(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物材料特性の損失を低減または防止する少なくとも１つの作用剤を含む溶液中に入られた生物材料を含む組成物であって、
前記溶液が血清を含まない溶液であり、
前記生物材料が細胞外マトリックスまたは軟骨組織中の軟骨細胞を含み、
前記少なくとも１つの作用剤が１．０ｎＭ〜１０μＭの範囲の濃度を有するドキシサイクリンを含み、
前記生物材料特性は、細胞外マトリックス透過性を含む細胞外マトリックス完全性及び細胞生存性を含む、組成物。
【請求項２】
前記細胞外マトリックス完全性が、細胞外マトリックス含水量、細胞外マトリックスグリコサミノグリカン含有量、またはこれらのいずれかの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記血清がウシ胎児血清である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記溶液が等張性である細胞外タイプ溶液である、または前記溶液が等張性である細胞内タイプ溶液である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞内タイプ溶液が、下記の成分：Ｄ−グルコース、グリシン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチン塩酸塩、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、これらのいずれかの塩、またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも１つを含む栄養素カクテルをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ドキシサイクリンが酵素活性を最小化して生物材料特性の損失を低減または防止し、前記生物材料特性が細胞外マトリックス完全性を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ドキシサイクリンがマトリックスメタロプロテイナーゼの酵素阻害剤であり、前記マトリックスメタロプロテイナーゼがＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２３Ａ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、およびＭＭＰ２８からなる群から選択される１つ以上のメンバーを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物を調製するステップを含む、−２５℃〜＋３５℃の範囲の低温で生物材料を保存する方法であって、組成物の調製が前記生物材料を生物材料特性の損失を低減または防止する少なくとも１つの作用剤を含む溶液中に入れるステップを含む、方法。
【請求項９】
血清を含まない溶液を含む組成物であって、
前記血清を含まない溶液がドキシサイクリンを１．０ｎＭ〜１０μＭの範囲の濃度で含み、
前記血清を含まない溶液が細胞培地を含まない細胞内タイプ溶液であり、
ドキシサイクリンがＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２３Ａ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも１つの酵素活性を低減または阻害する、組成物。
【請求項１０】
ドキシサイクリンがＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、およびＭＭＰ１３の少なくとも２つの酵素活性を低減もしくは阻害する、またはドキシサイクリンがＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、およびＭＭＰ１３の少なくとも３つの酵素活性を低減もしくは阻害する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞内タイプ溶液が下記の成分：Ｄ−グルコース、グリシン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチン塩酸塩、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、これらのいずれかの塩、またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも１つを含む栄養素カクテルをさらに含む、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
生物材料を−２５℃〜＋３５℃の範囲の低温で請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物中に保存するステップを含む方法であって、
前記組成物が細胞外マトリックス完全性および細胞生存性の維持を促進する少なくとも１つの添加剤を含み、
前記少なくとも１つの添加剤が１つの酵素阻害剤、１つのアミノ酸、複数のアミノ酸、１つの糖、複数の糖、１つの脂質、複数の脂質、１つのビタミン、複数のビタミン、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、真核生物材料（例えば、材料および組織に関連する細胞）を、保存に伴う生物材料特性の損失を低減または防止しながら保存する方法に関する。本開示はさらに保存中の生物材料の（ｉ）細胞外マトリックス透過性、含水量、およびグリコサミノグリカン含有量を含む、細胞外マトリックス完全性、ならびに（ｉｉ）細胞生存性の維持に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年の間に、真核組織および細胞を保存するための保存方法および技術が開発された。これらの保存方法および技術は、人工細胞外マトリックス、人工組織、および天然組織中のさまざまな真核細胞をある時間、これらの保存された組織を後日、例えば患者への移植または薬剤もしくは化学物質スクリーニングバイオアッセイに使用することができるように、保存するためのものである。
【０００３】
これらの保存方法および技術は基礎研究および橋渡し研究の両方の環境において幅広く適用可能であるが、保存中に生物材料特性（例えば、細胞外マトリックス完全性および細胞生存性）を維持することは課題のままである。例えば、現行の技術を用いて顕著に低下した細胞外マトリックス透過性および組織細胞生存性が観察されており、これらの低下により保存状態から取り出された後の生物材料機能は非効率的となり得る。
【０００４】
１つの例では、軟骨細胞および軟骨組織は各種保存技術を用いて保存され、その後保存状態から取り出され、骨軟骨同種移植片として用いられる。同種移植片は（１）外傷誘発性軟骨欠損および（２）変形性関節症により損傷した軟骨表面を修復することができる。米国では現在約２０００万人の人々が変形性関節症の影響を受けていると推定されるため、変形性関節症を治療するための骨軟骨同種移植片としての軟骨細胞および軟骨組織の使用は重要である。よって、結果として、関節障害、骨粗鬆症性骨折、または内因性軟骨組織の欠損もしくは内因性軟骨組織の損傷により引き起こされる腰痛を患う人々を治療するための整形外科用インプラントを提供する大きな産業が成長した。
【０００５】
骨軟骨同種移植片は軟骨関連疾患治療の可能性を示すが、骨軟骨同種移植片移植の結果（すなわち、手術結果が成功か失敗か、等）は移植された関節軟骨組織の軟骨細胞生存性および細胞外マトリックス完全性に大きく左右される。現行の保存技術は軟骨組織の細胞外マトリックス完全性を満足に維持せず、特定の態様では、軟骨細胞生存性には向上の余地がある。例えば、軟骨細胞および軟骨組織の従来の凍結保存はこれらの細胞および組織をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む溶液中で凍結するステップを含むが、これらの技術は氷生成による関節軟骨組織中の軟骨細胞の８０〜１００％の死および細胞外マトリックス損傷をもたらす。
【０００６】
上述したように凍結保存結果が悪いため、結局いわゆる「未処理」の関節セグメント（すなわち、軟骨細胞および／または軟骨組織同種移植片）を移植することが慣例となった。例えば、ドナーからの骨軟骨組織移植片は一般的にはドナーの死の２４時間以内に摘出され、軟骨欠損症の修復のため４℃で最大４２日間保存される。また、市販の未処理の骨関節同種移植片は少なくとも１７日間保存され、移植前に血清および微生物検査が行われ、レシピエントにおける感染症の可能性を最小化する。
【発明の概要】
【０００７】
骨軟骨同種移植片移植は（１）外傷誘発性軟骨欠損および（２）変形性関節症により損傷した軟骨表面を修復するための効果的な治療であるが、保存中に軟骨組織の軟骨細胞生存性および細胞外マトリックス完全性を維持するには依然として多くの課題が存在する。最近の研究が示すように、同種移植片移植の成功を促進するには軟骨細胞生存性および細胞外マトリックス完全性の両方を維持することが重要となり得る。例えば、保存中または保存状態から取り出した後に細胞生存性および／またはマトリックス完全性が低下する場合、移植成功の可能性も低下し得る。これらの課題は人工または天然組織中のほとんどの真核細胞が抱えている。よって、新規真核組織および細胞保存技術は有用である。
