(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ιの構造を有するトリフルオロアセトヒドラジド類化合物であり、
【化１】
0006407444.tif 000004
式中、R1，R2とR3は同一又は異なって、それぞれ独立にH又はアルキル基であり、但し同時にHであることができなく、XとYはNである。
【請求項２】
前記アルキル基は低級アルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
R1，R2とR3は何れもメチル基であり、下記式IIの構造を有する、請求項１又は２に記載の化合物。
【化２】
0006407444.tif 000005
【請求項４】
3,5,6-トリメチル-2-ピラジンホルムアルデヒドと2,4-ジメチルフェニルヒドラジン塩酸塩を縮合して得た中間体フェニルヒドラゾンをトリフルオロ酢酸無水物と反応して最終化合物を得ることを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物の調製方法。
【請求項５】
医薬品が予防または治療に利用される疾患はグルタミン酸興奮毒性、MEF2の機能障害、酸化ストレス損傷もしくはフリーラジカルに関する疾患、または神経変性疾患である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物の医薬品を製造するための使用。
【請求項６】
前記グルタミン酸興奮毒性に関する疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、重症筋無力症、緑内障、老人性痴呆症、甲状腺機能亢進症、高血圧、気管支喘息、IV型高リポタンパク血症、または腎不全である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記MEF2機能障害に関する疾患はパーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆症、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、または重症筋無力症である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記酸化ストレス損傷もしくはフリーラジカルに関する疾患は脳卒中、脳外傷、癲癇、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、 低酸素虚血性脳障害、脳溢血、痴呆症、虚血性心疾患、血管塞栓、粥状動脈硬化症、高コレステロール血症、肺気腫、白内障、糖尿病、急性膵炎、アルコール性肝疾患、腎臓損傷、または癌である、請求項５に記載の使用。
【請求項９】
前記神経変性疾患は脳虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、牛海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、小脳萎縮症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、または脊髄性筋萎縮症である、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬技術分野に属し、神経保護作用を有する多機能性化合物、特に、トリフルオロアセトヒドラジド類化合物、その合成方法、製薬用途及び疾患の予防または治療における応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病(Alzheimer’s disease, AD)は老年期痴呆症の主要タイプであり、老年認知衰退の要因であり、高齢者の生活品質に深い影響を及ぼす神経システム変性疾患である。わが国の複数の疫学調査結果によって、65歳以上の高齢者のAD罹患率が約5%であり、その発病率は通常年齢によって高まる。現在の臨床では認知障害を有効的に逆戻りする医薬品はない。コリンエステラーゼ阻害剤（ドネベジル、リバスチグミン、フペルジンA、ガランタミン）が軽中度のAD患者の治療に対して一定的な治療効果があるが、症状を一時的に軽減するだけで、神経細胞の減衰をさらに阻止することができなく、かつ重大な副作用がある。脳血流と脳代謝改善剤を併用し、例えば、オキシラセタム(oxiracetam)が記憶力の向上において一定的な治療効果を有するが、多くの場合にはスマート・ドラッグとして存在する。アミロイド前駆体タンパク質とβアミロイドに関する医薬品の開発は新た、かつ有望な方法であると見なされている。しかし、イーライリリー等の大手医薬会社が開発した一連のセクレターゼ阻害剤の臨床試験の結果から見れば、この方法は頂門の一針であるのに疑いなく、アミロイド前駆体タンパク質とβアミロイドに関する医薬品の開発も同じで、失敗になってしまう可能性が大きい。
【０００３】
ADの発生原因は多種多様であるから、現在では単一経路或いは単一ターゲットのみに対して投薬するのは良い治療効果を与えることができなく、「一つの薬、一つのターゲット」というパターンを用いるのはこの種類の疾患を根本的に治療することができない。多機能性医薬品(Multifunctional Drugs)は同じ疾患に対して複数の治療メカニズムのある医薬品を指す。一つの疾患の複数のターゲットに対して同時に発効する多機能性医薬品は現在公知の「一つの薬、一つのターゲット」というパターンより潜在力があると多くの医者と科学者に信じられる。多機能性医薬品の対象疾患は主に認知と運動障害、鬱病、統合失調症などの難病を含む(Morphy et al. Drug Discov Today. 2004, 9(15): 641-651)。
【０００４】
前期、我が実験室はアメリカSalk研究所のSchubert教授が合成した神経保護作用を有する化合物J147によって、構造修飾して伝統的な漢方薬センキュウの主要薬効成分リグストラジンを引き入れ、多機能治療メカニズムを有する化合物T-006を得た。T-006はトリフルオロアセトヒドラジド類化合物であり、ADの治療に対して、グルタミン酸受容体の阻害、MEF2の転写活性化、認知力の向上、神経分化作用とフリーラジカルの消去を含む多重の作用メカニズムを有し、且つ細胞特に神経細胞に対してよい保護作用がある。
【０００５】
