(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＦＴＲタンパク質機能不全に関連する病気である嚢胞性線維症の治療用の変異ＣＦＴＲタンパク質の修飾剤であって、
以下の構造
【化１】
0006284914.tif 000007
で表される修飾剤。
【請求項２】
変異ＣＦＴＲタンパク質に影響を及ぼし、ここで、前記ＣＦＴＲ変異は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ変異、又はクラスＩＩの別の変異であり、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ変異、又はクラスＩＩの別の変異は、ＣＦＴＲタンパク質機能不全に関与する、請求項１に記載の修飾剤。
【請求項３】
ＣＦＴＲタンパク質機能不全に関連する前記病気は、嚢胞性線維症である、請求項２に記載の修飾剤。
【請求項４】
細胞膜を横断するＣＦＴＲ依存性イオン輸送に影響を与え、及び／又は前記細胞表面に到達する変異ＣＦＴＲタンパク質の数を増加する能力を有する、請求項１に記載の修飾剤。
【請求項５】
前記変異ＣＦＴＲタンパク質の前記構造に対する安定効果を有し、及び／又は変異ＣＦＴＲの成熟前分解に関与する細胞タンパク質との相互作用を遮断する、請求項１に記載の修飾剤。
【請求項６】
変異ＣＦＴＲタンパク質に影響を及ぼし、ここで、前記ＣＦＴＲ変異は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ変異、又はクラスＩＩの別の変異である、請求項１に記載の修飾剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異ＣＦＴＲタンパク質の機能を変質させることができる新規の修飾因子、及びＣＦＴＲタンパク質異常に関連する病気の治療へのその使用に関する。本発明は、変異ＣＦＴＲタンパク質の細胞変質を補正する組成物、製剤及び方法を提供し、ここで、ＣＦＴＲ変異はΔＦ５０８−ＣＦＴＲ変異又はクラスＩＩの別の変異である。
【背景技術】
【０００２】
嚢胞性線維症（ＣＦ又は膵臓線維症としても知られる）はヒトの致命的遺伝病の中で最も多い病気の一つである。ＣＦは生産児２５００人当たり約１人を襲う遺伝的な常染色体性劣性遺伝病である（１）。ＣＦは、上皮塩化物イオンチャンネルとしての活性を有する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲタンパク質）をコードするＣＦＴＲ遺伝子の変異によって引き起こされる（２、３）。このタンパク質の機能が損なわれた結果は、呼吸器系及び消化器系さらに男性生殖器系に関連する重篤な症状として現れる（４）。これまでにＣＦＴＲ遺伝子には１６００を超える変異が特定され、報告されている（５）。
【０００３】
ＣＦＴＲ遺伝子変異は、ＣＦＴＲタンパク質の機能不全につながる分子のメカニズムに基づいて５つのクラスに分類されている（６、７）。クラスＩ変異は、長さが不完全なタンパク質の形成の一因となり、通常はその活性が完全に失われている（例えばＧ５４２Ｘ）。クラスＩＩの変異は小胞体及びゴルジ装置におけるタンパク質の成熟異常につながる。これらの変異の影響は、タンパク質の成熟前の分解である。したがってＣＦＴＲは、その機能を発現すべき細胞膜に到達しない（例えばΔＦ５０８、ΔＩ５０７、Ｓ５４９Ｒ）（８）。クラスＩＩＩの変異を有する遺伝子産物は適切に合成され、細胞膜へと輸送されて取り込まれるが、タンパク質の制御異常によって活性低下が引き起こされる。
【０００４】
これらの変異はヌクレオチド結合ドメインの一つ（例えばＧ５５１Ｄ／Ｓ）内に位置することが多い。クラスＩＶの変異は膜貫通タンパク質の構造に異常を引き起こし、それにより塩化物チャンネルの伝導を低下させる（例えば、Ｒ１１７Ｈ、Ｒ３３４Ｗ）。ｍＲＮＡの安定性を変更する変異は、ＣＦＴＲ遺伝子の変異のクラスＶである（３８４９＋１０ｋｂＣ−＞Ｔ，５Ｔ）。
【０００５】
患者の約９０％の少なくとも１つの対立遺伝子中に存在する最も一般的な変異（９）は、ＣＦＴＲアミノ酸配列の５０８位のフェニルアラニンの欠失である（ΔＦ５０８ＣＦＴＲ）。これは、タンパク質の成熟前分解を引き起こすクラスＩＩ変異の古典的な例である（８、１０）。この変異は（特に細胞膜を介した細胞からの塩化物陰イオン流出（１１）と細胞内へのナトリウムイオンの移動（１２）との）水−電解質異常を伴い、その結果、病理学的症状が現れる。最も重篤な症状の幾つかは、上下気道の鬱血及び粘液粘度上昇であり、肺の損傷につながる。これらの症状は、例えば緑膿菌などによって引き起こされる細菌感染の発症にとって好ましい環境を生じる。さらに、ＣＦＴＲタンパク質の機能不全は、外分泌膵管の閉塞及び関連する消化系障害につながる（１３）。
【０００６】
ＣＦＴＲは１４８０アミノ酸を有する糖タンパク質であり、ＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）輸送体に分類される。このタンパク質は５つのドメインで構成される。２つのヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ１及びＮＢＤ２）、１つの調節ドメイン（ＲＤ）及び２つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ１及びＴＭＤ２）がある。タンパク質活性は、調節ドメイン（ＲＤ）の燐酸化を触媒するｃＡＭＰ依存タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）によって、また、２つのＡＴＰ分子がＮＢＤ１及びＮＢＤ２ドメインに結合することによっても調節される（１４）。
【０００７】
国際公開第ＷＯ２００５／１２０４９７号（米国特許出願公開第２００８／０３１９００８号）では、変異ＣＦＴＲタンパク質の活性（イオン輸送）を増加させる化合物、及びその使用が説明されている。この発明は、嚢胞性線維症（ＣＦ）の治療に有用である変異ＣＦＴＲタンパク質、すなわちΔＦ５０８ＣＦＴＲ、Ｇ５５１Ｄ−ＣＦＴＲ、Ｇ１３４９Ｄ−ＣＦＴＲ又はＤ１１５２Ｈ−ＣＦＴＲのイオン輸送活性を増加させる組成物、製剤及び方法も提供している。この発明の組成物及び製剤は、１つ又は複数のフェニルグリシン含有化合物又はスルホンアミド含有化合物又はその類似体又は誘導体を含むことがある。
【０００８】
