(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）対象における免疫応答を増強する、および／もしくはT細胞寛容を低下させるための、または（ii）癌の処置のための、CEACAM1とそのリガンドの相互作用を阻害する抗体およびPD1とそのリガンドの相互作用を阻害する抗体の治療的有効量を含む、治療用の組み合わせ。
【請求項２】
（i）同時にCEACAM1およびPD1と物理的に接触し、かつCEACAM1とそのリガンドの相互作用を阻害し、PD1とそのリガンドの相互作用を阻害することが可能な分子を含む、二重特異性抗体、または
（ii）CEACAM1とそのリガンドの相互作用を阻害する抗体の抗原結合部分、およびPD1とそのリガンドの相互作用を阻害する抗体の抗原結合部分を含む、二重特異性抗体
を含む、請求項1記載の治療用の組み合わせ。
【請求項３】
前記抗体の1つもしくは複数が、CEACAM1、PD1、およびPD-L1からなる群より選択される標的を結合する、請求項1または2記載の治療用の組み合わせ。
【請求項４】
前記抗体が、標的によって媒介されるシグナル伝達を阻害する、請求項3記載の治療用の組み合わせ。
【請求項５】
前記CEACAM1とそのリガンドの相互作用を阻害する抗体が、SEQ ID NO:32に記載の配列を有するCEACAM1分子、またはSEQ ID NO:32の対立遺伝子変種もしくはスプライス変種を結合する、請求項1〜4のいずれか一項記載の治療用の組み合わせ。
【請求項６】
前記CEACAM1とそのリガンドの相互作用を阻害する抗体が、CEACAM1リガンド相互作用部位を結合する、請求項1〜5のいずれか一項記載の治療用の組み合わせ。
【請求項７】
前記CEACAM1とそのリガンドの相互作用を阻害する抗体が、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基番号1〜429のいずれかに対応するアミノ酸残基に結合する、請求項6記載の治療用の組み合わせ。
【請求項８】
前記CEACAM1とそのリガンドの相互作用を阻害する抗体が、CEACAM1の細胞外ドメインを結合する；および／またはCEACAM1のホモフィリックな相互作用ドメインを結合し、かつCEACAM1分子のホモフィリックな相互作用を阻害する、請求項1〜7のいずれか一項記載の治療用の組み合わせ。
【請求項９】
前記PD1とそのリガンドの相互作用を阻害する抗体が、SEQ ID NO:1に記載の配列を有するPD1分子、またはSEQ ID NO:1の対立遺伝子変種もしくはスプライス変種を結合する、請求項1〜8のいずれか一項記載の治療用の組み合わせ。
【請求項１０】
前記PD1とそのリガンドの相互作用を阻害する抗体が、PD1リガンド相互作用部位を結合する、請求項1〜9のいずれか一項記載の治療用の組み合わせ。
【請求項１１】
前記PD1とそのリガンドの相互作用を阻害する抗体が、SEQ ID NO:1のアミノ酸残基番号41〜136のいずれかに対応するアミノ酸残基に結合する、請求項10記載の治療用の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年10月12日付で出願された米国特許仮出願第61/713,203号の35 U.S.C. § 119(e)下での恩典を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所により授与された、助成金交付番号第DK051362号の政府支援でなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は配列表を含み、この配列表は、ASCII形式で電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。2013年10月10日付で作出された前記ASCIIのコピーは、043214-075201_SL.txtという名称であり、サイズが29,715バイトである。
【０００４】
技術分野
本発明は、分子免疫学および細胞生物学に関する。より具体的には、本明細書において記述される技術は、T細胞寛容の調節に関する。
【背景技術】
【０００５】
背景
免疫系は、異物の進入および病変細胞から身体を保護するために存在する。健康な免疫系は、異質または異常細胞を認識し、それらを破壊の標的としうる。免疫系の自然制御の一端として、健康な宿主細胞を認識する免疫系の成分(例えばT細胞)は、破壊されるか、または不活性状態に入らざるを得ない。これが、「T細胞寛容」といわれる現象である。これは、免疫系が宿主生物自体の健康な細胞を攻撃するのを防ぐ。
【０００６】
しかしながら、慢性疾患の場合、慢性疾患に対する免疫系の持続的応答は、逆効果となるT細胞寛容を招く可能性がある。異質または病変細胞を認識かつ攻撃しているT細胞は、T細胞寛容を介して「オフにされ(turned off)」うる。これは明らかに、慢性疾患に応答して、それから回復する宿主の能力を低減する。
【０００７】
慢性免疫障害、特にがんのような、T細胞寛容に関連したものは、大きな損害を与えうる。世界保健機関からの最新のデータによれば、世界中の1000万人が2000年にはがんと診断され、それが原因で600万人が死亡した。さらに、統計資料から、がん発生率が世界中で上昇中であることが示されている。例えば、米国では、見積もりから、存命中の者の50%がその生涯のある時点である種のがんと診断されるものと示唆されている。ゆえに、T細胞寛容を介した免疫障害を処置するための組成物および手法に対する差し迫った必要性が残されている。
【発明の概要】
【０００８】
概要
対象において免疫応答を増強するためのおよび/またはT細胞寛容を低減するための組成物および方法が本明細書において提供される。本明細書において記述されるように、本発明者らは、ある種のT細胞亜集団が、別々のシグナル伝達経路を通じてT細胞寛容を促進するCEACAM1、PD1、および/またはLAPの2つまたはそれ以上を共発現しうることを発見した。T細胞がこれらの分子を共発現するという発見は、1経路のみを阻害することによって可能であるよりも高い、T細胞寛容の低減度を達成するために、これらの分子の2つまたはそれ以上の阻害剤を投与することに関する、本明細書において記述される技術の基礎となる。
【０００９】
したがって、いくつかの局面において、本明細書において記述される組成物および方法は、CEACAM1、PD1、および/またはLAPの少なくとも2つによって制御されるシグナル伝達経路の活性を同時に阻害することにより対象においてT細胞を介した免疫応答を増大させる(すなわちT細胞寛容を低減させる)。免疫系の抑制を軽減させることは、例えば、免疫不全の対象またはがんを患っている対象において極めて望ましい。
【００１０】
1つの局面において、対象において免疫応答を増強するためのまたはT細胞寛容を低下させるための組成物であって、CEACAM1阻害剤; PD1阻害剤; およびLAP阻害剤からなる群より選択される少なくとも2つの剤を含む該組成物が本明細書において記述される。いくつかの態様において、2つの剤はCEACAM1阻害剤およびPD1阻害剤でありうる。いくつかの態様において、2つの剤はCEACAM1阻害剤およびLAP阻害剤でありうる。いくつかの態様において、2つの剤はPD1阻害剤およびLAP阻害剤でありうる。いくつかの態様において、組成物はCEACAM1阻害剤、PD1阻害剤、およびLAP阻害剤を含みうる。
【００１１】
いくつかの態様において、組成物は、CEACAM1阻害剤である第1部分およびPD1阻害剤である第2部分を含む二重特異性剤を含みうる。いくつかの態様において、組成物は、CEACAM1阻害剤である第1部分およびLAP阻害剤である第2部分を含む二重特異性剤を含みうる。いくつかの態様において、組成物は、LAP阻害剤である第1部分およびPD1阻害剤である第2部分を含む二重特異性剤を含みうる。
【００１２】
いくつかの態様において、阻害剤の1つまたは複数は阻害核酸でありうる。
【００１３】
いくつかの態様において、阻害剤の1つまたは複数は抗体試薬でありうる。いくつかの態様において、抗体試薬は、CEACAM1; PD1; およびLAPからなる群より選択される標的を結合しうる。いくつかの態様において、抗体試薬は、標的によって媒介されるシグナル伝達を阻害しうる。
【００１４】
いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、SEQ ID NO:32に記載の配列を有するCEACAM1分子またはSEQ ID NO:32の対立遺伝子変種もしくはスプライス変種を結合しうる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、CEACAM1リガンド相互作用部位を結合しうる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基番号1〜429のいずれかに対応するアミノ酸残基に結合しうる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、CEACAM1の細胞外ドメインを結合しうる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、CEACAM1のホモフィリックな相互作用ドメインを結合しえ、CEACAM1分子のホモフィリックな相互作用を阻害する。
【００１５】
いくつかの態様において、PD1阻害剤は、SEQ ID NO:1に記載の配列を有するPD1分子、またはSEQ ID NO:1の対立遺伝子変種もしくはスプライス変種を結合しうる。いくつかの態様において、PD1阻害剤は、PD1リガンド相互作用部位を結合しうる。いくつかの態様において、PD1阻害剤は、SEQ ID NO:1のアミノ酸残基番号41〜136のいずれかに対応するアミノ酸残基に結合しうる。
【００１６】
いくつかの態様において、LAP阻害剤は、SEQ ID NO:34に記載の配列を有するLAP分子、またはSEQ ID NO:34の対立遺伝子変種もしくはスプライス変種を結合しうる。いくつかの態様において、LAP阻害剤は、LAPリガンド相互作用部位を結合しうる。いくつかの態様において、LAP阻害剤は、SEQ ID NO:33のアミノ酸残基番号218に対応するアミノ酸残基に結合しうる。
【００１７】
1つの局面において、慢性疾患を処置するための方法であって、その処置を必要としている対象に、本明細書において記述される組成物の有効量を投与する段階を含む該方法が本明細書において記述される。いくつかの態様において、慢性疾患は、がん; 持続感染; および慢性ウイルス感染からなる群より選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】野生型(WT)マウスにおけるAOM-DSSモデルの概略図を描く。
【図２】CD4およびCD8 T細胞におけるPD1およびTIM-3の発現を調べたFACS分析の結果を描く。
【図３】CD4およびCD8 T細胞におけるPD1およびCEACAM1の発現を調べたFACS分析の結果を描く。
【図４】CD4およびCD8 T細胞におけるCEACAM1およびTIM-3の発現を調べたFACS分析の結果を描く。
【図５】CEACAM1およびPD1が慢性的に活性化されたCD4+ (図5A)およびCD8+ (図5B)腫瘍浸潤Tリンパ球の細胞表面上に共発現されることを実証するグラフを描く。
【図６Ａ】CEACAM1-4Sが循環血中CD4+ T細胞および腸CD4+ T細胞の両方の特定のサブセット上に選択的に発現されることを実証する。CEACAM1の発現が特異的な細胞表面分子の濃縮に関連していることを実証するFACS分析のグラフを描く。ヒストグラムゲート上の割合は、WTマウス由来のMLN CD3+ T細胞の、それぞれ、CD4+CEACAM1-およびCD4+CEACAM1+細胞集団における所与のマーカーが陽性の細胞の頻度を示す。1群あたりマウスn = 5〜6匹での独立した3回の実験からの代表的なデータを示す。
【図６Ｂ】CEACAM1-4Sが循環血中CD4+ T細胞および腸CD4+ T細胞の両方の特定のサブセット上に選択的に発現されることを実証する。CEACAM1発現が潜伏関連ペプチド(LAP)発現と同時分離し、未処置WTマウスのMLN由来のCD4+ T細胞におけるFoxp3発現とは無関係であることを実証するFACS分析のグラフを描く。1群あたりマウスn = 5〜6匹での独立した3回の実験からの代表的なデータを示す。
【図６Ｃ】CEACAM1-4Sが循環血中CD4+ T細胞および腸CD4+ T細胞の両方の特定のサブセット上に選択的に発現されることを実証する。CEACAM1-Sアイソフォームが、LAPを発現するCD4+CEACAM1+ T細胞上で濃縮されることを実証する図を描く。図6Cにおいてプールされた脾臓およびリンパ節(LN)からT細胞を単離した。1群あたりマウスn = 5〜6匹での独立した3回の実験からの代表的なデータを示す。
【図７】CEACAM1-SがCD4+LAP+の作出を直接増強することを実証する。図7A〜7D: CD4+LAP+細胞の割合が、T細胞において特異的にCEACAM1-4Sアイソフォームを過剰発現している未処置CEACAM1-4Sトランスジェニック(4S Tg)マウスのMLNにおいて増大される(図7A)が、しかしCEACAM1-4L (4L Tg)マウスではそうでない(図7B)ことを実証するFACS分析結果のグラフを描く。CEACAM1-/- -4L Tgマウス(図7D)ではなくCEACAM1-/- -4S Tgマウス(図7C)は、その同腹子対照と比べてCD4+LAP+ T細胞が濃縮されている。図7E: 4S Tgマウスのプールされた脾臓およびLN由来CD4+LAP+ Treg細胞との共培養時の応答体T細胞の増殖の低下によって示されるように、CEACAM1-4Sの過剰発現がインビトロにおいてCD4+LAP+ Treg細胞の調節機能を増強することを実証するFACS分析結果のグラフを描く。図7F: 抗CD3抗体の経口摂取が、CEACAM1-/-マウスではなく、WTマウスのMLNにおけるCD4+LAP+ Treg細胞の割合を有意に増加させることを実証する図を描く。マウスに5連続日の各日に抗CD3 (またはアイソタイプ対照) 5 μgを与え、CD4+LAP+ T細胞の頻度を7日後に評価した。
【図８】新規のCEACAM1アイソフォーム識別性のqPCRアッセイ法の結果を描き、これには、mCEACAM1-4Lおよび4Sプラスミドを用いて検証されたマウスCEACAM1-Lおよび-Sアイソフォーム増幅用qPCRプライマーの特異性および効率性が描かれている。この新規のアッセイ法を図6Cにおいて用いた。
【図９】CD4+ T細胞上のCEACAM1-S発現が、パイエル板(PP)および固有層(LP)における特定のT細胞サブセットを特徴付ける分子の発現に関連していることを実証する。図9Aおよび9B: WTマウスのPPおよびLP中のCD4+CEACAM1+およびCD4+CEACAM1-細胞上の細胞表面分子の発現を特徴付けるFACS分析のグラフを描く。ヒストグラムゲート上の割合は、それぞれ、CD4+CEACAM1-およびCD4+CEACAM1+細胞集団における所与のマーカーが陽性の細胞の頻度を示す。1群あたりマウスn = 5〜6匹での独立した3回の実験からの代表的なデータ。
【図１０】選択的スプライシングによって作出されたCEACAM1のアイソフォームを描く。
【図１１】図8におけるqPCRアッセイ法を用いたCEACAM1-SおよびCEACAM1-L発現のグラフを描く。脾臓由来の全T細胞を、プレートに結合されコーティングされた抗CD3または抗CD3に加えてCD8で2日間、その後に4日間刺激した。CEACAM1-S、-Lおよび全CEACAM1をqPCRによって評価した。図11: 休止T細胞では低い、主要なCEACAM1アイソフォーム(SおよびL)の両方とも、TCR/CD3複合体を通じたT細胞のライゲーション(シグナル1)によって転写的に調節されるが、しかしCD28がもたらす古典的な共刺激シグナル(シグナル2)によってTCR/CD3複合体が共会合(co-engage)される場合に負に調節されることを示す。
【図１２】CEACAM1-4Sが初代T細胞の活性化および活性化誘導性の細胞死に対する増感に関連することを実証する。図12A: WT同腹子と比べて、4S Tgマウス(1群あたりマウスn = 5匹)がいっそう高い割合のCD3+アネキシンV+/7AAD-アポトーシス細胞を示すことを実証するグラフを描く。図12B〜12C: 4S TgマウスおよびそのWT同腹子の脾臓から単離されたCD3+ T細胞を、表示した濃度の抗CD3抗体、または1 μg/mlの抗CD3とともに表示した時間的経過にわたって培養した実験の結果のグラフを描く。増殖アッセイ法を[3H]-チミジン取り込みによって行い(図12B)、アネキシン-Vおよび7-AAD染色を用いてアポトーシスを判定した(図12C) (1群あたりマウスn = 5匹)。図12D: 免疫ブロットを描く。CD3+ T細胞を4S TgまたはWTマウスの脾臓から単離し、IL-2 (100 U/ml)または抗CD3 (1 μg/ml)コーティングプレートとともに培養した。細胞溶解物を表示の時点で調製し、カスパーゼ-3およびその活性化型を免疫ブロットによって判定した。図12E: Ceacam1-/-マウスと比べて、Ceacam1-/- -4S Tgマウスがいっそう高い割合のアネキシンV+/7AAD-アポトーシス細胞を有することを実証するグラフを描く(1群あたりマウスn = 5匹)。
【図１３】CEACAM1-SがPD-1担持T濾胞性ヘルパー(TFH)調節性細胞の作出を直接的に増強することを実証する。図13Aおよび13C: 脾臓、MLNおよびPPにおけるCD4+PD1+CXCR5+ TFH細胞の割合がその同腹子対照と比較して4S Tgマウス(図13A)において増加し、Ceacam1-/-マウス(図13C)において減少していることのグラフを描く。図13B: FACS分析の結果のプロットを描く。4S Tgマウスの脾臓中ではなく、PPまたはLP内のCD4+ T細胞は、そのWT同腹子対照と比べてCD69、PD-1およびCD40Lレベルの増大を示す。全てのデータは、1群あたりマウスn = 3〜6匹での独立した3回の実験を代表する。
【図１４】生理学的条件下でのT細胞上のCEACAM1およびPD1の共発現を実証する。固有層リンパ球を結腸、回腸、空腸および十二指腸ならびに腸間膜リンパ節(MLN)および脾臓から単離し、CD3陽性細胞でのゲーティング後にPD1およびCEACAM1の共発現について染色した。上パネルは陽性細胞の量の要約のグラフを描き、下パネルはフローサイトメトリーのヒストグラムを描く。
【図１５】Rag欠損およびCEACAM1欠損動物でのナイーブCD4+ T細胞の養子免疫伝達によって誘導された結腸炎を有するマウスの結腸に浸潤している固有層リンパ球におけるCEACAM1およびPD1の共発現を実証する。CEACAM1およびPD1の共発現が、近位、中位および遠位結腸から得られたCD3+リンパ球でのゲーティング後に示されている。
【図１６】CEACAM1およびPD1の遮断が腫瘍浸潤リンパ球(TIL)からのTNF-aの産生を増加させることを実証する。TILを、CT26結腸直腸がん細胞株と関連した皮下腫瘍から単離した。TILをアイソタイプ対照抗体または異なる共阻害性の細胞表面分子を遮断する抗体の存在下において抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体で刺激した。抗CEACAM1抗体および抗PD1抗体で処理されたTILによるTNF-a産生の相乗的増大に留意されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
T細胞寛容は、一つには、自己主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子を認識するが、しかし自己ペプチドを認識しない免疫系細胞の集団をもたらすように機能する。慢性疾患(例えば慢性感染またはがん)において、T細胞寛容は、対象が依然として、強い免疫応答を必要としている時に起きる。過去の研究から、がん胎児性抗原関連細胞接着分子1 (CEACAM1)、プログラム細胞死1 (PD1)およびTGFβ1潜伏関連ペプチド(LAP)は、T細胞寛容を増大させる免疫調節の重要な因子であることが示されている。これらの分子は、とりわけ持続的活性化後の、活性化T細胞の別々の亜集団にて発現されることが観察されている。このように、CEACAM1、PD1およびLAPはT細胞免疫調節に関わることが示されているが、本明細書において記述される発見の前には検出可能なレベルのCEACAM1、PD1、および/またはLAPの2つまたはそれ以上を発現するT細胞の集団が存在することは確立または示唆されていなかった。
【００２０】
本明細書において記述されるように、本発明者らは、ある種のT細胞亜集団が検出可能なレベルの(i) CEACAM1およびLAP、(ii) CEACAM1およびPD1、(iii) PD1およびLAP、または(iv) CEACAM1、PD1、およびLAPを共発現することを見出した。そのような細胞の発見は、これらのT細胞寛容促進分子の少なくとも2つを阻害することによりT細胞寛容を低減するという本明細書において記述される概念の基礎となる。T細胞寛容に寄与する複数の経路を標的とする能力は、例えば相乗効果により、T細胞寛容に対していっそう大きな効果を及ぼし、T細胞寛容の治療的低下をもたらしうる。CEACAM1、PD1、および/またはLAPの2つまたはそれ以上の阻害はそれゆえ、免疫系の応答性を増強しうる。
【００２１】
本明細書において使用されるように、「CEACAM1」 (CD66aまたは胆汁糖タンパク質としても公知)は、単一のIg可変ドメイン様アミノ末端、1個〜3個のIg定常ドメイン様領域、および単一の膜貫通セグメントに続いて、短い(CEACAM1-S)または長い(CEACAM1-L)細胞質ドメインを有するポリペプチドを指す(Hinoda et al., 85 PNAS 6959 (1988) ; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。N末端ドメインは、細胞活性化および/または細胞周期進行に関連した広範囲の細胞過程に影響を与えるホモフィリックな細胞間結合を助長することが示されており; また、ウイルス性(ネズミ肝炎ウイルス)病原菌および細菌性(淋菌(Neisseria gonorrhoeae)および髄膜炎菌(N. meningitidis)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、ならびにインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae))病原菌のヘテロフィリックな接着により標的化され、インビボで、多種多様のCEACAM1発現ヒト細胞および組織にそれらが感染することを可能にする。
【００２２】
発現される際、CEACAM1は、ヒトでは11種のアイソフォームおよびマウスでは少なくとも4種のアイソフォームをもたらす重要な選択的RNAスプライシングによって特徴付けられる。これらのアイソフォームは、細胞質尾部の長さおよび細胞外Ig様ドメインの数が異なり、それに応じて命名されている。上記のように、CEACAM1アイソフォームの大部分は長い(CEACAM1-L) CTまたは短い(CEACAM1-S)細胞質尾部を保有する(Azuz-Lieberman et al., 17 Intl. Immunol. 837 (2005); Gray-Owen & Blumberg, 2006; Moller et al., 65 Int. J. Cancer 740 (1996); Nakajima et al., 168 J. Immunol. 1028 (2002); Singer et al., 168 J. Immunol. 5139 (2002))。長い細胞質尾部(ヒトではおよそ72アミノ酸)は、免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ(immune-receptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM))を2つ含む(Chen et al., 172 J. Immunol. 3535 (2004))。これらのアイソフォームはT細胞応答に対して阻害性であり、この阻害には一般に、ITIMドメイン、およびSrc相同性2ドメインホスファターゼ1 (Src homology 2 domain phosphatase 1 (SHP-1))が関与する。ITIMのリン酸化および、その結果として、ITIMとSHP-1との結合には、p56 Lckキナーゼおよびホモフィリックに結合する能力が必要になる。CEACAM1はSHP-1をT細胞受容体(TCR)シグナロソームに動員し、そこでSHP-1がCD3-ζ、ZAP-70、またはその両方の脱リン酸化を介してZAP-70活性化を遮断する。実際に、特異的なFabでホモフィリック結合部位をマスクすることで、細胞傷害性の増大およびリンパ球の脱顆粒が引き起こされる(Chen et al., 180 J. Immunol. 6085 (2008))。CEACAM1-Sアイソフォームは、活性化誘導性の細胞死に対する細胞の感受性を増加させる弱い共刺激シグナルおよびCD4+LAP+ T細胞などの調節性細胞の集団の出現を誘導することにより阻害性である(Chen et al., 172 J. Immunol. 3535 (2004))。前出の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２３】
臨床的証拠から、腫瘍および腫瘍浸潤リンパ球上の高レベルのCEACAM1発現が予後不良および転移の高リスクと相関することが示されている。CEACAM1は、リンパ系細胞種および骨髄性細胞種の両方に対する制御性共受容体として機能し、広範囲の組織および細胞種において構成的に発現される。しかしながら、ナチュラルキラー(NK)細胞およびT細胞上でのその発現は、サイトカインおよび膜活性化受容体の活性化によって主に誘導される。本明細書において記述されるように、過去の研究から、CEACAM1がそれ自身のリガンドであり(ホモフィリックなライゲーション)、ガレクチン3およびセレクチンとのヘテロフィリックなライゲーションに関与していることが明らかにされている。休止T細胞上では低い、CEACAM1の発現は、TCR/CD3複合体を通じたT細胞のライゲーション(シグナル1)により転写的に制御されるが、CD28により提供される古典的な共刺激シグナル(シグナル2)によってTCR/CD3複合体が共会合され主要なクラスのCEACAM1アイソフォームの両方とも(CEACAM1-長鎖およびCEACAM1-短鎖)を誘導する場合には負に制御される(米国仮出願番号第61/677,596号参照; これは、参照により本明細書に組み入れられる)。TCR/CD3のライゲーションのみ(共刺激の非存在下)がT細胞寛容の誘導の一般機構であるという事実を考えると、そのような刺激によるCEACAM1の強力な誘導は、理論によって束縛または制限されることを望むわけではないが、寛容プログラムの一部でありうる。
【００２４】
さらに、CEACAM1の三次構造に関して、細胞質ドメインのみが異なる、2種の主要なアイソフォームであるCEACAM1-4LおよびCEACAM1-4Sは、4つのグリコシル化されたIgドメインから構成される細胞外ドメイン(外部ドメイン)を有する。CEACAM1誘導性の細胞シグナル伝達は細胞表面におけるその細胞間のホモフィリック結合により制御され、これはN末端Igドメイン(D1)による相互的なD1-D1相互作用において媒介される。CEACAM1のIgV N末端ドメインの基本構造は、一対の積層したβシートの三次元折り畳みである。9個の構成要素のβストランドが存在し、ストランドA、B、E、およびDは一方のシートに位置しており、ストランドC、C'、C''、F、およびGは他方のシートにおいて逆平行で存在している。CEACAM1のN末端ドメインのGFCC'表面は、ホモフィリックな接着の媒介に不可欠であることが知られている。ホモフィリックおよびヘテロフィリックな相互作用は、他の接着受容体-リガンドのペアで観察されており、例えばCD2とCD58とのペア; ICAM-1とICAM-1、LFA-1、ライノウイルス、もしくは熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)に感染した赤血球とのペア; またはカドヘリンとカドヘリンとのペア(Watt et al., 98 Blood 1469 (2001))。これらの相互作用から、免疫グロブリンファミリーメンバーのGFCC'表面は、理論によって束縛または制限されることを望むわけではないが、種々のタンパク質間相互作用を認識するための粘着性のパッチとして進化した可能性のあることが示された(Springer et al., 6 Ann. Rev. Cell Biol. 359 (1990))。
【００２５】
いくつかの態様において、CEACAM1阻害試薬は、T細胞寛容を促進しうるCEACAM1の1種または複数種のアイソフォームを阻害しうる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害試薬は、T細胞寛容を促進しうるCEACAM1の1種または複数種のアイソフォームを阻害しうるが、CEACAM1のその他のアイソフォームを阻害しえない。T細胞寛容を促進しうるCEACAM1のアイソフォームには、図11に描かれているアイソフォーム、例えば、可溶性アイソフォームおよび膜貫通アイソフォームの両方、ならびにその変種、置換変種および保存的置換変種を含めてCEACAM1-1L、CEACAM1-1S、CEACAM1-3L、CEACAM1-3S、CEACAM1-4L、CEACAM1-4S、CEACAM1-3AL、CEACAM1-3AS、CEACAM1-3、CEACAM1-4C1、およびCEACAM1-4C2が含まれるが、これらに限定されることはない。CEACAM1アイソフォームのさらなる考察は、例えばBeauchemin et al. Exp Cell Res 1999:252-243において見出すことができる; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２６】
例えばナイセリア(Neisseria) Opaタンパク質との、CEACAM1のヘテロフィリックな相互作用に関与するペプチド領域は、GFCC'C''表面上にもあり、ホモフィリックな結合部位と部分的に重複する。Fedarovich et al., D62 Acta Cryst. 971 (2006)。比較すると、ネズミコロナウイルスへのネズミCEACAM1の結合には、ユニークに折り畳まれたCC'ループが必要とされ、ここではアミノ酸34〜52が重要な役割を果たす(Tan et al., 21 EMBO J. 2076 (2002); Watt et al., 2001)。さらに、GFCC'C''表面の残基27〜42の間のアミノ酸(特にD27L28F29)ならびにS32、Y34、V39、Q44、Q89、およびI91は、インフルエンザ菌、ならびに淋菌および髄膜炎菌のOpaタンパク質の結合のための異なるアドヒジオトープ(adhesiotope)を形成する。これらのアドヒジオトープは、溝である可能性が高く、V39およびD40のCC'ループ残基が関与するホモフィリックなシス結合によって形成されるか、またはCEACAM1/病原菌結合より先に起こるサイトカイン(例えば、TNFα)の活性化によるCEACAM1のシス二量体化の破壊後に形成される(Watt et al., 2001)。前出の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２７】
