(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノマー組成物で形成される、エステル結合を介して架橋されている生分解性ポリエーテルネットワークポリマーであって、
前記モノマー組成物が、
複数個のヒドロキシ官能基を含む分岐状多官能性ポリエーテルモノマーであって、グリセロールエトキシレート及びペンタエリスリトールエトキシレートからなる群より選ばれるポリエーテルモノマーと、
塩化スクシニル、塩化アジポイル、塩化セバコイル、塩化グルタロイル、塩化ピメロイル、塩化スベロイル、及び塩化トリメソイルからなる群より選ばれる多官能性架橋モノマーであって、前記ポリエーテルモノマーの前記ヒドロキシ官能基と反応してエステル結合を形成することが可能な架橋モノマーと、
最大で２０％（ｗ／ｗ）の機械特性改質剤であって、ジヒドロキシポリ（カプロラクトン）である機械特性改質剤と
を含み、かつ、
前記ポリエーテルモノマーの前記架橋モノマーに対するモル比が、３：１〜１：３の範囲内にある、
生分解性ポリエーテルネットワークポリマー。
【請求項２】
０．１％〜１５％（ｗ／ｗ）の量で前記ジヒドロキシポリ（カプロラクトン）を含む、請求項１記載の生分解性ポリエーテルネットワークポリマー。
【請求項３】
０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）の量で前記ジヒドロキシポリ（カプロラクトン）を含む、請求項１又は２記載の生分解性ポリエーテルネットワークポリマー。
【請求項４】
前記ポリエーテルモノマーの前記架橋モノマーに対するモル比が、１：２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生分解性ポリエーテルネットワークポリマー。
【請求項５】
前記架橋モノマーが、塩化スクシニル及び塩化セバコイルからなる群より選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生分解性ポリエーテルネットワークポリマー。
【請求項６】
エステル結合を介して架橋されている生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造するための方法であって、当該方法は、
（ｉ）  複数個のヒドロキシ官能基を含む分岐状多官能性ポリエーテルモノマーであって、グリセロールエトキシレート及びペンタエリスリトールエトキシレートからなる群より選ばれるポリエーテルモノマーと、
（ｉｉ）  塩化スクシニル、塩化アジポイル、塩化セバコイル、塩化グルタロイル、塩化ピメロイル、塩化スベロイル、及び塩化トリメソイルからなる群より選ばれる多官能性架橋モノマーであって、前記ポリエーテルモノマーの前記ヒドロキシ官能基と反応可能な架橋モノマーと、
（ｉｉｉ）  最大で２０％（ｗ／ｗ）の機械特性改質剤であって、ジヒドロキシポリ（カプロラクトン）である機械特性改質剤と
を含むモノマー組成物を、当該ポリエーテルモノマーと当該架橋モノマーとの間でのエステル結合の形成と、前記ジヒドロキシポリ（カプロラクトン）を前記ネットワークポリマーの構成部分としてそのヒドロキシ官能基を介して共有結合で組み入れることとを可能にする条件下で反応させる工程を含み、ここで、前記ポリエーテルモノマーの前記架橋モノマーに対するモル比が、３：１〜１：３の範囲内にある、方法。
【請求項７】
前記モノマー組成物が、０．１％〜１５％（ｗ／ｗ）の量で前記ジヒドロキシポリ（カプロラクトン）を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記モノマー組成物が、０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）の量で前記ジヒドロキシポリ（カプロラクトン）を含む、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
前記ポリエーテルモノマーの前記架橋モノマーに対するモル比が、１：２である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記架橋モノマーが、塩化スクシニル及び塩化セバコイルからなる群より選ばれる、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含むフィルム基材と、当該フィルム基材上に播種された角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞からなる群より選ばれる細胞とを含む、眼インプラント。
【請求項１２】
前記フィルム基材が、水和状態である場合、１０〜１５０μｍの範囲での厚さを有する、請求項１１記載の眼インプラント。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含むフィルム基材と当該フィルム基材上に播種された角膜内皮細胞とを含む眼インプラントを含む、角膜内皮機能障害の治療のための材料。
【請求項１４】
前記フィルム基材が、水和状態である場合、１０〜１５０μｍの範囲での厚さを有する、請求項１３記載の材料。
【請求項１５】
水性溶媒で溶媒和している請求項１〜５のいずれか１項に記載の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む、ヒドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、生物学的環境に適合する生分解性ネットワークポリマーに関する。特に、本発明は、エステル結合を介して架橋されている生分解性ポリエーテルネットワークポリマーに、当該生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材、インプラント及び足場材に、そのようなネットワークポリマー、インプラント及び足場材を製造するための方法に、並びに、該ネットワークポリマーを含む基材、インプラント及び足場材を特に細胞培養及び組織再生のために使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的環境に適合するポリマー材料は、さまざまな生物医学的用途、例えば組織工学でのその利用可能性から、高い関心がもたれている。そのような用途での利用のために研究されてきているポリマー材料は、一般的に、合成由来又は天然起源のものである。
【０００３】
天然ポリマー材料、例えば、コラーゲン、アルギン酸塩、キトサン及びヒドロキシアパタイトは、さまざまな組織を標的とする組織工学用途のための足場材を製造するために利用されてきた。そのような天然材料は、利点が多いものの、その使用に関しては、バッチ間変動、疾病伝播及び免疫原性のリスクといった所定の問題が存在する。さらには、それら天然材料を入手するために要する処理方法が、それら材料の物理的特性に影響を及ぼしかねない。例を挙げると、コラーゲンはインビボで高い機械的強度を示すけれども、採取、単離、及び精製の処理は、天然の架橋が損なわれることに起因して、この特性を著しく低下させる。
【０００４】
それに対して、合成ポリマーは、天然ポリマーに対して所定の利点を提供する。そのような利点には、バッチ間変動の低減、ポリマー構造に対する制御性の高さ、並びに、ポリマー組成物のテイラーメイド性と特定用途への適合性を挙げることができる。
【０００５】
ポリエーテルポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）をベースとする親水性材料が、生物医学的用途のために模索されてきた。特に、ＰＥＧは、それ自体が水溶性、非毒性、最小免疫原性、及び、抗タンパク質汚染性を有するが故に、広く研究されてきており、また、医薬及び化粧品の用途での利用のためにＵＳの食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されてきた。インビボ及びインビトロのさまざまな研究が、ＰＥＧが組み込まれた材料の生体適合性が望ましいものであることを実証している。
【０００６】
ＰＥＧなどのポリエーテルをベースとする、架橋ポリマーネットワークポリマー及びヒドロゲルは、細胞培養及び組織工学の用途のために模索されてきた。そして、さまざまな研究グループが、さまざまな反応条件を用いたＰＥＧのヒドロゲルの構築を報告している。しかし、ＰＥＧポリマー及びヒドロゲルは、一般に生体適合性であるものの、それらはたいがい生分解性ではない。
【０００７】
生分解性ＰＥＧヒドロゲルは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、例えば、酪酸及びポリ（グリコール酸）をベースとするポリマーセグメントをヒドロゲルに組み入れることで製造されてきた。しかしながら、ポリ（α−ヒドロキシ酸）セグメントのＰＥＧヒドロゲルへの組み入れにともなう問題は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）セグメントが非常に疎水性になり得ること、これにより、主要な異物応答を招くことの著しい要因となり得ることにある。ポリ（α−ヒドロキシ酸）セグメントにともなうさらなる問題は、それらが分解すると、酸濃度が局所的に高めることになりかねず、これにより、炎症応答を招き得るということである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
既存材料に関連する１つ以上の欠点若しくは短所を解決又は改善する生分解性ポリエーテルネットワークポリマーが提供されること、並びに／又は、そのような材料の有用な代替物が少なくとも提供されることが望ましいといえよう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ある１つの態様では、本発明は、多官能性ポリエーテルモノマーと多官能性架橋モノマーとを含むモノマー組成物を重合させることによって製造される、エステル結合を介して架橋されている生分解性ポリエーテルネットワークポリマーであって、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの一方が、ヒドロキシ官能基を含み、かつ、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの他方が、前記ヒドロキシ官能基と反応してエステル結合を形成することが可能な相補的な官能基を含み、かつ、前記ポリエーテルモノマー及び前記架橋モノマーより選ばれる少なくとも１つが分岐している、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを提供する。
【００１０】
該ポリエーテルネットワークポリマーは、ポリエーテルモノマーと架橋モノマーとの間で形成されるエステル結合を介して架橋されている。該エステル結合は、生理学的条件下で加水分解性であり、かつ、加水分解により、前記ネットワークポリマーの分解を生じさせる。
【００１１】
もう１つの態様では、本発明は、エステル結合を介して架橋されている生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造するための方法であって、当該方法は、多官能性ポリエーテルモノマーと多官能性架橋モノマーとを含むモノマー組成物を、当該ポリエーテルモノマーと当該架橋モノマーとの間でのエステル結合の形成を可能にする条件下で反応させる工程を含み、ここで、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの一方が、ヒドロキシ官能基を含み、かつ、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの他方が、前記ヒドロキシ官能基と反応してエステル結合を形成することが可能な相補的な官能基を含み、かつ、前記ポリエーテルモノマー及び前記架橋モノマーより選ばれる少なくとも１つが分岐している、方法を提供する。
【００１２】
本発明の１以上の態様によれば、ポリエーテルモノマーと架橋モノマーの一方が、ヒドロキシ官能基を含み、一方、ポリエーテルモノマーと架橋モノマーの他方が、ヒドロキシ官能基と反応してエステル結合を形成することが可能な相補的な官能基を含む。一組の実施形態では、該相補的な官能基は、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物及びカルボン酸ハロゲン化物からなる群より選ばれる。特定の一組の実施形態では、該相補的な官能基はカルボン酸ハロゲン化物である。
【００１３】
ポリエーテルネットワークポリマーを形成することを可能にするためには、ポリエーテルモノマー及び架橋モノマーより選ばれる少なくとも１つが分岐していなければならない。ある１つの実施形態では、ポリエーテルモノマーが分岐している。
【００１４】
本発明の１以上の態様に係る実施形態では、ポリエーテルモノマーが複数個のヒドロキシル官能基を含む。したがって、そのような実施形態では、架橋モノマーが上記相補的な官能基を含む。
【００１５】
幾つかの実施形態では、ポリエーテルモノマーが、分岐しており、かつ、以下の式（Ｉ）：
Ａ（ＢＸ）ｎ                  （Ｉ）
（式中、
Ａは、ｎ価のコアであり、
Ｂは、ポリエーテルセグメントであり、
Ｘは、ヒドロキシ官能基であり、かつ、
ｎは、（ＢＸ）基の数を示しており、かつ、少なくとも３である。）
の構造を有する。
【００１６】
幾つかの実施形態では、ポリエーテルネットワークポリマーの製造に採用されるポリエーテルモノマーが、Ｃ２〜Ｃ３ジオールから誘導されたポリエーテルセグメントを含む。
【００１７】
一組の実施形態では、ポリエーテルモノマーにおけるポリエーテルセグメントの各々が、約１００〜約１０，０００Ｄａ、約１５０〜約５０００Ｄａ、及び、約２００〜約１０００Ｄａからなる群より選ばれる範囲内の分子量を有する。
【００１８】
幾つかの実施形態では、ポリエーテルモノマーが、グリセロールエトキシレート及びペンタエリスリトールエトキシレートからなる群より選ばれる。
【００１９】
本発明の１以上の態様に係る実施形態では、架橋モノマーが、ヒドロキシ官能基と反応してエステル結合を形成することが可能な相補的な官能基を少なくとも２つ含む。特定の一組の実施形態では、架橋モノマーが、カルボン酸ハロゲン化物の官能基を少なくとも２つ含む。
【００２０】
ある１つの形態では、架橋モノマーが、以下の式（ＩＩ）：
Ｒ（Ｙ）ｍ                  （ＩＩ）
（式中、
Ｒは、ヒドロカルビル基であり、
【００２１】
Ｙは、相補的な官能基であって、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物及びカルボン酸ハロゲン化物からなる群より選ばれる相補的な官能基（好ましくは、カルボン酸ハロゲン化物の官能基）であり、かつ、
ｍは、Ｙ基の数を示しており、かつ、少なくとも２である。）
の構造を有していてもよい。
【００２２】
幾つかの実施形態では、式（ＩＩ）の架橋モノマーが、以下の式（ＩＩａ）又は式（ＩＩｂ）：
【００２３】
【化１】
0006403754.tif 000002
【００２４】
（式中、
Ｒは、ヒドロカルビル基であり、かつ、
【００２５】
Ｙは、相補的な官能基であって、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物及びカルボン酸ハロゲン化物（好ましくは、カルボン酸ハロゲン化物）からなる群より選ばれる相補的な官能基である。）
の構造を有していてもよい。
【００２６】
式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）及び式（ＩＩｂ）の架橋モノマーに係る実施形態において、Ｒは、直鎖状、分岐状、環状、又はアリールのヒドロカルビル基であってもよい。幾つかの特定の実施形態では、Ｒが２〜１２個の炭素原子を含んでいてもよい。
【００２７】
ある１つの形態では、架橋モノマーが、塩化スクシニル、塩化アジポイル、塩化セバコイル、塩化グルタロイル、塩化ピメロイル、塩化スベロイル、及び塩化トリメソイル、好ましくは、塩化スクシニル及び塩化セバコイルからなる群より選ばれていてもよい。
【００２８】
上記生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造するために用いるモノマー組成物は、ポリエーテルモノマーの架橋モノマーに対するモル比が、およそ５：１〜１：５、又は、およそ３：１〜１：３からなる群より選ばれる範囲内にあるものを含んでいてもよい。一組の実施形態では、ポリエーテルモノマーの架橋モノマーに対するモル比は、およそ１：２である。
【００２９】
一組の実施形態では、上記生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造するために用いるモノマー組成物は、さらに機械特性改質剤を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、モノマー組成物が、該機械特性改質剤を最大で２０％（ｗ／ｗ）、最大で１５％（ｗ／ｗ）、又は、最大で１０％（ｗ／ｗ）含んでいてもよい。該機械特性改質剤が、疎水性高分子又は疎水性オリゴマーであってもよい。
【００３０】
該機械特性改質剤が疎水性高分子である場合、該高分子は、例えばジヒドロキシポリ（カプロラクトン）のようなポリエステルポリオールであってもよい。
【００３１】
一組の実施形態では、本発明に係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーが多孔性である。そのような実施形態では、該生分解性ポリエーテルネットワークポリマーは、平均細孔径が約１ｎｍ〜約３ｍｍの範囲内にあってもよい。
【００３２】
ある形態では、ポリエーテルモノマーと架橋モノマーとの反応によって、ポリエーテルネットワークポリマー内に細孔を生じるガス状形態縮合生成物が生成される。
【００３３】
一組の実施形態では、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーの製造に用いるモノマー組成物がさらに固形ポロゲン、例えば、ポロゲン粒子を含んでいてもよい。該ポロゲン粒子は、粒径が約５０〜１００μｍ、約１００〜７００μｍ、及び、約３００〜６００μｍからなる群より選ばれる範囲内にあってもよい。幾つかの実施形態では、該ポロゲン粒子が塩粒子を含んでいてもよい。
【００３４】
本発明に係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーは、さまざまな用途において使用されてもよい。
【００３５】
ある１つの態様では、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含むインビトロ細胞培養基材が提供される。ある１つの形態では、該細胞培養基材がフィルム形状をなしている。
【００３６】
もう１つの態様では、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材と、当該基材の上に播種された細胞とを含む移植可能な器具が提供される。
【００３７】
あるもう１つの態様では、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む足場材が提供される。幾つかの形態では、該足場材が多孔性スポンジ状をなしている。
【００３８】
