(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞群に対して該細胞群の像を撮像するための照明光を照射する照明光照射部と、
前記細胞群への前記照明光の照射によって前記細胞群を透過した透過光を検出して前記細胞群の画像を検出する画像検出部と、
前記画像検出部によって検出された前記細胞群の画像内における前記細胞群の領域を特定する細胞群領域特定部と、
前記細胞群における散乱光を検出するための検出光を前記細胞群に対して照射する検出光照射部と、
前記細胞群への前記検出光の照射によって前記細胞群において発生した散乱光を検出する散乱光検出部と、
前記散乱光検出部によって検出された前記散乱光の強度の空間的な広がりまたは時間的な揺らぎに基づいて前記細胞群を評価する細胞評価部と、
前記細胞群領域特定部によって特定された前記細胞群の領域に基づいて前記検出光の照射範囲を決定する照射範囲決定部とを備え、
前記検出光照射部が、前記照射範囲決定部より決定された照射範囲に前記検出光を照射する細胞評価装置。
【請求項２】
前記透過光と前記散乱光とを分離して前記透過光を前記画像検出部に導光し、前記散乱光を前記散乱光検出部に導光する波長分離光学系を備えたことを特徴とする請求項１記載の細胞評価装置。
【請求項３】
前記照明光および前記検出光のいずれか一方を反射して前記細胞群に照射し、他方を透過して前記細胞群に照射する照明光学系を備えた請求項１または２項記載の細胞評価装置。
【請求項４】
前記照明光照射部が、位相差計測用の照明光を前記細胞群に照射するものであり、
前記画像検出部が、前記細胞群の位相差像を検出するものである請求項１から３いずれか１項記載の細胞評価装置。
【請求項５】
前記画像検出部が、前記細胞群の明視野像を検出するものである請求項１から３いずれか１項記載の細胞評価装置。
【請求項６】
前記照明光照射部が、微分干渉計測用の照明光を前記細胞群に照射するものであり、
前記画像検出部が、前記細胞群の微分干渉像を検出するものである請求項１から３いずれか１項記載の細胞評価装置。
【請求項７】
前記検出光照射部が、前記細胞群が存在しない非細胞群領域に前記検出光を照射するものであり、
前記散乱光検出部が、前記細胞群が存在しない非細胞群領域において発生した散乱光をノイズ成分として検出するものであり、
前記細胞評価部が、前記細胞群において発生した散乱光の強度の空間的な広がりまたは時間的な揺らぎから前記ノイズ成分を除去して前記細胞群を評価するものである請求項１から６いずれか１項記載の細胞評価装置。
【請求項８】
前記検出光がレーザ光であり、
前記細胞評価部が、前記散乱光の強度の時間的な揺らぎに基づいて前記細胞群を評価するものである請求項１から７いずれか１項記載の細胞評価装置。
【請求項９】
前記検出光が平行光であり、
前記細胞評価部が、前記散乱光の角度分布を取得し、該角度分布に基づいて前記細胞群を評価するものである請求項１から７いずれか１項記載の細胞評価装置。
【請求項１０】
前記検出光が収束光であり、
前記細胞評価部が、前記散乱光の空間分布を取得し、該空間分布に基づいて前記細胞群を評価するものである請求項１から７いずれか１項記載の細胞評価装置。
【請求項１１】
前記画像検出部によって検出された前記細胞群の画像に基づいて、前記散乱光の検出の条件を決定するものである請求項１から１０いずれか１項記載の細胞評価装置。
【請求項１２】
細胞群に対して該細胞群の像を撮像するための照明光を照射し、
該照明光の照射によって前記細胞群を透過した透過光を検出して前記細胞群の画像を検出し、
該検出した前記細胞群の画像内における前記細胞群の領域を特定し、
該特定された前記細胞群の領域に基づいて前記細胞群における散乱光を検出するための検出光の照射範囲を決定し、
該決定された照射範囲に前記検出光を照射し、
該検出光の照射によって前記細胞群において発生した散乱光を検出し、
該検出した前記散乱光の強度の空間的な広がりまたは時間的な揺らぎに基づいて前記細胞群を評価する細胞評価方法。
【請求項１３】
コンピュータを、細胞群への照明光の照射によって前記細胞群を透過した透過光を検出した前記細胞群の画像を取得する画像取得部と、
前記細胞群の画像内における前記細胞群の領域を特定する細胞群領域特定部と、
該細胞群領域特定部によって特定された前記細胞群の領域に基づいて前記細胞群における散乱光を検出するための検出光の照射範囲を決定する照射範囲決定部と、
該照射範囲決定部により決定された照射範囲での前記細胞群への検出光の照射によって前記細胞群において発生した散乱光の強度の情報を取得する散乱光情報取得部と、
前記散乱光情報取得部によって取得された前記散乱光の強度の空間的な広がりまたは時間的な揺らぎに基づいて前記細胞群を評価する細胞評価部として機能させることを特徴とする細胞評価プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞群において発生した散乱光を検出し、その散乱光の強度に基づいて細胞群を評価する細胞評価装置および方法並びにプログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＳＴＡＰ細胞などの多能性幹細胞や分化誘導された細胞などを培養して顕微鏡で撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の状態を評価する方法が提案されている。
【０００３】
また、細胞の状態を評価する方法としては、上述したような画像観察に限らず、細胞への光の照射によって細胞において発生した散乱光を検出し、その散乱光の強度に基づいて細胞の状態を評価する方法も種々提案されている。
【０００４】
たとえば特許文献１においては、精子の散乱光をイメージセンサによって撮像し、その撮像した画像の時間相関関数を評価することによって画像内の精子の揺らぎを評価することが提案されている。
【０００５】
また、特許文献２には、血液の散乱光を検出し、その散乱光の角度の分布から情報を得ることが開示されており、特許文献３には、生物由来の生理活性物質の散乱光を検出し、その散乱光の時間的な変動を取得することが開示されている。また、特許文献４には、ラマン散乱光の時間的な変動から細胞の状態の変化を求めることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５２７３５９号公報
