(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
装置であって、
ポリマー分離媒体中に形成された複数のマイクロウェルを含む該ポリマー分離媒体を含み、
前記ポリマー分離媒体が、紫外線を適用すると前記分離媒体中の１つ以上の対象試料成分に共有結合するベンゾフェノン官能基を含み、
前記マイクロウェルが、単一細胞を収容するように寸法決定される、
前記装置。
【請求項２】
前記ポリマー分離媒体の表面に接触する固体支持体を更に含み、
前記装置が、前記ポリマー分離媒体および前記固体支持体のうち１つ以上の一部分を通過する少なくとも１つのチャネルを含む、
請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記マイクロウェルが、前記ポリマー分離媒体中でマイクロウェルのアレイとして配列される、
請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記マイクロウェルが、前記ポリマー分離媒体の前記表面上にある開口端部、および前記ポリマー分離媒体中にある反対の閉口端部を含む、
請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記ポリマー分離媒体が、外周部上に位置付けられ、かつ中心ウェルと流体連通している複数のマイクロウェルを含む前記中心ウェルを含む、
請求項１に記載の装置。
【請求項６】
各マイクロウェルが、前記中心ウェルと流体連通している開口端部、および前記ポリマー分離媒体中にある反対の閉口端部を含む、
請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記マイクロウェルが、前記中心ウェルの実質的に全外周部の周りに配列される、
請求項５に記載の装置。
【請求項８】
前記ポリマー分離媒体が、１００個以上のマイクロウェルを含む、
請求項１〜７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
前記マイクロウェルの前記開口端部が、前記マイクロウェルの前記閉口端部を上回る幅を有する、
請求項４または６に記載の装置。
【請求項１０】
方法であって、
試料を、請求項１〜９のいずれかに記載の装置におけるポリマー分離媒体と接触させることと、
前記ポリマー分離媒体に、前記試料の少なくとも一部の成分を前記マイクロウェルから前記ポリマー分離媒体へと移動させるのに十分な様態で電場を適用して、前記ポリマー分離媒体中で分離した試料成分をもたらすことと、
を含む前記方法。
【請求項１１】
前記試料が、細胞および／または細胞成分を含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞を溶解して、前記試料中で前記細胞成分をもたらすことを更に含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞をインキュベートして、前記試料中で前記細胞成分をもたらすことを更に含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマー分離媒体中で前記分離した試料成分を固定することを更に含む、
請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記分離した試料成分を検出することを更に含む、
請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記検出することが、前記分離した試料成分を分析物検出試薬と接触させることを含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分離した試料成分を第２の分析物検出試薬と接触させることを更に含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマー分離媒体を撮像して、前記分離した細胞成分の画像をもたらすことを更に含む、請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれかに記載の装置と、
前記装置を包む包装と、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に準拠し、本出願は、２０１３年３月７日に出願された米国仮出願第６１／７７４，５１９号、２０１３年３月２６日に出願された米国仮出願第６１／８０５，４１４号、および２０１３年８月１５日に出願された米国仮出願第６１／８６６，３９６号の出願日への優先権を主張し、その各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援への参照
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＯＤ００７２９４、および国立科学財団によって授与された助成金番号１０５６０３５の下で政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
序文
種々の分析技法を使用して、所与の試料中の特定の分析物を分離および検出することができる。様々な関連する免疫ブロッティングは、生体分子分離およびアッセイを合わせることによって、例えば、ＤＮＡ（サザンブロット）、ＲＮＡ（ノーザンブロット）、タンパク質（ウエスタンブロット）、およびタンパク質間相互作用（ファーウエスタンブロット）の識別および半定量的特性評価を可能にした。例えば、ウエスタンブロッティングは、試料中のタンパク質を分離するためのゲル電気泳動を使用し、その後の標的タンパク質に特異的な抗体を用いるプロービングによって、試料中のタンパク質を検出することができる。典型的なウエスタンブロットでは、ゲル電気泳動を使用して、３Ｄ構造によって天然タンパク質を、またはポリペプチドの長さによって変性タンパク質を分離する。タンパク質は次に、膜（典型的にはニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）に移動し、そこで標的タンパク質に特異的な抗体を使用してプロービング（検出）される。
【０００４】
希少細胞集団のプロテオーム解析は、分析試料中の非常に低い細胞濃度が原因で、困難となり得る。例えば、循環腫瘍細胞は血液１ｍＬ当たり１〜１０細胞で存在し得、正確な結果を得るには約１０６細胞を必要とする従来のアッセイ（例えば、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー）には好適でないことがある。加えて、大規模な細胞集団の分析は、平均とは異なる挙動をする亜集団を不明瞭にし得る。細胞間変動は異なる結果につながり得るため、個別細胞挙動の研究は、単一細胞分析によって行い得る。
【発明の概要】
【０００５】
電気泳動分離装置およびそれを使用するための方法を提供する。本開示の実施形態の態様は、複数のマイクロウェルを有するポリマー分離媒体を含む装置を含む。ポリマー分離媒体は、適用刺激を適用すると分離媒体中の１つ以上の目的とする試料成分に共有結合する官能基を含む。
【０００６】
一部の実施形態では、装置は、ポリマー分離媒体の表面に接触する固体支持体を更に含み、ここで装置は、ポリマー分離媒体および固体支持体のうち１つ以上の一部分を通過する少なくとも１つのチャネルを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、マイクロウェルは、ポリマー分離媒体中でマイクロウェルのアレイとして配列される。一部の実施形態では、マイクロウェルは、ポリマー分離媒体の表面上にある開口端部、およびポリマー分離媒体中にある反対の閉口端部を含む。
【０００８】
一部の実施形態では、ポリマー分離媒体は、外周部上に位置付けられ、かつ中心ウェルと流体連通している複数のマイクロウェルを有する中心ウェルを含む。一部の実施形態では、各マイクロウェルは、中心ウェルと流体連通している開口端部、およびポリマー分離媒体中にある反対の閉口端部を含む。一部の実施形態では、マイクロウェルは、中心ウェルの実質的に全外周部の周りに配列される。一部の実施形態では、装置は、ポリマー分離媒体を保持する固体支持体を含み、ここで装置は、ポリマー分離媒体および固体支持体のうち１つ以上の一部分を通過する少なくとも１つのチャネルを含む。
【０００９】
一部の実施形態では、ポリマー分離媒体は、１００個以上のマイクロウェルを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、マイクロウェルは、単一細胞を収容するように寸法決定される。
【００１１】
一部の実施形態では、マイクロウェルの開口端部は、マイクロウェルの閉口端部を上回る幅を有する。
【００１２】
一部の実施形態では、適用刺激は光である。
【００１３】
本開示の態様は、試料を、複数のマイクロウェルを有するポリマー分離媒体と接触させ、ポリマー分離媒体に、試料の少なくとも一部の成分をマイクロウェルからポリマー分離媒体へと移動させるのに十分な様態で電場を適用して、ポリマー分離媒体中で分離した試料成分をもたらすことを含む方法を、更に含む。一部の実施形態では、ポリマー分離媒体は、適用刺激を適用すると分離媒体中の１つ以上の目的とする試料成分に共有結合する官能基を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、試料は、細胞および／または細胞成分を含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞を溶解して、試料中で細胞成分をもたらすことを含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞をインキュベートして、試料中で細胞成分をもたらすことを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本方法は、ポリマー分離媒体中で分離した試料成分を固定することを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、本方法は、分離した試料成分を検出することを含む。一部の実施形態では、検出することは、分離した試料成分を分析物検出試薬と接触させることを含む。一部の実施形態では、本方法は、分離した試料成分を第２の分析物検出試薬と接触させることを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、本方法は、ポリマー分離媒体を撮像して、分離した細胞成分の画像をもたらすことを含む。
【００１８】
本開示の態様はまた、キットも含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に開示の装置、および本装置を包む包装を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】ａは、本開示の実施形態に従う単一細胞ウエスタン（ｓｃウエスタン）ブロッティングアッセイの画像および図を示す。ｂは、本開示の実施形態に従う、オープンゲル（ｏｐｅｎ−ｇｅｌ）ｓｃウエスタンブロッティングを、細胞沈降、改変ＲＩＰＡ緩衝液を用いた化学的溶解、ＰＡＧＥ（Ｅ：電場）、可変多孔率を持つ光活性捕捉ゲル（ＰＡＣＴゲル）上へのＵＶタンパク質固定化（ｈｖ：光子エネルギー）、および拡散駆動型抗体プローブ法（例えば、一次および蛍光標識された二次抗体プローブ、１°Ａｂおよび２°Ａｂ＊）を含んだ、４時間の多段式アッセイとして実行した、プロセスの流れ図を示す。
【図１Ｂ】ｃは、本開示の実施形態に従う、１５μｍの蛍光ビーズの広視野顕微鏡写真、およびローダミン−ＰＡゲル（ＧＥＬ）中で沈降させた生きたＥＧＦＰを発現しているラットの神経幹細胞（ＮＳＣ）の共焦点顕微鏡写真を示す。ｄは、本開示の実施形態に従う、５５０μｍの分離距離にあるＰＡＧＥ分解された５個の蛍光標識タンパク質の画像を示す（ＤＲＯ、ドロンパ２７ｋＤａ；ＯＶＡ、オボアルブミン４５ｋＤａ；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン６６ｋＤａ；ＯＶＡ’、ＯＶＡ二量体９０ｋＤａ；ＢＳＡ’、ＢＳＡ二量体１３２ｋＤａ）。ｅは、本開示の実施形態に従う、単一のラットＮＳＣからのＥＧＦＰおよびβ−チューブリン（βＴＵＢ）のｓｃウエスタン分析を示す（ＲＦＵ：相対的蛍光単位）。
【図２Ａ】ａは、本開示の実施形態に従う、神経幹細胞（ＮＳＣ）集団のｓｃウエスタンブロッティングの画像を示す。ｂ（右上）は、本開示の実施形態に従う、ウェル当たりの細胞（ｃｅｌｌｓ−ｐｅｒ−ｗｅｌｌ）によって分類した（０’ｓ、１’ｓ、２’ｓなど）、βＴＵＢの４，１２８ブロットにわたるライン蛍光強度のプロファイルによって示される、ｓｃウエスタンアレイにわたる分離一様性性能のグラフを示す。ｂ（左下）は、任意蛍光単位（ＡＦＵ）におけるβＴＵＢのプロファイルプロット下の総蛍光に加え、ウェル当たりの細胞の数の移動平均（ｂ（左上）、ｓｃウエスタンアレイにわたるマイクロウェル占有率および蛍光読出における空間的変動を追跡）のグラフを示す。移動平均ウインドウサイズは、３０ブロットであった。ウェル番号は、マイクロウェルブロックによって順序付け、アレイの左手から右手に移動する。ｂ（右下）は、ウェル当たりの細胞によって分類し、細胞分裂の存在下でのｍＲＮＡの動態およびタンパク質産生を説明するガンマ分布に当てはめたヒストグラムを示す（ａ１’ｓ＝１４．８、ａ２’ｓ＝２３．０、ａ３’ｓ＝２８．６、ｂ１’ｓ＝１．６×１０５、ｂ２’ｓ＝ｂ３’ｓ＝１．８×１０５）。
【図２Ｂ】ｃは、本開示の実施形態に従って、固着させたＮＳＣ（ＥＧＦＰトランスフェクト、＋ｖｅ、および非トランスフェクト、−ｖｅのＮＳＣ）中のＥＧＦＰの抗体プロービング後の、単一およびゼロのウェル当たりの細胞によるＥＧＦＰブロットについての較正した蛍光分布のグラフが、発現ゲーティングおよびダイナミックレンジにおいて、従来型フローサイトメトリーと同等であったことを示し、ａｒｃｓｉｎｈ変換スケールに留意されたい。
【図２Ｃ】ｄは、本開示の実施形態に従って、ＥＲＫ１、ｐＥＲＫ１（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、βＴＵＢ、およびＥＧＦＰ精製標準物についての線形の直接的較正曲線（±ＳＤ、ｎ＝ドットブロット当たり3つの目的領域）が、およそのＥＲＫおよびβＴＵＢの生理学的濃度範囲（細胞内濃度の文献値から予想したブロットしたバンドにおける濃度に較正した）に及ぶことを示す。ｄ（下）は、直接的および間接的方法を使用して導き出したＥＧＦＰ較正曲線のシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）分析（ｎ＝ドットブロット当たり3つの目的領域）によって２７，０００分子の検出限界が示されたグラフを示す。残留蛍光シグナルのストリッピングおよび再撮像後の間接的な較正スライドに対する、効果的なストリッピング性能が示された。
【図３Ａ】ａは、本開示の実施形態に従う、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路動態、および分子量に対するゲーティングによる標的外プロービングの最小化した寄与を捕捉した単一細胞ウエスタンブロットを示す。ａ（上）は、βＴＵＢおよびＥＧＦＰラダーに対する、ＥＲＫ１／２（ＥＲＫ）およびリン酸ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、ｐＥＲＫ）についてプローブした単一ラットＮＳＣのｓｃウエスタンブロットの蛍光顕微鏡写真および線変化図を示す（ＲＦＵ：相対的蛍光単位）。ａ（下）は、ＭＥＫ１／２およびリン酸ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）の類似の顕微鏡写真を示す。一次抗体ブロットを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識した二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識したＥＧＦＰを除く）を使用して、各プロービングの間にストリッピングを挟み、ｐＥＲＫ、ＥＲＫ／ＥＧＦＰ共プローブ、βＴＵＢ、ｐＭＥＫ、ＭＥＫの順でプローブした。ｂは、本開示の実施形態に従う、１０３ｋＤａのｐＥＲＫ標的外バンドでのプロービングの、その総蛍光シグナルへの寄与のグラフを示す。
【図３Ｂ】ｃは、本開示の実施形態に従う、１６時間の欠乏状態後のラットＮＳＣの２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ刺激についてのレーン当たり約３０，０００細胞の従来型ウエスタンブロットを示す。ｄは、マイクロウェルに播種したラットＮＳＣを２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦで刺激した際の、それぞれ総ＥＲＫおよびＭＥＫに対する比としての特定のｐＥＲＫおよびｐＭＥＫバンド蛍光の倍数変化バイオリンプロットを示す。本開示の実施形態に従って、ａｒｃｓｉｎｈ変換スケールに留意されたい。プロットは、ｄにおける従来型ウエスタンブロットからの濃度測定によって判定した対応するデータと重なり、比率測定基準がｐＥＲＫ／ｐＭＥＫにおける技術的ノイズ閾値を下回るというブロットからのデータが示された。＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【図３Ｃ】ｅは、本開示の実施形態に従う、ハイスループット免疫細胞化学による相補的ＥＲＫおよびＭＥＫリン酸化データを示す。細胞をｐＥＲＫ／ＥＲＫペアおよびｐＭＥＫ／ＭＥＫペアについて共プローブした。リン酸化標的を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識した二次抗体を使用してプローブし、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ｐＥＲＫ、ＥＲＫ、およびＭＥＫを持つ全標的は細胞質に局在し、ｐＭＥＫ抗体は、不適正な核局在化を示した。
【図４Ａ】ａは、本開示の実施形態に従う、単一細胞ウエスタンブロットを使用して強い形態学的勾配の存在下でのＮＳＣ分化動態を追跡した画像を示す。ａ（上）は、幹細胞マーカ（ネスチン（ＮＥＳＴ）、ＳＯＸ２）および分化マーカ（βＩＩＩチューブリン（βＩＩＩＴＵＢ）、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ））についての従来型免疫細胞化学によってプローブした、０日目および６日目のラット神経幹細胞の混合分化培地に存在する細胞型の広視野蛍光顕微鏡写真を示す。ｂは、本開示の実施形態に従う、ａ中のように固着させ染色した、ｓｃウエスタンマイクロウェル中に播種したＮＳＣについての蛍光顕微鏡写真を示す。明視野画像を重ねて、マイクロウェル辺部を強調した。ｃは、本開示の実施形態に従う、ローダミンでタグ付けしたゲル（ＧＥＬ）内に沈降した、固着させ染色した幹細胞型（ＮＥＳＴ＋、ＳＯＸ２＋）、神経細胞型（βＩＩＩＴＵＢ＋）、および星細胞型（ＧＦＡＰ＋）の共焦点画像を示す。
【図４Ｂ】ｄは、本開示の実施形態に従う、神経幹細胞および分化マーカのｓｃウエスタンブロットについての蛍光顕微鏡写真および線変化図を示す（ＲＦＵ：相対的蛍光単位）。ＳＯＸ２（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識した二次抗体）およびネスチン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識）を、ＧＦＡＰ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５標識）およびβＩＩＩＴＵＢ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識）のように、別のブロック中で共プローブし、次に、ブロックの両セットをストリッピングし、βＴＵＢ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５標識）およびＥＧＦＰ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識）について共プローブした。各日からのブロットのセットは、対応するセットと同一のアレイ行における分離からであったＥＧＦＰブロットを除いて、同一の分離からであった。ｅは、本開示の実施形態に従う、分化０日目および６日目のマーカについての、レーン当たり約３０，０００個の細胞の従来型ウエスタンブロットを示す。
【図４Ｃ】ｆは、６日間の分化実験にかけてのβＴＵＢブロット蛍光によって正規化した、幹細胞および分化マーカ総ｓｃウエスタンブロット蛍光のプロットを示す。本開示の実施形態に従って、ａｒｃｓｉｎｈ変換スケールに留意されたい。
【図５】上図は、本開示の実施形態に従う、ベンゾフェノンメタクリルアミド（ＢＰＭＡ）モノマーのカルボニル官能基と標的ポリペプチドとの間の共有結合反応が光刺激の適用の際に発生する、光活性化ベンゾフェノン官能化ポリアクリルアミドゲルを示す。下図は、本開示の実施形態に従う、ベンゾフェノンメタクリルアミド（ＢＰＭＡ）モノマーのカルボニル官能基と標的ポリペプチドとの間の光活性化共有結合反応の反応スキームの分子モデルを示す。
【図６】本開示の実施形態に従う免疫ブロットワークフローを示す。
【図７】本開示の実施形態に従う、ゲル捕捉精製タンパク質分離のゲル内プロービングの画像を示す。
【図８】ａおよびｂは、本開示の実施形態に従う、実施例２中の単一細胞免疫ブロット較正における、精製ＥＧＦＰの直接的および間接的較正手順を示す。ａおよびｂは、単一細胞免疫ブロッティングアッセイにおけるダイナミックレンジおよび検出限界を判定するために使用した、２つの較正方法の略図を示す。ａ：分離および捕捉前のマイクロウェル中のＥＧＦＰ分子を計数することにより、直接的較正を行った。ｂ：マイクロウェルおよびゲルＥＧＦＰ濃度を平衡状態で取った蛍光値から推測した個々の実験において作図した分配曲線（図９に示すａ〜ｃを参照されたい）からＥＧＦＰ分子の数を推測することにより、間接的較正を行った。
【図９】ａは、本開示の実施形態に従う、Ｋ＝（［ＥＧＦＰ］ゲル−［ＥＧＦＰ］ゲル，ｂｇ）／（［ＥＧＦＰ］ウェル−［ＥＧＦＰ］ウェル，ｂｇ）によって、修飾ＲＩＰＡ緩衝液中でＥＧＦＰの希釈シリーズを用いてインキュベートした８％Ｔのゲルシート中のマイクロウェルブロックについて判定したＥＧＦＰの分配曲線を示し、式中、［ＥＧＦＰ］ゲルおよび［ＥＧＦＰ］ウェルは、深度３０μｍの個々のマイクロチャネルにおける蛍光較正によって判定した、平衡状態のＥＧＦＰのゲル内およびウェル内濃度である。［ＥＧＦＰ］ゲル，ｂｇおよび［ＥＧＦＰ］ウェル，ｂｇは、ＥＧＦＰ溶液を用いたインキュベーション前のｓｃウエスタンスライドのバックグラウンド蛍光を補正する。ｂは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識したロバ抗ウサギＩｇＧについてであった「ＩｇＧ」を除いて（ａ）中のように判定した、いくつかのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８で標識したタンパク質についての分配係数を示し、ｎは、各標的のための単一の実験における個々のマイクロウェルである。ｃは、修飾ＲＩＰＡ緩衝液中で３０分間１μＭのドロンパを用いてインキュベートした８％Ｔのｓｃウエスタンゲルシート中の、カバーガラスで密封した直径５０μｍのマイクロウェルからの、蛍光タンパク質ドロンパの反復注入を示す。マイクロウェルへのドロンパの分配により、ドロンパのバックグラウンドゲル濃度に対抗する反復注入が可能となった。
【図１０】ａおよびｂは、図２Ｃに示すｄ中の較正曲線に使用した直接的および間接的較正スライドを示す。ａ（左上）は、精製ＥＧＦＰ濃度の範囲でインキュベートし、カバーガラスで密封し、広視野蛍光顕微鏡を使用して内在ＥＧＦＰ蛍光を撮像した、ブロックからのマイクロウェルの小集団の対数変換モンタージュを示す。ａ（右上）は、ＥＧＦＰ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識した二次抗体）の同一のスライドを分離、捕捉、およびプロービングした後の対数変換プローブ蛍光を示す。ａ（右下）は、マイクロウェル中のＥＧＦＰの分子数を判定するために使用した個々の微小流体チャネル中のＥＧＦＰの較正曲線を示す（ＡＦＵ：任意蛍光単位、ＲＯＩ：目的領域）。ａ（左下）は、ＥＧＦＰ濃度範囲にかけての例示的なマイクロウェルおよび免疫ブロットを示す。ｂ：分配のための調整（図９に示すｂ）、ＵＶへのスポット露出、およびＥＧＦＰ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識した二次抗体）についてのプロービング後の、示されたゲル内濃度を達成している、精製ＥＧＦＰ濃度でインキュベートしたｓｃウエスタンスライド。続いてスライドをストリッピングし、同一のスキャナ設定下で再撮像した。ｃおよびｄは、精製βチューブリン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識した二次抗体）およびＥＲＫ１／ｐＥＲＫ１（共にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識した二次抗体、スライドはｐＥＲＫプロービングとＥＲＫプロービングとの間でストリッピングした）についての類似の間接的較正スライドを示す。
【図１１】ａは、粒子画像速度測定によるｓｃウエスタン電気泳動チャンバ中に注ぎ入れる間の測定したバルク緩衝液速度のグラフを示す。溶解時間も前後関係のために示した（±ＳＤ、ｎ＝６細胞）。平均溶解時間付近の最大バルク速度は０．０１３ｍｓ−１であり、それをｂ〜ｅにおける流量シミュレーションに使用した。ｂ〜ｄは、０．０１３ｍｓ−１のバルク流体速度で厚さ３０μｍのｓｃウエスタンゲルフィルム中の直径２０μｍのマイクロウェル上に水を注ぎ入れる間の一方向の定常状態層流のＣＯＭＳＯＬモデルを示す。５、１０、１５、２０、および２５μｍの開始場所からウェルへの無質量で非浮揚性の粒子の移動を表す流線によって追跡されるバルク流方向に平行なウェル中のボルテックスの存在に留意されたい。ウェル表面上の流れ境界条件は「すべり無し」であった。ｅは、モデル速度分布の流れ方向に横断する中心線でのスライスを示し、ｕ＝４．４μｍ  ｓ−１の等流速線はウェルの領域を画定し、その中で、物質輸送が細胞溶解中に拡散的（Ｐｅ＜１）または移流的（Ｐｅ＞１）支配された。
【図１２】本開示の実施形態に従うラット神経幹細胞のウェル当たりの細胞数のグラフを示す。ラット神経幹細胞を、公称寸法が直径２０μｍおよび深度３０μｍである２，２４０個のｓｃウエスタンマイクロウェル中に５分間沈降させ、元の懸濁液中の３細胞密度の明視野顕微鏡写真から手作業で計数した。ウェル当たりの単一細胞占有率は、０．５５〜０．７５のファノ因子（σ２／μ）を持つ４０〜５０％範囲であり、それは、ウェル当たり４個超の細胞の制限された播種による可能性が高いポアソン的播種分布からの離脱を示す。
【図１３】本開示の実施形態に従う、ｓｃウエスタンゲルフィルムにかけての抗体輸送動態のグラフを示す。残留スライド蛍光を、自由溶液中で３０分間１００ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８で標識した抗オボアルブミンを用いてインキュベーションした後の厚さ８０μｍのゲル層のＴＢＳＴ洗浄についての蛍光顕微鏡写真によって判定した。ｓｃウエスタンゲル層での抗体平衡のための時定数τ＝４．８分は、適合の指数の逆数であった。
【図１４】ａおよびｂは、本開示の実施形態に従う、ｓｃウエスタンゲルシート中の蛍光標識したタンパク質の分離特性のグラフを示す。ａは、図１Ｂに示すｄ中の蛍光標識した種の８％Ｔのｓｃウエスタンゲルにおける移行距離に対する種の分子量の対数線形プロットを示す（ポイントサイズ内のｘ軸エラーバー（±ＳＤ、ｎ＝３分離）；ドロンパ、２７ｋＤａ；ＯＶＡ、４５ｋＤａ；ＢＳＡ、６６ｋＤａ、ＯＶＡ’、９０ｋＤａ；ＢＳＡ’、１３２ｋＤａ）。ｂは、一定のタンパク質バンド幅（ＳＤ  σｉ）を仮定するグラフを示し、バンドペア間の分離分解能のプロットＲｓ＝｜ｘ１−ｘ２｜／（２σ１＋２σ２）は、それらの分子量の対数比が線形となることが予想され、式中、ｘｉは移行距離である。これらのデータの線形適合を示し、Ｒｓ＝１の代入の際にｓｃウエスタンマイクロウェルから分離した精製タンパク質についての５１±１．６％の分離可能な分子量差異（±ＳＤ、ｎ＝３分離）を得た。
【図１５】本開示の実施形態に従う、単一細胞ウエスタンブロットスライドのストリッピングおよび再プロービングの画像を示す。図２Ｃに示すｄからの「直接的」ＥＧＦＰ較正スライドを撮像、ストリッピング、ならびにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識した二次抗体のみを用いて（陰性対照）か、一次抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識した二次抗体を用いてかいずれかでＥＧＦＰに再プロービングした。例示的な陰性対照ブロットがごくわずかな特定のシグナルを示す一方で、例示的な再プローブしたブロットのシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）は、元のプロービングのものとほぼ一致した。
【図１６】本開示の実施形態に従う、ウェル当たりの細胞によって順位付けした、図２Ａ〜Ｃに提示したブロットの無作為の試料の画像を示す。全てのブロットは、塵埃および他の蛍光アーチファクトに対する半自動スクリーニングを通過した。
【図１７】本開示の実施形態に従う、ラットＮＳＣについてのβチューブリン蛍光読出シグナルに対する抗体フォールド希釈の影響のグラフであり、６０倍〜１０倍の抗βチューブリン一次抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識した二次抗体希釈のラットＮＳＣの単一細胞ウエスタンブロットを示す。ゼロウェル当たりの細胞対照を上回る絶対蛍光シグナルの増加が、希釈範囲にかけて１つおよび２つのウェル当たりの細胞ブロットについて観察された。
【図１８】本開示の実施形態に従う、図２Ｃに示すｄにおける間接的較正曲線についてのＳＮＲのプロットを示す。図２Ｃに示すｄにおける間接的較正曲線についてのシグナル対ノイズ比によって、各精製標的のための検出濃度限界はＳＮＲ＝３に設定された。
【図１９】本開示の実施形態に従う、図３Ｂに示すｄに提示したブロットの無作為の試料を示す。全ての顕微鏡写真は、同一セットの分離についてであった。全てのブロットは、ウェル当たりの単一細胞装置のためであり、塵埃および他の蛍光アーチファクトに対する、およびＥＲＫとのＥＧＦＰ共プロービングからのスペクトルの漏れ込みに対する半自動スクリーニングを通過した。３８．８±１．０ｋＤａ（ｐＥＲＫ）、３９．１±０．６ｋＤａ（ＥＲＫ）、４７．４±１．１ｋＤａ（ｐＭＥＫ）、および４８．１±１．８ｋＤａ（ＭＥＫ、±ＳＤ、ｎ＝３分離）の推測分子量で、明瞭なバンドが観察され、公称質量は、ｐＥＲＫ／ＥＲＫが４３ｋＤａ、ｐＭＥＫ／ＭＥＫが４６ｋＤａであった。
【図２０】本開示の実施形態に従う、図３Ａ〜ＣにおけるＦＧＦ刺激実験の全ての時点にわたる３９ｋＤａのｐＥＲＫバンドでの特定の蛍光に対する、１０３ｋＤａでの推定標的外ｐＥＲＫバンドの総単一細胞ブロット蛍光のプロットを示す。
【図２１】本開示の実施形態に従う、約５８および７１ｋＤａで推定非特異的ｐＥＲＫバンドを示す、ｐＥＲＫおよびＥＲＫの露出過度のウエスタンブロットの画像を示す。
【図２２Ａ】本開示の実施形態に従う、図３Ｂに示すｃにおける刺激実験についての完全ウエスタンブロットの画像を示す。
【図２２Ｂ】本開示の実施形態に従う、図３Ｂに示すｃにおける刺激実験についての完全ウエスタンブロットの画像を示す。