グルタミン酸受容体は以下の二種類ある。一つはN-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDAR）、カイニン酸受容体(KAR)とα-アミノ基-3ハイドロキシ-5メチル基-4イソオキサゾール受容体（AMPAR）を含むイオン型受容体である。これらはイオンチャネルとカップリングし、受容体チャネル複合体を形成し、ファーストシグナル伝達が仲介する；もう一つは膜内Gタンパク質とカップリングする代謝型受容体(mGluRs)である。これらの受容体は活性化された後、Gタンパク質エフェクター、脳内セカンドメッセンジャーなどからなるシグナル伝達システムを通じて作用し、より緩慢な生理反応が発生する（Wang S J, Yang T T, et al. Drug News Perspect, 2005, 18(9): 561-566）。グルタミン酸は中枢神経システムにおけるもっとも豊富且つ重要なアミノ酸であり、シナプス伝達に参加すると同時に神経細胞の正常の生理機能を維持する。通常の状況では、グルタミン酸の釈放、摂取と再吸収は動的バランスを維持する。しかし、それが過度釈放或いは摂取障害の時には、グルタミンが脳内で大量に蓄積し、濃度が急激に上げ、受容体の過剰活性化により、広範な脳組織病変になってしまう可能性がある（Kumar A, Zou L, Yuan X, et al. Journal of neuroscience research, 2002, 67(6): 781-786）。グルタミン酸のこのような興奮毒性作用は複数種の神経変性疾患の発生、発展とは密接な関りがあり、神経変性疾患中の神経細胞死を導く重要なメカニズムの1つである。
【０００６】
MEF2は四つの亜型構造からなり（MEF2A-D）、はじめは筋肉に発見された核転写因子であり、DNA中のA/Tに富む序列と結合し、多くの筋肉形成と発育に参加する遺伝子発現を調整して制御する。大量の研究により、MEF2が筋肉組織に高度発現するだけでなく、神経システムにも大量に存在し、細胞の分化、成長、形態、存続及びアポトーシスに調剤作用を有することを証明した（Potthoff M J, Olson E N, et al. Development, 2007, 134(23): 4131-4140, McKinsey T A, Zhang C L, Olson E N, et al. Trends Biochem Sci, 2002, 27: 40-47）。MEF2が依存性シナプスの成長及び長期的な記憶の形成を調整できるが、MEF2の記憶形成を促進する作用はまた伝統的な転写因子CREBに違うと大量の実験で表明される（Josselyn S A, Nguyen P V, et al. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, 2005, 4(5): 481-497）。MEF2に対する活性化或いは抑制作用は主としてそのDNA結合の親和力によって決められ、PKA、 CKII and GSK3β、p38、ERK5 and CaMKIV、PP2BはMEF-2 C-端の残基へのアセチル化或いはユビキチン化によって、MEF2の転写活性を活性化し、しかし、神経毒物のリソソームに対する分解及びカスパーゼ( caspase)への表現は何れもMEF2D上のHSc70との結合によってMEF2の転写活性を抑制でき、HDACはそれぞれPP1αとCaMKIIαによる活性化及び抑制によってMEF2の転写活性を抑制できる（Rashid A J, Cole C J, et al. Genes, Brain and Behavior, 2014, 13(1): 118-125）。MEF2の表現は新生ニューロンの生存率を上げることができるが、MEF2の突然変異はアポトーシスニューロンの数の増加及び記憶の減退を引き起こし、一連の神経疾患の発生を起こす可能性がある。ADの病変に参加する微小管関連タンパク質Tauはグリコーゲン合成酵素 キナーゼ3 (GSK3)の基質の一つであり、後者はMEF2Dを直接にリン酸化することによってその活性を抑制し、この過程はADの変性変化に参加する、とWangなどは証明した（Wang X, She H, et al. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(47): 32619-32626.）。Lipton教授の最新の研究結果は、PDの発病メカニズムがMEF2C-PGC1の転写過程の抑制によるミトコンドリア機能の混乱、アポトーシスの発生及び細胞死に密接的な関りがあることを表明した（Ryan S D, Lipton S A, et al. Cell, 2013, 155(6): 1351-1364.）。
【０００７】
AD患者の一つの主要な病理学的特徴はβアミロイドの沈着であり、即ち俗に老人斑と言う。その行動学の重要な変化は学習記憶機能の障害である。βアミロイドはAβと略称し、前駆体タンパク質APPが一連のセクレターゼによる加水分解してなるものである。Aβは主に二つの形式があり、一つはAβ40で、もう一つはAβ42であり、その中Aβ42の比率は約10％である。Aβ42は疎水性が強く、繊維を形成しやすい。これもAD患者の大脳で発見された大脳斑(俗称老人斑)の主要組成成分である。研究により、単一のAβは機体に対して害毒作用がないが、大量のAβの生成、凝集と沈着は一連の神経毒性を引き起こすことができ、例えば、神経シナプスの活動を妨害し、タンパク質の機能障害を起こし、カルシウムの流入を引き起こし、Tauタンパクのリン酸化を促すなどが挙げられると表明した（LaFerla F M, et al. Nature Reviews Neuroscience, 2007, 8(7): 499-509）。
【０００８】
