(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の大腸菌線毛大サブユニットの全体または免疫原性フラグメントから構成され、当該線毛大サブユニットのうちの１つは、同じ線毛型の大腸菌線毛小サブユニットに連結でき、2つ以上の当該線毛大サブユニットは、同じ線毛型の異なる大サブユニットタンパク質であると共にドナーβ鎖を包含し、前記線毛サブユニットは、ポリペプチドリンカーによって連結され、前記線毛大サブユニットのうちの１つが有するN末端は、隣接する線毛小サブユニットまたは線毛大サブユニットのＣ末端に連結され、Ｃ末端大腸菌線毛大サブユニットが、リンカーによって、隣接するＮ末端大サブユニットと同種または異種の大腸菌線毛大サブユニットに由来するＣ末端ドナーβ鎖に連結され、当該線毛型はクラス５ａ、クラス５ｂ、クラス５ｃ、およびＣＳ３で構成される群から選択される大腸菌に由来する線毛から選択され、当該構築物は、当該Ｃ末端でヒスチジンタグを含みうる、組み換えポリペプチド構築物。
【請求項２】
前記ドナーβ鎖は、１２〜１６個のアミノ酸を包含する、請求項１に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項３】
前記小および大サブユニットのうちの１つの前記Ｎ末端は、１８〜２２アミノ酸シグナルペプチドを包含する、請求項１に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項４】
前記ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列は、配列番号５またはトリグリシンである、
請求項１に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項５】
１つ以上の大サブユニットは、１４〜１８個のＮ末端アミノ酸の欠失を包含する、請求
項１に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項６】
前記構築物が、請求項１に従って１つ以上の他の構築物と連結され、当該構築物の各々は、前記連結された構築物の他のどの構築物とも異なる線毛型に由来する線毛サブユニットを包含し、当該線毛型はクラス５ａ、クラス５ｂ、クラス５ｃ、およびＣＳ３で構成される群から選択される大腸菌に由来する線毛から選択され、クラス５ａ、クラス５ｂ、クラス５ｃまたはＣＳ３に由来する前記１つ以上の構築物は、ポリペプチドリンカーによって、ＣＳ６に由来するさらに２つの線毛大サブユニットを含む構築物に連結されてよく、前記ＣＳ６線毛大サブユニットは、ドナーβ鎖を包含すると共に、ポリペプチドリンカーによって相互に連結される、請求項１に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項７】
前記Ｃ末端同種または異種ドナーβ鎖は、ポリペプチドリンカーによって、細菌毒素に連結されて、キメラ分子を形成し、当該細菌毒素は、細菌毒素多量体組成物に非共有的に結合している、請求項１に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項８】
前記大腸菌線毛小サブユニットは、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｓｂＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤおよびＣｏｔＤで構成される群から選択され、前記大サブユニットは、ＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｓｄＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡ、ＣｏｔＡ、ＣｓｔＧ、ＣｓｔＨ、ＣｓｓＡおよびＣｓｓＢ、これらの免疫原性フラグメント、およびこれらの誘導体で構成される群から選択される、請求項１に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項９】
１つ以上のグリシン残基によって連結されている、請求項６に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項１０】
前記ドナーβ鎖は、１２〜１６個のアミノ酸を包含する、請求項６に記載の組み換えポ
リペプチド構築物。
【請求項１１】
前記小および大サブユニットのうちの１つの前記Ｎ末端は、１８〜２２アミノ酸シグナ
ルペプチドを包含する、請求項６に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項１２】
１つ以上の前記大サブユニットは、１４〜１８個のＮ末端アミノ酸の欠失を包含する、
請求項６に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項１３】
前記大腸菌線毛小または大サブユニットは、クラス５、ＣＳ３およびＣＳ６で構成され
る群から選択されるＥＴＥＣ株に由来する、請求項６に記載の組み換えポリペプチド構築
物。
【請求項１４】
前記大腸菌線毛小サブユニットは、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、Ｃｓｂ
Ｄ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤおよびＣｏｔＤで構成される群から選択され、前記大サブユニッ
トは、ＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｓｄＡ、ＣｏｓＡ、
ＣｓｂＡ、ＣｏｔＡ、ＣｓｔＧ、ＣｓｔＨ、ＣｓｓＡおよびＣｓｓＢ、および、これらの
免疫原性フラグメントおよび誘導体で構成される群から選択される、請求項６に記載の組
み換えポリペプチド構築物。
【請求項１５】
前記リンカーのアミノ酸配列は、配列番号５またはトリグリシンである、請求項６に記
載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項１６】
前記細菌毒素は、コレラ毒素であり、前記多量体細菌組成物は、ＬＴＢ５であり、当該構築物は、配列番号３７、４１および４３で構成される群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記細菌毒素多量体組成物は、配列番号３９のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項１７】
前記大腸菌線毛小サブユニットの前記アミノ酸配列は、配列番号４５、４６、５１、５２、５７、５８、６５、７１、７５、７９、８３、８８、９０、９３、９５および９７、および、これらの誘導体で構成される群から選択され、前記大腸菌線毛大サブユニットの前記アミノ酸配列は、配列番号２、４、４８、４９、５４、５５、６０、６１、６３、６７、６９、７３、７７、８１、８５、８７、８９、９１、９２、９４、９６、９８、９９、１０１、１３５および１３７、および、これらの誘導体で構成される群から選択される、請求項８に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項１８】
前記小サブユニットは、配列番号４４、５０、５６、６４、７０、７４、７８、８２、１１５、１１７、１１９、１２２、１２４、１２７、１２９および１３３、および、これらの誘導体で構成される群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ、前記大サブユニットは、配列番号１、３、４７、５３、５９、６２、６６、６８、７２、７６、８０、８４、８６、１１６、１１８、１２０、１２１、１２３、１２５、１２６、１２８、１３０、１３１、１３２、１３４および１３６、および、これらの誘導体で構成される群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項８に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項１９】
配列番号３６、４０および４２で構成される群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ、前記細菌毒素多量体組成物は、配列番号３８のアミノ酸配列を有する、請
求項７に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項２０】
前記大腸菌線毛小サブユニットの前記アミノ酸配列は、配列番号４５、４６、５１、５２、５７、５８、６５、７１、７５、７９、８３、８８、９０、９３、９５および９７、および、これらの誘導体で構成される群から選択され、前記大腸菌線毛大サブユニットの前記アミノ酸配列は、配列番号２、４、４８、４９、５４、５５、６０、６１、６３、６７、６９、７３、７７、８１、８５、８７、８９、９１、９２、９４、９６、９８、９９、１０１、１３５および１３７、および、これらの誘導体で構成される群から選択される、請求項１４に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項２１】
前記小サブユニットは、配列番号４４、５０、５６、６４、７０、７４、７８、８２、１１５、１１７、１１９、１２２、１２４、１２７、１２９および１３３、および、これらの誘導体で構成される群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ、前記大サブユニットは、配列番号１、３、４７、５３、５９、６２、６６、６８、７２、７６、８０、８４、８６、１１６、１１８、１２０、１２１、１２３、１２５、１２６、１２８、１３０、１３１、１３２、１３４および１３６、および、これらの誘導体で構成される群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１４に記載の組み換えポリペプチド構築物。
【請求項２２】
ａ．緩衝水溶液中で、サブユニットワクチンとしてまたは適切な発現ベクターで発現されたものとして、請求項１または請求項７に記載の組み換えポリペプチド構築物のプライム投与量を１回以上投与し、
ｂ．緩衝水溶液中で、単位用量範囲が１μｇ〜１ｍｇの免疫原を用いて、プライム投与の少なくとも１週間後の初回投与でブースト投与量を１回以上投与し、免疫応答が誘発されることを特徴とする、  請求項１または請求項７に記載の構築物を含有する、哺乳動物に対する免疫応答誘発薬剤。
【請求項２３】
前記ベクターは、ＤＮＡプラスミド、ウイルスベクターまたは細菌である、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２４】
前記大腸菌線毛小または大サブユニットは、クラス５、ＣＳ３およびＣＳ６で構成される群から選択されるＥＴＥＣ株に由来する、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２５】
前記大腸菌線毛小サブユニットは、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｓｂＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤおよびＣｏｔＤで構成される群から選択され、前記大サブユニットは、ＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｓｄＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡ、ＣｏｔＡ、ＣｓｔＧ、ＣｓｔＨ、ＣｓｓＡおよびＣｓｓＢ、これらの免疫原性フラグメント、およびこれらの誘導体で構成される群から選択される、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２６】
前記リンカーは、配列番号５またはトリグリシンのアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２７】
前記ドナーβ鎖は、１２〜１６個のアミノ酸を包含する、組み換えポリペプチド構築物である、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２８】
前記小および大サブユニットのうちの１つの前記Ｎ末端は、１８〜２２個のアミノ酸シ
グナルペプチドを包含する、組み換えポリペプチド構築物である、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２９】
１つ以上の大サブユニットは、１４〜１８個のＮ末端アミノ酸の欠失を包含する、組み
換えポリペプチド構築物である、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３０】
前記大腸菌線毛小サブユニットの前記アミノ酸配列は、配列番号４５、４６、５１、５２、５７、５８、６５、７１、７５、７９、８３、８８、９０、９３、９５および９７、および、これらの誘導体で構成される群から選択され、前記大腸菌線毛大サブユニットの前記アミノ酸配列は、配列番号２、４、４８、４９、５４、５５、６０、６１、６３、６７、６９、７３、７７、８１、８５、８７、８９、９１、９２、９４、９６、９８、９９、１０１、１３５および１３７、および、これらの誘導体で構成される群から選択される、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３１】
