(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における膀胱癌の診断を補助する方法であって、前記患者から得た尿路上皮細胞のサンプルをハイブリダイゼーション条件下で、８番染色体上のｑ２４のｃ−ｍｙｃ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズするｃ−ｍｙｃに対する遺伝子座特異的プローブ、２０番染色体上のｑ１３のＡＵＲＫＡ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズするＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブからなる検出可能に標識されているプローブのセットと接触させること、および染色体異常の存在を調べることを含み、前記の検出可能に標識されているプローブに関わる染色体異常の存在は該患者が膀胱癌を有していることを示し、これにより患者の膀胱癌が診断される、方法。
【請求項２】
患者が血尿を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者が以前、膀胱癌と診断されていた、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
患者における膀胱癌の再発のモニタリングを補助する方法であって、前記患者から得た尿路上皮細胞のサンプルをハイブリダイゼーション条件下で、８番染色体上のｑ２４のｃ−ｍｙｃ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズするｃ−ｍｙｃに対する遺伝子座特異的プローブ、２０番染色体上のｑ１３のＡＵＲＫＡ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズするＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブからなる検出可能に標識されているプローブのセットと接触させること、および染色体異常の存在を調べることを含み、前記の検出可能に標識されているプローブに関わる染色体異常の存在は該患者において膀胱癌が再発したことを示し、これにより患者における膀胱癌の再発がモニターされる、方法。
【請求項５】
８番染色体上のｑ２４のｃ−ｍｙｃ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズするｃ−ｍｙｃに対する遺伝子座特異的プローブ、２０番染色体上のｑ１３のＡＵＲＫＡ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズするＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブからなる、膀胱癌の診断または膀胱癌の再発をモニターするための、検出可能に標識されているプローブのセット。
【請求項６】
膀胱癌の診断または膀胱癌の再発をモニターするためのキットであって、（ａ）患者における膀胱癌の診断またはその再発のモニタリングのための検出可能に標識されているプローブのセットであって、８番染色体上のｑ２４のｃ−ｍｙｃ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズするｃ−ｍｙｃに対する遺伝子座特異的プローブ、２０番染色体上のｑ１３のＡＵＲＫＡ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズするＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブからなるプローブのセット、ならびに（ｂ）患者における膀胱癌を診断またはその再発をモニターするための説明書を含み、前記説明書は患者から得た尿路上皮細胞のサンプル中の染色体異常の存在を調べることを含み、前記プローブに関わる染色体異常の存在は前記患者が膀胱癌を有していることを示す、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膀胱癌の診断及びその再発のモニタリング、染色体異常の測定及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、並びに膀胱癌の診断のために有用なプローブのセット及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
膀胱癌は５０才以上の人々でしばしば発症している。男性は女性よりも２〜３倍高い率で膀胱癌を発症している。また、喫煙者の膀胱癌の発症率は非喫煙者のおおよそ４倍である。
【０００３】
膀胱癌は大まかに２つのタイプ、すなわち表在性膀胱癌及び浸潤性膀胱癌に分類される。表在性膀胱癌は膀胱の内面から突き出る浅い乳頭腫瘍及び比較的低い悪性度により特徴づけられる。表在性膀胱癌は、半分またはそれ以上の患者の膀胱で再発するが、内視鏡的に治療され得る。対照的に、浸潤性膀胱癌は例えば膀胱壁のような深部浸潤及び身体の他の部分への転移により特徴づけられる。浸潤性膀胱癌は膀胱摘出、化学療法及び放射線療法により治療され得る。
【０００４】
膀胱癌の最も一般的な兆候は無痛の血尿である。しかしながら、症状は頻尿、排尿痛または残尿感のような膀胱炎の症状に類似している。膀胱癌の診断は尿分析（細胞学的診断）、Ｘ線画像診断または内視鏡検査により実施されている。
【０００５】
例えば尿または血液のアッセイにより早期診断するための特異的且つ高感受性の腫瘍マーカーがないために、膀胱癌はしばしば癌が進行した後に検出されている。従って、尿路上皮癌、特に膀胱癌に対する特異的且つ高感受性のマーカーを用いる簡単な検出方法の実際的使用が望ましい。
【０００６】
膀胱癌の診断のために各種マーカー及び方法が提案されている。その例には、遺伝子、例えばヌクレンフォスミン／Ｂ２３（ＪＰ特許公開（公開）Ｎｏ．２００４−３３７１２０（Ａ））、ＨＵＲＰ（ＪＰ特許公開（公開）Ｎｏ．２００４−２４８５０８（Ａ））、及びＣＹＰ４Ｂ１またはＣＹＰ４Ｂ２（ＪＰ特許公開（公開）Ｎｏ．２００２−２３８５９９（Ａ））の発現レベルの変化の検出、尿中の所与タンパク質のレベルの変化の検出（ＪＰ特許公開（公開）Ｎｏｓ．２００４−６１２８８（Ａ）及びＨ７−３０９８９５（１９９５）（Ａ））、及び血液または尿中の可溶性Ｆａｓのレベルの変化の検出（ＪＰ特許公開（公開）Ｎｏ．２０００−１３１３２１（Ａ）；及び米国特許Ｎｏ．７，７５９，０７７を参照されたい）が含まれる。より最近では、ＣＸＣＬ１タンパク質のレベルの増加の検出（米国特許Ｎｏ．７，９１０，３１６を参照されたい）、１８４Ｐ１Ｅ２タンパク質のレベルの増加の検出（米国特許Ｎｏｓ．７，８７９，５７０及び７，１３５，５４９を参照されたい）、癌胎児性抗原の存在の検出（ＣＥＡ；米国特許Ｎｏ．７，８６２，９９７を参照されたい）、５８Ｐ１Ｄ１２タンパク質のレベルの増加の検出（米国特許Ｎｏ．７，８４２，４５８を参照されたい）、サバイビンの存在の検出（米国特許Ｎｏｓ．７，７９４，９２６及び７，７７６，５１８を参照されたい）、２１３Ｐ１Ｆ１１のレベルの増加の検出（米国特許Ｎｏ．７，５６３，４４４を参照されたい）、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ活性のアッセイ（米国特許Ｎｏｓ．７，３７４，９０２及び７，３７４，８９７を参照されたい）、３６Ｐ６Ｄ５のレベルの増加の検出（米国特許Ｎｏ．７，２２３，５４２を参照されたい）、メチルチオアデノシンホスホリラーゼの不在（ＭＴＡＰ；米国特許Ｎｏ．７，１９２，７１１を参照されたい）、ＳＩＸ１の増加のレベルの検出（米国特許Ｎｏ．７，１５３，７００を参照されたい）、ヌクレオフォスミン／Ｂ２３のレベルの増加の検出（米国特許Ｎｏ．７，０１１，９５０を参照されたい）、シンデカン−１及び肝細胞増殖因子活性化剤−阻害剤タイプ２のレベルの増加の検出（米国特許Ｎｏ．６，９９８，２３２を参照されたい）、前立腺幹細胞抗原の増加の検出（米国特許Ｎｏ．６，９６０，４４３を参照されたい）、ＢＬＣＡ−６の存在の検出（米国特許Ｎｏ．６，９５１，９２６を参照されたい）、抗−Ｃｓｋ自己抗体の存在の検出（米国特許Ｎｏ．６，７５９，２０４を参照されたい）、１番、７番、８番、９番、１０番、１１番、Ｙ及び／またはＸ染色体の数の変化（米国特許Ｎｏ．６，５７３，０４２を参照されたい）、尿中のニューロトロフィン−３、神経成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子及び／またはトリプターゼのレベルの検出（米国特許Ｎｏ．６，００８，００３を参照されたい）、並びにＡＮＸＡ１０、Ｃ１４ｏｒｆ７８、ＣＴＳＥ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＬＦ９、ＫＲＴ２０、ＭＡＧＥＡ３、ＰＯＳＴＮ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ｄ、ＳＬＣ１Ａ６、ＴＥＲＴ、ＡＳＡＭ及びＭＣＭ１０の発現の検出及び定量（欧州特許出願公開Ｎｏ．ＥＰ  ２１３８８４８を参照されたい）が提案されている。３番、７番及び１７番染色体に対するセントロメアプローブ��び遺伝子座特異的プローブ９ｐ２１から構成されているプローブセットを用いる異数染色体細胞の検出は再発及び継続治療の必要性をモニターするために有用であると提案されている（米国特許Ｎｏ．７，２３２，６５５）。
