロジーに基づくモデルは、正しい癌表現型の予測に関して平均して極めて良好であった。このデータセットでは、すべてのタンパク質にわたって、正常サンプルと対比して、癌性サンプルにおいて、より高いリン酸化レベルが観察された。すなわち、癌確率変数に対してすべてのタンパク質確率変数を条件付けることで、癌性サンプルにおけるリン酸化レベルがより高いという、この一般的傾向を捕捉するのには十分であった。AXL＋MET＋AKTが、期待成績が最も優れるトポロジーであった。このトポロジーは、Naive Bayesトポロジーに加えてさらに3つの辺を有していた。Met.pのリン酸化レベルを癌およびAxlに対して条件付けること（AXL＋MET＋AKT）により、Met.pのリン酸化レベルを癌のみに対して条件付けた場合（MET＋AKT）よりも優れた仮説空間が得られ、その際、いずれの場合にもcRaf.pはMet.p、Akt.pおよび癌に対して条件付けされていた（図23および24）。Met.p、Akt.pおよび癌に対してcRaf.pを条件付けすることにより（MET＋AKT）、癌のみに対するcRaf.pの条件付け（NAIVE BAYES）または癌およびMet.pのみに対するcRaf.pの条件づけ（MET）を行うことによるよりも優れた仮説空間が得られた（図23および24）。重要なこととして、AXL＋MET＋AKTトポロジーに対してさらに複雑度を追加すると、結果的に得られるLearnerの仮説空間は最適な複雑度レベルを上回って拡張され、過剰適合が理由となってそれらの期待成績は改善しなかった。
【０２３５】
Bayes Netトポロジーへのさらなる辺の組み入れが、結果的に得られる学習モデルのより優れた分類精度をもたらした理由について、1つの説明を図25に示している。癌性サンプルにおけるMet.pレベルの分布は非癌性サンプルにおけるMet.pの分布と類似していた。このため、二値化の後には、癌性サンプルおよび非癌性サンプルのいずれにおいても、Met.pが高度にリン酸化される確率は、Met.pが低レベルでリン酸化される確率とほぼ等しかった。しかし、AxlからMet.pへの条件付けの矢印を追加することにより、Axl＝高、癌＝偽という条件則を付した場合とAxl＝高、癌＝真という条件則を付した場合で、Met.pの異なる条件付き分布が得られた（図25）。事実上、Axlレベルの高いサンプルでは、Met.pのリン酸化レベルは癌性サンプルにおける方が非癌性サンプルにおけるよりも低い可能性が高かった。Axl-Met.pの辺をMET＋AKTトポロジーに追加した後には、そのような相違により、分類作業に用いた同時確率分布においてすべての条件付き確率を掛け合わせた場合に、より優れた平均分類精度が導かれた（図24）。
【０２３６】
Bayes Netは、条件付き独立性仮定が人によって明らかに了解されていればグラフ・トポロジーの変更が可能であるため、上記のアプローチを、癌の、隠れた真の概念を捕捉するために仮説空間を最適化する条件付き独立性仮定を検索するために用いることができる。最適なBayes Netトポロジーの辺は、タンパク質相互作用に関連して、因果関係として解釈することができる。単細胞のレベルで、このアプローチにより、細胞型の基礎となる概念を捕捉することを可能にするBayes Netトポロジーを検索することが可能である。複数の異なる細胞型からサンプリングされた高次元データセットが与えられれば、各細胞型の概念（分子機構）を正確に捕捉するBayes Net（トポロジーおよびその結果得られるモデル）を同定することができる。そのような細胞型特異的なBayes Netは、薬物に反応した、これまで見られなかった刺激条件に対する各細胞の機構的応答を予測するためのデータ補間のために用いることができる。
【０２３７】
インサイドアウト溶解によって、および単細胞ライセートマイクロアレイによって可能になる単細胞測定の状況において、最適なLearner（Bayes Netトポロジー＋固定MLサブルーチン）を選択するための手順を適用するために実験を行うことができる。また、動物固形組織またはヒト腫瘍組織における単細胞測定に関する実験を行うこともできる。また、隠れた確率変数として構築することによって、およびパラメーター推定のためにEMを用いることによって、単細胞データに基づいて新たな細胞型を探索して同定するために実験を行うこともできる。
【０２３８】
実施例5：精神疾患の調査におけるインサイドアウト溶解技術
本明細書に記載のインサイドアウト溶解技術を、精神疾患の調査のために用いることができる。近年、数種類のマウスが、統合失調症および自閉症において認められる遺伝子改変を保有するように操作されており、それらのマウスは今日では販売されている。本明細書中の他所に記載されたマウスをこれらの疾患モデルと交配させて、介在ニューロンの定められたサブセットにおいてGFPを発現する、疾患に関連する遺伝子突然変異を保有するマウスを作製することができる。脳の発生に関する疑問を研究するには、切片培養物が特に妥当である。マウスの適切な系統を作製した後に、インサイドアウト溶解技術を用いて、脳の複数の異なる領域において、発生上のいくつかの時点から、介在ニューロンライセートを得ることができる。
【０２３９】
