(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢単核細胞を肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）で処理して前記末梢単核細胞の免疫調節白血球への分化を誘導して作出された細胞集団を含む免疫調節細胞集団であって、
前記細胞集団がＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋骨髄由来免疫抑制細胞とＣＤ１４＋ＣＤ１６−ＩＬ１０＋単球を含む、
免疫調節細胞集団。 
【請求項２】
前記末梢単核細胞が哺乳動物に由来する、請求項１に記載の免疫調節細胞集団。
【請求項３】
前記肝細胞増殖因子が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に由来し、前記ＨＧＦの濃度は、培地１ミリリットル（ｍｌ）当たり３〜４０ｎｇである、請求項１に記載の免疫調節細胞集団。
【請求項４】
前記免疫調節白血球が活性化された同種異系リンパ球の増殖を抑制する、請求項１に記載の免疫調節細胞集団。
【請求項５】
アルギナーゼ、一酸化窒素合成酵素、抗炎症性サイトカインおよびＩＬ−１０を産生し、制御性Ｔ細胞を誘導し、免疫応答をＴｈ２優位な応答に調節する、請求項１に記載の免疫調節細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の機能を有する細胞に関する。特に本発明は、免疫調節細胞集団に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、体内に通常存在する物質および組織に対する身体の不適切な免疫応答によって引き起こされる。言い換えれば、免疫系が身体のある部分を病原体と間違えて自己の細胞を攻撃する。望ましくない免疫応答により引き起こされるもう一つの問題が移植拒絶である。移植は、ある部位から別の部位に細胞、組織、または臓器を移行する行為である。移植は慣例の医学的処置になっているとはいえ、免疫系はなお最も手強い障壁である。
【０００３】
免疫抑制薬は、免疫応答を低下させる自己免疫疾患および移植拒絶の治療／予防に一般に適用される。免疫抑制薬は、免疫系全体を抑制する、および患者を容易に感染させるなどの様々な副作用を伴う。また、前記処置には生物学的薬剤も適用され、抗サイトカイン療法、Ｔ細胞除去療法、Ｂ細胞除去療法および免疫寛容誘導療法などが含まれる。近年、養子Ｔ細胞または幹細胞の提供を含む細胞療法が自己免疫疾患および移植拒絶の治療／予防の新規な選択肢となっているが、なお開発中である。
【０００４】
ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、複数の間葉系統への分化能を有する多系統前駆細胞の集団である。ＭＳＣは、骨髄（ＢＭ）および他のいくつかの臓器、例えば、脂肪組織、胎盤、羊水、および胎児組織、例えば、胎児の肺および血液から単離されている。この単離の容易さは、中胚葉外細胞種への分化の報告とあいまって、これらの出生後前駆細胞を様々な疾患に対する細胞療法の一般的な選択肢とした。
【０００５】
多系統分化能に加え、ＢＭおよび胎児ＭＳＣは、免疫調節作用を保有することが示された。ＭＳＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球由来樹状細胞（ＤＣ）およびナチュラルキラーリンパ球（ＮＫ）の増殖能およびエフェクター機能の調節に関連付けられている。免疫細胞に対するヒトＭＳＣの作用は主として細胞接触性のプロセスを介したものであるが、厳密な機構はまだ分かっていない。
【０００６】
免疫調節免疫細胞の重要性を示す研究が増えてきている。現在、制御性Ｔリンパ球、ＩＩ型マクロファージ、および未熟ＤＣを含む数種の白血球亜集団が免疫抑制作用を示すことが知られている。一方、免疫調節単球に関するデータは少ない。
【０００７】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、周知の分裂促進因子であり、発生上重要な分子である。また、分散因子としても知られ、ＨＧＦは強力な増殖シグナルを与えるだけでなく、細胞に遊走を促すことから、ＨＧＦは癌の増殖および転移に関してよく研究されている。その非分裂促進作用についてはほとんど知られていない。ＨＧＦは間葉細胞により分泌され、主として上皮細胞および内皮細胞を標的とし、これらの細胞に作用するが、造血系前駆細胞にも作用する。ＨＧＦは、胚の臓器発達、生体の臓器再生および創傷治癒に主要な役割を持つことが示されている。混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖の抑制のメディエーターとしてのＨＧＦおよびＴＧＦ−βの役割は、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦに対する中和抗体を提供し、その後にＴ細胞の増殖応答が回復されることによって証明されるとの報告がある（非特許文献１）。しかしながら、これらの因子は分裂促進因子によって刺激されたＴ細胞に対するＭＳＣによる抑制作用とは無関係であるという異なる結論も報告されており、これらの刺激に依存する異なる機構が示唆されている（非特許文献２；非特許文献３）。従って、ＨＧＦと免疫系との間の機能および相互作用はまだ明らかでない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａら，  Ｂｌｏｏｄ  ２００２；９９：３８３８−３８４３
【非特許文献２】Ｌｅ  Ｂｌａｎｃら，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；６０：３０７−３１５
【非特許文献３】Ｒａｓｍｕｓｓｏｎ  Ｉら，  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００５；３０５：３３−４１
【発明の概要】
【０００９】
本出願は、免疫調節細胞を作出するための方法であって、末梢単核細胞を肝細胞増殖因子で処理して前記末梢単核細胞の免疫調節白血球への分化を誘導することを含む方法を記載する。
【００１０】
本出願はまた、それによって作出された免疫調節細胞を記載する。
【００１１】
本出願はさらに、異常な免疫応答により引き起こされる疾患を治療するための方法であって、前記疾患に罹患している患者に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を投与すること、前記患者の末梢単核細胞を免疫調節白血球に分化させること、および異常な免疫応答を調節することを含む方法を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）および胎盤由来ＭＳＣ（Ｐ−ＭＳＣ）の特性評価を示す。図１Ａ：表面マーカープロファイル、および図１Ｂ：ＢＭ−ＭＳＣおよびＰ−ＭＳＣの３系統分化表現型。Ｏｓｔｅｏ、骨形成系統；ｃｈｏｎｄｒｏ、軟骨形成系統；ａｄｉｐｏ、脂肪生成系統；スケールバー、２００ｍｍ。
【図２】図２は、ＭＳＣが、同種異系末梢血白血球（ＰＢＬ）において機能的ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の数を増すことを示す。図２Ａ：ＭＳＣによるＰＢＬ由来ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋細胞の増幅。同種異系ＰＢＬ（ドナー３０人）の単独培養（上のパネル）またはＭＳＣとの共培養（下のパネル；ドナー３人のＢＭ−ＭＳＣ、およびドナー３人のＰ−ＭＳＣ）；図２Ｂ：ＭＳＣとの共培養後のＰＢＬ  ＣＤ１１ｂ＋（上のグラフ）またはＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋細胞（下のグラフ）のパーセンテージの定量；＊、ｐ＜０．０５（ＰＢＬ単独と比較）；図２Ｃ：ＭＳＣにより誘導されたＭＤＳＣの抑制機能。同種異系ＰＢＬ（Ｔ、標的細胞）を細胞分裂の評価のためにカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色し、無添加またはＭＳＣにより増幅されたＭＤＳＣ（Ｅ、エフェクター細胞）の種々のＥ：Ｔ比での添加を伴って、抗ＣＤ３／２８（ａ−ＣＤ３／２８）で刺激した。ＰＢＬの細胞分裂を評価するためにフローサイトメトリー解析を行った。チャート（右）は実験結果の定量的概要である。＊、ｐ＜０．０５（傾向分析）。