【０００８】
本明細書には生物材料を保存するための組成物および方法が記載される。特定の態様では、これらの生物材料は真核細胞および真核組織、例えば軟骨細胞および軟骨組織を含む。本明細書に記載される方法は、これらの生物材料を、保存中または生物材料を保存状態から取り出した後に起こる、生物材料特性、例えば細胞外マトリックス透過性および軟骨細胞生存性の損失を低減または防止するように保存するステップを含む。特定の態様では、これらの生物材料は動物由来生成物を含み得る溶液中に入れられ、後ほど使用するために保存される。特定の態様では、本明細書に記載される溶液は生物材料特性の損失を防止または低減する作用剤を含有し、特定の態様では、この作用剤は少なくとも１つの酵素の阻害剤を含むことができる。例えば、この作用剤は、それぞれ、これらに限定されないが、内因性のメタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ）、ＴＩＭＰ合成を制御する化合物、またはドキシサイクリンを含むことができる、天然または合成マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤を含むことができる。
【０００９】
本開示の利点は以下の説明において部分的に説明され、または後述する態様の実施により理解され得る。後述する利点は添付の特許請求の範囲においてとくに指摘される要素および組み合わせにより実現および入手される。前記の一般的な説明および下記の詳細な説明の両方は例示的および説明的なものにすぎず、限定的なものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】軟骨細胞が４つの異なる溶液中で２８日間保存された後の軟骨細胞生存性および増殖性を比較するグラフである。生存性および増殖性は各試料の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定することにより定量化された。
【図２】４つの異なる溶液中での低温保存中に起こる高い細胞生存性と軟骨組織マトリックス透過性および導電性の損失との間の相関係数（Ｒ２）を示すグラフである。図２に示されるように、相関係数は保存後回復組織培養の４日間で０．７８から０．９０まで増加した。
【図３】低張生理食塩水中の軟骨試料の導電性に基づく軟骨組織透過性に対する低温保存の影響を示すグラフである。
【図４】軟骨組織の力学特性（例えば、クリープ圧縮）を定量化するのに用いられる圧縮チャンバーの概略図である。
【図５】さまざまな保存間隔後の軟骨細胞生存性に対するドキシサイクリン濃度の影響を示すグラフである。
【図６】さまざまな濃度のドキシサイクリン中での１ヶ月の冷蔵保存後のブタ軟骨プラグ導電性に対する影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
開示される方法および組成物は、下記の特定の実施形態の詳細な説明、本明細書に含まれる実施例、ならびに図面およびその説明を参照してより容易に理解され得る。後述する態様は、もちろん構成変更され得る、記載のような具体的な組成物および／または方法に限定されるものではない。
【００１２】
本出願を通してさまざまな刊行物が参照される。これらの刊行物、および以下の参考文献リストに含まれる刊行物の全開示はこれによって本出願に参照により組み入れられ、本開示の属する技術分野の状況をより完全に説明する。開示される参考文献も参照される具体的な部分について本明細書に参照により個別かつ具体的に組み入れられる。
【００１３】
濃度、量、および他の数値データは本明細書では範囲形式で表現または表示され得る。こうした範囲形式は単に便利さおよび簡潔さのために用いられ、よって範囲の限界として明示的に挙げられる数値だけでなく、範囲内に含まれる個別の数値または部分範囲も各数値および部分範囲が明示的に挙げられているかのように含むと柔軟に解釈されるべきであると理解されるものである。例として、「約１〜５」の数値範囲は約１から約５までの明示的に挙げられる値だけでなく、２、３および４のような個別の値、１〜３、２〜４、および３〜５、等のような部分範囲、ならびに個別に１、２、３、４および５も含むと解釈されるべきである。同じ原理が最小または最大として１つの数値のみが挙げられる範囲に適用される。さらに、こうした解釈は範囲の幅または説明される特徴に関係なく適用されるべきである。
【００１４】
本明細書および下記の特許請求の範囲では、いくつかの用語が用いられ、下記の意味を有すると定義される。
【００１５】
「動物生成物を含まない」溶液は、いずれの動物生成物またはさらに以下で記載する生物材料を除くいずれの動物由来生成物も含まない溶液を含む。「動物生成物」としては、成長因子を含み、従来の細胞培養によく用いられる動物由来生成物である、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を挙げることができる。よって、１つの例では、「動物生成物を含まない」溶液としてはＦＢＳを含まない溶液を挙げることができる。
【００１６】
「生物材料」の語は非植物、哺乳類真核細胞および組織を含む。
【００１７】
本明細書には生存可能な生物材料およびこうした生物材料の保存方法が記載される。特定の態様では、これらの生物材料は人工および天然両方の組織中の真核細胞を含み、本明細書に記載される方法は、これらの生物材料を、保存中または生物材料を保存状態から取り出した後に起こる生物材料特性の損失を低減または防止（例えば、細胞外マトリックス完全性、組織細胞生存性、またはこれらの組み合わせの損失を低減または防止）するように保存するステップを含む。特定の態様では、これらの生物材料は、生物材料特性の損失を低減または防止する少なくとも１つの作用剤を含有する、動物生成物を含まない溶液を含むことができる、溶液中に入れられる。その後、少なくとも１つの作用剤を含有する溶液中に入れられた生物材料は次に特定の温度範囲でこれらの生物材料がさらに必要となるまで保存される。少なくとも１つの作用剤の濃度は、生物材料特性（例えば、細胞外マトリックス完全性および細胞生存性）が最大化されるように最適化される。
【００１８】
特定の態様では、生物材料は一次細胞（例えば、非不死化細胞および／または組織）および不死化細胞を含むいずれかの非植物、哺乳類真核細胞および／または組織を含むことができる。特定の態様では、生物材料は天然および人工組織および細胞を含むことができる。天然および人工生物材料の例としては、これらに限定されないが、軟骨細胞、軟骨組織、骨芽細胞、破骨細胞、骨、組織プラグ、同種移植片組織プラグ、軟骨組織プラグ、角膜、心臓弁、血管、尿管、腸、皮膚、歯、腫瘍生検、椎間板または体、靭帯、腱、等を挙げることができる。少なくとも１つの態様では、生物材料は少なくとも軟骨細胞、軟骨組織、またはこれらの組み合わせを含む。他の態様では、生物材料は軟骨細胞、細胞組織、またはこれらの組み合わせのみを含む。特定の態様では、生物材料は自家移植片組織、同種移植片組織、および異種移植片組織を含む。例えば、適切なヒト移植片組織に関して、同種移植片組織および／または組織プラグはヒトドナーから誘導することができる。異種移植片組織は医療用にブタドナー、ウシドナー、ヒツジドナー、ウマドナー、またはその他の種から誘導することができる。本明細書に記載される組織は動物種から同種間の獣医用途に誘導してもよく、例としてはイヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、およびウマが挙げられる。
【００１９】
本明細書に記載される組織および細胞を本明細書に記載される組成物および方法で用いる場合、１つの目的は細胞外マトリックス完全性の損失を防止および／または細胞生存性の損失を低減もしくは防止することである。例えば、細胞外マトリックス完全性は細胞外膜透過性、細胞外膜含水量、細胞外膜グリコサミノグリカン含有量、またはこれらの組み合わせに基づいて測定することができる。特定の態様では、１つの目的は、生物材料を保存し、細胞外マトリックス完全性の損失を防止または低減しながら、細胞外膜透過性、細胞外膜含水量、細胞外膜グリコサミノグリカン含有量、またはこれらの組み合わせの少なくとも１つを維持することである。生物材料のマトリックス完全性を測定する場合、当技術分野において知られる多数の技術を用いることができる。これらの技術としては、透過性、含水量、およびグリコサミノグリカン含有量を測定するマトリックス導電性アッセイ、押込み試験、応力／歪み試験、弾性、ラマン分光法、各種顕微鏡法（例えば第２次高調波発生を伴うレーザー走査顕微鏡法）、等が挙げられる。上でさらに記載したとおり、別の目的は生物材料の細胞生存性の損失を低減または防止することである。特定の態様では、本明細書に記載される組成物および方法を用い、これらに限定されないが、壊死性細胞死、アポトーシス細胞死、オートファジー（ＩＩ型）細胞死、アノイキス、およびネクロプトーシスを含む、さまざまなタイプの細胞死を低減または防止することができ、特定の態様では、これらのタイプの細胞死は以下でさらに記載するような作用剤の使用により限定することができる。また、代謝活性アッセイ（例えば、レサズリンアッセイ）、各種細胞染色技術（例えば、トリパンブルー色素排除アッセイおよび生／死染色）、免疫組織化学、生化学および各種遺伝子発現アッセイを用いることができる。