興味深いことに、統合失調症患者のパルブアルブミン発現性介在ニューロンでは、TrkBシグナル伝達が著しく変化していることが見いだされている（Lewis D, et al. (2005) Nature Rev. Neurosci. 6, 312-324）。本明細書中の他所に記載されている技術を用いて、統合失調症および自閉症のマウスモデルにおける介在ニューロンの複数の異なるサブセットにおけるTrkBシグナル伝達の違いを発生の最初の2カ月間にわたって調査することにより、これらの消耗性疾患の基礎をなす分子イベントについての洞察が得られるであろう。
【０２４０】
実施例6：単細胞における測定されたタンパク質の絶対値数の決定
各単細胞における測定されたタンパク質の絶対値数を決定するために実験を行うことができる。これらの計数値は、GFP、PKCδおよびPKCαなどのタンパク質に関するシグナルを絶対的数量に対してマッピングすると得ることができる。プリントされた同時並行的漸増系列の各スポット中にAushon Arrayerによって付着された正確な体積を判定することは、実際上は困難であるが、Aushonによってプリントされた漸増系列の隣に、対照ライセートの規定量の各々の精製タンパク質を手動でプリントすることによって、このことを解決できる。抗原の数量が判明しているスポット中の抗原量を測定することにより、Aushon Arrayerによってプリントされた漸増系列のスポットを、それらの各々の絶対的数量に対してマッピングすることができる。その結果として、絶対値標準曲線を導き出すことができ、プリントされた各単細胞ライセートにおけるタンパク質の絶対値レベルを決定することができる。
【０２４１】
ソマトスタチン介在ニューロンを、本明細書中に表示され、本明細書中の他所に記載されているようなニトロセルロース上にスポット化された、生きた脳切片培養物から溶解させることができる。ニトロセルロースプレートは、種々のレベルのアクチンバックグラウンド（平均的海馬ライセート）に対して漸増された精製GFPの高度の希釈系列（1：1.25の分解能）を用いて調製することができる。希釈系列の高い分解能により、過剰適合を伴わずに非線形関数の確実な適合を行うことができる（漸増データにより、その仮説空間内にある仮説が制約される）。誤差値も同様に確実に推定することができ、交差反応性を除去することができる。正しい集団サイズ推定のために極めて重要であるシグナル-数量関数の非線形性は、高分解能の漸増系列および非線形的適合によって説明される。ホスホ-ペプチド（リン酸化部位特異的抗体の遮断ペプチド）の漸増物のプリンティングを実施することができる。絶対的リン酸化レベルとタンパク質の絶対的総量との組み合わせを、上記の様式で決定することもできる。
【０２４２】
実施例7：神経生物学における分析化学技術
最近の推定値によれば、単一のニューロンにおけるATPの量は質量分析器の感度範囲内にある。単一のニューロンにおけるATPの量を決定するために実験を行うことができる。また、Dynalビーズまたは他の方法を利用して、高度の多重化を得るために実験を実施することもできる。ホモ接合性GFPの保有体と非保有体とを交配させることにより、介在ニューロン内のGFP量が半分であるマウスを作製することができる。続いて、絶対的測定値の特異性をさらに評価することができる。これらの実験により、どのタイプのデータを取得しうるかに関する現在の実験的限界を決定づけることができる。これらの限界が与えられれば、神経生物学における分析化学技術の規模設定を可能にする目的で、病態に関連した調査を実現することができる。
【０２４３】
ほとんどのヒト疾患は固形組織で起こる（例えば、白血病のような血液系疾患を除く）が、神経科学およびシステムバイオロジーにおけるほとんどの分子プロファイリング研究は、これまでのところ、ネイティブな組織の状況の外側にあるペトリ皿の中で成長させた細胞株および解離培養物で行われてきた。細胞型のネイティブな異種混交性は、これらのサンプルでは保持されていない。
【０２４４】
本発明のサンプリング技術は、複雑な化学反応を利用して、固形組織中の単細胞を細胞内空間の内側から溶解させる。可溶化プロセスの「内側からの」方向性により、複雑な組織における完全な空間的な、および高い時間的な単細胞分解能が可能になる。可溶化化学反応により、各サンプル単細胞のすべての分子の収集、および、最も高感度な定量的プロファイリング法によるこれらの分子の分析が可能になる。
【０２４５】
本明細書に引用された特許、特許出願および刊行物のそれぞれおよびすべての開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。具体的な態様を参照しながら本発明を開示してきたが、本発明の真の趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明の他の態様および変形物も当業者によって考案されうることは明らかである。添付された特許請求の範囲は、そのようなすべての態様および同等の変形物を含むことを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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