本発明に係るもう１つの態様では、エステル結合を介して架橋されている多孔性の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造するための方法であって、当該方法は、多官能性ポリエーテルモノマーと多官能性架橋モノマーとを含むモノマー組成物を、エステル結合を介して架橋しているポリエーテルネットワークポリマーの形成を可能にし、かつ、前記ネットワークポリマー内部に複数の細孔を生じさせるガス状縮合生成物のインサイチュでの生成を可能にする条件下で反応させる工程を含み、ここで、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの一方が、ヒドロキシ官能基を含み、かつ、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの他方が、前記ヒドロキシ官能基と反応してエステル結合を形成することが可能な相補的な官能基を含み、かつ、前記ポリエーテルモノマー及び前記架橋モノマーより選ばれる少なくとも１つが分岐している、方法が提供される。
【００３９】
本発明は、被験体内組織再生方法であって、当該方法が、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む足場材を前記被験体における所望の部位に移植する工程を含む、方法をさらに提供する。一組の実施形態では、前記組織が脂肪組織であり、かつ、前記足場材が前記被験体の胸部領域内に移植される。
【００４０】
本発明は、細胞培養方法であって、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材に細胞を細胞培養条件下で接触させる工程を含む方法をさらに提供する。
【００４１】
本発明は、移植可能な器具を製造するための方法であって、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材を細胞に提供する工程と、当該基材に細胞を播種する工程とを含む方法をさらに提供する。ある１つの形態では、該器具は、被験体の眼に移植するための眼インプラントであり、かつ、該細胞は、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞からなる群より選ばれる。
【００４２】
本発明は、被験体における障害又は状態の治療のための方法であって、当該方法が、本明細書に記載されている実施形態の１つ以上に係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材と、当該基材の上に播種された細胞とを含む移植可能な器具を提供する工程と、当該器具を被験体における治療が望まれる部位に移植する工程とを含む、方法をさらに提供する。幾つかの実施形態では、病気又は障害が角膜内皮機能障害であり、かつ、上記方法は、本明細書に記載されている実施形態の１つ以上に係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材上に播種された角膜内皮細胞を含む器具を被験体の眼に移植する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本明細書では、本発明に係る好ましい実施形態は、以下の添付図面を参照しつつ例としてのみ説明されることとなる：
【図１】図１は、本発明の一実施形態に関する、グリセロールエトキシレート（ＧＥ）と塩化セバコイル（ＳｅｂＣｌ）とジヒドロキシＰＣＬとの反応を介した生分解性ポリエーテルネットワークポリマーの合成を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の実施形態に関する、機械特性改質剤（ＰＣＬ）を異なる量で有する生分解性ポリエーテルネットワークポリマーのインビトロでの８週間にわたる分解過程を示すグラフを示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施形態に関する、ＰＣＬを異なる量で含有する生分解性ポリエーテルネットワークポリマーの（ａ）ポリマー馴化培地及び（ｂ）分解生成物の細胞毒性評価結果を示すグラフを示す図である。
【図４】図４は、本発明の一実施形態に関する、（ａ）組織培養プレート上で培養されたヒツジ角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の顕微鏡画像と、（ｂ）５ｗｔ％ＰＣＬの生分解性ポリエーテルネットワークポリマー上で培養されたＣＥＣの顕微鏡画像を示す図である。
【図５】図５は、（ａ）コントロール、及び、（ｂ）生分解性ポリエーテルネットワークポリマー（ＰＨＦ）が移植されたヒツジ角膜の、移植２８日経過後におけるＨ＆Ｅ染色切片の顕微鏡画像を示す図である。
【図６】図６は、本発明の一実施形態に関する、ペンタエリスリトールエトキシレート（ＰＥ）と塩化セバコイル（ＳｅｂＣｌ）を用いた生分解性多孔ＰＥＧスポンジの製造を示す模式図である。
【図７】図７は、本発明の一実施形態に係る生分解性多孔ＰＥＧスポンジの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す図である。
【図８】図８は、（ａ）本発明の一実施形態に係る、ペンタエリスリトールエトキシレート（ＰＥ）と塩化セバコイル（ＳｅｂＣｌ）とＰＣＬ（２ｗｔ％）とを用いて製造された生分解性多孔ＰＥＧスポンジに関する、圧縮応力対圧縮張力の３０圧縮サイクルにわたるプロフィールを示すグラフ、及び、（ｂ）本発明の実施形態に係るさまざまな生分解性多孔ＰＥＧスポンジに関する圧縮弾性率を示すグラフを示す図である。
【図９】図９は、本発明の一実施形態に係る生分解性多孔ＰＥＧスポンジのインビトロでの８週間（ＰＢＳ，３７℃）にわたる分解を示すグラフである。
【図１０】図１０は、（ａ）多孔ＰＥＧスポンジ馴化培地、及び、（ｂ）多孔ＰＥＧスポンジ分解生成物の細胞毒性評価結果を示すグラフを示す図である。
【図１１】図１１は、（ａ）本発明の一実施形態に係る、ペンタエリスリトールエトキシレート（ＰＥ）と塩化セバコイル（ＳｅｂＣｌ）とＰＣＬ（２ｗｔ％）とを用いて製造された生分解性多孔ＰＥＧスポンジの移植及び縫合前の画像、（ｂ）背面皮下ポケットの用意の画像、（ｃ）当該背面ポケットへ挿入されている生分解性多孔ＰＥＧスポンジの画像、（ｄ）２週目の生分解性多孔ＰＥＧスポンジ外植片の巨視的断面の画像、（ｅ）８週目の生分解性多孔ＰＥＧスポンジ外植片の巨視的断面の画像、（ｆ）８週目の生分解性多孔ＰＥＧスポンジ外植片の拡大断面の画像、（ｇ）２週目に取り出された生分解性多孔ＰＥＧスポンジ外植片のＨ＆Ｅ染色切片の１．２５倍の画像、（ｈ）同１０倍の画像、及び（ｉ）同２０倍の画像、並びに、（ｊ）８週目に取り出された生分解性多孔ＰＥＧスポンジ外植片のＨ＆Ｅ染色切片の１．２５倍の画像、（ｋ）同１０倍の画像、及び（ｌ）同２０倍の画像を示す図である。
【図１２】図１２は、（ａ）本発明の一実施形態に係る、ペンタエリスリトールエトキシレート（ＰＥ）と塩化セバコイル（ＳｅｂＣｌ）とＰＣＬ（２ｗｔ％）とを用いて製造された生分解性多孔ＰＥＧスポンジを移植した位置の１６週後、（ｂ）１６週目に取り出された生分解性多孔ＰＥＧスポンジの巨視的断面、（ｃ）該生分解性多孔ＰＥＧスポンジを移植した箇所の組織のＨ＆Ｅ染色切片、（ｄ）２週目に取り出された生分解性多孔ＰＥＧスポンジのＥＤ１染色切片の１．２５倍、（ｅ）同１０倍、及び（ｆ）同２０倍、（ｇ）８週目に取り出された生分解性多孔ＰＥＧスポンジのＥＤ１染色切片の１．２５倍、（ｈ）同１０倍、及び（ｉ）同２０倍、並びに、（ｊ）１６週目における移植部位中の組織のＥＤ１染色切片の１．２５倍、（ｋ）同１０倍、及び（ｌ）同２０倍を示す図である。
【図１３】図１３は、本発明の実施形態に係る、塩テンプレートを用いて形成された生分解性多孔ＰＥＧスポンジのＥｎｖｉｒｏ−ＳＥＭ画像を示す図であり、（ａ）は、塩化スクシニル架橋モノマーと２ｗｔ％のＰＣＬを用いた場合、（ｂ）は、塩化セバコイル架橋モノマーと２ｗｔ％のＰＣＬを用いた場合、（ｃ）は、塩化トリメソイル架橋モノマーと２ｗｔ％のＰＣＬを用いた場合を示す。
【図１４】図１４は、（ａ）本発明の実施形態に関する、塩テンプレート、及び、異なるｗｔ％のＰＣＬを用いて製造された生分解性多孔ＰＥＧスポンジの圧縮弾性率を示すグラフ、並びに、（ｂ）本発明の一実施形態に係る、塩テンプレートと塩化セバコイル架橋モノマーと２ｗｔ％のＰＣＬとを用いて製造された生分解性多孔ＰＥＧスポンジに関する、圧縮応力対圧縮張力の１５圧縮サイクルの間のプロフィールを示すグラフを示す図である。
【図１５】図１５は、塩テンプレートを用いて製造された、本発明の実施形態に関する、異なる架橋モノマーを用いて製造された生分解性多孔ＰＥＧスポンジのインビトロでの８週間（ＰＢＳ，３７℃）にわたる分解を示すグラフを示す図である。
【図１６】図１６は、架橋モノマーを異なる量で用いて製造された、本発明の実施形態の多孔性ＰＥＧスポンジから得られた（ａ）馴化培地及び（ｂ）分解生成物の細胞毒性評価結果を示すグラフを示す図である。
【図１７】図１７は、（ａ）本発明の実施形態に関する、塩テンプレートと塩化セバコイル架橋モノマーを用いて製造された生分解性多孔ＰＥＧスポンジを移植するための用意された皮下ポケット、（ｂ）該生分解性多孔ＰＥＧスポンジの移植及び縫合前、（ｃ）該背面ポケットへ挿入されて縫合された生分解性多孔ＰＥＧスポンジ、（ｄ）該生分解性多孔ＰＥＧスポンジの２週後の移植部位からの切除前、（ｅ）２週目の生分解性多孔ＰＥＧスポンジ外植片の巨視的断面、（ｆ）８週目の生分解性多孔ＰＥＧスポンジ外植片の巨視的断面、（ｇ）２週目に取り出された生分解性多孔ＰＥＧスポンジのＨ＆Ｅ染色切片の１．２５倍、（ｈ）同１０倍、及び（ｉ）同２０倍、並びに、（ｊ）８週目に取り出された生分解性多孔ＰＥＧスポンジのＨ＆Ｅ染色切片の１．２５倍、（ｋ）同１０倍、及び（ｌ）同２０倍を示す図である。
【図１８】図１８は、（ａ）本発明の実施形態に関する、塩テンプレートと塩化セバコイル架橋モノマーを用いて製造された生分解性多孔ＰＥＧスポンジの１６週目に取り出された巨視的断面、（ｂ）該生分解性多孔ＰＥＧスポンジが移植された箇所の組織のＨ＆Ｅ染色切片の１．２５倍、（ｃ）同１０倍、（ｄ）２週目に取り出された生分解性多孔ＰＥＧスポンジのＥＤ１染色切片の１．２５倍、（ｅ）同１０倍、及び（ｆ）同２０倍、（ｇ）８週目に取り出された生分解性多孔ＰＥＧスポンジのＥＤ１染色切片の１．２５倍、（ｈ）同１０倍、及び（ｉ）同２０倍、並びに、（ｊ）１６週目における移植部位中の組織のＥＤ１染色切片の１．２５倍、（ｋ）同１０倍、及び（ｌ）同２０倍を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、エステル結合を介して架橋されている生分解性ポリエーテルネットワークポリマー及びこれらのネットワークポリマーを製造する方法に関する。ポリエーテルネットワークポリマーに含有されるエステル結合は、生物学的環境において生分解性であり、かつ、加水分解で及び／又は酵素によって切断可能であり、架橋されたネットワークポリマーの分解を可能にする。ネットワークポリマーの分解から生じる分解生成物は生体には実質的に非毒性である。
【００４５】
用語「分解性」及び「生分解性」は、物質、結合又は基に関連して本明細書で使用されるとき、物質、結合又は基が生理的条件下で又は生物学的環境において経時的な分解、切断又は断片化に感受性であることを意味する。そのような分解、切断又は断片化は、選ばれる生理的条件下又は生物学的条件下で好適に不安定な部分の化学的な分解を介して（例えば、加水分解又は還元を介して）生じ得る。ポリマー物質に関連して使用される場合、用語「分解性」及び「生分解性」は、ポリマーが、そのポリマーの分子構造の一部として好適に不安定な又は分解性の部分を含むことを示す。ポリマーにおける１つ以上の分解性部分の切断又は分解は、ポリマーの、一般的にはモノマー及び／又は低分子量ポリマー断片への断片化をもたらす。
【００４６】
ある１つの態様では、本発明は、多官能性ポリエーテルモノマーと多官能性架橋モノマーを含むモノマー組成物を重合させることによって製造される、エステル結合を介して架橋されている生分解性ポリエーテルネットワークポリマーであって、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの一方がヒドロキシ官能基を含み、かつ、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの他方が前記ヒドロキシ官能基と反応してエステル結合を形成することが可能な相補的な官能基を含み、かつ、前記ポリエーテルモノマー及び前記架橋モノマーから選ばれる少なくとも１つが分岐している生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを提供する。
【００４７】
生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを形成するには、多官能性ポリエーテルモノマーと多官能性架橋モノマーを含むモノマー組成物が採用される。モノマー組成物に存在するポリエーテルモノマー及び架橋モノマーはそれぞれ、重合し、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを形成するために共有結合反応することが可能である官能基を含む。重合反応の結果生じるポリエーテルネットワークポリマーは固形であり、不溶性のポリマーマトリクスである。
【００４８】
モノマー組成物に含有されるポリエーテルモノマー及び架橋モノマーの少なくとも一方が分岐している。幾つかの実施形態では、ポリエーテルモノマーが分岐する。他の実施形態では、架橋モノマーが分岐する。一方のモノマーが分岐している場合、他方のモノマーは直鎖状であっても分岐状であってもよい。
【００４９】
幾つかの実施形態では、少なくとも３の分岐度でポリエーテルモノマーが分岐する。そのような実施形態では、架橋モノマーは直鎖状であっても分岐状であってもよい。ポリエーテルモノマーが分岐している一組の実施形態では、架橋モノマーは直鎖状である。
【００５０】
モノマー組成物に含有されるポリエーテルモノマー及び架橋モノマーは多官能性であり、モノマーのそれぞれが複数個の官能基を含む。多官能性であるモノマーは２つ以上の官能基を含む。しかしながら、モノマーが分岐している場合、そのモノマーは一般に少なくとも３つの官能基を含む。
【００５１】
本発明によれば、ポリエーテルモノマー及び架橋モノマーの一方はヒドロキシ官能基を含み、ポリエーテルモノマー及び架橋モノマーの他方は、ヒドロキシ官能基と反応してエステル結合を形成することが可能である相補的な官能基を含む。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、用語「結合」は、２つの相補的な官能基の間での共有結合化学反応の結果、形成される基を指す。
【００５３】
ヒドロキシ基と反応する相補的な官能基は、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、及びカルボン酸ハロゲン化物の官能基から成る群より選ばれ得る。一組の実施形態では、相補的な官能基はカルボン酸ハロゲン化物基である。
【００５４】
以下でさらに説明されるように、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーの製造におけるヒドロキシ官能基とカルボン酸ハロゲン化物官能基とを含むモノマーの使用は、そのようなモノマーの共有結合反応から生じる縮合生成物が多孔性ネットワークポリマー構造の生成に役立ち得るので、有利であり得る。
【００５５】
一組の実施形態では、モノマー組成物は複数個のヒドロキシ官能基を含むポリエーテルモノマーを含む。ポリエーテルモノマーに存在する官能基の数は、ポリエーテルモノマーが直鎖状であるか、分岐状であるかどうかに依存し得る。一組の実施形態では、ポリエーテルモノマーは直鎖状ポリエーテルポリオール、分岐状ポリエーテルポリオール、又はそれらの混合物である。
【００５６】
一組の実施形態では、モノマー組成物は２つのヒドロキシ官能基を含む直鎖状ポリエーテルモノマーを含む。そのような直鎖状ポリエーテルモノマーは本明細書では直鎖状ポリエーテルジオールと呼ばれ得る。直鎖状ポリエーテルモノマーは、Ｃ２〜Ｃ３ジオールに由来してもよいポリエーテルセグメントを含んでもよい。好適な直鎖状ポリエーテルモノマーには、以下の一般式：
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−Ｈ      ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｑ−Ｈ
【００５７】
によって示されるようなポリ（エチレングリコール）及びポリ（プロピレングリコール）が挙げられ、式中、ｐ及びｑはそれぞれ、反復エチレンオキシド単位又は反復プロピレンオキシド単位の数を示す。
【００５８】
モノマー組成物に存在する直鎖状ポリエーテルジオールは、約１００〜１０，０００Ｄａ、約１５０〜５０００Ｄａ及び約２００〜１０００Ｄａからなる群より選ばれる範囲での分子量を有してもよい。
【００５９】
一組の実施形態では、モノマー組成物は少なくとも３つの官能基を含む分岐状ポリエーテルモノマーを含んでもよい。そのような実施形態では、該ポリエーテルモノマーは式（Ｉ）
Ａ（ＢＸ）ｎ                  （Ｉ）
（式中、
Ａはｎ価のコアであり、
Ｂはポリエーテルセグメントであり、
Ｘはヒドロキシ官能基であり、かつ
ｎは（ＢＸ）基の数を示しており、かつ、少なくとも３である）の構造を有してもよい。
【００６０】
式（Ｉ）では、Ａは分岐状ポリエーテルモノマーを作るのに好適である中心のｎ価のコア部分を示す。幾つかの実施形態では、ポリエーテルモノマーは星形状であってもよく、その際、複数のアームが中心のコアから放射状に広がる。そのような実施形態では、Ａは星のコアを表し、星のアームは基（ＢＸ）によって示される。
【００６１】
ポリエーテルモノマーの分岐度（ｎによって示される）はコア部分Ａの性質を変化させることによって変化させることができる。異なる分岐度を用いてポリエーテルネットワークポリマーの機械特性及び物性を制御してもよい。式（Ｉ）の幾つかの実施形態では、ｎは３、４、６及び８からなる群より選ばれる整数である。
【００６２】
式（Ｉ）の幾つかの実施形態では、Ａは、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール、ペンタエリスリトールオリゴマー、ソルビトール、トリメチロイルプロパン及びジ（トリメチロイルプロパン）からなる群より選ばれる多価化合物に由来してもよい。
【００６３】
式（Ｉ）では、Ｂはポリエーテルモノマーのポリエーテルセグメントを示す。ポリエーテルセグメントはＣ２〜Ｃ３ジオールに由来してもよい。特定の実施形態では、各ポリエーテルセグメントはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む。
【００６４】
式（Ｉ）のモノマーが星形状である場合、星の各アームは、約１００〜１０，０００Ｄａ、約１５０〜５０００Ｄａ及び約２００〜１０００Ｄａからなる群より選ばれる範囲での分子量を有するポリエーテルセグメントを含んでもよい。幾つかの実施形態では、各ポリエーテルセグメントは、前述のものから選ばれる範囲における分子量を有するポリ（エチレングリコール）を含む。ポリエーテルセグメントの分子量は、アームの長さを決定づけるであろうし、かつ、得られるポリエーテルネットワークポリマーの物性の一部、例えば、水相溶性又は親水性に影響し得る。
