(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の存在下に、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はβＣＴＦ領域を介したＡＰＰとの相互作用を測定することを特徴とする、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの共発現又は相互作用による小胞の肥大化を抑制することに基づくアルツハイマー病予防治療薬のスクリーニング方法であって、
ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの相互作用の測定が、（１）ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの結合阻害作用を測定するか、又は（２）培養細胞又は非ヒト動物においてＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰを共発現させて小胞の肥大化又はＡＰＰの発現量の変化を検出するものであるスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病予防治療薬をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病では、びまん性の脳萎縮、大脳皮質に老人斑（アミロイドβ（Ａβ）の沈着像）と、アルツハイマー型神経原線維変化の広範囲出現がみられる。家族性アルツハイマー病は遺伝子変異によりＡβ産生制御の異常が生じるが、孤発性アルツハイマー病の発症原因は解明されていない。
【０００３】
一方、エンドソームの蓄積、巨大化はダウン症やアルツハイマー病の初期にみられる現象であり、エンドソームの蓄積には、アミロイドβ前駆体蛋白質（ＡＰＰ）及びＢＡＣＥ１（(beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1)活性が必要であるが、Ａβは必要ないと報告されている（非特許文献１）。ＢＡＣＥ１産物であり、Ａβの前駆体であるＡＰＰのカルボキシ末端断片（βＣＴＦ）は、エンドソームの蓄積、巨大化を引き起こすことが報告されている。βＣＴＦのエンドソームにおける蓄積は、エンドソームの肥大化、ライソソームにおける代謝障害につながる、Traffic jam仮説が考えられているが、その分子機構はわかっていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】PNAS, Jiang et al., 2010; 107(4):1630-5
【非特許文献２】Nature，Lauren et al., 2009; 457(7233):1128-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アルツハイマー病疾患の９０％を占める孤発性アルツハイマー病の原因は明確になっておらず、その解明が待たれている。
従って、本発明の課題は、アルツハイマー病の原因解明と新たなアルツハイマー病治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者は、エンドソーム−ライソソーム機構を解明すべく、Ｐ４−ＡＴＰａｓｅファミリータンパク質と複合体をつくり、Lipid Flippaseを形成することが知られているＴＭＥＭ３０Ａ（Transmembrane protein ３０Ａ（別名ＣＤＣ５０Ａ））に着目した。ＴＭＥＭ３０Ａは、凝集Ａβと結合し、細胞膜上で凝集Ａβの受容体として機能する可能性が示唆されている（非特許文献２）が、Ａβ産生機構やアルツハイマー病発症機構に対する影響は不明であった。ＴＭＥＭ３０Ａは、Ａβ前駆体であるＡＰＰと共発現させると小胞の肥大化を誘導し、エンドソーム形態を変化させること、さらには肥大化したエンドソームは各種エンドソームが融合し、ライソソームへの成熟が阻害されていることを見出した。また、ＴＭＥＭ３０ＡはＡＰＰと結合してＡＰＰを蓄積させる作用を有すること、ＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰの結合部位がＢＡＣＥ１活性により産生されるＡＰＰカルボキシル末端ドメインであるβＣＴＦ領域にあることも見出した。かかる知見から、ＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰ又はβＣＴＦとの結合を阻害する物質を探索すれば、小胞の肥大化を抑制でき新たなアルツハイマー病予防治療薬がスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔３〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕被験物質の存在下に、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの相互作用を測定することを特徴とするアルツハイマー病予防治療薬のスクリーニング方法。
〔２〕ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの相互作用が、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの結合阻害作用である〔１〕記載のスクリーニング方法。
〔３〕ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの相互作用が、培養細胞又は非ヒト動物においてＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰを共発現させて小胞体の肥大化又はＡＰＰ発現量の変化を検出するものである〔１〕記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明方法によれば、アルツハイマー病やダウン症の初期に生じるエンドソームの肥大化を抑制するという、新たな作用機序のアルツハイマー病予防治療薬を探索できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰの共発現による小胞の変化を示す。
