(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィの間にグリコサミノグリカンから１以上のタンパク質を分離する方法であって、
（ｉ）１以上のタンパク質およびグリコサミノグリカンを含むサンプルを、２．５またはそれ以下のｐＨを有する移動相を用いて、サイズ排除クロマトグラフィに供すること、ならびに
（ｉｉ）１以上のタンパク質を含む移動相画分を回収すること
を含み、
移動相は、塩を含み、移動相画分は、グリコサミノグリカンを含まないかまたは少量のみのグリコサミノグリカンを含み、
サンプルが１つまたはそれ以上の血液カスケードタンパクを含む方法。
【請求項２】
前記移動相画分におけるグリコサミノグリカンの量を測定するための検出装置を用いることをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記サンプルにおける前記グリコサミノグリカンの量が閾値レベルを超えるかどうかを測定することをさらに含む、請求項２の方法。
【請求項４】
前記閾値レベルが２μｇ／ｍｌである、請求項３の方法。
【請求項５】
前記サンプルが未精製である、請求項１から４のうちいずれか１つの方法。
【請求項６】
前記サンプルが部分的に精製されている、請求項１から４のうちいずれか１つの方法。
【請求項７】
前記サンプルが因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸを含む、請求項１から６のうちいずれか１つの方法。
【請求項８】
前記グリコサミノグリカンは負に帯電している、請求項１から７のうちいずれか１つの方法。
【請求項９】
前記グリコサミノグリカンはデキストラン硫酸である、請求項１から８のうちいずれか１つの方法。
【請求項１０】
前記デキストラン硫酸は６〜８ｋＤａのサイズを有する、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記グリコサミノグリカンはヘパリン硫酸である、請求項１から８のうちいずれか１つの方法。
【請求項１２】
前記検出装置がＵＶ検出器である、請求項２から１１のうちいずれか１つの方法。
【請求項１３】
前記サイズ排除クロマトグラフィが充填材料を含む、請求項１から１２のうちいずれか１つの方法。
【請求項１４】
前記充填材料はシリカ系であり、１００から２００オングストロームの間の孔径と、５ミクロンまたはそれ以下の粒子径を有する、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記サイズ排除クロマトグラフィはシリカ系サイズ排除カラム上で行われる、請求項１から１４のうちいずれか１つの方法。
【請求項１６】
前記移動相の前記ｐＨは２．５である、請求項１から１５のうちいずれか１つの方法。
【請求項１７】
前記塩は２００ｍＭのＮａＣｌである、請求項１から１６のうちいずれか１つの方法。
【請求項１８】
前記サンプルが因子ＶＩＩＩＦｃを含む、請求項１から１７のうちいずれか１つの方法。
【請求項１９】
前記サンプルが因子ＩＸＦｃを含む、請求項１から１７のうちいずれか１つの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年４月１１日出願の米国仮出願第６１／６２２，７２０号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張し、その内容が、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、生体試料の分析および分離に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子組換え型および合成タンパク質サンプルは、タンパク生産工程でもたらされる不必要な非タンパク成分を含むことが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
関心タンパク質の産生の向上のために、遺伝子組換え型または合成タンパクからこれらの非タンパク成分を区別するための新たな方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
いくつかの実施形態では、本発明の態様は、タンパク質サンプルにおけるグリコサミノグリカンの存在または量を評価するために使用され得る、簡易なクロマトグラフ技術を提供する。グリコサミノグリカンは、サイズ排除クロマトグラフィ中の移動相のｐＨにより影響を受けることが発見された。驚くべきことに、中性を下回るｐＨを有する移動相は、タンパク質サンプルにおける他の成分に対してグリコサミノグリカン分画の移動を有意に遅らせる。また、グリコサミノグリカン分画の移動は、中性のｐＨよりも低い移動相を用いる場合に、有意により少なく分散される。このことは、複雑なサンプル処理なしに、グリコサミノグリカン検出の感度の増強を可能にする。
【０００６】
従って、いくつかの実施形態では、本発明の態様は、サンプルにおける、例えば、タンパク生産工程から得られるサンプルにおける、タンパクおよび他の成分からグリコサミノグリカンを区別するための方法および構成に関する。グリコサミノグリカンは、遺伝子組換え型タンパクの収量を増加させるためのタンパク産生中に使用され得る（例えば、米国特許第５，９１４，３９０号参照）。例えば、グリコサミノグリカンは、血液カスケードタンパクまたは他の遺伝子組換え型タンパクの産生中の細胞培養培地に添加され得る。
【０００７】
本明細書に記載される方法は、分析的および分取アプリケーションの両方に使用され得る。いくつかの実施形態では、サンプルにおける１つまたはそれ以上のグリコサミノグリカンに対する１つまたはそれ以上のタンパクの純度を測定するために、サンプルが評価され得る。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のタンパクが、サンプルにおける１つまたはそれ以上のグリコサミノグリカンから分離および単離され得る。これらのアプリケーションは、例えば、タンパク産生および／または分離手順のうえで有用であり得る。
【０００８】
