(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌を被っていない対象において乳癌となる危険性を予測するための方法であって、下記：
−該対象から得られた体液中の配列番号１であるプロ−タキキニン又は配列番号２であるプロ−タキキニン１−３７のレベルを決定し；及び
−該プロ−タキキニン又は該プロ−タキキニン１−３７のレベルと乳癌となる危険性を相関させる
ことを含み、ここで、レベルの減少は、乳癌となる危険性の増大を示す上記方法。
【請求項２】
以下の工程：
−前記対象から得られた体液中のプロ−ニューロテンシン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを決定し；及び
−追加的に、プロ−ニューロテンシン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片と乳癌となる危険性を相関させる
ことを含み、ここで、プロ−ニューロテンシン又はその断片のレベルの増加は、乳癌となる危険性の増大を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程：
−前記対象から得られた体液中のプロ−エンケファリン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを決定し；及び
−追加的に、プロ−エンケファリン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片と乳癌となる危険性を相関させる
ことをさらに含み、ここで、プロ−エンケファリン又はその断片のレベルの減少は、乳癌となる危険性の増大を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程：
−前記対象から得られた体液中のインスリンのレベルを決定し；及び
−追加的に、インスリンと乳癌となる危険性を相関させる
ことをさらに含み、ここで、インスリンのレベルの減少は、乳癌となる危険性の増大を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
追加的に相関させることが、個々のバイオマーカーによって得られた乳癌発症についての相対的な危険因子を考慮することによって、決定されたバイオマーカーレベルの組み合わせた分析を意味する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
プロ−タキキニン、そのスプライス改変体又はその断片のレベルの減少は、閾値を下回るレベルであり、閾値は、１００ｐｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
閾値が、８０ｐｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
閾値が、６０ｐｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
閾値が、５０ｐｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
閾値が、４５．６ｐｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
閾値が、４０ｐｍｏｌ／Ｌである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
プロ−ニューロテンシン又はその断片のレベルの増加は、閾値を上回るレベルであり、閾値は、７８ｐｍｏｌ／Ｌ以上である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
閾値が、１００ｐｍｏｌ／Ｌ以上である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
閾値が、１５０ｐｍｏｌ／Ｌである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
プロ−エンケファリン又はその断片のレベルの減少は、閾値を下回るレベルであり、閾値は、１００ｐｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
閾値が、７５ｐｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
閾値が、５０ｐｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
閾値が、４０．４ｐｍｏｌ／Ｌである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
インスリンのレベルの減少は、閾値を下回るレベルであり、閾値は７０ｐｍｏｌ／Ｌである、請求項４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が女性である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
体液試料が該対象から採取された時点で、該対象が乳癌の診断歴がない、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
体液試料が該対象から採取された時点で、該対象が、乳癌の診断歴を有し、治療されていている、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
体液試料が該対象から採取された時点で、該対象が、心臓血管疾患又は糖尿病を有すると診断されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
年齢、真性糖尿病の存在、現在の喫煙を含む群から選択される追加的に少なくとも１つの臨床パラメータが決定される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
プロ−タキキニン、そのスプライス改変体若しくはその断片、及びプロ−ニューロテンシン若しくはその断片、及び／又はプロ−エンケファリン若しくはその断片、及び／又はインスリンのレベルがイムノアッセイによって測定される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
対象において乳癌となる危険性をモニターするために、又は治療経過をモニターするために、１回を超えて該方法が行われる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
採用された予防的及び／又は治療的測定に対する該対象の応答を評価するために、該モニターリングが行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該対象を危険群に分類するための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
体液が、血液又は血漿又は血清である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、癌を被っていない対象において癌となる危険性を予測し又はあるいは対象において癌であると診断するための方法であって、
−該対象から得られた体液中の、サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、プロ−タキキニン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを決定し；及び
−プロ−タキキニン又はその断片の該レベルを癌となる危険性と相関させる
ことを含み、
ここで、レベルの減少は、癌となる危険性の増大を予測し又はあるいは癌であると診断し、レベルの減少は、癌の診断と相関する。
【背景技術】
【０００２】
サブスタンスＰ（ＳＰ）は神経ペプチドであり、神経伝達物質として、及び神経調節物質として機能するウンデカペプチドである。これは、タキキニン神経ペプチドファミリーに属する。サブスタンスＰ及びその密接に関連した神経ペプチドニューロキニンＡ（ＮＫＡ）は、プレプロ−タキキニンＡ遺伝子の異なるスプライシング後に、ポリタンパク質前駆体から産生される。ＣＮＳにおいて、サブスタンスＰは、疼痛伝達系に関与する。
【０００３】
サブスタンスＰは、炎症過程で役割を果たし（Ａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）、癌細胞において抗アポトーシス活性を有する（Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。
【０００４】
サブスタンスＰ受容体（ニューロキニン１受容体）は、癌の発症において重要な役割を果たす（Ｆｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３；Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ，２０１０；Ｒａｍｅｓｈｗａｒ，２００７；Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。サブスタンスＰ経路をブロックすることにより、インビトロで細胞増殖を顕著に減少させた（概説については、Ｍｕｎｏｚ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｏｗ，２００９参照）。
【０００５】
男性における癌の危険性を予測するための血管作動性ペプチドの使用は、Ｂｅｌｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｓ  ＆  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎによって報告されている。ＭＲ−プロ−ＡＮＰ、ＭＲ−プロ−ＡＤＭ及びコペプチンは、１９９１〜１９９４年におけるベースライン試験前の癌でない、Ｍａｌｍｏ  Ｄｉｅｔ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙの参加者からの空腹時血漿において測定された（男性１７６８人及び女性２２９３人）。著者は、女性の間で、バイオマーカーと癌発生率の間には関係がなかったと述べている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の主題は、癌発生率を予測し、及び癌の再発の危険性を予測するためのプロ−タキキニンの予後及び診断力を調査することであった。この問題に対処するに、空腹時血漿中のプロ−タキキニンの安定な断片（Ｅｒｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）は、スウェーデンの予測されたコホート研究（Ｍａｌｍｏ  Ｄｉｅｔ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ）において測定され、フォローアップ１５年チュに乳癌の発生率にこのバイオマーカーのベースラインレベルを関連付けた。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、典型的なＰＴＡ用量／シグナル曲線を示す。標準的な曲線ＰＴＡ。
【図２】図２は、カプラン・マイヤーグラフであり、女性における累積的な乳癌診断を示す。四分位数（Ｑ）１（４５．６ｐｍｏｌ／Ｌを下回る）、四分位数２（４５．６−５５．３ｐｍｏｌ／Ｌ）、四分位数３（５５．４−６５．９ｐｍｏｌ／Ｌ）、四分位数４（６５．９ｐｍｏｌ／Ｌを上回る）。ＰＴＡの減少は、乳癌発症の長期危険性の増加を示す。基準（血液サンプリング）の日に癌病歴を有するいかなる女性も除いたため、ＰＴＡは、将来的な乳癌発症について高く予測する。全体として、Ｑ１からの女性は、Ｑ４からの女性より乳癌を発症する危険性が２．１倍高い。
