(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物を生産するために、市販のヒト血清アルブミン組成物およびアスパラギン酸−アラニンジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ）を含む供給流を処理するための方法であって、前記方法は、
前記供給流を濾過して第１のアルブミンリーン流および第１のアルブミンリッチ流を生成する工程であって、前記第１のアルブミンリーン流は、前記供給流中に存在するＤＡ−ＤＫＰの第１の部分を含み、前記第１のアルブミンリッチ流は、前記供給流中に存在するＤＡ−ＤＫＰの第２の部分を含む、工程と、
前記第１のアルブミンリッチ流を加熱して、ＤＡ−ＤＫＰを生成してアルブミンおよびＤＡ−ＤＫＰを含む反応物流を得る工程であって、４０℃〜８０℃の範囲である平均内部温度に前記第１のアルブミンリッチ流を加熱することを含む、工程と、
前記反応物流を濾過して第２のアルブミンリーン流および第２のアルブミンリッチ流を生成する工程であって、前記第２のアルブミンリーン流は、前記反応物流中に存在するＤＡ−ＤＫＰの一部を含み、前記第２のアルブミンリッチ流は、前記反応物流中に存在するＤＡ−ＤＫＰの第２の部分を含む、工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記濾過が、タンジェンシャルフローフィルトレーションを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記供給流が、アセチルトリプトファンナトリウム、Ｎ−アセチルトリプトファン、カプリル酸ナトリウム、カプリル酸およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの追加の成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のアルブミンリッチ流が、前記供給流中のアルブミンの少なくとも９０重量％を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２のアルブミンリッチ流が、前記反応物流中のアルブミンの少なくとも９０重量％を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のアルブミンリーン流中に存在するＤＡ−ＤＫＰの前記第１の部分が、前記供給流中に存在するＤＡ−ＤＫＰの少なくとも８０重量％を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記供給流、前記反応物流または両方を希釈することをさらに含む、請求項１に記載の方法であって、希釈が、生理食塩水、乳酸加リンゲル液、酢酸リンゲル液、ヒドロキシエチルデンプン溶液およびデキストロース溶液からなる群から選択される少なくとも１種の希釈液を用いる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ジケトピペラジン、例えば、アスパラギン酸−アラニンジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ）を生産するための、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）などのペプチダーゼを採用する方法を含む、方法を提供する。また、タンパク質およびペプチドの医薬組成物を作製するため方法であって組成物中のジケトピペラジンの含有量を増加させる方法を提供する。さらに、治療的使用のためのジケトピペラジン組成物および精製アルブミン組成物を生産するための、ジケトピペラジン含有流およびアルブミン含有流の処理方法を提供する。低アルブミン含有量を有する第１の治療用ジケトピペラジン組成物に加えて、高アルブミン濃度を特徴とする、第２の治療用組成物を生産することができる。
【背景技術】
【０００２】
アルブミンは、可溶性、単量体の球状タンパク質（分子量約６６ｋＤａ）であり、哺乳動物血漿中に見られる最も豊富なタンパク質であり、０．０３〜０．０５ｇ／ｍｌの範囲の正常濃度で存在する。アルブミンは、膠質浸透圧の維持を含む、心血管系においていくつかの重要な役割を果たす。アルブミンの濃度が高くなると、流体が周囲組織の細胞内空間から血管内系統へと移行することによって、血漿量の増加が生じる。加えて、アルブミンは、ステロイドホルモン、ヘミンおよび脂肪酸を送達するための輸送タンパク質としても機能する。また、アルブミンは、血液ｐＨを維持するのに役立ち、凝固経路にも関与する。
【０００３】
これらの重要な機能から、血流中での正常なアルブミン濃度は、ホメオスタシスを維持するために不可欠である。血中アルブミン濃度の減少または増加は深刻な健康問題につながることがある。血液中での低アルブミン濃度、低アルブミン血症は、肝機能障害および腎障害などの疾患からだけでなく、外傷、重症の火傷、および敗血症からも起こり得る。アルブミン療法から利益を得ることが知られている他の状態としては、限定されるものではないが、栄養失調、飢餓、ネフローゼ症候群、膵炎および腹膜炎が挙げられる。このような理由で、低温殺菌したアルブミン含有溶液が手術室や救急治療状況で蘇生液としてよく投与される。
【０００４】
危篤状態での市販のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）溶液の使用は、火傷、急性肺損傷（ＡＬＩ：ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ）、およびショックなどの特定の状態での血液量回復に必要であることがある。これらの患者では、ＨＳＡ投与が議論の的になっており、最近の証拠から、生理食塩水などのより安価な代替案と比較して、最善でも死亡率の減少はないことが示されている。加えて、市販ＨＳＡ溶液の不均一性が示されており、不均一性にはＨＳＡ分子の酸化およびトランケーションが含まれる。市販ＨＳＡ溶液の処理および保存の間に、そのタンパク質のＮ末端でタンパク質トランケーションが起こり、その結果、ＨＳＡの最初の２つのアミノ酸、Ａｓｐ−Ａｌａの切断が生じる。ＨＳＡのＮ末端の特有の性質から、このジペプチドは、３−メチル−２，５−ジケトピペラジン−６−酢酸としても知られている、アスパラギン酸−アラニンジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ：ａｓｐａｒｔａｔｅ−ａｌａｎｉｎｅ  ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）と呼ばれる環状ジペプチドへさらに変換される。ＤＡ−ＤＫＰは、市販ＨＳＡ溶液中にかなりの量で見出されており、ＤＡ−ＤＫＰ自体はｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＰＢＭＣおよびＴリンパ球に対して免疫抑制効果を有する。
【０００５】
ＨＳＡからのＤＡ−ＤＫＰの形成の機構は現在不明であるが、Ｎ末端の自己分解および／またはペプチダーゼを含む酵素反応は理論上寄与し得る。アデノシンデアミナーゼ複合タンパク質２またはＣＤ２６（分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）２６）としても知られている、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、タンパク質のＮ末端からＸａａ−ＰｒｏおよびＸａａ−Ａｌａジペプチドを優先的に切断するペプチダーゼである。ＤＰＰ−ＩＶ活性は、免疫細胞および内皮細胞の細胞表面上だけでなく、可溶性形態として血清中でも報告されている。ＤＰＰ−ＩＶの主な機能は、免疫応答および細胞分化を調節するための、生物学的に活性なペプチド、サイトカイン、および他の細胞表面タンパク質の修飾であると考えられる。また、細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）のＤＰＰ−ＩＶ媒介性の分解によるコラーゲンマトリックス中への内皮細胞の浸潤を含む新規機構も解明されている。
【０００６】
ＤＫＰは、ヒト自己免疫疾患を治療する可能性を含む、独自の治療的使用を有することが示されている。例えば、ＤＡ−ＤＫＰは、活性化した末梢血単核細胞およびＴリンパ球に対して顕著な免疫抑制効果を有することが示されている。ＨＳＡ、ＤＡ−ＤＫＰおよびそれに関連する治療的処置に関するさらなる開示は、特許文献１、特許文献２および特許文献３に見出すことができ、これらは全て、その全内容を本明細書の一部として援用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，５５５，５４３号明細書
【特許文献２】米国特許第７，７３２，４０３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１３／００９０２９２Ａ１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、ヒト自己免疫疾患および他の障害を治療するためのＤＫＰの潜在的な治療的使用と、低アルブミン血症、血液量減少症および様々な他の障害を治療するためのアルブミンの重要性を考えると、高品質の治療用ＤＫＰ組成物および高品質のアルブミン蘇生液の両方が必要である。本開示は、これらの治療用組成物の両方を、効率的な高収率プロセスにより生産するための方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
市販のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の投与は、多発外傷患者などの患者において潜在的に必要である。その不均一な性質から、プロテアーゼなど、他の成分が市販のＨＳＡの治療効果に寄与することができる。そのような１つのプロテアーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、アルブミンのＮ末端から、既知免疫調節分子であるアスパラギン酸−アラニンジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ）を放出させることができる。例えば、コーン分画（Ｃｏｈｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）によって、調製された市販ＨＳＡ溶液はＤＰＰ−ＩＶ活性を有することが示されている。
【００１０】
本開示の１つの態様は、ＤＫＰ、例えば、ＤＡ−ＤＫＰの生産である。ある実施形態では、ＤＡ−ＤＫＰは、ＤＰＰ−ＩＶの存在下でアルブミンから生産される。ある実施形態では、前記ＤＰＰ−ＩＶは内因性であり、例えば、ヒト血漿またはＨＳＡ中に存在する。ある実施形態では、前記血漿またはＨＳＡは加熱される。特定の理論に縛られることを望むものではないが、前記加熱は、前記溶液の温度を上げてＤＰＰ−ＩＶ活性の最適温度に近づけることによってかつ／または熱的分解によってＤＰＰ−ＩＶの濃度を高めることができると考えられる。
【００１１】
本開示の別の態様は、組成物を生産するために、アルブミンおよびＤＫＰ、例えば、ＤＡ−ＤＫＰを含む供給流を処理するための方法であり、その方法は、第１のアルブミンリーン（ａｌｂｕｍｉｎ−ｌｅａｎ）流および第１のアルブミンリッチ（ａｌｂｕｍｉｎ−ｒｉｃｈ）流を生成するために、前記供給流を処理する工程を含み、ここで、前記第１のアルブミンリーン流は、前記供給流中に存在するＤＫＰの第１の部分を含み、前記第１のアルブミンリッチ流は、前記供給流中に存在するＤＫＰの第２の部分を含む。前記第１のアルブミンリッチ流は、追加のＤＫＰを生成してアルブミンおよびＤＫＰを含む反応物流を得るために反応させる。前記反応物流は、第２のアルブミンリーン流および第２のアルブミンリッチ流を生成するために処理され、ここで、前記第２のアルブミンリーン流は、前記反応物流中に存在するＤＫＰの一部を含み、前記第２のアルブミンリッチ流は、前記反応物流中に存在するＤＫＰの第２の部分を含む。
【００１２】
本開示のいくつかの実施形態では、生成された前記アルブミンリッチ流は治療的価値を有する可能性があり、それには、限定されるものではないが、低アルブミン血症および血液量減少症の治療における有効性が含まれる。本開示のいくつかの実施形態では、生成された、前記アルブミンリーンなＤＫＰ含有流は治療的価値を有する可能性があり、それには、限定されるものではないが、炎症状態の治療における有効性が含まれる。
【００１３】