いくつかの実施形態では、方法および構成は、中性のｐＨを下回って（例えば、ｐＨ６．８またはそれ以下）行われる、サイズ排除クロマトグラフィ中のタンパクおよびグリコサミノグリカンの予期されない挙動に関する。６．８またはそれ以下のｐＨを有する移動相は、サイズ排除クロマトグラフィ中のタンパクからのグリコサミノグリカンの分離を向上させることがわかる。いくつかの実施形態では、向上された分離は、移動相の低いｐＨに起因し、タンパクおよび／またはグリコサミノグリカンのより少なく分散された分画の溶出を生じさせる。いくつかの実施形態では、タンパクおよび／またはグリコサミノグリカン分画間の重複が低減される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、サンプルにおける１つまたはそれ以上の他の成分からのグリコサミノグリカンを区別する方法は、６．８またはそれ以下のｐＨを有する移動相を用いるサイズ排除クロマトグラフィをサンプルに供することを含む。いくつかの実施形態では、検出装置は、サイズ排除クロマトグラフィに供された移動相におけるグリコサミノグリカンの量を測定するために、例えば、サンプルにおけるグリコサミノグリカンの量を測定するために使用される。したがって、いくつかの実施形態では、サンプルがグリコサミノグリカンを含むかどうかを測定するための方法は、サイズ排除カラムにサンプルを適用し、サイズ排除カラムを通ってサンプルが流れるように６．８またはそれ以下のｐＨを有する移動相を適用し、カラムを流れた移動相にグリコサミノグリカンが存在するかどうかを測定するために検出装置を用いることによりサンプルがグリコサミノグリカンを含むかどうかを測定することを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、サンプルにおけるグリコサミノグリカンの量が閾値レベルを上回るかどうかを測定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、閾値レベルは２μｇ／ｍｌである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、サンプルからグリコサミノグリカンを分離するために使用され得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法により処理されるサンプルはタンパクを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは未精製または部分的に精製されている。
【００１３】
いくつかの実施形態では、サンプルは、１つまたはそれ以上の血液カスケードタンパク、例えば、これらに限定されないが、因子ＶＩＩＩ‐Ｆｃまたは因子ＩＸ‐Ｆｃを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、負に帯電しているグリコサミノグリカンはタンパクから分離される。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンはデキストラン硫酸である。いくつかの実施形態では、デキストラン硫酸は６〜８ｋＤａのサイズを有する。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンはヘパリン硫酸である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンを検出するために使用される検出装置は、ＵＶ検出器である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィは、クロマトグラフィ充填材料を用いて行われる。いくつかの実施形態では、充填材料は、使用される移動相との二次相互作用を可能にする。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィ充填材料はシリカ系である。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィ充填材料は、１００〜２００オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、充填材料は、５ミクロンまたはそれ以下の粒子径を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、移動相のｐＨは、６．０もしくはそれ以下、５．０もしくはそれ以下、４．０もしくはそれ以下、３．０もしくはそれ以下、または２．５もしくはそれ以下である。いくつかの実施形態では、移動相は塩を含む。いくつかの実施形態では、塩は２００ｍＭのＮａＣｌである。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明、実施例、および請求の範囲において記載されおよび示される。
【００１９】
図は、単なる説明であって、本明細書に開示される発明を実施可能にするために必要とされるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、デキストラン硫酸標準物質を添加した因子ＩＸ‐Ｆｃサンプル（ＬＰ５‐１０‐ＦＩＸ‐００１）についての直線のプロットを示す。
【図２】図２は、デキストラン硫酸標準物質についての検量線、および因子ＩＸ‐Ｆｃサンプル単体、因子ＩＸ‐Ｆｃ製剤バッファ単体、および２μｇ／ｍＬのデキストラン硫酸（６〜８ｋＤａ）を添加した因子ＩＸ‐Ｆｃサンプルを含む、いくつかの拡大クロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明の態様は、タンパクおよび／または他の成分を含むサンプルにおけるグリコサミノグリカン検出の感度を高めるための方法および構成に関する。いくつかの実施形態では、方法は、サイズ排除クロマトグラフィを用いる場合に、グリコサミノグリカンおよびタンパク間の分離を増進させることにより、サンプルにおけるタンパクからグリコサミノグリカンを区別するために提供される。いくつかの実施形態では、方法は、サイズ排除クロマトグラフィを用いる場合に、グリコサミノグリカンおよびタンパク間の分離を増進させることにより、サンプルにおけるタンパクからグリコサミノグリカンを分離するために提供される。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィ物質からのグリコサミノグリカンの溶出プロファイルは、標準的なクロマトグラフィ条件に代えて、本明細書に記載の方法および構成を使用する場合に、より少なく分散される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明の態様は、簡易な検出装置を用いて、タンパク質サンプルにおいて少量混入するグリコサミノグリカンを検出するのに有用である。このことは、タンパク除去のような、より複雑な手順またはより多くのサンプル材料を必要とし、少量のグリコサミノグリカンを検出し損なうことが多い、現在の分析的な技術を上回る有意な向上を提供する。タンパクからグリコサミノグリカンを有効に区別するための性能は、より再現性よくサンプルにおけるグリコサミノグリカンの存在および量を評価するために使用され得る。このことは、例えば、混入するグリコサミノグリカン（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン硫酸、または他のグリコサミノグリカン）を除去することが重要であり得る場合に、タンパク産生および精製のうえで有用である。いくつかの実施形態では、少量のグリコサミノグリカンを検出するための性能が、少量のグリコサミノグリカンの存在に起因して、有効性をより少なくしそうなタンパク質サンプルを識別するための品質管理ツールとして有用である。しかしながら、本発明の態様は、分析的なアプリケーションに限定されないだけでなく、タンパクの単離または精製を補助するための分取の目的のためにも使用され得ることは理解されるべきである。
【００２３】
