(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドとラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはラクトフェリンの生物活性を有するラクトフェリン由来のペプチドとの融合タンパク質であって、
（ＬＦ−ｓ−Ｙ）ｎ  又は  （Ｙ−ｓ−ＬＦ）ｎ
〔式中、ＬＦはラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはラクトフェリンの生物活性を有するラクトフェリン由来のペプチド、ＹはＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチド、ｓは０〜１０個の任意のアミノ酸の配列、ｎは１〜１０の整数を表す〕
で表される融合タンパク質、又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体。
【請求項２】
ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドが、ＩｇＧ、ＩｇＧの重鎖、ＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン、アルブミン又はアルブミンのＦｃＲｎ結合領域のいずれかを含む、請求項１記載の融合タンパク質、又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体。
【請求項３】
融合タンパク質が、単量体又は二量体（ｎ＝１又は２）である、請求項１又は２記載の融合タンパク質、又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体。
【請求項４】
融合タンパク質が、単量体である、請求項１又は２記載の融合タンパク質、又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体。
【請求項５】
融合タンパク質が、天然又は遺伝子組換え型ラクトフェリンの５０％以上の鉄キレート能を保持している、請求項１〜４のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体。
【請求項６】
融合タンパク質は、ラクトフェリン受容体、ＩｇＧ受容体及びアルブミン受容体からなる群より選択される少なくとも1つの受容体を介して取り込まれるものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体。
【請求項７】
融合タンパク質は、天然又は遺伝子組換え型ラクトフェリンと比べてキモトリプシン耐性が向上したものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の融合タンパク質又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体をコードする核酸分子。
【請求項９】
請求項８記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項８記載の核酸分子を含む非ヒト遺伝子組換え動物。
【請求項１２】
請求項８記載の核酸分子を含む遺伝子組換え植物。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項記載の融合タンパク質又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体を含む、ラクトフェリンによって改善される疾患の治療剤。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項記載の融合タンパク質又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体及び担体を含む、医薬品組成物。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項記載の融合タンパク質又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体の製造方法であって、この融合タンパク質又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体をコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養して融合タンパク質を発現させ、この宿主細胞又はその培地から融合タンパク質又はラクトフェリンの生物活性を保持しているその改変体を回収することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された特性を有するラクトフェリン融合タンパク質、その用途及びその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリンは、主に哺乳動物の乳汁中に存在し、好中球、涙、唾液、鼻汁、胆汁、精液などにも見出されている、分子量約８０，０００の糖タンパク質である。ラクトフェリンは、鉄を結合することから、トランスフェリンファミリーに属する。ラクトフェリンの生理活性としては、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用などが知られている。さらに、最近、ラクトフェリンが脂質代謝改善作用、鎮痛・抗ストレス作用、アンチエイジング作用を有することも明らかにされている。このように、ラクトフェリンは、多様な機能を示す多機能生理活性タンパク質であり、健康の回復又は増進のため、医薬品や食品などの用途に使用されることが期待されており、ラクトフェリンを含む食品は既に市販されている。
【０００３】
ラクトフェリンは、経口的に摂取した場合、胃液中に存在する酸性プロテアーゼのペプシンにより加水分解を受け、ペプチドに分解されるため、ラクトフェリン分子としてはほとんど腸管まで到達することができない。しかし、ラクトフェリン受容体は消化管では小腸粘膜に存在することが知られており、最近、ラクトフェリンが腸管から体内に取り込まれて、生物活性を発現していることが明らかにされている。そのため、ラクトフェリンの持つ生物活性を発揮させるには、ラクトフェリンを胃液中でのペプシンによる加水分解を受けない状態で腸管まで到達させることが重要である。また、注射剤とした場合、キモトリプシンやエラスターゼといった組織、器官に含まれるプロテアーゼによる分解に曝されるため、体内での投与組織、器官での安定性を増加させるためには、これらのプロテアーゼに対する抵抗性を付与することが実用上重要である。
【０００４】
ＩｇＧ抗体は、生体内で新生児Ｆｃ受容体（neonatal Fc receptor；以下「ＦｃＲｎ」という）を介したリサイクリング機構により分解が抑制されるため、血中半減期が長いことが知られている。また、抗体薬は、特定のタンパク質やペプチドなどに標的が限定され、作用メカニズムが限定されるため、従来の合成化合物と比べ、副作用は少ないと考えられている。
【０００５】
ＩｇＧ抗体やそのＦｃ領域を用いた融合タンパク質を利用する生物学的製剤の概念自体は、従来知られており、例えば、腎移植後の急性拒絶反応を抑制する薬として１９８６年にＣＤ３をターゲットとする抗体医薬品が承認され、長く使用されている。
【０００６】
しかし、一般に融合タンパク質は、融合によって活性部位が影響を受けることにより、融合されていないタンパク質と比べ、生物活性が低減されることも頻繁に観察されている。例えば、ＴＰＯＲ結合擬似ペプチドは、内在性のＴＰＯと比べ、ＴＰＯＲとの結合量には遜色はないが、インビトロ試験において生物活性は若干低い傾向があった。
【０００７】
さらに、ＩＦＮ−αとＦｃ領域とを結合してＩＦＮ−αの血中半減期を増加させた融合タンパク質については、血中半減期は大幅に増加されたものの、ＩＦＮ−αの生理活性は低下してしまうという欠点がある。したがって、望ましい特性を備えた融合タンパク質を作製するための条件等については、タンパク質ごとに充分に検討されなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１０５０４４号公報
【特許文献２】特許第４２３４４３８号公報
【特許文献３】特表２０１１−５２３３５１号公報
【特許文献４】特表２００４−５２１６５５号公報
【特許文献５】米国特許第５，７２３，１２５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Jazayeri, J.A. et al., Biodrugs, 22, 11-26 (2008)
【非特許文献２】Yeung, Y.A. et al., J.Immunol., 182, 7663-7671 (2009)
【非特許文献３】Suzuki, T. et al., J.Immunol., 184, 1968-1976 (2010)
【非特許文献４】Batra, J. K., et al., Mol Immunol., 30, 379-386, (1993)
【非特許文献５】Dimitrov, D. S., mAbs, 1, 26-28 (2009)
【非特許文献６】Gong, R. et al., J.Biol.Chem., 286, 27288-27293 (2011)
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、抗原性を低減し、プロテアーゼ耐性を付与し、経口、組織、器官投与を可能にし、体内寿命を延ばした、臨床的有用性の高いラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法等を提供することを目的とする。さらに、天然ラクトフェリンの生物活性を保持し、体内寿命が有意に延長されており、臨床的有用性が天然ラクトフェリン及び遺伝子組換え型ラクトフェリンよりも優れたラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法等を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明者らは、天然物と遜色ない高次構造を有するラクトフェリンであって、生理活性が損なわれていないうえに、長い半減期を維持するラクトフェリンを創出すべく鋭意努力し、ラクトフェリンタンパク質にＦｃＲｎ結合タンパク質（Ｆｃ領域）を融合させたものを製造し、血中での安定性を調べた結果、Ｆｃ領域と融合させたラクトフェリンタンパク質は、融合をしていないものと比べて半減期が5.4倍に顕著に増大されたことを見出した。また、ＣＤスペクトルと鉄結合能の測定の結果から、融合タンパク質において、Ｆｃ領域と融合されることによるラクトフェリン自体の立体構造の変化は見られず、熱安定性についても立体構造が少なくとも３０℃以上、さらには６５℃以上でも維持され、生物活性についても全く損なわれていないという全く予期しない結果であることを見出し、さらに、製造されたラクトフェリン融合タンパク質はプロテアーゼに対する抵抗性を有し、最も重要な生物活性である鉄キレート能も保存されているという結果を得、本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明は、
〔１〕  ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドとラクトフェリンとの融合タンパク質であって、
（ＬＦ−ｓ−Ｙ）ｎ  又は  （Ｙ−ｓ−ＬＦ）ｎ
〔式中、ＬＦはラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチド、ＹはＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチド、ｓは０〜１０個の任意のアミノ酸の配列、ｎは１〜１０の整数を表す〕
で表される融合タンパク質、又はその改変体；
〔２〕  ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドが、ＩｇＧ、ＩｇＧの重鎖、ＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン、アルブミン又はアルブミンのＦｃＲｎ結合領域のいずれかを含む、〔１〕記載の融合タンパク質、又はその改変体；
