(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
着目する生合成経路の産物を生産する方法であって、該方法が：
（ａ）産物を生産する生合成経路の酵素を発現する細菌性細胞を培養すること、ここで少なくとも１つの酵素が：
（ｉ）生合成経路において代謝フラックスを制御する酵素であり、および
（ｉｉ）周辺質を標的とするために備わる配列に付着するように遺伝学的に改変されている酵素であり、これにより少なくとも１つの周辺腔へと隔離される改変酵素を含む培養細菌性細胞を生産し、ここで遺伝学的改変および周辺腔への隔離が、代謝産物の経路フラックスにおいて有害性の増大をもたらすことがない、および少なくとも１つの周辺質を標的とする配列改変酵素が、生合成経路の入口酵素、律速酵素または生合成経路に供給される基質または補因子の率を増大させる酵素である；
および
（ｂ）前記培養細菌性細胞を溶解すること、それにより前記生合成経路の酵素および前記少なくとも１つの周辺質を標的とする配列改変酵素を含む細胞溶解物を生産すること；
（ｃ）前記細胞溶解物と、基質、酵素、栄養素、補因子、緩衝剤、還元剤、およびＡＴＰ産生システムからなる群から選択される１種または２種以上の物質とを組み合わせること；および
（ｄ）前記細胞溶解物と前記１種または２種以上の物質とを、酵素学的に産物を生産するのに十分な期間および条件下でインキュベートすること、ここで産物が、抗生物質、生物系界面活性剤、バイオ燃料、アミノ酸、有機酸、脂肪酸、アルコール、ポリオール、香味料、香料、ヌクレオチド、ビタミン、色素、糖、多糖、生体高分子、合成樹脂、イソプレノイド、テルペン、および細胞の代謝産物からなる群から選択される、
を含む、前記方法。
【請求項２】
細菌性細胞を培養することが、該細菌性細胞の複数の培養を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶解することが、２または３以上の溶解物を生産する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
２または３以上の溶解物を組み合わせることをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細菌性細胞において、少なくとも１つの周辺質を標的とする配列改変酵素の対応する野生型をコードする少なくとも１つの遺伝子が、細胞質において、標準的なレベルで発現される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細菌性細胞において、少なくとも１つの周辺質を標的とする配列改変酵素の対応する野生型が、ノックアウトされている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細菌性細胞において、少なくとも１つの周辺質を標的とする配列改変酵素が、過剰発現されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
細菌性細胞において、少なくとも１つの周辺質を標的とする配列改変酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が、エピソーム性のベクターまたは染色体に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細菌性細胞において、生合成経路における少なくとも２つの酵素が、周辺質を標的とする配列に付着するように遺伝学的に改変されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細菌性細胞を培養することが、酵素の活性を高めるかもしくは維持する因子の添加により改変されている細胞増殖培地で培養することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
周辺質を標的とするために備わる配列が、
ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ（配列番号１）、
ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ（配列番号２）、
ＭＭＩＴＬＲＫＬＰＬＡＶＡＶＡＡＧＶＭＳＡＱＡＭＡ（配列番号３）、
ＭＮＫＫＶＬＴＬＳＡＶＭＡＳＭＬＦＧＡＡＡＨＡ（配列番号４）、
ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）、
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡ（配列番号６）、
ＭＭＴＫＩＫＬＬＭＬＩＩＦＹＬＩＩＳＡＳＡＨＡ（配列番号７）、
ＭＫＱＡＬＲＶＡＦＧＦＬＩＬＷＡＳＶＬＨＡ（配列番号８）、
ＭＲＶＬＬＦＬＬＬＳＬＦＭＬＰＡＦＳ（配列番号９）、および
ＭＡＮＮＤＬＦＱＡＳＲＲＲＦＬＡＱＬＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＴＡ（配列番号１０）
からなる群から選択される配列である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
生合成経路の産物が、バイオエタノール、バイオディーゼル、およびバイオブタノールからなる群から選択されるバイオ燃料である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
生合成経路の産物が、グリセロール、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、ポリ−３−ヒドロキシブチレートおよびイソブタノールからなる群から選択されるアルコールまたはポリオールである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
生合成経路の産物が、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリ−γ−グルタミン酸および１，３−プロパンジオールからなる群から選択される生体高分子または合成樹脂である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
生合成経路の産物が、アモルファジエン、ファルネセン、リコペン、アスタキサンチン、ビタミンＡ、メントールおよびベータ−カロテンからなる群から選択されるイソプレノイドまたはテルペンである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
生合成経路の産物が、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２−ケトグルタレート、３−ホスホグリセレート、４−ヒドロキシベンゾエート、６−ホスホグルコネート、アセトアセチルコエンザイムＡ、アセチルコエンザイムＡ、アセチルホスフェート、アデニン、アデノシン、アデノシンホスホサルフェート、アデノシン二リン酸、アデノシン二リン酸−グルコース、アラニン、アデノシン一リン酸、アントラニレート、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、アデノシン三リン酸、カルバミルアスパルテート、シス−アコニテート、シトレート、シトルリン、シトシン一リン酸、コエンザイムＡ、シトシン三リン酸、サイクリックアデノシン一リン酸、シチジン、シトシン、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシリボース−５−リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、ジヒドロオロテート、ジヒドロキシアセトンリン酸、デオキシチミジン二リン酸、デオキシチミジン三リン酸、エリトロース−４−リン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、フラビンモノヌクレオチド、フルクトース−１，６−ビスリン酸、フルクトース−６−リン酸、フマレート、グアノシン二リン酸、グルコネート、グルコノラクトン、グルコサミン−６−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルコース−１−リン酸、グルタメート、グルタミン、グルタチオン、グルタチオンジスルフィド、グリセラアルデヒド−３−リン酸、グリセラート、グリセロール−３−リン酸、グアノシン一リン酸、グアノシン三リン酸、グアニン、グアノシン、ヒスチジン、ヒスチジノール、ホモシステイン、イノシン二リン酸、イノシン一リン酸、イノシン三リン酸、イソロイシン、リジン、マレート、マロニルコエンザイムＡ、メチオニン、ミオイノシトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン−１−リン酸、Ｎ−アセチル−オルニチン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドヒドラート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ヒドラート、オルニチン、オキサロアセテート、フェニルアラニン、フェニルピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、プロリン、プロピオニルコエンザイムＡ、ホスホリボシルピロリン酸、ピルベート、キノリン、リボフラビン、リボース−５−リン酸、リブロース−５−リン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、セリン、シキミ酸、シキメート、スクシネート、スクシニルコエンザイムＡ、トレオニン、トリプトファン、チロシン、ウリジン二リン酸、ウリジン二リン酸−グルコース、ウリジン二リン酸−グルクロネート、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン、ウリジン三リン酸、バリン、およびキシルロース−５−リン酸からなる群から選択される細胞の代謝産物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞の代謝産物が、シキミ酸またはシキメートである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
生合成経路の酵素が、３−デオキシ−Ｄ−アラビノースヘプツロース−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネートシンターゼ、３−デヒドロキネートデヒドラターゼ、シキメートデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝的に改変された少なくとも１つの酵素が、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細菌性細胞が、Escherichia coli細胞である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、35 U. S. C. § 119(e) の下、2011年5月7日に出願された米国仮出願U.S.S.N. 61/332,624の優先権を主張するものであって、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
微生物宿主において、合成酵素の経路を介して化学物質を生産することは、イソプレノイド、ポリケチド、非リボソーム性のペプチド、バイオプラスチック、および化学的構成要素を含む多くの重要なクラスの分子に有用であることを証明している。合成生物学は、生物情報に固有のモジュール性により、微生物で生産した化合物のこのリストをさらにもっと広げる可能性を多いに有する。それにもかかわらず、宿主細胞の代謝ネットワークに新規生化学的経路を埋め込むことによって、または、野生型の生化学的経路において酵素発現を改変することによって、細胞が何千年にもわたって徐々に進化してきた繊細な調節機構が破壊される可能性もある。設計された細胞の代謝への悪影響は、細胞内で起こる複雑な相互作用についての理解が限られているため予測することが難しく、実際に化合物の最終的な収率はしばしば制限されてしまう。細胞内資源の制御されていない消費、異種タンパク質生産による代謝負担、および宿主に対して抑制性または毒性のある経路中間体／産物の蓄積はすべて、全体の収率を制限し得る大きな課題である。
【０００３】
所望の目標を達成するために、様々な実験技術を採用することによって、代謝ネットワークおよび細胞内ネットワークの意図的な改変として定義することができる代謝工学の概念が、この目的をかなえるために浮上してきた。代謝工学を、遺伝子工学および菌株改良から区別するものは、設計される標的を同定するために、代謝ネットワークおよび他の細胞内ネットワークを考慮することである。この意味において、代謝のフラックス(flux)は、代謝工学の実施に際し、本質的な概念となる。遺伝子発現レベルと、細胞におけるタンパク質および代謝産物の濃度とが、代謝ネットワークの状態に対する手がかりを与え得るが、それらは、これら細胞内成分どうしの相互関係についての情報が欠如していることにより、細胞の表現型を十分に説明するのには固有の限界がある。代謝のフラックスは、代謝経路の反応速度を表し、数学的枠組みによりこれら因子を統合するのに役立つものである。よって、代謝のフラックスは、様々な細胞成分間の相互作用の結果として、細胞の表現型を表す１つの観点と見なすことができ；観察される代謝のフラックスのプロフィールは、相互接続した転写、翻訳、および複雑な調節を包含する酵素反応の結果を反映するものである。
【０００４】
無細胞合成は、インビボ生産方法に勝る利点を提供する。無細胞システムは、細胞の代謝資源のほとんど（全部ではないが）を、１経路による排他的な生産に向けさせることができる。さらに、インビトロでの細胞壁の欠如には利点がある。なぜなら、それによって合成環境の制御が可能になるからである。酸化還元電位、pH、またはイオン強度もまた、インビボより大きな適応性をもって変更することができる。なぜなら、それらは、細胞増殖または細胞生存に関知しないからである。さらに、産物の直接回収が、容易に成し遂げられる。
【発明の概要】
【０００５】
細胞増殖期に主要な経路の酵素の細胞内濃度を維持または変更するための操作と、続いて、生産期（着目する経路の産物が生産される）に（a）主要な経路の酵素の濃度を上げる、および／または（b）競合的酵素の濃度を下げるための操作とを含み、着目する経路に関係する標的酵素の操作により代謝経路のフラックスを制御するための組成物および方法を提供する。細胞増殖期では無傷細胞が含まれるが、生産期では大抵、かかる細胞の溶解物を用いて実施する。特に、本発明は、着目する経路の１種または２種以上の主要酵素が細胞内または細胞外の区画にリロケーションするように、該主要酵素をコードする改変された遺伝子配列を提供するものであり、前記区画には該主要酵素が天然に位置しておらず、かつ、該主要酵素が例えば周辺腔(periplasmic space)にそのようにしてリロケーションされた場合に、前記区画では該主要酵素は無傷細胞の経路のフラックスに実質的に関与しない。
【０００６】
いくつかの態様において、着目する経路の１種または２種以上の主要酵素は、天然に存在する区画以外の細胞内区画または細胞外区画（例えば、異なる細胞質外区画または周囲の培地へ分泌される細胞外部）への１種または２種以上の酵素のリロケーションをもたらすように、改変される。
【０００７】
具体的な態様において、着目する経路の１種または２種以上の主要酵素をコードする遺伝子配列を、細胞の周辺腔に酵素をリロケーションまたは隔離させるため、周辺質(periplasm)を標的とするポリペプチドに備わるペプチド配列をコードするように、改変する。いくつかの態様において、改変された経路酵素は、本明細書で記載されるように、経路の入口酵素である。他の態様において、改変された経路酵素は、律速酵素である。
【０００８】
目的の大部分において、周辺質を標的とするかまたは他にリロケーションする酵素を、そのコード配列を高レベルの構成的プロモータまたは誘導型プロモータに作動可能に(operably)繋ぐことによって、野生型の細胞の発現レベルと比べ、当該細胞内で過剰発現する。本発明のある態様において、標的酵素の野生型のコピーまたは標的酵素のアイソザイムを、例えば野生型のプロモータから生理学的に正常なレベルで、細胞に発現させる。いくつかの態様においては、標的酵素以外の経路の酵素を過剰発現させる、すなわち生理学的に正常なレベルより高いレベルで発現させる。
【０００９】
リロケーションされた酵素は、例えば周辺質に隔離されていてもよいが、細胞増殖期の間、経路のフラックスに影響を及ぼさない。生産期を開始するために、その細胞を溶解し、その時点でリロケーションされた酵素を着目する経路の細胞質酵素に加えることで、着目する産物の高レベルな生産が可能となる。
【００１０】
いくつかの態様において、着目する産物を高速のフラックス(high flux rate)で生産するための方法が提供され、該方法には下記が含まれる：着目する経路における少なくとも１種のリロケーションする酵素を過剰発現するように遺伝学的に改変した細胞を所望の集団密度まで増殖させること；これらの細胞を溶解させること；および、この溶解物を含む無細胞システムで経路の産物を生産させること。１種もしくは２種以上の基質、酵素、栄養素、補因子、緩衝剤、還元剤、および／またはATP産生システムを、前記無細胞システムに追加してもよい。
【００１１】
他の側面において、着目する経路における少なくとも１種のリロケーションする酵素を過剰発現する、遺伝学的に改変した細胞が提供される。
【００１２】