【図３】図３は、典型的なＰＮＴ用量／シグナル曲線を示す。標準的な曲線ＰＮＴ。
【図４】図４は、典型的なＭＲ  ＰＥＮＫ用量／シグナル曲線を示す。標準的な曲線ＭＲ  ＰＥＮＫ。
【図５】乳癌予測についてのＰＴＡ及びＰＮＴの組み合わせ分析の例証的な実施例であり、危険群は表９に定義されるように表示される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
驚くべきことに、プロ−タキキニンは、対象において癌となる危険性を予測し、又はあるいは対象において癌と診断するための強力かつ非常に重要なバイオマーカーであることが示されている。
【０００９】
したがって、本発明の主題は、癌を被っていない対象において癌となる危険性を予測し、又はあるいは対象において癌であると診断するための方法であって、
−該対象から得られた体液中のサブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、プロ−タキキニン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを決定し；及び
−プロ−タキキニン又はその断片の該レベルを癌となる危険性と相関させる
ことを含み、
ここで、レベルの減少は、癌となる危険性の増大を予測し、又はあるいは癌であると診断されることを予測し、レベルの減少は、癌の診断と相関する。
【００１０】
本発明の別の主題は、以下の工程：
−該対象から得られた体液中のプロ−ニューロテンシン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを追加的に決定し；及び
−プロ−ニューロテンシン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片の該レベルと、癌となる危険性をさらに相関させる
ことをさらに含み、ここで、プロ−ニューロテンシン又はその断片のレベルの増加は、癌となる危険性の増加を予測し、又はあるいは癌と診断されることを予測し、プロ−ニューロテンシン又はその断片のレベルの増加は、癌の診断と相関される。
【００１１】
本発明の別の実施形態によれば、上記方法は、さらに、以下の方法：
−該対象から得られた体液中のプロ−エンケファリン又はその断片を追加的に決定し；及び
−追加的なプロ−エンケファリン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片と、癌となる危険性を相関させる
ことを含んでもよく、ここで、プロ−エンケファリン又はその断片のレベルの減少は、癌となる危険性の増大を予測し、又はあるいは癌であると診断し、プロ−エンケファリン又はその断片のレベルの減少は、癌の診断と相関させる。
【００１２】
本発明の別の実施形態によれば、上記方法は、さらに、以下の工程：
−該対象から得られた体液中のインスリンのレベルを追加的に決定し；及び
−インスリンの該レベルと、癌となる危険性を追加的に相関させる
ことを含んでもよく、ここで、インスリンのレベルの減少は、癌となる危険性の増大を予測し又はあるいは癌であると診断し、レベルの減少は、癌の診断と相関される。
【００１３】
したがって、本発明の方法は、体液中の、サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、プロ−タキキニン、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを決定することを含み、場合により、以下：
−プロ−ニューロテンシン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを決定し、及び
−プロ−エンケファリン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを決定し、及び
−インスリンのレベルを決定すること
を含む群から選択される癌の危険性の少なくとも１つの更なる決定と追加の相関をさらに含んでもよい。
【００１４】
本発明の一実施形態において、前述のさらなるバイオマーカーの少なくとも１つをさらに決定し、追加的に、サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、プロ−タキキニン、そのスプライス改変体もしくはその少なくとも５つのアミノ酸の断片に加えて、該癌の危険性を相関させる。本発明の一実施形態において、前述のさらなるバイオマーカーの少なくとも２つをさらに決定し、追加的に、サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、プロ−タキキニン、そのスプライス改変体もしくはその少なくとも５つのアミノ酸の断片に加えて、該危険性を相関させる。一実施形態において、上記の４つのバイオマーカーの全てが決定される。
【００１５】
サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、プロ−タキキニン、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片に加えて、更なるバイオマーカーが決定され、該危険性と相関させる具体的な一実施形態において、「追加的に相関すること」とは、個々のバイオマーカーによって得られた癌の発症についての相対的な危険因子を考慮することによって、決定されたバイオマーカーレベルの組み合わせ分析を意味する。
【００１６】
１を超えるバイオマーカーの組み合わせ分析は、実施例５において説明されている例である。当業者は、１を超えるマーカー又はパラメータの組み合わせ分析を行ってもよい統計学的方法を知っている。
【００１７】
上記方法の一実施形態において、プロ−タキキニン、そのスプライス改変体又はその断片のレベルの減少は、閾値を下回るレベルであり、該閾値は、約１００ｐｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは約８０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは約６０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは約５０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは約４５．６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは約約４０ｐｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００１８】
上記方法の一実施形態において、プロ−ニューロテンシン又はその断片のレベルの増加は、閾値を上回るレベルであり、閾値は、約７８ｐｍｏｌ／Ｌ  ＰＮＴ、好ましくは１００ｐｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは約１５０ｐｍｏｌ／Ｌ以上である。
【００１９】
上記方法の一実施形態において、プロ−エンケファリン又はその断片のレベルの減少は、閾値を下回るレベルであり、閾値は、約１００ｐｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは７５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは約５０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは約４０．４ｐｍｏｌ／Ｌである。
【００２０】
上記方法の一実施形態において、インスリンのレベルの減少は、閾値を下回るレベルであり、閾値は約７０ｐｍｏｌ／Ｌである。
【００２１】
閾値は、使用される較正方法に照らして見る必要があり、上記値は、本実施例１、３及び４において使用されるアッセイ及び較正方法に照らして見る必要がある。
【００２２】
具体的な一実施形態において、該対象は女性である。具体的な一実施形態において、該対象は女性であり、癌は乳癌である。
【００２３】
具体的な一実施形態において、該癌は肺癌である。
【００２４】
癌の更なる例は、乳癌、肺癌、膵臓癌及び結腸癌を含む群から選択されてもよい。
【００２５】
明細書を通じて、プロ−タキキニン及びプロ−タキキニンＡ（ＰＴＡ）なる用語は、同義的に使用される。該用語は、プロ−タキキニンＡの全ての種スプライス改変体、すなわちαΡΤΑ、βΡΤΑ、γΡΤΑ、及びδΡΤΑを含む。明細書を通じて、プロ−タキキニンの断片なる用語はまた、サブスタンスＰ及びニューロキニンを含むことが理解されるべきである。
【００２６】
用語「サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、プロ−タキキニン、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片を決定すること」とは、通常、前述の分子内の領域に対する免疫反応性が決定されることを意味する。これは、特定の断片が選択的に測定されることは必要ないことを意味する。サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、プロ−タキキニン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを決定するために使用される結合剤は、該結合剤の結合領域を含む任意の断片に結合することが理解される。該結合剤は、抗体又は抗体断片又は非ＩｇＧ足場であってもよい。
【００２７】
したがって、本発明の主題は、一実施形態において、癌、例えば、乳癌、肺癌などを獲得する、男性又は女性の感受性の決定である。
【００２８】
Ｍａｌｍｏ研究において得られたデータは、男性対象において癌となる危険性と、該男性対象から得られた体液中のプロ−タキキニン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルとの相関を示した；しかしながら、この相関は、現データセットに対して統計学的に有意ではないが、男性において、プロ−タキキニン又はそのスプライス改変体又はその断片のレベルの減少で、癌の危険性の増加について明確な傾向があった。したがって、男性対象に対しても本発明の方法は価値があるが、本研究において、観察された効果は、女性と比較して、男性に対して強いものではなかった。これは、主には、男性人口における癌発症率の低値による可能性がある。
【００２９】
用語「対象」とは、本明細書で使用するとき、生きているヒト又は非ヒト生物を意味する。好ましくは、本明細書では、対象はヒト対象である。
【００３０】
用語「レベルの減少」とは、特定の閾値レベルを下回るレベルを意味する。用語「レベルの増加」とは、特定の閾値を上回るレベルを意味する。体液は、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び唾液を含む群から選択することができる。
【００３１】
具体的な実施形態において、該体液は、血液、血清又は血漿である。
【００３２】
本発明の一実施形態において、該対象は、体液試料が該対象から採取された時点で、癌であると診断されたていない。
【００３３】
別の実施形態において、対象は、以前に癌であると診断され、体液の試料が該対象から採取された時点で治癒しており、癌となる再発の危険性が決定され、又はあるいは癌の再発が予測される。
【００３４】
プロ−タキキニンは、以下の配列を有してもよい：
配列番号１（プロ−タキキニンＡ（１−１０７））