さらに、CEACAM1のIgC2ドメインはまた、コロナウイルスおよびインフルエンザ菌の受容体活性に関連付けられている。固定化されたCEACAM1は、この場合にはこの高度に柔軟な分子の三次構造が制限されるが、接着の低下も呈し、これは、分子の細胞質領域(例えば、細胞内二量体化)が、ホモフィリックおよびヘテロフィリックの両方の相互作用、ならびにシグナル伝達に関係あるとする。さらに、シスでのホモ二量体の形成が、複数のスプライスバリアント(アイソフォーム)について、IgC2ドメインを欠いているものについてさえも、特徴付けられている。
【００２８】
N末端D1ドメインにおけるドメイン内ジスルフィド架橋の欠如は、CEACAM1外部ドメインを高度に柔軟にする。CEACAM1は細胞膜にマイクロクラスタの状態で存在する; ホモフィリック結合が、2つの異なる種類の二量体、ならびに三量体およびさらに高次のオリゴマーをもたらす再編成を誘発する。Igドメイン間のヒンジ領域のため、逆平行性のトランス二量体(C二量体)および平行性のシス二量体(A二量体)が形成されうる。N末端D1ドメインは、C二量体化およびA二量体化の両方に関与するが、D2-D4ドメインはA二量体化にのみ関わる。二価陽イオンは外部ドメインの柔軟性を低下させ、CEACAM1媒介性の細胞接着にさらに関与する多量体複合体の形成を増強させた。重要なことに、外部ドメインの二量体化は、膜貫通ドメインから細胞質ドメインへと伝達され、したがって、次いで、細胞内シグナル伝達を指令する。別の結合部位は、CEACAM1分子上でのグリコシル化のレベルおよび柔軟性に依存して、ABED表面全体で関与しうる(Klaile et al., 187 J. Cell Biol. 553 (2009) ; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。
【００２９】
CEACAM1の機能はまた、グリコシル化によって影響を受ける可能性が高い。糖質は、細胞表面に発現されているCEACAM1の重量の60%までを占める。この非常に大きな糖質含量の役割により、CEACAM1アイソフォームの「亜種」の構築が可能となる。例えば、CEACAM1がシアリルルイスx修飾を発現する能力は、白血球ホーミングに影響を与えうる(Chen et al., 86 J. Leuk. Biol. 195 (2009) ; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。
【００３０】
いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、SEQ ID NO:32に記載の配列を有するCEACAM1分子またはSEQ ID NO:32の対立遺伝子変種もしくはスプライス変種を結合しうる。SEQ ID NO:32の対立遺伝子変種およびスプライス変種は、例えばGaur et al. Molecular Cancer 2008 7:46 Barnett et al. Mol Cell Biol 1993, 13: 1273-1282; およびBarnett et al. J Cell Biol 1989, 108:267-276に記述されている変種を含むことができる; これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００３１】
いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、CEACAM1の細胞外ドメインの1つまたは複数、例えばSEQ ID NO:32のアミノ酸番号1〜429のいずれかを結合しうる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、CEACAM1のIg V-setドメイン、例えばSEQ ID NO:32のアミノ酸番号35〜140のいずれかを結合しうる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、CEACAM1のIg C-setドメイン、例えばSEQ ID NO:32のアミノ酸番号140〜415のいずれかを結合しうる。CEACAM1変種の細胞外ドメイン構造は、例えば、Watt et al. Immunobiology 2001 98: 1469-1479においてさらに記述されている; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００３２】
いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、CEACAM1リガンド相互作用ドメインを結合しうる。いくつかの態様において、CEACAM1リガンド相互作用ドメインはCEACAM1ポリペプチドの細胞外残基を含みうる。非限定的な例として、CEACAM1のホモフィリックなリガンド相互作用ドメインは、SEQ ID NO:32のアミノ酸番号73、74、98、および116を含むことができ、CEACAM1のヘテロフィリックなリガンド相互作用ドメインは、SEQ ID NO:32のアミノ酸番号61、62、63、66、68、73、78、123、および125を含むことができる。いくつかのCEACAM1変種におけるリガンド結合に重要な残基は、例えば、Watt et al. Immunobiology 2001 98: 1469-1479においてさらに記述されている; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、これらのホモフィリックなリガンド相互作用アミノ酸、例えばSEQ ID NO:32のアミノ酸番号73、74、98、および116の1つまたは複数に結合(またはそれらと物理的に相互作用)しうる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、これらのヘテロフィリックなリガンド相互作用アミノ酸、例えばSEQ ID NO:32のアミノ酸番号61、62、63、66、68、73、78、123、および125の1つまたは複数に結合(またはそれらと物理的に相互作用)しうる。これに関連して、物理的相互作用は、免疫寛容導入に関与するリガンドと1つまたは複数のこれらの部位との相互作用の立体障害を包含しうる。
【００３３】
いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、CEACAM1のホモフィリックな相互作用ドメインを結合することができ、CEACAM1分子のホモフィリックな相互作用を阻害することができる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、CEACAM1のホモフィリックな結合を低減することができる。トランス-ホモフィリックなCEACAM1結合は、N末端免疫グロブリン様ドメインによって伝達されるアロステリック機構によるシス-二量体化を誘導する。CEACAM1-Lホモ二量体形成は、CEACAM1-Sの共発現により低減され、抗体ライゲーションにより調節される。CEACAM1による膜貫通シグナル伝達は、単量体/二量体平衡の変化によって作動しうる。Muller et al., 187 J. Cell Biol. 569 (2009)。ホモフィリックなCEACAM1結合を選択的に低下させる例示的な剤は、例えば、米国特許第7,132,255号および同第6,852,320号ならびにその中で引用されている参考文献において記述されており、それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００３４】
単量体可溶型のCEACAM1は、CEACAM1シグナル伝達を阻害することが実証されている(例えばMarkel. EJI 2004 34:2138-2148を参照のこと; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、単量体CEACAM1 Fcポリペプチドでありうる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、単量体CEACAM1 Fc融合タンパク質でありうる。単量体CEACAM1 Fc融合タンパク質は、当技術分野において記述されており、例えば、Biotoni et al. PNAS 2004 101:9763-8を参照されたい; これは参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、CEACAM1阻害剤は、可溶性CEACAM1ポリペプチドの二量体型またはCEACAM1 Fcポリペプチドの二量体型ではない。
【００３５】
最も長いアイソフォームCEACAM1-4L (アイソフォーム1)は、526アミノ酸を有し、以下の配列を有する:
0006356134.tif 000002
【００３６】
上記のアミノ酸配列は、リーダー配列(34アミノ酸)、およびQLTから始まる成熟ペプチドを含む。ヒト(ID: 634)、マウス(ID: 26365)、ラット(ID: 81613)、ウシ(ID: 404118)、ゼブラフィッシュ(ID: 114465)、イヌ(ID: 612435)、ヤギ(ID: 100384959)、およびオランウータン(ID: 100172828)を含めて、さまざまな種のCEACAM1アイソフォームのDNAおよびアミノ酸配列が、NCBIからオンラインで入手可能である。
【００３７】
例えば、分泌ヒトCEACAM1アイソフォーム2 (UniProtKB P13688-2)は、以下のアミノ酸を有する:
0006356134.tif 000003
【００３８】
分泌ヒトCEACAM1アイソフォーム3 (UniProtKB P13688-3)は、以下のアミノ酸を有する:
0006356134.tif 000004
【００３９】
分泌ヒトCEACAM1アイソフォーム4 (UniProtKB P13688-4)は、以下のアミノ酸を有する:
0006356134.tif 000005
【００４０】
PD1 (またはCD279)は、1つの免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリードメイン、20アミノ酸ストーク、膜貫通ドメイン、および免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ(ITIM)と免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ(ITSM)とを含有しているおよそ95残基の細胞内ドメインから構成される、288アミノ酸のI型膜貫通型タンパク質である。PD1は、マウスにおいては第1染色体上のPdcd1遺伝子、ヒトにおいては第2染色体上のPDCD1遺伝子によりコードされる。両方の種において、Pdcd1は5つのエキソンからなる。エキソン1は、短いシグナル配列をコードし、エキソン2はIgドメインをコードする。ストークおよび膜貫通ドメインがエキソン3を構成し、エキソン4は、細胞質ドメインの始めを特徴付ける短い12アミノ酸配列をコードする。エキソン5は、C末端細胞内残基および長い3'UTRを含有している(Keir ME et al., 2008. Annu Rev Immunol. 26:677-704)。PD1は受容体のB7ファミリーのメンバーである。
【００４１】
PD1のスプライス変種が、活性化されたヒトT細胞からクローニングされている。これらの転写物は、エキソン2、エキソン3、エキソン2および3、またはエキソン2〜4を欠く。休止末梢血単核細胞(PBMC)において、エキソン3のみを欠くスプライス変種(PD1Δex3)を除き、これらの変種は全て、全長PD1と類似のレベルで発現されている。全ての変種が、抗CD3および抗CD28によるヒトT細胞の活性化により、有意に誘導される(Keir ME et al., 2008. Annu Rev Immunol. 26:677-704)。
【００４２】
したがって、本明細書において用いられる「PD1」という用語は、例えば、NP_005009によって記述される、 
0006356134.tif 000006
のアミノ酸配列を有する288アミノ酸ポリペプチドをいい、さらに、天然に存在するその対立遺伝子変種、スプライス変種、およびプロセッシングされた型もいう。典型的には、PD1とは、ヒトPD1をいう。「PD1」という用語は、PD1ポリペプチドの短縮型または断片をいうように用いられる。PD1のそのような型の言及は本出願において、例えば「PD1 (42〜136)」により特定されうる。例えば、成熟PD1ペプチドは本明細書において、PD1 (21〜288)といわれ、PD1 IgVドメインはPD1 (42〜136)といわれる。PD1の特定の残基は、例えば「PD1 (68)」ということができる。
【００４３】
PD1は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラーT細胞、活性化された単球、および樹状細胞(DC)において発現されることが示されている。PD1は、休止T細胞においては発現されないが、活性化の後に誘導可能に発現される。T細胞受容体またはB細胞受容体のライゲーションは、Tリンパ球およびBリンパ球におけるPD1を上方制御することができる。正常なヒト反応性リンパ組織において、PD1は、胚中心関連T細胞において発現されている。細胞内貯蔵庫におけるPD1区画化は、調節性T細胞集団において記述されている。PD1は、ヒトにおいて骨髄CD11c+ DC上のAPCおよび単球において誘導可能に発現される(Keir ME et al., 2008. Annu Rev Immunol. 26:677-704; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。
【００４４】
PD1は、2種の公知のリガンドPD-L1およびPD-L2を有し、それらもB7ファミリーのメンバーである。PD1のPD-L1との結合界面は、IgV様ドメイン(すなわち、PD1 (42〜136))を介している。PD1のそのリガンドとの結合にとって重要な残基には、残基番号64、66、68、73、74、75、76、78、90、122、124、126、128、130、131、132、134、および136が含まれる。PD-L1/CD274は、マウスのT細胞およびB細胞、DC、マクロファージ、間葉系幹細胞、ならびに骨髄由来肥満細胞において構成的に発現されていることが示されている。CD274/PD-L1発現は、広範囲の非造血系細胞にも見出され、活性化の後に多数の細胞型において上方制御される。PD-L1は、IFN-γによる処理により、PA1骨髄腫、P815肥満細胞腫、およびB16黒色腫を含むほぼ全てのマウス腫瘍細胞株において発現される。がんにおいては、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)およびAktのシグナル伝達を修飾する細胞ホスファターゼであるホスファターゼテンシンホモログ(PTEN)の損失または阻害が、転写後PD-L1発現を増加させる(Keir ME et al., 2008. Annu Rev Immunol. 26:677-704)。PD1との結合にとって重要なPD-L1の残基には、PD-L1 (67)、PD-L1 (121)、PD-L1 (122)、PD-L1 (123)、PD-L1 (123)、PD-L1 (124)、およびPD-L1 (126)が含まれる。
【００４５】
PD-L2発現は、PD-L1発現より制限されている。PD-L2は、DC、マクロファージ、および骨髄由来肥満細胞において誘導可能に発現される。PD-L2は、休止腹膜B1細胞の50%〜70%においても発現されているが、普通のB2 B細胞においては発現されない。PD-L2は、GM-CSF、IL-4、およびIFN-γによって、単球およびマクロファージにおいても誘導されうる。PD-L2発現は、腫瘍株においても観察されている。
【００４６】
いくつかの態様において、PD1阻害剤は抗PD-L1抗体試薬でありうる。いくつかの態様において、PD1阻害剤は抗PD-L2抗体試薬でありうる。この関連において、抗PD-L1抗体試薬または抗PD-L2抗体試薬は、標的リガンドに結合し、かつPD1へのリガンドの結合を抑止するものである。
【００４７】
PD1およびそのリガンドは、急性感染および慢性感染を引き起こす微生物に対する免疫防御の調節において重要な役割を有することが示されている。PD1:PD-L経路は、感染の転帰、および有効な抗微生物免疫防御と免疫により媒介される組織傷害との間の微妙なバランスの調節において、重要な役割を果たしているようである。したがって、本明細書において記述される局面のいくつかの態様において、PD1阻害剤(例えば抗体試薬)は、PD1のそのリガンドとの結合を阻害するかまたは遮断する。
【００４８】
慢性感染を引き起こすいくつかの微生物が、免疫応答を逃れ、持続感染を確立するため、PD1:PD-L経路を活用しているようである。慢性ウイルス感染のリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)モデルにおける研究は、慢性感染におけるPD1:PD-L経路の役割を最初に示した(Barber DL et al. 2006. Nature 439:682-87)。慢性感染を引き起こすウイルスは、ウイルス特異的なT細胞を非機能性にし、それにより、抗ウイルスT細胞応答をサイレンシングすることができる(Wherry EJ and Ahmed R.2004. J. Virol. 78:5535-45)。CD8 T細胞の、本明細書において「枯渇」とも呼ばれる機能調節障害は、慢性感染における無効なウイルス制御の重要な理由であり、マウスにおける慢性LCMV感染に特徴的であり、ヒトにおけるHIV感染、HBV感染、HCV感染、およびHTLV感染、ならびに霊長類におけるSIV感染にも特徴的である。
【００４９】
ヒトにおける慢性ウイルス感染において、HIV特異的なT細胞(Petrovas C et al. 2006. J. Exp. Med. 203:2281-92; Day CL et al. 2006. Nature 443:350-54; Trautmann L et al 2006. Nat. Med. 12: 1198-202)、HBV特異的なT細胞(Boettler T et al. 2006. J. Virol. 80:3532-40; Boni C et al. 2007. J. Virol. 81:4215-25)、およびHCV特異的なT細胞(Bengsch B. et al., 2010 PLoS Pathog. 6(6); Urbani S et al. 2006. J. Virol. 80: 11398-403)において、PD1発現が高いことを、いくつかのグループが示している。インビトロのPD1:PD-L相互作用の遮断は、HIVに特異的な、HBVに特異的な (Boni C et al. 2007. J. Virol. 81:4215-25)、HCVに特異的な、およびSIVに特異的な (Velu V et al. 2007. J. Virol.81:5819-28) CD8 T細胞およびCD4 T細胞の枯渇を逆転させ、増殖およびサイトカイン産生を回復させることが示されている(Petrovas C et al. 2006. J. Exp. Med. 203:2281-92; Day CL et al. 2006. Nature 443:350-54; Trautmann L et al. 2006. Nat. Med. 12: 1198-202; Urbani S et al. 2006. J. Virol. 80: 11398-403)。最近の研究は、ヌクレオカプシドタンパク質であるHCVコアが、健康なドナーT細胞におけるPD1およびPD-L1の発現を上方制御しうること、そしてPD1の上方制御が、HCVコアの補体受容体C1QBPとの相互作用により媒介されることを示している(Yao ZQ et al. 2007. Viral Immunol. 20:276-87)。前記の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５０】
PD1:PD-L経路は、細菌感染の慢性においても重大な役割を果たすことができる。ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)は、慢性胃炎および胃十二指腸潰瘍を引き起こし、胃がんの発症のリスク因子である。H.ピロリ感染においては、T細胞応答が、感染を除去するためには不十分であり、そのことが持続感染をもたらす。胃上皮細胞は、MHCクラスII分子を発現しており、H.ピロリ感染において重要なAPC(抗原提示細胞)機能を有すると考えられている。抗PD-L1遮断抗体は、H.ピロリに曝された胃上皮細胞およびCD4 T細胞の培養物におけるT細胞増殖およびIL-2産生を増強し、このことから、PD1:PD-L1経路が、H.ピロリ感染におけるT細胞応答の阻害において重要な役割を果たしていることが示唆される(Das S et al. 2006. J. Immunol. 176:3000-9; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。
【００５１】
寄生虫も、強力な抑制機能を有するマクロファージを誘導するためにPD1:PD-L経路を活用している。マウスにおけるテニア・クラッシセプス(Taenia crassiceps)感染においては、CD4 T細胞の高い割合が、PD1を発現しており、活性化されたマクロファージにおいて、PD-L1およびPD-L2が上方制御されている。PD-L1、PD-L2、またはPD1の遮断は、テニア感染マウス由来のマクロファージによるインビトロT細胞増殖の抑制を有意に減少させた(Terrazas LI et al. 2005. Int. J. Parasitol. 35:1349-58)。同様に、マウスにおけるマンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)感染においては、マクロファージが、高レベルのPD-L1および比較的低レベルのPD-L2を発現している。抗PD-L1は、これらのマクロファージの、インビトロでT細胞増殖を抑制する能力を完全に排除したが、抗PD-L2には効果がなかった(Keir ME et al., 2008. Annu Rev Immunol. 26:677-704)。PD1:PD-L経路は、寄生原虫メキシコリーシュマニア(Leishmania mexicana)に対する免疫応答においても明瞭な役割を有することが示されている(Keir ME et al., 2008. Annu Rev Immunol. 26:677-704)。前記の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５２】
腫瘍は、宿主T細胞が認識することができる抗原を発現しているが、腫瘍の免疫学的除去は稀である。この不全の一部は、腫瘍微小環境による免疫抑制のためである。最近の研究は、PD1:PD-L経路が、抗がん/腫瘍免疫応答の抑制に関与していることを示した。腫瘍浸潤リンパ球においては、PD1発現が上方制御され、これが腫瘍免疫抑制に寄与することができる。PD-L1発現は、乳房、肺、結腸、卵巣、黒色腫、膀胱、肝臓、唾液、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺上皮、頭部、および頸部を含む多様な固形腫瘍においてインサイチューで示されている。さらに、卵巣がんにおいて、PD-L1発現は、上皮内浸潤CD8 T細胞と逆相関しているが、間質浸潤CD8 T細胞とは逆相関しておらず、このことから、PD-L1がCD8 T細胞の腫瘍内遊走を阻害することが示唆される。また、腫瘍におけるPD-L1発現を疾患転帰と関係付ける研究は、PD-L1発現が、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、胃がん、および膵臓がんにおける予後不良と強く相関しているが、小細胞肺がんとは相関していないことを示している(Keir ME et al., 2008. Annu Rev Immunol. 26:677-704)。
【００５３】
PD1経路は、血液悪性疾患においても役割を果たしうる。PD1が、血管免疫芽球性リンパ腫のT細胞において高度に発現されており、PD-L1が、関連濾胞樹状細胞ネットワークにおいて発現されている。結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫においては、リンパ球および/または組織球(L＆H)細胞に関連したT細胞が、PD1を発現している。PD1およびPD-L1は、HTLV-1により媒介される成人T細胞白血病およびリンパ腫においてCD4 T細胞において発現されている。PD-L2は、マントル細胞リンパ腫において高度に発現されていることが特定されている。PD-L1は、多発性骨髄腫細胞において発現されているが、正常な形質細胞においては発現されておらず、骨髄腫細胞に応答して起こるT細胞増大は、PD-L1遮断によりインビトロで増強される。PD-L1は、いくつかの原発性T細胞リンパ腫、具体的には、未分化大細胞Tリンパ腫において発現されている(Keir ME et al., 2008. Annu Rev Immunol. 26:677-704)。
【００５４】
いくつかの態様において、PD1阻害剤は、SEQ ID NO:1に記載の配列を有するPD1分子またはSEQ ID NO:1の対立遺伝子変種もしくはスプライス変種を結合しうる。PD1のスプライス変種は、例えば、Keir et al. Annual Review of Immunology 2008 26:677-704およびNielsen et al. Cell Immunol 2005 235: 109-116に記述されている; これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５５】
いくつかの態様において、PD1阻害剤はPD1リガンド相互作用部位に結合しうる。いくつかの態様において、PD1リガンド相互作用部位への特異的結合は、PD-L1とのPD1の相互作用を調節する。いくつかの態様において、PD1リガンド相互作用部位への特異的結合は、PD-L2とのPD1の相互作用を調節する。いくつかの態様において、PD1リガンド相互作用部位への特異的結合は、PD-L1およびPD-L2とのPD1の相互作用を調節する。いくつかの態様において、PD1のリガンド相互作用部位は、SEQ ID NO:1のアミノ酸残基番号41〜136のいずれかを含みうる。いくつかの態様において、PD1上のリガンド相互作用部位は、SEQ ID NO:1のアミノ酸番号64、66、68、73、74、75、76、78、90、122、124、126、128、130、131、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含みうる。いくつかの態様において、PD1上のリガンド相互作用部位は、SEQ ID NO:1のアミノ酸番号78、126、および136からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む。いくつかの態様において、PD1阻害剤は、SEQ ID NO:1のアミノ酸番号64、66、68、73、74、75、76、78、90、122、124、126、128、130、131、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかに結合し、またはそれらと物理的に相互作用しうる。いくつかの態様において、PD1阻害剤は、SEQ ID NO:1のアミノ酸番号41〜136からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかに結合し、またはそれらと物理的に相互作用しうる。いくつかの態様において、PD1阻害剤は、SEQ ID NO:1のアミノ酸番号78、126、および136からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかに結合し、またはそれらと物理的に相互作用しうる。これに関連して、物理的相互作用は、免疫寛容導入に関与するリガンドとのこれらの部位の1つまたは複数の相互作用の立体障害を包含しうる。
【００５６】
抗PD1抗体試薬の非限定的な例としては、ヒトPD1に特異的なモノクローナル抗体、例えば、MDX-1106 (ONO-4538)、完全ヒトIgG4抗PD1遮断抗体(Journal of Clinical Oncology, 2008 Vol 26, No 15S); CT-011 (CureTech, LTD, 以前はCT-AcTibodyもしくはBAT)、ヒト化モノクローナルIgG1抗体(Benson DM et al., Blood. 2010 May 11)、またはクローンNAT (Abcam)、クローンEH12.2H7 (Biolegend)、クローンJ116 (eBioscience)、クローンMIH4 (eBioscience)、クローンJ105 (eBioscience)、もしくはクローン192106 (R&D systems)から得られるもの由来のPD1結合部位配列を含みうる。
【００５７】
いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物および方法は、LAP阻害剤に関する。本明細書において記述される場合、「潜伏関連ペプチド」または「LAP」は、TGFβ3前駆体ペプチドのアミノ末端ドメインをいう。LAPが前駆体ペプチドから切断される際、それはTGFβ3との非共有結合性会合を保ち続け、潜伏複合体を形成しうる。いくつかの態様において、LAPはLAP分子のホモ二量体として存在しうる。いくつかの種について、LAPポリペプチドの配列、例えばヒトLAP (SEQ ID NO:33のアミノ酸番号30〜278)が知られている。これらの相互作用部位と物理的に相互作用するか、これらの相互作用部位に結合するか、またはこれらの相互作用部位へのリガンドの結合を立体的に妨げる剤は、LAP活性、および特に免疫寛容導入の維持の樹立に関与するLAP活性を阻害するために用いることができる。
【００５８】
LAPは、結合パートナー、例えばTGFβとの相互作用に必要とされる重要な残基を含む。システイン224および226は、2つのLAP間の分子間ジスルフィド結合において重要である。セリンへのそれらの変異は、分子を「活性」にする(Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2572-2576 (1995); Brunner et al, Mol. Endocrinol. 6, 1691-1700 (1992); Brunner et al, J. Biol. Chem, 264, 13660-13664 (1989); これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。RGDモチーフ(245〜247)は、インテグリンとの相互作用を容易にする(Munger et al, Mol Biol Cell, 9:2627-2638 (1998; DerynckR, TIBS, 19, 548-553 (1994); これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。システイン33は、潜伏TGFβ結合タンパク質(LTBP)の3番目のシステイン・リッチリピートとのジスルフィド架橋にとって重要である(Saharinen et al. The EMBO Journal, 15, 245-253 (1996))。TGFβをコードする核酸は、米国特許第5,801,231号において記述されている。前記の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５９】
