(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドであって，前記保護基が下記一般式（Ｉ）で示される，リボヌクレオシド,又はリボヌクレオチド。
【化１】
0006284977.tif 000025
式中，Ｏ＊は，リボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドの２’位水酸基の酸素原子を示し，
Ｒ１〜Ｒ４は,いずれも水素原子を示し,
Ｒ５は,ハロゲン原子,Ｃ１−３アルキル基，Ｃ２−３アルケニル基，Ｃ２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ２−３アルキル基，又はＣ１−３ハロアルキル基を示し,
Ｒ６は,水素原子,フッ素原子又は塩素原子を示し,
Ｒ７は,フッ素原子又は塩素原子を示す（ただし，Ｒ６が水素原子であり，Ｒ５がフッ素原子である組み合わせ，及びＲ６が水素原子であり，Ｒ５が塩素原子である組み合わせを除く。）。
【請求項２】
下記一般式（Ｉ）で示される２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドの製造方法であって，
下記一般式（ＩＩ）で示される化合物に下記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を作用させる工程を含む，方法。
【化２】
0006284977.tif 000026
（一般式（Ｉ）中，Ｏ＊は，リボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドの２’位水酸基の酸素原子を示し，
Ｒ１〜Ｒ４は,いずれも水素原子を示し,
Ｒ５は,ハロゲン原子,Ｃ１−３アルキル基，Ｃ２−３アルケニル基，Ｃ２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ２−３アルキル基，又はＣ１−３ハロアルキル基を示し,
Ｒ６は,水素原子,フッ素原子又は塩素原子を示し,
Ｒ７は,フッ素原子又は塩素原子を示す（ただし，Ｒ６が水素原子であり，Ｒ５がフッ素原子である組み合わせ，及びＲ６が水素原子であり，Ｒ５が塩素原子である組み合わせを除く。）。）
【化３】
0006284977.tif 000027
（一般式（ＩＩ）中,Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ２１，Ｒ２２,Ｒ２３及びＲ２４は，同一でも異なってもよく，直鎖又は分岐してもよいＣ１−５アルキル基, Ｃ１−５アルコキシ基又はＣ１−５ハロアルキル基を示し，Ｒ１及びＲ２は一般式（Ｉ）におけるＲ１及びＲ２と同義である。）
【化４】
0006284977.tif 000028
（一般式（ＩＩＩ）中，Ｒ３〜Ｒ７は，一般式（Ｉ）におけるＲ３〜Ｒ７と同義である。）
【請求項３】
請求項２に記載の２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドの製造方法であって，
前記一般式（ＩＩ）で示される化合物に前記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を作用させ，下記一般式（ＩＶ）で示される化合物を得た後，
前記一般式（ＩＶ）で示される化合物と，Ｃ１−３アルコールと反応させ，
下記一般式（Ｖ）で示される化合物を得る工程と，
前記一般式（Ｖ）で示される化合物とハロゲン化ジメトキシトリフェニルメチルと反応させ，一般式（ＶＩ）で示される化合物を得る工程を含む，方法。
【化５】
0006284977.tif 000029
（一般式（ＩＶ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ１〜Ｒ７は，一般式（Ｉ）におけるＲ１〜Ｒ７と同義であり，Ｒ２１〜Ｒ２４は，一般式（ＩＩ）におけるＲ２１〜Ｒ２４と同義である。）
【化６】
0006284977.tif 000030
（一般式（Ｖ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ１〜Ｒ７は，一般式（Ｉ）におけるＲ１〜Ｒ７と同義である。）
【化７】
0006284977.tif 000031
（一般式（ＶＩ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ１〜Ｒ７は，一般式（Ｉ）におけるＲ１〜Ｒ７と同義であり，式ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示す。）
る。）
【請求項４】
請求項３に記載の２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドの製造方法であって，
前記一般式（ＶＩ）で示される化合物を得る工程の後に，
前記一般式（ＶＩ）で示される化合物と下記一般式（ＶＩＩ）で示される化合物を反応させ，下記一般式（ＶＩＩＩ）で示される化合物を得る工程を含む，
方法。
【化８】
0006284977.tif 000032
(一般式（ＶＩＩ）中，
Ｒ３１〜Ｒ３４は，同一でも異なってもよく，水素原子,Ｃ１−３アルキル基,又はＣ１−３ハロアルキル基を示し,
Ｒ３５〜Ｒ３６は，同一でも異なってもよく，Ｃ１−５アルキル基又はＣ１−５ハロアルキル基を示し,
Ｒ３７は，ハロゲン原子を示す。）
【化９】
0006284977.tif 000033
(一般式（ＶＩＩＩ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ１〜Ｒ７は，一般式（Ｉ）におけるＲ１〜Ｒ７と同義であり,Ｒ３１〜Ｒ３６は，一般式（ＶＩＩ）におけるＲ３１〜Ｒ３６と同義であり, 式ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ハロゲン原子による置換基を有する２’−Ｏ−修飾ＲＮＡに関する。より詳しく説明すると，本発明は，高い二重鎖形成能を有し，製造が容易な，ハロゲン原子による置換基を有するＲＮＡの２’−Ｏ−アルコキシメチル修飾体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年，核酸分子を医薬や機能性分子として利用することを目指し，様々な核酸類縁体が合成されている。その中で２’修飾型核酸は，適切な化学修飾を施すことで二重鎖形成能，酵素耐性を向上することが示され，有用な化学修飾型核酸であることが知られている。
【０００３】
２’修飾型核酸の中で，２’−Ｏ−メチル修飾体は最も単純な２’−Ｏ−アルキル型の修飾体である。非特許文献１（Inoue, H; Miura, K.; Ohtsuka, E. et al,G Nucleic Acid Res.,
1987, 15, 6131-6148）には，核酸を２’−Ｏ−メチル修飾（Ｏ＊−ＣＨ３）することにより，Ｔｍ値を向上できることが示唆されている。一方，非特許文献２（Saneyoshi, H.; Seio, K.; Sekine, M., J. Org. Chem. 2005, 70,
10453-10460）には，核酸の１ヵ所のみに２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を施した場合には，Ｔｍ値が減少することが示されている。
【０００４】
特開２００９−２５６３３５号公報（下記特許文献１）には，２’位にアルキル型保護基を有するリボ核酸の製造法が開示されている。
【０００５】
また，非特許文献３（Martin,
P., Helv. Chim. Acta., 1995, 78, 486-504.）には，２’−Ｏ−メトキシエチル修飾体（Ｏ＊−Ｃ２Ｈ４ＯＣＨ３）が開示されている。
【０００６】
上述した２’−Ｏ−メチル修飾体や２’−Ｏ−メトキシエチル修飾体をはじめとする２'修飾型ＲＮＡの多くは，核酸塩基の種類によっては導入が困難である。すなわち，２’−Ｏ−メチル修飾体及び２’−Ｏ−メトキシエチル修飾体は，ピリミジン核酸塩基を有するＲＮＡの修飾体のみの合成例しか報告されていないものがある。またこれらの修飾体を製造する場合,核酸塩基の種類によって，合成方法を変えた適切な製造方法を探索する必要がある。
【０００７】
非特許文献４（Tereshko, V.;
Portmann, S.; Tay, E.; Martin, P; Natt, F.; Altmann, K.; Egli, M. Biochemistry, 1998, 37,
10626 -10634.）には, ２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体（Ｏ＊−ＣＨ２ＯＣ２Ｈ５）が開示されている。しかしながら，２’−Ｏ−エトキシメチル修飾を行うと，二重鎖融解温度Ｔｍが減少する。すなわち，２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体は，二重鎖形成能が低い。このため２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体はＲＮＡの修飾体として有用ではないと考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2009-256335号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Inoue, H; Miura, K.; Ohtsuka, E. et al,G Nucleic Acid Res.,1987, 15, 6131-6148
【非特許文献２】Saneyoshi, H.; Seio, K.; Sekine, M., J. Org. Chem. 2005, 70,10453-10460
【非特許文献３】Martin, P., Helv.Chim. Acta., 1995, 78, 486-504
【非特許文献４】Tereshko, V.;Portmann, S.; Tay, E.; Martin, P; Natt, F.; Altmann, K.; Egli, M. Biochemistry, 1998, 37,10626 -10634.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は，高い二重鎖形成能を有する新規の修飾ＲＮＡを製造することを目的とする。
本発明は，付加する核酸塩基によらずに採用できる修飾ＲＮＡの効果的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は，基本的には，アルコキシメチル系保護基を有するリボヌクレオシド等の修飾体について，保護基部分にハロゲン原子を置換基として導入することで，高い二重鎖形成能を付与できたという実施例による知見に基づく。先述したとおり，アルコキシメチル系保護基を有するＲＮＡの修飾体は，二重鎖形成能が低かった。しかし,本発明のハロゲン置換アルコキシメチル系保護基を有するＲＮＡの修飾体は，核酸の２’−Ｏ−メチル修飾体と同程度の高い二重鎖形成能を示した。
【００１２】
また,本発明は，アルコキシメチル骨格を有するリボヌクレオシド等の修飾体について，保護基部分にハロゲン原子を置換基として導入することで，ＲＮＡの核酸塩基の種類によらずＲＮＡの修飾体を容易に合成できるという実施例による知見に基づく。先述したとおり，２’−Ｏ−メチル修飾体や２’−Ｏ−メトキシエチル修飾体は，ＲＮＡに含まれる核酸塩基により適切な合成方法を検討しなければならず，合成できていない修飾体もある。一方,本発明の製造方法は，ＲＮＡに含まれる核酸塩基によらず，共通の方法で２’−修飾体を製造することができる。すなわち,本発明の製造方法は,先に説明した高い二重鎖形成能を有する２’−修飾体を，ＲＮＡ中の核酸塩基の種類によらず容易に合成できる方法であるといえる。