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡＲＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＧＫＲＤＡＤＳＳＩＥＫＱＶＡＬＬＫＡＬＹＧＨＧＱＩＳＨＫＲＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭＧＫＲＡＬＮＳＶＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥＲＲＲ
体液において決定され得るプロ−タキキニンの断片は、例えば、以下の断片の群から選択されてもよい：
配列番号２（プロ−タキキニン１−３７、Ｐ３７）
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡ
配列番号３（サブスタンスＰ）
ＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭ（−ＮＨ２）
配列番号４（神経ペプチドＫ）
ＤＡＤＳＳＩＥＫＱＶＡＬＬＫＡＬＹＧＨＧＱＩＳＨＫＲＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭ（−ＮＨ２）
配列番号５（神経ペプチドガンマ）
ＧＨＧＱＩＳＨＫＲＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭ（−ＮＨ２）
配列番号６（ニューロキニン１）
ＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭ（−ＮＨ２）
配列番号７（Ｃ末端フランキングペプチド、ＰＴＡ  １  ９２−１０７）
ＡＬＮＳＶＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥ
配列番号８（ＰＴＡアイソフォームα）
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡＲＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＧＫＲＤＡＤＳＳＩＥ  ＫＱＶＡＬＬＫＡＬＹＧＨＧＱＩＳＨＫＭＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥＲＲＲ
配列番号９（ＰＴＡアイソフォームベータ）
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡＲＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＧＫＲＤＡＤＳＳＩＥＫＱＶＡＬＬＫＡＬＹＧＨＧＱＩＳＨＫＲＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭＧＫＲＡＬＮＳＶＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥＲＲＲ
配列番号１０（ＰＴＡアイソフォームデルタ）
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡＲＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＧＫＲＤＡＧＨＧＱＩＳＨＫＭＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥＲＲＲ
配列番号１１（ＰＴＡアイソフォームガンマ）
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡＲＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＧＫＲＤＡＧＨＧＱＩＳＨＫＲＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭＧＫＲＡＬＮＳＶＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥＲＲＲＳＥＱ
配列番号１２（ＰＴＡ３−２２）
ＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫ
配列番号１３（ＰＴＡ２１−３６）
ＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩ
【００３５】
ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片のレベルを決定することは、サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、ＰＴＡ又はその断片に対する免疫反応性が決定されることを意味し得る。結合領域に依存して、ＰＴＡ、又はそのスプライス改変体又はその断片を決定するために使用される結合剤は、上記で示された分子の１個を超えて結合してもよい。これは、当業者に明らかである。
【００３６】
本発明に方法のより具体的な実施形態において、ｐ３７（ＰＴＡ１−３７、配列番号２、ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡ）のレベルが決定される。本発明のさらにより具体的な実施形態において、ＰＴＡ１−３７、配列番号２、ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡ内の２つの異なる領域に好ましくは結合する１を超える結合剤の場合において、ＰＴＡ１−３７、配列番号２、ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡに結合する少なくとも１又は２つの結合剤が使用される。該結合剤（単数又は複数）は、好ましくは、抗体又はその結合断片であってもよい。
【００３７】
さらにより具体的な実施形態において、結合剤（単数又は複数）は、ＰＴＡ１−３７内の以下の領域の、それぞれ、１つ又は両方に結合するＰＴＡ、その改変体又は断片を決定するために使用される。
【００３８】
【表１】
0006317763.tif 000002
【００３９】
具体的な実施形態において、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片のレベルは、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片に結合する抗体又は抗体の断片を用いたイムノアッセイにより測定される。ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片の決定に有用であり得るイムノアッセイは、実施例１に概説されるステップを含んでもよい。全ての閾値及び値は、実施例１に従って使用される試験及び較正に相関して見る必要がある。当業者は、閾値の絶対値が使用される較正によって影響される可能性があることを知っている可能性がある。これは、本明細書で与えられる値及び閾値が、本明細書で使用される較正との関連で理解されるべきであることを意味する（実施例１）。
【００４０】
本発明によれば、ＰＴＡに対する診断的結合剤又は他の追加のバイオマーカーは、抗体、例えば、ＩｇＧ、典型的な全長イムノグロブリン、又は、例えば、化学的に結合された抗体（断片抗原結合）のように、重鎖及び／又は軽鎖の少なくともＦ可変領域を含有する抗体断片、例えば、限定されないが、Ｆａｂ断片、例えばＦａｂミニボディ、一本鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価Ｆａｂ抗体、例えば、Ｆａｂ−Ｖ５Ｓｘ２；ＣＨ３ドメインで二量体化された二価Ｆａｂ（ミニ抗体）；二価Ｆａｂ又は多価Ｆａｂ、例えば、異種ドメインの助けを借りた多量体化を介して形成されたもの、例えばｄＨＬＸドメインの二量体化を介したもの、例えば、Ｆａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳｘ２；Ｆ（ａｂ’）２−断片、ｓｃＦｖ−断片、多量体化された多価又は／及び多重特異的ｓｃＦｖ−断片、二価及び／又は二重特異的ダイアボディ、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ））、三機能性抗体、多価抗体、例えば、Ｇとは異なるクラス由来のもの；単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ又は魚類のイムノグロブリン由来のナノボディからなる群から選択される。
【００４１】
具体的な実施形態において、ＰＴＡ、そのスプライス改変体若しくはその断片、又は他の更なるバイオマーカーのレベルは、ＰＴＡ、そのスプライス改変体若しくはその断片、又はあるいは更なるバイオマーカーに結合する、より詳細には以下に記載される、アプタマー、非Ｉｇ足場を含む群から選択される結合剤を用いたアッセイにより測定される。
【００４２】
ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片のレベルを決定するために使用され得る結合剤は、少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは１０8Ｍ-1のＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片に対する親和性定数を示し、好ましい親和性定数は、１０9Ｍ-1より大きく、最も好ましくは１０10Ｍ-1を超える。当業者は、より高い用量の化合物を適用することによって、より低い親和性を相殺されることが考えられる可能性があり、この測定が、本発明の範囲外をもたらさないことを知っている。結合親和性は、サービス分析、例えば、Ｂｉａｆｆｍ，Ｋａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｆｆｍ．ｃｏｍ／ｄｅ／）として提供される、Ｂｉａｃｏｒｅ法を用いて決定されてもよい。
【００４３】
親和性定数
抗体の親和性を決定するために、固定された抗体に対する、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片の結合の動力学は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、標識なしの表面プラズモン共鳴によって決定された。抗体の可逆的固定化は、製造業者の説明書（マウス抗体捕捉キット；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従って、ＣＭ５センサー表面に高密度で共有結合させた抗マウスＦｃ抗体を用いて行われた。
（Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＩｓａＡ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ａｕｇｍｅｎｔ  Ｈｏｓｔ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  Ｏｐｅｎ  Ｎｅｗ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ”；Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１１  Ｊａｎｕａｒｙ；５５（１）：１６５−１７３）。
【００４４】