〔３〕  融合タンパク質が、単量体又は二量体（ｎ＝１又は２）である、〔１〕又は〔２〕記載の融合タンパク質、又はその改変体；
〔４〕  融合タンパク質が、単量体である、〔１〕又は〔２〕記載の融合タンパク質、又はその改変体、又はその改変体；
〔５〕  融合タンパク質が、天然ラクトフェリンの５０％以上の鉄キレート能を保持している、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はその改変体；
〔６〕  融合タンパク質は、ラクトフェリン受容体、または/かつ  ＩｇＧ/アルブミン受容体を介して取り込まれるものである、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はその改変体。
〔７〕  融合タンパク質は、天然又は遺伝子組換え型ラクトフェリンと比べてキモトリプシン耐性が向上したものである、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はその改変体。
〔８〕  〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体をコードする核酸分子；
〔９〕  〔８〕記載の核酸分子を含む発現ベクター；
〔１０〕  〔９〕記載の発現ベクターを含む宿主細胞；
〔１１〕  〔８〕記載の核酸分子を含む非ヒト遺伝子組換え動物；
〔１２〕  〔８〕記載の核酸分子を含む遺伝子組換え植物；
〔１３〕  〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体を含む、ラクトフェリンによって改善される疾患の治療剤；
〔１４〕  〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体及び担体を含む、医薬品組成物；
〔１５〕  〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体の製造方法であって、この融合タンパク質又はその改変体をコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養して融合タンパク質又はその改変体を発現させ、この宿主細胞又はその培地から融合タンパク質又はその改変体を回収することを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明の融合タンパク質又はその改変体（以下、「融合タンパク質等」と表記することがある）は、ラクトフェリンが有する鉄の結合能が保持されており、したがって、少なくとも鉄結合能に基づくラクトフェリンの重要な生物活性が保持されている。また、体内寿命が長く、プロテアーゼに対する抵抗性を有しているため、体内で長時間にわたって生物活性を発揮することができる。さらに、融合タンパク質にすることによって胃でのペプシンによる消化分解を受けにくくなっているため、さらなる腸溶化のための製剤的な処理を行わなくても、充分に腸内に到達しうる。
【００１４】
また、本発明の融合タンパク質等は、遺伝子組換えによって製造されることによって、製造管理・品質管理の点でも有利であり、医薬品成分としての使用に特に適している。即ち、本発明にしたがった融合タンパク質等及び融合タンパク質等の製造方法により、ラクトフェリンを医薬品成分としてさらに有用性の高い形とすることができる。ラクトフェリンは、安全性が非常に高く、多様な生物活性を有するので、本発明により、有効な治療薬がない疾患又は症状の治療薬又は予防薬として、さらに有利に適用が可能となる。例えば、生活習慣病（動脈硬化、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧、糖尿病、脂肪肝など）、がん（発がん予防、がんの二次予防、転移抑制、制癌剤の作用増強など）、自己免疫疾患（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎、悪性関節リウマチ、膠原病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、全身性紅斑性狼蒼など）、精神神経疾患（痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、テンカン、うつ病、ヒキコモリ、統合失調症、各種ストレス性疾患、更年期障害など）、疼痛緩和（モルヒネ等のオピオイド増強作用、がん性疼痛、神経因性疼痛、ヘルペス後疼痛、線維筋痛症、術後疼痛、舌痛症、生理痛、歯痛、関節痛、更年期障害など）、肝炎（各種ウイルス性肝炎、非アルコール性肝炎、肝硬変など）、炎症性腸疾患（大腸性潰瘍炎、クローン病など）、過敏性腸症候群、前立腺肥大、頻尿、不眠症、便秘などへ適応を拡大できる。さらに、ラクトフェリンは、抗菌・抗ウイルス作用及び免疫能賦活作用があるので、本発明の融合タンパク質又はそれを含む医薬品組成物は、各種感染症及びそれに基づく炎症、例えば、ヘリコバクター・ピロリ菌の胃粘膜感染、歯周病、歯槽膿漏、口臭、口腔カンジダ症、口内炎、口角炎、鼻炎、食道炎、胆嚢炎、尿路感染症、膣感染症、水虫、ニキビ、ヘルペス属ウイルスの感染症、老人性肺炎、術後感染症などへの適用も可能であり、また、抗生物質の作用を増強する作用がある。一方、ラクトフェリンは免疫的な寛容をもたらす作用もあり、本発明の融合タンパク質又はそれを含む医薬品組成物は、花粉症、アトピー性皮膚炎、脂漏症、蕁麻疹等のアレルギー性疾患にも適用可能である。注目すべきことは、ラクトフェリンには鉄キレート作用に基づく強い抗酸化ストレス作用があり、本発明の融合タンパク質又はそれを含む医薬品組成物は、ウィルソン病、劇症肝炎などや、肌や眼の抗加齢・若返り作用、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、粘膜上皮細胞の角化抑制・若返り作用などへの適用も可能である。
また、本発明の融合タンパク質は、ラクトフェリン受容体、ＩｇＧ受容体及びアルブミン受容体からなる群より選択される少なくとも1つの受容体を介して細胞に取り込まれるため、副作用が低いことが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、全長ヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）ｃＤＮＡを含むベクターｐＢＳIIＬｆＡＬにＢａｍＨＩサイトを含む合成オリゴヌクレオチドを挿入し、ｐＢＳIIＬｆＡＬ／Ｂａｍを作製する方法の概略を表す図である。
【図２】図２は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３のゲノム配列をもつベクターｐＴｅｕＩｇＧの構造及びこのベクターへのｈＬＦｃＤＮＡの挿入を表す図である。
【図３】図３は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＣＨ２、ＣＨ３のｃＤＮＡ配列をもつベクターｐｍＩｇＧの構造及びこのベクターへのｈＬＦｃＤＮＡの挿入を表す図である。
【図４】図４は、ＤＧ４４細胞用発現ベクターｐＯｐｔｉ-ＶＥＣにベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II（Stratagene社）のＴ７プライマー結合部位からＴ３プライマー結合部位までの領域を挿入し、ベクターｐＯｐｔｉ-ＶＥＣ-ＭＣＳを作製する方法の概略を表す図である。
【図５】図５は、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）発現ベクター及びヒンジ欠損融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）発現ベクターの作製方法の概略を表す図である。ｐＴｅｕＩｇＧ／ｈＬＦのｈＬＦ、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３のゲノム配列を含む領域、又は ｐｍＩｇＧ／ｈＬＦのヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２、ＣＨ３のｃＤＮＡ配列を含む領域をＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片として切り出し、ｐＯｐｔｉＶＥＣ-ＭＣＳ のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。
【図６】図６は、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）をＤＧ４４細胞に発現誘導させた際の発現量を表す図である。
【図７】図７は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃをＤＧ４４細胞に発現誘導させた際の発現量を表す図である。
【図８】図８は、ヒンジ付加融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）の精製を表す図である。
【図９】図９は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの精製を表す図である。
【図１０】図１０は、ヒンジ付加融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）の硫酸アンモニウム沈殿による濃縮を表す図である。
【図１１】図１１は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの硫酸アンモニウム沈殿による濃縮を表す図である。
【図１２Ａ】図１２は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の二次構造の相同性を表す図である。パネルＡはｈＬＦのＣＤスペクトルを表す。
【図１２Ｂ】図１２は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の二次構造の相同性を表す図である。パネルＢはヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃのＣＤスペクトルを表す。
【図１２Ｃ】図１２は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の二次構造の相同性を表す図である。パネルＣはヒンジ付加融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）のＣＤスペクトルを表す。
【図１３Ａ】図１３は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性を表す図である。パネルＡはｈＬＦのＣＤスペクトルを表す。
【図１３Ｂ】図１３は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性を表す図である。パネルＢはヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃのＣＤスペクトルを表す。
【図１３Ｃ】図１３は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性を表す図である。パネルＣはヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）のＣＤスペクトルを表す。
【図１４】図１４は、ヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の分解を表す図である。
【図１５Ａ】図１５−Ａは、ヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の３７℃、３週間後の分解物を表す図である。
【図１５Ｂ】図１５−Ｂは、ヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の模式図とその分解箇所を表す図である。
【図１６】図１６は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの血中安定性を表す図である。
