(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）０．５から１５％を含む重量／体積濃度で、２００００（２０Ｋ）から５００００（５０Ｋ）を含む分子量のポリエチレングリコール；
（ｂ）一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤
0006374954.tif 000008
[ここで、ｎは５から４０を含み、前記界面活性剤は０．１％から２．０％を含む体積／体積濃度である]；並びに
（ｃ）液体担体、結合剤及び印刷に適した添加剤から選択される一又は複数の成分
を含み、
生体分子、生体分子マーカー又はマーカーとコンジュゲートした生体分子からなる群より選択される分子を含む、インク組成物。
【請求項２】
界面活性剤のｖ／ｖ濃度が０．１から１．０％を含む、請求項１に記載のインク組成物。
【請求項３】
ポリエチレングリコールの重量／体積濃度が６から８％を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
ポリエチレングリコールが３５０００（３５Ｋ）の分子量を有し、重量／体積濃度が６から８％を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
一般式（Ｉ）の界面活性剤が、ｎが９から１０を含む値を有するものである、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
一般式（Ｉ）の界面活性剤が０．１から１．０％を含む体積／体積濃度である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
一般式（Ｉ）の界面活性剤が１．０％の体積／体積濃度である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
一般式（Ｉ）の界面活性剤が０．１％の体積／体積濃度である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
（ａ）１０％の重量／体積濃度％で２００００の分子量のポリエチレングリコール；及び１．０％の体積／体積濃度％でｎ＝９−１０である一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤；あるいは、
（ｂ）７．５％の重量／体積濃度％で３５０００の分子量のポリエチレングリコール；及び１．０％の体積／体積濃度％でｎ＝９−１０である一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤；あるいは
（ｃ）５％の重量／体積濃度％で４００００の分子量のポリエチレングリコール；及び１．０％の体積／体積濃度％でｎ＝９−１０である一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤
を含む、請求項１に記載のインク組成物。
【請求項１０】
液体担体及び印刷のための添加剤を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
添加剤がｐＨ緩衝液である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ｐＨ緩衝液がアルカリ性リン酸緩衝液である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
液体担体が水である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
分子を基質上にインクジェット印刷するための請求項１から１３に記載の組成物の使用であって、前記分子が生体分子、生体分子マーカー又はマーカーとコンジュゲートした生体分子からなる群より選択される、使用。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物で印刷された基質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インクジェット印刷及び分子生物学に関する。特に、本発明は、基質上のアミノ酸、ペプチド及び／又はタンパク質等の、生物学的重要性のあるインクジェット印刷分子に有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インクジェット印刷は、多孔質表面上にテキスト及び画像を印刷するために広く使用される印刷方法である。
【０００３】
近年、インクジェット印刷技術は、核酸又はタンパク質アレイを開発するために、生物学の分野に適用されてきている。
【０００４】
遺伝子チップは、およそ１００μｍの分解能を有するペン先が割れた（それにより希釈溶液の液滴が回収され、前処理されたホイル上に沈着する）万年筆を使用して、典型的に生成される。したがって、ＤＮＡは基質に共有結合する。ＤＮＡライブラリーがフィルム一式に印刷されるのを可能にするロボットシステムも記載されている。加えて、ガラス上に、イムノアッセイに関するポリカーボネートＣＤ上の抗原の円形アレイ、及び濾紙上の酵素アレイに、それらを印刷するための明らかなＤＮＡ分解のない「バブルジェット」印刷方式を使用した３００ｄｐｉでＤＮＡを膜上に沈着させるための従来のプリンターが記載されている。オリゴヌクレオチドの沈着のための代替的なものは、スライドに滴下される全液滴中のｉｎ ｓｉｔｕでの目的のＤＮＡの合成のための試薬の印刷である。コンビナトリアル化学の要件を満たすために、異なるタンクからの４８の異なる試薬を可能にする制御バルブを備えたインクジェットプリンターが開発された。
【０００５】
インクジェット印刷技術は、バイオセンサーの製造にも適用されてきた。
【０００６】
印刷及び結合プロセスが変性及びタンパク質の機能の損失を引き起こしてはならないため、タンパク質アレイは、核酸のそれらよりもより問題である。
【０００７】
組織工学において、またポリマー表面の修正において、その他追加的に適用され、それは細胞が局所的に結合するのを許可し又は妨げる。懸濁液中の細胞の直接的なインクジェット印刷も実証されてきた。
【０００８】
しかしながら、上述されているように、分子生物学の分野に応用されるインクジェット印刷を使用することの主な限定のうちの一つは、印刷される成分（核酸、タンパク質、細胞等のいずれか）の変性／機能の損失を妨げることである。
【０００９】
更に、印刷のための組成物が粘度及び表面張力の一定のパラメーターを満たす必要があることが考慮されるべきである。インクの粘度は、インクが注入される経路がおよそ１００μｓで満たされることが可能となる程度に十分低くなければならない。しかしながら、表面張力は、インクが滴り落ちることなくノズルにとどまることが可能となる程度に十分高くある必要がある。インクの設計における重要な態様は、「最初の一滴」の問題である。
【００１０】
したがって、分子生物学の分野に関するインクジェット印刷おける進歩にも関わらず、印刷される分子の安定性及び適用される基質に対する結合に悪影響を及ぼすことのない、印刷で使用するための好適な表面張力及び粘度パラメーターを提示する組成物を発見する必要がある。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の発明者は、印刷に使用するためのインク組成物を開発し、これは上の背景技術で言及した問題を解決する。
【００１２】
したがって、第一の態様において、本発明は、
（ａ）０．５から１５重量／体積％に含まれる濃度で、２００００（２０Ｋ）から５００００（５０Ｋ）に含まれる分子量のポリエチレングリコール；
（ｂ）一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤
0006374954.tif 000002
[ここで、ｎは５から４０に含まれる]前記界面活性剤は０．１％から２．０体積／体積％に含まれる濃度である；並びに
（ｃ）液体担体、結合剤及び印刷のための添加剤から選択される一又は複数の成分