【図２３】ａおよびｂは、ｐＥＲＫ：ＥＲＫおよびｐＭＥＫ：ＭＥＫについての分布統計のグラフ、および図３Ｂに示すｄにおけるｓｃウエスタンブロットデータのためのＦＧＦ刺激時間経過にわたるβチューブリン、ＥＲＫ、およびＭＥＫについての倍数変化ドットプロットを示す。ａは、刺激時間経過にわたるｐＥＲＫ：ＥＲＫおよびｐＭＥＫ：ＭＥＫ分布についての歪みと平均との間の関係のグラフを示す。ＣＶおよび歪度は、それぞれパーセンテージおよび無次元単位であり、便宜上、倍数蛍光比と同一の規模でプロットしたことに留意されたい。ｂは、βチューブリン、ＥＲＫ、およびＭＥＫについての任意蛍光（線形単位）にある倍数変化のグラフが、各刺激時間で細胞集団にわたって少しの変動しか示さないことを示す。
【図２４】図３Ｃに示すｅにおける培養プレート中のＮＳＣのＦＧＦ刺激についてのｓｃウエスタンブロットデータを企図するＩＣＣ研究のための完全データのグラフを示す。細胞をｐＥＲＫ／ＥＲＫおよびｐＭＥＫ／ＭＥＫペアについて共プローブし、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識した二次抗体を使用してリン酸化標的を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識したものを用いて全標的を、プローブした。個々にプローブしたｐＭＥＫ／ＭＥＫについてのデータを図２５中に提示する。図３Ｃに示すｅ中に提示した特定の複製を四角の中に示す。平均ｐＭＥＫ：ＭＥＫ比は３複製全体で２を超過せず、平均のＥＲＫおよびＭＥＫ値は、刺激時間経過にかけて少しの変動しか示さない。
【図２５】図３Ｃに示すｅにおけるＩＣＣ研究についての単一プローブｐＭＥＫ／ＭＥＫ分布のグラフを示す。ｐＭＥＫおよびＭＥＫ標的を個々の細胞中でプローブして、共プロービング実験における抗体間のエピトープ競合の可能性を検討した（Ｃｙ３で標識した二次抗体）。平均ｐＭＥＫ倍数変化値が、図２４中の平均ｐＭＥＫ：ＭＥＫ値と類似の範囲にあったため、競合の証拠は観察されなかった。
【図２６】図３Ｃに示すｅにおけるＦＧＦ刺激実験についてのｐＥＲＫおよびＥＲＫ標的の培養プレートＩＣＣ蛍光顕微鏡写真の自動分析によって判定した、無作為に選択した単一細胞ＲＯＩの例を示す。実験の詳細については図２４を参照されたい。
【図２７】図３Ｃに示すｅにおけるＦＧＦ刺激実験についてのｐＭＥＫおよびＭＥＫ標的の培養プレートＩＣＣ蛍光顕微鏡写真の自動分析によって判定した、無作為に選択した単一細胞ＲＯＩの例を示す。実験の詳細については図２４を参照されたい。ｐＭＥＫへの一次抗体の不適正な核局在化に留意されたい。二次抗体対照は、この見かけの局在化を説明しない。
【図２８】図４Ｃに示すｆに提示した単一細胞ブロットの無作為の試料を示す。βチューブリン顕微鏡写真は、列内の２色顕微鏡写真の分離と一致した。全てのブロットは、ウェル当たりの単一細胞装置のためであり、塵埃および他の蛍光アーチファクトに対する半自動スクリーニング、およびβチューブリンとのＥＧＦＰ共プロービングからのスペクトルの漏れ込みに対するスクリーニングを通過した。
【図２９】図４Ｂに示すｅにおける分化実験についての完全ウエスタンブロットの画像を示す。
【図３０】図４Ｃに示すｆについての完全な幹細胞および分化マーカ発現のデータのグラフを示す。
【図３１】図４Ｃに示すｆにおけるｓｃウエスタンブロットからの平均βチューブリン正規化マーカ発現レベルのグラフを示す。
【図３２】本開示の実施形態に従う分離装置を示す。
【図３３】本開示の実施形態に従う装置のマイクロウェル中に閉じ込められた細胞の画像を示す。
【図３４】パネルＡ〜Ｄは、本開示の実施形態に従う装置を使用する細胞アッセイのためのワークフローの概略図を示す。パネルＡは、細胞を中心チャンバ中に注入することを示す。パネルＢは、装置が直立スピナー上で回転させられて、細胞をトラップ中に位置付けることを示す。パネルＣは、組み合わせの溶解−電気泳動緩衝液をチャンバ中に注入することを示す。電気泳動中のエレクトロスモティック流は、溶解のために緩衝液を細胞へと移動させる。パネルＤは、タンパク質がＵＶ露出によって分離および固定され、標識した抗体を使用して目的とするタンパク質を判定することを示す。
【図３５】本開示の実施形態に従う種々のＲＰＭでのビーズ捕捉率のグラフを示す。１０００、２０００、３０００、および４０００ＲＰＭで回転させたビーズの平均捕捉率は、それぞれ、１３、５７、８９、および９０パーセントである。４０００ＲＰＭでの相対的遠心力は約１１２ｇである。（ｎ＝２）
【図３６Ａ】本開示の実施形態に従うポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）を通したタンパク質運動の画像を示し、低電場（５０Ｖ）に露出させたときに最初にウェル中に蓄積された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を示す。
【図３６Ｂ】本開示の実施形態に従うポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）を通したタンパク質運動の画像を示し、タンパク質分離を促進するためのより高い電圧（２００Ｖ）でＰＡＧを通過したＧＦＰの画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
電気泳動分離装置およびそれを使用するための方法を提供する。本開示の実施形態の態様は、複数のマイクロウェルを有するポリマー分離媒体を含む装置を含む。ポリマー分離媒体は、適用刺激を適用すると分離媒体中の１つ以上の目的とする試料成分に共有結合する官能基を含む。
【００２１】
以下では、主題の電気泳動分離装置をまずより詳細に記載する。主題の装置の使用が見出される、試料中の１つ以上の分析物を検出する方法も開示する。加えて、主題の装置を含むシステムおよびキットも記載する。
【００２２】
装置
本開示の実施形態は、分離装置を含む。ある特定の実施形態では、分離装置は、試料中の分析物を分離するように構成される。例えば、分離装置は、試料中の分析物を、分析物の１つ以上の物理的および／または化学的特性に基づいて分離するように構成されてもよい。一部の例では、分析物は、それらの分子量、サイズ、電荷（例えば、質量対電荷比）、等電点、親和性相互作用などにおいて、検出可能な差異を含み得る。本開示の分離装置は、それらの分子量、サイズ、電荷（例えば、質量対電荷比）、等電点、親和性相互作用などのうちの１つ以上に基づいて、異なる分析物を相互に区別するように構成され得る。
【００２３】
ある特定の実施形態では、分離装置は、微小流体分離装置である。「微小流体装置」は、小規模（例えば、ミリメートル未満）に幾何学的に拘束された流体を制御および操作するように構成された装置である。微小流体装置の実施形態は、ポリマー媒体、例えば、本明細書でより詳細に記載されるポリマー分離媒体を含む。ポリマー媒体は、試料中の目的とする分析物に特異的に結合する、共有結合した捕捉部材を含み得る。
【００２４】
ある特定の実施形態では、分離装置は固体支持体を含む。固体支持体は、ポリマー媒体（例えば、ポリマー分離媒体）を支持するように構成されてもよい。例えば、ポリマー分離媒体は、ポリマー分離媒体の少なくとも一部分が固体支持体の表面と接触するように、固体支持体上に提供されてもよい（例えば、装置はポリマー媒体を保持する固体支持体を含む）。一部の場合には、固体支持体は、主題の装置および方法中で使用される試料、緩衝液、試薬などに関して、不活性である（例えば、分解または反応しない）材料から成る。例えば、固体支持体は、ガラス、石英、ポリマー、エラストマー、紙、これらの組み合わせなどであるがこれらに限定されない材料で作製されてもよい。ある特定の実施形態では、固体支持体は、実質的に透明である。「透明」とは、物質が、可視光に物質を通過させることを意味する。一部の実施形態では、透明な固体支持体は、ポリマー媒体に結合した分析物、例えば、蛍光標識などの検出可能な標識を含む、もたらす、またはそれによって標識される分析物の検出を促進する。一部の場合には、固体支持体は、実質的に不透明である。「不透明」とは、物質が、可視光が物質を通過することを実質的に遮断することを意味する。ある特定の例では、不透明な固体支持体は、光の存在下で反応または分解する分析物などの、光に敏感な分析物の分析を促進することができる。
【００２５】
ある特定の実施形態では、固体支持体は、ポリマー分離媒体を収容するように寸法決定される。例えば、固体支持体は、ポリマー分離媒体全体が固体支持体によって支持されるような寸法（例えば、長さおよび幅）を有し得る。一部の場合には、固体支持体は、ポリマー分離媒体より大きい寸法（例えば、長さおよび幅）を有し得る。一部の例では、固体支持体は、５０ｍｍ×５０ｍｍ以下、例えば、２５ｍｍ×２５ｍｍ以下、または１０ｍｍ×１０ｍｍ以下、または５ｍｍ×５ｍｍ以下、例えば、１ｍｍ×１ｍｍ以下などの、１００ｍｍ×１００ｍｍ以下の寸法を含む、１０ｍｍ×１０ｍｍ〜２００ｍｍ×２００ｍｍの範囲内の寸法を有する。一部の場合には、固体支持体は、０．５ｍｍ〜５ｍｍ、または１ｍｍ〜４ｍｍ、または１ｍｍ〜３ｍｍ、または１ｍｍ〜２ｍｍの範囲の厚さを有する。ある特定の例では、固体支持体は、１ｍｍの厚さを有する。
【００２６】
上記の通り、固体支持体は、ポリマー分離媒体を支持するように構成され得る。ポリマー分離媒体の態様を、以下でより詳細に記載する。
【００２７】
ポリマー分離媒体
ポリマー分離媒体は、試料の構成成分を相互から分離するように構成され得る。一部の場合には、分離媒体は、試料中の構成物質を、構成物質の物理的特性に基づいて分離するように構成される。例えば、分離媒体は、試料中の構成物質を、構成物質の分子量、サイズ、電荷（例えば、電荷対質量比）、等電点、親和性相互作用などに基づいて分離するように構成され得る。
【００２８】
ある特定の例では、分離媒体は、試料中の構成物質を、構成物質のサイズおよび電荷に基づいて分離するように構成される。分離媒体は、試料中の構成物質を、構成物質の明瞭な検出可能なバンド中へと分離するように構成され得る。「バンド」とは、構成物質の濃度が外周領域よりも著しく高い、明瞭な検出可能な領域を意味する。構成物質の各バンドは、構成物質の単一のバンド中の各構成物質が、上記のように、実質的に類似した物理的特性を有する、単一の構成物質またはいくつかの構成物質を含み得る。
【００２９】
ある特定の実施形態では、分離媒体は、試料が分離媒体を横断するときに、試料中の構成物質を分離するように構成される。一部の場合には、分離媒体は、試料が分離媒体中を流動するときに、試料中の構成物質を分離するように構成される。分離媒体の態様は、以下でより詳細に記載する通り、分離媒体が、方向分離軸、または別の場合には複数の方向分離軸を有することを含む。一部の例では、方向分離軸は、試料が分離媒体を横断するときに試料が移動する方向に配向される。
【００３０】
マイクロウェルの平面アレイを持つポリマー分離媒体
ある特定の実施形態では、ポリマー分離媒体は、マイクロウェルの平面アレイを含む。これらの実施形態では、方向分離軸は、分離媒体の長さ（または幅）と整列する。例えば、方向分離軸は、分離媒体の長さ（または幅）に実質的に平行であり得る。一部の実施形態では、分離媒体の形状は、正方形または長方形であり、分離媒体の方向軸は、分離媒体の長さ（または幅）と整列され得る。これらの実施形態では、試料は、その長さ（または幅）に沿って分離媒体を横断する。試料が分離媒体の長さを横断する一部の場合には、分離媒体の長さは、分離媒体の幅の２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、１７５倍、または２００倍以上など、分離媒体の幅を上回る。一部の例では、より長い分離軸は、試料中の異なる分析物のバンド間の分解能増加を促進し得る。
【００３１】
ある特定の実施形態では、分離媒体は、分離媒体中の複数のマイクロウェルを含む。一部の例では、分離媒体は、分離媒体中のマイクロウェルの実質的に平面であるアレイを含む。「マイクロウェルのアレイ」は、任意の２次元または実質的に２次元のマイクロウェル配列を含む。例えば、マイクロウェルの平面アレイは、マイクロウェルの行および列に配列されてもよい。マイクロウェルの平面アレイ中のマイクロウェルは、個別にアドレス可能であり得る。マイクロウェルは、アレイが、アレイ中の特定の所定位置（例えば「アドレス」）に位置付けられた複数のマイクロウェルを含むときに、「アドレス可能」である。マイクロウェルは、介在空間によって分離され得る。マイクロウェルの平面アレイは、２個以上、４個以上、８個以上、１０個以上、２５個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、７５０個以上、１０００個以上、１５００個以上、２０００個以上、２５００個以上、３０００個以上、３５００個以上、４０００個以上、４５００個以上、５０００個以上、５５００個以上、６０００個以上、６５００個以上、７０００個以上、７５００個以上、８０００個以上、８５００個以上、９０００個以上、９５００個以上、１０，０００個以上、または２５，０００個以上、または５０，０００個以上、または７５，０００個以上、または１００，０００個以上を含む、１個以上のポリマー分離媒体中のマイクロウェルを含み得る。一部の場合には、マイクロウェルの平面アレイは、５０００個以上のマイクロウェルを含んでもよい。各ポリマー分離媒体は、１個以上のマイクロウェルのアレイ、例えば、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１２個以上、１４個以上、１６個以上、１８個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上、７５個以上、または１００個以上のマイクロウェルのアレイを含み得る。一部の場合には、ポリマー分離媒体は、１０個以上のマイクロウェルのアレイを含む。用途に応じて、マイクロウェルのうちのいずれかまたは全ては、同一であるか、または相互に異なってもよく、各々は、別個の試料または試料構成物質を含むように構成され得る。個別のマイクロウェルの態様は、以下でより詳細に記載するが、マイクロウェルのアレイ中のマイクロウェルのうちのいずれかまたは全てに適用してもよい。
【００３２】
ある特定の実施形態では、ポリマー分離媒体は、上記のように、マイクロウェルの平面アレイを含む。マイクロウェルの平面アレイは、各マイクロウェルが、分離媒体の表面上（例えば、分離媒体の上面上）に提供された開口端部を有するように配列され得る。これらの実施形態では、各マイクロウェルの内部体積は、ポリマー分離媒体の表面上のマイクロウェルの開口端部から、ポリマー分離媒体中へと延在し得る。ある特定の実施形態では、マイクロウェルの開口端部（および故にマイクロウェルの内部体積）は、分離媒体（例えば、緩衝液、試料など）の表面上に提供された流体と流体連通している。一部の例では、例えば、マイクロウェルの深度がポリマー分離媒体の厚さと等しい場合などの、マイクロウェルの内部体積が分離媒体全体を通して延在する実施形態では、マイクロウェルの底部（すなわち、閉口端部）は、ポリマー分離媒体を支持する固体支持体によって形成される。他の例では、例えば、マイクロウェルの深度がポリマー分離媒体の厚さ未満である場合などの、マイクロウェルの内部体積が分離媒体全体を通して延在しない実施形態では、マイクロウェルの底部（すなわち、閉口端部）は、ポリマー分離媒体によって形成される。
【００３３】
ある特定の実施形態では、マイクロウェルは、マイクロウェルの閉口端部から開口端部までのマイクロウェルの軸が、分離媒体の表面（例えば、マイクロウェルの開口端部を有する分離媒体の表面）に実質的に垂直であるように構成される。ある特定の実施形態では、マイクロウェルの内部体積がポリマー分離媒体中に延在し、ポリマー分離媒体に囲まれる場合などに、マイクロウェルの壁（例えば、側壁）はポリマー分離媒体によって形成される。
【００３４】
ポリマー分離媒体中のマイクロウェルの平面アレイの例を図１Ａに示し、図１Ａに示すａは、各アレイ中４２０個のマイクロウェルを持つ１６個のアレイ、合計で６，７２０個のマイクロウェルを含む、ポリマー分離媒体を保持する固体支持体の画像である。図１Ａに示すポリマー分離媒体は、マイクロポストブロックを含んだ型を使用して形成された。以下の実施例１でより詳細に記載する通り、ポリマー分離媒体からのマイクロポスト型の除去は、示す通り、マイクロウェルのアレイを持つポリマー分離媒体をもたらした。
【００３５】
マイクロウェルの円形配列を持つポリマー分離媒体
他の実施形態では、分離媒体は、マイクロウェルの平面アレイとして配置されるのではなく、マイクロウェルの円形配列を含む。例えば、分離媒体は、放射状に配向された複数の分離軸を有するマイクロウェルの円形配列を含んでもよい。マイクロウェルの円形配列中の各マイクロウェルは、それ自体の放射状に配向された分離軸と関連付けられ得る。これらの実施形態では、放射分離軸は、試料が、分離媒体を通して中心ウェルから離れて放射状に延在する方向に、分離媒体中の中心ウェルから分離媒体の外周部に向かって、分離媒体を横断するように、配列され得る。
【００３６】
例えば、ある特定の実施形態では、装置は、中心ウェルを有するポリマー分離媒体を含む。一部の例では、中心ウェルは、中心ウェルがポリマー分離媒体中で空隙を形成するように、ポリマー分離媒体中に位置付けられる。ある特定の実施形態では、中心ウェルの周壁は、ポリマー分離媒体によって形成される。例えば、ポリマー分離媒体は空隙を含んでもよく、ここで、空隙を囲むポリマー分離媒体は、中心ウェルの周壁を形成する。一部の場合には、中心ウェルの形状は、実質的に円形である。一部の例では、分離媒体は、試料が分離媒体の中心ウェル中に置かれるように、構成される。
【００３７】
ある特定の実施形態では、ポリマー分離媒体の中心ウェルは、外周部上に位置付けられ、かつ中心ウェルと流体連通している複数のマイクロウェルを含む。中心ウェルと流体連通しているマイクロウェルは、流体およびその構成物質が中心ウェルの内部体積からマイクロウェルの内部体積へと流動し、その逆もまた同様であるように、中心ウェルの内部体積に面する開口端部を有し得る。一部の実施形態では、各マイクロウェルは、マイクロウェルの開口端部とは反対の閉口端部を有する。ある特定の場合には、マイクロウェルの閉口端部は、周囲のポリマー分離媒体によって形成される。ある特定の例では、マイクロウェルは、中心ウェルと同一平面にある。例えば、マイクロウェルは、マイクロウェルの閉口端部から開口端部までのマイクロウェルの軸が、中心ウェルの横（すなわち、水平）半径と同一平面にあるように（例えば、車輪のスポークに類似して）、構成されてもよい。このように、マイクロウェルは、ポリマー分離媒体と同一平面にある、マイクロウェルの閉口端部から開口端部までのマイクロウェルの軸を有し得る。
【００３８】
ある特定の実施形態では、マイクロウェルは、上記の通り、中心ウェルの外周部の周りに配列される。一部の場合には、マイクロウェルは、中心ウェルの実質的に全外周部の周りに配列される。ある特定の実施形態では、マイクロウェルは、中心ウェルの外周部の９０％、または中心ウェルの外周部の８０％、または７０％、または６０％、または５０％、または４０％、または３０％、または２０％、または１０％などの、中心ウェルの外周部の一部分の周りに配列される。一部の例では、マイクロウェルを含む中心ウェルの外周面は、複数のマイクロウェル、例えば、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、１５０個以上、２００個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、６００個以上、７００個以上、８００個以上、９００個以上、１０００個以上、１２５０個以上、１５００個以上、１７５０個以上、２０００個以上、２５００個以上、３０００個以上、３５００個以上、４０００個以上、４５００個以上、または５０００個以上のマイクロウェルを含む。
【００３９】
一部の実施形態では、マイクロウェルは、隣接するマイクロウェルから一定距離分離される。例えば、マイクロウェルは、隣接するマイクロウェルから、９０μｍ以下、または８０μｍ以下、または７０μｍ以下、または６０μｍ以下、または５０μｍ以下、または４０μｍ以下、または３０μｍ以下、または２０μｍ以下、または１０μｍ以下など、４５０μｍ以下、または４００μｍ以下、または３５０μｍ以下、または３００μｍ以下、または２５０μｍ以下、または２００μｍ以下、または１５０μｍ以下、または１００μｍ以下など、５００μｍ以下の距離で分離されてもよい。一部の場合には、マイクロウェルは、隣接するマイクロウェルから、１０μｍ〜９０μｍ、または１０μｍ〜８０μｍ、または１０μｍ〜７０μｍ、または１０μｍ〜６０μｍ、または２０μｍ〜６０μｍ、または３０μｍ〜６０μｍ、または４０μｍ〜６０μｍなど、１０μｍ〜１００μｍの距離で分離されてもよい。
【００４０】
ある特定の実施形態では、装置はカバーを含む。一部の場合には、カバーは、ポリマー分離媒体が支持体とカバーとの間に位置付けられるように、ポリマー分離媒体上に配置され得る。ある特定の実施形態では、カバーは、中心ウェルと流体連通するように構成された貯留ウェルを含む。例えば、貯留ウェルは、中心ウェルの内部体積と流体連通にある内部体積を有してもよい。一部の例では、貯留ウェルは、カバーの表面（例えば、カバーの底面）上のポリマー媒体中に形成される。一部の例では、貯留ウェルは、貯留ウェルがポリマー媒体中に空隙を形成するように、ポリマー媒体中に位置付けられる。ある特定の実施形態では、貯留ウェルの周壁は、ポリマー媒体によって形成される。例えば、ポリマー分離媒体は空隙を含んでもよく、ここで、空隙を囲むポリマー分離媒体は、貯留ウェルの周壁を形成する。一部の場合には、貯留ウェルの形状は、実質的に円形である。
【００４１】
ある特定の実施形態では、貯留ウェルを形成するポリマー媒体は、カバー上に配置される。このように、貯留ウェルの上部は、カバーの表面（例えば、カバーの底面）によって形成され得る。一部の例では、貯留ウェルの周壁は、カバーの底面から実質的に垂直に下方へと延在する。カバーの実施形態は、主題の装置に適合し、主題の装置中で使用される試料、緩衝液、試薬などに適合する、任意の好適な材料で作製され得る。一部の場合には、カバーは、主題の装置および方法中で使用される試料、緩衝液、試薬などに関して、不活性である（例えば、分解または反応しない）材料で作製され得る。例えば、カバーは、ガラス、石英、ポリマー、エラストマー、紙、これらの組み合わせなどであるがこれらに限定されない材料で作製されてもよい。ある特定の実施形態では、貯留ウェルは、貯留ウェルの外周部上にマイクロウェルを含まない。
【００４２】
ある特定の実施形態では、貯留ウェルの直径は、中心ウェルの直径未満である。一部の場合には、中心ウェルの直径は、４０ｍｍ以下、または３０ｍｍ以下、または２０ｍｍ以下、または１５ｍｍ以下、または１０ｍｍ以下など、５０ｍｍ以下である。ある特定の例では、中心ウェルの直径は１２ｍｍである。一部の場合には、貯留ウェルの直径は、３０ｍｍ以下、または２０ｍｍ以下、または１５ｍｍ以下、または１０ｍｍ以下、または５ｍｍ以下など、４０ｍｍ以下である。ある特定の例では、貯留ウェルの直径は、８ｍｍである。
【００４３】
ある特定の実施形態では、装置は、上記の通り、中心ウェルを有するポリマー分離媒体を持つ個体保持体、および貯留ウェルを持つポリマー媒体を有するカバーを含む。装置は、固体支持体のポリマー分離媒体およびカバーのポリマー媒体が相互に接触しているように、固体支持体に適用されるように、構成され得る。これらの例では、中心ウェルおよび貯留ウェルは、それらが中心ウェルおよび貯留ウェル両方の内部体積を含む密閉空間を形成するように、相互に流体連通していてもよい。一部の例では、カバーは、貯留ウェルと流体連通している（故に、中心ウェルと流体連通している）流体注入口を含み得る。
【００４４】
マイクロウェルの円形配列を含むポリマー分離媒体の例を、中心（底部）ウェルを持つポリマー分離媒体（例えば、ポリアクリルアミドゲル、ＰＡＧ）を保持する固体支持体と、貯留（上部）ウェルを持つポリマー媒体（例えば、ポリアクリルアミドゲル、ＰＡＧ）を含むカバーとを含む装置の画像である、図３２に示す。貯留ウェルは、貯留ウェルと流体連通している（故に、中心ウェルとも流体連通している）溶液注入口を含む。中心ウェルは、中心ウェルの外周部の周りに配列されたマイクロウェルを含む（図３３）。
【００４５】
マイクロウェルの更なる態様
ある特定の実施形態では、マイクロウェルは、規定形状を持つ内部体積を有する。例えば、マイクロウェルの内部体積は、円筒、立方体、長方形直方体、切頭台（例えば、正方形切頭台、長方形切頭台、円錐切頭台）などの形状を有する。
【００４６】
ある特定の実施形態では、マイクロウェルの開口端部は、マイクロウェルの閉口端部を上回る寸法を有する。例えば、マイクロウェルの開口端部は、マイクロウェルの閉口端部の寸法の１．２倍、または１．３倍、または１．４倍、または１．５倍、または１．６倍、または１．７倍、または１．８倍、または１．９倍、または２倍など、マイクロウェルの閉口端部の寸法を１．１倍上回る寸法（例えば、マイクロウェルの形状に応じて、幅および／もしくは長さ、または直径）を有してもよい。
【００４７】
「マイクロウェル」は、マイクロメータ規模の寸法を有するウェルである。寸法は異なり得るが、一部の例では、マイクロウェルの開口端部は、９０μｍ以下、または８０μｍ以下、または７０μｍ以下、または６０μｍ以下、または５０μｍ以下、または４０μｍ以下、または３０μｍ以下、または２０μｍ以下、または１０μｍ以下など、１００μｍ以下の幅を有する。例えば、マイクロウェルの開口端部は、１０μｍ〜９０μｍ、または１０μｍ〜８０μｍ、または１０μｍ〜７０μｍ、または１０μｍ〜６０μｍ、または１０μｍ〜５０μｍ、または１０μｍ〜４０μｍ、または１０μｍ〜３０μｍなど、１０μｍ〜１００μｍの範囲の幅を有してもよい。ある特定の実施形態では、マイクロウェルは、マイクロウェル中で単一細胞を収容するように寸法決定された開口端部を有し得る。
【００４８】
一部の場合には、マイクロウェルの閉口端部は、９０μｍ以下、または８０μｍ以下、または７０μｍ以下、または６０μｍ以下、または５０μｍ以下、または４０μｍ以下、または３０μｍ以下、または２０μｍ以下、または１０μｍ以下など、１００μｍ以下の幅を有する。例えば、マイクロウェルの閉口端部は、１０μｍ〜９０μｍ、または１０μｍ〜８０μｍ、または１０μｍ〜７０μｍ、または１０μｍ〜６０μｍ、または１０μｍ〜５０μｍ、または１０μｍ〜４０μｍ、または１０μｍ〜３０μｍ、または１０μｍ〜２０μｍなど、１０μｍ〜１００μｍの範囲の幅を有してもよい。ある特定の実施形態では、マイクロウェルは、マイクロウェル中で単一細胞を収容するように寸法決定された閉口端部を有し得る。
【００４９】
ある特定の実施形態では、マイクロウェルは、９０μｍ以下、または８０μｍ以下、または７０μｍ以下、または６０μｍ以下、または５０μｍ以下、または４０μｍ以下、または３０μｍ以下、または２０μｍ以下、または１０μｍ以下など、１００μｍ以下の深度（例えば、マイクロウェルの開口端部から閉口端部までの距離）を有する。例えば、マイクロウェルは、１０μｍ〜９０μｍ、または１０μｍ〜８０μｍ、または１０μｍ〜７０μｍ、または１０μｍ〜６０μｍ、または２０μｍ〜６０μｍ、または３０μｍ〜６０μｍ、または４０μｍ〜６０μｍなど、１０μｍ〜１００μｍの範囲の深度を有してもよい。ある特定の実施形態では、マイクロウェルは、マイクロウェル中で単一細胞を収容するように寸法決定された深度を有し得る。
【００５０】
ポリマー分離媒体中のマイクロウェルは、実質的に一様であり得る。例えば、分離媒体中のマイクロウェルの形状およびサイズは、実質的に一様であってもよい。他の実施形態では、マイクロウェルは、異なる形状、異なるサイズ、それらの組み合わせなどを有するなど、異なってもよい。異なるマイクロウェルを含む分離媒体は、異なる試料構成物質の同時の分析を促進し得る。例えば、異なる形状および／またはサイズを有するマイクロウェルは、異なる形状またはサイズの試料構成物質（例えば、試料中の異なる形状またはサイズの細胞）を選択的に捕捉し得る。
【００５１】
分離媒体の更なる態様
ある特定の実施形態では、分離媒体は、ポリマーゲルなどのポリマーを含む。ポリマーゲルは、ゲル電気泳動に好適なゲルであり得る。ポリマーゲルとしては、ポリアクリルアミドゲル（例えば、メタクリルアミドゲル）、アガロースゲルなどを含むがこれらに限定されない。分離媒体の分解能は、細孔径、総ポリマー含量（例えば、総アクリルアミド含量）、架橋剤の濃度、適用電場、アッセイ時間などなどであるがこれらに限定されない、種々の要因に依存し得る。例えば、分離媒体の分解能は、分離媒体の細孔径に依存してもよい。一部の場合には、細孔径は、分離媒体の総ポリマー含量および／または分離媒体中の架橋剤の濃度に依存する。ある特定の例では、分離媒体は、５，０００Ｄａ以下、または２，０００Ｄａ以下、または１，０００Ｄａ以下、例えば、５００Ｄａ以下、または１００Ｄａ以下を含む、７，０００Ｄａ以下など、５０，０００Ｄａ以下、または２５，０００Ｄａ以下、または１０，０００Ｄａ以下の分子量差異をもって分析物を分解するように構成される。一部の場合には、分離媒体は、５％〜１０％を含む、３％〜１５％など、１％〜２０％の範囲の総アクリルアミド含量Ｔ（Ｔ＝アクリルアミドおよびビスアクリルアミドモノマーの総濃度、％ｗ／ｖ）を有するポリアクリルアミドゲルを含み得る。一部の例では、分離媒体は、７％の総アクリルアミド含量を有する。ある特定の場合には、分離媒体は、６％の総アクリルアミド含量を有する。ある特定の実施形態では、分離媒体は、２％〜５％を含む、２％〜７％など、１％〜１０％の範囲の架橋剤含量Ｃ（％ｗ／ｖ）を有するポリアクリルアミドゲルを含む。一部の例では、分離媒体は、３％の総架橋剤含量を有する。
【００５２】
ある特定の実施形態では、分離媒体は、前駆体部分から形成されるように構成される。例えば、分離媒体は、ゲル前駆体（例えば、ポリアクリルアミドゲルモノマーなどのポリアクリルアミドゲル前駆体）から形成されるゲル（例えば、ポリアクリルアミドゲル）であってもよい。前駆体部分は、反応して分離媒体を形成するように構成され得る。例えば、ゲル前駆体は、相互に反応してポリアクリルアミドゲル分離媒体を形成するように構成されてもよい。ゲル前駆体間の反応は、化学活性化、光活性化などであるがこれらに限定されない、任意の好適なプロトコルによって活性化され得る。一部の実施形態では、ゲル前駆体は、例えば、ゲル前駆体を、過酸化物などであるがこれに限定されない活性化剤と接触させることによって、化学的に活性化されるように構成される。一部の実施形態では、ゲル前駆体は、例えば、ゲル前駆体を光と接触させることによって、光によって活性化（すなわち、光活性化）されるように構成される。光は、分離媒体の形成を活性化するのに好適な任意の波長であり得、一部の例では、可視スペクトル内の青色光と関連付けられる波長を有してもよい。例えば、分離媒体の形成を活性化するために使用される光は、４２０ｎｍ〜４８０ｎｍ、または４３０ｎｍ〜４８０ｎｍ、または４４０ｎｍ〜４８０ｎｍ、または４５０ｎｍ〜４８０ｎｍ、または４６０ｎｍ〜４８０ｎｍ、または４６５ｎｍ〜４７５ｎｍを含む、４１０ｎｍ〜４９０ｎｍなど、４００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の波長を有してもよい。ある特定の場合には、分離媒体の形成を活性化するために使用される光は、４６５〜４７５ｎｍの範囲の波長を有する。一部の例では、分離媒体の形成を活性化するために使用される光は、４７０ｎｍの波長を有する。
【００５３】
一部の例では、分離媒体は、５０ｍｍ×５０ｍｍ以下、例えば、２５ｍｍ×２５ｍｍ以下、または１０ｍｍ×１０ｍｍ以下、または５ｍｍ×５ｍｍ以下、例えば、１ｍｍ×１ｍｍ以下など、１００ｍｍ×１００ｍｍ以下の寸法を含む、１０ｍｍ×１０ｍｍ〜２００ｍｍ×２００ｍｍの範囲にある寸法を有する。一部の場合には、分離媒体は、１０μｍ〜７５μｍ、または１０μｍ〜５０μｍ、または２０μｍ〜５０μｍなど、１μｍ〜１００μｍの範囲内の厚さを有する。一部の場合には、分離媒体は、３０μｍの厚さを有する。
【００５４】
ある特定の実施形態では、分離媒体は、緩衝液を含む。緩衝液は、ゲル電気泳動に使用される任意の簡便な緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、トリス緩衝液である。ある特定の実施形態では、分離媒体は、トリス−グリシン緩衝液などの緩衝液を含む。例えば、緩衝液は、トリスとグリシンとの混合物を含んでもよい。