図２Ｄ：誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現、および図２Ｅ：ＭＳＣにより増幅されたＭＤＳＣによるアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）。負の選択を受けたＰＢＬ由来ＣＤ１４−細胞を単独で（上のパネル）またはＭＳＣとともに（下のパネル）培養し、さらにＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、およびｉＮＯＳ（図２Ｄ）またはＡＲＧ１（図２Ｅ）で染色した。図２Ｆ：ＭＳＣにより増幅されたＭＤＳＣによるＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ型の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増幅。ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＭＳＣにより増幅されたＭＤＳＣを選別し（ＦＡＣＳ）、抗ＣＤ３／２８により刺激された同種異系ＰＢＬと種々の比率で共培養し、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ型のＴ細胞の誘導を評価した。チャート（右）は実験結果の定量的概要である。＊、ｐ＜０．０５（ＰＢＬ／ａ−ＣＤ３／２８との比較）。
【図３】図３は、ＭＳＣによるＭＤＳＣの増幅は分泌される肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）により媒介されることを示す。図３Ａ：ＭＳＣによるＭＤＳＣの増幅は、分泌される因子により媒介される。同種異系ＰＢＬを、ＭＳＣとともに、直接接触させて（ＭＳＣ）またはトランスウェルで分離して（ＴＷ）共培養し、ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＭＤＳＣの増幅を評価した；＊、ｐ＜０．０５（ＰＢＬ単独との比較）；ｎ．ｓ．、有意でない。図３Ｂ：定量的サイトカインアレイにより評価されるＭＳＣの高分泌因子；ＩＬ、インターロイキン；ＬＡＰ、潜在型関連ペプチド；ＳＤＦ、間質細胞由来因子。図３Ｃ：組換えＨＧＦをＰＢＬに外から添加すると、ＭＤＳＣの数が増える（＊、ｐ＜０．０５（傾向分析））。図３Ｄ：ＨＧＦにより増幅されたＭＤＳＣにおけるｉＮＯＳ発現（上のパネル）およびＡＲＧ１発現（下のパネル）の評価。図３Ｅ：細胞分裂に関するＣＦＳＥ染色のフローサイトメトリー解析により評価される、ＨＧＦにより増幅されたＭＤＳＣによる、抗ＣＤ３／２８刺激性ＰＢＬ増殖の抑制。図３Ｆ：ＨＧＦ特異的低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いたＭＳＣにおけるＨＧＦ分泌のノックダウンは、ＭＤＳＣの増幅を排除する。同種異系ＰＢＬを非標的低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  Ｃｔｒｌ）またはＨＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＨＧＦ）のいずれかをトランスフェクトしたＭＳＣ（ドナー３人）と共培養し、ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋細胞を評価した；＊、ｐ＜０．０５（ＭＳＣ（左のグラフ）またはＰＢＬ単独（右のグラフ）との比較）。
【図４】図４は、癌細胞により分泌されるＨＧＦおよびマウスにおけるＨＧＦのｉｎ  ｖｉｖｏ投与がＭＤＳＣの数を増し得ることを示す。図４Ａ：ＭＳＣ、ＭＧ６３（骨肉腫細胞株）、胚性幹細胞由来間葉前駆細胞（ＥＭＰ）、およびＪＥＧ−３（絨毛癌細胞株）によるＨＧＦ分泌のレベル、および図４Ｂ：４つの細胞種のＰＢＬとの共培養後のＭＤＳＣの増幅倍率；＊、ｐ＜０．０５（傾向分析）。図４Ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対する組換えＨＧＦ（１００ｎｇ）の尾静脈注射、ならびに注射１日および３日後の末梢血、脾臓、および骨髄におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の評価、＊、ｐ＜０．０５（ＰＢＳとの比較）。
【図５】図５は、ＨＧＦによるＭＤＳＣの増幅が、その受容体であるｃ−ｍｅｔ、およびＳＴＡＴ３のリン酸化の増大により媒介されることを示す。図５Ａ：フローサイトメトリー解析により評価されるＭＤＳＣにおけるｃ−ｍｅｔの発現（ドナー１２人）；左のチャート、平均蛍光強度  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）の定量；＊、ｐ＜０．０５（アイソタイプ対照（Ｃｔｒｌ）との比較）。図５Ｂ：ＨＧＦにより媒介されるＭＤＳＣの増幅におけるｃ−ｍｅｔの関与。ＰＢＬをアイソタイプ対照抗体（ＩｓｏＡｂ）またはｃ−ｍｅｔ遮断抗体（抗ｃ−Ｍｅｔ）で遮断し、組換えＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋細胞の増幅を評価した。図５Ｃ：ＨＧＦにより媒介されるＭＤＳＣの増幅におけるＳＴＡＴ３の関与。組換えＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）をＣＤ１４−白血球に添加し、フローサイトメトリーにより評価されるようにＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、およびリン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）に関して染色した（右上の値、ＭＦＩ）。チャート（右）は、ＭＦＩの定量的概要である。＊、ｐ＜０．０５（傾向分析）。図５Ｄ：組換えＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を、無添加およびｃｐｄ１８８（ＳＴＡＴ３阻害剤）の種々の用量での添加を伴って、ＰＢＬに加え、フローサイトメトリーにより評価されるようにＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、およびｐＳＴＡＴ３に関して染色した。チャート（右）は、ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ｐＳＴＡＴ３＋細胞のパーセンテージの定量的概要である。ａ、ｐ＜０．０５（ＰＢＬ単独との比較）；ｂ、ｐ＜０．０５（傾向分析）。
【図６】図６は、ＨＧＦにより媒介されるＭＤＳＣの増幅の機構を示す。
【図７】図７は、胎盤由来ＭＳＣにより分泌された肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が抗ＣＤ３／２８により活性化された同種異系末梢血リンパ球（ＰＢＬ）増殖の抑制に関与することを示す。図７Ａ：ＰＢＬの単独培養（非刺激；黒いバー）、ＭＳＣ細胞馴化培地（ＣＭ）の存在下および不在下でのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；白いバー）もしくは抗ＣＤ３／２８活性化ビーズ（灰色のバー）、または図７Ｄ：組換えヒトＨＧＦ（ｒｈＨＧＦ）による刺激を行った；ｎ＝１５。刺激したＰＢＬの増殖を１００％とし、これは、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色に関するフローサイトメトリー解析により分析した場合、＞９０％のＰＢＬが細胞分裂下にあると定義される。ａ、ｐ＜０．０１；ｂ、ｐ＜０．０５（対照との比較）。ｃ、ｐ＜０．０５、（図７ＡのＭＳＣ−ＣＭを伴うＰＨＡ活性化ＰＢＬとの比較）。ａ、ｐ＜０．０５；ｂ、ｐ＜０．０５（図７ＤのＨＧＦを伴うＰＨＡ活性化ＰＢＬとの比較）。図７Ｂ：培養３日後に定量的サイトカインアレイにより検出された、ＭＳＣ（黒いバー）、ＰＢＬ（白いバー）、ＭＳＣと共培養されたＰＢＬ（灰色のバー）、抗ＣＤ３／２８活性化ＰＢＬ（斜線のバー）、およびＭＳＣと共培養された抗ＣＤ３／２８活性化ＰＢＬ（ドットのバー）によるサイトカイン産生；ｎ＝１。図７Ｃ：定量的サイトカインアレイにより測定されたＭＳＣによるサイトカインおよび間質細胞関連因子の分泌。図７Ｅ：酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定された、ＭＳＣ、ＨＧＦのＲＮＡサイレンシング（ＨＧＦ−ｓｉＲＮＡ）後のＭＳＣ、および非標的ｓｉＲＮＡ後のＭＳＣの、ＣＭにおけるＨＧＦ産生；ｎ＝１０。図７Ｆ：７２時間後にＣＦＳＥに関するフローサイトメトリー解析により評価された、単独培養またはｓｉＲＮＡトランスフェクトＭＳＣとの共培養を行った抗ＣＤ３／２８活性化ＰＢＬの増殖；ｎ＝９。ａ、ｐ＜０．０５（ＭＳＣと共培養した抗ＣＤ３／２８活性化ＰＢＬとの比較）。特に断りのない限り、データは３回の独立した実験に典型的なものであり、平均値±ＳＥＭとして示す。†、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．００１（バーによりそうではないことが示されていない限り対照との比較）。
