(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなることを特徴とするニューロピリン(ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ)に特異的に結合する腫瘍浸透性ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、セマフォリン３Ａまたは３Ｆ由来ペプチド、またはその誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の腫瘍浸透性ペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の腫瘍浸透性ペプチドに、リンカーペプチドがさらに連結されたことを特徴とする腫瘍浸透性ペプチド。
【請求項４】
前記リンカーペプチドは、１〜５０のアミノ酸からなることを特徴とする請求項３に記載の腫瘍浸透性ペプチド。
【請求項５】
前記リンカーペプチドは、グリシン(ｇｌｙｃｉｎｅ)、セリン(ｓｅｒｉｎｅ)またはアラニン(ａｌａｎｉｎｅ)で構成されることを特徴とする請求項３に記載の腫瘍浸透性ペプチド。
【請求項６】
前記リンカーペプチドは、(ＧＡ)ｎまたは(ＧＧＧＧＳ)ｍのアミノ酸配列からなり、ここで、ｎ及びｍは、各々独立的に整数１〜２０であることを特徴とする請求項３に記載の腫瘍浸透性ペプチド。
【請求項７】
前記腫瘍浸透性ペプチドは、配列番号５〜１０からなる群より選択されるアミノ酸配列で構成されたことを特徴とする請求項３に記載の腫瘍浸透性ペプチド。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のうちいずれか１項に記載の腫瘍浸透性ペプチドが融合された融合タンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質は、抗体、抗体の断片、免疫グロブリン、ペプチド、酵素、成長因子(ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ)、サイトカイン(ｃｙｔｏｋｉｎｅ)、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、ホルモン、運搬タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、信号(ｓｉｇｎａｌｉｎｇ)タンパク質、保存タンパク質、膜タンパク質、膜貫通(ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ)タンパク質、内部(ｉｎｔｅｒｎａｌ)タンパク質、外部(ｅｘｔｅｒｎａｌ)タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、タンパク質複合体及び化学的に改質されたタンパク質からなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ニューロピリンに２価(ｂｉｖａｌｅｎｔ)で結合することを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記融合は、リンカーペプチドによることを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記タンパク質が抗体の場合、抗体断片は、抗体の重鎖不変領域(Ｆｃ)、抗原結合断片(ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ(Ｆａｂ))、単一鎖抗体断片(ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ(ｓｃＦｖ))、重鎖可変領域、軽鎖不変領域または軽鎖可変領域であることを特徴とする請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記タンパク質が抗体の場合、ペプチドは、抗体の重鎖不変領域(Ｆｃ)のＣ−末端に結合されることを特徴とする請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記結合は、リンカーペプチドによることを特徴とする請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群より選択されることを特徴とする請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜請求項７のうちいずれか１項に記載の腫瘍浸透性ペプチドが融合されたナノ粒子。
【請求項１７】
ニューロピリンに２価(ｂｉｖａｌｅｎｔ)で結合することを特徴とする請求項１６に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
前記融合は、リンカーペプチドによることを特徴とする請求項１６に記載のペプチドが融合されたナノ粒子。
【請求項１９】
請求項１〜請求項７のうちいずれか１項に記載の腫瘍浸透性ペプチドが融合されたリポソーム。
【請求項２０】
ニューロピリンに２価(ｂｉｖａｌｅｎｔ)で結合することを特徴とする請求項１９に記載のリポソーム。
【請求項２１】
前記融合は、リンカーペプチドによることを特徴とする請求項１９に記載のペプチドが融合されたリポソーム。
【請求項２２】
請求項１〜請求項７のうちいずれか１項に記載の腫瘍浸透性ペプチドが融合された小分子薬物。
【請求項２３】
配列番号１〜１０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドをコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項１〜請求項７のうちいずれか１項に記載のペプチドを含むことを特徴とする癌または新生血管関連疾患の治療または予防用薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項８に記載の融合タンパク質、請求項１６に記載のナノ粒子、請求項１９に記載のリポソームまたは請求項２２に記載の小分子薬物を含むことを特徴とする癌または新生血管関連疾病の治療または予防用薬学的組成物。
【請求項２６】
請求項１〜請求項７のうちいずれか１項に記載のペプチドを含む癌または新生血管関連疾患の診断用組成物。
【請求項２７】
請求項８に記載の融合タンパク質、請求項１６に記載のナノ粒子、請求項１９に記載のリポソームまたは請求項２２に記載の小分子薬物を含むことを特徴とする癌または新生血管関連疾患の診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニュ−ロピリンに特異的に結合する腫瘍浸透性ペプチド(ＴＰＰ：Ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ)に関する。
【０００２】
また、本発明は、前記腫瘍浸透性ペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームに関する。
【０００３】
また、本発明は、前記腫瘍浸透性ペプチドをコーディングするポリヌクレオチド、これを含む組換えベクター、このベクターに形質転換された宿主細胞及びこれを利用した腫瘍浸透性ペプチドの製造方法に関する。
【０００４】
また、本発明は、前記腫瘍浸透性ペプチドまたはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを含む癌の治療または予防用薬学的組成物に関する。
【０００５】
また、本発明は、前記腫瘍浸透性ペプチドまたはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを含む癌の診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００６】
治療用抗体開発の研究において、約３５年前から単一クローン抗体を生産することができるハイブリドーマ  (ｈｙｂｒｉｄｏｍａ)技術が開発された。また、マウス抗体の免疫原性(ＨＡＭＡ：Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ)を克服したキメラ/ヒト化抗体が１９９７年に最初で臨床許可を受けた。また、完全ヒト抗体であるヒュミラ(Ｈｕｍｉｒａ)抗体が２００３年度に許可を受けた。さらに、治療効能を増強させるために、二重特異抗体、抗体薬物結合体(ＡＤＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ)、重鎖不変領域(Ｆｃ)を改良した持続型抗体に対する研究が活発に行われている。
【０００７】
固形癌(ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ)治療用抗体の場合、多くの障壁により抗体が腫瘍組織内に伝達される過程で実際ヒトの生体内で腫瘍組織内に伝達される抗体の量は、注入した量の０.０１〜０.００１％に過ぎないので、抗体の治療効果が非常に制限的である(Ｔｈｕｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ.  ２００８)。したがって、抗体が腫瘍組織に選択的に蓄積されて腫瘍組織内部への高浸透性を有するようにする抗体技術開発は、抗体の治療効果を高めることができるので、非常に重要である。
【０００８】
抗体が組織によく浸透されない原因は、大きく１)抗体の本質的な特徴(サイズ、抗原結合特性など)(Ｔｈｕｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｎｅ  Ｗｉｔｔｒｕｐ、２０１２)、２)正常組織とは異なる腫瘍組織の微細生理学的特性の二つに起因すると見られる(Ｊａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｙｌｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ、２０１０)。
【０００９】
抗体は、１２個のドメインからなる１５０ｋＤａの大きい分子であるので、血液にある抗体が拡散または対流を通じて腫瘍組織に伝達されにくい(Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ.  ２００８)。したがって、これを克服するために実行された研究のうち、抗体の抗原と結合するドメインのみを投与する試みがあった。単一鎖抗体断片(ｓｃＦｖ、３０ｋＤａ)、重鎖可変部位(ＶＨＨ、１４ｋＤａ)の場合、抗体自体より一層多くの量が腫瘍組織内部に浸透した。但し、サイズが減少することによってその多くが腎臓に抜け、半減期(Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ)が短くなり抗体の効能があまり向上されなかった(Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ.  １９９８)。
【００１０】
抗体が組織内に多量分布することができないもう一つの原因は、抗体の抗原結合能である。固形癌治療用抗体は、腫瘍に関連された抗原(Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ)、または腫瘍に過発現されて腫瘍の生長に重要なターゲットに対して高い親和度を有する。抗体が特定抗原のある組織に到逹しても、抗原発現量が多い細胞からなった腫瘍組織では、抗体の高い親和度のために抗体が抗原に結合されたまま留まるようになる(Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｔａｎｎｏｃｋ、２０１０)。また、結合後に抗原と一緒に細胞内に流入(Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ)し、結果的に溶解(Ｌｙｓｉｓ)されて抗体が抗癌効果をまともに発揮することができない。これを克服するために、親和度を調節するか、半減期を増やすための研究が進行されている(Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ.  ２００７)。
【００１１】
抗体の腫瘍組織内部への浸透及び分布を妨害する腫瘍組織の生理学的性質は、大きく四つに分類されることができ、これは内皮障壁(Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ)、高い腫瘍組織間質液圧(ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ)、基質障壁(Ｓｔｒｏｍａｌ  ｉｍｐｅｄｉｍｅｎｔ)、上皮障壁(Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ)である。
【００１２】
内皮障壁(Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ)において、腫瘍は、急激な成長速度に応じて多量の栄養分の供給を受けるために、血管の周囲に位置した血管内皮細胞の生長を促進させる因子(Ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ)を過発現及び分泌する。これによって、新生血管が不均一に多量生成されて全体的な血流の速度が減少するようになる。これを克服するために、溢血(Ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ)を増加させて治療剤が血管から抜け出して組織に分布されるようにする方法がある。溢血と関連された炎症反応サイトカインであるＴＮＦ−αとＩＬ−２、溢血を促進する化学物質(Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｒｕｇ)  (Ｍａｒｃｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ.  ２０１３)、ｉＲＧＤペプチドなどと治療剤を併用投与(Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ)して腫瘍組織への薬物伝達を増進させた事例がある。しかし、このような試みは、抗体及び溢血促進剤の二つの物質を生産しなければならない点で実用化及び臨床実験に困難がある。また、ｉＲＧＤペプチドの場合は、多量(２ｍｇ/ｋｇあるいは４ｍｇ/ｋｇ)投与しなければならないという点で限界に到逹している(Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ.  ２０１０)。
【００１３】
高い腫瘍組織間質液圧(ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ)は、薬物が血管から組織に対流されるための圧力差が小さいかあるいは組織の流圧が血液の流圧より高い状況から起因する。これは、正常組織とは異なり、腫瘍組織にリンパ管が存在せず、組織内部の流体が蓄積されることによって主に発生し、非正常的な血管生成(ａｂｎｏｒｍａｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)にも寄与する。これを克服するために、血管内皮細胞の生長を促進させる因子、特に、血管内皮細胞生長因子−Ａ(ＶＥＧＦ−Ａ)の作用を阻んで新生血管生成を抑制して血管を正常化する方法、または血管の流圧を増加させる方法が試みられた。血管の流圧を増加させる方法は、血漿タンパク質であるアルブミンを抗体と併用投与して血管の浸透圧を増加させて抗体の腫瘍組織伝達効果を向上させた事例がある(Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ.  ２００９)。
【００１４】
基質障壁(Ｓｔｒｏｍａｌ  ｉｍｐｅｄｉｍｅｎｔ)は、抗体が微細血液に抜け出して組織に対流される際に会う細胞外基質障壁(Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｂａｒｒｉｅｒ)として、主にコラーゲン(Ｃｏｌｌａｇｅｎ)とヒアルロナン(Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ)で構成されている。細胞外基質によって腫瘍の模様は大きく影響を受ける。これにより薬物がよく分布される所とそうではない所の差が生じるため、薬物分布が不均一になる。また、細胞外基質の発現量が多くなると、固形癌圧迫(Ｓｏｌｉｄ  ｓｔｒｅｓｓ)で高い細胞密度による腫瘍組織流圧が上昇する。これを克服するめのアプローチとしては、腫瘍組織細胞の死滅を誘導して腫瘍組織内の細胞密度を減らす方法がある。また、腫瘍組織のコラーゲンを分解する酵素(Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ)を処理して固形癌圧迫を減らして対照群に比べて薬物伝達効果を約２倍高めた事例がある(Ｅｉｋｅｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ.  ２００４)。
【００１５】
上皮障壁(Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ)は、腫瘍組織上皮細胞の細胞−細胞間接着因子が稠密に細胞間隙を満たしているので、細胞の間に治療剤が拡散または対流されない。Ｅ−カドヘリン(Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ)は、このような細胞−細胞間接着の主要因子として知られている。このようなＥ−カドヘリンを減少させる物質がウイルス(Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−３)から発見されて、ウイルスを構成するタンパク質のうち、細胞のＥ−カドヘリンを減少させる活性を有した部分(ＪＯ−１)のみを抗体と併用投与して抗体の抗癌効果を増進させた事例がある(Ｂｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ.  ２０１１)。
【００１６】
現在までの、治療剤を腫瘍に容易に伝達するための方案を総合した結果、大部分の事例が治療剤とこれを腫瘍組織によく伝達するための物質を併用投与する程度にとどまっている。特に、ペプチドの場合、小さい分子のサイズに起因した薬物動態学的(ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ)に非常に短い半減期(ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ)のため、実際に患者に投与する量と投与回数が非常に多くなければならない。さらに、併用投与の不可避な過程である治療剤及び腫瘍透過作用物質を各々生産しなければならないので、産業的に実用可能性が低い。また、自然界に存在しないペプチド配列及びタンパク質は、免疫原性(ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ)を誘発する可能性が存在する。したがって、理想的には抗体それ自体としての組織侵透性を獲得して、一つの抗体分子の腫瘍組織内部への伝達効果を増進することができるフォーマットの開発が要求されている。
【００１７】
自然界に存在するタンパク質のうち血管内皮細胞生長因子−Ａ(ＶＥＧＦ−Ａ)は、血液の噴出(溢血)(Ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ)を誘導することでよく知られている。これは、他の名前で血管透過性因子(Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ)とも呼ばれる。この作用は、血管内皮細胞生長因子受容体(ＶＥＧＦＲ２)との結合により発生する現象として知られており、血管内皮細胞生長因子−Ａの突然変異実験において、血管内皮細胞生長因子受容体に結合しなくても血管透過性が増進される事例が示された。これは、血管内皮細胞生長因子−Ａの別の受容体が存在することを提示した(Ｓｔａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ.  １９９９)。同時代の他の研究陣は、この受容体がニューロピリン(ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ、ＮＲＰ)であることを明らかにした。
【００１８】