酸化ストレスは機体が刺激を受ける時、体内では大量の酸化物中間体を生成するため、活性酸素と抗酸化システムのバランスが崩れる生理過程である。バランス崩れは大量のフリーラジカルの生成に傾き、抗酸化システムの活性が弱くなるため、機体が酸化損傷するようになってしまう。これらのフリーラジカルは活性酸素フリーラジカル (Reactive oxygen species, ROS)と活性窒素フリーラジカル(Reactive nitrogen species, RNS)を含む。フリーラジカルの生成段階は非常に複雑で、多種の生理生化過程と緊密に関る(Conrad et al. Neurochem Int. 2013, 62(5):738-49)。ニューロンのリン脂質二重層は大量の多価不飽和脂肪酸を有し、脂質過酸化反応が極めて発生しやすいから、ニューロン細胞は他の細胞より、酸化ストレスに対して敏感である(Facecchia K, et al. Journal of toxicology, 2011, 2011.)。中枢神経システムの酸素代謝損傷はより厳重な酸化ストレス作用を引き起こすことができるため、神経システムをさらに損害する(Mohsenzadegan et al. Iran J Allergy Asthma Immunol. 2012 Sep; 11(3):203-16)。通常の生理状況では、体内の過剰なフリーラジカルと過酸化水素(H2O2)、一重項酸素、オゾン(O3)等の活性酸素は抗酸化システムに迅速に消去されることができるが、病理条件ではこの消去力が損傷される。活性酸素の蓄積は核酸切断、酵素鈍化、多糖解重合、脂質過酸化を引き起こし、最後にニューロン死を引き起こすことができる(Yan et al. Free Radic Biol Med. 2013; 62:90-101)。酸化ストレスを引き起こす要素が多く、Aβ、金属イオン及びミトコンドリアなどは何れも酸化ストレス過程では重要な役割を果たすと見なされる。可溶性のAβ含量は過酸化水素の生成速度とは良好な線形関係を示す。Aβはカルシウムイオンチャネルの透過性を変え、NADPH酸化酵素II(NOX2)を活性化することができるため、電子をNADPHから酸素に移し、ROSの生成速度を上げ、同時に酸化還元活性のある金属イオンに対して強い親和力を持つ(Pimentel et al. Oxid Med Cell Longev. 2012; 2012:132-146)。これらの金属イオンと結合した後、過酸化水素を生じることができる。酸化促進剤がAβの生成を促進でき、ビタミンE及び他のフリーラジカル消去剤などの酸化防止剤がAβのニューロンに対する損傷を阻止して認知障害を改善することができる。
【０００９】
ミトコンドリアは細胞内酸化還元反応の主要場所及びエネルギーの主要供与体であり、それによって生成するフリーラジカルは細胞内フリーラジカル総量の90％を超えるから、ミトコンドリアの正常機能はニューロンの正常の生理活性の維持に重要な意義がある(Yan et al. Free Radic Biol Med. 2013, 62:90-101)。Alzheimer’s disease (AD)、Parkinson’ disease (PD)、Huntington病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)と進行性核上性麻痺 (PSP)などの複数の神経変性疾患は主にニューロンミトコンドリアの機能異常によるものであるという観点がある(Du et al. Int J Biochem Cell Biol. 2010, 42(5): 560-572)。AD患者の大脳ニューロンの異なるタイプのミトコンドリア（正常、部分損傷と全部損傷）に対する定量形態学の計数により、同年齢の正常の大脳のニューロンと比べると、AD大脳のニューロン正常ミトコンドリア含量は顕著に減少するが、全部損傷されるミトコンドリアの含量は明らかに増加する（Beal et al. Curr Opin Neurobiol. 1996 6(5): 661-6666）。ミトコンドリア損傷によるニューロン酸化損傷は以下の2つの面に作用する。一つは電子伝達鎖(ETC)の機能を異常にし、フリーラジカルの含量を向上する。もう一つは、ミトコンドリア内のグルタチオン、コエンザイムQ、ビタミンC、ビタミンEなどの抗酸化小分子及び酸化反応触媒酵素の含量を低減することにより、ミトコンドリア内の抗酸化システムの活性を下げる。
【００１０】
アメリカSalk研究所はJ147の臨床前の主な薬理と毒性学研究を既に完成した。J147の前期実験結果はトリフルオロアセトヒドラジド類化合物が良好なドラッガビリティを備えることを充分に表明し、現在はFDAに臨床実験を申告する。また、本発明は伝統的な漢方薬センキュウの主要薬効成分リグストラジン（TMP）をJ147に導入し、J147とTMPの多重作用メカニズムと多機能AD治療活性を兼ね備える新たな化合物T-006を得た。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、グルタミン酸受容体の阻害、MEF2の転写活性化、認知力の向上、神経分化作用とフリーラジカルの消去という強い作用を有し、且つ細胞、特に神経細胞に対して良い保護作用を有するトリフルオロアセトヒドラジド類化合物を提供する。また、本発明は前記トリフルオロアセトヒドラジド類化合物の調製方法を提供する。
また、本発明は前記トリフルオロアセトヒドラジド類化合物が製薬における用途及び疾患の予防と治療における応用を提供する。
【００１２】
本発明の提供する化合物は下記一般式Iの構造またはその薬学的に許容される塩を備えるものであり、
【化１】
0006407444.tif 000002
式中、
R1，R2，R3は同一若しくは異なって、それぞれ独立にH、OH、NH2、COOH、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、脂質基、アミン基またはカルバメートであり、但し同時にHであることができない。
【００１３】
XとYは同一若しくは異なって、それぞれC，N，O，Sであり；但し同時にCであることができない。
【００１４】
実施例によって、一般式Iの好ましい化合物では、XとYは同時にNである。
【００１５】
一般式Iの好ましい化合物では、XとYは同時にNであり、R1，R2とR3は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ独立にアルキル基である。
【００１６】
実施例によって、前記アルキル基は低級アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ブチル基、n-ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、n- ヘプチル基、n-オクチル基、イソプロピル基、 sec-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ネオペンチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基またはシクロヘキシル基が挙げられ、特に、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基が挙げられる。
【００１７】
一般式Iのさらに好ましい化合物では、XとYは同時にNであり、R1，R2とR3はメチル基で、即ち前記化合物の構造は以下（式II）の通りである。