【００２０】
１つの態様において、マトリックスを含有する組織が生物材料として用いられる場合、細胞外マトリックス完全性の損失および細胞生存性の損失を防止または低減することは、組織の構造的完全性および正常な生物学的機能を維持するために重要である。例えば、軟骨組織は軟骨細胞（すなわち、細胞）および細胞外マトリックスを含有し、細胞外マトリックスは主にコラーゲン線維、プロテオグリカン、およびエラスチン線維からなる。軟骨細胞生存性および軟骨組織細胞外マトリックス完全性の両方は、インビボ、エクスビボおよびインビトロ用途において正常な生理学的、生物学的機能を維持するために重要である。例えば、軟骨組織の細胞外マトリックスは構造的完全性を提供し、インビボで特定のレベルの剛性を維持し、骨サポート、適切な関節可動性、等において機能する。特定の態様では、軟骨組織の細胞外マトリックスの透過性はとくに重要である。例えば、軟骨組織透過性は軟骨組織の細胞外マトリックスの構造的完全性の維持およびまた軟骨細胞生存性の維持の促進に関連し、重要な役割を果たし得る。特定の態様では、軟骨組織の細胞外マトリックスの透過性の低下は軟骨細胞生存性の増加および軟骨組織細胞外マトリックス構造的完全性の低下に関連し得る。酵素のような細胞生成物の生成によるこの生存性の増加および構造的完全性の低下は、保存された軟骨組織がその後同種移植片移植に用いられる場合、移植の成功の可能性の低下をもたらし得る。よって、特定の態様では、軟骨細胞生存性の損失を低減および／または防止しながら軟骨組織細胞外マトリックス完全性の損失を防止または低減するのに本明細書に記載される方法および組成物が用いられ、特定の態様では、軟骨細胞生存性を最適化しながら同種移植片における軟骨組織細胞外マトリックス完全性の損失を低減および／または防止するのに本明細書に記載される方法および組成物が用いられる。
【００２１】
本明細書に記載される生物材料は、生物材料特性（例えば、細胞外マトリックス完全性、細胞生存性、またはこれらの組み合わせ）の損失を防止または低減する溶液中に入れることができ、特定の態様では、この溶液は動物生成物を含まない（例えば、ＦＢＳを含まない）溶液とすることができ、または動物生成物を含有する（例えば、ＦＢＳを含む）ことができる。なお、生物材料を含む動物生成物を含有する溶液は以下の説明および実施形態にも適用される。特定の態様では、生物材料は溶液中に少なくとも部分的に浸漬され、他の態様では、生物材料は溶液中に完全に浸漬される。
【００２２】
１つの態様では、溶液は生物材料特性（例えば、細胞外マトリックス完全性、細胞生存性、またはこれらの組み合わせ）の損失を防止または低減する少なくとも１つの作用剤を含む細胞外タイプ溶液とすることができる。例えば、細胞外タイプ溶液は、細胞および組織の正常な細胞外環境を模倣するイオン補体を有する等張性の血漿様溶液を含むことができる。これらの等張性の血漿様溶液は、生物材料（例えば、細胞および／または組織）に栄養補給のため各種アミノ酸および代謝物質を提供する細胞培地を含むことができる。例えば、細胞外タイプ溶液に用いられる細胞培地としては、これらに限定されないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、αＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ、ハムＦ−１０、ハムＦ−１２、レイボビッツＬ−１５、イスコフ改変ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ハムＦ−１２、およびこれらの組み合わせを挙げることができる。細胞外タイプ溶液は動物生成物を含まないものとし、生物材料を細胞溶液中に入れる前に、細胞溶液が動物生成物を含有しないようにすることができる。例えば、細胞培地を用いる場合、細胞培地はウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはその他の動物由来の生成物を含有しない。
【００２３】
特定の態様では、溶液は細胞内タイプ溶液を含む。細胞内タイプ溶液としては、これに限定されないが、保存中に生物材料および細胞内タイプ溶液中の細胞間の水およびイオンの受動的交換を制限するように製剤された等張溶液を挙げることができる。例えば、細胞内タイプ溶液は細胞外空間中の塩素イオンを部分的に置換するラクトビオネートおよびグルコネートのような非透過性アニオンを含むことができ、これは細胞内部に閉じ込められたサイトゾルの巨大分子およびそれらの関連対イオンにより生成された細胞内膠質浸透圧のバランスをとる浸透促進を提供する。細胞内タイプ溶液としては、これらに限定されないが、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）（すなわち、ベルザー溶液）およびＵＮＩＳＯＬ（登録商標）（例えば、ＳＰＳ−１）を挙げることができる。上述した細胞外タイプ溶液と同様に、細胞内タイプ溶液は動物生成物を含まないものとすることができる。
【００２４】
細胞内タイプ溶液に追加成分を添加し、細胞内タイプ溶液をさらに補完し、生物材料生存性をさらに促進することができる。例えば、これらの追加成分は生物材料の追加の栄養補給を提供し、これは生物材料の生存性の損失を低減または防止する。これらの追加成分としては、これに限定されないが、非動物由来（すなわち、合成由来）必須アミノ酸、合成由来非必須アミノ酸、合成由来ビタミン、合成由来脂質、合成由来炭水化物、またはこれらのいずれか組み合わせを有する栄養素カクテルを挙げることができる。栄養素カクテルに含まれる炭水化物の例としては、単糖類（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース）、二糖類（例えば、マルトース、ラクトース、等）、またはこれらの組み合わせをさらに挙げることができる。カクテル中に提供されるアミノ酸の例としては、これらに限定されないが、グリシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、またはこれらのいずれかの塩を挙げることができる。カクテル中に提供されるビタミンの例としては、これらに限定されないが、コリン、Ｄ−カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、またはこれらのいずれかの塩のいずれかの組み合わせを挙げることができる。
【００２５】
上で示したとおり、生物材料特性（例えば、細胞外マトリックス完全性、細胞生存性、またはこれらの組み合わせ）の損失を防止または低減する作用剤を溶液中に含めることができる。特定の態様では、作用剤は細胞外マトリックス完全性の損失を防止または低減することができる。例えば、細胞外マトリックス完全性の損失を防止または低減する作用剤は、例えば、対照と比較した場合、溶液中の細胞外マトリックス完全性の損失を防止または低減する小有機化合物、無機化合物、生体分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー）、またはこれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。特定の態様では、作用剤は生物材料の特性（例えば、細胞外マトリックス完全性）の損失を、例えば、対照と比較した場合、例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９９％以上低減することができる。言い換えると、作用剤は生物材料の特性の損失を実質的にまたは完全に、例えば、対照と比較した場合、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％防止することができる。特定の態様では、溶液は作用剤を１ｐＭ〜１０００μＭ、１ｐＭ〜５００μＭ、１ｐＭ〜３０μＭ、１ｐＭ〜１０００ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜２５０ｎＭ、１００ｐＭ〜７５０μＭ、１００ｐＭ〜５００μＭ、１００ｐＭ〜２０μＭ、１００ｐＭ〜１０００ｎＭ、１ｐＭ〜７５０ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜２５０ｎＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、５００ｐＭ〜５００μＭ、５００ｐＭ〜２５０μＭ、５００ｐＭ〜１００μＭ、５００ｐＭ〜１０μＭ、５００ｐＭ〜１０００ｎＭ、５００ｐＭ〜７５０ｎＭ、５００ｐＭ〜５００ｎＭ、５００ｐＭ〜２５０ｎＭ、５００ｐＭ〜１００ｎＭ、５００ｐＭ〜１ｎＭ、１ｎＭ〜１０００μＭ、１ｎＭ〜７５０μＭ、１ｎＭ〜５００μＭ、１ｎＭ〜２５０μＭ、１ｎＭ〜１００μＭ、１ｐＭ〜１μＭ、１００ｎＭ〜１０００μＭ、１００ｎＭ〜７５０μＭ、１００ｎＭ〜５００μＭ、１００ｎＭ〜２５０μＭ、１００ｎＭ〜１００μＭ、１００ｐＭ〜１μＭ、２５０ｎＭ〜１０００μＭ、２５０ｎＭ〜７５０μＭ、２５０ｎＭ〜５００μＭ、２５０ｎＭ〜２５０μＭ、２５０ｎＭ〜１００μＭ、２５０ｎＭ〜１μＭ、５００ｎＭ〜１０００μＭ、５００ｎＭ〜７５０μＭ、５００ｎＭ〜５００μＭ、５００ｎＭ〜２５０μＭ、１００ｎＭ〜１００μＭ、５００ｎＭ〜１μＭ、７５０ｎＭ〜１０００μＭ、７５０ｎＭ〜７５０μＭ、７５０ｎＭ〜５００μＭ、７５０ｎＭ〜２５０μＭ、７５０ｎＭ〜１００μＭ、７５０ｎＭ〜１μＭ、０．