(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素分子が固定化された電極を備えるｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で分析物の濃度を測定するための電極システムであって、
スペーサーメンブレンが、前記電極システムの外層の少なくとも一部分を形成しており、前記スペーサーメンブレンが、アクリルおよび／またはメタアクリルモノマーの親水性コポリマーから形成されており、前記親水性コポリマーが、５０モル−％より多い親水性モノマーユニットを含むことを特徴とする電極システム。
【請求項２】
電極システムの外側から酵素分子への分析物の拡散を制御する拡散バリアをさらに備える請求項１記載の電極システム。
【請求項３】
前記スペーサーメンブレンが、少なくとも２つまたは３つのアクリルおよび／またはメタアクリルモノマーからの親水性コポリマーである請求項１または２記載の電極システム。
【請求項４】
前記親水性モノマーユニットが、極性基をもつ親水性の（メタ）アクリル酸エステル、親水性の（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸またはそれらの組み合わせより選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項５】
前記極性基が、ＯＨ、ＯＣＨ3またはＯＣ2Ｈ5基より選択される請求項４記載の電極システム。
【請求項６】
前記親水性モノマーユニットが、
２−ヒドロキシエチルアクリレート、
２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、
２−メトキシエチルアクリレート、
２−メトキシエチルメタクリレート、
２−エトキシエチルアクリレート、
２−エトキシエチルメタクリレート、
２−または３−ヒドロキシプロピルアクリレート、
２−または３−ヒドロキシプロピルメタクリレート（２−または３−ＨＰＭＡ）、
２−または３−メトキシプロピルアクリレート、
２−または３−メトキシプロピルメタクリレート、
２−または３−エトキシプロピルアクリレート、
２−または３−エトキシプロピルメタクリレート、
１−または２−グリセロールアクリレート、
１−または２−グリセロールメタクリレート、
アクリルアミド、
メタクリルアミド、
Ｎ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドおよび
Ｎ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキルメチルアミドであって、
前記アルキル基は１〜３個の炭素原子を有し、
アクリル酸、
メタクリル酸
およびそれらの組み合わせ
より選択される請求項４または５記載の電極システム。
【請求項７】
前記親水性モノマーユニットが、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（２−ＨＰＭＡ）およびそれらの組み合わせより選択される請求項６記載の電極システム。
【請求項８】
前記スペーサーメンブレンの前記親水性コポリマーが、少なくとも６０モル−％の親水性モノマーユニットを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項９】
前記スペーサーメンブレンの前記親水性コポリマーが、少なくとも７０モル−％の親水性モノマーユニットを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項１０】
前記スペーサーメンブレンの前記親水性コポリマーが、４０モル−％以下の疎水性モノマーユニットをさらに含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項１１】
前記スペーサーメンブレンの前記親水性コポリマーが、３０モル−％以下の疎水性モノマーユニットをさらに含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項１２】
前記疎水性モノマーユニットが、
メチルアクリレート、
メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、
エチルアクリレート、
エチルメタクリレート（ＥＭＡ）、
ｎ−またはｉ−プロピルアクリレート、
ｎ−またはｉ−プロピルメタクリレート、
ｎ−ブチルアクリレート、
ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＵＭＡ）、
ネオペンチルアクリレート、
ネオペンチルメタクリレート
およびそれらの組み合わせ
より選択される請求項１０または１１記載の電極システム。
【請求項１３】
前記疎水性モノマーユニットが、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＵＭＡ）およびそれらの組み合わせより選択される請求項１２記載の電極システム。
【請求項１４】
前記疎水性モノマーユニットが、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）またはｎ−ブチルメタクリレート（ＢＵＭＡ）であり、および、前記親水性モノマーユニットが、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）および／または２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（２−ＨＰＭＡ）である請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項１５】
前記スペーサーメンブレンが、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＵＭＡ）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（２−ＨＥＭＡ）および２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（２−ＨＰＭＡ）であるモノマーユニットを含むコポリマーから形成されている電極システムであって、前記コポリマーが、８０モル−％の２−ＨＥＭＡモノマーユニットを含む請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項１６】
前記親水性ポリマーが、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマーである請求項１〜１５のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項１７】
前記スペーサーメンブレンの厚みが、２０μｍ未満である請求項１〜１６のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項１８】
前記スペーサーメンブレンの厚みが、５μｍ未満である請求項１７記載の電極システム。
【請求項１９】
前記スペーサーメンブレンの厚みが、１〜３μｍである請求項１７記載の電極システム。
【請求項２０】
前記親水性コポリマーの相対的水分取り込み量が、コポリマーの総重量に対して５０重量％を超えない請求項１〜１９のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項２１】
前記親水性コポリマーの相対的水分取り込み量が、コポリマーの総重量に対して４０重量％を超えない請求項２０記載の電極システム。
【請求項２２】
前記親水性コポリマーの相対的水分取り込み量が、コポリマーの総重量に対して３０重量％を超えない請求項２０記載の電極システム。
【請求項２３】
前記拡散バリアが、親水性ポリウレタン、または、少なくとも一つの親水性ブロックと少なくとも一つの疎水性ブロックとを有するブロックコポリマーを含む請求項２〜２２のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項２４】
導電体（２ａ）を有する対電極（２）、および導電体（１ａ）を有する作用電極（１）を基板（４）上に含み、さらに、作用電極（１）上に配置される固定化された酵素分子を含む酵素層（５）と、酵素層（５）を被覆する拡散バリア（８）と、拡散バリア（８）および対電極（２）を被覆するスペーサーメンブレン（９）と、を含む請求項１〜２３のいずれか１項に記載の電極システム。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の電極システムを含む、身体内に挿入可能または埋め込み可能であるセンサー。
【請求項２６】
グルコースの測定のための請求項２５記載のセンサー。
【請求項２７】
アクリルおよび／またはメタアクリルモノマーの親水性コポリマーの使用であって、前記親水性コポリマーが、酵素的電極システムのためのスペーサーメンブレンとして、５０モル−％より多い親水性モノマーユニットを含む使用。
【請求項２８】
酵素的電極システムに対する異物反応（ＦＲＢ）を最小限にするための請求項２７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素分子が固定化された電極と、電極システムの周りの体液から酵素分子への分析物の拡散を制御する改良された拡散バリアと、を備えるｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で分析物の濃度を測定するための電極システムに関する。
【０００２】
さらに、本発明は、酵素分子が固定化された電極と、任意には、電極システムの外側から酵素分子への分析物の拡散を制御する拡散バリアおよび電極システムの外層の少なくとも一部分を形成する改良されたスペーサーメンブレンと、を備えるｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で分析物の濃度を測定するための電極システムに関する。
【０００３】
埋め込み可能なまたは挿入可能な電極システムを備えるセンサーは、生理学的に重要な分析物、例えば患者の身体内の乳酸またはグルコースなどの測定を容易にする。この種類のシステムの作用電極は、その中に酵素分子が結合されている導電性の酵素層であって分析物分子の触媒的変換によって電荷キャリアを遊離する酵素層を備える。その過程において、測定シグナルとして電流が生成され、その大きさは、分析物濃度と相関する。
【０００４】
このような電極システムとしては、例えば国際公開第２００７／１４７４７５号および国際公開第２０１０／０２８７０８号などで公知であり、これらの内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００５】
電極システムの作用電極には、電極システムの周りの体液または組織から、酵素層中に固定化されている酵素分子への、測定される分析物の拡散を制御する拡散バリアが設けられる。国際公開第２０１０／０２８７０８号によれば、電極システムの拡散バリアは、少なくとも２つの異なるポリマー、好ましくはアクリレートの固溶体である。ポリマーは、コポリマー、例えば、メタクリル酸メチルとヒドロキシエチルメタクリレートとのコポリマーまたはブチルメタクリレートとヒドロキシエチルメタクリレートとのコポリマーなど、であってもよい。
