(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児ヒトケラチノサイト細胞及び胎児ヒト線維芽細胞の混合物を含む、皮膚欠陥、例えば創傷、やけど又は潰瘍の処置に使用するための組成物であって、前記ケラチノサイト及び前記線維芽細胞の比率が0.75から2.5の範囲である組成物。
【請求項２】
前記比率が、1:1又は7:3である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞の混合物が、非免疫原性細胞外マトリックスに統合される、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
マトリックス1mL又は1cm3あたり0.1から5×106個の間の細胞を含有することを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記マトリックスが、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリン、及びエラスチン、並びにそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも1種の化合物を含有することを特徴とする、請求項3又は4に記載の組成物。
【請求項６】
前記マトリックスが、ヒトフィブリノゲン、ヒト第XIII因子、ヒトフィブロネクチン、プラスミノゲン、ウシアプロチニン及びヒトトロンビンで構成される、請求項3又は4に記載の組成物。
【請求項７】
請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物を含有する包帯。
【請求項８】
滅菌されて、微生物を通さない容器中にパッケージングされることを特徴とする、請求項7に記載の包帯。
【請求項９】
薬物として使用するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
0.75から2.5の範囲の比率で、胎児ヒトケラチノサイト細胞及び胎児ヒト線維芽細胞を、非免疫原性細胞外マトリックスと混合する工程を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記比率が、1:1又は7:3であることを特徴とする、請求項10に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記混合する工程の前に、以下の2つの工程:
a)胎児ヒトケラチノサイト細胞を得る工程、及び
b)胎児ヒト線維芽細胞を得る工程
を含むことを特徴とする、請求項10又は11に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記混合する工程の前に、以下の2つの工程:
a)胎児ヒトケラチノサイト細胞のバンクを得る工程、及び
b)胎児ヒト線維芽細胞のバンクを得る工程
を含むことを特徴とする、請求項10又は11に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎児ヒトケラチノサイト細胞及び胎児ヒト線維芽細胞の比率が0.75から2.5の範囲である混合物を含む組成物、並びに前記混合物を含有する包帯に関する。
【背景技術】
【０００２】
創傷の瘢痕化は、外科医の介入なしに起こる自然で自発的な現象である。長年にわたり血液凝固の基本過程であるフィブリン沈着、コラーゲンの合成及び組織化が研究されてきたにもかかわらず、それらを開始させて制御する要因は未だによく理解されていない。創傷治癒は、洗練された内分泌の薬理学的及び物理的な操作によって、又はより簡単には外科的介入によってその進化に修正が加えられてきたが、開放創治癒に影響を与える最も重要な作用は、開放創に適用される包帯の性質にある。
【０００３】
創傷治癒を容易にするために、油脂性の包帯(greasy bandage)、半閉鎖包帯又は閉鎖包帯が使用される可能性がある(Begaud B. Ann Dermatol Venereol 2002)。しかしながら、皮膚欠陥のサイズが大きいか又は従来の処置では効果がない状態が続く場合、治癒を刺激するために皮膚移植が必要になることもある。これらの皮膚移植は、患者自身の損傷を起こしていない領域(自家移植片)から採取してもよいが、過大なサイズの自己移植片の採取は採皮部のレベルで多くの治癒上の問題を引き起こし、静脈性潰瘍タイプの皮膚欠陥はすでに治癒上の障害(高齢、糖尿病)を示すヒトに影響を与えることから、自家移植片は未だに難しい場合がある。
【０００４】
自家移植片が難しい事象では、皮膚欠陥の処置における天然の皮膚の代用品として、様々な人工皮膚製品が役立ち、そのまま正常な皮膚に刷新させることができる(Ho Cら、Technological report 52.2005号)。これらの代用品は、3つのカテゴリー:培養表皮の移植(これは、表皮の表面だけを置き換える)、代用皮膚(これは、より下部の皮層を置き換える)及び複合移植(これは、皮膚の成分と表皮の成分とを組み合わせることを本質とする)に分類できる。これらのカテゴリーのそれぞれにおいていくつかの製品が利用可能である。最後に、第四のカテゴリーの代表例は、生物学的マトリックス中に懸濁された状態のケラチノサイトである。これらの様々な代用皮膚モデルに行われた全ての以前の臨床研究によれば、不要な重篤作用は示されていない。これらのモデルのあらゆる適用が患者に許容されてきた。
【０００５】
表皮移植片は、一般的に、1975年にRheinwald及びGreenによって開発されたケラチノサイト培養技術に従って得られる(Cell 1975: 6: 331〜344)。この技術は、栄養細胞(放射線照射したマウス線維芽細胞)の層上で患者又はドナーのケラチノサイトを培養することによって大量の表皮血小板を産生する。集密状態で分化した血小板は、移植前に支持体上に移される。培養されたケラチノサイトは、自己[Laserskin(登録商標)、Epibase(登録商標)の場合]であってもよいし、又は同種(CryoCealの場合)であってもよい。患者以外のドナーから産生された同種ケラチノサイトの層の使用は実際に待機期間を短くするが、ウイルス性疾患が伝染する危険が著しい。これらの培養上皮の使用は、他の不利益を有する。第一に、血小板の培地として機能してきた支持体から血小板を酵素で取り外すときに、血小板のサイズが10〜50%小さくなり、第二に、これらの血小板は脆く取り扱いが難しい(Chester DLら、J Burn Care Rehabil 2004;Shen JT及びFalanga V. J Cutan Med Surg 2003)。また移植率もばらつきがあり、このような移植片は短期間でしか安定でないことが多く、新生皮膚の再生はゆっくりでしか起こらない。最終的に、皮膚成分がないために、創傷の収縮、移植片の不安定さ及び移植片レベルでの気泡の形成が起こる。
【０００６】
これらの問題を排除するために、皮膚マトリックスを含有する代用皮膚(例えばApligraf又はDermagraftブランドのもの)が開発されてきた。これらの代用品は、表皮代用品とは逆に同種細胞のみを使用する。
【０００７】
より詳細には、Dermagraft(登録商標)は、ポリグラクチン又はグリコール酸の生体吸収性格子で培養された新生児包皮の同種線維芽細胞を含有する、代謝という観点で生きた活性な皮膚構造である(US5,460,939を参照)。これらの線維芽細胞は、治癒させようとする創傷上での、増殖因子(PDGF、VEGFなど)、糖タンパク質及びタンパク質(コラーゲン、フィブロネクチンなど)のin situでの合成に適している。この皮膚マトリックスは、創傷の収縮及び移植片の不安定さといった問題を回避する(Shen JT及びFalanga V. J Cutan Med Surg 2003)。別の皮膚代用品は、Apligraf(登録商標)(又はGraftskin(登録商標)、US4,837,379を参照)であり、これは、ウシのI型コラーゲンゲル中に同種の新生児由来包皮線維芽細胞を含有する。この線維芽細胞層で、増殖し分化した同種ケラチノサイトが培養される。Apligraf(登録商標)を構成する細胞は、それ自体のマトリックス及びそれ自体のサイトカインを産生できる。この代用品は、ランゲルハンス細胞、又は真皮の樹状細胞、又は内皮細胞若しくは白血球などの抗原提示細胞を含有しない。しかしながら、Apligraf(登録商標)又はDermagraft(登録商標)の皮膚欠陥の処置に関する臨床効果を実証することを目的とした臨床試験は、これらの移植片の有益な作用について不十分な証拠しか示していない(Jones JE及びNelson EA. The Cochrane library 2006)。また、同種細胞を使用することによって、ウイルス性疾患伝染の危険も抑制される。
【０００８】
また、2〜3週間培養した後にフィブリン[Tissucol(登録商標)]ベースの生体用接着剤中に懸濁された状態で置かれた成人自己由来ケラチノサイトを含有する自己由来の皮膚代用品であるBioSeed(登録商標)-Sモデルなどの生体用接着剤中に懸濁された状態の自己由来ケラチノサイトを使用することも可能である。またケラチノサイトの増殖及び移動を刺激するフィブリンも、細胞が創傷上に確実に固定されるようにする(Clark RAFら、J Invest Dermatol 1982;Hunyadi Jら、J Dermatol Surg Oncol 1988)。移植後、懸濁された状態の密集状態前のケラチノサイトは、ブタモデルで実証されたように、よりよく発達しより高い耐性を有する、真皮表皮接合部を有する連続した基底膜を形成できる(Chester DL.ら、J Burn Care Rehabil 2004)。しかしながら、このような自己由来系は、患者の細胞が増幅した後でしか利用できないため、それらが使用できるようになるまで数週間を要する。この極めて長い遅れは、ある種の緊急的な状況(手術後の皮膚の被覆又はやけど)では受け入れ難い。
【０００９】
それに加えて、創傷治癒を効果的に促進する新生児又は成人(自己又は非自己由来)細胞を含有する利用可能な包帯はこれまでに一つとして証明されていない。
【００１０】
皮膚欠陥を処置するための胎児細胞の使用は、成人細胞と比較して多くの利点を有する。実際に、成人皮膚とは対照的に、妊娠24週未満の胎児では、皮膚修復の後、瘢痕化を起こすことなく迅速な治癒が起こる(Bullard KMら、World J Surg 2003;Hohlfeld Jら、Lancet 2005)。この現象は24週未満の胎児の皮膚に固有のようであり、子宮内環境とは無関係である。これらの胎児細胞に固有の特性は、分泌されたサイトカインのプロファイル及びこれらの細胞の遺伝子発現に起因する(Bullard KMら、World J Surg 2003)。炎症性浸潤もそれほど顕著ではなく、胎児細胞の寛容性もより優れている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】US5,460,939
【特許文献２】US4,837,379
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Begaud B. Ann Dermatol Venereol 2002
【非特許文献２】Ho Cら、Technological report 52.2005号
【非特許文献３】Cell 1975: 6: 331〜344
【非特許文献４】Chester DLら、J Burn Care Rehabil 2004
【非特許文献５】Shen JT及びFalanga V. J Cutan Med Surg 2003
【非特許文献６】Jones JE及びNelson EA. The Cochrane library 2006
【非特許文献７】Clark RAFら、J Invest Dermatol 1982
【非特許文献８】Hunyadi Jら、J Dermatol Surg Oncol 1988
【非特許文献９】Chester DL.ら、J Burn Care Rehabil 2004
【非特許文献１０】Bullard KMら、World J Surg 2003
【非特許文献１１】Hohlfeld Jら、Lancet 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
現在のところ、胎児皮膚細胞をベースとした皮膚代用品の唯一のモデルが存在する[Neocutis(登録商標)]。この皮膚代用品は、90%の線維芽細胞及び10%のケラチノサイトの混合物で構成される、単一の細胞バンクに由来する固定された所定量の胎児ヒト細胞を含有する。本発明者らは、in-vitroの治癒モデルにおいて、ケラチノサイト及び胎児線維芽細胞の比率が、0.75から2.5の範囲、好ましくは1:1(50%ケラチノサイト及び50%線維芽細胞)からの範囲、又はさらには7:3(70%ケラチノサイト及び30%線維芽細胞)からの範囲であることが、治癒にとって最適なようであることに注目した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この状況において、本発明者らは、i)胎児ケラチノサイト/線維芽細胞の比率を制御することによって、特に増殖因子及び分泌されたサイトカインの量及び性質を制御することによって治癒の最適化をもたらし、ii)胎児細胞の性質によって、優れた免疫寛容と局所炎症の減少とを確保する系を調査した。
【００１５】
具体的にケラチノサイト又は胎児ヒト線維芽細胞によって構成される2つの別個の細胞バンクにより、本発明者らは、in-vitroの試験によって、これらの細胞を約1:1又は約7:3の比率で使用することにより最適な治癒がもたらされると予想されることを実証した。それゆえにこれらの比率は、創傷及び皮膚欠陥を処置するために選択されている。このような比率での胎児細胞の適用は、特定のサイトカイニン因子の(胎児細胞による)分泌のために、レシピエントのケラチノサイト及び線維芽細胞を刺激する。加えて、このような系は胎児細胞由来であるため、特定のサイトカインの産生によって拒絶の危険が実質的に抑えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ドナーのBKF07から得られたケラチノサイト及び胎児線維芽細胞の上清、並びに同じドナーからの線維芽細胞及びケラチノサイトが1:1の比率の混合物の上清における、VEGFA因子(上のグラフ)、PDGF-AA(中央のグラフ)及びIL-1β(下のグラフ)の産生を例示する図である。
【図２Ａ】単独の、又は1:1の比率で混合されたドナーのBKF07から得られたケラチノサイト及び胎児線維芽細胞の上清中、並びに単独の、又は1:1の比率で混合されたケラチノサイト及び成人線維芽細胞の上清中の因子GM-CSF(2A及び2B)、IL-1α(2C及び2D)、IL-8(2E及び2F)、HGF(2G及び2H)、並びにVEGF-A(2I及び2J)の産生を例示する図である(PA:成人ドナーの腹壁形成術から得た細胞;PC:成人ドナーの大腿部の外科手術から得た細胞;PR01:成人ドナーの包皮由来の細胞)。サイトカインごとに、2タイプのグラフを示す。A、C、E、G及びIのグラフは、試験されたドナーのサンプルごとのサイトカイン測定の結果を例示し、一方でB、D、F、H及びJのグラフは、成人細胞サンプルの平均サイトカイン産生と、胎児由来細胞のサイトカイン産生との比較を例示する。
【図２Ｂ】図2A参照。
【図２Ｃ】図2A参照。
【図２Ｄ】図2A参照。
【図２Ｅ】図2A参照。
【図２Ｆ】図2A参照。
【図２Ｇ】図2A参照。
【図２Ｈ】図2A参照。
【図２Ｉ】図2A参照。
【図２Ｊ】図2A参照。
【図３Ａ】単独の、又は異なる比率で混合されたケラチノサイト細胞の上清(K)及び胎児線維芽細胞(F)中でのGM-CSFの産生を例示する図である。
【図３Ｂ】単独の、又は異なる比率で混合されたケラチノサイト細胞の上清(K)及び胎児線維芽細胞(F)中でのIL-1αの産生を例示する図である。
【図３Ｃ】単独の、又は異なる比率で混合されたケラチノサイト細胞の上清(K)及び胎児線維芽細胞(F)中でのIL-8の産生を例示する図である。
【図３Ｄ】単独の、又は異なる比率で混合されたケラチノサイト細胞の上清(K)及び胎児線維芽細胞(F)中でのHGFの産生を例示する図である。
【図３Ｅ】単独の、又は異なる比率で混合されたケラチノサイト細胞の上清(K)及び胎児線維芽細胞(F)中でのVEGF-Aの産生を例示する図である。
【図４】胎児ケラチノサイト及びドナーのBKF07から得られた線維芽細胞の特徴付けを例示する図である。Aは、ケラチノサイト(左の画像)及び線維芽細胞(右の画像)の臨床バッチ由来の密集培養された細胞の位相差顕微鏡写真である。Bは、血球計算法のヒストグラムであり、ケラチノサイトの臨床バッチ内におけるケラチン14を発現する細胞の百分率(左のヒストグラム)と、線維芽細胞の臨床バッチ内におけるプロリル-4-ヒドロキシラーゼを発現する細胞の百分率(右の画像)とを示す。Cは、ケラチノサイトの臨床バッチ(左の画像)及び線維芽細胞の臨床バッチ(右の画像)の細胞を融解させた後に得られた細胞マット上でのケラチン14及びプロリル-4-ヒドロキシラーゼの発現を示す蛍光顕微鏡写真である。Dは、ケラチノサイト(左の細胞所見)及び胎児線維芽細胞(右の細胞所見)によるインテグリンβ1、α2及びα3の発現を示す細胞所見である。それによれば、ケラチノサイトはインテグリンβ1、α2及びα3を強く発現するが、それに対して線維芽細胞はインテグリンβ1しか発現しないことが示される。
【図５Ａ】胎児線維芽細胞単独(線維芽細胞/PBMCの比率:1/4、1/20、1/100及び1/200)、胎児ケラチノサイト細胞単独(ケラチノサイト細胞/PBMCの比率:1/4、1/20、1/100及び1/200)、又はケラチノサイト及び線維芽細胞の1:1混合物(線維芽細胞及びケラチノサイト/PBMCの比率:1/4、1/20、1/100及び1/200)による、末梢血単球細胞(PBMC)の増殖の阻害を例示する図である。異なる条件ごとに、結果を、陽性対照(胎児細胞非存在下でPHA-L及びIL-2で刺激したPBMC)に対する増殖の百分率で表す。
【図５Ｂ】200μM、20μM及び2μMの濃度で使用された特異的な阻害剤であるIDO(インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ)、1-MT(1-メチルトリプトファン)の存在下又は非存在下での、胎児線維芽細胞単独(線維芽細胞/PBMCの比率:1/4)(a)、ケラチノサイト細胞単独(ケラチノサイト細胞/PBMCの比率:1/4)(b)、又はケラチノサイト及び線維芽細胞の1:1混合物(線維芽細胞及びケラチノサイト/PBMCの比率:1/4)(c)によるリンパ球増殖の阻害を例示する図である。
【図６】異なる細胞条件(線維芽細胞/ケラチノサイトの比率は、100/0、75/25、50/50又は0/100である)での、細胞のスクラッチ閉鎖の経時的な(スクラッチ後、0時間から20時間の)進行を例示する図である。
【図７】異なる細胞条件(線維芽細胞/ケラチノサイトの比率は、100/0、75/25、50/50又は0/100である)での、スクラッチが行われてから5時間後(A)又は20時間後(B)におけるスクラッチ閉鎖の百分率を例示する図である。
【図８】異なる細胞条件(線維芽細胞/ケラチノサイトの比率は、100/0、75/25、50/50又は0/100である)で、異なる時間(T0、T5及びT20時間)において顕微鏡により得られたスクラッチの画像を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは初めて、別個の胎児ヒト細胞の2つのバンクを確立し、そのうち一方は胎児ヒトケラチノサイト細胞を含有し、他方は胎児ヒト線維芽細胞を含有する。これらの2つのバンクを樹立したことにより、これらの細胞タイプそれぞれの皮膚創傷治癒への影響を研究するのにそれらを利用できるようになった。したがって、2つのバンクにより、とりわけ線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトによって産生された増殖因子の分泌を介して皮膚の治癒が効果的に刺激されるように、線維芽細胞及び/又は胎児ヒトケラチノサイトの比率を正確に適合させた組成物の開発が可能になった。
【００１８】
この組成物の独創性は、それまで提唱されていなかった、本発明者らによって同定された線維芽細胞及び/又は胎児ヒトケラチノサイトの特定の比率にある。この特定の比率が、治癒過程を促進する。
【００１９】
このような組成物の利点は多数ある:
一方では、純粋に実用面での観点で、この組成物は分化した表皮又は真皮表皮接合部を必要としないことから、要望があってから48〜72時間以内に患者が利用できるようになる。その他にも、本組成物の各成分(ケラチノサイト又は線維芽細胞)は、好ましくは窒素蒸気中の容器内の凍結したアンプル中で、長距離でも容易に輸送できる。
【００２０】