【特許文献２】特開平０８−０５４３８８号公報
【特許文献３】特開２０１０−１８５８４９号公報
【特許文献４】特開２０１１−２５７６９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ここで、上述した幹細胞や分化誘導された細胞は、培養が進むにつれてコロニー化するまでに至り、大面積に増殖する。細胞コロニーのサイズは数ミリ〜数センチのオーダーとなり、さらに細胞コロニーは細胞が積層化されて３次元的に成長する場合もある。
【０００８】
このように細胞コロニーが３次元的に成長した場合、細胞コロニーの位相差像や明視野像を撮像して観察を行っても、細胞コロニー内の細胞による多重散乱、屈折および回折などが影響し、これらの像から細胞コロニー内の個々の細胞の状態を観察することは困難である。
【０００９】
そこで、細胞コロニーの状態を評価するため、細胞コロニーにおいて発生した散乱光を検出してこれを解析することが考えられるが、細胞コロニーの散乱光を検出する際、たとえば細胞コロニーが培養されている領域全体を光で走査しながら散乱光を検出するようにしたのでは、細胞コロニーが存在しない領域まで光で走査することになり、検出時間が長くなるとともに、散乱光を検出したデータも膨大となり、その解析にも時間がかかる。
【００１０】
なお、特許文献１から特許文献４には、個々の細胞の散乱光を検出することは開示されているが、細胞コロニーの散乱光の検出する際の具体的な手法については何も示されていない。
【００１１】
本発明は、上記の問題に鑑み、細胞コロニーにおいて発生する散乱光の検出および解析をより効率的に行うことができる細胞評価装置および方法並びにプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の細胞評価装置は、細胞群に対してその細胞群の像を撮像するための照明光を照射する照明光照射部と、細胞群への照明光の照射によって細胞群を透過した透過光を検出して細胞群の画像を検出する画像検出部と、画像検出部によって検出された細胞群の画像内における細胞群の領域を特定する細胞群領域特定部と、細胞群における散乱光を検出するための検出光を細胞群に対して照射する検出光照射部と、細胞群への検出光の照射によって細胞群において発生した散乱光を検出する散乱光検出部と、散乱光検出部によって検出された散乱光の強度の空間的な広がりまたは時間的な揺らぎに基づいて細胞群を評価する細胞評価部とを備えたことを特徴とする。
【００１３】
また、上記本発明の細胞評価装置は、細胞群領域特定部によって特定された細胞群の領域に基づいて検出光の照射範囲を決定する照射範囲決定部を設け、検出光照射部は、照射範囲決定部より決定された照射範囲に検出光を照射することができる。
【００１４】
また、透過光と散乱光とを分離して透過光を画像検出部に導光し、散乱光を散乱光検出部に導光する波長分離光学系を備えることができる。
【００１５】
また、照明光および検出光のいずれか一方を反射して細胞群に照射し、他方を透過して細胞群に照射する照明光学系を備えることができる。
【００１６】
また、照明光照射部は、位相差計測用の照明光を細胞群に照射することができ、画像検出部は、細胞群の位相差像を検出することができる。
【００１７】
また、画像検出部は、細胞群の明視野像を検出することができる。
【００１８】
また、照明光照射部は、微分干渉計測用の照明光を細胞群に照射することができ、画像検出部は、細胞群の微分干渉像を検出することができる。
【００１９】
また、検出光照射部は、細胞群が存在しない非細胞群領域に検出光を照射することができ、散乱光検出部は、細胞群が存在しない非細胞群領域において発生した散乱光をノイズ成分として検出することができ、細胞評価部は、細胞群において発生した散乱光の強度の空間的な広がりまたは時間的な揺らぎからノイズ成分を除去して細胞群を評価することができる。
【００２０】
また、検出光としてレーザ光を用いることができ、細胞評価部は、散乱光の強度の時間的な揺らぎに基づいて細胞群を評価することができる。
【００２１】
また、検出光として平行光を用いることができ、細胞評価部は、散乱光の角度分布を取得し、その角度分布に基づいて細胞群を評価することができる。
【００２２】
また、検出光として収束光を用いることができ、細胞評価部は、散乱光の空間分布を取得し、その空間分布に基づいて細胞群を評価することができる。
【００２３】
また、画像検出部によって検出された細胞群の画像に基づいて、散乱光の検出の条件を決定することができる。
【００２４】
本発明の細胞評価方法は、細胞群に対してその細胞群の像を撮像するための照明光を照射し、その照明光の照射によって細胞群を透過した透過光を検出して細胞群の画像を検出し、その細胞群の画像内における細胞群の領域を特定し、細胞群における散乱光を検出するための検出光を細胞群に対して照射し、その検出光の照射によって細胞群において発生した散乱光を検出し、その検出した散乱光の強度の空間的な広がりまたは時間的な揺らぎに基づいて細胞群を評価することを特徴とする。
【００２５】
本発明の細胞評価プログラムは、コンピュータを、細胞群への照明光の照射によって細胞群を透過した透過光を検出した細胞群の画像を取得する画像取得部と、細胞群の画像内における細胞群の領域を特定する細胞群領域特定部と、細胞群への検出光の照射によって細胞群において発生した散乱光の強度の情報を取得する散乱光情報取得部と、散乱光情報取得部よって取得された散乱光の強度の空間的な広がりまたは時間的な揺らぎに基づいて細胞群を評価する細胞評価部として機能させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の細胞評価装置および方法並びにプログラムによれば、散乱光を検出するための検出光の照射とは別に、細胞群の像を撮像するための照明光を細胞群に照射し、その照明光の照射によって細胞群を透過した透過光を検出して細胞群の画像を検出し、その細胞群の画像内における細胞群の領域を特定するようにしたので、たとえばその特定した細胞群の領域に基づいて検出光の照射範囲を決定し、その決定した照射範囲に対して検出光を照射して細胞群の散乱光を検出することができ、すなわち検出光の照射を細胞群の領域に限定することができるので、より効率的に検出光の照射および散乱光の検出を行うことができる。
