(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株に由来するシアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを調製する方法であって、
（ａ）寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株の子実体から粗抽出物を得る工程、及び
（ｂ）以下のシアル化糖鎖を含む糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、オリゴ糖又は単糖と固定化又は結合されている樹脂で満たしたカラムを用いて、前記粗抽出物からレクチンを精製する工程、を含む、方法、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→３）がＧａｌ残基又はＧｌｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→６）がＧａｌ残基又はＧｌｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→３）がＧａｌ（β１→４）Ｇｌｃ残基又はＧｌｃ（β１→４）Ｇｌｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→６）がＧａｌ（β１→４）Ｇｌｃ残基又はＧｌｃ（β１→４）Ｇｌｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→３）がＧａｌ（β１→４）ＧｌｃＮａｃ残基又はＧａｌ（β１→３）ＧｌｃＮａｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→６）がＧａｌ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基又はＧａｌ（β１→３）ＧｌｃＮＡｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→３）がＧａｌ（β１→３）［αＦｕｃ（１→４）］ＧｌｃＮＡｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→６）がＧａｌ（β１→３）［αＦｕｃ（１→４）］ＧｌｃＮＡｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→３）がＧａｌ（β１→４）［αＦｕｃ（１→３）］ＧｌｃＮＡｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→６）がＧａｌ（β１→４）［αＦｕｃ（１→３）］ＧｌｃＮＡｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→８）がＮｅｕＡｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→８）がＮｅｕＡｃ（α２→３）Ｇａｌ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→８）がＮｅｕＡｃ（α２→８）ＮｅｕＡｃ（α２→３）Ｇａｌ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→８）がＮｅｕＡｃ（α２→８）［ＮｅｕＡｃ（α２→８）］ｎＮｅｕＡｃ（α２→３）Ｇａｌ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、及び、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→８）が［ＮｅｕＡｃ］ｎ残基に添加されているシアル化糖鎖。
【請求項２】
前記糖鎖と前記レクチンとの間の結合を妨げることにより標的レクチンを糖鎖コンジュゲート樹脂から選択的に溶出する更なる工程を含む、請求項１に記載のヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株に由来するシアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを調製する方法。
【請求項３】
配列番号７又は配列番号８によって表されるタンパク質Ｎ末端配列を含有し、１５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有する、寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株から産生されるレクチン、又は配列番号９によって表されるタンパク質Ｎ末端配列を含有し、５０ｋＤａ〜７５ｋＤａの分子量を有する、寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株から産生されるレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体又はオリゴ糖の測定又は定量化のためのキット。
【請求項４】
配列番号７又は配列番号８によって表されるタンパク質Ｎ末端配列を含有し、１５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有する、寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株から産生されるレクチン、又は配列番号９によって表されるタンパク質Ｎ末端配列を含有し、５０ｋＤａ〜７５ｋＤａの分子量を有する、寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株から産生されるレクチンを含む、シアロ糖複合体を有する細胞系統、細菌又はウイルスのモニタリング、測定又は定量化のためのキット。
【請求項５】
シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体又はオリゴ糖から構成されるシアル化コンジュゲートを測定又は定量化する方法であって、
ａ）試験サンプルと、配列番号７又は配列番号８によって表されるタンパク質Ｎ末端配列を含有し、１５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有する、寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株から産生されるレクチン、又は配列番号９によって表されるタンパク質Ｎ末端配列を含有し、５０ｋＤａ〜７５ｋＤａの分子量を有する、寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株から産生されるレクチンとを接触させる工程、及び
ｂ）前記レクチンに結合する前記糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体又はオリゴ糖を分析する工程、
を含む、方法。
【請求項６】
シアロ糖複合体を有する細胞系統、細菌又はウイルスを測定又は定量化する方法であって、
ａ）試験サンプルと、配列番号７又は配列番号８によって表されるタンパク質Ｎ末端配列を含有し、１５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有する、寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株から産生されるレクチン、又は配列番号９によって表されるタンパク質Ｎ末端配列を含有し、５０ｋＤａ〜７５ｋＤａの分子量を有する、寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株から産生されるレクチンとを接触させる工程、及び
ｂ）前記レクチンに結合する細胞系統、細菌又はウイルスを分析する工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のヤマブシタケ（Hericium erinaceum）ＮＥＵ−１Ｌ株（寄託番号：ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰ）、それにより産生されるシアル酸に特異的に結合するレクチン、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