【図８】図８は、Ｔリンパ球機能に対するＨＧＦの免疫調節作用にはＣＤ１４＋単球が必要とされることを示す。図８Ａおよび８Ｂ：Ｔリンパ球細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）、単球細胞株（Ｕ９３７）、およびＰＢＬから精製された初代ＣＤ１４＋細胞（Ｂ；ｎ＝７）におけるｃ−Ｍｅｔ発現；ＭＦＩ、蛍光強度中央値。図８Ｃ：ＰＢＬ（白いバー）またはＣＤ１４＋細胞除去ＰＢＬ（黒いバー）の単独培養または抗ＣＤ３／２８ビーズによる刺激をｒｈＨＧＦの存在下または不在下で行った；ｎ＝１５。ｒｈＨＧＦ処理ＰＢＬにおける増殖の程度を抗ＣＤ３／２８活性化ＰＢＬまたはＣＤ１４＋除去ＰＢＬに対するパーセンテージとして表す。ａ、ｐ＜０．０１；ｂ、ｐ＜０．０５（ＨＧＦの存在下の抗ＣＤ３／２８活性化ＰＢＬとの比較）。図８Ｄ：ｒｈＨＧＦ処理ＣＤ１４＋細胞の存在下または不在下で単独培養または抗ＣＤ３／２８による刺激を行ったＣＤ４＋Ｔ細胞の、共培養７２時間後の増殖（ＣＤ１４＋とＣＤ４＋Ｔ細胞の比は、１／１０、１／５、１／２および１／１）。刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を１００％とし、これは、ＣＦＳＥ染色に関するフローサイトメトリー解析により分析した場合、＞９０％のＣＤ４＋Ｔ細胞が細胞分裂下にあると定義される。ａ、ｐ＜０．０５（傾向分析）。図８Ｅ：ｒｈＨＧＦ処理ＣＤ１４＋細胞と共培養した場合または共培養しなかった場合の抗ＣＤ３／２８活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の細胞内産生。Ｔ細胞総数を１００％とする。特に断りのない限り、データは３回の独立した実験に典型的なものであり、平均値±ＳＥＭとして示す。＃、ｐ＜０．０５；＊、ｐ＜０．００１（バーによりそうではないことが示されていない限り対照との比較）。
【図９】図９Ａは、７２時間後にフローサイトメトリー解析により検出された、ｒｈＨＧＦで処理した（灰色および斜線のバー）または無処理の（黒いバー）ＣＤ１４＋細胞における樹状細胞（ＤＣ）関連およびマクロファージ関連表面マーカー発現を示す。アイソタイプ対照の発現（ＭＦＩ、蛍光強度中央値）（白いバー）を１とする。データは３回の独立した実験に典型的なものであり、平均値±ＳＥＭとして示す。図９Ｂは、フローサイトメトリー解析により検出された、ｒｈＨＧＦで処理した、または無処理のＰＢＬにおけるＣＤ１４およびＣＤ１６発現を示す；ｎ＝８。
【図１０】図１０は、ＨＧＦが単球におけるＩＬ−１０産生を高めることを示す。図１０Ａ：培養３日後に定量的サイトカインアレイにより検出された、ＣＤ１４＋細胞単独（白いバー）またはＭＳＣとの共培養（黒いバー）によるＴｈ１／２サイトカインプロファイル（ｎ＝１）。図１０Ｂ：ＥＬＩＳＡにより測定された、ｒｈＨＧＦ、ＭＳＣ−またはｓｉＨＧＦ−ＭＳＣ−ＣＭで処理したまたは無処理のＣＤ１４＋細胞によるＩＬ−１０産生。図１０Ｃ：ｒｍＨＧＦを注射したまたはしなかったマウス由来のＢＭおよび脾細胞におけるＩＬ−１０産生単球（ＩＬ１０＋ＣＤ１１ｂ＋細胞）集団。細胞総数を１００％とする。データは３回の独立した実験に典型的なものであり、平均値±ＳＥＭとして示す。＃、ｐ＜０．０５（バーによりそうではないことが示されていない限り対照との比較）。
【図１１】図１１は、ＣＤ１４＋単球による、ＨＧＦにより誘導されるＩＬ−１０の産生はＥＲＫ１／２経路により媒介されることを示す。図１１Ａ：ＲＴ−ＰＣＲにより検出された、示された時間ｒｈＨＧＦで処理したまたは無処理のＵ９３７細胞におけるＩＬ−１０発現；内部対照β−アクチン。図１１Ｂ：ウエスタンブロット法により検出された、ｒｈＨＧＦで処理したまたは無処理のＵ９３７細胞におけるリン酸化（ｐ−）ＥＲＫ１／２、ｐ−ＳＴＡＴ３、ｐ−ｐ３８、およびｐ−ＡＫＴの発現；ＥＲＫ１／２、ＳＴＡＴ３、ｐ３８、ＡＫＴ、およびα−チューブリンを内部対照として用いた。図１１Ｃ：ＲＴ−ＰＣＲにより検出された、ｒｈＨＧＦ処理有りまたは無しの場合の、ＥＲＫ１／２阻害剤Ｕ０１２６、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０、またはＳＴＡＴ３阻害剤ｃｐｄ１８８で前処理したＵ９３７細胞によるＩＬ−１０の遺伝子発現。図１１Ｄ：ｒｈＨＧＦ無し（白いバー）または有り（黒いバー）の場合の、阻害剤Ｕ０１２６またはＳＢ２０３５８０で前処理したＵ９３７細胞によるＩＬ−１０のタンパク質発現；ｎ＝３；データは平均値±ＳＥＭとして示す。†、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．００１（対照との比較）。
【図１２】図１２は、ＣＤ１４＋単球におけるＨＧＦにより誘導されるＩＬ−１０産生の機構を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本出願は、免疫調節細胞を作出するための方法であって、末梢単核細胞を肝細胞増殖因子で処理して前記末梢単核細胞の免疫調節白血球への分化を誘導することを含む方法を提供する。
【００１４】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）としては、組換えタンパク質または天然タンパク質、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはその他の細胞株により産生されるタンパク質であり得る。一実施形態では、ＨＧＦはＭＳＣに由来する。ＨＧＦは、ＭＳＣにより産生される分泌タンパク質である。一実施形態では、ＭＳＣは、哺乳動物、例えば、限定されるものではないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコなどから得られる。
【００１５】
本出願の方法において、ＨＧＦ処理は、ＨＧＦを提供して、ならびにＭＳＣを提供して、末梢単核細胞と接触させることによって達成することができる。一実施形態では、末梢単核細胞を、ＨＧＦを産生してそれを環境に分泌するＭＳＣと共培養することができる。
【００１６】
誘導のためのＨＧＦの濃度は、例えば、限定されるものではないが、培地１ミリリットル（ｍｌ）当たり３〜４０ｎｇの間であり得る。一実施形態では、ＨＧＦ濃度は、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌまたは上記のいずれか２つの値の間であり得る。一実施形態では、５〜３０ｎｇ／ｍｌが好ましく、１０〜３０ｎｇ／ｍｌがより好ましい。
【００１７】
本出願では、末梢単核細胞は、いずれの血液細胞も１個の球形の核を有することを意味する。末梢単核細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、好塩基球および樹状細胞を含む。リンパ球は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞からなる。一実施形態では、末梢単核細胞は哺乳動物に由来する。
【００１８】
ＨＧＦは、末梢単核細胞を、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、単球などの免疫調節白血球に分化させる。一実施形態では、免疫調節白血球は、活性化された同種異系リンパ球の増殖を抑制することができる。
【００１９】
骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、アルギナーゼの産生、一酸化窒素合成酵素の産生、制御性Ｔ細胞の誘導などを含む数種の免疫調節機能を有する。一実施形態では、ＭＤＳＣはＣＤ１１ｂおよびＣＤ３３を呈し、ＣＤ１４陰性であり、すなわち、ＭＤＳＣはＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋を示す。一実施形態では、本出願の方法を使用することにより、ＭＤＳＣの量を１．５〜５倍増幅することができる。一実施形態では、ＭＤＳＣは、非処理の末梢単核細胞では、約１％といった微量を占めるに過ぎないが、ＨＧＦ処理後には約３％を超えるまでに増幅される。一実施形態では、ＭＤＳＣは、末梢単核細胞の約３〜１０％を占めるまでに増幅することができるが、約３〜５％がより好ましい。