を含むインク組成物を提供する。
【００１３】
特に、発明者は、２０−５０Ｋの範囲内の分子量を有し、０．５から１５重量／体積％に含まれる範囲の濃度を有するポリエチレングリコールを含む組成物が、（ａ）１０−１３ｍＰａ・ｓの値に調整される粘度；（ｂ）球状の、得られる均一な液滴（図１に示される）；（ｃ）増加する液滴の乾燥動力学、及び（ｄ）最小限にされる、例えば「コーヒーリング効果」等の望ましくない効果（図１及び図２を参照のこと）を可能にすることを発見した。この効果は、液滴中の溶媒のエバポレーション及び機能材料粒子の縁に対する変位の結果であり、均一インク層ではなくリングを生じさせる。
【００１４】
第一の態様において、本発明は、
（ａ）０．５から１５重量／体積％に含まれる濃度で、２００００（２０Ｋ）から５００００（５０Ｋ）に含まれる分子量のポリエチレングリコール；
（ｂ）一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤
0006374954.tif 000003
[ここで、ｎは５から４０に含まれる]前記界面活性剤は０．１％から１．０体積／体積％に含まれる濃度である；並びに
（ｃ）液体担体、結合剤及び印刷に適した添加剤から選択される一又は複数の成分
を含むインク組成物を提供する。
【００１５】
加えて、本発明の発明者は、式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤を０．１％から１．０体積／体積％の濃度範囲で含むことにより、表面張力がインクジェット印刷に理想的なおよそ３５ｍＮ／ｍに調整され得ることを発見した。更に、以下に示されるように、一般式（Ｉ）の界面活性剤の濃度が１％体積を超える場合、インクの質は悪化し、したがって、インジェクターホールを通じた注入のための液滴の適切な形成を妨げる泡の一種を生成する。
【００１６】
更に、以下に示されるように、同一濃度値に関して、インクに４５ｍＮ／ｍ超、即ちインクジェット印刷の最適範囲外の表面張力値を提供するＴｗｅｅｎ ８０等の、印刷組成物の形成に広く使用される別の界面活性剤では、一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤の包含に関連する効果は観察されなかった。したがって、Ｔｗｅｅｎ ８０が使用される場合、印刷に適した表面張力値を達成するために、他の界面活性剤が含まれることが必要であり、それは組成物調製をより高価にし、加えて、分子が基質上に印刷されることが意図される分子結合の安定性及び効率を危うくするであろう。
【００１７】
有利には、一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤の包含により、他の界面活性剤を使用して組成物の表面張力を調整する必要はなく、これはＴｗｅｅｎ ８０の使用に関する大きな進歩を意味する。
【００１８】
上に開示されているように、生物学の領域における目的の分子のインクジェット印刷の分野において、一方では、印刷に適しており（好適な表面張力及び粘度パラメーターを満たさなければならないことを意味する）、他方では、本発明の組成物の印刷が生じる基質に対して印刷される分子及びそのアンカーの安定性／活性の両方を尊重する組成物を達成することが重大である。
【００１９】
この意味において、本発明の発明者は、基質に印刷される分子の安定性又は結合に悪影響を及ぼすことなく、ある一定の範囲の分子量及び濃度でＰＥＧを含み、所定の濃度で一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤を含む第一の態様の一つのような組成物で、インクジェット印刷に適した組成物が得られることを発見した。特に、以下に提供される実験データは、マーカー、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドマーカー（生物学の分野で、バイオセンサーの開発における生体分子のマーカーとして広く使用される）が、どのようにして機能化基質に完全に固定されているかを説明する（図３を参照のこと）。加えて、蛍光性顕微鏡検査を使用することにより、一旦基質に印刷されたマーカーの蛍光性活性が、その強度の有意な劣化を伴わずに維持されることを立証することが可能である（図３を参照のこと）。本発明の組成物は、基質に印刷される分子の活性に悪影響を及ぼさないこと及びそれが基質に固定することを妨げ又は阻害しないことが示されている。
【００２０】
本発明の組成物の目的の別の著しい利点は凝集体を生成しないことであり、それは本発明の組成物に印刷に使用される理想的なプロファイルを提供する。
【００２１】
上記の全てに関して、本発明の組成物の目的は、バイオテクノロジーの分野に適用されるインクジェット印刷における突破口を示す。
【００２２】
本発明において、用語「ポリエチレングリコール」（ＰＥＧ）（ポリエチレンオキシド又はポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られる）は、式（ＩＩ）：のモノマーにより形成されるポリエーテルである。
0006374954.tif 000004
【００２３】
従来、重合度は、粘度の関数であるＫ値により特徴づけられている。重合度が大きければ大きいほど、Ｋの値は大きくなる。一実施態様において、ＰＥＧは２５０００（２５Ｋ）から５００００（５０Ｋ）の分子量を有する。別の実施態様において、ＰＥＧは２００００（２０Ｋ）から４００００（４０Ｋ）の分子量を有する。別の実施態様において、ＰＥＧは２００００（２０Ｋ）、２５０００（２５Ｋ）、３５０００（３５Ｋ）、及び４００００（４０Ｋ）からなる群より選択される分子量を有する。好ましくは、ポリエチレングリコールの分子量は３５０００（３５Ｋ）である。
【００２４】
別の実施態様において、ＰＥＧは５から１０％に含まれる重量／体積濃度の範囲内である。別の実施態様において、ＰＥＧは６から８％の重量／体積濃度である。別の実施態様において、ＰＥＧは７．５％の重量／体積濃度である。
【００２５】
別の実施態様において、ＰＥＧは３５Ｋの分子量を有し、０．５から１５％に含まれる重量／体積濃度の範囲内である。別の実施態様において、ＰＥＧは３５Ｋの分子量を有し、５から１０％に含まれる重量／体積濃度の範囲内である。別の実施態様において、ＰＥＧは３５Ｋの分子量を有し、６から８％に含まれる重量／体積濃度の範囲内である。好ましくは、ＰＥＧは３５Ｋの分子量を有し、７．５％ｗ／ｖの重量／体積濃度である。
【００２６】
本発明において、一般式（Ｉ）のアルキルアリールポリエーテルアルコールタイプの非イオン性界面活性剤は、商業的にＴｒｉｔｏｎ Ｘ（登録商標）（Union Carbide Co., Inc.の登録商標）としても知られている。例示的及び非制限的な方法において、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘシリーズの例は以下の通りである。
0006374954.tif 000005
【００２７】
好ましい実施態様において、一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるもの（商業的にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００としても知られる）である。
【００２８】
別の実施態様において、一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、０．５から２．０ｖ／ｖ％に含まれる体積／体積濃度である。別の実施態様において、界面活性剤は、０．５から１．５ｖ／ｖ％に含まれる濃度である。好ましくは、一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、１．０ｖ／ｖ％の濃度である。
【００２９】
