(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）治療剤の複数回投薬を被験体の標的部位に送達するための送達システムであって、
前記ＰＥＧ化治療剤を前記標的部位に送るための、抗ＰＥＧ抗体；及び
前記抗ＰＥＧ抗体及び／又は前記ＰＥＧ化治療剤を前記標的部位で少なくとも３日間保持するための、ヒドロゲル；
を含み、
前記ヒドロゲルが、ヒアルロナン（ＨＡ）又はＨＡの誘導体、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、アルジネート、キトサン、フィブリン糊、及び合成生体適合性ポリマーからなる群より選択され、前記抗ＰＥＧ抗体及び前記ヒドロゲルが前記送達システム中に独立して存在し、前記ＰＥＧ化治療剤が前記ヒドロゲル上に固定化されていない、送達システム。
【請求項２】
前記合成生体適合性ポリマーが、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリシアノアクリレート（ＰＣＡ）、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）（ＰＥＶＡ）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＧＣＬ）、又はポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）である、請求項１に記載の送達システム。
【請求項３】
前記ＨＡが、約２０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の送達システム。
【請求項４】
前記ＨＡが、約１，５００ｋＤａの分子量を有する、請求項３に記載の送達システム。
【請求項５】
前記ＨＡの誘導体が、ヒアルロン酸の部分的エステル又は全エステル、アジピン酸ジヒドラジド修飾ヒアルロナン、ヒアルロナンのアミド、架橋ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の重金属塩、硫酸化ヒアルロン酸、Ｎ−硫酸化ヒアルロン酸、アミン修飾ヒアルロン酸、ジアミン修飾ヒアルロン酸又はヒアルロナン複合体のいずれかである、請求項３に記載の送達システム。
【請求項６】
ＰＥＧ化治療剤の複数回適用を、それを必要とする被験体に投与することを可能にするアジュバントの製造における、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物の使用であって、
前記抗ＰＥＧ抗体及び前記ヒドロゲルが、前記混合物中に約１：１（ｖ／ｖ）〜約１：１００（ｖ／ｖ）の比で独立して存在し、前記ヒドロゲルが、ヒアルロナン（ＨＡ）又はＨＡの誘導体、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、アルジネート、キトサン、フィブリン糊、及び合成生体適合性ポリマーからなる群より選択され、前記ＰＥＧ化治療剤が前記ヒドロゲル上に固定化されていない、使用。
【請求項７】
前記合成生体適合性ポリマーが、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリシアノアクリレート（ＰＣＡ）、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）（ＰＥＶＡ）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＧＣＬ）、又はポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記抗ＰＥＧ抗体が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ヒト化ＩｇＭ又はヒト化ＩｇＧであり、前記ヒドロゲルが、ＨＡ又はＨＡの誘導体であり、ここで前記ＨＡが、約２０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの分子量を有する、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記ＨＡが約１，５００ｋＤａの分子量を有する、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗ＰＥＧ抗体及び前記ＨＡが、前記混合物中に約１：４（ｖ／ｖ）の比で存在する、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＨＡの誘導体が、ヒアルロン酸の部分的エステル又は全エステル、アジピン酸ジヒドラジド修飾ヒアルロナン、ヒアルロナンのアミド、架橋ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の重金属塩、硫酸化ヒアルロン酸、Ｎ−硫酸化ヒアルロン酸、アミン修飾ヒアルロン酸、ジアミン修飾ヒアルロン酸、又はヒアルロナン複合体のいずれかである、請求項６に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＰＥＧ化治療剤が、がん又は虚血疾患を処置するのに適している、請求項６に記載の使用。
【請求項１３】
前記虚血疾患が、脳卒中、心筋梗塞（ＭＩ）又は四肢虚血である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記四肢虚血が、重症四肢虚血、急性四肢虚血又はバージャー病のいずれかである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記がんが、乳がん、子宮頚部がん、卵巣がん、子宮内膜がん、メラノーマ、ぶどう膜黒色腫、脳腫瘍、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、神経上皮腫、腎臓がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、結腸がん、子宮がん、リンパ系の造血器腫瘍、骨髄性白血病、甲状腺がん、甲状腺濾胞がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉由来腫瘍、テラトカルシノーマ、神経芽細胞腫、グリオーマ、グリオブラストーマ、ケラトアカントーマ、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平上皮がん腫、濾胞樹状細胞がん腫、腸がん、筋肉浸潤性がん、精嚢腫瘍、表皮がん腫、脾臓がん、頭頸部がん、胃がん、骨がん、網膜のがん、胆道がん、小腸がん、だ液腺がん、子宮肉腫、睾丸のがん、結合組織のがん、前立腺肥大、骨髄形成異常、ワルデンストレームマクログロブリン血症、鼻咽頭がん、神経内分泌がん、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、食道胃がん、卵管がん、腹膜がん、乳頭状漿液性ミュラー管がん、悪性腹水、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、リー・フラウメニ症候群又はフォンヒッペル・リンダウ症候群（ＶＨＬ）のいずれかである、請求項６に記載の使用。
【請求項１６】
前記リンパ系の造血器腫瘍が、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫のいずれかである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＰＥＧ化治療剤が、３回の独立した適用で、各適用を約１週間離して、前記被験体に投与される、請求項６に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＰＥＧ化治療剤及び前記混合物が、前記被験体の異なる部位に投与される、請求項６に記載の使用。
【請求項１９】
各適用で投与される前記ＰＥＧ化治療剤が異なる、請求項６に記載の使用。
【請求項２０】
各適用で投与される前記ＰＥＧ化治療剤が同一である、請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．  本発明の分野
【０００２】
本開示は、マルチドラッグ送達システム及び疾患を処置するためのその使用に関する。具体的には、本開示は、がん及び血管疾患を含むがこれらに限定されない疾患を処置するために、被験体にＰＥＧ化薬を複数回送達させることにおける、抗ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）抗体及びヒドロゲルの新規の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．  関連技術の説明
【０００４】
ＰＥＧ化治療剤（すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、化合物、ペプチド又はタンパク質などの治療薬剤との結合体）は、薬物投与システムの新たな方法となってきており、それが提供することのできる様々な有利な特徴の中でも、それが二重特異性抗ＰＥＧ抗体と共に使用された場合の、部位特異的ターゲティングが、おそらく最もユニークな特徴である。例えば、がん処置レジメンの場合、ＰＥＧ化ナノ粒子（例えば、ドキソルビシンリポソーム）を二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）（ＢｓＡｂの一方の端部はＰＥＧ分子の骨格を認識し、ＢｓＡｂのもう一方の端部は腫瘍細胞上の受容体部分を認識する）と共に注射し、ＢｓＡｂの作用を介してＰＥＧ化ナノ粒子を腫瘍細胞へ送らせる。しかしながら、抗ＰＥＧ抗体は投与後に迅速に血液循環から除去され、それによりＰＥＧ化治療剤が提供できたであろう治療効果が減少する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述の観点から、本技術分野において、ＰＥＧ化薬をその処置部位に送り続けることができ、ＰＥＧ化薬の複数回適用をそこに送達することを可能にし、それによりＰＥＧ化薬により与えられる治療効果が改善又は強化されるように、被験体中での抗ＰＥＧ抗体の寿命が延長される薬剤及び送達システムが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本開示は、少なくとも部分的に、ヒアルロナン（ＨＡ）などのヒドロゲルが、抗ＰＥＧ抗体及び／又はＰＥＧ化治療剤を被験体の標的部位で保持するのを助け、それによりＰＥＧ化治療剤の複数回投薬を、それを必要とする被検体に投与することができる、という予期せぬ発見に基づく。本研究において、マウス後肢虚血モデルシステムを使用して、がん又は血管虚血の処置のための、抗ＰＥＧ抗体及び／又はＰＥＧ化治療剤の被験体中での保持におけるヒドロゲルの効果を調べた。本発明に係る結果は、ゲル様構造を形成することのできるヒドロゲル又は化合物を、抗ＰＥＧ抗体と共に、ＰＥＧ化治療剤（例えば、ＰＥＧ化抗虚血性薬剤）に対するアジュバントとして、それを必要とする被験体を処置するために、使用することができることを示唆している。