【００２７】
また、細胞群において発生した散乱光の強度の空間的な広がりまたは時間的な揺らぎに基づいて細胞群を評価する際、上述したようにして特定された細胞群の領域において発生した散乱光の強度に限定して解析するようにすれば、散乱光の強度の解析を効率的に行うことができ、また、細胞群の領域以外の散乱光のノイズの影響を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の細胞評価装置の一実施形態を用いた顕微鏡システムの概略構成を示す図
【図２】スリット板の構成を示す図
【図３】位相差レンズの構成を示す図
【図４】細胞コロニーにおいて発生した散乱光の強度の時間的な揺らぎの一例を示す図
【図５】本発明の細胞評価装置の一実施形態を用いた顕微鏡システムの作用を説明するためのフローチャート
【図６】図１に示す顕微鏡システムの変形例の概略構成を示す図
【図７】細胞コロニーに平行光を照射した場合の散乱光の角度分布の一例および角度分布に基づいて算出された細胞サイズに関するヒストグラムの一例を示す図
【図８】細胞コロニーに収束光を照射した場合の散乱光の空間分布の一例を示す図
【図９】未分化状態の細胞コロニーと分化状態の細胞コロニーとに平行光を照射した場合の散乱光を説明するための図
【図１０】未分化状態の細胞コロニーと分化状態の細胞コロニーとに平行光を照射した場合における散乱光の光強度の角度分布の一例を示す図
【図１１】未分化状態の細胞コロニーと分化状態の細胞コロニーとに収束光を照射した場合の散乱光を説明するための図
【図１２】未分化状態の細胞コロニーと分化状態の細胞コロニーとに収束光を照射した場合における散乱光の光強度の空間分布の一例を示す図
【図１３】図１に示す顕微鏡システムのその他の変形例の概略構成を示す図
【図１４】細胞コロニー領域の情報に基づいてゴミなどに起因するノイズ成分を算出する方法を説明するための図
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の細胞評価装置および方法並びにプログラムの一実施形態を用いた顕微鏡システム１について、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の顕微鏡システム１の概略構成を示す図である。
【００３０】
本実施形態の顕微鏡システム１は、図１に示すように、照明光照射部１０と、画像検出部２０と、検出光照射部３０と、散乱光検出部４０と、照明光学系５０と、波長分離光学系６０と、細胞評価装置７０と、ディスプレイ８０とを備えている。
【００３１】
照明光照射部１０は、細胞コロニー（細胞群）が培養される培養皿１５に対して、いわゆる位相差計測用の照明光を出射するものであり、本実施形態では、その位相差計測用照明光としてリング状照明光Ｌ１を出射するものである。本実施形態の照明光照射部１０は、具体的には、白色光を出射する白色光源１１と、リング形状のスリットを有し、白色光源１１から出射された白色光が入射されてリング状照明光Ｌ１を出射するスリット板１２と、スリット板１２から射出されたリング状照明光Ｌ１が入射され、その入射されたリング状照明光Ｌ１を培養皿１５内の細胞コロニーに対して照射する対物レンズ１３とを備えている。
【００３２】
図２は、スリット板１２の具体的な構成を示す図である。図２に示すように、スリット板１２は、白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板１２ｂに対して白色光を透過するリング形状のスリット１２ａが設けられたものであり、この白色光がスリット１２ａを通過することによってリング状照明光Ｌ１が形成される。
【００３３】
なお、本実施形態においては、上述したようにスリット板１２を用いてリング状照明光Ｌ１を形成するようにしたが、リング状照明光Ｌ１を形成する方法としては、これに限らず、たとえば空間光変調素子などを用いてリング状照明光Ｌ１を形成するようにしてもよい。
【００３４】
また、本実施形態においては、位相差計測用照明光としてリング状照明光Ｌ１を用いるようにしたが、リング状以外の構造を有する照明光でもよく、後述する位相板と共役な形状となっていれば三角形状や四角形状などその他の形状でもよい。
【００３５】
画像検出部２０は、位相差レンズ２１と、結像レンズ２４と、撮像素子２５とを備えている。
【００３６】
位相差レンズ２１は、対物レンズ２２と、位相板２３とを備えたものである。図３は、位相板２３の具体的な構成を示す図である。図３に示すように、位相板２３は、リング状照明光Ｌ１の波長に対して透明な透明板２３ｂに対して位相リング２３ａを形成したものである。なお、上述したスリット１２ａの大きさは、この位相リング２３ａと共役な関係にある。
【００３７】
位相リング２３ａは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相差レンズ２１に入射された直接光は対物レンズ２２によって集光され、位相リング２３ａを通過することによって位相が１／４波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、培養皿１５内の細胞コロニーなどによって回折された回折光は大部分が位相板２３の透明板２３ｂを通過し、その位相および明るさは変化しない。
【００３８】
なお、本実施形態の位相差レンズ２１は、細胞コロニーへの後述する検出光の照射によって細胞コロニーにおいて発生した散乱光も入射されるものであり、この散乱光の大部分が位相板２３の透明板２３ｂを透過する。
【００３９】
結像レンズ２４は、位相差レンズ２１および波長分離光学系６０を通過した直接光および回折光が入射され、これらの光を結像するものであり、撮像素子２５は、結像レンズ２４によって結像された位相差像を撮像するものである。撮像素子２５としては、ＣＣＤ（charge-coupled device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどが用いられる。
【００４０】
