(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗タウ抗体またはそのタウ結合断片であって、
（ａ）該ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、該ＶＬ  ＣＤＲ１、２および３がそれぞれ配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０に示されるアミノ酸配列からなる、または
（ｂ）該ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、該ＶＬ  ＣＤＲ１、２および３がそれぞれ配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８に示されるアミノ酸配列からなる、
抗タウ抗体またはそのタウ結合断片。
【請求項２】
（ａ）前記ＶＨが、配列番号４８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
前記ＶＬが、配列番号４９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、または
（ｂ）前記ＶＨが、配列番号４７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
前記ＶＬが、配列番号４９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｃ）前記ＶＨが、配列番号５４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
前記ＶＬが、配列番号５５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、または
（ｄ）前記ＶＨが、配列番号２２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
前記ＶＬが、配列番号５５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、
請求項１に記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片。
【請求項３】
（ａ）前記ＶＨが、配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
前記ＶＬが、配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなる、または
（ｂ）前記ＶＨが、配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
前記ＶＬが、配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなる、
（ｃ）前記ＶＨが、配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
前記ＶＬが、配列番号５５に示されるアミノ酸配列からなる、または
（ｄ）前記ＶＨが、配列番号２２０に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
前記ＶＬが、配列番号５５に示されるアミノ酸配列からなる、
請求項１または２に記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合断片が重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号２１８に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、該軽鎖が配列番号２１９に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項５】
前記抗タウ抗体またはタウ結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、およびジスフィルド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片。
【請求項６】
前記抗タウ抗体またはそのタウ結合断片が、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域およびヒトラムダ軽鎖定常領域を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片。
【請求項７】
前記抗タウ抗体またはそのタウ結合断片が、ヒトラムダ軽鎖定常領域を含む、請求項１〜３および５〜６のいずれかに記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片。
【請求項８】
前記抗タウ抗体またはそのタウ結合断片が、ポリエチレングリコール、または酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物及び重金属からなる群から選択される検出可能な標識を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
（ａ）配列番号１７３及び／もしくは配列番号１７４に示される核酸配列、または
（ｂ）配列番号１７９及び／もしくは配列番号１８０に示される核酸配列
を含む、請求項１０に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の１つまたは複数の発現ベクター、あるいは請求項１０または１１に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞。
【請求項１４】
抗タウ抗体またはそのタウ結合断片を調製するための方法であって、
細胞培養物において請求項１３に記載の宿主細胞を培養することと、
該細胞培養物から該抗タウ抗体またはそのタウ結合断片を単離することと、を含む、方法。
【請求項１５】
前記抗タウ抗体またはタウ結合断片を、ヒト対象への投与に適切な滅菌の薬学的組成物へと製剤化することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
神経変性タウオパチーを治療するための医薬品の製造における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗タウ抗体またはタウ結合断片、あるいは請求項９に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項１７】
中枢神経系内のタウの異常蓄積または沈着を治療することを必要とするヒト対象において、中枢神経系内のタウの異常蓄積または沈着を治療するための医薬品の製造における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗タウ抗体またはタウ結合断片、あるいは請求項９に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項１８】
前記神経変性タウオパチーが、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン病−認知症複合病、嗜銀顆粒性認知症、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、皮質基底核変性症、クロイツフェルトヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、前頭側頭認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソン病を伴う前頭側頭認知症、前頭側頭葉変性症、ゲルストマンストロイスラーシャインカー病、ハレルフォルデンスパッツ病、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、Ｃ型ニーマンピック病、神経原線維変化を伴う非グアム島人型運動ニューロン病、ピック病、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症、多発梗塞性認知症、及び虚血性脳卒中からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記神経変性タウオパチーが、アルツハイマー病である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
前記神経変性タウオパチーが、１７番染色体に連鎖しパーキンソン病を伴う前頭側頭認知症である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２１】
前記神経変性タウオパチーが、前頭側頭葉変性症である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２２】
タウオパチーのインビボ診断を必要とするヒト対象における、タウオパチーのインビボ診断において使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗タウ抗体またはタウ結合断片を含む組成物。
【請求項２３】
神経変性タウオパチーの進行をモニタリングするインビトロの方法であって、
（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片を用いて、ヒト対象から得られた試料中の病理的修飾型または凝集型タウのレベルを測定すること、および
（ｂ）修飾型または凝集型タウの該レベルを、１つ以上の対照対象における該病理的修飾型または凝集型タウのレベルを示す参照基準と比較すること
を含み、
病理的修飾型または凝集型タウの該レベルと該参照基準との間の差異または類似性は、該ヒト対象が神経変性タウオパチーを有することを示す、方法。
【請求項２４】
病理的修飾型または凝集型タウのレベルを、神経変性タウオパチーの指標とするインビトロの方法であって、
（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片を用いて、ヒト対象から得られた試料中の病理的修飾型または凝集型タウのレベルを測定すること、および
（ｂ）修飾型または凝集型タウの該レベルを、１つ以上の対照対象における該病理的修飾型または凝集型タウのレベルを示す参照基準と比較すること
を含み、
病理的修飾型または凝集型タウの該レベルと該参照基準との間の差異または類似性は、該ヒト対象が神経変性タウオパチーを有することを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本発明は、概して、新規のタウ特異的結合分子、特に、病理的にリン酸化されたタウ及び凝集型のタウを含む、タウタンパク質を認識するヒト抗体、ならびにその断片、誘導体、及び変異体に関する。さらに、本発明は、血漿及びＣＳＦ中でタウ及び有毒性タウ種を特定する診断用ツールとして、ならびにまた、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン病−認知症複合病（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、前頭側頭認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソン病を伴う前頭側頭認知症（ＦＴＤＰ−１７）、前頭側頭葉変性症、ゲルストマンストロイスラーシャインカー病、ハレルフォルデンスパッツ病、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、Ｃ型ニーマンピック病（ＮＰ−Ｃ）、神経原線維変化を伴う非グアム島人型運動ニューロン病、ピック病（ＰｉＤ）、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症、多発梗塞性認知症、及び虚血性脳卒中等の神経変性タウオパチーを治療するための受動的ワクチン投与戦略においての両方で有用な、そのような結合分子、抗体、及びそれらの模倣体を含む薬学的組成物及び診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の蓄積、修飾、及び凝集は、多数の神経変性疾患の病理的態様である。高リン酸化タウ配座異性体を含む、病理的修飾型及び凝集型タウは、タウオパチーの普遍の顕著な特徴であり、疾患の重症度と相関する。
【０００３】
タウは、中枢神経系で発現する微小管結合タンパク質であり、その主要な機能は微小管を安定させることである。主に成体期のヒトの脳で発現するタウには６つの主要なアイソフォームが存在するが、それらは選択的スプライシングによって、１つの遺伝子から得られる。病理的条件下で、タウタンパク質は高リン酸化され、その結果、チューブリンと結合しなくなり、微小管が不安定化し、病原性神経原線維変化においてタウの凝縮及び蓄積が生じる。タウに関連する障害は、神経変性タウオパチーと集合的に称されるが、それらは、とりわけ、アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺、ピック病、皮質基底核変性症、ＦＴＤＰ−１７を含むタンパク質の誤った折り畳み障害群の一部である。タウ遺伝子の４０超の突然変異が遺伝性前頭側頭認知症と関連することが報告されており、このことは、タウ遺伝子の突然変異が神経変性を引き起こすのに十分であることを示している（Ｃａｉｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７１（２００７），２２７−４０）。トランスジェニックマウス及び細胞培養での研究は、ＡＤにおいて、Ａβがタウの上流に位置する病理的カスケードによってタウ病理が引き起こされる可能性があることを示す（Ｇｏｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３（２００１），１４９１−１４９５）。しかしながら、他の発見は、両方のカスケードが互いに独立して機能する二重経路モデルを指し示す（ｖａｎ  ｄｅ  Ｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１１１（２００６），１２６−１３８）。ＡＤにおけるベータアミロイドペプチドを標的とする免疫療法は、有望な結果を動物モデルでもたらしており、臨床試験での見込みを示している。さらに最近の少数の対象の剖検データは、進行したＡＤを有する患者におけるベータアミロイド斑の除去が認知衰退を停止させるのに充分ではあり得ないことを示唆し、ＡＤに対するさらなる治療戦略の必要性を強調している（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３７２（２００８），２１６−２２３、Ｂｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２０（２０１０），１３−２０）。トランスジェニック動物モデルにおけるＡベータベースの免疫療法の成功を受けて、能動的免疫療法の構想がタウタンパク質にまで広がった。しかしながら、タウタンパク質を用いる野生型マウスの能動的ワクチン投与は、神経障害を伴う神経原線維変化の形成、軸索の損傷、及び単核性の浸潤物を中枢神経系において誘導することが見出された（Ｒｏｓｅｎｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．６３（２００６），１４５９−１４６７）。トランスジェニックマウス系列でのリン酸化タウペプチドによる能動的ワクチン投与を用いるその後の研究は、脳におけるタウ凝集物の脳内レベルの低下と行動障害の進行の遅滞を示した（Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｉｓ．１５（２００８），１５７−１６８、Ｂｏｉｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２２４（２０１０），４７２−４８５）。これらの所見は、タウを標的とする能動的免疫療法アプローチに関係する潜在的な利益を強調するが、途方もない危険性も強調する。有効かつ安全な治療法を用いて���理的タウタンパク質に対応する新規の治療戦略が緊急に必要とされる。
【０００４】
進化的に最適化され、ヒトの免疫系によって親和性成熟を経た、健康なヒト対象に由来するヒト抗体を用いる受動免疫によって、極めて有効かつ安全である可能性が高い、見込みのある新しい治療手段が提供されるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃａｉｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００７）１７１、２２７〜４０
【非特許文献２】Ｇｏｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）２９３、１４９１〜１４９５
【非特許文献３】ｖａｎ  ｄｅ  Ｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（２００６）１１１、１２６〜１３８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、天然抗タウ特異的ヒトモノクローナル抗体の単離のために健康なヒト対象のタウ特異的免疫反応を活用する。特に、本発明に従って行われた実験は、神経変性タウオパチーの兆候を示さない健康なヒト対象のプールからモノクローナルタウ特異的抗体を単離することに成功した。
【０００７】
したがって、本発明は、タウを特異的に認識することが可能であるヒト抗体、抗原結合断片、及び類似の抗原結合分子に関する。「タウを特異的に認識する」、「タウに／に対して特異的な抗体」、及び「抗タウ抗体」とは、天然型タウまたは凝集型タウアイソフォームまたは病理的修飾型タウアイソフォームに対する抗体を具体的に、全般的に、そして集合的に意味する。全長型、病理的リン酸化形態、及び凝集型形態に選択的なヒト抗体が、本明細書において提供される。
【０００８】
本発明の特定の実施形態において、ヒト抗体またはその抗原結合断片は、図７に示されるようなＶＨ及び／またはＶＬの可変領域を特徴とする抗体の免疫学的結合特性を示す。
【０００９】
抗体の抗原結合断片は、一本鎖Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）断片、及びＦ（ａｂ’）２断片、または他の任意の抗原結合断片であり得る。特定の実施形態において、以下、抗体またはその断片は、ヒトＩｇＧアイソタイプ抗体である。あるいは、抗体は、キメラヒト−ネズミまたはネズミ化抗体であり、後者は動物における診断方法及び研究に特に有用である。
【００１０】
さらに、本発明は、本発明の抗体もしくはその活性断片、またはアゴニスト及び同種の分子、またはあるいはそのアンタゴニストを含む組成物、そして、タウオパチーの予防、診断、または治療にそのような組成物を用いる、有効量の組成物がそれを必要とする患者に投与される免疫治療的及び免疫診断的方法に関する。
【００１１】
当然、本発明は、それぞれ、以下に定義される明確かつ特有の特徴を有する抗体を産生する不死化ヒトＢメモリリンパ球及びＢ細胞にまで範囲が広がる。
【００１２】
本発明はまた、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチドにも関する。一実施形態において、該可変領域は、図７に記載されるようなＶＨ及び／またはＶＬの可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１３】
したがって、本発明はまた、該ポリヌクレオチドを含むベクター及びそれを用いて形質転換された宿主細胞ならびにタウに特異的な抗体及び同等の結合分子の産生のためのそれらの使用を包含する。抗体及びその模倣体の組み換え技術による産生の手段及び方法、ならびに競合結合分子、例えば、抗体のスクリーニング方法は、当該技術分野において知られている。しかしながら、本明細書に記載されるように、特にヒトにおける治療用途に関連して、ヒト抗体の適用には、そのような抗体に対して向けられる免疫反応であって、キメラ抗体に観察され及びヒト化抗体にさえ観察される、免疫反応がないという意味で、本発明の抗体はヒト抗体である。
【００１４】
さらに、試料中のタウを特定するために使用することができる組成物及び方法が本明細書において開示される。本開示の抗タウ抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡベースのまたは表面適合アッセイを用いることにより、試料中のタウの存在についてヒトの血液、ＣＳＦ、及び尿をスクリーニングするために使用することができる。本明細書において開示される方法及び組成物は、アルツハイマー病等の神経変性タウオパチーの診断に役立てることができ、疾患の進行及び治療の有効性をモニタリングするために使用することができる。
【００１５】
それ故に、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン病−認知症複合病、嗜銀顆粒性認知症、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、皮質基底核変性症、クロイツフェルトヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、前頭側頭認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソン病を伴う前頭側頭認知症、前頭側頭葉変性症、ゲルストマンストロイスラーシャインカー病、ハレルフォルデンスパッツ病、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、Ｃ型ニーマンピック病、神経原線維変化を伴う非グアム島人型運動ニューロン病、ピック病、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症、多発梗塞性認知症、及び虚血性脳卒中等の神経変性タウオパチーの治療、診断、または予防のための方法を提供することは、本発明の特定の目的である。本方法は、抗体がタウを標的とする場合に、対象に、有効濃度のヒト抗体または抗体誘導体を投与することを含む。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
ヒトモノクローナル抗タウ抗体またはそのタウ結合断片であって、前記抗体が、ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体と同じタウのエピトープに結合する、ヒトモノクローナル抗タウ抗体またはそのタウ結合断片。
（項目２）
モノクローナル抗タウ抗体またはそのタウ結合断片であって、
（ｉ）組み換えヒトタウに結合可能である、
（ｉｉ）病理的修飾型タウに結合可能である、
（ｉｉｉ）脳内の神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）、糸屑状構造物、及び／またはジストロフィー性神経突起におけるプレタングル段階の病理的凝集型タウに結合する、
（ｉｖ）脳内で生理型タウに実質的に結合しない、
（ｖ）配列番号１〜６により表されるタウアイソフォームＢ〜Ｆまたは胎児型タウのうちのいずれか１つに特異的に結合する、
（ｖｉ）タウＣ末端に特異的に結合する、
（ｖｉｉ）タウＮ末端に特異的に結合する、
（ｖｉｉｉ）生理学的微小管結合タウではマスクされている微小管結合ドメインに位置するタウエピトープに特異的に結合する、
（ｉｘ）脳内の神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）、糸屑状構造物、及び／またはジストロフィー性神経突起におけるプレタングル段階の病理的凝集型タウに結合する、ならびに
（ｘ）配列番号６の残基１２５〜１３１、３９７〜４４１、２２６〜２４４、２１７〜２２７、３７〜５５、３８７〜４０６、４２１〜４２７、４２７〜４３９、１〜１５８、１９７〜２０７、５７〜６７、３５５〜４４１、３１３〜３１９、３０９〜３１９、及び２２１〜２３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタウエピトープに特異的に結合する、のうちの１つ以上を特徴とし、
前記抗体が、ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体と同じタウのエピトープに結合する、モノクローナル抗タウ抗体またはそのタウ結合断片。  
（項目３）
重鎖可変領域ＶＨを含み、前記重鎖可変領域が、ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体の１つ、２つ、または３つのＶＨ  ＣＤＲを含む、項目１または２に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目４）
ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＶＨ  ＣＤＲ３を含む、項目３に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目５）
（ａ）配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、及び１６３からなる群から選択されるＶＨ  ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、及び１６４からなる群から選択されるＶＨ  ＣＤＲ２、ならびに
（ｃ）配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、及び１６５からなる群から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３、のうちの１つ以上を含む、項目３に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目６）
（ａ）配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、及び１６３からなる群から選択されるＶＨ  ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、及び１６４からなる群から選択されるＶＨ  ＣＤＲ２、ならびに
（ｃ）配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、及び１６５からなる群から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３、を含む、項目４に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目７）
ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体の前記ＶＨ
ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＶＨ  ＣＤＲ３を含み、前記ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＶＨ  ＣＤＲ３が表２に列記されるように定義される、項目６に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目８）
軽鎖可変領域ＶＬを含み、前記軽鎖可変領域が、ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体のうちの１つ、２つ、または３つのＶＬ  ＣＤＲを含む、項目１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目９）
ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３を含む、項目８に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目１０）
（ａ）配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、及び２２４からなる群から選択されるＶＬ  ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、及び１６７からなる群から選択されるＶＬ
ＣＤＲ２、ならびに
（ｃ）配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、及び１６８からなる群から選択されるＶＬ
ＣＤＲ３、のうちの１つ以上を含む、項目８に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目１１）
（ａ）配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、及び２２４からなる群から選択されるＶＬ  ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、及び１６７からなる群から選択されるＶＬ
ＣＤＲ２、ならびに
（ｃ）配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、及び１６８からなる群から選択されるＶＬ
ＣＤＲ３を含む、項目９に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目１２）
ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体の前記ＶＬ
ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３が表２に列記されるように定義される、項目１１に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目１３）
配列番号４４、４５、４７、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７６、及び２２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である重鎖可変領域ＶＨを含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目１４）
前記重鎖可変領域が、配列番号４４、４５、４７、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７６、及び２２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１３に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目１５）
配列番号４６、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７７、７８、２２１、及び２２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である軽鎖可変領域ＶＬを含む、項目１〜１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目１６）
前記軽鎖可変領域が、配列番号４６、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７７、７８、２２１、及び２２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１５に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目１７）
配列番号４５のＶＨ及び配列番号４６のＶＬ、配列番号４５のＶＨ及び配列番号２２１のＶＬ、配列番号４５のＶＨ及び配列番号２２２のＶＬ、配列番号４８のＶＨ及び配列番号４９のＶＬ、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、配列番号２２０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６４のＶＬ、配列番号６５のＶＨ及び配列番号６６のＶＬ、配列番号６７のＶＨ及び配列番号６８のＶＬ、配列番号６９のＶＨ及び配列番号７０のＶＬ、配列番号７１のＶＨ及び配列番号７２のＶＬ、配列番号７３のＶＨ及び配列番号７４のＶＬ、配列番号７６のＶＨ及び配列番号７８のＶＬ、配列番号４４のＶＨ及び配列番号４６のＶＬ、配列番号４７のＶＨ及び配列番号４９のＶＬ、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、ならびに配列番号７５のＶＨ及び配列番号７７のＶＬ、からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬ対を含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗タウ抗体。
（項目１８）
ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体と同じタウのエピトープに結合する、モノクローナル抗体。
（項目１９）
ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体と、タウに対する特異的結合について競合する、モノクローナル抗体。
（項目２０）
ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラネズミ−ヒト抗体、またはネズミ化抗体である、項目２〜１９のいずれか一項に記載の抗体またはそのタウ結合断片。
（項目２１）
一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）断片、及びＦ（ａｂ’）２断片からなる群から選択される、項目１〜２０のいずれか一項に記載の抗体またはそのタウ結合断片。
（項目２２）
項目３〜２１のいずれか一項に記載の抗体のＶＨ及び／またはＶＬを含む、単離されたポリペプチド。
（項目２３）
項目２２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２４）
配列番号１６９〜２０２及び２２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目２３に記載のポリヌクレオチド。
（項目２５）
項目２３または２４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目２６）
項目２３または２４に記載のポリヌクレオチドまたは項目２５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目２７）
抗タウ抗体またはそのタウ結合断片を調製するための方法であって、
（ａ）項目２６に記載の細胞を培養することと、
（ｂ）前記培養物から前記抗体またはそのタウ結合断片を単離することと、を含む、方法。
（項目２８）
項目２７に記載の方法により得られた、抗タウ抗体またはそのタウ結合断片。
（項目２９）
（ａ）検出可能に標識され、前記検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、フルオロフォア、及び重金属からなる群から選択されるか、または
（ｂ）薬物に結合される、項目１〜２１または２８のいずれか一項に記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片。
（項目３０）
項目１〜２１または２８のいずれか一項に記載の抗タウ抗体またはそのタウ結合断片を含む、組成物。
（項目３１）
薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物である、項目３０に記載の組成物。
（項目３２）
神経変性タウオパチーを治療するために有用な追加薬剤をさらに含む、項目３０または３１に記載の組成物。
（項目３３）
診断用組成物であり、任意に、免疫または核酸ベースの診断方法で従来使用される試薬を含む、項目３０に記載の組成物。
（項目３４）
治療を必要とする対象における神経変性タウオパチーの治療方法であって、治療有効量の、項目１〜２１または２８のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
（項目３５）
対象における神経変性タウオパチーの予防及び治療処置のための薬学的もしくは診断用組成物の調製、対象における神経変性タウオパチーの進行のモニタリング、または対象における神経変性タウオパチーの処置に対する反応のモニタリングのための、項目１〜２１または２８のいずれか一項に記載の抗体の使用。
（項目３６）
対象における神経変性タウオパチーの進行を診断またはモニタリングする方法であって、
（ａ）ＩＨＣにより項目１〜２１または２８のいずれか一項に記載の抗体またはそのタウ結合断片を用いて、診断される前記対象に由来する試料中の病理的修飾型または凝集型タウのレベルを測定することと、
（ｂ）修飾型または凝集型タウの前記レベルを、１つ以上の対照対象における前記病理的修飾型または凝集型タウのレベルを示す参照基準と比較することと、を含み、
病理的修飾型または凝集型タウの前記レベルと前記参照基準との間の差異または類似性が、前記対象が神経変性タウオパチーに罹患していることを示す、方法。
（項目３７）
前記神経変性タウオパチーが、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン病−認知症複合病、嗜銀顆粒性認知症、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、皮質基底核変性症、クロイツフェルトヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、前頭側頭認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソン病を伴う前頭側頭認知症、前頭側頭葉変性症、ゲルストマンストロイスラーシャインカー病、ハレルフォルデンスパッツ病、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、Ｃ型ニーマンピック病、神経原線維変化を伴う非グアム島人型運動ニューロン病、ピック病、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症、多発梗塞性認知症、及び虚血性脳卒中からなる群から選択される、項目３５に記載の使用または項目３４もしくは３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ヒトまたは動物の身体でのタウのインビボ検出のため、または治療もしくは診断用薬剤をタウに標的合わせするための方法であって、治療もしくは診断用薬剤に結合された、項目１〜２１または２８のいずれか一項に記載の抗体またはそのタウ結合断片を含む組成物を投与することを含む、方法。
（項目３９）
前記インビボ検出が、陽電子放出トモグラフィー（ＰＥＴ）、単一光子放出トモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学イメージング、または磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体により特異的に認識されるタウのエピトープを有するペプチドであって、配列番号６の残基１２５〜１３１、３９７〜４４１、２２６〜２４４、２１７〜２２７、３７〜５５、３８７〜４０６、４２１〜４２７、４２７〜４３９、１〜１５８、１９７〜２０７、５７〜６７、３５５〜４４１、３１３〜３１９、３０９〜３１９、及び２２１〜２３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
（項目４１）
対象における神経変性タウオパチーを診断するための方法であって、前記対象の生物学的試料中における、項目３６に記載のペプチドに結合する抗体の存在を検出することを含む、方法。
（項目４２）
神経変性タウオパチーの診断に有用なキットであって、項目１〜２１または２８のいずれか一項に記載の抗体またはそのタウ結合断片を、試薬または使用説明書と共に含む、キット。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、以下の説明及び実施例から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒト抗体ＮＩ−１０５．４Ｅ４（Ａ）、ＮＩ−１０５．２４Ｂ２（Ｂ）、及びＮＩ−１０５．４Ａ３（Ｃ）の可変領域、すなわち、重鎖及びラムダ軽鎖のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列。フレームワーク（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が、下線を引かれたＣＤＲと共に示されている。クローニング戦略のため、重鎖及び軽鎖のＮ末端のアミノ酸配列は、ＦＲ１にプライマーにより引き起こされた変異を潜在的に含む場合があるが、しかしながら、それらは抗体の生物学的活性に実質的に影響を与えない。ヒトコンセンサス抗体を提供するために、元のクローンのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、データベース内の適切なヒト生殖系列の可変領域配列と整列させ、それに従って調整した。例えば、ＭＲＣタンパク質工学センター（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）が提供するＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照のこと。ＰＣＲプライマーに起因してコンセンサス生殖系列の配列から潜在的に逸脱していると考えられ、したがって、アミノ酸配列内で置換されたアミノ酸は、太字で示されている。
【図２】ＮＩ−１０５．４Ｅ４は、ＡＤの脳及びヒトＴａｕＰ３０１Ｌを発現するマウスにおいて、神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）、ジストロフィー性神経突起、及び糸屑状構造物に結合する。ＮＩ−１０５．４Ｅ４染色は、ＡＤの脳（Ａ）内において、ＮＦＴ及び糸屑状構造物を特定し、健康な対照対象（Ｂ）の脳内においてタウへの有意な結合はない。ＴａｕＰ３０１Ｌトランスジェニックマウス（Ｅ〜Ｉ）において、ＮＩ−１０５．４Ｅ４は、病理学的にタウに類似しているＮＦＴ（Ｅ、Ｆ、及びＨ）、糸屑状構造物（Ｅ及びＧ）、及びジストロフィー性神経突起（Ｅ及びＨ）に強固に結合する。さらに、ＮＩ−１０５．４Ｅ４はまた、タウがプレタングル段階（Ｉ）で凝集することも特定する。ＮＩ−１０５．４Ｅ４は、Ｓｗｅｄｉｓｈ及びＡｒｃｔｉｃ突然変異を有するヒトＡＰＰ及びＴａｕＰ３０１Ｌを発現するトランスジェニックマウスにおいてＮＦＴ、ジストロフィー性神経突起、及び糸屑状構造物に結合する；矢印は、ＮＩ−１０５．４Ｅ４によって認識されるジストロフィー性神経突起によって取り囲まれるベータアミロイド斑を示す（Ｊ）。二次抗体は、ヒトＡＤ（Ｃ）及び健康な対照（Ｄ）の両方においてのみシグナルを示さない。
【図３】組織アミロイド斑免疫反応性（ＴＡＰＩＲ）アッセイ。神経原線維濃縮体は、健康な老齢対象から単離された抗−リン−タウ抗体ＡＴ１００または血清のいずれかで染色された。
【図４】ＮＩ−１０５．４Ｅ４及びＮＩ−１０５．４Ａ３のエピトープならびに一般に使用される市販のマウスモノクローナルタウ抗体のエピトープの略図を示す。ヒト抗体ＮＩ−１０５．４Ｅ４は、２つの直鎖状ポリペプチドを含む特有のエピトープを標的とし、これらのうちの１つは、生理学的微小管に関連するタウにおいてマスクされているタウの微小管結合ドメイン（Ｒ４）に位置する。Ｔａｕ−１２（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ＨＴ７、ＡＴ８、ＡＴ１８０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）；ＰＨＦ１（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３（２００１），１４８７−１４９１）。
【図５】３０ｍｇ／ｋｇのＮＩ−１０５．４Ｅ４またはＮＩ−１０５．４Ａ３のヒト抗タウ抗体の腹腔内投与後のマウスの血漿中のヒトＩｇＧレベル。
【図６】３０ｍｇ／ｋｇのＮＩ−１０５．４Ｅ４またはＮＩ−１０５．４Ａ３のヒト抗タウ抗体の腹腔内投与後のマウス脳ホモジネートにおけるヒトＩｇＧレベル。
【図７−１】（Ａ）ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、（Ｂ）ＮＩ−１０５．６Ｃ５、（Ｃ）ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、（Ｄ）ＮＩ−１０５．６Ｌ９、（Ｅ）ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、（Ｆ）ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、（Ｇ）ＮＩ−１０５．６Ｅ３、（Ｈ）ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、（Ｉ）ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、（Ｊ）ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、（Ｋ）ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、（Ｌ）ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、（Ｍ）ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、（Ｎ）ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及び（Ｏ）ＮＩ−１０５．９Ｃ４のヒト抗タウ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く。
【図７−２】（Ａ）ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、（Ｂ）ＮＩ−１０５．６Ｃ５、（Ｃ）ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、（Ｄ）ＮＩ−１０５．６Ｌ９、（Ｅ）ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、（Ｆ）ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、（Ｇ）ＮＩ−１０５．６Ｅ３、（Ｈ）ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、（Ｉ）ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、（Ｊ）ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、（Ｋ）ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、（Ｌ）ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、（Ｍ）ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、（Ｎ）ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及び（Ｏ）ＮＩ−１０５．９Ｃ４のヒト抗タウ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く。
【図７−３】（Ａ）ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、（Ｂ）ＮＩ−１０５．６Ｃ５、（Ｃ）ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、（Ｄ）ＮＩ−１０５．６Ｌ９、（Ｅ）ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、（Ｆ）ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、（Ｇ）ＮＩ−１０５．６Ｅ３、（Ｈ）ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、（Ｉ）ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、（Ｊ）ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、（Ｋ）ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、（Ｌ）ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、（Ｍ）ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、（Ｎ）ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及び（Ｏ）ＮＩ−１０５．９Ｃ４のヒト抗タウ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く。
【図７−４】（Ａ）ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、（Ｂ）ＮＩ−１０５．６Ｃ５、（Ｃ）ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、（Ｄ）ＮＩ−１０５．６Ｌ９、（Ｅ）ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、（Ｆ）ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、（Ｇ）ＮＩ−１０５．６Ｅ３、（Ｈ）ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、（Ｉ）ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、（Ｊ）ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、（Ｋ）ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、（Ｌ）ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、（Ｍ）ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、（Ｎ）ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及び（Ｏ）ＮＩ−１０５．９Ｃ４のヒト抗タウ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く。