いくつかの態様において、LAP阻害剤は、SEQ ID NO:34に記載の配列を有するLAP分子またはSEQ ID NO:34の対立遺伝子変種もしくはスプライス変種を結合しうる。
【００６０】
LAP阻害抗体試薬は、当技術分野において公知である。例えばAli et al. PLOS ONE 2008:e1914を参照されたい; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。抗LAP抗体試薬のさらなる例は、米国特許第8,198,412号および米国特許出願公開第2008/0206219号において記述されている; これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６１】
いくつかの態様において、LAP阻害剤は、LAPリガンド相互作用部位、例えば成熟TGFβと相互作用する部位を結合しうる。そのような部位の非限定的な例としては、R218 (例えばMcGowan et al. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2003 88:3321-6を参照されたい; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)が挙げられる。
【００６２】
CEACAM1の阻害因子(すなわち、CEACAM1阻害剤)、PD1の阻害因子(すなわちPD1阻害剤)、および/またはLAPの阻害因子(すなわちLAP阻害剤)のうちの少なくとも2つを含む、組成物およびそれに関連する方法が本明細書において記述される。本明細書において記述される場合、「阻害剤」は、該剤の非存在下におけるレベルおよび/または活性と比べて標的のレベルおよび/または活性を統計的に有意な量だけ低減する剤である。あいまいさを避けるために、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%またはそれ以上だけの低減は、阻害性と考えられよう。標的のレベルはポリペプチド標的のレベル、ポリペプチド標的のアイソフォームもしくは変種のレベル、またはポリペプチド標的をコードするRNA転写産物のレベルでありうる。ポリペプチド標的の活性は、通常のリガンドを結合する標的の能力、他のポリペプチド(例えば下流のシグナル伝達パートナー)と相互作用する標的の能力、および/または下流の応答(例えばリン酸化レベルもしくは遺伝子発現)をもたらす標的ポリペプチドの能力を含みうるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、阻害剤は、CEACAM1、PD1、およびLAPの個々の分子間の相互作用(例えばホモフィリックおよびヘテロフィリックの両方の、結合)を低減する剤でありうる。例えば、阻害剤は、CEACAM1およびPD1の相互作用を低減しうる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、CEACAM1阻害剤およびPD1阻害剤を含みうる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、CEACAM1阻害剤およびLAP阻害剤を含みうる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、LAP阻害剤およびPD1阻害剤を含みうる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、CEACAM1阻害剤、LAP阻害剤、およびPD1阻害剤を含みうる。
【００６３】
標的特異的な阻害剤(すなわち、所与の標的、本明細書においては、CEACAM1、PD1、および/またはLAPの少なくとも1つに特異的な阻害剤)は非限定的な例として、標的に特異的に結合して、そのシグナル伝達活性を阻害するタンパク質、抗体、抗体試薬、または標的をコードするmRNAに特異的なもしくは標的をコードするmRNAを標的とする低分子干渉RNAを含みうる。本明細書において用いられる場合、「阻害剤」は、本明細書において記述されるCEACAM1、PD1、および/またはLAPの阻害を可能にするタンパク質結合剤をいうことができる。そのような剤は、抗体(「抗体」は、エピトープもしくは抗原に結合するペプチド、パラトープ、機能的CDRのような抗体の抗原結合部分; 組み換え抗体; キメラ抗体; トリボディ; ミディボディ; またはそれらの抗原結合誘導体、類似体、変種、一部分、もしくは断片を含む)、タンパク質結合剤、小分子、組み換えタンパク質、ペプチド、アプタマー、アビマーおよびタンパク質結合誘導体、それらの一部分もしくは断片を含むが、これらに限定されることはない。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書において記述される組成物および方法において有用である別のクラスの剤に相当する。このクラスの剤ならびにそれらを調製および使用するための方法は全て、リボザイムおよびmiRNA分子と同様に、当技術分野において周知である。例えば、十分な考察についてはPCT US2007/024067 (これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい。
【００６４】
本明細書において用いられる場合、「特異的結合」という用語は、第1の実体が第2の、標的実体に、標的ではない第3の実体に結合するよりも高い特異性および親和性で結合する2つの分子、化合物、細胞および/または粒子間の化学的相互作用をいう。いくつかの態様において、特異的結合は、第3の非標的実体に対する親和性よりも少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍またはそれより高い第2の標的実体に対する第1の実体の親和性をいうことができる。
【００６５】
いくつかの態様において、阻害剤は、阻害核酸、阻害ペプチド、阻害小分子、阻害抗体試薬もしくは阻害模倣体(例えばペプチド模倣体)またはそれらの組み合わせでありうる。いくつかの態様において、阻害剤は、標的の天然リガンドの模倣体または変種、例えばLAPと相互作用して、成熟TGFβへのLAPの結合を抑止するTGFβの断片または変種でありうる。
【００６６】
いくつかの態様において、阻害剤は、本明細書において記述される標的(例えばCEACAM1、PD1、および/またはLAP)のいずれかのドミナント・ネガティブな変種でありうる。例えば、ホモ二量体化/ホモ親和性相互作用ドメインを介して野生型CEACAM1に結合しうるCEACAM1変種は、CEACAM1を要するシグナル伝達を低減または阻害しうる。
【００６７】
いくつかの態様において、標的(例えばCEACAM1、PD1、および/またはLAP)に特異的な阻害剤(例えば抗体試薬)は、標的の細胞外領域に特異的に結合しうる。いくつかの態様において、標的(例えばCEACAM1、PD1、および/またはLAP)に特異的な阻害剤(例えば抗体試薬)は、標的のリガンド相互作用領域に特異的に結合しうる。いくつかの態様において、阻害剤は標的とのリガンドの相互作用を低減または阻害しうる。阻害剤によって標的化されうるCEACAM1、PD1および/またはLAPの特異的領域は、本明細書の他の箇所に記述されている。
【００６８】
いくつかの態様において、阻害剤は、抗体試薬を含みうる。本明細書において用いられる場合、「抗体試薬」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、かつ所与の抗原(例えばCEACAM1、PD1、および/またはLAP)を特異的に結合するポリペプチドをいう。いくつかの態様において、抗体試薬は、CEACAM1、PD1、およびLAPの1つまたは複数に特異的に結合しうる。いくつかの態様において、抗体試薬は、標的分子のシグナル伝達活性を阻害し、例えばCEACAM1、PD1、および/またはLAPのシグナル伝達活性を阻害しうる。標的分子のシグナル伝達活性を測定するための方法は、本明細書の他の箇所に論じられている。
【００６９】
抗体試薬は、抗体の抗原結合ドメインを含む抗体またはポリペプチドを含みうる。いくつかの態様において、抗体試薬は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含みうる。例えば、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書においてVHと略される)、および軽(L)鎖可変領域(本明細書においてVLと略される)を含みうる。別の例において、抗体は、2つの重(H)鎖可変領域および2つの軽(L)鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、完全な抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片(例えば、一本鎖抗体、FabおよびsFab断片、F(ab')2、Fd断片、Fv断片、scFv、ならびに単一ドメイン抗体(dAb)断片(例えばde Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39を参照のこと; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる))も包含する。抗体はIgA、IgG、IgE、IgD、IgM (ならびにそれらのサブタイプおよび組み合わせ)の構造的特徴を持ちうる。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、および霊長類(ヒトおよび非ヒト霊長類)を含む、任意の供給源ならびに霊長類化抗体に由来しうる。抗体はまた、ミディボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体なども含む。
【００７０】
VHおよびVL領域は、「相補性決定領域」(「CDR」)とよばれる超可変領域にさらに細分することができ、「フレームワーク領域」(「FR」)とよばれるより保存された領域が散在している。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、精密に定義されている(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を参照のこと; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。各VHおよびVLは、典型的には、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された3つのCDRおよび4つのFR: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4から構成される。
【００７１】
用語「抗原結合断片」または「抗原結合ドメイン」; これらは、関心対象の標的に特異的に結合する能力を保持している完全長抗体の1つまたは複数の断片をいうように互換的に用いられる。「抗原結合断片」という用語のなかに包含される結合断片の例としては、(i) Fab断片、つまりVL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片; (ii) F(ab')2断片、つまりヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片; (iii) VHおよびCH1ドメインからなるFd断片; (iv) 抗体の単腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片、(v) VHまたはVLドメインからなるdAb断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる); ならびに(vi) 特異的な抗原結合の機能性を保持している単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。さらに、Fv断片の2つのドメインVLおよびVHは別々の遺伝子によってコードされるが、VLおよびVH領域が対になって、一本鎖Fv (scFv)として公知の一価分子を形成している単一のタンパク質鎖として作出されることを可能にする合成リンカーにより、組み換え法を用いて、それらを連結することができる。例えば、米国特許第5,260,203号、同第4,946,778号、および同第4,881,175号; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; ならびにHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい。当業者に公知の従来の技法を含む任意の適切な技法を用いて、抗体断片を得ることができる。「単一特異性抗体」という用語は、特定の標的、例えば、エピトープに対する単一の結合特異性および親和性を呈する抗体をいう。この用語は「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」を含み、これらは、本明細書において用いられる場合、抗体が作出された方法に関係なく、単一の分子組成の抗体またはその断片の調製物をいう。
【００７２】
「特異性」という用語は、特定の抗体またはその抗原結合断片が結合できる抗原または抗原決定基の異なる型の数を指す。抗体またはその抗原結合部分の特異性は、単独で、または二重特異性ポリペプチド剤もしくは多重特異性ポリペプチド剤に関連して、親和性および/または結合力に基づき決定されうる。(二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤などの)抗原結合タンパク質と抗原との解離についての平衡定数(KD)により表される親和性は、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度についての尺度であり: KDの値が低いほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合強度が強い。あるいは、1/KDである親和性定数(KA)として、親和性を表すこともできる。当業者には明らかであるように、親和性は、関心対象の特異抗原に依存するそれ自体公知の方法で決定されうる。したがって、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、本明細書において定義されるように、該アミノ酸配列またはポリペプチドが、別の標的またはポリペプチドと結合する親和性よりも、少なくとも10×、例えば、少なくとも100×、好ましくは、少なくとも1000×、および10,000×まで、またはそれ以上良好な(上記の通り、例えば、KD値として適切に表される)親和性で第1の抗原と結合する時、別の標的または抗原と比較して、第1の標的または抗原に対して「特異的」であると言われる。例えば、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤が、別の標的または抗原と比較して、ある標的または抗原に対して「特異的」である時、該ポリペプチド剤は、該標的または抗原に指向し、そのような他の標的または抗原に指向しない。
【００７３】
結合力とは、(本明細書において記述される二重特異性ポリペプチド剤などの)抗原結合分子と関連抗原との間の結合の強度の尺度である。結合力は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、および抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関係している。典型的には、(本明細書において記述される二重特異性ポリペプチド剤などの)抗原結合タンパク質は、10-5〜10-12モル/リットルもしくはそれ以下、例えば10-7〜10-12モル/リットルもしくはそれ以下または10-8〜10-12モル/リットルの解離定数(KD)で(すなわち、105〜1012リットル/モルもしくはそれ以上、および例えば107〜1012リットル/モルまたは108〜1012リットル/モルの会合定数(KA)で)、同族抗原または特異抗原に結合する。10-4モル/リットルより大きい任意のKD値(または104M-1未満の任意のKA値)は一般に、非特異的結合を示すと見なされる。有意(例えば、特異的)であると見なされる生物学的相互作用についてのKDは典型的には、10-10 M (0.1 nM)〜10-5 M (10000 nM)の範囲内にある。相互作用が強力であるほど、そのKDは低い。本明細書において記述される二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、500 nM未満、200 nM未満、または10 nM未満、例えば500 pM未満の親和性で、所望の抗原に結合しうる。抗原または抗原決定基との抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば、ラジオイムノアッセイ法(RIA)、酵素イムノアッセイ法(EIA)、およびサンドイッチ競合アッセイ法などのスキャッチャード分析および/または競合結合アッセイ法、ならびに当技術分野においてそれ自体公知のそれらの種々の変法; ならびに本明細書中に言及される他の技法を含む、それ自体公知の任意の適当な方法で決定されうる。
【００７４】
したがって、本明細書において用いられる場合、「選択的に結合する」または「特異的に結合する」とは、本明細書において記述されるポリペプチドドメインが、10-5 M (10000 nM)もしくはそれ以下、例えば10-6 Mもしくはそれ以下、10-7 Mもしくはそれ以下、10-8 Mもしくはそれ以下、10-9 Mもしくはそれ以下、10-10 Mもしくはそれ以下、10-11 Mもしくはそれ以下、または10-12 Mもしくはそれ以下のKDで、細胞表面に存在する分子などの標的に結合することができることを指す。例えば、本明細書において記述されるポリペプチド剤が、10-5 Mもしくはそれ以下のKDでCEACAM1に結合し、別のCEACAM分子、例えばCEACAM5、または関連相同体には結合しない場合、その剤は、CEACAM1に特異的に結合すると言われる。特異的結合は、例えば、ポリペプチド剤の親和性および結合力ならびにポリペプチド剤の濃度により影響を受ける可能性がある。当業者は、適当な細胞結合アッセイ法におけるポリペプチド剤の滴定などの任意の適当な方法を用いて、本明細書において記述されるポリペプチド剤が標的と選択的に結合するための適切な条件を決定することができる。
【００７５】
いくつかの態様において、ヒト化抗体または複合ヒト抗体試薬は、本明細書において記述される組成物および方法において用いることができる。非限定的な例として、そのような抗体は、例えば、2011年12月1日付で出願されたAnti-CEACAM1 Recombinant Antibodies for Cancer Therapyと題する米国特許出願第61/565,640号およびその中で論じられている参考文献に記述されている。例えば、本明細書において記述される組成物および方法のいくつかの態様において、CEACAM1に特異的に結合する特定の単離された組み換え抗体またはその抗原結合部分は、アミノ酸残基SSHGMS (SEQ ID NO:2)からなる重鎖相補性決定領域(CDR) 1、アミノ酸残基
0006356134.tif 000007
からなる重鎖CDR2、アミノ酸残基
0006356134.tif 000008
からなる重鎖CDR3、アミノ酸残基
0006356134.tif 000009
からなる軽鎖CDR1、アミノ酸残基LTSNLAS (SEQ ID NO:6)からなる軽鎖CDR2、およびアミノ酸残基QQWSSNPPT (SEQ ID NO:7)からなる軽鎖CDR3を含みうる。
【００７６】
あるいは、本明細書において記述される組成物および方法のいくつかの態様において、CEACAM1結合抗体またはエピトープ結合ペプチドは、以下より選択されるCDR領域を有するように構築されうる: アミノ酸残基SSHGMS (SEQ ID NO:8)、SFYGMS (SEQ ID NO:9)、またはSDYYLY (SEQ ID NO:10)からなる重鎖CDR1; アミノ酸残基
0006356134.tif 000010
からなる重鎖CDR2; アミノ酸残基
0006356134.tif 000011
からなる重鎖CDR3; アミノ酸残基
0006356134.tif 000012
からなる軽鎖CDR1; アミノ酸残基
0006356134.tif 000013
からなる軽鎖CDR2; およびアミノ酸残基
0006356134.tif 000014
からなる軽鎖CDR3。例えば、米国特許出願公開第2004/0047858号も参照されたい。
【００７７】
本明細書において記述される組成物および方法において有用な他の抗CEACAM1モノクローナル抗体には、マウスにおいてCEACAM1媒介性のEAE抑制を阻害するAgB10 (Fujita et al., 175 Am. J. Pathol. 1116 (2009)); CEACAM1抗体(Chen et al., 2004); ネズミD14HD11 (Yu et al., 281 J. Biol. Chem. 39179 (2006)); ネズミCEACAM1特異的CC1 (Iijima et al., 199 J. Exp. Med. 471 (2004)); マウス抗ヒトCEACAM1 MRG-1 (Ortenberg 2012); 各々がCEACAM1のN末端ドメインを認識する(Watt et al., 2001)、マウス抗ヒトCEACAM1 N-ドメイン特異的抗体5F4、34B1、および26H7 (IgG1) (Morales et al., 1999); ならびに12-I40-4,4/3/17、COL-4、YG-C28F2、D14HD11、B18.7.7、D11-AD11、HEA 81、CLB-gran-10、F34-187、T84.1、B6.2、およびB1.1が含まれる。モノクローナル抗体34B1、26H7、および5F4もまた、米国特許出願公開第2004/0047858号, Therapeutic anti-BGP(C-CAM1) antibodies and uses thereof; 米国特許第7,132,255号; WO 99/52552、およびMorales et al., 163 J. Immunol. 1363 (1999)に論じられている。特異性のさらなる評価はWatt et al., 2001に公開されており、これには、モノクローナル抗体5F4が、異なるCEACAM1分子のN-ドメイン間のホモフィリックな相互作用に関与している、CEACAM1のN-ドメイン内のドメインに結合することが記述されている。
【００７８】
例えば、哺乳類発現ベクターにおいてヒトIgFcに融合されたCEACAM1の細胞外部分(Markel et al., 110 J. Clin. Invest. 943 (2002)); pCEP4-N-CEACAM1-Fc、Gallagher, 71 J. Virol. 3129 (1997)を参照されたい); および当業者には公知のように、商業的に利用可能なCEACAM1融合タンパク質の供給元を含む、他のCEACAM1-Fc融合タンパク質が記述されている。
【００７９】
CEACAM1に結合する例示的な剤、ならびにそのような剤を特定するためおよびそのような剤がT細胞活性を増強または抑制するかどうかを特定するための方法は、例えば、米国特許第7,132,255号および同第6,852,320号、ならびにその中で引用されている参考文献の中に見出され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００８０】
いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物および方法は、二重特異性阻害剤、例えば二重特異性ポリペプチド剤に関する。二重特異性剤は、同時にCEACAM1、PD1、および/またはLAPの少なくとも2つを物理的に接触し、阻害しうる分子を含む。本明細書において用いられる場合、「二重特異性ポリペプチド剤」という用語は、第1の標的に対する結合特異性を有する結合部位を有する第1のポリペプチドドメイン、および第2の標的に対する結合特異性を有する結合部位を有する第2のポリペプチドドメインを含むポリペプチドをいい、すなわち、該剤は2つの標的、例えば、CEACAM1およびPD1; PD1およびLAP; またはCEACAM1およびLAPに対する特異性を有する。第1の標的および第2の標的は、同じものではない(すなわち、異なる標的(例えば、タンパク質)である)。いくつかの態様において、異なる標的は、同じ細胞上に共発現されうる。いくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤は、単一の細胞上に存在する標的を結合することができ(シスのヘテロフィリック結合)、および/または1つの細胞上の1つの標的かつもう1つの細胞上の他の標的を結合することができる(トランスのヘテロフィリック結合)。したがって、本明細書において記述される二重特異性ポリペプチド剤は、第1の標的および第2の標的を発現する細胞に選択的かつ特異的に結合することができる。二重特異性ポリペプチド剤の非限定的な例は、二重特異性抗体構築体である。当業者は、2つの異なる抗原、例えば、PD1およびCEACAM1; またはCEACAM1およびLAP; またはLAPおよびPD1に特異的な抗体の抗原結合部分を含む二重特異性抗体構築体を容易に構築することができる。一般に、1つの抗原上の所望のエピトープを結合することが特徴付けられ、かつ知られている第1の抗体の抗原結合ドメインをコードする配列は、直接的に、または当業者に公知の種々のリンカーのいずれかを通じて、もう1つの抗原上の所望のエピトープを結合することが特徴付けられ、かつ知られている第2の抗体の抗原結合ドメインをコードする配列に連結されうる。そのような配列を適切なベクターへ挿入し、細胞に導入して、当業者に公知の方法により二重特異性抗体ポリペプチドを産生することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、CEACAM1阻害剤である第1の部分およびPD1阻害剤である第2の部分を含む二重特異性剤を含みうる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、CEACAM1阻害剤である第1の部分およびLAP阻害剤である第2の部分を含む二重特異性剤を含みうる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、LAP阻害剤である第1の部分およびPD1阻害剤である第2の部分を含む二重特異性剤を含みうる。
【００８１】
いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物および方法は、三重特異性剤、すなわちCEACAM1、PD1、およびLAPの全てに対する特異性を有する剤に関しうる。本明細書において記述される場合、「三重特異性ポリペプチド剤」という用語は、少なくとも、第1の標的に対する結合特異性を有する結合部位を有する第1のポリペプチドドメイン、第2の標的に対する結合特異性を有する結合部位を有する第2のポリペプチドドメイン、ならびに第3の標的（例えば、CEACAM1、PD1、およびLAP）に対する結合特異性を有する結合部位を有する第3のポリペプチドドメインを含むポリペプチドをいう。第1、第2、および第3の標的は、同じものではない(すなわち、異なる標的(例えば、タンパク質)である)が、しかし全て、細胞上に存在し(例えば、共発現され)うる。
【００８２】
さらなる態様において、本明細書において記述される多重特異性ポリペプチド剤は、1つまたは複数のさらなる標的を結合することができ、すなわち、多重特異性ポリペプチドは、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、またはそれ以上の標的を結合することができ、ここで多重特異性ポリペプチド剤は、それぞれ少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、またはそれ以上の標的特異的な結合部位を有する。多重特異性ポリペプチド剤は、該剤が特異的である全ての標的を発現する細胞を、1つの標的しか、または該剤が特異的であるよりも少ない標的しか発現しない細胞よりも強力に(例えば、より高い結合力で)結合する可能性がある。多重特異性ポリペプチド剤の非限定的な例は、多重特異性抗体またはその抗原結合断片である。あいまいさを避けるために、二重特異性ポリペプチド剤または三重特異性ポリペプチド剤は、多重特異性ポリペプチド剤の一種またはサブセットである。
【００８３】
多重特異性抗体試薬、例えば二重特異性抗体試薬は、試薬が特異的である標的抗原の各々を発現している細胞に選択的に結合しうることに留意されたい。例えば、二重特異性抗体試薬は、各々が標的抗原の1つを発現する2つの別個の細胞に結合しうるが、それは、同じ細胞表面上に標的抗原の両方を発現する細胞に対していっそう特異的でありうる。
【００８４】
いくつかの態様において、本明細書において提供される、または本明細書において記述される方法において用いられる、抗体試薬は、翻訳後修飾をさらに含むことができる。例示的な翻訳後ポリペプチド修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ADP-リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、sumo化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖のまたは疎水性基の付加が含まれる。結果として、修飾されたポリペプチドは、脂質、多糖類または単糖類、およびホスフェートなどの、非アミノ酸要素を含みうる。そのような分子を誘導体ということもできる。
【００８５】
本明細書において記述される組成物および方法で用いるための試薬には、インビボでペプチドの半減期を増強できる、PEGなどのポリマーと結合されたまたは結び付けられたものが含まれる。PEG修飾は当技術分野において周知である。例えば、PCT US2007/024067を参照されたい。
【００８６】
本明細書において用いられる場合、「標的」という用語は、結合部位を有するポリペプチドドメインまたは他の部分(例えば、とりわけ小分子またはアプタマー)が選択的に結合できる生物学的分子(例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、糖質)を指す。標的は、例えば、細胞内標的(例えば、細胞内タンパク質標的)または細胞表面標的(例えば、膜タンパク質、受容体タンパク質)でありうる。