５μＭ〜１０００μＭ、１０μＭ〜９５０μＭ、２０μＭ〜９００μＭ、３０μＭ〜８５０μＭ、４０μＭ〜８００μＭ、５０μＭ〜７５０μＭ、６０μＭ〜７００μＭ、７０μＭ〜６５０μＭ、８０μＭ〜６００μＭ、９０μＭ〜５５０μＭ、１００μＭ〜５００μＭ、１１０μＭ〜４５０μＭ、１２０μＭ〜４００μＭ、１３０μＭ〜３５０μＭ、１４０μＭ〜３００μＭ、１５０μＭ〜２５０μＭ、１６０μＭ〜２００μＭ、０．５μＭ〜１００μＭ、１μＭ〜９０μＭ、５μＭ〜９０��Ｍ、１０μＭ〜８５μＭ、１０μＭ〜７５μＭ、２０μＭ〜８５μＭ、２０μＭ〜６５μＭ、３０μＭ〜７０μＭ、３０μＭ〜５０μＭ、４０μＭ〜８０μＭ、または４０μＭ〜５０μＭの範囲内の濃度で含み、上記範囲内のいずれの濃度も範囲の終点となることができる。
【００２６】
１つの態様では、作用剤は生物材料の特性（例えば、細胞外マトリックス完全性）に影響を及ぼす酵素の活性を阻害または低減すると考えられる。よって、作用剤は生物材料の損傷（例えば、細胞外マトリックス損傷）の促進に関連する特定の酵素の酵素阻害剤として作用することができる。この態様では、酵素阻害剤を上述した範囲で用い、酵素の活性を阻害または低減し、生物材料特性の維持（例えば、細胞外マトリックス完全性の維持）を向上させることができる。１つの態様では、この酵素阻害剤としては具体的には、これに限定されないが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤を挙げることができる。
【００２７】
例えば、特定の態様ではＭＭＰは、生物材料の少なくとも一部分の酵素分解によって生物材料特性（例えば、細胞外マトリックス完全性）に悪影響を及ぼし、潜在的に保存後の生物材料機能を不十分なものにし得る。よって、特定の態様では、ＭＭＰ阻害剤を用いることによりＭＭＰ酵素活性を低減または阻害することが望ましい。例えば、ＭＭＰ阻害剤はＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２３Ａ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８またはこれらのいずれかの組み合わせの酵素活性を阻害または低減することができる。特定の態様では、ＭＭＰ阻害剤はＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも１つの酵素活性を低減または阻害する。特定の態様では、ＭＭＰ阻害剤はＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも２つの酵素活性を低減または阻害する。特定の態様では、ＭＭＰ阻害剤はＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、これらのいずれかの組み合わせの少なくとも３つの酵素活性を低減または阻害する。さらに、ＭＭＰ阻害剤としては、これらに限定されないが、天然または合成マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤を挙げることができる。合成ＭＭＰ阻害剤は一般的には触媒亜鉛原子をＭＭＰの活性部位に密接に結合するキレート化基を含有する。一般的なキレート化基としてはヒドロキサメート、カルボキシレート、チオール、およびホスフィニルが挙げられる。特定の態様では、ヒドロキサメートはそれらの亜鉛原子の二座キレート化によりＭＭＰのとくに強力な阻害剤である。亜鉛キレート化剤としてはジエチルジチオカルバメート（ＤＥＤＴＣ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）カルシウムを挙げることができる。特定の態様では、本明細書に記載される阻害剤としては、これらに限定されないが、ドキシサイクリン、ＰＣＫ３１４５（前立腺分泌タンパク質９４のアミノ酸３１〜４５に対応する合成ペプチド）、ＢＢ−２５１６（マリマスタット）、ＢＢ−９４（すなわち、（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ４−ヒドロキシ−Ｎ１−［（１Ｓ）−２−（メチルアミノ）−２−オキソ−１−（フェニルメチル）エチル］−２−（２−メチルプロピル）−３−［（２−チエニルチオ）メチル］ブタンジアミドであるバチマスタット）、内因性メタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ）を制御する化合物（例えば、ＴＩＭＰ合成を制御する化合物）、またはこれらのいずれかの組み合わせを挙げることができる。例えば、天然化合物であるゲニピンはＴＩＭＰ−１の発現を上方制御することが示された。理論に縛られることを望むものではないが、ゲニピンが誘発するＴＩＭＰ−１の上方制御はＭＭＰ−２活性を低減または阻害し、特定の態様では、本明細書に記載される方法および組成物においてＭＭＰ酵素活性を阻害または低減するのにゲニピンを用いることができる。さらに、成長因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達の変換は、コラーゲン生成お��び他の細胞外マトリックスタンパク質を刺激することにより、ならびにＴＩＭＰ−１遺伝子の上方制御によりマトリックス分解を阻害することにより、細胞外マトリックス堆積において中心的な役割を果たすことが示された。したがって、本明細書に記載される方法とともに、ＴＧＦ−βシグナル伝達を制御し、最終的にＴＩＭＰ発現（例えば、ＴＩＭＰ−１発現）およびＭＭＰ阻害を制御する化合物を阻害剤として用いてもよい。
【００２８】
1つの態様では、生物材料は、生物材料の細胞外マトリックス完全性の損失を低減または防止する少なくとも１つの作用剤および細胞生存性の維持を促進する少なくとも１つ以上の追加の作用剤を含む溶液中に入れられる。
【００２９】
生物材料を上述した溶液のいずれかに入れた後、生物材料を保存することができる。例えば、生物材料を少なくとも１つの作用剤を含む溶液中に入れた後、この混合物をさまざまな温度で保存し、生物材料の細胞外マトリックスの保存をさらに促進し、生物材料の生存性の損失をさらに防止または低減することができる。例えば、これらの温度は、これらに限定されないが、低温および常温を含むことができる。生物材料を低温で保存する場合、氷核を低減または防止することが好ましい。特定の態様では、低温としては、−２５℃〜＋３５℃の範囲、−１５℃〜＋３０℃の範囲、−５℃〜＋２５℃の範囲、−５℃〜＋２０℃の範囲、−５℃〜＋１５℃の範囲、−５℃〜＋１０℃の範囲、−５℃〜＋５℃の範囲、０℃〜＋１０℃の範囲、０℃〜＋９℃の範囲、０℃〜＋８℃の範囲、０℃〜＋７℃の範囲、０℃〜＋６℃の範囲、０℃〜＋５℃の範囲、０℃〜＋４℃の範囲、０℃〜＋３℃の範囲、０℃〜＋２℃の範囲、＋１℃〜＋８℃の範囲、＋１℃〜＋６℃の範囲、＋１℃〜＋４℃の範囲、＋１℃〜＋３℃の範囲、＋２℃〜＋９℃の範囲、＋２℃〜＋６℃の範囲、＋２℃〜＋４℃の範囲、＋３℃〜＋８℃の範囲、＋３℃〜＋６℃の範囲、＋３℃〜＋５℃の範囲、＋４℃〜＋８℃の範囲、＋４℃〜＋６℃の範囲、＋５℃〜＋９℃の範囲、＋５℃〜＋７℃の範囲、＋６℃〜＋１０℃の範囲、＋６℃〜＋８℃の範囲、＋７℃〜＋９℃の範囲、および＋８℃〜＋１０℃の範囲の温度を挙げることができる。特定の態様では、生物材料に応じて、低温が好ましい場合があり得る。例えば、軟骨細胞および／または軟骨組織が生物材料である場合、軟骨細胞および／または軟骨組織は上述した低温を用いて保存することができる。例えば、軟骨細胞および／または軟骨組織が生物材料である場合、低温は好適には−２５℃〜＋３５℃の範囲、より好適には−５℃〜＋２５℃の範囲、もっとも好適には０℃〜＋１０℃の範囲である。特定の態様では、生物材料は数時間、数日、数ヶ月または数年間保存することができる。例えば、軟骨細胞および／または軟骨組織（例えば、軟骨組織プラグ）を数時間〜３ヶ月、数時間〜２ヶ月、数時間〜１ヶ月、等の間保存することが好ましい場合があり得る。
【００３０】
特定の態様では、保存された生物材料の動物生成物を含まない溶液はさまざまな望ましい時間間隔で取り替えることができる。例えば、動物生成物を含まない溶液は、生物材料保存の期間を通して、保存された生物材料をさらなる使用のため保存状態から取り出すまで、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、等の間隔で取り替えることができる。
【００３１】
