(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーコーティングを含む物体であって、
前記コーティングが、ａ）第１の切断部位を含む１種または複数のポリマーと、ｂ）前記第１の切断部位の切断で前記コーティングから放出可能な第１の剤とを含み、
前記第１の切断部位が、限られた数の微生物菌株、種または属からなる第１の群に属する微生物によって特異的に提供される第１の化合物によって切断されるが、前記第１の群に属さない微生物によって提供される化合物によって切断されないことを特徴とし、
前記第１の切断部位の切断が前記コーティングからの前記第１の剤の放出をもたらし、
前記第１の剤の放出が前記第１の群に属する微生物の存在の指標となり、
少なくとも主要な第１の機能および第２の補助機能を有し、
前記第２の補助機能が前記コーティングからの前記第１の剤の放出を含み、
前記主要な第１の機能が前記コーティングまたはそこからの前記第１の剤の放出に関連せず、
前記第１の剤は、近赤外蛍光剤である診断剤であり、
前記物体は医療機器または医療用インプラントであり、
前記近赤外蛍光剤は、患者の体内に植え込まれた前記医療機器または前記医療用インプラント上で検出される物体。
【請求項２】
前記ポリマーコーティングが、ｃ）第２の切断部位を含む１種または複数のポリマーと、ｄ）前記第２の切断部位の切断で前記コーティングから放出可能な第２の剤とをさらに含み、
前記第２の切断部位が、限られた数の微生物菌株、種または属からなる第２の群に属する微生物によって特異的に提供される第２の化合物によって切断されるが、前記第２の群に属さない微生物によって提供される化合物によって切断されないことを特徴とし、
前記第２の切断部位の切断が前記コーティングからの前記第２の剤の放出をもたらし、
前記第２の剤の放出が前記第２の群に属する微生物の指標となり、
前記第２の切断部位が前記第１の切断部位とは異なり、前記第１の化合物によって切断されず、
前記第２の群に属する限られた数の微生物菌株、種または属は、前記第１の群に属する限られた数の微生物菌株、種または属とは異なる、請求項１に記載の物体。
【請求項３】
前記第１の化合物が酵素である、請求項１または２に記載の物体。
【請求項４】
前記第１の剤が第１のリンカーを介して第１のポリマーと共有結合しており、前記第１のリンカーが前記第１の切断部位を含み、
前記第２の剤が第２のリンカーを介して第２のポリマーと共有結合しており、前記第２のリンカーが前記第２の切断部位を含み、
前記コーティングが、前記第１の切断部位の切断で放出される第１の追加の剤を任意に含み、
前記コーティングが、前記第２の切断部位の切断で放出される第２の追加の剤を任意に含む請求項２または３に記載の物体。
【請求項５】
前記第１のリンカーおよび／または第２のリンカーが、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、カルバメート結合、好ましくはアミド結合からなる群から選択される１つまたは複数の結合を含み、
前記リンカーが好ましくはペプチドを含み、および／または
前記第１の切断部位および／または第２の切断部位が、好ましくはＰＰＴＰ（配列番号２）、ＰＰＳＰ（配列番号３）、ＬＰＡＴＧ（配列番号４）、ＬＰＥＴＧ（配列番号５）、ＬＰＤＴＧ（配列番号６）、ＬＰＱＴＧ（配列番号７）、ＮＰＱＴＮ（配列番号８）、ＮＰＫＴＮ（配列番号９）、ＧＧＡ、ＧＧＬ、ＡＡＲ、ＡＡＦ、ＧＦＰＲＧ（配列番号１０）およびＧｆＰＲＧ（配列番号１１）からなる群から選択される特異的アミノ酸モチーフを含む、請求項４に記載の物体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の前記第１の剤および／または請求項２〜５のいずれかに記載の前記第２の剤および任意に請求項４または５のいずれかに記載の前記第１の追加の剤および任意に前記第２の追加の剤が、治療剤または診断剤であって、
前記治療剤が、βラクタム抗生物質、セファロスポリン抗生物質、マクロライド、環状デプシペプチドおよびテトラサイクリンからなる群から好ましくは選択され、好ましくは環状デプシペプチド、より好ましくはバンコマイシンであり、
前記診断剤が、好ましくは生物発光剤、発光剤、化学発光剤または核剤からなる群から選択される光子放出剤であり、
前記第２の剤は、好ましくは前記第１の剤とは異なる、請求項１から５のいずれか一項に記載の物体。
【請求項７】
前記第１の追加の剤および／または前記第２の追加の剤が、第１の追加のリンカーおよび／または第２の追加のリンカーを介して第１の追加のポリマーおよび／または第２の追加のポリマーと共有結合しており、
第１の追加のリンカーおよび／または前記第２の追加のリンカーが、前記第１の切断部位および／または前記第２の切断部位をそれぞれ含み、好ましくは前記第１のリンカーおよび／または前記第２のリンカーと同一であり、
第１の追加のポリマーおよび／または第２の追加のポリマーは、好ましくは前記第１のポリマーおよび／または前記第２のポリマーと同一である、請求項６に記載の物体。
【請求項８】
前記第１のポリマー、および／または存在する場合には前記第１の追加のポリマーおよび／または存在する場合には前記第２のポリマーおよび／または存在する場合には前記第２の追加のポリマーが、ヒドロゲル、好ましくは生分解性ポリマー、より好ましくはポリエチレングリコール、さらにより好ましくはポリエチレングリコールビニル−スルホンまたはポリエチレングリコールジアクリレート、最も好ましくはポリエチレングリコールジアクリレートを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の物体。
【請求項９】
侵襲的な外科手術中に患者の体内に植え込まれることが意図されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の物体。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の物体からの光子放出を感知する方法であって、
前記第１の剤および／または存在する場合には前記第２の剤が光子放出剤を含み、
前記物体に、前記コーティングから放出されると前記第１の剤および／または存在する場合には前記第２の剤からの光子放出を誘導することができる光を照射するステップと、
前記光子放出を登録するステップとを含み、
前記光子放出が、それぞれ前記第１または第２の群に属する微生物菌株、種または属の存在の指標となる方法。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか一項に記載のコーティングされた物体を製造する方法であって、ａ）物体を第１の切断部位と前記第１の剤および場合により第１の追加の剤とを含むポリマー、ならびに存在する場合には前記第２の切断部位と前記第２の剤および場合により第２の追加の剤とを含むポリマーの溶液に浸漬コーティングして、浸漬された物体を得るステップと、ｂ）前記浸漬された物体を乾燥させコーティングされた物体を製造するステップと、を含む方法。
【請求項１２】
（ａ）第１の切断部位を含む１種または複数のポリマーと、（ｂ）前記第１の切断部位の切断でコーティングから放出可能な第１の剤とを含み、
前記第１の切断部位が、限られた数の微生物菌株、種または属からなる第１の群に属する微生物によって特異的に提供される第１の化合物によって切断されるが、前記第１の群に属さない微生物によって提供される化合物によって切断されないことを特徴とし、前記第１の切断部位の切断がコーティングからの前記第１の剤の放出をもたらし、前記第１の剤の放出が前記第１の群に属する微生物の存在の指標となり、前記第１の剤は、近赤外蛍光剤である診断剤であり、
医療機器または医療用インプラントのコーティングに用いられ、
前記近赤外蛍光剤は、患者の体内に植え込まれた前記医療機器または前記医療用インプラント上で検出されるポリマーコーティング。
【請求項１３】
感染症、特にバイオフィルム関連感染症の存在および／または発達を監視するためのならびに／あるいはその治療のための医療機器または医療用インプラントである物体をコーティングするための請求項１２に記載のポリマーコーティングの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）第１の切断部位を含む１種または複数のポリマーと、（ｂ）前記第１の切断部位の切断でコーティングから放出可能な第１の剤とを含むポリマーコーティングを含む物体に関する。本発明はさらに、物体からの光子放出を感知する方法、患者の微生物感染症の存在を感知する方法、物体をコーティングする方法およびポリマーコーティングに関する。
【背景技術】
【０００２】
当技術分野では、上記の型の物体が、例えば、物体、特に、インプラント上への感染の治療のための放出可能な抗微生物剤を含むコーティングマトリックスでコーティングされたインプラントが記載されている米国特許第８３７２４２０号明細書から知られている。この剤は、例えば、インプラントの位置での細菌感染症の結果としての宿主のｐＨ低下の結果としてマトリックスから放出される。抗微生物剤の放出によって、インプラントの位置での感染症を治療することができる。このようにして、感染したインプラントを治療するための侵襲性外科手術を回避することができる。しかしながら、ｐＨの変化は、任意の非特異的細菌感染症の結果である。さらに、米国特許第８３７２４２０号明細書によると、インプラントの部位での微生物感染症をそれ自体検出することができない。微生物感染症の検出に関するいかなるシグナル伝達もなしに非特異的様式で抗微生物剤の放出があるにすぎない。前記剤は、共有結合的および非共有結合的などの任意の様式でコーティングマトリックスと結合することができる。多くの例の中の１つとして、細菌感染時に宿主によって発現される内因性酵素によって切断可能な、リンカーを介した剤とポリマーコートの共有結合の可能性が開示されている。
【０００３】
米国特許第６３０６４２２号明細書は、治療剤および／または診断剤などの埋め込まれた放出可能な活性剤を含むヒドロゲルマトリックスでコーティングされたインプラントを記載している。インプラントの位置での宿主のｐＨ変化により（このｐＨ変化は細菌感染症によって誘導される）、ヒドロゲルマトリックスが、ヒドロゲルの近くに存在する水の取り込みによって膨潤し、埋め込まれた活性剤が放出される。診断剤として、感染の部位を可視化する色素が記載されている。米国特許第６３０６４２２号明細書によって記載されているこのヒドロゲルマトリックスは、特異的微生物には反応しないが、米国特許第８３７２４２０号明細書のものと同様に、インプラントの部位での一般的な環境変化に反応する。
【０００４】
米国特許第４３５１３３７号明細書は、治療剤および診断剤、例えば、病的状態の存在または欠如を監視する色素を含む活性剤の徐放のためのマトリックスコート材料を含むインプラントを記載している。インプラントマトリックスは微生物感染に感受性ではないが、このようなインプラントを有する宿主中に存在する酵素に感受性である。宿主によって産生されるこれらの酵素が、特定の病的状態に対する一般的な反応として作用し、また特異的微生物感染症時には放出されないが、宿主のいくつかのより一般的な状態で放出される。したがって、宿主の病的状態に対する反応後にのみ剤の放出が可能である。
【０００５】
国際公開第２００８／０５３３６２号明細書は、その主要なプラットフォームにおいて、ペプチダーゼ酵素による選択的加水分解を受けやすいポリアミドリンカーを介してポリマーと共有結合した生物活性剤を含むポリマーを含む植込み型ポリマー物体を記載している。活性剤は、加水分解を受けて、ポリマーから放出される。
【０００６】
米国特許第５７７０２２９号明細書は、酵素反応によって切断される切断可能な基を含む医療用ポリマーゲルと、抗生物質ゲンタマイシンなどの薬物とを含むインプラントを記載している。切断可能な基は、感染部位に植え込まれた場合、細菌によって産生される酵素によって切断され得、その結果、抗生物質がインプラントから放出される。同様のインプラントが国際公開第００／６４４８６号パンフレットに記載されている。
【０００７】
そのため、当技術分野では、抗微生物感染に反応性の剤を含むコーティングを有する感染症にかかりやすい物体が知られている。しかしながら、このような剤は、一般的な抗微生物刺激の結果としてコーティングから放出される抗微生物剤に限定される。コーティングからの剤の放出は、例えば、温度またはｐＨの条件変化によって誘引され、この変化は特異的微生物による感染に関連せず、微生物によって引き起こされる感染症に関連する必要すらなく、無菌性感染症または一般的炎症反応のみに関連する。コーティングは、環境因子の変化、例えば、いずれの感染にも反応する、すなわち、反応は特異的でない。さらに、ポリマーマトリックスが切断可能な活性剤を含むポリマーインプラントが知られている。しかしながら、このようなインプラントは、抗微生物感染に反応性の剤を含むコートを有さないが、そのマトリックス、すなわちその主要なプラットフォームにポリマーを含み、このことは、これらのインプラントは長期間にわたって持続性放出様式で活性剤を提供するよう設計されているので、意味をなす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第８３７２４２０号明細書
【特許文献２】米国特許第６３０６４２２号明細書
【特許文献３】米国特許第４３５１３３７号明細書
【特許文献４】国際公開第２００８／０５３３６２号明細書
【特許文献５】米国特許第５７７０２２９号明細書
【特許文献６】国際公開第００／６４４８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ここで、本発明者らは、特異的微生物あるいは限られた数の異なる微生物菌株、種または属からなる特異的微生物群による感染で剤を放出するコーティングを含むインプラントに限定されない物体を提供した。この剤の放出は、このような微生物の存在を示している。それに対して本発明は、ポリマーコーティングを含む物体であって、前記コーティングがａ）第１の切断部位を含む１種または複数のポリマーと、ｂ）前記第１の切断部位の切断で前記コーティングから放出可能な第１の剤とを含み、前記第１の切断部位が、限られた数の微生物菌株、種または属からなる第１の群に属する微生物によって特異的に提供される第１の化合物によって切断されるが、前記第１の群に属さない微生物によって提供される化合物によって切断されないことを特徴とし、前記第１の切断部位の切断がコーティングからの前記第１の剤の放出をもたらし、前記第１の剤の放出が前記第１の群に属する微生物の存在を示している物体を提供する。
【００１１】
新規な物体は、ポリマー上に存在する切断部位が切断されると、そのポリマーコーティングから剤を放出する。この切断は、限られた数の微生物菌株、種または属からなる群に属する微生物によって提供される化合物によってもたらされる。便宜上、微生物菌株、種または属の第１の群として示されるこの群のメンバーは、前記第１の切断部位を切断する化合物を特異的に提供することができる。「特異的に」という用語は、前記第１の群に属していない微生物菌株、種または属が、前記第１の群のメンバーと対照的に前記切断部位を認識および切断することができる化合物を提供することができないことを意味することを意図している。この化合物は、例えば、微生物からの前記化合物の放出によって提供され得る、または例えば、その外表面上に提示され得る。後者の場合、微生物がコーティングと接触して切断が起こるが、放出された化合物が微生物から放出された後にコーティングに到達することができる限り、化合物が微生物から放出された時に、微生物がコーティングされた物体から離れていてもよい。特定の群に属する微生物が、宿主に感染すると、宿主による特定の化合物の放出または産生を誘導することも可能である。後者の場合、この化合物は、前記群に属していない別の微生物の感染で宿主から産生も放出もされない。切断は化合物によってもたらされ得る、または例えば、コーティングの環境中に存在する、すなわち、微生物または微生物に感染し、物体を含む宿主によって提供される切断因子によって認識される複合体を形成する前記化合物の結合によって誘導され得る。微生物が特定の群、例えば、第１の群の菌株、種または属に属するためには、これらの微生物の存在によって切断部位の切断が誘導されなければならない一方で、別の群の微生物によって切断が誘導されない。この切断は、同じ化合物によって生じ得るが、複数の異なる化合物が同じ切断部位の切断を誘導する限り、これらの化合物によっても生じ得る。例えば、第１の群は３種の異なる細菌種を含み、第１および第２の種はコーティングの切断部位を切断する同じ化合物を提供し、第３の種は第１および第２の種の化合物とは異なるが、同様にコーティングの同じ切断部位を特異的に切断する化合物を提供する。「限られた」という用語は、このような群が全ての微生物または全ての細菌を含むわけではないが、より少ない、すなわち、限られた数を含むことを意味することを意図しているので、結果として第１の剤の放出は実際に１種または複数の微生物を示しているが、全てのまたは任意の微生物または細菌等を示しているわけではない。
【００１２】
第１の剤からの放出は、第１の化合物による第１の切断部位の切断でもたらされる。前記剤は、ポリマーコーティングによって形成されたポリマーウェブに埋め込まれ得る。第１の切断部位の切断で、ウェブが開き、第１の剤がウェブから脱出することができる。第１の剤をポリマーと共有結合することも可能であり、この共有結合が第１の切断部位を含む。第１の剤を切断する。本明細書の「放出する」という用語は、剤がポリマーコートから脱出することができることを意味するだけでなく、第１の切断部位の切断がコーティング中に保持されている剤の活性化を誘導する限り、ポリマーコーティング中にまだ存在するまたは保持されている剤の活性化も包含する。
【００１３】
前記第１の群に属する微生物のみが、前記第１の切断部位を切断することができる化合物を提供することができるので、第１の剤の放出は、前記第１の群に属する１種または複数の微生物の存在を示している。そのため、第１の剤は、第１の切断部位が切断された場合にのみコートから放出され得る。この切断のためには、いくつかの第１の群の微生物菌株、種または属が存在しなければならない。そのため、放出された第１の化合物の観察は、このような微生物の存在を示している。
【００１４】
この群の微生物菌株、種または属は、単一の微生物菌株、種もしくは属、または限られた数の、すなわち、属のうちの全てではない異なる種を含むことができる。例えば、群は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびエシェリキア・フェルグソニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）からなることができるが、エシェリキア・ハーマンニイ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｈｅｒｍａｎｎｉ）は前記群に属さない。第１の群はまた、グラム陽性菌を除外してグラム陰性菌も包含することができ、もしくは逆もまた同じである、または限られた数のこのようなグラム陽性菌もしくはグラム陰性菌を包含することができる。
【００１５】
ソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）は、グラム陽性菌によって産生されるクラスの化合物の例である。グラム陽性菌は、細胞壁を含むペプチドグリカンの存在によってさらに定義され得る細菌属の群であり、グラム陽性菌の代表的な例としては、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（球菌）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）およびリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）などの臨床的に関連する微生物属が挙げられる。グラム陽性菌の群に属する全ての属が、ペプチドおよびタンパク質中の切断モチーフを認識および切断するいわゆるソルターゼ酵素を産生する。コーティングのポリマーの切断部位がこのようなソルターゼによって認識されるモチーフを含有する場合、対応するグラム陽性菌の１種または複数の存在下でコーティングから剤が放出され得る。そのため、前記剤の放出は、前記グラム陽性菌の存在を示しており、このことを以下でさらに解明する。
【００１６】
微生物属の別の群は、グラム陰性菌、例えば、全てがＨｒｔＡ化合物を産生する大腸菌、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）およびカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）を含む。グラム陰性菌はさらに、細胞壁中のペプチドグリカンの欠如によって定義される。そのため、ＨｒｔＡに特異的な切断部位を含むポリマーコーティングは、グラム陰性菌の存在下でのみ剤を放出し、他の群の細菌では放出しないだろう。この選択性レベルは、先行技術のポリマーコーティングによっては達することができない。
【００１７】
特定の微生物種に特異的な化合物の例には、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によって分泌される「トロンビン型プロテアーゼ」がある。本発明による切断部位が前記「トロンビン型プロテアーゼ」の認識モチーフを含有する場合、ポリマーコーティングに含有される剤は、緑膿菌による感染の存在下でのみ放出される。この感染が、バイオフィルム関連感染症における高い罹患率の原因であるので、本発明は、先行技術のポリマーコーティングでは可能でなかったこのような感染症と戦う新規な方法を提供する。
【００１８】
さらに、微生物の特定の菌株を標的化することもできる。リソバクター属（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）菌株ＩＢ９３７４は、特定の「リジン特異的セリンプロテアーゼ」ＬｅｐＢを産生する。切断部位が前記プロテアーゼに特異的である場合、リソバクター属菌株ＩＢ９３７４の存在下で剤がポリマーコーティングから放出される。そのため、本発明は、特異的微生物種の存在下でポリマーコーティングから剤を放出する高度に特異的な手段を提供し、この特異的放出は先行技術に記載される方法を用いて可能でなかった。
【００１９】
上に示される本発明の説明から分かるように、限られた数の微生物からなる群は、菌株特異的化合物、例えば、上記リソバクター属菌株ＩＢ９３７４の「リジン特異的プロテアーゼ」の場合、単一メンバーのみからなり得る、または少なくとも６種の臨床的に関連する属、例えば、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、腸球菌属（球菌）、バチルス属、クロストリジウム属およびリステリア属を含有するグラム陽性菌の群などのいくつかのメンバーを含み得る。
【００２０】
「微生物」という用語は、当技術分野で十分に理解されており、複製に必要なゲノムを有する、細菌、真菌、原虫、ウイルスおよびバクテリオファージなどの単細胞生物および多細胞生物を含む。多細胞生物は、その細胞が分化していない限り、微生物とみなされる。本出願では、微生物という用語は、特に病原菌に関する。病原菌の属の例としては、それだけに限らないが、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）およびクラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属、コルニネバクテリウム属（Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デルマバクター属（Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ）、腸球菌属、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、グラニュリカテラ属（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｄｕｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ブドウ球菌属、連鎖球菌族およびビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）が挙げられる。
【００２１】
本発明のさらなる利点は、微生物菌株、種または属の群によって提供される化合物が、前記切断部位を切断する限り、全く同じである必要はないということである。微生物によって産生される多くの化合物は類似であるが、同じ分子構造ではないので、同族として当技術分野で知られている。同族化合物は、切断部位についての同じ認識部位を含有し得るが、認識部位から離れた分子構造は異なる。同族化合物の例には、共に同じモチーフを切断するが、化合物が異なる長さを有する、それぞれコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）菌株ＣＨＡ６．８ΔｐｒｔＶおよびＶＣ１６４９によって産生される化合物がある。化合物全体というよりむしろ特異的モチーフを認識することの利点は、化合物の構造に自然突然変異がある場合に、化合物がまだ切断部位を切断するので、剤がまだ放出されるということである。
【００２２】
そのため、第１の切断部位を切断することができるこのような化合物を産生しない微生物菌株、種または属は、前記第１の群に属さない。このようにして、例えば、健康な腸管内菌叢の存在下で剤がポリマーコーティングから放出されるのを防ぐことが可能であるが、剤は第１の切断部位を切断することができる化合物を分泌する病原菌の存在下で放出される。
【００２３】
前記第１の群に属する微生物によって産生または提供されるこのような化合物と前記第１の切断部位の相互作用が切断、それゆえ剤の放出をもたらす。そのため、剤の放出は、前記第１の群に属する微生物の存在を示している。先行技術の切断は、微生物に対する一般的な反応、例えば、物体を囲んでいるｐＨまたは温度の変化によって促進されるのであって、特異的微生物産物に対する反応によって促進されないので、これは先行技術とは異なる。
【００２４】
コーティングから放出される剤は、コーティングから放出されると検出可能なシグナルを与えるシグナル伝達分子であり得る。そのため、剤は、微生物菌株、種または属の群のメンバーの存在下でのみ検出可能である。このようなシグナル伝達分子が当技術分野で知られており、以下でさらに論じる。
【００２５】
剤はまた、治療剤、例えば、抗生物質であってもよい。この例では、感染症の存在を視覚的に検出することができないが、放出された抗生物質の存在によって検出することができる。抗生物質はさらに、感染症が起こることを防ぐための予防手段を提供する。ポリマーコーティングと結合することができる任意の適切な抗生物質を使用することができるが、抗生物質を、剤の切断を引き起こす微生物菌株、種または属の種類に調和するよう選択することができる。例えば、切断部位がグラム陽性菌に特異的である場合、バンコマイシンなどの広域グラム陽性特異的抗生物質を剤として使用することができる。先行技術のポリマーコーティングでは、抗生物質および切断部位を微生物菌株、種または属の特異的群に特異的に調整することが可能でなかったので、抗生物質を切断部位に適合するよう調整する能力は、先行技術に対する本発明のさらなる利点である。
【００２６】
そのため、診断剤または治療剤である剤の放出は、限られた数の微生物菌株、種または属の存在を示している。
【００２７】
剤を、リンカーによってポリマーコーティングと共有結合することができ、該リンカーは切断部位を含む。あるいは、剤をポリマーコーティングと非共有結合することができる、換言すれば、剤がポリマーコーティングのネットワーク内に捕捉される。切断部位は、コーティングを含むポリマー鎖内に含有され、切断部位の切断で、捕捉された剤が拡散することができる孔がコーティング中に現れる。
【００２８】
本発明によるポリマーコーティングを物体上にコーティングすることができ、それによって、「ポリマーコーティング」という用語は、前記物体を少なくとも部分的に覆い、これに付着するポリマーを含む組成物を意味するものと理解される。コーティングする物体は、前記物体上の微生物の存在を検出およびまたは治療することが必要な任意の物体であり得る。
【００２９】
本発明はそこから剤を放出することのみを意図した医療用インプラント、すなわち、例えば、持続放出ビヒクルを意図したインプラントも包含するが、本発明の好ましい実施形態では、物体が少なくとも主要な第１の機能および第２の補助機能を有し、第２の補助機能がコーティングからの少なくとも第１の剤の放出であり、第１の主要な機能が前記コーティングまたはそこからの剤の放出に関連しない。そこから剤を放出することのみを意図した医療用インプラントでは、第１のおよびおそらくは唯一の主要な機能がインプラントからの剤の放出である。
【００３０】
しかしながら、医療機器および医療用インプラントは通常、例えば、人工股関節、または注入針などの特定の医学的理由のために植え込まれる。そのため、主要な機能は、それぞれ、人工股関節置換機能、または患者の血流中への薬液用の入口を提供することである。このような物体は感染がないままであることが必要であり、本発明は、前記機器およびインプラント上の微生物の存在を検出およびまたは治療する単純な方法を提供する。治療的もしくは診断的または両方の剤の放出は、主要な機能に関連しない、このような物質の二次機能である。本発明は、バイオフィルム形成を起こしやすい物体、例えば、整形外科プレートおよびピンに特に適している。そのため、コーティングする物体は、患者の骨を補強するなどの機能を果たすよう選択され、ポリマーコーティングは物体がその意図した主要な機能を行いながらも、ポリマーコーティングに含有される切断部位の独特の反応性を介して特定のまたは限られた数の微生物菌株、種または属の存在を検出または治療することもできるように物体に付着する。そのため、本発明は、限られた数の微生物菌株、種または属に特異的な切断部位を含むポリマーコーティングを、当業者に周知のコーティング技術を用いて広範囲の臨床機器に適用することができるという利点を有する。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、第１の化合物が酵素である。多くの微生物は、いくつかの分泌系を使用して、微生物が宿主生物、例えば、ヒトなどの哺乳動物に侵入するのを可能にする１種または複数の化合物を分泌する。このような分泌化合物は通常、酵素であり、このような酵素は特定の分子モチーフに高度に特異的である。分泌酵素は膜結合性であり得、したがって、微生物細胞壁の表面に近いままであり得る、または周囲媒体内に分泌され得る。そのため、本発明者らは、限られた数の微生物菌株、種または属によって産生される酵素によってのみ切断される切断部位をポリマーコーティングに組み込むことによって、この特異性を本発明の様式に使用した。
【００３２】
微生物種によって分泌される酵素の例にはＩｇＡプロテアーゼがある。本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ」という用語は、本明細書でさらに定義される特異的アミノ酸モチーフを切断することができる酵素を記載するために使用される。
【００３３】
Ｋｏｒｎｆｅｌｄら、１９８１、３、３、５２１〜５３３に報告されているように、ポリマーがＩｇＡプロテアーゼによって認識される切断部位を含む場合、この切断部位はＩｇＡプロテアーゼを分泌する微生物、すなわち、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）およびストレプトコッカス・サングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）によってのみ切断される。そのため、剤は、この特定の状況では、第１の群を定義する指定した感染性微生物種の１種または複数の存在下でのみ放出される。
【００３４】
本発明による切断部位を切断する化合物として選択することができる病原菌によって分泌される酵素のさらなる例には、上で既に論じられているソルターゼがある。本出願で使用されるソルターゼという単語は、ソルターゼプロテアーゼの包括的クラスを指す。ソルターゼは、配列相同性、ソルターゼ切断のための基質およびソルターゼによって受容される求核剤に基づいて４つのグループ（ソルターゼクラスＡ〜Ｄ）に分類されている（Ａｎｔｏｎｉｏ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１、９、１６６〜１７６；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００６、１９２〜２２１参照）。ソルターゼは、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）によって分泌されるプロテアーゼである。ソルターゼの機能は、宿主防御機構を回避するために、黄色ブドウ球菌の表面上のタンパク質を宿主タンパク質と結合するというものである。代表的なソルターゼとして、ソルターゼＡは、２０種の異なる表面タンパク質を黄色ブドウ球菌菌株の細胞壁に固定するのを担っている。これらの表面タンパク質の１つ、タンパク質Ａは、非免疫様式で哺乳動物免疫グロブリンのＦｃ末端に結合して、抗体によるブドウ球菌表面の修飾を引き起こす。この機構により、黄色ブドウ球菌はヒト免疫系を回避することができる。
【００３５】
ソルターゼクラスＡ酵素は、全てのグラム陽性菌に存在し、通常ハウスキーピングソルターゼと呼ばれる。そのため、グラム陽性菌の存在下でポリマーコーティングから剤を放出することができるように、グラム陽性菌からの感染のリスクが高い場合、ソルターゼによって認識される切断部位を本発明に組み込むことができる。
【００３６】
ソルターゼクラスＡ反応の生成物は、脂質ＩＩと共有結合した表面タンパク質であり、次いで、これが細胞壁エンベロープに組み込まれる。ソルターゼクラスＡ基質には、複数のグラム陽性菌種の病原性に関連した接着性マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭ（配列番号１））ファミリーを認識する微生物表面成分からの表面タンパク質が含まれる。
【００３７】
ソルターゼクラスＢ酵素は、ブドウ球菌属の種、バチルス属の種、リステリア属の種およびクロストリジウム属の種を含む限られた数の微生物種によってコードされている。ソルターゼクラスＢ酵素は、ヘム鉄捕集に関与し、膜輸送体近くの固定されたヘム含有生成物を架橋するタンパク質中の独特のＮＰ（Ｑ／Ｋ）ＴＮ局在化シグナルを認識する。ソルターゼクラスＢ酵素のβ−バレル構造は、クラスＡ酵素のものと類似であるが、さらなるα−ヘリックスを包含する。
【００３８】
ソルターゼＡＢと同じ切断部位を認識するが、異なる構造を有する化合物の例には、ピリン特異的クラスＣソルターゼがある。そのため、ソルターゼＡがソルターゼＡ切断部位を切断するのに十分な量産生されない場合に、ピリン特異的クラスＣソルターゼが前記切断部位を切断することが可能である。同じ微生物種によって産生される異なる化合物による同じ切断部位のこのような複数認識により、剤が特異的な、または限られた数の微生物菌株、種または属の存在下で放出される可能性が増加する。理論によって拘束されることを望むものではないが、求核剤として単一細胞壁ペプチドのみを受容するソルターゼＡと対照的に、ピリン特異的ソルターゼは、基質と求核剤との両方として複数のピリンタンパク質を認識する。ピリン特異的クラスＣソルターゼは、その同族基質と共にピリン遺伝子クラスターにコードされ、通常、他のクラスのソルターゼでは見られないＣ末端疎水性ドメインを含有する。肺炎連鎖球菌の３種のピリン特異的ソルターゼクラスＣ酵素（ＳｒｔＢ、ＳｒｔＣおよびＳｒｔＤ（それぞれ、ＳｒｔＣ１、ＳｒｔＣ２およびＳｒｔＣ３としても知られている））の結晶構造は、切断部位を前記酵素によって最適な切断を確保するよう設計することができるように分子レベルでの機構洞察を提供する。
【００３９】
切断が限られた数の微生物種によって提供される化合物によって促進されるさらなる例は、例えば、バチルス属の種およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種を含有する胞子形成微生物の群から得られる。前記胞子形成微生物は、ソルターゼＤと呼ばれる化合物を提供する。第１の切断部位がソルターゼＤの認識モチーフを含有する場合、第１の剤は胞子形成微生物の存在下でのみ放出される。換言すれば、ポリマーコーティングがソルターゼＤによって切断される第１の切断部位を含むポリマーコーティングからの剤の放出は、胞子形成微生物の存在を示している。ソルターゼＤの化学構造に関して、この酵素の結晶構造は解明されていない。
【００４０】
病原菌によって分泌される酵素のさらなる例には、緑膿菌由来アルカリプロテアーゼ（ＡｐｒＡ）、エラスターゼＡ（ＬａｓＡ）、エラスターゼＢ（ＬａｓＢ）およびプロテアーゼＩＶがあり、これらはこの生物の病原性において重要な役割を果たしていると考えられる。これらの酵素の各々を、本発明によるポリマーコーティング中の切断部位を切断するのに適した化合物として選択することができる。
【００４１】
別の実施形態では、第１の剤が第１のリンカーを介して第１のポリマーと共有結合しており、第１のリンカーが第１の切断部位を含む。しかしながら、第１の剤が１種または複数の異なるポリマーと結合することも可能である。「異なるポリマー」により、特に明示しない限り、異なる型のポリマーに関するのであって、同じポリマーの異なる分子に関するのではないことが意図される。
【００４２】
これにより、切断部位は、その周知の意味、すなわち、特異的化合物によって切断される、その固有の部分としてのまたはそこに結合したコーティングの分子構造の一部を有すると理解される。本明細書で論じられる切断部位は、本発明の一実施形態では、ポリマーコーティングと第１の剤との間のリンカーに組み込まれるのに適しているので、結果として前記第１の切断部位に特異的な化合物を分泌する微生物の存在下で第１の剤を選択的に放出することが可能である。
【００４３】
第１のリンカーは、好ましくはアミド結合、エステル結合、チオエステル結合、カルバメート結合、ウレタン結合からなる群から選択される１つまたは複数の結合を含み、第１のリンカーは好ましくはアミド結合、最も好ましくはペプチドを含む。
【００４４】