ニューロピリンは、初めてＸｅｎｏｐｕｓ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍで発見された。ニューロピリンには、膜透過性糖タンパク質(ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ)として、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２の二つの形態がある。ニューロピリンは、正常細胞においては非常に微弱に発現されるが、大部分の腫瘍血管内皮細胞、固形癌細胞、血液腫瘍細胞では過発現されている。ニューロピリンは、ＶＥＧＦファミリーリガンド結合によりＶＥＧＦＲｓ(ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ)のコレセプター(ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ)として作用する。特に、ＮＲＰ１は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３コレセプターと作用して多様なＶＥＧＦリガンドと結合することで、腫瘍組織において新血管生成(ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)、細胞生存、移動/付着(ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ＆  ａｄｈｅｓｉｏｎ)及び浸潤(ｉｎｖａｓｉｏｎ)などに寄与する。一方、ＮＲＰ２は、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３のコレセプターと作用してリンパ管の形成(ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)及び細胞付着(ａｄｈｅｓｉｏｎ)に寄与する。また、ＮＲＰ１/ＮＲＰ２(ＮＲＰ１/２)は、Ｐｌｅｘｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓのコレセプターと作用して分泌されたセマフォリン３系列リガンド(ｃｌａｓｓ  ３  ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ；Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３Ｃ、Ｓｅｍａ３Ｄ、Ｓｅｍａ３Ｅ、Ｓｅｍａ３Ｆ、Ｓｅｍａ３Ｇ)と結合する。ニューロピリンには機能性細胞内ドメインがなく、リガンドが結合しても単独では活性がなく、コレセプターであるＶＥＧＦ受容体またはプレキシン共受容体を通じて信号が伝達されることで知られている。Ｓｅｍａ３は、ニューロピリン、プレキシン受容体と２：２：２で結合して作用する。  
ニューロピリンとコレセプターの作用はニューロピリンのみをターゲッティングした時にも抑制される事例が報告されている。例えば、抗−ニューロピリン１抗体の場合、ＶＥＧＦＲ２とニューロピリン１に結合することで知られたＶＥＧＡ−Ａに対して、ニューロピリン１との結合にのみ競合的に結合することで、ＶＥＧＦＲ２の作用である新血管生成(ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)、細胞生存、移動/付着(ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ＆  ａｄｈｅｓｉｏｎ)及び浸潤(ｉｎｖａｓｉｏｎ)の抑制機能を有することが報告されている(Ｐａｎ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ.  ２００７)。抗−ニューロピリン２抗体の場合、ＶＥＧＦＲ３とニューロピリン２に同時に結合することで知られたＶＥＧＡ−Ｃに対して、ニューロピリン２との結合に競合的に結合し、ＶＥＧＦＲ３の作用であるリンパ管形成(ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)及び細胞付着(ａｄｈｅｓｉｏｎ)の抑制機能を有することが報告されている(Ｃａｕｎｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ.  ２００８)。
【００１９】
したがって、本発明者は、前記ニューロピリンとＳｅｍａ３ＡまたはＳｅｍａ３Ｆの相互作用による血管内皮細胞の透過性増進効果を有する最小限のＳｅｍａ３ＡまたはＳｅｍａ３Ｆ由来ペプチド部分を類推し、ニューロピリンと高い親和度を有する突然変異ペプチドを考案した。このペプチドがホモ二量体(ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ)で作用するＳｅｍａ３Ａ/Ｓｅｍａ３Ｆの機能を模倣するように、ペプチドを抗体の重鎖Ｃ−末端に融合させた２価形態を考案した。これは、抗体−ペプチドが融合された単一分子であり、抗体固有機能はそのまま維持させて、ニューロピリンとの結合を通じて抗体の腫瘍組織蓄積及び腫瘍組織内部への浸透を増進させて、追加的に、ニューロピリンターゲッティングを通じてニューロピリンコレセプターの作用を妨害し、新生血管生成の抑制効果を有する融合抗体技術を開発した。
【発明の概要】
【技術的解決課題】
【００２０】
本発明の目的は、ニューロピリンに特異的に結合する腫瘍浸透性ペプチド(ＴＰＰ：Ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ)を提供することにある。
【００２１】
本発明の他の目的は、前記腫瘍浸透性ペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを提供することにある。
【００２２】
本発明のまた他の目的は、前記ペプチドをコーディングするポリヌクレオチド、これを含む組換えベクター、このベクターに形質転換された宿主細胞及びこれを利用した腫瘍浸透性ペプチドの製造方法を提供することにある。
【００２３】
本発明のまた他の目的は、前記ペプチドまたはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを含む癌または新生血管関連疾病の治療または予防用薬学的組成物を提供することにある。
【００２４】
本発明のまた他の目的は、前記ペプチドまたはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを含む癌または新生血管関連疾病の診断用組成物を提供することにある。
【技術的解決方法】
【００２５】
本発明は、ニューロピリンに特異的に結合する腫瘍浸透性ペプチド(ＴＰＰ：Ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ)を提供する。
【００２６】
また、本発明は、前記腫瘍浸透性ペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを提供する。
【００２７】
また、本発明は、前記ペプチドをコーディングするポリヌクレオチド、これを含む組換えベクター、このベクターに形質転換された宿主細胞及びこれを利用した腫瘍浸透性ペプチドの製造方法を提供する。
【００２８】
また、本発明は、前記ペプチドまたはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを含む癌または新生血管関連疾病の治療または予防用薬学的組成物を提供する。
【００２９】
また、本発明は、前記ペプチドまたはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを含む癌または新生血管関連疾病の診断用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明による腫瘍浸透性ペプチド及びこのペプチドが融合されたタンパク質は、ニューロピリンと特異的に結合する特性を有することで、腫瘍組織に特異的に蓄積され、腫瘍血管内皮細胞の細胞間隔を広げて血管外への流出を増進させて、腫瘍組織内部でも細胞間隙を調整して腫瘍組織内部への浸透が顕著に増加する。また、Ｓｅｍａ３Ａ及びＳｅｍａ３Ｆ由来ペプチド及びこの野生型ペプチドのニューロピリンに対する親和度が顕著に向上されたペプチドが、抗体または抗体の断片に融合された融合抗体は、ペプチドが融合されない対照群抗体に比べて、同じ用量で投与された時、腫瘍組織に特異的に蓄積されて腫瘍組織内部への浸透が増加し、生体内で顕著に増強された腫瘍抑制活性を示す。
【００３１】
本発明による腫瘍浸透性ペプチドが融合された抗体またはその断片は、抗体固有の抗原結合能を維持しながら、腫瘍浸透性ペプチドが結合するニューロピリンとの結合性を有するようになる二重特異性抗体の特性を有し、これによって、高効率で融合抗体を腫瘍組織に蓄積して腫瘍組織内部への浸透を促進させる特性を有することで、腫瘍治療及び診断に高い効果を期待することができる。また、本発明による腫瘍浸透性ペプチドが融合された抗体の断片は、ＶＥＧＦ１６５Ａのニューロピリン１/２に対する結合を抑制し、ＶＥＧＦ１６５Ａによる新生血管形成を抑制する特性を有することで、血管形成と関連された糖尿病性網膜症、慢性関節リュウマチまたはアテローム性動脈硬化症など多様な疾病の治療及び診断にも活用が期待できる。
【００３２】
本発明によるペプチドが融合された抗体またはその断片は、ペプチドが融合されない野生型抗体と同様の生産収率を示し、大量生産が可能である。また、融合抗体またはその断片は、元の野生型抗体が有する抗原結合能、重鎖不変領域(Ｆｃ)の固有機能、すなわち、ＦｃＲｎ(ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ)との結合性が維持されて血液中で長い半減期(ｌｏｎｇ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ)を有するようになる。また、精製過程での結合部位(ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ及びｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ)が保存される利点があるだけではなく、ＦｃγＲｓ(Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ)との結合性が維持されて、抗体−依存性細胞毒性(ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ)及び補体−依存性細胞毒性(ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ)を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、セマフォリンとＶＥＧＦ１６５Ａ及びニューロピリン１及び２の構造を示した図である(Ａ)、(Ｂ)  セマフォリンは、大きく３種のドメインに区分される。Ｎ−末端から、セマフォリンドメインは、プレキシンと結合する部位であり、Ｉｇ−ｌｉｋｅ  Ｃ２  ｔｙｐｅ部分は、ニューロピリンａ１、ａ２と結合する部分であり、Ｂａｓｉｃ(Ｂａｓｉｃ  ｒｉｃｈ  ｒｅｇｉｏｎ)は、フーリン(Ｆｕｒｉｎ)により切られながらニューロピリンと結合できる部分が露出される部位である。(Ｃ)ＶＥＧＦ１６５Ａは、本来ＶＥＧＦの受容体ＶＥＧＦＲ２(以下、ＫＤＲ)に結合できる部位とニューロピリンと結合できるＨＢＤ(Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ)部位に分けられる。また、各セマフォリン及びＶＥＧＦ１６５Ａは、二量体(ｄｉｍｅｒ)を形成する界面(ｉｎｔｅｒｆａｃｅ)が存在する。(Ｄ)、(Ｅ)ニューロピリンは、大きく５種のドメインで構成されている。Ｎ−末端から、ａ１、ａ２ドメインは、ＣＵＢドメインに分類され、セマフォリンのＩｇ−ｌｉｋｅ  Ｃ２  ｔｙｐｅ部分が結合する部分である。特に、この部位は、プレキシンと複合体を形成してセマフォリン−プレキシンとの結合力を増加させる役目をする。ｂ１、ｂ２ドメインは、ＦＶ/ＶＩＩＩドメインに分類され、ＶＥＧＦやセマフォリン３系列のリガンドのＣ−末端部位が結合する。特に、この部分には、ヘパリンが結合できる部位が存在し、(＋)を示す残基が多いリガンドが容易に結合されるようにする。また、ＭＡＭは、オリゴマー化(ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ)を誘導し、ＴＭ(ｔｒａｎｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ)は、ニューロピリンが細胞表面に固定されるようにし、細胞内ドメイン(ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｄｏｍａｉｎ)には、ＰＤＺ(Ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ９５、Ｄｉｓｋ  ｌａｒｇｅ、Ｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ１)ドメインと結合できる部位が存在する。
【図２】図２は、セマフォリン３Ａ(Ｓｅｍａ３Ａ)のプレキシン(Ｐｌｅｘｉｎ)及びそのコレセプター(ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ)であるニューロピリンとの２：２：２複合体を示した図である。自然界に存在するセマフォリン３Ａ(Ｓｅｍａ３Ａ)及びセマフォリン３Ｆ(Ｓｅｍａ３Ｆ)は、ホモ二量体を形成し、Ｓｅｍａドメインは、プレキシンのＳｅｍａドメインと相互作用する。そして、セマフォリンのＣ−末端部位は、ニューロピリンのｂ１ドメインと相互作用する。
【図３】図３は、ニューロピリンとリガンド及びＴＰＰが融合された抗体重鎖不変領域(Ｆｃ−ＴＰＰ)の結合複合体を示した図である。各タンパク質は、二量体(ｄｉｍｅｒ)の形態でＣ−末端部位がニューロピリン(特に、ｂ１ドメイン)に結合すると予想した。
【図４】図４は、Ｆｃ−ＴＰＰを動物細胞で発現するためのベクターの模式図である。図４の(Ａ)は、宿主細胞に発現させるためのベクターの切断地図のＦｃ−ＴＰＰをエンコードする部分を示す。図４の(Ｂ)は、Ｆｃ−ＴＰＰを宿主細胞で発現させるためのベクターの全体切断地図を示す。
【図５】図５は、ＴＰＰが融合された抗体重鎖不変領域の図式と発現精製ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す(Ａ)抗体重鎖不変領域は、Ｎ−末端にヒンジ(ｈｉｎｇｅ)から始めて２個のジスルフィド結合を維持するようにし、二量体を容易に形成できるように製作した。ＣＨ３末端に４個のアミノ酸ＧＡＧＡあるいは１５個のアミノ酸(Ｇ４Ｓ)３のペプチドリンカーを利用してＴＰＰの外部露出程度を調節し、以後、２２個のセマフォリン由来配列及び改良した由来配列を追加して製作した。(Ｂ)ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で各クローンの二量体形成と精製時の純度を確認することができる。また、ＴＰＰを導入したことによる大きさの違いを確認することができる。
【図６】図６は、ＮＲＰ−１及び２のｂ１ｂ２ドメインに対して結合するか否かを確認するためのＥＬＩＳＡ実験結果である。ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ、ＮＲＰ−１及び２のｂ１ｂ２  ｄｏｍａｉｎをプレートに固定し、ビオチン化(ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ)されたペプチドとＦｃ−ＴＰＰクローンを１００ｎＭの濃度(ペプチドの場合１００ｎＭ、１μＭ)で結合させた後、抗−ビオチン−抗体ＡＰ(ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＡＰ)(ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)とｐＮＰＰ(ｐｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)で結合の有無を確認した。(Ａ)は、対照群及びセマフォリン３Ａ由来ペプチド及びＦｃ−ＴＰＰを比較して示し、(Ｂ)は、対照群及びセマフォリン３Ｆ由来ペプチド及びＦｃ−ＴＰＰを比較して示す。突然変異が誘導されたＡ２２ｐ、Ｆ２２ｐペプチド、Ｆｃ−Ａ２２ｐ/Ｆ２２ｐクローンで、ニューロピリン１/２に対する比較的強い結合が現われ、連結子がＧＡＧＡまたは(Ｇ４Ｓ)３であるクローンの中では、(Ｇ４Ｓ)３連結子を使用したクローンで僅かにより高い結合が現われた。また、対照群であるＶＥＧＦＲ２に対する結合は観察されなかった。これによって、ＴＰＰがニューロピリンに選択的に結合することが分かった。
【図７】図７は、Ｆｃ−ＴＰＰのうちニューロピリンに対する結合力が強く現われたクローンについて、ＶＥＧＦ１６５ＡまたはＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａとニューロピリンの結合に競合するかを確認し、ニューロピリンに対する結合特異性を確認した。Ｆｃ−１５Ａ２２ｐがＦｃ−１５−Ｆ２２ｐより高いリガンド濃度で競合することを確認した。
【図８】図８は、この実験でＴＰＰの生物学的同定のために使われた細胞株表面のニューロピリン１及び２の発現程度についてＦＡＣＳ分析を実行した結果である。ＰＰＣ−１(ヒト大膓癌細胞株)、ＦａＤｕ(ヒト頭頸部癌細胞株)、ＨＵＶＥＣ(ヒト血管内皮細胞株)、ＳＫ−ＯＶ−３(ヒト卵巣癌細胞株)で実験した結果、各細胞株にニューロピリン１とニューロピリン２が発現されたことを確認した。
【図９】図９の(Ａ)は、Ｆｃ−ＴＰＰが細胞表面に発現されたニューロピリン１及び２に結合するかを確認するため、ヒト卵巣癌細胞株(Ｓｋ−ＯＶ−３)でＦＡＣＳ分析をした結果である。上記生化学的同定結果(図６)から、ニューロピリン１及び２−ｂ１ｂ２ドメインに結合能を有しているＦｃ、Ｆｃ−１５Ａ２２、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐを同一条件で処理してその結合能を確認した。その結果、対照群であるＦｃとは異なり、Ｆｃ−１５Ａ２２ＰとＦｃ−１５Ｆ２２Ｐは細胞表面に結合することを確認した。図９の(Ｂ)は、(Ａ)の結果に基づいてＦｃ−ＴＰＰの結合能がニューロピリン１及び２に特異的であることを確認するために、精製されたニューロピリン１−ｂ１ｂ２ドメインとニューロピリン２−ｂ１ｂ２ドメインを各々Ｆｃ及びＦｃ−ＴＰＰと常温であらかじめ反応させた後、(Ａ)の実験と同一の方法で結合能を確認した結果を示した図である。その結果、ニューロピリン１及び２−ｂ１ｂ２ドメインをあらかじめ反応させたサンプルで、Ｆｃ−ＴＰＰの結合能が顕著に減少されることを確認した。これは、Ｆｃ−ＴＰＰがニューロピリン１及び２に特異的に結合することを意味する。図９の(Ｃ)及び(Ｄ)は、ニューロピリン１及び２に結合能を有するＶＥＧＦ１６５Ａとセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｆとの結合部位を比較するためにＦＡＣＳ分析を実行した結果である。その結果、Ｆｃ−ＴＰＰの結合能がＶＥＧＦ１６５により阻害されることを確認し、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐの場合は、セマフォリン３Ａにより結合能が阻害され、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐの場合は、セマフォリン３Ｆにより結合能が阻害されることを確認した。
【図１０】図１０は、Ｆｃ−ＴＰＰの細胞内へのニューロピリン１及び２の特異的な流入能を確認するため、共焦点顕微鏡(ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ)分析を通じてＦｃ−ＴＰＰとニューロピリン１及び２との共局在(ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ)を観察した結果である。ヒト前立腺癌細胞株であるＰＰＣ−１にＰＢＳ、Ｆｃ、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐを同一条件で処理し、細胞内に流入された程度を染色して観察した結果、Ｆｃとは異なり、Ｆｃ−１５Ａ２２ＰとＦｃ−１５Ｆ２２Ｐは、細胞内に流入されたことを観察した。また、これは細胞内のニューロピリン１及び２と共局在することから、Ｆｃ−ＴＰＰの流入能はニューロピリン１及び２に特異的であることを確認した。
【図１１】図１１の(Ａ)は、Ｆｃ−ＴＰＰのＨＵＶＥＣでの生物学的機構を調べるためのウエスタンブロット結果である。ＴＰＰの効果的なフォーマットを確認するために単一形態であるペプチドＡ２２、Ａ２２Ｐ、Ｆ２２、Ｆ２２Ｐを使用した。融合形態であるＦｃフォーマットの場合、ＴＰＰとのリンカーの長さによる比較のために、Ｆｃ−４Ａ２２、Ｆｃ−１５Ａ２２、Ｆｃ−１５ＡｓｓＰ、Ｆｃ−４Ｆ２２、Ｆｃ−１５Ｆ２２、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐを使用した。対照群としてＶＥＧＦ１６５Ａとセマフォリン３Ａの場合、セマフォリン３Ｆとは異なりＨＵＶＥＣで透過能の向上効果を示した。これは、ＶＥ−カドヘリンの減少により間接的に確認することができる。セマフォリン３Ａ由来ＴＰＰの場合、Ｆｃ−１５Ａ２２とＦｃ−１５Ａ２２Ｐは効果的にＶＥ−カドヘリンを減少させ、ＶＥＧＦ１６５Ａとセマフォリン３Ａも同じ結果を示した。また、セマフォリン３Ｆ由来ＴＰＰの場合、本来のリガンドであるセマフォリン３ＦはＶＥ−カドヘリンの変化を誘導しなかったが、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐは、同一条件でＶＥ−カドヘリンを減少させた。図１１の(Ｂ)は、ＴＰＰが血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)の透過能を向上させるかを確認するために、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ａｓｓａｙを実行した結果である。その結果、ＶＥＧＦ１６５、セマフォリン３Ａ、Ｆｃ−１５Ａ２２、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐが効果的に透過能を向上させた。一方、単一形態のペプチドＡ２２、Ａ２２Ｐ、Ｆ２２、Ｆ２２Ｐは、透過能を向上させることができなかった。これは、図１１の(Ａ)の結果と密接に関連する結果である。図１１の(Ｃ)は、実際腫瘍組織内のＴＰＰの浸透能を確認するための免疫組織化学(Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ)結果である。ヒト表皮癌細胞株であるＡ４３１をヌードマウスに移植してＴＰＰの効果を血管(ＣＤ３１)との二重染色を通じて確認した結果、ペプチドであるＡ２２Ｐおよび対照群であるＦｃとは異なり、Ｆｃ−１５Ａ２２及びＦｃ−１５Ａ２２Ｐの場合、腫瘍組織に選択的に到逹し、腫瘍組織内に効果的に浸透されることを確認した。図１１の(Ｄ)は、血管透過能の向上をＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ  ａｓｓａｙを通じて確認した結果である。その結果、上の結果と同様にＦｃとは異なりＦｃ−１５Ａ２２Ｐにより効果的に組織浸透能が向上されたことを確認した。図１１の(Ｅ)は、血管内皮細胞だけではなく、癌細胞での効果を確認するために、ヒト頭頸部癌細胞株であるＦａＤｕでＥ−カドヘリンの変化に対してウエスタンブロットを実行した結果である。その結果、セマフォリン３Ａ由来ＴＰＰの場合、セマフォリン３Ａとは異なり、Ｆｃ−１５Ａ２２とＦｃ−１５Ａ２２ＰのみがＥ−カドヘリンの減少を誘導した。セマフォリン３Ｆ由来ＴＰＰの場合、セマフォリン３Ｆと同様にＦｃ−１５Ｆ２２ＰのみがＥ−カドヘリンの減少を誘導した。また、ニューロピリン１と２のｓｉＲＮＡを共注入してニューロピリン１と２の発現を減少させた場合、Ｆｃ−ＴＰＰによるＥ−カドヘリンの減少が発生しないことを確認することで、Ｆｃ−ＴＰＰがニューロピリン特異的にＥ−カドヘリンの減少を誘導することを確認した。