【図７−５】（Ａ）ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、（Ｂ）ＮＩ−１０５．６Ｃ５、（Ｃ）ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、（Ｄ）ＮＩ−１０５．６Ｌ９、（Ｅ）ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、（Ｆ）ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、（Ｇ）ＮＩ−１０５．６Ｅ３、（Ｈ）ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、（Ｉ）ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、（Ｊ）ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、（Ｋ）ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、（Ｌ）ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、（Ｍ）ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、（Ｎ）ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及び（Ｏ）ＮＩ−１０５．９Ｃ４のヒト抗タウ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く。
【図８】（Ａ）ＥＬＩＳＡアッセイにおける組み換えタウへのｃｈ１７Ｃ１、ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）ｍＩｇＧ２ａ及びｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）ｍＩｇＧ１  Ａｇｌｙの結合。（Ｂ）ＥＬＩＳＡアッセイにおけるｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）ｍＩｇＧ２ａ及びｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ，Ｉ４８Ｖ）ｍＩｇＧ２ａによる組み換えタウ結合の比較。
【図９】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＮＩ−１０５．４０Ｅ８  ｈＩｇＧ１及びＮＩ−１０５．４０Ｅ８（Ｒ１０４Ｗ）ｈＩｇＧ１による組み換えタウ結合の比較。
【図１０】ＡＤの脳内及びタウオパチーのトランスジェニックマウスモデルの脳内での病理的に凝集されたタウへのＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、及びＮＩ−１０５．１７Ｃ１（Ｉ４８Ｖ）ヒト抗タウ抗体の結合。アルツハイマー病（ＡＤ）の脳内及びタウオパチー（Ｔｇ）のトランスジェニックマウスの脳内での病理的タウ凝集体へのヒト抗タウ抗体の結合の代表的な画像。対照組織試料は、精神的に健康な対象（Ｃｔｒ）または野生型マウス脳（Ｗｔ）から得られた。
【図１１】ＴａｕＰ３０１ＬマウスにおけるＮＩ−１０５．６Ｃ５またはＮＩ−１０５．６Ｅ３ヒト抗タウ抗体の脳透過性。「ｔｇ」は処理または未処理のトランスジェニック動物からの代表的な切片を示し、「ｗｔ」は未処理の非トランスジェニック動物を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図１２−１】ｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）及びｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）によるＴａｕＰ３０１Ｌマウスの長期間処置による効果。脳タンパク質抽出物の可溶性及び不溶性画分におけるヒトタウ（Ａ）、ヒトｐＳ１９９タウ（Ｂ）、ヒトｐＴ２３１タウ（Ｃ）、及びヒトｐＴ１８１タウ（Ｄ）の全レベルは、市販のＥＬＩＳＡにより定量された。
【図１２−２】ｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）及びｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）によるＴａｕＰ３０１Ｌマウスの長期間処置による効果。脳タンパク質抽出物の可溶性及び不溶性画分におけるヒトタウ（Ａ）、ヒトｐＳ１９９タウ（Ｂ）、ヒトｐＴ２３１タウ（Ｃ）、及びヒトｐＴ１８１タウ（Ｄ）の全レベルは、市販のＥＬＩＳＡにより定量された。
【図１３】ウェスタンブロットにより検出されたｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）で処置されたＴａｕＰ３０１Ｌマウスにおける可溶性及び不溶性ヒトタウ。
【図１４】最終腹腔内投与から２４時間後、ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）で処置された動物における平均血漿薬物濃度。ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）の平均血漿薬物濃度は、それぞれ、１４５及び２００μｇ／ｍｌであった。
【図１５】ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）で処置されたＴａｕＰ３０１Ｌマウスにおける空間的作業記憶が２試験性Ｙ迷路によって評価された。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
Ｉ．定義
神経変性タウオパチーは、ニューロン及び／またはグリア細胞において主に病理的に高リン酸化されたタウより構成される異常な線維の細胞内凝集体からなる共通した病理的傷害を共有する多様な集団の神経変性障害である。タウオパチーの臨床的特色は、不均一であり、認知症及び／または運動性症候群を特徴とする。線維性タウ封入体の進行性蓄積は、例えば、アルツハイマー病におけるベータアミロイドのような他の沈着物と組み合わさって、または、家族型前頭側頭認知症及び１７番染色体に連鎖したパーキンソン症（ＦＴＤＰ−１７）に関係するタウ遺伝子内の突然変異によって示されるような唯一の病原性実体として、ニューロン及びグリア細胞の変性を引き起こす場合がある。それらの臨床症状が不均一であるため、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン病−認知症複合病、嗜銀顆粒性認知症、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、皮質基底核変性症、クロイツフェルトヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、前頭側頭認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソン病を伴う前頭側頭認知症、前頭側頭葉変性症、ゲルストマンストロイスラーシャインカー病、ハレルフォルデンスパッツ病、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、Ｃ型ニーマンピック病、神経原線維変化を伴う非グアム島人型運動ニューロン病、ピック病、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症、多発梗塞性認知症、及び虚血性脳卒中を含むタウオパチー疾患の潜在的に非排他的な一覧が提供され得る。概説として、例えば、表１がタウオパチーの特有のメンバーをカタログ化するＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４（２００１），１１２１−１１５９、またはＳｅｒｇｅａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ  １７３９（２００５），１７９−９７をその中の図２内の一覧と共に参照のこと。
【００１９】
本明細書において、「タウ」という用語は、天然単量体型のタウを特異的に指すために互換的に使用される。「タウ」という用語はまた、タウの他の配座異性体、例えば、オリゴマーまたは凝集体のタウを全般に特定するためにも使用される。「タウ」という用語はまた、すべての種類及び形態のタウを集合的に指すためにも使用される。選択的スプライシングによって、６つのタウアイソフォームがヒト脳中に存在する。これらのアイソフォームのタンパク質配列は以下の通りである。
３５２ａａの胎児型タウアイソフォーム
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ（配列番号１）
３８１ａａのタウ−Ｂアイソフォーム
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ（配列番号２）
４１０ａａのタウ−Ｃアイソフォーム
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶＤＥＧＡＰＧＫＱＡＡＡＱＰＨＴＥＩＰＥＧＴＴＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ（配列番号３）
３８３ａａのタウ−Ｄアイソフォーム
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ（配列番号４）
４１２ａａのタウ−Ｅアイソフォーム
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ（配列番号５）
４４１ａａのタウ−Ｆアイソフォーム
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶＤＥＧＡＰＧＫＱＡＡＡＱＰＨＴＥＩＰＥＧＴＴＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ（配列番号６）
【００２０】
「野生型」タウアミノ酸配列は、「ｈＴａｕ４０」、「ＴａｕＦ」、「Ｔａｕ−４」、または「全長型タウ」としてもさらに参照される４４１ａａのタウ−Ｆアイソフォーム（配列番号６）によって表される。タウのアミノ酸配列は、文献及び適切なデータベースから引き出すことができる。Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１９８８），４０５１−４０５５、Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９），３９３−３９９、Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．９（１９９０），４２２５−４２３０、及びＧｅｎＢａｎｋ  ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ｌｏｃｕｓ  ＴＡＵ＿ＨＵＭＡＮ、受託番号Ｐ１０６３６−２（胎児型タウ）及びＰ１０６３６−４〜−８（Ｂ〜Ｆアイソフォーム）を参照のこと。
【００２１】
タウタンパク質の別の顕著な特色は、リン酸化であり、７９か所の潜在的なセリン（Ｓｅｒ）及びトレオニン（Ｔｈｒ）リン酸化部位のうちの約３０か所で起こる。タウは、脳の発生の間に高リン酸化される。成体期では、リン酸化の程度は、減少する。リン酸化部位のいくつかは、タウの微小管結合ドメイン内に局在し、タウリン酸化の増加が微小管の結合を負に調節することが示されている。例えば、Ｓｅｒ２６２及びＳｅｒ３９６は、微小管結合モチーフ内にまたはそれに隣接して位置し、ＡＤ患者の脳内の神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）の主要な構成成分である異常な対らせん状線維（ＰＨＦ）のタウタンパク質において高リン酸化される。ＰＨＦは、異常なほど高リン酸化されているタウタンパク質の線維状の凝集体であり、特異的な抗タウ抗体で染色し、光学顕微鏡法で検出することができる。いわゆる直鎖状タウ線維について同じことが当てはまる。ＰＨＦは、約８０ｎｍの周期性で互いに巻きつく２つの線維からなるねじれたリボンを形成する。これらの病理的特色は、「タウ病理」、「タウオパソロジー」、または「タウ関連病理」と一般的に称される。タウオパチーの神経病理的特色のさらに詳細な説明については、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４（２００１），１１２１−１１５９及びＧｏｅｔｚ，Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．３５（２００１），２６６−２８６を参照されたく、それらの開示の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。生理学的なタウタンパク質は、ニューロンにおいて微小管を安定化する。病理的なリン酸化は、異常なタウの局在及び凝集をもたらし、微小管の不安定化及び細胞輸送の障害を引き起こす。凝集したタウは、インビトロでは神経毒性である（Ｋｈｌｉｓｔｕｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６），１２０５−１２１４）。しかしながら、的確な神経毒性を有する種は依然として不明確であり、神経細胞の死をもたらす機序（複数を含む）も同様である。アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭認知症、核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、皮質基底核変性症、ＦＴＤＰ−１７、パーキンソン病、ボクサー認知症等の多くのタウオパチーにおいて、神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）の主要な構成成分としてタウの凝集体を観察することができる（Ｇｅｎｄｒｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ，Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．４：１３（２００９）に概説されている）。これらの観察の他にも、タウが介在する神経細胞の死が、濃縮体形成の不在下であっても起こり得るという証拠が明らかになっている。可溶性リン酸化タウ種は、脳脊髄液中に存在する（Ａｌｕｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１７８２（２００８），５４９−５５８）。タウ凝集体は、細胞の外から内に誤って折り畳まれた状態を伝達し、共培養されている細胞の間でその状態を伝達することができる（Ｆｒｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（２００９），１２８４５−１２８５２）。
【００２２】
神経変性タウオパチーへの関与に加えて、虚血／再潅流の間及び後に観察されるタウリン酸化の変化は、虚血性脳卒中等の神経血管性障害の神経損傷と臨床病理生理においてタウが果たす重要な役割を示唆する（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９（２０１０），２６−２９）。
【００２３】
本明細書において開示されるヒト抗タウ抗体は、タウ及びそのエピトープならびに様々な立体構造のタウ及びそのエピトープに特異的に結合する。例えば、タウ、その全長型のタウ、病理的修飾型タウアイソフォーム、及びタウ凝集体に特異的に結合する抗体が、本明細書において開示される。本明細書に使用される、タウ「に特異的に結合する」、「選択的に結合する」、または「優先的に結合する」抗体への言及は、他の無関連のタンパク質には結合しない抗体を指す。一例では、本明細書において開示されるタウ抗体は、タウまたはそのエピトープに結合し、他のタンパク質にはバックグラウンドの約１．５倍を超える結合を示さない。タウ配座異性体「に特異的に結合する」または「選択的に結合する」抗体は、あらゆる立体構造のタウに結合するわけではない、すなわち、少なくとも１つの他のタウ配座異性体に結合しない抗体を指す。例えば、ＡＤ組織内の凝集型タウに優先的に結合することができる抗体が本明細書において開示される。本発明のヒト抗タウ抗体がタウ特異的免疫反応を示す健康なヒト対象のプールから単離されているので、それらの抗体が対象によって実際に発現されたのであって、例えば、ヒト様抗体を提供しようとするために一般的な１つの方法を今まで代表した、ヒト免疫グロブリンを発現するファージライブラリーから単離したのではないことを強調するために、本発明のタウ抗体はまた、「ヒト自己抗体」と呼ぶこともまた可能である。
【００２４】
「１つの（ａまたはａｎ）」実体という用語は、１つ以上のその実体を指し、例えば、「１つの抗体」は、１つ以上の抗体を表すことが理解されることに留意されたい。このように、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で同じ意味で使用することができる。
【００２５】
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド類」を包含することを意図し、（ペプチド結合としても知られている）アミド結合によって直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸のいずれの鎖または鎖類をも指し、特定の長さの産物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖または鎖類を指すのに用いられるいずれの他の用語も、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれの代わりにも、またはそれと互換的に使用され得る。
【００２６】
「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、天然に生じないアミノ酸による修飾が挙げられるが、これらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的源から誘導され得るか、または組み換え技術によって生産され得るが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されない。それは、化学合成によることを含む、いずれの方法でも作製され得る。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有し得るが、それらはそのような構造を必ずしも有さない。規定された三次元構造を持つポリペプチドは、折り畳まれていると称され、規定された三次元構造を保有せず、むしろ、非常に多数の異なる立体配座をとることができるポリペプチドは、折り畳まれていないと称される。本明細書で使用する、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合される、少なくとも１つの炭水化物部分にカップリングされたタンパク質を指す。
【００２８】
「単離された」ポリペプチド、またはその断片、変異体、または誘導体とは、その自然環境（ｍｉｌｉｅｕ）中にないポリペプチドが意図される。特定レベルの精製が、必要とされることはない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現された、組み換えにより生産されたポリペプチド及びタンパク質は、本発明の目的では単離されていると考えられ、いずれかの好適な技術によって分離され、分画され、または部分的もしくは実質的に精製された、天然または組み換えポリペプチドも同様である。
【００２９】
また、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、及びそれらのいずれかの組み合わせが、本発明のポリペプチドとして含まれる。「断片」、「変異体」、「誘導体」、及び「類似体」という用語には、本発明の抗体または抗体ポリペプチドを指す場合、対応する天然の結合分子、抗体、またはポリペプチドの抗原結合特性の少なくともいくつかを保有する任意のポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドの断片は、本明細書の他の箇所で説明する特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片を含む。本発明の抗体及び抗体ポリペプチドの変異体は、上述の断片を含み、アミノ酸の置換、欠失、または挿入のため、改変されたアミノ酸配列を持つポリペプチドも含む。変異体は、天然に生じるか、または非天然に生じることができる。非天然に生じる変異体は、当該技術分野において既知の突然変異生成技術を用いて産生され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を含み得る。タウ特異的結合分子、例えば、本発明の抗体及び抗体ポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドでは見出されない、さらなる特徴を呈するように改変されたポリペプチドである。例は、融合タンパク質を含む。変異体ポリペプチドはまた、本明細書中においては、「ポリペプチド類似体」とも称され得る。本明細書で使用する、結合分子またはその断片、抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」とは、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドを指す。また、「誘導体」として２０個の標準アミノ酸のうちの１個以上の天然に生じるアミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに置き換えることができ、５−ヒドロキシリジンをリジンの代わりに置き換えることができ、３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに置き換えることができ、ホモセリンをセリンの代わりに置き換えることができ、オルニチンをリジンの代わりに置き換えることができる。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸ならびに複数の核酸を包含することを意図し、単離された核酸分子または構築体、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、慣用的なホスホジエステル結合または非慣用的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で見出されるようなアミド結合）を含み得る。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。例えば、ベクターに含有される抗体をコードする組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞に維持された組み換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチドを含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生される、そのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターのような調節因子であり得るか、またはそれを含み得る。
【００３１】
本明細書で使用する「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、それはコード領域の一部と考えられ得るが、いずれかのフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等は、コード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築体に、例えば、単一のベクター上に、あるいは別々のポリヌクレオチド構築体に、例えば、別々の（異なる）ベクター上に存在させることができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含有することができ、または２つ以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターが、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることができる。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、結合分子、抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸に融合されているか、あるいは融合されていない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域としては、分泌シグナルペプチドまたは異種機能的ドメインのような特殊化された因子またはモチーフが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ある実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合では、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、１つ以上のコード領域と作動可能に会合したプロモーター及び／または他の転写もしくは翻訳調節因子を含むことができる。作動可能な会合は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドについてのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列（複数を含む）の影響または制御下に置くように、１つ以上の調節配列と会合する場合に存在する。プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写という結果になる場合、及び２つのＤＮＡ断片の間の結合の性質が遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨害しないか、または転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨害しない場合に、（ポリペプチドコード領域及びそれと結合するプロモーター等の）２つのＤＮＡ断片は、「作動的に会合している」または「作動可能に連結している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合には、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合されることとなる。プロモーターは、所定の細胞内のＤＮＡのみの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写調節因子、例えば、エンハンサ、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するようにポリヌクレオチドと作動可能に会合させることができる。好適なプロモーター及び他の転写調節領域は、本明細書において開示される。
【００３３】
様々な転写調節領域が、当業者に知られている。これらには、例えば、サイトメガロウイルス（最初期プロモーター、イントロン−Ａと併用して）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーター及びエンハンサセグメントに限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写調節領域が挙げられるが、これらに限定されない。他の転写調節領域は、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、及びウサギβ−グロビン等の脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞において遺伝子発現を調節できる他の配列を含む。さらなる好適な転写制御領域は、組織特異的なプロモーター及びエンハンサ、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導できるプロモーター）を含む。
【００３４】
同様に、種々の翻訳調節因子が、当業者に知られている。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、ならびにピコルナウィルスに由来する因子（特に、ＣＩＴＥ配列とも称される、内部リボソームエントリー部位、またはＩＲＥＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と会合され得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、一旦粗面小胞体にわたる成長タンパク質鎖の輸出が開始されると、成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般にポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、それは完全なまたは「全長型」のポリペプチドから切断されて、分泌型または「成熟」型のポリペプチドを産生することを理解している。ある実施形態において、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、あるいはそれに作動可能に会合されるポリペプチドの分泌を指示する能力を保有するその配列の機能性誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能性誘導体を使用し得る。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
【００３７】
特に記載されない限り、「障害」及び「疾患」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００３８】
本発明の文脈で使用される場合、「結合分子」は、主に、抗体及びその断片に関連するが、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）等のシャペロンならびにカドヘリン、インテグリン、Ｃ型レクチン、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバー等の細胞間接着分子を含むが、これらに限定されないタウに結合する他の非抗体分子を指すこともできる。したがって、本発明の範囲を制限することなく、ただ明確にすることを目的として、治療用及び診断用薬剤の開発のための結合分子の特定の実施形態を表す抗体及び抗体様分子に関して、以下の実施形態の大部分が考察される。
【００３９】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において同義的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常、少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む、タウ結合分子である。脊髄動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照のこと。
【００４０】
以下でより詳細に説明されるように、「免疫グロブリン」という用語は、生物化学的に区別することができる様々な広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、これらの間にいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を有することが理解されるであろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定するのがこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソフォーム）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等は良く特徴付けられており、機能分化を付与することが知られている。これらのクラス及びアイソフォームのそれぞれの修飾型は、本開示を考慮すると、当業者には容易に識別可能であり、したがって、本発明の範囲内である。すべての免疫グロブリンのクラスが明らかに本発明の範囲内にあり、以下の考察は概してＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子に関するものである。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。４つの鎖が典型的にはジスルフィド結合により「Ｙ」配置に結合され、軽鎖が、「Ｙ」の口から始まり、可変領域にわたって続き、重鎖を囲む。
【００４１】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。概して、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合し、免疫グロブリンが雑種細胞、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、２つの重鎖の「尾」部分は、共有ジスフィルド結合または非共有結合により互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ配置の又状端のＮ末端から各鎖の下部のＣ末端へ及ぶ。
【００４２】
軽鎖及び重鎖の両方が、構造的及び機能的相同性がある領域に分けられる。「定常」及び「可変」という用語は、機能的に使用される。この点において、軽（ＶＬ）及び重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが、抗原認識及び特異性を決定することが理解されるであろう。逆に、軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等の重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれて増す。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３及びＣＬドメインは、実際には、それぞれ、重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００４３】
前述の通り、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することが可変領域によって可能になる。すなわち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、３次元の抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四要素からなる抗体構造が、Ｙのそれぞれのアームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ及びＶＬ鎖のそれぞれの３つのＣＤＲによって定義される。タウに特異的に結合するのに十分な構造を含有する任意の抗体または免疫グロブリン断片は、「結合断片」または「免疫特異的断片」として互換的に本明細書に示される。
【００４４】
天然に存在する抗体では、抗体は、各抗原結合ドメインに存在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と時々呼ばれる６つの超可変領域を含み、それらは、抗体が水性環境でその三次元構造を呈するため、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される、アミノ酸の短い非連続な配列である。分子間の多様性がより少ない、４つの比較的に保存された「フレームワーク」領域または「ＦＲ」が「ＣＤＲ」に隣接する。フレームワーク領域は主としてβシート立体配座を取り入れ、ＣＤＲは、βシート構造を接続し、一部の場合ではその一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によってＣＤＲの正しい配向での配置を提供する足場を形成する役目を果たす。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対する表面の相補性を定義する。この相補的な表面が、抗体のその同種のエピトープへの非共有結合を促進する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、正確に定義されているため、当業者は任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について容易に特定することができる。“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）、及びＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（１９８７），９０１−９１７を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４５】
当技術分野内で使用及び／または許容される用語について２つ以上の定義が存在する場合には、本明細書において使用される用語の定義が、明確に反論されない限り、すべてのそのような意味を含むと意図される。具体的な例は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続的な抗原結合部位を説明するために、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語を使用することである。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（１９８７），９０１−９１７（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）によって説明されており、互いに比較されると、アミノ酸残基の重複またはサブセットが定義に含まれる。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すいずれの定義の適用も、本明細書において定義され、かつ使用される用語の範囲内にあると意図される。上で引用した参照文献のそれぞれが定義するＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として、以下の表１に示される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて変化するであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基がヒトＩｇＧサブタイプの抗体の特定の超可変可変領域またはＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。
【表１】
0006284548.tif 000002
【００４６】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用できる可変ドメイン配列についての番号付け系も定義した。当業者は、配列それ自体を超えるいかなる実験データに依存することなく、任意の可変ドメイン配列に対して「Ｋａｂａｔ番号付け」のこの系を明確に割り当てることができる。本明細書で使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）に示される番号付け系を指す。特に明記されない限り、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、変異体、または誘導体の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けに対する言及は、Ｋａｂａｔ番号付け系に従うものであるが、しかしながら、それは理論上のものであり、本発明のすべての抗体を等しく適応することができない。一実施形態において、最初のＣＤＲの位置に応じて、以降のＣＤＲがどちらかの方向に移動する可能性がある。
【００４７】
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、免疫特異的断片、変異体、もしくは誘導体には、ポリクローナル、モノクローナル、多特異的、ヒト、ヒト化、霊長類化、ネズミ化、もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスフィルド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬあるいはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書において開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野において知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。
【００４８】
一実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＭまたは５価構造を有するその誘導体ではない。特に、本発明の特定の用途、特に治療上の使用において、ＩｇＭは多くの場合、その５価構造と親和性成熟の欠如のために非特異的な交差反応性と非常に低い親和性を示すので、ＩｇＭはＩｇＧ及び他の２価の抗体または対応する結合分子よりも有用ではない。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明の抗体はポリクローナル抗体ではない、すなわち、それは、血漿免疫グロブリン試料から得られた混合物である、というよりもむしろ１つの特定の抗体種から実質的になる。
【００５０】
一本鎖抗体を含む抗体断片は、可変領域（複数を含む）のみ、またはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの全体もしくは一部と併せて含むことができる。可変領域（複数を含む）とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせを含むタウ結合断片もまた、本発明に含まれる。本発明の抗体またはその免疫特異的断片は、鳥類及び哺乳動物を含む任意の動物起源であり得る。一実施形態において、抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域は、起源が（例えば、サメからの）コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）であり得る。
【００５１】
一態様において、本発明の抗体は、ヒトから単離されたヒトモノクローナル抗体である。任意に、ヒト抗体のフレームワーク領域は、データベース内の適切なヒト生殖系列の可変領域配列と整列させ、それに従って調整する。例えば、ＭＲＣタンパク質工学センター（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）が提供するＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照のこと。例えば、本当の生殖系列の配列から潜在的に逸脱していると考えられるアミノ酸は、クローニング工程の間に組み込まれたＰＣＲプライマー配列に起因する可能性がある。ファージディスプレイ抗体ライブラリーまたは異種マウスに由来する一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）等の人工的に生成されたヒト様抗体と比較して、本発明のヒトモノクローナル抗体は、（ｉ）代理の動物の免疫反応よりもむしろヒト免疫反応を用いて得られていること、すなわち、その抗体が人体においてその関連立体配座において天然タウに対する反応で生成されたこと、（ｉｉ）個体を保護してきたこと、またはタウの存在について少なくとも重要であること、及び（ｉｉｉ）抗体の起源がヒトであるので、自己抗原に対する交差反応性の危険性が最小化されることを特徴とする。したがって、本発明に従って、「ヒトモノクローナル抗体」、「ヒトモノクローナル自己抗体」、「ヒト抗体」のような用語は、ヒト起源からのタウ結合分子、すなわち、Ｂ細胞またはそのハイブリドーマ等のヒト細胞から単離された、または、そのｃＤＮＡがヒト細胞、例えば、ヒトメモリＢ細胞のｍＲＮＡから直接的にクローンされたことを示すために使用される。ヒト抗体は、例えば、結合特徴を改善するためにその抗体にアミノ酸置換が行われてもなお、「ヒト」抗体である。
【００５２】
以下に記載されるような、及び例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるような、ヒト免疫グロブリンライブラリー、または１つ以上のヒト免疫グロブリンについてのトランスジェニック動物であって内在性免疫グロブリンを発現しない動物に由来する抗体は、それらを本発明の真のヒト抗体から区別するためにヒト様抗体と示される。
【００５３】
例えば、典型的にはファージディスプレイから単離された合成及び半合成抗体等のヒト様抗体の重鎖及び軽鎖の対合は、元のヒトＢ細胞で生じた通りの元の対合に必ずしも反映しているわけではない。したがって、先行技術において一般的に用いられるような組み換え発現ライブラリーから得られたＦａｂ及びｓｃＦｖ断片は、免疫原性及び安定性におけるすべての可能な関連効果に対して人工的であると考えられ得る。
【００５４】
対照的に、本発明は、ヒトにおけるそれらの治療上の有用性及びその耐容性を特徴とする、選択されたヒト対象から単離された親和性成熟抗体を提供する。
【００５５】
本明細書で使用される、「ネズミ化抗体」または「ネズミ化免疫グロブリン」という用語は、本発明のヒト抗体由来の１つ以上のＣＤＲ、ならびにマウス抗体配列に基づくアミノ酸置換及び／または欠失及び／または挿入を含有するヒトフレームワーク領域を含む抗体を指す。ＣＤＲを提供するヒト免疫グロブリンは、「親」または「受容体」と呼ばれ、フレームワーク変化をもたらすマウス抗体は、「ドナー」と呼ばれる。定常領域は、存在する必要がないが、存在する場合、それらは、通常、マウス抗体の定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上同一である。それ故に、いくつかの実施形態において、全長型ネズミ化ヒト重鎖または軽鎖免疫グロブリンは、マウス定常領域、ヒトＣＤＲ、及び多数の「ネズミ化」アミノ酸置換を有する実質的にヒトフレームワークを含有する。典型的には、「ネズミ化抗体」は、ネズミ化可変軽鎖及び／またはネズミ化可変重鎖を含む抗体である。例えば、ネズミ化抗体は、例えば、キメラ抗体の全可変領域が非マウスであるため、典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。「ネズミ化」の工程により「ネズミ化」した修飾型抗体は、ＣＤＲを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、通常、親抗体と比較して、マウスにおける免疫原性が低い。
【００５６】
本明細書で使用される「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上方、中央、及び／または下方のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその変異体もしくは断片のうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明で用いられる結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むことができる。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明において使用される結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部）を欠失し得る。上述の通り、これらのドメイン（例えば重鎖部分）は、天然の免疫グロブリン分子からのアミノ酸配列とは異なるように修飾され得ることが、当業者には理解される。
【００５７】
本明細書において開示されるある抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体において、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第２のポリペプチド鎖上のものと同一である。あるいは、本発明の重鎖部分含有単量体は同一ではない。例えば、各単量体は、異なる標的結合部位を含むことができ、例えば、二特異性抗体またはダイアボディを形成する。
【００５８】
別の実施形態において、本明細書において開示される抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ｓｃＦｖ等の単一ポリペプチド鎖から構成され、潜在的なインビボ治療及び診断用途のために細胞内に発現され得る（細胞内抗体）。
【００５９】
本明細書において開示される診断及び治療方法において使用される結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメイン、及びＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例においては、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、部分的にＩｇＧ３分子に由来する、ヒンジ領域を含み得る。別の例においては、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、部分的にＩｇＧ４分子に由来する、キメラヒンジを含み得る。
【００６０】
