(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質を有効成分とする肺高血圧症の予防および／または治療用医薬。
【請求項２】
ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質が、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質である請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質が、抗ＩＬ−２１抗体、抗ＩＬ−２１受容体抗体、ＩＬ−２１と結合するペプチドおよびＩＬ−２１受容体と結合するペプチドからなる群から選択される一種である請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質が、抗ＩＬ−２１抗体である請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
ＩＬ−２１およびＩＬ−２１受容体を用いることを特徴とする肺高血圧症治療薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質を選択することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質を選択することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
被験物質とＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体を発現する細胞を接触させる工程と、ＩＬ−２１受容体の下流のシグナル量を測定する工程と、被験物質を接触させない場合の前記細胞におけるシグナル量と比較して、シグナル量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
被験物質とＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体を接触させる工程と、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との結合レベルを測定する工程と、被験物質を接触させない場合の結合レベルと比較して、結合レベルを低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺高血圧症治療薬およびそのスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
循環器系は体循環と肺循環とから構成され、肺循環の主要な存在意義は肺ガス交換の場を提供することである。左心室から駆出された血液は体組織全体を広く潅流するが、肺血管系には右心系（右心室と右心房）を介してこの体組織全体を潅流した血液が流入して、肺毛細血管と肺胞間でガス交換を行っている。よって、肺循環系は基本的にｈｉｇｈ ｆｌｏｗ−ｌｏｗ ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｌｏｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅな系であり、肺血流量の増加に対しては肺血管の拡張や再疎通（閉じている血管の再開通）などの機序で圧の上昇を抑える仕組みが内在している。
【０００３】
肺動脈平均圧は正常・安静時には上限２０ｍｍＨｇの範囲で制御されている。運動などで肺血流量が増加しても直ちに肺動脈の著明な増加は見られないが、肺血管床の約５０−６０％程度以上が閉塞すると圧や血管抵抗の上昇が生じることが報告されている。２００８年の第４回肺高血圧ワールドシンポジウム（ダナポイント会議）では、安静時に右心カテーテル検査を用いて実測した肺動脈平均圧（ｍｅａｎ ＰＡＰ）が２５ｍｍＨｇ以上の場合が肺高血圧症と定義された。さらに肺高血圧症例中で特に肺動脈楔入圧（ＰＣＷＰ）が１５ｍｍＨｇ以下の場合を肺動脈性肺高血圧症（pulmonary arterial hypertension）と定義した。２０１３年のニース会議でもこの定義は変更されておらず、肺動脈平均圧２５ｍｍＨｇ以上が肺高血圧症の定義として維持されている。
【０００４】
肺動脈性肺高血圧症（以下「ＰＡＨ」と略記する場合がある）は肺動脈の中膜、内膜の過増殖を病態背景に有する疾患である。現在、肺高血圧症治療には、エンドセリン受容体拮抗薬（ボセンタン、アンブリセンタン等）、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）５阻害薬（シルデナフィル、タダラフィル等）、プロスタグランジンＩ２およびその誘導体（エポプロステノール、べラプロスト等）などが使用されている。しかし、これらの治療による予後の改善は十分とは言えず、ＰＡＨは難病の１つに指定されている。それゆえ、ＰＡＨの新しい治療法の開発が要請されている。
【０００５】
近年、炎症がＰＡＨの病態の進行に関わると報告されており、特に炎症性サイトカインであるＩＬ−６（インターロイキン−６）の関与が報告されている。例えば、ＩＬ−６の血中濃度が高い特発性ＰＡＨ患者は、ＩＬ−６の血中濃度が低い特発性ＰＡＨ患者と比べて、予後が不良であることが報告されている（非特許文献１）。また、低酸素（１０％Ｏ２）負荷による実験的肺高血圧症モデルマウスを用いた検討の結果、ＩＬ−６がその病態形成に重要であることが報告されている（非特許文献２、３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Soon E et al, Circulation 122, 920-927, 2010
【非特許文献２】Steiner MK et al, Circ. Res. 104, 236-244, 2009
【非特許文献３】Savale L et al, Respir Res. 10, 6, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、肺動脈性肺高血圧症の病態形成に関与する分子を見出し、当該分子を標的とする新規な肺高血圧症の予防および／または治療用医薬を提供することを課題とする。また、当該分子を標的とする肺高血圧症治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］ＩＬ−２１（インターロイキン−２１）からのシグナル伝達を阻害する物質を有効成分とする肺高血圧症の予防および／または治療用医薬。
［２］ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質が、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質である前記［１］に記載の医薬。
［３］ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質が、抗ＩＬ−２１抗体、抗ＩＬ−２１受容体抗体、ＩＬ−２１と結合するペプチドおよびＩＬ−２１受容体と結合するペプチドからなる群から選択される一種である前記［２］に記載の医薬。
［４］ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質が、抗ＩＬ−２１抗体である前記［３］に記載の医薬。
［５］ＩＬ−２１およびＩＬ−２１受容体を用いることを特徴とする肺高血圧症治療薬のスクリーニング方法。
［６］ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質を選択することを特徴とする前記［５］に記載の方法。
［７］ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質を選択することを特徴とする前記［５］に記載の方法。
［８］被験物質とＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体を発現する細胞を接触させる工程と、ＩＬ−２１受容体の下流のシグナル量を測定する工程と、被験物質を接触させない場合の前記細胞におけるシグナル量と比較して、シグナル量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする前記［６］に記載の方法。
［９］被験物質とＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体を接触させる工程と、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との結合レベルを測定する工程と、被験物質を接触させない場合の結合レベルと比較して、結合レベルを低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする前記［７］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、肺高血圧症の予防および／または治療に有用な新規な医薬を提供することができる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、肺高血圧症の治療薬として有用な物質を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】低酸素チェンバー内で飼育したマウスの肺におけるＩＬ−６遺伝子の経時的な発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である（**p<0.01）。
【図２】低酸素チェンバー内で飼育したマウスの肺の抗ＩＬ−６抗体による免疫組織化学染色像である。上段が細動脈（arteriole）、下段が小動脈（small artery）であり、左が正常酸素負荷、右が低酸素負荷である。
