(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体由来試料において、ＤＪ−１タンパク質のアイソフォームの発現レベルを測定する測定工程を含み、血清中のＤＪ−１タンパク質濃度が、１００ｎｇ／ｍＬ以上の被験体に対して行うことを特徴とする被検体由来試料の乳癌検出方法。
【請求項２】
上記測定工程が、被検体由来試料中のＤＪ−１タンパク質のアイソフォームの濃度を測定する工程である、請求項１に記載の乳癌検出方法。
【請求項３】
上記被検体由来試料が血清である、請求項１または２に記載の乳癌検出方法。
【請求項４】
上記ＤＪ−１タンパク質が、等電点6.3のアイソフォーム（isoform）を含む複数のアイソフォームを含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の乳癌検出方法。
【請求項５】
被検体由来試料において、ＤＪ−１タンパク質のアイソフォームの発現レベルを測定する測定工程を含み、２次元電気泳動後ウェスタンブロットで検出できるＤＪ−１タンパク質のスポットのうち、等電点が６．３のスポットの発現強度を指標にすることを特徴とする被検体由来試料の乳癌検出方法。
【請求項６】
上記測定工程が、被検体由来試料中のＤＪ−１タンパク質のアイソフォームの濃度を測定する工程である、請求項５に記載の乳癌検出方法。
【請求項７】
上記被検体由来試料が血清である、請求項５または６に記載の乳癌検出方法。
【請求項８】
上記ＤＪ−１タンパク質が、等電点6.3のアイソフォーム（isoform）を含む複数のアイソフォームを含むことを特徴とする請求項５ないし７のいずれか１項に記載の乳癌検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌の選択的な検出に用いられる新規乳癌検出用血清腫瘍マーカー、当該新規乳癌検出用血清腫瘍マーカーを検出するための検出手段を備える乳癌検出キット、および当該新規乳癌検出用血清腫瘍マーカーを検出する工程を含む乳癌検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は年々増加の一途をたどり、日本人女性の４人に一人は乳癌を発症する時代が到来した。画像診断の技術革新には目覚ましいものがあり、乳癌の診断精度は向上している。その結果、乳管内病変や新たな前癌状態が、早期の乳癌とともに発見された。
【０００３】
乳腺新生物の生物学的あるいは医学的性格がより鮮明になるにつれて個別化治療も進歩する一方で、乳癌のスクリーニングに足るバイオマーカーは存在しない。タンパク質を検出する方法は出願されているものの十分な特異性があるとは言えず、予後の診断に使用しうるものではなかった（例えば、特許文献１、特許文献２）。
【０００４】
社会における女性の活躍が目覚ましい昨今、前癌状態や早期癌も含めて、容易にスクリーニングすることが可能な血清マーカーの開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５０７６９４号公報
【特許文献１】特表２００７−５０７６９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のとおり、従来公知の血清腫瘍マーカーによっては、乳癌の早期発見が困難であり、さらに偽陽性や偽陰性が生ずる、予後の予想が困難等という問題があった。つまり、早期の乳癌の検出が可能な特異性の高い血清腫瘍マーカーはこれまでに知られていなかった。それゆえ、早期の乳癌の検出が可能な特異性の高い血清腫瘍マーカーの開発が望まれていた。
【０００７】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、乳癌の選択的な検出に有効な血清腫瘍マーカー、乳癌を選択的に検出するためのキット、および当該血清腫瘍マーカーを用いた乳癌の特異性の高い検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願によれば、以下の発明が提供される。