上述した方法および組成物を用いる場合、特定の態様では、生物材料は軟骨細胞および／または軟骨組織を含む。本開示の１つの目的は、その後の使用のための保存中の細胞外マトリックス材料特性の損失の低減または防止および生物材料の細胞生存性の維持の最適化を含む。この態様では、軟骨細胞および／または軟骨組織は細胞外マトリックス完全性の損失を少なくとも低減または防止する少なくとも１つの作用剤を含む溶液中に入れられる。軟骨細胞および／または軟骨組織はＭＭＰ阻害剤を上述したような濃度で含む細胞外タイプ溶液中に入れることができ、この混合物はその後−２５℃〜＋３０℃の範囲の低温である時間保存することができる。別の態様では、軟骨細胞および／または軟骨組織はＭＭＰ阻害剤を上述したような濃度で含む細胞内タイプ溶液中に入れることができ、特定の態様では、この細胞内タイプ溶液は任意で上述した栄養素カクテルをさらに含み、細胞生存性の維持を促進する。細胞内タイプ溶液中に入れられた軟骨細胞および／または軟骨組織はその後−２５℃〜＋２５℃の範囲の低温である期間保存される。
【００３２】
１つの態様では、どの溶液が保存中に生物材料特性（例えば、細胞外マトリックス透過性、含水量を含む細胞外マトリックス完全性、細胞生存性、等）の損失をもっとも低減または防止するかを決定することが望ましい。生物材料特性の損失をもっとも低減または防止する方法および組成物をさらに決定する際、同じ生物材料を上述したような２つの異なる溶液（すなわち、細胞内タイプおよび細胞外タイプ）中に入れることができる。２つの溶液はともに生物材料の細胞外マトリックス特性の損失を低減または防止する作用剤を含有し、細胞内タイプ溶液は任意で栄養素カクテルを含有することができる。同じ生物材料を２つの異なる溶液中に入れた後、２つの異なる溶液中の生物材料は同様に（すなわち、同じ温度、同じ時間、等で）保存される。ある時間後、２つの異なる溶液中に入れられた同じ生物材料を保存状態から取り出すことができ、生物材料特性（例えば、細胞生存性、細胞外マトリックス透過性、等）が試験および比較され、どの方法および組成物が生物材料の生存性の損失をもっとも低減または防止するかが決定される。特定の態様では、これらの方法および技術は軟骨細胞および／または軟骨組織に適用され、どの溶液が保存中に生物材料完全性の損失をもっとも低減または防止するかがさらに決定される。
【００３３】
いくつかの実施態様では、本開示は、生物材料特性の損失を低減または防止する少なくとも１つの作用剤を含む溶液中に入れられた生物材料を含む組成物に関する。生物材料特性は細胞外マトリックス完全性、細胞生存性、またはこれらの組み合わせを含み得る。細胞外マトリックス完全性は、例えば、細胞外マトリックス透過性、細胞外マトリックス含水量、細胞外マトリックスグリコサミノグリカン含有量、またはこれらのいずれかの組み合わせを含み得る。生物材料は真核組織を含み得る。いくつかの実施形態では、生物材料は軟骨組織を含み得る。いくつかの実施形態では、生物材料は細胞外マトリックス中の軟骨細胞を含む。いくつかの実施形態では、生物材料は生細胞を有する同種移植片材料を含む。いくつかの実施形態では、生物材料は生細胞および細胞外マトリックスを有する同種移植片材料を含み得、作用剤が細胞外マトリックス完全性、細胞生存性、またはこれらの組み合わせの損失を低減または防止する。こうした実施形態では、同種移植片材料は軟骨組織であり得る。実施形態では、溶液は動物生成物を含まない溶液、例えばウシ胎児血清を含まない溶液であり得る。いくつかの実施形態では、溶液は細胞外タイプ溶液、例えば、等張性細胞外タイプ溶液であり得る。いくつかの実施形態では、溶液は細胞内タイプ溶液、例えば等張性細胞内タイプ溶液であり得る。
【００３４】
いくつかの実施形態では、生物材料特性の損失を低減または防止する少なくとも１つの作用剤は溶液中に１００ｐＭ〜１ｍＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの作用剤は酵素阻害剤、例えば酵素活性を最小化し、細胞外マトリックス完全性を含む生物材料特性の損失を低減または防止する酵素阻害剤である。例えば、酵素阻害剤は少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ、例えばＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２３Ａ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８またはこれらのいずれかの組み合わせの１つ以上を阻害し得る。いくつかの実施形態では、酵素阻害剤は溶液中に１．０ｎＭ〜１０００μＭの範囲の濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、酵素阻害剤はドキシサイクリン、ＴＩＭＰ、内因性ＴＩＭＰを上方制御する化合物、ＰＣＫ３１４５、ＢＢ−２５１６、およびＢＢ−９４からなる群から選択され得る。
【００３５】
いくつかの実施態様では、本開示は、生物材料特性の損失を低減または防止する少なくとも１つの作用剤を含む溶液中に入れられた生物材料を含む組成物であって、溶液が等張性である細胞外タイプ溶液を含む動物生成物を含まない溶液であり、生物材料が細胞外マトリックスまたは軟骨組織中の軟骨細胞を含み、少なくとも１つの作用剤が１．０ｎＭ〜１ｍＭの範囲の濃度を有するマトリックスメタロプロテイナーゼの酵素阻害剤を含む、組成物に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、生物材料特性の損失を低減または防止する少なくとも１つの作用剤を含む溶液中に入れられた生物材料を含む組成物であって、溶液が等張性である細胞内タイプ溶液を含む動物生成物を含まない溶液であり、生物材料が細胞外マトリックスまたは軟骨組織中の軟骨細胞を含み、少なくとも１つの作用剤が１．０ｎＭ〜１ｍＭの範囲の濃度を有するマトリックスメタロプロテイナーゼの酵素阻害剤を含む、組成物に関する。
【００３６】
いくつかの実施態様では、本開示は、生物材料を生物材料特性の損失を低減または防止する少なくとも１つの作用剤を含む溶液中に入れるステップを含む生物材料の保存方法に関する。いくつかの実施形態では、生物材料は天然または人工真核組織を含み得る。いくつかの実施形態では、生物材料は軟骨組織を含み得る。いくつかの実施形態では、生物材料は細胞外マトリックス中の軟骨細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、生物材料は生細胞を有する同種移植片材料を含み得る。いくつかの実施形態では、生物材料は生細胞および完全な細胞外マトリックスを有する同種移植片材料を含み得る。いくつかの実施形態では、同種移植片材料は軟骨組織であり得る。いくつかの実施形態では、溶液は動物生成物を含まない溶液であり得る。いくつかの実施形態では、溶液は細胞外タイプ溶液、例えば等張性である細胞外タイプ溶液であり得る。いくつかの実施形態では、溶液は細胞内タイプ溶液、例えば等張性である細胞内タイプ溶液であり得る。いくつかの実施形態では、溶液はウシ胎児血清を含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの作用剤は溶液中に１．０ｎＭ〜１ｍＭの範囲の濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの作用剤は酵素阻害剤、例えば酵素活性を最小化して細胞外マトリックス完全性を含む生物材料特性の損失を低減または防止する酵素阻害剤であり得る。いくつかの実施形態では、酵素阻害剤は少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ、例えばＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２３Ａ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害し得る。いくつかの実施形態では、酵素阻害剤はドキシサイクリン、ＴＩＭＰ、内因性ＴＩＭＰを上方制御する化合物、ＰＣＫ３１４５、ＢＢ−２５１６、およびＢＢ−９４からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、本方法は溶液中に入れられた生物材料を−２５℃〜＋３５℃の範囲の温度で保存するステップをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、溶液は細胞外タイプ溶液を含む動物生成物を含まない溶液であり、細胞外タイプ溶液は等張性であり、生物材料は細胞外マトリックスまたは軟骨組織中の軟骨細胞であり、少なくとも１つの作用剤は１．０ｎＭ〜１ｍＭの範囲の濃度を有するマトリックスメタロプロテイナーゼの酵素阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、溶液は細胞内タイプ溶液を含む動物生成物を含まない溶液であり、細胞内タイプ溶液は等張性であり、生物材料は細胞外マトリックスまたは軟骨組織中の軟骨細胞であり、少なくとも１つの作用剤は１．０ｎＭ〜１ｍＭの範囲の濃度を有するマトリックスメタロプロテイナーゼの酵素阻害剤を含む。