【化２】
0006407444.tif 000003
【００１８】
本発明に関する化合物は細胞、特に神経細胞に対して良い保護作用を有し、細胞保護作用を有する医薬品の調製に用いられる。前記医薬品は患者に提供して服用させる有効治療投与量の前記構造を備える化合物またはその薬学的に許容される塩を含むことができる。
【００１９】
本発明はグルタミン酸受容体の阻害、MEF2の転写活性化、認知力の向上、神経分化作用とフリーラジカルの消去を含む多重の作用メカニズムを有し、且つ細胞特に神経細胞に対してよい保護作用を有する。前記化合物は細胞保護作用を有する医薬品の調製に用いられ、グルタミン酸受容体活性化、MEF2の機能障害またはフリーラジカルなどに関する疾患、老人性痴呆症、パーキンソン病、脳卒中などの神経変性疾患、及び心臓病、糖尿病などフリーラジカルに関する疾患の予防または治療に利用される。前記疾患の予防または治療の方法は患者に本発明に記載の化合物で調製された、有効治療投与量の前記構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬品を服用させることを含む。
【００２０】
以下の定義をもって、本明細書における各技術用語の意味及び範囲を説明して画定する。
【００２１】
本明細書における技術用語「アルキル基」とは、無置換もしくは置換の直鎖、分岐鎖或いは環状の炭素数10もあるアルキル基炭素鎖を指す。直鎖アルキル基はメチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ブチル基、n-ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、n- ヘプチル基、n-オクチル基等を含む。分岐鎖アルキル基はイソプロピル基、 sec-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ネオペンチル基等を含む。環状アルキル基（シクロアルキル基）はシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基とシクロヘキシル基等を含む。アルキル基は一つまたは複数の置換基に置換されてもよい。前記置換基の非制限的例として、NH2、NO2、N(CH3)2、ONO2、F、Cl、Br、I、OH、OCH3、CO2H、CO2CH3、CN、アリール基とヘテロアリール基が挙げられる。技術用語「アルキル基」も無置換もしくは置換の直鎖、分岐鎖或いは環状の炭素数10もあり、鎖に少なくとも一つのヘテロ原子（例えば、窒素、酸素または硫黄）を含むアルキル基炭素を指す。前記直鎖アルキル基は例えばCH2CH2OCH3、CH2CH2N(CH3)2とCH2CH2SCH3を含む。分岐鎖基は例えばCH2CH(OCH3)CH3、CH2CH(N(CH3)2)CH3とCH2CH(OCH3)CH3を含む。前記環状基は例えば六員環CH(CH2CH2)2O、CH(CH2CH2)2NCH3とCH(CH2CH2)2S及びその対応する五員環等を含む。前記アルキル基は一つまたは複数の置換基に置換されてもよい。前記置換基の非制限的例として、NH2、NO2、N(CH3)2、ONO2、F、Cl、Br、I、OH、OCH3、CO2H、CO2CH3、CN、アリール基とヘテロアリール基が挙げられる。
【００２２】
本明細書における技術用語「アリール基」とは、無置換もしくは置換の芳香族化合物、炭素環基とヘテロアリール基を意味する。アリール基は単環式または縮合多環式化合物である。例えば、フェニル基は単環式アリール基である。ナフチル基は縮合多環式アリール基である。アリール基は一つ或いは複数の置換基に置換されてもよく、置換基の非制限的例としては、NH2、NO2、N(CH3)2、ONO2、F、Cl、Br、I、OH、OCH3、CO2H、CO2CH3、CN、アリール基とヘテロアリール基が挙げられる。
【００２３】
ヘテロアリール基は置換もしくは無置換の単環基または多環基に関わり、環内には少なくとも一つのヘテロ原子、例えば窒素、酸素及び硫黄を含む。例を挙げると、典型的なヘテロ環基は一つまたは複数の窒素原子、例えば、テトラゾール基、ピロール基、ピリジル基(例えば、4-ピリジル基，3-ピリジル基，2-ピリジル基等)、ピリンダジン基、インドール基、キノリン基、(例えば、2-キノリン基，3-キノリン基等)、イミダゾール基、イソキノリン基、ピラゾール基、ペラジン基、ピリミディン基、ピリドン基或はピリンダジン基を含む。典型的な一つの酸素原子を含むヘテロ環基は2-フラン基、３-フラン基またはベンゾフラン基を含む。典型的な硫黄ヘテロ原子基はチオフェン基、ベンゾチオフェン基を含む。典型的な混合ヘテロ原子基はフラザニル基、オキサゾール基、イソオキサゾール基、チアゾール基とフェノキサチイン基を含む。ヘテロ環基は一つまたは複数の置換基に置換されてもよい。これらの置換基はNH2、NO2、O-アルキル基、NH-アルキル基、N(アルキル基)2、NHC(O)- アルキル基、ONO2、F、Cl、Br、I、OH、 OCF3OSO2CH3、CO2H、、CO2-アルキル基、CN及びアリール基とポリアリール基を含む。これらの状況は同時に環内のヘテロ原子の酸化、例えば、N-酸化物、ケトンまたはスルフォンを形成するのを含む。
【００２４】
本明細書における技術用語「薬学的に許容される」とは、塩または賦形剤などの化合物に許容されない毒性がないことを指す。薬学的に許可される塩は、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、硫酸塩基、亜硫酸塩基、硝酸塩基、亜硝酸塩基、リン酸塩基、リン酸水素塩基などの無機陰イオンと、酢酸塩基、プロピオン酸塩基、桂皮酸塩基、ベンゼンメタンスルホン酸塩基、クエン酸塩基、乳酸塩基、グルコン酸塩基などの有機陰イオンを含む。薬学的に許容される賦形剤は後文で説明がある。E. W. Martin, in Remington’s Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Company (1995), Philadelphia, PA, 19thed参考。
【００２５】