【００１３】
本発明の第１の側面は，２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体に関する。そして, リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の２’−位の酸素原子をＯ＊として表現した場合，保護基が下記一般式（Ｉ）で示される。
【００１４】
【化１】
0006284977.tif 000002
【００１５】
式中，Ｏ＊は，リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の２’位水酸基の酸素原子を示す。なお，上記の式（Ｉ）において，Ｏ＊と接続されている部位が保護基部分である。このため上記一般式（Ｉ）では，リボース及び核酸塩基を含む部分をかっこで括っている。リボヌクレオチドは，ＲＮＡを構成する単位である。そして，リボヌクレオシドは，リボース及び核酸塩基を含む。リボヌクレオシドリン酸がリボヌクレオチドである。リボヌクレオシド又はリボヌクレオチドの誘導体は，ＲＮＡを構成するリボヌクレオシド又はリボヌクレオチドに１又は複数の置換基が付加したものである。置換基の例は，リボヌクレオシド又はリボヌクレオチドの水素原子と置換されるＣ１−３アルキル基,又はＣ１−３ハロアルキル基であるが，これらに限定されない。
【００１６】
一般式（Ｉ）において，Ｒ１及びＲ２は,同一でも異なってもよく，水素原子, Ｃ１−３アルキル基，Ｃ２−３アルケニル基，Ｃ２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ２−３アルキル基，又はＣ１−３ハロアルキル基を示す。
Ｒ３及びＲ４は,同一でも異なってもよく，水素原子,ハロゲン原子，Ｃ１−３アルキル基，Ｃ２−３アルケニル基，Ｃ２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ２−３アルキル基，又はＣ１−３ハロアルキル基を示す。
Ｒ５及びＲ６は,同一でも異なってもよく，水素原子，ハロゲン原子, Ｃ１−３アルキル基，Ｃ２−３アルケニル基，Ｃ２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ２−３アルキル基，Ｃ１−３ハロアルキル基，１つ又は２つのＣ６−１２アリール基で置換されたＣ１−３アルキル基，又は置換基を有してもよいＣ６−１２アリール基を示す。  Ｒ７は,ハロゲン原子又はＣ１−３ハロアルキル基を示す。
【００１７】
「Ｃ１−３アルキル基」は，１から３個の炭素原子を持つ直鎖アルキル基，３個の炭素原子を持つ分鎖アルキル基，又は３個の炭素原子を持つ環状アルキル基を意味する。Ｃ１−３直鎖アルキル基の例は，メチル基，エチル基，及びプロピル基である。Ｃ１−３分鎖アルキル基の例は，イソプロピル基である。Ｃ１−３環状アルキル基の例は，シクロプロピル基である。Ｃ１−３アルキル基は，直鎖又は分鎖アルキル基が好ましい。
【００１８】
「Ｃ２−３アルケニル基」は，２個又は３個の炭素原子を有し，少なくとも１つの二重結合を有する直鎖アルケニル基，３個の炭素原子を有する分鎖アルケニル基を意味する。Ｃ２−３アルケニル基の例は，ビニル基及びアリール基である。
【００１９】
「Ｃ２−３アルキニル基」とは２個又は３個の炭素原子を有し，少なくとも１つの三重結合を有する直鎖アルキニル基を意味する。Ｃ２−３アルキニル基の例は，２−プロピニル基である。
【００２０】
「ヒドロキシＣ２−３アルキル基」は，少なくとも１つのヒドロキシ基で置換されたＣ２−３アルキル基を意味する。ヒドロキシＣ２−３アルキル基の例は，２−ヒドロキシエチル基及び３−ヒドロキシプロピル基である。
【００２１】
「Ｃ１−３ハロアルキル基」は，「ハロゲノＣ１−３アルキル基」と同義であり，フッ素原子，塩素原子，臭素原子及びヨウ素原子の少なくとも１つで水素原子が置換されたＣ１−３アルキル基を意味する。Ｃ１−３ハロアルキル基の例は，２−クロロエチル基，２−ブロモエチル基，２−ヨ−ドエチル基，及び３−クロロプロピル基である。
【００２２】
「１つ又は２つのＣ６−１２アリール基で置換されたＣ１−３アルキル基」は，Ｃ１−３アルキル基の水素原子の１つ又は２つがＣ６−１２アリール基で置換されたものを意味する。１つ又は２つのＣ６−１２アリール基で置換されたＣ１−３アルキル基の例は，ベンジル基；ジフェニルメチル基；２−フェニルエチル基；２−フェニルプロピル基；１−メチル−１−フェニルエチル基；２−ニトロベンジル基；３−ニトロベンジル基；４−ニトロベンジル基；２，４−ジニトロベンジル基；２，４，６−トリニトロベンジル基；２−フェニルベンジル基；３−フェニルベンジル基；４−フェニルベンジル基；２−ヒドロキシベンジル基；３−ヒドロキシベンジル基；４−ヒドロキシベンジル基；２−クロロベンジル基；３−クロロベンジル基；４−クロロベンジル基；２−フルオロベンジル基；３−フルオロベンジル基；４−フルオロベンジル基；２−ブロモベンジル基；３−ブロモベンジル基；４−ブロモベンジル基；２−ヨ−ドベンジル基；２，３−ジクロロベンジル基；２，４−ジクロロベンジル基；２，５−ジクロロベンジル基；２，６−ジクロロベンジル基；３，４−ジクロロベンジル基；３，５−ジクロロベンジル基；２−メチルベンジル基；３−メチルベンジル基；４−メチルベンジル基；２−エチルベンジル基；３−エチルベンジル基；４−エチルベンジル基；２−イソプロピルベンジル基；３−イソプロピルベンジル基；４−イソプロピルベンジル基；２−メトキシベンジル基；３−メトキシベンジル基；４−メトキシベンジル基；２，３−ジメトキシベンジル基；２，４−ジメトキシベンジル基；２，５−ジメトキシベンジル基；２，６−ジメトキシベンジル基；３，４−ジメトキシベンジル基；３，５−ジメトキシベンジル基；２−エトキシベンジル基；３−エトキシベンジル基；４−エトキシベンジル基；２−イソプロポキシベンジル基；３−イソプロポキシベンジル基；４−イソプロポキシベンジル基；２−メトキシメチルベンジル基；３−メトキシメチルベンジル基；４−メトキシメチルベンジル基；２−イソプロポキシメチルベンジル基；３−イソプロポキシメチルベンジル基；４−イソプロポキシメチルベンジル基；２−トリフルオロメチル基；３−トリフルオロメチル基；４−トリフルオロメチル基；２−ヒドロキカルボニルベンジル基；３−ヒドロキカルボニルベンジル基；４−ヒドロキカルボニルベンジル基；２−アミノベンジル基；３−アミノベンジル基；４−アミノベンジル基；２−アミノメチルベンジル基；３−アミノメチルベンジル基；４−アミノメチルベンジル基；２−シアノベンジル基；３−シアノベンジル基；４−シアノベンジル基；２−ヒドロキシメチルベンジル基；３−ヒドロキシメチルベンジル基；４−ヒドロキシメチルベンジル基；２−フェノキシベンジル基；３−フェノキシベンジル基；及び４−フェノキシベンジル基である。
【００２３】
Ｃ６−１２アリール基は，炭素数が６〜１２の多環芳香族を意味する。Ｃ６−１２アリール基の例は，フェニル基，１−ナフチル基及び２−ナフチル基である。「置換基を有してもよいＣ６−１２アリール基」は，Ｃ６−１２アリール基における１又は２以上の水素原子が，他の原子又は基により置換されたものを意味する。置換基を有してもよいＣ６−１２アリール基における置換基の例は，ハロゲン原子，Ｃ１−３アルキル基，Ｃ１−３アルコキシ基，及びヒドロキシＣ２−３アルキル基である。
【００２４】
ハロゲン原子の例は，フッ素原子，塩素原子，臭素原子及びヨウ素原子である。ハロゲン原子として，フッ素原子又は塩素原子が好ましく用いられる。
【００２５】
第１の側面の好ましい態様は，上記した２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体であって，置換基が以下の基で示されるものである。すなわち，Ｒ１〜Ｒ４は,同一でも異なってもよく，水素原子,メチル基又はエチル基を示す。Ｒ５及びＲ６は,同一でも異なってもよく，水素原子，ハロゲン原子,又はＣ１−３ハロアルキル基を示す。そして，Ｒ７は,ハロゲン原子を示す。
【００２６】
第１の側面の好ましい態様は，上記した２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体であって，置換基が以下の基で示されるものである。すなわち，Ｒ１〜Ｒ４は,いずれも水素原子を示す。Ｒ５及びＲ６は,同一でも異なってもよく，水素原子,フッ素原子，塩素原子又は臭素原子を示す。Ｒ７は,フッ素原子，塩素原子又は臭素原子を示す。
【００２７】
第１の側面の好ましい態様は，上記した２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体であって，置換基が以下の基で示されるものである。すなわち，Ｒ１〜Ｒ５は,いずれも水素原子を示す。Ｒ６は,水素原子,フッ素原子又は塩素原子を示す。Ｒ７は,フッ素原子又は塩素原子を示す。
【００２８】
第１の側面の好ましい態様は，上記した２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体であって，置換基が以下の基で示されるものである。すなわち，Ｒ１〜Ｒ５は,いずれも水素原子を示す。Ｒ６は,水素原子,又は塩素原子を示し,Ｒ７は,塩素原子を示す。
【００２９】
後述する実施例により示された通り,２−クロロエトキシキメチル基及び２，２−ジクロロエトキシキメチル基を２’−位の保護基として有する核酸は,高い二重鎖形成能を有する新規物質である。
【００３０】
第１の側面の好ましい態様は，上記した２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体であって，上記一般式（Ｉ）において,Ｒ７がＣ１−３ハロアルキル基である場合，Ｃ１−３ハロアルキル基の例は, クロロメチル基；ジクロロメチル基；トリクロロメチル基；１−クロロエチル基；２−クロロエチル基；１，１，−ジクロロエチル基；１，２−ジクロロエチル；２，２−ジクロロエチル基；１−クロロプロピル基；２−クロロプロピル基；１，１，−ジクロロプロピル基；１，２−ジクロロプロピル；又は２，２−ジクロロプロピル基であることが好ましい。Ｒ７がＣ１−３ハロアルキル基である場合，Ｒ１〜Ｒ６は，水素原子であるものが好ましい。
【００３１】
第１の側面の好ましい態様は，核酸塩基Ｂを,アデノシン，グアノシン，シチジン又はウリジンとしたときに,以下の化合物である。核酸塩基Ｂは，リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体を構成する核酸塩基である。
【００３２】
すなわち，好ましい化合物は，
２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）核酸塩基Ｂ,
２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）核酸塩基Ｂ,
２’−Ｏ−（２，２−ジフルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）核酸塩基Ｂ，
２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ，
２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ，