前記小サブユニットは、配列番号４４、５０、５６、６４、７０、７４、７８、８２、１１５、１１７、１１９、１２２、１２４、１２７、１２９および１３３、および、これらの誘導体で構成される群から選択される核酸配列によってコードされ、前記大サブユニットは、配列番号１、３、４７、５３、５９、６２、６６、６８、７２、７６、８０、８４、８６、１１６、１１８、１２０、１２１、１２３、１２５、１２６、１２８、１３０、１３１、１３２、１３４および１３６、および、これらの誘導体で構成される群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３２】
前記免疫原性組成物は、皮下投与され、経皮投与され、筋肉内投与され、経口投与され、経皮的に投与され、または経鼻投与される、請求項２３に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌線毛成分を用いて毒素原性大腸菌に対する免疫応答を誘発する方法に関する。本方法は、安定化構築物に組み込まれる毒素原性大腸菌線毛大および小サブユニットを免疫原として利用することが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、物資が乏しい国の幼児およびこれらの地域への旅行者において下痢の主原因である（非特許文献１、非特許文献２）。ＥＴＥＣ関連の下痢は、小腸上皮細胞への細菌付着ならびに易熱性（ＬＴ）および／または熱安定性（ＳＴ）腸毒素の発現によってもたらされる（非特許文献３）。通常、ＥＴＥＣは、定着因子（ＣＦ）として知られている糸状細菌表面構造によって宿主細胞に付着する。今まで２０個を超える異なるＣＦが説明されているが、そのうちの少数は、明白に、病理発生の原因とみなされている（非特許文献４）。
【０００３】
説明する第一ヒト特異的ＥＴＥＣ  ＣＦである定着因子抗原Ｉ（ＣＦＡ／Ｉ）には、病理的役割についての証拠が存在する。ＣＦＡ／Ｉは、遺伝子的および生化学的特徴を共有する８つのＥＴＥＣ線毛からなる１つのファミリーの原型である（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。このファミリーは、大腸菌表面抗原１（ＣＳ１）、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９および推定定着因子Ｏ７１（ＰＣＦＯ７１）を含む。ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１およびＣＳ２をコードする遺伝子クラスターの完全ＤＮＡ配列は、公表されている（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。また、他の２つの関連線毛の大サブユニットの遺伝子も、報告されている（非特許文献１３、非特許文献１４）。（順番に）ペリプラズムシャペロン、線毛大サブユニット、外膜アッシャータンパク質および線毛小サブユニットをコードする、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１およびＣＳ２の４遺伝子生体組み立てオペロンが、同様にまとめられている。ＣＦＡ／Ｉの組み立ては、Ｉ型線毛形成の古典的シャペロン−アッシャー経路およびＩＶ型線毛などの他の糸状構造のそれとは異なる、代替シャペロン経路によって行われる（非特許文献１５、非特許文献１６）。線毛大サブユニットの一次配列に基づいて、ＣＦＡ／Ｉおよび関連線毛は、クラス５の線毛と分類された。
【０００４】
クラス５の線毛と異なり、大腸菌表面抗原３（ＣＳ３）は、ＥＴＥＣ定着因子抗原ＩＩ（ＣＦＡ／ＩＩ）複合体の共通付着微細繊維の代表である。これらの抗原を発現するＥＴＥＣは、世界の多くの地域で流行している。微細繊維を包含するＣＳ３の配座特性は、クラス５の微細繊維ほど解明されていないが、それらの構造が抗ＥＴＥＣ免疫防御を惹起する上で重要であることは予想される。同様に、大腸菌表面抗原６（ＣＳ６）（非特許文献１７）もＥＴＥＣ媒介下痢に関連して記述されている（非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１）。
【０００５】
ＣＳ１の研究は、クラス５線毛の組成および機能的特徴に関する詳細をもたらした（非特許文献２２）。ＣＳ１線毛柄は、繰り返しＣｏｏＡ大サブユニットで構成されている。ＣｏｏＤ小サブユニットは、線毛先端に限局されているとされ、線毛塊の非常にごく一部を構成し、線毛形成の開始に必要である（非特許文献２３）。大サブユニットが結合を媒介することを示唆する先行証拠に反して、研究結果は、小サブユニットを付着因子として暗示し、ＣＳ１およびＣＦＡ／Ｉ線毛のインビトロ付着に必要な特定のアミノ酸残基を同定した（非特許文献２５）。配列が決定されたそれら大サブユニットの推定一次アミノ酸構造は、広範な類似性を共有する。しかし、天然線毛の血清学的交差反応は限られており、交差反応のパターンは、大サブユニットの系統学的に定義されたサブ分類群と相関する（非特許文献２６）。
【０００６】
クラス５ＥＴＥＣ線毛の小サブユニットと大サブユニットの進化的関係および２つの集合タンパク質の進化的関係を調べる研究が行われた（非特許文献２７）。その結果、クラス５線毛の小サブユニットと大サブユニットの間に進化的区別が存在すること、および、小サブユニットが付着因子として働くこと、が明らかにされた。
【０００７】
ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７およびＣＳ１９の遺伝子クラスターの大サブユニット対立遺伝子は、各々、これまでにジェンバンク（GenBank）に預けられた遺伝子配列に対して、１対立遺伝子当たりわずか４つのヌクレオチドの差しかない、９９〜１００％のヌクレオチド配列同一性を示した。各遺伝子座は、ＣＦＡ／Ｉクラスシャペロン、大サブユニット、アッシャーおよび小サブユニットとの相同性を持つタンパク質をコードした４つの読み取り枠（open reading frame）を有する。既に報告された通り（非特許文献２８）、１つの例外はＣＳ１４遺伝子クラスターに対するものであり、このＣＳ１４遺伝子クラスターはシャペロン遺伝子の下流に２つの縦列読み取り枠を包含していた。それらの予測タンパク質配列は、互いに９４％のアミノ酸同一性を共有し、両方ともに他のクラス５線毛大サブユニットと同種である。
【０００８】
クラス５線毛生合成に関わる全てのタンパク質ホモログの推定アミノ酸配列の検査は、多くの基本的な類似性を明らかにする。属を超えて、一般に、各組のホモログは、ポリペプチドの長さ、質量および理論的等電点に関して類似の物理化学的特性を共有する。関係するタンパク質はすべて、ＩＩ型分泌経路によってプリペラズムへの転座を促進するアミノ末端シグナルペプチドを包含する。大サブユニットタンパク質はいずれもシステイン残基を包含していないが、６つのシステイン残基の数と位置は、ペスト菌ホモログ３８０２の小サブユニットを除く全ての小サブユニットについて保存されている。ペスト菌ホモログ３８０２は、これら６つの残基のうちの４つのみを包含する。
【０００９】
１型およびＰ型線毛は、古典的シャペロン−アッシャー経路（２３、２４、２５）によって組み立てられる線毛の遺伝子的および構造的詳細を解明するのに有用なモデルになっている。１型およびＰ型線毛に対する研究の成果（非特許文献２９、非特許文献３０、非特許３１）は、ドナー鎖相補性の原理、つまり、線毛サブユニットが重要な欠失β鎖の反復サブユニット間共有によって隣接サブユニットと非共有結合的に結合する方法、の開発につながった（非特許文献３２、非特許文献３３）。
【００１０】
８つのＥＴＥＣクラス５線毛は、メンバー数３（ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ４およびＣＳ１４）、メンバー数４（ＣＳ１、ＰＣＦＯ７１、ＣＳ１７およびＣＳ１９）ならびにメンバー数１（ＣＳ２）の３つのサブクラス（それぞれサブクラス５ａ、５ｂおよび５ｃと呼ばれる）に分かれた（２１）。以前の報告は、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４およびＣＳ１９を有するＥＴＥＣが培養Ｃａｃｏ−２細胞への付着を示すことを明らかにした（６、２２）。しかし、ＣＦＡ／ＩおよびＣＳ１の成分サブユニットのどれが付着を媒介するかに関して、相反するデータが発表された（１９、２０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開 20060153878号 公報
【特許文献２】米国特許出願 11/340,003 号公報
【非特許文献】
【００１２】
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【非特許文献２】Huilan, et al., Bull. World Health Organ. 69:  549-55 (1991)
【非特許文献３】Nataro and Kaper, Clin. Microbiol. Rev. 11:  142-201 (1998)
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【非特許文献５】Evans, et al., Infect. Immun., 12:  656-667 (1975)
【非特許文献６】Gaastr and Svennerholm, Trends Microbiol., 4:  444-452 (1996)
【非特許文献７】Grewal, et al., Infect. Immun., 65:  507-513 (1997)
【非特許文献８】Froehlich, et al., Mol. Microbiol., 12:  387-401 (1994)
【非特許文献９】Froehlich, et al., Infect. Immun., 63:  4849-56 (1995)
【非特許文献１０】Perez-Casal, et al., Infect. Immun. 58:  3594-3600 (1990)
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【非特許文献１３】Gaastra, et al., Int. J. Med. Microbiol. 292:  43-50 (2002)
【非特許文献１４】Grewal, et al., Infect. Immun. 65:  507-513 (1997).
【非特許文献１５】Ramer, et al., J. Bacteriol., 184:  3457-65 (2002)
【非特許文献１６】Soto and Hultgren., J. Bacteriol., 181:  1059-1071 (1999)
【非特許文献１７】Tobias, et al., Vaccine., 26:  5373-5380 (2008)
【非特許文献１８】Gaastra and Svennerholm., Trends Microbiol., 4:  444-452 (1996)
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【非特許文献２０】Sack, et al., Vaccine, 25:  4392-4400 (2007)
【非特許文献２１】Al-Gallas, et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 77:  571-582 (2007)
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【非特許文献３０】Sauer, et al., Science, 285:  1058-1061 (1999)
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【非特許文献３３】Viboud, et al., Microb. Athogen, 21:  139-147 (1996)
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【非特許文献３６】Svennerholm, et al., Infect. Immun. 58:  341-346 (1990)
【非特許文献３７】Zavialov, et al., FEMS Microbiol. Rev. 31:  478-514 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、毒素原性大腸菌線毛サブユニットを発現する組み換えポリペプチド構築物に関する。その組成物は、ＥＴＥＣ株に対する免疫原性組成物として有用である。
【００１４】
好適な一実施形態では、組成物は、同じＥＴＥＣ線毛型に由来する大または小サブユニットが、ポリペプチドリンカーによって連結され、ドナー鎖相補性によって安定化している、組み換えポリペプチド構築物設計を含む。Ｃ末端最ＥＴＥＣ大サブユニット（C-terminal most ETEC major subunit）は、リンカーによって、Ｃ末端大サブユニットと同種あるいは異種でありうるＥＴＥＣ大サブユニットのドナー鎖領域に連結されている。免疫原性組成物は、ＥＴＥＣ線毛大または小サブユニットの、ドナーβ鎖領域を包含する、全体または免疫原性フラグメントを含みうる。構築物のいくつかの実施例では、不注意によるサブユニットの会合（特にＣＳ６サブユニットにおいて互いに）を防止するため、ＥＴＥＣ線毛大サブユニットは、１４〜１８個のＮ末端アミノ酸の欠失を包含しうる。
【００１５】