レクチンは、微生物から高等動物にわたる様々な生物において内因性の糖鎖に結合することができるタンパク質の１つである。レクチンは糖鎖に特異的に結合することによってタンパク質の品質管理、宿主−病原体相互作用、細胞間連絡、炎症、免疫応答、癌の進行及び発生を含む様々な生命現象に関与することが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
レクチンは酵素活性も抗体様特徴も示さない多価タンパク質である。レクチンは、１９世紀後半にロシア人科学者Sillmarkによってトウゴマ（Ricinus communis）から初めて単離された。それ以降、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を含む４０種のレクチンが同定され、研究され、様々な分野で使用されてきた。近年の分子生物学及び生化学の発展により、レクチンはヌクレオチド配列及びタンパク質構造に従って多くの群に分類される。起源に従うと、レクチンは植物レクチン（植物レクチンファミリー）及び動物レクチン（無脊椎動物／脊椎動物レクチンファミリー）に分類される。脊椎動物レクチンはその特徴に従うとＣ型（マンノース結合レクチン、ＭＢＬ）、Ｓ型（ガレクチン：β−ガラクトシド結合レクチン）、Ｐ型（マンノース−６−リン酸結合レクチン）及びＩ型（セレクチン）のような群に分けられ、そのタンパク質構造に従うと環状五量体構造に代表されるペントラキシンに属する。このようにレクチンは多数あるにもかかわらず、細胞の生理的代謝において何らかの形で機能する無脊椎動物／脊椎動物レクチンファミリーの数は少ない。したがって、天然の系から抽出される植物レクチンは、その糖鎖特異的結合特性を用いて血液型の診断及びその適用に広く利用されている（非特許文献２）。
【０００４】
植物レクチンは葉、茎、根、花及び花粉を含む植物の殆ど全ての部分、更には採取することができる種子及び球根において同定される。したがって、植物レクチンは植物から容易に精製されている。植物においてレクチンは様々な活性及び機能、例えば免疫機能、有害な昆虫からの自己防衛、アレルギー反応を引き起こすことによる動物からの自己防衛、抗真菌活性、抗ウイルス活性、植物と微生物との間の細胞間相互作用による共生微生物の特定の領域への定着、栄養素及び金属イオンの送達及び保存、寒さからの植物の保護、細胞における酵素活性を増大するパートナーとしての作用、並びに糖タンパク質の輸送等に関与する。これらの活性及び機能は、以前の報告によるとレクチンの糖鎖特異的結合活性によって達成される（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００５】
このようなレクチンの糖鎖特異的結合活性を用いることで、レクチンは細胞表面上に存在する糖タンパク質、糖脂質及びオリゴ糖の変化を観察することによって特定の疾患の早期診断に効果的に使用されると考えられ、疾患を引き起こす主要細胞の細胞表面又はウイルス及び微生物の細胞表面の糖鎖との凝集によりｉｎ  ｖｉｖｏ免疫系を強化することによって疾患に対抗する動物実験により更に研究されている。光学顕微鏡法及び様々な蛍光プローブの合成法の近年の発展に伴って、レクチンの糖鎖特異的結合活性が、特定の細胞、ウイルス及び微生物の表面上の糖鎖の認識におけるその有用性のために癌細胞の早期診断、特定の内因性タンパク質の位置の同定、細胞間相互作用の測定、並びにウイルス及び微生物の細胞内浸潤の画像の走査の主要な因子として用いられている。最近の商品化されているレクチンは植物、動物及び微生物等の様々な供給源から分離され、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ、ノイラミン酸）、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ＧａｌＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、マンノース（Ｍａｎ）及びグルコース（Ｇｌｃ）の基本的なモノマーの測定に有用である（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
【０００６】
しかしながら、α結合及びβ結合を含む糖鎖構造の多様性、並びに糖鎖を構成するモノマー間の結合の組合せの多様性から、理論的には数百又は数千もの異なる糖鎖構造を天然系に見出すことができる。それにもかかわらず、このような糖鎖の多様性の測定又は理解が限定されているために、これまでに同定されたレクチンの数は極めて少ない。特に、商品化されているイヌエンジュ（Maackia amurensis）（ＭＡＡ）、セイヨウニワトコ（Sambucus nigra）（ＳＮＡ）及びアメリカカブトガニ（Limulus polyphemus）のレクチンは、微生物及びウイルスによる感染に直接的若しくは間接的に関与する癌細胞マーカーとして認識される特定のシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、又はその変異体であるＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）に特異的に結合することが知られている。しかしながら、これらのレクチンはシアル酸特異的なα（２，３）結合、α（２，６）結合及びα（２，８）結合を正確に区別せず、Ｎｅｕ５ＡｃにコンジュゲートしたＧａｌ及びＧａｌＮＡｃ等による非特異的結合のために非特異的結合に起因して示されるシグナルに問題がある。
【０００７】
したがって、本発明者らはシアル酸に特異的に結合する新規のレクチンの開発を試みた。結果として、ヤマブシタケ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰ）から精製プロセスにより新規の活性レクチンタンパク質が得られた。本発明者らは、新規のレクチンタンパク質が、糖鎖によって媒介される生命現象を明らかにする研究、更には糖タンパク質、糖脂質及びオリゴ糖等のシアル酸糖鎖を有する細胞、タンパク質及び糖鎖化合物の測定、並びにシアル酸糖鎖を含有する微生物のモニタリングに広く利用され得ることを確認することによって最終的に本発明を完成させた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lam and Ng, 2011. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 45
【非特許文献２】Lehmann et al., 2006, Cell. Mol. Life Sci. 63, 1331
【非特許文献３】Singh et al., 2010 Crit. Rev. Biotechnol. 30, 99
【非特許文献４】Kajiwara et al., 2010, Microbes Environ. 25, 152
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、新規のヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株（寄託番号：ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰ）を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、シアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを新規のヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株（寄託番号：ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰ）の子実体から作製する方法、及びそれにより作製されるレクチンを提供することである。
【００１１】
シアル酸糖鎖に特異的に結合する本発明のレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体又はオリゴ糖の測定又は検出のための組成物又はキットを提供することも本発明の目的である。
【００１２】
本発明の更なる目的は、シアル酸糖鎖に特異的に結合する本発明のレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する細胞系統、細菌又はウイルスの測定又は検出のための組成物又はキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、新規のヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株（寄託番号：ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰ）を提供する。