ポリマーと少なくとも第１の剤との間のリンカーはウレタン結合を介して可能であり（Ｚａｌｉｐｓｋｙら  １９９１、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第１０章、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ参照）、ウレタン結合の安定性は、生理的条件下で証明されている（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、１９８５、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１〜１４１；Ｌａｒｗｏｏｄら、１９８４、Ｊ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．、２１〜６０３）。少なくとも第１の剤をポリマーに付着させる別の方法は、カルバメート結合を用いることによる（Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、１９８３、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１、２５；Ｂｅｒｇｅｒら  １９８８、Ｂｌｏｏｄ  ７１、１６４１）。カルバメート結合は、カルボニルジイミダゾール活性化ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の使用によって作成される。
【００４５】
リンカーがアミド結合を含む例では、リンカーは構造ＸＹＺ（Ｘは少なくとも１個のアミノ酸であり、Ｙは第１の切断部位を表す少なくとも３個のアミノ酸で構成される分子構造の一部であり、かつＺは少なくとも１個のアミノ酸である）を有し得る。使用されるアミノ酸は任意のアミノ酸、好ましくは天然アミノ酸の群または合成アミノ酸の群から選択されるαアミノ酸、特に天然アミノ酸の誘導体であり得る。ペプチドリンカーは、例えば、４〜１０個の間の、例えば、アミノ酸、例えば、５〜１１個の間のアミノ酸、例えば、６〜１２個の間のアミノ酸、例えば、７〜１３個の間のアミノ酸および例えば、８〜１４個の間のアミノ酸を含むことができる。
【００４６】
切断部位は、標準的ハンドブックＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｌ  Ｓｔｒｙｅｒ編、第７版、２０１２、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ、第１部、第２章  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅに記載されているように、好ましくはいくつかのアミノ酸、例えば、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも５個のアミノ酸を含む。切断部位中の分子構造の一部を「アミノ酸モチーフ」と呼ぶこともできる。本発明では、切断部位を、限られた数の微生物菌株、種または属からなる群に属する微生物によって提供される化合物によって認識されるように設計する。
【００４７】
適切なリンカーの例は、例えば、１４個のアミノ酸：ＧＧＧ“ＧｆＰＲＧＦＰＡ”ＧＧＧ（配列番号１３）（Ｘは３個のアミノ酸であり、リンカーの部分を表し、Ｙは８個のアミノ酸であり、第１の切断部位（“ＧｆＰＲＧＦＰＡ”で示したアミノ酸）を表し、かつＺは３個のアミノ酸であり、リンカーの部分を表す）を含むリンカーであり得るトロンビン型プロテアーゼによって切断され得る。全体を通して標準的なアミノ酸表記法を用い、これにより各アミノ酸を１文字で示す。Ｓｔｒｙｅｒ、上記、第２４章に記載されているように、大文字は「Ｌ」配置アミノ酸を示し、小文字アミノ酸は「Ｄ」アミノ酸を示す。
【００４８】
別の実施形態では、少なくとも第１の切断部位が、好ましくはＰＰＴＰ（配列番号２）、ＰＰＳＰ（配列番号３）、ＬＰＡＴＧ（配列番号４）、ＬＰＥＴＧ（配列番号５）、ＬＰＤＴＧ（配列番号６）、ＬＰＱＴＧ（配列番号７）、ＮＰＱＴＮ（配列番号８）、ＮＰＫＴＮ（配列番号９）、ＧＧＡ、ＧＧＬ、ＡＡＲ、ＡＡＦ、ＧＦＰＲＧ（配列番号１０）およびＧｆＰＲＧ（配列番号１１）からなる群から選択される特異的アミノ酸モチーフを含む。
【００４９】
上記のように、ポリマーの切断部位は、限られた数の微生物菌株、種または属によって産生される化合物によって認識される分子構造の一部を含む。「特異的」という用語は、本明細書において、限られた数の微生物菌株、種または属からなる第１の群に属する微生物によって産生される特定の化合物によってのみ認識されるアミノ酸モチーフを記載するために使用される。切断部位は、前記微生物によって提供される化合物によって認識され得るいくつかのアミノ酸または他の分子、例えば、複素環またはラクトンまたは不飽和脂肪族炭素結合を含み得る。
【００５０】
ＩｇＡプロテアーゼの切断部位は、Ｓ．サングイス、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌（ＩＩ）および淋菌の場合にはプロリン−スレオニンアミド結合、または髄膜炎菌（Ｉ）およびインフルエンザ菌アミド結合ではプロリン−セリンアミド結合のプロリンのＣ末端側である。前記ＩｇＡプロテアーゼ切断部位の特異的アミノ酸モチーフは、ＰＰＴ（Ｓ）Ｐ（配列番号２／配列番号３）と要約される。ＰＰＴＰ（配列番号２）はＳ．サングイス、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌（ＩＩ）および淋菌からなる限られた数の微生物種に特異的であり、ＰＰＳＰ（配列番号３）は髄膜炎菌（Ｉ）およびインフルエンザ菌からなる限られた数の微生物種に特異的である。
【００５１】
特異的アミノ酸モチーフのさらなる例は、ソルターゼクラスの酵素によって提供される。ソルターゼクラスＡは、表面タンパク質前駆体のカルボキシル末端におけるアミノ酸モチーフＬＰＸＴＧ（Ｘは任意のアミノ酸であり得る）を認識する。ソルターゼクラスＢ酵素は独特のＮＰ（Ｑ／Ｋ）ＴＮ（配列番号８／配列番号９）を認識するが、ピリン特異的ソルターゼはＬＰＸＴＧ様モチーフを切断する。
【００５２】
理論によって拘束されることを望むものではないが、切断の特異性は、ソルターゼ特異的モチーフ（ＬＰＸＴＧまたはＮＰ（Ｑ／Ｋ）ＴＮ）の認識によって決定される。各ソルターゼは、その特異的モチーフを切断し、その後、ソルターゼ活性部位と局在化シグナル中の残基との間でアシル（チオエステル）結合を形成する。次いで、このアシル中間体が特異的求核性アミノ酸によって除去されるので、タンパク質が結合する細胞壁成分が特定される。例えば、黄色ブドウ球菌では、クラスＡソルターゼがＴｈｒ残基とＧｌｙ残基との間のＬＰＸＴＧ局在化シグナルを切断して、表面タンパク質のＴｈｒ残基と、ソルターゼのＴＬＸＴＣ（配列番号１２）触媒ポケット中の反応性Ｃｙｓとの間にアシル中間体を形成する。その後、アシル中間体が細胞壁前駆体脂質ＩＩによる求核性攻撃によって分解される。
【００５３】
特に、非限定的例を用いて、黄色ブドウ球菌、病原菌は、ペンタペプチドモチーフＬＰＥＴＧ（配列番号５）を切断するＳｒｔＡを分泌するので、ＬＰＥＴＧ（配列番号５）モチーフを黄色ブドウ球菌に特異的な切断部位として使用することができる。黄色ブドウ球菌によって切断されるペンタペプチドモチーフのさらなる例にはＬＰＡＴＧ（配列番号４）がある。
【００５４】
緑膿菌によって産生されるＬａｓＡおよびＬａｓＢは、それぞれタンパク質およびペプチド中のＧｌｙ−ＧｌｙまたはＧｌｙ−Ｌｅｕ対に続くペプチド結合を優先的に切断する亜鉛メタロエンドペプチダーゼである。ＧＧＡ配列がエラスチン中のＬａｓＡ切断の好ましい部位として同定されており、ＬａｓＡがエラスターゼによるエラスチン消化を増強する能力は、エラスターゼの量に大いに依存し、過剰量のＬａｓＡを要し得る。ＧＧＬ配列はまたＬａｓＡに適した基質である。
【００５５】
シュードモナス性プロテアーゼＩＶは、リジン含有ペプチドのカルボキシル側についての活性を示し、免疫グロブリン、フィブリノーゲンおよびプラスミノーゲンを含むいくつかの生物学的に重要なタンパク質を消化することができる。
【００５６】
アルカリプロテアーゼ（当技術分野でセラリシンとしても知られている）は、Ｌｉｏｕｓら「Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ４９−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｆｏｒ  ａ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｌ  ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ、１９９９、Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３１、１２、１４３５〜１４４１」による研究によると、アラニン−アルギニン（ＡＡＲ）、アラニン−フェニルアラニン（ＡＡＦ）からなるモチーフ中のアラニンのカルボキシル側についての活性を示している。
【００５７】
さらに、黄色ブドウ球菌はトロンビン型プロテアーゼを分泌する。トロンビンは、グリシンにアルギニン−プロリンが先行し、グリシンに対してＮ末端のアミノ酸が疎水性、例えば、フェニルアラニンである、例えば、ＧＦＰＲＧ（配列番号１０）であるとグリシンアミノ酸のＮ末端側で切断する。さらに、プロテアーゼとプロテアーゼ切断部位の結合を増強するために、アルギニンに先行するアミノ酸はＤ配置、例えば、Ｄ−フェニルアラニンであるべきであり、これは当技術分野において１文字記号「ｆ」と呼ばれ、例えば、ＧｆＰＲＧ（配列番号１１）である。
【００５８】
プロテアーゼの基質に関するデータを見つけるために、当業者が使用することができる参考ハンドブックＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、第２版−編集者：Ｂａｒｒｅｔｔ  ＆  Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ＆  Ｗｏｅｓｓｎｅｒ、２００４。
【００５９】
上記のように、第１の剤は、好ましくはリンカーを介してポリマーと共有結合しており、該リンカーは第１の結合部位を含む。リンカーおよび切断部位は、好ましくはいくつかのアミノ酸からなる、換言すれば、リンカーおよび切断部位はペプチドを含む。
【００６０】
リンカーおよび切断部位を含むペプチドは、固相ペプチド合成を介して合成することができる。当業者であれば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９７３、Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、３３５〜３６１（ＫａｔｓｏｙａｎｎｉｓおよびＰａｎａｙｏｔｉｓ編）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９；Ｄａｖｉｓら、１９８５、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．、１０、３９４〜４１４；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、１９６９、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３９４１７６３号明細書；Ｆｉｎｎら、１９７６、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（第３版）２、１０５〜２５３；およびＥｒｉｃｋｓｏｎら、１９７６、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（第３版）２、２５７〜５２７に記載されている商業的に入手可能な構築ブロックおよび試薬を用いて所望の配列を合成することができる。保護基、リンカーおよび固相支持体の使用、ならびに特異的保護および脱保護反応条件、リンカー切断条件、捕捉剤の使用、ならびに固相ペプチド合成の他の態様は周知であり、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第３版、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔａｌｏｇ、２０００；「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ」、Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９２；「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ＆  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ、Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｍ．Ｒ．ＲｈｏｄｅｓおよびＨ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ編、１９９８、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ；「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版」、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９３；「Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版」、Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＡ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９４；「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ」、Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ編、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、ドイツ、１９９４にも記載されている。
【００６１】
手短に言えば、それぞれＦｍｏｃおよびＢｏｃ固相ペプチド合成と呼ばれる２つの型の固相ペプチド合成が当技術分野で知られている。Ｆｍｏｃ合成は使用する極めて反応性の酸を含む専門化された操作手順を要さないので、Ｆｍｏｃペプチド合成はＢｏｃペプチド合成、およびＦｍｏｃ固相対ペプチドを行うのに必要な技術よりも容易に実施することができることが周知である。Ｆｍｏｃ合成は、ハンドブック：Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）、ＣｈａｎおよびＷｈｉｔｅ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９に記載されている。
【００６２】
こうして合成された切断部位を、当業者に既知の標準的なカップリング反応を用いて、一方ではポリマーコーティング、他方では第１の剤および／または他の追加の剤と結合することができる。このような方法は、ハンドブック：Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）、ＣｈａｎおよびＷｈｉｔｅ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９中のＩａｎ  Ｗ．ＤｒｉｆｔｈｏｕｔおよびＰｅｔｅｒ  Ｈｏｏｇｅｒｈｏｕｔによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」に記載されている。ポリマーとプロテアーゼ切断部位の架橋についてのさらなる技術は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに含まれる。
【００６３】
架橋のための官能基は全て同じであっても官能基の組み合わせであってもよく、これにはアミノ、例えば、リジン、カルボキシル、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸、グアニジン、例えば、アルギニン、ヒドロキシル、例えば、セリンおよびスレオニン、ならびにチオール、例えば、システインなどの天然アミノ酸の官能基が含まれ得る。好ましくは、官能基は窒素、例えば、アミノ（ＮＨ２）、例えば、グアニジン（ＮＨＣＮＨＮＨ２）を含有する。
【００６４】
架橋剤は通常は二官能性であり、官能基は同じであっても異なってもよく、高官能基が存在してもよいが、通常は４個の官能基を超えない（Ｓｔｅｄｒｏｎｓｋｙ  米国特許第６４２３３３３号明細書）。ポリマー上の利用可能な特定の官能基に応じて、種々の架橋剤が使用され得る。架橋剤は通常、少なくとも約３個の炭素原子かつ約５０個以下の炭素原子であり、一般的には約３〜３０個に及ぶ炭素原子、より通常は約３〜１６個に及ぶ炭素原子である。２つの官能基を結合する鎖は、少なくとも１個の原子かつ約１００個以下の原子、通常は約６０個以下の原子、好ましくは約４０個以下の原子、特に約２０個以下の原子であり、原子は炭素、酸素、窒素；硫黄、リンなどであり得る。連結基は脂肪族的に飽和であっても不飽和であってもよく、好ましくは脂肪族であり、これにはオキシ、エステル、アミド、チオエーテル、アミノおよび亜リン酸エステルのような官能基が含まれ得る。架橋剤は疎水性であっても親水性であってもよい。
【００６５】
アルデヒド、イソシアネート、混合カルボン酸無水物、例えば、エトキシカルボニル無水物、活性化オレフィン、活性化ハロ、アミノなどの種々の反応性官能基を使用することができる。ペプチドリンカーおよびポリマーコーティング上の官能基の適切な選択によって、架橋剤、反応速度および架橋度を制御することができる。
【００６６】
種々の架橋剤を使用することができる。使用することができる架橋剤には、ジアルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、活性化ジオレフィン、ジイソシアネート（テトラメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、オクタメチレンジイソシアネートなど）、酸無水物（コハク酸二無水物、エチレンジアミン四酢酸二無水物など）、ジアミン（ヘキサメチレンジアミンなど）、シクロ（Ｌ−リジル−Ｌ−リジン）等が含まれる。架橋剤は非対称官能基を含有してもよい、例えば、活性化オレフィン無水物、例えば、アクロレインおよびキノイドアルデヒド、活性化ハロカルボン酸無水物などであってもよい。架橋剤は通常、商業的に入手可能である、または接着剤の塗布前にもしくはｉｎ  ｓｉｔｕ合成によって、従来の方法にしたがって容易に合成することができる。
【００６７】
通常、ポリマーコーティングは、特に水性の分散液または溶液として入手可能であり、一般的にはタンパク質ポリマーの濃度は約５０ｍｇ〜１ｇ／ｍｌ、より通常は約１００〜８００ｍｇ／ｍｌの範囲にある。溶液を、架橋速度を増強または遅延させるｐＨで緩衝化することができる。通常、ｐＨは約２〜１２、より通常は８〜１１の範囲にある。リン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩等などの種々の緩衝剤を使用することができる。カチオンは生成物の性質に影響を及ぼし得るので、その程度まで、アルカリ金属カリウムおよびナトリウムが好まれる。タンパク質組成物は一般的に、容易に処理することができる組成物を提供するために約５〜４０、より通常は約５〜２０、好ましくは約１０〜２０重量％であり、所望の時間制限内に設定される。緩衝液濃度は一般的に約５０〜５００ｍＭの範囲内にある。安定剤、界面活性剤などの他の剤がタンパク質溶液中に存在してもよい。多官能性の第２の化合物が存在する場合、その濃度はその架橋剤およびポリマーとの比により決定される。