他の実施形態では、１つ以上の上記構築物がポリペプチドリンカーによって連結されて、複数の線毛型に由来するサブユニットが発現される分節融合構築物を形成している。この実施形態では、線毛サブユニットは、クラス５ａ、５ｂまたは５ｃを含むＥＴＥＣクラス５線毛型、ＥＴＥＣ  ＣＳ３およびＥＴＥＣ  ＣＳ６を含む、しかしこれらに限定されない、任意のＥＴＥＣ線毛型に由来しうる。
【００１６】
実施される分節構築物は、他のモノマーまたはマルチマーとの望ましくない会合を防止するために、また、プロテアーゼ切断を減らすためにポリペプチド間のアミノ酸配列長を短くするために、１つ以上の線毛サブユニットのＮ末端領域の欠失を包含しうる。
【００１７】
組み換えポリペプチド構築物をコードするＤＮＡを用いてサブユニットワクチンなどの免疫原性組成物に封入されるポリペプチドを発現することができ、または、組み換えポリペプチド構築物をコードするＤＮＡを、ＤＮＡプラスミド、ウイルス発現または細菌ベクターなどの適切な発現系に挿入することができる。このように、本発明の目的は、ＥＴＥＣ株に対して、ヒトを含む哺乳動物に免疫を与えるために、当該構築物を利用することも含む。実施される利用は、サブユニットワクチンとして、あるいは、生ワクチンなどの適切な発現系に挿入される分子構築物から発現されるものとして、１つ以上の免疫原性組成物の１回以上のプライム投与を含む。プライム投与の後に、サブユニットワクチンとしてまたはＤＮＡプラスミド、ウイルスもしくは細菌発現ベクターに挿入される組み換え構築物として発現される構築物の１回以上のブースト投与が続きうる。
関連出願の相互参照
【００１８】
本願は、２００５年１月１１日提出の米国仮出願第６０／６４２，７７１号の優先権を主張する２００６年１月１０日提出の米国非仮出願第１１／３４０，００３号の一部継続出願であり、かつ、２００６年１月１１日提出の仮出願第６０／７５８，０９９号の優先権を主張する２００７年１月１１日提出の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０００７１２の国内段階の一部継続出願であり、これらの内容は参照により組み込まれている。また、本願は、２０１２年１１月１９日提出の米国仮出願第６１／７２７，９４３号の優先権をも主張し、この内容も参照により組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】同じＥＴＥＣ線毛型に由来する大または小サブユニットが、ポリペプチドリンカーによって連結され、ドナー鎖相補性によって安定化している、本発明の構築物設計を示す図である。当該構築物は、Ｎ末端サブユニットのＮ末端領域の欠失を包含しうる。この特徴は、他のモノマーまたはマルチマーとの望ましくない会合を防ぐ。また、前記欠失は、ドメイン折り畳み（domain folding）に関わらないポリペプチド間のアミノ酸配列長を短くし、また、サブユニット間のプロテアーゼ切断の可能性をなくしたり低くしたりもする。Ｃ末端サブユニットは、ポリペプチドリンカーによってサブユニットに連結されたドナーβ鎖によって安定化している。前記ドナーβ鎖は、このドナー鎖が安定化させるサブユニットと同じサブユニットとして定義される同種のサブユニットに由来し、あるいは、やはり同じ線毛型とは異なるサブユニットに由来するものとして定義される異種のサブユニットに由来する。
【図２】図１に示す組成物が複数のポリペプチドリンカーによって連結されている分節構築物設計を示す図である。第１サブユニットは、ＥＴＥＣ線毛大または小サブユニット（例えば、ＥＴＥＣクラス５付着因子）である。そして、１つ以上のＥＴＥＣ線毛大サブユニットが、リンカーによって、第１サブユニットに互いに連結されている。サブユニットは、ドナー鎖相補性によって安定化している。Ｃ末端最ＥＴＥＣ大サブユニットは、リンカーによって、その末端大サブユニットと同種あるいは異種でありうるＥＴＥＣ大サブユニット由来のドナー鎖領域に連結されている。構築物のいくつかの実施例では、不注意によるサブユニットの会合（特にＣＳ６サブユニットにおいて互いに）を防止するため、ＥＴＥＣ線毛大サブユニットは、１４〜１８個のＮ末端アミノ酸の欠失を包含しうる。折り畳み（folding）に関わらないアミノ酸配列長の欠失は、タンパク質分解の可能性も低くする。
【図３】使用される株の系統発生関係を示す図である。
【図４】原型ｄｓｃＣｆａＥ（ＣｆａＥ）付着因子と比較した付着因子−ピリン融合体の免疫原性の亢進。パネルＡは、ＣＦＡ／Ｉ−ＥＴＥＣ（上段）、ＣＳ１４−ＥＴＥＣ（中段）およびＣＳ４−ＥＴＥＣ（下段グラフ）に対する血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）力価を示す。パネルＢは、ＣＦＡ／Ｉ（上段）、ＣＳ１４（中段）およびＣＳ４（下段）の線毛に対する血清ＩｇＧ力価を示す。ここで留意すべきは、各パネルの中段および下段のグラフは、対応する上段のグラフとｙ軸の目盛りが異なることである。グラフのラベルに示すタンパク質の名前の省略表現および対応するフルネームは、次の通りである。ＣｆａＥ，ｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６；ＣｆａＥＢ，ｄｓｃ１９ＣｆａＥ−ＣｆａＢ［Ｈｉｓ］６；ＣｆａＥＢ−ＣｓｕＡ２，ｄｓｃ１５ＣｆａＥＢ−ＣｓｕＡ２−［Ｈｉｓ］６；ＣｆａＥＢ−ＣｓｕＡ２−ＣｓｆＡ，ｄｓｃ１５ＣｆａＥＢ−ＣｓｕＡ２−ＣｓｆＡ［Ｈｉｓ］６；ｍＬＴ，ＬＴＲ１９２Ｇ。
【図５】ｄｓｃＣｏｔＤ（ＣｏｔＤ）付着因子と比較したクラス５ｃ付着因子−ピリン融合体の免疫原性の亢進。パネル（Ａ）は、ＨＡＩ力価を示す。パネル（Ｂ）は、抗ＣＳ２  ＩｇＧ反応を示す。
【図６】ｄｓｃＣｓｂＤ（ＣｓｂＤ）付着因子と比較したクラス５ｂ付着因子−ピリン融合体の免疫原性の亢進。パネル（Ａ）は、ＨＡＩ力価を示す。パネル（Ｂ）は、抗ＣＳ１または抗ＣＳ１７  ＩｇＧ反応を示す。
【図７】ウサギにおけるＣＳ６構築物の免疫。示すのは、ＣＳ６、ｄｓｃＣｓｓＢまたはｄｓｃＣｓｓＡ抗原投与後の血清ＩｇＧ力価である。
【図８】ＣＳ６単量体、ヘテロ二量体およびホモ二量体投与後のマウスにおける免疫の比較。
【図９】ＣｓｔＨの非共有結合オリゴマー（３〜１４個のサブユニット）（ＣｓｔＨ（ｉ）として示す）と比較したｄｓｃＣｓｔＨの血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）力価および血清反応性。ＣｓｔＨ（ｉ）は、インテインＣｓｔＨ融合産物から切断された付着インテイン（「ｉ」）の捕獲によって分離された。
【図１０】ＣｓｔＧのオリゴマー（３〜１４個のサブユニット）（ＣｓｔＧ（ｉ）として示す）と比較したｄｓｃＣｓｔＧの血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）力価および血清反応性。
【図１１】多量体ドナー鎖相補ＣｓｔＨの免疫およびＨＡＩ応答。同図において、Ｈ＝ｄｓｃＣｓｔＨ、Ｈ２＝ｄｓｃＣｓｔＨ２、Ｈ３＝ｄｓｃＣｓｔＨ３、Ｈ４＝ｄｓｃＣｓｔＨ４、Ｈ５＝ｄｓｃＣｓｔＨ５。
【図１２】安定化ＣＳ３ベースのヘテロ二量体および四量体に対する免疫応答。免疫応答は、ＣＳ３−ＥＴＥＣに対する血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）（パネルＡ）および血清ＩｇＧ抗ＣＳ３力価（パネルＢ）によって測定され、最後の投与（４２日目）後２週間経った血清に対して示されている。
【図１３】図１の構築物設計を利用したＣＳ３分節タンパク質構築物の実施例。
【図１４】図１の構築物設計を利用したＣＳ６分節タンパク質構築物の実施例。
【図１５】クラス５ＥＴＥＣ線毛型つまりＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡおよびＣＳ３線毛型つまりＣｓｔＧＨからのサブユニットを含む分節融合体ＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡ−ＣｓｔＧＨが線毛型の免疫原性効果を保持することを示すデータの概要。グラフのラベルに示すタンパク質の名前の省略表現および対応するフルネームは、次の通りである。ＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡ，ｄｓｃ１５ＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡ［Ｈｉｓ］６；ＣｓｔＧＨ，ｄｓｃ１６ＣｓｔＧＨ（Ｈｉｓ）６；ＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡ＋ＣｓｔＧＨ，ＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡとＣｓｔＧＨの混合物；ＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡ−ＣｓｔＧＨ，分節融合体ｄｓｃ１４ＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡ−ｎｔｄ１８ｄｓｃ１６ＣｓｔＧＨ（Ｈｉｓ）６
【図１６】構築物の混合物に対するＣＳ３融合構築物の免疫原性の比較。ｘ軸に記載されたグループは、表９に説明されている。同図において、「Ｆｕ」＝融合体、「Ａｄ」＝混合物、黒棒は１００ｎｇのｍＬＴを投与した場合、白棒はｍＬＴなしにワクチンを投与した場合。
【図１７】構築物の混合物に対するＣＳ３融合構築物例のＨＡＩ力価の比較。ｘ軸に記載されたグループは、表９に説明されている。
【図１８】クラス５ＥＴＥＣ線毛型つまりＣｆａＥＢおよびＣＳ６線毛型つまりＣｓｓＢＡからのサブユニットを含む分節融合体ＣｆａＥＢ−ＣｓｓＢＡが線毛型の免疫原性効果を保持することを示すデータの概要。パネル（Ａ）は、ＣＦＡ／ＩおよびＣＳ１４に対するＨＡＩ力価を示す。パネル（Ｂ）は、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ６およびＣｆａＥに対するＩｇＧ力価を示す。グラフのラベルに示すタンパク質の名前の省略表現および対応するフルネームは、次の通りである。ＣｆａＥＢ，ｄｓｃ１９ＣｆａＥＢ［Ｈｉｓ］６；ＣｓｓＢＡ，ｄｓｃ１６ＡＣｓｓＢＡ（Ｈｉｓ）６；ＣｆａＥＢ＋ＣｓｓＢＡ，ＣｆａＥＢとＣｓｓＢＡの混合物；ＣｆａＥＢ−ＣｓｓＢＡ，分節融合体ｄｓｃ１４ＣｆａＥＢ−Ｇ−ｄｓｃ１６ＡＣｓｓＢＡ（Ｈｉｓ）６
【図１９】抗ＣＳ６線毛サブユニットＩｇＧ免疫応答。ｘ軸は、図１９の表に示すように投与された抗原を表す。色の濃い棒は、ＣｓｓＢに対する応答を表し、色の薄い棒は、ＣｓｓＡ抗原に対する応答を示す。したがって、これらの棒は、成分ＣＳ６線毛サブユニットＣｓｓＢまたはＣｓｓＡに対するＩｇＧ応答を示す。同図において、全てのマウスは、図１９に示すように、１００ｎｇのｍＬＴを包含する投与を受けたが、例外として、数匹のマウスは、同図に示すように、ＣｆａＥＢ−ＣｓｓＢＡ（またはＣｓｓＡＢ）構築物を受けた。
【図２０】抗ＣＳ６線毛サブユニットＩｇＡ免疫応答。各棒は、図１９に示すように免疫性を与えられたマウスからのマウス血清の貯留を表す。マウスは、真っ白な棒を除き、１００ｎｇのｍＬＴを包含する投与を受けた。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ここで使用する用語「ポリペプチド（polypeptide）」、「ペプチド（peptide）」および「タンパク質（protein）」は、交互に使用可能であり、２つ以上のアミノ酸残基から成るポリマーを指す。ここで、２つ以上のアミノ酸残基は、天然アミノ酸である。用語「アミノ酸配列（amino acid sequence）」は、ポリペプチド中のアミノ酸の順序を指す。ここで使用されるように、「オリゴマー（oligomer）」は、比較的少ないアミノ酸を含むポリペプチド配列である。
【００２１】
ここで使用する用語「組み換えポリペプチド（recombinant polypeptide）」、「組み換えペプチド構築物（recombinant polypeptide construct）」または「組み換えタンパク質（recombinant protein）」は、遺伝子組み換え技術によって作られた、つまり、所望のポリペプチドまたは所望のタンパク質をコードする外来性ＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞から作られたポリペプチドまたはタンパク質を指す。用語「組み換え構築物（recombinant construct）」は、組み換えポリペプチド、組み換えペプチド構築物または組み換えタンパク質をコードするＤＮＡを指す。
【００２２】
用語「ドナー鎖（donor strand）」または「ドナーβ鎖（donor β strand）」は、ドナー鎖相補性において他のＥＴＥＣ線毛サブユニットと会合するＥＴＥＣ線毛サブユニットのＮ末端領域を指す。
【００２３】
用語「免疫原性組成物（immunogenic composition）」は、タンパク質またはポリペプチド、および、体液性および／または細胞性免疫反応を誘導する他の構築物を含む製剤を指す。用語「免疫原性範囲（immunogenic coverage）」または「範囲スペクトル（spectrum of coverage）」は、その「範囲」下における特定の細菌株に対する体液性および／または細胞性免疫反応の誘導を指す。用語「免疫原性フラグメント（immunogenic fragment）」は、１つ以上のＢまたはＴ細胞エピトープを包含するポリペプチドを指し、免疫反応を誘導しまたはＴまたはＢ細胞によって認識されるのに十分な長さである。用語「誘導体（derivative）」は、同定された遺伝子の配列と少なくとも８０％一致するポリペプチドまたは核酸配列を指す。本文脈において、「一致（identity）」は、最大限対応するように配列された場合に、同じ、または、同じアミノ酸残基を所定割合有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。ある配列が同類置換、つまり、残基を同一の特性と置換するという点で異なる場合、配列の一致度を上方に調整して置換の保存的性質を修正しうる。類似度は、同一および類似（保存変化）残基の割合を指す。