本発明の態様は、少なくとも部分的に、サイズ排除クロマトグラフィ材料からのグリコサミノグリカンの溶出における、中性のｐＨを下回る移動相の予期されない効果に基づく。いくつかの実施形態では、中性のｐＨを下回る移動相は、サンプルにおけるタンパクおよび／または他の成分からのグリコサミノグリカンの分離を向上させることにより、それらの溶出プロファイルの重複を低減する。いくつかの実施形態では、中性のｐＨを下回る移動相は、グリコサミノグリカンの溶出プロファイルを狭める（つまり、より少なく分散させる）ことにより、少量のグリコサミノグリカンを検出する性能を増進し、簡易な検出装置（例えば、ＵＶ検出器）が使用されることを可能にする。よって、本明細書に提供される方法は、これまで可能であったよりも低いレベルで、これまで可能であったよりもより簡易な装置を用いて、サンプルにおけるグリコサミノグリカン（複数を含む）の存在を測定するために有用である。具体的なメカニズムに限定されるものではないが、中性を下回るｐＨは、カラムの固定相によるタンパクおよび／またはグリコサミノグリカンのイオン性相互作用を最小化することが考えられる。
【００２４】
サンプルにおけるデキストラン硫酸のようなグリコサミノグリカンを検出するための現行の方法は、（尿またはバッファのような）低タンパク質サンプルに制限される。より濃縮されたタンパク質サンプル、例えば、タンパク産生手順から得られたサンプルは、グリコサミノグリカンの存在または量についての分析の前に、タンパクを除去する処理を今のところ必要とする。現行の方法は煩雑であり、蛍光色素を有するデキストランの標識、または２Ｄ液体クロマトグラフィのような高価な高分離能の方法の使用を必要とする（例えば、Maderich et al., 1993, J. of Chromatography 620: 137-142; Araki et al., 2001, J. of Chromatography B 753: 209-215参照）。しかしながら、蛍光標識および／または２Ｄ‐ＬＣの使用でさえ、一般的に、いくつかまたは全てのタンパクを除去するための精製工程をまだ必要とする。
【００２５】
対照的に、本明細書に記載される方法は、濃縮されたタンパク質サンプルにおけるグリコサミノグリカンが、単一の手順および簡易な分離および検出装置を用いて、高い感度で区別され、定量化されることを可能にする。例えば、本明細書に記載される方法は、タンパク質サンプルが、１つまたはそれ以上のグリコサミノグリカン（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン硫酸等）の低い閾値レベル（例えば、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、またはそれ以下）の存在について、評価されることを可能にする。従って、低いレベルのグリコサミノグリカンが、タンパク、塩、並びに界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ‐２０、Ｔｗｅｅｎ‐８０）およびポリプロピレングリコールのような他の成分の存在下で、有効に検出され得る。しかしながら、本発明の態様は低いレベルのグリコサミノグリカンの除去および検出に限定されないため、より高いレベルのグリコサミノグリカンもまた検出および／または除去されることとしてもよいことが理解されるべきである。
【００２６】
サイズ排除クロマトグラフィは、グリコサミノグリカンを、タンパク質、特に濃縮されたタンパク質サンプルのうえで有効に分離することを可能にすることが期待されないことが理解されるべきである。現行の方法論を用いると、サイズ分離カラムを通って流れるときに、グリコサミノグリカンおよびタンパクは（部分的にまたは完全に）重複する。また、グリコサミノグリカンは、サンプルにおけるタンパクまたは他の成分と結合する傾向があり、それらが有効に分離されるのを妨げる。その結果、グリコサミノグリカンは、現行のサイズ排除技術を用いるとき、容易に検出可能ではなく、複雑な技術（例えば、特異的な標識）が、タンパクからそれらを区別するために必要とされるであろう。対照的に、本明細書に記載される方法は、簡易な技術（例えば、分光光度法）を用いて、それぞれの成分の個別の検出を可能にするために、タンパクからグリコサミノグリカンを十分に分離する。いくつかの実施形態では、タンパクおよびグリコサミノグリカン分画は、あらゆるタンパクまたはグリコサミノグリカンに特異的な検出または結合試薬を用いることなく、（例えば、２１４ｎｍのような、２００〜３００ｎｍの間の波長を用いる）標準的なＵＶ分光光度計を用いて検出されおよび／または定量化され得る。グリコサミノグリカンおよびタンパク成分が十分に分離されるので、両方の成分を検出する単一の技術（例えば、分光光度計または特定の波長または波長の範囲から信号を検出する簡易なＵＶ検出器）が、グリコサミノグリカンおよびタンパクならびに／または他の成分を個別に評価および定量化するために使用され得る。しかしながら、本明細書に記載される技術は、この点で限定されない本開示の態様として、グリコサミノグリカンに特異的な検出または結合試薬とともに使用され得ることが理解されるべきである。
【００２７】
サンプル
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および構成は、タンパク質サンプル、例えば濃縮されたタンパク質サンプル、例えば治療用のタンパク質のサンプルにおける他の成分からグリコサミノグリカンを区別するために有用である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、サンプルは生体試料である。本明細書で用いられる生体試料は、核酸、ポリペプチド、微生物、または真核細胞のような、１つまたはそれ以上の生物学的成分を含むあらゆるサンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは、製造サンプルである。本明細書で用いられる製造サンプルは、核酸またはポリペプチド（例えば、治療用タンパク）のような生体成分を産生するために使用されるあらゆるサンプルである。いくつかの実施形態では、製造サンプルは、微生物および真核細胞の溶解物を含む、微生物（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を含む。いくつかの実施形態では、サンプルはタンパクを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、サンプルは未精製である。本明細書で用いられる未精製のサンプルは、不溶性の成分の除去以外のあらゆる精製工程を経ていないサンプルを指す。未精製のサンプルは、例えば、遠心分離またはろ過により不溶性の粒子を除去したが、可溶分（例えば、核酸、塩）を除去するためのあらゆる精製工程を経ていない生体試料（例えば、血漿、血液、尿）を含む。また、未精製のサンプルは、製造サンプルを含み得る。未精製の製造サンプルは、不溶性の細片は除去されているが、可溶分（例えば、塩）を除去するための精製工程を経ていない、細胞溶解物および細胞上清を含む。いくつかの実施形態では、未精製のサンプルは、発酵プロセス由来の上清である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、サンプルは部分的に精製される。