(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から単離した血液または血清試料中の少なくともｍｉＲ−２６ｂの発現レベルを測定し、該発現レベルをコントロール値と比較することを含む、対象において虚血性急性腎不全発現の素因を示すか否かを決定するための方法であって、該発現レベルの低下は虚血性急性腎不全発現の素因を示す、方法。
【請求項２】
該方法が、対象から単離した血液または血清試料中のｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−４５４、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０ａから選ばれる少なくとも１のミクロＲＮＡの発現レベルを測定し、該発現レベルをコントロール値と比較することをさらに含み、該発現レベルの低下が虚血性急性腎不全発現の素因を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該方法が、対象から単離した血液または血清試料中のｍｉＲ−２６ｂの発現レベルおよびｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−４５４、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０ａから選ばれる少なくとも１のミクロＲＮＡの発現レベルをまとめて測定し、該発現レベルをコントロール値と比較することを含み、該発現レベルの低下が虚血性急性腎不全発現の素因を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ミクロＲＮＡの発現をＰＣＲ法により測定する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ミクロＲＮＡの発現を定量的ＰＣＲ法により測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって対象において虚血性急性腎不全発現の素因を示すか否かを決定するための、キットであって、該キットは、血液または血清試料中の少なくともｍｉＲ−２６ｂの発現レベルを測定するのに必要なプローブおよびプライマーを含む、キット。
【請求項７】
キットが、血液または血清試料中のｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−４５４、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０ａからなる群から選ばれる少なくとも１のミクロＲＮＡの発現レベルを測定するのに必要なプローブおよびプライマーをさらに含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
キットが、血液または血清試料中のｍｉＲ−２６ｂの発現レベルおよびｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−４５４、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０ａからなる群から選ばれるミクロ−ＲＮＡの発現レベルをまとめて測定するのに必要なプローブおよびプライマーを含む、請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学の一般的領域に含まれ、特に、急性腎障害の診断および/または予後診断（prognosis）方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
miRNAは、メッセンジャーRNAを認識し、標的ｍRNAとの部分的または完全な相補性によりRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)内のタンパク質発現を負に調節することができる内因性にコードされた小RNA(22〜25ヌクレオチド)である。ほとんどのmiRNAは、個々の遺伝子から、またはそのいくつかの多シストロン性転写物からRNA Pol IIによって一度に転写される。miRNAは、より長いプレmiRNAとして生成され、リボヌクレアーゼIIIにより核中でプロセシングされ、Exportin-5およびRan-GTP-依存性機序により細胞質に移動し、最終的に別のリボヌクレアーゼIIIによりプロセシングされて細胞質中で成熟型になる。
【０００３】
その機能は、胚発生、ストレス反応、または生物学的プロセスの厳密な調節、すなわち、身体の恒常性維持を含む広範なプロセスに必須である。
【０００４】
ごく最近、miRNAが、栄養素の欠乏または低酸素症を含むあらゆるタイプの刺激に対する急速で正確な細胞応答の主要調節因子であることがわかった(Ivan M、Harris AL、Martelli F、Kulshreshtha R. Hypoxia response and microRNA: no longer two separate worlds. J Cell Mol Med.;12(5A):1426-31、2008)。
【０００５】
特許出願WO2011012074は、肝臓癌の血漿マーカーとして特にmiR-29aを含む一連のmiRNAと、該miRNAの少なくとも１の検出に基づく肝臓癌の診断および評価方法を開示している。
【０００６】