【図１２】図１２の(Ａ)は、Ｆｃ−１５Ａ２２ＰのＶＥＧＦ１６５Ａによる血管内皮細胞のチューブ形成(ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ)が抑制されるかを確認するために、チューブ形成アッセイ(ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ)を実行した結果である。その結果、Ｆｃ−１５Ａ２２ＰがＶＥＧＦ１６５Ａにより誘導された内皮細胞のチューブ形成を効果的に抑制した。図１２の(Ｂ)は、マウスの生体内でＶＥＧＦ１６５Ａにより誘導された新生血管形成をＦｃ−１５Ａ２２Ｐが抑制することができるか否かを調べるために、インビボマトリゲルプラグアッセイ(ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｐｌｕｇ  ａｓｓａｙ)を実行した。また、免疫組織化学(Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ)を通じて抗ＣＤ３１抗体で血管の密度を測定した。その結果、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐは、マウス生体内でＶＥＧＦ１６５Ａにより誘導される血管の形成を抑制し得ることを確認した。
【図１３】図１３の(Ａ)は、単一クローン抗体の重鎖不変領域Ｃ−末端に、ニューロピリンと結合するペプチドがペプチドリンカーで連結された融合抗体(ｍＡｂ−ＴＰＰ)の模式図である。図１３の(Ｂ)は、前記(Ａ)の融合抗体がニューロピリン１あるいは２のｂ１ドメインに結合する模式図である。図１３の(Ｃ)は、前記融合抗体(ｍＡｂ−ＴＰＰ)を生体内に投入した時に予想される機構を示した模式図である。ペプチドが融合された抗体が腫瘍血管内皮及び多様な腫瘍細胞に過発現されたニューロピリン１または２に結合して腫瘍組織の選択的分布が増加し、腫瘍血管外への溢出(ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ)が増加し、腫瘍組織内部への浸透が増加される信号伝逹を誘導することで、融合抗体の腫瘍組織特異分布及び腫瘍組織内部への浸透を顕著に増加させることができる。
【図１４】図１４は、ＩｇＧ重鎖−ＴＰＰを発現するためのベクターの切断地図の例である。(Ａ)は、宿主細胞に発現させるためのベクターの切断地図のＩｇＧ重鎖−ＴＰＰをエンコードする部分を示す。(Ｂ)は、ＩｇＧ重鎖−ＴＰＰを宿主細胞に発現させるためのベクターの全体切断地図を示す。
【図１５】図１５は、各々ＩｇＧ軽鎖を動物細胞で発現するためのベクターの切断地図の例である。(Ａ)は、宿主細胞に発現させるためのベクターの切断地図のＩｇＧ軽鎖をエンコードする部分を示す。(Ｂ)は、ＩｇＧ軽鎖を宿主細胞に発現させるためのベクターの全体切断地図を示す。
【図１６】図１６の(Ａ)は、既存の抗−ＥＧＦＲ  ＩｇＧであるＣｅｔｕｘｉｍａｂ  ＩｇＧのＦｃのＣ−末端にＴＰＰを導入して構築された抗体を図式化した図である。(Ｂ)は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に共形質転換を通じて一時的に発現及び精製した後、還元性及び非還元性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でサイズ及び純度を分析した結果である。(Ｃ)は、Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡを通じてＣｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰが抗原であるＥＧＦＲとニューロピリンに同時に結合することができることを確認した結果である。
【図１７】図１７の(Ａ)は、既存の抗−ＨＥＲ２  ＩｇＧであるＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂにも前記実験と同様にＴＰＰを導入した抗体の図式化された図である。(Ｂ)は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に共形質転換を通じて一時的に発現及び精製した後、還元性及び非還元性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でサイズ及び純度を分析した結果である。(Ｃ)は、Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡによりＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰが抗原であるＨｅｒ２とニューロピリンに同時に結合することができることを確認した結果である。
【図１８】図１８は、ｍＡｂ及びｍＡｂ−ＴＰＰのＦｃＲｎに対するｐＨによる結合能が類似であるかを確認するためにＳＰＲ(Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ)を実行した結果である。ｍＡｂ(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ)はｐＨ６.０で結合曲線を示し、ｐＨ７.４では完全に結合しない野生型抗体の特性がｍＡｂ−ＴＰＰ(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰ)で維持されていることを証明する結果である。
【図１９】図１９の(Ａ)は、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰの腫瘍組織内浸透能を確認するためのＩＨＣ結果である。ＥＧＦＲが発現されているヒト頭頸部癌細胞株であるＦａＤｕとヒト表皮癌細胞株であるＡ４３１を各々ヌードマウスに移植し、ＣｅｔｕｘｉｍａｂとＣｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐを注入した後、組織内浸透能を血管(ＣＤ３１)との二重染色を通じて確認した。その結果、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの場合、血管周辺にのみ浸透されるが、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐの場合、血管から多少遠くの組織内部に浸透されたことを確認した(上部パネル)。これを、Ｉｍａｇｅ  Ｊを利用して定量化した(下部パネル)。図１９の(Ｂ)は、図１８の(Ａ)の条件のマウスから摘出した癌細胞組織からウエスタンブロットを実行した結果である。図１９の(Ｃ)は、向上された腫瘍組織内浸透性が実際に癌細胞抑制に影響を及ぼすかを確認するためのヌードマウスでの癌細胞成長阻害実験結果である。その結果、ＰＢＳに比べてＣｅｔｕｘｉｍａｂとＣｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐが癌細胞の成長を阻害し、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐが同一条件で一層効果的に抑制することを確認した。図１９の(Ｄ)は、前記実験時のマウスの重さを測定した結果である。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂを注入した実験群と比較した時、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐを注入した実験群のマウスの重さには大きい差がなかった。これは、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂに比べてＣｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐがマウスに他の毒性がないことを間接的に証明した結果である。
【図２０】図２０の(Ａ)は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰの腫瘍組織内浸透能を確認するためのＩＨＣ結果である。ＨＥＲ２が発現されているヒト卵巣癌細胞株であるＳＫ−ＯＶ−３をヌードマウスに移植し、ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐを注入した後、組織内浸透能を血管(ＣＤ３１)との二重染色を通じて確認した。その結果、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの場合、血管周辺にのみ浸透されるが、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐの場合、血管からより遠くの組織内部に浸透されたことを確認した(上部パネル)。これをＩｍａｇｅ  Ｊを利用して定量化した(下部パネル)。図２０の(Ｂ)は、図１９の(Ａ)の条件のマウスから摘出した癌細胞組織からウエスタンブロットを実行した結果である。図２０の(Ｃ)は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰの癌細胞成長抑制効果を確認するための実験結果である。その結果、同一条件でＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂに比べてＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐが効果的に癌細胞の成長抑制を誘導することを確認した。図２０の(Ｄ)は、前記実験時のマウスの重さを測定した結果である。Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを注入した実験群と比較した時、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐを注入した実験群のマウスの重さには大きい差がなかった。これは、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂに比べてＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐがマウスに他の毒性がないことを間接的に証明した結果である。
【図２１】図２１は、頭頸部癌細胞株であるＦａＤｕと卵巣癌細胞株であるＳＫ−ＯＶ−３をＦｃ−ＴＰＰとｍＡｂ−ＴＰＰで処理し、細胞成長阻害の程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した結果である。その結果、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ及びＣｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐは、ＦａＤｕ細胞株で約３０％程度細胞成長を抑制し、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ及びＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐは、ＳＫ−ＯＶ−３細胞株で約３０〜３５％程度の細胞成長を抑制した。各々のｍＡｂとｍＡｂ−ＴＰＰの間の差はないことが確認された。これと同様に、ＦｃとＦｃ−ＴＰＰは、ＦａＤｕとＳＫ−ＯＶ−３の両方で細胞成長阻害効果を有しなかった。これは、ニューロピリンによるＴＰＰの機構は、ＴＰＰ自体は直接的に癌細胞の成長には影響を及ばないものの、腫瘍組織内浸透能を増加させて効果を極大化させることを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本発明の例示的な説明に過ぎず、本発明の範囲が下記実施例により限定されるものではない。
【００３５】
実施例１：ニューロピリンに特異的に結合するセマフォリン３系列リガンド由来ペプチド及びニューロピリンと親和度が向上されたペプチドのデザイン
ニューロピリンに特異的に結合するペプチドを類推するために、ニューロピリンと結合することで知られたリガンド、すなわち、血管内皮成長因子−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ(Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ)、セマフォリン３−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ(Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ｃｌａｓｓ３)、線維芽細胞増殖因子−２(ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２：ＦＧＦ２)、肝細胞生長因子(Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ)及びガレクチン−１(ｇａｌｅｃｔｉｎ−１)の配列を分析した。
【００３６】
代表的に血管内皮成長因子−Ａとセマフォリン３系列(Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ｃｌａｓｓ３)の全体配列をＰｕｂＭｅｄ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅから選抜した。
【００３７】
図１の(Ａ)及び(Ｂ)に示したように、分泌セマフォリン３系列(Ｓｅｍａ３ｓ)リガンドは、セマフォリン３Ａから３Ｇまで明らかとなり、共通して３種のドメインに区分される。Ｎ−末端から見れば、セマドメインは、プレキシン(ｐｌｅｘｉｎ)と結合する部位であり、Ｉｇ−ｌｉｋｅ  Ｃ２  ｔｙｐｅ部分は、ニューロピリンａ１、ａ２と結合する部分であり、塩基性残基がリッチなドメイン(Ｂａｓｉｃ  ｒｉｃｈ  ｒｅｇｉｏｎ)は、フーリン(Ｆｕｒｉｎ)により切られながらニューロピリンと結合できる部分が露出される部位である。
【００３８】
図１の(Ｃ)に示したように、現在まで知られたニューロピリンのリガンドのうちニューロピリンに一番強く結合する血管内皮細胞生長因子−Ａ、特に、ＶＥＧＦ１６５Ａは、本来ＶＥＧＦの受容体であるＶＥＧＦＲ２に結合できる部位とニューロピリンと結合できるＨＢＤ(Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ)部位に分けられる。ＶＥＧＦ１６５Ａの場合、ニューロピリン１の結合時にニューロピリン１と結合する部分(１６０−１６５、Ｅｘｏｎ８ａ)以外にニューロピリン１に結合されたヘパリンと結合する(＋)を示す残基が多い部分(１１５−１５９、Ｅｘｏｎ７ａ、７ｂ)を一緒に含んでいる。(＋)を示す残基が多い部分は、細胞外壁にあるヘパリンに非特異的結合(ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ)を引き起こすことができる。また、ＶＥＧＦ１６５Ａは、Ｅｘｏｎ８に該当する部分にシステイン(Ｃｙｓｔｅｉｎｅ)を含んでいるので、抗体などのようなタンパク質に融合して発現した場合に、発現量の減少をもたらし得ると予想して排除した。
【００３９】
図１の(Ｄ)及び(Ｅ)に示したように、ニューロピリンは、大きく５種のドメインで構成されている。Ｎ−末端から、ａ１、ａ２ドメインは、ＣＵＢドメインに分類され、セマフォリンのＩｇ−ｌｉｋｅ  Ｃ２  ｔｙｐｅ部分が結合する部分である。特に、この部位は、プレキシンと複合体を形成してセマフォリン−プレキシンとの結合力を増加させる役目をする。ｂ１、ｂ２ドメインは、ＦＶ/ＶＩＩＩドメインに分類され、ＶＥＧＦやセマフォリン３系列のリガンドのＣ−末端部位が結合する。特に、この部分には、ヘパリンが結合できる部位が存在し、(＋)を示す残基が多いリガンドが容易に結合できる。また、ＭＡＭは、オリゴマー化(ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ)を誘導し、ＴＭ(ｔｒａｎｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ)は、ニューロピリンが細胞表面に固定されるようにし、細胞内ドメイン(ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｄｏｍａｉｎ)には、ＰＤＺ(Ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ９５、Ｄｉｓｋ  ｌａｒｇｅ、Ｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ１)ドメインと結合できる部位が存在する。
【００４０】
図２は、セマフォリン３Ａ(Ｓｅｍａ３Ａ)のプレキシン(Ｐｌｅｘｉｎ)及びそのコレセプター(ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ)であるニューロピリンとの２：２：２複合体を図式化した図である。自然界に存在するセマフォリン３Ａ(Ｓｅｍａ３Ａ)及びセマフォリン３Ｆ(Ｓｅｍａ３Ｆ)は、ホモ二量体を形成し、Ｓｅｍａドメインは、プレキシンのＳｅｍａドメインと相互作用する。そして、セマフォリンのＣ−末端部位は、ニューロピリンのｂ１ドメインと相互作用する。
【００４１】
図３は、ニューロピリンとリガンド及びＴＰＰが融合された抗体重鎖不変領域の結合複合体を図式化した図である。各タンパク質は、自然界に存在するセマフォリン３Ａ及び３Ｆと同様に二量体(ｄｉｍｅｒ)の形態でＣ−末端部位がニューロピリン(特に、ｂ１ドメイン)に結合すると予想した。
【００４２】
前記のような血管内皮成長因子−Ａとセマフォリン３系列の構造及び配列に基づいて配列類似性を分析した結果、Ｃ−末端に類似性を発見した。特に、セマフォリン３系列のニューロピリンとの結合は、フーリン(ｆｕｒｉｎ)により切開された(ｃｌｅａｖａｇｅ)後に活性があることが知られているが、ここで、ニューロピリンと相互作用をする血管内皮成長因子−ＡのＣ−末端と類似であることを発見した。これを下記表１に示した。下記表１は、ニューロピリン１及び２のリガンドであるセマフォリン３系列リガンド及び血管内皮成長因子−Ａ系列リガンドのＣ−末端部分のアミノ酸配列の類似性を分析した結果を示す。
【表１】
0006391676.tif 000002
【００４３】
前記配列類似性を基にして、セマフォリン３系列(Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ｃｌａｓｓ３)がフーリン(ｆｕｒｉｎ)により切開される部分のＣ−末端からＮ−末端に抗体に導入するための潜在的な配列を類推した。下記表２は、セマフォリン３系列リガンド及び血管内皮成長因子−Ａ系列リガンドの潜在的なニューロピリン結合部位のアミノ酸配列情報を示す。
【表２】
0006391676.tif 000003
【００４４】
この中で、ニューロピリンと結合能がよく知られたセマフォリン３Ａ(Ｓｅｍａ３Ａ)及びセマフォリン３Ｆ(Ｓｅｍａ３Ｆ)のＣ−末端の配列情報から各々２２個のアミノ酸を選抜した。すなわち、セマフォリン３Ａの塩基性ドメインの一部である残基７３９〜７６０から由来した２２個のアミノ酸を有したＡ２２ペプチド、セマフォリン３Ｆの塩基性ドメインの一部である残基７５８〜７７９から由来した２２個のアミノ酸を有したＦ２２ペプチドを選択した。
【００４５】
また、セマフォリン３系列リガンドと血管内皮成長因子−Ａ系列リガンドの潜在的なニューロピリン結合部位のアミノ酸配列を比較分析した結果、セマフォリン３系列リガンドは、特徴がＣ−末端から３番目であるアミノ酸残基が、アスパラギン(Ａｓｎ)で保存されていたのに対し、ニューロピリンに対する親和度が高い血管内皮成長因子−Ａ系列リガンドは、その残基がプロリン(Ｐｒｏ)で保存されていたことが分かる(表２)。特に、このプロリンは、ニューロピリンの相互作用においてドメインを特定構造に制限する役目を果たし、ニューロピリン−ドメイン間の親和度に大きく寄与をすることが予想された。このような論理で、ニューロピリンに対する親和度が向上されたペプチドを考案するために、Ａ２２、Ｆ２２の最後の３番目のアミノ酸をプロリンに置換したＡ２２ｐ、Ｆ２２ｐを考案した。下記表３は、ニューロピリンに結合するセマフォリン３Ａ及び３ＦのＣ−末端由来のアミノ酸配列を有したＡ２２、Ｆ２２及びニューロピリンに対する親和度を向上させるために考案したＡ２２ｐ、Ｆ２２ｐのペプチド配列及び配列番号を示す。Ａ２２ｐＦ２２ｐにおいて突然変異を誘導した部位は、下線で強調した。