【０００７】
したがって、本開示の第一の態様は、ＰＥＧ化治療剤の複数回投薬を被験体の標的部位に送達するための送達システムを提供する。この送達システムは、ＰＥＧ化治療剤を標的部位に送るための抗ＰＥＧ抗体、及び抗ＰＥＧ抗体及び／又はＰＥＧ化治療剤を標的部位で少なくとも３日間保持するためのヒドロゲルを含み、ヒドロゲルは、ヒアルロナン（ＨＡ）又はＨＡの誘導体、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、アルジネート、キトサン、フィブリン糊、及び合成生体適合性ポリマーからなる群より選択される。
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、合成生体適合性ポリマーは、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリシアノアクリレート（ＰＣＡ）、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）（ＰＥＶＡ）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＧＣＬ）、又はポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）であってよい。
【０００９】
他の実施形態によれば、ヒドロゲルはＨＡ又はＨＡの誘導体であり、ここでＨＡは、約２０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、好ましくは約１，５００ｋＤａの分子量を有する。
【００１０】
さらなる実施形態によれば、ＨＡの誘導体は、ヒアルロン酸の部分的エステル又は全エステル、アジピン酸ジヒドラジド修飾ヒアルロナン、ヒアルロナンのアミド、架橋ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の重金属塩、硫酸化ヒアルロン酸、Ｎ−硫酸化ヒアルロン酸、アミン修飾ヒアルロン酸、ジアミン修飾ヒアルロン酸又はヒアルロナン複合体のいずれかであってよい。
【００１１】
本開示の第二の態様は、ＰＥＧ化治療剤を、それを必要とする被験体の標的部位に投与する方法を提供する。この方法は、被験体に、ＰＥＧ化治療剤を投与する前、投与するのと同時、又は投与した後に、十分量の抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物を投与するステップを含み、ここでヒドロゲルは、ヒアルロナン（ＨＡ）又はＨＡの誘導体、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、アルジネート、キトサン、フィブリン糊、及び合成生体適合性ポリマーからなる群より選択され、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルは、混合物中に約１：１〜１：１００（ｖ／ｖ）の比で存在し、ＰＥＧ化治療剤の少なくとも２回の適用は、各適用を約１時間〜１週間離して、被験体に投与される。
【００１２】
本開示の実施形態によれば、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、ＰＥＧ化治療剤の部位とは異なる部位に投与される。いくつかの例において、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、意図される標的部位（例えば、腫瘍又は虚血領域）に投与され、一方でＰＥＧ化治療剤は、意図される標的部位から遠位の別の部位から、例えば四肢上の部位から、投与される。さらに、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は直接筋肉内注射により被験体に投与することができ、一方でＰＥＧ化治療剤は静脈内注射により被験体に投与される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化治療剤の少なくとも２回の適用が、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物の投与の後に、被験体に投与される。他の実施態様において、ＰＥＧ化治療剤の少なくとも３回の適用が被験体に投与される。
【００１４】
抗ＰＥＧ抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＭであってよく、好ましくは、ヒト化ＩｇＧ又はＩｇＭであってよい。本開示のある実施形態によれば、抗ＰＥＧ抗体はＩｇＭであり、ヒドロゲルはＨＡ又はＨＡの誘導体であり、ここでＨＡは、約２０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、より好ましくは、約５０ｋＤａ〜１，８００ｋＤａ、最も好ましくは、約１，５００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態によれば、抗ＰＥＧ抗体はＩｇＧであり、ヒドロゲルはＨＡ又はＨＡの誘導体であり、ここでＨＡは約２０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、より好ましくは、約５０ｋＤａ〜１，８００ｋＤａ、最も好ましくは、約１，５００ｋＤａの分子量を有する。ＨＡの誘導体は、ヒアルロン酸の部分的エステル又は全エステル、アジピン酸ジヒドラジド修飾ヒアルロナン、ヒアルロナンのアミド、架橋ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の重金属塩、硫酸化ヒアルロン酸、Ｎ−硫酸化ヒアルロン酸、アミン修飾ヒアルロン酸、ジアミン修飾ヒアルロン酸のいずれかであってよい。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、抗ＰＥＧ抗体及びＨＡ又はその誘導体は、混合物中に約１：３（ｖ／ｖ）〜約１：５（ｖ／ｖ）の比で存在する。いくつかの実施形態において、抗ＰＥＧ抗体及びＨＡ又はその誘導体は、混合物中に約１：３（ｖ／ｖ）の比で存在する。ある実施形態において、抗ＰＥＧ抗体及びＨＡ又はその誘導体は、混合物中に約１：４（ｖ／ｖ）の比で存在する。さらに別の実施形態において、抗ＰＥＧ抗体及びＨＡ又はその誘導体は、混合物中に約１：５（ｖ／ｖ）の比で存在する。
【００１６】
ＰＥＧ化治療剤は、任意のＰＥＧ化医薬品であってよく、好ましくはがん又は虚血疾患（これは、脳卒中、心筋梗塞（ＭＩ）又は四肢虚血を含むがこれらに限定されない）を処置するのに適したＰＥＧ化医薬品であってよい。四肢虚血は、慢性四肢虚血、急性又は慢性四肢虚血又はバージャー病（ＢＤ）のいずれかであってよい。
【００１７】
したがって、本開示の第三の態様は結果として、がん又は虚血疾患を患う被験体の処置のための、ＰＥＧ化治療剤に対するアジュバントを製造するための、上述の混合物（すなわち、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲル）の使用を提供する。
【００１８】
ＰＥＧ化治療剤をその処置部位に、例えば被験体中の腫瘍又は虚血性が位置する部位などに、送るのを助けるために、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物を、ＰＥＧ化治療剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に、被験体に投与してよい。
【００１９】
本開示の実施形態によれば、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、ＰＥＧ化治療剤の部位とは異なる部位に投与される。いくつかの例において、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、意図される標的部位（例えば、腫瘍又は虚血領域）に投与され、一方でＰＥＧ化治療剤は、意図される標的部位から遠位の別の部位から、例えば四肢上の部位などから投与される。さらに、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、直接筋肉内注射により被検体に投与してよく、一方でＰＥＧ化治療剤は静脈内注射により被検体に投与される。
【００２０】
ＰＥＧ化治療剤は好ましくは、少なくとも２回の独立した投薬、例えば２、３、４又は５回の投薬で投与され、各投薬は約１時間〜１週間離して、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間離して、又は２、３、４、５、６、又は７日間離して、投与される。いくつかの例において、ＰＥＧ化治療剤は３回の独立した投薬で、各投薬を８時間離して、投与される。他の例において、ＰＥＧ化治療剤は、３回の独立した投薬で、各投薬を約１週間離して投与される。いくつかの実施形態によれば、各投薬で投与されるＰＥＧ化治療剤は、同一又は異なるＰＥＧ化治療剤であってよい。
【００２１】
被験体は、ほ乳類、好ましくはヒトであってよい。がんは、乳がん、子宮頚部がん、卵巣がん、子宮内膜がん、メラノーマ、ぶどう膜黒色腫、脳腫瘍、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、神経上皮腫、腎臓がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、結腸がん、子宮がん、リンパ系の造血器腫瘍、骨髄性白血病、甲状腺がん、甲状腺濾胞がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉由来腫瘍、テラトカルシノーマ、神経芽細胞腫、グリオーマ、グリオブラストーマ、ケラトアカントーマ、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平上皮がん腫、濾胞樹状細胞がん腫、腸がん、筋肉浸潤性がん、精嚢腫瘍、表皮がん腫、脾臓がん、頭頸部がん、胃がん、骨がん、網膜のがん、胆道がん、小腸がん、だ液腺がん、子宮肉腫、睾丸のがん、結合組織のがん、前立腺肥大、骨髄形成異常、ワルデンストレームマクログロブリン血症、鼻咽頭、神経内分泌がん、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、食道胃、卵管がん、腹膜がん、乳頭状漿液性ミュラー管がん、悪性腹水、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、リー・フラウメニ症候群又はフォンヒッペル・リンダウ症候群（ＶＨＬ）のいずれかであってよい。
