(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親和結合性磁性熱可塑性粒子抽出プロセスで用いるための緩衝液であって、塩、ならびに下記式の基本構造を有する少なくとも１種の可溶性ポリオールを含み、
【化１】
0006391595.tif 000015
式中、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＨ３、（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ、または
【化２】
0006391595.tif 000016
であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に、Ｈ、または（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨであり、
各ｎは独立に１以上の整数であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のうちの少なくとも１つが（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨであり、
（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ基の総数がＮｔであり、かつ
Ｎｔは少なくとも６である、緩衝液。
【請求項２】
親和結合性磁性熱可塑性粒子抽出プロセスで用いるための緩衝液であって、塩、ならびに下記式の基本構造を有する少なくとも１種の可溶性ポリオールを含み、
【化３】
0006391595.tif 000017
式中、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＨ３、（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ、または
【化４】
0006391595.tif 000018
であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に、Ｈ、または（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨであり、
各ｎは独立に１以上の整数であり、
（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ基の総数がＮｔであり、
前記ポリオールが３個以上の末端ＯＨ基を有し、かつ
末端ＯＨ基に対するＮｔの比が２：１より大きい、緩衝液。
【請求項３】
前記ポリオールがアルコキシル化ペンタエリトリトールまたはアルコキシル化トリメチロールプロパンである、請求項１または２に記載の緩衝液。
【請求項４】
磁性ビーズをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の緩衝液。
【請求項５】
請求項４に記載の緩衝液を使用する方法において、
固相により誘導体官能基を介して生体分子が磁性ビーズの表面に結合するように、前記生体分子を含む物質を、請求項４に記載の緩衝液と接触させるステップと、
前記物質から前記生体分子を分離するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条に基づき、２０１３年２月４日に出願された米国仮特許出願第６１／７６０３７５号明細書の優先権を主張するものであり、その内容が根拠とされ、その全体が本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、親和結合性および／または磁気感受性の熱可塑性粒子と共に使用するための緩衝液、ならびにそれを製造する方法ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体分子（核酸およびタンパク質など）およびそれに関連した生物システム（細胞およびウイルスなど）の分離は、生物の研究における基本的な手法である。分離は、生体分子を特徴付け、構造および機能を理解し、さらに生物システムに対する実験および試験を観測、洗練、および実施するための基盤となる。
【０００４】