さらに他の側面において、そのように遺伝学的に改変した細胞の溶解物が提供され、着目する産物を生産するための無細胞システムを産生するために、その溶解物を、１種もしくは２種以上の基質、酵素、栄養素、補因子、緩衝剤、還元剤、および／またはATP産生システムと組み合わせてもよい。
【００１３】
本発明の１つまたは２つ以上の態様は、その詳細が本明細書に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、本発明の説明、図面、例、および特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、遺伝学的に改変されたAroGの周辺質への局在を示す。
【００１５】
【図２】図２は、OmpA-aroGを発現するBL21(DE3)または空ベクターpACYCを対照として細胞培養した増殖データを図示するものであって、AroGの周辺質発現が細胞増殖に何の弊害も与えないことを示す。
【００１６】
【図３】図３は、周辺質で発現された3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロン酸-7-リン酸（DAHP）シンターゼの比活性度を示す。
【００１７】
【図４】図４は、シキミ酸の生合成経路を図示するものである。
【００１８】
【図５】図５は、アモルファジエンの生合成経路を図示するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のある態様の詳細な説明
本発明は、機能的な素子（例えば酵素）を生産するように遺伝学的に操作された細胞を設計することができるという着想に基づく。当該機能的な素子は、細胞の外部または細胞内の隔離された場所にその機能的な素子をリロケーションすることがなかったら、細胞の健康状態に悪影響をもたらすだろう。一態様において、このような隔離された場所は、細胞の周辺腔である。ある態様において、機能的な素子は、着目する経路におけるフラックスを制御する主要酵素である。
【００２０】
例えば、一側面において、着目する経路におけるフラックスを制御する少なくとも１種の酵素を有する細胞を提供する。ここで、前記酵素は、天然に存在しない細胞内または細胞外の区画（すなわち酵素が天然に存在する区画以外の細胞内または細胞外の区画）に主要酵素がリロケーションするように遺伝学的に改変され、かつ、前記酵素は、そのようにリロケーションされた場合に無傷細胞の経路のフラックスに関与しない。着目する経路の典型としては、本明細書に記載されているように、シキメート、様々なイソプレノイドおよびテルペノイド、ポリ-3-ヒドロキシブチレート、イソブタノール、ならびに1-ブタノールの合成が挙げられるが、限定されない。
【００２１】
ある態様において、酵素は、周辺質を標的とするポリペプチドに備わるペプチド配列を含むように、遺伝学的に改変され、そこで酵素が細胞の周辺質に隔離される。ある態様において、酵素は、経路の入口酵素である。ある態様において、酵素は、律速酵素である。ある態様において、酵素は、着目する経路に対して、前駆体供給速度を上げるか、または、必要とする他の基質もしくは補因子のいずれかを供給する。ある態様において、酵素の対応する野生型は、細胞質において、標準的なレベルで発現される。ある態様において、対応する野生型は、ノックアウトされている。ある態様において、酵素は、細胞中、過剰発現されている。ある態様において、酵素は、エピソーマル性のベクターか染色体のいずれかに存在する。ある態様において、着目する経路の少なくとも２種の酵素（例えば、２種、３種、４種、５種、またはそれ以上の酵素）は、周辺質を標的とするポリペプチドに備わるペプチド配列を含むように遺伝学的に改変される。ある態様において、細胞増殖培地は、酵素の活性を高めるか、もしくは維持する因子（例えば、栄養素、補因子、還元剤）の添加または増強により改変されている。
【００２２】
他の側面において、着目する経路の産物を生産するためのシステムが提供され、該システムには、本発明の細胞；ならびに任意に、１種または２種以上の基質、酵素、栄養素、補因子、緩衝剤、還元剤、およびATP産生システムが含まれる。
他の側面において、着目する経路の産物を生産するためのシステムが提供され、該システムには、本発明の細胞の溶解物；ならびに任意に、１種または２種以上の基質、酵素、栄養素、補因子、緩衝剤、還元剤、およびATP産生システムが含まれる。ある態様において、前記システムにはさらに、１種または２種以上の細胞溶解物を追加して含まれる。
【００２３】
さらに他の側面において、着目する経路の産物を生産する方法が提供され、該方法には、本発明の細胞を所望の細胞密度まで増殖させること；該細胞を溶解すること；および、その溶解物と、１種もしくは２種以上の基質、酵素、栄養素、補因子、緩衝剤、還元剤、またはATP産生システムとを組み合わせること、が含まれ、着目する経路の酵素は所望の産物の生産をもたらす。ある態様において、前記方法にはさらに、溶解物と、追加の１種または２種以上の細胞溶解物とを組み合わせることが含まれる。
【００２４】
さらに他の側面において、周辺質を標的とするポリペプチドに備わるペプチド配列を含むように遺伝学的に改変された酵素をコードするベクターが提供される。
周辺質の隔離
【００２５】
本発明のいくつかの態様において、酵素リロケーションは周辺腔までである。かかる側面において、本発明は、細胞；溶解物を産生する方法；およびそれらの使用を備えるものであり、着目する経路における１種または２種以上の主要酵素が、周辺質を標的とするポリペプチドに備わるペプチド配列を含むように遺伝学的に改変されている。周辺質を標的とするシグナルペプチド配列（標的シグナルまたはシグナル配列とも呼ばれる）は通常、細菌の分泌タンパク質のN末端に見出される。それらは、約１５〜約７０アミノ酸の長さで変動する。また、シグナルペプチドの一次アミノ酸配列も変動するが、一般に、以下の部分を含む：ｉ）N末端部分が可変長を有し、一般に正味の正電荷を帯びている；ii）中央部に約６〜約１５アミノ酸の疎水性コアが続き；およびiii）最後の部分に、シグナルペプチダーゼの切断部位を規定する４〜６アミノ酸が含まれる、共通する全体構造を有する。
【００２６】
本発明における使用に好適な、周辺質を標的とするシグナルペプチド配列は一般に、グラム陰性細菌に分泌されるタンパク質に由来する。分泌されるタンパク質は、細菌または細菌に感染するバクテリオファージにコードされていてもよい。分泌されるタンパク質の供給源であるグラム陰性細菌の好適な例としては、Escherichia、Pseudomonas、Klebsiella、Salmonella、Caulobacter、Methylomonas、Acetobacter、Achromobacter、Acinetobacter、Aeromonas、Agrobacterium、Alcaligenes、Azotobacter、Burkholderia、Citrobacter、Comamonas、Enterobacter、Erwinia、Rhizobium、Vibrio、およびXanthomonasの属の一員が挙げられるが、限定されない。
【００２７】
細胞膜を横断して移動するのには、３種の経路がある：（i）SecB依存性、（ii）シグナル認識粒子（SRP）、および（iii）ツインアルギニン移動（TAT）、の経路である。SecB依存性およびシグナル認識粒子の経路のいずれも、SecYEGトランスロコンを使用する。ツインアルギニン移動経路は、TatABCE複合体を使用する。SecB依存性移動は、最も一般的に使用されるが、この経路は、折り畳まれたタンパク質を輸送することができない。細胞質での迅速な折り畳みは、SRP経路またはTAT経路の使用を必要とし得る。周辺質を標的とするシグナルペプチドを有する細菌性分泌タンパク質の例としては、以下の遺伝子：ompA、geneIII、E. coliアルカリホスファターゼ、lamB、malE、secE、secY、およびprlA-4によりコードされるタンパク質が挙げられるが、限定されない。当業者は、これらのタンパク質および他の細菌性分泌タンパク質のそれぞれのN末端に位置する、周辺質を標的とするシグナルペプチドを、容易に同定することができる。周辺質を標的とするシグナルペプチドにおいて、いくつかのアミノ酸置換、付加、および／または欠失がなされてもよいが、その標的機能は保持されていることも、当業者には公知である。したがって、本発明において使用される、周辺質を標的とする機能的なシグナルペプチドは、完全に天然の配列または改変された配列であってもよい。
【００２８】
周辺質に隔離する工程における段階には下記が含まれる：i）周辺質に隔離するために主要な入口酵素を同定する経路分析、ii）シグナルペプチド分泌および発現最適化を含む、周辺質を標的とする酵素のための発現カセットの構築、iii）周辺質で発現した活性のある標的酵素の確認、ならびにiv）代謝的に健全な細胞増殖に続き、溶解後、活性のある無細胞反応において、着目する産物に対するフラックス増大の実証。
【００２９】
本発明の融合タンパク質には、周辺質標的シグナル（PerS）と経路酵素（例えば経路の入口酵素および／または律速酵素）とが含まれる。一般に、周辺質を標的とするタンパク質それぞれに最適な周辺質シグナルペプチドは、かかるペプチドを選択することによって実験的に決定される。分泌の効率は、様々なパラメータ、例えば、使用するシグナルペプチド、標的にされるタンパク質、使用する宿主株、および／または発現レベルによって決まるだろう。例えば、異なる周辺質シグナルペプチドをコードする５’領域を変動させて改変した遺伝子のライブラリは、PCRまたは当業者によく知られている他の方法を使用して作製することができる。このライブラリは、発現の制御を可能とするベクター（例えば、pETシリーズのベクターなどの、Ｔ７誘導システムを使用する、発現の制御を可能とするベクター）にサブクローニングし、標的とされたタンパク質活性と同様に、排出効率について試験する（例えば、Dahl et al., J. Biol. Chem. (1992) 267:4882-4888；Chen et al., J. Biol. Chem. (1992) 267:12375-12379；米国公報第2007/0111283；Mergulhao et al., J. Microbiol. Biotechnol. (2007) 17:1236-1241；およびMergulhao et al., Biotechnology Advances (2005) 23:177-202を参照。それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。典型的な周辺質標的シグナルは、限定されずに、表１に挙げられたものである。
【表１】
0006374569.tif 000002
【００３０】
例の表４および５には、表１の配列の１つを着目するタンパク質のN末端に組み込むのに有用な典型的なプライマーが提供され、かつサブクローニングに有用な制限部位の配列が挙げられている。当業者が、遺伝暗号の縮重という性質に基づき、表４および５に例示されているものとは異なる核酸配列を使用して、表１に例示するような、周辺質を標的とするシグナルをコードすることができるだろうことは理解される。核酸配列のサイレント突然変異（すなわちアミノ酸配列に影響を与えない）は、周辺質を標的とする活性に影響を与えないだろう。周辺質への標的に実質的な影響を与えないだろう核酸配列の非サイレント突然変異（すなわちアミノ酸配列に影響を与える）も可能である。ある態様において、表１の周辺質を標的とするシグナルにおける１種、２種、３種、４種、または５種の突然変異によって、周辺質への標的は成し遂げられる。ある態様において、表４および／または５のアミノ酸配列における少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性によって、着目するタンパク質の周辺質への標的は成し遂げられる。ある態様において、周辺質を標的とするシグナルをコードする核酸配列におけるコドンの利用は、宿主生物に最適化される。
【００３１】
切断部位は、これらペプチドの分離を可能にするために、周辺質標的シグナル（PerS）と酵素との間に任意に位置する。切断部位は、PerSと酵素との分離に使用することができるいずれの部位であってもよい。タンパク質切断のための任意の方法に使用される切断部位のいずれも、使用することができる。E. coliのPerSには、シグナル配列のプロセシングと切断とのためのリーダーペプチダーゼ（Lep）により認識されるモチーフが、それらシグナル配列内に含まれていてもよい。使用を見出し得る他の方法としては、例えば、トロンビン、Xa因子プロテアーゼ、およびトリプシンなどの他のエンドペプチターゼなどのプロテアーゼ切断方法が挙げられる。融合タンパク質をコードする遺伝子は、PerSペプチドと酵素配列との間にこれらプロテアーゼの１種に対する切断部位を含むように、合成することができる。融合と切断とのための他のシステムは、インテインタンパク質の自己切断特性を使用するインテイン／キチン結合ドメインシステムである（例えばChong et al., Gene (1997) 192:271-281を参照）。
【００３２】
本発明に有用な周辺質標的シグナルをコードするDNA配列は、それらが由来する遺伝子に存在する天然のコード配列であってもよい。さらに、コード配列は、周辺質標的シグナルのアミノ酸配列を使用し、任意に最適化されたコドンを使用して、折り返し翻訳してもよい。単離された核酸断片にコードされる融合タンパク質に使用される周辺質標的シグナルをコードするDNA断片は、天然物からの単離、化学合成、組み換え技術、またはPCR使用による等の増幅などの任意の方法を使用して得られてもよい。
本発明における使用のための核酸、ポリペプチド、および細胞
【００３３】
この発明を実行するために使用する核酸は、RNA、iRNA、アンチセンス核酸、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、人工染色体、ウイルス、またはそれらのハイブリッドが様々な供給源から単離し得るものであろうとなかろうと、遺伝学的に設計、増幅、および／または、組み換えて発現／産生された。本発明に関連する酵素のいずれかをコードする核酸分子(a nucleic acid molecule)または核酸分子(nucleic acid molecules)は、当該分野において標準的な方法および技術を使用する細胞(a cell)または細胞(cells)に導入することができる。例えば、核酸分子は、化学的形質転換およびエレクトロポレーション、形質導入、粒子衝突などを含む形質転換などの標準的なプロトコルにより、導入することができる。酵素をコードする核酸分子の発現は、核酸分子をゲノムに統合することによっても達成することができる。核酸分子は、当該分野において周知の標準技術を使用して細胞のゲノムDNAに統合することができる。これらの核酸から産生した組み換えポリペプチドは、個々に単離またはクローニングし、かつ所望の活性について試験することができる。任意の組み換え発現システムを使用することができ、細菌の、哺乳動物の、酵母の、昆虫の、または植物の細胞発現システムなどが挙げられるが、限定されるものではない。本発明に使用される核酸は、例えばAdams et al., J. Am. Chem. Soc. (1983)  105:661；Belousov et al., Nucleic Acids Res. (1997)  25:3440-3444；Frenkel et al., Free Radic. Biol. Med. (1995) 19:373-380；Blommers et al., Biochemistry (1994) 33:7886-7896；Narang et al., Meth. Enzymol. (1979) 68:90；Brown et al., Meth. Enzymol. (1979) 68:109；Beaucage et al., Tetrahedron Letters (1981)  22:1859；および米国特許第4,458,066号（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような、周知の化学合成技術によりインビトロで合成することができる。
【００３４】