検出光照射部３０は、細胞コロニー内において発生する散乱光を検出するための検出光を、培養皿１５内の細胞コロニーに対して照射するものである。本実施形態の検出光照射部３０は、レーザ光源を備えたものであり、そのレーザ光源から出射されたレーザ光Ｌ２が細胞コロニーに照射される。
【００４１】
散乱光検出部４０は、培養皿１５内の細胞コロニーにおいて発生した散乱光を検出するものである。本実施形態の散乱光検出部４０は、位相差レンズ２１を透過し、波長分離光学系６０によって反射された散乱光が入射される結像レンズ４１と、結像レンズ４１によって結像された散乱光Ｌ３を検出する光検出器４２とを備えている。
【００４２】
本実施形態の光検出器４２は、散乱光Ｌ３を検出してその強度信号を出力するものであり、上述した撮像素子２５と同様に、ＣＣＤやＣＭＯＳなどのイメージセンサを用いるようにしてもよいし、ラインセンサなどの１次元センサを用いるようにしてもよいし、１つのフォトダイオードを用いるようにしてもよい。
【００４３】
照明光学系５０は、照明光照射部１０から出射されたリング状照明光Ｌ１を透過し、かつ検出光照射部３０から出射された検出光Ｌ２をその入射方向に対して垂直方向に反射する光学特性を有するものである。具体的には、照明光学系５０としてハーフミラーやプリズムなどを用いることができる。また、その他の公知な光学系を用いるようにしてもよい。
【００４４】
波長分離光学系６０は、細胞コロニーへのリング状照明光Ｌ１の照射によって細胞コロニーを透過した透過光を透過し、かた細胞コロニーへの検出光Ｌ２の照射によって細胞コロニーから発生した散乱光をその入射方向に対して垂直方向に反射する光学特性を有するものである。具体的には、波長分離光学系６０としてハーフミラーやプリズムなどを用いることができる。また、その他の公知な光学系を用いるようにしてもよい。
【００４５】
細胞コロニーが培養された培養皿１５は、ステージ１６上に設置される。ステージ１６は、培養皿１５の設置面内において互いに直交するＸ方向およびＹ方向に移動可能に構成されている。ステージ１６は、後述する細胞評価装置７０の照射範囲制御部７７から出力された制御信号に基づいて移動するものであり、これにより培養皿１５内における細胞コロニーの領域に検出光が照射される。
【００４６】
細胞評価装置７０は、コンピュータに対して本発明の細胞評価プログラムの一実施形態がインストールされたものである。 
【００４７】
細胞評価装置７０は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えており、ハードディスクに本発明の細胞評価プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、この細胞評価プログラムが中央処理装置を有する制御部７６によって実行されることによって、図１に示すような画像取得部７１、細胞コロニー領域特定部７２（細胞群領域特定部に相当する）、照射範囲決定部７３、散乱光情報取得部７４、細胞評価部７５および照射範囲制御部７７が動作する。
【００４８】
画像取得部７１は、画像検出部２０の撮像素子２５から出力された位相差像を取得し、これを記憶するものである。
【００４９】
細胞コロニー領域特定部７２は、画像取得部７１から読み出された位相差像を取得し、その位相差像内における細胞コロニーの領域を特定するものである。細胞コロニーの領域の特定方法としては、たとえば画像検出部２０によって撮像された位相差像を２値化画像に変換した後、テンプレートマッチングなどによって細胞コロニーの領域を自動的に抽出して特定するようにすればよい。また、細胞コロニーの領域の自動抽出については、上述した方法に限らず、その他の公知な方法を用いるようにしてもよい。
【００５０】
また、自動抽出に限らず、制御部７６によってディスプレイ８０に位相差像を表示させ、ユーザが所定の入力装置（図示省略）を用いて位相差像内における細胞コロニーの領域を指定し、その指定された座標などの情報を細胞コロニー領域特定部７２が取得することによって、細胞コロニーの領域を特定するようにしてもよい。
【００５１】
照射範囲決定部７３は、細胞コロニー領域特定部７２によって特定された細胞コロニーの領域に基づいて、検出光照射部３０から出射される検出光としてのレーザ光Ｌ２の照射範囲を決定するものである。レーザ光Ｌ２の照射範囲としては、細胞コロニー領域全体をレーザ光Ｌ２で操作するようにしてもよいし、細胞コロニー領域の中央部分を照射範囲としてもよいし、細胞コロニー領域の周辺部分を照射範囲としてもよい。細胞コロニー領域内のどの範囲にレーザ光Ｌ２を照射するかは、予め設定しておいてもよいし、ユーザが所定の入力装置（図示省略）を用いて設定入力するようにしてもよい。
【００５２】
散乱光情報取得部７４は、散乱光検出部４０の光検出器４２から出力された強度信号を取得し、これを記憶するものである。
【００５３】
細胞評価部７５は、散乱光情報取得部７４から読み出された散乱光の強度信号を取得し、その強度信号の時間的な揺らぎを解析することによって、細胞コロニーの状態を評価するものである。
【００５４】
図４の上図は、細胞コロニー内の各細胞が活発に動いている場合における散乱光Ｌ３の強度信号の時間的な揺らぎの一例を示すものであり、図４の下図は、細胞コロニー内の各細胞があまり活発に動いていない場合における散乱光Ｌ３の強度信号の時間的な揺らぎの一例を示すものである。図４に示すグラフの横軸は時間ｔであり、縦軸は散乱光Ｌ３の強度信号Ｉの大きさを示している。
【００５５】
なお、散乱光Ｌ３の強度信号Ｉとしては、たとえば光検出器４２がイメージセンサやラインセンサの場合には、複数のフォトダイオードによって検出された信号の平均値、最大値、最小値などの統計値を強度信号Ｉとすればよく、光検出器４２が１つのフォトダイオードから構成されるものである場合には、その検出信号をそのまま強度信号Ｉとすればよい。
【００５６】
図４の上図のグラフでは、細胞コロニー内の細胞が活発に動いているので強度信号Ｉの時間的な揺らぎが大きく、図４の下図のグラフでは、細胞コロニー内の細胞があまり活発に動いていないので強度信号Ｉの時間的な揺らぎは、上図のグラフよりも小さくなっている。
【００５７】