【００１４】
本発明はまた、シアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを新規のヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株（寄託番号：ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰ）の子実体から作製する方法、及びそれにより作製されるレクチンを提供する。
【００１５】
本発明はまた、シアル酸糖鎖に特異的に結合する本発明のレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体又はオリゴ糖の測定又は検出のための組成物又はキットを提供する。
【００１６】
本発明はまた、シアル酸糖鎖に特異的に結合する本発明のレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する細胞系統、細菌又はウイルスの測定又は検出のための組成物又はキットを提供する。
【００１７】
本発明はまた、本発明のレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体又はオリゴ糖の測定又は定量化のためのキットの使用を提供する。
【００１８】
本発明はまた、本発明のレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する細胞系統、細菌又はウイルスのモニタリング、測定又は定量化のためのキットの使用を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、シアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを新規のヤマブシタケ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰ）ＮＥＵ−１Ｌ株の子実体から作製する方法、及びそれにより作製されるレクチンを提供する。本発明のレクチンは、シアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体若しくはオリゴ糖の測定若しくは検出のための組成物若しくはキット、又はシアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する細胞系統、細菌及びウイルスの測定若しくは検出のための組成物若しくはキットの主成分として有用であり得る。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態の応用は、添付の図面を参照することによって最もよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ヤマブシタケＮＥＵ−Ｌ１株の２６Ｓ  ｒＤＮＡと類似株の２６Ｓ  ｒＤＮＡとの遺伝的相関を示す図である。
【図２】フェチュインコンジュゲートアガロースカラムを用いてヤマブシタケ子実体から分離されたレクチンによるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。ＣＬ：細胞抽出物、ＦＴ：非結合の通過濾液、ＭＷ：標準タンパク質マーカー、洗液（Wash）Ｗ１：カラム通過濾液画分１、洗液Ｗ２：カラム通過濾液画分２、洗液Ｗ３：カラム通過濾液画分３、溶出液（Elution）２０：２０ｍＭガラクトースで溶出した画分、溶出液４０：４０ｍＭガラクトースで溶出した画分、及び、溶出液２００：２００ｍＭガラクトースで溶出した画分。
【図３】各相中のヤマブシタケ子実体から分離されたレクチンタンパク質（左）、並びにＤＥＡＤ−セファロースカラム、フェチュイン−アガロースカラム及びＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムを用いて上記から最後に分離されたＨＥＬ１及びＨＥＬ２レクチンタンパク質（右）による１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。ＭＷ：標準タンパク質マーカー、ＣＬ：細胞抽出物、ＦＴ：非結合の通過濾液、Ｗ：ＤＥＡＥ−セファロースカラム通過濾液画分、Ｅ１：ＤＥＡＥ−セファロースカラムから溶出した画分、Ｅ２：フェチュイン−アガロースカラムから溶出した画分、及び、Ｅ３：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムから溶出した画分。
【図４】精製ＨＥＬ１レクチンによる１６％Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＰＡＧＥの結果、並びにＭＡＬＴＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定されたＨＥＬ１レクチン中に含まれる２つのレクチンタンパク質ＨＥＬ１ａ及びＨＥＬ１ｂの分子量を示す図である。ＭＷ：標準タンパク質マーカー、及び、ＨＥＬ：ＨＥＬ１レクチンタンパク質。
【図５】非変性条件で測定されたＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムによって精製されたＨＥＬ１タンパク質のサイズ（図５Ａ）、及びｐＩ  ３〜７  ＩＥＦゲルにおけるＨＥＬ１レクチンのｐＩ値（図５Ｂ）を示す一組の図である。ｐＩ標準タンパク質：標準タンパク質マーカー、及び、ＨＥＬ１：ＨＥＬ１レクチンタンパク質。
【図６】ヒト、ウサギ及びブタの赤血球を用いて確認されたＨＥＬ１レクチンタンパク質の凝集活性を示す図である。ヒト（Ｂ型）：ヒト赤血球（血液型：Ｂ）、ウサギ：ウサギ赤血球、ブタ：ブタ赤血球、ブランク、対照陰性：陰性対照、試験、ＨＥＬ１：実験群、ＨＥＬ１レクチン、及び、陽性、ＳＮＡ−１陽性：陽性対照、ＳＮＡ−１レクチン。
【図７】シアル酸糖鎖を含有するフェチュイン、及びシアル酸無含有アシアロフェチュインを基質として用いた、ヤマブシタケ子実体から分離されたレクチンのレクチンブロッティングによって測定されたシアル化タンパク質への結合の強度を示す図である。
【図８】ヤマブシタケ子実体から分離されたレクチンを蛍光物質で標識した後の共焦点顕微鏡下でのシアル酸糖鎖を含有するＡ５４９細胞系統の表面の観察を示す図である。ＨＥＬ１：ヤマブシタケＨＥＬ１レクチンを用いた実験群、ＳＮＡ：セイヨウニワトコ（ＳＮＡ）レクチンを用いた陽性対照、及び、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた陰性対照。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明は、シアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを産生することができる、寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株を提供する。
【００２４】
上記株は、配列番号１によって表される２６Ｓ  ｒＤＮＡヌクレオチド配列及び配列番号４によって表されるＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ４  ｒＤＮＡヌクレオチド配列から構成されることが好ましいが、必ずしもこれに限定されるわけではない。
【００２５】
シアル酸糖鎖に特異的に結合する上記レクチンタンパク質は、シアル酸が付加したフェチュイン糖タンパク質中のＮ結合型糖鎖構造又はＯ結合型糖鎖構造に結合することが好ましいが、必ずしもこれに限定されるわけではない。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らは、シアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを調査するためにキノコ農場から購入したヤマブシタケから新規の株を単離し、株の分子生物学的同定のために２６Ｓ  ｒＤＮＡ及び５．８Ｓ  ｒＤＮＡ配列を更に分析した。結果として、本発明者らにより株の２６Ｓ  ｒＤＮＡ配列が配列番号１によって表される配列と同じであることが確認された（表１を参照されたい）。次いで、配列番号１によって表される配列から構成される２６Ｓ  ｒＤＮＡと類似種との関係を調査した。結果として、本発明の株とヤマブシタケ５．８ＳリボソームＲＮＡ及びヤマブシタケ１８ＳリボソームＲＮＡとの比較から、その両方との配列同一性が９８％であることが確認された（図１を参照されたい）。したがって、本発明の株は「ヤマブシタケＨＥＵ−１Ｌ」と名付けられ、２０１３年１０月４日に韓国微生物カルチャーコレクション（Korean Collection for Type Cultures）（ＫＣＴＣ）、韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology）（ＫＲＩＢＢ）に寄託された（ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰ）。