他方では、存在する細胞が胎児由来であることは、この組成物に十分な寛容性と最小の拒絶の危険をもたらす。
【００２１】
最終的に、治療的な(theracanic)観点から、この組成物に存在する胎児細胞は、血管新生、移動及び細胞増殖を効果的に刺激して、迅速で上質な治癒を導くことにより、治癒において必須の役割を果たす多数のサイトカイン因子(例えばPDGF-AA、VEGF-A、GM-CSF、HGF)を分泌する。
【００２２】
それゆえに本発明は、第一の態様において、胎児ヒトケラチノサイト細胞及び胎児ヒト線維芽細胞の混合物を含む組成物であって、前記ケラチノサイト及び前記線維芽細胞の比率が0.75から2.5の範囲である組成物に関する。本発明の好ましい実施形態によれば、前記比率が、0.75から1.25の間で構成され、より好ましくは1:1である。他の好ましい実施形態によれば、前記比率は、1.25から2.5の範囲であり、より好ましくは7:3である。
【００２３】
本発明によれば、用語「組成物」は、それらの生存及びそれらの移動に適合させた非免疫原性媒体(例えばコラーゲン、フィブリン、キトサン)に懸濁又は統合させた、胎児ヒトケラチノサイト細胞及び胎児ヒト線維芽細胞の混合物を示し、前記媒体は、前記細胞によって自然に分泌されるサイトカイン及び増殖因子、特に「血管内皮増殖因子」(VEGF)、「血小板由来増殖因子」PDGF-AA、及びインターロイキン1-ベータ(IL1β)の分泌に適している(又はどのような場合においても妨げない)。また前記媒体は、前記細胞によって発揮される免疫調節物質能力にも適している(又はどのような場合においても妨げない)。この組成物は、動物又はヒト対象において創傷、病変、やけど、又は皮膚欠陥に適用されると、i)迅速に病変に向かって移動して真皮及び/又は表皮を再建し、ii)対象の細胞が分泌する増殖因子により対象の細胞の移動に良い影響を与え、iii)その免疫抑制特性によって局所炎症を制限するためにダメージを受けた皮膚の再生に適していることから、特にこの組成物は皮膚代用品とみなすことができる。
【００２４】
本発明によれば、「胎児ヒトケラチノサイト細胞」は、胎児由来の、すなわち胎児ヒト皮膚から得られたケラチノサイト細胞を意味し、前記細胞は、以下の特異的な特色:i)典型的な上皮細胞の形態、ii)治癒過程において必須の増殖因子及びサイトカインを分泌する傾向、iii)免疫寛容を生じる特性、及びiv)強い移動能力を有する。有利には、本発明の組成物で使用される胎児ヒトケラチノサイト細胞は、サイトカイン及びケラチノサイトの特異的な増殖因子(例えばPDFG-AA及びIL-1β)を分泌し、1種又は複数のケラチノサイト前駆体の公知のマーカー(例えばケラチン14、ケラチン5、又はケラチン15)を発現し、さらに、機能的な移動特性(例えば、インテグリンβ1、α2及びα3の発現)と、それらが胎児由来であることに関連し、さらにインドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)の酵素活性に基づく免疫抑制とを示す(図5Bのbを参照)。これらの特異的な特色は、この作用に関して慣習的に使用されるあらゆる技術によって、とりわけ従来の顕微鏡法、Elisa測定、フローサイトメトリー(FACS)、免疫蛍光法、及びリンパ球増殖試験によって示すことができる。
【００２５】
これらの胎児ケラチノサイト細胞は、上記の特性の保持に関する当業者公知のあらゆる方法により得ることができる。特に胎児ケラチノサイト細胞は、胎児ヒト皮膚の外植片を培養し、外植片からケラチノサイトを放出させて適切な培地でそれらを増殖できるようにすることにより得ることができる。このような培地は文献で広く記載されている。例えばCELLnTECによって販売されているCnT-07培地、Promocell社によって販売されているKGM2培地、Invitrogen社によって販売されているKSFM培地を使用することが可能であり、これらは任意選択で細胞培養工程中の細菌汚染を回避するために典型的な抗生物質が補充されていてもよい。
【００２６】
本発明の組成物での使用に適した胎児ヒトケラチノサイト細胞を生成するために、本発明者らは、同じ胎児ヒト皮膚サンプルから、ケラチノサイト細胞及び胎児ヒト線維芽細胞を別々に得るための特定のプロトコールを有利に使用する(実施例I、1.3章を参照)。このプロトコールは、本明細書において以下に記載された実施例I+IIIで記載される。簡単に要約すると、胎児皮膚のサンプルを、緩衝食塩水培養培地(例えば「リン酸緩衝生理食塩水」(PBS)培地又は「ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水」(DPBS)培地)中に浸漬することにより濯ぎ、次いで小さいサイズの外植片(1辺あたり約1mm)に切り出し、これを培養プレート中に投入し、次いでこれを典型的な培養培地(例えば20%ウシ胎児血清及び1%ペニシリン-ストレプトマイシンが補充されたMEM又はDMEM)で覆い、その後、5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で37℃で平均10〜15日にわたりインキュベートした。5日間培養した後、培地の半分を取り去って等量の新しい培地を添加することにより培地の交換を行った。特にこの方法に従って、ケラチノサイトを接着したままにして線維芽細胞だけが取り外されるように、5〜10分間の短期間で酵素作用(トリプシンEDTA)により線維芽細胞を引き離す。懸濁された状態の線維芽細胞をチューブに移し、遠心分離し、培養フラスコ中に戻して培養する。接着したままのケラチノサイトのみを含有するウェルをトリプシンの作用を阻害する培地(例えばDMEM、SVF10%)で濯ぐ。ウェルをDPBSで濯いだ後、ケラチノサイトの成長は、ケラチノサイトの増殖に適した抗生物質が補充された培養培地(例えばCnT-07培地)で最初の培養培地を交換することによって促進される。線維芽細胞を除去した後、5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で37℃で5〜7日間培養し、ケラチノサイト細胞をトリプシンの作用によって取り外し、培養フラスコ中に植え付ける。細胞を追加で5〜7日インキュベートし、次いでトリプシンの作用によって取り外し、最後にP1で凍結して、ケラチノサイト細胞の最初のバンクを構成する。本発明の特定の実施形態において、この最初のバンクのアリコートを融解させ、第三継代であるP3(P1からの細胞を融解させた後、2週間の培養)まで、ケラチノサイト細胞を5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で37℃
で増幅させ、凍結して、本発明の組成物での使用に適した対象の胎児ケラチノサイト細胞の臨床バッチ(又は「細胞バンク」)を構成する。
【００２７】
これらの胎児ケラチノサイト細胞は、例えばタンパク質性溶液(例えば40mg/mLのヒトアルブミン)と凍結保護剤(cryoformulator)(例えばジメチルスルホキシド)とを9:1の比率で組み合わせた凍結用化合物の溶液を使用する当業者公知のあらゆる方法によって凍結できる。
【００２８】
この臨床バッチが形成されたら、本発明の組成物に統合された胎児ヒトケラチノサイト細胞は、適切な培地(例えば上記のCnT-07培地)中で胎児ヒトケラチノサイト細胞のサンプルを再度培養することによって胎児ヒトケラチノサイト細胞の臨床バッチから直接得ることができるために、それらを胎児の皮膚から即座に生成する必要がなくなる。
【００２９】
本発明によれば、「胎児ヒト線維芽細胞」は、胎児由来の、すなわち胎児ヒト皮膚から得られた線維芽細胞を意味し、前記細胞は、以下の特異的な特色:i)線維芽細胞の典型的な形状、ii)治癒過程に必須の増殖因子及びサイトカインを分泌する性質、iii)免疫寛容を生じる特性、及びiv)強い移動能力を有する。有利には、本発明の組成物で使用される胎児ヒト線維芽細胞は、サイトカイン及びVEGF-Aなどの増殖因子を強く分泌し、プロリル-4-ヒドロキシラーゼなどの1種又は複数の公知の線維芽細胞マーカーを発現する。これらは、機能的な移動特性(例えばインテグリンβ1の発現)と、それらが胎児由来であることに関連し、さらにインドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)の酵素活性に基づく免疫抑制とを示す(図5Bのaを参照)。これらの特異的な特色は、この作用に関して慣習的に使用されるあらゆる技術によって、とりわけ従来の顕微鏡法、Elisa測定、フローサイトメトリー(FACS)、免疫蛍光法、及びリンパ球増殖試験によって解明できる。
【００３０】
これらの胎児線維芽細胞は、上記の特性を保存するための当業者公知のあらゆる方法によって得ることができる。これらの胎児線維芽細胞はとりわけ、胎児ヒト皮膚の外植片を培養して、外植片から線維芽細胞を放出させて適切な培地でそれらを増殖できるようにすることにより得ることができる。このような培地は、広く文献で記載されている。例えば、20%SVFと細胞培養工程中の細菌汚染を回避するために従来の抗生物質とが補充されたMEM又はDMEMを使用することが可能である。
【００３１】
また、以下に記載の実施例I(1.2章)で記載される特定のプロトコールを使用することも可能である。同じ胎児皮膚サンプルからの線維芽細胞及びケラチノサイトの両方の入手を可能にするこのプロトコールによれば、緩衝食塩水培養培地(例えばPBS又はDPBS培地)中で前記胎児ヒト皮膚サンプルを濯ぎ、次いで培養プレート上に皮膚外植片を置き、次いでこれを典型的な培養培地(例えば20%ウシ胎児血清及び1%ペニシリン-ストレプトマイシンが補充されたDMEM)で覆い、その後、5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で37℃で平均10〜15日インキュベートすることによって、胎児線維芽細胞が得られる。培地の交換は、5日間培養した後に、培地の半分を取り去って等量の新しい培地を添加することによってなされる。この特定の方法に従って、ケラチノサイトを接着したままにして線維芽細胞だけが取り外されるように、5〜10分間の短期間で酵素作用(トリプシンEDTA)により線維芽細胞を引き離す。懸濁された状態の線維芽細胞をチューブに移し、遠心分離し、37℃/5%CO2でフラスコ中の10%SVFが補充されたDMEMなどの典型的な培地に戻して培養する。培地の交換は、3日から4日ごとに培地の半分を取り去って等量の新しい培地を添加することによってなされる。10〜15日間培養した後、トリプシン-DETAの作用によって細胞を取り外し、次いでP1で凍結して、線維芽細胞の最初のバンクを構成する。本発明の特定の実施形態において、この最初のバンクのサンプルを融解させ、線維芽細胞を5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で37℃で増幅させ第三継代(P3、P1からの細胞を融解させた後に20日間培養)を得て、次いで凍結して、本発明の組成物での使用に適した対象の胎児線維芽細胞の臨床バッチを構成する。
