(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I:
【化１】
0006317742.tif 000019
(式中、
n=3、4、5、6又は7であり、
R1は、水素、エタノイル、プロパノイル、ブタノイル、又は1つ以上のC1〜10アルキル、C1〜10アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ若しくはアミノ基で場合により置換されたベンゾイルであり、
R2は、メチル、エチル、又は1つ以上のC1〜10アルキル、C1〜10アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ若しくはアミノ基で場合により置換されたフェニルである)
によって表される化合物又はその塩若しくは溶媒和物。
【請求項２】
式Ia:
【化２】
0006317742.tif 000020
(式中、
n=3又は4であり、
R1は、水素、エタノイル、プロパノイル又はブタノイルである)
によって表される、請求項1に記載の化合物並びにその塩又は溶媒和物。
【請求項３】
n=3である、請求項1又は2に記載の化合物。
【請求項４】
R1が、水素又はエタノイルである、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
酢酸3-(2,5-ビスアジリジン-1-イル-4-メチル-3,6-ジオキソシクロヘキサ-1,4-ジエニル)-プロピルエステル又は2,5-ビスアジリジン-1-イル-3-(3-ヒドロキシプロピル)-6-メチル-1,4-ベンゾキノン又はその塩若しくは溶媒和物である、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項７】
1種以上のさらなる治療剤をさらに含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記さらなる治療剤が、がんの治療において使用するためのものである、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記さらなる治療剤が、シスプラチナム、ドセタキセル及びマイトマイシンCから選択される、請求項7又は8に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記さらなる治療剤がシスプラチナムである、請求項7又は8に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記さらなる治療剤が、ドセタキセル又はマイトマイシンCである、請求項7又は8に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
治療方法において使用するための、請求項6から11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
がんを治療する方法において使用するための、請求項6から11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記がんの細胞がDT-ジアホラーゼを過剰発現する、請求項13に記載の、がんを治療する方法において使用するための組成物。
【請求項１５】
前記化合物が、DT-ジアホラーゼによる酵素的還元を受けてヒドロキシキノンを生成する、請求項13又は14に記載の、がんを治療する方法において使用するための組成物。
【請求項１６】
前記がんが、脳のがん、白血病、非小細胞肺がん、結腸がん、CNSがん、メラノーマ、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん又は乳がんである、請求項13から15のいずれか一項に記載の、がんを治療する方法において使用するための組成物。
【請求項１７】
前記方法が、患者からがん細胞のサンプルを得るステップ、前記がん細胞がDT-ジアホラーゼを過剰発現するかどうかを決定するステップ、及び、前記がん細胞がDT-ジアホラーゼを実際に過剰発現する場合には、式Iによって表される化合物で前記患者を治療するステップを含む、請求項13から16のいずれか一項に記載の、がんを治療する方法において使用するための組成物。
【請求項１８】
がんを治療する方法において使用するための請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物であって、前記方法が、シスプラチナム、ドセタキセル及びマイトマイシンCから選択されるさらなる治療剤での治療を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