【００５５】
一部の場合には、緩衝液は、界面活性剤を含む。ある特定の例では、界面活性剤は、試料中の分析物に、実質的に類似した電荷対質量比を提供するように構成される。実質的に類似した電荷対質量比を持つ分析物は、試料中の分析物の分子量に基づいて分析物が分離媒体中の１つ以上のバンドへと分解するのを促進し得る。ある特定の場合には、界面活性剤は、試料中の分析物に、負電荷などの電荷を提供するように構成される、陰イオン界面活性剤である。例えば、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などであるがこれに限定されない、陰イオン界面活性剤であってもよい。
【００５６】
ある特定の実施形態では、分離媒体は、構成物質の等電点（ｐＩ）（例えば、等電点電気泳動法、ＩＥＦ）に基づいて試料中の構成物質を分離するように構成される。一部の場合には、分離媒体は、上記のようなポリマーゲルを含む。例えば、ポリマーゲルは、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどを含んでもよい。ある特定の例では、ポリマーゲルは、一部の実施形態ではポリマーゲルと共重合される、ｐＨ勾配を含む。ｐＨ勾配がポリマーゲルと共重合される実施形態では、ｐＨ勾配が実質的に固定されることにより、固定化ｐＨ勾配を有する分離媒体をもたらし得る。ある特定の例では、ｐＨ勾配は、弱酸もしくは弱塩基（例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ）、または両性電解質などを含む。
【００５７】
ある特定の実施形態では、分離媒体は、サイズに基づいて試料中の構成物質を分離するように構成される。例えば、一部の場合には、分離媒体は、細孔径勾配を有するポリマーゲルを含む。細孔径勾配は、分離媒体の方向軸に沿って減少し得る。例えば、細孔径勾配は、分離媒体を横断する試料が、分離媒体中で徐々に小さくなっていく細孔径に遭遇するように、分離媒体の方向軸に沿って減少する細孔径を有してもよい。試料中の構成物質は、試料中の構成物質が細孔径勾配を横断するときに、サイズに基づいて分離され得る。例えば、試料中のより大きい構成物質は、減少していく細孔径勾配を通過してより大きい距離を横断することができる、より小さい構成物質よりも容易に、分離媒体中に留められ得る。
【００５８】
一部の場合には、分離媒体の細孔径は、分離媒体の総ポリマー含量および／または分離媒体中の架橋剤の濃度に依存する。ある特定の例では、５，０００Ｄａ以下、または２，０００Ｄａ以下、または１，０００Ｄａ以下、例えば、５００Ｄａ以下、または１００Ｄａ以下を含む、７，０００Ｄａ以下など、５０，０００Ｄａ以下、または２５，０００Ｄａ以下、または１０，０００Ｄａ以下の分子量差異をもって分析物を分解するのに十分な分離媒体細孔径。一部の場合には、分離媒体は、総アクリルアミド含量Ｔ（Ｔ＝アクリルアミドおよびビスアクリルアミドのモノマーの総濃度）に依存する細孔径を有するポリアクリルアミドゲルを含み得、ここで総アクリルアミド含量Ｔは、５％〜１０％を含む、３％〜１５％など、１％〜２０％の範囲である。一部の例では、分離媒体は、７％の総アクリルアミド含量によって画定される細孔径を有する。ある特定の場合には、分離媒体は、６％の総アクリルアミド含量によって画定される細孔径を有する。ある特定の実施形態では、分離媒体は、２％〜５％を含む、２％〜７％など、１％〜１０％の範囲の架橋剤含量Ｃ（％ｗ／ｖ）を有するポリアクリルアミドゲルを含む。一部の例では、分離媒体は、３％の総架橋剤含量を有する。
【００５９】
ある特定の実施形態では、分離媒体は、目的とする構成物質に共有結合するように構成される。共有結合は、適用刺激を適用すると形成され得る。例えば、適用刺激は、光などの電磁放射線を含んでもよい。一部の場合には、光は紫外線（ＵＶ）光である。一部の例では、目的とする構成物質を分離媒体に共有結合するために使用される光は、１００ｎｍ〜４００ｎｍ、または１５０ｎｍ〜４００ｎｍ、または２００ｎｍ〜４００ｎｍ、または２５０ｎｍ〜４００ｎｍ、または３００ｎｍ〜４００ｎｍ、または３２５ｎｍ〜３７５ｎｍ、または３５０ｎｍ〜３６５ｎｍを含む、５０ｎｍ〜４００ｎｍなど、１０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲の波長を有する。ある特定の場合には、光は、３５０〜３６５ｎｍの範囲の波長を有する。
【００６０】
ある特定の実施形態では、目的とする構成物質を分離媒体に共有結合するために使用される光は、分離媒体の形成を活性化するために使用される光とは異なる波長を有する。例えば、上記の通り、分離媒体の形成を活性化するために使用される光は、可視スペクトル内の青色光の波長を有してもよい。上記の通り、目的とする構成物質を分離媒体に共有結合するために使用される光は、ＵＶ光の波長を有し得る。このように、ある特定の実施形態では、分離媒体は、光の第１の波長を適用すると形成されるように構成され、光の第２の波長を適用すると目的とする構成物質を共有結合するように構成される。上記の通り、光の第１および第２の波長は、それぞれ、青色光およびＵＶ光であり得る。
【００６１】
一部の場合には、分離媒体は、１個以上の目的とする構成物質に共有結合する官能基を含む。例えば、目的とする構成物質は、タンパク質、ペプチドなどであるがこれらに限定されない、目的とする分析物であってもよい。官能基は、上記の通り、電磁放射線（例えば、光）などの適用刺激を適用すると活性化される官能基を含み得る。このように、ある特定の例では、官能基は、光によって活性化可能な官能基である。光を適用すると、光によって活性化可能な官能基は、ラジカルアルキル中間体などの、共有結合を形成することができる反応種を形成し得る。適用刺激（例えば、光）を適用すると目的とする構成物質に共有結合し得る官能基の例としては、ベンゾフェノン基などが挙げられるが、これに限定されない。適用刺激によって活性化されると、官能基は、目的とする構成物質（例えば、タンパク質またはペプチド）に結合して、分離媒体と目的とする構成物質との間に共有結合を形成し得る。例えば、官能基は、官能基と目的とする構成物質との間に炭素間結合を形成してもよい。
【００６２】
一部の実施形態では、官能基は、分離媒体と共重合される。例えば、官能基は、分離媒体に結合されるリンカー基を含んでもよい。官能基は、リンカー基の第１の端部でリンカー基に結合され得、リンカー基の第２の端部は、分離媒体に結合され得、それにより、官能基を間接的に分離媒体に結合させる。一部の例では、分離媒体に結合されるリンカー基の第２の端部は、アクリルアミドコモノマーなどであるがこれらに限定されないコモノマーを含む。一部の実施形態では、リンカー基の第２の端部は、メタクリルアミドコモノマーを含む。ある特定の場合には、官能基はベンゾフェノン官能基であり、リンカー基はアクリルアミドコモノマーなどのコモノマーを含む。例えば、官能基（リンカー基を含む）は、Ｎ−（３−［（４−ベンゾイルフェニル）ホルムアミド］プロピル）メタクリルアミド（ＢＰＭＡまたはＢＰＭＡＣとしても知られる）であってもよい。上記の通り、リンカー基は、官能基に結合する第１の端部、および分離媒体に結合する第２の端部を有し得る。一部の例では、第１の端部と第２の端部との間にあるリンカー基の中間部分は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基などであるがこれらに限定されない脂肪族基を含む。ある特定の場合には、リンカー基の中間部分は、低級アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基）を含む。例えば、リンカー基の中間部分は、プロピル基を含んでもよい。
【００６３】
分離媒体と共重合され得る官能基の実施例を、光活性化ベンゾフェノン官能基を含む架橋ポリアクリルアミドゲル分離媒体を示す図５に示す。光活性ベンゾフェノン基は、光によって活性化されて、目的とする構成物質（例えば、分離した試料中のタンパク質）への共有結合を形成し得る。
【００６４】
ある特定の実施形態では、分離媒体は、最低捕捉効率で試料中の構成物質に結合するように構成される。捕捉効率とは、分離媒体によって結合される試料中の構成物質のパーセンテージである。一部の例では、捕捉効率ηは、勾配押し流し（ＡＦＵｗ）後に測定される蛍光性の、フォーカシング（ＡＦＵｆ）中の蛍光性に対する比であり、εそれは、因数によって補正され、種の蛍光シグナルに対するｐＨの予想される影響を説明する。ある特定の実施形態では、分離媒体は、１０％以上、または２０％以上、または３０％以上、または４０％以上、または５０％以上、または６０％以上、または７０％以上、または８０％以上、または９０％以上、または９５％以上を含む、５％以上など、１％以上の捕捉効率を有するように構成される。一部の例では、分離媒体は、７５％以上の捕捉効率を有する。
【００６５】
ポリマー分離媒体の更なる態様は、２０１０年５月１８日出願の米国出願公開第２０１１／０１７７６１８号、および２０１２年６月２１日出願の米国出願公開第２０１２／０３２９０４０号に記載され、各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
装置の更なる態様
ある特定の実施形態では、装置は、ポリマー分離媒体のうち１つ以上の一部分を通過するチャネルと、ポリマー分離媒体の表面に接触する固体支持体とを含む。一部の例では、チャネルの１つ以上の壁または端部は、ポリマー分離媒体と流体連通している。ある特定の場合には、ポリマー分離媒体と流体連通しているチャネルの１つ以上の壁または端部を有するチャネルは、チャネルの内容物（例えば、緩衝液、溶液、分析物検出試薬などの試薬など）をポリマー分離媒体の１つ以上の領域に送達するのを促進する。一部の例では、物質をポリマー分離媒体の１つ以上の特定領域に送達することは、アッセイプロトコル中に使用される消耗物質量の減少を促進することによって、効率を高める。例えば、チャネルを通して分析物検出試薬をポリマー分離媒体の所定領域に送達することは、ポリマー分離媒体全体が分析物検出試薬と接触するアッセイプロトコルと比較したとき、使用される分析物検出試薬の量の減少を促進し得る。
【００６７】
ある特定の実施形態では、チャネルは、ポリマー分離媒体の一部分を通過するように位置付けられてもよい。一部の実施形態では、チャネルの１つ以上の壁は、ポリマー分離媒体によって形成され得る。例えば、チャネルは、チャネルがポリマー分離媒体の表面に伸長した空隙を形成するように、ポリマー分離媒体の表面に提供されてもよい。これらの実施形態では、ポリマー分離媒体は、チャネルの側壁および底部を形成する。一部の例では、チャネルの片側（例えば、上部）は開いている。他の実施形態では、チャネルは、チャネルがポリマー分離媒体によって囲まれる空隙を形成するように、ポリマー分離媒体の中心部分を通過する。これらの実施形態では、チャネルの壁は、ポリマー分離媒体によって形成される。ある特定の実施形態では、チャネルは、チャネルがポリマー分離媒体と同一表面にあるように位置付けられる。
【００６８】
一部の例では、チャネルは、分離媒体を保持する固体支持体の一部分を通過するように位置付けられる。一部の実施形態では、チャネルの１つ以上の壁は、固体支持体によって形成され得る。例えば、チャネルは、チャネルが固体支持体の表面に伸長した空隙を形成するように、固体支持体の表面に提供されてもよい。これらの実施形態では、固体支持体は、チャネルの側壁および底部を形成する。一部の例では、チャネルの片側（例えば、上部）は、チャネルの内部体積が露出する（例えば、覆っているポリマー分離媒体に露出する）ように、開いている。他の実施形態では、チャネルは、チャネルが固体支持体によって囲まれる空隙を形成するように、固体支持体の中心部分を通過する。これらの実施形態では、チャネルの壁は、固体支持体によって形成される。ある特定の実施形態では、チャネルは、チャネルが固体支持体と同一表面にあるように位置付けられる。ある特定の実施形態では、固体支持体は、その表面上に配置されたポリマー分離媒体の支持体である。ある特定の例では、１つ以上のチャネルは、上記の通り、支持体中に提供される。一部の実施形態では、固体支持体は、ポリマー分離媒体の表面上に配置されたカバーである。ある特定の例では、１つ以上のチャネルは、上記の通り、カバー中に提供される。ある特定の実施形態では、チャネルは、支持体とカバーとの両方の中に提供されてもよい。
【００６９】
ある特定の実施形態では、チャネルは、チャネルがポリマー分離媒体と同一表面にないように位置付けられる。例えば、チャネルは、ポリマー分離媒体の平面に相対的な角度で位置付けられてもよい。一部の実施形態では、チャネルは、チャネルがポリマー分離媒体を保持する固体支持体と同一表面にないように位置付けられる。例えば、チャネルは、固体支持体の平面に相対的な角度で位置付けられてもよい。これらの実施形態では、チャネルは、ポリマー分離媒体の一部分および固体支持体の一部分を通過し得る。
【００７０】
チャネルは、第１の端部（例えば、上流端部）で、流入貯留部と流体連通していてもよい。流入貯留部は、アッセイにおける１つ以上のステップ中で分離媒体に提供され得る、緩衝液、溶液、試薬などを含み得る。一部の場合には、チャネルの反対の端部（例えば、下流端部）は、流出貯留部と流体連通していてもよい。他の実施形態では、チャネルの下流端部は、チャネルの内容物がチャネルの閉口端部に送達され得るように、閉口端部であり得る。例えば、チャネルの閉口端部は、チャネルの内容物がポリマー分離媒体のその部分に送達されるように、ポリマー分離媒体の一部分と接触していてもよい。
【００７１】
ある特定の実施形態では、装置は、１個以上のチャネルを含む。例えば、装置は、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１２個以上、１４個以上、１６個以上、１８個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上、７５個以上、または１００個以上のチャネルなど、１個のチャネルまたは２個以上のチャネルを含んでもよい。チャネルは、個別のチャネルであり得る。これらの実施形態では、個別のチャネルは、物質をポリマー分離媒体の異なる所定部分に送達するために、提供され得る。一部の実施形態では、２つ以上のチャネルは、相互に流体連通していてもよい。例えば、２つ以上のチャネルの内部体積は、チャネルの内容物が別のチャネルに流れ得るように、相互に接続していてもよい。一部の場合には、２つ以上のチャネルが相互に流体連通していてもよい実施形態は、単一の上流流入チャネルから２つ以上のチャネルに同一の緩衝液、溶液、試薬などを提供するのを促進する。一部の場合には、２つ以上のチャネルが相互に流体連通していてもよい実施形態は、２つ以上のチャネルから下流の単一の流出チャネルを提供するのを促進する。
【００７２】
ある特定の実施形態では、チャネルの内部体積は空隙である。一部の例では、空隙は、アッセイプロトコルに対して所望され得る通りに、溶液、緩衝液、試薬（例えば、分析物検出試薬または抗体、タンパク質、酵素、代謝産物など）、それらの組み合わせなどで充填され得る。ある特定の実施形態では、チャネルの内部体積は、材料を含む。例えば、チャネルの内部体積は、ポリマーゲルなどのポリマー材料を含んでもよい。ポリマーゲルは、ゲル電気泳動に好適なゲルであり得る。ポリマーゲルとしては、ポリアクリルアミドゲル（例えば、メタクリルアミドゲル）、アガロースゲルなどを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、チャネルの内部体積中のポリマー材料は、ポリマー分離媒体と比較したとき、異なる物理的および／または化学的特性を有する。例えば、チャネルの内部体積中のポリマー材料は、ポリマー分離媒体と比較したとき、異なる細孔径、総ポリマー含量（例えば、総アクリルアミド含量）、架橋剤の濃度、および／または官能基を有してもよい。
【００７３】
ある特定の実施形態では、チャネル中の溶液、緩衝液、試薬などは、拡散によってポリマー分離媒体の１つ以上の部分に送達され得る。例えば、溶液、緩衝液、試薬などは、チャネルの内部体積中に提供されてもよく、チャネルと接触しているポリマー分離媒体の１つ以上の部分へと拡散できてもよい。一部の例では、溶液、緩衝液、試薬などは、電気泳動、電気浸透、圧力駆動流（例えば、ポンプまたは重力を使用する）、およびそれらの組み合わせなどを含むがこれらに限定されない有向輸送によって、ポリマー分離媒体の１つ以上の部分に送達されてもよい。
【００７４】
用途に応じて、チャネルのうちのいずれかまたは全ては、同一であるか、または相互に異なってもよく、各々は、別個の緩衝液、溶液、試薬などを含むように構成され得る。個別のチャネルの態様は、以下でより詳細に記載されるが、チャネルのうちのいずれかまたは全てに適用されてもよい。
【００７５】
ある特定の実施形態では、チャネルは、伸長したチャネルである。伸長したチャネルは、幅よりも大きい長さを有する。一部の場合には、チャネルの長さは、チャネルの幅より２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、１７５倍、または２００倍以上大きいなど、チャネルの幅より大きい。
【００７６】
ある特定の実施形態では、チャネルはマイクロチャネルである。「マイクロチャネル」は、マイクロメータ規模の寸法を有するチャネルである。寸法は異なり得るが、一部の例では、チャネルは、９０μｍ以下、または８０μｍ以下、または７０μｍ以下、または６０μｍ以下、または５０μｍ以下、または４０μｍ以下、または３０μｍ以下、または２０μｍ以下、または１０μｍ以下、または５μｍ以下、または１μｍ以下など、１００μｍ以下の幅を有する。例えば、チャネルは、１μｍ〜９０μｍ、または１μｍ〜８０μｍ、または１μｍ〜７０μｍ、または１μｍ〜６０μｍ、または１μｍ〜５０μｍ、または１μｍ〜４０μｍ、または１μｍ〜３０μｍ、または１μｍ〜２０μｍ、または１μｍ〜１０μｍなど、１μｍ〜１００μｍの範囲の幅を有してもよい。
【００７７】
ある特定の実施形態では、チャネルは、９０μｍ以下、または８０μｍ以下、または７０μｍ以下、または６０μｍ以下、または５０μｍ以下、または４０μｍ以下、または３０μｍ以下、または２０μｍ以下、または１０μｍ以下、または５μｍ以下、または１μｍ以下など、１００μｍ以下の深度を有する。例えば、チャネルは、１μｍ〜９０μｍ、または１μｍ〜８０μｍ、または１μｍ〜７０μｍ、または１μｍ〜６０μｍ、または１μｍ〜５０μｍ、または１μｍ〜４０μｍ、または１μｍ〜３０μｍ、または１μｍ〜２０μｍ、または１μｍ〜１０μｍなど、１μｍ〜１００μｍの範囲の深度を有してもよい。
【００７８】
ある特定の実施形態では、チャネルは、２０μｍ以上、または３０μｍ以上、または４０μｍ以上、または５０μｍ以上、または６０μｍ以上、または７０μｍ以上、または８０μｍ以上、または９０μｍ以上、または１００μｍ以上、または１５０μｍ以上、または２００μｍ以上、または２５０μｍ以上、または３００μｍ以上、または３５０μｍ以上、または４００μｍ以上、または４５０μｍ以上、または５００μｍ以上、または５５０μｍ以上、または６００μｍ以上、または６５０μｍ以上、または７００μｍ以上、または７５０μｍ以上、または８００μｍ以上、または８５０μｍ以上、または９００μｍ以上、または９５０μｍ以上、または１０００μｍ以上など、１０μｍ以上の長さを有する。
【００７９】
一部の実施形態では、チャネルは、隣接するチャネルから一定距離分離される。例えば、チャネルは、隣接するチャネルから、９０μｍ以下、または８０μｍ以下、または７０μｍ以下、または６０μｍ以下、または５０μｍ以下、または４０μｍ以下、または３０μｍ以下、または２０μｍ以下、または１０μｍ以下、または５μｍ以下など、４５０μｍ以下、または４００μｍ以下、または３５０μｍ以下、または３００μｍ以下、または２５０μｍ以下、または２００μｍ以下、または１５０μｍ以下、または１００μｍ以下など、５００μｍ以下の距離で分離されてもよい。
【００８０】
ある特定の実施形態では、チャネルは実質的に直線である。他の実施形態では、チャネルは曲線である。一部の例では、チャネルの１つ以上の部分は実質的に直線であり、一方で、チャネルの１つ以上の隣接する部分は曲線である。一部の実施形態では、チャネルは、１つ以上の屈曲部または角部を含む。これらの実施形態では、チャネルは、屈曲部または角部を通して第２の部分に接続される第１の部分を含み得る。１つ以上の屈曲部または角部によって接続されたチャネルの更なる部分を、所望のように提供してもよい。
【００８１】
上記の通り、チャネルを含む装置は、ポリマー分離媒体の１つ以上の特定の部分への物質（例えば、溶液、緩衝液、試薬など）の局所送達において使用を見出す。一部の実施形態では、チャネルは、チャネルを含まない装置と比較したとき、より速い速度でのポリマー分離媒体への物質の送達を促進し得る。一部の実施形態では、チャネルは、アッセイプロトコル中の異なる時間間隔で１つ以上の物質をポリマー分離媒体の特定の部分に送達することを促進する。例えば、第１の物質は、第１の時点でポリマー分離媒体の一部分に送達されてもよく、第２の物質は、第２の時点でポリマー分離媒体の同一または異なる部分に送達されてもよい。ある特定の場合には、チャネルからの物質の持続放出は、適用刺激の適用または物質を放出する反応に依存し得る。例えば、物質は、光活性化反応または酸もしくは塩基活性化反応などによって、チャネルから放出されてもよい。例えば、一部の例では、放出される物質は、チャネルの内部体積中の材料に結合し（例えば、分解性架橋剤によって）、上記のような適用刺激を適用することによって物質から放出（例えば、非結合）されてもよい。非結合物質はその後、チャネルの内部体積からポリマー分離媒体へと横断する。一部の実施形態では、チャネルを含む装置は、アッセイプロトコル中に使用される物質量の減少を促進する。一部の場合には、チャネルは、ポリマー分離媒体の所定部分における物質の局所濃度の上昇を促進し得る。例えば、チャネル中に提供された物質の局所濃度は、チャネルから離れたポリマー分離媒体の領域と比較したとき、チャネルに隣接したポリマー分離媒体の領域においてより高くてもよい。
【００８２】
ある特定の実施形態では、装置は、チャネルの縦軸がポリマー分離媒体の平面に実質的に垂直であるように配向される、例えば、チャネルが水平に配置されたポリマー分離媒体に対して垂直に配向される、チャネルを含む。一部の例では、チャネルは、上記のような中心ウェルを含む。このように、チャネルは、ポリマー分離媒体中に空隙を形成し得、ここで、空隙を囲むポリマー分離媒体は、チャネルの周壁を形成する。一部の場合には、チャネル（例えば、中心ウェル）の形状は、実質的に円形である。
【００８３】
一部の例では、分離媒体は、試料が分離媒体のチャネル中に置かれるように、構成される。ある特定の場合には、チャネルは、ポリマー分離媒体の表面（例えば、上面）上にある開口端部などの開口端部を含む。一部の場合には、チャネルの開口端部は、反対の閉口端部を有する。閉口端部は、ポリマー分離媒体によって形成され得るか（例えば、チャネルの高さがポリマー分離媒体の厚さ未満である場合）、またはポリマー分離媒体を保持する固体支持体によって形成され得る（例えば、チャネルがポリマー分離媒体の厚さ全体を通過する場合）。
【００８４】
ある特定の実施形態では、ポリマー分離媒体のチャネル（例えば、中心ウェル）は、外周部上に位置付けられ、かつチャネルと流体連通している複数のマイクロウェルを含む。チャネルと流体連通しているマイクロウェルは、流体およびその構成物質がチャネルの内部体積からマイクロウェルの内部体積へと流動し、その逆もまた同様であるように、チャネルの内部体積に面する開口端部を有し得る。一部の実施形態では、各マイクロウェルは、マイクロウェルの開口端部とは反対の閉口端部を有する。ある特定の場合には、マイクロウェルの閉口端部は、周囲のポリマー分離媒体によって形成される。ある特定の例では、マイクロウェルは、チャネルと同一平面にある。例えば、マイクロウェルは、マイクロウェルの閉口端部から開口端部までのマイクロウェルの軸が、チャネルの横（すなわち、水平）半径と同一平面にあるように（例えば、車輪のスポークに類似して）、構成されてもよい。このように、マイクロウェルは、ポリマー分離媒体と同一平面にある、マイクロウェルの閉口端部から開口端部までのマイクロウェルの軸を有し得る。上のチャネルの実施形態の更なる態様は、中心ウェルとマイクロウェルの円形配列とを持つポリマー分離媒体に関係して本明細書で記載される。
【００８５】
方法
方法の実施形態は、細胞の構成物質（例えば、細胞成分）などの試料の構成物質を分離することを対象とする。方法の態様は、試料を、上記の通り、複数のマイクロウェルを含むポリマー分離媒体を接触させることを含む。ある特定の実施形態では、以下でより詳細に記載する通り、ポリマー分離媒体は、適用刺激を適用すると分離媒体中の１つ以上の目的とする試料成分に共有結合する官能基を含む。一部の場合には、方法はまた、ポリマー分離媒体に、試料の少なくとも一部の成分をマイクロウェルからポリマー分離媒体へと移動させるのに十分な様態で電場を適用して、ポリマー分離媒体中で分離した試料成分をもたらすことを含む。
【００８６】
ある特定の実施形態では、試料は、試料の構成物質がポリマー分離媒体中の１つ以上のマイクロウェル中に位置付けられるように、ポリマー分離媒体に接触させられ得る。例えば、試料は、分離媒体の表面に提供されもよく、試料中の構成物質は、マイクロウェルへと受動的に沈降（例えば、重力により溶液から受動的に沈降）させられてもよい。一部の例では、上記の通り、ポリマー分離媒体はマイクロウェルの平面アレイを含み、一部の場合には、試料構成物質は、試料を分離媒体に適用すること、および試料中の構成物質をマイクロウェルの平面アレイへと受動的に沈降させることにより、マイクロウェルの平面アレイ中に位置付けられてもよい。ある特定の実施形態では、マイクロウェルのアレイは、上記の通り、実質的に一様であるか、または他の実施形態では非一様である形状および／またはサイズを有するマイクロウェルを含み得る。ポリマー分離媒体が非一様なマイクロウェルを含む実施形態では、本方法は、異なる形状および／またはサイズのマイクロウェルを使用する、サイズ選択沈降を含み得る。例えば、試料は分離媒体に適用されてもよく、試料構成物質（例えば、細胞）は、細胞およびマイクロウェルの形状および／またはサイズに応じて、ある特定の対応するマイクロウェルへと選択的に沈降してもよい。
【００８７】
他の実施形態では、上記の通り、ポリマー分離媒体は、マイクロウェルの円形配列を含み得る。これらの実施形態では、試料構成物質をマイクロウェル中に位置付ける方法は、試料の成分をマイクロウェル中に位置付けるのに十分な様態で、ポリマー分離媒体に遠心力を適用することを含み得る。例えば、試料をポリマー分離媒体の中心ウェルに導入し、次に、中心ウェル中の試料構成物質が中心ウェルの外周部上の１つ以上のマイクロウェルへと押しやられるように遠心力を適用してもよい（例えば、装置を回転させることにより）。一部の例では、適用遠心力は、細胞などの試料成分を装置のマイクロウェル中に位置付けるのに十分な大きさのものであり得る。ある特定の例では、適用遠心力は、試料中の構成物質（例えば、細胞）に著しい損傷を引き起こさずに、試料成分、例えば細胞を装置のマイクロウェル中に位置付けるのに十分な大きさのものであり得る。ある特定の例では、適用遠心力は、６０ｇ以上、または７０ｇ以上、または８０ｇ以上、または９０ｇ以上、または１００ｇ以上、または１１０ｇ以上、または１２０ｇ以上、または１３０ｇ以上、または１４０ｇ以上、または１５０ｇ以上など、５０ｇ（重力）以上である。
【００８８】
試料構成物質をマイクロウェル中に位置付ける他の方法も可能である。例えば、試料構成物質は、試料に電場を適用すること；密度勾配を適用して、マイクロピペット、ノズル、光ピンセットなどであるがこれらに限定されない位置付け装置を使用して、試料構成物質をマイクロウェル中に物理的に位置付けること；圧力を適用すること；磁力を適用すること（例えば、目的とする試料構成物質が磁気ビーズに結合している場合）；対流；異なるサイズのマイクロウェルを使用するサイズ選択沈降；細胞または細胞溶解物を含む試料の液滴をマイクロウェル中に位置付けること；およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上によって、ポリマー分離媒体の１つ以上のマイクロウェル中に位置付けられてもよい。
【００８９】
ある特定の実施形態では、試料および／または試料成分は、試料成分をマイクロウェル中に位置付ける前または後に操作され得る。例えば、試料および／または試料成分は、マイクロウェル中に位置付ける前に操作されてもよい。他の実施形態では、試料および／または試料成分は、マイクロウェル中に位置付けた後に操作されてもよい。一部の例では、試料は、１つ以上の目的とする細胞を含み得る。このように、本方法は、細胞を操作して、細胞成分をもたらすことを含み得る。例えば、本方法は、細胞を溶解して、細胞から細胞成分を放出することを含んでもよい。一部の例では、細胞成分は、特定の細胞内区分の差異溶解によってもたらされ得る。例えば、特定の細胞内区分の差異溶解は、異なる細胞内区画の内容物の個別分析を促進してもよい。ある特定の場合には、細胞成分は、細胞が目的とする細胞成分を放出するように（例えば、細胞を溶解することなく）細胞を処理することによって、細胞からもたらされ得る。例えば、細胞は、細胞が１つ以上の目的とする細胞成分を分泌するように、処理（例えば、より暖かい温度またはより冷たい温度でインキュベートする、活性化剤で処理するなど）されてもよい。ある特定の実施形態では、細胞は、試料液滴中にカプセル化され得、試料液滴は、細胞成分がもたらされるように、上記のように処理され得る。液滴は、マイクロウェル中に位置付けられ、その後上記のように処理され得るか、または液滴は、液滴をマイクロウェル中に位置付ける前に処理されてもよい。
【００９０】
試料構成物質がマイクロウェル中に位置付けられると、本方法は、分離媒体中の試料構成物質を分離して、分離した試料構成物質をもたらすことを更に含んでもよい。一部の場合には、分離した構成物質は、試料がマイクロウェルの壁、および分離媒体を通って横断するときに、ゲル電気泳動によってもたらされる。他の場合には、分離した試料は、分離媒体中で等電点電気泳動法によってもたらされる。分離した試料は、構成物質（例えば、分析物）の明瞭な検出可能なバンドを含んでもよく、ここで、各バンドは、行われた分離の種類に応じて、分子量、サイズ、電荷（例えば、電荷対質量比）、等電点、親和性相互作用などの、実質的に類似の特性を有する１つ以上の構成物質を含む。
【００９１】
例えば、上記の通り、ポリマー分離媒体がマイクロウェルの平面アレイを含む実施形態では、本方法は、試料構成物質の少なくとも一部を、マイクロウェルの側壁を通しておよびポリマー分離媒体へと移動させて、ポリマー分離媒体中で分離した試料構成物質をもたらすのに十分な様態で、ポリマー分離媒体にわたって電場を適用することにより、試料構成物質を分離することを含んでもよい。上記の通りポリマー分離媒体がマイクロウェルの円形配列を含む他の実施形態では、本方法は、試料構成物質の少なくとも一部を、マイクロウェルの閉口端部（例えば、マイクロウェルの底部）を通しておよびポリマー分離媒体へと移動させて、ポリマー分離媒体中で分離した試料構成物質をもたらすのに十分な様態で、ポリマー分離媒体にわたって電場を適用することにより、試料構成物質を分離することを含んでもよい。
【００９２】
ある特定の実施形態では、装置は、試料を電場に供するように構成される。電場は、装置中の試料の運動（例えば、装置のある領域から装置の別の領域への試料の動電移動）を促進し得る。電場はまた、上記の通り、電気泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法など）による試料中の分析物の分離を促進し得る。
【００９３】