【００２４】
「線毛（fimbria）」は、ＥＴＥＣ細菌上の突起またはフィラメントとして定義され、ＣＳ３およびＣＳ６線毛の場合のように大サブユニットから構成され、または、クラス５ａ、５ｂおよび５ｃＥＴＥＣの場合のように大および小サブユニットから構成されている。「微細繊維（fibril）」は、細菌からの狭い突起である。ＣＳ３およびＣＳ６線毛は、その狭い特徴により、微細線毛とも称されうる。用語「線毛サブユニット（fimbrial subunit）」は、ＥＴＥＣ線毛を含むタンパク質を指し、「ピリン（pilin）」と同じ意味で使用される。したがって、「ピリン」は、ＥＴＥＣ線毛を含む「大（major）」または「小（minor）」「線毛サブユニット」を指しうる。「線毛小サブユニット（minor fimbrial subunit）」は、クラス５ＥＴＥＣ線毛の先端にある付着因子タンパク質を指し、「大」サブユニットと比較して化学量的に少量で発現される。「線毛小サブユニット」は、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤを含むがこれらに限定されない。「線毛大サブユニット（major fimbrial subunit）」は、「線毛小サブユニット」と比較して、ＥＴＥＣ線毛において化学量的に大量に表されるＥＴＥＣ線毛タンパク質を指す。「線毛大サブユニット」は、ＥＴＥＣクラス５タンパク質ＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ２、ＣｓｕＡ１、ＣｏｏＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｄＡ、ＣｓｂＡ、ＣｏｔＡ、ＥＴＥＣ  ＣＳ３タンパク質ＣｓｔＨ、ＣｓｔＧ、およびＥＴＥＣ  ＣＳ６タンパク質ＣｓｓＡ、ＣｓｓＢを含む。ここでは「融合体（fusion）」は、共有的に結合された２つの分子として定義される。したがって、「付着因子−ピリン（adhesin-pilin）」融合体は、クラス５付着因子に共有的に結合されたＥＴＥＣ線毛大または小サブユニットである。
【００２５】
用語「線毛型（fimbrial type）」は、異なるＥＴＥＣ型の線毛に由来する線毛タンパク質を指す。本願で使用する、異なる「線毛型」は、ＣＳ６（ＣｓｓＡおよびＣｓｓＢを含む）、ＣＳ３（ＣｓｔＨおよびＣｓｔＧを含む）、ＥＴＥＣクラス５ａ、ＥＴＥＣクラス５ｂおおびＥＴＥＣクラス５ｃ線毛を含むがこれらに限定されない。
【００２６】
用語「同種サブユニット（homologous subunit）」は、当該サブユニットが連結されるサブユニットと同一の型であるサブユニットとして定義される。用語「異種サブユニット（heterologous subunit）」は、当該サブユニットが連結されるサブユニットと異なるサブユニットであるが同じＥＴＥＣ線毛型に由来するサブユニットを指す。
【００２７】
本発明は、免疫原性組成物に使用される組み換えポリペプチド構築物に関し、また、毒素原性大腸菌に対する免疫応答を誘発するために前記組成物を利用する方法に関する。本発明の組成物は、複数のＥＴＥＣ線毛型からのＥＴＥＣ線毛サブユニットを組み込む構築物設計を利用する。線毛型は、幅広いＥＴＥＣ免疫を取得するために、クラス５ａ、５ｂ、５ｃならびにＣＳ３およびＣＳ６を含むがこれらに限定されない。前記構築物は、ドナー鎖相補性によって、ＣＳ３およびＣＳ６などのサブユニットの会合、ならびに、タンパク質分解からのサブユニットの安定化をも可能にする。
【００２８】
図１は、基本的な組み換えポリペプチド構築物設計を示している。図１に示すように、当該構築物設計は、同じＥＴＥＣ線毛型に由来し、ポリペプチドリンカーによって連結され、かつ、ドナー鎖相補性によって安定化している、大または小サブユニットを含む。当該構築物は、Ｎ末端サブユニットのＮ末端領域（「ｎｔｄ」）の欠失を包含しうる。この特徴は、他のモノマーまたはマルチマーとの望ましくない会合を防ぐ。Ｎ末端領域の欠失の大きさは、１４〜１８個のアミノ酸である。
【００２９】
Ｃ末端サブユニットは、ポリペプチドリンカーによってサブユニットに連結されたドナーβ鎖に連結され、かつ、このドナーβ鎖によって安定化している。このドナーβ鎖は、隣接サブユニットに由来し（つまり、同種）、あるいは、同じ線毛型の異なるサブユニットに由来する（つまり、異種）。Ｎ末端ドナー鎖の大きさは、線毛型および安定化サブユニットに依存する。好適な実施形態では、クラス５線毛サブユニットに対して、安定化クラス５サブユニットのＮ末端領域に由来するドナーβ鎖は、１２〜１６個のアミノ酸である。好適な一実施形態では、ＣＳ３およびＣＳ６サブユニットに対して、ドナーβ鎖は、１４〜１６個のアミノ酸である。
【００３０】
図２は、図１に示す組成物が複数連結されて、２つ以上の線毛型を含む組み換えポリペプチド構築物を形成する、基本的な分節構築物を示している。図１に示すように、同じ線毛型からの大または小サブユニットが、ポリペプチドリンカー配列によって連結されている。当該分節構築物では、図１に示すように、２つ以上の構築物が、ポリペプチドリンカーによって連結されている。
【００３１】
当該分節構築物設計では、基本的設計に示すように（図１と図２を比較する）、第１サブユニット（Ｎ末端）は、ＥＴＥＣ線毛大または小サブユニットである。各追加サブユニットは、分子成分の自由な回転を許容するポリペプチドリンカーによって隣接サブユニットに連結される。サブユニットは、ポリペプチドリンカーによって安定化サブユニットのＣ末端に連結されたドナーβ鎖によってＣ末端隣接サブユニットからドナー鎖相補性に関連しこれによって安定化している。いくつかの実施形態では、サブユニットは、Ｎ末端から１４〜１８個のアミノ酸の欠失を包含しうる。加えて、特定の構築物は、１８〜２２個のアミノ酸のシグナルペプチドの有無にかかわらず、また、Ｃ末端におけるヒスチジンタグの有無にかかわらず、構築されうる。
【００３２】
当該分節構築物では、同じ線毛型からのサブユニットは、直接連結される。そして、同じ線毛型からのサブユニットのグループが、他の線毛型からのサブユニットの他のグループに連結される。線毛型は、ＥＴＥＣクラス５ａ、５ｂ、５ｃ、ＣＳ３およびＣＳ６を含むがこれらに限定されない。例えば、単一の構築物は、クラス５ａ、５ｂ、５ｃ、ＣＳ３およびＣＳ６線毛型のうちの任意の２つ以上に由来するサブユニットを含みうる。
【００３３】
複数のリンカー配列を個々のサブユニットの連結に利用しうる。特定のリンカーの例には、配列番号５のテトラペプチドが含まれる。他の例は、トリグリシンリンカー（つまり、Ｇ−Ｇ−Ｇ）を含む。本発明の構築物では、代表的なクラス５ａ、５ｂ、５ｃ付着因子に対してシスドナー鎖相補性（in cis donor strand complementation）を利用して付着因子および付着因子−ピレン融合体を安定化する。クラス５の小サブユニット（つまり、付着因子）と大サブユニットの系統発生関係の概要は、図３に示されている。
【００３４】
目的の組成物は、ＥＴＥＣ株のカバー範囲をできるだけ広くできるように作られる。そのようなものとして、一実施形態では、目的の組成物および利用は、クラス５ａ、５ｂ、５ｃＥＴＥＣ、および、ＣＳ３またはＣＳ６線毛成分を発現するＥＴＥＣ株、に対する免疫原性応答を誘発することを目的としている。
実施例１：組み換え抗ＥＴＥＣ構築物
【００３５】
ＥＴＥＣ付着因子に対する免疫は、ＥＴＥＣ細菌の定着を減少させる上で重要である。しかし、ＥＴＥＣクラス５の、ＥＴＥＣ細菌の腸管腔への接触部位である、小サブユニット（つまり、付着因子）は、大サブユニットに比べて化学量的に非常に少数で表される。したがって、免疫原性組成物においては、通常は天然線毛にない免疫認識を超えて小サブユニットの免疫認識を高めることが重要である。
【００３６】
ＣｆａＥなどの線毛サブユニットは線毛構造の外側で比較的タンパク質分解を起こしやすいため、付着因子の安定化も重要である。したがって、構築物は、ドナー鎖相補性によって誤った折り畳み（misfolding）および分解から安定化したＥＴＥＣサブユニットを発現するように作られる。ドナーβ鎖は、線毛大サブユニットによって提供される。例えば、ＣｆａＥの場合、安定化は、ＣｆａＢのＮ末端領域によって提供される。ドナーペプチド鎖をＣＦＡ／Ｉ大サブユニットＣｆａＢのＮ末端からそのＣ末端で取り込むことによるｄｓｃＣｆａＥの工学により、不溶性の扱いにくい天然組み換えタンパク質を安定な免疫原性組成物に形質転換した（特許文献１）。この内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００３７】
ｄｓｃＣｆａＥは、その原子構造に基づいて、２つの半バレル（half-barrel）で構成され、Ｎ末端付着因子ドメイン（ＣｆａＥａｄ）短いαヘリックスコネクタおよびＣ末端ピリンドメイン（ＣｆａＥｐｄ）を含む、天然のβサンドイッチ立体構造に折り畳まれる。その分子は、ウシおよびヒトの赤血球のＭＲＨＡを直接媒介する点で機能的であり、免疫電子顕微鏡法に関してＭＲＨＡを抑制しＣＦＡ／Ｉ線毛の先端を飾るように作用する中和抗体を生成する。
【００３８】
融合タンパク質は、ＣｆａＥなどの小サブユニットの３’末端に、ＣｆａＢなどのＥＴＥＣ付着因子の成熟構造大サブユニットのコード配列の遺伝子を挿入することによって操作された。この概念は、特許文献２に開示された。この内容は、参照により本明細書に組み込まれている。この分子は、ＣＦＡ／Ｉ線毛の３つのドメイン（つまり、ａｄ、ｐｄおよび大サブユニット）を全て、天然線毛で見られる割合（約１：１：１０００）ではなく、１：１：１の割合で含む。
【００３９】
多くの観測が、ワクチン抗原としてのｄｓｃＣｆａＥ（ＥＴＥＣ株Ｅ７４７３からクローンとして作られた）の適合性を示している。まず、さまざまな地理的起源および血清型のＥＴＥＣ分離株からのｃｆａＥの３１個の異なる野生型対立遺伝子のシークエンシング（sequencing）は、遺伝子および予測ポリペプチド配列がほとんど不変であり、これら３１個の対立遺伝子のうちのたった５つについてそれぞれ１部位で３つの異なる非同義ヌクレオチド置換があることを示している（非特許文献３４）。したがって、標的タンパク質は、天然ＥＴＥＣ細菌集団の均一性を示している。
【００４０】
さらに、ＣｆａＥつまりクラス５ａ線毛付着因子は、他のクラス５ａ小サブユニットタンパク質付着因子である、ＣＳ１４線毛のＣｓｕＤおよびＣＳ４線毛のＣｓｆＤと、８０〜８１％同一である。ＣｓｕＤおよびＣｓｆＤは９４％の同一性を共有する。これは、他のクラス５ｂおよび５ｃ線毛付着因子との平均同一性（平均５０％の同一性）よりもかなり高い。
また、ウサギ抗ｄｓｃＣｆａＥ血清は、血球凝集反応試験（ＨＡＩ）においてＣＳ４およびＣＳ１４ＥＴＥＣと交差中和する。数多くのワクチン接種の研究が、小動物（ウサギとマウス）および大型動物（サルとウシ）において、さまざまな投与経路とアジュバンド組み合わせを用いて実施され、ｄｓｃＣｆａＥが、ｄｓｃＣｆａＥを認識する全身性抗体および粘膜抗体を誘導しうる強力な免疫原であり、（ＨＡＩによって測定されたように）中和していることを示した。
【００４１】
一実施形態は、図１に示す構築物設計に基づく抗クラス５ＥＴＥＣ構築物を含む。その構築物設計によって、Ｎ末端サブユニットは、表１に示す、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｓｄＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤを含む、ＥＴＥＣクラス５小サブユニット（つまり、付着因子）である。このＥＴＥＣクラス５小サブユニットは、ポリペプチドリンカーによって、同じＥＴＥＣクラス５型からの、表１に示す、１つ以上のＥＴＥＣ大サブユニットに連結されている。ポリペプチドリンカーは、多数のポリペプチドサイズのどれであってもよい。好適な一実施形態では、リンカーは、配列番号５のポリペプチド配列を有するテトラペプチドである。Ｃ末端クラス５サブユニットは、同種のサブユニットに由来するドナーβ鎖に連結され、典型的には１２〜１９個のアミノ酸である。別の実施形態では、１つ以上の大サブユニットは、当該サブユニットのＮ末端領域から１２〜１６個のアミノ酸の欠失を含みうる。
【００４２】
図１の設計は、安定化クラス５ＥＴＥＣ付着因子を提供するためにドナー鎖相補性を含む、特許文献２に開示された概念を利用している。ＥＴＥＣクラス５の小サブユニットおよび大サブユニットの相同性のために、図１は、さらに、表１の線毛サブユニット、または、これらポリペプチドの誘導体もしくはＤＮＡ配列、を取り込む複数の構築物が考慮されている。
【００４３】
【表１】
0006403680.tif 000002
【００４４】
図１に示す構築物設計は、特許文献２のドナー鎖相補性安定化の特徴を組み込んでおり、これを、特定のＥＴＥＣ型からの複数の大サブユニットを単一の付着因子−ピリン構築物に取り込むことによって、さらに進展させている。例えば、複数のクラス５ｂ大サブユニットを、クラス５ｂ付着因子（つまり、小サブユニット）に連結することができる。実施形態は、ＣｓｂＤ（ＥＴＥＣクラス５ｂ線毛付着因子）およびＣｏｔＤ（ＥＴＥＣクラス５ｃ線毛付着因子）を包含する付着因子−ピリン構築物を含む。説明のために、クラス５ａ、５ｂおよび５ｃを表す、付着因子−ピリンＥＴＥＣクラス５の付着因子−ピリン構築物の実施形態の実施例が、表２に示されている。
