(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺損傷及び／又は肺損傷に関連した疾患の治療のための薬物用の医薬組成物であって、
有効量のミトコンドリア及び少なくとも１種の医薬的に許容可能な担体を含み、
前記肺損傷は急性呼吸促迫症候群であることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項２】
前記肺損傷たる急性呼吸促迫症候群に関連した疾患は、肺炎、無気肺、呼吸困難、肺線維症及び肺水腫から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
有効量のメラトニンをさらに含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
肺損傷及び／又は肺損傷に関連した疾患の治療のための薬物の製造における、有効量のミトコンドリア及び少なくとも１種の医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物の使用。
【請求項５】
前記肺損傷に関連した疾患は、肺炎、無気肺、呼吸困難、肺線維症及び肺水腫から成る群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記肺損傷は急性呼吸促迫症候群であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬組成物は有効量のメラトニンをさらに含むことを特徴とする、請求項４乃至６の何れかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物及びその使用、特にはミトコンドリアを含有する医薬組成物に関し、肺損傷の改善又は治療に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
肺は呼吸器系における重要な器官であり、６００万〜８億個の肺胞が含まれる、柔らかく弾力があるスポンジ様の構造を有する。ヒトにおけるガス交換は肺胞及び肺胞の表面を覆う微小血管系において行われる。肺は極めて弱い器官であり、肺移植、心肺バイパス術、心肺蘇生、低酸素呼吸不全、煙の吸入及び急性呼吸促迫症候群につながり得る敗血症等の一部の状況下では急性の肺損傷が起き得る（Ｂｒｕｎ−Ｂｕｉｓｓｏｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍａｔｔｈａｙ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｒｕｂｅｎｆｅｌｄ  ＧＤ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｐｈｕａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ａｉｌａｗａｄｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｆｉｓｅｒ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｗａｒｅ  ＬＢ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃｉｅｓｌａ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；ｄｅｎ  Ｈｅｎｇｓｔ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０００３】
いわゆる急性呼吸促迫症候群は、命に関わる重篤な肺損傷である（Ｗａｒｅ  ＬＢ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃｈｏｉ  ＷＩ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。幾つかの研究によると、急性呼吸促迫症候群及び重篤な肺損傷は複数の要因、例えば重度の炎症反応、肺胞白血球の過形成、タンパク質の滲出、ミトコンドリアの酸化、活性酸化物の産生、肺の酸化ストレスの亢進及びアポトーシスにより引き起こされる（Ｗａｒｅ  ＬＢ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；ｄｅｎ  Ｈｅｎｇｓｔ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｄｏｌｉｎａｙ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｂｈａｒｇａｖａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓｕｎ  ＣＫ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｂｕｄｉｎｇｅｒ  ＧＲ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｙｉｐ  ＨＫ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
重篤な疾患を抱えた患者のための医療、治療方法及び医療機器は改良され続けており、また急性呼吸促迫症候群の病因は判明しているものの、急性呼吸促迫症候群の場合、支持療法、例えば人工呼吸器及びステロイドの使用が依然として主な治療法である。しかしながら、そのような支持療法は効果的ではない。したがって、急性呼吸促迫症候群の罹患率は高いままであり、高い死亡率につながる（Ｂｒｕｎ−Ｂｕｉｓｓｏｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍａｔｔｈａｙ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｒｕｂｅｎｆｅｌｄ  ＧＤ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｐｈｕａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ａｉｌａｗａｄｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。統計は、急性呼吸促迫症候群の死亡率は４０〜７０％に達することを示している。
【０００４】
したがって、急性呼吸促迫症候群及び／又はその関連疾患の臨床治療法として用いることができる新規且つ安全な治療レジメンが依然としてない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｒｕｎ−Ｂｕｉｓｓｏｎ  Ｃ，Ｍｉｎｅｌｌｉ  Ｃ，Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ  Ｇ，Ｂｒａｚｚｉ  Ｌ，Ｐｉｍｅｎｔｅｌ  Ｊ，Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ  Ｋ，Ｂｉｏｎ  Ｊ，Ｒｏｍａｎｄ  ＪＡ，Ｖｉｌｌａｒ  Ｊ，Ｔｈｏｒｓｔｅｉｎｓｓｏｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ａｃｕｔｅｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｃａｒｅ  ｕｎｉｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＡＬＩＶＥ  ｓｔｕｄｙ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００４，３０：５１−６１．
【非特許文献２】Ｍａｔｔｈａｙ  ＭＡ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ＧＡ：Ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｆｏｕｒ  ｄｅｃａｄｅｓ  ｏｆ  ｉｎｑｕｉｒｙ  ｉｎｔｏ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００５，３３：３１９−３２７．
【非特許文献３】Ｒｕｂｅｎｆｅｌｄ  ＧＤ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  Ｅ，Ｐｅａｂｏｄｙ  Ｅ，Ｗｅａｖｅｒ  Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ  ＤＰ，Ｎｅｆｆ  Ｍ，Ｓｔｅｒｎ  ＥＪ，Ｈｕｄｓｏｎ  ＬＤ：Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００５，３５３：１６８５−１６９３．
【非特許文献４】Ｐｈｕａ  Ｊ，Ｂａｄｉａ  ＪＲ，Ａｄｈｉｋａｒｉ  ＮＫ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  ＪＯ，Ｆｏｗｌｅｒ  ＲＡ，Ｓｉｎｇｈ  ＪＭ，Ｓｃａｌｅｓ  ＤＣ，Ｓｔａｔｈｅｒ  ＤＲ，Ｌｉ  Ａ，Ｊｏｎｅｓ  Ａ，ｅｔ  ａｌ：Ｈａｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｏｖｅｒ  ｔｉｍｅ？：Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００９，１７９：２２０−２２７．