ヒトＰＴＡ対照試料は、ＩＣＩ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｉ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／によって利用可能である。また、アッセイは、合成（本発明者らの実験では、合成のＰ３７、配列番号２）又は組換えＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片によって較正されてもよい。
【００４５】
本発明の方法による、女性対象において乳癌となる危険性を決定し、又は女性対象における乳癌と診断するためのＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片の閾値は、１００ｐｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは８０ｐｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは６０ｐｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは５０ｐｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは４５．６ｐｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは４０ｐｍｏｌ／Ｌ未満である。これらの閾値は、上述した較正方法に関連する。閾値を下回るＰＴＡ値は、対象が、癌となる危険性が増大し又はすでに癌であることを意味する。
【００４６】
本発明の一実施形態において、該方法は、女性対象において乳癌となる危険性をモニターするため、又は治療経過をモニターするために、１回を超えて行われる。具体的な一実施形態において、該モニターリングは、採用された予防的及び／又は治療的測定に対して、該女性対象の応答を評価するために行われる。
【００４７】
本発明の一実施形態において、該方法は、危険群に該対象を分類するために使用される。
【００４８】
さらに、本発明の主題は、それぞれの領域が少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む、アミノ酸３−２２（ＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫ、配列番号１２）とアミノ酸２１−３６（ＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩ、配列番号１３）であるＰＴＡの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含む試料において、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片を決定するためのアッセイである。
【００４９】
本発明による試料中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片を決定するためのアッセイの一実施形態において、該アッセイのその分析的アッセイ感受性は、健常な対象のＰＴＡ、そのスプライス改変体又はＰＴＡ断片を定量することができ、＜２０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜１０ｐｍｏｌ／Ｌ、及びより好ましくは＜５ｐｍｏｌ／Ｌである。
【００５０】
本発明に従って試料中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又は断片を決定するためのアッセイの一実施形態において、このようなアッセイは、サンドイッチアッセイ、好ましくは完全に自動化されたアッセイである。それは、ＥＬＩＳＡ、完全に自動化されたアッセイ又は手動アッセイであってもよい。それは、いわゆるＰＯＣ検定（ポイントオブケア）であってもよい。自動化又は完全に自動化されたアッセイの例としては、以下のシステム：Ｒｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｃｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、Ｂｒａｈｍｓ  Ｋｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ  Ｖｉｄａｓ（登録商標）、Ａｌｅｒｅ  Ｔｒｉａｇｅ（登録商標）の１つについて使用されてもよいアッセイが挙げられる。試験フォーマットの例は、上記で与えられている。
【００５１】
本発明に従って試料中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又は断片を決定するためのアッセイの一実施形態において、該２つの結合剤のうちの少なくとも１つは、検出されるために標識される。標識の例は、上記で与えられている。
【００５２】
本発明に従って試料中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又は断片を決定するためのアッセイの一実施形態において、該２つの結合剤のうちの少なくとも１つは、固相に結合される。固相の例は、磁気ビーズ、ポリスチレンチューブ又はマイクロタイタープレートである。一実施形態において、均質アッセイが使用され、例えば、Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ（ＴＲＡＣＥ）が使用される。
【００５３】
本発明に従って試料中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又は断片を決定するためのアッセイの一実施形態において、該標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される。
【００５４】
本発明のさらなる主題は、該アッセイの成分が、１つ以上の容器に含まれていてもよい本発明のアッセイを含むキットである。
【００５５】
本発明の主題はまた、女性において癌となる危険性を予測し、又は先行する実施形態のいずれかによる癌となる危険性が増大した対象を同定するための方法であり、ここで、単独で又は他の予測実験室若しくは臨床パラメータと併せて、該対象から得られた体液中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルは、以下の選択肢から選択されてもよい方法によって、有害事象となる対象の危険性を予測するために使用される：
−「健常な」又は「見かけ上健常な」対象の集団において予め決定された試料の集合において、対象から得られた体液中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルの中央値との比較。
−「健常な」又は「見かけ上健常な」対象の集団において予め決定された試料の集合において、対象から得られた体液中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルの分位点との比較。
−Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄ分析に基づく、又はＮＲＩ（Ｎｅｔ  Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）若しくはＩＤＩ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）などの危険指標計算を用いることによる計算。
【００５６】
主題の一実施形態において、本発明はまた、女性における癌となる危険性を予測し、又は先行する実施形態のいずれかによる癌となる危険性が増大した対象を同定する方法であり、ここで、単独で又は他の予測バイオマーカーと併せて、該対象から得られた体液中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルであってもよい。
【００５７】
このような有用な追加のバイオマーカーは、プロ−ニューロテンシン及びその少なくとも５つのアミノ酸の断片、又はプロ−エンケファリン及びその少なくとも５つの断片、又はインスリンであってもよい。
【００５８】
本発明による方法の具体的な一実施形態において、プロ−ニューロテンシン１−１１７又はその断片のレベルは、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片の決定に加えて決定される。
【００５９】
本出願を通じて断片に言及するとき、該断片は、少なくとも４つ又は５つのアミノ酸を含む。
【００６０】
したがって、本発明の主題はまた、以下：
−該対象から得られた体液中の、サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルの決定；及び
−該対象から得られた体液中のプロ−ニューロテンシン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルの決定；及び
−ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片の該レベル及びプロ−ニューロテンシン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片と、癌となる危険性との相関
を含む、癌を被っていない対象において癌となる危険性を予測し、又はあるいは対象において癌であると診断するための方法であり、ここで、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片のレベルの減少は、癌である危険性の増大を予測し、又はあるいは癌であると診断し、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片のレベルの減少は、癌の診断と相関し、及びプロ−ニューロテンシン及びその断片のレベルの増加は、癌となる危険性の増大又はあるいは癌の診断を予期し、プロ−ニューロテンシン及びその断片のレベルの図岡は、癌の診断と相関する。
【００６１】
プロ−ニューロテンシン及び断片は、以下の配列を有してもよい：
配列番号１４（プロ−ニューロキニン１−１４７）
ＳＤＳＥＥＥＭＫＡＬＥＡＤＦＬＴＮＭＨＴＳＫＩＳＫＡＨＶＰＳＷＫＭＴＬＬＮＶＣＳＬＶＮＮＬＮＳＰＡＥＥＴＧＥＶＨＥＥＥＬＶＡＲＲＫＬＰＴＡＬＤＧＦＳＬＥＡＭＬＴＴＹＱＬＨＫＩＣＨＳＲＡＦＱＨＷＥＬＩＱＥＤＩＬＤＴＧＮＤＫＮＧＫＥＥＶＩＫＲＫＩＰＹＩＬＫＲＱＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬＫＲＤＳＹＹＹ
配列番号１５（プロ−ニューロテンシン１−１２５（ラージニューロメジンＮ））
ＳＤＳＥＥＥＭＫＡＬＥＡＤＦＬＴＮＭＨＴＳＫＩＳＫＡＨＶＰＳＷＫＭＴＬＬＮＶＣＳＬＶＮＮＬＮＳＰＡＥＥＴＧＥＶＨＥＥＥＬＶＡＲＲＫＬＰＴＡＬＤＧＦＳＬＥＡＭＬＴＴＹＱＬＨＫＩＣＨＳＲＡＦＱＨＷＥＬＩＱＥＤＩＬＤＴＧＮＤＫＮＧＫＥＥＶＩＫＲＫＩＰＹＩＬ
配列番号１６（ニューロメジンＮ）
ＫＩＰＹＩＬ
配列番号１７（ニューロテンシン）
ピロＱＬＹＥＮＫＰＲＲＰ  ＹＩＬ
配列番号１８（プロ−ニューロテンシン１−１１７）
ＳＤＳＥＥＥＭＫＡＬＥＡＤＦＬＴＮＭＨＴＳＫＩＳＫＡＨＶＰＳＷＫＭＴＬＬＮＶＣＳＬＶＮＮＬＮＳＰＡＥＥＴＧＥＶＨＥＥＥＬＶＡＲＲＫＬＰＴＡＬＤＧＦＳＬＥＡＭＬＴＩＹＱＬＨＫＩＣＨＳＲＡＦＱＨＷＥＬＩＱＥＤＩＬＤＴＧＮＤＫＮＧＫＥＥＶＩ
配列番号１９（プロ−ニューロテンシン１−１３２）
ＳＤＳＥＥＥＭＫＡＬＥＡＤＦＬＴＮＭＨＴＳＫＩＳＫＡＨＶＰＳＷＫＭＴＬＬＮＶＣＳＬＶＮＮＬＮＳＰＡＥＥＴＧＥＶＨＥＥＥＬＶＡＲＲＫＬＰＴＡＬＤＧＦＳＬＥＡＭＬＴＩＹＱＬＨＫＩＣＨＳＲＡＦＱＨＷＥＬＩＱＥＤＩＬＤＴＧＮＤＫＮＧＫＥＥＶＩＫＲＫＩＰＹＩＬＫＲＱＬＹＥＮ
配列番号２０（プロ−ニューロテンシン１２０−１４０）
ＫＩＰＹＩＬＫＲＱＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ
配列番号２１（プロ−ニューロテンシン１２０−１４７）
ＫＩＰＹＩＬＫＲＱＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬＫＲＤＳＹＹＹ
配列番号２２（プロ−ニューロテンシン１２８−１４７）
ＱＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬＫＲＤＳＹＹＹ
【００６２】
具体的な実施形態において、プロ−ニューロテンシンのレベルは、イムノアッセイを用いて測定される。より具体的には、イムノアッセイは、エルンストら（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００６），（２７）１７８７−１７９３）に記載されるように使用される。プロ−ニューロテンシン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルの決定に有用であり得るイムノアッセイは、実施例３に概説されている工程を含んでもよい。全ての閾値及び値は、実施例３に従って使用される試験及び較正と相関して見る必要がある。当業者は、閾値の絶対値が、使用される較正によって影響を及ぼされ得ることを知っている可能性がある。これは、本明細書で与えられる値と閾値が、本明細書で使用される較正との関連で理解されるべきことを意味する（実施例３）。ヒトプロ−ニューロテンシン較正因子は、ＩＣＩ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによって利用可能である。あるいは、アッセイはまた、合成又は組換えＰ−ＮＴ１−１１７又はその断片によって較正されてもよい（Ｅｍｓｔら、２００６も参照）。
【００６３】
プロ−ニューロテンシン又はその断片のレベルを決定するために使用されてもよい結合剤は、少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは１０8Ｍ-1のプロ−ニューロテンシン又はその断片に対する親和性を示し、好ましい親和性は１０9Ｍ-1より大きく、最も好ましくは１０10Ｍ-1より大きい。当業者は、より高い用量の化合物を適用することによって、より低い親和性を相殺されることが考えられる可能性があり、この測定が、本発明の範囲外をもたらさないことを知っている。結合親和性は、サービス分析、例えば、Ｂｉａｆｆｍ，Ｋａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｆｆｍ．ｃｏｍ／ｄｅ／）として提供される、Ｂｉａｃｏｒｅ法を用いて決定されてもよい。
【００６４】
本発明の方法に従って、対象における癌となる危険性を決定し、又は対象における癌、具体的には女性対象における乳癌を診断するための閾値は、約７８ｐｍｏｌ／Ｌ以上のＰＮＴ、好ましくは約１００ｐｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは約１５０ｐｍｏｌ／Ｌ以上である。具体的な実施形態において、閾値は、約１００ｐｍｏｌ／Ｌ以上である。これらの閾値は、下記の較正方法に関連する。該閾値を上回るＰＮＴ値は、対象が、癌となる危険性が増大しており、又はすでの癌であることを意味する。
【００６５】
対象から得られた体液中の、サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片のレベルの決定に加えて；及び／又は該対象から得られた体液中のプロ−ニューロテンシン（ＰＮＴ）又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片の決定に加えて、プロ−エンケファリン（ＰＥＮＫ）又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片は、該対象から得られた体液中で測定されてもよい。ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つの断片のレベルの決定に加えて、プロ−エンケファリン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片が、該対象から得られた体液中で測定されてもよいことは理解されなければならない。これは、ＰＴＡ単独又はＰＥＮＫ若しくはＰＮＴのいずれかと合わせたＰＴＡのレベルが測定され、又はＰＴＡとＰＮＴとＰＥＮＫの決定が組み合わせられ、該危険性と相関させる。
【００６６】
本発明の方法のより具体的な実施形態において、プロ−エンケファリン（ＰＥＮＫ）又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルは、プロ−ニューロテンシン１−１１７のレベルの決定に加えて、及びＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片の決定に加えて決定される。
【００６７】
したがって、本発明の主題はまた、癌を被っていない対象において癌となる危険性を予測し、又はあるいは対象において癌であると診断する方法であり、以下：
−該対象から得られた体液中の、サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを決定し；及び
−該対象から得られた体液中のプロ−ニューロテンシン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを決定し；及び／又は
−該対象から得られた体液中のプロ−エンケファリン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを決定し；及び
ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片及びプロ−ニューロテンシン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片及び／又はプロ−エンケファリン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片と、癌となる危険性を相関させること
を含み、
ここで、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片のレベルの減少が、癌となる危険性の増大又はあるいは癌であるとの診断を予測し、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片のレベルの減少が、癌の診断と相関し、プロ−ニューロテンシン及びその断片のレベルの増加が、癌となる危険性の増大又はあるいは癌と診断を予測し、プロ−ニューロテンシン及びその断片が、癌の診断と相関され、プロ−エンケファリン又はその断片のレベルの減少が、癌となる危険性の増大又はあるいは癌の診断を予測し、プロ−エンケファリン又はその断片のレベルの減少が、癌の診断と相関する。
【００６８】
具体的には、対象は女性であってもよく、癌は乳癌である。女性における上記バイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせ及び乳癌事象の間の相関は、特に注目に値し、本発明によるすべての方法にとって具体的な実施形態である。
【００６９】
プロ−エンケファリン又は断片は、以下の配列を有してもよい：
配列番号２３（プロ−エンケファリン（１−２４３））
ＥＣＳＱＤＣＡＴＣＳＹＲＬＶＲＰＡＤＩＮＦＬＡＣＶＭＥＣＥＧＫＬＰＳＬＫＩＷＥＴＣＫＥＬＬＱＬＳＫＰＥＬＰＱＤＧＴＳＴＬＲＥＮＳＫＰＥＥＳＨＬＬＡＫＲＹＧＧＦＭＫＲＹＧＧＦＭＫＫＭＤＥＬＹＰＭＥＰＥＥＥＡＮＧＳＥＩＬＡＫＲＹＧＧＦＭＫＫＤＡＥＥＤＤＳＬＡＮＳＳＤＬＬＫＥＬＬＥＴＧＤＮＲＥＲＳＨＨＱＤＧＳＤＮＥＥＥＶＳＫＲＹＧＧＦＭＲＧＬＫＲＳＰＱＬＥＤＥＡＫＥＬＱＫＲＹＧＧＦＭＲＲＶＧＲＰＥＷＷＭＤＹＱＫＲＹＧＧＦＬＫＲＦＡＥＡＬＰＳＤＥＥＧＥＳＹＳＫＥＶＰＥＭＥＫＲＹＧＧＦＭＲＦ
【００７０】
体液において決定されてもよいプロ−エンケファリンの断片は、例えば、以下の断片の群から選択されてもよい：
配列番号２４（Ｓｙｎエンケファリン、プロ−エンケファリン１−７３）
ＥＣＳＱＤＣＡＴＣＳＹＲＬＶＲＰＡＤＥＮＦＬＡＣＶＭＥＣＥＧＫＬＰＳＬＫＩＷＥＴＣＫＥＬＬＱＬＳＫＰＥＬＰＱＤＧＴＳＴＬＲＥＮＳＫＰＥＥＳＨＬＬＡ
配列番号２５（Ｍｅｔエンケファリン）
ＹＧＧＦＭ
配列番号２６（Ｌｅｕ−エンケファリン）
ＹＧＧＦＬ
配列番号２７（プロ−エンケファリン９０−１０９）
ＭＤＥＬＹＰＭＥＰＥＥＥＡＮＧＳＥＩＬＡ
配列番号２８（プロ−エンケファリン１１９−１５９、中間領域プロ−エンケファリン、ＭＲＰＥＮＫ）
ＤＡＥＥＤＤＳＬＡＮＳＳＤＬＬＫＥＬＬＥＴＧＤＮＲＥＲＳＨＨＱＤＧＳＤＮＥＥＥＶＳ
配列番号２９（Ｍｅｔ−エンケファリン−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）
ＹＧＧＦＭＲＧＬ
配列番号３０（プロ−エンケファリン１７２−１８３）
ＳＰＱＬＥＤＥＡＫＥＬＱ
配列番号９（プロ−エンケファリン１９３−２０３）
ＶＧＲＰＥＷＷＭＤＹＱ
配列番号３１（プロ−エンケファリン２１３−２３４）
ＦＡＥＡＬＰＳＤＥＥＧＥＳＹＳＫＥＶＰＥＭＥ
配列番号３２（プロ−エンケファリン２１３−２４１）
ＦＡＥＡＬＰＳＤＥＥＧＥＳＹＳＫＥＶＰＥＭＥＫＲＹＧＧＦＭ
配列番号３３（Ｍｅｔ−エンケファリン−Ａｒｇ−Ｐｈｅ）
ＹＧＧＦＭＲＦ
【００７１】
Ｌｅｕ−エンケファリン及びＭｅｔ−エンケファリン又はそれらの断片を含むプロ−エンケファリンのレベルを決定することは、Ｌｅｕ−エンケファリン及びＭｅｔ−エンケファリンを含むプロ−エンケファリン又はその断片に向かった免疫反応性を決定することを意味する。結合の領域に依存して、Ｌｅｕ−エンケファリン及びＭｅｔ−エンケファリン又はそれらの断片を含むプロ−エンケファリンを決定するために使用される結合剤は、上記に提示された分子の１つを超えるものに結合し得る。これは、当業者には明らかである。
【００７２】
本発明による方法のより具体的な実施形態において、
ＤＡＥＥＤＤＳＬＡＮＳＳＤＬＬＫＥＬＬＥＴＧＤＮＲＥＲＳＨＨ  ＱＤＧＳＤＮＥＥＥＶＳ
であるＭＲＰＥＮＫ（配列番号２８：プロ−エンケファリン１１９−１５９、中間領域プロ−エンケファリン−断片、ＭＲＰＥＮＫ）が決定される。
【００７３】
具体的な実施形態において、プロ−エンケファリン又はその断片のレベルは、プロ−エンケファリン又はその断片に結合する抗体又は抗体の断片を用いたイムノアッセイにより測定される。プロ−エンケファリンはその少なくとも５つのアミノ酸の断片の決定に有用であり得るイムノアッセイは、実施例４に概説される工程を含んでもよい。全ての閾値及び値は、実施例４に従って使用される試験及び較正に相関して見る必要がある。当業者は、閾値の絶対値が、使用される較正によって影響を及ぼされ得ることを知っている可能性がある。これは、本明細書に与えられた全ての値及び閾値は、本明細書において使用される較正との関連で理解されなければならないことを意味する（実施例４）。
【００７４】