【００４５】
【表２】
0006403680.tif 000003
【００４６】
クラス５構築物（つまり、表２に記載された付着因子−ピリン）の免疫原性検査が実施された。これらの研究の結果は、原型ｄｓｃＣｆａＥ（ＣｆａＥ）付着因子と比較して付着因子−ピリン融合体の免疫原性の亢進を示している。この結果は、図４に示されている。
これらの研究では、５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループに、アジュバンドＬＴＲ１９２Ｇ（つまり、ｍＬＴ、１００ｎｇ）と同時投与されるモル当量用量（各ピリンサブユニットを５μｇ包含するように規格化された投与量）で各タンパク質を皮内投与した。マウスは、３回、０日目、１４日目および２８日目に投与された。表示された力価は、４２日目に採取された血清からのものである。
【００４７】
図４に示すように、パネルＡは、ＣＦＡ／Ｉ−ＥＴＥＣ（上段）、ＣＳ１４−ＥＴＥＣ（中段）およびＣＳ４−ＥＴＥＣ（下段グラフ）に対する血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）力価を示す。ＣＳ１４−ＥＴＥＣおよびＣＳ４−ＥＴＥＣに対するＨＡＩ力価の上昇は、それぞれ、ＣＳ１４（ＣｓｕＡ２）およびＣＳ４（ＣｓｆＡ）ピリンの添加と一致する。パネルＢは、ＣＦＡ／Ｉ（上段）、ＣＳ１４（中段）およびＣＳ４（下段）の線毛に対する血清ＩｇＧ力価を示す。ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１４およびＣＳ４に対する血清抗線毛力価の増大は、それぞれ、ＣＦＡ／Ｉ（ＣｆａＢ）、ＣＳ１４（ＣｓｕＡ２）およびＣＳ４（ＣｓｆＡ）ピリンの添加と一致する。各組み換えタンパク質は、シスドナー鎖相補性によって安定化された。
【００４８】
同様の結果がＣｓｂＤおよびＣｏｔＤ付着因子について説明され、その結果は図５に示されている。図５は、原型ｄｓｃＣｏｔＤ（ＣｏｔＤ）付着因子と比較したクラス５ｃ付着因子−ピリン融合体の免疫原性の亢進を示している。図５に示す付着因子−ピリンタンパク質では、ＣＳ２ピリン（ＣｏｔＡ）は、ｄｓｃＣｏｔＤのＣ末端に融合しており、各成分タンパク質は、シスドナー鎖相補性によって安定化している。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループに、各タンパク質を２５μｇ鼻腔内投与し、アジュバンドＬＴＲ１９２Ｇ（１．５μｇ）を同時投与した。マウスは、３回、０日目、１４日目および２８日目に投与された。表示された力価は、４２日目に採取された血清からのものである。パネルＡは、ＣＳ２−ＥＴＥＣに対する血清血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）力価を表示している。ＣＳ２ピリンの添加は、より高い相同ＨＡＩ力価の誘発に関係している。パネルＢは、ＣＳ２線毛に対する血清ＩｇＧ力価を示している。図５には、血清抗線毛ＩｇＧ力価の増大が示されており、ＣＳ２（ＣｏｔＡ）ピリンの添加と一致している。データは、幾何平均力価＋標準誤差として表示されている。各グラフの水平の点線は、検査の検出限界を示している。グラフのラベルに示すタンパク質の名前の省略表現および対応するフルネームは、次の通りである。ＣｏｔＤ，ｄｓｃ１９ＣｏｔＤ（Ｈｉｓ）６；ＣｏｔＤＡ，ｄｓｃ１５ＣｏｔＤ−ＣｏｔＡ［Ｈｉｓ］６。
【００４９】
図６は、表２に示す構築物の例「ｄｓｃ１４ＣｓｂＡＣｓｂＤ−ＣｓｂＡ−ｎｔｄ１５ｄｓｃ１４ＣｏｏＡＣｏｏＡ」の応答を示している。図５の場合と同様に、図６は、原型ｄｓｃＣｓｂＤ（ＣｓｂＤ）付着因子と比較したクラス５ｂ付着因子−ピリン融合体の免疫原性の亢進を示している。２つのクラス５ｂ付着因子−ピリンタンパク質では、次のクラス５ｂピリン成分を、ｄｓｃＣｓｂＤ；ＣＳ１７ピリン（ＣｓｂＡ）とＣＳ１ピリン（ＣＯＯＡ）とに連続して融合させた。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループに、各タンパク質を２５μｇ鼻腔内投与し、アジュバンドＬＴＲ１９２Ｇ（１．５μｇ）を同時投与した。マウスは、３回、０日目、１４日目および２８日目に投与された。表示された力価は、４２日目に採取された血清からのものである。パネルＡは、（上から下のパネルへ）ＣＳ１７−ＥＴＥＣ、ＣＳ１９−ＥＴＥＣ、ＣＳ１−ＥＴＥＣ、ＰＣＦＯ７１−ＥＴＥＣおよびＣＦＡ／Ｉ−ＥＴＥＣに対する血清血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価を表示している。４つのクラス５ｂ線毛のそれぞれを発現するＥＴＥＣの全てに対して同じようなＨＡＩ力価の上昇が誘発された。同時に、最も大きな融合体であるｄｓｃＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡも、異種クラス５ａ線毛ＣＦＡ／Ｉを発現するＥＴＥＣに対してＨＡＩの上昇を誘発した。パネルＢは、ＣＳ１７線毛（上段）およびＣＳ１線毛（下段）に対する血清ＩｇＧ力価を示している。ＣＳ１７およびＣＳ１に対する血清抗線毛価の増大は、それぞれ、ＣＳ１７（ＣｓｂＡ）およびＣＳ１（ＣｏｏＡ）ピリンの添加と一致している。データは、幾何平均力価＋標準誤差として表示されているが、例外として、ＣＳ１９−ＥＴＥＣおよびＰＣＦＯ７１−ＥＴＥＣ  ＨＡＩについては、グループプール血清から単一の値が得られた（重複ランの平均）。各グラフの水平の点線は、検査の検出限界を示している。グラフのラベルに示すタンパク質の名前の省略表現および対応するフルネームは、次の通りである。ＣｓｂＤ，ｄｓｃ１９ＣｓｂＤ（Ｈｉｓ）６；ＣｓｂＤＡ，ｄｓｃ１５ＣｓｂＤ−ＣｓｂＡ［Ｈｉｓ］６；ＣｓｂＤＡ−ＣＯＯＡ，ｄｓｃ１５ＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡ［Ｈｉｓ］６。各組み換えタンパク質は、シスドナー鎖相補性によって安定化された。
実施例２：ＣＳ６およびＣＳ３
【００５０】
ウサギモデル（ＲＩＴＡＲＤ）の研究は、定着因子ＣＳ６およびＣＳ３が免疫防御能を持つことを示唆している（非特許文献３５、非特許文献３６）。従って、重要な技術目標は、ＣＳ６に向けられた付着因子に対して抑制的である抗体反応を最大限に誘発するＣＳ６抗原を発現する組み換え構造を発現する安定化ＣＳ６を再現することである。
クラス５ＥＴＥＣ線毛とは異なり、線毛構造は、モノ付着因子ではなくポリ付着因子として機能しうる（非特許文献３７）。関連線毛から推定して、ＥＴＥＣ  ＣＳ６とＣＳ３の集合体は、ドナー鎖相補性媒介プロセスによって、ＣＳ６またはＣＳ３サブユニットを隣接サブユニットのＮ末端ドナー鎖領域に会合させることを通じて、もたらされうる。さらに、誤った折り畳みおよびタンパク質分解に対する防御も、ドナー鎖相補性によって与えられうる。
ＣＳ６およびＣＳ３のモノマーの会合は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）における変性状態および非変性状態の下でサブユニットタンパク質を可視化することによって評価した。ＣＳ６とＣＳ３の両方のモノマーに対して、変性状態の下でタンパク質は、予想されたサイズで移動した。非変性状態の下では、多様なサイズ（つまり、はしご様（ladders））が、サブユニットの多重結合によって形成されているのが見える。
ＣＳ６線毛
【００５１】
ＣＳ６線毛は、ＣｓｓＡおよびＣｓｓＢを含む。２つのＣＳ３大サブユニットはポリペプチド配列の変化が皆無かほとんど見られないのに対して、ＣＳ６タンパク質では適度の変化が観察される。例えば、９０％を超える同一性がＣＳ６タンパク質ＣｓｓＡで見られ、９５％を超える同一性がＣｓｓＢアロタイプで見られる。両方のＣＳ６構造タンパク質は、比較的低い変化（つまり、９０％を超えるアミノ酸保存）を示すが、ＣｓｓＡの変化はより大きく、突然変異はＣｓｓＡポリペプチドに沿ってランダムに分布している。
【００５２】
ワクチン製剤への封入に適切である有効な免疫原性組成物を設計するために、数多くの基準が適切な構築物を決定するために考案された。これらには、不要な自己会合または組み立てなしに構造を維持する能力、熱安定性、およびＣＳ６を用いた免疫付与によって誘発される抗体値と同レベルの抗ＣＳ６  ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体値を生成する能力が含まれていた。
【００５３】
単量体ＣＳ６サブユニット集合体は、上記のように、隣接ＣＳ６サブユニットからドナー鎖によって媒介されるように見える。これらの安定構造を形成する相互作用は、ドナー鎖相補性によるサブユニット間の相互作用によってもたらされると仮定される。ドナー鎖相補性は、誤った折り畳みおよびタンパク質分解に対する防御も与える。したがって、好適な実施形態では、多量体ＣＳ６構築物は、ドナー鎖相補性のこのような属性を活用するために開発された。さらに、多量体の発現は、モノマーの産生よりも効率的な製造を提供する。
【００５４】
ＣｓｓＡおよびＣｓｓＢ単量体は、表３に示すように、同様の熱安定性を示す。しかし、表３に示すように、ＣｓｓＡまたはＣｓｓＢの二量体は、一般に、より大きな構造よりも熱的に安定している。さらに、ＣｓｓＡとＣｓｓＢの両方を含む多量体は、一般に、ホモ多量体（つまり、単にＣｓｓＡまたはＣｓｓＢを含む）よりも熱的に安定していた。さらには、ＣｓｓＡに対するＮ末端であるＣｓｓＢサブユニットを有する多量体構築物は、一般に、ＣｓｓＢに対するＣｓｓＡ  Ｎ末端を包含する構築物よりも熱的に安定していた。
【００５５】
【表３】
0006403680.tif 000004
【００５６】
表３に示す結果から、具体化された構築物は、１つ以上の、ＣＳ６サブユニットＣｓｓＡおよびＣｓｓＢ、または、対立遺伝子変異もしくは誘導体を有する多量体ＣＳ６を含む。構築物の設計構成は、図１に示されている。好適な一実施形態では、構築物は、ＣｓｓＡに対するＣｓｓＢ  Ｎ末端を有する、ＣｓｓＢおよびＣｓｓＡの二量体（つまり、ＣｓｓＢ−ＣｓｓＡ）を含む。
【００５７】
図１または図２に示すように、ＣＳ６サブユニット会合は、シスドナーβ鎖相補性によって安定化している。ドナー鎖相補性は、テトラペプチドリンカーによって、ＣＳ６サブユニットをそのＣ末端で、他のＣＳ６サブユニットのドナーβ鎖領域に結合することによって与えられる。リンカーは、多くのポリペプチド領域のいずれでもよい。しかし、好適な一実施形態では、リンカーは、配列番号５にあるようなものまたはトリグリシンリンカーのいずれかである。末端ＣＳ６サブユニットの場合、安定化は、そのＣ末端で連結され同種または異種ＣＳ６サブユニットからのドナーβ鎖によって提供される。同種サブユニットは、同じ形態（例えば、ＣｓｓＡまたはＣｓｓＢ）の２つのサブユニットとして定義される。異種サブユニットは、異なる形態をしている（例えば、一方はＣｓｓＡに由来し、他方はＣｓｓＢに由来する）。ＣＳ６ドナーβ鎖は、典型的には、ＣＳ６サブユニットのＮ末端１４〜１６アミノ酸領域である。組み換えタンパク質は、一般にＣ末端上にあるヘキサヒスチジン親和性タグの有無にかかわらず、構築することができる。
【００５８】
さらに、望ましくない非共有結合オリゴマー形成をもたらす分子会合を形成する組み換えポリペプチド構築物を防止するために、Ｎ末端ＣＳ６サブユニットのＮ末端１４〜１６アミノ酸が削除される。例示として、「ｄｓｃＢ１４ＣｓｓＢＡ」は、構築物のＣ末端で挿入される、ＣＳ６  ＣｓｓＢからの、異種ドナー鎖（つまり、「ｄｓｃ」）を含む。この場合、ドナー鎖は、「１４」で示されるように、長さが１４個のアミノ酸である。同様に、構築された指定「ｎｔｄ１５ｄｓｃＡＣｓｓＢＡ」は、構築物のＣ末端で同種ドナー鎖を含み、また、Ｎ末端アミノ酸領域（「ｎｔｄ」と呼ばれる）の欠失をも含む。
【００５９】
構築物の例は、配列番号２（ＣｓｓＡ）もしくは配列番号４（ＣｓｓＢ）またはこれらのポリペプチドの誘導体で構成される群から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＳ６サブユニットを含む。ＣｓｓＡのＤＮＡ配列は、配列番号１であり、ＣｓｓＢのＤＮＡ配列は、配列番号３である。サブユニットは、ポリペプチドリンカー配列によって連結される。好適な一実施形態では、リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列を有するテトラペプチドである。
【００６０】
さまざまな単量体（図７）および二量体（図８）ＣＳ６構築物による免疫応答の評価がなされた。図７では、一グループ当たり２匹のウサギを用いて、８４日間にわたって２８日毎にウサギに免疫を与えた。動物には、フロイントアジュバント（Freund’s adjuvant）に、ＣＳ６、ｄｓｃＣｓｓＡまたはｄｓｃＣｓｓＢのいずれかを、４００μｇプライム投与し、３回２００μｇずつブースト投与した。動物は、０日目、１４日目、４２日目、７０日目、９８日目、１０５日目に採血した。図７に示すように、ＣＳ６は、高い同種抗体力価および高い抗ＣＳ６（つまり、ＣｓｓＡまたはＣｓｓＢ）サブユニット力価を誘発する。ドナー鎖安定化ＣｓｓＢ（ｄｓｃＣｓｓＢ）によるウサギの免疫付与は、高い抗ＣＳ６および抗ＣｓｓＢ力価をもたらした。しかし、ｄｓｃＣｓｓＡによる免疫付与は、ＩｇＧの、やや低い抗ＣＳ６力価および中レベルの抗ＣｓｓＡ力価を誘発した。
