(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液悪性腫瘍細胞の、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫｉ：Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に対する感受性をインビトロで決定する方法であって、
ａ）前記腫瘍細胞内のサイクリンＤ３（ＣＣＮＤ３：ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ３）の突然変異についてインビトロでアッセイするステップであり、前記ＣＣＮＤ３突然変異がＰＥＳＴドメイン内にある、ステップと、
ｂ）ＣＣＮＤ３突然変異を、非がん性細胞または正常な対照細胞と比較するステップと
を含み、前記腫瘍細胞内のＣＣＮＤ３突然変異の存在が、前記腫瘍細胞がＣＤＫｉに対して感受性であることを示す方法。
【請求項２】
血液悪性腫瘍細胞がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＣＮＤ３突然変異がアミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤＫｉが以下の式
0006387001.tif 000007
で示されるＣＤＫｉ（１）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
血液悪性腫瘍患者のＣＤＫｉによる処置に対する感受性を予測する方法であって、
ａ）患者から得られた前記腫瘍試料中のＣＣＮＤ３突然変異についてアッセイするステップであり、前記ＣＣＮＤ３突然変異がＰＥＳＴドメイン内にある、ステップと、
ｂ）ＣＣＮＤ３突然変異を、非がん性試料または正常な対照試料と比較するステップと
を含み、前記腫瘍試料中のＣＣＮＤ３突然変異の存在が、患者がＣＤＫｉによる処置に対して感受性であることを示す方法。
【請求項８】
血液悪性腫瘍試料がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＣＮＤ３突然変異がアミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤＫｉが以下の式
0006387001.tif 000008
で示されるＣＤＫｉ（１）である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ｃ）患者から得られた血液悪性腫瘍試料中のＣＣＮＤ３の差次的なタンパク質発現を測定するステップと、
ｄ）前記腫瘍試料中のＣＣＮＤ３タンパク質の発現を、非がん性試料または正常な対照試料のＣＣＮＤ３タンパク質発現と比較するステップと
をさらに含み、前記腫瘍試料中のＣＣＮＤ３タンパク質レベルの増大が、患者がＣＤＫｉによる処置に対して感受性であることを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
患者の血液悪性腫瘍を処置するための、ＣＤＫｉを含む組成物であって、
前記患者が、
ａ）患者から得られた前記腫瘍試料中のＣＣＮＤ３突然変異についてアッセイするステップであり、前記ＣＣＮＤ３突然変異がＰＥＳＴドメイン内にある、ステップと、
ｂ）前記腫瘍試料中のＣＣＮＤ３突然変異状態を、非がん性試料または正常な対照試料と比較するステップであり、ＣＣＮＤ３突然変異の存在が、患者がＣＤＫｉによる処置に対して感受性であることを示すステップと、
を含む方法で選択される、前記組成物。
【請求項１５】
血液悪性腫瘍試料がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
ＣＣＮＤ３突然変異が、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
ＣＤＫｉを治療有効量で投与する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
ＣＤＫｉが以下の式
0006387001.tif 000009
で示されるＣＤＫｉ（１）である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
ＣＤＫｉ候補物質をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞を、ＣＤＫｉ候補物質と接触させるステップであり、前記ＣＣＮＤ３突然変異がＰＥＳＴドメイン内にある、ステップと、
ｂ）細胞生存率の低減を測定するステップと、
ｃ）ＣＤＫｉ候補物質と接触させたＣＣＮＤ３突然変異細胞による細胞生存率の低減を、対照のＣＤＫｉと接触させたＣＣＮＤ３突然変異細胞による細胞生存率と比較するステッ
プと
を含む方法。
【請求項２２】
対照のＣＤＫｉが以下の式
0006387001.tif 000010
で示されるＣＤＫｉ（１）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＣＮＤ３突然変異がアミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
選択された血液悪性腫瘍患者の集団の前記腫瘍の処置に使用するためのＣＤＫｉを含む組成物であって、前記患者の集団が、前記患者から得られた前記腫瘍細胞試料中の、正常な対照細胞試料と比較したＣＣＮＤ３突然変異を示すことに基づき選択され、前記ＣＣＮＤ３突然変異がＰＥＳＴドメイン内にある、組成物。
【請求項２８】
血液悪性腫瘍細胞試料がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
血液悪性腫瘍患者のＣＤＫｉによる処置に対する感受性を予測するためのキットであって、ｉ）ＣＣＮＤ３突然変異を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ、プライマーまたは抗体と、ｉｉ）前記キットの使用法についての指示書とを含み、前記ＣＣＮＤ３突然変異がＰＥＳＴドメイン内にある、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム薬理学の分野、ならびにサイクリン依存性キナーゼ阻害剤に対して感受性の細胞の決定において有用なバイオマーカーの使用、処置法、および化合物のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトサイクリンＤ３（ＣＣＮＤ３：ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ３）は、１９９２年に、とりわけ、Ｇ１〜Ｓ期の進行において細胞周期を調節する遺伝子についてのスクリーニングにより初めてクローニングされた（Xiongら、Genomics、1992、13:575〜584、Motokuraら、J. Biol. Chem. 1992、267:20412〜20415）。ＣＣＮＤ３は、３つのＤ型サイクリン（サイクリンＤ１、Ｄ２、およびＤ３）のうちの１つである。Ｄ型サイクリンとしてのＣＣＮＤ３は、サイクリン依存性キナーゼであるＣＤＫ４およびＣＤＫ６とアセンブルして、細胞周期のＧ１の進行を促進するホロ酵素を形成することが発見された（Batesら、Oncogene  1994、9:71〜79）。後期Ｇ１を通過すると、ＣＣＮＤ３は、細胞周期の進行にもはや必要でなくなる（Sherr、Trends in Bio.Sci  1995、20（5）187〜190）。
【０００３】
構造的には、ＣＣＮＤ３は、１つのサイクリンドメインおよび２つのＰＥＳＴドメインを含有する。ＰＥＳＴドメインは、ユビキチンを媒介する分解に使用され、細胞が迅速に調節およびターンオーバーすることを要請するタンパク質内に見出される。ＰＥＳＴドメインは、プロリン（Ｐ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基、セリン（Ｓ）残基およびトレオニン（Ｔ）残基に富み、１２〜６０アミノ酸の範囲の長さである。ヒトＣＣＮＤ３は、アミノ酸２５６〜２６８（端点を含む（inclusive））および２７１〜２９１（端点を含む）においてＰＥＳＴドメインを含有する。ＰＥＳＴドメインの役割を探索する中で、研究者らは、ＣＣＮＤ３の単一の対立遺伝子ＳＮＰが、アミノ酸２５９におけるセリンからアラニンへのアミノ酸変化（Ｓ２５９Ａ）を結果としてもたらすことを見出した。Ｓ２５９Ａの変化は、ＰＥＳＴドメインを破壊し、結果として、変異体のＣＣＮＤ３は、突然変異していない対立遺伝子と比較した場合の安定性を増大させた（Savasら、OMICS  2007、11（2）: 200〜208）。
【０００４】
ＣＣＮＤ３は、リンパ球の発生において必要とされる。ＣＣＮＤ３の機能について調べるために、ＣＣＮＤ３ノックアウトマウス（ＣＣＮＤ３−／−）を作り出した（Sicinskaら、Cancer Cell  2003、4（6）:451〜461）ところ、これらのノックアウトマウスは、未成熟Ｔ細胞の正常な増殖を経ないという、極めて組織特異的な欠陥を呈した。Ｔ細胞性悪性腫瘍においてＣＣＮＤ３が果たしうる役割について取り組むため、ＣＣＮＤ３ノックアウトマウスを多数のＴ細胞性腫瘍を提示するｐ５６ＬＣＫを過剰発現するマウスと交雑させた。野生型ＣＣＮＤ３／ｐ５６ＬＣＫを発現しているマウスは、Ｔ細胞性悪性腫瘍を迅速に形成した。これに対し、ＣＣＮＤ３ノックアウト／ｐ５６ＬＣＫマウスでは、Ｔ細胞性悪性腫瘍の形成が６〜８週間遅延した。このデータを使用してヒト悪性腫瘍について調査するため、同じ研究グループは、ｓｉＲＮＡアプローチを使用して、ヒトＴ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞系においてＣＣＮＤ３をノックダウンした。ＣＣＮＤ３のノックダウンが１２の被験細胞系全てにおいて細胞の増殖を著明に阻害したことから、マウスでのデータが確認され、ヒトＴ細胞性悪性腫瘍におけるＣＣＮＤ３の重要性が実証された。
【０００５】
ＤＮＡシークエンシング技術の容易さが向上し、速度が増大し、費用が低廉化したことから、調査者は、がん細胞の全ゲノムを、変化について検討することが可能となっている。このアプローチを利用して、２つの研究グループが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ：ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）の全ゲノム解析を、このがんの一因となりうる特異的な遺伝子および経路を見い出すために実施した（Pasqualucciら、Nature Genetics  2011、43（9）: 830〜837: Morinら、Nature  2011、476:298〜303）。このアプローチにより、５４例の被験ＤＬＢＣＬ中の３例において、ＣＣＮＤ３突然変異が見出された。
【０００６】
本開示では、ＣＣＮＤ３突然変異をバイオマーカーまたは指標として使用して、患者を特異的な治療について予測し、特異的な治療の標的とする。どの患者に治療剤を施すべきなのかを示すバイオマーカーを見い出すことは、とりわけ、がんに関して有用である。このようなアプローチにより、試行錯誤によるアプローチとは対照的に、より時宜にかない積極的な処置が可能とされる。加えて、投与後に細胞が治療に対して感受性であり続けることを示すバイオマーカーの発見もまた有用である。これらのバイオマーカーを使用して、治療剤を施される患者の応答をモニタリングすることができる。バイオマーカーが、患者が処置に対して非感受性となったことを示す場合は、投与される用量を増大させることもでき、減少させることもでき、中止することもでき、さらなる治療剤を投与することもできる。そのようなものとして、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ：Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ）阻害剤と関連するバイオマーカーを開発することが必要とされている。このアプローチにより、適正な患者に適切な処置を施すことが確保され、処置コースにおいて患者をＣＤＫ阻害剤に対する感受性の持続についてモニタリングすることができる。
【０００７】
ＣＤＫ阻害剤の開発において、特異的なバイオマーカーは、投与時における作用機構の理解の一助となるであろう。作用機構は、細胞周期および差次的な遺伝子発現調節機構の複雑なカスケードを伴いうる。この解析は、がん細胞のＣＤＫ阻害剤候補物質に対する特定の感受性および候補物質の活性を決定するために、薬物開発の前臨床段階でなされる。薬力学的な調査において特に興味深いのは、本明細書で開示されるマーカーなどの、感受性および活性の特異的なマーカーの同定である。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、サイクリンＤ３（以下では、「ＣＣＮＤ３」と称する）のＰＥＳＴドメイン内の突然変異が、サイクリン依存性キナーゼ４および／またはサイクリン依存性キナーゼ６の阻害剤（以下では、「ＣＤＫｉ：Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」と称する）に対する細胞の感受性の決定において特異的なバイオマーカーとして作用することを提示する。本開示は、どのがん細胞がＣＤＫｉに対して感受性であるのかを予測するときの精度および特異性を増大させたＣＤＫｉについての「遺伝子署名」（gene signature）を結果としてもたらす、ＣＣＮＤ３突然変異解析を含む。方法では、患者から採取され、非がん性対照または正常対照と比較される、がん試料中のＰＥＳＴドメイン内のＣＣＮＤ３突然変異について解析し、がん試料のＣＤＫｉに対する感受性を予測する。ＣＣＮＤ３突然変異の解析は、好適な応答を示す場合もあり、好適でない応答を示す場合もある。本発明は、患者を、その個体に特異的な機能的ゲノム署名に基づき処置する「個別化医療」（personalized medicine）の例である。