２’−Ｏ−２，２−ジフルオロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ，  
２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ  ３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト）,
２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ  ３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト），又は
２’−Ｏ−（２，２−ジフルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ  ３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト），である。
【００３３】
第１の側面の好ましい態様は，核酸塩基Ｂを,アデノシン，グアノシン，シチジン又はウリジンとしたときに,
２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリイル）核酸塩基Ｂ  ３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト）,又は２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリイル）核酸塩基Ｂ  ３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト）である。
【００３４】
本発明の第２の側面は，下記一般式（Ｉ）で示される２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の製造方法に関する。この方法において，リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体は，第１の側面において説明したいずれの化合物をも採用できる。そして，この方法は，下記一般式（ＩＩ）で示される化合物に下記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を作用させる工程を含む。
【００３５】
【化２】
0006284977.tif 000003
【００３６】
（一般式（Ｉ）中，Ｏ＊は，リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の２’位水酸基の酸素原子を示し，
Ｒ１〜Ｒ７は,先に説明したと同義である。）
【００３７】
【化３】
0006284977.tif 000004
【００３８】
（一般式（ＩＩ）中,Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ２１，Ｒ２２,Ｒ２３及びＲ２４は，同一でも異なってもよく，直鎖又は分岐してもよいＣ１−５アルキル基, Ｃ１−５アルコキシ基又はＣ１−５ハロアルキル基を示し，Ｒ１及びＲ２は一般式（Ｉ）におけるＲ１及びＲ２と同義である。）
【００３９】
「保護基で保護されてもよい核酸塩基」における核酸塩基は，ＲＮＡに含まれる塩基を含む置換基を意味し，具体的にはアデノシン，グアノシン，シチジン又はウリジンである。本発明における核酸塩基の例は，アデニン，グアニン，シトシン，ウラシル又はそれらの誘導体である。核酸塩基の誘導体の例は，５−メチルシトシン；５−ヒドロキシメチルシトシン；５−フルオロウラシル；チオウラシル；６−アザウラシル；５−ヒドロキシウラシル；２，６−ジアミノプリン；アザアデニン；アザグアニン；及びイソグアニンである。
【００４０】
「保護基で保護されてもよい核酸塩基」における，保護基で保護された核酸塩基の例は，核酸塩基中のアミノ基中の原子が脱離できる基により置換されたものである。核酸塩基中のアミノ基の保護基の例は，アセチル基；プロピオニル基；ブチリル基；イソブチリル基等の脂肪族アシル基；ベンゾイル基；４−メチルベンゾイル基；４−メトキシベンゾイル基；フェニルアセチル基；フェノキシアセチル基；４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基；４−イソプロピルフェノキシアセチル基等の芳香族アシル基；ハロゲン原子；Ｃ１−１０アルキル基；Ｃ１−１０アルキルオキシ基等の置換基を有する脂肪族アシル基又は芳香族アシル基；２−シアノエチル基；２−（ｐ−ニトロフェニル）エチル基；２−（ベンゼンスルホニル）エチル基；ジメチルアミノメチレン基；ジブチルアミノメチレン基；２−シアノエトキシカルボニル基；２−（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基；２−（ベンゼンスルホニル）エトキシカルボニル基である。
【００４１】
「Ｃ１−５アルキル基」は，炭素数が１個〜５個のアルキル基である。Ｃ１−５直鎖アルキル基の例はメチル基，エチル基，プロピル基，ブチル基，及びペンチル基である。Ｃ１−５分鎖アルキル基の例はイソプロピル基，イソブチル基，１−メチルプロピル基，ｔ−ブチル基，１−メチルブチル基，２−メチルブチル基，３−メチルブチル基，１−エチルプロピル基，１，１−ジメチルプロピル基，２，２−ジメチルプロピル基，１，２−ジメチルプロピル基である。Ｃ１−５環状アルキル基の例はシクロプロピル基，シクロブチル基，及びシクロペンチル基である。
【００４２】
「Ｃ１−５アルコキシ基」は，炭素数が１個〜５個のアルコキシ基である。Ｃ１−５アルコキシ基の例は，メトキシ基，エトキシ基，及びプロピルオキシ基である。
【００４３】
Ｃ１−５ハロアルキル基は，炭素数が１個〜５個のハロアルキル基である。
【００４４】
Ｒ２１〜Ｒ２４の好ましい例は，Ｃ２−４アルキル基であり，具体的なＲ２１〜Ｒ２４は，エチル基，プロピル基，イソプロピル基，ｎ−ブチル基，ｓｅｃ−ブチル基，イソブチル基，又はｔｅｒ−ブチル基である。
【００４５】
【化４】
0006284977.tif 000005
【００４６】
（一般式（ＩＩＩ）中，Ｒ３〜Ｒ７は，一般式（Ｉ）におけるＲ３〜Ｒ７と同義である。）
【００４７】
この工程は，たとえば，一般式（ＩＩ）で示される化合物を適切な溶媒により乾燥させた後，溶媒に溶解させる。溶媒の例は，ＴＨＦである。この溶液に，一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を加える。そして，溶液を−５０℃以上−２０℃以下，好ましくは−４５℃以上−３０℃以下に冷却する。その後，ＮＩＳやＮＢＳといったハロゲン源及びトルエンスルホン酸やトリフロオロメタンスルホン酸等の有機酸を撹拌しつつ添加する。撹拌時間の例は，３０分以上２時間以下である。反応を中止させるためには，トリエチルアミンなどの塩基を添加すればよい。その後，精製する。このようにして後述する一般式（ＩＶ）で示されるリボヌクレオシドを得ることができる。この一般式（ＩＶ）で示される化合物を用いることで，後述するように一般式（Ｉ）で示される化合物を得ることができる。
【００４８】
本発明の第２の側面は，上記の工程の後に以下の工程を含むものが好ましい。すなわち，先に説明した工程で，一般式（ＩＩ）で示される化合物に一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を作用させ，下記一般式（ＩＶ）で示される化合物を得る。その後，前記一般式（ＩＶ）で示される化合物とＣ１−３アルコールとを反応させ，脱保護することにより，下記一般式（Ｖ）で示される化合物を得る。
【００４９】
【化５】
0006284977.tif 000006
【００５０】
一般式（ＩＶ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ１〜Ｒ７は，一般式（Ｉ）におけるＲ１〜Ｒ７と同義であり，Ｒ２１〜Ｒ２４は，一般式（ＩＩ）におけるＲ２１〜Ｒ２４と同義である。保護基で保護されてもよい核酸塩基は，一般式（ＩＩ）におけるものと同義である。
【００５１】
【化６】
0006284977.tif 000007
【００５２】
一般式（Ｖ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ１〜Ｒ７は，一般式（Ｉ）におけるＲ１〜Ｒ７と同義である。
【００５３】
この工程は，たとえば，一般式（ＩＶ）で示される化合物を乾燥させた後に行う。そして，Ｃ１−３アルコール（低級アルコール）に溶解させる。低級アルコールの例は，メタノール又はエタノールである。溶液に例えばフッ化アンモニウムを添加し，撹拌する。撹拌時の温度は，３０℃以上６０℃以下であっても，４５℃以上５５℃以下であってもよい。反応時間は，３時間以上１日以下であり，４時間以上７時間以下でもよい。得られた化合物を公知の方法で濃縮又は抽出する。
【００５４】
次に，前記一般式（Ｖ）で示される化合物とハロゲン化ジメトキシトリフェニルメチルと反応させ，一般式（ＶＩ）で示される化合物を得る。
【００５５】
【化７】
0006284977.tif 000008
【００５６】
一般式（ＶＩ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ１〜Ｒ７は，一般式（Ｉ）におけるＲ１〜Ｒ７と同義であり，式ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示す。
【００５７】
ハロゲン化ジメトキシトリフェニルメチルの例は，４，４’−ジメトキシトリチルクロライドである。
【００５８】
本発明の第２の側面は，先に説明した工程の後に，さらに以下の工程を有するものが好ましい。すなわち，先に説明した工程で得られた一般式（ＶＩ）で示される化合物と下記一般式（ＶＩＩ）で示される化合物を反応させ，下記一般式（ＶＩＩＩ）で示される化合物を得る工程を含む。
【００５９】
【化８】
0006284977.tif 000009
【００６０】
(一般式（ＶＩＩ）中，
Ｒ３１〜Ｒ３４は，同一でも異なってもよく，水素原子,Ｃ１−３アルキル基,又はＣ１−３ハロアルキル基を示し,
Ｒ３５及びＲ３６は，同一でも異なってもよく，Ｃ１−５アルキル基又はＣ１−５ハロアルキル基を示し,
Ｒ３７は，ハロゲン原子を示す。）
【００６１】
Ｒ３１〜Ｒ３４の好ましい例は，同一でも異なってもよく，水素原子，又はメチル基である。なお，Ｒ３１〜Ｒ３４は，いずれも水素原子であるものが最も好ましい。
Ｒ３５及びＲ３６の好ましい例は，Ｃ２−４アルキル基であり，具体的なＲ２１〜Ｒ２４は，エチル基，プロピル基，イソプロピル基，ｎ−ブチル基，ｓｅｃ−ブチル基，イソブチル基，又はｔｅｒ−ブチル基である。
Ｒ３７の好ましい例は，フッ素原子，塩素原子又は臭素原子である。
【００６２】
【化９】
0006284977.tif 000010
【００６３】
(一般式（ＶＩＩＩ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ１〜Ｒ７は，一般式（Ｉ）におけるＲ１〜Ｒ７と同義であり,Ｒ３１〜Ｒ３６は，一般式（ＶＩＩ）におけるＲ３１〜Ｒ３６と同義であり, 式ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示す。）
【００６４】
この工程は，一般式（ＶＩ）で示される化合物を適宜乾燥させる。この化合物を溶媒に溶解させ，式（ＶＩＩ）で示される化合物を滴下する。例えば，２０℃以上３０℃以下の温度で，３０分以上２時間以下撹拌する。反応を停止するためには低級アルコールを加えればよい。
【発明の効果】
【００６５】