本発明が関する新規化合物は式(I)と式(II)を備えるTMPトリフルオロアセトヒドラジド化合物を含む。構造式(I)と式(II)が関するトリフルオロアセトヒドラジド化合物はグルタミン酸受容体の阻害、MEF2活性の向上及び強いフリーラジカル消去活性を備え、細胞、特に神経細胞によい保護作用を有し、細胞保護作用を有する医薬品の調製に用いられ、グルタミン酸受容体の過度活性化、MEF2機能障害及び／またはフリーラジカル過剰生成などに関する疾患の治療に用いられる。一般的には神経変性に関する疾患及びフリーラジカルに関する疾患等に用いられることを指す。これらの疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆症、高血圧、下痢、鬱病、喘息、アレルギーが挙げられ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、重症筋無力症、緑内障、老人性痴呆症、甲状腺機能亢進症、高血圧、気管支喘息、IV型高リポタンパク血症、腎不全等のアセチルコリンエステラーゼに関する疾患が挙げられ、脳卒中、脳損傷、癲癇、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、 低酸素虚血性脳障害、脳溢血、痴呆症、虚血性心疾患、血管塞栓、粥状動脈硬化症、高コレステロール血症、肺気腫、白内障、糖尿病、急性膵炎、アルコール性肝疾患、腎臓損傷、癌のような酸化ストレス損傷もしくはフリーラジカルに関する疾患も挙げられ、脳虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、牛海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、小脳萎縮症、多発性硬化症、原発性側索硬化、脊髄性筋萎縮症などの神経変性疾患が挙げられる。
【００２６】
本発明が関るTMPトリフルオロアセトヒドラジド類化合物は、薬学的に許容される塩または薬物複合体の形態で患者に投薬できる。ある複合体は適当なキャリア或は賦形剤と配合して薬物組成物を形成することにより、有効な治療投与量に達することを確保する。「有効な治療投与量」はこの種類の化合物及びその誘導体が治療効果を果たすための必要の投与量を指す。
【００２７】
TMPトリフルオロアセトヒドラジド類化合物は固形剤、半固形剤、液体製剤とエアゾール剤を含む多種の剤型に調製することができる（Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company (1995), Philadelphia, PA, 19th ed）。これらの剤型は具体的に錠剤、丸薬、糖衣錠、顆粒剤、ゲル剤、ペースト、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤及び噴霧剤を含む。これらの剤型は体の一部或は全体の投薬に用いられると同時に、速放或は徐放持続投薬にも用いられる。この種類の薬物の投薬方法は複数種あり、前記方式の他、経口投与、経頬投与、直腸投与、腹膜投与、腹膜内投与、経皮投与、皮下投与と気管内投与などを含む。
【００２８】
TMPトリフルオロアセトヒドラジド類化合物を注射投与する時、水溶性或は脂溶性の溶剤によって、液剤、懸濁液と乳剤に調製できる。脂溶性溶剤は具体的に植物油及び類似の油類、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステル及びグリコールエステル。この種類の化合物はHank’s溶液、Ringer’s溶液或は生理食塩水にさらに溶解しやすい。
【００２９】
TMPトリフルオロアセトヒドラジド類化合物を経口投与する時、常用の技術により薬学的に許容される賦形剤と複合体に調製することができる。これらの賦形剤は前記化合物を患者に投与できる複数の剤型、例えば、錠剤、丸薬、懸濁剤、ゲル剤などに製造できる。経口製剤は調製方法が複数あり、例えば、まず化合物と固形賦形剤を均一に混ぜて、混合物を充分に研磨し、適当な助剤を加えて加工・処理して顆粒にする。経口剤の調製に用いられる助剤は、乳糖、蔗糖、マンニトール或はソルビトールのような糖類、コーンスターチ、コムギ澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドンなどのセルロース類を含む。
【００３０】
本発明が関わるTMPトリフルオロアセトヒドラジド類化合物は一つの加圧器と一つの噴霧器或は乾燥粉末吸入器によって実現する噴霧剤にも調製できる。噴霧器に利用できる適当な噴射剤として、ジクロロジフルオロメタン、フルオロトリクロロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素とジメチルエーテルなどが挙げられる。エアゾール剤投与量は噴射器のバルブにより調節できる。
【００３１】
本発明が関する各剤型は何れもTMPトリフルオロアセトヒドラジド類化合物及びその誘導体の有効治療投与用量に関わる。この種類の化合物の有効治療用量は治療を受ける患者によって決まる。適切な用量を決定する時には患者の体重、病状、服薬方式及び処方医師の主観的判断等の要素を考えに入れるべきである。この種類の多重作用メカニズムの化合物及びその誘導体の有効治療用量は高技量で、かつ経験豊富な処方医師によって決められなければならない。TMPトリフルオロアセトヒドラジド類化合物及びその誘導体の有効治療用量は患者の状況によって変更するにもかかわらず、適切な投与量範囲は10 mg-10 gである。
【００３２】
従来技術と比べ、本発明は以下のメリットを有する。本発明は新たな構造を有するとともに、多重作用メカニズムを有し、グルタミン酸受容体が阻害でき、MEF2活性が向上でき、フリーラジカル活性が強く、かつ細胞、特に神経細胞によい保護作用を有し、細胞保護作用を有する医薬品の調製に有用であり、グルタミン酸受容体、MEF2またはフリーラジカルなどに関する疾患の治療に用いられ、一般的には、老人性痴呆症、パーキンソン病、脳卒中等神経変性に関する疾患、及び心臓病、糖尿病等フリーラジカルに関する疾患の治療に用いられる物質を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１はTMPとT-006の化合物の構造を指す。
【図２】図2はT-006の化学合成経路を示す。
【図３】図3はT-006のIAA誘導PC12細胞損傷に対する保護作用を示す。
【図４】図4はT-006のt-BHP誘導PC12細胞損傷に対する保護作用を示す。
【図５】図5はT-006のIAA誘導皮質ニューロン損傷に対する保護作用を示す。
【図６】図6はT-006のt-BHP誘導皮質ニューロン損傷に対する保護作用を示す。
【図７】図7はT-006のglutamate誘導小脳顆粒損傷に対する保護作用を示す。
【図８】図8はT-006のMPP+誘導小脳顆粒損傷に対する保護作用を示す。