細胞評価部７５は、上述したように図４に示すような散乱光Ｌ３の強度信号Ｉの時間的な揺らぎを解析して細胞コロニーの状態を評価する。具体的には、たとえば強度信号Ｉの時間相関関数や微分値や強度信号Ｉのグラフの複雑度などを算出することによって時間的な揺らぎの解析値を取得し、その解析値の大きさに基づいて細胞コロニーの活性度を段階的に評価する。また、解析値に基づいて、細胞コロニー内の細胞の増殖速度、遊走速度または細胞内の微小器官の運動能などを評価するようにしてもよい。
【００５８】
また、未分化状態の細胞コロニーは、活性度が高い細胞が密に充填しており、分化状態の細胞コロニーは、活性度の低い細胞が分散しているので、解析値に基づいて、細胞コロニーが未分化状態であるか分化状態であるか、または細胞コロニーの分化度などを評価するようにしてもよい。なお、解析値の算出方法については、時間相関関数や微分値や複雑度に限らず、その他の公知な算出方法を用いることができる。
【００５９】
図１に戻り、制御部７６は、細胞評価装置７０全体を制御するものであるが、特に、本実施形態の制御部７６は、照射範囲制御部７７を備えている。照射範囲制御部７７は、照射範囲決定部７３において決定したレーザ光Ｌ２の照射範囲に基づいて、ステージ１６の移動機構（図示省略）に制御信号を出力して制御するものである。照射範囲制御部７７によるステージ１６の移動制御によって、上述したように細胞コロニー領域全体に亘ってレーザ光Ｌ２が走査されたり、細胞コロニー領域の中央部にレーザ光Ｌ２が照射されたり、細胞コロニー領域の周辺部にレーザ光Ｌ２が照射されたりする。
【００６０】
また、制御部７６は、画像検出部２０によって撮像された細胞コロニーの位相差像や、細胞評価部７５における評価結果をディスプレイ８０に表示させるものである。
【００６１】
次に、図１に示す顕微鏡システム１の作用について説明する。
【００６２】
まず、ステージ１６上に細胞コロニーが培養された培養皿１５が設置される（Ｓ１０）。培養対象の細胞としては、たとえばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞や、幹細胞を分化誘導した細胞などがある。
【００６３】
次に、培養皿１５内の細胞コロニーに対してリング状照明光Ｌ１が照射され、これによる細胞コロニーの位相差像が撮像される（Ｓ１２）。具体的には、照明光照射部１０からリング状照明光Ｌ１が出射され、照明光学系５０を透過して培養皿１５内の細胞コロニーに照射される。
【００６４】
リング状照明光Ｌ１の照射によって細胞コロニーを透過した透過光は、位相差レンズ２１および波長分離光学系６０を透過し、結像レンズ２４によって撮像素子２５に結像され、撮像素子２５によって細胞コロニーの位相差像が撮像される。
【００６５】
撮像素子２５によって撮像された位相差像は、細胞評価装置７０の画像取得部７１によって取得されて記憶される。そして、画像取得部７１から読み出された位相差像は、細胞コロニー領域特定部７２に出力され、細胞コロニー領域特定部７２は、入力された位相差像内における細胞コロニーの領域の領域を特定する（Ｓ１４）。
【００６６】
細胞コロニー領域特定部７２によって特定された細胞コロニーの領域情報は、照射範囲決定部７３に出力され、照射範囲決定部７３は、入力された細胞コロニーの領域情報に基づいて、検出光としてのレーザ光の照射範囲を決定する（Ｓ１６）。
【００６７】
照射範囲決定部７３によって決定されたレーザ光の照射範囲は、照射範囲制御部７７に出力され、照射範囲制御部７７は、入力されたレーザ光の照射範囲に基づいて、ステージ１６の移動機構に制御信号を出力し、上述したレーザ光の照射範囲にレーザ光が照射されるようにステージ１６を移動させる（Ｓ１８）。
【００６８】
そして、細胞コロニーに対して検出光としてのレーザ光Ｌ２が照射され、このレーザ光Ｌ２の照射によって細胞コロニーにおいて発生した散乱光Ｌ３が検出される（Ｓ２０）。具体的には、検出光照射部３０からレーザ光Ｌ２が出射され、照明光学系５０によって反射されて培養皿１５内の細胞コロニーに照射される。
【００６９】
レーザ光Ｌ２の照射によって細胞コロニーにおいて発生した散乱光Ｌ３は、位相差レンズ２１を透過した後、波長分離光学系６０によって反射され、結像レンズ４１によって光検出器４２に結像され、光検出器４２によって散乱光Ｌ３が検出される。
【００７０】
光検出器４２によって検出された散乱光Ｌ３の強度信号は、散乱光情報取得部７４によって取得されて記憶される。そして、散乱光情報取得部７４から読み出された散乱光Ｌ３の強度信号は細胞評価部７５に出力され、細胞評価部７５は、散乱光Ｌ３の強度信号の時間的な揺らぎを解析して細胞コロニーの状態を評価する（Ｓ２２）。
【００７１】
細胞評価部７５における細胞コロニーの評価結果は制御部７６に出力され、制御部７６は入力された評価結果をディスプレイ８０に表示させる（Ｓ２４）。
【００７２】
上記実施形態の顕微鏡システム１によれば、散乱光を検出するための検出光の照射とは別に、細胞コロニーの像を撮像するための照明光を細胞コロニーに照射し、その照明光の照射によって細胞コロニーを透過した透過光を検出して細胞コロニーの画像を検出し、その検出した細胞コロニーの画像内における細胞コロニーの領域を特定し、その特定した細胞コロニーの領域に基づいて検出光の照射範囲を決定し、その決定した照射範囲に対して検出光を照射して細胞コロニーの散乱光を検出するようにしたので、検出光の照射を細胞コロニーの領域に限定することができ、より効率的に検出光の照射および散乱光の検出を行うことができる。
【００７３】
次に、上記実施形態の顕微鏡システムの変形例について、図６を参照しながら説明する。この変形例は、上述した実施形態の顕微鏡システムにおいて、さらに培養皿１５内における細胞コロニーが存在しない領域（以下、非細胞群領域という）にも検出光としてのレーザ光を照射し、その非細胞群領域において発生した散乱光をノイズ成分として検出し、そのノイズ成分を除去して細胞コロニーの評価を行うようにしたものである。なお、このノイズ成分は、細胞コロニーを培養する培養液の成分や、培養液内を浮遊するゴミまたは死細胞に起因するものである。
【００７４】