本開示のさらなる態様は、上記のように、治療用組成物を生産するために、アルブミンおよびＤＫＰを含む供給流を処理するための方法であって、分析工程をさらに含む方法であり、前記分析工程は、少なくとも１つのメトリック（ｍｅｔｒｉｃ）を得るために、アルブミンリッチ流を分析すること、前記少なくとも１つのメトリックを少なくとも１つの基準値と比較することを含み、ここで、前記少なくとも１つのメトリックが前記基準値を上回るまたは下回る場合に、前記反応工程および処理工程は、その後のアルブミンリッチ流の前記少なくとも１つのメトリックが前記少なくとも１つの基準値以下または以上になるまで繰り返される。例えば、前記メトリックは、前記流中のアルブミンの量またはＤＡ−ＤＫＰの量であってよい。
【００１４】
本開示のさらなる態様は、市販のヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）調製品（５重量％アルブミン溶液ではＨＳＡ  １Ｌ当たりアルブミン約５０ｇ（ｇ／Ｌ）または２５重量％アルブミン溶液では約２５０ｇ／Ｌである）よりもアルブミン濃度が低い、ＤＫＰを含む組成物である。本開示のいくつかの実施形態では、前記ＤＫＰ含有組成物中のアルブミンの濃度は、約２５０ｇ／Ｌ未満、約２００ｇ／Ｌ未満、約１００ｇ／Ｌ未満、約５０ｇ／Ｌ未満、約４０ｇ／Ｌ未満、約３０ｇ／Ｌ未満、約２０ｇ／Ｌ未満、約１０ｇ／Ｌ未満、約５ｇ／Ｌ未満、約４ｇ／Ｌ未満、約３ｇ／Ｌ未満、約２ｇ／Ｌ未満、約１ｇ／Ｌ未満、約０．９ｇ／Ｌ未満、約０．８ｇ／Ｌ未満、約０．７ｇ／Ｌ未満、約０．６ｇ／Ｌ未満、約０．５ｇ／Ｌ未満、約０．４ｇ／Ｌ未満、約０．３ｇ／Ｌ未満、約０．２ｇ／Ｌ未満、約０．１ｇ／Ｌ未満、約０．０９ｇ／Ｌ未満、約０．０８ｇ／Ｌ未満、約０．０７ｇ／Ｌ未満、約０．０６ｇ／Ｌ未満、約０．０５ｇ／Ｌ未満、約０．０４ｇ／Ｌ未満、約０．０３ｇ／Ｌ未満、約０．０２ｇ／Ｌ未満、約．０１ｇ／Ｌ未満、約．００９ｇ／Ｌ未満、約．００８ｇ／Ｌ未満、約．００７ｇ／Ｌ未満、約．００６ｇ／Ｌ未満、または約．００５ｇ／Ｌ未満であり得る。本開示のさらなる実施形態では、前記ＤＫＰ含有組成物中のアルブミンの濃度は、約０ｇ／Ｌ、または検出不能量であり得る。
【００１５】
本開示のいくつかの実施形態では、ＤＫＰを含む組成物は治療的価値を有する可能性があり、それには、限定されるものではないが、炎症状態の治療における有効性が含まれる。
【００１６】
加えて、本開示は、ＤＫＰを合成する方法を提供する。一実施形態では、前記方法は、ＤＫＰを形成させるのに有効な条件下で哺乳動物血漿を加熱することを含む。ある実施形態では、前記方法は、ＤＫＰを生成するのに有効な条件下で、血漿を、前記タンパク質またはペプチドの前記２つのＮ末端アミノ酸を切断する酵素と接触させることを含む。ある実施形態では、前記方法は、ＤＡ−ＤＫＰを生成するのに有効な条件下で、血漿を、前記タンパク質またはペプチドの前記２つのＮ末端アミノ酸を切断するＤＰＰ−ＩＶと接触させることを含む。
【００１７】
本開示はさらに、タンパク質またはペプチドの改善された医薬組成物を作製する方法を提供する。前記方法は、タンパク質またはペプチドの医薬組成物中のＤＡ−ＤＫＰなどのＤＫＰの含有量を増加させるために、血漿を処理することを含む。
【００１８】
本開示はまた、タンパク質またはペプチドの改善された医薬組成物を提供する。その改善は、前記組成物が増加した含有量のＤＫＰを含むということである。
前述は、本明細書に開示する態様、実施形態および構成の最初の理解を与えるための簡単な概要である。この概要は、それらの態様、実施形態、または構成の徹底的かつ網羅的な概観ではない。主要または重要な要素を特定するものでも、それらの態様、実施形態、または構成の範囲を定めるものでもなく、以下に示すより詳細な説明への導入として、選択した概念を簡略化して示すものである。理解されるように、上記のまたは以下に詳細に説明する特徴の１以上を単独でまたは組み合わせて利用する、他の態様、実施形態、および構成も可能である。
【００１９】
添付の図面は、態様、実施形態、または構成を作製し使用し得る方法を例示するために、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成しているが、それらの態様、実施形態、または構成を、例示し記載した例だけに限定するものとして解釈してはならない。さらなる特徴および利点は、様々な態様、実施形態、または構成についての以下の、より詳細な、説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、５％市販ＨＳＡ溶液におけるＤＰＰ−ＩＶ活性を示している。ＤＰＰ−ＩＶ活性（Ｎ＝３）は、３７℃で２４時間のインキュベーション中に生成されたｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ、μＭ）の総量として表される。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（ジプロチンＡ）の使用によってＤＰＰ−ＩＶ活性の完全抑制がもたらされた（データは示していない）。
【図２】図２は、５％市販ＨＳＡ溶液（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）におけるＤＰＰ−ＩＶ活性に対する温度の効果を示している。ＤＰＰ−ＩＶ活性（Ｎ＝３）は、３７℃（黒塗りのバー）および６０℃（縦線）で２時間のインキュベーション中に生成されたｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ、μＭ）の総量として表される。
【図３】図３は、異なる製造方法によって生産されたＨＳＡ溶液におけるＤＰＰ−ＩＶ活性を示している。ＤＰＰ−ＩＶ活性（Ｎ＝３）は、３７℃で２４時間のインキュベーション中に生成されたｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ、μＭ）の総量として表される。ＤＰＰ−ＩＶ活性は、コーン分画を用いて生産された市販ＨＳＡ溶液（黒塗りのバー、ｃＨＳＡ）およびイネにおいて生産された組換えＨＳＡ溶液（縦線、ｒＨＳＡ）において測定した。
【図４】図４は、６０℃で加熱された５％市販ＨＳＡにおけるＤＡ−ＤＫＰの生成を示している。ＤＡ−ＤＫＰの生成（Ｎ＝３）は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の存在下（▲）または不在下（■）で、６０℃で加熱された５％市販ＨＳＡ溶液において異なる時点で測定した。５％市販ＨＳＡ溶液の低分子量画分（＜５ｋＤａ）を単離し、ＬＣＭＳによってＤＡ−ＤＫＰ含有量について分析した。アスタリスク（＊）は純５％ＨＳＡに対する統計的有意性（ｐ＜０．０５）を表す。
【図５】図５は、２つの処理工程および１つの反応工程を含む、本開示の一実施形態を示している。これらの工程によって、２つの別個のＤＫＰ含有生成物流および１つのアルブミン含有生成物流が生成される。
【図６】図６は、図５と類似している、アルブミン含有再循環流を含む、本開示の一実施形態を示している。
【図７】図７は、図５と類似している、第２の処理工程中にＤＫＰ回復を支援するための希釈流を含む、本開示のある実施形態を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の詳細な説明は、本発明を例として示すものであり、限定を目的としていない。この説明によって、明らかに、当業者は本発明を作製し使用することができる。
本明細書において、「一実施形態」、「ある実施形態」、「例示的実施形態」などという場合、記載する実施形態はある特定の特徴、構造、または特性を含み得るが、全ての実施形態がその特定の特徴、構造、または特性を必ずしも含んでいなくてよいことを示している。さらに、そのような成句は必ずしも同じ実施形態を指し示すものではない。さらに、ある特定の特徴、構造、または特性がある実施形態に関連して記載されている場合、明示的に記載されているか否かに関わらず、他の実施形態に関連してそのような特徴、構造、または特性に影響することは当業者の知識の範囲内であると思われる。
【００２２】
本明細書において使用するように、「少なくとも１つ」および「１つまたは複数」および「および／または」は、言い回しにおいて接続的でも離接的でもあるオープンエンドな表現である。例えば、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの１つまたは複数」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの１つまたは複数」および「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」という表現の各々は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢをともに、ＡとＣをともに、ＢとＣをともに、またはＡとＢとＣをともに、を意味する。
【００２３】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、リガンド結合特性および輸送特性、抗酸化機能、および酵素活性を有する最も豊富な循環タンパク質である。ＨＳＡは、危篤状態における血液量および浸透圧の調節のために重要であることから、製薬産業によって大量に生産されている。市販ＨＳＡの好ましい製造技術は、冷エタノール分画法を用いてＨＳＡを単離するコーン（Ｃｏｈｎ）らの方法に基づいている。市販ＨＳＡ調製品は通常、安定剤であるＮ−アセチル−トリプトファン（ＮＡＴ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）およびカプリル酸ナトリウムを、ＨＳＡの０．０８ｍｍｏｌ／ｇの濃度で含有する。市販ＨＳＡ溶液の保存期間は一般的に３年である。変色、タンパク質酸化、タンパク質分解、凝集、および沈殿など、溶液特性の経年変化が観察されているが、活性酸素種の産生に起因する可能性が最も高い。結果として、安定剤ＮＡＴは経時的に酸化され、利用可能な既知毒性データのない２つの主要な分解生成物が生成されることになる。
【００２４】
コーン分画法は、ＨＳＡに対して特異的ではないことから、いくつかのタンパク質およびペプチドはＨＳＡと同時精製され、市販溶液中に存在する。加えて、ＨＳＡは複数のリガンドと結合する固有の能力を有することから、既知生物活性を有する他のペプチドおよびタンパク質が、プロテオーム技術を用いて市販ＨＳＡ溶液中で同定されている。同時精製または結合されるこれらのタンパク質としては、プロテアーゼ（カリクレイン、カテプシン、カルボキシペプチダーゼ類、およびジペプチダーゼ類）、プロテアーゼ阻害剤（キニノゲン）、細胞表面接着タンパク質（セレクチン、カドヘリン類、およびＩＣＡＭ類）、および免疫に関与するタンパク質（補体系の免疫グロブリン鎖および成分）が挙げられる。最近では、還元性条件下でＨＳＡ分子の独特の固有のタンパク質分解活性が報告されている。よって、不均一な性質上、ＨＳＡの投与は、危篤状態の患者に潜在的に不当な副作用をもたらし得る。
【００２５】
タンパク質に加えて、市販ＨＳＡ溶液は、ＨＳＡの最初の２つのＮ末端アミノ酸由来の小免疫抑制分子、アスパラギン酸−アラニンジケトピペラジンまたはＤＡ−ＤＫＰを含有する。ＤＡ−ＤＫＰは、Ｒａｐ１活性を高めることによりＴ細胞サイトカイン産生を調節し、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路に関連する活性化因子を減少させると考えられている。市販ＨＳＡ溶液におけるＤＡ−ＤＫＰの形成機構は現在不明であるが、Ｎ末端の独特の化学的特性に起因するＨＳＡのＮ末端の自己分解およびその後のＤＡ−ＤＫＰ形成を示唆する１つの仮説がある。
【００２６】
本開示は、市販ＨＳＡ溶液中にプロテアーゼ、具体的には、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）が存在することに基づいている。下の実施例に示すように、既知発色アッセイを用いて、３種の市販ＨＳＡ溶液においてＤＰＰ−ＩＶ活性が測定された。また、この活性は、ＤＰＰ−ＩＶの既知阻害剤であるジプロチンＡの使用により失われた。よって、ＤＰＰ−ＩＶタンパク質の存在に加えて、ＤＰＰ−ＩＶ活性も市販ＨＳＡ溶液に存在する。この活性は組換えＨＳＡには存在せず、観察されたＤＰＰ−ＩＶ活性がコーン分画処理によるものであることが示唆された。
【００２７】
市販ＨＳＡの生産中、生成物は、６０℃で加熱することにより１０〜１１時間低温殺菌される。血清、組換え型、および精液のＤＰＰ−ＩＶでは、最適なＤＰＰ−ＩＶ活性は５０〜６０℃の間で報告されており、６５℃で活性は徐々に喪失する。ＤＰＰ−ＩＶのこの独特の特性によってそれが市販ＨＳＡ溶液中でのＤＡ−ＤＫＰ生成の候補となる。また、（ＨＳＡと結合しない）低分子量成分は、低温殺菌工程の前に除去される可能性が最も高い。従って、市販ＨＳＡ溶液中で測定されたＤＡ−ＤＫＰの大部分は低温殺菌工程以降にデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）生成される。調査した市販ＨＳＡ溶液では、６０℃で顕著なＤＰＰ−ＩＶ活性が測定された。しかしながら、総活性は３７℃でインキュベーションしたものに存在する活性の７０〜８０％に過ぎなかった。