【図９】図9はT-006がPC12細胞のMEF2活性が向上できることを示す。
【図１０】図10Aと図10BはT-006がスコポラミン誘導マウスの記憶障害を顕著に改善できることを示す。
【図１１】図11はT-006がPC12細胞からニューロンへの分化、シナプスの生成と伸長を促すことを示す；
【図１２】図12Aないし図12DはT-006のフリーラジカルに対する消去作用を示す；
【図１３】図13Aないし図13CはT-006が t-BHP誘導PC12細胞のアポトーシスを減少することを示す；
【図１４】図14Aないし図14DはT-006が t-BHP誘導PC12細胞のROSとRNSの上昇を減少することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明に関する実施形態或いは実施例を挙げる。これらの実施形態或いは実施例は本発明の内容をさらに説明するだけで、本発明の保護範囲を制限することではない。
【００３５】
実施例１、化合物T-006の合成(図２)
2,4- ジメチルフェニルヒドラジン塩酸塩(1.72g, 10 mmol)を10 mLのメタノールに溶解し、N2の保護の下で氷浴で3,5,6-トリメチルピラジン-2-ホルムアルデヒド（1.50 g, 12 mmol)を加え、10 min撹拌した後に大量の赤れんが色の沈殿物が析出するまで反応を続ける。吸引漏斗で吸引ろ過して得られた赤れんが色の固体は真空の乾燥箱に移して乾燥した後、直接に次の反応に入る。赤れんが色中間体(3.04 g, 10 mmol)を25mLのメタノールに溶解しN2の保護の下で氷浴で1.68 mlの無水トリエチルアミンと1.7 mlのトリフルオロ酢酸無水物を加え30 min反応させる。TLCで反応を監視し、反応終了後、酢酸エチルで抽出し、無水Na2SO4で乾燥し、減圧して溶剤を蒸発乾固する。シリカゲルカラムで分離させ（酢酸エチル:石油エーテル=1 : 3）、淡黄色固体（3.25 g，89.3%）T-006を得る。ESI-MS: [M+H]+ m/z 365.1. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 2.1(s, 3H), 2.42 (s, 3H), 2.46 (s, 3H), 2.54 (s, 3H), 2.85 (s, 3H),7.08 (d, j = 7.05 Hz, 1H),7.24 (d, J = 7.21 Hz, 1H), 7.25(s, 1H), 7.55 (s,1H); Anal. (C18H19F3N4O) C, H, C; found C 59.44%, H 5.319%, N 15.23%; requires: C 59.33%, H 5.26%, N 15.38%。
【００３６】
実施例2、T-006のIAA誘発PC12細胞損傷に対する保護作用(図3)
PC12細胞を96有孔板に接種して、37℃、5% CO2の培養器に24時間培養した後、100 μl IAA（50 μM）を加えて2時間誘導する。2時間後、培地を吸い出し、各化合物(T-006, TMP, Edaravone)を加えて24時間培養する。その後、各孔にMTTを入れ、4時間後、マイクロプレートリーダーで570nmの吸光度を測定する。その結果として、図3の示すように、T-006はIAA誘導PC12細胞損傷に対して顕著な保護作用を有し、且つ母体化合物TMP及びEdaravoneより遥かに強い。IAA組と比べて****P<0.0001。
【００３７】
実施例3、T-006のt-BHP誘導PC12細胞損傷に対する保護作用(図４)
PC12細胞を96有孔板に接種して37℃、5% CO2の細胞培養器に24時間培養した後、濃度勾配の異なる各化合物(T-006, TMP, Edaravone)を加えて2時間プレインキュベーションする。2時間後、培地を吸い出し、Control組を除いて各孔に100 μl t-BHP(100μM)を入れ、培養器に24時間培養した後、各孔にMTTを入れ、4時間後、マイクロプレートリーダーで570 nmの吸光度を測定する。その結果として、図4の示すように、T-006はt-BHP誘導PC12細胞損傷に対して顕著な保護作用を有し、且つ母体化合物TMP及びEdaravoneより遥かに強い。t-BHP組と比べて****P<0.0001。
【００３８】
実施例4、T-006のIAA誘導皮質ニューロン損傷に対する保護作用。(図5)
E16〜18日のSDマウス胎児皮質ニューロンを96有孔板に接種して37℃、5%CO2の培養器に8日まで培養する。同時に濃度勾配の異なる各化合物(T-006, TMP, Edaravone)を50μl加えControl組を除いて各孔に50μl IAA(40μM)を入れる。培養器に24時間培養した後、各孔にMTTを入れ、4時間後、マイクロプレートリーダーで570 nmの吸光度を測定する。その結果として、図5の示すように、T-006はIAA誘導皮質ニューロン損傷に対して顕著な保護作用を有し、且つ母体化合物TMP及びEdaravoneより遥かに強い。IAA組と比べて****P<0.0001。
【００３９】
実施例5、T-006のt-BHP誘導皮質ニューロン損傷に対する保護作用。(図6)
E16〜18日のSDマウス胎児皮質ニューロンを96有孔板に接種して37℃、5%CO2の培養器に8日まで培養する。同時に濃度勾配の異なる各化合物(T-006, TMP, Edaravone)を50μl加えControl組を除いて各孔に50 μl t-BHP(50 μM)を入れる。培養器に24時間培養した後、各孔にMTTを入れ、4時間後、マイクロプレートリーダーで570 nmの吸光度を測定する。その結果として、図6の示すように、T-006はt-BHP誘導皮質ニューロン損傷に対して顕著な保護作用を有し、且つ母体化合物TMP及びEdaravoneより遥かに強い。t-BHP組と比べて****P<0.0001。
【００４０】
実施例6、T-006のglutamate誘導小脳顆粒細胞損傷に対する保護作用。(図7)
初代小脳顆粒細胞は生後7〜8日、15〜20gのSD乳飲みマウスから抽出され、37℃、5%CO2の培養器に8日まで培養する。濃度勾配の異なる各化合物(T-006)を90μl加えて培養器に2時間孵化し、Control組を除いて各孔に10μl glutamate(最終濃度75μM)を入れる。培養器に24時間培養した後、各孔にMTTを入れ、4時間後、マイクロプレートリーダーで570 nmの吸光度を測定する。その結果として、図7の示すように、T-006はglutamate誘導小脳顆粒細胞損傷に対して顕著な保護作用を有し、且つ良い濃度依存性を示す。glutamate組と比べて**P<0.01。