【図１７Ａ】図１７−Ａは、発現ベクターｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃがコードするヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）／ヒトＩｇＧＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号５）を表す図である。二重線はスペーサーアミノ酸、斜字体はヒンジ領域のアミノ酸、下線つきの太字はＣＨ２ドメインのアミノ酸、太字はＣＨ３ドメインのアミノ酸の配列をそれぞれ表す。
【図１７Ｂ】図１７−Ｂは、発現ベクターｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃがコードするｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号６）を表す図である。二重線はスペーサーアミノ酸、下線つきの太字はＣＨ２ドメインのアミノ酸、太字はＣＨ３ドメインのアミノ酸の配列をそれぞれ表す。
【図１８】図１８は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの血清溶液中での安定性を示す図である。
【図１９】図１９は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの小腸上皮様細胞への取り込みを表す図である。
【図２０】図２０は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃのキモトリプシン耐性を表す電気泳動写真である。
【図２１】図２１は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃのキモトリプシン耐性を表す図である。
【図２２】図２２は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃが溶液中でホモダイマーを形成することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2012年4月23日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2012-098085号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明の融合タンパク質は、ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドとラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとの生物学的に活性な融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質においてラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドと結合されるタンパク質又はペプチドは、一般に、ＦｃＲｎに結合することの知られている配列を含むタンパク質やペプチドであり、生体に対して適合可能又は薬理学的に不活性であればよい。例えば、血液成分タンパク質であるＩｇＧ又はアルブミンはＦｃＲｎに結合することが知られている。したがって、本発明において使用されるＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドとしては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６、ＩｇＧ７）、ＩｇＧの重鎖、ＩｇＧの重鎖にあるＦｃ領域、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、アルブミン、アルブミンのＦｃＲｎ結合領域を含む領域が挙げられる。これらのタンパク質及びペプチドのアミノ酸配列は公知であり、本発明において使用される場合、天然の配列と同一であってもよく、また、変異を有していてもよい。
【００１７】
好ましくは、本発明において使用されるＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドは、ラクトフェリンと融合させた状態から分解しにくいものが良い。例えば、ＩｇＧのヒンジ領域を含むＦｃ領域を使用するとヒンジ領域がジスルフィド結合を形成することにより二量体形態の融合タンパク質が形成されるが、ヒンジ領域はプロテアーゼに対して感受性が高いため、ヒンジ領域を含まないもの、又はヒンジ領域のシステインを他のアミノ酸で置換したり、システインの位置を変更したものを使用することができる。あるいは、糖鎖付加部位を含む他のアイソタイプ由来のヒンジ領域と入れ替えることで、糖鎖によりプロテアーゼ耐性を増大させてもよく（特許文献２）、これらもＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドに含まれる。
ヒンジ領域のプロテアーゼによる分解を防ぐためには、ヒンジ領域を削除することにより、ヒンジ欠損型融合タンパク質を作製する方法が好ましい。この融合タンパク質はヒンジ領域を持たないことから、エフェクター機能に関わるＦｃγレセプターや、補体への結合低下が考えられ、副作用につながるエフェクター機能を介した細胞障害や、血中からの融合タンパク質の排除につながるエフェクター機能を介した免疫反応の活性化が軽減し、ヒンジ領域を有するもの（ヒンジ付加型融合タンパク質等）と比較して有利である。
【００１８】
このようなＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドは、ＦｃＲｎ結合領域に加えて、他の配列を含んでいてもよく、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭなどの多量体を形成するＪ鎖が含まれる配列を付加することによって、さらに多量体化することができる。
ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドとは、融合タンパク質においてどちらをＮ末端側又はＣ末端側に位置させてもよいが、ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドをＮ末端側、ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドをＣ末端側とすることが好ましい。したがって、本発明の融合タンパク質としては、（ＬＦ−Ｙ）ｎで表されるもの、及び／又は前記〔１〕の式においてｎ＝１又は２のものが好ましく、（ＬＦ−Ｙ）ｎで表されるものであってｎ＝１のものがさらに好ましい。なお、後述するように、ＬＦとＹとの間に付加的な配列が存在してもよい。
【００１９】
本発明の融合タンパク質等において使用される「ラクトフェリン」（ＬＦ）又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドは、遺伝子組換え型（一部のアミノ酸が置換された改変型を含む）ラクトフェリンであって、使用される配列の由来する生物種及び改変の有無などは問わない。例えば、ラクトフェリンは、ヒト及び種々の動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ等）から得られる天然のラクトフェリンと同一のアミノ酸配列を有していてもよいし、目的とするラクトフェリンの生理活性を有する限りにおいて、一部のアミノ酸が欠失、付加、置換していてもよい。ラクトフェリンの機能的（生物活性を有する）断片、ペプチドは、種々のものが公知であり（例えば、「プログラム・抄録集第２回  臨床ラクトフェリンシンポジウム２００９」、２１〜２７頁（島崎敬一）、Peptides. 2011 Sep;32(9):1953-63. Epub 2011 Jul 30, Discovery and development of asynthetic peptide derived from lactoferrin for clinical use, Brouwer CP, Rahman M, Welling MM、Biometals. 2010 Jun;23(3):493-505. Epub 2010 Mar 18, The human lactoferrin-derived peptide hLF1-11 primes monocytes for an enhanced TLR-mediated immune response, van der Does AM, Bogaards SJ, Jonk L, Wulferink M, Velders MP, Nibbering PH、J Agric Food Chem. 2010 Jun 9;58(11):6721-7, Antihypertensive properties of lactoferricin B-derived peptides, Ruiz-Gimenez P, Ibanez A, Salom JB, Marcos JF, Lopez-Diez JJ, Valles S, Torregrosa G, Alborch E, Manzanares P）、必要に応じて設計することができる。
【００２０】
本発明の融合タンパク質等に関して「生物（学的）活性」とは、特にことわらない限り、ラクトフェリンの生理薬理活性を意味する。特に、本発明の融合タンパク質等は、天然ラクトフェリン（又は天然と同等の配列を有する組換え型ラクトフェリン）と同等の鉄キレート（結合）能を有している。具体的には、後述する実施例の方法で測定して天然ラクトフェリン（又は天然と同等の配列を有する組換え型ラクトフェリン）の鉄結合能を１００％とした場合に、本発明の融合タンパク質等は、少なくとも５０％以上（例えば約５０％〜約１５０％又は約５０％〜約１２０％）の鉄結合能を保持しており、好ましい態様においては、本発明の融合タンパク質等は、天然ラクトフェリン（又は天然と同等の配列を有する組換え型ラクトフェリン）の約７０％〜約１００％又はそれ以上（例えば約７０％〜約１５０％又は約７０％〜約１２０％）、さらには約９０％以上に相当する鉄結合能を有する。なお、鉄結合能は、実施例に記載した方法又はそれと同等の方法によって測定する場合、±２０％程度の誤差がありうる。
【００２１】
本発明の融合タンパク質は、さらに、付加的なアミノ酸配列及び（又は）糖鎖等を含んでいてもよい。ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドと、ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとの間に、スペーサー配列として適切な長さの任意のアミノ酸配列を有することができる。スペーサー配列（ｓ）は、例えば０〜１０個、又は０〜５個の任意のアミノ酸の配列であることができる。その他の付加的な配列は、スペーサー配列のような立体構造上の利点を提供するものであってもよく、また、例えばシグナルペプチドや精製に利用されるタグ配列のように、何らかの機能を融合タンパク質に与えるものであってもよく、これらを有するものを改変体と称する。
【００２２】
本発明の融合タンパク質等は、遺伝子組換えにより製造することができる。所望のアミノ酸配列を有するラクトフェリン遺伝子とＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドの遺伝子とを、常法により連結し、所望の宿主細胞において発現させるのに必要なその他の要素を含む発現ベクターを構築し、このベクターを宿主細胞に導入して融合タンパク質を発現させ、発現された融合タンパク質を細胞又は培地から回収することができる。
【００２３】
本発明の融合タンパク質等をコードする核酸分子は、公知の配列及び標準的な遺伝子操作技術によって設計し、作製することができる。ラクトフェリン及びＦｃＲｎ結合領域含有タンパク質をコードする遺伝子は、公知の核酸又はアミノ酸配列に基づくプローブを用いて、一般に利用可能な種々のゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって合成することにより、得ることができる。これらの遺伝子に所望の改変を加えたり変異を導入してもよい。
【００２４】
核酸分子を複製するために使用する宿主細胞及びベクター系、及び融合タンパク質を発現させるために使用する宿主及びベクター系は、公知の多数の真核細胞（哺乳動物細胞、植物細胞、酵母、昆虫細胞など）及び原核細胞（細菌など）の系から適宜選択して使用することができる。