【００６８】
架橋剤とポリマーの比は、架橋剤、ポリマー上に存在する官能基の数、所望の硬化速度などに応じて広く変化する。一般的に、ポリマーと架橋剤の重量比は、少なくとも約１：１かつ約１００：１以下、通常は約５０：１以下、一般的に約２〜５０：１の範囲にあるが、いくつかの例では、３０：１以下となり得る。タンパク質と架橋剤の当量比は、一般的に約０．１〜１：３の範囲内にあり、より通常は約０．５〜２：２の範囲内にある。ポリマー−ペプチド架橋剤当量比の選択における考慮事項は、設定の速度、架橋剤の反応性、架橋剤の混合物への相対的溶解度、架橋剤の生理的特性、架橋剤の所望の安定度などである。
【００６９】
ポリマー−ペプチド抱合体を調製する異なる合成経路が可能である。適切な末端反応性ポリマーの選択的修飾または適切な反応性側鎖の官能化を介したペプチド−合成ポリマー抱合体の収束的合成のために、広範囲の反応が利用可能である。
【００７０】
ペプチド−ポリマーコーティング抱合体を合成するために、好ましくは伝統的なペプチドカップリング条件を使用する。これらの反応条件は、一般的に高変換を提供し、標準的固相ペプチド合成プロトコルと適合性であるので魅力的である。種々のペプチド−合成ポリマー抱合体を調製するために、例えば、カルボン酸修飾ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体を用いた固体支持ペプチドのＮ末端修飾が広く使用されてきた。欠点は、これらの反応が通常は生体直交型ではなく、未保護ペプチドから均質（水性）溶液で抱合体を合成するために使用することができないことである。
【００７１】
しかしながら、この目的のために使用することができる多くの生体直交型カップリング反応が存在する。例としては、Ｐｄ（０）触媒カップリング反応、シュタウディンガーライゲーション、環化付加反応（ディールス−アルダー、１，３−双極子環化付加）、還元的アルキル化、オキシムおよびヒドラジン形成、チオール付加反応、ならびに酸化的カップリングが挙げられる。タンパク質−合成ポリマー抱合体（下記参照）を調製するために種々のこれらの戦略が使用されてきたが、ペプチド−合成ポリマー抱合体を合成するために、いくつかの例では、ヒュスゲン１，３−双極子環化付加反応のみが使用されてきた。利用可能な他の生体直交型カップリング反応の範囲が、考えられる複雑な保護基戦略を必要とすることなく、新規で複雑なペプチド−合成ポリマー抱合体を合成するための十分な機会を提供することが自明である。
【００７２】
ペプチド−合成ポリマー抱合体の多岐にわたる合成を固相ならびに均質溶液で行うことができる。ペプチド−合成ポリマー抱合体の多岐にわたる固相合成はしばしば、ポリ（エチレングリコール）鎖を不安定なリンカーを介して固体支持体に結合させる商業的に入手可能なＴｅｎｔａｇｅｌ樹脂を用いて行われる。凝集を回避し、困難なペプチド配列の合成を促進するために、いわゆるスイッチエステルセグメント（ｓｗｉｔｃｈ  ｅｓｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ）をペプチド骨格に導入することができる。合成の完了後、選択的なＯからＮへのアシル転換を介してペプチド骨格を再建することができる。スイッチエステルセグメントの使用に加えて、骨格アミド保護基の使用またはマイクロ波合成を含む、凝集を起こしやすい困難なペプチド配列を調製するために使用することができる種々の他の戦略が存在する。可溶性または不溶性合成ポリマー支持体から段階的にペプチドセグメントをグラフトする代わりに、制御ラジカル重合技術を用いて、適切な開始剤修飾樹脂結合ペプチドから合成ポリマーセグメントを成長させることもできる。
【００７３】
これらの重合技術は、均質溶液中でペプチド−合成ポリマー抱合体を合成するためにも使用されてきた。例えば、ペプチド−官能化連鎖移動剤（ＣＴＡ）を用いて、可逆的付加−開裂連鎖移動（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ−ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＲＡＦＴ）重合を介してペプチド−合成ポリマー抱合体を調製することができる。ペプチドをＣＴＡのＺ基またはＲ基に結合させることができるが、後者のアプローチを使用してチオール末端官能化ペプチド−合成ポリマー抱合体を作成することができるので、後者のアプローチが特に魅力的である。チオール末端基はさらなる生体直交型鎖末端官能化のための多用途のハンドルとなるので、これを使用して抱合体の単層で金基板をコーティングすることもできる。いくつかの報告により、環状または直鎖ペプチド原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）開始剤を用いてペプチド−合成ポリマー抱合体の合成が記載されている。これらのＡＴＲＰ開始剤は、典型的には適切なＡＴＲＰ開始剤を用いてＮもしくはＣ末端アミノ酸または適切な側鎖官能基の修飾によって得られた。近年、Ｍａｙｎａｒｄら（２００８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０４１〜１０４７）は、この概念をさらに一歩進め、標準的なＦｍｏｃ  ＳＰＰＳと適合性の側鎖ＡＴＲＰ開始剤を用いて人工アミノ酸を合成した。ここでは、これらのアミノ酸を用いて、ペプチド中の特定のアミノ酸の出現にも精巧な保護基戦略の使用にも頼る必要なく、抱合部位に対する正確な制御によりペプチド開始剤を合成することが可能である。
【００７４】
ペプチド−合成ポリマーコーティング抱合体を合成するための最後の多岐にわたるアプローチは、ペプチド系モノマーの重合に基づく。種々のペプチド系モノマーが従来のフリーラジカル重合、開環メタセシス重合または制御ラジカル重合を介して重合されてきた。
【００７５】
ポリマーコーティングは生分解性または非生分解性ポリマーコーティングであり得る。適切なプロテアーゼ切断部位を含有するよう操作できる限り、任意のポリマーコーティングがインプラント上のコーティングとして本発明に使用するのに適したものとなり得る。例えば、ポリマーコーティングを、ポリマーコーティング自体の中に、限られた数の微生物菌株、種または属による切断を受けやすい特異的切断部位を含有し、それによってポリマーコーティング内に捕捉されている治療剤または診断剤が放出されるように操作することができる。
【００７６】
切断部位は、ポリマーコーティングと、少なくとも第１の剤およびまたは少なくとも第２の剤との間に黄色ブドウ球菌の前記ペンタペプチドＬＰＴＥＧモチーフを含み得る。好ましくは、切断部位は、配列ＰＰＴＰ（配列番号２）、ＰＰＳＰ（配列番号３）を含む。
【００７７】
本発明の別の実施形態では、切断部位がポリマーコーティングに組み込まれる。換言すれば、切断が２本のＰＥＧ鎖の間の存在する、すなわち、プロテアーゼ切断部位のＣ末端が第１のＰＥＧ鎖と結合しており、プロテアーゼ切断部位のＮ末端が第２のＰＥＧ鎖と結合している。
【００７８】
別の実施形態では、第１の剤が診断剤または治療剤、好ましくは診断剤である。
【００７９】
そのため、第１の剤が診断分子である場合、第１の剤の放出は、特定の微生物菌株、種または属の存在を示している。第１の剤が治療剤である場合、ポリマーからの第１の剤の放出で、微生物菌株、種または属は放出された治療剤によって忌避される。放出された診断剤の存在は対応する微生物の存在を示している。
【００８０】
第１の剤が診断剤であることの利点は、物体、例えば、医療用インプラントが微生物菌株、種または属に感染しているかどうかを、医療用インプラントを囲む組織をサンプリングするために必然的に外科生検に頼ることなく、決定する容易な方法が提供されることである。
【００８１】
好ましい実施形態、特に、物体が哺乳動物宿主などの宿主に植え込まれる場合では、第１の剤が好ましくは蛍光剤、生物発光剤、発光剤、化学発光剤または核剤（ｎｕｃｌｅａｒ  ａｇｅｎｔ）からなる群から選択される好ましくは光子放出剤であり、蛍光剤が好ましくはＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷである。このような剤は、近赤外イメージングなどの光学イメージング技術を用いて検出可能である。組織自己蛍光が極めて低く、この長波長光の組織への侵入は他の領域のスペクトルよりも有意に良好であるので、近赤外（ＮＩＲ）ウィンドウ（６５０〜９００ｎｍ）内の光学イメージングが有利である。好ましい剤は、ＮＩＲウィンドウ（望ましくない源からの寄与が最小であるので、微生物感染の位置を強調する有効なビーコンとなる能力を有している）の「スイートスポット」で直接放出するＩＲＤｙｅ（商標）８００ＣＷ（励起／発光＝７７４／７８９ｎｍ）である。特異的微生物による細菌感染で、前記微生物はポリマーコーティングに含有される切断部位を特異的に切断する化合物を分泌し、前記第１の剤の放出をもたらす。第１の剤が色素、例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷである場合、近赤外イメージング装置の使用により、限られた数の微生物菌株、種または属によって引き起こされる感染症を検出するために用意された効率的な方法が提供される。近赤外イメージング装置はしばしば診療所で使用されるので、本発明は現代の業界の慣習に適用可能である。
【００８２】
前記光子放出剤のさらなる例は、蛍光色素（例えば、インドシアニングリーン、フルオレセイン等）、生物発光分子（例えば、ルシフェラーゼ、ガウシア等）、化学発光分子（例えば、化学反応の結果として限られた熱放射と共に発光が起こるルミノール）、磁気共鳴（例えば、超小型イオン化粒子）、光音響（金ナノ粒子、フルオロフォア）、熱音響（フルオロフォア、金ナノ粒子）、核剤（例えば、ＦＤＧ、ジルコニウム）からなる群から選択され得る。生物用途では、一般的適用性、毒性および合成の理由から蛍光剤の使用が好ましい。前記光子放出剤は、好ましくは物質からの放出時に発光すべきであるが、前記物質中にまだ捕捉されているまたはこれと結合している場合には発光するべきでないまたは少なくとも有意にわずかしか発光すべきでない。
【００８３】
当業者であれば、光輸送および細胞との相互作用の数学的モデル化のための有限差分時間領域シミュレーションなどの重要な方法を記載し、光学およびテラヘルツ分光学ならびに生物医学診断のためのイメージング法を議論し、分子レベルの細胞および組織イメージングを提供する光子弾道学、多次元蛍光、ラマン、共焦点、ＣＡＲＳおよび他の非線形分光法の新規な様式を提示し、光力学、低強度レーザーおよび光熱療法を含む療法および手術のための重要な光子技術を調査し、どのようなナノ粒子光子技術をがん治療およびＵＶ照射からの人体保護のために使用するかを説明し、胚、眼、皮膚、脳および胃組織などの種々の正常および病理組織の高度な分光学およびイメージングに焦点を当てるＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖａｌｅｒｙ  Ｖ．Ｔｕｃｈｉｎ編、２０１０からの標準的な教示を適用することができる。
【００８４】
さらなる実施形態では、物体が、第１の切断部位の切断で放出される第１の追加の剤を含む。第１の切断部位が切断されると、ここでは第１の剤に加えて、第１の追加の剤も選択的に放出される。
【００８５】
前記第１の剤は、診断剤および治療剤などの本明細書に記載される剤のいずれであってもよく、第１の追加の剤は同じものから選択することができる。これは、想起される群の微生物によるコーティングの感染で、第１の剤と第１の補助剤の両方が放出されることを意味する。第１の剤として診断剤（上記光子放出剤など）および第１の追加の剤として治療剤（抗生物質など）を選択することが有利であり、逆もまた同じである。このような組み合わせによって、感染症が容易に可視化され得る一方で、感染症が抗生物質によって同時に攻撃される。
【００８６】
魅力的な実施形態では、第１の追加の剤が第１の追加のリンカーを介して第１の追加のポリマーと共有結合しており、第１の追加のリンカーが第１の切断部位を含む。本発明はまた、第１の剤および第１の追加の剤が異なるリンカーと連結することも可能にする。リンカーが切断部位を介して第１の剤と結合しており、リンカーが、大まかに言えば、ＸＹアミニオ（ａｍｉｎｉｏ）酸を含み、Ｘが切断部位のアミノ酸を表す、リンカーを含むポリマーを調製することができる。ポリマー−リンカー構築物の全体量を２つ（またはそれ以上）の反応容器に分けて、このポリマー−リンカー構築物の第１の部分をＹアミノ酸を介して第１の剤と共有結合することを可能にすることができる。第２の容器中のポリマー−リンカー構築物の別の部分をＹアミノ酸を介して第１の追加の剤と結合することができる。次いで、第１の剤または第１の追加の剤のいずれかを含む２つのポリマー−リンカー構築物を合わせ、物体をコーティングするために使用することができる。両構築物は同じ切断部位（Ｘアミノ酸で構成される）を有する異なるリンカー分子を含むので、切断部位が限られた数の微生物菌株、種または菌株によって産生される化合物によって切断され、前記化合物が前記切断部位に特異的である場合に、第１の剤と第１の追加の剤の両方が放出される。第１の剤と第１の追加の剤の両方を単一容器中、単一ステップでリンカー分子と連結することも可能である。
【００８７】
上に概説されるように、本発明の物体のポリマーコーティングに含有され、かつ同じ切断部位の切断によって放出される２つの異なる診断剤、または診断剤と治療剤、または２つの異なる治療剤を提供することが可能である。
【００８８】
そのため、第１の切断部位の切断で、診断剤および治療剤が放出され、該診断剤は特定の微生物菌株、種または属を示しており、かつ治療剤は前記特定の微生物菌株、種または属を標的化するポリマーコーティングを構築することが可能である。
【００８９】
第１の剤が第１のリンカーを介してカップリングした第１のポリマー、および第１の追加の剤が同じリンカーまたは同じ切断部位もしくは第１の切断部位として同じ化合物によって切断される少なくとも１つの部位を含むが異なるリンカーで連結した第１の追加のポリマーを調製することも可能である。好ましくは、第１の追加のリンカーが第１のリンカーと同一である。
【００９０】
別の魅力的な実施形態では、第１の追加のポリマーが第１のポリマーと同一である。第１の剤と第１の追加の剤の両方を結合するために同じポリマーを使用することにより、均一かつ均質なコーティングの調製が可能になる。第１の追加のポリマーが第１のポリマーと異なることも可能である。この実施形態では、物体を、例えば、第１の追加の剤が結合した同じポリマーとブレンドした第１の剤が結合したポリマーのブレンド、または一方には第１の剤が結合し、他方のポリマーには第１の追加の剤が結合した異なるポリマーのブレンドでコーティングすることができる。このようなブレンドを用いて想起される物品をコーティングすることができる。
【００９１】
想起される物品を、ブレンドではなく、別々のポリマー成分でコーティングすることも可能である。例えば、第１の追加の剤が結合した第１の追加のポリマーから内層を適用し、引き続いて、第１の剤が結合した第１のポリマーを含む第２の外層を適用し、感染症の侵入段階に対する異なるシグナルまたは反応を可能にすることができる。例えば、内層は第１の追加の（治療）剤として抗生物質を含むことができる一方で、外部コーティングは第１の（診断）剤を含むことができる。感染で、第１の剤が外層から放出され、感染症が進行するにつれて、感染症が内層に到達し、第１の追加の剤の放出がもたらされる。別々のリンカー分子上に存在する場合の第１の剤と第１の追加の剤の組み合わせの場合も同様である。
【００９２】
別の魅力的な実施形態では、第１のポリマーのポリマー分子が、そこに共有結合している、第１の剤の少なくとも１個の分子および第１の追加の剤の少なくとも１個の分子を含む。したがって、第１の剤と第１の追加の剤の両方が同じポリマー分子上に存在し、両剤の改善し協調した放出をもたらす。
【００９３】
例えば、ペプチド（リンカー）配列ＧｆＰＲ“ＧＦ”ＰＡＧＧＥＧ（配列番号１４）を含むポリマー分子では、ペプチドがＧ−Ｆ間（“ＧＦ”で示したテキスト）で切断され、診断剤をグルタミン酸（Ｅ）のカルボキシル側鎖を介して共有結合することができ、治療剤をＣ−末端グリシン（Ｇ）のＣ末端で共有結合することができる。
【００９４】
切断部位を含むペプチドリンカーを用いることの利点は、診断剤と治療剤の両方がプロテアーゼ切断部位での切断と同時に放出されるように、診断剤および治療剤が同じポリマー上に位置することができることである。
【００９５】
より好ましくは、治療剤で標識されたペプチド配列ＧｆＰＲＧＦＰＡＧＧＥＧ（配列番号１４）および診断分子で標識されたペプチド配列ＧｆＰＲＧＦＰＡＧＧＥＧ（配列番号１４）の統計学的混合物をポリマーコーティングのポリマーと共有結合することができる。
【００９６】
さらに別の実施形態では、第１の追加の剤が少なくとも第１の剤と共有結合している。
【００９７】
例えば、前記切断部位の特異的切断で、第１の剤および第１の追加の剤が単一切断イベントによって放出されるように、第１の剤および第１の追加の剤を単一リンカーを介してポリマーと共有結合することができる。このために、第１の剤と第１の追加の剤の両方を互いに、すなわち、共有結合的に連結することができ、前記剤の一方を第１のリンカーに連結する。第１の追加の剤を第１の剤と共有結合する場合、これは、第１の剤と第１の追加の剤の両方を同時に放出することができるという利点を有する。また、第１の剤および第１の追加の剤を、リンカーと共有結合する前に一緒に反応させて、ポリマー−リンカー構築物に行う必要がある反応ステップの数を減少させることができる。第１の剤および第１の追加の剤が２つの異なる機能を有する場合、単一切断の結果として２つの効果が得られる。前記２つの異なる機能は診断および治療機能であり得る、あるいは１つが内部標準を提供し、１つが微生物菌株、種または属の存在を報告する手段を提供するという２つの異なる診断シグナルであり得る。
【００９８】
さらなる実施形態では、ポリマーコーティングが第２の剤と、限られた数の微生物菌株、種または属からなる第２の群に属する微生物によって特異的に提供される第２の化合物によって切断される第２の切断部位を含むポリマーとを含み、前記第２の切断部位の切断がポリマーコーティングからの第２の剤の放出をもたらし、第２の切断部位が第１の切断部位と異なり、かつ第１の化合物によって切断可能でなく、かつ第２の群の１種または複数の微生物菌株、種または属が第１の群に属するものと異なり、前記第２の剤の放出が前記第２の群に属する微生物の存在を示している、本発明による物体が提供される。
【００９９】