【００４１】
実施例7、T-006のMPP+誘導小脳顆粒損傷に対する保護作用。(図8)
初代小脳顆粒細胞は生後7〜8日、15〜20gのSD乳飲みマウスから抽出され、37℃、5%CO2の培養器に8日まで培養する。濃度勾配の異なる各化合物(T-006)を90 μl加えて培養器に2時間孵化し、Control組を除いて各孔に10μl MPP+ (最終濃度35μM)を入れる。培養器に24時間培養した後、各孔にMTTを入れ、4時間後、マイクロプレートリーダーで570 nmの吸光度を測定する。その結果として、図8の示すように、T-006はMPP+誘導小脳顆粒細胞損傷に対して顕著な保護作用を有し、且つ良い濃度依存性を示す。MPP+組と比べて**P<0.01。
【００４２】
実施例8、T-006がPC12細胞のMEF2転写が活性化できる。(図9)
MEF2レポーター遺伝子  pGreenFire1TM-MEF2-EF1レンチウイルスべクター(lentivector)をクローンすることによってPC12をトランスフェクションする。安定トランスフェクションされたPC12細胞を普通の方法で培養し、96有孔板に接種して、粘着した後、濃度勾配の異なるT-006を加えて24時間孵化し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子試薬キット(Luciferase reporter assay kit, Promega, USA)方法で活性を測定する。その結果として、図9の示すようにT-006がPC12細胞のMEF2転写活性を顕著に活性化できる。IAA組と比べて**P<0.01。
【００４３】
実施例9、T-006はスコポラミン誘導マウスの記憶障害を顕著に改善できる。(図10Aと図10B)
本実験は昆明マウスを採用する。それを正常対照組(control, Ctrl)、スコポラミンモデル組(Scopolamine, Sco)、ドネペジル治療組(Sco+3 mg/kg donepezil)、1 と10 mg T-006治療組(Sco+1 mg/kg T-006和Sco+1 mg/kg T-006)に分ける。2週間連続で胃内注入の方式で投薬し、最終回に24h投薬し、水迷路試験訓練を行い、4日続ける。訓練前の30 minに腹腔にスコポラミンモデル(1mg/kg)を注射して、モデルを作る。第5日は空間捜索実験である。データはMean± SDで表示される(各組の動物n=9)。その結果として、図10 Aと図10Bの示すように、スコポラミン誘導マウスの記憶が明かに損傷され、初めてプラットフォームに着く潜伏期は顕著に延長し、ターゲットプラットフォームを通す回数は減少し（正常対照組と比較して、##p<0.01）、1と10mgT-006治療組及び3 mg/kgドネペジル治療組はスコポラミンモデル誘導の記憶損傷を顕著に改善でき（スコポラミンモデル組と比較して、**p<0.01）、且つ10mg/kgT-006の治療効果は3mg/kgドネペジル($p < 0.05)より明らかに優れている。
【００４４】
実施例10、T-006はPC12細胞からニューロンへの分化、シナプスの生成と伸長を促す。(図11)
PC12細胞を6有孔板に接種して37℃、5%CO2の培養器に24時間培養する。Control組培地が変えず、NGF対照組には、無血清F-12K + 50 ng/ml NGF、薬物処理組は濃度の異なるT-006を含む無血清F-12Kを使って、72時間孵化した後、倒立顕微鏡で撮影し、各孔にランダムに5つの視野を撮り、例えば、細胞シナプスの長さが細胞体の二倍を超えると、細胞分化、シナプス形成と見なす。その結果として、図11の示すように、T-006と陽性対照NGFが何れもPC12細胞の分化、シナプスの生成と伸長を顕著に促し、かつ濃度依存性を呈する。Control組と比べて**P < 0.01。
【００４５】
実施例11、化合物のOH●、O2●-、ONOO-，DPPHフリーラジカルに対する消去作用(図12 Aないし図12D)
水酸基フリーラジカル(OH●)：フェナントロリン-金属イオン-H2O2を採用して Fenton 反応 (H2O2 + Fe2+ → ・OH + H2O + Fe3+)を通じて、水酸基フリーラジカルを生成し、フェナントロリン-Fe2+をフェナントロリン-Fe3+に酸化させ、その水溶液が波長440nmに最大消失し、その消去率を測量して計算する。具体的なステップは下記のとおりである。48有孔板に300μLの再蒸留水（ブランク）或いは濃度の異なるT-006、TMP、Edaravone（DMSOで溶解し10 mMの貯蔵液を配合してから、再蒸留水で4μM、20μM、80μM、320μMに希釈する）を入れ、50μL of 1.0 mMのフェナントロリン (50 mM NaCl溶液に溶解して1.0mMを配合する)を加えて、そして、それぞれ125 μL 1.0 mM H2O2と125 μL 2.0 mM Fe2+を入れて均一に混合し、BioTek Synergy HTマイクロプレートリーダーで100秒内の440 nm波長の吸光度の減少百分率を測定する。水酸基フリーラジカル消去率計算公式は消去率(%)= [1−(A0−A100)/A0]×100 %で、A0とA100はそれぞれ0秒と100秒の時の光吸収値である。
【００４６】
超酸化物陰イオンフリーラジカル(O2●-)：ピロガロールの自動酸化方法を利用して、具体なステップは下記のとおりである。48有孔板にそれぞれ250 μL 50 mM Tris-HClの緩衝液(pH 8.2)、300 μLの再蒸留水(ブランク組)或いは濃度の異なるT-006、TMP、Edaravone（DMSOで溶解して10 mMの貯蔵液を配合してから、再蒸留水で4μM、20 μM、80μM、320μMに希釈する）を入れる。50μL ２.0 mMのピロガロールを入れて渦型混合機で均一に混合する。ブランクで320 nm波長に30秒ごとに記録し、30 min連続でBioTek Synergy HTマイクロプレートリーダーで光吸収値を測定し、同様の条件でサンプルの光吸収値を測定する。酸化速度は一分間の吸光度の増加値である。線形回帰法は時間(秒)を横座標とし吸光度値を縦座標とし図を作って吸光度値と時間の線形関係を得て、ピロガロールの自動酸化率を計算して、結果は毎秒の吸光度値の増加量dA/dtで示し、即ち線形回帰方程式におけるy = ax+b中のa値である。消去率(%)=(dA/dt−dAs/dt)/(dA/dt)。dA/dtはサンプルのない条件下のピロガロールの自動酸化率で、dAs/dtはサンプルのある条件下のピロガロールの自動酸化率である。