別の実施態様において、一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、０．１から０．５ｖ／ｖ％に含まれる体積／体積濃度である。好ましくは、一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、０．１％のｖ／ｖ濃度である。
【００３０】
別の実施態様において、一般式（Ｉ）の界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から２．０％に含まれる体積／体積濃度である。別の実施態様において、一般式（Ｉ）の界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．５から１．５％に含まれる体積／体積濃度である。別の実施態様において、一般式（Ｉ）の界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、１．０％の体積／体積濃度である。
【００３１】
別の実施態様において、一般式（Ｉ）の界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から１．０％に含まれる体積／体積濃度である。別の実施態様において、一般式（Ｉ）の界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から０．５％に含まれる体積／体積濃度である。別の実施態様において、一般式（Ｉ）の界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１％の体積／体積濃度である。
【００３２】
本発明において、「重量／体積濃度％（ｗ／ｖ％）」との表現は、組成物の総体積（ミリリットルで表される）に対して加えられたポリエチレングリコールのグラムで割り、得られた値に１００を掛けて計算される。
【００３３】
本発明において、「体積／体積濃度％（ｖ／ｖ％）」との表現は、組成物の総体積に対する非イオン性界面活性剤の体積で割り（界面活性剤の体積と組成物の総体積は、どちらも同じ単位で表される）、得られた値に１００を掛けて計算される。
【００３４】
一実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、３５０００（３５Ｋ）の分子量のＰＥＧを含み、非イオン性界面活性剤はｎが９から１０に含まれるものである。
【００３５】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、０．５から１５％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から２．０％に含まれるｖ／ｖ濃度％である。
【００３６】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、０．５から１５％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から１．０％に含まれるｖ／ｖ濃度％である。
【００３７】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、５から１０％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から２．０％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００３８】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、５から１０％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から１．０％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００３９】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、６から８％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から２．０％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００４０】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、６から８％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から１．０％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００４１】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、７．５％の重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から２．０％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００４２】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、７．５％の重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から１．０％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００４３】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、０．５から１５％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．５から１．５％に含まれるｖ／ｖ濃度％である。
【００４４】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、０．５から１５％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から０．５％に含まれるｖ／ｖ濃度％である。
【００４５】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、５から１０％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．５から１．５％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００４６】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、５から１０％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から０．５％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００４７】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、６から８％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．５から１．５％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００４８】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、６から８％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から０．５％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００４９】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、７．５％の重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．５から１．５％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００５０】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、７．５％の重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１から０．５％に含まれる体積／体積濃度％である。