【００２２】
リンパ系の造血器腫瘍は、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫のいずれかであってよい。骨髄性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）であってよい。間葉由来腫瘍は、線維肉腫又は横紋筋肉腫である。
【００２３】
虚血疾患は、脳卒中、心筋梗塞（ＭＩ）、又は四肢虚血であってよい。四肢虚血は、慢性四肢虚血、急性又は慢性四肢虚血又はバージャー病（ＢＤ）のいずれかであってよい。
【００２４】
したがって、本開示の第四の態様は、がん又は虚血疾患に関連する１又は複数の症候を改善するために、被験体に、十分量の上述の抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物を、有効量のＰＥＧ化治療剤と共に投与することによる、がん又は虚血疾患を患う被験体を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、有効量のＰＥＧ化治療剤は、２回の独立した投薬で投与される。他の実施態様において、有効量のＰＥＧ化治療剤は、３回の独立した投薬で投与される。
【００２５】
本発明の１又は複数の実施形態の詳細は、以下の付随の説明に記載されている。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本説明は、以下の詳細な説明を添付の図面に照らして読むことによって、よりよく理解されるであろう。
【００２７】
【図１】抗ＰＥＧ抗体、ＡＧＰ４は、ＰＥＧ化化合物に特異的に結合する。（Ａ）ＡＧＰ４抗体がコーティングされたウェルに対するＰＥＧ化化合物の結合プロファイル。（Ｂ）ＰＥＧ−Ｑｄ８００のＩｇＭに対する結合、及びＬｉｐｏ−ＤＯＸのＡＧＰ４に対する結合と比較したときの、ＰＥＧ−Ｑｄ８００のＡＧＰ４に対する結合効率。（＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、対正常ＩｇＭ処置）
【００２８】
【図２】インビボマウスモデルにおけるＰＥＧ−Ｑｄ８００のターゲティングプロファイル。（Ａ）皮下及び静脈内注射が行われる位置を図示する模式図。（Ｂ）ＨＡ／ＡＧＰ４の蛍光シグナル及び（Ｃ）ＰＥＧ−Ｑｄ８００の蛍光シグナルを定量化した。ＨＡ／ＡＧＰ４及びＰＥＧ−Ｑｄ８００両方の１回投与後、１日目、４日目及び７日目で、器官を取り除き、（Ｄ）蛍光強度測定に供した。（Ｅ）ＨＡ／ＡＧＰ４又はＨＡ単独のｅａｒモデルへの１回皮下投与及びＰＥＧ−Ｑｄ６５５の１回静脈内注射の後、１．５及び４時間で、生体内画像を記録した。（Ｆ）ＰＥＧ−Ｑｄ６５５の蛍光強度を定量化した。（＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、対ＨＡ単独処置）
【００２９】
【図３】ＰＥＧ−Ｑｄ８００の複数回投与の蛍光分析。（Ａ）筋肉内及び静脈内注射が行われる位置を示す模式図。右脚筋肉のみにＨＡ／ＡＧＰ４を注射した（ＡＧＰ４＿脚）ときの、両脚から単離した筋肉組織中のＨＡ／ＡＧＰ４及びＰＥＧ−Ｑｄ８００の蛍光シグナル。この結果を、（Ｂ）に示されるように定量化フォーマットで表した。異なる器官におけるＰＥＧ−Ｑｄ８００の定量化結果を（Ｃ）に示した。ＰＥＧ−Ｑｄ８００（赤）の異なる回数の注射７日後の（Ｄ）免疫蛍光染色結果及び（Ｅ）ＰＥＧ−Ｑｄ８００の蛍光強度の定量化。骨格筋線維をトロポミオシン（緑）によりラベルし、核をＤＡＰＩ（青）で染色した。スケールバー：２０μｍ。（＊＊＊Ｐ＜０．００１、対１回注射又は対正常脚）
【００３０】
【図４】虚血性マウスモデルにおける、ＰＥＧ化ＩＧＦ−１（ＰＥＧ−ＩＧＦ−１）の再補充多回注射に関する治療的利益の分析。（Ａ）注射する時点及び位置を示す模式図。ＨＬＩ手術の後に続く、ＨＡ単独＋ＰＥＧ化ＩＧＦ−１、ＨＡ／ＡＧＰ４＋ＰＢＳ又はＨＡ／ＡＧＰ４＋ＰＥＧ化ＩＧＦ−１の処置の、（Ｂ）免疫蛍光染色結果及び（Ｃ）定量化。アポトーシス細胞をＴＵＮＥＬ染色（赤）により染色し、膜レクチンをＷＧＡ（緑）でラベルし、及び核をＤＡＰＩ（青）で染色した。（＊Ｐ＜０．０１；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．００１、対ＨＡ単独＋ＰＥＧ化ＩＧＦ−１又はＨＡ／ＡＧＰ４＋ＰＢＳ）
【００３１】
【図５】虚血性マウスモデルにおける、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ）の再補充多回注射に関する治療的利益の分析。
【００３２】
（Ａ）注射する時点及び位置を示す模式図。ＨＬＩ手術の後に続く、ＨＡ／ＡＧＰ４に続くＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、又はＨＡ／ＡＧＰ４に続くＰＢＳ、又はＨＡ単独に続くＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの処置の、（Ｂ）免疫蛍光染色結果及び（Ｃ）定量化。リクルートメントされた細胞を抗ＣＤ３４（赤）及び抗ＣＤ１３３（緑）でラベルし、核をＤＡＰＩ（青）で染色した。（＊Ｐ＜０．０１；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．００１、対ＨＡ単独＋ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、ＨＡ／ＡＧＰ４＋ＰＢＳ）
【００３３】
【図６】併用療法の治療効能の改善。（Ａ）注射する時点及び位置を示す模式図。（Ｂ）各実験群において、０、１、３、７、１４、２１、及び２８日目での血流を、レーザードップラー流量計により測定した。（Ｃ）後肢虚血の誘導後３〜２８日目のマウスの臨床スコア。（Ｄ）ＨＬＩ手術の後に続く、併用療法又はＰＢＳの処置の免疫蛍光染色結果。毛細血管を抗イソレクチン（赤）でラベルし、骨格筋を抗トロポミオシン（緑）でラベルし、核をＤＡＰＩ（青）で染色した。（Ｅ）傷害周辺領域における毛細血管密度の定量化。（＊Ｐ＜０．０１；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．００１、対ＰＢＳ処置）
【発明を実施するための形態】
【００３４】
説明
添付の図面に関連して下に提供される詳細な説明は、本例の説明として意図されており、本例を構築又は利用できる唯一の形態を表すことは意図されない。この説明は、本例の機能及び本例を構築及び動作させるための一連のステップを示している。しかしながら、同一又は同等の機能及び一連のステップを、異なる例により達成することができる。
【００３５】
１．  定義
【００３６】
便宜上、本開示の文脈で使用されるある特定の用語がここに集められる。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３７】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示物を含むものとして用いられる。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「処置」は、所望の薬理的及び／又は生理的効果を得ること、例えば、がん増殖を抑制すること又は器官（例えば、心臓）に対する虚血性傷害を改善すること、を意味することを意図する。効果は、疾患又はその症候を完全に又は部分的に妨げるという点で予防的であってよく、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害効果の部分的又は完全な治癒という点で治療的であってよい。本明細書で用いられる「処置」は、ほ乳類、特にヒトにおける疾患の、防止的（例えば、予防的）、治癒的又は緩和的処置を含み、（１）疾患にかかりやすい可能性があるが、それにかかっているとはまだ診断されていない個人における発症からの、疾患又は状態（例えば、がん又は虚血疾患）の、防止的（例えば、予防的）、治癒的又は緩和的処置；（２）疾患を（例えば、その進行を停止することにより）抑制すること；又は（３）疾患を緩和すること（例えば、疾患に関連する症候を低減すること）を含む。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「ＰＥＧ化」化合物、治療剤及び／又は薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの長い鎖が取り付けられた化合物、治療剤及び／又は薬を指す。ＰＥＧ化化合物、治療剤及び／又は薬は典型的には、ペプチド、タンパク質、抗体、ナノ粒子（例えば、リポソーム）などである。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「抗ＰＥＧ抗体」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に対し作られる抗体、特にモノクローナル抗体を指し、この抗体がＰＥＧ骨格の繰り返しサブユニットに結合できて、それ故にＰＥＧ化化合物（例えば、ＰＥＧ化抗がん剤又はＰＥＧ化抗虚血性薬）の定量化を助けることができることを意味する。本開示の抗ＰＥＧ抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＭであってよく、好ましくはヒト化ＩｇＧ又はＩｇＭである。本開示の抗ＰＥＧ抗体は、任意の既知の方法、好ましくは、Ｓｕらにより以前に説明された手順（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２０１０）  ２１、１２６４−１２７０）により、作製してよい。
【００４１】