本明細書で使用される「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリンの軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインのうちの少なくとも１つを含む。
【００６１】
抗体のペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５アミノ酸であると考えられる。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、少なくとも７、少なくとも９、または少なくとも約１５〜約３０の間のアミノ酸を含有することができる。ＣＤＲが、抗原性ペプチドまたはポリペプチドをその三次形態で認識することができるので、エピトープを含むアミノ酸は、連続的である必要はなく、いくつかの場合には、同じペプチド鎖上にさえ存在しなくてもよい。本発明では、本発明の抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドエピトープは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または約５〜約３０の間、約１０〜約３０の間、または約１５〜約３０の間の連続または不連続なタウのアミノ酸からなる配列を含有する。
【００６２】
本明細書において互換的に使用される「特異的に結合する」または「特異的に認識する」とは、一般に、結合分子、例えば、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及びその結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間にある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義に従って、抗体は、それが、ランダムな、非関連エピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。非連続的エピトープの直鎖状部分に対応するアミノ酸残基を含む、またはそれからなる、単離されたポリペプチドに、抗体が特異的に結合するか、またはそれを特異的に認識することができることを当業者は理解する。「特異性」という用語は、本明細書において、ある抗体があるエピトープに結合する相対的親和性を限定するために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所与のエピトープについて抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有すると見なしてよいし、または抗体「Ａ」は、関連エピトープ「Ｄ」について有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。
【００６３】
存在する場合、「免疫学的結合特性」という用語または抗体の抗原との他の結合特性は、そのすべての文法の形式で、抗体の特異性、親和性、交差反応性、及び他の結合特性を指す。
【００６４】
「優先的に結合する」とは、結合分子、例えば、抗体が、関連する、同様の、相同な、または類似のエピトープに結合する場合よりも容易にエピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連するエピトープに交差反応することが可能であっても、関連のエピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高いであろう。
【００６５】
非限定的な例として、結合分子、例えば、抗体が、第２のエピトープに対する抗体の解離定数（ＫＤ）よりも小さいＫＤで第１のエピトープに結合する場合、その抗体は第１のエピトープに優先的に結合すると見なされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも一桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、その抗体は第１の抗原に優先的に結合すると見なされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも二桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、その抗体は第１のエピトープに優先的に結合すると見なされ得る。
【００６６】
別の非限定的な例では、結合分子、例えば、抗体が、第２のエピトープに対する抗体のオフ速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）（ｋ（ｏｆｆ））よりも小さいｋ（ｏｆｆ）で第１のエピトープに結合する場合、その抗体は第１のエピトープを優先的に結合すると見なされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも一桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、その抗体は第１のエピトープに優先的に結合すると見なされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも二桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、その抗体は第１のエピトープに優先的に結合すると見なされ得る。
【００６７】
本明細書において開示される結合分子、例えば、抗体、または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、毎秒５×１０−２、毎秒１０−２、毎秒５×１０−３、または毎秒１０−３以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））でタウまたはその断片もしくは変異体に結合すると言うことができる。一実施形態において、本発明の抗体は、毎秒５×１０−４、毎秒１０−４、毎秒５×１０−５、または毎秒１０−５、毎秒５×１０−６、毎秒１０−６、毎秒５×１０−７、または毎秒１０−７以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））でタウまたはその断片もしくは変異体に結合すると言うことができる。
【００６８】
本明細書において開示される結合分子、例えば、抗体、または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、毎秒１０３Ｍ−１、毎秒５×１０３Ｍ−１、毎秒１０４Ｍ−１、または毎秒５×１０４Ｍ−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））でタウまたはその断片もしくは変異体に結合すると言うことができる。一実施形態において、本発明の抗体は、毎秒１０５Ｍ−１、毎秒５×１０５Ｍ−１、毎秒１０６Ｍ−１、毎秒５×１０６Ｍ−１、または毎秒１０７Ｍ−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））でタウまたはその断片もしくは変異体に結合すると言うことができる。
【００６９】
結合分子、例えば、抗体は、エピトープに対する参照抗体の結合をある程度までブロックするという程度までそのエピトープに優先的に結合する場合、参照抗体の所与のエピトープへの結合を競合的に阻害すると言われる。競合阻害は、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイ等の当該技術分野において知られている任意の方法によって決定され得る。抗体は、参照抗体の所与のエピトープへの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると言うことができる。抗体のそのエピトープへの結合がまた、抗体ではない結合分子によって競合的に阻害され得るということも当業者は理解する。例えば、本明細書に記載される抗体のタウ、例えば、ｈＴａｕ４０への特異的な結合は、微小管によって競合的に阻害され得る。
【００７０】
本明細書で使用される「親和性」という用語は、結合分子、例えば免疫グロブリン分子のＣＤＲとの個々のエピトープの結合強度の尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）の２７〜２８頁を参照されたい。本明細書で使用される「結合活性」という用語は、免疫グロブリンの集団と抗原の間の複合体の総合的な安定性、すなわち、免疫グロブリン混合物の抗原との機能的結合強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４頁を参照されたい。結合活性は、集団中の個々の免疫グロブリン分子の特異的エピトープとの親和性、及びまた、免疫グロブリンと抗原の結合価の両方に関連する。例えば、二価モノクローナル抗体と、ポリマー等の高度に反復するエピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高い結合活性の１つであるであろう。任意の好適な方法を用いて抗体の抗原への親和性または結合活性を実験的に決定することができる。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）内のＢｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、及び本明細書に記載される方法を参照のこと。抗体の抗原への親和性を測定するための一般的な技術には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び表面プラズモン共鳴が含まれる。塩濃度、ｐＨ等の異なる条件下で測定される場合、特定の抗体抗原間相互作用の測定された親和性は変化し得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ、例えば、ＫＤ、ＩＣ５０の測定は、抗体及び抗原の標準化した溶液、及び標準化した緩衝液を用いて行われるのが好ましい。
【００７１】
本発明の結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、または誘導体はまた、それらの交差反応性に関して、記載または明示され得る。本明細書で使用される「交差反応性」という用語は、１つの抗原に対して特異的な抗体の二次抗原と反応する能力、つまり、２つの異なる抗原性物質の間の関連性の尺度を指す。したがって、抗体は、それがその形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般には、誘導エピトープと同一の相補性構造特徴の多くを含有し、いくつかの場合、元来のものよりも実際には良好に適合し得る。
【００７２】
例えば、ある抗体は、関連するが同一でないエピトープ、例えば、参照エピトープに対して、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、及び少なくとも５０％の（当該技術分野において知られている、及び本明細書に記載の方法を用いて算出されるような）同一性を有するエピトープと結合するという点で、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、及び５０％未満の（当該技術分野において知られている、及び本明細書に記載の方法を用いて算出されるような）同一性を有するエピトープに結合しない場合、交差反応性は、ほとんどない、または全く有していないと言うことができる。抗体は、あるエピトープの任意の他の類似体、オルソログ、または相同体に結合しない場合、それはそのエピトープに対して「高度に特異的である」と見なすことができる。
【００７３】
本発明の結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はまた、タウに対するそれらの結合親和性に関して記載または特定され得る。一実施形態において、結合親和性には、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄのものが含まれる。
【００７４】
前述のように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元構造がよく知られている。本明細書で使用される「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接し、かつ免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端である。
【００７５】
本明細書で使用される「ＣＨ２ドメイン」という用語は、従来の番号付けスキームを用いて、例えば、抗体の約残基２４４から残基３６０まで延在する重鎖分子の部分を含む（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔ番号付け系；及び残基２３１〜３４０、ＥＵ番号付け系；Ｋａｂａｔ  ＥＡらの前掲書を参照のこと）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合していないという点で独特である。むしろ、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端まで延在し、約１０８個の残基を含むことも文書で十分に立証されている。
【００７６】
本明細書で使用される「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約２５個の残基を含み、かつ柔軟性があり、したがって、２個のＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、３つの別個のドメイン、すなわち、上方、中央、下方のヒンジドメインに細分化することができる。Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８），４０８３を参照のこと。
【００７７】
本明細書で使用される「ジスルフィド結合」という用語は、２個の硫黄原子の間で形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成することができる、または第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。ほとんどの天然のＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域とＣＬ領域は、ジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付け系を用いて、２３９及び２４２に対応する位置（位置２２６または２２９、ＥＵ番号付け系）での２つのジスルフィド結合によって連結される。
【００７８】
本明細書で使用される「連結した」、「融合した」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的複合体化または組み換え手段を含む何等かの手段によって、２つ以上の要素または構成成分を結合することを指す。「インフレーム融合」は、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を結合し、元のＯＲＦの正確な翻訳リーディングフレームを維持する方法で、連続する、より長いＯＲＦを形成することを指す。したがって、組み換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上の区分（かかる区分は、自然界では、通常、そのように結合されない）を含有する単一のタンパク質である。リーディングフレームは、そのようにして、融合した区分全体で連続的に形成されるが、この区分は、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的または空間的に分離され得る。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合され得るが、「融合した」ＣＤＲが連続的なポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離され得る。
【００７９】
本明細書で使用する「発現」という用語は、遺伝子が、生化学物質、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生する工程を指す。この工程は、遺伝子ノックダウンならびに一時的発現及び安定発現の両方を含むが、これらに限定されない、細胞内での遺伝子の機能的存在の任意の現れを含む。これには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、及びポリペプチド（複数を含む）へのそのようなｍＲＮＡの翻訳が含まれるが、これらに限定されない。最終的に所望される産物が生化学物質である場合、発現には、その生化学物質及び任意の前駆体の作製が含まれる。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用される、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、あるいは転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物には、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク分解切断等を有するポリペプチドがさらに含まれる。
【００８０】
本明細書で使用される「試料」という用語は、対象または患者から得られる任意の生物学的物質を指す。一態様において、試料は、血液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）、または尿を含み得る。他の態様において、試料は、全血、血漿、血液試料から濃縮されたＢ細胞、及び培養細胞（例えば、対象からのＢ細胞）を含み得る。試料はまた、生検試料、または神経組織を含む組織試料も含み得る。さらに他の態様において、試料は、細胞全体及び／または細胞の溶解物を含み得る。血液試料は、当該技術分野において知られている方法によって採取することができる。一態様において、２００μｌの緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ＩＸ  Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、及びＩＸ  Ｓｉｇｍａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１及び２）中に４℃でボルテックスすることによって沈殿物を再懸濁することができる。断続的にボルテックスをしながら、懸濁液を氷上で２０分間放置することができる。約４℃で５分間、１５，０００×ｇで遠心した後、上清のアリコートを約−７０℃で保存することができる。
【００８１】
本明細書で使用される「治療する」または「治療」という用語は、治療的処置及び予防的または予防手段の両方を指し、ここで、その目的は、パーキンソン症の進行のような望ましくない生理学的変化または障害を予防すること、または遅らせる（軽減する）ことである。有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能であろうと検出不可能であろうと、症状の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の安定化した（即ち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または減速、疾患状態の改善または軽減、及び（部分的であろうと全体的であろうと）寛解が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予期される生存期間と比較して、生存期間を延長させることを意味することもできる。治療を必要とする者には、障害または疾患を既に持つ者及び障害または疾患を患う傾向がある者、あるいは障害または疾患の出現が予防されるべき者が含まれる。
【００８２】
「対象」または「個人」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後予測、予防、または治療が望ましい任意の対象、特に哺乳動物対象、例えばヒト患者を意味する。
【００８３】
ＩＩ．抗体
本発明は、概して、ヒト抗タウ抗体及びその抗原結合断片に関する。一実施形態において、本発明の抗体は、実施例において示される抗体について概説されるような免疫学的結合特性及び／または生物学的特質を示す。本発明に従って、タウに特異的なヒトモノクローナル抗体は、健康なヒト対象のプールからクローン化された。
【００８４】
本発明に従って行われる実験の過程で、最初の試みは、タウ特異的抗体をクローン化することに失敗したが、ほとんどの場合、偽陽性クローンをもたらした。この問題を回避するために、組み換えタウタンパク質、ＡＤの脳から抽出されたＰＨＦＴａｕ、健康な対照脳抽出物、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）への結合について、ヒトメモリＢ細胞培養物の馴化培地中の抗体を並行してスクリーニングした。組み換えタウ及び／またはＰＨＦＴａｕについて陽性であるが、対照脳抽出物もしくはＢＳＡについて陽性ではないＢ細胞培養物のみが抗体のクローン化の対象とされた。
【００８５】
循環するタウ抗体血漿の上昇を示唆する、タウに対する高い血漿結合活性を有する健康なヒト対象のプールに、特異的な抗体を単離する最初の試みを集中した。予想外にも、これらの試みは、タウ特異的ヒトメモリＢ細胞を産生することに失敗し、本発明に記載される抗体は、高いタウ血漿反応性について予備選択されていない、またはタウに対して低い血漿反応性を有する健康なヒト対象のプールから単離された。
【００８６】
この手段により、いくつかの抗体を単離することができた。クラスと軽鎖サブクラスの決定のために、選択された抗体をさらに分析した。次いで、メモリＢ細胞培養物からの選択された関連性のある抗体のメッセージは、ＲＴ−ＰＣＲによって転写され、クローン化され、組み換え体の産生のために発現ベクターに組み込まれる。添付の実施例を参照のこと。ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞でのヒト抗体の組み換え発現、ならびにその後の、全長型タウ、ウェスタンブロットでのその病理的修飾型に対するそれらの結合特異性、及び病理的凝集型タウへのそれらの特色のある結合についての特徴付けにより、初めて、タウに対して非常に特異的であり、病理的修飾型タウタンパク質を特徴的に認識するヒト抗体がクローン化されたことが確認された。
【００８７】
したがって、本発明は、概して、単離された天然のヒトモノクローナル抗タウ抗体、ならびにその結合断片、誘導体、及び変異体に関する。本発明の一実施形態において、抗体は、ウェスタンブロットで全長型組み換えタウ及び／またはＡＤの脳から単離した病理的凝集型及び／もしくはリン酸化型（ＰＨＦＴａｕ）に変性条件下で特異的に結合することができる。
【００８８】
一実施形態において、本発明は、抗タウ抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体に関し、この抗体は、ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、またはＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される参照抗体と同じタウのエピトープに特異的に結合する。
【００８９】
さらなるヒト抗タウ抗体は、米国特許出願公開第２０１２／００８７８６１号に開示されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９０】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ｈＴａｕ４０（配列番号６）の残基１２５〜１３１、３９７〜４４１、２２６〜２４４、２１７〜２２７、３７〜５５、３８７〜４０６、４２１〜４２７、４２７〜４３９、１〜１５８、１９７〜２０７、５７〜６７、３５５〜４４１、３１３〜３１９、３０９〜３１９、及び２２１〜２３１に対応する残基からなる群から選択されるアミノ酸残基を含むエピトープでタウに特異的に結合する。さらなる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ｈＴａｕ４０（配列番号６）の残基３７〜５５及び３８７〜４０６に対応するアミノ酸残基を含むエピトープでタウに特異的に結合する。特定の実施形態において、タウは、ｈＴａｕ４０（配列番号６）である。
【００９１】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、タウの微小管結合ドメインを含むエピトープでタウに特異的に結合する。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、図４に示されるようなタウのＲ４領域からアミノ酸残基を含むエピトープでタウに結合する。一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、タウへの特異的結について微小管と競合する。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、微小管と結合していないタウへの抗体結合親和性と比較して、微小管が結合したタウへの低下した結合親和性を有する。さらなる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、微小管と結合したタウに結合しない、または実質的に結合しない。特定の実施形態において、タウタンパク質は、天然タウタンパク質または組み換えタウタンパク質であり得る。特定の実施形態において、タウは、ｈＴａｕ４０である。
【００９２】
一実施形態において、本発明のヒト抗タウ抗体は、病理的凝集型タウに特異的に結合することができるが、脳組織中の生理型タウに実質的に結合することができない。さらに、本発明のヒト抗タウ抗体は、脳内の神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）、糸屑状構造物、及び／またはジストロフィー性神経突起におけるプレタングル段階のタウを認識するその能力をさらに特徴とし得る。それ故に、本発明は、診断及び治療目的に特に有用である、結合特異性を有するヒトタウ抗体一式を提供する。
【００９３】
さらに、またはあるいは、本発明の抗タウ抗体は、具体的には、実施例４及び１８に従って分析される場合、生理型よりもむしろ病理的凝集型タウを優先的に認識する。さらに、またはあるいは、本発明の抗タウ抗体は、ヒトタウの疾患の原因となる突然変異体、具体的には、実施例４に記載されるものに結合する。これに関連して、結合特異性は、約１００ｐＭ〜１００ｎＭの半最大有効濃度（ＥＣ５０）、または野生型タウに対して約１００ｐＭ〜１０ｎＭのＥＣ５０を有する範囲内であり得る。
【００９４】
それ故に、本発明の抗タウ抗体は、実施例４及び１８に記載される免疫組織学的染色により例示されるように、脳内において病理的修飾型タウ、例えば、病理的凝集型タウに優先的に結合する。別の実施形態において、本発明の抗タウ抗体は、ウェスタンブロットによって実施例２において例示されるように、組み換えタウ及び病理的修飾型タウの両方に優先的に結合する。
【００９５】
本発明はまた、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、または誘導体を対象とし、本抗体は、ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される抗体の抗原結合ドメインと同一の抗原結合ドメインを含む。
【００９６】
本発明は、図７に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むＶＨ及び／またはＶＬ可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を可変領域、例えば、結合ドメインに含むことを特徴とし得る、いくつかのそのような結合分子、例えば、抗体及びその結合断片をさらに例示する。上で特定された可変領域をコードする対応するヌクレオチド配列を、以下の表４に示す。図７に示される、ＶＨ及び／またはＶＬ領域の上のアミノ酸配列の例示的な一式のＣＤＲ。しかしながら、以下に考察するように、さらに、またはあるいは、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の場合では、図７に記載されるものとそれらのアミノ酸配列が１個、２個、３個、またはもっと多くのアミノ酸だけ異なるＣＤＲを使用することができるという事実を当業者はよく理解する。
【表２】
0006284548.tif 000003
【００９７】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７９〜１６８及び２２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００９８】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７９〜１６８及び２２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲを含む。
【００９９】
一実施形態において、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号７９〜８４、８５〜９０、９１〜９６、９７〜１０２、１０３〜１０８、１０９〜１１４、１１５〜１２０、１２１〜１２６、１２７〜１３２、１３３〜１３８、１３９〜１４４、１４５〜１５０、１５１〜１５６、１５７〜１６２、または１６３〜１６８のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、２２４、８３、及び８４のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１００】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７９〜８１、８５〜８７、９１〜９３、９７〜９９、１０３〜１０５、１０９〜１１１、１１５〜１１７、１２１〜１２３、１２７〜１２９、１３３〜１３５、１３９〜１４１、１４５〜１４７、１５１〜１５３、１５７〜１５９、及び１６３〜１６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる１つ、２つ、または３つのＶＨ  ＣＤＲを含む。
【０１０１】
一実施形態において、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号７９〜８１、８５〜８７、９１〜９３、９７〜９９、１０３〜１０５、１０９〜１１１、１１５〜１１７、１２１〜１２３、１２７〜１２９、１３３〜１３５、１３９〜１４１、１４５〜１４７、１５１〜１５３、１５７〜１５９、または１６３〜１６５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【０１０２】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号８２〜８４、８８〜９０、９４〜９６、１００〜１０２、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１１８〜１２０、１２４〜１２６、１３０〜１３２、１３６〜１３８、１４２〜１４４、１４８〜１５０、１５４〜１５６、１６０〜１６２、１６６〜１６８、及び２２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる１つ、２つ、または３つのＶＬ  ＣＤＲを含む。
【０１０３】
一実施形態において、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号８２〜８４、８８〜９０、９４〜９６、１００〜１０２、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１１８〜１２０、１２４〜１２６、１３０〜１３２、１３６〜１３８、１４２〜１４４、１４８〜１５０、１５４〜１５６、１６０〜１６２、または１６６〜１６８のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、それぞれ、配列番号８３、８４、及び２２４のアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３。
【０１０４】
一実施形態に従って、本発明の抗体は、配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、または１６３のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、または１６４のＶＨ  ＣＤＲ２、あるいは配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、または１６５のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態に従って、抗体は、配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、または２２４のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、または１６７のＶＬ  ＣＤＲ２、あるいは配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、または１６８のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、または１６３のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、または１６４のＶＨ  ＣＤＲ２、あるいは配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、または１６５のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、かつ、配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、または２２４のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、または１６７のＶＬ  ＣＤＲ２、あるいは配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、または１６８のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。
【０１０５】
一実施形態に従って、本発明の抗体は、配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、または１６３のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、または１６４のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、または１６５のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態に従って、抗体は、配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、または２２４のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、または１６７のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、または１６８のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、または１６３のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、または１６４のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、または１６５のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、かつ、配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、または２２４のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、または１６７のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、または１６８のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。
【０１０６】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７９のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８０のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号８１のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号８２のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号８３のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号８４のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１０７】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７９のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８０のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号８１のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号２２４のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号８３のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号８４のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１０８】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号８５のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８６のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号８７のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号８８のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号８９のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号９０のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１０９】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号９１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９２のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号９３のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号９４のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号９５のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号９６のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１１０】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号９７のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９８のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号９９のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１００のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１０１のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１０２のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１１１】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１０３のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１０４のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１０５のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１０６のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１０７のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１１２】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１０９のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１０のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１１１のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１１２のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１１３のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１１４のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１１３】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１１５のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１６のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１１７のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１１８のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１１９のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１２０のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１１４】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１２１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１２２のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１２３のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１２４のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１２５のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１２６のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１１５】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１２７のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１２８のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１２９のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１３０のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１３１のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１３２のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１１６】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１３３のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１３４のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１３５のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１３６のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１３７のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１３８のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１１７】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１３９のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１４０のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１４１のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１４２のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１４３のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１４４のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１１８】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１４５のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１４６のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１４７のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１４８のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１４９のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１５０のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１１９】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１５１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１５２のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１５３のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１５４のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１５５のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１５６のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１２０】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１５７のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１５８のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１５９のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１６０のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１６１のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１６２のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１２１】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１６３のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１６４のＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１６５のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができ、かつ、配列番号１６６のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１６７のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１６８のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０１２２】
