(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  磁性粒子の懸濁液（１０２）と、
−  磁性粒子の前記懸濁液（１０２）を収容する光学リザーバ（１０４）と、
−  強度Ｉを有する波長λの光（１１２）を放射する光源（１１０）であって、前記光（１１２）は、前記光学リザーバ（１０４）に方向付けられるとともに、磁性粒子の前記懸濁液（１０２）と相互に作用するようになっており、前記光学リザーバに入る光（１１２）が強度Ｉｉｎを有し、前記光学リザーバを透過した光（１１３）が強度Ｉｔｒａｎｓを有する、光源（１１０）と、
−  始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔと終点周波数ｆｘ，ｅｎｄとの間で変化可能な周波数ｆｘで振動する一軸振動磁場（１０８）を発生させる磁場発生ユニット（１０６）であって、磁性粒子の前記懸濁液（１０２）を収容する前記光学リザーバ（１０４）に前記一軸振動磁場が印加され、それにより、磁性粒子の前記懸濁液を透過した光の強度Ｉｔｒａｎｓが前記光学リザーバに入る光の強度Ｉｉｎと比べて変調されるように磁性粒子の前記懸濁液が変調される、磁場発生ユニット（１０６）と、
−  検出ユニット（１１４）であって、該検出ユニットは、
・前記光学リザーバ内の磁性粒子の前記懸濁液を透過した光の強度Ｉｔｒａｎｓと、
・前記透過光（１１３）の同相（Ｖ’）成分及び逆相（Ｖ”）成分と、
を測定し、
前記透過光（１１３）の同相（Ｖ’）成分及び逆相（Ｖ”）成分並びに前記透過光（１１３）の強度Ｉｔｒａｎｓの変調は、前記一軸振動磁場が始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔから終点周波数ｆｘ，ｅｎｄまで掃引されるにつれて始点周波数ｆｙ，ｓｔａｒｔと終点周波数ｆｙ，ｅｎｄとの間で変化する周波数ｆｙで検出され、検出される周波数ｆｙは、前記透過光の強度Ｉｔｒａｎｓの第２高調波（ｆｙ＝２ｆｘ）成分又はそれよりも高い高調波成分である、検出ユニット（１１４）と、
を備えるバイオセンサ（１００）。
【請求項２】
前記振動一軸磁場（１０８）は、Ｂ｜｜ｋで示される形態で光源（１１０）伝播方向からの光（１１２）と平行に印加される請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記磁性粒子は、生物活性リガンドを用いて機能化される請求項１又は請求項２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記生物活性リガンドは、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、又は、タンパク質複合体である、請求項３に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記磁性粒子がゼロ以外の残留磁気モーメントを有する請求項１から４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記磁性粒子は、０．１μｇ／ｍＬ〜２０００μｇ／ｍＬの範囲内の懸濁液濃度で存在する請求項１から５のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記磁性粒子は、磁性ビーズである請求項１から６のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記磁性ビーズは、磁性高分子ビーズである、請求項7に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記磁性粒子は、個々の粒子が無視できる光学異方性を有するという意味で、略球状である請求項１から８のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記略球状の磁性粒子が１０〜３０００ｎｍの直径を有する請求項９に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記磁場発生ユニットは、ｆｘ，ｓｔａｒｔ＝０．１Ｈｚとｆｘ，ｅｎｄ＝１０ｋＨｚとの間で時間変動する磁場を発生させる電磁石であり、前記磁場が０．１ｍＴ〜５ｍＴの磁場強度を有する請求項１から１０のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
前記光源は、ＵＶランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、例えば紫外線（ＵＶ）、可視、又は、赤外線（ＩＲ）スペクトル域の光を放射するレーザである請求項１から１１のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
前記光源から放射される光が直線偏光される請求項１から１２のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１４】
前記光源と前記光学リザーバとの間に位置される偏光子を更に備える請求項１から１３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
少なくとも１つの反射物体（１２４）を更に備え、該反射物体は、
−  前記光学リザーバ内の磁性粒子の前記懸濁液を透過して該懸濁液により変調される光、及び／又は、
−  前記光学リザーバを透過して磁性粒子の前記懸濁液により変調されない光、
が前記反射物体により反射されて前記光学リザーバを通って戻るように位置される請求項１から１４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１６】
前記光源及び前記検出ユニットは、光ピックアップヘッドに組み込まれる請求項１から１５のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１７】
前記光ピックアップヘッドは、ＣＤプレーヤ／レコーダ、ＤＶＤプレーヤ／レコーダ、又は、ブルーレイプレーヤ／レコーダからの或いはこれらのプレーヤ／レコーダの光ピックアップヘッドである、請求項１６記載のバイオセンサ。
【請求項１８】
診断目的での請求項１から１７のいずれか一項に記載のバイオセンサの使用。
【請求項１９】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のバイオセンサ（１００）を使用して光透過により磁性粒子動態を検出するための方法であって、
−  分析されるべきサンプル流体と磁性粒子の懸濁液（１０２）とを光学リザーバ（１０４）内で混合させるステップと、
−  強度Ｉを有する波長λの光源（１１０）の放射光（１１２）を、前記光学リザーバ（１０４）を通り抜けるように方向付けるステップと、
−  周波数ｆｘで振動する一軸磁場（１０８）を与えるステップと、
−  前記一軸磁場を前記光学リザーバに印加し、それにより、磁性粒子の前記懸濁液を透過した光（１１３）の強度Ｉｔｒａｎｓが前記光学リザーバに入る光（１１２）の強度Ｉｉｎと比べて変調されるように磁性粒子の前記懸濁液が変調される、ステップと、
−  前記一軸磁場を始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔから終点周波数ｆｘ，ｅｎｄまで掃引するステップと、
−  前記一軸磁場が始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔから終点周波数ｆｘ，ｅｎｄまで掃引されるにつれて始点周波数ｆｙ，ｓｔａｒｔと終点周波数ｆｙ，ｅｎｄとの間で変化する周波数ｆｙで、
・前記光学リザーバ内の磁性粒子の前記懸濁液を透過した光の強度Ｉｔｒａｎｓと、
・前記透過光（１１３）の同相（Ｖ’）成分及び逆相（Ｖ”）成分と、