【００３７】
いくつかの実施態様では、本開示は、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を含む、動物生成物を含まない溶液を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、動物生成物を含まない溶液は細胞培地を含む。いくつかの実施形態では、動物生成物を含まない溶液は細胞培地を含まない細胞内タイプ溶液である。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤はＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２３Ａ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも１つの酵素活性を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤はＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも１つの酵素活性を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤はＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも２つの酵素活性を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤はＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも３つの酵素活性を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤は動物生成物を含まない溶液中に１．０ｎＭ〜１０００μＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤は動物生成物を含まない溶液中に１００ｎＭ〜１００μＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤は動物生成物を含まない溶液中に１ｐＭ〜３０μＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤は動物生成物を含まない溶液中に１００ｐＭ〜２０μＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤は動物生成物を含まない溶液中に５００ｐＭ〜１０μＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤は動物生成物を含まない溶液中に１μＭ〜５μＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤はドキシサイクリン、ＴＩＭＰ、内因性ＴＩＭＰを上方制御する化合物、ＰＣＫ３１４５、ＢＢ−２５１６、およびＢＢ−９４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤は１．０ｎＭ〜１０００μＭの範囲のドキシサイクリンである。いくつかの実施形態では、細胞内タイプ溶液は下記の成分：Ｄ−グルコース、グリシン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチン塩酸塩、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒス��ジン塩酸塩、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、これらのいずれかの塩、またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも１つを含む栄養素カクテルをさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞外マトリックス完全性および細胞生存性の維持を促進する溶液中の生物材料を含む組成物であって、溶液が酵素阻害剤を含む、組成物に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、生物材料を低温で細胞外マトリックス完全性および細胞生存性の維持を促進する少なくとも１つの添加剤を有する細胞内タイプ溶液中に保存するステップを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの添加剤は１つの酵素阻害剤、１つのアミノ酸、複数のアミノ酸、１つの糖、複数の糖、１つの脂質、複数の脂質、１つのビタミン、複数のビタミン、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。
【００３９】
前記について下記の実施例を参照してさらに例示されるが、これは例示の目的で示されるものであって、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００４０】
下記の実施例は、当業者に本明細書において記載および特許請求される組成物および方法がどのように作成および評価されるかの完全な開示および説明を提供するために記載され、純粋に説明的であることを意図するものであって、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。数値（例えば、量、温度、等）について正確さを確保する努力がなされたが、通常の誤差および偏差は考慮されるべきである。他に指示がない限り、部は重量部であり、温度は℃で表されるか周囲温度であり、圧力は大気圧またはその近傍である。反応条件、例えば成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力ならびに記載されるプロセスから得られる生成物純度および収率を最適化するのに用いることができる他の反応範囲および条件のバリエーションおよび組み合わせは多数ある。
【００４１】
（予備研究）
試料をさまざまな溶液（例えば、ＤＭＥＭ、ＳＰＳ、ＰＢＳ、およびＵＨＫ）中で２８日間低温保存した。これらの試料をその後保存状態から取り出し、軟骨組織の軟骨細胞生存性および透過性（すなわち、軟骨組織の細胞外マトリックス完全性）を評価した。図１に示されるように、軟骨細胞生存性および増殖性を４つの異なる溶液中に２８日間保存された試料において評価した。ＤＭＥＭ中に保存された細胞は、生存性をレサズリン還元代謝アッセイで評価することにより示されるようにＳＰＳ、ＰＢＳ、およびＵＨＫ中に保存された試料よりかなり高い軟骨細胞生存性を示した。具体的には、図１のデータは平均ＲＦＵ／６ｍｍプラグ±１ｓｅ（標準誤差）として表され、＊はｐ＜０．０５での有意差を示す。細胞生存性における統計的有意差をＤＭＥＭおよび他の溶液中に保存された細胞間で２日目から観測した。ＤＭＥＭは培養の４日後に対照レベルに達した。未処理の対照値は図の上部に平均（破線）±１ｓｅ（陰影）として示される。これらの結果と軟骨組織マトリックス透過性の損失（図３に示される）との間の相関係数（Ｒ２）は保存後回復組織培養の４日間で増加した（図１）。これらのデータは複合細胞外タイプ培地（例えば、ＤＭＥＭ）が軟骨細胞機能の維持に最適であることを示し（図１）、これは細胞生存（すなわち、細胞生存性）と相関する。さらに、これらの試料の細胞内タイプ溶液（すなわち、ＳＰＳおよびＵＨＫ）中での約１ヶ月間の保存は生理的組織培養条件下での回復後増殖中の代謝を低下させた（図１）。同様に、これらの試料のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、栄養素を含まない細胞外製剤中での保存も回復後組織培養中に低い増殖性を示した。これらの観測はＤＭＥＭ中に保存された軟骨プラグの有意により良好な性能（すなわち、軟骨細胞生存性）の要因は栄養素であることを示す（図１）。
【００４２】
興味深いことに、ＤＭＥＭ中に保存された軟骨組織は保存後回復の４日後もっとも高い細胞生存性（すなわち、ＲＦＵ生存性値）およびもっとも低い導電性（ｍＳ／ｃｍ）を示した。この結果はＤＭＥＭがもっとも高い細胞生存性を促進したことを示したが、この結果は軟骨組織がＤＭＥＭ中に保存されている間に起こった軟骨組織マトリックス透過性の損失がもっとも大きかったことも示した。この観測により、細胞生存性の維持が細胞由来材料の放出をもたらし、細胞外マトリックス透過性に影響を及ぼしたという仮説が導かれた。具体的には、これらの研究は細胞生存性の維持と軟骨組織マトリックス透過性の損失との間に強い相関（Ｒ２＝０．９０）を示した（図２）。図２は具体的には、４つの異なる溶液中での低温保存による、高い細胞生存性と軟骨組織マトリックス透過性および導電性の損失との間の相関係数（Ｒ２）は、保存後回復組織培養の４日間で０．７８から０．９０まで増加したことを示す。
【００４３】