【００２８】
市販ＨＳＡ中、６０℃でのＤＡ−ＤＫＰの生成を、ＤＡ−ＤＫＰ検出のためのＬＣＭＳ法を用いて調べた。市販ＨＳＡの純溶液では、ＤＡ−ＤＫＰは、６０℃で２４時間の間にかなりの量で生成された。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤ジプロチンＡを市販ＨＳＡ溶液に添加した場合、６０℃で生成されるＤＡ−ＤＫＰの量は２４時間の期間に約３倍減少した。よって、この発見により、ＤＰＰ−ＩＶは市販ＨＳＡ溶液中でのＤＡ−ＤＫＰ形成に部分的に関与することが示される。ジプロチンＡによって６０℃ではＤＡ−ＤＫＰ形成は完全にはなくならなかった。ジプロチンＡは、ＤＰＰ−ＩＶの活性部位内部のＳｅｒ６３０と共有結合した四面体型中間体として捕捉される。ジプロチンＡ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）は、見かけの競合阻害をもたらす代謝回転の低いＤＰＰ−ＩＶの基質である。ジプロチンＡは、６０℃で２４時間のインキュベーション後に十分な程度に加水分解され、残りのＤＰＰ−ＩＶ基質がＨＳＡのＮ末端などの活性部位中へ配分されることが考えられる。ＤＡ−ＤＫＰの酵素的形成と組み合わせて、ＨＳＡのＮ末端の自己分解を介してなされるＤＡ−ＤＫＰの形成が考えられる。
【００２９】
ＤＰＰ−ＩＶの既知基質としては、いくつかのケモカイン、サイトカイン、ニューロペプチド、循環ホルモンおよび生物活性ペプチドが挙げられる。最も研究されているＤＰＰ−ＩＶ基質の１つは、循環血漿グルコースレベルを調節することからＩＩ型糖尿病の病因において重要であるグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）である。これまでに知られていたＤＰＰ−ＩＶ基質はポリペプチドであり、ＨＳＡのＮ末端は、本発明者によって初めて基質として記載された。ＨＳＡのＮ末端のＤＰＰ−ＩＶ活性部位への接近は、天然の立体配座（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）のＨＳＡでは立体障害により起こりそうにない。しかしながら、ＤＡ−ＤＫＰを形成するためには、ＨＳＡのＮ末端のかなりの部分がＤＰＰ−ＩＶ活性部位に接近できなければならない。
【００３０】
特定の理論に縛られることを望むわけではないが、ＨＳＡのＮ末端がＤＰＰ−ＩＶの活性部位に提示され得る方法は少なくとも２つあると考えられる。第１に、保存中の市販溶液中でのＨＳＡの酸化によってＨＳＡの切断が起こり、その結果として、ＤＰＰ−ＩＶ活性部位に対するより良い基質であるＮ末端ペプチドが産生される可能性がある。鉄および銅などのレドックス活性金属は市販ＨＳＡ溶液中でかなりの量で見出される。実際に、ＨＳＡのＮ末端は銅と結合し、その結果として、ＨＳＡのＮ末端ペプチドの切断をもたらすと思われる活性酸素種（ＲＯＳ）のｉｎ  ｓｉｔｕ生成が生じ得る。第２に、ＨＳＡの緩徐な変性によってＮ末端のアンフォールディングが生じ、それがより接近しやすいＤＰＰ−ＩＶ基質になる可能性がある。これは、６０℃でＨＳＡは、Ｎ末端を露出していると思われる可逆的アンフォールディング形態であるという事実によって部分的に裏付けられる。この可逆的アンフォールディング形態は、ＨＳＡ溶液の長期保存中にますます一般的になり、ＤＡ−ＤＫＰの生成の増加につながる可能性がある。
【００３１】
ＨＳＡ投与による免疫抑制作用は十分に立証されている。出血性ショックのラットモデルでは、ＨＳＡによって、肺透過性および好中球分画が用量依存的に低下した。同様のラットショックモデルでは、投与されたＨＳＡによって、内皮との免疫細胞の接着に関与する因子であるインテグリンおよびＩＣＡＭ−１の発現が著しくダウンレギュレートされた。また、ＨＳＡは、ＴＮＦαまたは補体の曝露に応じて好中球の呼吸バーストも抑制し、結果として、好中球伸展の選択的かつ可逆的阻害をもたらした。最後に、ＨＳＡは、出血性ショックモデルにおいて利用される、炎症を最も誘発しにくい蘇生液であることが見出された。本発明者によるこれまでの免疫学的研究に基づいて、ＤＡ−ＤＫＰは、ＨＳＡの免疫抑制作用に部分的に関与すると思われる。
【００３２】
市販ＨＳＡ溶液の不均一性は、危篤状態の患者において、患者の免疫学的状態に応じた多くの有益または有害な影響をもたらす可能性がある。市販ＨＳＡ溶液で最近同定された化合物のいくつかは免疫調節および機能に関与している。加えて、安定剤ＮＡＴは、免疫および炎症反応だけでなく血管透過性の重要なメディエーターであるニューロキニン−１受容体の周知の拮抗薬である。本開示は、市販ＨＳＡ溶液においてマイクロモル濃度で見出される抗炎症性ＤＡ−ＤＫＰの形成機構を扱う。市販ＨＳＡ溶液はかなりのレベルのＤＰＰ−ＩＶ活性を有し、この活性は既知ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤であるジプロチンＡによって阻害される。また、ＤＰＰ−ＩＶ活性は、ＤＰＰ−ＩＶなどの他の血漿成分を単離するコーン（Ｃｏｈｎ）製造法に起因し、市販ＨＳＡ溶液に独特のものである。最後に、加熱された市販ＨＳＡ溶液中でのＤＡ−ＤＫＰのデノボ形成は、ジプロチンＡの存在下での対応する形成阻害とともに観察される。よって、市販ＨＳＡ溶液では、ペプチダーゼＤＰＰ−ＩＶが、既知の抗炎症性化合物であるＤＡ−ＤＫＰの形成に関与すると思われる。
【００３３】
本開示の別の態様は、組成物を生産するために、アルブミンおよびＤＫＰ、例えば、ＤＡ−ＤＫＰを含む供給流を処理するための方法を含み、その方法は、第１のアルブミンリーン流および第１のアルブミンリッチ流を生成するために、前記供給流を処理する工程を含み、ここで、前記第１のアルブミンリーン流は、前記供給流中に存在するＤＫＰの第１の部分を含み、前記第１のアルブミンリッチ流は、前記供給流中に存在するＤＫＰの第２の部分を含む。前記第１のアルブミンリッチ流は、追加のＤＫＰを生成してアルブミンおよびＤＫＰを含む反応物流を得るために反応させる。前記反応物流は、第２のアルブミンリーン流および第２のアルブミンリッチ流を生成するために処理され、ここで、前記第２のアルブミンリーン流は、前記反応物流中に存在するＤＫＰの一部を含み、前記第２のアルブミンリッチ流は、前記反応物流中に存在するＤＫＰの第２の部分を含む。
【００３４】
本開示のいくつかの実施形態では、生成された前記アルブミンリッチ流は、市販ＨＳＡ調製品によって通常治療される状態の治療において治療的価値を有する可能性があり、それには、限定されるものではないが、低アルブミン血症および血液量減少症の治療における有効性が含まれる。本開示のいくつかの実施形態では、生成された、前記アルブミンリーンなＤＫＰ含有流は治療的価値を有する可能性があり、それには、限定されるものではないが、炎症状態の治療における有効性が含まれる。
【００３５】
本開示のいくつかの実施形態では、ＤＫＰを含有する少なくとも２つのアルブミンリーン流は１つに合流する。
本明細書における供給流とは、アルブミンおよびＤＫＰを含有する任意の水溶液を指す。従って、「アルブミン」という用語は、市販のアルブミン調製品、例えば、コーン法、その変法、クロマトグラフィー、およびヒトまたは動物用の治療用タンパク質を生産するための任意の他の好適な手段によって生産されたアルブミン溶液を含む。また、「アルブミン」という用語は、任意の種のアルブミンも指し、限定されるものではないが、ヒトおよびウシアルブミンが含まれる。また、「アルブミン」は、組換え技術および／または細菌もしくは哺乳動物の発現宿主を用いた細胞発現系によるなどの合成方法によって生産されたアルブミンタンパク質も含む。
【００３６】
本開示のいくつかの実施形態では、アルブミンを含有する供給流およびＤＫＰを含有する供給流中のアルブミンの濃度は約１重量％〜約３５重量％の範囲であり得る。いくつかのさらなる実施形態では、前記供給流中のアルブミンの濃度は約２重量％〜約３０重量％の範囲内である。さらなる実施形態では、前記供給流中のアルブミンの濃度は約４重量％〜約２６重量％の範囲内である。特定の実施形態では、アルブミンの濃度は約５重量％または約２５重量％であり得る。
【００３７】
本明細書における「ジケトピペラジン」またはＤＫＰとは、下式：
【００３８】
【化１】
0006387019.tif 000002
【００３９】
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一であっても異なってもよく、各々は、アミノ酸の側鎖であり、ここで、前記アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ノルバリン、α−アミノイソ酪酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノ酪酸、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、セリン、ホモセリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニン、ホモアルギニン、シトルリン、フェニルアラニン、ｐ−アミノフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、チロキシン、システイン、ホモシステイン、メチオニン、ペニシラミンまたはオルニチンである；ただし、Ｒ１がアスパラギンまたはグルタミンの側鎖である場合は、Ｒ２はリジンまたはオルニチンの側鎖ではあり得ず、Ｒ１がリジンまたはオルニチンの側鎖である場合は、Ｒ２はアスパラギンまたはグルタミンの側鎖ではあり得ない）
を有する化合物のいずれかを指す。
【００４０】
本開示のいくつかの実施形態では、前記ＤＫＰ（例えば、供給流、アルブミン含有流、ＤＫＰ含有流、アルブミンリッチ流、アルブミンリーン流、およびそれらの組合せの少なくとも１つに存在する）は、アスパラギン酸−アラニンジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ）、メチオニン−アルギニンジケトピペラジン（ＭＲ−ＤＫＰ：ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、グルタミン酸−アラニンジケトピペラジン（ＥＡ−ＤＫＰ：ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ−ａｌａｎｉｎｅ  ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、チロシン−グルタミン酸ジケトピペラジン（ＹＥ−ＤＫＰ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、グリシン−ロイシンジケトピペラジン（ＧＬ−ＤＫＰ：ｇｌｙｃｉｎｅ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、プロリン−フェニルアラニンジケトピペラジン（ＰＦ−ＤＫＰ：ｐｒｏｌｉｎｅ  −ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）  アラニン−プロリンジケトピペラジン（ＡＰ−ＤＫＰ：ａｌａｎｉｎｅ−ｐｒｏｌｉｎｅ  ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）およびそれらの組合せの少なくとも１つを含み得る。本開示のいくつかの実施形態では、前記ＤＫＰ（例えば、供給流、アルブミン含有流、ＤＫＰ含有流、アルブミンリッチ流、アルブミンリーン流、およびそれらの組合せの少なくとも１つに存在する）は、３−メチル−２，５−ジケトピペラジン−６−酢酸としても知られている、ＤＡ−ＤＫＰを含み得る、すなわち、この場合、Ｒ１は−ＣＨ２−ＣＯＯＨであり、Ｒ２は−ＣＨ３である。
【００４１】
本開示のいくつかの実施形態では、前記供給流は、約０μＭ  ＤＫＰ〜約２００μＭ  ＤＫＰの範囲であるＤＫＰ濃度を有し得る。本開示のさらなる実施形態では、前記供給流は約５０μＭ  ＤＫＰ〜約１００μＭ  ＤＫＰの範囲であるＤＫＰ濃度を含み得る。本開示のいくつかの実施形態では、前記ＤＫＰは少なくとも５０％ＤＡ−ＤＫＰ、少なくとも６０％ＤＡ−ＤＫＰ、少なくとも７０％ＤＡ−ＤＫＰ、少なくとも８０％ＤＡ−ＤＫＰ、少なくとも９０％ＤＡ−ＤＫＰ、少なくとも９５％ＤＡ−ＤＫＰ、少なくとも９８％ＤＡ−ＤＫＰ、少なくとも９９％ＤＡ−ＤＫＰ、少なくとも９９．９％ＤＡ−ＤＫＰまたは１００％ＤＡ−ＤＫＰである。
【００４２】
