(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のタンパク質凝集体からの目的の単量体タンパク質を分離する方法であって、該方法は、該サンプルと、架橋被膜を有する多孔質固体支持体とを接触させることを含み、ここで、
該架橋被膜は、ベンジルアクリルアミドとアクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドとの共重合体を含み、
該固体支持体は、タンパク質凝集体を選択的に結合し、それによって該タンパク質凝集体から目的の単量体タンパク質を分離する方法。
【請求項２】
前記方法を６以上の中性〜高ｐＨで実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法を５ｍＳ／ｃｍ以上の中〜高伝導度の溶液で実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記固体支持体がクロマトグラフィー樹脂、膜、多孔質ビーズ、多孔質モノリス、翼状繊維、織布及び不織布よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質凝集体が低次タンパク質凝集体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記低次タンパク質凝集体が二量体、三量体及び四量体よりなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質凝集体が高分子量タンパク質凝集体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記高分子量タンパク質凝集体が五量体以上である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記目的の単量体タンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的の単量体タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的の単量体タンパク質がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的の単量体タンパク質をさらにウイルス保持フィルターによりろ過する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
目的のタンパク質の精製中にウイルスフィルターのろ過容量を改善させる方法であって、該目的のタンパク質を含むサンプルを、該ウイルスフィルターに通す前にプレフィルトレーションに付すことを含み、該プレフィルトレーション工程は、該サンプルと架橋被膜を有する多孔質固体支持体とを接触させることを含み、ここで、該架橋被膜は、ベンジルアクリルアミドとアクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドとの共重合体を含む方法。
【請求項１５】
前記サンプルを、６よりも高いｐＨ及び５ｍＳ／ｃｍよりも高い伝導度で前記固体支持体と接触させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記固体支持体がクロマトグラフィー樹脂、膜、多孔質ビーズ、多孔質モノリス、翼状繊維、織布及び不織布よりなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ウイルスフィルターとプレフィルターとを備える、目的のタンパク質を精製するためのろ過列であって、該プレフィルターが架橋被膜を有する多孔質固体支持体を備え、ここで、該架橋被膜は、ベンジルアクリルアミドとアクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドとの共重合体を含むろ過列。
【請求項１８】
クロマトグラフィー媒体をさらに備える、請求項１７に記載のろ過列。
【請求項１９】
前記多孔質固体支持体がクロマトグラフィー樹脂、膜、多孔質ビーズ、多孔質モノリス、翼状繊維、織布及び不織布よりなる群から選択される、請求項１７に記載のろ過列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年１２月１２日に出願された米国仮出願第６１／９１５１２５号の優先権を主張する。その開示を参照により本明細書で援用する。
【０００２】
発明の分野
ここに開示される実施形態は、アクリルアミド含有フィルターを使用して、目的の生成物を含有するバイオ医薬製剤からタンパク質凝集体を含む不純物を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
タンパク質精製のための従来の方法は、典型的には、例えば、目的のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を産生するように組換え操作された哺乳動物細胞株又は細菌細胞株を使用する細胞培養法を含み、その後、細胞培養液からの細胞及び細胞残屑を除去するための細胞回収工程が続く。この細胞回収工程の後に、通常、捕捉工程を行い、典型的には、その後に、通常は陽イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／又は混合モードクロマトグラフィー及び／又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの一つ以上を含むポリッシング工程とも呼ばれる１回以上のクロマトグラフィー工程を行う。また、ウイルス不活性化工程を捕捉工程の後に含むこともできる。ポリッシング工程の後に、通常、精製プロセスを完了させるウイルスろ過、限外ろ過／ダイアフィルトレーションを行う。例えば、Ｓｈｕｋｌａ外，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．，８４８（２００７）２８−３９；Ｌｉｕ外，ＭＡｂｓ，２０１０：Ｓｅｐ−Ｏｃｔ  ２（５）：４８０−４９９参照。
【０００４】
ウイルスろ過工程は、生成物が診断又は治療用途に使用することが望まれる場合には特に、タンパク質の精製において重要な工程である。ウイルスろ過工程は、典型的には、目的のタンパク質を通過させつつウイルス粒子を保持するウイルス保持フィルターを使用する。効率的なウイルスのろ過を達成することに伴う課題の一つは、不純物、特にタンパク質凝集体のいくらかがウイルス粒子と同様のサイズを有することである。したがって、タンパク質凝集体は、最終的にはウイルス保持フィルターを汚れさせ又は目詰まりさせ、フィルターを通した目的のタンパク質の流れを有意に減少させてしまう。
【０００５】
タンパク質凝集体などの不純物は、異なる精製プロセス段階で形成し、そしてウイルス保持フィルターの適切なスループットを維持するために、タンパク質凝集体は、ウイルス保持フィルターに到達する前に除去する必要がある。従来技術では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体に基づくフロースルー凝集体除去を実現する試みがなされている（例えば、米国特許第７４２７６５９号参照）。しかし、ＨＩＣベースの分取分離は、一般にプロセス開発が困難であり、動作ウィンドウが狭く、また高濃度の塩が緩衝液に必要なため、適用範囲が狭い。
【０００６】
弱分配クロマトグラフィー（ＷＰＣ）がクロマトグラフィー操作の別の態様であり、その際、生成物は、結合−溶出クロマトグラフィーの場合よりも弱く結合するが、フロースルークロマトグラフィーの場合よりも強く結合する（例えば、米国特許第８０６７１８２号参照）；しかしながら、ＷＰＣには、結合及び溶出法と比較して狭い動作ウィンドウ及び不純物除去のための低い結合容量を含めて、それに関連する所定の欠点もある。
【０００７】
さらに、タンパク質凝集体を選択的に除去するための最も便利な方法の一つは、タンパク質及び／又は他の生体分子の溶液をウイルス保持フィルターに到達する前にろ過媒体に通し、それによってタンパク質凝集体を除去し、精製されるタンパク質をウイルス保持フィルターにフロースルーさせることによるものである。このようなフィルターの例が、ウイルスろ過工程の前に、タンパク質及びウイルス溶液を、吸着性デプスフィルター又は荷電若しくは表面変性膜を通してろ過することについて説明する米国特許第７１１８６７５号に見出すことができる。
【０００８】
さらに、国際公開第２０１０／０９８８６７号には、タンパク質凝集体を除去するために負に荷電した多孔質媒体を使用することが記載され、また、国際公開第２０１２／１７５１５６号には、タンパク質凝集体を除去するためのポリアミド系フィルターが記載されている。最後に、米国出願第１３／７８３９４１号、２０１３年３月４日に出願されたＵＳ２０１３０２４５１３９Ａ１号には、タンパク質凝集体の除去用の陽イオン交換基を含む組成物の使用が記載されているが、そこに記載された組成物は、陽イオン交換クロマトグラフィーに適したｐＨ及び伝導度条件下でしか良好に機能しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７４２７６５９号明細書
【特許文献２】米国特許第８０６７１８２号明細書
【特許文献３】米国特許第７１１８６７５号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１０／０９８８６７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１２／１７５１５６号パンフレット
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３０２４５１３９号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｈｕｋｌａ外，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．，８４８（２００７）２８−３９
【非特許文献２】Ｌｉｕ外，ＭＡｂｓ，２０１０：Ｓｅｐ−Ｏｃｔ  ２（５）：４８０−４９９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
概要
ここに開示される実施形態は、目的のタンパク質、例えば抗体を含有するサンプルからタンパク質凝集体などの不純物を除去するための新規組成物を提供する。したがって、このような組成物をタンパク質精製の間にウイルスろ過工程前に使用して凝集物を除去し、ウイルスフィルターを汚れから保護し、それによってウイルスのフィルター容量を向上させることができる。
【００１２】