【０００９】
ＣＣＮＤ３突然変異の予測的価値はまた、ＣＤＫｉによる処置後において、患者が処置に対する感受性を維持しているのかどうかを決定するのにも使用することができる。ＣＤＫｉ治療剤を投与したら、ＣＣＮＤ３突然変異を、患者のＣＤＫｉ処置に対する感受性の持続についてモニタリングするバイオマーカーとして使用することができる。これは、患者が適正な処置コースを施されていることを決定するのに有用である。本開示は、患者のＣＤＫｉ処置に対する感受性を予測し、モニタリングする方法を含む。方法は、ＣＤＫｉの患者への投与ステップと、処置される患者から得られた生物学的試料におけるＣＣＮＤ３突然変異について解析するステップと、ＣＣＮＤ３突然変異を非がん性試料中または正常試料中のＣＣＮＤ３と比較するステップとを含む。患者の応答は、ＰＥＳＴドメイン内のＣＣＮＤ３突然変異の検出に基づき評定する。加えて、ＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞に由来するＣＣＮＤ３タンパク質の発現レベルの、正常対照細胞もしくは野生型対照細胞と比較した検出および／または変化は、患者の処置に対する感受性を予測することができる。ＣＣＮＤ３の突然変異体タンパク質の発現レベル変化のパターンは、好適な患者応答を示す場合もあり、好適でない患者応答を示す場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＣＣＮＤ３タンパク質およびある種の突然変異についての図解である。ＣＣＮＤ３のＰＥＳＴドメインとは、ヒトＣＣＮＤ３のアミノ酸２５６〜２６８および２７１〜２９１である。
【図２Ａ】野生型ＣＣＮＤ３を含有する細胞の細胞生存率についてのグラフであって、ＣＤＫｉ（１）に対する非感受性を実証するグラフである。
【図２Ｂ】突然変異体ＣＣＮＤ３を含有する細胞の細胞生存率についてのグラフであって、ＣＤＫｉ（１）に対する感受性を実証するグラフである。
【図２Ｃ】ＣＤＫｉ（１）により処置された野生型ＣＣＮＤ３細胞系および突然変異ＣＣＮＤ３細胞系のＥＣ５０値についてのボックスプロットである。
【図３Ａ】野生型ＣＣＮＤ３を含有する細胞の細胞生存率についてのグラフであって、ＣＤＫｉ（２）に対する非感受性を実証するグラフである。
【図３Ｂ】突然変異体ＣＣＮＤ３を含有する細胞の細胞生存率についてのグラフであって、ＣＤＫｉ（２）に対する感受性を実証するグラフである。
【図３Ｃ】ＣＤＫｉ（２）により処置された野生型ＣＣＮＤ３細胞系および突然変異ＣＣＮＤ３細胞系のＥＣ５０値についてのボックスプロットである。
【図４Ａ】野生型ＣＣＮＤ３を含有する細胞の細胞生存率についてのグラフであって、ＣＤＫｉ（３）に対する非感受性を実証するグラフである。
【図４Ｂ】突然変異体ＣＣＮＤ３を含有する細胞の細胞生存率についてのグラフであって、ＣＤＫｉ（３）に対する非感受性を実証するグラフである。
【図４Ｃ】ＣＤＫｉ（３）により処置された野生型ＣＣＮＤ３細胞系および突然変異ＣＣＮＤ３細胞系のＥＣ５０値についてのボックスプロットである。
【図５Ａ】ＣＣＮＤ３３突然変異が、タンパク質の安定性の増大を結果としてもたらすことを実証するウェスタンブロットである。
【図５Ｂ】ＣＣＮＤ３３突然変異が、タンパク質の安定性の増大を結果としてもたらすことを実証するウェスタンブロットである。
【図６Ａ】ＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞が、高レベルのＣＣＮＤ３突然変異体タンパク質を結果としてもたらすことを示すウェスタンブロットである。
【図６Ｂ】野生型の細胞系およびＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞系におけるｍＲＮＡ発現についてのグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
がん細胞の、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫｉ）に対する感受性を決定する方法であって、ａ）がん細胞内のサイクリンＤ３（ＣＣＮＤ３）の突然変異についてアッセイするステップと、ｂ）ＣＣＮＤ３突然変異を、非がん性細胞または正常な対照細胞と比較するステップとを含み、がん細胞内のＣＣＮＤ３突然変異の存在が、がん細胞がＣＤＫｉに対して感受性であることを示す方法。
【００１２】
がん細胞が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される当該方法。
【００１３】
ＣＣＮＤ３突然変異が、ＰＥＳＴドメイン内にある当該方法。
【００１４】
ＣＣＮＤ３突然変異が、配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である当該方法。
【００１５】
ＣＣＮＤ３突然変異が、配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である当該方法。
【００１６】
ＣＣＮＤ３突然変異が、表２における任意の突然変異である当該方法。
【００１７】
ＣＣＮＤ３突然変異が、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される当該方法。 
【００１８】
ＣＤＫｉが、表１から選択される当該方法。
【００１９】
がん患者のＣＤＫｉによる処置に対する感受性を予測する方法であって、ａ）患者から得られたがん試料中のＣＣＮＤ３突然変異についてアッセイするステップと、ｂ）ＣＣＮＤ３突然変異を、非がん性試料または正常な対照試料と比較するステップとを含み、がん試料中のＣＣＮＤ３突然変異の存在が、患者がＣＤＫｉによる処置に対して感受性であることを示す方法。
【００２０】
がん試料が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される当該方法。
【００２１】
ＣＣＮＤ３突然変異が、ＰＥＳＴドメイン内にある当該方法。
【００２２】
ＣＣＮＤ３突然変異が、配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である当該方法。
【００２３】
ＣＣＮＤ３突然変異が、配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である当該方法。
【００２４】
ＣＣＮＤ３突然変異が、表２における任意の突然変異である当該方法。
【００２５】
ＣＣＮＤ３突然変異が、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される当該方法。 
【００２６】
ＣＤＫｉが、表１から選択される当該方法。
【００２７】
ｃ）患者から得られたがん試料中のＣＣＮＤ３の差次的なタンパク質発現を測定するステップと、ｄ）がん試料中のＣＣＮＤ３タンパク質の発現を、非がん性試料または正常な対照試料によるＣＣＮＤ３タンパク質発現と比較するステップとをさらに含み、がん試料中のＣＣＮＤ３タンパク質レベルの増大が、患者がＣＤＫｉによる処置に対して感受性であることを示す当該方法。
【００２８】
がん患者をＣＤＫｉで処置する方法であって、ａ）患者から得られたがん試料中のＣＣＮＤ３突然変異についてアッセイするステップと、ｂ）がん試料中のＣＣＮＤ３突然変異状態を、非がん性試料または正常な対照試料と比較するステップであり、ＣＣＮＤ３突然変異の存在が、患者がＣＤＫｉによる処置に対して感受性であることを示すステップと、ｃ）患者にＣＤＫｉを投与するステップと、ｄ）腫瘍成長の抑制についてアッセイするステップとを含む方法。
【００２９】
がん試料が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される当該方法。
【００３０】
ＣＣＮＤ３突然変異が、ＰＥＳＴドメイン内にある当該方法。
【００３１】
ＣＣＮＤ３突然変異が、配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である当該方法。
【００３２】
ＣＣＮＤ３突然変異が、配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である当該方法。
【００３３】
ＣＣＮＤ３突然変異が、表２における任意の突然変異である当該方法。
【００３４】
ＣＣＮＤ３突然変異が、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される当該方法。 
【００３５】
ＣＤＫｉを、治療有効量で投与する当該方法。
【００３６】
ＣＤＫｉが、表１から選択される当該方法。
【００３７】
ＣＤＫｉ候補物質をスクリーニングする方法であって、ａ）ＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞を、ＣＤＫｉ候補物質と接触させるステップと、ｂ）細胞生存率の低減を測定するステップと、ｃ）ＣＤＫｉ候補物質と接触させたＣＣＮＤ３突然変異細胞による細胞生存率の低減を、対照のＣＤＫｉと接触させたＣＣＮＤ３突然変異細胞による細胞生存率と比較するステップとを含む方法。
【００３８】
対照のＣＤＫｉが、表１から選択される当該方法。
【００３９】
ＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される当該方法。
【００４０】
ＣＣＮＤ３突然変異が、ＰＥＳＴドメイン内にある当該方法。
【００４１】
ＣＣＮＤ３突然変異が、配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である当該方法。
【００４２】
ＣＣＮＤ３突然変異が、配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である当該方法。
【００４３】
ＣＣＮＤ３突然変異が、表２における任意の突然変異である当該方法。
【００４４】
ＣＣＮＤ３突然変異が、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される当該方法。 
【００４５】
選択されたがん患者の集団のがんの処置に使用するためのＣＤＫｉを含む組成物であって、がん患者の集団が、前記患者から得られたがん細胞試料中の、正常な対照細胞試料と比較したＣＣＮＤ３突然変異を示すことに基づき選択される組成物。
【００４６】
がん試料が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される当該組成物。
【００４７】
がん患者のＣＤＫｉによる処置に対する感受性を予測するためのキットであって、ｉ）ＣＣＮＤ３突然変異を検出するための手段と、ｉｉ）前記キットの使用法についての指示書とを含むキット。
【００４８】
定義
本明細書および特許請求の範囲で使用される、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（the）」は、文脈により別段であることが明確に指示されない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、「細胞（a cell）」という用語は、それらの混合物を含む複数の細胞を含む。
【００４９】
範囲を含む全ての数値の指定、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、０．１の増分だけ（＋）または（−）に変化する概数である。常に明示的に言明されるわけではないが、全ての数値の指定には、「約」という用語を先立たせていることを理解されたい。常に明示的に言明されるわけではないが、本明細書で記載される試薬は、単に例示的なものであり、当技術分野では、このような試薬の同等物が公知であることもまた理解されたい。
【００５０】
本明細書では、「マーカー」または「バイオマーカー」という用語を互換的に使用する。バイオマーカーとは、核酸またはポリペプチドであり、ポリペプチドの突然変異または差次的発現の存在または非存在を使用して、任意のＣＤＫｉに対する感受性を決定する。例えば、ＣＣＮＤ３は、それが、正常（非がん性）細胞内または対照細胞内のＣＣＮＤ３と比較して突然変異していれば、がん細胞内のバイオマーカーである。
【００５１】
細胞は、ＣＤＫｉで処置したときに、細胞の生存率が、処置されていない対照と比較して低減されれば、ＣＤＫｉによる阻害について「感受性」であるかまたは「感受性」を表示する。