を測定するステップであって、周波数ｆｙは、前記透過光の強度Ｉｔｒａｎｓの第２高調波（ｆｙ＝２ｆｘ）成分又はそれよりも高い高調波成分である、ステップと、
を備える方法。
【請求項２０】
前記一軸磁場がｆｘ，ｓｔａｒｔ＝０．１Ｈｚの始点周波数からｆｘ，ｅｎｄ＝１０ｋＨｚの終点周波数まで掃引される請求項１９に記載の方法。    
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性ナノ粒子を利用する標的検体の迅速な高感度検出のために適合される新規なバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
磁性ナノ粒子及び磁性ナノビーズ（ＭＮＢ）、すなわち、高分子マトリックス中に埋め込まれる超常磁性ナノ粒子は、近年の生物医学技術において広く行き渡るツールを代表する。特に、様々なバイオセンシングスキームにおける磁性ナノ粒子の利用がここ数年において探求されてきた。磁性ナノ粒子と外部磁場との間の長距離範囲の相互作用は、容易な操作及び高感度検出を可能にする。磁場及び磁性キャリアを利用するバイオセンシング手法により与えられる主な利点は、生物媒体が固有の低い磁化率を有するとともに、磁気的相互作用が一般に表面電荷、ｐＨ値、イオン濃度、又は、温度によって影響されないという点である。また、生物媒体中の標的検体を捕捉する、仕分ける、及び、検出するための磁性キャリアに基づくマイクロ流体装置の実現は、潜在的な低コスト、装置の簡素さ、及び、高い感度が得られることに起因して特に興味をそそる。
【０００３】
ＵＳ７６３９３５９は、バイオ機能化された磁性ナノ粒子の単一粒子動態を測定することによる検体の検出のための方法を開示する。ＵＳ７６３９３５９における方法は、振動磁場に晒されるバイオ機能化されたナノ粒子の懸濁液に対して直線偏光された光を印加し、その後、光の偏光が磁性ナノ粒子懸濁液を通過するときにどのくらい回転するのかを測定することを含む。この場合、監視される信号は、磁場励起に対して第１高調波信号を成す。
【０００４】
ＵＳ７６３９３５９に開示される方法に伴う１つの不都合は、この方法が複雑であり、この方法が光偏光回転に起因する非常に小さい信号に依存し、その結果、光偏光の回転が正しく測定されるようにするためにこの方法が整列偏光子などの光学素子を必要とするという点においてセットアップが高価になるという点である。ＵＳ７６３９３５９に開示される方法に伴う他の不都合は、磁性ナノ粒子が一般に効率的な光散乱体でないように仕向けるべくこの方法が単一領域磁性ナノ粒子を必要とするという点である。
【０００５】
ＵＳ２０１２０００３７５０は、バイオ機能化された超常磁性粒子の検体駆動クラスタ形成の動態を測定することによって検体を検出するための方法を開示する。ＵＳ２０１２０００３７５０における方法は、懸濁液中の超常磁性粒子が回転磁場の存在下で検体駆動クラスタを形成できるようにし、その後、駆動周波数の更に高い高調波の散乱光の強度及び振幅を測定することを含む。
【０００６】
ＵＳ２０１２０００３７５０に開示される方法の１つの不都合は、回転する同相磁場を形成する電磁石の要件である。回転磁場を形成する電磁石を有することは、より多くの空間を占め、したがって、実用的意義が制限され、バイオセンシングセットアップの小型化或いは他のシステムへのセットアップの組み込みが制限される。また、特に数百ｎｍの直径の粒子に関しては、入射光から大きな角度を成す磁性ビーズからの散乱光に起因する信号が極めて低く、また、大面積の非常に感度が高い光検出器又は光電子増倍管が必要とされる。
ＵＳ４７２５１４０は、光放射レーザと、放射光を直線偏光するための偏光子と、細胞中の磁性ナノ粒子の懸濁液と、光路に対して垂直に印加される所定の周波数の軸方向に変化する或いは回転する磁場と、好ましくは最初の偏光方向に対して９０°を成して方向付けられる分析器、すなわち、第２の偏光子と、磁場励起に対する透過光の第２高調波変化のスペクトル密度を検出するための光検出器とを備えるセットアップを開示する。
ＵＳ４７２５１４０のセットアップは、磁性粒子懸濁液の光学異方性を監視する。結合事象が行なわれずに粒子が凝集されない場合、略球状の粒子は、単離されて、光学的に異方性の散乱を示さず、すなわち、入射光の偏光方向の変化を示さず、また、名目上は、光が分析器を通過しない。しかしながら、標的の存在下で粒子が凝集すると、粒子は長尺な光学的に異方性の構造体を形成する。そのような構造体から散乱される光は、入射光のそれとは異なる偏光を伴う成分を有する場合があり、これがゼロ以外の光検出器信号をもたらす。ＵＳ４７２５１４０では、信号対雑音を改善して不規則な変動を排除するために、磁場励起に対する第２高調波信号の強度が検出される。この強度は、凝集された粒子の数に比例する。ＵＳ４７２５１４０では、粒子鎖が初期偏光に対してゼロ以外の平均的な（非対称な）配向を有するときにだけ信号が得られる。これは、さもなければゼロ平均偏光変化が９０°配向分析器の後にゼロ信号を与えるからである。これは、回転磁場が印加されること、或いは、軸方向に変化する磁場が偏光方向に対して角度を成して印加されることを必要とする。
ＵＳ２００３００３４６５は、光源を備えるセットアップと、二重ビーズ複合体が形成される小チャンバを備えるＣＤとを開示し、ビーズ複合体はその後に捕捉される。二重ビーズ複合体は、磁気捕捉ビーズをレポータービーズに連結する生物学的標的の存在下で形成され、この場合、レポータービーズが蛍光を発し得る。捕捉磁場に拘束されるレポータービーズの存在は、ディスクドライブ光ピックアップユニットを使用して捕捉磁場を走査することによって透過、反射のいずれかで、又は、蛍光分光法を使用して光学的に読み出される。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書中に開示されるのは、磁性粒子の懸濁液と、磁性粒子の懸濁液を収容する光学リザーバとを備えるバイオセンサである。光学リザーバは、キュベット又は同様のものであってもよい。
【０００８】
また、バイオセンサは、強度Ｉを有する波長λの光を放射する光源も備え、光源は、光学リザーバに方向付けられるとともに、磁性粒子の懸濁液と相互に作用するようになっており、光学リザーバに入る光は強度Ｉｉｎを有し、また、光学リザーバを透過した光は強度Ｉｔｒａｎｓを有する。光源は、例えば紫外線（ＵＶ）、可視、又は、赤外線（ＩＲ）スペクトル域の光を放射するレーザ、ＵＶランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、或いは、同様のものであってもよい。
【０００９】
また、バイオセンサは、始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔと終点周波数ｆｘ，ｅｎｄとの間で変化可能な周波数ｆｘで振動する振動一軸磁場を発生させる磁場発生ユニットも備え、磁性粒子の懸濁液を収容する光学リザーバに振動一軸磁場が印加され、それにより、磁性粒子の懸濁液を透過した光の強度Ｉｔｒａｎｓが光学リザーバに入る光の強度Ｉｉｎと比べて変調されるように磁性粒子の懸濁液が変調される。
【００１０】
バイオセンサは、光学リザーバ内の磁性粒子の懸濁液を透過した光の強度Ｉｔｒａｎｓを測定する検出ユニットを更に備え、透過光の強度Ｉｔｒａｎｓの変調は、振動一軸磁場が始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔから終点周波数ｆｘ，ｅｎｄまで掃引されるにつれて始点周波数ｆｙ，ｓｔａｒｔと終点周波数ｆｙ，ｅｎｄとの間で変化する周波数ｆｙで検出され、この場合、検出される周波数ｆｙは第１高調波成分ｆｘとは異なる。
【００１１】
バイオセンサは、主に、振動一軸磁場により駆動される磁性粒子の動的なクラスタリング挙動を測定するためのものである。或いは、バイオセンサは、外部磁場の印加後／印加時の粒子クラスタ破壊／再形成の時間分解測定のために使用することもできる。