【００２７】
本発明はまた、ヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株から分離されたシアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを調製する方法であって、
（ａ）寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株の子実体から細胞抽出物を得る工程、及び
（ｂ）シアル酸糖鎖を含有する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、オリゴ糖又は単糖とコンジュゲートする樹脂で満たしたカラムを用いて、上記細胞抽出物からレクチンを分離する工程、
を含む、方法を提供する。
【００２８】
糖鎖コンジュゲート樹脂中のレクチンと糖鎖とのコンジュゲーションを妨げることによって、上記工程（ｂ）において分離されたレクチンから標的レクチンを選択的に分離する更なる工程を含むことが好ましいが、必ずしもこれに限定されるわけではない。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、ヤマブシタケ子実体からレクチンを分離するために抽出物を調製した。レクチンを精製するために、上記で調製された抽出物を用いたフェチュイン−アガロースカラムクロマトグラフィーを行った。結果として、シアル酸糖鎖を含有する糖タンパク質フェチュインとコンジュゲートしたタンパク質が溶出した。
【００３０】
本発明は、本発明の方法によって調製されるシアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンも提供する。
【００３１】
本発明はまた、寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株から作製され、配列番号７、配列番号８又は配列番号９によって表されるタンパク質Ｎ末端配列を含む、シアル酸糖鎖に特異的に結合し、１５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有するレクチンを提供する。
【００３２】
本発明はまた、寄託番号ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰで寄託されたヤマブシタケＮＥＵ−１Ｌ株から作製され、配列番号９によって表されるタンパク質Ｎ末端配列を含む、シアル酸糖鎖に特異的に結合し、５０ｋＤａ〜７５ｋＤａの分子量を有するレクチンを更に提供する。
【００３３】
本発明はまた、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→３）がＧａｌ残基又はＧｌｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→６）がＧａｌ残基又はＧｌｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→３）がＧａｌ（β１→４）Ｇｌｃ残基又はＧｌｃ（β１→４）Ｇｌｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→６）がＧａｌ（β１→４）Ｇｌｃ残基又はＧｌｃ（β１→４）Ｇｌｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→３）がＧａｌ（β１→４）ＧｌｃＮａｃ残基又はＧａｌ（β１→３）ＧｌｃＮａｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→６）がＧａｌ（β１→４）ＧｌｃＮａｃ残基又はＧａｌ（β１→３）ＧｌｃＮａｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→３）がＧａｌ（β１→３）［αＦｕｃ（１→４）］ＧｌｃＮａｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→６）がＧａｌ（β１→３）［αＦｕｃ（１→４）］ＧｌｃＮａｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→３）がＧａｌ（β１→４）［αＦｕｃ（１→３）］ＧｌｃＮａｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→６）がＧａｌ（β１→４）［αＦｕｃ（１→３）］ＧｌｃＮａｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→８）がＮｅｕＡｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→８）がＮｅｕＡｃ（α２→３）Ｇａｌ（β１→４）ＧｌｃＮａｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→８）がＮｅｕＡｃ（α２→８）ＮｅｕＡｃ（α２→３）Ｇａｌ（β１→４）ＧｌｃＮａｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→８）がＮｅｕＡｃ（α２→８）［ＮｅｕＡｃ（α２→８）］ｎＮｅｕＡｃ（α２→３）Ｇａｌ（β１→４）ＧｌｃＮａｃ残基に添加されているシアル化糖鎖、及び、
ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＧｃ（α２→８）が［ＮｅｕＡｃ］ｎ残基に添加されているシアル化糖鎖からなる群から選択される糖鎖構造に特徴的に結合するレクチンを提供する。
【００３４】
本発明はまた、本発明のレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体又はオリゴ糖の測定又は定量化のためのキットを提供する。
【００３５】
本発明はまた、本発明のレクチンを含む、シアル酸糖鎖をその表面に有する細胞系統、細菌又はウイルスのモニタリング、測定又は定量化のためのキットを提供する。
【００３６】
本発明はまた、本発明のレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体又はオリゴ糖の測定又は定量化のためのキットの使用を提供する。
【００３７】
本発明はまた、本発明のレクチンを含む、シアル酸糖鎖をその表面に有する細胞系統、細菌又はウイルスのモニタリング、測定又は定量化のためのキットの使用を提供する。
【００３８】
本発明はまた、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体又はオリゴ糖から構成されるシアル化コンジュゲートを測定又は定量化する方法であって、
ａ）試験サンプルと本発明のレクチンとを接触させる工程、及び
ｂ）上記レクチンに結合する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体又はオリゴ糖を分析する工程、
を含む、方法を提供する。
【００３９】
本発明はまた、シアル酸糖鎖を有する細胞系統、細菌又はウイルスを測定又は定量化する方法であって、
ａ）試験サンプルと本発明のレクチンとを接触させる工程、及び
ｂ）上記レクチンに結合する細胞系統、細菌又はウイルスを分析する工程、