分離の１つの方法は、特定の生体分子に対して親和性を有するリガンドと結合した固相を用いて行われるものである。固相を、生体分子を含む物質と接触させることができ、その結果、生体分子は親和性リガンドに結合する。その後、固相を物質から分離し、それに関連した生体分子および／または生物システムを物質から分離することができる。そのような固相の例には、生体分子を結合するためにその表面上の親和性リガンドが組み込まれ、かつ磁場に引き寄せられるようにされた（これは、親和結合性磁性熱可塑性粒子抽出プロセス（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を構成する、後ほどの分離のためである）粒子がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
親和性リガンドへの生体分子の結合は、特定の緩衝溶液を用いることによって最適化することができる。有用な緩衝液（しばしば、「クラウディング（ｃｒｏｗｄｉｎｇ）」緩衝液と呼ばれる）を作るために、塩と一緒にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が使用されてきた。しかし、ポリエチレングリコールは粘稠であり、対象となる生体分子から洗い流すのが難しいことがある。それゆえに、洗い流すのが容易でありかつ／または環境に優しい親和結合性磁性熱可塑性粒子抽出プロセスを用いて、生体分子およびそれに関連した生物システムを分離するのに使用できる緩衝液が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
複数の実施形態において、本開示は、以下に定義するポリオールを含む、親和結合性磁性熱可塑性粒子抽出プロセスで用いるための緩衝溶液を提供する。
【０００７】
態様（１）では、本開示は、親和結合性磁性熱可塑性粒子抽出プロセスで用いるための緩衝液であって、式３：
【０００８】
【化１】
0006391595.tif 000002
【０００９】
の基本構造を有する少なくとも１種の可溶性ポリオールであって、
式中、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＨ３、（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ、または
【００１０】
【化２】
0006391595.tif 000003
【００１１】
であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に、Ｈ、または（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨであり、
各ｎは独立に１以上の整数であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のうちの少なくとも１つが（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨであり、
（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ基の総数がＮｔであり、かつ
Ｎｔは少なくとも６である、
ポリオールを含む、緩衝液を提供する。
【００１２】
態様（２）では、本開示は、ポリオールがアルコキシル化ペンタエリトリトールまたはアルコキシル化トリメチロールプロパンである、態様１の緩衝液を提供する。
【００１３】
態様（３）では、本開示は、ポリオールがアルコキシル化ペンタエリトリトールまたはアルコキシル化トリメチロールプロパンである、態様（２）の緩衝液を提供する。
【００１４】
態様（４）では、本開示は、磁性ビーズをさらに含む態様１の緩衝液を提供する。
【００１５】
態様（５）では、本開示は、固相により誘導体官能基を介して生体分子が磁性ビーズの表面に結合するように、生体分子を含む物質を請求項１に記載の緩衝溶液と接触させるステップと、物質から生体分子を分離するステップとを含む、態様４の緩衝液の使用を提供する。
【００１６】
態様（６）では、本開示は、親和結合性磁性熱可塑性粒子抽出プロセスで用いるための緩衝液であって、
【００１７】
【化３】
0006391595.tif 000004
【００１８】
の基本構造を有する少なくとも１種の可溶性ポリオールであって、
式中、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＨ３、（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ、または
【００１９】
【化４】
0006391595.tif 000005
【００２０】
であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に、Ｈ、または（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨであり、