【００５１】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、０．５から１５％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、１．０％の体積／体積濃度％である。
【００５２】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、０．５から１５％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１％の体積／体積濃度％である。
【００５３】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、５から１０％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、１．０％の体積／体積濃度％である。
【００５４】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、５から１０％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１％の体積／体積濃度％である。
【００５５】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、６から８％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、１．０％の体積／体積濃度％である。
【００５６】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、６から８％に含まれる重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１％の体積／体積濃度％である。
【００５７】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、７．５％の重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、１．０％の体積／体積濃度％である。
【００５８】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、７．５％の重量／体積濃度％で、３５Ｋの分子量のＰＥＧを含み；一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤は、ｎが９から１０に含まれるものであり、０．１％の体積／体積濃度％である。
【００５９】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、
（ａ）１０％の重量／体積濃度％で２００００の分子量のポリエチレングリコール；及び１．０％の体積／体積濃度％でｎ＝９−１０である一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤；あるいは、
（ｂ）７．５％の重量／体積濃度％で３５０００の分子量のポリエチレングリコール；及び１．０％の体積／体積濃度％でｎ＝９−１０である一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤；あるいは
（ｃ）５％の重量／体積濃度％で４００００の分子量のポリエチレングリコール；及び１．０％の体積／体積濃度％でｎ＝９−１０である一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤
を含むものである。
【００６０】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、
（ａ）１０％の重量／体積濃度％で２００００の分子量のポリエチレングリコール；及び０．１％の体積／体積濃度％でｎ＝９−１０である一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤；あるいは、
（ｂ）７．５％の重量／体積濃度％で３５０００の分子量のポリエチレングリコール；及び０．１％の体積／体積濃度％でｎ＝９−１０である一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤；あるいは
（ｃ）５％の重量／体積濃度％で４００００の分子量のポリエチレングリコール；及び０．１％の体積／体積濃度％でｎ＝９−１０である一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤
を含むものである。
【００６１】
一実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、生体分子、生体分子マーカー及び生体分子とコンジュゲートした生体分子マーカーからなる群より選択される分子を含む。
【００６２】
一実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、生体分子を含む。
【００６３】
別の実施態様において、生体分子は、組成物１ｍｌ当たり０．１から１ｍｇの生体分子に含まれる濃度である。
【００６４】
本発明において、用語「生体分子」とは、とりわけタンパク質、ビタミン、核酸及び炭化水素等の生物により生成される任意の分子を指す。これらの生体分子は、生体分子を産生させる生物体からそれらを単離させて得ることができ、又は当業者によく知られた技術を用いて実験室規模で合成され得る。本発明で言及される生体分子は、バイオセンサー及び材料工学においても、更に使用され得る。一実施態様において、生体分子はタンパク質である。別の実施態様において、生体分子はビオチンである。
【００６５】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、生体分子マーカーを含む。
【００６６】
本発明において、用語「生体分子マーカー」とは、特定の生体分子の追跡又は同定を可能にする任意の発色団標識を含む。説明に役立つ例はフルオロフォアである。蛍光性標識は、生体分子の検出及び分析にとって重要な要素である。現在、膨大な量の様々なフルオロフォアが存在する。生体分子の標識に使用されるそれらの中には、ダンシル、フルオレセイン及びローダミン Ｂがある。
【００６７】
一実施態様において、生体分子マーカーはフルオロフォアである。
【００６８】
本発明の組成物がフルオロフォアを含む場合、得られる組成物はバイオセンサーの開発に使用され得る。
【００６９】
別の実施態様において、フルオロフォアはフルオレセインである。別の実施態様において、前記フルオレセインはチオセミカルバジド基で化学的に修飾されている。
【００７０】
本発明の第一の態様の組成物は、ＰＥＧ及び一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤と共に、液体担体、結合剤及び印刷のための添加剤から選択される一又は複数の成分を含む。
【００７１】
本発明において、用語「液体担体」とは、組成物の液体成分を含み、その流動性及び乾燥特性を決定する。加えて、それは基質に分子を固定させる働きをする。
【００７２】
一実施態様において、液体担体は、水性である、即ち水を含む。別の実施態様において、液体担体は水及び水溶性の有機溶媒を含む。水溶性の有機溶媒の例は、アルコールである。別の実施態様において、液体担体は水及びアルコールＣ１−Ｃ１０を含む。アルコールＣ１−Ｃ１０の例は：とりわけメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソブタノール及びｔｅｒｔ−ブタノールである。好ましくは、液体担体は水である。
【００７３】