を含む、方法を提供する。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、溶出したタンパク質をＡｍｉｃｏｎ（商標）  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルター１０Ｋを用いて濃縮した。上記で得られた粗酵素溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに進め、続いてクマシーブリリアントブルー染色を行った。精製レクチンタンパク質の純度及びサイズを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Bio-Rad，USA）を標準タンパク質として用いて分析した。結果として、シアル酸を含む糖鎖が付加した糖タンパク質フェチュインにコンジュゲートしたレクチンがＨＥＬ１及びＨＥＬ２として同定され、これら２種類のタンパク質のサイズはおよそ１５ｋＤａ〜２０ｋＤａ及び５０ｋＤａ〜７５ｋＤａであった（図２を参照されたい）。これら２つのレクチンタンパク質ＨＥＬ１及びＨＥｌ２を用いて分離の最適化を完了した。結果として、純粋なＨＥＬ１及びＨＥＬ２レクチンタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーＤＥＡＥ−セファロースカラム、親和性クロマトグラフィーフェチュインカラム及びサイズ排除クロマトグラフィーＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２１０／３００  ＧＬカラムを通して分離した。各タンパク質のサイズはおよそ１５ｋＤａ〜２０ｋＤａ及び５０ｋＤａ〜７５ｋＤａであった（図３を参照されたい）。上記で分離された各タンパク質の正確な分子量を測定するために、Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ  Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ（Bruker Daltonik GmbH. Bremen，Germany）を行った。結果として、各レクチンの分子量は正確には１５３２７．５８７Ｄａ又は１５５３６．９５３Ｄａ及び７３２５３．１２Ｄａであった（図４を参照されたい）。ＨＥＬ１レクチンタンパク質のサイズ及びｐＩを非変性条件で調査した。結果として、ＨＥＬ１レクチンがｐｌ４．５の３２±５ｋＤａの二量体という構造のタンパク質として確認された（図５を参照されたい）。ＨＥＬ１レクチンを用いて赤血球凝集を調査した。陽性対照ＳＮＡ−１レクチンによる試験を同様に行った。結果として、全ての赤血球サンプルがＨＥＬ１によって凝集した。特に、ＨＥＬ１レクチンによる凝集はウサギ又はヒトの赤血球よりもブタ赤血球において活性であった（図６を参照されたい）。レクチンの結合活性を調査するために、シアル酸糖鎖を含有するフェチュイン及びシアル酸無含有アシアロフェチュインを基質として用いるレクチンブロッティングを行った。結果として、Ｎｅｕ５Ａｃ  α（２，３）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃのようなＮ結合型糖鎖基本構造及びＮｅｕ５Ａｃ  α（２，３）Ｇａｌβ（１，３）［ＧａｌＮＡ、Ｎｅｕ５Ａｃα（２，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇａｌβ（１，６）］のようなＯ結合型糖鎖を含有するフェチュインにおいてレクチンブロットシグナルが観察された。しかしながら、陰性対照である非シアル化フェチュインＧａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃの非シアル化Ｎ糖鎖、並びにＧａｌβ（１，３）、ＧｌｃＮＡ及びＧａｌβ（１，３）［ＧａｌＮＡ  β（１，６）］の糖鎖を含有するタンパク質においてレクチンブロットシグナルは観察されなかった（図７を参照されたい）。加えて、動物細胞表面上で同定されたシアル酸糖鎖を含有するＡ５４９細胞系統の表面を、蛍光標識レクチンを用いて観察した。結果として、細胞系統の表面上に蛍光標��レクチンが観察され、シアル酸糖鎖の存在が確認された（図８を参照されたい）。
【００４１】
本発明は、シアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを新規のヤマブシタケ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰ）ＮＥＵ−１Ｌ株の子実体から作製する方法、及びそれにより作製されるレクチンを提供する。本発明のレクチンは、シアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、糖前駆体若しくはオリゴ糖の測定若しくは検出のための組成物若しくはキット、又はシアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンを含む、シアル酸糖鎖を有する細胞系統、細菌及びウイルスの測定若しくは検出のための組成物若しくはキットの主成分として有用であり得る。
【００４２】
以下の実施例に示すように、本発明の実際に現在好ましい実施形態を説明する。
【００４３】
しかし、当業者であれば、本開示を考慮した上で本発明の趣旨及び範囲内の変更及び改善がなされ得ることが理解されるだろう。
【実施例】
【００４４】
実施例１：レクチン産生キノコ株の分離及び同定
＜１−１＞レクチン産生キノコ株の分離
以下の実験を行って、Dolsan mushroom farming association（Jeollanam-do Yeosu-si Dolsan-eup Geumbong-ri 1156）から購入したヤマブシタケから新規の株を分離した。
【００４５】
特に、Dolsan mushroom farming associationから購入したヤマブシタケのスポロシストから白金耳を用いることにより胞子を得た。得られた胞子をＰＤＡ、ＹＤＰ及びアミノ酸最少培地等の固体培地に散布し、続いて２２℃で静置培養した。少なくとも１０日間培養した後、単一細胞から産生された菌糸を分離し、これを再び上記と同じ培地に散布し、続いて２２℃で静置培養した。次いで、形態を観察することによってキノコの分離を確認した。
【００４６】
＜１−２＞レクチン産生キノコ株の同定
実施例＜１−１＞において分離された株を分子生物学的に同定するために、２６Ｓ  ｒＤＮＡ及び５．８Ｓ  ｒＤＮＡのシークエンシングを行った。
【００４７】
特に、実施例＜１−１＞において分離された株を１２５ｍｌ容フラスコ内の１０ｍＬのＰＤＡ、１０ｍＬのＹＤＰ及び１０ｍＬのアミノ酸最少培地の各液体培地に接種し、続いて２２℃で静置培養した。株を少なくとも１５日間培養した後、細胞を回収し、続いて遠心分離した。液体培地を除去した。回収した細胞を、液体窒素を用いて完全に凍結した後、物理的に溶解させた。溶解させた細胞に５０ｍＵ／ｍＬ  Ｌｙｐｔｉｃａｓｅ、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する細胞溶解バッファーを添加し、続いて３７℃で少なくとも１時間反応させた。反応の終了後、細胞を遠心分離によって回収し、ＡｃｃｕＰｒｅｐ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Bioneer，Daejeon，Korea）を用いて細胞内ＤＮＡを抽出した。２６Ｓ  ｒＤＮＡを増幅するために、ＮＬ１プライマー（配列番号２）及びＬＲ６プライマー（配列番号３）とともに上記の抽出されたＤＮＡを鋳型として用いて９４℃で４５秒間、５５℃で１秒間並びに７２℃で１分間及び３０秒間の３０サイクルでＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応を行った。結果として、１１４６ｂｐの遺伝子が増幅された。増幅された遺伝子をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Promega，USA）にクローニングし、続いてシークエンシングを行った。株の２６Ｓ  ｒＤＮＡのヌクレオチド配列が、下記表１に示されるように配列番号１によって表される配列として同定された（表１）。次いで、配列番号１によって表される配列から構成される２６Ｓ  ｒＤＮＡと類似種との関係を調査した。結果として、本発明の株とヤマブシタケ５．８ＳリボソームＲＮＡ及びヤマブシタケ１８ＳリボソームＲＮＡとの比較から、その両方との配列同一性が９８％であることが確認された（図１）。したがって、上記で得られた株は「ヤマブシタケＨＥＵ−１Ｌ」と名付けられ、２０１３年１０月４日に韓国微生物カルチャーコレクション（ＫＣＴＣ）、韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）に寄託された（ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰ）。ヤマブシタケＨＥＵ−１Ｌ株のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ４  ｒＤＮＡ配列を分析するために、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応を、ＩＴＳ１プライマー（配列番号５）及びＩＴＳ４プライマー（配列番号６、５’−ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ−３’）を用いて９４℃で４５秒間、５５℃で３０秒間、並びに７２℃で１分間及び３０秒間の３０サイクルで行った。結果として、６４４ｂｐの遺伝子が増幅された。増幅された遺伝子をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターにクローニングし、続いてシークエンシングを行った。結果として、この遺伝子が配列番号４によって表される配列から構成されることが確認された（表１）。