本発明の物体が限られた数の微生物菌株、種または属の第２の群に属する第２の微生物によって切断される第２の切断部位を有するポリマーコーティングを含む代表的な場合では、前記第２の切断部位の切断がポリマーコーティングからの第２の剤の放出をもたらす。この実施形態では、異なる微生物（すなわち、一方は第１の微生物群に属し、他方は第２の微生物群に属する）による切断で、少なくとも２種の異なる剤（すなわち、第１の剤および第２の剤）が放出されて、２種のまたは異なる微生物感染症の診断および／または忌避を同時に可能にする。したがって、コーティングは、対応する数の異なる微生物群の診断および／または忌避を可能にする第３のまたはさらなる切断部位を含むことができる。
【０１００】
例えば、第１の切断部位の切断によって放出可能な第１の剤は、例えば、フルオレセインの放出で、青色光を放出する蛍光剤などの第１の診断剤である一方で、第１の切断部位と異なる第２の切断部位の切断によって放出可能な第２の剤は、例えば、インドシアニングリーンの放出で緑色光を放出する第２の診断剤である。
【０１０１】
青色光の観察は第１の群に属する微生物の感染症を指し示す一方で、緑色光の存在は第２の群に属する微生物の感染症を指し示す。当然、第１の切断部位と第２の切断部位の両方の切断により、上に説明される診断剤と治療剤の両方などの２種以上の剤が放出され得る、または追加の第１の剤と追加の第２の剤の両方が存在して、２種の異なる微生物感染症の可視化と忌避の両方を同時に可能にすることができる。
【０１０２】
この実施形態により、第１の切断部位について上記のように、第２の切断部位の切断によって放出可能な異なる剤をさらに組み合わせることが可能になる。したがって、コーティングは、感染症を引き起こす２種の微生物菌株、種または属（それぞれ本明細書に定義される第１および第２の群に属する）の容易な診断および同時の忌避を可能にする、第２の切断部位の切断によって放出可能な診断剤と治療剤両方の組み合わせなどの、第２の剤ならびに第２の追加の剤を含むことができる。第１および第２の追加の剤として２種の異なる治療剤、ならびに第１および第２の剤として２種の異なる診断剤を有することが可能であり、逆もまた同じである。当然、ポリマーコーティングは、第３の切断部位の切断で放出される第３のおよび任意のさらなる剤を含むこともできる。
【０１０３】
コーティングの第１の剤の場合のようにおよびこれについて上記のように、第２の剤もこの場合好ましくは第２のリンカーを介して第２のポリマーと共有結合しており、第２のリンカーは第２の切断部位を含む。
【０１０４】
異なるポリマー上の異なる（すなわち、第１および第２の）切断部位を提供することが可能であるが、第２の切断部位を含む第２のポリマーは、好ましくは第１のポリマーと同じポリマーである。
【０１０５】
本発明によると、第１のポリマー（Ｐ）を含む物体を提供することができ、該ポリマーは切断部位（Ｘ１）を含む第１のリンカーを含み、かつ前記第１のポリマー（Ｐ）を使用して第２の切断部位（Ｘ２）を含む第２のリンカーを共有結合することもできる。大まかに言えば、Ｘ１の切断が第１の群の微生物によって提供される第１の化合物の存在下でのみ起こり、かつＸ２の切断が第２の群の微生物によって提供される第２の化合物の存在下でのみ起こるように、２つの可能なポリマー−リンカー構築物、すなわち、ＰＸ１およびＰＸ２が存在する。好ましくは、これは複数容器反応で行われ、ポリマーの第１の部分は第１の容器中でＸ１と反応し、第２の部分は第２の容器中でＸ２と反応し、場合により第３の部分が第３の容器中で第３の切断部位Ｘ３を有する第３のリンカーと反応するなどである。各リンカーに、第１、第２などの剤が連結する。好ましくは、異なる微生物の存在を決定するために、前記剤は異なる診断剤である。有利には、この複数容器アプローチを用いて切断部位と剤の特異的な組み合わせを適合させ、微生物の特異的組み合わせの検出／治療に適した特異的コーティングを特異的な異なる容器を混合することによって調製することができる。さらに、コーティングは、第１、第２、第３などのリンカーによってコーティングのポリマーに連結した第１、第２、第３などの追加の剤を含むこともできる。これにより、各切断部位が診断剤と治療剤の組み合わせを放出して、対応する感染症を決定および忌避することの両方が可能になる。このような場合、異なる感染症の決定は異なる診断剤によるので、治療剤は同じであってもよい。
【０１０６】
上に概説されるように、コーティングが第２の切断部位を有するポリマーを含む場合、本発明のコーティングは、好ましくは第２の追加の剤を含み、これは第２の切断部位の切断で放出され、第２の剤は好ましくは診断剤であり、かつ第２の追加の剤は好ましくは治療剤である。第２の剤は、好ましくは蛍光剤、生物発光剤、発光剤、化学発光剤または核剤からなる群から選択される、好ましくは光子放出剤である。しかしながら、第２の剤は、異なる対応する感染症を識別するために、好ましくは第１の剤と異なる。
【０１０７】
好ましい実施形態では、第２の追加の剤が第２の追加のリンカーを介して第２の追加のポリマーと共有結合しており、第２の追加のリンカーが第２の切断部位を含む。第１のリンカーおよび第１の追加のリンカーについて上に概説されるように、第２の追加のリンカーは、好ましくは第２のリンカーと同一である。したがって、第１の剤および第１の追加の剤について上に説明されるのと同じ理由で、第２の追加のポリマーは、好ましくは第２のポリマーと同一であり、かつ第２のポリマーのポリマー分子は、好ましくはそこに共有結合した第２の剤の少なくとも１個の分子および第２の追加の剤の少なくとも１個の分子を含む。
【０１０８】
第１の追加の剤および第１の剤が診断剤である場合、本発明は、第１の群の限られた数の微生物菌株、種または属に属する１種または複数の微生物の存在を検出する手段だけでなく、前記微生物を忌避する手段も提供する。治療剤は、現在のおよび将来の抗生物質に限定されないが特にバンコマイシンなどの、ウイルスを含む、細菌、マイコバクテリア、寄生生物または任意の感染性疾患を排除することを意図した抗生物質または任意の剤であり得る。第２の剤が診断剤である場合、異なる群の限られた数の微生物菌株、種または属に属する２種の異なる微生物を決定することができる。
【０１０９】
好ましくは、治療剤は、βラクタム抗生物質、セファロスポリン抗生物質、マクロライド、環状デプシペプチドおよびテトラサイクリンからなる群から選択され、好ましくはバンコマイシンである。グラム陽性菌によって認識される切断部位と結合すると、バンコマイシンはグラム陽性菌のｄ−Ａｌａ−ｄ−Ａｌａモチーフを標的化するので、好まれる抗生物質となるだろう。
【０１１０】
本発明で使用することができる治療剤のさらなる例としては、それだけに限らないが、クロルヘキシジン、２−ｐ−スルファニリアニリノエタノール（ｓｕｌｆａｎｉｌｙａｎｉｌｉｎｏｅｔｈａｎｏｌ）、４，４’−スルフィニルジアニリン、４−スルファニルアミドサリチル酸、アセジアスルホン、アセトスルホン、アミカシン、アモキシシリン、アムホテリシンＢ、アンピシリン、アパルシリン、アピシクリン、アプラマイシン、アルベカシン、アスポキシシリン、アジダムフェニコール、アジスロマイシン、アズトレオナム、バシトラシン、バンベルマイシン、ビアペネム、ブロジモプリム、ブチロシン、カプレオマイシン、カルベニシリン、カルボマイシン、カルモナム、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セフブペラゾン、セフクリジン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェタメト、セフィキシム、セフィネノキシム（ｃｅｆｉｎｅｎｏｘｉｍｅ）、セフミノクス、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォテタン、セフォチアム、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフプロジル、セフロキサジン、セフタジジム、セフテラム、セフチブテン、セフトリアキソン、セフゾナム、セファレキシン、セファログリシン、セファロスポリンＣ、セフラジン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリナフロキサシン、クリンダマイシン、クロモサイクリン、コリスチン、シクラシリン、ダプソン、デメクロサイクリン、ジアチモスルホン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、ジリスロマイシン、ドキシサイクリン、エノキサシン、エンビオマイシン、エピシリン、エリスロマイシン、フロモキセフ、フォーチミシン、ゲンタマイシン、グルコスルホンソラスルホン、グラミシジンＳ、グラミシジン、グレパフロキサシン、グアメサイクリン（ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）、ヘタシリン、イミペネム、イセパマイシン、ジョサマイシン、カナマイシン、ロイコマイシン、リンコマイシン、ロメフロキサシン、ルセンソマイシン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メロペネム、メタサイクリン、ミクロノマイシン、ミデカマイシン、ミノサイクリン、モキサラクタム、ムピロシン、ナジフロキサシン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ノルフロキサシン、オレアンドマイシン、オキシテトラサイクリン、ｐ−スルファニリルベンジルアミン、パニペネム、パロモマイシン、パズフロキサシン、ペニシリンＮ、ピパサイクリン、ピペミド酸、ポリミキシン、プリマイシン、キナシリン、リボスタマイシン、リファミド、リファンピン、リファマイシンＳＶ、リファペンチン、リファキシミン、リストセチン、リチペネム、ロキタマイシン、ロリテトラサイクリン、ロサラマイシン、ロキシスロマイシン、サラゾスルファジミジン、サンサイクリン、シソマイシン、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、サクシスルホン、スルファクリソイジン（ｓｕｌｆａｃｈｒｙｓｏｉｄｉｎｅ）、スルファロクス酸、スルファミドクリソイジン、スルファニル酸、スルホキソン、テイコプラニン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、テトロキソプリム、チアムフェニコール、チアゾールスルホン、チオストレプトン、チカルシリン、チゲモナム、トブラマイシン、トスフロキサシン、トリメトプリム、トロスペクトマイシン、トロバフロキサシン、ツベラクチノマイシン、バンコマイシン、アザセリン、カンジシジン、クロルフェネシン、デルモスタチン、フィリピン、ファンギクロミン（ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ）、メパルトリシン、ナイスタチン、オリゴマイシン、シプロフラキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ペフロキサシン、エノキサシン、ロソキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、テマフロアクシン（ｔｅｍａｆｌｏａｘｃｉｎ）、ロメフロキサシン、ペリマイシンＡまたはツベルシジンなどが挙げられる。
【０１１１】
本発明の特に好ましい実施形態では、第１のポリマー、および／または存在する場合には第１の追加のポリマーおよび／または第２のポリマーおよび／または第２の追加のポリマーがヒドロゲルを含む。「ヒドロゲル」という用語は、先行技術で一般的に理解される意味を有するよう本明細書で使用され、理解される。そのため、ヒドロゲルは、連続液相に包まれた連続固体ネットワークである。ヒドロゲルは、その有意な含水量のために、天然組織と極めて類似の柔軟度を有する。本明細書に記載されるヒドロゲルは、共有結合的に架橋した分岐または非分岐ポリマー鎖でできている。ヒドロゲルは、レオロジー特性を使用する環境に適合するよう調整することができるので、特定の利点を有する。
【０１１２】
好ましい実施形態では、第１のポリマー、および／または存在する場合には第１の追加のポリマーおよび／または第２のポリマーおよび／または第２の追加のポリマーが生分解性ポリマーを含む。ポリマーコーティングの生分解によって、望ましくない免疫効果などの望ましくない副作用を引き起こし得るポリマーコーティングが長期間患者中に存在することが防がれるので生分解性ポリマーコーティングは有利である。生分解性によって、宿主により宿主によって排泄され得る分子に分解され得るポリマーが意味される。生分解性ポリマーは、当技術分野で吸収性ポリマーとしても知られている。吸収性ポリマーコーティングによって、ポリマーコーティングが容易に崩壊または分解し、体に吸収されるまたは体を通過することが意味される。さらに特に、ポリ（エチレングリコール）系ポリマーコーティングは、永続性の微量分解産物も残留分解産物も体に保持されないように、体に吸収されるまたは体を通過するので、永続的な慢性異物反応を誘発しない分解産物に分解する。
【０１１３】
例えば、生分解性ポリマーとヒドロゲルの両方を含む、多種多様なポリマーを本明細書に記載される本発明による第１の、第１の追加の、第２のおよび／または第２の追加のポリマーとして利用することができる。
【０１１４】
生分解性ヒドロゲルの代表的な例としては、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸、デンプン、セルロースおよびその誘導体（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、アルギン酸塩、カゼイン、デキストラン、多糖、フィブリノーゲン、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（トリメチレンカルボネート）、ポリ（ヒドロキシバレレート）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（アルキルカルボネート）およびポリ（オルトエステル）、ポリエステル、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリジオキサノン、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリ（アミノ酸）、このようなポリマーのコポリマーおよびこのようなポリマーのブレンドが挙げられる（一般的に、Ｉｌｌｕｍ，Ｌ．、Ｄａｖｉｄｓ，Ｓ．Ｓ．（編）「Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」１９８７、Ｗｒｉｇｈｔ、Ｂｒｉｓｔｏｌ；Ａｒｓｈａｄｙ、１９９１、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １７：１〜２２；Ｐｉｔｔ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒ．５９：１７３〜１９６、１９９０；Ｈｏｌｌａｎｄら、１９８６、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４：１５５〜１８０参照）。
【０１１５】
切断部位含有リンカーを親水性ポリマーコーティングと抱合するならびに親水性ポリマーコーティングを架橋するための多官能性部位を有するポリ（エチレングリコール）も本発明での用途を見出している。多官能基性活性化合成ポリマーは、ポリマーに沿った種々の位置で官能基を提供する当技術分野で既知の種々の技術を用いて調製することができる。
【０１１６】
ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）は、光開始剤およびＵＶ光の存在下でヒドロゲルを形成する合成親水性出発材料である。過剰の細胞マトリックスタンパク質および／または成長因子をヒドロゲルに組み込むことができ、その剛度を１０〜１００ｋＰａに調節することができるので、ＰＥＧＤＡヒドロゲルは容易にカスタマイズできる。ＰＥＧＤＡは生体適合性であり、非免疫原性であり、かつ付着プロテアーゼ切断部位および治療剤または診断剤を組み込むための化学的操作が可能であると広く認識されている。
【０１１７】
ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）ヒドロゲルは、多くの生物医学用途に広く受け入れられている（Ｐｅｐｐａｓら、１９９９、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６２：８１〜８７）。例えば、ＰＥＧ（５７４）ＤＡ、ＰＥＧ（４０００）ＤＡおよびＰＥＧ（８０００）ＤＡを用いて調製したヒドロゲルは、本明細書において、配置前に植込みおよび操作のための十分な物理特性を有することが証明されている。ＰＥＧＤＡヒドロゲルは親水性、生体適合性、非毒性であり、かつＰＥＧマクロマー長に応じて可変性のメッシュサイズを示す。本明細書に例示されるように、第１または第２の切断部位ペプチドを介して結合している第１の剤、第１の追加の剤および／または第２の剤を含有するヒドロゲルは、第１の剤、第１の追加の剤および／または少なくとも第２の剤の放出を一定レベル制御する。
【０１１８】
本明細書で開示されるように、大きなＰＥＧ鎖長は、タンパク質がマトリックスの全体にわたって拡散するのを可能にする一方で、小さなＰＥＧ鎖長を用いて特異的タンパク質へのマトリックスの接近性を制御することができる（Ｅｌｂｅｒｔら、２００１、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７６：１１〜２５）。この点について、特定の実施形態は、細菌プロテアーゼがポリマーコーティングの全体にわたって拡散するのを可能にするメッシュサイズを有する親水性マトリックスを包含する。
【０１１９】
官能基に加えて、ポリマーコーティングのポリマーは、治療している対象からのマトリックスポリマーの除去を促進するための制御された生分解手段をさらに含有することができる。例えば、ＰＥＧＤＡヒドロゲルを、修飾によってより高速で生分解するよう製造することができる（Ｓａｗｈｎｅｙら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２８：８３１〜８３８）。生分解性架橋剤を組み込む、または生分解性コポリマーを利用することによって、ＰＥＧＤＡヒドロゲルを生分解性にすることができる。（Ｓａｗｈｎｅｙら、１９９３、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１〜５８７；Ｐａｒｋら  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．、１９９３、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．：Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂ．ｉｘ、２５２；Ｗａｔａｎａｂｅら、２００２、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３：４０４１〜４０４８；Ｙａｍｉｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ａ３４：２４６１〜２４７０）。例えば、プラスミンまたは粗製コラゲナーゼによって特異的に分解される、テレキーレック（これはその反応性末端基を通してさらなる重合または他の反応に入ることができるポリマーである）生分解性ブロックコポリマーが架橋ヒドロゲルに使用されている（Ｗｅｓｔら、１９９９、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３２：２４１〜２４４）。程度および速度または分解は、使用される特異的分解機構によって制御され、それによって、植込み部位での親水性ポリマーコーティングの蓄積が制限される（米国特許出願公開第２００７／０１５５９０６号明細書）。