例えば、試料中の分析物を分離することは、試料中の分析物に装置の分離媒体を通過させるように構成される電場を適用することを含んでもよい。電場は、分析物の物理的特性に基づく試料中の分析物の分離を促進するように構成され得る。例えば、電場は、分析物の分子量、サイズ、電荷（例えば、電荷対質量比）、等電点などに基づく試料中の分析物の分離を促進するように構成されてもよい。ある特定の例では、電場は、分析物の分子量に基づく試料中の分析物の分離を促進するように構成される。他の実施形態では、電場は、分析物の等電点（ｐＩ）に基づく試料中の分析物の分離を促進するように構成される。
【００９４】
一部の例では、本方法は、分離した試料成分をポリマー分離媒体中で固定することを更に含む。固定化は、例えば、ポリマー分離媒体を紫外線（ＵＶ）光に露出させることなどによって、分離した試料成分をポリマー分離媒体に共有結合させることなどの、任意の簡便な手法を使用して、達成され得る。例えば、試料中の構成物質が分離された後、本方法は、刺激を分離媒体に適用して、構成物質を分離媒体に共有結合させることを更に含んでもよい。一部の場合には、刺激の適用は、電磁放射線を分離媒体に適用することを含む。例えば、本方法は、分離媒体を、可視光、ＵＶ光、赤外光などであるがこれらに限定されない光に露出させることを含んでもよい。ある特定の場合には、本方法は、光（例えば、ＵＶ光）を分離媒体に適用して、構成物質を分離媒体に共有結合させることを含む。
【００９５】
ある特定の実施形態では、目的とする構成物質を分離媒体に共有結合するために使用される光は、分離媒体の形成を活性化するために使用される光とは異なる波長を有する。例えば、本明細書に記載の通り、分離媒体の形成を活性化するために使用される光は、可視スペクトル内の青色光の波長を有してもよい。上記の通り、目的とする構成物質を分離媒体に共有結合するために使用される光は、ＵＶ光の波長を有し得る。このように、ある特定の実施形態では、本方法は、分離媒体を光の第１の波長に露出させて分離媒体を形成させること、および分離媒体を光の第２の波長に露出させて目的とする構成物質を分離媒体に共有結合させることを含む。本明細書に記載の通り、光の第１および第２の波長は、それぞれ、青色光およびＵＶ光であり得る。
【００９６】
ある特定の実施形態では、本方法は、目的とする分析物が試料中に存在するかどうかを判定すること、例えば、試料中の１つ以上の目的とする分析物の有無を判定することを含む。一部の例では、装置は、試料中の１つ以上の分析物の存在を検出するように構成される。本方法のある特定の実施形態では、試料中の１つ以上の分析物の存在は、定性的または定量的に判定され得る。定性的判定は、試料中の分析物の存在に関する単純な合否結果がユーザに提供されるという判定を含む。定量的判定は、試料中の分析物の量に関して概略のスケール結果、例えば、少、中、多がユーザに提供される半定量的判定と、分析物の濃度の測定値がユーザに提供される委細のスケール結果との両方を含む。
【００９７】
ある特定の実施形態では、本方法は、分離媒体に結合した目的とする分析物の検出を含む。分離媒体への目的とする分析物の検出可能な結合は、試料中の目的とする分析物の存在を示す。一部の例では、目的とする分析物の検出は、目的とする分析物を、例えば分析物検出試薬中に存在し得るような、目的とする分析物に特異的に結合するように構成された標識と接触させることを含む。分析物検出試薬は、タンパク質もしくは核酸配列または標的化される生体高分子（例えば目的とする分析物）に特異的に結合する任意の分子であることができる。分析物の性質に応じて、分析物検出試薬は、核酸の検出のための標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の特異領域に相補的なＤＮＡの一本鎖、タンパク質およびペプチドの検出のためのペプチド分析物のエピトープに対する抗体、または特異的結合ペアの一員などの任意の認識分子などであることができるが、これらに限定されない。例えば、好適な特異的結合ペアとしては、受容体／リガンドペアの一員、受容体のリガンド結合部分、抗体／抗原ペアの一員、抗体の抗原結合断片、ハプテン、レクチン／炭水化物ペアの一員、酵素／基質ペアの一員、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシン／抗ジゴキシン、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー結合ペアの一員、ペプチドアプタマー結合ペアの一員などが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、分析物検出試薬は抗体を含む。抗体は、目的とする分析物に特異的に結合し得る。
【００９８】
ある特定の実施形態では、分析物検出試薬は、検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、本方法およびシステムを使用して検出され得る任意の簡便な標識を含み、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、多色試薬、酵素架橋試薬、アビジン−ストレプトアビジン関連の検出試薬、放射性標識、金粒子、磁気標識などが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、分析物検出試薬は、検出可能な標識と関連付けられた抗体を含む。例えば、分析物検出試薬は、目的とする分析物に特定的に結合する標識された抗体（例えば、蛍光標識された抗体）を含んでもよい。このように、本方法は、標識された目的とする分析物を検出することを含み得る。
【００９９】
上記の通り、目的とする分析物を検出することは、目的とする分析物を、目的とする分析物に特異的に結合するように構成された分析物検出試薬（例えば、標識）（例えば、目的とする分析物に特異的に結合する抗体）と接触させることを含む。例えば、目的とする分析物を分析物検出試薬と接触させることは、分析物検出試薬の溶液をポリマー分離媒体に提供することを含んでもよい。分析物検出試薬は、ポリマー分離媒体の上部または１つ以上の側部など、ポリマー分離媒体の任意の表面に接触させられてよい。一部の場合には、分析物検出試薬は、分析物検出試薬が、ポリマー分離媒体内に固定された目的とする分析物に接触するように、ポリマー分離媒体を通って移動し得る。例えば、分析物検出試薬は、ポリマー分離媒体に電場を適用すること、圧力を適用すること、遠心力を適用すること、および受動的拡散などによって、ポリマー分離媒体を通って移動してもよい。
【０１００】
ある特定の実施形態では、目的とする分析物を検出することは、目的とする分析物を、目的とする分析物に特異的に結合する一次標識と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、方法は、標識された目的とする分析物からの検出可能なシグナルを増強することを含む。例えば、標識された目的とする分析物からの検出可能なシグナルを増強することは、一次標識を、一次標識に特異的に結合するように構成された二次標識と接触させることを含んでもよい。ある特定の例では、一次標識は、目的とする分析物に特異的に結合する一次抗体であり、二次標識は、一次抗体に特異的に結合する二次抗体である。このように、標識された目的とする分析物からの検出可能なシグナルを増強することは、一次抗体を、一次抗体に特異的に結合するように構成された二次抗体と接触させることを含み得る。上記のような２つ以上の検出可能な標識の使用は、シグナル対ノイズ比を改善することによって、目的とする分析物の検出を促進し得る。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、分析物検出試薬は、目的とする分析物に特異的に結合しない場合がある。一部の場合には、分析物検出試薬は、目的とする分析物に特異的に結合することなく、目的とする分析物からの検出可能なシグナルをもたらすように構成され得る。例えば、目的とする分析物は、酵素（例えば、細胞性酵素）であってもよく、分析物検出試薬は、酵素のための基質であってもよい。一部の場合には、分析物検出試薬（例えば、酵素基質）を目的とする分析物（例えば、酵素）に接触させることは、基質が酵素によって変換されるため、検出可能なシグナルをもたらし得る。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、本方法は、分析物検出試薬を除去し、その後、目的とする分析物を別の分析物検出試薬と接触させること（例えば、ストリッピングおよび再プロービング）を含む。例えば、本方法は、標識された目的とする分析物を、分析物検出試薬を目的とする分析物から解離させるように構成された緩衝液（例えば、ストリッピング緩衝液）と接触させることを含んでもよい。解離された分析物検出試薬はその後、ポリマー分離媒体から洗い取られ得る。一部の場合には、目的とする分析物は、後続の分析物検出試薬と接触させられてもよい。後続の分析物検出試薬は、最初の分析物検出試薬と同一であるか、または異なってもよい。ストリッピングおよび再プロービングは、目的とする分析物を異なる分析物検出試薬と接触させることを促進し得る。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、本方法は、ポリマー分離媒体を貯蔵することを含む。例えば、本方法は、ポリマー分離媒体を脱水することによって、ポリマー分離媒体を貯蔵することを含んでもよい。ポリマー分離媒体は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間以上などであるがこれらに限定されない長期間、貯蔵され得る。一部の実施形態では、本方法は、ポリマー分離媒体を脱水することを更に含む。脱水されたポリマー分離媒体は、本明細書に記載のアッセイステップのうちの任意のものにおいて使用され得る。例えば、ポリマー分離媒体の脱水および再水和は、ポリマー分離媒体をもたらすこととアッセイを行うこととの間、目的とする分析物をポリマー分離媒体に固定することと分析物を分析物検出試薬と接触させることとの間、ストリッピングと再プロービングとの間など、アッセイステップのうちの任意のものの間に行われてもよい。
【０１０４】
主題の方法を用いてアッセイされ得る試料は、単純試料と複合試料との両方を含み得る。単純試料は、目的とする分析物を含み、かつ目的としない１つ以上の分子実体を含む場合も、含まない場合もある試料であり、ここで、これらの目的としない分子実体の数は、例えば、１０個以下、５個以下など、少なくてもよい。単純な試料は、最初の生体試料、またはある様態、例えば、干渉する可能性のある分子実体を試料から除去することで処理された他の試料を含み得る。「複合試料」とは、目的とする分析物を有する場合も、有しない場合もあるが、目的としない多くの異なるタンパク質および他の分子も含み得る試料を意味する。一部の例では、主題の方法でアッセイされる複合試料は、分子構造または物理的特性（例えば、分子量、サイズ、電荷、等電点、親和性相互作用など）の点で相互に異なる、１００個以上、例えば、１０３個以上、１０４個以上（１５，０００個など、２０，０００個または２５，０００個以上）を含む、２０個以上など、１０個以上の別個の（すなわち、異なる）分子実体を含むものである。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、目的とする分析物は、細胞および／または細胞成分である。一部の場合には、細胞は、尿、血液、血清、血漿、唾液、精液、前立腺液、乳頭吸引液、涙液、汗、便、頬スワブ、脳脊髄液、細胞溶解物試料、羊水、胃腸液、生検組織（例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）から取得される試料）などであるがこれらに限定されない試料（例えば、生体試料）から取得される。試料は、生体試料であり得るか、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、およびペプチドの抽出を成功させるための従来的な方法を使用して、ヒト、動物、植物、真菌、酵母菌、細菌、組織培養物、ウイルス培養物、またはそれらの組み合わせに由来する生体試料から抽出され得る。ある特定の実施形態では、試料は、流体中にある分析物（例えば、細胞および／または細胞成分）の溶液などの流体試料である。流体は、水および緩衝液などであるがこれらに限定されない、水性流体であり得る。
【０１０６】
上記の通り、主題の方法でアッセイされ得る試料は、１つ以上の目的とする分析物を含んでもよい。検出可能な分析物の例としては、核酸、例えば、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ、二本鎖または一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーなど；修飾を持つまたは持たないタンパク質およびペプチド、例えば、抗体、ダイアボディ、Ｆａｂ断片、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質、リン酸化タンパク質（ホスホプロテオミクス）、ペプチドアプタマー、およびエピトープなど；阻害剤、活性剤、リガンドなどの、小分子；オリゴ糖または多糖類；ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、方法は、試料サイズが小さい場合、試料中の目的とする構成物質を分離および／または検出するように構成される。例えば、本方法は、試料サイズが、５００μＬ以下、または２５０μＬ以下、または１００μＬ以下、または７５μＬ以下、または５０μＬ以下、または４０μＬ以下、または３０μＬ以下、または２０μＬ以下、または１０μＬ以下、または５μＬ以下、または１μＬ以下を含む、７５０μＬ以下など、１ｍＬ以下である場合、試料中の目的とする構成物質を分離および／または検出するように構成されてもよい。一部の例では、本方法は、試料サイズが２０μＬ以下である場合、試料中の目的とする構成物質を分離および／または検出するように構成される。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、本方法は、試料に分離媒体を通過させる前に、試料を濃縮、希釈、または緩衝液交換することを含む。試料を濃縮することは、試料を分離媒体と接触させる前に、試料を濃縮媒体と接触させることを含み得る。濃縮媒体は、小さい細孔径のポリマーゲル、膜（例えば、サイズ排除膜）、およびそれらの組み合わせなどを含んでもよい。試料を分離媒体と接触させる前に試料を濃縮することは、分離された試料中の分析物のバンド間の分解能の増大を促進し得、これは、分析物の分離されたバンド各々は、試料が分離媒体を通って横断するときの分散が少ないためである。試料を希釈することは、試料を分離媒体と接触させる前に、試料を更なる緩衝液と接触させることを含み得る。試料を緩衝液交換することは、試料を分離媒体と接触させる前に、試料を緩衝液交換媒体と接触させることを含み得る。緩衝液交換媒体は、試料緩衝液とは異なる緩衝液を含んでもよい。緩衝液交換媒体としては、分子篩および多孔性樹脂などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本方法は、目的とする分析物を検出する前に、分離媒体に結合した分離された分析物を遮断試薬と接触させることを含む。一部の場合には、目的とする分析物を検出する前に分離された分析物を遮断試薬と接触させることは、分離した分析物への検出可能な標識の非特異的結合を最小限にすることを促進し得る。例えば、目的とする分析物を検出する前に分離された分析物を遮断試薬と接触させることは、分離した分析物への標識された抗体の非特異的結合を最小限にすることを促進し得る。遮断試薬は、上記のように機能する任意の遮断試薬であることができ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、カゼイン、およびゼラチンが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、遮断ステップは求められない。故に、これらの実施形態では、本方法は、目的とする分析物を検出する前に遮断ステップを含まない。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、本方法はまた、本方法中の他のステップの前、最中、および後に何度も行われ得る、任意選択的な洗浄ステップも含む。例えば、洗浄ステップは、分離された試料を分離媒体に結合させた後、分離された試料を遮断試薬と接触させた後、分離された試料を検出可能な標識と接触させた後などに行われてもよい。
【０１１１】
本方法の実施形態はまた、分離媒体に結合した分析物を放出することも含み得る。放出することは、結合した分析物を放出剤と接触させることを含み得る。放出剤は、分析物と分離媒体との間の結合相互作用を妨害するように構成され得る。一部の場合には、放出剤は、分析物と分離媒体との間の結合相互作用を妨害して分離媒体に分析物を放出させる、試薬または緩衝液などである。分析物を分離媒体から放出した後、本方法は、分析物を分離媒体から離れて移動させることを含み得る。例えば、本方法は、ＵＶ分光計およびＩＲ分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイ装置、本明細書に記載の微小流体装置などであるがこれらに限定されない二次分析装置を用いた二次分析のために、放出された分析物を分離媒体から下流に向かわせることを含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、本方法は、試料中の分析物のユニプレックス分析を含む。「ユニプレックス分析」とは、試料を分析して、試料中の１つの分析物の存在を検出することを意味する。例えば、試料は、目的とする分析物と目的としない他の分子実体との混合物を含んでもよい。一部の場合には、本方法は、試料混合物中の目的とする分析物の存在を判定するための、試料のユニプレックス分析を含む。
【０１１３】
ある特定の実施形態は、試料中の２つ以上の分析物の多重分析を含む。「多重分析」とは、２つ以上の別個の分析物の存在を判定することであり、その２つ以上の物質が相互に異なることを意味する。例えば、分析物は、分子量、サイズ、電荷（例えば、質量対電荷比）、および等電点などにおいて、検出可能な差異を含んでもよい。一部の例では、分析物の数は、４個以上、６個以上、８個以上など、２個超であり、最大で、１００個以上を含む、２０個以上、例えば５０個以上の別個の分析物である。ある特定の実施形態では、本方法は、４〜２０個の別個の分析物を含む、４〜５０個の別個の分析物など、２〜１００個の別個の分析物の多重分析を含む。ある特定の実施形態では、多重分析はまた、２つ以上の異なる検出可能な標識の使用も含む。２つ以上の異なる検出可能な標識は、同一または異なる分析物に特異的に結合し得る。一部の場合には、２つ以上の異なる検出可能な標識は、同一の分析物に特異的に結合し得る。例えば、２つ以上の異なる検出可能な標識は、同一の分析物上の異なるエピトープに特異的な異なる抗体を含んでもよい。同一の分析物に特異的な２つ以上の検出可能な標識の使用は、シグナル対ノイズ比を改善することによって、分析物の検出を促進し得る。他の場合には、２つ以上の異なる検出可能な標識は、異なる分析物に特異的に結合し得る。例えば、２つ以上の検出可能な標識は、異なる分析物上のエピトープに特異的な異なる抗体を含んでもよい。異なる分析物に各々特異的な２つ以上の検出可能な標識の使用は、単一のアッセイにおける試料中の２つ以上のそれぞれの分析物の検出を促進し得る。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、本方法は、自動方法である。このように、本方法は、試料を装置に導入した後は、装置およびシステムとのユーザ交流は最小限であり得る。例えば、分離媒体中の試料構成物質を分離して、分離した試料をもたらすステップ、および刺激を分離媒体に適用して、構成物質を分離媒体に共有結合するステップは、ユーザがこれらのステップを手動で行う必要がないように、装置およびシステムによって所定の間隔で行われてもよい。一部の場合には、自動方法は、総アッセイ時間の減少を促進し得る。例えば、試料中の分析物の分離および検出を含む本方法の実施形態は、１５分以下、または１０分以下、または５分以下、または２分以下、または１分以下を含む、２０分以下など、９０分以下、または６０分以下、または４５分以下、または３０分以下など、２４０分以下、例えば、１８０分以下、１２０分以下以内に実行されてもよい。
【０１１５】
本開示の実施形態の態様は、上記のポリマー分離媒体の作製方法を更に含む。一部の例では、本方法は、ポリマー分離媒体のモノマー前駆体組成物を、１つ以上の構造的特徴を含む第１の表面と第２の表面との間に位置付けることと、所望の組成物をもたらすように前駆体組成物の重合化を始動するのに十分な波長を有する光（例えば、青色光）を、モノマー前駆体組成物に照射することとを含む。本方法は、第１の表面（例えば、固体支持体）が本明細書に記載の複数のマイクロウェルを含むポリマー分離媒体を保持するように、１つ以上の構造的特徴を含む第２の表面を除去することを更に含む。ある特定の実施形態では、第２の表面上の構造的特徴は、複数のポストを含む。第２の表面上のポストは、マイクロウェルの内部体積の所望の形状およびサイズに対応する形状およびサイズを含み得る。第２の表面上の複数のポストを含む実施形態では、マイクロウェルの平面アレイを含むポリマー分離媒体をもたらし得る。他の実施形態では、第２の表面上の構造的特徴は、本明細書に記載のマイクロウェルの円形配列を含むポリマー分離媒体の中心ウェルの形状およびサイズに対応し得る。例えば、第２の表面は、円筒の周縁部から離れて延在する複数のポストを含む円筒などの構造的特徴を含んでもよい。円筒の周縁部上のポストは、マイクロウェルの内部体積の所望の形状およびサイズに対応する形状およびサイズを含み得る。一部の実施形態では、円筒の高さは、ポリマー分離媒体の所望の厚さに対応する。
【０１１６】
システム
ある特定の実施形態の態様は、本開示の方法を行うように構成されたシステムを含む。一部の例では、本システムは、本明細書に記載の分離媒体を含む。本システムはまた、電磁放射線の源（すなわち、電磁放射線源）も含み得る。一部の場合には、電磁放射線源は光源である。例えば、光源は、可視光源、ＵＶ光源、赤外光源などを含んでもよい。一部の例では、電磁放射線源は、ＵＶ光源などの光源を含む。上記の通り、電磁放射線源を使用し、微小流体装置中で電磁放射線を分離媒体に適用して、試料構成物質を分離媒体に固定（例えば、共有結合）することができる。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、システムは検出器も含む。一部の場合には、検出器は、検出可能な標識を検出するように構成される。検出器は、アッセイで使用される検出可能な標識を検出するように構成された、任意の種類の検出器を含み得る。上記の通り、検出可能な標識は、蛍光標識、比色分析標識、化学発光標識、多色試薬、酵素架橋試薬、アビジン−ストレプトアビジン関連の検出試薬、放射性標識、金粒子、磁気標識などであり得る。一部の例では、検出可能な標識は、蛍光標識である。これらの例では、検出器は、蛍光標識を電磁放射線（例えば、可視、ＵＶ、ｘ線など）と接触させて、蛍光標識を励起し、蛍光標識に検出可能な電磁放射線（例えば、可視光など）を放射させるように構成されてよい。放射された電磁放射線を検出器によって検出して、分離媒体に結合した標識された分析物の存在を判定し得る。
【０１１８】
一部の例では、検出器は、上記の通りに蛍光標識からの放射を検出するように構成され得る。ある特定の場合には、検出器は、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、増強電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサ、視覚比色分析読み出し、フォトダイオードを含む。
【０１１９】
本開示のシステムは、所望のように種々の他の構成要素を含み得る。例えば、システムは、微小流体取扱構成要素などの流体取扱構成要素を含んでもよい。流体取扱構成要素は、１つ以上の流体を装置に通すように構成され得る。一部の例では、流体取扱構成要素は、流体試料、および緩衝液（例えば、電気泳動緩衝液、洗浄緩衝液、放出緩衝液など）などであるがこれらに限定されない流体を誘導するように構成される。ある特定の実施形態では、流体取扱構成要素は、流体が分離媒体と接触するように、流体を装置の分離媒体に送達するように構成される。流体取扱構成要素は、ポンプ（例えば、微小流体ポンプ）を含み得る。一部の場合には、ポンプは、本明細書に記載の装置およびシステムによる圧力駆動型流体取扱および流体の経路指定用に構成される。ある特定の例では、流体取扱構成要素は、例えば、５０μＬ以下、または２５μＬ以下、または１０μＬ以下、または５μＬ以下、または１μＬ以下など、１００μＬ以下を含む、５００μＬ以下などの、１ｍＬ以下など、少量の流体を送達するように構成される微小流体取扱構成要素である。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、本システムは、１つ以上の電場発生器を含む。電場発生器は、電場を、装置の種々の領域に、例えば分離媒体に適用するように構成され得る。本システムは、試料が装置中を動電的に輸送されるように、電場を適用するように構成され得る。例えば、電場発生器は、電場を分離媒体に適用するように構成されてもよい。一部の場合には、適用される電場は、分離媒体の方向軸と整列し得る。このように、適用される電場は、試料中の分析物および成分を分離媒体中で動電的に輸送するように構成され得る。一部の例では、電場発生器は、２００Ｖ／ｃｍ〜８００Ｖ／ｃｍまたは４００ｖ／ｃｍ〜８００Ｖ／ｃｍを含む、１００Ｖ／ｃｍ〜８００Ｖ／ｃｍなど、１０Ｖ／ｃｍ〜１０００Ｖ／ｃｍの範囲の強度で電場を適用するように構成される。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本システムは、試料中の分析物および／または構成物質が分離媒体中に等電的に集束されるように、電場を適用するように構成される電場発生器を含む。例えば、適用される電場は、分離媒体の方向軸と整列し得、かつ試料構成物質を分離媒体の方向軸に沿って等電的に集束させるように構成されてもよい。
【０１２２】
一部の実施形態では、電場は、方向に関して別個であり得る。例えば、電場は、分離媒体の方向軸と整列してもよい。電場は、試料または分析物を分離媒体の方向軸に沿って分離媒体に通すように、構成され得る。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、本システムは、電場を発生させるように構成される１つ以上の電場発生器を含む。ある特定の例では、電場発生器は、装置上に配列されるなど、装置に隣接していてもよい。一部の場合には、電場発生器は、装置から離れて位置付けられる。例えば、電場発生器は、装置と共に使用するために、システム中に組み込まれてもよい。
【０１２４】
実用
主題の装置、システム、および方法は、試料中の１つ以上の分析物の有無の判定および／または定量化が所望される、種々の異なる用途において使用を見出す。例えば、主題の装置、システム、および方法は、タンパク質、ペプチド、および核酸などの分離および検出において使用を見出す。一部の場合には、主題の装置、システム、および方法は、タンパク質の分離および検出において使用を見出す。
【０１２５】
主題の装置、システム、および方法は、幹細胞の脱分化および分化プロトコルの開発および検証において使用を見出す。例えば、人工多能性幹細胞は、皮膚細胞などの体細胞に由来することができ、これは、細胞を多能性状態にするために種々の外部刺激（例えば、化学的または生物学的刺激）を用いた体細胞の再プログラミングを伴い得る。一部の例では、多能性を達成するために新たな外部刺激を用いて実験する場合、多能性が達成されたかどうかを判定するために細胞集団の応答を測定することが望ましい場合がある。主題の装置、システム、および方法は、多能性が達成されたかどうかを判定するために細胞集団のこれらの応答を測定することにおいて使用を見出す。例えば、主題の装置、システム、および方法は、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、およびＳＯＸ２などであるがこれらに限定されない既知の多能性指標である複数のタンパク質標的の測定において使用を見出す。主題の装置、システム、および方法は、多能性状態への形質転換が成功した細胞のパーセンテージを判定するために、形質転換された細胞集団の不均一性を判定することにおいて使用を見出す。このような人工多能性幹細胞は、その後、外部の化学的または生物学的刺激を介して分化されて、心筋細胞、神経細胞、肝細胞、および内皮細胞などであるがこれらに限定されない種々の細胞型を導出することができる。主題の装置、システム、および方法は、そのような分化プロトコルの検証において使用を見出し、これは、ある特定の実施形態では、主題の装置、システム、および方法が、標的の細胞型への分化の成功を示す複数のタンパク質マーカを同時に検出することができるためである。主題の装置、システム、および方法は、標的の細胞型への分化が成功した細胞のパーセンテージを判定するために、形質転換された細胞集団の不均一性を判定することにおいて使用を見出す。
【０１２６】
主題の装置、システム、および方法はまた、「シャーレ中の疾患（ｄｉｓｅａｓｅ−ｉｎ−ａ−ｄｉｓｈ）」モデルの開発および検証においても使用を見出す。例えば、生きた患者から神経細胞を摘出することは難しく、かつ危険であるため、研究者がヒト脳中の疾患を研究することは困難であり得る。代替として、疾患の細胞モデルを創出し、基礎的科学研究および薬物開発を可能にすることができる。そのようなモデルは、例えば、遺伝性神経変性疾患を患う患者によって提供された皮膚細胞に由来する人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）から神経細胞を分化することによって、創出することができる。これらのモデルを創出するためには、幹細胞分化プロトコルを前述のように開発および検証して、皮膚細胞を幹細胞に脱分化し、その後、幹細胞を神経細胞に分化し得る。この形質転換が成功すると、モデルは、疾患の特徴が分化した細胞中に存在することを判定することによって、検証され得る。例えば、神経細胞は、ハンチントン病を患う患者の皮膚細胞から創出することができる。創出されると、得られた細胞は、ハンチンチンタンパク質の罹患形態の発現について試験され得る。主題の装置、システム、および方法は、疾患モデルにおけるハンチンチンタンパク質の存在および不均一性の検出、ならびに一次細胞との類似性の検証において使用を見出す。シャーレ中の疾患モデルはまた、細胞株の選択または遺伝子修飾によって創出されてもよい。そのような細胞を検証して、遺伝子修飾が、罹患一次細胞中で見られるものを模倣する罹患バイオマーカ（例えば、タンパク質）の安定した発現をもたらすことを確実にし得る。主題の装置、システム、および方法は、肝臓、腎臓、心臓、脳、血液、または他の器官、組織、および細胞型の疾患モデルを創出することにおいて使用を見出す。
【０１２７】
主題の装置、システム、および方法はまた、癌性腫瘍の不均一性を測定することにおいても使用を見出す。例えばＨＥＲ−２およびＢＲＡＦなどの特定のバイオマーカは、ある特定の癌変異を示し、それぞれトラスツズマブおよびベムラフェニブなどの薬物の標的である。癌は極めて不均一な疾患であり、ＨＥＲ−２およびＢＲＡＦなどの標的は、腫瘍内で一様に発現されない場合がある。そのような不均一性は、臨床診断および治療に影響を与える。主題の装置、システム、および方法は、腫瘍生検由来の細胞集団中の複数の標的の不均一性を分析することにおいて使用を見出す。そのような手法は、標的化治療薬のための基礎的科学研究、創薬および薬物開発、ならびにコンパニオン診断を促進し得る。
【０１２８】