【００４８】
【表１】
0006356256.tif 000002
【００４９】
実施例２：ヤマブシタケからのシアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチンの分離及び精製
＜２−１＞ヤマブシタケ子実体からのレクチンの分離のための抽出物の調製
以下の実験を行い、ヤマブシタケ子実体からのレクチンの分離のための抽出物を調製した。
【００５０】
特に、−８０℃で凍結して保管したヤマブシタケ子実体を乳鉢に入れ、続いて子実体が解凍されないように液体窒素を添加しながら子実体を粉砕した。子実体を乳鉢内での一連の粉砕プロセスにより凍結微粉末として調製した。調製された子実体凍結粉末を回収し、実験に使用されるまで再び−８０℃で保管した。上記方法により調製された子実体凍結粉末の重量を測定した後、それに子実体の重量の３倍容量のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche，Switzerland）を、１ｍＭ  ＰＭＳＦを子実体の容量の３倍容量で含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）とともに添加した。混合物を４℃で少なくとも６時間十分に混合した。非粉砕子実体粒子及び不溶性タンパク質を混合物から除去するために、Ａ５００Ｓ−６Ｎローター（Hanil Science Inc.，Korea）を備えるＳＵＰＲＡ  ２２Ｋ遠心機（Hanil Science Inc.，Korea）を用いて４℃、７０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行った。次いで、沈殿物を除去し、上清を得た。得られた上清を、Ａ５０Ｃ−６ローターを備えるＳＵＰＲＡ  ２２Ｋ遠心分離機を用いる４℃、１２０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離に進めた。次いで、沈殿物を除去し、レクチンの分離のための最終細胞抽出物として上清を得た。
【００５１】
＜２−２＞フェチュイン−アガロースカラムクロマトグラフィーによるレクチンの精製
実施例＜２−１＞の方法により得られた抽出物を用いてレクチンを精製するために、フェチュイン−アガロースカラムクロマトグラフィーを行った。
【００５２】
特に、シアル酸に特異的に結合するレクチンを精製するために、アガロース樹脂上にフェチュインを固定したフェチュイン−アガロースを用いてレクチン分離用のカラムを作製した。実施例＜１−１＞の方法によって調製されたヤマブシタケ子実体細胞抽出物を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したフェチュイン−アガロース樹脂（Sigma-Aldrich，USA）カラム（１．０ｃｍ×１０ｃｍ）に、Ｐｕｍｐ  Ｐ−１蠕動ポンプ（GE Healthcare，USA）を用いて１ｍＬ／分の注入速度で注入した。カラムを樹脂の容量の１０倍容量の同じバッファーで洗浄した。次いで、シアル酸糖鎖を含有する糖タンパク質であるフェチュインにコンジュゲートしたタンパク質を、ガラクトースの濃度を２０ｍＭから開始して４０ｍＭ、２００ｍＭまで増大して溶出した。これはＤ−ガラクトースを含有する同じバッファーの容量を樹脂の容量の２倍から４倍、１０倍まで増大することによって達成した。その時点で溶出速度は１ｍｌ／分とした。溶出したタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ（商標）  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルター１０Ｋを用いて濃縮した。
【００５３】
＜２−３＞ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるレクチンタンパク質の確認
実施例＜２−２＞の方法によって精製された粗酵素溶液中のタンパク質を確認するために、以下の実験を行った。
【００５４】
特に、実施例＜２−２＞に記載されるのと同様に得られた粗酵素溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、続いてクマシーブリリアントブルーによって染色した。上記で精製されたレクチンタンパク質の純度及びサイズを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Bio-Rad，USA）を標準タンパク質として用いて調査した。
【００５５】
結果として、図２に示されるように、シアル酸を含む糖鎖が付加した糖タンパク質フェチュインにコンジュゲートしたレクチンがＨＥＬ１及びＨＥＬ２として同定され、これら２種類のタンパク質のサイズはおよそ１５ｋＤａ〜２０ｋＤａ及び５０ｋＤａ〜７５ｋＤａであった（図２）。
【００５６】
＜２−４＞ヤマブシタケ子実体からのＨＥＬ１レクチンの分離最適化
以下の実験を行い、実施例＜２−１＞の方法によって調製された抽出物を用いて実施例＜２−２＞において同定されたＨＥＬ１及びＨＥＬ２レクチンタンパク質の分離最適化条件を得た。
【００５７】
特に、実施例＜２−１＞に記載のように調製及び保管された子実体凍結粉末の重量を測定した後、それに５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を子実体粉末の重量の２．５倍容量で添加し、４℃で少なくとも１２時間十分に混合した。非粉砕子実体粒子及び不溶性タンパク質を混合物から除去するために、４℃、２００００×ｇで３０分間の遠心分離を行った。次いで、沈殿物を除去して上清を得た。残存する不要な粒子を完全に除去するために、４℃、２５０００×ｇで４５分間の遠心分離を再び行った。次いで、再び沈殿物を除去して上清を得た。同じバッファーを子実体の重量の１．５倍容量で沈殿子実体に添加した。上記と同様にして上清を混合物から得た。上記で得られた各上清を混ぜ合わせ、最終細胞抽出物を調製した。それに硫酸アンモニウム（飽和濃度８０％）を添加し、４℃でゆっくりと撹拌してタンパク質を沈殿させた。混合物を４℃、２５０００×ｇで６０分間遠心分離して沈殿タンパク質を得た。得られたタンパク質を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファー（１／１０（ｖ／ｖ））に溶解し、続いて同じバッファー中で透析するか又はＰＤ−１０脱塩カラム（GE Healthcare）に通して、硫酸アンモニウムをタンパク質粗酵素溶液から除去した。
【００５８】
脱塩の後、タンパク質粗酵素溶液をＤＥＡＤ−セファロースカラム（１．５ｃｍ×１７ｃｍ）にロードし、続いてカラムの容量の５倍容量の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファーによるカラム平衡化を行った。０Ｍ〜０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファーを、ＡＫＴＡ精製システム（GE Healthcare）を用いた段階勾配又は線形勾配によってカラムに流し（spilled over）、レクチンタンパク質をＤＥＡＤ−セファロースカラムから溶出させた。レクチンタンパク質を含有する画分を、０．５％（ｖ／ｖ）ブタ赤血球を用いた凝集アッセイによって確認した。ブタ赤血球凝集アッセイに陽性であると確認された画分を回収し、Ａｍｉｃｏｎ（商標）  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルター１０Ｋを用いてタンパク質画分を濃縮した。