本開示のいくつかの実施形態では、前記供給流および前記反応物流の少なくとも一方の処理は、タンパク質リッチ流中に入る流れにおいてタンパク質、例えば、アルブミンを分離するために、タンパク質分離技術を含んでよい。そのような技術としては、濾過、クロマトグラフィー、沈殿、抽出、およびそれらの組合せの少なくとも１つを挙げることができる。本開示のいくつかの実施形態では、前記供給流および前記反応物流の少なくとも一方の処理は、濾過を含んでよい。さらなる実施形態では、前記供給流および前記反応物流の少なくとも一方の処理は、タンジェンシャルフィルトレーション（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を含んでよい。
【００４３】
本明細書における濾過とは、濾過媒体を通した圧力降下を利用して、アルブミン含有供給流の一画分を残りの画分から分離する機械的かつ／または物理的な操作を指す。本明細書において使用する「機械的濾過」という用語は、限定されるものではないが、サイズ排除濾過を指す。本明細書において使用する「物理的濾過」という用語は、限定されるものではないが、分子間相互作用、例えば、電荷引力および反発力、水素結合、および双極子相互作用を指す。濾過媒体としては、限定されるものではないが、濾紙、ガラス繊維、焼結ガラス、焼結金属、モノリシックセラミックス、ポリマー膜、および濾過助剤を含むまたは含まないこれらのいずれかを挙げることができ、濾過助剤は、例えば、限定されるものではないが、珪藻土である。濾過媒体は親水性および／または疎水性であってよい。
【００４４】
本開示のいくつかの実施形態では、濾過はタンジェンシャルフローフィルトレーションを含んでよい。本明細書において使用するように、「タンジェンシャルフロー」という用語は、濾過媒体に対するアルブミン含有供給流のフローの方向を指す。このフロー方向は、接線方向（一般的に「クロスフロー」とも呼ばれる）、または「ノーマルフロー」、またはその両方の組合せであってよい。タンジェンシャルフローとは、流れの大部分が濾過媒体表面を流れることを特徴とするアルブミン含有供給流を指し、一方、ノーマルフローとは、流れの大部分が濾過媒体表面に対して９０°の角度で、濾過媒体を通って流れることを特徴とする流れを指す。
【００４５】
本開示のいくつかの実施形態では、いずれかのタイプの濾過のための、または他の処理単位操作（例えば、クロマトグラフィー）を通るフローを起こすための圧力降下は、ポンプを使用して供給流および反応物流の少なくとも一方を加圧することによって、または濾過媒体の下流側を真空に曝すことによって、または濾過材と、供給流および反応物流の少なくとも一方を遠心力に曝すことによって、または任意の他の好適な手段、またはそれらの組合せによって、達成することができる。本明細書において使用するように、「下流側」とは、ＤＫＰ含有流、または濾液を含む濾過材の側（「アルブミンリーン」および「ＤＫＰ含有側」とも呼ばれる）を指し、それに対する「上流側」またはアルブミン含有流とは、保持液を含む濾過材の側（「アルブミンリッチ」および「アルブミン含有側」とも呼ばれる）を指す。本明細書において使用するように、「真空」とは、１４．７ポンド／平方インチ絶対圧力（ｐｓｉａ）（１０１．４ｋＰａＡ）未満の絶対圧力を指す。
【００４６】
本開示のいくつかの実施形態では、処理はクロマトグラフィーを含んでよい。本明細書における「クロマトグラフィー」とは、固定相を通した圧力降下を利用して、供給流および反応物流の少なくとも一方の一画分を残りの画分から分離する機械的かつ／または物理的な操作を指す。本明細書において使用する「機械的クロマトグラフィー」という用語は、限定されるものではないが、サイズ排除クロマトグラフィーを指す。本明細書において使用する「物理的クロマトグラフィー」という用語は、限定されるものではないが、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティクロマトグラフィーを指す。
【００４７】
クロマトグラフィー工程の固定相としては、限定されるものではないが、樹脂（すなわち、ポリスチレン、ポリスチレンジビニルベンゼンおよびポリアクリルアミド）、イオン交換樹脂（すなわち、スルホン酸官能基、第四級アンモニウム官能基、カルボン酸官能基およびジエチルアンモニウム官能基）、架橋アガロース、架橋デキストラン、ホスホセルロース、多孔質ガラスならびにシリカ、アルミナおよびジルコニアマトリックスを挙げることができる。さらに、前記固定相は、固相支持体粒子上、またはシリンダーの内壁上に、物理的引力、化学結合によって、およびまたは被覆後のｉｎ  ｓｉｔｕ重合によって、固定化されていてよい。固定化型固定相は、前記粒子およびシリンダーの外側を覆うことができ、かつ／または前記固体粒子内の利用可能な細孔に充填することができる。結合型固定相は、限定されるものではないが、ポリマー結合型、ポリマーグラフト化型、キャップド固定型、アルキル結合型、フェニル結合型、シアノ結合型、ジオール結合型、およびアミノ結合型の固定相からなる群から選択してよく、これらの全ては、クロマトグラフィー分野の当業者に公知の用語である。さらに、前記固定相は生体特異的リガンドで官能化してもよく、生体特異的リガンドとしては、限定されるものではないが、抗体、タンパク質受容体、ステロイドホルモン、ビタミンおよび酵素阻害剤が挙げられる。
【００４８】
本開示のいくつかの実施形態では、前記固定相は、クロマトグラフィーカラム内に収容され、固定されていてよい。少なくとも１つの供給流および反応物流がクロマトグラフィーカラムの入口に供給され、アルブミンリッチ流およびアルブミンリーン流がカラムの出口で出ていくことができ、ここで、前記アルブミンリッチ流およびアルブミンリーン流の分離は溶出時間の違いによって達成することができる。供給流をクロマトグラフィーカラムに通して送るための圧力降下は、少なくとも１つのポンプを使用して、少なくとも１つの供給流および反応物流を加圧することによって達成することができる。
【００４９】
本開示のいくつかの実施形態では、処理は、供給流または反応物流またはその両方がアルブミンリッチな保持液流とアルブミンリーンなＤＫＰ含有濾液流に分離されるサイズ排除処理を含んでよい。本開示のいくつかの実施形態では、前記保持液は、アルブミンを含有する供給流およびＤＫＰを含有する供給流中に存在するタンパク質の、約８０重量％より多く、約８５重量％より多く、約９０重量％より多く、約９５重量％より多く、または約９９重量％より多くを保持し、それらのタンパク質には、分子量が約１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａまたは１００ｋＤａより大きいタンパク質が含まれる。
【００５０】
本開示のいくつかの実施形態では、ＤＫＰの反応は、熱的、化学的、酵素的な処理、およびそれらの組合せの少なくとも１つを含んでよい。
本開示のいくつかの実施形態では、アルブミン含有流の反応は、熱処理、低温殺菌、酵素反応、化学反応、およびそれらの組合せの少なくとも１つを含んでよい。本開示のいくつかの実施形態では、アルブミン含有流の反応は、アルブミン含有流を、約４０℃〜約８０℃の範囲である平均内部温度（ｂｕｌｋ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に加熱することを含んでよい。本開示のいくつかの実施形態では、アルブミン含有流の反応は、アルブミン含有流を、約５０℃〜約７０℃の範囲である平均内部温度に加熱することを含んでよい。本開示のいくつかの実施形態では、アルブミン含有流の反応は、アルブミン含有流を、約５５℃〜約６５℃の範囲である平均内部温度に加熱することを含んでよい。本開示のいくつかの実施形態では、アルブミン含有流の反応は、アルブミン含有流を、約５７．５℃〜約６２．５℃の範囲である平均内部温度に加熱することを含んでよい。本開示のいくつかの実施形態では、アルブミン含有流の反応は、アルブミン含有流を約６０℃の平均内部温度に加熱することを含んでよい。
【００５１】
本開示のいくつかの実施形態では、アルブミン含有流の反応は、アルブミン含有流を、少なくとも１種のジペプチダーゼ、カリクレイン、カテプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびそれらの組合せと酵素反応させることを含んでよい。本開示のいくつかのさらなる実施形態では、アルブミン含有流の反応は、アルブミン含有流を、少なくともジペプチジルペプチダーゼＩＶと酵素反応させることを含んでよい。
【００５２】
本開示のいくつかの実施形態では、前記少なくとも１種のジペプチダーゼ、カリクレイン、カテプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびそれらの組合せは、商業的アルブミン供給者または非商業的アルブミン供給者から受け取った供給流中に存在していてよい。例えば、アルブミン含有供給原料は、その後の反応工程において、または例えば、周囲条件で保管されている間に、時間の経過とともに、さらなるＤＫＰを生産することができる酵素的に活性なジペプチダーゼを含有してよい。本開示のいくつかの実施形態では、供給流は、実施例に記載するように、発色基質、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを使用したアッセイにより測定した場合のジペプチダーゼ活性が、０μＭ  ｐＮＡより高く約２００μＭ  ｐＮＡまでの範囲であるジペプチダーゼを含んでよい。本開示のいくつかのさらなる実施形態では、供給流は、前記ジペプチダーゼ活性が約４０μＭ  ｐＮＡ〜約１４０μＭ  ｐＮＡの範囲であるジペプチダーゼを含んでよい。
【００５３】
本開示のいくつかのさらなる実施形態では、前記少なくとも１種のジペプチダーゼ、カリクレイン、カテプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびそれらの組合せを、供給流、第１のアルブミンリッチ流、第２のアルブミンリッチ流、その後の任意のアルブミンリッチ流、およびそれらの組合せの少なくとも１つに添加してよい。本開示のいくつかの実施形態では、ジペプチダーゼを、供給流、第１のアルブミンリッチ流、第２のアルブミンリッチ流、その後の任意のアルブミンリッチ流、およびそれらの組合せの少なくとも１つに添加してよい。本開示のさらなる実施形態では、ジペプチダーゼを、供給流、第１のアルブミンリッチ流、第２のアルブミンリッチ流、その後の任意のアルブミンリッチ流、およびそれらの組合せの少なくとも１つに添加してよく、ここで、前記ペプチダーゼ活性は約０μＭ  ｐＮＡ〜約２００μＭ  ｐＮＡであるように高めることができる。さらなる実施形態では、前記ペプチダーゼ活性は約４０μＭ  ｐＮＡ〜約１５０μＭ  ｐＮＡであるように高めることができる。
【００５４】
本開示のいくつかのさらなる実施形態では、アルブミンリッチ流の反応は、少なくとも１種のレドックス活性金属、例えば、鉄および銅を用いた、アルブミンリッチ流中に存在するアルブミンの触媒反応を含んでよい。他の潜在的な金属触媒としては、限定されるものではないが、リチウム、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛、ニッケル、鉛、マンガン、スズ、銀、白金、金、およびそれらの組合せが挙げられる。本開示のいくつかの実施形態では、アルブミンリッチ流の反応は、均一触媒、不均一触媒、またはその両方として存在する少なくとも１種のレドックス活性金属を含んでよい。本開示のいくつかのさらなる実施形態では、アルブミンリッチ流の反応は、少なくとも１種のレドックス活性金属が基板上に担持された固体触媒を含む充填床反応器にアルブミンリッチ流を通すことを含んでよい。本開示のいくつかのさらなる実施形態では、アルブミンリッチ流の反応は、そのアルブミンをスラリー反応器中で反応させることを含んでよく、ここで、前記レドックス活性金属は液体混合物中に懸濁され、かつ／または、混合するための手段を用いて混合される。
【００５５】
本開示のいくつかの実施形態では、アルブミンリッチ流を反応させるための反応器は、バッチ式反応器、連続式反応器、およびそれらの組合せを含んでよい。いくつかのさらなる実施形態では、反応器は、撹拌槽型反応器、連続式撹拌槽型反応器、充填床型反応器、栓流型反応器、およびそれらの組合せを含んでよい。
【００５６】
本開示のいくつかの実施形態では、アルブミンリッチ流の反応は、アルブミンリッチ流を、周囲温度より高い内部温度に加熱することを含んでよい。ただし、例えば、いくつかの実施形態では、アルブミンリッチ流の反応は、アルブミンリッチ流を、アルブミンおよびＤＫＰが変性される温度より低くかつ約２０℃より高い、約３０℃より高い、約４０℃より高い、約５０℃より高い、約６０℃より高い、約７０℃より高い、または約８０℃より高い温度に加熱することを含んでよい。本開示のいくつかのさらなる実施形態では、アルブミンリッチ流の反応は、アルブミンリッチ流を加熱することと、アルブミンリッチ流を少なくとも酵素反応させることおよび／または化学反応させることとの両方を含んでよい。