【００８７】
本明細書において用いられる場合、「抗体」とは、抗体を天然に産生する種に由来してもよい、または組み換えDNA技術によって作出されたものであってもい; 血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されてもよい、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE分子、またはそれらの抗原特異的な抗体断片(Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合scfv、ダイアボディを含むが、これらに限定されない)をいう。
【００８８】
本明細書において用いられる場合、「抗原」とは、ポリペプチド剤上の結合部位が結合する分子である。典型的には、抗原は、抗体リガンドによって結合され、インビボで抗体応答を起こすことができる。抗原は、ポリペプチド、タンパク質、核酸もしくは他の分子またはそれらの部分でありうる。一般に、本明細書において記述される二重特異性または多重特異性ポリペプチド剤は、2つまたはそれ以上の特定の抗原(すなわち、CEACAM1、PD1、および/またはLAP)に対する標的特異性によって選択される。通常の抗体およびその断片の場合、可変ループ(L1、L2、L3、およびH1、H2、H3)により定義されるような抗体結合部位が、抗原と結合することができる。「抗原決定基」という用語は、(本明細書において記述される二重特異性ポリペプチド剤のような)抗原結合分子、より具体的には、該分子の抗原結合部位により認識される抗原上のエピトープをいう。
【００８９】
本明細書において用いられる場合、「エピトープ」は、連続するアミノ酸からも形成されうるし、またはタンパク質の折り畳みにより並置された非連続アミノ酸からも形成されうる。連続するアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝されても保持されるが、折り畳みにより形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間的なコンフォメーションで、少なくとも3つ、一般的には、少なくとも5つ、約9つ、または約8〜10個のアミノ酸を含む。「エピトープ」には、通常、免疫グロブリンVH/VL対が結合する構造の単位が含まれる。エピトープは、抗体のための最小結合部位を定義し、したがって、抗体の特異性の標的を表す。単一ドメイン抗体の場合、エピトープは、単離された可変ドメインが結合する構造の単位を表す。「抗原決定基」および「エピトープ」という用語も、本明細書において互換的に用いられうる。
【００９０】
本明細書において用いられる場合、「免疫グロブリン」は、2つのβシートを含み、かつ、保存されたジスルフィド結合を通常含む、抗体分子に特徴的な免疫グロブリンの折り畳みを保持しているポリペプチドのファミリーを指す。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、免疫系における広範な役割(例えば、抗体、T細胞受容体分子など)、細胞接着への関与(例えばICAM分子)および細胞内シグナル伝達(例えば、PDGF受容体などの受容体分子)を含む、インビボの細胞および非細胞の相互作用の多くの局面に関与している。
【００９１】
標的分子上の「標的部位」または「リガンド相互作用部位」は、リガンド、受容体もしくは他の結合パートナーへの結合のための部位である標的上の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメインもしくはアミノ酸残基のストレッチ、触媒部位、切断部位、アロステリック相互作用のための部位、標的の多量体化(例えば、ホモ二量体化もしくはヘテロ二量体化)に関与する部位; または標的、例えば、PD1、LAPおよび/もしくはCEACAM1の生物学的作用もしくは機構に関与する抗原もしくは標的上の他の任意の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメインもしくはアミノ酸残基のストレッチを意味する。より一般的には、「リガンド相互作用部位」は、標的(および/または標的もしくは抗原が関与する任意の経路、相互作用、シグナル伝達、生物学的機構もしくは生物学的効果)、例えば、CEACAM1、PD1、および/またはLAPのいずれかのシグナル伝達が阻害されるように、本明細書において記述される剤または二重特異性もしくは多重特異性剤の結合部位が結合しうる、抗原または標的上の任意の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメインまたはアミノ酸残基のストレッチであることができる。
【００９２】
本明細書において用いられる場合、「遮断」抗体または抗体「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減するものである。例えば、CEACAM1/PD1二重特異性アンタゴニスト抗体は、CEACAM1およびPD1に結合し、T細胞寛容を誘導または維持するCEACAM1およびPD1の能力を阻害する。
【００９３】
本明細書において用いられる場合、「ドメイン」は、タンパク質の残部とは独立してその三次構造を保持している、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインは、タンパク質の別々の機能的特性を担っており、多くの場合、それが付加もしくは移動されたタンパク質の残りの部分および/またはドメイン自体の機能または特性の損失なしに、他のタンパク質に付加、除去または移動されうる。抗体またはその部分に関連して、「結合ドメイン」という用語は、抗原決定基に対するそのようなドメインを指す。「単一の抗体可変ドメイン」とは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む、折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。それゆえ、それには、完全な抗体可変ドメインおよび改変された可変ドメイン、例えば、1つもしくは複数のループが抗体可変ドメインに特徴的でない配列に交換されたもの、または切断されているかもしくはN末端もしくはC末端の伸張を含む抗体可変ドメインが含まれ、完全長ドメインの結合活性および特異性を少なくとも一部保持している可変ドメインの折り畳まれた断片も含まれる。したがって、二重特異性ポリペプチド剤は、少なくとも2つの異なる結合ドメインを含む。
【００９４】
当技術分野において周知のさまざまな手順によって、CEACAM1、LAP、および/またはPD1に特異的なポリクローナル抗体を産生することができる。例えば、PD1ポリペプチドまたはその断片、例えばSEQ ID NO:1のアミノ酸残基番号42〜136を含む断片を、タンパク質に特異的なポリクローナル抗体を含有している血清の産生を誘導するため、ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、これらに限定されない、さまざまな宿主動物に投与することができる。ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原、例えば、PD1断片およびアジュバントの複数回の皮下(sc)注射または腹腔内(ip)注射により動物において産生される。例えば、二官能性剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を通した結合)、N-ヒドロキシ-スクシンイミド(リジン残基を通したもの)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはRおよびR1が異なるアルキル基であるR1N=C=NRを用いて、免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤と、抗原を結合させることが有用でありうる。
【００９５】
例えば、(それぞれウサギまたはマウスのため)タンパク質または結合体を、3倍容量のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、その溶液を複数の部位において皮内注射することにより、抗原、免疫原性結合体、または誘導体に対して動物を免疫することができる。1ヶ月後、複数の部位における皮下注射により、最初の量の1/5〜1/10のペプチドまたは結合体を含むフロイント完全アジュバントにより、動物を追加免疫する。7〜14日後、動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーに達するまで、動物を追加免疫する。好ましくは、同一抗原の結合体であるが、異なるタンパク質と、かつ/または異なる架橋試薬を通して結合したものによって、動物を追加免疫する。結合体は、タンパク質融合体として組み換え細胞培養物において作出されてもよい。ミョウバンのような凝集剤も、免疫応答を増強するために適切に用いられる。
【００９６】
さまざまな他のアジュバントが、宿主種に依って、免疫学的応答を増加させるために用いられてもよく、それらはフロイント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG(カルメット・ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム・パルバム(corynebacterium parvum)のような有用である可能性のあるヒトアジュバントを含むが、これらに限定されることはない。
【００９７】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組み換え技術、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野において公知の極めて多様な技術を用いて調製することができる。本明細書において記述されているモノクローナル抗体を作出するためのさまざまな方法が、当技術分野において利用可能である。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature,256:495 (1975)により最初に記述されたハイブリドーマ法もしくはその応用法を用いて、または組み換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作出することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において知られているもの、および例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1988); Hammer-ling, et al., :Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybrido-mas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)中(該参照は、その全体が参照により組み入れられる)に教示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて産生することができる。本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通して産生された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む、単一のクローンに由来する抗体をいい、それが産生される方法をいうのではないことが理解されるべきである。
【００９８】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的な抗体を産生およびスクリーニングする方法は、当技術分野において日常的かつ周知である。非限定的な例において、例えばPD1、またはその断片もしくは誘導体、例えばSEQ ID NO:1のアミノ酸残基番号42〜136を含む断片、あるいはPD1もしくはその断片を発現している細胞により、マウスを免疫することができる。免疫応答が検出されたら、例えば、PD1に特異的な抗体がマウス血清中に検出されたら、マウス脾臓を採集し、脾細胞を単離する。次いで、脾細胞を、周知の技術により、適当な骨髄腫細胞、例えば、ATCCから入手可能な細胞株SP20に由来する細胞と融合させる。ハイブリドーマを選択し限界希釈によりクローニングする。次いで、当技術分野において公知の方法により、PD1を結合することができ、かつ活性化されたリンパ球に細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼすことができる抗体を分泌する細胞について、ハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンをマウスに注射することにより、一般に高レベルの抗体を含有している腹水を、作出することができる。
【００９９】
ハイブリドーマ法においては、免疫のために用いられるタンパク質と特異的に結合するであろう抗体を産生するかまたは産生できるリンパ球を誘発するため、マウス、またはハムスターもしくはマカクザルのような他の適切な宿主動物を、上記のように免疫する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。次に、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用い、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986); これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１００】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、適当な培養培地、好ましくは、非融合親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する1種または複数種の物質を含有している培養培地に播種し成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の成長を妨害する物質、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むであろう(HAT培地)。
【０１０１】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベルの産生を支持し、かつHAT培地のような培地に対して感受性であるものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USAから入手可能なマウス腫瘍MOPC-21およびMPC-11に由来するもの、ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, Md. USAから入手可能なSP-2細胞またはX63-Ag8-653細胞のようなマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロミエローマ(heteromyeloma)の細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記述されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。前記の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降により、または放射性免疫測定法(RIA)もしくは酵素免疫測定法(ELISA)のようなインビトロ結合アッセイ法により判定する。
【０１０３】
所望の特異性、親和性、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定されたら、限界希釈法によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法により成長させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))。この目的に適した培養培地には、例えば、D-MEM培地またはRPMI-1640培地が含まれる。さらに、動物において腹水腫瘍としてインビボでハイブリドーマ細胞を成長させることもできる。
【０１０４】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製法により、培養培地、腹水、または血清から適当に分離される。
【０１０５】
モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて(例えば、PCRによりまたはモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)容易に単離され配列決定されうる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい起源として機能する。単離されたら、DNAを発現ベクターに配し、次いで、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るため、大腸菌(E. coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または他の免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞へそれをトランスフェクションすることができる。抗体の組み換え産生は、以下にさらに詳細に記述される。
【０１０６】
別の例では、本明細書において記述されている方法および組成物において有用な抗体は、McCafferty et al., Nature, 348:552-554(1990)において記述された技術を用いて作出された抗体ファージライブラリからの単離のような、当技術分野において公知のさまざまなファージディスプレイ法を用いて作出することもできる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)には、ファージライブラリを用いて、それぞれ、マウス抗体およびヒト抗体を単離することが記述されている。その後の刊行物には、鎖シャフリングによる高親和性(nM範囲)ヒト抗体の産生(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、ならびに極めて大きなファージライブラリを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組み換え(Waterhouse et al.,Nuc.Acids.Res.,21:2265-2266(1993))が記述されている。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための、伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法の実行可能な代替法である。前記の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０７】
ファージディスプレイ法においては、機能的な抗体ドメインが、それらをコードする核酸配列を保持しているファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特定の態様において、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリ(例えば、ヒトまたはマウス)から発現された抗原結合ドメインをディスプレイするために利用されうる。ファージディスプレイ法においては、機能的な抗体ドメインが、それらをコードする核酸配列を保持しているファージ粒子の表面上にディスプレイされる。具体的には、VHドメインおよびVLドメインをコードするDNA配列を、動物cDNAライブラリ(例えば、ヒトまたはマウスのリンパ組織のcDNAライブラリ)から増幅する。VHドメインおよびVLドメインをコードするDNAを、PCRによりscFvリンカーと組み換え、ファージミドベクター(例えば、pCANTAB6またはpComb3HSS)へクローニングする。ベクターを大腸菌へ電気穿孔し、大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法において用いられるファージは、典型的には、ファージの遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのタンパク質のいずれかと組み換えにより融合した、Fab、Fv、またはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインを有するファージから発現されたfdおよびM13結合ドメインを含む繊維状ファージである。PD1、CEACAM1もしくはLAPまたはそれらの一部分に結合する抗原結合ドメインを発現しているファージは、例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合したもしくはそれらに捕捉された抗原を用いて、選択または特定されうる。本明細書において記述される抗体を作出するために使用されうるファージディスプレイ法の例には、Brinkman et al, 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al, 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology, 191-280; PCT出願第PCT/GB91/01134号; PCT公開WO90/02809; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; WO95/20401; ならびに米国特許第5,698,426号; 同第5,223,409号; 同第5,403,484号; 同第5,580,717号; 同第5,427,908号; 同第5,750,753号; 同第5,821,047号; 同第5,571,698号; 同第5,427,908号; 同第5,516,637号; 同第5,780,225号; 同第5,658,727号; 同第5,733,743号および同第5,969,108号において開示されたものが含まれ、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１０８】
上記の参考文献において記述されるように、ファージ選択の後、ファージから抗体コード領域を単離し、ヒト抗体を含む完全抗体、またはその他の所望の抗原結合断片を作出するために用い、例えば、以下に詳細に記述されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む所望の宿主において発現させることができる。例えば、Fab断片、Fab'断片およびF(ab')2断片を組み換え産生するための技法もPCT公開WO92/22324; Mullinax et al, BioTechniques 1992, 12(6):864-869; およびSawai et al, 1995, AJRI 34:26-34; およびBetter et al., 1988, Science 240:1041-1043において開示されたものなどの、当技術分野において公知の方法を用いて利用することができ、それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１０９】
単純な結合アッセイ法を用いて、CEACAM1、PD1、および/もしくはLAPのいずれかに結合する剤、ならびに/または前記のいずれかのシグナル伝達活性を低減する剤をスクリーニングまたは検出することができる。CEACAM1およびPD1は膜貫通タンパク質であるので、完全長タンパク質ではなくこれらのタンパク質の可溶型を用いるアッセイ法を、いくつかの態様において、用いることができる。可溶型には、例えば、膜貫通ドメインを欠いているもの、および/またはIgVドメインもしくはその同族の結合パートナーを結合するその能力を保持しているその断片を含んでいるものが含まれる。
【０１１０】
さらに、本明細書において記述される組成物および方法で用いるためのCEACAM1、PD1、および/またはLAPを阻害する剤は、例えば、CEACAM1、PD1および/またはLAPによって制御されるシグナル伝達経路の活性化を測定することにより特定することができる。非限定的な例として、CEACAM1、PD1、および/またはLAPシグナル伝達の活性化によって誘導または抑制された遺伝子の発現を、(例えば定量的RT-PCRにより)測定することができ、または下流のシグナル伝達パートナーのリン酸化のレベルを(例えば免疫化学により)測定することができる。これらの経路の各々のそのようなマーカー、およびそれらのレベルを測定する方法は、当技術分野において公知である。例示的なマーカーとしては、CEACAM1シグナル伝達のマーカーとしてのCEACAM1に結合されたSHP1のレベルおよびZAP-70リン酸化(例えばChen et al. Journal of Immunology 2008 6085-6093を参照のこと)、PD1シグナル伝達のマーカーとしてのSHP2リン酸化レベル(例えばYamamoto et al. Blood 2008 111:3220-4を参照のこと)、ならびにLAPシグナル伝達のマーカーとしてのリン酸化されたSMAD2およびSMAD3のレベル(例えばFleisch et al. Endocrine-Related Cancer 2006 13:379-400を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されることはない。前記の刊行物は全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１１】
例えばCEACAM1タンパク質への阻害剤の結合を判定するためのもう一つの種類のアッセイ法は、親和性バイオセンサ方法の使用によるものである。そのような方法は、圧電効果、電気化学、または光学的方法、例えば、楕円偏光法、光波ガイダンス(optical wave guidance)、および表面プラズモン共鳴(SPR)に基づきうる。
【０１１２】
もう一つの手法として、例えば、PD1、LAP、および/またはCEACAM1の発現に及ぼすsiRNAの効力は、各遺伝子それぞれに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーでの定量的RT-PCR、またはPD1、LAP、および/もしくはCEACAM1に対するELISAのような、当技術分野において公知の方法を用いてモニタリングすることができる。あるいは、T細胞の集団におけるPD1、LAPおよび/またはCEACAM1の発現を、当技術分野において知られるまたは本明細書において開示される特定の集団および亜集団に特徴的なマーカーを用いるFACS分析によって判定することができる。
【０１１３】
いくつかの局面において、本明細書において記述されるように、CEACAM1、LAP、および/またはPD1を阻害する1種または複数種の剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、インビボで免疫応答を増強するための方法が本明細書において提供される。そのような剤によるT細胞寛容の調節は、インビボで免疫応答を特異的に増強するのに有用であり、これは、がんおよび慢性感染を含む免疫機能に関連した状態の処置に有用でありうる。T細胞寛容の調節はまた、がんの実験モデルにおいて、処置がT細胞を非機能的にしたかを判定するために、例えば、特定の臓器または生理学的過程に及ぼすT細胞機能の増加または減少の効果を判定するために、およびT細胞活性を増加または減少させる剤を試験するために、対象のT細胞が機能的(例えば、増殖および/または細胞傷害機能)であるかどうかを判定することを含めて、インビトロにおいてまたは非治療用途において有用である。その他の使用が当業者には明らかであろう。PD1、LAPおよび/またはCEACAM1を阻害する剤は、一次療法として単独で用いてもよく、または併用療法として他の治療用物質との組み合わせで用いて、他の医学的処置の治療的有用性を増強してもよい。
【０１１４】
CEACAM1、PD1、および/またはLAP活性は、1つもしくは複数のシグナル伝達活性またはCEACAM1、PD1、および/もしくはLAP活性の下流の読み出しが、剤または刺激の存在下において、そのような調節のない場合と比べて、100%までを含め、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、またはそれ以上だけなどの、統計的に有意な量だけ低減または改変される場合、「減少され」る。当業者によって理解されるように、いくつかの態様において、CEACAM1、PD1、および/またはLAP活性が減少される場合、下流の読み出しのなかには減少するものもあるが、増加しうるもの(すなわち、CEACAM1、PD1、および/またはLAP活性によって通常抑制されているもの)もある。
【０１１５】
当業者には明らかであるように、標的の活性の減少は、リガンド、結合パートナー、ホモ多量体型もしくはヘテロ多量体型への会合のためのパートナー、または基質のうちの1種または複数種に対する、CEACAM1、PD1、またはLAPのような、標的または抗原の親和性、結合力、特異性および/または選択性の変化(増加または減少のどちらかでありうる)をもたらすこと; ならびに/あるいは同じ条件、ただし阻害剤の存在がないのと比べて、(pH、イオン強度、補因子の存在などのような)標的または抗原が存在する媒体または環境における1種または複数種の条件に対する、CEACAM1、PD1、またはLAPのような、標的または抗原の感度の変化(増加または減少のどちらかでありうる)をもたらすことも含むことができる。やはり、これも、関与する標的に依って、任意の適当な様式でかつ/またはそれ自体公知のもしくは本明細書において記述の任意の適当なアッセイ法を用いて判定することができる。標的の活性の減少は、標的もしくは抗原が関与している1種もしくは複数種の生物学的もしくは生理学的な機構、効果、応答、機能、経路もしくは活性(またはシグナル伝達経路もしくは代謝経路、およびそれらに関連した生物学的もしくは生理学的な効果のような、その基質、リガンドもしくは経路が関与しているもの)に対する変化(すなわち、CEACAM1、PD1、および/またはLAPのような、標的または抗原、ならびに所望の生物学的または生理学的な効果に依る、アゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとしての、それぞれの、活性の変化)をもたらすことも意味することができる。やはり、当業者には明らかであるように、アゴニストまたはアンタゴニストとしてのそのような作用も、関与する標的または抗原に依って、任意の適当な様式でかつ/またはそれ自体公知のもしくは本明細書において記述の任意の適当なアッセイ法(インビトロ・アッセイ法、通常は、細胞アッセイ法つまりイン・アッセイ法(in assay))を用いて判定することができる。
【０１１６】