【０１２０】
チオール抱合を介した剤のポリマーコーティング（例えば、ヒドロゲル）への固定が、ペプチドリンカーへのシステイン組込みを容易にし、チオレンクリック反応をヒドロゲル表面修飾に特に関連させる好ましいアプローチである。
【０１２１】
Ａｎｓｅｔｈおよび共同研究者（２００９、Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．、６５９〜６６４）は、ヒドロゲル合成とゲル化後修飾の両方に関連する連続クリックプロトコルを開発した。クリック架橋ＰＥＧヒドロゲルは、Ｍａｌｋｏｃｈら（２００６、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ、２７７４〜２７７６）によってとられた方法の延長として、ＣｕＡＡＣを介して最初に形成された。これらのＰＥＧヒドロゲルの光パターニング（ｐｈｏｔｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）を可能にするために、多官能性光反応性ポリペプチド配列が、非天然アミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ａｌｌｏｃ）−ＯＨを組み込むことによって、ネットワーク構造に含められた。アリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）保護基は、システインなどの任意のチオール含有化合物と反応することができるビニル官能基を含有する。ＵＶ光に暴露すると、水素引き抜き型光開始剤の光切断を介してチイルラジカルが産生され、光によるネットワーク中のチオレン官能化の空間的および時間的制御が達成される。この技術を示すために、蛍光標識システイン含有ペプチドを、透明視フォトリソグラフィパターン形成技術（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ−ｂａｓｅｄ  ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を介してＰＥＧヒドロゲル中でパターン形成した。このチオレン光パターンニング法を後で使用して、空間的活性化クリックカップリング（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｌｉｃｋ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（ＳＰＡＡＣ）を介して架橋したＰＥＧヒドロゲル中にペプチドおよびタンパク質を固定した。ヒドロゲルマトリックス中の特定の位置を光に選択的に暴露することによって、ならびに光強度および暴露時間を制御することによって、空間的および時間的制御を検証した。
【０１２２】
本発明はまた、手術台などの表面として使用するための物体に関し、このような用途においては、ポリマーコーティングが厳密な洗浄中に腐食しないように、非生分解性ポリマーが有利である。非分解性ポリマーの代表的な例としては、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）（「ＥＶＡ」）コポリマー、シリコーンゴム、アクリル系ポリマー（例えば、ポリアクリル酸、ポリメチルアクリル酸、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリメチルメタクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロプレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｌｅｎｅ）、ポリアミド（例えば、ナイロン６，６）、ポリウレタン（例えば、ポリ（エステルウレタン）、ポリ（エーテルウレタン）、ポリ（エステル−尿素）、ポリ（カルボネートウレタン））、ポリエーテル（例えば、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、プルロニックおよびポリ（テトラメチレングリコール））およびビニルポリマー［例えば、ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルアセテートフタレート）］が挙げられる。アニオン性（例えば、アルギン酸塩、カラゲナン、カルボキシメチルセルロースおよびポリ（アクリル酸））またはカチオン性（例えば、キトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミンおよびポリ（アリルアミン））のポリマーを開発することもできる（一般的に、Ｄｕｎｎら、Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．５０：３５３〜３６５、１９９３；Ｃａｓｃｏｎｅら、Ｊ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉ．：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：７７０〜７７４、１９９４；Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１６（１１）：１１６４〜１１６８、１９９３；ＴｈａｃｈａｒｏｄｉおよびＲａｏ、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１２０：１１５〜１１８、１９９５；Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１８：２５７〜２６３、１９９５参照）。
【０１２３】
特に好ましいポリマー担体には、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリウレタン、酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ無水物、ポリ（カプロラクトン）またはポリ（乳酸）とポリエチレングリコールのコポリマー（例えば、ＭｅＰＥＧ）、およびこれらのブレンドが含まれる。
【０１２４】
本発明の特に好ましい実施形態では、第１のポリマー、および／または存在する場合には第１の追加のポリマーおよび／または第２のポリマーおよび／または第２の追加のポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、好ましくはポリエチレングリコールビニル−スルホン、より好ましくはポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を含む。ＰＥＧ系ポリマーコーティングは特に好ましい生分解性特性を有し、当技術分野で既知の技術を用いて合成するのが容易であるので、本発明にとっての極めて優れた材料選択を形成する。
【０１２５】
ＰＥＧポリマーヒドロゲルは、当業者に既知の標準的方法、例えば、化学量論過剰のアルキンを保証するチオール−イン反応によって合成することができる。ゲル化後、光開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９）、硫酸銅、およびアジド標識診断剤または治療剤の溶液をゲルに膨潤することができる。フォトマスクを用いた照射で、Ｃｕ（Ｉ）が照射領域中に産生され、ポリマーネットワーク中のアジド標識診断剤または治療剤と、ペンダントアルキンとの間のｐＣｕＡＡＣ反応を触媒し、最終的にヒドロゲル中に空間的に規定された蛍光パターンを産生する。
【０１２６】
極めて魅力的な実施形態では、材料がポリエチレングリコールアクリレートまたはポリエチレングリコールビニル−スルホンを含む。特に、約３本のアーム〜約８本のアームを有するマルチアームＰＥＧ−ビニルスルホン（−ＶＳ）と約３本のアーム〜約８本のアームを有するマルチアームＰＥＧ−Ｒ−スルフヒドリル（−ＳＨ）（−ＳＨはチオールとしても知られている）（Ｒは、それだけに限らないが、カルボキシレートエステル（エステルとしても知られている）、ラクテートエステル（乳酸エステルとしても知られている）およびイソブチレートエステル（イソ酪酸エステルとしても知られている）を含むエステル結合である）の反応生成物を含む吸収性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）系ヒドロゲル。この吸収性ＰＥＧ系ヒドロゲルは薬物送達の分野で有用であり、ｉｎ  ｓｉｔｕ形成ヒドロゲルがタンパク質を捕捉し、ヒドロゲルが分解するにつれて経時的に剤を放出することができる（以下でさらに詳細に記載）。本明細書に記載される方法を利用して切断部位ペプチドをポリマーコーティングに組み込むことによって、少なくとも第１の剤が限られた数の微生物菌株、種または属からなる群に属する微生物の存在下で放出される、物体をコーティングするのに適したポリマーコーティングを調製することが可能である。
【０１２７】
吸収性ＰＥＧ系ヒドロゲルの架橋密度、分子量および分解速度を増加または減少させるようマルチアームＰＥＧ−ＶＳおよびマルチアームＰＥＧ−ＳＨを、適合させることができる。ＰＥＧアームの数を増加または減少させることによって、架橋密度を変化させることができる。ＰＥＧアームの分子量も変化させることができる。マルチアームＰＥＧの分子量は、ヒドロゲルが分解産物に分解した場合に、分解産物が腎臓によって取り除かれ得るようなものでなければならない。さらに、エステル結合の型を、ヒドロゲルが分解するのにどれくらい時間がかかるかを変化させるよう選択することができる。
【０１２８】
マルチアームＰＥＧ−ＶＳは約３本のアーム〜約８本のアームを有することができる。一実施形態では、マルチアームＰＥＧ−ＶＳが４本のアームを有する。別の実施形態では、マルチアームＰＥＧ−ＶＳが８本のアームを有する。マルチアームＰＥＧ−ＶＳは約１０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有することができる。一実施形態では、マルチアームＰＥＧ−ＶＳが約１０ｋＤａの分子量を有することができる。
【０１２９】
マルチアームＰＥＧ−Ｒ−ＳＨは約３本のアーム〜約８本のアームを有することができ、Ｒはそれだけに限らないが、カルボキシレートエステル、ラクテートエステルおよびイソブチレートエステルを含むエステル結合である。一実施形態では、マルチアームＰＥＧ−Ｒ−ＳＨが４本のアームを有する。マルチアームＰＥＧ−Ｒ−ＳＨは約２０００Ｄａ〜約４０ｋＤａの分子量を有することができる。一実施形態では、マルチアームＰＥＧ−Ｒ−ＳＨが約１０ｋＤａの分子量を有することができる。
【０１３０】
ＰＥＧ系ヒドロゲルは、マルチアームＰＥＧ−ＶＳとマルチアームＰＥＧ−Ｒ−ＳＨのマイケル付加反応によって形成される。マルチアームＰＥＧ−ＶＳおよびマルチアームＰＥＧ−Ｒ−ＳＨをそれぞれ約５％（ｗ／ｖ）〜約４０％（ｗ／ｖ）の濃度で別々の水溶液に溶解する。一実施形態では、マルチアームＰＥＧ−ＶＳおよびマルチアームＰＥＧ−Ｒ−ＳＨをそれぞれ約２０％（ｗ／ｖ）の濃度で別々の水溶液に溶解する。水溶液は、水またはそれだけに限らないがリン酸緩衝生理食塩水、クエン酸塩緩衝液およびホウ酸系緩衝液を含む緩衝水として定義される。緩衝水溶液の場合、ｐＨは約５．５〜約１１．０の範囲にある。一実施形態では、ｐＨが約７．４〜約８．５の範囲にある。
【０１３１】
次いで、別々のマルチアームＰＥＧ−ＶＳ溶液およびマルチアームＰＥＧ−Ｒ−ＳＨ溶液を一緒に混合し、これらが反応して吸収性ＰＥＧ系ヒドロゲルを形成する。マルチアームＰＥＧ−Ｒ−ＳＨ溶液と混合するマルチアームＰＥＧ−ＶＳ溶液の量は、マルチアームＰＥＧ−ＶＳとマルチアームＰＥＧ−Ｒ−ＳＨのモル比が約１：１〜約１：２となるように計算される。一実施形態では、マルチアームＰＥＧ−ＶＳとマルチアームＰＥＧ−Ｒ−ＳＨのモル比が約１：１である。本明細書に記載されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系ヒドロゲルは医療装置の少なくとも一部の形成にも適している。ヒドロゲルを、接着特性を有するように適合させて、これらを植込み型医療装置の分野で有用にすることができる。
【０１３２】
本発明による物体を調製するために使用することができるさらなる反応性ＰＥＧには多官能性活性化合成ポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）があり、これは塩化シアヌルなどの化合物を添加し、次いで、例えば、切断部位を含むリンカーとカップリングすることによって活性化され得る。活性化ＰＥＧの別の形態にＰＥＧ−スクシネート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＳ−ＰＥＧ）がある（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、１９８４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５参照）。ＳＳ−ＰＥＧなどのＰＥＧの活性化形態は、比較的温和な条件下でリンカー（特異的ペプチドリンカー）と反応し、ＰＥＧポリマーコーティングに付着しているペプチドまたは少なくとも第１の剤および／または少なくとも第２の剤の特異的生物活性および特異性を破壊することなく、抱合体を産生する。
【０１３３】
魅力的な実施形態では、物体が好ましくは医療機器、医療用注射針もしくは輸液針、医療用インプラント、または食品接触面からなる群から選択される。本明細書で使用される「インプラント」という用語は、ヒトまたは動物への植込みに適した物体を意味すると理解される。前記物体は固体であり得、固体は覆われる表面を示す任意の物体を意味すると理解され、例えば、物体は開いた側面、多孔質側面を含んでもよいし、または本質的に無孔でもよい。
【０１３４】
本発明は、医療用インプラント、すなわち、侵襲性外科手術中に患者の体内に植え込まれることを意図した物体の場合に特に適用可能である。患者は、適切にインプラントを受容するヒトまたは任意の動物対象であり得る。医療用インプラントの例としては、それだけに限らないが、心血管装置（例えば、植込み型静脈カテーテル、静脈ポート、トンネル静脈カテーテル、慢性輸液ラインまたはポート（総肝動脈輸液カテーテル、ペースメーカーおよび植込み型除細動器を含む））、神経性／神経外科装置（例えば、脳室腹膜シャント、脳室心房シャント、神経刺激装置、硬膜パッチおよび椎弓切除後硬膜外線維症を予防するためのインプラント、連続くも膜下輸液のための装置）；胃腸装置（例えば、慢性留置カテーテル、栄養管、門脈体循環シャント、腹水用シャント、薬物送達用腹膜インプラント、腹膜透析カテーテル、および外科手術癒着を防止するための固体インプラント）；尿生殖器装置（例えば、子宮内避妊器具（ＩＵＤ）を含む子宮インプラントおよび子宮内膜増殖症を予防するための装置、可逆不妊化装置を含む卵管インプラント、卵管ステント、人工括約筋および失禁用尿道周囲インプラント、尿管ステント、慢性留置カテーテル、膀胱拡大、または精管吻合術用のラップもしくはスプリント、中心静脈カテーテル、尿路カテーテル）；人工弁人工血管、眼科用インプラント（例えば、マルチノ（ｍｕｌｔｉｎｏ）インプラントおよび血管新生緑内障用の他のインプラント、翼状片用の薬剤溶出コンタクトレンズ、失敗した涙嚢鼻腔吻合術用のスプリント、角膜血管新生用の薬剤溶出コンタクトレンズ、糖尿病網膜症用のインプラント、高リスク角膜移植用の薬剤溶出コンタクトレンズ）；耳鼻咽喉科学装置（例えば、小骨インプラント、耳管スプリント、または経鼓膜ドレーン（ｔｒａｎｓｔｅｍｐａｎｉｃ  ｄｒａｉｎ）の代替としての膠耳もしくは慢性耳炎用ステント）；形成外科インプラント（例えば、乳房インプラントまたはあごインプラント）、カテーテルカフスならびに整形外科インプラント（例えば、セメント整形外科装具）が挙げられる。魅力的な実施形態では、インプラントがｋワイヤである。
【０１３５】
本発明はまた、主要な第１の機能が食品包装または無菌商品包装からなる群から選択される物体に関する。このような実施形態では、主要な第１の機能が例えば、ポリエチレンの食品容器である一方で、第２の補助機能がポリマーコーティング、例えば、容器のポリエチレングリコールからの剤の放出であり、前記ポリエチレングリコールコーティングが、微生物に特異的な化合物による切断部位の切断で、第１の剤および場合により第１の追加の剤が放出されるように、切断部位と、第１の剤および場合により第１の追加の剤とを含む。第１の剤が診断分子、例えば、フルオレセインであり、かつ第１の追加の剤が治療剤、例えば、抗生物質である例では、食品包装にＵＶ光を照射することにより、場合により抗生物質の微生物誘導放出と同時に、微生物を検出することが可能になる。そのため、抗生物質の放出は、食品包装の表面上の微生物を死滅させるはずである。
【０１３６】
本発明はまた、食品接触面からなる群から選択される物体に関する。このような実施形態では、主要な第１の機能が例えば、パン用オーブン中の生地またはパンを保持することである一方で、第２の補助機能がポリマーコーティング、例えば、前記表面のポリエチレングリコールからの剤の放出であり、ポリマーが、微生物に特異的な化合物による切断部位の切断で、第１の剤および第１の追加の剤が放出されるように、切断部位と、第１の剤および第１の追加の剤とを含む。第１の剤が診断分子、例えば、フルオレセインであり、かつ第１の追加の剤が治療剤、例えば、抗生物質である例では、食品包装にＵＶ光を照射することにより、抗生物質の微生物誘導放出と同時に、微生物を検出することが可能になる。そのため、抗生物質の放出は、パン用オーブンの表面上の微生物を死滅させるはずである。
【０１３７】
対象となるいずれの物体もコーティングすることができる。無菌のままであることを意図した物体、特にその表面を本発明の材料でコーティングすることができる。例えば、本発明による材料（材料は材料からの放出で発光する光子放出剤を組み込んでいる）でコーティングされた物体が特異的微生物で汚染されると、本発明の材料が光子放出剤を放出し、その結果として材料から光が放たれる。物体の汚染は適切な検出器を用いて観察可能である。
【０１３８】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明による物体からの光子放出を感知する方法であって、第１の剤および／または存在する場合には第２の剤が光子放出剤を含み、物体に、コーティングから放出されると剤からの光子放出を誘導することができる光を照射するステップと、前記光子放出を登録するステップとを含む方法に関する。このような実施形態では、例えば、手術台、適用可能な場合には、物体が植え込まれた患者も、ポリマーコーティング中の切断部位に特異的な化合物を産生する微生物菌株、種または属の存在によりＵＶ活性色素がポリマーコーティングから放出されたら前記色素を明るくするような、携帯型ＵＶ光の使用によって微生物の存在について容易に検査することができる。
【０１３９】
別の実施形態では、本発明は、観察される光子放出が、それぞれ第１または第２の群に属する微生物菌株、種または属の存在について示している方法に関する。光子放出の存在は、全て第１の切断部位を切断するための同じ化合物を産生する第１の群の微生物菌株、種または属の微生物菌株、種または属の存在を示していると理解され得る。