【００１２】
これにより、少ない数の要素だけで済み、また、セットアップ内の個々の部品を交換するための様々な選択肢が存在するという点において簡単な柔軟性のある安価なバイオセンサが得られる。重要なことには、バイオセンサの複雑さ及びコストの両方を増大させるであろう、直線偏光された光、レーザ光源、又は、偏光子を必要としないシステム内に任意の種類の光源を導入できる。
【００１３】
バイオセンサで使用される振動一軸磁場は、それが全体の空間要件を減らし、それにより、バイオセンサを様々な装置への実装に適するようにするという点において有益である。光の偏光変化ではなく、磁性粒子の懸濁液を透過する光の強度Ｉｔｒａｎｓの変調を測定することにより、光がサンプルを複数回透過した後であっても測定値を記録することができ、それにより、バイオセンサの柔軟性が更に高められる。
【００１４】
１つ以上の実施形態において、透過光の強度Ｉｔｒａｎｓの第２高調波（ｆｙ＝２ｆｘ）成分又はそれよりも高い高調波成分が検出ユニットによって検出される。
【００１５】
１つ以上の実施形態において、磁性粒子は、例えば抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、又は、タンパク質複合体などの生物活性リガンドを用いて機能化される。生物活性リガンドは、分析されるべきサンプル中の標的／検体分子に結合でき／該分子を捕捉でき、それにより、この標的／検体の存在を容易に検出できる。標的／検体分子なる用語は、細胞及び細菌も含む。
【００１６】
１つ以上の実施形態では、磁性粒子がゼロ以外の残留磁気モーメントを有する。これは、個々の粒子の物理的な回転を可能にするとともに、配列された粒子集合体、例えば鎖の破壊に役立つ。
【００１７】
１つ以上の実施形態において、磁性粒子は、０．１μｇ／ｍＬ〜２０００μｇ／ｍＬの範囲内の懸濁液濃度で存在する。或いは、懸濁液濃度は、０．１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの範囲内、又は、０．１μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの範囲内であってもよい。
【００１８】
１つ以上の実施形態において、磁性粒子は、例えば磁性高分子ビーズなどの磁性ビーズである。磁性粒子は、印加された振動一軸磁場に沿って個々の粒子が無視できる光学異方性を有するという意味で、略球状であってもよい。或いは、磁性粒子は、更に不規則な形状を有することができるが、振動一軸磁場が印加されても依然として個々の粒子の集合体の無視できる光学異方性を伴う。１つ以上の実施形態では、略球状の磁性粒子が１０〜３０００ｎｍの直径を有する。粒子は、２０〜１０００ｎｍ又は５０〜２５０ｎｍであってもよい。
【００１９】
１つ以上の実施形態において、磁場発生ユニットは、ｆｘ，ｓｔａｒｔ＝０．１Ｈｚとｆｘ，ｅｎｄ＝１０ｋＨｚとの間で時間変動する磁場を発生させる電磁石であり、磁場が０．１ｍＴ〜５ｍＴの磁場強度を有する。
【００２０】
１つ以上の実施形態において、光源は、ＵＶランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、例えば紫外線（ＵＶ）、可視、又は、赤外線（ＩＲ）スペクトル域の光を放射するレーザである。
【００２１】
１つ以上の実施形態では、放射光が直線偏光される。
【００２２】
１つ以上の実施形態において、バイオセンサは、光源と光学リザーバとの間に位置される偏光子を更に備える。信号を増強するために、光の偏光制御を用いることができる。
【００２３】
１つ以上の実施形態において、バイオセンサは少なくとも１つの反射物体を更に備え、該反射物体は、光学リザーバ内の磁性粒子の懸濁液を透過して該懸濁液により変調される光、及び／又は、光学リザーバを透過して磁性粒子の懸濁液により変調されない光が反射物体により反射されて光学リザーバを通って戻るように位置される。これにより、光は、光学リザーバを２回通過できるようにされる。これは、このようにすると検出ユニット及び光源を１つのユニットに組み込むことができ、それにより、バイオセンサのための空間が減少するという点において有利である。
【００２４】
１つ以上の実施形態において、光源及び検出ユニットは、例えばＣＤプレーヤ、ＤＶＤプレーヤ、又は、ブルーレイからの光ピックアップヘッドに組み込まれる。
【００２５】
１つ以上の実施形態では、バイオセンサが診断目的で使用される。これらの使用は、例えば、血液、サルビア、尿、水、血漿、又は、血清を分析するためであってもよい。
【００２６】
１つ以上の実施形態では、１つ以上のタイプの粒子が互いに混合される。異なるタイプの粒子は、異なるサイズ、磁性又は非磁性のいずれかであるなどの異なる特性を有することができ、或いは、粒子が磁性である場合、それらの粒子は異なる磁化率を有することができる。
【００２７】
１つ以上の実施形態において、磁性粒子は、蛍光色素を用いて機能化され得る、或いは蛍光色素を組み入れることができる
【００２８】
本明細書中には、先のものに係るバイオセンサを使用して光透過により磁性粒子動態を検出するための方法も開示される。
この方法は、
−  分析されるべきサンプル流体と磁性粒子の懸濁液とを光学リザーバ内で混合させるステップと、
−  強度Ｉを有する波長λの光源放射光を、光学リザーバを通り抜けるように方向付けるステップと、
−  周波数ｆｘで振動する一軸磁場を与えるステップと、
−  一軸磁場を光学リザーバに印加し、それにより、磁性粒子の懸濁液を透過した光の強度Ｉｔｒａｎｓが光学リザーバに入る光の強度Ｉｉｎと比べて変調されるように磁性粒子の懸濁液が変調される、ステップと、
−  一軸磁場を始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔから終点周波数ｆｘ，ｅｎｄまで掃引するステップと、
−  一軸磁場が始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔから終点周波数ｆｘ，ｅｎｄまで掃引されるにつれて始点周波数ｆｙ，ｓｔａｒｔと終点周波数ｆｙ，ｅｎｄとの間で変化する周波数ｆｙで光学リザーバ内の磁性粒子の懸濁液を透過する光の強度Ｉｔｒａｎｓを測定するステップであって、周波数ｆｙが第１高調波成分ｆｘとは異なるステップと
を備える。
【００２９】
これにより、バイオセンサは、磁場の印加後の粒子緩和の時間分解測定のために使用することもできる。
【００３０】
１つ以上の実施形態では、透過光の強度Ｉｔｒａｎｓの第２高調波（ｆｙ＝２ｆｘ）成分又はそれよりも高い高調波成分が測定される。
【００３１】
１つ以上の実施形態では、一軸磁場が始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔ＝０．１Ｈｚから終点周波数ｆｘ，ｅｎｄ＝１０ｋＨｚまで掃引される。
【００３２】
測定で使用される検出スキームは、光源からの光の波長の変化及び／又は光のＯＮ／ＯＦＦ切り換え及び／又は磁場の変調を含んでもよく、この場合、検出される信号は、光源からの光の変調の周波数と磁場の周波数との整数組み合わせである。
【００３３】
標的分子／細胞／細菌の検出は、標的分子が特異的に機能化された粒子表面上に結合するときの粒子の流体力学的直径の増大を測定することによって達成され得る。
【００３４】
また、標的分子／細胞／細菌の検出は、同じタイプの特異的に機能化された磁性粒子の標的分子誘発凝集体形成によっても達成され得る（すなわち、凝集分析）。
【００３５】
更に、標的分子／細胞／細菌の検出は、磁性／非磁性、異なるサイズの粒子、又は、表面上に蛍光色素を有する粒子或いは蛍光色素が内部に組み込まれる粒子など、異なるタイプの特異的に機能化された粒子の標的分子誘発凝集体形成によって達成されてもよい。