【００６５】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）セグメントを含むポリエーテルモノマーは、ポリ（エチレングリコール）が生体適合性、親水性、非毒性及び非免疫原性であるので、幾つかの実施形態では有利であってもよい。ＰＥＧを含むネットワークポリマーの分解の結果生じるポリマー断片は、正常な排泄経路を介して生体から一掃され易くてもよい。
【００６６】
一組の実施形態では、モノマー組成物はグリセロールエトキシレート及びペンタエリスリトールエトキシレートからなる群より選ばれる分岐状ポリエーテルモノマーを含んでもよい。
【００６７】
ＰＥＧを含むポリエーテルモノマーと共に製造される生分解性ポリエーテルネットワークポリマーは生分解性ポリ（エチレングリコール）ネットワークポリマーと見なされてもよい。
【００６８】
モノマー組成物が複数個のヒドロキシ官能基を含むポリエーテルモノマーを含む場合、モノマー組成物に同様に存在する架橋モノマーは、ポリエーテルモノマーのヒドロキシ官能基に対して相補的である複数個の官能基を含む。相補的な官能基はヒドロキシ官能基と反応してエステル結合を形成することが可能である。
【００６９】
幾つかの実施形態では、架橋モノマーは、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物及びカルボン酸ハロゲン化物の官能基からなる群より選ばれる複数個の相補的な官能基を含んでもよい。一組の実施形態では、架橋モノマーは少なくとも２つのカルボン酸ハロゲン化物の官能基を含む。
【００７０】
ポリエーテルモノマーが分岐している場合、架橋モノマーは直鎖状であっても分岐状であってもよい。
【００７１】
ポリエーテルモノマーが直鎖状である、例えば、直鎖状ポリエーテルジオールである場合、架橋モノマーは分岐しなければならない。
【００７２】
一組の実施形態では、架橋モノマーは式（ＩＩ）：
Ｒ（Ｙ）ｍ                  （ＩＩ）
（式中、
Ｒは、ヒドロカルビル基であり、
【００７３】
Ｙは、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物及びカルボン酸ハロゲン化物からなる群より選ばれる相補的な官能基（好ましくはカルボン酸ハロゲン化物）であり、かつ、
ｍは、Ｙ基の数を示し、かつ、少なくとも２である）の構造を有する。
【００７４】
架橋モノマーは少なくとも２つの相補的な官能基を含み、式（ＩＩ）では、相補的な官能基の数は群ｍによって示される。式（ＩＩ）では、ｍは少なくとも２であり、幾つかの実施形態では、ｍは３以上であってもよい。
【００７５】
幾つかの実施形態では、式（ＩＩ）の架橋モノマーは式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の構造を有してもよく、その際、ｍは式（ＩＩ）において２又は３である。
【００７６】
【化２】
0006403754.tif 000003
【００７７】
式（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）のモノマーでは、Ｒ及びＹは式（ＩＩ）について本明細書で定義される基から選ばれてもよい。
【００７８】
ある１つの形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の架橋モノマーにおいてＹによって示される相補的な官能基は、存在ごとにカルボン酸ハロゲン化物官能基であってもよい。Ｙがカルボン酸ハロゲン化物官能基である場合、官能基のハロゲン化物部分は従来使用されているもののいずれか１つから選ばれてもよい。幾つかの実施形態では、カルボン酸ハロゲン化物官能基のハロゲン化物部分は、フッ化物、塩化物、臭化物及びヨウ化物、好ましくは塩化物及び臭化物からなる群より選ばれてもよい。ある１つの形態では、カルボン酸ハロゲン化物官能基は、カルボン酸塩化物官能基又はカルボン酸臭化物官能基であってもよい。
【００７９】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）の架橋モノマーに存在するヒドロカルビル基Ｒは、直鎖状、分岐状、環状又はアリールのヒドロカルビル基からなる群より選ばれてもよい。幾つかの実施形態では、Ｒは、２〜１２個の炭素原子を含む直鎖状、分岐状、環状又はアリールのヒドロカルビル基である。幾つかの実施形態では、Ｒは、８〜１２個の炭素原子を含む直鎖状、分岐状、環状又はアリールのヒドロカルビル基である。そのような基は幾つかの実施形態では、疎水性のヒドロカルビル基であると見なされてもよい。
【００８０】
本発明に係る実施形態では、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造するのに使用されるモノマー組成物は、塩化スクシニル、塩化アジポイル、塩化セバコイル、塩化グルタロイル、塩化ピメロイル、塩化スベロイル、塩化トリメソイル、及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる架橋モノマーを含んでもよい。架橋モノマーの選択を用いてポリエーテルネットワークポリマーの膨潤度合い、分解速度及び機械特性を制御してもよい。例えば、疎水性のヒドロカルビル基を含む架橋モノマーを採用して、ポリエーテルモノマーによって提供される親水性とバランスを取ることによって、水膨潤性を低下させ、かつ、ポリマーネットワークの引張特性を改善してもよい。
【００８１】
幾つかの実施形態では、塩化スクシニル及び塩化セバコイルから選ばれる架橋モノマーを含むことはモノマー組成物にとって有利であってもよい。塩化スクシニル及び塩化セバコイルのようなモノマーの使用は、ネットワークポリマーの分解の際、そのようなモノマーが生物学的環境においてコハク酸及びセバシン酸に変換されることが可能であるので、有益であってもよい。コハク酸及びセバシン酸は生体適合性であり、かつ、最小毒性である。例えば、セバシン酸は細胞にて天然に存在するジカルボン酸であり、かつ、脂肪酸酸化の中間体であり、一方で、コハク酸はクレブス／クエン酸回路における中間体である。
【００８２】
生分解性ポリエーテルネットワークポリマーの製造で採用されるモノマー組成物は、任意の好適な量のポリエーテルモノマー及び架橋モノマーを含んでもよい。幾つかの実施形態では、モノマー組成物はおよそ５：１〜１：５又はおよそ３：１〜１：３の範囲でのポリエーテルモノマーの架橋モノマーに対するモル比を含んでもよい。一実施形態では、モノマー組成物におけるポリエーテルモノマーの架橋モノマーに対するモル比はおよそ１：２である。過剰の架橋モノマーを有して、特に直鎖状の架橋モノマーが使用されるのであれば、十分な数の架橋が確実に形成されることが望ましいことがあり得る。
【００８３】
一組の実施形態では、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造するのに使用されるモノマー組成物はさらに機械特性改質剤を含んでもよい。機械特性改質剤を用いてポリエーテルネットワークポリマーの機械特性、例えば、引張特性を制御するのを助ける。再生医療及び組織工学の適用で使用することが意図される材料の機械特性は、望ましい細胞及び組織の相互作用を促進するのに、かつ、インプラントの機械的完全性を保証するのに重要であり得る。
【００８４】
機械特性改質剤は、最大で２０％（ｗ／ｗ）、最大で１５％（ｗ／ｗ）及び最大で約１０％（ｗ／ｗ）からなる群より選ばれる量でモノマー組成物に存在してもよい。
【００８５】
幾つかの実施形態では、機械特性改質剤は、疎水性高分子、例えば、疎水性ポリマー又は疎水性オリゴマーであってもよい。疎水性オリゴマーは一般に疎水性ポリマーよりも少ないモノマー反復単位を含むであろう。例えば、疎水性オリゴマーは１０以下のモノマー反復単位を含んでもよい。疎水性高分子は生物学的環境に対して生体適合性であり、かつ、最小毒性であることが好ましい。
【００８６】
疎水性高分子は、一般的に親水性であってもよいポリエーテルネットワークポリマーよりも堅くてもよい。従って、疎水性高分子を含むことはネットワークポリマーの機械特性を改質することができる。
【００８７】
疎水性高分子は、水性環境にて一般に親水性のポリエーテルネットワークポリマーの膨潤性も改質してもよい。ネットワークポリマーの水膨潤性は、方程式（１）：
％ＥＳＲ＝（（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｄ）×１００％            （１）
に従って算出される平衡膨潤率（％ＥＳＲ）として測定されてもよく、式中、Ｗｓ及びＷｄはそれぞれ、ネットワークポリマーの膨潤重量及び乾燥重量を指す。
【００８８】
疎水性高分子を含むことは、ポリエーテルネットワークポリマーについて得られる％ＥＳＲを限定することができる。幾つかの実施形態では、最小膨潤（低％ＥＳＲ）を示すことは、ポリエーテルネットワークポリマーにとって有利であり得、というのも、これにより、ポリエーテルネットワークポリマーを用いて製造される任意のインプラントが水性の生物学的環境にさらされた場合に、物理的寸法に最小の変化を示すのを保証することができることとなるからである。
【００８９】
一組の実施形態では、機械特性改質剤として採用される疎水性分子は、生分解性であり、かつ、生物学的環境において分解することが可能である官能基を含む。このことは、疎水性高分子が、生物学的環境にて加水分解及び／又は酵素による切断等であって、生物学的環境にて低分子量の分解生成物に分解する高分子の能力をもたらす切断等に感受性であってもよいことを意味する。一組の実施形態では、機械特性改質剤は、エステル、アミド、ウレタン（カルバメート）及びジスルフィド官能基、及びそれらの混合物からなる群より選ばれる少なくとも１つの官能基を含む疎水性分子である。
【００９０】
一組の実施形態では、疎水性高分子は疎水性のポリエステルポリオールであってもよい。例となる疎水性のポリエステルポリオールはジヒドロキシポリ（カプロラクトン）である。ポリエステルポリオールはヒドロキシ官能基を含むので、ポリエステルポリオールは、相補的な官能基を含むモノマーと共有結合反応することが可能であり、従ってポリエステルポリオールをポリエーテルネットワークポリマーの構成部分として共有結合で組み入れることにつながる。さらに、ポリエステルポリオールにおけるエステル基は加水分解又は酵素による切断に感受性であってもよく、それによって、ネットワークポリマーが分解するにつれて低分子量断片の生成を介して疎水性高分子が除かれるのを可能にする。一組の実施形態では、ポリエステルポリオールはまたジスルフィド基を含んでもよい。ジスルフィド基は、生物学的環境にて還元又は酵素による切断に感受性であってもよく、ポリエステルポリオールの分解を促進してもよい。
【００９１】
一組の実施形態では、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーは、０〜２０％（ｗ／ｗ）、０．１〜１５％（ｗ／ｗ）及び約０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）からなる群より選ばれる量でポリエステルポリオールを含んでもよい。一実施形態では、ポリエステルポリオールはジヒドロキシポリ（カプロラクトン）である。
【００９２】
生分解性ポリエーテルネットワークポリマーは、多官能性ポリエーテルモノマーと多官能性架橋モノマーを含む混合物を形成し、次いでモノマーの混合物をポリエーテルネットワークポリマーを形成するのに十分な時間、共有結合反応させる１工程反応にて製造され得る。
【００９３】
もう１つの態様では、本発明は、エステル結合を介して架橋されている生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造する方法であって、当該方法は、多官能性ポリエーテルモノマーと多官能性架橋モノマーとを含むモノマー組成物を、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの間でのエステル結合の形成を可能にする条件下で反応させる工程を含み、ここで、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの一方がヒドロキシ官能基を含み、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの他方が前記ヒドロキシ官能基と反応してエステル結合を形成することが可能な相補的な官能基を含み、かつ、前記ポリエーテルモノマー及び前記架橋モノマーより選ばれる少なくとも１つが分岐している、方法を提供する。
【００９４】
モノマー組成物は、本明細書に記載されているもののいずれか１つより選ばれる、ポリエーテルモノマーと架橋モノマーとを含んでもよい。
【００９５】
モノマー組成物はさらに、本明細書に記載されているような機械特性改質剤も含んでもよい。
【００９６】
幾つかの実施形態では、モノマー組成物は溶媒を含む。溶媒は有機溶媒であってもよい。溶媒は、ポリエーテルモノマー及び架橋モノマーを可溶化するのを助けてもよいので、均質なモノマー組成物を得ることができる。例えば、グリセロールエトキシレート及びペンタエリスリトールエトキシレートのようなポリエーテルモノマーが水溶性である一方で、例えば、ジカルボン酸ハロゲン化物のような架橋モノマーが水不溶性であるので、これが有用であってもよい。添加される溶媒の非存在下では、結果として、モノマーを一緒に混合することにおいて困難さに遭遇し得る。他の実施形態では、モノマー組成物は添加される溶媒を含まない。
【００９７】
当業者は、ヒドロキシ官能基と相補的な官能基との間での共有結合反応が一般に縮合生成物を生じることを理解するであろう。縮合生成物は一般に、官能基間の共有結合反応の副産物として除去される小分子である。
【００９８】
一実施形態では、相補的な官能基はカルボン酸塩化物であり、カルボン酸塩化物とヒドロキシ官能基との間での反応は縮合生成物として塩酸（ＨＣｌ）を生じる。ポリエーテルネットワークポリマーを形成するのにカルボン酸塩化物／ヒドロキシ化学反応を使用する利点の１つは、生分解性のエステル結合を生じる反応に加えて、反応も相対的に速くかつ高い効率で進み、ポリマー形成を促進するために従来技術の方法で使用され得るようなカップリング剤又は他の添加剤を用いる必要性が低くなることである。しかも、カルボン酸塩化物／ヒドロキシの反応は、ラジカル重合によって形成されるネットワークポリマーには必要とされ得る特殊な反応条件（例えば、酸素を含まない環境）を必要としない。
【００９９】
生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造する方法は室温で又は温度を高めて実施されてもよい。ポリエーテルモノマーと架橋モノマーとの間での反応は発熱性であってもよく、モノマー間の反応が進んで、ポリエーテルネットワークポリマーが形成されるにつれて温度が上昇する。モノマー間の反応はガス状形態の縮合生成物の生成を促進し得る。例えば、カルボン酸塩化物官能基とヒドロキシ官能基とを含むモノマー間の反応はガス状形態での塩酸を生成することができる。ガス状縮合生成物はポリエーテルネットワークポリマーにて細孔を生じる。
【０１００】
一組の実施形態では、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーは多孔性であってもよく、細孔は、約１ｎｍ〜約３ｍｍの範囲での平均細孔直径を有する。幾つかの実施形態では、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーは、互いにつながった細孔を含む構造を有してもよい。
【０１０１】
細孔は、モノマー組成物の重合の間にインサイチュで生成されるガス状縮合生成物の泡の周りで形を成すネットワークポリマーの結果として作出されてもよい。インサイチュで生成されたガスが、栄養素移動を可能にし、かつ、細胞増殖、組織浸透及び血管新生を可能にするのに十分に大きい細孔を含む多孔性構造を生成するために界面活性剤のような作用因子を使用する必要性を排除することができることは利点である。
【０１０２】
細孔はまた、ポロゲンの使用を介してポリエーテルネットワークポリマーにて作出されてもよい。従って、多孔性の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーが望まれる幾つかの実施形態では、ポリマーを製造するのに使用されるモノマー組成物はさらに固形ポロゲンを含んでもよい。従って、ポリエーテルモノマーの架橋モノマーとの共有結合反応は、多孔性のポリエーテルネットワークポリマーを形成するようにポロゲンの存在下で起きる。ポロゲンを取り除いた後、多孔性のネットワークポリマーが得られる。ポロゲンはネットワークポリマーにて作出される細孔径に対してさらに大きな制御を提供するであろうから、ポロゲンを採用して多孔性のネットワークポリマーを形成するのは利点であり得る。
【０１０３】
一実施形態では、モノマー組成物はさらにポロゲン粒子を含む。該粒子は、約５０〜１０００μｍ、約１００〜７００μｍ、又は約３００〜６００μｍからなる群より選ばれる範囲での粒径を有してもよい。幾つかの実施形態では、ポロゲン粒子は水溶性である。一実施形態では、ポロゲン粒子は塩粒子である。塩粒子は一般に、好適な塩、例えば、塩化ナトリウムを含むであろう。塩粒子は、湿った環境で形成され得る溶融塩粒子であってもよい。溶融塩粒子を使用する利点の１つは、それらが大きな粒径（例えば、およそ１００〜７００μｍ）の水溶性ポロゲン粒子を形成することができるということである。溶融塩粒子は、ポリエーテルネットワークポリマーにて互いにつながった細孔を形成するのも助けてもよい。
【０１０４】
ポリマー形成の後、続いてポロゲン粒子を取り除いて、多孔性の架橋ポリエーテルネットワークポリマーを得てもよい。ポロゲン粒子は、ネットワークポリマーに適当な溶媒を導入し、次いでポロゲンを溶媒に溶解させ、それによってポリマーから絞り出すことにより取り除かれてもよい。ポロゲン粒子が水溶性である場合、粒子除去用の溶媒として水が使用されてもよい。ポリエーテルネットワークポリマーは三次元で架橋された高分子構造であるので、溶媒には可溶性ではない。
【０１０５】
生分解性ポリエーテルネットワークポリマーはさまざまな溶媒にて一般に不溶性である三次元で架橋された高分子構造である。幾つかの実施形態では、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーは選ばれた溶媒にて膨潤することが可能であってもよい。幾つかの実施形態では、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーは水性溶媒にて膨潤することが可能である。これは、ネットワークポリマーの製造で採用されるポリエーテルモノマーの親水性の性質及び／又はネットワークポリマーの多孔性のせいで生じてもよい。水性溶媒にて膨潤する際、ネットワークポリマーはゲルに似てもよい。その結果、そのような実施形態では、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーはヒドロゲルであると見なされてもよい。
【０１０６】