【００５９】
レクチン活性を示すタンパク質画分を、実施例＜２−２＞に記載されるのと同様に５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファーで平衡化したフェチュイン−アガロース樹脂（Sigma-Aldrich，USA）カラム（１．５ｃｍ×１７ｃｍ）にロードした。すなわち、Ｐｕｍｐ  Ｐ−１蠕動ポンプ（GE Healthcare，USA）を用いてＤＥＡＥ−セファロースカラム画分をそれに１ｍＬ／分の注入速度でロードした。カラムの容量の１０倍容量の同じバッファーでカラムを洗浄した。洗浄の後、シアル酸糖鎖を含有する糖タンパク質であるフェチュインにコンジュゲートしたタンパク質を、０．２Ｍ〜０．５Ｍ  Ｄ−ガラクトースを含有する同じバッファーを用いて溶出させた。溶出したタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ（商標）  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルター１０Ｋを用いて濃縮した。
【００６０】
レクチン活性を示す濃縮タンパク質溶液を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ（GE Healthcare）クロマトグラフィーカラムにロードした。ＡＫＴＡ精製システムを用いて０．５ｍＬ／分の流量でタンパク質を溶出させた。レクチン活性を示す画分をブタ赤血球凝集アッセイによって確認した。最後に、ブタ赤血球凝集アッセイに陽性であると確認された画分を回収し、Ａｍｉｃｏｎ（商標）  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルター１０Ｋを用いてタンパク質画分を濃縮した。
【００６１】
各工程で得られたレクチンタンパク質を含有するタンパク質画分を、実施例＜２−３＞に記載されるのと同様に１２％又は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、続いてクマシーブリリアントブルー染色を行った。精製レクチンタンパク質の純度及びサイズを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）  Ｓｔａｎｄａｒｄを標準タンパク質として用いて分析した。
【００６２】
結果として、図３に示されるように、純粋なＨＥＬ１及びＨＥＬ２レクチンタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーＤＥＡＥ−セファロースカラム、親和性クロマトグラフィーフェチュインカラム及びサイズ排除クロマトグラフィーＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２１０／３００ＧＬカラムを通して分離した。各タンパク質のサイズは、およそ１５ｋＤａ〜２０ｋＤａ及び５０ｋＤａ〜７５ｋＤａであった（図３）。
【００６３】
実施例３：ヤマブシタケ子実体から分離されたレクチンタンパク質のＮ末端配列の分析
ヤマブシタケ子実体から分離されたシアル酸に選択的に結合するレクチンタンパク質のアミノ酸配列を同定するために、実施例＜２−４＞の方法によって分離されたレクチンタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を以下のように分析した。
【００６４】
特に、実施例＜２−４＞の方法によって分離されたレクチンタンパク質を、１６％Ｔｒｉｃｉｎ−ＰＡＧＥを用いて展開した。Ｔｒｉｃｉｎ−ＰＡＧＥ上で展開されたタンパク質を、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（Bio-Rad，USA）を用いて１５Ｖで１時間ＰＶＤＦ膜に転写した。Ｔｒｉｃｉｎ−ＰＡＧＥからＰＶＤＦ膜上に転写されたタンパク質を、０．１％（ｗ／ｖ）ポンソーＳで染色した。染色されたタンパク質を膜から切り取り、そのＮ末端配列をeMass Co.（Seoul，Korea）で分析した。
【００６５】
結果として、実施例＜２−４＞で確認された分子量１５ｋＤａ〜２０ｋＤａのＨＥＬ１タンパク質の２つの配列は、ＨＥＬ１ａ及びＨＥＬ１ｂとして同定された。強いシグナルを示すＨＥＬ１ａは配列番号７によって表されるＮ末端配列として同定され（ＮＨ２−ＫＥＰＴＶＷＧＲＰＥＳ−ＣＯ２−）、やや弱いシグナルを示すＨＥＬ１ｂは配列番号８によって表されるＮ末端配列として同定された（ＮＨ２−ＷＰＶＡＰＤＹＰＰＥＳ−ＣＯ２−）。分子量５０ｋＤａ〜７５ｋＤａのタンパク質は、配列番号９によって表されるＮ末端配列を有することが確認された（ＮＨ２−ＧＧＨＳＶＰＬＴＮＦＭＮＡＱＹＦＴＥＩＳＬＧＳＰＰＱＱＦＫＶ−ＣＯ２−）。
【００６６】
実施例４：質量分析計を用いる分離／精製されたレクチンタンパク質のサイズの分析
実施例＜２−４＞の方法によって分離されたタンパク質の正確な分子量を測定するために、Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ  Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ（Bruker Daltonik GmbH. Bremen，Germany）を行った。
【００６７】
特に、実施例＜２−４＞の方法によって分離及び精製されたレクチンタンパク質を、ＰＤ−１０カラム（GE Healthcare，USA）にロードし、続いて蒸留水を用いて溶出させ、タンパク質溶液から塩を除去した。Ａｍｉｃｏｎ（商標）  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルター１０Ｋを用いてタンパク質を濃縮した（１ｍｇ／ｍｌ以上）。次いで、シナピン酸を、２５％アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸を１：２の比率で含む混合溶液に飽和するまで溶解させた。混合溶液を濃縮タンパク質と１：１（ｖ／ｖ）の比率で混合し、続いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上で結晶化した。結晶化したタンパク質をＭｉｃｒｏｆｌｅｘ  Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ（Bruker Daltonik GmbH. Bremen，Germany）に進めた。分離／精製されたレクチンのサイズを分析した。
【００６８】
結果として、ＨＥＬ１ｂのシグナルより５倍強いシグナルを示すＨＥＬ１ａレクチンの分子量は１５３２７．５８７Ｄａであり、弱いシグナルを示すＨＥＬ１ｂレクチンの分子量は１５５３６．９５３Ｄａであった（図４）。ＨＥＬ２レクチンの分子量は７３２５３．１２Ｄａであると確認された。
【００６９】
実施例５：非変性条件におけるＨＥＬ１レクチンタンパク質のサイズ及びｐＩの調査
非変性条件における実施例＜２−４＞の方法によって分離されたＨＥＬ１レクチンタンパク質のサイズを、ＡＫＴＡ精製システムを用いるＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬカラムで調査した。分子量較正キット（GE Healthcare）の標準タンパク質として、４４０ｋＤａのフェリチン、１５８ｋＤａのアルドース、４４ｋＤａのオボアルブミン、２９ｋＤａの炭酸脱水酵素、１３．７ｋＤａのリボヌクレアーゼＡ及び６．５ｋＤａのアプロチニンを使用した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬカラムから溶出したＨＥＬ１レクチンタンパク質を含有する画分に含まれるレクチン活性を、ブタ赤血球凝集アッセイによって確認した。得られたクロマトグラムを標準タンパク質のクロマトグラムと比較して、相対サイズを測定した。
【００７０】
結果として、図５Ａに示されるように、非変性条件において３２±５ｋＤａ二量体の形態でＨＥＬ１レクチンが確認された（図５Ａ）。
【００７１】