前記さらなる治療剤がシスプラチナムである、請求項18に記載の、がんを治療する方法において使用するための医薬組成物。
【請求項２０】
前記さらなる治療剤がドセタキセル又はマイトマイシンCである、請求項18に記載の、がんを治療する方法において使用するための医薬組成物。
【請求項２１】
前記がんの細胞が、DT-ジアホラーゼを過剰発現する、請求項18から20のいずれか一項に記載の、がんを治療する方法において使用するための医薬組成物。
【請求項２２】
前記化合物が、DT-ジアホラーゼによる酵素的還元を受けてヒドロキシキノンを生成する、請求項18から21のいずれか一項に記載の、がんを治療する方法において使用するための医薬組成物。
【請求項２３】
前記がんが、脳のがん、白血病、非小細胞肺がん、結腸がん、CNSがん、メラノーマ、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん又は乳がんである、請求項18から22のいずれか一項に記載の、がんを治療する方法において使用するための医薬組成物。
【請求項２４】
前記方法が、患者からがん細胞のサンプルを得るステップ、前記がん細胞がDT-ジアホラーゼを過剰発現するかどうかを決定するステップ、及び、前記がん細胞がDT-ジアホラーゼを実際に過剰発現する場合には、式Iによって表される化合物とさらなる治療剤とで前記患者を治療するステップを含む、請求項18から23のいずれか一項に記載の、がんを治療する方法において使用するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2012年7月30日に出願された英国特許出願GB1213486.2号に関するものであり、同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、キノン化合物、及び、その医学的な使用、詳細には、がんの治療のための使用に関する。より特定すれば、本発明は、DT-ジアホラーゼを発現するがん細胞において活性化させることが可能なプロドラッグである2,5-ジアジリジニルベンゾキノン化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
DT-ジアホラーゼ(DTD:DT-diaphorase)は、多くのタイプのがん組織、例えば乳房、結腸、肝臓、膀胱、胃、中枢神経系(CNS)及び肺の腫瘍において、並びにメラノーマにおいて、過剰発現する酵素である。多様なキノンプロドラッグが試験され、DTDを発現するがん細胞に及ぼすその効果が決定されてきた。DTDの発現は、原発性の非小細胞肺がん(NSCLC:non-small cell lung cancer)では正常肺の80倍まで、また、NSCLCでは小細胞肺がん(SCLC:small cell lung cancer)細胞株の400倍まで増加している例がある。DTDがキノン系プロドラッグを活性化することも公知であり、このことは、DTDを発現するがん細胞を選択的に標的化するためのアプローチとして提案されている。しかし、キノン系プロドラッグは、この生物学的機能を試して役立てようと設計及びテストされているものの、1つ以上の欠点があることが今日までに見出されている。
【０００４】
DTD活性の高い非小細胞肺がん異種移植片は、キノンプロドラッグであるマイトマイシンCの影響を受けやすいことが示されている例がある。しかし、マイトマイシンCは、非小細胞肺がんの治療において活性を有することが示されてはいるが、DTDに対しては比較的劣った基質であり(Beallら、Cancer Research、54、3196〜3201ページ、1994)、また、DTDによるマイトマイシンCの代謝はpH依存性であるため、pHが高くなるとDTDのpH依存性の阻害が起こる(Siegelら、Mol.Pharmacol.、44、1128〜1134ページ、1993)。
【０００５】
アパジコン(Apaziquone)又は(E)-5-(1-アジリニル(Azirinyl)-3-(ヒドロキシメチル)-2-(3-ヒドロキシ-1-プロペニル)-1-メチル-1H-インドール-4,7-ジオンは、マイトマイシンCと類縁のインドールキノンであり、この物質も、DTDによる活性代謝物への還元的変換の影響を受けやすい。この物質は、表在性膀胱がんの治療を目的とした臨床試験の対象となっている。しかし、アパジコンは、DTDによって効率的に還元されるものの、DNA架橋ではなく反応性酸素ラジカルを主に生じさせ、また、DNA鎖切断を専ら形成することが示されている。従来の「低酸素標的」薬剤であるアパジコンは、スフェロイド試験においては活性を示さず、スフェロイドの壊死中心部に向かってDTDの発現が増加することが実証された。この結果は、おそらく、アパジコンは細胞に浸透し細胞膜を通過する能力に乏しいということと関係している(Bibbyら、Int.J.Oncol.、3、661〜666ページ、1993)。
