(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物、植物の細胞又は植物細胞で組換え糖タンパク質を産生するプロセスであって、Ｎ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする第１の核酸配列を、前記植物、前記植物の細胞又は前記植物細胞で発現させるステップと、異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）をコードする第２の核酸配列を共発現させるステップとを含み、
ここで第１の核酸配列がウイルスベクターから発現し、そして第２の核酸配列が非ウイルスベクターから発現する、
上記プロセス。
【請求項２】
植物で組換え糖タンパク質を産生するプロセスであって、Ｎ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする、目的の第１のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第１のＤＮＡ分子を含有する第１のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いて、前記植物をトランスフェクトするステップと、異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）をコードする第２のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第２のＤＮＡ分子を含有する第２のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いて、前記植物をトランスフェクトするステップと、第１及び第２のＤＮＡ配列を発現させて、前記糖タンパク質として前記ポリペプチドのグリコシル化形態を産生するステップとを含み、
ここで第１のＤＮＡ配列がウイルスベクターから発現し、そして第２のＤＮＡ配列が非ウイルスベクターから発現する、
上記プロセス。
【請求項３】
単一サブユニットのＯＴａｓｅが、クラスＥＣ．２．４．１．１１９に属し、真核細胞で、ドリコールから新生タンパク質のＮ−グリコシル化部位のアスパラギン残基にオリゴ糖Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を転移する、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
単一サブユニットのＯＴａｓｅが、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）のＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質又はそれらの組合せである、請求項１から３までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
単一サブユニットのＯＴａｓｅをコードする核酸配列が、
ｉ．配列番号２のいずれか１つのアミノ酸配列全体と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列、又は
ｉｉ．配列番号２のいずれか１つのアミノ酸配列全体と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列、又は
ｉｉｉ．配列番号２のいずれか１つのアミノ酸残基数の少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の長さであり、そのような長さにわたって配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列、又は
ｉｖ．配列番号２のいずれか１つのアミノ酸配列に比べて、１アミノ酸から３０アミノ酸の添加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列
であるかそれを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記植物が、高等植物、好ましくは双子葉植物、さらに好ましくはナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａ）植物、さらに好ましくはタバコ科（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）植物、最も好ましくはベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）であり、前記植物細胞が、高等植物、好ましくは双子葉植物、さらに好ましくはナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａ）植物、さらに好ましくはタバコ科（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）植物、最も好ましくはベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）由来の細胞である、請求項１から５までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
Ｎ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）をコードする第２の核酸配列を含み、
第１の核酸配列がウイルスベクターから発現し、そして第２の核酸配列が非ウイルスベクターから発現する、
高等植物又は高等植物細胞。
【請求項８】
Ｎ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする、目的の第１のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第１のＤＮＡ分子を含有する第１のアグロバクテリウムと、異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第２のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第２のＤＮＡ分子を含有する第２のアグロバクテリウムとを含有し、
第１のＤＮＡ配列がウイルスベクターから発現し、そして第２のＤＮＡ配列が非ウイルスベクターから発現する、
アグロバクテリウム混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物、植物の細胞及び植物細胞で組換え糖タンパク質を産生するプロセスに関し、該糖タンパク質は、Ｎ−グリコシル化部位で高いＮ−グリカン占有率を有する。また、本発明は、植物で組換え糖タンパク質、具体的にはＩｇＧモノクローナル抗体の、Ｎ−グリコシル化部位でのＮ−グリカンの占有率を調節するための方法に関する。本発明はまた、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位に近接する特定のアミノ酸残基を有する組換え糖タンパク質を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−グリコシル化は、多くのバイオ医薬の生物活性及び薬物動態特性の決定に重要な役割を果たすことが知られている。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のアスパラギン残基２９７でのＮ−グリコシル化は、抗体の安定性及び免疫細胞が媒介するＦｃエフェクター機能に決定的に重要な役割を果たす。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのこの保存されたグリコシル化部位にグリカンがあること、並びにそのグリカン構造自体が、ｍＡｂとＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用を促進するために決定的に重要である。様々なグリコシル化の形態（例えば、様々なグリカン構造）は、様々な効果を規定し、ｍＡｂの生物特性と薬物動態特性に有益であるものもあれば、有害であるものもあることが示されている。例えば、ＣＨＯ細胞で製造されたハーセプチンのような脱フコシル化され且つグリコシル化された治療ｍＡｂ（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：２６７３３〜２６７４０）や、小型の水生植物であるコウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｏｒ）で発現された脱フコシル化抗ＣＤ３０ｍＡｂ（Ｃｏｘ，Ｋ．Ｍ．ら、２００６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２４：１５９１〜１５９７）は、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）が媒介するＡＤＣＣの効果の点で、アルファ−１，６（ＣＨＯ細胞）又はアルファ−１，３（ウキクサ）結合のフコース残基を有する同等物よりも、およそ３０〜５０倍大きな活性を有することが示された。同様の結果は、動物細胞及び植物細胞で産生されたリツキシマブ及び他のｍＡｂについて報告されている（Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．ら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：３４６６〜３４７３；Ｎｉｗａ，Ｒ．ら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６４：２１２７〜２１３３；Ｚｅｉｔｌｉｎ，Ｌ．ら、２０１１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０８：２０６９０〜２０６９４；Ｇａｓｄａｓｋａ，ＪＲ．ら、２０１２、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５０：１３４〜１４１）。
【０００３】
Ｆｃ領域のグリコシル化部位にグリカンがないことは、組換えｍＡｂの生物活性と薬物動態特性に有害な影響を及ぼす。Ｎ−グリカンの除去によって、ＣＨＯ細胞産生ｍＡｂのＡＤＣＣ及びＣＤＣは著しく減弱する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  Ｒ．、２００７、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．、７：１４０１〜１３）。非グリコシル化されたセツキシマブ（転移性の結腸直腸がん及び頭頸部がんの治療に使用される上皮成長因子受容体阻害剤）は、ＦｃγＲＩにもＦｃγＲＩＩＩａにも結合せず、高いエフェクター−標的細胞比率であってさえＡＤＣＣ活性もない（Ｐａｔｅｌ，Ｄ．ら、２０１０、Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１９：８９〜９９）。構造研究では、Ｎ−グリカンが、主にＦｃドメインの立体構造の安定化を通じて効果を発揮することが示唆されている（Ｍｉｍｕｒａ，Ｙ．ら、２０００、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３７：６９７〜７０６；Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ，Ｐ．ら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、４０６：２６７〜２７３；Ｍｉｍｕｒａ，Ｙ．ら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７６：４５５３９〜４５５４７）。最近の詳細な研究では、半グリコシル化は、Ｆａｂが媒介する抗原結合に影響を与えず、新生児型Ｆｃ受容体の結合にも影響を与えないことが実証された。しかし、半グリコシル化されたｍＡｂ−Ｘは、ＣＨ２ドメインの熱安定性が僅かに低下し、さらに重要なことに、半グリコシル化形態は、高親和性のＦｃγＲＩ、並びに低親和性のＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＢを含めた全てのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対し、大幅に低下した結合親和性を示す（Ｈａ，Ｓ．ら、２０１１、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２１：１０８７〜１０９１）。上述の場合、半グリコシル化されたｍＡｂ−ＸのＦｃγＲとの結合親和性が低下することによって、完全にグリコシル化された同等物に比べて、３．５倍の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）の低下がもたらされる。ＡＤＣＣは、多くの場合、治療抗体の薬効に重要な役割を果たすが、グリコシル化状態は、抗体の質に影響するだけではなく、生成物の生物機能にも影響を与えることが期待されている。
【０００４】
市販の治療抗体は、９９〜１００％のＦｃグリコシル化部位占有率を示すが、一方で、トランスジェニック植物に由来するモノクローナル抗体の試料は、しばしば、かなりの量の非グリコシル化バリアントを含有することがある［Ｋａｒｎｏｕｐ，Ａ．Ｓ．、Ｋｕｐｐａｎｎａｎ，Ｋ．及びＹｏｕｎｇ，Ｓ．Ａ．、２００７、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、８５９：１７８〜１９１；Ｇｉｏｒｎｏ，Ｃ．、２０１０，「モノクローナル抗体の糖鎖工学（Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」，博士論文、コンスタンツ大学］。本発明者らの内部データでも、植物産生ｍＡｂが、Ｆｃドメインに、最大３０％までの非グリコシル化されたＮ−グリコシル化部位をしばしば含有することが明らかになった。このようなデータは、ＣＨＯ細胞産生ｍＡｂと比較して、植物で産生された最終的な生成物が、さらに高い不均一性を有することを示しており、植物産生ｍＡｂの生物活性及び薬物動態特性に有害な影響を及ぼしうる。
【０００５】
しかし、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの亢進を介して患者の免疫系を惹起すべく、エフェクター細胞がＦｃ受容体と効率良く相互作用することは、がん治療用のものを含めたいくつかの治療ｍＡｂには決定的に重要ではない場合がある。エフェクター細胞の活性化は、シグナル伝達のモジュレーター（アゴニスト又はアンタゴニスト）として使用されるｍＡｂには必要ではない場合がある。また、Ｆｃのグリコシル化は、モノクローナル抗体の立体構造と安定性を維持するために必要であることから（Ｚｈｅｎｇ，Ｋ．、Ｂａｎｔｏｑ，Ｃ．及びＢａｙｅｒ，Ｒ．、２０１１、Ｍａｂｓ、３：５６８〜５７６；Ｍｉｍｕｒａ，Ｙ．ら、２０００、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３７：６９７〜７０６；Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ、Ｐ．ら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、４０６：２６７〜２７３；Ｍｉｍｕｒａ，Ｙ．ら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７６：４５５３９〜４５５４７）、グリコシル化部位を、例えば部位特異的突然変異などによって完全に除去することが、最適な解決策ではないことがある。
【０００６】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位占有率の調節は、免疫の活性化分子及び抑制分子を標的とする抗体カクテルの助力を得ることによって（Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．ら、２０１０、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８４：５４９３〜５５０１）、又は、例えば、腫瘍を標的とする抗体であるトラスツズマブを用いてＨＥＲ２陽性がんの連続的な治療を行い、続いて、宿主の生得の免疫系を活性化する第２の抗体アゴニスト（抗ＣＤ１３７）を用いて治療する際に（Ｋｏｈｒｔ，Ｈ．Ｅ．ら、２０１２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１２２：１０６６〜１０７５）、併用療法を使用する場合に有用でありうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それゆえ、植物によって発現される免疫グロブリンのＦｃ領域、及び植物によって発現される他の糖タンパク質における、Ｎ−グリコシル化部位の占有率をグリカンによって調節するプロセスを提供することが、本発明の一つの目的である。また、植物によって発現されている免疫グロブリンのＦｃ領域、及び植物によって発現されている他の糖タンパク質における、Ｎ−グリコシル化部位の占有率を、９０％超若しくはほぼ１００％まで、又は５０％以下までなどの異なるレベルで、グリカンによって調節するプロセスを提供することも一つの目的である。植物で発現され、Ｎ−グリコシル化部位、とりわけＩｇＧのＦｃ領域のＮ−グリコシル化部位に、所望のグリカン占有率を有する免疫グロブリン（とりわけＩｇＧ）などの組換え糖タンパク質を提供することは、別の一つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これらの目的は、以下によって達成される。
【０００９】
（１）植物、植物の細胞又は植物細胞で組換え糖タンパク質を産生するプロセスであって、ポリペプチドをコードする核酸を前記植物、植物の細胞又は植物細胞で発現させるステップを含み、前記ポリペプチドは、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位を有し、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、
（ａ）＋３位のアミノ酸残基が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔから選択されるか、又は
（ｂ）−１位のアミノ酸残基が、Ｇｌｕ及びＡｓｐから選択され、
その結果、前記組換え糖タンパク質を産生することができる、上記プロセス。
【００１０】
（２）コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位を有するＩｇＧ重鎖定常セグメントのＣＨ２を含むポリペプチドをコードする核酸を、前記植物、植物の細胞又は植物細胞で発現させるステップを含み、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、
（ａ）＋３位のアミノ酸残基が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔから選択されるか、又は
（ｂ）−１位のアミノ酸残基が、Ｇｌｕ及びＡｓｐから選択される、
項目１に記載のプロセス。
【００１１】
（３）植物の細胞で、前記発現されたポリペプチドが、前記Ｎ−グリコシル化部位で翻訳後修飾によってＮ−グリコシル化されて、組換え糖タンパク質を形成する、項目１又は２に記載のプロセス。
【００１２】
（４）植物の生来のグリコシル化機構によって、前記Ｎ−グリコシル化部位でＮ−グリコシル化が実施されて、植物型Ｎ−グリカンを当該Ｎ−グリコシル化部位に付加するか、又は、ヒト型若しくはヒト化されたＮ−グリカンをＮ−グリコシル化で産生するなどのために遺伝子操作されたＮ−グリコシル化機構を、植物又は植物細胞が有する、項目３に記載のプロセス。
【００１３】
（５）前記核酸によってコードされた前記ポリペプチドが、ＩｇＧ重鎖定常領域を含み、好ましくは、前記ポリペプチドが、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖であるかそれを含む、項目１から４までのいずれか一項に記載のプロセス。
【００１４】
（６）前記核酸配列によってコードされる前記ポリペプチドが、項目１に規定された＋３位又は−１位のアミノ酸残基を除いてヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖である、項目１から５までのいずれか一項に記載のプロセス。
【００１５】