各ｎは独立に１以上の整数であり、
（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ基の総数がＮｔであり、
ポリオールが３個以上の末端ＯＨ基を有し、かつ
末端ＯＨ基に対するＮｔの比が２：１より大きい、
ポリオールを含む、緩衝液を提供する。
【００２１】
態様（７）では、本開示は、Ｎｔが少なくとも６である態様６の緩衝液を提供する。
【００２２】
態様（８）では、本開示は、ポリオールがアルコキシル化ペンタエリトリトールまたはアルコキシル化トリメチロールプロパンである、態様６の緩衝液を提供する。
【００２３】
態様（９）では、本開示は、ポリオールがアルコキシル化ペンタエリトリトールまたはアルコキシル化トリメチロールプロパンである、態様７の緩衝液を提供する。
【００２４】
態様（１０）では、本開示は、磁性ビーズをさらに含む態様６の緩衝液を提供する。
【００２５】
態様（１１）では、本開示は、磁性ビーズをさらに含む態様７の緩衝液を提供する。
【００２６】
態様（１２）では、本開示は、固相により誘導体官能基を介して生体分子が磁性ビーズの表面に結合するように、生体分子を含む物質を請求項１に記載の緩衝溶液と接触させるステップと、物質から生体分子を分離するステップとを含む、態様６の緩衝液相の使用法を提供する。
【００２７】
態様（１３）では、本開示は、固相により誘導体官能基を介して生体分子が磁性ビーズの表面に結合するように、生体分子を含む物質を請求項１に記載の緩衝溶液と接触させるステップと、物質から生体分子を分離するステップとを含む、態様７に記載の緩衝液相の使用法を提供する。
【００２８】
上記および他の態様は、添付図面を参照しながら以下の詳細な説明を読むときにいっそうよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】表１、２および３に定義された実験溶液および市販の緩衝液（Ａｘｙｇｅｎ）（Ａｘｙｇｅｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）についての結合緩衝液性能を示すグラフであり、ＳＭＡ磁粉の場合の放出ＤＮＡ（Ｙ軸上のＲＵで測定）を示している。
【図２】表１、２および３に定義された緩衝液およびＡｘｙｇｅｎ緩衝液およびＰＥＧ緩衝液の結合緩衝液性能を示すグラフであり、放出ＤＮＡ（Ｙ軸のＲＵで測定）を示している。
【図３】知的財産権のある磁粉（Ａｘｙｇｅｎビーズ）の場合の、Ａｘｙｇｅｎ対照緩衝液と対比した、表１、２および３に定義されている緩衝液の結合緩衝液性能（ＲＵで測定される放出ＤＮＡで測定）を示すグラフである。
【図４】Ａｘｙｇｅｎ対照緩衝液と対比した、表１、２および３に定義されている緩衝液の結合緩衝液性能（ＲＵで測定される放出ＤＮＡで測定）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
これから、例としての実施形態が示されている添付図面を参照しながら、実施例をさらに詳しく以下に説明する。可能な場合には、図全体で同じ参照番号および／または記号を使用して、同じ部分または同様の部分を示す。ただし、態様は、多くの異なる形で具体化されうるので、本明細書で述べる実施形態に限定されると解釈すべきではない。
【００３１】
図に示すような、アルコキシル化ペンタエリトリトールまたはアルコキシル化トリメチロールプロパンを含む、親和結合性磁性熱可塑性粒子抽出プロセスで用いるための例示的な緩衝液が提供される。各実施例では、熱可塑性固相粒子を示す。ＤＮＡなどの生体分子と相互作用する特殊な界面化学的性質を有する熱可塑性固相粒子が、緩衝液で提供される。１つの用途は、ＰＣＲ反応で作られたＤＮＡの精製であり、熱可塑性粒子は、混合物質から任意の生体物質を抽出するのに適した任意の親和性リガンドで覆うことができる。これには、砕かれた植物物質からの植物ＤＮＡの抽出、細胞片で汚染された頬スワブ（Ｂｕｃｃａｌ  Ｓｗａｂｓ）からの抽出、血液からのＤＮＡの抽出などがあるが、これらに限定されない。これらのＤＮＡ源はすべて、タンパク質と他の生物学的実体（ＤＮＡの使用前にＤＮＡから除去する必要のあるもの）との混合物である。一例として、ＰＣＲ反応生成物は、終了時に、ＤＮＡ、ポリメラーゼ酵素、ＤＮＡプライマー、ヌクレオチド構成単位および他の不純物といったものの混合物を含む。あらゆる場合に、磁気感受性微粒子を含む緩衝液を用いて、生物学的不純物の残りから生体物質が抽出される。
【００３２】