【００３６】
これらは、このシステムをバイオセンサとして使用できる最も一般的な方法のうちの３つである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】バイオセンサのセットアップを示す。
【図２】図２ａ〜図２ｂは２つの異なる測定形態を示す。
【図３】図３ａは、図２ａの測定形態における透過光の時間的変化を示し、図３ｂは、図２ａのセットアップを使用する光検出器信号の高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を示す。
【図４】図２ａの測定形態で測定される周波数掃引を示す。
【図５】図５ａ〜図５ｃは、異なる測定形態で磁性ビーズの懸濁液に関して記録された同相及び逆相の第２高調波信号を示す。
【図６】同相の第２高調波信号における粒子濃縮懸濁液への依存を示す。
【図７】同相の第２高調波信号における磁場振幅への依存を示す。
【図８】同相の第２高調波信号における粒径への依存を示す。
【図９ａ】異なる濃度のビオチン化ＢＳＡ抗体と混合されるストレプトアビジン磁性ビーズの懸濁液に関して記録された同相の第２高調波信号を示す。
【図９ｂ】異なる濃度のビオチン化抗体と混合されるストレプトアビジン磁性ビーズの懸濁液に関して記録された同相の第２高調波信号を示す。
【図１０】図１０ａ−図１０ｂはバイオセンサの修正版を示し、この場合、図１０ｂは、図１０ａに示される光学リザーバの拡大図である。
【図１１】埋め込み型光学リザーバを伴うディスクを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
図１は、検体の検出のためのバイオセンサ１００の一実施形態を示す。検出原理は、ナノ粒子の懸濁液を通じて透過される光の強度Ｉｔｒａｎｓを測定することによる、振動一軸磁場により駆動される磁性ナノ粒子の動的挙動の測定に基づく。或いは、バイオセンサは、磁場の印加後の粒子緩和の時間分解測定のために使用することもできる。
【００３９】
標的分子／細胞／細菌の検出は、標的分子が特異的に機能化された粒子表面上に結合するときの粒子の流体力学的直径の増大を測定することによって達成され得る。
【００４０】
また、標的分子／細胞／細菌の検出は、同じタイプの特異的に機能化された磁性粒子の標的分子誘発凝集体形成によっても達成され得る（すなわち、凝集分析）。
【００４１】
更に、標的分子／細胞／細菌の検出は、磁性／非磁性、異なるサイズの粒子、又は、表面上に蛍光色素を有することによるなど、異なるタイプの特異的に機能化された粒子の標的分子誘発凝集体形成によって達成されてもよい。
【００４２】
これらは、このシステムをバイオセンサとして使用できる最も一般的な方法のうちの３つである。
【００４３】
バイオセンサ１００は、光学リザーバ内１０４に磁性粒子の懸濁液１０２を備える。溶液１０２中に懸濁される磁性粒子は、個々の粒子が無視できる光学異方性を有するという意味では、略球状の粒子であってもよい。例えば、楕円又は卵形形状の粒子などの別の形状（不規則形状）も使用できる。磁性粒子は、磁性高分子ビーズなどの磁性ビーズであってもよい。
【００４４】
磁性粒子の懸濁液は、互いに混合された複数のタイプの粒子を含んでもよい。異なるタイプの粒子は、異なるサイズ、或いは、磁性又は非磁性のいずれかであるなどの異なる特性を有することができる（ただし、粒子タイプのうちの１つが磁性の場合に限る）。粒子の全てが磁性粒子である場合、それらの粒子は異なる磁化率を有することができる。個々の粒子タイプのサイズは、ナノサイズの粒子からミクロンサイズの粒子まで様々であってもよい。より大きな粒子の使用は、標的分子が存在する場合には、より小さい粒子の回転を阻止し得る。
【００４５】
磁性粒子は、例えば抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、又は、タンパク質複合体などの生物活性リガンドを用いて機能化されてもよい。磁性粒子は、蛍光色素を用いて機能化されてもよい。
【００４６】
磁性粒子は、通常、ゼロ以外の残留磁気モーメントを有する。
【００４７】
光学リザーバ１０４は、図１ではキュベットとして示されるが、異なる形態のマイクロ流体装置などの代替物を想起することもできる。微小毛管バルブ、分析されるべきサンプルの注入、希釈、及び、混合のための微小針、及び、同様のものを備えるマイクロ流体システムを光学リザーバと組み合わせて使用することもできる。
【００４８】
バイオセンサ１００は、振動一軸磁場１０８を発生させる磁場発生ユニット１０６を備える。振動一軸磁場１０８は、図１に示されるように磁性粒子の懸濁液１０２を収容する光学リザーバ１０４に印加される。磁場発生ユニットは、例えば、磁場強度を有するＡＣ磁場を発生させる電磁石であり得る。通常は、ＡＣ磁場の周波数が０．１Ｈｚ〜１０ｋＨｚである。磁場強度は、通常、０．１ｍＴ〜５ｍＴである。
【００４９】
また、バイオセンサは、光学リザーバ１０４に向けられる光源１１０も備える。光源１１０からの光１１２は、磁性粒子の懸濁液１０２と相互に作用するようになっている。光源は、例えば紫外線（ＵＶ）、可視、又は、赤外線（ＩＲ）スペクトル域の光を放射するレーザ、ＵＶランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、或いは、同様のものであってもよい。放射される光は、通常、光源から出るときに直線偏光される。
【００５０】
通常、光源１１０は、強度Ｉを有する波長λの光を放射する。光学リザーバ１０４に入る光は強度Ｉｉｎを有し、また、光学リザーバを透過した光は強度Ｉｔｒａｎｓを有する。磁場発生ユニット１０６は、通常、始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔと終点周波数ｆｘ，ｅｎｄとの間で変化可能な周波数ｆｘで振動する振動一軸磁場を発生させる。
【００５１】
図１において、光源１１０からの光１１２及び磁場発生ユニット１０６からの振動一軸磁場１０８は、光学リザーバ１０４へ向けて互いに平行に伝播する。図２ａは、この測定セットアップを拡大図で示す。或いは、図２ｂに示されるような垂直測定形態も想起できる。
【００５２】
図１のバイオセンサ１００は、第１高調波成分ｆｘとは異なる透過光の周波数ｆｙの成分を測定する検出ユニット１１４を更に備える。これらの周波数は、光学リザーバ１０４内の磁性粒子の懸濁液１０２から透過される光１１３の第２高調波成分又はそれよりも高い高調波成分であり得る。通常は、振動一軸磁場が始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔから終点周波数ｆｘ，ｅｎｄまで掃引されるにつれて始点周波数ｆｙ，ｓｔａｒｔと終点周波数ｆｙ，ｅｎｄとの間で変化する周波数ｆｙが検出される。
【００５３】
図１において、検出ユニット１１４は、フォトダイオード１１６、ロックイン増幅器１１８、及び、ガウスメーター１２０を備える。この発明の範囲を変更することなく、異なる検出ユニットを使用することもできる。光源と光学リザーバとの間に偏光子が位置されてもよい。
【００５４】
後の図に示されて説明される実験データを生み出すために使用される光源１１０は、λ＝６３３ｎｍの波長を有する光を放射するコヒーレントレーザを使用して得られる。同様に、信号は、ＴｈｏｒＬａｂｓ  ＰＤＡ３６Ａ光検出器によって収集され、一方調整可能なＬＩＮＯＳビーム拡大器（図示せず）を用いてビームが５ｍｍの最終直径まで拡大される。磁場は、ホールプローブ（図示せず）を用いてリアルタイムで測定される。
【００５５】