【０００７】
本発明は、特に膀胱癌の症状を呈しているかまたは再発性膀胱癌を有している患者において膀胱癌を検出するため及び膀胱癌の再発をモニターするためのマーカーのセット、並びに使用方法及びキットを求めている。この目的及び他の目的及び作用効果、並びに本発明の特徴は本明細書中の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−３３７１２０号公報
【特許文献２】特開２００４−２４８５０８号公報
【特許文献３】特開２００２−２３８５９９号公報
【特許文献４】特開２００４−６１２８８号公報
【特許文献５】特開平０７−３０９８９５号公報
【特許文献６】特開２０００−１３１３２１号公報
【特許文献７】米国特許第７，７５９，０７７号明細書
【特許文献８】米国特許第７，９１０，３１６号明細書
【特許文献９】米国特許第７，８７９，５７０号明細書
【特許文献１０】米国特許第７，１３５，５４９号明細書
【特許文献１１】米国特許第７，８６２，９９７号明細書
【特許文献１２】米国特許第７，８４２，４５８号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，７９４，９２６号明細書
【特許文献１４】米国特許第７，７７６，５１８号明細書
【特許文献１５】米国特許第７，５６３，４４４号明細書
【特許文献１６】米国特許第７，３７４，９０２号明細書
【特許文献１７】米国特許第７，３７４，８９７号明細書
【特許文献１８】米国特許第７，２２３，５４２号明細書
【特許文献１９】米国特許第７，１９２，７１１号明細書
【特許文献２０】米国特許第７，１５３，７００号明細書
【特許文献２１】米国特許第７，０１１，９５０号明細書
【特許文献２２】米国特許第６，９９８，２３２号明細書
【特許文献２３】米国特許第６，９６０，４４３号明細書
【特許文献２４】米国特許第６，９５１，９２６号明細書
【特許文献２５】米国特許第６，７５９，２０４号明細書
【特許文献２６】米国特許第６，５７３，０４２号明細書
【特許文献２７】米国特許第６，００８，００３号明細書
【特許文献２８】欧州特許第２１３８８４８号明細書
【特許文献２９】米国特許第７，２３２，６５５号明細書
【発明の概要】
【０００９】
患者における膀胱癌の診断方法を提供する。この方法は、患者から得た尿路上皮細胞のサンプルをハイブリダイゼーション条件下で検出可能に標識されているプローブのセットと接触させることを含む。前記の検出可能に標識されているプローブのセットは、ｃ−ｍｙｃに対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブを含む。前記方法は染色体異常の存在を調べることをも含む。前記の検出可能に標識されているプローブの少なくとも２個に関わる染色体異常の存在は患者が膀胱癌を有していることを示す。
【００１０】
患者における膀胱癌の再発のモニタリング方法も提供する。この方法は、患者から得た尿路上皮細胞のサンプルをハイブリダイゼーション条件下で検出可能に標識されているプローブのセットと接触させることを含む。前記の検出可能に標識されているプローブのセットは、ｃ−ｍｙｃに対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブを含む方。前記方法は染色体異常の存在を調べることをも含む。前記の検出可能に標識されているプローブの少なくとも２個をに関わる染色体異常の存在は膀胱癌が患者において再発したことを示す。
【００１１】
プローブのセットも提供する。このプローブのセットは、ｃ−ｍｙｃに対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブを含む。
【００１２】
キットも提供する。このキットは、患者における膀胱癌の診断またはその再発のモニタリングを可能にするプローブのセット及び患者において膀胱癌を診断するかまたはその再発をモニターするための説明書を含む。前記プローブのセットは、ｃ−ｍｙｃに対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブを含む。前記説明書は患者から得た尿路上皮細胞のサンプル中の染色体異常の存在を調べることを含む。前記プローブの少なくとも２個に関わる染色体異常の存在は患者が膀胱癌を有していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、特に膀胱癌の症状を呈しているかまたは再発性膀胱癌を有している患者において膀胱癌を検出するため及び膀胱癌の再発をモニターするためのマーカーのセット、並びに使用方法及びキットを提供する。この方法により、膀胱癌を最初期段階で検出することができる。
【００１４】
以下の用語は本発明に関連している。
【００１５】
「約」は表示されている値からおおよそ±１０％の変動を指す。前記変動は、具体的な言及がなされていてもいなくても常に本明細書中に記載されている所与の値中に含まれると理解すべきである。
【００１６】
「膀胱癌」は、膀胱の組織中に形成する癌である。膀胱癌は、尿路上皮癌、扁平上皮癌及び腺癌とも称される移行上皮細胞癌（ＴＣＣ）を含むように本明細書中で使用されている。
【００１７】
国立衛生研究所が定義している「バイオマーカー」は、「治療介入に対する正常な生物学的プロセス、発病プロセスまたは薬理応答の指標として客観的に測定され、評価される特性」である。
【００１８】
「染色体エニュメレーションプローブ（ＣＥＰ）」または「セントロメアプローブ」は、細胞中の特定染色体の数を計数できるプローブである。染色体エニュメレーションプローブは、典型的には特定の染色体のセントロメアまたはその近く（「セントロメア周囲」と称する）の領域、典型的には反復ＤＮＡ配列（例えば、α−サテライトＤＮＡ）を認識し、結合する。細胞分裂中の正確な分離のためにセントロメアが必要であるので、染色体のセントロメアは典型的にはその染色体を表すと見なされる。特定の染色体領域の欠失または増幅は、特定遺伝子座に対応するシグナルの数（コピー数）をセントロメアに対応するシグナルの数と比較することによりその中に通常存在している全染色体（異数染色体）の損失または増加と区別され得る。この比較を行うための１つの方法は遺伝子座に相当するシグナルの数をセントロメアに相当するシグナルの数で割ることである。１未満の比は遺伝子座の相対的損失または欠失を示し、１を超える比は遺伝子座の相対的増加または増幅を示す。同様に、染色体内のアンバランスな増加または損失を示すべく同一染色体、例えば染色体の２つの異なる腕上の２つの異なる遺伝子座間で比較を行い得る。染色体に対するセントロメアプローブの代わりに、染色体腕プローブを交互に使用して全染色体損失または増加を概算することができることを当業者は認識している。しかしながら、前記プローブに対するシグナルの損失は必ずしも全染色体の損失を示さないことがあるので、そのプローブは染色体を計数するほど正確でない。染色体エニュメレーションプローブの例には、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デスプレーンズ（旧Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，イリノイ州ダウナーズグローブ）から市販されているＣＥＰ（登録商標）プローブが含まれる。
【００１９】
「コピー数」は、単一遺伝子座、１つ以上の遺伝子座、または全ゲノムにせよそのＤＮＡの測定値である。２の「コピー数」は（６つの染色体を除いて二倍性であるので）ヒトにおいて「野生型」である。（性染色体を除いて）ヒトにおける２以外の「コピー数」は野生型から逸脱している。この逸脱には、増幅、すなわちコピー数の増加、及び欠失、すなわちコピー数の減少及び０というコピー数も含まれる。
【００２０】
「標識されている」、「検出可能な標識で標識されている」及び「検出可能に標識されている」は、実在物（例えば、プローブ）が検出され得ることを指すべく本明細書中で互換可能に使用されている。「標識」及び「検出可能な標識」は、実在物が検出され得るように該実在物に結合している部分、例えば標的配列に結合するとプローブが検出され得るように該プローブに結合している部分を意味する。部分そのものは検出可能でなくてもよいが、更に別の部分と反応すると検出可能になり得る。用語「検出可能に標識されている」の使用は標識することを包含すると意図される。検出可能な標識は、標識が測定され得、その強度が結合している実在物の量に比例するシグナルを発生するように選択され得る。分子、例えばプローブのような核酸を標識する及び／または検出するための広範囲のシステムが公知である。標識されている核酸は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段により直接または間接的に検出可能である標識を取り込むまたはコンジュゲートすることにより作成され得る。適当な検出可能な標識には、放射性同位元素、蛍光体、発色団、化学発光剤、ミクロ粒子、酵素、磁気粒子、高電子密度粒子、質量標識、スピン標識、ハプテン等が含まれる。蛍光体及び化学発光剤が本発明において好ましい。