主題の装置、システム、および方法はまた、薬物化合物の作用機序の判定においても使用を見出す。例えば、「シャーレ中の疾患」モデルは、薬物開発のインビトロ試験プラットフォームとして使用してもよい。薬物は、疾病および疾患モデルの両方に存在する特定の標的および伝達経路を標的とするように開発され得る。主題の装置、システム、および方法は、薬物候補への露出後に細胞集団の不均一応答を分析することにおいて使用を見出す。薬物への応答は、一次標的の存在と相関し得、一次標的の有無によって説明されない細胞集団内の不均一応答は、他のタンパク質およびシグナル伝達経路と更に相関し得る。このように、主題の装置、システム、および方法は、薬物の作用機序を判定することにおいて使用を見出し、それは、より効率的な研究、開発、および薬物化合物の最終的な認可を促進し得る。
【０１２９】
主題の装置、システム、および方法はまた、血液から単離された循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分析においても使用を見出す。ＣＴＣは、原発腫瘍から出た循環している癌細胞であり、早期癌診断、予後、治療のモニタリング、転移の検出、または他の用途に使用され得る。ＣＴＣは不均一であるため、各個別細胞は、侵襲性、増殖、または他の因子を示すタンパク質バイオマーカについて試験され得る。全血からＣＴＣを濃縮するための典型的な方法によって、標的ＣＴＣに富む細胞の懸濁液が得られる。主題の装置、システム、および方法は、例えば、捕捉および分析される投入懸濁液中の細胞の数を最大化するために細胞の能動的沈降を利用する方法を使用して、そのような細胞懸濁液を分析することにおいて、使用を見出す。主題の装置、システム、および方法によるＣＴＣの分析は、基礎的科学研究、最小残留疾患の管理、および癌診断のための使用を見出す。ある特定の例では、能動的沈降としては、電場を試料に適用すること；密度勾配を適用して、マイクロピペット、ノズル、および光ピンセットなどであるがこれらに限定されない位置付け装置を使用して試料構成物質をマイクロウェル中に物理的に位置付けること；圧力を適用すること；磁力を適用すること（例えば、目的とする試料構成物質が磁気ビーズに結合している場合）；対流；異なるサイズのマイクロウェルを使用するサイズ選択沈降；細胞または細胞溶解物を含む試料の液滴をマイクロウェル中に位置付けること；およびそれらの組み合わせなどのうちの１つ以上を使用して、試料構成物質を１つ以上のマイクロウェル中に位置付けることを含む。
【０１３０】
主題の装置、システム、および方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の下流の分析において使用を見出す。ＦＡＣＳは、数百万個の細胞を選別し、数百個の細胞まで小さい亜集団を単離することができる。しかしながら、フローサイトメーターによるそのような小さい亜集団の更なる分析は、典型的なフローサイトメーターが最低１０，０００個以上の細胞を必要とするため、好適でない場合がある。主題の装置、システム、および方法は、例えば、捕捉および分析される投入懸濁液中の細胞の数を最大化するために細胞の能動的沈降または配置を利用する方法を使用して、そのような小さい細胞亜集団を分析することにおいて、使用を見出す。主題の装置、システム、および方法は、ＦＡＣＳ選別中の標的、およびＦＡＣＳ選別の一部ではなかった標的を含む、タンパク質標的についての亜集団の更なる分析において、使用を見出す。例えば、癌性のヒトまたは動物組織由来の一次細胞をＦＡＣＳによって選別して、１つ以上の表面マーカに基づく推定癌細胞である細胞の亜集団を単離することができる。その後、主題の装置、システム、および方法を使用して、１つ以上の表面マーカの存在を確認し、単離した亜集団の状態および不均一組成物を更に特性評価する、例えば細胞内タンパク質および転写因子などの更なる標的についてアッセイすることができる。
【０１３１】
主題の装置、システム、および方法は、試料中の核酸、タンパク質、または他の生体分子の検出において使用を見出す。本方法は、試料中の１組のバイオマーカ、例えば、２つ以上の別個のタンパク質バイオマーカの検出を含み得る。例えば、本方法は、例えば、被験体の病状の診断、または被験体の病状の継続的管理もしくは治療などにおいて採用され得るように、生体試料中の２つ以上の疾患バイオマーカの迅速な臨床検出において使用され得る。加えて、主題の装置、システム、および方法は、ウエスタンブロッティングなどであるがこれらに限定されない、試料中の分析物の検出のためのプロトコルにおいて使用を見出し得る。
【０１３２】
主題の装置、システム、および方法は、バイオマーカを検出することにおいて使用を見出す。一部の場合には、主題の装置、システム、および方法を使用して、特定のバイオマーカの有無、ならびに、尿、血液、血清、血漿、唾液、精液、前立腺液、乳頭吸引液、涙液、汗、便、頬スワブ、脳脊髄液、細胞溶解物試料、羊水、胃腸液、および生検組織などであるがこれらに限定されない、血液、血漿、血清、または他の体液もしくは排泄物中の特定のバイオマーカの濃度の上昇または低下を検出し得る。
【０１３３】
バイオマーカの有無またはバイオマーカの濃度の著しい変化を使用して、個体における、疾患リスク、疾患の存在を診断するか、または個体における疾患の治療を調整することができる。例えば、特定のバイオマーカまたはバイオマーカのパネルの存在は、個体に付与される薬物療法または投与計画の選択に影響し得る。見込みある薬物療法の評価においては、バイオマーカは、生存率または不可逆的死亡率などの自然的終点の代理として使用され得る。治療がバイオマーカを改変し、それが健康の改善に直接の関係を有する場合、バイオマーカは、特定の治療または投与計画の臨床的利益を評価するための代理終点として働くことができる。故に、個体中で検出された特定のバイオマーカまたはバイオマーカのパネルに基づく個人化した診断および治療は、主題の装置、システム、および方法によって促進される。更に、疾患と関連付けられるバイオマーカの早期検出は、上記の通り、主題の装置およびシステムの高に感度によって促進される。感度、拡張性、および使用簡便性と併せて、単一チップ上の複数のバイオマーカを検知する能力により、本開示の微小流体装置、システム、および方法は、形態型およびポイント・オブ・ケアまたは患者身辺での分子診断において使用を見出す。
【０１３４】
主題の装置、システム、および方法は、疾患または疾患状態についてのバイオマーカを検出することにおいて使用を見出す。ある特定の例では、主題の装置、システム、および方法は、創薬およびワクチン開発のために、細胞シグナル伝達経路および細胞内情報伝達の特性評価についてのバイオマーカを検出することにおいて、使用を見出す。例えば、主題の装置、システム、および方法を使用して、疾患試料、健常試料、または良性試料中のバイオマーカの量を検出および／または定量化してもよい。ある特定の実施形態では、主題の装置、システム、および方法は、感染性疾患または疾患状態についてのバイオマーカを検出することにおいて使用を見出す。一部の場合には、バイオマーカは、タンパク質、核酸、炭水化物、および小分子などであるがこれらに限定されない、分子バイオマーカであることができる。
【０１３５】
主題の装置、システム、および方法は、上記の通りのバイオマーカの検出および／または定量化、試料が無症候の被験体に対して一定間隔で試験されるスクリーニングアッセイ、バイオマーカの存在および／または数量を使用して起こり得る疾患経過を予測する予後アッセイ、異なる薬物治療への被験体の応答を予測することができる層別化アッセイ、および薬物治療の有効性をモニターする有効性アッセイなどであるがこれらに限定されない、診断アッセイにおいて使用を見出す。例えば、１つ以上のバイオマーカは、数日、数週、または数年などの長期間にわたって検出およびモニターされてもよい。１つ以上のバイオマーカの存在および／または数量の変化は、長期間にわたってモニターされ得る。
【０１３６】
主題の装置、システム、および方法はまた、検証アッセイにおいても使用を見出す。例えば、検証アッセイを使用して、見込みある疾患バイオマーカが、種々の個体にわたる疾患の有無の信頼性のある指標であることを検証または確認してもよい。主題の装置、システム、および方法の短いアッセイ時間は、最低限の時間で複数の試料をスクリーニングするためのスループットの増加を促進し得る。例えば、主題の装置、システム、および方法は、親和性試薬スクリーニングのためのプローブされたＩＥＦ分離媒体における使用を見出す。ホ明細書に記載の分離媒体を含むハイスループット微小流体装置を使用して、特定のモノクローナル抗体などのバイオマーカアイソフォームに特異的な親和性試薬を選択し得る。そのような試薬は、臨床タンパク性試料中の疾患特異的バイオマーカアイソフォームについてのＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用され得る。一部の場合には、試薬は、連続して、または高度に特異的な結合に対するそれらの多重（平行）性能について、スクリーニングされ得る。
【０１３７】
主題の装置、システム、および方法はまた、試料中の１つ以上の構成物質（例えば、分析物）の分離が所望される種々の異なる用途においても、使用を見出す。試料中の構成物質は、電気クロモトグラフィー、電気泳動的免疫アッセイ、平衡分離（等電点および温度勾配電気泳動法）、ミセル動電クロマトグラフィー、クロマトグラフィーの変型、ネイティブ電気泳動、および変性条件下のタンパク質質量による分離（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などであるがこれらに限定されない、種々の異なる分離技法に基づいて分離され得る。分離技法のうちの任意のものは、例えば、抗体（または変異体）、レクチン、基質、リガンド、脂質、被覆粒子、または染料による、後続の分析物プロービングと結び付けられ得る。例えば、後続の抗体プロービングを伴うタンパク質のサイズに基づく分離は、統合された微小流体ウエスタンブロッティング装置をもたらす。
【０１３８】
一部の例では、主題の装置、システム、および方法は、実装のために研究室環境を必要とせずに使用することができる。同等の分析研究室の器具と比較して、主題の装置およびシステムは、携帯型で手持ちのシステムにおいて同等の分析感度をもたらす。一部の場合には、質量および運営費は、典型的な静置研究室器具よりも低い。主題のシステムおよび装置は、目的とする分析物の分離、移動、標識、および検出を含むアッセイの全てのステップが単一の機器によって行われ得るように、単一の機器中に統合されてもよい。例えば、一部の例では、目的とする分析物の分離、移動、標識、および検出のための分かれた機器はない。加えて、主題のシステムおよび装置は、試料中の１つ以上の分析物を検出するための、医療訓練を受けていない人による市販の家庭検査のために、家庭環境において利用することができる。主題のシステムおよび装置はまた、臨床環境、例えばベッドサイドにおいて、迅速な診断のために、または静置研究室器具が費用または他の理由により提供されていない環境において、利用され得る。
【０１３９】
キット
本開示の実施形態の態様は、本明細書に記載の方法における使用のために構成されるキットを更に含む。一部の例では、キットは、複数のマイクロウェルを有するポリマー分離媒体を含む装置などの、本明細書に記載の装置を含む。ある特定の実施形態では、キットは、装置を含むように構成される包装を含み得る。包装は、滅菌密封包装などの密閉包装であってもよい。「滅菌」とは、実質的に微生物（例えば、真菌、細菌、ウイルス、胞子形態など）が存在しないことを意味する。一部の例では、包装は、任意選択的に気密および／または真空密封下で、密封されるように、例えば、耐水蒸発包装であるように構成されてもよい。
【０１４０】
本開示の態様は、緩衝液を更に含むキットを追加的に含む。例えば、キットは、電気泳動緩衝液および試料緩衝液などの緩衝液を含んでもよい。ある特定の場合には、緩衝液は、トリス緩衝液およびトリス−グリシンなどであるがこれらに限定されない電気泳動緩衝液である。一部の例では、緩衝液は、界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳなど）を含む。
【０１４１】
キットは、放出試薬、変性試薬、リフォールディング試薬、界面活性剤、および検出可能な標識（例えば、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、多色試薬、酵素架橋試薬、例えば少なくとも１つの分析物検出試薬（第１および第２の分析物検出試薬）の形態にある検出試薬（例えば、アビジン−ストレプトアビジン関連の検出試薬）、較正基準、放射性標識、金粒子、磁気標識など）などであるがこれらに限定されない追加の試薬を更に含み得る。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、キットは、本明細書に記載の通り、検出可能な標識などの分析物検出試薬を含み得る。検出可能な標識は、特異的結合ペアの一員と関連付けられてもよい。好適な特異的結合ペアとしては、受容体／リガンドペアの一員、受容体のリガンド結合部分、抗体／抗原ペアの一員、抗体の抗原結合断片、ハプテン、レクチン／炭水化物ペアの一員、酵素／基質ペアの一員、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシン／抗ジゴキシン、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー結合ペアの一員、ペプチドアプタマー結合ペアの一員などが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、特異的結合ペアの一員は抗体を含む。抗体は、分離媒体に結合した分離された試料中にある目的とする分析物に特異的に結合し得る。例えば、検出可能な標識は、目的とする分析物に特異的に結合する標識された抗体（例えば、蛍光標識された抗体）を含んでもよい。
【０１４３】
上記の成分に加えて、主題のキットは、主題の方法を実践するための使用説明を更に含み得る。これらの使用説明は、種々の形態で主題のキット中に存在してもよく、その１つ以上がキット中に存在し得る。これらの使用説明が存在し得る一形態は、好適な媒体、例えば、情報が印刷される１枚または複数の紙上、キットの包装中、添付文書中などに印刷された情報として存在してもよい。別の手段は、情報が記録または記憶された、コンピュータ可読媒体、例えば、ＣＤ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ−Ｒａｙ、コンピュータ可読メモリなどであり得る。存在し得るまた別の手段は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得るウェブサイトのアドレスである。任意の簡便な手段がキット中に存在し得る。
【０１４４】
上記の開示から理解できるように、本発明の実施形態は、多種多様な用途を有する。したがって、本明細書に提示の実施例は、例示の目的のために提供され、決して本発明を限定するものとして解釈されることは意図されない。当業者は、実質的に類似の結果を得るために変更または修正され得る多様な重要性の低いパラメータを容易に認識するであろう。故に、以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製および使用するかの完全なる開示および説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されず、以下の実験が全てまたは唯一の実行される実験であると示すようにも意図されない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験による誤差および偏差が計上されるはずである。別途指示のない限り、部は、質量部であり、分子量は、質量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。
【実施例】
【０１４５】
実施例１
光活性ポリアクリルアミドマイクロパターン化による単一細胞の免疫ブロッティング
概要
本開示の実施形態は、単一計器における単一細胞タンパク質発現の迅速な定量分析をもたらす。実施形態は、単一細胞のサイズを元に、ウェルでマイクロパターン化した光活性ポリアクリルアミドシート中に単一細胞を捕捉することを含む、単一細胞免疫ブロッティングのための微小流体手法を含む。単一の顕微鏡スライドフォーマットで、単一細胞ブロットを使用して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ除去（ブロッティング）によるタンパク質固定化、および後続の抗体プロービングを行う。微小流体設計の拡張可能なハイスループット性質は、スライド当たりおよそ１０，０００個の細胞スループットおよび３時間の速いアッセイ実装に適応可能な単一細胞免疫ブロットを支える。この方法はまた、他の免疫ブロッティングアッセイ（例えば、ネイティブ、ＤＮＡ−タンパク質、ＲＮＡ−タンパク質）および抗体以外の試薬（例えば、アプタマー、ナノボディ、レクチン、タンパク質）にも使用することができる。実施形態はまた、単一細胞または複数の細胞のアッセイに使用してもよい。ある特定の実施形態では、光パターン化可能（青色光）および光活性化（ＵＶ光）ポリアクリルアミドゲルを、画定されたスタッキング界面を持つＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離マトリックスと、手短なＵＶスイッチング後の捕捉効率の高い（７５％超）タンパク質固定化マトリックスとの両方に使用する。一部の例では、分析物は、ＵＶ光を適用して初めて分離媒体中で固定されるため、遮断ステップを必要としない。以下で考察する実施例では、単一細胞免疫ブロットアッセイを神経幹細胞分析に使用し、それは、所与の目的とする分析物の約４０，０００個のタンパク質分子の感受性を示した。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、細胞を、アッセイ時間（総アッセイ時間は２時間未満）１時間当たり数千個の細胞においてスループットで様々なタンパク質分化マーカについて免疫ブロットした。顕微鏡スライドフォーマットはマクロアレイ走査検出と統合し、それにより細胞当たり１０２〜１０６コピーの濃度範囲にあるマーカの４重較正検出が可能となる。
【０１４７】
単一細胞ウエスタンブロッティングは、試料要件を、典型的なウエスタンブロッティングワークフローの１０，０００個−細胞＋範囲から単一細胞感受性まで減少させ得る。一部の実施形態では、この技法は、単一細胞のタンパク質構成物質を分離および定量化して、フローサイトメトリー、単一細胞トランスクリプトーム、および全細胞撮像技法などの標準的方法と比較して性能をもたらす。タンパク質分離から分子量情報を抽出することは、タンパク質間相互作用の分析を可能にする。
【０１４８】
方法
単一細胞からのタンパク質分離および捕捉のための可変多孔率を持つデュアルバンド可変式光活性化捕捉ゲル（Ｄｕａｌ  Ｂａｎｄ−Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｇｅｌ  ｗｉｔｈ  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｐｏｒｏｓｉｔｙ）（ＰＡＣＴゲル）
【０１４９】
単一細胞免疫ブロッティングのためのガラス顕微鏡「オープンゲル」を使用した。薄い（およそ３０ミクロン）厚さのポリアクリルアミドゲルを、メタクリレートで官能化したガラススライドと、シリコン上のＳＵ−８のマイクロポストモールドとの間の界面で、化学または光化学重合によって製造した。マイクロポストは典型的に、高さが３０ミクロン、直径が２０ミクロンであった。製造したゲルをシリコンモールドから持ち上げて取り出して、単一細胞のための容器として働くマイクロウェルで点刻した薄いポリアクリルアミドシートを得た。ポリアクリルアミドは光活性でもあり、可変多孔率を持つデュアルスペクトルバンド光活性タンパク質捕捉ゲル（ＰＡＣＴゲル）分離およびブロッティングポリマーを含んだ。微小流体および機能性ポリマーを使用して、変性タンパク質分析物の重量式分離（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のための細胞沈降から、蛍光標識した一次および二次抗体を用いた免疫ブロッティングまでのアッセイステップを、約３時間で、ポリマー層内で行った。ポリアクリルアミド系ＰＡＣＴゲル骨格を、ゲルのスペクトル的に別個のＵＶ光応答性捕捉機能性を維持したリボフラビン駆動型光重合化戦略を使用して構築した。光化学的に製造したＰＡＣＴゲルを、青色光を使用してパターン化した。ＵＶスポット光源を介して適用した４５秒のＵＶ露出時間でのＰＡＧＥ分離（全ての分析物について約３０％の捕獲効率）の後に、ＰＡＣＴゲルを定量的タンパク質分析物捕捉のために最適化した。ゲルのベンゾフェノン官能化、光活性化特徴のため、タンパク質固定後の遮断ステップは必要とされなかった。最大４個のタンパク質分析物種の同時プロービングを、スペクトル的に多重化した二次抗体検出を用いて行った。
【０１５０】
単一細胞免疫ブロットアッセイ設計
ポリアクリルアミドゲル層を、次を含むいくつかの機能的役割に対して設計した：１）５０％以上の占有率での単一細胞捕捉に好適なマイクロウェル中への重力式沈降による捕捉、２）ピコリットル規模の注入体積にある可溶化タンパク質含量の溶解および拘束、３）マイクロウェルの壁に対するおよび壁を通したタンパク質含量のスタッキング、４）ゲルマトリックス内のタンパク質バンドの篩過、５）ゲル骨格内のタンパク質交差反応性ベンゾフェノン基によって媒介される高効率ＵＶ光誘発捕捉プロセスを介したタンパク質の固定化、ならびに６）蛍光ゲル内抗体式プロービング。
このプラットフォームを使用して、主要なラット神経幹細胞マーカ（つまり、ネスチンおよびｓｏｘ２）の発現を、神経細胞終点および神経膠終点に向けた中間状態を通したインビボ分化中に追跡した。亜集団動態のアレイを、単一細胞免疫ブロットからのマーカレベルの絶対定量化によって解決することで、分化プロセス中のプロテオミクス不均一性の精査を可能にした。
【０１５１】
詳細なプロトコル
このプロトコルは、１インチ×３インチの顕微鏡スライドチップ上の有孔ポリアクリルアミドシートを使用する単一細胞免疫ブロッティングに使用される製造および実験手順を説明する。使用した材料および器具：
・ＡｒｒａｙＩｔ製のメタクリレート官能化ガラススライド（製品番号ＳＭＲＹ３、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）。
・任意選択的に、Ａｒｒａｙｉｔ製の８×２のよく詰物をしたハイブリダイゼーションカセット（製品番号ＡＨＣ１×１６）。
・ＴｈｏｒＬａｂｓ（Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ）、ドライバ（ＬＥＤＤ１Ｂ）および１５Ｖの電力供給（ＴＰＳ００１）を持つ４７０ｎｍの青色ＬＥＤ平行光源（Ｍ４７０Ｌ２−Ｃ１）。
・スライドのインキュベーションのための小型トレイ。これらは、例えば細胞培養瓶の底部から作製した。
・標準的ゲル電気泳動電力供給、例えば、ＢｉｏＲａｄ  ＰｏｗｅｒＰａｃ  ＨＶ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。（例えば、全チップを実行するための５０ｍＡ超の電力供給）。
・ＨａｍａｍａｔｓｕのＵＶスポット光源（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。
・分離および読出撮像用の蛍光顕微鏡。
試薬（表１中、別途指示のない限り、全てのパーセンテージはｗ／ｖである）
0006317771.tif 000002
プロトコル（任意選択的な停止ポイントは＼ＳＴＯＰ”で示す）：
１．ゲル製造
（ａ）ＳＵ−８で所望のポスト形状で製造したシリコンウエハで開始する。
（ｂ）６０分間、２ｍｌのジクロロジメチルシラン（ＤＣＤＭＳ）を含む小型ペトリ皿中で、次に真空内でウエハをシラン化した。ウエハを水で漱ぎ、窒素流を使用して乾燥させた。
（ｃ）メタクリレート官能化ガラススライドを、処理した側を下にしてポスト構造を覆うウエハ上に置いた。
（ｄ）ＰＡＣＴゲル前駆体溶液を調製し、脱気した。
（ｅ）界面活性剤および開始剤をＰＡＣＴゲル前駆体に添加し、混合し、気泡の巻き込みを防止するために辺部を十分に湿らせた後、スライドの短い側のうちの１つから着実に注入した。
（ｆ）充填後、スライドをそっと押して、余分な前駆体溶液を隙間から押し出し、ウエハ上のポストがスライドと接触していることを確実にした。
（ｇ）青色ＬＥＤを下方に斜めに向けて、上からスライド全体を照射した。スライドを、およそ４７０ルクスの局所強度で７．５分間照射した。
（ｈ）ＬＥＤを消して、卓上で更に１０〜１５分間重合を継続させた。
（ｉ）２ｍｌのＰＢＳを、１ｍｌのピペッターを用いて、スライドの辺部に沿って適用した。これはスライドをウエハから持ち上げるのを促進した。
（ｊ）スライドを、鋭い剃刀刃を使用して短辺部のうちの１つから持ち上げて、スライドをシリコンウエハからてこで動かした。
（ｋ）顕微鏡を使用してウェルの完全性を確認し、スライドを、細胞が沈降するまで、ゲル側を上にしてＰＢＳ中で浸漬させた。
停止
２．細胞沈降（図６）
（ａ）細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、計数した。ある特定の実施形態では、最適なウェル充填は、およそ１〜３×１０６細胞／ｍｌで起きた。
（ｂ）スライドをＰＢＳ浴から除去し、余分な液体を角部に排水することによって除去し、スライドを大型の乾燥したペトリ皿上に置いた。１〜１．５ｍｌの細胞溶液を適用し、５〜１０分間インキュベートした。細胞沈降を、顕微鏡を用いて定期的に確認した。
（ｃ）ペトリ皿を１０〜２０°の角度に傾け、細胞溶液をピペットまたは緩真空を使用して、下辺部から除去した。
（ｄ）１ｍｌのアリコート（２〜３回）を持ち上げた辺部に適用し、緩真空を用いて下辺部から除去することによって、スライドをそっと洗浄した。スライド表面の浮遊細胞を確認し、スライドが比較的清潔であった場合にアッセイを続けた。
（ｅ）１ｍｌのＰＢＳを、スライドの約半分に広がるようにスライドの１つの辺部に適用し、清潔な透明スライドを１つの辺部から下げて、その上に適用した。スライドを下げると、ＰＢＳは隙間の間に均一に広がり、余剰分は辺部から流出した。
（ｆ）余分なＰＢＳを拭き取った。
（ｇ）後のウェル占有率の計数を可能にするために、スライド全体を、４倍の倍率、１×１のビニングを使用して明視野下で撮像した。
（ｈ）上部スライドを除去し、スライドが乾燥し切るのを防止するために次のステップを即座に行った。
３．溶解＆分離（図６）
（ａ）スライドを皿に一時的に接着するために短辺でワセリンを使用して、細胞スライドを、スライドの各辺部の長さ分続く白金電極を持った乾燥した開口電気泳動皿中に置いた。
（ｂ）皿を、顕微鏡の透明底載物台上に置いた。
（ｃ）蛍光細胞に焦点を当てた後、８ｍｌのＮ２でパージした溶解／ＥＰ緩衝液を、スライド全体にわたっておよび電極に対して注ぎ入れた。
（ｄ）細胞溶解（および１０秒）が観察された後、２００〜２５０Ｖを適用すると、蛍光タンパク質の移行が観察された。
（ｅ）電場を停止し、およそ４５秒間およそ７５ｍｍの距離でＨａｍａｍａｔｓｕ供給品によってＵＶ光を適用して、タンパク質バンドを捕捉した。電力はおよそ４０ｍＷｃｍ２であった。
（ｆ）スライドをＥＰ皿から除去し、ＰＢＳを伴う４０ｍｌのコニカル中に置き、プロービングまで４℃で貯蔵した（分離および捕捉後１週間以上まで行うことができる）。
停止
４．免疫ブロッティング（図６）
（ａ）抗体を高濃度で適用して、０．１％のＴｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）および２％のＢＳＡを含有したＴＢＳ（ｐＨ７．５の１００ｍＭのトリス＋１５０ｍＭのＮａＣｌ）中のポリアクリルアミド層（およそ１０倍希釈、または約０．６μＭ）からの排除を最小限にした。
（ｂ）抗体を、６０μｍのＳＵ−８シム（およそ１４０μｌの抗体溶液）によって、または複数の標的をプローブする場合にはＡｒｒａｙＩｔのマイクロアレイハイブリダイゼーションカセット（カセットウェル当たりおよそ４０μｌの抗体溶液）を使用して形成した隙間中で、透明なガラスウエハに対したスライドを用いてインキュベートした。インキュベーション時間は約１時間であった。
（ｃ）スライドを、１０〜２０分間、ＴＢＳＴ（ＢＳＡ無し）浴中で、プロービング間で洗浄した。
（ｄ）チップを、蛍光顕微鏡のタイル状露出によってか、またはマイクロアレイスキャナを使用して、撮像した。
【０１５２】
実施例２
序文
タンパク質媒介細胞シグナル伝達および分化プロセスの理解は、大規模集団における単一細胞の応答不均一性を捕捉することによって促進し得る。標準的な顕微鏡スライド上で単一細胞ウエスタンブロットを使用して実験を行い、４時間未満のプロセス中でブロット当たり６個超のタンパク質標的に対して１０３〜１０４個の分子検出限界を達成した。開口微小流体ポリアクリルアミドマイクロウェルアレイは、ＵＶ始動型タンパク質捕捉が可能であったポリアクリルアミドマイクロウェルアレイ中への単一細胞の重力駆動型捕捉を可能にした。マイクロウェル内での細胞の大規模溶解、タンパク質種の電気泳動分離、ブロッティング、および特定標的の抗体媒介検出を、スライド当たり約２，０００個の単一細胞に対して行った。アッセイおよび装置設計の物理的原理を以下に記載する。刺激に対する神経幹細胞応答および分化時間規模という２つの動的プロセスに単一細胞ウエスタンブロットを適用する実験を行った。本明細書で開示の装置および方法は、典型的な現在利用できるプロトコルの使用では、抗体系検出のみへの依存のため、またはプールした細胞集団の分析を必要とする感受性限界により検出が困難であり得るタンパク質シグナル伝達のハイスループット分析に使用を見出す。
【０１５３】
本開示の装置および方法はまた、組織および生物発達、癌、薬剤への応答、および免疫応答を含む、細胞プロセス中の不均一性の研究にも使用を見出す。例えば、本明細書に開示の装置および方法は、細胞応答の研究において、および大規模集団における単一細胞のアッセイに好適な標的化タンパク質測定ツールのための使用を見出す。本発明の装置および方法は、細胞集団中の細胞間不均一性を測定できる高特異性タンパク質アッセイのための使用を見出す。本装置および方法は、数千個の細胞をウエスタンブロッティングによって個別に評定するアッセイに使用してもよい。ウエスタンブロッティングは、タンパク質電気泳動（分子量報告のため）と、検出可能なプローブを用いた後続の標識化（プローブ標的間相互作用を得るため）とを組み合わせることにより、アッセイを複雑な背景の半定量的タンパク質分析のために有用とする。
【０１５４】
数分から数日の応答時間規模にわたる神経幹細胞モデル系についての不均一性および動的タンパク質発現ならびにリン酸化応答を研究することによって、インビトロの均一性刺激に応答した、細胞系譜の多様な集合への多能性幹細胞の分化を研究する実験を行った。
【０１５５】
方法
細胞培養
神経幹細胞（ＮＳＣ）を成熟した雌のＦｉｓｈｅｒ  ３４４ラットの海馬から単離し、１０μｇ／ｍＬのポリオルニチン（Ｐ３６５５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および５μｇ／ｍＬのラミニン（２３０１７−０１５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でコーティングした組織培養処理ポリスチレン板上で培養した。ＮＳＣを、Ｎ−２（１７５０２−０４８、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＦＧＦ−２（１００−１８、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を補充した１：１のＤＭＥＭ／Ｆ１２（１１０３９−０２１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養し、細胞剥離のためにａｃｃｕｔａｓｅ（Ａ１１１０５−０１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して８０％の集密度で継代培養した。
【０１５６】