本発明において、用語「印刷のための添加剤」とは、本発明の組成物の特性のいくつかを修正するために組成物に添加される任意のその他基質を意味する。当業者は、印刷のための添加剤の広範なリストから、とりわけｐＨ緩衝液、レオロジー改質剤及び湿潤剤等を選定し得る。
【００７４】
本発明において、「レオロジー改質剤」との表現は、とりわけ、組成物が沈着するのを妨げ、インクが一度印刷されてから飛び散るのを妨げる能力を有する物質を意味する。
【００７５】
一実施態様において、印刷のための添加剤はｐＨ緩衝液である。別の実施態様において、ｐＨ緩衝液は、以下からなる群より選択される：トリス−ＨＣｌ（トリエタノールアミンの塩酸塩）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＴＡＥ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン／酢酸／ＥＤＴＡ）、ＴＢＥ（トリス−ＨＣｌ／ボレート／ＥＤＴＡ）、及びＰＢＳ（アルカリ性リン酸緩衝液）。好ましくは、ｐＨ緩衝液はアルカリ性リン酸緩衝液である。
【００７６】
一実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、液体担体及び印刷のための添加剤を含む。別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、（液体担体として）水及び印刷のための添加剤を含む。別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、液体担体及び（印刷のための添加剤として）ｐＨ緩衝液を含む。別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、（液体担体として）水及び（印刷のための添加剤として）ｐＨ緩衝液を含む。好ましくは、本発明の第一の態様の組成物は、（液体担体として）水及び（印刷のための添加剤として）アルカリ性リン酸緩衝液を含む。
【００７７】
本発明において、「結合剤」とは、液体担体と印刷される分子との間の凝集性を保持する物質を指す。結合剤の説明に役立つ、非制限的な例は、ポリアクリル酸、アクリル製樹脂及びポリビニルピロリドンである。
【００７８】
本発明の第一の態様の組成物の調製は、異なる成分（ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、生物学的重要性のある分子等）をあらゆる順序で混合することにより行われ得る。
【００７９】
一実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、（ａ）ポリエチレングリコールを水溶液に溶解させること；（ｂ）一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤を添加すること；及び任意選択的に、（ｃ）生物学的重要性のある分子を添加することを含むプロセスにより調製される。
【００８０】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、（ａ）ポリエチレングリコールをｐＨ緩衝液水溶液に溶解させること；（ｂ）一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤を添加すること；及び任意選択的に、（ｃ）生物学的重要性のある分子を添加することを含むプロセスにより調製される。
【００８１】
別の実施態様において、本発明の第一の態様の組成物は、（ａ）ポリエチレングリコールをアルカリ性リン酸緩衝液水溶液に溶解させること；（ｂ）一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤を添加すること；及び（ｃ）生物学的重要性のある分子を添加することを含むプロセスにより調製される。
【００８２】
第二の態様において、本発明は、基質上の生物学的重要性のある分子をインクジェット印刷するための上に記載される組成物の使用であって、前記生体分子が生体分子、生体分子マーカー又はマーカーとコンジュゲートした生体分子からなる群より選択される、使用を提供する。
【００８３】
熱、圧電、静電及び音響技術に基づくプリンターがインクジェット印刷に一般的に使用される。しかしながら、最初の二つが最も一般に使用される。機能材料が分解するのを妨げる高温（２００−３００℃）を印刷に要しないため、圧電技術に基づく印刷システムは熱印刷よりも好ましい。
【００８４】
市場では、圧電技術に基づく最もよく知られた商業的なプリンターは、Ｐｉｘｄｒｏ、Ｄｉｍａｔｉｘ、Ｃｅｒａｄｒｏｐである。
【００８５】
圧電技術に基づく印刷のために考慮されるパラメーターは：放電開始電圧、波形、印刷される基質／注入ノズルの間隔、液滴間隔（ｄｒｓｐ）、及び適用する層の数である。
【００８６】
本発明において、「基質」とは、印刷可能であり、印刷された目的の分子が結合することによって、基で機能化された任意の物質を意味する。基質の説明に役立つ非制限的な例は、ＳＡＭ（自己組織化単分子膜）で修飾された金属基質（例えば金、シリコン若しくはガラス基質）又はポリマー基質（ポリスチレン（ＰＳ）若しくはポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ））である。当業者は、印刷される分子により、基質への分子の固定が生じるようにするにはどの官能基の型が基質に包含されるのに最も適しているかを決定する。非制限的な説明のため、アミノ酸性質の分子を印刷することが目的である場合、基質はマレイミド基、ビオチン−アビジン、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ）、アルデヒド（−ＣＨＯ）、及びエステル（−ＣＯＯＲ、ここで基Ｒは基Ｃ１−Ｃ１０アルキル及び５−６員環の基から選択され、前記員環は−Ｃ−、−ＣＨ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｎ−、−ＮＨ−、及び−Ｓ−からなる群より選択され、この環は芳香族の、飽和又は部分的に飽和した環であり、任意選択的に一又は複数の員環が一又は複数のハロゲン基で置換されている）で機能化され得る。一実施態様において、エステルはＲがＣ６Ｈ５又はＣ６Ｆ５であるものである。あるいは、別の実施態様において、基質はペンタフルオロフェニルメタクリレート（ＰＦＭ）基で機能化され得る。別の実施態様において、基質はポリスチレンであり、ＰＦＭで機能化されている。
【００８７】
目的の官能基での支持の機能化を実行する手順は、当業者によく知られている（Griesser H. J. et al., “Plasma Methods for the Generation of Chemically Reactive Surfaces for Biomolecule Immobilization and Cell Colonization - A Review”, Plasma Process. Polym., 2006, vol. 3, p. 392-418; Borros S. et al., “Functionalized, Swellable Hydrogel Layers as a Platform for Cell Studies”, Advanced Functional Materials, 2009, vol. 19, p. 1276-1286; Forch R. “Reactions of Plasma-Polymerised Pentafluorophenyl Methacrylate with Simple Amines”, Plasma Processes and Polymers, 2010, vol. 7, p. 915-925を参照のこと）。例えば、基質をＰＦＭで機能化することを望む場合、「プラズマグラフト」又は「プラズマ重合」技術を使用することが可能である。一実施態様において、基質はＰＳであり、プラズマグラフト又はプラズマ重合により産生されるＰＦＭで機能化されている。