本発明は，基本的には，アルコキシメチル系保護基を有するＲＮＡの修飾体について，保護基部分にハロゲン原子を置換基として導入することで，高い二重鎖形成能を付与できる。
【００６６】
また,本発明は，アルコキシメチル骨格を有するＲＮＡの修飾体について，保護基部分にハロゲン原子を置換基として導入することで，ＲＮＡの核酸塩基の種類によらずＲＮＡの修飾体を容易に合成できる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は，アルコキシメチル骨格修飾に対する置換基の影響を示す図面に替わるグラフである。
【図２】図２は，フッ素を含む修飾体の置換基の個数の影響を示す図面に替わるグラフである。
【図３】図３は，塩素原子を含む修飾体の置換基の個数の影響を示す図面に替わるグラフである。
【図４】図４は，塩素原子の１置換体及び２置換体と，シアノ基置換体及びメチル置換体を比較する図面に替わるグラフである。
【図５】図５は，フッ素を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を示す図面に替わるグラフである。
【図６】図６は，塩素原子を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を示す図面に替わるグラフである。
【図７】図７は，フッ素を含む修飾体の置換基の影響を示す図面に替わるグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
先に説明したとおり，本発明の第１の側面は，２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体に関する。そして,リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の２’−位の酸素原子をＯ＊として表現した場合，保護基が下記一般式（Ｉ）で示される。
【００６９】
【化１０】
0006284977.tif 000011
【００７０】
式中，Ｏ＊は，リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の２’位水酸基の酸素原子を示す。なお，Ｏ＊と接続されている部位が保護基部分である。このため上記一般式（Ｉ）では，リボース及び核酸塩基を含む部分をかっこで括っている。リボヌクレオチドは，ＲＮＡを構成する単位である。そして，リボヌクレオシドは，リボース及び核酸塩基を含む。リボヌクレオシドリン酸がリボヌクレオチドである。リボヌクレオシド又はリボヌクレオチドの誘導体は，ＲＮＡを構成するリボヌクレオシド又はリボヌクレオチドに１又は複数の置換基が付加したものである。置換基の例は，リボヌクレオシド又はリボヌクレオチドの水素原子と置換されるＣ１−３アルキル基,又はＣ１−３ハロアルキル基である。
【００７１】
一般式（Ｉ）において，Ｒ１及びＲ２は,同一でも異なってもよく，水素原子, Ｃ１−３アルキル基，Ｃ２−３アルケニル基，Ｃ２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ２−３アルキル基，又はＣ１−３ハロアルキル基を示す。Ｒ３及びＲ４は,同一でも異なってもよく，水素原子,ハロゲン原子，Ｃ１−３アルキル基，Ｃ２−３アルケニル基，Ｃ２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ２−３アルキル基，又はＣ１−３ハロアルキル基を示す。Ｒ５及びＲ６は,同一でも異なってもよく，水素原子，ハロゲン原子, Ｃ１−３アルキル基，Ｃ２−３アルケニル基，Ｃ２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ２−３アルキル基，Ｃ１−３ハロアルキル基を示す。Ｒ７は,ハロゲン原子又はＣ１−３ハロアルキル基を示す。
【００７２】
本発明は，上記のリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体を含むオリゴリボ核酸（オリゴＲＮＡ）をも提供する。そして，オリゴリボ核酸（オリゴＲＮＡ）は，アンチセンスＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，及びアプタマーを含む医薬品素材となる。このため，本発明は，上記のリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体を含む試薬，アンチセンスＲＮＡ用試薬，ｓｉＲＮＡ用試薬，及びアプタマー用試薬をも提供する。
【００７３】
先に説明したとおり，本発明の第２の側面は，２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の製造方法に関する。この製造方法については，後述する実施例に基づいて，当業者が公知の方法を適宜採用することで調整した者も本発明の第２の側面に含まれる。
【００７４】
以下，実施例を示し，本発明を具体的に説明する。しかしながら，本発明は，実施例に限定されず，当業者に自明な範囲で適宜修正したもの本発明に含まれる。
【実施例１】
【００７５】
測定系
ＮＭＲ［１Ｈ
ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ), ３１Ｐ ＮＭＲ
（１２１ ＭＨｚ）］測定には，ヴァリアンマーキュリー３００（Varian MERCURY） ３００
（３００ＭＨｚ） を用いた。１Ｈ ＮＭＲはＣＤＣｌ３中テトラメチルシラン（tetramethylsilane） (TMS) (δ0.0) を外部標準として用いた。３１Ｐ ＮＭＲは85% Ｈ３ＰＯ４ (δ0.0) を外部標準として用いた。ＵＶ／ｖｉｓスペクトル測定には，ＪＡＳＣＯ Ｖ−５５０ ＵＶ／ｖｉｓ スペクトロフォトメータ（spectrophotometer）を用いた。モルディタイムオブフライト質量分析（MALDI−TOF−MS）測定には，アプライドバイオシステム社製ボイジャーＤＥＳＴＲスペクトロメータ（Applied Biosystems Voyager−DE STR spectrometer）を用いた。薄相クロマトグラフィー (ＴＬＣ) には，ＴＬＣプレートシリカゲル（TLC plates Silica gel） ６０
Ｆ２５４ （メルク, Ｎｏ. ５７１５） を用いた。 シリカゲルカラムクロマトグラフィーには，カントーシリカゲル（Kanto silica gel ）60N （ｓｐｈｅｒｉｃａｌ, ｎｅｕｔｒａｌ, ６３−２１０マイクロm)を用いた。 逆相（Reversed−phase） HPLC (RP−HPLC) には，マイクロボンドアスフェア（μBondasphere） 5 μm C18 column (100 オングストローム, 3.9 mm × 150 mm) (Waters)，またはソース 5RPC ST 4.6/150 (4.6 mm × 150
mm) (GE ヘルスケア)を用いた。反応に用いた溶媒は，市販のものを適切に蒸留し，ナトリウムまたはモレキュラーシーブ （ＭＳ） で乾燥したものを用いた。反応は全てアルゴン（Ａｒ）雰囲気下に行った。
【００７６】
２’−Ｏ−ハロアルコシキメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリイル）ウリジン３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト）の合成
（2´−O−haloalchoxymethyl−5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)
uridine 3´−(2−cyanoethyl diisopropylphosphoramidite)）
以下のスキーム１〜３を,Ohgi,
T.; Kitagawa, H.; Yano, J.; Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,
2008, 2.15.1−2.15.19.に記載の方法を参照して行った。
【００７７】
２’−Ｏ−ハロアルコシキメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ａ−ｅ）の調整
（2´−O−
haloalchoxymethyl −3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3 −diyl)uridine (2a−e)）
【００７８】
スキーム１
【化１１】
0006284977.tif 000012
【００７９】
スキーム１において，ＮＩＳは，Ｎ−ヨードスクシンイミドを示す。ＴｆＯＨは，トリフルオロメタンスルホン酸を示す。ＴＨＦは，テトラヒドロフランを示す。
【００８０】
２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ａ）
（2´−O−(2−chloro)ethoxymethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine (2a)）
式１で示される化合物２’−Ｏ−メチルチオメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（１）（2´−O−methylthiomethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine） (1.09 g, 2 ｍｍｏｌ)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，THF(7 ml)に溶解させた。これに2−クロロエタノール (268 ml, 4 mmol)を加え，−４０°Cに冷却した。その後，N−ヨードスクシンイミド(540 mg, 2.4 mmol THF 5.4 ml中)を加え，トリフルオロメタンスルホン酸(351 ml, 2 mmol THF 7 ml中)を滴下した。反応混合物を−40°Cで1時間撹拌した後，トリエチルアミンを7 ml加えて反応を停止した。これにジクロロメタン(60 ml)を加え，10% Na2S2O3水溶液(40 ml×2)，飽和重曹水(40 ml×2)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(60 ml)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[3×10 cm, 30g のシリカゲル, ジクロロメタン−メタノール（dichloromethane−methanol） (99.5:0.5,v/v → 99:1,v/v)]によって精製することにより，式２ａで示される化合物(1.06 g, 92%)を得た。
【００８１】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 9.51 (1H, br, NH), d 7.90 (1H, d, J
= 8.1 Hz, 6−H) , d 5.75 (1H, s, 1´−H), d 5.69 (1H, d, J
= 8.4 Hz, 5−H) , d 5.05 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal) , d 4.99 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.29−3.67 (9H, m, 2´−H, 3´−H, 4´−H, 5´−H, CH2Cl−CH2−O),  d 1.11−0.93 (28H, m, iPr×4).