【００５２】
「ＣＣＮＤ３」とは、サイクリンＤ３遺伝子を指す。別段に具体的に言明されない限り、本明細書で使用されるＣＣＮＤ３とは、ヒトＣＣＮＤ３、受託番号ＢＣ０１１６１６（ＣＣＮＤ３の核酸（配列番号１））およびＡＡＨ１１６１６（ＣＣＮＤ３タンパク質（配列番号２））を指す。
【００５３】
「野生型」、「正常な」、または「非突然変異体」とは、受託番号ＢＣ０１１６１６／ＡＡＨ１１６１６（それぞれ、核酸（配列番号１）およびタンパク質（配列番号２））を含むＣＣＮＤ３の配列を指す。
【００５４】
「突然変異体」（mutant）または「突然変異」（mutation）とは、ＤＮＡ配列中またはタンパク質配列中の任意の変化であって、野生型ＣＣＮＤ３から逸脱する変化である。これは、限定されることなく、ＣＣＮＤ３遺伝子およびその対応するタンパク質における、単一塩基の核酸変化または単一のアミノ酸の変化、挿入、欠失、および切断を含む。
【００５５】
「対照細胞」、「正常細胞」、または「野生型」とは、非がん性組織または非がん性細胞を指す。
【００５６】
「対照組織」、「正常組織」、または「野生型」とは、非がん性組織または非がん性細胞を指す。
【００５７】
「核酸」という用語と「ポリヌクレオチド」という用語とは、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはこれらの類似体である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することが可能であり、任意の機能を果たしうる。遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴタグ、またはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーは、ポリヌクレオチドの非限定例である。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド、およびヌクレオチド類似体を含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリーの前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素により中断することができる。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素とのコンジュゲーションなどにより、重合化の後でさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子のいずれも指す。別段に指定または要請されない限り、ポリヌクレオチドである、本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々のいずれも包含する。
【００５８】
「遺伝子」とは、転写および翻訳された後で、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることが可能な、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列を使用して、それらが関連する遺伝子のより大型の断片または全長コード配列を同定することができる。当業者には、より大型の断片の配列を単離する方法が公知である。
【００５９】
「遺伝子発現」または、代替的に「遺伝子産物」とは、遺伝子が転写および翻訳されるときに産生される核酸またはアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。
【００６０】
「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」という用語と互換的に使用され、その最も広い意味において、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合により連結することができる。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル結合、エーテル結合などにより連結することもできる。
【００６１】
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸、Ｄ光学異性体およびＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体、ならびにペプチド模倣体を指す。３つ以上のアミノ酸によるペプチドは一般に、ペプチド鎖が短い場合は、オリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは一般に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００６２】
「単離」という用語は、天然では通常、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはこれらの断片が会合している細胞構成物質または他の形の構成物質から分離されていることを意味する。例えば、単離ポリヌクレオチドは、その自然または天然の環境では、例えば、染色体上では通常会合している、３’側および５’側の隣接するヌクレオチドから分離されている。当業者には明らかである通り、非自然発生のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはこれらの断片は、それをその自然発生の対応物と識別する「単離」を必要としない。加えて、「濃縮」、「分離」、または「希釈」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはこれらの断片は、容量当たりの分子の濃度もしくは数が、「濃縮」形ではその自然発生の対応物の容量当たりの分子の濃度もしくは数を超えるか、または「分離」形ではその自然発生の対応物の容量当たりの分子の濃度もしくは数未満であるという点でも、その自然発生の対応物から識別可能である。その一次配列により、または、例えば、そのグリコシル化パターンにより自然発生の対応物と異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはこれらの断片は、その一次配列により、または、代替的に、グリコシル化パターンなど、別の特徴により、その自然発生の対応物から識別可能であるので、その単離形態で存在する必要がない。したがって、非自然発生のポリヌクレオチドは、単離された自然発生のポリヌクレオチドとは別個の実施形態として提供される。細菌細胞内で産生されるタンパク質は、それが天然において産生される真核細胞から単離された自然発生のタンパク質とは別個の実施形態として提供される。
【００６３】
ポリヌクレオチド操作の文脈で使用される場合の「プローブ」とは、標的とハイブリダイズすることにより、対象の試料中に潜在的に存在する標的を検出する試薬として提供されるオリゴヌクレオチドを指す。通常、プローブは、標識、またはハイブリダイゼーション反応の前もしくは後において標識を接合させうる手段を含むであろう。適切な標識は、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質を含むがこれらに限定されない。
【００６４】
「プライマー」とは、標的とハイブリダイズすることにより、対象の試料中に潜在的に存在する標的または「鋳型」に結合し、その後、標的と相補的なポリヌクレオチドの重合化をプロモートする、遊離３’−ＯＨ基を一般に伴う短いポリヌクレオチドである。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」）とは、「上流」プライマーおよび「下流」プライマーからなる「プライマー対」または「プライマーセット」、ならびにＤＮＡポリメラーゼ、および、典型的に、熱安定性のポリメラーゼ酵素など、重合化の触媒を使用して、レプリケートコピーを、標的ポリヌクレオチドから作製する反応である。当技術分野では、ＰＣＲのための方法が周知であり、例えば、PCR: A Practical Approach、M. MacPhersonら、IRL Press at Oxford University Press（1991）において教示されている。本明細書では、ＰＣＲまたは遺伝子クローニングなど、ポリヌクレオチドのレプリケートコピーを作製する全ての工程を、「複製」と総称する。プライマーはまた、サザンブロット解析またはノーザンブロット解析など、ハイブリダイゼーション反応におけるプローブとしても使用することができる（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2版（1989））。
【００６５】
本明細書で使用される「発現」とは、ＤＮＡをｍＲＮＡへと転写する工程および／または転写されたｍＲＮＡをその後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳する工程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞内のｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【００６６】
遺伝子に適用される「差次的発現」（differentially expressed）とは、遺伝子から転写および／もしくは翻訳されるｍＲＮＡまたは遺伝子によりコードされるタンパク質産物の差次的産生を指す。差次的に発現する遺伝子は、正常細胞または対照細胞の発現レベルと比較して、過剰発現する場合もあり、過小発現する場合もある。しかし、本明細書で使用される過剰発現とは、遺伝子発現の増大であり、一般に、正常細胞もしくは正常組織または対照の対応する細胞もしくは組織において検出される発現の、少なくとも１．２５倍、または、代替的に、少なくとも１．５倍、または、代替的に、少なくとも２倍、または、代替的に、少なくとも３倍、または、代替的に、少なくとも４倍の発現である。本明細書で使用される過小発現とは、遺伝子発現の低減であり、一般に、正常細胞もしくは正常組織または対照の対応する細胞もしくは組織において検出される発現の、少なくとも１．２５分の１、または、代替的に、少なくとも１．５分の１、または、代替的に、少なくとも２分の１、または、代替的に、少なくとも３分の１、または、代替的に、少なくとも４分の１の発現である。「差次的発現」という用語はまた、がん細胞内またはがん性組織内の発現は検出されるが、対照細胞内または正常組織（例えば、非がん性細胞または非がん性組織）内の発現は検出不能な発現も指す。
【００６７】
遺伝子の高発現レベルは、遺伝子の過剰発現または遺伝子コピー数の増大のために生じうる。遺伝子はまた、負の調節因子の脱制御または非存在のために、タンパク質のレベルが増大して翻訳される場合もある。最後に、遺伝子の高発現は、タンパク質の蓄積を結果としてもたらす、タンパク質の安定化の増大またはタンパク質の分解の低減に起因して生じる場合もある。
【００６８】
「遺伝子発現プロファイル」または「遺伝子署名」とは、少なくとも１つのバイオマーカーの発現のパターンであって、突然変異、特定の処置に対する応答、または細胞内の特定の生物学的過程もしくは生物学的経路の活性化など、複数の試料中で反復され、これらの試料により共有される特性を反映するパターンを指す。遺伝子発現プロファイルは、その共通の特性を共有する試料と、その共通の特性を共有しない試料との間を、試料を２つの群へとランダムに割り当てることにより達成されるだろう精度よりも良い精度で差別化する。遺伝子発現プロファイルは、未知の状態の試料が、その共通の特性を共有するのか否かを予測するのに使用することができる。バイオマーカーと典型的なプロファイルとの間では、ある程度のばらつきが予測されるのであるが、バイオマーカーのプロファイルの典型的なプロファイルに対する全体的な類似性は、そのバイオマーカーが反映する共通の特性を共有しない試料中で類似性が偶然に観察される可能性があるような統計学的にはありそうにない類似性である。
【００６９】
「ｃＤＮＡ」という用語は、相補的ＤＮＡを指す、すなわち、細胞内または生物内に存在するｍＲＮＡ分子は、逆転写酵素などの酵素によりｃＤＮＡとされる。「ｃＤＮＡライブラリー」とは、細胞内または生物内に存在するｍＲＮＡ分子の全てのコレクションであって、全てが、逆転写酵素である酵素によりｃＤＮＡ分子へと転換され、次いで、「ベクター」（外来ＤＮＡを付加した後で複製され続けうる他のＤＮＡ分子）へと挿入されるコレクションである。ライブラリーのための例示的なベクターは、細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ（「ファージ」としてもまた公知である）、例えば、ラムダファージを含む。次いで、ライブラリーを、対象の特異的なｃＤＮＡ（したがって、ｍＲＮＡ）についてプローブすることができる。
【００７０】