【００６１】
図８では、ＣｓｓＡおよびＣｓｓＢ大サブユニットのヘテロ二量体、ホモ二量体または単量体を用いてマウスのグループ（ｎ＝４）に免疫付与した。全ての構築物は、ＣｓｓＡおよびＣｓｓＡＡを除き、高いＩｇＧ抗ＣＳ６血清抗体力価を誘発した（図８Ｄ）。図８Ａおよび図８Ｂは、投与したさまざまな抗原（図８Ｃ）に対する、抗ＣｓｓＡ  ＩｇＧ力価および抗ＣｓｓＢ  ＩｇＧ力価をそれぞれ示す。図８に示すように、ｄｓｃＣｓｓＢ−ＣｓｓＡを有する二量体構築物は、ｄｓｃＣｓｓＡ−ＣｓｓＢよりも、あるいは、ｄｓｃＣｓｓＡまたはｄｓｃＣｓｓＢを両方とも各単量体に対して２５μｇの投与量で一緒に投与した場合よりも、幾分良い免疫応答を誘発した。実際、ｄｓｃＣｓｓＢＡの投与は、（２５または５０μｇでの）ｄｓｃＣｓｓＢの投与と同様の抗ＣｓｓＢ応答を誘発し、また、ｄｓｃＣｓｓＡを２５μｇまたは５０μｇ投与した場合よりもかなり高い抗ＣｓｓＡ応答を誘発した。この結果は、多数の単量体の産生に関する場合と比べて、製造効率および製造コストを最大化しつつ、広い抗ＣＳ６免疫範囲を提供するのに高度に有利である。
【００６２】
天然ＣＳ６によって誘発された抗ＣＳ６  ＩｇＧ血清力価に対する各構築物によって誘発された抗ＣＳ６  ＩｇＧ血清力価の倍上昇の比率が、表４に示されている。全ての構築物が、少なくとも天然ＣＳ６と同等の免疫応答を誘発した。これらの結果は、異種ドナー鎖相補性が力価を最大に増加させたことを示している。
【００６３】
【表４】
0006403680.tif 000005
【００６４】
表４に示すように、最も高い比率は、「ｎｔｄ１５ｄｓｃＢＣｓｓＢＡ」に関連していた。この構築物は、自己のＣ末端にＣｓｓＢの１６アミノ酸ドナー鎖領域を含み、Ｃ末端サブユニット（つまり、ＣｓｓＡ）に対して異種である。「ｎｔｄ」は、構築物がまた、自己会合を防止するためにＣｓｓＢのＮ末端領域が削除されていることを示している。
また、表４には、多くの構築物に対してＣＳ６を用いてワクチン接種した動物で観察された力価に対するＩｇＧの倍増加が示されている。ＩｇＡの場合、ｎｔｄ１５ｄｓｃ１６ＢＣｓｓＢＡおよびｎｔｄ１５ｄｓｃＡＣｓｓＢＡは両方とも同様の力価を生じた。しかし、上記のように、ｎｔｄ１５ｄｓｃ１６ＡＣｓｓＢＡは、ＣｓｓＡに異種ドナー鎖を包含しており、おそらく安定性は低い。
ＣＳ６構築物の結果の概要が、表５に、ＣｓｓＢＡ構築物とＣｓｓＡＢ構築物とを比較しつつ、示されている。
【００６５】
【表５】
0006403680.tif 000006
ＣＳ３線毛
【００６６】
特許文献２は、ドナー鎖相補性安定化ＥＴＥＣ構築物をクレームしている。この出願の実施形態は、ＣｓｔＨのドナー鎖安定化を組み込むとともに、第２のＣＳ３サブユニットＣｓｔＧを追加している。本願の実施形態は、ＣＳ３サブユニットの安定化およびＣＳ３に対する免疫原性にとって重要であると考えられる付加的特徴を追加している。ＣＳ３は、ＣｓｔＨおよびＣｓｔＧを含む。ＣＳ３構造タンパク質ＣｓｔＨは、不変である。ＣｓｔＧも高度に保存されており、配列が解析された３９野生型ＣＳ３に対して９９〜１００％のポリペプチド配列同一性を示している。同様に、ある変異ＣｓｔＧが観察されるが、それも比較的不変であり、９９〜１００％のアミノ酸が保存されている。
【００６７】
ＣＳ３型線毛サブユニットの免疫原性を評価した。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に、一投与当たり１５０μｇで２週間間隔の３回投与で、３〜１４個のサブユニットまたはドナー鎖補足単量体ＣｓｔＨもしくはＣｓｔＧを含む、オリゴマーＣｓｔＨまたはＣｓｔＧのいずれかを用いて、アジュバント（ＬＴＲ１９２Ｇ）の有無にかかわらず、免疫を鼻腔内投与した。応答は、血清抗ＣＳ３  ＩｇＡまたはＩｇＧによって、および、血球凝集反応阻害によって観察した。結果は、図９および図１０に示されている。
【００６８】
図９に示すように、単量体ドナー鎖補足ＣｓｔＨは、多量体ＣｓｔＨの非共有結合オリゴマー（ＣｓｔＨ（ｉ）で示される）と比較して、免疫原性が低かった。これは、おそらく、ＣｓｔＨの結合された反復ドメインの存在に起因する。図９において、「ｉ」は、オリゴマーの単離に使用されるインテインを指す。一方で、ｄｓｃＣｓｔＧおよびＣｓｔＧの非共有結合オリゴマーは両方とも、免疫原性は示したものの（図１０）、ＣＳ３よりは低かった。
【００６９】
単量体ＣｓｔＨの免疫原性が低かったために、より大きなドナー鎖補足共有結合オリゴマーを評価するための研究が実施された。この研究の結果は、図１１に示されている。図９において、「Ｈ」は、ｄｓｃ１６ＣｓｔＨ（Ｈｉｓ）６を指し、それによって構築物は、そのＣ末端でテトラペプチドリンカーによって補完され、ＣｓｔＨのＮ末端β鎖の１６アミノ酸ポリペプチド配列に連結された、シスドナー鎖である。また、構築物は、そのＣ末端で６つのヒスチジンの鎖（Ｈｉｓ）６を包含している。同様に、Ｈ２は、ｄｓｃ１６ＣｓｔＨ２を指し、それによって構築物は、テトラペプチドリンカーによって結合された２つのＣｓｔＨ線毛サブユニットを含み、Ｃ末端ＣｓｔＨは、テトラペプチドリンカー、および、そのＣ末端で補完されたシスドナーによって、ＣｓｔＨのＮ末端β鎖の１６アミノ酸ポリペプチド配列に連結されている。同様の構築物が、Ｈ３（しかし、３つの縦列に結合されたＣｓｔＨ線毛サブユニットを有する）、Ｈ４（４つの縦列に結合されたＣｓｔＨサブユニット）およびＨ５（５つの縦列に結合されたＣｓｔＨサブユニット）に対しても言及される。
【００７０】
図１１に示すように、縦列ＣｓｔＨサブユニットの数を増加させることは、ＨＡＩ力価の増加に関連していた。しかし、二量体ｄｓｃＣｓｔＨは、より高いサイズのオリゴマーと同様のＨＡＩ力価を誘発した。単量体ｄｓｃＣｓｔＨは、確認できるＨＡＩ力価を誘発しなかった。
【００７１】
上記に照らして、ＣＳ３はＣｓｔＧおよびＣｓｔＨの両方をほぼ等量で含むため、図１のテンプレート構築物設計に従って、ＣｓｔＧおよびＣｓｔＨを取り込む二量体構築物を考案した。これらの構築物の分析結果の概要を図１２に示す。図１２では、それぞれ８匹のマウスから成るグループに、２５μｇの示されたワクチン±ＬＴＲ１９２Ｇアジュバント（１００ｎｇ，ＩＤ；１．５μｇ，ＩＮ）を、皮内（ＩＤ）経路により、３回投与スケジュール（０日目、１４日目、２８日目）で投与した。ＣＳ３の鼻腔内（ＩＮ）投与したグループは、粘膜ワクチン接種の対照群としての役割を果たした。ＣＳ３−ＥＴＥＣに対する血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）によって測定される免疫応答（パネル（Ａ））、および、血清ＩｇＧ抗ＣＳ３力価（パネル（Ｂ））が、最後の投与（４２日目）から２週間後に取り出された血清に対して示されている。略語：ＧＨ，ｄｓｃ１６ＣｓｔＧＨ；ＨＧ，ｄｓｃ１６ＣｓｔＨＧ；ＧＨＧＨ，ｄｓｃ１６ＣｓｔＧＨＧＨ；ＨＧＨＧ，ｄｓｃ１６ＣｓｔＨＧＨＧ；ＨＨＧＨ，ｄｓｃ１６ＣｓｔＨＨＧＨ、ここで、ｄｓｃ１６は、テトラペプチドリンカーによってＣ末端線毛サブユニットに連結された１６アミノ酸ドナーβ鎖を指す。全ての組み換え融合体は、シスドナー鎖相補性を用いて操作された。
【００７２】
図１２に示すように、単純分子「ＧＨ」および「ＨＧ」は、同様の応答を誘発し、両方ともにＣＳ３と同様であった。しかし、「ＧＨ」は、「ＨＧ」よりもやや高い応答を誘発した。ＣｓｔＧおよびＨ単量体のいずれに対しても応答はほとんど確認できなかった（データは図示せず）。したがって、二量体に対する免疫応答は、ＣｓｔＨまたはＣｓｔＧの単量体に比べて著しく高かった。また、ヘテロ二量体に対する応答は、四量体に対して観察された応答と比較して同等以上である。
【００７３】
これらの研究に基づき、ＣＳ３に対する免疫応答を誘発するのに使用可能なポリペプチド構築物の好適な一実施形態は、図１に従って設計された構築物を含む。図１では、ＣＳ３構築物は、ポリペプチドリンカーによって連結された１つ以上のＣＳ３線毛サブユニットを含む。Ｃ末端線毛サブユニットは、ポリペプチドリンカーによって、ＣＳ３線毛サブユニットのドナーβ鎖領域に連結されている。Ｃ末端ドナーβ鎖は、これが連結される同じＣＳ３サブユニットに由来し（つまり、同種）、または、異なるサブユニットに由来しうる（つまり、異種）。ポリペプチドリンカーは、どの番号のポリペプチド領域であってもよいが、好適な一実施形態では、当該リンカーは、配列番号５の配列を持つテトラペプチド、または、トリグリシン（つまり、Ｇ−Ｇ−Ｇ）である。ドナーβ鎖領域は、成熟ＣｓｔＨまたはＣｓｔＧタンパク質のＮ末端１４−１６アミノ酸である。この実施形態の代替案では、望ましくない会合を防止するために、Ｎ末端最サブユニット（N-terminal most subunit）のＮ末端領域の最初の１４−１８アミノ酸を削除する。
【００７４】
好適な一実施形態では、ＣＳ３の構築物は、二量体である。図１の設計を用いて他の例も考えられるが、実例として、組み換えポリペプチド構築物は、「ｄｓｃ１６ＣｓｔＨＣｓｔＧ−（リンカー）−ＣｓｔＨ」として構成可能である。この例では、成熟ＣｓｔＧポリペプチド（配列番号１０１）または完全長ポリペプチド配列（配列番号８７）が、ポリペプチドリンカーによって、そのＣ末端でＣｓｔＨポリペプチド（配列番号９９）に連結される。この例では、ＣｓｔＨポリペプチドは、そのＣ末端で、ポリペプチドリンカーによってＣｓｔＨ由来の１６アミノ酸のドナーβ鎖領域に連結される。
【００７５】
他の例は、図１に係る構築物を含みうる。他の例では、Ｃ末端のドナーβ鎖は、Ｃ末端最ＣＳ３線毛サブユニット（C-terminal most CS3 fimbrial subunit）に対して、同種（同じサブユニットに由来）にも異種（異なるサブユニットに由来）にもなりうる。
実施例４：分節融合構築物の構築
【００７６】
複数のＥＴＥＣ株に対する免疫は、最大の抗ＥＴＥＣ免疫範囲を得るために重要である。この目標に向かって、図２に示す設計に係る、異なるＥＴＥＣ線毛型に由来する１つ以上のサブユニットを含んで分節融合構築物を形成する組み換えポリペプチド構築物が開発された。本明細書で使用するように、分節融合体または分節融合構築物は、図２に係る組み換えポリペプチド構築物である。この設計では、表６に記載されているように異なる株ＥＴＥＣ型の線毛に由来する線毛タンパク質として、または、これらのポリペプチドもしくはＤＮＡ配列の誘導体として定義される。例えば、線毛タイプ「ＣＳ３」は、ＣｓｔＨおよびＣｓｔＧを含む。線毛タイプ「ＣＳ６」は、ＣｓｓＡおよびＣｓｓＢを含む。クラス５ＥＴＥＣの線毛型は、線毛型クラス５ａ、クラス５ｂおよびクラス５ｃを含む。
【００７７】
好適な一実施形態では、同じＥＴＥＣ線毛型に由来する大および／または小サブユニットは、図１および実施例１〜４に示すように、ポリペプチドリンカーによって連結され、かつ、ドナーβ鎖相補性によって安定化している。分節融合体は、図２に示すように異なる線毛型に由来する１つ以上の線毛サブユニットに連結された、図１に示すように同じ線毛型の１つ以上の線毛サブユニットを含む。
【００７８】
一実施形態では、分節融合構築物は、１つ以上の線毛サブユニットのＮ末端領域の欠失を含みうるが、好ましくは、図２に示すように、定められたＥＴＥＣ線毛型に対するＮ末端最線毛サブユニット（N-terminal most fimbrial subunit）上にある。この特徴により、他の単量体または多量体との望ましくない会合が防止される。Ｎ末端領域の欠失の大きさは、１４〜１８個のアミノ酸である。他の実施形態では、クラス５付着因子を含む分節融合構造物は、Ｎ末端領域の欠失を包含しない。
【００７９】
図２に示すように、ＥＴＥＣ線毛型に対するＣ末端サブユニットは、ドナーβ鎖に連結されて安定化している。このドナーβ鎖は、ポリペプチドリンカーによって当該サブユニットに連結されており、隣接サブユニットに由来するものであるか（つまり、同種）あるいは同じ線毛型の異なるサブユニットに由来するものである（つまり、異種）。Ｎ末端ドナー鎖の大きさは、線毛型および安定化したサブユニットに依存する。好適な実施形態では、クラス５線毛サブユニットに対して、安定化したクラス５サブユニットのＮ末端領域に由来するドナーβ鎖は、１２〜１６個のアミノ酸である。ＣＳ３およびＣＳ６サブユニットに対して、ドナーβ鎖は、１４〜１６個のアミノ酸である。上記のように、構築物は、Ｎ末端サブユニットのＮ末端領域の欠失を包含しうる。この特徴により、他の単量体または多量体との望ましくない会合が防止される。Ｎ末端領域の欠失の大きさは、１４〜１８個のアミノ酸である。
【００８０】
図２に示すように、複数の図１に示す構築物が連結されて、１つ以上のＥＴＥＣ線毛型を含む組み換えポリペプチド構築物を形成している。このように、同じＥＴＥＣ線毛型に由来する１つ以上の大または小サブユニットは、ペプチドリンカーによって連結され、かつ、ドナー鎖相補性によって安定化している。他の実施形態では、１つ以上のグリシン残基は、異なるＥＴＥＣ線毛型を分離して、ＥＴＥＣ型の間の「スイベル（swivel）」手段の役割を果たしている。グリシン残基は、小さくて分岐していないという分子的特徴を有するため、分子成分が自由に回転できる。（図１に示すように）同じ線毛型に由来するサブユニットは、ポリペプチドリンカーによって連結され、かつ、ドナー鎖相補性によって安定化している。図２に示すように、各ＥＴＥＣ線毛型のＣ末端サブユニットは、当該線毛型のＣ末端サブユニットに対して同種または異種であるドナーβ鎖によって安定化される。
【００８１】