【００８２】
２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ｂ）
（2´−O−(2,2−dichloro)ethoxymethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine (2b)）
【００８３】
上記式１で示される２’−Ｏ−メチルチオメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(820 mg, 1.5 mmol) をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，THF(10 ml)に溶解させた。これに2,2−ジクロロエタノール (250 ml, 3 mmol)，モレキュラーシーブス4A (1.6 g)を加え，−40°Cに冷却した後，N−ヨードスクシンイミド(420 mg, 1.8 mmol)を加え，トリフルオロメタンスルホン酸(270 ml, 3 mmol)を滴下した。反応混合物を−40°Cで1時間撹拌した後，トリエチルアミンを5 ml加えて反応を停止した。これにジクロロメタン(40 ml)を加え，10% Na2S2O3水溶液(30 ml×2)，飽和重曹水(30 ml×2)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(40 ml)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×10 cm, 20g of silica
gel, dichloromethane−methanol
(99.5:0.5,v/v →
97:3,v/v)]によって精製することにより，式2bで示される化合物(761 mg, 83%)を得た。
【００８４】
1H
NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.09 (1H, br, NH), d 7.89 (1H, d, J =
8.4 Hz, 6−H) ,  d 5.86 (1H, t, CHCl2−CH2−O), d 5.72 (1H, s, 1´−H), d 5.69−5.66 (1H, m, 5−H) , d 5.09 (1H, d, J =
6.6 Hz, H−C of acetal) , d 5.02 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.29−3.96 (7H, m, 2´−H, 3´−H, 4´−H, 5´−H, CHCl2−CH2−O),  d 1.11−0.93 (28H, m, iPr×4).
【００８５】
２’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ｃ）
（2´−O−(2,2,2−trichloro)ethoxymethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine ）
上記式１で示される２’−Ｏ−メチルチオメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン (1.09  g, 2 mmol) をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，THF(14 ml)に溶解させた。これに2,2,2−トリクロロエタノール (970 ml, 10 mmol)，モレキュラーシーブス4A (1.5 g)，及びN−ヨードスクシンイミド(545 mg, 2.4 mmol)を加え，−40°Cに冷却した後，トリフルオロメタンスルホン酸(351 ml, 4 mmol)を滴下した。反応混合物を−40°Cで1時間撹拌した後，トリエチルアミンを1.5 ml加えて反応を停止した。これにジクロロメタン(60 ml)を加え，10% Na2S2O3水溶液(40 ml×2)，飽和重曹水(40 ml×2)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(40 ml×2)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[3×17 cm, 25g of silica gel, dichloromethane−methanol (99.5:0.5,v/v → 99:1,v/v)]によって精製することにより式２ｃで示される化合物(826 mg, 64%)を得た。
【００８６】
1H
NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.35 (1H, br, NH), d 7.89 (1H, d, J =
7.5 Hz, 6−H), d 5.75 (1H, s, 1´−H), d 5.68 (1H, d, J
= 7.8 Hz, 5−H) , d 5.23 (1H, d, J =
6.6 Hz, H−C of acetal) , d 5.16 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.35−3.96 (7H, m, 2´−H, 3´−H, 4´−H, 5´−H, CCl3−CH2−O),  d 1.11−0.96 (28H, m, iPr×4).
【００８７】
２’−Ｏ−（２，２−ジフルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ｄ）
（2´−O−(2,2−difluoro)ethoxymethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine ）
上記式１で示される２’−Ｏ−メチルチオメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(3.25 g, 6 mmol) をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，THF(38 ml)に溶解させた。これに2,2−ジフルオロエタノール (760 ml, 12 mmol)，及びモレキュラーシーブス4Aを加え，−40°Cに冷却した後，N−ヨードスクシンイミド(1.62 g, 7.2 mmol)を加え，トリフルオロメタンスルホン酸(760 ml, 12 mmol)を滴下した。反応混合物を−40°Cで1時間撹拌した後，トリエチルアミンを10 ml加えて反応を停止した。これにジクロロメタン(150 ml)を加え，10% Na2S2O3水溶液(150 ml×2)，飽和重曹水(150 ml×2)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(50 ml×2)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[4×16 cm, 80g of silica gel, dichloromethane−methanol (99.5:0.5,v/v → 99:1,v/v)]によって精製することで式２ｄで示される化合物(2.85 g, 83%)を得た。
【００８８】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.90 (1H, br, NH), d 7.90 (1H, d, J
= 8.1 Hz, 6−H) ,  d 6.17−5.77 (1H, m, CHF2−CH2−O), d 5.73 (1H, s, 1´−H), d 5.69 (1H, d, J = 7.5 Hz, 5−H) , d 5.06 (1H, d, J
= 6.9 Hz, H−C of acetal) , d 4.97 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.29−3.77 (7H, m, 2´−H, 3´−H, 4´−H, 5´−H, CHF2−CH2−O),  d 1.14−0.91 (28H, m, iPr×4).
【００８９】
２’−Ｏ−（２，２，２−トリフルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ｅ）
（2´−O−(2,2,2−trifluoro)ethoxymethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine )
上記式１で示される２’−Ｏ−メチルチオメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(1.09 g, 2 mmol) をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，THF(12 ml)に溶解させた。これに2,2,2−トリフルオロエタノール (288 ml, 4 mmol)，モレキュラーシーブス4A (1 g)を加え，−40°Cに冷却した後，N−ブロモスクシンイミド(540 mg, 2．4 mmol)を加え，p−トルエンスルホン酸(288 ml, 4 mmol)を滴下した。反応混合物を−40°Cで1時間撹拌した後，トリエチルアミンを3 ml加えて反応を停止した。これにジクロロメタン(60 ml)を加え，10% Na2S2O3水溶液(40 ml×2)，飽和重曹水(40 ml×2)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(40 ml×2)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[4×8 cm, 40g of silica gel, dichloromethane−methanol (99.5:0.5,v/v → 99:1,v/v)]によって精製を行なった。式２ｅで示される化合物を得ることはできたものの，アノマー異性体と考えられる副生成物の除去が困難であったため，これ以上の精製は行なわずこのまま次の反応に用いた。
【実施例２】
【００９０】
２’−Ｏ−（ハロアルコシキメチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリイル）ウリジン（４ａ−ｅ）の合成
（2´−O− haloalchoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine）
スキーム２
【００９１】
【化１２】
0006284977.tif 000013
【００９２】
上記スキーム２において，ＭｅＯＨはメタノールを示す。ＤＭＴｒＣｌは，４，４’−ジメトキシトリチリルクロライドを示す。Ｐｙｒｉｄｉｎｅはピリジンを示す。ｒｔは室温を示す。
【００９３】
２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ａ）
（2´−O−(2−chloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine )
式２ａで示される２’−Ｏ−２−クロロエトシキメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(869 mg, 1.5 mmol)をピリジン，及びによって共沸乾燥を行ない，メタノール(7.5 ｍｌ)に溶解させた。これにフッ化アンモニウム (222 mg, 6 mmol)を加え，50°Cで7時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し，アセトニトリル(30 ｍｌ)を加え，不溶物をろ過により除去した。これをヘキサン(30 ｍｌ×2)で洗浄し，集めた洗液をアセトニトリル(30 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を減圧下濃縮し，これ以上の精製は行なわず次の反応に用いた。粗精製物をピリジンによって共沸乾燥を行ない，ピリジン(15 ｍｌ)に溶解させた。これに４，４’−ジメトキシトリチリルクロライド（4,4´−dimethoxytritylchloride：ＤＭＴｒＣｌ）(730 mg, 2.25 mmol)を加え，室温で3日間撹拌した。メタノール(1.5 ｍｌ)で反応を停止した後，溶媒を減圧下留去し，ジクロロメタン(40 ｍｌ)を加えた。これを飽和重曹水(40 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(40 ｍｌ×2)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[3×14 cm, 40g of silica gel, dichloromethane−methanol− pyridine (99.5:0:0.5,v/v/v → 96.5:3:0.5,v/v/v)]によって精製することにより式４ａで示される化合物(754 mg, 79%)を得た。
【００９４】
1H
NMR (300 MHz, CDCl3) d 9.35 (1H, br, NH) , d 7.94 (1H, d, J =
8.1 Hz, 6−H) , d 7.40−6.82 (13H, m,
DMTr) , d 6.03 (1H, d, J = 2.7 Hz, 1´−H) , d 5.33−5.30 (1H, m, 5−H) , d 5.03 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal) , d 4.93 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.50 (1H, m, 3´−H) , d 4.36−4.33 (1H, m, 2´−H) , d 4.09−4.07 (1H, m, 4´−H) , d 3.89−3.63 (8H, m, MeO×2, CH2Cl−CH2−O) , d 3.54−3.52 (2H, m, 5´−H),  d 2.74 (1H, d, 3´−OH).
