(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端が２つの異なるクローズドループの二本鎖オリゴヌクレオチド領域に結合した、単一ヌクレオチド標的に相補的なヌクレオチドからなる一本鎖ヌクレオチド領域を備える単一ヌクレオチド標的捕捉部位を備えることを特徴とする生体プローブであって、
２つの前記二本鎖オリゴヌクレオチド領域の少なくとも１つは、特徴的な検出特性を有する検出可能要素とクエンチャとを備え、
前記検出可能要素は、複数のフルオロフォアを備え、
前記単一ヌクレオチド標的は、遊離した単一ヌクレオチドであり、
前記フルオロフォア及び前記クエンチャは、前記フルオロフォアが前記クエンチャによりクエンチングされるように、前記二本鎖オリゴヌクレオチド領域の少なくとも１つにおける一部分に存在し、
前記単一ヌクレオチド標的を前記一本鎖ヌクレオチド領域に結合させることにより、前記プローブ中に少なくとも１つの制限酵素認識部位がもたらされる、生体プローブ。
【請求項２】
前記プローブは、前記フルオロフォアが検出される波長において本質的に非蛍光性であることを特徴とする、請求項１に記載の生体プローブ。
【請求項３】
２つの前記二本鎖オリゴヌクレオチド領域が、前記一本鎖ヌクレオチド領域によって互いに接続され、前記複数のフルオロフォアが、互いに近接している、ことを特徴とする、請求項２に記載の生体プローブ。
【請求項４】
前記クエンチャが、前記フルオロフォアに近接している、ことを特徴とする、請求項２または請求項３に記載の生体プローブ。
【請求項５】
前記単一ヌクレオチドが、チミン、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルの１つから選択されるヌクレオチド塩基からなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体プローブ。
【請求項６】
各二本鎖オリゴヌクレオチド領域が、最大で５０のヌクレオチド対からなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体プローブ。
【請求項７】
各二本鎖オリゴヌクレオチド領域が、１０〜３０のヌクレオチド対からなることを特徴とする、請求項６に記載の生体プローブ。
【請求項８】
二本鎖オリゴヌクレオチド領域における最大で１０のヌクレオチド対が、フルオロフォアで標識されることを特徴とする、請求項６または請求項７のいずれかに記載の生体プローブ。
【請求項９】
二本鎖オリゴヌクレオチド領域における最大で１０のヌクレオチド対が、クエンチャで標識されることを特徴とする、請求項２〜８のいずれか１項に記載の生体プローブ。
【請求項１０】
前記二本鎖オリゴヌクレオチド領域が、末端を折り畳み、前記一本鎖ヌクレオチド領域を備えるギャップを残すことにより、一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体から誘導されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の生体プローブ。
【請求項１１】
前記クエンチャが、全ての前記フルオロフォアが自己クエンチングできるように配置されるフルオロフォアを備える、ことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体プローブ。
【請求項１２】
基質上に支持されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の生体プローブ。
【請求項１３】
ポリメラーゼおよびリガーゼを用いて単一ヌクレオチドの標的をプローブの一本鎖ヌクレオチド領域に結合させて、全体として二本鎖である使用済プローブをもたらすステップを備えることを特徴とする、単一ヌクレオチドの標的を検出するための請求項１〜１２のいずれか１項に記載の生体プローブの使用方法。
【請求項１４】
前記使用済プローブを、制限酵素およびエキソヌクレアーゼで処理して、検出可能要素を検出することができる形態に解放する追加ステップを備えることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記解放された検出可能要素により示される検出可能特性を観察するステップを備えることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出可能要素が、フルオロフォアであることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記使用済プローブが、前記一本鎖ヌクレオチド領域への前記標的の結合により形成された制限酵素認識部位を備えることを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的が、単一ヌクレオチドであり、これを、（１）グアニン、