他の実施形態では、構築物は、構築物全体のＮ末端におけるＮ末端欠失、および、異なる線毛型をしている最初の「内部（internal）」サブユニットのＮ末端における、１４〜１８個のアミノ酸の追加欠失を含みうる。これは、図２に示されている。「内部」サブユニットのＮ末端上の欠失の場合、この欠失によってサブユニット間の長さが短くなるため、誤った折り畳みおよびタンパク質分解的切断の可能性が低くなる。他の実施形態では、同種または異種サブユニットに由来するドナーβ鎖が、Ｃ末端ＣＳ６またはＣＳ３サブユニットのＣ末端において挿入される。クラス５線毛サブユニットに対して、安定化したクラス５サブユニットのＮ末端領域に由来するドナーβ鎖は、１２〜１６個のアミノ酸である。例えば、好適な実施形態では、ＣｆａＢは、１４アミノ酸ドナーβ鎖によって安定化され、ＣｓｆＡは、１４アミノ酸ドナーβ鎖によって安定化され、ＣｓｂＡは、１５アミノ酸ドナーβ鎖によって安定化され、ＣｏｏＡは、１４アミノ酸ドナーβ鎖によって安定化され、ＣｏｔＡは、１４アミノ酸ドナーβ鎖によって安定化される。ＣＳ３およびＣＳ６サブユニットに対して、ドナーβ鎖は、１４〜１６個のアミノ酸であり、ＣＳ３線毛サブユニット（つまり、ＣｓｔＨまたはＣｓｔＧ）の好適な実施形態は、ＣｓｔＨまたはＣｓｔＧに由来する１６アミノ酸ドナーβ鎖によって安定化され、ＣＳ６線毛サブユニット（つまり、ＣｓｓＡまたはＣｓｓＢ）の好適な実施形態は、ＣｓｓＡまたはＣｓｓＢに由来する１６アミノ酸ドナーβ鎖によって安定化される。しかし、他のドナーβ鎖長は、想定される。
【００８２】
本発明の組成物は、異なるリンカー配列を利用しうる。好適な一実施形態では、リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、リンカーは、トリグリシンリンカーである。さらに他の実施形態では、構築物のＣ末端端部（C-terminal end）は、構築物精製用のヒスチジンタグを含む。
【００８３】
本発明の構築物では、シスドナー鎖相補性を用いて、付着因子、ならびに、代表的なクラス５ａ、５ｂおよび５ｃ付着因子に対する付着因子−ピリン融合体を安定化させる。各付着因子ターゲットグループに対して、好適な実施形態では、抗付着性免疫応答を誘発する目的で組成物が構築される。さらに、この目標に向かって、クラス５付着因子小サブユニットを含むクラス５分節融合体が、典型的には、付着因子（つまり、線毛小サブユニット）が構築物のＮ末端に位置し、その線毛小サブユニットがそのＣ末端で１つ以上の大サブユニットに結合され、続いて、当該構築物の末端端部（terminal end）で最後の大サブユニットのドナーβ鎖に結合されるように構築される。
【００８４】
他の実施形態は、そのＣ末端で１つ以上のＣｆａＢ（ＣＦＡ／Ｉ大サブユニット）、ＣｓｕＡ２（ＣＳ１４大サブユニット）およびＣｓｆＡ（ＣＳ４大サブユニット）に縦列結合されたクラス５ａ付着因子ＣｆａＥと、そのＣ末端で１つ以上のＣｓｂＡ（ＣＳ１７大サブユニット）（これはＣＳ１９ピリンサブユニットＣｓｄＡと高い同一性を共有する）およびＣｏｏＡ（ＣＳ１大サブユニット）（これはＰＣＦＯ７１ピリンサブユニットＣｏｓＡと高い同一性を共有する）に縦列結合されたクラス５ｂ付着因子ＣｓｂＤと、そのＣ末端でＣｏｔＡ（ＣＳ２大サブユニット）に縦列結合されたクラス５ｃ付着因子ＣｏｔＤと、を有する構築物を含む。
【００８５】
ＥＴＥＣ分節融合構築物の実施形態を、表７および表８に示す。この実施形態では、構築物は、図２に示す設計を利用して、リンカーポリペプチドによって連結され、かつ、ドナー鎖相補性によってタンパク質分解から安定化している、表６からの任意の大または小ＥＴＥＣ線毛サブユニットを複数の組み合わせで含む。表６は、図２の分節融合構築物設計に使用され取り込まれうるＥＴＥＣ線毛サブユニット（大および小サブユニット）を記載している。したがって、どのサブユニットも、クラス５ａ、５ｂ、５ｃ、ＣＳ３およびＣＳ６を含む任意のＥＴＥＣ線毛表現型からの１つ以上の他のＥＴＥＣ大サブユニットと結合している。
【００８６】
組み換えポリペプチド構築物モチーフは、そのＣ末端端部でリンカーに連結される小または大ＥＴＥＣ線毛サブユニットの全体または免疫原性フラグメントを含む。リンカーは、そのＣ末端で、同じ線毛型に由来する、ＥＴＥＣ線毛大サブユニット全体またはＥＴＥＣ構造大サブユニットのポリペプチドドナー鎖に連結される。その後、このＥＴＥＣ線毛大サブユニット全体またはポリペプチドドナー鎖は、リンカーによってそのＣ末端で、同じ線毛型に由来する、表６からの１つ以上の追加構造線毛大サブユニットに連結される。
【００８７】
【表６】
0006403680.tif 000007
【００８８】
特定の遺伝子的融合構築物を選択し発展させるための戦略は、一つには、サブユニットの系統発生的および抗原的関連性によって導かれる。例えば、クラス５ａ、５ｂおよび５ｃのピリンサブユニットを包含する構築物は、図３に示すように、特定のＥＴＥＣ線毛クラス（つまり、クラス５ａ、５ｂまたは５ｃ）内の小および大サブユニットの関連性に基づいて選択される。そのようなものとして、特定の線毛型（例えば、クラス５ａ）からの付着因子（つまり、線毛小サブユニット）は、クラス５ａ大サブユニットに結合される。ＥＴＥＣ株の最適な免疫原性範囲を達成するために、サブユニットの更なる選択が、疫学研究分析に基づいて導かれる。
【００８９】
表７および表８に記載した分節構築物の例を、さらに、図１３（ＣＳ３構築物に対して）および図１４（ＣＳ６構築物に対して）に示す。これらの図では、ポリペプチドリンカーは、構築物の例に応じて、４アミノ酸配列（テトラペプチド）またはトリグリシンを含みうる。また、図２に示すように、サブユニットは、相互に接続され、ドナー鎖相補性によって安定化している。これは、表７および表８に示すように、「ｄｓｃ」で示される。この命名法では、線毛サブユニットの由来も示されている。例えば、構築物「ｄｓｃ１６ＣｓｔＨＣｓｔＧ−ＣｓｔＨ−（Ｇ）−ｎｔｄ１５ｄｓｃ１６ＣｓｓＡＣｓｓＡ−ＣｓｓＢ」では、Ｎ末端ＣＳ３サブユニット「ＣｓｔＧ」は、リンカーによって、ＣＳ３サブユニット「ＣｓｔＨ」に連結され、ＣＳ３サブユニット「ＣｓｔＨ」は、リンカーによって、「ＣｓｔＨ」に由来する１６個のアミノ酸のドナー鎖に連結されている。同様に、Ｎ末端ＣＳ６サブユニット「ＣｓｓＢ」は、リンカーによって、図２に示すように、「ＣｓｓＡ」に由来する１６アミノ酸ドナー鎖に連結されている。この例では、「ＣｓｓＢ」サブユニットのドナー鎖相補性は、異種ドナー鎖（つまり、「ＣｓｓＡ」に由来）による。
【００９０】
表７および表８ならびに図１４および図１５における例は、「スイベル（swivel）」を提供するために「Ｇ」（つまり、グリシン）を包含する。また、いくつかの例では、Ｎ末端ＣＳ６サブユニットのＮ末端領域は、上記のように、他のＣＳ６サブユニットとの望ましくない会合を防止するために削除されている（「ｎｔｄ」で示される）。留意すべきは、表７または表８に示す例に加えて、図２に示す構築物設計および表６の線毛サブユニットを利用して大および小サブユニットの他の組み合わせが考えられることである。表に記載されたいくつかの配列では、６ヒスチジン（つまり、Ｈｉｓ６）タグが挿入されている。構築物は、このヒスチジン（つまり、Ｈｉｓ６）タグを含むように設計し、または、このタグ領域を持たないように設計しうる。さらに、いくつかの配列は、シグナルペプチド（表２および表３では「ｓｐｄ」で示される）領域を包含する。なお、構築物は、この領域の有無にかかわらず構築可能である。この領域は、分節融合構築物の製造効率を高めるために添加されうる。
【００９１】
【表７】
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【００９２】
【表８】
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実施例５：ＥＴＥＣ線毛サブユニット−毒素キメラ構築物
【００９３】
他の実施形態では、組み換えポリペプチド構築物は、キメラ分子を形成するために、コレラ毒素Ａ２（ＣＴＡ）などのＣ末端毒素Ａサブユニットを包含しうる。この実施形態では、完全長または短縮ＣＴＡが、ＣＳ６またはＣＳ３二量体などのＣＳ６またはＣＳ３多量体組み換えポリペプチド構築物に連結されている。
これら毒素構築物の例が、図１３および図１４（ならびに表７および表８）に示されている。これらの構築物では、ＬＴＢ遺伝子およびＣＳ３またはＣＳ６−毒素キメラは、別々に発現される。ＬＴＢは、ひとたび発現すると、自己組織化して五量体構造を形成する。そして、その後のＬＴＢ多量体組成物（つまり、ＬＴＢ５）およびＣＳ３またはＣＳ６−毒素キメラは、非共有的に結合して、ホロトキシン様へトロ六量体を形成する。
【００９４】
他の例が考えられるが、Ｃ末端毒素成分を包含する実例的キメラ構築物の配列は、表７（ＣＳ３に対して）および表８（ＣＳ６に対して）に示されている。
【００９５】
ＣＳ３−キメラ分子に対して、１つ以上のＣＳ３線毛サブユニットが、図１に示すように、ポリペプチドリンカー、好ましくは、テトラペプチドまたはトリグリシンによって連結されている。そして、Ｃ末端最ＣＳ３線毛サブユニット（C-terminal most CS3 fimbrial subunit）は、ポリペプチドリンカーによって、ドナーβ鎖に連結されている。ドナー鎖は、Ｃ末端線毛サブユニットに対して同種または異種でありうる。そして、ドナー鎖は、ＣＴＡ２などの毒素フラグメントに連結されている。表７に示すＣＳ３−キメラの例は、配列番号３６のＤＮＡ配列によってコードされる、配列番号３７のポリペプチド配列を含む。この例では、Ｎ末端線毛サブユニットは、そのＮ末端端部（N-terminal end）で連結されるｐｅｌＢリーダー（２２個のアミノ酸）を有するＣｓｔＧである（図１３参照）。しかし、ＣＳ３線毛サブユニットの異なる順序付けが考えられる。また、この例では、ＣｓｔＨは、ＣｓｔＨのＮ末端１６アミノ酸に由来する１６アミノ酸ドナー鎖に連結されている。この１６アミノ酸ドナー鎖は、Ａ２毒素フラグメント（つまり、ＣＴＡ２）に連結されている。好適な一実施形態では、ＬＴＢも発現する。ＬＴＢは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、配列番号３８のヌクレオチド配列によってコードされる。ＬＴＢ配列は、ひとたび発現すると、五量体に自己組織化してＣＳ３キメラと非共有的に結合してヘテロ六量体ホロトキシン様構造を形成する。
【００９６】
また、ＣＳ６毒素キメラの例も、表８および図１４に示されている。ＣＳ６キメラに対して、ＣＳ３に示すように、１つ以上のＣＳ６線毛サブユニットが、ポリペプチドリンカー、好ましくは、テトラペプチドまたはトリグリシンによって連結されている。そして、Ｃ末端最ＣＳ６線毛サブユニット（C-terminal most CS6 fimbrial subunit）は、ポリペプチドリンカーによって、ドナーβ鎖に連結されている。ドナー鎖は、Ｃ末端線毛サブユニットに対して同種または異種でありうる。そして、ドナー鎖は、毒素成分（例えば、ＣＴＡ２）に連結されている。好適な一実施形態では、ＣＳ３の場合のように、キメラは、ＬＴＢと共発現し、五量体に自己組織化してキメラ付着因子−トキソイド融合分子を形成する。
【００９７】
多くの追加の組み合わせが可能であるが、表８に示す例では、構築物は、テトラペプチドリンカーによってドナーβ鎖に連結されたＣ末端線毛サブユニットに、テトラペプチドリンカーによって連結されたＣＳ６サブユニットの二量体である。ドナーβ鎖は、Ｃ末端最線毛サブユニット（C-terminal most fimbrial subunit）に対して同種または異種でありうる。しかし、表８の例では、ドナー鎖は、Ｃ末端線毛サブユニットに対して異種である。そして、ドナー鎖は、コレラ毒素Ａ２（ＣＴＡ２）サブユニットに連結されている。１つの例におけるポリペプチド配列は、配列番号４２のヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号４３と同様である。この例では、Ｎ末端サブユニットは、ＣｓｓＡであり、成熟ＣｓｓＡ配列のＮ末端１５アミノ酸は、削除されている。この例では、ｐｅｌＢリーダー配列（２２個のアミノ酸）も添加された。これは、図１４に示されている。
実施例６：分節組み換えポリペプチド構築物の抗ＣＳ３および抗ＣＳ６免疫応答
【００９８】
好適な一実施形態では、広い抗ＥＴＥＣ免疫を取得するために、複数のＥＴＥＣ線毛型に由来する線毛サブユニットを含む組み換えポリペプチド構築物が、実施例５に記載したように構築された。上記のように、単一の構築物における広い免疫原性は、複数の個々の成分を含む組成物と比較して、製造の容易さおよび投与の標準化のために高度に有利である。
【００９９】
表７および表８に記載した分節例は、その線毛成分のそれぞれに対する免疫を維持した。実例として、組み換え分節融合体ＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡ−ＣｓｔＧＨは、複数の線毛型、つまりクラス５ｂおよびＣＳ３の線毛サブユニットに対する免疫原性を保持している。図１５は、ＥＴＥＣクラス５ｂおよびＣＳ３に由来する線毛サブユニットを含む、構築物ＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡ−ＣｓｔＧＨの複数の線毛成分の免疫原性を示している。
【０１００】