【００２１】
「遺伝子座特異的プローブ」は、染色体上の領域中の特定遺伝子座、例えば転移において増加／損失を受けることが分かっている遺伝子座に選択的に結合するプローブを指す。プローブは標的コーディングまたは非コーディング領域またはその両方、例えばエクソン、イントロン、及び／またはプロモーター配列等のような調節配列であり得る。
【００２２】
「核酸サンプル」は、プローブとのハイブリダイゼーションのために適した形態の核酸を含むサンプル、例えば核、または前記核から単離または精製された核酸を含むサンプルを指す。核酸サンプルは全部または部分的（例えば、特定の染色体）ゲノムＤＮＡ、全部または部分的ｍＲＮＡ（例えば、特定の染色体または遺伝子）、または選択した配列を含み得る。（間期または中期中に存在するような）凝縮した染色体がｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）において標的として使用するのに適している。
【００２３】
「所定カットオフ」及び「所定レベル」は、通常アッセイ結果を所定のカットオフ／レベルと比較することにより診断／予測／治療有効性結果を評価するために使用されるカットオフ値を指し、前記した所定のカットオフ／レベルはすでに各種臨床パラメーター（例えば、疾患の重症度、進行／非進行／改善等）にリンクまたは関連している。
【００２４】
本発明との関係で、「プローブ」は、選択的ハイブリダイゼーションを可能にするかまたは促進させる条件下で標的配列の少なくとも一部に対して選択的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。通常、プローブはＤＮＡのコーディング、すなわちセンス（＋）鎖に対して相補的であり、またはＤＮＡの非コーディング、すなわちアンチセンス（−）鎖に対して相補的（時に、「逆相補的」と称す）であり得る。プローブの長さは大きく変わり得る。幾つかの用途では、約１０〜約１００ヌクレオチド、例えば約１５〜約７５ヌクレオチド（例：約１５〜約５０ヌクレオチド）の長さが好ましいが、染色体プローブのためには約５０〜１×１０５ヌクレオチドの長さが好ましく、遺伝子座特異的プローブのためには約２５，０００〜約８００，０００ヌクレオチドの長さが好ましい。
【００２５】
本発明との関係で、「選択的にハイブリダイズする」（及び「選択的ハイブリダイゼーション」、「特異的にハイブリダイズする」及び「特異的ハイブリダイゼーション」）は、核酸分子をストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列に対して優先的に結合する、二重鎖を形成する、またはハイブリダイズすることを指す。用語「ストリンジェントな条件」は、プローブがその標的配列に対して優先的にハイブリダイズし、他の非標的配列に対して殆どまたは全くハイブリダイズしない条件を指す。核酸ハイブリダイゼーション（例えば、アレーにおいて、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーションまたはＦＩＳＨ）との関係で、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種条件下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する詳細な手引きは、例えばＴｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈ．２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ（１９９３）（“Ｔｉｊｓｓｅｎ”）中に記載されている。一般的に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定のイオン強度及びｐＨで特定配列についての融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔｍは（規定のイオン強度及びｐＨで）標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は特定のプローブについてのＴｍに等しいように選択される。アレー上、またはサザンまたはノーザンブロットのフィルター上に１００以上の相補的残基を有している相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は標準のハイブリダイゼーション溶液を用いて４２℃である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２００１）を参照されたい）。
【００２６】
「標的配列」、「標的領域」及び「核酸標的」は、例えばその損失及び／または増加を調べる特定の染色体位置にあるヌクレオチド配列を指す。
【００２７】
本明細書中で使用されている専門用語は特定の実施形態を説明するためのみであり、そうでないにしても限定的であると意図されない。
【００２８】
膀胱癌の診断方法
患者、例えば血尿、及び／または膀胱癌の他の兆候及び／または症状を呈している患者における膀胱癌の診断方法を提供する。この方法は、患者から得た尿路上皮細胞のサンプルをハイブリダイゼーション条件下でｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）に対する遺伝子座特異的プローブ、オーロラキナーゼ（ＡＵＲＫＡ；２０ｑ１３、具体的には２０ｑ１３．２）に対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブを含み、またはこれらから構成されている検出可能に標識されているプローブのセットと接触させて、染色体異常の存在を調べることを含む。前記の検出可能に標識されているプローブの少なくとも２個に関わる染色体異常の存在は患者が膀胱癌を有していることを示す。よって、上記にてらして、ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）及びオーロラキナーゼ（ＡＵＲＫＡ；２０ｑ１３）；ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）及び７番染色体；ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）及び１７番染色体；ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）及び７番染色体；ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）及び１７番染色体；７番染色体及び１７番染色体；ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）及び７番染色体；ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）及び１７番染色体；ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）、７番染色体及び１７番染色体；７番染色体、１７番染色体及びｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）；またはｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）、７番染色体及び１７番染色体に関わる染色体異常の検出は患者が膀胱癌を有していることを示す。
【００２９】