【０００６】
MeDZQ(2,5-ジアジリジニル-3,6-ジメチル-1,4-ベンゾキノン)は、DTD酵素に向けられたアプローチをがん治療に利用する有望な薬剤のさらなる一例である。最初の結果から、MeDZQは組換えヒトDTDの基質としてマイトマイシンCの150倍超有効であること、MeDZQはpH非依存性の代謝を有しており、pHが高くなってもDTDを不活性化させなかったことが示された(Beallら、上記文献、Rossら、Oncol.Res.、6、493〜500ページ、1994)。MeDZQは、DTDによる生体還元性の活性化を受けはするが、低酸素条件下での細胞傷害性を好気的条件下に比べてごく小規模に増加させるのみであることから、アパジコンとは明らかに異なる。さらに、種々のヒト腫瘍細胞株にわたってDTD活性とMeDZQ細胞傷害性との間の良好な相関を呈しているにも関わらず、有用な治療薬としてのMeDZQの製剤化は、その溶解性の乏しさによりうまくいっていない。
【０００７】
US6,156,744には、水溶性のキノンプロドラッグである2,5-ジアジリジニル-3-(ヒドロキシメチル)-6-メチル-1,4-ベンゾキノン、別名「RH1」、並びに、アセチル、ベンゾイル、ナフトイル基及び保護アミノ酸と一緒になって形成されるそのエステルが開示されている。US6,156,744には、RH1は、DTDによって還元され、DNAを架橋することによって、DTDを発現している細胞を選択的に殺すこと、及び、MeDZQより溶解度が高いことが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当技術分野においては、DTDによって活性化され、且つ、有効な薬物候補になれるような薬理学的特性を有するプロドラッグを開発する上での問題が未だに存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一般的には、本発明は、先行技術のRH1エステルは水溶液中で非常に不安定になる傾向があり、それにより治療剤としてのその有効性に限界が生じる、という本発明者らの洞察に基づいている。したがって、本発明は、腫瘍内での二電子還元によって選択的に活性化されるように設計された、薬理学的特性が改善されている新しいキノン系化合物に関する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、本発明の化合物は、がん細胞においてDT-ジアホラーゼによる酵素的二電子還元を受けて強力なDNA架橋剤であるヒドロキノンを生成するキノンプロドラッグであると考えている。DT-ジアホラーゼは種々のヒト腫瘍において過剰発現されるが、これは、本発明の化合物が、正常細胞と比較してがん細胞に対して選択的な細胞傷害性を有することを意味する。さらには、本発明は、キノンプロドラッグEs5の例に代表される本発明の化合物が、他のRH1エステルと比較して予想外の安定性を有し、且つ、DT-ジアホラーゼを発現する細胞に対するその選択性は、先行技術による化合物、例えばRH1及びそのエステルより高い、ということをさらに実証する。とりわけ、エステルEs5(化合物4.65)の半減期は24時間を超え、その加水分解生成物4.61も同様であることから、本発明の化合物は、RH1系の他のエステルの20倍を超える安定性を有することになる。
【００１０】
一般的には、本発明は、式I:
【００１１】
【化１】
0006317742.tif 000002
(式中、
n=2、3、4、5、6又は7であり、
R1は、水素、エタノイル、プロパノイル、ブタノイル、又は1つ以上のC1〜10アルキル、C1〜10アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ又はアミノ基で場合により置換されたベンゾイルであり、
R2は、メチル、エチル、又は1つ以上のC1〜10アルキル、C1〜10アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ又はアミノ基で場合により置換されたフェニルである)
によって表される化合物並びにその塩及び/又は溶媒和物、並びにそのような化合物を用いた治療の方法に関する。
【００１２】
より特定すれば、本発明は、式Ia:
【００１３】
【化２】
0006317742.tif 000003
(式中、
n=2、3又は4であり、
R1は、水素、エタノイル、プロパノイル又はブタノイルである)