【図３】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の肺におけるＳＴＡＴ３のリン酸化状態を、低酸素負荷後２日目の肺を試料とし、抗Ｐ−ＳＴＡＴ３−Ｔｙｒ７０５抗体および抗ＳＴＡＴ３抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す図である。
【図４】抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与によるＩＬ−６シグナル阻害が低酸素誘発性肺高血圧症の病態に与える影響を検討するための実験プロトコールである。
【図５】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の低酸素負荷後２８日目における肺高血圧症の病態を検討した結果を示す図であり、Ａは右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の結果、Ｂはフルトン係数の結果、Ｃは中膜肥厚係数の結果、Ｄは肺の切片をエラスチカ・ワンギーソン染色し肺血管リモデリングを観察した染色像を示す図である。
【図６】低酸素負荷後７日目の肺における、Ｆ４／８０（マクロファージに限局して発現する糖たんぱく質）の発現を検討した結果を示す図であり、ＡおよびＢは抗Ｆ４／８０抗体によるウエスタンブロットの結果を示し、ＣおよびＤは抗ＣＤ６８抗体による免疫組織化学染色により陽性細胞を観察した結果を示す図である。
【図７】低酸素チェンバー内で飼育したマウスの肺から採取したマクロファージにおけるＦｉｚｚ１遺伝子（Ｍ２マクロファージマーカー）の経時的な発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である（*p<0.05、**p<0.01）。
【図８】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与群および正常酸素コントロール抗体投与群のマウスの肺から、低酸素負荷後４日目に採取したマクロファージのＭ２マーカー遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図であり、ＡはＦｉｚｚ１遺伝子、ＢはＡｒｇ１遺伝子、ＣはＣｈｉ３ｌ３遺伝子、ＤはＭｒｃ１遺伝子、ＥはＣｘｃｌ１２遺伝子の結果である。
【図９】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与群および正常酸素コントロール抗体投与群のマウスの肺から、低酸素負荷後４日目に採取したマクロファージのＭ１マーカー遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図であり、ＡはＮｏｓ２遺伝子、ＢはＩＬ−１２β遺伝子、ＣはＴＮＦ−α遺伝子の結果である。
【図１０】マウスから気管支肺胞洗浄によって採取したマクロファージを培養し、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−１６受容体またはその両方で刺激した後に、マクロファージのＭ２マーカー遺伝子およびＭ１マーカー遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図であり、ＡはＦｉｚｚ１遺伝子、ＢはＡｒｇ１遺伝子、ＣはＣｈｉ３ｌ３遺伝子、ＤはＭｒｃ１遺伝子、ＥはＣｘｃｌ１２遺伝子、ＦはＮｏｓ２遺伝子、ＧはＩＬ−１２β遺伝子、ＨはＴＮＦ−α遺伝子の結果である。
【図１１】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の低酸素負荷後３日目の肺におけるＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞の動態をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図であり、Ａは各群のフローサイトメトリー解析結果であり、ＢはＩＦＮ−γ発現ＣＤ４陽性細胞の頻度を示す図であり、ＣはＩＬ−４発現ＣＤ４陽性細胞の頻度を示す図である。
【図１２】低酸素チェンバー内で飼育したマウスの肺におけるＩＬ−１７遺伝子の経時的な発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である（*p<0.05）。
【図１３】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の低酸素負荷後２日目の肺におけるＴｈ１７細胞マーカー遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図であり、ＡはＩＬ−１７Ａ遺伝子、ＢはＲｏｒｃ遺伝子、ＣはＣｘｃｌ１遺伝子、ＤはＴＮＦ−α遺伝子の結果である。
【図１４】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の低酸素負荷後２日目の肺におけるＩＬ−１７発現量をウエスタンブロットにより解析した結果を示す図であり、Ａはバンドの写真、Ｂはバンドの濃さを数値化した図である。
【図１５】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の低酸素負荷後２日目の肺におけるＴｈ１７細胞の動態をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図であり、Ａは各群のフローサイトメトリー解析結果であり、ＢはＩＬ−１７発現ＣＤ４陽性細胞の頻度を示す図である。
【図１６】ＩＬ−１７シグナルの阻害が低酸素誘発性肺高血圧症の病態に与える影響を検討するための実験プロトコールである。
【図１７】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−１７Ａ中和抗体投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の低酸素負荷後２８日目における肺高血圧症の病態を検討した結果を示す図であり、Ａは右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の結果、Ｂはフルトン係数の結果を示す図である。
【図１８】低酸素チェンバー内で飼育したマウスの肺におけるＩＬ−２１遺伝子の経時的な発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である（*p<0.05）。
【図１９】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の低酸素負荷後２日目の肺におけるＩＬ−２１遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である。
【図２０】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の低酸素負荷後２日目の肺におけるＩＬ−２１発現量をウエスタンブロットにより解析した結果を示す図であり、Ａはバンドの写真、Ｂはバンドの濃さを数値化した図である。
【図２１】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の低酸素負荷後２日目の肺におけるＩＬ−２１産生Ｔｈ１７細胞の動態をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図であり、Ａは各群のフローサイトメトリー解析結果であり、ＢはＩＬ−２１発現ＣＤ４陽性細胞の頻度を示し、ＣはＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−２１発現ＣＤ４陽性細胞の頻度を示す図である。
【図２２】マウスから気管支肺胞洗浄によって採取したマクロファージを培養し、ＩＬ−２１で刺激した後に、マクロファージのＭ２マーカー遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図であり、ＡはＦｉｚｚ１遺伝子、ＢはＡｒｇ１遺伝子、ＣはＣｘｃｌ１２遺伝子の結果である。
【図２３】マウスから気管支肺胞洗浄によって採取したマクロファージを培養し、ＩＬ−２１で刺激した後に、マクロファージのＭ１マーカー遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図であり、ＡはＮｏｓ２遺伝子、ＢはＩＬ−１２β遺伝子、ＣはＴＮＦ−α遺伝子の結果である。
【図２４】ヒト肺動脈平滑筋細胞をＩＬ−２１で直接刺激して増殖に及ぼす効果を検討した結果を示す図である。
【図２５】ヒト肺動脈平滑筋細胞を、ＩＬ−２１存在下でマウス肺胞マクロファージを培養して得られた培養上清（マクロファージ馴化培地）を用いて培養した際に増殖に及ぼす効果を検討した結果を示す図である。
【図２６】ヒト肺動脈平滑筋細胞を、ＩＬ−２１存在下でマウス肺胞マクロファージを培養して得られた培養上清（マクロファージ馴化培地）に、Ｃｘｃｌ１２受容体であるＣＸＣＲ４の選択的阻害剤ＡＭＤ３１００を添加した培地を用いて培養した際に、増殖に及ぼす効果を検討した結果を示す図である。
【図２７】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗抗ＩＬ−２１中和抗体投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の低酸素負荷後７日目の肺におけるＦｉｚｚ１陽性細胞（Ｍ２マクロファージ）を、抗Ｆｉｚｚ１抗体による免疫組織化学染色により観察した結果を示す図であり、Ａは免疫組織化学染色像、Ｂは各群のＦｉｚｚ１陽性細胞を数示す図である。
【図２８】低酸素コントロール抗体投与群、低酸素抗抗ＩＬ−２１中和抗体投与群および正常酸素コントロール抗体投与群の低酸素負荷後７日目の肺におけるリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）陽性細胞を、抗リン酸化ヒストンＨ３抗体による免疫蛍光染色により観察した結果を示す図であり、Ａは免疫蛍光染色像、Ｂは各群のリン酸化ヒストンＨ３陽性細胞数を示す図である。