ポリエチレングリコール（またはＰＥＧ）を適切な塩と組み合わせたものが、ＰＣＲ反応で作られたＤＮＡの精製に使用されてきた。緩衝液は、使いやすいように説明書付きの配合懸濁液として、顧客に「キット」の形で提供されることがある。塩を伴ったポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、この用途に使用される「クラウディング」緩衝系と言われてきた。クラウディング緩衝液とは、水を寄せ集めるかまたは結びつけて生物学的実体を締め出す緩衝系のことである。ＰＥＧおよび塩はどちらも、水和する傾向が非常に強く、それゆえに水を寄せ集め、それによって生体物質を「締め出し」、精製プロセスの効率を高める。
【００３３】
多官能性アルコール（ポリオールとして知られる）、特に「アルコキシル化ペンタエリトリトール」または「アルコキシル化トリメチロールプロパン」は、ポリウレタン配合物において多官能性架橋剤として使用される。製造業者のデータシートでは、それらは第一アルコールを有する多官能性アルコキシル化ポリオールとして分類される。アクリレート部分がアルコール部分と結合する場合、その物質は、コーティング用のラジカル開始重合における多官能性架橋剤として使用される。これは、一般的な化学構成ブロック（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）としても知られている。こうした多官能性アルコールは、分子量がおよそ８，０００でありうるＰＥＧと比べて小さい。この小さな多官能性アルコールがクラウディング剤としてＰＥＧよりも明らかに優れている１つの点は、それらが緩衝液の粘度を低下させることである。こうした物質はポリマーではなく、ＰＥＧなどのポリマーと比べて異なる物理的性質を有する。例えば、粘度が低い。こうした小さな物質はいっそう容易に洗い流され、いっそう迅速に混合および磁気抽出を行うことが可能になる。このように低い粘度であるため、ＤＮＡ抽出の後に、磁性ビーズペレットから緩衝液をいっそう容易に洗い流すことができる。緩衝液の粘度が低いので、ＤＮＡを捕捉する磁気感受性粒子の能力も改善されうる。予備的な結果によれば、ポリオールの濃度を変化させると、緩衝系で磁粉に結合するＤＮＡのサイズに応じて、ＤＮＡの抽出が制御されうる。
【００３４】
複数の実施形態において、親和結合性磁性熱可塑性粒子抽出プロセスで用いるための緩衝液は、次の２つの単位から作られる少なくとも１種の可溶性ポリオールを含む。
（１）式１に示す基本構造（ＣＡＳ番号１１５−７７−５、Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）４  １，３プロパンジオール）：
式１：
【００３５】
【化５】
0006391595.tif 000006
【００３６】
および（２）式２に示す構造を有する構成成分（ＣＡＳ番号７５−２１−８、Ｃ２Ｈ４Ｏ、オキシラン）（ここで、式２の組成物の式１の組成物に対する比率は少なくとも１：１である）。
式２：
【００３７】
【化６】
0006391595.tif 000007
【００３８】
式２の環構造を開くと、式２は（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨのようにも記述できる。こうした物質は、別の仕方では、置換アームを有するペンタエリトリトールエトキシレートとして記述される。例えば、式１の基本構造は式３に示すように置換できる。
式３：
【００３９】
【化７】
0006391595.tif 000008
【００４０】
式中、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＨ３、（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ、または式４に示す構造である。
式４：
【００４１】
【化８】
0006391595.tif 000009
【００４２】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に、Ｈ、または（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨであり、各ｎは独立に１以上の整数であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のうちの少なくとも１つが（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨであり、（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ基の総数がＮｔであり、さらにＮｔは少なくとも６である。
【００４３】