【表３】
0006391676.tif 000004
【００４６】
実施例２：腫瘍浸透性ペプチドが抗体重鎖不変領域であるＦｃに融合されたＦｃ−ＴＰＰの構築
前記実施例１から考案された４種のペプチド配列をヒト抗体ＩｇＧ1の不変部位領域ＦｃのＣ−末端に導入するためのリンカーの長さを実験するために、グリシン、セリン及びアラニンで構成される４個のアミノ酸または１５個のアミノ酸からなるリンカーを選抜した。選抜されたリンカーは、ＧＡＧＡ及び(ＧＧＧＧＳ)３の配列を有する。これに対するクローン名称及び配列情報は、下記表４に示した。
【表４】
0006391676.tif 000005
【００４７】
表４のペプチド(配列番号５〜１０)をヒト抗体ＩｇＧ1の不変部位領域ＦｃのＣ−末端に融合させて２価形態でニューロピリンに結合する特性を有するようにした。これは、元々セマフォリン３Ａ、３Ｆリガンドがホモ二量体(ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ)でニューロピリンに付くことを模倣して、ターゲットであるニューロピリン受容体を活性化させるための考案である。
【００４８】
ＦｃのＣ−末端に考案された腫瘍浸透性ペプチド(ＴＰＰ)が融合されたＦｃ−ＴＰＰ発現ベクターを動物細胞発現ベクターにクローニングして具現した。図４の(Ａ)は、宿主細胞に発現させるためのベクターの切断地図のＦｃ−ＴＰＰをエンコードする部分を示す。図４の(Ｂ)は、Ｆｃ−ＴＰＰを宿主細胞に発現させるためのベクターの全体切断地図を示す。
【００４９】
Ｆｃ−ＴＰＰを製作する前に、Ｆｃを制限酵素ＡｓｃＩ/ＨｉｎｄＩＩＩでｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクターにクローニングした。各Ｆｃ−ＴＰＰは、Ｆｃを鋳型にしてＣＨ３から始める同一な正方向プライマーと、Ｃ−末端にＴＰＰを導入するための各々の逆方向(ｒｅｖｅｒｓｅ)プライマーでＰＣＲし、ＣＨ３から末端までの制限酵素ＢｓｒＧＩ/ＨｉｎｄＩＩＩで置換した。
【００５０】
前記のようにＦｃ及びＦｃ−ＴＰＰを発現すると、精製されたタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でＴＰＰが導入されたことによるサイズの相違が現われる(図５の(Ｂ))。Ｆｃをサイズに対する対照群として使用した。対照群で使用する２２個のアミノ酸からなるセマフォリン由来配列のビオチン−ペプチドは、化学的合成により製作された(Ｐｅｐｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ)。
【００５１】
実施例３：Ｆｃ−ＴＰＰの発現及び精製
ＨＥＫ２９３−Ｆシステム(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を使用して前記実施例２で構築された各々のＦｃ−ＴＰＰをエンコードするプラスミド(図４)を一時的トランスフェクション(ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ)を利用してタンパク質を発現させた。振とうフラスコで、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)で浮遊成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)をプラスミド及びポリエチレンアミン(Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ)(Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ)の混合物でトランスフェクションした。振とうフラスコ(Ｃｏｒｎｉｎｇ)に２００ｍＬトランスフェクションするとき、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を２.０Ｅ＊６細胞/ｍｌの密度で培地１００ｍｌに播種し、１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養した。その後、Ｆｃ−ＴＰＰをエンコードするプラスミドを１０ｍｌ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)に２５０μｇ(２.５μｇ/ｍｌ)に希釈し、ＰＥＩ７５０μｇ(７.５μｇ/ｍｌ)を希釈した１０ｍｌの培地と混合して室温で１０分間反応させた。その後、反応させた混合培地に前に１００ｍｌで播種した細胞を入れて４時間、１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養した後、残り１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地を追加して７日間培養した。上清液を７日後に採取した。
【００５２】
標準プロトコルを参照して、採取した細胞培養上清液からタンパク質を精製した。タンパク質Ａセファロースカラム(Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ)(ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)に抗体を適用し、ＰＢＳ(ｐＨ７.４)で洗浄した。０.１Ｍグリシン緩衝液を利用してｐＨ３.０で抗体を溶離した後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液を利用してサンプルをすぐ中和した。溶離した抗体分画は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ(５Ｋ  ＭＷＣＯ)を利用してＰＢＳ(ｐＨ７.４)で緩衝液を交換した後、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ(１０  ＭＷＣＯ)遠心分離濃縮機を使用して濃縮し、精製されたＦｃ−ＴＰＰは、２８０ｎｍ波長で吸光度と吸光係数を利用して定量した。精製されたＦｃ−ＴＰＰは、還元性及び非還元性条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。
【００５３】
図５の(Ａ)は、ＴＰＰが融合された抗体重鎖不変領域を図式化した図である。抗体重鎖不変領域は、Ｎ−末端に蝶番(ｈｉｎｇｅ)から始めて２個のジスルフィド結合を維持するようにして容易に二量体を形成できるように製作した。ＣＨ３末端にＧＡＧＡあるいは(ＧＧＧＧＳ)３のリンカーペプチドを利用してＴＰＰの外部露出程度を調節し、以後、２２個のセマフォリン由来配列を追加して製作した。
【００５４】
図５の(Ｂ)は、精製されたＦｃ−ＴＰＰの還元性及び非還元性条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを分析した結果である。図５の(Ｂ)では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから各クローンた二量体形成と純度を確認することができる。
【００５５】
下記表５は、精製されたＴＰＰ融合タンパク質の培養１Ｌ当たり生産されるタンパク質の収率を示す。３回実行して得た結果を統計処理した。±は、標準偏差値を示す。得られたタンパク質の収率は、野生型タンパク質と大きい差がなかった。
【表５】
0006391676.tif 000006
【００５６】
実施例４：Ｆｃ−ＴＰＰのニューロピリン１及び２のｂ１ｂ２ドメイン(Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ１/２−ｂ１ｂ１  ｄｏｍａｉｎ)に対する結合能の確認
精製されたＦｃ−ＴＰＰのニューロピリン１及び２のｂ１ｂ２ドメイン(Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ(ＮＲＰ)１/２−ｂ１ｂ１  ｄｏｍａｉｎ)に対する結合能をＥＬＩＳＡ(Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ)で確認した。
【００５７】
対照群として、ＶＥＧＦ１６５Ａ、セマフォリン３Ａ(２６−７６０)、セマフォリン３Ｆ(１９−７７９)及びＦｃと各々のＦｃ−ＴＰＰを、ＮＨＳ−ビオチンキット(ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)を利用してビオチン化(ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ)させた。
【００５８】
標的分子のニューロピリン１のｂ１ｂ２ドメイン(２７３−５８６)及びニューロピリン２のｂ１ｂ２ドメイン(２７５−５９５)と対照群であるＶＥＧＦＲ２(４６−７５３)を、９６ｗｅｌｌ  ＥＩＡ/ＲＩＡプレート(ＣＯＳＴＡＲ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎ.,  ＵＳＡ)に１μｇずつ１時間常温で結合させた後、０.１％のＰＢＳＴ(０.１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７.４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)で１０分間３回洗浄した。５％スキムミルク(５％  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ、ｐＨ７.４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)で１時間結合した後、０.１％のＰＢＳＴ(０.１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７.４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,ＵＳＡ)で１０分間３回洗浄した。対照群としてビオチン化されたＶＥＧＦ１６５Ａ、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｆ及びＦｃ、実験群として各々のＦｃ−ＴＰＰ、ＴＰＰペプチドを、１００ｎＭあるいはペプチド１μＭの濃度で結合させた後、０.１％のＰＢＳＴで１０分間３回洗浄した。ＡＰが接合された抗ビオチン抗体(ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｎ  ｍＡｂ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ)を結合させた後、ｐＮＰＰ(ｐｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)で反応させて、４０５ｎｍの吸光度を定量した。ＡＰ−ｐＮＰＰを３０分間反応させて得たＥＬＩＳＡ結果を通じて発現精製したＦｃ−ＴＰＰのニューロピリン１及び２のｂ１ｂ２ドメインに対する結合能を確認した。
【００５９】
図６は、ＮＲＰ−１び２のｂ１ｂ２ドメインに対する結合の有無を確認するためのＥＬＩＳＡ実験結果である。(Ａ)は、対照群及びセマフォリン３Ａ由来ペプチド及びＦｃ−ＴＰＰを比較して示し、(Ｂ)は、対照群及びセマフォリン３Ｆ由来ペプチド及びＦｃ−ＴＰＰを比較して示す。突然変異が誘導されたＡ２２ｐ、Ｆ２２ｐペプチド、Ｆｃ−Ａ２２ｐ/Ｆ２２ｐクローンから比較的強い結合が現われた。連結子がＧＡＧＡ、(Ｇ４Ｓ)３であるクローンの中で(Ｇ４Ｓ)３連結子を使用したクローンにおいて、僅かにより高い結合が明らかとなった。
【００６０】
実施例５：Ｆｃ−ＴＰＰのニューロピリン１及び２のｂ１ｂ２ドメインに対する結合特異性の確認
Ｆｃ−ＴＰＰのニューロピリン１及び２のｂ１ｂ２ドメインに対する結合特異性を確認するために、対照群である血管内皮細胞生長因子(ＶＥＧＦ１６５Ａ)及びセマフォリン３Ａとの競合結合ＥＬＩＳＡを実行した。
【００６１】
具体的には、ニューロピリン１のｂ１ｂ２ドメイン(２７３〜５８６)、ニューロピリン２のｂ１ｂ２ドメイン(２７５〜５９５)を９６ウェルＥＩＡ/ＲＩＡプレート(ＣＯＳＴＡＲ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎ.,  ＵＳＡ)に１時間常温で結合させた後、０.１％のＰＢＳＴ(０.１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)で１０分間３回洗浄した。５％のＳｋｉｍ  ｍｉｌｋ(５％  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ、ｐＨ７.４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)で１時間結合した後、０.１％のＰＢＳＴ(０.１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７.４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,ＵＳＡ)で１０分間３回洗浄した。高い結合力を示したＦｃ−１５Ａ２２ｐ(３０ｎＭ)、Ｆｃ−１５Ｆ２２ｐ(３０ｎＭ)と血管内皮細胞生長因子(ＶＥＧＦ１６５Ａ)(２５ｎＭで０.０２ｎＭ)、セマフォリン３Ａ(３.３μＭで０.２ｎＭ)を濃度別に交ぜた混合物を生成し、ニューロピリン１び２−ｂ１ｂ２ドメインに結合させた。ＡＰが接合された抗ヒト抗体(ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｍＡｂ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ)を結合させた後、ｐＮＰＰ(ｐｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)で反応させて、４０５ｎｍの吸光度を定量した。ＥＬＩＳＡ結果を通じて血管内皮細胞生長因子(ＶＥＧＦ１６５Ａ)、セマフォリン３ＡとＦｃ−ＴＰＰがニューロピリン１及び２のｂ１ｂ２ドメインに対する結合に競合することを確認した。
【００６２】
図７は、Ｆｃ−ＴＰＰのうちニューロピリンに対する結合力が強く現われたクローンに対して、ＶＥＧＦ１６５Ａ及びセマフォリン３Ａとニューロピリンに競合して結合するかを確認した結果である。図７に示したように、Ｆｃ−１５Ａ２２ｐがＦｃ−１５Ｆ２２ｐより高いリガンドの濃度で競合することを確認した。
【００６３】
実施例６：Ｆｃ−ＴＰＰのニューロピリン１及び２のｂ１ｂ２ドメインに対する結合力の確認
Ｆｃ−ＴＰＰのニューロピリン１及び２のｂ１ｂ２ドメインに対する結合力をより詳しく確認するために、ＳＰＲ(Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ)を実行した。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００器機(ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)を利用し、ＥＬＩＳＡ上で結合能が確認されたＶＥＧＦ１６５、セマフォリン３Ｆ、セマフォリン３Ａ、Ｆｃ−４Ａ２２、Ｆｃ−４Ｆ２２、Ｆｃ−１５Ａ２２、Ｆｃ−１５Ｆ２２、Ｆｃ−１５Ａ２２ｐ及びＦｃ−１５Ｆ２２ｐのニューロピリン１及び２のｂ１ｂ２ドメインに対する結合力を分析した。
【００６４】
具体的には、ニューロピリン１及び２のｂ１ｂ２ドメインを各々１０ｍＭ  Ｎａ−アセテート緩衝液(ｐＨ４.０)に希釈し、ＣＭ５センサーチップ(ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ)に約１０００  ｒｅｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔｓ(ＲＵ)固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液[１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３ｍＭ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、ａｎｄ  ０.００５％  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０(ｐＨ７.４)、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ]を３０μｌ/ｍｉｎの流速で分析し、ＶＥＧＦ１６５を８０ｎＭで５ｎＭ、セマフォリン３Ｆ及びセマフォリン３Ａを１μＭで６２.５ｎＭ、Ｆｃ−ＴＰＰを２５μＭで１.５６２５μＭの濃度で分析した。結合、解離分析した後、ＣＭ５チップの再生(ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ)は、緩衝液(２０ｍＭ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ１０.０)を３０μｌ/ｍｉｎの流速で１分間流して施行した。結合３分、解離３分から得られた各センサーグラム(ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ)は、空白セル(Ｂｌａｎｋ  ｃｅｌｌ)と比較して規格化(ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ)及び減算(Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ)して親和度を計算した。
【００６５】
表６は、ＳＰＲ(Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ)を利用した、Ｓｅｍａ３Ａ由来Ａ２２ペプチド及び単一突然変異Ａ２２ｐの、Ｆｃ−ＴＰＰの形態でのニューロピリン１、２(ＮＲＰ１及び２)のｂ１ｂ２ドメインに対する親和度分析結果を示す。表７は、Ｓｅｍａ３Ｆ由来Ｆ２２ペプチド及び単一突然変異Ｆ２２ｐの、Ｆｃ−ＴＰＰの形態でのニューロピリン１、２(ＮＲＰ１及び２)のｂ１ｂ２ドメインに対する親和度分析結果を示す。
【００６６】
表６及び表７に示したように、連結子がＧＡＧＡであるクローンと(ＧＧＧＧＳ)３であるクローン間の親和度の差は、Ｆｃ−４Ａ２２とＦｃ−１５Ａ２２を比較した場合、１０倍程度親和度の差があった。Pｒｏ突然変異クローンの親和度は、野生型ニューロピリン結合ペプチドを融合したものより約１００倍高い親和度を有することを示した。分析時に少なくとも５個のセンサーグラムを利用して分析し、２回実行して得た結果を統計処理した。±は、独立的な実験結果の標準偏差値を示す。
【表６】
0006391676.tif 000007
【表７】
0006391676.tif 000008
【００６７】
実施例７：Ｆｃ−ＴＰＰの細胞表面に発現されたニューロピリン１及び２との特異的結合の確認
まず、この実験においてＴＰＰの生物学的同定のために使用された細胞株表面のニューロピリン１及び２の発現程度を確認するために、ＦＡＣＳ分析を実行した。
【００６８】
図８は、細胞株にニューロピルリン１及び２が発現されることを示した図である。図８に示したように、ＰＰＣ−１(ヒト大膓癌細胞株)、ＦａＤｕ(ヒト頭頸部癌細胞株)、ＨＵＶＥＣ(ヒト血管内皮細胞株)、ＳＫ−ＯＶ−３(ヒト卵巣癌細胞株)で実験した結果、各細胞株にニューロピリン１とニューロピリン２が発現されることを確認した。
【００６９】
Ｆｃ−ＴＰＰが細胞表面に発現されたニューロピリン１及び２とも結合するかどうかを確認するために、ＦＡＣＳ分析を実行した。この時、ニューロピリン１及び２に特異的に結合することが確認されたＦｃ−１５Ａ２２ＰとＦｃ−１５Ｆ２２Ｐを使用した。
【００７０】
具体的には、ヒト卵巣癌細胞株(ＳＫ−ＯＶ−３)を５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した後、各サンプル当たり１ｘ１０５個の細胞を２％のＢＳＡが添加されたＰＢＳ緩衝液に再懸濁してＦＡＣＳ  ｔｕｂｅに移して実験を実行した。緩衝液にＦｃ、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐを各々１μＭに希釈して４℃で１時間反応させた後、Ｆｃを認識するＦＩＴＣ結合抗体(Ｓｉｇｍａ)を利用して細胞に結合されたタンパク質を染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ(ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)で分析した。
【００７１】
図９は、Ｆｃ−ＴＰＰが細胞表面に発現されたニューロピリン１及び２に結合するかどうかを確認するため、ヒト前立腺癌細胞株(ＰＰＣ−１)でＦＡＣＳ分析した結果である。図９の(Ａ)に示したように、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐの場合、Ｆｃとは異なりＰＰＣ−１細胞表面に結合することを確認した。
【００７２】