方法は再発膀胱癌を検出またはモニターするために使用され得る。よって、患者における膀胱癌の再発のモニタリング方法を提供する。この方法は、患者から得た尿路上皮細胞のサンプルをハイブリダイゼーション条件下で検出可能に標識されているプローブのセットと接触させることを含む。前記の検出可能に標識されているプローブのセットは、ｃ−ｍｙｃに対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブを含み、またはこれらから構成されている。前記方法は染色体異常の存在を調べることをも含む。前記の検出可能に標識されているプローブの少なくとも２個に関わる染色体異常の存在は膀胱癌が患者において再発したことを示す。よって、上記にてらして、ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）及びオーロラキナーゼ（ＡＵＲＫＡ；２０ｑ１３）；ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）及び７番染色体；ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）及び１７番染色体；ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）及び７番染色体；ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）及び１７番染色体；７番染色体及び１７番染色体；ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）及び７番染色体；ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）及び１７番染色体；ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）、７番染色体及び１７番染色体；７番染色体、１７番染色体及びｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）；またはｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）、７番染色体及び１７番染色体に関わる染色体異常の検出は患者において膀胱癌が再発したことを示す。通常、反復検査を行い得るアッセイ（例えば、疾患の再発のモニタリング）のためには、第２またはその後の検査サンプルを第１検査サンプルを被験者から得た後ちょうどよいときに得る。具体的には、被験者からの第２検査サンプルを第１検査サンプルを被験者から得てから数週間または数年間後に得られ得る。例えば、第２検査サンプルは被験者から第１検査サンプルを得てから約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３．０年間、約３．５年間、約４．０年間、約４．５年間、約５．０年間、約５．５年間、約６．０年間、約６．５年間、約７．０年間、約７．５年間、約８．０年間、約８．５年間、約９．０年間、約９．５年間または約１０．０年間後に被験者から得られ得る。
【００３０】
上記方法は当業界で公知の検出方法を用いて実施され得る。好ましくは、上記方法はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて実施される。好ましくは、各プローブは別個の標識、例えば別個の蛍光体で検出可能に標識されている。上記方法を各プローブが検出可能に標識されている（２個以上のプローブを同一サンプルで同時にまたは逐次使用する場合には、別個に標識されている）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、例えば各プローブが蛍光体で標識されているＦＩＳＨにより実施する場合には、方法は典型的には排尿サンプルまたは（例えば、水または食塩液を用いる）膀胱洗浄液から得た尿路上皮細胞のサンプルに対して実施される。細胞を尿サンプルから得る場合、尿サンプルを患者の早朝尿から得ることが好ましい。尿または膀胱洗浄液中に含まれている細胞は当業界で公知の方法で収集し得る。好ましくは、遠心し、ペレット化細胞を再懸濁させることにより細胞を収集する。典型的には、細胞をリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中に再懸濁させる。細胞を収集したら、これらの細胞を当業界で公知の方法に従ってｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために作成し得る。細胞は収集から短時間以内に分析され得る。或いは、細胞を（例えば、酸アルコール溶液、例えばメタノール：氷酢酸（３：１）、酸アセトン溶液、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒド）、または中性緩衝ホルマリン溶液（リン酸ナトリウム水溶液中ホルムアルデヒド）を用いて）固定し、その後分析し得る。所望ならば、新鮮（新鮮細胞は１〜３日間培養し、染色体が高度に凝縮される中期中に細胞をブロックするように培養物にコルセミドのようなブロッカーを添加し、可視化し得る）、凍結されている、または固定されている（例えば、エタノールまたはホルマリン固定・パラフィン包埋されている）細胞を標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の接近可能性を高め、非特異的結合を減らすように（例えば、ＲＮアーゼ及びペプシン）で処理した後、１個以上のプローブとハイブリダイズし、非結合プローブを除去するために洗浄し、ハイブリダイズしたプローブを検出し得る。例えば、細胞懸濁液を顕微鏡による検査に適した固体支持体（例えば、スライドまたはカバーガラス）上に単層として適用し得、細胞密度を光学または位相差顕微鏡により測定し得る。収集し、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔのような溶液を用いて固定した排尿標本を細胞沈着システム（例えば、ＴｈｉｎＰｒｅｐ  ２０００）を用いてスライド（ＵｒｏＣｙｔｅ，Ｈｏｌｏｇｉｃ，マサチューセッツ州マールボロから入手可能）上に載せ得る。スライドを作成し、９５％脱水剤中に室温で３０分間浸してもよい。その後、スライドをベンチトップで立向きに約３０分間〜１時間乾燥した後、ハイブリダイズし得る。次いで、スライドを２×塩−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を用いて７２℃で約２分間前処理し、プロテアーゼ（１０ｍＭ  ＨＣｌ中０．１〜０．５ｇ／ｍＬ）を用いて３７℃で約１０分間消化する。プロテアーゼ消化後、スライドを１×リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を用いて室温で約５分間濯ぎ、１％中性緩衝ホルマリン溶液を��いて室温で約５分間固定し、再び１×ＰＢＳを用いて室温で約５分間すすぎ、グレードエタノール中に通し、乾燥させ得る。好ましくは、スライドを１個以上のプローブと接触させ、ＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ変性／ハイブリダイゼーションシステム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デスプレーンズ）を用いて７３℃で約２分間共変性し、３７℃で一晩（約１６〜２４時間）ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスをスライドから外した後、スライドを初回洗浄緩衝液中に７３℃で約５間、次いで第２回洗浄緩衝液中に室温で約１分間浸す。次いで、スライドを乾燥し、４’，６’−ジアミジノ−２−フエニルインドール二塩酸塩水和物（ＤＡＰＩ）ＩＩ退色防止溶液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を載せる。好ましくは、スライドをシングルバンドパスフィルターを備えている落射蛍光顕微鏡（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて分析する。
【００３１】
或いは、（例えば、疑わしい腫瘍からの）尿路上皮細胞のホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルの切片（おおよそ厚さ５μｍ）をスライド、例えばＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ正電荷を持っているスライド（ＴｈｅｒｍｏＳｈａｎｄｏｎ，ペンルベニア州ピッツバーグから入手可能）上に載せ、５０〜６０℃で一晩焼き、Ｈｅｍｏ−Ｄｅ、ＣｔｒｉＳｏｌｖまたはキシレンを用いて５分間脱パラフィン化し、１×塩−クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．３）中に８０℃で３５分間沈め、水を用いて３分間洗浄し得る。３７℃で１５分間プロテアーゼ消化（１〜４ｍｇ  ペプシン／ｍＬ、例えば１．５ｍｇ  ペプシン／ｍＬ，０．１〜０．２Ｎ  ＨＣｌ中に溶解させた）した後、切片を水を用いて３分間濯ぎ、グレードエタノール中に通し、乾燥させ得る。好ましくは、上記した１個以上のプローブとのハイブリダイゼーションを自動化共変性オーブン（ＨＹＢｒｉｔｅまたはＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ変性／ハイブリダイゼーションシステム，Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デスプレーンズ）を製造業者の指示に従って用いて３７℃で１６〜２４時間実施する（前記方法は典型的にはプローブ及び標的核酸の変性を含む）。ハイブリダイゼーション後、好ましくはカバーガラスを外すために切片を洗浄緩衝液（２×３０  塩−クエン酸ナトリウム／０．３％ＮＰ４０；Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能）中に室温で２〜１０分間入れた後、７３℃洗浄緩衝液中に２分間浸漬し、乾燥し、４’６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩水和物（ＤＡＰＩ）Ｉ退色防止溶液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を載せる。好ましくは、スライドをシングルバンドパスフィルターを備えた落射蛍光顕微鏡（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて分析する。