式２の構造は、その開環形状では、（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ（エチレンオキシドアーム、またはＥＯアーム）である。複数の実施形態において、ポリオールは、エチレンオキシドアーム（式２の構造）と式３の基本構造との混合物から作ることができる。エチレンオキシドアームは、利用可能なヒドロキシ基（ＯＨ基）と結合するかまたは互いに結合して、（式３の）基本構造に対するエチレン基（式２）（互いに反応する）の比率に応じて、エチレンオキシド基のコア構造に対するある比率を有する分枝状構造を形成する。
【００４４】
コア構造（式３）は置換できる。例えば、以下の表１に、ポリオール３１６５のコア構造を示す（ポリオール３１６５は、Ｐｅｒｓｔｏｒｐ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  ＡＢ  Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）。ポリオール３１６５は、３つのＯＨ置換基をＲ１、Ｒ２およびＲ４に有する基本構造として説明できる。Ｒ３はＣＨ３である。エチレンオキシド基の総数は、物質の分子量に基づいて計算できる。例えば、エチレンオキシド基（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨの場合、「ｎ」の合計値（Ｎｔ）は、コア（式３。上記のように、また表１に示すように置換されている）の分子量を、報告されているポリオールの分子量（製造業者が報告しているもの）から差し引き、その結果を４４（エチレンオキシドの分子量）で割ることによって計算できる。こうしたＮｔの計算値を表１に示す。Ｎｔ値は、Ｎｔ：利用可能なＯＨ基の数という比率で表現することもできる。これは、表１中でＮｔ／ＯＨとして示されている。例えば、緩衝液３２１５（ポリオール３２１５を含む）の場合、Ｎｔ／ＯＨの比率は１５／３である。エチレンオキシド基は、基本構造（これは、表１に示すように、３個、４個、または６個のＯＨ基を持つことができる）と、エチレンオキシドの基本構造に対するある比率で混ざるので、エチレンオキシド基は、利用可能なＯＨ基とランダムに結合するか、または互いに結合しうる。ＮｔおよびＮｔ／ＯＨの比率を計算することはできるが、ポリオールに存在しうるエチレンオキシド基のランダムな配列を完全に説明することは不可能である。したがって、基本構造と比べた場合の、あるいは置換基本構造上の利用可能なＯＨ基の数と比べた場合のエチレンオキシド基の総数（つまり、Ｎｔ／ＯＨの比率）は、ポリオール構造を説明するのに適している。こうした緩衝液を説明する別の仕方として、エチレンオキシド置換の総数（つまりＮｔ）で説明する方法がある。
【００４５】
こうした組成物は、ＰＥＲＳＴＯＲＰポリオールとしても知られており、Ｐｅｒｓｔｏｒｐ（Ｐｅｒｓｔｏｒｐ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  ＡＢ  Ｓｗｅｄｅｎ）から入手可能である。例えば、以下に示す構造は、番号付きのポリオール（以下の表１に示す構造を有するポリオール３１６５、ポリオール４８００、ポリオールＲ６４０５、ポリオール４６４０およびポリオール４２９０）としてＰｅｒｓｔｏｒｐから購入できる。こうした物質は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈなどの他の供給業者からも得ることができる。いずれの場合にも、ポリオールは、式３の基本構造と式２のエチレンオキシド構造（環が開いている場合、水溶液中に生じる（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ）としても表される）との混合物として購入される。
【００４６】
例示的な構造を表１に示す。
【００４７】
【表１】
0006391595.tif 000010
【００４８】
本明細書に開示されている実施例で使用された緩衝液を、表２および表３に示す。
【００４９】
【表２】
0006391595.tif 000011
【００５０】
【表３−１】
0006391595.tif 000012
【００５１】
【表３−２】
0006391595.tif 000013
【００５２】
【表３−３】
0006391595.tif 000014
【００５３】