国際公開第ＷＯ２００９／０５１９１０号では、変異ＣＦＴＲタンパク質のイオン輸送活性を増加させる化合物、及びその使用が説明されている。この発明は、変異ＣＦＴＲの活性を増加させる組成物、製剤及び方法を提供している。この組成物、製剤及び方法は、嚢胞性線維症のような変異ＣＦＴＲに関連する障害の研究及び治療に有用である。この発明の組成物及び製剤は、１つ又は複数のフェニルグリシン含有化合物、又はその類似体又は誘導体を含むことがある。
【０００９】
米国特許第５９４８８１４号は、ＣＦ治療のためのゲニステイン化合物の使用について説明している。変異ＣＦＴＲを含む細胞内にＣＦＴＲの機能を生成することによって嚢胞性線維症を治療する方法、及び治療用の治療組成物が説明されている。治療法は、有効量のゲニステイン又はゲニステイン類似体及び誘導体を嚢胞性線維症に悩む患者に投与することを含む。
【００１０】
米国特許出願公開第２００４／０００６１２７号では、塩化物を活性化する方法が説明されている。フルオレセイン及び誘導体がヒトを含む動物生体の症状の治療に使用されており、その病気はＣＦＴＲ塩化物チャンネルの活性化に反応するものであり、例えば嚢胞性線維症、播種性気管支拡張症、肺感染症、慢性膵臓炎、男性不妊症及びＱＴ延長症候群である。
【００１１】
国際公開第ＷＯ２００６／１０１７４０号（米国特許出願公開第２００８／０３１８９８４号）では、変異ＣＦＴＲタンパク質の細胞変質を補正する化合物及びその使用が説明されている。この発明は、嚢胞性線維症の治療に有用である変異ＣＦＴＲタンパク質（例えばΔＦ５０８ＣＦＴＲ）の細胞プロセッシングを補正する組成物、製剤及び方法を提供している。この発明の組成物及び製剤は、１つ又は複数のアミノベンゾチアゾール含有化合物、アミノアリルチアゾール含有化合物、キナゾリニルアミノピリミジノン含有化合物、ビスアミノメチルビチアゾール含有化合物、又はフェニルアミノキノリン含有化合物、又はその類似体又は誘導体を含むことがある。
【００１２】
国際公開第ＷＯ２００９／０５１９０９号では、変異ＣＦＴＲタンパク質の細胞変質を改善する化合物及びその使用が説明されている。この発明は、変異ＣＦＴＲの活性を増加させる組成物、製剤及び方法を提供する。組成物、製剤及び方法は、嚢胞性線維症などの変異ＣＦＴＲに関連する疾患の研究及び治療に有用である。この発明の組成物は、１つ又は複数の上記発明のビチアゾール含有化合物、又はその類似体又は誘導体を含むことがある。
【００１３】
ＣＦＴＲタンパク質のフェニルアラニン５０８は、ＣＦＴＲのＮＢＤ１ドメインの表面に生じる。現在の構造研究及び生物物理学的研究では、野生型ドメインのタンパク質とΔＦ５０８変異ドメインとの間に、ＣＦＴＲタンパク質の折り畳み動態及び熱力学的安定性に影響を及ぼし得る有意な差は明らかになっていない。両方のドメインの解析された結晶構造は、Ｆ５０８が占有すべき部位の付近に位置するアミノ酸の再構成にわずかな違いを示すのみである（１０）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、変異ＣＦＴＲタンパク質の細胞プロセッシングを補正する組成物、製剤及び方法を提供することである。Ｆ５０８の欠失は、Ｘ線の結果で観察されているようにＮＢＤ１ドメインの構造に最小限の影響しか与えず、細胞中のＣＦＴＲタンパク質の変異型と自然型の挙動における劇的な違いを説明することができない。本発明では、両方のタンパク質型の構造データを、ＮＢＤ１の動的性質を解明するために設計されたコンピュータシミュレーションにかけた。本発明では、分子動力学的方法を使用している。この方法は、シミュレートされた系を形成する原子間の相互作用の反復計算、及び運動方程式の解析に基づいている（１５）。（研究した両ＮＢＤ１の型の）これらのシミュレーションの結果、初期の物理学的仮定に従って目的タンパク質がとることができる幾つかの構造セット、いわゆる軌跡が得られる。
【００１５】
２つのドメインの分子動力学的軌跡の分析により、野生型タンパク質がとっている配座状態とは有意に異なる変異タンパク質配座を単離することが可能であった。この配座は、ＡＴＰ結合部位の両側に位置する、タンパク質の表面上に２つの主要ポケットを有する。この配座のタンパク質の構造を使用して、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性を補正するための化合物を開発した。
【００１６】
本発明においては、本発明の目的の実現、及び先行技術で説明されているような嚢胞性線維症の治療に実際使用される化合物に関連する問題の解決がプロセスの最高の効率で達成されている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の主題は、変異ＣＦＴＲタンパク質の修飾因子である一般式（ＩＩ）の化合物、
【化１】
0006284914.tif 000002
その互変異性体、Ｅ及びＺ幾何異性体、鏡像異性体やジアステレオ異性体を含む光学活性体、及びそれらのラセミ体又は立体異性体の混合物又はその薬学的に許容可能な塩又はその錯体に関し、
ここで、Ｑ１及びＱ２は、Ｃ、ＣＨ、Ｎ、ＮＨからなる群から独立に選択され、
ここで、Ａは、窒素、硫黄又は酸素を含む０〜３個の独立に選択されるヘテロ原子を有する縮合五員環であり、
ここで、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、−ＯＲＢ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＣ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＢ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＯＲＢ）ＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＢ、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＣ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ、−ＣＨ２ＯＲＢ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＲＢ、−ＣＨ２Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＲＣ、−ＣＨ２Ｎ（ＲＡ）ＣＨ２ＲＣ、−ＳＲＤ、−Ｓ（＝Ｏ）ＲＤ、−ＳＯ２ＲＤ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、−ＳＯ３ＲＢ、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＢ、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ’）ＲＡ”、−Ｎ（ＲＡ）ＳＯ２ＲＤ、−Ｎ（ＲＡ）ＳＯ２Ｎ（ＲＡ’）ＲＡ”、−Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＢ、−Ｎ（ＲＡ）Ｎ（ＲＡ’）ＲＡ”、−Ｎ（ＲＡ’）Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＮＨ２、−ＳＣＮ、−ＳＯ２ＣＮ、−Ｆ、Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＯＰＯ３Ｈ２から独立に選択される任意の置換基を表し、これは必要に応じて、分岐状又は非分岐状でｎが１から４までの整数である−ＣｎＨ（２ｎ−１）ＲＣ、分岐状又は非分岐状でｎが２から５までの整数であるＥ又はＺ幾何異性体の−ＣｎＨ（２ｎ−３）ＲＣ、分岐状又は非分岐状でｎが２から５までの整数である−ＣｎＨ（２ｎ−５）ＲＣにより先行され、
ここで、Ｚ２は、単結合、−Ｎ（ＲＡ’）−、−Ｓ−、−Ｓ−ａｌｋｙｌ−、−Ｏ−、−Ｏ−ａｌｋｙｌ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ’）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ’）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（ＲＡ’）−、−Ｎ（ＲＡ’）ＳＯ２−、−Ｎ（ＲＡ’）ＳＯ２Ｎ（ＲＡ”）−、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ”）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｎ（ＲＡ”）−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｎ（ＲＡ”）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ’）Ｎ（ＲＡ”）−、ＣＨ２Ｎ（ＲＡ’）−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＲＡ’）−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２Ｎ（ＲＡ’）ＣＨ２−、分岐状又は非分岐状でｎが１から５までの整数である−ＣｎＨ２ｎ−、分岐状又は非分岐状でｎが２から５までの整数であるＥ又はＺ幾何異性体の−ＣｎＨ（２ｎ−２）−、分岐状又は非分岐状でｎが２から５までの整数である−ＣｎＨ（２ｎ−４）−から選択され、
ここで、Ｒ７は、−Ｈ、芳香環又は複素芳香族環からなる群から独立に選択され、
ここで、Ｚ３は、単結合、二重結合、−Ｎ（ＲＡ’）−、−Ｓ−、−Ｓ−ａｌｋｙｌ−、−Ｏ−、−Ｏ−ａｌｋｙｌ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ’）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ’）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（ＲＡ’）−、−Ｎ（ＲＡ’）ＳＯ２−、−Ｎ（ＲＡ’）ＳＯ２Ｎ（ＲＡ’）−、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ”）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｎ（ＲＡ”）−、−Ｎ（ＲＡ’）Ｎ（ＲＡ”）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ’）Ｎ（ＲＡ”）−、−ＣＨ２Ｎ（ＲＡ’）、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＲＡ’）−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２Ｎ（ＲＡ’）ＣＨ２−、分岐状又は非分岐状でｎが１から５までの整数である−ＣｎＨ２ｎ−、分岐状又は非分岐状でｎが２から５までの整数であるＥ又はＺ幾何異性体の−ＣｎＨ（２ｎ−２）−、分岐状又は非分岐状でｎが２から５までの整数である−ＣｎＨ（２ｎ−４）から選択され、
ここで、Ｒ８は、Ｈ、Ｏ、Ｓ、芳香環又は複素芳香族環、分岐状又は非分岐状でｎが１から５までの整数である−ＣｎＨ（２ｎ＋１）−、分岐状又は非分岐状でｎが２から５までの整数であるＥ又はＺ幾何異性体の−ＣｎＨ（２ｎ−１）−、分岐状又は非分岐状でｎが２から５までの整数である−ＣｎＨ（２ｎ−３）から選択され、
ここで、ＲＡ、ＲＡ’、ＲＡ”はそれぞれ、−Ｈ、低級アルキル基、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＯＨからなる群から独立に選択され、
ここで、ＲＢは、−Ｈ、低級アルキル基、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉからなる群から独立に選択され、
ここで、ＲＣは、−Ｈ、低級アルキル基、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＨ２からなる群から独立に選択され、
ここで、ＲＤは、−Ｈ、低級アルキル基からなる群から独立に選択され、五員環Ａは、
【化２】
0006284914.tif 000003
からなる群から選択される部分であり、化合物６−［（４−オキソ−１Ｈ−キノリン−３−イル）カルボニルアミノ］−１Ｈ−インドール−４−カルボン酸エチルエステルを除く、ＣＦＴＲタンパク質機能不全に関連する病気を治療するための薬物を製造するための、変異ＣＦＴＲタンパク質修飾因子である。
【００１８】
好ましくは、上述の化合物は、一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）である。
【化３】
0006284914.tif 000004