（７）前記植物又は前記植物細胞から前記組換え糖タンパク質を単離及び／又は精製するステップをさらに含む、項目１から６までのいずれか一項に記載のプロセス。
【００１６】
（８）植物又は植物細胞での発現後、ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位のグリコシル化占有率を調節するプロセスであって、前記ポリペプチドは、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを有する前記Ｎ−グリコシル化部位を有するＩｇＧ重鎖定常セグメントのＣＨ２を含み、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、
前記ポリペプチドをコードする核酸配列で、前記Ｎ−グリコシル化部位の０位のＡｓｎ残基から数えて＋３位のＴｙｒ又はＰｈｅ残基をコードするコドンを、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換するステップと、
先のステップで前記植物又は植物細胞に作製した置換を有する核酸配列を発現させるステップと
を含む、上記プロセス。
【００１７】
（９）植物又は植物細胞での発現後、ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位のグリコシル化占有率を調節するプロセスであって、前記ポリペプチドは、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを有する前記Ｎ−グリコシル化部位を有するＩｇＧ重鎖定常セグメントのＣＨ２を含み、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、
前記ポリペプチドをコードする核酸配列で、前記Ｎ−グリコシル化部位の０位のＡｓｎ残基から数えて−１位のＴｙｒ又はＰｈｅ残基をコードするコドンを、Ｇｌｕ及びＡｓｐから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換するステップと、
先のステップで前記植物又は植物細胞に作製した置換を有する核酸配列を発現させるステップと
を含む、上記プロセス。
【００１８】
（１０）前記植物が、高等植物、好ましくは双子葉植物、さらに好ましくはナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａ）植物、さらに好ましくはタバコ科（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）植物、最も好ましくはベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）であり、前記植物細胞が、高等植物、好ましくは双子葉植物、さらに好ましくはナス科植物、さらに好ましくはタバコ科植物、最も好ましくはベンサミアナタバコ由来の細胞である、項目１から９までのいずれか一項に記載のプロセス。
【００１９】
（１１）前記植物、植物細胞又は植物の細胞で、異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第２の核酸配列を共発現させるステップをさらに含む、項目１から１０までのいずれか一項に記載のプロセス。
【００２０】
（１２）異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼが、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）のＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質又はそれらの組合せである、項目１１に記載の方法。
【００２１】
（１３）ポリペプチドをコードする前記核酸配列と前記第２の核酸配列が、好ましくはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が媒介するトランスフェクションによって、どちらも植物内で一過的に発現される、項目１１又は１２に記載のプロセス。
【００２２】
（１４）Ｎ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする、目的のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第１のＤＮＡ分子を含有する第１のアグロバクテリウムを用いて、前記植物を共トランスフェクトするステップと、異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第２のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第２のＤＮＡ分子を含有する第２のアグロバクテリウムを用いて、前記植物をトランスフェクトするステップと、第１及び第２のＤＮＡ配列を発現させて、前記糖タンパク質として前記ポリペプチドのグリコシル化形態を産生するステップとによって、ポリペプチドをコードする前記核酸配列と前記第２の核酸配列とを植物で発現させる、項目１１から１３までのいずれか一項に記載のプロセス。
【００２３】
（１５）糖タンパク質が、２つの異なるポリペプチド鎖（ヘテロ二量体又はヘテロ多量体の糖タンパク質）を含み、前記プロセスが、第１のサブユニットのポリペプチドをコードする目的の核酸配列を発現させるステップであって、前記ポリペプチドは、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位を有し、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、＋３位又は−１位のアミノ酸残基が先に規定された通りでありうるステップと、組換え糖タンパク質の別のサブユニットの別のポリペプチドをコードする核酸配列を発現させるステップとを含む、項目１から１４までのいずれか一項に記載のプロセス。
【００２４】
（１６）植物、植物の細胞又は植物細胞で、組換えタンパク質を産生するプロセスであって、前記植物、植物の細胞又は植物細胞で、Ｎ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする核酸配列を発現させるステップと、異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を共発現させるステップとを含む、上記プロセス。
【００２５】
（１７）植物で組換えタンパク質を産生するプロセスであって、Ｎ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする、目的のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第１のＤＮＡ分子を含有する第１のアグロバクテリウムを用いて、前記植物をトランスフェクトするステップと、異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第２のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第２のＤＮＡ分子を含有する第２のアグロバクテリウムを用いて、前記植物をトランスフェクトするステップとを含み、第１及び第２のＤＮＡ配列を発現させて、前記糖タンパク質として前記ポリペプチドのグリコシル化形態を産生する、上記プロセス。
【００２６】
（１８）単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼが、リーシュマニアのＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質又はそれらの組合せである、項目１６又は１７に記載のプロセス。
【００２７】
（１９）コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのグリコシル化されたＮ−グリコシル化部位を有するＩｇＧ重鎖定常セグメントのＣＨ２を含むポリペプチドを含む組換え糖タンパク質であって、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、
（ａ）＋３位のアミノ酸残基が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔから選択されるか、又は
（ｂ）−１位のアミノ酸残基が、Ｇｌｕ及びＡｓｐから選択される、
上記組換え糖タンパク質。
【００２８】
（２０）前記組換え糖タンパク質が、植物又は植物細胞で発現された糖タンパク質である、項目１９に記載の組換え糖タンパク質。
【００２９】
（２１）項目（ａ）の前記組換え糖タンパク質が、少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の前記Ｎ−グリコシル化部位でのグリコシル化占有率を有し、項目（ｂ）の前記糖タンパク質が、多くとも６５％、好ましくは多くとも５５％の前記Ｎ−グリコシル化部位でのグリコシル化占有率を有する、項目１９又は２０に記載の組換え糖タンパク質。
【００３０】
（２２）前記ポリペプチドが、ＩｇＧ重鎖定常領域を含み、好ましくは前記ポリペプチドが、可変領域及び定常領域を含むＩｇＧ重鎖を含む、項目１９から２１までのいずれか一項に記載の組換え糖タンパク質。
【００３１】
（２３）前記ポリペプチドが、項目１に規定された＋３位又は−１位のアミノ酸残基を除いてヒトＩｇＧ重鎖である、項目１９から２２までのいずれか一項に記載の組換え糖タンパク質。
【００３２】
（２４）前記ポリペプチドが、Ｇ１型、Ｇ２型、Ｇ３型及びＧ４型のいずれか１つのヒトＩｇＧ重鎖をコードする、項目２２又は２３に記載の組換え糖タンパク質。
【００３３】
（２５）前記ポリペプチドが、
（ｉ）項目１に規定された＋３位及び−１位のアミノ酸残基を除いた配列番号１のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％であり、且つ項目１に規定された＋３位及び−１位のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列に、１アミノ酸から１０アミノ酸、好ましくは１アミノ酸から５アミノ酸の置換、添加及び／又は欠失があるが、項目１に規定された＋３位及び−１位のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列
を含む重鎖領域を含む、項目１９から２４までのいずれか一項に記載の組換え糖タンパク質。
【００３４】
（２６）ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ断片である、項目１９から２５までのいずれか一項に記載の組換え糖タンパク質。
【００３５】
（２７）ＣＤ２０又はＨｅｒ２／Ｎｅｕとの親和性がある可変ドメインを有するＩｇＧ抗体である、項目１９に記載の組換え糖タンパク質。
【００３６】
（２８）項目１９から２７までのいずれか一項に規定された組換え糖タンパク質及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【００３７】
（２９）Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ陽性がんの治療などの治療に使用するための、項目１９から２７までのいずれか一項に記載の組換え糖タンパク質。
【００３８】
（３０）項目２７に規定された有効量の前記組換え糖タンパク質を前記患者に投与するステップを含む、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ陽性がんに罹患している患者を治療する方法。
【００３９】
（３１）コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒのＮ−グリコシル化部位を有するＩｇＧ重鎖定常セグメントのＣＨ２を含むポリペプチドをコードする核酸であって、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、
（ａ）＋３位のアミノ酸残基が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔから選択されるか、又は
（ｂ）−１位のアミノ酸残基が、Ｇｌｕ及びＡｓｐから選択される、
上記核酸。
【００４０】
（３２）項目１に規定された＋３位及び−１位のアミノ酸残基を除いてヒトＩｇＧ重鎖定常領域をコードする、項目３１の単離された核酸。
【００４１】
（３３）植物で活性があるプロモーターと、それに動作可能に連結された項目３１又は３２に記載の核酸とを含む、核酸構築物。
【００４２】
（３４）項目３３の核酸構築物を含むベクター。
【００４３】
（３５）項目３３の核酸構築物又は項目３４のベクターを含む植物又は植物細胞。
【００４４】
（３６）異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列をさらに含む、項目３５に記載の植物又は植物細胞。
【００４５】
（３７）異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む、植物又は植物細胞。
【００４６】
（３８）Ｎ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする、目的のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第１のＤＮＡ分子を含有する第１のアグロバクテリウムと、異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第２のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第２のＤＮＡ分子を含有する第２のアグロバクテリウムとを含有する、アグロバクテリウム混合物。
【００４７】
（３９）ＩｇＧ重鎖であるポリペプチドを含む組換え糖タンパク質であって、前記ポリペプチドは、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのグリコシル化されたＮ−グリコシル化部位を有するＩｇＧ重鎖定常セグメントのＣＨ２を含み、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、
（ａ）＋３位のアミノ酸残基が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔから選択されるか、又は
（ｂ）−１位のアミノ酸残基が、Ｇｌｕ及びＡｓｐから選択される、
上記組換え糖タンパク質。
【００４８】
（４０）植物又は植物細胞で組換え糖タンパク質を産生するプロセスであって、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位を有するＩｇＧ重鎖定常セグメントのＣＨ２を含むポリペプチドをコードする核酸配列を、前記植物又は植物細胞で発現させるステップを含み、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、
（ａ）＋３位のアミノ酸残基が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔから選択されるか、又は
（ｂ）−１位のアミノ酸残基が、Ｇｌｕ及びＡｓｐから選択される、
上記プロセス。
【００４９】
（４１）コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのグリコシル化されたＮ−グリコシル化部位を有するＩｇＧ重鎖定常セグメントのＣＨ２を含む、ポリペプチドを含む組換え糖タンパク質であって、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、
（ａ）＋３位のアミノ酸残基が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔから選択されるか、又は
（ｂ）−１位のアミノ酸残基が、Ｇｌｕ及びＡｓｐから選択される、
上記組換え糖タンパク質。
【００５０】
（４２）植物、植物の細胞又は植物細胞で組換え糖タンパク質を産生するプロセスであって、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする核酸を変異させるステップを含み、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、＋３位及び／又は−１位のアミノ酸残基が、下記の項目（ａ）又は（ｂ）
（ａ）＋３位のアミノ酸残基が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔから選択され、その結果Ｔｈｒが好適であること、又は
（ｂ）−１位のアミノ酸残基が、Ｇｌｕ及びＡｓｐから選択されること
に規定された通りであり、また、前記植物、前記植物の細胞又は前記植物細胞で、得られた（変異した）核酸を発現するステップと、それによって前記組換え糖タンパク質を産生するステップとを含む上記プロセス
【００５１】
植物で発現される哺乳類動物のタンパク質は、時として、Ｎ−グリコシル化部位でのグリコシル化占有率が、動物発現系での発現によって得られるよりも低い。本発明者らは、驚くべきことに、Ａｓｎ残基を０位に割り当てた場合の、従来のコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基から数えて−１位又は＋３位のアミノ酸残基を適切に選択することによって、植物で発現されたタンパク質のＮ−グリコシル化部位でのグリカン占有率を改変することができることを見出している。好ましくは、以下のアミノ酸残基：Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔを＋３位に配置することによって、植物で発現されるとすぐに、Ｎ−グリコシル化部位に、高い又は増加したグリコシル化占有率を達成することができる。以下のアミノ酸残基：Ｇｌｕ及びＡｓｐを−１位に配置することによって、植物での発現後、Ｎ−グリコシル化部位に、低い又は減少したグリコシル化占有率を達成することができる。このように、本発明は、植物で発現されるとすぐに、Ｎ−グリコシル化部位又はタンパク質でのグリコシル化占有率を改変することを可能にする。また、本発明は、植物又は植物細胞で、Ｎ−グリコシル化部位に所望のグリコシル化占有率を有する組換え糖タンパク質を産生することを可能にする。本発明はまた、１つ又は複数のコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位に、上記に示したアミノ酸置換を有する、組換え糖タンパク質を提供する。
【００５２】
本発明者らは、植物又は植物細胞で発現された糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位でのグリコシル化占有率を、該植物又は植物細胞で異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼを共発現させることによって、増加させることができることをさらに見出している。この実施形態を、先に規定された又はそれとは独立している＋３位及び−１位のアミノ酸交換と組み合わせて、採用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域の配列（配列番号１）である。ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスに従って、位置が付番されている［Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＤＨＨＳ、ワシントンＤＣ）、第５版］。Ｎは、グリコシル化部位である（太字及び下線で示す）。３００位のアミノ酸残基Ａｓｎは、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位であり、そのグリコシル化占有率は、本発明にて調節される。実施例で作製及び記載されているアミノ酸置換に用いるアミノ酸の位置を、イタリック及び太字で示す。示された付番の３００位は、Ｎ−グリコシル化部位でグリコシル化占有率を増加させるために本発明で使用される、アミノ酸配列位置＋３である。示された付番の２９６位は、Ｎ−グリコシル化部位でグリコシル化占有率を低下させるために本発明で使用される、アミノ酸配列位置−１である。
【図１Ｂ】大型リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）のＳＴＴ３−Ｄ遺伝子（ＬｍＪＦ３５．１１６０、受入番号Ｅ９ＡＥＴ９）のクローニングされたＨｉｓタグバージョンのアミノ酸配列（配列番号２）である。追加されたアミノ酸残基を下線で表す。