本明細書で用いられる部分的に精製されたサンプルは、１つまたはそれ以上の可溶成分が除去されたサンプルを指す。部分的に精製されたサンプルから除去された成分は、例えば、糖、塩、色素、および栄養素（例えば、アミノ酸）を含む。１つまたはそれ以上の可溶成分の除去は、部分的または完全であり得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、１つまたはそれ以上の透析工程により部分的に精製される。また、部分的に精製されたサンプルにおいて、不溶性の成分もまた除去されることとしてもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態では、サンプルはタンパク（またはポリペプチド）を含む。生体試料と製造サンプルはともに、一般的にタンパクを含む。本明細書で提供される方法は、例えば、細胞溶解物、および血液といった製造サンプルのような高タンパクのサンプル、およびバッファおよび尿のような低タンパクのサンプルの両方で行われ得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、サンプルは、産生のための１つまたはそれ以上の治療用タンパクを含む。いくつかの実施形態では、タンパク産生サンプルは、遺伝子組換え型の産生タンパクのサンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは、血漿から回収されるタンパクを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、グリコサミノグリカンを結合し得るタンパクを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、サンプルは、１つまたはそれ以上の血液カスケードタンパク（例えば、凝固因子）を含む。血液カスケードタンパクは当該技術分野で知られており、因子ＶＩＩ、組織因子、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩ、因子ＸＩＩ、組織因子経路インヒビター、因子Ｖ、プロトロンビン、トロンビン、フォンヴィレブランド因子、キニノーゲン、プレカリクレイン（ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｉｅｎ）、カリクレイン、フィブリノーゲン（ｆｒｉｂｒｏｎｏｇｅｎ）、フィブリン、プロテインＣ、トロンボモジュリン、因子ＩＶ、因子ＶＩ、因子ＶＩＩＩ、フィブロネクチン、ヘパリン補助因子、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ‐関連プロテアーゼインヒビター、プラスミノーゲン、アルファ２抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤‐１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤‐２、およびアンチトロンビンを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、血液カスケードタンパクは、因子ＩＸまたは因子ＶＩＩＩである。因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸ活性を測定するための分析は、例えば、国際出願公開第２０１３／０１６４５４号に記載されている。いくつかの実施形態では、血液カスケードタンパクは、ヒトタンパクである。いくつかの実施形態では、血液カスケードタンパクは、例えば、１つまたはそれ以上の血液カスケードタンパクにおいて欠乏している対象（例えば、血友病を有する対象）における治療に使用される。
【００３４】
また、方法は、血液カスケードタンパクおよび血液カスケードタンパクを含むポリペプチドの改変されたものを含むサンプルに適用可能であることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、血液カスケードタンパクは、他のタンパクと共有結合される。いくつかの実施形態では、血液カスケードタンパクは、抗体またはＦｃのような抗体フラグメントと共有結合される。いくつかの実施形態では、血液カスケードタンパクは、因子ＩＸ‐Ｆｃ（ＦＩＸＦｃ）または因子ＶＩＩＩ‐Ｆｃ（ＦＶＩＩＩＦｃ）である。キメラの血液凝固因子‐Ｆｃ結合体は、例えば、国際出願公開第２０１３／０１２７３３号、国際出願公開第２０１３／００９６２７号、国際出願公開第２０１２／１７０９６９号、国際出願公開第２０１２／００６６２４、および国際出願公開第２０１１／０６９１６４号に記載され、その全体において具体的に本明細書に組み込まれる。
【００３５】
血液カスケードタンパクは、血友病に罹っている対象のような、ホメオスタシスの調製に困難性を有する対象に投与されることが多い。凝固誘導／刺激タンパクを含む治療が対象に投与される場合、そのような治療が坑凝固剤を含まないことが非常に重要である。いくつかの実施形態では、本開示は、血液カスケードタンパク質サンプル由来の、グリコサミノグリカンのような坑凝固剤を除去する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、血液カスケードタンパクを含むサンプルが、所定のレベルを下回る量の坑凝固剤を含むかどうかを検出するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、血液カスケードタンパクを含むサンプルが、下流の処理のためにサンプルを準備する（例えば、投与される薬学的組成物を準備する）のに十分少ない量の坑凝固剤を含むかどうかを検出するための方法を提供する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、サンプルは、タンパクホルモン、調節タンパク質、および／または神経栄養因子を含む。神経栄養因子は、当該技術分野で知られており、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン‐３（ＮＴ‐３）、ニューロトロフィン‐４（ＮＴ‐４）、グリア細胞株由来神経栄養因子リガンド（ＧＤＮＦ）のメンバー、ネトリン（ｎｅｒｔｅｒｉｎ）、アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）、パーセフィン、および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、ニューブラスチンを含む（例えば、その全体において具体的に本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２７６，５８０号参照）。いくつかの実施形態では、神経栄養因子はヒトタンパクである。いくつかの実施形態では、神経栄養因子は、例えば、末梢神経疾患および関連する疼痛症候群に罹っている対象における治療に使用される。
【００３７】