ここで、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５は、−ＯＲＢ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＲＣ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲＢ、
−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＯＲＢ）ＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＢ、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＣ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ、−ＣＨ２ＯＲＢ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＲＢ、−ＣＨ２Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＲＣ、−ＣＨ２Ｎ（ＲＡ）ＣＨ２ＲＣ、−ＳＲＤ、−Ｓ（＝Ｏ）ＲＤ、−ＳＯ２ＲＤ、−ＳＯ２Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、−ＳＯ３ＲＢ、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＢ、
−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ’）ＲＡ”、−Ｎ（ＲＡ）ＳＯ２ＲＤ、−Ｎ（ＲＡ）ＳＯ２Ｎ（ＲＡ’）ＲＡ”、−Ｎ（ＲＡ）ＲＡ’、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＢ、−Ｎ（ＲＡ）Ｎ（ＲＡ’）ＲＡ”、−Ｎ（ＲＡ’）Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＣ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＮＨ２、−ＳＣＮ、−ＳＯ２ＣＮ、−Ｆ、Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、分岐状又は非分岐状でｎが１から５までの整数である−ＣｎＨ２ｎＲＣ、分岐状又は非分岐状でｎが２から５までの整数であるＥ又はＺ幾何異性体の−ＣｎＨ（２ｎ−２）ＲＣ、分岐状又は非分岐状でｎが２から５までの整数である−ＣｎＨ（２ｎ−４）ＲＣ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＯＰＯ３Ｈ２からなる群から独立に選択される任意の置換基を表す。
【００１９】
好ましくは、上記修飾因子は、以下の構造で表される。
【化４】
0006284914.tif 000005
【発明の効果】
【００２０】
好ましくは、変異ＣＦＴＲタンパク質に影響を及ぼし、ここで、上記ＣＦＴＲ変異は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ変異、又はクラスＩＩの別の変異であり、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ変異、又はクラスＩＩの別の変異は、ＣＦＴＲタンパク質機能不全に関与するものである。
【００２１】
好ましくは、ＣＦＴＲタンパク質機能不全に関連する病気とは嚢胞性線維症である。
【００２２】
本発明の第二の主題は、上述の修飾因子であって、細胞膜を横断するＣＦＴＲ依存性イオン輸送に影響を与え、及び／又は細胞表面に到達する変異ＣＦＴＲタンパク質の数を増加させる活性を有することを特徴とするものである。
【００２３】
好ましくは、修飾因子は、変異ＣＦＴＲタンパク質の構造に対する安定効果を有し、及び／又は変異ＣＦＴＲの成熟前分解に関与する細胞タンパク質との相互作用を遮断することを特徴とする。
【００２４】
好ましくは、変異ＣＦＴＲタンパク質に影響を及ぼし、ここで、上記ＣＦＴＲ変異は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ変異、又はクラスＩＩの別の変異である。
【００２５】
本発明を添付図面に図示する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ  ＨｅＬａ細胞中での１μＭのヨウ化物流出に対する様々な化合物の影響。（ａ）Ａのように様々な薬剤で処理した細胞中におけるＦｓｋ／Ｇｓｋ依存ヨウ化物流出のピーク振幅を示す棒グラフ。値は３つの独立した実験の平均値である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（ｂ）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定した活性補正剤の化学構造。（ｃ）ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定トランスフェクトし、１０μＭの様々な化合物で２４時間処理したＨｅＬａ細胞から得られたヨウ化物流出曲線の例。ＣＦＴＲ依存性応答は、トレース上の水平線で示すように１０μＭのフォースコリン（Ｆｓｋ）＋３０μＭのゲニステインによって誘導した。（ｄ）ポケット２に活性を有する化合物４０７８８２及び７３１００、並びに、ポケット１に活性を有する化合物１３０８１３について、ＥＣ５０を測定した。１１８２０８については、１００μＭでもヨウ化物流出が最高値に達しなかったため正確に測定できなかった（これも図示）。
【図２】化合物がＣＦＴＲ輸送に及ぼす影響とは無関係に増強活性を有するか試験するために、未処理のＷＴ−ＣＦＴＲＨｅＬａ細胞のヨウ化物流出を検査した。フォースコリンと一緒に化合物を添加し、その影響をフォースコリンのみ、又はフォースコリン＋ゲニステインの場合と比較した。ゲニステインと異なり、試験した分子はすべてフォースコリンのみの場合より大きいＩ−の流出を誘導した。
【図３】ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを救済するためにミグルスタットで２時間処理したΔＦ５０８−ＣＦＴＲＨｅＬａ細胞で、増強作用も検査した。フォースコリンのみ、フォースコリン＋ゲニステイン、又はフォースコリン＋様々な化合物でＩ−流出を刺激した。図に示すように、ゲニステインのみが流出を増加させることができ、本発明者らの薬剤では増強活性がないことが実証された。