ここに記載の組成物には、広範囲の溶液条件下で使用できる点で、タンパク質凝集体などの不純物を除去するためにウイルスろ過工程前に使用される既知の組成物を上回る利点がある。
【００１３】
いくつかの実施形態では、組成物は、負に荷電している。他の実施形態では、該組成物は中性（疎水性）である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、組成物は、低いｐＨ及び低い伝導度条件下で使用できる（例えば、負に荷電した組成物）。他の実施形態では、組成物は、中性〜高ｐＨ及び中〜高伝導度条件下で使用できる（例えば、疎水性組成物）。
【００１５】
いくつかの実施形態では、サンプル中のタンパク質凝集体からの目的の単量体タンパク質を分離するフロースルー方法が提供され、ここで、該方法は、該サンプルと少なくとも２種の単量体を含む共重合体を有する多孔質固体支持体とを接触させることを含み、ここで、該単量体の少なくとも１種はアクリルアミドを含み、少なくとも第２単量体は疎水性結合基を有し、ここで、該固体支持体は、タンパク質凝集体を選択的に結合し、それによって該タンパク質凝集体から目的の単量体タンパク質を分離し；しかも、該方法は、疎水性相互作用に貢献する条件下、例えば中性〜高ｐＨ及び中〜高伝導度条件下で実行できる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、疎水性結合基は、エチル基、ブチル基、ヘキシル基、２−エチルヘキシル基、ドデシル基、ステアリル基、ヒドロキシプロピル基、フェニル基及びベンジル基よりなる群から選択される。
【００１７】
特定の実施形態では、疎水性結合基は、ベンジルアクリルアミドである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ここに記載される組成物に係る共重合体は、次の構造を含む：
【化１】
0006326499.tif 000002
式中、ｘ、ｙ及びｚは、該共重合体中における各単量体の平均モル分率であり、独立して約０．０１〜０．９９の範囲にあり；
Ｒ1は、エチル基、ブチル基、ヘキシル基、２−エチルヘキシル基、ドデシル基、ステアリル基、ヒドロキシプロピル基、フェニル基及びベンジル基よりなる群から選択される疎水性脂肪族又は疎水性芳香族結合基であり；
Ｒ2は、アクリレート、アクリルアミド、メタクリレート、ビニルエーテル及びスチレンよりなる群から選択される重合性単量体から誘導される２つの重合体間にある非荷電脂肪族又は芳香族有機リンカーであり；
ｍは、同様の共重合体鎖がリンカーの他の末端に結合していることを意味する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ここに記載される組成物に係る共重合体は、次の構造を含む：
【化２】
0006326499.tif 000003
式中、ｘ及びｙは、該共重合体中における各単量体の平均モル分率であり、独立して約０．０１〜０．９９の範囲にあり；
Ｒ1は、エチル基、ブチル基、ヘキシル基、２−エチルヘキシル基、ドデシル基、ステアリル基、ヒドロキシプロピル基、フェニル基及びベンジル基よりなる群から選択される疎水性脂肪族又は疎水性芳香族結合基であり、ここで、該共重合体は、長方形として示される固体支持体上に共有結合によりグラフトしている。
【００２０】
ここに記載される様々な構造において、疎水性結合基は、ベンジルアクリルアミド基である。所定の実施形態では、プレフィルター、清澄ろ過器、クロマトグラフィー媒体（例えば、陽イオン交換、陰イオン交換）、膜吸着体及び製品／プロセス汚染物質を除去するためのウイルス除去フィルターを備えるろ過列が設けられる。
【００２１】
所定の実施形態では、プレフィルターは、少なくとも２種の単量体を含む共重合体を有する多孔質固体支持体を備え、ここで、該単量体の少なくとも１種はアクリルアミドを含み、少なくとも第２単量体は疎水性結合基を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、負に荷電したプレフィルターをウイルスフィルターの上流で異なるｐＨ及び伝導度値でのＩｇＧ供給溶液と共に使用するときの、ウイルスフィルターＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏのスループットを実証する等高線グラフを示す。Ｘ軸は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）を表し、右側のＹ軸はｐＨを表す。
【図２】図２は、ウイルスフィルターの上流に次のプレフィルターを使用する場合のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ（ＶＰｒｏ）ウイルスフィルターのマススループットを実証する棒グラフを示す：１．８％ＡＭＰＳ及び３．０％ＡＭを含むプレフィルター（３）；１．５％ＡＭＰＳ及び３．３％ＤＭＡＭを含むプレフィルター（４）；１．８％ＡＭＰＳ及び３．０％ＤＭＡＭを含むプレフィルター（５）；２．１％ＡＭＰＳ及び２．７％ＤＭＡＭを含むプレフィルター（６）；２．４％ＡＭＰＳ及び２．４％ＤＭＡＭを含むプレフィルター（７）；４．８％ＡＭＰＳ及び０％ＤＭＡＭを含むプレフィルター（８）；１．５％ＡＭＰＳ及び３．３％ＢＭＡを含むプレフィルター（９）；１．８％ＡＭＰＳ及び３．０％ＢＭＡを含むプレフィルター（１０）；２．１％ＡＭＰＳ及び２．７％ＢＭＡを含むプレフィルター（１１）；１．８％ＡＭＰＳ及び３．０％ＩＯＡを含むプレフィルター（１２）；１．８％ＡＭＰＳ及び６．０％ＩＯＡを含むプレフィルター（１３）；１．５％ＡＭＰＳ及び３．３％ＨＰＭＡＭを含むプレフィルター（１４）及び２．５％ＡＭＰＳ及び２．３％ＨＰＭＡＭを含むプレフィルター（１５）。棒グラフの最初の２つのバーはコントロールを示す：ウイルスフィルターのみ（１）及びいかなる変性もないプレフィルターベース膜（２）。Ｘ軸はプレフィルター組成物を表し、Ｙ軸はＶ７５でのウイルス膜フィルターのＩｇＧ／ｍ2のマススループット（ｋｇ）を表す。プレフィルター対ウイルスフィルター面積は３．１ｃｍ2で１：１である。
【図３】図３は、様々なプレフィルター／ウイルスフィルターの組み合わせ（表２）についての緩衝液及びタンパク質溶液の容量対時間曲線を示すグラフを示す。曲線の傾きは透過性に相当する。Ｘ軸は時間（分）を示し、Ｙ軸は容量（ｍｌ）を表す。１．８％ＡＭＰＳ及び３．０％ＡＭを含むプレフィルター（３）は、初期フラックスに用いたのと同じ緩衝液中においてＩｇＧの存在下で透過性の増加を示す唯一の列である。
【図４】図４は、緩衝液のみから同じ緩衝液へのＩｇＧ溶液に切り換えたときの、様々なプレフィルター／ウイルスフィルターの組み合わせのろ過列（ｘ軸（表２））の透過性の変化（ＬＭＨ／ｐｓｉのｙ軸）を表す棒グラフを示す。１．８％ＡＭＰＳ及び３．０％ＡＭを含有するプレフィルター（３）を含む列は、ＩｇＧの存在下で透過性の増加を示した唯一の列である。
【図５】図５は、膜表面がアクリルアミドを含有する（プレフィルター３）図３及び４で観察された透過性の増加のための可能なメカニズムの図を示す。プレフィルター３／ＶＰｒｏの組合せ（表２）の透過性の増加は、アクリルアミドを含有する独特の負に荷電したヒドロゲル表面が正に荷電したＩｇＧとのイオン性相互作用により収縮した結果である。
【図６】図６は、ｐＨ４．０及び異なる溶液の伝導度（ｙ軸、ｍＳ／ｃｍ）での表３における様々なＣＥＸ表面変性膜のＩｇＧ（膜のＩｇＧ／ｍＬのｍｇで表すＹ軸）についての静的結合容量を示す。膜３及び１７におけるＣＥＸ結合基ＡＭＰＳを有する小さな中性及び親水性アクリルアミドの存在は、≦２５ｍＳ／ｃｍの伝導度でより大きな静的ＩｇＧ容量を与えるユニークな高分子ヒドロゲルを可能にする。
【図７】図７は、膜へＣＥＸ結合条件下で同等の動負荷後の表３における様々なＣＥＸ表面変性膜（ｘ軸）のＩｇＧに対する総結合容量（ｙ軸、ｍｇ／ｍｌ）を示す。同等の負荷後のＣＥＸ溶出液を使用して、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりＩｇＧ容量、凝集体選択性を決定し、表４における膜の凝集体容量を算出する。動的ＣＥＸ凝集体容量を、表３における膜について測定して、表３における膜の総選択性の相違を定量化する。
【図８】図８は、高い凝集体容量を有する膜（表４、図７）が良好なウイルスフィルター（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ）保護を与え、それによって例１のプロセスを使用してより高いＩｇＧマススループット（右側のＹ軸）を得る傾向があることを示す。
【図９】図９は、表４からの膜３、１６、５及び８からの供給ローディング溶液及び溶出液を含む正規化されたＳＥＣ−ＨＰＬＣオーバーレイの代表的なクロマトグラムである（ｙ軸はＵＶ２３０ｎｍ  Ａｂｓであり、ｘ軸は分である）。このオーバーレイは、アクリルアミドを含有する膜３の溶出が中性共重合体なしの膜８及び１６又は共重合体ＤＭＡＭを有する膜５よりも高い凝集体の割合を有することを示す。この結果は、アクリルアミドの存在が凝集体（６〜８．５分の大きいピーク面積）に対する膜選択性を改善することを示す。
【図１０】図１０、１１及び１２は、２．５％ＢＡＭ、１．０又は２．０％アクリルアミドで変性された膜３及び４（表５）が、アクリルアミドを含有しなかった膜５、６、７又は８（表５、ｘ軸）よりも大きいウイルス除去フィルター保護（ｋｇ／ｍ2、ｙ軸）（ｐＨ７．０及び５ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．５及び１５ｍＳ／ｃｍ及びｐＨ６．０及び２５ｍＳ／ｃｍでより大きいマススループット）を与えることを示す。また、アクリルアミド含有膜３及び４は、３つの溶液条件下で、ウイルスプレフィルター（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ）（主として疎水性のメカニズム）と同様のマススループットを与え、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｓｈｉｅｌｄ（ＣＥＸ機構）よりも非常に良好なスループットを与える。
【図１１】図１０、１１及び１２は、２．５％ＢＡＭ、１．０又は２．０％アクリルアミドで変性された膜３及び４（表５）が、アクリルアミドを含有しなかった膜５、６、７又は８（表５、ｘ軸）よりも大きいウイルス除去フィルター保護（ｋｇ／ｍ2、ｙ軸）（ｐＨ７．０及び５ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．５及び１５ｍＳ／ｃｍ及びｐＨ６．０及び２５ｍＳ／ｃｍでより大きいマススループット）を与えることを示す。また、アクリルアミド含有膜３及び４は、３つの溶液条件下で、ウイルスプレフィルター（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ）（主として疎水性のメカニズム）と同様のマススループットを与え、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｓｈｉｅｌｄ（ＣＥＸ機構）よりも非常に良好なスループットを与える。