【０００６】
国際公開第２００７／１４７４７５号は、双性イオン構造を有するポリマーから作製される拡散バリアを開示する。このようなポリマーの例としては、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）が挙げられる。双性イオンポリマーは、別のポリマー、例えばポリウレタンなどと混合されてもよい。
【０００７】
しかしながら、ポリマーまたはコポリマー混合物の使用は、混合物の調製およびセンサーへのその適用が、面倒であり、潜在的に問題があるという難点がある。通常、混合されるポリマーは、個々に溶解され、そして得られた溶液がその後所望の比率で混合される。しかしながら、これは、成分のうちの一つの沈殿をもたらし得、結果的に、例えば噴霧プロセスなどにおける加工性の問題点をもたらし得る。混合物がイオン性の特性をもつポリマーを含んでいる場合、すなわち、混合されるポリマーのうちの一つがアニオン性またはカチオン性基を有するモノマーを含んでいる場合に困難性は増大する。このような荷電基の存在は、しかしながら、溶解性に強く影響を及ぼし、荷電ポリマーおよび非荷電ポリマーの両方に適切な溶媒を見つけることを困難にさせる。
【０００８】
特許文献１は、少なくとも一つのポリマー材料を含む一体化された拡散層および酵素層を備える酵素系センサー、そして、粒子が酵素を担持しており、前記粒子がポリマー材料中に分散されていることを開示する。ポリマーは、親水性および疎水性ポリマー鎖配列を含んでいてもよく、例えば、ポリマーは、高いまたは低い水分取り込み性のポリエーテル−ポリウレタンコポリマーであってもよい。拡散層として、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有するブロックコポリマーの使用は開示されていない。
【０００９】
特許文献２は、導電体を備えた対電極と、導電体を備えた作用電極であって、その上に固定された酵素分子を含む酵素層が局在している作用電極と、を備える分析物の濃度のｉｎ  ｖｉｖｏでの測定のための電極システムを記載する。拡散バリアは、周囲の体液から酵素分子への分析物の拡散を制御する。拡散バリアは、４，４’−メチレン−ビス−（シクロヘキシルイソシアネート）およびジオール混合物（ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールであってもよい）の縮合重合によって得られ得る親水化されたポリウレタンを含んでいてもよい。親水性ポリウレタン層は、スペーサー、例えばブチルメタクリレートと２−メタクリロイルオキシエチル−ホスホリルクロリンとのコポリマーなどで覆われ得る。少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有するブロックコポリマーの拡散層としての使用は開示されていない。５０モル−％より多い親水性モノマーを含む、（メタ）アクリル酸モノマーの親水性コポリマーの使用もまた開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００６／０５８７７９号
【特許文献２】欧州特許出願公開第２１６３１９０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、所望の物理化学的特性を提供し、および、容易に製造され得る、酵素的ｉｎ  ｖｉｖｏセンサーの電極システムにおける拡散バリアを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的は、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有する単一のブロックコポリマーからなる拡散バリアを提供することによって達成される。親水性および疎水性ブロックは、互いに共有結合的に結合されている。好ましくは、ブロックは、（メタ）アクリル酸ポリマーブロックである。
【００１３】
ブロックコポリマーベースの拡散バリアは、以下のような、非常に優れた物理化学的特性を提供する：
（ｉ）拡散バリアの測定される分析物透過性
（ii）電極の短期的挙動（濡れ性）および長期的挙動（センサーのドリフト）に適切である拡散バリアの透過特性
（iii）延長された複数の電極を備えるｉｎ  ｖｉｖｏセンサーの製造を可能にする、拡散バリアの機械的柔軟性
（iv）拡散層へのイオン性基の効率の良い組み込み、すなわち、ポリマー内のカチオン性またはアニオン性電荷密度が効率良く調整され得、これは、荷電性分析物の反発または親和性、および／または、例えば周りの体液または組織からの単球などの細胞の接着の制御に関連する。
【００１４】
本発明の主題は、酵素分子が固定化された電極と、電極システムの外側から酵素分子への分析物の拡散を制御する拡散バリアと、を備えるｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で分析物の濃度を測定するための電極システムであって、拡散バリアが、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有するブロックコポリマーを含むことを特徴とする電極システムである。
【００１５】
好ましくは、拡散バリアは、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有する、単一の、すなわちただ一つの、ブロックコポリマーを含み、すなわち、さらなるポリマーまたはコポリマーは存在しない。より好ましくは、拡散バリアは、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有する、単一のブロックコポリマーからなる。
【００１６】
本発明の電極システムは、身体内への、例えば、ヒトの身体内などの哺乳類の身体内への、挿入または埋め込みに適する。電極システムは、例えば、細胞外空間（間質）内、血管もしくはリンパ管内、または細胞間の間隙内などの体液および／または身体組織内の所望の分析物を測定するために適合される。
【００１７】
挿入されたまたは埋め込まれた電極システムは、短期の適用、例えば３〜１４日間など、また、長期の適用、例えば６〜１２か月間などに適する。挿入または埋め込みの期間のあいだ、所望の分析物が、継続的または非継続的な測定によって測定され得る。
【００１８】
本発明の電極システムは、好ましくは、酵素的、非流体的（enzymatic, non-fluidic）（ＥＮＦ）センサーの一部であって、ここで分析物の酵素的変換が測定される。好ましくは、センサーは、分析物の変換のための酵素分子が固定化された作用電極であって、電気的信号の生成をもたらす作用電極を含む。酵素は、電極を被覆する層中に存在し得る。追加で、酸化還元メディエーターおよび／または電解触媒や導電性粒子およびポア形成剤が存在していてもよい。この種の電極は、例えば、国際公開第２００７／１４７４７５号に記載されており、その開示は本明細書中に参照によって組み込まれる。
【００１９】
作用電極の領域は、センサーの感度領域である。この感度領域には、外側、例えば電極システムのまわりの体液および／または組織など、からの酵素分子への分析物の拡散を制御する拡散バリアが設けられる。拡散バリアは、例えば、酵素層を覆うカバー層、すなわち酵素を含まない層であり得る。しかしながら、拡散制御粒子が拡散バリアとして機能するように酵素層中に組み込まれていることもまた可能である。例えば、酵素層のポアが、分析物分子の拡散を制御するポリマーで充填され得る。拡散バリアの厚みは、通常、約２〜２０μｍ、例えば、約２〜１５μｍ、または約５〜２０μｍ、特には約５〜１０μｍ、または約１０〜１５μｍのあいだ（乾燥状態で）である。
【００２０】
本発明の電極システムの拡散バリアは、ブロックコポリマー、好ましくは、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有する単一のブロックコポリマーを含む。ブロックコポリマーは、ブロックの交互配列、すなわち親水性ブロックが疎水性プロックへと結合されている配列を含んでいてもよい。親水性および疎水性ブロックは、ポリマー分子内で互いに共有結合的に結合する。ポリマーの（重量）平均分子量は、通常２０〜７０ｋＤ、特には２５〜６０ｋＤおよびより特には３０〜５０ｋＤである。ブロックコポリマー中の、親水性部分の疎水性部分に対するモル比は、通常約７５％（親水性）：２５％（疎水性）〜約２５％（親水性）：７５％（疎水性）の範囲、約６５％（親水性）：３５％（疎水性）〜約３５％（親水性）：６５％（疎水性）の範囲、または、約６０％（親水性）：４０％（疎水性）〜約４０％（親水性）：６０％（疎水性）の範囲である。
【００２１】
ブロックコポリマーの親水性ブロックは、少なくとも９０％の、少なくとも９５％のおよび特には完全に、親水性モノマーユニットからなる。これは通常、５０〜４００の、例えば５０〜２００の、または１５０〜３００の、特には１００〜１５０の、または２００〜２５０などの、モノマー分子長を有する。コポリマーの疎水性ブロックは、少なくとも９０％の、少なくとも９５％のおよび特には完全に、疎水性モノマーユニットからなる。これは通常、５０〜３００の、例えば５０〜２００の、または１５０〜２５０の、特には８０〜１５０の、または１７０〜２００などの、モノマーユニット長を有する。
【００２２】
親水性ブロックおよび／または疎水性ブロックは好ましくは、（メタ）アクリル系のユニットからなる。より好ましくは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックの両方が、（メタ）アクリル系のモノマーユニットからなる。
【００２３】
親水性ブロックの親水性モノマーユニットは、好ましくは、親水性の（メタ）アクリル酸エステル、すなわち極性基をもつエステル、すなわちＯＨ、ＯＣＨ3またはＯＣ2Ｈ5基をエステルのアルコール部分内にもつエステル、親水性の（メタ）アクリルアミドであって、アミド（ＮＨ2）またはＮ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキルアミド基を有し、アルキル基が１〜３個の炭素原子および任意には例えばＯＨ、ＯＣＨ3またはＯＣ2Ｈ5基などの親水性基を含む（メタ）アクリルアミド、ならびに、例えばアクリル酸（アクリレート）またはメタクリル酸（メタクリレート）などの荷電性の基、例えばアニオン性基またはカチオン性基などをもつ適切な（メタ）アクリル酸ユニットから選択される。さらに、モノマーユニットの組み合わせも使用され得る。
【００２４】
親水性ブロックのための好ましいモノマーユニットの具体的な例は以下から選択される：
２−ヒドロキシエチルアクリレート、
２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、
２−メトキシエチルアクリレート、
２−メトキシエチルメタクリレート、
２−エトキシエチルアクリレート、
２−エトキシエチルメタクリレート、
２−または３−ヒドロキシプロピルアクリレート、
２−または３−ヒドロキシプロピルメタクリレート（２−または３−ＨＰＭＡ）、