また、このような結合能がニューロピリン１及び２に特異的であるかどうかを確認するために、前記実験において使用したニューロピリン１及び２のｂ１ｂ２ドメイン２μＭを、Ｆｃ、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐ  １μＭに各々混合して常温で２０分間反応させた後、同様の方法で、ＳＫ−ＯＶ−３細胞株に４℃で１時間反応させてタンパク質を染色した後、ＦＡＣＳ分析をした。図９の(Ｂ)に示したように、ニューロピリン１及び２−ｂ１ｂ２ドメインにＦｃ−１５Ａ２２Ｐ、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐをあらかじめ反応させたサンプルでは、Ｆｃ−ＴＰＰの結合能が顕著に減少されることを確認した。これは、Ｆｃ−ＴＰＰがニューロピリン１及び２に特異的に結合することを意味する。
【００７３】
追加的に、Ｆｃ−ＴＰＰがニューロピリン１及び２に結合する部位を確認するため、Ｆｃ−１５Ａ２２ＰとＦｃ−１５Ｆ２２Ｐを各々ＶＥＧＦ１６５Ａ(１μｇ/ｍｌ)と混合し、上のような方法で結合能を確認した。図９の(Ｃ)に示したように、ＶＥＧＦ１６５Ａによって結合能が減少したことを確認した。これは、ＶＥＧＦ１６５Ａと競合的に結合することを意味する。
【００７４】
また、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐが来由されたリガンドであるセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｆ(１００μｇ/ｍｌ)を各々混合して反応させた後、結合能を確認した。図９の(Ｄ)に示したように、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ及びＦｃ−１５Ｆ２２Ｐは、各々セマフォリン３Ａ及び３Ｆにより結合能が減少されたことを確認した。これは、Ｆｃ−ＴＰＰとニューロピリン１及び２との結合が、本来のリガンドと同様に特異的であることを意味する。
【００７５】
実施例８：Ｆｃ−ＴＰＰのニューロピリン１及び２を通じた細胞内への特異的流入能の確認
他のニューロピリンリガンドの細胞流入能のように、Ｆｃ−ＴＰＰもニューロピリン１またはニューロピリン２により細胞内流入能を有しているかを確認するために、細胞内に流入するか否か、及びニューロピリン１及び２と共局在(ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ)するか否かを共焦点顕微鏡(ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ)で観察した。
【００７６】
具体的には、２４ウェルプレートに各ウェル当たり５ｘ１０４個のＰＰＣ−１細胞を１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地０.５ｍｌに入れて２４時間、５％のＣＯ２、３７℃条件で培養した。細胞が安定化されると、各ウェルをＰＢＳ  ０.５ｍｌを利用して洗浄し、ＴＯＭ(Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ、ＷｅｌＧＥＮＥ  Ｉｎｃ、Ｋｏｒｅａ)培地０.５ｍｌにＦｃ及びＦｃ−１５Ａ２２Ｐ、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐを１μＭで希釈して１時間、３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。その後、培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、Ｆｃ−ＴＰＰの場合、ＦＩＴＣ(緑色蛍光)が結合されているＦｃを特異的に認識する抗体(Ｓｉｇｍａ)で染色し、ニューロピリン１と２は、各々を認識する１次抗体(ＳａｎｔａＣｒｕｚ)とＴＲＩＴＣ(赤色蛍光)が結合されている２次抗体(Ｓｉｇｍａ)を利用して染色した。ＤＡＰＩを利用して核を染色(青色蛍光)して共焦点顕微鏡で分析した。
【００７７】
図１０は、Ｆｃ−ＴＰＰのニューロピリン１及び２を通じた細胞内への特異的な流入能を確認するため、共焦点顕微鏡分析を通じてＦｃ−ＴＰＰとニューロピリン１及び２との共局在(ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ)を観察した結果である。図１０に示したように、対照群であるＦｃの場合、細胞内に流入されなかったが、Ｆｃ−１５Ａ２２ＰとＦｃ−１５Ｆ２２Ｐは、細胞内に流入され、ニューロピリン１及び２と各々共局在(ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ)することを確認した。これは、Ｆｃ−ＴＰＰがニューロピリン１及び２による特異的な流入能を有することを意味する。
【００７８】
実施例９：Ｆｃ−ＴＰＰの細胞透過能向上の確認
(１)Ｆｃ−ＴＰＰのＨＵＶＥＣでの生物学的機構を調べるためのウエスタンブロット
セマフォリン３ＡまたはＶＥＧＦ１６５Ａは、ニューロピリン１(ＮＲＰ１)をコレセプター(ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ)として利用して血管透過能(ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ)を向上させることで知られている。このような過程で、内皮細胞のＶＥ(ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ)−カドヘリン(ｃａｄｈｅｒｉｎ)の減少、リン酸化などの変化が起きるようになる。すなわち、ＶＥ−カドヘリンまたはＥ(Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ)−カドヘリンは、内皮細胞と上皮細胞の間の接着結合の基礎を形成して内皮細胞間の接着に関与するようになり、この分子の変化は、接着結合の稠密さを緩和させて血管の透過性を高め、細胞内透過能を向上させる。
【００７９】
これをもとに、血管透過性の増進を間接的に確認することができる実験方法として、ウエスタンブロットによるＶＥ−カドヘリンの変化を確認した。具体的には、６ウェルプレートにＨＵＶＥＣ細胞をウェル当たり３ｘ１０５個の細胞を播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)した後に２４時間培養した後、単一ペプチド及びＦｃ−ＴＰＰを１μＭで１０分間処理してウエスタンブロットを実行した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行したゲルをＰＶＤＦ膜(ｍｅｍｂｒａｎｅ)に移し、各々ＶＥ−カドヘリンとβ−ａｃｔｉｎを認識する１次抗体(ＳａｎｔａＣｒｕｚ)とＨＲＰが結合された２次抗体(ＳａｎｔａＣｒｕｚ)とを利用して検出した。分析は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００  ｍｉｎｉ(ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)を利用した。
【００８０】
図１１の(Ａ)は、Ｆｃ−ＴＰＰのＨＵＶＥＣでの生物学的機構を調べるためのウエスタンブロットの結果である。図１１の(Ａ)に示したように、セマフォリン３Ａ由来タンパク質の場合、対照群であるＶＥＧＦ１６５Ａとセマフォリン３Ａで処理した時、ＶＥ−カドヘリンの減少が観察された。単一ペプチドであるＡ２２及びＡ２２Ｐでは、ＶＥ−カドヘリンの変化が観察されなかった。また、Ｆｃ及びＦｃ−４Ａ２２の場合は、ＶＥ−カドヘリンが減少しなかったが、Ｆｃ−１５Ａ２２、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐの場合、ＶＥ−カドヘリンが減少したことを確認した(左側パネル)。セマフォリン３Ｆ由来ＴＰＰの場合、対照群であるＶＥＧＦ１６５ＡとＦｃ−１５Ｆ２２ＰのみがＶＥ−カドヘリンの減少を誘導した(右側パネル)。
【００８１】
(２)Ｆｃ−ＴＰＰの血管と内皮細胞透過能を確認するためのトランスウェルアッセイ(Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ａｓｓａｙ)
前記実験結果に基づいて、血管内皮細胞の透過能が向上するか否かを確認するための実験として、単一ペプチド及びＦｃ−ＴＰＰを処理してトランスウェルアッセイ(Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ａｓｓａｙ)を実行した。
【００８２】
具体的には、血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)をＴｒａｎｓｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ(Ｃｏｒｎｉｎｇ)にウェル当たり５x１０４個の細胞を、ＥＧＭ(Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ)培地を利用して上位チャンバ(ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ)に播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)した後、３日間３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。その後、ＥＢＭ(Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ)培地に変えた後、対照群としてＶＥＧＦ１６５Ａ、セマフォリン３Ａ及びセマフォリン３Ｆを約１.３ｎＭで、単一ペプチド及びＦｃ−ＴＰＰは、１μＭで、３０分間処理した。その後、Ｄｅｘｔｒａｎ−ＦＩＴＣ(Ｓｉｇｍａ)５０μｇを上位チャンバ(ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ)に入れて、血管内皮細胞の透過性が向上された場合、下位チャンバ(ｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ)で蛍光物質が観察される原理を利用して、３０分後、  下位チャンバの培地をサンプリングして蛍光を測定した。
【００８３】
図１１の(Ｂ)は、ＴＰＰが血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)の透過能を向上させるかどうかを確認するために、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ａｓｓａｙを実行した結果である。図１の(Ｂ)に示したように、ＶＥＧＦ１６５Ａとセマフォリン３Ａの場合、血管内皮細胞の透過能が向上されたことを確認した。単一ペプチドであるＡ２２とＡ２２Ｐ、Ｆｃ部分とＴＰＰのリンカー長さが短いＦｃ−４Ａ２２の場合、血管透過能の向上は誘導されなかった。一方、融合形態であるＦｃ−１５Ａ２２、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐの場合、血管内皮細胞の透過能が向上したことを確認した。セマフォリン３Ｆ由来ＴＰＰの場合、セマフォリン３Ｆ自体では血管内皮細胞透過能を向上させることができなかったが、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐの場合は、血管透過能の向上を誘導した。また、単一ペプチドであるＦ２２とＦ２２Ｐ、融合形態であるが結合能が低いＦｃ−４Ｆ２２、Ｆｃ−１５Ｆ２２の場合には、血管内皮細胞透過能は向上しなかった。
【００８４】
(３)マウスモデルでＦｃ−ＴＰＰの透過能の向上を確認するための免疫組織化学(Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ)実験
前記実施例９の(１)〜(２)では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でＦｃ−ＴＰＰが血管内皮細胞の透過能を向上させることを確認した。したがって、マウスモデルでＦｃ−ＴＰＰの透過能の向上を確認するためにＩＨＣ(Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ)実験を実行した。
【００８５】
腫瘍組織内衣のＦｃ−ＴＰＰの透過能の向上を確認するための実験として、Ｂａｌｂ/ｃヌードマウスにＡ４３１  ｃｅｌｌをマウス当たり５ｘ１０６個の細胞を皮下注射で注入し、約９日後に腫瘍の体積が約３００−４００mm3程度になった時、各々ＰＢＳ、Ｆｃ、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ及びペプチドであるＡ２２Ｐを５ｍｇ/ｋｇで静脈注射した。注射後、各々３時間後にマウスから腫瘍を摘出し、免疫組織化学(ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ)実験を実行した。摘出した腫瘍は、凍結切片(ｆｒｏｚｅｎ  ｓｅｃｔｉｏｎ)方法で２０μｍの厚さで切って、１次抗体であるＣＤ３１抗体(ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ)とこれを認識するＴＲＩＴＣ(赤色蛍光)が結合された２次抗体で血管を染色し、組織内に分布されているＦｃ−ＴＰＰを観察するため、Ｆｃを認識するＦＩＴＣ(緑色蛍光)が結合された抗体を使用した。
【００８６】
図１１(Ｃ)は、実際腫瘍組織内のＴＰＰの浸透能を確認するための免疫組織化学の結果である。図１１(Ｃ)に示したように、単一ペプチドであるＡ２２とＡ２２Ｐの場合は、組織内に浸透されかったが、融合形態であるＦｃ−１５Ａ２２とＦｃ−１５Ａ２２Ｐの場合には、対照群であるＦｃとは異なり腫瘍組織に選択的に到逹し、腫瘍組織内に浸透したことを確認した。また、Ｆｃ−１５Ａ２２よりニューロピリン１及び２に対する結合結合能が高いＦｃ−１５Ａ２２Ｐがさらに効果的に組織内に浸透することを確認した。
【００８７】
(４)血管透過能の確認のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏエバンスブルーアッセイ(Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ  ａｓｓａｙ)
追加的に、血管透過能の向上をｉｎ  ｖｉｖｏでも確認するために、エバンスブルーアッセイ(Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ  ａｓｓａｙ)を実行した。実験方法では、Ｂａｌｂ/ｃヌードマウス(ＮＡＲＡＢＩＯ、４週齢、ｆｅｍａｌｅ)にＦａＤｕ  ｃｅｌｌをマウス当たり５ｘ１０６個の細胞を皮下注射で注入し、約１０日余り後に腫瘍の体積が約５００mm3程度になった時、１ｍｇのＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ(Ｓｉｇｍａ)と各々ＰＢＳ、Ｆｃ、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐを７.５ｍｇ/ｋｇで静脈注射した。対照群としては、ＶＥＧＦ１６５Ａ(４００ｎｇ)、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａ(４００ｎｇ)を同一条件で注射した。４０分後、マウスの心臓を通じて１％のＢＳＡをとかしたＰＢＳで貫流させて、腫瘍組織を摘出した(図１１の(Ｄ))。そして、１ｍｌの２,２Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｆｏｒｍａｍｉｄｅ(Ｓｉｇｍａ)に入れて３７℃で一晩、軽い振とう(ｍｉｌｄ  ｓｈａｋｉｎｇ)条件で反応させた。その後、遠心分離通じて上清液を得て吸光度(６００ｎｍ)を測定し、Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅが透過された量を定量化した。
【００８８】
図１１の(Ｄ)は、血管透過能の向上をＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ  ａｓｓａｙを通じて確認した結果である。左側パネルは、摘出した癌細胞の写真であり、右側パネルは、これを定量化するために吸光度(６００ｎｍ)を測定した結果である。図１１の(Ｄ)に示したように、ＶＥＧＦ１６５Ａとセマフォリン３Ａは、既知のとおり血管透過能が増強された。Ｆｃとは異なりＦｃ−１５Ａ２２Ｐも血管透過能を増強したことを確認した。
【００８９】
(５)ＴＰＰの癌細胞での効果の確認
ＴＰＰの効果を癌細胞でも確認するために、ヒト頭頸部癌細胞株であるＦａＤｕで、前記実験と同じ条件でＥ−カドヘリンの変化をウエスタンブロットで確認した。
【００９０】
図１１の(Ｅ)は、ヒト頭頸部癌細胞株であるＦａＤｕでＥ−カドヘリンの変化をウエスタンブロットした結果である。図１１(Ｅ)に示したように、セマフォリン３Ａ由来ＴＰＰの場合、セマフォリン３Ａは、Ｅ−カドヘリンの変化を誘導しなかったが、Ｆｃ−１５Ａ２２とＦｃ−１５Ａ２２ＰはＥ−カドヘリンの減少を誘導した。また、セマフォリン３Ｆの場合、Ｅ−カドヘリンの減少を誘導し、Ｆｃ−１５Ｆ２２Ｐを処理した時、Ｅ−カドヘリンが減少した。
【００９１】
前記実験結果を総合した時、セマフォリン３Ａと３Ｆで各々ペプチドを由来してＦｃ−ＴＰＰを構築したところ、本来のタンパク質の性質であるニューロピリン１やニューロピリン２に対する特異性、ＶＥ−カドヘリンやＥ−カドヘリンの減少などの信号伝達の傾向は、本来のタンパク質と由来ペプチドの間で常に同一の結果を誘導しなかった。また、ニューロピリン１及び２に結合能を有するペプチドが、単一形態ではＴＰＰによる信号伝逹を誘導することができなかったが、融合された形態であるＦｃ−ＴＰＰで処理した時には、信号伝逹を効果的に誘導することを確認した。これは、ニューロピリン１及び２による信号伝逹は、Ｆｃ−ＴＰＰの融合形態である時に効果的に伝達されることを意味する。そして、Ｆｃ−４Ａ/Ｆ２２は、信号伝逹を誘導することができなかったが、Ｆｃ−１５Ａ/Ｆ２２、Ｆｃ−１５Ａ/Ｆ２２Ｐの場合、信号伝達を誘導した。これは、単一形態のペプチドより融合形態であるＦｃ−ＴＰＰがニューロピリン１及び２による信号伝達を効果的に誘導し、Ｆｃ−ＴＰＰの中でもリンカーの長さによってその効果に差が生じることを意味する。
【００９２】
実施例１０：Ｆｃ−ＴＰＰの新生血管形成抑制能の確認
(１)Ｆｃ−１５Ａ２２ＰのＨＵＶＥＣでのチューブ形成抑制能の確認のためのチューブ形成アッセイ(ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ)
ＶＥＧＦ１６５Ａは、ニューロピリン１をコレセプターとして利用して新生血管を形成(ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)させることが知られている。これに基づいて、新生血管形成をｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認することができる実験方法として、チューブ形成アッセイを実行した。実験方法では、５０μｌのＥＣＭａｔｒｉｘを９６ウェルプレートに注入し、３７℃で２時間ポリマー化した。２時間後に、ＨＵＶＥＣ細胞をＥＢＭ(Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ)培地を利用して懸濁し、ＶＥＧＦ１６５Ａ(２０ｎｇ/ｍｌ)、Ｆｃ、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ(１μＭ)と交ぜてＥＣＭａｔｒｉｘ上にウェル当たり１ｘ１０４個ずつプレーティングして８時間培養した。培養された細胞を顕微鏡で観察して画像を得た。
【００９３】
図１２の(Ａ)は、チューブ形成抑制能をチューブ形成アッセイで確認した結果である。図１２の(Ａ)に示したように、ＶＥＧＦ１６５Ａは、既知のとおりチューブ形成を増加させ、Ｆｃとは異なりＦｃ−１５Ａ２２Ｐは、チューブ形成を抑制したことを確認した。
【００９４】
(２)Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐの新生血管形成抑制能を確認するためのｉｎ  ｖｉｖｏマトリゲルプラグアッセイ(ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｐｌｕｇ  ａｓｓａｙ)
追加的に、新生血管形成抑制能をｉｎ  ｖｉｖｏでも確認するために、マトリゲルプラグアッセイを実行した。実験方法は、６〜８週齢のｂａｌｂ/ｃヌードマウスの皮下にマウス当たりＡ４３１  ｃｅｌｌ  ７.５ｘ１０６個の細胞と８０μｇのＦｃまたはＦｃ−１５Ａ２２Ｐ、そして、０.４ｍｌのマトリゲル(Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ)を注入した後、９日後にマトリゲルプラグを摘出し、次の画像を撮影した後(図１２の(Ｂ))、凍結切片方法で２０μｍの厚さで切って、免疫組織化学(Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ)実験を実行した。１次抗体であるＣＤ３１抗体とこれを認識するＴＲＩＴＣ(赤色蛍光)が結合された２次抗体で血管を染色し、血管の密度を測定した。図１２の(Ｂ)は、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐがマウス生体内でＶＥＧＦ１６５Ａにより誘導される血管の形成を抑制することができることを確認した結果である。