一実施形態において、本発明の抗体は、図７及び表３に示される、ＶＨ及び／またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体のいずれか１つである。一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＢ細胞で存在したような、重鎖及び軽鎖の同種の対合を維持することを特徴とする。
【表３】
0006284548.tif 000004
【０１２３】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４４、４５、４７、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７６、及び２２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４６、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７７、７８、２２１、及び２２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４４、４５、４７、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７６、及び２２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、かつ、配列番号４６、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７７、７８、２２１、及び２２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む。特定の実施形態において、抗体は、配列番号４５のＶＨ及び配列番号４６のＶＬ；または配列番号４５のＶＨ及び配列番号２２１のＶＬ；または配列番号４５のＶＨ及び配列番号２２２のＶＬ；または配列番号４８のＶＨ及び配列番号４９のＶＬ；または配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ；または配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ；または配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ；または配列番号２２０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ；または配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ；または配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ；または配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ；または配列番号６２のＶＨ及び配列番号６４のＶＬ；または配列番号６５のＶＨ及び配列番号６６のＶＬ；または配列番号６７のＶＨ及び配列番号６８のＶＬ；または配列番号６９のＶＨ及び配列番号７０のＶＬ；または配列番号７１のＶＨ及び配列番号７２のＶＬ；または配列番号７３のＶＨ及び配列番号７４のＶＬ；または配列番号７６のＶＨ及び配列番号７８のＶＬ；または配列番号４４のＶＨ及び配列番号４６のＶＬ；または配列番号４７のＶＨ及び配列番号４９のＶＬ；または配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ；または配列番号７５のＶＨ及び配列番号７７のＶＬを含む。
【０１２４】
あるいは、本発明の抗体は、図７及び表３に示される、ＶＨ及び／またはＶＬ領域を有する抗体うちの少なくとも１つと、例えば、ｈＴａｕ４０等のタウへの結合に対して競合する抗体、またはその抗原結合断片、誘導体、もしくは変異体である。一実施形態において、本発明の抗体は、ｈＴａｕ４０への特異的結合について、ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、またはＮＩ−１０５．９Ｃ４と競合する。それらの抗体は、特に治療用途について、同様にヒト抗体であり得る。あるいは、抗体は、ネズミ、ネズミ化、及びキメラネズミ−ヒト抗体であり、動物における診断方法及び研究に特に有用である。
【０１２５】
一実施形態において、本発明の抗体は、培養される単一またはオリゴクローナルＢ細胞の培養物により提供され、該Ｂ細胞によって産生された抗体を含有する培養物の上清を、その中の抗タウ抗体の存在及び親和性についてスクリーニングする。スクリーニング工程は、国際出願公開第ＷＯ２００４／０９５０３１号（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような感受性組織アミロイド斑免疫反応性（ＴＡＰＩＲ）アッセイのステップ、脳切片でのＰＨＦＴａｕへの結合についてのスクリーニングステップ、該細胞のアミノ酸Ｓｅｒ−２０２及びＴｈｒ−２０５、アミノ酸Ｔｈｒ−２３１ならびに／またはアミノ酸Ｓｅｒ−３９６及びＳｅｒ−４０４にリン酸基を有する配列番号６によって表されるアミノ酸配列のタウに由来するペプチドの結合についてのスクリーニングステップ、配列番号６によって表されるアミノ酸配列の組み換えヒトタウの結合についてのスクリーニングステップ、ならびに結合が検出される抗体または該抗体を産生する細胞を単離するステップを含む。
【０１２６】
上述のように、ヒト免疫反応に応じて生成されるため、本発明のヒトモノクローナル抗体は、特定の病理と関連があり、例えば、マウスモノクローナル抗体の生成のための免疫化工程の場合、及びファージディスプレイライブラリのインビトロスクリーニングの場合、それぞれ、アクセスできる可能性がない、または免疫原性が低い可能性がないエピトープを認識する。したがって、本発明のヒト抗タウ抗体のエピトープが特有であり、本発明のヒトモノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合することができる他の抗体は存在しないと明記することが賢明である。したがって、本発明はまた、概して、本発明のヒトモノクローナル抗体とタウに対する特異的結合について競合する抗タウ抗体及びタウ結合分子にまで及ぶ。本発明は、より具体的には、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体に関し、この抗体は、ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される参照抗体と同じタウのエピトープに特異的に結合する。
【０１２７】
抗体間の競合は、試験下で免疫グロブリンがタウ等の共通の抗原への参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイによって判定される。非常に多くのタイプの競合結合アッセイが知られている。例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９（１９８３），２４２−２５３を参照、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６），３６１４−３６１９及びＣｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６（１９９０），５４６−５５２を参照、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照、Ｉ１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１９８８），７−１５及びＭｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（１９９０），７７−８２を参照。典型的に、そのようなアッセイは、固体表面に結合された精製タウもしくはその凝集体、またはこれらのいずれかを保有する細胞と、非標識試験免疫グロブリンと、標識参照免疫グロブリン、すなわち、本発明のヒトモノクローナル抗体との使用を伴う。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で、固体表面または細胞に結合した標識の量を判定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは、過剰に存在する。一実施形態において、競合的結合アッセイは、添付の実施例中のＥＬＩＳＡアッセイについて記載されるような条件下で行われる。競合アッセイによって特定された抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び参照抗体が結合するエピトープに立体障害が生じるほど十分近位の隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。通常、競合抗体が過剰に存在するとき、それは共通抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも５０％または７５％阻害する。それ故に、本発明は、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をさらに対象とし、この抗体は、タウに結合することからＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、またはＮＩ−１０５．９Ｃ４からなる群から選択される参照抗体を競合的に阻害する。
【０１２８】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的にはそれからなる、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供し、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つまたは重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つは、本明細書において開示される抗体の参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。あるいは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書において開示される抗体の参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、図７に示される群に関連するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図７は、Ｋａｂａｔ系により定義されるＶＨ−ＣＤＲを示す一方、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ系により定義されるＶＨ−ＣＤＲもまた、本発明に含まれ、図７に示されるデータを用いて、当業者により容易に特定され得る。一実施形態において、参照ＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、または１６３であり、参照ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、または１６４であり、参照ＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、または１６５である。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供し、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、図７に示されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する。一実施形態において、ＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、または１６３であり、ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、または１６４であり、ＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、または１６５である。
【０１３０】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供し、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、いずれか１つのＶＨ−ＣＤＲにおいて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸置換を除いて、図７に示される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。一実施形態において、ＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、または１６３であり、ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、または１６４であり、ＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、または１６５である。
【０１３１】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供し、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つまたは軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つは、本明細書において開示される抗体の参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書において開示される抗体の参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図７に示されるポリペプチドと関連するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図７は、Ｋａｂａｔ系により定義されるＶＬ−ＣＤＲを示す一方、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ系により定義されるＶＬ−ＣＤＲもまた、本発明に含まれる。一実施形態において、参照ＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、または２２４であり、参照ＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、または１６７であり、参照ＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、または１６８である。
【０１３２】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供し、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、図７に示されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する。一実施形態において、ＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、または２２４であり、ＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、または１６７であり、ＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、または１６８である。
【０１３３】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供し、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、いずれか１つのＶＬ−ＣＤＲにおいて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸置換を除いて、図７に示される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。一実施形態において、ＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、または２２４であり、ＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、または１６７であり、ＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、または１６８である。
【０１３４】
別の実施形態において、本発明は、図７及び表３に示される参照重鎖可変領域と同一である免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供する。一実施形態において、参照重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４４、４５、４７、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７６、または２２０を含む。
【０１３５】
別の実施形態において、本発明は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸置換を除いて、図７及び表３に示される参照重鎖可変領域（ＶＨ）配列と同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供する。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。一実施形態において、参照重鎖可変領域配列のアミノ酸配列は、配列番号４４、４５、４７、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７６、または２２０を含む。
【０１３６】
一実施形態に従って、本発明は、本明細書において開示される抗体の参照軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供する。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図７及び表３に示される軽鎖可変領域と関連するポリペプチド配列を有する。一実施形態において、参照軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号４６、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７７、７８、２２１、または２２２を含む。
【０１３７】
別の実施形態において、本発明は、図７及び表３に示される参照軽鎖可変領域と同一である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供する。一実施形態において、参照軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４６、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７７、７８、２２１、または２２２を含む。
【０１３８】
別の実施形態において、本発明は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸置換を除いて、図７及び表３に示される参照軽鎖可変領域（ＶＬ）配列と同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供する。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。一実施形態において、参照軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列は、配列番号４６、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７７、７８、２２１、または２２２を含む。
【０１３９】
免疫グロブリンまたはそのコードするｃＤＮＡは、さらに修飾され得る。それ故に、さらなる実施形態において、本発明の方法は、キメラ抗体、ネズミ化抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、二特異性抗体、融合抗体、標識化抗体、またはこれらのうちのいずれか１つの類似体を産生するステップ（複数を含む）のうちのいずれか１つを含む。対応する方法は、当業者には知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）に記載される。該抗体の誘導体がファージディスプレイ技術により得られるとき、ＢＩＡｃｏｒｅ系に利用される、表面プラズモン共鳴は、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つのエピトープと同じエピトープに結合するファージ抗体の効率を増大させるために使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），９７−１０５、Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），７−１３）。キメラ抗体の産生は、例えば、国際出願公開第ＷＯ８９／０９６２２号に記載される。ヒト化抗体の産生方法は、例えば、欧州特許出願第ＥＰ−Ａ１  ０  ２３９  ４００号及び国際出願公開第ＷＯ９０／０７８６１号に記載される。本発明に従って、利用される抗体のさらなる起源は、いわゆる異種抗体である。マウスにおけるヒト様抗体等の異種抗体の産生のための一般的原理は、例えば、国際出願公開第ＷＯ９１／１０７４１号、同第ＷＯ９４／０２６０２号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、及び同第ＷＯ９６／３３７３５号に記載される。上記で説明されるように、本発明の抗体は、完全抗体のほかに様々な型に存在し得、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖を含む。例えば、国際出願公開第ＷＯ８８／０９３４４号を参照のこと。
【０１４０】
本発明の抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖（複数を含む）は、当該技術分野において知られている従来の技術を用いて、例えば、アミノ酸の欠失（複数を含む）、挿入（複数を含む）、置換（複数を含む）、付加（複数を含む）、及び／または組み換え（複数を含む）、及び／または単独、あるいは組み合わせのいずれかで、当該技術分野において知られている任意の他の修飾（複数を含む）を使用することによって、さらに修飾され得る。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎をなすＤＮＡ配列におけるそのような修飾を導入する方法は、当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。本発明の抗体の修飾は、１つ以上の構成アミノ酸における化学的及び／または酵素的誘導体化を含み、例えば、側鎖修飾、骨格修飾、ならびにＮ及びＣ末端修飾、例えば、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、及び炭水化物または脂質部分、共同因子等の付着を含む。同様に、本発明は、カルボキシル末端での免疫刺激リガンド等の異種分子に融合されたアミノ末端での記載の抗体またはいくつかのその断片を含む、キメラタンパク質の産生を包含する。例えば、対応する技術的詳細に関しては、国際出願公開第ＷＯ００／３０６８０号を参照のこと。
【０１４１】
さらに、本発明は、上に記載される結合分子を含有するもの、例えば、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は、抗原抗体相互作用において、さらに高い変動率及び優勢な関与を有する領域であることが、しばしば、観察されているため、言及された抗体、特に、重鎖のＣＤＲ３のうちのいずれか１つの可変領域のＣＤＲ３領域を含有する、ペプチドを包含する。そのようなペプチドは、本発明に従って有用な結合剤を生成するための組み換え手段により、容易に合成または生成され得る。そのような方法は、当業者によく知られている。ペプチドは、例えば、市販の自動ペプチドシンセサイザーを使用して合成され得る。ペプチドはまた、ペプチドを発現するＤＮＡを発現ベクターに組み込み、細胞を発現ベクターで形質変換してペプチドを産生することによって、組み換え技術によって産生することもできる。
【０１４２】
それ故に、本発明は、本発明のヒト抗タウ抗体に指向され、言及した特性、すなわち、タウを特異的に認識する任意の結合分子、例えば、抗体またはその結合断片に関する。そのような抗体及び結合分子は、本明細書に記載される、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット及び免疫組織化学によってそれらの結合特異性及び親和性について試験することができる。例えば、実施例を参照のこと。さらに、本発明に従って行われたその後の実験の予備的結果により、一実施形態において、本発明のヒト抗タウ抗体は、さらに、アルツハイマー病（ＡＤ）に罹患している患者のヒト脳切片に存在する神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）、糸屑状構造物にさらに共通点がある病理的凝縮型タウに主に結合することが明らかになった。したがって、本発明の特に好ましい実施形態において、ヒト抗体またはその結合断片、誘導体、または変異体は、ヒトＡＤ脳切片上でタウを認識する。
【０１４３】
不死化したＢ細胞またはＢメモリ細胞の培養物から直接免疫グロブリンを得る代用として、不死化細胞を、その後の発現及び／または遺伝子操作のために、再構成された重鎖及び軽鎖遺伝子座の供給源として使用することができる。再構成された抗体遺伝子は、適切なｍＲＮＡから逆転写して、ｃＤＮＡを生成することができる。所望により、重鎖定常領域は、異なるアイソタイプのものと交換するか、または完全に除去することができる。一本鎖Ｆｖ領域をコードするために可変領域を連結することができる。複数のＦｖ領域を連結して、１つ超の標的への結合能を付与することができるか、またはキメラ重鎖及び軽鎖の組み合わせを使用することができる。一旦遺伝子材料が利用可能になると、所望の標的に結合するそれらの両方の能力を保持する上述の類似体の設計は簡単である。抗体可変領域のクローン化及び組み換え抗体の作製の方法は、当業者に知られており、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７（１９９６），１−２０、Ｄｏｅｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１（１９９７），１７８７−１７９２に記載される。
【０１４４】
一旦適切な遺伝子材料を得て、所望により、類似体をコードするように修飾すると、最小でも重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするものを含む、そのコード配列を、標準的な組み換え宿主細胞に形質移入することができるベクターに含有される発現系に挿入することができる。様々なそのような宿主細胞を使用することができる。しかしながら、効率的な処理のためには、哺乳動物細胞が考慮され得る。この目的に有用な典型的な哺乳動物細胞株には、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＮＳＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４５】
次いで、宿主細胞の増殖及びコード配列の発現に適切な培養条件下で、修飾された組み換え宿主を培養することによって、抗体または類似体の生成を行う。次いで、培養物から抗体を単離することによってそれらを回収する。発現系は、シグナルペプチドを含むように設計されており、そのため、得られた抗体が培地中に分泌される。しかしながら、細胞内生産もまた可能である。
【０１４６】
上記に従って、本発明はまた、本発明の抗体または同等の結合分子をコードするポリヌクレオチドに関する。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、上述の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードする。典型的には、ポリヌクレオチドによってコードされる該可変領域は、該抗体の可変領域のＶＨ及び／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１４７】
当業者は、上述の可変ドメインを有する抗体の可変ドメインが所望の特異性及び生物学的機能の他のポリペプチドまたは抗体の構築のために使用することができることを容易に理解する。したがって、本発明はまた、上述の可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含むポリペプチド及び抗体を包含し、それらは、添付されている実施例に記載される抗体と実質的に同じまたは同様の結合特性を有利に有する。当業者は、ＣＤＲ内、またはＫａｂａｔによって定義されたようなＣＤＲと部分的に重複する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７）内でアミノ酸置換を行うことにより、結合親和性が増大し得ることを知っている。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（１９８８），３２３−３２７を参照のこと。したがって、本発明はまた、言及されたＣＤＲの内の１つ以上が、１つ以上の、または２つ以下のアミノ酸置換を含む抗体に関する。一実施形態において、本発明の抗体は、その免疫グロブリン鎖の一方または両方に、図１に記載されるような可変領域のうちの２つまたは３つすべてのＣＤＲを含む。
【０１４８】
本発明の結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、当業者に知られているように、１つ以上のエフェクター機能を仲介する定常領域を含むことができる。例えば、補体のＣ１成分の抗体定常領域への結合は、補体系を活性化し得る。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化及び溶解で重要である。補体の活性化はまた、炎症応答も刺激し、自己免疫過敏性にも関与し得る。さらに、抗体は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位で、Ｆｃ領域を介して様々な細胞上の受容体に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）、及びＩｇＭ（ミュー受容体）を含む、抗体の異なるクラスに対して特異的な多数のＦｃ受容体がある。細胞表面上でのＦｃ受容体への抗体の結合は、抗体被覆粒子の取り込み及び破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介細胞傷害性、またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症メディエータの放出、胎盤通過、及び免疫グロブリン産生の制御を含む、多数の重要かつ多様な生物学的反応を誘発する。
【０１４９】
したがって、本発明のある実施形態は、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を含み、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも一部は、欠失されているか、またはそうでなければ、ほぼ同一の免疫原性の未改変抗体全体と比較して、エフェクター機能の低下、非共有結合的に二量体化する能力、タウ凝集及び蓄積の部位に局在化する能力の向上、血清半減期の低下、または血清半減期の増大のような所望の生化学的性質を提供するように改変されている。例えば、本明細書に記載される診断及び治療方法において使用されるある抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似するポリペプチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖ドメインのうちの少なくとも一部分を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある抗体において、修飾型抗体の定常領域の１つのドメイン全体を欠失、例えばＣＨ２ドメインのすべてまたは一部を欠失する。他の実施形態において、本明細書に記載される診断及び治療方法において使用されるある抗体は、本明細書の他の箇所で脱グリコシル化抗体または「アグリ（ａｇｌｙ）」抗体と称される、グリコシル化を除くように改変されている定常領域、例えば、ＩｇＧ重鎖定常領域を有する。そのような「アグリ」抗体は、酵素的に、ならびに定常領域内のグリコシル化コンセンサス部位（複数を含む）を操作することによって、調製することができる。理論にとらわれるものではないが、「アグリ」抗体は、インビボで改善された安全性及び安定性プロファイルを有する可能性があると考えられている。所望のエフェクター機能を有する脱グリコシル化抗体の生成方法は、例えば、国際出願公開第ＷＯ２００５／０１８５７２号に見出され、参照によりその全体が組み込まれる。
【０１５０】
本明細書に記載されるある抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体では、当該技術分野において知られている技術を用いて、Ｆｃ部分を突然変異させて、エフェクター機能を減少させることができる。例えば、定常領域ドメインの（点突然変異または他の手段による）欠失または不活性化が、循環する修飾型抗体のＦｃ受容体結合を低下させることができ、それによって、タウの局在化を増加する。他の場合では、本発明と一致する定常領域の修飾が補体結合を緩和し、ひいては、血清半減期及び共役された細胞毒素の非特異性の関連性を低下させることがあり得る。定常領域のさらに他の修飾は、上昇した抗原特異性または抗体柔軟性により局在化の強化を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を修飾するために使用され得る。得られる生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティ、及びタウの局在、生体内分布、及び血清半減期等の修飾の他の生化学的効果は、過度な実験を行うことなく、よく知られている免疫学的手法を使用して、容易に測定及び定量することができる。
【０１５１】
本明細書に記載されるある抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体では、Ｆｃ部分を突然変異させて、または代替タンパク質配列と交換して、例として、Ｆｃγ受容体、ＬＲＰ、もしくはＴｈｙ１受容体による抗体の受容体介在エンドサイトーシスを増強させることにより、または抗体が生細胞を損傷することなくそれらに輸送されることを可能にすると言われている「スーパー抗体技術」（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５），２３７−２４１）により、抗体の細胞取り込みを増加させることができる。例えば、抗体結合領域及び細胞表面受容体の同種のタンパク質リガンドの融合タンパク質、またはタウ及び細胞表面受容体に結合する特異的配列を有する二重もしくは多重特異性抗体の生成が、当該技術分野において知られている技術を用いて操作され得る。
【０１５２】
本明細書に記載されるある抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体では、Ｆｃ部分を突然変異させて、または代替タンパク質配列と交換することができるか、または抗体を、その血液脳関門透過性を増加させるように化学的に修飾することができる。
【０１５３】
本発明の修飾型抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、当該技術分野において知られている技術を用いて、前駆体全体または親抗体から作製され得る。例示的な技術は、本明細書でより詳細に説明される。本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、当該技術分野において知られている技術を用いて、作製または製造され得る。ある実施形態において、抗体分子またはその断片は、「組み換え的に作製」される、すなわち、組み換えＤＮＡ技術を用いて生成される。抗体分子またはその断片を作製するための例示的な技術は、本明細書の他の箇所でより詳細に説明される。
【０１５４】
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はまた、例えば、抗体への任意の型の分子の共有結合であって、抗体がその同種のエピトープに特異的に結合することを妨げないような共有結合によって修飾されている誘導体を含む。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合等により修飾される、抗体が含まれる。任意の多数の化学修飾は、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等が含まれるが、これらに限定されない、既知の技術によって実行することができる。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有することができる。
【０１５５】
特定の実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、処置される動物、例えば、ヒトにおける有害な免疫反応を誘発しない。ある実施形態において、本発明の結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、患者、例えば、ヒト患者に由来し、その後、それらが由来する同じ種、例えば、ヒトにおいて使用され、有害な免疫反応の発生を軽減または最小化する。
【０１５６】
脱免疫化はまた、抗体の免疫原性を低下させるために使用することもできる。本明細書で使用される「脱免疫化」という用語は、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変を含む。例えば、国際出願公開第ＷＯ９８／５２９７６号、第ＷＯ００／３４３１７号を参照のこと。例えば、出発抗体からのＶＨ及びＶＬ配列が分析され、各Ｖ領域に由来するヒトＴ細胞エピトープ「マップ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）及び配列内の他の鍵となる残基に関してエピトープの位置を示す。最終抗体の活性を改変するリスクの低い代替的アミノ酸置換を特定するために、Ｔ細胞エピトープマップからの個別のＴ細胞エピトープが分析される。アミノ酸置換の組み合わせを含む一連の代替的ＶＨ及びＶＬ配列を設計し、これらの配列が、その後、一連の結合ポリペプチド、例えば本明細書において開示される診断及び治療方法において使用されるタウ特異的抗体、またはその免疫特異的断片に組み込まれ、次いで、機能について試験される。典型的には、１２〜２４個の変異体抗体が生成され、試験される。次いで、修飾されたＶ及びヒトＣ領域を含む完全な重鎖及び軽鎖遺伝子を発現ベクターにクローン化し、その後のプラスミドを、抗体全体を産生するために細胞系に導入する。次いで、抗体は、適切な生化学的及び生物学的アッセイで比較され、最適な変異体が特定される。
【０１５７】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマの使用、組み換え、及びファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせを含む、当該技術分野において知られている多種多様な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）に教示されるものを含む、ハイブリドーマ技術を使用して産生することができ、該参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核性、原核性、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法を指さない。したがって、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。ある実施形態において、本発明の抗体は、本明細書に記載される、エプスタインバーウイルスを用いる形質転換により不死化したヒトＢ細胞から得られる。
【０１５８】
このよく知られているハイブリドーマのプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５），４９５）では、哺乳動物からの比較的短命、または死ぬ運命にあるリンパ球、例えば、本明細書に記載されるように、ヒト対象に由来するＢ細胞が、不死化腫瘍細胞系（例えば、骨髄腫細胞系）と融合し、これにより、不死であり、かつ、Ｂ細胞の遺伝的にコードされた抗体を産生することができるハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」を産生する。得られたハイブリッドは、選択、希釈、及び再増殖によって、単一の遺伝子的系統に分離され、各個々の系統が、単一の抗体を形成する特異的な遺伝子を含む。それらは所望の抗原に対して均質である抗体を産生し、それらの純粋な遺伝的系統に関して、「モノクローナル」と称される。
【０１５９】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する好適な培養培地に播種され、生育される。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択、及び増殖のための試薬、細胞株、及び培地が、多くの供給元から市販されており、標準的なプロトコルが十分に確立されていることを理解するであろう。一般的に、ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、本明細書に記載されるように、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロアッセイによって決定される。所望の特異性、親和性、及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、このクローンを限界希釈法によってサブクローン化し、標準的な方法によって増殖させることができる。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ  ５９−１０３（１９８６）を参照のこと。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばタンパク質Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィー等の従来の精製法により、培養培地、腹水、または血清から分離し得ることがさらに理解されるであろう。
【０１６０】
別の実施形態において、顕微操作によりリンパ球を選別し、可変遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血液単核細胞を免疫化した、または自然に免疫のある哺乳動物、例えば、ヒトから単離し、インビトロで約７日間培養することができる。スクリーニング基準を満たす特定のＩｇＧについて、培養物をスクリーニングすることができる。陽性のウェルからの細胞を単離することができる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳにより、あるいはそれらを補体媒介溶血プラークアッセイで特定することにより単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞を管の中に顕微操作することができ、ＶＨ及びＶＬ遺伝子を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＶＨ及びＶＬ遺伝子は、抗体発現ベクターにクローン化し、発現のために細胞（例えば、真核または原核細胞）に形質移入することができる。
【０１６１】
あるいは、当業者によく知られている手法を使用して、抗体産生細胞株を選択及び培養することができる。そのような手法は、様々な実験マニュアル及び一次刊行物に記載されている。この点において、以下に記載する本発明での使用に適切な手法が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されており、これは、参照により補足を含むその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６２】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の手法によって生成することができる。例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を組み換え的に、またはパパイン（Ｆａｂ断片を産生する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生する）等の酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって産生することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖の定常領域、及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。そのような断片は、例えば、免疫グロブリンの免疫特異的部分を放射性同位体等の検出試薬に結合させることを含む免疫診断的方法において使用するのに十分である。
【０１６３】
本明細書に記載されるようなヒト抗体は、ヒト患者における治療上の使用に特に望ましい。本発明のヒト抗体は、例えば、その年齢のため、タウオパチー障害、例えば、アルツハイマー病を発症する危険性があると疑うことができる健康なヒト対象、または障害を有するが、著しく安定した疾患経過を有する患者から単離される。しかしながら、老齢で健康な対象及び無症状の対象は、それぞれ、より若い対象よりも頻繁に保護性抗タウ抗体を生じているであろうと予測するのが賢明ではあるが、本発明のヒト抗体を得るための供給源として、後者も同様に使用することができる。このことは、家族型タウオパチー疾患を発症しやすいが、免疫系がより老齢の成人よりも有効に機能するため、無症状なままである、より若い患者に特に当てはまる。
【０１６４】
一実施形態において、本発明の抗体は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。対象抗体に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子が、本明細書に記載される。
【０１６５】
本発明の抗体は、抗体を合成するための当該技術分野において知られている任意の方法により、具体的には、化学合成により、または本明細書に記載する組み換え発現手法により産生することができる。
【０１６６】
一実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、１つ以上のドメインが部分的または全体的に欠失している合成定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。ある実施形態において、互換的な修飾された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されているドメイン欠失構築体または変異体（ΔＣＨ２構築体）を含む。他の実施形態については、欠失したドメインの代わりに短い連結ペプチドを置換し、可変領域に柔軟性及び運動の自由を提供することができる。当業者は、そのような構築体が、抗体の異化率に対するＣＨ２ドメインの調節特性のために、特に好ましいことを理解するであろう。ドメイン欠失構築体は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクターを用いて誘導することができる。例えば、国際出願公開第ＷＯ０２／０６０９５５号及び同第ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号を参照のこと。このベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失し、ドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するように操作される。
【０１６７】
ある実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ミニボディである。ミニボディは、当該技術分野において記載される方法を用いて作製することができる。例えば、米国特許第５，８３７，８２１号または国際出願公開第ＷＯ９４／０９８１７号を参照のこと。
【０１６８】