【０００９】
（１）ＤＪ−１タンパク質を含む乳癌検出用血清腫瘍マーカー。
【００１０】
（２）前記ＤＪ−１タンパク質が、等電点（ｐＩ）6.3のアイソフォーム（isoform）を含む複数のアイソフォームを含むことを特徴とする乳癌検出用血清腫瘍マーカー。アイソフォーム（イソフォーム、イソ型ともいう）とは、同じタンパク質の異なる形をいう。例えばＳＤＳ―ＰＡＧＥで１個のスポットであっても、等電点電気泳動すれば、数個のスポットに分かれる場合がある。本願発明は、このアイソフォームの発現パターンを検出することにより乳癌を検出するものである。
【００１１】
（３）ＤＪ−１タンパク質のアイソフォームの発現を検出するための検出手段を含むことを特徴とする乳癌検出キット。
【００１２】
（４）前記検出手段がＤＪ−１タンパク質のアイソフォームと特異的に相互作用する物質であることを特徴とする（３）に記載の乳癌検出キット。
【００１３】
（５）前記ＤＪ−１タンパク質と特異的に相互作用する物質が抗ＤＪ−１抗体であることを特徴とする（４）に記載の乳癌検出キット。
【００１４】
（６）前記検出手段が、ｐＩ6.3のアイソフォーム（isoform）を含む複数のアイソフォームを検出するための検出手段を含むことを特徴とする（３）ないし（５）のいずれか１に記載の乳癌検出キット。
【００１５】
（７）被検体由来試料において、ＤＪ−１タンパク質のアイソフォームの発現レベルを測定する測定工程を含むことを特徴とする被検体由来試料の乳癌検出方法。
【００１６】
（８）上記測定工程が、被検体由来試料中のＤＪ−１タンパク質のアイソフォームの濃度を測定する工程である、（７）に記載の乳癌検出方法。
【００１７】
（９）上記被検体由来試料が血清である、（７）または（８）に記載の乳癌検出方法。
【００１８】
（１０）上記ＤＪ−１タンパク質が、等電点6.3のアイソフォームを含む複数のアイソフォームを含むことを特徴とする（７）ないし（９）のいずれか１に記載の乳癌検出方法。
【００１９】
（１１）血清中のＤＪ−１タンパク質濃度が、１００ｎｇ／ｍＬ以上の被験者に対して行うことを特徴とする（７）ないし（１０）のいずれか１に記載の乳癌検出方法。
【００２０】
ここで、本発明の乳癌検出方法に適する血清中のＤＪ−１タンパク質の濃度は、４０ｎｇ／ｍＬ以上が好ましく、より好ましくは、５０ｎｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは、７０ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは１４０ｎｇ／ｍＬ以上である。血清中のＤＪ−１タンパク質濃度が少ない場合は、血清タンパク質を濃縮することで検出することができる。
【００２１】
（１２）２次元電気泳動後ウェスタンブロットで検出できるＤＪ−１タンパク質のスポットのうち、等電点が６．３のスポットの発現強度を指標にすることを特徴とする（７）ないし（１１）のいずれか１に記載の乳癌検出方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の乳癌マーカーによれば、血清中のDJ-1タンパク質のアイソフォームを２次元電気泳動とウェスタンブロットにより検出することで精度よく乳癌マーカーを検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は乳腺組織におけるＤＪ−１の免疫染色（Ａ，Ｃ，Ｅ）およびｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ，Ｄ，Ｆ）の図である（実施例１）。
【図２】図２は乳癌の担癌患者B１２８の２次元電気泳動のウェスタンブロットとそのスポットの濃度を数値化した図である（実施例３）。