設計する経路のための着目する宿主細胞には、広範な従属栄養微生物および独立栄養微生物が含まれ、細菌、真菌および原生動物が挙げられるが限定されるものではない。好ましい宿主細胞としては、ポリペプチドを細胞内区画または細胞外区画に向かわせることができるための手段として知られているものが挙げられる。本発明は、原核細胞および真核細胞を含む、本発明に関連する核酸を組み換えにより発現する細胞のいずれのタイプも包含する。いくつかの態様において、細胞は、Escherichia spp.、Streptomyces spp.、Zymonas spp.、Acetobacter spp.、Citrobacter spp.、Synechocystis spp.、Rhizobium spp.、Clostridium spp.、Corynebacterium spp.、Streptococcus spp.、Xanthomonas spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Alcaligenes spp.、Pseudomonas spp.、Aeromonas spp.、Azotobacter spp.、Comamonas spp.、Mycobacterium spp.、Rhodococcus spp.、Gluconobacter spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium spp.およびPantoea spp.などの細菌性細胞である。細菌性細胞は、Escherichia coli（E. coli）細胞などのグラム陰性細胞、またはBacillus種などのグラム陽性細胞であってもよい。他の態様において、細胞は、例えば、Saccharomyces spp.、Schizosaccharomyces spp.、Pichia spp.、Paffia spp.、Kluyveromyces spp.、Candida spp.、Talaromyces spp.、Brettanomyces spp.、Pachysolen spp.、Debaryomyces spp.、Yarrowia spp.および工業用の倍数体酵母菌株の酵母細胞などの真菌の細胞である。真菌の他の非限定例としては、Aspergillus spp.、Pennicilium spp.、Fusarium spp.、Rhizopus spp.、Acremonium spp.、Neurospora spp.、Sordaria spp.、Magnaporthe spp.、Allomyces spp.、Ustilago spp.、Botrytis spp.、およびTrichoderma spp.が挙げられる。他の態様において、細胞は、藻細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である。本発明に矛盾しないいくつかの細胞は、組み換えコピーと同様、本発明に関連する遺伝子の１種または２種以上の内因性のコピーを発現してもよいことは理解されるはずである。着目する種としては、限定されずに、S. cerevisiae、E. coli、Pseudomonas種、Klebsiella種、およびSynechocystis種が挙げられる。リロケーションするタンパク質の不要な分解を避けるため、宿主菌株は、様々な区画プロテアーゼ（例えば周辺質のプロテアーゼ）を除くために、および／または、タンパク質の折り畳みを助けるシャペロンおよびマチュラーゼなどのタンパク質を増やすために、改変することができる；このような改変および増加は、当業者によく知られている方法を採用する；例えば、米国特許第4,946,783号および第6,921,659号、ならびに Chen et al., Biotechnology and Bioengineering (2004) 85: 463-474を参照（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３５】
いくつかの態様において、本発明に関連する１種または２種以上の遺伝子は、細菌性細胞において組み換えで発現する。本発明に関連する細菌性細胞は、任意のタイプ（富化または最少）および任意の組成の培地で培養することができる。いくつかの態様において、細胞は最少培地で培養する。当業者には理解されるだろうが、所定の最適化によって、様々なタイプの培地の使用が可能になる。選択培地には、様々な追加成分を補充することができる。補充成分のいくつかの非限定例としては、グルコース、抗生物質、IPTG、遺伝子誘導用のテトラサイクリンまたは無水テトラサイクリン（aTc）およびATCC Trace Mineral Supplementが挙げられる。同様に、培地の他の側面、および本発明の細胞の増殖条件は、所定の実験により最適化してもよい。例えば、pHおよび温度は、最適化可能因子の非限定例である。いくつかの態様において、補充成分の濃度および量を最適化することができる。いくつかの態様において、培地に１種または２種以上の補充成分を補充する頻度、および培地を培養する時間を最適化する。
【００３６】
核酸を操作する技術、例えば、サブクローニング、プローブの標識（例えば、Klenowポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を使用するランダムプライマー標識）、シークエンシング、ハイブリダイゼーションなどは、科学文献および特許文献に十分に記載されている。例えば、Sambrook, Ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.) Vols 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)；Ausubel, Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)；およびTijssen, Ed., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N.Y. (1993)を参照（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３７】
本発明に関連する酵素をコードする遺伝子が様々な供給源から得られ得ることは理解されるはずである。当業者は知っているだろうが、これら酵素の相同遺伝子は多くの種に存在し、相同性検索、例えばNCBIのインターネットサイト（www.ncbi.nlm.nih.gov）で利用可能なタンパク質BLAST検索により同定することができる。当業者には理解されるだろうが、これらの酵素をコードする遺伝子は、例えば縮重プライマーを使用して、特定の酵素を含む任意の供給源のDNAからPCR増幅することができる。いくつかの態様において、特定の酵素をコードする遺伝子は、合成することができる。ここで述べた酵素をコードする遺伝子を得るための手段はいずれも、本発明の側面と矛盾しない。
【００３８】
本発明はまた、核酸にコードされた単離ポリペプチドも提供する。このようなポリペプチドは、例えば単独でも、融合タンパク質としても有用である。本発明に関連するポリペプチドは、組織または細胞のホモジネートを含む生物学的試料から単離することができ、かつ、発現システムに適切な発現ベクターを構築すること、発現ベクターを発現システムに導入すること、および組み換えで発現したタンパク質を単離することによって、様々な原核および真核の発現システムにおいて組み換えで発現することもできる。ポリペプチドはまた、確立された方法またはペプチド合成を使用して化学的に合成することもできる。
【００３９】
熟練した実践者に周知の様々な方法論は、本発明に関連する単離ポリペプチドを得るために利用することができる。ポリペプチドは、クロマトグラフ的手段または免疫学的認識により天然にポリペプチドを生産する細胞から精製してもよい。代わりに、発現ベクターは、ポリペプチドの生産をもたらすために、細胞に導入してもよい。他の方法において、コードされるポリペプチドの生産をもたらすために、mRNA転写物を細胞にマイクロインジェクトしてもよいし、または別の方法により導入してもよい。網状赤血球溶解物（reticulocyte lysate）のシステムなどの無細胞システムにおけるmRNAの翻訳も、ポリペプチドを生産するために使用してもよい。当業者はまた、ポリペプチドを単離するための公知の方法を容易に追随することもできる。これらとしては、免疫クロマトグラフィ、HPLC、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィおよび免疫親和性クロマトグラフィが挙げられるが、限定されるものではない。
【００４０】
本発明の分子の発現は、当業者に公知の所定の方法を使用して、決定してもよい。これらの方法としては以下が挙げられるが、限定されない：RNAの直接増幅、RNAからcDNAへの逆転写、リアルタイムRT-PCR、cDNAの増幅、ハイブリダイゼーション、および免疫学に基づいたアッセイ方法であり、該アッセイ方法としては、免疫組織化学、抗体サンドイッチ捕捉アッセイ、ELISA、および酵素結合免疫スポットアッセイ（EliSpotアッセイ）が挙げられるが、限定されない。例えば、対象(subject)または組織における本発明の核酸分子の存在レベルの決定は、ポリメラーゼ連鎖反応を含む任意の標準的な核酸決定アッセイ、または標識されたハイブリダイゼーションプローブによるアッセイにより実行することができる。このようなハイブリダイゼーションの方法としては、マイクロアレイ技術が挙げられるが、限定されない。
【００４１】
よって、本発明は一側面において、酵素、それら酵素をコードする遺伝子、前述の機能的な改変体および変異体、ならびにそれらに関する使用を包含する。本発明の核酸のホモログおよび対立遺伝子は、従来技術により同定することができる。ストリンジェントな条件下で本明細書に記載の核酸にハイブリダイズする核酸もまた、本発明に包含される。本明細書で用いられる「ストリンジェントな条件」という用語は、当該技術分野においてよく知られているものが有するパラメータを指す。核酸ハイブリダイゼーションのパラメータは、かかる方法を集めた参考文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds.,  John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに見出すことができる。より具体的には、本明細書で用いられるストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×SSC、０．０２％のFicoll、０．０２％のポリビニルピロリドン、０．０２％の仔ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭのNaH２PO４（pH７）、０．５％のSDS、２ｍＭのEDTA）における６５℃のハイブリダイゼーションを指す。SSCは０．１５Ｍの塩化ナトリウム／０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、pH７であり；SDSはドデシル硫酸ナトリウムであり；およびEDTAはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、DNAを転移したメンブレンを、例えば２×SSC中で室温において洗浄した後、０．１〜０．５×SSC／０．１×SDSで、室温から最高６８℃までで洗浄した。
【００４２】
ストリンジェントの度合いが同じものをもたらす他の条件、試薬なども使用可能である。当業者は、かかる条件をよく知っており、したがってここには記載していない。しかしながら、当業者は、（例えばより低いストリンジェントな条件を使用することにより）本発明の核酸のホモログおよび対立遺伝子の明確な同定を可能にする方法で条件を操作することができるだろうことを理解するだろう。当業者はまた、かかる分子の発現について細胞およびライブラリをスクリーニングするための方法論にも精通しており、該分子はその後、所定の通りに単離し、続いて関連する核酸分子を単離し、スクリーニングする。
【００４３】
一般に、ホモログおよび対立遺伝子は、典型的には、核酸およびポリペプチドそれぞれの配列に対して、少なくとも７５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、いくつかの場合においては、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９０もしくは９５％のアミノ酸同一性を有し、ならびにさらに他の場合においては、少なくとも９５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するだろう。いくつかの態様において、ホモログおよび対立遺伝子は、核酸の配列に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド同一性、および／または、ポリペプチドの配列に対して、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するだろう。
【００４４】
相同性は、NCBIのインターネットサイトから得られる、NCBI（Bethesda, Maryland）により開発された、公的に入手可能な様々なソフトウェアツールを使用して算出することができる。典型的なツールには、BLASTソフトウェアが含まれ、これもNCBIインターネットサイト（www.ncbi.nlm.nih.gov）から入手可能である。Kyte-Doolittleヒドロパシー分析と同様、PairwiseおよびClustalWアライメント（BLOSUM30 matrix setting）は、MacVector配列分析ソフトウェア（Oxford Molecular Group）を使用して得られる。前述の核酸のWatson-Crick相補体も、本発明に包含される。
【００４５】
遺伝子のスクリーニングおよび同定において、サザンブロット、ノーザンブロットなどの当業者に公知の技術および配列にハイブリダイズするプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応などの増幅プロトコルも適用できる。
【００４６】
本発明にはまた、野生型の材料に存在するコドンに対する代わりのコドンを含む縮重核酸も含まれる。例えば、セリン残基は、TCA、AGT、TCC、TCG、TCTおよびAGCのコドンにコードされる。これら６つのコドンそれぞれは、セリン残基をコードする目的により均等である。したがって、セリンをコードするヌクレオチドトリプレットのいずれも、伸長しているポリペプチドにセリン残基を組み込むために、インビトロまたはインビボで、タンパク質合成装置に向かわせるために、採用してもよい。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとしては以下が挙げられるが、限定されない：CCA、CCC、CCGおよびCCT（プロリンのコドン）；CGA、CGC、CGG、CGT、AGAおよびAGG（アルギニンのコドン）；ACA、ACC、ACGおよびACT（トレオニンのコドン）；AACおよびAAT（アスパラギンのコドン）；ならびにATA、ATCおよびATT（イソロイシンのコドン）。他のアミノ酸残基も同様に、複数のヌクレオチド配列にコードされていてもよい。よって、本発明には、遺伝コードの縮重により、生物学的に単離された核酸とコドン配列の点で異なる縮重核酸が包含される。本発明にはまた、宿主細胞の最適なコドン使用頻度に適合したコドン最適化も包含される。
【００４７】
本発明はまた、１種または２種以上のヌクレオチドの付加、置換および欠失を含む改変された核酸分子も提供する。好ましい態様において、これらの改変された核酸分子および／またはそれらがコードするポリペプチドは、酵素活性などの、非改変の核酸分子および／またはポリペプチドの少なくとも１種の活性または機能を保持する。ある態様において、改変核酸分子は、改変ポリペプチド、好ましくは、本明細書の他で記載した保存アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。改変核酸分子は、非改変核酸分子に構造的に関連し、好ましい態様において、当業者に公知のストリンジェントな条件下で改変核酸分子と非改変核酸分子とがハイブリダイズするように、非改変核酸分子に構造的に十分に関連する。
【００４８】
例えば、アミノ酸１つが変化したポリペプチドをコードする改変核酸分子を調製することができる。これらの核酸分子それぞれは、本明細書に記載の遺伝コードの縮重に対応するヌクレオチド変化を除く１つ、２つまたは３つのヌクレオチド置換を有することができる。同じように、２つのアミノ酸が変化したポリペプチドをコードする（例えば２〜６つのヌクレオチドが変化した）改変核酸分子を調製することができる。これらのような、例えば２つおよび３つ、２つおよび４つ、２つおよび５つ、２つおよび６つなどのアミノ酸をコードするコドンにおけるヌクレオチド置換を含む多数の改変核酸分子は、当業者に容易に想定されるだろう。前述の例において、２つのアミノ酸の組み合わせのそれぞれは、アミノ酸置換をコードするすべてのヌクレオチド置換と同様に、一連の改変核酸分子に含まれる。さらなる置換（すなわち３つまたはそれ以上）、付加または欠失（例えば終始コドンまたはスプライス部位の導入による）を有するポリペプチドをコードするさらなる核酸分子もまた、調製することができ、かつ、当業者に容易に想定されるように本発明に包含される。前述の核酸またはポリペプチドのいずれも、本明細書に記載の核酸および／またはポリペプチドとの構造的関係または活性の保持について所定の実験により試験することができる。
【００４９】
本発明には、本明細書に記載のポリペプチドの変異体が包含される。本明細書で用いられるポリペプチドの「変異体」は、ポリペプチドの一次アミノ酸配列に対して１種または２種以上の改変を含むポリペプチドである。例えば、１）酵素の細胞内分布を変更するため；２）酵素の活性を低減もしくは除外するため；３）酵素の特性、発現システムにおけるタンパク質安定性、もしくはタンパク質−タンパク質の結合安定性を増強するため；４）抗原のエピトープの付加もしくは検出可能な部分の付加などの、酵素に新規な活性または特性を与えるため；または５）均等物もしくは酵素と酵素の基質との間の良好な結合を提供するために、酵素変異体を作製する改変が、酵素に対してなされ得る。
【００５０】
ポリペプチドに対する改変は、典型的には、ポリペプチドをコードする核酸に対してなされ、欠失、点突然変異、トランケーション（truncation）、アミノ酸置換およびアミノ酸または非アミノ酸部分の付加を含むことができる。代わりに、改変は、切断、リンカー分子の付加、ビオチンなどの検出可能部分の付加、脂肪酸の付加等によるなどして、直接ポリペプチドになされ得る。また、改変には融合タンパク質も包含される。当業者は、タンパク質配列における、タンパク質コンホメーション（conformation）変化に対する効果を予測する方法についてよく知っているだろう。したがって、当業者は、公知方法に従い変異ポリペプチドを「考案する」ことができる。かかる方法の一例は、Dahiyat and Mayo in Science 278:82 87, 1997に記載されており、それにより、タンパク質を新たに考案することができる。当該方法は、ポリペプチド配列の一部のみを変動するためであっても、公知タンパク質に適用することができる。DahiyatおよびMayoの計算法を適用することにより、ポリペプチドの特定の変異体を提案することができ、その変異体が所望のコンホメーションを保持するか否か決定するために試験することができる。