用語「投与された（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」又は「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は本明細書中で互いに交換可能に使用され、経口、鼻、肺、経皮（受動的又はイオントフォレーシス送達など）、又は非経口（例えば、直腸、デポ、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、小脳内、点眼液又は軟膏）が含まれるがこれらに限定されない送達の様式を指す。本開示の一つの実施形態において、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、直接筋肉内注射により被験体に投与され、一方でＰＥＧ化薬は、直接静脈内注射により被験体に投与される。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「有効量」は、投薬時、及び必要な時間の間、疾患の処置について所望の結果を達成するのに有効な量を指す。例えば、がんの処置において、がんの任意の症候を減少させる、妨げる、遅延させる又は抑制する又は停止させる薬剤（すなわち、化合物又は組成物）が有効となるだろう。有効量の薬剤は、疾患又は状態を治癒するために必要とされるものではないが、疾患又は状態の発現を遅延させ、妨害し又は妨げる、又は疾患又は状態の症候が改善されるような、疾患又は状態の処置を提供するだろう。有効量は、１、２又はそれ以上の投薬量に適切な形で分け、指定された時間にわたり、１回、２回又はそれ以上の回数で投与してよい。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「十分量」は、それが十分な時間の間続けて存在し、処置レジメンの活性薬剤（例えば、ＰＥＧ化医薬品）を、その標的部位又は被験体の処置を必要とする部位（例えば、腫瘍部位又は虚血領域）へ送るのを助けるような、投薬時、及び必要な時間の間、処置レジメンの成分（例えば、抗ＰＥＧ抗体）のインビボ寿命を延長することについて所望の結果を達成するのに十分な量を指す。好ましい例において、十分量の抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、ＰＥＧ化医薬品（例えば、ＰＥＧ化抗がん剤又はＰＥＧ化抗虚血薬）により処置可能な疾患（例えば、がん又は虚血疾患）を患う被験体に投与され、ここで抗ＰＥＧ抗体は、単回の注射の後に少なくとも３日間被験体中に存在し続けた。
【００４４】
本明細書で用いられる用語「アジュバント」は、それだけでは治療効果を生じないが、治療薬剤を、被験体の、その意図される標的部位又は処置部位（例えば、虚血領域又は腫瘍）に送るのを助ける薬剤を指す。本開示の好ましい実施形態によれば、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、ＰＥＧ化医薬品（例えば、ＰＥＧ化抗がん剤又はＰＥＧ化抗虚血性薬）に対する、それを必要とする被験体を処置するための、アジュバントとしての役割を果たす。
【００４５】
用語「被験体」又は「患者」は、本発明の方法で処置可能な、ヒト種を含む動物を指す。用語「被験体」又は「患者」は、１つの性別が具体的に示されない限り、オス及びメスの両方の性別を指すと意図される。したがって、用語「被験体」又は「患者」は、本開示の処置方法から利益を得る可能性のある任意のほ乳類を含む。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「がん」は、任意の細胞悪性腫瘍を意味すると意図される。この細胞悪性腫瘍のユニークな特質は、未制御の増殖を引き起こす正常な制御の損失、分化の欠如及び局部組織に侵入し転移する能力である。がんは、任意の器官又は組織で進行することができ、乳がん、子宮頚部がん、卵巣がん、子宮内膜がん、メラノーマ、ぶどう膜黒色腫、脳腫瘍、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、神経上皮腫、腎臓がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、結腸がん、子宮がん、リンパ系の造血器腫瘍、骨髄性白血病、甲状腺がん、甲状腺濾胞がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉由来腫瘍、テラトカルシノーマ、神経芽細胞腫、グリオーマ、グリオブラストーマ、ケラトアカントーマ、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平上皮がん腫、濾胞樹状細胞がん腫、腸がん、筋肉浸潤性がん、精嚢腫瘍、表皮がん腫、脾臓がん、頭頸部がん、胃がん、骨がん、網膜のがん、胆道がん、小腸がん、だ液腺がん、子宮肉腫、睾丸のがん、結合組織のがん、前立腺肥大、骨髄形成異常、ワルデンストレームマクログロブリン血症、鼻咽頭、神経内分泌がん、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、食道胃、卵管がん、腹膜がん、乳頭状漿液性ミュラー管がん、悪性腹水、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、リー・フラウメニ症候群又はフォンヒッペル・リンダウ症候群（ＶＨＬ）のいずれかであってよい。リンパ系の造血器腫瘍は、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫のいずれかであってよい。骨髄性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）であってよい。間葉由来腫瘍は、線維肉腫又は横紋筋肉腫である。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「虚血性疾患」は、動脈の閉塞に通常起因する、心臓、四肢又は脳などの領域の血液供給の減少により特徴づけられる状態を意味すると意図される。典型的な虚血性疾患としては、脳卒中、心筋梗塞（ＭＩ）及び四肢虚血があるがこれらに限定されない。用語「四肢虚血」は、被験体の四肢の血流に影響を及ぼす状態を指し、これには慢性四肢虚血（ＣＬＩ）（これは重症四肢虚血へ進行し、遠位の四肢を切断の危険にさらす）、及び急性四肢虚血（これは組織を数時間内に損傷する血流の急速な損失を伴う）などがある。重症四肢虚血はしばしば糖尿病に関連し、血管系の障害及び組織損傷の悪化を引き起こす。別個の慢性状態、バージャー病（ＢＤ）は手足への血流を障害し、指及び足指の損失を引き起こすだろう。ＣＬＩ又はＢＤなどの四肢虚血は一般に、非外傷性切断の結果として、罹患四肢の損失を引き起こす可能性のある、四肢及び手足における創傷治癒の悪さ、潰瘍及び組織壊死を引き起こす。
【００４８】
２．  好ましい実施形態の詳細な説明
【００４９】
本開示は、少なくとも部分的に、ヒドロゲルが抗ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）抗体及び／又はＰＥＧ化治療剤を被験体の標的部位に少なくとも３日間保持することができ、それによりＰＥＧ化治療剤の複数回適用を、それを必要とする被験体に投与することを可能にする、という予期せぬ発見に基づく。被験体における抗ＰＥＧ抗体の継続的な存在は、ＰＥＧ化治療剤の複数回投薬を被験体に適用することを可能にするだけでなく、ＰＥＧ化治療剤をその標的部位（すなわち、処置を必要とする部位）に送るのを助け、結果として、従来の処置レジメンにおけるＰＥＧ化治療剤の単回の適用と比べて治療効果の改善が達成される。
【００５０】
したがって、本開示の一つの態様は、ＰＥＧ化治療剤をそれを必要とする被験体に投与する方法を提供する。この方法は、被験体に、ＰＥＧ化治療剤を投与する前、投与するのと同時、又は投与した後に、十分量の抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物を投与するステップを含み、ここで抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルは、混合物中に約１：１〜１：１００（ｖ／ｖ）の比で存在し、ヒドロゲルは、ヒアルロナン（ＨＡ）又はＨＡの誘導体、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、アルジネート、キトサン、フィブリノーゲンとトロンビンで作られているフィブリン糊、及び合成生体適合性ポリマーからなる群より選択され、ＰＥＧ化治療剤の少なくとも２回の適用は、各適用を約１時間〜１週間離して被験体に投与される。
【００５１】
好ましい実施形態によれば、ヒドロゲルは、ＨＡ又はＨＡの誘導体などの、天然起源のものである。ＨＡはヒアルロン酸としても知られ、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＤ−グルクロン酸の繰り返し二糖単位から成る、アニオン性、非硫酸化グリコサミノグリカンである。ＨＡは細胞外マトリクスの必須成分であり、免疫中立性多糖であると考えられている。したがって、ＨＡは数十年間、生物医学的用途において幅広く使用されてきた。様々な数の二糖類サブユニットは、２０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、好ましくは、５０ｋＤａ〜１，８００ｋＤａ、より好ましくは１００ｋＤａ〜１，７００ｋＤａの、様々な分子量のＨＡをもたらす。本開示の一つの好ましい実施形態において、ＨＡ又はその誘導体は、約１，５００ｋＤａの分子量を有する。
【００５２】
ヒアルロン酸の誘導体としては、ヒアルロン酸の部分的エステル又は全エステル、アジピン酸ジヒドラジド修飾ヒアルロナン、ヒアルロナンのアミド、架橋ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の重金属塩、硫酸化ヒアルロン酸、Ｎ−硫酸化ヒアルロン酸、アミン修飾ヒアルロン酸、ジアミン修飾ヒアルロン酸、及びヒアルロナン複合体（ヒアルロナンと絹の複合体、及び他の天然又は合成材料で架橋されたヒアルロン酸など）があるがこれらに限定されない。ヒアルロン酸の誘導体は、ヒアルロン酸の１又は複数の官能基（例えば、カルボン酸基、ヒドロキシル基、還元末端基、Ｎ−アセチル基）を化学的に修飾することにより及び／又は本技術分野において既知の方法を使用してヒアルロナンを他の分子で架橋することにより、得ることができる。
【００５３】