多孔性ネットワークポリマーの細孔径は、機械特性に対して影響を及ぼすことができる。さまざまな方法条件によって異なる弾性率を持つ多孔性の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを作出することができる。多孔性を変化させることによって多孔性ネットワークポリマーの圧縮弾性率をテイラーメイドする可能性は、ネットワークポリマーの機械特性並びにネットワークポリマーによって製造される移植可能な器具及び足場材の特性がさまざまな組織型、例えば、脂肪、腎臓や前立腺の組織及び心筋に適合するように調整されるのを可能にすることになる。
【０１０７】
本発明の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーはさまざまな応用で使用されてもよい。
【０１０８】
ある１つの態様では、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含むインビトロの細胞培養基材が提供される。ある１つの形態では、該細胞培養基材がフィルム形状をなしている。フィルムは、ナノメートル範囲での細孔直径を持つ細孔を有するナノ多孔性フィルムであってもよい。ナノ多孔性フィルムは細胞増殖を支えるのに必要とされる栄養素及び流体の移動を可能にするであろう。
【０１０９】
もう１つの態様では、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材と、該基材に播種される細胞とを含む移植可能な器具が提供される。
【０１１０】
所望であれば、移植可能な器具は、特定の種類の細胞の成長又は増殖を促進する因子及び／又は他の生物学的な及び化学的な実体物も含んでもよい。
【０１１１】
ある１つの形態では、移植可能な器具は、被験体の眼に移植するための眼科用器具であり、かつ、細胞は角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞からなる群より選ばれる。
【０１１２】
従って、幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材と、該基材上に播種される角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞からなる群より選ばれる細胞とを含む眼インプラントを提供する。
【０１１３】
眼インプラントの基材は好ましくは、可視光に対して９８％を超える透明性を有し、かつ、フィルム形状をなしてもよい。ある１つの形態では、基材はナノ多孔性フィルム形状をなしてもよい。基材は、被験体の眼における所望の部位での器具の操作及び器具の移植を円滑にする好適な厚さであってもよい。基材の厚さは、生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造するのに使用されるモノマー組成物に存在するモノマーの量を変化させることによって調整されてもよい。一組の実施形態では、基材は、水和状態である場合、約１０〜１５０μｍの範囲での厚さを有する。ネットワークポリマーの機械特性が、ネットワークポリマーを用いて相対的に薄いフィルムを製造することが可能であるほどのものであるということは、本発明の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーの利点である。このことは、移植可能な器具における基材としてフィルムが使用される場合、フィルムが極めて低い侵襲性の外科処置で楽に使用することができるので、有益であり得る。
【０１１４】
もう１つの態様では、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む足場材が提供される。幾つかの実施形態では、足場材は本明細書に記載されているような多孔スポンジ形状をなしている。以下でさらに議論されるように、足場材は、組織工学の応用、特に軟組織工学にて採用されてもよい。
【０１１５】
本発明のもう１つの態様では、エステル結合を介して架橋されている多孔性の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造するための方法であって、当該方法は、多官能性ポリエーテルモノマーと多官能性架橋モノマーを含むモノマー組成物を、エステル結合を介して架橋されているポリエーテルネットワークポリマーの形成を可能にし、かつ、前記ネットワークポリマー内部にて複数の細孔を生じさせるガス状縮合生成物のインサイチュでの生成を可能にする条件下で反応させる工程を含み、ここで、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの一方がヒドロキシ官能基を含み、かつ、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーの他方が前記ヒドロキシ官能基と反応してエステル結合を形成することが可能な相補的な官能基を含み、かつ、前記ポリエーテルモノマーと前記架橋モノマーより選ばれる少なくとも１つが分岐している、方法が提供される。
【０１１６】
上記方法のある１つの形態では、インサイチュで生成されるガス状縮合生成物は、それが生じるにつれてポリエーテルネットワークポリマーを膨張させ、それによってネットワークポリマーの発泡を生じる。膨張した多孔性のポリエーテルネットワークポリマーは、ある１つの形態では、多孔スポンジに似てもよいし、又は多孔スポンジであってもよい。ポリマーのスポンジは生分解性であり、かつ、ポリエーテルモノマーと架橋モノマーとの間で形成されたエステル結合の結果、架橋されている。
【０１１７】
多孔性の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造するための方法の一組の実施形態では、ポリエーテルモノマーと架橋モノマーを含有するモノマー組成物を有限の空隙容量の容器にて反応させる。有限の空隙容量の容器は密封された反応容器であってもよい。有限の空隙容量の容器におけるモノマーの反応は細孔の径又は構造に影響を及ぼし得る。例えば、大きな有限の空隙容量の容器におけるモノマー組成物の反応は、同じモノマー組成物をさらに小さな有限の空隙容量の容器で反応させる場合に比べて、多孔性ポリエーテルネットワークポリマーにて大きな細孔を生成するであろう。細孔径の差異は、ガス状縮合生成物のインサイチュでの生成の結果生じる容器内の圧力に関係すると考えられる。細孔径における類似の変化は、モノマー組成物におけるモノマーの量を変化させることによっても得ることができる。
【０１１８】
多孔性の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを製造するための方法の他の実施形態では、モノマー組成物を無限の空隙容量の容器で反応させる。例えば、モノマー組成物を開放容器で反応させてもよい。この例では、得られる多孔性のポリエーテルネットワークポリマーは大きな細孔径を有するであろう。
【０１１９】
モノマー組成物におけるポリエーテルモノマーと架橋モノマーの反応は、室温で又は温度を高めて進行されてもよい。
【０１２０】
多孔性の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーの製造にて採用されるモノマー組成物は、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つのポリエーテルモノマー及び架橋モノマーを含んでもよい。
【０１２１】
ある１つの形態では、ポリエーテルモノマーは複数個のヒドロキシ官能基を含み、かつ、架橋モノマーは複数個のカルボン酸ハロゲン化物官能基を含む。
【０１２２】
特定の形態では、ポリエーテルモノマーは複数個のヒドロキシ官能基を含み、かつ、架橋モノマーは複数個のカルボン酸塩化物官能基を含む。そのような実施形態では、ヒドロキシ官能基とカルボン酸塩化物官能基が反応してエステル結合を形成する場合にインサイチュで生成されるガス状縮合生成物はガス状の塩酸（ＨＣｌ）である。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、多孔性の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーの製造で採用されるモノマー組成物はさらに、本明細書に記載されているような機械特性改質剤を含んでもよい。一組の実施形態では、モノマー組成物は、最大で２０％（ｗ／ｗ）、最大で１５％（ｗ／ｗ）及び最大で１０％（ｗ／ｗ）からなる群より選ばれる量で機械特性改質剤を含んでもよい。
【０１２４】
機械特性改質剤は疎水性高分子であってもよい。例となる疎水性高分子は、ポリエステルポリオール、例えば、ジヒドロキシポリ（カプロラクトン）である。一組の実施形態では、モノマー組成物は０〜２０％（ｗ／ｗ）、０．１〜１５％（ｗ／ｗ）及び約０．５〜１０％（ｗ／ｗ）からなる群より選ばれる量でポリエステルポリオールを含んでもよい。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、多孔性の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーの製造で採用されるモノマー組成物はさらに、ポロゲン、例えば、本明細書に記載されているようなポロゲン粒子を含んでもよい。一実施形態では、ポロゲン粒子は塩粒子、例えば、溶融塩粒子である。ポロゲンは、約５０〜１０００μｍ、約１００〜７００μｍ、又は約３００〜６００μｍからなる群より選ばれる範囲での粒径を有してもよい。ポロゲンは、ポリエーテルネットワークポリマーにおいてさらに大きな細孔を作出するのに役立ってもよく、かつ／又は、生成される細孔のサイズ及び構造を制御するのに役立ってもよい。
【０１２６】
生分解性の多孔性ポリエーテルネットワークポリマーは、ポリエーテルモノマーと架橋モノマーとの間での反応の結果インサイチュで形成される互いにつながった細孔構造と、該反応から生じるガス状縮合生成物とを有してもよい。多孔性ネットワークポリマーを製造するのに使用されるモノマー組成物がポロゲンを含むのであれば、大きな細孔を有する互いにつながった細孔構造が作出されてもよい。
【０１２７】
互いにつながっている流路と共に大きな細孔を含む互いにつながった細孔構造は、組織工学の応用に有利であってもよい。大きな細孔は、組織及び血管新生が浸透するのを可能にし、かつ、組織の増殖及び発達を促進するのを可能にする。しかも、互いにつながっている流路は、多孔性構造の中での細胞の移動、組織の拡張、及び血管系の形成のための手段を提供することができる。多孔性構造の互いにつながった性質は、細胞性の老廃物のクリアランスと同様に栄養素及び流体の輸送も可能にすることになる。
【０１２８】
本明細書に記載されているポリエーテルネットワークポリマーは、生体適合性で、かつ、生分解性のポリマーが望まれるさまざまな応用での使用に好適である。
【０１２９】
生分解性ポリエーテルネットワークポリマーは、インビトロ及びインビボで非毒性及び最小免疫原性と共に優れた機械特性及び分解特性を示す。これらの特徴によって結局のところ、ネットワークポリマーが組織工学応用における足場材として、かつ、細胞培養及び移植可能な器具のための基材として使用するのに優れた候補であることが可能になる。ポリエーテルネットワークポリマーの生分解性は、外来性の材料が移植部位に蓄積しないことを意味し、そうして、これにより、周囲の組織が本来の構造に戻るのを可能にする。
【０１３０】
本発明はさらに被験体にて組織を再生する方法であって、当該方法が、被験体の所望の部位に、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む足場材を移植する工程を含む、方法を提供する。一組の実施形態では、組織は脂肪組織であり、かつ、足場材は被験体の胸部領域に移植される。足場材は、組織の再生が望まれる再構成処置又は美容目的の処置にて使用することができる。
【０１３１】
本発明は、さらに、細胞培養方法であって、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材に細胞培養条件下で細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。方法は、細胞培養で増殖することが可能である増殖性細胞と共に使用されてもよい。方法の一組の実施形態では、細胞は内皮細胞及び上皮細胞、特に角膜内皮細胞及び角膜上皮細胞からなる群より選ばれる。
【０１３２】
本発明は、さらに、移植可能な器具を製造するための方法であって、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材に細胞を提供する工程と、当該基材に細胞を播種する工程とを含む方法をさらに提供する。ある１つの形態では、該器具は被験体の眼に移植するための移植可能な眼科用器具であり、かつ、該細胞は、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞からなる群より選ばれる。
【０１３３】
本発明は、さらに、被験体における障害又は状態の治療のための方法であって、当該方法が、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つに係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材と当該基材上に播種された細胞を含む移植可能な器具を提供する工程と、当該器具を被験体の治療が望まれる部位に移植する工程とを含む、方法をさらに提供する。幾つかの実施形態では、病気又は障害は角膜内皮機能障害であり、かつ、上記方法は、被験体の眼に眼インプラントを移植する工程を含み、当該眼インプラントは、本明細書に記載されている１以上の実施形態に係る生分解性ポリエーテルネットワークポリマーを含む基材と、基材上に播種された角膜内皮細胞とを含む。本発明者らは、角膜透明性は、眼インプラントによって数週間にわたって有利に維持され得ることを観察している。
【０１３４】
本発明のポリエーテルネットワークポリマーは、生物学的環境にて分解することが可能であり、かつ、非毒性の分解副産物を生じることが可能である。生分解の速度は数日から数週で変化してもよく、ポリエーテルネットワークポリマーにおける不安定なエステル結合の量を変化させることによって調整することができる。幾つかの実施形態では、ポリエーテルネットワークポリマーの分解は約２週間から約２０週間の時間で起き得る。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、ポリエーテルネットワークポリマーの生分解性は、ネットワークポリマーの形態を調整することによって改変されてもよい。例えば、多孔スポンジの形態でのポリエーテルネットワークポリマーは、生物学的環境にさらすことができるさらに大きな表面積を提供するポリマーの多孔性構造の故にさらに速い分解速度を示してもよい。
【０１３６】
本発明の生分解性ポリエーテルネットワークポリマーは、生体適合性であり、非毒性で、かつ、最小免疫原性であることが分かっている合成ポリマーである。ネットワークポリマーの分解性、機械特性及び透過性を制御する能力によって、これらのポリマーが再生医療及び組織工学の応用のために多用途の基材及び足場材に製作されるのが可能になる。
【０１３７】
以下の実施例は、本発明の範囲を説明し、再現及び比較を可能にするように意図される。それらは、本開示の範囲を限定することを決して意図するものではない。
【実施例】
【０１３８】
［生分解性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）フィルム］
【０１３９】
＜材料＞
【０１４０】
グリセロールエトキシレート（Ｍｎ約１ｋＤａ）、塩化セバコイル（≧９５％）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）錠剤、ε−カプロラクトン（９７％）、２，２’−ジチオジエタノール（９０％）、オクタン酸第一スズ（約９５％）、トルエン（無水、９９．８％）、Ｃｏｓｔａｒ超低結合プレート、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）蛍光染色、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及びデキストランＭｒ約５０００００、グルコースアッセイキット（Ｓｉｇｍａ、ＧＡＧＯ−２０：グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ試薬及びＯ−ジアニシジン二塩酸塩）及びウシ由来のアルブミン−フルオレセインイソチオシアネート抱合体（アルブミン−ＦＩＴＣ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、受け取ったまま使用した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％）、トリパンブルー（０．４％）及びペニシリン−ストレプトマイシンはＧＩＢＣＯから入手した。細胞生存率アッセイでの使用の前に、ＤＭＥＭを１０％ｖ／ｖのＦＢＳ、１％ｖ／ｖのＬ−グルタミン及び１％ｖ／ｖのペニシリン−ストレプトマイシンで補完した。ＮＵＮＣＴ２２５カントネックのフラスコはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ組織培養用プラスチック（ＴＣＰ）カバースリップはＮＵＮＣから入手した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ１２（ＤＭＥＭ：Ｆ１２）、抗生剤−抗真菌剤、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ、トリプシン、及びＥＤＴＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。マウスクローンＭ１７−Ｐ５−Ｆ１１にて産生された抗−Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ（β２−サブユニット）モノクローナルＩｇＧはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分光分析（ＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ  ＭＳ）マトリクストランス−２−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−２−メチル−２−プロペニリデン］マロノニトリル（ＤＣＴＢ）（≧９９．０）及びカチオン化剤（ＮａＴＦＡ（９９．９９９％））はＡｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったまま使用した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ，９９．９９％）、Ｄ−グルコース（≧９９．５％）、ジクロロメタン（９９．５％）はＣｈｅｍ−Ｓｕｐｐｌｙから供給され、受け取ったまま使用した。細胞生存率アッセイのためのＣｅｌｌｔｉｔｅｒＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ溶液はＰｒｏｍｅｇａから入手し、受け取ったまま使用した。
【０１４１】
＜α，ω−ジヒドロキシルポリカプロラクトン（機械特性改質剤）の合成＞
【０１４２】