【００５７】
本開示のいくつかの実施形態では、アルブミンおよびＤＫＰに加えて、供給流は複数の追加の成分を含んでよい。そのような成分は、アルブミン溶液の生産起源である血液由来の天然に存在する種であってよく、またはそれらは、合成的に生産されたアルブミンの合成方法から生じる種であってよく、またはそれらは、天然産物の精製、例えば、限定されるものではないが、コーン法およびその変法を用いた血漿の精製中に導入もしくは生成される種であってよい。アルブミン含有供給流に導入される種は、合成アルブミンの合成前もしくは合成後、または天然に存在するアルブミンの精製前もしくは精製後のいずれかに、アルブミン含有供給流に意図的に添加される添加剤を含んでよい。そのような添加剤としては、限定されるものではないが、ナトリウム、カリウム、Ｎ−アセチルトリプトファン、カプリル酸ナトリウムおよび／またはカプリル酸が挙げられる。天然アルブミン産物の精製中に生成される種としては、限定されるものではないが、天然に存在する血漿タンパク質の熱的、物理的、酵素的または化学的分解によって生じるアミノ酸、ＤＫＰおよび任意の他の化合物または種が挙げられる。
【００５８】
本開示のいくつかの実施形態では、前記第１のアルブミンリッチ流は、前記供給流中のアルブミンの、重量で、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも９９．９％、少なくとも約９９．９１％、少なくとも約９９．９２％、少なくとも約９９．９３％、少なくとも約９９．９４％、少なくとも約９９．９５％、少なくとも約９９．９６％、少なくとも約９９．９７％、少なくとも約９９．９８％、少なくとも約９９．９９％を含み得る。
【００５９】
例として、アルブミン含有供給流の処理によって、前記供給流中のアルブミンの少なくとも約９０重量％を含むアルブミン含有流がもたらされる場合、アルブミン含有供給流がアルブミン含有供給材料１００ｍｌを、アルブミン０．０３ｇ／ｍｌのアルブミン濃度で含むならば、前記処理工程（すなわち、濾過、クロマトグラフィーなど）から生じる生成物流は少なくとも２．７ｇのアルブミンを含む。同様に、例として、アルブミン含有供給流がアルブミン含有供給材料１００ｍｌを、アルブミン０．５ｇ／ｍｌのアルブミン濃度で含むならば、得られるアルブミン含有流は少なくとも４５ｇのアルブミンを含む。上記の例示的な容量および／またはパーセンテージのスケールアップまたはダウンによって、簡単な計算を用いて算出されるように、アルブミンリッチ流およびアルブミンリーン流中に存在するアルブミンの量は対応して変化することは当業者には明らかであろう。
【００６０】
本開示のいくつかの実施形態では、前記第２のアルブミンリッチ流は、前記反応物流中のアルブミンの、重量で、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９１％、少なくとも約９９．９２％、少なくとも約９９．９３％、少なくとも約９９．９４％、少なくとも約９９．９５％、少なくとも約９９．９６％、少なくとも約９９．９７％、少なくとも約９９．９８％、少なくとも約９９．９９％を含み得る。
【００６１】
本開示のいくつかの実施形態では、最初の２つの処理工程以外の処理工程によって生成された、その後のアルブミンリッチ流は、最初の２つの処理工程以外の処理工程に供給するアルブミンリッチ流中に存在するアルブミンの、重量で、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９１％、少なくとも約９９．９２％、少なくとも約９９．９３％、少なくとも約９９．９４％、少なくとも約９９．９５％、少なくとも約９９．９６％、少なくとも約９９．９７％、少なくとも約９９．９８％、少なくとも約９９．９９％を含み得る。
【００６２】
本開示のいくつかの実施形態では、前記第１のアルブミンリーン流中に存在するＤＫＰの第１の部分は、前記供給流中に存在するＤＫＰの、少なくとも約５重量％、少なくとも約１０重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、または少なくとも約９９重量％を含み得る。
【００６３】
本開示のいくつかの実施形態では、前記第２のアルブミンリーン流中に存在するＤＫＰの第１の部分は、前記反応物流中に存在するＤＫＰの、少なくとも約５重量％、少なくとも約１０重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、または少なくとも約９９重量％を含み得る。
【００６４】
本開示のいくつかの実施形態では、最初の２つの処理工程以外の処理工程よって生じる、その後のアルブミンリーン流中に存在するＤＫＰのその後の部分は、最初の２つの処理工程以外の処理工程に供給するアルブミンリッチ流中に存在するＤＫＰの、少なくとも約５重量％、少なくとも約１０重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、または少なくとも約９９重量％を含み得る。
【００６５】
本開示のいくつかの実施形態では、前記第１のアルブミンリーン流は、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約６０μＭ、少なくとも約７０μＭ、少なくとも約８０μＭ、少なくとも約９０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１１０μＭ、少なくとも約１２０μＭ、少なくとも約１３０μＭ、少なくとも約１４０μＭ、少なくとも約１５０μＭ、少なくとも約１６０μＭ、少なくとも約１７０μＭ、少なくとも約１８０μＭ、少なくとも約１９０μＭ、少なくとも約２００μＭ、少なくとも約２５０μＭ、少なくとも約３００μＭ、少なくとも約３５０μＭ、少なくとも約４００μＭ、少なくとも約４５０μＭ、または少なくとも約５００μＭのＤＫＰ濃度を有し得る。さらなる実施形態では、前記第２のアルブミンリーン流は、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約６０μＭ、少なくとも約７０μＭ、少なくとも約８０μＭ、少なくとも約９０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１１０μＭ、少なくとも約１２０μＭ、少なくとも約１３０μＭ、少なくとも約１４０μＭ、少なくとも約１５０μＭ、少なくとも約１６０μＭ、少なくとも約１７０μＭ、少なくとも約１８０μＭ、少なくとも約１９０μＭ、少なくとも約２００μＭ、少なくとも約２５０μＭ、少なくとも約３００μＭ、少なくとも約３５０μＭ、少なくとも約４００μＭ、少なくとも約４５０μＭ、または少なくとも約５００μＭのＤＫＰ濃度を有し得る。
【００６６】
本開示のさらなる態様は、上記のように、治療用組成物を生産するために、アルブミンおよびＤＫＰを含む供給流を処理するための方法であって、分析工程をさらに含む方法であり、前記分析工程は、少なくとも１つのメトリック（ｍｅｔｒｉｃ）を得るために、アルブミンリッチ流を分析すること、前記少なくとも１つのメトリックを少なくとも１つの基準値と比較することを含み、ここで、前記少なくとも１つのメトリックが前記基準値を上回るまたは下回る場合に、前記反応工程および処理工程は、その後のアルブミンリッチ流の前記少なくとも１つのメトリックが前記少なくとも１つの基準値以下または以上になるまで繰り返される。
【００６７】
本開示のいくつかの実施形態では、前記分析工程は高圧液体クロマトグラフィーおよび質量分析、または対象となるメトリックを測定するための任意の他の好適な分析方法を含んでよい。本開示のいくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのメトリックは、少なくとも１つの処理工程後に残っている全長アルブミンの質量であり、前記基準値は、ＤＡ−ＤＫＰを生産するために処理され得るアルブミンの理論上の最大質量値（ａ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｍａｓｓ）である。他の実施形態では、前記少なくとも１つのメトリックは、少なくとも１つの処理工程において生成されたＤＫＰの質量であり、前記基準値は、前記供給流中のアルブミンから生成され得るＤＫＰの理論上の最大質量値である。
【００６８】
本開示のいくつかの実施形態では、治療用組成物を生産するために、アルブミンおよびＤＫＰを含む供給流を処理するための方法は、アルブミンリッチ流のｐＨの調整をさらに含んでよい。本開示のいくつかの実施形態では、供給流はｐＨ調整されていてよい。いくつかのさらなる実施形態では、アルブミンリッチ流は、反応工程前および／または反応工程中にｐＨ調整される。いくつかのさらなる実施形態では、アルブミンリッチ流は、処理工程前および／または処理工程中にｐＨ調整される。アルブミンリッチ流のｐＨは、酵素反応、触媒反応、熱分解、およびそれらの組合せの少なくとも１つを改善するために、調整することができる。本開示のいくつかの実施形態では、アルブミンリッチ流のｐＨの調整は、ｐＨを、約１．５〜約１０．０の範囲に調整することを含んでよい。本開示のいくつかのさらなる実施形態では、アルブミンリッチ流のｐＨの調整は、ｐＨを、約４．０〜約８．０の範囲に調整することを含んでよい。本開示のさらなる実施形態では、アルブミンリッチ流のｐＨは、おおよそ生理的ｐＨ、すなわち、約ｐＨ７．３〜７．４に調整される。
【００６９】
本開示のいくつかの実施形態では、治療用組成物を生産するために、アルブミンおよびＤＫＰを含む供給流を処理するための方法は、アルブミンリッチ流の希釈をさらに含んでよい。本開示のいくつかのさらなる実施形態では、前記供給流および前記反応物流の少なくとも一方は、希釈されていてよい。本開示のさらなる実施形態では、希釈は、生理食塩水、乳酸加リンゲル液、酢酸リンゲル液、ヒドロキシエチルデンプン溶液およびデキストロース溶液からなる群から選択される希釈液を用いて、達成することができる。
【００７０】
希釈工程は、アルブミンリーン流および／またはアルブミンリッチ流のいずれかに、追加の成分を添加するための手段を提供することができ、それによって、これらは様々な追加の治療的価値を有する。例えば、乳酸加リンゲル液は、免疫不全の患者における代謝性アシドーシスの制御を支援するために、ＤＫＰ豊富な、アルブミンリーン流に希釈液として添加することができる。他の溶液は、特定の患者または特定の層（ｄｅｍｏｇｒａｐｈｉｃ）の特定の治療要件を満たすように、希釈液として個別にまたは混合物として選択され、アルブミンリッチ流およびアルブミンリーン流の一方または両方に添加することができる。
【００７１】
加えて、希釈工程は、出発アルブミン供給材料中に存在するＤＫＰのより高い回収率を可能とするために、置換容量を与える希釈液を提供することができる。本開示のいくつかの実施形態では、前記処理工程はサイズ排除分離を含んでよく、この場合、供給流中に存在するアルブミンの本質的に全てが保持液中に保持される。逆に言えば、これらの実施形態では、前記供給流中に存在するアルブミンには、濾液とともにサイズ排除分離単位を通過するものは本質的にない。このシナリオでは、アルブミンは、スラリー中の微粒子とみなすことができ、残りのＤＫＰ含有水相はスラリー中にアルブミン微粒子が懸濁された液体とみなすことができる。従って、濾液は、保持液中に残っているものと本質的に同じＤＫＰ含有水相である。さらに、このシナリオでは、一段階、あるいは多段階のサイズ排除単位操作では、アルブミンからＤＫＰ含有水相の全てを完全には除去することができない。支援がないと、前記アルブミンリッチ流はＤＫＰ含有水相の一部を保有する。希釈液は、サイズ排除単位操作を通して、保持液、またはアルブミンリーン流中へ、アルブミンからある割合のこのＤＫＰ含有水相をフラッシュし、置換することができる液体容量を与えることができる。
【００７２】
本開示のさらなる態様は、１０重量％未満のアルブミンを含有する、ＤＫＰを含む組成物である。本開示のいくつかの実施形態では、前記ＤＫＰ含有組成物中のアルブミンの濃度は、約１重量％未満または約０．１重量％未満であり得る。本開示のさらなる実施形態では、前記ＤＫＰ含有組成物中のアルブミンの濃度は、約０重量％であり、または検出不能限界にあり得る。
【００７３】
本開示のいくつかの実施形態では、ＤＫＰを含む前記組成物は、治療的有用性、例えば、限定されるものではないが、炎症状態の治療における有効性を提供し得る。
本開示のいくつかの実施形態では、前記ＤＫＰは、アスパラギン酸−アラニンＤＫＰ、メチオニン−アルギニンＤＫＰ、グルタミン酸−アラニンＤＫＰ、チロシン−グルタミン酸ＤＫＰ、グリシン−ロイシンＤＫＰ、プロリン−フェニルアラニンＤＫＰ、アラニン−プロリンＤＫＰ、およびそれらの組合せの少なくとも１つを含み得る。さらなる実施形態では、前記ＤＫＰは、約２５μＭ  ＤＫＰ〜約２００μＭ  ＤＫＰの範囲である濃度で存在し得る。