【０１４０】
本発明による方法のさらなる利点は、医療装置を植え込むための外科手術後の患者を監視することにある。例えば、位相性眼内レンズ植込み後、レンズから放出された蛍光について監視することによって、感染症を容易に検出することができる。
【０１４１】
光子放出剤の使用により、柔軟かつ直接的なイメージング方法論がもたらされる。光子放出剤は、適切な光源による励起およびＣＣＤカメラまたは他の光学検出器による放出光子の捕捉によって可視化され得る。蛍光イメージングでは、一般的に、光子と組織の相互作用を特徴付けるために使用する３つのパラメータ：光吸収、光散乱および蛍光発光が存在する。光学イメージングにおける最も重要な考慮事項の１つが、組織侵入深さを最大化することである。光の吸収および散乱は、主として励起源の波長の関数である。光は、ヘモグロビン、メラニンおよび脂質を含む、生体組織中に見られる内因性発色団によって吸収される。一般に、光吸収および散乱は、波長増加と共に減少する。特に、組織の吸収係数は、近赤外（ＮＩＲ）領域（７００〜１０００ｎｍ）ではかなり低いので、ＮＩＲの光は数センチメートルの深さまでより深く侵入することができる。ＮＩＲでの放出を有する剤は、自己蛍光を妨げることによって干渉されないので、最高のシグナル対背景をもたらす傾向がある。このような剤は、例えば、それだけに限らないが、ＩＲＤＹＥ８００などの近赤外蛍光剤である。
【０１４２】
別の実施形態では、本発明は、物体を有する患者の微生物感染症の存在を感知する方法であって、前記患者由来の流体試料中の放出された第１の剤またはコーティング中に存在する場合には放出された第１の追加の剤、第２の剤または第２の追加の剤の存在を検出するステップを含む方法に関する。そのため、物体または生きている患者を照射するのとは別に、本発明のこの実施形態によって、患者中の植え込まれた物体を囲む組織領域の流体の試料の分析に基づいて特異的微生物感染症を診断する単純な方法が可能になる。多種多様な診断剤および適切な検出器を本出願の他で記載されるように使用することができる。
【０１４３】
本発明はさらに、本発明による物体が植え込まれた患者の微生物感染症の存在を感知する方法であって、前記患者由来の流体試料中の放出された第１剤、第１の追加の剤または第２の剤の存在を検出するステップを含む方法に関する。剤が対応する切断部位の切断でポリマーコーティングから放出されると、患者の体液の試料中の前記剤の存在が対応する微生物感染症を示している。
【０１４４】
本発明のさらに別の実施形態では、本発明は、本発明によるコーティングされた物体を製造する方法であって、ａ）物体を第１の切断部位と第１の剤および場合により第１の追加の剤とを含むポリマー、ならびに存在する場合には第２の切断部位と第２の剤および場合により第２の追加の剤とを含むポリマーの溶液に浸漬コーティングするステップと、ｂ）浸漬した物体を乾燥させるステップとを含む方法に関する。
【０１４５】
本発明による物体は、浸漬コーティング、スプレーコーティング、スピンコーティングまたは溶液流延などの技術を用いて前記ポリマーでコーティングされ得る。分子の生体材料表面上へのケミカルグラフティングを伴うコーティング技術も利用可能である。自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）、表面テザリングポリマー（ｓｕｒｆａｃｅ−ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）（ポリマーブラシ）に基づくナノ薄コーティング、または交互積層に基づく多層コーティングは、化学基の位置および配向の正確な制御をもたらし、コーティング表面上の生体分子は、種々の理由で種々のコーティングを矯正部品および他の医療装置に適用することが当技術分野で一般的に知られている。Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｒ．（編）、第９章、「Ｃｏａｔｉｎｇｓ」２００３を参照されたい。
【０１４６】
ポリマーコーティングは、少なくとも主要な機能を提供する手段の表面積に関して部分的であっても完全であってもよい。
【０１４７】
さらに、ＩｎｎｏＣｏｒｅによって開発された技術（ｗｗｗ．ｉｎｎｏｃｏｒｅ．ｎｌ）が本発明によるポリマーコーティングに適している。例えば、ＤＬ−ラクチド、グリコリド、ε−カプロラクトンおよびポリエチレングリコールを含む組成物は、ヒトインビボ用途について承認されている生物学的に安全なモノマーであり、既に多数の市販の生物医学的インプラントおよび医薬徐放製剤に使用されている。このような薬剤溶出コーティングを、種々の型の薬物分子の制御送達および局所送達のために多種多様な生物医学的インプラント装置に適用することができる。典型的な用途には、冠動脈ステントおよび他の血管装置、整形外科装具および泌尿器インプラントが含まれる。
【０１４８】
コーティングに対する試験は、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｓｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｆｏｒｍｓ  ｆｏｒ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ＡＳＴＭＦ１６３５〜１１にしたがって行うことができる。
【０１４９】
本発明はまた、ａ）第１の切断部位を含む１種または複数のポリマーと、ｂ）限られた数の微生物菌株、種または属からなる第１の群に属する微生物によって特異的に提供される第１の化合物によって切断されるが、前記第１の群に属さない微生物によって提供される化合物によって切断されない、前記第１の切断部位の切断で前記コーティングから放出可能な第１の剤とを含み、前記第１の切断部位の切断がコーティングからの前記第１の剤の放出をもたらし、前記第１の剤の放出が前記第１の群に属する微生物の存在を示しているポリマーコーティングに関する。
【０１５０】
上に論じられるように、第１の剤、第１の追加の剤および／または第２の剤を、本発明のポリマーコーティングと共有結合することができる、または本発明のポリマーコーティング中に非共有結合様式で結合することができる。両方の場合で、微生物によって誘導されるポリマーコーティングの特異的切断によって放出がもたらされる。第１の剤、第１の追加の剤および／または第２の剤を、例えば、ポリマーコーティングに埋め込むことができ、前記ポリマーコーティングはウェブ型構造を有すると言うことができる。前記ウェブ型構造は、微生物に特異的な化合物、例えば、酵素、例えば、ソルターゼに基づいて、前記の特異的切断部位によって識別することができる。
【０１５１】
本発明はまた、微生物感染症、特にバイオフィルム関連感染症を監視および／または治療する、本発明による物体の使用に関する。感染症、特にバイオフィルム関連感染症の存在および／または発達を監視することができる。微生物のバイオフィルムは、本発明による物体の表面上に形成され得る。そのため、物体のポリマーコートからの剤の放出は、このようなバイオフィルムの存在を示しており、例えば、手術面、または照射がインプラントを有している患者の外面上でおよびｉｎ  ｓｉｔｕ発光の検出によって行われ得るインプラントなどの物体の照射によって決定され得る。
【０１５２】
本発明はまた、感染症、特にバイオフィルム関連感染症の存在および／または発達を監視するための監視ならびに／あるいはその治療のための物体、特に植込み型装置をコーティングするのに適した本発明によるポリマーコーティングの使用に関する。本発明によるポリマーコーティングは、前記ポリマーが特定の微生物または微生物の群の存在を示している特定の剤を放出するので、バイオフィルム関連発明を監視およびまたは治療するのに理想的に適している。そのため、コーティングの適用は、物体を特定の微生物感染症の検出に極めて適したものにする。
【０１５３】
本発明を以下の非限定的な例および図面によって示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】剤がリンカー分子を介してポリマーマトリックスと共有結合している本発明によるコーティングの模式図である。
【図２】剤が埋め込まれているポリマーウェブを有する本発明によるコーティングの模式図である。
【図３】本発明によるポリマーコーティングでコーティングされた物体の模式図である。
【図４】ポリマーコーティング中の切断部位に特異的な化合物を産生する特定の微生物の存在下での図３の物体の模式図である。
【図５】照射時の図４の物体の模式図である。
【図６】創傷を閉じる前の、ヒト足首に植え込まれた本発明によるポリマーコーティングでコーティングされた整形外科プレートの写真である。
【図７】外部光源による照射時の閉じた後の図６のインプラントの蛍光画像である。
【図８】ヒト足首に皮下に植え込まれた本発明によるポリマーコーティングでコーティングされた留置カテーテルの写真である。
【図９】外部光源による照射時の図８のインプラントの蛍光画像である。
【図１０】共にコーティングされかつヒト足首に植え込まれた整形外科プレートおよびカテーテル（対照インプラント）の写真である。
【図１１】外部光源による照射時の図１０のインプラントの蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【０１５５】
図１では、ポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）が実線１１によって描かれている。点線で描かれているリンカー分子、例えば、オリゴペプチドはポリマーと共有結合している。リンカー分子は、１種または複数の微生物によって提供される１種または複数の化合物によって切断可能な切断部位を含む。前記リンカー１２は、例えば、細菌の群の細菌によって産生および排出されるプロテアーゼによって認識可能な、分子構造の特異的部分を含むアミノ酸モチーフであり得る。リンカーは、第１の剤１３、例えば、光子放出剤などの診断剤、または抗生物質などの治療剤と共有結合している。
【０１５６】
図２では、ウェブ構造を有するポリマーコーティング２１が示されている。ウェブ中に、診断剤または治療剤などの剤２３が捕捉されている。剤はポリマーコーティング中に非共有結合的に結合している。ウェブ構造は、特異的微生物によって切断可能な特異的プロテアーゼ切断部位を含む。切断により、ポリマーコーティング２１から剤２３の放出がもたらされる。
【０１５７】
図３では、植込み型物体または手術面などの物体３１の表面部分が、第１の剤３３（円形）および第２の剤３４（正方形）を含む本発明のポリマーコーティング３２の層でコーティングされている。第１の剤と第２の剤の両方が、好ましくは互いに異なる、すなわち、放出時に異なるシグナルを与える診断剤、またはそれ応じて共に治療剤であり得る。第１の剤が診断剤であり、かつ第２の剤が治療剤であることも可能であり、逆もまた同じである。第１の剤と第２の剤の両方が、図２に示されるようにポリマーに埋め込まれていてもよいし、またはリンカー分子を介してポリマーに共有結合していてもよい。第１の剤および第２の剤が共にコーティングからのその放出時にシグナル伝達において異なる診断剤である場合、これらの剤を異なるリンカー分子を介してポリマーと共有結合させることが好ましい。その場合、第１の剤は第１のリンカーを介してポリマーに連結しており、第２の剤は第２のリンカ−を介して連結している。第１のリンカーは、第２のリンカー上に存在する第２の切断部位と異なる第１の切断部位を有する。第１のリンカーおよび第２のリンカーの第１の切断部位および第２の切断部位はそれぞれ、異なる微生物、すなわち、本明細書で定義される２種の異なる群に属する微生物がそれぞれ第１または第２の切断部位のいずれかを切断することができるように、好ましくは互いに異なる。第１の剤の放出は第１の群に属する微生物の存在を示しており、かつ第２の剤の放出は第２の群の微生物の存在を示している。第１および第２の剤について、規定される波長の光による励起で異なる色を有する化学発光剤などの異なる診断剤を用いることによって、色の差で第１または第２の群に属する微生物の存在が判別可能となる。
【０１５８】
図４では、図３のような物体が、病原菌などの微生物４１に感染している。この場合、円形は第１の剤（円形）を表し、診断剤であり得、正方形は第１の追加の剤または第２の剤を表し、好ましくは前記微生物に対する抗生物質などの治療剤である。第１の剤と第２の剤の両方が、同じリンカー分子、すなわち、同じ切断部位を有するものを介してコーティングのポリマーに結合している。第１の剤と第１の追加の剤の両方が、両剤が微生物４１（雲形）の化合物４２（星形）による単一切断で放出されるように、まさに同じ第１の単一リンカー分子と連結するよう選択され得る。各リンカー分子が第１の剤または第１の追加の剤のいずれかとだけ結合しており、かつこれらの異なって結合したリンカーの混合物がコーティングのポリマーと結合しているように配置することもできる。両方の場合で、第１の剤と第１の追加の剤の両方が同じ化合物４２による切断によって放出される。切断により、第１の（例えば、診断）剤３３および第１の追加の（例えば、治療）剤３４の放出がもたらされる。診断剤の放出によって感染時に感染性微生物を容易に検出することができる一方で、治療剤の放出によって同時に感染症に対抗する。
【０１５９】
物体を最初に第１の剤を含む第１のポリマーコーティングで、引き続いて第１のコーティング上を第２のコーティングでコーティングするよう選択することもでき、第２のコーティングは第２の剤または第１の追加の剤（またはこれらの組み合わせ）を含む。この配置では、微生物による感染症が最初に第２のコーティングに到達し、第２の剤、例えば、診断剤を放出する。感染症が継続する場合、感染症は第１のコーティングに到達し、放出される抗生物質などの治療剤などの第１の剤がもたらされる。
【０１６０】
図５では、図４の感染した物体に外部光５１が照射されている。放出された第１の（診断）剤（円形）が外部光５１によって活性化され、外部光５１の波長と異なる波長の光５２を励起する。前記放出光５２は、例えば、近赤外光（ＮＩＲＦ）であり得る。照射により感染症が目に見えるようになる一方で、放出された第１の追加の剤（抗生物質）は既に病原菌を排除するよう作用している。
【０１６１】
図６では、本発明のコーティングでコーティングされた金属製整形外科装置が、創傷を閉じる直前にヒト足首の骨上に固定されて示されている。
【０１６２】
図９は、微生物による感染および外部光源による照射後の図６のインプラントの部位においてＩＶＩＳ（インビボイメージングステーション）カメラで撮影した画像を示している。さらなる詳細については、実施例８を参照されたい。放出光は微生物感染症の存在を示している。
【０１６３】
図８は、ヒト足首に皮下に配置された留置カテーテルを示している。
【０１６４】
図９は、実施例８による感染および外部光源による照射後の図８のインプラントの部位においてＩＶＩＳカメラで撮影した蛍光画像を示している。放出光は微生物感染症の存在を示している。
【０１６５】
図１０は、創傷を閉じた後のヒト足首に植え込まれた整形外科プレートおよびカテーテルの写真を示している。
【０１６６】
図９は、照射後の図８の対照インプラントの部位においてＩＶＩＳカメラで撮影した蛍光画像を示している。発せられたシグナルの欠如は、感染因子の欠如を示している。
【実施例】
【０１６７】
［実施例１］
ポリマーコーティングの調製
ａ）ポリマーの合成
ＰＥＧ（４０００）またはＰＥＧ（８０００）、および塩化アクリロイルを用いてポリマーＰＥＧＤＡを合成した（ＨｅｒｎおよびＨｕｂｂｅｌｌ、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．３９（２）：２６６〜２７６）。
【０１６８】
ｂ）リンカーの合成
ＦＭＯＣ固相ペプチド化学（Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）、ＣｈａｎおよびＷｈｉｔｅ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）を用いて、２種のペプチドリンカーを作成した。
ｉ）ＣＧＧＧＬＰＥＴＧＧＳＧＧＫ（配列番号１５）は、黄色ブドウ球菌のソルターゼＡによって切断される第１の切断部位、ＬＰＴＥＧを含有している。
ｉｉ）ＣＧＧＧＡＡＦＧＧＳＧＧＫ（配列番号１５）は、緑膿菌のセラリシンによって切断可能な第２の切断部位、ＡＡＦを含有している。
【０１６９】
標準的な条件（トリフルオロ酢酸、９５％）を用いて、ペプチドを樹脂から切断した。逆相高速液体クロマトグラフィーによってペプチドを精製（＞９７％純度）した。液体クロマトグラフィー−質量分析によってペプチド構造を確認することができる。
【０１７０】
ｃ）第１の剤および第１の追加の剤、バンコマイシンと共有結合したＩＲＤｙｅ８００の合成
ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷで標識したバンコマイシンは、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ  ＮＥ、米国）によって提供された。適合させた文献手順によって、バンコマイシン−ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（バンコ−８００ＣＷ）を合成した。塩酸バンコマイシン水和物（３．０ｍｇ、２．０μｍｏｌ）を、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ−ＮＨＳエステル（１．０ｍｇ、０．８６μｍｏｌ）およびＮ，Ｎジイソプロピルエチルアミン（２．０μＬ、１１μｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（２００μＬ）中溶液に添加した。周囲温度で一晩の反応後、得られたバイオコンジュゲート（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を逆相ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥すると緑色蛍光固体（１．０ｍｇ、４８％）が得られた。ＨＰＬＣ検出の限界内で、最終生成物は非抱合色素（７８０ｎｍで検出）も非標識バンコマイシン（２８０ｎｍで検出）も含有していなかった。ＵＶ／Ｖｉｓ（メタノール）λｍａｘ＝７７８ｎｍ；低分解能質量分析（ＥＳ／ギ酸アンモニウム）、ｍ／ｚ計算値２４３０．７［Ｍ−Ｈ］−、実測値８１０．６［Ｍ−３Ｈ］３−。
【０１７１】
ｄ）抱合体合成：第１の切断部位を有する第１のリンカー−第１の剤および第１の追加の剤
ｉ）上で調製した（ステップ（ｂ）（ｉ））ペプチドリンカーの１ｇバッチを、文献手順（Ｔｉｙａｎｏｎｔ，Ｋら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国  ２００６、１０３、１１０３３〜１１０３８）を用いて、第１の剤、ＩＲｄｙｅ  ８００ＣＷ  ＮＨＳエステル（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ  ＮＥ、米国））でリジン（Ｋ）側鎖上で標識した。