本発明によれば、プロ−エンケファリン（及び／又はプロ−ニューロテンシン及びその断片）に対する診断的結合剤は、抗体、例えば、ＩｇＧ、典型的な全長イムノグロブリン、又は、例えば、化学的に結合された抗体（断片抗原結合）のように、重鎖及び／又は軽鎖の少なくともＦ可変領域を含有する抗体断片、例えば、限定されないが、Ｆａｂ断片、例えばＦａｂミニボディ、一本鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価Ｆａｂ抗体、例えば、Ｆａｂ−Ｖ５Ｓｘ２；ＣＨ３ドメインで二量体化された二価Ｆａｂ（ミニ抗体）；二価Ｆａｂ又は多価Ｆａｂ、例えば、異種ドメインの助けを借りた多量体化を介して形成されたもの、例えばｄＨＬＸドメインの二量体化を介したもの、例えば、Ｆａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳｘ２；Ｆ（ａｂ’）２−断片、ｓｃＦｖ−断片、多量体化された多価又は／及び多重特異的ｓｃＦｖ−断片、二価及び／又は二重特異的ダイアボディ、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー）、三機能性抗体、多価抗体、例えば、Ｇとは異なるクラス由来のもの；単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ又は魚類のイムノグロブリン由来のナノボディからなる群から選択される。
【００７５】
具体的な実施形態において、プロ−エンケファリン又その断片（及び／又はニューロテンシン及びその断片）は、プロ−エンケファリン又はその断片に結合する、より詳細には以下に記載される、アプタマー、非Ｉｇ足場を含む群から選択される結合剤を用いたアッセイにより測定される。
【００７６】
プロ−エンケファリン又は断片（及び／又はプロ−ニューロテンシン及びその断片）のレベルを決定するために使用され得る結合剤は、少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは１０8Ｍ-1のプロ−エンケファリン（及び／又はプロ−ニューロテンシン及びその断片）に対する親和性定数を示し、好ましい親和性定数は、１０9Ｍ-1より大きく、最も好ましくは１０10Ｍ-1を超える。当業者は、より高い用量の化合物を適用することによって、より低い親和性を相殺されることが考えられる可能性があり、この測定が、本発明の範囲外をもたらさないことを知っている。結合親和性は、サービス分析、例えば、Ｂｉａｆｆｍ，Ｋａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｆｆｍ．ｃｏｍ／ｄｅ／）として提供される、Ｂｉａｃｏｒｅ法を用いて決定されてもよく、同様に上記を参照されたい。
【００７７】
ヒトプロ−エンケファリン対照試料は、ＩＣＩ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｉ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／によって利用可能である。また、アッセイは、合成（ＭＲＰＥＮＫ、配列番号２８）又は組換えプロ−エンケファリン又はその断片によって較正されてもよい。
【００７８】
本発明の方法による、対象における癌、具体的には乳癌となる危険性を決定し、又は対象における癌、具体的には乳癌と診断するためのプロ−エンケファリンの閾値は、約１００ｐｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは約７５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは約５０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは４０．４ｐｍｏｌ／Ｌ以下である。具体的な実施形態において、閾値は、約４０．４ｐｍｏｌ／Ｌである。これらの閾値は、上述した較正方法に関連する。閾値を下回るＰＥＮＫ値は、対象が、癌となる危険性が増大し又はすでに癌であることを意味する。
【００７９】
本発明の一実施形態において、該方法は、女性対象において癌、具体的には乳癌となる危険性をモニターするため、又は治療経過をモニターするために、１回を超えて行われる。具体的な一実施形態において、該モニターリングは、採用された予防的及び／又は治療的測定に対して、該対象の応答を評価するために行われる。
【００８０】
本発明の一実施形態において、該方法は、危険群に該対象、具体的には女性対象を分類するために使用される。
【００８１】
本発明の主題はまた、対象において癌となる危険性、具体的には女性対象において乳癌となる危険性を予測し、又は先行する実施形態のいずれかによる癌、具体的には乳癌となる危険性が増大した対象、具体的には女性対象を同定するための方法であり、ここで、単独で又は他の予測実験室若しくは臨床パラメータと併せて、該対象から得られた体液中のプロ−ニューロテンシン、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルは、以下の選択肢から選択されてもよい方法によって、癌となる対象の危険性を予測するために使用される：
−「健常な」又は「見かけ上健常な」対象の集団において予め決定された試料の集合において、対象から得られた体液中のプロ−タキキニン、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルの中央値との比較。
−「健常な」又は「見かけ上健常な」対象の集団において予め決定された試料の集合において、対象から得られた体液中のプロ−タキキニン、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルの分位点との比較。
−Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄ分析に基づく、又はＮＲＩ（Ｎｅｔ  Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）若しくはＩＤＩ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）などの危険指標計算を用いることによる計算。
【００８２】
本発明の一実施形態において、該方法は、対象において癌となる危険性、具体的には女性対象において乳癌となる危険性をモニターするため、又は治療経過をモニターするために、１回を超えて行われる。具体的な一実施形態において、該モニターリングは、採用された予防的及び／又は治療的測定に対して、該対象の応答を評価するために行われる。
【００８３】
本発明の一実施形態において、該方法は、危険群に該対象を分類するために使用される。
【００８４】
本発明の一実施形態において、癌は、乳癌、及び肺癌を含む群から選択される。
【実施例】
【００８５】
実施例１
ＰＴＡ−イムノアッセイ
抗ＰＴＡ抗体の生成
免疫化のためのペプチド／コンジュゲート：
免疫化のためのペプチドを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）へのペプチドのコンジュゲートのために、追加のＮ末端システイン残基を用いて合成した（ＪＰＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。そのペプチドを、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｅｒｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによってＢＳＡに共有結合で連結した。カップリング手順を、Ｐｅｒｂｉｏのマニュアルに従って実施した。
【００８６】
【表２】
0006317763.tif 000003
【００８７】
抗体を、以下の方法に従って作製した：
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０及び１４日目に１００μｇのペプチド−ＢＳＡコンジュゲート（１００μｌの完全フロイントアジュバント中に乳化）、２１及び２８日目に５０μｇ（１００μｌの不完全フロイントアジュバンド中）で免疫した。融合実験を実施する３日前に、動物に、１回の腹腔内注射及び１回の静脈内注射として与えられる、１００μｌの生理食塩水中に溶解した５０μｇのコンジュゲートを与えた。
【００８８】
免疫したマウスからの脾細胞と、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞を３７℃にて３０分間、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールを用いて融合した。洗浄後に、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種した。ハイブリッドクローンをＨＡＴ培地中での成長によって選択した［２０％のウシ胎仔血清及びＨＡＴサプリメントを補ったＲＰＭＩ１６４０培地］。２週間後に、ＨＡＴ培地を、３回の継代の間、ＨＴ培地に置き換え、それに続いて正常細胞培養培地に置き換えた。
【００８９】
融合の３週間後に、細胞培養上清を抗原に特異的なＩｇＧ抗体について一次スクリーニングした。陽性の試験微量培養を繁殖のために２４ウェルプレートに移した。再試験後に、選択した培養物をクローニングし、限界希釈を使用することで再びクローニングし、アイソタイプを決定した。
【００９０】
（Ｌａｎｅ，  Ｒ．Ｄ．“Ａ  ｓｈｏｒｔ−ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｓｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８１：２２３−２２８；（１９８５），Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．“Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  （ＧＡＤ）  ｉｓ  ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｒａｔ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘａｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＧＡＤ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２８：１１−１５，（１９９６））。
【００９１】
モノクローナル抗体産生
抗体を標準的な抗体製造法によって産生させ（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＡＴＬＡ  ２５，１２１，１９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−クロマトグラフィーによって精製した。抗体純度は、ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づき＞９５％であった。
【００９２】
抗体の標識及びコーティング
以下の手法に従って、アクリジニウムエステルを用いて全ての抗体を標識した：