本明細書で互換的に使用される「固相支持体」または「固体支持体」は、支持体の特殊な種類に限定されない。そうではなくて、多数の支持体が利用可能であり、当業者に公知である。固相支持体は、シリカゲル、樹脂、誘導体化されたプラスチック製薄膜、ガラス製ビーズ、プラスチックビーズ、アルミナゲル、マイクロアレイ、およびチップを含む。本明細書で使用される「固体支持体」はまた、合成の抗原提示マトリックス、細胞、およびリポソームも含む。適切な固相支持体は、所望の使用目的および多様なプロトコールに対する適性に基づいて選択することができる。例えば、ペプチド合成では、固相支持体は、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られるＰＡＭ樹脂）、ポリＨＩＰＥ（商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ、Ｃａｎａｄａから得られる）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）、ポリエチレングリコールをグラフトしたポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌＲ（商標）、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得られる）などの樹脂を指す場合がある。
【００７１】
ポリヌクレオチドはまた、ハイスループットスクリーニングアッセイにおける使用のための固体支持体へも接合させることができる。ＰＣＴ  ＷＯ９７／１０３６５は、例えば、高密度オリゴヌクレオチドチップの構築について開示する。米国特許第５，４０５，７８３号；同第５，４１２，０８７号；および同第５，４４５，９３４号もまた参照されたい。この方法を使用して、誘導体化されたガラス表面上でプローブを合成して、チップアレイを形成する。光保護されたヌクレオシドホスホルアミダイトを、フォトリソグラフィーマスクを介する光分解により選択的に脱保護されたガラス表面へとカップリングさせ、第２の保護されたヌクレオシドホスホルアミダイトと反応させる。所望のプローブが完成するまで、カップリング／脱保護工程を反復する。
【００７２】
例として述べると、転写活性は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＨＧ−Ｕ１３３−Ｐｌｕｓ−２  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）などの遺伝子チップを使用して、メッセンジャーＲＮＡのレベルを測定することにより評価することができる。このようにして、膨大な数の対象の遺伝子のＲＮＡのハイスループットでリアルタイムの定量化が、再現可能なシステムにおいて可能となる。
【００７３】
「厳密なハイブリダイゼーション条件」という用語は、核酸プローブが、その標的の部分配列と特異的にハイブリダイズし、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ハイブリダイゼーションの厳密性を決定する条件は、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度を含む。これらの因子のうちの１つを変化させることにより、別の因子に影響を及ぼすことが可能であり、当業者は、所望の厳密性のレベルを維持する条件の変化を察知するであろう。高度に厳密なハイブリダイゼーションの例は、６５〜６８℃の０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、または４２℃の０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％のホルムアミド（Sambrook、前出を参照されたい）である。「中程度に厳密な」ハイブリダイゼーションの例は、５０〜６５℃の０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、または３７〜５０℃の０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および２０％のホルムアミドによる条件である。中程度に厳密な条件は、中程度量の核酸のミスマッチが所望される場合に使用する。当業者は、洗浄がハイブリダイゼーション条件の一部であることを察知するであろう。例えば、洗浄条件は、０２．倍濃度〜０．１倍濃度のＳＳＣ／０．１％のＳＤＳおよび４２〜６８℃の温度を含むことが可能であり、この場合、温度の上昇により、洗浄条件の厳密性が増大する。
【００７４】
ハイブリダイゼーションを２つの一本鎖ポリヌクレオチドの間のアンチパラレルの構成で行う場合、反応を「アニーリング」と呼び、これらのポリヌクレオチドを「相補的」と記載する。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの鎖のうちの１つとの間で生じうる場合、別のポリヌクレオチドと「相補的」または「相同的」でありうる。「相補性」または「相同性」（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に許容されている塩基対合規則に従い、互いと水素結合を形成することが予測される、対向する鎖内の塩基の比率との関係で定量化可能である。
【００７５】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）が、別の配列に対してある百分率（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）の「配列同一性」を有するとは、整列して、２つの配列を比較すると、その百分率の塩基（またはアミノ酸）が同じであることを意味する。このアライメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編（1987）付録30、7.7.18節、表7.7.1において記載されているソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。アライメントにはデフォルトのパラメータを使用することが好ましい。好ましいアライメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータ：Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔを使用する、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。
【００７６】
「細胞増殖性障害」という用語は、異常な細胞成長および／もしくは細胞分裂または機能の喪失を特徴とする、正常な生理学的機能の調節異常を含むものとする。「細胞増殖性障害」の例は、過形成、新生物、化生、および多様な自己免疫障害、例えば、Ｔ細胞アポトーシスの調節異常を特徴とする細胞増殖性障害を含むがこれらに限定されない。
【００７７】
本明細書で使用される「新生物性細胞」、「新生物性疾患」、「新生物」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「がん」、および「がん細胞」（互換的に使用される）という用語は、それらが、細胞増殖の制御の著明な喪失（すなわち、無調節の細胞分裂）を特徴とする異常な成長表現型を呈示するように、比較的自律的な成長を呈示する細胞を指す。新生物性細胞は、悪性の場合もあり、良性の場合もある。「転移性細胞または転移性組織」とは、細胞が近傍の体内構造に浸潤してこれらを破壊しうることを意味する。がんは、限定されることなく、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫を含みうる。
【００７８】
「ＰＢＭＣ」という用語は、末梢血単核細胞を指し、「ＰＢＬ」末梢血リンパ球を含む。
【００７９】
腫瘍成長を「抑制すること」または腫瘍成長の「抑制」とは、ＣＤＫｉと接触させたときの、腫瘍細胞成長の、ＣＤＫｉ化合物と接触させなかったときの腫瘍成長と比較した低減を示す。腫瘍細胞成長は、腫瘍サイズを測定すること、３Ｈ−チミジン取込みアッセイを使用して、腫瘍細胞が増殖しつつあるのかどうかを決定すること、ＦＤＧ−ＰＥＴ（フルオロデオキシグルコースポジトロン放射断層）造影によりブドウ糖の取込みを測定すること、または腫瘍細胞をカウントすることを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の手段により評価することができる。腫瘍細胞成長を「抑制すること」とは、腫瘍成長の緩徐化、遅延、停止、ならびに腫瘍の退縮のうちのいずれかまたは全ての状態を意味する。
【００８０】
「組成物」とは、活性薬剤と別の担体、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性の溶媒、保存剤、アジュバントなど、不活性（例えば、検出可能な薬剤または標識）または活性の化合物または組成物との組合せである。担体はまた、医薬賦形剤および添加剤、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、単糖およびオリゴ糖を含む糖；アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖などなどの誘導体化された糖；ならびに多糖または糖ポリマー）も含み、単独で存在させることもでき、組合せで存在させることもでき、単独または重量もしくは容量で１〜９９．９９％の組合せを含む。炭水化物賦形剤は、例えば、果糖、マルトース、ガラクトース、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖；ならびにマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、およびミオイノシトールなどのアルジトールを含む。
【００８１】
例示的なタンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）などの血清アルブミン、ゼラチン、カゼインなどを含む。緩衝能においてもまた機能しうる代表的なアミノ酸／抗体成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどを含む。
【００８２】
「担体」という用語は、緩衝剤またはｐＨ調整剤をさらに含み、典型的には、緩衝剤とは、有機酸または有機塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤は、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、またはフタル酸の塩などの有機酸塩；トリス緩衝剤、トロメタミン塩酸緩衝剤、またはリン酸緩衝剤を含む。さらなる担体は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、２−ヒドロキシプロピル−クアドラチュア（qudrature）−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコールなどのポリマー賦形剤／添加剤、芳香剤、抗微生物剤、甘味剤、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０（商標）およびＴＷＥＥＮ８０（商標）などのポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、およびキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含む。
【００８３】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩液、水、および水中油エマルジョンまたは油中水エマルジョンなどのエマルジョン、ならびに多様な種類の保湿剤など、標準的な医薬担体のうちのいずれかを包含する。組成物はまた、安定化剤および保存剤も含む場合があり、それらがｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用に許容可能であるというさらなる条件を伴い、上記で言及した担体のうちのいずれかも含む場合がある。担体、安定化剤、およびアジュバントの例については、Remington’s Pharmaceutical Science、15版（Mack Publ. Co.、Easton（1975））；およびPhysician’s Desk Reference、52版、Medical Economics、Montvale、N.J.（1998）を参照されたい。
【００８４】
「有効量」とは、有益であるかまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与で投与することもでき、１回または複数回の適用で投与することもでき、１または複数の投与量で投与することもできる。
【００８５】
本明細書では、「対象」、「個体」、または「患者」は、互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトを指す。哺乳動物は、マウス、サル、ヒト、農場動物、競技動物、およびペットを含むがこれらに限定されない。
【００８６】