【００８８】
第三の態様において、本発明は、上に記載されたような組成物で印刷された基質を提供する。
【００８９】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその語の変化形は、その他技術的特徴、添加剤、成分又は工程を排除することを意図しない。更に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、「〜からなる」の場合を包含する。追加的な目的、利点及び特徴は、本明細書の調査により当業者に明らかとなり、本発明の実施により理解され得る。以下の例及び図面は説明のために提供され、本発明を制限することは意図されていない。更に、本発明は、本明細書中に記載される特定の、好ましい実施態様の全ての組合せの可能性を含む。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】吐出電圧２５ＶでのＰＥＯ−３５Ｋに基づく液滴の展開挙動。ストロボ画像の写真は、２０μ秒後（ａ）及び６０μ秒後（ｂ）に撮影された。
【図２】二つの異なるモチーフ：ａ）ラインｄｒｓｐ＝２０μｍで２層、ｂ）ドットｄｒｓｐ＝２５μｍを使用して、実施例１で処方されたインクの印刷後に生成されたパターン。
【図３】実施例１で処方されたインク組成物の印刷により生成されたパターンの蛍光顕微鏡写真（λｅｘ＝４９２ｎｍ；λｅｍ＝５１６ｎｍ）。
【図４】実施例６で処方されたインク組成物の印刷により生成されたパターンの蛍光顕微鏡写真（λｅｘ＝４９２ｎｍ；λｅｍ＝５１６ｎｍ）。
【実施例】
【００９１】
−インク組成物の粘度を決定するためのプロトコール
以下で処方される組成物の粘度を決定するために、４５０μｌの組成物をＡｎｔｏｎ Ｐａａｒのレオメータの分析プラットフォームに沈着させた。分析するインクを、円錐プレートと分析プラットフォームとの間１ｍｍの距離で、直径１ｍｍの円錐プレートに接触させた。その後１・１０２から１・１０５ｓ−１のせん断速度を適用した。この範囲において、インクの挙動はニュートン的であり、即ちインクの粘度はせん断力に影響されない。
【００９２】
−インク組成物の表面張力を決定するためのプロトコール
以下で処方される組成物の表面張力を決定するために、表面張力の分析のために特別に設計された針を備えた２連シリンジ（Ｂ／ＢＲＡＵＮ）を〜５０μｌの処方されたインクで満たす。シリンジには、分析する液滴の形成を可能にする特別なピストンが制御された方法で針の先端に提供されている。Ｌａｐｌａｃｅ−Ｙｏｕｎｇの等式を通じて特別なソフトウェアで液滴の曲率半径を計算し、表面張力を決定する。
【００９３】
実施例１  バイオインク１の調製
ビーカー中で０．０１ＭのＰＢＳ（Sigma-Aldrich）の８ｍｌの水溶解に０．７５ｇのＰＥＧ−３５Ｋを溶解させて、７．５重量／体積％のＰＥＧ−３５Ｋ（Aldrich）の溶液を調製した。ＰＥＧ及びＰＢＳ溶液をマグネティックスターラー（４００ＲＰＭ、１０分）を使用して撹拌し、均質化した。その後、０．０１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）を添加し、更に５分間均質化した。得られた溶液に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Sigma-Aldrich）中０．４３Ｍの６０μｌのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド溶液（Fluka）を添加した。得られた混合物を１分間均質化した。得られた溶液をファルコン型のチューブに移し、０．０１ＭのＰＢＳの緩衝溶液で１０ｍｌまでフラッシュした。最終的に、得られた組成物を直径０．４５μｍ及び０．２μｍのポリビニリデンフルオライドＰＶＤＦフィルターを用いて連続的に濾過した。
【００９４】
前述のプロトコールに従い、製剤１は１１．２０±１．１ｍＰａ・ｓの粘度及び３５．５３±０．３ｍＮ／ｍの表面張力を有することを見出した。
【００９５】
実施例２  バイオインク２の調製
ビーカー中で０．０１ＭのＰＢＳ（Sigma-Aldrich）の８ｍｌの水溶解に０．１００ｇのＰＥＧ−２０Ｋを溶解させて、１０．０重量／体積％のＰＥＧ−２０Ｋ（Aldrich）の溶液を調製した。ＰＥＧ及びＰＢＳ溶液をマグネティックスターラー（４００ＲＰＭ、１０分）を使用して撹拌し、均質化した。その後、０．０１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）を添加し、混合物を更に５分間均質化した。得られた溶液に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中０．４３Ｍの６０μｌのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド溶液（Fluka）を添加し、混合物を１分間均質化した。得られた溶液をファルコン型のチューブに移し、０．０１ＭのＰＢＳの緩衝溶液で１０ｍｌまでフラッシュした。最終的に、得られたインクを直径０．４５μｍ及び０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて連続的に濾過した。
【００９６】
前述のプロトコールに従い、製剤は１３．２±２．１ｍＰａ・ｓの粘度及び３５．８１±０．７ｍＮ／ｍの表面張力を有することを見出した。
【００９７】
実施例３  バイオインク３の調製
ビーカー中で０．０１ＭのＰＢＳ（Sigma-Aldrich）の８ｍｌの水溶解に０．５ｇのＰＥＧ−４０Ｋを溶解させて、５．０重量／体積％のＰＥＧ−４０Ｋ（Aldrich）の溶液を調製した。ＰＥＧ及びＰＢＳ溶液をマグネティックスターラー（４００ＲＰＭ、１０分）を使用して撹拌し、均質化した。その後、０．０１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）を添加し、混合物を更に５分間均質化した。得られた溶液に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中０．４３Ｍの６０μｌのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド溶液（Fluka）を添加し、得られた混合物を１分間均質化した。得られた溶液をファルコン型のチューブに移し、０．０１ＭのＰＢＳの緩衝溶液で１０ｍｌまでフラッシュした。最終的に、得られたインクを直径０．４５μｍ及び０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて連続的に濾過した。
【００９８】
実施例４：式（Ｉ）の界面活性剤の効果
Ａ．１％を超える濃度の影響
実施例１のバイオインク組成物を使用して、非イオン性界面活性剤の％の増加がその特性に関して有する効果を決定した。
【００９９】
このために、以下の量：１０ｍｌの溶解中０．１５ｍｌ及び０．２０ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（一般式（Ｉ）（式中、ｎは９−１０である）の非イオン性界面活性剤）が包含された、実施例１に記載の組成物に基づく２つの組成物を処方した。
【０１００】
異なる組成物を均質化した場合、泡の生成が観察された。
【０１０１】
この現象は、印刷の際、圧電システムのチャンバ―内で制御困難な相当量の泡が生成され、それがバブル注入をもたらしたため、インク印刷において悪影響を及ぼした。液滴の形成が可能であったケースはなかった。
【０１０２】
したがって、この試験は、一般式（Ｉ）の非イオン性界面活性剤の量は注入に適した組成物を達成するのに重要であり、それが均一な液滴をもたらすことを示す。
【０１０３】
Ｂ．Ｔｗｅｅｎ ８０界面活性剤の効果
Ｔｗｅｅｎ ８０の場合、実施例１及び２に記載のようなインクを、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を別のＴｗｅｅｎ ８０溶液（Sigma-Aldrich）で置き換えて、各ポリエチレングリコールに関して調製した。Ｔｗｅｅｎ ８０の割合は０．１から１ｖ／ｖ％の範囲で様々である。