使用される磁気コイルの自己インダクタンスは、一定の磁場振幅対周波数を維持するべく補正された。信号は、Ｓｉｇｎａｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ７２２５コンピュータ制御のロックイン増幅器を使用してフィルタ処理された。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ装置を用いて動的な光散乱測定が行なわれた。
【００５６】
磁場が磁性粒子の懸濁液に印加されると、磁場に合わせて整列される粒子の直鎖の形成に起因して媒体中に光学異方性が誘発される。この異方性は、線二色性の現象、すなわち、異なる吸着及び／又は散乱に起因する光の異なる偏光成分における透過光の異なる減衰をもたらす。直鎖の形成動態は、粒子のブラウン回転によって支配され、また、これは光透過／散乱によって検出できる。
【００５７】
この方法は、粒子クラスタの動的な破壊及び再形成と、生体分子認識の存在下での恒久的クラスタの形成とに依存する。この手法は、基本的に、ＵＳ２０１２０００３７５０において提示されるクラスタの回転動態とは異なる。そこでは、回転磁場内の平衡クラスタサイズ（磁場サイクルにわたって一定である）が散乱光の変調を与える。一般に、ゼロ以外の残留モーメントを有する磁性ビーズがこれらの測定のために使用される。この出願に開示される手法では、透過光信号の変調をもたらす軸方向変化磁場のサイクル中にわたってクラスタが動的に破壊されて再形成される。したがって、この手法における信号は、軸方向磁場に合わせて整列して磁気鎖を再形成できる個々の粒子の能力によって与えられ、また、これは、一般に、残留磁気モーメントを有する粒子を用いて行なわれる。これらの磁性ナノ粒子の動態は、個々の粒子の物理的回転（ブラウン回転）によってそれらの残留磁気モーメントを整列させることができるとともに粒子クラスタを再形成できる粒子の能力によって支配される。ブラウン緩和周波数は、
【数１】
0006387091.tif 000002
【００５８】
ここで、ｋＢはボルツマン定数、Ｔは絶対温度、Ｖｈは流体力学的な粒子体積、及び、ηは流体の動粘度である。
【００５９】
弱い交番磁場（ＨＡＣ（ｔ）＝Ｈ０ｓｉｎ（２πｆｔ）を伴う）による励起時に、例えば磁性ナノ粒子の磁化ｍ（ｔ）がそれらの粒子の物理的回転に起因して変化する。時間領域では、磁化を以下のように書き表わすことができる。
【数２】
0006387091.tif 000003
【００６０】
ここで、φは、磁化応答と励起との間の位相遅れであり、また、ｍＡＣは、磁化の周波数依存振幅である。
【００６１】
周波数領域では、磁性ナノ粒子応答が、以下のように、同相成分χ’及び逆相成分χ”を伴う複素磁化率によって特徴付けられる。
【数３】
0006387091.tif 000004
【００６２】
低い周波数において、磁性ナノ粒子の磁化は、印加磁場（φ＝０）と同相で応答する。周波数の増大時には、磁性ナノ粒子磁化が印加磁場に遅れをとり、χ’が単調減少する、それに対応して、χ”は、最初は、ｆ＝ｆＢのときにその最大値をとるように増大し、ｆＢよりも上で減少する。
【００６３】
ビーズ群の磁化率は、以下によってうまく表わされる。
【数４】
0006387091.tif 000005
【００６４】
ここで、χ０及びχ∞はそれぞれ、ｆ＝０及びｆ＝∞のにおける磁化率であり、また、αは多分散性をもたらすパラメータである（磁性ナノ粒子の単分散群においてはα＝０である）。
【００６５】
正規化された磁化率は以下によって規定される。
【数５】
0006387091.tif 000006
【００６６】
これは
【数６】
0006387091.tif 000007
及び
【数７】
0006387091.tif 000008
を満たす。
【００６７】
個々の粒子の光学異方性を無視できる十分に小さい或いは弱く磁気相互作用する磁性ナノ粒子は、ゼロ印加磁場内で大きな凝集を示さず、このことは、残留モーメントに起因して熱エネルギーが磁気相互作用エネルギーよりも大きいことを示す。その結果、ナノ粒子の溶液によって伝えられる光は、磁場及び／又は検体が存在しないときに無視できる光学異方性を示す。磁性ナノビーズは、それらがクラスタ化されないときに無視できる光学異方性を示す磁性ナノ粒子の例である。
【００６８】
図２ａに示される測定形態では、振動一軸磁場１０８が光源１１０からの光１１２−この図ではレーザビームである−と平行に伝播方向で印加される。以下では、この形態がＢ｜｜ｋで示される。
【００６９】
粒径の大部分においては、磁場が大きいときにＢ｜｜ｋ形態における透過信号が最大であり、このことは、懸濁液の幾何学的断面を減少させる鎖が光路に沿って形成されるという事実と一致する。正の飽和の後に磁場がゼロに近づくと、熱運動に起因して鎖が壊れ或いは緩く結合するようになる。
【００７０】
磁場が符号を変えると、粒子は、それらの残留磁気モーメントを磁場に合わせて整列させるように物理的に回転しなければならない。単一の磁性ナノ粒子のゼーマンエネルギーがその粒子と隣り合う粒子との相互作用エネルギーよりも大きいときには、これにより、粒子の鎖の回転ではなく、個々の粒子の回転がもたらされる。したがって、この場合、観察される動態は、（１）熱運動及び／又は磁場の符号変化に起因する磁性ナノ粒子鎖の破壊と、（２）磁場と向きを合わせようとする個々の磁性ナノ粒子の回転と、（３）磁性ナノ粒子鎖の再形成とから成る。そのため、個々の磁性ナノ粒子の拡散及び回転のためのタイムスケールは、光信号の変調を生じさせる磁性ナノ粒子鎖の再形成のためのタイムスケールを設定する。
【００７１】
図２ｂに示される別の測定形態では、一軸磁場１０８が光源１１０からの光１１２−この図ではレーザビームである−に対して垂直に伝播方向で印加される。以下では、この形態が（Ｂ⊥ｋ）で示される。
【００７２】
振動磁場がレーザビーム方向に対して垂直に印加されるときには（Ｂ⊥ｋ）、磁場方向に対して角度θを成す直線偏光を規定するためにレーザと粒子を収容する光学リザーバとの間の光ビーム中に偏光子１２２が導入され、この場合、ｘ軸との角度θは図２ｂの右下に描かれるとおりである。
【００７３】
鎖の磁化方向に対して対称な光信号は、以下によって簡単な態様で説明されてもよい。
【数８】
0006387091.tif 000009
【００７４】
ここで、ＶＡＣは信号変調の周波数依存振幅であり、Ｖｏｆｆｓｅｔは信号オフセットであり、また、我々は、ｓｉｎ（ωｔ−φ）の偶数累乗の想定し得る高次の項を無視した。ＶＡＣは、以下のように磁化率と同じ周波数依存性を有する。
【数９】
0006387091.tif 000010
【００７５】
ここで、Ｖ０はｆ→０における振幅である。磁性ナノビーズ懸濁液中で伝えられる光による信号の第２高調波成分を記録することにより、５０ｎｍ、１３０ｎｍ、２５０ｎｍの直径を有する磁性ナノビーズの周波数応答を正確に記録して区別することができる。これは、更に図８において示されて論じられる。
【００７６】
以下の第２高調波信号
【数１０】
0006387091.tif 000011
は、以下となるようにロックイン技術によって測定される。
【数１１】
0006387091.tif 000012
【００７７】
図３ａは、１０μｇＭＮＢ／ｍＬの濃度の懸濁液及び直径が５０ｎｍのサイズを有する磁性ナノビーズの懸濁液に関する形態Ｂ｜｜ｋにおける透過光の時間的変化２００を示す。線２０２は振動外部磁場波形を示し、一方、線２０４，２０６は、振動磁場下での或いは振動磁場が無い場合の光検出器信号の測定されたＡＣ成分を表わす。
【００７８】
印加磁場は、１ｍＴの振幅及びｆ＝５Ｈｚを有する。図には、磁場最大領域内のｚ方向に沿う磁性ビーズクラスタの位置が描かれる。
【００７９】
図３ａにおいて、測定形態は、レーザ源（λ＝６３３ｎｍ）及び透明な円形流体セルを備え、流体セルは、５ｍｍの直径と、液体中の光路に対応する１ｍｍの高さとを有する。約２０μＬの容積を有するセルは、ＡＣ磁場を発生させるための２つの小型電磁石と光検出器とによって取り囲まれる。光学セルは、キュベット又はマイクロ流体装置であってもよい。