特許出願WO2009036236は、肝臓癌の血漿マーカーとして特にmiR-146aを含む一連のmiRNAと、該miRNAの少なくとも１の検出に基づく種々の腫瘍病理の診断および評価方法を開示している。
【０００７】
Akkina、S. et al.、「MicroRNA in renal function and disease」、Translational Research、2011 Apr、Vol. 157、No. 4、pg 236-240、およびLi、J.Y. et al.、「Review: The role of microRNA in renal disease」、NEPHROLOGY (CARLTON)、Sep 2010、Vol. 15、No.6、p599-608は、腎臓生理学および病理学におけるmiRNAの関与について記載している。
【０００８】
JUAN、D. et al.、「Identification of a microRNA panel for clear-cell renal cancer」、UROLOGY、2010 Apr、Vol.75、No. 4、p.835-41は、腎臓癌のマーカーとして一連のmiRNAを開示している。
【０００９】
症候群としての急性腎不全(ARF)は、数日または数週間以内に糸球体ろ過液が激減することを特徴とし、窒素化老廃物の排泄不能や、液体および電解質の恒常性の調節不能が臨床的に現れる。
【００１０】
ARFは、死亡率が約50％と高いため、発展途上国における腎疾患のなかで最も重大な問題の１つである。全ARF発作の約30％が、ICUに収容された患者に多臓器不全の結果として生じる。この最後の状況では死亡率は80％まで増加する。
【００１１】
ARFの発現は、スペインで年間30000人に及ぶ心臓介入（治療介入）後の最も一般的な合併症の１つでもあり、該介入の１％以上が本病院内で行われる。実質的に、介入を受けるすべての患者がある程度のARFを発現する。患者の長期進行は、この術後ARFの重症度に依存し、心臓介入後に透析が必要な症例では死亡率はほぼ60％である(Candela-Toha A、Elias-Martin E、Abraira V et al. Predicting Acute Renal Failure after Cardiac Surgery: External Validation of Two New Clinical Scores. Clin J Am Soc Nephrol; 3:1260-1265. 2008)。心臓外科手術と腎臓移植はともに、瞬間的および持続的虚血刺激が知られており、モニターすることもできるので、ヒトのATNを研究するための２つの「擬似」実験状況である。すべてのこの罹患率・死亡率統計は、過去数十年にわたり有意な変化はなく、現在まですべてのこれら状況においてATNを予防しおよび/または減少させる有効な治療法はない。これは、大部分、現在まで用いている血清中のクレアチンおよび尿素の測定以外により正確な腎臓障害のマーカーがないためである。この常套的マーカーは、細胞損傷を直接反映せず、該損傷が生じる腎臓組織のコンパートメント（尿細管または内皮）も反映せず、損傷によって生じる腎機能障害を示すパラメーターにすぎない(Vaidya VS、Waikar SS、Ferguson MA、et al.、Urinary Biomarkers for Sensitive and Specific Detection of Acute Renal Injury in Humans. Clin Transl Sci. ;1(3):200-208、2008)。実際に、血清クレアチンおよび尿素濃度に有意な変化がないために無症候性腎障害の患者がほとんど同定されない可能性がある。したがって、最近数年間に、成人ポピュレーションではなくさらなる顕著な病状のない子供ポピュレーションにおいて良いマーカーと働くと思われるNGAL、IL18、KIM、シスタチンC、VEGF、またはCXCL10などのARFの新規マーカーを同定し、認証するための種々の研究が行われている(Vaidya VS、Waikar SS、Ferguson MA、et al.、Urinary Biomarkers for Sensitive and Specific Detection of Acute Renal Injury in Humans. Clin Transl Sci. 1(3):200-208、2008)。
【００１２】
上記のことはすべて、測定が簡単で速く、患者を生検する必要がない、該障害が生じる組織コンパートメントを示す腎障害の進行ならびに障害および/または回復の程度のより正確な新規バイオマーカーを同定し、認証する必要があることを正当化する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、第1の局面において、本発明は、対象から単離した試料中のmiR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93、miR-10aから選ばれる少なくとも１のmicro-RNAの発現レベルを測定することを含む、急性腎障害の診断および/または予後診断に用いることができるデータを得るための方法に関する。
【００１４】
本発明において、急性腎障害は、数時間または数日間以内に腎機能の顕著な低下をもたらすあらゆる損傷、糸球体ろ過液の減少もしくは血清窒素化生成物の蓄積、または恒常性の調節不能として理解される。
【００１５】