本方法は、神経栄養因子および神経栄養因子を含むポリペプチドの改変されたものを含むサンプルに適用可能であることも理解されるべきである。いくつかの実施形態では、神経栄養因子は他のタンパクと共有結合される。いくつかの実施形態では、神経栄養因子は、抗体またはＦｃのような抗体フラグメントと共有結合する。いくつかの実施形態では、サンプルは、ニューブラスチンの変異体を含む（例えば、その全体において具体的に本明細書に組み込まれる、国際出願公開第２００６／０２３７９１号参照）。いくつかの実施形態では、サンプルは、ニューブラスチンの結合体を含む（例えば、その全体において具体的に本明細書に組み込まれる、国際出願公開第２００４／０９４５９２号および国際出願公開第２００４／０６９１７６号参照）。
【００３８】
血液カスケードタンパクまたは他のタンパクの生産工程の間に、坑凝固剤が生産の最適化のために添加され得る。坑凝固剤が除去されることとなり、および／またはタンパク質サンプル（例えば、血液カスケードタンパク質サンプル）が、さらに処理または投与され得る前に所定のレベルを下回ることとなる。本明細書に開示される方法は、さらなる処理または投与前のサンプルにおけるグリコサミノグリカンのような坑凝固剤の量の測定を可能にする。いくつかの実施形態では、タンパクは、グリコサミノグリカンの量が測定されることとなるサンプルから除去されない。
【００３９】
本明細書に記載される方法は、グリコサミノグリカンを含むサンプルにとって有用であることが理解されるべきである。グリコサミノグリカンは、繰返し二糖単位からなる枝分かれのない多糖類である。繰返し単位は、ヘキソサミンに結合されるヘキソースまたはヘキスロン酸からなる。グリコサミノグリカンの多くは負に帯電しており、硫酸基を含む。グリコサミノグリカンは、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸（ｋｅｒａｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ヘパリン、ヘパリン硫酸、およびヒアルロナンを含む。グリコサミノグリカンは、ヒトの体内で自然に産生される。グリコサミノグリカンは、自然界において、種々のポリマー長で発見される。さらに、グリコサミノグリカンは、所望のポリマー長（例えば、所望のｋＤａ）でグリコサミノグリカンを生成するために改変されおよび／または精製され得る。
【００４０】
いくつかの態様では、本明細書に開示される方法のグリコサミノグリカンは特性を有する。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンは負に帯電している。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンはデキストラン硫酸である。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンは約６〜８ｋＤａのサイズである。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンは、約６〜８ｋＤａのサイズのデキストラン硫酸である。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンはヘパリン硫酸である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、濃縮されたタンパク質サンプル（例えば、タンパク含有量の高いサンプル）は、遺伝子組換え型タンパク発現調製物から得られるタンパク質サンプルを含むが、これに限定されない。
【００４２】
クロマトグラフィ
いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンは、６．８またはそれ以下のｐＨを有する移動相とともにサイズ排除クロマトグラフィを用いることにより、サンプルにおける他の成分から分離される。サイズ排除クロマトグラフィは、サンプルにおける成分のサイズおよび分子量に基づく分離技術である。サイズ排除カラムは、一般的に、サンプル成分が進む「迷路」をもたらす、特定の孔径のシリカ粒子を含む。より小さな粒子がカラムのポアに嵌って遅れ、一方、ポアに嵌らないより大きな粒子は最初にカラムから溶出する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、サンプルをサイズ排除クロマトグラフィに供する構成を含む。いくつかの実施形態では、サンプルをサイズ排除クロマトグラフィに供することは、サイズ排除クロマトグラフィカラム上にサンプルを適用することを含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィカラム上にサンプルを適用することは、サンプルとサイズ排除クロマトグラフィカラムを接触させることを含む。
【００４４】
サンプルは、一定分量または複数のバッチとしてカラム上に適用されることとしてもよいことがさらに理解される。いくつかの実施形態では、サンプルは溶液である。いくつかの実施形態では、サンプルは、移動相の適用後に溶解され得る固体またはエマルジョンである。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィカラムは、サンプルを適用する前に（例えば、バッファにより）洗浄される。また、サイズ排除クロマトグラフィカラムは、サンプルの適用後に洗浄されることとしてもよい。一般的に、サイズ排除クロマトグラフィカラム上に適用されるサンプルは、カラムに移動相を適用することにより、カラムを通って流れるであろう。
【００４５】
本発明の態様はこの観点において限定されないため、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）は、異なるサイズのカラムを含む、マイクロ流体チャネルを含む、あらゆる適切なフォーマット、および他のフォーマットにおいて行われ得ることが理解されるべきである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィは、パーフュージョンクロマトグラフィを用いて行われる。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィは、陰イオン交換クロマトグラフィを用いて行われる。
【００４７】
本明細書に記載される方法に従って、複数のクロマトグラフィ工程が行われ得ることが理解されるべきである。よって、例えば、サンプルが、第１のサイズ排除クロマトグラフィ工程およびその後の第２のサイズ排除クロマトグラフィ工程に供され得、または、例えば、サンプルが、パーフュージョンクロマトグラフィ工程の後にサイズ排除クロマトグラフィ工程に供され得る。クロマトグラフィの選択は、例えば、複数の精製工程を受ける可能性が高い複合的なサンプルによる、サンプルの性質によることとしてもよい。
【００４８】