によって表される化合物並びにその塩及び/又は溶媒和物に関する。
【００１４】
したがって、第1の態様において、本発明は、式I:
【００１５】
【化３】
0006317742.tif 000004
(式中、
n=3、4、5、6又は7であり、
R1は、水素、エタノイル、プロパノイル、ブタノイル、又は1つ以上のC1〜10アルキル、C1〜10アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ又はアミノ基で場合により置換されたベンゾイルであり、
R2は、メチル、エチル、又は1つ以上のC1〜10アルキル、C1〜10アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ又はアミノ基で場合により置換されたフェニルである)
によって表される化合物又はその塩及び/若しくは溶媒和物を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ia:
【００１７】
【化４】
0006317742.tif 000005
(式中、
n=3又は4であり、
R1は、水素、エタノイル、プロパノイル又はブタノイルである)
によって表される化合物並びにその塩及び/又は溶媒和物を提供する。
【００１８】
いくつかの好ましい実施形態において、n=3である。
【００１９】
好ましい一実施形態において、n=3であり、R1は、水素又はエタノイルであり、したがって本化合物は、酢酸3-(2,5-ビスアジリジン-1-イル-4-メチル-3,6-ジオキソシクロヘキサ-1,4-ジエニル)-プロピルエステル又は2,5-ビスアジリジン-1-イル-3-(3-ヒドロキシプロピル)-6-メチル-1,4-ベンゾキノンであり、本出願においてはこれをEs5及び4-61と呼ぶ。本発明の任意の態様において、任意選択のハロゲン置換基は、フルオロ、クロロ又はブロモ基であってよい。
【００２０】
さらなる一態様において、本発明は、本明細書で定義される式Iの化合物を含み、1種以上のさらなる治療剤を場合によりさらに含む医薬組成物を提供するが、例えば、さらなる治療剤は、がんの治療において使用するためのものである。好適な例としては、限定するものではないが、シスプラチナム(シスプラチン)、ドセタキセル、塩化コバルト、エピルビシン、シタラビン(ARA-C)及びマイトマイシンCを挙げることができる。好ましくは、治療剤の組合せは、相加又は相乗効果、より好ましくは相乗効果を実証する。
【００２１】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で定義される式Iの化合物を、シスプラチナム、ドセタキセル、塩化コバルト及びマイトマイシンCから選択される1種以上のさらなる治療剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。好ましくは、本組成物は、本明細書で定義される式Iの化合物を、シスプラチナム又は塩化コバルトと組み合わせて含む。
【００２２】
とりわけ好ましい組合せとしては、Es5(4.65)とシスプラチナム、及び、Es5(4.65)と塩化コバルトが挙げられる。
【００２３】
さらなる一態様において、本発明は、治療方法において使用するための、本明細書で定義される式Iの化合物、又は本明細書で定義される式Iの化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
さらなる一態様において、本発明は、がんを治療する方法において使用するための、本明細書で定義される式Iの化合物、又は本明細書で定義される式Iの化合物を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、本発明の化合物は、がん細胞がDT-ジアホラーゼを過剰発現するタイプのがんの治療のために使用される。この場合、本発明の化合物は、プロドラッグとして作用し、DT-ジアホラーゼによる酵素的還元を受けて、がん細胞に対する細胞傷害性を有する化合物であるヒドロキシキノンを生成する。例示すれば、本発明は、脳のがん、白血病、非小細胞肺がん、結腸がん、CNSがん、メラノーマ、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん又は乳がんの治療において使用することができる。したがって、本発明には、本発明の化合物での治療に対するがん罹患個体の適合性を決定することが含まれ得る。好ましくは、これには、患者からがん細胞のサンプルを得るステップ、該がん細胞がDT-ジアホラーゼを過剰発現するかどうかを決定するステップ、及び、該がん細胞がDT-ジアホラーゼを実際に過剰発現する場合には、式Iによって表される化合物で該患者を治療するステップが含まれる。この方法には、式Iによって表される化合物での治療に対して個体が適合するか否かを決定するために、個体にDTDの過剰発現を割り当てるステップが含まれ得る。これには、治療が有効である可能性が高い個体と、治療が有効である可能性があまり高くない又はその可能性が低い個体(例えば、その個体由来のがん細胞が、本発明の化合物を細胞傷害性のヒドロキノンに効率的に還元することが可能なレベルでDT-ジアホラーゼを発現しない場合がある)とを区別する尺度で、DTDの過剰発現を割り当てるステップが含まれ得る。