【図２】ＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰの共発現による小胞の変化を示す。
【図３】ＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰの相互作用を示す。
【図４】ＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰの直接相互作用を示す。
【図５】ＴＭＥＭ３０ＡによるＡＰＰ蓄積を示す。
【図６】肥大化したエンドソームの性質を示す。
【図７】Ａβ結合化合物のＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦの結合に及ぼす作用を示す。
【図８】Ａβ結合化合物のＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦの結合に及ぼす作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ＴＭＥＭ３０Ａは、ＡＰＰと結合する作用を有し、その結合部位はβＣＴＦ中に存在する。一方、ＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰとを細胞中で共発現させると小胞であるエンドソームが肥大化する。このエンドソームの肥大化は、アルツハイマー病の初期に生じることである。従って、被験物質の存在下に、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの相互作用を測定し、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの結合を阻害する物質を選択すれば、アルツハイマー病の予防治療薬が探索できる。
【００１２】
ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの相互作用の測定は、in vitroでもin vivoでも行うことができる。in vitroの測定方法としては、例えば次の方法が挙げられる。
（１）ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとを含む溶液における両者の結合性と、これに被験物質を添加した場合の結合性を対比する。
ここで、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの結合性は、これらの抗体を用いた免疫沈降、ＧＳＴ融合タンパク質を用いた解析等により検出できる。
【００１３】
（２）被験物質の存在下で、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの共発現細胞を培養し、両者の共発現性を検出する。被験物質を添加していない場合の共発現性と対比する。このとき、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの共発現性は、これらの抗体を用いた免疫沈降、ＡＰＰの発現増強の有無等により検出できる。
【００１４】
（３）被験物質の存在下で、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦ又はＡＰＰとの共発現細胞を培養し、培養した細胞の小胞の肥大化を検出する。被験物質を添加していない場合の小胞の肥大化と対比する。
【００１５】
in vivoの測定は、被験物質を投与したアルツハイマー病モデルマウスを用いて、小胞の肥大化又はＡＰＰの発現変化を検出すればよい。被験物質を投与しないモデルマウスの小胞又はＡＰＰと対比すればよい。ここでアルツハイマー病モデルマウスとしては、Ｊ２０（家族性変異ＡＰＰ（スウェーデン型およびロンドン型の二重変異）を過剰発現するマウス）、ＴＧ２５７６(家族性変異ＡＰＰ（スウェーデン型変異）を過剰発現するマウス)等が挙げられる。
【実施例】
【００１６】
次に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。
【００１７】
試験例１
培養細胞にＡＰＰとＴＭＥＭ３０Ａを共発現させた。すなわち、アフリカミドリザル由来ＣＯＳ−７細胞に蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓをカルボキシ末端に融合させたＡＰＰ−Ｖｅｎｕｓ、及びアミノ末端に蛍光たんぱく質ｍＣｈｅｒｒｙを融合させたＴＭＥＭ３０Ａを、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（プロメガ）を用いて遺伝子導入を行った。遺伝子導入２４時間後の細胞を４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液で固定し、水溶性封入剤により観察用サンプルを作成した。ＡＰＰとＴＭＥＭ３０Ａの共発現は、蛍光顕微鏡により確認した（図１、Ａ）。培養細胞中の小胞の大きさと、ＡＰＰとＴＭＥＭ３０Ａの共発現を測定した（図１、Ｂ）。その結果、ＡＰＰとＴＭＥＭ３０Ａの共発現により、小胞が肥大化することが判明した（図１、Ｂ）。
【００１８】
ＣＯＳ−７細胞にＡＰＰと蛍光たんぱく質ＣＦＰをアミノ末端に融合させたＴＭＥＭ３０ＡをＦｕｇｅｎｅ  ＨＤを用いて遺伝子導入した。遺伝子導入２４時間後の細胞をＡＰＰ抗体  （ＡＰＰ（Ｃ）：ＩＢＬ社）、初期エンドソームマーカーであるＲａｂ−５抗体（Ｄ−１１：サンタクルズ社）を用いて免疫染色を行った。
その結果、（図２）ＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰの共発現により、小胞の肥大化が確認されるとともに、Ｒａｂ−５が肥大化した小胞に集積する事が判明した、すなわちＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰの共発現により肥大化した小胞はエンドソームとしての性質を持つ事がわかった。
【００１９】
試験例２