いくつかの例において、ヒドロゲルはフィブリン糊であり、これはフィブリノーゲンとトロンビンで作られ、ここでトロンビンは比較的短い時間で（例えば、１０〜６０秒間で）フィブリノーゲンをフィブリンモノマーに変換し、それにより三次元ゲル様構造を生じることが知られている。
【００５４】
他の実施形態によれば、ヒドロゲルは合成生体適合性ポリマーなどの合成起源のものであり、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリシアノアクリレート（ＰＣＡ）、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）（ＰＥＶＡ）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＧＣＬ）、及びポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）からなる群より選択してよい。
【００５５】
ヒドロゲルは、抗ＰＥＧ抗体が迅速に代謝されるのを妨げることにより、被験体における抗ＰＥＧ抗体の循環を延長するのを助けることができ、それ故に抗ＰＥＧ抗体及び次いでＰＥＧ化薬を、処置部位に、より長い期間保持することができる。本開示の実施形態によれば、抗ＰＥＧ抗体は、ヒドロゲル（ＨＡなど）のゲル様構造内に封入され、それ故に、被験体における抗ＰＥＧ抗体の寿命を少なくとも３日間に、例えば３、４、５、６又は７日間に延長する。被験体における抗ＰＥＧ抗体の存在の延長に起因して、ＰＥＧ化薬の、単回の投薬ではなく、複数回投薬（例えば、２、３、４、５又は６回投薬）を、被験体に投与し、それにより被験体において治療効果の改善をもたらすことができる。いくつかの例において、ＰＥＧ化薬の少なくとも２回の投薬が投与される。他の例において、ＰＥＧ化薬の少なくとも３回の投薬が投与される。ＰＥＧ化薬の各投薬は、約１時間〜１週間離して、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４時間離して、又は２、３、４、５、６、又は７日間離して、投与される。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ化薬の各投薬は、約４時間離して、例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４時間離して、又は２、３、４、５、６、又は７日間離して、投与される。他の実施形態によれば、より好ましくは、ＰＥＧ化薬の各投薬は、約８時間離して、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４時間離して、又は２、３、４、５、６、又は７日間離して投与される。さらなる実施形態によれば、ＰＥＧ化薬の各投薬は、約７日間離して、例えば７、８、９、１０、１１又は１２日間離して投与される。
【００５６】
抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルを、約１：１〜１：１００（ｖ／ｖ）、例えば約１：１〜１：５０（ｖ／ｖ）、又は１：１〜１：２０（ｖ／ｖ）の比で混合することにより調製する。好ましくは、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルは、約１：３（ｖ／ｖ）〜約１：５（ｖ／ｖ）、例えば約１：３（ｖ／ｖ）、約１：４（ｖ／ｖ）、又は約１：５（ｖ／ｖ）の比で混合される。より好ましくは、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルは、約１：４（ｖ／ｖ）の比で混合される。一般に、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、ＰＥＧ化薬に対するアジュバントとして使用される。これは、混合物はそれだけでは疾患の処置についてなんら治療効果を生じないが、ＰＥＧ化薬を被験体内のその標的部位へ保持する及び／又は送るのを助けるものである、ということを意味する。
【００５７】
したがって、混合物は任意のＰＥＧ化薬と共に使用することができ、ＰＥＧ化薬としては、Ｐｅｇａｓｙｓ（慢性肝炎Ｃ又はＢの処置用のＰＥＧ化インターフェロンアルファ２Ａ）、Ｐｅｇｉｎｓａｔｉｄｅ（透析を受けている成人患者における、慢性腎臓疾患に関連する貧血の処置用のＰＥＧ化薬）、Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ（痛風の処置用のＰＥＧ化ウリカーゼ）、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ（中等度から重度のリウマチ性関節炎、クローン病、又は炎症性胃腸疾患の処置用のＰＥＧ化モノクローナル抗体）、メトキシＰＥＧ−エポエチンベータ（慢性腎臓疾患に関連する貧血の処置用のＰＥＧ化エリスロポエチン）、Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ（新生血管加齢性黄斑変性の処置用）、Ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ又はＮｅｕｌａｓｔａ（重度のがん化学療法により誘発される好中球減少症の処置用のＰＥＧ化組換えメチオニルヒト顆粒球コロニー刺激因子）、Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｔｅ（先端巨大症の処置用のＰＥＧ−ヒト増殖ホルモンムテインアンタゴニスト）、ドキソルビシンリポソーム（がんの処置用のドキソルビシン含有ＰＥＧ化リポソーム）、Ｐｅｇａｓｐａｒｑａｓｅ（急性リンパ芽球性白血病の処置用のＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼ）、ウシＰｅｇａｄｅｍａｓｅ（重度の複合免疫不全症（ＤＳＩＤ）の処置用のＰＥＧ化アデノシンデアミナーゼ）；及びＰＥＧ化メカノ増殖因子（ＰＥＧ−ＭＧＦ）及びＰＥＧ化顆粒球コロニー刺激因子（ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ）などのＰＥＧ化抗虚血薬剤があるがこれらに限定されない。一つの好ましい実施形態において、ＰＥＧ化薬はＰＥＧ化ドキソルビシンリポソームである。別の好ましい実施形態において、ＰＥＧ化薬はＰＥＧ−ＭＧＦ及びＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの組み合わせである。
【００５８】
本開示の実施形態によれば、被験体に各適用で投与されるＰＥＧ化薬は、同一又は異なる治療剤である。さらに、ＰＥＧ化薬並びに抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、異なる部位に異なる経路を介して、それぞれ投与される。一つの例において、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物は、虚血領域（例えば、心筋梗塞部位）に筋肉内注射により直接投与され、一方でＰＥＧ化薬は、四肢（すなわち、腕又は脚）上の部位から静脈内に投与される。
【００５９】
具体的には、本開示は虚血疾患を患う被験体を処置する方法を提供する。この方法は、虚血疾患に関連する１又は複数の症候を改善するために、被験体に、十分量の本発明の混合物、及び少なくとも２回の独立した投薬で与えられ、各投薬が少なくとも８〜２４時間離して与えられる、虚血疾患を処置するための有効量のＰＥＧ化医薬品（例えば、ＰＥＧ化抗虚血薬剤）を、投与することを含む。
【００６０】
被験体は、ほ乳類、好ましくはヒトであってよく、虚血疾患は、脳卒中、心筋梗塞（ＭＩ）又は四肢虚血であってよい。一つの実施形態において、処置される虚血疾患はＭＩである。別の実施形態において、処置される虚血疾患は四肢虚血であり、この四肢虚血は、重症四肢虚血、急性四肢虚血又はバージャー病のいずれかであってよい。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化抗虚血薬剤は２回の独立した適用で投与される。他の実施態様において、ＰＥＧ化抗虚血薬剤は３回の独立した適用で投与される。
【００６２】
本開示はまた、がんを患う被験体を処置する方法を包含する。この方法は、がんに関連する１又は複数の症候を改善するために、被験体に、十分量の本発明の混合物、及び少なくとも２回の独立した投薬で与えられ、各投薬が少なくとも１週間離して与えられる、有効量のＰＥＧ化抗がん剤を投与することを含む。
【００６３】
被験体は、ほ乳類、好ましくはヒトであってよく、がんは、乳がん、子宮頚部がん、卵巣がん、子宮内膜がん、メラノーマ、ぶどう膜黒色腫、脳腫瘍、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、神経上皮腫、腎臓がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、結腸がん、子宮がん、リンパ系の造血器腫瘍、骨髄性白血病、甲状腺がん、甲状腺濾胞がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉由来腫瘍、テラトカルシノーマ、神経芽細胞腫、グリオーマ、グリオブラストーマ、ケラトアカントーマ、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平上皮がん腫、濾胞樹状細胞がん腫、腸がん、筋肉浸潤性がん、精嚢腫瘍、表皮がん腫、脾臓がん、頭頸部がん、胃がん、骨がん、網膜のがん、胆道がん、小腸がん、だ液腺がん、子宮肉腫、睾丸のがん、結合組織のがん、前立腺肥大、骨髄形成異常、ワルデンストレームマクログロブリン血症、鼻咽頭、神経内分泌がん、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、食道胃、卵管がん、腹膜がん、乳頭状漿液性ミュラー管がん、悪性腹水、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、リー・フラウメニ症候群又はフォンヒッペル・リンダウ症候群（ＶＨＬ）のいずれかであってよい。
【００６４】