【図２９】低酸素野生型マウス群、低酸素ＩＬ−２１受容体遺伝子欠損マウス群、正常酸素野生型マウス群の低酸素負荷後２８日目における肺高血圧症の病態を検討した結果を示す図であり、Ａは右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の結果、Ｂはフルトン係数の結果、Ｃは中膜肥厚係数の結果を示す図である。
【図３０】低酸素による肺高血圧症発症の分子機構を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、ＩＬ−６シグナルの下流でヘルパーＴ細胞の１つのサブセットであるＴｈ１７細胞からＩＬ−２１が分泌されて、肺高血圧症の病態形成において重要な役割を持つことを見出した。すなわち、本発明者らは、低酸素条件下においてＩＬ−６シグナル依存性にＩＬ−２１がＴｈ１７細胞から分泌され、ＩＬ−２１の作用により、肺胞マクロファージがＭ２マクロファージ優位な状態に分化誘導されて、Ｍ２マクロファージから分泌される液性因子（ＳＤＦ−１など）により肺動脈平滑筋細胞が増殖して肺血管がリモデリングすることで肺高血圧症を発症することを明らかにした（図３０参照）。本発明者らは、ＩＬ−２１シグナルが欠損するＩＬ−２１受容体欠損（ＩＬ−２１ＲＫＯ）マウスを用いて、低酸素誘発性肺高血圧症モデルを作成したところ、野生型マウスと比較してＩＬ−２１ＲＫＯマウスは肺高血圧症の病態の指標である右室収縮期圧、右室/左室＋心室中隔重量比、肺動脈中膜肥厚率が有意に抑制されることを見出し、ＩＬ−２１からのシグナル伝達阻害によって肺高血圧症の病態抑制が可能であることを見出した。ＩＬ−２１からのシグナル伝達阻害による肺高血圧症治療の可能性を示唆する報告はこれまで全く無く、本発明者らの知見は、当該分野において革新的な成果と考えられる。
【００１２】
〔肺高血圧症の予防および／または治療用医薬〕
本発明は、ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質を有効成分とする肺高血圧症の予防および／または治療用医薬を提供する。本発明の医薬の有効成分は、ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質であればどのような物質でもよく、特に限定されないが、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質であることが好ましい。ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質としては、例えば、抗ＩＬ−２１抗体、抗ＩＬ−２１受容体抗体、ＩＬ−２１と結合するペプチド、ＩＬ−２１受容体と結合するペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体またはペプチドは、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１受容体と結合することにより、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害することができる抗体（中和抗体）またはペプチドであることが好ましい。ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害することができる抗体またはペプチドは、ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害することができ、肺高血圧症の病態形成を抑制することができる。
【００１３】
ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害することができる抗体として公知の抗体は、本発明の医薬の有効成分として好適に用いることができる。このような公知の抗ＩＬ−２１抗体および抗ＩＬ−２１受容体抗体としては、例えば「Rosanne Spolski and Warren J. Leonard, Interleukin-21: a double-edged sword with therapeutic potential, Nature Reviews Drug Discovery  13, 379-95 (2014)」のTable 1に記載の抗ＩＬ−２１抗体および抗ＩＬ−２１受容体抗体、ＷＯ２０００／０５３７６１に記載の抗ｚａｌｐｈａ１１リガンド抗体、ＷＯ２０１０／０５５３６６に記載の抗ＩＬ−２１抗体、ＷＯ２００４／０８３２４９に記載の抗ＩＬ−２１受容体抗体などが挙げられる。
【００１４】
ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害することができるペプチドとして公知のペプチドは、本発明の医薬の有効成分として好適に用いることができる。このような公知のＩＬ−２１と結合するペプチドおよびＩＬ−２１受容体と結合するペプチドとしては、例えば、ＷＯ２００３／０４０３１３、ＷＯ２００６／１１３３３１、ＷＯ２００８／０４９９２０、ＪＢＣ２８５、１２２２３−１２２３１，２０１０等に記載のＩＬ−２１と結合するペプチド、ＩＬ−２１受容体と結合するペプチドなどが挙げられる。
【００１５】
抗ＩＬ−２１抗体は、ＩＬ−２１またはそのフラグメントを抗原として作製することができる。抗原に用いるＩＬ−２１は、どのような動物由来のＩＬ−２１でもよいが、哺乳動物のＩＬ−２１であることが好ましく、ヒトのＩＬ−２１であることがより好ましい。抗原に用いるＩＬ−２１またはそのフラグメントは、ＩＬ−２１発現細胞の培養上清や細胞抽出物から公知の方法（例えば、アフィニティーカラム）で精製する方法や、公知の遺伝子組換え技術を用いて組換えタンパク質として作製する方法などにより取得することができる。主要な哺乳動物のＩＬ−２１をコードする遺伝子の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができる。例えば、ヒトＩＬ−２１をコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号はＡＦ２５４０６９であり、ヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列のアクセッション番号はＡＡＧ２９３４８である。
【００１６】
抗ＩＬ−２１受容体抗体は、ＩＬ−２１受容体またはそのフラグメントを抗原として作製することができる。抗原に用いるＩＬ−２１受容体は、どのような動物由来のＩＬ−２１受容体でもよいが、哺乳動物のＩＬ−２１受容体であることが好ましく、ヒトのＩＬ−２１受容体であることがより好ましい。抗原に用いるＩＬ−２１受容体またはそのフラグメントは、ＩＬ−２１受容体発現細胞の培養上清や細胞抽出物から公知の方法（例えば、アフィニティーカラム）で精製する方法や、公知の遺伝子組換え技術を用いて組換えタンパク質として作製する方法などにより取得することができる。主要な哺乳動物のＩＬ−２１受容体をコードする遺伝子の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができる。例えば、ヒトＩＬ−２１受容体をコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、ＡＦ２５４０６７であり、ヒトＩＬ−２１受容体のアミノ酸配列のアクセッション番号は、ＡＡＧ２９３４６である。
【００１７】
本発明の医薬の有効成分として用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。抗体はヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体が好ましい。
【００１８】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は公知の方法で作製することができる。ポリクローナル抗体は、例えば、抗原（ＩＬ−２１もしくはそのフラグメント、またはＩＬ−２１受容体もしくはそのフラグメント）をＰＢＳに溶解し、所望により通常のアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）を適量混合したものを免疫原として哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫し、常法に従い免疫した動物から血液を採取して血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより作製することができる。免疫方法は特に限定されないが、例えば、１回または適当な間隔で複数回、皮下注射または腹腔内注射する方法が好ましい。モノクローナル抗体は、例えば、上記免疫された哺乳動物から得た免疫細胞（例えば脾細胞）とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによって作製することができる。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え型のモノクローナル抗体を産生させることもできる。さらに、ファージディスプレイ法を用いてモノクローナル抗体を作製することもできる。得られた抗体がＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害することは、例えばＩＬ−２１がＩＬ−２１受容体に結合すると細胞分裂が誘導される細胞（マウス由来Ｂ９細胞株、Ｎ１１８６ヒトＴ細胞株など）を用いて、ＩＬ−２１依存性細胞増殖に対する阻害効果を測定することにより確認できる。