第2の局面において、本発明は、対象から単離した試料中のmiR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、miR-93、miR-10aから選ばれる少なくとも１のmicro-RNAの発現レベルを測定し、その発現レベルをコントロール値と比較することを含む、該発現レベルの変化が急性腎障害を示す、急性腎障害の診断および/または予後診断方法（以後、本明細書では本発明の方法という）に関する。
【００１６】
本発明のより具体的態様において、分析する試料は血液、血清、または尿から選ばれる。
【００１７】
本発明のより具体的態様において、コントロール値に対するmiR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93、および/またはmiR-10aの血清中発現レベルの低下は急性腎障害を示す。
【００１８】
本発明の好ましい態様において、ミクロRNAまたはミクロRNAの発現は定量的PCRにより測定される。
【００１９】
本発明の別の好ましい態様において、ミクロRNAの発現レベルはRNAミクロアレイにより測定される。
【００２０】
別の好ましい態様において、本発明の方法は、miR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93、およびmiR-10aの発現レベルをまとめて測定することを含む。別のより好ましい態様において、該ミクロRNAの少なくとも１の発現レベルの低下は急性腎障害を示す。
【００２１】
第3の局面において、本発明は、急性腎障害の診断および予後診断のためのmiR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93、およびmiR-10aから選ばれる少なくとも１のミクロRNAの使用に関する。
【００２２】
第4の局面において、本発明は、急性腎障害の診断および予後診断のために、miR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93、およびmiR-10aをまとめて使用することに関する。
【００２３】
第5の局面において、本発明は、miR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93、およびmiR-10aから選ばれる少なくとも１のミクロRNAの発現レベルを測定するのに必要なプローブおよびプライマーを含む本発明の方法による急性腎障害の診断および/または予後診断用キット（以後、本明細書では本発明のキットという）に関する。
【００２４】
第6の局面において、本発明は、急性腎障害の診断および/または予後診断用の本発明のキットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】健康個体(健康)の２プールにおけるmiRNA発現と比較した、診断時（DO）から診断後７日までの虚血性病因（P）と毒性病因（PT）を有するARF患者における血清miR-26b発現を示す。ａ）本技術の内部コントロールとして用いる合成ミクロRNAに対する、miRNA発現が全試料中で検出される増幅サイクル(交差(crossing)閾値、CT)のデータ；ｂ）指数関数的数式で１に等しい健康個体に対するARF患者におけるmiRNA発現の倍率。
【図２】健康個体(健康)の２プールにおけるmiRNA発現と比較した、診断時（DO）から診断後７日までの虚血性病因（P）と毒性病因（PT）を有するARF患者における血清miR-29a発現を示す。ａ）本技術の内部コントロールとして用いる合成ミクロRNAに対する、miRNA発現が全試料中で検出される増幅サイクル(交差(crossing)閾値、CT)のデータ；ｂ）指数関数的数式で１に等しい健康個体に対するARF患者におけるmiRNA発現の倍率。
【図３】健康個体(健康)の２プールにおけるmiRNA発現と比較した、診断時（DO）から診断後７日までの虚血性病因（P）と毒性病因（PT）を有するARF患者における血清miR-454発現を示す。ａ）本技術の内部コントロールとして用いる合成ミクロRNAに対する、miRNA発現が全試料中で検出される増幅サイクル(交差(crossing)閾値、CT)のデータ；ｂ）指数関数的数式で１に等しい健康個体に対するARF患者におけるmiRNA発現の倍率。
【図４】健康個体(健康)の２プールにおけるmiRNA発現と比較した、診断時（DO）から診断後７日までの虚血性病因（P）と毒性病因（PT）を有するARF患者における血清miR-146発現を示す。ａ）本技術の内部コントロールとして用いる合成ミクロRNAに対する、miRNA発現が全試料中で検出される増幅サイクル(交差(crossing)閾値、CT)のデータ；ｂ）指数関数的数式で１に等しい健康個体に対するARF患者におけるmiRNA発現の倍率。
【図５】健康個体(健康)の２プールにおけるmiRNA発現と比較した、診断時（DO）から診断後７日までの虚血性病因（P）と毒性病因（PT）を有するARF患者における血清miR-27a発現を示す。ａ）本技術の内部コントロールとして用いる合成ミクロRNAに対する、miRNA発現が全試料中で検出される増幅サイクル(交差(crossing)閾値、CT)のデータ；ｂ）指数関数的数式で１に等しい健康個体に対するARF患者におけるmiRNA発現の倍率。