図１および２のデータに基づき、軟骨組織透過性を異なる溶液中で保存された試料においてさらに評価した。ＤＭＥＭ中に２８日間保存された試料（すなわち、ＤＭＥＭ２８）は他の溶液（すなわち、ＰＢＳ、ＵＨＫ、およびＳＰＳ）中に保存された試料より有意に低い導電性を示した。図３は、低張生理食塩水中での導電性を測定することにより評価された、低温保存の軟骨組織透過性に対する影響を示す。データは平均±１ｓｅとして表され、＊は１日目のＤＭＥＭ対照と２８日後の保存群との間の比較でｐ＜０．０５での有意差を示し、ｎ＝５はブタドナー当たりの試料数である。２８日目のＤＭＥＭ群は４つの独立した実験において有意に低かった。よって、これらのデータは、軟骨組織がＤＭＥＭ中に保存された場合の高い細胞生存性と低い透過性との間の相関をさらに示す。
【００４４】
（実施例）
実施例１：細胞外タイプ溶液中での保存中のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害の軟骨組織特性に対する影響を評価する
動物生成物を含まない培地を異なる濃度のＭＭＰ阻害剤（例えば、ドキシサイクリン）で製剤する。軟骨細胞生存性、軟骨組織化学的性質、透過性および他の生物材料特性を含む生物材料特性を少なくとも１ヶ月の低温保存期間にわたり比較する。生物材料試験は構築された方法［Ｙａｏ，２００２；Ｇｕ，２００４；Ｂｒｏｃｋｂａｎｋ，２０１１（以下の参考文献リスト参照）］を用いて行う。
【００４５】
ドキシサイクリンは歯周病の治療に臨床で用いられており、臨床使用に幅広く利用可能な唯一のＭＭＰ阻害剤である。ドキシサイクリンは、動物モデルおよびヒトにおいてＭＭＰ８、９、および１０活性を低減するというような軟骨組織に対する有益なインビボ効果を有することが示されている。さらに、インビトロ研究はドキシサイクリンがＭＭＰ活性に加えてＭＭＰ合成も阻害し得ることを示す。
【００４６】
例えば、ＴＩＭＰ、ＰＣＫ３１４５、前立腺分泌タンパク質９４のアミノ酸３１〜４５に対応する合成ペプチド、およびマリマスタット（ＢＢ−２５１６）を含む追加のＭＭＰ阻害剤も効果的であり得る。ＰＣＫ３１４５およびマリスタットはともに初期臨床研究において十分に忍容された。週に１回の間隔での溶液交換は必要ない可能性もあるが、軟骨組織質量の溶液体積に対する比は探求される必要があり得る。溶液交換なしでの長期保存には高いドキシサイクリン濃度が必要であり得る。
【００４７】
（実験設計）
ブタ軟骨プラグを入手し、これらのプラグを４℃（低温条件）で０〜３００μＭのドキシサイクリンを補充した動物生成物を含まないＤＭＥＭ中に保存する。特定の試料では、予備研究（図１〜３）と同様に培地を毎週交換し、他の試料については保存中に培地を交換しない。これらの２つの試料セット（すなわち、（１）毎週培地交換と（２）培地交換なし）を比較する。特定の態様では、同種移植片を一度保存した後再度処理する必要性は最小化することが望ましい。
【００４８】
（方法）
ブタの膝を成体家畜ヨークシャー雑種農場ブタ（２５Ｋｇ）から屠殺後に調達する。膝を調達した後、膝をヨウ素溶液を含むジップロックバッグに入れ、無菌解剖のため実験室まで氷の上に置いて輸送する。大腿骨頭軟骨円板形状プラグを無菌パンチを用いて用意する。５つのプラグの群を無菌容器中の保存溶液中に毎週の培地交換ありおよびなしで１〜２ヶ月間入れる。
【００４９】
（代謝活性）
レサズリン還元アッセイを用い、対照および処理後の軟骨プラグの代謝活性を評価する［Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，２０００；Ｂｒｏｃｋｂａｎｋ，２０１１］。組織プラグ（ｎ＝５／実験／ドナー）を２ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中で１時間インキュベートし、平衡化した後、２０％レサズリン還元アッセイ溶液を標準的な細胞培養条件下で３時間添加する。レサズリン還元アッセイ試薬は代謝活性の検出に基づく蛍光指示薬である。蛍光の量はマルチモードマイクロプレートリーダーにより５４４ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で２回測定する。この評価は毎日数日間行い、組織中の再加熱された細胞の特徴分析を可能にする（図２）。レサズリンは用いられる濃度では細胞毒性でないため、同じ組織試料を数回試験することができる。再加熱直後（０日目）の結果は細胞生存性を示し、１〜２日後の低下はアポトーシスによる細胞死を示し、増加は細胞増殖性を示す。組織プラグを次に乾燥させ、乾燥重量を求める。各実験群および未処理の対照について、細胞代謝活性は乾燥重量ｍｇ当たりまたは組織プラグ当たりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表す。
【００５０】
（他の生存性評価方法）
上述した代謝アッセイは主要な生存性評価方法であるが、追加の生存性評価アッセイを行ってもよい。例えば、細胞生存性は細胞の蛍光生／死染色によりさらに測定することができる。細胞は酵素消化による組織プラグからの放出後評価、および膜完全性に基づくトリパンブルー色素排除アッセイを用いて評価することもできる［Ｂｒｏｃｋｂａｎｋ，２０１１］。細胞はまた、細胞、軟骨細胞が実際にインビトロで接着および増殖することができるかを確認するため、ＤＭＥＭ中で少なくとも１週間培養してもよい。培養について細胞数およびデジタル画像分析を行ってもよい。
【００５１】
水、プロテオグリカン、およびコラーゲン含有量：材料特性測定後、試料を凍結乾燥し、水（多孔性）、プロテオグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）、およびコラーゲン（ヒドロキシプロリン）含有量を測定してもよい。試料を多孔性についてアルキメデスの原理に基づき［Ｇｕ，２００４］、Ｓ−ＧＡＧについてＦａｒｎｄａｌｅ（１９８２）により記載された方法を用い、ヒドロキシプロリン含有量についてＢｅｒｇｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｏｘｌｅｙ（１９７０）の方法を用いて分析する。
【００５２】
（導電性）
組織導電性をゼロ流体流動条件で、各試料を含有するプレキシグラスチャンバーの周りに配置された電流および電圧電極からなる標準的な装置［Ｇｕ２００２ａ；２００２ｂ］を用いて測定する。４線法およびＫｅｉｔｈｌｅｙソースメーターの組み合わせを用い、試料にかかる抵抗（Ｒ）を０．０１５ｍＡ／ｃｍ２の非常に低い電流密度で測定する。電流  感知マイクロメーターを用いて試料寸法を測定し、対応する導電性を下記の式：
【数１】
0006374872.tif 000002
であって、式中、Ａが断面積であり、ｈが組織試料の厚さである、式を用いて求める。導電性測定は等張または低張リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中で室温（２２℃）で行う。
【００５３】
（溶質拡散性）
ゼロ流体流動条件下、ＮａＣｌ溶液中の組織の導電性（χ）は、Ｍａｒｏｕｄａｓ（１９６８）：
【数２】
0006374872.tif 000003
であって、式中、Ｆｃがファラデー定数であり、φｗが水の体積分率（多孔性）であり、ｃ＋がカチオン（Ｎａ＋）濃度であり、ｃ−がアニオン（Ｃｌ−）濃度であり、Ｒが気体定数であり、Ｔが温度である、式によりＮａ＋およびＣｌ−拡散性（Ｄα、α＝＋、−）に関連づけられる。ｃ＋およびｃ−はドナン式［Ｍａｒｏｕｄａｓ，１９７５］：
【数３】
0006374872.tif 000004
用いて計算することができる。ここではｃＦは組織固定電荷密度（ＦＣＤ）であり、ｃ＊は浸漬溶液のＮａＣｌ濃度である。組織ＦＣＤは測定されたプロテオグリカン含有量から割り出す。導電性、ＦＣＤ、多孔性、および浸漬溶液の濃度のデータを用い、イオン拡散性は式３から計算することができる。この方法はブタおよびウシ軟骨組織の研究に用いることができる［Ｇｕ，２００４；Ｊａｃｋｓｏｎ，２００６］。
【００５４】
（圧縮集合弾性および流体力学的透過性）
軟骨試料の力学特性は閉じ込め圧縮クリープ試験を用いて測定する。この試験は動的粘弾性測定装置（Ｑ８００、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、デラウェア州ニューキャッスル）上で荷重負荷軸方向で行う。試料を閉じ込めチャンバーにおいて１分の圧縮自重負荷下で測定されたその初期高さでＰＢＳ中で平衡化させる（図４）。平衡化後、膨張応力を初期高さで記録し、試料に一定の圧縮応力を３時間加える。クリープデータは二相理論に曲線あてはめを行い、集合弾性ＨＡおよび流体力学的透過性を求める［Ｙａｏ，２００２］。
【００５５】
（実験データ）
実施例１においてすぐ上に記載した方法を用いる低温保存実験では、１頭のブタから４５片のブタ軟骨プラグを採取した。２０片の軟骨プラグを生存性試験（図５）に用いた。この生存性試験では、ドキシサイクリン濃度当たり４つのプラグを用いた。残りの２５片は力学試験（図６）に用いた。
【００５６】