ε−カプロラクトンの開環重合（ＲＯＰ）を介してα，ω−ジヒドロキシルポリカプロラクトン（ジヒドロキシＰＣＬ）を製造した。ε−カプロラクトン（２０．０ｇ、１７５ミリモル）と２，２’−ジチオジエタノール（１．０８ｇ、７．００ミリモル）とオクタン酸第一スズ（０．９５ｇ、２．３４ミリモル）を無水トルエン（４５ｍＬ）に溶解し、アルゴンのもとで１１０℃で２４時間加熱した。混合物を室温に冷却し、ＴＨＦ（５０ｍＬ）で希釈し、冷メタノール（−１８℃、１Ｌ）中にて沈殿させた。濾過により沈殿物を回収し、真空（０．１ミリバール）で乾燥させて白色粉末としてα，ω−ジヒドロキシルＰＣＬを得た。１８．８ｇ（９４％）；Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３．２ｋＤａ，Ｍｎ（ＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ）＝３．３ｋＤａ（ＰＤＩ＝１．０７）。
【０１４３】
＜生分解性ＰＥＧフィルムの製造＞
【０１４４】
所望の量のジヒドロキシルＰＣＬ（それぞれ５ｗｔ％又は１０ｗｔ％のＰＣＬ含量）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（１５ｍＬ）に溶解した。グリセロールエトキシレート（０．７０ミリモル）と塩化セバコイル（１．４２ミリモル）をジヒドロキシルＰＣＬ溶液に加え、それを十分に混合し、時折撹拌しながら、室温で１時間静置した。ＰＣＬを含まない試料も製造した。ＰＥＧフィルムを製造するのに使用したモノマー溶液を表１に詳述する。
【０１４５】
【表１】
0006403754.tif 000004
【０１４６】
それぞれの容量（７．５ｍＬ）の上記モノマーをガラス製のペトリ皿（直径１０ｃｍ）にてピペットでかき混ぜた。各皿を次いで６０℃の真空オーブンに２０分間入れ、その後、真空（２０ミリバール）を適用した。さらに３０分後、皿を取り出し、室温に冷却した。フィルムの周囲に外科用メスで刻み目を入れ、ペトリ皿に脱イオン水を満たした（２０ｍＬ）。１５分後、水を取り除き、１：１のＴＨＦ：脱イオン水（４０ｍＬ）を加えた。フィルムをペトリ皿表面から剥離し、水（２５０ｍＬ）に入れた。１５分ごとに水を新鮮な水と交換し（２５０ｍＬで３回）、真空下（２０ミリバール、３０℃）でフィルムを２４時間乾燥させた。乾燥させたフィルムはさらなる使用までデシケータにて保存した。
【０１４７】
環境走査電子顕微鏡（Ｅｎｖｉｒｏ−ＳＥＭ）及びスペクトル反射解析を用いて架橋ＰＥＧフィルムの厚さを測定した。水和フィルムはおよそ５０μｍの平均厚さを有すると測定された。
【０１４８】
フィルムの薄さ及び成形条件（２０ミリバール、６０℃）の結果、成形工程の間に揮発性溶媒ジクロロメタン及び形成されたＨＣｌガスは容易に取り除かれる。その後、洗浄及び水によるヒドロゲルフィルムの膨潤を行ってＨＣｌの完全な除去を確保した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）による水の置き換えによって、フィルム内での水とＴＨＦの間での溶媒交換が可能になり、かつ、その結果生じる膨潤によってフィルムがペトリ皿表面から容易に剥離するのが可能になるが、それは乾燥状態では成形フィルムを損傷することなく達成することはできない。
【０１４９】
＜平衡膨潤率及び接触角の測定＞
【０１５０】
膨潤特性を観察するために、上記で製造したＰＥＧフィルムを１×ＰＢＳにて２４時間膨潤させた。方程式％ＥＳＲ＝（（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｄ）×１００％（式中、Ｗｓ及びＷｄはそれぞれ、膨潤重量及び乾燥重量を指す）を用いて、さまざまなフィルムの平衡膨潤率（％ＥＳＲ）を算出した。解析は各種フィルムについて３つ組で行い、結果を平均した。
【０１５１】
水接触角の測定は、ＤａｔａＰｈｙｓｉｃｓのＯＣＡ２０張力計で実施した。測定は、０、５ｗｔ％及び１０ｗｔ％のＰＣＬ含量を伴った完全に膨潤したフィルムにて液滴法（１０μｌの液滴）を用いてＯＣＡソフトウエアで記録された。測定は、フィルム表面に水滴を載せた６０秒後に行った。
【０１５２】
上記実験の結果を表２にて示す。
【０１５３】
【表２】
0006403754.tif 000005
【０１５４】
表２に示すように、ＰＣＬ含量が増加する（０、５及び１０ｗｔ％）のに伴ってフィルムの％ＥＳＲはやや低下した（それぞれ１１８、１０９、１００％）。これは、ＰＥＧフィルムの膨潤能を低下させる疎水性ＰＣＬ成分の撥水効果の結果である。上昇するＰＣＬ含量はまた、それぞれ４４°から５８°及び６７°への接触角の増大ももたらすということは、ＰＥＧフィルムの疎水性の軽い上昇を示している。
【０１５５】
＜光線透過率の評価＞
【０１５６】
水和ＰＥＧフィルムを１×ＰＢＳ溶液に１時間入れ、次いでＵＶ−Ｖｉｓ評価に供した。紫外光及び可視光のスペクトル（２９０〜７５０ｎｍ）についてフィルムの透過率を２５℃で記録した。結果は、０％、５％及び１０％のＰＣＬを含有するＰＥＧフィルムがすべての波長（４００〜７００ｎｍ）で可視光線の＞９８％を透過することができることを明らかにした。
【０１５７】
＜引張の評価＞
【０１５８】
引張試験を行ってさまざまな量のＰＣＬ（０、５及び１０ｗｔ％）で製造したＰＥＧフィルムの引張能を測定し、ヒトの角膜との比較を可能にした（表３）。脱水したフィルムを１×ＰＢＳで膨潤させ、引張特性の評価のために２×２ｃｍのゲージ領域と２ｃｍのタブを伴った犬用の骨（ドッグボーン型）の形状に切断した。Ｉｎｓｔｒｏｎマイクロテスターの金属クランプの中で木製タブの間にフィルムを固定し、フィルムのズレ及び押さえる部分での引裂きを防いだ。引張試験に先立って応力の前提条件についてフィルムを調整しなかった。フィルムの引張の評価は１×ＰＢＳ溶液にて３５℃で温度を制御したマイクロテスターの水槽において実施した。各種類のフィルム（０、５又は１０ｗｔ％のＰＣＬ）で最低３回繰り返して調べた。クランプで固定した試料を０．１ｍｍ／秒の速度で５０Ｎのロードセルにてゲージ領域でのフィルムの破損が生じるまで引っ張った。ゲージ領域内で破損しなかったフィルムは生データの複雑さのために無視した。Ｂｌｕｅｈｉｌｌソフトウエアから得たデータをグラフ作成とカギとなるパラメータ、例えば、最終的な引張応力／張力及び引張弾性率の決定のためにＯｒｉｇｉｎＰｒｏ７．５ソフトウエアにエクスポートした。結果を表３にて要約する。
【０１５９】
【表３】
0006403754.tif 000006
【０１６０】
上記の結果から、疎水性ＰＣＬの添加は得られたＰＥＧフィルムの機械特性を改善することができることを示している。さらに、０及び５ｗｔ％ＰＣＬ含量のＰＥＧフィルムは、デスメ膜に匹敵する引張弾性率を示し、それは、角膜内皮細胞の再生のための移植可能な器具を開発する場合、役に立ち得る。
【０１６１】
＜インビトロの分解試験＞
【０１６２】
０、５及び１０％ＰＣＬ含量を伴った水和フィルムを２×２ｃｍ四方に切断した。５分間隔にて水（２０ｍＬ）で３回洗浄した後、４０℃にて真空（２０ミリバール）で２４時間フィルムを乾燥させた。乾燥させたフィルムを秤量し、バイアル（２８ｍＬ）に移し、１×ＰＢＳ（２０ｍＬ）を加えた。その後、角膜前房の自然温度である３５℃で温度制御したオービタルシェーカーに容器を入れた。フィルムを伴った３つの容器を１、２、４及び８週目の時点でオービタルシェーカーから取り出した。取り出したフィルムを時折穏やかに撹拌しながら１５分間水（２０ｍＬで３回）で洗浄し、４０℃にて真空（２０ミリバール）で２４時間乾燥させた。乾燥させたフィルムを秤量し、時間に対して質量をプロットしてフィルムの分解プロフィールを得た。０％、５％及び１０％のＰＣＬ含量を持つフィルムの分解の程度の計算は、８週目にてそれぞれ約２４％、１５％及び１０％の質量損失を示した。結果を図２に示す。
【０１６３】
＜ＰＥＧフィルムのインビトロでの透過性の評価＞
【０１６４】
５ｍＬのセル容量を持つサイドバイサイド型拡散セル（米国ペンシルベニア州ベスレヘムのＰｅｒｍｅＧｅａｒ）にてグルコース及びアルブミンの拡散性測定を行った。フィルム（５ｗｔ％のＰＣＬ）を拡散セル間に配置し、きつく締めて漏出を防いだ。グルコースの測定については、一方のセル（供給源）をグルコースのＰＢＳ溶液（０．０５ｇ／ｍＬ、４ｍＬ）で満たし、他方のセル（標的）をＰＢＳ緩衝液（４ｍＬ）のみで満たした。アルブミンの測定については、アルブミン−フルオレセインイソチオシアネート抱合体（アルブミン−ＦＩＴＣ）のＰＢＳ溶液（５０μＭ、４ｍＬ）を供給源セルに入れ、ＰＢＳ緩衝液を標的セルに入れた。グルコース及びアルブミン双方の測定について、各セルにて磁気撹拌しながら、チャンバーを３５℃で維持した。設定した時間（３０、４５、６０、８０及び１００分）にアリコート（２ｍＬ）を標的セルから取り出し、ＰＢＳ（２ｍＬ）で置き換えた。グルコースの測定については、グルコースアッセイキット（Ｓｉｇｍａ  ＧＡＧＯ−２０：グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ試薬及びジヒドロ塩化Ｏ−ジアニシジン試薬）を用いて分光光度分析用に試料を調製し、島津ＵＶ−１８００分光光度計を５４０ｎｍで用いて分析した。アルブミンの測定については、島津ＵＶ−１８００分光光度計を用いて４９５ｎｍでのアルブミン−ＦＩＴＣの吸光度を測定した。
【０１６５】
インビトロの透過性試験は、５％ＰＣＬを伴ったフィルムがグルコース及びアルブミンについてそれぞれ２．３（±０．３）×１０−６ｃｍ２／秒及び１．０（±０．２）×１０−７ｃｍ２／秒の拡散性を有することを示した。比較すると、文献の報告は、ヒト角膜がそれぞれ２．６（±０．３）×１０−６ｃｍ２／秒及び１．０×１０−７ｃｍ２／秒のグルコース及びアルブミンの拡散性を有することを示唆している（Ｒａｆａｔ  Ｍ，Ｌｉ  Ｆ，Ｆａｇｅｒｈｏｌｍ  Ｐ，Ｌａｇａｌｉ  ＮＳ，Ｗａｔｓｋｙ  ＭＡ，Ｍｕｎｇｅｒ  Ｒ，Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｔ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｍ“角膜組織工学のためのＰＥＧで安定化したカルボジイミド架橋のコラーゲン−キトサンヒドロゲル”Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００８；２９：３９６０−３９７２）。インビトロの拡散性試験は、ＰＥＧフィルムが、例えば、ヒト角膜のような組織の生存及び機能にとって重要である大分子及び小分子双方に対して透過性であることを実証している。
【０１６６】
＜ＰＥＧフィルムのインビトロの細胞毒性の評価＞
【０１６７】
フィルムの細胞毒性を評価するために、脱水したフィルム（５ｗｔ％のＰＣＬ、１００ｍｇ）を８０％ｖ／ｖエタノール溶液に３０分間入れた。次いでフィルムを洗浄し、１０分間隔で無菌のＰＢＳにて再水和した（２０ｍＬで３回）。その後、再水和したフィルムを無菌の補完ＤＭＥＭ（２ｍＬ）に入れ、その後３７℃で７２時間インキュベートした。溶液からフィルムを取り出し、馴化培地を細胞生存率アッセイに使用した。細胞の生存率に対するフィルム分解生成物の影響を検討するために、脱水フィルム（５００ｍｇ）を１ＭのＨＣｌ（５ｍＬ）で３０分間にわたって分解させた。真空で溶液を濃縮し、残留物を水で共沸させ（２０ｍＬで５回）、次いで真空（０．１ミリバール）で乾燥させた。分解生成物（１００ｍｇ）を無菌のＤＭＥＭ（２ｍＬ）に溶解した。次いで、毒性試験における使用に先立って、溶液を紫外光のもとで３０分間滅菌し、０．２２μｍのナイロンフィルターを介して濾過した。Ｔ２２５フラスコにて補完されたＤＭＥＭ中で３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気で９５〜１００％の湿度でＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１細胞を集密まで増殖させた。０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を用いて細胞をトリプシン処理し、生／死の染色としてトリパンブルーを用いて手動で数を数え、新鮮な培地で希釈して１．２５×１０５個／ｍＬの播種密度を得て、それを９６穴プレート（８０μＬ／ウェル）に入れた。一部のウェルはブランクのままにして細胞／ブランクコントロールとして役立てた。フィルムで馴化した培地及びフィルム分解生成物溶液の添加に先立ってプレートを４時間インキュベータに戻した。調製したストック溶液（５００ｍｇ／ｍＬ）を、新鮮な完全培地を用いて１０倍で２回希釈した。２０μＬのストック溶液及びその２つの希釈を３つ組で９６穴プレートに加え（１００、１０００及び１００００ｐｐｍの濃度を得て）、プレートの撹拌揺動運動によって穏やかに混合し、次いでプレートをインキュベータに戻し、さらに７２時間インキュベートした。その後、ＣｅｌｌｔｉｔｅｒＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ溶液をプレートに加え（２０μＬ／ウェル）、プレートを穏やかに揺り動かして混合を促進し、次いで３０分間〜４時間インキュベータに戻した。周期的な間隔で、マイクロプレートリーダーを装備したＣａｒｙ  ５０  Ｂｉｏ  紫外−可視分光光度計を用いて４９０ｎｍ及び７００ｎｍにてプレートの紫外光−可視光の吸光度を読み取った。約２時間のインキュベートの後、溶液の色は平衡化した。４９０ｎｍでの吸光度の値をバックグランドの吸光度（７００ｎｍ）及び培地のみ（細胞／ブランクコントロール）の吸光度について補正し、次いで増殖コントロールに対して基準化した。
【０１６８】
さまざまな濃度（１００、１０００及び１００００ｐｐｍ）のＰＥＧフィルムで馴化した培地及び分解生成物の存在下で７２時間細胞をインキュベートした後、図３（ａ）及び（ｂ）にて見られるように最小毒性が認められた。
【０１６９】
分解生成物（加速された酸触媒の加水分解を介して得られた）の存在下では、１００００ｐｐｍの極度に高い濃度においてさえ、細胞はコントロール（分解生成物なし）に比べて生存可能のままであり、かつ、代謝上活発であり続けた（図３（ｂ））。エステル結合の加水分解を介したＰＥＧフィルムの分解は、ＰＥＧ、セバシン酸及び６−ヒドロキシヘキサン酸（ＰＣＬの分解に由来する）のような毒性の低い化合物を生じる。
【０１７０】
ＰＥＧフィルムで馴化した培地に関して、１００ｐｐｍ及び１０００ｐｐｍの濃度では細胞の生存性及び代謝活性に対して否定的な効果は認められなかった。１００００ｐｐｍの非常に高い濃度では細胞の代謝活性にて軽度の低下が認められたが（図３（ａ））、このデータの標準偏差は十分にコントロールデータの範囲内にあり、統計的に無視できると見なすことができる。細胞毒性試験の結果は、ＰＥＧフィルム及びそれらの分解生成物が、細胞の増殖を損傷せず、かつ、無害であり、このことは、それらが、組織再生のための及び移植可能な基材としての好適な構築基盤になることを示唆している。
【０１７１】
＜角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の採取及びインビトロでのＰＥＧフィルム基材の細胞播種＞
【０１７２】
脱水したフィルム（５ｗｔ％のＰＣＬ）をＰＢＳ（２０ｍＬ）で再水和し、丸穴穴開け機を用いて円板状（直径１６ｍｍ）に切断した。その後、フィルムを８０％ｖ／ｖのエタノール（２０ｍＬ）に１時間入れた。次いで１５分間隔で無菌ＰＢＳ溶液にてフィルムを洗浄した（２０ｍＬで３回）。次いでフィルムを２４穴プレートに入れ、フィルムの上に無菌のガラスリング（外径１５ｍｍ）を置いた。フィルムを含有するウェルにＰＢＳ（２ｍＬ）を加え、細胞培養試験に先立ってウェルプレートを冷蔵庫にて８℃で保存した。細胞培養試験に先立ってフィルムにて表面修飾もタンパク質抱合も行わなかった。
【０１７３】
ヒツジの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）をインビトロの細胞播種試験のために選んだ。メリノ種のヒツジの新しく捕集した実験死体に由来する眼球をプロビオジン（１：５０、８分）、メタノール（２０％ｖ／ｖ、６０秒）、過酢酸（０．１％ｖ／ｖ、５分）及び抗生剤−抗真菌剤を伴ったＰＢＳで洗浄した。次いで角膜を切り離し、薄化（thinning）培地（１：１のＤＭＥＭ：Ｆ１２、インスリン（０．５μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（０．２７５μｇ／ｍＬ）、セレニウム（０．２５ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ、２％ＦＣＳ、抗生剤−抗真菌剤及びデキストラン）に１６時間移した。デスメ膜を角膜組織から切り離し、コラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）で６０分間、及びトリプシン（０．０５％）／ＥＤＴＡ（０．０２％）で５分間処理した。次いで試料におけるデスメ膜を小片に切断し、粉砕して単個細胞浮遊液を作製し、その後、脱細胞化したデスメ断片を取り出した。角膜培地（１：１のＤＭＥＭ：Ｆ１２、インスリン０．５μｇ／ｍＬ、トランスフェリン０．２７５μｇ／ｍＬ、セレニウム０．２５ｎｇ／ｍＬ、ＥＧＦ、１０％ＦＣＳ、及び抗生剤−抗真菌剤）におけるフィルム又はＴｈｅｒｍａｎｏｘ組織培養プラスチック（ＴＣＰ）カバースリップの上に５００００個の細胞を播種した。標準の条件下（３７℃、５％ＣＯ２）にて細胞培養を行った。
【０１７４】
免疫蛍光試験については、ヒツジの角膜から切り離したデスメ膜を陽性コントロールとして用いた。試験試料は、フィルム上で培養したヒツジのＣＥＣだった。試料はすべて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定し、その後ＰＢＳで洗浄し、使用まで４℃で保存した。免疫蛍光法は以下のように行った。０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１５分間試料を透過処理し、その後ＰＢＳで洗浄した。３％の正常ヤギ血清で３０分間ブロッキングを行った。加湿チャンバーにて２時間、ＰＢＳ中の一次抗体（抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼＩｇＧ抗体）とともに試料をインキュベートした。陰性コントロールは一次抗体を含まずにインキュベートした。ＰＢＳによる洗浄の後、試料を二次抗体と共に１時間インキュベートした（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ４８８）。ＰＢＳによる洗浄の後、試料を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と共に５分間インキュベートした。最後のＰＢＳによる洗浄の後、試料を水性媒体と合わせた。ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ６１を用いて画像を得た。
【０１７５】
コンピュータを使った立体画法断層撮影法（ＣＡＳＴ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いてヘマトキシリン標識した核から細胞密度を測定した。比較のために、新しく切り離したヒツジの角膜の細胞密度を位相差顕微鏡によって測定した（Ｌｉｏｎｓ  Ｅｙｅ  Ｄｏｎａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＣＥＲＡ）。
【０１７６】
＜ＰＥＧフィルムを伴った基材上でのインビトロのＣＥＣの付着及び増殖＞
【０１７７】