【図２Ａ】グリコシル化が改変された定常領域を有するＩｇＧ重鎖を産生するのに用いる、リツキシマブ及びトラスツズマブのアミノ酸配列をコードする核酸モジュールのクローニングスキームである。ＢｓａＩなどのＩＩＳ型の制限酵素を、核酸配列モジュールを継ぎ目なく組立てるために使用した。
【図２Ｂ】Ｃ末端Ｈｉｓタグを付した大型リーシュマニアのＳＴＴ３−Ｄ（ＬｍＪＦ３５．１１６０、受入番号Ｅ９ＡＥＴ９）のトウモロコシコドン最適化バージョンのクローニングスキームである。ＢｓａＩなどのＩＩＳ型の制限酵素を、核酸配列モジュールを継ぎ目なく組立てるために使用した。
【図２Ｃ】大型リーシュマニアのＳＴＴ３−Ｄ（ＬｍＪＦ３５．１１６０、受入番号Ｅ９ＡＥＴ９）のアミノ酸配列である配列番号２１である。
【図２Ｄ】大型リーシュマニアのＳＴＴ３−ＤのクローニングされたＨｉｓタグバージョンのアミノ酸配列である配列番号２２である。
【図３】植物ウイルスＴＭＶ及びＰＶＸに基づくバイナリーウイルスクローニングベクター［ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）系］の概略図である。左右の境界によって画定されたＴ−ＤＮＡは、植物で活性があるプロモーター（Ａｃｔ２プロモーター）、イントロンを含むウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのコード配列、イントロンを含むウイルス移動タンパク質のコード配列、ｌａｃＺαを含有するＢｓａＩクローニング部位及びＮｏｓターミネーターを含有する。
【図４】組換えトラスツズマブの可変領域（配列番号５）及び汎用の軽鎖カッパ定常領域（配列番号６）のアミノ酸配列、並びにそれらをコードする核酸配列（それぞれ配列番号３及び配列番号４）である。
【図５】組換えトラスツズマブＩｇＧ１の可変領域（配列番号８）及び重鎖定常領域（配列番号１０）のアミノ酸配列、並びにそれらをコードする核酸配列（それぞれ配列番号７及び配列番号９）である。
【図６】組換えリツキシマブの可変領域（配列番号１２）及び汎用の軽鎖カッパ定常領域（配列番号１４）のアミノ酸配列、並びにそれらをコードする核酸配列（それぞれ配列番号１１及び配列番号１３）である。
【図７】組換えリツキシマブＩｇＧ１の可変領域（配列番号１６）及び重鎖定常領域（配列番号１８）のアミノ酸配列、並びにそれらをコードする核酸配列（それぞれ配列番号１５及び配列番号１７）である。
【図８】リツキシマブの還元条件でのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）分析の電気泳動図である。ＨＣは重鎖であり、ＬＣは軽鎖であり、ＭａｂＴｈｅｒａは市販のリツキシマブである。ＨＣの非グリコシル化バリアント及びグリコシル化バリアントのモル百分率を、各電気泳動図の上部に示す。
【図９】植物産生リツキシマブ及びその変異バリアントの還元条件でのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）分析の電気泳動図である。ＨＣは重鎖であり、ＬＣは軽鎖であり、Ｙ３００Ｔは、重鎖定常領域のＮ−グリコシル部位から＋３位に対応する重鎖の３００位で、ＹをＴにアミノ酸置換されているリツキシマブである。Ｙ３００Ｇは、重鎖の３００位で、ＹをＧにアミノ酸置換されているリツキシマブである。ＨＣの非グリコシル化バリアント及びグリコシル化バリアントのおおよそのモル百分率を、各電気泳動図の対応するピークの上部に示す。
【図１０】市販のハーセプチン、植物産生トラスツズマブ及びその変異バリアントの還元条件でのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）分析の電気泳動図である。ＨＣは重鎖であり、ＬＣは軽鎖であり、Ｙ３００Ｔは、重鎖の３００位で、ＹをＴにアミノ酸置換されているトラスツズマブである。ＨＣの非グリコシル化バリアント及びグリコシル化バリアントの百分率を、各電気泳動図の対応するピークの上部に示す。
【図１１】市販のハーセプチン、植物産生トラスツズマブ及び変異バリアントの還元条件でのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）分析の電気泳動図である。ＨＣは重鎖であり、ＬＣは軽鎖であり、Ｙ２９６Ｅは、重鎖の２９６位で、ＹをＥにアミノ酸置換されているトラスツズマブである。ＨＣの非グリコシル化バリアント及びグリコシル化バリアントの百分率を、各電気泳動図の対応するピークの上部に示す。
【図１２Ａ】ＭａｂＴｈｅｒａ（市販のリツキシマブ）、植物産生リツキシマブ及びその変異バリアントの還元条件でのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）分析の電気泳動図である。ＨＣは重鎖であり、ＬＣは軽鎖であり、Ｙ２９６Ｅは、重鎖の２９６位で、ＹをＥにアミノ酸置換されているリツキシマブである。ＨＣの非グリコシル化バリアント及びグリコシル化バリアントの百分率を、各電気泳動図の対応するピークの上部に示す。
【図１２Ｂ】抗ＣＤ２０マウスｍＩｇＧ２ａのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）分析の電気泳動図である。ＨＣは重鎖であり、ＬＣは軽鎖である。
【図１２Ｃ】ＬｍＳＴＴ３−Ｄ遺伝子を共発現させた場合とさせなかった場合の、植物産生リツキシマブ及び植物産生トラスツズマブのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）分析の電気泳動図である。ＨＣは重鎖であり、ＬＣは軽鎖である。ＨＣの非グリコシル化バリアント及びグリコシル化バリアントの百分率を、各電気泳動図の対応するピークの上部に示す。
【図１３Ａ】各種ヒトＩｇＧサブクラスのＣＨ２領域のアラインメント図である。Ｎ−グリコシル化部位を含有する配列セグメントを四角に囲んでいる。Ｎ−グリコシル化部位Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを灰色の背景によって示す。ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスに従って、アミノ酸残基の位置が付番されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＤＨＨＳ、ワシントンＤＣ、第５版）。ＩｇＨＧ１＊０１の先頭列は、配列番号１９である。末尾列は、マウスＩｇＧ２サブクラスの対立遺伝子ＡのＣＨ２領域を示す。
【図１３Ｂ】各種ＩｇＧサブクラスの重鎖定常領域のアラインメント図である。ＩｇＨＧ＊０１の先頭列は、配列番号２０である。
【図１４Ａ】大型リーシュマニアのオリゴサッカリルトランスフェラーゼＬｍＳＴＴ３−Ｄを共発現させた場合とさせなかった場合の、植物産生リツキシマブ及び植物産生トラスツズマブの還元条件でのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）分析の電気泳動図である。ＨＣは重鎖であり、ＬＣは軽鎖である。ＨＣの非グリコシル化バリアント及びグリコシル化バリアントの百分率を、各電気泳動図の対応するピークの上部に示す。
【図１４Ｂ】大型リーシュマニアのオリゴサッカリルトランスフェラーゼＬｍＳＴＴ３−Ｄを共発現させた場合とさせなかった場合の、植物産生パリビズマブ及び植物産生抗エボラｍＡｂの還元条件でのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）分析の電気泳動図である。ＨＣは重鎖であり、ＬＣは軽鎖である。ＨＣの非グリコシル化バリアント及びグリコシル化バリアントの百分率を、各電気泳動図の対応するピークの上部に示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明のプロセスは、植物又は植物細胞での発現によって、組換え糖タンパク質を産生することを可能にする。しかし、本発明の組換え糖タンパク質は、植物又は植物細胞での発現に限定されない。一般に、様々な産生宿主（細菌、真菌、動物、昆虫及び植物細胞）と、安定なトランスジェニック発現又は一過性発現のどちらかに用いるために設計された発現ベクターとに基づいて、組換え糖タンパク質を産生するために、多くの様々な発現系を使用することができる。そのような系は、一般に当業者に公知であり、文献に記載されている［概観のために以下を参照されたい：Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｊ．、Ｌｉｎ，Ｈ．及びＹａｎｇ，Ｘ．、２０１２、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３９：３８３〜３９９；Ｈｏｕ，Ｊ．、Ｔｙｏ，Ｋ．Ｅ．、Ｌｉｕ，Ｚ．ら、２０１２、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．、１２：４９１〜５１０；Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．Ｌ．、Ｌｉｕ，Ｌ．、Ｐｅｔｒａｎｏｖｉｃ，Ｄ．ら、２０１２、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４月１２日、（印刷に先駆けた電子公開）；Ｓｕ，Ｘ．、Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｇ．、Ｚｈａｎｇ，Ｍ．ら、２０１２、Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、８１：１〜６１；Ｇｈａｄｅｒｉ，Ｄ．、Ｚｈａｎｇ，Ｍ．、Ｈｕｒｔａｄｏ−Ｚｉｏｌａ，Ｎ．及びＶａｒｋｉ，Ａ．、２０１２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、２８：１４７〜１７５；Ｅｇｅｌｋｒｏｕｔ，Ｅ．、Ｒａｊａｎ，Ｖ．及びＨｏｗａｒｄ，Ｊ．Ａ．、２０１２、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、１８４：８３〜１０１］。発現系の選択は、タンパク質を産生するための材料のコストや所望のスピード及び規模など、種々の要因に依存する。
【００５５】
一実施形態では、組換え糖タンパク質は、本発明の産生プロセス又は改変プロセスに従って植物又は植物細胞で産生される。植物発現系の中でも、植物ウイルスに基づく一過性発現系は、モノクローナル抗体のようなヘテロ多量体のタンパク質を含めた様々な種類の組換えタンパク質の産生に関して、スピード又は産生、収量及び汎用性の点で有利である。植物発現系の別の利点は、発現ベクターから植物ウイルス被覆タンパク質又は融合タンパク質を発現させることによって、植物ウイルス粒子の産生を付与することができることである（Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．ら、２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：１７６７８〜１７６８３；ＷＯ２００７／０３１３３９）。本発明に適した植物発現系は、数多くの研究論文、総説及び特許文書に記載されている（例えば、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、Ｔｈｏｅｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．、Ｋａｎｄｚｉａ，Ｒ．ら、２００５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：７１８〜７２３；Ｇｉｒｉｔｃｈ，Ａ．、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．ら、２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：１４７０１〜１４７０６；Ｇｌｅｂａ，Ｙ．、Ｋｌｉｍｙｕｋ，Ｖ．及びＭａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、２００７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：１３４〜１４１；Ｋｌｉｍｙｕｋ，Ｖ．、Ｐｏｇｕｅ，Ｇ．、Ｈｅｒｚ，Ｓ．ら２０１２、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４月１５日；ＷＯ２００５／０４９８３９；ＷＯ２００６／０７９５４６）。ＷＯ２００５／０４９８３９には、想定しうる植物ウイルス発現ベクターの詳細な情報が、その配列情報を含めて収載されている。免疫グロブリンを含めた組換えタンパク質のウイルスベクター設計、クローニング戦略及び発現は、ＷＯ００２００６／０７９５４６及び本明細書にて実施例１に詳細に記載されている。
【００５６】
発現させるポリペプチドをコードする核酸配列のクローニングは、当業者の一般知識の一部である。特に便利なクローニング戦略は、異なるＤＮＡ断片を継ぎ目なく綴じ合わせるためのモジュール式のクローニングであり、このクローニングは、本発明者らの研究室で確立された（Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．、Ｋａｎｄｚｉａ，Ｒ．及びＭａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、２００８、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、３：ｅ３６４７；Ｗｅｂｅｒ  Ｅ．、Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．、Ｇｕｅｔｚｎｅｒ，Ｒ．ら、２０１１、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６：ｅ１６７６５；Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．及びＭａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、２０１１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、７２９：１６７〜８１；Ｔｈｉｅｍｅ，Ｆ．、Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．、Ｋａｎｄｚｉａ，Ｒ．ら、２０１１、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６：ｅ２０５５６）。この系は、簡素であり、信頼性があり、使用するのに便利であり、任意の複雑な構築物を迅速に操作することを可能にする。リツキシマブ及びトラスツズマブに用いるＩｇＧ重鎖をコードする核酸配列を含む構築物をＴ−ＤＮＡに含むバイナリーベクターを、４つの遺伝子モジュール及び１つのウイルスベクターから継ぎ目なく組立てる全体的なスキームを、図２Ａに示す。重鎖モジュールの継ぎ目のない組み立ては、ＩＩＳ型制限酵素によって達せられる。今回の場合、ＢｓａＩを使用した。発現させるポリペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドを用いて、該ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端にシグナルペプチドをコードするコード配列を配置することによって、提供されうる。以降の実施例では、この戦略を使用して、目的のＩｇＧの重鎖及び様々なＦｃ変異バリアントを組み立て、適切なウイルスベクターへクローニングした。抗体を発現させるために、重鎖（ＨＣ）をコードする核酸配列を、ＴＭＶに基づくベクターにクローニングし、軽鎖（ＬＣ）をコードする核酸配列を、ＰＶＸに基づくベクターにクローニングしてもよい（図３を参照）。以降の実施例では、アグロバクテリウムを使用して植物細胞内に形質転換することが可能なバイナリーベクターを使用した。また、別の形質転換方法も使用されうる。最終的な発現ベクターを、植物で発現させるために試験してもよい。
【００５７】
植物又は植物細胞での本発明のポリペプチドをコードする核酸配列（ポリヌクレオチド）の発現は、一般に、核酸配列を含有する核酸構築物を含む核酸分子（本明細書ではベクターともよぶ）を用いて、該植物又は植物細胞を形質転換するステップを含む。グリコシル化されるＮ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする核酸配列はまた、本明細書では「目的の核酸配列」ともよぶ。それぞれがＮ−グリコシル化部位を有する２つ以上の異なるポリペプチドを発現させる場合、例えば、ヘテロ二量体又はヘテロ多量体の糖タンパク質を産生するために発現させる場合には、目的の２つ以上の異なる核酸配列がある。
【００５８】
核酸分子は、一般にＤＮＡ分子である。今回の場合、その中に含有されている目的の核酸配列は、ＤＮＡである。ＤＮＡ分子の一例は、アグロバクテリウムが媒介する形質転換によって植物細胞内に形質転換されうるバイナリーベクターである。核酸分子の別の一例は、粒子衝撃によって形質転換されるＤＮＡベクターである。
【００５９】
組換え糖タンパク質のポリペプチドは、安定に形質転換されたトランスジェニック植物又はその細胞で、本発明のプロセスの際に発現されてもよい。植物細胞の場合の「安定に形質転換された」とは、娘細胞に転移するように、目的の核酸配列（単数又は複数）を染色体ＤＮＡ内に組み入れることを意味する。（全）植物の場合の「安定に形質転換された」とは、子孫植物に受け継ぐことができるように、植物の体細胞全てが染色体ＤＮＡ内に組み入れられた目的の核酸配列（単数又は複数）を含有することを意味する。しかし、好ましくは、組換え糖タンパク質は、一過的に形質転換された植物から、一過的発現によって発現される。「一過的」という用語は、核酸分子（ベクター）又は核酸構築物を用いて、例えば、選抜可能な薬剤と、該選抜可能な薬剤を解毒することのできる選抜可能なマーカー遺伝子とを使用して、非トランスフェクト細胞又は植物から、トランスフェクトされた細胞又は植物を選抜するための、選抜方法を使用しないことを意味する。その結果、トランスフェクトされた核酸は、一般に、植物染色体ＤＮＡ内へ安定に導入されない。一過性発現法は、まさにトランスフェクトされた植物細胞でのトランスフェクションの効果を利用する。一過性発現は、上述の通り、なかんずく迅速な発現のために好適である。さらに、植物細胞又は植物を選抜するための選抜可能なマーカー遺伝子の必要性はなく、それゆえ、抗生物質耐性遺伝子又は除草剤耐性遺伝子を植物内へ挿入する必要はないことから、これらの植物がおかれる環境では、そのような遺伝子の拡散を避けることができる。アグロバクテリウムが媒介するトランスフェクションによる植物の一過性トランスフェクションの場合に、バイナリーベクター又はＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡは、好ましくは選抜マーカー遺伝子を持たず、その結果、そのようなマーカー遺伝子は植物細胞内へ挿入されない。
【００６０】
一過性発現のために、植物又は植物細胞へＤＮＡ分子などの核酸分子を導入するための種々の方法が公知である。本発明では、核酸分子（ベクター）又は核酸構築物を用いて、植物をトランスフェクトするために、例えばアグロ浸潤などによって、アグロバクテリウムを好ましくは使用する。アグロバクテリウムを使用して植物に大規模に浸潤させるための系及び方法は、ＷＯ２００９／０９５１８３に記載されている。別の実施形態では、植物又は植物の一部に、アグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液を用いて噴霧するが、この方法は、圃場の植物など多数の植物への大規模な施用に非常に適している。そのような噴霧トランスフェクションのプロセスは、なかんずくＷＯ２０１２／０１９６６０に記載されている。
【００６１】