【００２５】
さらなる一態様において、本発明は、がんを治療する方法において使用するための本明細書で定義される式Iの化合物を提供し、該方法は、シスプラチナム、ドセタキセル、塩化コバルト及びマイトマイシンCから選択されるさらなる治療剤での治療を含む。とりわけ好ましい組合せとしては、Es5(4.65)とシスプラチナム、Es5(4.65)と塩化コバルト、Es5(4.65)とドセタキセル、及び、Es5(4.65)とマイトマイシンCが挙げられる。
【００２６】
さらなる一態様において、本発明は、がんを治療する方法であって、その治療を必要とする患者に、治療有効量の、本明細書で定義される式Iの化合物、又は本明細書で定義される式Iの化合物を含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００２７】
さらなる一態様において、本発明は、がんを治療する方法であって、その治療を必要とする患者に、治療有効量の、本明細書で定義される式Iの化合物と、シスプラチン、ドセタキセル、塩化コバルト及びマイトマイシンCから選択されるさらなる治療剤とを投与することを含む方法を提供する。
【００２８】
本発明は、記載されている態様及び好ましい特徴の組合せを含むが、但し、そのような組合せが、明らかに許容できない場合又は回避すべきであると明確に述べられている場合を除く。次に、本発明の実施形態を、限定ではなく例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】対応したs.c.又はi.p.対照に対する細胞生存率(%)として表される治療の比較を示すin vivo実験の結果のグラフ表示である。
【図２】対応したs.c.又はi.p.対照に対する細胞生存率(%)として表される細胞株の比較を示すin vivo実験の結果のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
DT-ジアホラーゼ
本発明の化合物、医薬組成物及び医学的使用は、DT-ジアホラーゼ(DTD)、すなわち当技術分野においては別名NQO1及びNAD(P)H:キノン受容体オキシドレダクターゼ1(EC1.6.99.2)としても公知の酵素を過剰発現するがんの治療にとりわけ適している。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、DTDを過剰発現するがん細胞は、比較的不活性なキノンプロドラッグをがん細胞内での酵素的二電子還元により選択的に活性化させて強力なDNA架橋剤であるヒドロキノンを生成し、これががん細胞に対して細胞傷害性を有することになると一般に考えられている。この治療的用途の選択性は、DTDが正常細胞と比較して種々のヒト腫瘍において過剰発現されることから達成でき、そのような腫瘍としては、脳のがん、白血病、非小細胞肺がん、結腸がん、CNSがん、メラノーマ、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び乳がんが挙げられる(Zappaら、J.Histochem.Cytochem.、49、1187〜1188ページ、2001、Tudorら、Anti-Cancer Drugs、16、381〜391ページ、2005、Dansonら、Annals of Oncology、22、1653〜1660ページ、2011)。がん細胞によるDTDの過剰発現は、細胞の野生型表現型の結果であることが一般に好ましい。代替的又は追加的に、DTDの過剰発現は、DTDをコードする核酸を用いて標的がん細胞を形質転換させることによって生じさせてもよい(Dansonら、上記文献を参照のこと)。
【００３１】
しかし、本化合物のこうした用途は本発明の好ましい一態様であるが、2,5-ジアジリジニルベンゾキノン化合物は、DTDをそれほど過剰発現しない一部の形態のがん、例えば白血病に対して細胞傷害性を有することも、当技術分野において公知である。また、この一般的タイプの化合物が還元を受けると、がん細胞において見出される他のタイプの還元酵素の作用を通して細胞傷害性の生成物を形成する場合もあることも公知である。