【非特許文献５】Ａｉｌａｗａｄｉ  Ｇ，Ｌａｕ  ＣＬ，Ｓｍｉｔｈ  ＰＷ，Ｓｗｅｎｓｏｎ  ＢＲ，Ｈｅｎｎｅｓｓｙ  ＳＡ，Ｋｕｈｎ  ＣＪ，Ｆｅｄｏｒｕｋ  ＬＭ，Ｋｏｚｏｗｅｒ  ＢＤ，Ｋｒｏｎ  ＩＬ，Ｊｏｎｅｓ  ＤＲ：Ｄｏｅｓ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓｔｉｌｌ  ｃａｕｓｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｆｔｅｒ  ｌｕｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ？  Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ２００９，１３７：６８８−６９４．
【非特許文献６】Ｆｉｓｅｒ  ＳＭ，Ｔｒｉｂｂｌｅ  ＣＧ，Ｌｏｎｇ  ＳＭ，Ｋａｚａ  ＡＫ，Ｋｅｒｎ  ＪＡ，Ｊｏｎｅｓ  ＤＲ，Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＭＫ，Ｋｒｏｎ  ＩＬ：Ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｌｕｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｌａｔｅ  ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ  ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ２００２，７３：１０４１−１０４７；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １０４７−１０４８．
【非特許文献７】Ｗａｒｅ  ＬＢ，Ｍａｔｔｈａｙ  ＭＡ：Ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０００，３４２：１３３４−１３４９．
【非特許文献８】Ｃｉｅｓｌａ  ＤＪ，Ｍｏｏｒｅ  ＥＥ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＪＬ，Ｂｕｒｃｈ  ＪＭ，Ｃｏｔｈｒｅｎ  ＣＣ，Ｓａｕａｉａ  Ａ：Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎ  ｐｏｓｔｉｎｊｕｒｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２００５，１３８：７４９−７５７；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ７５７−７４８．
【非特許文献９】ｄｅｎ  Ｈｅｎｇｓｔ  ＷＡ，Ｇｉｅｌｉｓ  ＪＦ，Ｌｉｎ  ＪＹ，Ｖａｎ  Ｓｃｈｉｌ  ＰＥ，Ｄｅ  Ｗｉｎｄｔ  ＬＪ，Ｍｏｅｎｓ  ＡＬ：Ｌｕｎｇ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｖｉｅｗ  ｏｎ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２０１０，２９９：Ｈ１２８３−１２９９．
【非特許文献１０】Ｃｈｏｉ  ＷＩ，Ｓｈｅｈｕ  Ｅ，Ｌｉｍ  ＳＹ，Ｋｏｈ  ＳＯ，Ｊｅｏｎ  Ｋ，Ｎａ  Ｓ，Ｌｉｍ  ＣＭ，Ｌｅｅ  ＹＪ，Ｋｉｍ  ＳＣ，Ｋｉｍ  ＩＨ，ｅｔ  ａｌ：Ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｐｏｏｒ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｈｙｐｏｘｅｍｉｃ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｊ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  ２０１４．
【非特許文献１１】Ｄｏｌｉｎａｙ  Ｔ，Ｋｉｍ  ＹＳ，Ｈｏｗｒｙｌａｋ  Ｊ，Ｈｕｎｎｉｎｇｈａｋｅ  ＧＭ，Ａｎ  ＣＨ，Ｆｒｅｄｅｎｂｕｒｇｈ  Ｌ，Ｍａｓｓａｒｏ  ＡＦ，Ｒｏｇｅｒｓ  Ａ，Ｇａｚｏｕｒｉａｎ  Ｌ，Ｎａｋａｈｉｒａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ：Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｒｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２０１２，１８５：１２２５−１２３４．
【非特許文献１２】Ｂｈａｒｇａｖａ  Ｍ，Ｗｅｎｄｔ  ＣＨ：Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ  ２０１２，１５９：２０５−２１７．
【非特許文献１３】Ｓｕｎ  ＣＫ，Ｙｅｎ  ＣＨ，Ｌｉｎ  ＹＣ，Ｔｓａｉ  ＴＨ，Ｃｈａｎｇ  ＬＴ，Ｋａｏ  ＹＨ，Ｃｈｕａ  Ｓ，Ｆｕ  Ｍ，Ｋｏ  ＳＦ，Ｌｅｕ  Ｓ，Ｙｉｐ  ＨＫ：Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ａ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１１，９：１１８．
【非特許文献１４】Ｂｕｄｉｎｇｅｒ  ＧＲ，Ｍｕｔｌｕ  ＧＭ，Ｕｒｉｃｈ  Ｄ，Ｓｏｂｅｒａｎｅｓ  Ｓ，Ｂｕｃｃｅｌｌａｔｏ  ＬＪ，Ｈａｗｋｉｎｓ  Ｋ，Ｃｈｉａｒｅｌｌａ  ＳＥ，Ｒａｄｉｇａｎ  ＫＡ，Ｅｉｓｅｎｂａｒｔ  Ｊ，Ａｇｒａｗａｌ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ：Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｓ  ａｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２０１１，１８３：１０４３−１０５４．
【非特許文献１５】Ｙｉｐ  ＨＫ，Ｃｈａｎｇ  ＹＣ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＣＧ，Ｃｈａｎｇ  ＬＴ，Ｔｓａｉ  ＴＨ，Ｃｈｅｎ  ＹＬ，Ｃｈａｎｇ  ＨＷ，Ｌｅｕ  Ｓ，Ｚｈｅｎ  ＹＹ，Ｔｓａｉ  ＣＹ，ｅｔ  ａｌ：Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ  Ｐｉｎｅａｌ  Ｒｅｓ  ２０１３，５４：２０７−２２１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の第１の目的は、有効量のミトコンドリア及び少なくとも１種の医薬的に許容可能な担体を含む新規な医薬組成物を提供することであり、この新規な医薬組成物を個体に投与することで、ミトコンドリアを個体の特定の細胞に送達できる。
【０００７】
本発明の別の目的は、肺損傷及び／又は肺損傷に関連した疾患の治療又は改善のための新規な医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明のある実施形態は、少なくとも有効量のミトコンドリア及び少なくとも１種の医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を開示する。本発明の医薬組成物を個体に投与することで、ミトコンドリアを細胞に送達し、細胞の損傷を修復できる。
【０００９】
好ましくは、医薬組成物は、有効量のメラトニンをさらに含む。
【００１０】
本発明の特定の実施形態において、医薬組成物は、肺損傷又は肺損傷に関連した疾患を治療又は改善するために使用できる。特には、医薬組成物を個体に投与することで、ミトコンドリアは肺に進入し、肺損傷又は肺損傷に関連した疾患を治療又は改善できる。
【００１１】
好ましくは、肺損傷に関連した疾患は、肺炎、無気肺、呼吸困難、肺線維症、肺水腫などである。
【００１２】
好ましくは、肺損傷は急性呼吸促迫症候群である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の有益な効果は、以下の通りである。
【００１４】
損傷を受けた又は酸化ストレスを有する肺細胞にミトコンドリアを送達することで、本発明の医薬組成物は肺容量を取り戻し、急性呼吸促迫症候群が誘発した肺実質の損傷を改善し、酸化ストレスを改善し、肺胞上皮細胞のアポトーシスを減少させ、酸化物の発生を低減し、それにより重篤な肺実質の損傷を改善又は治療できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】単離したミトコンドリアの活動の検出結果を示す。
【図２Ａ】ヒト臍帯静脈内皮細胞に進入する外来ミトコンドリアを観察するための蛍光免疫染色のグラフであり、緑色の蛍光はミトコンドリア抗体Ａｂ−２で染色されたシグナルである。