培養したＣＥＣは図４（ａ）及び（ｂ）で見られるようにその天然のインビボでの多角形の形態を保持した。ＰＥＧフィルム基材上で培養した細胞のＣＡＳＴによる計数によって３１５０細胞／ｍｍ２の細胞密度が得られた（標準誤差＝４５９、ｎ＝４）。この細胞密度はスペキュラーマイクロスコープによって測定したヒツジＣＥＣのインビボのそれである３１５０細胞／ｍｍ２（標準誤差＝８８、ｎ＝３）と同一である。免疫蛍光法は、培養した細胞がＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼに対して陽性であることを示している。Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼはポンプ機能の調節因子であり、ＣＥＣのマーカーとして使用されている。ＣＥＣの外側末端部でのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼの観察は完全なままのポンプ機能を示している。ヒツジＣＥＣはＰＥＧフィルム基材上で容易に増殖した。ＰＥＧフィルムは、例えば、コラーゲンやＲＧＤのような付着リガンドを抱合しないでＣＥＣの付着及び増殖を支えることが可能だった。１４ヵ月齢の老齢のメリノ種のヒツジに由来する角膜における３１５０細胞／ｍｍ２（ＳＥＭ  ８８、ｎ＝３）の密度と比べて、フィルム上で培養した細胞は３１５０細胞／ｍｍ２（ＳＥＭ  ４５９、ｎ＝４）の細胞密度を提供した。これらの細胞密度は健常なヒト角膜のそれに匹敵し、眼球提供事業の品質管理基準（一般に＞２５００細胞／ｍｍ２）には十分である。
【０１７８】
＜インビボでの毒性及び免疫応答の評価＞
【０１７９】
穴開け機を用いて水和フィルム（５ｗｔ％のＰＣＬ）を円板状（直径１０ｍｍ）に切断し、４０℃で２４時間乾燥させ、二重試料バッグに封じ込めた。Ｓｔｅｒｉｔｅｃｈ（オーストラリア、ビクトリアのＤａｎｄｅｎｏｎｇ）にて２５ｋＧｙの最少線量でフィルムを滅菌した。滅菌したフィルムをフィルムのインビボでの毒性及び免疫応答の評価に使用した。
【０１８０】
手順はすべてオーストラリアの国立保健医療研究審議会（ＮＨＭＲＣ）の指針に従って実施され、メルボルン大学獣医学部動物倫理員会によって認可された。外科的処置に先立って、メリノ種のヒツジ（ｎ＝４）を２４時間絶食させた。処置の１時間前に局所１％の硫酸アトロピン１滴と１０％粘性塩酸フェニルエフリン１滴によって手術される眼の瞳孔を拡張させた。外頸静脈への静脈内での２５ｍｇ／ｋｇのチオペントンナトリウムによって麻酔を誘導し、２：１の空気／酸素にて１．５％のハロタンによる気道の挿管の後、維持した。眼科用スリットナイフを介して角膜に３ｍｍのスリットを作り、微小鉗子を用いてフィルムを挿入した。フィルム挿入に先立って前房に作った切開を縫合し、ヒツジを回復させた。
【０１８１】
手術に続いて、手で持って操作できるスリットランプを用いて２〜３日ごとに角膜の形態を調べ、検証された形式を用いて清澄性、浮腫及び炎症の指標についてスコア化した。具体的には、清澄性及び浮腫はそれぞれ０〜４の尺度でスコア化し、０は完全に透明（清澄性について）又は薄い（浮腫について）及び４は完全に不透明（清澄性について）又は最大に厚い（浮腫について）となる。
【０１８２】
移植の２８日後、頸静脈内リーサバルブ注射を介してヒツジを安楽死させ、眼球を採取した。評価項目（エンドポイント）の組織学のために、組織を緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィンワックスに包埋し、５μｍで切断し、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。切片を調べて免疫反応、フィルムの分解、ＣＥＣ単層の維持及び小柱網の閉塞を見つけ出した。
【０１８３】
＜結果＞
【０１８４】
インビボの移植試験で使用した５ｗｔ％を伴ったＰＥＧフィルムは処置の間、その完全性を維持し、その弾性特性によって手術の全体を通して容易な取り扱いが可能になった。
【０１８５】
２８日間にわたるスリットランプでの観察では、試験（ＰＥＧフィルム−ＰＨＦと示した）角膜はその光学的透明性を維持し、コントロール角膜（ＰＥＧフィルムを含まない）に比べて視覚的に有意差は指摘されなかった。浮腫又は不透明性の証拠は観察されなかった。巨視的には、有害効果はスリットランプでの観察を介しては識別できなかった。微視的レベルで否定的な効果が生じたかどうかを見つけ出すために、組織学的な分析を行った。
【０１８６】
移植の２８日後にヒツジの眼球を採取し、組織学的な評価のために準備した。切片作製及びヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）による染色に続いて、コントロール角膜及び試験角膜の組織学的な分析は、ストロマ、デスメ膜及び角膜内皮の自然な形態を明らかにした（図５）。ＰＥＧフィルムは毒性を持たずに一部の領域では角膜の内部表面に付着したことも観察された。ＣＥＣの上の角膜の内部表面へのＰＥＧフィルムの付着は、試験全体を通して角膜がその光学的な透明性を維持していたので、生来のＣＥＣ機能を損なわなかった。フィルムの付着は、ＣＥＣがフィルムを横切ってポンプ作用し、かつ、角膜が角膜透明性を維持することを可能にするのに必要であるので、このことは有利である。それは、その付着によって外科医が所定の位置でインプラントを維持するのが容易になるので外科的処置についても有用である。
【０１８７】
＜ヒツジのモデルにおける組織工学で作製した角膜内皮（ＴＥＣＥ）のインビボ安全性試験＞
【０１８８】
外科的方法を確立するための一連の予備実験の一部として、最初に内在性のＯＣＥＣを取り除かずに、１匹の動物に組織工学で作製した角膜内皮（ＴＥＣＥ）（培養した同種のヒツジの角膜内皮細胞（ＯＣＥＣ）単層を伴ったＰＥＧキャリアフィルム）を移植し、５１日間（５１ｄ）維持した。角膜は透明のままであり、浮腫は生じなかった。５１日目で毒性又は免疫拒絶の証拠はなかった。組織学によって眼球内でポリマーフィルムを見いだすことができなかったということは、５１日目までにそれが完全に生分解されたことを示している。
【０１８９】
＜ＣＥＣ喪失のヒツジモデルの確立及びＴＥＣＥ移植による治療＞
【０１９０】
角膜内皮を手動ではぎ取ることによって角膜内皮細胞喪失のヒツジモデルを確立した。ＤＳＥＡＫ様の手順を用いてＴＥＣＥを移植することができた。ＴＥＣＥは移植の容易さのための十分な引張強度を有し、角膜の後面に対して平滑かつ平坦に容易に広がった。ＤＭＥＫドナーはきつく巻き、角膜の後面に対して広げ、平坦に置くのが難しい。創傷上に置かれたＴＥＣＥが存在しない状態での実験的角膜内皮喪失を伴った動物は治癒しない角膜浮腫を有した。ＴＥＣＥを創傷領域に置くと、浮腫は弱まった。ストロマの傷による試験動物の角膜の小さな領域での軽い混濁（１症例における観察及び組織学により確認された）。手術後６２日間維持された動物では、組織学によって眼球内にＰＥＧフィルムの痕跡が見いだされなかったということは、フィルムが前房内で完全に生分解することを裏付けている。
【０１９１】
［多孔性の生分解性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）スポンジ］
＜材料＞
【０１９２】
ペンタエリスリトールエトキシレート（Ｍｎ約７９７Ｄａ）、塩化セバコイル（≧９５％）及びリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）錠剤はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、受け取ったまま使用した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％）、トリパンブルー（０．４％）及びペニシリン−ストレプトマイシンはＧＩＢＣＯから入手した。細胞生存率アッセイでの使用に先立って、１０％ｖ／ｖのＦＢＳ、１％ｖ／ｖのＬ−グルタミン、及び１％ｖ／ｖのペニシリン−ストレプトマイシンでＤＭＥＭを補完した。ＮＵＮＣ  Ｔ２２５カントネックのフラスコはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。ジクロロメタン（≧９９．５％）、エタノール（未変性１００％）、炭酸ナトリウム（≧９９．２％、無水）はＣｈｅｍ−Ｓｕｐｐｌｙから入手し、受け取ったまま使用した。Ｓｅｌｌｅｙｓ  Ｑｕｉｃｋ  Ｆｉｘ  Ｓｕｐａ  Ｇｌｕｅ（シアノアクリル酸エチル／ポリ（メタクリル酸メチル））はオーストラリアのＷｏｏｌｗｏｒｔｈｓから入手した。細胞生存率アッセイ用のＣｅｌｌｔｉｔｅｒＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ溶液はＰｒｏｍｅｇａから入手し、受け取ったまま使用した。
【０１９３】
＜多孔性の生分解性ＰＥＧスポンジの製造＞
【０１９４】
ペンタエリスリトールエトキシレート（ＰＥ）と塩化セバコイル（ＳｅｂＣｌ）を１：２のモル比（表４に示す量）でポリエチレンのバイアル（２８ｍＬの総容量）にピペットで入れた。
【０１９５】
実施例４〜７については、ＰＥとＳｅｂＣｌの容量（モノマー容量）を変化させて異なる前駆体占有容量（％ＰＯＶ）を得たが、それは容器の総容量の百分率として示される。実施例８〜１１については、モノマー容量を一定のままにしたが、さまざまな量のジクロロメタン（ＤＣＭ）を加えて％ＰＯＶを変化させた。次いでフタをきつく締めつけ、バイアルを直ちに１５秒間ボルテックスした後、ドラフト装置の中に入れた。さらに６０秒後、フタを外してドラフト装置にて１５分間バイアルを放置した。実施例１２は実施例６と同一であるが、ボルテックスの後、フタを外した。
【０１９６】
得られたスポンジをバイアルから取り出し、底の均一ではない区分を外科用メスで取り除いた。その後、スポンジを３０ｍＭの炭酸ナトリウム溶液（１００ｍＬ／スポンジ）に１時間入れてＨＣｌを中和し、その後、脱イオン水に３０分間浸した（２００ｍＬで３回）。エタノールに２０分間浸す（１００ｍＬで２回）ことによってスポンジを脱水し、真空で２４時間乾燥させ（３０℃、２０ミリバール）、次いでさらなる使用までデシケータに保存した。
【０１９７】
【表４】
0006403754.tif 000007
【０１９８】
密封した容器での制約された容量の条件下におけるペンタエリスリトールエトキシレート（ＰＥ）と塩化セバコイル（ＳｅｂＣｌ）との間の反応は多孔ポリ（エチレングリコール）スポンジの形成を生じた。ＳｅｂＣｌ架橋剤の酸塩化物基とＰＥのヒドロキシル末端基との間の反応は、エステル結合の形成と同時に塩化水素（ＨＣｌ）ガスの放出をもたらした。反応は発熱性であり、非常に素早く気体としてＨＣｌを放出する。ＰＥとＳｅｂＣｌとの間での迅速な架橋反応の結果としてのＨＣｌガスの生成及び溶液の粘性の上昇の組み合わせは混合物の発泡を招き、ゲル化はボルテックスに続いて２０秒以内に起きる（図６）。架橋及びゲルの形成は所定の位置でガス泡を捕捉し、互いにつながった多孔性のネットワークを生じる。
【０１９９】
＜多孔性構造のＳＥＭ評価＞
【０２００】
多孔ＰＥＧスポンジを半分に切り、炭素タブに載せた。低真空条件下でＦＥＩ  ＱｕａｎｔａＦＥＧ２００Ｅ−ＳＥＭを用いて、さらされた内面を分析してスポンジの多孔性構造を観察した。ＩｍａｇｅＪ（米国、国立衛生研究所）ソフトウエアを利用して平均細孔径を測定した。結果を表５に示す。
【０２０１】
【表５】
0006403754.tif 000008
【０２０２】
ＳＥＭによる評価の結果は、空隙容量、溶媒含量及び圧力解放が細孔の特質に影響を有することが分かることを示した。一般に、ＨＣｌガス形成を伴った酸塩化物／アルコールの反応はＳＥＭ画像によって示されるように小さな丸みを帯びた流路を介して内部で接続される大きな丸みを帯びた細孔をもたらすことが観察された（図７）。大きな細孔は、発熱反応の間に核となり、そして、拡大するＨＣｌ気泡のせいで形成されるようである。架橋の間に拡大し、一緒につながる隣接ＨＣｌ気泡の間での接触が、細孔間の互いにつながる流路をもたらす。これらの流路はその後、ＳＥＭ画像から観察することができる多孔ＰＥＧスポンジの相互接続性もたらす。
【０２０３】
架橋反応の間のＨＣｌの放出は容器内での圧力増加をもたらす。さまざまな前駆体（モノマー）容量を調べる試験では、より大きな前駆体容量は、発砲の間でのＨＣｌガスの生成の上昇に伴ってそれぞれのその後、空隙容量を減らすようになることが観察された。さらには、前駆体量の増加のために、発熱反応の間に生成される熱も増加する。熱及び気体から生じる圧力増加を確保することは、溶液内でのＨＣｌ気泡の拡張に抵抗することになり、このことは、さらに小さな細孔径をもたらす。逆に、容量が少ないほど、さらに少ないＨＣｌが形成され、圧力増加がさらに小さくなる。このことは、気泡の拡張に対する抵抗がさらに小さくなり、その後、観察されるさらに大きな細孔と流路の形成につながる。
【０２０４】
モノマー組成物への溶媒の添加によって一定の空隙容量（８５．７％）での細孔径分布に対する前駆体（モノマー）濃度の効果を調べた。従って、溶媒としてさまざまな量のジクロロメタン（ＤＣＭ）（５、１０、２０及び５０％ｖ／ｖ）を用いて実施例８〜１１を調製し、その原液相当物である実施例６と比較した。
【０２０５】
実施例８及び９については、溶媒の非存在下で調製した実施例６に比べて細孔径及び流路径の双方で軽い低下が認められた。実施例１０及び１１については、発泡は観察されず、多孔性ではない架橋ゲルが得られた。さらに低い前駆体濃度（さらに高い希釈）では、反応速度は、低下した温度変化速度から明らかなように低下する。同時にＨＣｌの形成速度も低下することになる。ＨＣｌガスはさらにゆっくり生成されているので、気泡もさらに遅い速度で核となり、拡大し、これにより、実施例６に比べてさらに小さい細孔を生じる。ＤＣＭ含量を２０％ｖ／ｖ及び５０％ｖ／ｖに増加させたら、スポンジ形成はなかった。これらの低い濃度では、反応速度及びその後のＨＣＬ形成の速度はさらに低下する。結果的には、生成された熱及び気体は発泡させることなくさらに容易に消える。高めた反応速度によるさらに高い濃度では、温度はさらに迅速に高められる。次いで温度のこの上昇は迅速な気泡の形成及び拡張をもたらす。
【０２０６】
密封されない容器にて反応を行うことによって細孔径に対する開放環境の効果も調べた。得られたスポンジである実施例１２は、拡張した細孔を伴った大きな開放細孔構造とあまり球形ではない形態を持つ流路を有することが分かった。これは、フタが密閉された場合に得られるさらに小さな流路と接続した大きな細孔の区分化された構造（実施例６）とは対照的な分岐するネットワークを形成するはるかに薄い壁を生じた。細孔径及び流路径にも有意な増大があった。フタの取り外しによって、容器で圧力を上昇させることなくＨＣｌガスが自由に逃げるのが可能になる。従って、ガスの気泡は容易に拡張することができ、このことは、観察された大きな細孔径をもたらす。
【０２０７】
全体としては、多孔ＰＥＧスポンジすべて（実施例９及び１０を除く）の細孔の評価は高い相互接続性を持つ大きな細孔径を明らかにした。これは組織工学の応用に好適であり、それによって、大きな径の細孔は組織及び血管新生が容易に足場材に浸透するのを可能にすることになる。大きな細孔は組織の増殖及び発達に必要とされる空間を提供することになる一方で、互いにつながった流路は足場材の中での細胞の移動、組織の拡張及び血管系の形成のための手段を提供する。多孔ＰＥＧスポンジの高度に互いにつながった性質は細胞老廃物のクリアランスと同様に容易な栄養素及び流体の輸送も可能にすることになる。
【０２０８】
＜機械的評価＞
【０２０９】
従って、多孔ＰＥＧスポンジの移植可能な組織工学の足場材としての機械的完全性を、圧縮試験を介して検討した。試験に先立って多孔ＰＥＧスポンジを円筒状（直径＝１５ｍｍ、高さ＝１０ｍｍ）に切断した。圧縮評価に先立ってスポンジを応力前提条件調整に供さなかった。Ｉｎｓｔｒｏｎマイクロテスター５８４８（５０Ｎ負荷セル）の金属板の間に円筒状試料を置き、最大で８０％張力の圧縮に供した。得られた応力対張力のプロフィールを用いて圧縮弾性率を決定した。結果を表６に示す。
【０２１０】
【表６】
0006403754.tif 000009
【０２１１】
実施例４〜９及び１２の機械的試験は、調べた多孔ＰＥＧスポンジすべてが８０％の圧縮張力まで弾性変形を示し、元々の寸法に完全に戻る前に繰り返し圧縮することができることを明らかにした。例えば、最大８０％の実施例５の反復圧縮は、圧縮粉砕が存在することなく同じ応力対張力のプロフィールを示した（図８（ａ））。
【０２１２】
その弾性特性に加えて、多孔ＰＥＧスポンジの圧縮特性に対する製作条件の影響を検討した。実施例４が約３８０ｋＰａの最高の圧縮弾性率を有することが認められたのに対して、実施例５、６及び７の圧縮弾性率はそれぞれ低下した（図８（ｂ）及び表６）。この傾向は前駆体容量が低下するにつれて得られる細孔径が大きくなることに起因し得る。さらに大きな細孔はさらに小さな細孔を持つ同じ容量の足場材と比べて容量当たりの足場材の材料を少なくすることにつながる。溶媒の存在下で製造された実施例８及び９もその原液の対応物（実施例６）に比べてやや低下した圧縮弾性率を示した。硬化過程の間での溶媒の添加は反応の速度を低下させるので、架橋密度を低下させ、圧縮弾性率を低下させるようになる。実施例１２の圧縮評価は、調べた多孔ＰＥＧスポンジすべてのうちでそれが最も低い圧縮弾性率（０．０１１ＭＰａ）を持つことを示した。このことは、他の多孔ＰＥＧスポンジと矛盾せず、かつ、細孔径と圧縮弾性率の間での相関を示し、それによってさらに大きな細孔はさらに低い圧縮弾性率をもたらし、逆もまた同様である。実施例１０及び１１は、それらがＳＥＭを介して測定されたように均一の多孔スポンジを形成しなかったので機械的試験には供さなかった。
【０２１３】
多孔ＰＥＧスポンジについて得られた圧縮弾性率は、例えば、脂肪、腎臓、前立腺組織及び心筋のような組織についての範囲内にある。
【０２１４】
＜インビトロでの分解試験＞
【０２１５】
実施例５で脱水した多孔ＰＥＧスポンジの加水分解の分解率の指標を提供するために、試料を立方体（５×５×５ｍｍ）に切断し、秤量し、１×ＰＢＳ（２０ｍＬ、０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウム）に入れた。バイアルにキャップをして、温度を制御したオービタルシェーカー（３７℃、１００ｒｐｍ）に入れた。各時点（１、２、４及び８週目）で３つの試料をオービタルシェーカーから取り出し、３０分間脱イオン水に浸した（２０ｍＬで３回）。その後、エタノールに１時間浸し（２０ｍＬで２回）、次いで真空で乾燥させる（６０℃、２４時間）ことによってスポンジを脱水した。次いでスポンジを秤量し、得られた質量値を時間に対してプロットして分解プロフィールを得た。
【０２１６】
インビトロでの分解試験は８週で約２０％の質量損失を伴う線形の分解プロフィールを明らかにした（図９）。
【０２１７】
＜多孔ＰＥＧスポンジ及び分解生成物のインビトロでの細胞毒性の評価＞
【０２１８】