本発明の態様はこの観点において限定されないため、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）は、あらゆる適切な温度および圧力条件下で行われ得ることが理解されるべきである。例えば、１つまたはそれ以上のクロマトグラフィ工程は、４℃、室温、またはより高い温度（例えば、４０℃）で行われることとしてもよい。一般的に、クロマトグラフィ中に使用される圧力は、カラム、カラム材料、および操作条件によるであろう。例示的な圧力は、５００〜２０００ｐｓｉの間、例えば、９００〜１０００ｐｓｉである。
【００４９】
本明細書に開示されるサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）は、特定の計装設備に限定されるものではなく、あらゆる市販の入手可能なＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）機器で行われ得ることが理解されるべきである。ＨＰＬＣの計装設備は、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、およびＳｈｉｍａｄｚｕ（Ｎａｋａｇｙｏ，Ｊａｐａｎ）を含む種々のベンダーから入手可能である。
【００５０】
異なるクロマトグラフィの材料が使用されることとしてもよいことが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、シリカ系クロマトグラフィの充填材料が使用されることとしてもよい。いくつかの実施形態では、充填材料は、５０から１０００オングストロームの間の孔径を有する。いくつかの実施形態では、充填材料は、７５から５００オングストロームの間の孔径を有する。いくつかの実施形態では、充填材料は、１００から２００オングストロームの間の孔径を有する。いくつかの実施形態では、充填材料は、約１２５オングストロームの孔径を有する。しかしながら、より小さいまたはより大きい孔径が使用されることとしてもよい。いくつかの実施形態では、充填材料は、２〜３０ミクロンの間の粒子径を有する。いくつかの実施形態では、充填材料は、約５、８、１０、１３、または１７ミクロンの粒子径を有する。いくつかの実施形態では、充填材料は、５ミクロンまたはそれ以下の粒子径を有する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ＴＳＫゲルＧ２０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡから入手可能）に関連するシリカ系ゲルが使用される。しかしながら、本発明の態様はこの観点において限定されないため、他のシリカ系ゲル（例えば、Ｚｅｎｉｘ  ＳＥＣ‐１５０  Ｓｅｐａｘ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥより）も使用され得ることが理解されるべきである。
【００５２】
いくつかの実施形態では、理論により限定されることを望むことなく、クロマトグラフィのために使用される条件は、グリコサミノグリカン（例えば、デキストラン硫酸）およびクロマトグラフィ材料間の二次相互作用を促進する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィ材料はヒドロキシル基を保有する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィ材料は、ヒドロキシル基を保有するシリカ系ゲルである。いくつかの実施形態では、これらの相互作用は、クロマトグラフィ材料を通るグリコサミノグリカンの移動を遅らせることにより、サンプルにおけるタンパクおよび他の成分からグリコサミノグリカンを分離することを補助する。いくつかの実施形態では、これらの相互作用は、グリコサミノグリカン分画がカラムを通って移動するため、その濃縮をもたらし、これにより、より狭い溶出ピーク／プロファイルを生成する。
【００５３】
検出器
本明細書において提供される方法の一態様は、検出装置が、サンプルにおける関心成分の存在を測定するために使用される。いくつかの実施形態では、関心成分は、グリコサミノグリカン（例えば、デキストラン硫酸）である。いくつかの実施形態では、関心成分は、タンパク（例えば、遺伝子組換え型産生タンパク）である。いくつかの実施形態では、検出装置は、サイズ排除カラムを通って流れた後の移動相をモニターする。
【００５４】
いくつかの実施形態では、検出装置は分光光度計である。いくつかの実施形態では、検出装置はＵＶ検出器であり、例えば、あらかじめ設定されたＵＶ波長またはあらかじめ設定されたＵＶ波長の範囲でサンプル吸収を検出するために設定する。ＵＶ検出器は、異なる成分のＵＶ吸収スペクトルは十分に区別可能ではなく、溶出プロファイルは十分に分離するものではなく、または、異なる溶出ピークを識別できる固有のものではないので、典型的には、サイズ排除クロマトグラフィのうえでサンプル成分の存在またはレベルを測定するために使用されないことが理解されるべきである。しかしながら、本明細書に記載の方法は、サイズ排除クロマトグラフィにおけるグリコサミノグリカンの移動に予期しない効果を有し、使用される分光光度計、例えば、ＵＶ検出器が、サンプルにおけるグリコサミノグリカン存在および／または量を評価することを可能にし、他のサンプル成分（例えば、タンパク、塩等）から十分にそれらを区別する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、タンパクおよびグリコサミノグリカン分画間の十分な分離を可能にし、（単一の波長で設定されるＵＶ検出器のような）検出器がタンパクおよびグリコサミノグリカンの吸収波長の両方を検出することを可能にする、本明細書に開示される方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＵＶ検出器のような非特異的な検出技術を用いて検出されるための、低いレベルのグリコサミノグリカンについてのグリコサミノグリカン分画の十分なフォーカシング（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）を可能にする。しかしながら、グリコサミノグリカンを検出し得るあらゆる検出器が使用され得ることが理解されるべきである。本明細書に記載される方法により使用され得る検出器は、コロナ荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）、示差屈折率（ＲＩ）検出器、凝縮核形成光散乱検出器（ＣＮＬＳＤ）、およびナノクオンティティ分析物検出器（Ｎａｎｏ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（ＮＱＡＤ）を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、分析用のサンプルは、より大きな調製物（例えば、製造調製物）から取り除かれる。分析は、分離クロマトグラフィおよび／または検出機器を用いて行われ得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、製造装置は、連続的または間欠的なサンプル分析のために構成される適切な検出器を有するクロマトグラフィ成分を含むように適用されることとしてもよい。
【００５７】
移動相