より具体的には、細胞コロニーへのレーザ光の照射によって細胞コロニーにおいて発生した散乱光が検出され、その強度信号が細胞評価部７５によって取得された後、制御部７６からの制御信号に基づいて、ステージ１６の移動機構（図示省略）が制御されてステージ１６が移動する。この際、制御部７６は、細胞コロニー領域特定部７２によって特定された細胞コロニーの領域情報に基づいて、細胞コロニーが存在しない非細胞群領域にレーザ光が照射されるようにステージ１６を移動させる。
【００７５】
そして、検出光照射部３０からレーザ光が出射され、照明光学系５０において反射されたレーザ光が、非細胞群領域に照射される。非細胞群領域へのレーザ光の照射によって非細胞群領域において発生した散乱光は、位相差レンズ２１を透過した後、波長分離光学系６０によって反射され、結像レンズ４１によって光検出器４２に結像され、光検出器４２によって散乱光が検出される。
【００７６】
このとき検出された散乱光の強度信号は散乱光情報取得部７４によって取得されて記憶される。そして、非細胞領域群において発生した散乱光の強度信号は、散乱光情報取得部７４から読み出されて細胞評価部７５に出力され、細胞評価部７５は、この散乱光の強度信号をノイズ成分として取得する。細胞評価部７５は、細胞コロニーの散乱光の強度信号から非細胞群領域の散乱光の強度信号を除去し、その除去後の強度信号の時間的な揺らぎを解析して細胞コロニーの状態を評価する。なお、非細胞群領域の散乱光の強度信号を除去の方法としては、たとえば強度信号を対数変換して減算するようにすればよい。
【００７７】
また、非細胞群領域として、具体的に死細胞やゴミなどの浮遊物の領域を位相差像から抽出してその位置を特定し、その特定した浮遊物の領域にレーザ光を照射することによってノイズ成分を検出するようにしてもよい。浮遊物の領域については、たとえば位相差像から抽出された所定のパターンの大きさ、形状または輝度値などに基づいて抽出するようにすればよい。また、位相差像の含まれる各細胞のパターンの動きや増殖速度などに基づいて細胞コロニー領域と浮遊物の領域とを区別して特定するようにしてもよい。
【００７８】
また、上記説明では、培養皿１５内の培養液におけるノイズ成分を除去するようにしたが、これに限らず、たとえば培養皿１５自体の傷などに基づくノイズ成分を予め取得しておき、この培養皿１５自体のノイズ成分を細胞コロニーの散乱光の強度信号から除去して細胞コロニーを評価するようにしてもよい。
【００７９】
上述したようにノイズ成分を取り除くことによって、細胞コロニーの評価の精度を向上させることができる。
【００８０】
また、上記実施形態の顕微鏡システム１においては、検出光としてレーザ光を照射するようにしたが、レーザ光に限らず、平行光または収束光を検出光として照射し、この平行光または収束光の細胞コロニーへの照射によって細胞コロニーにおいて発生した散乱光を光検出器４２によって検出するようにしてもよい。そして、検出光としてレーザ光を照射した場合には、上述したように散乱光の強度の時間的な揺らぎに基づいて細胞コロニーを評価するようにしたが、平行光や収束光を照射する場合には、散乱光の空間的な広がりに基づいて細胞コロニーを評価することができる。
【００８１】
たとえば検出光として平行光を細胞コロニーに照射する場合には、光検出器４２としてイメージセンサを用い、そのイメージセンサによって検出された散乱光の検出像の角度分布を解析することによって細胞コロニーの状態を評価することができる。
【００８２】
具体的には、細胞評価部７５は、図７の上図に示すように、光検出器４２によって検出された検出像を散乱光の角度分布（θｘ−θｙ軸）として取得し、この角度分布に基づいて、散乱理論から細胞コロニー内の各細胞（粒子）の大きさを推定し、図７の下図に示すような細胞サイズに関するヒストグラムを算出する。ここで、未分化状態の細胞コロニーは、分化細胞よりも小さい未分化細胞が密集した状態であり、逆に、分化状態の細胞コロニーは、未分化細胞よりも大きい分化細胞が分布した状態であるので、たとえば、相対的に小さい細胞の頻度が、相対的に大きい細胞の頻度よりも高い場合には、細胞コロニーは未分化状態であると評価し、逆に、相対的に大きい細胞の頻度が、相対的に小さい細胞の頻度よりも高い場合には、細胞コロニーは分化状態であると評価するようにすればよい。
【００８３】
また、たとえば検出光として収束光を細胞コロニーに照射する場合には、光検出器４２によって検出された散乱光の検出像の空間分布を解析することによって細胞コロニーの状態を評価することができる。
【００８４】
具体的には、細胞評価部７５は、図８に示すように、光検出器４２によって検出された検出像を散乱光の空間分布（Ｘ−Ｙ軸）として取得し、この空間分布に基づいて、散乱理論から細胞コロニー内の各細胞（粒子）の大きさを推定し、上述した平行光の照射の場合と同様に、細胞サイズに関するヒストグラムを算出する。ヒストグラムに基づく細胞コロニーの評価については、上記と同様である。
【００８５】
なお、上述した散乱理論に基づくヒストグラムの算出については、公知な演算方法であるのでその詳細な説明は省略する。
【００８６】
また、上記説明では、細胞コロニーに含まれる個々の細胞のサイズに関するヒストグラムを算出するようにしたが、このようなヒストグラムを算出する方法に限らず、検出像の光強度の空間的な分布の広がりを直接解析することによって、細胞コロニーが未分化状態であるか、分化状態であるかを評価するようにしてもよい。
【００８７】
具体的には、図９に示すように、未分化状態の細胞コロニーは多数の細胞が密集して積層された状態であるのに対し、分化状態の細胞コロニーは個々の細胞の細胞質が培地を這うように変形し、単層で形成されるような状態となる。
【００８８】
したがって、未分化状態の細胞コロニーに平行光を照射した場合、個々の細胞から散乱光が発せられるとともに、その個々の細胞において発生した散乱光は細胞コロニー内で反射を繰り返すため、分化状態の細胞コロニーに平行光を照射した場合と比較すると、種々大きさの広がり角を有する散乱光が発生することになる。一方、分化状態の細胞コロニーに平行光を照射した場合、単層の個々の細胞から散乱光が発生するだけなので、未分化状態の細胞コロニーに平行光を照射した場合と比較すると、広がり角が小さい散乱光となる。
【００８９】