２−または３−メトキシプロピルアクリレート、
２−または３−メトキシプロピルメタクリレート
２−または３−エトキシプロピルアクリレート、
２−または３−エトキシプロピルメタクリレート、
１−または２−グリセロールアクリレート、
１−または２−グリセロールメタクリレート、
アクリルアミド、
メタクリルアミド、
Ｎ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドおよび
Ｎ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキルメチルアミドであって、アルキル基は例えばメチル、エチルまたはプロピルなどの１〜３個の炭素原子を含む、
アクリル酸（アクリレート）、
メタクリル酸（メタクリレート）
およびそれらの組み合わせ。
【００２５】
好ましい親水性モノマーは、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）および／または２−または３−ヒドロキシプロピルメタクリレート（２−または３−ＨＰＭＡ）である。より好ましくは、親水性ブロックは、少なくとも２つの異なる親水性モノマーユニットからなる。例えば、ＨＥＭＡおよび２−ＨＰＭＡなどの少なくとも２つの異なる親水性モノマーユニットのランダムコポリマーであってもよい。
【００２６】
イオン性基をモノマー中に導入するために、荷電性モノマーユニット、例えばアクリル酸（アクリレート）および／またはメタクリル酸（メタクリレート）が親水性ブロック中に組み込まれてもよい。したがって、本発明の特定の実施様態において、親水性ブロックは、少なくとも一つの非イオン性親水性モノマーユニット（例えば上述されているもの）および少なくとも一つのイオン性親水性モノマーユニットから作製され得、ここでイオン性モノマーユニットは、好ましくは１〜２０モル−％のモル量で存在する。親水性ブロックが例えばアクリル酸またはメタクリル酸などのイオン性モノマーユニットを含む場合、特にはＮ，Ｎ−ジアルキルアクリルまたはメタクリルアミドなどの（メタ）アクリルアミドの群より選択される親水性モノマーとの共重合化が好ましい。
【００２７】
疎水性ブロックの疎水性モノマーユニットは、好ましくは、疎水性のアクリル酸および／またはメタクリル酸ユニット、スチレン系のモノマーユニット、またはそれらの組み合わせより選択される。好ましくは、疎水性モノマーユニットは、例えば、親水性基を有さない１〜３個の炭素原子をもつアルコール部位を有するエステルなどの、疎水性の（メタ）アクリル酸エステルより選択される。疎水性ブロックのためのモノマーユニットの具体的な例は以下から選択される：
メチルアクリレート、
メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、
エチルアクリレート、
エチルメタクリレート（ＥＭＡ）、
ｎ−またはｉ−プロピルアクリレート、
ｎ−またはｉ−プロピルメタクリレート、
ｎ−ブチルアクリレート、
ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＵＭＡ）、
ネオペンチルアクリレート、
ネオペンチルメタクリレート
およびそれらの組み合わせ。
【００２８】
疎水性ブロックは、例えばランダムなコポリマーとして存在する、少なくとも２つの異なる疎水性モノマーユニットを含む。好ましい実施態様において、疎水性ブロックは、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）およびｎ−ブチルメタクリレート（ＢＵＭＡ）を含む。特に好ましい実施態様において、疎水性ブロックは、ＭＭＡおよびＢＵＭＡのランダムコポリマーである。ＭＭＡおよびＢＵＭＡのあいだのモル比は、好ましくは、約６０％（ＭＭＡ）：４０％（ＢＵＭＡ）〜約４０％（ＭＭＡ）：６０％（ＢＵＭＡ）、例えば、約５０％（ＭＭＡ）：５０％（ＢＵＭＡ）などである。疎水性ブロックのガラス転位温度は、好ましくは１００℃以下、９０℃以下、または８０℃以下、例えば約４０〜８０℃である。代替的な実施態様において、疎水性ブロックは、スチレンユニット、例えば約９５℃のガラス転位温度を有するポリスチレンなどからなっていてもよい。
【００２９】
本発明において使用されるブロックコポリマーは、公知の方法にしたがって製造され得る（Boeker et al., Macromolecules 34 (2001), 7477-7488）。
【００３０】
ブロックコポリマーは、通常の手法によって、例えば、エーテルなどの有機溶媒などの適切な溶媒または溶媒混合物中のブロックコポリマーの溶液を提供し、それが、既成の電極システムに適用され、そしてその上で乾燥されることなどによって、電極システムに適用され得る。
【００３１】
ブロックコポリマーが水と接触される場合、３７℃の温度およびｐＨ７．４（１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、および１４７ｍＭ  ＮａＣｌの水性リン酸緩衝液）で、好ましくは約１５〜３０重量％（ポリマーの乾燥重量に基づいて）の水分取り込みを示す。
【００３２】
ブロックコポリマーに加えて、拡散バリアはまた、さらなる成分、特には非ポリマー性成分を含んでいてもよく、これらはポリマー中に分散および／または溶解されていてもよい。これらさらなる成分としては、例えば、可塑剤、特には生体適合性の可塑剤、例えばトリ−（２−エチルヘキシル）トリメリテートおよび／またはグリセロールなどが挙げられる。
【００３３】
本発明の拡散バリアは、３７℃の温度およびｐＨ７．４で、好ましくは≧１０-10ｃｍ2／ｓである、より好ましくは≧５×１０-10ｃｍ2／ｓである、およびさらにより好ましくは≧１０-9ｃｍ2／ｓである、および例えば１０-7または１０-8ｃｍ2／ｓまでである、グルコースに対する高い実効拡散係数Ｄeffを有する。実効拡散係数は、好ましくは、実施例４に記載されるように以下の式：
【数１】
0006374860.tif 000002
（ここで、ＳＥmは作用電極の感度であり、Ｆは作用電極の面積であり、および、Ｌmは拡散バリアの層厚である）
によって決定される。ＳＥmおよびＬmは実施例に記載されるように決定され得る。
【００３４】
本発明の電極システムは、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下での分析物の濃度の測定に、すなわち、身体内に挿入されるまたは埋め込まれる場合に適する。分析物は、組織または体液内に存在する任意の分子またはイオン、例えば、酸素、二酸化炭素、塩（カチオンおよび／またはアニオン）、脂肪もしくは脂肪成分、炭水化物もしくは炭水化物成分、タンパク質もしくはタンパク質成分、または他の種類の生体分子などであり得る。特に好ましくは、例えば血液などの体液および組織のあいだで効率よく移動され得る、例えば酸素、二酸化炭素、ナトリウムカチオン、塩素アニオン、グルコース、尿素、グリセロール、乳酸およびピルビン酸などの分析物が測定される。
【００３５】
電極システムは、電極上に固定された酵素を含む。酵素は所望の分析物の測定に適切である。好ましくは、酵素は、分析物を触媒的に変換することができ、およびこれによって、作用電極の導電体によって検出可能な電気信号を生成する。分析物を測定するための酵素は、好ましくは、例えばグルコースオキシダーゼもしくは乳酸オキシダーゼなどの酸化酵素、または、例えばグルコースデヒドロゲナーゼもしくは乳酸デヒドロゲナーゼなどの脱水素酵素である。酵素に加えて、酵素層はまた、作用電極の導電性成分例えば黒鉛粒子などへの電子の移動を助ける電解触媒または酸化還元メディエーターを含んでいてもよい。適切な電解触媒は、例えば二酸化マンガンなどの金属酸化物、または、例えばコバルトフタロシアニンなどの有機金属系化合物である。好ましい実施態様において、酸化還元メディエーターは、過酸化水素を分解する能力をもち、これゆえ作用電極の周りにおける酸素の枯渇を相殺する。別の実施態様において、酸化還元メディエーターは、酵素に共有結合的に結合されてもよく、そしてこれによって、作用電極への直接的な電子移動に効果を及ぼす。直接的な電子移動に適切な酸化還元メディエーターは、補欠分子族、例えばピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）または他の公知の補欠分子族などである。電極上に固定された酵素は、例えば、国際公開第２００７／１４７４７５号に記載されており、その内容は本明細書中に参照によって組み込まれる。
【００３６】
電極システムの好ましい実施態様は、導電体を備えた対電極と、導電体を備えた作用電極であって、その上に酵素層および拡散バリアが配置されている作用電極と、を備える。酵素層は、好ましくは、互いに例えば少なくとも０．３ｍｍまたは少なくとも０．５ｍｍなどの距離で、作用電極の導体上に配置されている複数のフィールドの形にデザインされる。作用電極の個々のフィールドは、一連の個々の作用電極を形成していてもよい。これらのフィールドのあいだにおいて、作用電極の導体は、絶縁層によって被覆されていてもよい。酵素層のフィールドを、電気的絶縁層の開口部の上に配置することによって、信号対雑音比が改善され得る。このような配置は、国際公開第２０１０／０２８７０８号に開示されており、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３７】
本発明の電極システムは、追加で、例えばＡｇ／Ａｇ−Ｃｌ参照電極などの、作用電極のための参照電位を提供することが可能である参照電極を備える。さらに、本発明の電極システムは、追加の対電極および／または作用電極を有し得る。
【００３８】
電極システムは、例えば、ポテンシオスタットおよび電極システムの測定シグナルの増幅のための増幅器に連結されることなどによって、センサーの一部分とされてもよい。センサーは好ましくは、酵素的、非流体的（ＥＮＦ）センサーであり、より好ましくは、電気化学的ＥＮＦセンサーである。電極システムの電極は、ポテンシオスタットを担持する基板上に配置されてもよく、また、ポテンシオスタットを担持する回路基板へと接着されていてもよい。
【００３９】
本発明のさらなる主題は、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有するブロックコポリマーの、酵素的電極のための拡散バリアとしての使用に関する。ブロックコポリマーは、好ましくは、上述されるように、例えば単一のブロックコポリマーである。拡散バリアおよび酵素的電極もまた、好ましくは上で記載されているようなものである。
【００４０】
本発明のさらなる詳細および利点は、添付の図面を参照して、例示的な実施態様にもとづいて説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明の電極システムの例示的な実施態様を示す。
【図２】図１の詳細図である。
【図３】図１の別の詳細図である。
【図４】図２の断面線ＣＣに沿った断面図を示す。
【図５】バリア層として異なるブロックポリマー（Ｃ、Ｆ、Ｄ、Ｂ）が設けられた４つのグルコースセンサーの（１０ｍＭグルコースでの）感度を（標準偏差と共に）示す。