また、実施例＜２−４＞に記載されるのと同様に分離されたＨＥＬ１レクチンタンパク質のｐＩを、等電点分画（ＩＥＦ）電気泳動によって調査した。正確には、陰極バッファー及び陽極バッファー中１００Ｖで１時間、２００Ｖで１時間及び５００Ｖで３０分間のＩＥＦ−ＰＡＧゲルの展開をｐＩ  ３〜７  ＩＥＦゲルシステム（KOMABIOTECH）を用いて行い、結果を標準タンパク質のｐＩと比較した。図５Ｂに示されるように、ＨＥＬ１レクチンがｐＩ  ４．５のタンパク質として確認された（図５Ｂ）。
【００７２】
実施例６：ＨＥＬ１レクチンを用いた赤血球凝集の調査
実施例＜２−４＞の方法によって分離されたＨＥＬ１レクチンの活性を赤血球凝集との関連で調査するために、ブタ血液、ウサギ血液及びヒト血液（Ｂ型）を１０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に希釈し、続いて４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。結果として赤血球が沈殿した。上清を除去した。上記の手順を３回繰り返した。最終沈殿物をＰＢＳに希釈し、２％（ｖ／ｖ）赤血球溶液の調製物を得た。Ｖ字型９６ウェルプレートを用いて凝集アッセイを行った。実施例＜２−４＞で分離された１００ｕＬのレクチンタンパク質（０．１ｍｇ／ｍＬ）を１／２の比率で段階希釈し、等量の２％赤血球溶液と混合した。９６ウェルプレート中の混合物を室温で１時間静置した。ブタ赤血球、ウサギ赤血球及びヒト赤血球のレクチン媒介凝集が観察された。この時点で、陽性対照としてシアル酸糖鎖と選択的に結合するＳＮＡ−Ｉレクチンを同じ濃度で使用した。陰性対照としては、レクチン無含有ＰＢＳを使用した。
【００７３】
結果として、図６に示されるように、ＨＥＬ１レクチンは陽性対照ＳＮＡ−１レクチンと同様に全ての試験サンプル中で赤血球凝集を誘導した。特に、ＨＥＬ１によるブタ赤血球の凝集はウサギ赤血球及びヒト赤血球よりも強かった（図６）。
【００７４】
実施例７：レクチンブロッティングによるシアル酸糖鎖を含有する糖タンパク質の測定
実施例＜２−４＞の方法によって分離されたレクチンの結合活性を調査するために、シアル酸糖鎖を含有するフェチュイン及びシアル酸無含有アシアロフェチュインを基質として用いてレクチンブロッティングを行った。
【００７５】
特に、それぞれフェチュイン及びアシアロフェチュインを含有する各タンパク質溶液を５×Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと混合し、続いて１０分間加熱した。タンパク質分離のために８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて電気泳動を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離されたタンパク質を、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（Bio-Rad，USA）を用いてニトロセルロース膜に１５Ｖで１時間転写し、続いて３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＰＢＳＴ及び０．５％ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで１時間ブロッキングした。次いで、膜を１ｍｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートレクチンを含有する３％ＢＳＡ−ＰＢＳ中にロードし、続いて室温で４時間培養した。実施例＜２−３＞の方法によって分離されたレクチンのビオチン化コンジュゲーションを、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Genomine，KOREA）を用いて行った。レクチンと膜とのインキュベーションの後、膜をＰＢＳＴで６回１０分間洗浄した後、０．２ｍｇ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ビオチン抗体（１：５００、Sigma-Aldrich）と１時間反応させた。反応の終了後、膜を再び上記と同様にしてＰＢＳＴで６回１０分間洗浄した。ＥＣＬキット（GE Healthcare，USA）を用いてシアル化タンパク質が確認された。
【００７６】
結果として、図７に示されるように、Ｎｅｕ５Ａｃ  α（２，３）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃのようなＮ結合型糖鎖基本構造及びＮｅｕ５Ａｃ  α（２，３）Ｇａｌβ（１，３）［ＧａｌＮＡ、Ｎｅｕ５Ａｃα（２，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇａｌβ（１，６）］のようなＯ結合型糖鎖を含有するフェチュインにおいてレクチンブロットシグナルが観察された。しかしながら、陰性対照である非シアル化フェチュインＧａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃの非シアル化Ｎ糖鎖並びにＧａｌβ（１，３）、ＧｌｃＮＡ及びＧａｌβ（１，３）［ＧａｌＮＡβ（１，６）］の糖鎖を含有するタンパク質では、レクチンブロットシグナルは観察されなかった（図７）。
【００７７】
実施例８：蛍光標識レクチンを用いたシアル酸糖鎖を含有する動物細胞表面の観察
動物細胞表面上で同定されたシアル酸糖鎖を含有するＡ５４９細胞系統（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５ＴＭ、Rockville MD，USA）の表面を、蛍光標識レクチンを用いて観察した。
【００７８】
特に、Ａ５４９細胞系統を血清無含有培地中で培養した。遠心分離によって細胞を得た。実施例＜２−４＞の方法によって分離されたレクチンを、当該技術分野で既知の従来の方法に従い、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Invitrogen，USA）を用いて蛍光物質で標識した。実施例＜２−４＞に記載されるのと同様に分離及び精製されたレクチンのシアル酸糖鎖特異的結合活性を調査するために、細胞を１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＰＢＳで洗浄し、続いて遠心分離を行った。細胞を再び回収した。得られた細胞を、ＢＳＡを含有する少量のＰＢＳ（ＰＢＳＢ）に懸濁し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８にコンジュゲートしたレクチンをそれに０．５ｎＭ〜１．０ｎＭの最終濃度で添加した。レクチンと反応する細胞を氷中で１時間培養した。１時間の培養後、細胞を遠心分離した。細胞をＰＢＳＢで少なくとも３回洗浄した。細胞を同じバッファー中に１〜５×１０６細胞／ｍＬの最終密度で懸濁した。蛍光標識レクチンに特異的に結合する細胞表面上のシアル酸糖鎖を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Carl Zeiss Germany）下で観察した。
【００７９】
結果として、図８に示されるように、動物細胞表面上に通常観察されるシアル酸糖鎖を含有するＡ５４９細胞系統の表面上で蛍光標識レクチンが観察され、シアル酸もその上で確認されることが示唆された（図８）。
【００８０】
寄託番号
寄託機関：韓国生命工学研究院
寄託番号：ＫＣＴＣ  １２４９９ＢＰ
寄託日：２０１３１００４
【００８１】
当業者であれば、上記の明細書に開示された概念及び具体的な実施形態が、本発明と同じ目的で実施される他の実施形態を改変又は設計する基礎として容易に利用し得ることが理解されるだろう。当業者であれば、このような同等の実施形態が添付の特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨及び範囲から逸脱することがないことも理解されるだろう。
【図１】
0006356256.tif 000003
【図２】
0006356256.tif 000004
【図３】
0006356256.tif 000005
【図４】
0006356256.tif 000006
【図５】
0006356256.tif 000007
【図６】
0006356256.tif 000008
【図７】
0006356256.tif 000009
【図８】
0006356256.tif 000010
【配列表】
0006356256000001.app