すなわち、未分化状態の細胞コロニーに平行光を照射した場合における散乱光の光強度の角度分布は、図１０に示すように、広がり角θｘ，θｙ＝０°の散乱光の光強度をピークとして、広がり角θｘ，θｙの増加とともに光強度が徐々に小さくなるような分布となる。これに対し、分化状態の細胞コロニーに平行光を照射した場合の散乱光の光強度の角度分布は、図１０に示すように、広がり角θｘ，θｙ＝０°の散乱光の光強度がピークとなるが、広がり角θｘ，θｙが小さい範囲に大部分の光強度が分布することになる。
【００９０】
よって、細胞コロニーに平行光を照射した場合における散乱光の光強度の角度分布を取得し、その角度分布が、図１０に示す未分化状態の細胞コロニーの角度分布と分化細胞の細胞コロニーの角度分布のどちらに近いかを解析することによって、その細胞コロニーが未分化状態であるか、分化状態であるかを評価することができる。なお、評価方法としては、角度分布の相関関数を求めるようにしてもよいし、図１０に示すような角度分布の半値幅を取得し、その半値幅が閾値以上である場合に未分化状態であると評価し、閾値未満である場合に分化状態であると評価するようにしてもよい。
【００９１】
また、図１１に示すように、未分化状態の細胞コロニーに収束光を照射した場合、上述したように個々の細胞において発生した散乱光は細胞コロニー内で反射を繰り返すため、分化状態の細胞コロニーに収束光を照射した場合と比較すると、広い範囲に一様に広がるような散乱光となる。一方、分化状態の細胞コロニーに収束光を照射した場合、上述したように細胞コロニー内で発生する散乱光は、未分化状態の細胞コロニーに収束光を照射した場合と比較すると、狭い範囲にしか広がらない散乱光となる。
【００９２】
すなわち、未分化状態の細胞コロニーに収束光を照射した場合における散乱光の光強度の空間分布は、図１２に示すように、Ｘ＝Ｙ＝０（検出像の中心近傍）の散乱光の光強度をピークとして、その空間的な広がりとともに光強度が徐々に小さくなるような分布となる。これに対し、分化状態の細胞コロニーに収束光を照射した場合における散乱光の光強度の空間分布は、図１２に示すように、Ｘ＝Ｙ＝０（検出像の中心近傍）の散乱光の光強度がピークとなるが、狭い範囲に大部分の光強度が分布することになる。
【００９３】
よって、細胞コロニーに収束光を照射した場合における散乱光の光強度の空間分布を取得し、その空間分布が、図１２に示す未分化状態の細胞コロニーの空間分布と分化細胞の細胞コロニーの空間分布のどちらに近いかを解析することによって、その細胞コロニーが未分化状態であるか、分化状態であるかを評価することができる。なお、評価方法としては、空間分布の相関関数を求めるようにしてもよいし、図１２に示すような空間分布の半値幅を取得し、その半値幅が閾値以上である場合に未分化状態であると評価し、閾値未満である場合に分化状態であると評価するようにしてもよい。
【００９４】
次に、上記実施形態の顕微鏡システム１のその他の変形例について説明する。図１３は、その他の変形例の顕微鏡システム２の概略構成を示す図である。上記実施形態の顕微鏡システム１においては、培養皿１５内で平面培養される細胞コロニーの散乱光を検出するようにしたが、図１３に示す顕微鏡システム２は、平面培養ではなく、浮遊培養される細胞コロニーの散乱光を検出するようにしたものである。なお、図１３に示す顕微鏡システム２における照明光照射部１０、画像検出部２０、散乱光検出部４０、照明光学系５０および波長分離光学系６０は、上記実施形態の顕微鏡システムと同様であり、検出光照射部３０は、検出光として収束光を照射するものである。
【００９５】
顕微鏡システム２は、図１３に示すように、細胞コロニーが浮遊培養される培養タンク９０と、培養タンク９０から培養液とともに細胞コロニーが流れ出す透明チューブ９１と、透明チューブ９１内を流れる細胞コロニーの状態の評価結果に基づいて、その細胞コロニーを良質細胞タンク側流路９３か廃棄タンク側流路９５かに選別して流す選別部９２と、選別部９２によって選別されて良質細胞タンク側流路９３に流された良質な細胞コロニーが貯留される良質細胞タンク９４と、選別部９２によって選別されて廃棄タンク側流路９５に流された細胞コロニーが貯留される廃棄タンク９６とを備えている。
【００９６】
透明チューブ９１は、照明光照射部１０から出射される照明光Ｌ１および検出光照射部３０から出射される検出光Ｌ２を透過する材料から形成されるものである。
【００９７】
そして、図１３に示すように、培養タンク９０から透明チューブ９１に流れ出した細胞コロニーに対して、リング状照明光Ｌ１および検出光としての収束光Ｌ２が同時に照射される。そして、上記実施形態と同様に、細胞コロニーへのリング状照明光Ｌ１の照射によって画像検出部２０により細胞コロニーの位相差像が撮像され、細胞コロニーへの収束光Ｌ２の照射によって細胞コロニーにおいて発生した散乱光が散乱光検出部４０の光検出器４２によって検出される。
【００９８】
画像検出部２０によって撮像された位相差像および散乱光検出部４０によって検出された散乱光の強度は、図１３に示す細胞評価装置１００に出力される。
【００９９】
細胞評価装置１００は、図１３に示すように、画像取得部１０１と、細胞コロニー領域特定部１０２と、散乱光情報取得部１０３と、細胞評価部１０４と、制御部１０５とを備えており、制御部１０５は、選別制御部１０６を備えている。画像取得部１０１および細胞コロニー領域特定部１０２は、上記実施形態の画像取得部７１および細胞コロニー領域特定部７２と同様であり、本変形例の散乱光情報取得部１０３は、散乱光の強度信号の空間分布（Ｘ−Ｙ軸）を取得して記憶するものである。
【０１００】
細胞評価部１０４は、散乱光情報取得部１０３から読み出された散乱光の強度信号の空間分布に基づいて細胞コロニーを評価するものであるが、この際、細胞コロニー領域特定部１０２において特定された細胞コロニー領域の情報を用いて、散乱光の強度信号の空間分布を解析するものである。
【０１０１】
具体的には、たとえば図１４の右図に示すように、位相差像には細胞コロニーのみが現れているが、図１４の左図に示すように、散乱光の検出像には、細胞コロニーの散乱光の強度分布だけでなく、細胞コロニー以外のゴミや死細胞といった浮遊物の散乱光の強度分布も含まれる場合がある。このような場合、検出像全体に亘って解析を行ったのでは、浮遊物の散乱光の強度分布がノイズ成分となって正確な評価を行うことができない場合がある。
【０１０２】