【００１９】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、ヒト抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域からなる抗体をいう。ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体のＣＤＲ（相補性決定領域：complementarity determining region）をヒト抗体のＣＤＲへ移植したものをいい、ＣＤＲ移植抗体、再構成抗体などとも称される。ヒト化抗体のＦＲ（フレームワーク領域：framework region）は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、ヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるＦＷのアミノ酸配列を置換してもよい。ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列は、公知のデータベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等）から取得することができる。
【００２０】
本発明の医薬の有効成分として用いるペプチドは、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により作製することができる。また、ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いて作製することができる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いる方法により作製することができる。ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステルのいずれであってもよい。また、ペプチドは、Ｎ末端のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているものであってもよい。ペプチドは塩を形成していてもよく、その塩としては、生理学的に許容される塩が好ましい。得られたペプチドがＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害することは、例えばＩＬ−２１がＩＬ−２１受容体に結合すると細胞分裂が誘導される細胞（マウス由来Ｂ９細胞株、Ｎ１１８６ヒトＴ細胞株など）を用いて、ＩＬ−２１依存性細胞増殖に対する阻害効果を測定することにより確認できる。
【００２１】
本発明の医薬は、ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質を有効成分とし、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、本発明の医薬の有効成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。直腸投与に用いられる坐剤は、本発明の医薬の有効成分を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。本発明の医薬の有効成分がペプチドまたは抗体である場合、薬学的に許容される担体とともに製剤化された注射剤または輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下または局所に投与することが好ましい。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
【００２２】
本発明の医薬には、有効成分を０．００１〜５０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％、更に好ましくは０．１〜１質量％含有することができる。
本発明の医薬の投与量は、目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約６５〜７０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり０．０２ｍｇ〜４０００ｍｇ程度が好ましく、０．１ｍｇ〜２００ｍｇ程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００２３】
〔スクリーニング方法〕
本発明は、肺高血圧症治療薬のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、ＩＬ−２１およびＩＬ−２１受容体を用いることを特徴とする。本発明のスクリーニング方法で用いるＩＬ−２１およびＩＬ−２１受容体は、全長タンパク質でもよく、機能断片でもよい。本発明のスクリーニング方法に用いるＩＬ−２１およびＩＬ−２１受容体は、どのような動物由来のＩＬ−２１でもよいが、哺乳動物のＩＬ−２１であることが好ましく、ヒトのＩＬ−２１であることがより好ましい。ＩＬ−２１およびＩＬ−２１受容体またはこれらのフラグメントは、上述の方法で作製することができる。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法において用いる被験物質は、特に限定されないが、例えば、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等を好ましく用いることができる。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法により、ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質を選択することが好ましい。ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害すれば、肺高血圧症の病態形成を抑制することができ、肺高血圧症を予防および／または治療することができる。本発明のスクリーニング方法により、ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質を選択する場合、例えば、被験物質とＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体を発現する細胞を接触させる工程と、ＩＬ−２１受容体の下流のシグナル量を測定する工程と、被験物質を接触させない場合の前記細胞におけるシグナル量と比較して、シグナル量を低下させる被験物質を選択する工程とを含む方法を好適に用いることができる。
【００２６】
ＩＬ−２１受容体を発現する細胞は、ＩＬ−２１との相互作用によりＩＬ−２１受容体の下流のシグナル量を測定可能なＩＬ−２１受容体発現細胞であればどのような細胞でもよい。このような細胞としては培養細胞が好ましく、初代培養細胞でもよく、細胞株でもよい。初代培養細胞として、例えばマウス肺胞マクロファージ、ヒトＢリンパ球細胞などが挙げられ、細胞株として、例えばヒトＮ１１８６Ｔ細胞株、マウスＢ９細胞株、ＩＬ−２１受容体を強制発現させたＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。これらはいずれも本発明のスクリーニング方法に好適に用いることができる。被験物質とＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体発現細胞を接触させる方法は、特に限定されず、例えば、培養細胞を用いる場合には、培地に被験物質とＩＬ−２１を添加する方法などが挙げられる。接触時間は特に限定されず、適宜選択すればよい。また、被験物質を接触させない対照群を設ける。
【００２７】
ＩＬ−２１受容体の下流のシグナル量は、例えばＩＬ−２１がＩＬ−２１受容体に結合すると細胞分裂が誘導される細胞（マウス由来Ｂ９細胞株、Ｎ１１８６ヒトＴ細胞株など）をＩＬ−２１受容体発現細胞として用いた場合には、用いたＩＬ−２１受容体発現細胞の細胞増殖を指標として測定することができる。細胞増殖の測定には、公知の細胞増殖方法を適宜選択して用いることができる。また、ＩＬ−２１依存性に活性化されるＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化のレベルを指標として測定することができる。ＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化のレベルは、例えばウエスタンブロット等の公知の方法を用いて検出、定量することができる。
【００２８】
被験物質と接触させない対照群におけるシグナル量と比較して、被験物質を接触させた場合にシグナル量が低下していれば、当該被験物質を肺高血圧症治療薬候補物質として選択すれることができる。対照群のシグナル量と比較して、統計学的に有意にシグナル量を低下させる被験物質を選択することが好ましく、シグナル量を５０％以下に低下させる被験物質を選択することがより好ましく、シグナル量を２５％以下に低下させる被験物質を選択することがさらに好ましい。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法により、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質を選択することが好ましい。ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害すれば、ＩＬ−２１からのシグナル伝達が阻害され、肺高血圧症の病態形成を抑制することができ、肺高血圧症を予防および／または治療することができる。本発明のスクリーニング方法により、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との相互作用を阻害する物質を選択する場合、例えば、被験物質とＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体を接触させる工程と、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との結合レベルを測定する工程と、被験物質を接触させない場合の結合レベルと比較して、結合レベルを低下させる被験物質を選択する工程とを含む方法を好適に用いることができる。