【００３２】
したがって、DTDの発現は、本発明に関する場合、本明細書において開示する化合物及び組成物を使用して所与のタイプのがんを治療することができるかどうかを決定するための、並びに/又は、治療対象となる患者の選定の規準として、有用な手段である。どちらの場合も、これには、がん細胞のサンプルをテストして、DTDが過剰発現されるかどうか、つまり、そのタイプのがん又は個々の患者に治療が有効である可能性が高いかどうかを、例えば、Husseinら、British Journal of Cancer、(2009)、101、55〜63ページで実証されているように決定することが含まれ得る。
【００３３】
したがって、本発明は、がん細胞のサンプルをテストして、あるタイプのがん又は所与の個体を本発明により治療することができるかどうかを決定することを含む。これは、DT-ジアホラーゼタンパク質がサンプルの細胞において、例えば正常細胞における発現と比較して高いレベルで存在するかどうかを決定することによって、又は、DT-ジアホラーゼの遺伝子発現を決定することによって、行うことができる。サンプルは、個体由来のがん細胞のものであってよい。一般に、過剰発現は、対照との比較で、例えば、好ましくは同一組織由来の非がん性細胞との比較で、決定することができる。この方法には、処置が有効である可能性が高い個体と、治療が有効である可能性があまり高くない又はその可能性が低い個体とを区別する尺度で、DTDの過剰発現を割り当てるステップが含まれ得る。
【００３４】
したがって、一態様において、本発明は、患者が、DT-ジアホラーゼを過剰発現するがんを有しているかどうかを決定することを含み、これは、DT-ジアホラーゼタンパク質発現の分析によって実行することができる。
【００３５】
好ましくは、DT-ジアホラーゼタンパク質の有無又は量は、DT-ジアホラーゼタンパク質又はその断片と特異的に結合することが可能な結合剤を用いて決定し得る。好ましいタイプのDT-ジアホラーゼタンパク質結合剤は、DT-ジアホラーゼ又はその断片と特異的に結合することが可能な抗体である。抗体は、それ自体を検出することができるように標識してもよく、又は、1つ以上のさらなる種との反応後に検出が可能なものであってもよく、後者の場合の検出には、例えば、標識されている若しくは検出可能な結果をもたらすことが可能な二次抗体をELISAタイプのアッセイなどにおいて使用する。代替手段として、標識された結合剤をウェスタンブロットに用いることでDT-ジアホラーゼタンパク質を検出してもよい。一部の形態のがんはNAD(P)Hデヒドロゲナーゼ[キノン]遺伝子に突然変異を有すること、つまり、この遺伝子が、機能的に不活性なDT-ジアホラーゼをコードしていることを特徴とするが、このような場合についても、不活性な又は低下したレベルのDTジアホラーゼを有しているため本発明による化合物での治療にあまり応答しない個体である、と決定することができることも公知である。このことは、SNP分析又は制限酵素断片長多型(RFLP:restriction fragment length polymorphism)によって決定することができる。
【００３６】
代替的又は追加的に、DT-ジアホラーゼタンパク質の有無を決定するための方法は、腫瘍サンプルに対して、例えば、免疫組織化学的(IHC:immunohistochemical)分析を用いて実行することができる。IHC分析は、パラフィン固定サンプル又は凍結組織サンプルを用いて実行することができ、これには一般に、サンプルを染色してDT-ジアホラーゼタンパク質の有無及び位置をハイライトすることが含まれる。
【００３７】
1つの具体例においては、Zappaら(上記文献)において用いられているアプローチに従って、免疫組織化学(IHC)を用いてホルマリン固定パラフィン包埋組織のサンプルを分析することでDTD発現を検出することができ、ここで使用するのは、精製された組換えヒトDTDタンパク質で免疫化されたBALB-cマウスに由来する抗DTDモノクローナル抗体(IgG1)である(Siegelら、Clin.Cancer Res.、4、2065〜2070ページ、1998)。このアプローチでは、組織培養物中で産生された非ヒト反応性のモノクローナルマウス抗体(IgG1)を陰性対照試薬として使用する。組織切片(3μm)は、キシレン中で脱パラフィンし、段階的な濃度のアルコール(graded alcohol)により再水和し、マイクロウエーブ照射してもよい。内因性ペルオキシダーゼ活性及び非特異的結合は、それぞれ、ペルオキシダーゼブロッキング剤(DAKO EnVision Kit、Carpinteria、CA)及び20%正常ウサギ血清を添加することによってブロックすることができる。