アグロバクテリウム株は、植物の形質転換及びトランスフェクションのために通常使用されて、当業者に一般知識から公知である、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の種に属する。本発明のプロセスで使用されるアグロバクテリウム株は、前記核酸分子としてＤＮＡ分子（Ｔｉプラスミド）を含み、本核酸分子は、目的のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含む。目的のＤＮＡ配列は、本発明のポリペプチド又は発現される１つ以上のポリペプチドをコードしていてもよい。核酸構築物は、アグロバクテリウム株の分泌系によって植物細胞内へ核酸構築物を導入するために、典型的には、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに存在する。少なくとも１つの側又は両側で、核酸構築物は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列に隣接しており、前記植物（単数又は複数）のトランスフェクションと、前記核酸構築物の前記植物の細胞への導入を可能にする。好ましくは、前記核酸構築物は、Ｔ−ＤＮＡに存在し、両側にＴ−ＤＮＡ境界配列が隣接する。
【００６２】
好ましくは、核酸構築物は、アグロバクテリウム株のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに存在する。Ｔｉプラスミドは、細菌のクローニング及び遺伝子操作を可能にするために、前記Ｔ−ＤＮＡの外部に選抜マーカーを含有していてもよい。しかし、前記植物の細胞内へ転移されるＴ−ＤＮＡは、存在する場合、前記Ｔ−ＤＮＡを含有する植物又は植物細胞の選抜を可能にする選抜マーカーを好ましくは含まない。本実施形態で、ＤＮＡ分子（Ｔｉプラスミド）のＴ−ＤＮＡに存在するべきではない選抜マーカー遺伝子の例は、抗生物質耐性遺伝子又は除草剤耐性遺伝子である。本発明のプロセスが一過性トランスフェクション及び目的の（又は前記ポリペプチドの）前記核酸配列の発現を使用する場合、そのプロセスは、そのような抗生物質耐性遺伝子又は除草剤耐性遺伝子を使用することによって、本発明の核酸分子を組み入れられている植物細胞を選抜するステップを含まない。したがって、抗生物質耐性遺伝子又は除草剤耐性遺伝子を前記植物に組み入れる必要はなく、それによって、本発明のプロセスでは、そのような遺伝子が環境に拡散する可能性が低い。
【００６３】
先に示したように、本発明の糖タンパク質として、抗体などのヘテロ多量体タンパク質を発現させるために、全てのサブユニット（ポリペプチド鎖）を、植物又は植物細胞の同じ細胞で、好ましくは一過的に、発現させてもよい。これを、各サブユニット又はポリペプチドのためのアグロバクテリウムの混合物を用いて、植物又は植物細胞を共トランスフェクトすることによって行う。そのため、本発明は、ＩｇＧ抗体などの２種以上の（好ましくは２種の）異なるポリペプチド鎖を含む組換え糖タンパク質を、植物で産生するプロセスを提供し、本プロセスは、糖タンパク質の第１のサブユニットのポリペプチドをコードする、目的のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含むＤＮＡ分子を含有するアグロバクテリウムを用いて、植物をトランスフェクトするステップであって、前記ポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化部位（先に規定されたように、本明細書に規定されたような＋３位及び−１位のアミノ酸残基を伴う）を有する、ステップと、糖タンパク質の別のサブユニットのポリペプチドをコードする（別の）ＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含む（別の）Ｔ−ＤＮＡを含む（別の）ＤＮＡ分子を含有するアグロバクテリウムを用いて、前記植物をトランスフェクトするステップと、該ＤＮＡ配列を発現して糖タンパク質を産生するステップとを含む。別のサブユニットのポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化部位を含有していてもしていなくともよい。該ポリペプチドがＮ−グリコシル化部位を有する場合、本明細書に規定された＋３位及び−１位のアミノ酸残基を有していてもいなくともよい。好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位を有する別のサブユニットのポリペプチドはまた、全てのＮ−グリコシル化部位で高いＮ−グリカン占有率を達成するために、本明細書に規定された＋３位及び−１位のアミノ酸残基を有する。
【００６４】
しかし、異なる植物又は植物細胞で別々に、ヘテロ多量体タンパク質の複数のサブユニットの複数のポリペプチドを発現させることも可能である。別々に発現したポリペプチドは、そのうち少なくとも１つは本発明のプロセスに従って産生されるが、別々に精製しｉｎ  ｖｉｔｒｏで再構成して、組換えヘテロ多量体タンパク質を形成してもよい。
【００６５】
核酸構築物は、植物細胞で発現することができるように、目的の核酸配列を含む。このために、前記核酸構築物で、目的の核酸配列は、植物細胞で活性があるプロモーターの制御下にある場合がある。目的の核酸配列の例は、ＤＮＡウイルスレプリコン若しくはＲＮＡウイルスレプリコン、又は発現させる遺伝子をコードするＤＮＡである。遺伝子は、植物で発現すると、ポリペプチドを産生する。ウイルスレプリコンもまた、植物（単数又は複数）の細胞で発現されるポリペプチドをコードしていてもよい。核酸構築物は、核酸配列に加えて、転写プロモーター及びターミネーターなど、目的の核酸配列を発現するための調節配列などの他の配列を含む。核酸配列は、追加的に、ポリペプチドのＮ末端シグナルペプチドとして発現されるシグナルペプチドをコードしていてもよい。核酸構築物は、さらに発現させる遺伝子を含んでいてもよく、例えば、Ｐ１９タンパク質などの遺伝子サイレンシングのサプレッサーをコードする遺伝子などがある。そのようなさらに含まれる遺伝子の発現は、本発明のタンパク質を発現するのに使用されるプロモーターと同じ又は異なるプロモーターの制御下にありうる。アグロバクテリウムが媒介する遺伝子転移とそのためのベクターは、当業者に公知であり、例えば、先に引用された参考文献、又はＳｌａｔｅｒ，  Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｆｏｗｌｅｒ，  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００８などの植物生物工学の教科書に因る。
【００６６】
本明細書で使用される場合の「植物細胞で活性があるプロモーター」とは、植物細胞で転写を制御する（開始する）ことができるＤＮＡ配列を意味する。これには、植物起源の任意のプロモーターが挙げられるが、植物細胞での転写を誘導することができる非植物起源のプロモーター、すなわちウイルス又は細菌由来のある特定のプロモーターも挙げられ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）［Ｈａｒｐｓｔｅｒら（１９８８）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．、２１２（１）：１８２〜９０］、ジモグリツメクサウイルスプロモーターＮｏ４若しくはＮｏ７（ＷＯ９６／０６９３２）又はＴ−ＤＮＡ遺伝子プロモーターのみではなく、以下に限定されないが、種子特異的プロモーター（例えばＷＯ８９／０３８８７）、器官原基特異的なプロモーター［Ａｎら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８（１）：１５〜３０］、茎特異的なプロモーター［Ｋｅｌｌｅｒら（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７（１２）：３６２５〜３６３３］、葉特異的なプロモーター［Ｈｕｄｓｐｅｔｈら（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１２：５７９〜５８９］、葉肉特異的なプロモーター（光誘導性Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターなど）、根特異的なプロモーター［Ｋｅｌｌｅｒら（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：１６３９〜１６４６］、塊茎特異的なプロモーター［Ｋｅｉｌら（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８（５）：１３２３〜１３３０］、維管束組織特異的なプロモーター［Ｐｅｌｅｍａｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８４：３５９〜３６９］、雄蕊選択的プロモーター（ＷＯ８９／１０３９６、ＷＯ  ９２／１３９５６）、裂開部特異的なプロモーター（ＷＯ９７／１３８６５）などの組織特異的若しくは器官特異的なプロモーターも挙げられる。一過性発現には、恒常的なプロモーターを好ましくは使用する。しかし、恒常的なプロモーターは、組織特異的又は器官特異的であってもよく、一実施形態では、組織特異的でも器官特異的でもない。好適なプロモーターは、以降に記載された実施例で使用されているものである。
【００６７】
タンパク質のグリコシル化は、真核細胞のＥＲ及び／又はゴルジ装置で起こる。新たに作製されたポリペプチドをこれらの区画に方向付けるために、グリコシル化されるＮ−グリコシル化部位を有したポリペプチドには、Ｎ末端に適切なシグナルペプチドを備え付けるべきである。ＥＲ及び／又はゴルジに方向付けるためにそのようなシグナルペプチドを使用することは、公知である。適切なシグナルペプチドが、植物でベータ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現させるために使用され、そのような発現は、以降に引用されたいくつかの刊行物に記載されている。
【００６８】
本明細書で「構築物」の用語は、目的のヌクレオチド配列を含む組換え構築物を意味する。好ましくは、該構築物は少なくとも、本発明による＋３位及び−１位のアミノ酸残基を具えるＮ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする。さらにポリペプチドをコードする他の核酸配列もまた、同じ又は別の構築物に含まれていてもよい。
【００６９】
ポリペプチドを強力に発現することが望ましい実施形態では、核酸構築物は、植物細胞で複製してウイルスベクターのレプリコンを形成するウイルスベクターをコードしていてもよい。複製されるために、ウイルスベクター及びレプリコンは、レプリコンから発現されるウイルスポリメラーゼなど、植物細胞に存在する核酸ポリメラーゼによって認識されうる複製起点を含有する。ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスベクターであってもよく、その理由は、ＲＮＡウイルスベクターが、ＲＮＡレプリコンを形成するためである。ＲＮＡウイルスベクターの場合、レプリコンは、植物細胞の核にＤＮＡ構築物が導入された後に、該ＤＮＡ構築物から、植物細胞で活性があるプロモーターの制御下での転写によって形成されてもよい。ＤＮＡレプリコンの場合、ＤＮＡレプリコンは、例えばＷＯ００／１７３６５及びＷＯ９９／２２００３に記載されているように、ＤＮＡ構築物のウイルスレプリコンをコードする配列に隣接する２つの組換え部位の間での組換えによって形成されてもよい。レプリコンが、ＤＮＡ構築物によってコードされる場合は、ＲＮＡレプリコンが好適である。ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスベクター（ＤＮＡ又はＲＮＡレプリコン）の使用は、何年にもわたって広く文献に記載されている。いくつかの例が、以下の特許刊行物：ＷＯ２００８／０２８６６１、ＷＯ２００７／１３７７８８、ＷＯ２００６／００３０１８、ＷＯ２００５／０７１０９０、ＷＯ２００５／０４９８３９、ＷＯ０２／０９７０８０、ＷＯ０２／０８８３６９、ＷＯ０２／０６８６６４である。ＤＮＡウイルスベクターの例は、ジェミニウイルスに基づくものである。本発明には、植物ＲＮＡウイルスに基づくウイルスベクター又はレプリコン、とりわけプラスセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスに基づくものが使用されうる。したがって、ウイルスレプリコンは、プラスセンスの一本鎖ＲＮＡレプリコンであってもよい。そのようなウイルスベクターの例が、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）及びポテックスウイルスＸ（ＰＶＸ）に基づくものである。「に基づく」とは、ウイルスベクターが、これらのウイルスの複製系を使用することを意味する。ポテックスウイルスに基づくウイルスベクター及び発現系は、ＥＰ２０６１８９０又はＷＯ２００８／０２８６６１に記載されている。多数の他の植物ウイルスレプリコンが、上述の特許刊行物に記載されている。
【００７０】
本発明で使用可能なアグロバクテリウム株は、植物をトランスフェクト又は形質転換するために、本技術分野で一般的に使用されているものである。一般に、バイナリーベクター系及びバイナリー株を用いる。すなわち、一方に植物細胞へＴ−ＤＮＡが転移するのに必要なｖｉｒ遺伝子と、他方にＴ−ＤＮＡとを、別々のプラスミド上に搭載する。使用することができるアグロバクテリウム株の例は、Ｈｅｌｌｅｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５（２０００）４４６〜４５１の論文に、バイナリーアグロバクテリウム株及びベクター系に関して供されている。バイナリーアグロバクテリウム株に関する文脈では、ｖｉｒ遺伝子を含有するプラスミドを、「ｖｉｒプラスミド」又は「ｖｉｒヘルパープラスミド」とよぶ。トランスフェクトされるＴ−ＤＮＡを含有するプラスミドは、本明細書で「ＤＮＡ分子」又は「ベクター」ともよばれる、いわゆるバイナリーベクターである。「株」又は「アグロバクテリウム株」の用語は、バイナリーベクター以外のアグロバクテリウムの構成要素に関する。そのため、本明細書では、バイナリーベクターを含有しないバイナリーアグロバクテリウム株とバイナリーベクターを導入した後のものとを、同じ株名でよぶ。
【００７１】
植物は、先に記載された核酸分子を含むアグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液、好ましくは水性懸濁液を、植物の一部に供することによって、一過的にトランスフェクトされうる。アグロバクテリウムの懸濁液は、以下のように産生されうる。核酸構築物を含有するＤＮＡ分子又はベクターを、アグロバクテリウム株へ形質転換してもよく、形質転換されたアグロバクテリウム培養物を、任意選択で、前記ＤＮＡ分子を維持するために、選択圧の適用下で増殖させてもよい。一方法では、使用するアグロバクテリウム株を、次いで培養培地に播種して、高い細胞密度になるまで増殖させる。大量の培養培地を得るために、さらに大規模な培養に、小容量の高密度の培養培地を播種してもよい。一般に、アグロバクテリウムは、６００ｎｍで少なくとも１のＯＤに、典型的には約１．５のＯＤに対応する細胞密度まで増殖させる。そのような高密度のアグロバクテリウム懸濁液を、次いで希釈して、トランスフェクションに用いる所望の細胞密度に達せしめる。高密度のアグロバクテリウム懸濁液を希釈するためには、水を使用する。水は、緩衝剤又は塩を含みうる。水は、ＷＯ２０１２／０１９６６０に記載されているような界面活性剤をさらに含みうる。
【００７２】
アグロバクテリウムに基づく一過性発現を使用した本発明の産生プロセスの好適な実施形態は、なかんずく以下の２つのプロセスである：
植物で組換え糖タンパク質を産生するプロセスであって、核酸配列を含有する核酸構築物を含む核酸分子を含むアグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液を用いて、植物又はその一部をトランスフェクトするステップを含み、前記核酸配列は、ポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位を有し、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、
（ａ）＋３位のアミノ酸残基が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔから選択される、又は
（ｂ）−１位のアミノ酸残基が、Ｇｌｕ及びＡｓｐから選択される、
上記プロセス、
植物で組換え糖タンパク質を産生するプロセスであって、核酸配列を含有する核酸構築物を含む核酸分子を含むアグロバクテリウム株の細胞を含有する水性懸濁液を、前記植物の一部に付与するステップを含み、前記核酸配列は、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位を有する、ＩｇＧ重鎖定常セグメントのＣＨ２を含むポリペプチドをコードし、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、
（ａ）＋３位のアミノ酸残基が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔから選択されるか、又は
（ｂ）−１位のアミノ酸残基が、Ｇｌｕ及びＡｓｐから選択される、
上記プロセス、
２つ以上の異なるポリペプチド鎖（サブユニット）を含む、ＩｇＧ抗体などの組換え糖タンパク質を植物で産生するプロセスであって、糖タンパク質の第１のサブユニットのポリペプチドをコードする、目的のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含むＤＮＡ分子を含有するアグロバクテリウムを用いて、前記植物をトランスフェクトするステップであって、前記ポリペプチドは、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位を有し、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基であり、ここで、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、＋３位又は−１位のアミノ酸残基が先に規定された通りである、ステップと、該糖タンパク質の別のサブユニットのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含むＤＮＡ分子を含有するアグロバクテリウムを用いて、前記植物をトランスフェクトするステップと、ＤＮＡ配列を発現して糖タンパク質を産生するステップとを含む、上記プロセス。
【００７３】
本発明のプロセスで発現させるポリペプチドは、一般に、本発明でその内部（又はその細胞内）で発現させる植物とは異種である。すなわち、当該植物又はその一部は、天然にはそのタンパク質を産生しない。ポリペプチド（単数又は複数）をコードする、目的の核酸配列のコドン使用を、植物、とりわけ当該ポリペプチドの発現のために採用された植物で発現させるために、最適化することは可能であり、望ましい。コドンの最適化は、植物で動物タンパク質などのタンパク質の発現収量を増加させるための標準的な方法である。植物又は特定の属若しくは種の植物で発現させるために、コドンを最適化された遺伝子及び核酸配列を、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨ、レーゲンスブルク、ドイツなどの商業的な供給元に注文することもできる。
【００７４】
ポリペプチドの発現及び組換え糖タンパク質の産生のために使用されうる植物又はその細胞は、特に限定されない。好適なのは、多細胞植物であり、とりわけ高等植物である。単子葉と双子葉のどちらも使用することができる。ヒトの食料又は動物の食餌の産生に使用されない植物が好適である。例えば、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）やベンサミアナタバコなどのタバコ種である。後者が最も好適である。
【００７５】
ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位に付加されるグリカンについては、本発明に特定の制限はない。以降にさらに詳細に記載されるように、産生及び付加されるグリカンの種類は、ポリペプチドを発現させるのに使用される生物に依拠する。また、植物の中でも、付加されるグリカンは、植物が生来のグリコシル化系を有するか、又は遺伝子操作されたグリコシル化系を有するかに依拠する。そのため、本明細書では、Ｎ−グリコシル化部位が任意のサイズの任意のグリカンを担持する場合に、ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位は、Ｎ−グリコシル化されているか、又はＮ−結合型グリカン（「Ｎ−グリカン」）を有するものと考えられる。
【００７６】