【図１２】図１０、１１及び１２は、２．５％ＢＡＭ、１．０又は２．０％アクリルアミドで変性された膜３及び４（表５）が、アクリルアミドを含有しなかった膜５、６、７又は８（表５、ｘ軸）よりも大きいウイルス除去フィルター保護（ｋｇ／ｍ2、ｙ軸）（ｐＨ７．０及び５ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．５及び１５ｍＳ／ｃｍ及びｐＨ６．０及び２５ｍＳ／ｃｍでより大きいマススループット）を与えることを示す。また、アクリルアミド含有膜３及び４は、３つの溶液条件下で、ウイルスプレフィルター（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ）（主として疎水性のメカニズム）と同様のマススループットを与え、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｓｈｉｅｌｄ（ＣＥＸ機構）よりも非常に良好なスループットを与える。
【図１３】図１３は、膜（３）（表５及び６）がｐＨ６．０及び２５ｍＳ／ｃｍで市販のプレフィルター及び表６からの非変性膜よりも大きいウイルス除去フィルター保護（ｋｇ／ｍ2、ｙ軸）を与えることを示す。
【図１４】図１４（表７）は、膜（３）が、ｐＨ７．０、４．２ｍＳ／ｃｍ、１５．３ｇ／Ｌ、０．２２ｍｌ／分（１６６ＬＭＨ）で、プレフィルターされていないＶＰｒｏと比較して、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより０．８％の凝集体を含むＭＡｂ０１に対して汚れを減少させ、かつ、より大きなＶＰｒｏマススループット（ｘ軸）を与えるように圧力上昇（ｙ軸）を低減させる点で有効であることを示す。
【図１５】図１５（表７）は、膜（３）が、ＶＰｒｏを保護することで、ｐＨ７．５、１８ｍＳ／ｃｍ、９．２ｇ／Ｌ、０．２２ｍｌ／分（１６６ＬＭＨ）で、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより０．４％の凝集体を含有するＭＡｂ０５に対して、プレフィルターされていないＶＰｒｏと比較して汚れの指標である圧力（ｙ軸）を低下させるによりＭＡｂ０５のマススループット（ｘ軸）を４倍向上させることを示す。
【図１６】図１６（表７）は、膜（３）が、ＶＰｒｏを保護することで、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで４％の凝集体を含むＭＡｂ０７について、ｐＨ７．０、８ｍＳ／ｃｍ、８ｇ／Ｌ、０．２２ｍＬ／分（１６６ＬＭＨ）で、予備ろ過なしでのＶＰｒｏウイルスろ過並びにポリアミドから構成される非変性膜プレフィルター（５）及び市販の滅菌等級膜フィルター（４）でのＶＰｒｏウイルスろ過よりも良好な汚れの指標である圧力上昇（ｙ軸）を低減させることによりマススループット（ｘ軸、ｋｇ／ｍ2）を向上させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
詳細な説明
ここに開示される実施形態をさらに容易に理解できるように、まず所定の用語を定義する。追加の定義は、詳細な説明の全体にわたって示されている。
【００２４】
Ｉ．定義
ここで使用するときに、用語「クロマトグラフィー」とは、生物医薬製剤中における汚染物及び／又はタンパク質凝集体から目的の生成物（例えば、治療用タンパク質又は抗体）を分離する任意の種類の技術をいう。
【００２５】
本明細書において区別なく使用される用語「フロースループロセス」、「フロースルーモード」及び「フロースルークロマトグラフィー」とは、目的の生成物を含む生物医薬製剤が材料をフロースルーすることを目的とする生成物分離技術をいう。いくつかの実施形態では、目的の生成物は、材料を通って流れ、そして望ましくない実在物が該材料に結合する。ここに記載される所定の実施形態では、目的の生成物は、アクリルアミドを含む材料を通って流れる。特定の実施形態では、材料は、アクリルアミドを含む共重合体を含有し、ここで、該材料は、タンパク質精製プロセスにおけるウイルスろ過工程（すなわちウイルスフィルターとして）の前に使用される。
【００２６】
本明細書において区別なく使用される用語「汚染物」、「不純物」及び「破片」とは、任意の外来又は好ましくない分子、例えば外来又は好ましくない分子の１種以上から分離されている目的の生成物を含有するサンプル中に存在する場合のあるＤＮＡ、ＲＮＡなどの生体高分子、１種以上の宿主細胞タンパク質、内毒素、脂質、タンパク質凝集物及び１種以上の添加剤をいう。さらに、このような汚染物は、分離工程の前に行う場合のある工程で使用される任意の試薬を含む場合がある。特定の実施形態では、ここに記載の組成物及び方法は、目的の生成物を含有するサンプルからタンパク質凝集体を選択的に除去することを目的とする。いくつかの実施形態では、ここに記載の組成物及び方法は、ウイルスろ過工程の前に使用され、それによって、ウイルス保持フィルターを汚しかつフィルターを通した目的のタンパク質の透過性に悪影響を与えるタンパク質凝集物及び他の不純物を除去する。
【００２７】
用語「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」又は「抗体」（本明細書において区別なく使用される）とは、２個の重鎖及び２個の軽鎖からなる基本的な４つのポリペプチド鎖構造を有するタンパク質であって、該鎖が例えば鎖間ジスルフィド結合によって安定化され、抗原に特異的に結合する能力を有するものをいう。用語「単鎖免疫グロブリン」又は「単鎖抗体」（本明細書において区別なく使用される）とは、重鎖及び軽鎖からなる２つのポリペプチド鎖構造を有するタンパク質であって、該鎖が例えば鎖間ペプチドリンカーによって安定化され、抗原に特異的に結合する能力を有するものをいう。用語「ドメイン」とは、例えばβプリーツシート及び／又は鎖内ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループを含む（例えば、３〜４個のペプチドループを含む）重鎖又は軽鎖ポリペプチドの球状領域をいう。さらに、ドメインは、「定常」ドメイン又は「可変」ドメインとも呼ばれ、これは、「定常」ドメインの場合には様々なクラスメンバーのドメイン内における配列多様性の相対的な欠如、又は「可変」ドメインの場合には様々なクラスメンバーのドメイン内における有意な多様性に基づく。抗体又はポリペプチド「ドメイン」は、当該技術分野では、抗体又はポリペプチド「領域」と区別なく呼ばれる場合が多い。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域又は「ＣＬ」ドメインと区別なく呼ばれる。抗体の重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域又は「ＣＨ」ドメインと区別なく呼ばれる。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域又は「ＶＬ」ドメインと区別なく呼ばれる。抗体の重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域又は「ＶＨ」ドメインと区別なく呼ばれる。
【００２８】
免疫グロブリン又は抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナルであることができ、かつ、単量体又は重合体形態で存在することができ、例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体及び／又は単量体、二量体又は多量体形態で存在するＩｇＡ抗体であることができる。用語「断片」とは、そのままの若しくは完全な抗体又は抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の一部又は部分をいう。断片は、そのままの若しくは完全な抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処理によって得ることができる。また、断片は、組換え手段によって得ることもできる。典型的な断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ及び／又はＦｖ断片が挙げられる。
【００２９】
用語「抗原結合断片」とは、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド部分であって、抗原を結合させる又は抗原結合（すなわち、特異的結合）に対してそのままの抗体と（すなわち、これらのものが由来するそのままの抗体と）拮抗するものをいう。結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって又はそのままの免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断によって産生できる。結合断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、単鎖及び単鎖抗体が挙げられる。
【００３０】
ここで使用するときに、用語「サンプル」とは、精製される標的タンパク質を含む任意の組成物又は混合物をいう。サンプルは、生物学的源又は他の源に由来してもよい。生物学的源としては、植物及び動物の細胞、組織及び臓器などの真核生物源及び原核生物源が挙げられる。いくつかの実施形態では、サンプルは、精製されるべき目的のタンパク質を含む生物医薬製剤を含む。特定の実施形態では、サンプルは、精製されるべき目的のタンパク質を含有する細胞培養原料である。また、サンプルとしては、標的タンパク質又は目的のタンパク質と混合した状態で見出される希釈液、緩衝液、界面活性剤及び汚染性種、破片等を挙げることもできる。サンプルは、「部分的に精製された」ものであってよく（すなわち、ろ過工程などの１回以上の精製工程に供されている）又は標的分子を産生する宿主細胞若しくは生物から直接得たものでもよい（例えば、サンプルは、採取された細胞培養液を含むことができる）。いくつかの実施形態では、ここに記載のフロースルー精製プロセスに供されるサンプルは、結合及び溶出クロマトグラフィー工程、例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーからの溶出液である。