多孔ＰＥＧスポンジの細胞毒性を評価するために、脱水したスポンジ（１００ｍｇ）を８０％ｖ／ｖエタノール溶液に３０分間入れた。次いでスポンジを無菌ＰＢＳで３０分間洗浄し（２０ｍＬで３回）、無菌ＤＭＥＭ（２ｍＬ）に入れ、３７℃で７２時間インキュベートした。次いで多孔ＰＥＧスポンジを取り出し、馴化培地を細胞生存率アッセイに使用した。細胞生存率に対する分解生成物の影響を検討するために、脱水したスポンジ（５００ｍｇ）を１ＭのＨＣｌ（５ｍＬ）中で分解させた。ＨＣｌを真空で取り除き、残留物を水と共沸し（２０ｍＬで５回）、その後真空で乾燥させた（０．１ミリバール、５０℃、３時間）。分解生成物（１００ｍｇ）を無菌のＤＭＥＭ（２ｍＬ）に溶解／再懸濁し、紫外光照射のもとで溶液を３０分間滅菌し、次いで毒性試験での使用に先立って０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。Ｔ２２５フラスコにて９５〜１００％の湿度の５％ＣＯ２の雰囲気で３７℃でのＤＭＥＭ中でＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１細胞を集密まで増殖させた。トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞をトリプシン処理し、生／死の染色としてトリパンブルーを用いて手動で数を数え、ＤＭＥＭで希釈して１．２５×１０５個／ｍＬの播種密度にし、９６穴プレート（８０μＬ／ウェル）に入れ、一部のウェルはブランクのままにして細胞ブランクコントロールとして役立てた。次いでプレートをインキュベータに４時間入れ、その後、多孔ＰＥＧスポンジで馴化した培地又は分解生成物を加えた。製造したストック溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を、新鮮な培地を用いて２回１０倍希釈した。その２回の希釈液の２０μＬを３つ組で９６穴プレートに加え（１００、１０００ｐｐｍの濃度を得）、プレートの撹拌揺動運動によって穏やかに混合し、次いでプレートをさらに７２時間インキュベータに戻した。３日間のインキュベートに続いてＣｅｌｌｔｉｔｅｒＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ（ＣＡＯ）溶液をプレートに加えた（２０μＬ／ウェル）。プレートを穏やかに揺り動かして混合を促進し、次いで３０分間〜４時間インキュベータに戻した。マイクロプレートリーダーを備えたＣａｒｙ  ５０  Ｂｉｏ  紫外−可視分光光度計を用いて４９０ｎｍ（ＣＡＯ試薬の添加の際に代謝上活性のある細胞によって生成される生成物の吸光度）及び７００ｎｍにて周期的な間隔でプレートの紫外光−可視光の吸光度を読み取った。普通、色はおよそ２時間のインキュベートの後平衡化した。４９０ｎｍでの吸光度の値をバックグランドの吸光度（７００ｎｍ）及び培地のみ（細胞ブランクコントロール）の吸光度について補正し、次いで増殖コントロールに対して基準化した。
【０２１９】
さまざまな濃度（１００、１０００ｐｐｍ）の実施例５の馴化培地の存在下での７２時間のインキュベートの後、細胞生存率に対して最少限の影響が認められた（図１０（ａ））。実施例５の１００ｐｐｍの分解生成物（加速された酸触媒の加水分解を介して得られた）の存在下で細胞の代謝活性に対する影響は認められなかった。しかしながら、１０００ｐｐｍでは、細胞の代謝活性の低下が認められたが、それは培地のｐＨを下げることになる、分解生成物中の高濃度のセバシン酸から生じると考えられる（図１０（ｂ））。分解生成物について採用された濃度は一例としてスポンジの完全な分解に基づくので、そのような高濃度はインビボでは見られないと予想される。
【０２２０】
＜多孔ＰＥＧスポンジのインビボでの評価＞
【０２２１】
皮下ポケットモデルを用いて実施例５をラットにおけるインビボアッセイに供した。移植された際、外力の結果としての圧縮破損にそれが耐えるのを可能にする、その高度に互いにつながった細孔構造、圧縮弾性率及び高い剛性の結果として試験には実施例５が選ばれた。
【０２２２】
実施例５の試料を円板状（１０×４ｍｍ、直径×高さ）に切断し、γ線滅菌に先立って二重密封したジッパーの付いた袋の中のプラスチックのバイアルに入れた。オーストラリア、ビクトリアのＳｔｅｒｉｔｅｃｈでγ線滅菌を行った（最低２５ｋＧｙ）。滅菌に続いて、移植の前にスポンジを１×無菌のＰＢＳに３時間入れた。３つの時点で１２匹のラットにスポンジを移植した。手順はすべてオーストラリアの国立保健医療研究審議会（ＮＨＭＲＣ）の指針に従って実施され、メルボルンのＳｔ．Ｖｉｎｃｅｎｔ’ｓ病院の動物倫理員会によって認可された。スプラーグドーリー系のオスラット（Ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｍｕｒｄｏｃｈ，Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、体重３５０ｇ±５０ｇ）を認可された施設で飼育し、標準のラット用の餌と水を自由摂取で与えた。抗生剤であるエンロフロキサシン（Ｂａｙｔｒｉｌ５０、Ｂａｙｅｒ）を２５．５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で手術の前２日間と手術後２日間飲水で投与し、傷の感染を回避した。手術については、イソフルランを用いて動物を麻酔し、麻酔状態で維持した。背面の皮膚で被毛を刈り、消毒し、正中に沿って約１．５ｃｍの長さで１．５ｃｍ離して４つの別々の長手方向の切開を作った。主切開のいずれかの側で慎重な剥離によって各足場材用の個々の皮下ポケットを準備し、各ポケットにスポンジを挿入し、３−０のプロリーン縫合糸を用いて中心孔を介して周囲の筋膜に適所で係留した。傷クリップを用いて傷を閉じ、加熱パッド上で動物を３０分間回復させた。移植に続いて２、８及び１６週の期間の後、ラットを上記で記載したように麻酔し、元々の傷を再び開け、足場材及び周囲の組織を取り出し、次いでリーサバルブの心臓内注射によってラットを安楽死させた。取り出したスポンジを球状面に対して垂直で半分に切り、４％パラホルムアルデヒド溶液で４℃で４８時間固定し、パラフィン処理まで処理した。処理の後、完全な断面及び周囲の組織を見て分析することができるように外植片を包埋した。試料の中点を通って厚さ５μｍの切片を切り、ポリリジンを被覆したスライドに載せた。切片をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、マクロファージ及び巨細胞についてはＥＤ１に対する抗体を用いて免疫組織化学的に染色した。
【０２２３】
２週目の摘出試料は、スポンジの組織への統合が明らかな、移植した多孔ＰＥＧスポンジの周りでの薄い繊維性カプセルの形成を示した（図１１（ｄ））。二等分後のスポンジの巨視的観察は、黄色の着色が認められ、それは分解過程を示し得たが（図１１（ｅ））、２週後のスポンジの大きさに関して最少限の変化があり、スポンジは無傷のままであり、明らかに眼に見えることを示した。パラフィン処理への処理に続いて、スポンジを切片にし、その後ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して多孔ＰＥＧスポンジへの細胞及び組織の浸透を観察した（図１１（ｇ）〜（ｉ））。染色した切片は、周りの組織からの密な細胞の及び高度に血管新生した組織のスポンジへの浸潤を示した。血管新生は、血管の位置を示す染色した赤血球から明瞭に見ることができる（図１１（ｈ）及び（ｉ））。組織の大きな浸透があったとしても、切片の中央の空隙から明らかなように、多孔ＰＥＧスポンジは２週目では組織によって完全に満たされることはなかった（図１１（ｇ））。多孔ＰＥＧスポンジの断片を、スポンジの細孔の壁の位置を示している染色した組織間でも見ることができた（図１１（ｈ））。
【０２２４】
８週目での採取もまた、周辺組織への統合を伴った多孔ＰＥＧスポンジを取り囲む薄い繊維性カプセルを示した。２週目で採取した多孔ＰＥＧスポンジとは対照的に、二等分した外植片の巨視的分析は、均一な組織の完全な浸潤を明らかにした（図１１（ｆ））。移植片のサイズにも最少限の変化も認められたということは多孔ＰＥＧスポンジが収縮することなくその完全性を維持したことを示している。２週目の切片とは対照的に、８週目の切片のＨ＆Ｅ染色は、多孔ＰＥＧスポンジが右から中心まで血管新生した組織で完全に満たされることを明らかにした（図１１（ｊ））。８週後に存在する組織は、２週目で存在する密な細胞性組織ではなく、緩んだ結合組織であることも言及された（図１１（ｋ）、（ｌ））。スポンジが統合した組織内で見られる血管系は、多孔ＰＥＧスポンジが細胞と共に播種されなかった又はバイオ因子を負荷されなかったので、周辺組織に由来する新生血管系の誘導による可能性が最も高い。足場材の多孔性構造内におけるそのような血管新生は再生組織の増殖及び生存に極めて重要である。
【０２２５】
完全な組織浸潤は、多孔ＰＥＧスポンジの孔の高度に互いにつながった性質を明らかにしている。多孔ＰＥＧスポンジに細胞は播種されず、かつ、バイオ因子は組み入れられなかったので、多孔ＰＥＧスポンジ内で発達した組織は周辺組織から浸潤したにちがいなく、従って２週目までの細胞及び血管組織の浸透並びに８週目までの完全な浸潤は、細胞組織及び血管新生に対する多孔ＰＥＧスポンジの浸透性を実証している。従って、多孔ＰＥＧスポンジは、細胞及び血管の統合に好適である３Ｄ環境を提供して、浸潤組織の生存を保証することができる。
【０２２６】
１６週目では、インプラントの回収は、インプラントを探すことが非常に難しいことを巨視的に明らかにした。２週目及び８週目とは対照的にインプラントの突出の証拠がなかった。代わりに、多孔ＰＥＧスポンジの位置はそれらを所定の位置に固定するように元々使用された縫合糸の存在によって識別された。縫合糸に隣接した有害効果の巨視的な証拠はなかった。縫合糸に付着して少量の固形組織の存在が認められた（図１２（ａ））。縫合糸に付着し、それを取り囲む組織を切り離し、組織学検査用に処理した。
【０２２７】
Ｈ＆Ｅ染色を行って組織の形態を判別し、多孔ＰＥＧスポンジの存在を認めることができるかどうか見た。Ｈ＆Ｅ染色した切片の分析は、１６週までにインプラント部位のいずれにても多孔ＰＥＧスポンジが残っている証拠はないことを明らかにした（図１２（ｃ））。周囲の組織は、平凡な密度の細胞性及び血管性の組織だった。これは、１６週では多孔ＰＥＧスポンジは完全に分解されていることを示し、このことは、そのインビボでの生分解性を実証している。
【０２２８】
インプラントに向けられた先天性の免疫応答は、マクロファージ及び異物巨細胞（ＦＢＧＣ）の存在を観察することを介して認識することができる。マクロファージ及びＦＢＧＣの浸潤を判定する手段として、３つの時点での切片すべてにてＥＤ１免疫染色を行った（図１２（ｄ）〜（ｌ））。２週目の試料の分析は予想どおりマクロファージの存在を明らかにした。２週目におけるＥＤ１染色によって観察されたマクロファージは主として足場材／組織の界面に存在するのに対して、中心組織は非炎症性細胞が多数を占めた（図１２（ｄ）〜（ｆ））。ＥＤ１染色した８週目の切片の分析は、マクロファージの応答が有意に低下し、大きさがはるかに小さかったことを明らかにした（図１２（ｇ）〜（ｉ））。染色された組織は足場材／組織の界面でさえ非炎症性細胞が多数を占めたということは、スポンジ材に向かった応答の低下を実証している。１６週までに、多孔ＰＥＧスポンジは完全に分解したので、ＥＤ１染色は多孔ＰＥＧスポンジ及び最終的には分解生成物に対する主要な応答があったかどうかを明らかにすることになる。ＥＤ１染色した１６週目の切片はマクロファージがほとんど存在しないことを示した（図１２（ｊ）〜（ｌ））。このことは、全般的に見れば、多孔ＰＥＧスポンジ及びその分解生成物は当初、軽微な炎症性反応を生じ、この反応は経時的に衰えることを実証している。
【０２２９】
インビボの試験は、多孔ＰＥＧスポンジに向けられた組織の応答及び相互作用は非常に有益であり、成果は高度に有望であることを明らかにした。多孔性の３Ｄ構造内部での浸潤、血管新生及び組織の生存を可能にすることによって、多孔ＰＥＧスポンジは組織再生のための優れた候補である。１６週での毒性を伴わない最小免疫原性、組織の浸潤及び完全な生分解と一緒に、多孔ＰＥＧスポンジは組織工学のための足場材として高度に望ましい特性を持つ。
【０２３０】
＜制御された物性を持つ多孔性の生分解性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）スポンジ＞
【０２３１】
本明細書で我々は、塩浸出法を介して作出される制御可能な細孔径を有する多孔ＰＥＧヒドロゲルの製作及び性状分析を記載する。さらには、３つの架橋剤：塩化セバコイル、塩化スクシニル及び塩化トリメソイルを利用して、得られるネットワークポリマーの機械的特性及び分解特性を制御した。
【０２３２】
＜材料＞
【０２３３】
ペンタエリスリトールエトキシレート（Ｍｎ約７９７Ｄａ）、ポリ（エチレングリコール）（Ｍｎ約６００Ｄａ）、塩化セバコイル（≧９５％）、塩化スクシニル（９５％）、三塩化１，３，５−ベンゼントリカルボニル（塩化トリメソイル）（９８％）、ε−カプロラクトン（９７％）、２，２’−ジチオジエタノール（９０％）、オクタン酸第一スズ（約９５％）、トルエン（無水、９９．８％）及びリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）錠剤は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、受け取ったまま使用した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％）、トリパンブルー（０．４％）及びペニシリン−ストレプトマイシンはＧＩＢＣＯから入手した。細胞生存率アッセイでの使用に先立って１０％ｖ／ｖのＦＢＳ、１％ｖ／ｖのＬ−グルタミン及び１％ｖ／ｖのペニシリン−ストレプトマイシンによってＤＭＥＭを補完した。ＮＵＮＣＴ２２５カントネックのフラスコはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。ジクロロメタン（≧９９．５％）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ、９９．９９％）、エタノール（未変性、１００％）、炭酸ナトリウム（≧９９．２％、無水）はＣｈｅｍ−Ｓｕｐｐｌｙから入手し、受け取ったまま使用した。細胞生存率アッセイのためのＣｅｌｌｔｉｔｅｒＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅはＰｒｏｍｅｇａから入手し、受け取ったまま使用した。マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分光分析（ＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ  ＭＳ）のマトリクスであるトランス−２−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−２−メチル−２−プロペニリデン］マロノニトリル（ＤＣＴＢ）（≧９９．０）及びカチオン化剤（ＮａＴＦＡ（９９．９９９％））はＡｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったまま使用した。
【０２３４】
＜溶融塩テンプレートの製造＞
【０２３５】
先ず、結晶性塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を乳鉢と乳棒で粉砕し、篩にかけて（Ｅｎｄｅｃｏｔｔｓ  Ｌｔｄ．（英国、ロンドン）、標準の研究室の試験篩のセット）、３００〜６００μｍの大きさの塩粒子を得た。４ｇの塩粒子を秤量し、ポリエチレンバイアル（２８ｍＬ）の中に入れ、円筒状の金属圧縮器によって穏やかに圧縮した。次いでバイアルを加湿器に移し、室温（８０％湿度）にて２４時間、加湿器にて維持して溶融塩テンプレートを作出した。次いで溶融テンプレートを作り付けの減圧器（ハウスバキューム）で１８時間（１００℃、２０ミリバール）乾燥させ、キャップをしてさらなる使用までデシケータに入れた。
【０２３６】
＜α，ω−ジヒドロキシルＰＣＬ（機械特性改質剤）の合成＞
【０２３７】
開環重合（ＲＯＰ）によってα，ω−ジヒドロキシルＰＣＬを製造した；ε−カプロラクトン（２０．０ｇ、１７５ミリモル）と２，２’−ジチオジエタノール（１．０８ｇ、７．００ミリモル）とオクタン酸第一スズ（０．９５ｇ、２．３４ミリモル）とを無水トルエン（４５ｍＬ）に溶解し、アルゴンのもとで２４時間１１０℃で加熱した。混合物を室温に冷却し、ＴＨＦ（５０ｍＬ）で希釈し、冷メタノール（−１８℃、１Ｌ）に沈殿させた。濾過によって沈殿物を回収し、真空（０．１ミリバール）で乾燥させて白色粉末１８．８ｇ（９４％）としてα，ω−ジヒドロキシルＰＣＬを得た；Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３．２ｋＤａ，Ｍｎ（ＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ）＝３．３ｋＤａ（ＰＤＩ＝１．０７）。
【０２３８】
＜塩がテンプレートになる生分解性多孔ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）スポンジの製造＞
【０２３９】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ６００）（０．７５ｇ、１．２５５ミリモル）とペンタエリスリトールエトキシレート（ＰＥ）（０．５０ｇ、０．６３ミリモル）と０ｍｇ、３３ｍｇ又は８２ｍｇのジヒドロキシル−ＰＣＬ（それぞれ０、２又は５ｗｔ％のＰＣＬに相当する）とをジクロロメタン（ＤＣＭ、１０％ｖ／ｖ）に溶解した（表７）。その後、塩化セバコイル（ＳｅｂＣｌ）（０．６０ｇ、２．５１ミリモル）、塩化スクシニル（ＳｕｃＣｌ）（０．３９ｇ、２．５１ミリモル）又は塩化トリメソイル（ＴｍｓＣｌ）（１．２７ｇ、４．７７ミリモル）を加えた。モノマー組成物を１０秒間ボルテックスし、直ちに１．２ｍＬのこの溶液を、溶融塩テンプレートを含有するバイアルにピペットで入れ、３０秒間遠心分離した。次いでバイアルを６０℃のオーブンに１時間入れ、真空オーブンで２４時間減圧した（２０ミリバール、６０℃）。架橋されたゲルをバイアルから取り出し、穏やかに撹拌しながら脱イオン水（１００ｍＬ）に入れた。３０分ごとに２時間、水を交換し、次いで１時間ごとに３時間水を交換し、その後２４時間で最後の交換を行った。次いで膨潤したポリマーを炭酸ナトリウム溶液に入れて穏やかに２時間撹拌し、３０分間脱イオン水で洗浄して（１００ｍＬで３回）ＨＣｌを中和した。次いで、生じた多孔ＰＥＧスポンジを性状分析に先立ってＰＢＳにて保存した。
【０２４０】
【表７】
0006403754.tif 000010
【０２４１】
組織の浸透及び血管新生のために互いにつながった多孔性構造を作製するのに犠牲的な溶融塩化ナトリウムテンプレートを使用した。架橋に続いて、多孔ＰＥＧスポンジを６０℃にて２４時間真空下に置き、脱イオン水に入れて多孔ＰＥＧスポンジを膨潤させ、塩テンプレートを取り除いた。
【０２４２】
塩化スクシニル（ＳｕｃＣｌ）、塩化セバコイル（ＳｅｂＣｌ）及び塩化トリメソイル（ＴｍｓＣｌ）と共に作製した多孔ＰＥＧスポンジをそれぞれＳｕｃ−ＳＰＨ、Ｓｅｂ−ＳＰＨ及びＴｍｓ−ＳＰＨと呼ぶ。
【０２４３】
＜膨潤試験＞
【０２４４】
膨潤試験を行って多孔ＰＥＧスポンジの水の取り込みを測定した。脱水した多孔ＰＥＧスポンジ（１×１×１ｃｍ３）を秤量し、次いでＭｉｌｌｉＱ水に４８時間浸した。方程式％ＥＳＲ＝（（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｄ）×１００％（式中、Ｗｓ及びＷｄはそれぞれ膨潤重量及び乾燥重量を指す）を用いてヒドロゲルの百分率での平衡溶媒比（％ＥＳＲ）を算出した。各型のポリマーについて３つ組で分析を行い、結果を平均した。結果を表８にて示す。