一実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、単量体サブユニット間での会合を可能にする限り、少数または１つですらあるアミノ酸の欠失または置換を有する、免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択した領域における単一のアミノ酸の突然変異が、Ｆｃ結合を実質的に減少させ、それによって、タウの局在化を増加するために十分であり得る。同様に、調節すべきエフェクター機能（例えば補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインのその一部を単に欠失することが望ましくあり得る。定常領域のそのような部分的欠失は、対象の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を無傷で残しつつ、抗体の選択した特性（血清半減期）を改善することができる。さらに、上記で暗に示したように、開示される抗体の定常領域は、得られた構築体のプロファイルを増強する、１つ以上のアミノ酸の突然変異または置換により合成されたものであり得る。この点において、修飾型抗体の立体構造及び免疫原性プロファイルを実質的に維持しつつ、保存された結合部位によってもたらされる活性（例えば、Ｆｃ結合）を破壊することが可能であり得る。さらに他の実施形態は、エフェクター機能等の望ましい特性を増強するか、あるいはより多くの細胞毒素または炭水化物の結合を提供するように、定常領域へ１つ以上のアミノ酸を付加することを含む。そのような実施形態において、選択した定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入または複製することが望ましい場合がある。
【０１６９】
本発明はまた、抗体またはその断片がタウに免疫特異的に結合する、本明細書に記載する抗体分子（例えばＶＨ領域及び／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる抗体を提供する。当業者に知られている標準的手法を使用して、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない、抗体をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することができる。一実施形態において、変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３に対して、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、同様の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基と置換する、置換である。同様の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が含まれる。あるいは、飽和突然変異誘発等により、コード配列のすべてまたは一部に沿って無作為に突然変異を導入することができ、得られた突然変異体を生物学的活性についてスクリーニングし、活性（例えば、タウに結合する能力）を保有する突然変異体を特定することができる。
【０１７０】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみに、またはＣＤＲ領域のみに突然変異を導入することが可能である。導入された突然変異は、サイレントまたは中立的ミスセンス突然変異であり得、例えば、抗体の抗原に結合する能力に全く、またはほとんど効果がない可能性があり、実際にいくつかのそのような突然変異はアミノ酸配列を全く変えない。これらのタイプの突然変異は、コドン使用頻度の最適化、またはハイブリドーマの抗体産生の改善に有用であり得る。本発明の抗体をコードするコドン最適化コード領域が本明細書の他の箇所で開示される。あるいは、非中立的ミスセンス突然変異が、抗体の抗原に結合する能力を変える可能性がある。ほとんどのサイレントまたは中立的ミスセンス変異の位置は、フレームワーク領域内である可能性が高く、これに対して、ほとんどの非中立的ミスセンス変異の位置は、ＣＤＲ内である可能性が高いが、これは絶対要件ではない。当業者は、抗原結合活性を改変しない、または結合活性を改変する（例えば、抗原結合活性の改善、または抗体特異性の変化）等の、所望の特性を持つ突然変異分子を設計し、試験することができるであろう。突然変異誘発後、コードされたタンパク質をルーチン的に発現させることができ、本明細書で記載される手法を使用して、あるいは当該技術分野において知られている手法をルーチン的に修正することにより、コードされたタンパク質の機能的及び／または生物学的活性（例えば、タウの少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する能力）を判定することができる。
【０１７１】
神経変性タウオパチーの任意のインビボまたはインビトロモデルを用いて、タウ結合因子、例えば、限定されないが、本発明のタウ結合抗体を特徴付けることができる。本発明のタウ結合因子（例えば、抗体）は、神経変性タウオパチーのマウスモデルで特徴付けることができると当業者は容易に理解する。例えば、これに限定されないが、本発明のタウ抗体（及びその結合特異性を有する分子）を特徴付け、検証するために、タウオパチーの以下の３つの異なる動物モデルのうちのいずれか１つを用いることができる。
【０１７２】
１．トランスジェニックＴａｕＰ３０１Ｌマウス（系統１８３）：ネズミＴｈｙ１．２プロモーター下で、Ｐ３０１Ｌ突然変異を有するヒトＴａｕ４０を発現する（これらのトランスジェニック動物の作製は、Ｇｏｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１），５２９−５３４及び国際出願公開第ＷＯ２００３／０１７９１８号に記載されており、その開示の内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７３】
２．ネズミＰｒＰプロモーター下で、Ｐ３０１Ｌ突然変異を有する最短４Ｒヒトタウアイソフォームを発現するＪＮＰＬ３マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ,  Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ）から入手可能）。
【０１７４】
３．ネズミＰｒＰプロモーター下で、Ｐ３０１Ｓ突然変異を有するヒトタウを発現するＰ３０１ＳＴａｕ（系統ＰＳ１９）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ）から入手可能）。
【０１７５】
神経変性タウオパチーの実験モデルを予防的環境で使用することができる、またはそれを治療的環境で使用することができることを当業者は理解する。予防的環境では、神経変性タウオパチーまたはその症状の発症前に、動物への投与が始まる。予防的環境では、本発明のタウ結合因子（例えば、抗体）は、神経変性タウオパチーまたはその症状の発症を防ぐ、低減させる、または遅延させるその能力について評価される。治療的環境では、神経変性タウオパチーまたはその症状の発症後に、動物への投与が始まる。治療的環境では、本発明のタウ結合因子（例えば、抗体）は、神経変性タウオパチーまたはその症状を治療、低減させる、または軽減するその能力について評価される。神経変性タウオパチーの症状には、実験対象のニューロン、脳、脊髄、脳脊髄液、または血清における病原的タウ沈着物、神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）、高リン酸化タウポリペプチド、不溶性タウ画分の蓄積が含まれるが、これらに限定されない。神経変性タウオパチーの任意の動物モデルでの肯定的な予防または治療結果は、特定のタウ結合因子（例えば、抗体）が実験モデル生物以外の対象における予防または治療目的に使用することができる、例えば、それを必要とするヒト対象において神経変性タウオパチーを治療するために使用することができることを示していると当業者は理解する。
【０１７６】
一実施形態において、本発明のタウ結合因子（例えば、抗体）を、タウオパチーマウスモデル及び対応する対照野生型マウスに投与することができる。投与された抗体は、本発明のネズミ化抗体または本発明の抗体のヒト−マウスキメラであり得る。タウ結合因子（例えば、抗体）を、当該技術分野において知られている任意の手段によって、例えば、腹腔内、頭蓋内、筋肉内、静脈内、皮下、経口、及びエアロゾル投与により投与することができる。実験動物に、１、２、３、４、５またはそれ以上の用量のタウ結合因子（例えば、抗体）またはＰＢＳ等の対照組成物を与えることができる。一実施形態において、実験動物に、１または２用量のタウ結合因子（例えば、抗体）を投与する。例えば、実施例９を参照のこと。別の実施形態において、数週間または数か月にわたって、動物にタウ結合因子（例えば、抗体）を慢性的に投与する。例えば、実施例１０を参照のこと。当業者は、実験目的に合う投与計画、例えば、急性試験用の投与計画、慢性試験用の投与計画、毒性試験用の投与計画、予防的または治療的試験用の投与計画を容易に設計することができる。当該技術分野のよく知られている方法を用いて、実験動物の特定の組織区画、例えば、これらに限定されないが、血清、血液、脳脊髄液、脳組織におけるタウ結合因子（例えば、抗体）の存在を確証することができる。例えば、実施例９及び１０を参照のこと。一実施形態において、本発明のタウ結合因子（例えば、抗体）は、血液脳関門を透過することができる。タウ結合因子（例えば、抗体）の用量及び投与頻度を調節することにより、実験動物における所望のタウ結合因子（例えば、抗体）の濃度を維持することができることを当業者は理解する。治療した及び対照動物におけるタウのレベル、生化学的特性、または分布を比較することにより、タウオパチーモデルにおける本発明のタウ結合因子（例えば、抗体）の任意の効果を評価することができる。一例では、神経原原子濃縮体（ＮＦＴ）中の病理的リン酸化タウを認識する、Ｇａｌｌｙａｓの鍍銀染色技術を用いて、またはモノクローナルマウス抗体ＡＴ１００及びＡＴ１８０による免疫染色によりＮＦＴを調査する。抗体で処理したマウス及び対照動物の脳及び脊髄におけるＧａｌｌｙａｓ陽性ニューロン及び／またはＡＴ１００、ＡＴ１８０標識ニューロンの数または頻度が測定されて、抗体処理の効果を評価することができる。一実施形態において、本発明の抗体は、動物モデルの脳または脊髄における神経原線維濃縮体のレベル、量、または濃度を減少させることができる。この抗体は、神経原線維濃縮体のレベル、量、または濃度を少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％またはそれ以上減少させることができる。別の実施形態において、本発明の抗体は、動物モデルの脳または脊髄におけるＧａｌｌｙａｓ陽性ニューロンの数または頻度を、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％またはそれ以上減少させることができる。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、動物モデルの脳または脊髄におけるＡＴ１００またはＡＴ１８０抗体陽性ニューロンの数または頻度を、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％またはそれ以上減少させることができる。本発明の抗体の効果はまた、抗体投与後のタウの分布及び生化学的性質を試験することによっても評価することができる。一実施形態において、本発明の抗体は、動物モデルの脳または脊髄におけるタウタンパク質の量または濃度を、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％またはそれ以上減少させることができる。別の実施形態において、本発明の抗体は、動物モデルの脳または脊髄における不溶性タウタンパク質の量または濃度を、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％またはそれ以上減少させることができる。不溶性タウ画分は、例えば、実施例１０またはＧｏｅｄｅｒｔ  Ｍ，Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ  ＭＧ，Ｃａｉｒｎｓ  ＮＪ，Ｃｒｏｗｔｈｅｒ  ＲＡ．Ｎｅｕｒｏｎ  ８，１５９（１９９２）に記載されるように調製され得る。例えば、実施例１０に記載される、当業者に知られている任意の方法によって、生物試料中のタウタンパク質の量を決定することができる。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、動物モデルの脳または脊髄における高リン酸化タウタンパク質の量または濃度を、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％またはそれ以上減少させることができる。高リン酸化タウは、ＡＴ１００またはＡＴ１８０等の病理的高リン酸化型タウに特異的な抗体を用いて検出することができる。本発明の抗体はまた、例えば、血液、血清、または脳脊髄液、または動物モデルにおけるタウ濃度を、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％またはそれ以上変化、例えば、減少または増加させることができる。一実施形態において、％減少または増加は、処置前に存在したレベル、数、頻度、量、もしくは濃度、または未処置／対照処置対象に存在するレベル、数、頻度、量、もしくは濃度に対して相関的である。
【０１７７】
一実施形態において、本発明の抗体は、対象における神経変性タウオパチーの少なくとも１つの症状の発症を予防する、または遅延させることができる。一実施形態において、本発明の抗体は、対象における神経変性タウオパチーの少なくとも１つの症状を低減または除去することができる。この症状は、対象の脳または脊髄における病理的タウ沈着物、高リン酸化タウ沈着物、不溶性タウ沈着物、神経原線維性線維、神経原線維性線維、プレタングルリン酸化タウ凝集体、ニューロン内神経原線維濃縮体、またはニューロン外神経原線維濃縮体の形成であり得る。例えば、Ａｕｇｕｓｔｉｎａｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  １０３：２６−３５（２００２）を参照のこと。この症状はまた、血清、血液、尿、または脳脊髄液中のタウの存在、または上昇した濃度もしくは量であり得、上昇した濃度量は健康な対象と比較される。この症状は、神経学的症状、例えば、条件付け味覚嫌悪の変化、文脈恐怖条件付けの変化、記憶障害、運動機能の喪失であり得る。一実施形態において、記憶障害は、２試験性Ｙ迷路試験を用いて評価される。特定の実施形態において、２試験性Ｙ迷路試験は、実施例１０に記載されるように実質的に行われる。一実施形態において、少なくとも１つの症状は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、７０％、または９０％減少する。別の実施形態において、２試験性Ｙ迷路試験比率は、対照対象よりも抗体処理対象において著しく高い。特定の実施形態において、２試験性Ｙ迷路試験比率は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％増加する。別の実施形態において、２試験性Ｙ迷路試験比率は、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、または２０倍高い。本発明はまた、本明細書に記載される治療有効量のタウ抗体を投与することを含む、それを必要とする対象の神経変性タウオパチーの少なくとも１つの症状の発症を予防する、または遅延させる方法を提供する。本発明は、本明細書に記載される治療有効量のタウ抗体を投与することを含む、それを必要とする対象の神経変性タウオパチーの少なくとも１つの症状を低減または除去する方法をさらに提供する。一実施形態において、対象は、トランスジェニックマウス等であるが、これに限定されない実験生物である。一実施形態においては、対象はヒトである。
【０１７８】
ＩＩＩ．抗体をコードするポリヌクレオチド
抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成されることができ、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域または二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖領域または二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくは、より典型的には、二本鎖、または一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。さらに、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三重鎖領域から構成され得る。抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、１つ以上の修飾塩基、または安定性もしくは他の理由のために修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含有することもできる。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及びイノシン等の異常塩基を含む。多様な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【０１７９】
免疫グロブリン由来のポリペプチド（例えば免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）の非自然変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がコードタンパク質に導入されるように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することによって作製することができる。部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異形成等の標準的手法によって、突然変異を導入することができる。一実施形態において、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行われる。
【０１８０】
よく知られているように、グアニジンイソチオシアネート抽出及び沈殿、続いて、遠心分離またはクロマトグラフィー等の標準的技術により元のＢ細胞、ハイブリドーマ細胞から、または他の形質転換細胞からＲＮＡを単離することができる。所望により、オリゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィー等の標準的技術により、全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離することができる。適切な技術は当該技術分野においてよく知られている。一実施形態において、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、よく知られている方法に従って逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを用いて、同時または別々のどちらかで作製することができる。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開されている重鎖及び軽鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始することができる。また、上記で説明されるように、ＰＣＲはまた、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用され得る。この場合、ライブラリーは、コンセンサスプライマー、またはヒト定常領域プローブ等のより大きい相同性プローブによってスクリーニングすることができる。
【０１８１】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、当該技術分野において知られている技術を用いて細胞から単離することができ、例えば、組み換えＤＮＡ技術に関する前述の参考文献に詳細に記載される標準的なよく知られている技術に従って、制限マッピング及び配列決定することができる。当然、ＤＮＡは、単離プロセスまたはその後の解析の間のいかなる時点でも、本発明に従う合成のものであり得る。
【０１８２】
一実施形態において、本発明は、重鎖可変領域のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、または重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つが、本明細書において開示される抗体の参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。あるいは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書において開示される抗体の参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、図７に示されるポリペプチド配列に関連するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。一実施形態において、参照ＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、または１６３であり、参照ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、または１６４であり、参照ＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、または１６５である。
【０１８３】
一実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリヌクレオチドを提供し、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、いずれか１つのＶＨ−ＣＤＲにおいて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸置換を除いて、図７に示される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。一実施形態において、ＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、または１６３であり、ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、または１６４であり、ＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、または１６５である。
【０１８４】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリヌクレオチドを提供し、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つまたは軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つは、本明細書において開示される抗体の参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書において開示される抗体の参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図７に示されるポリペプチドに関連するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。一実施形態において、参照ＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、または２２４であり、参照ＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、または１６７であり、参照ＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、または１６８である。
【０１８５】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリヌクレオチドを提供し、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、いずれか１つのＶＬ−ＣＤＲにおいて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸置換を除いて、図７に示される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。一実施形態において、ＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、または２２４であり、ＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、または１６７であり、ＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、または１６８である。
【０１８６】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリヌクレオチドを提供し、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、図７に示されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する。一実施形態において、ＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、または１６３であり、ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、または１６４であり、ＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、または１６５である。
【０１８７】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたポリヌクレオチドを提供し、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、図７に示されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する。一実施形態において、ＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、または２２４であり、ＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、または１６７であり、ＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、または１６８である。
【０１８８】
当該技術分野において知られているように、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸または核酸配列を第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列と比較することによって決定される。本明細書において考察されるとき、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドに対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｕｎｉｘ（登録商標）用ウィスコンシン配列解析パッケージバージョン８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）等に限定されない、当該技術分野において知られている方法及びコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて、決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列間相同性の最適なセグメントを見出すためにＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２（１９８１），４８２−４８９の局所的相同性アルゴリズムを使用する。特定の配列が、例えば、本発明に従う参照配列に対して９５％同一であるかどうかを決定するためにＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列調整プログラムを使用するとき、パラメータは、当然のことながら、同一性の割合（％）が、参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、相同性の差が参照配列におけるアミノ酸の総数の最大５％まで許容されるように設定される。
【０１８９】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、表４に示されるような抗タウ抗体のＶＨまたはＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。この点において、当業者は、軽及び／または重鎖の少なくとも可変ドメインをコードするポリヌクレオチドが両方の免疫グロブリン鎖または一方のみの可変ドメインをコードすることができることを容易に理解する。
【表４】
0006284548.tif 000005
【０１９０】
一実施形態において、本発明は、参照重鎖ＶＨと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９５％同一である免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸を含む、本質的にはそれからなる、またはそれからなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、参照重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４４、４５、４７、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７６、または２２０を含む。
【０１９１】
一実施形態において、本発明は、参照軽鎖ＶＬと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９５％同一である免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする核酸を含む、本質的にはそれからなる、またはそれからなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、参照軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４６、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７７、７８、２２１、または２２２を含む。
【０１９２】
本発明はまた、他の箇所で記載されるような、本発明のポリヌクレオチドの断片を含む。さらに、本明細書に記載される融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂ断片、及び他の誘導体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって企図される。
【０１９３】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野において知られている任意の方法によって作製または製造され得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が知られている場合、例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７（１９９４），２４２に記載されるように、その抗体をコードするポリヌクレオチドを化学合成したオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、それは、簡潔に言えば、その抗体をコードする配列の一部を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結反応、ならびにＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
【０１９４】
あるいは、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源に由来する核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが利用可能ではないが、抗体分子の配列が知られている場合、抗体をコードする核酸を化学合成することができるか、あるいは配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅により、または例えば、ｃＤＮＡライブラリーから抗体をコードするｃＤＮＡクローンを特定するために、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローン化することにより適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞等のタウ特異的抗体を発現する任意の組織または細胞から単離された核酸、好ましくは、ポリＡ＋ＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリー）からその抗体をコードする核酸を得ることができる。次いで、当該技術分野においてよく知られている任意の方法を用いて、ＰＣＲにより生成された増幅核酸を複製可能なクローニングベクターにクローン化することができる。
【０１９５】
一旦、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が決定されると、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成するために、例えば、アミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を生成するために、ヌクレオチド配列を操作するための当該技術分野においてよく知られている方法、例えば、組み換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異形成、ＰＣＲ等を用いてそのヌクレオチド配列を操作することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８）を参照されたく、これらは両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１９６】
ＩＶ．抗体ポリペプチドの発現
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を提供するために単離された遺伝物質の操作後、抗体をコードするポリヌクレオチドを、典型的には、所望の量の抗体を産生するために使用され得る宿主細胞への導入のために発現ベクターに挿入する。抗体、またはその断片、誘導体、もしくは類似体、例えば、標的分子に結合する抗体の重鎖または軽鎖の組み換え発現が本明細書に記載される。一旦、本発明の抗体分子、または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその一部分（好ましくは、重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子を産生するためのベクターは、当該技術分野においてよく知られている技術を用いて組み換えＤＮＡ技術によって産生することができる。したがって、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製するための方法が、本明細書に記載される。抗体をコードする配列ならびに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために、当業者によく知られている方法を使用することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成的技術、及びインビボ遺伝子組み換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに操作可能に結合された、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖または軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、国際出願公開第ＷＯ８６／０５８０７号及び同第ＷＯ８９／０１０３６号、並びに米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、重鎖または軽鎖の全体を発現するために抗体の可変ドメインをそのようなベクターにクローン化することができる。
【０１９７】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、宿主細胞に所望の遺伝子を導入し、発現するためのビヒクルとして、本発明に従って使用されるベクターを意味するために本明細書において使用される。当業者に知られているように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、及びレトロウイルスからなる群から容易に選択され得る。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを促進する適切な制限部位、ならびに真核細胞または原核細胞内に侵入及び／またはそれらの中で複製する能力を含む。本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を使用することができる。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、またはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他のクラスは、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン性系の使用を伴う。さらに、ＤＮＡをそれらの染色体に統合した細胞を、遺伝子導入した宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、栄養素要求性の宿主に対する原栄養体、殺生剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅等の重金属に対する耐性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現すべきＤＮＡ配列に直接結合されるか、または同時形質転換によって同一細胞に導入することができる。また、ｍＲＮＡの最適合成のために、追加要素が必要とされる場合もある。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサ、及び終止シグナルを含み得る。
【０１９８】
特定の実施形態において、クローン化された可変領域遺伝子は、上記で説明されるように、重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子（例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子）と共に発現ベクターに挿入される。一実施形態において、これは、米国特許第６，１５９，７３０号において開示されるＮＥＯＳＰＬＡと称されるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の特許発現ベクターを用いて行われる。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサ、マウスベータグロブリン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１及びエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、及びリーダー配列を含有する。このベクターは、可変領域遺伝子及び定常領域遺伝子の組込み、ＣＨＯ細胞でのトランスフェクション、続いて、Ｇ４１８含有培地での選択、及びメトトレキセート増幅に際して、抗体の非常に高いレベルの発現をもたらすことが見出されている。当然のことながら、真核細胞中で発現を誘発することができる任意の発現ベクターを本発明において使用することができる。好適なベクターの例には、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、及びｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、及びプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）が含まれるが、これらに限定されない。概して、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が、例えば、ロボット系により実施することができるルーチン的な実験である場合、適切に高レベルを発現するものについて、数多くの形質転換された細胞をスクリーニングする。ベクター系はまた、米国特許第５，７３６，１３７号及び同第５，６５８，５７０号に教示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この系は、例えば３０ｐｇ／細胞／日を超える高発現レベルを提供する。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示される。
【０１９９】
他の実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、米国特許出願公開第２００３−０１５７６４１  Ａ１号において開示され、その全体が本明細書に組み込まれるもの等のポリシストロン性構築体を使用して発現させることができる。これらの新規の発現系では、抗体の重鎖及び軽鎖等の目的となる複数の遺伝子産物は、単一のポリシストロン性構築体から産生することができる。これらの系は、有利なことに、比較的高レベルの抗体を供給するために内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用する。適合性のＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号において開示され、これもまた本明細書に組み込まれる。当業者は、本願において開示されるすべての範囲の抗体を効果的に産生するためにそのような発現系を用いることができることを理解する。
【０２００】
より一般的には、一旦、抗体の単量体サブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入され得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者によく知られている種々の技術により達成することができる。これらには、例えば、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）またはリポフェクタミンを用いるリポトランスフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降、包膜ＤＮＡを用いた細胞融合、マイクロインジェクション、及び無傷ウイルスによる感染を含むトランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。典型的には、宿主へのプラスミド導入は、標準的なリン酸カルシウム共沈殿法によるものである。発現構築体を保有する宿主細胞を、軽鎖及び重鎖の産生に適した条件下で増殖させ、重鎖及び／または軽鎖のタンパク質合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞選別分析法（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学等が含まれる。
【０２０１】
従来の技術により宿主細胞に発現ベクターを移入し、次いで、従来の技術によりその形質移入した細胞を培養して、本明細書に記載される方法において使用される抗体を産生する。したがって、本発明は、異種プロモーターに操作可能に結合する、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現についての特定の実施形態において、以下に詳述するように、免疫グロブリン分子全体を発現するために、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを、宿主細胞において同時発現させることができる。
【０２０２】
本発明の２つの発現ベクター、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクター、及び軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターで宿主細胞を共形質移入することができる。２つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有することができる。あるいは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを使用することができる。そのような状況では、有害な遊離重鎖が過剰であることを避けるために、軽鎖を重鎖の前に配置することが有利である。Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２（１９８６），５２、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（１９８０），２１９７を参照のこと。重鎖及び軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。
【０２０３】
本明細書で使用される「宿主細胞」は、組み換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを保持する細胞を指す。組み換え宿主からの抗体の単離過程の説明では、「細胞」及び「細胞培養物」という用語は、特に明確に特定されない限り、抗体の供給源を示すために互換的に使用される。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心分離した細胞全体から、または培地及び懸濁細胞の両方を含有する細胞培地からの回収のいずれかを意味することができる。
【０２０４】
種々の宿主発現ベクター系は、本明細書に記載される方法において使用される抗体分子を発現するために利用することができる。そのような宿主発現系は、目的となるコード配列が産生され、その後、精製され得る媒体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換または形質移入されると、原位置で本発明の抗体分子を発現することができる細胞も表す。これらには、抗体コード配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）等の微生物、抗体コード配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス属、ピキア属）、抗体コード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した、または抗体コード配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系、あるいは哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーターもしくは哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組み換え発現構築体を保有する哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、大腸菌等の細菌性細胞、及びより好ましくは、特に組み換え抗体分子全体の発現のために真核細胞を、組み換え抗体分子の発現のために使用する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルスからの主要な中間初期遺伝子プロモーター要素等のベクターと併せて、抗体の効果的な発現系である。例えば、Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４５（１９８６），１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８（１９９０），２を参照のこと。
【０２０５】
タンパク質発現に使用される宿主細胞系列は、多くの場合、哺乳動物起源であり、当業者は、そこで発現する所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞系列を決定する能力を有すると信じられている。例示的な宿主細胞系には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣細胞系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系列）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を用いるＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系列）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）及び２９３（ヒト腎臓）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主細胞系は、ＣＨＯ細胞または２９３細胞である。宿主細胞系は、典型的には、商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公開された文献から入手可能である。
【０２０６】
さらに、所望の特定の様式で挿入した配列の発現を調節、または遺伝子産物を修飾及び処理する宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えばグリコシル化）及びプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾に対して特徴的かつ特異的な機序を有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的のために、遺伝子産物の一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、及びリン酸化のための細胞機構を有する真核性宿主細胞を使用することができる。