【００８０】
レーザスポットサイズは、想定し得る最大数の粒子と相互に作用するために調整可能なビーム拡大器を用いて〜５ｍｍ直径に至るまで拡大され得る。いずれの場合にも、印加磁場の振幅は１〜３ｍＴの範囲内である。ＡＣ磁場は、ＡＣ駆動磁場と同相及び逆相で光検出器から出力される第２高調波電圧をフィルタ処理して検出するために使用されるロックイン増幅器のための基準も与える高速ホールプローブを使用してリアルタイムで測定される。一実施形態では、ＡＣ磁場の周波数が０．１Ｈｚ〜１０ｋＨｚであり、また、磁場が０．１ｍＴ〜５ｍＴの強度を有する。
【００８１】
以下に記載される測定では、懸濁液中の磁性粒子鎖の形成に起因して測定される光学的効果が異なる符号を有することができる。これは、ビーズサイズ、ビーズクラスタリング状態、及び／又は、使用される光の波長に応じて磁場が最大のときに磁場がゼロのときに対して多い或いは少ない光が伝えられるかどうかによって決まる。これについては図９ｂにおいて更に論じられる。
【００８２】
図３ａにおいて、磁場励起を伴うことなく得られた測定値における信号レベル、すなわち、線２０６は、実験の前後で同じである。磁場励起を伴う信号、すなわち、線２０４は、２ｆの成分によって支配されるとともに、印加磁場強度がゼロに近いときに急激な最小値を示し、磁場が数値的に大きいときに最大値を示す。最小値の信号レベルは、磁場励起が適用されないときに得られるレベルに近い。
【００８３】
図３ｂは、図３ａの場合と同じ光検出器信号の高速フーリエ変換（ＦＦＴ）３００を示す。図３ｂは、信号が１０Ｈｚの２ｆ成分によって支配されるが、更に弱い高次の偶数の高調波も存在するという点において、図３からの結果を裏付ける。
【００８４】
図４は、直径が５０ｎｍで濃度が５０μｇ／ｍＬのＭＮＢの懸濁液に関して形態Ｂ｜｜ｋにおいて測定された周波数掃引を示す。図４は、ロックイン技術によって測定される複素第２高調波信号４００と印加磁場の周波数との間の関係を示す。測定された同相信号（Ｖ２’）４０２は約１００Ｈｚ付近に明確なピークを有し、一方、逆相信号（Ｖ２”）４０４は、低い周波数では飽和を伴う階段状の移行部を示すとともに、高い周波数ではゼロに近い値を示す。実線４１２，４１４は、方程式（９）を使用した同相信号（Ｖ２’信号）４０２及び逆相信号（Ｖ２”信号）４０４における曲線のフィットを示す。
【００８５】
図５ａ及び図５ｂは、図５ａ及び図５ｂに示されるＶ２’信号５００及びＶ２”信号５１０をそれぞれ用いて異なる実験形態を使用して同じＭＮＢ懸濁液に関して収集されたデータの比較を示す。データは、濃度が１０μｇ／ｍＬの５０ｎｍ磁性ビーズの懸濁液に関して記録される。
【００８６】
信号は４つの異なる測定形態で測定される。すなわち、線５０２，５１２が形態Ｂ｜｜ｋを用いて測定され、線５０４，５１４が形態Ｂ⊥ｋ及びθ＝０°を用いて測定され、線５０６，５１６が形態Ｂ⊥ｋ及びθ＝９０°を用いて測定され、及び、線５０８，５１８は、円偏光ビームを使用して形態Ｂ⊥ｋを用いて測定される。全ての線は、ビームの全強度Ｉ０に対して正規化されてしまっている。角度θは、レーザビーム偏光方向とＢ磁場軸方向との間の角度として規定される図２ｂに描かれた角度である。
【００８７】
今しがた論じられたＢ｜｜ｋ形態５０２，５１２におけるスペクトルは直線偏光したレーザを使用して収集されるが、これらのスペクトルは、ビームの特定の偏光状態に依存せず（これらのスペクトルは、電磁波の横波の性質にのみ起因する）、そのため、例えば偏光が完全に解消された光源を使用して同じ結果を得ることを予期し得る。
【００８８】
仮説は、光学リザーバに先行する光路中にクォーター（π／４）リターダーを挿入することにより得られる円偏光ビームを使用してチェックされる（リターダーの主軸は、レーザ源により発生されるビームの偏光方向に対して４５°を成す）。これらの測定の結果は、確かに、図５ｃに示されるように図５ａにおける測定結果と同一である。この場合、Ｂ｜｜ｋ及びθ＝９０°の形態を用いて測定される同相Ｖ２’信号が線５２０として示され、また、Ｂ｜｜ｋ及び円偏光の形態を用いて測定される同相Ｖ２’信号が線５２２として示される。
【００８９】
スペクトルを並べて比較するため、データが透過ビームの平均強度Ｉ０に正規化される。レーザビームが印加ＡＣ磁場方向に対して垂直に直線偏光される場合、すなわち、Ｂ⊥ｋ及びθ＝９０°である場合、信号は、前述した形態Ｂ｜｜ｋの場合と同じ特徴を示す。これは、偏光方向に対して垂直であるＡＣ磁場に合わせて鎖が整列されるときにより多くの光が伝えられるからである。逆に、印加磁場と平行に直線偏光された光ビームを使用すると、すなわち、Ｂ⊥ｋ及びθ＝０°を使用すると、光散乱機構は、ＭＮＢ形成された鎖の長い軸を高い磁場でレーザビームの電場と平行に整列させて更に良好な信号コントラストを得ることによって最大にされる。異なる光偏光成分が異なって散乱されることを意味する二色性効果の確認として、円偏光された光ビームが使用される場合には、低い信号であるがθ＝０°の同じ符号を有する信号を記録できる（図５ａにおけるＢ⊥ｋ、偏光されないスペクトル）。
【００９０】
図６は、２ｍＴの印加磁場においてＢ⊥ｋ及びθ＝０°の形態（したがって、図６ａ−図６ａにおける線５０２，５１２と同様の形態）で測定された１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲の異なる懸濁液濃度における５０ｎｍ磁性ビーズの懸濁液に関して記録されたＶ２’信号６００を示す。線６０２は１μｇ／ｍＬの濃度を表わし、線６０４は２μｇ／ｍＬの濃度を表わし、線６０６は５μｇ／ｍＬの濃度を表わし、及び、線６０８は１０μｇ／ｍＬの濃度を表わす。磁性ナノ粒子は、０．１μｇ／ｍＬ〜２０００μｇ／ｍＬの濃度範囲で存在してもよい。或いは、懸濁液濃度は、０．１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの範囲又は０．１μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの範囲となり得る。
【００９１】
図７は、１ｍＴ〜３ｍＴの範囲の印加磁場振幅の異なる値において１０μｇ／ｍＬの濃度の５０ｎｍ磁性ビーズに関して記録されたＶ２’信号７００を示し、この場合、線７０２は１ｍＴの印加磁場振幅を表わし、線７０４は１．５ｍＴの印加磁場振幅を表わし、線７０６は２ｍＴの印加磁場振幅を表わし、線７０８は２．５ｍＴの印加磁場振幅を表わし、及び、線７１０は３ｍＴの印加磁場振幅を表わす。
【００９２】
図７におけるＶ２’スペクトルは、同じＭＮＢ懸濁液に関してピーク周波数値と信号強度とがＡＣ磁場の振幅と共に増大することを示す。
【００９３】
図８は、ビーズのサイズを変える一方でビーズの濃度を１０μｇ／ｍＬで一定に維持するとともにＡＣ磁場の２ｍＴの振幅を維持しつつθ＝０°を伴うＢ⊥ｋの測定形態で記録されたＶ２’スペクトルの比較を示す。
【００９４】
線８０２は、５０ｎｍのサイズを有する粒子を用いて得られ、線８０４は、１３０ｎｍのサイズを有する粒子を用いて得られ、及び、線８０６は、２５０ｎｍのサイズを有する粒子を用いて得られる。明確にするために、スペクトルは、それらの最大値に正規化されてしまっている。３つのＭＮＢタイプは、５０ｎｍ（線８０２）、１３０ｎｍ（線８０４）、及び、２５０ｎｍ（線８０６）のサイズをそれぞれ有する粒子に関して、同様の挙動と、２１Ｈｚ、１４１Ｈｚ、及び、２３３ＨｚであるｆＢの３つの異なる値とを示す。
【００９５】
一般に、磁性粒子は、１０〜３０００ｎｍ又は２０〜１０００ｎｍ又は５０〜２５０ｎｍの直径を有してもよい。
【００９６】