【００５１】
一般に、変異体には、その所望の生理学的活性とは無関係なポリペプチドの特徴を変更するため具体的に改変されたポリペプチドが含まれる。例えば、不要なジスルフィド連結を抑えるために、システイン残基を置換または欠失することができる。同様に、あるアミノ酸は、発現システムにおいて、プロテアーゼによるタンパク質分解を除外することによって、ポリペプチドの発現を増強するために変化させることができる（例えば、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母発現システムにおける二塩基性アミノ酸残基）。
【００５２】
ポリペプチドをコードする核酸の改変によっても、好ましくは、コード配列のアミノ酸読み枠が保存され、好ましくは、変異体ポリペプチドの発現に有害になり得るヘアピンまたはループなどの二次構造を形成するハイブリダイズしそうな核酸領域が創出されない。
【００５３】
アミノ酸置換の選択によって、またはポリペプチドをコードする核酸の選択部位のランダム突然変異生成によって、改変がなされ得る。その結果、変異体ポリペプチドが発現され、突然変異により所望の特性を有する変異体ポリペプチドが得られたか決定するために、１種または２種以上の活性について試験する。さらに、突然変異は、ポリペプチドのアミノ酸配列にはサイレントであるが、特定の宿主における翻訳のための好ましいコドンを提供する変異体に対して（または非変異体ポリペプチドに対して）なされ得る。例えばE. coliにおける核酸の翻訳のための好ましいコドンは、当業者に周知である。さらに他の突然変異は、ポリペプチド発現を増強するための遺伝子またはcDNAクローンの非コード配列に対してなされ得る。ポリペプチドの変異体の活性は、変異体ポリペプチドをコードする遺伝子を細菌または哺乳動物の発現ベクターにクローニングし、適切な宿主細胞に該ベクターを導入し、変異体ポリペプチドを発現し、本明細書に開示されたポリペプチダーゼの機能(functional capability)について試験することによって、試験することができる。
【００５４】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換が、前述のポリペプチドの機能的に均等な変異体を提供するために、ポリペプチドにおいてなされてもよい、すなわち、該変異体はポリペプチドの機能を有することも認識するだろう。本明細書で用いられる「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的な電荷または大きさの特質を変更しないアミノ酸置換を指す。変異体は、当業者に知られているポリペプチド配列を変更する方法に従い調製することができ、当業者は、かかる方法を集めた参考文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds.,  John Wiley & Sons, Inc., New Yorkから見出す。機能的に均等なポリペプチドの典型的な変異体には、本明細書に開示されたタンパク質のアミノ酸配列において、保存的アミノ酸置換が含まれる。アミノ酸の保存的置換には、以下の群：（a）M、I、L、V；（b）F、Y、W；（c）K、R、H；（d）A、G；（e）S、T；（f）Q、N；および（g）E、D内のアミノ酸の中でなされる置換が含まれる。
【００５５】
一般に、変異体ポリペプチドを調製する場合、全部より少ないアミノ酸を変化させることが好ましい。特定のアミノ酸残基が機能をもたらすことが知られている場合、かかるアミノ酸は交換しないか、または代わりに、保存的アミノ酸置換により交換するだろう。変異体ポリペプチドを調製する場合、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０残基を変化させる。一般に、最小限の置換しかなされないことが好ましい。よって、変異体ポリペプチドを産生する一方法は、特定の１つのアミノ酸に対して他のすべてのアミノ酸を置換し、その後、該変異体の活性をアッセイし、そして最も良好な活性を有するポリペプチドの１種または２種以上を用いる工程を繰り返すことである。
【００５６】
機能的に均等なポリペプチドの変異体を生産するために、ポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、典型的には、ポリペプチドをコードする核酸の変更によってなされる。かかる置換は、当業者に知られている様々な方法によってなされ得る。例えば、アミノ酸置換は、PCR特異的突然変異、Kunkel（Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1985) 82: 488-492）の方法に従う部位特異的突然変異生成によって、またはポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成によってなされてもよい。
本発明における使用のためのベクターおよび発現構築物
【００５７】
本発明の融合タンパク質をコードする単離DNA断片を好適な宿主細胞に形質転換するために有用なベクターは、当該分野において周知である。本明細書に用いられる「ベクター」は、異なる遺伝的な環境の間での輸送のため、または宿主細胞での発現のため、所望の配列(単数)または配列(複数)が制限およびライゲーションにより挿入される多数の核酸のいずれであってもよい。RNAベクターも利用できるが、ベクターは、典型的にはDNAからなる。ベクターとしては以下が挙げられるが、限定されない：プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノムおよび人工染色体。典型的に、ベクターには、関連する遺伝子、選択マーカー、および自己複製または染色体統合を可能にする配列の転写および翻訳に向いた配列が含まれる。好適なベクターには、転写開始制御を有する遺伝子の５’領域および転写終結を制御するDNA断片の３’領域が含まれる。本発明の融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子の宿主細胞ゲノムへの統合を促進するベクターも使用してもよい。かかるベクターは、ランダム統合用であっても、部位特異的統合用であっても、相同的組み換え用であってもよい。ベクターは、シングルクロスオーバー型またはダブルクロスオーバー型の相同的組み換えを可能にする特徴を有していてもよい。１つまたは多数のコピーは、宿主細胞ゲノムに統合されていてもよい。
【００５８】
クローニングベクターは、自己複製が可能なものか、または宿主細胞のゲノムに統合されるものであり、新規組み換えベクターが宿主細胞内でその複製能を保持するように、決定可能なやり方でベクターが切断され、かつ所望のDNA配列がライゲートされる１種または２種以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によりさらに特徴付けられる。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、宿主の細菌内でプラスミドのコピーが増加するにつれて何度も起こり得るか、または有糸分裂による宿主の複製前に宿主ごとにたった１度しか起こり得ない。ファージの場合、複製は、溶菌相の間は能動的に、または溶原相の間は受動的に起こり得る。
【００５９】
発現ベクターは、所望のDNA配列が調節配列に作動可能に接合するようにDNA配列が制限およびライゲーションにより挿入され得るものであり、かつRNA転写物として発現し得るものである。ベクターにはさらに、ベクターを用いて形質転換もしくは形質導入したか、またはされていない細胞の同定に使用するのに好適な１種または２種以上のマーカー配列が含まれていてもよい。マーカーとしては、例えば、抗生物質もしくは他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増大あるいは減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当該分野において公知の標準的なアッセイによって検出可能である酵素をコードする遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）、および形質転換もしくは形質導入された細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に目に見える影響を及ぼす遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）などが挙げられる。好ましいベクターは、自己複製できるものであり、かつベクターと作動可能に接合したDNA断片に存在する構造遺伝子産物を発現できるものである。
【００６０】
本明細書に用いられるコード配列および調節配列は、コード配列の発現または転写が調節配列の影響下または制御下に置かれるように、それらと共有結合で繋がっている場合に、「作動可能に」接合されているという。コード配列が機能的なタンパク質に翻訳されることが望ましい場合であって、もし５’調節配列のプロモータの誘導によりコード配列の転写がもたらされ、かつ２つのDNA配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異を誘導するという結果にならず、（２）プロモータ領域の、コード配列の転写に向かわせる能力に干渉せず、または（３）対応するRNA転写物の、タンパク質に翻訳される能力に干渉しないなら、２つのDNA配列は作動可能に接合したという。よって、もし、得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るようにプロモータ領域がそのDNA配列の転写をもたらすことが可能であったら、プロモータ領域はコード配列に作動可能に接合しただろう。
【００６１】
特許請求の範囲にかかる発明の酵素のいずれもコードする核酸分子が細胞内で発現される場合、様々な転写制御配列（例えばプロモータ／エンハンサ配列）はその発現に向かうように使用することができる。プロモータは野生型のプロモータ、すなわち、遺伝子発現の正常な調節を与える、その内因性の環境における当該遺伝子のプロモータであり得る。いくつかの態様において、プロモータは構成的であり得る、すなわちプロモータは、その関連する遺伝子の連続的な転写を可能にするため、調節されるものではない。様々な条件付きプロモータもまた使用することができ、例えば、分子の有無により制御されるプロモータである。
【００６２】
遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種または細胞のタイプの間でも変動し得るが、必要に応じて、転写および翻訳それぞれの開始に含まれる、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列などの５’非転写配列および５’非翻訳配列も一般に含まれるものとする。特に、かかる５’非転写の調節配列には、作動可能に接合した遺伝子の転写制御のためのプロモータ配列を含むプロモータ領域が含まれるだろう。また、調節配列には、記載のエンハンサ配列または上流のアクチベータ配列も含まれていてもよい。本発明のベクターには任意に、５’リーダー配列またはシグナル配列が含ふくまれていてもよい。ベクターの適切な選択および考案は、当業者の能力および思慮の範囲内である。
【００６３】
発現に必要な要素がすべて含まれる発現ベクターは市販されており、当業者にも知られている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照。細胞は、異種DNA（またはRNA）の細胞内への導入により遺伝学的に設計する。その異種DNA（またはRNA）は、宿主細胞において異種DNAの発現を可能とするために、転写素子の作動可能な制御下に置かれる。いくつかの態様において、本発明の２種または３種以上の核酸は、同じ発現ベクターまたはプラスミドにクローニングされてもよい。
【００６４】
本発明の方法は、様々なコード配列の構成的な発現または調節的な発現を使用する。発現は様々な合図、例えば、化学物質による誘導、増殖期の変化、栄養素の枯渇、温度変化、および／または光により調節され得る。いくつかの態様において、誘導型プロモータは、誘導剤、例えば当該分野で公知のラクトース、アラビノース、またはテトラサイクリンなどの化学物質の存在により調製される。典型的に、「高レベル」の発現を示す場合、細胞内で発現されたタンパク質の濃度は、基底レベルから少なくとも約２倍；基底レベルから少なくとも約１０倍；基底レベルから少なくとも約２５倍；基底レベルから少なくとも約５０倍；またはそれ以上であり、例えば、基底レベルから約２倍〜約１００倍の間である。
【００６５】
発現ベクターおよびクローニングベクターは大抵、宿主生命体により認識され、かつ着目するコード配列に作動可能に繋がったプロモータが含まれる。プロモータは、プロモータが作動可能に繋がった特定の核酸配列の転写を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列である。かかるプロモータは典型的には、２つのクラスに分類される：誘導的および構成的である。誘導型プロモータは、培養条件のある変化（例えば栄養素の有無または温度の変化）に応答する該プロモータの制御下で、DNAからの増加したレベルの転写を開始するプロモータである。現時点で、様々な潜在的宿主細胞により認識される大多数のプロモータが周知であり、例えばE.coliについては、例えばHawley and McClure Nucleic Acids Res. (1983) 11:2237-55を参照；B. subtilisについては、例えばIshii et al., Nucleic Acids Res. (2001) 29:278-280を参照；Saccharomyces cerevisiaeについては、例えばChang et al., Nucleic Acids Res. (2011) 39:D647-52を参照。Madigan, Martinko, and Parker, eds., Brock Biology of Microorganisms. 9th Ed. Prentice Hall Upper Saddle River, NJも参照。野生型のプロモータを使用してもよいが、ほとんどの目的においては、異種プロモータが、一般により多くの転写とより高い収率とを可能とするため、好ましい。
【００６６】
原核の宿主に使用するのに好適なプロモータとしては、□−ラクタマーゼおよびラクトースプロモータシステム、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモータシステム、ならびにtacプロモータなどの多くのハイブリッドプロモータが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌のまたはバクテリオファージのプロモータもまた好適である。例えば、lacIプロモータ、lacZプロモータ、T3プロモータ、T7プロモータ、アラビノースプロモータ、gptプロモータ、ラムダPRプロモータ、ラムダPLプロモータ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）などの糖分解酵素をコードするオペロンのプロモータ、および酸性ホスファターゼプロモータである。それらのヌクレオチド配列は公開されており、それによって、当業者は、リンカーまたはアダプターを使用して着目する配列にそれらを作動可能にライゲートすることができる。細菌のシステムに使用するプロモータにはまた、コード配列に作動可能に繋がったシャイン−ダルガーノ（S.D.）配列も含まれるだろう（例えば、Shine and Dalgarno, Nature (1975) 254: 34-8; Madigan, Martinko, and Parker, eds., Brock Biology of Microorganisms. 9th Ed. Prentice Hall. Upper Saddle River, NJを参照）。ある場合においては、また、宿主細胞も、培養中のすべての細胞を均等に誘導するため、代謝産物または誘導輸送タンパク質の濃度を調製するように遺伝学的に改変してもよい。
【００６７】
真核細胞（例えば酵母細胞）に好適なプロモータも、当該分野において知られている。実際すべての真核の遺伝子は、転写が開始する部位から約２５〜３０塩基上流に位置するATリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見出された他の配列は、CXCAAT領域であり、ここでXはいずれのヌクレオチドであってもよい。ほとんどの真核の遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端にポリAテールを付加するシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列すべては、真核の発現ベクターに好適に挿入される。酵母宿主とともに使用する好適なプロモータ配列の例としては、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の糖分解酵素のプロモータが挙げられる。
【００６８】