【０２０７】
長期にわたる高収量の組み換えタンパク質の産生のために、安定的な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞系を操作して作製することができる。ウイルス性複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えばプロモーター、エンハンサ、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によって制御されるＤＮＡ、及び選択可能なマーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作した細胞を１〜２日間富化培地中で増殖させることが可能であり、次いで、選択培地に切り替える。組み換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がそれらの染色体中にプラスミドを安定的に組み込み、増殖して、増殖巣を形成することを可能にし、今度はそれがクローン化され、細胞系へと拡大することができる。本方法を有利に使用して、抗体分子を安定的に発現する細胞系を操作することができる。
【０２０８】
ｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、またはａｐｒｔ−細胞でそれぞれ使用することができる単純ヘルペスウイルチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１（１９７７），２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８（１９９２），２０２）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２（１９８０），８１７）遺伝子を含むが、これらに限定されない多数の選択系を使用することができる。また、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（１９８０），３５７、Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（１９８１），１５２７）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（１９８１），２０７２）、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ  Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２（１９９３），４８８−５０５、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３（１９９１），８７−９５、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２（１９９３），５７３−５９６、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０（１９９３），９２６−９３２、及びＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（１９９３），１９１−２１７、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（１９９３），１５５−２１５、ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３０（１９８４），１４７の遺伝子の選択の基礎として、代謝拮抗物質耐性を使用することができる。使用され得る組み換えＤＮＡ技術の当該技術分野において一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、及びＤｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）の第１２章及び第１３章、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２０９】
抗体分子の発現レベルを、ベクター増幅によって増大させることができる（概説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害物質のレベルの上昇は、マーカー遺伝子の複製物の数を増加させる。増幅された領域は、抗体遺伝子に関連するため、抗体の産生もまた増大するであろう。Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３（１９８３），２５７を参照のこと。
【０２１０】
インビトロでの産生は、大量の所望のポリペプチドを得るスケールアップを可能にする。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養の技術は、当該技術分野において知られており、例えば、エアリフト式反応器または連続撹拌式反応器における均一懸濁培養、または、例えば、中空糸中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上での固定化または封入細胞培養が含まれる。必要に応じて、及び／または所望により、ポリペプチドの溶液は、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後に、あるいは本明細書に記載されるＨＩＣクロマトグラフィーステップの前もしくは後に、慣用のクロマトグラフィー方法で、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィーまたは（免疫）親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。
【０２１１】
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードする遺伝子はまた、細菌または昆虫または酵母または植物の細胞等の非哺乳動物細胞で発現させることもできる。核酸を容易に取り込む細菌には、大腸菌またはサルモネラ菌等のエンテロバクター科、枯草菌等のバシラス科、ニューモコッカス属、ストレプトコッカス属のメンバー、及びヘモフィスインフルエンザが含まれる。細菌で発現される場合、異種ポリペプチドは、典型的には、封入体の一部となることもさらに理解されよう。異種ポリペプチドは、単離し、精製し、次いで、機能的分子に組み立てらなければならない。四価形態の抗体が望ましい場合、次いで、サブユニットは四価抗体に自己組み立てされる。例えば、国際出願公開第ＷＯ０２／０９６９４８号を参照のこと。
【０２１２】
細菌系では、発現すべき抗体分子に意図される使用に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の薬学的組成物の作製のために、大量のそのようなタンパク質を産生する場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが、望ましくあり得る。そのようなベクターには、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列を、ｌａｃＺコード領域とインフレームで個別にベクターにライゲートすることができる、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２（１９８３），１７９１）、ならびにｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３（１９８５），３１０１−３１０９、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４（１９８９），５５０３−５５０９）等が含まれるが、これらに限定されない。また、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために、ｐＧＥＸベクターを使用することもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズマトリックスへの吸着及び結合、その後の遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０２１３】
原核生物に加えて、真核微生物もまた使用することができる。多数のその他の菌株、例えば、ピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が一般的に利用可能であるが、サッカロマイセスセレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母が、真核微生物の中で最も一般的に使用される。サッカロミセス属における発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８２（１９７９），３９、Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７（１９７９），１４１、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０（１９８０），１５７）が一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母の突然変異株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５（１９７７），１２）のための選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子をすでに含有する。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在が、次いで、トリプトファンの不存在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【０２１４】
昆虫系では、オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、典型的には、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞で増殖する。抗体コード配列をこのウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０２１５】
一旦、本発明の抗体分子が組み換え技術によって発現すると、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に、タンパク質Ａ後の特異的抗原に対する親和性、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿等の差示的溶解性による、またはタンパク質精製の任意の他の標準的な技術によるものを含む、当該技術分野の標準的な方法に従って、本発明の抗体全体、それらの二量体、個々の軽鎖及び重鎖、または他の免疫グロブリン形態を精製することができる。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと。あるいは、本発明の抗体の親和性を増大させるための別の方法が、米国特許出願公開第２００２−０１２３０５７  Ａ１号に開示される。
【０２１６】
Ｖ．融合タンパク質及び複合体
ある実施形態において、抗体ポリペプチドは、通常、抗体と結合していないアミノ酸配列または１つ以上の部分を含む。例示的な修飾が、以下により詳細に説明される。例えば、本発明の一本鎖Ｆｖ抗体断片は、フレキシブルリンカー配列を含むことができ、または機能性部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、または蛍光標識、放射性標識、酵素標識、核磁気標識、重金属標識等の標識）を付加するために修飾され得る。
【０２１７】
本発明の抗体ポリペプチドは、融合タンパク質を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなることができる。融合タンパク質は、例えば、免疫グロブリンタウ結合ドメインを少なくとも１つの標的結合部位、及び少なくとも１つの異種性部分、すなわち、自然界では本来それと結合していない部分と共に含むキメラ分子である。アミノ酸配列は、通常、融合ポリペプチドにおいてひとまとまりになる別々のタンパク質に存在することができ、またはそれらは、通常、同じタンパク質に存在することができるが、融合ポリペプチドでは新しい配置に置かれる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作製し、翻訳することによって作製され得る。
【０２１８】
「異種性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される場合、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それが比較されている実体の残りのものとは別個の実体に由来するということを意味する。例えば、本明細書に使用される、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは類似体に融合される「異種性ポリペプチド」は、同じ種の非免疫グロブリンポリペプチドまたは異なる種の免疫グロブリンもしくは非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。
【０２１９】
本明細書の他の箇所により詳細に説明されるように、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、異種性ポリペプチドとＮ末端もしくはＣ末端で組み換え技術によりさらに融合され、またはポリペプチドもしくは他の組成物と化学的に複合体化（共有結合的複合体化または非共有結合的複合体化を含む）され得る。例えば、検出アッセイでの標識として有用な分子及び異種性ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒物等のエフェクター分子に抗体を組み換え技術により融合する、または複合体化することができる。例えば、国際出願公開第ＷＯ９２／０８４９５号、同第ＷＯ９１／１４４３８号、同第ＷＯ８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号、及び欧州特許出願第ＥＰ  ０  ３９６  ３８７号を参照のこと。
【０２２０】
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターによって互いに連結したアミノ酸から構成されることができ、２０の遺伝子にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。翻訳後プロセシング等の天然の過程により、または当該技術分野においてよく知られている化学修飾技術により抗体を修飾することができる。そのような修飾は、基本的な教科書、及びより詳細にはモノグラフと膨大な研究文献によく記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ末端もしくはカルボキシル末端を含む抗体、または炭水化物等の部分のどこにでも生じ得る。同じ、または異なる程度で同じ種類の修飾が、所与の抗体におけるいくつかの部位に存在し得ることが理解されるであろう。また、所与の抗体は、多くの種類の修飾を含有し得る。抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として分岐状抗体であり得、それらは、分岐を持つ、または持たない環状抗体であり得る。環状抗体、分岐状抗体、及び分岐環状抗体は、翻訳後の天然の過程により生じることができ、または合成方法によって作製され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋形成、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ｐｅｇ化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，（１９９３）、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２（１９９０），６２６−６４６、Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３（１９９２），４８−６２を参照のこと）。
【０２２１】
本発明はまた、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体、及び異種性ポリペプチドを含む融合タンパク質も提供する。一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ領域のうちのいずれか１つ以上のアミノ酸配列、または本発明の抗体、またはその断片、もしくは変異体のＶＬ領域のうちのいずれか１つ以上のアミノ酸配列、及び異種性ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。別の実施形態において、本明細書において開示される診断方法及び治療方法に使用される融合タンパク質は、抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体のＶＨ−ＣＤＲのうちのいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列、あるいは抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体のＶＬ−ＣＤＲのうちのいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び異種性ポリペプチド配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。一実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体、またはその断片、誘導体、もしくは変異体のＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチド及び異種性ポリペプチド配列を含み、その融合タンパク質はタウに特異的に結合する。別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列、及び本発明の抗体、またはその断片、誘導体、もしくは変異体のうちの少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびに異種性ポリペプチド配列を含む。一実施形態において、融合タンパク質のＶＨ及びＶＬ領域は、タウに特異的に結合する単一起源抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂ断片）に対応する。さらに別の実施形態において、本明細書において開示される診断方法及び治療方法で使用される融合タンパク質は、抗体のＶＨ  ＣＤＲのうちのいずれか１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸配列、及び抗体、またはその断片もしくは変異体のＶＬ  ＣＤＲのうちのいずれか１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに異種性ポリペプチド配列を含む。一実施形態において、ＶＨ−ＣＤＲ（複数を含む）またはＶＬ−ＣＤＲ（複数を含む）のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上が、本発明の単一起源抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂ断片）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子もまた、本発明に包含される。
【０２２２】
文献に報告される例示的な融合タンパク質は、Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４（１９８７），２９３６−２９４０、ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７（１９８９），５２５−５３１、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（１９８９），６８−７０、Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９（１９９０），３４７−３５３、及びＢｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４（１９９０），６６７−６７０）、Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０（１９９０），２２２１−２２２９、及びＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９（１９９１），１６４−１６７）、ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１（１９９０），１３０３−１３１３）、ＣＤ２８及びＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３（１９９１），７２１−７３０）、ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１），５６１−５６９）、ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６（１９９１），１１３３−１１４４）、ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（１９９１），１０５３５−１０５３９、Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９１），２８８３−２８８６、及びＰｅｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１），１４８３−１４８９（１９９１）、ならびにＩｇＥ受容体ａ（Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５（１９９１），Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１４４８）の融合を含む。
【０２２３】
本明細書の他の箇所で説明されるように、ポリペプチドのインビボ半減期を増加させるため、または当該技術分野において知られている方法を用いる免疫アッセイで使用するために、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、異種性ポリペプチドに融合することができる。例えば、一実施形態において、インビボでそれらの半減期を増加させるために、本発明の抗体に、ＰＥＧを複合体化させることができる。例えば、Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６（２００１），１０６−１１９；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２），５３１、またはＷｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（２００２），５１２を参照のこと。
【０２２４】
さらに、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、マーカー配列、例えば、それらの精製または検出を容易にするためのペプチドに融合することができる。特定の実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、市販されている多くのものの中でもｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）に提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチド（ＨＩＳ）である。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（１９８９），８２１−８２４に記載されるように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７（１９８４），７６７）に由来するエピトープに応答する「ＨＡ」タグ及び「ｆｌａｇ」タグが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２５】
当該技術分野においてよく知られている方法を用いて融合タンパク質を調製することができる。例えば、米国特許第５，１１６，９６４号及び同第５，２２５，５３８号を参照のこと。融合タンパク質の分泌または結合特性を最適化するための融合が行われる正確な部位は実証的に選択され得る。次いで、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、発現のため宿主細胞に形質移入される。
【０２２６】
非複合体形態で本発明の抗体を使用することができ、または、様々な分子の少なくとも１つと、例えば、この分子の治療特性を改善するために、標的の検出を容易にするために、または患者のイメージングもしくは治療のために、本発明の抗体を複合体化することができる。本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、精製が行われるとき、精製の前に、または後に標識または複合体化することができる。特に、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応修飾因子、薬学的薬剤、またはＰＥＧに、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を複合体化することができる。
【０２２７】
従来の抗体を含む免疫毒素である複合体は、当該技術分野において広く説明されている。従来のカップリング技術により毒素を抗体に結合することができ、またはタンパク質毒素部分を含有する免疫毒素を融合タンパク質として産生することができる。そのような免疫毒素を得るために対応する方法で本発明の抗体を使用することができる。Ｂｙｅｒｓ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１），５９−７０及びＦａｎｇｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １２（１９９１），５１−５４によって記載されるものがそのような免疫毒素を説明する。
【０２２８】
複合体はまた、複合体化される選択された因子に応じて、様々な技術を用いて組み立てられ得ることを当業者は理解する。例えば、ビオチンとの複合体を、例えば、タウ結合ポリペプチドをビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等のビオチンの活性化エステルと反応させることにより調製する。同様に、蛍光マーカーとの複合体を、カップリング剤、例えば、本明細書に記載されるものの存在下で、またはイソチオシアネート、すなわち、フルオレセイン−イソチオシアネートとの反応により調製することができる。本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の複合体を類似の方法で調製する。
【０２２９】
本発明は、診断剤または治療剤に複合体化した本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をさらに包含する。例えば、所与の治療及び／または予防計画の有効性を判定するための臨床試験手順の一部として、例えば、神経性疾患の存在を示すために、神経性疾患になる危険性を示すために、神経性疾患、すなわち、タウオパチー疾患の発生または進行をモニタリングするために、診断的にこの抗体を使用することができる。抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を検出可能な物質に結合することにより検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、様々なポジトロン放射トモグラフィーを使用するポジトロン放射金属、及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。例えば、本発明による診断薬として使用される抗体に複合体化され得る金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ、適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが含まれ、発光物質の例には、ルミノールが含まれ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ、ならびに適切な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃが含まれる。
【０２３０】
抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はまた、それを化学発光化合物に結合させることにより検出可能であるように標識され得る。次いで、化学発光タグ化抗体の存在は、化学反応の最中に生じる発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
【０２３１】
抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を検出可能に標識することができる１つの方法は、それを酵素に結合し、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，“Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２（１９７８），１−７）、Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１（１９７８），５０７−５２０、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１），４８２−５２３、Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，（１９８０）、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ（１９８１）でこの結合産物を使用することによるものである。例えば、分光光度法、蛍光定量法、または視覚的手段により検出することができる化学部分を生じるように、抗体に結合している酵素が適切な基質、好ましくは発色性基質と反応する。抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。さらに、酵素の発色性基質を使用する比色分析法によって検出を達成することができる。同様に調製した標準物質との比較で、基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することによって検出を達成することができる。
【０２３２】
様々な他の免疫アッセイのいずれかを用いて検出を達成することもできる。例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を放射活性物質で標識することにより、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，（Ｍａｒｃｈ，１９８６）を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）の使用によりこの抗体を検出することが可能である。ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーを含むが、これらに限定されない手段により放射性同位元素を検出することができる。
【０２３３】
抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、１５２Ｅｕ、またはランタニド系の他のもの等の蛍光放射金属を用いて、検出可能であるように標識することもできる。ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属キレート性基を用いてこれらの金属を抗体に結合させることができる。
【０２３４】
様々な部分を抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体に複合体化する技術がよく知られている。例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．６２３−５３（１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３０３−１６（１９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２（１９８２），１１９−１５８を参照のこと。
【０２３５】
言及したように、ある実施形態において、結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、抗体またはその免疫特異的断片の安定性または有効性を向上させる部分を複合体化することができる。例えば、一実施形態において、本発明の結合分子に、そのインビボ半減期を増加させるためにＰＥＧを複合体化することができる。Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６（２００１），１０６；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２），５３１、またはＷｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（２００２），５１２。
【０２３６】
ＶＩ．組成物及び使用方法
本発明は、前述のタウ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、または誘導体、もしくは変異体、または本発明のポリヌクレオチド、ベクター、もしくは細胞を含む組成物に関する。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。さらに、本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の意図した使用法に応じて、インターロイキンまたはインターフェロン等のさらなる薬剤を含むことができる。タウオパチー疾患、例えば、アルツハイマー病の治療での使用には、さらなる薬剤が、小有機分子、抗タウ抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。それ故に、特定の実施形態において、本発明は、タウオパチー疾患の予防的及び治療的処置のための薬学的または診断用組成物の調製のために、対象におけるタウオパチー疾患の進行またはタウオパチー疾患の治療に対する反応をモニターするために、または対象のタウオパチー疾患を発症する危険性を判定するために、タウ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用すること、またはそれらのいずれか１つと実質的に同じ結合特異性を有する結合分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、もしくは細胞を使用することに関する。
【０２３７】
それ故に、一実施形態において、本発明は、それぞれ、脳及び中枢神経系内のタウの異常蓄積及び／または沈着を特徴とする神経性障害を治療する方法であって、治療有効量の、前述のタウ結合分子、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは細胞のうちのいずれか１つを、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。「神経性障害」という用語には、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン病−認知症複合病、嗜銀顆粒性認知症、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、皮質基底核変性症、クロイツフェルトヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、前頭側頭認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソン病を伴う前頭側頭認知症、前頭側頭葉変性症、ゲルストマンストロイスラーシャインカー病、ハレルフォルデンスパッツ病、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、Ｃ型ニーマンピック病、神経原線維変化を伴う非グアム島人型運動ニューロン病、ピック病、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症、多発梗塞性認知症、及び虚血性脳卒中等のタウオパチー疾患が含まれるが、これらに限定されない。特に記載されない限り、神経変性、神経性、または精神神経性という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【０２３８】
本発明の抗体は、タウオパチー疾患の徴候がない健康なヒト対象のＢ細胞またはＢメモリ細胞に由来し、したがって、ある確率で、臨床的に明らかなタウオパチー疾患を予防することができる、または臨床的に明らかな疾患が発生する危険性を減少させることができる、または臨床的に明らかな疾患の発症もしくは進行を遅延させることができるという事実に本発明の治療アプローチの特定の利点がある。典型的には、本発明の抗体はまた、体細胞成熟、すなわち、標的タウ分子への高親和性結合における選択性と有効性について、抗体の可変領域の体細胞変異による最適化にすでに成功している。
【０２３９】
インビボでの、例えば、ヒトにおけるそのような細胞は、自己免疫反応またはアレルギー反応という意味で、関連の、または他の生理的なタンパク質または細胞構造によって活性化されていないという知識もまた、このことが臨床試験相を通して成功的に生存する著しく増大した可能性を示すので、医学的に非常に重要である。いわば、少なくとも１つのヒト対象において、予防用または治療用抗体の前臨床及び臨床開発の前に、有効性、受容性、及び耐容性がすでに示されている。したがって、本発明のヒト抗タウ抗体の、その治療薬としての標的構造に特異的な有効性とその減少した副作用の可能性の両方が、その臨床上の成功の可能性を著しく増加させることを想定することができる。
【０２４０】
本発明はまた、上述の成分、例えば、本発明の抗タウ抗体、その結合断片、誘導体、もしくは変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは細胞のうちの１つ以上で満たされた１つ以上の容器を含む、それぞれ、薬学的及び診断用のパックまたはキットも提供する。そのような容器（複数を含む）には、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を監督する官庁が規定する形態の通知書を付随させることができ、その通知書は製造、使用、または販売についての監督官庁によるヒトへの投与に対する認可を反映する。さらに、またはあるいは、このキットは、適切な診断アッセイでの使用のための試薬及び／または説明書を含む。この組成物、例えば、本発明のキットは、当然、タウの存在に伴う障害の危険性評価、診断、予防、及び治療に特に適切であり、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン病−認知症複合病（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、前頭側頭認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソン病を伴う前頭側頭認知症（ＦＴＤＰ−１７）、前頭側頭葉変性症、ゲルストマンストロイスラーシャインカー病、ハレルフォルデンスパッツ病、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、Ｃ型ニーマンピック病（ＮＰ−Ｃ）、神経原線維変化を伴う非グアム島人型運動ニューロン病、ピック病（ＰｉＤ）、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症、多発梗塞性認知症、及び虚血性脳卒中の治療に特に適用できる。
【０２４１】
本発明の薬学的組成物は、当該技術分野においてよく知られている方法に従って製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）ｂｙ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＩＳＢＮ  ０−６８３−３０６４７２を参照のこと。適切な薬学的担体の例は、当該技術分野においてよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水乳剤等の乳剤、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液等が含まれる。そのような担体を含む組成物は、よく知られている従来の方法によって製剤化することができる。これらの薬学的組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。適切な組成物の投与は、異なる方法で、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、局所、または皮内投与または脊髄もしくは脳送達により適切な組成物の投与をもたらすことができる。点鼻スプレー製剤等のエアロゾル製剤は、保存剤及び等張剤を有する、活性薬剤の精製した水溶液または他の溶液を含む。そのような製剤は、鼻粘膜に適合するｐＨと等張状態に調節される。直腸投与用または経膣投与用の製剤は、適切な担体を有する坐剤として提供され得る。
【０２４２】
さらに、本発明は、今では標準的な（幸いにも、まれではあるが）本発明の薬物を投与するために頭骨に小さい穴を開ける方法を含むが、一態様において、本発明の結合分子、特に、抗体または抗体ベースの薬物は、血液脳関門を越えることができ、静脈内または経口投与を可能とする。
【０２４３】
投薬計画は、担当の医師及び臨床的要因によって決定される。医学分野においてよく知られているように、任意の１人の患者への投与量は、その患者の体格、体表面、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び経路、一般的健康状態、同時に投与されている他の薬物を含む多数の因子によって異なる。典型的な用量は、例えば、０．００１〜１０００μｇ（またはこの範囲内の発現のための、または発現の阻害のための核酸）の範囲内であり得るが、この例示的な範囲の下または上の用量が、特に前述の因子を考慮して想定される。一般的に、投与量は、例えば、宿主の体重に対して、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）の範囲であり得る。例えば、投与量は、体重１ｋｇ当たり１ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり１０ｍｇであるか、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記範囲の中間の用量もまた、本発明の範囲内であると意図される。そのような投与量を、毎日、１日おき、１週間に１回、または実験による分析によって決定される任意の他のスケジュールに従って、対象に投与することができる。例示的な治療は、長期間、例えば、少なくとも６ヶ月をかけて、複数回投与での投与を必要とする。さらなる例示的な治療レジメンは、２週間毎に１回、または１ヶ月に１回、あるいは３〜６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。例示的な投与量スケジュールには、連日での１〜１０ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきに３０ｍｇ／ｋｇ、または１週間に１回６０ｍｇ／ｋｇの投与が含まれる。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投与量は、示した範囲内に含まれる。定時的評価によって経過をモニターすることができる。非経口投与用の製剤は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、及び乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール溶液／水性溶液、乳剤、または懸濁液が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内媒体には、体液及び栄養補充液、（リンゲルブドウ糖液に基づくもの等の）電解質補充液等が含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等のような保存剤及び他の添加物も存在し得る。さらに、本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の意図される使用法に応じて、ドーパミンまたは精神薬理学的薬物等のさらなる薬剤を含むことができる。
【０２４４】
さらに、本発明の特定の実施形態において、薬学的組成物は、例えば、本発明の薬学的組成物が受動免疫のために抗タウ抗体またはその結合断片、誘導体、もしくは変異体を含む場合、ワクチンとして製剤化され得る。背景技術の項で言及したように、リン酸化タウ種は、血漿及びＣＳＦにおいて細胞外に報告されており（Ａｌｕｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１７８２（２００８），５４９−５５８）、トランスジェニックマウス系列でのリン酸化タウペプチドを使用する能動的ワクチン投与を用いる研究により、脳内のタウ凝集体の脳内レベルの低下を示し、行動障害の進行の遅滞を示した（Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．１５（２００８），１５７−１６８、Ｂｏｉｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２２４（２０１０），４７２−４８５）。したがって、本発明のヒト抗タウ抗体及び同等のタウ結合分子を用いる受動免疫は、背景技術の項で既に論じられたように、能動免疫法構想のいくつかの有害作用を回避するのに役立つであろうと想定するのが賢明である。したがって、本発明の本抗タウ抗体及びそれらの同等物は、ＡＤ、ＡＬＳ−ＰＤＣ、ＡＧＤ、ＣＢＤ、ＣＪＤ、ＦＴＤ、ＦＴＤＰ−１７、ＮＰ−Ｃ、ＰｉＤ、ＰＳＰ、または以前に言及したような他のタウオパチー等のタウオパチー疾患の予防または改善のためのワクチンとして特に有用である。
【０２４５】
一実施形態において、本発明の抗体の組み換え二重特異性または多重特異性構築体を使用することが有益であり得る。参照としては、例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌeｇｅｒ，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４（２００７），３−１４を参照のこと。そのような二重特異性分子は、１つの結合アームでタウを標的とし、第２の結合アームでＡβまたはアルファ−シヌクレインまたは異なるタウの病理的立体構造等の別の病理的実体を標的とするように設計され得る。あるいは、第２の結合アームは、脳への抗体の透過を促進するために、血液脳関門に存在するタンパク質を標的とするように設計され得る。
【０２４６】
一実施形態において、細胞膜をより容易に透過し得る、本発明の抗体の組み換えＦａｂ（ｒＦａｂ）断片及び一本鎖断片（ｓｃＦｖ）を使用することが有益であり得る。例えば、先にインターネット上で公開されたＲｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２００８）Ｏｃｔ  １６；Ｓ１７４１−０１３４は、ＡβのＮ末端領域にあるエピトープを認識するモノクローナル抗体ＷＯ−２のキメラ組み換えＦａｂ（ｒＦａｂ）断片及び一本鎖断片（ｓｃＦｖ）の使用を説明する。操作された断片は、ＩｇＧ分子全体と同じ程度に有効に（ｉ）アミロイド原線維の形成を予防し、（ｉｉ）予め形成されたＡβ１−４２原線維を脱凝集させ、（ｉｉｉ）Ａβ１−４２オリゴマー媒介性神経毒性をインビトロで阻害することができた。エフェクター機能を欠く小さいＦａｂ及びｓｃＦｖ操作抗体形式の認められる利点には、血液脳関門を越えるより効率的な通過及び炎症性副作用を引き起こす危険性の最小化が含まれる。さらに、ｓｃＦｖ及び一本鎖ドメイン抗体が全長型抗体の結合特異性を保持することに加えて、それらは単一遺伝子として発現することができ、哺乳動物細胞では細胞内に、それらの標的の折り畳み、相互作用、修飾、または細胞内局在を変える可能性がある細胞内抗体として発現することができる。参照として、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２（２００５），３９４−４０１を参照のこと。
【０２４７】
異なるアプローチでは、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５），２３７−２４１が、「スーパー抗体技術」と称される技術プラットフォームについて記載しており、それは、抗体が細胞を損傷することなく生細胞に輸送されることを可能にすると言われている。そのような細胞透過性抗体は、新しい診断的及び治療的な窓口を開く。「ＴｒａｎｓＭａｂ」という用語は、これらの抗体のために作り出された。
【０２４８】
さらなる実施形態において、タウオパチー疾患を治療するのに有用な他の抗体の同時投与または連続投与が望ましくあり得る。一実施形態において、さらなる抗体が、本発明の薬学的組成物に含まれる。対象を治療するために使用することができる抗体の例には、ベータ−アミロイド、アルファ−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、及びＳＯＤ−１を標的とする抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４９】