本発明の融合タンパク質を発現させるためのベクターは、ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドをコードする配列及びＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドをコードする配列（又は、ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドをコードする配列及びラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドをコードする配列）に加えて、一般に、作動可能に連結された状態で、転写プロモーター、分泌シグナルペプチド配列、転写ターミネーター、ポリＡシグナルなどの要素を含み、さらに通常、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを含む。
【００２５】
これらのベクターを用いて、公知の種々の技術にしたがって宿主細胞を形質転換することができる。
【００２６】
本発明の融合タンパク質等は、遺伝子組換え植物及び遺伝子組換え動物を製造することによって、これらの動物及び植物に産生させることができる。例えば、ヒツジ、ヤギなどの非ヒト動物のゲノムに本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を組み込むことにより、本発明の融合タンパク質を乳汁中に分泌させるようにすることができる。また、植物に組み込むことによって本発明の融合タンパク質等を産生する有用植物を製造することもできる（例えば特表２００４−５２８０２２号公報）。
【００２７】
本発明の融合タンパク質等は、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞の培地などから、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィー技術を適宜用いて単離精製することができる。特に好ましい精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。
【００２８】
ラクトフェリンは、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用、脂質代謝改善作用、鎮痛作用、抗ストレス作用などを含む広範な生理活性を有しており、これらの作用によって、生活習慣病（例えば、高コレステロール血症、高脂血症など）、疼痛管理（がん性疼痛、神経因性疼痛など）、膠原病（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎など）、歯周病、Ｃ型肝炎などを含む、多くの疾患又は症状の治療（改善を含む）及び予防が可能である。
【００２９】
本発明の融合タンパク質等は、ラクトフェリンの生物活性を充分に保持しているので、単独で、又は他の薬剤と組合せて、ラクトフェリンが有効である疾患の予防又は治療剤として、投与することができる。また、本発明の融合タンパク質等は、製剤学の分野で公知の各種の担体、治療上不活性な基剤及び／又は添加物を配合することによって、所望の剤型の医薬品組成物とすることができる。便宜上、本発明に関して医薬品又は医薬品組成物というときは、投与対象が人の場合のほか、動物である場合（即ち、獣医薬等）も含む。このような医薬品組成物に含有させることができる各種成分及び剤型は当業者には充分に公知である。
【００３０】
本発明の融合タンパク質等を含む治療剤又は医薬品組成物の有効投与量は、治療又は予防すべき疾患又は症状の種類や程度、投与対象の状態、剤型、投与経路などによって異なり、公知の有効ラクトフェリン量を目安に適宜選択することができる。一般に、公知の有効ラクトフェリン量と比較して有意に少ない用量（例えばラクトフェリン量換算で１／２〜１／２０量）とすることができ、同等の用量で用いるのであれば投与回数を減らすことが可能である。
【００３１】
実施例  以下に、実施例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１：ヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）とヒンジ領域を含むヒトＩｇＧＦｃ領域との融合タンパク質の作製及び生物活性評価
１．ヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）遺伝子のクローニング
ヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）ｃＤＮＡは、ヒトｃＤＮＡライブラリー（商品名「Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ   ｃＤＮＡ」、クロンテック社）からＰＣＲ法により取得した。フォーワード側プライマーとして、Ｓ＿ＬＦｅｘ＿ＸｈｏＩ＿ＡＴＧ（配列番号１；５’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＡＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＴＣ（開始コドンであるＡＴＧの上流に下線部ＸｈｏＩサイトを導入）、リバース側プライマーとして、ＡＳ＿ＬＦｅｘ＿ＴＡＡ  ＿ＸｂａＩ（配列番号２；５’−ＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣ（終止コドンＴＡＡの下流に下線部ＸｂａＩサイトを導入）を用い、ＤＮＡ合成酵素は「ＫＯＤ−ｐｌｕｓ」（商品名、東洋紡社）を使用して、ｈＬＦ  ｃＤＮＡを増幅した。
得られたＤＮＡ断片に、Ａを付加し、「ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター」（商品名、インビトロジェン社）にクローニングした。その後、このベクターをＸｈｏＩとＸｂａＩで消化することにより、ｈＬＦ  ｃＤＮＡのＤＮＡ断片を切り出し、予めＸｈｏＩとＸｂａＩで消化したベクター「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II」（商品名、Stratagene社）にクローニングした。このベクターを、「ｐＢＳIIＬｆＡＬ」と命名した。ｈＬＦ  ｃＤＮＡの塩基配列は、ジデオキシ法シークエンシングで確認した。ｐＢＳIIＬｆＡＬには、ｈＬＦ遺伝子全長がベクターのＸｈｏＩ及びＸｂａＩ制限酵素サイトに挟まれる形でクローン化されている。ｐＢＳIIＬｆＡＬの構造を図１（左図）に示す。
【００３３】
上記で作製した、ｈＬＦ遺伝子全長を含むベクターｐＢＳIIＬｆＡＬを用いて、ｈＬＦ遺伝子３’末端側に存在するＥｃｏＲＩとＸｂａＩとの間にＢａｍＨＩサイトを導入したベクター、ｐＢＳIIＬｆＡＬ／Ｂａｍを作製した。合成オリゴヌクレオチドＥｃｏ＿ｈＬＦ＿Ｂａｍ−Ｓ（配列番号３；５’−ＡＡＴＴＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＴＣＣＴ−３’）及びＥｃｏ＿ｈＬＦ＿Ｂａｍ−Ａ（配列番号４；５’−ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧ−３’）を用意し、それぞれ１００μＭの濃度で滅菌水に溶解した。その後、以下の表１に示した試薬を混合して、サンプル溶液とした。
【００３４】
【表１】
0006356115.tif 000002
【００３５】
このサンプル溶液を７０℃に加熱後、ゆっくり室温まで冷却させることでアニーリングさせ、二本鎖ＤＮＡを形成させた（アニーリングオリゴ）。ＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで完全消化したｐＢＳIIＬｆＡＬ（１０ng/μl）を用意し、以下の表２に示した試薬を混合して、１６℃で３０分間ライゲーションした。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
このライゲーション溶液５μlとコンピテントセルＴＯＰ１０  ５０μlとを混合し、氷上で３０分インキュベートした。その後、４２℃で４０秒間、コンピテントセルにヒートショックをかけ、氷上で２分間静置後、ＳＯＣ培地を１００μl加え、３７℃で１時間インキュベートした。１時間インキュベートしたサンプルを、アンピシリン入りＬＢ寒天培地に播き、３７℃で一晩培養した。翌日、得られたコロニーを１．５mlのＬＢ液体培地（１００μg/mlアンピシリン入り）中で３７℃、２００rpmの条件下で、一晩、振とう培養した。
【００３８】
プラスミドＤＮＡ抽出は、「ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ」（商品名、QIAGEN社）を用いて行った。アニーリングオリゴとｐＢＳIIＬｆＡＬとのライゲーションは、アニーリングオリゴ近傍の塩基配列を解読することで確認した。作製したベクターを、ｐＢＳIIＬｆＡＬ／Ｂａｍと命名した（図１、右）。
【００３９】
２．ヒンジ領域を含むｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質発現ベクターの構築
２−１  ｐＴｅｕＩｇＧ／ｈＬＦの構築
ｈＬＦとヒトＩｇＧＦｃ（ｈＩｇＧＦｃ）との融合タンパク質（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）がヒンジ領域でジスルフィド（ｓ−ｓ）結合により二量体化した構造の融合タンパク質（ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）と表記することがある）を動物細胞にて発現させるための発現ベクターを構築した。
【００４０】
ヒトＩｇＧＦｃ領域のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３のゲノム配列をもつ発現ベクター、ｐＴｅｕＩｇＧ（図２）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩサイトに、ｐＢＳIIＬｆＡＬ／ＢａｍのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をクローニングした。このヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）発現ベクターを、ｐＴｅｕＩｇＧ／ｈＬＦと命名した。発現ベクターの作製は、上記記載の方法に準じた。
なお、ｐＴｅｕＩｇＧは、強力な発現プロモーターであるＳＲαの下流にヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３領域に対応するゲノムＤＮＡ配列を導入して構築した（Sato, A. et al., Biochem. J. 371, 603-608 (2003)）。
【００４１】
ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の安定発現細胞株構築のために、ＣＨＯ細胞の一種であるＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＤＧ４４）を用いた。ＤＨＦＲとは、ジヒドロ葉酸還元酵素であり、核酸の生合成には必須である。ＤＨＦＲのアンタゴニストであるメトトレキサート（ＭＴＸ）の存在下で細胞を培養すると、ＤＨＦＲの産生が阻害される。その際、細胞は生き残るためにＤＨＦＲ遺伝子を増幅し、ＤＨＦＲ遺伝子の近傍に存在する遺伝子も増幅されるために、その遺伝子のタンパク質発現が増幅することが知られている。このようにして、目的とするタンパク質を高発現させることが可能である。
【００４２】
ＤＧ４４細胞用発現ベクターには、インビトロジェン社製ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商品名）を使用した。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II（商品名、Stratagene社）のＴ７プライマー結合部位からＴ３プライマー結合部位までの領域をＰＣＲ法で増幅して、ＴＡクローニング法でｐＯｐｔｉＶＥＣに連結することにより、ベクターｐＯｐｔｉＶＥＣ-ＭＣ