【００９５】
２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ｂ）
（2´−O−(2,2−dichloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine )
式２ｂで示される化合物２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(５３１ｍｇ, ８６５ｍｍｏｌ)をピリジン，及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，メタノール(5 ｍｌ)に溶解させた。これにフッ化アンモニウム (１３２ ｍｇ, ３．５６ ｍｍｏｌ)を加え，５０℃Ｃで４時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し，アセトニトリル(30 ｍｌ)を加え，不溶物をろ過により除去した。これをヘキサン(３０ ｍｌ×２)で洗浄し，集めた洗液をアセトニトリル(２０ ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を減圧下濃縮し，これ以上の精製は行なわず次の反応に用いた。粗精製物をピリジンによって共沸乾燥を行ない，ピリジン(10 ｍｌ)に溶解させた。これにＤＭＴｒＣｌ(２９０ ｍｇ, ８５０ ｍｍｏｌ)を加え，室温で10時間撹拌した。メタノール(２ ｍｌ)で反応を停止した後，溶媒を減圧下留去し，ジクロロメタン(15 ｍｌ)を加えた。これを飽和重曹水(10 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(10 ｍｌ×2)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[3×14 cm, 40g of silica gel, dichloromethane−methanol− pyridine (99.5:0:0.5,v/v/v → 98.5:1:0.5,v/v/v)]によって精製することで式４ｂで示される化合物(470 mg, 86%)を得た。
【００９６】
1H
NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.24 (1H, br, NH) , d 7.96 (1H, d, J = 8.1
Hz, 6−H) , d 7.39−6.83 (13H, m,
DMTr) , d 6.01 (1H, d, J = 2.7 Hz, 1´−H) ,  d 5.80
(1H, t, CHCl2−CH2−O) , d 5.78−5.31 (1H, m, 5−H) , d 5.11 (1H, d, J = 6.9 Hz, H−C of
acetal) , d 4.98 (1H, d, J = 6.6 Hz, H−C of
acetal), d 4.53−4.46 (1H, m, 3´−H) , d 4.35−4.32 (1H, m, 2´−H) , d 4.06−4.04 (1H, m, 4´−H) , d 4.02−4.00 (2H, m, CHCl2−CH2−O) , d 3.80 (6H, s, MeO×2) , d 3.61−3.51 (2H, m, 5´−H),  d 2.41 (1H, d, 3´−OH).
【００９７】
２’−Ｏ−２，２，２−トリクロロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ｃ）
（2´−O−(2,2,2−trichloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine )
式２ｃで示される化合物２’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（６５０ ｍｇ, １ ｍｍｏｌ）をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，メタノール（５ ｍｌ）に溶解させた。これにフッ化アンモニウム (148 mg, 4 mmol)を加え，５０°Cで７時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し，アセトニトリル(20 ｍｌ)を加え，不溶物をろ過により除去した。これをヘキサン(20 ｍｌ×2)で洗浄し，集めた洗液をアセトニトリル(20 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を減圧下濃縮し，これ以上の精製は行なわず次の反応に用いた。粗精製物をピリジンによって共沸乾燥を行ない，ピリジン(10 ｍｌ)に溶解させた。これにＤＭＴｒＣｌ(５１０ ｍｇ,  １．５１ｍｍｏｌ）を加え，室温で18時間撹拌した。メタノール(1 ｍｌ)で反応を停止した後，溶媒を減圧下留去し，ジクロロメタン(30 ｍｌ)を加えた。これを飽和食塩水(30 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(30 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×10 cm, 25g of silica gel, dichloromethane−methanol− pyridine (99.5:0:0.5,v/v/v → 98.5:1:0.5,v/v/v)]によって精製することにより式４ｃで示される化合物(621 mg, 88%)を得た。
【００９８】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.27 (1H, br, NH) , d 7.95 (1H, d, J
= 7.8 Hz, 6−H) , d 7.40−6.83 (13H, m, DMTr) , d 6.04 (1H, d, J = 3.0 Hz, 1´−H) , d 5.33−5.29 (1H, m, 5−H) , d 5.22 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal) , d 5.11 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.52−4.48 (1H, m, 3´−H) , d 4.41−4.39 (1H, m, 2´−H) , d 4.29−4.20 (2H, m, CCl3−CH2−O), d 4.10−4.08 (1H, m, 4´−H), d 3.80 (6H, s,
MeO×2) , d 3.57−3.53 (2H, m, 5´−H),  d 2.42
(1H, d, 3´−OH).
【００９９】
２’−Ｏ−２，２−ジフルオロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ｄ） 
（2´−O−(2,2−difluoro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine )
式２ｄで示される化合物２’−Ｏ−（２，２−ジフルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン (1.16 g, 2 mmol)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，メタノール(10 ｍｌ)に溶解させた。これにフッ化アンモニウム (296 mg, 8 mmol)を加え，50°Cで7時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し，アセトニトリル(40 ｍｌ)を加え，不溶物をろ過により除去した。これをヘキサン(50 ｍｌ×2)で洗浄し，集めた洗液をアセトニトリル(30 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を減圧下濃縮し，これ以上の精製は行なわず次の反応に用いた。粗精製物をピリジンによって共沸乾燥を行ない，ピリジン(20 ｍｌ)に溶解させた。これにＤＭＴｒＣｌ(1.42 g, 4.2 mmol)を加え，室温で3日間撹拌した。メタノール(2 ｍｌ)で反応を停止した後，溶媒を減圧下留去し，ジクロロメタン(30 ｍｌ)を加えた。これを飽和重曹水(30 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をクロロホルム (30 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[3×8 cm, 20g of silica gel, dichloromethane−methanol− pyridine (99.5:0:0.5,v/v/v → 96.5:3:0.5,v/v/v)]によって精製することにより，式４ｄで示される化合物(376 mg, 90%)を得た。
【０１００】
1H NMR
(300 MHz, CDCl3) d 8.25 (1H, br, NH) ,
d 7.96 (1H, d, J = 8.1 Hz, 6−H) , d 7.39−6.83 (13H, m, DMTr) ,  d 6.10−5.73 (1H, m, CHF2−CH2−O) , d 6.00 (1H, d, J = 2.7 Hz, 1´−H) , d 5.32−5.28 (1H, m, 5−H) , d 5.07 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal) , d 4.93 (1H, d, J =
6.6 Hz, H−C of acetal), d 4.53−4.47 (1H, m, 3´−H) , d 4.34−4.31 (1H, m, 2´−H) , d 4.08−4.06 (1H, m, 4´−H) , d 3.88−3.78 (8H, m, CHCl2−CH2−O, MeO×2) , d 3.60−3.51 (2H, m, 5´−H),  d 2.39
(1H, d, 3´−OH).
【０１０１】
２’−Ｏ−２，２，２−トリフルオロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ｅ） 
（2´−O−(2,2,2−trifluoro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine )
式２ｅで示される化合物２’−Ｏ−（２，２，２−トリフルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(414 mg, 692 mmol, crude)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，メタノール(4 ｍｌ)に溶解させた。これにフッ化アンモニウム (103 mg, 2.78 mmol)を加え，50°Cで8時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し，アセトニトリル(15 ｍｌ)を加え，不溶物をろ過により除去した。これをヘキサン(15 ｍｌ×2)で洗浄し，集めた洗液をアセトニトリル(10 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を減圧下濃縮し，これ以上の精製は行なわず次の反応に用いた。粗精製物をピリジンによって共沸乾燥を行ない，ピリジン(7 ｍｌ)に溶解させた。これにＤＭＴｒＣｌ（５１０ｍｇ, １．５１  ｍｍｏｌ）を加え，室温で17時間撹拌した。メタノール(1 ｍｌ)で反応を停止した後，溶媒を減圧下留去し，クロロホルム(20 ｍｌ)を加えた。これを飽和食塩水(20 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をクロロホルム(20 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[1×15 cm, 10g of silica gel, dichloro methane−methanol− pyridine (99.5:0:0.5,v/v/v → 98.5:1:0.5,v/v/v)]によって精製することにより，式４ｅで示される化合物(205 m,式１で示される化合物からの収率19%)を得た。
【０１０２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.06 (1H, br, NH) , d 7.95 (1H, d, J
= 8.4 Hz, 6−H) , d 7.39−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.00 (1H, d, J = 2.7 Hz, 1´−H) , d 5.1 (1H, d, J
= 8.4 Hz, 5−H) , d 5.10 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal) , d 4.96 (1H, d, J =
7.2 Hz, H−C of acetal), d 4.48 (1H, m, 3´−H) , d 4.35−4.33 (1H, m, 2´−H) , d 4.08−3.95 (2H, m, CF3−CH2−O, 4´−H) , d 3.80 (6H, s,
MeO×2) , d 3.57−3.53 (2H, m, 5´−H),  d 2.33
(1H, d, 3´−OH).
【０１０３】
２’−Ｏ−ハロアルコシキメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリイル）ウリジン３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ａ−ｅ）の調整
（2´−O−haloalchoxymethyl−5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyanoethyl diisopropylphosphoramidite)）
スキーム３
【０１０４】
【化１３】
0006284977.tif 000014
【０１０５】
スキーム３中，ＤＩＰＥＡは，ジイソプロピルアミンを示す。
【０１０６】
２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ａ）
（2´−O−(2−chloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyanoethyl diisopropylphosphoramidite) ）
式４ａで示される２’−Ｏ−２−クロロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（５１１ ｍｇ, ８００ ｍｍｏｌ）をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，ジクロロメタン(4 ｍｌ)に溶解させた。これにジイソプロピルアミン (410 ｍｌl, 2.4 ｍmol)を加え，2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジド (268 ｍｌ, 1.2 ｍmol in CH2Cl2 4 ｍｌ) を滴下した。室温で1時間撹拌し，エタノール(1.5  ｍｌ)で反応を停止した。これにジクロロメタン(40  ｍｌ)を加え，飽和重曹水(40 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(40 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×10 ｃｍ, 15g of amino silica gel, hexane−ethylacetate (7:3,v/v → ethylacetate only)]によって精製することで，ジアステレオマー混合物の目的物である式５ａで示される化合物(469 mg, 70%)を得た。
【０１０７】
1H
NMR (300 MHz, CDCl3) d 9.15 (1H, br, NH) , d 7.99−7.92 (1H, m, 6−H) , d 7.41−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.06 (1H, m, 1´−H) , d 5.30−5.23 (1H, m, 5−H) , d 5.06−4.93 (2H, m, H−C of acetal) , d 4.58−4.56 (1H, m, 3´−H) , d 4.47−4.42 (1H, m, 2´−H) , d 4.27−4.18 (1H, m, 4´−H) , d 3.99−3.44 (16H, m, MeO×2, 5´−H, 2×(CH3)2CH−N, CH2Cl−CH2−O, NC−CH2CH2−), d 2.69−2.41 (2H, m, NC−CH2CH2−) , d 1.17−1.02 (12H, m, 2×(CH3)2CH−N).