植物は、Ｎ−結合型グリカンを有する糖タンパク質を含め、糖タンパク質を天然に産生する。そのため、植物は、この種の翻訳後修飾に必要な機構を天然に有している。本発明に従って発現されて組換え糖タンパク質を形成する、ポリペプチドのＮ−グリコシル化は、それゆえ、該ポリペプチドを発現させる植物細胞で起こる。本発明のプロセスに使用される植物又はその細胞は、野生型植物のグリコシル化機構を有していてもよい。この場合、Ｎ−グリコシル化部位に付加されているＮ−グリカンは、植物型グリカンとなる。植物型のグリカンは、動物細胞で産生されたものといくつかの点で異なる。植物では、ベータ（１，２）−キシロース残基及びアルファ（１，３）−フコース残基が、グリカンのコアＭａｎ３ＧｌｕｃＮＡｃ２−Ａｓｎに連結されることが示されており、一方で、それらは、哺乳類グリカンには検出されず、代わってシアル酸残基及び末端ベータ（１，４）−ガラクトシル構造が発生する。植物に追加される固有のＮ−グリカンは、タンパク質の免疫原性と機能的活性との両方に影響を及ぼし、それゆえ、植物をタンパク質産生プラットフォームとして使用することの制限を意味しうる。実際に、哺乳類でのベータ（１，２）−キシロース残基及びアルファ（１，３）−フコースの免疫原性が記載されている（Ｂａｒｄｏｒら、２００３、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３：４２７）。ＵＤＰ−キシロースから、タンパク質に結合しているＮ−グリカンのコアβ−結合マンノースへのキシロースの転移を触媒する酵素は、ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ（「ＸｙＩＴ」、ＥＣ２．４．２．３８）である。ベータ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼは、植物及びいくつかの無脊椎動物種に固有の酵素であり、ヒト又は他の脊椎動物では発生しない。ＷＯ２００７／１０７２９６には、ベンサミアナタバコなどのタバコ属由来のベータ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼの同定及びクローニングが記載されている。ＧＤＰ−フコースから、タンパク質に結合しているＮ−グリカンのコアβ−結合Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）へのフコースの転移を触媒する酵素は、アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ（「ＦｕｃＴ」、ＥＣ２．４．１．２１４）である。ＷＯ２００９／０５６１５５には、ベンサミアナタバコ由来のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列が記載されている。そのため、Ｎ−グリコシル化で植物型のベータ（１，２）−キシロース残基及び／又はアルファ（１，３）−フコースを含有するＮ−グリカンを回避するため、ベータ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ及び／又はアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼを発現しない植物（又はその細胞）を、それぞれ本発明に採用してもよい。そのような植物及びその使用は記載されている。ＷＯ２００８／１４１８０６には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の２つのアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子及び１つのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子でのノックアウト体が記載されている。ＷＯ２００９／０５６１５５には、異種糖タンパク質上にベータ−１，２−キ���ロース構造の形成を欠くと共にアルファ−１，３−フコース構造もないベンサミアナタバコ植物を生成するための、ＲＮＡ干渉戦略が記載されている。Ｙｉｎらは（２０１１、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ  ２：４１）、タバコで、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）戦略を使用して、内因的なキシロシルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラーゼの発現を下方制御したことを報告している。彼らは、糖鎖操作された系列で、キシロシル化且つコアフコシル化されたＮ−グリカンが、完全ではないものの大幅に低減されることを見出した。ＷＯ２０１０／１４５８４６には、ベンサミアナタバコの２つのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子でのノックアウト体が記載されている。ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼのない４つの対立遺伝子をホモ接合に組合せることが、ベンサミアナタバコで、ベータ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性を完全に取り除くのに十分であることが証明された。ＷＯ２０１３／０５０１５５には、アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ及びベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼの活性を欠いたタバコ属の植物が記載されており、この植物は、本発明に従って異種糖タンパク質を産生するための宿主植物又は宿主細胞として適用されうる。
【００７７】
或いは、又は好ましくは、追加的に、本発明のプロセスに使用される植物は、ベータ（１，４）−ガラクトシル構造を付加するために、動物又はヒトを由来としうるベータ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現するように遺伝子操作されていてもよい。ベータ（１，４）−ガラクトースは、ヒトベータ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ＧａｌＴ）（Ｂａｋｋｅｒら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２８９９）、並びにニワトリ及びゼブラフィッシュベータ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ＷＯ２００８／１２５９７２）を発現することによって、植物産生糖タンパク質へ導入されている。Ｂａｋｋｅｒら（２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：７５７７）及びＷＯ２００３／０７８６３７には、ヒトＧａｌＴと、シロイヌナズナのキシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の細胞質尾部、膜貫通ドメイン及び幹領域（ＣＴＳドメイン）との融合体が記載されている。彼らはまた、タバコで、ＣＴＳドメインの添加によって、キシロース残基及びフコース残基がコアに結合されたＮ−グリカンの著しい減少が引き起こされることを見出した。Ｖｅｚｉｎａら（２００９、Ｐｌａｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．  ７：４４２）及びＷＯ２００８／１５１４４０では、植物の早期の分泌経路にＧａｌＴ活性を適合させるために、タバコ由来のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧＮＴＩ）の膜繋留ドメインに、ＧａｌＴが融合された。ＧＮＴＩ−ＧａｌＴ融合体を発現しているベンサミアナタバコ植物から得たグリカンは、ガラクトシル化及び非ガラクトシル化されたハイブリッド型及び未熟なオリゴマンノース型のＮ−グリカンから成り、検出されうるアルファ（１，３）−フコース残基及びベータ（１，２）−キシロース残基は含有されていなかった。ＷＯ２００８／１２５９７２では、ニワトリ及びゼブラフィッシュのＣＴＳドメインが、ラットのシアリルトランスフェラーゼのＣＴＳに置き換えられた。アミノ末端をラットのシアリルトランスフェラーゼＣＴＳ領域に置換されたゼブラフィッシュＧａｌＴは、ベンサミアナタバコで、主に二分岐型の、二重にガラクトシル化されたＮ−グリカンを産生した。Ｓｔｒａｓｓｅｒら（２００９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：２０４７９）では、ヒトＧａｌＴが、ラットのシアリルトランスフェラーゼＣＴＳドメインに融合された。この融合タンパク質は、植物特異的なベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ及びコアのアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼの活性を欠失し、且つ抗ヒト免疫不全ウイルス抗体を発現する、ベンサミアナタバコで発現された。ＥＰ２５５１３４８Ａには、植物でのガラクトシル化されたＮ−グリカンの産生が記載されている。ＥＰ１１３７７８９Ａには、植物でのベータ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が記載されている。
【００７８】
好適な実施形態では、ベータ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現し、アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ及びベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼの活性を全く又は殆ど持たない植物（又はその細胞）が使用される。
【００７９】
糖タンパク質は、植物又は植物細胞で産生された後に、一般に公知の方法を使用して精製することができる。一実施形態では、糖タンパク質は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して精製されうる免疫グロブリンＩｇＧであり、さらに好ましくはＩｇＧ１である。精製は、次いで、必要であれば、精製タグに対する親和性を有するマトリックスを使用する、他の種類のカラムクロマトグラフィーを含めることができる。代表的なＩｇＧ１サブクラスの２つの免疫グロブリン、リツキシマブ及びトラスツズマブに用いる精製プロトコールの詳細な記載を、実施例２及び３にそれぞれ示す。各種クラス及びサブクラス、特にＩｇＧクラスに属する免疫グロブリンの精製方法及び詳細なプロトコールは、学界及び産業界の当技術分野で公知であり、数多くの刊行物に記載されている［Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ，Ａ．ら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１１５：７９〜８８；Ｋｌｅｉｎｅ−Ｔｅｂｂｅ，Ｊ．ら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１７９：１５３〜１６４；Ｄｅｎｉｚｌｉ，Ａ．ら、１９９５、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．、６６８：１３〜１９；Ｈｕｓｅ，Ｋ．ら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．、５１：２１７〜２３１；ＭｃＡｔｅｅ，Ｃ．Ｐ．及びＨｏｒｎｂｕｃｋｌｅ，Ｊ．、２０１２、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、第８章：ユニット８．１０；概観のために、Ｍａｒｉｃｈａｌ−Ｇａｌｌａｒｄｏ，Ｐ．Ａ．及びＡｌｖａｒｅｚ，Ｍ．Ｍ．、２０１２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２８：８９９〜９１６を参照されたい］。また、Ｉｇ精製のためのキットは、多くの企業から市販されている（例えばＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなど）。抗体の精製に関する書籍は、「抗体のプロセス規模の精製（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」，  Ｕｗｅ  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ホーボーケン、ニュージャージー州、２００９である。
【００８０】
本発明では、組換え糖タンパク質のコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（本明細書では「Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ」とも略記される）のＮ−グリコシル化部位のＮ−グリカン占有率は、Ｘが標準的な２０のアミノ酸残基であり、ある特定のアミノ酸残基を、Ｎ−グリコシル化部位から＋３位又は−１位に配置することによって、植物又は植物細胞で発現されるとすぐに適合されうる。「Ｎ−グリコシル化部位」という用語は、真核細胞で発現されるとすぐにタンパク質又はポリペプチドのＮ−結合型グリコシル化の周知のコンセンサス配列「Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ」に存在する、アスパラギン残基をいう。「＋３位」とは、Ｎ−グリコシル化部位からＣ末端方向へポリペプチドの３残基目のアミノ酸の位置を意味し、それによって、Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基は、０位が割り当てられる。「−１位」とは、Ｎ−グリコシル化部位からＮ末端方向へポリペプチドの１残基目のアミノ酸の位置を意味し、それによって、Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基は、０位が割り当てられる。
【００８１】
選択されたＮ−グリコシル化部位の「グリカン占有率」又は「グリコシル化占有率」とは、複数の組換え糖タンパク質の分子を含む組成物における組換え糖タンパク質の分子の画分を指し、ここで、Ｎ−グリコシル化部位は、任意のグリカンを担持する。Ｎ−グリコシル化部位に連結されるグリカン構造の種類は限定されない。所与のポリペプチドが、そのアミノ酸配列に複数のＮ−グリコシル化部位を有する場合、これらの複数のＮ−グリコシル化部位のそれぞれについて、占有率は別々に規定される。
【００８２】
所与のＮ−グリコシル化部位での高い又は増加したＮ−グリカン占有率を達成するために、＋３位のアミノ酸残基は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔのいずれか１つである。Ｔｈｒ、Ｓｅｒ及びＧｌｙは、これらの残基の中で好適であり、Ｔｈｒ及びＳｅｒはさらに好適であり、Ｔｈｒは最も好適である。しかし、＋３位の残基は、これらの残基のいずれでもよい。
【００８３】
所与のＮ−グリコシル化部位での低い又は減少したＮ−グリカン占有率を達成するために、−１位のアミノ酸残基は、Ｇｌｕ及びＡｓｐのどちらか１つである。しかし、高い又は増加したＮ−グリカン占有率のために提供することが好適である。
【００８４】
増加したＮ−グリカン占有率は、植物又は植物細胞で発現された糖タンパク質で、＋３位のアミノ酸残基が先に規定された通りである場合に、該位置に別のアミノ酸残基を有し且つそれ以外は同じ条件下で発現された糖タンパク質に比べて、Ｎ−グリカン占有率がさらに高いことを意味する。減少したＮ−グリカン占有率は、植物又は植物細胞で発現された糖タンパク質で、−１位のアミノ酸残基が先に規定された通りである場合に、該位置に別のアミノ酸残基を有し且つそれ以外は同じ条件下で発現されたポリペプチドに比べて、Ｎ−グリカン占有率がさらに低いことを意味する。
【００８５】
Ｎ−グリカン占有率は、実験によって決定されてもよく、例えば、実施例で行われたように、キャピラリーゲル電気泳動を使用する。増加又は低下したＮ−グリカン占有率の定性解析は、しばしば十分である場合がある。項目（ａ）の組換え糖タンパク質は、少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、いっそう好ましくは少なくとも９５％のＮ−グリコシル化部位でのグリコシル化占有率を有し得る。項目（ｂ）の組換え糖タンパク質は、多くとも６５％、好ましくは多くとも５５％のＮ−グリコシル化部位でのグリコシル化占有率を有し得る。
【００８６】
ポリペプチドに複数のＮ−グリコシル化部位がある場合、全て又はいくつかを、高い又は低いＮ−グリカン占有率となるように操るのもよいし、別個に操るのもよい。
【００８７】
また、本発明は、植物、植物の細胞又は植物細胞で組換え糖タンパク質を産生するためのプロセスを提供し、本プロセスには、＋３位及び／又は−１位に所望のアミノ酸残基を得るための遺伝子操作が含まれる。本プロセスは、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−ＴｈｒのＮ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする核酸を提供するステップであって、Ｘは、任意の標準的なアミノ酸残基である、ステップと、前記Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎ残基をアミノ酸配列の０位に割り当てた場合に、＋３位及び／又は−１位のアミノ酸残基が本明細書に規定された項目（ａ）又は（ｂ）に規定された通りになるように、核酸を操作するステップと、植物、植物の細胞又は植物細胞で、当該操作された核酸を発現するステップであって、それによって組換え糖タンパク質を産生するステップとを含む。
【００８８】
組換え糖タンパク質は、単量体の糖タンパク質であっても多量体の糖タンパク質であってもよい。組換え糖タンパク質の形成は、植物、植物の細胞又は植物細胞での少なくとも１種の本発明のポリペプチドの発現、Ｎ−グリコシル化、フォールディングを含み、任意選択でさらに進んだ翻訳後修飾、又は特定の細胞区画若しくはアポプラストへ方向付けるなどのプロセスを含む。しかし、このことは、本発明による組換え糖タンパク質を他の手段又は方法によって得る可能性を排除しない。組換え糖タンパク質が多量体である場合、ホモ多量体であってもヘテロ多量体であってもよい。ヘテロ多量体の組換え糖タンパク質である場合、１個のみ又は複数のサブユニットが、Ｎ−グリコシル化部位を有し得、Ｎ−グリコシル化されうる。したがって、複数のサブユニットのうち１個のみが、本明細書に規定されたような改変されたＮ−グリコシル化部位を有していてもよい。ヘテロ多量体タンパク質の複数のサブユニットは、例えばＷＯ００２００６／０７９５４６に記載されているように、植物又は植物細胞で共発現されてもよい。好適なヘテロ多量体タンパク質は、免疫グロブリン、とりわけ免疫グロブリンＧ型の抗体であり、以下にさらに記載される。
【００８９】
本発明の組換え糖タンパク質は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）でありうるか、ＩｇＧ重鎖を含む。典型的なＩｇＧ抗体は、互いに会合する２つの軽鎖と２つの重鎖とから成り、可撓性のあるヒンジ領域を介して連接された３つの主要なドメイン：Ｆａｂ断片にさらに存在する２つの同一の抗原結合領域と、Ｆｃ断片を形成しうる重鎖の定常領域とを形成する。ＩｇＧのＦｃ領域は、２つのＣＨ１ドメインが非共有性相互作用を介して対を成す、ホモ二量体である。ＣＨ１とＣＨ２との間の２つのヒンジ領域重鎖は、共有結合を介して対を成す。２つのＣＨ２ドメインは、対を成さないが、それぞれには、Ａｓｎ２９７にＮ−グリコシル化部位が保存されている。ＩｇＧのいくつかのサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４があり、本発明の組換え糖タンパク質は、これらのサブクラスのうちどの１つに属していてもよい。前記サブクラスのＣＨ２ドメインのアラインメントを図１３Ａに示し、重鎖定常領域のアラインメントを図１３Ｂに示す。
【００９０】