【００９５】
実施例１１：ｍＡｂ−ＴＰＰの生産及び抗原結合能の確認
(１)ｍＡｂ−ＴＰＰの生産のためのベクター及び発現、精製
前記実施例９で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＦｃ−ＴＰＰが血管内皮細胞の透過能を向上させることを確認した。したがって、マウスモデルでＴＰＰの効果を検証するためのフォーマットとして抗体のＦｃ末端にＴＰＰを融合した。
【００９６】
図１３の(Ａ)は、単一クローン抗体の重鎖不変領域Ｃ−末端にニューロピリンと結合するペプチドがペプチドリンカーに連結された融合抗体(ｍＡｂ−ＴＰＰ)の模式図を示す。(Ｂ)は、前記(Ａ)の融合抗体がニューロピリン膜タンパク質のb１ドメインに結合する模式図を示す。また、(Ｃ)は、前記融合抗体(ｍＡｂ−ＴＰＰ)を生体内に投入した時に予想される機構を示す。ペプチドが融合された抗体が腫瘍血管内皮及び多様な腫瘍細胞に過発現されたニューロピリン膜タンパク質に結合して、（１）腫瘍組織の選択的分布が増加し、（２）腫瘍血管外への溢出(ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ)が増加し、（３）腫瘍組織内部への浸透が増加される信号伝逹を誘導して融合抗体の腫瘍組織特異分布及び腫瘍組織内部への浸透を顕著に増加させることができる。
【００９７】
マウスモデルにおいてＴＰＰの効果を検証するためのフォーマットとして、ＴＰＰが融合されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ及びＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂを製造した。既存の抗−ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ  ＩｇＧ及びＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＩｇＧのＦｃのＣ−末端にＴＰＰを融合した。図１４及び図１５は、各々ＩｇＧ重鎖−ＴＰＰとＩｇＧ軽鎖を宿主細胞で発現させるための例示的ベクターの切断地図である。
【００９８】
図１６及び図１７の(Ａ)は、このＴＰＰ融合された抗体の模式図を示す。発現及び精製は、前記実施例４で実行した方法によりＨＥＫ２９３Ｆで行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認した。図１６及び図１７の(Ｂ)は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に共形質転換で一時的に発現及び精製した後、還元性及び非還元性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でサイズ及び純度を分析した結果である。
【００９９】
下記表８は、精製されたＴＰＰ融合タンパク質の培養１Ｌ当たり生産されるタンパク質の収率を示す。３回実行して得た結果を統計処理した。±は、標準偏差値を示す。得られたタンパク質の収率(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２ｐ及びＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２ｐ)は、各々の野生型タンパク質(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ及びＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ)の収率と比較した結果、大きい差がなかった。
【表８】
0006391676.tif 000009
【０１００】
(２)ｍＡｂ−ＴＰＰの抗原結合能の確認ＳＰＲ
ＳＰＲ(Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ)を通じてｍＡｂ−ＴＰＰが既存抗体の抗原結合能と結合親和度を維持するかを確認するために、ＣＭ５チップの上にＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２を約１０００ＲＵほど固定化した。３０μｌ/ｍｉｎの速度で流れるＨＢＳ−ＥＰ緩衝液[１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸及び０.００５％のｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０(ｐＨ７.４)、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ]で分析した。結合、解離を分析した後、ＣＭ５チップの再生(ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ)は、緩衝液(２０ｍＭ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ１０.０)を３０μｌ/ｍｉｎの流速で１分間流して施行した。ｍＡｂ(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ)及びｍＡｂ−ＴＰＰ(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰ)の結合３分、解離３分から得られた各センサーグラム(ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ)は、空白セル(Ｂｌａｎｋ  ｃｅｌｌ)と比較して規格化(ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ)及び減算(Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ)して親和度を計算した。その結果を表９に示す。表９に示したように、ＣｅｔｕｘｉｍａｂのＥＧＦＲに対する親和度が他の文献とほとんど類似に分析され、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰがＣｅｔｕｘｉｍａｂと比較してＥＧＦＲに対する親和度が類似に分析された。また、ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂのＨｅｒ２に対する親和度が他の文献とほとんど類似に分析され、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰがＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂと比較してＨｅｒ２に対する親和度が類似に分析された。ｍＡｂにＴＰＰを融合した時、既存の抗体の抗原結合には何の影響も与えないことを確認した。分析時に少なくとも５個のセンサーグラムを利用して分析し、２回実行して得た結果を統計処理した。±は、独立的な実験結果の標準偏差値を示す。
【表９】
0006391676.tif 000010
【０１０１】
(３)ｍＡｂ−ＴＰＰの二重特異性の確認のためのＳａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ
Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡを実行してｍＡｂ−ＴＰＰの二重結合能を確認した。
【０１０２】
具体的に、ニューロピリン１−ｂ１ｂ２ドメイン(２７３−５８６)、ニューロピリン２−ｂ１ｂ２ドメイン(２７５−５９５)を各１μｇずつ、９６ウェルＥＩＡ/ＲＩＡプレート(ＣＯＳＴＡＲ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎ.,  ＵＳＡ)に１時間常温で結合させた後、０.１％のＰＢＳＴ(０.１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７.４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)で１０分間３回洗浄した。５％のＳｋｉｍ  ｍｉｌｋ(５％  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ、ｐＨ７.４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)で１時間結合した後、０.１％のＰＢＳＴ(０.１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７.４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,ＵＳＡ)で１０分間３回洗浄した。ｍＡｂ及びｍＡｂ−ＴＰＰを１００ｎＭの濃度でニューロピリン１及び２−ｂ１ｂ２ドメインに結合した後、０.１％のＰＢＳＴ０(０.１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７.４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,ＵＳＡ)で１０分間３回洗浄した。各ウェルに上述の方法でビオチン化されたＥＧＦＲ(ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,ＵＳＡ)及びＨｅｒ２−ＥＣＤ(Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ)を１μＭから１ｎＭまで希釈して結合させた後、０.１％のＰＢＳＴ(０.１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７.４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,ＵＳＡ)で１０分間３回洗浄した。ＡＰが接合された抗ヒト抗体(ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｍＡｂ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ)で結合させた後、ｐＮＰＰ(ｐｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,  ＵＳＡ)で反応させて、４０５ｎｍの吸光度を定量した。
【０１０３】
図１６及図１７の(Ｃ)は、ＥＬＩＳＡ結果を通じてｍＡｂ−ＴＰＰがニューロピリン１あるいは２と本来ｍＡｂの抗原に対する同時結合能があることで二重特異性を確認した結果である。
【０１０４】
(４)ｍＡｂ−ＴＰＰのＦｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒに対する結合能の確認ＳＰＲ
ＳＰＲ(Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ)を通じてｍＡｂ−ＴＰＰが既存抗体のＦｃ受容体に対する結合能が維持されるかを確認するために、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃＲｎに対する親和度を分析した。ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂに対しては、前記実施例６と同一の方法を実行した。ＦｃＲｎに対しては、野生型抗体の場合、ｐＨ６.０でのみＦｃＲｎに結合し、ｐＨ７.４では、結合しない特性を有する。親和度の分析のために、ｐＨ６.０の条件で、ｍＡｂ及びｍＡｂ−ＴＰＰのＦｃＲｎに対するＳＰＲを実行した。ＣＭ５チップ上にＦｃＲｎを約１０００ＲＵほど固定化した。３０μｌ/ｍｉｎの速度で流れるＰＢＳＴ緩衝液[ｐＨ６.０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、０.００５％  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ.,ＵＳＡ]で分析した。結合、解離を分析した後、ＣＭ５チップの再生(ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ)は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液[１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸及び０.００５％  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０(ｐＨ８.０)、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ]を３０μｌ/ｍｉｎの流速で１分間流して施行した。ｍＡｂ(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ)及びｍＡｂ−ＴＰＰ(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰ)の結合３分、解離３分から得られた各センサーグラム(ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ)は、空白セル(Ｂｌａｎｋ  ｃｅｌｌ)と比較して規格化(ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ)及び減算(Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ)して親和度を計算した。その結果を表１０に示した。
【０１０５】
このセンサーグラムと前記実施例６のように分析されたセンサーグラムのうち、ｐＨ６.０で分析した濃度のうち最高濃度である６２５ｎＭでのｐＨによる結合差を確認した。図１８は、ｍＡｂ及びｍＡｂ−ＴＰＰのＦｃＲｎに対するｐＨによる結合能が類似しているかどうかを確認した結果を示す。図１８に示したように、ｍＡｂ(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ)及びｍＡｂｍ−ＴＰＰ(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰ)は、全てｐＨ６.０でのみＦｃＲｎに結合し、ｐＨ７.４では結合しない特性を確認した。これによって、ＴＰＰ融合がＦｃ受容体に対する結合能に影響を与えないことを確認した。
【表１０】
0006391676.tif 000011
0006391676.tif 000012
【０１０６】
実施例１２：ｍＡｂ−ＴＰＰの組織浸透能向上の確認
前記実験で構築されたＩｇＧ−ＴＰＰの腫瘍組織内の抗体浸透を確認するために、Ｂａｌｂ/ｃヌードマウスに各々ＦａＤｕとＡ４３１をマウス当たり５ｘ１０６個の細胞を皮下注射で注入し、約９日後に腫瘍の体積が約３００〜４００mm3程度になった時、各々ＰＢＳ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐを２.５ｍｇ/ｋｇで静脈注射した。注射後、各々３時間、１２時間後にマウスから腫瘍を摘出し、免疫組織化学実験を実行した。実施例９と同様に組織を染色して観察した。
【０１０７】
図１９の(Ａ)は、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰの腫瘍組織内浸透能を確認するためのＩＨＣ結果である。図１９の(Ａ)に示したように、ＦａＤｕとＡ４３１の二つの癌細胞組織において、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの場合、血管周囲にのみ緑色蛍光が観察されたが、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐの場合は、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂと比較した場合、血管から多少遠くの組織内部に浸透されたことが確認された。また、３時間、１２時間サンプルの比較を通じて、時間によってさらに組織内部に浸透されることを確認した。これを定量化するためにＩｍａｇｅＪを使用した。
【０１０８】
追加的に、この条件で使用された癌細胞組織からウエスタンブロットを実行し、その結果を図１９の(Ｂ)に示した。図１９の(Ｂ)から分かるように、ヒト抗体の重鎖部位と軽鎖部位を各々認識する抗体を利用してウエスタンブロットを実行すると、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂに比べてＣｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐの場合に、組織内により多い量が存在することを確認した。また、癌細胞の転移と関連されたタンパク質であるＮ−カドヘリンとビメンチン(ｖｉｍｅｎｔｉｎ)、フェブロネクチンなどの変化なしに、Ｅ−カドヘリンのみがＣｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰにより減少されることを確認した。Ｅ−カドヘリンの減少とＮ−カドヘリン、ビメンチン、フェブロネクチンなどの増加が伴う癌細胞の転移現象とは異なり、ＴＰＰによる効果では、癌細胞の転移及び浸透が起きないことを間接的に証明した。
【０１０９】
また、実際にこのような傾向が癌細胞の抑制に影響を及ぼすかどうかを確認するため、ヌードマウスにおいて癌細胞成長阻害の確認に関する実験を行った。実施例９と同様に、ＦａＤｕ細胞株をヌードマウスに皮下注射し、細胞を移植してから約５日後、腫瘍の体積が約１２０mm3程度になった時、ＣｅｔｕｘｉｍａｂとＣｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐを２.５、１０ｍｇ/ｋｇで３日間隔、６回静脈注射した(Ｎ＝６)。
【０１１０】
図１９の(Ｃ)に示したように、対照群であるＰＢＳに比べてＣｅｔｕｘｉｍａｂ(ＣＴＸ)とＣｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐは、癌細胞の成長を抑制し、ＣｅｔｕｘｉｍａｂよりＣｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐが一層効果的に抑制することを確認した。また、図１９の(Ｄ)に示したように、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ実験群と比較してＣｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐ実験群があまり体重の変化がないことを確認した。これによって、毒性はないものと判断された。
【０１１１】
前記実験と同一の方法で構築されたＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐを利用して、腫瘍組織内に浸透された抗体を確認するためのＩＨＣ実験を実行した。Ｂａｌｂ/ｃヌードマウスにＳＫ−ＯＶ−３をマウス当たり５ｘ１０６個の細胞を皮下注射で注入し、約９日後に腫瘍の体積が約３００−４００mm3程度になった時、各々ＰＢＳ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ及びＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐを２.５ｍｇ/ｋｇで静脈注射した。注射した後、各々３時間、１２時間後にマウスから腫瘍を摘出し、前記実験と同様に組織を染色して観察した。
【０１１２】
図２０の(Ａ)は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰの腫瘍組織内浸透能を確認するためのＩＨＣ結果である。図２０の(Ａ)に示したように、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの場合、血管周囲にのみ緑色蛍光が観察されたが、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐの場合は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂと比較した時、血管からより遠く組織内部に浸透したことが確認された。また、３時間、１２時間サンプルの比較を通じて、時間によってさらに組織内部に浸透することを確認した。これを定量化するためにＩｍａｇｅ  Ｊを使用した。
【０１１３】
追加的に、この条件で使用された癌細胞組織からウエスタンブロットを行い、その結果を図２０(Ｂ)に示した。図２０(Ｂ)に示したように、ヒト抗体の重鎖部位と軽鎖部位を各々認識する抗体を利用してウエスタンブロットを実行した時、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂに比べてＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐの場合、組織内により多くの量が存在することを確認した。また、癌細胞の転移と関連するタンパク質であるＮ−カドヘリンとビメンチン、フェブロネクチンなどの変化なしにＥ−カドヘリンのみがＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰにより減少されることを確認した。これを通じて、ＴＰＰにより癌細胞の転移及び浸透が起きないことを間接的に証明した。
【０１１４】