本明細書で使用されるＣＤＫの「阻害剤」（ＣＤＫｉ）は、ＣＣＮＤ３とＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６との会合を低減する。この阻害は、例えば、ＣＣＮＤ３とＣＤＫ４／６との会合を、それらが一体に結合する前に低減すること、またはＣＣＮＤ３とＣＤＫ４／６との会合を、それらが一体に結合した後で低減すること、したがって、両方の分子を遊離させることを含みうる。低減は、低量であるが検出可能な量の低減から分子の完全な解離の範囲でありうる。
【００８７】
多数のＣＣＮＤ３突然変異が、ＣＤＫｉについてのバイオマーカーとして同定されている。ＰＥＳＴドメイン内のＣＣＮＤ３突然変異を使用して、患者の任意のＣＤＫｉに対する感受性を決定することができる。ＣＣＮＤ３突然変異は、限定されることなく、ＰＥＳＴドメイン内の挿入、欠失、フレームシフト、および１または複数の点突然変異を含む。例えば、ＰＥＳＴドメイン内のＣＣＮＤ３突然変異は、限定されることなく、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）を含む。例えば、ＣＣＮＤ３のＰＥＳＴドメイン内のアミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの突然変異（Ｉ２９０Ｔ）は、がん患者が、任意のＣＤＫｉの投与に対して感受性であり、これに対して好適に応答することを示す。
【００８８】
ＣＤＫ阻害剤（ＣＤＫｉ）とは、ＣＣＮＤ３−ＣＤＫ４／６間の会合の阻害剤である化合物であり、本発明の方法を伴うと有用である。ＣＤＫｉは、ヒトにおける使用または獣医科における使用であって、ＣＣＮＤ３−ＣＤＫ４／６間の会合の阻害が適応である使用、例えば、腫瘍および／またはがん性細胞の成長の処置における使用のための医薬組成物中で有用である。ＣＤＫｉ化合物は、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫の処置において有用である。
【００８９】
表１：ＣＤＫｉ化合物
ＣＤＫｉ（１）
【００９０】
【化１】
0006387001.tif 000002
ＣＤＫｉ（２）
【００９１】
【化２】
0006387001.tif 000003
ＣＤＫｉ（３）
【００９２】
【化３】
0006387001.tif 000004
ＣＤＫｉ（４）
【００９３】
【化４】
0006387001.tif 000005
【００９４】
【表１】
0006387001.tif 000006
【００９５】
ＣＣＮＤ３突然変異の検出
ＣＣＮＤ３突然変異の検出は、任意の数の方途、例えば、ＤＮＡシークエンシング、ＲＴ−ＰＣＲを含むＰＣＲベースの方法、マイクロアレイ解析、サザンブロット法、ノーザンブロット法、およびディップスティック解析により行うことができる。
【００９６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、腫瘍組織から抽出されたゲノムＤＮＡまたはＲＮＡに由来するＣＣＮＤ３突然変異を増幅および同定することができる。当技術分野では、ＰＣＲが周知であり、Saikiら、Science  1988、239:487；ならびに米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０３号において詳細に記載されている。
【００９７】
ＣＣＮＤ３突然変異をハイブリダイゼーションにより検出する方法が提供される。その方法には、試料に由来する核酸を、ＣＣＮＤ３突然変異を伴う核酸またはその断片とハイブリダイズすることが可能な核酸プローブと接触させ、ハイブリダイゼーションを検出することにより、試料中のＣＣＮＤ３突然変異を同定するステップが含まれる。核酸プローブは、放射性同位元素、蛍光剤、または発色剤などの標識で検出可能に標識される。放射性同位元素は、限定されることなく、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、および３５Ｓなどを含みうる。蛍光剤は、限定されることなく、ＦＩＴＣ、テキサスレッド、ローダミンなどを含みうる。
【００９８】
検出において使用されるプローブであって、ＣＣＮＤ３突然変異を伴う核酸とハイブリダイズすることが可能なプローブは、約８ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約７５ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、または約２０〜約３０ヌクレオチドでありうる。１または複数のプローブは、ＣＣＮＤ３突然変異とハイブリダイズするかまたはこれと隣接してハイブリダイズする、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含むキットにより提供することができる。キットはまた、ＣＣＮＤ３突然変異を含有しうる患者のがん試料を解析するための指示書も提供することが可能であり、そのＣＣＮＤ３突然変異により、患者がＣＤＫｉによる処置に対して感受性または非感受性であることが指し示される。
【００９９】
一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）もまた、ＣＣＮＤ３突然変異を検出するのに使用することができる。この技法は、Oritaら、PNAS  1989、86:2766〜2770において十分に記載されている。
【０１００】
ＣＣＮＤ３を指向する抗体は、がんの検出およびＣＣＮＤ３の突然変異形態の検出において有用でありうる。ＣＣＮＤ３の特異的な突然変異体だけを認識し、ＣＣＮＤ３の特異的な突然変異体だけに特異的に結合し、野生型ＣＣＮＤ３には結合しない（または弱く結合する）抗体を作り出すことができる。これらの抗体であれば、どの特異的な突然変異が存在するのかを決定するのに有用であろうし、ＣＣＮＤ３タンパク質のレベルを定量化するのにも有用であろう。例えば、抗体は、２９０位のアミノ酸におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）を指向しうる。このアミノ酸変化を認識し、野生型ＣＣＮＤ３には特異的に結合しない抗体であれば、組織切片内の特異的な突然変異を同定しうるであろうし、ウェスタンブロット法により、タンパク質レベルもまた同定しうるであろう。ＣＣＮＤ３突然変異に対するこのような抗体は、対象の特異的なＣＣＮＤ３突然変異を含有するペプチドを使用することにより作り出すことができる。
【０１０１】
当技術分野では、リン酸化されたエピトープとリン酸化されていないエピトープとを識別しうる抗体が公知である（Lucaら、PNAS USA  1986 83（4）:1006〜1010）。ＰＥＳＴドメイン内の２８３位のトレオニン（Ｔ２８３）におけるＣＣＮＤ３の非リン酸化形態を指向する抗体はまた、ＣＣＮＤ３の突然変異体形態の検出においても有用でありうる。例えば、ＰＥＳＴドメイン内のＣＣＮＤ３の突然変異は、Ｔ２８３のリン酸化を低減または防止しうる。ＣＣＮＤ３の突然変異体形態だけを認識する抗体と組み合わされた、ＣＣＮＤ３の非リン酸化形態だけを認識する抗体による染色手順によれば、患者試料がＣＤＫｉに対して感受性であることがさらに検証および確認されるであろう。別の例では、上記で記載した標準的なＰＣＲ技法を使用して、ＰＣＲをがん試料に対して実施して、ＣＣＮＤ３突然変異を検出しうるであろう。ＰＣＲによりＣＣＮＤ３突然変異が指し示されれば、リン酸化されたエピトープを指向する抗ＣＣＮＤ３抗体により、がん試料のタンパク質について解析することができる。ＰＣＲ反応による陽性の結果および抗体による陽性の染色であって、ＣＣＮＤ３がリン酸化されていないことを示す結果および染色によれば、患者がＣＤＫｉによる処置に対して感受性であることが決定されるであろう。
【０１０２】
ＣＣＮＤ３突然変異を含有すると考えられるがん細胞を溶解させ、野生型ＣＣＮＤ３を含有する細胞を対照として使用してウェスタンブロット法を実施して、ＣＣＮＤ３の突然変異体タンパク質の量を定量化することができる。がん細胞内で、正常細胞内の野生型ＣＣＮＤ３と比較して高いタンパク質レベルが検出されることと組み合わせて、ＣＣＮＤ３のリン酸化形態がほとんどまたは全く検出されなければ、がん細胞内のＣＣＮＤ３において、リン酸化を低減または阻止する突然変異が生じており、したがって、このがん細胞であれば、ＣＤＫｉに対して感受性であることが指し示されるであろう。
【０１０３】
遺伝子発現の測定
遺伝子発現の検出は、例えば、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量、または遺伝子から転写されるｍＲＮＡの逆転写から産生されるｃＤＮＡの量、または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の量の検出を含む、任意の適切な方法を介することが可能である。これらの方法は、試料ごとのベースで実施することもでき、ハイスループット解析のために改変することもできる。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）Ｕ１３３マイクロアレイチップを使用して、実施することができる。
【０１０４】
一態様では、遺伝子発現は、そのバイオマーカーに適するプローブと特異的にハイブリダイズするプローブとのハイブリダイゼーションにより検出および定量化する。プローブはまた、当技術分野で公知の方法を使用するハイスループットスクリーニングアッセイにおける使用のための固体支持体へと接合させることもできる。例えば、ＷＯ９７／１０３６５および米国特許第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、および同第５，４４５，９３４号は、本明細書で開示される配列のうちの１または複数を含有しうる、高密度オリゴヌクレオチドチップの構築について開示している。米国特許第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、および同第５，４４５，９３４号において開示されている方法を使用して、本発明のプローブを、誘導体化されたガラス表面上で合成する。光保護されたヌクレオシドホスホルアミダイトを、フォトリソグラフィーマスクを介する光分解により選択的に脱保護されたガラス表面へとカップリングさせ、第２の保護されたヌクレオシドホスホルアミダイトと反応させる。所望のプローブが完成するまで、カップリング／脱保護工程を反復する。
【０１０５】
一態様では、遺伝子の発現レベルは、核酸試料のプローブ修飾チップへの曝露を介して決定する。抽出された核酸は、例えば、好ましくは増幅ステップにおいて、蛍光タグで標識する。標識された試料のハイブリダイゼーションは、適切な厳密性のレベルで実施する。プローブ−核酸間のハイブリダイゼーションの程度は、検出デバイスを使用して定量的に測定する。米国特許第５，５７８，８３２号および同第５，６３１，７３４号を参照されたい。
【０１０６】
代替的に、遺伝子のコピー数、転写、または翻訳のうちのいずれか１つを、公知の技法を使用して決定することができる。例えば、ＰＣＲなどの増幅法が有用でありうる。ＰＣＲのための一般的な手順は、MacPhersonら、PCR: A Practical Approach、（IRL Press at Oxford University Press（1991））において教示されている。しかし、各適用反応のために使用されるＰＣＲ条件は、経験的に決定する。多数のパラメータが、反応の成功に影響を及ぼす。それらのパラメータには、アニーリング温度およびアニーリング時間、伸長時間、Ｍｇ２＋濃度および／またはＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、鋳型、およびデオキシリボヌクレオチドの相対濃度がある。増幅後、結果として得られるＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動に続く、臭化エチジウム染色および紫外光照射による造影により検出することができる。
【０１０７】
一実施形態では、試料核酸へと接合させた１または複数の標識を検出することにより、ハイブリダイズした核酸を検出する。標識は、当業者に周知の多数の手段のうちのいずれかにより組み込むことができる。しかし、一態様では、標識は、増幅ステップの試料核酸の調製において同時に組み込む。したがって、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドを伴うポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識された増幅産物をもたらすであろう。個別の実施形態では、標識されたヌクレオチド（例えば、フルオレセインで標識されたＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用する、上記で記載した転写増幅では、標識を、転写される核酸へと組み込む。
【０１０８】
代替的に、標識は、元の核酸試料（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）または増幅が完了した後の増幅産物へと直接付加することもできる。当業者には、標識を核酸へと接合させる手段が周知であり、例えば、核酸のキナーゼ反応、およびその後の、試料核酸を標識（例えば、フルオロフォア）へと接続する核酸リンカーの接合（ライゲーション）を介する、ニックトランスレーションまたは末端標識化（例えば、標識されたＲＮＡによる）を含む。