本発明のプロセス及び本発明の組換え糖タンパク質の一実施形態では、ポリペプチドは、ＩｇＧ重鎖定常セグメントのＣＨ２を含み、先に規定されたようなＮ−グリコシル化部位の＋３位又は−１位のアミノ酸残基を有する。重鎖定常領域の例を図１３Ａに示すが、このうちどれを使用してもよい。しかし、好ましくは、図１３Ａ（下部の配列はマウス由来である）の上部に示された３２種のアミノ酸配列セグメントのうちの配列セグメントに示されるような、ヒト由来のＩｇＧ重鎖定常セグメントのＣＨ２を使用する。図１３ＡのヒトＣＨ２領域の想定されうる代替物は、図１３Ａの上部に示されたＣＨ２領域（配列番号１９）を元に１アミノ酸から１５アミノ酸、好ましくは１アミノ酸から１０アミノ酸の置換を有する、ＣＨ２領域である。他の想定されうる代替物は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を有するＣＨ２領域である。さらに想定されうる代替物は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列類似性を有するＣＨ２領域である。配列同一性は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１、ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．の構成部であるＡｌｉｇｎＸを用いて、標準的な設定（Ｋ−タプルサイズ：２；最良ダイアゴナル数：４；ウィンドウサイズ４；ギャップペナルティ  ５；ギャップ開始ペナルティ  １５；ギャップ伸長ペナルティ  ６．６６）を使用して計算されうる。アミノ酸配列類似性は、ＢＬＡＳＴＸ  ２．２．１４を使用して、標準的な設定を用いて決定されうる。
【００９１】
本発明のプロセス及び本発明の組換え糖タンパク質の一実施形態では、ポリペプチドは、ＩｇＧ重鎖定常領域を含み、先に規定されたようなＮ−グリコシル化部位での＋３位又は−１位のアミノ酸残基を有する。ヒト重鎖定常領域の例を図１３Ｂに示すが、このうちどれを使用してもよい。図１３Ｂの上部にある配列部分は、配列番号２０である。配列番号２０の重鎖定常領域又は図１３Ｂに示されたＩＧＨＧ３＊０１配列の重鎖定常領域の想定されうる代替物は、図１３Ｂの上部に示された定常領域又は図１３Ｂに示されたＩＧＨＧ３＊０１配列の定常領域を元に、１アミノ酸から２０アミノ酸、好ましくは１アミノ酸から１５アミノ酸、さらに好ましくは１アミノ酸から１０アミノ酸の置換又は添加を有する、定常領域である。他の想定されうる代替物は、配列番号２０のアミノ酸配列又は図１３Ｂに示されたＩＧＨＧ３＊０１配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％、さらに好ましくは少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有する定常領域である。さらに想定されうる代替物は、配列番号２０のアミノ酸配列又は図１３Ｂに示されたＩＧＨＧ３＊０１配列のアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列類似性、又は同一性を有する定常領域である。
【００９２】
別の実施形態では、ポリペプチドは、ＩｇＧ重鎖定常領域（定常セグメントＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含める）を含み、先に規定されたようなＮ−グリコシル化部位の＋３位又は−１位のアミノ酸残基を有する。別の実施形態では、ポリペプチドは、可変領域及び定常領域を含み、且つ先に規定されたようなＮ−グリコシル化部位の＋３位又は−１位のアミノ酸残基を有する、ＩｇＧ重鎖を含む。組換え糖タンパク質が、ＩｇＧ重鎖であるか、それを含む場合に、重鎖の可変領域のアミノ酸配列に関して、とりわけ相補性決定領域（ＣＤＲ）に関して、特定の制限はない。好適なＩｇＧは、実施例に使用された抗体の可変領域によって付与される結合親和性を有する。そのため、好適なＩｇＧは、図５に示されるような可変領域及び定常領域がある重鎖と、図４に示されるような軽鎖とを有する。別の好適なＩｇＧは、図７に示されるような可変領域及び定常領域がある重鎖と、図６に示されるような軽鎖とを有する。
【００９３】
ＩｇＧの場合、重鎖定常領域には１つのＮ−グリコシル化部位があり、そのＮ−グリカン占有率は、本発明に従って改変されうる。このＮ−グリコシル化部位は、上述し且つ図１Ａに示されているＫａｂａｔの配列付番法で、２９７位にある。
【００９４】
組換え糖タンパク質は、本明細書に規定された＋３位のＮ−グリコシル化部位にあるアミノ酸を除いて、ヒトＩｇＧの定常領域のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を含んでいてもよい。
【００９５】
一実施形態では、本発明は、ＩｇＧ、及びそのようなＩｇＧを含む医薬組成物又は他の組成物である、組換え糖タンパク質を提供し、当該ＩｇＧは、以下の公知の抗体：イブリツモマブ・チウキセタン、アダリムマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、アレムツズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、１−１３１トシツモマブ、エファリズマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ナタリズマブ、エタネルセプト、ＩＧＮ１０１（Ａｐｈｔｏｎ）、ムロモマブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、ダクリズマブ、ボロシキシマブ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｅ及びＰＤＬ  ＢｉｏＰｈａｒｍ）、ＣＰ−６７５，２０６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＡＬ（Ｒｏｃｈｅ）、抗ＣＤ８０ｍＡｂ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｅ）、 抗ＣＤ２３ｍＡｂ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｌ）、スタムルマブ、ＣＡＴ−３８８８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＤＰ７９１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）、エラプツズマブ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＭＤＸ−０１０（Ｍｅｄａｒｅｘ及びＢＭＳ）、ＭＤＸ−０６０（Ｍｅｄａｒｅｘ）、ニモツズマブ、ＭＤＸ−０７０（Ｍｅｄａｒｅｘ）、マツズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、ブレンツキシマブ、ザノリムマブ、アデカツムマブ、オレゴボマブ、ブリアキヌマブ、デノスマブ、ＡＭＧ１０８、ジェンマブ、フォントリズマブ、ダクリズマブ、ウステキヌマブ、オクレリズマブ、ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、ベリムマブ、エプラツズマブ、ＭＬＮ１２０２、ビジリズマブ、トシリズマブ、オクレルリズマブ、セルトリズマブ・ペゴル、エクリズマブ、ペキセリズマブ、アブシキシマブ、ラニビジムマブ、メポリズマブ、イバリズマブ又はゴリムマブのうち、いずれか１つと同一の重鎖と軽鎖の両方の可変領域を有する。
【００９６】
そのような抗体は、重鎖定常領域のＮ−グリコシル化部位の＋３位の改変を除いて、これらの公知の抗体にあるような軽鎖と重鎖の両方の定常領域をさらに有していてもよい。また、これらの重鎖をコードする単離された核酸、該核酸を含む核酸構築物、該構築物を含むベクター、及び該構築物を含む植物も提供される。
【００９７】
精製されたＩｇＧ及びそれらのＣＨ２変異バリアントを、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を使用して、グリコシル化部位占有率について分析した。グリコシル化重鎖と非グリコシル化重鎖とは、グリカン付加（およそ２〜５ｋＤａ）に起因する分子量の違いによって分離することが可能である。リツキシマブ、トラスツズマブ及びそれらの様々な変異バリアントのＣＧＥ分析の電気泳動図を、図８〜１２に示す。グリコシル化ＨＣと非グリコシル化ＨＣとの比率は、対応するピーク範囲を電気泳動図から使用することによって、合理的に良好に測定することができる。さらに大きなピークにはさらに正確な測定値が得られることから、最適なＩｇＧをゲルにロードすることが必要である。少量（例えば１ｇバッチ）由来の不十分量のＩｇをロードすることは、正確さに劣る測定値につながる。しかし、この点以外では、取得されて表１及び表２にまとめられた全てのデータは、様々なアミノ酸残基の置換がもたらすグリコシル化部位占有率への影響を、説得力を以て実証する。２９６位でチロシン残基をフェニルアラニンへ置換することは、グリコシル化部位占有率に目立った影響を及ぼさず、中性的であるが、一方で、同じ位置でグルタミン酸へ置き換えることによって、前記部位の占有率に大幅な減少をもたらす。これに対して、３００位のチロシンをトレオニン又はグリシンへ置き換えることによって、Ｆｃのグリコシル化レベルが大幅に増加する。２９６位でチロシンをフェニルアラニンに置き換えることが、グリコシル化占有率に何も影響を及ぼさないことを考慮すると、ＩｇＧ１のＦｃに関する本発明者らの発見を、他のＩｇＧのサブクラスへ広げることができ、その場合に、２９６位及び／又は３００位のチロシンをフェニルアラニンで置き換える（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、図１３Ａを参照）。興味深いことに、抗ＣＤ２０  ＩｇＧ２Ａ抗体のＦｃグリコシル化部位は、９８％以上が占有されている（図１２Ｂ）。Ｎ−グリコシル化部位に隣接したマウスＩｇＧ２Ａの配列断片は、単アミノ酸置換（マウスＩｇＧ２ａ及びヒトＩｇＧについて、それぞれＹＮＳＴＬＲＶＶ対ＹＮＳＴＹＲＶＶ）を除いて、ヒトＩｇＧ１の１種に一致する。本発明者らは、ＩｇＧ可変領域の配列を含めて、Ｆｃ領域のＮ−グリコシル化部位占有率へ及ぼす他の配列位置の影響を、排除することができない。しかし、Ｎ−グリコシル化レベルへの最も強力な効果には、隣接しているアミノ酸残基、特に３００位が含まれることが証明されている。このことは、Ｙ３００Ｌの置き換えが、Ｆｃ領域のグリコシル化部位占有率へ正の効果を及ぼすことを意味する。
【００９８】
一実施形態では、組換え糖タンパク質は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）などのボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種由来の外表面タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）ではなく、ＷＯ２００９／１２６８１６の図１のアミノ酸配列と９５％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは８０％超のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質でもない。
【００９９】
本発明者らは、植物で作製されたトラスツズマブ及びリツキシマブを、大型リーシュマニアのＳＴＴ３Ｄ（ＬｍＳＴＴ３Ｄ）タンパク質（図１Ｂ及び図２Ｂ）をコードする遺伝子と併せて共発現させることによって、Ｎ−グリコシル化部位の＋３位に変異を導入する必要なく、Ｎ−グリコシル化部位の占有率が大きく増加されることを見出した。ＳＴＴ３Ｄタンパク質をコードする遺伝子は、好ましくは植物コドンが最適化されている。図１２Ｃに示すデータは、グリコシル化部位の占有率は、Ｙ３００Ｔ又はＹ３００Ｇの変異体と同様か、又はそれらよりもいくぶん僅かに良好であることを実証している（図９及び図１０を参照）。ＳＴＴ３Ｄをリツキシマブ及びトラスツズマブの変異体バージョン（Ｙ３００Ｔ又はＹ３００Ｇ、データ示さず）と共発現させると、動物細胞発現系で産生された市販の生成物とは区別がつかないグリコシル化レベルを示す。そのようなアプローチの有用性は、酵母発現系、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどでも示された（Ｃｈｏｉ，ＢＫ．ら、２０１２、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９５：６７１−６８２；米国特許出願公開第２０１２／０３２８６２６号）。
【０１００】
また、本発明は、植物、植物の細胞及び植物細胞で、組換え糖タンパク質を産生するプロセスを提供し、本プロセスは、Ｎ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする核酸配列を、前記植物、植物の細胞及び植物細胞で発現するステップと、異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）をコードする第２の核酸配列を共発現させるステップとを含む。Ｎ−グリコシル化部位を有するポリペプチドは、ある特定のアミノ酸残基を＋３位に有する、先に記載されたポリペプチド、又はＮ−グリコシル化部位を有する別のポリペプチドであってもよい。異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第２の核酸配列は、目的の核酸配列（第１の核酸配列）のために、先に記載されたように発現されてもよい。ウイルスベクターと非ウイルスベクターのどちらからの発現も可能である。第２の核酸配列は、第１の核酸配列と同じベクターから発現されてもよい。この場合、バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡは、第１の核酸配列に用いる１つと、第２の核酸配列に用いる１つとの、２つの発現カセットを含有しうる。一実施形態では、第１及び第２の核酸配列はどちらも、先に記載された核酸構築物に含有される。
【０１０１】
さらなる実施形態では、第２の核酸配列を含有し発現するトランスジェニック植物系列を作出してもよく、例えば、恒常的プロモーター又は制御プロモーターの制御下で発現されてもよい。そのようなトランスジェニック植物又はその細胞を、次いで、先に記載された本発明の糖タンパク質を発現するために使用してもよく、例えば、アグロバクテリウムが媒介するトランスフェクションを一過的に使用して発現してもよい。
【０１０２】
或いは、第１と第２の核酸配列を、別々のベクターから発現させてもよい。この場合、どちらの核酸配列も、Ｔ−ＤＮＡの一部として、アグロバクテリウムが媒介するトランスフェクション又は形質転換を使用して、植物細胞へトランスフェクト又は形質転換してもよい。共形質転換は、Ｔ−ＤＮＡに第１の核酸配列を含有するバイナリーベクターを含有する１種と、Ｔ−ＤＮＡに第２の核酸配列を含有するバイナリーベクターを含有する１種との、２種のアグロバクテリウム集団又は株を混合することによって、容易に実施することができる。該混合物を、次いでトランスフェクションに使用してもよく、例えば、先に記載されたように浸潤又は噴霧によって使用してもよい。両方のベクターが、ウイルスベクターと非ウイルスベクターのどちらかである必要はない。例えば、ウイルスベクターから第１の核酸配列を発現させて、一方で、非ウイルスベクターから第２の核酸配列を発現させることができる。アグロバクテリウム集団又は株の混合比率は、その場合の必要とするところに適するように調整してもよい。例えば、核酸配列が１つのみウイルスベクターから発現される場合、非ウイルスベクターを含有するアグロバクテリウムを、ウイルスベクターを含有するアグロバクテリウムより高い濃度で使用してもよい。
【０１０３】
好適な実施形態では、植物で組換え糖タンパク質を産生するプロセスが提供され、本プロセスは、Ｎ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをコードする、目的のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第１のＤＮＡ分子を含有する第１のアグロバクテリウムを用いて、植物をトランスフェクトするステップと、異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする、第２のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＴ−ＤＮＡを含む第２のＤＮＡ分子を含有する第２のアグロバクテリウムを用いて、該植物をトランスフェクトするステップと、第１及び第２のＤＮＡ配列を発現させて、前記糖タンパク質として、前記ポリペプチドのグリコシル化形態を産生するステップとを含む。ヘテロ二量体又はヘテロ多量体のタンパク質が産生される場合に、異種の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第２のＤＮＡ配列と共に、目的の２つの核酸配列を発現させてもよい。
【０１０４】
第１及び第２のＤＮＡ配列をトランスフェクトするために使用されうるアグロバクテリウムに関しては、先に示した情報が適用される。とりわけ、Ｔ−ＤＮＡは、両側にＴ−ＤＮＡ境界配列が隣接しうる。ＤＮＡ分子のどちらか１つ又は両方は、細菌でクローニング及び遺伝子操作することを可能にするために、前記Ｔ−ＤＮＡの外側に選抜マーカーを含有していてもよい。しかし、前記植物の細胞へ転移されるＴ−ＤＮＡは、存在すれば、前記Ｔ−ＤＮＡを含有する植物又は植物細胞を選抜することを可能にするような選抜マーカーを、好ましくは含有しない。本プロセスは、抗生物質耐性遺伝子又は除草剤耐性遺伝子を使用して第１のＤＮＡ配列も第２のＤＮＡ配列も組み入れられていない植物細胞を選抜するステップを、好ましくは含まない。したがって、前記植物へ組み入れる抗生物質耐性遺伝子も除草剤耐性遺伝子も必要ではない。
【０１０５】
第２の核酸配列は、それを発現させるために使用される植物（又は細胞）にとって異種である単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする。オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（又は「ＯＳＴ」）は、クラスＥＣ２．４．１．１１９に属する。オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、真核細胞で、ドリコールから近隣のタンパク質へ１４糖のオリゴ糖を転移する膜タンパク質複合体である。オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼの１種である。糖Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（式中、Ｇｌｃ＝グルコース、Ｍａｎ＝マンノース、及びＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン）が、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｅのアスパラギン（Ａｓｎ）残基に付加されており、式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。このコンセンサス配列は、グリコシル化シークオンとよばれる。ＯＳＴによって触媒される反応は、Ｎ−結合型糖タンパク質のグリコシル化経路の中心的な段階である。
【０１０６】
単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＳＴＴ３−Ａ、ＳＴＴ３−Ｂ、ＳＴＴ３−Ｃ若しくはＳＴＴ３−Ｄ、又はそれらの組合せなどのリーシュマニアタンパク質でありうる。これらのタンパク質の好適な起源は、大型リーシュマニアである。好適なタンパク質は、大型リーシュマニアのＳＴＴ３Ｄ（ＬｍＳＴＴ３Ｄ）である。これらのタンパク質の配列及びそれらのコード配列は、米国特許出願公開第２０１２／０３２８６２６号から公知である。図１２Ｃ及び図１４に結果を報告している実験で発現させた、ＬｍＳＴＴ３−ＤのＨｉｓタグバリアントのアミノ酸配列を、図１Ｂの配列番号２に示す。野生型ＬｍＳＴＴ３−Ｄのアミノ酸配列を図２Ｄ（配列番号２２）に示す。
【０１０７】
本発明は、先に列挙されたＬｍＳＴＴ３タンパク質及びそれらをコードする核酸配列のいずれかに限定されない。或いは、以下の核酸配列を第２の核酸配列として使用してもよい：
−配列番号２のいずれか１つのアミノ酸配列全体と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列、又は