【００３２】
検出前に、サンプル中の細胞を場合により見かけ上の細胞学的異常に基づいて前選択してもよい。前選択は疑わしい細胞を同定し、これによりスクリーニングをこれらの細胞に集中させることができる。前選択により、より早いスクリーニングが可能となり、陽性結果が見落とされない可能性が高まる。前選択中、生物学的サンプルからの細胞を顕微鏡スライド上に載せ、通常異形成及び新生細胞に関係している細胞学的異常について視覚的にスキャンすることができる。前記異常には、通常プローブをその標的ＤＮＡにハイブリダイゼーションした後、核を核酸ステインまたは染料（例えば、ヨウ化プロピジウムまたは４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ））で対比染色することにより評価される核サイズ、核の形及び核染色の異常が含まれる。典型的には、新生細胞は広がった不規則な形を有する核を持っている、及び／またはまだらな核染色パターンを示す。典型的には約０．４μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの濃度で使用されるヨウ化プロピジウムは６１４ｎｍの発光ピーク波長で観察され得る赤色蛍光ＤＮＡ特異的染料である。典型的には約１２５ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用されるＤＡＰＩは低倍率のＤＡＰＩフィルターを用いて４５２ｎｍの発光ピークで観察され得る青色蛍光ＤＮＡ特異的ステインである。この場合、検出のために前選択した細胞のみを染色体損失及び／または増加についてカウントする。好ましくは、少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０〜４０個のオーダーの前選択した細胞を染色体損失及び／または増加について評価するために選択する。
【００３３】
或いは、あるレベルの異形成または疑わしい病変を示すエリアを低倍率のＤＡＰＩフィルターを用いて局在化させ、異常コピー数のプローブを有している核の存在について十分に調査し得る。正常細胞では、所与プローブの２コピーが検出される。異常細胞では、所与プローブよりもより多いまたはより少ないコピーが検出される。最も有意なコピー数変化を有するエリアをエニュメレーションのために選択することが好ましい。可能ならば、３つの異常エリアを選択し、各異常エリア内で１０個のランダムな核を高倍率（６４×または１００×対物レンズ）で分析する。好ましくは、核は非重複性であり、十分に明るいシグナルを呈する。
【００３４】
或いは、検出のための細胞は細胞学的または組織学的特徴と無関係に選択され得る。例えば、顕微鏡スライド上の所与の１つ以上のエリア中のすべての非重複細胞を染色体損失及び／または増加について評価し得る。更なる例として、スライド上の細胞、例えば顕微鏡スライド上に順序通りに現れる少なくとも約５０個、より好ましくは少なくとも約１００個のオーダーの変化した形態を示している細胞が染色体損失及び／または増加を評価するために選択され得る。
【００３５】
ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）、７番染色体及び１７番染色体のコピーをカウントし、記録する。ｃ−ｍｙｃ、ＡＵＲＫＡ、７番染色体及び１７番染色体の少なくとも２個に関わる染色体異常の存在は患者が膀胱癌を有していることを示す。
【００３６】
よって、前記方法は、患者から得た尿路上皮細胞のサンプル、例えば核酸サンプルをプローブがその標的核酸配列との選択的な結合及び安定なハイブリダイゼーション複合物の形成を可能にする（または、促進させる）条件下でｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブを含む検出可能に標識されているプローブのセットと接触させることを含む。方法は更に、ハイブリダイゼーション複合物の形成を検出し、ハイブリダイゼーション複合物の数をカウントすることを含む。ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）、７番染色体及び１７番染色体を含むハイブリダイゼーション複合物の数にてらして、前記方法はｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）、７番染色体及び１７番染色体のコピー数を測定することを含む。所望ならば、コピー数を所定のカットオフと比較することができ、必要に応じて所定のカットオフよりも高いコピー数（すなわち、増加について）及び所定のカットオフ未満のコピー数（すなわち、損失について）は患者が膀胱癌を有していることを示す。
【００３７】
脱パラフィン、前処理、染色及びルーチンのスライド洗浄も当業界で公知の方法に従って実施され得るが、ＶＰ  ２０００  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デスプレーンズ）のような自動化システムを使用すると評価のためのスライドを作成するために必要な時間が短縮される。標準のコプリンジャーをハイブリダイゼーション後洗浄のために使用するときには、スライドは小バッチ（例えば、４スライド）とは対照的に大バッチ（例えば、５０スライド）で作成され得る。加えて、スライドの採点は自動化イメージングを用いて完全自動化され得、これにより標本分析のために必要に実地時間を短縮することができる。完全自動化により、より多くの異常細胞をより高頻度で着実に捕捉することができるイメージングアルゴリズムを使用することもできる。また、当業界で公知のスライド作成の適当な方法を使用できるが、細胞のより均一で安定した単層を生成するＴｈｉｎＰｒｅｐ  ２０００（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いてスライドを作成することが好ましい。
【００３８】
当業界で既に公知であるかまたは現在開発中の他の方法は、ホルマリン固定・パラフィン包埋されている細胞以外の尿路上皮細胞、例えば尿路上皮細胞からの新鮮または凍結細胞、ホモジナイズした細胞、溶解した細胞、または単離または精製した核酸（例えば、ＤＮＡのような「核酸サンプル」）を使用することが必要なことがある（本明細書中で使用されている「尿路上皮細胞のサンプル」はコピー数及び増加／損失を調べることができる尿路上皮細胞のすべての形態のサンプルを包含すると意図される）。核は、打ち切りアーティファクトを減らし、埋め込まれている異物をなくすためにパラフィン包埋標本の厚い切片から抽出することができる。典型的には、一度得た生物学的サンプルを収集し、当業界で公知の標準方法を用いてプロセッシングした後ハイブリダイズする。前記プロセッシングは典型的にはプロテアーゼ処理及びアルデヒド溶液（例えば、ホルムアルデヒド）中での追加の固定を含む。
【００３９】
本発明において使用され得る方法の例には、場合によりコピー数を測定しようとする遺伝子及び／または染色体領域の前増幅を含む定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、リアルタイムＱ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティ）、ＰＣＲ産物のデンシトメトリースキャニング、デジタルＰＣＲ（例えば、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９６：９２３６−９２４１（１９９９）；米国特許出願公開Ｎｏ．２００５／０２５２７７３；及び米国特許出願公開Ｎｏ．