【図４】特定された補正剤がΔＦ５０８−ＣＦＴＲの成熟及び細胞局在化に及ぼす影響。（ａ）様々な化合物がＣＦＴＲプロセッシングに及ぼす影響。Ｍａｂ２４−１と共に１μＭの様々な化合物で２４時間処理したＨｅＬａ細胞からのタンパク質のＷＴ−ＣＦＴＲ及びΔＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質の代表的な免疫ブロット。ＣＦＴＲの成熟形（バンドＣ）及び未成熟形（バンドＢ）の位置を示す。（ｂ）ＷＴ−ＣＦＴＲ、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲのみ、及び本発明の分子で補正した後のΔＦ５０８−ＣＦＴＲの相対的強度（Ｃ／Ｂ＋Ｃ）の比較。（ｃ）１μＭで使用した様々な化合物がＣＦＴＲの局在化に及ぼす影響。ＷＴ−ＣＦＴＲの細胞膜局在化及びΔＦ５０８−ＣＦＴＲの細胞内局在化を示す共焦点像。薬剤の影響をパネルｃからｆに示す。棒：２０μＭ。矢印は細胞膜におけるＣＦＴＲの染色を示す。
【図５】１μＭで試験したヨウ化物流出に対する活性化合物の増強効果。（ａ）４０７８８２、１１８２０８、（ｂ）１１８２０８、７３１００、（ｃ）４０７８８２、３７１７３のそれぞれについて、単独及び両方の化合物で２４時間処理した細胞について、トレースの上の水平線で示された１μＭのフォースコリン（Ｆｓｋ）＋３０μＭのゲニステイン（Ｇｓｋ）への反応としてのヨウ化物流出。（ｄ）同様に様々な薬剤で処理した細胞中のＦｓｋ／Ｇｓｋ依存性ヨウ化物流出のピーク振幅を示す棒グラフ。値は３つの独立した実験の平均値である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図６】（ａ）／（ｂ）１μＭの４０７８８２（１２）＋１１８２０８（６）化合物で処理したＨｅＬａ細胞中のｃＡＭＰ依存塩化物流の電流と電圧の関係。
【図７】ΔＦ５０８ＣＦ患者（ＣＦ−４ＫＭ）の細胞由来の上皮漿液細胞株における１μＭでのヨウ化物流出に与える様々な化合物の影響。最も有力な分子４０７８８２では濃度依存性が示された。
【図８】ΔＦ５０８／ΔＦ５０８マウスの鼻電位差（ΔＶＴＥ）に与える７３１００＋１１８２０８分子の影響。基準値ＶＴＥ、及び１００μＭのアミロライドΔＶＴＥａｍｉｌを鼻上皮に灌流することによって誘発された変化ΔＶＴＥは、２種類の分子で、又はリポソームのみで処理したマウスで同様であった。マウス５匹中３匹での低Ｃｌ−溶液の灌流は、ＶＴＥを２ｍＶ（ΔＶＴＥａｍｉｌ−ｌｏｗＣｌ）、すなわち処理の有意な効果として発明者らが確定した閾値より大きく過分極化した。ＣＦＴＲ阻害剤ＩＩｎｈ１７２によって明らかとなったＣＦＴＲ関連電流は、（ΔＶＴＥａｍｉｌ−ｌｏｗＣｌ）の約３０％を表す（データは開示せず）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明をよりよく理解するために、本発明の主題の実施例を以下に開示する。
【００２８】
実施例
材料及び方法
抗体
以下の抗体を使用した。すなわちＭＡＢ２５０３１（クローン２４−１、R&D systems、米国）及びＭＭ１３−４（Upstate）、ＣＦＴＲ検出用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。蛍光二次抗体Ａｌｅｘａ  ５９４及び４８８はMolecular Probes（Cergy Pontoise、フランス）から購入した。
【００２９】
細胞培養
安定トランスフェクトＨｅＬａ細胞（コントロールとしてのｐＴｒａｃｅｒプラスミド（ｐＴｒａｃｅｒ）のみ、又は発現したＷＴ−ＣＦＴＲ（ｓｐＴＣＦ−ＷＴ）、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲｓ（ｐＴＣＦ−Ｆ５０８ｄｅｌ）を有する）はPascale Fanen（Inserm U.468、クレテイユ（Creteil）、フランス）から提供され、他（１６）で説明の通りに培養した。簡潔に言うと、ＨｅＬａ細胞を１０％の熱不活化したＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び２５０μｇ／ｍｌのゼオシンを追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。培養は３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベータ内で行った。これらの細胞中のＷＴ−ＣＦＴＲ及びΔＦ５０８−ＣＦＴＲの発現は、研究中、常に免疫沈降反応及び免疫細胞化学法によって検証した。７５％コンフルーエンスに到達した細胞について、（１及び１０μＭの）様々な分子及び溶媒で処理を実行した。
【００３０】
野生型ＳＶ４０ウィルスを使用してΔＦ５０８同型変異体のＣＦ気管腺漿液細胞の初代培養を形質転換させることによって得たＣＦ−ＫＭ４細胞株を他（１７）で説明の通りに培養した。
【００３１】
免疫ブロット実験
７５ｃｍ２のフラスコ中で培養した細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、２ｍｌのＰＢＳ中でかき集め、６００ｇで５分間遠心分離した。ペレットを３００μｌのＲＩＰＡ緩衝剤（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、１％のＮａデオキシコレート、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ７．５）中、４℃で３０分間攪拌して懸濁させた。１５０００ｇで３０分間遠心分離した後、上澄みを、上述（１８）をわずかに変更して免疫ブロット実験用に処理した。
【００３２】
サンプルを８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ＰＶＤＦ膜上に転写させ、オデッセイ赤外線画像システム（LI-COR Biosciences、ネブラスカ州、米国）の製造業者の推奨事項に従って分析を実行した。ブロット膜をオデッセイ緩衝剤（ScienceTec、パリ、フランス）で１時間ブロッキングし、モノクローナル抗ＣＦＴＲ  Ｍａｂ２４−１（１／１０００）を使用してハイブリダイズさせた。タンパク質は、二次抗体（１／１００００）とのインキュベーションによって可視化し、ＥＣＬ技術（１９）を使用して検出した。
【００３３】
免疫蛍光染色