【０１０９】
本開示における使用に適する、検出可能な標識は、分光光度的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段により検出可能な任意の組成物を含む。本発明で有用な標識は、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートによる染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般に使用される他の酵素）、および金コロイドビーズまたは有色ガラスビーズまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色標識を含む。このような標識の使用について教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号を含む。
【０１１０】
標識の検出は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射性標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、発せられた光を検出する光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は典型的に、酵素に基質を施し、酵素の基質に対する作用により生成する反応産物を検出することにより検出し、比色標識は、有色標識を単に目視することにより検出する。
【０１１１】
検出可能な標識は、ＷＯ９７／１０３６５において記載されているハイブリダイゼーションなどハイブリダイゼーションの前に、標的（試料）核酸へと付加することもでき、ハイブリダイゼーションの後に、標的（試料）核酸へと付加することもできる。これらの検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの前に標的（試料）核酸へと直接接合させるか、または標的（試料）核酸へと直接組み込む。これに対し、「間接的標識」は、ハイブリダイゼーションの後で、ハイブリッド体の二重鎖へと接合させる。一般に、間接的標識は、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸へと接合させた結合性部分へと接合させる。例えば、標的核酸は、ハイブリダイゼーションの前にビオチニル化することができる。ハイブリダイゼーションの後、アビジンとコンジュゲートされたフルオロフォアは、ビオチンを保有するハイブリッド体二重鎖に結合し、容易に検出される標識をもたらすであろう。核酸を標識化し、標識された、ハイブリダイズした核酸を検出する方法の詳細な総説については、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、24巻:Hybridization with Nucleic Acid Probes、P. Tijssen編、Elsevier、N.Y.（1993）を参照されたい。
【０１１２】
ポリペプチドの検出
ＣＣＮＤ３突然変異は、タンパク質へと翻訳されると、特異的抗体により検出することができる。ＣＣＮＤ３タンパク質内の突然変異は、ＣＣＮＤ３突然変異体抗原（例えば、突然変異を含有する特異的なペプチド）に対する抗体が、突然変異体のＣＣＮＤ３に特異的に結合し、野生型を認識しないように、ＣＣＮＤ３タンパク質の抗原性を変化させうる。
【０１１３】
ＣＣＮＤ３突然変異の発現レベルはまた、ＣＣＮＤ３突然変異体のタンパク質発現またはタンパク質産物を検討することによっても決定することができる。タンパク質レベルの決定は、患者から得られた試料中のバイオマーカーのポリペプチドを選択的に認識し、これに結合する抗体間に生じる任意の免疫特異的結合の量を測定し、これを、対照試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの免疫特異的結合の量と比較することを伴う。ＣＣＮＤ３のタンパク質発現の量は、対照の発現と比較して増大する場合もあり、低減する場合もある。
【０１１４】
当技術分野では、タンパク質解析のための様々な技法が利用可能である。それらには、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射測定アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、金コロイド標識、酵素標識、または放射性同位元素標識を使用する）、ウェスタンブロット解析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、フローサイトメトリー、免疫組織化学、共焦点顕微鏡法、酵素アッセイ、表面プラズモン共鳴、およびＰＡＧＥ−ＳＤＳが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１５】
バイオマーカーおよびＣＤＫｉ処置についてのアッセイ
患者をＣＣＮＤ３の状態についてアッセイし、ＣＤＫｉに対して感受性であると予測したら、患者に対する任意のＣＤＫｉの投与を単回投与で行うこともでき、処置コースを通して持続的に行うこともでき、間欠的に行うこともできる。当業者には、最も効果的な投与手段および投与量を決定する方法が周知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される対象により変化するであろう。単回投与または複数回投与は、主治医により選択される投与レベルおよび投与パターンで実行することができる。薬剤の適切な用量処方および投与法は、経験的に調整することができる。
【０１１６】
ＣＣＮＤ３突然変異は、患者が、ＣＤＫｉ処置に対する感受性を維持しているのかどうかを決定するために、ＣＤＫｉの投与後にアッセイすることができる。加えて、ＣＣＮＤ３突然変異は、単回のＣＤＫｉ投与後の複数の時点でもアッセイすることができる。例えば、初回のボーラスＣＤＫｉを投与し、ＣＣＮＤ３突然変異を、初回の処置の１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、３日間、１週間、もしくは１カ月、または数カ月後にアッセイすることができる。
【０１１７】
ＣＣＮＤ３突然変異は、各回のＣＤＫｉ投与の後にアッセイすることができるので、複数回のＣＤＫｉ投与がなされる場合は、各回の投与後のＣＣＮＤ３突然変異についてのアッセイにより、患者の感受性の持続を決定することができる。患者は、複数回のＣＤＫｉ投与を受け、次いで、異なる時点において、ＣＣＮＤ３突然変異についてアッセイされる可能性があろう。例えば、処置コースは、初回のＣＤＫｉ投与、指定された時間の後における２回目の投与、および２回目の投与の数時間後におけるさらなる３回目の投与の実施を必要としうる。ＣＣＮＤ３突然変異は、各回のＣＤＫｉ投与を実施した１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、３日間、１週間、もしくは１カ月、または数カ月後においてアッセイすることができる。
【０１１８】
最後に、異なるＣＤＫｉを投与し、その後、ＣＣＮＤ３突然変異についてアッセイすることができる。この実施形態では、複数のＣＤＫｉを選び、患者に投与する。次いで、各異なるＣＤＫｉの投与後に、ＣＣＮＤ３突然変異についてアッセイすることができる。このアッセイもまた、異なるＣＤＫｉの投与後の複数の時点において行うことができる。例えば、第１のＣＤＫｉを患者に投与し、ＣＣＮＤ３突然変異を、投与の１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、３日間、１週間、もしくは１カ月、または数カ月後においてアッセイしうるであろう。次いで、第２のＣＤＫｉを投与し、ＣＣＮＤ３突然変異を、第２のＣＤＫｉ投与の１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、３日間、１週間、もしくは１カ月、または数カ月後において再度アッセイしうるであろう。
【０１１９】
任意のＣＤＫｉの活性を評価するためのキットを作製することができる。例えば、ＣＣＮＤ３突然変異についてのＰＣＲまたはマイクロアレイハイブリダイゼーションのための核酸プライマーを含むキットを、ＣＤＫｉへの感受性を評価するために使用することができる。代替的に、表２で列挙されるＣＣＮＤ３突然変異に対する抗体を備えたキットであれば、ＣＤＫｉへの感受性についてのアッセイにおいて有用であろう。
【０１２０】
当技術分野では、がんは、とりわけ、その処置が長期にわたる場合に、化学療法剤による処置に対して耐性となりうることが周知である。ＣＣＮＤ３突然変異についてのアッセイを、長期にわたる任意の化学療法剤による処置の後で行い、がんがＣＤＫｉに対して感受性であるのかどうかを決定することができる。例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）などのキナーゼ阻害剤は、特異的なキナーゼを強く阻害するであろうが、他のキナーゼもまた弱く阻害する可能性がある。患者が、かつて別の化学療法剤または別のＣＤＫｉで処置されている場合、ＣＣＮＤ３突然変異についてアッセイして、腫瘍がＣＤＫｉに対して感受性であるのかどうかを決定することが有用である。このアッセイは、とりわけ、がんが寛解へと向かい、次いで、再成長するかまたは異なる部位へと転移している場合に、患者に有益でありうる。
【０１２１】
ＣＤＫ阻害剤についてのスクリーニング
ＣＣＮＤ３突然変異を使用して、他のＣＤＫｉについてスクリーニングすることが可能である。この方法は、表２のＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞を用意するステップと、細胞を候補ＣＤＫｉと接触させるステップとを含み、処置された細胞のＩＣ５０を、公知のＣＤＫｉの、ＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞との接触と比較する。例えば、ＰＥＳＴドメイン内のＣＣＮＤ３突然変異を含む細胞について、候補ＣＤＫｉのＩＣ５０は、ＣＤＫｉ（１）のＩＣ５０以上である。
【実施例】
【０１２２】
実施例１：ＣＣＮＤ３突然変異についてのクラスタリング
ＣＣＮＤ３突然変異の初めての発見は、ＣＣＬＥシークエンシングデータをクラスタリングすることによりなされた。細胞系パネルは、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）のイニシアティブ（Barretina J.、Caponigro G.ら、The Cancer Cell Line Encyclopedia: using preclinical models to predict anticancer drug sensitivity、Nature  2012  483（7391）:603〜607）で取り扱われている細胞系パネルである。詳細なゲノム的特徴付け、遺伝子的特徴付け、および薬理学的特徴付けは、ＣＣＬＥ細胞系について施された。
【０１２３】
エクソーム捕捉シークエンシングのためのマルチプレックス化ライブラリーは、特注のＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を活用して構築した。細胞系に由来するゲノムＤＮＡを切断し、８ｂｐのインデックスを含むＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプターへとライゲーションした。次いで、アダプターをライゲーションされたＤＮＡを、２００〜３５０ｂｐの間の長さについてサイズ選択し、溶液相にある過剰量のベイトとハイブリダイズさせた。
【０１２４】
次いで、バーコード付けされたエクソン捕捉ライブラリーをプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ測定器（ペアードエンドリード（paired-end reads）を７６ｂｐとする）上でシークエンシングした。８ｂｐのインデックスは、測定器によりリード２の始まりで読み取られ、シークエンシングのリードを下流のデータアグリゲーションパイプライン内の特定の試料へと割り当てるのに使用された。
【０１２５】
配列リードは、ＢＷＡソフトウェアにより、ＮＣＢＩ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＧＲＣｈ３７に対して整列された（Liら、Bioinformatics  2010  25:1754〜60）。（DePristoら、Nat Genet  2011  43:491〜8）において記載されているＧＡＴＫ  ｌｏｃａｌ  ｒｅａｌｉｇｎｅｒを使用して、微細な挿入または欠失（インデル）を保有しうるゲノム領域に対応する配列リードを併せて再整列して、インデルの検出を改善し、特に、３’端において誤整列されたリードにより引き起こされる、偽陽性の単一のヌクレオチド変異の数を減少させた。インデルを含有する可能性が高い部位を、ＢＷＡによりインデルを伴うと初めて整列されたリードを含有するｄｂＳＮＰデータベース（Sherryら、Nucleic Acids Res  2001  29:308〜11）の部位、および検出されたヌクレオチド置換のクラスターに隣接する部位に由来する、公知の生殖細胞系列内のインデル変異の部位として規定した。