標識された化合物（トレーサー、抗ＰＴＡ３−２２）：１００μｇ（１００μｌ）抗体（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を１０μｌのアクリジニウムＮＨＳ−エステル（アセトニトリル中１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎ  Ｖｅｎｔ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＥＰ０３５３９７１）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。標識された抗体をＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ４００−５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）上のゲル濾過ＨＰＬＣによって精製した。精製された標識抗体を（３００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＮａ−ＥＤＴＡ、５ｇ／１ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）に希釈した。最終濃度は、２００μｌあたり、標識化合物の約８００，０００相対光単位（ＲＬＵ）（約２０ｎｇの標識抗体）であった。アクリジニウムエステルの化学発光は、ＡｕｔｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９５３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ）を用いて測定された。
【００９３】
固相抗体（コーティングされた抗体）：
固相：ポリスチレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ，Ａｕｓｔｒｉａ）を抗ＰＴＡ２２−３６抗体（１．５μｇ抗体／０．３ｍｌ  １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）でコーティングした（１８時間室温）。５％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、チューブをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、真空乾燥させた。
【００９４】
ＰＴＡイムノアッセイ：
５０μｌのサンプル（又は較正因子）をコーティングしたチューブにピペットで入れ、標識抗体（２００μｌ）を添加後、チューブを２時間１８〜２５℃でインキュベートした。非結合のトレーサーを洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で５回（各１ｍｌ）洗浄することによって除去した。チューブに結合した標識抗体は、Ｌｕｍｉｎｕｍｅｔｅｒ  ＬＢ９５３、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｓｙを用いて測定された。
【００９５】
較正：
２０ｍＭ  Ｋ２ＰＯ４、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、５０μＭアムスタチン、１００μＭロイペプチン、ｐＨ８．０中で希釈した合成Ｐ３７の希釈物を用いてアッセイを較正した。ＰＴＡ対照血漿は、ＩＣＩ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙで入手可能である。
【００９６】
図１は、典型的なＰＴＡ用量／シグナル曲線を示す。
【００９７】
分析アッセイ感度は、（０−較正因子（ＰＴＡの添加なし）＋２ＳＤ２標準偏差（ＳＤ）の２０個の決定によって生じた中央値シグナル、対応するＰＴＡ濃度は標準曲線から計算される）４．４ｐｍｏｌ／Ｌであった。
【００９８】
実施例２
集団研究／ＰＴＡ
方法
本発明者らは、１９９１〜１９９４年のＭａｌｍｏ  Ｄｉｅｔ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ基準試験ベースの集団（年齢５８±６歳）の２５５９人の女性の参加者からの空腹時血漿中のＰＴＡを測定した。本発明者らは、１２年を超える中央値経過観察期間中の最初の事象の試験終点のそれぞれに対する、基準ＰＴＡ（対数変換ＰＴＡの標準偏差増大毎あたりのハザード比）を関連付けるために、多変数補正された（すべての従来の心疾患リスク因子、糖尿病リスク因子、癌の分析において癌の遺伝も同様である）コックス比例ハザードモデルを使用した。終点は、Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，ｔｈｅ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，ｔｈｅ  Ｓｔｒｏｋｅ  ｉｎ  Ｍａｌｍｏ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙを通じて検索した。これらの登録簿を通じた終点の検索は、正当性が立証され、且つ、正確であることがわかっていた（Ｂｅｌｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ；１−１０．２０１２  ＡＣＲも参照されたい）。インスリンは、標準実験室法によって測定された。
【００９９】
【表３】
0006317763.tif 000004
【０１００】
女性集団におけるＰＴＡの分布（Ｎ＝２５５９）：
女性人口におけるＰＴＡの平均値は、５４．３ｐｍｏｌ／Ｌ、標準偏差±＋１．４ｐｍｏｌ／Ｌであった。すべての結果は、アッセイの測定範囲内であった。最も低いＰＴＡ５濃度は９．１ｐｍｏｌ／Ｌであった。これらの結果は、使用したアッセイの適合性を指示する（アッセイ感度４．４ｐｍｏｌ／Ｌ）。
【０１０１】
ＰＴＡ及び乳癌の予測
本発明者らは、ＰＴＡと乳癌の間の関係を評価した（表３）。以前に癌を患っていた全ての女性（Ｎ＝４５９）を評価から除外した。ＰＴＡと女性における乳癌の間に強い関係があった。完全に調整されたモデルにおいて、ＰＴＡの疾患の各ＳＤ（本発明者らは逆四分位、ｒｅｖＰＴＡを使用した。表３／４参照）は、将来の乳癌の危険性を２８．２％増加と関連付け（表３）、ＰＴＡの最高の四分位対最低の四分位は、乳癌の危険性において２．１倍を超える差があると特定した（表５と図２参照）。方程式中のＰＴＡなしのインスリンは、将来の乳癌発症と有意に関連しなかったが、驚くべきことに、ＰＴＡが方程式の一部である場合、インスリンは有意になった（ｐ＝０．０３５）。インスリンの増加は、将来の乳癌のＳＤあたり３４．６％の危険性の減少と関連した。ＰＴＡの予測力はインスリンによって影響されなかった。
【０１０２】
【表４】
0006317763.tif 000005
【０１０３】
【表５】
0006317763.tif 000006
【０１０４】
【表６】
0006317763.tif 000007
【０１０５】
実施例３
プロ−ニューロテンシンアッセイ
抗体を上記のように作製した。標識用抗体（ＬＡ）は、Ｐ−ＮＴ１−１９（Ｈ−ＣＳＤＳＥＥＥＭＫＡＬＥＡＤＦＬＴＮＭＨ（配列番号３３））に対して作製され、固相抗体（ＳＰＡ）は、ペプチドＰ−ＮＴ４４−６２（ＣＮＬＮＳＰＡＥＥＴＧＥＶＨＥＥＥＬＶＡ（配列番号３４））に対して作製された。抗体の開発及び製造を上記のように行った。
【０１０６】
ヒトプロ−ニューロテンシンの定量化のためのアッセイ
使用された技術あ、アクリジニウムエステル標識に基づいて、サンドイッチ被覆されたチューブ発光イムノアッセイであった。
【０１０７】
標識された化合物（トレーサー）：１００μｇ（１００μｌ）ＬＡ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を１０μｌのアクリジニウムＮＨＳ−エステル（アセトニトリル中１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎ  Ｖｅｎｔ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＥＰ０３５３９７１）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。標識されたＬＡをＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ４００−５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）上のゲル濾過ＨＰＬＣによって精製した。精製されたＬＡを（３００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＮａ−ＥＤＴＡ、５ｇ／１ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）に希釈した。最終濃度は、２００μｌあたり、標識化合物の約８００，０００相対光単位（ＲＬＵ）（約２０ｎｇの標識抗体）であった。アクリジニウムエステルの化学発光は、ＡｕｔｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９５３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ）を用いて測定された。
【０１０８】
固相：ポリスチレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ，Ａｕｓｔｒｉａ）をＳＰＡ（１．５μｇ  ＳＰＡ／０．３ｍｌ  １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）でコーティングした（１８時間室温）。５％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、チューブをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、真空乾燥させた。
【０１０９】
較正：
ヒト血清を含有するプロ−ニューロテンシンの希釈物を用いて、アッセイを較正した。高いプロ−ニューロテンシン免疫反応性を有するヒト血清のプール（ＩｎＶｅｎｔ  Ｄｉａｇｏｓｔｉｋａ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、ウマ血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）（アッセイ標準）を用いて希釈された。標準は、ヒトプロ−ニューロテンシン−較正因子（ＩＣＩ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用によって較正された。あるいは、アッセイは、アッセイは、合成若しくは組換えＰ−ＮＴ１−１１７又はその断片によって較正されてもよい（Ｅｍｓｔら、２００６も参照）。
【０１１０】
プロＮＴイムノアッセイ：
５０μｌのサンプル（又は較正因子）をＳＰＡコーティングしたチューブにピペットで入れ、標識ＬＡ（２００μｌ）を添加後、チューブを１６〜２２時間１８〜２５℃でインキュベートした。非結合のトレーサーを洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で５回（各１ｍｌ）洗浄することによって除去した。チューブに結合したＬＡは、Ｌｕｍｉｎｕｍｅｔｅｒ  ＬＢ９５３を用いて測定された。結果は、較正曲線から計算された。典型的な較正曲線を図３に示す。
【０１１１】
実施例４
プロ−エンケファリンイムノアッセイ
抗体の開発
免疫化のためのペプチド／コンジュゲート：
免疫化のためのペプチドを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）へのペプチドのコンジュゲートのために、追加のＮ末端システイン残基を用いて合成した（ＪＰＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。そのペプチドを、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｅｒｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによってＢＳＡに共有結合で連結した。カップリング手順を、Ｐｅｒｂｉｏのマニュアルに従って実施した。
【０１１２】
【表７】