ＥＧＦＰ  ＮＳＣ細胞株を、安定したレトロウイルス感染によって創出した。レトロウイルスベクターｐＣＬＰＩＴ−ＧＦＰをパッケージ化し、精製したウイルスをＮＰＣ上で滴定した。高発現ＥＧＦＰ  ＮＳＣを感染多重度３（ＭＯＩ＝３）で感染させ、図２Ａ〜Ｃで分析し、一方で低発現ＥＧＦＰ  ＮＳＣはＭＯＩ＝０．５で感染させ、全ての他の研究で使用した。安定した細胞株を、７２時間の０．３μｇ  ｍｌ−１のピューロマイシン（Ｐ８８３３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する培地中での選択によって採取した。
【０１５７】
ｓｃウエスタンブロットＥＧＦＰ発現研究のためのＥＧＦＰ  ＮＳＣを、非感染ＮＳＣについて記載の通りに培養した。ｓｃウエスタンブロットシグナル伝達研究のために、ＥＧＦＰ  ＮＳＣを１６時間ＦＧＦ欠乏状態にした。細胞をａｃｃｕｔａｓｅおよび懸濁液で剥離し、ｓｃウエスタンブロッティングにより分析した（以下の単一細胞免疫ブロットアッセイを参照されたい）。ｓｃウエスタンブロット分化研究のためのＥＧＦＰ  ＮＳＣを、０．５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２、１μＭのレチノイン酸（ＲＡ、ＢＭＬ−ＧＲ１００、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）、および１％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＳＨ３００８８０３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｎ２中で０〜６日間培養した。細胞を、所望の分化時間の後で、トリプシンＥＤＴＡで剥離し（２５−０５３−Ｃｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、分析した（Ｎ．Ｂ．細胞はマイクロウェル内で分化しなかった。以下の単一細胞免疫ブロットアッセイを参照されたい）。関連のフローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、および免疫細胞化学実験については、検証アッセイを参照されたい。
【０１５８】
タンパク質および試薬
１５μｍの蛍光ポリスチレン微小球は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製（Ｆ−８８４４、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）であった。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識した精製したオボアルブミンおよびウシ血清アルブミンも、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製（Ｏ３４７８１、Ａ１３１００）であった。単一細胞免疫ブロット較正のための精製標準物は、ウシ脳からのβチューブリン（ＴＬ２３８、細胞骨格、Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）、Ｈｉｓタグ付け組換えＥＧＦＰ（４９９９−１００、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）、組換えヒトｐＥＲＫ１（ａｂ１１６５３６、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）であった。これらの精製標準物のアリコートを、間接的較正実験における分配係数の判定のために、製造業者の使用説明（Ａ−１０２３８、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってタンパク質標識化キットを使用してＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８で標識した（以下の単一細胞免疫ブロット較正を参照されたい）。
【０１５９】
精製したＨｉｓでタグ付けしたドロンパを、ｐＥＴのＨｉｓ６タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）リガーゼ非依存性クローニング（ＬＩＣ）のクローニングベクターである２ＢＴ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して形質転換し、３７℃の２ＹＴ媒体中で０．５のＯＤ６００に増殖させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、採取前に更に２．５時間３７℃で増殖させた、Ｒｏｓｅｔｔａ適格細胞中で発現させた。細胞を４℃で１５分間５，０００ｒｐｍの遠心分離によってペレット化し、ペレットをプロテアーゼ阻害剤（ｐＨ７．５の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、４００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、２０ｍＭのイミダゾール、１μｇ／ｍｌのロイペプチンおよびペプスタチン、０．５ｍＭのＰＭＳＦ）を補充したニッケル緩衝液Ａ中で再懸濁した。細胞を、１５，０００ｐｓｉの圧力でＡｖｅｓｔｉｎ  Ｃ３ホモジナイザー（Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用して溶解した。細胞残屑を３０分間１５，０００ｒｐｍでペレット化した。浄化した溶解物を、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ  Ｃｒｕｄｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）上に装填し、ニッケル緩衝液Ａを用いて非結合物質を洗い流した。結合タンパク質を、ニッケル緩衝液Ａ中イミダゾール４００ｍＭまで１０ＣＶの勾配で溶出した。溶出物質の吸収を５０３ｎｍおよび２８０ｎｍでモニタリングして、標的タンパク質のプールを助けた。ドロンパを含有する画分をプールし、ＩＥＸ緩衝液Ａ（ｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム）中に脱塩した。脱塩したタンパク質を、５ｍｌのＳＰ  ＨＰイオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填し、非結合物質をＩＥＸ緩衝液Ａで洗い流した。結合物質を、ＩＥＸ緩衝液Ａ中ＮａＣｌ  １Ｍまで２０ＣＶの勾配で溶出した。ドロンパを含有する画分をプールし、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、４００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ５／１５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって、凝集についてアッセイした。最後に試料を貯蔵緩衝液（ｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）中に脱塩した。
【０１６０】
使用した抗体試薬の詳細は、ｓｃウエスタン、従来のウエスタンブロッティング、および免疫細胞化学アッセイに対応する方法の節で列挙する。
【０１６１】
Ｎ−［３−［（４−ベンゾイルフェニル）ホルムアミド］プロピル］メタクリルアミド（ＢＰＭＡＣ）を、標準的プロトコルに従って、触媒トリエチルアミンの存在下でのＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩との４−ベンゾイル安息香酸のスクシンイミジルエステルの反応によって、研究所内で合成した。
【０１６２】
マイクロウェルｓｃウエスタン固体支持体の製造
ＳＵ−８マイクロポストを、標準的なソフトリソグラフィー方法によって機械級のシリコンウエハ上で製造した。ＳＵ−８  ２０２５フォトレジスト（Ｙ１１１０６９、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を、製造業者の指針に従って（典型的に）３０μｍの厚さの層に紡績し、２０，０００ｄｐｉで２０μｍの円形機構を印刷したマイラーマスク下で、１２秒間約４０ｍＷ  ｃｍ−２で３６５ｎｍのＵＶ光に露出させた。機構を、分離方向に５００μｍ、横断方向に１９０μｍの間隔幅で正方形配置に配列した。１４×３０の機構（合計６，７２０個）の２×８のブロックに、２×８のウェルマイクロアレイハイブリダイゼーションカセット（ＡＨＣ１Ｘ１６、ＡｒｒａｙＩｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）の寸法に一致するように９ｍｍの間隔を空けた。２４ｍｍ間隔のマイクロポストのアレイの長さに及ぶ厚さ１ｍｍのレールも、マイクロポストの高さでガラス固体支持体を支持するようにパターン化した。露出およびＳＵ−８現像溶液（Ｙ０２０１００、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）を用いた現像後の機構の一様性を、光学的プロフィロメトリーによって検証した。マイクロポストブロック内の測定した機構の高さおよび直径は、それぞれ、３０．３０±０．１５μｍ（±ＳＤ、ｎ＝４マイクロポスト）および２０．５２±０．６８μｍ（±ＳＤ、ｎ＝４マイクロポスト）であった。アレイの全長にかけて間隔をあけたブロックの高さおよび直径測定値におけるブロック間ＣＶは、それぞれ、１．１％および５．２％であった（ｎ＝３マイクロポスト）。ウエハを、真空内で１時間の２ｍｌの疎水性シランジクロロジメチルシラン（ＤＣＤＭＳ、４４０２７２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の蒸着によってシラン化し、脱イオン水でよく洗浄し、使用の直前に窒素流下で乾燥させた。
【０１６３】
透明ガラス顕微鏡スライド（４８３００−０４７、ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）をシラン化して、標準的なプロトコルに従って、メタクリレート官能基の自己組織化表面単分子層を確立した。シラン化スライドを、表面を下にしてマイクロポストウエハ上に置き、ＳＵ−８レールおよびマイクロポスト機構に手動で整列させた。ゲル前駆体溶液は、ＨＣｌでｐＨ８．８に滴定した７５ｍＭのトリス緩衝液中、８％のＴ（ｗｔ／ｖｏｌ総アクリルアミド）、２．７％のＣ（３０％のＴからの架橋剤Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドのｗｔ／ｗｔ、２．７％のＣストック（Ａ３６９９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＤＭＳＯ中の１００ｍＭのストックからの３ｍＭのＢＰＭＡＣ、０．１％のＳＤＳ（１６１−０３０１、ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＢＰ１５１、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）、０．０００６％リボフラビン５’リン酸（Ｆ１３９２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１５％の過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、Ａ３６７８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および０．０５％のテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、Ｔ９２８１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。ローダミンでタグ付けしたｓｃウエスタンゲルにおける細胞の共焦点撮像については、前駆体は、蛍光モノマーであるメタクリルオキシエチルチオカルバモイルローダミンＢ（２３５９１、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を１００μＭのＤＭＳＯ中ストックから３μＭ含んだ。界面活性剤（ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ）および重合開始剤（リボフラビン、ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ）を添加する直前に、前駆体混合物を超音波処理し、真空内で１分間脱気した（Ａｑｕａｓｏｎｉｃ  ５０Ｄ、ＶＷＲ）。その後、標準的な２００μｌのピペットを使用して、前駆体をガラススライドとシリコンウエハとの間の隙間に注入した。隙間を通して約３０秒間前駆体を吸い上げさせた後、スライドを、スライドの上に取り付けた４７０ｎｍの平行ＬＥＤ（Ｍ４７０Ｌ２−Ｃ１、Ｔｈｏｒ  ｌａｂｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ）からの５００ルクスの青色光に７．５分間露出させた（高度露出計、８４００２２、Ｓｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）。重合を更に１１分継続させた。ゲル製造ガラススライドを、ｐＨ７．４の２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（２１−０４０、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）を使用してそれらの辺部で湿らせ、剃刀刃を使用してウエハからてこで動かした。製造したスライドは、篩過またはフォトキャプチャ特性を喪失することなく、使用前最長２週間、ＰＢＳ中で、４℃で貯蔵し得る。
【０１６４】
単一細胞免疫ブロットアッセイ
製造したスライドをＰＢＳから除去し、余分な液体を重力によって角部に排水し、キムワイプ（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ−Ｃｌａｒｋ，Ｉｒｖｉｎｇ，ＴＸ）を使用して吸収した。１〜２ｍｌの細胞懸濁液を、スライドの表面にわたって均一に適用し、１００×１００ｍｍのペトリ皿内の平面上に沈降させた。沈降時間は５〜３０分で異なり、マイクロウェル占有率は、大体４０〜５０％の単一細胞占有率が達成されるまで明視野顕微鏡法によってモニタリングした。２〜５分ごとに１０秒間のペトリ皿の断続的で緩やかな運動は、ゲル表面上での細胞の回転によって細胞がマイクロウェルにアクセスすることを確実にするのに十分であった。沈降後、スライドを短辺部のうちの１つから１０〜２０°の角度に持ち上げて、余分な細胞培地を除去し、余分な緩衝液を真空によって下辺部から除去しながら、スライドの表面上の細胞を、４〜５個のＰＢＳの１ｍｌアリコートをスライド表面の持ち上がった辺部にそっとピペッティングすることによって除去した。スライドを平らに置き、スライド上に１ｍｌのＰＢＳを適用することによって細胞計数のために調製した。第２の透明ガラススライドを、気泡の閉じ込めを防止するために一方の短辺部からもう一方へとＰＢＳ層に適用し、スライドの「サンドイッチ」を形成するように下げた。１×１画素のビニングでの５０ｍｓの露出時間と移動載物台を誘導するための事前設定位置リストとを使用し、４倍の倍率での明視野顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＵＰｌａｎＦＬＮ，ＮＡ  ０．１３）を使用して、サンドイッチ内のマイクロウェルを撮像した（ｉＸｏｎ＋ＥＭＣＣＤカメラ，Ａｎｄｏｒ，Ｂｅｌｆａｓｔ，ＵＫ、モーター駆動載物台，ＡＳＩ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ、およびシャッター付き水銀灯光源、Ｘ−ｃｉｔｅ，Ｌｕｍｅｎ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａを装備し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡによって制御されるＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１倒立蛍光顕微鏡）。６，７２０個の機構全てを約４分で撮像することができた。
【０１６５】
細胞計数後、上部ガラススライドを、ゲル層をわたってそっと滑らせることでサンドイッチから除去した。次に、沈降した細胞を載せたｓｃウエスタンスライドを、厚さ３ｍｍのパースペックスプラスチックから製造した６０×１００ｍｍの特注水平電気泳動チャンバに即座に移動させた。白金線電極（直径０．５ｍｍ、２６７２２８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、チャンバの長辺部に沿って置き、標準的な電気泳動用電源（モデル２５０／２．５，ＢｉｏＲａｄ）にワニ口クリップで接続した。ペトロラタムを使用して、スライドをチャンバの底面に一時的に接着した。０．５％のＳＤＳ、０．１％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１２．５ｍＭのトリス中の０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム（Ｄ６７５０，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ８．３の９６ｍＭのグリシン（１０倍ストックからの０．５倍、１６１−０７３４，ＢｉｏＲａｄ）からなる１０ｍｌの修飾ＲＩＰＡ溶解／電気泳動緩衝液をスライド上に注ぎ入れて、細胞を溶解した。この緩衝液に、リンタンパク質ブロットのために１ｍＭのフッ化ナトリウムおよびオルトバナジウム酸ナトリウムを補充した。溶解を、電場を切って１０秒間進め、次いで約３０秒間２００Ｖ（Ｅ＝４０Ｖ  ｃｍ−１）を適用した。単一のＥＧＦＰを発現しているＮＳＣからの分離を、ＥＧＦＰのために最適化されたフィルタセット（ＸＦ１００−３，Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）、４×４のカメラビニング、２５０ｍｓの露出時間を使用して、１０倍の倍率で、リアルタイムでモニタリングした。分離に続いて、スライドを、約４０ｍＷ  ｃｍ−２のスライド表面でのＵＶ出力（３２０〜４００ｎｍのＵＶメータ、Ｃ６０８０−３６５，Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を用いて、スライドのおよそ１０ｃｍ上に吊るしたインラインＵＶフィルタ（３００〜３８０ｎｍのバンドパス，ＸＦ１００１，Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ）を持つＬｕｍａｔｅｃシリーズ３８０液体光ガイドを通過させたＵＶ水銀アーク灯（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇｃｕｒｅ  ＬＣ５，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を使用して、上から４５秒間即座に露出させた。
【０１６６】
細胞内容物の分離およびフォトキャプチャに続いて、スライドを、１０ｍｌの修飾ＲＩＰＡ緩衝液、次いで１０ｍｌのＴＢＳＴ（ＨＣｌでｐＨ７．５に滴定した１００ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０、９４８０，ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、各々１０分間洗浄した。スライドは、免疫ブロッティングの成功の前に、ＴＢＳＴ中４℃で少なくとも１週間貯蔵することができた。
【０１６７】
ＦＧＦ刺激実験では、細胞を、ウェル当たりの細胞の計数ステップと溶解／電気泳動ステップとの間に、所望の刺激時間、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ投入媒体１ｍｌをスライド表面に適用することで、刺激した。その後余分な媒体を、溶解／電気泳動の直前にスライド表面から排水した。
【０１６８】
精製タンパク質ｓｃウエスタンブロット
精製タンパク質を、単一細胞用のものと類似のプロトコルを使用してアッセイした。ゲルスライドを、修飾ＲＩＰＡ緩衝液中の精製タンパク質で３０分間インキュベートし、新たな修飾ＲＩＰＡ中に５分間浸水させ、第２のガラススライドで「サンドイッチ」して、タンパク質をゲル層内に閉じ込めた。ガラススライドサンドイッチを、単一細胞アッセイ中のように、電気泳動、ＵＶ媒介タンパク質捕捉、洗浄、およびプロービングに供し、捕捉ステップ後に上部ガラス層を除去した。
【０１６９】
スライドプロービング、撮像、およびストリッピング
スライドを、２×８のウェルマイクロアレイハイブリダイゼーションカセット（ＡＨＣ１Ｘ１６，ＡｒｒａｙＩｔ）中で拡散送達により、一次抗体および蛍光標識した二次抗体を用いてプローブした。
【０１７０】
単一細胞ブロットのために採用した倍数希釈を伴う一次抗体（別途指示のない限り）は、ウサギ抗オボアルブミン（１：２０、ａｂ１２２１，Ａｂｃａｍ）、ヤギ抗ＧＦＰ（１：２０、ａｂ６６７３，Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗βチューブリン（１：２０、ａｂ６０４６，Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ビメンチン（１：２０、ａｂ９２５４７，Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ｐＥＲＫ１／２（１：４０、Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、４３７０，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ウサギ抗ＥＲＫ１／２（１：２０、４６９５，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗ｐＭＥＫ１／２（１：４０、Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１、９１５４，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗ＭＥＫ１／２（１：２０、９１２６，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ヤギ抗ＳＯＸ２（１：２０、ｓｃ−１７３２０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、マウス抗ネスチン（１：２０、６１１６５８，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、ヤギ抗ＧＦＡＰ（１：２０、ａｂ５３５５４，Ａｂｃａｍ）、マウス抗βＩＩＩチューブリン（１：２０、Ｔ８５７８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であった。二次抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ−１１０１１，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した図７のオボアルブミンのプロービングを除き、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、５５５、または６４７で標識したＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のロバ抗マウス、ウサギ、またはヤギＩｇＧ（Ａ３１５７１、Ａ３１５７３、Ａ２１４４７、Ａ３１５７０、Ａ３１５７２、Ａ２１４３２、Ａ２１２０２、Ａ２１２０６、Ａ１１０５５）であった。対応する一次抗体と同一の希釈計数で全てを使用した。
【０１７１】
図７については、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識したＯＶＡおよびＢＳＡの混合物を、スライド全域で一定した分離距離にわたり、サンドイッチスライド配置で分離および捕捉した（ブロック内のウェルリップからのプローブしたＯＶＡバンドの距離：１６７±６．５μｍ、±ＳＤ、ｎ＝６ブロット、ブロック間：１６４±３．８μｍ、±ＳＤ、ｎ＝３ブロック）。捕捉した分析物を標識するために使用するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８染料からの個々のスペクトルチャネルを利用し、特定の一次抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体を使用して、ＯＶＡ種をプローブした。
【０１７２】
分離の各ブロックを、１時間、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ａ７３０，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＴＢＳＴ中で、１：４０〜１：１０に希釈した４０μｌの一次抗体溶液（タンパク質および試薬を参照されたい）を用いてインキュベートした。スライドをハイブリダイゼーションカセットから除去し、洗浄１回当たり１５分間、１０ｍｌのＴＢＳＴ中で３回洗浄した（合計４５分）。次に、スライドを、２％のＢＳＡを補充したＴＢＳＴ中１：２０の希釈での蛍光標識したロバの二次抗体を用いて、同様にプローブおよび洗浄した。スライドを、最後に１０ｍｌのＤＩ水中で５分間洗浄し、窒素流下で乾燥させた。免疫ブロット蛍光の飽和のない最大ダイナミックレンジのために最適化した、４００〜５５０のＰＭＴゲインおよび３０〜１００％のレーザー出力でのＧｅｎｅＰｉｘ  ４３００Ａマイクロアレイスキャナを使用して、撮像を実施した。フィルタセットを、それぞれ４８８、５３２、および６３５ｎｍのレーザーを使用してＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、５５５、および６４７で標識した二次抗体を使用する３チャネル検出のために採用した。４８８および５３２ｎｍのスペクトルチャネルのための直径１２．５ｍｍの発光フィルタはＯｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ製（それぞれＸＦ３４０５およびＸＦ３４０３）であり、６３５ｎｍのチャネルには内臓遠赤発光フィルタを採用した。
【０１７３】
スペクトルの漏れ込みは、それぞれ図３Ａ〜Ｃおよび図４Ａ〜Ｃ中のＥＲＫまたはβチューブリン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識した二次抗体）のＥＧＦＰ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識した二次抗体）との共プロービングを除いて、標的上の蛍光線変化図のノイズ閾値を下回った。ＥＲＫブロットが技術的ノイズを超えるＥＧＦＰの漏れ込みに影響を受けた図３Ｂに示すｄ中のレシオメトリックは、分析から切り捨てた。ＥＧＦＰの漏れ込みに同様に影響を受けたβチューブリンブロット由来の図４Ｃに示すｆ中のレシオメトリックも切り捨てた。蛍光顕微鏡写真または派生データセットは、スペクトルの漏れ込みに対して蛍光補償しなかった。
【０１７４】
ＨＣｌでｐＨ６．８に滴定した６２．５ｍＭのトリス中の２．５％のＳＤＳおよび１％のβメルカプトエタノール（Ｍ３１４８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる、５０℃に加熱したストリッピング緩衝液中での３時間のインキュベーションによって、スライドのストリッピングを行った。ストリッピング後、スライドを、１０ｍｌのＴＢＳＴ中で洗浄１回当たり５分間、３回洗浄し、再プロービングまで４℃のＴＢＳＴ中で貯蔵した。このプロセスは、ストリッピング前の乾燥状態にあるスライドの長期貯蔵（約１ヶ月）に対して堅牢であることを見出した。
【０１７５】
単一細胞免疫ブロットデータ分析
ウェル当たりの細胞の採点を、手動か、またはＩｍａｇｅｊ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）において細胞サイズおよび真円度に基づく閾値化および粒子分析をダウンストリームゲーティングと一体化するスクリプトを採用して研究室で設計した特注のソフトウェアによって実施して、Ｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）において単一細胞を含むマイクロウェルを特定した。
【０１７６】
ウェル当たりの細胞の自動採点の性能を定量化するために、精度＝ｔｐ／（ｔｐ＋ｆｐ）、および感度＝ｔｐ／（ｔｐ＋ｆｎ）を計算し、式中、ｔｐは、実際に単一細胞を含んだ、単一細胞を含むとして採点されたウェルの数であり、ｆｐは、単一細胞を含まなかった、単一細胞を含むとして採点されたウェルの数であり、ｆｎは、実際には単一細胞を含有した、単一細胞を含有しないとして採点されたウェルの数である。精度＝１は、単一細胞を含むとして採点された全てのウェルが、実際に単一細胞を含んだことを意味した。感度＝１は、実際に単一細胞を含む全てのウェルが、単一細胞を含むとして採点されたことを意味した。精度および感度の測定基準は、それぞれ、０．９０±０．０９（±ＳＤ、ｎ＝８枚のスライド上の４２０個のウェルの５６個のブロック）、および０．６８±０．１７であり、それは、ダウンストリーム分析に含まれるウェルの総数を犠牲にした単一細胞の厳選を反映する。
【０１７７】
ＧｅｎｅＰｉｘスキャナからの蛍光画像は、Ｆｉｊｉ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｊｉ．ｓｃ／Ｆｉｊｉ）中でランドマーク対応を使用して記録した。特注クリプトにより、各蛍光画像から、関心領域（ＲＯＩ）のグリッドからの線変化図を抽出した。線変化図を、関心ピークの近似境界に設定した点間の線形補間を使用して、バックグラウンド減算した。異常線変化図が原因でフラグが立てられた免疫ブロットＲＯＩを視覚的に再検討することによって、データ品質管理を行った。例えば自己蛍光微粒子の存在に明らかに影響を受けた免疫ブロットをデータセットから切り捨て、技術的ノイズを上回るβチューブリン装填制御シグナルを含まない単一細胞ブロットとして誤って採点されたウェル当たりのゼロ細胞ブロットも切り捨てた。
【０１７８】
目的とする総ピーク下面積（ＡＵＣ）（またはＡＵＣ比および較正ＡＵＣなどのそれらに由来する測定基準）を、該当する場合、関数ＡＵＣｔ＝ａｒｃｓｉｎｈ（ＡＵＣ／Ｆ）を使用して変換し、式中、ＡＵＣｔは逆双曲線関数変換値であり、Ｆは線形から対数尤度挙動への遷移を規定する余因数である。Ｆの値を、Ｆ＝μ以下のもの＋３σ以下のものに従って設定することによって最適化し、式中、μ以下のものおよびσ以下のものは、ＡＵＣ（または測定基準）が技術的ノイズ閾値を下回るウェル当たりの単一細胞免疫ブロットのセットの平均および標準偏差である。技術的ノイズ閾値ＴをＴ＝μゼロ＋３σゼロで設定し、式中、μゼロおよびσゼロは、所与の実験におけるウェル当たりのゼロ細胞免疫ブロットからのＡＵＣまたは測定基準値の平均および標準偏差である。該当する場合、Ｔを下回るレシオメトリックの分子におけるＡＵＣを持つ免疫ブロットにフラグを立てて、プロット時にそのように表示した。分母中Ｔを下回るＡＵＣを持つ免疫ブロットを、データセットから切り捨てた。
【０１７９】
統計分析
単一細胞ブロットデータのノンパラメトリック比較（単一比較のみ）を、ＳＰＳＳのｖ．２１のソフトウェア（ＩＢＭ，Ａｒｍｏｎｋ，ＮＹ）中で、それぞれ分散の正規性および均等性に対するシャピロ・ウィルクおよびルビーン検定と併せて、マン・ホイットニーのＵ検定を使用して行った。
【０１８０】
単一細胞免疫ブロット較正
直接的および間接的な較正アッセイの概念的概観および図式を以下および図８に提供する。
【０１８１】