２００９／００６９１９４を参照されたい）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ；例えば、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：８１８−８２１（１９９２）；及び国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ  ９３／１８１８６を参照されたい）、マイクロサテライトまたはサザンアレロタイプ解析、ドットブロット、アレー、マイクロアレー（Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，３９：Ｓ１６−Ｓ２１（Ｊｕｌｙ  ２００７））、多重増幅可能プローブハイブリダイゼーション（ＭＡＰＨ）、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ；例えば、Ｓｃｈｏｕｔｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：ｅ５７（２００２）を参照されたい）、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ；Ｋｕｍａｒら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６４（３）：２２６−２３４（２００５））、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、櫛分けしたゲノムＤＮＡ上の蛍光プローブ長さの測定（Ｈｅｒｒｉｃｋら，ＰＮＡＳ，９７（１）：２２２−２２７（２０００））、リファレンスクエリパイロシーケンシング（ＲＱＰＳ；Ｌｉｕら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４９１（２０１０））、フォスミド末端の参照配列へのマッピング（キャピラリーに基づく技術）、微量電気泳動及びナノポアシーケンシング（例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１１：１５４４−１５４６（２００６）；及びＳｈｅｎｄｕｒｅら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，５：３３５−３４４（２００４）を参照されたい）等が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び類似方法による分析のための核酸標的の変性は典型的には細胞形態を維持するように実施する。例えば、染色体ＤＮＡは高ｐＨ、高温（例えば、約７０〜９５℃の温度）、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）及びその組合せにより変性され得る。一方、プローブは数分程度の加熱により変性され得る。
【００４１】
変性後、ハイブリダイゼーションを実施する。プローブをその核酸標的に対して特異的にハイブリダイズさせるための条件には通常特定ハイブリッドを産生するための所与のハイブリダイゼーション手順において使用可能な条件の組合せが含まれ、これらの条件は当業者により容易に決定され得る。前記条件には、典型的には制御された温度、液相、及びプローブと標的間の接触が含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、プローブ濃度、標的長さ、標的及びプローブＧ−Ｃ含量、溶媒組成、温度及びインキュベーション時間を含めた多くの要因に応じて異なる。少なくとも１つの変性ステップをプローブの標的との接触に先行させ得る。或いは、プローブと標的を相互に接触させながら、またはその後プローブを生物学的サンプルと接触させて一緒に変性条件にかけられ得る。ハイブリダイゼーションは、その後プローブ／サンプルを例えば約５０：５０容量比の２〜４×ＳＳＣとホルムアミドの混合物の液相中、約２５〜約５５℃の範囲の温度で、例えば約０．５〜約９６時間の範囲の時間、またはより好ましくは約３２〜約４２℃の温度で約２〜約２４時間の範囲の時間インキュベートすると達成され得る。特異性を高めるために、米国特許Ｎｏ．５，７５６，６９６（全文を参照することにより、特にブロッキング核酸の使用の説明のためにその内容を本明細書に組み入れる）に記載されている非標識ブロッキング核酸を使用してもよい。当業者にとって容易に自明であるように、プローブをサンプル中に存在するその核酸標的に対して特異的にハイブリダイズさせるために他の条件が容易に使用され得る。ハイブリダイゼーションプロトコルは、例えばＰｉｎｋｅｔら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５：９１３８−９１４２（１９８８）；Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３３，Ｃｈｏｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４）；及びＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８９：５３２１−５３２５（１９９２）に記載されている。
【００４２】
適当なインキュベーション時間が終了したら、染色体プローブのサンプルＤＮＡに対する非特異的結合は一連の洗浄により除去され得る。所望のストリンジェンシーのために温度及び塩濃度が適当に選択される。必要なストリンジェンシーのレベルはゲノム配列に対する特定プローブ配列の複雑さに依存し、公知の遺伝組成のサンプルに対してプローブを系統的にハイブリダイズすることにより決定され得る。一般的に、高ストリンジェンシー洗浄は約０．２×〜約２×ＳＳＣ及び約０．１％〜約１％の非イオン性洗浄剤（例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０））を用いて約６５〜約８０℃の範囲の温度で実施され得る。低ストリンジェンシー洗浄が必要ならば、洗浄は塩濃度を高めてより低い温度で実施され得る。
【００４３】
蛍光体標識したプローブまたはプローブ組成物を使用する場合、検出方法は蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、またはプローブハイブリダイゼーションを調べるための他の手段を含み得る。適当な顕微鏡イメージング方法が複数の蛍光体を観察するための本明細書中に記載されている方法と一緒に使用され得る。蛍光顕微鏡法を使用する場合には、ハイブリダイズしたサンプルを各蛍光体の励起に適した光の下で１つ以上の適当なフィルターを用いて調査することができる。或いは、ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ、ＢｉｏＶｉｅｗ、Ｌｅｉｃａ、ＩｋｏｎｉｓｙｓまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇシステムのような自動化デジタルイメージングシステムを使用し得る。
【００４４】
使用する方法に応じて、結果の表示を容易にし、蛍光強度の小さな違いを検出する感度を向上させるためにデジタル画像分析システムを使用することができる。例示のシステムは、自動化ステージ、焦点コントロール及びフィルターホイールを備えた標準蛍光顕微鏡に基づく自動化画像解析システム（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｔｄ．，ニューヨーク州ホーソーン）であるＱＵＩＰＳ（定量画像プロセッシングシステムの頭文字）である。フィルターホイールは励起波長を選択するために顕微鏡の蛍光励起路中に置かれている。二色性ブロック中の特殊フィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ハーモント州ブラトルボロ）により、画像表示シフトなしに複数の染料を励起させることができる。顕微鏡は２つのカメラポートを有しており、その１つは高感度の高速ビデオ画像表示のための強化ＣＣＤカメラ（Ｑｕａｎｔｅｘ  Ｃｏｒｐ．，カリフォルニア州サニーベール）を有しており、これはスライド上の関心エリアを見つけ、焦点を合わせるために使用される。他のカメラポートは冷却ＣＣＤカメラ（モデル２００，Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｌｔｄ．，アリゾナ州ツーソン）を有しており、これは実際の画像を高い解像度及び感受性で獲得するために使用される。冷却ＣＣＤカメラはＶＭＥバスを介してＳＵＮ  ４／３３０ワークステーション（ＳＵＮ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州マウンテンビュー）とインターフェース接続されている。多色画像の全獲得は画像加工ソフトウェアパッケージＳＣＩＬ−Ｉｍａｇｅ（Ｄｅｌｆｔ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，オランダ国デルフト）を用いてコントロールされる。
【００４５】
アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）では、プローブを基質上の離れた位置で固定化し、標識されていない（例えば、国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ  ９６／１７９５８を参照されたい）。代わりに、標的核酸を含むサンプル核酸が標識されている。ハイブリダイゼーション前にサンプル核酸を標識し、またはハイブリダイゼーション複合物を検出可能に標識する。二色または多色ａＣＧＨでは、プローブアレイを別々に標識した標的核酸の２つ以上のコレクションに対して同時にまたは順次ハイブリダイズする。
【００４６】