引き続き、連続切片を、抗DTD抗体又は対照抗体のいずれかで、次いで二次抗体(標識されたポリマーHRP抗マウス抗体)で、インキュベートしてもよい。免疫検出は、基質-色素原溶液(過酸化水素及び3,3-ジアミノベンジジン色素原)を用いて実行する。スライドは、ヘマトキシリンで対比染色する。免疫染色(褐色染色)の強度について視覚的に評点を付け、0(陰性)、+1(非常に弱い)、+2(弱い)、+3(強い)、+4(非常に強烈)とした。このタイプのアッセイでは、非特異的な抗体を使用した場合、対照切片には免疫染色は実質的に生じないはずである(評点0)。一方、本発明により治療可能ながん又は個々の患者由来のがん細胞においては、IHCテストにおける染色の強度は+3又は+4となることが予想される。
【００３８】
さらなる例では、DTD活性は、550nm、25℃でのシトクロムcの減少を測定することにより分光光度法で決定してもよい。Chenら、Biochem J.、284、855〜860ページ、1992を参照のこと。このアッセイは、25mMトリス緩衝液、pH7.5、200μM NAD(P)H、0.8μMメナジオン及び30μMシトクロムcを含有するアッセイ混合液(1mL)を使用する。このアッセイでは、メナジオンが電子受容体であり、シトクロムcは、形成されたメナジオールを再酸化するために使用される。他のキノンレダクターゼの効果は、このアッセイにおいては、DTDの選択的阻害剤である1μmジクマロールを添加することによって区別することができる。
【００３９】
代替的又は追加的に、DT-ジアホラーゼ遺伝子発現の決定には、サンプル中のDT-ジアホラーゼmRNAの有無又は量を決定することが含まれ得る。これを行うための方法は、当業者には周知である。例として、そのような方法としては、(i)標識プローブであり、FISHなどの手法を用いることで、DT-ジアホラーゼ核酸とハイブリダイズすることが可能なものを使用して、及び/又は(ii)DT-ジアホラーゼ転写物がサンプル中に存在するかどうかを決定するために、DT-ジアホラーゼ核酸配列に基づく1つ以上のプライマーが含まれているPCRを使用して、DT-ジアホラーゼmRNAの有無を決定することが挙げられる。プローブは、マイクロアレイ中に含まれる配列として固定化することもできる。
【００４０】
好ましくは、DT-ジアホラーゼmRNAの検出は、腫瘍のサンプルからRNAを抽出すること、及び、DT-ジアホラーゼ発現を、具体的には定量リアルタイムRT-PCRを用いて測定することによって、実行する。代替的又は追加的に、DT-ジアホラーゼの発現は、腫瘍サンプルから抽出されたRNAを使用して、マイクロアレイ分析を用いて評価検討することも可能である。マイクロアレイ分析は、基板上に固定化された複数のプローブを使用してアレイを形成することで遺伝子群のmRNAレベルを測定するものである。
【００４１】
上述のように、タンパク質発現若しくは遺伝子発現又はその両方のいずれを用いてDTD過剰発現を決定するかについての選定は、手法のそれぞれの精度及び感度、偽陽性及び偽陰性の発生頻度、並びに、経済的若しくは他の現実的な理由が生じた場合の異なるアッセイの利用可能性を考慮した異なるアプローチの利点と欠点の知識に照らして、当業者が決定することである。
【００４２】
医薬組成物
本明細書において開示する、がんの治療のための本発明の化合物は、単独で投与してもよいが、一般には、本化合物を、1種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝液、安定化剤、保存剤、滑沢剤、又は当業者に周知の他の材料、及び、他の治療的又は予防的な薬剤を場合により追加で含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。医薬組成物の成分の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第20版、2000、Lippincott、Williams & Wilkins発行に記載されている。
【００４３】
これらの化合物又はその誘導体は、本発明においては、がん、とりわけ、DTDを過剰発現するがんの治療のために使用することができる。本明細書において使用する場合、治療剤の「誘導体」としては、塩、配位錯体、エステル、例えばin vivoで加水分解可能なエステル、遊離酸若しくは塩基、水和物、プロドラッグ、又は脂質、及びカップリングパートナーが挙げられる。
【００４４】