【００４７】
過酸化亜硝酸フリーラジカル(ONOO-): 過酸化亜硝酸フリーラジカル(ONOO-)の測定はSIN-1で体内のONOO-生成過程を模擬し、SIN-1が弱アルカリ性の条件で（PBS pH 7.4）分解し、スーパーオキシドアニオンフリーラジカル（O2●-）及び一酸化窒素フリーラジカル(NO・)を同時に生成し、両者が瞬時に過酸化亜硝酸陰イオン(ONOO-)を生成する。ONOO-はルミノールと反応し、それを酸化活性化し、脱励起する時に425 nm波長の光を発射し、その発光強度を測定するとONOO-の生成を判断できる。酸化防止剤（AH）とルミノール（L）は競ってONOO-と反応し、ONOO-とLH-の反応を減少し、発光強度を下げる。その発光強度は酸化防止剤の酸化防止力とは負相関があるため、反応前後の発光強度の変化によって定量分析を行うことができる。具体的な実験ステップは下記のとおりである。3 mLの丸底型の光度計管にそれぞれ300 μL 0.1 M PBS緩衝液(pH 7.4)、50μL 1 mM Luminol 溶液、100μL PBS或いは濃度の異なるT-006、TMP、Edaravoneを入れる（DMSOで溶解して10 mMの貯蔵液を配合し、再蒸留水で4μM、20μM、80μM、320μMに希釈する）。50μL 3 mg/mLのSIN-1 hydrochloride溶液を入れて渦型混合機で均一に混合する。ブランクで光度計管を37℃の温度制御条件に置き、発光機器で100秒ごとに発光値を記録し、2000秒続けて記録し、各濃度に対して少なくとも三回繰り返してその平均値を取る。消去率は以下の公式で計算する。消去率(%)= (Actrl -Asample)/Actrl ×100。
【００４８】
1,1-ジフェニル基-2-フェニルヒドラジンフリーラジカル(DPPH)：1,1-ジフェニル基-2-フェニルヒドラジンフリーラジカル(DPPH) 分光測光法の測定原理はDPPHが517 nmに強吸収があり、そのメタノール溶液が深い紫色であることを根拠とする。フリーラジカル消去剤が存在する時、それが単電子とペアリングするから、その吸収力が次第に消え、その退色程度が受ける電子数と定量関係がある。従って、反応前後の吸光度の変化によって定量分析を行うことができる。濃度の異なるサンプルのDPPHに対する吸光度値の変化を測定することにより、消去率でフリーラジカルへの消去力の強弱を表すことができる。具体的な実験ステップは下記のとおりである。96有孔板にそれぞれ100μLの濃度の異なるT-006、TMP、Edaravone（DMSOで溶解し10 mMの貯蔵液に配合し、再蒸留水で4μM、20μM、80μM、320μMに希釈する）或いは100μLメタノール(ブランク組)を入れ、そして100μL 100μMのDPPHメタノール溶液(最終濃度50 μM)を迅速に添加する。各サンプル濃度は孔が3-5個あり、均一に混ぜた後遮光条件で室温下に1時間放置し、そして、マイクロプレートリーダーの517nm波長の吸光度値を測定し、消去率は以下の公式で計算する。消去率(%)=(Actrl−Asample)/Actrl ×100。
【００４９】
実施例12、T-006はt-BHP誘導PC12細胞のアポトーシスを減少する。(図13 Aないし図13C)
PC12細胞を96有孔板に接種して37℃、5% CO2の培養器に24時間培養した後、濃度勾配の異なるT-006 とTMP (100μM)を加えて2時間プレインキュベートする。2時間後、培地を吸い出し、Control組を除いて各孔に100 μl t-BHP(100 μM)を入れ、培養器に置いて24時間培養した後、Hoechst作動液を入れ、蛍光顕微鏡で観察してPC12細胞アポトーシスの数を統計する。(A) T-006はt-BHP誘導のPC12細胞アポトーシスを減少する。（B）PC12細胞アポトーシスの数を統計する。（C）T-006は t-BHP誘導のPC12細胞ミトコンドリア膜電位紊乱作用を改善する。PC12細胞を96有孔板に接種して37℃、5% CO2の培養器に24時間培養した後、濃度勾配の異なるT-006 と TMP (100μM)を加えて2時間プレインキュベーションする。2時間後、Control組を除いて各孔に100 μl t-BHP(100 μM)を入れて誘導する。誘導完了後、各孔にJC-1作動液を入れ、フローサイトメーターでミトコンドリア膜電位測定分析を行う。control組と比べて、###p<0.001; t-BHPと比べて、*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001。
【００５０】
実施例13、T-006が t-BHP誘導PC12細胞のROSとRNSの上昇を減少させる。(図14 Aないし図14D)
PC12細胞を96有孔板に接種して37℃、5% CO2の培養器に24時間培養した後、濃度勾配の異なるT-006 とTMP (100μM)を加えて2時間プレインキュベートする。2時間後、培養基を吸収しControl組を除いて各孔に100μl t-BHP(100 μM)を入れ、培養器に6 時間培養した後、それぞれDCF-DAプローブ、HFPプローブ、DAF-FMプローブとDHR123プローブを入れて、細胞内のROS総量、水酸基フリーラジカル、一酸化窒素フリーラジカルと過酸化亜硝酸を測定する。（A）DCF-DAプローブで細胞内のROS総量を測定する。（B）HFPプローブで細胞内の水酸基フリーラジカルを測定する。（C）DAF-FMプローブで一酸化窒素フリーラジカルを測定する。（D）DHR123プローブで細胞内の過酸化亜硝酸を測定する。control組と比べて、###p<0.001; t-BHPと比べて、*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001。
【００５１】
本文では一部の具体的な実施例に対して詳しく説明するが、これは発明の目的実例の説明に過ぎなく、以下の請求の範囲の範囲を制限しない。本文の具体方案に対する違った差し替え、変更と修飾は全部本発明の請求項に定義される内包と外延を逸脱しないため、本出願の保護請求する発明の範囲に属する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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