標的の活性の減少は、例えば、(CEACAM1、PD1、および/もしくはLAPのような)標的のアロステリックな調節; ならびに/あるいは標的のその基質もしくはリガンドのうちの1種との結合を低減させるかもしくは阻害すること、および/または標的への結合で天然リガンド、基質と競合することも含むことができる。標的の活性の減少は、例えば、標的の折り畳みもしくは高次構造(confirmation)に関しての変化、または標的の折り畳まれる能力、(例えば、リガンドの結合により)その高次構造を変化させる能力、他の(サブ)ユニットと結び付く能力、または解離する能力に関しての変化をもたらすことも含むことができる。標的の活性の減少は、例えば、標的の、シグナル伝達する、リン酸化する、脱リン酸化するなどの能力の変化をもたらすことも含むことができる。
【０１１７】
宿主免疫応答の免疫抑制は、持続感染および腫瘍免疫抑制のような種々の慢性免疫病において役割を果たしている。最近の証拠は、この免疫抑制が、免疫細胞の表面において発現された免疫阻害性受容体、およびそれらのリガンドとの相互作用により媒介されうることを示している。例えば、細胞傷害性CD8 T細胞は、「機能的枯渇」または「非応答性」の状態になる場合があり、その際、それらは、増殖およびサイトカイン産生のような抗原特異的な応答を妨害する阻害性受容体を発現している。したがって、そのような阻害性受容体の活性および/または発現を阻害することにより、抑制されているか、阻害されているか、または非応答性である、持続感染またはがんもしくは腫瘍に対する免疫応答を、増強するかまたは阻害されないようにすることができる。
【０１１８】
本明細書において用いられる場合、「免疫応答」は、B細胞、T細胞(CD4もしくはCD8)、調節性T細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、NKT細胞、NK細胞、好塩基球、好酸球、または好中球のような、免疫系の細胞による、刺激に対する応答をいう。いくつかの態様において、応答は、特定の抗原に特異的であり(「抗原特異的な応答」)、抗原特異的な受容体を介したCD4 T細胞、CD8 T細胞、またはB細胞による応答をいう。いくつかの態様において、免疫応答は、CD4+応答またはCD8+応答のような、T細胞応答である。これらの細胞によるそのような応答は、例えば、細胞傷害、増殖、サイトカインもしくはケモカインの産生、輸送、または食作用を含むことができ、応答を起こしている免疫細胞の性質に依存しうる。
【０１１９】
本明細書において用いられる場合、免疫細胞に関する「非応答性」または「機能的枯渇」には、活性化受容体またはサイトカインを介した刺激のような刺激に対する免疫細胞の抵抗性が含まれる。非応答性は、例えば、免疫抑制薬への曝露、高用量もしくは一定用量の抗原への曝露のため、またはCEACAM1、PD1および/もしくはLAPのような阻害性受容体もしくは因子の活性を通して起こりうる。本明細書において用いられる場合、「非応答性」という用語には、活性化受容体により媒介される刺激に対する抵抗性が含まれる。そのような抵抗性は、一般に、抗原特異的であり、抗原曝露が終わった後、持続する。非応答性免疫細胞は、同一の型の対応する対照免疫細胞に比べて、細胞傷害活性、サイトカイン産生、増殖、輸送、食作用活性、またはそれらの任意の組み合わせの、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%もの低下を有しうる。
【０１２０】
本明細書において用いられる場合、「T細胞寛容を低減する」という用語は、所与の処置または一連の条件がT細胞寛容の低減、すなわち、より高いT細胞活性、応答性、および/または活性化に関する能力もしくは受容力をもたらすことを意味する。T細胞活性を測定する方法は、当技術分野において公知である。非限定的な例として、T細胞寛容は、T細胞をリコール抗原、副刺激の非存在下での抗CD3、および/またはイオノマイシンと接触させることにより誘導することができる。例えばLDH-A、RAB10、および/またはZAP70 (細胞内型および分泌型の両方)の、レベルをモニタリングして、例えば、T細胞免疫寛容導入の程度を判定することができる(IL-2、インターフェロン-γおよびTNFのレベルは、T細胞寛容の増大と関連している)。例えばイオノマイシン、で予め処理された細胞の、抗原に対する応答を、例えば、分泌型および/または細胞内型IL-2および/またはTNF-αのレベルをモニタリングすることによって、細胞または細胞の集団におけるT細胞寛容の程度を判定するために測定することもできる(例えばMacian et al. Cell 2002 109:719-731を参照されたい; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。対照として有用でありうるが、しかし診療所での適用性が極めて限られている、T細胞寛容を低減することが公知の化合物には、CTLA4を含めることができる。1つの態様において、T細胞寛容を低減することが公知の化合物は、CTLA4ではない。
【０１２１】
適応寛容を起こしたT細胞の他の特徴は、それらがFynおよびZAP-70/Syk、Cb1-b、GRAIL、Ikaros、CREM (cAMP応答要素調節因子)、Bリンパ球誘導成熟タンパク質-1 (Blimp-1)、PD1、CD5、ならびにSHP2のレベルの増大; ZAP-70/Syk、LAT、PLCγ1/2、ERK、PKC-Θ/IKBAのリン酸化の増大; 細胞内カルシウムレベルの活性化の増大; ヒストンアセチル化もしくは低アセチル化の低下および/またはIL-2遺伝子座でのCpGメチル化の増大を有するということである。したがって、いくつかの態様において、これらのパラメータのいずれかの1つまたは複数の低減をアッセイして、CEACAM1、LAP、および/またはPD-1を阻害する1種または複数種の剤が免疫応答をインビボで増強するかどうか、または免疫寛容を低下させるかどうかを判定することができる。
【０１２２】
例えば3H-チミジン取り込みアッセイ法または細胞数により、アッセイされる関連抗原の存在下でのT細胞の増殖を判定することによって、T細胞寛容の低減を測定することもできる。例えばT細胞活性化を示す細胞表面マーカー(例えばCD69、CD30、CD25、およびHLA-DR)のフローサイトメトリー分析により、関連抗原への曝露後のT細胞活性化のマーカーをアッセイすることもできる。抗原攻撃に応じたT細胞活性化の低減は、寛容誘導を示す。逆に、抗原攻撃に応じたT細胞活性化の増大は、寛容の低減を示す。
【０１２３】
T細胞寛容の低減は、いくつかの態様において、阻害剤がその標的の活性を阻害する度合いを判定することにより、測定することもできる。非限定的な例として、CEACAM1阻害剤の活性は、ブドウ球菌エンテロトキシンB (SEB)モデルを用いて判定することができる。SEBは、典型的には、CEACAM1を刺激し、TIM3の上方制御を引き起こす。CEACAM1阻害剤の存在下において、SEBに応じたTIM3の上方制御が低減されよう。
【０１２４】
T細胞寛容およびその調節を測定するために、SEBモデルを適合させることもできる。正常マウスでは、ブドウ球菌エンテロトキシンB (SEB)の新生児期注入により、反応性T細胞受容体(TCR) Vβ領域を発現するT細胞において寛容が誘導される。CEACAM1、PD1、および/またはLAP阻害剤の存在下において、反応性TCR Vβ領域(例えば、Vbeta8)を発現しているT細胞が、阻害剤と接触されていないT細胞よりも統計的に有意な高いT細胞活性を呈するなら、阻害剤は、T細胞寛容を低減するものである。
【０１２５】
本明細書において記述される阻害剤を用いてT細胞寛容の低減を測定するためにいくつかの局面および態様において用いることができる末梢寛容の他のインビボモデルには、例えば、TCRトランスジェニックマウスおよび二重トランスジェニックマウス由来のT細胞の均質集団が、移入されたT細胞によって認識される抗原を構成的に発現する宿主へ移入されている末梢寛容のモデル、例えば、H-Y抗原TCRトランスジェニックマウス; ハトチトクロームC抗原TCRトランスジェニックマウス; またはヘマグルチニン(HA) TCRトランスジェニックマウスが含まれる。そのようなモデルにおいて、レシピエントマウスにより構成的にまたは誘導的に発現された抗原に特異的なTCRを発現している細胞は、典型的には、即時拡大・増殖期を起こし、その後に非応答性の期間を起こすが、これは、抗原が除去されると、および/または抗原発現が阻害されると、反転する。したがって、もし、CEACAM1、PD1、および/またはLAP阻害剤の存在下、そのようなモデルにおいて、T細胞が、該阻害剤の非存在下におけるT細胞よりも有意にいっそう、増殖または拡大するなら、サイトカイン活性を示すなどなら、該剤は、T細胞寛容を低減するものである。増殖のそのような測定はインビボで、BrDU、CFSEもしくは抗原を発現しているレシピエント動物に移入する前に増殖の追跡を可能にする別の生体内色素で標識されたT細胞、またはサイトカイン受容体T細胞を用いて、あるいはチミジン増殖アッセイ法、ELISA、サイトカインビーズアッセイ法などのような、細胞増殖および/またはサイトカイン産生を分析するためのエクスビボ法を用いて行うことができる。
【０１２６】
T細胞寛容の低減は、定着腫瘍(established tumor)から流れ出るリンパ節内の腫瘍浸潤リンパ球またはTリンパ球の検査によって評価することもできる。そのようなT細胞は、例えば、PD1、TIM-3またはLAG-3のような細胞表面分子の発現を通じた「枯渇」、およびインターフェロン-γのようなサイトカインの分泌の減少といった特徴を示す。したがって、CEACAM1、PD1、および/またはLAP阻害剤の存在下において、1) (例えば腫瘍関連ペプチドを含有する主要組織適合性遺伝子複合体クラスIまたはクラスII四量体によって判定される)腫瘍関連抗原に対する抗原特異性を有するT細胞の量の増大が認められるなら、および2)該阻害剤の非存在下において認められるものと比べて、高レベルのインターフェロン-γおよび細胞溶解性エフェクタ分子、例えばグランザイム-Bを分泌できるT細胞の量の増大が認められるなら、これは、T細胞寛容が低減されたという証拠であろう。1つの局面において、本明細書において記述される技術は、慢性疾患を処置するための方法に関する。そのような方法は、慢性疾患の処置を必要としている対象に、本明細書において記述される組成物(すなわち(i) CEACAM1阻害剤、(ii) PD1阻害剤、および(iii) LAP阻害剤の少なくとも2つを含む組成物)を投与する段階を含むことができる。いくつかの態様において、慢性疾患は、がん; 持続感染; および慢性ウイルス感染からなる群より選択することができる。いくつかの態様において、慢性疾患の処置を必要としている対象は、望ましくない高レベルのT細胞寛容を患っている対象、望ましくない高レベルのT細胞寛容を患っていると診断された対象、またはT細胞寛容の低減もしくは阻害を必要としている対象でありうる。本明細書において用いられる場合、「望ましくない高レベルのT細胞寛容」は、対象の免疫系が感染もしくは慢性疾患に応答すること、および/または感染もしくは慢性疾患を取り除くことを可能にしないT細胞寛容のレベルでありうる。本明細書において記述される方法を用いたT細胞寛容の低減または阻害を必要としている対象は、がんもしくは前がん状態(例えば、まだ新生物ではないが、しかし新生物表現型に進行する傾向を特徴付ける正常表現型からのシフトを示唆している細胞学的変化)を有している対象、慢性感染を有する対象、または病原体による感染を患っている対象を含むが、これらに限定されることはない。
【０１２７】
本明細書において記述される方法のいくつかの態様において、CEACAM1、PD1、および/またはLAPのうちの少なくとも2つを阻害するための剤を投与される対象は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫による持続感染を有する。「持続感染」とは、急性感染とは対照的に、自然発生の宿主免疫応答の誘導により効果的に除去されない感染をいう。そのような持続感染においては、感染性病原体と免疫応答とが平衡に達するため、感染対象は、必ずしも症状を発現することなく、長期にわたり感染したままとなる。持続感染は、しばしば、宿主細胞を急速に死滅させず、過度の傷害を与えることすらない、無症候性感染および増殖性感染の両方の期を含む。持続感染には、例えば、潜伏感染、慢性感染、および遅発性感染が含まれる。持続感染は、ヒトT細胞白血病ウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、麻疹、パポーバウイルス、プリオン、肝炎ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、およびパピローマウイルスを含むが、これらに限定されないウイルスにより起こる。
【０１２８】
「慢性感染」において、感染性病原体は、対象において常に存在する。しかしながら、疾患の兆候および症状は、存在するかもしれないしまたは長期間存在しないかもしれない。慢性感染の非限定的な例には、(B型肝炎ウイルス(HBV)により引き起こされる)B型肝炎、(C型肝炎ウイルス(HCV)により引き起こされる)C型肝炎、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、ヒトヘルペスウイルス6型、水痘帯状疱疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスB19、ポリオーマウイルスBK、ポリオーマウイルスJC、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトT細胞白血球ウイルスI型、およびヒトT細胞白血球ウイルスII型が含まれる。寄生虫持続感染は、例えば、リーシュマニア、トキソプラズマ、トリパノソーマ、プラスモディウム、住血吸虫、およびエンセファリトゾーンによる感染の結果として起こりうる。
【０１２９】
いくつかの態様において、慢性感染は潜伏感染でありうる。いくつかの態様において、慢性感染は、感染が潜伏感染である期間を含みうる。「潜伏感染」において、(ウイルスのような)感染性病原体は、外見的には不活性であり休止状態にあるため、対象は兆候または症状を必ずしも示さない。潜伏ウイルス感染においては、症状が再び出現するまで、ウイルスは、長期間、宿主との平衡状態にある; しかしながら、疾患の再活性化が起こるまで、実際のウイルスは典型的には検出され得ない。潜伏感染の非限定的な例には、単純ヘルペスウイルス(HSV)-1 (単純疱疹)、HSV-2 (性器ヘルペス)、および水痘帯状疱疹ウイルスVZV (水痘帯状疱疹)により引き起こされる感染が含まれる。
【０１３０】
「遅発性感染」において、感染性病原体は、極めて長期にわたり徐々に数を増加させ、その間、有意な兆候または症状は観察されない。遅発性感染の非限定的な例には、(HIV-1およびHIV-2により引き起こされる)エイズ、動物において腫瘍を引き起こすレンチウイルス、ならびにプリオンが含まれる。
【０１３１】
さらに、本明細書において記述される方法を用いて処置されうる持続感染には、急性感染の後期合併症としてしばしば起こる感染が含まれる。例えば、亜急性硬化性全脳炎(SSPE)は急性麻疹感染の後に起こることがあり、退行性脳炎は風疹感染の結果として起こることがある。
【０１３２】
持続感染が維持される機序には、ウイルスおよび細胞の遺伝子発現の調節、ならびに宿主免疫応答の改変が含まれうる。潜伏感染の再活性化は、細胞生理学の変化、別のウイルスによる重複感染、および身体的なストレスまたは外傷を含むさまざまな刺激により誘発されうる。宿主免疫抑制は、しばしば、多数の持続性ウイルス感染の再活性化に関連している。本明細書において記述される方法のいくつかの態様において、例えば、CEACAM1およびPD1またはCEACAM1およびLAPを阻害するための剤を投与される対象は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫のような、病原体による感染を有する。
【０１３３】
感染性ウイルスの例としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されることはない: レトロウイルス科(Retroviridae) (例えば、HIV); ピコルナウイルス科(例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス; エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス); (胃腸炎を引き起こす株のような)カリシウイルス科; トガウイルス科(例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス); フラビウイルス科(例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス); コロナウイルス科(例えば、コロナウイルス); ラブドウイルス科(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス); フィロウイルス科(例えば、エボラウイルス); パラミクソウイルス科(例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス); オルトミクソウイルス科(例えば、インフルエンザウイルス); ブニヤウイルス科(例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス); アレナウイルス科(出血熱ウイルス); レオウイルス科(例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス); ビルナウイルス科; ヘパドナウイルス科(B型肝炎ウイルス); パルボウイルス科(パルボウイルス); パポーバウイルス科(パピローマウイルス、ポリオーマウイルス); アデノウイルス科(大部分のアデノウイルス); ヘルペスウイルス科(単純ヘルペスウイルス(HSV)1型およびHSV-2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス); ポックスウイルス科(痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス); ならびに(アフリカブタコレラウイルスのような)イリドウイルス科; ならびに未分類のウイルス(例えば、海綿状脳症の病原体、(B型肝炎ウイルスの欠陥サテライトであると考えられている)D型肝炎の病原体、非A非B型肝炎(クラス1＝経口伝播型; クラス2＝非経口伝播型(すなわち、C型肝炎))の病原体; ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス)。本明細書において記述される組成物および方法は、これらのおよびその他のウイルス性病原体による感染の処置で用いるために企図される。
【０１３４】
真菌感染症の例としては、アスペルギルス症; (カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)により引き起こされる)鵞口瘡; (クリプトコッカス(Cryptococcus)により引き起こされる)クリプトコッカス症; およびヒストプラズマ症が挙げられるが、これらに限定されることはない。したがって、感染性真菌の例としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)、ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)、カンジダ・アルビカンスが挙げられるが、これらに限定されることはない。本明細書において記述される組成物および方法は、これらのおよびその他の真菌性病原体による感染の処置で用いるために企図される。
【０１３５】
感染性細菌の例としては、以下のものが挙げられる: ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borelia burgdorferi)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophilia)、(結核菌(M.tuberculosis)、M.アビウム(avium)、M.イントラセルラーレ(intracellulare)、M.カンサシ(kansaii)、M.ゴルドナエ(gordonae)のような)マイコバクテリア(Mycobacteria)種、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)(A群ストレプトコッカス)、ストレプトコッカス・アガラクチア(agalactiae)(B群ストレプトコッカス)、ストレプトコッカス(ビリダンス群)、ストレプトコッカス・フェカリス(faecalis)、ストレプトコッカス・ボビス(bovis)、ストレプトコッカス(嫌気性種)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(pneumoniae)、病原性カンピロバクター(Campylobacter)種、エンテロコッカス(Enterococcus)種、インフルエンザ菌、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、コリネバクテリウム・ジフテリエ(corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、破傷風菌(Clostridium tetani)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、パスツレラ・マルトシダ(Pasturella multocida)、バクテロイデス(Bacteroides)種、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、ストレプトバチルス・モニリフォルミス(Streptobacillus moniliformis)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidium)、トレポネーマ・パーテヌエ(Treponema pertenue)、レプトスピラ(Leptospira)、およびアクチノミセス・イスラエリー(Actinomyces israelii)。本明細書において記述される組成物および方法は、これらのおよびその他の細菌性病原体による感染の処置で用いるために企図される。(原生生物のような)他の感染性生物には、熱帯熱マラリア原虫およびトキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)が含まれる。本明細書において記述される組成物および方法は、これらのおよびその他の病原体による感染の処置で用いるために企図される。
【０１３６】
本明細書において記述される局面のいくつかの態様において、本方法は、PD1、LAPおよび/またはCEACAM1を阻害するための剤とともにウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、または寄生虫抗原の有効量を投与する段階をさらに含む。適当なウイルス抗原の非限定的な例としては、とりわけ、以下のものが挙げられる: インフルエンザHA抗原、NA抗原、M抗原、NP抗原、およびNS抗原; HIV p24、pol、gp41、およびgp120; メタニューモウイルス(Metapneumovirus)(hMNV)Fタンパク質およびGタンパク質; C型肝炎ウイルス(HCV)E1タンパク質、E2タンパク質、およびコアタンパク質; デングウイルス(DEN 1-4)E1タンパク質、E2タンパク質、およびコアタンパク質; ヒトパピローマウイルスL1タンパク質; エプスタインバーウイルスgp220/350およびEBNA-3Aペプチド; サイトメガロウイルス(CMV)gB糖タンパク質、gH糖タンパク質、pp65、IE1(エキソン4)、およびpp150; 水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)IE62ペプチドおよび糖タンパク質Eエピトープ; 単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Dエピトープ。抗原性ポリペプチドは、天然に存在する動物もしくはヒトのウイルス単離株のポリペプチドに相当してもよいし、または天然の(病原性もしくは非病原性の)単離株と比べて、1つもしくは複数のアミノ酸置換を組み込むために操作されてもよい。
【０１３７】
本明細書において記述される方法の他の局面および態様において、PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤を投与される対象は、がんまたは腫瘍を有する。したがって、いくつかの局面において、PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するするための剤の有効量を投与する段階を含む、がんまたは腫瘍を有する対象を処置する方法が本明細書において提供される。
【０１３８】
本明細書において用いられる「がん」または「腫瘍」は、身体の臓器および系の正常な機能に干渉する、制御されない細胞の成長を指す。がんまたは腫瘍を有する対象は、対象の体内に存在する客観的に測定可能ながん細胞を有する対象である。良性および悪性のがんも、この定義に含まれ、休止状態の腫瘍または微小転移巣も含まれる。最初の位置から遊走し、生命の維持に必要な臓器に播種したがんは、最終的には、影響を受けた臓器の機能的悪化を通して対象の死をもたらすことがある。白血病などの造血系のがんは、対象における正常な造血コンパートメントより優勢となり、それにより、(貧血、血小板減少症および好中球減少症の形態で)造血不全をもたらし、最終的には死を引き起こしうる。
【０１３９】
「転移」とは、がんの原発部位から体内の他の場所へのがんの伝播を意味する。がん細胞は、原発腫瘍から離れ、リンパ管および血管に浸透し、血流中を循環し、体内の他の場所にある正常組織内の遠位病巣において成長する(転移する)ことができる。転移は、局所または遠位でありうる。転移は、腫瘍細胞の原発腫瘍からの離脱、血流中の移動、および遠位部位における停止に依存する、逐次的な過程である。新たな部位で、細胞は、血液供給を確立し、成長して、生命を脅かす腫瘤を形成することができる。腫瘍細胞内の刺激性分子経路および阻害性分子経路の両方が、この挙動を制御し、遠位部位における腫瘍細胞と宿主細胞との間の相互作用も重要である。転移は、ほとんどの場合、特定の症状のモニタリングに加えて、磁気共鳴画像(MRI)スキャン、コンピュータ断層撮影(CT)スキャン、血球数および血小板数、肝機能研究、胸部X線ならびに骨スキャンの単独使用または組み合わせ使用を通して検出される。
【０１４０】
がんの例としては、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されることはない。そのようながんのより具体的な例としては、基底細胞癌、胆道がん; 膀胱がん; 骨がん; 脳およびCNSのがん; 乳がん; 腹膜がん; 子宮頸がん; 絨毛癌; 結腸がんおよび直腸がん; 結合組織がん; 消化器系がん; 子宮内膜がん; 食道がん; 眼のがん; 頭頸部がん; 胃がん(胃腸がんを含む); 膠芽腫; 肝癌; 肝細胞癌; 上皮内新生物; 腎臓がんまたは腎がん; 喉頭がん; 白血病; 肝がん; 肺がん(例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、および肺の扁平上皮癌); ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫; 黒色腫; 骨髄腫; 神経芽腫; 口腔がん(例えば、唇、舌、口、および咽頭); 卵巣がん; 膵がん; 前立腺がん; 網膜芽細胞腫; 横紋筋肉腫; 直腸がん; 呼吸器のがん; 唾液腺がん; 肉腫; 皮膚がん; 扁平上皮がん; 胃がん; 精巣がん; 甲状腺がん; 子宮がんまたは子宮内膜がん; 泌尿器系のがん; 外陰がん; ならびに他のがん腫および肉腫; ならびにB細胞リンパ腫(低悪性度/濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL); 小リンパ球性(SL)NHL; 中悪性度/濾胞性NHL; 中悪性度びまん性NHL; 高悪性度免疫芽球性NHL; 高悪性度リンパ芽球性NHL; 高悪性度小型非切れ込み核細胞性NHL; 巨大腫瘤病変NHL; マントル細胞リンパ腫; エイズ関連リンパ腫; およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む); 慢性リンパ球性白血病(CLL); 急性リンパ芽球性白血病(ALL); ヘアリーセル白血病; 慢性骨髄芽球性白血病; および移植後リンパ球増殖性障害(PTLD)、ならびに母斑症に関連した異常血管増殖、(脳腫瘍に関連したものなどの)浮腫、ならびにメイグス症候群が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１４１】
本明細書において記述されるいくつかの態様において、本方法は、本明細書において記述されるPD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤を投与される対象に、腫瘍抗原またはがん抗原を投与する段階をさらに含む。特定のがんに関連しているいくつかの腫瘍抗原が同定されている。本明細書において用いられる場合、「腫瘍抗原」および「がん抗原」という用語は、がん細胞により差次的に発現され、それによって、がん細胞を標的化するために活用されうる抗原を指すように互換的に用いられる。がん抗原は、見けか上は腫瘍特異的な免疫応答を刺激する可能性がある抗原である。これらの抗原のいくつかは正常細胞によって、コードされているが、必ずしも発現されるわけではない。これらの抗原は、正常細胞においては通常サイレントである(すなわち、発現されない)もの、ある分化段階においてのみ発現されるもの、ならびに胚抗原および胎児抗原などの一時的に発現されるものとして特徴付けられうる。他のがん抗原は、がん遺伝子(例えば、活性化されたrasがん遺伝子)、抑制遺伝子(例えば、変異p53)、内部欠失または染色体転座に起因する融合タンパク質などの変異細胞遺伝子によりコードされる。さらに他のがん抗原は、RNA腫瘍ウイルスおよびDNA腫瘍ウイルスが保持しているものなどのウイルス遺伝子によってコードされうる。多くの腫瘍抗原が、複数の固形腫瘍に関して定義されている: 免疫により定義されたMAGE 1、2、および3; MART-1/Melan-A、gp100、癌胎児性抗原(CEA)、HER-2、ムチン(すわなち、MUC-1)、前立腺特異抗原(PSA)、ならびに前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)。加えて、B型肝炎(HBV)、エプスタインバー(EBV)、およびヒトパピローマ(HPV)タンパク質などのウイルスタンパク質は、それぞれ、肝細胞癌、リンパ腫、および子宮頸がんの発症において重要であることが示されている。しかしながら、がんと診断された患者の免疫抑制のため、これらの患者の免疫系は、腫瘍抗原に対して応答できないことが多い。
【０１４２】