他の酵母プロモータは、増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有する誘導型プロモータであるが、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用に関連する酵素のプロモータ領域である。酵母のエンハンサもまた、酵母のプロモータとともに有利に使用される。
【００６９】
排出効率を最適化するために発現速度を実験的に調整することが望ましいことであり得る。移動が乏しいのは、排出機構能力の不十分さに起因している。発現速度を調整する方法としては、限定されずに、周辺質に排出されるタンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミドのコピー数の改変が挙げられる。当該分野において公知かつ使用されているレプリコンとしては、P15A（１０コピー/細胞）、ColA（３０コピー/細胞）、ColE1（４０コピー/細胞）、およびRSF1030（＞１００コピー/細胞）が挙げられる。周辺質に排出されるタンパク質をコードする遺伝子の５’UTRにおけるリボソーム結合部位は、強さを変動させたリボソーム結合部位のライブラリを作製し試験することができる場合に、改変することができる；例えば、Salis et al., Nature Biotechnology (2009) 27: 946-950；およびSimmons et al., Nature Biotechnology (1996) 14:629-634を参照（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。排出されるタンパク質をコードする遺伝子の上流のプロモータ領域は、強さを変動させたプロモータ領域のライブラリを作製し試験することができる場合に、転写速度を調整するために改変することができる；例えば、Alper et al., PNAS (2005) 102:12678-12683；およびDe Mey et al., BMC Biotechnology (2007) 7:34を参照（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
代謝フラックス
【００７０】
「フラックス」または「代謝フラックス」は、分子が、着目する経路または反応を経る速度を指す。フラックスを制御する因子のうち、経路における酵素の触媒速度、基質の稼働率、細胞における酵素濃度、および／または経路における酵素の近接度がある。
【００７１】
着目する経路を経るフラックスは高速であることが望ましいが、同時に、細胞において高レベルで正常に蓄積されない産物が、通常の条件下で生産されるのと比べて高速に生産される場合、それは毒性問題を引き起こす可能性がある。高速のフラックスが、経路特異的であり、かつ産物が例えば約０．１〜約２０グラム産物/Ｌ/ｈの速度で生産されるなど時間を伴う経路産物の濃度を指すことは理解される。
【００７２】
ストレスを受けた細胞では、活発な生体触媒作用を維持するためには望ましくない、ヌクレアーゼ、熱ショックタンパク質、プロテアーゼなどのタンパク質が多数生産される。
【００７３】
代謝産物の経路フラックスにおいて、または代謝産物の毒性蓄積に対して、（細胞の健康に対する）有害性の増大をもたらすことなく、所望の経路に関係する酵素濃度が増大する間に、健全な細胞（例えば実質的に正常な生理機能を有する）が高密度（例えば、OD５５０が約３０〜約３００など）に増殖可能となるように、本発明の方法は、経路を経るフラックスを制御する手段を提供する。OD５５０は、５５０ｎｍでの光学密度を指し、ここで１OD５５０は約１０９細胞/ｍＬ（E.coli）である。
【００７４】
フラックスの速度を決定する方法は、当該分野において公知であり使用されている；例えば、Wiechert et al., Metab. Eng. (2001) 3:265-283、およびWiechert et al., Metab. Eng.  (2001)3:195-206を参照；ならびにLee and Papoutsakis, Eds., Metabolic Engineering, Marcel Dekker, Inc. New York (1999)；Stephanopoulos, Nielsen, and Aristidou, Eds., Metabolic Engineering: Principles and Methodology, Academic Press, New York (1998)；Nielsen and Eggeling, Eds., Metabolic Engineering, Springer, London (2001)などの代謝工学の教科書を参照（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。フラックスは、代謝フラックス分析（MFA）などの技術を使用して、例えば同位体標的基質の変換速度の直接測定による測定値から算出してもよい。
着目する経路
【００７５】
本明細書で用いられる「酵素経路」または「着目する経路」という用語は、基質を、着目する産物に変換する細胞システムを指し、該システムは、複数の酵素を含み、さらに、酵素、酵素触媒反応の産物、酵素に利用される補因子などの１種または２種以上に作用する基質も含んでもよい。システムには、無傷細胞または細胞の溶解物が存在していてもよい。多くの代謝経路が知られており、微生物システムにおいても説明がなされ、かつ公開データベースにアクセスすることができる；例えば、Smolke, Ed., The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Tools and Applications, CRC Press, New York (2009)；Stephanopoulos, Nielsen, and Aristidou, Eds., Metabolic Engineering: Principles and Methodology, Academic Press, New York (1998)；Greenberg, Metabolic Pathways: Energetics, Tricarboxylic Acid Cycle, and Carbohydrates, Academic Press, New York (1967)；およびD.M. Greenberg’s multi-volume series entitled Metabolic pathways, Volumes 1-7を参照（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７６】
着目する経路としては、例えば、炭水化物、アミノ酸、核酸、ステロイド、脂肪酸、および生合成された天然産物に関係する経路が挙げられ、以下を含むが限定されない様々な化学化合物および化学材料の合成が包含される：
a)  抗生物質；例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、リファマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、リンコマイシン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、シクロヘキサミド、ピューロマイシン、シクロセリン、バシトラシン、ペニシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、ポリミキシン、およびグラミシジン；
b)  生物系界面活性剤；例えば、ラムノリピッド、ソホロリピッド、糖脂質、およびリポペプチド；
c)  バイオ燃料（biological fuel）；例えば、バイオエタノール、バイオジエステル、およびバイオブタノール；
d)  アミノ酸；例えば、L−グルタメート、L−リジン、L−フェニルアラニン、L−アスパラギン酸、L−イソロイシン、L−バリン、L−トリプトファン、L−プロリン（ヒドロキシプロリン）、L−トレオニン、L−メチオニン、およびD−p−ヒドロキシフェニルグリシン；
e)  有機酸；例えば、クエン酸、乳酸、グルコン酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、フマル酸、およびイタコン酸；
f)  脂肪酸；例えば、アラキドン酸、多価不飽和脂肪酸（PUBA）、およびγ−リノール酸；
g)  アルコールおよびポリオール；例えば、グリセロール、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、ポリ-3-ヒドロキシブチレート、イソブタノール、および1-ブタノール；
h)  香味料(flavor)および香料(fragrance)；例えば、バニリン、ベンズアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、4-(R)-デカノリド、および2-アセチル-1-ピロリン；
i)  ヌクレオチド；例えば、5’-グアニル酸および5’-イノシン酸；
j)  ビタミン；例えば、ビタミンC、ビタミンF、ビタミンB2、プロビタミンD2、ビタミンB12、葉酸、ニコチンアミド、ビオチン、2-ケト−L−グロン酸、およびプロビタミンQ10；
k)  色素；例えば、アスタキサンチン、β−カロテン、リコペン、モナスコルブリン、およびルブロプンクタチン（rubropunctatin）；
l)  糖(sugar)および多糖(polysaccharide)；例えば、リボース、ソルボース、キサンタン、ジェラン、およびできストラン；ならびに
m)  生体高分子(biopolymer)および合成樹脂(plastic)；例えば、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）、ポリ-γ-グルタミン酸、および、1,3-プロパンジオール。
【００７７】
着目する経路の他の例としては、様々なE. coli代謝産物の合成が挙げられる。代謝産物は、代謝の間に使用されるか、または生産された任意の物質である（すなわち、酵素、基質、または産物）。本発明の目的において、代謝産物はしばしば（常にではないが）着目する経路における酵素の産物である。典型的なE. coli代謝産物としては、2,3-ジヒドロキシ安息香酸、2-ケトグルタレート、3-ホスホグリセレート、4-ヒドロキシベンゾエート、6-ホスホグルコネート、アセトアセチルCoA、アセチルCoA、アセチルホスフェート、アデニン、アデノシン、アデノシンホスホサルフェート、ADP、ADP-グルコース、アラニン、AMP、アントラニレート、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、ATP、カルバミルアスパルテート、シス−アコニテート、シトレート、シトルリン、CMP、コエンザイムA、CTP、サイクリックAMP、シチジン、シトシン、dAMP、dATP、dCTP、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシリボース-5-P、dGMP、ジヒドロオロテート、ジヒドロキシアセトンリン酸、dTDP、dTTP、エリトロース-4-リン酸、FAD、フラビンモノヌクレオチド、フルクトース-1,6-ビスリン酸、フルクトース-6-リン酸、フマレート、GDP、グルコネート、グルコノラクトン、グルコサミン-6-リン酸、グルコース-6-リン酸、グルコース-1-リン酸、グルタメート、グルタミン、グルタチオン、グルタチオンジスルフィド、グリセラアルデヒド-3-リン酸、グリセラート、グリセロール-3-リン酸、GMP、GTP、グアニン、グアノシン、ヒスチジン、ヒスチジノール、ホモシステイン、イノシン二リン酸、イノシン一リン酸、イノシン三リン酸、イソロイシン、リジン、マレート、マロニルCoA、メチオニン、ミオイノシトール、N-アセチル-グルコサミン-1P、N-アセチル-オルニチン、NAD+、NADH、NADP+、NADPH、オルニチン、オキサロアセテート、フェニルアラニン、フェニルピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、プロリン、プロピオニルCoA、PRPP、ピルベート、キノリン、リボフラビン、リボース-5-リン酸、リブロース-5-リン酸、S-アデノシル-L-メチオニン、セリン、シキミ酸、シキメート、スクシネート、スクシニルCoA、トレオニン、トリプトファン、チロシン、UDP、UDP-グルコース、UDP-グルクロネート、UDP-N-アセチルグルコサミン、ウリジン、UTP、バリン、およびキシルロース-5-リン酸が挙げられるが、限定されない。
【００７８】
ある態様において、着目する経路は、シキミ酸および／またはシキメート（シキメートはシキミ酸のアニオン形態である）、ならびにそれらの合成中間体（例えば図４に掲載のように）、イソプレノイドまたはテルペン（例えばアモルファジエン、ファルネセン、リコペン、アスタキサンチン、ビタミンＡ、メントール、ベータ−カロテン）、ポリ-3-ヒドロキシブチレート、イソブタノール、ならびに1-ブタノール（例えば、本明細書に掲載の例１〜５ならびに図４および５を参照）の合成を備える。
【００７９】
着目する経路の酵素によって、多数の反応が触媒され得る。酵素分類番号（enzyme classification number）により同定可能な、広範なクラスの酵素を、丸括弧に挟んで記載する。該酵素としては以下が挙げられるが限定されない：
（EC 1）オキシドレダクターゼ；例えば、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、オキシドレダクターゼ、シンターゼ、オキシゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、ペルオキシゲナーゼ、カタラーゼ、エポキシダーゼ、ヒドロキシラーゼ、デメチラーゼ、デサチュラーゼ、ジスムターゼ、ヒドロキシルトランスフェラーゼ、デハロゲナーゼ、およびデヨージナーゼ；
（EC 2）トランスフェラーゼ；例えば、トランスアミナーゼ、キナーゼ、ジキナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼ、ホルムイミノトランスフェラーゼ、カルボキシトランスフェラーゼ、カルボミルトランスフェラーゼ、アミジノトランスフェラーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、パルミトイルトランスフェラーゼ、スクシニルトランスフェラーゼ、マロニルトランスフェラーゼ、ガロイルトランスフェラーゼ、シナポイルトランスフェラーゼ、チグロイルトランスフェラーゼ、テトラデカノイルトランスフェラーゼ、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、フェルロイルトランスフェラーゼ、ミコリルトランスフェラーゼ、ベンゾイルトランスフェラーゼ、ピペロイルトランスフェラーゼ、トリメチルトリデカノイルトランスフェラーゼ、ミリストイルトランスフェラーゼ、クマロイルトランスフェラーゼ、チオラーゼ、アミノアシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ヘキソシルトランスフェラーゼ、ペントシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ピリジニラーゼ、ジホスホリラーゼ、シクロトランスフェラーゼ、スルフリラーゼ、アデノシルトランスフェラーゼ、カルボキシビニルトランスフェラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、アミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ、ジメチルアリルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランストランスフェラーゼ、ヘキサプレニルトランストランスフェラーゼ、デカプレニルシストランスフェラーゼ、ペンタプレニルトランストランスフェラーゼ、ノナプレニルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、アミノカルボキシプレニルトランスフェラーゼ、オキシミノトランスフェラーゼ、プリントランスフェラーゼ、ホスホジスムターゼ、ホスホトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、コリンホスホトランスフェラーゼ、ホスホリルムターゼ、サルファトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、およびCoAトランスフェラーゼ；
（EC 3）ヒドロラーゼ；例えば、リパーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、ラクトナーゼ、デアシラーゼ、デアセチラーゼ、ホスホビダーゼ、デポリメラーゼ、チオールエステラーゼ、ホスファターゼ、ジホスファターゼ、トリホスファターゼ、ヌクレオチダーゼ、フィターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、サルファターゼ、シクラーゼ、オリゴヌクレオチダーゼ、リボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレオシダーゼ、グリコシラーゼ、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、オメガ−ペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、トレオニンエンドペプチダーゼ、アミナーゼ、アミダーゼ、デスクシニラーゼ、デホルミラーゼ、アシラーゼ、デイミナーゼ、デアミナーゼ、ジヒドロラーゼ、シクロヒドロラーゼ、ニトリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＧＴＰアーゼ、ハリダーゼ、デハロゲナーゼ、およびスルホヒドロラーゼ；