【図２Ｂ】外来ミトコンドリアを観察するための蛍光免疫染色のグラフであり、外来ミトコンドリアは赤色の蛍光を発するマイトトラッカーで染色され、細胞と共培養された後、ヒト臍帯静脈内皮細胞に進入する。
【図２Ｃ】図２Ａと２Ｂとを重ねた結果を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ及び２Ｂと同じ視野での明視野顕微鏡で観察した、外来ミトコンドリアと共培養したヒト臍帯静脈内皮細胞を示す。
【図３Ａ】透過型電子顕微鏡で１２０００倍で観察した、単離したミトコンドリアのモルホロジーを示す。矢印はインタクトなミトコンドリアを示す。
【図３Ｂ】透過型電子顕微鏡で２５０００倍で観察した、単離したミトコンドリアのモルホロジーを示す。矢印はインタクトなミトコンドリアを示す。
【図４Ａ】０．５時間にわたる異なる条件下での処理後、ウェスタンブロット法による、各グループにおける酸化タンパク質の発現の検出を示す。
【図４Ｂ】６時間にわたる異なる条件下での処理後、ウェスタンブロット法による、各グループにおける酸化タンパク質の発現の検出を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ及び４Ｂの定量結果を示す。
【図５】各グループの酸素飽和度の解析結果を示す。
【図６】各グループのラットの右室収縮期圧の測定結果を示す。
【図７】各グループのラットの大腿動脈における収縮期血圧の測定結果を示す。
【図８】各グループのラットの心臓の重量の測定結果を示す。
【図９】各グループのラットの肺の重量の測定結果を示す。
【図１０】各グループのラットの肺重量対心臓重量比を示す。
【図１１Ａ】ＳＤＳゲル電気泳動で検出した各グループのラットのＢＡＬ液におけるアルブミンレベルを示す。
【図１１Ｂ】各グループのラットのＢＡＬ液におけるアルブミン濃度を示す。
【図１２】各グループのラットのＢＡＬ液におけるＭＰＯ＋細胞の比を示す。
【図１３】各グループのラットのＢＡＬ液におけるＣＤ４０＋細胞の比を示す。
【図１４】各グループのラットのＢＡＬ液におけるＣＤ１１ｂ／ｃ＋細胞の比を示す。
【図１５Ａ】第３グループのラットの肺実質に進入するミトコンドリアを観察するための蛍光免疫染色のグラフを示し、緑色の蛍光はミトコンドリア抗体Ａｂ−２で染色されたシグナルである。
【図１５Ｂ】第３グループのラットの肺実質に進入するミトコンドリアを観察するための蛍光免疫染色のグラフを示し、赤色の蛍光はマイトトラッカーで染色されたシグナルである。
【図１５Ｃ】図１５Ａと１５Ｂとを重ね合わせた結果を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃと同じ視野での可視光で観察した肺組織のモルホロジーを示す。
【図１６Ａ】透過型電子顕微鏡で観察した第１グループのラットの肺組織切片の画像であり、矢印はミトコンドリアを示す。
【図１６Ｂ】透過型電子顕微鏡で観察した第２グループのラットの肺組織切片の画像であり、矢印はミトコンドリアを示す。
【図１６Ｃ】透過型電子顕微鏡で観察した第３グループのラットの肺組織切片の画像であり、矢印はミトコンドリアを示す。
【図１７Ａ】ヘマトキシリン及びエオシンで染色した１グループのラットの肺組織切片の１００倍の画像である。
【図１７Ｂ】ヘマトキシリン及びエオシンで染色した２グループのラットの肺組織切片の１００倍の画像である。
【図１７Ｃ】ヘマトキシリン及びエオシンで染色した３グループのラットの肺組織切片の１００倍の画像である。
【図１７Ｄ】ヘマトキシリン及びエオシンで染色した４グループのラットの肺組織切片の１００倍の画像である。
【図１７Ｅ】ヘマトキシリン及びエオシンで染色した５グループのラットの肺組織切片の１００倍の画像である。
【図１８】各グループのラットの肺胞嚢数の統計結果を示す。
【図１９】各グループのラットの肺実質の重複領域（ｃｒｏｗｄｅｄ  ａｒｅａ）の積分による統計結果を示す。
【図２０Ａ】蛍光免疫染色による第１グループのラットの肺組織切片におけるＦ４／８０の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２０Ｂ】蛍光免疫染色による第２グループのラットの肺組織切片におけるＦ４／８０の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２０Ｃ】蛍光免疫染色による第３グループのラットの肺組織切片におけるＦ４／８０の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２０Ｄ】蛍光免疫染色による第４グループのラットの肺組織切片におけるＦ４／８０の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２０Ｅ】蛍光免疫染色による第５グループのラットの肺組織切片におけるＦ４／８０の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２０Ｆ】各グループのラットの肺組織切片においてＦ４／８０を発現している細胞の定量結果を示す。
【図２１Ａ】蛍光免疫染色による第１グループのラットの肺組織切片におけるγ−Ｈ２ＡＸの発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２１Ｂ】蛍光免疫染色による第２グループのラットの肺組織切片におけるγ−Ｈ２ＡＸの発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２１Ｃ】蛍光免疫染色による第３グループのラットの肺組織切片におけるγ−Ｈ２ＡＸの発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２１Ｄ】蛍光免疫染色による第４グループのラットの肺組織切片におけるγ−Ｈ２ＡＸの発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２１Ｅ】蛍光免疫染色による第５グループのラットの肺組織切片におけるγ−Ｈ２ＡＸの発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２１Ｆ】各グループのラットの肺組織切片においてγ−Ｈ２ＡＸを発現している細胞の定量結果を示す。
【図２２Ａ】蛍光免疫染色による第１グループのラットの肺組織切片におけるＣｘ４３の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２２Ｂ】蛍光免疫染色による第２グループのラットの肺組織切片におけるＣｘ４３の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２２Ｃ】蛍光免疫染色による第３グループのラットの肺組織切片におけるＣｘ４３の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２２Ｄ】蛍光免疫染色による第４グループのラットの肺組織切片におけるＣｘ４３の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２２Ｅ】蛍光免疫染色による第５グループのラットの肺組織切片におけるＣｘ４３の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２２Ｆ】各グループのラットの肺組織切片においてＣｘ４３を発現している細胞の定量結果を示す。
【図２３Ａ】蛍光免疫染色による第１グループのラットの肺組織切片におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２３Ｂ】蛍光免疫染色による第２グループのラットの肺組織切片におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２３Ｃ】蛍光免疫染色による第３グループのラットの肺組織切片におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２３Ｄ】蛍光免疫染色による第４グループのラットの肺組織切片におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２３Ｅ】蛍光免疫染色による第５グループのラットの肺組織切片におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）の発現を示し、スケールバーは２０μｍである。
【図２３Ｆ】各グループのラットの肺組織切片においてヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）を発現している細胞の定量結果を示す。
【図２４Ａ】ウェスタンブロット法により検出した各グループのラットの肺細胞におけるマトリックスメタロプロテナーゼ９の発現を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ａにおける各グループのラットのマトリックスメタロプロテナーゼ９の発現の定量結果を示す。
【図２５Ａ】ウェスタンブロット法により検出した各グループのラットの肺細胞における腫瘍壊死因子αの発現を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ａにおける各グループのラットの腫瘍壊死因子αの発現の定量結果を示す。