【図６】バリア層として異なるブロックポリマー（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）が設けられた４つのグルコースセンサーのセンサードリフトを示す。
【図７】ブロックコポリマーＡの時間依存性伝導度を示す（２つの実験）。
【図８】ブロックコポリマーＦの時間依存性伝導度を示す（３つの実験）。
【図９】それぞれ２．７７μｍまたは４．４３μｍの層厚であるブロックコポリマーＨの、時間依存性伝導度を示す。
【図１０】コーティングされていないプレート（対照）に対する、種々のスペーサーメンブレンポリマー（Ａｄａｐｔ（登録商標）およびＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）  Ｅ１００）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフィブリノゲン接着を示す。
【図１１】スペーサーメンブレン（Ａｄａｐｔ（登録商標）およびＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６）でコーティングされているセンサーまたはコーティングされていない（対照＝未処理の細胞）センサーとのインキュベーション後のＴＨＰ−１細胞による表面タンパク質ＣＤ５４の発現を示す。
【図１２ａ】スペーサーメンブレン（Ａｄａｐｔ（登録商標）およびＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６）でコーティングされているセンサーまたはコーティングされていない（対照＝未処理の細胞）センサーとのインキュベーション後のＴＨＰ−１細胞による、サイトカインＩＬ−８の分泌を示す。
【図１２ｂ】スペーサーメンブレン（Ａｄａｐｔ（登録商標）およびＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６）でコーティングされているセンサーまたはコーティングされていない（対照＝未処理の細胞）センサーとのインキュベーション後のＴＨＰ−１細胞による、ＭＣＰ−１の分泌を示す。
【図１３】スペーサーメンブレン（Ａｄａｐｔ（登録商標）、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６およびＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）  Ｅ１００）でコーティングされているまたはコーティングされていない（Ｐｏｌｙｓｔ．）組織培養プレートとのインキュベーション後のＴＨＰ−１細胞による、サイトカインＩＬ−８の分泌を示す。
【図１４】センサーなしのスペーサーポリマーＡｄａｐｔ（登録商標）（負の対照＝インキュベーション培養液のみ；陽の対照＝１００％の浸透圧溶解）と比較された、スペーサーメンブレン（Ａｄａｐｔ（登録商標）およびＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６）でコーティングされているセンサーまたはコーティングされていないセンサーとのインキュベーション後の溶血を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
図１は、例えば皮膚または皮下の脂肪組織などのヒトまたは動物の身体組織内への挿入のための電極システムの例示的実施態様を示す。Ａの拡大された詳細図が、図２に示されており、Ｂの拡大された詳細図が、図３に示されている。図４は、図２の断面線ＣＣに沿った対応する断面図を示す。
【００４３】
示されている電極システムは、作用電極１、対電極２、および参照電極３を備える。電極の導電体１ａ、２ａ、３ａは、基板４上に好ましくはパラジウムまたは金で作製される金属導体のパスの形状で配置される。示されている例示的な実施態様において、基板４は、例えばポリエステルから作製される柔軟性のあるプラスチックプレートである。基板４は、０．５ｍｍ未満、例えば１００〜３００マイクロメーターの厚さであり、そしてこれゆえ、その挿入後に周囲の身体組織の動きに適合することができるように屈曲し易い。基板４は、患者の身体組織内への挿入のための狭い軸部と、身体の外側に位置される電気システムへの接続のための幅の広い上端部とを備える。基板４の軸部は好ましくは、少なくとも１ｃｍの長さ、特には２ｃｍ〜５ｃｍの長さである。
【００４４】
示されている例示的な実施態様において、測定機構の一部分、すなわち、基板の上端部は、使用のあいだ患者の身体から突き出ている。代替的には、しかしながら、測定機構の全体を埋め込むことおよび測定データを無線形式で身体の外側に配置されている受信機へと伝達することもまた可能である。
【００４５】
作用電極１は、分析物の触媒的変換のための固定化された酵素分子を含む酵素層５を担持する。酵素層５は、例えば、カーボン粒子の硬化ペースト、高分子結合剤、酸化還元メディエーターまたは電解触媒、および、酵素分子の形態で、適用され得る。この種の酵素層５の製造の詳細は、例えば、国際公開第２００７／１４７４７５号に開示されており、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４６】
示されている例示的な実施態様において、酵素層５は、作用電極１の導電体１ａに連続的には適用されず、むしろ、互いに距離を隔てて配置される個々のフィールドの形状で適用される。示されている例示的な実施態様における酵素層５の個々のフィールドは、一連のシリーズとしては配置される。
【００４７】
作用電極１の導電体１ａは、図２で特によく示されているように、酵素層フィールドのあいだに狭い部位をもつ。対電極２の導電体２ａは、作用電極１の導電体１ａのパスに沿う外形をもつ。この手段は、有利に短い電流経路および低い電流密度をともなう、作用電極１および対電極２がインターカレートしている配置または互いに組み合わされた配置をもたらす。
【００４８】
その実効表面を増大させるために、対電極２には、対電極２の導電体２ａ上に個々のフィールドの形状で位置している、多孔性の導電層６が設けられ得る。作用電極１の酵素層５と同様に、この層６は、カーボン粒子の硬化ペーストおよび高分子結合剤の形態で適用され得る。層６のフィールドは好ましくは、酵素層５のフィールドと同じ大きさをもつが、これは必須なわけではない。しかしながら、対電極の表面を増加させるための手段がとられなくてもよく、そして、対電極２が、いかなる種類のコーティングもなしに、または、上述のブロックコポリマーから作製されるコーティングおよび任意にはスペーサーとともに、直線的な伝導体パスであるようにデザインされてもよい。
【００４９】
参照電極３は作用電極１の導電体１ａおよび対電極２の導電体２ａとのあいだに配置される。図３に示されている参照電極は、その上に導電性の銀／塩化銀ペーストのフィールド３ａが配置されている、導電体３ａからなる。
【００５０】
図４は、図２の断面線ＣＣに沿った断面図を示す。断面線ＣＣは、作用電極１の酵素層フィールド５の一つを通って、そして、対電極２の導電層のフィールド６間まで及ぶ。酵素層５のフィールド間で、作用電極１の導電体１ａは、導電層６のフィールド間の対電極２の導電体２ａと同様に、導電パス１ａ、２ａの金属によって触媒されるかもしれない干渉反応を防ぐために、電気的な絶縁層７によって被覆され得る。酵素層５のフィールドは、したがって、絶縁層７の開口部内に位置されている。同様に、対電極２の導電層６のフィールドもまた、絶縁層７の開口部の上に位置され得る。
【００５１】
酵素層５は、測定される分析物に対する拡散抵抗を示し、これゆえ拡散バリアとして作用するカバー層８によって被覆される。拡散バリア８は、上述されるように、交互に親水性および疎水性ブロックを有する単一のコポリマーからなる。
【００５２】
カバー層８の好ましい厚さは、例えば、３〜３０μｍ、特には約５〜１０μｍまたは約１０〜１５μｍである。その拡散抵抗に起因して、カバー層８は、単位時間あたり、わずかな数の分析物分子しか酵素層５へと到達させない。したがって、カバー層８は、分析物分子が変換される速度を低下させ、そしてしたがって、作用電極のまわりの分析物濃度の枯渇に対抗する。
【００５３】
カバー層８は、作用電極１の導電体１ａの実質的に全体のエリアにわたって、連続的に広がる。カバー層８上において、生体適合性のメンブレンが、酵素層５と身体組織のまわりの細胞とのあいだに最小の距離を確立するスペーサー９として配置され得る。この手段は、有利には、酵素層フィールド５のまわりにおける流体交換の一過性の障害の場合に、そこから分析物分子が対応する酵素層フィールド５へと到達できるような、分析物分子の貯留槽を生成する。電極システムのまわりにおける体液の交換が一時的に制限される、または妨げられる場合、スペーサー９内に保管された分析物分子が、そこで分子が変換される作用電極１の酵素層５へ、拡散し続ける。したがって、スペーサー９は、分析物濃度の著しい減少を引き起こすが、対応する測定結果の歪曲は、顕著により長い期間後にしか起こらない。示されている例示的な実施態様において、スペーサー９を形成しているメンブレンはまた、対電極２および参照電極３を被覆する。
【００５４】
スペーサーメンブレン９は、例えば、透析メンブレンであってもよい。この意味において、透析メンブレンとは、最大の大きさよりも大きな分子が透過することのできないメンブレンであると理解される。透析メンブレンは、別個の製造プロセスにおいて先に製造され得、そして、その後電極システムの製造のあいだに適用されてもよい。透析メンブレンが透過させることのできる分子の最大の大きさは、分析物分子は通過できるが、より大きな分子は保持されるように選択される。
【００５５】
代替的には、透析メンブレンの代わりに、例えばポリウレタンまたはアクリレートをベースとした、分析物および水に対して非常に透過性であるポリマーから作られるコーティングが、スペーサーメンブレン９として電極システム上に適用され得る。
【００５６】
好ましくは、スペーサーは、（メタ）アクリレートのコポリマーで作製される。好ましくは、スペーサーメンブレンは、少なくとも２つまたは３つの（メタ）アクリレートからのコポリマーである。より好ましくは、スペーサーメンブレンは、５０モル−％より多い、少なくとも６０モル−％、または、少なくとも７０モル−％の親水性モノマーユニット、例えばＨＥＭＡおよび／または２−ＨＰＭＡなど、ならびに、４０モル−％までの、または３０モル−％までの疎水性ユニット、例えばＢＵＭＡおよび／またはＭＭＡなどを含む。スペーサーは、ランダムまたはブロックコポリマーであり得る。特に好ましいスペーサーメンブレンは、疎水性成分としてＭＭＡまたはＢＵＭＡ、ならびに、親水性成分として２−ＨＥＭＡおよび／または２−ＨＰＭＡを含む。好ましくは、親水性モノマーＨＥＭＡおよび／またはＨＰＭＡの量は、８０モル−％〜８５モル−％のあいだ、および、疎水性成分ＭＭＡおよび／またはＢＵＭＡの量は、１５モル−％〜２０モル−％のあいだである。
【００５７】
本発明の極めて好ましいスペーサーメンブレンは、Ａｄａｐｔ（登録商標）（BioInteractions Ltd, Reading, England）コポリマーから作製される。Ａｄａｐｔ（登録商標）は、疎水性部位としてＢＵＭＡ、および、親水性部位として２−ＨＥＭＡおよび２−ＨＰＭＡを含み、ここで、２−ＨＥＭＡ親水性モノマーの量は約８０モル−％である。