【０２４５】
【表８】
0006403754.tif 000011
【０２４６】
異なる架橋モノマーであるＳｅｂＣｌ、ＳｕｃＣｌ及びＴｍｓＣｌによって製造されたポリマーにおける差異は測定された平衡膨潤比（％ＥＳＲ）において明らかだった。ＳｕｃＣｌで製造した実施例１３〜１６はすべて、ＳｅｂＣｌ及びＴｍｓＣｌの相当物に比べてはるかに高いＥＳＲを示した。このことは、ＳｅｂＣｌ及びＴｍｓＣｌの疎水性を証明することができる。ＳｅｂＣｌのさらに長いアルキル骨格及びＴｍｓＣｌのベンゼン環が、架橋されたポリマーのネットワークの中でＳｕｃＣｌに比べてさらに疎水性の環境を創るので、多孔ＰＥＧスポンジの吸水能を低下させる。ＳｕｃＣｌはさらに短いアルキル骨格を有するので作製される多孔ＰＥＧスポンジはさほど疎水性ではなく、さらに多くの水を吸収する。
【０２４７】
多孔ＰＥＧスポンジのＰＣＬ含量も０ｗｔ％から２ｗｔ％及び５ｗｔ％に変化させると、架橋剤すべてから製造されたヒドロゲルについてＰＣＬ含量の増加に伴って％ＥＳＲが低下することが観察された。このことは、ＳｅｂＣｌ及びＴｍｓＣｌで観察された疎水性の効果に一致する。ＰＣＬは疎水性ポリマーなのでＰＣＬ量の増加もさらに低い％ＥＳＲにつながる。
【０２４８】
＜細孔径の分析＞
【０２４９】
２ｗｔ％のＰＣＬを伴った多孔ＰＥＧスポンジを１×ＰＢＳで膨潤させ、次いで半分に切り、炭素タブに載せた。低真空条件下でＦＥＩ  Ｑｕａｎｔａ  ＦＥＧ２００  Ｅ−ＳＥＭを用いて、さらされた内側面を分析し、ヒドロゲルの多孔性構造を観察した。ＩｍａｇｅＪ（米国、国立衛生研究所）ソフトウエアを利用して平均細孔径を測定した。
【０２５０】
ＳＥＭは、さまざまな架橋モノマーと共に製造された多孔ＰＥＧスポンジ内で観察された細孔径が準備された溶融塩テンプレートとよく相関し、かつ、互いにつながっていると認められることを明らかにした（図１３）。得られた平均細孔径を表８に示す。準備された塩粒子のサイズは３００〜６００μｍに及ぶので、多孔ＰＥＧスポンジについて得られる平均径は準備された塩粒子に非常によく相関する。
【０２５１】
また、ポリマー間で膨潤に差異があったとしても、さまざまな架橋剤と共に製造された多孔ＰＥＧスポンジ間での細孔径に有意な差異は認められなかった。このことは、膨潤特性にかかわらず、細孔径は影響を受けないままであることを実証している。多孔ＰＥＧスポンジすべてについてのこれらの細孔の径を大きくすることは、組織及び血管新生が足場材に容易に浸透するのを可能にすることになる。大きな互いにつながった細孔は、足場の中で組織の増殖や成長及び血管系の形成に必要とされる空間を提供することになる。多孔ＰＥＧスポンジの互いにつながった性質は細胞老廃物のクリアランスと同様に栄養素や流体の輸送も可能にすることになる。
【０２５２】
塩テンプレート化法に関して、ポロゲン（塩）の粒径はそのまま特定の範囲にテイラーメイドできるのでヒドロゲルの細孔径を制御することは可能である。これは、特定の細孔径が特定の組織又は細胞の種類にさらに良好に適合することが分かった場合、特定の組織の種類について有利であり得る。
【０２５３】
＜多孔ＰＥＧスポンジの機械的評価＞
【０２５４】
圧縮試験に先立って、膨潤させた多孔ＰＥＧスポンジを立方体（１×１×１ｃｍ３）に切断した。圧縮評価に先立って多孔ＰＥＧスポンジを応力前提条件調整に供さなかった。Ｉｎｓｔｒｏｎマイクロテスター５８４８（５０Ｎ負荷セル）の金属板の間に立方体試料を置き、最大で８０％張力の圧縮に供した。得られた応力対張力のプロフィールを多孔ＰＥＧスポンジの圧縮弾性率の測定に用いた。一部の多孔ＰＥＧスポンジを最大で８０％張力の繰り返し圧縮にも供してその弾性特性を測定した。結果を表９に示す。
【０２５５】
【表９】
0006403754.tif 000012
【０２５６】
使用したさまざまな架橋剤については、さまざまな圧縮挙動が観察された。弾性「Ｊ」形状の圧縮応力対圧縮張力のプロフィールはＳｅｂＣｌ及びＴｍｓＣｌと共に製造したＰＣｌを含有するポリマーネットワークすべてについて得られた。ＳｅｂＣｌポリマー及びＰＣＬを含有するＴｍｓＣｌポリマーはその弾性構造を維持した。ＳｅｂＣｌポリマーは最大で８０％の反復圧縮の後でさえ裂け目なしで弾性のままだった（図１４（ａ））。ＳｅｂＣｌポリマーの圧縮弾性率は、ジヒドロキシＰＣＬの含量が０ｗｔ％から２ｗｔ％及び５ｗｔ％に増加するのに伴ってそれぞれ約１８０ｋＰａから約２５０ｋＰａ及び３３０ｋＰａに上昇した。
【０２５７】
一方、ＳｕｃＣｌと共に製造した多孔ＰＥＧスポンジは「Ｎｅｗｒｏｎｉａｎ」の線形の応力対張力の挙動を示し、ＰＣＬ含量の増加に伴って約４５〜７０％の間の圧縮張力で破砕した（表９）。これらのポリマーはＰＣＬ含量が増大するにつれて改善された破壊応力及び破壊張力を示した。にもかかわらず、圧縮弾性率は有意に影響されなかった（図１４（ｂ））。
【０２５８】
ＴｍｓＣｌと共に製造した多孔ＰＥＧスポンジは当初、ＰＣＬを組み入れるまでＳｅｂＣｌと共に製造したＰＥＧスポンジの弾性の高い性質を持たなかった。ＰＣＬの組み入れに続いて、ＴｍｓＣｌスポンジも最大で８０％の圧縮に耐性を示す弾性構造を維持した（図１４（ｂ）、表９）。
【０２５９】
＜多孔ＰＥＧスポンジのインビトロの分解試験＞
【０２６０】
多孔ＰＥＧスポンジを立方体（５×５×５ｍｍ）に切断し、エタノールで脱水し、真空オーブン（６０℃）で一晩乾燥させた。乾燥させた試料を秤量し、１×ＰＢＳ（２０ｍＬ、０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウム）に入れた。バイアルを密封し、温度制御したオービタルシェーカー（３７℃、１００ｒｐｍ）に入れた。各時点（１、２、４及び８週目）でオービタルシェーカーから３つの試料を取り出し、脱イオン水で３０分間洗浄した（２０ｍＬで３回）。その後、エタノールに１時間浸した（２０ｍＬで２回）後、真空で乾燥させる（６０℃で２４時間）ことによってポリマーを脱水した。次いで乾燥させた試料を秤量し、得られた質量値を時間に対してプロットして分解プロフィールを得た。
【０２６１】
分解試験は、ＴｍｓＣｌと共に製造した多孔ＰＥＧスポンジが８週で約４０％の質量損失を有する一方で、ＳｅｂＣｌと共に製造したものは８週を超えて約３５％の質量損失を有することを明らかにした。ＳｕｃＣｌと共に製造した多孔ＰＥＧスポンジは４週までに完全に分解した（図１５）。
【０２６２】
＜多孔ＰＥＧスポンジのインビトロでの細胞毒性の評価＞
【０２６３】
多孔ＰＥＧスポンジの細胞毒性の評価については、２種類の試料を製造した。多孔ヒドロゲルの細胞毒性を評価するために、乾燥させた多孔ＰＥＧスポンジを秤量し、１００ｍｇを８０％ｖ／ｖのエタノール溶液に３０分間入れた。次いで多孔ＰＥＧスポンジを洗浄し、無菌ＰＢＳで再水和し（２０分間で３回）、２ｍＬの無菌ＤＭＥＭに入れ、その後３７℃で７２時間インキュベートした。次いで多孔ＰＥＧスポンジを取り出し、馴化培地を細胞生存率アッセイに用いた。ヒドロゲルの分解生成物の細胞生存率に対する影響を検討するために、乾燥させたヒドロゲル（５００ｍｇ）を１ＭのＨＣｌ溶液（５ｍＬ）で分解させた。真空での水（２０ｍＬで５回）との共沸でＨＣｌを取り除き、高真空下で最終的に乾燥させた。１００ｍｇの分解生成物を秤量し、２ｍＬの無菌ＤＭＥＭにて溶解／再懸濁した。次いで、毒性試験で使用するのに先立って、溶液を紫外線のもとで３０分間滅菌し、０．２２μｍのフィルターで濾過した。９５〜１００％の湿度での５％ＣＯ２の雰囲気で３７℃にてＴ２２５フラスコ内のＤＭＥＭ中でＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１細胞を集密まで増殖させた。０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞をトリプシン処理し、生／死の染色としてトリパンブルーを用いて手動で数を数え、新鮮な培地で希釈して１．２５×１０５個／ｍＬの播種密度にし、９６穴プレートに入れ（８０μＬ／ウェル）、一部のウェルはブランクのままにして細胞／ブランクコントロールとして役立てた。プレートをインキュベータに４時間戻した後、多孔ＰＥＧスポンジで馴化した培地及び分解生成物を加えた。製造したストック溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を、新鮮な完全培地を用いて２回１０倍希釈した。その希釈液の２０μＬを３つ組で９６穴プレートに入れ（１００ｐｐｍ及び１０００ｐｐｍの濃度を得た）、プレートの撹拌揺動運動によって穏やかに混合し、次いでプレートをインキュベータに戻し、さらに７２時間インキュベートした。インキュベートに続いてＣｅｌｌｔｉｔｅｒＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ溶液をプレートに加えた（２０μＬ／ウェル）。プレートを穏やかに揺れ動かして混合を促進し、次いで３０分間〜４時間インキュベータに戻した。周期的な間隔で、マイクロプレートリーダーを装備したＣａｒｙ  ５０  Ｂｉｏ  紫外−可視分光光度計を用いて４９０ｎｍ及び７００ｎｍにてプレートの紫外光−可視光の吸光度を観察した。約２時間のインキュベートの後、色は平衡化した。４９０ｎｍでの吸光度の値をバックグランドの吸光度（７００ｎｍ）及び培地のみ（細胞−ブランクコントロール）の吸光度について補正し、次いで増殖コントロールに対して基準化した。
【０２６４】
さまざまな濃度（１００ｐｐｍ及び１０００ｐｐｍ）の多孔ＰＥＧスポンジで馴化した培地の存在下で７２時間インキュベートした後、架橋剤すべてについて細胞生存率に対する最小効果が認められた（図１６（ａ））。酸が介在する迅速な分解を介して得られた分解生成物の存在下では、１００ｐｐｍにて細胞の代謝活性に対して有意な効果は観察されなかった（図１６（ｂ））。一方、１０００ｐｐｍでは代謝活性における小さな低下が観察されたが、コントロールに比べてこの差異は最小である。
【０２６５】
＜多孔ＰＥＧスポンジのインビボでの評価＞
【０２６６】
塩化セバコイルと共に製造した膨潤させた多孔ＰＥＧスポンジ（２％ｗｔＰＣＬ）（実施例１７）を１０×４ｍｍ（直径×高さ）の円板状に切断し、真空で乾燥させ（２０ミリバール、６０℃）、プラスチックのバイアルに入れ、滅菌のためのγ線照射に先立ってしたジッパーの付いた袋にて二重密封した。オーストラリア、ビクトリアのＳｔｅｒｉｔｅｃｈでγ線滅菌を行った（最低２５ｋＧｙ）。滅菌に続いて、移植の前にヒドロゲルを１×無菌ＰＢＳに３時間入れた。３つの時点で１２匹のラットに多孔ＰＥＧスポンジを移植した。手順はすべてオーストラリアの国立保健医療研究審議会（ＮＨＭＲＣ）の指針に従って実施され、メルボルンのＳｔ．Ｖｉｎｃｅｎｔ’ｓ病院の動物倫理員会によって認可された。スプラーグドーリー系のオスラット（Ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｍｕｒｄｏｃｈ，Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、体重３５０±５０ｇ）を認可された施設で飼育し、標準のラット用の餌と水を自由摂取で与えた。抗生剤であるエンロフロキサシン（Ｂａｙｔｒｉｌ５０、Ｂａｙｅｒ）を２５．５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で手術前２日間と手術後２日間飲水で投与し、傷の感染を回避した。手術については、イソフルランによって動物を麻酔し、麻酔状態で維持した。背面の皮膚で被毛を刈り、消毒し、正中に沿って約１．５ｃｍの長さで１．５ｃｍ離して４つの別々の長手方向の切開を作った。主切開のいずれかの側で慎重な剥離によって各足場材用の個々の皮下ポケットを準備し、各ポケットにヒドロゲルを挿入し、３−０のプロリーン縫合糸を用いて中心孔を介して周囲の筋膜に適所で係留した。傷クリップを用いて傷を閉じ、加熱パッド上で３０分間動物を回復させた。移植に続いて２、８及び１６週後、ラットを上記で記載したように麻酔し、元々の傷を再び開け、ヒドロゲル足場材及び周囲の組織を取り出し、次いでリーサバルブの心臓内注射によってラットを安楽死させた。取り出した多孔ＰＥＧスポンジを球状面に対して垂直で半分に切り、４℃にて４％パラホルムアルデヒド溶液で４８時間固定し、パラフィン処理まで処理した。処理の後、完全な断面及びその周囲の組織を見て分析することができるように外植片を包埋した。試料の中点を通って厚さ５μｍの切片を切り、ポリリジンを被覆したスライドに載せた。切片をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、マクロファージ及び巨細胞についてはＥＤ１に対する抗体を用いて免疫組織化学的に染色した。
【０２６７】
移植の２週後、多孔ＰＥＧスポンジは薄いカプセルの形成のみを伴って組織に上手く統合した（図１７ｄ）。２週間後、ヒドロゲルのサイズに関して最少限の変化が認められ；ポリマースポンジは無傷のままであり、明瞭に眼に見えるままだった（図１７ｅ）。パラフィン処理への処理に続いてポリマースポンジを切片にし、その後、Ｈ＆Ｅで染色してポリマースポンジへの細胞及び組織の浸透を観察した（図１７ｇ〜ｉ）。Ｈ＆Ｅ染色した切片は、周辺組織からのヒドロゲルへの密な細胞の及び高度に血管化した組織の浸潤を示した。血管系の位置を示している染色された赤血球から血管を明瞭に見ることができる（図１７ｈ〜ｉ）。Ｈ＆Ｅ染色された切片からも明らかなように周辺組織から血管化した組織がポリマースポンジの中心に浸透することができるのを見ることが可能だった。染色された切片で観察された大きなギャップは、パラフィン処理への処理が原因で生じた脱水による多孔ＰＥＧスポンジの細孔壁及び浸透した組織の収縮によると思われる。
【０２６８】
８週目の回収も、周辺組織に統合した多孔ＰＥＧスポンジを取り囲む薄い線維性カプセルを示した。回収した組織の二等分は外植片のサイズの厚さの低下を示し、ポリマースポンジ材の黄変が観察された。足場材の中心への組織の浸潤はＨ＆Ｅ染色によって確認されたが、浸透した組織の量における有意差は認められなかった（図１７ｊ）。とはいえ、８週後に存在する組織は、２週目で存在する密な細胞組織ではなく緩い結合組織であることが言及された（図１７ｋ、ｌ）。多孔ＰＥＧスポンジの血管化は、細胞又はバイオ因子の負荷を行わなかったので、周辺組織からの新血管形成による可能性が最も高い。
【０２６９】
血管化組織のポリマースポンジの中心への浸透は、多孔ＰＥＧスポンジの細孔の互いにつながった性質を実証している。２週までの細胞及び血管の浸透は多孔ＰＥＧスポンジが細胞組織及び血管新生に対して浸透性であることを実証している。従って、多孔ＰＥＧスポンジは細胞及び血管の統合に適する３Ｄ環境を持ち、浸潤した組織の生存を保証する。
【０２７０】
切除の間に観察されるインプラントの突起部が最小化されるので２週目及び８週目に比べて１６週目でインプラントを探すのははるかに困難だった。２週目及び８週目と同様、周辺組織に有害効果の巨視的証拠はなかった。少量の固形組織が存在し、縫合糸に付着していた。縫合糸に付着し、それを取り囲む組織を切除し、組織学検査のために処理した。回収した組織の二等分は、インプラントのサイズが非常に小さく、非常に少量の多孔ＰＥＧスポンジが残っていることを明らかにした（図１８ａ）。
【０２７１】
Ｈ＆Ｅ染色を行って組織の形態を識別し、多孔ＰＥＧスポンジの存在を観察した。Ｈ＆Ｅ染色した切片の分析は、１６週までに最少量の多孔ＰＥＧスポンジが残っていることを明らかにした（図１８ｂ、ｃ）。多孔ＰＥＧスポンジの残部があった場合、周辺組織は平凡な密度の細胞組織及び血管組織だった。このことは、１６週では、ポリマースポンジはそのインビボでの生分解性を実証する主要な分解を受けていることを示している。
【０２７２】
マクロファージ及び異物巨細胞（ＦＢＧＣ）の存在はインプラントに向けられた先天性の免疫応答の指標である。マクロファージ及びＦＢＧＣの応答を測定する手段として切片すべてについてＥＤ１免疫染色を行った（図１８ｄ〜ｌ）。２週目の試料のＥＤ１染色は予測どおりマクロファージの存在を明らかにした。２週目でのＥＤ１染色によって観察されるマクロファージは主として浸透した組織の中心に存在し、一部は組織／ポリマーの界面に位置していた（図１８ｄ〜ｆ）。８週目の切片の分析は、マクロファージの応答が有意に低下したこと、及びマクロファージのサイズが非常に小さいことを示した（図１８ｇ〜ｉ）。染色された組織は非炎症性細胞が優勢であり、かつ、最少の数で足場材／組織の界面に存在するということは、ヒドロゲル材に向けた最少の応答を実証している。非常に少ない量の足場材が残っていることから明らかなように１６週までにポリマースポンジは主要な分解を受けていた。ＥＤ１染色した１６週目の切片は最少数のマクロファージを示した（図２０ｊ〜ｌ）。ＥＤ１染色を介した切片の分析は、多孔ＰＥＧスポンジ及びその分解生成物が当初軽微な炎症性反応を生じ、この反応は１６週間かけて有意に低下することを示した。
【０２７３】
インビボの試験は、移植の１６週間後、多孔ＰＥＧスポンジ及びその分解生成物に関して有害効果は観察されないことを明らかにした。多孔ＰＥＧスポンジは最小免疫原性を伴った血管組織の浸透、及び１６週までの主要な分解を可能にすることによって足場材としての望ましい特性を実証している。
【０２７４】
本明細書で要点が述べられているような本発明の精神から逸脱することなくさまざまな他の改変及び／又は変更が為されてもよいことが理解されるべきである。
【０２７５】
本明細書及び後に続く特許請求の範囲の全体を通して、文脈が特に要求しない限り、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び、たとえば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」のような変形は、言及される整数又は工程又は整数若しくは工程の群の包含を暗示するが、他の整数又は工程又は整数若しくは工程の群の排除を暗示しないように理解されるであろう。
【０２７６】
先行公開（又はそれに由来する情報）又は既知である事項に対する本明細書における参照は、先行公開（又はそれに由来する情報）又は既知の事項が、本明細書が関連する試みの分野における一般常識の一部を形成するという認識又は承認又は任意の形態の示唆として解釈されない、かつ、解釈されるべきではない。
【図１】
0006403754.tif 000013
【図２】
0006403754.tif 000014
【図３】
0006403754.tif 000015
【図４】
0006403754.tif 000016
【図５】
0006403754.tif 000017
【図６】
0006403754.tif 000018
【図７】
0006403754.tif 000019
【図８】
0006403754.tif 000020
【図９】
0006403754.tif 000021
【図１０】
0006403754.tif 000022
【図１１】
0006403754.tif 000023
【図１２】
0006403754.tif 000024
【図１３】
0006403754.tif 000025
【図１４】
0006403754.tif 000026
【図１５】
0006403754.tif 000027
【図１６】
0006403754.tif 000028
【図１７】
0006403754.tif 000029
【図１８】
0006403754.tif 000030