図１５において、ＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡ−ＣｓｔＧＨは、ＣｓｂＤ、ＣｓｂＡ（それぞれ、ＣＳ１７線毛の付着因子およびピリンサブユニット）、ＣｏｏＡ（ＣＳ１線毛のピリンサブユニット）、ＣｓｔＧおよびＣｓｔＨ（ＣＳ３の２つの大サブユニット）の縦列融合体（Ｎ末端からＣ末端まで）を含み、各サブユニットは、シスドナー鎖相補性によって安定化している。
【０１０１】
この研究では、５〜８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスから成るグループに、分節融合体またはＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡおよびＣｓｔＧＨの混合物（「ＣｓｂＤＡ−ＣＯＯＡ＋ＣｓｔＧＨ」）を、個々の成分タンパク質がモル当量用量（すべてＣｓｂＤＡ−ＣｏｏＡ−ＣｓｔＧＨの２５μｇ投与量に一致）で、皮内投与し、かつ、アジュバンドＬＴＲ１９２Ｇ（１００ｎｇ）を同時投与した。マウスは、２回、０日目および２１日目に投与された。表示された力価は、３２日目に採取された血清からのものである。
【０１０２】
パネルＡは、ＣＳ３−ＥＴＥＣ（上段）、ＣＳ１７−ＥＴＥＣ（中段）およびＣＳ１−ＥＴＥＣ（下段グラフ）に対する血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）力価を示す。図１５に示すように、ＣＳ３−ＥＴＥＣ  ＨＡＩ力価の著しい上昇は、全ての調合液で誘発され、ＣｓｔＧＨ単独では、力価の多少の上昇が観察された。分節融合体および混合調合液は両方とも、ＣＳ１７−ＥＴＥＣおよびＣＳ１−ＥＴＥＣに対して同様にＨＡＩ力価の上昇を誘発した。パネルＢは、ＣＳ３に対する血清ＩｇＧおよびＩｇＡ力価（上段の２グラフ）、ならびに、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗ＣｓｂＤ力価（下段の２グラフ）を示す。同様に、高い血清抗ＣＳ３力価が、分節融合体を含めて、ＣｓｔＧＨを包含する全ての調合液によって誘発された。分節融合体および混合調合液は両方とも、高い抗ＣｓｂＤ  ＩｇＧ力価を誘発し、単に融合体のみが、検出可能なＩｇＡ抗ＣｓｂＤ力価を誘導した。データは、幾何平均力価＋標準誤差として表示されている。各グラフの水平の点線は、検査の検出限界を示している。
【０１０３】
図１３に示すいくつかの例におけるＣＳ３成分の免疫応答が、図１６にまとめられている。ＣＳ３またはＣＳ３ドナー鎖相補性安定化構築物の投与に伴う免疫誘導を評価した。この研究では、マウスに、０日目および２１日目に免疫を皮内付与し、２８日目に採血した。表９に記載した代表的な数のＥＴＥＣ構築物によって誘発されたＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価を、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。図１６に示すように、同様のレベルのＩｇＧおよびＩｇＡ抗ＣＳ３免疫応答が、分節融合構築物のそれぞれによって誘発された。また、図１６には、ｄｓｃＣｓＧＨ−ＣＴＡ２／ＬＴＢ付着因子−トキソイドキメラによる抗ＣＳ３応答の誘導も示されている（実施例５参照）。
【０１０４】
【表９】
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【０１０５】
図１７は、血球凝集反応阻害試験（ＨＡＩ）におけるマンノース耐性血球凝集反応を阻害する、異なるＥＴＥＣ分節融合構築物の能力を評価する研究の結果をまとめたものである。評価した構築物は、表９に記載されている。
【０１０６】
ＨＡＩを測定する際に、細菌株（ＣＳ３＋ＥＴＥＣ株ＷＳ２０１０Ａ）を、最小の血球凝集反応力価の２倍（２ｘＭＨＴ）に相当する濃度で使用した。ＭＨＴは、細菌懸濁液を連続倍数希釈することによってＨＡＩ試験の開始時に測定した。合計２５μＬの各希釈液は、同量の３％赤血球懸濁液および０．５％Ｄ−マンノースを有するＰＳＢに添加し、氷の上で揺り動かした。ＭＨＴは、少なくとも１＋ＭＲＨＡを示す最低の細菌濃度の逆数として定義された。
【０１０７】
各抗血清調合液のＨＡＩ力価を測定するために、抗体の倍数希釈系列を作製した。体積が２５μＬの各希釈液を同量の２ｘＭＨＴ細菌懸濁液に添加し、２０分間揺り動かしながら室温で事前培養した。その後、同量の赤血球懸濁液（３％）を各ウェル（well）に添加し、氷の上で２０分間揺り動かした後、ＭＲＨＡを記録した。ＨＡＩ力価は、完全にＭＲＨＡを阻害した最高の抗血清希釈の逆数として表される。
【０１０８】
図１７（Ａ）に示すように、ＰＢＳは阻害を示さなかった。しかし、ｄｓｃＣｓｔＧ−ＣｓｔＨ（ｄｓｃＣｓｔＧＨ）およびＣｓｔＧＨ分節融合構築物は、著しいＨＡＩを示した。興味深いことに、ＣｓｔＧＨが融合構築物の成分であったか２つの成分の混合物の一部であったかにかかわらず、同様のＨＡＩが示された。これは、図１７のパネルＢにグラフで示されている。
【０１０９】
結果は、まとめると、分節構築物として異なる線毛型からの線毛サブユニットを含めることによって成分線毛サブユニットに対する強力な免疫応答が生じることを示している。上記のように、複数株からの複数の二量体を含む単一の融合構築物は、より広範囲の免疫を与え、より大きな投与の標準化が得られる。さらに、単一の構築物の製造は、複数の構築物に比べて好ましい。
【０１１０】
また、クラス５およびＣＳ６サブユニットを含む分節構築物も調製し、抗ＣＳ６免疫原性に対する反応性を評価した。これらの研究では、マウスに、アジュバントｍＬＴ（遺伝子組み換え易熱性エンテロトキシン）の有無にかかわらず、ＥＴＥＣクラス５およびＣＳ６サブユニットを含む異なる構築物に対する免疫を付与した。
【０１１１】
実例として、分節融合構築物ＣｆａＥＢ−ＣｓｓＢＡの成分に対する免疫応答の結果が、図１８に示されている。図１８では、ＣｆａＥＢ−ＣｓｓＢＡは、ＣｆａＥ、ＣｆａＢ（それぞれ、ＣＦＡ／Ｉ線毛の小および大サブユニット）、ＣｓｓＢおよびＣｓｓＡ（ＣＳ６の２つの大サブユニット）の縦列融合体（Ｎ末端からＣ末端まで）を含み、各サブユニットは、シスドナー鎖相補性によって安定化している。
【０１１２】
図１８では、８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループに、分節融合体またはＣｆａＥＢおよびＣｓｓＢＡの混合物（「ＣｆａＥＢ＋ＣｓｓＢＡ」）を、個々の成分タンパク質がモル当量用量（すべてＣｆａＥＢ−ＣｓｓＢＡの２５μｇ投与量に一致）で、皮内投与し、かつ、アジュバントＬＴＲ１９２Ｇ（１００ｎｇ）を同時投与した。マウスは、３回、０日目、１４日目および２８日目に投与された。表示された力価は、４２日目に採取された血清からのものである。
パネルＡは、ＣＦＡ／Ｉ−ＥＴＥＣ（上段）およびＣＳ１４−ＥＴＥＣ（下段のグラフ）に対する血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）力価を示している。分節融合体、混合物およびＣｆａＥＢ単独（ヒストリカルコントロール）の接種後に、同種（ＣＦＡ／Ｉ−ＥＴＥＣ）およびサブクラス内異種（ＣＳ１４−ＥＴＥＣ）のＨＡＩ力価の同じような上昇が観察された。
【０１１３】
パネルＢは、ＣＳ６（上段）、ＣＦＡ／Ｉ線毛（中段）およびｄｓｃＣｆａＥ（下段）付着因子に対する血清ＩｇＧ力価を示している。同じように高い血清抗ＣＳ６力価が、分節融合体を含む、ＣｓｓＢＡを包含する全ての調合液によって誘発された。同様に、分節融合体を含む、ＣｆａＥＢを包含する全ての調合液は、高い抗ＣＦＡ／Ｉおよび抗ＣｆａＥ（つまり、抗付着因子）ＩｇＧ力価を誘発した。しかし一方、ＣｓｓＢＡは、予想通り抗ＣｆａＥ  ＩｇＧ力価を誘発しなかった。データは、幾何平均力価＋標準誤差として表示されている。各グラフの水平の点線は、検査の検出限界を示している。
【０１１４】
図１８にまとめた結果は、構築物（つまり、分節融合体）が、その複数の線毛成分、特にＥＴＥＣクラス５ａおよびＣＳ６に由来する線毛サブユニットに対する免疫応答を誘発する能力を保持することを示している。
【０１１５】
まとめて、ＣＳ６分節構築物による結果は、複数の構築物成分（つまり、さまざまな線毛型に由来する各々）からの干渉によって何も阻害されなかったことを示している。
【０１１６】
図１９に示すように、ヘテロ二量体としてのＣＳ６サブユニットＣｓｓＡおよびＣｓｓＢは、個々のＣＳ６サブユニットに対する強力なＩｇＧ応答を誘発する。図１９において、パネルＡは、投与された抗原を示す。パネルＢは、ｘ軸に沿って示された投与した抗原構築物に対して誘発された、ＣｓｓＡまたはＣｓｓＢのいずれかに対する抗ＣＳ６  ＩｇＧ応答を示している。
【０１１７】
図１９に示すように、クラス５サブユニットに融合したＣＳ６サブユニット（つまり、グループ２〜５）は、ＣｆａＥＢとＣｓｓＡＢまたはＣｓｓＢＡとの混合物（つまり、グループ６および７）と比較して、ＣＳ６サブユニットに対する同様のまたはより高い抗体反応を誘発する。図１９に示す抗原と同じ一団に対して、ＩｇＧ応答が図２０に示されている。
【０１１８】
上記の結果は、非ＣＳ６サブユニット成分からの干渉が、融合構築物の結果として起きないことを示している。ＣｓｓＡＢと比較して、ＣｓｓＢＡに対して、とりわけＩｇＡに対して、やや高めの抗ＣＳ６応答が観察された。そのようなものとして、当該結果および図１５〜１８にまとめた結果は、分節融合構築物の構成成分に対する強い免疫応答を誘発する構築物が操作可能であること(operability)を示している。
実施例７：ＥＴＥＣ組み換えポリペプチド構築物に対する免疫の誘発方法
【０１１９】
付着因子は、下痢原性大腸菌細菌免疫誘導のための重要な要素である。本発明の一態様は、腸管毒素原性大腸菌媒介性下痢に対する免疫原として使用するための安定したポリペプチド構築物を構築することである。
【０１２０】
ＥＴＥＣに起因する病変に対する保護は、線毛媒介付着因子を遮断することによって細菌の定着を阻止し、もって、付着因子ポリペプチド領域への特異Ｂ細胞応答の誘導による細菌定着を阻止することによってもたらされうる。したがって、本発明の他の態様は、構造的に安定したポリペプチド構築物の投与によって免疫を誘導することである。さらなる態様は、できるだけ多くのＥＴＥＣ型に対する、ヒトなどの哺乳動物における免疫誘導能力である。免疫原の投与および産生を容易にするために、できるだけ多くのＥＴＥＣ型に対するできるだけ多くの免疫原を包含するよう構築することは高度に有利である。
【０１２１】
図１および図２の設計ならびに図１３および図１４に記載の例を用いて産出した組み換えポリペプチド構築物を製剤に用いて複数のＥＴＥＣ型に対する免疫を誘導することができる。
【０１２２】
一実施形態では、図１および／もしくは図２または図１３および図１４の例に基づいて構築される、免疫原としての構築物は、以下のステップを含む。
【０１２３】
ａ．実施例１〜６に上記したポリペプチド構築物を包含する免疫原性組成物の投与によるプライム（priming）。免疫原性組成物は、経口投与、経鼻投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、舌下投与、経皮的投与、筋肉内投与、または腸内投与されうる。免疫原の単位用量の範囲は、１μｇ〜１ｍｇのポリペプチド構築物である。免疫原性組成物は、キャリアタンパク質またはアジュバントの有無にかかわらずいくつもの溶液中で投与され、または、ミクロスフェアなどの粒子上に吸着されうる。
ｂ．プライム投与後に、緩衝水溶液または他の適切な溶液中で、１μｇ〜１ｍｇの単位用量範囲のポリペプチド構築物を用いて、２〜４回のブースト投与を行う。
別のワクチンアプローチは、組み換えポリペプチドを発現しうる組み換えＤＮＡ構築物を投与することである。この例では、免疫原をコードする組み換えＤＮＡは、適切な発現系に挿入され、宿主細菌細胞内で発現させる。そして、組み換え宿主細胞は、宿主細胞に対する免疫のみならず発現されたＥＴＥＣ組み換え付着因子ポリペプチドに対する免疫をも付与するために、全細胞ワクチンとして投与されうる。代表的な宿主細胞には、大腸菌、赤痢菌属のメンバー、カンピロバクター属のメンバー、サルモネラ属のメンバーおよびコレラ菌などのビブリオ属のメンバーを含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
全細胞性免疫を誘導する方法は、次のステップを包含する。
ａ．実施例１〜６に上記したポリペプチド構築物をコードするＤＮＡを含み発現しうる、適切な数の全細胞細菌を含むプライム投与量の投与。細菌は、大腸菌、赤痢菌類、サルモネラ類、カンピロバクター類、ビブリオ類およびコレラ菌で構成される群から選択される。
ｂ．プライム投与後に、全細胞細菌の２〜４回のブースト投与量の投与。全細胞細菌は、大腸菌、赤痢菌類、カンピロバクター類、ビブリオ類およびコレラ菌で構成される群から選択され、実施例１〜６に上記した組み換えポリペプチドをコードするＤＮＡを含み発現しうる。あるいは、ブースト投与量は、実施例１〜６に上記した組み換えポリペプチドを、緩衝水溶液中、免疫原を１μｇ〜１ｍｇの単位用量範囲で含むタンパク質でありうる。
本発明を説明してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲において、上記の教示に照らして本発明の多くの修正および変更が可能であると理解される。したがって、添付の特許請求の範囲内において本発明を明確に記載された以外の別の方法で実施しうることは理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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