【００５８】
スペーサーメンブレンは、分析物に対して非常に透過性であり、すなわち、作用電極の単位面積あたりの感度を顕著に、例えば、約２０μｍ未満、好ましくは約５μｍ未満の層厚で、２０％以下、または５％以下などに低下させる。特に好ましいスペーサーメンブレンの厚さは、約１〜約３μｍである。
【００５９】
電極システムの酵素層５は、金属酸化物粒子、好ましくは二酸化マンガン粒子を、触媒的酸化還元メディエーターとして含み得る。二酸化マンガンは、例えばグルコースおよび他の生体分析物の酵素的酸化によってなどで形成される過酸化水素を触媒的に変換する。過酸化水素の分解のあいだ、二酸化マンガン粒子は、電子を作用電極１の導電性成分へ、例えば酵素層５内の黒鉛粒子などへ電子を移動する。過酸化水素の触媒的分解は、酵素層５における酸素濃度のいかなる低下も相殺する。有利には、これは、酵素層５において検出されるべき分析物の変換が局所的な酸素濃度によって制限されないことを可能にする。触媒的な酸化還元メディエーターの使用は、したがって、酸素濃度が低くなったことによってもたらされる測定結果の歪曲に対抗する。触媒的な酸化還元メディエーターの別の有利な点は、細胞に障害をもたらし得る濃度の過酸化水素の産生を防止することである。
【００６０】
本明細書において記載される好ましいスペーサーメンブレンポリマーは、本発明の拡散バリアのための外側のコーティングとして使用されてもよいが、一般的な電極システムの、特には、酵素分子が固定化された電極と、電極システムの外側から酵素分子への分析物の拡散を制御する拡散バリアとを備えるｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で分析物の濃度を測定するための電極システムの、外側のコーティングとしても使用され得る。したがって、スペーサーメンブレンは、拡散バリア上に配置され得るが、スペーサーメンブレンはまた、酵素層上に直接的に配置されてもよい。この最後の意味において、スペーサーメンブレンはまた、拡散バリア自身としても作用し得、そして、分析物分子の酵素層への拡散を低下させ得る。
【００６１】
本発明の電極システムが身体内に挿入されるまたは埋め込まれる場合、スペーサーメンブレンは、埋め込まれたセンサーと、まわりの体液または組織とのあいだの境界となる。結果的に、体液または組織に暴露された場合、本発明のスペーサーメンブレンは、それがセンサーを変形させたり、または、押し動かしたりしないように、機械的に強固でなければならない。この目的を達成するために、コポリマーの固有の親水性にかかわらず、スペーサーメンブレンコポリマーの水分取り込み量およびこれに付随するコポリマーの膨潤は、制限されなければならない。
【００６２】
好ましくは、スペーサーメンブレンコポリマーの相対的水分取り込み量は、コポリマーの全比率に対して５０重量％、好ましくは４０重量％、より好ましくは３０重量％を超えるべきではない。本発明の意味において、相対的水分取り込み量の測定は、乾燥コポリマーを３７℃の温度で４８時間、過剰のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に付することによって行われた。相対的水分取り込み量（ＷＵ％）は、好ましくは以下の式：
【数２】
0006374860.tif 000003
（式中、ｍ1およびｍ2は、それぞれ、乾燥コポリマーおよび上記の測定条件にしたがった水和後のコポリマーの重量を示す）
にしたがい決定される。
【００６３】
本発明の発明者らは、コポリマーＡｄａｐｔ（登録商標）で作製された好ましいスペーサーメンブレンは、３７℃で４８時間でそれ自身の重量に対して３３±１．８重量％のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を取り込むことを見つけ出した。同条件下、ポリマーＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６（NOF Corporation, Japan）のメンブレンは、それ自身の重量に対して１５７±９．７重量％のリン酸緩衝液を取り込む。ポリマーのより低い水分取り込みは、本発明のスペーサーメンブレンの機械的安定性を有利に向上させる。対照的に、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６は、より高い水分取り込みを示し、および、特に酵素的ｉｎ  ｖｉｖｏセンサーの電極システム上に適用された場合に、よりもろく、容易に変形するまたは押し動かされるハイドロゲルへと膨潤する。
【００６４】
さらに、電極システムの挿入および埋め込みのあいだ、スペーサーは組織および／または例えば間質液または血液などの、タンパク質および細胞などの生体分子を含む体液と直接的に接触している。有利には、スペーサーメンブレンは、組織および／または体液環境に挿入されたおよび埋め込まれたセンサーを保護するべきであり、したがって、インプラントに対する身体の組織反応を最小限にしなければならない。実際、埋め込まれた材料に対する身体の反応は、「異物反応（foreign body response）」（ＦＢＲ）として知られている。ＦＢＲによって、身体はインプラントを破壊しようとするか、またはそれが可能でない場合、それを周囲の組織から分離するためにカプセルを作り出そうと試みる（異物肉芽腫）。ＦＢＲ反応の最初の段階は、タンパク質（例えば、フィブリノゲン、アルブミン、イミュノグロブリン、相補体など）の、先の材料、すなわちインプラントの表面への結合である。このタンパク質コートは、免疫細胞上のレセプターに対する結合部位を呈示する。例えば、フィブリノゲンはモノサイトレセプターＭＡＣ−１に結合する構造モチーフを含む。フィブリノゲンがインプラントの表面に結合した場合、そのコンフォーメーションが変化し、そして、ＭＡＣ−１のための結合部位が露出する。結果的に、単球などの免疫細胞がインプラントに補充され、そして活性化され、インプラントを攻撃する酵素およびラジカルを分泌する。加えて、免疫細胞は、他の免疫細胞を補充しそして活性化するために、可溶性因子、すなわちサイトカインを分泌し、そしてこれによって免疫反応が増幅される。インプラントが除去され得ないと、線維性被膜が結合組織細胞およびタンパク質によって形成される。しかしながら、このカプセルは、分析物にとってセンサーに到達することを妨げる拡散バリアである。これらをまとめると、上述されるような異物反応という事象は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける電極システムの機能およびその寿命を妨害すると考えられる。
【００６５】
したがって、酵素的ｉｎ  ｖｉｖｏセンサーの電極システムの改良されたスペーサーメンブレンはさらに、インプラントに対する組織反応の低減を提供し、そして、センサーを周囲組織および体液から分離するカプセルの形成を防止する。
【００６６】
したがって、本発明のさらなる目的は、酵素分子が固定化された電極と、好ましくは、電極システムの外側の体液から酵素分子への分析物の拡散を制御する拡散バリアと、を備え、スペーサーメンブレンが電極システムの外層の少なくとも一部分を形成することを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で分析物の濃度を測定するための電極システムであって、スペーサーメンブレンがアクリルおよび／またはメタアクリルモノマーの親水性コポリマーを含み、ポリマーが５０モル％より多い親水性モノマーを含む電極システムを提供することである。
【００６７】
上述されるように、本発明のスペーサーメンブレンは、免疫細胞の応答をトリガーし得るおよびそのｉｎ  ｖｉｖｏにおける性能を制限するまたは妨害するかもしれないタンパク質吸着からセンサーの電極システムを保護するために、制限されたタンパク質結合能力をまさに有する。実施例５および６は、本発明の好ましいスペーサーメンブレンが、フィブリノゲンへの結合をほとんど提供せず、および、単球に対するＭＡＣ−１結合モチーフの露出を導くであろうフィブリノゲンのコンフォーメーション変化を防ぐことを示している。有利には、スペーサーメンブレンコポリマーの材料は免疫細胞をそれ自身で活性化しない。実施例６によって、本発明のスペーサーメンブレンコポリマーが、埋め込まれたセンサーによる免疫細胞の活性化を減少させ得ることが示され得る。さらに、有利には、スペーサーメンブレンは生体適合性材料であり、特には、体液例えば血液などに適合性である。実施例７は、本発明のスペーサーメンブレンコポリマーが、埋め込まれたセンサーによる溶血および補体活性化を防ぐことができることを示している。したがって、本発明のスペーサーメンブレンは、高い機械的安定性を示すだけでなく、理想的な生体適合特性を有しており、これは、湿潤された際の低い水分取り込み量を考慮すると驚くべきことである。
【００６８】
電極システムの構造、分析物および酵素分子に特に関する本実施態様の特性は、本明細書中に記載されるようなものである。拡散バリアは、好ましくは、本明細書中に記載されるようなものであるが、しかしながら、それはまた異なる組成を有していてもよく、また、存在していなくてもよい。ある好ましい実施態様において、拡散バリアは好ましくは、本明細書中に記載されるような少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有するブロックコポリマーを含む。
【００６９】
さらに好ましい実施態様において、拡散バリアは、親水性ポリウレタンを含む。拡散メンブレンとして使用される親水性ポリウレタンは、（ポリ）ジイソシアネート、好ましくは４，４’−メチレン−ビス−（シクロヘキシルイソシアネート）のポリアルコール、好ましくはジオール混合物への重付加によって作製され得る。
【００７０】
ジオール混合物の成分は、好ましくは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）などのポリアルキレングリコール、および、例えばエチレングリコールなどの脂肪族ジオールである。好ましくは、親水性ポリウレタンは、４５〜５５モル％、好ましくは５０モル％のイソシアネートおよび２５〜３５モル％、好ましくは３０モル％のエチレングリコールを含む。そして、親水化の程度が、ＰＰＧに対するＰＥＧの比によって調整される。好ましくは、ポリウレタンは、２〜３モル％、より好ましくは２．５モル％のＰＥＧおよび１７〜１８モル％、好ましくは１７．５モル％のＰＰＧを含む。ポリウレタンの親水性を増大させるために、ＰＥＧの割合が、例えば、きわめて親水性なポリウレタンを得るために、４．５〜５．５モル％まで、好ましくは５モル％ＰＥＧまで増加されてもよい。ポリウレタンの種々の親水性変異体がまた、拡散バリアの特性を最適化するために混合され得る。
【００７１】
スペーサーメンブレンコポリマーの好ましいアクリルおよびメタアクリルモノマーは本明細書中に記載されるようなものである。
【００７２】