【００２０】
単球は、ＩＬ−１０の産生、抗炎症性サイトカインの産生、免疫応答のＴｈ２優位な応答への調節などを含む数種の免疫調節機能を有する。特に、本出願の方法を使用することにより、単球はＩＬ−１０を産生し得るように（すなわち、ＩＬ１０＋）誘導される。一実施形態では、誘導された単球はまたＣＤ１４も呈し、かつ、ＣＤ１６陰性であり、すなわち、誘導された単球はＣＤ１４＋ＣＤ１６−ＩＬ１０＋を示す。一実施形態では、作出されたＣＤ１４＋ＣＤ１６−ＩＬ１０＋単球は、本出願の方法を使用することにより末梢単核細胞の約３％を超え得るのに対して、非処理の末梢単核細胞はＣＤ１４＋ＣＤ１６−ＩＬ１０＋単球を全く含まず、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−ＩＬ１０−単球のみである。好ましい一実施形態では、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−ＩＬ１０＋単球は、末梢単核細胞の量に対して約５％である。
【００２１】
本出願はまた、上記の方法に従って作出された免疫調節細胞を提供する。免疫調節細胞は、ＭＳＣと共培養され、かつ／またはＭＳＣにより分泌されるＨＧＦによって処理される、従って、細胞分化が誘導される末梢単核細胞に由来する。一実施形態では、免疫調節細胞は、ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＭＤＳＣである。別の実施形態では、免疫調節細胞は、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−ＩＬ１０＋単球である。
【００２２】
本出願は、末梢単核細胞から免疫調節細胞を作出するための簡単、直接的、かつ、迅速な方法を開発する。この方法論は、自己免疫疾患および臓器移植後の移植片拒絶における臨床適用のための免疫調節細胞を作出するためにさらに使用することができる。
【００２３】
本出願はさらに、異常な免疫応答により引き起こされる疾患を治療するための方法を提供する。異常な免疫応答により引き起こされる疾患は、例えば、臓器移植の移植片拒絶、または全身性紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｅｍ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、小児脂肪便症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病などを含む自己免疫疾患である。
【００２４】
本治療方法では、前記疾患を罹患している患者にＨＧＦが投与される。患者は哺乳動物であり得る。一実施形態では、投与されるＨＧＦはタンパク質形態であり、ＭＳＣにより分泌されるＨＧＦが好ましく、ヒト起源のＭＳＣにより分泌されるＨＧＦがより好ましい。別の実施形態では、ＨＧＦを生成する間葉系幹細胞を患者に投与することが実行可能である。ＨＧＦを提供した後、患者の末梢単核細胞をＭＤＳＣ、単球などの免疫調節白血球へ分化させることができる。この細胞分化から誘導された免疫調節白血球は、患者の免疫系を調節するための様々な免疫機能を示し、従って、異常な免疫応答が調節され得る。
【実施例】
【００２５】
実施例１：免疫調節骨髄由来免疫抑制細胞の作出
材料および方法
細胞培養
従前に記載されているように（Ｙｅｎ  ＢＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００５；  ２３（１）：  ３−９；  Ｃｈａｎｇ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００６；  ２４（１１）：  ２４６６−７７；  Ｌｉｕ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２０１１；  ２０：  １７２１−３０）、ヒト胎盤由来ＭＳＣ、すなわち、満期胎盤由来のＭＳＣ集団を単離し、増幅した。健康なドナー母胎からの満期（妊娠３８〜４０週）胎盤は、治験審査委員会により承認されたインフォームド・コンセントを伴って入手した。簡単に述べれば、ＭＳＣを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ）を含む低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。集密度７０％のＭＳＣ培養からの細胞馴化培地（ＣＭ）を採取し、試験まで−８０℃で保存した。無作為に選択したバフィーコートサンプルからのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、治験審査委員会により承認されたインフォームド・コンセント後に健康なボランティアから得た。従前に記載されているようにフィコール−パーク（１．０７７ｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）密度勾配遠心分離によって、ＰＢＬを分離した。ＣＤ１４＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、それぞれＭＡＣＳ（磁気細胞選別）ＣＤ１４およびＣＤ４単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の説明書に従って使用することにより、ＰＢＬから精製した。簡単に述べれば、ＰＢＬを適当な磁気ビーズとともに４℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＬおよび磁気ビーズ複合体を、１％ＦＢＳを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）により陽性画分および陰性画分に単離した。陽性画分を回収し、ＣＤ１４＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の純度が９８％を超えることをＦＡＣＳ分析により実証し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。
【００２６】
免疫表現型検査
細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析は、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ミシソーガ、カナダ）で行った。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）からのＣＤ１４、ＣＤ３３、およびＣＤ１１ｂ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）からのＡＲＧ１；Ａｂｃａｍ（ケンブリッジ、ＵＫ）からのｉＮＯＳ；およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）からのｃ−ｍｅｔ以外の抗体は全て、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【００２７】
ＭＤＳＣの増幅
ＰＢＬを３日間ＭＳＣまたは癌細胞株と共培養し（１０：１比）、その後、ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３−に関して評価した（なお、これはＢＤ  Ａｒｉａセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＭＤＳＣのＦＡＣＳ細胞選別にも使用した細胞表面マーカーであった）。一部の実験は、ＰＢＬの代わりに、製造者の説明書に従い（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）、磁気ビーズにより負の選択を行ったＣＤ１４−細胞を用いて行った。組換えヒトＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を示された用量でＰＢＬに加えた。ＰＢＬ細胞分裂のＭＤＳＣ抑制分析評価を次のように行った。簡単に述べれば、同種異系ＰＢＬを２．５μｍｏｌ／Ｌの蛍光色素カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、グランドアイランド、ＮＹ、ＵＳＡ）で１０分間標識した後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激した。ＭＳＣにより増幅されたＭＤＳＣをＦＡＣＳ細胞選別により選別して均質化を図った後、刺激された同種異系ＰＢＬと種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で３日間共培養した。フローサイトメトリー解析を行い、ＣＦＳＥ色素強度に関してＰＢＬ細胞分裂を評価した。