方程式（１）を使用した平均流体力学的直径の計算（３００Ｋの等価球に関して）は、１２２ｎｍ（５０ｎｍＭＮＢに関して）、１４４ｎｍ（１３０ｎｍＭＮＢに関して）、及び、２７１ｎｍ（２５０ｎｍＭＮＢに関して）の流体力学的サイズを与える。全く同じビーズ懸濁液に関する動的な光散乱測定は、１１４ｎｍ、１２６ｎｍ、及び、２５０ｎｍのビーズにおける平均測定直径を示す（ここにはデータが示されない）。
【００９７】
ｆＢを監視することにより、回転するＭＮＢクラスタ懸濁液の平均流体力学的体積を正確に特徴付けることができる。また、２ｍＴの印加磁場の下で懸濁液を測定することにより、１つの周波数値におけるスペクトルピークのＶ２’成分は、方程式（１）からのχ’スペクトルから予期されるものとほぼ一致する。この理論的記述は、残留磁気モーメントを有するＭＮＢにおいて妥当であるが、同様のサイズを有する完全に超常磁性のＭＮＢの挙動は異なる。これは、個々のＭＮＢがブラウン緩和に晒されない場合があるからである。
【００９８】
生物検体の存在下でセットアップの感度を検査するため、ビオチン化ウシ血清アルブミンの存在下でＭＮＢ懸濁液中においてクラスタの形成が誘発されたときにスペクトルの変化が記録された。図９ａには、これらの結果が同相の第２高調波成分に関して示される。データは、磁場が光に対して垂直に伝播している形態、すなわち、図２ｂの検出形態において得られる。異なる濃度のビオチン化ウシ血清アルブミンを含む２０μｌサンプルと混合された、８０ｎｍの公称直径を有する０．５ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンコーディングされたＭｉｃｒｏｍｏｄ  Ｓｔａｒｃｈ粒子の２０μｌ懸濁液が図示される。サンプルが１０分間にわたって培養して放置され、その後、バイアルチューブが、該チューブの側で全ての粒子が収集されるまで、市販の磁気分離器内に挿入された。粒子は、クラスタ形成を生じさせるべくそこで保持された。最後に、懸濁液は、総量が２００μｌｍになるまで希釈されて測定された。異なる濃度のビオチン化ＢＳＡ（ｂＢＳＡ）と混合される８０ｎｍ（５０μｇ／ｍＬ）ＭＮＢＳの懸濁液が得られるとともに、外部磁石を用いてＭＮＢクラスタリングを生じさせた後にＶ２’信号９００が測定される。信号は、４５０ｎｍの波長を有する青色光レーザを使用して測定される。線９０２，９０４，９０６，９０８，９１０，９１２は、０ｐＭ、１００ｐＭ、２５０ｐＭ、５００ｐＭ、１０００ｐＭ、及び、２０００ｐＭのビオチン化ＢＳＡ濃度を表わす。
【００９９】
図９ｂは、磁場と平行に伝播する光ビームを用いた図２ａの形態を使用するビオチン化抗体検出における同相成分を示す。ブランクの信号は、懸濁液中の自由な磁性ビーズ回転に起因する単一のピークを示す。ビーズがクラスタを形成すると、スペクトルの低い周波数範囲内に符号が反対の余分なピークが現れる。これは、自由ビーズに対して反対の外部磁場励起への光応答を有するクラスタ化されたビーズに起因する。自由ビーズの鎖形成破壊動態によりもたらされる光変調は、クラスタ化されたビーズのうちの１つとは反対の符号を有する。これは、それらのビーズが４０５ｎｍ波長で異なるミー散乱断面を有するからである。図９ｂにおいて分かるように、抗体の濃度がかなり大きくなるまで増大するにつれて、プラスの符号を有する低周波ピークの強度が増大する。
【０１００】
したがって、図９ｂに示されるデータは、単一のクラスタ化されたビーズを容易に区別して定量化できるため、方法の感度のかなりの向上を示す。
【０１０１】
これらの測定のため、散乱効果を増幅させるべく４５０ｎｍの波長で放射する青色光レーザが使用され、また、２００μｌの液体を収容するとともに光により横断される５ｍｍの全厚を有する市販のキュベットが使用された。ｂＢＳＡの濃度を数ｎＭに至るまで増大させることにより、ビーズの大部分が更に大きな塊を成すクラスタを形成し、したがって、信号振幅が劇的に減少するとともに、周波数ピークが数Ｈｚに下がる。大きな塊は、低い周波数でのみ外部磁場変動に追従することができ、また、それらの塊は、磁気的に整列されると、単一の粒子よりも小さく散乱し、これが信号のかなりの減少を引き起こす。低い濃度では、粒子の小さい塊だけが形成される可能性が高く、これは、粒子懸濁液の更に低い周波数ピークによって示される。この実験においては、１００ｐＭにまで下がるｂＢＳＡ濃度に至るまで信号の一貫した変化を観察できる。
【０１０２】
図１０ａは、バイオセンサの改変されたセットアップ１０００を示し、図１０ｂは、光学リザーバを貫く光路の拡大図である。改変されたセットアップ１０００では、例えばミラーなどの反射物体１２４が、光学リザーバ１０４内の磁性粒子１０２の溶液を透過した光が反射物体１２４によって反射されて（項目１３２としてマークされる）再び光学リザーバ１０４を通じて戻されるように位置される。光学リザーバ１０４を少なくとも２回通過した光１３３は、その後、検出ユニット１１４によって検出される。
【０１０３】
粒子懸濁液１０２を２回通過する光を有することにより、外部磁場によりもたらされる磁性粒子鎖の形成及び破壊によって散乱される光が増大される。
【０１０４】
図１０ａ〜図１０ｂでは、検出ユニット１１４が光源ユニット１１０に組み込まれるように示される。しかしながら、これは必要条件ではなく、２つのユニットを別個のユニットにすることもできる。後者が当てはまる場合、光学リザーバ１０４を少なくとも２回通過した透過光１３３は、入射光１１２から分離されなければならない。これは、多くの異なる方法で、例えば光ビームが空間的に重なり合わないように反射物体１２４を傾けることによって、或いは、透過光１３３を別個の検出ユニット１１４へ向けて方向付ける１つ以上の物体を挿入することによって行なうことができる。
【０１０５】
図１０ａ〜図１０ｂにおいて、振動磁場１０８は、光源１１０からの光１１２と比べてＢ⊥ｋ形態で位置される２つの電磁石から成る磁場発生ユニット１０６によって発生される。しかしながら、平行形態を同様に使用することもできる。
【０１０６】
図１〜図２に示されて描かれるセットアップの場合と同様に、図１０ａ〜図１０ｂにおけるセットアップで使用するのに適した磁性粒子は、例えば抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、又は、タンパク質複合体などの生体活性リガンドを用いて機能化され得る。
【０１０７】
磁性粒子は、通常、ゼロ以外の残留磁気モーメントを有するとともに、１μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの範囲内の懸濁液濃度で更に存在する。
【０１０８】
また、磁性粒子は、略球状であってもよく、或いは、より不規則な形状を有することができる。略球状の磁性粒子は１０〜３００００ｎｍの直径を有してもよい。
【０１０９】
図１０ａ−図１０ｂに示されるようなバイオセンサを使用すると、セットアップ１０００を次の図に示されて更に説明されるようなＤＶＤタイプのセットアップに実装できる。このとき、この種のセットアップにおける光源１１０は、光ピックアップヘッド、例えばＣＤ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、又は、ＢＬＵ−ＲＡＹ光ピックアップヘッドに実装されるレーザである。この場合、レーザ光１１２は、２つの電磁石間に挿入される磁性粒子懸濁液を通過した後、ミラー１２４によって反射されてピックアップヘッド光検出器に戻る。このようにすると、光学式ドライブを検出ユニットとしても使用できるため、透過光を測定するために付加的なレンズ又は光検出器が全く必要ない。
【０１１０】
ＤＶＤタイプのセットアップを使用すると、ピックアップヘッドにより放射される光が既に偏光され、したがって、磁場から散乱効果が簡単に高められる。また、ピックアップヘッドは既に磁気要素及びコイルを含み、したがって、光検出器は、磁場の影響から既に保護される。