【００３１】
用語「ウイルス膜目詰まり不純物」又は「ウイルス膜目詰まり種」とは、ウイルス粒子を保持するように設計された多孔質膜、すなわち、ウイルスろ過膜又はウイルス保持膜の孔閉塞又は汚れに有意に寄与する溶液の任意の可溶性又は可溶化成分をいうことができる。一般に、これらの種のサイズは、目的のタンパク質よりも大きく、場合によってはウイルス膜によって保持されることを目的とするウイルス粒子の大きさに匹敵し得る。
【００３２】
様々な実施形態において、ここで提供される組成物は、このようなウイルス膜目詰まり種を捕捉するために意図され、かつ、タンパク質精製プロセス中におけるウイルス保持膜の前に使用される。様々な実施形態では、ウイルス膜目詰まり種としては、タンパク質凝集体が挙げられる。
【００３３】
本明細書において区別なく使用される用語「タンパク質凝集体」又は「複数のタンパク質凝集体」とは、目的の生成物、例えば治療用タンパク質又は抗体の少なくとも２種の分子の会合物をいう。目的の生成物のうちの少なくとも２種の分子の会合物は、共有結合、非共有結合、ジスルフィド又は非還元性架橋（これらに限定されない）を含めた任意の手段によって生じる場合がある。
【００３４】
凝集体の濃度は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、すなわち当該技術分野において周知であり、広く受け入れられている方法を使用してタンパク質サンプル中において測定できる（例えば、Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ外，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９６，（２００７），２６８−２７９）。様々な分子量の種の相対的濃度は、ＵＶ吸光度を用いて流出液で測定される一方で、それらの画分の分子量は、カラムメーカーの指示に従って、系の検定を実行することによって決定される。
【００３５】
本明細書において区別なく使用される用語「二量体」、「複数の二量体」又は「タンパク質二量体」又は「複数のタンパク質二量体」は、主として２種の単量体分子を含む集合体から構成されるが、所定量の三量体及び四量体を含有してもよいタンパク質凝集体の低次画分をいう。この画分は、通常、ＳＥＣクロマトグラムにおける主単量体ピークの直前の最初の分解可能ピークとして観察される。  
【００３６】
本明細書において区別なく使用される用語「高分子量凝集体」又は「ＨＭＷ」とは、タンパク質凝集体の高次画分、すなわち五量体以上をいう。この画分は、通常、ＳＥＣクロマトグラムにおいて二量体のピークの前の１以上のピークとして観察される。
【００３７】
ここで使用するときに、用語「固体支持体」とは、一般に、アクリルアミド及び疎水性結合基を有する共重合体を含む任意の材料（多孔質又は非多孔質）をいう。ここに記載される方法及び組成物において使用される固体支持体形式の例としては、膜、多孔質ビーズ、翼状繊維、モノリス、クロマトグラフィー樹脂、織布及び不織布が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
ここで使用するときに、用語「選択性」とは、移動相と固定相との間の２つの種の分配係数の無次元比をいう。分配係数（Ｋp）が比Ｑ／Ｃであり、ここで、Ｑ及びＣは、それぞれ結合及び遊離タンパク質濃度である。
【００３９】
ここで使用するときに、用語「疎水性結合基」とは、疎水性相互作用として定義される、別の疎水性表面との分子間会合が可能な非極性脂肪族又は芳香族有機「疎水性」残基をいう。典型的な疎水性基は、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、フルオロアルキル、アリール等である。特定の実施形態では、疎水性結合基はベンジルアクリルアミドである。
【００４０】
用語「中性〜高ｐＨ」とは、［Ｈ3Ｏ+］［ＯＨ-］＝１．０×１０-14（ここで、ｐＨ＝−ｌｏｇ［Ｈ3Ｏ+］）である水中でのイオン平衡から決定される０〜１４のスケールで６以上のｐＨをいう。
【００４１】
用語「中〜高伝導度」とは、ミリジーメンス／センチメートルで測定されたイオン伝導度が５ｍＳ／ｃｍに等しい又は典型的にそれよりも大きい溶液状態をいう。この溶液の伝導度は、一定の間隔で分離された２つの平坦又は円筒形電極間の溶液の抵抗を決定することによって測定される電解質を有する溶液の電気伝導度である。
【００４２】
用語「ウイルスプレフィルター」又は「プレフィルター」とは、ウイルスフィルター若しくはウイルス保持フィルターの上流で使用され、かつ、ウイルスフィルターを早期に詰まらせる不純物、例えば、タンパク質凝集体を除去することによってウイルスフィルターのスループットを改善させるために使用される正方向流れろ過媒体、膜、又は装置をいう。
【００４３】
用語「ウイルスフィルター」又は「ウイルス保持フィルター」とは、タンパク質精製プロセスの間にウイルス除去を与えるための、サイズ排除メカニズムによる約２０〜１００ｎｍのウイルス又はウイルス粒子を保持する膜又は媒体をいう。ウイルス保持フィルターの例としては、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）ＮＦＰ及びＶｉｒｏｓｏｌｖｅ（登録商標）ＮＦＲが挙げられる。
【００４４】
ＩＩ．例示的な固体支持体
本明細書に開示される実施形態は、単量体の少なくとも１種がアクリルアミドである共重合体を含む固体支持体を提供する。ここに記載される固体支持体は、好ましくは、通常は目的の生成物であるタンパク質の単量体形態よりも、タンパク質凝集体などのウイルスフィルター目詰まり種又は不純物を結合させる。理論に束縛されるものではないが、任意の好適な固体支持体形式を使用することができることが意図される。例えば、固体支持体は、多孔性又は非多孔性であることができ、あるいはモノリス又は膜の形態のように連続的であることができる。また、固体支持体は、粒子、ビーズ又は繊維の形態のように不連続であってもよい。いずれの場合（連続又は不連続）にも、固体支持体の重要な特徴は、高表面積、機械的完全性、水性環境中での完全性及び結合基の近づきやすさを確保するように流れ分布を与える能力を有するというものである。
【００４５】
典型的な連続多孔質固体支持体としては、微多孔膜、すなわち約０．０５ミクロン〜１０ミクロンの間の孔径を有するものが挙げられる。本明細書に開示される実施形態に係る組成物及び方法で使用できる多孔質膜は、本質的に対称又は非対称として分類でき、これは、膜の厚さにわたる又は中空繊維については繊維の微多孔質壁にわたる孔径の均一性をいう。ここで使用するときに、用語「対称膜」とは、膜断面にわたって実質的に均一な孔径を有する膜をいう。ここで使用するときに、用語「非対称膜」とは、平均孔径が膜断面にわたって一定ではない膜をいう。いくつかの実施形態では、非対称膜の場合には、孔径は、膜断面全体にわたる位置に応じて均一に又は不連続的に変化できる。いくつかの実施形態では、非対称膜は、外部表面上の孔径対反対側の外部表面上の孔径の所定の比を有することができ、その比は１よりも実質的に大きい
【００４６】
様々な材料から製造された様々な微孔質膜をここに記載組成物及び方法で使用することができる。このような材料の例としては、多糖類、合成及び半合成重合体、金属、金属酸化物、セラミック、ガラス及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４７】
ここに記載の組成物及び方法において使用できる微孔質膜を製造するために使用できる例示的な重合体としては、置換又は非置換ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリメタクリルアミド、ポリイミド、ポリアクリレート、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリビニル親水性重合体、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体、芳香族ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、過フッ素化熱可塑性重合体、ポリオレフィン、芳香族ポリアミド、脂肪族ポリアミド、超高分子量ポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
典型的な市販の微孔質膜は、ＥＭＤミリポア社（米国マサチューセッツ州ビレリカ）から入手できるＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）；ポール・コーポレーション（米国ニューヨーク州ポートワシントン）から入手できるＳｕｐｏｒ（登録商標）；及びＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．（フランス国オバーニュセデックス）から入手できるＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）及びＳａｒｔｏｂｒａｎ（登録商標）である。
【００４９】
他の例示的な連続固体支持体は、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（オーストリア国フィラッハ）から入手できるＣＩＭ（登録商標）モノリシック材料などのモノリスである。
【００５０】
代表的な不連続固体支持体としては、多孔質クロマトグラフィービーズが挙げられる。当業者であれば容易に認識されるように、クロマトグラフィービーズは、多糖類、アクリレート、メタクリレート、ポリスチレン、ビニルエーテル、制御孔ガラス、セラミック等といった多種多様の重合体材料及び無機材料から製造できる。
【００５１】
典型的な市販のクロマトグラフィービーズは、ＥＭＤミリポア社製のＣＰＧ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ社製のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）；東ソー株式会社性のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）；及びライフテクノロジーズ社製のＰＯＲＯＳ（登録商標）である。
【００５２】
他の例示的な固体支持体は、繊維マット及びフェルトなどの製織又は不織繊維材料、並びに好適なハウジング、例えばクロマトグラフィーカラム、使い捨てプラスチックハウジングなどに充填される繊維である。また、典型的な固体支持体としては、翼状繊維も挙げられる。
【００５３】
ＩＩＩ．例示的な結合基
本明細書に記載される様々な実施形態において、組成物は、アクリルアミド及び結合基の共重合体を含む。