【図２６Ａ】ウェスタンブロット法により検出した各グループのラットの肺細胞における核内因子κＢの発現を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ａにおける各グループのラットの核内因子κＢの発現の定量結果を示す。
【図２７Ａ】各グループのラットの肺細胞における酸化タンパク質の発現を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ａにおける各グループのラットの酸化タンパク質の発現の定量結果を示す。
【図２８Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞におけるＮＯＸ−１の発現を示す。
【図２８Ｂ】図２８Ａにおける各グループのラットのＮＯＸ−１の発現の定量結果を示す。
【図２９Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞におけるＮＯＸ−２の発現を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ａにおける各グループのラットのＮＯＸ−２の発現の定量結果を示す。
【図３０Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞におけるＮＯＸ−４の発現を示す。
【図３０Ｂ】図３０Ａにおける各グループのラットのＮＯＸ−４の発現の定量結果を示す。
【図３１Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞におけるトランスフォーミング増殖因子βの発現を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ａにおける各グループのラットのトランスフォーミング増殖因子βの発現の定量結果を示す。
【図３２Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞におけるＳｍａｄ３の発現を示す。
【図３２Ｂ】図３２Ａにおける各グループのラットのＳｍａｄ３の発現の定量結果を示す。
【図３３Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞における骨形成タンパク質２の発現を示す。
【図３３Ｂ】図３３Ａにおける各グループのラットの骨形成タンパク質２の発現の定量結果を示す。
【図３４Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞におけるＳｍａｄ１／５の発現を示す。
【図３４Ｂ】図３４Ａにおける各グループのラットのＳｍａｄ１／５の発現の定量結果を示す。
【図３５Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞における活性化カスパーゼ３の発現を示す。
【図３５Ｂ】図３５Ａにおける各グループのラットの活性化カスパーゼ３の発現の定量結果を示す。
【図３６Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞における活性化ＰＡＲＰの発現を示す。
【図３６Ｂ】図３６Ａにおける各グループのラットの活性化ＰＡＲＰの発現の定量結果を示す。
【図３７Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞のサイトゾルにおけるチトクロムｃの発現を示す。
【図３７Ｂ】図３７Ａにおける各グループのラットの肺細胞のサイトゾルにおけるチトクロムｃの発現の定量結果を示す。
【図３８Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞のミトコンドリアにおけるチトクロムｃの発現を示す。
【図３８Ｂ】図３８Ａにおける各グループのラットの肺細胞のミトコンドリアにおけるチトクロムｃの発現の定量結果を示す。
【図３９Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）の発現を示す。
【図３９Ｂ】図３９Ａにおける各グループのラットのヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）の発現の定量結果を示す。
【図４０Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞におけるＮＱＯ１の発現を示す。
【図４０Ｂ】図４０Ａにおける各グループのラットのＮＱＯ１の発現の定量結果を示す。
【図４１Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞におけるＧＲの発現を示す。
【図４１Ｂ】図４１Ａにおける各グループのラットのＧＲの発現の定量結果を示す。
【図４２Ａ】ウェスタンブロット法により検出された各グループのラットの肺細胞におけるＧＰｘの発現を示す。
【図４２Ｂ】図４２Ａにおける各グループのラットのＧＰｘの発現の定量結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
別途定義がない限り、本発明の明細書及び請求項で用いる技術及び科学用語の意味は、本発明が関係する分野の技術に精通したものが一般に理解するものと同じである。矛盾が生じる場合は、本発明の内容が優先される。
【００１７】
本発明で開示の「単離したミトコンドリア」又は「外来ミトコンドリア」という語は、ドナー、レシピエント又は特定の細胞から単離したミトコンドリアを指す。ミトコンドリアの単離方法は、請求の発明が関係する分野の通常の技術を有するものに既知の分離及び抽出技法である。例えば、ミトコンドリアは、ミトコンドリアを含有する細胞又は組織をホモジナイズし、次にホモジナイズした細胞又は組織を遠心分離することで得られる。
【００１８】
本発明で開示の「メラトニン」という語は、生体内にあり且つ以下の式（Ｉ）：
【００１９】
【化１】
0006355220.tif 000002
【００２０】
を有するホルモンを指す。
【００２１】
本発明で開示の「急性呼吸促迫症候群のラットモデル」という語は、ラットを純酸素（１００％のＯ２）に４８時間にわたって連続的に曝露することで成功裡に用意されたと判明している。具体的には、過去の研究結果は、純酸素を５３時間にわたって吸ったラットは７２時間以内に死亡したことを示している。加えて、純酸素を４８時間にわたって吸ったラットは７２時間後も生存していたが、動脈酸素飽和度（ＳａＯ２）は８９％未満であり、肺は肺実質が重度の損傷を受けていた。
【００２２】
本発明で開示の「ウェスタンブロット」又は「ウェスタンブロット法」という語は、サンプルにおけるタンパク質の存在を検出するための１つのイムノアッセイ法を指す。ウェスタンブロット法の主なステップには、ＳＤＳゲル電気泳動によりサンプル中のタンパク質を分離し、分離したタンパク質を転写膜、例えばＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）膜に転写し、転写膜をブロッキングバッファ、次にターゲットタンパク質に対する一次抗体を含有する溶液に浸漬させ、蛍光染料で標識した二次抗体でターゲットタンパク質を検出することが含まれる。
【００２３】
本発明で開示の「タンパク質酸化検出キット」という語は、細胞におけるタンパク質酸化を検出する方法を指す。例えば、本発明の実施例で使用したＯｘｙｂｌｏｔ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｓ７１５０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）は、サンプル中の酸化タンパク質を２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）で標識し、サンプル中のタンパク質を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、分離したタンパク質を転写膜、例えばニトロセルロース膜に転写し、転写膜を抗ＤＮＰ一次抗体を含有するバッファ（１：１５０）に約２時間浸漬させ、次に転写膜を二次抗体を含有する室温のバッファ（１：３００）に約１時間浸漬させ、次にサンプルにおける酸化タンパク質の発現を観察することで酸化タンパク質を検出する。
【００２４】
本発明で開示の「有効量」という語は、所望の効果を生み出すのに必要な化合物又は有効成分の量を指し、組成物における重量パーセントで示される。請求の発明が関係する分野の通常の技術を有するものならばわかるように、この有効量は特定の効果を引き起こす投与方法に応じて異なる。概して、組成物における有効成分又は化合物の量は、組成物の重量の約１〜約１００％、好ましくは約３０〜約１００％になり得る。
【００２５】