31P NMR (121 MHz, CDCl3) d 151.35, d 150.48
【０１０８】
２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｂ）
（2´−O−(2,2−dichloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyano ethyl diisopropylphosphoramidite) ）
式４ｂで示される２’−Ｏ−２，２−ジクロロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジンをピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，ジクロロメタン(3 ｍｌ)に溶解させた。これにジイソプロピルアミン (255 ｍｌ, 1.5 mmol)を加え，2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジド (167 ｍｌ, 1.2 mmol in CH2Cl2 2 ｍｌ) を滴下した。室温で1.5時間撹拌し，エタノール(1 ｍｌ)で反応を停止した。これにジクロロメタン(30 ｍｌ)を加え，飽和重曹水(30 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(30 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×6 cm, 10g of amino silica gel, hexane−ethylacetate (7:3,v/v → ethylacetate only)]によって精製することで，ジアステレオマー混合物の目的物である式５ｂで示される化合物(324 mg, 77%)を得た。
【０１０９】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.16 (1H, br, NH) , d 7.99−7.94 (1H, m, 6−H) , d 7.41−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.04−6.01 (1H, m, 1´−H) , d 5.86−5.79 (1H, m, 5−H) ,  d 5.29−5.20 (1H, m, CHCl2−CH2−O) , d 5.02−4.86 (2H, m, H−C of アセタール) , d 4.58−4.54 (1H, m, 3´−H) , d 4.44−4.41 (1H, m, 2´−H) , d 4.27−4.18 (1H, m, 4´−H) , d 4.13−3.42 (14H, m, MeO×2, 5´−H, 2×(CH3)2CH−N, CHCl2−CH2−O, NC−CH2CH2−), d 2.68−2.44 (2H, m, NC−CH2CH2−) , d 1.25−1.03 (12H, m, 2×(CH3)2CH−N).
31P NMR (121 MHz, CDCl3) d 151.49, d 150.43
【０１１０】
２’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｃ）
（2´−O−(2,2,2−trichloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyano ethyl diisopropylphosphoramidite) )
式４ｃで示される２’−Ｏ−２，２，２−トリクロロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン(283 mg, 400 ｍｍｏｌ)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，ジクロロメタン(2 ｍｌ)に溶解させた。これにジイソプロピルアミン (204 ｍｌ, 1.5 mmol)を加え，2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジド (134 ｍｌ, 600 ｍｍｏｌ in CH2Cl2 2 ｍｌ) を滴下した。室温で1時間撹拌し，エタノール(1 ｍｌ)で反応を停止した。これにジクロロメタン(25 ｍｌ)を加え，飽和重曹水(25 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(25 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×6 cm, 10g of amino silica gel, hexane−ethylacetate (8:2,v/v → ethylacetate only)]によって精製することで，ジアステレオマー混合物の目的物である式５ｃで示される化合物(285 mg, 83%)を得た。
【０１１１】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.11 (1H, br, NH) , d 7.96−7.94 (1H, m, 6−H) , d 7.41−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.06 (1H, m, 1´−H) , d 5.30−5.06 (3H, m, 5−H, H−C
of acetal) , d 4.59−4.47 (2H, m, 3´−H, 2´−H) , d 4.29−3.41 (15H, m, 4´−H, MeO×2, 5´−H, 2×(CH3)2CH−N, CCl3−CH2−O, NC−CH2CH2−), d 2.68−2.42 (2H, m, NC−CH2CH2−) , d 1.26−1.03 (12H, m, 2×(CH3)2CH−N).
31P NMR (121 MHz, CDCl3) d 151.49, d 150.43
【０１１２】
２’−Ｏ−（２，２−ジフルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｄ）
（2´−O−(2,2−difluoro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyano ethyl diisopropylphosphoramidite) )
式４ｄで示される２’−Ｏ−２，２−ジフルオロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン(320 mg, 500 ｍｍｏｌ)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，ジクロロメタン(5 ｍｌ)に溶解させた。これにジイソプロピルアミン (255 ｍｌ, 1.5 mmol)を加え，氷浴下で2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジド (225 ｍｌ, 1 mmol) を滴下した。室温で1時間撹拌し，反応混合物にクロロホルム(30 ｍｌ)を加えた。これをリン酸バッファー (pH 7.0, 20 ｍｌ×4)で洗浄し，集めた洗液をクロロホルム(40 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[1×8 cm, 5g of amino silica gel, hexane−ethylacetate (7:3,v/v → ethylacetate only)]によって精製することで，ジアステレオマー混合物の目的物である式５ｄで示される化合物(227 mg, 54%)を得た。
【０１１３】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.10 (1H, br, NH) , d 8.00−7.94 (1H, m, 6−H) , d 7.39−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.10−5.73 (2H, m, 1´−H) ,  d 5.28−5.20 (2H, m, CHF2−CH2−O, 5−H) , d 5.03−4.89 (2H, m, H−C of acetal) , d 4.61−4.56 (1H, m, 3´−H) , d 4.43−4.41 (1H, m, 2´−H) , d 4.27−4.20 (1H, m, 4´−H) , d 3.93−3.42 (14H, m, MeO×2, 5´−H, 2×(CH3)2CH−N, CHF2−CH2−O, NC−CH2CH2−) , d 2.65−2.44 (2H, m, NC−CH2CH2−) , d 1.29−0.85 (12H, m, 2×(CH3)2CH−N).
31P NMR (121 MHz, CDCl3) d 151.56, d 150.38
【０１１４】
２’−Ｏ−（２，２，２−トリフルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチル  ジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｅ）
（2´−O−(2,2,2−trifluoro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyano ethyl diisopropylphosphoramidite) ）
式４ｅで示される２’−Ｏ−２，２，２−トリフルオロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン (184 mg, 280 ｍｍｏｌ)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，ジクロロメタン(2 ｍｌ)に溶解させた。これにジイソプロピルアミン (143 ｍｌ, 840 ｍｍｏｌ)を加え，2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジド (93.7 ｍｌ, 420 ｍｍｏｌ in CH2Cl2 1 ｍｌ) を滴下した。室温で1.5時間撹拌し，エタノール(500 ｍｌ)で反応を停止した。これにジクロロメタン(15 ｍｌ)を加え，飽和重曹水(15 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(15 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×7 cm, 11g of amino silica gel, hexane−ethylacetate (8:2,v/v → ethylacetate only)]によって精製することで，ジアステレオマー混合物の目的物である式５ｅで示される化合物(188 mg, 80%)を得た。
【０１１５】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 9.00 (1H, br, NH) , d 7.99−7.94 (1H, m, 6−H) , d 7.39−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.01 (1H, m, 1´−H) ,  d 5.30−5.21 (1H, m, 5−H) , d 5.05−4.97 (2H, m, H−C of acetal) , d 4.62−4.55 (1H, m, 3´−H) , d 4.44 (1H, m, 2´−H) , d 4.27−4.18 (1H, m, 2´−H) , d 4.10−3.42 (14H, m, MeO×2, 5´−H, 2×(CH3)2CH−N, CCl3−CH2−O, NC−CH2CH2−), d 2.64−2.41 (2H, m, NC−CH2CH2−) , d 1.26−1.02 (12H, m, 2×(CH3)2CH−N).
31P NMR (121 MHz, CDCl3) d 151.74, d 150.40
【実施例３】
【０１１６】
２’−Ｏ−（２−フルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｆ）の調整
（2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-5´-O-(4,4´-dimethoxytrityl) uridine 3´-(2-cyanoethyl diisopropylphosphoramidite) (5f)）
【０１１７】
スキーム４
【化１４】
0006284977.tif 000015
【０１１８】
スキーム４中，ＮＩＳは，Ｎ−ヨードスクシンイミドを示す。ＴｆＯＨは，トリフルオロメタンスルホン酸を示す。ＴＨＦは，テトラヒドロフランを示す。ＭｅＯＨはメタノールを示す。ＤＭＴｒＣｌは，４，４’−ジメトキシトリチリルクロライドを示す。Ｐｙｒｉｄｉｎｅはピリジンを示す。ｒｔは室温を示す。
【０１１９】
２’−Ｏ−（２−フルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン（２ｆ）
（2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl)uridine(2f)）
2fの粗精製物は1(1.64 g, 3 mmol)と2-フルオロエタノール (1.65 ml, 30 mmol) から、2aと同様の手法により得た。シリカゲルクロマトグラフィー[3×17 cm, 50g of silica gel, hexane-ethylacetate (7:3,v/v)]によって精製を行い、2fを得た(1.13 g, 66%)。
【０１２０】
1H NMR (300
MHz, CDCl3), 9.57 (1H, br, NH), 7.90 (1H, d, J = 8.1 Hz, 6-H),
5.76 (1H, s, 1´-H), 5.69 (1H, d, J
= 8.1 Hz, 5-H), 5.04 (1H, d, J = 6.9 Hz, H-C of acetal), 5.00 (1H, d, J
= 6.9 Hz, H-C of acetal), 4.68-4.53 (2H, m, CH2F-CH2-O)
4.29-3.86 (7H, m, 2´-H, 3´-H, 4´-H, 5´-H, CH2F-CH2-O),
1.10-0.91 (28H, m, iPr×4).