前記実験と同様に、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰの癌細胞成長抑制効果を確認するため、５ｘ１０６個のＳＫ−ＯＶ−３細胞をヌードマウスに皮下注射し、細胞を移植してから約７日後、腫瘍の体積が約８０mm3程度になった時、ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐを２.５、５ｍｇ/ｋｇで３日間隔、６回で静脈注射した(Ｎ＝６)。図２０の(Ｃ)は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＴＰＰの癌細胞成長抑制効果を確認するために腫瘍の体積を測定した実験結果である。図２０の(Ｃ)から分かるように、同一条件でＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂに比べてＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐが、効果的に癌細胞の成長抑制を誘導することを確認した。図２０の(Ｄ)は、前記実験時のマウスの重さを測定した結果である。図２０の(Ｄ)に示したように、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ実験群に比べてＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐ実験群君が、あまり体重の変化がないことが分かり、他の毒性はないものと判断された。
【０１１５】
前記の結果は、腫瘍浸透性Ａ２２ｐペプチドを多様な抗原を認識する多くの単一クローン抗体に対して一般的に適用可能であることを示す。
【０１１６】
実施例１３：Ｆｃ−ＴＰＰ、ｍＡｂ−ＴＰＰの細胞毒性の評価
前記の結果、ＴＰＰの組織内浸透能向上効果によるマウスでの癌細胞成長阻害を確認した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＴＰＰ自体が細胞毒性を有するかを確認するため、前記実験で使用した細胞株であるＦａＤｕとＳＫ−ＯＶ−３にＦｃ−ＴＰＰとｍＡｂ-ＴＰＰを各々処理して細胞成長阻害の程度を評価した。
【０１１７】
具体的には、２４ウェルプレートにウェル当たり１x１０４個の細胞(ＦａＤｕ、ＳＫ−ＯＶ−３)を各々１０％のＦＢＳが含まれた培地０.５ｍｌに希釈して培養した。細胞が安定化した時、１μＭのＦｃ、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ、ｍＡｂ、ｍＡｂ−１５Ａ２２Ｐを処理して７２時間観察した後、生きている細胞の個数をカウンティングして細胞の成長程度を比較した。ＦａＤｕ細胞株には、Ｆｃ、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐを処理し、ＳＫ−ＯＶ−３には、Ｆｃ、Ｆｃ−１５Ａ２２Ｐ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐを処理して、その効果を確認した。
【０１１８】
図２１は、ＦａＤｕとＳＫ−ＯＶ−３でＦｃ−ＴＰＰとｍＡｂ−ＴＰＰを処理して細胞成長阻害程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した結果である。図２１に示したように、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ及びＣｅｔｕｘｉｍａｂ−１５Ａ２２Ｐは、ＦａＤｕ細胞株で約３０％程度の細胞成長を抑制し、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ及びＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−１５Ａ２２Ｐは、ＳＫ−ＯＶ−３細胞株で約３０〜３５％程度の細胞成長を抑制した。各々のｍＡｂとｍＡｂ−ＴＰＰの間の差はないことで確認された。これと同様に、ＦｃとＦｃ−ＴＰＰは、ＦａＤｕとＳＫ−ＯＶ−３で全て細胞成長を阻害しなかった。これは、ニューロピリンによるＴＰＰの効果は、ＴＰＰ自体が直接的には癌細胞の成長に影響しないものの、腫瘍組織内浸透能を増加させて効果を極大化させることを意味する。また、前記実験を通じて確認したｍＡｂ−ＴＰＰの効果は、各々ＥＧＦＲとニューロピリン、ＨＥＲ２とニューロピリンの間の相互作用による効果ではないことを間接的に確認した。
【０１１９】
＜発明の実施のための形態＞
本発明の一様態は、ニューロピリンに特異的に結合する腫瘍浸透性ペプチド(ＴＰＰ、Ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ)を提供することである。
【０１２０】
前記一様態で腫瘍浸透性とは、例えば、１)腫瘍特異血管内皮細胞、腫瘍細胞または組織を特異的に認識して蓄積され、２)腫瘍血管内皮細胞の細胞間隙を広げて血管外への溢出(Ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ)を促進させて、３)腫瘍内部で腫瘍細胞間隙を調節して腫瘍内部に深く浸透を促進する特性のうちいずれか一つの特性を有することを意味する。
【０１２１】
本発明で用語「ニューロピリン(ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ、ＮＲＰ)は、膜透過性タンパク質(ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ)として、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２の二つの形態を有する。ＮＲＰ１及びＮＲＰ２の構造は、図１の(Ｄ)及び(Ｅ)に各々示した。ニューロピリンは、大きく５種のドメインで構成される。Ｎ−末端から、ａ１、ａ２ドメインは、ＣＵＢドメインに分類され、セマフォリンのＩｇ−ｌｉｋｅ  Ｃ２  ｔｙｐｅ部分が結合する部分である。特に、この部位は、プレキシンと複合体を形成してセマフォリン−プレキシン(ｐｌｅｘｉｎ)との結合力を増加させる役目をする。ニューロピリンのｂ１、ｂ２ドメインは、ＦＶ/ＶＩＩＩドメインに分類され、ＶＥＧＦファミリーリガンドや分泌されたセマフォリン３系列のリガンドの(ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｓｅｍａ３ｓ)Ｃ−末端部位が結合する。ＶＥＧＦリガンド及びセマフォリン３系列リガンドは、フーリンタンパク質加水分解酵素の認識部位を(ＲＸＲＲ、Ａｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ)有しており、フーリン作用(Ｆｕｒｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ)によって共通的にＣ−末端にもつアルギニン(Ａｒｇ)アミノ酸残基で終わる(Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ.  １９９７)。このようなＶＥＧＦ、Ｓｅｍａ３ｓリガンドのＣ−末端のＡｒｇ残基は、ニューロピリンｂ１ｂ２ドメイン間の相互作用において非常に重要であると報告されている(Ｔｅｅｓａｌｕ  ｅｔ  ａｌ.  ２００９)。ＶＥＧＦリガンドとニューロピリンｂ１ｂ２ドメイン間の結合体の３次構造が究明されているので(Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ.,  ２０１２)、ニューロピリンのｂ１ｂ２ドメインと結合に重要なＶＥＧＦのアミノ酸配列は知ることができる。しかし、ＮＲＰ１に結合するＳｅｍａ３Ａ、ＮＲＰ２に結合するＳｅｍａ３Ｆの場合、これらリガンドのＣ−末端のどの部位が具体的にＮＲＰに結合するかはまだ究明されていなかった。
【０１２２】
前記配列番号１〜４からなる群より選択されるアミノ酸配列で表示された腫瘍浸透性ペプチドは、ニューロピリンのｂ１ｂ２ドメインに結合するＶＥＧＦ１６５Ａリガンドの結合部位アミノ酸配列及び長さを分析し、ニューロピリンに結合することで知られたセマフォリン３Ａ及びセマフォリン３ＦのフーリンＣ−末端配列ＶＥＧＦ１６５Ａの塩基配列を分析して、Ｃ−末端の配列が類似であることに基づいて設計されたペプチドである。
【０１２３】
配列番号１のアミノ酸配列で表示された腫瘍浸透性ペプチドであるＡ２２は、セマフォリン３Ａの塩基性ドメインの一部である残基７３９〜７６０から由来した２２個のアミノ酸で構成されたペプチドである。配列番号２のアミノ酸配列で表示された腫瘍浸透性ペプチドであるＡ２２ｐは、前記Ａ２２のＣ−末端から３番目のアミノ酸である７５８番目のアスパラギン(Ａｓｎ７５８)をプロリン(Ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｐｒｏ、Ｐ)に変更したものである(Ａｓｎ７５８Ｐｒｏ)。配列番号３のアミノ酸配列で表示された腫瘍浸透性ペプチドであるＦ２２は、セマフォリン３Ｆの塩基性ドメインの一部である残基７５８〜７７９から由来した２２個のアミノ酸から由来する２２個のアミノ酸で構成されたペプチドである。配列番号４のアミノ酸配列で示された腫瘍浸透性ペプチドであるＦ２２ｐは、前記Ｆ２２のＣ−末端から３番目のアミノ酸である７７７番目のアスパラギン(Ａｓｎ７５８)をプロリン(Ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｐｒｏ、Ｐ)に変更したものである(Ａｓｎ７７７Ｐｒｏ)。前記ペプチドＡ２２ｐ、Ｆ２２ｐは、各々Ｓｅｍａ３Ａ及びＳｅｍａ３Ｆ由来ペプチドに突然変異を挿入してニューロピリンとの親和度が改良されたペプチドを導出するために考案したものである。
【０１２４】
本発明のペプチドの名称及びセマフォリン由来配列及び配列番号は、下の通りである。
【０１２５】
0006391676.tif 000013
【０１２６】
前記一様相の腫瘍浸透性ペプチドは、リンカーペプチドを追加で含むことができる。前記リンカーペプチドは、１〜５０個のアミノ酸からなることができ、好ましくは、４〜２０個、より好ましくは、４〜１５個のアミノ酸からなることができる。また、前記リンカーペプチドは、グリシン(ｇｌｙｃｉｎｅ)、セリン(ｓｅｒｉｎｅ)またはアラニン(ａｌａｎｉｎｅ)で構成されることができ、好ましくは、前記リンカーペプチドの配列は、(ＧＡ)ｎまたは(ＧＧＧＧＳ)ｍのアミノ酸配列からなること(但し、前記ｎ及びｍは、各々独立的に整数１〜２０である)ができ、より好ましくは、ＧＡＧＡまたは(ＧＧＧＧＳ)３のアミノ酸配列からなることができる。
【０１２７】
本発明の具体例では、前記リンカーとセマフォリン由来配列の多様な組合せにより腫瘍標的能を確認した。ペプチドの名称、リンカーの配列、セマフォリン由来配列、全体アミノ酸の長さ及び配列番号は、下の通りである。
【０１２８】
0006391676.tif 000014
【０１２９】
本発明の他の様相は、前記の腫瘍浸透性ペプチドが融合された融合タンパク質、ナノ粒子またはリポソームを提供する。
【０１３０】
前記タンパク質は、抗体、抗体の断片、兔疫グロブリン、ペプチド、酵素、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、ホルモン、運搬タンパク質、構造タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、信号(ｓｉｇｎａｌｉｎｇ)タンパク質、保存タンパク質、膜タンパク質、膜貫通(ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ)タンパク質、内部(ｉｎｔｅｒｎａｌ)タンパク質、外部(ｅｘｔｅｒｎａｌ)タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、天然(ｎａｔｉｖｅ)タンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、ジスルフィド結合を有するタンパク質、タンパク質複合体、化学的に改質されたタンパク質またはプリオン(ｐｒｉｏｎｓ)などであることができる。
【０１３１】
本発明において、リポソームは自ら会合することができる、水性内部区画を取り囲む一つ以上の脂質二重層膜で構成される。リポソームは、膜タイプ及びそのサイズにより特定されることができる。小型ユニラメラ小胞(ＳＵＶ)は、単一膜を有し、２０nm〜５０nmの直径を有することができる。大型ユニラメラ小胞(ＬＵＶ)は、５０nm以上の直径を有することができる。オリゴラメラ大型小胞及びマルチラメラ大型小胞は、複数の、通常は同心の膜層を有し、直径が１００nmより大きい。幾つかの非同心膜を有するリポソーム、すなわち、一つの大型小胞内に含まれる幾つかの小型小胞は、マルチ小胞性小胞(ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ)と呼ばれる。
【０１３２】
本発明において、ナノ粒子(ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ)は、直径１〜１０００nmサイズを有する物質からなった粒子を意味し、前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子、金属ナノ粒子コア及び前記コアを取り囲む金属シェルで構成される金属/金属コアシェル複合体、金属ナノ粒子コア及び前記コアを取り囲む非金属シェルで構成される金属/非金属コアシェルまたは非金属ナノ粒子コア及び前記コアを取り囲む金属シェルで構成される非金属/金属コアシェル複合体であることができる。一具体例によると、前記金属は、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、パラジウム、白金、磁性鉄及びその酸化物から選択されるものであることができるが、これに限定されず、前記非金属は、シリカ、ポリスチレン、ラテックス及びアクリレート系列の物質から選択されるものであることができるが、これに限定されるものではない。
【０１３３】
また、前記腫瘍浸透性ペプチドは、ニューロピリンに２価(ｂｉｖａｌｅｎｔ)またはその以上に結合することができる。
【０１３４】
本発明において融合は、機能または構造が相違であるか同一な二つの分子を一体化することで、前記タンパク質、ナノ粒子またはリポソームに前記腫瘍浸透性ペプチドが結合することができる全ての物理、化学的または生物学的方法による融合であることができる。前記融合は、好ましくは、リンカーペプチドによることができ、このリンカーペプチドは、例えば、抗体のＦｃ断片のＣ−末端に結合することができる。
【０１３５】
本発明で完全な抗体は、２個の全長(ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ)軽鎖及び２個の全長重鎖を有する構造であり、各々の軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合(ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ、ＳＳ−ｂｏｎｄ)抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ(γ)、ミュー(μ)、アルファ  (α)、デルタ(δ)及びエブシロン(ε)タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１(γ１)、ガンマ２(γ２)、ガンマ３(γ３)、ガンマ４(γ４)、アルファ１(α１)及びアルファ２(α２)を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ(κ)及びラムダ(λ)タイプを有する。
【０１３６】
「重鎖(ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ)」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片を全て含む意味で解釈される。また、用語「軽鎖(ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ)」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片を全て含む意味で解釈される。
【０１３７】
本発明において、抗体の断片は、抗体の重鎖または軽鎖の各々のドメインまたはその断片を意味し、例えば、抗体の重鎖不変領域、重鎖可変領域、軽鎖不変領域または軽鎖可変領域またはこれらの断片であることができる。好ましくは、前記抗体の断片は、抗体の重鎖不変領域であることができる。
【０１３８】
また、前記抗体の断片は、単量体(ｍｏｎｏｍｅｒ)、二量体(ｄｉｍｅｒ)または多量体であることができる。
【０１３９】
前記抗体は、単一クローン抗体、非特異的抗体、非ヒト抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ(ｓｃＦＶ)、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ')断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ(ｓｄＦＶ)及び抗−イディオタイブ(抗−Ｉｄ)抗体、そして前記抗体のエピトープ−結合断片を含むが、これに限定されるものではない。
【０１４０】
前記単一クローン抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥであることができ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ５またはＩｇＤタイプであることができ、ＩｇＧ１タイプであることができる。また、前記抗体の軽鎖不変領域は、λまたはκ型であることができる。
【０１４１】
前記ペプチドは、抗体の重鎖不変領域(Ｆｃ)断片に結合されることができ、好ましくは、抗体の重鎖不変領域(Ｆｃ)断片のＣ−末端に結合することができ、前記結合は、リンカーペプチドによる結合であることができる。
【０１４２】
また、本発明の他の様相は、配列番号１〜１０からなる群より選択されるアミノ酸配列で表示されたペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを提供する。
【０１４３】
前記「ポリヌクレオチド(ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ)」は、単一本または二重本形態で存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体である。ＲＮＡゲノム配列、ＤＮＡ(ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ)及びこれから転写されるＲＮＡ配列を包括し、特別に言及しない限り、天然のポリヌクレオチドの類似体を含む。
【０１４４】
前記ポリヌクレオチドは、前記配列番号１〜１０のうちいずれか一つのアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列だけではなく、その配列に相補的な(ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ)配列も含む。前記相補的な配列は、完璧に相補的な配列だけではなく、実質的に相補的な配列も含む。これは、当業界に公知されたストリンジェントな条件(ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ)の下で、例えば、配列番号１〜１０のうちいずれか一つのアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列と混成化されることができる配列を意味する。
【０１４５】
また、前記ポリヌクレオチドは、変形されることができる。前記変形は、ヌクレオチドの追加、結実または非保存的置換または保存的置換を含む。前記アミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチドは、前記ヌクレオシド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むと解釈される。前記実質的な同一性は、前記ヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限対応するように調整し、当業界において通常的に利用されるアルゴリズムを利用して調整された配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、最小９０％の相同性または最小９５％の相同性を示す配列であることができる。
【０１４６】
本発明の他の様相は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
【０１４７】
用語「ベクター(ｖｅｃｔｏｒ)」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター及びバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記組換えベクターで使用することができるベクターは、当業界において一般的に使われるプラスミド(例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８/９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣ１９など)、ファージ(例えば、λｇｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λ△ｚ１及びＭ１３など)またはウイルス(例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０など)を操作して製作されることができる。