単一細胞免疫ブロットアッセイの線形ダイナミックレンジおよび検出限界を判定するために、精製タンパク質を使用してそれを較正するために２つの方法を使用した（図２Ｃに示すｄならびに図８および図１０）。第１の（「直接的な」）方法は、ＥＧＦＰの公称濃度中の範囲でインキュベートしたウェルについての、分離、捕捉、およびプロービング直前のマイクロウェル中のＥＧＦＰ濃度の直接的測定に依存した。終点プローブ蛍光法を、ｓｃウエスタンゲルシートの厚さ（３０μｍ）と同一の深度のマイクロチャネル中で作製されたものに対してＥＧＦＰ蛍光測定値を較正することによって推測される、対応するマイクロウェル中に元来存在するＥＧＦＰ分子の数に対する曲線上にプロットした。第２の（「間接的な」）方法は、マイクロウェル内に存在するタンパク質分子の直接的な測定を必要とせず、代わりに、大規模なスポット露出を使用して自由溶液から精製タンパク質を捕捉し、それらのゲル濃度は分配係数測定値から推測された（図９に示すａ〜ｃ）。最終結果は、捕捉タンパク質が単一細胞ブロットバンドから生じた場合、大体予想されたもののサイズであるスポット内に存在するタンパク質分子の数に対する所与のタンパク質の蛍光プローブ読出の較正曲線であった。故に、所与のタンパク質のゲル濃度は公称溶液濃度および分配係数から知られるため、直接観察できるものよりも低いタンパク質濃度を間接的な較正曲線に使用することができる。
【０１８２】
抗体ストリッピングの有効性を間接的ＥＧＦＰ較正スライドについて検証すると、それは大部分の較正範囲（約１０４〜１０６個の分子）に対する検出閾値（ＳＮＲ＝３）での残留シグナル、および１０個超この範囲を上回るＳＮＲ中の倍数減少を示した（図２Ｃに示すｄおよび図１０）。
【０１８３】
ＥＧＦＰの「直接的な」較正のために、４μＭのＢＳＡ（単一細胞ブロット中のおよその総タンパク質レベル）を補充した修飾ＲＩＰＡ緩衝液中のＥＧＦＰの８アリコート希釈シリーズ（アリコート当たり４０μｌ）を、ＡｒｒａｙＩｔハイブリダイゼーションカセット中のｓｃウエスタンスライドの別個のウェルに添加した（図１０）。スライドを、１つの追加のステップを伴って精製タンパク質ブロットに対してのように（精製タンパク質ｓｃウエスタンブロットを参照されたい）サンドイッチしアッセイした。各ブロック中のマイクロウェルの小集団を、ＩＸ７１蛍光顕微鏡上で移動載物台を誘導するための事前設定位置リストを使用して、電気泳動ステップの直前に、ＥＧＦＰ蛍光法（ＥＧＦＰキューブ、１０倍のＯｌｙｍｐｕｓ  ＵＰｌａｎＦＬＮ  ＮＡ  ０．３対物レンズ、２００ｍｓの露出時間、１×１画素のビニング）について撮像した。濃度範囲にわたる分配係数を、［ＥＧＦＰ］ゲルおよび［ＥＧＦＰ］ウェルが、３０μｍの深度の個々の微小流体チャネルにおける蛍光較正によって判定された平衡にあるＥＧＦＰのゲル内およびウェル内濃度である、Ｋ＝（［ＥＧＦＰ］ゲル−［ＥＧＦＰ］ゲル，ｂｇ）／（［ＥＧＦＰ］ウェル−［ＥＧＦＰ］ウェル，ｂｇ）に従って、これらの画像から判定した（図９）。特注の直線チャネル微小流体チップを、標準的な湿式エッチングプロセス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してソーダ石灰ガラス中で製造した。［ＥＧＦＰ］ゲル，ｂｇおよび［ＥＧＦＰ］ウェル，ｂｇは、ＥＧＦＰ溶液を用いたインキュベーション前のｓｃウエスタンスライドのバックグラウンド蛍光を補正する。各マイクロウェルボクセル中のＥＧＦＰ分子の数もこれらのデータから見積もり、円筒状マイクロウェルの公称寸法を直径２０μｍ、深度３０μｍ（体積９．４ｐｌ）と仮定した。
【０１８４】
電気泳動ステップの非存在下での、４μＭのＢＳＡを補充した修飾ＲＩＰＡ中の所与の精製タンパク質の希釈シリーズのｓｃウエスタンゲルシートへの捕捉およびプロービングによって、「間接的な」較正を行った（図８および図１０）。約４０ｍＷ  ｃｍ−２のスライド表面でのＵＶ出力（３２０〜４００ｎｍのＵＶメータ、Ｃ６０８０−３６５，Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を用いた特注のＵＶ−ロングパスフィルタセット（励起３００〜３８０ｎｍ、発光４１０ｎｍ超、ＸＦ１００１、ＸＦ３０９７、Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ）を通して、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１蛍光顕微鏡上で各４５秒間１０倍の対物レンズを介して、スポットＵＶ露出を各マイクロウェルブロック内のスライドの下面に適用した。このようにして捕捉した精製タンパク質のゲル内濃度を、各タンパク質のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８で標識したアリコートを使用して、個々の分配係数の測定から判定した（図９）。ＥＧＦＰの間接的較正は、単一細胞ブロット実験（面積４５×４５μｍ、深度３０μｍ）からの典型的なブロットしたＥＧＦＰバンドのものに等しいボクセルサイズの推測したゲル内濃度を使用して、分子数を報告する。間接的較正データにおけるプローブＡＦＵおよびＳＮＲ値を、較正標準の非存在下でＵＶ露出ゲルスポットの非特異的プロービングによって引き起こされた蛍光バックグラウンドについて補正した。
【０１８５】
マイクロウェル内溶解中のバルク緩衝液速度の判定
１０ｍｓの露出時間でｓｃウエスタンスライド上に蛍光マイクロビーズ投入ＲＩＰＡ緩衝液を注ぎ入れる（１０５個のビーズ／ｍｌ）間に、広視野蛍光顕微鏡法（４倍の対物レンズ、ＥＧＦＰフィルタセット）によって、溶解中のバルク最大流速（ベクトル情報は無視）を見積もった（図１１）。バルク流体挙動を観察するためにｓｃウエスタンスライド平面の中心の約１ｍｍ上に焦点を当てた対物レンズを用いて、露出期間にわたって水平面におけるビーズの運動が引き起こす蛍光筋から、速度を抽出した。
【０１８６】
ＣＯＭＳＯＬ流体モデリング
ｓｃウエスタンマイクロウェル中の流量を、ＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ  ４．２ａ中でモデル化した（図１１）。ＣＯＭＳＯＬモデル化は、ウェル上部近くの再循環渦付近を除いて、ゲル表面下のマイクロウェルへの垂直距離の関数としての局所流体速度の単調減少を示した。この下で、ペクレ数１をもたらす４．４μｍ  ｓ−１の限界局所流体速度を、特徴的長さＬがマイクロウェル直径（２０μｍ）であり、ｕが局所流体速度である、Ｐｅ＝Ｌｕ／Ｄによって判定した。Ｄ＝ｋＢＴ／６πμｒＨ＝８．８×１０−１１ｍ２ｓ−１は、低分子量モデル分析物としてのＥＧＦＰの自由溶液拡散率であり、ボルツマン定数ｋＢ＝１．３８×１０−２３ｍ２  ｋｇ  ｓ−２  Ｋ−１、温度Ｔ＝２９３．１５Ｋ、水の動粘度μ＝０．００１ｋｇ  ｍ−１  ｓ−１、流体力学半径ｒＨ＝０．５９５（Ｍｗ）０．４２７＝２．４３ｎｍ（Ｍｗ＝２７ｋＤａ、ＥＧＦＰの分子量）である。
【０１８７】
４．４μｍ  ｓ−１のこの限界速度での等速は、それぞれｚ方向にそれを下回る（Ｐｅ＜１）および上回る（Ｐｅ＞１）マイクロウェル座標に溶解緩衝液を注ぎ入れる間の拡散および移流卓越質量輸送体制の領域を大まかに画定する（図１１）。
【０１８８】
マイクロウェルの上のバルク流を、横断面１００×１００μｍの正方形チャネル中の水の定常状態層流としてシミュレーションした。チャネルの上壁および側壁を、すべり境界条件に設定した。チャネルの底壁およびマイクロウェル壁を、すべり無しに設定した。流入速度を０．００８７ｍｓ−１に設定して、０．０１３ｍｓ−１の最大バルク流速度を達成した。流出圧力は０に設定した。マイクロウェル再循環流を粒子追跡によって可視化した。
【０１８９】
フローサイトメトリー
ＥＧＦＰ発現についてのフローサイトメトリーのために、ＥＧＦＰ  ＮＳＣおよび非感染ＮＳＣを、ａｃｃｕｔａｓｅで剥離し、４％のパラホルムアルデヒド（Ｐ６１４８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中での１５分間の懸濁によって固着させ、次にフロー染色緩衝液（ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍＬのサポニンを伴う５％のロバ血清、Ｄ９６６３および４７０３６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５分間ブロッキングおよび透過処理した。細胞を、フロー染色緩衝液中で１時間、ヤギ抗ＧＦＰ（１：１００、製品の詳細についてはスライドプロービング、撮像、およびストリッピング。を参照されたい）を用いてインキュベートし、次いで、フロー染色緩衝液中で１時間、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識したロバ抗ヤギＩｇＧ（１：１００）を用いてインキュベートした。フローサイトメトリーを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  ６ＨＴ−２Ｌを使用して行った。
【０１９０】
従来型ウエスタンブロッティング
図３Ａ〜Ｃ中のシグナル伝達研究のために、ＥＧＦＰ  ＮＳＣを、６ウェルプレート中にウェル当たり２．５×１０５細胞で播種した。細胞を、１６時間ＦＧＦ欠乏状態にし、所望の刺激時間中２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを用いてインキュベートし、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤とのカクテル（８７７８６および７８４２０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１０ｍｇ／ｍＬのＰＭＳＦ（７８８３０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ８）中で溶解した。分化アッセイのために、ＥＧＦＰ  ＮＳＣを、６ｃｍの皿中にウェル当たり５×１０５細胞で播種した。０日目の分化細胞を翌日溶解し、６日目の分化細胞を、分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｎ２、０．５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ、１μＭのＲＡ、１％のＦＢＳ）中で６日間培養し、その後溶解した。ビシンコニン酸アッセイ（２３２２７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって判定した等しい総タンパク質濃度の細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動的に分離し、標準的な方法を使用してニトロセルロース膜上に移動させた。ブロットを、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＢＰ３３７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびホスホタンパク質抗体については３％のＢＳＡ（Ａ４５０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、または全ての他の抗体については５％の脱脂粉乳を伴うＴＢＳ中で１時間ブロッキングした。ブロットを、同一のブロッキング緩衝液中で一次抗体（ウサギ抗ｐＥＲＫ１／２（１：２０００）、ウサギ抗ＥＲＫ１／２（１：１０００）、ウサギ抗ｐＭＥＫ１／２（１：１０００）、ウサギ抗ＭＥＫ１／２（１：１０００）、ヤギ抗ＳＯＸ２（１：５００）、マウス抗ネスチン（１：１０００）、ヤギ抗ＧＦＡＰ（１：１０００）、マウス抗βＩＩＩチューブリン（１：２０００）、ウサギ抗βチューブリン（１：５００））によって一晩プローブし、次いで適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体（マウス抗ヤギＨＲＰ（１：５０００、３１４００）、ヤギ抗マウスＨＲＰ（１：１００００、３２４３０）、ヤギ抗ウサギＨＲＰ（１：１００００、３２４６０）、全てＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて１時間インキュベートした。タンパク質バンドをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（３４０７６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して検出し、ブロットを、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）上でデジタル撮像した。ブロットを、３％の酢酸、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５の溶液中で１０分間ストリッピングし、０．５ＭのＮａＯＨで１分間中和し、その後必要に応じて再プローブした。バックグラウンド減算したＲＯＩ強度を測定することによって、ブロット濃度測定をＩｍａｇｅＪ中で行った。
【０１９１】
免疫細胞化学
図３Ａ〜Ｃ中のシグナル伝達研究のために、ＥＧＦＰ  ＮＳＣを、９６ウェルプレート中にウェル当たり５×１０３細胞で播種した。従来型ウエスタンブロッティングについて記載した通りに、細胞をＦＧＦ欠乏状態にし、刺激した。標準的な細胞培養条件における分化アッセイのために、ＥＧＦＰ  ＮＳＣを、２４ウェルプレート中にウェル当たり４×１０４細胞で播種し、分化させた。ｓｃウエスタンマイクロウェルのために、ＥＧＦＰ  ＮＳＣを培養プレート中で分化させ、適切な日に懸濁し、ｓｃウエスタンスライド中に沈降させ、培養プレートについて使用したものと類似のワークフローによってＡｒｒａｙＩｔハイブリダイゼーションカセット内で処理した。細胞培養物および沈降させた細胞を、４％のパラホルムアルデヒド中で１５分間固着させ、その後、染色緩衝液（ＰＢＳ中の０．３％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を伴う５％のロバ血清）を用いて３０分間ブロッキングおよび透過処理した。培養物および細胞を、染色緩衝液中で、一次抗体（ウサギ抗ｐＥＲＫ１／２（１：２００、製品の詳細についてはプロービング、撮像、およびストリッピング。を参照されたい）、マウス抗ＥＲＫ１／２（１：５０、４６９６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗ｐＭＥＫ１／２（１：２００）、マウス抗ＭＥＫ１／２（１：２５、４６９４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ヤギ抗ＳＯＸ２（１：１００）、マウス抗ネスチン（１：２００）、ヤギ抗ＧＦＡＰ（１：５００）、マウス抗βＩＩＩチューブリン（１：５００））の組み合わせを用いて２４〜４８時間インキュベートし、次いで、核対比染色としてＤＡＰＩ（５μｇ／ｍＬ、Ｄ１３０６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた染色緩衝液中で、適切なＣｙ３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、および６４７で標識したロバ抗マウス、ウサギ、またはヤギＩｇＧ二次抗体（１：２５０，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１５−１６５−１５０、７１５−６０５−１５０、７１１−６０５−１５２、７０５−６０５−１４７，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いて２時間インキュベートした。細胞培養物を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）またはＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ  ＸＬ  Ｗｉｄｅｆｉｅｌｄ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して撮像した。マイクロウェル内細胞は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡を使用して撮像した（単一細胞免疫ブロットアッセイを参照されたい）。
【０１９２】
共焦点画像を、掃引フィールド共焦点光学（Ｐｒａｉｒｉｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を持つＢＸ５１Ｗ１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）上で取得し、Ｉｃｙバイオインフォマティクスソフトウェア（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）によって分析した。図４Ａに示すｃにおけるｓｃウエスタンマイクロウェル中の分化細胞の共焦点撮像のために、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：５００、ａｂ７２６０、Ａｂｃａｍ）を使用し、全ての他の抗体試薬は列挙したものと同一であった。
【０１９３】
免疫化学データ分析
図３Ａに示すａ中のシグナル伝達研究のために、細胞を、閾値化および粒子分析を使用する特注のＩｍａｇｅＪスクリプトによって特定して、ＤＡＰＩで染色した核を探し出した。分析のための単一細胞を選択し、最近隣への距離およびＲにおけるバックグラウンドシグナルの一様性に対するゲーティングによって選択した。蛍光を、各単一細胞の周囲のバックグラウンド減算した７５×７５画素のＲＯＩの画素強度を合計することによって定量化した。各ＲＯＩ中の画素のおよそ５０％がバックグラウンドシグナルからなり、それはガウス分布であった最高画素数を持つ強度値を、平均バックグラウンド強度として取り、個別のＲＯＩのためのバックグラウンド減算に使用した。ノイズ閾値を、Ｔ＝３σｂｇに設定し、式中、σｂｇは、各実験条件での蛍光顕微鏡写真中のバックグラウンドシグナル強度の最大標準偏差であった。分子中のＴを下回る蛍光の測定値を、プロットされたデータ中のものとして特定した。分母中のＴを下回る蛍光の測定値を、データセットから切り捨てた。
【０１９４】
培養プレート中のＩＣＣ実験および図４Ａ〜Ｃ中の分化実験のためのｓｃウエスタンマイクロウェルからの蛍光顕微鏡写真を、ＩｍａｇｅＪにおいて恣意的に判定された蛍光閾値に従って、マーカ発現について手動で採点した。異なる盲検の研究者らが、ＩＣＣ計数およびｓｃウエスタンマーカ発現分析を実施した。
【０１９５】
結果
単一細胞分析のためのｓｃウエスタンブロットアレイの設計および特性評価
単一細胞ウエスタン（ｓｃウエスタン）ブロッティングを、６，７２０個のマイクロウェルのアレイでマイクロパターン化した光活性化可能な薄いポリアクリルアミド（ＰＡ）ゲルをコーティングした顕微鏡スライド上で行った（図１Ａ及びＢ）。ｓｃウエスタンアレイは、ガラス顕微鏡スライド上に置いた厚さ３０μｍの光活性ポリアクリルアミドゲル中でパターン化した数千個のマイクロウェル（直径２０μｍ、深度３０μｍ）を含んだ。アレイは、ソフトリソグラフィーによって製造したＳＵ−８フォトレジスト原型で鋳造した１４×３０のマイクロウェルの１６個のブロックを含んだ（図１Ａに示すａ）。
【０１９６】
マイクロウェル（直径２０μｍ）を、ＳＵ−８マイクロポストをちりばめたシリコンウエハで、厚さ３０μｍのＰＡゲルの重合中にパターン化した（図１Ａに示すｂ）。数千個の単一細胞の同時ウエスタンブロッティングを可能にするため、ｓｃウエスタンアレイおよびアッセイ設計は、６つ全てのブロット段階を高密度のアレイフォーマット中に統合し、数千個の細胞の同時操作を可能にした。３つの属性が、ｓｃウエスタンアレイ設計を支え、単一細胞ウエスタンブロッティング能力の基礎を形成する。
【０１９７】
第１に、ｓｃウエスタンアレイを、数千のマイクロウェルのうちの各々の局所的作動とは対照的に、大域的に対応させた。細胞播種のために、受動的重力駆動型細胞沈降を使用した。単一細胞の懸濁液をｓｃウエスタンアレイ上に沈降させ、それにより５〜１０分の沈降時間でマイクロウェル当たり０〜４個の細胞を捕捉した。１，０００〜１，８００細胞ｍｍ−２スライド領域（合計２〜３．５×１０６細胞）のラット神経幹細胞密度については、ウェルの４０〜５０％において単一細胞が観察された（図１２）。沈降した細胞の溶解を、後続のタンパク質電気泳動に使用した。細胞を大域的に溶解するために、ｓｃウエスタンアレイ表面にわたるバルク緩衝液交換を使用した。後続の電気泳動に好適な伝導性を維持しながら細胞内タンパク質の可溶化を最大化するように修飾したＲＩＰＡを使用した。ＲＩＰＡ緩衝液は、変性非還元条件をもたらした。細胞溶解が２．６±１．５秒（±ＳＤ、ｎ＝６細胞）で、次いで約１０秒以内で細胞からのタンパク質抽出が、マイクロウェル中で観察された（図１Ｂに示すｅ）。開口マイクロウェル上への溶解緩衝液の注ぎ入れは、細胞内容物をマイクロウェルから移流的に取り除かなかった（図１１）。マイクロウェル中の流量を平均細胞溶解時間でシミュレーションした。シミュレーションは、マイクロウェルの底１０μｍを占めるほぼ停滞した流れを伴う、マイクロウェル深度の最初の約２０μｍにおける再循環流を示した（ペクレ数はＰｅ＜１）。沈降した細胞は移流輸送から大部分遮蔽されたため、拡散が、ウェルからのタンパク質の損失に大きく関与した可能性が高い。実験的に、４０．２±３．６％の合わせたＥＧＦＰタンパク質損失を溶解中に測定した（±ＳＤ、ｎ＝３つの個々のスライドからの３つのマイクロウェル）。図１Ｂに示すｅでは、各二次抗体上の別個の蛍光染色は、多重標的分析（ＥＧＦＰ：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識した二次抗体、βＴＵＢ：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識）を可能にした。ストリッピング、および化学的ストリッピングを介したブロービングは、二量体形にあるビメンチン（ＶＩＭ’、１０７ｋＤａ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５標識）のｓｃウエスタンブロッティングを可能にする。全ての数字に対する抗体希釈因子はこれまでに上述した。
【０１９８】
第２に、高密度のマイクロウェルアレイレイアウトを達成するために、アレイを短分離距離のタンパク質電気泳動に対して最適化した。ｓｃウエスタンアレイでは、マイクロウェル間の間隔幅が、有効な分離距離を決定する。細胞溶解後に電気泳動を始動および駆動するために、浸水させたｓｃウエスタンスライドにかけて電場を適用した。印加電場は、タンパク質を、マイクロウェル壁を通して薄いゲルシートへと駆動し、それによりポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）が始動した。この構築におけるＰＡＧＥ性能を理解するために、マイクロウェル中に分配した蛍光標識したラダータンパク質（２７〜１３２ｋＤａ、図１Ｂに示すｄ）のモデル溶液をアッセイした（図９）。
【０１９９】
自由溶液およびポリアクリルアミドゲルへのタンパク質の分配−タンパク質を含む粒子は、分配係数Ｋ、ｃｌとｃｂとの比、局所ゲルおよびバルク自由溶液タンパク質濃度
0006317771.tif 000003
（１）
に従って、高密度のヒドロゲルネットワークと自由溶液とに分配されることが見込まれ、式中、Φはポリマーネットワークの体積画分であり、ａはタンパク質のストークス−アインシュタインの半径であり、ａｆはポリマー繊維半径である。平衡分配およびｓｃウエスタンマイクロウェルからの蛍光タンパク質ドロンパ反復注入の実演を、様々な目的とする精製タンパク質標的についての測定した分配係数と併せて、図９に示す。
【０２００】
プローブ抗体のサイズの大きさ（約１５０ｋＤａ）によって悪化すると見込まれた予想の分配効果を所与として、厚さ８０μｍのｓｃウエスタンゲル層中のプローブ抗体の平衡時間を判定した（図１３）。蛍光標識した一次抗体をゲルコーティングしたスライドの上の自由溶液中で３０分間インキュベートした後、スライドをＴＢＳＴ中で洗浄し、定期的に撮像した。抗体が拡散によってスライドを離れたとき、スライド蛍光の指数関数的減衰が大体５分の時定数で観察され、約４τ＝２０分の完全洗い出しまでの時間は、見積もった拡散時間ｔ〜ｘ２／４Ｄ＝２７分と遜色がなかった。ゲル層は、細胞の寸法をより厳密に一致させることによって、マイクロウェル内の複数細胞の垂直なスタッキングの発生率を最小化するために、典型的に厚さ３０μｍであった。大体４分の抗体拡散時間が見込まれた。
【０２０１】
この実験は、プローブの溶液濃度が、プローブのゲル濃度の減少における分配の影響を補正するために、そのバルク溶液濃度に関して０．１７の測定分配係数分上昇したにもかかわらず、ｓｃウエスタンゲルとのプローブ抗体の迅速な平衡が、その微小規模の厚さを所与として、プロービングおよび洗浄中に達成され得ることを示した（図９）。
【０２０２】
電気泳動中、マイクロウェルの周縁に対するタンパク質のスタッキングが、ＰＡＧＥ後に観察された。十分に変性および還元するＳＤＳ−ＰＡＧＥについて見込まれた通り、変性非還元ＰＡＧＥ条件下で、タンパク質分子量と移行距離との対数線形関係を立証した（Ｒ２＝０．９７、図１４）。二量体の分離が観察され、それは、緩衝液条件がタンパク質間相互作用の分析にも適用可能であり得ることを示した。中等度のＰＡＧＥ性能を達成し、分子量差が５１±１．６％（±ＳＤ、ｎ＝３分離）であるタンパク質ペアは、約５００μｍの分離の長さで分解可能であった。ｓｃウエスタンアレイでは、分析物の移行距離の変動係数は、アレイのブロック内およびブロック間の両方で４％以内であった（図７）。
【０２０３】
第３のｓｃウエスタン属性は、ウエスタンブロットアッセイのブロッティングおよびプロービング段階の両方を促進する、反応および輸送の小さい特徴的長さの使用であった。ブロッティング段階、後のＰＡＧＥのために、タンパク質バンドを、ＵＶ光への手短な露出（４５秒）によって、ＰＡＧＥ後に光活性ＰＡゲル中に共有的に固定した。ゲルに架橋したベンゾフェノンメタクリルアミドコポリマーがこのフォトキャプチャ挙動を授けた。チャネル表面に種を固定するように設計された手法とは異なり、光活性ゲルの使用は、より効率的な擬似均一３Ｄ反応環境をもたらす。光活性ＰＡゲルの捕捉効率、線形性、および種特異性を理解するために、まずＮＳＣ中に発現したＥＧＦＰの見かけの捕捉効率を測定した。ＥＧＦＰを発現しているＮＳＣの沈降、溶解、ＰＡＧＥ分析の後、ＥＧＦＰバンドの内在蛍光を、ＵＶで誘導した捕捉および洗浄後のその蛍光と比較した（図１Ｂに示すｅ）。η＝２７．５±２．９％の捕獲効率を測定すると（±ＳＤ、ｎ＝別々の４日に行った実験からの６ブロット）、それは天然ＰＡＧＥ（非標識の野生型ＧＦＰについてη＝１．８％）および変性／還元ＰＡＧＥ（種々の蛍光標識した標的についてη＞７５％）ＰＡＧＥについてこれまでに判定したものの間の効率で、一貫した日々の捕捉性能を示した。溶解、分離、およびブロッティングステップを７５秒で完了した。
【０２０４】
固定したタンパク質分離のプロービングを、薄いＰＡゲル層への抗体の拡散によって行った。ｓｃウエスタンブロットの多重化するために、マイクロウェルアレイを、固有のプロービング溶液の適用および単離を可能にする、マイクロアレイガスケットに適合するレイアウトである、４２０個のマイクロウェルからなる１６「ブロック」に典型的に編成した。プロービングステップは、４５分の緩衝液洗浄ステップと交互にした、一次抗体溶液および蛍光標識した二次抗体溶液を用いたｓｃウエスタンアレイの逐次的な１時間のインキュベーションからなった（図７）。薄いＰＡゲルを通した抗体拡散速度論は、５分未満の平衡時定数を示した（図１３）。プロービング後、蛍光マイクロアレイスキャナ、３重標的定量化を伴う単一試料中４８標的のｓｃウエスタンブロットを使用して、ｓｃウエスタンアレイを撮像した。
【０２０５】
各細胞中の多重標的分析を得るために、化学的ストリッピングを使用して、単一細胞ｓｃウエスタンブロットの再プロービング性能を評定した。単一細胞ブロッティング後に強力な変性緩衝液を用いてｓｃウエスタンアレイをインキュベーションすることによって、ＥＧＦＰおよびβチューブリンへのプローブに関連付けられるシグナル対ノイズ比の１０倍超の減少を達成した（図１Ｂに示すｅ）。更に、ストリッピングしたスライド上のＥＧＦＰの再プロービングにより第１回目のプロービングのものに類似したＳＮＲを回収したが、二次抗体のみの対照についてはなかった（図１５）。
【０２０６】
細胞集団の単一細胞ウエスタンブロッティング
６，７２０個のマイクロウェルからの同時分析のためにｓｃウエスタンブロットをスケーリングする実験を行った。図２Ａに示すａは、βＴＵＢ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識した二次抗体）およびＥＧＦＰ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５標識、ＲＦＵ：相対蛍光単位）についてのＥＧＦＰを発現しているＮＳＣの同時ｓｃウエスタンブロット合計５，０４０個のうち４２０個のブロックを示す。マイクロウェル中に播種した細胞の明視野顕微鏡写真によって、ウェル当たりの細胞数の決定が可能となった。ｓｃウエスタンブロットアッセイを使用して、単一スライドの１２ブロックに及ぶＥＧＦＰを発現している神経幹細胞（ＮＳＣ）を分析した。見込みある５，０４０個のうち４，１２８ブロット（８２％）が、塵埃粒子および欠陥に対する半自動ゲーティングを通過した。これらのうち１，６０８個（３９％）を単一細胞上に行った。ＥＧＦＰおよびβチューブリンの２個の標的を同一のｓｃウエスタンアレイ上でプローブし、関連するマイクロウェル占有率（ウェル当たりの細胞）値を示す得られたｓｃウエスタンブロット読出強度を、手動の採点によって決定した（図２ａおよび図１６）。ウェル当たりの単一細胞装置のゲーティングに対して最適化した自動採点を、全ての他のデータセットに使用した（方法を参照されたい）。
【０２０７】
標準的に実行している空間マイクロウェル占有率は、０〜２．１細胞／ウェルの範囲であり、平均値は１．１細胞／ウェルであった（図２Ａに示すｂ）。この測定基準における空間的変動は、ｓｃウエスタンアレイにわたる非一様な細胞沈降密度に起因する可能性が高い。βチューブリンバンドの総蛍光は、ウェル当たりの細胞数と共に非線形的に変動した（図２Ａに示すｂ）。非線形性は、マイクロウェル播種における細胞サイズのバイアスを反映した可能性が高い非ポアソン的細胞沈降統計の結果であると考えられた（図２Ｃに示すｄ）。
【０２０８】
βチューブリン蛍光分布に対する細胞沈降統計および効果−ウェル当たりの細胞沈降分布を説明するファノ因子はポアソン的分布から逸脱した（ポアソン分布についてはＦ＝σ２／μ＝１、ウェル当たりの細胞分布についてはＦ約０．５５〜０．７５、図１２）。縮小したウェル当たりの細胞分布は、ウェル当たりの細胞軸に沿ったβチューブリンの細胞当たりの寄与を減少し得る、マイクロウェル播種によって課されたサイズバイアスを反映し得る。平均して、１細胞／ウェルを上回る各追加の細胞は、２個および３個の細胞／ウェルブロットについて元の細胞のそれぞれ７９％および４２％のβチューブリン寄与を付加し、標準偏差は、同一の１細胞／ウェルβチューブリン分布の単純な付加に基づく見込まれた標準偏差に対して、１０５％および３６％であった（すなわち、μｆ，２’ｓ＝μｆ，１’ｓ＋０．７９μｆ，１’ｓ，μｆ，３’ｓ＝μｆ，２’ｓ＋０．４２μｆ，１’ｓ、ＳＤｆ，２’ｓ＝ＳＤｆ，１’ｓ＋１．０５（√２−１）ＳＤｆ，１’ｓ、ＳＤｆ，３’ｓ＝ＳＤｆ，２’ｓ＋０．３６（√２−１）ＳＤｆ，１’ｓであり、式中、μｆ，ｉ’ｓおよびＳＤｆ，ｉ’ｓは、ｉ細胞／ウェルブロットにわたるβチューブリン蛍光シグナルにおける平均値および標準偏差である）。
【０２０９】
βチューブリン蛍光分布は、分裂細胞の均一集団における転写および翻訳の確率動態モデルから生じるガンマ分布によってよく説明された。本モデルによって、ポアソン的ｍＲＮＡ産生および指数関数的に分布したタンパク質放出数が仮定され、ｆ（ｘ）＝（ｘａ−１ｅ−ｘ／ｂ）／（Γ（ａ）ｂａ）を得て、式中、ｘは総ブロット蛍光、ａ＝μｐ２／σｐ２（ノイズ項の逆数）、ｂ＝σｐ２／μｐ（ファノ因子）、およびΓはガンマ関数である。ｓｃウエスタンβチューブリンデータは、故に、大腸菌および哺乳動物細胞における蛍光タンパク質融合ライブラリについてのガンマ分布単一細胞タンパク質発現プロファイルと合致した。