【００５４】
多種多様の結合基又はリガンドを固体支持体に結合させ、そしてここで記載されるようにサンプルからのタンパク質凝集体の効果的な除去のために使用することができる。一般に、結合基は、溶液中のタンパク質凝集体を求引しかつそれに結合することが可能でなければならない。結合基へのタンパク質求引は、イオン性（例えば、陽イオン交換基）、極性、分散性、疎水性、親和性、金属キレート化又はファンデルワールスを含めて、任意のタイプのものとすることができる。
【００５５】
例示的なイオン結合基としては、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、ホスホネート、カルボキシレート、第一級、第二級、第三級アミン及び第四級アンモニウム；複素環式アミン、例えばピリジン、ピリミジン、ピリジニウム、ピペラジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
極性基としては、Ｃ−Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ−Ｎ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ≡Ｎ、Ｎ−Ｈ、Ｏ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｓ、Ｓ−Ｈ、Ｓ−Ｏ、Ｓ＝Ｏ、Ｃ−Ｐ、Ｐ−Ｏ、Ｐ＝Ｏ、Ｐ−Ｈなどの分極化化学結合を有する様々な化学物質が挙げられる。例示的な極性基としては、カルボニル、カルボキシル、アルコール、チオール、アミド、ハロゲン化物、アミン、エステル、エーテル、チオエステルなどである。
【００５７】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ここに記載される組成物は、アクリルアミド及び疎水性結合基の共重合体を含む。疎水性結合基は、疎水性相互作用が可能である。典型的な疎水性基は、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、フルオロアルキル、アリール等である。例示的なアリール基は、ベンジル、フェニル、ナフチル、トリル等である。
【００５８】
親和性結合基は、一斉に標的タンパク質との高特異的相互作用を与える数個の結合官能基の配列である。例示的な親和性結合基としては、プロテインＡ及びプロテインＧ並びにそれらのドメイン及び変異体が挙げられる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、結合基はイオン性基である。特定の実施形態では、結合基は、負に荷電したスルホン酸基である。一般に、負に荷電したスルホン酸基はいくつかの利点を有する。例えば、これらのものは、溶液状の正に荷電したタンパク質を結合させる広範な適用可能性を示す；その化学物質は、安価でかつ簡単であり、多くの合成製造方法が容易に利用できる；結合基とタンパク質との間の相互作用はよく理解されており（例えば、Ｓｔｅｉｎ外，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ，８４８（２００７）１５１−１５８参照）、この相互作用は、溶液条件を変更することによって容易に操作でき、また、このような相互作用は、他の相互作用から隔離できる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、好ましい結合基は疎水性基である。疎水性結合基は、イオン結合基があまり効果的でない高イオン伝導度条件下で溶液種を結合させるという利点を与える。特定の実施形態では、結合基は、芳香族炭化水素基、例えば、ベンジル基又はエチル基、ブチル基、ヘキシル基、２−エチルヘキシル基、ドデシル基、ステアリル基、ヒドロキシプロピル基若しくはフェニル基である。
【００６１】
結合基の他に、固体支持体は、結合基と共に存在し、かつ、次のいずれか１つ以上を与える中性基（例えば、アクリルアミド）を含有することができる：結合基を互いに最適な距離に分離し、多孔質支持体に水湿潤性を与え、サンプルと固体支持体との間の非特異的相互作用を低減し、吸水率を制御し、そして結合基を含む重合体構造を膨潤させ、結合基を含む重合体構造に適切な機械的特性を与え、固体支持体に対する重合体構造の密着性を向上させ、容量及び／又は選択性を増大させる、サンプルとの二次相互作用を与える。
【００６２】
例示的な中性基は、アルコール、糖、グリコール、エーテル、アミド、ニトリルなどである。好適な中性基は、単純なアミド基Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2である。
【００６３】
ＩＶ．固体支持体に結合基を結合させる方法
ここに記載の組成物及び方法では、好適な結合基（例えば、イオン性又は疎水性結合基）を固体支持体に結合させて、目的の生成物に対する、より高いタンパク質凝集体結合容量を与える。
【００６４】
ここに記載の組成物及び方法は、該組成物中にアクリルアミドが存在すると、高次のタンパク質凝集体を含めてウイルス膜目詰まり種に対する固体支持体の選択性が有意に向上するという驚くべきかつ予想外の発見に基づくものである。
【００６５】
ここに記載される組成物及び方法は、フロースルーモードで、一般に例えば五量体以上などの高次の凝集体と比較してタンパク質の単量体形態から分離するのがより困難な例えば二量体、三量体及び四量体などの低次タンパク質凝集体の除去に特に効果的である。
【００６６】
当該技術分野で知られている様々な方法及び本明細書に記載のものは、ここに記載される方法で使用するための固体支持体に結合基を結合させるために使用できる。一般に、成功する結合の基準としては、所望の結合基密度の達成及び結合基の脱離率の低さ（すなわち、結合基の低浸出）が挙げられる。結合基は、固体支持体に直接結合でき、又は重合体分子に取り入れられることができ、これをその後固体支持体に結合させることができる。あるいは、結合基を、固体支持体上に塗布された架橋被膜に、被膜と固体支持体との間に化学結合を形成させて又は形成させずに取り入れることができる。
【００６７】
固体支持体に結合する基を結合させるための多数の方法が当該技術分野で知られている（例えば、Ｕｌｂｒｉｃｈｔ，Ｍ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｐｏｌｙｍｅｒ，４７，２００６，２２１７−２２６２）。これらの方法としては、好適なカップリング化学により固体支持体を結合基により直接変性させること；重合体分子を吸着及び結合させることが挙げられる。後者は、「に」グラフトさせる（重合体が表面との反応の前に予め作製されている場合）又は「から」グラフトする（重合が表面基を使用して開始される場合）ことによって達成できる。
【００６８】
結合基を有する重合体を生じさせる際に使用される単量体の選択は、単量体の反応性によって決定される。様々な単量体の種類の反応性及び重合体組成物に及ぼす影響は、十分に研究され、文書化されている（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８９，ｐ．ＩＩ参照）。重合体の組成及びその構造を予測する単量体の十分に受け入れられているパラメータは単量体の反応性比である（例えば、Ｏｄｉａｎ，Ｊ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００４，ｐ．４６６参照）。
【００６９】
固体支持体にイオン性又は疎水性結合基を結合させるための好ましい方法は、固体支持体上に塗布された架橋被膜に結合基を導入する現場重合反応である。この方法は、米国特許第４９４４８７９号及び同４６１８５３３号並びに米国特許出願公開第ＵＳ２００９／２０８７８４号に開示されている。この方法は、容易なだけでなく経済的である。疎水性又は荷電結合リガンドの密度を減少させるために使用できる中性単量体は、例えば、アクリルアミド、アクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸ヒドロキシエチル及びメタクリル酸ヒドロキシエチルといったアクリル系、メタクリル系及びアクリルアミド単量体の大きな基から選択できる。本明細書に記載された様々な実施形態では、中性単量体はアクリルアミドである。
【００７０】
固体支持体上に被覆される結合基含有重合体の代表的な化学構造を式Ａに示す。重合体を被覆するために、一般には、このものは他の重合体に架橋される。式Ａでは、Ｒ1が疎水性又は陽イオン交換基を有する任意の脂肪族又は芳香族有機残基であり、例えば、エチル、ブチル、ヘキシル、２−エチルヘキシル、ドデシル、ステアリル、ヒドロキシプロピル、フェニル及びベンジル基から選択される疎水性脂肪族若しくは芳香族有機基又はスルホン酸、スルフェート、リン酸、ホスホン酸又はカルボン酸基から選択される陽イオン交換基などであり、Ｒ2が任意の非荷電脂肪族又は芳香族有機リンカー、例えば、任意の２個以上の重合体鎖間のアクリレート、アクリルアミド、メタクリレート、ビニルエーテル及びスチレンなどである重合体構造が示されている。
【００７１】
式Ａに示される重合体構造において、ｘ、ｙ及びｚは重合体中における各単量体の平均モル分率であり、かつ、独立して約０．０１〜０．９９の範囲にあり；ｍは、リンカーを介した第２の重合体への結合を意味する。
【００７２】
固体支持体にグラフトする結合基含有重合体の代表的な化学構造を式Ｂに示す。式Ｂにおいて、Ｒ1が疎水性又は陽イオン交換基を含有する任意の脂肪族又は芳香族有機残基、例えば、エチル、ブチル、ヘキシル、２−エチルヘキシル、ドデシル、ステアリル、ヒドロキシプロピル、フェニル及びベンジルからなる群から選択される疎水性脂肪族若しくは芳香族有機基又はスルホン酸、スルフェート、リン酸、ホスホン酸若しくはカルボン酸基から選択される陽イオン交換基などである重合体構造が示されている。
【００７３】
式Ｂに示された重合体構造において、ｘ及びｙは重合体中における各単量体の平均モル分率であり、独立して約０．０１〜０．９９の範囲である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、結合基（例えば、疎水性結合基）を含む重合体は、ブロック共重合体であり、これは、このものが一方のタイプの単量体の長いストリング又はブロック、その後異なるタイプの単量体の長いストリング又はブロックを有することを意味する。
【００７５】
他の実施形態では、結合基を含有する共重合体は、単量体をランダムな順序で含有する。
【００７６】
さらに他の実施形態では、結合基を含有する共重合体は、各単量体が、常に、異なる種類の２つの単量体にどちらかの側で隣接している交互共重合体である。
【００７７】