【００７４】
本開示のいくつかの実施形態では、ＤＫＰを含む前記組成物は、生理食塩水、乳酸加リンゲル液、酢酸リンゲル液、ヒドロキシエチルデンプン溶液、デキストロース溶液、およびそれらの組合せの少なくとも１つをさらに含んでよい。本開示のいくつかの実施形態では、ＤＫＰを含む前記組成物は、アセチルトリプトファンナトリウム、Ｎ−アセチルトリプトファン、カプリル酸およびその塩、例えば、カプリル酸ナトリウム、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの追加の成分をさらに含んでよい。そのような追加の成分は、市販のＨＳＡ中で典型的に見出される量で存在し得る。例えば、そのような成分は、約０．１ｍＭ〜約３０ｍＭの量でまたは約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、または約２０ｍＭから選択される範囲の下限を有する範囲で存在し得る。そのような範囲は、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、または約３５ｍＭから選択される範囲の上限を有し得る。
【００７５】
本開示の方法は、これまでに知られているＤＫＰの合成方法よりも効率的にＤＫＰの量を増加させることが有利である。特に、本開示の方法のこれらの実施形態は、哺乳動物血漿からＤＫＰを合成する。その血漿は、哺乳動物、例えば、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマまたはヒト由来であってよい。その動物は、好ましくは、ヒトであり、その血漿は、好ましくは、ヒト血漿である。
【００７６】
血漿は、アルブミン、免疫グロブリン、およびエリスロポエチン、ならびに他のタンパク質およびペプチドを含む、ＤＫＰの合成のための成分を含有する。本開示の方法は、血漿からＤＫＰを合成することを含み、この場合、本開示の方法は、ＤＫＰを生産する先行技術の方法と比べたときに、合成されるＤＫＰの量を増加し得ることが有利である。
【００７７】
ＨＳＡは、血漿中に存在する主要なタンパク質成分であり、５８５個のアミノ酸残基を含む１本鎖ポリペプチドからなり、分子量は約６６，０００ダルトンに相当する（Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ，Ｐ．Ｐ．他、（１９８６）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈｉｎ  １１−２２  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ４．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１、ｐｐ．６７４７−６７５７を参照）。ＨＳＡは、典型的には、ヒト血漿を、コーン分画法、低温エタノール分画法、または同様の方法に供して、ＨＳＡを含有する画分（ＨＳＡは画分Ｖ中に分画される）を得、その後、その画分を様々な精製技術の使用を介して精製することによって、調製されている。ＨＳＡは、その後、塩析法、限外濾過法、および等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー技術、ゲル濾過クロマトグラフィー技術ならびに／またはアフィニティクロマトグラフィー技術の１つまたは複数を用いて精製された。
【００７８】
血漿を処理して、ＨＳＡまたは他のタンパク質および／もしくはペプチドの溶液を生成する場合、その処理によって、ＤＫＰを生成するために利用可能な、アルブミン、免疫グロブリン、およびエリスロポエチン、ならびに他のタンパク質およびペプチドの量を減少させる。言い換えれば、血漿は、ＨＳＡまたは他のペプチドまたはタンパク質の精製溶液と比べて、アルブミン、免疫グロブリン、およびエリスロポエチン、ならびに他のタンパク質およびペプチドの量が多かった。従って、本明細書に記載する本開示の方法の一部は、ＤＫＰを生成するために、血漿を使用する。
【００７９】
従って、本開示において使用するためのＤＫＰは、血漿を加熱することによって調製することができる。「血漿」とは、未処理血漿、または中性ｐＨのリン酸バッファー中の血漿溶液を指し得る。好ましくは、前記血漿溶液は、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸のプロトン化を達成するために、濃縮された溶液（例えば、約１００〜５００ｍＭ）である。前記血漿は、ＤＫＰを形成させるために、６０℃で、少なくとも約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日の間加熱することができる。前記タンパク質の変性は、好ましくは、避けるべきである。これは、それぞれについて、時間を短くすることによって、かつ／または、カプリル酸またはＮ−アセチルトリプトファンを約０．０２Ｍで添加することによって、達成することができる。
【００８０】
本開示において使用するためのＤＫＰはまた、血漿中のタンパク質もしくはペプチドから前記２つのＮ末端アミノ酸を切断することができる酵素（例えば、ジペプチジルペプチダーゼ、特に、ＤＰＰ−ＩＶ）、または前記タンパク質もしくはペプチドから前記２つのＣ末端アミノ酸を切断することができる酵素（例えば、カルボキシペプチダーゼ）と血漿を接触させることによっても調製することができる。その反応は、ｐＨ６〜８において、好ましくは、バッファー、例えば、リン酸バッファー中で、反応を加速するのに十分高いが前記タンパク質が変性されるほど高くはない温度で行われるべきである。
【００８１】
ある実施形態では、前記所望のＤＫＰはＤＡ−ＤＫＰであり、前記酵素はＤＰＰ−ＩＶであり、前記温度は約４０℃〜約８０℃、好ましくは、約６０℃であり、前記反応時間は約５時間〜約６日である。ある実施形態では、前記ＤＰＰ−ＩＶは、内因性であり、血漿中に既に存在し、前記処理またはその組合せの間に血漿に添加される。前記処理温度は、少なくとも約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃、および約８０℃であり得る。前記反応時間は、少なくとも約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間以上、約１日、約１．１日、約１．２日、約１．３日、約１．４日、約１．５日、約１．６日、約１．７日、約１．８日、約１．９日、約２日、約２．１日、約２．２日、約２．３日、約２．４日、約２．５日、約２．６日、約２．７日、約２．８日、約２．９日、約３日、約３．１日、約３．２日、約３．３日、約３．４日、約３．５日、約３．６日、約３．７日、約３．８日、約３．９日、約４日、約４．１日、約４．２日、約４．３日、約４．４日、約４．５日、約４．６日、約４．７日、約４．８日、約４．９日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日または約１０日であり得る。
【００８２】
本開示の方法によって作製されるＤＫＰは、アルブミン、免疫グロブリンおよびエリスロポエチンを含む市販の医薬組成物を含めた、それらを含有する溶液から、周知の方法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎでの濾過）、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、所望のＤＫＰ（単数または複数）に向けられた抗体（単数または複数）またはその末端切断型タンパク質もしくはペプチドに向けられた抗体（単数または複数）が結合したビーズのカラムを使用する）、陰イオン交換または陽イオン交換によって、精製することができる。精製されたＤＫＰは、使用することができ、上記の医薬組成物に組み込むことができる。
【００８３】
前記ＤＫＰには、個々のキラル中心、軸または表面の構成を変更することによって得ることができる、考えられる全ての立体異性体が含まれる。言い換えれば、前記ＤＫＰには、考えられる全てのジアステレオマーだけでなく、全ての光学異性体（鏡像異性体）も含まれる。
【００８４】
本開示のＤＫＰの生理学上許容される塩もまた、本開示の実施において使用し得る。生理学上許容される塩としては、従来の無毒の塩、例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）、有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、安息香酸、サリチル酸、シュウ酸、アスコルビン酸など）または塩基（例えば、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、Ｄ−グルコサミン、またはエチレンジアミン由来の、薬学上許容される金属カチオンまたは有機カチオンの、水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩）から誘導される塩が挙げられる。これらの塩は、従来の方法によって、例えば、前記化合物の遊離塩基形態を酸で中和することによって、調製される。
【００８５】
上述したように、本開示のＤＫＰ、またはその生理学上許容される塩は、Ｔ細胞媒介性疾患を治療するために、またはＴ細胞の活性化を阻害するために、使用することができる。このように使用するために、ＤＫＰ、またはその生理学上許容される塩は、そのような治療を必要とする動物に投与される。好ましくは、前記動物は、哺乳動物、例えば、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマまたはヒトである。本開示の化合物についての効果的な投与形態、投与様式および投与量は、経験的に決定することができ、このような決定は当技術分野の技術の範囲内である。投与量は、使用される特定の化合物、治療される疾患または病態、疾患または病態の重篤度、投与経路（単数または複数）、化合物の排泄速度、治療の継続期間、動物に投与されている任意の他の薬物の固有性、動物の年齢、大きさおよび種、ならびに医学分野および獣医学分野で公知の類似因子に応じて変動することが当業者には理解されるであろう。一般的には、本開示の化合物の好適な１日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量である化合物量である。しかしながら、１日用量は、担当の医師または獣医師によって、健全な医学的判断の範囲内で決定される。有効１日用量は、必要に応じて、１日を通して適当な間隔で分けて投与される、２回、３回、４回、５回、６回以上の副用量として投与してよい。化合物の投与は、許容応答が得られるまで継続する必要がある。
【００８６】
本開示の化合物（すなわち、ＤＫＰおよびその生理学上許容される塩）は、療法のために動物患者に、任意の好適な投与経路によって投与し得、その投与経路としては、経口、経鼻、経直腸、経膣、非経口（例えば、静脈内、脊髄内、腹膜内、皮下または筋肉内）、大槽内、経皮、頭蓋内、脳内、および局所（頬側および舌下を含む）が挙げられる。好ましい投与経路は経静脈内である。
【００８７】
本開示の化合物は単独での投与が可能であるが、その化合物を医薬処方物（組成物）として投与することが好ましい。本開示の医薬組成物は、有効成分としての本開示の化合物（単数または複数）を、１種または複数種の薬学上許容される担体と、場合によっては１種または複数種の他の化合物、薬物または他の材料と混合した状態で含む。各担体は、この処方物の他の成分と適合性であり、動物に対して有害ではないという意味において「許容される」ものでなければならない。薬学上許容される担体は当技術分野で周知である。選択される投与経路に関係なく、本開示の化合物は、当業者に公知の従来の方法によって、薬学上許容される投与形態に処方される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ参照。
【００８８】
ここに全般的に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。これらの実施例は、単に、本発明の実施形態の特定の態様を例示するために含められているにすぎない。実施例は本発明を限定するものではなく、当業者ならば、上述の教示および以下の実施例から、他の技術および方法も、特許請求の範囲を満たすことができ、かつ特許請求する発明の範囲を逸脱することなく使用することができることを理解するであろう。
【実施例１】
【００８９】