【図３】図３は花粉症の患者で、乳癌検診では異常を認めなかったC２５３の２次元電気泳動のウェスタンブロットとそのスポットの発現強度を数値化した図である（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本願にかかる発明は、血清中のＤＪ−１タンパク質のアイソフォームを検出することにより、乳癌を検出する血清腫瘍マーカー、検出キット、検出方法である。
本願明細書において、「乳癌」とは、乳房組織に発生する癌腫であり、好ましくは悪性である。「悪性」とは、浸潤や転移をきたし、臨床的に死に至らしめる性質を有することを意味する。
【００２５】
本願にかかる発明によれば、予後の悪い悪性腫瘍の乳癌を検出することができる。
ＤＪ−１遺伝子は、新規癌遺伝子として発見され、その後Parkinson  disease(PARK)7として家族性のパーキンソン病の原因遺伝子として再発見された。ＤＪ−１タンパク質は多機能タンパク質であるが、主な機能は、様々な酸化ストレスから細胞を保護するために応答する。
【００２６】
乳癌細胞においては、ＤＪ−１はほとんど全ての症例でmRNAの発現が亢進している。これに対してタンパク質レベルでは、約半数の症例で低発現を示しており、mRNAレベルとの乖離がみられた。この様な発現パターンを示す乳癌細胞株を検討したところ、ＤＪ−１タンパク質が培養液中に分泌していた。実際に、乳癌患者の乳汁分泌液中には、高濃度のＤＪ−１タンパク質が認められ、in vivoにおいても乳癌細胞はＤＪ−１タンパク質を分泌することが推察された。
【００２７】
また、既存のＥＬＩＳＡキットを用いてＤＪ−１タンパク質を検出した場合、良性腫瘍と悪性腫瘍の区別については、ＤＪ−１のタンパク質レベルには有意差が見られなかった。
新規のＥＬＩＳＡキット（ＣｉｒｃｕＬｅｘ）を用いた場合には、未治療例の良性腫瘍と悪性腫瘍の区別が可能な場合もある。
【００２８】
従ってしかしながら、従来のＤＪ−１タンパク質を検出する方法では、乳癌患者の約半数が陰性となり、新規のＥＬＩＳＡキット（ＣｉｒｃｕＬｅｘ）を用いても良性、悪性の区別もつかないことから実際の医療現場におけるバイオマーカーとして使用することは難しかった。
【００２９】
そこで、本発明者らは、ＤＪ−１の血清濃度が140ng/mL（2SD）を超える異常高値を示す21例について、２−Ｄウェスタンブロット法によりアイソフォームを検討した。ＤＪ−１タンパク質の３つの主なアイソフォームに着目して検討したところ、担癌症例13例全例で、最もアルカリよりのスポット（ｐＩ6.3付近）の強度が最も高く、非担癌症例6例では逆に酸性のスポットの強度が最も高いことを見出した（図２および図３参照）。
【００３０】
これらの知見から、ＤＪ−１の血清濃度が、140ng/mL（2SD）を超える異常高値を示す患者においては、２−Ｄウェスタンブロット法により、最もアルカリよりのスポット（等電点６．３のスポット）の発現強度を測定することにより、高い精度で乳癌の検出ができることを見出し、発明を完成した。
【００３１】
すなわち、本願発明は、ＤＪ−１の血清濃度が高い患者において、血清タンパク質を調製し、２−Ｄウェスタンブロット法により、アイソフォームのパターンを検出することにより、乳癌を検出する方法を提供する。
ここで、「ＤＪ−１の血清濃度が高い」とは、血清中のＤＪ−１タンパク質の濃度が、４０ｎｇ／ｍＬ以上をいい、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは１４０ｎｇ／ｍＬ以上である。
【００３２】
また、本願発明はＤＪ−１の血清濃度が異常高値を示す患者に限られず、２−ＤウェスタンブロットでＤＪ−１タンパク質が血清中に分泌されていることが検出できる患者においてもそのスポットパターンにより乳癌を検出できるため、血清マーカーを用いて簡便に乳癌を検出することができる。血清中のＤＪ−１タンパク質濃度があまり高くない場合は、タンパク質を濃縮して２Ｄウェスタンブロット法を行うことにより、スポットパターンを検出することで、乳癌を検出することもできる。
【００３３】