シトシン、アデニンおよびチミンまたは（２）グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルから選択される異なる単一ヌクレオチドを備える一本鎖ヌクレオチド領域をそれぞれ有する４つの異なる生体プローブの混合物と接触させることを特徴とする、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記４つのプローブのそれぞれが、異なる検出可能要素を有することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記異なる検出可能要素が、フルオロフォアであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的が、ＤＮＡまたはＲＮＡの試料中のヌクレオチドの配列に対応する一連の単一ヌクレオチドを備えることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
（１）ヌクレオチドホスホラミダイトモノマーから一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体を合成するステップ、および（２）前記前駆体の末端を折り畳み、一本鎖ヌクレオチド領域の両側に並置する２つの二本鎖オリゴヌクレオチド領域をもたらすステップを備えることを特徴とする、請求項１に記載の生体プローブの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチド含有標的分子中の相補的な単一ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の存在を検出するのに有用な生体プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体プローブは、一般的に既知の配列順序を有する１０００未満のヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドを備え、分析分子生物学において広く知られる。こうしたプローブは、一般的には、プローブのヌクレオチド塩基と標的との間に完全なまたは十分に完全な配列相補性が存在する場合に、標的（例えば、自然発生病原体のＤＮＡに由来するもの）に結合することにより機能する。通常、こうしたプローブのヌクレオチドは、放射性または蛍光マーカーのような検出可能要素で標識され、プローブを用い、中にまたは上に標的が捕捉されていると考えられる検体溶液または基質を処理すると、検出要素の特徴的な検出特性を検索および検出することにより標的の存在または非存在が明らかとなる。
【０００３】
こうしたプローブの１つの種類は、例えば国際公開第０２／０６５３１号または米国特許第８２１１６４４号に記載されるように、当技術分野において「分子ビーコン」として知られる物質に代表される。これらのプローブは、一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、これが実際に折り畳まれて、プローブのセンサーとして作用する残った一本鎖ループと、２つの末端に隣接するヌクレオチドが相補的なヌクレオチド塩基対を介して互いに結合し、これにより二本鎖領域を作り出す短いステムとがもたらされる。この配置は、一本鎖ループが概念的な二本鎖オリゴヌクレオチド（すなわちステム）の同じ末端の相補鎖に結合しているヘアピンに例えることができ、高度に歪んでいる。（ここでは互いに隣接し、ステムの遠端にある）オリゴヌクレオチドの自由３’および５’末端には、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャが結合する。それらを互いに近接させることにより、顕著な蛍光が発生しないようにする。使用時において、標的は、一本鎖ループに結合してさらなる歪みをもたらし、これはその後ステムを展開させ、これによりフルオロフォアおよびクエンチャが離れ、前者を蛍光させる。これらのプローブの１つの不利点は、ループが、比較的長い、例えば２０〜３０のヌクレオチドである必要があり、これにより、小さな標的および特に単一ヌクレオチドを含むものを検出するのに、不向きとなることである。
【０００４】
米国特許出願公開第２００６／０６３１９３号は、未知の一本鎖の検体をそれぞれ異なる配列を有する種々の一連のプローブタイプと接触させるステップ；検体をその相補的なプローブにハイブリダイズするステップ；およびハイブリダイズしたプローブの質量分光測定を行うことにより配列を決定するステップを含む検出方法が記載されている。しかしながら、この方法は、本発明とは異なり、単一ヌクレオチドまたは小さなオリゴヌクレオチド断片の同定にはあまり適していない。
【０００５】