ガラスカバースリップ上で培養したＨｅＬａ細胞を上述の通り、及びLipecka他（２０）で説明の通りに処理した。細胞を４％のホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％のトリトンで透過化処理した。細胞をＰＢＳ／トリトン中の１％のウシ血清アルブミンでブロッキングし、一次抗体２４−１（１：３００）と共に４℃で一晩インキュベートした。洗浄し、５％の正常ヤギ血清でブロッキングした後、細胞を二次抗体と共にインキュベートした。ガラスカバースリップはVectashield封入剤（Vector Laboratories）を使用して封入し、共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss、LSM510）で検査した。
【００３４】
ヨウ化物流出実験
ＣＦＴＲ塩化物チャンネルの活性を、以前の説明（２１）通りに形質転換されたＣＨＯ細胞からのヨウ化物（１２５Ｉ）流出を測定することによって測定した。９６ウェルのプレートで４日間培養した細胞を、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５．３６ｍＭのＫＣｌ、０．４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．８ｍＭのＭｇＣｌ２、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、５．５ｍＭのグルコース、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むｐＨ７．４の改変アール塩溶液２ｍｌで２回洗浄した。次に、１ｍＭのＫＩを含む同じ培地（１ｍＣｉのＮａ１２５Ｉ／ｍｌ、NEN Life Science Products）と共に３７℃で３０分細胞をインキュベートした。洗浄後、細胞を１ｍｌの改変アール塩溶液と共にインキュベートした。１分後、培地を取り出してカウントし、１ｍｌの同じ媒質と素早く交換した。この手順を１分毎に８分間繰り返した。最初の３つのアリコートを使用して、流出緩衝剤のみの安定したベースラインを確定した。ＣＦＴＲ塩化物チャンネルを活性化させるために、次のアリコートでは細胞内ｃＡＭＰの増加を目的とするカクテル（１０μＭのフォースコリン及び３０μＭのゲニステイン）を含む培地を使用した。インキュベーションの最後に培地を回収し、細胞を１ＮのＮａＯＨ中で可溶化した。ガイガーカウンター（ＬＫＢ）を使用して放射性を測定した。時間０における１２５Ｉ（ｃｐｍ）の総カウントは、１分毎のサンプルでカウントしたｃｐｍとＮａＯＨ画分のｃｐｍとの合計として計算した。各時点で失われた当初の細胞内１２５Ｉの画分を求め、１２５Ｉ流出の時間依存係数をBecq他（２２）に従って下式から計算した。
ｌｎ（１２５Ｉｔ１／１２５Ｉｔ２）／（ｔ１−ｔ２）
ここで、
１２５Ｉｔは、時間ｔにおける細胞内１２５Ｉであり、
ｔ１及びｔ２は、連続する時点である。
【００３５】
曲線は１２５Ｉの流出対時間の係数をプロットすることによって作成した。データはｎ個の別個の実験の平均値±標準誤差として表される。
【００３６】
差は、ｐ値が０．０５未満の場合、スチューデントのｔ検定を使用して統計的に有意と見なした。
【００３７】
全細胞パッチクランプ記録
全細胞構成のパッチクランプ記録法の技術は、他（２３，２４）で説明されている。安定トランスフェクト細胞を、倒立顕微鏡のステージに装着した３５ｍｍの細胞培養プラスチックペトリ皿に播種した。パッチクランプ実験は、ディジットデータ１４４０（digitdata 1440）インタフェース（Axon Intruments、米国）を介してコンピュータによって制御されたAxopatch 200A増幅器で室温にて実施した。Setterマイクロピペットプラーを使用して硬質ガラス（Kimax 51）からピペットを引き出し、その先端を熱加工した。ナイスタチン穿孔パッチクランプ構成を使用して、電流記録を実施した。ナイスタチン原液（５０ｍｇ／ｍｌ）は、ＤＭＳＯ中で毎日調製した。原液を内部溶液で希釈し（１：２５０）、次にこれを１分間超音波処理した。内部溶液は、１３１ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ−Ｎａ＋を含み、ＮａＯＨでｐＨ７．３に調整した。浴液は１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、３５ｍＭの蔗糖及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ−Ｎａ＋を含み、ＮａＯＨでｐＨ７．３に調整した。
【００３８】
電流は、０ｍＶの保持電位から３秒の間隔で６０ｍＶの振幅の規則的電圧パルスを１秒間加えることにより記録した。
【００３９】
Ｉ−Ｖ曲線を確立するために、−１００ｍＶと＋８０ｍＶの間の膜電位に向かって一連の９回の電圧ジャンプ（毎回１秒の継続時間）で、規則的電圧パルスを中断した。２００μｍの８−（４−クロロフェニルチオ）−ｃＡＭＰナトリウム塩（ＣＰＴ−ｃＡＭＰ）と１００μＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）でＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流を活性化した。
【００４０】
最大刺激に到達すると、ＣＰＴ−ｃＡＭＰ溶液に添加した５μＭの特定のＣＦＴＲ阻害剤、すなわちＣＦＴＲｉｎｈ−１７２に細胞を浸漬した。ＣＦＴＲ電流とは、ＣＰＴ−ｃＡＭＰによる最大刺激中とＣＦＴＲｉｎｈ−１７２による阻害後に記録された電流振幅の差と定義した。
【００４１】
鼻電位差（ＮＰＤ）測定