複数の実施形態において、本開示は、式３［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に、Ｈまたは（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨであり、各ｎは独立に１以上の整数であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のうちの少なくとも１つが（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨであり、（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ基の総数がＮｔであり、さらにＮｔが少なくとも６であり、（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ基の総数がＮｔであり、ポリオールが３個以上の末端ＯＨ基を有し、さらに末端ＯＨ基に対するＮｔの比率が１：１より大きい］の基本構造を有する少なくとも１種の可溶性ポリオールを含む、親和結合性磁性熱可塑性粒子抽出プロセスで用いるための緩衝液を提供する。
【００５４】
理論によって限定されるわけではないが、高分子量の固体ポリマー（例えば、室温で固体であるＰＥＧ８０００など）ではなく低粘度の低分子量物質を使用する利点の１つは、低分子量の物質を水に溶かすと、最大２倍のポリオール濃度でＰＥＧよりも高粘度の緩衝液が生じることである。こうしたポリオールが配合された緩衝液は、ＰＥＧが配合された緩衝液と比べて粘度が著しく低い。このように粘度が低いため、ＤＮＡおよびＤＮＡの捕捉に用いられる粒子はいっそう容易に混ざることが可能になる。さらに、低粘度の緩衝液は、ＤＮＡ抽出後に、磁性ビーズからいっそう容易に洗い流される。緩衝溶液の粘度が低いため、ビーズは磁石によってより迅速に集めることができる。こうした特性により、ＤＮＡを捕捉する磁気感受性粒子の能力も改善されうる。それは、低分子量のＤＮＡが、クラウディング剤を粒子表面から閉め出す必要があるからである。予備的な結果によると、結合緩衝液中のポリオールの濃度を変化させることにより、粒子に結合するＤＮＡの大きさを選択することが可能でありうることも明らかである。ポリオール４３６０（表１および３中でアスタリスク（＊）を付けて示されている）は、エチレンオキシド基本構造の代わりに、プロピレンオキシド基本構造を有することに留意されたい。この物質は、ここで実施したＤＮＡ抽出試験に適する高塩（ｈｉｇｈ  ｓａｌｔ）緩衝溶液が得られるほど十分に可溶性でなかった。複数の実施形態において、「可溶性」とは、ポリオールが、２．５Ｍの塩（ＮａＣｌ溶液など）中に少なくとも３０〜４０％まで溶けることを意味する。例えば、ポリオール４３６０は可溶性ではなかった。
【実施例】
【００５５】
実施例１：磁粉および結合緩衝液調製
実験用ＤＮＡ結合緩衝液は、幾種類かのＰｅｒｓｔｏｒｐポリオール（「アルコキシル化ペンタエリトリトール」）を、ＤＮＡ結合緩衝液である、２．５Ｍ  塩化ナトリウム溶液中に溶かされた２０重量％ＰＥＧ  ８，０００ｍｗ標準液に加えることによって調製した（ＰＥＧ／塩の結合緩衝液は、例えば、米国特許第５７０５６２８号明細書、およびＳｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｍ．ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｅｖｏｒ  Ｌ．Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２２，ｐｐ  ４７４２−４７４３に記載されている）。実験用緩衝系では、現在のところ、２．５モル塩化ナトリウムおよび１０〜４０％Ｐｅｒｓｔｏｒｐポリオール（ポリオール４２９０、ポリオール４８４０、ポリオール４６４０、ポリオールＲ３２１５およびポリオールＲ６４０５など）を、水を捕捉／誘引する添加剤として使用した。１０ｍＭトリスおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡも結合緩衝混合液に含めた。市販のビーズ（Ａｘｙｇｅｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）および社内で製造された知的財産権のあるＳＭＡ磁粉（例えば、２０１２年６月２９日に出願された米国特許出願第６１／６６６１３８号明細書（その全体を本明細書に援用する））の両方を、これらの実験に使用した。本発明者らのポリオール系緩衝液に懸濁させたＡｘｙｇｅｎビーズの場合、ＰＣＲ精製に必要なキット緩衝液の標準アリコートを量り分け、ビーズをＰＣＲ分離管の側に引き寄せた。キット緩衝液を除去し、ビーズを洗浄し、空気乾燥させ、同量の本発明者らの社内のポリオール結合溶液を加えてキット緩衝液と置き換えた。このようにして、もとのキットと同じビーズ濃度を維持した。ＳＭＡ磁粉の場合、試験したすべての結合緩衝液において、１５Ｍ３０Ｆ粒子を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【００５６】