【０１０４】
Ｂ．１ビーカー中で８ｍｌの０．０１ＭのＰＢＳ水溶液（Sigma-Aldrich）に０．７５ｇのＰＥＧ−３５Ｋを溶解させて、７．５重量／体積％のＰＥＧ−３５Ｋ（Aldrich）の溶液を調製した。ＰＥＧ及びＰＢＳ溶液をマグネティックスターラー（４００ＲＰＭ、１０分）を使用して撹拌し、均質化した。続いて、異なる量のＴｗｅｅｎ ８０（Sigma-Aldrich）を、０．１−１ｍｌの範囲で添加し、更に５分間均質化した。得られた溶液に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中０．４３Ｍの６０μｌのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド溶液（Fluka）を添加した。得られた混合物を１分間均質化した。得られた溶液をファルコン型のチューブに移し、０．０１ＭのＰＢＳの緩衝溶液で１０ｍｌまでフラッシュした。最終的に、得られたインクを直径０．４５μｍ及び０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて連続的に濾過した。表面張力の結果を表１にまとめる。
0006374954.tif 000006
【０１０５】
観察され得るように、Ｔｗｅｅｎ ８０を含む製剤は、バイオインク製剤１により示される値よりもおよそ４０％高い表面張力を示した。
【０１０６】
Ｂ．２ビーカー中で０．０１ＭのＰＢＳ（Sigma-Aldrich）の８ｍｌの水溶液に０．１ｇのＰＥＧ−２０Ｋを溶解させて、１０重量／体積％のＰＥＧ−２０Ｋ（Aldrich）の溶液を調製した。ＰＥＧ及びＰＢＳ溶液をマグネティックスターラー（４００ＲＰＭ、１０分）を使用して撹拌し、均質化した。続いて、異なる量のＴｗｅｅｎ ８０（Sigma-Aldrich）を、０．１−１ｍｌの範囲で添加し、更に５分間均質化した。得られた溶液に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中０．４３Ｍの６０μｌのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド溶液（Fluka）を添加した。得られた混合物を１分間均質化した。得られた溶液をファルコン型のチューブに移し、０．０１ＭのＰＢＳの緩衝溶液で１０ｍｌまでフラッシュした。最終的に、得られたインクを直径０．４５μｍ及び０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて連続的に濾過した。表面張力の結果を表２にまとめる。
0006374954.tif 000007
【０１０７】
観察され得るように、Ｔｗｅｅｎ ８０を含む製剤は、バイオインク製剤２により示される値よりも少なくとも３０％高い表面張力を示した。
【０１０８】
したがって、このセクションで示すデータは、インクの表面張力を適切に調製するためには、０．１−１．０％のｖ／ｖ濃度範囲において一般式（Ｉ）の界面活性剤を選択することが不可欠であることを示す。
【０１０９】
実施例５  バイオインクの印刷
シリンジを使用して、印刷カートリッジ（ＤＭＰ １１６１０）を実施例１で処方されたおよそ０．５ｍｌのバイオインクで満たした。圧電システム（１０ρｌのインジェクターが備えられている）を採用してそのシステムを２時間そのままにするようにし、インジェクターを下向きの位置に維持した。その後、カートリッジをプリンターのホルダーに置き、ＤＭＰプリンター１１６１０のストロボカメラを使用して、注入ノズル中で生成された液滴とその挙動を観察した。これらの印刷試験を実行するために、吐出ノズルのパルス及びトリガー電圧を調整した。ノズルパルスに関して、チャンバ―内の液滴の注入時間、滞留時間及び排出時間を、それぞれ３．５８４μｓ、１０．６８８μｓ及び７．２９μｓに制御する。トリガー電圧を２５Ｖ（ＰＥＧ３５Ｋ及びＰＥＧ４０Ｋ）及び２１Ｖ（ＰＥＧ  ２０Ｋ）に調製する。ストロボ画像を２０μ秒（ａ）及び６０μ秒（ｂ）で撮影した（図１（ａ）及び（ｂ））。
【０１１０】
得られた結果から、注入した液滴は均質であり、コーヒーリング効果の兆候はなかったことが強調される。加えて、液滴は一旦注入されるとすぐに乾燥することが確認された。凝集体の形成は観察されず、それは本発明の組成物に、印刷に使用される理想的なプロファイルを提供する。
【０１１１】
一旦液滴の理想的な条件が確立されると、印刷される基質（この場合、基質は、材料工学のグループGEMAT, Chemical Institute of Sarriaにより供給されるＰＳ−ＰＦＭである）は印刷プラットフォームに置かれ、基質と印刷カートリッジ間の最小間隔は１ｍｍに設定された。最終的に、印刷されるパターン、液滴間隔及び印刷される層の数を決定した。印刷ラインに関して、２０μｍのｄｒｓｐを選択し、二層のバイオインクを適用した。印刷ドットに関して、２５μｍのｄｒｓｐを選択し、一層のみのバイオインクを適用した。
【０１１２】
この方法において、平行線は、液滴と適用する基質上の二層のバイオインクとの間、２０μｌの間隔で印刷され、したがって図２に示される結果が達成された。
【０１１３】
得られた結果から、注入された液滴は均質であり、コーヒーリング効果の兆候はなかったことが強調される。加えて、液滴は一旦注入されるとすぐに乾燥することが確認された。
【０１１４】
凝集体の形成は観察されず、それは本発明の組成物に、印刷に使用される理想的なプロファイルを提供する。
【０１１５】
最終的に、λｅｘ＝４９２ｎｍ；λｅｍ＝５１６ｎｍの範囲内で蛍光顕微鏡検査法（蛍光色素のための特別なフィルターＩ１３を備えるＬｅｉｋａ ＤＭＲＡ ２）を使用して、実施例１で処方されたインクで印刷される基質を分析し、図３の画像を生成した。
【０１１６】
図３で示される結果から、第一に、蛍光性分子は基質の表面に固定され、それがマーカーの第１級アミノ基と基質のＰＦＭ基との間の反応を引き起こし、アミドを生じさせることを示すことが強調される。これは、本発明の組成物が、目的の分子が基質に結合することを阻害せず、したがって、「スクリーン効果」問題が克服される事実を示す。
【０１１７】
図３において、印刷されたラインの高解像度及び分解能（４０μｍ）が観察され得る。
【０１１８】
最終的に、固定された分子は長時間にわたるその蛍光性の特性を維持したことが観察された。これは、本発明の組成物が印刷された分子の安定性／活性に悪影響を及ぼさないことを示す。
【０１１９】
実施例６  バイオインク４の調製
ビーカー中で０．０１ＭのＰＢＳ（Sigma-Aldrich）の８ｍｌの水溶解に０．７５ｇのＰＥＧ−３５Ｋを溶解させて、７．５重量／体積％のＰＥＧ−３５Ｋ（Aldrich）の溶液を調製した。ＰＥＧ及びＰＢＳ溶液をマグネティックスターラー（４００ＲＰＭ、１０分）を使用して撹拌し、均質化した。その後、０．１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）を添加し、混合物を更に５分間均質化した。得られた溶液に、ＰＢＳ中０．０４２Ｍの６０μｌのビオチン（ビオチニル−３，６，９−トリオキサウンデカンジアミン、Thermo Scientific）溶液を添加し、得られた混合物を１分間均質化した。得られた溶液をファルコン型のチューブに移し、０．０１ＭのＰＢＳの緩衝溶液で１０ｍｌまでフラッシュした。
【０１２０】
前述のプロトコールに従い、製剤４は１４．３０±０．１ｍＰａ・ｓの粘度及び３６．１０±０．０２ｍＮ／ｍの表面張力を有することを見出した。
【０１２１】
実施例７  バイオインク５の調製