本明細書において記述される方法のいくつかの態様において、本方法は、PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤を投与される対象に化学療法剤を投与する段階をさらに含む。化学療法剤の非限定的な例としては、チオテパおよびサイトキサン(CYTOXAN) (登録商標)シクロフォスファミドなどのアルキル化剤; ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル; ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン; アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド(trietylenephosphoramide)、トリエチレンチオホスファオラミド(triethiylenethiophosphoramide)およびトリメチロロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン; アセトゲニン(特にブラタシンおよびブラタシノン); カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む); ブリオスタチン; カリスタチン; CC-1065 (そのアドゼレシン、カルゼルシンおよびビゼレシン合成類似体を含む); クリプトフィシン(特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8); ドラスタチン; デュオカルマイシン(合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む); エリュテロビン; パンクラチスタチン; サルコジクチイン; スポンジスタチン; クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェンテルミン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード; カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン(ranimnustine)などのニトロソ尿素(nitrosureas); 抗生物質、例えばエンジイン抗生物質(例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγ1IおよびカリケアミシンωI1(例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照のこと); ダイネマイシンAを含むダイネマイシン; クロドロネートなどのビスホスホネート; エスペラマイシン; ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連した色素タンパク質エネジン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン(chromomycinis)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、アドリアマイシン(ADRIAMYCIN) (登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン; メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル(5-FU)などの代謝拮抗物質; デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体; フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体; アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体; カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン; アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤; フロリン酸などの葉酸補給剤; アセグラトン; アルドホスファミドグリコシド; アミノレブリン酸; エニルウラシル; アムサクリン; ベストラブシル; ビサントレン; エダトレキサート; デフォファミン; デメコルシン; ジアジクオン; エルホルミチン; 酢酸エリプチニウム; エポチロン; エトグルシド; 硝酸ガリウム; ヒドロキシウレア; レンチナン; ロニダイニン; メイタンシンおよびアンサマイトシンなどのメイタンシノイド; ミトグアゾン; ミトキサントロン; モピダンモール; ニトラエリン; ペントスタチン; フェナメット; ピラルビシン; ロソキサントロン; ポドフィリン酸; 2-エチルヒドラジド; プロカルバジン; PSK(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products、Eugene、Oreg.); ラゾキサン; リゾキシン; シゾフラン; スピロゲルマニウム; テヌアゾン酸; トリアジクオン; 2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン; トリコテセン(特にT-2毒素、ベラクリンA、ロリジンAおよびアングイジン); ウレタン; ビンデシン; ダカルバジン; マンノムスチン; ミトブロニトール; ミトラクトール; ピポブロマン; ガシトシン; アラビノシド(「Ara-C」); シクロホスファミド; チオテパ; タキソイド、例えば、タキソール(TAXOL) (登録商標) パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、アブラキサン(ABRAXANE) (登録商標) パクリタキセルのクレモフォール(Cremophor)無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, I11.)、およびタキソテール(TAXOTERE) (登録商標) ドキセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); クロランブシル; GEMZAR(登録商標)ゲムシタビン; 6-チオグアニン; メルカプトプリン; メトトレキサート; シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体; ビンブラスチン; 白金; エトポシド(VP-16); イホスファミド; マイトキサントロン; ビンクリスチン; ナベルビン(NAVELBINE); ビノレルビン; ノバントロン; テニポシド; エダトレキサート; ダウノマイシン; アミノプテリン; ゼローダ; イバンドロナート; イリノテカン(Camptosar、CPT-11) (イリノテカンと5-FUおよびロイコボリンとの処置レジメンを含む); トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000; ジフルオロメチルオルニチン(DMFO); レチノイン酸などのレチノイド; カペシタビン; コンブレタスタチン; ロイコボリン(LV); オキサリプラチン処置レジメン(FOLFOX)を含む、オキサリプラチン; ラパチニブ(タイケルブ(TYKERB)); 細胞増殖を低減するPKC-α、Raf、H-Ras、EGFR (例えば、エルロチニブ(タルセバ(TARCEVA) (登録商標)))およびVEGF-Aの阻害剤ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を挙げることができる。加えて、処置の方法は放射線の使用をさらに含むことができる。
【０１４３】
本明細書において用いられる場合、用語「処置する」、「処置」、「処置すること」または「改善」は、疾患または障害と関連した状態の進行または重症度を逆行させる、軽減する、改善する、阻害する、遅らせるまたは阻止することが目的である、治療的処置を指す。用語「処置すること」は、自己免疫疾患、慢性感染症またはがんなどの、状態、疾患または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を低減することまたは軽減することを含む。処置は一般に、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減されるなら、「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減または停止されるなら、処置は「有効」である。つまり、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置がない場合に予想されるであろう症状の進行または悪化の休止、少なくとも緩徐化も含む。有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、1つもしくは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮減、安定化した(すなわち、悪化していない)疾患状態、疾患の進行の遅延もしくは緩徐化、疾患状態の改善もしくは緩和、および寛解(部分的であるか全体的であるかにかかわらず)が含まれるが、これらに限定されることはない。疾患の「処置」という用語はまた、疾患の症状または副次的作用からの解放の提供(待機的処置を含む)を含む。
【０１４４】
本明細書において用いられる用語「有効量」は、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を軽減するために必要とされる、PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤の量を指し、所望の効果を与えるのに、すなわち、例えばT細胞寛容を阻害するのに十分な薬理学的組成物の量に関する。用語「治療的有効量」はそれゆえ、典型的な対象への投与時に特定の効果をもたらすのに十分である、本明細書において開示される方法を用いてPD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤の量を指す。本明細書において用いられる有効量はまた、疾患の症状の発現を遅延させるのに、疾患の症状の経過を変化させるのに(例えば、限定されることはないが、疾患の症状の進行を遅らせるのに)、または疾患の症状を逆行させるのに十分な量を含む。したがって、正確な「有効量」を指定することは可能ではない。しかしながら、いかなる所与の場合でも、当業者は通常の実験法のみを用いて適切な「有効量」を決定することができる。
【０１４５】
有効量、毒性、および治療効力は、例えば、LD50 (集団の50%に対して致死的な用量)およびED50 (集団の50%において治療的に有効な用量)を決定するための、細胞培養物または実験動物での標準の薬学的手順によって決定することができる。投与量は、採用される剤形および利用される投与経路に依存して変化しうる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これはLD50/ED50比として表すことができる。大きい治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイ法から最初に推定することができる。また、細胞培養においてまたは適切な動物モデルにおいて決定されたような症状の最大半数阻害を達成する、IC50を含む循環血漿濃度範囲(すなわち、PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤の濃度)を達成するようにある用量を動物モデルにおいて製剤化することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、適当なバイオアッセイ法によってモニターすることができる。投与量は、医師が決定し、必要に応じて観察された処置の効果に合わせるよう、調整することができる。
【０１４６】
抗体および他のポリペプチドを含む、本明細書において記述される組成物および方法による有用な剤は、単離された剤であり、これは、その剤が、実質的に純粋であって、天然またはインビボ系においてともに見出されうる他の物質を、その意図した用途に対して実用的かつ適切な程度にまで、本質的に含まないことを意味する。具体的には、剤は、例えば、薬学的調製物の産生で有用であるように、十分に純粋であって、宿主細胞の他の生物学的成分を実質的に含まない。単離された剤は薬学的調製物中で薬学的に許容される担体と混合されうるので、剤は調製物の重量でわずかな割合のみを構成してもよい。
【０１４７】
PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための本明細書において記述される剤は、対象における有効な処置をもたらす任意の適切な経路により、それを必要とする対象へ投与されうる。本明細書において用いられる場合、「投与すること」および「導入すること」という用語は、互換的に用いられ、所望の効果が生じるよう、炎症部位などの所望の部位におけるポリペプチド剤の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路により、そのようなポリペプチド剤を対象へ配置することを指す。
【０１４８】
いくつかの態様において、PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための本明細書において記述される剤は、剤を全身に送達するかまたは所望の表面もしくは標的へ送達する、注射、注入、点滴注入、および吸入投与を含みうるがこれらに限定されない、任意の投与方法によって対象に投与される。ポリペプチド剤が消化管における不活化から防御されうる範囲で、経口投与形態も企図される。「注射」は、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内への注射および注入を含む。好ましい態様において、本明細書において記述される方法において用いるための、PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤は、静脈内への注入または注射により投与される。
【０１４９】
本明細書において用いられる「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、腸内投与および局所投与以外の投与方法、通常、注射による投与方法を指す。本明細書において用いられる「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」という語句は、腫瘍部位などの標的部位、標的組織、または標的臓器への直接投与以外の、剤が対象の循環系に入り、したがって、全身代謝などの過程を受けるような、PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤の投与を指す。
【０１５０】
本明細書において記述される方法の臨床用途のため、PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤の投与は、非経口投与、例えば、静脈内投与; 粘膜投与、例えば、鼻腔内投与; 眼投与、または他の投与方法のための薬学的組成物または薬学的製剤への製剤化を含みうる。いくつかの態様において、本明細書において記述されるPD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤は、対象における有効な処置をもたらす任意の薬学的に許容される担体化合物、材料、または組成物とともに投与されうる。したがって、本明細書において記述される方法で用いるための薬学的製剤は、1種または複数種の薬学的に許容される成分との組み合わせで、本明細書において記述されるPD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤を含有してもよい。
【０１５１】
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益/リスク比に見合う、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適した、化合物、材料、組成物、および/または剤形を指す。本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という語句は、PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤の安定性、可溶性、または活性の維持に関与する、液体または固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、媒質、封入材料、製造支援物質(例えば、滑沢剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸)、または溶媒を封入する材料などの、薬学的に許容される材料、組成物または媒体を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、患者にとって有害ではない、という意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として働きうる材料のいくつかの例としては、(1) ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類; (2) トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン; (3) セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロース; (4) 粉末トラガカント; (5) 麦芽; (6) ゼラチン; (7) カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤; (8) 落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油などの油; (9) プロピレングリコールなどのグリコール; (10) グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール(PEG)などのポリオール; (11) オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル; (12) 寒天; (13) 水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤; (14) アルギン酸; (15) 発熱物質を含まない水; (16) 等張食塩水; (17) リンゲル液; (19) pH緩衝化溶液; (20) ポリエステル、ポリカーボネートおよび/またはポリ無水物; (21) ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤(22) 血清アルブミン、HDLおよびLDLなどの血清成分; (23) エタノールなどのC2〜C12アルコール; ならびに(24) 薬学的製剤中で採用される他の無毒性の適合物質が挙げられる。放出剤、コーティング剤、保存料、および抗酸化物質も、製剤中に存在しうる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などのような用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【０１５２】
本明細書において記述されるPD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤は、以下に対して適合させたものを含めて、固体、液体またはゲルの形態での対象への化合物の投与のために特別に製剤化されうる: (1) 非経口投与、例えば、滅菌溶液もしくは滅菌懸濁液、または徐放性製剤として皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射または硬膜外注射による; (2) 局所適用、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、または放出制御性パッチもしくはスプレイとして; (3) 膣内もしくは直腸内に、例えば、腟坐薬、クリームもしくは気泡として; (4) 眼に; (5) 経皮に; (6) 経粘膜に; あるいは(79) 経鼻に。さらに、二重特異性または多重特異性ポリペプチド剤は、患者へ移植されても、または薬物送達系を用いて注射されてもよい。例えば、Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. 「Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals」 (Plenum Press, New York, 1981); 米国特許第3,773,919号; および米国特許第35 3,270,960号を参照されたい。
【０１５３】
本明細書において記述される方法において用いることができるPD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤の投与の方法および製剤のさらなる態様を以下に例証する。
【０１５４】
非経口剤形
PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤の非経口剤形はまた、皮下、静脈内(ボーラス注射を含む)、筋肉内、および動脈内を含むが、これらに限定されない、さまざまな経路によって対象に投与することができる。非経口剤形の投与では、典型的には、汚染物質に対する患者の自然防御が回避されるので、非経口剤形は好ましくは、無菌であり、または患者への投与の前に滅菌可能である。非経口剤形の例としては、すぐに注射することができる溶液、注射用の薬学的に許容される媒体にすぐに溶解または懸濁することができる乾燥品、すぐに注射できる懸濁液、放出制御性の非経口剤形、および乳濁液が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１５５】
開示の非経口剤形を提供するために用いられうる適当な媒体は、当業者には周知である。例としては、非限定的に、滅菌水; 注射用水USP; 生理食塩溶液; グルコース溶液; 限定されることはないが、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸加リンゲル注射液などの、水性媒体; 限定されることはないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの、水混和性媒体; ならびに限定されることはないが、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなどの、非水性媒体が挙げられる。
【０１５６】
エアロゾル製剤
PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤は、加圧エアロゾル容器中に、適当な高圧ガス、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンなどの炭化水素の高圧ガスと通常の補助剤とともに充填することができる。PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤は、噴霧器または霧吹きのような加圧されない形態で投与することもできる。PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤は、乾燥粉末の形態で、例えば、吸入具の使用により、気道に直接投与することもできる。
【０１５７】
適当な粉末組成物には、例として、ラクトース、または気管支内投与に許容される他の不活性の粉末と十分に混合されたPD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤の粉末状調製物が含まれる。粉末組成物はエアロゾルディスペンサを介して投与されてもよく、または破壊性のカプセル中に封入し、カプセルに穴を開けて吸入に適する定常流体として粉末を噴出する装置内に対象が挿入できるようにしたものであってもよい。組成物は、高圧ガス、界面活性剤、および共溶媒を含んでもよく、適当な計量弁で封鎖した従来のエアロゾル容器へ充填されてもよい。
【０１５８】
気道への送達のためのエアロゾルは、当技術分野において公知である。例えば、Adjei, A. and Garren, J. Pharm. Res., 1: 565-569 (1990); Zanen, P. and Lamm, J.-W. J. Int. J. Pharm., 114: 111-115 (1995); Gonda, I. 「Aerosols for delivery of therapeutic an diagnostic agents to the respiratory tract」, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6中:273-313 (1990); Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989))、ペプチドおよびタンパク質の全身送達の可能性も有する(Patton and Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8: 179-196 (1992)); Timsina et. al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995); およびTansey, I. P., Spray Technol. Market, 4:26-29 (1994); French, D. L., Edwards, D. A. and Niven, R. W., Aerosol Sci., 27: 769-783 (1996); Visser, J., Powder Technology 58: 1-10 (1989)); Rudt, S. and R. H. Muller, J. Controlled Release, 22: 263-272 (1992); Tabata, Y, and Y. Ikada, Biomed. Mater. Res., 22: 837-858 (1988); Wall, D. A., Drug Delivery, 2: 10 1-20 1995); Patton, J. and Platz, R., Adv. Drug Del. Rev., 8: 179-196 (1992); Bryon, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5: 107-132 (1990); Patton, J. S., et al., Controlled Release, 28: 15 79-85 (1994); Damms, B. and Bains, W., Nature Biotechnology (1996); Niven, R. W., et al., Pharm. Res., 12(9); 1343-1349 (1995); およびKobayashi, S., et al., Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996)を参照されたく、これらの全ての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１５９】
水はいくつかの化合物の分解を助長しうるため、本明細書において記述されるPD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤の製剤は、開示された化合物を活性成分として含む、無水の薬学的組成物および剤形をさらに包含する。例えば、水(例えば、5%)の添加は、貯蔵寿命または経時的な製剤の安定性のような特徴を決定するための、長期保管をシミュレーションする手段として、薬学分野において広く認められている。例えば、Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 379-80 (2nd ed., Marcel Dekker, NY, N.Y.: 1995)を参照されたい。本開示の無水の薬学的組成物および剤形は、無水の成分または低水分含有成分、および低水分または低湿度の条件を用いて調製されうる。ラクトースおよび一級アミンまたは二級アミンを含む少なくとも1種の活性成分を含む薬学的組成物および剤形は、製造、パッケージング、および/または貯蔵の間の水分および/または湿気との実質的な接触が予想される場合、好ましくは、無水である。無水の組成物は、好ましくは、適当な製剤キットに含まれうるよう、水への曝露を防止することが既知の材料を用いてパッケージングされる。適当なパッケージングの例としては、密閉ホイル、プラスチック、乾燥剤を含むまたは含まない単位用量容器(例えば、バイアル)、ブリスタパック、およびストリップパックが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１６０】
放出制御性剤形および徐放性剤形
本明細書において記述される方法のいくつかの態様において、PD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤は、放出制御手段または徐放手段により対象へ投与することができる。理想的には、医学的処置における最適にデザインされた放出制御性調製物の使用は、最小限の薬物物質が、最少限の時間で、状態の対処または制御のために利用されることを特徴とする。放出制御性製剤の利点には、以下のものが含まれる: 1) 薬物の活性の拡張; 2) 投薬頻度の低減; 3) 患者コンプライアンスの増加; 4) より少ない全薬物の使用; 5) 局所または全身の副作用の低減; 6) 薬物蓄積の最小化; 7) 血中レベル変動の低減; 8) 処置の効力の改善; 9) 薬物活性の増強または損失の低減; および10) 疾患または状態の制御速度の改善(Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000))。放出制御性製剤は、式(I)の化合物の作用の開始、作用の継続時間、治療ウィンドウ内の血漿レベル、およびピーク血中レベルを制御するために用いることができる。特に、放出制御性または長期放出性の剤形または製剤は、薬物の過小投薬(すなわち、最小治療レベル未満)からも、薬物の毒性レベルを超えることからも起こる可能性のある有害効果および安全性懸念を最小化しつつ、式(I)の化合物の最大の有効性が達成されることを確実にするために用いることができる。
【０１６１】