【００３２】
これらの胎児線維芽細胞は、当業者公知のあらゆる方法によって、例えばタンパク質溶液(例えば40mg/mLヒトアルブミン)を凍結保護剤(例えばジメチルスルホキシド)と共に9:1の比率で含む凍結用溶液を使用して凍結できる。
【００３３】
臨床バッチが構成された後、本発明の組成物に統合された胎児ヒト線維芽細胞は、適切な培地(例えば上述のDMEM培地)中で胎児ヒト線維芽細胞のサンプルを再度培養することによって構成された胎児ヒト線維芽細胞の臨床バッチから直接得ることができるために、それらを胎児の皮膚から即座に生成する必要がなくなる。
【００３４】
本発明の組成物で使用されるケラチノサイト及び線維芽細胞を産生するのに使用される皮膚は、好ましくは18〜24週齢のヒト胎児から、さらにより好ましくは18〜20週齢のヒト胎児からサンプリングされる。
【００３５】
皮膚病変の有効で迅速な治癒を誘導するには、ヒトケラチノサイト及び胎児線維芽細胞は、本発明の組成物中に極めて正確な比率で存在していなければならない。したがって、本発明の組成物中のケラチノサイト細胞の数と線維芽細胞の数との比率(ケラチノサイト/線維芽細胞)は、0.75から2.5の範囲であってもよい。好ましい実施形態において、ケラチノサイト細胞の数と線維芽細胞の数との比率(ケラチノサイト/線維芽細胞)は、0.75から1.25の間、好ましくは0.85から1.15の間で構成され、最も好ましくは1:1である(細胞計数に起因する誤差による)。代替の好ましい実施形態において、ケラチノサイト細胞の数と線維芽細胞の数との比率(ケラチノサイト/線維芽細胞)は、1.25から2.5、好ましくは1.5から2.5、1.75から2.5、2から2.5、2.25から2.5の範囲であり、最も好ましくは7:3である(細胞計数に起因する誤差による)。
【００３６】
現在、細胞をカウントする技術は非常によく記載されており、数パーセント(典型的には2から5%)もの高い信頼性がある。例えば自動細胞カウンター(特に、Millipore社、Invitrogen社又はBiorad社によって販売されている「Cellcounter」システム)を使用したり、又は専用の細胞計数法(マラッセ細胞、Thoma社製)を使用することによって手動で細胞をカウントしたりすることが可能である。計数技術に起因するあらゆる誤差が同じになるように、各細胞タイプの量を決定するのに同じカウントシステムを使用することが重要である。
【００３７】
特定の実施形態において、ケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞とは別に、本発明の組成物は、好ましくはヒト用の、天然又は合成の非免疫原性細胞外マトリックスを含有する。より詳細には、本発明の組成物のヒトケラチノサイト及び胎児線維芽細胞は、ウシ由来I型コラーゲンで構成される細胞外マトリックスに統合される。注目すべきことに、ウシコラーゲンは、フランスのヒトでの臨床用途に関する監督官庁によって承認されている。実際に、このタイプの異種マトリックスは、コラーゲンの免疫原性が低いために患者において免疫性応答を誘導しない。
【００３８】
用語「細胞外マトリックス」は、本明細書において、多細胞生物の結合組織と他の組織との間に自然に存在する一連の細胞外高分子を示す。このマトリックスは、大部分が糖タンパク質及び純粋なタンパク質、加えてマトリックス状ネットワークを形成するグリコサミノグリカンで作製されている。細胞外マトリックスは、組織内の細胞の構造的な支持体、接着、移動及び制御において役割を果たす。天然の細胞外マトリックスのタンパク質は、より詳細には、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、テネイシン[サイトアクチン(cytoactin)]、エンタクチン(ニドゲン)、オステオネクチン(SPARC)、アンコリンCII、コンドロネクチン、エピネクチン(epinectin)、ヒアルオネクチン、アミロイドP化合物(compound P amyloid)、フィブリリン、メロシン、ラミニンS、アンジュリン(undulin)、エピリグリン及びカリニンである。
【００３９】
「非免疫原性」マトリックスとは、本明細書において、このマトリックスが、組成物が対象とする個体において免疫性応答を誘導しない(又は極めてわずかしか誘導しない)化合物で作製されていることを意味する。好ましくは、前記マトリックスは、ヒトにとって非免疫原性である。ヒトにとって「同種」のマトリックスとは、マトリックスが、本質的にヒト由来のタンパク質又は化合物で作製されていることを意味する。ヒトにとって「異種」のマトリックスそのものは、本質的に(ヒト以外の)動物由来のタンパク質又は化合物で作製されている。これら2タイプのマトリックスが、本発明の組成物で使用できる。ただし異種マトリックスが使用される事象では、異種マトリックスのヒトに対する免疫原性を確実に最小限にすべきである(例えばウシコラーゲンなど)。
【００４０】
また人工的に生産された高分子化合物(或いは「ヒドロゲル」とも呼ばれる)も使用できる。当業者であれば、好ましい治療的用途に応じてどの化合物(人工又は天然)が適しているのかを同定して選択することが可能である。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明の組成物のケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞は、コラーゲン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、キトサン、ヘパリンから選択される少なくとも1種の天然化合物を含有する細胞外マトリックスに統合される。さらにより好ましい実施形態において、本発明の組成物のケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞は、コラーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、及びエラスチンから選択される少なくとも1種の化合物を含有する細胞外マトリックスに統合される。最も好ましい実施形態において、本発明の組成物のケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞は、ヒトコラーゲン、ヒトフィブリン、ヒトフィブロネクチン、及びヒトエラスチンから選択される少なくとも1種の化合物を含有する細胞外マトリックスに統合される。また、ケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞は、ウシコラーゲン、ウシフィブリン、ウシフィブロネクチン、及びウシエラスチンから選択される少なくとも1種の化合物を含有する細胞外マトリックスに統合されてもよい。
【００４２】
有利には、本発明の組成物における細胞外マトリックスとして、Baxter laboratories社製の「Tissucol」と呼ばれる病巣内接着剤を使用できる。この接着剤は、ヒトフィブリノゲン、ヒト第XIII因子、ヒトフィブロネクチン、プラスミノゲン、ウシアプロチニン及びヒトトロンビンを含有する。より詳細には、この接着剤は、再溶解した溶液0.5mLあたり、45mgのヒトフィブリノゲン、5UIのヒト第XIII凝固因子(1単位の第XIII因子は、1mLの新鮮な血漿中に含有される活性に相当する)、2.75mgのヒトフィブロネクチン、0.04mgのヒトプラスミノゲン、0.83UPE(欧州薬局方の単位)のウシアプロチニン及び250UIのヒトトロンビンを含有する。この病巣内接着剤は、組織の血流を遮断し、結合させ、接着させ、引き締める特性を持ち、さらに外科創傷の治癒も促進する。病巣内接着剤は、抗凝固処置を受けた患者又は血流遮断障害を有する患者にも使用できる。この接着剤の作用機序は、凝固の最終段階、すなわちカルシウムの作用を受けたトロンビンと第XIII因子との働きによってフィブリノゲンが不溶性フィブリンになることを再現する。結果生じたフィブリンは、処置された組織に物理的及び化学的に接着して、高度な網状化を呈する。トロンビン、フィブリン及び第XIII因子は、線維芽細胞の増殖に好ましい作用を有する。それに続く創傷治癒過程の工程は、フィブリンネットワークのタンパク質分解及び食細胞による分解からなる。線維素溶解は生体組織のプラスミノゲンの活性化剤によっても左右され、このような活性化剤の濃度は、臓器及び組織に応じて様々であり得る。フィブリン接着剤に添加されたアプロチニンは、位置に応じて2週間にわたり、血漿及び生体組織のプロテアーゼにより誘導された線維素溶解を阻害する。最終工程は、フィブリン層と瘢痕状の結合組織との置換である。この接着剤は、製造元の説明書に従って再溶解させることができる。
【００４３】
最終的に、真皮における細胞外マトリックスの主要な成分であり、したがって線維芽細胞及びケラチノサイトの天然支持体であるヒト又はウシコラーゲンを、本発明の組成物における細胞外マトリックスとして使用することが可能になる。ここで好ましくは、結合組織のウェフト(weft)を構成し、皮膚組織の主要なマトリックス状の要素であるI型コラーゲンが使用されると予想される。
【００４４】
細胞外マトリックスの化合物が絡み合うことによって作られたマトリックス状ネットワークにケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞が挿入されたとき、ケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞が細胞外マトリックスに「統合される」といわれる。実際には、マトリックスの成分と細胞を混合することによって細胞が統合された組成物が得られる。そのプロトコールは使用されるマトリックスに応じて様々である。例えば、接着剤である「tissucol」が使用される場合、線維芽細胞及び胎児ヒトケラチノサイトをトロンビン及び第XIII因子と直接混合してもよく、次いでフィブリノゲンを添加してもよく、さらにその全体を、創傷、やけど又は潰瘍などの皮膚欠陥に直接適用して固体ゲルを形成してもよい。