ＨＳＡ溶液を用いた治療に関わる治療効果、副作用、および機構を理解するために、市販ＨＳＡ溶液に対してプロテオーム解析を行った。この研究では、ＨＳＡとは異なる１４１のタンパク質に対応する合計１２１９のペプチドが同定された。さらに重要なことには、市販ＨＳＡ溶液においてペプチダーゼＤＰＰ−ＩＶが明確に同定された。従って、アラニン残基後のペプチドを切断するその酵素の能力から、ＤＰＰ−ＩＶは市販ＨＳＡ溶液中でのＤＡ−ＤＫＰの形成に関与していることが考えられる。この仮説を検証するために、市販ＨＳＡ溶液をＤＰＰ−ＩＶ活性について、発色基質および既知ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を用いてアッセイした。また、コーン分画法によって生産されたものではない組換えＨＳＡ源において、ＤＰＰ−ＩＶ活性の存在を検証した。最後に、市販ＨＳＡ溶液中でのＤＰＰ−ＩＶ活性ならびにＤＡ−ＤＫＰ生成に対する温度の効果を評価した。
【００９０】
材料および方法
材料。この研究を通して、３種の市販の２５０ｍＬ  ５％ＨＳＡ（ｗ／ｖ）製品（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＬＬＣ（アメリカ合衆国、イリノイ州カンカキー）；Ｇｒｉｆｏｌｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ロサンゼルス）；Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（アメリカ合衆国、ニュージャージー州ホーボーケン））を使用した。Ｎ末端ＨＳＡペプチド（ＤＡＨＫ）は、Ｄｉｏｓｙｎｔｈ  Ｉｎｃ．（オランダ国）によって製造されたものであった。組換えＨＳＡ（ｅｃｏＨＳＡ（商標））は、Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ  Ｉｎｃ．（アメリカ合衆国、カリフォルニア州サンディエゴ）から入手し、アジア栽培イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）の種子において生産されたものであった。合成ＤＡ−ＤＫＰは、Ｓｙｎｇｅｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．（インド国）によって生産されたものであった。ＤＰＰ−ＩＶ基質および阻害剤を含む他の試薬は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ（アメリカ合衆国、ミズーリ州セントルイス）から入手した。
【００９１】
ＤＰＰ−ＩＶアッセイ。Ｅ．Ｎｅｍｏｔｏ、Ｓ．Ｓｕｇａｗａｒａ、Ｈ．Ｔａｋａｄａ他、“Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ＣＤ２６／ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｉｎｇｉｖａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｕｐｏｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７”（１９９９）６２２５−３３、に記載のとおり、ＤＰＰ−ＩＶ活性を、発色基質、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを用いてアッセイした。全ての反応を、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１２Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭグルコース、および１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で構成されたＤＰＰ−ＩＶアッセイバッファー（ｐＨ７．６）中で行った。５％市販ＨＳＡ、組換えＨＳＡ、またはバッファー対照液（０．９％ＮａＣｌ）を、１ｍＭ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（ＤＰＰ−ＩＶ基質）のアッセイバッファー溶液またはアッセイバッファー単独（−ＣＯＮ）と組み合わせた。インキュベーションは、３７℃または６０℃で２〜２４時間行った。ＤＰＰ−ＩＶ阻害研究のために、ＤＰＰ−ＩＶ基質添加前に、１ｍＭジプロチンＡのアッセイバッファー溶液を、ＨＳＡ溶液とともに３７℃で１５分間プレインキュベートした。全てのインキュベーションを４０５ｎｍで測定した（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２分光光度計，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＬＣ，アメリカ合衆国、カリフォルニア州サニーベール）。４０５ｎｍでの各測定値は、試験した各ＨＳＡ溶液について、ＤＰＰ−ＩＶ基質を含むインキュベーションでのＡ４０５を−ＣＯＮインキュベーションでの対応するＡ４０５から減算することによって補正した。
【００９２】
＜５ｋＤａのＨＳＡ画分の単離。ＤＡ−ＤＫＰ形成の分析のため、アリコートをマイクロ遠心フィルター（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２、ＭＷＣＯ  ５，０００、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ドイツ連邦共和国ゲッティンゲン）に入れた。フィルターを室温で３，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。＜５ｋＤａ画分を集め、ＬＣＭＳ分析のために別の保存チューブに移した。
【００９３】
ＬＣＭＳアッセイ  ＜５ｋＤａ画分およびＤＡ−ＤＫＰ合成標準（２０〜２０００ｎｇ／ｍＬ）各々を０．０１ｍＭ  Ｌ−トリプトファン−ｄ５（インドール−ｄ５）でスパイクし、内部標準として使用した。５０μｌを、質量分析計（ＬＣＴ−ＴＯＦ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，ＵＫ）と連結している高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｗａｔｅｒｓ  ２７９５セパレーションモジュール、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ミルフォード）に接続された強陰イオン交換カラム（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ、Ｓ５  ＳＡＸ  ２５０ｍｍ×４．０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ，アメリカ合衆国マサチューセッツ州ミルフォード）に注入した。ｄＨ２Ｏ（溶媒Ａ）、メタノール（溶媒Ｂ）、および２００ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ５．４、溶媒Ｃ）で構成された三元移動相を、下の勾配（表１）を用いて流速０．５ｍＬ／分で使用した。
【００９４】
【表１】
0006387019.tif 000003
【００９５】
ＨＰＬＣからの成分を１：２０（ｖ／ｖ）に分け、質量分析計に注入し、スキャン範囲８０〜１０００ｍ／ｚ、コーン電圧３０ｅＶ、ソース温度１００℃、およびガス温度３００℃でエレクトロスプレーイオン化法ネガティブモード（−ＥＳＩ）を使用した。ＤＡ−ＤＫＰは、単一プロトン（−Ｈ＋）を欠いたＤＡ−ＤＫＰに相当する［Ｍ−］＝１８５をモニタリングすることによって測定した。ＤＡ−ＤＫＰ、Ａｓｐ−Ａｌａの直鎖も、この方法を用いて［Ｍ−］＝２０３をモニタリングすることによって分析することができる。
【００９６】
統計的手法。生成したｐＮＡのμＭ量を、ＨＥＰＥＳバッファー中でのｐＮＡモル吸光係数に基づいて計算した（Ｒ．Ｌｏｔｔｅｎｂｅｒｇ、Ｃ．Ｍ．Ｊａｃｋｓｏｎ，“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ．”、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７４２（１９８３）５５８−６４を参照）。統計分析は、ソフトウェアパッケージ、エクセル（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＭａｔｌａｂ（登録商標）Ｒ１３（Ｍａｔｈ  Ｗｏｒｋｓ）を使用して行った。両側スチューデントｔ検定を用いて有意水準ｐ＜０．０５で群を比較した。全てのデータを平均±ＳＤとして報告している。
【００９７】
結果
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）活性を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の市販調製品において評価した。選択した活性測定法は、文献において十分に立証されており、既知ＤＰＰ−ＩＶ基質、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡの切断を含む。結果として生じた色素原、ｐＮＡの遊離を、分光光度法により４０５ｎｍで測定した。市販の５％ＨＳＡ溶液３種は、特に製造業者を選択せずに選択した。唯一の要件は、それらの溶液が、期限切れになっておらず、異なる製造業者によってコーン分画法を用いて生産されたものであることであった。酵素アッセイのインキュベーション温度については、３７℃および６０℃を選択し、その理由は、前者は生理学的状態を表す温度であり、後者は市販ＨＳＡ溶液の低温殺菌温度であるためである。
【００９８】
３７℃でのＤＰＰ−ＩＶ活性を、３種の５％市販ＨＳＡ溶液全てにおいて測定した。３種の市販ＨＳＡ溶液は全て有意なＤＰＰ−ＩＶ活性を有し、ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ社のＨＳＡはＯｃｔａｐｈａｒｍａ社およびＧｒｉｆｏｌｓ社のＨＳＡよりも活性がわずかに低かった（図１）。ＤＰＰ−ＩＶ活性の量はＨＳＡ源の使用期限と相関しなかった。ＤＰＰ−ＩＶは、既知ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（ジプロチンＡ）の存在下で完全に抑制された。この結果、全インキュベーション期間中に、−ＣＯＮ（データは示していない）と比べて追加の色素原の生成は起こらなかった。市販ＨＳＡ溶液のうち１種（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）において、６０℃でのＤＰＰ−ＩＶ活性をアッセイした。ＤＰＰ−ＩＶ活性は有意なレベルで存在した（図２）。しかしながら、６０℃でのＤＰＰ−ＩＶ活性は、３７℃での最初のＤＰＰ−ＩＶ活性の約７０〜８０％であった。どちらの温度においても、ＨＳＡ溶液の濃度増加に伴って、ＤＰＰ−ＩＶ活性における用量反応が観察された。
【００９９】
非コーン分画法を用いて単離されたＨＳＡにおけるＤＰＰ−ＩＶ活性を比較するために、イネにおいて生産された組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）を分析した。コーン分画によって生産された市販ＨＳＡ溶液の１種（ｃＨＳＡ）もＤＰＰ−ＩＶ活性アッセイに含めた。両方のＨＳＡタイプについて、濃度は純溶液（５％ｗ／ｖ）〜希釈溶液（１％および２．５％）の範囲であった。３種の濃度全てにおいて、ｃＨＳＡ溶液におけるＤＰＰ−ＩＶ活性の量はｒＨＳＡ溶液よりも有意に高かった（図３）。また、ｒＨＳＡ溶液におけるＤＰＰ−ＩＶ活性は、アッセイバッファー単独のインキュベーションから統計的に有意ではなかった。従って、ｒＨＳＡ溶液には有意なＤＰＰ−ＩＶ活性は存在しなかった。
【０１００】
本ＤＫＰ、ＤＡ−ＤＫＰの形成を、既知ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（ジプロチンＡ）の存在下または不在下で、６０℃で加熱した市販ＨＳＡ溶液において測定した。ＤＡ−ＤＫＰを含有するＨＳＡの低分子量画分を、５ｋＤａ  ＭＷＣＯのスピンカラムを用いて単離した。＜５ｋＤａ画分を、エレクトロスプレーイオン化法ネガティブモード（−ＥＳＩ）を用いたＬＣＭＳによりＤＡ−ＤＫＰ含有量についてアッセイした。最初の２４時間の間に、阻害剤を含まないインキュベーションにおけるＤＡ−ＤＫＰ含有量はＤＡ−ＤＫＰのベースラインレベルから３０％増加した（図４）。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の存在下では、６０℃、２４時間で観察されたのは、ＤＡ−ＤＫＰ生成のたった１０％の増加であった。
【０１０１】