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、サイズ排除クロマトグラフィカラムに移動相を適用する行為を含む。一般的に、サイズ排除クロマトグラフィカラム上に適用されるサンプルは、カラムに移動相を適用することによりカラムを通って流れるであろう。カラムに適用される移動相は、サンプルがカラムを通って流れることを可能にする、例えば、塩、バッファ濃度、ｐＨのような特性を有するであろう。
【００５８】
いくつかの実施形態では、サンプルは、６．８またはそれ以下のｐＨでサイズ排除クロマトグラフィに供される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約６．０もしくはそれ以下、約５．０もしくはそれ以下、約４．０もしくはそれ以下、約３．０もしくはそれ以下、または約２．５もしくはそれ以下である。いくつかの実施形態では、サンプルはサイズ排除カラムに適用され、移動相はカラムに適用され、移動相は６．８またはそれ以下のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相のｐＨは、約６．０もしくはそれ以下、約５．０もしくはそれ以下、約４．０もしくはそれ以下、約３．０もしくはそれ以下、または約２．５もしくはそれ以下である。いくつかの実施形態では、移動相は、２から６．８、３から６．８、４から６．８、５から６．８、６から６．８、２から６、３から６、４から６、５から６、２から５、３から５、４から５、または３から４のｐＨの範囲を有する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィ材料（例えば、カラムまたは他のフォーマット）は、６．８またはそれ以下のｐＨを有する移動相を用いて調製される。いくつかの実施形態では、サンプルは、６．８またはそれ以下のｐＨを有する移動相を用いてロードされおよび／または溶出される。いくつかの実施形態では、移動相のｐＨは、６．８を下回る。いくつかの実施形態では、移動相のｐＨは、６．０またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、移動相のｐＨは、５．０またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、移動相のｐＨは、４．０またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、移動相のｐＨは、３．０またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、移動相のｐＨは、２．５またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、移動相は、所望のｐＨのサンプルを安定化するバッファを含む。異なるｐＨバッファは当該技術分野で知られており、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、およびリン酸緩衝液を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、バッファは、リン酸一水素カリウムおよびリン酸二水素カリウム緩衝液である。いくつかの実施形態では、バッファは、リン酸一水素ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウム緩衝液である。いくつかの実施形態では、バッファの濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの間、２ｍＭから４００ｍＭの間、または１０から３００ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、バッファは、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、移動相は、１つまたはそれ以上の塩をさらに含む。特定のメカニズムに限定されないが、塩はサンプルの１つまたはそれ以上の成分の可溶化を補助し、カラムを通るサンプルの均質流を提供することが考えられる。いくつかの実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、塩は塩化カリウムである。いくつかの実施形態では、塩濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの間、２ｍＭから４００ｍＭの間、または１０から３００ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、塩は、２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、移動相は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムに加えて、１つまたはそれ以上の塩をさらに含む。移動相で使用され得る他の塩の非限定的な例は（ナトリウムおよび／またはカリウム塩に加えて、またはこれらに代えて）、アンモニウム塩およびカルシウム塩を含む。いくつかの実施形態では、これらの１つまたはそれ以上の他の塩の濃度は、１０ｍＭから２５０ｍＭの間、例えば、２５ｍＭから１００ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、塩濃度は５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、塩濃度は１０ｍＭより低い。いくつかの実施形態では、塩濃度は２５０ｍＭより高い。いくつかの実施形態では、塩濃度は５０ｍＭである。
【００６２】
いくつかの実施形態では、サンプルは、クロマトグラフィに供される前に（例えば、サイズ排除カラムにロードされる前に）、（例えば、透析または適切な技術により）移動相で平衡化される。しかしながら、サンプルは、クロマトグラフィ前に移動相で平衡化されることなく直接処理されることとしてもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、カラムは、サンプルを適用する前に調整される。いくつかの実施形態では、カラムは、サンプルの適用の前にタンパク溶液で調整される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、カラムを通って流れた（例えば、溶出された）移動相は、サンプルの成分を含む。いくつかの実施形態では、カラムを通って流れた移動相が収集される。いくつかの実施形態では、カラムを通って流れた、サンプルの成分を含む移動相が収集される。いくつかの実施形態では、カラムを通って流れた移動相のサブセットが収集される（例えば、溶出液の分画）。例えば、カラムの端部で検出器が、関心成分（例えば、因子ＩＸのようなタンパク）が移動相に存在するときを示すこととしてもよい。いくつかの実施形態では、関心成分を含む移動相が収集される。いくつかの実施形態では、収集された関心成分は、関心成分（例えば、関心タンパクまたはグリコサミノグリカン）の性質を測定するためにさらに分析される。