【００３０】
被験物質とＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体を接触させる接触させる方法は特に限定されない。例えば、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体とを含む反応系を準備し、ここに被験物質を添加する方法が挙げられる。接触時間、接触温度は特に限定されず、適宜選択すればよい。ＩＬ−２１受容体としてＩＬ−２１受容体発現細胞を用いてもよい。ＩＬ−２１受容体発現細胞を用いる場合は、当該細胞を培養している培地に被験物質とＩＬ−２１を添加する方法などが挙げられる。どのような系を用いる場合も、被験物質を接触させない対照群を設ける。
【００３１】
ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との結合レベルを確認する方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、蛍光偏光法、細胞増殖を測定する方法などを好適に用いることができる。ＥＬＩＳＡ法を用いる場合、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体のいずれか一方を固相化し、そこに他方および被験物質を添加して反応させ、ＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体の結合レベルを適当な一次抗体および二次抗体を用いて検出することができる。
【００３２】
被験物質を接触させない対照群におけるＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との結合レベルと比較して、被験物質を接触させた場合にＩＬ−２１とＩＬ−２１受容体との結合レベルが低下していれば、当該被験物質を目的物質として選択すれることができる。対照群の結合レベルと比較して、統計学的に有意に結合レベルを低下させる被験物質を選択することが好ましく、結合レベルを５０％以下に低下させる被験物質を選択することがより好ましく、結合レベルを２５％以下に低下させる被験物質を選択することがさらに好ましい。
【００３３】
本発明には、ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質の有効量を投与する工程を包含することを特徴とする肺高血圧症の予防および／または治療方法が含まれる。また、本発明には、肺高血圧症の予防および／または治療用医薬組成物を製造するための、ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質の使用が含まれる。また、本発明には、肺高血圧症の予防および／または治療に使用するための、ＩＬ−２１からのシグナル伝達を阻害する物質が含まれる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
〔実験材料と方法〕
（１）実験動物
全ての実験は８週齢の雄マウスを使用して行った。ＩＬ−２１受容体欠損（ＩＬ−２１ＲＫＯ）マウスを用いた実験以外の実験には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本ＳＬＣから購入）を用いた。ＩＬ−２１ＲＫＯ）マウスは米国ＮＩＨのＷａｒｒｅｎ Ｊ. Ｌｅｏｎａｒｄ博士から供与を受けた。ＩＬ−２１ＲＫＯマウスの遺伝子バックグラウンドはＣ５７ＢＬ／６である。
全てのマウスは明暗１２時間／１２時間サイクルで２４±１℃に調節した飼育室に収容し、標準的マウス飼料と水を自由に摂取させた。低酸素負荷をする際には、マウスを１０％酸素の低酸素チェンバー内に４週間収容した。ただし、低酸素チェンバー内の掃除のために週２回各５分間、マウスをチェンバー外（正常酸素環境）に置いた。低酸素チェンバーへ低酸素ガスを流量１Ｌ／分で持続的に供給した。実験では、低酸素コントロール抗体投与群および低酸素中和抗体投与群、ならびに正常酸素コントロール抗体投与群を設けた。１群の匹数は８〜１２匹とした。低酸素曝露後、マウスの血行動態測定を行った後にマウスを安楽死させ、心臓と肺を摘出して臓器重量を測定し、病理学的解析に供した。
【００３６】
（２）中和抗体を用いた肺高血圧症モデルマウスの治療実験
（２−１）抗ＩＬ−６受容体中和抗体
抗ＩＬ−６受容体中和抗体（ＭＲ１６−１）は、中外製薬株式会社から供与された。ＭＲ１６−１は、マウスＩＬ−６受容体に対するラットモノクローナルＩｇＧ１抗体である。ＭＲ１６−１によるＩＬ−６シグナル阻害効果を検討するために、最初にＭＲ１６−１またはコントロール抗体（purified rat non-immune isotype IgG; MP Biomedicals）２ｍｇを、それぞれ低酸素または正常酸素負荷の直前に静脈内投与し、その後は１週間に１回０．５ｍｇのＭＲ１６−１またはコントロール抗体を腹腔内投与した（図４参照）。
【００３７】
（２−２）ＩＬ−１７中和抗体
ＩＬ−１７中和抗体は、ラット抗マウスＩＬ−１７モノクローナル抗体（MAB421;R&D systems）を購入して使用した。抗ＩＬ−１７中和抗体またはコントロールＩｇＧ０．２ｍｇを、それぞれ低酸素または正常酸素の負荷１日前から負荷後４日目まで毎日、その後は負荷後７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８日目に腹腔内投与した（図１６参照）。
【００３８】
（２−３）ＩＬ−２１中和抗体
ＩＬ−２１中和抗体は、市販のラット抗マウスＩＬ−２１モノクローナル抗体（FFA21, eBioscience）を購入して使用した。抗ＩＬ−２１中和抗体またはアイソタイプコントロール抗体１００μｇを、それぞれ低酸素または正常酸素の負荷１日前、負荷当日、負荷後１，２，３，４日目に腹腔内投与した。
【００３９】
（３）右心カテーテルによる血行動態測定
ペントバルビタールナトリウム（60 mg/kg 腹腔内投与）と鎮痛薬の酒石酸ブトルファノール（0.1-0.4 mg/kg腹腔内投与）でマウスを麻酔した。さらに、ペントバルビタールナトリウム（15-20 mg/kg/h 腹腔内投与）と酒石酸ブトルファノール（0.03-0.05 mg/kg/h 腹腔内投与）を手術レベルの麻酔深度を維持するために定期的に追加投与した。直腸温モニターと連動したサーモスタット制御のヒートパッドを用いて、血行動態測定中のマウスの体温を３７〜３８℃に維持した。気管にカニュレーションを挿入し、マウス用の人工呼吸器（Minivent type 845; Harvard apparatus）を用いて肺を換気した。吸気ガスは高濃度酸素に調整され、人工呼吸器を１回換気量６μＬ／ｇ、頻度１７０〜１９０／分に設定した。
【００４０】
ポリエチレンチューブを右外頸静脈に挿入して右室まで進めて右室圧（ＲＶＰ）を測定した。ＲＶＰシグナルは圧トランスデューサー（MLT0670; ADインスツルメンツ）で検出し、圧アンプリファイアー（ML117; ADインスツルメンツ）でそのシグナルを中継して、Ｐｏｗｅｒ Ｌａｂシステム（ADインスツルメンツ）で連続的にサンプリングし、Ｃｈａｒｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ADインスツルメンツ）を用いてコンピューターに記録した。心拍数は右室収縮期のピークから得られた。心拍数が３００〜５００回／分の条件を満たす場合に測定を行った。３００回／分以下に心拍数が低下した場合は測定から除外した。全身の血圧は、コンピューター化されたテールカフシステム（BP-98A-L; ソフトロン）を用いて、意識のある状態のマウスから非侵襲的に測定した。
【００４１】
（４）ウエスタンブロット
凍結したマウス肺を溶解用緩衝液（50 mM HEPES, 100 mM sodium fluoride, 2 mM sodium orthovanadate, 4 mM EDTA, 1% Tween-20, 0.1% SDS, プロテアーゼ阻害薬カクテルComplete (Roche Applied Science)）中で、ポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。遠心分離により固形物を除去し、肺の溶解液を定法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ブロットはＥＣＬシステム（GEヘルスケア）を用いて発色させた。ウエスタンブロット解析では以下の抗体を使用した。抗Ｐ−ＳＴＡＴ３−Ｔｙｒ７０５抗体（CloneD3A7, Cell Signaling Technology）、抗ＳＴＡＴ３抗体（Clone 79D7, Cell Signaling Technology）、抗Ｆ４／８０抗体（MCA497GA, AbD Serotec）、抗ＲＥＬＭ ａｌｐｈａ （Ｆｉｚｚ１）抗体（ab39626, Abcam）、抗ＩＬ−１７抗体（sc-52567, Santa Cruz）および抗ＩＬ−２１抗体（MAB594, R&D Systems）。また、抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（T5201, Sigma-Aldrich）によるウエスタンブロットを内部コントロールとして用いた。
【００４２】
（５）マウス肺からのマクロファージの単離