本発明で開示の「医薬組成物」という語は、特定の効果を生み出す有効量の所望の化合物又は有効成分及び少なくとも１種の医薬的に許容可能な担体を指す。請求の発明が関係する分野の通常の技術を有するものならばわかるように、医薬組成物のタイプは特定の効果を引き起こす投与方法に応じて異なり、例えば錠剤、粉末、注射等である。加えて、担体は、医薬組成物の形態に応じて固体、半固体又は液体になり得る。例えば、担体には、以下に限定するものではないが、ゼラチン、乳化剤、炭化水素混合物、水、グリセロール、生理食塩水、緩衝食塩水、ラノリン、パラフィン、蜜蝋、ジメチルシリコーンオイル及びエタノールが含まれる。
【００２６】
本発明で開示の「投与」という語は、身体の特定の部位、特定の細胞又は特定のターゲットに物質を送達する手段又はその物質が個体と接触する経路を指す。概して、投与経路には、以下に限定するものではないが、経口投与、経皮投与、噴霧、吸入及び注射が含まれる。
【００２７】
本発明で開示の「ある」又は「その」という語は、別段の定めがない限り、明細書及び請求項において１以上の数値をその範囲に含むものとする。
【００２８】
本発明で開示の「有意差」、「有意に上昇」又は「有意に低下」における「有意」又は「有意に」という語は、統計解析後、２組のデータ間に統計的な差がある、すなわちｐ値＜０．０５であることを示す。本発明の実施形態において、いわゆる有意差はｐ値＜０．０１である。
【００２９】
本発明の複数の効果についてさらに説明するために、以下の実施例を参照しながら本発明についてさらに詳しく述べる。しかしながら、これらの実施例は説明のためのものであって、実施例で用いた語は本発明の明細書及び請求項の範囲及び意味を限定しない。
【００３０】
加えて、実施例における全ての動物試験はＫａｏｈｓｉｕｎｇ  Ｃｈａｎｇ  Ｇｕｎｇ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｃｏｎｓｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｎｏ．２００８１２１１０８）により承認され、またｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓが発行したＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ：８５−２３，１９９６）に準拠して行われたことを明記しておかなくてはならない。
【００３１】
実施例における全ての量子化データは平均±標準偏差で提示される。別段の定めがない限り、統計方法はＡＮＯＶＡであり、解析ソフトウェアはＳＡＳ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ケアリー、ノースカロライナ）であった。
【実施例】
【００３２】
実施例１：外来ミトコンドリアの準備
一晩絶食させてからラットを屠殺し、胆嚢及び肝臓を取り出した。約３グラムの肝臓を速やかに５０ｍｌの氷冷ＩＢｃ溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＭＯＰＳ、５ｍＭのＥＧＴＡ／Ｔｒｉｓ及び２００ｍＭのスクロース、ｐＨ７．４）に浸漬させ、続いて肝臓を氷冷ＩＢｃ溶液で洗浄して血液を除去した。この肝臓を、周囲を氷で取り囲んだ容器内で細断し、清浄化のためのＩＢｃ溶液を除去し、１８ｍｌの新たなＩＢｃ溶液を加えた。肝臓をホモジナイズした後、ホモジネートを６００ｘｇで１０分間にわたって４℃で遠心分離した。上清を除去し、７０００ｘｇで１０分間にわたって４℃で遠心分離し、次に上清を除去した。沈殿物は、ラットの肝臓から単離したミトコンドリアを含有した。この沈澱物を懸濁させるとミトコンドリア懸濁液が得られ、ミトコンドリア懸濁液の濃度をビウレット試験により測定した。
【００３３】
それぞれ１０ｍｇの単離したミトコンドリアを、続く実施例で後々使用するために赤色蛍光の１μＭのマイトトラッカー（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カルフォルニア）で標識した。
【００３４】
実施例２：単離したミトコンドリアの活動の検出
ミトコンドリア懸濁液（１０μｇ）を冷たい１倍のミトコンドリアアッセイ溶液（ＭＡＳ）で希釈し、３０００ｘｇで３０分間にわたって回転させた。このミトコンドリアアッセイ溶液はｐＨ７．２を有し、７０ｍＭのスクロース、２２０ｍＭのマンニトール、１０ｍＭのリン酸カリウム、５ｍＭの塩化マグネシウム、２ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１０ｍＭのＥＧＴＡを含有する。
ミトコンドリアをＸＦ２４  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、マサチューセッツ、米国）の培養皿に付着させ、次にカップリングによりミトコンドリア酸素消費速度について試験し、カップリングの各段階で追加する化合物の濃度は以下の通りであった：１０ｍＭのスクシネート、０．５ｍＭのＡＤＰ、２μＭのオリゴマイシン、４μＭのＦＣＣＰ及び４μＭのアンチマイシンＡ。ミトコンドリア酸素消費速度の統計結果を図１に示す。
【００３５】
図１に示すように、ラットの肝臓から単離したミトコンドリアにおける電子伝達系及び酸化的リン酸化は正常であり、これはミトコンドリアが正常な機能を有したことを意味する。
【００３６】
実施例３：外来ミトコンドリアの細胞への変換のアッセイ
ヒト臍帯静脈内皮細胞（５．０ｘ１０６細胞）を２μＭのメナジオンと３０分間にわたって共培養し、次に標識したミトコンドリアと３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。細胞へのミトコンドリアの変換は蛍光免疫染色により、透過型電子顕微鏡を使用して観察された。結果を図２及び図３に示す。
【００３７】
図２及び図３に示すように、多量のミトコンドリアが、メナジオンで処理したヒト臍帯静脈内皮細胞に進入した。
【００３８】
実施例４：細胞内タンパク質酸化の検出
ヒト臍帯静脈内皮細胞を３つのグループに分けた。第１グループのヒト臍帯静脈内皮細胞は無処理のままとした。第２グループのヒト臍帯静脈内皮細胞をメナジオンで処理し、第３グループのヒト臍帯静脈内皮細胞をメナジオン、次に外来ミトコンドリアで処理した。各グループにおけるタンパク質酸化を、処理から０．５時間及び６時間後に市販のタンパク質酸化アッセイキット（Ｏｘｙｂｌｏｔ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｓ７１５０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で検出し、各グループの細胞における酸化ストレスをさらにソフトウェア（Ｌａｂｗｏｒｋ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＶＰ）で解析した。結果を図４に示す。
【００３９】
細胞におけるメナジオン誘発性の酸化ストレスは細胞損傷を引き起こすため、図４に示す結果は、酸化ストレス下にある第２グループのヒト臍帯静脈内皮細胞においてタンパク質酸化が、第１グループの細胞におけるタンパク質酸化と比較して、有意に増加したことを示す。加えて、第３グループのヒト臍帯静脈内皮細胞も酸化ストレス下にあるものの、第３グループの細胞におけるタンパク質酸化は第２グループの細胞におけるものと比較して有意に減少した。したがって、正常な機能を有する外来ミトコンドリアの細胞への変換により、酸化ストレスにより引き起こされる損傷から細胞を保護できる。
【００４０】
したがって、本発明で開示のミトコンドリアを含有する医薬組成物は、酸化ストレスにより誘発される損傷から細胞を保護できる。
【００４１】
実施例５：ラットのグループ分け
それぞれ体重が３５０〜４００ｇの全部で４０頭の特定病原体除去（ＳＰＦ）のオスの成体ＳＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、台湾）を実施例において用いた。ＳＤラットをランダムに５つのグループに分けた。
第１グループは正常なコントロールグループであり、第２グループは急性呼吸促迫症候群のラットモデルであり、第３グループは、純酸素を吸ってから６時間及び２４時間後に体重１キログラムあたり各用量５０ｍｇでメラトニンを腹腔内注射した急性呼吸促迫症候群のラットモデルであり、第４グループは、純酸素を吸ってから６時間後にラット１頭あたり１５００μｇの用量でミトコンドリアを静脈内注射した急性呼吸促迫症候群のラットモデルであり、第５グループは、第３及び第４グループのものとそれぞれ同じやり方、頻度及び用量でメラトニン及びミトコンドリアを投与した急性呼吸促迫症候群のラットモデルであった。
【００４２】
実施例６：各グループのラットについての血行動態試験の結果
実施例５における各グループのラットに麻酔をかけた。動脈血を各グループのラットの頸動脈から採取し、血液サンプルの酸素飽和度を分析した。結果を図５に示す。
【００４３】