【０１２６】
変異体の呼出し、注記、およびフィルタリング
ヌクレオチド置換はＭｕＴｅｃｔにより検出され、短いインデルはＢｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで開発されたＩｎｄｅｌｏｃａｔｏｒソフトウェアにより呼び出された。いずれのプログラムも、正常ＤＮＡとのマッチングを必要とせず、基準ゲノムと異なる全ての変異体を同定するモードで立ち上げた。検出された変異体には、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒの「ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｅｓ」トラックによる転写物に由来する基準転写物を使用して注記した。
【０１２７】
対立遺伝子比（allelic fraction）の低い変異体の除外
各試料中で検出された各変異体についての対立遺伝子比を、位置に重複するリード中の、代替的な（基準と異なる）対立遺伝子を裏付けるリードの割合として計算した。潜在的な試料汚染、サブクローナルイベント、およびアライメントアーチファクトに起因する偽陽性の影響を制限するため、対立遺伝子比が２０％を上回る突然変異だけを下流の解析において使用した。
【０１２８】
一般的な生殖細胞系列変異体の除外
かつて、生殖細胞系列多型として報告されたことのある変異体であって、それらについての、ｄｂＳＮＰ１３４におけるグローバル対立遺伝子頻度（global allelic frequency）（ＧＡＦ）、またはＮＨＬＢＩ  Ｅｘｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔにおいて検出された対立遺伝子頻度が、０．１％より高かった変異体は、さらなる解析から除外した。自然による選択は、機能的に有害な突然変異の除去に極めて効果的であることが知られており、通常それらが集団内で比較的高い頻度に到達することを可能としないが、集団内頻度のローエンドでの多型は、極めて有害である可能性があり、体細胞突然変異の一部と同一でありうる。したがって、公知の生殖細胞系列多型と同一であるが、集団内頻度が０．１％以下である少数の突然変異を保持した。
【０１２９】
正常のパネルにおいて観察される変異体の除外
当該Ｂｒｏａｄにおいて、１０００  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔの一部としてシークエンシングされた、全２７８のエクソーム試料のパネルにおいて検出される変異体もまた、さらなる解析から除外した。このステップにより、さらなる生殖細胞系列変異の除去に加えて、アライメントアーチファクトに主に由来する一般的な偽陽性の効果的な除去が可能となった。
【０１３０】
中立突然変異の除外
少なくとも２つの温血脊椎動物のタンパク質のオルソログ内の相同的位置において野生型として観察される残基を創出する任意のアミノ酸置換は、中立である可能性が高い置換として、さらなる解析から除外した。このフィルタリングステップに、本発明者らは、ＢＬＡＳＴＺプログラムにより創出され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから得られた、複数のアミノ酸アライメントを使用した。
【０１３１】
サイクリンＤ３（ＣＣＮＤ３）Ｃ末端突然変異の、Ｂ細胞性血液悪性腫瘍に特異的な突然変異としての同定
８８３細胞系を、それらの細胞系列およびがん型により、３７のクラスへと類別した。次いで、クラスにわたり、統計学的に有意なランダムでない分布を示す突然変異について探索した。異なる腫瘍において広範に異なる突然変異率、およびばらつきのあるシークエンシングの深さ（突然変異の検出力に影響を及ぼす）について標準化した後で、カイ二乗検定を使用した。この解析で明らかなヒットとして現れた遺伝子のうちの１つが、ＣＣＮＤ３であった。ＣＣＮＤ３の突然変異は、血液悪性腫瘍、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫から確立された１０の細胞系では存在したが、固形腫瘍に由来する細胞系では存在せず、このデータを表２に示す。突然変異は、サイクリンＤ３の分解および核局在化を促進とすることが公知のＣ末端ドメインに局在化した（図１）。
【０１３２】
実施例２：ＣＤＫｉに対する感受性の、非突然変異体細胞と比べた増大を示すＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞
ＣＣＬＥ細胞系の薬理学的特徴付けを使用して、ＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞系を、ＣＤＫｉへの感受性について調べた。ＤＯＨＨ−２細胞、ＮＵ−ＤＨＬ−１細胞、ＳＥＭ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞、およびＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）から購入した。ＤＢ細胞およびＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。Ａ４／ＦＵＫ細胞は、Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ（ＨＳＲＲＢ）から購入した。これらの細胞は、１０％（Ａ４／ＦＵＫ細胞、ＤＢ細胞、ＤＯＨＨ−２細胞、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞、およびＳＥＭ細胞）または２０％（ＮＵ−ＤＨＬ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−４、ＳＵ−ＤＨＬ−６、およびＳＵ−ＤＨＬ−１０）のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＡＴＣＣ）中で培養し、３７℃／５％のＣＯ２でインキュベートした。スクリーニングのために、細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ：型番３９０４）内の８０μｌの培地中１０，０００（ＤＢ、ＤＯＨＨ−２、ＮＵ−ＤＨＬ−１、ＳＥＭ、ＳＵ−ＤＨＬ−４、ＳＵ−ＤＨＬ−６、およびＳＵ−ＤＨＬ−１０）、１５，０００（Ａ４／ＦＵＫ）または２０，０００（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）個の細胞密度で播種し、一晩にわたりインキュベートしてから、化合物を添加した。Ａ４／ＦＵＫ細胞、ＤＯＨＨ−２細胞、ＮＵ−ＤＨＬ−１細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞、ＤＢ細胞、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞、およびＳＵ−ＤＨＬ−６細胞は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞系である。ＳＥＭ細胞は、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病細胞である。
【０１３３】
化合物原液（５倍濃度）を、適切な培養培地中で新たに調製し、手作業で、電子式マルチチャネルピペットによりプレートへと添加した。最小で３つのレプリケートウェルにおいて、化合物付加時における細胞の数および生存率のほか、７２時間後における単剤効果を、製造元のプロトコールに従い、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を介して、細胞内ＡＴＰレベルを定量化することにより評価した。標準的な４パラメトリック曲線適合法（ＸＬＦｉｔ：モデル２０５）を使用して、０日目を差し引いたＥＣ５０を計算した。
【０１３４】
ＣＤＫｉ（１）〜ＣＤＫｉ（３）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧで合成し、化合物原液は、ＤＭＳＯ中１０ｍＭの最終濃度で調製した。作業用原液は、適切な細胞培養培地中、３倍の増分で段階希釈して、１０μＭ〜１．５ｎＭの範囲の最終アッセイ濃度を達成した。
【０１３５】
図２Ａにおいて示される野生型ＣＣＮＤ３または図２Ｂにおいて示される突然変異体ＣＣＮＤ３を保有するＤＬＢＣＬモデルについて、０日目を差し引いたＥＣ５０曲線を示す。ＣＣＮＤ３ＷＴを含有する細胞は、ＣＤＫｉ（１）による処置に対して感受性であり、標準濃度で細胞の生存率が低減されることに注意されたい。これに対し、ＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞は、ＣＤＫｉ（１）で処置すると細胞生存率の大きな低減を提示することから、野生型ＣＣＮＤ３を含有する細胞と比較して、ＣＤＫｉ（１）に対する感受性の増大が裏付けられる。
【０１３６】
この概要を図２Ｃに示す。０日目を差し引いたＥＣ５０値のボックスプロットを、野生型ＣＣＮＤ３または突然変異ＣＣＮＤ３について示す。中心の塗りつぶされたボックスは下方四分位数および上方四分位数を示し、群の中央値を白線で描示する。ウィスカーは試料の最小値（下方ウィスカー）および最大値（上方ウィスカー）を描示し、黒丸は異常値と考えられうる試料の最大値を描示する。「カウント」は、１群当たりの細胞系の数を表示する。ＣＣＮＤ３のＰＥＳＴドメイン突然変異を伴うモデルでは、ＣＤＫｉ（１）に対する感受性の、野生型と比較して３倍を超えるシフトが観察された。
【０１３７】
ＣＤＫｉ（２）は、異なる化合物であり、ＰＤ０３３２９９１としてもまた公知である（Fryら、Mol. Cancer Ther.  2004、3（11）:1427〜1438）。同じ細胞系において、上記で記載したＣＤＫｉ（１）と同じプロトコールを使用して、ＣＤＫｉ（２）について調べた。結果を、図３Ａおよび３Ｂに示す。ＣＤＫｉ（１）と同様に、ＣＣＮＤ３ＷＴを含有する細胞は、ＣＤＫｉ（２）による処置に対して通常の感受性を示し、標準濃度で細胞の生存率を低減させた。ＣＣＮＤ３突然変異体細胞においてＣＤＫｉ（２）について調べたところ、細胞の生存率は、はるかに低い濃度で低減されたことから、これらの細胞は、ＣＤＫｉ（２）に対する感受性がＣＣＮＤ３ＷＴを含有する細胞と比較して大きいことが指し示された。図３Ｃのボックスプロットは、ＣＣＮＤ３のＰＥＳＴドメイン突然変異を伴う細胞における感受性の、野生型と比較した場合の３倍のシフトを示す。
【０１３８】
ＣＤＫｉ（３）は、汎用ＣＤＫ阻害剤であり、ＣＤＫファミリーのメンバーの全てに対して、阻害の程度を変化させて作用する。ＣＤＫｉ（３）について調べたところ、全ての被験細胞型（ＣＣＮＤ３および野生型の両方）で、汎用ＣＤＫ阻害剤に対する感受性が、特異的なＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性より大きいことが見出された。これは、図４Ａおよび４Ｂの細胞生存率曲線において見ることができるが、図４Ｃに示す通り、ＥＣ５０の差違は見られない。
【０１３９】
実施例３：ＣＣＮＤ３突然変異は、タンパク質の安定性の増大を結果としてもたらす