図５に示すデータについて、各プラグ直径は６ｍｍとした。注射可能形態のドキシサイクリン（ＤＯＸＹ１００（商標））をＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ（イリノイ州シャンバーグ）から１，０２５．８９ダルトンの分子量で入手した。保存溶液はアスコルビン酸ｍｌ当たり１．４４ｍｇのＤＭＥＭ、０．９ｍｇのマニトール、および異なる濃度のドキシサイクリン（０μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、３００μＭ）を含有した。保存温度は４℃とした。図５に示すように、生存性試験は０週目から４週目まで記録した。図６に示すように、力学試験は４週目のみに行った。
【００５７】
（生存性評価）
レサズリン還元法を用いて軟骨細胞代謝活性を評価した。一般的にはアラマーブルーアッセイとして知られるレサズリン還元アッセイは、成長培地の化学還元に応じた蛍光および色の変化の両方により代謝活性を検出する水溶性蛍光生存性酸化−還元（ＲＥＤＯＸ）指示薬を組み入れる。代謝活性細胞はレサズリンを蛍光性レゾルフィンに還元する。未処理の対照および低温保存された組織試料を３７℃の培養条件に１時間入れ、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中での組織培養条件まで調節した。組織を次に３時間レサズリン希釈標準溶液でインキュベートした後、培地のアリコートをマイクロ滴定プレートウェルに入れ、５９０ｎｍの波長でマイクロ滴定プレート分光蛍光光度計で測定した。データは平均±１ｓｅ相対蛍光単位として表す。
【００５８】
（生物材料試験）
軟骨プラグは透過性についてもそれらの導電性を測定することにより評価し、軟骨組織マトリックス特性が保存中に変化したかを割り出した。試料は保存された直径６ｍｍの軟骨円板から角膜トレフィンを用いて５ｍｍ円筒状プラグを切断することにより用意した。試料を保存の０および１ヶ月後に試験し、軟骨表面を鋭刃を用いて手作業で整えた。導電性は低張生理食塩水中で試験した。各試料の高さは電流感知マイクロメーターで測定した。すべての導電性測定は低張生理食塩水中で室温（２２℃）で行った。導電性は生体組織の材料特性である。その値は、組織組成および構造によって決まる、組織内部の小イオンの拡散性に関連づけられる。
【００５９】
（統計的手法）
一元配置ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５を有意とみなす）を行い、細胞蛍光単位および導電性の平均値の差を割り出した。
生存性は用量依存的にドキシサイクリンの存在の影響を受けた。図５に示すように、ゼロ群（すなわち、ドキシサイクリンを添加していない群）はすべての時間点ですべての処理群より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。図５にさらに示すように、１０μＭ群は２〜４週目ですべての他の群より有意に高かった（図５；ｐ＜０．０５）。このデータは一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて平均±１標準誤差として表し、ｎ＝４である。
図６に示すように、導電性は０μＭ群において１ヶ月でより低く、すべてのドキシサイクリン群（すなわち、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、および３００μＭ）は時間ゼロ群と同様だった（図６；ｐ＜０．０５）。このデータは一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて平均±１標準誤差として表し、ｎ＝５である。
【００６０】
ドキシサイクリンを用いるこの実験の結果は、ＭＭＰの阻害が生細胞の存在下で導電性および透過性の維持を促進することを示す。例えば、これは１０μＭ群の生存性（図５）および導電性結果（図６）により示される。
【００６１】
実施例２：主要な培地成分の細胞内タイプ低張溶液中に保存された軟骨組織に対する影響を測定する
ステップＩ：動物生成物を含まない低温保存溶液をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で主要栄養素ありおよびなしで製剤する。ステップＩＩ：さまざまな濃度のドキシサイクリンを実施例２の新規細胞内タイプ保存製剤に添加してＭＭＰ活性を最小化する。
【００６２】
（実験設計）
ステップＩ：ＤＭＥＭ製剤ベースの栄養素カクテルをベルザー溶液、ＳＰＳ−１（Ｏｒｇａｎ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、イリノイ州アイタスカ）として市販される先導的な臨床臓器保存製剤に添加する。栄養素カクテルはＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、バージニア州マナサス、Ｃａｔ♯１０−０１４−ＣＭ）に用いられる濃度のＤ−グルコースおよびアミノ酸（グリシン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２０、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩脱水物およびＬ−バリン）からなる。改変製剤を元の製剤と比較する。ステップＩＩ：０〜３００μＭのドキシサイクリンを改変ベルザー溶液に添加する。細胞生存性、生物材料特性、および軟骨組織生物化学性質を軟骨プラグについて少なくとも１ヶ月の低温保存期間にかけて測定する。実施例１からの最適化された細胞外溶液との比較に最適なドキシサイクリン用量を選択する。溶液交換スケジュールについても実施例１に記載したとおり評価する。
【００６３】
ＦＤＡ認可製品であるためベルザー溶液（ＳＰＳ−１）およびドキシサイクリンを選択する。ステップＩ：予備データ（図２）においてＤＭＥＭを用いてより高い生存性値が得られるのはおそらく栄養成分のためであり、低温保存中の４℃での予想される低レベルの代謝（＜１０％）を支持する。ステップＩＩ：ＭＭＰ合成の増加は軟骨細胞生存性がステップＩにおける栄養補給により向上される場合起こり得るため、このステップは有用であり得る。
【００６４】
実施例３：細胞外タイプおよび細胞内タイプ溶液を比較する
（実験設計）
軟骨プラグ特性は実施例１および実施例２において記載した細胞外タイプおよび細胞内タイプ保存製剤中での保存後に評価する。プラグは２ヶ月の期間（例えば、時間０ならびに保存の１、４および８週間後）にかけて評価し、前記実施例に用いたアッセイに加えて遺伝子発現を評価する。２つの試料を各時間点で各群について評価し、実験を４回繰り返す（７群×２組×４実験＝５６個の試料）。
【００６５】
この実施例の目的は実施例１の細胞外タイプ溶液を実施例２の細胞内タイプ溶液と比較することである。上述した細胞生存性およびＥＣＭアッセイに加えて、遺伝子発現の分析を行い、軟骨細胞が未処理の軟骨組織中の軟骨細胞に対して適切な前軟骨遺伝子を発現しているかを確認する。
【００６６】
（方法）
遺伝子発現：試料を液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存する。細胞ＲＮＡ全体を単離し（ＲＮｅａｓｙキット、Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州）、ｃＤＮＡに逆転写し（ＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔＲＴキット、Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州）、その質について評価し、保存による遺伝子発現の変化をリアルタイムＰＣＲを用いて定量化する。表現型の維持（および／または表現型の損失）はＳｏｘ９、アグリカン、コラーゲンＩＩ型（脱分化マーカーであるコラーゲンＩ型に対して）、軟骨オリゴマーマトリックス、ＥＣＭ再吸収マーカー（ＭＭＰ−９）ならびにタンパク質および肥大性マーカー遺伝子（コラーゲン１０型およびアルカリホスファターゼ）の発現を評価することにより評価する。
【００６７】
他に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術および科学用語は開示される発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００６８】
当業者であれば、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの同等物を認識し、または日常的にすぎない実験を用いてこれらを確認することができる。こうした同等物は特許請求の範囲に含まれることを意図するものである。
【００６９】
（参考文献）
下記の参考文献のリストにおける引用は、少なくとも本文中に引用される理由で本明細書において参照により関連部分に組み入れられる。
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【図１】
0006374872.tif 000005
【図２】
0006374872.tif 000006
【図３】
0006374872.tif 000007
【図４】
0006374872.tif 000008
【図５】
0006374872.tif 000009
【図６】
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