本願において、ＤＪ−１タンパク質のアイソフォームとは、抗ＤＪ−１抗体によりバンドまたはスポットとして検出されるタンパク質をいう。２−Ｄウェスタンブロット法により３ないし７程度のアイソフォームのスポットが検出される場合が多いが、より少ない場合や多い場合もありうる。
【００３４】
ＤＪ−１の検出スポット中、等電点６．３のスポットの発現強度が強ければ、乳癌を検出したと判定できる。この場合、等電点６．３のスポット強度が他のスポットに比べて１．５倍以上強ければ乳癌を検出したと言える。他のスポットが検出されている場合でも、等電点６．３のスポットが有意差を持って検出できれば、乳癌を検出したと言える。
本願の２−Ｄウェスタンブロット分析に用いる、ＤＪ−１と特異的に相互作用する物質としては、ＤＪ−１タンパク質に結合し、その後の２次抗体による発色や発光に問題を起こさない物質であれば特に制限なく使用できる。例えば、ＤＪ−１タンパク質と特異的にタンパク質―タンパク質相互作用をするタンパク質や、特異的なアプタマー等があげられる。
【００３５】
典型的には、ＤＪ−１と特異的に相互作用する物質は抗体が好ましい。抗体としては、ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体のいずれであってもよいが、等電点６．３のＤＪ−１タンパク質のアイソフォームを検出できる抗体である必要がある。本願発明は、等電点６．３のＤＪ−タンパク質のアイソフォームを検出することにより乳癌を検出するシステムだからである。
【００３６】
ＤＪ−１検出抗体としては、ＤＪ−１の等電点６．３のアイソフォームのみを検出する抗体でも使用できるが、本願発明においては、パターンにより乳癌を検出するので、図３のように複数のスポットを検出できる抗体が好ましく用いられる。
【００３７】
このようなＤＪ−１特異的抗体は、マウス、ウサギ等を用いて、ＤＪ−１タンパク質をアジュバントとともに注射して免疫することにより作成することができる。抗原となるＤＪ−１タンパク質は、ＤＪ−１遺伝子（ＮＣ＿０１８９１２．２，ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１３１５）を大腸菌、枯草菌、酵母等に導入、発現させ、菌体から回収し、精製して用いることができる。あるいは、菌体外に分泌生産させて培地から回収することも可能である。
また、抗原となる部位を塩基配列から推定したアミノ酸の表面に出ている部分のペプチド配列を化学合成して抗原として使用することもできる。
【００３８】
本願発明の適用範囲は、ヒトに限らず、イヌ、ネコ等のペットの乳癌の検出にも適用できる。
【実施例１】
【００３９】
乳腺組織におけるＤＪ−１の免疫染色(A, C, E)およびin situ  hybridization (B,D,F)を行った。A, B: 正常乳管、C, D: 強発現を示す乳癌症例、E, F: 低発現を示す乳癌症例（図１）。
ＤＪ−１の免疫染色の、E, F症例の如くタンパク質とmRNAレベルとの乖離がみられる症例では、乳汁内のＤＪ−１タンパク質の濃度が高かった。この発現パターンを示す乳癌は、増殖能が高く、臨床病理学的検討でも予後不良であることを見出した。
【００４０】
（実施例２）
（対象）
2011年1月から2013年6月の間、東京医科大学病院、東京医科大学茨城医療センター、および防衛医科大学校病院にて乳腺疾患の精査目的にて来院した患者より採取された血液365例、および霞ヶ浦成人病研究事業団医療センター検診センターより健康診断目的にて訪れた健常女性より採取された300例の血液の、合計665例を対象とした。
【００４１】
（方法）
ELISA法にて血中総ＤＪ−１濃度を測定した。血清を10倍希釈し、各々3回測定した平均値を測定値として採用した。ELISA法はDJ-1/PARK7 ELISA kit (CircuLex, Ina, Japan)を用いてサンドイッチ法を行った。濃度が140ng/mL (2SD)を超えた症例について2次元電気泳動後、Western blot法を行い、ＤＪ−１のisoformを検討した。Western blot法では、スポットの位置決めをするために金コロイド法にて転写されたPVDF膜上のタンパク質を可視化した。Western blot法は蛍光発色を行い、LAS3000（Fuji film）とGEヘルスケアのdecyderを用いて発現を検出・同定した。