【００２８】
ＨＧＦ分泌の定量
細胞培養物から上清を回収して、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の説明書に従って使用することによりＨＧＦの検出を行った。
【００２９】
ＲＮＡ干渉実験
ＩＬ−６およびＨＧＦに特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をＧｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、ノックダウン実験を製造者の説明書に従って行った。ＭＳＣにより分泌される因子のｓｉＲＮＡノックダウンの効率をＥＬＩＳＡにより確認した。
【００３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
全ての動物研究は、所内動物実験委員会により承認されたプロトコールに従って行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（４〜８週齢）を台湾国家実験動物センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｔａｉｗａｎ）（台北、台湾）から入手した。組換えマウスＨＧＦ（１００ｎｇ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を尾静脈から注射し、注射３日後にマウスを屠殺した。Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞のフローサイトメトリー解析のために、末梢血、骨髄、および脾臓を採取した。
【００３１】
統計分析
上記の実験において、統計分析はＳＰＳＳ  １８．０ソフトウエア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、シカゴ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて行い、統計的有意性をｐ＜０．０５と定義した。２群間の比較にはスチューデントのｔ検定を用い、多群の比較にはＡＮＯＶＡを用いた。
【００３２】
実施例１−（１）
ＭＳＣは、ＰＢＬから多数の機能的ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３−ＭＤＳＣを増幅することができる。
多様な供給源のＭＳＣの強い免疫抑制特性は、ＭＤＳＣの増幅を伴うに至ったという報告はこれまでにない。骨髄ＭＳＣおよび胎盤ＭＳＣは両方とも、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ９０の表面発現が陽性であるが、共刺激分子ＣＤ８０および８６を含む造血系マーカーは陰性である（図１Ａ）。両ＭＳＣ集団は、多能性ＭＳＣの判定基準を満たす骨芽細胞系統、軟骨形成系統、および脂肪生成系統に分化し得る（図１Ｂ）。
【００３３】
ＭＳＣを同種異系ヒトＰＢＬと共培養し、ヒト系においてＣＤ３３とＣＤ１１ｂを発現するが、ＣＤ１４を発現しないと特徴付けられるＭＤＳＣに関してアッセイした。図２Ａおよび２Ｂに示されるように、骨髄ＭＳＣおよび胎盤ＭＳＣは両方とも、ＰＢＬから、ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３−細胞の数を増すことができる。ＭＳＣにより増幅されたＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３−細胞（「ＭＳＣにより誘導されたＭＤＳＣ」）の特性および生物学的機能を試験し、それらの結果を図２Ｃ〜２Ｆに示す。ＭＳＣにより誘導されたＭＤＳＣは、共培養によるリンパ球増殖を用量依存的に抑制する機能を持つ（図２Ｃ）。ＭＳＣにより誘導されたＭＤＳＣは、ＡＧＲ１およびｉＮＯＳを発現することができ（図２Ｄおよび２Ｅ）、刺激されたＰＢＬから多数のＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ  Ｔｒｅｇを誘導することができる（図２Ｆ）。従って、ＭＳＣにより誘導されたＭＤＳＣは、複数の免疫調節機能を有する。
【００３４】
実施例１−（２）
ＭＳＣによるＭＤＳＣの増幅は分泌されたＨＧＦにより媒介される
図３Ａに示されるように、ＭＳＣによるＭＤＳＣの増幅は細胞のトランスウェル分離によって影響を受けず、このことは細胞間接触が必要とされなかったことを示し、このプロセスにおける分泌性因子を暗示する。ＭＳＣの上清の分析から、図３Ｂに示されるように、ＭＳＣは数種の間質細胞関連因子、例えば、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、ＨＧＦ、およびＩＬ−６を分泌する。ＩＬ−６はＭＤＳＣの増幅に関連付けられているが、遮断抗体およびｓｉＲＮＡノックダウン研究の両方を用いたところ、ＩＬ−６はＭＳＣによるＭＤＳＣの増幅には寄与しなかった（データは示されていない）。
【００３５】
ＨＧＦはＭＳＣにより高度に分泌されるので、この分子がＭＳＣによるＭＤＳＣの増幅に関与するかどうかを評価しなければならない。図３Ｃに示されるように、組換えＨＧＦを添加するとＭＤＳＣの増幅が得られ、この作用はＨＧＦ濃度が３０ｎｇ／ｍｌまでは用量依存的であり、この濃度はＭＳＣの細胞馴化培地で見られたほぼ上限である（図３Ｂ）。ＨＧＦにより増幅されたＭＤＳＣはまたｉＮＯＳおよびＡＲＧ１も発現するとともに、抑制エフェクター機能も有する（それぞれ図３Ｄおよび３Ｅ）。ＭＳＣによるＭＤＳＣの増幅におけるＨＧＦの関与を評価するために、ＨＧＦの分泌を、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉を有するＭＳＣによって抑制した。ＭＳＣによるＨＧＦの分泌が効果的に抑制されるとともに、ＭＳＣによるＭＤＳＣの増幅が排除された（図３Ｆ）。従って、このデータは、ＭＳＣにより分泌されたＨＧＦがＭＤＳＣの増幅に関与することを裏付ける。
【００３６】
他の細胞株由来のＨＧＦも試験した。図４Ａおよび４Ｂに示されるように、数種の細胞株により分泌されたＨＧＦのレベルは、増幅されたＭＤＳＣの数と相関する。
【００３７】
これらのｉｎ  ｖｉｖｏにおける所見をバリデートするために、組換えＨＧＦを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静注した。３日後、これらのマウスの骨髄におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋ＭＤＳＣの増加が見られ（図４Ｃ）、このことは、ＨＧＦがｉｎ  ｖｉｖｏ状況下でＭＤＳＣを増幅し得ることを示す。
【００３８】
実施例１−（３）
ＨＧＦによるＭＤＳＣの増幅は、その受容体であるｃ−ｍｅｔ、およびＳＴＡＴ３のリン酸化の増大により媒介される。
さらに、ＨＧＦにより媒介されるＭＤＳＣの増幅の機構を検討した。ＭＤＳＣ上でのｃ−ｍｅｔ、すなわち、ＨＧＦのコグネイト受容体の発現を調べ、ＣＤ１４−白血球が低レベルのｃ−ｍｅｔを構成的に発現すること（図５Ａ）、およびＣＤ１４−細胞上のｃ−ｍｅｔが中和抗体で遮断された場合に、ＨＧＦによるＭＤＳＣの増幅が排除されたこと（図５Ｂ）が判明した。次に、ＭＤＳＣにおけるＨＧＦにより誘導されたＳＴＡＴ３のリン酸化を調べ、ＨＧＦ／ｃ−ｍｅｔ軸のこれらの作用がＳＴＡＴ３により媒介されることを確認した。図５Ｃに示されるように、ＨＧＦの外からの添加は、リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）のベースラインレベルを超える増加を誘導し、このことはこの経路の活性化を示す。ＳＴＡＴ３阻害剤ｃｐｄ１８８を外因性ＨＧＦの存在下で添加すると、ＭＤＳＣにおいて上昇したｐＳＴＡＴ３のレベルが用量依存的に排除される（図５Ｄ）。従って、ＨＧＦは、その受容体ｃ−ｍｅｔと結合することによりＭＤＳＣの増幅を媒介し、ＳＴＡＴ３のリン酸化の増大をもたらす。
【００３９】