−配列番号２のいずれか１つのアミノ酸配列全体と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列、又は
−配列番号２のいずれか１つのアミノ酸残基数の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の長さであり、そのような長さにわたって配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列、又は
−配列番号２のいずれか１つのアミノ酸配列に比べて、１アミノ酸から３０アミノ酸の添加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列。アミノ酸の添加、置換又は欠失の最大数は、多くとも２０、好ましくは多くとも１５、さらに好ましくは多くとも１０、いっそう好ましくは多くとも５であり、これによって、添加、置換及び欠失の総数は、共に「アミノ酸の添加、置換又は欠失」の数を決定する。
【０１０８】
配列同一性及び類似性は、上述のように決定されうる。
【０１０９】
好ましくは、ＬｍＳＴＴ３−Ｄのバリアントでは、ＬｍＳＴＴ３−Ｄと同様に、好ましくは同じ効率で、Ｎ−グリコシル化部位占有率が増加し、この占有率は、実施例に記載されたように、実験によって試験されうる。ＯＴａｓｅを発現させるのに使用した植物細胞は、好ましくはその生来のＯＴａｓｅ複合体を有する。
【０１１０】
本発明の医薬組成物は、本発明の組換え糖タンパク質、好ましくはＩｇＧ抗体を含有する。該医薬組成物は、水性液体組成物であっても固体組成物であってもよい。固体組成物は、水性液体組成物から凍結乾燥すること（凍結乾燥）によって調製してもよい。凍結乾燥された固体組成物は、水又は水性溶媒を添加することによって、再構成して液体水性組成物を形成させてもよい。水性液体組成物は、糖タンパク質に加えて緩衝剤及び水を含む組成物であってもよい。組成物は、等張化剤、保存剤などの医薬的賦形剤（以下をさらに参照）をさらに含有していてもよい。
【０１１１】
水性組成物では、糖タンパク質は、約０．１から約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、好ましくは約０．５から約５ｍｇ／ｍＬの量で、さらに好ましくは約０．７から２．５ｍｇ／ｍＬで存在しうる。
【０１１２】
水性組成物の緩衝剤濃度は、５ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭから５０ｍＭ、及び一実施形態では２０ｍＭから３０ｍＭでありうる。緩衝物質の例は、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、酢酸、ヒスチジン、イミダゾール、トリスやＨＥＰＥＳなどの有機酸及び有機塩基、又はリン酸や二リン酸などの無機緩衝剤である。ヒスチジンは、好適な緩衝物質である。水性組成物のｐＨについては、患者へ投与するために使用する際には、ヒトの生理的ｐＨに近いｐＨを選ぶべきである。ｐＨは、７．０から７．８の間でありうる。一実施形態では、ｐＨは７．２と７．６との間であり、さらに好ましくは７．３から７．５である。ｐＨは、通常知られているように、ヒスチジン水溶液に酸を添加することによって設定しうる。酸の例は、塩酸や硫酸などの無機酸、又はクエン酸、乳酸、酒石酸や他の生理的に許容されうる酸などの有機酸である。
【０１１３】
医薬組成物は、任意選択で、非イオン性界面活性剤をさらに含有しうる。界面活性剤の例は、例えばＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ、１９８６、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、グレンロック、ニュージャージー州などから、当業者に公知である。本発明の製剤に用いるなどの医療適用には、医薬的に許容されうる非イオン性界面活性剤を、当業者に公知のように使用することができる。また、非イオン性界面活性剤の組合せも、本発明に使用することができる。
【０１１４】
非イオン性界面活性剤のうち、ポリソルベート界面活性剤が特に好ましい。ポリソルベート界面活性剤は、ポリソルベート８０［ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレアート、Ｔｗｅｅｎ−８０としても知られる］、ポリソルベート６０［ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノステアラート、Ｔｗｅｅｎ−６０としても知られる］、ポリソルベート４０［ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノパルミテート、Ｔｗｅｅｎ−４０としても知られる］、ポリソルベート２０［ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ−２０としても知られる］、ポリソルベート８５［ポリ（オキシエチレン）ソルビタントリオレアート、Ｔｗｅｅｎ−８５としても知られる］やポリソルベート６５［ポリ（オキシエチレン）ソルビタントリステアラート、Ｔｗｅｅｎ−６５としても知られる］などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含むものと本明細書では理解される。これらのうち、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０が好適であり、ポリソルベート８０が特に好適である。
【０１１５】
本発明で使用可能な他の非イオン性界面活性剤は、ポリ（プロピレンオキシド）、及びシンペロニック（登録商標）Ｆ−６８、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、ルトロール（登録商標）Ｆ６８やポロキサマー１８８などのポリ（プロピレンオキシド）とポリ（エチレンオキシド）とのブロックコポリマーである。
【０１１６】
非イオン性界面活性剤に代えて使用されうる、本発明の組成物に用いる別の添加剤は、ＨＰ−β−ＣＤなどのシクロデキストリンであり、タンパク質の安定化に使用してもよく、薬剤の非経口投与に使用することができる。
【０１１７】
非イオン性界面活性剤は、水性組成物又は水性液体製剤に、約０．００１％から約２％（重量／体積）、好ましくは約０．０１％から約０．５％（重量／体積）の濃度で存在しうる。好適な実施形態では、界面活性剤は、約０．１％（重量／体積）の濃度で存在し、代替の好適な実施形態では、約０．０１％（重量／体積）の濃度である。
【０１１８】
医薬組成物は、等張化剤を含んでいてもよい。医薬組成物の非経口投与に用いるには、製剤の張度を人体の体液に合わせることが望ましい。使用される等張化剤は、当業者にとって明らかとなろう。しかし、糖アルコール、ポリビニルピロリドン及び二糖が、明確に挙げられる。これらのうち、マンニトール及び二糖が好適であり、二糖がさらに好適である。特に好適な二糖は、トレハロース及びスクロースを含む。
【０１１９】
医薬組成物は、緩衝剤、抗酸化剤、静菌剤、希釈剤、担体、界面活性剤、塩、保存剤、安定化剤、湿潤剤若しくは可溶化剤、及び／又は浸透圧を調節するための賦形剤などの、追加の１種又は複数の医薬的に許容されうる賦形剤をさらに含有していてもよい。
【０１２０】
一般に、本明細書での医薬組成物は、患者、とりわけヒト患者への投与に適した組成物を意味する。該医薬組成物は、非経口投与の手法によって、好ましくは皮下投与又は筋肉内投与によって、さらに好ましくは皮下投与の手法によって、患者へ投与されうる。
【０１２１】
本発明の医薬組成物又は糖タンパク質は、治療方法に使用されうる。好ましくは、がんの治療に使用される。がんの例は、以下に挙げられるようなＨｅｒ２／Ｎｅｕ陽性がんである。
【０１２２】
ヒト上皮成長因子受容体Ｈｅｒ２は、Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２又はｐ１８５としても知られ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ）ファミリーのメンバーであり、ＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされる。ＥｒｂＢファミリーの他のメンバーのように、Ｈｅｒ２は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び下流のシグナル分子と相互作用することができる細胞内ドメインからなる膜結合受容体チロシンキナーゼである。ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅は、ヒト乳がん及び卵巣がんの２０〜３０％に発生し、侵襲性がさらに高い疾患経過とさらに悪い予後とに連関している（Ｂａｎｇｅ，Ｊ．、Ｚｗｉｃｋ  Ｅ．及びＵｌｌｒｉｃｈ  Ａ．、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７：５４８〜５５２；Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｃｌａｒｋ，Ｇ．Ｍ．、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｇ．ら、１９８７’  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：１７７〜１８２；Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｇｏｄｏｌｐｈｉｎ，Ｗ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ａ．ら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：７０７〜７１２；Ｂｅｒｃｈｕｃｋ，Ａ．、Ｋａｍｅｌ，Ａ．、Ｗｈｉｔａｋｅｒ．Ｒ．ら、１９９０、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５０：４０８７〜４０９１）。ＥＲＢＢ２＋腫瘍細胞では、該受容体は、それ自体に機能するか、及び／又は細胞の新生物性の挙動の原因となる制御解除された増殖シグナルを伝達するために、別のＥｒｂＢメンバーとヘテロ二量体を形成することが必要である。ＨＥＲ２は、乳がん治療の重要な標的として、特にモノクローナル抗体治療によって発展しており、例えば、この表面標的に対するヒト化モノクローナル抗体であるハーセプチン（トラスツズマブ）は、１９９８年にＦＤＡによって認可されている。ハーセプチンは、ＨＥＲ２陽性の乳がん患者の生存率に、有意な影響を及ぼす（Ｔａｎ，Ａ．Ｒ．及びＳｗａｉｎ，Ｓ．Ｍ．、２００２、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、３０：５４〜６４）。トラスツズマブは、ＨＥＲ２ホモ二量体に対し活性を有するが、リガンドによって誘導されたＨＥＲ２ヘテロ二量体には有効ではない（Ａｇｕｓ，Ｄ．Ｂ．、Ａｋｉｔａ，Ｒ．Ｗ，、Ｆｏｘ，Ｗ．Ｄ．ら、２００２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２：１２７〜１３７；Ｃｈｏ，Ｈ．Ｓ．、Ｍａｓｏｎ，Ｋ．、Ｒａｍｙａｒ，Ｋ．Ｘ，ら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ、４２１：７５６〜６０）。トラスツズマブは、後期の転移性がんの治療に効果的である。米国特許第７，４４９，１８４号及び第７，９８１，４１８号には、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性の転移性乳がんの抗体治療が記載されている。
【０１２３】
Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ陽性がんを治療するために、採用された糖タンパク質は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕとの親和性を有していてもよい。好ましくは、このために、糖タンパク質は、トラスツズマブの重鎖及び軽鎖の可変ドメインを有する抗体などの、ＨＥＲ２／Ｎｅｕに親和性を有する抗体である。
【実施例】
【０１２４】
以下に実施例を使用して、本発明をさらに説明する。しかし、本発明は、これらの実施例に限定されない。
【０１２５】
（例１）
構築物の設計
バイナリーベクターは、ｍａｇＩＣＯＮ（登録商標）技術（Ｇｌｅｂａ，Ｙ．、Ｋｌｉｍｙｕｋ，Ｖ．及びＭａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、２００５、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：２０４２〜２０４８；Ｇｌｅｂａ，Ｙ．、Ｋｌｉｍｙｕｋ，Ｖ．及びＭａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、２００７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：１３４〜１４１）に基づき、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）又はジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）由来のエレメント（Ｇｉｒｉｔｃｈら、２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：１４７０１〜１４７０６）を使用して、Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓで開発された。
【０１２６】
ＴＭＶベクターは、物理的な力による伝染によってナス科及びアブラナ科植物に天然に感染する、２種の密に関連した植物ウイルス、すなわちＴＶＣＶ（カブ葉脈透化ウイルス、Ｌａｒｔｅｙ，Ｒ．Ｔ．、Ｌａｎｅ，Ｌ．Ｃ．及びＭｅｌｃｈｅｒ，Ｕ．、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１３８：２８７〜２９８；Ｌａｒｔｅｙ，Ｒ．Ｔ．、Ｖｏｓｓ，Ｔ．Ｃ．及びＭｅｌｃｈｅｒ，Ｕ．、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６６：３３１〜３３２）及びｃｒＴＭＶ（アブラナ感染性トバモウイルス、Ｄｏｒｏｋｈｏｖ，Ｙ．Ｌ．、Ｉｖａｎｏｖ，Ｐ．Ａ．、Ｎｏｖｉｋｏｖ，Ｖ．Ｋ．ら、１９９４、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３５０：５〜８）のｃＤＮＡに基づき構築した。どちらの親ウイルスもトバモウイルスであり、周知のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に関連があることから、本発明者らは、結果として得たベクターを「ＴＭＶに基づく」とよぶ。３種のウイルス（ＴＶＣＶ、ｃｒＴＭＶ及びＴＭＶ）全てが、陽性鎖のＲＮＡウイルスであり、同じ全体構造及び複製様式を有している。基本的にこれらのウイルスは、以下のタンパク質、すなわち（１）その機能が、完全なウイルスＲＮＡ転写物（ゲノムＲＮＡ）、並びに２種の他のウイルスタンパク質（移動タンパク質及び被覆タンパク質）を発現させるために必要な２種のサブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を複製することである、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）と、（２）ウイルスゲノムＲＮＡの細胞間移動（浸潤葉内に限定された短距離移動）に必要な、移動タンパク質（ＭＰ）と、（３）ウイルス粒子の形成及び全身への移動（維管束系を介した葉から葉への長距離移動）に必要な、被覆タンパク質（ＣＰ）とをコードする。興味深いことに、ウイルス粒子の形成は、細胞間移動には必要ではない。そのため、本発明者らは、自分達のベクターから被覆タンパク質を取り除いて、目的の遺伝子に置き換えている。このことによって２つの結果：ウイルスベクターがウイルス粒子を作ることができないこと、及びウイルスベクターがＣＰと目的の遺伝子とのどちらも含有する場合よりも、目的の遺伝子が高いレベルで発現されること、がもたらされている。ウイルスタンパク質及び目的の遺伝子に加えて、ウイルスベクターは、５’及び３’の非翻訳（５’ｎｔｒ及び３’ｎｔｒ）ウイルス配列も含有するべきである（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、Ｇｉｒｉｔｃｈ，Ａ．、Ｇｉｌｓ，Ｍ．ら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１０１：６８５２〜６８５７）。ＴＭＶに基づくウイルスベクターを植物細胞で効率良く発現させるために、ウイルスベクターのｃＤＮＡが、植物プロモーターと植物ターミネーター（Ａｃｔ２及びｎоｓ）との間にクローニングされており（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、Ｇｉｒｉｔｃｈ，Ａ．、Ｇｉｌｓ，Ｍ．ら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１０１：６８５２〜６８５７）、植物イントロンが、ＲｄＲＰ配列内及びＭＰ配列内に添加された（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、Ｔｈｏｅｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．、Ｋａｎｄｚｉａ，Ｒ．ら、２００５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：７１８〜７２３）。
【０１２７】
免疫グロブリンなどのヘテロ多量体タンパク質を発現させるために、２種のタンパク質を同じ細胞で発現させる必要があり、今回の場合は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖である。ＴＭＶに基づく２種の相異なるウイルスベクターは、感染細胞内で互いに排除する傾向があることから（１細胞内では１種のみのベクターが複製に成功することになる）、本発明者らは、感染細胞内で共複製することが可能な２種のウイルスのｃＤＮＡ上に構築した、２種の相異なるウイルスベクターを使用した。この第２のウイルスは、ジャガイモウイルスＸ［ＰＶＸ；分離型ＰＶ−００１８、「ドイツ微生物細胞培養収集機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）」、受入番号ＰＶ−００１８］である。ＰＶＸは、物理的な力による伝染によってナス科及びアブラナ科の植物に天然に感染する、フレキシウイルス科（Ｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ）ポテックスウイルス属（Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）の陽性鎖のＲＮＡウイルスである。ＰＶＸは、ＴＭＶとは異なる複製様式を有する。ＴＭＶのように、ＰＶＸは、複製のためのＲｄＲｐ、細胞間移動のための３種の遺伝子（２５Ｋ、１２Ｋ及び８Ｋのタンパク質からなる３遺伝子ブロック）、並びにウイルス粒子の形成及び全身への移動のためのＣＰを含有する。ＴＭＶとの重要な違いは、ＰＶＸのＣＰが、細胞間移動にも必要であることである。そのため、ＣＰをウイルスベクターから除去することができない。高いレベルの発現を得るためには、目的の遺伝子をＣＰ遺伝子の後にクローニングする。ＴＭＶに基づくベクターとは対照的に、初発のＰＶＸベクター転写物を核から細胞質ゾルへ効率良く輸送するためにイントロンは必要ではない。
【０１２８】