【００４５】
他の実施形態において、予め構築されたマトリックスにケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞を含有する培養培地を添加して、細胞が移動することによってそこに透過するまで待つことにより、本発明の組成物を得てもよい。細胞外マトリックス中に細胞が分散し始めたら、それらの成長に適合させた培養培地によって、細胞がマトリックス全体に定着できるようになると予想される。
【００４６】
第二の態様において、それゆえに本発明は、より一般的には組成物の製造方法に関し、本方法は、0.75から2.5の範囲の比率で、胎児ヒトケラチノサイト細胞及び胎児ヒト線維芽細胞を、非免疫原性細胞外マトリックスと混合する工程を含む。本明細書の上記で記載される前記比率の好ましい範囲及び値は、必要な変更を加えて本発明の本態様に適用される。
【００４７】
特定の実施形態において、この方法は、混合する工程の前に、以下の2つの工程:
a)胎児ヒトケラチノサイト細胞を得る工程、及び
b)胎児ヒト線維芽細胞を得る工程
を含む。
【００４８】
これらの細胞は、本明細書で上述されている。
【００４９】
本発明の方法は、前記細胞を得るための工程と前記細胞を細胞外マトリックスと混合する工程との間に、前記細胞を培養する工程を含まないことが好ましい。この方式において、ケラチノサイト細胞及び胎児ヒト線維芽細胞が産生された後に、それらを細胞外マトリックスと直接混合してもよい。この特定の調製様式により、細胞中での本発明に係る組成物の生存能力を増加させることができる。この特定の実施形態によれば、前記細胞外マトリックスは、好ましくは、I型コラーゲンなどのコラーゲンのマトリックスである。
【００５０】
好ましくは、これらのケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞は、これらの細胞を含有する2つの別個のバンクから得られる。このケースにおいて、本発明の製造方法は、以下の2つの工程:
a)胎児ヒトケラチノサイト細胞のバンクを得る工程、及び
b)胎児ヒト線維芽細胞のバンクを得る工程
を含む。
【００５１】
当業者であれば、好ましい適用に応じて(実際に、ある種の創傷又はやけどは、それらの程度に応じて程度の差はあるが高い細胞濃度を必要とする場合がある)、慣例的な取り扱いにより、細胞外マトリックスにおけるケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞の十分な濃度及び/又は密度を容易に決定する方法について知っている。
【００５２】
同様に、簡単な慣例的試験により、当業者であれば、好ましい程度の網状化(ケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞の移動を損なってはならないマトリックス状ネットワークにおける繊維の間隔に影響を与える)を達成するための細胞外マトリックスの各成分の量及び/又は濃度を正確に設定する方法について知っている。本発明者らは、組成物が細胞外マトリックスを含有する場合、マトリックス1mL/cm3あたり0.1から5×106個の細胞を導入することが推奨されることを特定した。
【００５３】
本発明の組成物においてケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞の理想的な量を達成するためには、適合させた培地(例えばSVFが10%で補充されたDMEM)中で、培養に好ましい総数の細胞を直接導入するか、又はそれよりも少ない数の細胞を導入して、次いでこの組成物を数日間置き、マトリックス中でケラチノサイト及び胎児ヒト線維芽細胞を移動させて増殖させることにより、創傷に適用する前に最適化された包帯を得ることが可能である。
【００５４】
ダメージを受けた皮膚(傷を負った、又はやけどした)への本発明の組成物の適用は、本組成物が含有する細胞の生存能力及び移動度に影響を及ぼさない当業界公知のあらゆる手段によって行うことができる。例えば、本発明の組成物は、シリンジを使用して、又は創傷上に局所化させた組成物を維持する包帯によって創傷上に適用できる。その投与方法に応じて、本発明の組成物はまた、局所投与できる組成物で従来使用される抗菌剤、抗真菌剤、又はあらゆる溶媒などの薬学的に許容される賦形剤を含有していてもよい。当業者であれば、増殖因子及びサイトカインの分泌又は組成物中に存在する細胞の移動度及び増殖に影響を及ぼさない程度にどの賦形剤が本発明の組成物で使用できるかを正確に決定することが可能である。
【００５５】
本発明の組成物は、好ましくはヒトに使用される。しかしながら、本発明の組成物は、獣医学的な適用、とりわけ家畜、例えばイヌ、ネコ、ウマなどにおいても使用できる。
【００５６】
第三の態様において、本発明は、例えば創傷、やけど若しくは潰瘍などのあらゆる皮膚欠陥を処置するため、並びに/又はあらゆる皮膚欠陥、例えば創傷、やけど若しくは潰瘍における皮膚を再生するため、及び/若しくはそれらの治癒を促進するために使用される本発明の組成物にも関する。また本発明は、あらゆる皮膚欠陥、例えば創傷、やけど、潰瘍における皮膚を再生すること、それらの治癒を促進すること、又はそれらをケアすることを意図した包帯若しくは薬物を製造するための、本発明の組成物の使用も対象とする。最終的に本発明は、あらゆる皮膚欠陥、例えば創傷、やけど若しくは潰瘍の皮膚を再生する方法、並びに/又はそれらをケアする方法及び/若しくはそれらの治癒を促進する方法であって、前記皮膚欠陥に本発明の組成物を局所適用することを含む方法に関する。
【００５７】
第四の態様において、最終的に本発明は、例えば本明細書の上記で定義したような本発明の組成物を含有する包帯に関する。「包帯」とは、本明細書において、皮膚のダメージを受けた部分を覆うための予防的デバイスを意味する。
【００５８】
好ましい実施形態において、本発明の包帯は、滅菌されて、微生物を通さない容器中にパッケージングされる。この包帯中で、本発明の組成物は、例えば柔軟剤で覆われており、ここで柔軟剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ソルビトール、他のグリコール類及びエーテルグリコール類、例えば、ポリアルキレングリコールのモノ-又はジエーテル類、ポリアルキレングリコールのモノ-又はジエステル、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールのグリコレート類、プロピレングリコールのジペラルゴン酸エステル及びポリプロピレングリコールのグリセロール、ソルビタンエステル類、クエン酸及び酒石酸のエステル類、イミダゾリン、ラクタム類、アミド類、ポリアミド類、第四級アンモニウムの化合物から得られた両性表面作用剤、フタル酸エステル類、アジピン酸エステル類、ステアリン酸エステル類、パルミチン酸エステル類、セバシン酸エステル類又はミリスチン酸エステル類などのエステル類及びそれらの組み合わせ、アジピン酸ジイソプロピル、フタル酸エステル類及びセバシン酸ジエチル;炭化水素化合物(hydrocarbides)、例えば流動パラフィン;ステアリルエトキシルアルコール、グリセロールのエステル類、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソトリデシル、ラウリン酸エチル、N-メチルピロリドン、オレイン酸エチル、オレイン酸、アジピン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸オクチル、1,3-ブタンジオール及びそれらの混合物からなる群より選択してもよい。
【００５９】
別の態様において、本発明は、あらゆる皮膚欠陥、例えば創傷、やけど又は潰瘍を処置するため、及び/又はそれらの治癒を促進するのに使用するための本発明の包帯に関する。最終的に本発明は、創傷、やけど又は潰瘍などのあらゆる皮膚欠陥をケアする方法及び/若しくはそれらの皮膚を再生する方法、並びに/又はそれらの治癒を促進する方法であって、前記皮膚欠陥に本発明の包帯を局所適用することを含む方法に関する。
【００６０】
最終的な態様において、本発明はまた、瘢痕化を起こさずに治癒を誘導する包帯における、本発明の組成物の美容的な使用にも関する。この使用は、創傷が再び閉じられれば創傷の痕が残らないという点で、上述の治療的用途とは異なる。
【実施例】
【００６１】
I.器具及び方法
I.1.胎児の皮膚のサンプルの調製
ドナーの選択作業は、ナントのCHUの産婦人科が請け負う。この作業は、医療的な妊娠中絶中に採取された12から22週の間の在胎期間の胎児を使用することからなる。これらの胎児は、ウイルス関連の異常又は染色体異常を有していてはならない。母親の血清学的特徴は、C型肝炎、AgHB、Ac HBc、HIV1及び2、Ag p24、HTLV1及び2、CMVに関して陰性でなければならない。
【００６２】
胎児は、滅菌条件でのエコーグラフによる制御下における医療的な妊娠中絶中に回収される。産科医は胎児を検査して、胎児を不適格にすると予想される奇形について調べる。
【００６３】
熟練の産科医によって分娩室で皮膚サンプルを採取し、そのサンプルを空の滅菌チューブ中に入れる。サンプルを抗生物質(ペニシリン-ストレプトマイシン)を含有する培養培地(DMEM/SVF)で覆う。
【００６４】
UTCGの制御された雰囲気の領域中のエアフローキャビネットで胎児の皮膚のサンプルを処置する。皮膚サンプルを、20mlのDPBS/P-S(2%)を含有する2つの一連の50mlチューブ中で1分浸漬して攪拌することにより濯ぐ。次いでこれを滅菌トレイに移して、真皮を上面に塗り広げる。
【００６５】
鉗子で皮膚を掴み、メスの刃で表面を掻き取って皮下組織を切り離す。メスの刃を皮膚表面に対して45°の角度に傾ける。20mlのDPBS/P-S(2%)を含有する2つの一連の50mlチューブ中で浸漬及び攪拌することにより、皮膚を再度濯ぐ。
【００６６】
胎児の皮膚のサンプルをペトリ皿に投入し、表皮を上に向かせる。皮膚から1辺あたり2〜3mmの2つの断片を切り出し、クライオチューブに入れ、次いで-80℃で凍結乾燥する。これらの断片は、治療目的の追加調査に向けたものである。
【００６７】
残りの皮膚を、可能な限り最小の外植片(1辺あたり約1mm)に切断する。
【００６８】