【００６５】
一態様では、本開示は、サンプルにおける１つまたはそれ以上のグリコサミノグリカンから、（１つまたはそれ以上の）タンパクを分離するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、タンパクは、タンパクを含み（そして、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｏａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）を含まない、または少量のみのグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｏａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）を含む）、カラムを通って流れた移動相のサブセットを収集することにより分離される。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンから分離されたタンパクは、サイズ排除カラムクロマトグラフィ前のタンパク質サンプルに存在するグリコサミノグリカンのレベルの１０％以下を含む（例えば、クロマトグラフィ後に１ｍｇのタンパクを有するサンプルは０．０１ｍｇのグリコサミノグリカンを含むが、クロマトグラフィ前は、１ｍｇのタンパクを有するサンプルは０．１ｍｇのグリコサミノグリカンを含んでいた。）。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンから分離されたタンパクは、サイズ排除カラムクロマトグラフィ前のタンパク質サンプルで存在するグリコサミノグリカンのレベルの１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下、０．０５％以下、０．００１％以下、０．０００１％以下、またはそれ以下を含む。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンから分離されたタンパクは、サイズ排除カラムクロマトグラフィ前のタンパク質サンプルで存在するグリコサミノグリカンのレベルの２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、９０％以下、１００％以下を含む。
【００６６】
アプリケーション
本明細書に記載される方法および構成は、サンプルを分析的に評価するため、およびサンプルにおける１つまたはそれ以上のグリコサミノグリカンの存在および／または量を測定するために使用されることとしてもよいことが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、分析は、サンプルにおけるグリコサミノグリカン（例えば、デキストラン硫酸）の量が、所定の閾値を上回るまたは下回るかどうかを測定するために較正されることとしてもよい。例えば、閾値は、グリコサミノグリカンの基準量を用いて設定されることとしてもよい（例えば、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、またはそれ以下）。閾値は、タンパク調製物が拒絶されおよび／またはさらに処理されるべき上記の量を表すこととしてもよい。
【００６７】
本明細書に記載される分析技術は、例えば、市販のタンパク調製物が純度の許容レベル（例えば、あらかじめ設定されたレベルを下回るグリコサミノグリカンのレベル）を満たすかどうかを測定するための、品質管理工程のように、それらを評価するために使用されることとしてもよい。しかしながら、本明細書に記載される分析技術は、また、適切なレベルのグリコサミノグリカンが存在するかどうかを測定するための、１つまたはそれ以上の製造および／または精製処理を評価するために使用されることとしてもよい。いくつかの実施形態では、生産工程は、本明細書に記載される方法を用いて、連続的にモニタリングされることとしてもよい。
【００６８】
本発明は、さらなる限定として決して解釈されるべきではない、以下の実施例によってさらに説明される。本出願を通して挙げられる全ての参照（参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の全体の内容が、特に上記に参照された教示について、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００６９】
実施例
実施例１：タンパク質サンプルからのデキストランの分離
因子ＩＸ‐Ｆｃの製造のために部分的に精製されたタンパク製造サンプルは、デキストラン硫酸（６〜８ｋＤａ）が添加され、１μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌのデキストラン硫酸の範囲のサンプルをもたらす。
【００７０】
一定分量のサンプルが、ＴＳＫゲルＧ２０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ）に適用され、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ２．５の移動相で溶出される。溶出液は、ＵＶ検出器（２１４ｎｍ）でモニタリングされる。デキストラン硫酸サンプルは、タンパクから分離され、タンパクよりも後に溶出する。
【００７１】
試験サンプルにおけるデキストラン硫酸の定量は、デキストラン硫酸標準物質からなる外部標準物質の検量線を用いて行われる。図１は、デキストラン硫酸標準物質を添加した因子ＩＸ‐Ｆｃサンプル（ＬＰ５‐１０‐ＦＩＸ‐００１）についての直線プロットを示す。
【００７２】
２μｇ／ｍＬまで低い、部分的に精製されたタンパク製造サンプル（因子ＩＸ‐Ｆｃ）におけるデキストラン硫酸の濃度が測定され得る。図２は、デキストラン硫酸標準物質についての検量線、並びに、それぞれ因子ＩＸ‐Ｆｃサンプル単体、因子ＩＸ‐Ｆｃ製剤バッファ単体、および２μｇ／ｍＬのデキストラン硫酸（６〜８ｋＤａ）を添加した因子ＩＸ‐Ｆｃサンプルを含む、いくつかの拡大クロマトグラムを示す。
【００７３】
均等物
上記明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするために十分であると考えられる。実施例は本発明の一態様の１つの例示として意図され、他の機能的に均等な実施形態が本発明の範囲内のものとなるため、本発明は提供された実施例により範囲を限定されるものではない。本明細書に示されおよび記載されるものに加えて、本発明の種々の改変は、上記明細書から、当業者にとって明らかとなり、添付の請求の範囲の範囲内に属するであろう。本発明の利点および目的は、本発明の各実施形態により包含される必要はない。
【００７４】
本出願を通して挙げられる全ての参照文献、特許、および公開された特許出願の内容は、特に、本明細書で参照される使用または構成要素について、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
0006317328.tif 000002
【図２】
0006317328.tif 000003