他の実施形態では、結合基（例えば、疎水性結合基）を含む共重合体は、単量体をランダムな順序で含有する。
【００７８】
他の実施形態では、結合基を含有する共重合体は交互共重合体であるのに対し、各単量体は、常に異なる種類の２つの単量体に隣接している。
【００７９】
ＩＶ．ここに記載される組成物を取り入れた装置
いくつかの実施形態では、ここに記載された組成物は、装置に取り入れられる。微孔質膜などの固体支持体に適した装置としては、ろ過カートリッジ、カプセル及びポッドが挙げられる。また、例示的な装置としては、本明細書において参照により援用される米国特許公開第ＵＳ２０１００２８８６９０Ａ１号及び同２００８０２５７８１４Ａ１号に開示された積層板ろ過カートリッジが挙げられる。これらの装置の場合には、固体支持体は、重合体ハウジングに永久的に結合され、該装置は、液体入口、出口及び通気口を有し、さらに、保持される液体の量を最小限に抑える。他の例示的な装置としては、プリーツフィルターカートリッジ及び渦巻きフィルターカートリッジが挙げられる。他の例示的な装置はクロマトグラフィーカラムである。クロマトグラフィーカラムは、ガラス、金属、セラミック及びプラスチックといった多数の好適な材料から製造できる。これらのカラムに、エンドユーザーが固体支持体を充填することができ、又は製造業者が予め充填し、そして充填された状態でエンドユーザーに出荷できる。
【００８０】
Ｖ．ここに記載された組成物及び装置の使用方法
ここに記載された組成物を含む装置は、フロースルーモードでのタンパク質凝集体の除去のために使用できる。実験規模分離のための適用前に、プロセスを開発し、そしてｐＨ及び伝導度などの適切な溶液条件について検証しなければならず、また、装置へのタンパク質負荷の範囲を決定しなければならない。プロセス開発及び検証のための方法は広く知られており、当該技術分野において日常的に実施されている。
【００８１】
装置は、一般に、使用前にフラッシュされ、消毒され、そして適切な緩衝液で平衡化される。タンパク質溶液は、所望の伝導度及びｐＨに調整され、続いて一定の圧力又は一定の流量のいずれかで装置を通してポンピングされる。流出液を回収し、そしてタンパク質の収量及び凝集体濃度を分析することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ここに記載されるように、凝集体除去用の装置は、例えば、米国特許第７１１８６７５号（その全体が参照により本明細書で援用される）に教示されるようなウイルス粒子のサイズベースの除去を確実にするように設計されるウイルスろ過装置に直接接続される。
【００８３】
限定として解釈されるべきではない以下の例により実施形態をさらに例示する。本願を通して引用した全ての参考文献、特許及び公開特許出願並びに図面の内容は、参照により本明細書で援用する。
【実施例】
【００８４】
例１．アクリルアミドを含有する負に荷電したフィルターの製造及びジメチルアクリルアミドを含むフィルターとの比較
この実験は、タンパク質凝集体などの不純物を除去するために使用される吸着膜を製造するために共単量体としてアクリルアミドを添加することの予想外の利点を実証するものである。
【００８５】
一連の陽イオン交換（ＣＥＸ）表面変性膜を結合基で製造し、この場合に、これらのものは負に荷電されたスルホン酸残基である。ＣＥＸ密度を、表面変性のために使用される反応溶液の配合によって制御する。より低いＣＥＸ密度を達成するために使用される非荷電反応性共単量体の効果を評価するために、荷電していない反応性単量体であるアクリルアミド（ＡＭ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＭ）、メタクリル酸ベンジル（ＢＭＡ）又はアクリル酸イソオクチル（ＩＯＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡＭ）を様々な量で反応溶液に添加する。これらの共単量体は、様々なサイズ及び疎水性又は親水性の程度をカバーするように選択される。
【００８６】
１．５〜２．５重量％の範囲のＣＥＸ単量体２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）をＡＭ、ＤＭＡＭ、ＢＭＡ、ＩＯＡ又はＨＰＭＡＭ及び架橋剤のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（０．８重量％）とＵＶ開始剤イルガキュア２９５９（０．２重量％）（２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン）との一定質量パーセントと共に含有する一連の水性又は水：アセトニトリル（５０：５０）溶液を製造する。０．１０μｍの孔径等級及び０．１００ｍｍの厚さを有する親水性ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を、１４ｃｍ×１４ｃｍの正方形片に切断し、そして各片を３０秒間にわたって溶液の一つに浸漬して完全な湿潤を確保する。過剰の溶液を除去し、そして膜をＵＶ放射線に曝露する。その後、この膜を脱イオン水ですすぎ、そして空気中で乾燥させる。表Ｉは、共単量体の効果を評価するために製造されたＣＥＸ表面変性膜の変形例を列挙する。
【００８７】
【表１】
0006326499.tif 000004
【００８８】
アクリルアミドを含有する負に荷電したプレフィルター及び他の共単量体含有プレフィルターの評価を、ろ過中に下流のウイルス保持フィルターのスループットを向上させるためにそれらのプレフィルトレーション性能を決定することによって達成する。供給流れは、一般に、フィルターの上流にウイルスプレフィルターを有しないウイルスフィルターを急速に汚すポリクローナルＩｇＧ凝集体を含有する。使用される結合基は負に荷電しているため、ＩｇＧに対する強ＣＥＸ溶液結合条件を使用してプレフィルターの性能を評価する。
【００８９】
ウイルスフィルターによって与えられる保護を試験するためのポリクローナルＩｇＧ供給液を４．０ｇ／ＬのＩｇＧ濃度で、ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のヒトガンマグロブリン粉末（カタログ番号ＨＳ−４７０−９０）を使用してｐＨ４、２．０ｍＳ／ｃｍでの１０ｍＭ酢酸ナトリウムで新たに調製する。最終ｐＨ及び伝導度の調節は、１０ＭのＨＣｌ、ＮａＯＨ又は４ＭのＮａＣｌを使用して行い、そしてこの溶液を使用前に滅菌ろ過する。
【００９０】
３．１ｃｍ2のろ過面積を有するマイクロろ過装置を、膜の３層を使用して予備成形し、そしてＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｍｉｃｒｏ装置（ＥＭＤミリポア社、米国マサチューセッツ州ビレリカ）と１：１の面積比で直列に取り付ける。両方の装置を、緩衝液（ｐＨ４、１０ｍＭ酢酸、２ｍＳ／ｃｍ）のみを使用して予め湿らせ、空気を除去するように排気する。３０ｐｓｉの一定圧力下で、１分当たりの緩衝液の初期フラックス（ｍＬ）を、初期透過率の値に到達させるために２０分間かけて質量を測定することによって決定する。供給物を３０ｐｓｉで４ｇ／ＬポリクローナルＩｇＧ供給物に切り替え、容量スループットを、フラックスが初期緩衝液のみのフラックスの２５％に低下するまで測定し、時間に対してプロットする。ポリクローナルＩｇＧ溶液の総スループットをＶ７５でＬ／ｍ2で測定し、膜のｍ2当たりのポリクローナルＩｇＧのｋｇに変換する。
【００９１】
表１及び図２から分かるように、１．８％のＡＭＰＳ、３．０％のアクリルアミドで変性された膜３は、他のＡＭＰＳと共単量体との組み合わせよりも大きいウイルス除去フィルターに対する保護（大きいマススループット）を与える。アクリルアミド含有膜３は、ベース膜制御膜２及びプレフィルターされていないウイルス膜１を超える高いマススループットを与える。
【００９２】
例２．溶液中におけるタンパク質の存在に応じた透過性の変化はアクリルアミドを含む表面被膜の３次元的性質の指標である
この例は、共単量体としてアクリルアミドを使用して調製された表面化学の性質を実証するものである。例１で使用した装置の組み合わせの透過性を、４ｇ／ＬのＩｇＧを含む供給溶液及びいかなるタンパク質も含まない同一の緩衝液の両方を使用して試験する。共単量体としてアクリルアミドを含む装置は、列の透過性がＩｇＧの存在下で他のプレフィルター及び非プレフィルターＶＰｒｏ（膜１）の場合における透過性と比較して増加する（表２、図３及び４）点で、いくつかの独特の特性を有することが観察される。理論に束縛されるものではないが、膜３においてＣＥＸ結合基ＡＭＰＳを有する小さな親水性共重合アクリルアミドを使用すると、独特の高分子ヒドロゲル（図５）が可能になり、これはＩｇＧが架橋イオンを形成したときに容易に収縮し、それによって膜孔を開き、透過性の増加をもたらすと仮定される。
【００９３】
共単量体ＢＭＡ及びＤＭＡＭを使用した表２におけるより疎水性の配合物（膜４、５、及び９）は、透過性に及ぼす同じ効果を有しない（表２、図３及び４）。
【００９４】
【表２】
0006326499.tif 000005
【００９５】
例３．伝導度に応じたタンパク質結合容量
この例は、ｐＨ４．０及び様々な溶液伝導度で表３の表面変性膜の静的ＩｇＧ結合容量を測定することによって、共単量体としてのアクリルアミドのユニークな効果を実証するものである。
【００９６】
静的結合容量を測定するためのポリクローナルＩｇＧ供給液を１．０ｇ／ＬのＩｇＧ濃度で、ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のヒトガンマグロブリン粉末（カタログ番号ＨＳ−４７０−９０）を使用してｐＨ４、１０ｍＭ酢酸ナトリウムで新たに調製する。表３における最終ｐＨ４．０及び伝導度を、１０ＭのＨＣｌ、ＮａＯＨ又はＮａＣｌを使用して作製する。この溶液を使用前に滅菌ろ過する。
【００９７】
膜サンプルを、環状ダイを使用して既知の半径に切断する。膜体積（Ｖ＝πｒ2ｈ）を、１００ミクロンの膜の厚さを使用して計算する。膜ディスクサンプルを水で予め湿らせ、そして表３の通りに適切なｐＨ４．０緩衝液に交換する。その後、膜ディスクを、ｐＨ４．０で１ｇ／ＬのＩｇＧの適切な容量に入れる。目標負荷は、２ｍＳ／ｃｍについて約１００ｍｇ／ｍｌ、１５及び２５ｍＳ／ｃｍについて５０ｍｇ／ｍｌ、３７及び４９ｍＳ／ｃｍについて２５ｍｇ／ｍｌである。膜サンプル及びＩｇＧ溶液を８時間にわたって回転混合させ、そして上清をＵＶ２８０吸光度によって最終ＩｇＧ濃度について測定する。膜の１ｍＬの当たりのＩｇＧ（ｍｇ）で表される静的ＩｇＧ容量を、最終上清濃度に基づいて物質収支によって算出する。表３及び図６における最終膜静的ＩｇＧ容量は、アクリルアミドを含み（すなわち膜３及び１７）、かつ、ＭＢＡＭの代わりにテトラ（エチレングリコール）ジアクリレート架橋剤を有する膜が試験を受けた他の膜（すなわち、ベース膜２）、より多くの結合基を有する膜（すなわち、膜７及び８）、アクリルアミドなしの膜（すなわち、膜８、１６、１８）及び共単量体ＤＭＡＭ有する膜（すなわち、膜７、５、１９）よりもｐＨ４、２５ｍＳ／ｃｍまでで高い静的ＩｇＧ容量を有することを示す。