ｉｉ）上で調製した（ステップ（ｂ）（ｉ））ペプチドリンカーの第２の１ｇバッチを、標準的なカップリング法（Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）、ＣｈａｎおよびＷｈｉｔｅ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）を用いて、第１の追加の剤、バンコマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって供給されたものとして使用）でセリン（Ｓ）側鎖上で標識した。
ｉｉｉ）上で調製した（ステップ（ｂ）（ｉ））ペプチドリンカーの第３の１ｇバッチを、第１の剤、ＩＲＤｙｅ８００と第１の追加の剤、バンコマイシンの両方で標識した。
ｉｖ）上で調製した（ステップ（ｂ）（ｉ））ペプチドリンカーの第４の１ｇバッチを、ステップ（ｃ）の生成物、ＩＲＤｙｅ８００−バンコマイシン共有結合抱合体で標識した。
【０１７２】
ｅ）ポリマー−リンカー抱合体の合成
ペプチドリンカー（２ｍＭ）をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中ＰＥＧＤＡ（８ｍＭ〜１００ｍＭ）に添加し、４時間〜一晩攪拌することによって、ステップ（ｄ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において上で調製した３種のペプチドリンカーをそれぞれステップ（ａ）で合成したＰＥＧＤＡポリマーと共有結合した。エルマン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）を用いて、アクリレート基の、システイン上のスルフヒドリル基へのミカエル付加（Ｈｅｇｇｌｉら（２００３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１４：９６７〜９７３）を確認し、それによって遊離スルフヒドリル基の還元を定量化した（Ｅｌｌｍａｎ（１９５９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８２：７０〜７７）。次いで、３７℃で過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、２０ｍＭ）およびＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、５１．６ｍＭ）を用いて溶液を重合した。これらのカップリング反応の生成物を表１に要約する。
【０１７３】
【表１】
0006359559.tif 000002
【０１７４】
ｆ）第２の切断部位を含むリンカー−第２の剤の抱合体合成
上で調製した（ステップ（ｂ）（ｉｉ））ペプチドリンカーの１ｇバッチを、表２に示すように文献手順（Ｖｉｌｌａｒａｚａ，Ａ．ら  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２０１０、２１（１２）２３０５〜２３１２頁）を用いて、第２の剤、インドシアニングリーン（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ  ＮＥ、米国））でセリン（Ｓ）側鎖上で標識した。
【０１７５】
【表２】
0006359559.tif 000003
【０１７６】
ｇ）ポリマーコーティングの調製
ステップ（ｅ）の生成物を用いて、異なる割合の抱合体１ｅ（ｉ）〜（ｉｘ）および１ｆを互いに単純に混合することによっていくつかの異なるポリマーコーティングを調製した。
【０１７７】
第１の切断部位および第１の剤（１ｅ（ｉ））を含むポリマーと、第１の切断部位および第１の追加の剤（１ｅ（ｉｉ））を含むポリマーとを含有するポリマーコーティング（１ｇ（ｉ））を調製した。そのため、このようにして、第１の剤（ＩＲＤｙｅ８００）および第１の追加の剤（バンコマイシン）が等しいまたは異なる割合で存在することができ、例えば、前記コーティングを５０％ＩＲＤｙｅおよび５０％バンコマイシンを用いて調製した。
【０１７８】
さらに、抱合体１ｅ（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかを抱合体１ｅ（ｖｉ）〜（ｉｘ）のいずれかと混合することができる。このようにして、第１の剤（ＩＲＤｙｅ８００）を含む５０％の第１のポリマー（ＰＥＧＤＡ４０００）（抱合体１ｅ（ｉ））を含むポリマーコーティング（１ｇ（ｉｉ））を、第１の追加の剤（バンコマイシン）を含む５０％の第２のポリマー（ＰＥＧＤＡ８０００）（抱合体１ｅ（ｖｉｉ））と混合した。そのため、得られたポリマーコーティングは、２種のポリマーから作成したコーティングのレオロジー特性が最適化され得るように２種のＰＥＧＤＡポリマーを含有するという利点を有していた。
【０１７９】
さらなる例として、５０％の抱合体１ｅ（ｉ）および５０％の１ｆを含有するポリマーコーティング（１ｇ（ｉｉｉ））を調製した。このポリマーコーティングは、黄色ブドウ球菌の存在下でＩＲＤｙｅ８００が放出され得るように、黄色ブドウ球菌のソルターゼＡによって切断可能な第１の切断部位、ＬＰＥＴＧ（配列番号５）、および緑膿菌の存在下でインドシアニングリーンが放出され得るように、緑膿菌のセラリシンによって切断可能な第２の切断部位ＡＡＦを含有していた。このようにして、コーティング１ｆ（ｖ）は、２種の特異的微生物、すなわち、黄色ブドウ球菌および緑膿菌の存在を検出することができる。
【０１８０】
抱合体１ｅ（ｉｖ）および１ｅ（ｉｘ）により、第１の剤および第１の追加の剤が互いに共有結合しているポリマーコーティングの調製が可能になる。そのため、このようなコーティングでは、第１の切断部位が微生物に特異的な化合物によって切断されると、第１の剤および第１の追加の剤が正確に同じ位置でポリマーコーティングから放出される。
【０１８１】
引き続く様式で、異なるコーティングを物体にコーティングして、上に説明される異なるコーティング層を得ることもできる。
【０１８２】
［実施例２］
ポリマーウェブに埋め込まれた剤を含むコーティング
ａ）リンカーの合成
リンカーがポリマーマトリックス自体に組み込まれているポリマーコーティングを合成するために、実施例１に使用したのと異なるリンカーが必要である。
【０１８３】
Ｖａｎ  Ｄｉｊｋら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１０、１１、１６０８〜１６１４に記載されている修飾アミノ酸構築ブロック（Ｎ３）およびＫ（Ｎ３）を用いて、上記のＦｍｏｃ固相ペプチド合成を用いて、リンカー（Ｎ３）ＧＧＧＬＰＥＴＧＧＳＧＧＫ（Ｎ３）を合成した。
【０１８４】
ｂ）ポリマー−リンカー−ポリマーマトリックスの調製
切断部位を含むリンカーがヒドロゲルマトリックス自体に組み込まれているポリマーマトリックスを、ｖａｎ  Ｄｉｊｋの方法、すなわち、実施例２ステップ（ａ）において上で調製した切断部位含有ビス−アジドペプチドリンカーと、星型アルキン誘導体化ＰＥＧ部分との間のＣｕ（Ｉ）触媒１，３−双極子環化付加反応によって合成した（Ｖａｎ  Ｄｉｊｋら、上記）。ペプチドリンカーは、黄色ブドウ球菌のソルターゼＡによって切断されるＬＰＥＴＧ（配列番号５）切断部位を含有している。
【０１８５】
ｃ）第１の剤および第１の追加の剤のポリマーマトリックスへの組込み
ｉ）第１の剤（ＩＲＤｙｅ８００）および第１の追加の剤（バンコマイシン）、または実施例１ステップ（ｃ）で調製した第１の剤−第１の追加の剤抱合体を、ポリマーマトリックスの溶液に浸漬することによってヒドロゲルマトリックスに非共有結合的に組み込んだ。これらの反応の生成物を表３に要約する。表３に記載される生成物を使用してポリマーコーティングを調製することができ、そのため、第１の剤または第１の追加の剤はＬＰＥＴＧ（配列番号５）モチーフに特異的なソルターゼＡがポリマーマトリックス自体に存在する切断部位を切断すると、ポリマーコーティングから放出される。
【０１８６】
【表３】
0006359559.tif 000004
【０１８７】
［実施例３］
コーティング整形外科プレート（図３）の調製
整形外科プレート、ネジおよびカテーテルを、ステップ（ｇ）による組成物を含むポリマーコーティングでコーティングした。例えば、ポリマーコーティング１ｇ（ｉ）を連続プロセスで整形外科プレート、ネジおよびカテーテル上にコーティングした。
【０１８８】
最初に、実施例１ｇ（ｉ）で調製したポリマーの溶液を、ポリマーコーティングを水に溶解することによって作成し、次いで、プレートおよびカテーテルをポリマーコーティングの溶液に１〜２ｍ／秒の速度で通して約１００℃で長さおよそ１ｍの赤外線乾燥オーブンに引き入れた。物体を完全に覆い、実質的に均一なコーティングの塗布を示した。このプロセスを、米国特許第７４４２２０５号明細書、Ｓｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｓｔｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｒｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｌａｙｅｒｓ  ｔｈｅｒｅｏｎの標準的手順にしたがって行った。
【０１８９】
［実施例４］
コーティング手術面の調製
コーティング１ｆ（ｉ）〜（ｉｖ）および２ｃ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を手術台上にスプレーコーティングした。手段で、手術台をコーティング２ｃ（ｉ）でスプレーコーティングした。手短に言えば、この方法は以下のステップを含んでいた：（ａ）コーティングする医療装置の表面を接地するステップ、（ｂ）溶媒としてクロロホルムをさらに含んでいたコーティング２ｃ（ｉ）を、（１）コーティング２ｃ（ｉ）を分配するための少なくとも１個の開口部に接続したチャンバを含むノズル装置を用意する；（２）コーティングをチャンバに入れる；（３）コーティング配合物を電気的に帯電させる；（４）電気的に帯電したコーティング配合物の液滴を作成する；および（５）コーティング配合物の液滴を接地面上に堆積させて面上にコーティングを形成することによって塗布するステップ。
【０１９０】
［実施例５］
黄色ブドウ球菌の培養
黄色ブドウ球菌の臨床分離株を、一般外科病棟に入院している患者からの同意により得た。臨床分離株の培養物を作成した。分離株の１０ｍＬ懸濁液を、５×１０８個細胞／ｍｌ培養液の細胞密度で調製した。
【０１９１】
［実施例６］
植え込む物体の調製
ａ）陽性対照
実施例３で調製した整形外科プレート、ネジおよびカテーテルを、実施例５で調製した分離株懸濁液１０ｍＬ中で３０分間インキュベートした。
ｂ）陰性対照
ｉ）黄色ブドウ球菌の欠如
整形外科プレート１つ、ネジ２つおよびカテーテル１つを、実施例３にしたがって調製した。コーティングした物体をＮａＣｌ０．９％（ｗ／ｖ）の溶液１０ｍＬ中で３０分間インキュベートした。調製した物体の概要を表４に示す。
【０１９２】
【表４】
0006359559.tif 000005
【０１９３】
［実施例７］
コーティングインプラントの植込み
図６および図８はそれぞれ、ヒト足首に植え込まれた、ネジを含む整形外科プレート、および実施例６（ａ）によるポリマーコーティングでコーティングしたカテーテルの写真を示している。図１０は、インプラント創傷を閉じた後の、ヒト足首に植え込まれた実施例６（ｂ）によるポリマーコーティングでコーティングした整形外科プレート、ネジおよびカテーテルの写真を示している。
【０１９４】
実施例６（ａ）および（ｂ）でコーティングした物体を植え込むための手順は以下の通り行った：
整形外科プレート、ネジおよびカテーテルをヒト屍体の足首に植え込んだ。屍体への植込みを使用して前記物体の生きている患者への植込みをシミュレートした。各インキュベートプレートを、標準的外科手順にしたがって、それぞれインキュベートしたネジを用いて腓骨に取り付けた。
【０１９５】
各インキュベートカテーテルを、足の側部に皮下挿入した。
【０１９６】
［実施例８］
整形外科インプラント上の感染の存在の決定
実施例６により植え込んだ物体のイメージングを、術中臨床マルチスペクトル蛍光カメラ（Ｔ３−イメージングシステム、ＳｕｒｇＯｐｔｉｘ  ＢＶ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、オランダ）およびＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（励起：７１０ｎｍ、発光：８００ｎｍ、取得時間５秒、ビニング４、Ｆ−ｓｔｏｐ２、ＦＯＶ２１．２）を用いて植込みの２４時間後に行った。
【０１９７】
ＩＶＩＳ  ＳｐｅｃｔｒｕｍおよびＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩから得た結果を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．２（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬＳ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ  ＭＡ、米国）で分析した。最適検出限界を、陽性シグナルが陰性対照から楽々と識別される最低シグナルに設定した。関心領域（ＲＯＩ）を引き出し、これらの領域中の平均カウントを測定することによってシグナル強度を決定した。背景シグナルを対象となるシグナルから引くことによって、シグナルを背景について補正し、正味カウントと本文で呼んだ。１×１０５±４．２×１０４カウント；ｐ＝０．００７の強い近赤外シグナルは、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷに起因するものであった。
【０１９８】
図７に見られるように、コーティング整形外科プレートおよびネジは、黄色ブドウ球菌の存在下で、背景シグナルとは異なる検出可能なシグナルを発した（図７の白色領域）。図９は、マルチ蛍光カメラを用いて撮影した、黄色ブドウ球菌に感染した場合の皮下植込みカテーテルの画像を示している。
【０１９９】
図７および図９に記録されたシグナルは、インプラント上または近くの黄色ブドウ球菌の存在を示している。黄色ブドウ球菌はソルターゼＡを提供し、これはポリマーコーティング中のペプチドリンカーに含有されるＬＰＥＴＧ（配列番号５）モチーフに特異的な化合物である。上記のように、リンカーはソルターゼＡ化合物によって切断されたので、ＩＲＤｙｅ８００がポリマーコーティングから放出された。その後、赤外線による放出ＩＲＤｙｅ８００の照射によって、色素からの光子放出が誘導され、これが検出器によって記録され、図９において白点として見られる。
【０２００】
図１１は、マルチスペクトル蛍光カメラで撮影した、実施例６（ｂ）により調製した対照整形外科プレート、ネジおよびカテーテルの画像を示している。画像中に目に見える強い白点は存在しないので、コーティングは検出可能なシグナルを発しおらず、ＩＲＤｙｅ８００がまだポリマーコーティングに結合しているので、黄色ブドウ球菌が存在していることを示している。
【０２０１】
［実施例９］
植え込まれた物体上の微生物の存在の検出
実施例３により調製したポリマー抱合体１ｅ（ｉｖ）から作成したポリマーコーティングを含むインプラントを、免疫適格マウス（合計３匹）の後肢に植え込んだ。３匹の対照マウスは、近赤外色素を欠くポリマー抱合体１ｅ（ｉｉ）で覆われたインプラントを受け入れた。
【０２０２】
その後、６匹のマウスに黄色ブドウ球菌菌株Ｘｅｎ２９、黄色ブドウ球菌の存在下でポリマーコーティングから放出されるルシフェラーゼ生物発光およびＩＲＤｙｅ８００−バンコマイシン由来の蛍光シグナルの同時イメージングによる生菌の位置特定を容易にするルシフェラーゼを産生する黄色ブドウ球菌の標準的な操作菌株の接種材料を注射した。
【０２０３】
黄色ブドウ球菌（Ｘｅｎ２９）接種の３日後、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩイメージングシステムを用いて生物発光と蛍光イメージングの両方を行った。ＩＲＤｙｅ８００−バンコマイシンに起因する強い近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）シグナルは、生物発光シグナルと共局在しているように見えた（すなわち、３．７×１０５±９．８×１０４カウントの強度）。ＩＲＤｙｅ８００を欠くポリマーでコーティングしたインプラントを受け入れた感染マウスではＮＩＲＦシグナルが観察されなかった。
【０２０４】
インプラントを囲む組織を取り出し、蛍光検出器を用いて組織を可視化することによって、対照インプラント（１ｅ（ｉｉ）でコーティング）に対して、背景シグナルについて補正した１ｅ（ｉｖ）でコーティングしたインプラント（上記の通り白点として見える）について４．２の標的対背景比が得られた。
【０２０５】
［実施例１０］
微生物の存在の無菌性異物反応からの識別
微生物感染症を無菌性異物反応または無菌性炎症から識別するために、静脈内注射後に、黄色ブドウ球菌（Ｘｅｎ２９）誘発筋炎（これは黄色ブドウ球菌、ｎ＝６による感染症による免疫応答である）で検出された蛍光シグナルを、無菌的に植え込まれたＣｙｔｏｄｅｘビーズ（ｎ＝６）によって誘発された無菌性筋炎（これは異物による免疫応答であり、感染症ではない）のマウスにおける蛍光シグナルと比較した。
【０２０６】
同じ動物内のシグナルを信頼して比較するために、黄色ブドウ球菌（Ｘｅｎ２９）を注射したマウスのうち３匹は、左後肢の筋炎ならびに対側性無菌性筋炎を有していた。エキソビボで、無菌性炎症の筋組織は、健康な組織の蛍光シグナル（１．２×１０２±０．１×１０２カウント、ｐ＝０．０６、有意でない）に匹敵する蛍光シグナル（１．８×１０２±０．８×１０２カウント）を示した。また、黄色ブドウ球菌（Ｘｅｎ２９）に感染した筋組織は、非感染対側性の健康な筋組織（ｐ＝０．００８）および無菌性炎症を有する組織（ｐ＝０．０１）と比較して有意に高い蛍光シグナル（４．１×１０２±２．６×１０２カウント）を発した。この例は、ＩＲＤｙｅ８００が黄色ブドウ球菌によって提供される化合物の存在下でのみ放出されるので、ポリマーコーティングからのＩＲＤｙｅの放出が黄色ブドウ球菌の存在を示していることを示している。そのため、本発明により調製したポリマーコーティングを使用して植え込まれた物体の表面上または近くの微生物の存在を示すことができる。ビーズ植込み後の無菌性炎症の存在は、ギムザ染色、すなわち、ビーズの周りの白血球の蓄積および健康な筋組織中の白血球の欠如を用いて、光学顕微鏡によって確認した。白血球は、抗ＣＤ４５  ｐａｎ白血球蛍光染色（データ不掲載）によっても検出された。非感染筋組織または無菌性炎症筋組織のいずれの培養物中にも生物発光細菌は見られなかった。
【図１】
0006359559.tif 000006
【図２】
0006359559.tif 000007
【図３】
0006359559.tif 000008
【図４】
0006359559.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006359559.tif 000013
【図９】
0006359559.tif 000014
【図１０】
0006359559.tif 000015
【図１１】
0006359559.tif 000016
【配列表】
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