上記にてらして、手動手順は尿から細胞を収集し、カルノア試薬を用いて固定することを含み得る。３μＬ、１０μＬ及び３０μＬの細胞懸濁液のサンプル液滴を含有している２４ウェルスライドを作成し得る。スライドを手動で前処理し（場合により、ＶＰ２０００（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デスプレーン）を用いて前処理）し、手動でハイブリダイズし（場合により、Ｔｈｅｒｍｏｂｒｉｔｅ変性／ハイブリダイゼーションシステム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を用いてハイブリダイズし）、手動で洗浄し得る。顕微鏡法を用いて、異常細胞を選択し得、プローブを計数し得る。好ましくは、自動化手順を使用する。自動化手順は尿から細胞を収集し、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いて固定することを含み得る。ＴｈｉｎＰｒｅｐスライド（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）を作成し、ＶＰ２０００（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて前処理し、Ｔｈｅｒｍｏｂｒｉｔｅ変性／ハイブリダイゼーションシステム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を用いてハイブリダイズし得る。スライドを洗浄し、顕微鏡法を用いて異常細胞を同定し、プローブを計数し得る。細胞を前スキャンし、分類し、画像を得、よって自動プローブエニュメレーション及び遠隔再検討ができる。ＴｈｉｎＰｒｅｐを使用すると、より明瞭なバックグラウンド、より少ない細胞ロス、より大きくて平らな細胞形態及びより良好なシグナル品質が得られる。
【００４７】
プローブ
プローブのセットも提供する。このプローブのセットは、ｃ−ｍｙｃに対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブを含み、またはこれらから構成されている。
【００４８】
遺伝子座特異的プローブとして使用するのに適したプローブは、遺伝子を含有している染色体上の特定領域に対してハイブリダイズする。遺伝子ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）に対する遺伝子座特異的プローブは８番染色体上のｑ２４（すなわち、８ｑ２４）の遺伝子ｃ−ｍｙｃのすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得る。遺伝子ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブは２０番染色体上のｑ１３（すなわち、２０ｑ１３、具体的には２０ｑ１３．２）のＡＵＲＫＡ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得る。ＡＵＲＫＡのクローンはテキサス大学のＭ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒから入手可能である。或いは、２０ｑ１３のすべてまたは一部、及び２０ｑ１３の片側または両側の隣接領域に対してハイブリダイズするプローブを使用してもよい。前記プローブは、例えば１７．５ｋｂ  ＺＮＦ２１７遺伝子のすべてまたは一部及び／または２０ｑ１２に位置しているＤ２０Ｓ１０８遺伝子座のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得る。
【００４９】
染色体プローブとして使用するのに適したプローブは染色体のセントロメアに関係する反復ＤＮＡとハイブリダイズする。霊長類染色体のセントロメアは、α−サテライトＤＮＡと称される約１７１塩基対（ｂｐ）のモノマー反復長から構成されているＤＮＡの長タンデムリピートの複合ファミリーを含んでいる。染色体プローブは典型的には約５０〜１×１０５ヌクレオチド長である。より長いプローブは典型的には約１００〜５００ヌクレオチド長の小さい断片からなる。７番染色体に対するプローブは７番染色体のセントロメアに位置しているα−サテライトＤＮＡに対してハイブリダイズし得、１７番染色体に対するプローブは１７番染色体のα−セントロメアに位置しているα−サテライトＤＮＡに対してハイブリダイズし得る。前記プローブの例にはＣＥＰ７及びＣＥＰ１７が含まれる。
【００５０】
染色体領域または小領域を標的とする染色体エニュメレータープローブ（ＣＥＰ）及び遺伝子座特異的プローブは市販されているかまたは当業者により容易に作成され得る。前記プローブはＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（イリノイ州デスプレーンズ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（オレゴン州ユージーン）、またはＣｙｔｏｃｅｌｌ（英国オックスフォードシャー）から入手可能である。染色体プローブは、例えばタンパク質核酸（ＰＮＡ）、クローン化ヒトＤＮＡ（例えば、プラスミド）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、及びヒトＤＮＡ配列のインサートを含有しているＰｌ人工染色体（ＰＡＣ）から作成できる。関心領域はＰＣＲ増幅またはクローニングにより得られ得る。別の実施形態では、染色体プローブはオリゴプローブであり得る。或いは、染色体プローブは当業界で公知の方法に従って合成され得る。
【００５１】
特定の遺伝子座のターゲッティングが所望される場合には、必須ではないが、標的される遺伝子の全長に沿ってハイブリダイズするプローブが好ましいことがある。遺伝子座特異的プローブは、その遺伝子異常が転移と相関している癌または腫瘍抑制遺伝子、例えばｃ−ｍｙｃにハイブリダイズするように設計され得る。
【００５２】
プローブは当業界で公知の方法により作成され得る。プローブは合成しても、組換え産生させてもよい。
【００５３】
好ましくは、プローブは検出可能に標識されており、２個以上のプローブを同一サンプルに対して同時にまたは順次使用する場合には各プローブが別個に標識されていることが好ましい。好ましくは、プローブは蛍光体で検出可能に標識されており、２個以上のプローブを同一サンプルに対して同時にまたは順次使用する場合には各プローブが別個に蛍光体で標識されていることが好ましい。好ましい蛍光体の例には、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート、テトラメチルローダミン−６−イソチオシアネート、５−カルボキシルテトラメチルローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、Ｎ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−３−インダセンプロピオン酸、エオシン−５−イソチオシアネート、エリスロシン−５−イソチオシアネート、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシファーイエロー及びＣＡＳＣＡＤＥブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）が含まれるが、これらに限定されない。使用する特定標識は重要でない。しかしながら、特定標識がプローブのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他のプローブ上の標識の検出を妨害しないことが望ましい。標識がアッセイの感受性を最大限とし、バックグラウンドシグナルを超えて検出され得るようにできるだけ少ないコピー数で検出され得ることが望ましい。また、標識が高局在シグナルを与え、これにより高度の空間分解能を与えることが望ましい。
【００５４】
核酸プローブへの蛍光体の結合は当業界で公知であり、利用可能な手段により実行され得る。蛍光体は例えば特定ヌクレオチドに共有結合され得、標識されているヌクレオチドは標準技術、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミング（Ｒｉｇｂｙら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３：２３７（１９９７））、ＰＣＲラベリング、エンドラベリング、シトシン残基のような特定残基の化学修飾による直接ラベリング（米国特許Ｎｏ．５，４９１，２２４）等を用いてプローブに取り込まれ得る。或いは、蛍光体は、例えばアミノ交換されているプローブのデオキシシチジンヌクレオチドに対してリンカーを介してプローブに取り込まれている活性化リンカー腕を用いてヌクレオチドに共有結合され得る。プローブのラベリング方法は米国特許Ｎｏ．５，４９１，２２４及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ”，ｐｐ．２１−４０，Ｆａｎ，Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）に記載されており、これらはいずれもプローブのラベリングを説明するために参照により本明細書に組み入れられる。
【００５５】