鼻電位測定法は、発明者らが幼児のために開発した技術（２５）を採用し、小型化したものである。ケタミン（１３３ｍｇ／ｋｇ；ＩＭＡＬＧＥＮＥ  １０００、ＭＥＲＩＡＬ、フランス）及びキシラジン（１３．３ｍｇ／ｋｇ；Rompun  ２％、BayerPharma、フランス）を腹腔内投与して、マウスに麻酔をかけた。マウスを４５°傾斜した板上に位置決めし、マウスの殺傷を回避するために鼻の下に紙パッドを配置した。皮下注射針を寒天ブリッジでＡｇ＋／ＡｇＣｌ基準電極に接続した。二腔管ポリエチレンカテーテル（直径０．５ｍｍ）を一方の鼻孔に深さ４ｍｍで挿入した。リンゲル液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭの蔗糖、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２で、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）を０．１５ｍＬ／時で灌流した一方の腔管を、測定用Ａｇ＋／ＡｇＣｌ電極に接続した。２つのＡｇ＋／ＡｇＣｌ電極を高インピーダンス電圧計（LOGAN research Ltd、英国）に接続した。第２の腔管は以下のシーケンスで溶液を灌流した。すなわち（１）リンゲル液、（２）アミロライド（Ｎａ＋コンダクタンスの阻害剤、１００μＭ）を含むリンゲル液、（３）Ｃｌ−コンダクタンスを明らかにする低塩化物リンゲル液（１４０ｍＭのグルコン酸ナトリウム、６ｍＭのグルコン酸カリウム、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１０ｍＭの蔗糖、１ｍＭのＭｇＣｌ２、６ｍＭのグルコン酸カルシウムで、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、（４）ＣＦＴＲの関与を評価するＣＦＴＲ阻害剤−１７２（５μＭ、Calbiochem、ドイツ）を含む低塩化物リンゲル液である。各溶液は少なくとも３分間灌流し、灌流を切り換える前に３０秒間安定させる必要があった。定常状態の経上皮電位ＶＴＥ、ΔＶＴＥＡｍｉｌ（アミロライド含有溶液の灌流後に記録したＶＴＥと経上皮電位との差）、ΔＶＴＥａｍｉｌＬｏｗＣｌ（低Ｃｌ−含有溶液とアミロライド含有溶液で灌流した後に記録したＶＴＥと経上皮電位との差）、及びΔＶＴＥａｍｉｌＬｏｗＣｌＩｎｈ−１７２（ＶＴＥと以前の溶液にＣＦＴＲ阻害剤を添加した後との差）は、安定中に記録した３０の値の平均であった。
【００４２】
ＭＴＴ細胞生存度アッセイ（２６）
細胞生存度を測定するために、典型的なＭＴＴアッセイを用いた。ＨｅＬａ細胞を９６ウェルのプレートで培養し、様々な濃度の本発明の化合物に２４時間曝露した。洗浄後、次いでＭＴＴ溶液及び培地を導入した。インキュベーション後、その結果のホルマザン結晶をジメチルスルホキシド中で溶解させ、マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍの吸収強度を測定した。
【００４３】
生細胞中では黄色いＭＴＴは紫のホルマザンに還元される。この染色溶液の吸収率は、分光光度計で特定の波長を測定することによって定量化することができる。この変換は、生（生）細胞の数に直接関連づけることができる。
【００４４】
仮想スクリーニング−修飾因子化合物の特定
ヒット源として仮想スクリーニングプロセスでは低分子量化合物のデータベースを使用した。分子ドッキングプログラムＤｏｃｋ６．１を使用して、タンパク質表面上の２つの有望な結合部位内にある小分子の配座空間を検査した。その後、選択した全リガンド及び全錯体を分子力場中で十分に極小化した。各ステップで、有望な錯体の評価のために一組のスコアリング関数を使用し、適切な分子を実験用に選択した。
【表１】
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【００４５】
結果
ヨウ化物（Ｉ−）流出に対する薬剤の効果
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの輸送及び機能の薬剤補正を検査するために、Ｉ−流出技術を使用したロボットのセルベースの方法を使用した肉眼アッセイでハロゲン化物の透過性を評価した。第一系列の実験では、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲＨｅＬａ細胞を２４時間、１μＭの全化合物で前処理し、その後にｃＡＭＰ依存性放射標識ヨウ化物流出を測定することによって、電位補正剤の効果を検査した。ポケット１の化合物１３０８１３及び１１８２０８、及びポケット２の７３１００及び４０７８８２で処理すると、ｃＡＭＰで刺激された放射標識ヨウ化物流出が大幅に増加し（図１ａ）、４０７８８２が最も有効である。この低い用量（１μＭ）では、ｃＡＭＰで刺激された流出の増加は、既知の補正剤ミグルスタット（２７）を１００μＭ使用して観察した増加量よりも少なかった。４つの活性化合物のそれぞれで処理した後のＩ−流出刺激の例を図１ｂに示す。ＣＦＴＲチャンネルブロッカーＣＦＴＲｉｎｈ−１７２の存在下で実験を実施した場合、ｃＡＭＰで刺激されたＩ−流出は完全に阻止された。
【００４６】
４つの化合物の効果を広範囲の濃度でさらに検査し、１μＭのポケット１の化合物１３０８１３、及びそれぞれ１０μＭ及び８４４ｎＭのポケット２の２つの化合物４０７８８２及び７３１００についてＥＣ５０を測定した（図１ｃ）。ポケット１の１１８２０８のＥＣ５０は、１００μＭでも最大ヨウ化物流出に到達していなかったので、厳密に測定できなかった（図１ｄ）。化合物４０７８８２の効果は、１０μＭで使用した場合、３倍に増加することがあり、ＷＴ−ＣＦＴＲで観察された値に匹敵する刺激流出に到達することは注目に値する（図２）。
【００４７】
ＣＦＴＲ輸送に対する効果に関係なく、化合物が増強活性を有するか否かを検査するために、未処理ＷＴ−ＣＦＴＲＨｅＬａ細胞中にヨウ化物流出を試験した。フォースコリンとともに化合物を添加し、その効果をフォースコリンのみ又はフォースコリンとゲニステインとの場合と比較した。ゲニステインと異なり、検査したすべての分子はフォースコリンのみの場合より多くのＩ−流出を誘導した（図２）。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを救済するために、ミグルスタットで２時間処理したΔＦ５０８−ＣＦＴＲＨｅＬａ細胞で、増強作用も検査した。Ｉ−流出を、フォースコリンのみ、フォースコリンとゲニステイン、又はフォースコリンと別の化合物で刺激した。図３に示すように、ゲニステインのみが流出を増加させることができ、本発明の薬剤に増強活性がないことが実証された。
【００４８】
ＣＦＴＲの成熟に対する薬剤の効果