次いで外植片を、均一に間隔をあけてウェル1つあたり10個の外植片の割合で6-ウェルプレートに入れる。10分間そのままにした後、外植片を750μlの培養培地(20%SVF、1%P-Sが補充されたDMEM)で覆う。次いで6-ウェルプレートを6時間又は一晩インキュベーターに入れる。この期間後、各ウェルに2mlの培養培地を添加する。6-ウェルプレートを、5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で37℃で平均して10〜15日間インキュベーターに移す。
【００６９】
3日から4日ごとに、細胞の出現を評価するために培養の顕微鏡観察を行う。培地の交換は、培地の半分を取り去って等量の新しいDMEM/SVF(10%)/PS(1%)培地を添加することによって行われる。
【００７０】
平均して10〜15日後、外植片は、クラウン状のケラチノサイトで取り囲まれ、その上に線維芽細胞のマットが存在する。線維芽細胞及びケラチノサイトを別々に2回、回収する。
【００７１】
I.2.胎児線維芽細胞の産生
最初のトリプシン処理により線維芽細胞を産生する。そのために、ピペットを使用して6-ウェルプレートから培養培地を切り離す。次いでウェルを2mlのDPBSで濯ぐ。
【００７２】
各ウェルからDPBSを切り離し、0.5mlのトリプシン-EDTA 1×で交換する。プレートを37℃で5〜10分間インキュベートする。トリプシンを周囲温度で使用すると、ケラチノサイトは接着したままであるが、線維芽細胞は取り外される。顕微鏡でのプレート観察により層間剥離を検証する。
【００７３】
線維芽細胞をウェル1つあたり1mlのDMEM/SVF(10%)/PS(1%)で溶解させ、トリプシンの作用を阻害する。懸濁された状態の線維芽細胞を15又は50mlチューブ中に「プール」して、これを遠心分離する。上清を除去し、PRBC細胞を1〜5mlのDMEM/SVF培地(10%)/PS(1%)に溶解させる。線維芽細胞を1cm2あたり細胞8000〜12000個の割合で培養フラスコ中に植え付け、これを37℃/5%CO2で7〜10日間インキュベーターに移す。
【００７４】
3日から4日ごとに、細胞の出現を評価するための培養の顕微鏡観察を行う。培地の交換は、培地の半分を取り去って等量の新しいDMEM/SVF(10%)/PS(1%)培地を添加することによってなされる。
【００７５】
この段階でサンプルを凍結して、最初の継代(P1)の完了時に胎児線維芽細胞の最初のバンクを形成する。凍結のために、1mlあたり細胞100万個になるように、9:1の比率の4%ヒトアルブミン含有凍結用溶液及びジメチルスルホキシド(DMSO)で細胞を調節する。2mlのクライオチューブに、1ml/チューブの割合で細胞を分注する。これらのクライオチューブの凍結を、1℃/分から-80℃まで温度を低下させることによって行い、次いで24〜72時間後にクライオチューブを-130から-196℃の間の窒素蒸気中に移す。次いで最初のバンクのアリコートを融解させ、次いでDMEM/SVF培地(10%)中で胎児線維芽細胞を増幅させてさらに2回継代し、上記で記載した手法に従って凍結して、P3の胎児線維芽細胞の臨床バッチ(作業用バンク)を構成する。形態学的な外観と、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ並びにインテグリンβ1、α2及びα3の発現とを従来の顕微鏡、FACS及び免疫蛍光法によって制御する(図4)。
【００７６】
I.3.胎児ケラチノサイトの産生
トリプシン処理後に線維芽細胞を回収したら、6-ウェルプレートを2mL/ウェルのDPBSで濯ぎ、ケラチノサイトの増殖に有利になるように最初の培養培地をCnT-07/PS培地(1%)で交換する。プレートを37℃/5%CO2で3〜7日間インキュベートする。
【００７７】
3日から4日ごとに、培養を顕微鏡で観察して、細胞の出現を評価する。培地の交換は、培地の半分を取り去って等量の新鮮なCnT-07/PS培地(1%)を添加することによってなされる。
【００７８】
可能な細胞数になったら(70〜80%の密集度)、ケラチノサイトを引き離して、培養する。ピペットを使用して6-ウェルプレートから培養培地を切り離す。次いでウェルを2mLのDPBSで濯ぐ。各ウェルからDPBSを切り離し、0.5mLトリプシン-EDTA 1×で交換する。6-ウェルプレートを37℃で10〜15分間インキュベートする。顕微鏡でのプレート観察により層間剥離を検証する。
【００７９】
ケラチノサイトを1ml/ウェルのDMEM/SVF(10%)/PS(1%)に溶解させて、トリプシンの作用を阻害する。懸濁された状態のケラチノサイトを15又は50mLのチューブに「プール」し、これを遠心分離する。上清を除去し、1〜5mlの特殊なケラチノサイト用培地であるCnT-07にPRBCを溶解させる。
【００８０】
ナンバリング/生存能力のためのサンプリングがなされる。
【００８１】
ケラチノサイトを1cm2あたり細胞4000〜6000個の割合で培養フラスコ中に植え付ける。
【００８２】
培養フラスコを、37℃/5%CO2で7〜10日間インキュベーターに移す。
【００８３】
この段階でサンプルを凍結して、最初の継代(P1)の完了時に胎児ケラチノサイト細胞の最初のバンクを形成する。凍結のために、1mlあたり細胞100万個になるように、9:1の比率の4%ヒトアルブミン含有凍結用溶液及びジメチルスルホキシド(DMSO)で細胞を調節する。2mlのクライオチューブに、1ml/チューブの割合で細胞を分注する。これらのクライオチューブの凍結を、温度を1℃/分から-80℃に低下させることによって行い、次いで24〜72時間の後にクライオチューブを-130から-196℃の間の窒素蒸気中に移す。次いで最初のバンクのアリコートを融解させ、次いでCnT-07培地中で胎児ケラチノサイト細胞を増幅させてさらに2回継代し、上記で記載した手法に従って凍結して、P3の胎児ケラチノサイト細胞の臨床バッチ(作業用バンク)を構成する。形態学的な外観と、ケラチン14並びにインテグリンβ1、α2及びα3の発現とを従来の顕微鏡、FACS及び免疫蛍光法によって制御する(図4)。
【００８４】
I.4.得られた2種の細胞タイプのサイトカイン分泌のプロファイル
上記で得られた胎児タイプ又は成人細胞の培養物由来のケラチノサイト、線維芽細胞又は異なる比率の両細胞タイプの混合物の培養上清を、48時間培養した後に凍結し、それらのVEGF-A、PDGF-AA、IL1β、GM-CSF、IL-1α、IL-8及びHGF含量をELISA測定で分析した。
【００８５】
I.5.線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの免疫調節能力
上述したようにして得られた線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトに放射線照射し、次いでフィトヘマグルチニン-L(PHA-L)及びインターロイキン2(IL-2)によって刺激されたPBMCの存在中に入れた。異なる比率の胎児細胞/PBMCを試験して(1/4;1/20;1/100;1/200)、リンパ球増殖に対する胎児細胞用量のあらゆる作用を観察した。5日間培養した後にチミジン取り込みの量を測定することによって増殖を評価した。
【００８６】
I.6.線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの免疫調節能力に対するIDO(インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ)の役割
線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの免疫調節能力に対するIDOの役割を評価するために、リンパ球増殖に対する胎児細胞の阻害作用のあらゆる逆転が観察されるように、リンパ球増殖期中にIDOの特異的阻害剤である1-MT(1-メチルトリプトファン)を200μM、20μM及び2μMの濃度で添加したという違いを除いては、段落I.5で記載したのと同じタイプの実験を行った。
【００８７】
I.7.in-vitroにおける胎児細胞の治癒試験
本明細書で上述されたプロトコールに従って得られた線維芽細胞及びケラチノサイトによりこの試験を行った。この試験の目的は、最適な治癒を達成するための各細胞タイプの比率を決定することであった。密集状態に近い密度(12-ウェルプレートのウェル1つあたり100,000個の細胞)で細胞をCnT-07培地に植え付けた。追加で24時間培養した後、針を使用して細胞マットを「スクラッチ」した(「スクラッチ」の測定幅は、300〜500μmの規模である、図8を参照)。細胞をPBSで洗浄し、次いで何も補充されていない新しい培地を各ウェルに添加した。すぐにプレートを23時間にわたりタイムラプスで分析した(細胞のリアルタイム分析)。
【００８８】
タイムラプス分析のために、「スクラッチ」ごとに4ポイントを研究した。23時間の分析にわたり10分毎にそれぞれのポイントで写真を撮った。
【００８９】
4つの異なる細胞マットに相当する様々な条件を研究した:
1-  線維芽細胞単独(100/0の線維芽細胞/ケラチノサイト比)
2-  75%線維芽細胞+25%ケラチノサイト(75/25の線維芽細胞/ケラチノサイト比)
3-  50%線維芽細胞+50%ケラチノサイト(50/50の線維芽細胞/ケラチノサイト比)
4-  ケラチノサイト単独(0/100の線維芽細胞/ケラチノサイト比)。
【００９０】
イメージングソフトウェアのイメージJを使用して結果を分析した。温度T0の時間、5時間、10時間、15時間及び20時間におけるスクラッチされた領域の細胞被覆率の百分率によってスクラッチ閉鎖の測定を評価した。この被覆率の百分率を、100%の細胞被覆率とみなされるスクラッチの右及び左の領域(細胞マットの領域)の平均細胞被覆率と比較した。
【００９１】
II-結果
II.1.線維芽細胞及び胎児ケラチノサイト単独又は混合物(1:1の比率)によるサイトカインの分泌
図1に結果を示す。
【００９２】
胎児細胞、より特定には胎児線維芽細胞は、VEGF-Aを強く分泌する。線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの共培養中、線維芽細胞培養のケースで達成されたのと同じ値のVEGF-A濃度が達成されたことは、2つの細胞タイプ間のVEGF-A分泌の相乗作用があるということを示したに他ならない。実際に、そうでないとすれば、共培養物の上清中のVEGF濃度は、線維芽細胞単独の上清と比べて低く、ケラチノサイトの分泌レベルもより低くなったであろう。