欧州特許第１６６２００６号は、異なる長さの２つの相補的なオリゴヌクレオチド鎖に由来するＤＮＡプローブであって、そのうちの長いほうが一本鎖標的の配列の相補体となるように設計されているものについて教示している。その未使用状態では、プローブは、したがって、二本鎖領域と、ハイブリダイゼーションにより、標的を認識することができ且つこれに部分的に付着することができる一本鎖領域とを備える。その後、プローブ中の２本の鎖のうち短いほうと標的の配列の残りとが交換されし、検体をプローブに完全にハイブリダイズさせることができる。１つの実施形態において、プローブの２本の鎖上の対応するヌクレオチドは、フルオロフォアおよびクエンチャの組み合わせで機能させ、未使用プローブを非蛍光性にする。しかしながら、短いほうの鎖が標的の残りで交換される場合は、フルオロフォアは解放されて蛍光する。
【０００６】
国際公開第２００６／０７１７７６号は、二本鎖領域および一本鎖３’末端領域を含む核酸の使用を含む、ライゲーションに基づくＲＮＡ増幅方法について記載している。この方法では、ＲＮＡの５’末端は一本鎖領域に結合し、３’末端は５’である二本鎖領域の鎖に結合する。その後、ＲＮＡは既知の技術を用いて増幅することができる。しかしながら、核酸は、検出可能要素では標識されないようである。
【０００７】
国際公開第２００９／１２０３７２号は、未知の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを、まず第１および第２のヘアピン一本鎖領域をその末端に結合させることにより、テンプレート核酸に変換する方法について教示している。こうして作成されたテンプレートは、その後、ヘアピンをプライミングするステップ；二本鎖オリゴヌクレオチドの構成鎖を分離するステップ；およびプライマーを分離した鎖に沿って延長するステップを含む従来のポリメラーゼ媒介配列決定方法を用い、センスおよびアンチセンス方向の両方の二本鎖オリゴヌクレオチドを同時に配列決定するのに用いることができる。しかしながら、テンプレート内のヌクレオチドのいずれも、検出可能要素では標識されないようである。
【発明の概要】
【０００８】
そこで、我々は１つまたは一連の検出可能要素をプローブからより容易に検出可能な状態に解放する一連の生体化学／酵素反応によって明確に活性化されない限り検出可能要素が本質的に検出不能な、代替の生体プローブを開発した。こうした生体プローブは、標的の濃度が非常に小さい状況、特に標的が一連の単一ヌクレオチドを備え、その関連ヌクレオチド塩基の順序が配列を決定する必要がある未知の生体分子のそれに対応する状況において、有用である。これは、高スループットＤＮＡ配列決定装置において、本発明のプローブを用いる可能性を広げる。
【０００９】
したがって、本発明によれば、本発明の第１態様において、末端がそれぞれ２つの異なる二本鎖オリゴヌクレオチド領域に付着した一本鎖ヌクレオチド領域を備えることを特徴とする生体プローブであって、オリゴヌクレオチド領域の少なくとも１つは、特徴的な検出特性を有する検出可能要素を備え、検出可能要素は、オリゴヌクレオチド領域上において、同じ数の検出可能要素が対応する数の単一ヌクレオチドに結合した場合よりも検出可能特性が検出できないように配置される、生体プローブが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヌクレオチド捕捉ステップの働きを示すための、ゲルクロマトグラフデータである。レーンＡは、上述したタイプの未使用プローブの試料から得られた結果を示す。レーンＢは、関連核酸（ｄＮＴＰ形態）、ポリメラーゼおよびリガーゼを添加した後の同様の試料からの結果を示す。完了済プローブの存在を示す第２バンドの存在を確認することができる。
【図２】完了済プローブの開裂における制限エンドヌクレアーゼの働きを示すための、ゲルクロマトグラフデータである。レーンＡは完了済プローブを示し、レーンＢはプローブが制限酵素と一定期間接触した後の状況を示す。レーンＢにおける複数のバンドの存在が、２つの断片への開裂が起こったことを示している。
【図３】上述したタイプの開裂した「暗い」完了済プローブにその構成要素であるフルオロフォアを活性状態に解放する漸進的エキソヌクレアーゼ分解を行った後の、時間に伴う蛍光の展開を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１つの好適な実施形態において、検出可能要素は、フルオロフォアを備え、プローブそのものは、フルオロフォアが検出されるように設計された波長において本質的に非蛍光性である。よって、フルオロフォアは、電磁スペクトルの広範部分にわたって一般的な低レベルのバックグラウンド蛍光を示し得るが、一般的には、蛍光の強度が最大である１つまたは少数の特定の波長または波長包絡線がある。フルオロフォアが特徴的に検出されるこれら最大の１つ以上では、蛍光は本質的にまったく発生すべきではない。本発明の文脈では、「本質的に非蛍光性」の語または同等の語は、関連する特徴的な波長または波長包絡線においてプローブに結合した全フルオロフォアの蛍光の強度が、同等数の遊離フルオロフォアの蛍光の対応する強度の２５％未満；好適には１０％未満；より好適には１％未満；もっとも好適には０．１％未満であることを意味する。