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ輸送の補正剤としての４つの化合物の有効性を、免疫ブロットでさらに確認した。十分にグリコシル化したバンドＣが検出された場合、これがΔＦ５０８−ＣＦＴＲの適切なプロセッシングを示唆すると仮定した。代表的な免疫ブロットを図４ａに示す。抗ＣＦＴＲ抗体がＷＴ−ＣＦＴＲ細胞に由来するタンパク質の２つのバンド（図４ａのＷＴ−ＣＦＴＲの列）を検出する。約１７０ｋＤａの拡散バンド（バンドＣ）は、ゴルジ装置を通してプロセッシングされた十分にグリコシル化した成熟タンパク質に相当する。約１４５ｋＤａより下のバンドは、小胞体中に局在する中心がグリコシル化した未成熟のタンパク質に相当する。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ発現細胞では、未成熟タンパク質のみが検出可能である（図４ａのΔＦ５０８の列）。バンドＣは、未処理細胞と比較して１μＭの化合物４０７８８２で処理した細胞で明白に検出可能であり、１７０ｋＤａの信号は、１μＭの化合物１１８２０８又は１３０８１３で処理した細胞のＤＭＳＯ処理との違いがなかった、又は１μＭの化合物７３１００で処理した細胞で非常にわずかに増加した。化合物はいずれもタンパク質の総発現量を変化させなかった。バンドＣ＋バンドＢに対するバンドＣの比率として表現される成熟ＣＦＴＲの相対的存在量を図４ｂに示す。化合物４０７８８２のみが、成熟ＣＦＴＲの相対的存在量を大幅に増加させた。
【００４９】
ＣＦＴＲ免疫局在決定における薬剤の効果
図４ｃは、ＷＴ−ＣＦＴＲ発現ＨｅＬａ細胞の細胞膜における典型的なＣＦＴＲ染色を示し、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲは細胞質全体に見られた。１μＭの４０７８８２で細胞を２４時間処理した結果、細胞膜で、又はその付近でＣＦＴＲが明白に染色され、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ輸送の救済が免疫ブロット実験と合致することを示す。細胞を３つの他の化合物１１８２０８、７３１００又は１３０８１３のそれぞれで処理した場合、図４ｃの化合物１１８２０８で示すように、細胞のごく一部分で細胞膜が点々状に断続的に染色されていることが観察された。
【００５０】
様々なポケットに結合した化合物の複合効果
２つの化合物が同じタンパク質配座であるが異なる表面腔に結合することによってΔＦ５０８−ＣＦＴＲを補正することができる場合、その効果は相加的又は相乗的になり得る。２つの独立型のアッセイ、すなわちヨウ化物流出とパッチクランプによって、この仮説を検査した。ヨウ化物透過性検査の結果（図５ａ）は、それぞれ１μＭの化合物１１８２０８と４０７８８２又は１１８２０８と７３１００で細胞を複合処理すると、いずれかの分子のみで観察された結果よりｃＡＭＰ依存性陰イオン流出が多くなることを示した。この系列の実験では、コントロールとして化合物３７１７３を使用した。何故なら、同じ濃度でｃＡＭＰで刺激したヨウ化物流出を全く誘導しなかったからである。図５ａに示すように、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲＨｅＬａ細胞を３７１７３と４０７８８２で同時処理すると、４０７８８２処理のみと同様の振幅でｃＡＭＰで刺激したヨウ化物流出を誘導した。対照的に、化合物１１８２０８及び４０７８８２での同時処理は、各化合物によって誘導された流出の合計に等しい振幅のヨウ化物流出を誘導するが、１１８２０８と７３１００で処理した後は、わずかな相乗効果が観察された。
【００５１】
様々な化合物の活性を、パッチクランプ実験でも評価した。図６ａは、様々な実験条件で−６０ｍＶにて記録した電流振幅の平均値をまとめたものである。ＣＦＴＲ関連電流密度（ＩΔＦ５０８−ＣＦＴＲ；ｐＡ／ｐＦ）は、ｃＡＭＰで刺激した電流から、５μＭのＣＦＴＲｉｎｈ−１７２で阻害し、細胞のキャパシタンスまで正常化した後に記録した電流を引いた値と定義される。ＩΔＦ５０８−ＣＦＴＲは未処理細胞中では非常に低く、記録前に細胞を２７℃で２４時間培養した場合は約３倍刺激された。細胞を１μＭの１１８２０８、４０７８８２又は７３１００のみで２４時間処理しても、個々のコントロールと比較して、電流振幅は増加しなかった（データは図示せず）。しかし、１μＭの１１８２０８と４０７８８２又は１１８２０８と７３１００で２４時間前処理すると、ＩΔＦ５０８−ＣＦＴＲが有意な増加を示した。ｃｐｔｃＡＭＰ＋ＩＢＭＸが存在する状態で刺激する前、及びＣＦＴＲｉｎｈ−１７２で阻害した後に１１８２０８と４０７８８２で前処理した細胞の線形Ｉ／Ｖプロットの例を図６ｂに示す。
【００５２】
ＣＦ−４ＫＭ細胞に対する４０７８８２及び１１８２０８の効果
次に、少量の内在性ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを発現しているΔＦ５０８−ＣＦ患者（ＣＦ−ＫＭ４）由来の上皮漿液細胞株中のＣＦＴＲ依存ヨウ化物流出に対するＨｅＬａ細胞中で活性の４つの分子の効果を検査した。これらの上皮細胞では、化合物４０７８８２及び１１８２０８がなお大量のｃＡＭＰ依存ヨウ化物流出を誘導することができた（図７）。しかし、ＨｅＬａ細胞中でΔＦ５０８−ＣＦＴＲを補正する２つの分子（１３０８１３及び７３１００）は、この細胞株では活性でなかったことに留意されたい。
【００５３】
ΔＦ５０８マウスの鼻電位差に対する７３１００と１１８２０８の効果
細胞での結果は、別々のポケットに作用する分子対が追加の補正効果を示すことを示唆している。これらの分子が生体内で活性であるか否かを検査するために、リポソームに（５：１で）組み込んだ３０μｌの７３１００と１１８２０８（それぞれ、０．１μモル）で、又はリポソームのみで２４時間鼻腔内処理したΔＦ５０８／ΔＦ５０８マウスで、鼻電位差（ΔＶＴＥ）を観察した（２５）。得られた結果を図８にまとめた。ΔＦ５０８マウスでは、ベースのＶＴＥ値、及び１００μＭのアミロライドで鼻上皮を灌流することによって誘導されたΔＶＴＥの変化ΔＶＴＥａｍｉｌが、２種類の分子で、又はリポソームのみで処理したマウスと同様であった。対照的に、マウス５匹中３匹での低Ｃｌ−溶液の灌流は、ＶＴＥを２ｍＶ（ΔＶＴＥａｍｉｌ−ｌｏｗＣｌ）、すなわち処理の有意の効果として発明者らが規定した閾値より大きく過分極化した（原稿は準備中）。ＣＦＴＲ阻害剤ＩＩｎｈ１７２によって明らかとなったＣＦＴＲ関連電流は、（ΔＶＴＥａｍｉｌ−ｌｏｗＣｌ）の約３０％を表す（データは開示せず）。
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【図１】
0006284914.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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