ＨＧＦにより媒介されるＭＤＳＣの増幅の機構を図６に示し、ＨＧＦ（特にＭＳＣにより分泌される）がＭＤＳＣの増幅をもたらし得る。機構的に、ＭＳＣにより誘導されるＭＤＳＣの増幅は、ＨＧＦ／ｃ−ｍｅｔ軸を介するものであり、この下流でＳＴＡＴ３が関与する。ＭＳＣまたはＨＧＦとの共培養により増幅されるＭＤＳＣは、機能的であり、ｉＮＯＳおよびＡＲＧ１を発現するだけでなく、抑制機能を保持し、Ｔｒｅｇを誘導する。従って、ＨＧＦにより誘導されるＭＤＳＣは、免疫調節機能を達成する。前記免疫調節機能は、自己免疫疾患、および移植片対宿主病などの他の免疫関連疾患に治療的であり得る。
【００４０】
実施例２：免疫調節単球の作出
本出願では、ＭＳＣが肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の分泌を介して免疫調節性ＩＬ−１０産生ＣＤ１４＋単球の集団を誘導し得ることが分かる。これらの免疫調節単球の存在は、Ｔ細胞の増殖を抑制するとともに、Ｔ細胞のエフェクター機能をＴｈ１からＴｈ２プロファイルへ変更する。ＨＧＦとＣＤ１４＋単球の間の相互作用もまた検討したところ、このシグナル伝達経路はこれらの免疫調節単球によるＩＬ−１０産生に関与していた。
【００４１】
材料および方法
細胞培養
実施例１に記載のように、ヒト胎盤由来ＭＳＣを単離し、増幅した。
【００４２】
ヒト組織球性リンパ腫細胞株Ｕ９３７、およびヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）から入手し、公開されているプロトコールに従って培養した。いくつかの実験では、Ｕ９３７を、組換えヒトＨＧＦ（ｒｈＨＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）処理の前に、ＥＲＫ１／２阻害剤Ｕ０１２６（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０（Ｍｅｒｃｋ）、およびＳＴＡＴ３阻害剤ｃｐｄ１８８（Ｍｅｒｃｋ）で３０分間処理でした。
【００４３】
細胞増殖アッセイ
細胞を０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中、２５℃で１０分間、２．５μＭのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。０．１％ＢＳＡ中で２回洗浄した後、細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁した後、２５℃でさらに１０分間インキュベートした。ＰＢＬまたはＣＤ１４−除去ＰＢＬを、ＭＳＣ培養培地およびｒｈＨＧＦの存在下または不在下でヒトＴ−アクチベーター抗ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または分裂促進因子であるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、１００μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。さらに、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激したＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ｒｈＨＧＦで処理したＨＬＡミスマッチＣＤ１４＋細胞と種々の比率で共培養した。７２時間後、ＣＦＳＥ標識細胞（５×１０５細胞／ウェル）を採取し、ＰＢＳの中で０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２回洗浄した。細胞分裂の分析は、従前に報告されているように、ＦＡＣＳによって実施した。
【００４４】
サイトカインアレイ
ＣＤ１４＋細胞と共培養したまたはしなかったＭＳＣからのＣＭを分析した。サイトカインプロファイルはヒト定量的抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を用いて行い、製造者の推奨に従って処理した。簡単に述べれば、これらの膜を室温で３０分間ブロッキングバッファーとともにインキュベートすることによりブロッキングし、サンプルとともに室温で９０分間インキュベートした。膜をウォッシュバッファーＩで３回、ウォッシュバッファーＩＩで２回、室温にて各５分洗浄し、ビオチン結合抗体とともに室温で９０分間インキュベートした。最後に、これらの膜を洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとともに室温で２時間、また、検出バッファーとともに２分間、インキュベートした。発光検出器（ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂマイクロアレイスキャナー、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を検出に用い、データをデジタル化し、画像解析を行った（ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏソフトウエア、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）。相対的タンパク質濃度は、バックグラウンド染色を差し引いて、同じ膜上の陽性対照に対して正規化することによって得た。
【００４５】
ＲＮＡサイレンシング
ＭＳＣにおけるＨＧＦ分泌のＲＮＡサイレンシングは、製造者の推奨に従い、２つの異なるＨＧＦサイレンシングＲＮＡ（ＨＧＦ  ｓｉＲＮＡ）（Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＲＮＡｉ（商標）ｓｉＲＮＡ、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者が推奨している陰性対照ｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ（商標）陰性対照）とともに使用することにより行った。ｓｉＲＮＡは、製造者が推奨している手順に従い、リポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによりＭＳＣにトランスフェクトした。簡単に述べれば、無血漿培地に４〜６時間置き、完全培地に置き換えてから２４時間後の細胞にトランスフェクションミックスを加えた。培養３日後に、ＭＳＣにおけるＨＧＦのノックダウンを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）をＣＭのＨＧＦに対して特異的に実施することにより確認した。ＭＳＣによるＨＧＦ産生および単球／細胞株によるＩＬ−１０産生を、従前に報告されているように、また、製造者の説明書（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってＥＬＩＳＡにより測定した。
【００４６】
免疫表現型検査
細胞（ＰＢＬ、ＣＤ１４＋細胞、白血病細胞株）を種々の表面発現に関して染色し、従前に報告されているようにＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した（Ｙｅｎ  ＢＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００５；  ２３（１）：  ３−９；  Ｃｈａｎｇ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００６；  ２４（１１）：  ２４６６−７７；  Ｌｉｕ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２０１１；  ２０：  １７２１−３０）。ｃ−Ｍｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）以外のフローサイトメトリー解析用の全ての抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。各解析には適当なＦＩＴＣ結合アイソタイプ対およびＰＥ結合アイソタイプ対照を含めた。
【００４７】
細胞内サイトカイン染色