リンパ系の造血器腫瘍は、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫のいずれかであってよい。骨髄性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）であってよい。間葉由来腫瘍は、線維肉腫又は横紋筋肉腫である。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化抗がん剤は、２回の独立した投薬で投与される。他の実施態様において、ＰＥＧ化抗がん剤は３回の独立した投薬で投与される。
【００６６】
本発明の混合物（すなわち、抗ＰＥＧ抗体及びヒドロゲルの混合物）は、ＰＥＧ化治療剤と同様に、ほ乳類、好ましくはヒトに、混合物及び／又はＰＥＧ化治療剤を適切な又は所望の作用部位に有効に輸送することのできる任意の経路により投与してよく、経路としては、経口、鼻、肺、経皮（受動的又はイオントフォレーシス送達など）、又は非経口（例えば、直腸、デポ、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、小脳内、点眼液又は軟膏）などがある。さらに、本発明の混合物は、ＰＥＧ化治療剤と共に、被験体の同一又は異なる部位に投与してよく、同時に又は連続的に投与してよい。
【００６７】
好ましくは、本発明の混合物は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、又は腹腔内注射により投与することのできる、滅菌溶液、又は懸濁液である、液体医薬組成物に製剤化してよい。一方で、ＰＥＧ化薬は任意の剤形であってよく、この剤形としては経口、非経口、鼻又は舌下投与のための固体又は液体剤形があるがこれらに限定されない。本発明の混合物の滅菌注射可能溶液又は懸濁液を製造するために適した希釈剤又は溶媒としては、１，３−ブタンジオール、マンニトール、水、リンガー溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液があるがこれらに限定されない。オリーブ油又はヒマシ油などの天然の医薬的に許容される油と同様に、オレイン酸などの脂肪酸及びそのグリセリド誘導体もまた、注射液の調製に有用である。これらの油溶液又は懸濁液は、アルコール希釈剤又はカルボキシメチルセルロース又は同様な分散剤を含有してもよい。医薬的に許容される剤形の製造において一般的に使用される、Ｔｗｅｅｎｓ又はＳｐａｎｓなどの他の一般的に使用される界面活性剤又は他の同様な乳化剤又は生物学的利用能エンハンサーもまた、製剤化の目的で使用することができる。経口投与は、液体又は固体組成物のいずれの形であってもよい。
【００６８】
適切な投薬は最終的には担当医師の裁量にあり、本発明の混合物の投薬は、選択された特定の抗ＰＥＧ抗体又はＰＥＧ化治療剤、投与の経路、及び患者において所望の応答を誘発するＰＥＧ化治療剤の能力のためだけでなく、因子、例えば、軽減されるべき状態の重症度又は病状、患者の体重、年齢、性別、患者の状態、及び処置される病的状態の重症度、同時の薬物治療又は次いで患者により守られる特別食、及び当業者が認識するであろう他の因子のために、患者によって異なるだろうということが理解されるであろう。投薬レジメンは、所望の応答を提供するように調整してよい。好ましくは、本発明の混合物は、ＰＥＧ化治療剤の少なくとも１回の投薬（例えば、２、３、４回又はさらに多くの回数の投薬、抗ＰＥＧ抗体が存在してＰＥＧ化治療剤を処置部位に送る限りにおいて）が、被験体に順次投与され、治療剤応答の改善を達成することができるような、量と時間で投与される。
【００６９】
本発明はここで、限定ではなく例示の目的で提供される以下の実施形態を参照し、より具体的に説明される。
【実施例】
【００７０】
実施例
【００７１】
材料及び方法
【００７２】
蛍光−コンジュゲートＡＧＰ４及びＨＡヒドロゲルの調製
【００７３】
以前に説明された手順（Ｓｕ，  Ｙ．  Ｃ．  ら、  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２０１０）  ２１、  １２６４−１２７０）にしたがい、メスＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＥＧ由来タンパク質で免疫化することにより、ＡＧＰ４（ＰＥＧに対するＩｇＭ  ｍＡｂ）を作製した。ＨＡ粉末（１，５００  ｋＤａ；  Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧｗｏｒｋｓ、Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ、ＮＣ、ＵＳＡ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、これを０．２２μｍフィルターを通して４℃でろ過して、２％（ｗ／ｖ）ＨＡヒドロゲルを形成した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）コンジュゲートＡＧＰ４を製造者の説明書にしたがって調製した。コンジュゲート比は４０：１（ｗ／ｗ）であった。次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−コンジュゲートＡＧＰ４及びＨＡ（比は１：４（ｖ／ｖ）であった）を混合し、４℃で穏やかに撹拌して、最終生成物、２％（ｗ／ｖ）ＨＡ−ＡＧＰ４ヒドロゲルを形成した。
【００７４】
サンドイッチＥＬＩＳＡ
【００７５】
サンドイッチＥＬＩＳＡを、以前に説明された手順（Ｓｕ，  Ｙ．  Ｃ．  ら、  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２０１０）  ２１、１２６４−１２７０）にしたがい実施した。簡単に述べると、５μｌ／ｍＬ  ＡＧＰ４−及び正常マウスＩｇＭ−コーティング済み（Ｊａｓｏｎ  Ｌａｂ、ＵＳＡ）プレートを調製し、次いで、希釈バッファー中の勾配のついた濃度のＰＥＧ−Ｑｄｏｔ  ８００及びＬｉｐｏ−Ｄｏｘ（５０μｌ／ウェル）を、コーティング済みウェルに、２時間室温で添加した。ＰＢＳ−Ｔ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で３回及びＰＢＳで２回洗浄した後、プレートを、５０μＬ／ウェルの検出抗体（５μｇ／ｍＬ  ３．３−ビオチン）で１時間、次いで０．５μｇ／ｍＬのＨＲＰ−コンジュゲートストレプトアビジンで１時間、室温で、連続的に被覆した。プレートをＰＢＳ−Ｔで６回、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＡＢＴＳ基質（０．４ｍｇ／ｍＬ  ２，２'−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）、０．００３％  Ｈ２Ｏ２、１００ｍＭ  リン酸塩クエン酸塩、ｐＨ４．０）を、３０分間室温で添加した。４０５ｎｍでのウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。
【００７６】
実験動物
【００７７】
動物研究を含む全ての手順は、実験動物委員会、アカデミアシニカによって承認された。成体メスＦＶＢマウスモデル（６〜８週齢、２５ｇ）を国立実験動物センターから入手した。簡単に述べると、手術及びインビボ測定の前に、全てのマウスをＺｏｌｅｔｉｌ（１２．５ｍｇ／ｋｇ；  Ｖｉｒｂａｃ、Ｃａｒｒｏｓ、１６２  Ｆｒａｎｃｅ）及びＲｏｍｐｕｎ（０．２ｍｌ／ｋｇ；  Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｋｉｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で麻酔した。
【００７８】
ナビゲートテスタメント（Ｎａｖｉｇａｔｅｄ  ｔｅｓｔａｍｅｎｔｓ）及び定量化
【００７９】
本開示の２％ＨＡ−ＡＧＰ４ヒドロゲルを、マウスの前側の３つの異なる位置に皮下注射（各部位につき５０μｌ）、又は右脚に筋肉内注射し（各部位につき５０μｌ、全容積：２００μｌ）、ＰＥＧ−Ｑｄｏｔ  ８００を静脈内注射により直ちに与えた。さらに、ＰＥＧ−Ｑｄ８００の３回投与を用いて、本開示の２％ＨＡ−ＡＧＰ４ヒドロゲルにより達成される再補充機能性を実証した。マウスを、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  スペクトル装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）及び対応するフィルターセットを用いてイメージングした。手動で描いた関心領域（ＲＯＩ）内の光子の数を計算することにより蛍光強度を決定した。対照群の組織自己蛍光を排除するように強度を調整した。
【００８０】
後肢虚血（ＨＬＩ）の動物モデル及び処置
【００８１】
マウスにおいて左大腿動脈及び腸骨動脈の結紮を実施し、次いで切断して後肢虚血を誘導することにより、ＨＬＩモデルを作製した（Ｌｉｍｂｏｕｒｇら、Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００９）  ４、１７３７−１７４８）。実験マウスへの投与を、３区分：ＰＥＧ−ＩＧＦ−１、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ、及び併用処置、に分けた。ＰＥＧ−ＩＧＦ−１及びＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの処置は、５群：Ｓｈａｍ、２％ＨＡ単独＋治療剤の処置をしたＨＬＩ、ＡＧＰ４を含むＨＡに続いてＰＢＳの処置をしたＨＬＩ、ＡＧＰ４を含むＨＡに続いて治療剤の処置をしたＨＬＩを含んでいる。併用処置は、３群：Ｓｈａｍ、ＨＡ／ＡＧＰ４とそれに続く併用治療剤、ＨＡ／ＡＧＰ４とそれに続くＰＢＳ、を含んでいる。２％ヒドロゲルを筋肉内注射した。ここで、注射を虚血領域の４部位に送達した（各部位につき５０μｌ、全容積：２００μｌ）。そしてＰＢＳ又は治療剤を静脈内注射によって連続的に送達した。
【００８２】
血流測定
【００８３】
毛細血管血流をレーザードップラーイメージャ（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＵＫ）で測定した。手術前の血流、１日後の血流、次の４週間の各週の血流を、両肢について、マウスを屠殺する前に記録した。データは、虚血肢（左）と正常肢（右）との血流比として提示される。
【００８４】
免疫蛍光染色
【００８５】