さらなる実施形態において、タウオパチー疾患を治療するのに有用な他の神経保護薬剤の同時投与または連続投与が望ましくあり得る。一実施形態において、さらなる薬剤が、本発明の薬学的組成物に含まれる。対象を治療するために使用することができる神経保護薬剤の例には、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、グルタミン酸作動性受容体アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、抗炎症剤、ジバルプロエクスナトリウム、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物と同時に使用することができる他の神経保護薬剤の例は、当該技術分野において説明されている。例えば、国際出願公開第ＷＯ２００７／０１１９０７号を参照のこと。一実施形態において、さらなる薬剤は、ドーパミンまたはドーパミン受容体アゴニストである。
【０２５０】
治療上有効用量または治療有効量とは、症状または状態を改善するのに十分な有効成分の量を指す。細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）によって、そのような化合物の治療上の有効性及び毒性を決定することができる。治療的効果と毒性効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表され得る。一実施形態において、組成物中の治療薬剤は、ＡＤ、ＡＬＳ−ＰＤＣ、ＡＧＤ、ＣＢＤ、ＣＪＤ、ＦＴＤ、ＦＴＤＰ−１７、ＮＰ−Ｃ、ＰｉＤ、ＰＳＰ、または以前に言及されたような他のタウオパチー疾患の場合、正常な行動及び／または認知特性を再建または保護するのに十分な量で存在する。
【０２５１】
前述したことから、本発明は、とりわけ、上述のようなタウオパチー疾患、特に、アルツハイマー病の診断及び／または治療のために、上述の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むタウ結合分子のいかなる使用も包含することが明らかである。一実施形態において、該結合分子は、本発明の抗体またはその免疫グロブリン鎖である。さらに、本発明は、上文に記載される言及された抗体のいずれか１つの抗イディオタイプ抗体に関する。これらは、抗体の抗原結合部位の近くの可変領域に位置する特有の抗原性ペプチド配列に結合する抗体または他の結合分子であり、そして、例えば、対象の試料中の抗タウ抗体の検出に有用である。
【０２５２】
別の実施形態において、本発明は、上述の本発明のタウ結合分子、抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞のうちのいずれか１つ、及び任意に、免疫または核酸ベースの診断方法で従来使用される試薬等の検出に適切な手段を含む診断用組成物に関する。本発明の抗体は、例えば、それらを液相で、または固相担体に結合して使用することができるイムノアッセイでの使用に適している。本発明の抗体を使用することができるイムノアッセイの例は、直接的形式または間接的形式のいずれかの競合的及び非競合的イムノアッセイである。そのようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（免疫アッセイ）、フローサイトメトリー、及びウェスタンブロットアッセイである。本発明の抗原及び抗体は、多くの異なる担体に結合させることができ、それらに特異的に結合する細胞を単離するために使用することができる。よく知られている担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然型及び修飾型セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的のため、可溶性または不溶性のいずれかであり得る。当業者に知られている多くの異なる標識及び標識方法がある。本発明において使用することができる標識の種類の例には、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、及び生物発光化合物が含まれる。本明細書上部で論じられた実施形態も参照のこと。
【０２５３】
さらなる実施形態によって、試験される個体からの血液試料、リンパ液試料、または任意の他の体液試料であり得る体液試料を得ること、及び抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で体液試料を本発明の抗体と接触させることによって、個体において障害を診断するための方法に、タウ結合分子、特に、本発明の抗体を使用することもできる。次いで、そのような複合体のレベルは、当該技術分野において知られている方法によって決定され、対照試料で生じたものよりも著しく高いレベルが試験された個体における疾患を示す。同じ方法で、本発明の抗体が結合する特異的な抗原も使用することができる。したがって、本発明は、結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片を含むインビトロイムノアッセイに関する。
【０２５４】
これに関して、本発明はまた、この目的のために特別に設計された手段に関する。例えば、例えば、タウを特異的に認識する本発明の抗体または同等の抗原結合分子が負荷された抗体ベースのアレイを使用することができる。マイクロアレイイムノアッセイの設計は、Ｋｕｓｎｅｚｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５（２００６），１６８１−１６９６に要約される。したがって、本発明はまた、本発明に従って特定されたタウ結合分子が負荷されたマイクロアレイに関する。
【０２５５】
一実施形態において、本発明は、対象においてタウオパチー疾患を診断する方法に関し、本方法は、本発明の少なくとも１つの抗体、そのタウ結合断片、またはそれらのいずれか１つと実質的に同じ結合特異性を有するタウ結合分子を用いて診察される対象からの試料中にタウ及び／または病理的修飾型及び／または凝集型タウの存在を判定することを含み、病理的修飾型及び／または凝集型タウの存在が神経変性タウオパチーを示し、生理的タウ形態のレベルと比較した病理的修飾型及び／または凝集型タウのレベルの増加が該対象における神経変性タウオパチーの進行を示す。
【０２５６】
診断される対象は、疾患について無症状または前臨床段階であり得る。一実施形態において、対照対象は、タウオパチー疾患、例えば、ＡＤ、ＡＬＳ−ＰＤＣ、ＡＧＤ、ＣＢＤ、ＣＪＤ、ＦＴＤ、ＦＴＤＰ−１７、ＮＰ−Ｃ、ＰｉＤ、ＰＳＰ、または以前に言及された他のタウオパチーを持ち、病理的修飾型及び／または凝集型タウのレベルと参照標準の間の類似性により、診断される対象がタウオパチー疾患を持っていることが示される。あるいは、またはさらに、第２の対照として、対照対象は、タウオパチー疾患を持たず、タウ及び／または病理的修飾型及び／または凝集型タウと参照標準のレベル間の差異により、診断される対象がタウオパチー疾患を持っていることが示される。一実施形態において、診断される対象及び対照対象（複数を含む）の年齢が一致する。分析される試料は、病理的修飾型及び／または凝集型タウを含有すると疑われる任意の体液、例えば、血液、ＣＳＦ、または尿試料であり得る。
【０２５７】
タウ及び／または病理的修飾型及び／または凝集型タウのレベルは、例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性細胞選別（ＦＡＣＳ）、二次元ゲル電気泳動、質量分光分析法（ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間−ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、方面増強レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、続いて、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ／ＭＳ）、及びレーザーデンシトメトリーから選択される１つ以上の技術によるタウの分析を含む、当該技術分野において知られている任意の適切な方法によって評価することができる。一実施形態において、タウの該インビボ画像化法は、陽電子放出トモグラフィー（ＰＥＴ）、単一光子放出トモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学イメージング、または磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を含む。
【０２５８】
本発明に従って適応することができる抗体及び関連の手段を用いる、アルツハイマー病等のタウオパチー疾患を診断する方法、タウオパチー疾患の進行をモニターする方法、及びタウオパチー疾患の治療をモニターする方法はまた、国際出願公開第ＷＯ９３／０８３０２号、同第ＷＯ９４／１３７９５号、同第ＷＯ９５／１７４２９号、同第ＷＯ９６／０４３０９号、同第ＷＯ２００２／０６２８５１号、及び同第ＷＯ２００４／０１６６５５号に記載される。同様に、タウの抗体ベースの検出方法は、国際出願公開第ＷＯ２００５／０８０９８６号に記載され、すべての開示の内容が参照により本明細書に組み込まれる。それらの方法は、本発明のタウ特異的抗体、結合断片、誘導体、または変異体を用いることを除いて記載される通りに適用することができる。
【０２５９】
さらなる態様において、本発明はまた、本発明の任意の抗体によって特異的に認識されるタウのエピトープを有するペプチドに関する。一実施形態において、そのようなペプチドは、配列番号６の残基１２５〜１３１、３９７〜４４１、２２６〜２４４、２１７〜２２７、３７〜５５、３８７〜４０６、４２１〜４２７、４２７〜４３９、１〜１５８、１９７〜２０７、５７〜６７、３５５〜４４１、３１３〜３１９、３０９〜３１９、２２１〜２３１、及びそれらの任意の組み合わせ、ならびに１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれ以上のアミノ酸は置換、欠失、及び／または付加されたそれらの修正された配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、それらからなる、または本質的にそれらからなり、このペプチドは本発明の任意の抗体によって認識される。
【０２６０】
本発明の一実施形態において、そのようなペプチドは、対象における神経変性タウオパチーを診断するために使用することができ、本方法は、該対象の生体試料中のペプチドに結合する抗体の存在を判定するステップを含み、本発明の前述のペプチドを認識する抗体のレベルを測定し、同等の年齢及び性別の健康な対象に見出されるレベルに対してその測定値を比較することによる、該対象におけるタウオパチーの診断に使用される。本発明の該ペプチドに特異的な測定された抗体のレベル上昇は、該対象におけるタウオパチーを診断するための指標であり得る。本発明のペプチドは、上文に記載されるようにアレイ、キット、及び組成物にそれぞれ製剤化され得る。
【０２６１】
これら及び他の実施形態は、本発明の説明及び実施例によって開示及び包含される。本発明に従って採用される材料、方法、使用法、及び化合物のうちのいずれか１つに関するさらなる文献は、公開ライブラリー及びデータベースから、例えば、電子機器を使用して引き出され得る。例えば、米国国立衛生研究所の国立生物工学情報センター及び／または国立医学図書館が提供する公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を活用することができる。欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部である欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）のもの等のさらなるデータベース及びウェブアドレスは、当業者に知られており、インターネットの検索エンジンを用いてそれらを得ることもできる。遡及的な検索及び現状の認識に有用な生物工学の特許情報の概要、及び関連する特許情報の供給源の調査は、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２（１９９４），３５２−３６４において与えられる。
【０２６２】
上記の開示は、概して、本発明を説明する。特に記載されない限り、本明細書において使用される用語には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７年、２０００年改編、及び２００３年再版、ＩＳＢＮ  ０  １９  ８５０６７３  ２において提供されるような定義が与えられる。いくつかの文献が本明細書の本文を通して引用される。特許請求の範囲の直前の本明細書の末尾で、完全な書誌引用を見出すことができる。引用された参考文献のすべての内容（参考文献、発行された特許、本願を通して引用された特許出願公開、及び製造業者の仕様書、説明書等を含む）は、本明細書に参照により明確に組み込まれるが、いかなる文書も実に本発明に対する先行技術であると認めるものではない。
【０２６３】
以下の具体的な実施例を参照することにより、さらに完全な理解を得ることができるが、それは例証のみを目的として本明細書に提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０２６４】
実施例
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明の範囲を多少なりとも限定すると理解されてはならない。クローン化されたＮＩ−１０５．４Ｅ４、ＮＩ−１０５．２４Ｂ２、及びＮＩ−１０５．４Ａ３、すなわち、ヒト可変重鎖及び軽鎖の生殖系列（ＧＬ）配列に適合していないフレームワーク１（ＦＲ１）Ｉｇ−可変領域に関して、以下の実施例の実験を説明及び記載する。図１を参照のこと。
【０２６５】
材料及び方法
引用した参考文献中に、本明細書において使用した方法等の、従来の方法についての詳細な説明を見出すことができる。“Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ”Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ．ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋｏｗ（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．２００３）及び米国特許出願公開第２０１２／００８７８６１号も参照されたく、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６６】
本発明の実施は、特に示されない限り、当該技術分野の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生理学、遺伝子導入生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を使用する。本発明の実施において有用な一般的な技術のさらなる詳細については、実施者は、細胞生物学と組織培養の標準的な教科書と概説を参照することができる。実施例において引用される参考文献もまた参照のこと。分子生化学及び細胞生化学の一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ａｌａｎ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）、及びＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｗｕ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）のような標準的な教科書に見出すことができる。Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４及び１５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、学術論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａ��  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６）、Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｔｔ  ＆  Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）、及びＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）。本開示において言及される遺伝子操作用の試薬、クローニングベクター、及びキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、及びＣｌｏｎＴｅｃｈのような販売業者から入手可能である。細胞培養及び培地コレクションについての一般的な技術は、Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９９７），１４８）、Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｋｉｔａｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７（１９９１），７３）、Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９１），３７５）、及びＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１９９０），２５１）、Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ，Ｈｅｒｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＨＡＯＳ  １１（２００１），９８−１０７に概説されている。
【０２６７】
タウ特異的Ｂ細胞の特定及びそれぞれの抗体のクローン化の方法
以下に、特に記載されない限り、タウ特異的Ｂ細胞の特定及び目的とする特異性を示す抗タウ抗体の分子クローニング、ならびにそれらの組み換え発現及び機能的特性解析は、一般的に、国際出願公開第ＷＯ２００８／０８１００８号として公開された国際出願公開第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００００５３号の実施例及び捕捉の方法の項において記載される通りに実行されており、または実行することができ、それらの開示の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許出願公開第２０１２／００８７８６１号も参照されたく、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。タウ特異的Ｂ細胞の特定及び目的とする特異性を示すタウ抗体の分子クローニング、ならびにそれらの組み換え発現及び機能的特性解析の新しい方法が本明細書内に提供される。上述のように、本発明の一実施形態において、単一またはオリゴクローナルＢ細胞の培養物を培養し、該Ｂ細胞によって産生される抗体を含む培養物の上清を、その中の新しい抗タウ抗体の存在及び親和性についてスクリーニングする。そのスクリーニングプロセスは、国際出願公開第ＷＯ２００４／０９５０３１号（その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載され、図３に示されるような、敏感な組織アミロイド斑免疫反応性（ＴＡＰＩＲ）アッセイのステップ、実施例２に記載されるＰＨＦＴａｕへの結合についての脳抽出液のスクリーニングのステップ、抗体ＮＩ−１０５．４Ｅ４のエピトープ確定実験のため、非リン酸化ペプチドを用いる、同様に実施例３に記載される、該配列のアミノ酸Ｓｅｒ−２０２及びＳｅｒ−２０５、アミノ酸Ｔｈｒ−２３１、及び／またはアミノ酸Ｓｅｒ−３９６及びＳｅｒ−４０４にリン酸基を有する配列番号６によって表されるアミノ酸配列のタウに由来するペプチドの結合についてのスクリーニングのステップ、国際特許第ＷＯ２００８／０８１００８号に記載され、実施例１に記載されるような、配列番号６によって表されるアミノ酸配列の全長型タウの結合についてのスクリーニングのステップ、及び結合が検出される抗体または該抗体を産生する細胞を単離するステップを含む。
【０２６８】
抗原の精製
組み換えヒトＴａｕ４０は、ｒＰｅｐｔｉｄｅ（Ｂｏｇａｒｔ，ＧＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＰＨＦＴａｕは、ＡＤの脳から抽出した。
【０２６９】
改変したＧｏｅｄｅｒｔらによる方法（Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ８（１９９２），１５９−１６８）に従って、病理的リン酸化タウ線維（ＰＨＦＴａｕ）を含有する対らせん状細線維の単離を実行した。１グラムのＡＤの脳組織を、可視的なすべての血管を取り除き、５ｍｍの小片に切断した。この組織を４０ｍｌの氷冷洗浄溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、６ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、及び１ｍＭ  ＮａＦ）で３回洗浄し、続いて、２０ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、１０％  スクロース）でホモジナイズした。ホモジネートを４℃、２０’０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を回収し、Ｎ−ラウロイルサルコシネート（Ｓｉｇｍａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１％（ｗ／ｖ）まで添加した。振とうしながら３７℃で２時間インキュベートした後、上清を４℃、１００’０００×ｇで１時間遠心分離した。沈殿物を回収し、ＰＢＳに再懸濁した。プロテインＡ磁気ビーズで混入している可能性がある免疫グロブリンを除去した後、ＰＨＦＴａｕ懸濁液を使用前に−８０℃で保存した。健康な対照ヒト脳組織から抽出した対照抽出物を同様に調製した。
【０２７０】
ヒトタウ抗体スクリーニング
ＥＬＩＳＡ：
９６ウェルハーフエリアマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、炭酸ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中の標準的な濃度である１μｇ／ｍｌの組み換えタウタンパク質（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，Ｂｏｇａｒｔ，ＵＳＡ）を用いて、４℃で一晩コーティングした。ＰＨＦＴａｕスクリーニングには、９６ウェルのイモビライザーマイクロプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）は、炭酸ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中に１：１００で希釈したヒトＡＤ脳から抽出したＰＨＦＴａｕを用いて、４℃で一晩コーティングした。プレートは、ＰＢＳ−Ｔ  ｐＨ７．６で洗浄し、２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有するＰＢＳ−Ｔを用いて、非特異的結合部位を室温で２時間ブロックした。Ｂ細胞条件培地をメモリＢ細胞培養プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ，ＵＫ）とインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、標準的な比色分析でＨＲＰ活性を測定することによりヒト抗体の結合を決定した。
【０２７１】
ＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ（登録商標）マイクロプレートスクリーニング
標準的な９６ウェル１０−スポットＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＵＳＡ）を、ＰＢＳ中の３０μｇ／ｍｌのｒＴａｕ（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）、ＰＨＦＴａｕ脳抽出物、及び健康な対照脳抽出物でコーティングした。３％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ−Ｔを用いて、非特異的結合部位を室温で１時間ブロックし、続いて、室温で、１時間Ｂ細胞条件培地でインキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで、ＳＵＬＦＯ−Ｔａｇで共役した抗ヒトポリクローナル抗体（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＵＳＡ）とインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＵＳＡ）を用いる電気化学発光測定により抗体の結合を検出した。
【０２７２】
タウ抗体の分子クローニング
健康なヒト対象からメモリＢ細胞を含む試料を得た。選別されたメモリＢ細胞培養物の生きているＢ細胞を回収し、ｍＲＮＡを調製する。次いで、ネスト化されたＰＣＲアプローチを用いて免疫グロブリン重鎖及び軽鎖配列を得る。
【０２７３】
ヒト免疫グロブリン生殖系列レパートリーのすべての配列ファミリーに対応するプライマーの組み合わせを、リーダーペプチド、Ｖセグメント、及びＪセグメントの増幅のために使用する。５’末端のリーダーペプチド特異的プライマー及び３’末端の定常領域特異的プライマーを用いて、１回目の増幅を行う（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．４（２００９），３７２−３８４）。重鎖及びカッパ軽鎖については、５’末端のＶセグメントの特異的プライマー及び３’末端のＪセグメントの特異的プライマーを用いて、２回目の増幅を行う。ラムダ軽鎖については、５’末端のＶセグメントの特異的プライマー及び３’末端のＣ領域特異的プライマーを用いて、２回目の増幅を行う（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１），５８１−５９７、ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６（１９９９），１８２１８−１８２３０）。
【０２７４】
完全抗体を組み換え発現させて、ＥＬＩＳＡにおける再スクリーニングにより、所望の特異性を有する抗体クローンの特定を行う。５’末端にリーダーペプチドをコードする配列及び３’末端に適切な定常ドメイン（複数を含む）をコードする配列を有する可変領域配列を相補する発現ベクターに、可変重鎖及び軽鎖配列が「正しいリーディングフレームで」挿入されて、完全ヒトＩｇＧ１抗体またはキメラＩｇＧ２ａ抗体の組み換え発現が達成される。そのために、プライマーは、抗体発現ベクターに可変重鎖及び軽鎖配列のクローニングを促進するように設計された制限酵素部位を含んだ。シグナルペプチド及びヒト免疫グロブリンガンマ１またはマウス免疫グロブリンガンマ２ａの定常ドメインを担持する重鎖発現ベクターに免疫グロブリン重鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物をインフレームで挿入することによって、重鎖免疫グロブリンが、発現する。シグナルペプチド及びヒトカッパ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインを提供する軽鎖発現ベクターにカッパ軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物をインフレームで挿入することによって、カッパ軽鎖免疫グロブリンが、発現する。シグナルペプチド及びヒトまたはマウスラムダ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインを提供するラムダ軽鎖発現ベクターにラムダ軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物をインフレームで挿入することによって、ラムダ軽鎖免疫グロブリンが、発現する。
【０２７５】
Ｉｇ重鎖発現ベクター及びカッパもしくはラムダＩｇ軽鎖発現ベクターの、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞（または、ヒトもしくはマウス起源の任意の他の適切な受容細胞株）への同時トランスフェクションにより、機能性組み換えモノクローナル抗体を得る。その後に、標準的なプロテインＡカラム精製を用いて条件培地から組み換えヒトモノクローナル抗体を精製する。一過性または安定的なトランスフェクト細胞を用いて、無限量の組み換えヒトモノクローナル抗体を産生することができる。Ｉｇ発現ベクターを直接使用するか、または異なる発現ベクターにＩｇ可変領域を再クローニングすることによって、組み換えヒトモノクローナル抗体を産生する細胞株を構築することができる。Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、及びｓｃＦｖ等の誘導体をこれらのＩｇ可変領域から作製することもできる。
【０２７６】
抗体
製造業者のプロトコルに従って、マウスモノクローナル抗ヒトタウ抗体Ｔａｕ１２（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）及びマウスモノクローナルタウ抗体ＡＴ１８０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用した。組み換えヒトタウ抗体ＮＩ−１０５．４Ｅ４、ＮＩ−１０５．２４Ｂ２、及びＮＩ−１０５．４Ａ３は、米国特許出願公開第２０１２／００８７８６１号に記載されており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。組み換えヒトタウ抗体ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４は、本発明の抗体である。それらは、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞で発現され、条件培地から精製され、特に指定されない限り、その後の適用において直接使用された。
【０２７７】
直接ＥＬＩＳＡ
炭酸ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．６）中に１μｇ／ｍｌの濃度に希釈した組み換えタウタンパク質（ｈＴａｕ４０、ｒＰｅｐｔｉｄｅ，Ｂｏｇａｒｔ，ＵＳＡ）を用いて、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）を４℃で一晩コーティングした。２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳを用いて、非特異的結合部位を室温で２時間ブロックした。ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ，ＵＫ）を用い、続いて、標準的な比色分析でＨＲＰ活性を測定することによって、本発明のヒト抗体の結合が、決定された。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて、非線形回帰によりＥＣ５０値を推定した。
【０２７８】
ウェスタンブロットタンパク質染色
ＰＨＦＴａｕ及び組み換えｈＴａｕ４０を勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって分離し、続いて、ニトロセルロース膜上に電気ブロットした。２％  ＢＳＡを用いて、非特異的な結合を室温で１時間ブロックした後、ブロットを一次ヒト抗タウ抗体またはＴａｕ１２（マウスモノクローナル抗体、Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）と一晩インキュベートし、続いて、ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ（ヒト一次抗体用）またはＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体とインキュベートした。
【０２７９】
ＥＣＬ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ３５０検出法（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｏｔｅｌｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてブロットを現像した。
【０２８０】
ＡＤの脳からのＰＨＦＴａｕの抽出
改変したＧｏｅｄｅｒｔらによる方法（Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ８（１９９２），１５９−１６８）に従って、病理的リン酸化タウ線維（ＰＨＦＴａｕ）を含有する対らせん状細線維の単離を実行した。１グラムのＡＤの脳組織を、可視的なすべての血管を取り除き、５ｍｍの小片に切断した。この組織を４０ｍｌの氷冷洗浄溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、６ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、及び１ｍＭ  ＮａＦ）で３回洗浄し、続いて、２０ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、１０％  スクロース）でホモジナイズした。ホモジネートを４℃、２０’０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を回収し、Ｎ−ラウロイルサルコシネート（Ｓｉｇｍａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１％（ｗ／ｖ）まで添加した。振とうしながら３７℃で２時間インキュベートした後、上清を４℃、１００’０００×ｇで１時間遠心分離した。沈殿物を回収し、ＰＢＳに再懸濁した。プロテインＡ磁気ビーズで混入している可能性がある免疫グロブリンを除去した後、ＰＨＦＴａｕ懸濁液を使用前に−８０℃で保存した。健康な対照ヒト脳組織から抽出した対照抽出物を同様に調製した。
【０２８１】
タウペプチドの合成
Ｐｅｐｓｐｏｔマッピング（アミノ酸３３７〜３４３）により特定されたＮＩ−１０５．４Ｅ４のエピトープを含むｈＴａｕ４０のアミノ酸３３３〜３４６（３３３ＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦ３４６）に対応するペプチドが、Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）により合成された。イモビライザーマイクロプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）への共有結合を可能にするために追加のシステインをＣ末端に付加した。市販されているマウスモノクローナルタウ抗体ＡＴ１８０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）の同種のエピトープであるヒトタウのアミノ酸２２６〜２３９（２２６ＶＡＶＶＲｐＴＰＰＫＳＰＳＳＡ２３９）に対応する第２のペプチドが同様に合成され、対照として使用された。
【０２８２】
トランスジェニックマウス
本発明のタウ抗体（及びその結合特異性を有する分子）を検証するために、３つの異なるタウオパチーの動物モデルを使用する。
【０２８３】
１．トランスジェニックＴａｕＰ３０１Ｌマウス（系統１８３）：ネズミＴｈｙ１．２プロモーター下で、Ｐ３０１Ｌ突然変異を有するヒトＴａｕ４０を発現する（これらのトランスジェニック動物の作製は、Ｇｏｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１），５２９−５３４及び国際出願公開第ＷＯ２００３／０１７９１８号に記載されており、その開示の内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２８４】
２．ネズミＰｒＰプロモーター下で、Ｐ３０１Ｌ突然変異を有する最短４Ｒヒトタウアイソフォームを発現するＪＮＰＬ３マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ）から入手可能）。
【０２８５】
３．ネズミＰｒＰプロモーター下で、Ｐ３０１Ｓ突然変異を有するヒトタウを発現するＰ３０１ＳＴａｕ（系統ＰＳ１９）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ）から入手可能）。
【０２８６】
タウオパチーマウスモデル及び対応する野生型マウスは、自由に摂食及び飲水が可能であり、１２時間：１２時間転換の明／暗周期で標準的な居住条件下で飼育される。処理群は、年齢及び性別について釣り合いがとれている。
（実施例１）
ヒトタウ抗体の標的及び結合特異性の検証
【０２８７】
単離された抗体の認識された標的としてタウを検証するために、上述のように直接ＥＬＩＳＡアッセイを実行した。例示的な組み換えヒトＮＩ−１０５．４Ａ３抗体について、３μｇ／ｍｌの濃度に希釈した組み換えヒトタウ（ｈＴａｕ４０、ｒＰｅｐｔｉｄｅ，Ｂｏｇａｒｔ，ＵＳＡ）、または炭酸ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中のＢＳＡを用いて、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）をコーティングし、抗体の結合効率を試験した。例示的なＮＩ−１０５．４Ａ３抗体は、ＥＬＩＳＡによりヒトタウに特異的に結合した。ＢＳＡに対して結合は観察されなかった。
【０２８８】
例示的な抗体ＮＩ−１０５．４Ｅ４及びＮＩ−１０５．２４Ｂ２の半最大有効濃度（ＥＣ５０）の決定のために、様々な抗体濃度を有するさらなる直接ＥＬＩＳＡ実験を行った。炭酸ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液中に１μｇ／ｍｌ（ＮＩ−１０５．４Ｅ４抗体を用いたアッセイ用）の濃度、または３μｇ／ｍｌ（ＮＩ−１０５．２４Ｂ２抗体を用いたアッセイ用）の濃度に希釈した組み換えヒトタウ（ｈＴａｕ４０、ｒＰｅｐｔｉｄｅ、Ｂｏｇａｒｔ、ＵＳＡ）を用いて９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）をコーティングし、抗体の結合効率を試験した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、非線形回帰によりＥＣ５０値を推定した。組み換えヒト由来抗体ＮＩ−１０５．４Ｅ４は、２．４ｎＭ  ＥＣ５０の低いナノモル範囲の高親和性でｈＴａｕ４０に結合した。ＮＩ−１０５．２４Ｂ２は、６．６ｎＭ  ＥＣ５０の低いナノモル範囲の高親和性でｈＴａｕ４０に結合した。
【０２８９】
直接ＥＬＩＳＡ実験を用いて例示的な抗体ＮＩ−１０５．４Ａ３の半最大有効濃度（ＥＣ５０）もまた、決定された。組み換えヒトタウ（ｈＴａｕ４０、１ｕｇ／ｍｌ）、ＰＨＦＴａｕ（１：１００）、及び対照調製物（１：１００）を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、様々な濃度の抗体とインキュベートした。ＮＩ−１０５．４Ａ３は、１．４ｎＭ  ＥＣ５０の低いナノモル範囲の高親和性でｒＴａｕに結合した。ＮＩ−１０５．４Ａ３は、１．２ｎＭ  ＥＣ５０の低いナノモル範囲の高親和性でＰＨＦＴａｕに結合する。
（実施例２）
組み換えタウ及びＡＤの脳から抽出された病理的タウへの組み換えヒト抗体結合の分析
【０２９０】
ＡＤの脳から抽出された病理的タウ種へのＮＩ−１０５．４Ｅ４及びＮＩ−１０５．２４Ｂ２の結合能力を決定するために。上に詳述されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析を行った。ブロットを、一次抗体ＮＩ−１０５．４Ｅ４（ヒト）、ＮＩ−１０５．２４Ｂ２（ヒト）、またはＴａｕ１２（マウスモノクローナル抗体、Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）と一晩インキュベートし、続いて、ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ（ヒト抗体用）またはＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体とインキュベートした。
【０２９１】
組み換え抗体ＮＩ−１０５．４Ｅ４及びＮＩ−１０５．２４Ｂ２は、ウェスタンブロットにおいて、組み換えｈＴａｕ４０ならびにＡＤの脳から抽出した病理的修飾型ＰＨＦＴａｕを認識した。対照抗体Ｔａｕ１２も、両方のタウ種を認識した。
【０２９２】
さらに、上の実施例１に説明されるように、ＰＨＦＴａｕを用いた直接ＥＬＩＳＡ実験において、例示的な抗体ＮＩ−１０５．４Ａ３の半最大有効濃度（ＥＣ５０）が決定された。ＮＩ−１０５．４Ａ３は、１．２ｎＭ  ＥＣ５０の低いナノモル範囲の高親和性でＰＨＦＴａｕに結合した。
（実施例３）
ｈＴａｕ４０上のＮＩ−１０５．４Ｅ４及びＮＩ−１０５．４Ａ３の結合エピトープのマッピング
【０２９３】
２つの隣接するペプチド間で１１個のアミノ酸の重複を有する全長型ｈＴａｕ４０（アミノ酸１〜４４１）をカバーする１１８ペプチド配列のペプチドアレイを、ニトロセルロース膜（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上にスポットした。製造業者の使用説明書に従って抗体の免疫標識及び膜の再生を行った。検出抗体の非特異的な結合を除外するために、最初に一次抗体を省略してＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧによって膜をプローブした。再生した後、１００ｎＭ  組み換えＮＩ−１０５．４Ｅ４抗体で膜をプローブした。ＥＣＬ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ３５０検出法（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｏｔｅｌｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて結合した抗体を検出した。
【０２９４】
検出抗体のみと比較した場合、２つの群の隣接するペプチドスポット（ペプチド８３、８４、及び８５；ペプチド９６及び９７）がＮＩ１０５．４Ｅ４によって特異的に特定された。これらの２つの群のペプチドによってカバーされる配列は、ｈＴａｕ４０のアミノ酸３２９〜３５１及び３８７〜３９７に対応する。これらのデータは、ＮＩ−１０５．４Ｅ４がＲ４微小管結合ドメイン内の１つの配列及びＣ末端ドメインの別の配列の２つの直鎖状配列を含む非連続的なエピトープを認識したことを示唆している。
【０２９５】
ペプチド８３〜８５によって共有される配列は、ｈＴａｕ４０のアミノ酸残基３３７〜３４３を含む。Ｐｅｐｓｐｏｔ（ＪＰＴ）のデータは、ＮＩ−１０５．４Ｅ４がヒトタウのアミノ酸３３７〜３４３を含むｈＴａｕ内のエピトープを認識することを示唆した。この領域は、タウの微小管結合ドメイン内に局在し、すべての神経性ヒトタウアイソフォームの間ならびにマウス及びラットを含む他の種の間にも保存されている。
【０２９６】
生理的微小管結合タウでは、このドメインは微小管と結合するため、ＮＩ−１０５．４Ｅ４は、微小管から脱離した病理的関連性を有するタウのプールを優先的に標的とすると予想される。
【０２９７】
ＮＩ−１０５．４Ｅ４結合ペプチド内の重要な残基を決定するために、アラニンスキャニングを行って、それぞれの残基を１つずつアラニンと置換した。元の配列中のアラニン残基（Ａ３８４及びＡ３９０）をプロリン及びグリシンに置換した。スポット３５〜５０及び５１〜６８は、元のペプチド（スポット３５及びスポット５１）及びそれらのアラニン置換変異体である。アラニンスキャンは、Ｖ３３９、Ｅ３４２、Ｄ３８７、Ｅ３９１、及びＫ３９５がＮＩ−１０５．４Ｅ４結合に必要であることを示唆した。
【０２９８】
ＮＩ−１０５．４Ｅ４のタウペプチドへの結合を試験することにより、さらなる実験を行った。直接ＥＬＩＳＡは、ＮＩ−１０５．４Ｅ４がＰｅｐｓｐｏｔマッピングにより特定されるアミノ酸残基３３７〜３４３を含有するｈＴａｕ４０のアミノ酸３３３〜３４６に対応するペプチドを特異的に認識したことを示した。ＡＴ１８０エピトープをカバーする対照ペプチドに対して、ＮＩ−１０５．４Ｅ４の交差反応性は観察されなかった。その反対に、ＡＴ１８０は、ペプチドを含有するその同種のエピトープを認識したが、ＮＩ−１０５．４Ｅ４特異的ペプチドに結合することができなかった。種特異的二次抗体は、ペプチドのいずれにも結合しなかった。まとめると、コーティングペプチドを用いる直接ＥＬＩＳＡは、ＮＩ−１０５．４Ｅ４がＰｅｐｓｐｏｔマッピングにより特定されたヒトタウのアミノ酸残基３３７〜３４３を含有するペプチドを特異的に認識することを確認した。
【０２９９】
ｈＴａｕ４０上のＮＩ−１０５．４Ａ３結合エピトープを全体にマッピングするために、４つのタウドメインポリペプチド（タウドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩＩ、及びドメインＩＶ）を生成した。Ｎ末端に６×ＨｉｓタグしたそれぞれのタウドメインをコードするＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成したＤＮＡ断片を、ｐＲＳＥＴ−Ａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にトランスフェクトした。超音波処理によりリゾチームで細菌を溶解する前に、Ｈｉｓタグ化タウドメインの発現を、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧにより６時間誘導した。Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてさらに精製する前に、溶解液を５分間煮沸した。溶出したＨｉｓタグ化タウドメインをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングするか、またはウェスタンブロットのためにポリアクリルアミドゲル上に負荷した。これらの連続的に重複するタウドメインポリペプチドは、全長型のｈＴａｕ４０をカバーした。精製したタウドメインをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、ＮＩ−１０５．４Ａ３の結合を試験した。ＮＩ−１０５．４Ａ３は、タウドメインＩ及び全長型ｈＴａｕ４０のみに結合し、このことは、エピトープがｈＴａｕ４０のＮ末端部分（ａａ１〜１３６）内にあったことを示す。ウェスタンブロットは、ＮＩ−１０５．４Ａ３のタウドメインＩへの特異的結合を確認した。ＰｅｐＳｐｏｔ（ＪＰＴ）技術を用いるＮＩ−１０５．４Ａ３エピトープのマッピングが、ヒトＴａｕ４０のアミノ酸Ｑ３５〜Ｑ４９を特定した。ＮＩ−１０５．４Ａ３結合のためのエピトープ内の重要な残基を決定するために、アラニンスキャンを行って、それぞれの残基を１つずつアラニンと置換した。元の配列中のアラニン（Ａ４１）をグリシンまたはプロリンと置換した。アラニンスキャンは、Ｄ４０、Ａ４１、及びＫ４４がＮＩ−１０５．４Ａ３の結合に重要な残基であることを示した。
（実施例４）
ＡＤの脳組織及びヒトタウトランスジェニックマウスにおけるタウの生理的形態ならびに病理的凝集体へのＮＩ−１０５．４Ｅ４の結合の評価
【０３００】
高リン酸化タウ線維からなる神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）は、ＡＤの神経病理学的特徴である。高リン酸化タウ線維はまた、ジストロフィー性神経突起及び糸屑状構造物の主要な成分でもあり、それらの両方がＡＤの共通した神経病理的特色である。マウスにおける家族性Ｐ３０１Ｌタウ突然変異を含有するヒトタウの過剰発現は、６か月齢でのＮＦＴ形成を誘導する（Ｇｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ）。
【０３０１】
タウの生理的形態ならびに病理的凝集体への組み換えヒトタウ抗体の結合を評価するために、本発明の例示的なＮＩ−１０５．４Ｅ４抗体を用いてＡＤの脳組織及びＴａｕＰ３０１Ｌトランスジェニックマウスにおける免疫組織学的染色を行った。
【０３０２】
深麻酔下、室温で２０ｍｌの１００ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ／６ｍＭ  ＥＧＴＡ（ｐＨ７．４）を用いてマウスに灌流を行った。脳を取り出し、固定のために４℃で一晩、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％  ＰＦＡに浸漬し、続いて、パラフィンに包理した。ヒト組織については、ＡＤ及び健康な対照対象からの脳組織のパラフィンブロックを使用した。標準的なプロトコルに従ってＤＡＢ染色を行った。陽性対照として、マウスモノクローナル抗体Ｔａｕ−１２（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用した。一次抗体なしのＨＲＰ共役検出抗体もまた含まれた。
【０３０３】
組み換えヒト抗体ＮＩ−１０５．４Ｅ４は、ＡＤの脳内で多数のＮＦＴ及び糸屑状構造物を特定した（図２Ａ）が、健康な対照の脳では存在しなかった（図２Ｂ）。二次抗体のみでは、ＡＤ（図２Ｃ）及び対照の脳（図２Ｄ）の両方でシグナルが得られなかった。Ｐ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスの脳内では、ＮＩ−１０５．４Ｅ４は、ＮＦＴ（図２Ｅ、Ｆ、及びＨ）、糸屑状構造物（図２Ｅ及びＧ）、及びジストロフィー性神経突起（図２Ｅ及びＨ）に類似する病理的タウに強く結合した。さらに、ＮＩ−１０５．４Ｅ４はまた、プレタングル段階でタウ凝集体を特定した（図２Ｉ）。ヒトＰ３０１Ｌタウならびにスウェーデン型及び北極型突然変異を有するヒトＡＰＰの両方を過剰発現するトランスジェニックマウスの脳内では、ＮＩ−１０５．４Ｅ４は、ベータ−アミロイド斑を取り囲むジストロフィー性神経突起に特異的に結合した（図２Ｊ）。