【０２１０】
ｓｃウエスタンブロットの分析性能
これらのＮＳＣ中のＥＧＦＰ発現は変動することが見込まれたため、ｓｃウエスタンブロットの検出性能を評定するために、レトロウイルス形質導入によって生成したＥＧＦＰを発現しているＮＳＣをアッセイした（図２Ｂに示すｃ）。それぞれＥＧＦＰ＋細胞（技術的ノイズを上回るブロットシグナルについて）は１９％、ｓｃウエスタンブロットおよびフローサイトメトリーアッセイについては２６．７±１．１％であり（±ＳＤ、ｎ＝３技術的複製）、ダイナミックレンジは同等であった。スライドの個々に播種した領域からのウェル当たりのゼロ細胞ｓｃウエスタンブロット（ブロット４，１００〜４，１２８、０’ｓ＊）によって、理想の技術的ノイズの見積もりが可能となった。抗体消費は、従来型スラブゲルウエスタンブロットのレーン当たり約０．５〜２μｇの各一次抗体と比較して、ｓｃウエスタンアレイ当たり約３２μｇの各抗体または単一細胞ブロット当たり４．８ｎｇであった（図１７）。
【０２１１】
ｓｃウエスタンブロットの分析性能−１：２０の抗体希釈因子を使用して、ｓｃウエスタンブロット蛍光シグナルとＥＧＦＰおよびβ−チューブリンの試薬消費との間の許容可能な均衡をもたらした（図１７）。これらのプロービング条件下で、６，７２０ｓｃウエスタンブロットからなるスライド当たり各抗体３２μｇ、またはブロット当たり４．８ｎｇの消費を見積もった（従来型スラブゲルウエスタンブロットのレーン当たり各一次抗体約０．５〜２μｇと比較して）。
【０２１２】
ｓｃウエスタンブロットのダイナミックレンジを、技術的ノイズ限界および最大細胞蛍光強度から見積もった。ｓｃウエスタンブロットの技術的ノイズを、（ｉ）マイクロウェルは細胞を含まなかった、および（ｉｉ）マイクロウェルは細胞を含んだマイクロウェルから離れていたという２つの特徴を持つブロットからのシグナルを評定することによって判定した。ウェル当たりの有限細胞アッセイに近位のウェル当たりのゼロ細胞ブロットからのｓｃウエスタンシグナルが、空間的に孤立したウェル当たりのゼロ細胞ブロットからのｓｃウエスタンシグナルよりも約１０高かったため（μゼロ＋３σゼロ＝２．５×１０４〜２．４×１０５分子の画素数正規化閾値から）、これらの基準を選択した。結果として、高ダイナミックレンジ標的を持つ細胞集団において、アレイ密度と低コピー数限界測定値の忠実度との間に設計トレードオフが存在する。技術的ノイズ限界を決定した後、理想のダイナミックレンジは、ｓｃウエスタンブロットおよび従来型フローサイトメトリーとそれぞれ２．９および２．６桁で同等であることを見出した。
【０２１３】
ｓｃウエスタンブロット蛍光読出の線形性および感受性を分析した。ＥＧＦＰの「直接的」較正、ならびにβチューブリン、ｐＥＲＫ、およびＥＲＫ標的の「間接的」較正を決定した（図２Ｃに示すｄ）。直接的方法は、免疫ブロッティング後のプローブ蛍光へのカバーガラス密閉マイクロウェル分離における精製ＥＧＦＰ分子の数を較正し、一方で間接的方法は、分配係数測定を使用して、ドットブロット型実験からのブロットしたｓｃウエスタンバンドにおける分子数を推測した（図８および１０）。較正結果は、２７，０００個の分子（４５ｚｍｏｌ）での検出限界から２．２桁の線形ダイナミックレンジを示して、ＥＧＦＰ（図２Ｃに示すｄ）と合致した。この検出限界は、２５，０００個の分子の検出の「理想の」ノイズ閾値を１０％以内に合わせ、これは、検出限界が蛍光マイクロアレイスキャナと関連付けられる技術的ノイズによって大まかに設定されたことを示した。２７，０００個の分子の検出限界は、マイクロウエスタンアレイよりも４５倍の改善であり、微小流体ウエスタンブロッティングよりも３．２倍の改善であった。効率的な抗体ストリッピングを、間接的ＥＧＦＰ較正スライド全体で検証した（図２Ｃに示すｄ）。βチューブリン、ｐＥＲＫ、およびＥＲＫについての間接的較正曲線は、精製した各標準の推測されたゲル内濃度において１．３〜１．８桁にわたる線形性を示し、ＳＮＲ＝３（Ｒ２＝０．９４〜０．９８、図２Ｃに示すｄならびに図１０および図１８）をもたらした。さらに、無傷細胞からブロットしたバンドへのタンパク質の移動に固有の約４０倍の希釈因子について補正したβチューブリンおよびＥＲＫの見積もった生理学的濃度は、両曲線の線形領域内である。
【０２１４】
ＮＳＣのＦＧＦ刺激後のシグナル伝達における細胞間不均一性の観察
ｓｃウエスタンアレイを使用して、神経前駆マイトジェンＦＧＦで刺激した後のラットＮＳＣにおけるＭＡＰＫシグナル伝達動態をモニタリングした。ｓｃウエスタンブロットを６回間隔で６０分の時間経過にわたり実施した（図３Ａ〜Ｃ）。まず、リン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）およびＭＥＫ（ｐＭＥＫ）標的に対してプローブし、次いで総ＥＲＫおよびＭＥＫ（図３Ａに示すａおよび図１９）に対して再プローブした。βチューブリンおよびＥＧＦＰによって、各標的の分子量の推定が可能となった。ｐＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐＭＥＫ、およびＭＥＫの観察された分子量は、それらの公称質量の１０％以内であった。リン酸化した総標的読出の各ペアについては、１０３±３ｋＤａでのｐＥＲＫプロファイルにおける推定非特異的バンドを除いて、分離プロファイルは対応していた（±ＳＤ、ｎ＝３分離）。ＥＧＦＰブロットは、各々同一の細胞からであった他のブロットと同一のアレイの行にある細胞からであった。ＥＲＫバンドと一致しないｐＥＲＫ抗体によって特定された１０３ｋＤａでの標的外ピークに留意されたい。この未知のピークは、従来型ウエスタンブロッティングによって裏付けられる通り、標的上のｐＥＲＫシグナルと相関しなかった強力な細胞間変動性を示した（図３Ａに示すｂ、ならびに図２０および図２１）。
【０２１５】
標的外種に結合している非特異的プローブは、細胞内タンパク質の単一細胞分析（例えば、免疫細胞化学であるＩＣＣ、フローサイトメトリー）に影響し得る。この分析的懸念を踏まえると、ＥＲＫに対するｓｃウエスタンブロットにおける標的外シグナルの寄与が更に特徴付けられた。総ｐＥＲＫプローブシグナルへの非特異的な１０３ｋＤａの寄与は、平均で、ゼロ時点（未刺激）のｓｃウエスタンブロットシグナルの１３％（最大５２％）を構成した。しかしながら、ＦＧＦ刺激に対するＮＳＣの最大応答に対応する１２分の時点では、１０３ｋＤａの標的外ｐＥＲＫプローブシグナルは、総シグナルの平均０．７％（最大１８％）しか含まなかった。ＥＲＫリン酸化の基礎レベルは、標的特異的ノックダウン実験なしの従来型アッセイにおいて標的外プロービングから容易に区別できないため、ｓｃウエスタンブロッティングなしでは、刺激時間規模にわたる免疫蛍光への約１０３ｋＤａの標的外ピークの寄与における細胞間変動性は、検出が困難であり得る。
【０２１６】
次に、ｓｃウエスタンブロットからの動的応答測定値を、従来型スラブゲルウエスタンブロッティングと比較した。従来型ウエスタンブロットとｓｃウエスタンブロットとの両方は、ＥＲＫおよびＭＥＫのリン酸化動態における類似の動向（図３Ｂに示すｃおよび図３Ｂに示すｄ、ならびに図２２Ａ及びＢ）、およびｓｃウエスタンブロットによる刺激されていないものと最大の細胞集団応答との間の差異が、統計的に有意であったことを示した。
【０２１７】
ＦＧＦ刺激実験におけるｓｃウエスタンおよびＩＣＣデータの統計的分析（図３Ｂに示すｄ、図３Ｃに示すｅ）単一細胞のｐＥＲＫ：ＥＲＫおよびｐＭＥＫ：ＭＥＫのｓｃウエスタンブロットデータにおける、それぞれ１２および２０分の最大値での倍数変化（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）分布は、対応する時間ゼロ分布と著しく異なった（ｐＥＲＫ：ＥＲＫ：マン・ホイットニーのＵ＝５３７、ｎ０分＝１８６、ｎ１２分＝５７、Ｐ＜０．００１；ｐＭＥＫ：ＭＥＫ：マン・ホイットニーのＵ＝６，８８４、ｎ０分＝１８６、ｎ２０分＝２３６、Ｐ＜０．００１）。前後関係のため、ｓｃウエスタンブロッティングによるβチューブリン、ＥＲＫ、およびＭＥＫの平均倍数変化は、各刺激時間で、細胞集団全体で１．６未満であった（図２３）。同様に、ｐＥＲＫ：ＥＲＫおよびｐＭＥＫ：ＭＥＫのＩＣＣデータに対する５および２０分の最大値での倍数変化分布（図２４）は、対応する時間ゼロ分布と著しく異なった（ｐＥＲＫ：ＥＲＫ：マン・ホイットニーのＵ＝１２３、ｎ０分＝１６０、ｎ５分＝１１５、Ｐ＜０．００１；ｐＭＥＫ：ＭＥＫ：マン・ホイットニーのＵ＝６，６５３、ｎ０分＝１８４、ｎ２０分＝２２３、Ｐ＜０．００１）。前後関係のため、ＩＣＣによるＥＲＫおよびＭＥＫの平均倍数変化は、各刺激時間で、細胞集団全体で１．５未満であった（図２４）。
【０２１８】
最大のｐＭＥＫ：ＭＥＫのリン酸化動向は、最大値対ゼロ時点での値の比における約３．５倍の増加をもって定量的に一致した。両方のアッセイフォーマットについて、ｐＥＲＫ：ＥＲＫ比における応答は、ｐＭＥＫ：ＭＥＫ比について観察されたものを超えたが、最大値は、従来型ブロット濃度測定とｓｃウエスタン蛍光撮像との間で時間において異なった。従来型ウエスタンブロットにおける刺激と溶解との間の中間処理ステップの結果であると考えられる応答における遅延が、従来型ウエスタンブロットとｓｃウエスタンブロットとの間で観察された。ｐＥＲＫ：ＥＲＫ分布は、０、５、３０、および６０分時点で２．５超の歪度を有し（図２３）、それは、得られた集団への希少な活性化細胞の寄与を示した。これらは、構成的シグナル伝達、または基準リン酸化状態からの一過性のＦＧＦ非依存性偏位によって起こり得る。ｐＥＲＫ：ＥＲＫおよびｐＭＥＫ：ＭＥＫのリン酸化応答について、歪度は１２分の刺激時点で最小（それぞれ１．１および０．１）であり、ｐＭＥＫ：ＭＥＫ比は１２分の刺激時点で正常に分布し（シャピロ・ウィルクのＷ＝０．９８、ｎ１２分＝５７、Ｐ＝０．５８）、それは、各標的に対する最大リン酸化の上限への集団全体の接近を示した。応答速度および／または大きさにおける細胞間不均一性は、ｐＥＲＫ：ＥＲＫおよびｐＭＥＫ：ＭＥＫについて１２分でそれぞれ７．３および３．７倍数変化単位の四分位範囲で、高かった。
【０２１９】
従来型単一細胞技法を用いてのＦＧＦ刺激に対するタンパク質シグナル伝達応答における細胞間不均一性を比較するために、ＥＲＫおよびＭＥＫリン酸化をハイスループットＩＣＣによって分析した（図３Ｃに示すｅ、ならびに図２４および図２５）。ｐＥＲＫ：ＥＲＫのプロファイルは、ｓｃウエスタンデータと従来型ウエスタンブロットデータとの両方とさほど違わなかった。対照的に、ｐＭＥＫ：ＭＥＫ応答は、統計的に有意であるにもかかわらず、これらの技術的複製にわたって２未満の最大平均倍数変化で強く減衰した。この応答不良は、ｐＭＥＫ／ＭＥＫ２８の予想された細胞質内局在化と食い違う、ｐＭＥＫ抗体の不適正な核局在化の結果であると考えられた（図２６および図２７）。ＩＣＣにおけるｐＭＥＫ抗体の標的外特異性は、ｓｃウエスタンブロッティングと従来型ウエスタンブロッティングとの両方によって捕捉されたわずかなリン酸化応答を不明瞭にする可能性が高い。
【０２２０】
ＮＳＣの分化中の細胞間不均一性
細胞の大型のアレイをｓｃウエスタンブロットによって分析して、星細胞（グリア繊維性酸性タンパク質、ＧＦＡＰ＋）および神経（βＩＩＩチューブリン、βＩＩＩＴＵＢ＋）終点への単一細胞レベルのネスチン（ＮＥＳＴ）＋／ＳＯＸ２＋ＮＳＣ分化動態を、６日の期間にわたって研究した。ＮＳＣを、培養プレート中の神経および星細胞混合集団へと分化した（図４Ａに示すａ）。２４時間ごとに、ＮＳＣをｓｃウエスタンマイクロウェルへと沈降させ（図４Ａに示すｂ及びｃ）、単一細胞ブロットを６日の期間にわたり実施した。ｓｃウエスタンブロットは、ＮＥＳＴ（９５．７±３．５ｋＤａ）、ＳＯＸ２（４３．３±１．９ｋＤａ）、βＩＩＩＴＵＢ（４７．２±０．７ｋＤａ）、およびＧＦＡＰ（５４．０±１．０ｋＤａ、全て±ＳＤ、ｎ＝３分離、図４Ｂに示すｄ、図２８）に特異的なバンドの報告に成功した。各標的タンパク質は、３３．８ｋＤａのその公称質量から２８％異なったＳＯＸ２を除いて、その予想質量の２０％以内であった（従来型ウエスタンブロッティングによって判定）。観察されたＳＯＸ２質量の差異は、（ｉ）ｓｃウエスタンにおける、高い９．７ｐＩのタンパク質および変性非還元ＰＡＧＥ条件、（ｉｉ）他の（全て細胞質）タンパク質標的と比較した、核からのＳＯＸ２の抽出に対する限定された溶解時間および分化影響、（ｉｉｉ）標的外プロービング、という３つの起源から生じたと仮定した。文献報告と調和して、ＮＥＳＴは、従来型ウエスタンブロッティングにおいて２つのバンドを呈したが（ＮＥＳＴおよびＮＥＳＴ＊に対してそれぞれ８２および１４９ｋＤａ、図４Ｃに示すｅ、図２９）、ｓｃウエスタンブロットは、マイクロウェル中で観察されたより高い分子量の物質の滞留を伴うより低い分子量バンドのみを報告する。
【０２２１】
従来のウエスタンブロッティングは、６日の分化時間経過にわたって、ＮＥＳＴ（８２ｋＤａバンド）およびＳＯＸ２における１０倍超の減少、およびβＩＩＩＴＵＢおよびＧＦＡＰにおける１０倍超の増加を示した（図４Ｃに示すｅ）。類似の動向は、ＮＥＳＴ、βＩＩＩＴＵＢ、およびＧＦＡＰについて、そしてＳＯＸ２についてはより少ない程度に、分化時間規模にわたるβチューブリン正規化ｓｃウエスタンブロットデータにおいて明らかであった（図４Ｃに示すｆ、ならびに図３０および図３１）。０および６日目でのＮＥＳＴおよびＧＦＡＰの単一細胞発現レベルは、それぞれ、それらの対応する技術的ノイズ閾値から２２および４６倍の範囲に及んで特に不均一であった。ｓｃウエスタンブロットにおいて技術的ノイズを上回って採点されたβＩＩＩＴＵＢ＋（神経細胞）およびＧＦＡＰ＋（星細胞）の細胞型のパーセンテージは、６日目で５３％および７．１％であった。これらの値は、１５％以内に元の培養プレートにおける研究者盲検ＩＣＣ実験からの手動で採点した数と一致し（以下の表２）、それは、ｓｃウエスタンブロットにおける技術的ノイズ閾値がマーカ陽性および陰性細胞状態を忠実に描出したことを示す。
【０２２２】
細胞型バイアスの証拠は、培養プレートおよびｓｃウエスタンマイクロウェル中のＩＣＣデータから手動で採点した数において、細胞沈降中、観察されなかった（沈降後）。これらデータは、ｓｃウエスタンブロッティングが、回転楕円形ＮＳＣから高度に分岐した神経およびグリア細胞型まで多種多様な細胞形態に対して堅牢であったことを示した（以下の表２）。培養プレートおよびマイクロウェル内ＩＣＣによって、ＮＥＳＴ＋ＮＳＣの数は０から６日目までで大体９０〜４０％減少し、この集団におけるパーセンテージ変化と類似の大きさが、ｓｃウエスタンブロッティングによって観察された（５３〜２％）。ＩＣＣ測定値が、刺激非反応性の１４９ｋＤａのＮＥＳＴ＊種の発現によって設定されるより低い閾値に達した可能性があるのに対して、この測定値の記録における見かけの偏移は、ｓｃウエスタンアッセイの、刺激反応性の８２ｋＤａのＮＥＳＴ種から蛍光シグナルを単離する能力を示した（図４Ａに示すａ）。しかしながら、ＩＣＣとｓｃウエスタンアッセイとの両方は、０日目と６日目との間に従来のウエスタンブロッティングによって観察されたＳＯＸ２発現の急落を反映せず、それは、恐らく各々における標的外抗体読出を示し、ｓｃウエスタンブロッティングによって予測されたＳＯＸ２の分子量における比較的高い誤差によって更に証明された。
【０２２３】
考察
数千の単一細胞の標的化プロテオーム解析が可能である単一細胞ウエスタンブロッティングを、本明細書で開示する。ｓｃウエスタンブロットは、免疫細胞化学およびフローサイトメトリーなどの基本的な細胞プロセスを調査するためのハイスループット単一細胞プロテオームツールにおいて使用を見出す。既存のタンパク質分析ツールが試薬特異性への共通の脆弱性に悩むのに対して、分離ステップと免疫プロービングステップとの両方を含むことにより、ｓｃウエスタンブロッティングにおいてこの脆弱性が減少する。免疫蛍光検出読出が標的分子量などの二次的特徴のアッセイによって補充されるため、ｓｃウエスタンブロットはアッセイの偽陽性率の減少を促進する。ｓｃウエスタンブロッティングはまた、上流の機能的または形態学的スクリーニングを統合するワークフローにおける希少一次細胞の分析から、特異性評定についての抗体ライブラリスクリーニング、薬剤への応答における細胞間変動の定量化（例えば、循環腫瘍細胞などの希少細胞）まで、多種多様な研究においても使用を見出す。最後に、ここで詳述するｓｃウエスタンブロットは、複雑なマクロからミクロへの接続および流量制御スキームの意図的な欠如のために、幅広い採用に対して設計される。
【０２２４】
表２。培養プレートおよびマイクロウェル内ＩＣＣによって、および分化０日目および６日目の図４Ｃに示すｆからの単一細胞ｓｃウエスタンブロット蛍光データにおける技術的ノイズレベルに設定された閾値によって、マーカ陽性として採点した細胞のパーセンテージ（±ＳＤ、ｎ＝３技術的複製、反復当たり１００個超の細胞を採点）。太字になっている神経細胞（βＩＩＩＴＵＢ＋）および星細胞（ＧＦＡＰ＋）の終点数が目的とするものである。
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【０２２５】
実施例３
マイクロウェルの円形配列を含むポリマー分離媒体
図３２に示される通り、マイクロウェルの円形配列を有するポリマー分離媒体を含んだ本開示に従う装置を使用して実験を行った。装置は、２つのパターン化したポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）スライドを含んだ（図３２）。底部ＰＡＧは、異なるサイズの細胞を捕捉するために平面で傾斜したマイクロウェルで囲まれた直径１２ｍｍの中心ウェルでパターン化した（図３３）。直径８ｍｍの貯留ウェルを、マイクロウェルを用いずに上部ＰＡＧ中でパターン化し、２つのＰＡＧスライドを共に「サンドイッチ」して、細胞を閉じ込めるための密封チャンバを創出した。細胞および緩衝液を、上部ＰＡＧ中の中心注入口へと注入した。堆積した溶液は最初、８ｍｍウェルの辺部と１２ｍｍウェルの辺部との間の空隙に移動し（図３２−青色色素、例えば、外側の陰影の付いた環）、その後、より小さいウェル中の空間を充填した（図３２−緑色色素、例えば、中心の陰影の付いた領域）。この充填は、細胞を側部のマイクロウェルに近接するように位置付け、空隙を創出し、それを通してチャンバが緩衝液または他の溶液で充填された。遠心力を使用して、細胞をマイクロウェル中に活発に位置付けた。装置により、細胞は、後続のタンパク質分離のためにすぐにマイクロウェル中に沈降した。ＰＡＧスライドを分離し（図３６Ａおよび３６Ｂ）、目的とするタンパク質についてプローブした。図３４は、細胞タンパク質の分析のためのワークフローの概略図を示す。
【０２２６】
主題の装置の実施形態は、細胞集団の単一細胞タンパク質分析を提供する（例えば、循環腫瘍細胞または幹細胞）希少細胞集団）。これらの希少細胞集団は、細胞消失を防止するために特別な取扱を必要とし得る。ポリスチレンビーズで試験した場合、４０００ＲＰＭまたは約１１２ｇで２分回転させたとき、主題の装置の実施形態の捕捉率は約９０％であった（図３５）。装置のマイクロウェルおよび密封チャンバへの細胞の迅速な沈降は、処理中に細胞を保護することで、細胞死の減少を促進した。主題の装置の実施形態は、目的とするタンパク質（例えば、細胞内タンパク質）の分析を促進する。単一細胞レベルでのタンパク質の分析は、細胞挙動における変動の検出を促進し得る。
【０２２７】
本開示の実施形態は、次の付記によって更に説明されるが、それらに限定されない。
１．装置であって、
複数のマイクロウェルを含むポリマー分離媒体を含み、該ポリマー分離媒体が、適用刺激を適用すると該分離媒体中の１つ以上の対象試料成分に共有結合する官能基を含む、装置。
２．該ポリマー分離媒体の表面に接触する固体支持体を更に含み、該装置が、該ポリマー分離媒体および該固体支持体のうち１つ以上の一部分を通過する少なくとも１つのチャネルを含む、付記１に記載の装置。
３．該マイクロウェルが、該ポリマー分離媒体中でマイクロウェルのアレイとして配列される、付記１または付記２に記載の装置。
４．該マイクロウェルが、該ポリマー分離媒体の表面上にある開口端部、および該ポリマー分離媒体中にある反対の閉口端部を含む、前述の付記のいずれかに記載の装置。
５．該ポリマー分離媒体が、外周部上に位置付けられ、かつ中心ウェルと流体連通している複数のマイクロウェルを含む該中心ウェルを含む、付記１に記載の装置。
６．各マイクロウェルが、該中心ウェルと流体連通している開口端部、および該ポリマー分離媒体中にある反対の閉口端部を含む、付記５に記載の装置。
７．該マイクロウェルが、該中心ウェルの実質的に全外周部の周りに配列される、付記５または付記６に記載の装置。
８．該ポリマー分離媒体を保持する固体支持体を更に含み、該装置が、該ポリマー分離媒体および該固体支持体のうち１つ以上の一部分を通過する少なくとも１つのチャネルを含む、付記５に記載の装置。
９．該ポリマー分離媒体が、適用刺激を適用すると該分離媒体中の１つ以上の対象試料成分に共有結合する官能基を含む、付記５に記載の装置。
１０．該ポリマー分離媒体が、１００個以上のマイクロウェルを含む、前述の付記のいずれかに記載の装置。
１１．該マイクロウェルが、単一細胞を収容するように寸法決定される、前述の付記のいずれかに記載の装置。
１２．該マイクロウェルの該開口端部が、該マイクロウェルの該閉口端部を上回る幅を有する、付記４または６に記載の装置。
１３．該ポリマー分離媒体が、ゲルを含む、前述の付記のいずれかに記載の装置。
１４．該ゲルが、直方体状に成形される、付記１３に記載の装置。
１５．該直方体が、２５〜２５０ミクロンの範囲の厚さを有する、付記１４に記載の装置。
１６．該マイクロウェルが、５〜４０ミクロンの範囲の奥行き、および５〜２０ミクロンの範囲の直径を有する、前述の付記のいずれかに記載の装置。
１７．該適用刺激が、電磁放射線である、前述の付記のいずれかに記載の装置。
１８．該電磁放射線が光である、付記１７に記載の装置。
１９．方法であって、
試料を、前述の付記のいずれかに記載の装置と接触させることと、
該ポリマー分離媒体に、該試料の少なくとも一部の成分を該マイクロウェルから該ポリマー分離媒体へと移動させるのに十分な様態で電場を適用して、該ポリマー分離媒体中で分離した試料成分をもたらすことと、を含む、方法。
２０．該ポリマー分離媒体が、適用刺激を適用すると該分離媒体中の１つ以上の対象試料成分に共有結合する官能基を含む、付記１９に記載の方法。
２１．該試料が、細胞および／または細胞成分を含む、付記１９または２０に記載の方法。
２２．該細胞を溶解して、該試料中で該細胞成分をもたらすことを更に含む、付記１９〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．該細胞をインキュベートして、該試料中で該細胞成分をもたらすことを更に含む、付記１９〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．該試料を該ポリマー分離媒体と接触させることが、該試料の少なくとも一部の成分を１つ以上のマイクロウェル中に位置付けることを含む、付記１９〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．該位置付けることが、試料成分を重力により受動的に沈降させることを含む、付記２４に記載の方法。
２６．該位置付けることが、該ポリマー分離媒体に遠心力を適用することを含む、付記２４に記載の方法。
２７．該配置付けることが、該ポリマー分離媒体に電場を適用することを含む、付記２４に記載の方法。
２８．該位置付けることが、該試料に密度勾配を適用することを含む、付記２４に記載の方法。
２９．該位置付けることが、該試料の少なくとも一部の成分を、マイクロピペットまたはノズルを使用して、１つ以上のマイクロウェルに導入することを含む、付記２４に記載の方法。
３０．該位置付けることが、該試料の少なくとも一部の成分を、光ピンセットを使用して、１つ以上のマイクロウェルに導入することを含む、付記２４に記載の方法。
３１．該位置付けることが、該試料に磁場を適用することを含み、該試料中の該成分の少なくとも一部が、磁気ビーズに結合する、付記２４に記載の方法。
３２．該位置付けることが、該試料に対流を適用することを含む、付記２４に記載の方法。
３３．該位置付けることが、異なる形状および／またはサイズのマイクロウェルを使用する、サイズ選択沈降を含む、付記２４に記載の方法。
３４．該試料の少なくとも一部の成分が、液滴中に含有され、該位置付けることが、該液滴を該マイクロウェルに導入することを含む、付記２４に記載の方法。
３５．該ポリマー分離媒体中の該試料成分を、該試料成分のサイズに基づいて分離することを更に含む、付記１９〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．該ポリマー分離媒体中の該試料成分を、該試料成分の等電点に基づいて分離することを更に含む、付記１９〜３４のいずれかに記載の方法。
３７．該ポリマー分離媒体中の該試料成分を、該試料成分の質量対電荷比に基づいて分離することを更に含む、付記１９〜３４のいずれかに記載の方法。
３８．該ポリマー分離媒体中の該試料成分を、該試料成分の親和性相互作用に基づいて分離することを更に含む、付記１９〜３４のいずれかに記載の方法。
３９．該ポリマー分離媒体中で該分離した試料成分を固定することを更に含む、付記１９〜３８のいずれかに記載の方法。
４０．該固定することが、該分離した細胞成分を該ポリマー分離媒体に共有結合させることを含む、付記３９に記載の方法。
４１．該分離した細胞成分が、該ポリマー分離媒体を紫外線（ＵＶ）光に露出させることによって、該ポリマー分離媒体に共有結合される、前述の付記のいずれかに記載の方法。
４２．該分離した試料成分を検出することを更に含む、付記１９〜４１のいずれかに記載の方法。
４３．該検出することが、該分離した試料成分を分析物検出試薬と接触させることを含む、付記４２に記載の方法。
４４．該分離した試料成分を第２の分析物検出試薬と接触させることを更に含む、付記４３に記載の方法。
４５．該分析物検出試薬が、標識分析物特異的結合部材を含む、付記４３または４４に記載の方法。
４６．該標識分析物特異的結合部材が、標識抗体である、付記４５に記載の方法。
４７．該分離した試料成分が酵素を含み、該分析物検出試薬が該酵素の基質を含む、付記４３に記載の方法。
４８．該検出することが、該ポリマー分離媒体に、該分析物検出試薬を該分離した試料成分に移動させるのに十分な電場を適用することを含む、付記４３に記載の方法。
４９．該分析物検出試薬が、該ポリマー分離媒体の上面を通して適用される、付記４８に記載の方法。
５０．該分析物検出試薬が、該ポリマー分離媒体の側面を通して適用される、付記５８に記載の方法。
５１．該分析物検出試薬を、該ポリマー分離媒体から除去することを更に含む、付記４３〜５０のいずれかに記載の方法。
５２．該ポリマー分離媒体中の該分離した試料成分を、分析物検出試薬と再接触させることを更に含む、付記５１に記載の方法。
５３．該ポリマー分離媒体を脱水することを更に含む、付記１９〜５２のいずれかに記載の方法。
５４．該脱水したポリマー分離媒体を、長期間貯蔵することを更に含む、付記５３に記載の方法。
５５．該ポリマー分離媒体を再水和することを更に含む、付記５４に記載の方法。
５６．該ポリマー分離媒体を分析物検出試薬と接触させることを更に含む、付記５５に記載の方法。
５７．該ポリマー分離媒体を撮像して、該分離した細胞成分の画像をもたらすことを更に含む、付記１９〜５６のいずれかに記載の方法。
５８．該分離した細胞成分の該画像から、特定の細胞成分を識別することを更に含む、付記５７に記載の方法。
５９．該ポリマー分離媒体が実質的に一様である、前述の付記のいずれかに記載の装置。
６０．該ポリマー分離媒体が、該ポリマー分離媒体の、細孔径、ｐＨ勾配、または官能基化のうちの１つ以上に関して非一様である、前述の付記のいずれかに記載の装置。
６１．前述の付記のいずれかに記載の装置と、
該装置を包む包装と、を含む、キット。
６２．分析物検出試薬を更に含む、付記６１に記載のキット。
【０２２８】
上述の実施形態は、理解を明確にする目的のために解説および例という方法によって詳細に説明されたが、ある特定の変更および改変を、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、それに行い得ることは、本開示の教示を踏まえて当業者には明白である。本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定的とは意図されないことも理解されたい。
【０２２９】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値および下限値の間の各介在値（文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで）、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って本発明内にも包含される。表示範囲がそれらの上限値および下限値のうちの１つまたは両方を含む場合、それら含まれる上限値および下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【０２３０】
本明細書で引用される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、参照により組み込まれることを具体的および個別に示され、刊行物の引用が関連する方法および／または物質を開示および説明するために参照によって本明細書に組み込まれるかのごとく、参照により本明細書に組み込まれる。一切の刊行物の引用は、出願日前にそれを開示するためであり、本発明が、先行発明が原因でそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
【０２３１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意する。特許請求の範囲が一切の任意的要素を除外するように作成されてもよいことに更に留意する。そのため、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」などの排他的な専門用語の使用のため、または「否定的な」制限の使用のための先行記述となるよう意図される。
【０２３２】
本開示を読めば当業者には明らかであろうが、本明細書で記載および解説される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいかなるものの特徴からも容易に分離されるか、またはそれらと組み合わされ得る、個別の部分および特徴を有する。一切の列挙される方法は、列挙される事象順で、または倫理的に可能な任意の他の順序で、実行することができる。
【０２３３】
したがって、前述のものは、単に本発明の原理を例示する。当業者であれば、本明細書で明確に記載または示されなくても、本発明の原理を具現化し、その趣旨および範囲内に含まれる、種々の構成を考案することができるであろうことが、理解されるであろう。更に、本明細書に列挙される全ての例および条件語句は、本発明の原理、および技術分野を拡大するために発明者が寄与した概念を読者が理解するのを助けることを主に意図し、そのような具体的に列挙される例および条件に対して非限定的であると解釈されるべきである。その上、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにそれらの特定の例を列挙する本明細書の全ての記述は、その構造的均等物および機能的均等物の両方を包含することが意図される。加えて、そのような均等物は、現在知られている均等物および将来開発される均等物、すなわち、構造に関わらず、同一の機能を果たす、開発される一切の要素を含むことが意図される。本発明の範囲は、故に、本明細書に示され記載される例示的な実施形態に限定されるとは意図されない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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