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）は、０．９ｍＬのＰＢＳを３回気管支内に滴下して取得し、塊状の上皮細胞を除去するために４０μｍのセルストレーナーでろ過した。細胞培養実験のために、ＢＡＬＦから初代マウス肺胞マクロファージを得た。２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭを用いて、マクロファージを含む回収細胞を培養した。細胞を２４ウェル細胞培養プレートに１．５×１０５個／ウェルで播種し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで培養した。３７℃で４時間培養した後、血清を含有しないＤＭＥＭに培地交換し、種々のサイトカインによる刺激試験に供した。血清を含まない培地で一夜培養した後、組換えマウスＩＬ−２１（20ng/mL）、ＩＬ−６（20ng/mL）、可溶性ＩＬ−１６受容体（sIL6R、20ng/mL）（R&D systems）で１８時間刺激した。
【００４３】
（６）形態学的解析
血行動態測定後、マウスを過麻酔により安楽死させ、心臓を摘出した。心房を取り除き、右心室（ＲＶ）壁を左心室（ＬＶ）と中隔（ｓｅｐｔｕｍ）から分離した。水分を吸い取ったうえで組織重量を測定し、１００ｇの体重換算で標準化した。ＲＶと（ＬＶ＋ｓｅｐｔｕｍ）との重量比（フルトン係数）を、右室肥大の指標として用いた。
肺は、組織学的および免疫組織化学的な解析のために回収した。肺動脈と気管は、それぞれ４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）を定圧で（肺動脈は100cmH2O、気管は25cmH2O）潅流して、肺血管と気道を完全に拡張した状態で固定した。切除した肺は４％ＰＦＡにて４℃で一夜固定し、パラフィン包埋して４μｍで切片化した。肺血管の形態解析のために、切片にエラスチカ・ワンギーソン染色を施した。動脈の画像はＢＺ−９０００顕微鏡（Keyence）で撮像した。各処置群でランダムに選んだ５〜６匹の動物の肺切片を用いて形態解析を行った。肺血管リモデリングは肺実質にある肺動脈、終末細気管支レベルにある小動脈（small artery）、肺細葉レベルにある細小動脈(arteriole)で中膜肥厚係数（％ wall thickness）を測定して検討した。中膜肥厚係数は、内弾性板と外弾性板の間の距離を２倍して、外弾性板間の距離（血管の直径）で除したものに１００を乗じたものと定義される。一層の弾性板しかない血管では、弾性板と内皮下の基底膜との間の距離を計測した。中膜肥厚は、切り口がほぼ円形の血管のみを対象に解析した。肺動脈の直径はＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて測定した。中膜肥厚係数は１匹のマウスあたり少なくとも１０の肺小動脈と肺細小動脈で計算した。
【００４４】
（７）肺血管の組織学的、免疫組織化学的解析
免疫組織化学解析に用いるサンプルは４％ＰＦＡ／ＰＢＳで１時間固定した後、５〜２０％のスクロース入りＰＢＳで置換してから、ＯＣＴコンパウンド（Sakura）で包埋して凍結し、１０μｍ厚で切片化した。凍結切片はＰＢＳ処理してから、１％過酸化水素水／メタノールで３０分処理し、ＰＢＳＴ（PBS/0.1％Triton-X100）中に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または５％スキムミルクを含むブロッキング溶液で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴ中の１次抗体で４℃一晩インキュベートした。１次抗体には、抗ＣＤ６８抗体（1:200希釈; MCA1957GA, AbD Serotec）、抗ＲＥＬＭ ａｌｐｈａ（Ｆｉｚｚ１）抗体（1:100希釈; ab39626, Abcam）、抗ＩＬ−６抗体（1:200希釈; ab6672, Abcam）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈｉｓｔｏｎｅ−Ｈ３抗体（Ser10）（1:100希釈; 06-570, Upstate）、抗Ａｃｔｉｎ, ａｌｐｈａ−Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ−Ｃｙ３抗体（1:200希釈; C6198, Sigma-Aldrich）を用いた。次に、ＰＢＳＴで切片を洗浄し、蛍光標識２次抗体（1:200希釈; Alexa Fluor 488- or 546-結合; Invitrogen）またはＨＲＰ標識２次抗体（1:200希釈; 7074, Cell Signaling Technology）で室温１時間インキュベートした。必要に応じてＰＢＳＴで洗浄後、ＤＡＢ（Sigma）を用いて発色させた。染色像はＢＺ−９０００蛍光顕微鏡（Keyence）で撮像した。
【００４５】
（８）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析
マウスの肺組織をコラゲナーゼおよびＤＮａｓｅＩ（1U/mL;Takara）含有ＤＭＥＭ中に直接浸漬し、で３７℃４０分〜１時間インキュベートした。組織懸濁液を４０μｍのメッシュに通し、ペレットをＰＢＳ−Ｆ（2％FBS入りPBS）で再懸濁して、ＰＢＳ−Ｆで２回洗浄した。Ｆｃγレセプターをブロックするために、ＣＤ１６／３２で細胞をプレインキュベートし、洗浄後、全量１００μＬのＰＢＳ−Ｆで蛍光標識した抗ＣＤ４抗体と３０分間インキュベートした。
【００４６】
細胞内のサイトカインを染色するために、２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、１μｇ／ｍＬのｉｏｎｏｍｙｃｉｎおよび１０μｇのｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Sigma-Aldrich）を含む培地で５時間刺激した。ＣＤ４の表面染色後、細胞を固定してマウスＦｏｘｐ３ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（BD Pharmingen）で膜透過化処理した。２回洗浄した後、細胞を蛍光標識抗体（抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＬ−１７Ａ抗体、抗ＩＬ−２１抗体）で氷上３０分間染色した。細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（BD Biosciences）で解析し、続いてＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tristar）で解析した。用いた抗体は以下の通りであり、いずれもeBiosciences社の製品である。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５）、ＰＥ標識抗ＩＦＮ−γ抗体（ＸＭＧ１．２）、ＡＰＣ標識抗ＩＬ−４抗体（１１Ｂ１１）、ＡＰＣ標識抗ＩＬ−１７Ａ（ｅＢｉｏ１７Ｂ７）、ＰＥ標識抗ＩＬ−２１抗体（ｍｈａｌｘ２１）。
【００４７】
（９）定量ＲＴ−ＰＣＲによる解析
肺組織または肺胞マクロファージからＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen）を用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、８０ｎｇのトータルＲＮＡを１０分間５０℃で逆転写させ、９５℃で５分間変性した後、９５℃１０秒間と６０℃３０秒間を４０サイクル行った。蛍光データはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴを用いて収集し、解析した。用いた遺伝子とそのプライマーは以下の通りである。
Gapdh:  5’- TCTCCACACCTATGGTGCAA -3’ （配列番号１）
5’- CAAGAAACAGGGGAGCTGAG -3’ （配列番号２）
Fizz1:  5’- CCCTTCTCATCTGCATCTCC -3’ （配列番号３）
5’- AGGAGGCCCATCTGTTCATA -3’ （配列番号４）
Arg1:   5’- GTGAAGAACCCACGGTCTGT -3’ （配列番号５）
5’- CTGGTTGTCAGGGGAGTGTT -3’ （配列番号６）
Chi3I3: 5’- CCCACCAGGAAAGTACACAG -3’ （配列番号７）
5’- GAGGGAAATGTCTCTGGTGA -3’ （配列番号８）
Mrc1:   5’- CGCGAGGCAATTTTTAATCT -3’ （配列番号９）
5’- ATTTGCATTGCCCAGTAAGG -3’ （配列番号１０）
Cxcl12: 5’- GGTTCTTCGAGAGCCACATC -3’ （配列番号１１）
5’- TAATTTCGGGTCAATGCACA -3’ （配列番号１２）
Il17a:  5’- TCCAGAAGGCCCTCAGACTA -3’ （配列番号１３）
5’- CTCGACCCTGAAAGTGAAGG -3’ （配列番号１４）
Rorc:   5’- AACCAGGCATCCTGAACTTG -3’ （配列番号１５）
5’- CGTAGAAGGTCCTCCAGTCG -3’ （配列番号１６）
Il17ra: 5’- TGTACCTCGAGGGTGCAGA -3’  （配列番号１７）
5’- GGCCAGGATCTACCACAAAG -3’ （配列番号１８）
Cxcl1:  5’- GCCTATCGCCAATGAGCTG -3’  （配列番号１９）
5’- TCTGAACCAAGGGAGCTTCA -3’ （配列番号２０）
Cxcl5:  5’- CTGCCCCTTCCTCAGTCATA -3’ （配列番号２１）
5’- TGGATCCAGACAGACCTCCT -3’ （配列番号２２）
Il21:   5’- GGACAGTGGCCCATAAATCA -3’ （配列番号２３）
5’- CAGGGTTTGATGGCTTGAGT -3’ （配列番号２４）
Il21r:  5’- ATGCGCTTGTCTCAATTCCT -3’ （配列番号２５）
5’- CACGTAGTTGGAGGGTTCGT -3’ （配列番号２６）