【００９３】
PDGF-AA及びIL-1β因子は、胎児ケラチノサイトによって特異的に分泌される。線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトが1:1の比率で混合されれば、これらの2種の因子の分泌は、それがケラチノサイト単独の場合よりも低いとしても常に明白に示される。
【００９４】
これらの測定から、各細胞タイプは、極めて差異的、定性的、及び定量的に増殖因子を分泌することが示される。またこれらの結果からは、ケラチノサイト及び線維芽細胞の(少なくとも1:1の比率での)連携は、2種の細胞タイプのそれぞれに特異的な因子の放出を妨害しないが、それとは逆にいくつかの因子に関しては、(特にVEGF-Aに関して)この放出を増強する可能性があることも示される。
【００９５】
II.2.単独の、又は混合された(1:1の比率)線維芽細胞並びに胎児及び成人ケラチノサイトのサイトカインプロファイルの比較
図2に結果を示す。
【００９６】
・GM-CSF(図2A及び2B)
本発明者らは、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイト単独は、GM-CSFを分泌しないことを観察した。しかしながら、これらの細胞が1:1の比率で共培養されると、培養上清中でGM-CSFが強く過剰発現される(562pg/ml)。
【００９７】
さらに、使用された成人線維芽細胞サンプルの由来に関わりなく、これらはGM-CSFも分泌しない。PA01(腹壁形成術)及びPC01(大腿部形成術)サンプルの成人ケラチノサイトそれ自体は、少量のGM-CSFを分泌する(110及び150pg/ml)。
【００９８】
各細胞タイプ単独ではGM-CSFを分泌しないが、共培養ではこのサイトカイン分泌の相乗作用が観察されていることから(538pg/ml)、PR01(包皮)サンプルは、胎児細胞のものと近いGM-CSFの分泌プロファイルを示す。
【００９９】
これらの結果は、明らかに、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの連携は、成人細胞の共培養の場合よりもいっそう高くGM-CSFの分泌を増強することを示す(335pg/mlに対して562pg/ml)。
【０１００】
・IL-1α(図2C及び2D)
本発明者らは、試験された細胞サンプルに関わりなく極めて類似したIL-1αの分泌プロファイルを観察した。この方式において、線維芽細胞は、単一培養ではIL-1αを分泌しないが、それに対してケラチノサイトは分泌するようである(胎児タイプの細胞の場合、最大157pg/ml)。
【０１０１】
線維芽細胞及びケラチノサイトが1:1の比率で共培養の状態にあると、IL-1αの分泌における減少が観察される。しかしながらこの減少は、胎児タイプの細胞の場合よりも成人細胞においてかなり大きい。
【０１０２】
・IL-8(図2E及び2F)
IL-8の分泌プロファイルも極めて類似している。したがって、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトは単一培養では分泌を行わないようである。PA05(腹壁形成術)及びPC01(大腿部の外科手術)サンプルに由来する成人ケラチノサイト単独は極めて低いレベルで分泌を行う(それぞれ870及び1000pg/ml)。
【０１０３】
しかしながら、ケラチノサイト及び線維芽細胞の共培養は、胎児細胞(6632pg/ml)及び成人細胞(5590pg/ml)の両方に関してIL-8分泌を著しく上昇させる。
【０１０４】
・HGF(図2G及び2H)
単一培養では、線維芽細胞も胎児ケラチノサイトもHGFを分泌しない。しかしながら、共培養では、HGF濃度の顕著な上昇が観察される(39.5pg/ml)。共培養における胎児及び成人細胞の比較から、胎児細胞は、成人細胞より強くHGF因子を分泌する(23pg/mlに対して39.5pg/ml)ことが示される。また、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの連携は、実質的にHGF分泌を増強するが、それに対して成人細胞では逆の作用も観察されるようである。
【０１０５】
・VEGF-A(図2I及び2J)
本発明者らは、胎児線維芽細胞は、成人ドナーの線維芽細胞より2倍多くVEGF-Aを分泌する(1323pg/mlに対して2770pg/ml)ことを観察した。しかしながら、成人ケラチノサイトによるVEGF-A分泌は、胎児ケラチノサイトの場合よりも高い(1404pg/mlに対して1875pg/ml)。
【０１０６】
また、胎児線維芽細胞は、胎児ケラチノサイトより多くのVEGF-Aも分泌するが(1404pg/mlに対して2770pg/ml)、成人細胞ではその逆である(線維芽細胞において1323pg/mlであるのに対して、ケラチノサイトにおいて1875pg/ml)。
【０１０７】
最後に、共培養では、胎児細胞は、成人細胞よりわずかに多くのVEGF-Aを分泌する(2100pg/mlに対して2617pg/ml)。
【０１０８】
・結論
この方式において、本発明者らは、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの共培養は、単一培養ではこれらの細胞によって自然には分泌されないGM-CSF、IL-8及びHGF因子の分泌に必須であることを実証した。またこの共培養は、それほど強くなくともVEGF-A分泌にも良い影響を与える。
【０１０９】
また本発明の結果から、共培養条件(1:1の比率)では、GM-CSF、HGF、Il-8、IL-1α及びVEGF-A因子の分泌は、成人細胞よりも胎児由来の線維芽細胞及びケラチノサイトの場合のほうが高いことも示される。
【０１１０】
II.3.異なる比率の線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトのサイトカインプロファイル
サイトカイン産生に対する線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの比率の影響を研究するために、本発明者らは、これらの細胞の異なる比率に対する異なるサイトカイン濃度を研究した。
【０１１１】
図3にこの研究の結果を示す。
【０１１２】
・GM-CSF(図3A)
本発明者らは、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの連携が、前記細胞でのGM-CSF発現を可能にすることを観察した。したがって、これらの結果から、これらの2つの細胞タイプ間の相互作用が、GM-CSFの分泌に必要であることが確認される。
【０１１３】
加えて、ケラチノサイトの比率が増加すればするほど、GM-CSFの分泌は、30%線維芽細胞/70%ケラチノサイトの比率でプラトーに達するまで増加する(1014pg/ml)。次いでケラチノサイトの比率が70%を超えたら、GM-CSF分泌は低下し始める。
【０１１４】
・IL-1α(図3B)
ポイントII.2の結果のように、胎児ケラチノサイトだけがIL-1αを分泌することは明らかである。しかしながら、GM-CSFとは対照的に、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの共培養は、IL-1α分泌に影響しないようである。したがって、90%線維芽細胞/10%ケラチノサイトの比率ではIL-1α分泌は極めて低く、逆の比率(10%線維芽細胞/90%ケラチノサイト)になるに従って次第に増加し、ケラチノサイトの単一培養で得られたレベルをわずかに超えるレベルに達する(157pg/mlに対して188pg/ml)。各細胞タイプが50%の比率は、ケラチノサイトの単一培養で得られたレベルの半分に達する。
【０１１５】
・IL-8(図3C)
GM-CSFに関して、本発明者らは、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの連携がIL-8発現を引き起こすことを観察した。この方式において、これらの結果から、これらの2つの細胞タイプ間の相互作用が、このサイトカインの分泌に必要であることが確認される。
【０１１６】
IL-8分泌の最大レベルは、70%線維芽細胞/30%ケラチノサイトの比率で達成されるが(5470pg/ml)、これは、50%/50%の比率まで比較的安定を保つ(4464pg/ml)。次いで、ケラチノサイトの比率が増加すればするほど(50%より高く)、IL-8の分泌がより減少する。
【０１１７】
・HGF(図3D)
GM-CSF及びIL-8に関して、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの連携が、前記細胞でのHGF分泌を可能にする。したがってこれらの結果から、これらの2つの細胞タイプ間の相互作用が、HGFの発現に必要であることが確認される。
【０１１８】
しかしながら、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの比率は、HGFの分泌レベルに影響しないようである(21から25pg/mlの間で様々である)。
【０１１９】
・VEGF-A(図3D)
ポイントII.2で観察されたように、VEGF-Aは、単一培養における線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトで発現された唯一のサイトカインである。
【０１２０】
これらの2つの細胞タイプを組み合わせることは、VEGF-Aの発現に良い影響を与える。したがってVEGF-Aの最大濃度は、90%線維芽細胞/10%ケラチノサイトの比率で観察されている(3570pg/ml)。続いて、ケラチノサイトの比率が増加すればするほど、VEGF-Aの濃度がより減少する。
【０１２１】
・結論
これらの結果から、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトを組み合わせることにより、数種の増殖因子及びサイトカイン、特に、単一培養ではこれらの細胞によって自然には発現されるものではなく、治癒過程において密接な関係にあることがわかっているGM-CSF、HGF及びIL8の過剰発現が可能になることが確認される。
【０１２２】
またこれらの2つの細胞タイプ間の比率もこれらの因子及びサイトカインの分泌を調節する。結果から特に、これらの因子の放出は、一般的に、9:1の線維芽細胞/ケラチノサイトの比率の場合(WO 03/068287、Neocutis SA)、1:1の比率と比べて低いことが示される。IL-1α濃度は、治癒におけるその役割に関して知られているが、ケラチノサイトの比率が増加している場合に特に高い。