【００９８】
膜３及び１７においてＣＥＸ結合基ＡＭＰＳを有する小さな中性の水性アクリルアミドの存在は、より大きな静的ＩｇＧ容量を与えるユニークな高分子ヒドロゲルを可能にする。
【００９９】
【表３】
0006326499.tif 000006
【０１００】
例４．ＣＥＸ動的結合からの溶出液のＳＥＣ測定によって評価されるときのタンパク質凝集体に対するアクリルアミド含有膜の選択性
この例は、ＩｇＧ凝集体に対するアクリルアミド含有膜の選択性を実証する。
【０１０１】
動的ＣＥＸ凝集体容量を表３の膜について測定して、膜の凝集体選択性の差を定量化する。凝集体を含むポリクローナルＩｇＧ供給物を使用して、表３における膜に対する結合条件下で同等の動的ＣＥＸ負荷を与える。同等の負荷後のＣＥＸの溶出液を使用して、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、表４の膜のＩｇＧ容量、凝集態選択性及び凝集体容量を決定する。
【０１０２】
この供給物を１０．０ｇ／ＬのＩｇＧで、ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のヒトガンマグロブリン粉末（カタログ番号ＨＳ−４７０−９０）を使用して２．０ｍＳ／ｃｍ（ＮａＣｌを使用）でのｐＨ４の１０ｍＭ酢酸ナトリウムで新たに調製する。最終ｐＨ及び伝導度の調節を、１０ＭのＨＣｌ、ＮａＯＨ又は４ＭのＮａＣｌを使用して行い、この溶液を使用前に滅菌ろ過する。
【０１０３】
３．１ｃｍ2のろ過面積を有するマイクロろ過装置を、膜の３層を使用して予備成形する。装置を２０ｍｌの緩衝液、ｐＨ４、１０ｍＭ酢酸塩、２ｍＳ／ｃｍで予め湿らせ、そしてフラッシュし、その後４０ｍＬの１０ｇ／Ｌ  ＩｇＧ（４．０ｋｇ／Ｌ又は１．３ｋｇ／ｍ2の負荷）を０．２ｍＬ／分（２ＣＶ／分）で個々の装置に流す。装置を２ｍＬ（２０ＣＶ）の緩衝液で洗浄し、そして２ｍＬ（２０ＣＶ）のｐＨ４、０．５ＭのＮａＣｌで溶出させる。
【０１０４】
溶出液を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して分子量種について分析する。ＳＥＣクロマトグラムとＩｇＧ結合容量（ＵＶ２８０の溶出液濃度から）との積分から決定されるパーセント凝集体を使用して、表４並びに図７及び８における膜の凝集体容量を算出する。
【０１０５】
図９は、表４からの膜３、１６、５及び８からの供給ローディング溶液及び溶出液を含む正規化ＳＥＣ−ＨＰＬＣオーバーレイの代表的なクロマトグラムである。このオーバーレイは、アクリルアミドを含有する膜３の溶出が中性共単量体なしの膜８及び１６又は共単量体ＤＭＡＭを有する膜５よりも高い凝集体割合を有することを示す。この結果は、アクリルアミドの存在が凝集体に対する膜選択性を改善することを実証するものである。
【０１０６】
表４並びに図７及び８における凝集体容量は、アクリルアミド含有膜３及び１７（ＭＢＡＭの代わりにテトラ（エチレングリコール）ジアクリレート架橋剤を有する）について最も高い。アクリルアミドを含有する膜は、ベース膜２、多くの結合基を有する膜（膜８及び７）、アクリルアミドのない膜（膜８、１６、１８）並びにＤＭＡＭを有する膜（膜７、５、１９）よりも高い凝集体容量を有する。
【０１０７】
図８は、より高い凝集体容量を有する膜が良好なＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ保護を与え、それにより例１のプロセスを使用して、より高いＩｇＧマススループットをもたらす傾向があることを示す。
【０１０８】
【表４】
0006326499.tif 000007
【０１０９】
例５．アクリルアミドなしのプレフィルターと比較したアクリルアミド含有疎水性プレフィルターの製造及び試験
この例は、疎水性結合条件（中性〜高ｐＨ及び中〜高伝導度）下でウイルスフィルターを保護するために疎水性結合基を有する共単量体としてアクリルアミドを使用することの利点を実証するものである。
【０１１０】
疎水性単量体のＮ−ベンジルアクリルアミド２．５重量％（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  Ｌ１１４５０）を結合基として使用し、そして２．０重量％のアクリルアミド及び架橋剤Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（０．８重量％）と共重合させる。これらの単量体を５０：５０水：ＭＰＤ（（±）−２−メチル−２，４−ペンタンジオール）に溶解させ、そして０．２２ミクロン定格親水性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜の１４×１４ｃｍシートを３０秒間にわたってこの溶液に浸漬させ、そして過剰の溶液を除去する。重合を、電子ビーム（１７０ｋＶで２．５ＭＲａｄ）を使用して開始させ、その後、膜を脱イオン水ですすぎ、そして空気中で乾燥させた。アクリルアミド共単量体あり及びなしの疎水性結合基を有するプレフィルター膜について、下流ウイルスフィルターのスループットを向上させるためにそれらのプレフィルトレーション性能を評価する。供給流れは、一般にプレフィルターしていないウイルスフィルターを急速に汚すポリクローナルＩｇＧ凝集体を含有する（例１）。結合基は疎水性なので、アクリルアミドあり及びなしの効果を、一般に抗体の疎水性相互作用を強化する中性〜高ｐＨ及び中〜高伝導度の溶液条件下で評価する。
【０１１１】
ポリクローナルＩｇＧ供給物を０．５又は２．０ｇ／ＬのＩｇＧ、ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のヒトガンマグロブリン粉末（カタログ番号ＨＳ−４７０−９０）で、トリス緩衝液及びＮａＣｌを使用してｐＨ７．０、５ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．５、１５ｍＳ／ｃｍ及びｐＨ６．０、２５ｍＳ／ｃｍを使用して新たに調製する。最終ｐＨ及び伝導度の調節を、１０ＭのＨＣｌ、ＮａＯＨ又は４ＭのＮａＣｌを使用して行い、この溶液を使用前に滅菌ろ過する。
【０１１２】
３．１ｃｍ2のろ過面積を有するマイクロろ過装置を、膜の３層を使用して予備成形し、そしてＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｍｉｃｒｏ装置（ＥＭＤミリポア社、米国マサチューセッツ州ビレリカ）と１：１の面積比で直列に取り付ける。両方の装置を、緩衝液を使用して予め湿らせ、空気を除去するように排気する。３０ｐｓｉの一定圧力下で、緩衝液の初期フラックス（ｍＬ／分）を、初期の一定の透過率値を決定するために２０分間かけて質量で測定する。供給物を３０ｐｓｉでポリクローナルＩｇＧ溶液に切り替え、そして容量スループットを、フラックスが初期緩衝液のフラックスの２５％に低下するまで測定し、時間に対してプロットする。ポリクローナルＩｇＧ溶液の総スループットをＶ７５でＬ／ｍ2で測定し、膜のｍ2当たりのポリクローナルＩｇＧのｋｇに変換する。表５並びに図１０、１１及び１２から分かるように、２．５％のＢＡＭ、１．０又は２．０％のアクリルアミドで変性された膜３及び４は、アクリルアミドを含有しない膜５、６、７又は８よりも大きいウイルス除去フィルターに対する保護（大きいマススループット）を与える。また、アクリルアミド含有膜３及び４は、３つの溶液条件下で、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）プレフィルター（主として親水性メカニズム）と同様のマススループットを与え、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｓｈｉｅｌｄ（ＣＥＸメカニズム）プレフィルターよりもかなり良好なスループットを与える。
【０１１３】
【表５】
0006326499.tif 000008
【０１１４】
例６．ポリクローナルＩｇＧを使用した、アクリルアミド含有疎水性プレフィルターと市販のプレフィルター及び未変性ベース膜との比較
この例は、疎水性結合リガンドＮ−ベンジルアクリルアミド（ＢＡＭ）及びアクリルアミド（ＡＭ）の表面変性化学的性質を有する例５（表５）からの膜（３）が、疎水性結合条件（中性〜高ｐＨ及び中〜高伝導度）下でウイルスフィルターを保護することを実証するものである。観察されるように、膜（３）は、市販のプレフィルター及び非変性ベース重合体膜よりも良好に、下流ウイルスフィルター（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ、米国マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤミリポア社）のポリクローナルＩｇＧマススループットを向上させる。
【０１１５】
表６のプレフィルターを、下流ウイルスフィルターのポリクローナルＩｇＧマススループットを向上させるためにプレフィルトレーション性能について評価した。膜サンプル（１）は、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｓｈｉｅｌｄ、すなわち、ＣＥＸメカニズムを基礎とする表面変性を有する膜フィルターであり（ＶＰＭＳＫＩＴＮＢ９、米国マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤミリポア社）；サンプル（２）は、ＯｐｔｉＳｃａｌｅ−４０  Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）プレフィルター、すなわち５ｃｍ2のろ過面積を有する疎水性メカニズムを基礎とするデプスフィルター（ＳＳＰＶＡ４０ＮＭ９、米国マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤミリポア社）である。
【０１１６】