親水性モノマーユニットは、好ましくは、親水性の（メタ）アクリル酸エステル、すなわち極性基をもつエステル、すなわちＯＨ、ＯＣＨ3またはＯＣ2Ｈ5基をエステルのアルコール部分内にもつエステル、親水性の（メタ）アクリルアミドであって、アミド（ＮＨ2）またはＮ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキルアミド基を有し、アルキル基が１〜３個の炭素原子および任意には例えばＯＨ、ＯＣＨ3またはＯＣ2Ｈ5基などの親水性基を含む（メタ）アクリルアミド、ならびに、例えばアクリル酸（アクリレート）またはメタクリル酸（メタクリレート）などの荷電性の基、例えばアニオン性基またはカチオン性基などをもつ適切な（メタ）アクリル酸ユニットから選択される。さらに、モノマーユニットの組み合わせも使用され得る。
【００７３】
親水性ブロックのための好ましいモノマーユニットの具体的な例は以下から選択される：
２−ヒドロキシエチルアクリレート、
２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、
２−メトキシエチルアクリレート、
２−メトキシエチルメタクリレート、
２−エトキシエチルアクリレート、
２−エトキシエチルメタクリレート、
２−または３−ヒドロキシプロピルアクリレート、
２−または３−ヒドロキシプロピルメタクリレート（２−または３−ＨＰＭＡ）、
２−または３−メトキシプロピルアクリレート、
２−または３−メトキシプロピルメタクリレート、
２−または３−エトキシプロピルアクリレート、
２−または３−エトキシプロピルメタクリレート、
１−または２−グリセロールアクリレート、
１−または２−グリセロールメタクリレート、
アクリルアミド、
メタクリルアミド、
Ｎ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドおよび
Ｎ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキルメチルアミドであって、アルキル基は例えばメチル、エチルまたはプロピルなどの１〜３個の炭素原子を含む、
アクリル酸（アクリレート）、
メタクリル酸（メタクリレート）
およびそれらの組み合わせ。
【００７４】
好ましい親水性モノマーは、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）および／または２−または３−ヒドロキシプロピルメタクリレート（２−または３−ＨＰＭＡ）である。
【００７５】
疎水性モノマーユニットは、好ましくは、疎水性のアクリル酸および／またはメタクリル酸ユニット、またはそれらの組み合わせより選択される。好ましくは、疎水性モノマーユニットは、例えば、親水性基を有さない１〜３個の炭素原子をもつアルコール部位を有するエステルなどの、疎水性の（メタ）アクリル酸エステルより選択される。疎水性ブロックのためのモノマーユニットの具体的な例は以下から選択される：
メチルアクリレート、
メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、
エチルアクリレート、
エチルメタクリレート（ＥＭＡ）、
ｎ−またはｉ−プロピルアクリレート、
ｎ−またはｉ−プロピルメタクリレート、
ｎ−ブチルアクリレート、
ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＵＭＡ）、
ネオペンチルアクリレート、
ネオペンチルメタクリレート
およびそれらの組み合わせ。
【００７６】
好ましい実施態様において、疎水性ブロックは、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）およびｎ−ブチルメタクリレート（ＢＵＭＡ）を含む。
【００７７】
外側のスペーサーメンブレンは、少なくとも、酵素分子を含む作用電極の部分、および、任意にはまた他の部分、例えば対電極などを被覆する。存在するのであれば、スペーサーメンブレンはまた、参照電極も被覆する。スペーサーメンブレンは好ましくは、電極システムの埋め込まれた表面全体を被覆する。スペーサーメンブレンは好ましくは、作用電極、任意には対電極および存在する場合には参照電極を、連続層の形状で被覆する。
【００７８】
本発明の改善されたスペーサーメンブレンを含む電極システムは、例えば、ポテンシオスタットおよび電極システムの測定シグナルの増幅のための増幅器に連結されることなどによって、センサーの一部分とされてもよい。センサーは好ましくは、酵素的、非流体的（ＥＮＦ）センサーであり、より好ましくは、電気化学的ＥＮＦセンサーである。電極システムの電極は、ポテンシオスタットを担持する基板上に配置されてもよく、また、ポテンシオスタットを担持する回路基板へと接着されていてもよい。好ましくは、センサーはグルコースの測定のためのものである。
【００７９】
本発明のさらなる主題は、アクリルおよび／またはメタクリルモノマーの親水性コポリマーの使用に関し、ここで、親水性コポリマーは、酵素的電極のためのスペーサーメンブレンとして５０モル％より多い親水性モノマーを含む。親水性コポリマーは、好ましくは上述されるようなものである。好ましくは、スペーサーメンブレンは、それが身体内に挿入された場合または埋め込まれた場合に、酵素的電極に対する異物反応（ＦＲＢ）を最小限にするために使用される。
【実施例】
【００８０】
実施例１  一つの単一なブロックコポリマーからなる拡散層を有する経皮的埋め込みのための、分散された電極を有する酵素的、非流体的（ＥＮＦ）センサーの透過性
センサーは、２５０μｍの厚さを有するポリエステル基板上の既成のパラジウムストリップ導体構造上に作製された。作用電極（ＷＥ）および対電極（ＣＥ）が（図１〜２に示されるように）分散されて配置された。
【００８１】
ＣＥのフィールドは、カーボンペーストを用いて重ね刷りされ、残りのストリップ導体は絶縁された。ＷＥのフィールドは、架橋化グルコース酸化酵素（酵素）、導電性ポリマーペーストおよび電気的触媒、ここでは二酸化マンガン（Technipur）の混合物を用いて重ね刷りされた。ストリップ導体の残りのパスは、同様に絶縁された。参照電極（ＲＥ）はＡｇ／ＡｇＣｌペーストからなる。電極はセンサー軸部の約１ｃｍを被覆する。
【００８２】
ＷＥのフィールドは、ＨＥＭＡブロックおよびＢＵＭＡブロックからなるブロックコポリマーの拡散層によってコーティングされた。層厚は７μｍである。
【００８３】
センサーの４つのバッチが作製され、それぞれに、拡散層として特定のブロックコポリマーが設けられた（以下のリストを参照のこと）。全てのブロックコポリマーは、Polymer Source, Montrealより入手され、そして、以下の表１に挙げられている。
【００８４】
【表１】
0006374860.tif 000004
【００８５】
それぞれのブロックコポリマーは、有機溶媒（２５％濃度）に溶解され、そして、それらを用いてセンサーがコーティングされた。ベルトドライヤーを用いて（２分、３０〜５０℃）乾燥させた後、コーティングされたセンサーが、種々の濃度のグルコース溶液中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験された。それぞれのセンサーのバッチとして１０個のセンサーが無作為のサンプルとして測定された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感度の測定として、１０ｍＭおよび０ｍＭのグルコース濃度における測定された電流の相違によってシグナルが算出され、そして１０ｍＭで除された（実施例４を参照のこと）。
【００８６】
全てのセンサーは、Ａｇ／ＡｇＣｌに対する分極電圧３５０ｍＶで操作され、測定温度は３７℃で一定に保たれた。この測定シリーズで用いられたセンサーは、国際公開第２０１０／０２８７０８号に記載のスペーサーを備えていなかったが、試験されたシグナルレベルに照らしていかなる相違も生じなかった。図５は、４つの異なる拡散層に関する標準偏差を用いたセンサー感度を示す。
【００８７】
ブロックコポリマーＣ、ＤおよびＦに関し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ感度と親水性ブロックに対する疎水性ブロックのモル比とのあいだに明白な関連が存在する。ほぼ同一の全鎖長のコポリマーにおいて、感度は、親水性ブロック（ＨＥＭＡ）の量が増大するにつれて向上した。
【００８８】
ブロックコポリマーＢの拡散層を有するセンサーは、例外である。ポリマーＢは、ポリマーＦと類似の、親水性の量に対する疎水性の量の相対比を有するにも関わらず、感度およびしたがってグルコースの透過性は低下する。経験的に、ポリマーＢの場合、全鎖長（コポリマー分子の分子量（総計）に対応する）が非常に大きく、このため層の透過性は低下されるということができる。これはまた、重量測定法的に測定された、ブロックコポリマーＢの、他のポリマーと比較した水分取り込み量においても見ることができるであろう。ポリマーＢは、１０．６％＋１．５％の水分取り込み（ポリマーの乾燥重量に照らした重量パーセント）をもつ。ポリマーＣは、１５．６％＋０．０％であり、ポリマーＦは、１６．５％＋３．１％、および、ポリマーＤは２７％＋１．７％である。
【００８９】
実施例２  ＥＮＦグルコースセンサーの拡散層の機械的柔軟性
センサーは、国際公開第２０１０／０２８７０８号に記載されるように、しかしながら本発明の拡散層をもつように製造された。ガラス転位温度（Ｔｇ）が機械的柔軟性の代替のパラメータであると仮定された。さらに、疎水性ブロックに割り当てられ得る、ガラス転位温度がｉｎ  ｖｉｖｏ適用における機械的柔軟性を決定すると仮定された。一つのブロックコポリマーに対し、いくつかのＴｇが、ブロック数に対応して特定されるかもしれないことに留意するべきである。
【００９０】
センサーは、実施例１と同じ電極ペーストを用いてコーティングされた。その後、いくつかのセンサーが、ＭＭＡ−ＨＥＭＡ（Polymer Source, Montrealによって製造された）より選択されるコポリマーを用いてコーティングされた。このポリマー（Ｅと称される）は、４１ｋＤの総分子量を有し、ＨＥＭＡに対するＭＭＡ（疎水性量）のモル比は６０％：４０％である。ＤＳＣを用いて１０℃／分の加熱速度で測定された、疎水性ブロックのガラス転位温度は、１１１℃である。
【００９１】
なお、他のセンサーには、本発明のブロックコポリマー（Ａと称される）の拡散層が設けられた。前記コポリマーＡの疎水性ブロックは、ＭＭＡおよびＢＵＭＡをランダム配列内に等モル量で含む。この場合も、親水性部分に対する疎水性部分のモル比は６０％：４０％である。分子量は３６ｋＤである。疎水性ブロックのＴｇは、ＭＭＡおよびＢＵＭＡ（約４５℃のＴｇ）のランダム配列に起因して７３℃まで低下する。
【００９２】
拡散層はともに、コポリマーのそれぞれのエーテル溶液（２５％）から作製され、そして、実施例１に記載されるように乾燥された。拡散層の厚みは７μｍであった。スペーサー層が続いてディップコーティングにより適用され、そして、室温で２４時間乾燥された。スペーサー層は、NOF Japanによって製造された、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６から作製された。