ＨＧＦにより処理したＣＤ１４＋細胞と共培養した、またはしなかった抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ１３産生を、７２時間のインキュベーション後に測定した。細胞を５０μｇ／ｍｌのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．７４５μｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および４μＭのモネンシン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在下で４〜６時間再懸濁させた。次に、これらの細胞は抗ヒトＩＦＮ−γ  ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＩＬ−４  ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）または抗ヒトＩＬ１３  ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに４℃で４５分間インキュベートした。ＦＩＴＣ結合アイソタイプ対照およびＰＥ結合アイソタイプ対照を並行使用した。これらの細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のためにＰＢＳ−ＢＳＡに懸濁させた。
【００４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ組換えマウスＨＧＦチャレンジ
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に１５０μｌのＰＢＳに希釈した２００ｎｇの組換えマウスＨＧＦ（ｒｍＨＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を静注した、またはしなかった。８日後、ＢＭ細胞をマウス大腿からＰＢＳで潅流することにより抽出し、脾臓を摘出し、４℃にて３ｍｌシリンジの先端で摩砕し、ナイロンメッシュで濾過した。その後、細胞懸濁液を遠心分離し、赤血球を溶解させ、得られた単細胞懸濁液を洗浄した。Ｂリンパ球およびＴリンパ球を、それぞれＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０  ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン：ＲＡ３−６Ｂ２）、ＣＤ９０．２  ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン：５３−２．１）、および抗ＰＥ磁気ビーズを用いた脾細胞の磁気選別（ａｕｔｏ−ＭＡＣＳ）によって除去した。この細胞懸濁液を抗マウスＣＤ１１ｂ  ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗マウスＩＬ１０  ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにインキュベートした後、ＦＡＣＳにより検出した。
【００４９】
ＲＮＡ単離および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを従前に報告されているように行った（Ｃｈａｎｇ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００６；  ２４（１１）：  ２４６６−７７）。下記のＰＣＲプライマーセットを用いた：ＩＬ−１０、フォワードプライマー５’−ＣＴＧＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣ−３’、リバースプライマー５’−ＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＣＴＣＣＣ−３’およびβ−アクチン陽性対照、フォワードプライマー５’−ＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣ−３’、リバースプライマー５’−ＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣ−３’。実験は３反復で行った。相対的ｍＲＮＡレベルを、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ）を用いた濃度測定分析により定量し、β−アクチンに対して正規化した。
【００５０】
ウエスタンブロット解析
タンパク質は、従前に報告されているように、細胞から取得した（Ｙｅｎ  ＢＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．  ２０１３２；  ２５；１（２）：１３９−５１）。ＥＲＫ１／２、ＳＴＡＴ３、およびα−チューブリンに対する一次抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手し、ホスホ−ＥＲＫ１／２、ホスホ−ＳＴＡＴ３、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ホスホ−ｐ３８  ＭＡＰＫ、Ａｋｔ、およびホスホ−Ａｋｔに対する一次抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。
【００５１】
統計分析
統計分析は、ＳＰＳＳソフトウエア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、バージョン１９．０）を用い、一対比較にはスチューデントのｔ検定を、多重比較にはＡＮＯＶＡを使用することによって行った。データは全て平均±ＳＥＭとして表し、ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。実験は全て少なくとも３反復で行った。
【００５２】
実施例２−（１）
ＨＧＦは抗ＣＤ３／２８により活性化されたＰＢＬの増殖の抑制に関与する
実施例１に示されるように、ＭＳＣは、分泌因子により媒介される作用で、免疫調節をＴリンパ球に強く傾ける。図７Ａに示されるように、ＭＳＣの細胞馴化培地（ＣＭ）（ＭＳＣ−ＣＭ）は、単球を優先的に刺激するＰＨＡ、またはＴリンパ球を特異的に刺激する抗ＣＤ３／２８のいずれかで活性化されたＰＢＬの増殖を抑制することができる。ＭＳＣ−ＣＭは、抗ＣＤ３／２８刺激ＰＢＬに対して、ＰＨＡ刺激ＰＢＬよりもやや強い抑制作用を示した。さらに、抗ＣＤ３／２８刺激ＰＢＬをＭＳＣと共培養した場合には、サイトカインプロファイルは、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αにより表される炎症誘発性Ｔｈ１環境から、ＩＬ−１０により表されるより免疫調節的な環境に変化する（図７Ｂ）。
【００５３】
アッセイした種々のサイトカイン、ケモカイン、および間質細胞関連分子のうち（図７Ｃ）、ＨＧＦはＭＳＣ−ＣＭ中に最も多く分泌される分子である。次に、ｒｈＨＧＦを活性化されたＰＢＬに添加した。驚くことに、ｒｈＨＧＦは抗ＣＤ３／２８により活性化されたＰＢＬの増殖を抑制することができるが、ＰＨＡにより活性化されたＰＢＬの増殖を抑制することはできず（図７Ｄ）、このことは、ＨＧＦの免疫抑制作用がＴリンパ球に向けられることを示唆する。興味深いことに、ＰＢＬ増殖の抑制に対してＨＧＦの用量依存作用は無い。さらに、ｓｉＲＮＡによるＭＳＣにおけるＨＧＦのノックダウン実験を行い、ＥＬＩＳＡ結果を図７Ｅに示す。抗ＣＤ３／２８活性化されたＰＢＬをｓｉＨＧＦ−ＭＳＣと共培養した場合、免疫抑制は有意な程度まで復帰した（図７Ｆ）。さらに、ＨＧＦ−ｓｉＲＮＡ  ＭＳＣの培養培地もまた、ＰＢＬの増殖抑制を部分的に回復させた（データは示されていない）。これらの結果を考え合わせると、ＭＳＣにより分泌されるＨＧＦが、抗ＣＤ３／２８により活性化されたＰＢＬ増殖の抑制に関与することが示される。
【００５４】
実施例２−（２）
ＣＤ１４＋単球は活性化されたＣＤ４＋細胞に対するＨＧＦを介した免疫調節作用に必要とされる
ＨＧＦは、チロシンキナーゼ受容体であるｃ−Ｍｅｔのリガンドである。ＰＨＡにより活性化されたＰＢＬとは対照的な抗ＣＤ３／２８により活性化されたＰＢＬに対するＨＧＦの抑制結果に基づけば、ＨＧＦの免疫調節作用はＴ細胞を標的とすると思われる。しかしながら、ｃ−Ｍｅｔは、初代Ｔ細胞（データは示されていない）またはＴ細胞白血病細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞（図８Ａ）上では発現しなかった。Ｔ細胞はｃ−Ｍｅｔを発現しないが、単球は低レベルのこの受容体を発現するということは従前に報告されている。単球、すなわちＣＤ１４＋細胞は、約１０％のヒトＰＢＬを含み、ヒト単球白血病細胞株Ｕ９３７、ならびにドナーＰＢＬ由来の初代ＣＤ１４＋単球はｃ−Ｍｅｔを発現することが判明した（図８Ａおよび８Ｂ）。
【００５５】