野生型マウスの脳と、培養細胞（ＡＰＰとＴＭＥＭ３０Ａの共発現細胞）における、ＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰの相互作用を検討した。すなわち、８週齢の野生型マウス脳海馬、またはＣＯＳ−７にＡＰＰとＣＦＰ融合ＴＭＥＭ３０ＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で遺伝子導入し、４８時間後の細胞を、１％ＣＨＡＰＳを含む溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡにプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えたもの）で溶解し、マウス海馬はＴＭＥＭ３０Ａの抗体、培養細胞はＧＦＰ抗体（３Ｅ６  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて免疫沈降実験を行った。
その結果、マウスでも共発現細胞でも、ＴＭＥＭ３０ＡはＡＰＰと結合し、その結合はβＣＴＦ特異的であることがわかった（図３）。
【００２０】
試験例３
ＴＭＥＭ３０Ａの細胞外ドメインをＧＳＴタンパク質と融合したタンパク質を大腸菌内で発現させ、大腸菌を１％ＴｒｉｔｏｎＸ  １００を含むリン酸緩衝液において溶解させた後、グルタチオンセファロースビーズを添加し、ＧＳＴ融合タンパク質をビーズに吸着させ、ビーズを３回洗浄したのち使用した。ＣＯＳ−７細胞にＡＰＰのスウエーデン型変異、または人工的なβＣＴＦであるＳＣ１００を遺伝子導入し、１％ＣＨＡＰＳを含む溶解緩衝液に溶解したのち、溶解緩衝液で平衡化した融合タンパク質の吸着したビーズを添加した。コントロールとしてＧＳＴを吸着したビーズを使用した。４℃下で１時間穏やかに攪拌を行った後、１％ＣＨＡＰＳ を含む溶解緩衝液でビーズを３回洗浄し、非結合タンパク質を除去した。ビーズに吸着したタンパク質をレムリサンプル緩衝液により溶出した。各サンプルはイムノブロット法により解析した。
その結果、βＣＴＦはＴＭＥＭ３０Ａの細胞外ドメインに直接結合することが判明した（図４）。
【００２１】
試験例４
ＣＯＳ−７細胞にＡＰＰ単独、またはＡＰＰとＣＦＰ融合ＴＭＥＭ３０ＡをLipofectamine２０００により遺伝子導入し、遺伝子導入４８時間後のＡＰＰの代謝をイムノブロット法により解析した。ＡＰＰの代謝解析はＡＰＰのカルボキシ末端抗体（Ｃ１２Ｃ１５）もしくはβＣＴＦ特異的抗体（８２Ｅ１：ＩＢＬ社）により行った。
その結果、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦとの共発現は、ＡＰＰ及びβＣＴＦを有意に蓄積することが判明した（図５）。
【００２２】
試験例５
ＣＯＳ−７細胞にＡＰＰとＣＦＰ融合ＴＭＥＭ３０ＡをＦｕｇｅｎｅ  ＨＤにより遺伝子導入を行い、遺伝子導入２４時間後の細胞を免疫染色により観察した。ＡＰＰカルボキシ末端抗体（ｍｃ９９（８０−９０）；ミリポア社）、後期エンドソームマーカーであるＲａｂ−７（Ｄ９５Ｆ２；Cell signaling社）、リサイクリングエンドソームマーカーであるＲａｂ−１１（Ｄ４Ｆ５；Cell signaling社）を用いた。
その結果を図６に示す。
肥大化したエンドソームは各種エンドソームマーカーが集積（通常では局在は異なる）していた（図６Ａ、Ｂ）。またLysosomeマーカー（Lysotracker:Lifetechnologies社）と一致しなかったため（図６Ｃ）、Ｌｙｓｏｓｏｍｅへの移行が阻害されている可能性を考えた。LysosomeでＡＰＰを分解するβカテプシンの阻害剤の効果を検証した結果、ＡＰＰ単独発現では阻害剤処理によりＡＰＰ−ＣＴＦが蓄積するが、ＴＭＥＭ３０Ａとの共発現でもともと蓄積したＡＰＰ−ＣＴＦは阻害剤処理により変化しない、この結果はＴＭＥＭ３０Ａとの共発現でLysosome分解低下が起こっていた事を示しており、ＡＰＰのLysosome分解が低下するとするTraffic jam仮説と矛盾しない。
【００２３】
試験例６
Ａβ結合化合物であるクルクミンとタキシフォリンを用いて、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦの結合阻害、βＣＴＦの蓄積性を検討した。まず毒性評価のため、ＣＯＳ−７細胞にクルクミン（５０、１００μＭ）、タキシフォリン（１００、２００μＭ）を加え８時間後、アラマーブルー反応液を含む培地で１時間培養し、培地に放出される蛍光物質の量をコントロール細胞（溶媒のみ加えた細胞）の値により規格化して検討した。次にＣＯＳ−７細胞にＡＰＰとＣＦＰ融合ＴＭＥＭ３０ＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて共発現させ、２４時間後にクルクミン（５０μＭ）タキシフォリン（１００μＭ）を添加し、８時間培養した。サンプルはレムリサンプル緩衝液で溶解し、イムノブロット法により解析した。ＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入したβＣＴＦ（ＳＣ１００）を１％ＣＨＡＰＳを含む細胞溶解緩衝液により溶解し、溶解液をクルクミン（５０μＭ）、タキシフォリン（１００μＭ）で前処理を行い、３０分後にＧＳＴ融合ＴＭＥＭ３０Ａ細胞外ドメインを吸着させたグルタチオンセファロースビーズを添加し、１時間４℃で穏やかに攪拌した。ビーズに吸着したタンパク質をレムリサンプル緩衝液により溶解してイムノブロット法により解析した
その結果、Ａβ結合化合物（図７、Ａ）は、ＴＭＥＭ３０ＡとβＣＴＦの相互作用を阻害し（図７、Ｆ）、細胞毒性が軽微な（１０％未満）濃度で（図７、Ｂ）ＡＰＰ−βＣＴＦの蓄積を減少させた（図７Ｃ〜Ｅ）。
【００２４】
試験例７
クルクミンとタキシフォリンが、ＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰ共発現系に及ぼす作用について検討した。ＣＯＳ−７細胞にＶｅｎｕｓ融合ＡＰＰ、及びｍｃｈｅｒｒｙ融合ＴＭＥＭ３０ＡをＦｕｇｅｎｅ  ＨＤにより遺伝子導入した。遺伝子導入２４時間後、クルクミン（５０μＭ）、タキシフォリン（１００μＭ）を含む培地で８時間培養した。
その結果、ＴＭＥＭ３０ＡとＡＰＰの共発現によりＡＰＰ発現蛍光強度が強くなるが、クルクミンとタキシフォリンは、いずれも、その蛍光強度を低下させた（図８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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