細胞を１００μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドで処理し、１時点当たり最小で２×１０６個の細胞を、全タンパク質単離のために採取した。細胞溶解物を３０分間ごとに２時間にわたり調製し、以後２時間ごとに処理の８時間後まで調製した。ＤＬＢＣＬ細胞を、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．２、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＥＧＴＡ、および１％のＮＰ４０に加えてプロテアーゼを含有する緩衝液（Ｒｏｃｈｅ：型番０５８９２７９１００１、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ）およびホスファターゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ：型番５２４６２５、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）中で溶解させた。溶解の後、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ：型番２３２５、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、タンパク質濃度を決定した。細胞系１つ当たり等量の全タンパク質を、４〜１２％のビス−トリスＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）上で分離し、その後、ドライブロット法システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｉＢＬＯＴ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）へと転写した。タンパク質は、製造元のプロトコールに従い、適切な一次抗体および近赤外色素検出システム（Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＩＲＤｙｅ、ＬＩ−ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を使用して検出した。ウェスタンブロット解析のためのモノクローナル抗体は、サイクリンＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：型番６１０２７９、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、Ｍｃｌ−１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：型番４５７２、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、およびβ−アクチン（Ａｍｂｉｏｎ：型番４３０２、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）である。シクロヘキシミドは、Ｓｉｇｍａ（型番：Ｃ４８５９  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
【０１４０】
図５Ａでは、野生型ＣＣＮＤ３を含有する細胞を表示される時間にわたりシクロヘキシミドで処理し、等量の全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＣＣＮＤ３、β−アクチン、およびＭｃｌ−１のタンパク質レベルを示す。Ｍｃｌ−１タンパク質は、半減期が短く、対照として使用された。野生型ＤＬＢＣＬ細胞では、ＣＣＮＤ３は、処置の４〜６時間後において著明に枯渇する。図５Ｂではまた、ＣＣＮＤ３突然変異体細胞を、シクロヘキサミドでも処置したところ、８時間後まで、ほとんどまたは全く枯渇を提示しなかった。これに対し、β−アクチンも同等に安定であり、Ｍｃｌ−１は異なる細胞系において不安定であった。このデータは、ＰＥＳＴドメイン内のＣＣＤＮ３の突然変異が、タンパク質の安定性の増大をもたらすことを示唆する。
【０１４１】
このタンパク質の安定性は、ＣＣＮＤ３タンパク質の蓄積をもたらしうる。図６Ａは、ＣＣＮＤ３のＰＥＳＴドメイン突然変異を含有する細胞内では、突然変異体ＣＣＮＤ３のタンパク質レベルが高いことを実証するウェスタンブロットである。ＣＣＮＤ３ＷＴに由来するｍＲＮＡのレベルと、ＣＣＮＤ３突然変異体細胞に由来するｍＲＮＡのレベルとを比較すると、発現レベルはほぼ同様であるから、ＣＣＮＤ３タンパク質の増大は、タンパク質の安定性の増大に起因するものであり、発現の増大に起因するものではない可能性が極めて高いことが指し示される。
【０１４２】
したがって、いかなる１つの理論にも束縛されることなく述べると、ＣＣＮＤ３突然変異はＣＣＮＤ３  ｍＲＮＡの発現を促進もプロモートもしないので、ＣＣＮＤ３突然変異は翻訳後のレベルに作用しうる。ＣＣＮＤ３タンパク質についての表示を、図１にグラフで示すが、２８３位のアミノ酸におけるトレオニン（Ｔ２８３）がリン酸化されると、これによりＣＣＮＤ３タンパク質がユビキチン化およびその後の分解の標的とされる。ＣＣＮＤ３は、アミノ酸２５６〜２６８および２７１〜２９１において、ＰＥＳＴドメインを有する。ＰＥＳＴドメイン内の突然変異は、このリン酸化イベントを遮断または低減する可能性があり、したがって、ＣＣＮＤ３を安定化させる結果として、半減期の延長および細胞内の蓄積の増大をもたらす。次いで、この安定化したＣＣＮＤ３は、自由にＣＤＫ４／ＣＤＫ６に結合し、活性化させることができ、これにより、がんをもたらす制御不能な細胞の増殖が誘発される。がん性細胞は、高レベルのＣＤＫ４／６の活性化により駆動されるか、またはこれに依存するので、ＣＤＫ４／６に結合し、ＣＤＫ４／６のＣＣＮＤ３との会合を低減するＣＤＫｉであれば、ＣＣＮＤ３のレベルが高くても、細胞増殖の低減を結果としてもたらすであろう。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
がん細胞の、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫｉ：Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に対する感受性を決定する方法であって、
ａ）がん細胞内のサイクリンＤ３（ＣＣＮＤ３：ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ３）の突然変異についてアッセイするステップと、
ｂ）ＣＣＮＤ３突然変異を、非がん性細胞または正常な対照細胞と比較するステップと
を含み、がん細胞内のＣＣＮＤ３突然変異の存在が、がん細胞がＣＤＫｉに対して感受性であることを示す方法。
［２］
がん細胞がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
［３］
ＣＣＮＤ３突然変異がＰＥＳＴドメイン内にある、請求項１に記載の方法。
［４］
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項１に記載の方法。
［５］
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項１に記載の方法。
［６］
ＣＣＮＤ３突然変異が表２における任意の突然変異である、請求項１に記載の方法。
［７］
ＣＣＮＤ３突然変異がアミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
［８］
ＣＤＫｉが表１から選択される、請求項１に記載の方法。
［９］
がん患者のＣＤＫｉによる処置に対する感受性を予測する方法であって、
ａ）患者から得られたがん試料中のＣＣＮＤ３突然変異についてアッセイするステップと、
ｂ）ＣＣＮＤ３突然変異を、非がん性試料または正常な対照試料と比較するステップと
を含み、がん試料中のＣＣＮＤ３突然変異の存在が、患者がＣＤＫｉによる処置に対して感受性であることを示す方法。
［１０］
がん試料がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
［１１］
ＣＣＮＤ３突然変異がＰＥＳＴドメイン内にある、請求項９に記載の方法。
［１２］
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項９に記載の方法。
［１３］
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項９に記載の方法。
［１４］
ＣＣＮＤ３突然変異が表２における任意の突然変異である、請求項９に記載の方法。
［１５］
ＣＣＮＤ３突然変異がアミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
［１６］
ＣＤＫｉが表１から選択される、請求項９に記載の方法。
［１７］
ｃ）患者から得られたがん試料中のＣＣＮＤ３の差次的なタンパク質発現を測定するステップと、
ｄ）がん試料中のＣＣＮＤ３タンパク質の発現を、非がん性試料または正常な対照試料のＣＣＮＤ３タンパク質発現と比較するステップと
をさらに含み、がん試料中のＣＣＮＤ３タンパク質レベルの増大が、患者がＣＤＫｉによる処置に対して感受性であることを示す、請求項９に記載の方法。
［１８］
がん患者をＣＤＫｉで処置する方法であって、
ａ）患者から得られたがん試料中のＣＣＮＤ３突然変異についてアッセイするステップと、
ｂ）がん試料中のＣＣＮＤ３突然変異状態を、非がん性試料または正常な対照試料と比較するステップであり、ＣＣＮＤ３突然変異の存在が、患者がＣＤＫｉによる処置に対して感受性であることを示すステップと、
ｃ）患者にＣＤＫｉを投与するステップと、
ｄ）腫瘍成長の抑制についてアッセイするステップと
を含む方法。
［１９］
がん試料がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
［２０］
ＣＣＮＤ３突然変異がＰＥＳＴドメイン内にある、請求項１８に記載の方法。
［２１］
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項１８に記載の方法。
［２２］
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項１８に記載の方法。
［２３］
ＣＣＮＤ３突然変異が表２における任意の突然変異である、請求項１８に記載の方法。
［２４］
ＣＣＮＤ３突然変異が、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
［２５］
ＣＤＫｉを治療有効量で投与する、請求項１８に記載の方法。
［２６］
ＣＤＫｉが表１から選択される、請求項１８に記載の方法。
［２７］
ＣＤＫｉ候補物質をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞を、ＣＤＫｉ候補物質と接触させるステップと、
ｂ）細胞生存率の低減を測定するステップと、
ｃ）ＣＤＫｉ候補物質と接触させたＣＣＮＤ３突然変異細胞による細胞生存率の低減を、対照のＣＤＫｉと接触させたＣＣＮＤ３突然変異細胞による細胞生存率と比較するステップと
を含む方法。
［２８］
対照のＣＤＫｉが表１から選択される、請求項２７に記載の方法。
［２９］
ＣＣＮＤ３突然変異を含有する細胞がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
［３０］
ＣＣＮＤ３突然変異がＰＥＳＴドメイン内にある、請求項２７に記載の方法。
［３１］
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２５６〜２６８における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項２７に記載の方法。
［３２］
ＣＣＮＤ３突然変異が配列番号２のアミノ酸２７１〜２９２における少なくとも１つのアミノ酸変化である、請求項２７に記載の方法。
［３３］
ＣＣＮＤ３突然変異が表２における任意の突然変異である、請求項２７に記載の方法。
［３４］
ＣＣＮＤ３突然変異がアミノ酸２９０におけるイソロイシンからリシンへの変化（Ｉ２９０Ｋ）、アミノ酸２９０におけるイソロイシンからトレオニンへの変化（Ｉ２９０Ｔ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからロイシンへの変化（Ｐ２８４Ｌ）、アミノ酸２８４におけるプロリンからセリンへの変化（Ｐ２８４Ｓ）、およびアミノ酸２８７におけるバリンからアスパラギン酸への変化（Ｖ２８７Ｄ）からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
［３５］
選択されたがん患者の集団のがんの処置に使用するためのＣＤＫｉを含む組成物であって、がん患者の集団が、前記患者から得られたがん細胞試料中の、正常な対照細胞試料と比較したＣＣＮＤ３突然変異を示すことに基づき選択される組成物。
［３６］
がん細胞試料がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ性白血病、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、およびバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項３５に記載の組成物。
［３７］
がん患者のＣＤＫｉによる処置に対する感受性を予測するためのキットであって、ｉ）ＣＣＮＤ３突然変異を検出するための手段と、ｉｉ）前記キットの使用法についての指示書とを含むキット。
【図１】
0006387001.tif 000011
【図２Ａ】
0006387001.tif 000012
【図２Ｂ】
0006387001.tif 000013
【図２Ｃ】
0006387001.tif 000014
【図３Ａ】
0006387001.tif 000015
【図３Ｂ】
0006387001.tif 000016
【図３Ｃ】
0006387001.tif 000017
【図４Ａ】
0006387001.tif 000018
【図４Ｂ】
0006387001.tif 000019
【図４Ｃ】
0006387001.tif 000020
【図５Ａ】
0006387001.tif 000021
【図５Ｂ】
0006387001.tif 000022
【図６Ａ】
0006387001.tif 000023
【図６Ｂ】
0006387001.tif 000024
【配列表】
0006387001000001.app