【０１２３】
また、3:7の線維芽細胞/ケラチノサイトの比率は、HGF及びGM-CSFの最大発現をもたらし、治癒に必須のIL-1αの最適な発現を維持することから、この比率が最適のようである。この比率においてVEGF-A及びIL-8発現のレベルが最適ではないが、これらのレベルは比較的高い状態を保つ。この点において、注目すべきことに、治癒を促進する機能とは別に、サイトカインIL-8は、炎症促進特性を示す。したがって、過剰な濃度のIL-8は、治癒の質にとって有害であると思われる炎症性反応の増加を引き起こす可能性があるために、好ましくない。
【０１２４】
II.2.線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの特徴付け
図4に結果を示す。
【０１２５】
それによれば、ケラチノサイト及び線維芽細胞の臨床バッチ由来の細胞は、ケラチノサイト及び線維芽細胞それぞれの形態学的特徴を有することが示される。これらの臨床バッチの純度を血球計算法によって確認した。それによれば、ケラチノサイトの臨床バッチの細胞の98.5%がケラチン14(ケラチノサイトの特異的マーカー)を発現し、線維芽細胞の臨床バッチ由来の細胞の99.2%がプロリル-4-ヒドロキシラーゼ(線維芽細胞マーカー)を発現する。これらの結果から、単一の胎児の皮膚サンプルからの極めて純粋なケラチノサイト及び線維芽細胞の2つのバンクを産生する、選り抜きの産生方法であることが確認される。
【０１２６】
II.3.混合状態の線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトによるリンパ増殖の阻害
図5に結果を示す。
【０１２７】
これらの結果から、リンパ球増殖の阻害が、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトによって引き起こされることが示される。この阻害は用量依存性のようであり、とりわけ線維芽細胞及びケラチノサイトが同じ比率で混合されると常に効果的である。
【０１２８】
これらの結果から、胎児細胞はリンパ球の活性化を阻害できることから、胎児細胞を同種系で使用することが有利であることが示される。このように宿主のリンパ球の活性化をブロックすることによって、胎児細胞は、十分許容されると予想されることに加えて、それによって胎児細胞のパラ分泌活性により治癒促進的な役割を果たす可能性がある。同様に、胎児細胞の免疫抑制特性が、局所的に炎症の減少に反映され、したがって(炎症の程度によるが)瘢痕の品質及び審美的な外観の向上にも反映されると予想される。
【０１２９】
II.4.IDOはリンパ球増殖に対する胎児細胞の阻害作用に関与する
図5Bのa、b及びcのグラフに結果を示す。
【０１３０】
これらの結果から、本発明の胎児細胞(線維芽細胞、ケラチノサイト又は線維芽細胞+ケラチノサイト)は、1-MTの非存在下でリンパ球増殖を阻害することが示される。全てのケースにおいて(線維芽細胞、ケラチノサイト又は線維芽細胞+ケラチノサイト)、1-MTを200μMまで添加することによって、この濃度での阻害剤の存在下でリンパ球増殖が陽性対照(リンパ球+PHA-L+IL-2)のレベルとほぼ同じレベルに戻るように、増殖の阻害が強められる。また、1-MTの作用は用量依存性であることも明白である。
【０１３１】
これらの結果から、本発明の線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトによるリンパ球増殖の阻害は、このタイプの細胞において周知のIDOの酵素活性に基づいていることが示される。
【０１３２】
II.5.スクラッチ閉鎖の経時的な進化
図6のグラフに結果を示す。
【０１３３】
これらの結果から、以下のことが示される:
1-  線維芽細胞50%/ケラチノサイト50%の条件での発生から極めて迅速にスクラッチが閉鎖されること。次いで15時間で安定化し、次いで再度スクラッチ領域の被覆率が強く加速されること。
2-  100%線維芽細胞の条件において、初期の閉鎖は極めて遅く、次いで5時間後に増加するが、スクラッチ閉鎖は比較的穏やかなままであり、20時間で17%にしか達しない。
3-  100%ケラチノサイト及び75%線維芽細胞/25%ケラチノサイトの条件の場合、スクラッチ閉鎖は、発生から20時間まで直線的に起こり、捕捉の完了時には約35%の閉鎖が達成される。
【０１３４】
II.6.条件ごとの5時間目及び20時間目におけるスクラッチ閉鎖
図7A及び7Bに結果を示す。この他の代表的な結果から、捕捉の最も早い時間及び完了時における異なる条件間のケラチノサイト/線維芽細胞の比率の重要性が解明される。
【０１３５】
このin-vitroの治癒試験から、線維芽細胞及びケラチノサイトを50%/50%の高度に正確な比率で組み合わせることにより、線維芽細胞又はケラチノサイト単独の使用と比べてより速いスクラッチ領域の閉鎖が可能になると考えられる。この比率は、初期のスクラッチ領域の閉鎖の間に特に効果的なようである。
【０１３６】
III-本発明に係る皮膚代用品の実施例
III.1 本発明に係るTissucolをベースとした皮膚代用品の調製
上記で記載したプロトコールに従って液体窒素中で保存された線維芽細胞及び胎児ケラチノサイト細胞を融解させ、75cm2の培養フラスコに植え付け、5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で37℃で48時間にわたりインキュベートした。線維芽細胞及びケラチノサイト細胞を、培養フラスコから完全に層間剥離するまでトリプシン/EDTA 1×中で別々に処置した。10%SVFが補充されたDMEM培地を添加して、トリプシンの作用を阻害する。ケラチノサイト及び線維芽細胞を遠心分離し、次いでカウントした(常に別々に)。等しい数の線維芽細胞及びケラチノサイト細胞(ケラチノサイト:線維芽細胞=1:1の比率)、すなわち0.2×106から10×106個の細胞、好ましくは2×106個の細胞を同じ15mlチューブ中で徹底的に混合した。このチューブを遠心分離し、体積1mLのTissucolキットの第二の成分(ヒトトロンビン+塩化カルシウム)中にPRBCを溶解させた。第一のTissucol(登録商標)の成分(ヒトフィブリノゲン+ヒト第III凝固因子+ヒトフィブロネクチン+ヒトプラスミノゲン+ウシアプロチニン)を、1mLのTissucolキットの使用により、等しい体積で生体用接着剤の第二の成分と混合した。2種の混合された接着剤成分を、創傷、やけど又は潰瘍上に置いてもよい。
【０１３７】
III.2 本発明に係るウシコラーゲンIをベースとした皮膚代用品の調製
III.2.a)上記で記載したプロトコールに従って液体窒素中で保存された線維芽細胞及び胎児ケラチノサイト細胞を融解させ、75cm2の培養フラスコに植え付け、5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で37℃で48時間にわたりインキュベートした。次いで線維芽細胞及びケラチノサイト細胞を、培養フラスコから完全に層間剥離するまでトリプシン/EDTA 1×中で別々に処置した。10%SVFが補充されたDMEM培地を添加して、トリプシンの作用を阻害する。次いでケラチノサイト及び線維芽細胞を遠心分離し、次いでカウントした(常に別々に)。次いで等しい数の線維芽細胞及びケラチノサイト細胞(ケラチノサイト:線維芽細胞=1:1の比率)を15mlのチューブに移し、遠心分離し、10%SVFが補充されたDMEM培養培地中に溶解させた。1:1の比率で混合された線維芽細胞及びケラチノサイト細胞を、マトリックス1cm3あたり0.1から5×106個の細胞の密度でI型ウシコラーゲンのスポンジ状マトリックスに植え付けた。マトリックス上に植え付けられた細胞を、5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で、37℃でインキュベートした。48時間後、細胞状になった(cellularised)マトリックスは、創傷、やけど又は潰瘍に適用できる。
【０１３８】
III.2.b)次いで上記のポイントIII.2.a)で記載したプロトコールを以下のように最適化した:液体窒素中で保存された線維芽細胞及び胎児ケラチノサイト細胞を融解させ、次いで融解後に、プロトコールIII.2.a)のように培養に戻さずにI型ウシコラーゲンのマトリックスに直接植え付けた。1:1の比率のケラチノサイト:線維芽細胞も維持した。マトリックス上に植え付けられた細胞を、5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で、37℃でインキュベートした。72時間後、細胞状になったマトリックスは、創傷、やけど又は潰瘍に適用できる。
【０１３９】
このプロトコールは、
(i)業者による介入の数が限られており、皮膚代用品の調製が簡易化され;
(ii)皮膚代用品の調製時間が全体で24時間であり、患者にとってより迅速に皮膚代用品の利用が可能になる
ために、上記のポイントIII.2.a)で開示されたものと比べて数々の利点を有する。
【０１４０】
皮膚代用品中の細胞によって放出されたLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)活性の酵素による測定からも、この新規の調製様式は、優れた細胞の生存を可能にすることが示された。特に、この最適化された調製方法は、植え付け時に包帯中で85%の細胞生存をもたらし、皮膚代用品調製が完了した植え付けの3日後には82%の細胞生存をもたらす。
【０１４１】
(参考文献)
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【図１】
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【図２Ａ】
0006391587.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
0006391587.tif 000013
【図３Ａ】
0006391587.tif 000014
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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