次に、各グループのラットに、小動物用ベンチレータ（ＳＡＲ−８３０／Ａ、ＣＷＥ，Ｉｎｃ．、米国）及び挿管を用いて陽圧換気（１分間あたり１８０ｍｌ）でもって空気を与えた。左開胸術を各グループのラットに行い、軟性プラスチックニードルを各グループのラットの右室に挿入した。右室収縮期圧のシグナルを圧力トランスデューサ（ＵＦＩ、モデル１０５０、カリフォルニア、米国）で測定し、ブリッジ増幅器（ＭＬ８６６  ＰｏｗｅｒＬａｂ  ４／３０  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ。ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．、キャッスルヒル、ニューサウスウェールズ、オーストラリア）に伝送することで各グループのラットの右室収縮期圧を肺高血圧の基準として得た。加えた、各グループのラットの大腿動脈収縮期血圧を測定した。右室収縮期圧及び大腿動脈収縮期血圧をソフトウェア（Ｌａｂｃｈａｒｔ、ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で解析した。結果を図６及び図７に示す。
【００４４】
その後、各グループのラットを屠殺し、計量するために心臓及び肺を取り出した。結果を図８〜図１０に示す。
【００４５】
図５に示すように、第１グループのラットは最も高い酸素飽和度を有し、第２グループのラットは最も低い酸素飽和度を有した。第３グループの酸素飽和度は第４グループのものより有意に高かった。第５グループの血液酸素飽和度は第３及び第４グループのものより有意に高く、第１グループと第５グループとの間に有意差はなかった。
【００４６】
図６に示すように、第１グループのラットは最も低い右室収縮期圧を有し、第２グループのラットは最も高い右室収縮期圧を有した。第４グループと比較すると、右室収縮期圧は第３グループで有意に低下した。第５グループの右室収縮期圧は第３及び第４グループのものより有意に低かった。図７に示すように、第１〜第５グループ間で大腿動脈収縮期血圧に有意差はなかった。
【００４７】
図８を参照する。図８は、各グループにおける心臓組織の重量が同様であることを示している。しかしながら、５つのグループの酸化飽和度の比較結果（図５を参照のこと）と肺組織の重量（図９を参照のこと）及び肺重量対心臓重量（図１０を参照のこと）の比較結果との間には負の相関関係がある。さらに、肺組織の重量（図９を参照のこと）と右室収縮期圧（図６を参照のこと）との間には正の相関関係がある。
【００４８】
上記の結果に基づいて、７２時間にわたって個体に純酸素を連続的に投与することで肺損傷、酸素飽和度の低下及び右室収縮期圧の上昇が起きることが判明した。有効量のミトコンドリア又はミトコンドリア及びメラトニンを含有する組成物を個体に投与することで、酸素飽和度を効果的に上昇させることができ、また右室収縮期圧を効果的に低下させることができる。これら全ての処置の中でも、外来ミトコンドリア及びメラトニンを含有する組成物の投与が最良の効果を有した。
【００４９】
したがって、本発明の医薬組成物は、肺損傷、呼吸促迫症候群及び／又はその関連症状を治療できる。
【００５０】
実施例７：各グループのラットのＢＡＬ液の検出
ＢＡＬ液を各グループのラットから気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）により得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色を用いて各グループのＢＡＬ液におけるアルブミン濃度を検出し、結果を図１１に示す。さらに、各グループのＢＡＬ液中のＭＰＯ＋、ＣＤ４０＋及びＣＤ１１ｂ／ｃ＋細胞の数をフローサイトメトリで計算した。統計解析の結果を図１２〜図１４に示す。
【００５１】
図１１〜図１４に示すように、第１グループにおけるアルブミン濃度及び炎症細胞数は５つのグループの中で最も低かったが、第２グループにおけるアルブミン濃度及び炎症細胞数は５つのグループの中で最も高かった。第５グループにおけるアルブミン濃度及び炎症細胞数は第２及び第４グループのものより有意に低く、第３グループにおけるアルブミン濃度及び炎症細胞数は第２グループにおけるものより有意に低かった。
【００５２】
第２グループにおいてアルブミン濃度及び炎症細胞数が有意に上昇した結果に基づくと、純酸素を個体に７２時間にわたって連続的に投与することで急性肺損傷の症状が誘発され、肺炎が引き起こされた。しかしながら、ミトコンドリア又はミトコンドリア及びメラトニンを含有する組成物を急性肺損傷の症状を抱えた個体に投与することで、ＢＡＬ液中のアルブミン濃度及び炎症細胞数を効果的に低下させることができる。これら全ての処置の中でも、外来ミトコンドリア及びメラトニンを含有する組成物の投与が最良の効果を有した。
【００５３】
したがって、本明細書で開示の医薬組成物は、急性肺損傷又は肺炎の症状を治療又は改善できる。
【００５４】
実施例８：各グループのラットの肺組織切片の観察
各グループのラットの左肺を一定の気道圧（１５〜２０ｍｍＨｇ）で膨らませ、免疫組織化学染色用にＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）を埋め込んだ。各グループのラットの右肺を４％パラホルムアルデヒド及び０．１％リン酸グルタルアルデヒド緩衝液で固定し、次にパラフィンに包埋し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【００５５】
ラットの肺薄片の蛍光免疫染色の結果を共焦点顕微鏡で観察した。図１５に示すように、緑色は、肺組織においてミトコンドリア抗体２で染色されたミトコンドリアを表し、赤色はマイトトラッカーの赤色の蛍光で染色された外来ミトコンドリアを表す。さらに、第１グループ、第２グループ及び第３グループの肺切片を透過型電子顕微鏡で観察した。結果を図１６に示し、矢印はミトコンドリアを示す。
【００５６】
ヘマトキシリン及びエオシンで染色した各グループのラットの肺組織切片を１００倍で観察した。結果を図１７に示す。さらに、各グループの１頭のラットからの３つの肺切片を選択し、３つの高倍率視野（ＨＰＦ、１００ｘ）をランダムに切片のそれぞれから選択し、高倍率視野において各グループの肺胞嚢数を計算した。肺胞嚢の総数を９で割ると、高倍率視野における各グループの肺胞嚢平均数が得られた。結果を図１８に示す。
【００５７】
各グループのラットの肺組織における重複領域の積分を以下の基準によりさらに計算した。０は重なりがないことを表し、１は高倍率視野のそれぞれにおいて重複領域が１５％未満であることを表し、２は高倍率視野のそれぞれにおいて重複領域が１５〜２５％であることを表し、３は高倍率視野のそれぞれにおいて重複領域が２５〜５０％であることを表し、４は高倍率視野のそれぞれにおいて重複領域が５０〜７５％であることを表し、５は高倍率視野のそれぞれにおいて重複領域が７５〜１００％であることを表す。
いわゆる重複領域とは、肺実質における厚みがある区間のことであり、これは肺胞が部分的又は完全に潰れることに関連している。各グループのラットの肺組織における重複領域の積分を図１９に示す。
【００５８】
図１５に示すように、外来ミトコンドリアは、急性呼吸促迫症候群のラットの肺胞上皮に進入した。図１６に示すように、第２グループのラットのミトコンドリアのサイズは第１グループのラットのものと比較して増大し、第２グループのラットのミトコンドリア内膜にクリステは殆どない。第２グループのラットのものと比較して、第３グループのラットのミトコンドリアのサイズは小さく、ミトコンドリア内膜にはクリステがある。
【００５９】
図１７及び図１８に示すように、第１グループにおける肺胞嚢数が最も多く、第２グループにおける肺胞嚢数が最も少なかった。第５グループにおける肺胞嚢数は第３及び第４グループのものより有意に多く、第３グループにおける肺胞嚢数は第２グループにおけるものより有意に多かった。
図１９に示すように、第１グループのラットの肺組織に重複領域は殆どなく、積分は最も低かった。第２グループの肺組織における重複領域が最も多かった。第５グループの肺組織における重複領域は第３グループ及び第４グループのものより有意に少なく、第４グループの肺組織における重複領域は第２グループのものより有意に少なかった。
図１８を図１９と比較すると、２つの結果は負の相関関係を示すことが判明した。
【００６０】
上記の結果から、急性呼吸促迫症候群のラットモデルは膨脹し変形したミトコンドリア及び無気肺を有し、これは重篤な肺損傷につながる。しかしながら、正常な機能を有する外来ミトコンドリア又は外来ミトコンドリア及びメラトニンを含有する組成物を重篤な肺損傷を抱えた個体に投与して外来ミトコンドリアを肺胞に進入させることで、ミトコンドリアのモルホロジーを改善し、ミトコンドリアの機能を回復させ、肺の虚脱を軽減できる。これら全ての処置の中でも、外来ミトコンドリア及びメラトニンを含有する組成物の投与が最良の効果を有した。
【００６１】
したがって、本明細書で開示の医薬組成物は、重篤な肺損傷及び／又は関連症状の治療又は改善効果を有する。
【００６２】
実施例９：各グループのラットにおける炎症細胞及び抗酸化物質バイオマーカーの検出
各グループの肺組織のパラフィン切片を３０分間にわたって３％過酸化水素で再水和させ、続いて高機能Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｌｏｃｋ試薬（ＢｉｏＳＢ）を室温で３０分間にわたって添加した。次に、切片を以下のタンパク質：Ｆ４／８０（１：１００、Ａｂｃａｍ）、γ−Ｈ２ＡＸ（１：５００、Ａｂｃａｍ）、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１、１：２０００、Ａｂｃａｍ）及びＣｘ４３の特異的一次抗体でそれぞれ処理した。