Il6:    5’- TGTGCAATGGCAATTCTGAT -3’ （配列番号２７）
5’- GGTACTCCAGAAGACCAGAGGA -3’（配列番号２８）
Nos2:   5’- GCTCATGACATCGACCAGAA -3’ （配列番号２９）
5’- TGTTGCATTGGAAGTGAAGC -3’ （配列番号３０）
Il12b:  5’- AGGTCACACTGGACCAAAGG -3’ （配列番号３１）
5’- AGGGTACTCCCAGCTGACCT -3’ （配列番号３２）
Tnf-α: 5’- TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC -3’,（配列番号３３）
5’- GGTCTGGGCCATAGAACTGA -3’ （配列番号３４）
【００４８】
（１０）ヒト肺動脈平滑筋細胞の増殖アッセイ
ヒト肺動脈平滑筋細胞はＬｏｎｚａ社から購入した。ヒト肺動脈平滑筋細胞は最初から６世代までのものを使用した。ヒト肺動脈平滑筋細胞を９６ウェル細胞培養プレートに２×１０３個／１００μＬ／ウェルで播種した。培地には、５％ＦＢＳおよびＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔサプリメント（Lonza）を含むＳｍＢＭ（Lonza）を用いた。アッセイの２日前に、０．１％ＦＢＳ、１０ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＳｍＢＭに培地交換した。
【００４９】
マクロファージ馴化培地を得るために、正常酸素条件で飼育したマウスから気管支肺胞洗浄によって初代マウス肺胞マクロファージを採取し、プールし、遠心分離により洗浄し、細胞数をカウントして、９６ウェル細胞培養プレートに２×１０５個／１００μＬ／ウェルで播種した。培地には、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭを用いた。３７℃で４時間培養後、血清を含有しないＤＭＥＭに培地交換した。血清を含まない培地で一夜培養した後、組換えマウスＩＬ−２１（20ng/mL）で１８時間刺激し、ＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ単独で２４時間培養した。培地を回収し、０．２％ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭで２倍に希釈して、馴化培地として用いた。
【００５０】
この馴化培地を用いてヒト肺動脈平滑筋細胞を３日間培養した。必要であれば、馴化培地に、ＣＸＣＲ４の化学抑制剤であるＡＭＤ３１００（1μg/μL、Sigma）または溶媒（ＰＢＳ）を添加した。ヒト肺動脈平滑筋細胞を、組換えヒトＩＬ−２１で２４時間刺激した。細胞増殖はＭＴＳアッセイ（Cell Titer 96 kit、Promega）を用いて評価した。すなわち、各ウェル（１００μＬ）に２０μＬのＭＴＳ試薬を添加し、３７℃で２時間培養後にＯＤ４９０を測定した。
【００５１】
（１１）統計解析
全てのデータは平均値±標準誤差で表した。多群間の差は一元配置分散分析法それに続くＳｈｅｆｆｅ法を用いた事後比較により比較した。２群間の差の検定には、スチューデントｔ検定を用いた。Ｐ＜０．０５の場合に統計的有意差ありと判断した。
【００５２】
〔実験結果〕
実験１：低酸素負荷によるＣ５７ＢＬ６マウス肺でのＩＬ−６発現動態の検討
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを低酸素チェンバー（１０％酸素）内で飼育し、低酸素負荷後２、４、７、１４および２８日目のマウス肺からＲＮＡを回収し、ＩＬ−６ ｍＲＮＡの発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した。ＩＬ−６ ｍＲＮＡの発現量は低酸素負荷後２日目に負荷前の約８倍に増加したが、負荷後４日目には約５倍に下がり、負荷後７日目にはベースラインレベルに復帰した（図１）。
抗ＩＬ−６抗体による免疫組織化学染色によりＩＬ−６の発現部位を検討すると、低酸素負荷後２日目のマウス肺の細動脈（arteriole）、小動脈（small artery）の内皮細胞（内膜）と平滑筋細胞（中膜）に発現が強く見られた（図２）。
【００５３】
実験２：低酸素誘発性肺高血圧症モデルでの抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲ１６−１）によるＩＬ−６シグナル阻害の肺高血圧症病態に対する効果の検討
ＩＬ−６シグナルは主に転写因子ＳＴＡＴ３（signal transducer and activator of transcription 3）により媒介されるため、低酸素負荷後２日目の肺におけるＳＴＡＴ３活性化、すなわちＳＴＡＴ３の７０５チロシン残基のリン酸化状態をウエスタンブロットにより検討した。低酸素コントロール抗体投与群では、正常酸素コントロール抗体投与群よりＳＴＡＴ３チロシンリン酸化が亢進していたが、低酸素ＭＲ１６−１投与群では、そのリン酸化が正常酸素コントロール抗体投与群と同レベルに抑制されていた（図３）。この結果から、抗ＩＬ−６受容体抗体投与により、マウス肺でのＩＬ−６によるＳＴＡＴ３活性化が効率的に抑制されることが示された。
【００５４】
抗ＩＬ−６受容体抗体投与によるＩＬ−６シグナル阻害が低酸素誘発性肺高血圧症の病態に与える影響を検討するために、図４に示した実験プロトコールでコントロール抗体（ラットＩｇＧ）またはＭＲ１６−１を投与した。低酸素負荷後２８日目に右心カテーテルによりマウスの右室収縮期圧（right ventricular systolic pressure; RVSP）を測定し、その後マウスの心臓を摘出して右室肥大の度合いの指標であるフルトン係数、肺動脈のリモデリングの指標である中膜肥厚係数を計測した。結果を図５Ａ〜Ｄに示した。低酸素コントロール抗体投与群のマウスでは、右室収縮期圧、フルトン係数および中膜肥厚係数のいずれにおいても、正常酸素コントロール抗体投与群よりも有意な増加が認められたが、低酸素ＭＲ１６−１投与群ではその増加が有意に抑圧された。この結果より、抗ＩＬ−６受容体抗体投与により、ＩＬ−６シグナル阻害は低酸素誘発性ＰＡＨと肺血管のリモデリングが効果的に抑制されることが示された。
【００５５】
実験３：低酸素負荷による肺でのマクロファージの動態と抗ＩＬ−６受容体抗体によるＩＬ−６シグナル阻害の効果の検討
低酸素負荷後の肺における炎症細胞の浸潤を検討する目的で、マクロファージに焦点を当てて、その動態を検討した。低酸素負荷後７日目の肺における、Ｆ４／８０（マクロファージに限局して発現する糖たんぱく質）の発現を、ウエスタンブロットにより検討した結果を図６Ａ、Ｂに示した。低酸素コントロール抗体投与群では正常酸素コントロール抗体投与群に比して有意に増加していたが、低酸素ＭＲ１６−１投与群ではその増加が有意に抑制されていた。Ｆ４／８０に対する免疫組織化学染色でもウエスタンブロットと同様の結果が得られた（図６Ｃ、Ｄ）。以上の結果より、抗ＩＬ−６受容体抗体投与によるＩＬ−６シグナル阻害は、低酸素により誘導される肺へのマクロファージ浸潤を抑制することが示された。
【００５６】
低酸素負荷により肺のマクロファージはＭ２マクロファージ型の特徴を獲得することが報告されている（Vegardi E et al. Circulation 123, 1986-1995, 2011）。そこで、抗ＩＬ−６受容体抗体投与のマクロファージの極性形成への影響を検討した。２，４，７および１４日間低酸素（１０％酸素）に曝したＣ５７ＢＬ／６マウスから気管支肺胞洗浄液を採取して、その中のマクロファージの極性を定量ＲＴ−ＰＣＲで同定したところ、Ｍ２マクロファージマーカーの１つＦｉｚｚ１遺伝子の発現量は低酸素負荷後４日目にピークを示した（図７）。そこで、低酸素負荷後４日目に採取したマクロファージのＭ２マーカー遺伝子Ｆｉｚｚ１、Ａｒｇ１、Ｃｈｉ３ｌ３、Ｍｒｃ１およびＣｘｃｌ１２の発現状態をコントロール抗体投与群とＭＲ１６−１投与群とで比較したところ、低酸素コントロール投与群では、これらの遺伝子発現が正常酸素コントロール投与群より有意に増加していたが、低酸素ＭＲ１６−１投与群ではこれらの遺伝子の発現増加は有意に抑制されていた（図８Ａ〜Ｅ）。一方、Ｍ１マクロファージの代表的遺伝子であるＮｏｓ２、ＩＬ−１２βおよびＴＮＦ−αの発現量は２群間で有意な差を認めなかった（図９Ａ〜Ｃ）。
【００５７】
気管支肺胞洗浄によって採取したマクロファージをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−１６受容体をそれぞれ単独刺激または共刺激してもＭ１、Ｍ２マクロファージマーカーの発現量の変動は観察されなかったため（図１０Ａ〜Ｈ）、上記の低酸素誘発性マクロファージのＭ２極性化現象はＩＬ−６とＩＬ−６受容体による直接刺激で誘導されたものではないことが示唆された。
【００５８】
実験４：低酸素誘発性肺高血圧症モデルでの抗ＩＬ−６受容体抗体によるＩＬ−６シグナル阻害のＴｈ１７細胞とＴｈ１７サイトカインに対する効果の検討
マクロファージの極性形成にヘルパーＴ細胞が決定的な働きをすることが近年報告されている。そこで、低酸素負荷後３日目の肺組織でのＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞の動態に対して抗ＩＬ−６受容体抗体投与が影響を与えるかどうかを検討した。正常酸素コントロール投与群、低酸素コントロール投与群および低酸素ＭＲ１６−１投与群のマウスから試験開始３日目に肺を摘出し、上記実験材料と方法（８）に記載の方法で実験を行った。
ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞をＴｈ１マーカーのインターフェロン−γ、Ｔｈ２マーカーのＩＬ−４でＦＡＣＳ展開して、コントロール抗体投与群とＭＲ１６−１投与群とで比較したが、有意な差を認めなかった（図１１Ａ〜Ｃ）。