市販のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の投与は、多発外傷患者などの患者において潜在的に必要である。その不均一な性質から、プロテアーゼなど、他の成分が市販のＨＳＡの治療効果に寄与することができる。そのような１つのプロテアーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、アルブミンのＮ末端から、既知免疫調節分子、アスパラギン酸−アラニンジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ）を放出させることができる。例えば、コーン分画によって、調製された市販ＨＳＡ溶液を、特異的なＤＰＰ−ＩＶ基質および阻害剤を用いてＤＰＰ−ＩＶ活性についてアッセイした。ＤＰＰ−ＩＶ活性は３７℃および６０℃でアッセイしたが、その理由は、市販ＨＳＡ溶液は６０℃で１０〜１１時間低温殺菌されるためである。市販ＨＳＡ溶液におけるＤＰＰ−ＩＶ活性を、組換えアルブミンなどの他のアルブミン源と比較した。市販ＨＳＡ溶液において有意なレベルのＤＰＰ−ＩＶ活性が存在した。この活性は、特異的なＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を用いて失われ、ＤＰＰ−ＩＶ活性が市販のＨＳＡにおいて存在することが示唆される。この活性は６０℃でも存在し、３７℃でインキュベートしたものから７０〜８０％の活性が残存した。組換え型供給源にはＤＰＰ−ＩＶ活性は存在せず、ＤＰＰ−ＩＶ活性は、コーン分画法を用いて生産されたアルブミン溶液にしか存在しないことが示唆される。最後に、ＨＳＡ溶液を６０℃で加熱した場合に、ＤＡ−ＤＫＰ形成の増加が観察された。この形成は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の存在下で有意に減少した。ＨＳＡにおけるＤＰＰ−ＩＶ活性は、危篤状態の患者に対して、ＤＡ−ＤＫＰを含む、多くの副生成物の生成をもたらす可能性がある。
【実施例２】
【０１０２】
まず、図５を参照すると、本開示の１つの実施形態、治療用組成物を生産するために、アルブミンおよび場合によってはＤＫＰを含む供給流１２０を処理するための方法を、ブロック図の形式で示している。供給流１２０は、例えば、コーン法によって生産された約２５重量％のヒト血清アルブミンを含み、およびアルブミンフリーで、アスパラギン酸−アラニンジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ）を約５０μＭ  ＤＡ−ＤＫＰ〜約１００μＭ  ＤＡ−ＤＫＰの範囲である濃度で含有する、生理食塩溶液を含み得る。また、この供給流は、様々な濃度の、アセチルトリプトファンナトリウム、Ｎ−アセチルトリプトファン、およびカプリル酸ナトリウムを含み得る。この供給流は、例えば、サイズ排除分離を提供するタンジェンシャルフローフィルトレーションを含む第１の処理工程１００に供給され、ここで、約６６〜約６９ｋＤａの分子量より小さいあらゆる分子がフィルターを通過し、第１のアルブミンリーン流１４０中へ入る（濾液）。この実施例では、第１のアルブミンリーン流は、アルブミンを本質的に含まない；約０重量％アルブミン。言い換えれば、供給流１２０中の約１００％のアルブミンが第１のアルブミンリッチ流１３０中に保持される。第１のアルブミンリーン流１４０は、アルブミンフリーで、ＤＡ−ＤＫＰ濃度が、約５０μＭ  ＤＡ−ＤＫＰ〜約１００μＭ  ＤＡ−ＤＫＰの範囲である生理食塩溶液を含む。保持液は、第１のアルブミンリッチ流１３０中に、分子量が約６６〜約６９ｋＤａより大きいあらゆる分子と、タンジェンシャルフローフィルターを通って出ていかないＤＫＰ含有生理食塩溶液とを保持する。
【０１０３】
この実施例では、ＤＡ−ＤＫＰの理論上の最大量が供給流１２０中に、アルブミンの、Ｎ末端および／もしくはＣ末端、もしくは連続する端部の熱的、化学的、および／もしくは酵素的分解の産物として存在する遊離分子としてまたは未反応のアルブミンとして、存在する。
【０１０４】
図５を参照すると、第１のアルブミンリッチ流１３０は次に反応工程１１０に供給される。反応工程は温度およびｐＨ制御の反応器、例えば、発酵容器に類似した撹拌槽型反応器または容器を含み得る。この実施例では、酵素１５０は、約５０℃で維持され、希硫酸の添加によってｐＨ約５．０で維持される加熱反応器（示していない）中に存在し、加熱反応器中で生成されおよび／または加熱反応器中へ計量される。この特定の実施例では、添加される酵素１５０はジペプチジルペプチダーゼＩＶを含む。約４０μＭ  ｐＮＡ〜約１５０μＭ  ｐＮＡのペプチダーゼ活性を提供するのに、十分なジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）が反応工程１１０に添加される。この実施例の反応工程１１０はバッチ反応器であり、ここで、反応物、アルブミンおよびＤＰＰ−ＩＶは、反応器内で設定点温度およびｐＨで約１時間〜約２４時間維持される。得られた反応物流、第２のアルブミンリッチ流１３０は、続いて、第２の処理工程１００において処理される。
【０１０５】
この特定の実施例では、この反応工程は、アルブミンの、Ｎ末端および／もしくはＣ末端、もしくは連続する端部の酵素分解によって、かなりの量の追加のＤＡ−ＤＫＰを生成する。これにより、アルブミンフリーで、第２のアルブミンリッチ流１３０中のＤＡ−ＤＫＰ濃度の増加をもたらすことができる。従って、供給流１２０のＤＡ−ＤＫＰ濃度は、アルブミンフリーで、約５０μＭ  ＤＫＰ〜約１００μＭ  ＤＡ−ＤＫＰの範囲であり得たが、第２のアルブミンリッチ流１３０のＤＡ−ＤＫＰ濃度は、アルブミンフリーで、約１００μＭ  ＤＫＰ〜約１５０μＭ  ＤＡ−ＤＫＰの範囲であり得る。
【０１０６】
第２のアルブミンリッチ流１３０は第２の処理工程１００に供給される。この実施例では、第２の処理工程１００は第２の独立した単位操作である。従って、それは第２のタンジェンシャルフローフィルトレーション単位であってよく、またはいくつかの全く異なる技術であってよい；例えば、クロマトグラフィーカラム。また、第２の処理工程は、第１の処理工程で使用した同じ装置を使用することによって、例えば、バッチまたはセミバッチモードで処理を実行することによって、達成することができる。この実施例では、第２の処理工程１００は、この実施例２において上記した第１の単位と同じ原理で操作する第２の専用のタンジェンシャルフローフィルトレーション単位である。
【０１０７】
この実施例２では、上記のように、第２のアルブミンリッチ流１３０は、供給流１２０より高いＤＡ−ＤＫＰ濃度を有する。しかしながら、第１の処理工程１００中に除去された生理食塩水によって、存在するアルブミンフリーの生理食塩溶液は少なくなっている。従って、この実施例２では、理論量のＤＡ−ＤＫＰの収率の増加は本質的に大きくなる。
【０１０８】
第２のアルブミンリッチ流１３０の濾過によって、最終的なアルブミンリッチな生成物流１６０と、第１の治療用組成物と、アルブミンフリーで、ＤＡ−ＤＫＰ濃度が約１００μＭ  ＤＫＰ〜約１５０μＭ  ＤＡ−ＤＫＰの範囲である生理食塩溶液を含む第２のアルブミンリーン（この場合、アルブミンフリー）流１４０とがもたらされる。ＤＡ−ＤＫＰを含有する、第１のアルブミンリーン流と第２のアルブミンリーン流は、１つの流れに合わせて、第２の治療用組成物を生成することができる。例えば、アルブミンリッチな生成物流１６０は、限定されるものではないが、栄養失調、飢餓、ネフローゼ症候群、膵炎および腹膜炎などの状態を治療するために使用することができる。次に、合わせた、ＤＡ−ＤＫＰを含有するアルブミンフリー流は、ヒト自己免疫疾患を治療するために使用することができる。
【０１０９】
図５は１つだけの反応工程１１０および２つだけの処理工程１００を例示しているが、これは、本開示の範囲を１つの反応工程および２つの処理工程に限定することを意図していない。追加の反応工程および処理工程によって、ＤＡ−ＤＫＰの収率はさらに増加させることができる。例えば、３つの反応工程１１０および４つの処理工程１００後に累積収率が達成され得る。当業者ならば、処理工程および反応工程の数、ならびにそれらの相互の配置（例えば、直列、並列、再循環ループ有り、再循環ループ無しなど）は包括的な経済分析に依存し、場所および用途によって異なることが分かるであろう。
【実施例３】
【０１１０】
次に、図６を参照すると、実施例２の変形、治療用組成物を生産するために、アルブミンおよび場合によってはＤＫＰを含む供給流１２０を処理するための方法であって、アルブミンリッチな再循環流１７０をさらに含む方法を、ブロック図の形式で例示している。
【０１１１】
この実施例も２つの処理工程１００および１つの反応工程１１０を含む。この実施例では、これらの工程後のＤＫＰの収率は許容できないほど低い；例えば、５０％未満であるケースが想定される。そのため、アルブミンの２回目のシステム通過を行って、収率を５０％を超えて上げるために、第２の処理工程１００を出るアルブミンリッチ流１３０はアルブミンリッチな再循環流１７０へと分かれ、供給流１２０と合流した後、第１の処理工程１００に供給されるように再循環される。
【０１１２】
この実施例では、連続モードで処理が実行されることが想定される。従って、この処理から最終的なアルブミンリッチな生成物流１６０が連続的に取り出される一方で、この処理に新しい供給材料１２０が連続的に供給される。内部再循環ループ１７０は、供給流１２０および流れ１６０よりも著しく大きくてよく、これらの流れの実際の大きさおよび比率は、処理工程１００において得られる通過ごとの収率に依存する。
【実施例４】
【０１１３】
次に図７を参照すると、治療用組成物を生産するために、アルブミンおよび場合によってはＤＫＰを含む供給流１２０を処理するための方法の１つのさらなる実施形態を例示しており、この方法では、実施例２を、第２の処理工程１００に供給される希釈液流１８０を含むように変更している。
【０１１４】
この実施例は、前記処理工程中にアルブミンからＤＫＰを含有する水相を置換する置換液を提供する必要性を想定している。この実施例では、乳酸加リンゲル液を希釈液流１８０として使用して、タンジェンシャルフローフィルターユニットを通して水相中に存在するＤＫＰのより多くを置換する。
【０１１５】
本明細書において例示的に開示した本発明は、本明細書において具体的に開示していない要素の不在下で好適に実施することもできる。しかしながら、方法に対する多くの変更、変形、修飾、他の使用、および応用が可能であり、本発明の趣旨および範囲から逸脱しない変更、変形、修飾、他の使用、および応用もまた本発明に含まれると考えられ、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定されることが当業者には明らかである。
【０１１６】
本発明の前の論述は例示および説明のために示してきた。前述は、本発明を本明細書において開示した形式（単数または複数）に限定することを意図していない。例えば、前述の詳細な説明では、本開示を簡素化するために、本発明の様々な特徴を１つまたは複数の実施形態にまとめている。本発明の実施形態の特徴は、組み合わせて、上述したもの以外の別の実施形態にすることができる。この開示方法は、特許請求する発明が各請求項に明示的に記載されているものよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映するものと解釈してはならない。むしろ、以下の特許請求の範囲が示すように、発明の態様は、前述の開示した実施形態１つの全ての特徴より少ない特徴で存在する。従って、以下の特許請求の範囲はこれによってこの詳細な説明に組み込まれ、各請求項は、本発明の別々の好ましい実施形態として独立する。
【０１１７】
さらに、本発明の説明には１つまたは複数の実施形態ならびに特定の変形および修飾の説明が含まれているが、本開示を理解した上で、例えば、当業者の技術および知識の範囲内である場合には、他の変形、組合せ、および修飾も本発明の範囲内である。特許請求する構造、機能、範囲または工程に対する代替の、交換可能なおよび／または等価の構造、機能、範囲または工程を含む、許容される範囲で代替実施形態を含む権利を取得することを意図しており、そのような代替の、交換可能なおよび／または等価の構造、機能、範囲または工程は本明細書に開示されているか否かには関係なく、特許性のある主題全てを公開することを意図していない。
【符号の説明】
【０１１８】
１００…処理工程、１１０…反応工程、１２０…供給流、１３０…アルブミンリッチ流、１４０…アルブミンリーン流、１５０…酵素または触媒、１６０…最終アルブミンリッチ生成物流、１７０…アルブミンリッチ再循環流、１８０…希釈液流。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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