【００１２】
原理的には、プローブの未使用状態においてフルオロフォアがそれぞれその対応する単一ヌクレオチドに結合した場合より弱く蛍光するようにするため、いかなる方法を用いることもできる。１つの方法は、クエンチャを、それに近接して、追加で結合させることである。別の方法は、複数のフルオロフォアを互いに近接して同一のプローブに結合させる場合に、前段落に記載した基準をクエンチャの必要なしに達成することができるほど十分に互いをクエンチする傾向があるという観察に基づくものである。本発明のこの文脈では、フルオロフォア間またはフルオロフォアとクエンチャとの間の「近接」を構成するものは、用いられる特定のフルオロフォアおよびクエンチャ、ならびに場合によってはオリゴヌクレオチド領域の構造的特徴に応じて決まる。したがって、この語は、プローブ上のいずれかの特定の構造的配置を参照してではなく、求められる結果を参照して解釈されることを意図している。しかしながら、例を提供することを目的として、隣接するフルオロフォアまたは隣接するフルオロフォアおよびクエンチャが、それらの特徴的なフェルスター距離に対応する距離（一般的には５ｎｍ未満）だけ離れる場合、十分なクエンチングが達成されることが指摘される。
【００１３】
好適には、プローブを備えるオリゴヌクレオチド領域の少なくとも１つは、最大２０個、好適には最大１０個、もっとも好適には最大５個のフルオロフォアで標識される。最大の利益を得るには、オリゴヌクレオチド領域の少なくとも１つは、少なくとも２つ、好適には少なくとも３つのフルオロフォアで標識されることが好ましい。したがって、本明細書では、これらの最大および最小のいずれかの変更から構成される範囲が具体的に想定される。クエンチャが用いられる場合、プローブは、最大２０個、好適には最大１０個、もっとも好適には最大５個のフルオロフォアで標識されることが同様に好ましい。例えば特徴的な指紋をもたらすため、２つ以上のタイプのフルオロフォアをプローブに結合することができると想定されるが、所定のプローブに結合したすべてのフルオロフォアは同じタイプであることが好ましい。好適には、フルオロフォアおよびクエンチャは、オリゴヌクレオチド領域の異なる鎖上にあるか、または、一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体を折り畳むことによりもたらされるところの対向にある。
【００１４】
フルオロフォアそのものに関して、それらは、原則として、これらに限定されないが、例えばフルオレセイン、ローダミンおよびフルオレセインイソチオシアネート、ローダミンＢ等のようなそれらの誘導体などのキサンテン部分、、クマリン部分（例えばヒドロキシ−、メチル−およびアミノクマリン）、ならびにＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７のようなシアニン部分を含む、当技術分野において従来用いられるもののいずれかから選択することができる。具体例としては、Ａｌｅｘａ染料、シアニン染料、Ａｔｔｏ  Ｔｅｃ染料、およびローダミン染料。例としては：Ａｔｔｏ  ６３３（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ）、テキサスレッド、Ａｔｔｏ  ７４０（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ）、ローズベンガル、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）７５０  Ｃ５−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）５３２  Ｃ２−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにローダミンレッドＣ２−マレイミドおよびローダミングリーン、またＱｕａｓａｒ  ５７０のようなホスホラミダイト染料などの、よく用いられる染料から誘導されるフルオロフォアが挙げられる。あるいは、量子ドットまたはＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより供給されるような近赤外染料を用いることができる。フルオロフォアは、一般的には、当技術分野において知られる化学的方法を用いて、ヌクレオチド塩基を介してオリゴヌクレオチドに結合される。
【００１５】