Ｓを作製した（図４）。
【００４３】
ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）発現ベクターを作製するために、ベクターｐＴｅｕＩｇＧ／ｈＬＦから、ｈＬＦ、ヒトＩｇＧＦｃ領域のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３のゲノム配列を含む領域をＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片として切り出し、ｐＯｐｔｉＶＥＣ-ＭＣＳのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。このベクターをｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃと命名した（図５）。発現ベクターの作製は、上記記載の方法に準じた。
【００４４】
ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）発現ベクターであるｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃがコードするヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）／ヒトＩｇＧＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を、配列表の配列番号５に記載した。配列番号５において、それぞれ、アミノ酸番号１〜７１１はｈＬＦ、７１２〜７１４はスペーサー、７１５〜７２９はヒンジ領域、７３０〜８３９はＣＨ２ドメイン、８４０〜９４６はＣＨ３ドメインのアミノ酸配列である（図１７Ａ：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＢ６０３２４．１．及びＡＡＡ０２９１４．１配列に基づく）。
【００４５】
３．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の発現及び精製
３−１．ＤＧ４４細胞を宿主とするヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質安定発現細胞株の構築
作製したｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃをＤＧ４４細胞へ導入して、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）安定発現細胞株を樹立した。発現ベクターを効率的に細胞へ導入するために、ベクター２０μg分をＰｖｕＩで制限酵素処理して直鎖状にした。このサンプルにフェノール／クロロホルム１容量分を加え、ミキサー（Vortex）で攪拌してタンパク質を除去した。１５０００rpmで５分間遠心後、上清を新しいチューブに移した。上清に１／１０容量の３M酢酸ナトリウム及び２．５容量の１００％エタノールを加え、１５０００rpmで２０分間遠心してベクターを沈殿させた。上清を除去したチューブに、７０％エタノールを１００μl加えてリンスした。その後、１５０００rpmで５分間遠心して上清を捨て、１０分間風乾した。風乾したチューブに滅菌水１５μlを加え、発現ベクターを懸濁した。ＰｖｕＩ処理した発現ベクターを、ｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃ／ＰｖｕＩと命名した。
【００４６】
作製したｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃ／ＰｖｕＩを用いてＤＧ４４細胞へのトランスフェクションを行った。ｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃ／ＰｖｕＩ  ２０μｇ分を、「Ｆｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ  ＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ」（商品名、インビトロジェン社）１５μl、「Ｏｐｔｉ  Ｐｒｏ  ＳＦＭ」（商品名、インビトロジェン社）１２００μlと混合し、室温で１０分間静置して、トランスフェクション溶液とした。ＤＧ４４細胞（１５×１０６細胞）を培地（「ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＣＤ  ＤＧ４４  ｍｅｄｉｕｍ」、インビトロジェン社）３０mlに懸濁して、この中に予め用意したトランスフェクション溶液を混合して、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２） で４８時間培養した。その後、培地を「ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＣＤ  ＤＧ４４  ｍｅｄｉｕｍ」から「ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＣＤ  ｏｐｔｉ  ＣＨＯ   ｍｅｄｉｕｍ」（インビトロジェン社）に交換した。この培地はヒポキサンチンやチミジン不含の培地であり、ＤＨＦＲ欠損細胞は生育できない。一方、ＰｖｕＩで制限酵素処理した発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子をコードしているため、ＤＧ４４細胞の染色体に発現ベクターが組み込まれれば、細胞が生育可能となる。トランスフェクション後４８時間経過した細胞を、４００×gで５分間遠心して集め、「ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＣＤ  ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  ｍｅｄｉｕｍ」３０mlに懸濁した（３×１０６細胞/ml）。その後、培地交換を２日毎に行いながら、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養した。細胞密度が培養開始時の９０％以上になるまで培養した。
【００４７】
その後、メトトレキサート（ＭＴＸ、和光純薬）による細胞内のゲノム増幅を行った。「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＣＤ  ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  ｍｅｄｉｕｍ」で培養したＤＧ４４細胞の細胞数を計測し、１．２×１０７細胞分を４００×gで５分間遠心した。この細胞を、「ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＣＤ  ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  ｍｅｄｉｕｍ」３０mlと１mM  ＭＴＸ  １．５μl（終濃度：０．０５μM）の混合培地に懸濁した。その後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で細胞密度が培養開始時の９０％以上になるまで培養した。その後は、ＭＴＸの濃度を０．５μM、１μM、２μM、３μM、４μMと段階的に上げて、同様の培養を行った。
【００４８】
３−２．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の発現確認
１．２×１０７細胞分の細胞を、各濃度（０、０．０５μM、０．５μM、１μM、２μM、３μM、４μM）のＭＴＸを含む「ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＣＤ  ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  ｍｅｄｉｕｍ」に懸濁してＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で細胞密度が培養開始時の９０％以上になるまで培養した。その時点で４００×gで５分間遠心して細胞を沈殿させ、その上清を回収した。上清１５μlに非還元の４×サンプル緩衝液（０．５M  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH６．８）を２ml、ラウリル硫酸ナトリウム（ナカライテスク社）を０．８g、グリセリン（Wako社）を４ml混和し、純水で１０mlにメスアップして調製）を５μl混合し、９５℃で５分間熱処理を行い、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。バンドの染色にはＣＢＢを用いた。
【００４９】
結果を図６に示す。目的であるｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）の分子量は、約２１０kDaである。ＭＴＸ濃度１μMから、矢印で示した約２１０kDa付近にバンドが見られ、ＭＴＸ濃度が上昇するにつれて、そのバンドは濃くなり、タンパク質の発現量が増加したことが確認できた。
ＭＴＸ濃度４μM存在下で樹立した細胞株を、ＤＧ４４−ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）と命名した。
【００５０】
３−３．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の大量発現
大量発現は、１７５cm２のＴフラスコ（グライナー社製、培地５０ml使用）、あるいはＮｕｎｃ社製トリプルフラスコ（培地 ２００ml使用）を用いた静置培養で行った。ヒンジ付加型融合タンパク質安定発現株は、無血清培地「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  ｍｅｄｉｕｍ」で継代培養した。タンパク質発現の際は、培地を「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ」（商品名、Invitrogen社）＋４μM  メトトレ キセート（ＭＴＸ）＋６０μg/ml  プロリン（以下「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ」という）に換え、細胞濃度１×１０６細胞/mlで播き、３７℃、５％ＣＯ２で７日間培養した。７日後、細胞培養液を４００×gで５分間遠心することにより、上清と細胞とを分けた。細胞は、再びＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ  ５０mlに懸濁して、３７℃、５％ＣＯ２でさらに１週間培養することによりタンパク質を発現させた。上清は、８０００rpmで５分間再遠心し、得られた上清に最終濃度０．０２％アジ化ナトリウムを加え、４℃にて保存した。
【００５１】
３−４．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の精製
精製には、大量発現で得られた培地上清（最終濃度０．０２％アジ化ナトリウムを含む）をそのまま使用した。陽イオン交換担体である「ＭａｃｒｏＣａＰ  ＳＰ」（商品名、ＧＥヘルスケア社）４００μlを「Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ」（商品名、バイオラッド社）に充填して、５カラム容量（ＣＶ）分の１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．６）で平衡化した。平衡化に使用した１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．６）を捨てて、大量発現で得られた培地上清４mlを加え、シーソーシェイカーで３０分間反応させた。反応後、溶液は素通り画分として回収した。「Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ」を、「ＵＶ  ＤＥＴＥＣＴＯＲ」（東京理化器械社、２８０nmの吸光度を測定）、マイクロチューブポンプ（東京理化器械社）と接続し、ポンプの流速を１ml/minに設定し、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．６）を流して担体を洗浄した。「ＵＶ  ＤＥＴＥＣＴＯＲ」の２８０nmの吸光度が上昇し始めた時点から、排出液を回収した（Ｗａｓｈ画分）。この回収は２８０nmの吸光度が０になるまで続けた。その後、溶液を０．２M  ＮａＣｌ＋１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．６）に換えて同様の操作を行った（０．２M  ＮａＣｌ溶出画分）。この一連の操作を、ＮａＣｌ濃度を０．１Mずつ上げながら１．０M  ＮａＣｌまで続けた。回収した各溶出液は、４℃にて保存した。