【０１４８】
前記組換えベクターで配列番号１〜１０のうちいずれか一つのアミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動的に連結されることができる。用語「作動的に連結された(ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ)」は、ヌクレオチド発現調節配列(例えば、プロモーター配列)と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。これによって、前記調節配列は、前記他のヌクレオチド配列の転写及び/または解読を調節することができる。
【０１４９】
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されることができる。前記発現用ベクターは、当業界において植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するために使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公知された多様な方法を通じて構築されることができる。
【０１５０】
前記組換えベクターは、原刻細胞または真核細胞を宿主として構築されることができる。例えば、使用するベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター(例えば、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど)、解読の開始のためのライボゾーム結合位置及び転写/解読終決配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製原点は、ｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点、ＣＭＶ複製原点及びＢＢＶ複製原点などを含むが、これに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノムから由来されたプロモーター(例えば、メタロチオニンプローモーター)または哺乳動物ウイルスから由来されたプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７.５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター及びＨＳＶのｔｋプロモーター)が利用されることができ、転写終決配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【０１５１】
一方、前記ベクターは、本発明の腫瘍浸透性ペプチドだけではなく、このペプチドが融合された抗体の断片または抗体を発現することができる。ペプチドが融合された抗体または抗体の断片の場合、ベクターは、ペプチドと抗体またはその断片が一つのベクターで同時に発現されるベクターシステムであるかまたは各々別途のベクターで発現させるシステムがいずれも可能である。後者の場合、二つのベクターは、同時形質転換(ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ)及び標的形質転換(ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ)を通じて宿主細胞に導入されることができる。
【０１５２】
本発明の組換えベクターは、例えば、図４の(Ｂ)または図１３の(Ｂ)に示した切断地図を有することができる。
【０１５３】
本発明のまた他の様相は、前記組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１５４】
宿主細胞は、当業界において公知された全ての宿主細胞を利用することができ、原核細胞としては、例えば、Ｅ.  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ.  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｅ.  ｃｏｌｉ  ＲＲ１、Ｅ.  ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ.  ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ.  ｃｏｌｉ  Ｘ  １７７６、Ｅ.  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、バチルスサブティリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そして、ネズミチフス菌、セラチアマルセッセンス及び多様なシュードモナス種のような臓内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞、例えば、ＳＰ２/０、ＣＨＯ(Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ)Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＰＥＲ.Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株などが利用されることができる。
【０１５５】
本発明のまた他の様相は、前記宿主細胞を培養する段階を含む腫瘍浸透性ペプチドの製造方法を提供する。
【０１５６】
前記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への挿入は、当業界において広く知られた挿入方法を使用することができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞の場合、ＣａＣｌ２方法または電気穿孔方法などを使用することができ、宿主細胞が真核細胞の場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈澱法、電気穿孔法、リポソーム−媒介形質感染法及び遺伝子衝撃(ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ)などを使用することができるが、これに限定されるものではない。Ｅ.  ｃｏｌｉなどの微生物を利用する場合、生産性は動物細胞などに比べて高いが、糖化(ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ)問題により無傷(ｉｎｔａｃｔ)のＩｇ形態の抗体の生産には適当ではないが、Ｆａｂ及びＦｖのような抗原結合断片の生産には使用することができる。
【０１５７】
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現される表現型を利用し、当業界に広く知られた方法によって容易に実施することができる。例えば、前記選択標識が特定抗生剤耐性遺伝子の場合には、前記抗生剤が含有された培地で形質転換体を培養することで、形質転換体を容易に選別することができる。
【０１５８】
前記一様相は、腫瘍浸透性ペプチド(Ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＴＰＰ)だけではなく、このペプチドが融合された抗体またはその断片の製造を含む概念である。
【０１５９】
腫瘍浸透性ペプチド(ＴＰＰ)が融合された抗体の重鎖不変領域(Ｆｃ)の断片を製造する方法に対する例は、下記の通りである。
【０１６０】
１)前記ＴＰＰを抗体の蝶番から始まる抗体の重鎖不変領域(Ｆｃ)の断片を融合して(ｈｉｎｇｅ)−ＣＨ２−ＣＨ3−ｌｉｎｋｅｒ−ＴＰＰの核酸(ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ)をクローニングした組換ＴＰＰ融合重鎖不変領域(Ｆｃ−ＴＰＰ)発現ベクターを製造する段階；
２)前記製造された発現ベクターを細胞に形質転換して組換えＦｃ−ＴＰＰタンパク質を発現する段階；及び
３)前記発現された組換えＦｃ−ＴＰＰタンパク質を精製、回収する段階。
【０１６１】
また、腫瘍浸透性ペプチドが融合された抗体の製造方法に対する例は、下記の通りである。
【０１６２】
１)前記製造されたＩｇＧ−ＴＰＰのＶＨ−ＣＨ１−蝶番(ｈｉｎｇｅ)−ＣＨ２−ＣＨ３−ｌｉｎｋｅｒ−ＴＰＰの核酸(ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ)をクローニングした組換えＴＰＰ融合ＩｇＧの重鎖部位及びＶＬ−ＣＬの核酸(ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ)をクローニングした抗体軽鎖部位ベクターを製造する段階；
２)前記製造された重鎖、軽鎖発現ベクターを細胞に共同形質転換して組換えＩｇＧ−ＴＰＰタンパク質を発現する段階；及び
３)前記発現された組換えＩｇＧ−ＴＰＰタンパク質を精製、回収する段階。
【０１６３】
また、本発明の一様相は、前記腫瘍浸透性ペプチドまたはこのペプチドが融合された融合タンパク質、  小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを含む癌または新生血管関連疾患の治療または予防用薬学的組成物を提供する。
【０１６４】
本発明による腫瘍浸透性ペプチドは、ニューロピリンと特異的に結合することで、腫瘍に特異的に分布して腫瘍内部に浸透される効能を示す。また、特定部分を血管内皮細胞生長因子−Ａ(ＶＥＧＦ１６５Ａ)の配列に置換することで、腫瘍浸透効果は維持すると共にニューロピリンに対して親和度が顕著に向上された特性を有する。また、本発明による腫瘍浸透性ペプチドは、ヘパリン結合部位が欠損されて非特異的結合が最小化された特性を有する。
【０１６５】
本発明による腫瘍浸透性ペプチドが融合された抗体は、野生型抗体と同様の生産収率を示し、抗体が結合する抗原及び腫瘍浸透性ペプチドが結合するニューロピリンの２種の抗原を同時に標的することができる二重特異性抗体の特性を有し、これによって、高効率で抗体を腫瘍組織に到逹させる特性を有することで、癌治療において高い効果を期待することができる。
【０１６６】
また、前記腫瘍浸透性ペプチドが融合された抗体またはその断片は、本来の野生型抗体が有する抗原結合能、重鎖不変領域(Ｆｃ)の固有機能、すなわち、ＦｃγＲｎ(ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ)、ＦｃＲｓ(Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ)との結合性を維持し、血液中で長い半減期(ｌｏｎｇ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ)を有するようになる。また、精製過程での結合部位(ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ及びｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ)が保存されるという利点があるだけはなく、抗体−依存性細胞媒介細胞毒性(ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ)及び補体−依存性細胞毒性(ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ)を維持することができる。
【０１６７】
また、前記腫瘍浸透性ペプチドは、ニューロピリンと特異的に結合することで、ＶＥＧＦ１６５Ａがニューロピリンに結合することと競合する。これによって、ＶＥＧＦ１６５Ａがニューロピリンに結合して有する新生血管形成(ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)機能を抑制することで、癌治療だけではなく、血管新生関連疾病に対する治療効果を期待することができる。
【０１６８】
前記癌は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直腸癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝臓腫瘍、乳房癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝臓癌及び頭頸部癌からなる群より選択されるものであることができる。
【０１６９】
前記血管新生関連疾病としては、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、血管新生緑内障、後水晶体線維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏、コンタクトレンズの過渡着用、アトピー性角膜炎、上角膜輪部角膜炎、翼状片角膜炎乾性角、シェーグレン症侯群、にきび、フィレクテヌローシス、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学的熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解、精神的外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性動脈炎、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンジョンソン病、類天疱瘡放射状角膜切開、角膜移植拒否、ケロイド、傷顆粒化及び糸球体腎炎群から選択されるものであることができる。
【０１７０】
前記組成物が癌または血管新生関連疾病の予防または治療用薬学的組成物で製造される場合、前記組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。前記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトル、マンニトル、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。前記薬学的組成物は、前記成分以外に滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むことができる。
【０１７１】
前記癌または血管新生関連疾病の予防または治療用薬学的組成物は経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与することができる。経口投与時に、タンパク質またはペプチドは消化されるので、経口用組成物は活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように製剤化しなければならない。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置により投与されることができる。
【０１７２】
前記癌または血管新生関連疾病の予防または治療用薬学的組成物の適合な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方されることができる。前記組成物の好ましい投与量は、大人を基準として０.００１〜１００/ｋｇの範囲内である。用語「薬学的有効量」は、癌を予防または治療するために、または血管新生による疾患を予防または治療するたのに十分な量を意味する。
【０１７３】
前記組成物は、当業者が容易に実施できる方法によって、薬学的に許容される担体及び/または賦形剤を利用して製剤化することで、単位容量形態に製造されるかまたは多用量容器内に入れて製造されることができる。この時、剤型は、オイルまたは水性媒質内の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳剤形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であることができ、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。また、前記組成物は、個別治療剤で投与するか他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤と順次に投与するかまたは同時に投与されることができる。一方、前記組成物は、抗体または抗原結合断片を含むので、免疫リポソームで剤型化されることができる。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法によって製造されることができる。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びポリエチレングリコール−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物として、逆相蒸発法により製造されることができる。例えば、抗体のＦａｂ'  断片は、ジスルフィド−交替反応を通じてリポソームに接合されることができる。ドキソルビシンのような化学治療剤が追加でリポソーム内に含まれることができる。
【０１７４】
また、本発明の一様相は、前記腫瘍浸透性ペプチドまたはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを含む癌の診断用組成物を提供する。
【０１７５】
本明細書で使用された用語「診断」は、病態生理の存在または特徴を確認することを意味する。本発明での診断は、癌が発病するかどうか、および経過を確認することである。
【０１７６】
前記腫瘍浸透性ペプチドは、イメージングにより癌を診断するために分子イメージング用蛍光体と結合することができる。
【０１７７】
前記分子イメージング用蛍光体は、蛍光を発生するすべての物質を意味し、赤色や近赤外線(ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ)の蛍光を発光することが好ましく、量子収量(ｑｕａｎｔａｕｍ  ｙｉｅｌｄ)が高い蛍光体がより好ましいが、これに限定されるものではない。
【０１７８】
前記分子イメージング用蛍光体としては、前記腫瘍浸透性ペプチドと結合することができる蛍光体、蛍光タンパク質またはその他イメージング用物質が好ましいが、これに限定されるものではない。
【０１７９】
蛍光体は、フルオレセイン(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ)、ＢＯＤＹＰＹ、テトラメチルローダミン(Ｔｒｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ)、Ａｌｅｘａ、シアニン(Ｃｙａｎｉｎｅ)、アロフィコシアニン(ａｌｌｏｐｉｃｏｃｙａｎｉｎｅ)またはこれらの誘導体が好ましいが、これに限定されるものではない。
【０１８０】
蛍光タンパク質は、Ｄｒｏｎｐａタンパク質、蛍光発色遺伝子(ＥＧＦＰ)、赤色蛍光プロテイン(ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤｓＲＦＰ)、近赤外線蛍光を示すシアニン蛍光体であるＣｙ５.５またはその他蛍光タンパク質が好ましいが、これに限定されるものではない。
【０１８１】
その他イメージング用物質としては、酸化鉄、放射性同位元素などが好ましいが、これに限定されず、ＭＲ、ＰＥＴのようなイメージング装置に応用されることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−Ａ】
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【図１１−Ｂ】
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【図１１−Ｃ】
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【図１１−Ｄ】
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【図１１−Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９−Ｂ】
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【図１９−Ｃ】
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【図１９−Ｄ】
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【図２０−Ａ】
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【図２０−Ｂ】
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【図２０−Ｃ】
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【図２０−Ｄ】
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【図２１】
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【配列表】
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