実施例２：ＰＣＲ反応および精製プロトコル
標準ＰＣＲキットを用い、２種類のＰＣＲ反応を使用して、２００ｂｐおよび７００ｂｐの両方の断片を生じさせた。２種類のＰＣＲ反応物を１：１（ｖ／ｖ）で混ぜて、２００ｂｐおよび７００ｂｐの両方の断片を含むＰＣＲ混合物を生じさせた。すべての精製評価に以下のプロトコルを使用した：（１）合計で２０ｕｌの非精製ＰＣＲ溶液をピペットで１ｍｌ管に入れ、その後、３６ｕｌの磁性ビーズ／粒子溶液を加えて混合した；（２）結合させるために５分間放置した後、２〜５分間、ビーズ／粒子溶液を磁石の上に置いて、上澄みをピペットで回収し、廃棄した；（３）ビーズ／粒子がまだ磁石上にある間に、７０％アルコール溶液で２回洗浄し（各２００ｕｌ）、およびアルコール洗液を廃棄した（４）４０ｕｌの１ｘＴＥ緩衝液を加えて、捕捉されたＤＮＡを溶出させた。
【００５７】
実施例３：溶出ＤＮＡ断片のＵＰＬＣ分析
磁性ビーズ／粒子からの溶出ＤＮＡは、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣシステムを用いて、Ｃ１８逆相カラムで、ＵＰＬＣ分析によって同定し、量を求めた。Ｗａｔｅｒｓ  ＰＤＡ検出器を用いて、２００ｂｐおよび７００ｂｐの両方のＤＮＡ断片を検出し、２６０ｎｍのＵＶで定量した。各試料の溶出ＤＮＡ溶液１０ｕｌを、比較のために注入した。溶出ＤＮＡの収量は、２００ｂｐおよび７００ｂｐの両方のＤＮＡ断片のピーク面積に基づいたものだった。ＵＰＬＣでは、反応に使用された残留ＤＮＡプライマーも検出されるが、精製後にはプライマーは見られなかった。
【００５８】
親和結合性磁性熱可塑性固相抽出用の緩衝液の特徴をさらに詳しく考慮する際、図１〜４には、実験溶液Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５およびＢ６（表１で定義されている）、Ａｘｙｇｅｎ緩衝液およびＰＥＧ緩衝液についての結合緩衝液性能（磁粉を用いて分離された放出ＤＮＡ（Ｙ軸のＲＵで測定される）を示している）を示すグラフが示されている。
【００５９】
図１は、表１、２および３に定義された実験溶液および市販の緩衝液（Ａｘｙｇｅｎ）（Ａｘｙｇｅｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）についての結合緩衝液性能を示すグラフであり、ＳＭＡ磁粉での放出ＤＮＡ（Ｙ軸のＲＵで測定される）を示している。図１は、Ｎｔ／ＯＨの比率が１５／４であるポリオールを含んでいる緩衝液４２９０Ｃの場合、対照であるＡｘｙｇｅｎおよびＰＥＧ１と矛盾のない仕方で機能したことを示している。Ｎｔ／ＯＨの比率がそれぞれ３．４／４および５／４である緩衝液４８００Ａおよび４６４０Ａは、機能しなかった。言い方を変えれば、Ｎｔが少なくとも６であるポリオールを含んでいる緩衝液４２９０Ｃは機能したが、Ｎｔがそれぞれ３．４および５である緩衝液４８００Ａおよび４６４０Ａは機能しなかったということである。ＯＨ基を有しているがエチレンオキシド基のない物質、ソルビトール、デキストラン、およびＦＩＣＯＬＬ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能）を含んでいる更なる対照緩衝溶液は、負の対照であった。
【００６０】
図２は、Ａｘｙｇｅｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からの市販の緩衝液である「Ａｘｙｇｅｎ緩衝液」およびＰＥＧ１緩衝液（表２で定義されたもの）と比べた場合の、表１、２および３に定義されている４２９０緩衝液の結合緩衝液性能を示すグラフであり、放出ＤＮＡ（Ｙ軸のＲＵで測定される）を示している。図２は、４２９０ポリオールが用量依存的な仕方で挙動することを示している。
【００６１】
図３は、対照であるＡｘｙｇｅｎ緩衝液およびＰＥＧ２緩衝液と比較した場合の、知的財産権のある磁粉（Ａｘｙｇｅｎビーズ）での、表１、２および３に定義されている緩衝液の結合緩衝液性能（ＲＵで測定される放出ＤＮＡによって測定される）を示すグラフである。図３は、緩衝液３１６５Ｂ（Ｎｔ／ＯＨ＝２０／３）、Ｒ６４０５Ｂ（Ｎｔ／ＯＨ＝１３／６）、Ｒ３２１５Ｂ（Ｎｔ／ＯＨ＝１５／３）および４２９０Ｄ（Ｎｔ／ＯＨ＝１５／４）（それぞれが、６より大きいＮｔを有する）が、対照緩衝液と同程度の性能であることを示している。一方、Ｎｔがそれぞれ３．５および５である緩衝液４８００Ｂ（Ｎｔ／ＯＨ＝３．５／４）およびＲ４６４０Ｂ（Ｎｔ／ＯＨ＝５／４）は、機能しなかった。