（EC 4）リアーゼ；例えば、デカルボキシラーゼ、カルボキシラーゼ、カルボキシキナーゼ、アルドラーゼ、エポキシリアーゼ、オキソ酸−リアーゼ、炭素−炭素リアーゼ、デヒドラターゼ、ヒドラターゼ、シンターゼ、エンドリアーゼ、エキソリアーゼ、アンモニア−リアーゼ、アミジン−リアーゼ、アミン−リアーゼ、炭素−硫黄リアーゼ、炭素−ハロゲンリアーゼ、リン−酸素リアーゼ、およびデヒドロクロリナーゼ；
（EC 5）イソメラーゼ；例えば、イソメラーゼ、ラセマーゼ、ムターゼ、トートメラーゼ、ホスホムターゼ、ホスホグルコムターゼ、アミノムターゼ、シクロイソメラーゼ、シクラーゼ、トポイソメラーゼ；ならびに
（EC 6）リガーゼ；例えば、シンセターゼ、tNRA−リガーゼ、酸−チオールリガーゼ、アミドシンターゼ、ペプチドシンターゼ、シクロリガーゼ、カルボキシラーゼ、DNA−リガーゼ、RNA−リガーゼ、およびシクラーゼ。
【００８０】
酵素のより具体的なクラスとしては、限定されずに、下記のオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼが挙げられる。
【００８１】
典型的なオキシドレダクターゼとしては以下が挙げられるが、限定されるものではない：
（EC 1.1）ドナーのCH-OH基とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.2）ドナーのアルデヒド基またはオキソ基とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.3）ドナーのCH-CH基とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.4）ドナーのCH-NH２基とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.5）ドナーのCH-NH基とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.6）NADHまたはNADPHとアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.7）ドナーとしての他の窒素化合物とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.8）ドナーの硫黄基とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.9）ドナーのヘム基とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.10）ドナーとしてのジフェノールおよび関連する物質とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.11）アクセプターとしての過酸化物に作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.12）ドナーとしての水素とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.13）酸素分子を包含する単一のドナー（１個または２個の酸素原子も包含する）に作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.14）2-オキソグルタレート、NADH、NADPH、還元フラビン、フラビンタンパク質、プテリジン、鉄−硫黄タンパク質、アスコルベートであるドナーによる酸素分子の還元を包含する、対のドナーに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.15）アクセプターとしてのスーパーオキシドラジカルに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.16）金属イオンとアクセプターとを酸化するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.17）CH基またはCH２基とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.18）ドナーとしての鉄−硫黄タンパク質とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.19）ドナーとしての還元フラボドキシンとアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；
（EC 1.20）ドナーのリンまたはヒ素とアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；ならびに
（EC 1.21）X-Y結合を形成するためのX-HおよびY-Hとアクセプターとに作用するオキシドレダクターゼ；ここで、各ドナーのカテゴリに対するアクセプターとしては以下が挙げられ、限定されない：NAD、NADP、ヘムタンパク質、酸素、ジスルフィド、キノン、鉄−硫黄タンパク質、フラビン、含窒素基、シトクロム、二窒素、およびH＋。
【００８２】
典型的なトランスフェラーゼとしては以下が挙げられるが、限定されるものではない：
（EC 2.1）１炭素基を転移するトランスフェラーゼ；
（EC 2.2）アルデヒド基またはケトン基を転移するトランスフェラーゼ；
（EC 2.3）アシルトランスフェラーゼ；
（EC 2.4）グリコシルトランスフェラーゼ；
（EC 2.5）メチル基以外のアルキル基またはアルール基を転移するトランスフェラーゼ；
（EC 2.6）含窒素基を転移するトランスフェラーゼ；
（EC 2.7）リン含有基を転移するトランスフェラーゼ；
（EC 2.8）硫黄含有基を転移するトランスフェラーゼ；および
（EC 2.9）セレン含有基を転移するトランスフェラーゼ。
【００８３】
典型的なヒドロラーゼとしては以下が挙げられるが、限定されるものではない：
（EC 3.1）エステル結合に作用するヒドロラーゼ；
（EC 3.2）グリコシラーゼ；
（EC 3.3）エーテル結合に作用するヒドロラーゼ；
（EC 3.4）ペプチド結合に作用するヒドロラーゼ（ペプチダーゼ）；
（EC 3.5）ペプチド結合以外の炭素−窒素結合に作用するヒドロラーゼ；
（EC 3.6）酸無水物に作用するヒドロラーゼ；
（EC 3.7）炭素−炭素結合に作用するヒドロラーゼ；
（EC 3.8）ハロゲンの結合に作用するヒドロラーゼ；
（EC 3.9）リン−窒素結合に作用するヒドロラーゼ；
（EC 3.10）硫黄−窒素結合に作用するヒドロラーゼ；
（EC 3.11）炭素−リン結合に作用するヒドロラーゼ；
（EC 3.12）硫黄−硫黄結合に作用するヒドロラーゼ；および
（EC 3.13）炭素−硫黄結合に作用するヒドロラーゼ。
【００８４】
典型的なリアーゼとしては以下が挙げられるが、限定されるものではない：
（EC 4.1）炭素−炭素リアーゼ；
（EC 4.2）炭素−酸素リアーゼ；
（EC 4.3）炭素−窒素リアーゼ；
（EC 4.4）炭素−硫黄リアーゼ；
（EC 4.5）炭素−ハロゲンリアーゼ；および
（EC 4.6）リン−酸素リアーゼ。
【００８５】
典型的なイソメラーゼとしては以下が挙げられるが、限定されるものではない：
（EC 5.1）ラセマーゼおよびエピメラーゼ；
（EC 5.2）シス−トランス−イソメラーゼ；
（EC 5.3）分子内イソメラーゼ
（EC 5.4）分子内トランスフェラーゼ（ムターゼ）；ならびに
（EC 5.5）分子内リアーゼ。
【００８６】
典型的なリガーゼとしては以下が挙げられるが、限定されるものではない：
（EC 6.1）炭素−酸素結合を形成するリガーゼ；
（EC 6.2）炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ；
（EC 6.3）炭素−窒素結合を形成するリガーゼ；
（EC 6.4）炭素−炭素結合を形成するリガーゼ；
（EC 6.5）リン酸エステル結合を形成するリガーゼ；および
（EC 6.6）窒素−金属結合を形成するリガーゼ。
【００８７】
アイソザイム（イソ酵素としても知られている）は、アミノ酸配列は異なるが同じ化学反応を触媒する酵素である。着目する経路におけるいくつかのポイントで、２種または３種以上のアイソザイムが存在していてもよい。アイソザイムは、異なるキネティクスのパラメータ、または異なる調節特性を示してもよい。
【００８８】
着目する経路に関係する酵素または関連経路もまた、酵素の役割に従って分類してもよい。細胞または細胞溶解物において直接的に関係する酵素（クラス１）は、経路の反応を触媒する。１番目の酵素の産物が２番目の酵素の基質であり、２番目の酵素の産物が３番目の酵素の基質であるなどの場合、そのように直接関係する酵素が１つの連鎖となり、いずれは着目する産物をもたらすことが経路の象徴である。細胞または細胞溶解物において間接的に関係する酵素（クラス２）は、関連する経路において、大抵は着目する経路に使用される基質の生産において、反応するものである。酵素の過剰生産（「過剰発現」）が、２倍、３倍、またはそれ以上の過剰生産であっても、細胞に毒性があることは、これら２つのクラスにおける酵素の特質であり得る。かかる毒性は、毒性を有する産物が高濃度で過剰生産した結果か、または酵素が、正常な細胞生理に強い影響を与える速度で供給源を転換した結果である可能性がある。細胞への望まないストレスを避けるために、かかる酵素の発現は、誘導型プロモータの使用を介する等して、本発明の方法を用いて、別々の区画に選択的に調節して蓄積することにより利益を享受する。
【００８９】
経路内の酵素は、産物が生産される回転率と有効性とが変動するだろう。結果として、経路のある酵素は律速になる。経路の律速酵素の濃度が上昇すると（非律速酵素と比較して）、着目する経路を介するフラックスの上昇が可能になる（例えばZamboni et al. Nature Protocols (2009) 4:878-892を参照。参照により本明細書に組み込まれる）。しばしば、律速酵素は、過剰生産されたときの毒性に関連し、したがって、かかる酵素の使用可能な濃度は、選択した時点で、また場合によると、別々の区画に隔離されている間でも、律速活性の蓄積を選択的に上昇させる本発明の方法により、望ましくは調節される。
【００９０】
細胞または細胞溶解物の酵素の第３のクラスは、競合的酵素（クラス３）であって、着目する経路の基質または産物を利用する。競合的酵素の特質は、基質変換のキネティクスが十分に高く、該酵素の存在によって、着目する経路により触媒された所望の最終産物の全体的な収率および／または生産速度が低減する。正常細胞は、競合的酵素の発現を必要としてもよく、したがって、競合的酵素の発現を完全にノックアウトするよりむしろ、該酵素の濃度を選択的に低減せることが望ましい；例えば、PCT公報第WO 2010/077806を参照（参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９１】
命名の便宜上、着目する経路の酵素は、一番目を経路の入口酵素に分類し、それに続くものを下流の酵素(an enzyme)もしくは酵素(enzymes)に分類してもよい。経路の入口酵素は、本明細書におい便宜的にE1と称してもよく、下流の酵素は、E2, E3, . . . Enとして連続的に番号を付してもよい。本発明の方法に使用される、着目する経路は、通常、少なくとも１種の酵素、少なくとも２種の酵素、少なくとも３種の酵素、少なくとも４種の酵素、またはそれ以上、例えば、両端値を含む、１〜５０種の間の酵素、１〜４０種の間の酵素、１〜３０種の間の酵素、１〜２０種の間の酵素、１〜１０種の間の酵素、１〜５種の間の酵素、１〜２種の間の酵素、２〜５０種の間の酵素、２〜４０種の間の酵素、２〜３０種の間の酵素、２〜２０種の間の酵素、２〜１０種の間の酵素、２〜５種の間の酵素、２〜４種の間の酵素、５〜５０種の間の酵素、５〜４０種の間の酵素、５〜３０種の間の酵素、５〜２０種の間の酵素、５〜１０種の間の酵素、５〜８種の間の酵素、１０〜５０種の間の酵素、１０〜４０種の間の酵素、１０〜３０種の間の酵素、１０〜２０種の間の酵素、を含むだろう。
【００９２】
経路の酵素は天然に存在しても、または、着目する特定の特質（例えば、基質特異性、反応キネティクス、溶解性、および／またはフィードバック阻害への非感受性）を最適化するように改変されていてもよい。さらに、いくつかの場合において、該酵素を発現する遺伝子は、宿主細胞内でのコドン使用が最適化されるだろう。いくつかの態様において、完全な経路は、単一の生命体の酵素を含むが、このことは必要なことではなく、複数の生命体の酵素を組み合わせることも考慮する。いくつかの目的において、経路は宿主細胞に内因するが、このことも必要なことではなく、完全な経路または経路の成分を、宿主細胞に導入してもよい。前記システムが無傷細胞に備わっている場合、一般に、着目する経路の酵素一式は、細胞内に存在しているだろう。無細胞生産する目的においては、１種または２種以上の酵素を溶解物に添加してもよいし、代わりに、経路を完結するために、溶解物に生産させてもよい。
【００９３】
経路システムにおいて、１番目の基質（S１）は経路の入口酵素により作用され、１番目の産物に変換されるが、２種または３種以上の経路が単一の酵素で相互接続していてもよいように、酵素は同時に１種または２種以上の基質に作用し、１種または２種以上の産物を生産してもよいことは当業者に理解されるだろう。１番目の産物は、下流酵素であるE２の基質（S２）であり、E２により２番目の産物に変換される。経路の複雑性にもよるが、２番目の産物は、最終産物（PF）であっても、３番目の下流酵素（E３）の基質（S３）であってもよく、E３により３番目の産物に変換され、４番目の酵素の基質（S４）となってもよい。経路の最終酵素は、E２、E３、E４などであってもよいが、着目する産物（PF）を生産するものである。１種の酵素の産物が次の酵素の基質であることは、酵素経路の特質である。産物は安定であっても、比較的不安定であってもよいが、一般に、最終産物は、細胞、細胞溶解物、または反応混合物から単離することが可能なほどには十分安定である。競合的酵素は、着目する経路の基質または産物を利用するが、PF、S１、S２、S３、および／またはS４のいずれか１種を含んでもよく、競合的酵素（EＣ）と称してもよい。
【００９４】
本発明のいくつかの態様において、最初の基質であるS１は、中心となる代謝産物であるか、または細胞の「汎用品」である。代謝産物の中心となる経路には、解糖およびクエン酸回路が含まれる。かかるS１化合物は、一般に、着目する経路に特異的ではないが、様々な細胞に広く見出される化合物であり、かつ複数の酵素および経路の基質である。汎用品となる基質の例としては、限定されずに、グルコース、ATP、ピルベート、ホスホエノールピルビン酸などが挙げられる。経路の入口酵素であるE１は、汎用品である基質を、１種または比較的少数の酵素の選択的な基質である産物に変換してもよい。
【００９５】
一般に、主要な入口酵素は、着目する産物に対する経路の、１番目の関与段階を実施する１つと定義される。この段階には一般に、着目する産物の経路に対する化合物の生化学的関与が包含されている。主要な入口酵素の例としては、表２に記載のものが挙げられるが、限定されるものではない。
【表２】
0006374569.tif 000003
【００９６】
経路の具体的な非限定例は、例示を目的として提供しているが、シキミ酸の合成経路である（図４参照）。この経路において、例えば、細胞内の汎用品である化合物、ホスホエノールピルベート（S１Ａ）とエリトロース-4-リン酸（S１Ｂ）との反応は、3-デオキシ-D-アラビノースヘプツロース-7-リン酸（DAHP）を形成するための酵素であるDAHPシンターゼ（E１）により触媒される。経路における２番目の酵素であるDHQシンターゼ（E２）により、DAHP（S２）は3-デヒドロキネート（3-DHQ）に転換される。3-DHQ（S３）は、経路における３番目の酵素である3-DHQデヒドラターゼ（E３）により3-デヒドロシキメートに脱水される。3-デヒドロシキメート（S４）は、補因子としてNADPHを使用して、経路における４番目の酵素であるシキメートデヒドロゲナーゼ（E４）により、シキミ酸（PF）に還元される。経路の酵素は、当該分野において知られており、例えばE. coliを含む多数の生命体において特徴付られており、E. coliの酵素は、以下のような遺伝子座にコードされている：DAHPシンターゼ（aroG、aroF、aroH）；DHQシンターゼ（aroB）；3-DHQデヒドラターゼ（aroD）；シキメートデヒドロゲナーゼ（aroE）；例えば、PCT公報第WO2010/074760を参照（参照により本明細書に組み込まれる）。
生産方法
【００９７】
着目する経路を含む細胞質の酵素が例えば生理学的に正常なレベルまたは生理学的に正常なレベルを超えるレベルで発現している細胞；および経路の主要酵素の少なくとも１種が、（a）高レベルで発現され、かつ（b）天然に存在する区画以外の区画にリロケーションされた細胞を提供することによって、着目する産物の高収率な生産が達成される。いくつかの態様において、主要な酵素は、周辺質に隔離されている。主要な酵素は、着目する経路を介してフラックスを制御し、経路の入口酵素および／または律速酵素であってもよい。主要な酵素の対応する野生型は、通常、細胞質で正常なレベルで発現している。細胞培養の間、その活性を低減し得る状態に、周辺質に隔離された酵素が晒される（例えば金属などに晒される）ことを避けるために、細胞の増殖培地の成分を制御することが望ましい。例えばシキミ酸経路のDAHPシンターゼは銅触媒の酸化により不活化され得ることがわかっているため、利用可能な銅を打ち負かすために増殖培地のマンガンとマグネシウムとの金属濃度を上昇させることによって、培養条件を改変することが望ましい（例えば、Bauerle et al., J. Bacteriol. (1999) 181:1636-1642；およびStadtman et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:2005-2008を参照。それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。他の態様において、補因子を与えるか、または増殖培地の補因子の濃度を、周辺質または酵素がリロケーションする他の部位で酵素活性を増強させるために、変更する。