種々の公知の放出制御性または長期放出性の剤形、製剤、および装置は、本明細書において記述されるPD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤とともに用いるために適合されうる。例としては、各々、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第3,845,770号; 同第3,916,899号; 同第3,536,809号; 同第3,598,123号; 同第4,008,719号; 同第5674,533号; 同第5,059,595号; 同第5,591,767号; 同第5,120,548号; 同第5,073,543号; 同第5,639,476号; 同第5,354,556号; 同第5,733,566号; および同第6,365,185 B1号に記述されたものが挙げられるが、これらに限定されることはない。これらの剤形は、変動する割合で、所望の放出プロファイルを提供するため、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他の重合体マトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧系(例えば、OROS(登録商標) (Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA))、多層コーティング、微粒子、リポソームもしくはマイクロスフェア、またはそれらの組み合わせを用いて、1種または複数種の活性成分の徐放または放出制御を提供するために用いることができる。さらに、開示された化合物の固定化され、吸着された塩型を調製し、かくして、薬物の制御送達をもたらすために、イオン交換材料が用いられてもよい。具体的な陰イオン交換体の例としては、Duolite(登録商標) A568およびDuolite(登録商標) AP143 (Rohm&Haas, Spring House, Pa. USA)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１６２】
いくつかの態様において、本明細書において記述される方法で用いるためのPD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤は、徐放によってまたはパルスで対象へ投与される。パルス治療は、経時的な同一量の組成物の不連続投与の型ではなく、低減された頻度での同一用量の組成物の投与、または低減された用量の投与を含む。障害が対象に継続的に存在する時、例えば、対象がウイルス感染の継続的または慢性的な症状を有する場合、徐放またはパルス投与が特に好ましい。各パルス用量を低減させることができるので、処置の過程を通して患者へ投与されるPD1、LAP、および/またはCEACAM1を阻害するための剤の総量が最小化される。
【０１６３】
パルス間の間隔は、必要な場合、当業者によって決定されうる。しばしば、パルス間の間隔は、組成物または組成物の活性成分が、次のパルスの送達前に対象においてもはや検出可能でない時、組成物をもう一回投与することにより計算されうる。間隔は、組成物のインビボ半減期からも計算されうる。間隔は、インビボ半減期より長く、または組成物半減期より2倍、3倍、4倍、5倍、さらには10倍長いとして計算されうる。注入またはその他の型の送達により組成物を患者へパルス投与するためのさまざまな方法および装置は、米国特許第4,747,825号; 同第4,723,958号; 同第4,948,592号; 同第4,965,251号および同第5,403,590号に開示されている。
【０１６４】
本発明は、本明細書において記述される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって、変動しうることが理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様のみを記述するためのものに過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【０１６５】
本明細書においておよび特許請求の範囲において用いられる場合、単数形は、文脈上明らかに別の意味を示していると判断されない限り、複数の指示対象を含み、その逆もまた同様である。「または」という用語は、例えば「どちらか」によって修飾されなければ、包括的である。作業実施例を除き、または他に示された場合、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表す用語は全て、いかなる場合でも「約」という用語によって修飾されるものと理解されるべきである。
【０１６６】
特定された全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関して用いられうるそのような刊行物に記述された方法論を記述および開示する目的のため、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。この点に関して、先願発明のため、またはその他の理由のため、本発明者らがそのような開示に先行している資格を有しないことの承認として解釈されるべきものは存在しない。これらの文書の日付に関する記述または内容に関する表示は全て、出願人にとって入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関する承認を構成するものではない。
【０１６７】
本明細書において他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する技術分野の当業者にとって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。任意の公知の方法、装置、および材料が本発明の実施または試験において使用されうるが、この関連で本方法、装置、および材料が本明細書において記述される。
【０１６８】
本明細書において記載される技術のいくつかの態様は以下の番号付き項目のいずれかに従って定義される；
１.  対象において免疫応答を増強するためのまたはT細胞寛容を低下させるための組成物であって、CEACAM1阻害剤; PD1阻害剤; およびLAP阻害剤からなる群より選択される少なくとも2つの剤を含む、該組成物。
２.  2つの剤がCEACAM1阻害剤およびPD1阻害剤である、項目1記載の組成物。
３.  2つの剤がCEACAM1阻害剤およびLAP阻害剤である、項目1記載の組成物。
４.  2つの剤がPD1阻害剤およびLAP阻害剤である、項目1記載の組成物。
５.  CEACAM1阻害剤、PD1阻害剤、およびLAP阻害剤を含む、項目1記載の組成物。
６.  CEACAM1阻害剤である第1部分およびPD1阻害剤である第2部分を含む二重特異性剤を含む、項目1〜5のいずれか一項記載の組成物。
７.  CEACAM1阻害剤である第1部分およびLAP阻害剤である第2部分を含む二重特異性剤を含む、項目1〜5のいずれか一項記載の組成物。
８.  LAP阻害剤である第1部分およびPD1阻害剤である第2部分を含む二重特異性剤を含む、項目1〜5のいずれか一項記載の組成物。
９.  阻害剤の1つまたは複数が阻害核酸である、項目1〜8のいずれか一項記載の組成物。
１０.  阻害剤の1つまたは複数が抗体試薬である、項目1〜9のいずれか一項記載の組成物。
１１.  抗体試薬が、CEACAM1; PD1; およびLAPからなる群より選択される標的を結合する、項目10記載の組成物。
１２.  抗体試薬が、標的によって媒介されるシグナル伝達を阻害する、項目11記載の組成物。
１３.  CEACAM1阻害剤が、SEQ ID NO:32に記載の配列を有するCEACAM1分子、またはSEQ ID NO:32の対立遺伝子変種もしくはスプライス変種を結合する、項目1〜12のいずれか一項記載の組成物。
１４.  CEACAM1阻害剤が、CEACAM1リガンド相互作用部位を結合する、項目1〜13のいずれか一項記載の組成物。
１５.  CEACAM1阻害剤が、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基番号1〜429のいずれかに対応するアミノ酸残基に結合する、項目14記載の組成物。
１６.  CEACAM1阻害剤が、CEACAM1の細胞外ドメインを結合する、項目1〜15のいずれか一項記載の組成物。
１７.  CEACAM1阻害剤が、CEACAM1のホモフィリックな相互作用ドメインを結合し、かつCEACAM1分子のホモフィリックな相互作用を阻害する、項目1〜16のいずれか一項記載の組成物。
１８.  PD1阻害剤が、SEQ ID NO:1に記載の配列を有するPD1分子、またはSEQ ID NO:1の対立遺伝子変種もしくはスプライス変種を結合する、項目1〜17のいずれか一項記載の組成物。
１９.  PD1阻害剤が、PD1リガンド相互作用部位を結合する、項目1〜12および18のいずれか一項記載の組成物。
２０.  PD1阻害剤が、SEQ ID NO:1のアミノ酸残基番号41〜136のいずれかに対応するアミノ酸残基に結合する、項目19記載の組成物。
２１.  LAP阻害剤が、SEQ ID NO:34に記載の配列を有するLAP分子、またはSEQ ID NO:34の対立遺伝子変種もしくはスプライス変種を結合する、項目1〜12のいずれか一項記載の組成物。
２２.  LAP阻害剤が、LAPリガンド相互作用部位を結合する、項目1〜12および21のいずれか一項記載の組成物。
２３.  LAP阻害剤が、SEQ ID NO:33のアミノ酸残基番号218に対応するアミノ酸残基に結合する、項目22記載の組成物。
２４.  慢性疾患を処置するための方法であって、その処置を必要としている対象に、項目1〜23のいずれか一項記載の組成物の有効量を投与する段階を含む、該方法。
２５.  慢性疾患が、がん; 持続感染; および慢性ウイルス感染からなる群より選択される、項目24記載の方法。
【実施例】
【０１６９】
実施例1: 腫瘍浸潤リンパ球はCEACAM1を、T細胞寛容および枯渇に関連する他のアクセサリ分子とともに共発現する
リンパ球上の阻害分子の発現は、がんに対する免疫防御の制限において主要な役割を果たす。これらのタイプの分子の阻害は、腫瘍の根絶に関連して自然がん防御を可能にすることがますます示されている。TIM3、CTLA4、LAP、PD1および最近になってCEACAM1のような分子は、腫瘍浸潤リンパ球上で増加することや、場合によっては、予後不良に関連することが実証されている。今度は、これらの経路の遮断が、少なくとも、CTLA4およびPD1を用いた研究に関して、マウスモデルでのおよび最近になってヒトでのがん応答の増大に関連することが実証されている。しかしながら、個別にこれらの経路を遮断することは、ヒトにおいての利益がごくわずかしかないことに関連している。
【０１７０】
本明細書において実証されるのは、結腸がんモデルにおいて腫瘍浸潤リンパ球上でCEACAM1およびPD1ならびにCEACAM1およびLAPがともに上方制御されること(これまでに報告されていない所見)である。したがって、CEACAM1およびPD1またはCEACAM1およびLAPの両方をともに遮断することは、いずれか一方だけよりも効果的である。
【０１７１】
本明細書において記述されるのは、CEACAM1およびPD1陽性(二重陽性) T細胞が、生理学的環境下のリンパ球で観察されるものと比べて腫瘍浸潤リンパ球において増すことや、インビボにおいてT細胞上でCEACAM1およびLAP発現間の関連性が増すことを示唆している結果である。CEACAM1、PD1、および/またはLAPの2つまたはそれ以上をインビボでともに阻害することは、単因子だけの阻害よりも優れた治療的手法である。
【０１７２】
野生型マウスでのAOM-DSSモデルを用いて、PD-1、TIM-3、LAPおよびCEACAM1のような細胞表面分子の組み合わせによる寛容に関連した表現型の発現について調べた(例えばDe Robertis et al. J Carcinog 2011 10:9を参照のこと; これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。手短に言えば、1用量のアゾキシメタン(AOM)は、継続用量の炎症剤デキストラン硫酸ナトリウム(DSS) (図1)とともに、結腸直腸がんの発症を増大させ、したがって、結腸直腸がん細胞の近くの関連した腫瘍浸潤リンパ球のT細胞寛容を増大させる。
【０１７３】
AOM-DSSプロトコル44日目時点のこれらのマウスから得られたT細胞の亜集団をFACS分析に供した。腫瘍浸潤リンパ球、腫瘍上皮内リンパ球、隣接する腫瘍浸潤リンパ球、隣接する腫瘍上皮内リンパ球、および腸間膜リンパ節由来の細胞をCD4、CD8、PD1、CEACAM1、およびTIM3の細胞表面発現について調べた(図2〜4)。これらの分析の結果は図5A〜5Bに要約されており、腫瘍浸潤リンパ球、隣接する腫瘍浸潤リンパ球および隣接する腫瘍上皮内リンパ球がかなりのCEACAM1+PD1+細胞の亜集団を含有することを実証している。
【０１７４】
図5A〜5Bは、CEACAM1およびPD1が慢性的に活性化されたCD4+ (図5A)およびCD8+ (図5B)腫瘍浸潤Tリンパ球の細胞表面に共発現されることを実証しているグラフを描く。
【０１７５】
実施例2: CEACAM1発現を有するTリンパ球は、T細胞寛容および調節性の表現型に関連したアクセサリ分子の共発現によって特徴付けられる
CEACAM1は、循環性および組織常在性CD4+ T細胞の特異的サブセットに選択的に発現される。血液(データは示されていない)中および腸間膜リンパ節(MLN)中に生理学的条件の下で検出された小サブセットのCEACAM1+ T細胞により発現されるアクセサリ分子を定義することに焦点を置いた(図6A参照)が、それらはWTマウスのPPおよびLPにおいて頻度が増していた(図9Aおよび9B)。血液、MLN、PPおよびLP由来のCD4+CEACAM1+ T細胞は、CD4+CEACAM1- T細胞が発現するよりも高用量のCD44およびCD62Lの両方を発現することが認められた(図6Aならびに9Aおよび9B)。これは、CEACAM1がエフェクタおよび/またはセントラル記憶T細胞に関連していることと一致する(Boulton et al., 2002)。さらに、これらの組織コンパートメントの各々由来のCD4+CEACAM1+ T細胞は、そのCD4+CEACAM1-対応物よりも多くのα4β7-インテグリンを発現することが示され、T細胞上のCEACAM1発現は、末梢免疫系内でのものでさえ、腸組織に帰巣する可能性の増強に関連しうることが示唆された。興味深いことに、IgAの産生における調節能または補助能を保有しているT細胞サブセットと、これまでにどれもが関連付けられているPD1、LAP (TGFβ潜伏関連ペプチド)およびB220の選択的発現とCEACAM1の陽性が関連していることも示された(Fagarasan et al., 2001; Good-Jacobson et al., 2010; Ochi et al., 2006; Oida et al., 2003)。
【０１７６】
これらの所見は、特定された分子が濃縮されていることが知られている特異的な細胞サブセットの調査につながった。詳細には、本明細書において記述されるデータから、CEACAM1の発現が未処置WT動物由来のCD4+ T細胞上の表面LAPと強く共分離していることが示された(図6Aならびに図9Aおよび9B)ので、CD4+CD25-LAP+ T細胞、つまり全身で機能しているが腸組織において濃縮され、かつTGF-β依存的な調節機能をもたらし、潜在的には、分泌型IgA免疫を支持するTregのサブセットについて注意深く調べた(Niemir et al., 1995; Ochi et al., 2006; Oida et al., 2003)。MLN内の平均で43.6±10.9%のCD4+CD25-LAP+ T細胞がCEACAM1を共発現したが、WTマウスでは定常状態条件の下、わずか2.07±0.8%のCD4+CD25- LAP-細胞が同様にCEACAM1+であった(図6B)。これは、MLN由来のCD4+Foxp3+およびCD4+Foxp3- Treg細胞にて類似した低レベルのCEACAM1が認められた別の調節性T細胞サブセットにおけるCEACAM1発現とは全く対照的であった(図6B)。下記のリアルタイムPCRアッセイ法を用い、WTマウスのプールされた脾臓およびMLNからフローサイトメトリーにより選別されたCD4+CEACAM1-LAP-、CD4+CEACAM1+LAP-、またはCD4+CEACAM1+LAP+細胞におけるCEACAM1-LおよびCEACAM1-Sアイソフォームの相対発現レベルについて調べた(図8)。末梢CD4+ T細胞の全集団での所見と一致して、L:Sアイソフォーム比はCD4+CEACAM1+LAP-細胞において2.78 ± 0.07であり、このT細胞群におけるLアイソフォームの優位性を示唆していた(図6C)。対照的に、CD4+CEACAM1+LAP+細胞においてL:S比は1.16±0.27 (P<0.05)まで低下し、この調節性細胞サブセットにおけるCEACAM1-Sアイソフォームの濃縮を示唆していた(図6C)。脾臓およびLNから単離されたCD4+CEACAM1+CD25-細胞(1.52±0.29)とCD4+CEACAM1+CD25+細胞(1.52±0.11)との間のL:S比には差異が認められなかった(データは示されていない)。LおよびSアイソフォームの相対発現は、CD4+CEACAM1+CD25-およびCD4+CEACAM1+CD25+の調節性T細胞間で違わず、両集団においてはLアイソフォームが優位を占めている。L:S比はCD4+CEACAM1+CD25-細胞の場合1.52およびCD4+CEACAM1+CD25+細胞の場合1.52であった。プールされた脾臓およびMLNからフローサイトメトリー選別によって、細胞を分離した。これらのデータから、CEACAM1およびLAPの発現間の密接なつながりの存在が実証される。
【０１７７】
実施例3: CEACAM1-長鎖およびCEACAM1-短鎖アイソフォームは、抗CD3刺激がもたらす寛容原性シグナルによって調節される
がん胎児性抗原ファミリーのメンバーである、がん胎児性抗原細胞接着分子1 (CEACAM1)は、いくつかの細胞表面受容体によるシグナル伝達に影響を与える細胞間の結合相互作用に関与している。CEACAM1は、B細胞、多形核白血球、単球、および樹状細胞のような内皮由来、上皮由来および造血由来のものを含む種々の細胞種によって構成的に発現される。さらに、CEACAM1は、循環血中のナチュラルキラー(NK)細胞およびT細胞において最小レベルで発現されるが、しかし種々の異なる活性化形態にしたがってこれらの細胞種において上方制御される(Azuz-Lieberman et al., 2005; Boulton et al., 2002; Coutelier et al., 1994; Nakajima et al., 2002; Singer et al., 2002)。細胞表面で、CEACAM1は、発現されたCEACAM1アイソフォームによって決定付けられる多数のシグナル伝達受容体の機能と関係し、それを改変しうる。個々のCEACAM1アイソフォームは、選択的スプライシングにより作出され、ホモフィリックな結合において機能する特徴的な膜遠位の、IgV様ドメイン(N-ドメイン)を保有するが、膜近位の細胞外IgC2様ドメインの数およびその細胞質(cyt)尾部の長さに関して異なる膜貫通タンパク質からなる(Gray-Owen et al., 2006)。具体的には、11種のヒトおよび4種のマウスCEACAM1スプライス変種は、ほとんど知られていない短い(S) cyt尾部または免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ(ITIM)を含んだ長い(L) cyt尾部のいずれかをコードする。後者の場合には、そのcyt尾部内のITIMモチーフの存在と一致して、マウスおよびヒトのCEACAM1-Lアイソフォームが多くの異なるシグナル伝達受容体の阻害に関連付けられている(Chen et al., 2001; Chen et al., 2008; Kammerer et al., 1998; Pan et al., 2010)。各例において、CEACAM1-Lアイソフォームの阻害機能は、受容体チロシンキナーゼまたはSrc関連キナーゼによるITIMチロシン残基のリン酸化により誘発され、Srcホモロジー2 (SH2)ドメインを含んだタンパク質-チロシンホスファターゼ(SHP)-1または-2の動員をもたらす(Huber et al., 1999; Nagaishi et al., 2006)。したがって、CEACAM1-Lを介したこれらのホスファターゼの動員は、B細胞受容体、上皮成長因子受容体およびT細胞受容体(TCR)/CD3複合体のような種々の細胞表面受容体に関連した、活性化モチーフ内に含まれる重要なチロシンの脱リン酸化を引き起こす(Abou-Rjaily et al., 2004; Boulton et al., 2002; Chen et al., 2008; Lobo et al., 2009)。このように、CEACAM1-Lアイソフォームは、機能的に阻害性であり、NK細胞、B細胞およびT細胞を含むマウスおよびヒトリンパ球において記述されている主要なアイソフォームである。
【０１７８】
CEACAM1-LおよびCEACAM1-Sアイソフォームは、異なる細胞種においてさまざまな比率で発現され、このような発現はサイトカイン(例えばインターフェロン-γ)、転写因子(例えばIRF-1)およびスプライシング調節因子(例えば異種核リボヌクレオタンパク質ファミリーのメンバー)の影響下にあることを示す最近の証拠がある(Chen et al., 1996; Dery et al. 2011; Gencheva et al., 2010)。直接的に実証されているわけではないが、これはTリンパ球の場合で同様であるものと考えられる。マウスおよびヒトT細胞はCEACAM1-Lアイソフォームを主に発現するが、CEACAM1-Sアイソフォームが発現されうるという証拠があることが示されている(Donda et al., 2000; Singer et al., 2002)。T細胞におけるインビトロでのトランスフェクション試験から、CEACAM1-Sアイソフォームが共発現時にTCR/CD3複合体シグナル伝達との関連でCEACAM1-Lアイソフォームがもたらす阻害シグナルまたは新規のシグナルを改善できる弱い共刺激機能を保有しうることを考えれば、CEACAM1は「調節可能な」受容体系であることが示唆される(Chen et al., 2004a; Chen et al., 2008; Lee et al., 2008)。しかしながら、インビボでのT細胞におけるCEACAM1アイソフォームの調節およびこれが与えうる生理学的機能に関して利用可能な情報はない。
【０１７９】
マウスCEACAM1-SおよびCEACAM1-L変種を定量化するための新規のPCR法を樹立することにより、腸内のT細胞は、脾臓のような末梢組織と比べて、全体的なCEACAM1発現の増大を示すだけでなく、CEACAM1-Lアイソフォームと比べてCEACAM1-Sの相対的過多を一意的に有することが分かった。さらに、この環境において、CEACAM1-Sアイソフォームは、CEACAM1-Lアイソフォームとは無関係にT細胞活性化を細胞レベルで増強する特殊な生理学的機能を有し、T細胞調節および分泌免疫誘導を含む共通の粘膜免疫機能を果たす細胞において選択的に発現されることが本明細書において示される。具体的には、CEACAM1-Sは、CD4+LAP+ T調節性(Treg)細胞(図7A〜7D)、CD4+PD1+CXCR5+濾胞性ヘルパーT細胞(TFH) (図13A〜13C)の誘導、およびパイエル板(PP)内でのIgA拘束性B細胞の発生を促進する個別のシグナル伝達単位として作用することが本明細書において実証される(データは示されていない)。これと一致して、T細胞に関連したCEACAM1-Sアイソフォームは、片利共生微生物叢の組成とリステリア菌のような病原体への曝露に対する宿主防御の両方に影響を与える粘膜IgA分泌の増強をもたらす(データは示されていない)。CEACAM1発現の非存在下においては、IgAのこれらの障壁防御機能が弱められる。合わせて、これらの研究は、CEACAM1アイソフォーム調節および機能の組織特異的な証拠を提供する。
【０１８０】
現在利用可能な抗体は、これら2種の一般的クラスのCEACAM1を定量的な形で認識することができないので、マウスCEACAM1-Lおよび-S変種の発現を分析するための新規の、定量的アッセイ法を最初に樹立することにより、CEACAM1アイソフォームの相対発現を評価した。これらをマウスT細胞において特異的に定量化するために、2組のリアルタイムPCRプライマーをデザインした。マウス(m) CEACAM1-4L (4L)およびCEACAM1-4S (4S)プラスミドを用いて、これらのプライマーの特異性および効率性を検証した(図8)。脾臓およびリンパ節(LN)から単離されたマウス初代CD3+ T細胞の定量的(q)PCR分析から、CEACAM1-Lアイソフォームは休止末梢T細胞において、既述のように抗CD3刺激によって発現が増大し、優位を占めたことが実証された(Boulton et al., 2002; Nakajima et al., 2002) (データは示されていない)。さらに、CEACAM1-Sアイソフォームが検出されたとはいえ、過去の研究(Singer et al., 2002)と一致して、CEACAM1-Lが末梢T細胞において優位を占め、CEACAM1-L:CEACAM1-S (L:S)比は1.95±0.34であった。脾臓T細胞でこのqPCRアッセイ法を検証してから、いくつかの異なる組織より単離された初代T細胞におけるCEACAM1アイソフォームの発現の広範な調査を行った。CEACAM1発現が低く、CEACAM1-Sアイソフォームと比べてCEACAM1-Lアイソフォームが優位を占めていた、脾臓またはMLNから単離されたCD3+ T細胞とは異なり、十二指腸、空腸、回腸または結腸およびパイエル板(PP)の腸LP由来のCD3+ T細胞は、全体的に増加したレベルのCEACAM1転写産物を発現し、CEACAM1-Lアイソフォームと比べてCEACAM1-Sアイソフォームの量が有意に高いと認められることが示された。かくして、1.0未満の平均L:S比(PP: 0.53±0.08; 小腸: 0.36±0.11; および結腸; 0.19±0.04)が認められ、これは末梢T細胞とは逆であった(データは示されていない)。したがって、CEACAM1発現の量およびL:S比は腸の軸に沿って頭尾方向へ変化することが示された。具体的には、CEACAM1量およびL:S比は、脾臓、MLNおよび近位腸中の末梢血といっそう類似していた。さらに、CEACAM1のレベルは増大し、L:S比は遠位小腸(回腸)から結腸まで徐々に減少した。結果として、PPおよび結腸のLP T細胞は、試験したその他全てのコンパートメントと比べて最も高いレベルのCEACAM1および最も低いL:S比を含んでいた。これを、CC1 mAbを用いた免疫ブロッティングによって検証し、結腸LPおよびPPから単離されたT細胞が末梢血と比べて高いCEACAM1量、とりわけ、結腸LPにおいて最も顕著であったCEACAM1-Sアイソフォームを発現することをさらに確認した(データは示されていない)。WTマウスの脾臓由来のB細胞のほか、T細胞をWTマウスの脾臓(SP)、PP、結腸固有層(LP)ならびに4S Tgおよび4L Tgマウスの脾臓から精製した。これらの研究はともに、腸T細胞内でのCEACAM1の発現の増大を確認し、CEACAM1-Sアイソフォームが、初代T細胞によって発現されるばかりか、腸T細胞および潜在的に他の組織コンパートメント内での主要なアイソフォームであることを立証するものであるとさらに示唆する。
【０１８１】
脾臓由来のPan T細胞を、プレートに結合されコーティングされたCD3、およびCD3/CD8で2日間、その後に4日間刺激した。CEACAM1-S、-Lおよび全CEACAM1の定量的PCR分析を行った。休止T細胞上では低い、CEACAM1の発現は、TCR/CD3複合体を通じたT細胞のライゲーション(シグナル1)によって転写的に調節されるが、しかしCD28がもたらす古典的な共刺激シグナル(シグナル2)によってTCR/CD3複合体が共会合(co-engage)される場合に負に調節されることが認められた(図11)。これらの研究は、CEACAM1-Sおよび-Lアイソフォームが、寛容原性シグナルによって正に調節されることを示す。
【０１８２】
実施例4: T細胞上でのCEACAM1の強制発現は、LAP (Treg)およびPD-1を共発現する細胞(T濾胞性ヘルパーまたはTFH)の作出を促進する
CEACAM1-Sは、これが選択的に発現されるCD4+ T細胞の拡大および機能を独立的に調節する。WTマウス由来CD4+CD25-LAP+上の選択的なCEACAM1発現の、本明細書において記述される所見は、CEACAM1が、これらの細胞を調節する能力に関する疑問につながり、さらには、この過程におけるCEACAM1-LおよびCEACAM1-Sアイソフォームの相対的寄与を調べることにつながった。T細胞において特異的にCEACAM1を過剰発現するCEACAM1トランスジェニック(Tg)マウスを利用して、粘膜組織におけるCD4+CD25-LAP+ T細胞の頻度を、CEACAM1-4Lまたは-4Sアイソフォームの強制過剰発現の条件下で調べた。これらのデータから、WT対照と比べてCEACAM1-4S (4S Tg)マウス由来のMLN (図7Aおよび7B)での、およびCEACAM1-4SアイソフォームがT細胞によって発現される唯一のアイソフォームである、CEACAM1-/-対照と比較したCEACAM1-/- -4S Tgマウス(図7Cおよび7D)でのCD4+CD25-LAP+ T細胞の割合の有意な増加が実証された。このCD4+CD25-LAP+細胞の増加は、WT動物とCEACAM1-/-動物の両方においてCEACAM1-4Sアイソフォームの過剰発現の条件下で特異的に検出され(図7Aおよび7C)、CEACAM1アイソフォームが過剰発現されたCEACAM1-4Lトランスジェニックマウスにおいては存在しないことが顕著であった(図7Bおよび7D)。全く対照的に、分析から、WTマウスで認められたものと比べてT細胞でのCEACAM1-4Sの強制発現時のCD4+CD25+Foxp3+ T細胞の頻度の差異は明らかにされなかった(データは示されていない)。活性化CEACAM1-Sの濃縮がCD4+CD25-LAP+ T細胞と機能的に関連していたかどうかを突き止めるために、4S Tgマウスの腸間膜リンパ節から得られたCD4+LAP+ T調節性細胞のインビトロでの抑制機能について調べた。これらの細胞は、WT対照由来のCD4+CD25-LAP+ T細胞と比較した場合に増強された調節活性を保有することが分かった(図7E)。対照的に、類似のアッセイ法においてMLNから得られた4S TgとWTのCD4+CD25+ Treg細胞間の調節能には差異が認められなかった(図7E)。まとめると、これらの研究から、CEACAM1-4Sの相対的増加は、阻害性CEACAM1-Lアイソフォームの何らの寄与がなくとも、調節性CD4+CD25-LAP+ T細胞の発生的能力および機能的能力の両方を特異的に増強することが示唆される。
【０１８３】