【００６２】
図４は、対照であるＡｘｙｇｅｎ緩衝液と比較した場合の、表１、２および３に定義されている緩衝液の結合緩衝液性能（ＲＵで測定される放出ＤＮＡによって測定される）を示すグラフであり、市販の磁性ビーズ（Ａｘｙｇｅｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）を用いた場合のものである。図４は、緩衝液３１６５Ｂ（Ｎｔ／ＯＨ＝２０／３）、Ｒ６４０５Ｂ（Ｎｔ／ＯＨ＝１３／６）、Ｒ３２１５Ｂ（Ｎｔ／ＯＨ＝１５／３）および４２９０Ｄ（Ｎｔ／ＯＨ＝１５／４）（それぞれが、６より大きいＮｔを有する）が、市販ビーズを用いた場合、対照緩衝液と同程度の性能であることを示している。一方、Ｎｔがそれぞれ３．５および５である緩衝液４８００Ｂ（Ｎｔ／ＯＨ＝３．５／４）およびＲ４６４０Ｂ（Ｎｔ／ＯＨ＝５／４）は、市販のビーズを用いた場合、機能しなかった。
【００６３】
グラフは、塩を伴った適切なポリオール添加剤が、ＰＥＧ／塩の標準緩衝溶液ならびにキットして販売される市販の知的財産権のある結合緩衝液／磁粉系（Ａｘｙｇｅｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と同じレベルで機能することを示している。市販のＡｘｙｇｅｎキットで示された結果は、他の市販のＰＣＲ精製キットで見られる結果と一致している。試験したポリオールの中でも、ポリオール４２９０、ポリオールＲ３２１５、ポリオール３１６５およびポリオール３２１５はすべて、高塩において有効なクラウディング効果を示して、知的財産権のある実験用磁粉（ＳＭＡ磁粉）およびＡｘｙｇｅｎの磁性ビーズのどちらにおいてもＤＮＡ捕捉を促進する。性能は、ＰＥＧ−塩の標準バター状物質に基づく性能に匹敵するかそれより上回る（図１〜４を参照）。ポリオール４２９０を使用した場合、３０〜４０％のポリオール濃度で性能は最高である（図２）。知的財産権のある実験用磁粉（ＳＭＡ粒子）および市販のＡｘｙｇｅｎ磁性ビーズ（カルボキシに基づく界面化学的性質を有する）のどちらも、ポリオール系結合緩衝液でうまく作用する（図４および図５）。
【００６４】
一部のポリオール系結合緩衝液では、緩衝液のＰＣＲ反応物に対する比率（濃度）をさまざまに変えると、ＤＮＡサイズ選択性効果もある。例えば、ポリオール４２９０を含んでいる緩衝液では、３０％の濃度において、２００ｂｐの捕捉が少なく、小さなＤＮＡ粒子（２００ｂｐ）と大きなＤＮＡ粒子（７００ｂｐ）が放出された（図１および図２）。この特性を利用することがきる。例えば、この特性を用いて、ある特定粒径のＤＮＡ粒子を調製物から優先的に除去する精製緩衝液を得ることができる。あるいは、例えば、緩衝溶液中で２種類以上のポリオールの組合せを使用して、調製物から除去されるＤＮＡまたは他の生体物質のサイズ群を最適化することができる。複数の実施形態において、本明細書に開示されているポリオール緩衝液は、ある特定粒径の生体物質を調製物から除去するよう最適化される。更なる実施形態では、本明細書に開示されているポリオール緩衝液は、調製物から優先的に除去される粒径範囲を最適化するポリオールの混合物を含む。
【００６５】
評価されたＰｅｒｓｔｏｒｐポリオールは、公称分子量が８００であり、これは、好ましいＰＥＧ系緩衝液よりも小さいオーダーである。ＰＥＧのようなポリマーを使用せず、主な用途がポリウレタン配合物中での多官能性架橋剤である多官能性アルコールを使用することにより、本発明では、高粘度の緩衝液で作業することに伴う幾つかの問題を解決する。クラウディング剤として、この小さいサイズの多官能性アルコールをＰＥＧと比べた場合の予想外の１つの利点は、緩衝液の粘度が低いので、容易に洗い流され、さらにいっそう迅速に混合および磁気抽出を行えるという点である。
【００６６】
ＰＥＧおよびポリオール３４６０は、固体またはワックス状の構成成分であって、可溶性ではなかった。特許請求されている本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、様々な修正および変更を加えることができることは、当業者に明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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