免疫組織化学染色を各グループの肺組織の切片に行い、細胞におけるＦ４／８０、γ−Ｈ２ＡＸ、ヘムオキシゲナーゼ１及びＣｘ４３の発現を観察した。加えて、各グループの肺組織切片における、上で挙げたタンパク質の発現を定量化し、結果を図２０〜図２３に示す。赤色の蛍光はマイトトラッカーで標識した外来ミトコンドリアを表し、緑色の蛍光は肺内のミトコンドリアを表す。
【００６３】
データを以下のようにして定量化した。各グループの１頭のラットからの３つの肺切片を蛍光免疫染色用に選択し、次に３つの強拡大視野（ＨＰＦ、４００ｘ）をランダムに切片のそれぞれから選択し、高倍率視野において各グループのポジティブ染色細胞の数を計算した。ポジティブ染色細胞の総数を９で割ると、高倍率視野における各グループのポジティブ染色細胞平均数が得られた。
【００６４】
図２０及び図２１を参照する。Ｆ４／８０及びγ−Ｈ２ＡＸの発現に関して、第１グループは５つのグループの中で最も低く、第２グループは５つのグループの中で最も高く、第５グループは第３グループ及び第４グループより有意に低く、第３グループは第４グループより有意に低かった。
【００６５】
図２２を参照する。Ｃｘ４３の発現に関して、第１グループは５つのグループの中で最も高く、第２グループは５つのグループの中で最も低く、第５グループは第３グループ及び第４グループより有意に高く、第４グループは第３グループより有意に高かった。
【００６６】
図２３を参照する。ヘムオキシゲナーゼ１の発現に関して、第５グループは５つのグループの中で最も高く、第１グループは５つのグループの中で最も低く、第３グループは第２グループより有意に高かった。
【００６７】
過去の研究に基づくと、Ｆ４／８０はマクロファージの表面上の特異的マーカーであり、細胞内炎症反応のマーカーとして用いられる。γ−Ｈ２ＡＸはＤＮＡ損傷のマーカーである。Ｃｘ４３は、肺胞及び肺胞上の微小血管の透過性に発現が関係しているギャップ結合タンパク質である。ヘムオキシゲナーゼ１は抗酸化能力に関するバイオマーカーであり、肺保護を評価するための指標として用いられる。したがって、図２０〜図２３の結果は、純酸素を個体に連続的に投与することで細胞ＤＮＡ損傷が引き起こされ、肺細胞の正常な生理機能が影響を受け、個体の肺実質において炎症細胞の数が増加し、肺胞透過性が低下したことを示す。
外来ミトコンドリア又はミトコンドリア及びメラトニンを含有する組成物は、損傷をうけた肺組織が産生するヘムオキシゲナーゼ１に対抗し且つ酸化ストレスにより引き起こされた細胞の損傷及び炎症を軽減して肺細胞の正常な生理機能を維持可能な抗酸化物質である。これら全ての処置のなかでも、ミトコンドリア及びメラトニンを含有する組成物の投与は最良の効果を有した。
【００６８】
したがって、本明細書で開示の医薬組成物は肺損傷に対する有効な抗酸化物質であり、また急性呼吸促迫症候群及び／又は関連症状の治療又は改善に使用できる。
【００６９】
実施例１０：各グループの肺実質における炎症、酸化ストレス、線維症及びアポトーシスに関連したタンパク質の発現の検出
各グループのラットの左肺のタンパク質抽出物を準備した。各グループのラットの同量（１０〜３０μｇ）のタンパク質抽出物をそれぞれウェスタンブロット法及びＯｘｙｂｌｏｔ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｓ７１５０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）による検出に供した。結果を、増強化学発光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で観察し、各タンパク質の性能をソフトウェア（Ｌａｂｗｏｒｋ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＶＰ）で定量化した。結果を図２４〜４２に示す。
【００７０】
具体的には、ウェスタンブロット法の手順及び条件は以下の通りである。タンパク質を、グラジエントが８〜１０％のポリアクリルアミド溶液でのＳＤＳゲル電気泳動により分離した。使用したブロッキング剤は、５％スキムミルク粉末及び０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するＴ−ＴＢＳ溶液であった。一次抗体はそれぞれ以下のタンパク質：ＮＯＸ−１（１：１５００、Ｓｉｇｍａ）、ＮＯＸ−２（１：７５０、Ｓｉｇｍａ）、ＮＯＸ−４（１：１０００、Ａｂｃａｍ）に対するものであり、あるいは以下のタンパク質：腫瘍壊死因子α（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、核内因子κＢ（１：２５０、Ａｂｃａｍ）、マトリックスメタロプロテナーゼ９（１：３０００、Ａｂｃａｍ）、トランスフォーミング増殖因子β（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、Ｓｍａｄ３（１：５００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、骨形成タンパク質２（１：１００、Ａｂｃａｍ）、Ｓｍａｄ１／５（１：５００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＧＲ（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、ＧＰｘ（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、チトクロムＣ（１：２０００、ＢＤ）、ＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ１；１：１０００、Ａｂｃａｍ）、ヘムオキシゲナーゼ１（１：２５０、Ａｂｃａｍ）、カスパーゼ３（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ；１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対するポリクローナル抗体と相互作用した。ＨＲＰ酵素系蛍光染剤にコンジュゲートさせた二次抗体は、マウスＩｇＧに対するヤギ抗体、ラットＩｇＧに対するヤギ抗体又はウサギＩｇＧに対するヤギ抗体である。
【００７１】
図２４〜図２６に示すように、炎症指標タンパク質：マトリックスメタロプロテナーゼ９、核内因子κＢ及び腫瘍壊死因子αの発現レベルは第１グループで最も低く、第２グループで最も高かった。第５グループの３種の炎症指標タンパク質の発現レベルは第２及び第４グループのものより有意に低く、第３グループの３種の炎症指標タンパク質の発現レベルは第２及び第４グループのものより有意に低かった。
【００７２】
図２７を参照する。第２グループの酸化ストレスは５つのグループの中で最も高く、第５グループの酸化ストレスは第２〜第４グループのものより有意に低く、第３グループの酸化ストレスは第２及び第４グループのものより有意に低い。
【００７３】
図２８〜図３０に示すように、活性酸素種（ＲＯＳ）指標タンパク質：ＮＯＸ−１、ＮＯＸ−２及びＮＯＸ−４の発現レベルは第１グループで最も低く、第２グループで最も高かった。第５グループの３種のＲＯＳ指標タンパク質の発現レベルは第２〜第４グループのものより有意に低く、第３グループの３種のＲＯＳ指標タンパク質の発現レベルは第２及び第４グループのものより有意に低かった。
【００７４】
トランスフォーミング増殖因子β及びＳｍａｄ３は線維症指標タンパク質であり、骨形成タンパク質２及びＳｍａｄ１／５は抗線維症指標タンパク質である。
図３１及び図３２を参照する。トランスフォーミング増殖因子β及びＳｍａｄ３の発現レベルは第１グループで最も低く、第２グループで最も高かった。第５グループの発現レベルは第２〜第４グループのものより有意に低かった。第３グループの発現レベルは第２及び第４グループのものより有意に低かった。
図３３及び図３４を図３１及び図３２と比較すると、５つのグループの肺実質における骨形成タンパク質２及びＳｍａｄ１／５の発現レベルは、トランスフォーミング増殖因子β及びＳｍａｄ３の発現レベルと負の相関関係にあった。
【００７５】
さらに図３５〜図３７を参照する。アポトーシス指標タンパク質：活性化カスパーゼ３、活性化ＰＡＲＰ及びチトクロムｃの発現レベルは第１グループで最も低く、第２グループで最も高かった。第５グループの３種のアポトーシス指標タンパク質の発現レベルは第２及び第４グループのものより有意に低く、第３グループの３種のアポトーシス指標タンパク質の発現レベルは第２及び第４グループのものより有意に低かった。ミトコンドリアのチトクロムｃはミトコンドリアの構造的完全性の指標であるため、図３８を図３５〜図３７と比較すると、５つのグループの肺実質におけるミトコンドリアチトクロムｃの発現レベルは、３種のアポトーシス指標タンパク質の発現レベルと負の相関関係にあった。
【００７６】
図３９〜図４２を参照する。ＧＲ、ＧＰｘ、ＮＱＯ１及びヘムオキシゲナーゼ１である抗酸化物質バイオマーカーの発現レベルは第１グループで最も低く、第５グループで最も高かった。第３グループの４種の抗酸化物質バイオマーカーの発現レベルは第２及び第４グループのものより有意に高かった。