【０１２１】
２’−Ｏ−（２−フルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ｆ）
(2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-5´-O-(4,4´-dimethoxytrityl)uridine (4f))
4fの粗精製物は，2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane
-1,3-diyl)uridine 2f (1.13 g, 2.0 mmol)を原料とし、4aと同様の手法により得た。シリカゲルクロマトグラフィー[2.5×15 cm, 22g of silica gel, dichloromethane-methanol- pyridine
(99.5:0:0.5,v/v/v → 96.5:1:0.5,v/v/v)]によって精製を行い4fを得た(908 mg, 73%)。
【０１２２】
1H NMR (300
MHz, CDCl3) 8.03 (1H, br, NH), 7.93 (1H, d, J = 8.4 Hz, 6-H),
7.39-6.82 (13H, m, DMTr), 6.02 (1H, d, J = 3.3 Hz, 1´-H), 5.30-5.28 (1H, m, 5-H), 5.04 (1H, d, J
= 6.6 Hz, H-C of acetal), 4.93 (1H, d, J = 6.6 Hz, H-C of acetal),
4.67-4.46 (3H, m, 3´-H, CH2F-CH2-O),
4.36-4.34 (1H, m, 2´-H), 4.10-4.08 (1H, m, 4´-H),3.94-3.80 (8H, m, MeO×2, CH2F-CH2-O),
3.53-3.52 (2H, m, 5´-H), 2.61 (1H, d, 3´-OH).
【０１２３】
２’−Ｏ−（２−フルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｆ）
(2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-5´-O-(4,4´-dimethoxytrityl) uridine 3´-(2-cyanoethyl diisopropylphosphoramidite) (5f))
2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-5´-O-(4,4´-dimethoxytrityl)uridine
4f (908 mg, 1.46 mmol)を原料とし、5aと同様に合成、精製を行い、ジアステレオマー混合物の5fを得た(918 mg, 77%)。
【０１２４】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.34 (1H, br, NH) , d 7.95-7.90 (1H, m, 6-H) , d 7.41-6.84 (13H, m, DMTr)
, d 6.06 (1H, m, 1´-H) , d 5.30-5.23 (1H, m, 5-H) ,
d 5.01-4.86 (2H, m, H-C of acetal) , d 4.67-4.43 (4H, m, 2’-H, 3´-H, CH2F-CH2-O) , d 3.97-3.40 (14H, m, MeO×2, 5´-H, 2×(CH3)2CH-N, CH2F-CH2-O,
NC-CH2CH2-), d 2.68-2.41 (2H, m, NC-CH2CH2-) , d 1.28-1.03 (12H, m, 2×(CH3)2CH-N).
31P NMR (121 MHz, CDCl3) d 151.1, d 150.8
【実施例４】
【０１２５】
ＤＮＡ合成機ＡＢＩエクセペダイト８９０９を用いた固相合成
鎖長伸長サイクルは，2´−O−TBDMS RNA 0.2 マイクロモルスケールのプロトコルにより行なった。合成試薬は全て，グレンリサーチ（Glen Research）社より購入したＡＢＩ用のものを用いた。固相担体には，グレンリサーチより購入したＵ-ＲＮＡ-ＣＰＧ (0.2 マイクロmol for Expedite)を用いた。アミダイトユニットは，ジクロロメタンに溶解させ用いた。
【０１２６】
合成後，CPGの充填されているカラムに対しアンモニア水(1 ml)を加え，室温で3時間反応させた。溶液を減圧下濃縮し，凍結乾燥によって乾固させた。これを水に溶かし，逆相HPLCを用いて分析，精製した。
【０１２７】
ＲＮＡ合成のプロトコル
(2´−O−TBDMS RNA 0.2 mmol scale)
【０１２８】
【表１】
0006284977.tif 000016
【０１２９】
合成したオリゴヌクレオチドの配列と性質
【０１３０】
【表２】
0006284977.tif 000017
【０１３１】
Ｕ１２−Ａ１２デュープレックスの融解温度解析
合成したU12オリゴマーと，rA12またはdA12オリゴマー各々0.3 nmolを10 mM phosphate−100 mM NaCl−0.1 mM EDTA buffer (pH 7.0) 150 mlに溶かした。オリゴマー溶液を8連セルに100 ml加え，室温から5 °C / minの速度で90 °Cまで上昇させた後，90 °Cの状態を10分間保持し，−2 °Cの速度で0 °Cになるまで温度を下降させ，アニーリングを行なった。オリゴマー溶液を4 °Cで1時間静置した後，融解温度Tm値の測定を行なった。オリゴマー溶液をセルに入れ，減圧下15分間脱気した後，窒素気流下，0.5 °C / minの速度で90 °Cまで温度を上昇させながら，0.5 °C間隔で260 nmにおける吸光度を測定した。
【０１３２】
(1)アルコキシメチル骨格修飾に対する置換基の影響 (vs RNA  U12−rA12)
アルコキシメチル骨格修飾に対する置換基の影響を検討した。その結果を図１に示す。図１は，アルコキシメチル骨格修飾に対する置換基の影響を示す図面に替わるグラフである。図中，縦軸は相対的な吸収量を示す。Ｕは,核酸塩基がウラシルである核酸を示す。ＤＦＥＭは, 核酸の２，２−ジフルオロエトキシメチル修飾体を示す。ＤＣＥＭは，核酸の２，２−ジクロロエトキシメチル修飾体を示す。ＥＯＭは, 核酸の２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体を示す。また,これらの特性を下表に示す。
【０１３３】
【表３】
0006284977.tif 000018
【０１３４】
上記の表から, ２’−Ｏ−エトキシメチル修飾により，二重鎖融解温度Ｔｍが減少することが改めて示された。一方,ハロ置換２’−Ｏ−エトキシメチル修飾により, 二重鎖融解温度Ｔｍが上昇することが示された。特に，２，２−ジクロロエトキシメチル修飾体は，きわめて高い二重鎖結合能を有することが示された。
【０１３５】
(2)アルコキシメチル骨格修飾に対する置換基の個数の影響
(2−1)フッ素を含む修飾体 (vs RNA  U12−rA12)
フッ素を含む修飾体の置換基の個数の影響を検討した。その結果を図２に示す。図２は，フッ素を含む修飾体の置換基の個数の影響を示す図面に替わるグラフである。図中，縦軸は相対的な吸収量を示す。Ｕは,核酸塩基がウラシルである核酸を示す。ＤＦＥＭは, 核酸の２，２−ジフルオロエトキシメチル修飾体を示す。ＴＦＥＭは，核酸の２，２，２−トリクロロエトキシメチル修飾体を示す。ＥＯＭは, 核酸の２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体を示す。また,これらの特性を下表に示す。
【０１３６】
【表４】
0006284977.tif 000019
【０１３７】
上記の表から，フッ素原子で置換したハロエトキシメチル基を保護器とするリボヌクレオシドは，二重鎖形成能力を有するがそれほど高くないことがわかる。
【０１３８】
(2−2)塩素を含む修飾体 (vs RNA  U12−rA12)
塩素を含む修飾体の融解温度を測定した。その結果を図３に示す。図３は，塩素原子を含む修飾体の置換基の個数の影響を示す図面に替わるグラフである。
【表５】
0006284977.tif 000020
【０１３９】
上記の表から，塩素原子の１置換体及び２置換体において，融解温度が極めて顕著に増加することがわかる。
【０１４０】
(3)ハロアルコキシメチル修飾体とＣＥＭ体，Ｍｅ体との比較 (vs RNA  U12−rA12)
【０１４１】
次に，上記の通り，顕著な融解温度を示す塩素原子の１置換体及び２置換体と，２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）置換体及びメチル置換体とを比較した。その結果を図４に示す。図４は，塩素原子の１置換体及び２置換体と，シアノ基置換体及びメチル置換体を比較する図面に替わるグラフである。
【０１４２】
【表６】
0006284977.tif 000021
【０１４３】
上記のとおりであるから，塩素原子の１置換体及び２置換体は，２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）置換体に比べて融解温度が優位に上昇することがわかる。また，塩素原子の１置換体及び２置換体は，メチル置換体と同程度の高い溶解温度を示すことがわかる。
【０１４４】
(4) DNAに対する親和性の検討
(4−1)フッ素を含む修飾体  (vs DNA  U12−dA12)
次に，フッ素を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を検討した。その結果を図５に示す。図５は，フッ素を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を示す図面に替わるグラフである。
【０１４５】
【表７】
0006284977.tif 000022
【０１４６】
フッ素原子を含む修飾体はＤＮＡに対する親和性を示さなかった。
【０１４７】
(4−2)塩素を含む修飾体  (vs DNA  U12−dA12)
次に，塩素を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を検討した。その結果を図６に示す。図６は，塩素原子を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を示す図面に替わるグラフである。
【０１４８】
【表８】
0006284977.tif 000023
【０１４９】
塩素原子を含む修飾体はＤＮＡに対する親和性を示さなかった。
【０１５０】
(5)アルコキシメチル骨格修飾に対するフッ素置換基の影響 (vs RNA  U12−rA12)
フッ素を含む修飾体の置換基の影響を検討した。その結果を図７に示す。図７は，フッ素を含む修飾体の置換基の影響を示す図面に替わるグラフである。図中，縦軸は相対的な吸収量を示す。Ｕは,核酸塩基がウラシルである核酸を示す。ＥＯＭは, 核酸の２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体を示す。ＭＦＥＭは，核酸の２’−Ｏ−フルオロエトキシメチル修飾体を示す。また,これらの特性を下表に示す。
【０１５１】
【表９】
0006284977.tif 000024
【０１５２】
上記の表から，フッ素原子で置換したハロエトキシメチル基を有するリボヌクレオシドは，天然型RNAよりも高い二重鎖形成能力を有するが、安定化の効果はそれほど大きくない。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
オリゴリボ核酸（オリゴＲＮＡ）は，アンチセンスＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，アプタマーなどの医薬品素材となる機能性分子として注目され，世界中で医薬品としての開発が進められている。したがって，本発明は医薬産業の分野で利用され得る。
【図１】
0006284977.tif 000034
【図２】
0006284977.tif 000035
【図３】
0006284977.tif 000036
【図４】
0006284977.tif 000037
【図５】
0006284977.tif 000038
【図６】
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【図７】
0006284977.tif 000040