【００９８】
生産目的のために、細胞の溶解物を利用する。ここで、周辺質に隔離された酵素は、細胞質で発現している着目する経路の酵素に作動可能に接触させられる。細胞は、酵素活性を実質的に維持する任意の従来法、例えば、当該分野に公知の超音波処理、加圧型細胞破壊（French press）などにより溶解する。溶解物を分画してもよく、微粒子状物体は、遠心して除くか、または追加のプロセシング段階がない場合には使用してもよい。細胞溶解物は、酵素活性に必要な１種もしくは２種以上の基質、酵素、栄養素、補因子、緩衝剤、還元剤、および／またはATP産生システムなどとさらに組み合わせてもよい。ある態様において、かかるシステムは、本明細書で「無細胞システム」と称してもよく、すなわち、決定済みの基質を超えた割合および所定の配列で（例えば酵素経路で）作動する場合、産物である着目する化合物を優先して産生するという結果をもたらす、酵素または酵素カスケードを合成するために明確に設計された細胞溶解物または抽出物を含む、単離されたシステムである。着目する化合物は、典型的には、化学成分（例えば有機小分子）であり、それは、医薬品有効成分（API）、化学前駆体、または中間体として使用することができる。
【００９９】
本明細書で用いられる「基質」は、着目する化合物を合成するのに必要とされる必須素子を提供することができる化合物または化合物の混合物である。
【０１００】
本明細書で用いられる「有機小分子」または「小分子」は、８００ｇ/ｍｏｌ未満（例えば、７００ｇ/ｍｏｌ未満、６００ｇ/ｍｏｌ未満、５００ｇ/ｍｏｌ未満、４００ｇ/ｍｏｌ未満、３００ｇ/ｍｏｌ未満、２００ｇ/ｍｏｌ未満、１００ｇ/ｍｏｌ未満、両端値を含む５０〜８００ｇ/ｍｏｌの間、両端値を含む１００〜８００ｇ/ｍｏｌの間、または両端値を含む１００〜５００ｇ/ｍｏｌの間）の分子量を有する有機分子を指す。ある態様において、有機小分子は、薬物（例えば、米国連邦規制基準（CFR）に規定されているように米国食品医薬品局により認可された有機小分子）などの治療活性剤である。また、有機小分子には、金属も含まれていてもよい。この場合、有機小分子は「有機金属小分子」とも称される。
【０１０１】
本明細書に用いられる「還元均等物」または「還元剤」は、酸化還元反応における１電子の均等物を転移する化学種である。還元均等物の例は、孤立電子（例えば、金属イオンを含む反応における）、水素原子（プロトンと電子とからなる）、および２電子を運ぶ水素化物イオン（:H-）（例えばNADを含む反応における）である。「還元均等物のアクセプター」は、酸化還元反応において１電子均等物を受け取る化学種である。
【０１０２】
本明細書に用いられる「アデノシン三リン酸再生システム」または「ATP再生システム」は、アデノシン、AMP、およびADPをATPに変換する化学システムまたは生化学システムである。ATP再生システムの例としては、グルコース代謝、グルタメート代謝、および光合成を含むものが挙げられる。
【０１０３】
異なる遺伝的背景（例えば、前もって変更されたか、もしくは遺伝学的に設計された）または異なる種の細胞溶解物、あるいは異なる手順で調製された細胞溶解物は、バイオプロセスにおいて、本発明の細胞溶解物と混合し、同時にまたは別個に使用することができる。溶解物は遊離していても、固定化されていてもよく、該プロセスのステージ毎で再使用しても廃棄してもよい。例えば、ある態様において、細胞溶解物は、着目する経路の１種または２種以上の酵素を発現するように設計されたE. coli等の生命体の溶解物である。ある態様において、細胞溶解物は、異なる細胞溶解物の組み合わせ、例えば、着目する経路の１種または２種以上の酵素を過剰発現するようにそれぞれ設計された、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種の異なるE. coli等の生命体から得られた、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種の異なる細胞溶解物の組み合わせである。
【０１０４】
本発明の方法は、高収率の所望の産物を提供し、その収率は、野生型の微生物宿主により達成することが可能な収率より大きい。生産性（すなわち、体積または生物量１ユニット当たりの生産速度）も増大し得る。本発明の一態様において、産物の収率は、基本的な速度の少なくとも約２倍、基本的な速度の約５倍、基本的な速度の約１０倍、基本的な速度の約２５倍、基本的な速度の約５０倍、またはそれ以上、例えば基本的な速度の約２倍〜約１００倍の間である。ある態様において、本発明の方法を使用する産物収量の割合は、約０．１〜２０グラム産物/Ｌ/ｈの間である。
【０１０５】
接種が異なっても、異なる条件（例えば２種の異なる炭素源で増殖させた２種のバッチ）に適合することができ、または異なる遺伝子型を有することができ、そしてその工程を実行するために混合する（例えば、炭素源の混合物を同時に消費するため、または、別個になった細胞の２つのバッチに分けた経路を介して代謝産物を連続的にプロセシングに供するため）。反応一式が１容器で進行させ、その後上清をもう１つの容器に移すことを可能とすることによっても、順次工程を行うことができる。
【０１０６】
反応は、大規模な反応器、小規模なものを利用してもよく、複数の同時合成を実施するため多重化してもよい。連続反応は試薬の流れを導入するためのフィード機構を使用するだろうし、工程の一部として最終産物を単離してもよい。バッチシステムにも着目し、活性合成の時間を延ばすため、追加の試薬を、時間をかけて導入してもよい。バッチ、拡張バッチ、半バッチ、半連続的、供給バッチ、および連続的などの反応器は任意のモードで稼働してもく、これは、適用目的に従い選択されるだろう。
【０１０７】
反応は、小規模（例えば、通常、少なくとも約１ｍｌかつ約１５ｍｌ以下）または大規模な反応（例えば、反応体積が少なくとも約１５ｍｌ、通常少なくとも約５０ｍｌ、より通常では少なくとも約１００ｍｌであり、５００ｍｌ、１０００ｍｌまたはそれ以上、最高で何千リットル体積であってもよい）のいずれかで、任意の体積であってもよい。反応はいずれの規模で実行してもよい。
【０１０８】
様々な塩および緩衝剤が含まれてもよく、イオン種は典型的には産物生産に関して最適化する。反応培地の特定成分の濃度を変える場合、他の成分もそれに応じて変えてもよい。また、反応器の成分の濃度レベルも時間に伴い変更してもよい。チオール／ジスルフィドの酸化／還元電位の調整剤は、ジチオスレイトール、アスコルビン酸、グルタチオンおよび／またはそれらの酸化型であってもよい。また、一般的な酸化還元電位の他の調整剤も使用してよい。
【０１０９】
反応器は、半連続運転モードにおいて、透析、透析ろ過バッチまたは供給バッチモードで運転してもよい。フィード溶液を、同じメンブレンまたは別個の射出装置を介して反応器に供給してもよい。合成産物はが反応器に蓄積され、そして、システムの運転が終了した後、精製の常法に従い、単離し精製する。代わりに、連続または不連続のいずれかのモードにおいて、残留化合物の一部または全部を反応器に返送するという選択肢を有する工程の間に、産物を除去することもできる。
【０１１０】
試薬が流れている場合、液体の流れる方向は、メンブレンに対して垂直および／または接線方向であり得る。接線方向の流れはATPの再生およびメンブレン詰まりの防止に有効であり、垂直方向の流れに重ね合わせてもよい。メンブレンに垂直な流れは、陽圧ポンプもしくは真空吸引ポンプによるか、または当該分野に公知の他の方法を使用してメンブレン透過圧を適用することにより、引き起こすか、あるいはもたらしてもよい。メンブレンの外側表面に接触する溶液は、周期的に変化することがあり、メンブレンに対して安定して接線方向の流れであってもよい。反応器は、内部で撹拌しても、外部から撹拌してもよい。
【０１１１】
反応で生産された産物の量は、例えば、着色産物か、もしくは蛍光分析産物を生産する酵素アッセイにより、またはHPLC法により、様々なやり方で、測定することができる。ある態様において、産物は、生産されている特定産物の活性または濃度を測定するアッセイを利用して測定する。
【０１１２】
実施例
例
本発明を製造および使用する方法について完全な開示および説明を当業者に提供するために、下記の例を提示するものであって、下記の例は、本発明の範囲を限定する意図も、以下の実験が実施された全部のまたは唯一の実験であることを表す意図も、ない。用いられている数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を確かめる努力をしたが、いくつかの実験誤差および偏差は存在する可能性がある。特記がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は、大気圧またはそれに近いものである。
例１．シキミ酸の生産
【０１１３】
シキミ酸は、コリスメート生合成経路における中間体であり、該経路において、主要な入口酵素は、2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプトネートアルドラーゼ（3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸、DAHP、シンターゼ）である。DAHPシンターゼは、中心的な代謝産物であるホスホエノールピルベート（PEP）およびエリトロース-4-リン酸（E4P）をDAHPに変換することによって、シキメート生産の１番目の関与段階を触媒する。E.coliには、aroG、aroE、およびaroFの遺伝子にそれぞれコードされる−AroG、AroE、およびAroF−の３種類のDAHPシンターゼ酵素がある。最大活性を確かめるために、これらの酵素のフィードバック耐性型（Kikuchi et al., Appl. Environ. Microbiol. (1997) 63:761；Ray et al., J.Bacteriol. (1988) 170:5500；Weaver and Herrmann, J. Bacteriol. (1990) 172:6581）を使用することはよく知られている。
【０１１４】
この例において、DAHPシンターゼ遺伝子を、酵素が周辺質を標的とする様々な周辺質シグナル配列（周辺質リーダーペプチド）を含むように、改変する。発現最適化、様々なDAHPシンターゼの評価、ならびに周辺質プロテアーゼ部位同定および除去を、標的とされた周辺質の発現に関連する潜在的リスクおよび課題に取り組むために、使用する。周辺質の活性DAHPシンターゼの発現を実証し、誘導後の設計された株のより強固な増殖（選択した経路の遺伝子を細胞質のみで過剰発現する株と比較して）を実証し、続いて活性のある無細胞反応において溶解後に着目する産物への増大したフラックスを実証するために、下流経路遺伝子の細胞質での過剰発現と結び付ける。
【０１１５】
AroGを、E.coliの周辺質で発現させるために標的とする。当該タンパク質のN末端に異なる周辺質リーダーペプチドを有するAroGをコードするDNA配列ライブラリを作製するために、様々な周辺質リーダーペプチドをコードするDNA配列を、PCR増幅を介してaroG遺伝子に付加した。代わりに、PerS-AroGライブラリをコードするDNA配列を、DNA合成により作製する。いくつかの周辺質シグナル配列を、周辺質で活性酵素を最高レベルで生産するのにどれが最も効率的か決定するために、試験する。好適な周辺質リーダーを、例２の表４および５に記載する。PerS-AroGライブラリをコードするDNA配列を、PerS-AroG発現ベクターライブラリを作製するために、好適な発現ベクターに挿入する。発現ベクターライブラリを、E.coliの好適株に形質転換するために使用し、ここで該E.coliの好適株は、プレートに蒔かれ、PerS-AroG発現とAroGの周辺質局在とについてスクリーニングされる。複数のプロモータ結合部位およびリボソーム結合部位について試験することによって、選択した構築物を、発現のためにさらに最適化することができる。
【０１１６】
例えば、PerS-AroGライブラリをコードするDNA配列を、T7lacOプロモータから誘導発現させるためにpDuetベクターにクローニングする。E.coli株BL21(DE3)またはT7ポリメラーゼを発現する類似株を、PerS-AroGライブラリ含有プラスミドにより形質転換する。誘導剤であるイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）のレベルを変動させる方法の使用を介して、プロモータとリボソームとの結合部位変異体の使用を介して、および異なるpDuetベクターの間でコピー数を変動させる方法の使用を介して、発現改変を達成する。当業者によく知られている他のプラスミド、発現システム、または菌株も使用することができる。
【０１１７】
様々な周辺質リーダーを有するAroGと周辺質リーダーのないAroGとの両者のpDuet発現バージョンを有するいくつかの菌株を作製する。培養物を、０．０５〜１ｍＭのIPTGで発現誘導する前に富化合成培地において光学密度が中間になるまで、増殖させる。周辺質でのDAHPシンターゼの蓄積を可能にするために、数時間、発現を誘導する。周辺質を標的とするDAHPシンターゼを、浸透圧ショック、または当業者に知られている他の方法を使用して、抽出する。完全長タンパク質発現の確認を、適切な標準を用いる変性タンパク質ゲル電気泳動により決定する。周辺質を標的とするDAHPシンターゼ（または他の酵素）の発現または折り畳みを最適化するために、様々な方法を使用してもよい。これらとしては、下記が挙げられるが、限定されるものではない：i）IPTGレベルを変動する、プラスミドの複製起点を異なるものとする、および／または、RBSおよび／またはプロモータを改変する、方法の使用を介する発現の最適化、ii）保存的アミノ酸置換を介して周辺質プロテアーゼに特異的な公知部位の同定および除去、ならびにiii）オルソロガスな酵素の使用。図１に示すように、周辺質シグナル配列OmpAおよびSTIIを使用する場合、データは、完全長AroGの周辺質発現を示している。
【０１１８】
周辺質を標的とするDAHPシンターゼの比活性度を、PEP（E4Pを有する）のDAHPへの変換を測定するため２３２ｎｍでの吸光度を観測する連続分光光度アッセイを使用し、全細胞または周辺質抽出物において決定する。タンパク質を安定化するために、全細胞または周辺質抽出物には、例えば、３５ｍＭのリン酸カリウム（pH７．０）と５００μＭのPEP-Kとともに１０ｍＭのTris-HCl（pH７．５）が含まれている。アッセイ前に、アミノ酸と５ｋＤａ未満の他の分子とを除くため、同じ緩衝液で平衡化したSephadex G-25カラムに抽出物を通す。精製した抽出物の１マイクロリットルを、９９マイクロリットルの反応混合物（１００μＭのPEP-K、３００μＭのE4P-Na、１０ｍＭの1,3-ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン、１０μＭのMgCl２、pH７．０）に加え、２３２ｎｍの吸光度を、０．５〜２時間にわたって観測する。E4Pなしで実施した対照反応と同様、AroGを過剰発現しない菌株の適切な対照抽出物が、標準化として含まれる。全細胞または周辺質の抽出物における全タンパク質の濃度を、当業者によく知られている標準Bradfordアッセイを使用して決定する。全細胞またはAroGである周辺質タンパク質の画分を、クーマシーで染色した、全細胞または周辺質の抽出物のポリアクリルアミドゲルの画像分析により決定する。
【０１１９】
Cu＋＋がDAHPシンターゼの不可逆的不活性化を引き起こすことは知られているから（Park and Bauerle, J. Bacteriol. (1999) 181:1636）、増殖培地のCu＋＋含有量を制限する、Mn＋＋などの他の二価カチオンの濃度を上昇するなどして測定することは、その活性を維持するためと同様、酵素の完全活性化を促すために使用し得る。周辺質で発現したAroGの活性を証明するのにおいて、経路の前駆体または他の経路の基質（以下のリストに挙げた）を提供するのに有用なシキミ酸に追加する生化学的経路の酵素を、前記E.coliのBL21(DE3)の細胞質で過剰発現させるために、pDuetベクターにサブクローニングする。
【表３】
0006374569.tif 000004
【０１２０】