【００５９】
次に第３のヘルパーＴ細胞分画であるＴｈ１７細胞の動態について検討した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを低酸素チェンバーで飼育して、低酸素負荷後２、４、７、１４、２８日目の肺から回収したトータルＲＮＡを用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｔｈ１７細胞の代表的なマーカーであるＩＬ−１７ ｍＲＮＡの発現量を検討したところ、低酸素負荷後２日目に負荷前の約６倍に増加してピークを認めたが、負荷後７日目以降も発現は継続して上昇していた（図１２）。
【００６０】
次に、低酸素負荷後２日目の肺組織でのＴｈ１７細胞の動態に対する抗ＩＬ−６受容体抗体投与の影響を検討した。すなわち、低酸素負荷後２日目の肺から回収したトータルＲＮＡを用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＩＬ−１７Ａとその他のＴｈ１７細胞マーカー遺伝子であるＩＬ−１７Ａ、Ｒｏｒｃ（Ｒｏｒ−γｔ）、Ｃｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ５のｍＲＮＡの発現量を解析した。その結果、低酸素コントロール投与群では、正常酸素コントロール投与群と比較して有意な発現量の増加が観察されたが、低酸素ＭＲ１６−１投与群では、発現量の増加が有意に抑制されていた（図１３Ａ〜Ｄ）。また、ウエスタンブロットによりＩＬ−１７タンパク質の発現を検討すると同様の結果が得られた（図１４Ａ、Ｂ）。さらに、ＦＡＣＳによってＴｈ１７細胞の動態を確認したところ、低酸素コントロール投与群では、正常酸素コントロール投与群と比較して有意な増加が観察されたが、低酸素ＭＲ１６−１投与群では、低酸素負荷による増加が有意に抑制されていた（図１５Ａ、Ｂ）。
【００６１】
実験５：低酸素誘発性肺高血圧症モデルでの抗ＩＬ−１７Ａ中和抗体によるＩＬ−１７シグナル阻害の肺高血圧症病態に対する効果の検討
ＩＬ−１７シグナルの阻害が低酸素誘発性肺高血圧症の病態形成に与える影響を検討する目的で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを低酸素チェンバーで飼育して、図１６に示した実験プロトコールでコントロール抗体または抗ＩＬ−１７Ａ中和抗体を投与した。低酸素負荷後２８日目に右心カテーテルによりマウスの右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定して、マウスの心臓を摘出してフルトン係数を測定した。ＲＶＳＰおよびフルトン係数のどちらもコントロール抗体投与群と抗ＩＬ−１７Ａ中和抗体投与群との間に有意な差は観察されなかった（図１７Ａ、Ｂ）。なお、示してないが、コントロール抗体投与群と抗ＩＬ−１７Ａ中和抗体投与群とも、正常酸素コントロール抗体投与群と比較して有意な増加が観察され、低酸素誘発性ＰＡＨの病態が形成されていた。この結果より、ＩＬ−１７シグナル阻害は低酸素誘発性ＰＡＨの病態形成を抑制し得ないことが明らかになった。
【００６２】
実験６：低酸素誘発性肺高血圧症モデルでの抗ＩＬ−６受容体抗体によるＩＬ−６シグナル阻害のＩＬ−２１産生Ｔｈ１７細胞に対する効果の検討
次に、Ｔｈ１７細胞が産生するＴｈ１７サイトカインの１つであるＩＬ−２１に焦点を当てて検討した。低酸素負荷後２、４、７、１４、２８日目の肺から回収したトータルＲＮＡを用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＩＬ−２１ ｍＲＮＡの発現量を検討したところ、低酸素負荷後２日目に負荷前の約２倍に増加してピークを認め、負荷後７日目まで継続してその増加が観察されたが、１４日目以降はベースラインに復帰した（図１８）。
【００６３】
次に、正常酸素コントロール投与群、低酸素コントロール投与群および低酸素ＭＲ１６−１投与群について、実験開始２日目の肺から回収したトータルＲＮＡを用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＩＬ−２１ ｍＲＮＡの発現量を解析したところ、低酸素コントロール投与群では、正常酸素コントロール投与群と比較して有意な発現量の増加が観察されたが、低酸素ＭＲ１６−１投与群では、発現量の増加が有意に抑制されていた（図１９）。また、ウエスタンブロットによりＩＬ−１７タンパク質の発現を検討すると同様の結果が得られた（図２０Ａ、Ｂ）。さらに、ＦＡＣＳによってＩＬ−２１産生Ｔｈ１７細胞（ＣＤ４、ＩＬ−１７ａおよびＩＬ−２１の三重陽性細胞）の動態を確認したところ、低酸素コントロール投与群では、正常酸素コントロール投与群と比較して有意な増加が観察されたが、低酸素ＭＲ１６−１投与群では、低酸素負荷による増加が有意に抑制されていた（図２１Ａ〜Ｃ）。
【００６４】
実験７：ＩＬ−２１による肺胞マクロファージの極性化と肺動脈平滑筋細胞の増殖の検討
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから気管支肺胞洗浄で採取したマクロファージをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、一晩血清除去した後にＩＬ−２１存在下で１８時間培養してマクロファージマーカーの遺伝子発現を検討した。ＩＬ−２１刺激によりＭ２マクロファージマーカー遺伝子であるＦｉｚｚ１、Ａｒｇ１およびＣｘｃｌ１２のｍＲＮＡ発現量が約２倍に増加した（図２２Ａ〜Ｃ）のに対して、Ｍ１マクロファージマーカー遺伝子であるＮｏｓ２、ＩＬ−１２βおよびＴＮＦ−αの発現量には、有意な変化が見認められなかった（図２３Ａ〜Ｃ）。
【００６５】
次に、ＩＬ−２１と肺動脈平滑筋細胞の増殖の関連性を検討した。ヒト肺動脈平滑筋細胞に対してＩＬ−２１で直接刺激しても増殖応答は全く見られなかった（図２４）。一方、気管支肺胞洗浄で採取したマウス肺胞マクロファージを、ＩＬ−２１存在下で培養して、得られた培養上清（マクロファージ馴化培地）を用いてヒト肺動脈平滑筋細胞を培養すると、増殖促進効果が観察された（図２５）。この結果から、マクロファージにＩＬ−２１が作用して分泌された何らかの液性因子がヒト肺動脈平滑筋細胞に作用して増殖を促進することが示唆された。
【００６６】
Ｍ２マクロファージが分泌する液性因子の１つであるＣｘｃｌ１２は、肺動脈平滑筋の増殖に関連すること報告されている（Takeda Y et al. Nature 479, 122-126, 2011）。そこで、Ｃｘｃｌ１２の受容体であるＣＸＣＲ４の選択的阻害剤ＡＭＤ３１００をマクロファージ馴化培地に添加してヒト肺動脈平滑筋細胞を培養したところ、マクロファージ馴化培地による増殖促進作用が抑制された（図２６）。以上の結果から、ＩＬ−２１によるマクロファージのＭ２極性化が、肺動脈平滑筋細胞の増殖に必要であることが示唆された。
【００６７】
実験８：低酸素誘発性肺高血圧症モデルでの抗ＩＬ−２１抗体による肺高血圧症病態に対する効果の検討
低酸素誘発性肺高血圧症モデルでは、低酸素によりマウス肺動脈の内皮細胞や平滑筋細胞でＩＬ−６の発現が誘導され、その下流でＴｈ１７細胞からＩＬ−２１が分泌されることが肺高血圧症病態形成に決定的な役割をしていることが示唆された。そこで、我々は低酸素誘発性肺高血圧症モデルに対してコントロール抗体または抗ＩＬ−２１中和抗体を投与して、マクロファージのＭ２極性形成と肺動脈平滑筋細胞の増殖に対する効果を検討した。
【００６８】
低酸素負荷後７日目において、低酸素コントロール抗体投与群では、Ｍ２マクロファージマーカーであるＦｉｚｚ１陽性細胞が、正常酸素コントロール抗体投与群と比較して有意に増加していたが、低酸素ＩＬ−２１中和抗体投与群ではその増加は有意に抑制されていた（図２７Ａ、Ｂ）。また、低酸素負荷後７日目において、低酸素コントロール抗体投与群では、肺動脈平滑筋細胞の細胞分裂の指標となるリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）陽性細胞（図中矢印）が、正常酸素コントロール抗体投与群と比較して有意に増加していたが、低酸素ＩＬ−２１中和抗体投与群ではその増加が有意に抑制されていた（図２８Ａ、Ｂ）。これらの結果から、Ｔｈ１７細胞由来のＩＬ−２１がマクロファージのＭ２極性化を介して、肺動脈平滑筋細胞の増殖を正に調節していることが示唆された。
【００６９】
実験９：低酸素誘発性肺高血圧症モデルでのＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）遺伝子欠損（ＫＯ）による肺高血圧症病態に対する効果の検討
ＩＬ−２１受容体遺伝子欠損（ＩＬ−２１ＲＫＯ）マウス（Ozaki et al., Science 298, 1630-1634, 2002）と野生型マウスを用いて、それぞれ低酸素誘発性肺高血圧症モデルを作製し、肺高血圧症病態形成に対するＩＬ−２１Ｒ遺伝子欠損の影響を検討した。低酸素負荷後２８日目に右心カテーテルによりマウスのＲＶＳＰを測定し、その後マウスの心臓を摘出してフルトン係数を測定し、さらに肺組織をＥＶＧ染色して肺動脈の中膜肥厚係数を計測した。低酸素負荷した野生型マウスではＲＶＳＰ、フルトン係数および中膜肥厚係数のいずれにおいても、正常酸素環の野生型マウスに比べて有意な増加が認められたが、低酸素負荷したＩＬ−２１ＲＫＯマウスでは、これらの増加が有意に抑制された（図２９Ａ〜Ｃ）。この結果から、ＩＬ−２１シグナル阻害は低酸素誘発性高血圧症の病態形成過程を抑制し得ることが明らかになった。
【００７０】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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