【０１１１】
更に、ＤＶＤピックアップヘッドに既に存在するレンズを除去することにより、多量の粒子と相互に作用できる更に大きなビームサイズ（直径が数ｍｍ）を得ることができる。
【０１１２】
図１１には、光学リザーバがその上に実装されて成るディスク１００２が示される。ディスク１００２は、少なくとも１つの光学リザーバ１００４と、例えば分析されるべきサンプル及び磁性粒子の懸濁液の注入、希釈、及び、混合のための少なくとも１つのサンプル注入システムとを備える。サンプル注入システムは少なくとも１つのマイクロニードル１００６を備えてもよい。マイクロニードル１００６は、分析されるべきサンプル及び磁性粒子の懸濁液の少なくとも１つのマイクロチャネル１００４内における注入、希釈、及び、混合のために適合される。
【０１１３】
前述したバイオセンサは、全ての実施形態に関して、診断目的で使用され得る。バイオセンサは、例えば、血液、サルビア、尿、水、血漿、又は、血清を分析するために使用され得る。
【０１１４】
注入ポイントは、ユーザから例えば血液サンプルを収集するために使用されるマイクロニードル１００６のうちの少なくとも１つによって作られる。サンプルは、専用の遠心分離マイクロチャネルシステム１００４によって遠心分離され、希釈され、及び、磁性ビーズ懸濁液と混合される。
【０１１５】
ディスク１００２は複数のマイクロ流体システムを備えてもよい。複数の光学リザーバ１０４のそれぞれのリザーバ内の機能化された磁性粒子１０２は、他の光学リザーバ内の機能化された磁性粒子と異なってもよく或いは同様であってもよい。これは、複数のサンプルの同時検出を可能にする。
【０１１６】
前述のものに係るバイオセンサを使用して光透過により磁性粒子動態を検出する測定は、一般に、
−  分析されるべきサンプル流体と磁性粒子の懸濁液とを光学リザーバ内で混合させるステップと、
−  強度Ｉを有する波長λの光源放射光を、光学リザーバを通り抜けるように方向付けるステップと、
−  周波数ｆｘで振動する一軸磁場を与えるステップと、
−  一軸磁場を光学リザーバに印加し、それにより、磁性粒子の懸濁液を透過した光の強度Ｉｔｒａｎｓが光学リザーバに入る光の強度Ｉｉｎと比べて変調されるように磁性粒子の懸濁液が変調される、ステップと、
−  一軸磁場を始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔから終点周波数ｆｘ，ｅｎｄまで掃引するステップと、
−  一軸磁場が始点周波数ｆｘ，ｓｔａｒｔから終点周波数ｆｘ，ｅｎｄまで掃引されるにつれて始点周波数ｆｙ，ｓｔａｒｔと終点周波数ｆｙ，ｅｎｄとの間で変化する周波数ｆｙで光学リザーバ内の磁性粒子の懸濁液を透過する光の強度Ｉｔｒａｎｓを測定するステップであって、周波数ｆｙが第１高調波成分ｆｘとは異なるステップと、
を備える。
【０１１７】
測定では、図１又は図１０ａのセットアップを使用できる。
【０１１８】
検出スキームを全ての測定セットアップのために実施することができ、この場合、例えば光をＯＮ／ＯＦＦに切り換えることによって変調される光源からの光の周波数及び磁場の周波数の両方が２つ（又はそれ以上）の周波数でそれぞれ変調される。信号は、この状況で、これらの２つ（又はそれ以上）の周波数の整数の組み合わせとして検出される。
【０１１９】
バイオセンサは、主に、振動一軸磁場によって駆動される磁性粒子の動的挙動を測定するためのものである。或いは、バイオセンサは、外部磁場の印加後の粒子緩和の時間分解測定のために使用することもできる。
【０１２０】
標的分子／細胞／細菌の検出は、標的分子が特異的に機能化された粒子表面に結合するときの粒子の流体力学的直径の増大を測定することによって達成され得る。
【０１２１】
また、標的分子／細胞／細菌の検出は、同じタイプの特異的に機能化された磁性粒子の標的分子誘発凝集体形成によっても達成され得る（すなわち、凝集分析）。
【０１２２】
更に、標的分子／細胞／細菌の検出は、磁性／非磁性、異なるサイズの粒子、又は、表面上に蛍光色素を有することによるなど、異なるタイプの特異的に機能化された粒子の標的分子誘発凝集体形成によって達成されてもよい。例えば遠心分離、電場勾配又は磁場勾配によるサイズ分離のようなマイクロ流体操作は、異なる粒子群又はクラスタ化粒子を非クラスタ化粒子から更に分離し、それにより、異なるタイプ又は読み出しスキームの実施を可能にするために使用され得る。
【０１２３】
これらは、このシステムをバイオセンサとして使用できる最も一般的な方法のうちの３つである。
【符号の説明】
【０１２４】
１００  バイオセンサ
１０２  磁性粒子の溶液
１０４  光学リザーバ
１０６  磁場発生ユニット
１０８  振動一軸磁場
１１０  光源
１１２  光源からの光
１１３  透過光
１１４  検出ユニット
１１６  フォトダイオード
１１８  ロックイン増幅器
１２０  ガウスメーター
１２２  偏光子
１２４  反射物体、例えばミラー
１３２  反射された透過光
１３３  光学リザーバを少なくとも２回通過した透過光
２００  透過光の時間的変化
２０２  振動外部磁場波形
２０４  振動磁場下で測定された光検出器信号のＡＣ成分
２０６  振動磁場が存在しない状態で測定された光検出器信号のＡＣ成分
３００  高速フーリエ変換（ＦＦＴ）信号
４００  第２高調波信号
４０２  第２高調波信号の同相成分
４０４  第２高調波信号の逆相成分
４１２  曲線４０２のフィット
４１４  曲線４０４のフィット
５００  第２高調波信号の同相成分
５０２  Ｂ｜｜ｋ
５０４  Ｂ⊥ｋ及びθ＝０°
５０６  Ｂ⊥ｋ及びθ＝９０°
５０８  Ｂ⊥ｋ及び円偏光
５１０  第２高調波信号の逆相成分
５１２  Ｂ｜｜ｋ
５１４  Ｂ⊥ｋ及びθ＝０°
５１６  Ｂ⊥ｋ及びθ＝９０°
５１８  Ｂ⊥ｋ及び円偏光
５２０  Ｂ｜｜ｋ及びθ＝９０°
５２２  Ｂ｜｜ｋ及び円偏光
６００  第２高調波信号の同相成分
６０２  １μｇ／ｍＬの濃度
６０４  ２μｇ／ｍＬの濃度
６０６  ５μｇ／ｍＬの濃度
６０８  １０μｇ／ｍＬの濃度
７００  第２高調波信号の同相成分
７０２  １ｍＴの印加磁場振幅
７０４  １．５ｍＴの印加磁場振幅
７０６  ２ｍＴの印加磁場振幅
７０８  ２．５ｍＴの印加磁場振幅
７１０  ３ｍＴの印加磁場振幅
８００  第２高調波信号の同相成分
８０２  ５０ｎｍのサイズを有する粒子
８０４  １３０ｎｍのサイズを有する粒子
８０６  ２５０ｎｍのサイズを有する粒子
９００  第２高調波信号の同相成分
９０２  ０ｐＭのビオチン化ＢＳＡ濃度
９０４  １００ｐＭのビオチン化ＢＳＡ濃度
９０６  ２５０ｐＭのビオチン化ＢＳＡ濃度
９０８  ５００ｐＭのビオチン化ＢＳＡ濃度
９１０  ９００ｐＭのビオチン化ＢＳＡ濃度
９１２  ２０００ｐＭのビオチン化ＢＳＡ濃度
１０００  改変されたバイオセンサ
１００２  ディスク
１００４  マイクロチャネル
１００６  マイクロニードル
１００８  デジタルトラック領域
１０１０  光学式ドライブ
【図１】
0006387091.tif 000013
【図２】
0006387091.tif 000014
【図３】
0006387091.tif 000015
【図４】
0006387091.tif 000016
【図５−１】
0006387091.tif 000017
【図５−２】
0006387091.tif 000018
【図６】
0006387091.tif 000019
【図７】
0006387091.tif 000020
【図８】
0006387091.tif 000021
【図９−１】
0006387091.tif 000022
【図９−２】
0006387091.tif 000023
【図１０】
0006387091.tif 000024
【図１１】
0006387091.tif 000025