適切なクエンチャは、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）メカニズムにより機能するものである。上記フルオロフォアと関連して用いることができる市販のクエンチャの非限定的な例としては、これらに限定されないが、ＤＤＱ−１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱおよびＲＱ、ＩＲ  Ｄｙｅ−ＱＣ１、ＢＨＱ−１、−２および−３ならびにＱＳＹ−７および−２１が挙げられる。
【００１６】
プローブの一本鎖ヌクレオチド領域について、これは、最大で１０００のヌクレオチド、好適には最大で３００のヌクレオチド長とすることができ、化学合成により最初から生成、または細菌ＤＮＡのような自然発生源から誘導することができる。本発明の１つの有利な実施形態では、ヌクレオチド領域は、適切には長さが最大で１００のヌクレオチド、好適には最大で５０のヌクレオチド、もっとも好適には最大で３０のヌクレオチドである。別の実施形態では、一本鎖領域は１つのヌクレオチドのみからなり、これにより、プローブは、相補的なヌクレオチド塩基を有する遊離ヌクレオチドの検出について極めて選択的となる。自然発生のＤＮＡまたはＲＮＡに由来する標的の場合、これは、それぞれ標的に特徴的な異なるヌクレオチド塩基（すなわち、ＤＮＡは、グアニン、シトシン、アデニンおよびチミンの１つであり、また、ＲＮＡは、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルの１つである）について選択的であって、それぞれ異なる検出可能要素；特には異なる特徴的な波長または波長包絡線で蛍光する異なるフルオロフォアを用いた、本発明による最大４つの異なる生体プローブを備える多成分生体プローブ混合物を用いる可能性を広げる。
【００１７】
二本鎖オリゴヌクレオチド領域について、それらは、、２つのオリゴヌクレオチド前駆体であって、好適にそれぞれの一本鎖ヌクレオチド領域から離れた末端がクローズドループである２つのオリゴヌクレオチド前駆体から、または、１つの一般的な一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体であって、２つの末端を折り畳むことにより、２つのクローズドループのオリゴヌクレオチド領域と一本鎖ヌクレオチド領域を構成する中間ギャップとをもたらす一般的な一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体、から誘導される、または誘導可能であることが好ましい。すべての場合において、効果は同じであり；一本鎖ヌクレオチド領域の末端に、オリゴヌクレオチド領域の他方の鎖上の３’および５’自由末端が隣接し、ここに、標的の対応する５’および３’末端を結合させることができる。このように、プローブの使用は、前記３’および５’末端に結合することにより、一本鎖ヌクレオチド領域をヌクレオチド塩基の相補的な配列を有する標的に結合させて、全長に沿って二本鎖である使用済プローブをもたらすプロセスを含む。
【００１８】
生体プローブが２つの別々の二本鎖オリゴヌクレオチドからなる場合、ヌクレオチド領域から離れた各末端は、クローズドループであることが好ましい。適切には、オリゴヌクレオチド領域は、長さが、最大で５０のヌクレオチド対、好適には最大で４５のヌクレオチド対、より好適には５〜４０のヌクレオチド対の範囲内、もっとも好適には１０〜３０のヌクレオチドの範囲内である。より長いオリゴヌクレオチド領域を用いてもよいが、この実施形態は、それらが絡み合うようになることでヌクレオチド領域へのアクセスが制限され得るという潜在的なリスクにより、あまり魅力的ではない。
【００１９】
オリゴヌクレオチド領域に結合した検出可能要素は、ヌクレオチド領域から離れて位置することが好ましい。２つの別々のオリゴヌクレオチド領域が用いられる場合、検出可能要素は、ヌクレオチド領域から離れたその末端の１つまたは両方にまたはこれに向かって、位置または集合していることが好ましい。１つの好適な実施形態において、オリゴヌクレオチド領域の少なくとも１つは、好適には検出可能要素が位置または集合している領域に隣接した、制限酵素認識部位を備える。こうした制限酵素認識部位は、一般的には、２〜８のヌクレオチド対の特定配列を備える。本発明の別の好適な実施形態において、制限酵素認識部位は、ヌクレオチド領域への標的のの結合によりもたらされる。
【００２０】
本発明の生体プローブは、原則として、Ｈ−ホスホネート法、ホスホジエステル合成、ホスホトリエステル合成およびホスファイトトリエステル合成を含む、当技術分野において知られるヌクレオチドアセンブリ方法のいずれかにより製造することができる。それらの反応性のため、好ましくは、ヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックを用いる方法である。これらの方法において、合成は、デブロッキング、カップリング、キャッピングおよび酸化を含む循環４段階プロセスにおいて、選択されたヌクレオチドホスホラミダイトを、成長ヌクレオチド鎖の５’位へ逐次付加することにより行われる。このプロセスの循環性により、特に自動化が可能であり、これを行う装置は市場で容易に入手可能である。クエンチャおよび／またはフルオロフォアが導入される場合、適切に標識されたヌクレオチドホスホラミダイトは、必要な時点で用いられる。もっとも好適な実施形態において、ホスホラミダイト法は、急速加熱および徐冷のサイクルにより折り畳まれた一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体を、所望の特徴を有するプローブとするのに用いられる。