そこで、本変形例においては、位相差像において特定された細胞コロニー領域を散乱光の検出像に対応付けることによって、散乱光の検出像から細胞コロニー領域の検出像と細胞コロニー領域以外の領域の検出像とを分離し、細胞コロニー領域の検出像のみを用いて、上述したように散乱理論から各細胞コロニー内の各細胞（粒子）の大きさを推定し、各細胞コロニーについて、細胞サイズに関するヒストグラムを算出する。そして、上記と同様に、細胞サイズに関するヒストグラムから各細胞コロニーが分化状態であるか未分化状態であるかを評価する。
【０１０３】
なお、上記説明では、細胞コロニー領域の検出像のみを解析してヒストグラムを算出するようにしたが、この際、細胞コロニー領域以外の領域の検出像に基づいてノイズ成分を算出し、そのノイズ成分を細胞コロニー領域の検出像から減算した結果を解析してヒストグラムを算出するようにしてもよい。
【０１０４】
具体的には、たとえば位相差像に含まれる所定のパターンの大きさや輝度値や形状などに基づいて死細胞やゴミなどの浮遊物の領域を抽出し、その浮遊物の領域に対応する検出像の領域の空間分布や角度分布をノイズ成分として取得し、細胞コロニー領域の検出像の空間分布や角度分布から上記ノイズ成分を減算した結果を解析してヒストグラムを算出するようにしてもよい。
【０１０５】
制御部１０５は、細胞評価装置１００全体を制御するものである。そして、制御部１０５は、画像検出部２０により検出された位相差像および細胞評価部１０１における評価結果をディスプレイ８０に表示させるものである。また、制御部１０５における選別制御部１０６は、細胞評価部１０４における評価結果に基づいて上述した選別部９２に制御信号を出力し、選別部９２が評価対象の細胞コロニーを良質細胞タンク側流路９３に流すか、廃棄タンク側流路９５に流すかを制御するものである。なお、選別部９２は、たとえば弁機構を有するものであり、弁を図１３に示す矢印Ａ方向に移動させることによって細胞コロニーを良質細胞タンク側流路９３に流すか、廃棄タンク側流路９４に流すかを制御するものであるが、細胞コロニーを選別する構成としてはこのような構成に限らず、その他の公知な構成を用いることができる。
【０１０６】
より具体的には、選別制御部１０６は、細胞評価部１０４において細胞コロニーが未分化状態であると評価された場合には、その細胞コロニーが良質細胞タンク側流路９３に流されるように選別部９２を制御し、細胞評価部１０４において細胞コロニーが分化状態であると評価された場合には、その細胞コロニーが廃棄タンク側流路９５に流されるように選別部９２を制御する。
【０１０７】
上記のように細胞コロニーの評価結果に基づいて選別部９２を制御することによって、未分化状態の細胞コロニーと分化状態の細胞コロニーとを適切に選別することができ、未分化状態の細胞コロニーのみを取り出すことができる。なお、上記説明では、細胞評価部１０４において細胞コロニーが未分化状態であるか分化状態であるかを評価するようにしたが、これに限らず、たとえば分化誘導された細胞コロニーを培養する場合には、細胞コロニーの分化度を評価し、分化が適切に進んでいる良質な細胞コロニーだけを良質細胞タンク９４に貯留し、分化が適切に進んでいない細胞コロニーや異常な細胞コロニーについては廃棄タンク９６に貯留するようにしてもよい。
【０１０８】
また、上記変形例では、検出光として収束光を照射するようにしたが、平行光を細胞コロニーに照射するようにしてもよい。
【０１０９】
また、上記実施形態および変形例においては、細胞コロニーにリング状照明光を照射して細胞コロニーの位相差像を撮像するようにしたが、これに限らず、細胞コロニーに対して均一な照明光を照射して細胞コロニーの明視野像を撮像するようにしてもよいし、または、細胞コロニーに対して微分干渉計測用の照明光を照射して細胞コロニーの微分干渉像を撮像するようにしてもよい。
【０１１０】
また、上記実施形態および変形例において、細胞コロニーの位相差像や明視野像や微分干渉像に基づいて、散乱光を検出する際の条件を決定するようにしてもよい。たとえば細胞コロニーの位相差像などの輝度、濃度または色などの均一性に基づいて、散乱光を検出する際の検出光の照射範囲や、検出光の波長などを決定するようにしてもよい。より具体的には、細胞コロニー内の均一性が高い範囲に検出光の照射範囲を絞り込んだり、または、位相差像など全体的な均一性が高い場合に、散乱光をより多く発生させるために検出光の波長を短くしたりしてもよい。
【符号の説明】
【０１１１】
１，２ 顕微鏡システム
１０   照明光照射部
１１   白色光源
１２   スリット板
１３   対物レンズ
１５   培養皿
１６   ステージ
２０   画像検出部
２１   位相差レンズ
２２   対物レンズ
２３   位相板
２４   結像レンズ
２５   撮像素子
３０   検出光照射部
４０   散乱光検出部
４１   結像レンズ
４２   光検出器
５０   照明光学系
６０   波長分離光学系
７０   細胞評価装置
７１   画像取得部
７２   細胞コロニー領域特定部
７３   照射範囲決定部
７４   散乱光情報取得部
７５   細胞評価部
７６   制御部
７７   照射範囲制御部
８０   ディスプレイ
９０   培養タンク
９１   マイクロ流路
９２   選別部
９３   培養タンク側流路
９４   廃棄タンク側流路
９５   廃棄タンク
１００ 細胞評価装置
１０１ 画像取得部
１０２ 細胞コロニー領域特定部
１０３ 散乱光情報取得部
１０４ 細胞評価部
１０５ 制御部
１０６ 選別制御部
【図１】
0006284832.tif 000002
【図２】
0006284832.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0006284832.tif 000007
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0006284832.tif 000013
【図１３】
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【図１４】
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