【００９３】
組織からの外植の後、コポリマーＥ拡散層を有するセンサーは、拡散層中に散発的なクラックを示す。これは、機械的な負荷の影響としてみなされる。これとは対照的に、コポリマーＡ拡散層を有するセンサーは、同一の負荷の下、いかなるクラックも表さない。これは明らかにＴｇの低下に起因するものであり、これは、コポリマーの機械的安定性を向上させる。国際公開第２０１０／０２８７０８号に開示されるような、２つのコポリマーの物理的な混合は、もはや必要ではない。
【００９４】
実施例３  分散された電極および本発明の拡散層を有するＥＮＦグルコースセンサーの最適化された透過挙動
センサーは実施例１に記載されるように、しかしセンサーの軸部の全体上に追加のスペーサー層を備えるように製造された。実施例１および２に記載のコポリマーＡ、Ｃ、ＤおよびＦであるそれぞれの拡散層を有するセンサーが製造された。この目的のため、コポリマーの２４％エーテル溶液が生成された。それぞれの溶液が、１セット（Ｎ＝１０）のセンサー上に適用され、そして、バンドドライヤー中で乾燥された。これにより、７μｍの厚さを有する拡散層が得られた。
【００９５】
その後、センサーに実施例２で記載されるようなスペーサー層が設けられた。
【００９６】
センサーは、センサーの上端部上で測定システムに連結され、これは測定されたデータをデータストアへと移動させる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定が、実施例１のように、しかしながら、測定期間が７日間で、行われた。測定されたデータから、感度ドリフトが、それぞれのセンサーについて対応する測定期間にわたって算出された。図６は、センサーのそれぞれの変形、すなわち、異なる拡散層のセンサー、に関する各グループとしてのｉｎ  ｖｉｔｒｏドリフト値の平均値を示す。測定の初期段階（最初の６時間、いわゆる測定開始段階）は、算出から除かれた。
【００９７】
ＢＵＭＡの疎水性ブロックを有する全てのコポリマーＣ、ＤおよびＦに関し、正のドリフトが存在し、すなわち、感度は時間とともに向上する。これとは対照的に、ＭＭＡおよびＢＵＭＡのランダムコポリマーの疎水性ブロックを有するコポリマーＡは、非常に低い、わずかに負であるドリフトをもたらす。
【００９８】
これらの相違は、追加の実験によって測定された、それぞれの拡散層の長期間の透過応答性によって説明されるかもしれない。ＷＥペースト内ではあるが、規定の活性化表面は有する、すなわち、酵素層ももたない（その膨張挙動が結果に及ぼす影響を排除する）パラジウムセンサーが、上記のポリマー溶液を用いてコーティングされ、そしてその後、乾燥され、層厚が測定された。続いて、伝導度が、ナトリウムおよび塩素含有緩衝液中で測定された。
【００９９】
図７は、コポリマーＡの導電度が、短期の測定開始段階の後、ほぼ一定に保たれていたことを示している。
【０１００】
コポリマーＦの場合には、これは、同一の測定条件下でさえも、図８に示されるように当てはまらなかった。この場合、コポリマーＦの拡散層の、長期のおよび強力な透過応答性が観察され、これは、実質的に層厚には影響を受けなかった。ＢＵＭＡの疎水性ブロックを有する、コポリマーＦの場合（およびコポリマーＣおよびＤの場合も（データは示さず））、長期間にわたってさえも、透過性の増加がもたらされる。測定されるときに、拡散層が、分散された酵素層をもつセンサー上に適用されていたならば、これは感度の継続的な上昇を導く。これは、観測された正のセンサードリフトを説明する。
【０１０１】
同じように、ブロックコポリマーＡを有するセンサーは、負のドリフトを示すが、これは、伝導度測定における非常に小さい透過性の変化に起因するものである。しかしながら、測定開始直後から（その後約１時間まで）、大きな伝導度の上昇がコポリマーＡにおいて観察される。ここでは、非常に速い立ち上がりが観察され、これは約１時間後に終結する。この時点において、拡散層は、完全に湿潤され、そして、水分取り込みに起因する構造再構成が終結する。構造変化の程度は、おそらくＴｇに依存する。増大されたＴｇをもつコポリマーが、大気温度の範囲内のＴｇをもつコポリマーと比較して、時間的および大きさ的に制限されている再構成を通過することは妥当であると思われる。
【０１０２】
加えて、コポリマーＡを有するセンサーが、測定の開始時において、コポリマーＦの拡散層を有するセンサーと比較して、比較的高い感度を示すことに言及しておくべきである。これは、疎水性および親水性ブロックのあいだの同一の相対比に起因すると予想される。１〜１．５ｎＡ／ｍＭである得られた感度範囲（実施例１を参照のこと）は、理想的であると思われる。この感度は、コポリマーＡからなる拡散層を有するセンサーにおいては同様に得られる。
【０１０３】
３つの物理化学的特性（透過性、機械的安定性および透過応答性）の合計に関して、理想的なセンサーは、好ましくは、ランダム型に配置された少なくとも２つの異なる疎水性モノマーユニットを有する疎水性ブロックをもつブロックコポリマー、例えばブロックコポリマーＡなどの拡散層を用いて得られ得る。疎水性ブロックが単一のモノマーユニットからのみなる他のブロックコポリマーのいずれも、全ての３つのパラメータにおいてコポリマーＡに匹敵し得るような質には到達しない。
【０１０４】
実施例４  ブロックコポリマーの特性評価
グルコースの連続的測定のための複数のフィールドセンサー（作用電極および対電極のそれぞれ１０個のフィールド）が、作製され、そして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴付けられた。
【０１０５】
センサーには、ランダム型に共重合されたメチルメタクリレート（ＭＭＡ）およびｎ−ブチルメタクリレート（ＢＵＭＡ）の疎水性ブロックならびに２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）の親水性ブロックを含むブロックコポリマーからなる拡散層が設けられた。これらのポリマー（ＧおよびＨと規定する）は、Polymer Source, Montrealによって製造され、そして、実施例１〜３からのポリマーＡよりもより透過性であり、そして、これは参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０１０６】
以下の表２において、コポリマーが説明される。
【０１０７】
【表２】
0006374860.tif 000005
【０１０８】
それぞれのブロックの分子量Ｍｎが上記の表２において個々に示されており、ポリマーは特定の平均値のまわりに分子鎖長の分散を有することが知られているため、その平均値が示されている。これはまた、表２において導出された量に関しても適用される。
【０１０９】
疎水性ブロックの示されているガラス転位温度は、機械的柔軟性を保証するための好ましい範囲内にある。
【０１１０】
分析物のための拡散バリアの透過性に関する重要なパラメータは、作用電極のユニット面積（すなわち幾何学的面積）当たりの感度である。感度ＳＥは、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、１０ｍＭおよび０ｍＭグルコース濃度での電流（Ｉ）測定により、ｎＡ／ｍＭで、分析されたそれぞれのセンサーに関して算出された：
【数３】
0006374860.tif 000006
個々の測定値（Ｎ＝８）から平均感度ＳＥmが決定された。得られた感度値は、顕微鏡で測定された、複数のフィールドを有するセンサー上の全ての作用電極スポットの幾何学的な総面積Ｆで除された。これにより、感度密度ＳＥm／Ｆが得られた。
【０１１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能曲線の線形性Ｙは、作用電極上のポリマーカバー層の拡散制御機能性を示すものである。２０ｍＭ、１０ｍＭおよび０ｍＭのグルコース濃度における電流測定から、％で、以下の式：
【数４】
0006374860.tif 000007
にしたがい、分析されたセンサーのそれぞれについて算出された。個々の測定値から、平均線形性値およびその標準偏差が決定された（表３参照のこと）。
【０１１２】
最後に、センサーの拡散バリアの層厚Ｌが、それぞれのポリマーの光学的測定によって測定された。対応する平均値が、同じポリマーをもつ≧２３個のセンサーのサンプルについて算出された。これらから、カバー層の実効拡散係数Ｄeffが、以下の式：
【数５】
0006374860.tif 000008
にもとづき、ｃｍ2／ｓで算出され得、ここで式中、ＳＥmおよびＬmは感度および層厚それぞれの平均値であり、および、Ｆは全ての作用電極スポットの総面積である。
【０１１３】
センサードリフトは、７日間にわたるｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定のグルコース濃度工程の繰り返しから算出された。実質的に一定の導電度を示している、ポリマーＨに関する結果が図９に示されている。
【０１１４】
以下の表３は、機能的特性評価の結果を示している。
【０１１５】
【表３】
0006374860.tif 000009
【０１１６】
より親水性のポリマーＧ（グルコースに対しより透過性である）に関し、拡散係数がまた、代替的な方法、例えばブルコース溶液を含むチャンバーからのグルコースを含まない緩衝液を含むチャンバーへの、ポリマーのフィルムを通じたグルコースの透過などを用いて測定された。この方法により、拡散係数として類似の値が得られた（１．１７×１０-9  ｃｍ2／ｓ）。
【０１１７】
実施例５  タンパク質のスペーサー層材料への結合
スペーサー層材料へのタンパク質の結合を評価するために、Ａｄａｐｔ（登録商標）（BioInteractions Ltd, Reading, England）またはＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）  Ｅ１００（Evonik Industries）がインキュベーションプレート（FluoroNunc Maxisorp, Thermo Scientific）内に満たされた。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）  Ｅ１００は、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ブチルメタクリレートおよびメチルメタクリレートベースのカチオン性コポリマーである。ポリマーは、終夜４０℃で乾燥された。その後、スペーサー材料が、フィブリノゲン溶液で表面を覆われた。溶液は、ヒト血漿由来の、蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８（Invitrogenより購入された）に結合されているフィブリノゲンを含んでいた。４時間のインキュベーションの後、フィブリノゲン溶液は、吸引され、そして、スペーサー層がホウ酸緩衝液を用いて８回洗浄された。スペーサーに結合したタンパク質の量が、蛍光読取装置（Synergy4, BioTek Instruments）を使用して励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２８ｎｍで、インキュベーションプレート内の蛍光強度を測定することによって分析された。ラベルされたタンパク質の既知の濃度（６．２５〜５００ｎｇ）が、蛍光の読取り値をタンパク質の量へと変換するための較正曲線を作製するために使用された。