ＴＭＶベクターについて、本発明者らは、最初の転写物を生成するために、植物で活性があるプロモーターを使用している。しかし、ＰＶＸベクターの場合は、本発明者らは、カリフラワーモザイクウイルス由来の恒常的な３５Ｓプロモーターを使用している。ＰＶＸに基づくベクターには、植物ターミネーターは必要ではない。最後に、本発明者らは、植物細胞へウイルスベクターを効率良く送達するために、ＴＭＶに基づくベクターとＰＶＸに基づくベクターとの両方に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用している。そのため、完全なウイルスベクター（ＴＭＶに基づくベクター用の植物プロモーター、目的の遺伝子を具えたウイルスベクター配列、及び植物ターミネーター）が、バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡの左側境界と右側境界との間にクローニングされている（図３）。バイナリーベクターのエレメントは、以下：（１）アグロバクテリウム中でプラスミドを複製させるためのｐＶＳ複製起点（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．、Ｓｖａｂ，Ｚ．及びＭａｌｉｇａ，Ｐ．、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２５：９８９〜９９４）、（２）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で高いレベルにプラスミドを複製させるためのｃｏｌＥ１起点、（３）抗生物質耐性遺伝子（カナマイシン耐性を付与するｎｐｔＩＩＩ、Ｆｒｉｓｃｈ，Ｄ．Ａ．、Ｈａｒｒｉｓ−Ｈａｌｌｅｒ，Ｌ．Ｗ．、Ｙｏｋｕｂａｉｔｉｓ，Ｎ．Ｔ．ら、１９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７：４０５〜４０９）、並びに（４）植物細胞へ転移されたＤＮＡ片の末端を明確に定める、Ｔ−ＤＮＡの左側境界及び右側境界（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｄ．Ａ．、Ｈａｒｒｉｓ−Ｈａｌｌｅｒ，Ｌ．Ｗ．、Ｙｏｋｕｂａｉｔｉｓ，Ｎ．Ｔ．ら、１９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７：４０５〜４０９）である。青／白選抜を容易にするために、目的の遺伝子を継ぎ目なくフレームを合わせてクローニングすることを可能にする２つのＢｓａＩ制限酵素部位の間に、ｐＵＣ１９から増幅させたｌａｃＺαカセットを挿入した。そのため、初めにウイルスベクターを構築する間、天然に発生した全てのＢｓａＩ認識部位を除去して、目的の遺伝子を容易且つ堅牢にクローニングすることができるようにした。
【０１２９】
トラスツズマブ及びリツキシマブのアミノ酸配列に基づいて、タバココドンに最適化した可変領域のバージョンを合成した（図４〜７）。さらに、汎用のガンマ１重鎖及びカッパ軽鎖の定常領域を、タバコのコドン使用を用いて合成した（図１Ａ、図４〜７）。ＩＩＳ型酵素のＢｓａＩの制限酵素部位を配列の両端に添加して、ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）に基づく植物ウイルス発現ベクターへ併せてクローニングすることができる、ＤＮＡモジュールを生成した（図２Ａ，図３）。トラスツズマブ及びリツキシマブの汎用のガンマ１重鎖定常領域には、６つの単変異（Ｅ２９３Ｒ、Ｅ２９４Ｙ、Ｙ２９６Ｆ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ３００Ｔ及びＹ３００Ｇ）及び１つの三重変異（Ｅ２９４Ｌ＋Ｙ２９６Ｔ＋Ｙ３００Ｔ）（図１Ａ）が、ＰＣＲによって導入された。結果として得られたガンマ１定常領域のＤＮＡモジュールを、ＩＩＳ型酵素ＢｓａＩを使用して、シグナルペプチド及び可変領域配列と併せて、ＰＶＸ及びＴＭＶに基づくｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）植物ウイルスベクターにクローニングした（図２Ａ，図３）。図２には、ＩｇＧ  Ｆｃのグリコシル化の調節をもたらす変異を有した断片のクローニングが描図されている。結果として得られた重鎖構築物を、植物での発現に用いるそれぞれの軽鎖構築物と組み合わせた。
【０１３０】
ＩｇＧ１重鎖及び軽鎖のクローニングと同様の手法で、大型リーシュマニアのＳＴＴ３−Ｄ遺伝子（ＬｍＪＦ３５．１１６０、受入番号Ｅ９ＡＥＴ９）のクローニングを実施した。大型リーシュマニアのＳＴＴ３−Ｄのアミノ酸配列（ＬｍＪＦ３５．１１６０、受入番号Ｅ９ＡＥＴ９）に基づいて、Ｃ末端にＨｉｓタグを付し、且つＢｓａＩ  ＩＩＳ型制限酵素部位を隣接させた、トウモロコシのコドン最適化バージョンを合成した（図１Ｂ）。ＢｓａＩ制限酵素部位を添加して、継ぎ目なく共にバイナリー発現ベクター内へ、３５ＳプロモーターとＯＣＳターミネーターとの間にクローニングすることができる、ＤＮＡモジュールを生成した（図２Ｂ）。
【０１３１】
（例２）
リツキシマブの可変領域を有する組換え植物産生抗体の発現、精製及びグリコシル化分析
Ｉｇを産生するために、ＰＶＸベクター及びＴＭＶベクターを保有する、選択された両方のアグロバクテリウム株（Ｇｉｒｉｔｃｈら、２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：１４７０１〜１４７０６）を、トリプトンを大豆ペプトン（Ｄｕｃｈｅｆａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、ハールレム、オランダ）に置き換えたＬＢ培地中で別々に増殖させた。ＯＤ６００が３〜４に到達するまで、細菌培養物を２８℃で増殖させた。両方の細菌培養物を浸潤緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４）で混合して、規定の細胞密度（ＯＤ６００  １．０の培養物の５００倍希釈物と等価）になるように希釈することによって、浸潤溶液を調製した。制御及び標準化された条件下で生育させたベンサミアナタバコ植物を、アグロバクテリウム懸濁液（ＴＭＶベクター及びＰＶＸベクターを保有する２種のアグロバクテリウム株の混合物）を用いて減圧浸潤させ、次いで、生育チャンバーに７日間保ち、Ｉｇを発現させて蓄積させた。次いで、植物バイオマスを収穫し（バッチ当たり５ｋｇ）、＋４℃に予冷した２倍量（重量／体積）の抽出緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に混合して、ブレンダー中でホモジナイズした。ホモジネートのｐＨを＜５．１に低下させて、ルビスコを含む宿主細胞タンパク質を除去した。続いて、ＮａＯＨを用いてホモジネートのｐＨを８．５に調整し、次いで、粗抽出物をデッドエンド濾過によって清澄化した。プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して、清澄化抽出物からＩｇを精製した。親和性溶出液を、ＰＢＳ（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．３）に対して限外／透析濾過し、ＰＢＳ緩衝液を使用して、０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質終濃度に調整した。小規模のグリーンバイオマス（１ｇ、１００ｇ、最大１ｋｇまで）は、実施例３に記載されたように処理した。
【０１３２】
キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を使用して、抗体のＮ−グリカンの占有率を決定した。ＣＧＥ分析には、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー及びＰｒｏｔｅｉｎ２３０キットを、製造業者の取扱説明書に従って使用した。解析には、４μＬのタンパク質試料を、２μＬの還元試料緩衝液及び変性試料緩衝液と合一した。タンパク質サイズを見積もるために、試料中のタンパク質の電気泳動上の移動度を、分子量マーカー（所定の質量を有する様々なサイズのタンパク質の混合物）の移動度と比較した。
【０１３３】
還元された植物産生リツキシマブ及びそのＦｃ変異体の電気泳動図を、図８、図９及び図１２に示す。植物産生抗体の重鎖は、非グリコシル化形態及びグリコシル化形態にそれぞれ相当する、５３．４ｋＤａ及び５８．９ｋＤａの分子量を有する２つのピークに分かれている。このことは、糖ペプチドの質量スペクトル解析によって確認された（実施例４）。植物によって発現されたリツキシマブの重鎖のＮ−グリコシル化部位占有率は、野生型Ｆｃではおよそ７９％である。この数字は、Ｙ３００Ｔ及びＹ３００ＧのＦｃ変異体では５〜６％に低下した。表１に、植物産生リツキシマブの各種ＦｃバリアントのＮ−グリコシル化部位占有率をまとめる。
【０１３４】
また、植物産生リツキシマブ及びそのＦｃ変異バリアントを、ＳＴＴ３Ｄ遺伝子と併せて共発現させた。植物の浸潤、インキュベーション、ＩｇＧの精製を含めて、実験を実施するプロセスは、ＳＴＴ３Ｄ発現カセットを有するアグロを浸潤混合物に添加することを除いて、先に記載されたものと同じ手法で行った。しかし、ＳＴＴ３Ｄが非ウイルスベクター（図２Ｂに描図されたｐＩＣＨ９４９１１）から発現されることを考慮して、ＳＴＴ３Ｄ用の発現カセットを有するＴ−ＤＮＡを担持するアグロバクテリウムの濃度を、ｍａｇｎＩＣＯＮベクターのおよそ５０倍超高いものとした。ベクターを含有するアグロバクテリウムの濃度は、ＯＤ６００が１．０である培養物の４倍希釈と等価であった。結果を図１２Ｃに示す。
【表１】
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表１．植物産生リツキシマブの各種産生バッチでの非グリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃの百分率。キャピラリーゲル電気泳動スキャン由来の対応するＨＣピークの範囲サイズを使用して、グリコシル化重鎖及び非グリコシル化重鎖（それぞれ「ＨＣ  ｇｌｙｃ」及び「ＨＣ  ａｇｌｙｃ」）の比率の測定値を算出した。ＣＨＯ−ＣＨＯ細胞培養；Ｎ．ｂ．ｗｔ−ベンサミアナタバコ（野生型）植物；Ｎ．ｂ．ＲＮＡｉ−ＲＮＡｉによってフコシルトランスフェラーゼ及びキシロシルトランスフェラーゼをサイレンシングされた遺伝子を有するベンサミアナタバコ植物（Ｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｒ．ら、２００８、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、６：３９２〜４０２）；Ｎ．ｂ．ＲＮＡｉ（ΔＸｙｌＴ／ＦｕｃＴ）−ノックアウト遺伝子（キシロシルトランスフェラーゼをコードする２遺伝子及びフコシルトランスフェラーゼをコードする５遺伝子の化学突然変異）と、フコシルトランスフェラーゼ及びキシロシルトランスフェラーゼに対するＲＮＡｉサイレンシングとを組み合わせたベンサミアナタバコ植物；ＭａｂＴｈｅｒａ−市販のリツキシマブ；ＲＩＴ−植物で作製されたリツキシマブ；Ｙ２９６Ｆ、Ｅ２９４Ｙ、Ｙ３００Ｔ、Ｅ２９４Ｌ−Ｙ２９６Ｔ−Ｙ３００Ｔなど−植物で作製したリツキシマブのバリアントであり、Ｆｃ領域内のアミノ酸置換に対応するバリアントの名称。
【０１３５】
（例３）
組換え植物産生トラスツズマブの発現、精製及びグリコシル化分析
組換えタンパク質を産生するために、トリプトンを大豆ペプトン（Ｄｕｃｈｅｆａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、ハールレム、オランダ）に置き換え、且つ５０μｇ／ｍＬのリファンピシン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充したＬＢＳ液体培地中で、ＴＭＶに基づく発現ベクターを保有する選択されたアグロバクテリウム株を成長させた。ＯＤ６００が２〜４に到達するまで、アグロバクテリウム培養物を２８℃で成長させた。規定の細胞密度（ＯＤ６００  １．０の培養物の２００倍希釈物と等価）になるように、アグロバクテリウム培養物を浸潤緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４）に希釈することによって、浸潤溶液を調製した。
【０１３６】
制御及び標準化された条件下で６〜８週間生育させた、約４株から１０株のベンサミアナタバコ植物を、アグロバクテリウム浸潤溶液を用いて減圧浸潤させ、次いで、温室に６〜８日間保ち、組換えタンパク質を発現させて蓄積させた。次いで、植物葉を収穫し、液体窒素中で摩砕して葉の微粉末とし、タンパク質の抽出とそれに続く精製を行うまで−８０℃に保った。
【０１３７】
葉粉末（１ｇから１ｋｇのバッチサイズ）を、の、約２倍量（重量／体積）の抽出緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）中で抽出した。撹拌器上で、＋４℃で４０分間、抽出を実施した。１５，０００×ｇで１０分間、遠心分離することによって、ホモジネートを清澄化し、続いてＭｉｒａＣｌｏｔｈフィルターを通して濾過した。ペレットにした植物組織を、同じ抽出条件を使用して再抽出した。抽出物を合一して、ｐＨ調整に付した。５Ｎ  ＨＣｌを使用して清澄ホモジネートのｐＨを５．０に低下させて、ルビスコを含む宿主細胞タンパク質を除去した。ｐＨ５にて撹拌しながら約３０分間、インキュベーションした後、粗抽出物のｐＨを、５Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に再調整した。次いで、粗抽出物を遠心分離（２０，０００×ｇで１５分間）して、細胞の細片及び沈渣を除去した。親和性クロマトグラフィーカラムに粗抽出物をアプライする前に、粗抽出物をいくつかの濾過膜（２０μｍ−８μｍ−３μｍ−０．４５μｍ）を通して濾過した。１００μＬのプロテインＡセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−５２５５−０１）を満たし、１０ＣＶの洗浄緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．３）を用いて平衡化したスピンカラム上に、透明な濾液をアプライした。ロード後、２０ＣＶ（カラム体積）の洗浄緩衝液を用いて、カラムを洗浄した。５ＣＶの溶離緩衝液（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ３．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて、抗体を溶出させた。
【０１３８】
Ｓｐｉｎ−Ｘ  ＵＦ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ３０ｋ  ＭＷＣＯ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃４３１４８９）を使用して、溶出ＩｇＧを限外／透析濾過した。最後に、０．２μｍフィルターを使用して、濃縮物を滅菌濾過した。実施例２に記載されたプロトコールを使用して、５ｋｇのグリーンバイオマスのバッチを処理した。実施例２に記載されたように、抗体のＮ−グリカンの占有率を決定した。
【０１３９】
還元された植物産生トラスツズマブ及びそのＦｃ変異バージョンの電気泳動図を、図１０及び図１１に示す。植物産生トラスツズマブの重鎖（ＨＣ）は、およそ５３．４ｋＤａ及び５８．９ｋＤａの分子量を有する２つのピークに分離されている。５３．４ｋＤａのピークは、非グリコシル化重鎖バリアントに相当する。表２に、植物産生トラスツズマブの各種ＦｃバリアントのＮ−グリコシル化部位占有率をまとめる。
【０１４０】
また、植物産生トラスツズマブ及びそのＦｃ変異バリアントを、ＳＴＴ３Ｄ遺伝子と併せて共発現させた。植物の浸潤、インキュベーション、ＩｇＧの精製を含めて、実験を実施するプロセスを、Ｔ−ＤＮＡにＳＴＴ３Ｄ発現カセットを有するアグロバクテリウムを浸潤用のアグロバクテリウム混合物に添加することを除いて、先に記載されたものと同じ手法で行った。しかし、ＳＴＴ３Ｄが非ウイルスベクターから発現されることを考慮して、ＳＴＴ３Ｄ用の発現カセットを有するＴ−ＤＮＡを担持するアグロバクテリウムの濃度を、ウイルスベクターのおよそ５０倍超高いものとした。ベクターを含有するアグロバクテリウムの濃度は、ＯＤ６００が１である培養物の４倍希釈と等価であった。結果を図１２Ｃに示す。
【表２】
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表２．植物産生トラスツズマブの各種産生バッチでの非グリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃの百分率。キャピラリーゲル電気泳動スキャン由来の対応するＨＣピークの範囲サイズを使用して、グリコシル化重鎖及び非グリコシル化重鎖（それぞれＨＣ  ｇｌｙｃ及びＨＣ  ａｇｌｙｃ）の比率の測定値を算出した。ＣＨＯ−ＣＨＯ細胞培養；Ｎ．ｂ．ｗｔ−ベンサミアナタバコ（野生型）植物；Ｎ．ｂ．ＲＮＡｉ−フコシルトランスフェラーゼ及びキシロシルトランスフェラーゼをノックダウンされた遺伝子を有するベンサミアナタバコ植物（Ｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｒ．ら、２００８、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、６：３９２〜４０２）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−市販のトラスツズマブ；ＴＲＡ−植物で作製されたトラスツズマブ；Ｙ２９６Ｆ、Ｅ２９４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ−Ｙ２９６Ｔ−Ｙ３００Ｔなど−植物で作製したトラスツズマブのバリアントであり、Ｆｃ領域内のアミノ酸置換に対応するバリアントの名称。
【０１４１】
（例４）
トリプシン処理によって生じた糖ペプチドの逆相ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析
１０μｇの各試料を、ヨードアセトアミドを用いてＳ−アルキル化した。アセトンを用いた沈降によってタンパク質を回収し、シークエンシンググレードのトリプシン（Ｒｏｃｈｅ）を用いて消化した。ｐＨ３．０の６５ｍＭ  ギ酸アンモニウムを水性溶媒として使用して、約３μｇの各消化物を、ＢｉｏＢａｓｉｃ  Ｃ１８カラム（ＢｉｏＢａｓｉｃ−１８、１５０×０．３２ｍｍ、５μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードした。１０％から５５％までのアセトニトリルの勾配を、６μＬ／分の流速で２０分間にわたって展開した。検出は、Ｑ−ＴＯＦ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｌｏｂａｌ）を用いて、陽イオン、簡易ＭＳモードで行った。
【０１４２】
ＭＳプロファイルは、４５０、７５０及び９５０に設定した。ヨウ化セシウムを使用して、計器の較正を実施した。糖ペプチドを、ペプチド部分と、様々に糖残基（Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ又はＦｕｃ）が付加されている付加Ｎ−グリカンとからなるピークの組として、オリゴ糖分析によって同定した。これらの糖ペプチドの理論的な質量を、アミノ酸及び単糖に用いる単同位体質量を使用したスプレッドシートを用いて決定した。合計したスペクトルをＭａｘＥｎｔ３で逆重畳積分することによって、各部位のグリコシル化状態の描図を得た。各糖ペプチドの質量バリアントの定量的な存在を、ＭａｘＥｎｔ３スペクトルのピーク高さから推定した。グリカンの仮想的な平均質量を、加重平均（糖に起因する追加の質量のもの）の合計として算出した。そのため、非グリコシル化バリアント（例えばＦｃ領域にあるようなもの）は、「グリカン質量」が０である。一例として、非グリコシル化Ｆｃ糖ペプチドと、様々なグリコフォームのグリコシル化Ｆｃ糖ペプチドとの百分率の計算値を、表３に示す。
【表３】
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表３．重鎖のＮ−グリコシル化部位が改変されていない、植物で作製されたトラスツズマブの糖ペプチドの総量百分率（％）の定量
【０１４３】
２０１３年６月４日出願の欧州特許出願第１３００２８６６．５号の内容が、記載、特許請求の範囲及び図面を含めて、本明細書に組み入れられている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ−１】
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【図１３Ｂ−２】
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【図１３Ｂ−３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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