【００４２】
総 ＤＪ−１ 濃度
乳癌の精査・治療目的にて訪れた患者血清365例のうち、328例で癌の診断がなされた。残る27症例は線維腺腫あるいは乳腺症などであった。担癌症例のＤＪ−１濃度の平均は38.9ng/mLで、良性症例の平均値は21.4ng/mLで、担癌患者で高値を示したが、両者に明らかな有意差はみられなかった。
腫瘍組織において、ＤＪ−１タンパク質の発現が減弱している症例（分泌パターン）では、保たれている症例に比べて有意に高い血中濃度を示した。（P=0.025）検診者より採取された300例では、マンモグラフィーによる一次スクリーニングで55名が乳癌の精査を行い、乳癌はいずれにも発見されなかった。健常者の平均濃度は31.5ng/mLであった。
【００４３】
検診者血清にも、異常高値を示す症例が認められることから、総ＤＪ−１濃度は全身の生体反応に影響されることがわかった。これらの症例はＤＪ−１の多機能性が強く示唆される症例と考えられた。
【００４４】
（実施例３）
２−Ｄウェスタンブロット法
そこで、ＤＪ−１の血清濃度が140ng/mL（2SD）を超える異常高値を示す21例を２−Ｄウェスタンブロット法によりアイソフォームを検討した。血清にＳＤＳサンプルバッファーを5倍量添加し、加熱後2次元電気泳動によりタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜に転写後、抗ＤＪ−１抗体（CircuLex社製）を結合させ、さらに標識２次抗体を結合させて、化学蛍光の発光によりＤＪ−１のアイソフォームを検出した。
【００４５】
21例のうち担癌症例は13例で、非担癌症例は8例であった。このうち、担癌症例ではスポットが同定された。３つの主なアイソフォームに着目し、担癌症例13例全例で、最もアルカリよりのスポット（ｐＩ6.3）の強度が最も高く、非担癌症例6例では逆に酸性のスポットの強度が最も高かった（図２および図３参照）。
【００４６】
担癌症例13例では、遠隔転移（脳、骨、肝臓、胃）を来していた症例が５症例で、T4（腫瘍の広がりが高度）症例が３例あり、進行した癌が多く含まれていた。またtriple negativeの症例が2例みられ、いずれも予後不良の腫瘍であった。よって、本発明によれば、予後不良の腫瘍を検出できると考えられる。
【００４７】
非担癌症例では、高血圧、貧血、リウマチ、アレルギーあるいは甲状腺機能亢進症の現病歴があり、8人中6人までが内服治療中であった。
【００４８】
B128:症例は、遠隔転移がみられた進行性乳癌である。採血は未治療の状態で行われた。図２のピーク１で、高い発現を認めた。図２の右の上下の図は、検出機器の異なる同じ検体（血清タンパク質を転写後のＰＶＤＦ膜を抗ＤＪ−１抗体と反応させた。）である。
【００４９】
C253: 花粉症の患者で、乳癌検診では異常を認めなかった。最もpH4よりに最も強い反応を認めた（図３）。図３の右の上下の図は、図２同様、検出機器の異なる同じ検体（血清タンパク質を転写後のＰＶＤＦ膜を抗ＤＪ−１抗体と反応させた。）である。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、従来検出が困難であった乳がんの腫瘍マーカーをより正確に検出でき、より精度の高い検出が可能になる。これにより医療産業に利用可能である。
【符号の説明】
【００５１】
１    ｐＩ６．３のスポット
２    酸性側のスポット
３    酸性側のスポット
４    酸性側のスポット
【図１】
0006403486.tif 000002
【図２】
0006403486.tif 000003
【図３】
0006403486.tif 000004