膜（４）は、１１０μｍの厚さを有する親水化ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）０．２μｍ膜（エクスプレス滅菌グレード、ＧＥＰＰ、米国マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤミリポア社）である。膜（５）は、１７０μｍの厚さを有する親水性ナイロン（ポリアミド）０．２０μｍ膜（ＧＮＷＰ、米国マサチューセッツ州ビレリカＥＭＤミリポア社）である。膜（６）は、１１０μｍの厚さを有する非変性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）０．２μｍ膜（ＧＥＨＰ、米国マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤミリポア社）である。
【０１１７】
供給流れは、プレフィルターされていないウイルスフィルターを急速に汚すポリクローナルＩｇＧ凝集体を含有する（例１）。膜（３）の結合基は疎水性のため、そのプレフィルトレーション性能を、一般に抗体の疎水性相互作用を強化する溶液条件（中性〜高ｐＨ及び中〜高伝導度）下で評価した。
【０１１８】
ポリクローナルＩｇＧ供給物を２．０ｇ／ＬのＩｇＧ、ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のヒトガンマグロブリン粉末（カタログ番号ＨＳ−４７０−９０）で、酢酸塩緩衝液及びＮａＣｌを使用してｐＨ６．０、２５ｍＳ／ｃｍで新たに調製する。最終ｐＨ及び伝導度の調節を、１０ＭのＨＣｌ、ＮａＯＨ又は４ＭのＮａＣｌを使用して行い、この溶液を使用前に滅菌ろ過する。
【０１１９】
３．１ｃｍ2のろ過面積を有するマイクロろ過装置を、膜の２又は３層を使用して予備成形して同等の厚さ又は総容量を得、そしてウイルスろ過装置Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｍｉｃｒｏ（ＥＭＤミリポア社、米国マサチューセッツ州ビレリカ）と１：１の面積比で直列に取り付ける。両方の装置を、緩衝液を使用して予め湿らせ、空気を除去するように排気する。３０ｐｓｉの一定圧力下で、緩衝液のみの初期フラックス（ｍＬ／分）を、初期の一定のフラックス値を決定するために２０分間かけて質量で測定する。供給物を３０ｐｓｉでポリクローナルＩｇＧの緩衝溶液に切り替え、そして容量スループットを、フラックスが初期緩衝液のフラックスの２５％及び１０％に低下するまで測定し、時間に対してプロットする。ポリクローナルＩｇＧ溶液の総スループットをＶ７５でＬ／ｍ2で測定し、膜のｍ2当たりのポリクローナルＩｇＧのｋｇに変換する。
【０１２０】
表６並びに図１３から分かるように、２．５％のＢＡＭ、２．０％のアクリルアミド、０．８％のＭＢＡＭで変性された膜（３）は、市販の膜フィルター（１）及び（４）並びに非変性ベース重合体膜（５）及び（６）よりも大きなウイルス除去フィルターに対する保護（大きいポリクローナルＩｇＧのマススループット）を与える。これは、アクリルアミドを有する疎水性リガンドＢＡＭ共重合体を使用した表面変性が、市販の膜フィルター（１）、すなわちＣＥＸ機構及び親水化ＰＥＳ（４）並びにポリアミドから構成される非変性膜（５）及びポリエーテルスルホンから構成される非変性膜（６）よりも、典型的な疎水性結合条件（ｐＨ６、２５ｍＳ／ｃｍ）下で良好に保護されたことを実証するものである。膜（３）は、３．１ｃｍ2に正規化されたときに、主として疎水性メカニズムによりタンパク質を吸着することが知られているサンプル（２）のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）プレフィルター（マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤミリポア社）に対してより大きなマススループットを与えた。
【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
例７．モノクローナル抗体によるアクリルアミド含有疎水性プレフィルター性能
この例は、疎水性結合リガンドＮ−ベンジルアクリルアミド（ＢＡＭ）と共にアクリルアミド（ＡＭ）の表面変性化学的性質を有する例６（表６）からの膜（３）が、疎水性結合条件下でウイルスフィルター（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ、マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤミリポア社）を保護してモノクローナル抗体（ＭＡｂ）のマススループットを改善することを実証するものである。これらの例は、膜（３）を有するウイルスフィルターをプレフィルターすると、ポリアミド（５）から構成される非変性プレフィルター又は親水化ＰＥＳ膜（４）を使用したプレフィルトレーションなしのウイルスろ過よりも良好に機能することを実証した。
【０１２３】
表７における膜プレフィルター（３）、（４）及び（５）を、下流のウイルスフィルター（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ、マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤミリポア社）によるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）のマススループットを向上させるために、疎水性結合条件下（中性〜高ｐＨ及び中〜高伝導度）でそれらのプレフィルトレーション性能について評価した。
【０１２４】
膜（４）は、１１０μｍの厚さを有する親水化ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）０．２μｍ膜（エクスプレス滅菌グレード、ＧＥＰＰ、米国マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤミリポア社）である。膜（５）は、１７０μｍの厚さを有する親水性ナイロン（ポリアミド）０．２０μｍ膜（ＧＮＷＰ、米国マサチューセッツ州ビレリカＥＭＤミリポア社）である。
【０１２５】
ＭＡｂ供給流れＭＡｂ０１、０５及び０７の詳細並びにろ過容量実験条件及び結果を表７、図１４〜１６に詳しく示す。３種のＭＡｂを、全て少なくともプロテインＡ溶出後の状態にまで精製し、そして溶液条件を１０Ｍ  ＨＣｌ、ＮａＯＨ又は４Ｍ  ＮａＣｌを使用して表７の条件に調節した。
【０１２６】
０．８ｃｍ2のろ過面積を有するステンレス鋼Ｓｗｉｎｎｅｙ１３ｍｍ直径フィルターホルダー（ＸＸ３００１２００、マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤミリポア社）を、プレフィルトレーション膜（３）、（４）及び（５）の２又は３層を使用して組み立てて、同等の厚さ及び総容量を得、そしてＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏウイルスろ過膜（マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤミリポア社）の２層を有する同じホルダーを使用して、１：１の面積比で直列に取り付けた。
【０１２７】
プレフィルター及びウイルス膜装置を、３０ｐｓｉで緩衝液により予め湿らせ、そして試験のためにモノクローナル抗体供給物に移した。容量実験を、１６６ＬＭＨ（Ｌ／ｍ2．ｈｒ）の一定流量で実行し、そして圧力をろ過の上流で監視してろ過列の詰まりを検出した。ＭＡｂ溶液の総スループットを容量で測定し、そしてウイルス膜のｍ2当たりのＭＡｂのｋｇに変換した。
【０１２８】
３種の異なるＭＡｂを使用した３つの例は、全て、ＭＡｂの等電点及び／又は中程度の溶液伝導度に近い、より有利な疎水性結合条件下であった（中性〜高ｐＨ及び中〜高伝導度）。
【０１２９】
図１４は、膜（３）が、プレフィルターされていないＶＰｒｏと比較して圧力上昇を低減させる点で有効であることを示す。図１５は、膜（３）が、プレフィルターされていないＶＰｒｏと比較してＭＡｂ０５のマススループットを４倍向上させるようにＶＰｒｏを保護することを示す。図１６は、ＭＡｂ０７について、膜（３）が、プレフィルトレーションなしでのＶＰｒｏウイルスろ過並びにポリアミドから構成される非変性膜プレフィルター（５）及び市販の滅菌等級膜フィルター（４）よりも良好に機能するようにＶＰｒｏを保護することを示す。
【０１３０】
【表７】
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【０１３１】
まとめると、新たに見出された膜の化学的性質は、ウイルスフィルターの保護用のプレフィルターの性能の大幅な改善を可能にする。
【０１３２】
本明細書は、ほぼ全体が本明細書の範囲内で引用された文献（参照により本明細書で援用する）の教示に照らして理解される。明細書内の実施形態は、実施形態の例示を与えるものであり、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者であれば、本開示によって多くの他の実施形態が包含されることが分かる。全ての刊行物及び参考資料は、その全体が参考として援用される。参考資料によって援用されるものが本願明細書と反する又は矛盾する限り、本明細書は、このようなものに取って代わるであろう。ここで、任意の文献の引用は、そのような文献が先行技術であることを認めるものではない。
【０１３３】
特に断りのない限り、特許請求の範囲を含めて本明細書において使用される成分の量、細胞培養、処理条件などを表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されるものと理解すべきである。したがって、特に断らない限り、数値パラメータは近似値であり、本明細書に開示された実施形態によって得ようとする所望の特性に応じて変化する場合がある。特に断らない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の全ての要素をいうものと理解すべきである。当業者であれば、日常的な実験のみを用いて、ここに記載した特定の実施形態に対する多くの均等を認識し又は確認することができるであろう。このような均等は、特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０１３４】
当業者であれば明らかなように、本明細書に開示された実施形態の多くの改変及び変更を、その精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態は、例示としてのみ提供され、決して限定を意味するものではない。本明細書及び実施例は、単なる例示であるとみなされるべきであり、本開示の真の範囲及び精神は、特許請求の範囲によって示されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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