【００２１】
プローブは、通常、溶液中で用いられるが、所望に応じ、ポリマー、メンブレン、チップアレイ等の基質上に、或いは、ナノポアまたはナノチャネル中に、有利に固定することができる。
【００２２】
本発明の第２態様においては、（ａ）標的を上述したタイプの生体プローブの一本鎖ヌクレオチド領域に結合させて、全体として二本鎖である使用済プローブをもたらすステップを備えることを特徴とする、標的を検出するための生体プローブの使用方法が提供される。通常、このステップ（ａ）は、標的の５’末端をオリゴヌクレオチドの３’末端に結合させるポリメラーゼ、ならびに、標的および当該オリゴヌクレオチドまたは他のオリゴヌクレオチドの残りの自由末端を結合させるリガーゼを用いて行われる。これらに限定されないが、バクテリオファージＴ４、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）およびテルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ））等の容易に入手可能な細菌源に由来するものを含む、広範囲のポリメラーゼおよびリガーゼを用いることができる。好適には、ステップ（ａ）は、水性媒体中で、適切には１：１〜１：２０００、好適には１：１〜１：２００、より好適には１：２〜１：５０、もっとも好適には１：５〜１：２０の範囲内の標的対プローブのモル比を有する、過剰なプローブの存在下で行われる。適切には、標的は、生体プローブ上のヌクレオチド領域のものに相補的なヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基配列を有する単一ヌクレオチドまたは一本鎖オリゴヌクレオチドである。もっとも好適には、標的は、自然発生のＤＮＡまたはＲＮＡに特徴的な単一ヌクレオチドである。反応媒体が希薄である場合には、それぞれ標的に対して化学量論的に過剰な２つの酵素が適切に用いられる。
【００２３】
好適には、本発明の方法は、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた使用済プローブを制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）およびエキソヌクレアーゼで処理して、検出可能要素をそこから検出することができる形態に解放するステップをさらに備える。その後、ステップ（ｃ）では、こうして解放された検出可能要素が、これに関連した検出可能特性を観察することにより検出される。よって、プローブ中の検出可能要素が比較的非蛍光性のフルオロフォアである場合、ステップ（ｂ）は、それらを最適に蛍光させることができる形態に解放する。その後、この蛍光は、分析目的で使用可能な出力データセットまたはデータストリームを提供するために、従来技術を用いて検出および測定することができ、る。ステップ（ｂ）において、このフルオロフォアの解放は、まず、制限酵素が、使用済プローブにおける上記制限酵素認識部位で二本鎖を切断することにより行われる。こうしてもたらされた短い断片は、次いで、エキソヌクレアーゼによりさらに単一ヌクレオチドに分解され、その少なくともいくつかがフルオロフォアで標識される。プローブが複数のフルオロフォアを備える場合には、これによって一連の解放フルオロフォアがもたらされ、ここでこれらが互いにまたはそれらの関連クエンチャから離れることにより、通常の方法で自由に蛍光する。好適には、この蛍光は、ステップ（ｃ）においてフルオロフォアの特徴的な蛍光波長または波長包絡線に対して調整された光検出器または同等の装置により検出される。これにより、光検出器は、次に通常の方法で処理および分析することができる電気信号を発生する。一般的に、ステップ（ｂ）もまた、過剰の酵素を含む水性媒体中で行われる。未使用生体プローブを分解することを回避するため、制限酵素認識部位は、標的を一本鎖ヌクレオチド領域に付加することにより形成されるものであるか、あるいは、制限酵素は、中にニックを含有する二本鎖オリゴヌクレオチドとは反応しないように選択されることが好ましい。よって、制限酵素は、制限酵素部位の特徴を考慮して選択され、特にプローブが最適に機能する場合、部位について高い忠実度を示すものである。適切なエキソヌクレアーゼとしては、ＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼフリー）、エキソヌクレアーゼＩまたはＩＩＩ（例えば大腸菌）、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＶ（ＲｅｃＢＣＤ）、λエキソヌクレアーゼ、マイクロコッカルヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、ＲｅｃＪｆ、Ｔ５エキソヌクレアーゼおよびＴ７エキソヌクレアーゼ等が挙げられる。