【００５２】
各溶出画分１５μlに非還元の４×サンプル緩衝液を５μl混合し、９５℃で５分間熱処理を行い、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。バンドの染色にはＣＢＢを用いた。
【００５３】
その結果を、図８に示す。０．４M  ＮａＣｌの画分から目的タンパク質であるヒンジ付加型ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）が溶出していた。この結果から、「ＭａｃｒｏＣａＰ  ＳＰ」に結合したヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）は、０．３M  ＮａＣｌで洗浄して、１．０M  ＮａＣｌで溶出することにより効率よく回収できることがわかった。
【００５４】
３−５．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿による濃縮
液量１mlに対し、硫酸アンモニウムが２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％飽和になるように、それぞれ硫酸アンモニウム０．１１３g、 ０．１７６g、０．２４２g、０．３１４g、０．３９０g、０．４７２g、０．５６１g、０．６５７gを微量電子天秤で量りとり、２．０mlチューブに入れた。それぞれのチューブに、陽イオン交換担体で精製したＰＢＳに懸濁したヒンジ付加型ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）タンパク質溶液を１mlずつ加え、硫酸アンモニウムが溶けるまで転倒混和した後、４℃で一晩静置した。その後、１５０００rpm、３０分間の条件で遠心を行い、タンパク質を沈殿させた。上清を回収し、沈殿は１００μlのＰＢＳに溶解した。ＰＢＳで溶かした各沈殿と回収した上清を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色で調べた。
【００５５】
その結果を図１０に示す。５０％から９０％の飽和硫酸アンモニウムで沈殿が認められた。さらに、沈殿が認められた５０％から９０％の飽和硫酸アンモニウムの画分については、溶液中のタンパク質濃度を、既知濃度のＢＳＡをスタンダードとしてブラッドフォード法（プロテインアッセイ、バイオラッド社）で測定して、硫酸アンモニウム沈殿での回収率を算出した（ｎ＝５）。ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の場合は、分子量を用いてｈＬＦ換算濃度を算出した。具体的には、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）の場合は、ｈＬＦの分子量が８０kDa（×２）、Ｆｃ部分の分子量は５０kDaとして計算した。ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの場合は、ｈＬＦの分子量が８０kDa、Ｆｃ部分の分子量は２５kDaとして計算した。各硫酸アンモニウム濃度とその回収率（％）を以下の表３に示す。
【００５６】
【表３】
0006356115.tif 000004
【００５７】
７０％硫酸アンモニウムで回収率が最も高かった。硫酸アンモニウム沈殿後は、沈殿をＰＢＳに懸濁して、ＰＢＳに対して透析を行うことで、硫酸アンモニウムを除去した。
【００５８】
４．生物学的活性測定
４−１．  ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の鉄結合能の測定
ラクトフェリンは分子量８万の非ヘム性の鉄結合性糖タンパク質で、Ｎローブ、Ｃローブと呼ばれる二つの領域からなり、炭酸イオン（ＣＯ３２−）の存在下でタンパク質１分子当たり２個の鉄イオン（Ｆｅ３＋）を可逆的にキレート結合する能力を有する（Anderson, et al., Nature, 344, 784-78 (1990)）。ラクトフェリンの鉄結合能の測定は、以下のように行った。ホロ（ｈｏｌｏ）型ラクトフェリンから鉄イオン（Ｆｅ３＋）を遊離させ、アポ（ａｐｏ）型ラクトフェリンを調製する。次いで炭酸イオン（ＣＯ３２−）存在下で鉄イオン（Ｆｅ３＋） を付加させた鉄再結合ラクトフェリンを調製した。ａｐｏ型及び鉄再結合ラクトフェリンの鉄含量及びタンパク質濃度を測定し、鉄結合量の測定を行った。具体的には、ａｐｏ型ラクトフェリンは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ヒトＬＦ、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）を０．１Mクエン酸緩衝液（pH２．１）で２４時間、さらに蒸留水で２４時間透析を行い、調製した。鉄再結合型ラクトフェリンは、ａｐｏ型ラクトフェリンを０．００１％クエン酸鉄アンモニウム、５０mM炭酸ナトリウム及び５０mM塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（pH７．５）で２４時間透析を行った後、過剰の鉄イオンを除去するため、蒸留水、次いで５０mM塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（pH７．５）に対し２４時間透析を行い、調製した。タンパク質に結合している鉄イオンを比色法で測定するため、血清鉄測定キット「Ｆｅ  Ｃ−テストワコー」（商品名、和光純薬）を用いた。鉄の結合能は、ブラッドフォード法で定量したｈＬＦタンパク質１mg（ヒトＩｇＧＦｃ融合タンパク質の場合は、分子量を用いて算出したｈＬＦ換算で１mg）あたりに結合している鉄の結合量として算出した。２回実験を行った結果を以下の表４に示す。
【００５９】
【表４】
0006356115.tif 000005
【００６０】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦの鉄の結合活性を１００％とした場合、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）は、ほぼ１００％の活性を示した。
【００６１】
４−２．ＣＤスペクトルを用いたヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性の検討
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦとヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）の熱安定性を、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルで解析した。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルとは、物質にある波長をあてた場合の右円偏光と左円偏光の吸収の差を測定する方法で、タンパク質の二次構造の有無や種類、含量を推定することが可能である。
【００６２】
まず、ＰＢＳ（−）に０．１mg/mlで懸濁したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ、融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）を用意し、室温（約２０℃）で、波長２００nm〜２５０nmのＣＤスペクトルを測定した（日本分光のＪ−７２０使用）。
【００６３】
その結果を、図１２に示す。組換え型ｈＬＦ（パネルＡ）と、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）（パネルＣ）の二次構造には、大きな違いは認められなかった。
【００６４】
次に、各タンパク質の熱安定性を調べた。タンパク質溶液の温度を低温から高温へ変化させながらＣＤスペクトルを測定すると、ある温度で［θ］が上昇し一定の値を取る。この現象は、熱によりタンパク質の変性が起きて、二次構造が変化することに起因している。熱安定性を観察する場合は、一般に測定する波長は２２５nm付近を用いる。ＰＢＳ（−）に０．１mg/mlで懸濁したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）を用意し、３０〜９０℃まで１℃ずつ上昇させながら、波長２２５nmのＣＤスペクトルを測定した（日本分光のＪ−７２０使用）。
【００６５】
結果を図１３に示す。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ（パネルＡ）は、６７℃付近でＣＤスペクトル値の大きな変化が観察された。一方、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）（パネルＣ）では、３０〜９０℃まで加熱しても２２５nmにおけるＣＤスペクトルに大きな変化は観察されなかった。
【００６６】
以上より、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦと比較して、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）は、熱に対する安定性が向上していることが示された。構造的に安定になったヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）は、インビボにおける血中安定性の向上も期待できると考えられる。
【００６７】
４−３．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の安定性の検討
３−４．で示した陽イオン交換担体「ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ」で精製後のヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質を、ＰＢＳに透析し、さらにＰＢＳで希釈することで３３６μg/mLの濃度のサンプルを調製した。このサンプルを１．５mLチューブに１００μL加えて、３７℃で３週間静置反応させた。反応０、１、２、３週間後のサンプルを３μLとり、非還元の４×サンプル緩衝液を１μl混合し、９５℃、５分熱処理を行った。その後、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
ＣＢＢ染色の結果を図１４に示す。図１４において、Ｍはマーカー、レーン１はｈＬＦ（１μg/レーン）、レーン２〜５はそれぞれ０、１、２、３週間後のサンプルである。３７℃でも数週間は安定であるものの、時間経過と共に、＊で示したヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質のバンドが薄くなり、分解物と思われる＊＊、＊＊＊のバンドが濃くなった。これは精製過程で混入したプロテアーゼにより分解したものと考えられる。なお、ヒンジ欠損型融合タンパク質（後述）では、このような分解は観察されなかった。
【００６８】
４−４．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の分解箇所の解析
ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の分解箇所を特定するために、分解したバンドのＮ末端アミノ酸配列を解析した。上述した方法で、ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質（１２μg分）を３７℃で３週間静置反応させ、その後、分解したサンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。泳動後、定法に従いタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した。ＰＶＤＦ膜をＣＢＢ染色した図を図１５−Ａに示す。図１５−Ａにおいて、Ｍはマーカー、レーン１はｈＬＦ（４μg）、レーン２〜６はいずれも分解後のサンプル（各２μg/レーン）である。このＰＶＤＦ膜から約５０kDaのバンド（矢印）を切り出し、脱色した。そのバンドのＮ末端アミノ酸配列を、ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９１ＨＴ(商品名、ABI社)で解析した。得られたアミノ酸配列は、Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｘ−Ｐ(４アミノ酸目は解読不能)であり、その配列を調べたところ、配列表の配列番号５のアミノ酸番号７２２〜７２６（ヒンジ領域内）に対応していた（図１５−Ｂ）。
【００６９】
実施例２：ヒトラクトフェリンとヒンジ領域を含まないヒトＩｇＧＦｃ領域との融合タンパク質（「ヒンジ欠損型」）の作製、生物活性及び血中安定性評価
１．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質発現ベクターの構築
上記で作製したベクターｐＢＳIIＬｆＡＬ／Ｂａｍ（図１）を使用して、ｈＬＦとヒンジ領域を含まないhIgGFcとの融合タンパク質（ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）を動物細胞にて発現させるための発現ベクターを構築した。
【００７０】
ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ発現ベクターを作製するために、ヒトＩｇＧＦｃ領域のＣＨ２、ＣＨ３のｃＤＮＡ配列をもつ発現ベクターｐｍＩｇＧ（図３）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩサイトに、ｐＢＳIIＬｆＡＬ／ＢａｍのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をクローニングした。このベクターをｐｍＩｇＧ／ｈＬＦと命名した。各発現ベクターの作製は、上記記載の方法に準じた。
なお、ｐｍＩｇＧは、以下のようにして構築した。前述したヒンジ付加型融合タンパク質発現ベクターであるｐＴｅｕＩｇＧのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩに存在するヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３領域に対応するゲノムＤＮＡ配列を、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３領域に対応するｃＤＮＡ配列に入れ替えて作製した。
【００７１】
ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ発現ベクターを作製するために、ｐｍＩｇＧ／ｈＬＦのｈＬＦ、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２、ＣＨ３のｃＤＮＡ配列を含む領域をＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片として切り出し、上記で作製したｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＭＣＳ（図４）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。このベクターを、ｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃと命名した（図５）。発現ベクターの作製は、上記記載の方法に準じた。ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ発現ベクターｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃがコードするｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号６に記載した。配列番号６において、それぞれ、アミノ酸番号１〜７１１はｈＬＦ、７１２〜７１３はスペーサー、７１４〜８２３はＣＨ２ドメイン、８２４〜９３０はＣＨ３ドメインのアミノ酸配列である（図１７Ｂ：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＢ６０３２４．１及びＡＡＡ０２９１４．１の配列に基づく）。
【００７２】
２．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の発現及び精製
２−１．ＤＧ４４細胞を宿主とするヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質安定発現細胞株の構築
ヒンジ付加型の場合と同様にして、作製したｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃをＤＧ４４細胞へ導入して、ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質安定発現細胞株を樹立した。ＰｖｕＩ処理した発現ベクターを、ｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃ／ＰｖｕＩと命名した。
【００７３】
ヒンジ付加型の場合と同様にして、作製したｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃ／ＰｖｕＩを用いてＤＧ４４細胞へのトランスフェクションを行い、ＭＴＸの濃度を段階的に上げて、同様の培養を行った。
【００７４】
２−２．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の発現確認
ヒンジ付加型の場合と同様にして、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色で解析した。
【００７５】
結果を図７に示す。目的であるｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの分子量は、約１０５kDaである。ＭＴＸ濃度０．５μＭから矢印で示した約１０５kDa付近にバンドが見られ、ＭＴＸ濃度が上昇するにつれて、そのバンドは濃くなり、タンパク質の発現量が増加したことが確認できた。
ＭＴＸ濃度４μM存在下で樹立した細胞株を、ＤＧ４４−ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃと命名した。
【００７６】
２−３．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の大量発現
ヒンジ付加型の場合と同様にして、細胞を継代培養し、融合タンパク質を大量発現させた。得られた上清を４℃にて保存した。
【００７７】
２−４．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の精製
ヒンジ付加型の場合と同様にして、大量発現で得られた培地上清から融合タンパク質を精製した。
【００７８】
その結果を、図９に示す。０．５Mから０．７M  ＮａＣｌで、目的タンパク質であるヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃが溶出した。この結果から、その後は「ＭａｃｒｏＣａＰ  ＳＰ」に結合したヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃは、０．４M  ＮａＣｌで洗浄して、１．０M  ＮａＣｌで溶出することにより効率よく回収できることがわかった。
【００７９】
２−５．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿による濃縮
ヒンジ付加型の場合と同様にして、融合タンパク質を硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色で調べた。
【００８０】
その結果を図１１に示す。６０％から９０％の飽和硫酸アンモニウムで沈殿が認められた。さらにｎ沈殿が認められた６０％から９０％の飽和硫酸アンモニウムの画分については、溶液中のタンパク質濃度をブラッドフォード法で測定して、硫酸アンモニウム沈殿での回収率を算出した（ｎ＝２）。各硫酸アンモニウム濃度とその回収率（％）を以下の表５に示す。
【００８１】
【表５】
0006356115.tif 000006
【００８２】
６０％硫酸アンモニウムで回収率が最も高かった。硫酸アンモニウム沈殿後は、沈殿をＰＢＳに懸濁して、ＰＢＳに対して透析を行うことで、硫酸アンモニウムを除去した。
【００８３】
３．生物的活性測定
３−１．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の鉄結合能の測定
ラクトフェリンの鉄結合能の測定は、ヒンジ付加型の場合と同様にして行った。２回実験を行った結果を以下の表６に示す。
【００８４】
【表６】
0006356115.tif 000007
【００８５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦの鉄の結合活性を１００％とした場合、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は１００％の活性を示した。
【００８６】
３−２．ＣＤスペクトルを用いたヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性の検討
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦとヒンジ付加型、及びヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性を、ヒンジ付加型の場合と同様にしてＣＤスペクトルで解析した。その結果を、図１２に示す。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ（パネルＡ）と、ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質（パネルＢ）の二次構造には、大きな違いは認められなかった。
【００８７】
次に、ヒンジ付加型の場合と同様にして、各タンパク質の熱安定性を調べた。結果を図１３に示す。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ（パネルＡ）は、６７℃付近でＣＤスペクトル値の大きな変化が観察されたのに対し、ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質（パネルＢ）では、３０〜９０℃まで加熱しても２２５nmにおけるＣＤスペクトルに大きな変化は観察されなかった。
【００８８】
以上より、ｈＬＦと比較して、ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質は熱に対する安定性が向上していることが示され、インビボにおける血中安定性の向上も期待できると考えられる。
【００８９】
３−３．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質のラットを用いた血中安定性の検討