固定した遠位の腓腹筋及び大腿筋を、脱パラフィンし、再水和し、１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中で１０分間煮沸し、続いてトロポミオシン（ＤＨＳＢ、Ｉｏｗａ  ｃｉｔｙ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）、ＷＧＡ及びイソレクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）に対する抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、次いでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−又は５６８−コンジュゲート二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共にインキュベートした。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）での染色後、切片を共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ７００、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び蛍光顕微鏡下にマウントし観察した。境界域の毛細血管及び細動脈密度を測定し、各サンプル中の８つの無作為に選択した虚血領域（２００×倍率）から画像を取得し、各区画を手動で係数することにより定量化を実施し、８つの値を平均した。
【００８６】
後肢虚血（ＨＬＩ）後のマウスの臨床スコアづけ
【００８７】
以前に説明された手順（Ｌａｉ，  Ｃ．  Ｙ．  ら、  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （２０１３）  １５、５６４−５７３）にしたがい、異なる処置を受けた後のマウスの臨床スコアを取得した。臨床スコアを、マウスの活動及び後肢状態の毎日の観察に基いて推定した。スコアを、０（正常）、１〜３（筋萎縮）、４〜５（壊疽の発生）、６（四肢切断）の７段階に分類した。
【００８８】
統計的分析
【００８９】
全てのデータは、別段の指示がない限り平均±標準偏差として示される（インビトロスペクトル分析についてはｎ＝３、インビボナビゲートテスタメント（ｎａｖｉｇａｔｅｄ  ｔｅｓｔａｍｅｎｔｓ）についてはｎ＝６、後肢虚血性モデル及び処置についてはｎ＝８）。複数比較のために、ボンフェローニ調整による分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。Ｐ＜０．０５の確率値は統計的有意性を表すものとみなした。
【００９０】
例１  抗ＰＥＧ抗体及びＨＡの補助物を伴うＰＥＧ化化合物の複数回投与のための動物モデルの確立
【００９１】
１．１  抗ＰＥＧ抗体はＰＥＧ化化合物に特異的に結合する
【００９２】
この例では、ＰＥＧ化化合物（すなわち、ＰＥＧ化ＱＤｏｔ（ＰＥＧ−Ｑｄ８００））の抗ＰＥＧ抗体（すなわち、ＡＧＰ４）に対する結合プロファイル（図１Ａ）及び効率（図１Ｂ）を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによりそれぞれ決定した。
【００９３】
図１Ａに示されるように、ＰＥＧ−Ｑｄ８００は、非コーティングウェル（●）又は正常ＩｇＭ−コーティング済みウェル（■）と反応しなかった。対照的に、ＡＧＰ４−コーティング済みウェルでは投薬量に依存する吸光度読み取り値が見られた。ＰＥＧ−Ｑｄ８００の量が増加するにつれて、ＡＧＰ４−ＰＥＧ−Ｑｄ８００複合体（▲）の吸光度読み取り値も増加した。市販のＰＥＧ化リポソームドキソルビシン（ＰＥＧ−Ｌｉｐｏ）でも同一の効果が見られたが、読み取り値は濃度が１０ｎＭに到達した後飽和し始めた（▼）。ＩｇＭと比較すると、ＡＧＰ４抗体が、ＰＥＧ−Ｑｄ８００又はＬｉｐｏ−ＤＯＸのいずれにも、同様な結合効率で結合することが分かった（図１Ｂ）。
【００９４】
さらに、ＡＧＰ４（ＨＡヒドロゲルに封入されている）及びＰＥＧ化化合物からそれぞれ生じた蛍光シグナルが、インビトロ及びインビボの両方で、互いに独立していることが示された。ここで、Ａｌｅｘａ  ６４７染料−ラベル化ＡＧＰ４及びＰＥＧ−Ｑｄ８００の励起波長をそれぞれ６０５ｎｍ及び４６５ｎｍに設定した。
【００９５】
１．２  ＰＥＧ−Ｑｄ８００のインビボターゲティングプロファイル
【００９６】
この例では、ＰＥＧ化化合物（例えば、ＰＥＧ−ＱＤ）のインビボターゲティングプロファイルを調べた。ここで、ＨＡ／ＡＧＰ４の単回の投薬量を、単一マウスの体の３つの異なる位置に皮下注射した。次いで、１０分後に、尾静脈を介した静脈内注射によりＰＥＧ−Ｑｄ８００の投薬量を投与した（図２Ａ参照）。
【００９７】
ｓｈａｍ群及びＨＡ−単独群と比較して、ＡＧＰ４の蛍光シグナルは１日目から３日目まで見ることができたが、ＨＡ−単独群の蛍光シグナルは無視できるほど小さいままであった。対照的に、ＰＥＧ−Ｑｄ８００で処置したマウスについて、ＰＥＧ−Ｑｄ８００のシグナルは１日目から６日目まで見ることができたが、シグナルは時間の経過と共に徐々に減少した。さらに、ＨＡ−単独群とは異なり、ＡＧＰ４の存在は３つの皮下注射部位全てにおいて、ＰＥＧ−Ｑｄ８００のリクルートメント及び保持を強化した。ＨＡ−単独群において、皮下注射部位の１つで、ＰＥＧ−Ｑｄ８００が陽性に検出されたが、シグナルは２日目以降は見られなかった。ＨＡ／ＡＧＰ４及びＰＥＧ−Ｑｄ８００の検出された蛍光シグナルを、さらに定量化し、図２Ｂ及び２Ｃにそれぞれまとめた。
【００９８】
１日目、４日目及び７日目に単離された器官の蛍光分析により、他の器官と比べて、これら３つの日数のいずれにおいても、ＰＥＧ−Ｑｄ８００の大部分が肝臓に保持されることが明らかとなった（図２Ｄ）。各日間の差異が最小であっただけでなく、いずれの器官においても、ＨＡ−単独群とＨＡ／ＡＧＰ４群との間にも有意差はなかった。しかしながら、ＡＧＰ４を注射した部位（ＡＧＰ４＿部位）で有意差が認められた。ＨＡ−単独群と比較すると、注射部位におけるＨＡ／ＡＧＰ４の存在により、有意に高いレベルのＰＥＧ−Ｑｄ８００シグナルが１日目及び４日目の両方で検出される結果となった。生体内顕微鏡検査を利用することによりターゲティング能力も確認した。図２Ｅに示される結果は、ＨＡ／ＡＧＰ４ゲル又はＨＡゲル単独で処置したマウスからの蛍光シグナルが、ＦＩＴＣチャネルを介して観察でき、静脈内注射によるＰＥＧ−Ｑｄ６５５の投与１．５時間後に、ＨＡ／ＡＧＰ４群において、循環したＰＥＧ−Ｑｄは血管壁を貫通し、周囲に保持されることを示した。比較すると、ＨＡ単独群においては、ＰＥＧ−Ｑｄで処置してから１．５〜４時間後でさえ、ＰＥＧ−Ｑｄは血管内にとどまった。この結果は、ＨＡ単独群と比較し、ＨＡ／ＡＧＰ４処置がＰＥＧ−Ｑｄ６５５の蛍光強度を有意に強化することを示した（図２Ｆ）。
【００９９】
１．３  抗ＰＥＧ抗体及びＨＡの補助物を伴うＰＥＧ化化合物の複数回投与
【０１００】
この例において、抗ＰＥＧ抗体及びＨＡの補助物を伴うＰＥＧ化化合物（例えば、ＰＥＧ−Ｑｄ８００）の複数回適用を評価した。それ故に、抗ＰＥＧ抗体及びＨＡを伴うＰＥＧ−Ｑｄ８００の複数回注射後に、ＰＥＧ−Ｑｄ８００の蛍光シグナルを調べた。具体的には、０日目に、ＨＡ／ＡＧＰ４の単回の筋肉内注射をマウスの右脚に行い、続いて１回目のＰＥＧ−Ｑｄ８００の静脈内注射を行い、次いで２回目及び３回目のＰＥＧ−Ｑｄ８００の静脈内注射を次の２日間にそれぞれ行った。結果を図３に示す。
【０１０１】
図３Ａに示されるように、マウスの右脚へのＨＡ／ＡＧＰ４の筋肉内注射の後、注射は１回のみ行われたにもかかわらず、右脚筋肉組織におけるＡＧＰ４シグナルが３日目にも観察可能であった。同様に、ＰＥＧ−Ｑｄ８００の複数回注射の強い蛍光シグナルが３日目に見られたが、７日目には見られなかった。さらに、全３回の注射をするよう指定されたマウスは、他の２群と比較してより強いＰＥＧ−Ｑｄ８００のシグナルを示し、このシグナルは７日目でも見ることができるままであった。検出されたＰＥＧ−Ｑｄ８００シグナルを定量化することにより、３回の注射をしたマウスの群で測定された蛍光強度が、他の２群よりも有意に高いことが明らかとなった（図３Ｂ）。加えて、異なる日間での測定シグナルの差は、３回の注射をしたマウスでは有意ではなかった。この結果は、異なる日に投与された、有意な数のＰＥＧ−Ｑｄ８００が、ＨＡ／ＡＧＰ４注射部位の近傍に保持されることを示した。
【０１０２】
脚筋肉、並びに心臓、肝臓、肺、脾臓及び腎臓などの他の器官における、ＰＥＧ−Ｑｄ８００シグナルを評価することで、ＨＡ／ＡＧＰ４の生物学的意義がさらに証明された（図３Ｃ）。左脚筋肉と比較すると、右脚筋肉はＨＡ／ＡＧＰ４について強いシグナルを呈した。これは、右脚筋肉に注射されたＨＡ／ＡＧＰ４が、注射部位に注射後少なくとも７日目まで留まったことを示唆する。注射部位における強い蛍光シグナルにより、右脚におけるＰＥＧ−Ｑｄ８００の保持が証明されたが、いくらかのＰＥＧ−Ｑｄ８００が、循環に起因して、左脚筋肉で検出された。肝臓及び脾臓は別として、測定されたＰＥＧ−Ｑｄ８００シグナルは、右脚筋肉と比較して有意でないようである。このような結果は、ＰＥＧ−Ｑｄ８００で１回又は３回の注射をしたマウスから取り除かれた器官の定量分析においても見られた（図３Ｄ）。ＰＥＧ−Ｑｄ８００の１回又は３回の注射をしたマウスからの肝臓中で、強いシグナルが７日目に見られたが、残りの器官は、注射した右脚筋肉と比較して最小限のレベルのＰＥＧ化化合物を呈した。それ故に、この結果は、ＨＡ／ＡＧＰ４の投与が、有意な量の静脈内注射ＰＥＧ−Ｑｄ８００を、注射した部位に保持するのを助けることを示した。さらに、１回目と３回目の注射の間に右脚筋肉に検出された有意なレベルのＰＥＧ−Ｑｄ８００は、最初に注射されたＨＡ／ＡＧＰ４が、順次注射されたＰＥＧ−Ｑｄ８００を、注射した部位の近傍に保持し続けることができることを示す。
【０１０３】
７日目の組織レベルでのＰＥＧ−Ｑｄ８００の量を定量するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を、ＨＡ／ＡＧＰ４注射部位を包含する右脚筋肉の切片に対して実施した。３回注射したマウスとは対照的に、１回注射したマウスにおいて、より低いレベルのＰＥＧ−Ｑｄ８００染色が観察された（図３Ｄ）。さらに、ＨＡ／ＡＧＰ４で処置していない左脚筋肉（ｓｈａｍ）において、ＰＥＧ−Ｑｄ８００の染色は観察されなかった。図３Ｅに示されるように、各群の各マウスの注射部位におけるＰＥＧ−Ｑｄ８００の数を決定した。