インビボのシキミ酸生産を改善するために、これら酵素の１種または数種の過剰発現が示されている（Patnaik and Liao, Appl. Environ. Microbiol. (1994) 60:3903；Flores et al., Nat. Biotechnol. (1996) 14:620；Herrmann, Plant Physiol. (1995) 107:7；Bongaerts et al., Met. Eng. (2001) 3:289；Kramer et al., Met. Eng. (2003) 5:277）。経路の前駆体（エリトロース4-リン酸）の供給を増加させる目的を有する酵素であるトランスケトラーゼ（TktA）の場合、トランスケトラーゼ過剰発現が生命体の増殖に有害であることが観察される場合、当該酵素は、周辺質に排出されるだろう。類似な例において、可溶なヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（SthA遺伝子産物）も、増殖におけるその細胞質の過剰発現の効果を評価するために、細胞質または周辺質のいずれかにおいて、過剰発現について評価してもよい。さらに、細胞質を標的とするDAHPシンターゼを含むベクターが、細胞増殖の対照として働くために、含まれる。pDuetベクターそれぞれは、個々のプロモータから２種の遺伝子を発現することができ、最高３つのベクターによる全タンパク質の最大発現を確かめる。遺伝子の多シストロン性の配置を、これが細胞増殖を改善するのに必要である場合、単一ベクターから全遺伝子を発現するために、使用することができる。
【０１２１】
完全長タンパク質が細胞質で発現するのを確かめるために、適切な標準を有する変性タンパク質ゲル電気泳動を実施する。完全長タンパク質発現を確認する際、プラスミドをBL21(DE3)に同時形質転換し、全プラスミドの存在を確かめるために、同時形質転換体を適切な抗生物質培地で選択する。前記のとおり、細胞を富化合成培地で、光学密度が中程度になるまで増殖させ、過剰発現を０．０５〜１ｍＭのIPTGの添加により誘導する。細胞質（対照）または周辺質のいずれかで発現させたDAHPシンターゼとともに、細胞質でTktA、AroB、AroD、およびAroEを発現する細胞の産生時間を決定するために、規定の間隔での培養光学密度の分光光度測定を使用する。
【０１２２】
誘導後、様々な時点で細胞を集菌し、高圧ホモジナイザーの使用により溶解し、シキメートを生産する無細胞反応において使用するグルコース、グルタメートおよび他の基質と混合する。シキメート（および3-デヒドロキネートと3-デヒドロシキメートとを含む中間体）のレベルを、当業者によく知られている方法を使用するHPLCを介して測定する。このレベルと同様に、増殖の速度および程度、ならびに溶解物におけるシキメートのレベルおよび生産速度を、DAHPシンターゼを細胞質で発現させた場合に得られるものと相対的なDAHPシンターゼを周辺質で発現させた場合と比較する。
例２．増殖効果および周辺質で発現したAroGの活性
【０１２３】
DAHPシンターゼの周辺質での発現。酵素に周辺質を標的にさせる様々な周辺質シグナル配列により改変したAroGをコードする遺伝子（Genbank受入番号AAC73841.1）を含むように、プラスミドのライブラリを構築する。周辺質リーダーについて試験したコード配列を構築するために使用したプライマーのDNA配列を、表４および５に記載する。一連の周辺質シグナル配列をコードするDNA配列を、下記プライマーを使用するPCR増幅によりaroG遺伝子に付加する。
【表４】
0006374569.tif 000005
【表５】
0006374569.tif 000006
表４および５のプライマーを使用してPCR増幅したaroG構築物をBsaI/NotIで消化し、NcoI-NotI消化した誘導発現用pDueベクターにサブクローニングする。E.coli菌株であるBL21(DE3)を、サブクローニングした周辺質を標的とするAroGを含むプラスミドで形質転換する。異なるpDuetベクターのうちコピー数の変動を使用するのと同様に、IPTGレベルの変動を使用して、発現改変を達成する。当業者によく知られている他のプラスミド、発現システム、または菌株も使用してよい。
【０１２４】
以下の菌株の、凍結した通常在庫(working stock)の細胞培養：
a.  BL21(DE3)：pACYC-Duet1（対照の空ベクター）
b.  BL21(DE3)：pACYC-AroG（周辺質シグナル配列なし）
c.  BL21(DE3)：pACYC-OmpA-AroG（周辺質シグナル配列OmpAを有するAroGを含む）
d.  BL21(DE3)：pACYC-STII-AroG（周辺質シグナル配列STIIを有するAroGを含む）
を、３４μｇ/ｍＬのクロラムフェニコールを含む、２５０ｍｌのEZ Rich限定培地（Neidhardt et al. J. Bacteriol. (1974) 119:736）（６００ｎｍでの光学密度は０．００２５）に植菌した。OD６００が０．６になるまで３７℃で増殖した後、タンパク質発現を誘導するために０．１ｍＭのIPTGを添加した。その後、２５℃で１６時間、増殖と誘導とを行った。
【０１２５】
全細胞画分、周辺質画分、および細胞質画分を、当業者によく知られている方法を使用して得た（例えば、Chen et al., Biochem. Eng. J. (2004) 19:211；Soares et al., Prot. Eng. (2003) 16:1131を参照）。具体的には、１２ｍｌ培養物から４℃で３０分間３０００×ｇで集菌することによって、全細胞画分を得た。１２ｍｌの１ｍＭTris-HCl（pH７．０）に、細胞のペレットを再懸濁した。１５０００〜１７０００ｐｓｉでのEmulsiFlex-C3高圧ホモジナイザー（Avestin、Canada）に２回通して、再懸濁した細胞を溶解した。細胞のデブリを取り除くために、試料を２１０００×ｇで１５分間遠心分離した。周辺質画分および細胞質画分を以下のようにして得た：２００ｍｌ培養物を４℃で３０分間３０００×ｇで集菌した。４℃の１ｍＭTris HCl（pH７．０）２ｍｌに、細胞のペレットを穏やかに再懸濁した後、３０分間３０００×ｇで遠心分離した。周辺質画分として上清を使用した。細胞質画分を得るためにペレットをさらに処理した。５０ｍＭのTris-HClと５０ｍＭのNaClとの１１ｍｌに、ペレットを激しく再懸濁し、続いて、細胞抽出物について記載したように、溶解および清澄化し、細胞質画分を得た。
【０１２６】
完全長タンパク質の発現確認を、適切な標準を有する変性タンパク質ゲル電気泳動によって決定する。具体的には、０．０４ｍＭのジチオスレイトール（DTT）を含む１９．５μＬのSDS-PAGE用緩衝液(SDS-PAGE running buffer)を、３９μｌ抽出物に添加した後、９９℃で５分間インキュベートする。２００Ｖで５５分間、試料を１０％Bis-Trisゲルに流した。XCell IITM Blot Moduleを使用して、３０Ｖで９０分間、ニトロセルロースメンブレンにタンパク質を転移することによって、ウェスタンブロットを実施した。その後、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を用いる５分間の洗浄をメンブレンに対して２回行い、続いてPBSと１％脱脂粉乳とで１時間のブロッキング段階を経た（軌道振盪器により室温で）。C末端の抗HisHRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）抗体（Invitrogen）を、ブロッキング緩衝液で１：５０００に希釈し、洗浄したメンブレンとともに１時間インキュベートした。C末端にHis標識を含むタンパク質を、TMB免疫ブロット溶液（Invitrogen）にインキュベートした後、ニトロセルロースメンブレン上で観察した。図１に示すように、OmpAおよびSTIIの周辺質シグナル配列を使用した場合に完全長AroGが周辺質で発現したことを、データは示している。
【０１２７】
周辺質で発現されたDAHPシンターゼの活性。OmpA-aroGを発現しているか、または対照のpACYC空ベクターを含んでいるBL21(DE3)の培養物を、５０μＭのMnCl２で補充したEZ-Rich限定培地中３７℃で増殖させた。OD６００が０．３に達したときに、培養物を０．１ｍＭのIPTGで誘導し、さらに３０℃で３時間増殖させた。培養物を３０００×ｇで２０分間の遠心分離により集菌し、続いて３５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）と０．５ｍＭのPEPとの１３ｍｌに再懸濁した。１５０００ｐｓｉのホモジナイズにより細胞を溶解した。図２には、これら菌株の増殖データが含まれており、AroGの周辺質発現が細胞増殖に何ら弊害を与えないことを示している。
【０１２８】
PEP（E4Pを有する）のDAHPへの変換を測定するため２３２ｎｍでの吸光度を観測する連続的分光光度アッセイを使用して、周辺質を標的とするDAHPシンターゼの比活性度を決定する。OmpA-aroGを発現しているか、または対照のpACYC空ベクターを含んでいるBL21(DE3)菌株の全細胞抽出タンパク質画分において、DAHPシンターゼ活性アッセイを実施した。PD SpinTrap G-25カラム（GE Healthcare）を使用するゲルろ過により、タンパク質画分を精製した。反応混合物には、１００μＭのPEP、３００μＭのE4P、１０ｍＭのビス−トリスプロパン緩衝液（pH７）、５０μＭのMnCl２、および５０μｇ/ｍｌのタンパク質画分が含まれていた。反応物を２５℃でインキュベートした。周辺質で発現したDAHPシンターゼの比活性度を図３に示す。
例３．イソブタノールおよび／または1-ブタノールの無細胞生産
【０１２９】
E. coliでイソブタノールを産生する現行法は、内在性酵素２種：S. cerevisiaeの酵素であるアルコールデヒドロゲナーゼ2（ADH2、GenBank AAA34411.1）およびL. lactisの酵素である2-ケト-酸デカルボキシラーゼ（KivD、GenBank CAG34226.1）の過剰発現と合わせて、バリン生合成のE. coli酵素であるIlvI、H、C、Dの過剰発現に依存している（例えばAtsumi et al., Nature (2008) 451:86を参照）。同様に、1-ブタノールの生産には、E. coliにおけるイソロイシンとロイシンとの生合成酵素であるIlvAおよびLeuABCDの過剰発現と組み合わせて、同じ内在性酵素２種（ADH、KivD）の過剰発現が必要とされる（Atsumi同上）。高級アルコール（例えば、イソブタノール、1-ブタノール、n-ブタノール）の蓄積は、２％（w/v）の極めて低いレベルでも毒性があり（Atsumi同上；Reyes et al., Plos One (2011) 6:e17678）、その結果、増殖しているE. coliにおいてこれらの経路に活性があっても、細胞増殖も産物力価も貧弱となる。
【０１３０】
アミノ酸生合成前駆体からイソブタノールまたは1-ブタノールへのフラックスに転換させる主要酵素が周辺質に局在することによって、細胞増殖の間に産物の蓄積が止まり、Atsumi et al., Nature (2008) 451:86に記載の経路酵素が過剰発現するように設計された菌株溶解後の無細胞生産が可能となる。具体的には、様々な周辺質シグナル配列を有する主要な入口酵素であるKivDのライブラリは、例１および２に記載の方法に従い作製できる。最も効率的な周辺質発現を示すライブラリのメンバーを選択し、活性を確認後、前記のイソブタノールおよび1-ブタノールを生産するように設計された菌株を、周辺質で発現されたKivDを含むように改変する。周辺質で発現したKivDにより経路は不活性となるが、イソブタノールおよび1-ブタノールを生産するように設計されたE. coliは代謝的に健全な増殖を達成するだろう。細胞溶解に関し、グルコースからのイソブタノールおよび1-ブタノールの生産を活性化するため、周辺質および細胞質の内容物を組み合わせる。
例４．イソプレノイドおよびテルペンの無細胞生産
【０１３１】
E. coliでのイソプレノイドの過剰発現には、２つの一般的な手法：（1）天然のE. coliデオキシキシルロース-5-リン酸（DXP）経路の利用、または（2）非野生型のメバロネート（MEV）依存経路（例えばMartin et al., Nat. Biotechnol. (2003) 21:796-802参照）のうち１つが必要とされる。アモルファジエンは、抗マラリア性テルペノイドであるアテルミシニンの前駆体であるが、S. cerevisiaeのヒドロメチルグルタリル（HMG）CoAシンターゼ（ERG13、GenBank CAA90557.1）、トランケートされたHMG-CoAレダクターゼ（HMGR、GenBank CAA86503.1）、メバロネートキナーゼ（ERG12、GenBank CAA39359.1）、ホスホメバロネートキナーゼ（ERG8、GenBank CAA90191.1）、メバロネートピロリン酸デカルボキシキシラーゼ（MVD1、GenBank CAA66158.1）、および酵母での発現のためにコドンを最適化したArtemisia annuaバージョンのアモルファジエンシンターゼ（ADS、GenBank AAK15697.1）（例えばMartin et al., Nat. Biotechnol. (2003) 21:796-802および図５を参照）の遺伝子と同様に、野生型の遺伝子atoB、idi、ispAの過剰発現により、E. coliにおいてMEV経路により生産される。
【０１３２】
しかしながら、記載のイソプレノイド経路のプレニルジホスフェート中間体およびHMG-CoAには毒性があり、当該経路のテルペンシンターゼ（このテルペノイドについてはADS）および他の酵素の活性が不安定である場合に蓄積することが示されている（例えば、Martin et al., Nat. Biotechnol. (2003) 21:796-802；Withers et al., Appl. Environ. Microbiol. (2007) 73:6277-6283を参照）。この経路の主要な入口酵素であるAtoBが局在することによって、細胞増殖の間のこれら毒性問題を避けるための、発現を微調整する必要性が除去される。具体的には、様々な周辺質シグナル配列を有する主要な入口酵素であるAtoBのライブラリを、例１および２に記載の方法に従い作製する。最も効率的な周辺質発現を示すライブラリのメンバーを選択し、活性を確認後、イソプレノイドを生産するように設計されたE. coli菌株（例えばMartin同上を参照）を、周辺質で発現されたAtoBを有するように改変する。
【０１３３】
周辺質で発現されたAtoBにより経路が不活となるが、この菌株は代謝的に健全な増殖が達成されるだろう。細胞溶解に関し、グルコースからのイソプレノイド生産を活性化させるために、周辺質および細胞質の内容物を組み合わせる。
例５．ポリ-3-ヒドロキシブチレートの無細胞生産
【０１３４】
アセチルCoAからの３段階の経路を使用して、重要な生体高分子の構成要素であるポリ-3-ヒドロキシブチレート（PHB）を生産するように、E. coliを代謝的に設計した（Tyo et al.）。３種の内在性酵素に含まれるものは、R. eutrophaのベータ−ケトチオラーゼ（PhaA、GenBank CAJ92573.1）およびアセトアセチルCoAレダクターゼ（PhaB、GenBank AAA21973.1）およびAllochromatium vinosumのPHBシンターゼ（サブユニットPhaE、Gen Bank ABK60192.1；サブユニットPhaC、GenBank ABK60193.1）である。
【０１３５】
E. coliにおいてこの経路に活性があるとき、増殖速度は、バイオマス由来炭素の転用および／または細胞質における毒性のある大きなPHB顆粒の蓄積により、PHBフラックスに反比例する（例えば、Tyo et al., Metabolic Engineering (2010) 12:187-195を参照）。この経路の主要な入口酵素であるPhaAが局在することにより、細胞増殖中の毒性問題が排除されるだろう。具体的には、様々な周辺質シグナル配列を有する主要な入口酵素であるPhaAのライブラリを、例１および２に記載の方法に従い作製する。最も効率的な周辺質発現を示すライブラリのメンバーを選択し、活性を確認後、PHBを生産するように設計されたE. coli菌株（例えばTyo同上を参照）を、周辺質で発現されたPhaAを有するように改変する。周辺質で発現されたPhaAにより経路が不活性となるが、この菌株は代謝的に健全な増殖が達成されるだろう。細胞溶解に関し、グルコースからのイソプレノイド生産を活性化させるために、周辺質および細胞質の内容物を組み合わせる。
他の態様
【０１３６】
本明細書で用いられる「a」または「an」は、特に指定のない限り、「少なくとも１つ」または「１つまたは２つ以上」を意味する。
【０１３７】
特に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。
【０１３８】
本明細書で参照した特許、特許公報（公開または未公開）、参考文献、本、マニュアル、および他の刊行物のすべては、それら全体を参照することにより組み込まれる。本明細書に記載の定義が、組み込まれた特許、特許公報（公開または未公開）、参考文献、本、マニュアル、および／または他の刊行物に記載の定義と正反対か、そうでなければ矛盾する場合、本明細書に記載の定義を優先する。刊行物または公文書の引用は、かかる刊行物または公文書のいずれも関連先行技術であることを承認する意図もなければ、これらの刊行物もしくは公文書の内容または日付に関していかなる承認も構成していない。
【０１３９】
前述したものは、本発明のある非限定態様の説明である。この説明への様々な変更および改変が、以下の特許請求の範囲に定義される本発明の精神または範囲から逸脱せずになされてもよいことは、当業者に理解されるだろう。
【図１】
0006374569.tif 000007
【図２】
0006374569.tif 000008
【図３】
0006374569.tif 000009
【図４】
0006374569.tif 000010
【図５】
0006374569.tif 000011
【配列表】
0006374569000001.app