【００２４】
本方法の１つの好適な使用は、標的が単一ヌクレオチドであり、これを、それぞれその関連ヌクレオチド塩基が（１）グアニン、シトシン、アデニンおよびチミンまたは（２）グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを備えるものから選択される異なる単一ヌクレオチドを備える一本鎖ヌクレオチド領域を有する４つの異なる生体プローブの混合物と接触させる場合である。しかしながら、所望に応じて、他のヌクレオチド塩基に対応する他のヌクレオチド（例えば、他の合成ポリヌクレオチドを構成するもの）を用いることができる。すべての場合において、各プローブは、異なる関連検出可能要素、好適には異なるフルオロフォアを有することが好ましい。もっとも好適な実施形態において、標的は、配列が不明であるか又は部分的に知られているにすぎないＤＮＡまたはＲＮＡの資料におけるヌクレオチドの配列に順序が対応した、一連の単一ヌクレオチドを備える。こうした手段により、本方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定装置の設計および操作の基礎を提供することができる。
【実施例】
【００２５】
ここで、本発明を、下記の実施例および図により示す。
【００２６】
（実施例１）
ヌクレオチド塩基配列：
（５’）ＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＸＸＡＸＸＧＣＣＣＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＧＧＧＣＡＡＹＡＡＣＣＡＴＣＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＧＡＣＣＴＴＴＡＴＴＣＧＣＧＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＧＡＡＴＡＡＡＧＧＴＣＧＡＧＣＣＴＧＣ（３’）
［ＸはＱｕａｓａｒ  ５７０（フルオロフォア）で標識されたＴ塩基であり、ＹはＢＨＱ−２クエンチャで標識されたＴ塩基である］を有する１０３ヌクレオチド一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体（例えばＡＴＤＢｉｏ）を、その水溶液を９５℃まで加熱した後、１℃当たり１０分の割合で室温までゆっくり冷却することにより、第４９ヌクレオチド塩基辺りで折り畳んだ。この時間の終わりに、第４９ヌクレオチド塩基（ここではＴ）が一本鎖ヌクレオチド領域ならびにその両側にそれぞれ２４および２７ヌクレオチド塩基対長の２つの二本鎖オリゴヌクレオチドを備えた、本発明による末端がクローズドループであるプローブを形成した。
【００２７】
（実施例２〜４）
第４９位のヌクレオチド塩基がＧ（実施例２）、Ｃ（実施例３）およびＡ（実施例４）となるように１０３ヌクレオチド前駆体を修飾したことを除き、実施例１の方法をさらに３回繰り返し、異なるヌクレオチド塩基について選択的な３つのさらなるプローブを作製した。これらの各実施例において用いたＸ塩基は、それぞれ、フルオレセイン（５１７ｎｍ）、テキサスレッド（６１２ｎｍ）およびシアニン−５(６６７ｎｍ)で標識されたＴ塩基である。
【００２８】
（実施例５）
プローブ混合物を、等モル量の実施例１〜４の４つのプローブを水溶液中で室温で混合することにより、作製した。
【００２９】
（実施例６）
実施例５の混合物を５４７ナノメートルレーザー光で調査し、光検出器を用いて蛍光度を５７０ｎｍで測定した。その後、触媒量のクレノウ断片ポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼＩ（例えば大腸菌）およびサブチリシンから生成）および大腸菌ＤＮＡリガーゼとともに、関連Ａ塩基を有する単一ヌクレオチドを備える水溶液を添加した（単一ヌクレオチドのプローブに対するモル比１：５０）。１時間後、制限酵素Ｓｂｆ１およびλエキソヌクレアーゼの水溶液を触媒量で添加する前に、蛍光を再度測定した。さらに１時間が経過した後、蛍光度を再度測定した。最初の２回において５７０ｎｍで測定した蛍光は、最後に測定したものの９９％未満であることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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