ビーカー中で０．０１ＭのＰＢＳ（Sigma-Aldrich）の８ｍｌの水溶解に１ｇのＰＥＧ−２０Ｋを溶解させて、１０重量／体積％のＰＥＧ−２０Ｋ（Aldrich）の溶液を調製した。ＰＥＧ及びＰＢＳ溶液をマグネティックスターラー（４００ＲＰＭ、１０分）を使用して撹拌し、均質化した。その後、０．１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）を添加し、混合物を更に５分間均質化した。得られた溶液に、ＰＢＳ中０．０４２Ｍの６０μｌの溶解のビオチン（ビオチニル−３，６，９−トリオキサウンデカンジアミン、Thermo Scientific）を添加し、得られた混合物を１分間均質化した。得られた溶液をファルコン型のチューブに移し、０．０１ＭのＰＢＳの緩衝溶液で１０ｍｌまでフラッシュした。
【０１２２】
前述のプロトコールに従い、製剤５は１０．１０±０．１ｍＰａ・ｓの粘度及び３６．４５±０．０５ｍＮ／ｍの表面張力を有することを見出した。
【０１２３】
実施例８  バイオインク４での印刷
シリンジを使用して、印刷カートリッジ（ＤＭＰ １１６１０）を実施例６で処方されたおよそ０．５ｍｌのバイオインクで満たした。圧電システム（１０ρｌのインジェクターが備えられている）を採用してそのシステムを２時間そのままにするようにし、インジェクターを下向きの位置に維持した。その後、カートリッジをプリンターのホルダーに置き、ＤＭＰプリンター１１６１０のストロボカメラを使用して、注入ノズル中で生成された液滴とその挙動を観察した。これらの印刷試験を実行するために、吐出ノズルのパルス及びトリガー電圧を調整した。ノズルパルスに関して、チャンバ―内の液滴の注入時間、滞留時間及び排出時間を、それぞれ３．５８４μｓ、１０．６８８μｓ及び７．２９μｓに制御する。トリガー電圧を２７Ｖに調整する。
【０１２４】
得られた結果から、注入された液滴は均質であり、コーヒーリング効果の兆候はなかったことが強調される。加えて、液滴は一旦注入されるとすぐに乾燥することが立証された。凝集体の形成は観察されず、それは本発明の組成物に、印刷に使用される理想的なプロファイルを提供する。
【０１２５】
一旦液滴の理想的な条件が確立されると、印刷される基質（この場合、基質は、材料工学のグループGEMAT, Chemical Institute of Sarriaにより供給されるＰＳ−ＰＦＭである）は印刷プラットフォームに置かれ、基質と印刷カートリッジ間の最小間隔は１ｍｍに設定された。最終的に、印刷されるパターン、液滴間隔及び印刷される層の数を決定した。印刷ラインに関して、２０μｍのｄｒｓｐが選択された。
【０１２６】
この方法において、平行線は２０μｌの液滴間隔で印刷された。
【０１２７】
得られた結果から、注入された液滴は均質であり、コーヒーリング効果の兆候はなかったことが強調される。加えて、液滴は一旦注入されるとすぐに乾燥することが立証された。
【０１２８】
凝集体の形成は観察されず、それは本発明の組成物に、印刷に使用される理想的なプロファイルを提供する。
【０１２９】
一旦実施例６のバイオインクが印刷されると、基質は２０μｌのストレプトアビジン溶液（FITC, Invitrogen）中で１分間インキュベートされ、次いで０．０１ＭのＰＢＳ溶液（Sigma Aldrich）で洗浄され、窒素流で乾燥された。
【０１３０】
最終的に、λｅｘ＝４９２ｎｍ；λｅｍ＝５１６ｎｍの範囲内で蛍光顕微鏡検査法（蛍光色素のためのＩ１３特別フィルターを備えるＬｅｉｋａ ＤＭＲＡ ２）を使用して、実施例６で処方されたインクで印刷される基質を分析し、図４の画像を生成した。
【０１３１】
図４で示される結果から、第一に、分子は基質の表面に固定され、それがマーカーの第１級アミノ基と基質のＰＦＭ基との間の反応を引き起こし、アミドを生じさせることを示すことが強調される。これは、本発明の組成物が、目的の分子が基質に結合することを阻害せず、したがって、「スクリーン効果」問題が克服された事実を示す。
【０１３２】
実施例９  バイオインク６の調製
ビーカー中で０．０１ＭのＰＢＳ（Sigma-Aldrich）の８ｍｌの水溶解に０．７５ｇのＰＥＧ−３５Ｋを溶解させて、７．５重量／体積％のＰＥＧ−３５Ｋ（Aldrich）の溶液を調製した。ＰＥＧ及びＰＢＳ溶液をマグネティックスターラー（４００ＲＰＭ、１０分）を使用して撹拌し、均質化した。その後、０．１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）を添加し、更に５分間均質化した。得られた溶液に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Sigma-Aldrich）中０．４３Ｍの６０μｌのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド溶液（Fluka）を添加した。得られた混合物を１分間均質化した。得られた溶液をファルコン型のチューブに移し、０．０１ＭのＰＢＳの緩衝溶液で１０ｍｌまでフラッシュした。最終的に、得られた組成物を直径０．４５μｍ及び０．２μｍのポリビニリデンジフルオライドＰＶＤＦフィルターを用いて連続的に濾過した。
【０１３３】
前述のプロトコールに従い、製剤６はインクジェット印刷における使用に適切な粘度及び表面張力値を有することを見出した。
【０１３４】
実施例１０  バイオインク７の調製
ビーカー中で０．０１ＭのＰＢＳ（Sigma-Aldrich）の８ｍｌの水溶解に０．１００ｇのＰＥＧ−２０Ｋを溶解させて、１０．０重量／体積％のＰＥＧ−２０Ｋ（Aldrich）の溶液を調製した。ＰＥＧ及びＰＢＳ溶液をマグネティックスターラー（４００ＲＰＭ、１０分）を使用して撹拌し、均質化した。その後、０．１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）を添加し、混合物を更に５分間均質化した。得られた溶液に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中０．４３Ｍの６０μｌのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド溶液（Fluka）を添加し、混合物を１分間均質化した。得られた溶液をファルコン型のチューブに移し、０．０１ＭのＰＢＳの緩衝溶液で１０ｍｌまでフラッシュした。最終的に、得られたインクを直径０．４５μｍ及び０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて連続的に濾過した。
【０１３５】
前述のプロトコールに従い、製剤７は１１．９ｍＰａ・ｓの粘度及び３６．７０ｍＮ／ｍの表面張力を有することを見出した。
【０１３６】
実施例１１  バイオインク８の調製
ビーカー中で０．０１ＭのＰＢＳ（Sigma-Aldrich）の８ｍｌの水溶解に０．５ｇのＰＥＧ−４０Ｋを溶解させて、５．０重量／体積％のＰＥＧ−４０Ｋ（Aldrich）の溶液を調製した。ＰＥＧ及びＰＢＳ溶液をマグネティックスターラー（４００ＲＰＭ、１０分）を使用して撹拌し、均質化した。その後、０．１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）を添加し、混合物を更に５分間均質化した。得られた溶液に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中０．４３Ｍの６０μｌのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド溶液（Fluka）を添加し、得られた混合物を１分間均質化した。得られた溶液をファルコン型のチューブに移し、０．０１ＭのＰＢＳの緩衝溶液で１０ｍｌまでフラッシュした。最終的に、得られたインクを直径０．４５μｍ及び０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて連続的に濾過した。
【０１３７】
前述のプロトコールに従い、製剤８はインクジェット印刷に理想的な粘度及び表面張力値を有することを見出した。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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