【００７７】
上記の結果から、アポトーシス、線維症及び炎症に関連したタンパク質の発現レベルは急性呼吸促迫症候群のラットモデルの肺実質において有意に上昇し、ＲＯＳ指標タンパク質の発現レベルも同様に有意に上昇することが判明し、これはその肺細胞が損傷を受けた又は死に、肺の機能不全に至ることを示している。
ミトコンドリア又はミトコンドリア及びメラトニンを含有する組成物を投与することで、純酸素により誘発された損傷を受けた肺胞細胞へのミトコンドリアの導入は、肺実質におけるアポトーシス、線維症及び炎症に関連したタンパク質の発現レベルを有意に低下させ、また酸化ストレス、肺細胞における損傷又は死を低減できる。加えて、ミトコンドリア及びメラトニンを含有する組成物の投与は最良の効果を生んだ。
【００７８】
したがって、本発明の医薬組成物は、酸化ストレスを低下させ、炎症反応を抑制し、肺上皮細胞の死を減少させ、それにより重篤な肺損傷の治療効果を得て正常な肺機能を維持できる。
【００７９】
実施例１１：用量分析
急性呼吸促迫症候群のラットモデルを２つのグループに分けた。一方のグループはラット１頭あたり７５０μｇのミトコンドリアを与えられ、もう一方のグループはラット１頭あたり１５００μｇのミトコンドリアを与えられた。２つのグループのラットを動脈血ガス試験及び血行動態試験に供した。結果を下の表１に示す。
【００８０】
【表１】
0006355220.tif 000003
【００８１】
上の表１の結果からわかるように、高用量及び低用量のミトコンドリアの個体への投与により本発明の所望の効果を達成でき、高用量ではより良好な結果を達成できる。
【００８２】
これまでの説明から、損傷を受けた又は酸化ストレス下にある肺細胞にミトコンドリアを送達することで、本発明の医薬組成物は肺機能を復活させ、急性呼吸促迫症候群、酸化ストレス及び肺胞上皮細胞のアポトーシスにより誘発された肺実質の損傷を緩和し、酸化物の発生を低減し、それにより重篤な肺実質の損傷、例えば増加した肺重複領域、肺胞嚢数の減少及び肺胞上皮細胞におけるＣｘ４３の発現の増加を改善又は治療できることがわかる。さらに、過去の研究はメラトニンが抗酸化物質であることを開示しており、上の実施例の結果から、本発明の医薬組成物の投与が、メラトニンだけの投与より有意に改善された効果を有することがはっきりとわかる。
【００８３】
したがって、有効量の本発明の医薬組成物を肺損傷を有する個体に投与することで、肺実質の損傷を治療し、肺の正常な機能を復活させることが可能であり、ミトコンドリア及びメラトニンを含有する有効量の医薬組成物の投与はより良好な有効性を達成できる。
【００８４】
本発明を単なる例として詳細に説明してきた。本発明の実施形態における当業者による多数の改変又は変化形は、本発明の趣旨から逸脱することなく、添付の請求項の範囲内に含まれる。
【図１】
0006355220.tif 000004
【図２Ａ】
0006355220.tif 000005
【図２Ｂ】
0006355220.tif 000006
【図２Ｃ】
0006355220.tif 000007
【図２Ｄ】
0006355220.tif 000008
【図３Ａ】
0006355220.tif 000009
【図３Ｂ】
0006355220.tif 000010
【図４Ａ】
0006355220.tif 000011
【図４Ｂ】
0006355220.tif 000012
【図４Ｃ】
0006355220.tif 000013
【図５】
0006355220.tif 000014
【図６】
0006355220.tif 000015
【図７】
0006355220.tif 000016
【図８】
0006355220.tif 000017
【図９】
0006355220.tif 000018
【図１０】
0006355220.tif 000019
【図１１Ａ】
0006355220.tif 000020
【図１１Ｂ】
0006355220.tif 000021
【図１２】
0006355220.tif 000022
【図１３】
0006355220.tif 000023
【図１４】
0006355220.tif 000024
【図１５Ａ】
0006355220.tif 000025
【図１５Ｂ】
0006355220.tif 000026
【図１５Ｃ】
0006355220.tif 000027
【図１５Ｄ】
0006355220.tif 000028
【図１６Ａ】
0006355220.tif 000029
【図１６Ｂ】
0006355220.tif 000030
【図１６Ｃ】
0006355220.tif 000031
【図１７Ａ】
0006355220.tif 000032
【図１７Ｂ】
0006355220.tif 000033
【図１７Ｃ】
0006355220.tif 000034
【図１７Ｄ】
0006355220.tif 000035
【図１７Ｅ】
0006355220.tif 000036
【図１８】
0006355220.tif 000037
【図１９】
0006355220.tif 000038
【図２０Ａ】
0006355220.tif 000039
【図２０Ｂ】
0006355220.tif 000040
【図２０Ｃ】
0006355220.tif 000041
【図２０Ｄ】
0006355220.tif 000042
【図２０Ｅ】
0006355220.tif 000043
【図２０Ｆ】
0006355220.tif 000044
【図２１Ａ】
0006355220.tif 000045
【図２１Ｂ】
0006355220.tif 000046
【図２１Ｃ】
0006355220.tif 000047
【図２１Ｄ】
0006355220.tif 000048
【図２１Ｅ】
0006355220.tif 000049
【図２１Ｆ】
0006355220.tif 000050
【図２２Ａ】
0006355220.tif 000051
【図２２Ｂ】
0006355220.tif 000052
【図２２Ｃ】
0006355220.tif 000053
【図２２Ｄ】
0006355220.tif 000054
【図２２Ｅ】
0006355220.tif 000055
【図２２Ｆ】
0006355220.tif 000056
【図２３Ａ】
0006355220.tif 000057
【図２３Ｂ】
0006355220.tif 000058
【図２３Ｃ】
0006355220.tif 000059
【図２３Ｄ】
0006355220.tif 000060
【図２３Ｅ】
0006355220.tif 000061
【図２３Ｆ】
0006355220.tif 000062
【図２４Ａ】
0006355220.tif 000063
【図２４Ｂ】
0006355220.tif 000064
【図２５Ａ】
0006355220.tif 000065
【図２５Ｂ】
0006355220.tif 000066
【図２６Ａ】
0006355220.tif 000067
【図２６Ｂ】
0006355220.tif 000068
【図２７Ａ】
0006355220.tif 000069
【図２７Ｂ】
0006355220.tif 000070
【図２８Ａ】
0006355220.tif 000071
【図２８Ｂ】
0006355220.tif 000072
【図２９Ａ】
0006355220.tif 000073
【図２９Ｂ】
0006355220.tif 000074
【図３０Ａ】
0006355220.tif 000075
【図３０Ｂ】
0006355220.tif 000076
【図３１Ａ】
0006355220.tif 000077
【図３１Ｂ】
0006355220.tif 000078
【図３２Ａ】
0006355220.tif 000079
【図３２Ｂ】
0006355220.tif 000080
【図３３Ａ】
0006355220.tif 000081
【図３３Ｂ】
0006355220.tif 000082
【図３４Ａ】
0006355220.tif 000083
【図３４Ｂ】
0006355220.tif 000084
【図３５Ａ】
0006355220.tif 000085
【図３５Ｂ】
0006355220.tif 000086
【図３６Ａ】
0006355220.tif 000087
【図３６Ｂ】
0006355220.tif 000088
【図３７Ａ】
0006355220.tif 000089
【図３７Ｂ】
0006355220.tif 000090
【図３８Ａ】
0006355220.tif 000091
【図３８Ｂ】
0006355220.tif 000092
【図３９Ａ】
0006355220.tif 000093
【図３９Ｂ】
0006355220.tif 000094
【図４０Ａ】
0006355220.tif 000095
【図４０Ｂ】
0006355220.tif 000096
【図４１Ａ】
0006355220.tif 000097
【図４１Ｂ】
0006355220.tif 000098
【図４２Ａ】
0006355220.tif 000099
【図４２Ｂ】
0006355220.tif 000100