0006317763.tif 000008
【０１１３】
抗体を、以下の方法に従って作製した：
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０及び１４日目に１００μｇのペプチド−ＢＳＡコンジュゲート（１００μｌの完全フロイントアジュバント中に乳化）、２１及び２８日目に５０μｇ（１００μｌの不完全フロイントアジュバンド中）で免疫した。融合融合実験を実施する３日前に、動物に、１回の腹腔内注射及び１回の静脈内注射として与えられる、１００μｌの生理食塩水中に溶解した５０μｇのコンジュゲートを与えた。
【０１１４】
免疫したマウスからの脾細胞と、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞を３７℃にて３０分間、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールを用いて融合した。洗浄後に、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種した。ハイブリッドクローンをＨＡＴ培地中での成長によって選択した［２０％のウシ胎仔血清及びＨＡＴサプリメントを補ったＲＰＭＩ１６４０培地］。２週間後に、ＨＡＴ培地を、３回の継代の間、ＨＴ培地に置き換え、それに続いて正常細胞培養培地に置き換えた。
【０１１５】
融合の３週間後に、細胞培養上清を抗原に特異的なＩｇＧ抗体について一次スクリーニングした。陽性の試験微量培養を繁殖のために２４ウェルプレートに移した。再試験後に、選択した培養物をクローニングし、限界希釈を使用することで再びクローニングし、アイソタイプを決定した。
【０１１６】
（Ｌａｎｅ，  Ｒ．Ｄ．“Ａ  ｓｈｏｒｔ−ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｓｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８１：２２３−２２８；（１９８５），Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．“Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  （ＧＡＤ）  ｉｓ  ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｒａｔ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘａｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＧＡＤ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２８：１１−１５，（１９９６））。
【０１１７】
【表８】
0006317763.tif 000009
【０１１８】
モノクローナル抗体産生
抗体を標準的な抗体製造法によって産生させ（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＡＴＬＡ  ２５，１２１，１９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−クロマトグラフィーによって精製した。抗体純度は、ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づき＞９５％であった。
【０１１９】
抗体の標識及びコーティング
標識された化合物（トレーサー、ＣＴ−ＭＲＰＥＮＫ抗体）：１００μｇ（１００μｌ）抗体（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を１０μｌのアクリジニウムＮＨＳ−エステル（アセトニトリル中１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎ  Ｖｅｎｔ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＥＰ０３５３９７１）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。標識された抗体をＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ４００−５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）上のゲル濾過ＨＰＬＣによって精製した。精製された標識抗体を（３００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＮａ−ＥＤＴＡ、５ｇ／１ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）に希釈した。最終濃度は、２００μｌあたり、標識化合物の約８００，０００相対光単位（ＲＬＵ）（約２０ｎｇの標識抗体）であった。アクリジニウムエステルの化学発光は、ＡｕｔｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９５３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ）を用いて測定された。
【０１２０】
固相抗体（コーティングされたチューブ抗体、ＭＲ−ＭＲＰＥＮＫ抗体）：
固相：ポリスチレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ，Ａｕｓｔｒｉａ）を抗体（１．５μｇ抗体／０．３ｍｌ  １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）でコーティングした（１８時間室温）。５％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、チューブをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、真空乾燥させた。
【０１２１】
プロ−エンケファリンイムノアッセイ：
５０μｌのサンプル（又は較正因子）をコーティングしたチューブにピペットで入れ、標識抗体（２００μｌ）を添加後、チューブを２時間１８〜２５℃でインキュベートした。非結合のトレーサーを洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で５回（各１ｍｌ）洗浄することによって除去した。チューブに結合した標識抗体は、Ｌｕｍｉｎｕｍｅｔｅｒ  ＬＢ９５３、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｓｙを用いて測定された。
【０１２２】
較正：
２０ｍＭ  Ｋ２ＰＯ４、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、５０μＭアムスタチン、１００μＭロイペプチン、ｐＨ８．０中で希釈した合成Ｐ３７の希釈物を用いてアッセイを較正した。プロ−エンケファリン対照血漿は、ＩＣＩ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙで入手可能である。
【０１２３】
図４は、典型的なプロ−エンケファリン用量／シグナル曲線を示す。
【０１２４】
分析アッセイ感度（０−較正因子（ＭＲＰＥＮＫの添加なし）＋２ＳＤ２標準偏差（ＳＤ）の２０個の決定）は、５．５ｐｍｏｌ／Ｌであった。
【０１２５】
実施例５
乳癌予測のためのＰＴＡ、プロ−ニューロテンシンとＨＲＴ、及びＰＴＡ、プロ−ニューロテンシンとプロ−エンケファリンの組み合わせアッセイ
最近、プロ−ニューロテンシンとプロ−エンケファリンが乳癌について高度に予測的であることが示されたため、本発明者らは、乳癌予測についてこれらのバイオマーカーを組み合わせた。本発明者らは、ＰＴＡの増分値を示すために、乳癌について既知の危険因子として、ＨＲＴ（ホルモン補充療法）を加えた。
【０１２６】
最初に、本発明者らは、ＰＴＡ／プロニューロテンシン／ＨＲＴ／インスリンを組み合わせた：
ＰＴＡとプロ−ニューロテンシンの間に有意な相関はなかった（ｐ＝０．７１）。ＰＴＡとＰＮＴを用いたインスリン及びホルモン補充療法（ＨＲＴ）を含む組み合わせモデルにおいて（表８）、本発明者らは、乳癌予測においてそれらはともに独立であることを見出した。両マーカーは、非常に有意であった（ＰＴＡについてｐ＝０．０５、ＰＮＴについてｐ＜０．００１）。
【０１２７】
完全に調整されたモデルにおいて、ＰＮＴの各ＳＤ増加は、将来の乳癌の危険性を４．５．５％と関連付けた。ＰＴＡの各ＳＤ増加は、将来の乳癌の危険性を１８．９％と関連付けた。
【０１２８】
予期した通り、ＨＲＴは、同モデルにおいて有意であったが、インスリンは、驚くべきことに、乳癌の予測に上位であった（ｐ＝０．０２７）。インスリンの各ＳＤ増加は、将来の乳癌の減少を３５。７％と関連付けた。
【０１２９】
これらのデータは、ＰＴＡ、ＰＮＴ、インスリン及びＨＲＴは、それぞれ、乳癌予測に関する有意な情報を加えることを示す。
【０１３０】
【表９】
0006317763.tif 000010
【０１３１】
カプランマイヤー分析において、本発明者らは、ＰＴＡとＰＮＴの組み合わせ情報、表９及び図５を示す。
【０１３２】
本発明者らは、ＰＴＡとＰＮＴの四分位を組み合わせた：
低いＰＴＡ値が乳癌発症の危険性の増加を示すため、本発明者らは、ＰＴＡ四分位を逆転させた（ｒｅｖＰＴＡ）：第１四分位ＰＴＡ＝第４四分位ＰＴＡ  ｒｅｖＰＴＡ；第２四分位ＰＴＡ＝第３四分位  ｒｅｖＰＴＡ；第３四分位ＰＴＡ＝第２四分位  ｒｅｖＰＴＡ；第４四分位ＰＴＡ＝第１四分位  ｒｅｖＰＴＡ（表９）。
【０１３３】
【表１０】
0006317763.tif 000011
【０１３４】
最も高い四分位のＰＮＴと最も低いＰＴＡ四分位（グループ６）の組み合わせ対最も低いＰＮＴと最も高いＰＴＡ四分位（グループ１）は、将来の乳癌について４．９の組み合わせ危険性を示した（図５参照）。
【０１３５】
女性集団におけるＰＴＡ、プロエンケファリン、ＨＲＴ、インスリン及びＰＮＴの組み合わせ分析：
ＰＴＡとプロ−エンケファリンの間に有意な相関があった（ｐ＝０．００１、ｒ＝０．３５）。インスリン、ＰＴＡ、ＰＮＴとプロ−エンケファリンを含む組み合わせモデルにおいて、本発明者らは、全てのマーカーが、乳癌予測についての情報を独立して追加することを見出した（表１０）。全てのマーカーは、非常に有意であった（ＰＴＡについてｐ＝０．０２８、ＰＮＴについてｐ＜０．００１、インスリンについてｐ＝０．００９、及びプロエンケファリンについてｐ＜０．００１）。ＰＴＡは独立したままであるが、それは、プロエンケファリンに非常に相関する。
【０１３６】
完全に調整されたモデルにおいて、ＰＮＴの各ＳＤ増加は、将来の乳癌の４７．８％危険性増加と関連付けた。ＰＴＡの増加は、将来の乳癌の１５．８％危険性減少（ＳＤあたり）と関連付けた。プロ−エンケファリンの増加は、将来の乳癌の２６．４％危険性減少（ＳＤあたり）と関連付け、インスリンの増加は、将来の乳癌の４０．４％危険性減少（ＳＤあたり）と関連付けた。
【０１３７】
これらのデータは、ＰＴＡ、ＰＮＴ、プロ−エンケファリン及びインスリンによる、強い独立性と将来の乳癌発症に関する追加情報を示す。
【０１３８】
【表１１】
0006317763.tif 000012
【図１】
0006317763.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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