８週齢のＷｉｓｔａｒ系ラット（雄）６頭に、ペントバルビタールナトリウムによる麻酔下にて、外頸静脈に採血用カニューレを留置した。大腿静脈内注射によりＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ（１mg/kg体重で投与）及びヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）（ｈＬＦ換算で１mg/kg体重で投与）を投与した。投与前及び投与後５、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０、２４０分後に外頸静脈に留置したカニューレから採血し、血漿中のｈＬＦ濃度はＥＬＩＳＡ（「ＡｓｓａｙＭａｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ」、Assaypro社製）により測定した。なお、予備検討により、採血時に使用した抗凝固剤であるＥＤＴＡ、及び血漿は、このＥＬＩＳＡ測定に影響を及ぼさないことを確認している。また、使用したＥＬＩＳＡキットは、ビオチン化抗ヒトラクトフェリン抗体（１次抗体）とペルオキシダーゼ標識ストレプトアジビンで構成されている。したがって、２次抗体を使用する一般的なＥＬＩＳＡで問題となる２次抗体とヒンジ欠損型（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）のＦｃ領域との交差反応を懸念する必要がない。
【００９０】
まず、ブラッドフォード法で濃度既知であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ、及びヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）を用いて、検量線を作成した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦは０．４７〜７．５ng/mlで、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は０．２３５〜３０．０ng/mlで、それぞれ直線性が得られたので、この範囲に測定値が入るように各血漿サンプルを希釈してタンパク質濃度を測定した。
【００９１】
その結果を、図１６に示す。投与前はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）投与群ともに血中からＬＦは検出されなかった。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ投与群は投与後６０分後には血中からほぼクリアランスされたが、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）投与群は２４０分後においても検出された。
【００９２】
統計解析ソフトウエア「ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４」（GraphPad Software社）を用いて、血中半減期と時間曲線下面積（area under the curve、ＡＵＣ）を算出した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ投与群の半減期は１２．６分であるのに対し、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）投与群は６７．７分と約５．４倍に延長した。ＡＵＣについては、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）投与群がｈＬＦ投与群の約７．４倍に増加していた。以上より、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦと比較して、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は血中安定性の著しい向上を示した。
【００９３】
３−４．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質のインビトロでのプロテアーゼ耐性試験
ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）を、７５％ウシ血清／ＰＢＳ中で、０．２μg/μlの濃度で長期間３７℃で反応させた。０、１４、２１、３８、５５日後にサンプルを採取して、抗ｈＬＦ抗体を用いたイムノブロッティングにより残存するＬＦのサイズ及び量を検出した。
その結果、５５日間までの保存期間中、０日と比較してほとんど分解を受けずに当初の分子量を維持し、検出量も減少していなかった（図18）。したがって、本発明の融合タンパク質は、血中でのプロテアーゼによる分解に対し、十分な耐性を有する。
【００９４】
実施例３：ヒトラクトフェリンとヒトＩｇＧＦｃ領域の融合タンパク質（「ヒンジ欠損型」）のヒト小腸上皮様細胞への取り込み評価及びキモトリプシン耐性評価
１．ヒト小腸上皮様細胞Caco2への取り込み評価
LFは腸管から取り込まれて胸管リンパに移行することが知られている。そこで、本研究で作製したヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）がこの経路より取り込まれるかを、ヒト小腸上皮様細胞Caco2細胞を用いて確認した。
hLFとヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は、蛍光プローブであるAlexa Fluor 488で標識した。1 mg のAlexa Fluor 488にDMSO 100 μlを加え、その後、1 M NaHCO3を加えた各タンパク質とAlexa Fluor 488をモル比1:10で混合して、室温で、1 h反応させた。反応後、反応液を1×PBS(-)に対して24 時間透析を行い、未標識Alexa Fluor 488を除去した。
Caco-2細胞を12well plateに細胞濃度  5×104 cells/mlになるように撒き込み、37℃, 5% CO2で1週間培養(2日おきに培地交換)した。Caco-2細胞にPBS(−)を1 ml/well加えて、3回洗浄を行い、培地成分を完全に取り除いた。次に、Alexa標識済みの各タンパク質を15 μg/well加えて、1hr反応させた。1hr後、Alexa標識済みの各タンパク質を取り除き、cold PBS(−)を 1 ml/well加えて、1回洗浄を行った。洗浄後、0.25%Trypsin/EDTAを250 μl/well加えて、37℃条件下で5min反応させた。5min後、細胞をtubeに全量回収して、遠心機を用いて、200×g, 2min, 4℃で遠心を行った。遠心後、上清液を取り除き、cold PBS(−)を1 ml/tube加えて、軽く懸濁をして、200×g, 2min, 4℃で遠心を行った。遠心後、上清液を取り除き、4%PFA/PBS(−)を200 μl/tube加えて、軽く懸濁をして、室温で15min反応させた。15min後、200×g, 2min, 4℃で遠心を行った。遠心後、上清液を取り除き、1 μg/mlビスベンズイミド/PBS(−)を200 μl/tube加えて、軽く懸濁をして、室温で15min反応させた（核染色）。15min後、200×g, 2min, 4℃で遠心を行った。遠心後、上清液を取り除き、cold PBS(−)を200 μl/tube加えて、軽く懸濁をした。懸濁後、200×g, 2min, 4℃で遠心を行った。遠心後、上清液を取り除き、cold PBS(−)を200 μl/tube加えて、軽く懸濁をして、全量を8 well chamber plateに移した。その後、共焦点レーザースキャン顕微鏡LSM510で取り込みの蛍光を観察した。
【００９５】
その結果、hLF及びヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は4℃条件下ではCaco2細胞へ取り込まれないが（図19A）、37℃条件下ではCaco2細胞へ取り込まれていることが確認された（図19B）。また37℃における取り込みは、NaN3（図19C）、および過剰量の未標識ウシラクトフェリン(bLF) （図19D）で阻害されたため、この細胞内取り込みはレセプター介在性であり、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）はLFの取り込みルートで細胞内に取り込まれることが確認された。すなわち、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は、ラクトフェリン受容体、ＩｇＧ受容体又はアルブミン受容体のいずれか1つ以上の受容体を介して取り込まれるものと考えられる。
【００９６】
２．ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）のキモトリプシン消化耐性評価
本実験で用いたBufferは、表７の通り調製し、その後pHを7.4に調製した。
【表７】
0006356115.tif 000008
hLFやヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は1 mg/mlとなるように本Bufferにサスペンドした。
【００９７】
［消化酵素耐性試験］
150 μl の1 mg/ml  hLF、あるいはヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）をBuffer 120 μlと混合して、37℃で5分間静置した。その後、16.7 μg/mlのキモトリプシン溶液30 μlを加え、37℃で静置反応した。経時的に反応サンプル36 μlを回収し、あらかじめ用意しておいたSample Buffer （0.1 M Tris - HCl (pH6.8)、4% SDS、20% Glycerol、BPB少量）12 μlに加え、消化反応を停止させた。その後、反応液は10% SDS-PAGEで泳動後(15μl/レーン使用)、CBB染色した。
左から順に分子量マーカー、hLFのキモトリプシンを加えずに37℃で静置反応させたサンプル、hLFのキモトリプシンを加えて37℃静置反応させたサンプル、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）のキモトリプシンを加えずに37℃静置反応させたサンプル、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）のキモトリプシンを加えて37℃静置反応させたサンプルの泳動結果を図20に示す。
【００９８】
各バンドの濃さをImageJにより解析した。キモトリプシンを加えないバンドの濃さの平均値を100%としてグラフ化した（図21）。ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）はほとんど分解されなかったが、コントロールであるhLFは30秒で分解がおこり、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）のキモトリプシンに対する消化耐性が示された。
また、表7に示すBufferに溶解したhLF及びヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）をゲルカラムクロマトグラフィー分析したところヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）はホモダイマーとして存在することが分かった（図22）。
図22パネルBは溶出時間とタンパク分子量の相関性を示すグラフである。クロマトグラフ（図22パネルA）で、青曲線（「hLF/dhIgGFc」）は2量体を形成するための領域（ヒンジ領域）を含むヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の結果である。他方、緑曲線（「hLF/mhIgGFc」）はヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）の結果である。hLF/mhIgGFc及びhLF/dhIgGFcをゲルろ過すると、両者の溶出時間にほとんど差がないことが判明した。このことから、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は、溶液中ではダイマーを形成していることが示された。
【００９９】
産業上の利用性
本発明は、改良された特性を有するラクトフェリン融合タンパク質、その用途及びその製造方法を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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