（実施例５）
本発明の抗体のインビボ試験
【０３０４】
既に上述したように、トランスジェニックマウス系列におけるリン酸化タウペプチドを使用する能動的ワクチン投与を用いる研究は、脳内のタウ凝集体の脳内レベルの減少を示し、行動障害の進行の遅滞を示した（Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．１５（２００８），１５７−１６８、Ｂｏｉｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２２４（２０１０），４７２−４８５）。しかしながら、老齢集団のかなりの部分がワクチン投与に対する非反応者であると予想されるので、能動的ワクチン投与はヒトではあまり使用に適していない恐れがある。さらに、タウ指向性免疫反応に関連する潜在的な副作用は、制御しがたい可能性がある。本発明のタウ結合分子は、病理的タウ種に対する類似の結合特異性のため、マウス抗体について上述したように、タウ凝集体の脳内レベルの同様の減少を達成すると合理的に予想することができる。しかしながら、進化的最適化及びヒト免疫系内の親和性成熟のため、本発明の抗体は、優れた安全性プロファイル及び免疫原性の欠如の可能性が高い健康なヒト対象から単離されたことにより、価値のある治療手段を提供する。これらの予想される治療効果の確証は、マウス抗体を用いる上述の実験において記載されるような試験方法によってもたらされ得る。特に、腹腔内抗体注射、頭蓋内注射、脳室内脳点滴等の様々な可能な経路で動物にスクリーニングする抗体を投与し、治療効果について試験することができる。ベータアミロイド誘導性タウ病理への治療効果を評価するために、タウトランスジェニックマウスの脳へのベータアミロイド調製物の先の脳内注射の後に、上述の応用の可能性のいずれかを用いることもできる。
【０３０５】
Ｇａｌｌｙａｓ陽性細胞数、総ヒトタウ染色、リン酸化タウの脳負荷の定量及び／または連続的な脳抽出に基づく脳内の可溶性及び不溶性タウ及びリン酸化タウのレベルの生化学的決定を含む組織化学的方法により治療効果の評価を行うことができる。さらに、本発明の抗体の治療効果の確認のために、処理されたマウスの行動試験、例えば、条件付け味覚嫌悪または文脈恐怖条件付けを行うことができる（Ｐｅｎｎａｎｅｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ．５（２００６），３６９−７９，Ｐｅｎｎａｎｅｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．１５（２００４），５００−９）。
（実施例６）
抗体ＮＩ−１０５．４Ｅ４及びＮＩ−１０５．４Ａ３のマウスＩｇＧ２ａ定常ドメインとのキメラ化
【０３０６】
慢性治療試験用の免疫原性が低下した抗体を作製するために、組み換えＤＮＡ技術を用いて、マウスキメラ版の抗体ＮＩ−１０５．４Ｅ４及びＮＩ−１０５．４Ａ３を作製した。高親和性でマウスＦｃ−ガンマ受容体に結合し、したがって、免疫エフェクター反応を誘導することができる分子を作製するために、これらのキメラ抗体に対してマウスＩｇＧ２ａ／ラムダアイソタイプを選択した。キメラＮＩ−１０５．４Ｅ４（「ｃｈ４Ｅ４」）及びキメラＮＩ−１０５．４Ａ３（「ｃｈ４Ａ３」）重鎖及び軽鎖構築体のアミノ酸配列を以下に示す。
【表５】
0006284548.tif 000006
（実施例７）
ｃｈ４Ｅ４重鎖（マウスＩｇＧ２ａ）からのコンセンサスＮ結合型グリコシル化部位の除去
【０３０７】
ＮＩ−１０５．４Ｅ４重鎖のＣＤＲ１領域においてコンセンサスＮ結合型グリコシル化部位が特定された。哺乳動物（ＣＨＯ）細胞で発現すると、マススペクトロメトリーにより示されるように、予想されたＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−３０）が完全にグリカンによって占められた。この領域でのＮ−グリコシル化を除去し、産物の不均質性を低下させるために、ｃｈ４Ｅ４の重鎖のＡｓｎ−３０がグルタミンに変更された（表４）。産生され、ＣＨＯ細胞から精製されたとき、その修飾型抗体は、元のグリコシル化抗体に対して見かけ上、約４倍高い結合親和性で組み換えタウに結合した。
【表６】
0006284548.tif 000007
（実施例８）
脱グリコシル化キメラＮＩ−１０５．４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）（ｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）ｍＩｇＧ１  Ａｇｌｙ）の産生
【０３０８】
抗体のエフェクター機能と活性の間の関係を評価するために、生殖系列ＮＩ−１０５．４Ｅ４のマウスキメラ脱グリコシル化変異体を産生した（「ｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）ＩｇＧ１−Ａｇｌｙ」）。重鎖（配列番号２１４）については、コンセンサスＦｃグリコシル化部位を除去するためのアスパラギンからグルタミンへの突然変異を含有するマウスＩｇＧ１重鎖定常領域にＮＩ−１０５．４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）の可変ドメイン（配列番号４３）を融合させた。重鎖可変領域は、ＣＤＲ１のコンセンサスＮ−グリコシル化部位（実施例７）を除去するために、Ｎ３０Ｑの変化を含有した。軽鎖は、上述のｃｈ４Ｅ４ラムダ軽鎖（配列番号２１）であった。
（実施例９）
ヒト４Ｅ４及び４Ａ３の急性脳透過性試験
【０３０９】
ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによりヒトＮＩ−１０５．４Ｅ４及びＮＩ−１０５．４Ａ３の生殖系列抗体を産生し、親和性精製により精製した。エンドトキシンレベルを制御し、それらはすべて、１ＥＵ／ｍｇよりも低かった。３０ｍｇ／ｋｇのＮＩ−１０５．４Ｅ４（ｎ＝７）、４Ａ３（ｎ＝７）抗体、または等体積のＰＢＳ（ｎ＝７）を１日目及び４日目に、ＴａｕＰ３０１Ｌマウスに腹腔内注射した。５日目に、麻酔下、１単位／ｍｌのヘパリンを含有するＰＢＳを用いてマウスに灌流を行った。分析のために血液、脳、及び脊髄を採取した。脳の右半球を−８０℃で凍結し、脳の左半球及び脊髄を、パラフィンブロックに包理する前に、１０％  中和化ホルマリン中に４℃で２日間、後固定し、切片が作製された。血漿はアリコートに分けて−８０℃で保存された。
【０３１０】
脳タンパク質の抽出：凍結した右半球の重量を量り、５体積（５ｍＬ／ｇの湿組織）の５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  ジエチルアミン、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、及びホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を含有する溶液中でホモジナイズした。次いで、試料をポリカーボネート製の管に移し、さらに５体積のホモジナイズ溶液を加え、氷上で３０分間保持した。次いで、１００，０００ｇ、４℃で３０分間の遠心分離の後、可溶性画分を回収した。ヒトＩｇＧアッセイにおいて、この可溶性画分を使用した。プロテアーゼ及びホスフォターゼ阻害剤を含む、３体積のＰＢＳに沈殿物を再懸濁した。１６，０００ｇ、４℃で３０分間の遠心分離後、さらなる不溶性タウ抽出物のために上清及び沈殿物を別々に−８０℃で保存した。改変サルコシル抽出（Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｍ，Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ  ＭＧ，Ｃａｉｒｎｓ  ＮＪ，Ｃｒｏｗｔｈｅｒ  ＲＡ．Ｎｅｕｒｏｎ  ８，１５９（１９９２））を用いて、沈殿物をさらに抽出した。
【０３１１】
ヒトＩｇＧ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ：５０ｍＭ  炭酸ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中の２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を捕捉抗体として使用した。捕捉抗体を用いて３０μｌ／ウェルでハーフエリア９６ウェルマイクロタイタープレートを４℃で一晩コーティングした。次いで、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳを用いてプレートを４回洗浄した後に、２％  ＢＳＡを含有するＰＢＳを５０μｌ／ウェルで用いて室温で１時間インキュベートした。脳抽出物の可溶性画分、血漿試料、及び標準抗体（４Ａ３）を２％  ＢＳＡ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ中に希釈した。３０μｌの希釈試料をそれぞれのウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳを２００μｌ／ウェルで用いてプレートを４回洗浄した後、ＨＲＰ共役ロバ抗ヒトＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ、２％  ＢＳＡ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ中に１：１０，０００で希釈）と室温で１時間インキュベートした。次いで、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳを２００μｌ／ウェルで用いてプレートを４回洗浄した後、ＴＭＢ（１０ｍＭ  クエン酸塩溶液  ｐＨ＝４．１中に１：２０）を２０μｌ／ウェルで添加した。次いで、それぞれのウェルに１０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより、反応を停止した。ＮＩ−１０５．４Ａ３の段階希釈から抗体の標準曲線を得た。標準に従って血漿及び脳試料中の抗体濃度を計算した。次いで、図６に示されるように、脳ヒトＩｇＧレベルをμｇ抗体／グラム新鮮脳組織（１ｇ／１０ｍｌと仮定する）に変換した。
【０３１２】
すべてのＮＩ−１０５．４Ｅ４及びＮＩ−１０５．４Ａ３で処理されたマウスの血漿中に高レベルのヒトＩｇＧが検出された。対照的に、ＰＢＳで処理されたマウスの血漿中にはヒトＩｇＧが検出されなかった（図５）。４Ｅ４及び４Ａ３で処理されたマウスの脳ホモジネートで著しい量のヒトＩｇＧが検出された（図６）。
（実施例１０）
キメラＮＩ−１０５．４Ｅ４及びＮＩ−１０５．４Ａ３を用いる慢性試験
【０３１３】
元のヒト抗体の可変ドメイン及びマウスＩｇＧ２ａの定常領域を含有するキメラＮＩ−１０５．４Ｅ４及びＮＩ−１０５．４Ａ３をＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションにより作製することができ、親和性精製により精製することができる。抗体のそれぞれのバッチのエンドトキシンレベルが制御され、１Ｅｕ／ｍｇより低く保たれる。性別について釣り合いをとった、７．５〜８か月齢のＴａｕＰ３０１Ｌマウスに、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇの抗体溶液、または等体積のＰＢＳ対照を腹腔内注射する。それぞれの処理群は、２０〜２５匹のマウスを有する。処理は、１週間に１回、２６週間にわたって行われる。あるいは、処理は、１週間に２回、１３週間にわたって行われる。体重は、２週間ごとにモニターする。処理期間の最後に麻酔下でマウスに灌流を行う。脳、脊髄、及び血液を回収する。脳の半分及び脊髄を、１０％ホルマリン中で３日間、後固定した後、パラフィンブロックに包理することができる。これらの組織ブロックから切断された４〜６μｍの厚みの切片を免疫組織化学試験に使用することができる。脳の残りの半分の重量を量り、生化学分析のために−８０℃で深凍結する。
【０３１４】
神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）のレベルと異なる可溶性特性を有するタウのレベルを処理及び対照試料において比較することによって薬物効果を評価する。Ｇａｌｌｙａｓの鍍銀染色（Ｆ  Ｇａｌｌｙａｓ  Ａｃｔａ  Ｍｏｒｐｈｏｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｈｕｎｇ  １９．１（１９７１））、またはＮＦＴ中の病理的リン酸化タウを認識するモノクローナルマウス抗体ＡＴ１００及びＡＴ１８０を用いる免疫染色により、ＮＦＴを可視化することができる。抗体で処理したマウス及び対照動物の脳及び脊髄におけるＧａｌｌｙａｓ陽性ニューロン及び／またはＡＴ１００、ＡＴ１８０標識ニューロンの数及び頻度が判定され、抗体処理の効果を評価し得る。
【０３１５】
本明細書に記載される脳タンパク質抽出プロトコルに従って、可溶性及び不溶性タウを抽出することができる。あるいは、改変サルコシル抽出（Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｍ，Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ  ＭＧ，Ｃａｉｒｎｓ  ＮＪ，Ｃｒｏｗｔｈｅｒ  ＲＡ．Ｎｅｕｒｏｎ  ８，１５９（１９９２））を用いて可溶性及び不溶性タウを抽出することができる。簡潔に言えば、凍結した脳を１０体積（ｗｔ／ｖｏｌ）の、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．４）、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、及びホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）からなる１０％  ショ糖ホモジネート緩衝液中でホモジナイズする。ホモジネートを２０，０００ｇで２０分間遠心分離し、及び上清を保持する。沈殿物を１０体積のホモジナイズ緩衝液中でホモジナイズし、２回目の遠心分離を行う。上清を一つにまとめることができ、Ｎ−ラウリル−サルコシネート（Ｓｉｇｍａ）を１％（ｗｔ／ｖｏｌ）の最終濃度まで添加し、３００ｒｐｍで回転しながら３７℃で１．５時間インキュベートし、続いて、１００，０００ｇで１時間遠心分離を行う。サルコシル可溶性画分として上清を回収し、１ｇの脳組織の沈殿物をＰＨＦ画分として０．２ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．４）に再懸濁する。
【０３１６】
市販されているタウＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて可溶性及び不溶性タウのレベルを測定する。さらに、脳タンパク質抽出物を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、続いて、Ｔａｕ１２（ヒトタウ）、ＡＴ８（ｐＳ２０２／ｐＴ２０５）、ＡＴ１００（ｐＴ２１２／ｐＳ２１４）、ＡＴ１８０（ｐＴ２３１）、及びＥ１７８（ｐＳ３９６）抗体を用いるイムノブロッティングを行った。既知の量のタウの標準物質に対するそれぞれの試料の総密度を測定することで半定量的分析を行う。
【０３１７】
さらに、上の実施例５で示したように、行動試験を行うことができる。例えば、２試験性Ｙ迷路試験を用いて抗体で処理したＴａｕＰ３０１Ｌマウスのける作業記憶の改善を試験することができる（例えば、Ｐｅｎｎａｎｅｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ．５（２００６），３６９−７９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。その迷路の３つのアームは、長さ２２ｃｍ、幅５ｃｍ、及び高さ１５ｃｍである。黒と白の抽象的な手がかりが迷路を取り囲む黒いカーテンに配置される。暗期の間は、６ルクスの周囲光レベルで実験を実行する。それぞれの実験は、トレーニングセッションと観察セッションを含む。トレーニングセッションの間では、３つのアームのうちの２つ（開始アーム及び第２のアーム）にマウスを割り当て、マウスが４分間自由に探索することができるが、第３のアーム（新規のアーム）にはアクセスできない。次いで、マウスを迷路から取り出し、いかなる嗅覚の手がかりも除去するために７０％エタノールで迷路を徹底的に清掃する間、収容ケージに１．５〜５分間保持する。次いで、マウスを再び迷路に戻し、３つのアームすべてをアクセス可能にして４分間観察する。それぞれのアームへの進入の順序、進入の回数、及びそれぞれのアームで過ごした時間を記録する。その記録から、新規の第３のアームで過ごした時間の、他の２つのアーム（開始アーム及び第２のアーム）で過ごした時間の平均値に対する割合が計算され、タウオパチーマウスモデルの異なる処理群及び対応する対照野生型マウスの間で比較される。齧歯動物は、典型的には、既に訪れたアームに戻るよりもむしろ迷路の新しいアームを調べることを好む。それらの障害に関連する作業記憶障害のため、未処理のマウスの区別できない行動と比較して、処理されたタウオパチーモデルマウスによるこの好みを取り戻すことについて、抗体の効果をモニターすることができる。したがって、１に近い割合は、作業記憶障害を示す。割合が高いほど、作業記憶が良好であることを示す。ＴａｕＰ３０１Ｌマウスにおける作業記憶障害は、ヒトタウの過剰発現から生じるタウ病理に起因すると考えられる。したがって、抗タウ抗体で処理したＴａｕＰ３０１Ｌマウスで観察された、対照ＴａｕＰ３０１Ｌマウスよりも著しく高い割合は、抗タウ抗体がタウ病理に治療効果を有することを示す。
（実施例１１）
ヒト抗タウ抗体の特定
【０３１８】
組み換えヒトタウ抗体ＮＩ−１０５．１７Ｃ１、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．２９Ｇ１０、ＮＩ−１０５．６Ｌ９、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、ＮＩ−１０５．２２Ｅ１、ＮＩ−１０５．２６Ｂ１２、ＮＩ−１０５．１２Ｅ１２、ＮＩ−１０５．６０Ｅ７、ＮＩ−１０５．１４Ｅ２、ＮＩ−１０５．３９Ｅ２、ＮＩ−１０５．１９Ｃ６、及びＮＩ−１０５．９Ｃ４は、本明細書に記載される方法に従って単離された。これらのヒトタウ抗体の標的及び結合特異性は、上述のように有効であった。所見の概要を表５に提供する。ＮＩ−１０５．１７Ｃ１を除く使用された抗体のすべてが生殖細胞系統であった。
【表７】
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（実施例１２）
ヒト抗体のマウスＩｇＧ２ａ定常ドメインとのキメラ化
【０３１９】
慢性治療試験用の免疫原性が低下した抗体を作製するために、組み換えＤＮＡ技術を用いて、マウスキメラ版の抗体ＮＩ−１０５．１７Ｃ１（「ｃｈ１７Ｃ１」）、ＮＩ−１０５．６Ｃ５（「ｃｈ６Ｃ５」）、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８（「ｃｈ４０Ｅ８」）、及びＮＩ−１０５．６Ｅ３（「ｃｈ６Ｅ３」）を作製した。高親和性でマウスＦｃ−ガンマ受容体に結合し、したがって、免疫エフェクター反応を誘導することができる分子を作製するために、これらのキメラ抗体に対してマウスＩｇＧ２ａ／ラムダアイソタイプを選択した。ｃｈ１７Ｃ１、ｃｈ６Ｃ５、ｃｈ４０Ｅ８、ｃｈ４０Ｅ８（Ｒ１０４Ｗ）、及びｃｈ６Ｅ３重鎖及び軽鎖構築体のアミノ酸配列を以下に示す。
【表８】
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（実施例１３）
ＮＩ−１０５．１７Ｃ１軽鎖におけるＣＤＲグリコシル化部位の除去
【０３２０】
ＮＩ−１０５．１７Ｃ１軽鎖のＣＤＲ１領域においてコンセンサスＮ結合型グリコシル化部位が特定された。哺乳動物（ＣＨＯ）細胞で発現すると、マススペクトロメトリーにより示されるように、予想されたＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−３１）が完全にグリカンによって占められた。この領域でのＮ−グリコシル化を除去し、産物の不均質性を改善するために、ｃｈ１７Ｃ１の軽鎖のＡｓｎ−３１がグルタミンに変更された（以下の配列を参照のこと）。産生され、ＣＨＯ細胞から精製されたとき、その修飾型抗体（ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）ｍＩｇＧ２ａ）は、元のグリコシル化抗体に対して見かけ上、同様の結合親和性で組み換えタウに結合した（図８Ａを参照のこと）。ＮＩ−１０５．１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）軽鎖可変領域は、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む。
【表９】
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（実施例１４）
エフェクター機能が低下した抗体の産生
【０３２１】
重鎖ＦｃドメインにおけるコンセンサスＮ−グリコシル化部位内で突然変異体を含有する抗体変異体を作製した。「Ａｇｌｙ」と表されるこれらの変異体は、免疫エフェクター機能が低下した抗タウ抗体を作製するために設計された。タウ抗体のＡｇｌｙ変異体のアミノ酸配列を以下に提供する。
【表１０】
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（実施例１５）
ｃｈ１７Ｃ１−ｍＩｇＧ２ａ及びｃｈ１７Ｃ１−ｍＩｇＧ１−Ａｇｌｙの結合活性の比較
【０３２２】
抗体のエフェクター機能と活性の関係をｃｈ１７Ｃ１  Ａｇｌｙについて評価した（図８Ａ）。ｃｈ１７Ｃ１抗体は、ｃｈ１７Ｃ１重鎖（配列番号２０３）及びｃｈ１７Ｃ１軽鎖（配列番号２０４）からなった。ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）ｍＩｇＧ２ａ抗体は、ＣＤＲグリコシル化部位を除去するために、ＣＤＲ１のＮ３１Ｑ突然変異を組み込むｃｈ１７Ｃ１重鎖（配列番号２０３）及びｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）軽鎖（配列番号２１２）からなった。ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）ｍＩｇＧ１Ａｇｌｙ抗体は、ｃｈ１７Ｃ１−ｍＩｇＧ１−Ａｇｌｙ重鎖（配列番号２１６）を含み、コンセンサスＦｃグリコシル化部位を除去するために、２９４位（Ｋａｂａｔ残基２９７）でアスパラギンからグルタミンへの突然変異を含有するマウスＩｇＧ１重鎖、及びｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）軽鎖（配列番号２１２）に１７Ｃ１の可変ドメインを融合させる。産生され、ＣＨＯ細胞から精製されたとき、ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）ｍＩｇＧ１  Ａｇｌｙは、元のグリコシル化抗体に対して見かけ上、同様の結合親和性で組み換えタウに結合した（図８Ａを参照のこと）。
（実施例１６）
１７Ｃ１軽鎖の４８位でのバリン対イソロイシンの比較
【０３２３】
マウスキメラＩｇＧ２ａ版の生殖系列の抗体ＮＩ−１０５．１７Ｃ１を作製するプロセスにおいて、軽鎖の残基４８はまた、バリンからイソロイシンに変化した。この置換がＮＩ−１０５．１７Ｃ１の結合親和性に影響を及ぼさなかったことを確認するために、４８位でバリンを用いたマウスキメラＩｇＧ２ａ版のＮＩ−１０５．１７Ｃ１が調製された。産生され、ＣＨＯ細胞から精製されたとき、ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ、Ｉ４８Ｖ）ｍＩｇＧ２ａ抗体は、ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）ｍＩｇＧ２ａに対して見かけ上、同様の結合親和性で組み換えタウに結合した（図８Ｂを参照のこと）。ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）ｍＩｇＧ２ａ抗体は、ｃｈ１７Ｃ１重鎖（配列番号２０３）及びｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ、Ｉ４８Ｖ）軽鎖（配列番号２１７）からなった。
【表１１】
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（実施例１７）
ＮＩ−１０５．４０Ｅ８の１０４位でのアルギニン対トリプトファンの比較
【０３２４】
ヒト対らせん状細線維（ＰＨＦ）に見られるリン酸化型タウに対して選択的である抗体ＮＩ−１０５．４０Ｅ８は、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８  ＶＨの１０４位で通常ではないアルギニン残基を含有する。典型的には、ヒト免疫グロブリンレパートリー内のこの位置は、トリプトファン残基に占められる。残基Ａｒｇ１０４がトリプトファンで置き換えられた、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８重鎖形態であるＮＩ−１０５．４０Ｅ８（Ｒ１０４Ｗ）−ｈＩｇＧ１が作製された。産生され、ＣＨＯ細胞から精製されたとき、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８（Ｒ１０４Ｗ）−ｈＩｇＧ１抗体は、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８−ｈＩｇＧ１に対して見かけ上、同様の結合親和性でヒトＰＨＦタウに結合した（図９を参照のこと）。２つの抗体の軽鎖は同一であった。
【表１２】
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（実施例１８）
ヒト抗タウ抗体は、ＡＤの脳及びタウオパチーのトランスジェニックマウスモデルの脳内の病理的に凝集されたタウに結合する。
【０３２５】
アルツハイマー病及び対照患者から得られた脳組織試料、ならびにタウオパチーのトランスジェニックマウス及び野生型対照の脳は、本明細書に提供される生殖系列ヒト抗タウ抗体で染色された。アルツハイマー病（ＡＤ）の脳及びタウオパチーのトランスジェニックマウス（Ｔｇ）の脳内において病理的タウ凝集体への生殖系列ヒトＮＩ−１０５．４０Ｅ８、ＮＩ−１０５．４８Ｅ５、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、及びＮＩ−１０５．１７Ｃ１抗タウ抗体結合の代表的な画像を図１０に示す。これらの抗体のいずれも精神的に健康な対象（Ｃｔｒ）または野生型マウス脳（Ｗｔ）内において正常なタウに結合しない。これらの抗体の中での異なるパターンは、エピトープ特異性及び結合特異性の違いを反映した。
（実施例１９）
ＴａｕＰ３０１Ｌマウスにおける抗体の脳透過性
【０３２６】
動物及び抗体の処理：ヒトＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．４０Ｅ８、及びＮＩ−１０５．６Ｅ３抗タウ抗体は、ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションにより産生し、標準的な方法を用いて精製した。マウス抗原に対して交差反応性のないヒト化抗体をアイソタイプ対照（ｈＩｇＧ１）として使用した。第１の実験では、注射したＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、及びｈＩｇＧ１抗体の半分を、１：３の適切な抗体：Ｃｙ３の比率でＣｙ３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＰＡ１３１０５）で標識した。ＥＬＩＳＡ及びＴａｕＰ３０１Ｌ脳を用いた免疫染色により確認されるように、Ｃｙ３の標識化は、抗体結合を変化させなかった（データは示さず）。第２の実験では、非標識のＮＩ−１０５．６Ｃ５及びＮＩ−１０５．４０Ｅ８抗タウ抗体が使用された。
【０３２７】
１８〜２２か月齢のＴａｕＰ３０１Ｌマウスは、７日間以内に腹腔内注射によって、３０ｍｇ／ｋｇのＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１の２つの用量を受容した。第２の投与後から１日目、８日目、及び２２日目の時点でそれぞれの処理群の３匹のマウスから組織試料を回収した。第２の実験では、ＴａｕＰ３０１Ｌマウスに、７日間以内に２回、３０ｍｇ／ｋｇのｈ４０Ｅ８及びｈ６Ｃ５を腹腔内注射し、第２の注射後の１日目にそれらのマウスから組織試料を回収した。
【０３２８】
組織試料を回収するために、右心房を経由した血液を回収する前に、マウスをケタミン／キシラジンで深麻酔した。次いで、大槽穿刺により脳脊髄液を回収した。続いて、脳及び脊髄を回収し、その後、１０ＵＩ／ｍｌのヘパリンを含有する氷冷ＰＢＳで２分間、左心室を経由した１０％  中和化ホルマリンで５分間灌流した。脳を、さらに３時間、４℃で、１０％  中和化ホルマリン中で固定し、その後、３０％  ショ糖中で４８時間浸漬した。次いで、脳をドライアイス中で凍結させ、続いて、厚さ３０μｍの一連の冠状断切片に分割した。この一連の断切片を、使用前に０．０２５％  アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中１Ｍ  グルコース、３７．５％  エチレングリコールを含有する不凍液中で、−２０℃で保存した。脊髄を、１０％  中和化ホルマリン中に２日間、後固定し、パラフィンブロックに包理した。
【０３２９】
免疫組織化学：厚さ３０μｍの冠状断切片を浮遊染色によりビオチン化ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）でプローブした。浮遊切片をＴｒｉｓ−Ｔｒｉｔｏｎ  ｐＨ７．４（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で洗浄し、１％  Ｈ２Ｏ２  ＰＢＳ中で３０分間インキュベートし、及びＴｒｉｓ−Ｔｒｉｔｏｎ中２％  正常ヤギ及びウマ血清を含有するブロッキング溶液でインキュベートし、さらに０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で、室温で１時間インキュベートした。次いで、神経性ヒトＩｇＧを検出するために、１００ｒｐｍで振とうさせながら、切片を、ブロッキング溶液中、１：２００でビオチン化ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，７０９−０６５−１４９）と４℃で１６時間インキュベートした。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＫ６１００、１：１００）を用いて、組織結合したビオチン化抗体をペルオキシダーゼ発色反応により可視化した。氷冷ＰＢＳを用いて酵素反応を停止し、切片をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、切片をスライドガラス上に載置し、一晩風乾した後、核を可視化するために、ヘマトキシリン溶液で対比染色した（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ  ＋  Ｃｏ．，Ｔ８６５．１）。脱水ステップ後、このスライドガラスをカバークリップでカバーした後、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｄｏｔＳｌｉｄｅ  ２．１仮想顕微鏡システムで走査した。
【０３３０】
ヒト抗体は、腹腔内注射によってヒト抗タウ抗体またはｈＩｇＧ１対照抗体のいずれかを受容したＴａｕＰ３０１Ｌマウスの脳内に検出されたが、抗体で処理しなかったＴａｕＰ３０１Ｌ及び野生型マウスにおいては検出されなかった（図１１）。しかしながら、ニューロン染色は、ｈＩｇＧ１で処理したマウスでは観察されなかったが、ＮＩ−１０５．６Ｃ５、ＮＩ−１０５．６Ｅ３、及びＮＩ−１０５．４０Ｅ８抗タウ抗体で処理したマウスの海馬においてのみ観察された。抗タウ抗体を用いたニューロン染色は、注射後１日目に容易に検出可能であったが、注射後８日目にはあまりはっきり検出されず、注射後２２日目には検出されなかった（データは示されず）。ＴａｕＰ３０１Ｌマウスは、海馬体において高レベルのトランスジェニックヒトタウを産生し、この海馬体は、神経原線維濃縮体を生じる最早の領域のうちの１つである。したがって、末梢に注射された抗タウ抗体は脳に進入するだけではなく、高レベルのタウを含有したニューロンに進入する可能性が高かった。
（実施例２０）
ｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）及びｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）によるＴａｕＰ３０１Ｌマウスの長期間処置による効果
【０３３１】
動物及び抗体の処理：ヒト抗体の可変ドメイン及びマウスＩｇＧ２ａの定常領域を含有するキメラＮＩ−１０５．４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）（「ｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）」）及びキメラＮＩ−１０５．１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）（「ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）」）は、ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションにより産生し、標準的な方法を用いて精製した。
【０３３２】
性別について釣り合いをとった、７．５〜８か月齢のＴａｕＰ３０１Ｌマウスに１０ｍｇ／ｋｇのｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）（ｎ＝２０）、１０ｍｇ／ｋｇのｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）（ｎ＝２０）、または等体積のＰＢＳ（ｎ＝２０）を腹腔内注射により週１回投与した。体重は、２週間ごとにモニターした。有意な体重減少は観察されなかった。ＰＢＳ群から２匹のマウス及びｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）処理群から１匹のマウスが早期に死亡した。組織回収のために、２５回目の処理から１日後に、マウスに麻酔した。眼窩静脈叢より血液を採取した。続いて、脳及び脊髄を回収し、その後、左心室を経由した１０ＵＩ／ｍｌのヘパリンを含有する氷冷ＰＢＳで２分間灌流した。次いで、左半分の脳の重量を量り、ドライアイス中で深凍結させ、使用前に−８０℃で保存した。右半分の脳及び脊髄を１０％  中和化ホルマリン中に４℃で２日間、後固定し、続いて、ＰＢＳ中にさらに保存した後、パラフィン包理した脳及び脊髄ブロックの処理を行った。
【０３３３】
脳タンパク質の抽出：溶解度に基づいて、脳タンパク質を連続的に抽出した。まず、左半分の脳を、０．２％  ジエチルアミン、１×プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、及び１×ホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を含有する、１０倍のｗ／ｖの５０ｍＭ  ＮａＣｌでホモジナイズした。氷上で３０分間インキュベートした後、ホモジネートを１００，０００ｇで、４℃で３０分間遠心分離した。続いて、上清を回収し、可溶性画分として画定した。残りの沈殿物を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ７．４、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１×ホスファターゼ阻害剤、１×プロテアーゼ阻害剤、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、及び１ｍＭ  ＡＥＢＳＦを含有する、１２倍のｗ／ｖの１０％  ショ糖溶解緩衝液でホモジナイズした。氷上で３０分間インキュベートした後、ホモジネートを２０，５００ｇで、４℃で２０分間遠心分離した。サルコシル抽出のために、上清の９５％を慎重に回収した。沈殿物を−８０℃で保存した。Ｎ−ラウリル−サルコシネートを上清に添加した（１％（ｗ／ｖ）最終濃度）。２２０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で１時間インキュベートした後、この溶液を１００，０００ｇで、４℃で１時間遠心分離した。上清を回収し、サルコシル可溶性画分として画定した。沈殿物を室温で３０分間乾燥させた状態にし、次いで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４（２０％  ｖ／ｗ  初期脳重量）中に溶解し、ＰＨＦ不溶性画分として画定し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０３３４】
ＥＬＩＳＡ測定製造業者のプロトコルに従って、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、３つの脳タンパク質画分中のすべてのヒトタウ及びリン酸化タウを、定量した。すべてのヒトタウ、トレオニン２３１でリン酸化されたヒトタウ（ｐＴ２３１タウ）、セリン１９９でリン酸化されたヒトタウ（ｐＳ１９９タウ）、及びトレオニン１８１でリン酸化されたヒトタウ（ｐＴ１８１）のタウを検出した。可溶性画分の試料を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４を用いてＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により測定された総タンパク質含有量に基づいて１ｍｇ／ｍｌになるまで標準化された。標準化された試料のアリコートをＥＬＩＳＡ測定及びウェスタンブロットのために調製した。ＥＬＩＳＡ用の可溶化されたＰＨＦ不溶性画分を調製するために、１０μｌのＰＨＦＴａｕを、１０μｌの８Ｍ  塩酸グアニジンで、室温で１時間インキュベートし、続いて、１８０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ７．４を添加した。標準的なプロトコルに従ってＥＬＩＳＡ測定を行った。ＥＬＩＳＡによって測定されたそれぞれの試料中のタウレベルを、最終分析のために初期脳重量に対して正規化した。
【０３３５】
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、エンドポイント血漿薬物レベルを測定した。簡潔に言えば、１００ｎＭ  炭酸ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中の３μｇ／ｍｌのｒＴａｕ（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）（配列番号６）を、ＣｏｓｔａｒハーフエリアＥＬＩＳＡプレート中で、４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、ＰＢＳ中３％  ＢＳＡで、室温で１時間ブロックした。血漿試料を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳ中３％  ＢＳＡ中で１：２００、１：４００、及び１：８００で希釈した。ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）の段階希釈を用いて、標準曲線を得た。１時間インキュベートした後、このプレートを０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで４回洗浄し、続いて、ロバ抗マウスＩｇＧＦｃγ−ＨＲＰ（１：１０，０００）と１時間インキュベートした。洗浄後、標準的な比色分析によって結合抗体をさらに決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を用いたシグモイド曲線あてはめによって標準曲線を得た。
【０３３６】
ウェスタンブロット：３つの画分のタンパク質試料を、４×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、７０℃で１０分間加熱し、それぞれの試料から等量の総タンパク質をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）の４〜１２％（ｗ／ｖ）ゲル上で電気泳動した。ＰＶＤＦ膜へのタンパク質の半乾燥移動後、この膜を、ＴＢＳ中０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する３％  ＢＳＡ中でブロックし、続いて、異なる抗タウ抗体を用いて４℃で一晩プローブした。次いで、ペルオキシダーゼ共役二次抗体を室温で１時間インキュベートし、その後、ＴＢＳＴで４回洗浄した。続いて、増感化学発光（ＥＣＬ）（Ｐｉｅｒｃｅ）によって結合抗体を検出した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて免疫ブロットの濃度分析を行った。
【０３３７】
２試験性Ｙ迷路：２試験性Ｙ迷路試験を用いて、短期空間的記憶についてマウスを試験した。迷路のアームは、長さ３５ｃｍ、幅５ｃｍ、及び高さ１０ｃｍであった。抽象的な手がかりが迷路を取り囲むカーテンに配置された。６ルクスの周囲光レベルで実験を実行した。曝露期間の間では、２つのアーム（開始アーム及び１つの別のアーム）にマウスを割り当て、マウスが４分間自由に探索することができるが、迷路と同じ材料から作られているドアにより遮断された第３のアーム（新しいアーム）にはアクセスできない。次いで、マウスを迷路から取り出し、迷路を５０％  エタノールで清掃する場合には、収容ケージに２分間保持した。試験段階の間、マウスを開始アームの末端に入れ、４分間３つのアームすべてを自由に探索することができた。ビデオトラッキング及び動物行動分析用のＴＳＥ  ｖｉｄｅｏＭｏｔ２ソフトウェア（ＴＳＥ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて試験段階を記録した。新しいアームにおけるアーム進入の回数及びそこで過ごした時間を記録した。トレーニングセッションの間に開いていたその他の２つのアームにおけるアーム進入の回数及びそこで過ごした時間の平均値を計算した。新しいアームへのアーム進入の回数（またはそこで過ごした時間）とその他の２つのアームの平均値との間の比率を計算した。空間的作業記憶の障害がない野生型対照動物は、この試験では、１．５〜２の比率を有する。Ｐｅｎｎａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ  ５（５）：３６９−７９（２００６）。
【０３３８】
データ分析：二元分散分析のための正規性の仮定を満たすようにＥＬＩＳＡデータの対数変換を行った。ｐ＜０．０５の場合、有意差ありと見なされた。
【０３３９】
ｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）はＴａｕＰ３０１Ｌマウスにおいて可溶性ヒトタウを著しく低下した：脳タンパク質抽出物のＤＥＡ可溶性、サルコシル可溶性、及び不溶性画分におけるヒトタウレベルをＥＬＩＳＡにより定量した。ヒトタウの大部分は、ＤＥＡ可溶性画分において見られた（データは示さず）。ＰＢＳで処理したマウスのものと比較して、ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）で処理したマウスからのＤＥＡ可溶性画分においてヒトタウ（ｈＴａｕ）全体が減少した（ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）において平均して２９％の減少及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）において３７％の減少、図１２Ａ）。減少はまた、ＤＥＡ可溶性画分においてリン酸化タウ（ｐＴ２３１、ｐＳ１９９、及びｐＴ１８１）にも見られた（それぞれ、図１２Ｂ、Ｃ、及びＤ）。これまでに、雄の対照物よりも雌のＴａｕＰ３０１Ｌマウスにおいてより低いヒトタウの発現を観察している。したがって、データを正確に分析するために、２つの変数として性別及び処理による二元ＡＮＯＶＡを使用した。すべての可溶性ヒトタウ測定においてｐ＜０．０１である性別効果を確認した（ヒトタウ全体、ｐＳ１９９、ｐＴ１８１、及びｐＴ２３１ヒトタウ）。性別と処理との間に相互作用はなかった（すべての可溶性ヒトタウ測定において０．４９＜ｐ＜０．９１）。重要なことには、ＤＥＡ可溶性ヒトタウの有意な処理効果があった（ｈＴａｕ、ｐＳ１９９、及びｐＴ２３１についてはｐ＜０．０５、及びｐＴ１８１についてはｐ＝０．０６）。処理効果は、主に、ｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）によって決定された。ＰＢＳ対照と比較した場合、ｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）は、ｈＴａｕ（ｐ＜０．０５）、ｐＳ１９９（ｐ＜０．０１）、ｐＴ２３１（ｐ＜０．０１）、及びｐＴ１８１（ｐ＜０．０５）を著しく減少した。サルコシル不溶性画分を用いたＥＬＩＳＡ測定は、動物の中で高い変動性を示したが、有意な性別効果は観察されなかった。サルコシル不溶性画分において有意な処理効果は観察されなかった。同様に、サルコシル可溶性画分においてＥＬＩＳＡによる有意な処理効果は観察されなかった。
【０３４０】
ヒトタウ特異的なモノクローナル抗体Ｔａｕ１２を用いたウェスタンブロットは、ＤＥＡ可溶性画分における主要なタウ免疫活性成分として、６２ｋＤａで単一バンドとして全長型ヒトタウを示した。全長型ヒトタウの明らかな減少は、ｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）及びｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）で処理したマウスの大部分に観察された。サルコシル不溶性画分において、６４ｋＤａのバンド及びいくつかの他の高分子量のバンドが観察され、ヒトタウ断片に推定上対応するより小さい分子量のバンドも観察された。濃度分析は、個体の動物の中で高度の変動性を示し、これによりあらゆる定量比較を妨げた。しかしながら、ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）で処理したマウスにおけるＴａｕ１２により検出されたサルコシル不溶性画分において、すべてのヒトタウタンパク質の全体的な定量減少があった（図１３に示される代表的なウェスタンブロット）。
【０３４１】
血漿薬物レベル：腹腔内注射により週１回１０ｍｇ／ｋｇのｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）でマウスを処理した。薬物曝露を評価するために、血漿試料を最後の処理から２４時間後に回収した。捕捉剤としてｒＴａｕを用いてＥＬＩＳＡにより血漿薬物レベルを測定した。ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）の平均血漿レベルは、それぞれ、２００μｇ／ｍｌ及び１４５μｇ／ｍｌであり、これは両方の抗体が良好な血液曝露を有したことを示唆している（図１４）。
【０３４２】
抗体処理及び空間記憶：先行研究は、ＴａｕＰ３０１Ｌマウスにおける海馬依存性である空間参照記憶の障害を示唆した（Ｐｅｎｎａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ  ５（５）：３６９−７９（２００６））。２試験性Ｙ迷路が、タウトランスジェニックマウスにおける短期空間記憶の障害を検出するための高感度試験として報告された（Ｔｒｏｑｕｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓ．９（４）：３９７−４０５（２０１２））。曝露期間の間では、すべての群が平等に迷路を探索し、それぞれの利用可能なアームでの同等量の時間を過ごした（データは示さず）。移動した距離を比較した差は見られなかった。試験段階の間では、ＰＢＳで処理したＴａｕＰ３０１Ｌマウスは、曝露期間の間、探索した他の２つのアームの平均値とほぼ同等数（比率＝１．１８）の新しいアームにおける進入がなされ、このことは、ＰＢＳで処理したＴａｕＰ３０１Ｌマウスにおける不良な空間作業記憶を示唆した。ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）で処理したマウスは両方とも、他の２つのアームに対して新しいアームにおける優先傾向を示し、それらは、他の２つのアームの平均値よりも新しいアームにより多く訪問したことを示した（ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）については比率＝１．５０であり、ｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）については１．３０）。ＰＢＳで処理された群の進入と比較して、ｃｈ１７Ｃ１（Ｎ３１Ｑ）及びｃｈ４Ｅ４（Ｎ３０Ｑ）で処理したＴａｕＰ３０１Ｌマウスにおける新しいアームへの進入の比率を図１５に示す。
【０３４３】
本発明は、記載される特定の実施形態によって範囲内に限定されるものではなく、それは、本発明の個々の態様の単なる説明として意図され、機能的に同等であるいかなる組成物または方法は、本発明の範囲内である。実際には、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の種々の修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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