当業者は蛍光体の代わりに他の物質または染料が標識含有部分として使用され得ることを認識している。発光物質には、例えば放射線発光性、化学発光性、生物発光性及び燐光性標識含有部分が含まれる。可視光で検出可能な物質にはシアニン染料が含まれる。或いは、間接手段により可視化される検出部分を使用してもよい。例えば、プローブを当業界で公知のルーチンな方法を用いてビオチンまたはジゴキシゲニンで標識し、その後検出のために更に加工してもよい。ビオチン含有プローブの可視化はその後検出可能なマーカーにコンジュゲートしたアビジンを結合することにより実行され得る。検出可能なマーカーは蛍光体であり得、この場合プローブの可視化及び識別は下記するように実行され得る。
【００５６】
或いは、標的領域にハイブリダイズした染色体プローブは、標識部分を不溶の着色生成物を生じさせるために適当な基質と酵素反応させることにより可視化され得る。各プローブは別個の標識部分を選択することによりセット内の他のプローブから区別され得る。セット内のビオチン含有プローブは、その後アルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたアビジン及び適当な基質とインキュベートすることにより検出され得る。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラビリウム（ＮＢＴ）がアルカリホスファターゼに対する基質として役立ち、ジアミノベンゾエートがＨＲＰに対する基質として役立つ。
【００５７】
キット
キットも提供する。このキットは、（ａ）患者における膀胱癌の診断またはその再発のモニタリングを可能にするプローブのセット及び（ｂ）患者において膀胱癌の診断またはその再発のモニタリングのための説明書を含む。前記プローブのセットは、ｃ−ｍｙｃに対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＵＲＫＡに対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブを含み、またはこれらから構成されている。前記説明書は患者から得た尿路上皮細胞のサンプル中の染色体異常の存在を調べることを含み、前記プローブの少なくとも２個に関わる染色体異常の存在は該患者が膀胱癌を有していることを示す。前記キットは更にブロッキング剤または他のプローブ、プローブの検出を容易とするための各種標識またはラベリング剤、ハイブリダイゼーションのための試薬（例えば、緩衝剤）、中期スプレッド等を含み得、またはこれらから構成され得る。
【実施例】
【００５８】
下記実施例は本発明を説明するのに役立つ。実施例は特許請求されている発明の範囲を限定すると決して意図されない。
実施例１
本実施例は、ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３、具体的には２０ｑ１３．２）に対する遺伝子座特異的プローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブを含むプローブセットを用いる標本スライドの分析を記載する。
【００５９】
尿路上皮細胞の各サンプルをＴｈｉｎＰｒｅｐバイアル（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）中に入れ、２０ｍＬの容量とするためにバイアルにＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州ベッドフォード）を添加した。サンプル作成のためにＴｈｉｎＰｒｅｐ  Ｔ−２０００プロセッサー（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用した。スライドを作成し、室温で９５％脱水剤中に３０分間浸した。その後、ハイブリダイゼーション前にスライドをベンチトップに対して立て向きに約３０分間〜１時間乾燥させた。スライドを光学顕微鏡の下で細胞性及び核形態について評価した。
【００６０】
ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）に対する遺伝子座特異的プローブを赤色に標識し、ＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブは金色に標識し、７番染色体に対するセントロメアプローブは緑色に標識し、１７番染色体に対するセントロメアプローブは水色に標識した。
【００６１】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のために以下のプロトコルを使用した。スライドを２×ＳＳＣ中に７２℃で２分間、０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌ  ペプシン（１０ｍＭ  ＨＣｌ中）中に３７℃で１０分間、１×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液）中に室温で５分間、１％ＮＢＦ中に室温で５分間、１×ＰＢＳ中に室温で５分間、７０％エタノール中に室温で１分間、８５％エタノール中に室温で１分間、１００％エタノール中に室温で１分間入れた後、風乾させた。風乾させた後、各スライドを５μＬのプローブミックスと接触させ、１８×１８ｍｍカバーガラスで覆った。スライドをＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ変性／ハイブリダイゼーションシステム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デスプレーンズ）を用いて７３℃で２分間共変性し、３７℃で一晩（１６〜２４時間）ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、スライドを０．３％ＮＰ４０を含む０．４×ＳＳＣを用いて７３℃で２分間、０．１％ＮＰ４０を含む２×ＳＳＣを用いて室温で１分間洗浄した。次いで、ＤＡＰＩ  ＩＩをスライドに添加し、スライドを２４×３０ｍｍカバーガラスで覆った。スライドを赤色、金色、緑色、水色及びＤＡＰＩフィルターを用いて蛍光顕微鏡法により観察した。
【００６２】
スライドをＩｋｏｎｉｓｙｓ自動化スキャニングシステム（Ｉｋｏｎｉｓｙｓ，Ｉｎｃ．，コネチカット州ニューヘイブン）を用いてスキャンした。データを表Ｉに示す。
【００６３】
【表１】
0006284487.tif 000002
【００６４】
プローブパネルの感受性は、癌としてＰＵＮＬＭＰを含めて７６．２％（４８／６３）（９５％信頼区間）、癌としてＰＵＮＬＭＰを除いて７６．３％であった。プローブパネルの特異性は８６．８％（４６／５３）（９５％信頼区間）であった。
【００６５】
２１個は高悪性度、２８個は低悪性度、２個は不明及び７個はＰＵＮＬＭＰから構成した５８個の生検で確認された標本のうち５２個についてもプローブパネルを用いて検査した。４７／５２標本について診断が確認され、５／５２標本について否定された。
【００６６】
明細書中に挙げられているすべての特許明細書、出願公開明細書、論文、教科書及び他の刊行物は本発明が関係する当業者の技術レベルを示している。前記刊行物はすべて、各々の刊行物が具体的に、個々に参照により組み入れられると示されているのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【００６７】
好適には、本明細書中に例示的に記載されている発明は本明細書中に具体的に開示されていない要素または限定なしで実施され得る。よって、例えば、用語「含む」、「本質的に構成される」及び「構成される」の各々は他の２つの用語のいずれかで置換され得る。同様に、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈上そうでないとする明白な指示がない限り複数も含む。よって、例えば、「方法」に対する言及は本明細書中に記載されている及び／または開示内容を読むと当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法及び／またはステップを含む。
【００６８】
使用されている用語及び表現は説明の用語として、限定せずに使用されている。これに関して、ある用語が「定義」の欄で定義されており、「詳細説明」中の他のところで他の方法で規定、記載または検討されている場合、これらの規定、記載及び検討のすべてが前記用語に属していると意図される。示され、記載されている要件またはその一部の均等物を除外する前記用語及び表現の使用も意図していない。更に、副題、例えば「定義」が「詳細説明」中に使用されているが、その使用は単に参照を容易とするためであり、１つの欄でなされている開示内容をその欄のみに限定すると意図されない。むしろ１つの副題の下でなされている開示内容は他の副題のそれぞれの下の開示内容を構成すると意図される。
【００６９】
各種修飾が特許請求されている発明の範囲内で可能であることが認識されている。よって、本発明が好ましい実施態様及び任意の要件に関連して具体的に開示されているが、当業者は本明細書中に開示されている概念の修飾及び変更を用いることができる。前記修飾及び変更は本明細書中で特許請求されている発明の範囲内であると見なされる。