これらの結果は、Ｔ細胞に対するＨＧＦのこれらの作用が、媒介因子として働くための単球を必要とし得ることを示唆する。この仮説を検証するために、ＣＤ１４＋細胞をＰＢＬから除去し、次いで、ｒｈＨＧＦを抗ＣＤ３／２８により活性化されたＰＢＬに添加した。図８Ｃに示されるように、抗ＣＤ３／２８に刺激されたＰＢＬの増殖に対するＨＧＦの抑制作用は、ＣＤ１４＋細胞が除去されると完全に排除された。
【００５６】
ＣＤ１４＋ビーズにより選択された単球をｒｈＨＧＦで処理し、抗ＣＤ３／２８により刺激されたＣＤ４＋細胞と共培養した。図８Ｄに示されるように、Ｔ細胞増殖はＨＧＦで処理したＣＤ１４＋細胞により阻害することができ、これらの抑制作用はエフェクターと標的細胞（ＣＤ１４＋とＣＤ４＋細胞応答）の比が増すにつれ増大した。しかしながら、ＨＧＦの用量は、図７Ｄと同様に、単球を介した抑制には作用を示さなかった。抗ＣＤ３／２８により活性化されたＰＢＬとＨＧＦで処理したＣＤ１４＋単球の共培養は、サイトカインプロファイルをＴｈ１優位からＴｈ２プロファイルへ変化させた（図８Ｅ）。ＣＤ４＋  Ｔ細胞における細胞内Ｔｈ１（ＩＦＮ−γ）およびＴｈ２（ＩＬ−４およびＩＬ−１３）産生のＦＡＣＳ分析は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞をＨＧＦで処理したＣＤ１４＋細胞と共培養すると、ＩＬ−４およびＩＬ−１３生産が増大することを示した。対照的に、ＩＦＮ−γ産生は低下した。これらのデータは、ＨＧＦはＣＤ１４＋単球と直接相互作用してＴ細胞のエフェクター機能を変更することを示す。
【００５７】
実施例２−（３）
ＨＧＦはＩＬ−１０産生を有意に誘導する
単球は、炎症環境への細胞流入の主要な成分であり、環境刺激に応じて炎症誘導特性および抗炎症特性のいずれかを有するＤＣまたはマクロファージに分化する。ＨＧＦがＣＤ１４＋単球分化を調節するかどうかを調べるために、表面マーカー発現の、ＤＣ系統およびマクロファージ系統への変化を分析した。ＨＧＦ処理後、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびＨＬＡ−ＤＲのＤＣ関連マーカーにも、ＣＤ２０６のマクロファージ関連マーカーにも発現レベルに変化は無かった（図９Ａ）。さらに、ＤＣ−徴候、ＣＤ６８およびＣＤ７３の発現も検出されなかった。しかしながら、ＣＤ１６−細胞画分は若干増え（図９Ｂ）、ＣＤ１４＋単球のサブセットは免疫調節性があることが報告されている。
【００５８】
図１０Ａでは、ＭＳＣと共培養したＣＤ１４＋細胞の定量的サイトカインアレイ分析は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを含む炎症性サイトカインの産生の有意な減少と、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の有意な増加を示す。このデータは、ＭＳＣの免疫抑制作用がＩＦＮ−γの減少およびＩＬ−１０産生の増加によるものであり得ることを示す。ＨＧＦと単球のＩＬ−１０産生の増加との間の相互作用をさらに決定づけるために、初代ＣＤ１４＋細胞をｒｈＨＧＦと共培養し、培養培地中のＩＬ−１０濃度を測定した。図１０Ｂに示されるように、ＨＧＦで処理したＣＤ１４＋細胞ならびにＭＳＣ−ＣＭで処理したＣＤ１４＋細胞に由来するＣＭは、ベースラインレベルを超える高レベルのＩＬ−１０産生を有してした。
【００５９】
ｍＨＧＦを野生型Ｂ６マウスに注射してｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこれらの効果を調べた。図１０Ｃに示されるように、ＨＧＦは、脾細胞では、ＩＬ−１０産生単球集団に若干の増加を誘導するが、ＢＭ細胞または末梢血では誘導しない（データは示されていない）。よって、ＨＧＦは、ＣＤ１４＋単球からのＩＬ−１０の産生に関与する。
【００６０】
実施例２−（４）
ＨＧＦはＥＲＫ１／２のリン酸化を介してＩＬ−１０の分泌を誘導する
さらに、ＨＧＦにより誘導される単球におけるＩＬ−１０産生の機構を検討する。単球細胞株Ｕ９３７細胞をＨＧＦで処理し、ＩＬ−１０の遺伝子発現の変化を評価した。図１１Ａに示されるように、ＩＬ−１０転写産物の増加はｒｈＨＧＦ処理の６時間目をピークとし、ＨＧＦはＩＬ−１０産生を直接的に担っている可能性があることが示唆される。ＨＧＦは、多くの細胞内シグナル伝達経路を誘発し、これらの下流経路のうち、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、Ｒａｓ／ＥＲＫ１／２、ｐ３８／ＭＡＰＫ、およびＳＴＡＴ３もＩＬ−１０遺伝子発現の媒介に関与している。図１１Ｂに示されるように、Ｕ９３７細胞のＨＧＦ処理後に、ＥＲＫ１／２、ＳＴＡＴ３、およびｐ３８／ＭＡＰＫのリン酸化は増強されるが、ＡＫＴのリン酸化は増強されない。これらの３つの経路をさらに評価するために、Ｕ９３７細胞をＨＧＦと特異的阻害剤：Ｕ０１２６（ｐ−ＥＲＫ１／２阻害剤）、ＳＢ２０３５８０（ｐ３８／ＭＡＰＫ阻害剤）、およびｃｐｄ１８８（ｐＳＴＡＴ３阻害剤）で同時に処理した。図１１Ｃおよび１１Ｄに示されるように、ＩＬ−１０遺伝子発現は、Ｕ０１２６およびＳＢ２０３５８０群では用量依存的に排除されたが、ＥＲＫ１／２阻害だけが、ＨＧＦ処理後のＩＬ−１０タンパク質産生の有意な低下をもたした。これらの結果は、ＨＧＦを介するＩＬ−１０の単球産生はＥＲＫ１／２により媒介されることを示す。
【００６１】
図１２に示されるように、ＨＧＦ（特に、ＭＳＣにより分泌される）は、ＣＤ１４＋単球に対して、同種異系Ｔ細胞機能を調節し、ＥＲＫ１／２を介してＩＬ−１０を増強する働きをする。ＭＳＣにより分泌されるＨＧＦは、ＨＧＦの受容体であるｃ−Ｍｅｔを発現するＣＤ１４＋単球に直接作用して、活性化されたＣＤ４＋細胞増殖を抑制する。これらのＣＤ１４＋単球は，活性化されたＣＤ４＋細胞に対する、ＭＳＣにより分泌されたＨＧＦの抑制作用、例えば、免疫調節ＣＤ１４＋ＣＤ１６−単球画分の増大、ＩＬ−１０産生の誘導、ならびにＴ細胞サイトカインプロファイルのＴｈ１からＴｈ２プロファイルへの調節に必要とされる。機構的には、ＨＧＦは、ＥＲＫ１／２経路を介してＣＤ１４＋単球によるＩＬ−１０産生を誘導する。上記の例は、ＭＳＣの強力な免疫調節特性の背後にある機構の１つを浮き彫りにするとともに、Ｔ細胞のエフェクター機能の変更における免疫調節単球の重要な役割を強調する。
【００６２】
興味深いことに、Ｔ細胞増殖に対するＨＧＦの抑制作用は用量依存的ではなく、これは、単球上のその受容体ｃ−Ｍｅｔの発現レベルが低く、これはおそらく比較的低い閾値の受容体飽和をもたらすためであると思われる。
【００６３】
ＨＧＦは単球においてＥＲＫ１／２およびｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化を誘導し、ＨＧＦにより誘導されたＩＬ−１０産生はＥＲＫ１／２阻害剤によってのみ遮断されるが、このことは、Ｒａｓ／Ｒａｆシグナル伝達経路がＨＧＦにより誘導される、単球によるＩＬ−１０分泌に関与していることを示唆する。ＥＲＫ１／２は、免疫細胞においてＩＬ−１０発現を制御する数種の転写因子、例えば、ｐ３８の基質でないＭＡＦ、ＪＵＮ、ＧＡＴＡ３およびＳＭＡＤ４、のリン酸化および活性化を担う。従って、これらの転写因子は、単球におけるＨＧＦにより誘導されるＩＬ−１０産生に重要な役割を持ち得る。
【００６４】
上記の例は、ＨＧＦは、ＣＤ１４＋単球に、細胞が非接着性のまま（分化がまだ起こっていないことを示唆する）、免疫調節表現型を直接的かつ極めて迅速（３日以内）に誘導できることを示す。ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６−である循環末梢血単球のサブセットは、ＩＬ−１０を含む、高レベルの抗炎症性サイトカインを産生し得る。循環ＣＤ１４＋単球はＰＢＬの多量成分であり、免疫調節単球が迅速に誘導され得るのであれば、これらの白血球は循環免疫調節細胞全体の量に有意な寄与を果たし得る。
【００６５】
本発明は上記で好ましい実施形態および詳細な例に関して開示するが、これらの例は限定ではなく例示を意図するものであると理解されるべきである。改変および組合せも当業者には容易に想到され、これらの改変および組合せも本発明の趣旨および下記の特許請求の範囲ならびにその等価な系および方法の範囲内にあると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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