【０１１８】
期待されるように、フィブリノゲンは、コーティングされていないインキュベーションプレート（ブランク）に、３９０ｎｇの結合タンパク質という結果で接着した（図１０）。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）  Ｅ１００でコーティングされたプレートは、６０ｎｇである、低減されたタンパク質結合を示した。Ａｄａｐｔ（登録商標）でコーティングされたプレートにおいては、タンパク質結合はほとんど検出されなかった。インキュベーション前の読取り値は、バックグラウンド蛍光によるものであった。これらの結果は明らかに、スペーサー材料でコーティングされた表面、特にはＡｄａｐｔ（登録商標）でコーティングされた表面がフィブリノゲン接着を良好に防ぐことを示している。
【０１１９】
実施例６  スペーサー層との接触後の細胞からのサイトカイン遊離
センサーは、実施例２に記載されるように製造された。その後、センサーは、実施例２に記載されるようにスペーサー層を設けられた。スペーサー層は、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６（NOF Corporation, Japan）から作製されるか、または、Ａｄａｐｔ（登録商標）（BioInteractions Ltd, Reading, England）から作製された。
【０１２０】
スペーサー層を有さないセンサー、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６からなるスペーサー層を有するセンサーまたはＡｄａｐｔ（登録商標）からなるスペーサー層を有するセンサーが、単球性ＴＨＰ−１細胞とインキュベートされ、そして、炎症性マーカーの誘導が分析された。
【０１２１】
ＴＨＰ−１細胞は、センサーの存在下、３７℃で２４時間培養された。細胞は、その後、遠心分離によって収集された。上澄みがサイトカイン遊離を測定するために使用され、一方、細胞ペレットは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１％含むＰＢＳ中に再懸濁され、そして、細胞表面タンパク質ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１としても知られる、炎症性バイオマーカー）の発現を分析するために使用された。ＴＨＰ−１細胞は、蛍光色素フィコエリトリンで標識された抗ＣＤ５４抗体（BD Bioscience）とともにインキュベートされた。４℃で４５分間のインキュベーション後、細胞は、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄され、そして、１００００個の細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、フローサイトメーター（BD FACSArray, BD Bioscience）を用いて測定された（励起波長５３２ｎｍ、発光波長５８５ｎｍ）。未処理のＴＨＰ−１細胞と比較して、コーティングなしのセンサーとのインキュベーションは、高いＭＦＩ読取り値によって示されるように（図１１）、増大されたＣＤ５４の相対的な発現（６倍の誘導）をもたらした。ＣＭ５２５６またはＡｄａｐｔ（登録商標）のスペーサー層によって被覆されたセンサーとの細胞のインキュベーションは、それぞれ４５％または４１％のＣＤ５４発現の減少をもたらした。
【０１２２】
上澄み液は、サイトカイン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）および「単球走化性タンパク質−１（monocyte chemotactic protein-1）」（ＭＣＰ−１）の量を、製造者の取り扱い説明書にしたがいビーズを用いた免疫アッセイ（Flex sets, BD Bioscience）、そして、その後のフローサイトメトリー分析（BD FACSArray, BD Bioscience）を用いて測定するために使用された。データ分析は、ＦＣＡＰアレイソフトウェア  ｖ１．０．１（Soft flow Hungary Ltd）を用いて行われた。
【０１２３】
未処理のＴＨＰ−１細胞と比較して、コーティングなしのセンサーは、強力なＩＬ−８（４９対１９７ｐｇ／ｍＬ）（図１２ａ）およびＭＣＰ−１（６対４８ｐｇ／ｍＬ）（図１２ｂ）の遊離を誘導した。ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の遊離は、センサーがＣＭ５２５６またはＡｄａｐｔ（登録商標）のスペーサー層によって被覆されていた場合減少した。Ａｄａｐｔ（登録商標）で被覆されたセンサーは、１００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８および２５ｐｇ／ｍＬのＭＣＰ−１の遊離を誘導した。ＣＭ５２５６で被覆されたセンサーは、１２５ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８および１８ｐｇ／ｍＬのＭＣＰ−１の分泌をもたらした。
【０１２４】
まとめると、これらのデータは、スペーサー層が３個のよく知られた炎症性バイオマーカー、すなわちＣＤ５４、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の誘導を減少させることを示している。
【０１２５】
ＴＨＰ−１細胞の活性化のためのタンパク質吸着の役割を分析物するために、組織培養プレートが、ＣＭ５２５６、Ａｄａｐｔ（登録商標）またはＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）  Ｅ１００を用いてコーティングされた。スペーサーは、その後、ヒトフィブリノゲン（Sigma-Aldrich）と共にインキュベートされた。ＴＨＰ−１細胞は、種々のスペーサー＋フィブリノゲン層とインキュベートされた。３７℃での４８時間のインキュベーション後、細胞は遠心分離によって沈殿され、そして、上澄みがＩＬ−８遊離に関して分析された。対照として、細胞が、スペーサーを含まないが、フィブリノゲンでコーティングされている培養プレート（Polyst.＝培養プレート材料）中で培養された。図１３に示されるように、これらの細胞は、８９ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８を遊離した。ＣＭ  ５２０６＋フィブリノゲン上で、または、Ａｄａｐｔ（登録商標）＋フィブリノゲン上で培養された細胞は、それぞれ、６８または４９ｐｇ／ｍＬを遊離した。これに対し、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）  Ｅ１００＋フィブリノゲン上で培養された細胞は２０６ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８を遊離した。特に、フィブリノゲンコーティングなしでＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）  Ｅ１００上で培養された細胞は、５９ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８しか分泌しなかった。ポリマー表面上へのフィブリノゲンの吸着およびタンパク質中のコンフォーメーションの変化が、おそらくＭＡＣ−１結合部位を露出させる。ＭＡＣ−１レセプターへの結合を介して活性化されるＴＨＰ−１細胞が、ＩＬ−８などのサイトカインを遊離し、そして、これによって、炎症性応答をトリガーする。これゆえ、Ａｄａｐｔ（登録商標）またはＣＭ５２５６で作製されたスペーサー層は、タンパク質の沈着および構造モチーフの（センサーのような）表面上での露出を回避し、そしてこれによって、インプラントに対する炎症性反応を最小限にする。
【０１２６】
実施例７  スペーサー層でコーティングされたセンサーでの制限された溶血
センサーは実施例２に記載されるように製造された。その後、センサーは、実施例２に記載されるようにスペーサー層を設けられた。スペーサー層は、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６（NOF Corporation, Japan）から作製されるか、または、Ａｄａｐｔ（登録商標）（BioInteractions Ltd, Reading, England）から作製された。
【０１２７】
スペーサー層を有さないセンサー、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６からなるスペーサー層を有するセンサーまたはＡｄａｐｔ（登録商標）からなるスペーサー層を有するセンサーの溶血の可能性が分析された。このため、総表面積６ｃｍ2であるセンサーが赤血球細胞とインキュベートされ、そして、その後、上澄みへのヘモグロビンの遊離を測定することによって、細胞の溶解が測定された。赤血球が、遠心分離によって新鮮なヒト血液から単離された（クエン酸塩が凝集を避けるために使用された）。それらはその後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄され、その後、ＰＢＳ中に１：４０で希釈された。赤血球懸濁液は、回転式プラットフォーム上（３５０ｒｐｍ）で、暗所内３７℃で、２４時間センサーとインキュベートされた。その後、細胞は遠心分離によって沈殿され、そして、上澄みのヘモグロビン含有量が、波長５７５ｎｍで上澄みの吸収を測定することによってスペクトル的に決定された。結果は、％での溶解性指数によって示されており、これは、陽性対照（＝蒸留水中、赤血球の完全な浸透圧溶解）中のヘモグロビンの遊離量で除されたサンプル中のヘモグロビンの遊離量である。結果は、図１４に示されている。
【０１２８】
スペーサー層を有さないセンサーは、４７．４％という高い溶血指数によって示されるように、顕著な溶血を引き起こした。Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）  ＣＭ５２０６のスペーサー層を用いたセンサーのコーティングは、１４．７％の溶解指数によって示されるように、センサーの溶血可能性を低減した。Ａｄａｐｔ（登録商標）のスペーサー層を用いてコーティングされたセンサーは、７．５％の溶解指数をもたらすわずかな溶血を引き起こしたが、これは、負の対照（＝いかなる試験材料も無しにＰＢＳ中でインキュベートされた赤血球）またはＡｄａｐｔ（登録商標）のみの範囲内のものである。これらの結果は、溶血を低減させるためのスペーサー層の保護的機能を示していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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