過去の研究から、CD4+CD25-LAP+ T細胞が定常状態かつ炎症条件の下で腸組織に蓄積することや、経口投与されたCD3特異抗体がMLNにおいてCD4+CD25-LAP+調節性T細胞を誘導することが示されている(Boirivant et al., 2008; Ochi et al., 2006)。この手法は、CEACAM1が生理学的なCEACAM1発現の条件の下でCD4+CD25-LAP+ T細胞発生の誘導期に特異的に関与しているかどうかを判定するために用いられた。抗CD3抗体の経口投与は、CEACAM1-/-マウスではなくWTのMLNにおいてCD4+CD25-LAP+ T細胞の割合を有意に増加させた(図7F)。未処置またはアイソタイプ処置CEACAM1-/-およびWTマウスの脾臓、MLN、PPまたは血液中のCD3+CD25+/-LAP+ Treg細胞の比率には有意差は特定されなかった(データは示されていない)。対照的に、CD3特異抗体の経口投与は、WTまたはCEACAM1-/-マウスのMLNにおけるCD4+Foxp3+ T調節性細胞の割合を変化させることは認められなかった(データは示されていない)。マウスに5日間連続で抗CD3 (5 μg/マウス/日)またはアイソタイプ対照を与え、調節性T細胞の頻度の分析のために7日後に組織を分析した。これらの研究から、粘膜組織中のCD4+CD25-LAP+ T細胞の拡大を調節する際に、およびその抑制機能を促進する際にCEACAM1が果たす生理学的役割が確認される。
【０１８４】
複数の組織コンパートメントにおけるT細胞上のCEACAM1およびPD1の共発現を考慮して、4S Tgマウスの脾臓、MLNおよびPP中の、PD-1を共発現する細胞、またはいわゆるTFH細胞の頻度に及ぼす高レベルのCEACAM1-4Sの影響について調べた。これらの組織の各々のフローサイトメトリー分析から、PD1それ自体の濃縮だけでなく、4S Tgマウスでの、そのWT同腹仔対照と比べてCEACAM1とともにTFH細胞のPD1+CXCR5+集団の濃縮も明らかにされた(図13A〜13B)。重要なことに、CEACAM1-4Sを介したTFH細胞濃縮は、CEACAM1-/- 4S Tgマウスも、そのCEACAM1-/-対応物よりも高いレベルのTFH細胞を含んでいたので、CEACAM1-Lアイソフォームとは無関係に起きた(図13C)。まとめて、これらのデータは、組織化されたリンパ系構造および粘膜組織において濃縮されるだけでなく、免疫寛容およびB細胞スイッチングに関与することも知られているLAP (CD4+CD25+LAP+ T細胞)およびPD1 (TFH細胞)を発現する2種のアクセサリ細胞の発生の促進におけるCEACAM1、およびとりわけ、CEACAM1-Sアイソフォームの役割と一致している(Cerutti, 2008; Good-Jacobson et al.)。
【０１８５】
実施例5: CEACAM1-Sアイソフォームは、活性化誘導性の細胞死に対するT細胞の感受性を増加させる特有の活性化シグナルをもたらし、調節性T細胞集団の発生を促進する
がん胎児性抗原細胞接着分子様I (CEACAM1)は、活性化T細胞上に発現され、阻害機能をもたらす、免疫受容体チロシンに基づく阻害性モチーフを含んだ長い(L)細胞質尾部、またはNFATを介して少なくとも部分的にシグナルを伝達する短い(S)細胞質尾部のいずれかを通じてシグナルを伝達する(データは示されていない)。末梢由来のT細胞に関する過去の研究から、マウスおよびヒトにおいてはCEACAM1-Sアイソフォームがほとんどなく、CEACAM1-Lアイソフォームが優位を占めることが示された。これは、ヒトおよびマウスの両方でCEACAM1-Lアイソフォームと比べてCEACAM1-Sアイソフォームの優位な発現を実証する腸および腸管関連リンパ系組織におけるような組織常在性T細胞における場合ではないことが本明細書において実証される。かくして、初代マウスおよびヒトT細胞は、CEACAM1の両方のアイソフォームを発現する。
【０１８６】
CEACAM1-4Sは、T細胞活性化の誘導において独立したシグナル伝達単位として機能する。T細胞におけるCEACAM1-Lアイソフォームの発現は、src関連キナーゼp56lckによるITIMのリン酸化、ならびにCD3-ζおよびZAP70の脱リン酸化をもたらすSHP1動員後のTCR/CD3複合体機能の、重要な陰性調節をもたらすことが周知であるが(Chen et al., 2008)、一般にまたは特にT細胞におけるCEACAM1-Sの機能についてはほとんど分かっていない。T細胞における過去の結果は、トランスフェクションされたインビトロのモデル系に限られており、CEACAM1-Sスプライス変種に割り当てられた刺激機能および阻害機能の両方で議論の余地があった(Chen et al., 2004a; Chen et al., 2004b)。特異的なCEACAM1-Sスプライス変種のノックアウトマウスを、選択的CEACAM1-L変種を同様に欠失させずに作出することが不可能であることを考えて、インビボでT細胞におけるCEACAM1-Sアイソフォームの機能を探索するためにヒトCD2 (hCD2)プロモーターの下、T細胞において特異的にマウス4Sアイソフォームを過剰発現するCEACAM1-4S (4S)トランスジェニック(Tg)マウスを作出した。T細胞における4Sの過剰発現は、CC1 mAbを用いてフローサイトメトリーにより確認された。これらの結果から、4S TgマウスにおけるT細胞は、脾臓から単離された細胞においてCC1モノクローナル抗体および抗CD3抗体を用いたフローサイトメトリーによって示されるようにさらに高いCEACAM1を均一に発現することが確認された(データは示されていない)。図8に記述のアッセイ法を用いqPCR分析によって測定した場合に4S TgマウスにおけるT細胞上のCEACAM1-Sアイソフォームの過剰発現から、Tgマウスにおけるこのアイソフォームの優位性が確認された(データは示されていない)。
【０１８７】
フローサイトメトリーによって調べた場合、4S Tgマウスは、脾臓、MLN、PPおよび結腸LPにおいて、それぞれエフェクタ記憶かつ潜在的にセントラル記憶T細胞(Seder et al., 2003)と一致して、より低い割合のCD62LhiCD44loナイーブT細胞、およびより高い割合のCD62LloCD44hiまたはCD62LhiCD44hi細胞によって示されるように、いっそう多量の活性化CD4+およびCD8+ T細胞を示した(データは示されていない)。注目すべきは、4S Tgマウスは末梢血、脾臓、MLNおよびPP内のアポトーシスCD3+ T細胞(アネキシンV+7-AAD-CD3+細胞)の数の増大を示し、これはCD3+細胞のレベルの低下と逆相関していた(図12A)。これにもかかわらず、全PPおよびMLN細胞計数は、WTマウスとCEACAM1-4S Tgマウスとの間で非常に類似することが分かり(データは示されていない)、CEACAM1-4Sの過剰発現がT細胞を選択的に枯渇させていたことが示唆された。脾臓、MLNおよびPPから単離されたCD4+ T細胞の細胞内サイトカイン染色からも、WT同腹仔において認められたものと比較して4S TgマウスのT細胞においてIL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γおよびTGF-βが全て増加していることが明らかにされた(データは示されていない)。CEACAM1-Sによるサイトカイン(インターフェロン-γ)の誘導は、高レベルで発現された場合の4Sアイソフォームの広範な活性化機能と一致して全CD4+ T細胞集団(WTまたは4S TgマウスのPPから単離されたCD4+ T細胞)に影響を及ぼした(データは示されていない)。4S Tgマウスの脾臓から単離されたCD3+ T細胞も、WT同腹仔対照由来のT細胞に関連したものと比較してエクスビボでの抗CD3刺激によりいっそう高い増殖速度およびいっそう多くのIFN-γおよびIL-2分泌を示した(データは示されていない)。しかしながら、より長い培養期間で、[3H]-チミジン取り込みによって測定した場合の、脾臓CD3+ T細胞の増殖速度ならびに4S TgマウスからのIFN-γおよびIL-2の産生は、CEACAM1-4Sアイソフォームの存在下における活性化誘導性の細胞死(AICD)の増加によるインビトロでのT細胞崩壊と一致して、刺激後のWT同腹仔で検出されたものよりも低いことが認められた(図12B)。これと一致して、脾臓4S Tg T細胞は、抗CD3刺激3時間後にアネキシンV染色の増加(図12C)およびカスパーゼ3の切断(図12D)を示した。これらの結果は、マウス4Sアイソフォームが初代T細胞を共刺激もし、活性化誘導性の細胞死(AICD)に対するそれらの感受性を増大しもすることを示し、Lアイソフォームの阻害機能とは対照的に活性化機能をこのCEACAM1アイソフォームのものとみなした過去のインビトロでのトランスフェクション試験を支持している(Chen et al., 2004a; Chen et al., 2004b)。さらに、これらの所見は、腸組織中のT細胞にて認められた全CEACAM1発現の増大と一意的に活性化しているCEACAM1-Sアイソフォームの濃縮の両方が、定常状態下の正常腸LPにおいて優位を占めるエフェクタ記憶T細胞表現型(Hurst et al., 1999)および調節性表現型を有するT細胞の選択的拡大に関連しており、分泌IgAの促進に集中しているという考えをさらに支持している。
【０１８８】
T細胞におけるCEACAM1-4Sの活性化機能は、CEACAM1-Lアイソフォーム発現とは無関係に認められる。4S Tgマウスにおいて行われた研究は、内因性CEACAM1発現との関連で始められたので、4Sアイソフォームの見掛け上の活性化機能および阻害機能は、CEACAM1を介したCEACAM1-L阻害機能の中和の結果および/またはCEACAM1-Sによる直接的な活性化シグナルの結果のいずれかである可能性があった。この疑問について調べるため、4S TgマウスをC57BL/6バックグラウンドのCEACAM1-/-マウスと交配させることにより、いずれかの他のCEACAM1アイソフォームの発現を欠いた4S Tgマウス(CEACAM1-/- -4S Tg)を作出した。全ての細胞種で内因性レベルのCEACAM1を含有する4S Tg T細胞において認められたものよりも少なかったが、Ceacam1-1-/- -4S Tgマウスは依然として、CEACAM1-/-同腹子と比較して脾臓、MLN、PPおよび結腸LP (データは示されていない)におけるいっそう低い割合のCD4+(or CD8+) CD62LhiCD44loナイーブT細胞、およびいっそう高い割合のCD4+(またはCD8+) CD62LloCD44hiエフェクタ記憶T細胞によって明らかなように、インビボにおいていっそう活性化されたT細胞を含有していた。CEACAM1-/- -4S Tgマウスはまた、減少したレベルのCD3+細胞と逆相関してMLN、血液およびPP内にいっそう多くのアポトーシスの、アネキシン+ CD3+ T細胞を示した(図12E) (データは示されていない)。CEACAM1-/- -4S Tgマウスの脾臓から単離されたCD4+ T細胞はまた、抗CD3刺激によっていっそう活発に増殖し、いっそう多くのIL-2およびIFN-γを分泌した。顕著には、CEACAM1-/-マウス由来の脾臓CD4+ T細胞は、抗CD3刺激によって活性化の増大を示し、これはWTおよびCEACAM1-/- -4S Tg T細胞で認められた抗CD3誘導性の刺激の中間であった(データは示されていない)。他方、これまでに樹立された4L Tgマウス(Nagaishi et al., 2006)をCEACAM1-/-マウスと交配させることによって作出された、CEACAM1-4L (4L)アイソフォームだけがT細胞によって発現されたマウス由来の脾臓T細胞は、抗CD3刺激に対して鈍化した応答を示し、これはWT T細胞で認められたものよりも低く、このアイソフォームの直接的な阻害機能と一致している。まとめて、これらの研究から、CEACAM1-/- -4S Tg T細胞において認められたように、CEACAM1-/-マウスにおける優性な内因性CEACAM1-L阻害機能の喪失またはCEACAM1-Lアイソフォームとは無関係にCEACAM1-S発現の獲得は、増強されたTCR/CD3複合体シグナル伝達および後者の場合は活性化誘導性の細胞死に対する増感をもたらすことが示される。比較して、CEACAM1-Sアイソフォームとは無関係にCEACAM1-Lアイソフォームの獲得は、T細胞機能の阻害に直接的につながる。かくして、CEACAM1-SおよびCEACAM1-Lは、T細胞での独立した活性化かつ阻害性シグナル伝達単位として機能することが可能であり、それらは最終的にはともに免疫寛容と関連している。
【０１８９】
CEACAM1-Sの場合には、この活性化機能は、CD4+CEACAM1+LAP+ T細胞のような調節機能およびかくして阻害機能を有するT細胞の促進および活性化誘導性の細胞死に対する増感をもたらすので、免疫応答の調節に最終的に関連している。対照的に、CEACAM1-Lアイソフォームは、阻害シグナルをT細胞に直接送達する。
【０１９０】
考察
本明細書において記述されるのは、組織および細胞種特異的なCEACAM1発現、CEACAM1と、TIM3、PD-1およびLAPのような免疫寛容に関連している特定種の細胞表面分子との結び付きと同様に、免疫調節および体液性免疫に関連した特定のT細胞サブセットおよび腸常在性T細胞におけるCEACAM1-Sアイソフォームの特有の優位性およびCEACAM1-Sアイソフォームが果たす重要な役割を実証するT細胞におけるCEACAM1スプライシングの調節の証拠である。CEACAM1はT細胞上の活性化誘導性の分子であるが、認められた組織特異的スプライシングは、T細胞それ自体の活性化によるものではなかった。というのは、T細胞をエクスビボで刺激した場合にはこれを認めなかったからである。養子免疫伝達実験から、CEACAM1-Sの優位性は、腸への進入時にナイーブ末梢T細胞により得られ、粘膜T細胞が腸から除去され、エクスビボで再刺激される場合に失われることが実証された。これは、特異的な腸粘膜環境がT細胞におけるCEACAM1-Sの発現を促進することを示唆している。さらに、4S Tgマウスにおける結果から、CEACAM1-SがT細胞活性化、活性化誘導性の細胞死に対する増感ならびに調節機能を有する細胞および分泌IgA免疫の誘導を促進することが示唆される。これと一致して、粘膜組織に特徴的な記憶表現型を持つT細胞サブセット(Gibbons et al., 2011)ならびに調節機能を保有し、分泌免疫を助長するCD4+CD25-LAP+およびTFH細胞のような特定のT細胞サブセットは、CEACAM1-S発現によって濃縮を呈し、その存在によって推進される。かくして、CEACAM1-S発現は、粘膜環境により促進かつ維持され、粘膜調節、寛容および保護に関与する細胞種の作出に関連したT細胞活性化を促進する。
【０１９１】
重要なことに、本明細書において記述される研究は、これまで考えられたように(Gray-Owen et al., 2006)、CEACAM1-Sが初代T細胞において微量のアイソフォームではないことも実証する。T細胞でのCEACAM1の条件的発現を有するトランスジェニックマウスにおいて、CEACAM1-Sは、活性化誘導性の細胞死およびエフェクタ記憶表現型の両方を促進する特有の共刺激シグナルをもたらすのに対し、CEACAM1-LはTCR/CD3複合体シグナル伝達に対して直接的に共阻害性である(Nagaishi et al., 2006)ことが分かった。さらに、T細胞におけるCEACAM1-Sはこの刺激を、インビボでCEACAM1-Lの補助なしに独立したシグナル伝達単位として誘発しうることが今回示される。これらの特性を通じて、CEACAM1-Sは特定のT細胞サブセットを調節する。これらの細胞集団には、それぞれ粘膜組織および組織化されたリンパ系構造の不可欠な構成要素であり、かつ免疫寛容および分泌免疫を調節することが知られているCD4+LAP+ T細胞およびTFH細胞が含まれる(Linterman et al., 2011)。腫瘍浸潤リンパ球間でのそのような細胞表面分子、例えばPD1、TIM3およびLAPとともにCEACAM1、ならびにこれらの細胞表面分子に関連した細胞種(例えばCD4+CEACAM1+LAP+またはCD4+CEACAM+PD1+T細胞)の蓄積は、蓄積された調節性T細胞の作用を通じてエフェクタT細胞機能の直接的抑制またはエフェクタT細胞の阻害のいずれかを引き起こし、宿主にとって有害であるものと予測されよう。末梢または粘膜組織への局在化に関係なくこれらの後者の細胞種でのCEACAM1-Sの濃縮を考慮して、ならびに腸組織がCEACAM1-Sの発現を促進するという所見によって、これらの研究はまた、CD4+LAP+T細胞およびTFH細胞が生まれ、および/または粘膜因子によって遠隔的に修飾されうるという可能性を高めている。
【０１９２】
T細胞におけるCEACAM1-Sのシグナル伝達についてはほとんど分かっていないが、上皮細胞においては細胞骨格(アクチンおよびトロポミオシン)、カルモジュリンならびにアネキシンIIと結び付くことが示されている(Edlund et al., 1996; Kirshner et al., 2003; Schumann et al., 2001)。そのような細胞内の結び付きは、興味深いことに、腺房形態形成中の乳房上皮細胞のアポトーシスの促進に関連付けられている(Kirshner et al., 2003)。さらに、Jurkat T細胞における過去のトランスフェクションでの研究と一致して、CEACAM1-Sシグナル伝達はインビボでNFATを活性化することが可能であった(Chen et al., 2004b)。本明細書で示されるように、これは、NFAT依存性の可溶性分子および細胞表面分子、例えばPD1およびCD40Lの上方制御と関連していた(データは示されていない)。かくして、これらの研究は、生理学的条件下でのT細胞におけるCEACAM1-Sの重要性を実証するだけでなく、CEACAM1-Lアイソフォームがもたらすシグナルに対抗し、細胞死または調節機能のいずれかと関連している特有の行き先へ細胞を推進しうる独立したシグナルを送達するうえでのその役割についても実証する。
【０１９３】
実験手順
動物
野生型(WT) C57BL/6 (B6)マウスを、The Jackson Laboratoryから購入した。Brigham and Women's Hospital Transgenic Core Facility (Nagaishi et al., 2006)のなかで既述されているのと類似の戦略によってhCD2プロモーターにより制御されるCEACAM1-4Sトランスジェニックマウスを作出した。CEACAM1-/-マウスは既述されている(Leung et al., 2006)。Swiss Webster無菌(SWGF)マウスおよびC57BL/6無菌マウス(B6GF)はTaconicの無菌隔離飼育器の中で維持された。その他のマウスは全て、Harvard Medical SchoolのHarvard Center for Comparative Medicineにて特定病原体感染防止条件の下で維持された。マウスは全て、8週齢〜12週齢の間に用いられた。
【０１９４】
フローサイトメトリー
CEACAM1発現アッセイ法の場合、細胞を20分間CC1抗体とともに、その後FITC結合ラット抗マウスIgG1とともにインキュベートした。その他の細胞表面タンパク質の場合、細胞を、表示した蛍光結合抗体で20分間染色し、洗浄し、DAPI (Invitrogen)を含有する1% BSA/PBS FACS染色緩衝液で再懸濁した。アネキシンV-FITCアポトーシス検出キット(Apoptosis Detection Kit)マニュアル(BD Bioscience)にしたがって細胞アポトーシスアッセイ法を行った。細胞内サイトカイン染色の場合、細胞をイオノマイシン(Sigma, 2 tg/ml)、PMA (Sigma, 30 ng/ml)およびGOLGISTOP (商標) (BD Bioscience)で4時間刺激し、その後にCYTOFIX/CYTOPERM (商標)溶液キットを製造元の使用説明書(BD Bioscience)にしたがって用い細胞内サイトカインの染色を行った。ラット抗マウスIgA抗体(C10-3)に備え付けの使用説明書にしたがって、IgA染色を行った。CD4+LAP+ T細胞を既述のように(Ochi et al., 2006)、ビオチン化抗LAP抗体(R&D Systems)で20分間、その後にAPC結合ストレプトアビジン(BD Biosciences)で染色した。TFH細胞を既述のように(Linterman et al., 2011)、CXCR5およびPD1について染色した。全ての染色細胞をLSRII(商標) (BD Biosciences)またはMACSQUANT(商標) (Miltenyi Biotech)フローサイトメーターにて分析し、データをFLOWJO(商標)ソフトウェアを用いて分析した。
【０１９５】
抗CD3の経口摂取
既述のプロトコル(Ochi et al., 2006)を用いてマウスに抗CD3抗体を与えた。具体的には、対のマウスの群に5日間、5 μg/マウス/日の用量で抗CD3またはIgGアイソタイプ対照抗体を与えた。1日の休止後、マウスを7日目に殺処理し、CD4+LAP+調節性T細胞の割合を特定のリンパ系組織において判定した。
【０１９６】
抑制アッセイ法
調節性T細胞抑制アッセイ法を既述(Fantini et al., 2007)のように行った。手短に言えば、新鮮単離した脾臓CD4+CD25-T細胞1×105個をCFSEで染色し、磁気選別(Miltenyi)によって単離されたCD4+CD25+またはCD4+LAP+ T調節性細胞のいずれかの等数のものと混合した。T細胞混合物を次に、可溶性抗CD3 (1 μg/ml)および抗原提示体として放射線照射を受けた全脾細胞4×105個の存在下において活性化した。4日間の培養後、応答体CD4+CD25- T細胞のCFSE希釈液を増殖の指標として測定した。
【０１９７】
全血清および分泌免疫グロブリンELISA
血清、腸洗浄液または糞抽出物をELISAのため既述(Hapfelmeier et al., 2010)のように回収した。データは平均±S.Dとして提示されている。
【０１９８】
免疫組織化学的分析
PPを単離し、OCTコンパウンド(Sakura Finetechnical)内に包埋し、ドライアイス中で急速凍結した。クリオスタット(Leica)を用いてマイクロスライド上にて凍結切片を調製し、使用するまで-70℃で貯蔵した。スライドを100%アセトン中で4℃にて5分間固定し、室温で風乾した。クリオスタット切片を室温(RI)で1時間10%正常ヤギ血清でブロッキングした。B220およびIgA染色の場合、スライドをRIで1時間、精製ラット抗マウスIgA抗体で染色し、その後にRIで1時間、ALEXA FLURO(商標) 568結合ヤギ抗ラットIgG二次抗体(Invitrogen)およびFITC結合抗マウスB220抗体(BD Bioscience)とともにインキュベーションした。NFAI染色の場合、スライドをRIで2時間、ビオチン結合抗マウスCD4抗体およびウサギ抗NFAI1抗体で染色し、その後にRIで1時間、ローダミンレッド-X-ストレプトアビジン(Jackson ImmunoResearch)およびヤギ抗ウサギIgG (H+L)のALEXA FLUOR (登録商標) 488 F(ab')2断片(Invitrogen)とともにインキュベーションした。DAPI (Invitrogen)を用いて対比染色を行った。NIKON ECLIPSE II (商標)顕微鏡を用いて標本を分析した。
【０１９９】
統計
マンホイットニーU検定(両側)を用い、定量的培養アッセイ法においてlog10コロニー形成単位(c.f.u.)の差異を評価した。t検定(両側)を用いて、分析された他のデータの平均間の差異を評価した。0.05未満のP値を有する検定を、統計的に有意とみなした。
【０２００】
抗体および試薬
マウスCEACAM1に特異的なmAbであるCC1は、既述されている(Dveksler et al., 1993)。5F4は、マウス抗ヒトCEACAM1特異的mAbである(Morales et al., 1999)。カスパーゼ-3およびNFAT1抗体は、Cell Signalingから購入した。GAPDHおよび13-アクチン抗体は、Sigma-Aldrichから入手した。ビオチニル化抗LAP抗体は、R&D Systems (Ochi et al., 2006)からのものであった。フローサイトメトリーまたは免疫組織化学染色のために用いた他の全ての抗体は、BD Biosciences、eBioscienceまたはBiolegendから購入した。マウス初代T細胞の刺激用ヒトrIL-2は、国立衛生研究所によって提供された。
【０２０１】
リンパ球単離
脾臓、リンパ節、血液、パイエル板(PP) (Iwasaki and Kelsall, 1999)または腸固有層(LP)由来の単核細胞の単個細胞浮遊液を、既述(Nakajima et al., 2002)のように調製した。PPまたは腸(切除したPP、PBSで洗い流し、小さく切った)を37℃で30分間、RPMI1640中にジチオスレイトール100 μg/ml (Sigma)、25 mM Hepes、10%ウシ胎仔血清(FBS)、および5 mM EDTAを含有する培地で処理して、上皮細胞を除去し、RPMI1640で十分に洗浄した。30分間37℃にて振盪インキュベータ内で、2% FBS、コラゲナーゼD (400 U/ml, Roche)およびDNase I (0.1 mg/ml, Sigma)を含有するRPMI 1640中で組織をさらに消化した。細胞を次に、40〜75%のパーコール(Percoll)勾配(GE Healthcare)上に重層し、リンパ球が濃縮された集団を40〜75%の界面の細胞から単離した。洗浄後、単個細胞浮遊液を調製した。細胞をフロー染色に直接用いるか、またはPE結合抗CD3抗体で染色し、その後にMiltenyi Biotechによって提供される使用説明書にしたがい抗PEマイクロビーズ(MicroBeads)を用いて、CD3+ T細胞をさらに単離した。
【０２０２】
脾臓および腸間膜リンパ節由来の単個細胞単離を、40 tmのセルストレーナー(BD Bioscience)および赤血球枯渇用の赤血球溶解緩衝液(Sigma)で行った。CD3+またはCD4+ T細胞を、製造元の使用説明書にしたがいマウス用のpan T細胞単離キットまたはCD4+ T細胞単離キット(Miltenyi Biotech)によってマウスの脾臓および/またはリンパ節から単離した。
【０２０３】
パイエル板の定量化
小腸全体をマウスから切除した。表面上の脂質を注意深く除去し、その後、PPの数およびサイズを巨視的観察によって判定した。既述のように(Barreau et al., 2007)、PPスコアを、その数およびサイズを組み合わせることによって確立し、盲検的に計算した。PP数の絶対的定量化の場合、SIを腸間膜縁に沿って切開し、dH2O中で1時間振盪することによって洗浄し、終夜5%氷酢酸中で固定した。さらに1時間dH2O中で洗浄した後に、組織を、Unnaのポリクロームメチレンブルー染料(31.3 mMのメチレンブルー、72.4 mMの炭酸カリウム)中で短時間インキュベートすることによって染色した。組織をもう1回洗浄し、その後、48時間dH2O中に放置して、染料の差別化を可能にした。
【０２０４】
細胞培養、増殖およびサイトカイン産生の判定
細胞を、10% FBS、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン、2 mMグルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、20 mM HEPES、および1%非必須アミノ酸(全てInvitrogenより)を含有する完全RPMI 1640培地中に、細胞1×106個/mlの密度で再懸濁し、表示した濃度の、プレートに結合された抗CD3抗体(eBioscience)を含む96ウェル平底プレート中で培養した。培養上清を24時間の時点で収集し、製造元の使用説明書にしたがってELISA (BD Biosciences)によりサイトカイン産生を判定した。増殖アッセイ法は、48時間の時点で[3H]-チミジン(1.0 μCi/ウェル)を8時間加えることによって行った。
【０２０５】
タンパク質単離およびウエスタンブロッティング
脾臓およびMLN単核細胞を冷PBS中で2回洗浄した。全タンパク質を既述のように(Chen et al., 2008)、RIPA緩衝液で単離した。NE-PER核および細胞質抽出キット(Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit) (Thermo Scientific)を用いて、核および細胞質タンパク質を単離した。BACプロテインアッセイ(Protein Assay) (Thermo Scientific)を用いて、上清中のタンパク質の濃度を評価した。結果および説明文に示されているように、特異抗体を用いることによって既述のように免疫ブロッティングを行った(Chen et al., 2008)。
【０２０６】
リアルタイム定量的PCR
製造元の使用説明書にしたがってRNEASY(商標) Mini kit (Qiagen)を用いRNAを抽出し、ゲノムDNAをDNase Iで除去した。SYBR GREEN(商標)定量的PCRマスターミックス(Roche)を用いて、既述のようにqPCRを行った(Nagaishi et al., 2006)。運転には全て、2つの内部対照遺伝子13-アクチンおよびGAPDHをあわせた。サンプルをΔΔサイクル閾値に基づくアルゴリズムを用い規準化して、サンプル間の相対発現レベルに相当する任意単位を与えた。以下のプライマーをマウスCEACAM1のために用いた:
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hnRNP発現を、既述のように(Dery et al., 2011)、qPCRによって判定した。
【０２０７】
参考文献
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【０２０８】
実施例6
細胞上のCEACAM1およびPD1の発現を生理学的条件の下で調べた。固有層リンパ球を結腸、回腸、空腸および十二指腸ならびに腸間膜リンパ節(MLN)および脾臓から単離し、CD3陽性細胞でのゲーティング後、PD1およびCEACAM1の共発現について染色した(図14)。
【０２０９】
結腸炎をRag欠損動物およびCEACAM1欠損動物においてナイーブCD4+ T細胞の養子免疫伝達によりマウスにおいて誘導し、CEACAM1およびPD1の発現を、結腸に浸潤している固有層リンパ球において調べた。CEACAM1およびPD1の共発現を図15に、CD3+でのゲーティング後、近位、中位および遠位結腸から得たリンパ球において示した。
【０２１０】
腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を、CT26結腸直腸がん細胞株と関連した皮下腫瘍から単離した。TILをアイソタイプ対照抗体または異なる共阻害性の細胞表面分子を遮断する抗体の存在下において抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体で刺激した。このCEACAM1およびPD1の遮断は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)からのTNF-aの産生を増加させる。このデータは、抗CEACAM1抗体および抗PD1抗体で処理されたTILによるTNF-a産生の相乗的増大を実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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