【図６】健康個体(健康)の２プールにおけるmiRNA発現と比較した、診断時（DO）から診断後７日までの虚血性病因（P）と毒性病因（PT）を有するARF患者における血清miR-93発現を示す。ａ）本技術の内部コントロールとして用いる合成ミクロRNAに対する、miRNA発現が全試料中で検出される増幅サイクル(交差(crossing)閾値、CT)のデータ；ｂ）指数関数的数式で１に等しい健康個体に対するARF患者におけるmiRNA発現の倍率。
【図７】健康個体(健康)の２プールにおけるmiRNA発現と比較した、診断時（DO）から診断後７日までの虚血性病因（P）と毒性病因（PT）を有するARF患者における血清miR-10a発現を示す。ａ）本技術の内部コントロールとして用いる合成ミクロRNAに対する、miRNA発現が全試料中で検出される増幅サイクル(交差(crossing)閾値、CT)のデータ；ｂ）指数関数的数式で１に等しい健康個体に対するARF患者におけるmiRNA発現の倍率。
【実施例】
【００２６】
大規模なミクロRNA研究の実験を、最初に種々の病因の急性腎不全患者から得られたRNAを用いて行った。本方法に用いた試料は以下からなる。
・血清クレアチニンなどの一般的臨床診断パラメーターにより示される最大腎障害時の虚血性病因を有する急性腎不全患者から得た２試料。
・血清クレアチニンによる再評価で腎機能が回復したときの腎不全後7または10日の同じ患者から得た２試料。
・腎毒性物質により生じた腎不全の患者から得た２試料。１つは最大損傷時、他の１つは腎機能回復時。
・最大腎損傷時に得た、敗血症による腎不全患者から得た試料。
・コントロールとして用いる５人の健康人からなる２群。
【００２７】
大規模の血清ミクロRNA研究のため実験を、Applied BiosystemsのTaqman Low Density Array (TLDAs)プラットフォームを用いる定量的PCRにより行った。得られたデータの分析により、試験に用いるミクロRNAを選択した。
【００２８】
次に、先の実験で得た選択したミクロRNAの発現データを確認した。そのために、上記以外の以下からなる患者の試料を用いた。
・虚血性病因を有する急性腎不全患者４人（PI1、PI2、PI3、PI4という）。各患者から得た０日（腎不全の診断時）、腎不全の診断後１、３、５および７日の試料を用いた。
・腎毒性物質により生じた急性腎不全の患者３人（PT1、PT2、PT3という）。各患者から得た０日（腎不全の診断時）、腎不全の診断後１、３、５および７日の試料を用いた。
・それぞれ10人の健常人からなる２コントロール群。
【００２９】
データを確認するため、LNA technology(Exiqon)の各ミクロRNA用の個々のプローブを用いて定量的PCRを行った。
【００３０】
図１〜４に示すように、ARF患者の血清miRNA発現は健康コントロールに比べて低下する。
【００３１】
図５は、ARF患者のmiR-27a発現は健康コントロールに比べて低下することを示す。7日以内のmiR-27a発現は患者間でより変動的であり、そのいくつかは健康個体の発現値に回復する傾向があったことに注意すべきである。
ARF患者のmiR-93発現(図6)は、健康コントロールに比べて低下し、何人かの患者で第７日のこのmiRNAがコントロールに近い値に回復する傾向を示したことにも注意すべきである。
【００３２】
何人かの患者のmiR-10a発現(図7)は健康コントロールに比べて低下したが、この傾向は虚血性患者では観察されず、また、何人かの患者で、第７日のmiRNAレベルが回復したことに特に注意すべきである。
【００３３】
さらに、曲線値下面積を、種々の患者のmiRNA発現に対するROC曲線分析により計算した。
【００３４】
表１は、これらmiRNAがARF患者の病因に関わらずARFの診断的価値を有し、特異性と感受性が血清クレアチニン（今日用いられているマーカー）よりはるかに高いことを示す。
0006356071.tif 000002
表１：第０日におけるICUのARF患者のmiRNAに対するROC曲線分析。
【００３５】
表２のデータは、これらのmiRNAがクレアチニンより感受性と特異性が高いことを示し、クレアチニン値が正常であるにも関わらず、腎機能障害が持続し、これらのmiRNAに、これらの患者が徐々に長期の慢性腎機能障害へと進行することに対する高い予後診断的価値があったことを示す。
0006356071.tif 000003
表２．第７日におけるICUのARF患者のmiRNAに対するROC曲線分析
【００３６】
表３のデータは、これらmiRNAの変化が心臓外科手術後の虚血性ARF発現の素因を示したことを示す。
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表３．心臓手術後の患者のmiRNAのROC曲線分析。
【００３７】
表４のデータは、これらmiRNAの変化が心臓外科手術後のARF発現の早期指標であることを示す。
0006356071.tif 000005
表４．心臓手術直後の患者のmiRNAのROC曲線分析。
【図１】
0006356071.tif 000006
【図２】
0006356071.tif 000007
【図３】
0006356071.tif 000008
【図４】
0006356071.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
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