【０１０４】
まとめると、この結果は、順次静脈内に注射されたＰＥＧ−Ｑｄ８００が、他の器官に分配されるのではなく、ＨＡ／ＡＧＰ４注射部位の近傍に実際に保持されるという事実を示した。
【０１０５】
例２  ＰＥＧ化インシュリン増殖因子−１（ＰＥＧ−ＩＧＦ−１）の複数回注射は、ＨＡ／ＡＧＰ４注射部位での細胞死を最小限にする
【０１０６】
ＨＡ／ＡＧＰ４注射部位に投与されるＰＥＧ化抗虚血性化合物の複数回注射が、虚血領域への血流を増加させること又は虚血領域を減少させることなどによって、虚血性傷害を改善するかどうかを検証するために、例１のＨＬＩ動物を、ＨＡ／ＡＧＰ４、及びＰＥＧ化化合物（例えば、ＰＥＧ−ＩＧＦ−１）又はビヒクルで処置した。そして、ＰＥＧ化化合物の虚血性傷害に対する効果を、レーザードップラーを用いて血流を検出することにより又は虚血領域をイメージングすることにより、モニターした。図４Ａは、本例のプロトコル及び処置レジメンを図示する概略図である。具体的には、後肢虚血傷害を発生させた後１日目にＨＡ及び抗ＰＥＧ抗体を投与した。そして、ＨＡ／ＡＧＰ４の投薬量投与の１０分後にＰＥＧ−ＩＧＦ−１の１回目の投薬量（３０μｇ）を試験動物に与え、ＨＬＩの後１日目にＰＥＧ−ＩＧＦ−１の２回目の投薬量を与え、続いて、ＨＬＩ後２日目にＰＥＧ−ＩＧＦ−１の投薬量を与えた。ＰＥＧ−ＩＧＦ−１の各投薬量を、８時間の間隔で連続的に与えたことに留意されたい。虚血領域における血流をモニターし続け、動物を最終的に屠殺し、虚血領域におけるアポトーシスレベルの推定のために、損傷した脚の筋肉を染色した。結果を図４Ｂ〜４Ｃに示す。
【０１０７】
ｓｈａｍ群と比較して、手術後に取得した血流画像は、虚血性脚をＨＡ−単独＋ＰＥＧ−ＩＧＦ−１又はＨＡ／ＡＧＰ４＋ＰＢＳで１日目又は２日目に処置した場合に、有意な改善が見られないことを明らかにした。しかしながら、ＨＡ−単独＋ＰＥＧ−ＩＧＦ−１及びＨＡ／ＡＧＰ４＋ＰＢＳ処置群において、爪変色の兆候があった。対照的に、このような現象は、ＰＥＧ−ＩＧＦ−１をＨＡ／ＡＧＰ４の処置の後に投与した併用処置群では明らかではなかった。このように、ＨＡ／ＡＧＰ４処置はＰＥＧ−ＩＧＦ−１注射後の虚血性脚での血流を改善しなかったが、虚血性損傷を最小限にした。
【０１０８】
ＩＧＦ−１は細胞生存を強化することが知られているため、虚血性脚筋肉のＨＡ／ＡＧＰ４注射部位で示されるアポトーシス細胞の数をＴＵＮＥＬアッセイにより決定した（図４Ｂ及び４Ｃ）。ＡＧＰ４の非存在下では、投与されたＰＥＧ−ＩＧＦ−１は、ＨＡ−単独群におけるアポトーシス細胞の数を減少させることができなかった。同様に、ＰＢＳの注射は、ＨＡ／ＡＧＰ４群における細胞生存を改善しなかった。対照的に、ＨＡ／ＡＧＰ４の投与後にＰＥＧ−ＩＧＦ−１で処置したマウスは、アポトーシス細胞の有意な減少を示した。このことは、本ＨＡ／ＡＧＰ４システムが、ＰＥＧ−ＩＧＦ−１の治療効果を延長するのを助けることができることを示唆する。
【０１０９】
この例の結果は、抗ＰＥＧ抗体の寿命を延長することにおけるＨＡの使用を肯定した。これはＰＥＧ化治療剤の複数回適用を、その処置を必要とする被験体に投与することを可能にする。
【０１１０】
例３  ＨＡ／ＡＧＰ４注射部位に保持されるＰＥＧ化顆粒球コロニー刺激因子（ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ）は、細胞リクルートメントを促進する
【０１１１】
この例では、別のＰＥＧ化化合物としてＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを使用し、ＨＡ／ＡＧＰ４注射部位でのその治療効果を例１のＨＬＩモデルを使用して評価した。虚血性傷害に対するＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの効果を、レーザードップラーを使用して血流を検出することにより、又は虚血領域をイメージングすることにより、モニターした。
【０１１２】
図５Ａは、この例のプロトコル及び処置レジメンを図示する概略図である。具体的には、後肢虚血傷害を発生させた後１日目にＨＡ又はＨＡ／ＡＧＰ４（すなわち、抗ＰＥＧ抗体）を投与した。そして、ＨＡ又はＨＡ／ＡＧＰ４の投薬量投与の１０分後にＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの１回目の投薬量を試験動物に与え、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの２回目の投薬量をＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの１回目の投薬量投与の２４時間後、２日目に与え、続いてＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの２回目の投薬量投与の後３日目にＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの３回目の投薬量を与えた。虚血領域における血流をモニターし続け、動物を最終的に屠殺し、虚血領域におけるリクルートメントされた細胞の密度の推定のために、損傷した脚の筋肉を染色した。結果を図５Ｂ〜５Ｃに示す。
【０１１３】
ＨＡ又はＨＡ／ＡＧＰ４単独での処置は、マウスの２日目及び４日目での虚血領域における血流の有意な増加を誘導できなかった。しかしながら、爪変色が、ＨＡ−単独＋ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ群及びＰＢＳ投与したＨＡ／ＡＧＰ４群において見られ、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ注射をしたＨＡ／ＡＧＰ４群においては見られなかった。
【０１１４】
ＨＡ／ＡＧＰ４注射部位で造血幹細胞（ＨＳＣ）及び内皮前駆細胞（ＥＰＣ）をリクルートメントするＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの能力も調べた（図５Ｂ及び５Ｃ）。ＨＡ−単独＋ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ群及びＨＡ／ＡＧＰ４＋ＰＢＳ対照と比較して、注射したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは、ＨＡ／ＡＧＰ４注射部位に存在するＨＳＣ（ＣＤ１３３）及びＥＣ（ＣＤ３４）の数を増加させた（白い矢印）。
【０１１５】
例４  ＰＥＧ化薬物の併用送達は、毛細血管形成を強化する
【０１１６】
ＰＥＧ−ＩＧＦ−１及びＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの治療的作用が互いに異なることを考え、両方のＰＥＧ化治療剤の、ＨＬＩマウスモデルのＨＡ／ＡＧＰ４注射部位への連続的送達の全体的な治療効果を調べることにした。
【０１１７】
図６Ａは、本例のプロトコルを図示する概略図であり、ここでＰＥＧ−ＩＧＦ−１及びＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦが、様々な時点で注射された。Ｓｈａｍ群及びＰＢＳ対照群と比較すると、両方の治療剤を注射したＨＡ／ＡＧＰ４群は、早くも１４日目に、血流の有意な改善を示した（図６Ｂ）。血流の有意差は、ＰＢＳ対照群と併用送達した群との間で、２１日目及び２８日目に見られ続けている。さらに、後者の群は、２８日目で、ｓｈａｍ群と同様の血流値を示した。ＰＢＳ対照群もまた２８日間を通して血流の改善を示したが、マウスは早くも７日目で筋萎縮の兆候を、そして２１日目で足指壊死の兆候を示した（図６Ｃ）。対照的に、併用送達したＨＡ／ＡＰＧ４群の足指の物理的外観は、ｓｈａｍ群と同様であった。
【０１１８】
併用送達がＨＡ／ＡＧＰ４注射部位の血流を改善したかどうかをさらに検証するために、その部位を包含する組織切片を、毛細血管の存在について染色した（図６Ｄ及び６Ｅ）。ｓｈａｍ群と同様に、併用送達群の組織切片の蛍光染色は、虚血性組織に多数の毛細血管を示した（白い矢印）。比較すると、ＰＢＳ対照群は、染色された組織に比較的少ない数の毛細血管を有した。
【０１１９】
上の例からの結果は、ＨＡ及び抗ＰＥＧ抗体を同時に被験体の意図される標的部位へ投与することが、抗ＰＥＧ抗体を処置部位により長い期間保持するのを助け、これがその後のＰＥＧ化薬の複数回適用（例えば、２〜３回適用）を被験体に送ることを可能にし、それにより治療効果を改善する、ということを確認するものである。
【０１２０】
実施形態の上記説明は単なる例示として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるであろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態は、あるの程度の具体性をもって、又は１又は複数の個別の実施形態を参照して上に説明されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。
【図１Ａ】
0006355842.tif 000002
【図１Ｂ】
0006355842.tif 000003
【図２Ａ】
0006355842.tif 000004
【図２Ｂ】
0006355842.tif 000005
【図２Ｃ】
0006355842.tif 000006
【図２Ｄ】
0006355842.tif 000007
【図２Ｅ】
0006355842.tif 000008
【図２Ｆ】
0006355842.tif 000009
【図３Ａ】
0006355842.tif 000010
【図３Ｂ】
0006355842.tif 000011
【図３Ｃ】
0006355842.tif 000012
【図３Ｄ】
0006355842.tif 000013
【図３Ｅ】
0006355842.tif 000014
【図４Ａ】
0006355842.tif 000015
【図４Ｂ】
0006355842.tif 000016
【図４Ｃ】
0006355842.tif 000017
【図５Ａ】
0006355842.tif 000018
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
0006355842.tif 000024
【図６Ｅ】
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