本発明の化合物の塩は、好ましくは、生理学的に忍容性良好且つ非毒性である。塩の多くの例は、当業者に公知である。酸性基を有する化合物、例えばリン酸化合物又は硫酸化合物は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属、例えばNa、K、Mg及びCaと一緒に、また、有機アミン、例えばトリエチルアミン及びトリス(2-ヒドロキシエチル)アミンと一緒に、塩を形成することができる。塩は、アミンなど塩基性基を有する化合物と、塩酸、リン酸若しくは硫酸などの無機酸、又は酢酸、クエン酸、安息香酸、フマル酸若しくは酒石酸などの有機酸とで形成することができる。酸性基と塩基性基の両方を有する化合物は、内部塩を形成することができる。
【００４５】
エステルは、化合物中に存在するヒドロキシル又はカルボン酸基と適切なカルボン酸又はアルコール反応パートナーとの間で、当技術分野で周知の手法を用いて形成することができる。
【００４６】
本化合物のプロドラッグである誘導体は、in vivo又はin vitroで親化合物のうちの1つに変換可能である。典型的には、本化合物のプロドラッグ形態では本化合物の生物活性のうち少なくとも1つは低下していると予想されるが、プロドラッグが変換されると活性化して、本化合物又はその代謝産物を放出できる。プロドラッグの投与は、例えば、親化合物に関する保存安定性及び/又は製剤化/バイオアベイラビリティーの改善に有利であり得る。
【００４７】
他の誘導体としては、本化合物のカップリングパートナーが挙げられ、この場合、例えば本化合物と化学的にカップリングするか又は本化合物と物理的に会合することによって、本化合物はカップリングパートナーと連結している。カップリングパートナーの例としては、標識若しくはレポーター分子、支持基材、担体若しくは輸送分子、エフェクター、薬物、抗体又は阻害剤が挙げられる。カップリングパートナーは、本化合物上の適切な官能基、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基又はアミノ基を介して、本発明の化合物と共有結合できる。他の誘導体としては、リポソームを用いて本化合物を製剤化したものが挙げられる。
【００４８】
用語「薬学的に許容される」は、本明細書において使用する場合、適切な医学的判断の範囲内で、対象(例えばヒト)の組織と接触させた使用に適しており過剰な毒性、刺激、アレルギー応答又は他の問題若しくは合併症を伴わず合理的な利益/リスク比に見合う化合物、材料、組成物及び/又は剤形を包含する。各担体、賦形剤等も、他の製剤原料と適合性があるという意味で、「許容される」ものでなければならない。
【００４９】
本発明によるDTDを過剰発現するがんの治療のための本明細書において開示する活性剤は、好ましくは、個体に「予防有効量」又は「治療有効量」(場合によるが、予防が治療と判断されることもある)で投与するためのものであり、この量は、その個体への有益性を示すのに十分な量である。実際の投与量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療しようとする病態の性質及び重症度に応じて決まると予想される。治療の処方、例えば、用量等についての決定は、総合診療医及び他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、治療しようとする障害、個々の患者の病態、送達部位、投与方法、及び専門家に公知の他の因子を考慮する。上述の手法及びプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第20版、2000、Lippincott、Williams & Wilkinsに見出すことができる。組成物は、単独で、又は、他の治療と組み合わせて、同時若しくは逐次的に、治療しようとする病態に応じて、投与してもよい。
【００５０】
製剤は、単位剤形で好都合に提供することができ、薬学分野において周知の任意の方法によって調製することができる。そのような方法は、活性化合物を担体と合せるステップを含み、担体は、1つ以上の副原料を構成し得る。一般には、製剤は、活性化合物を液体担体又は微粉状の固体担体又はその両方と均一且つ密接に合せ、次いで必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【００５１】
DTDを過剰発現するがんの治療のための本明細書において開示する薬剤は、全身/末梢投与であるか所望の作用部位での投与であるかにかかわらず任意の好都合な投与経路によって対象に投与することができ、そのような投与としては、限定されるものではないが、経口投与(例えば摂取による)、局所投与(例えば、経皮、鼻腔内、経眼、頬側及び舌下など)、経肺投与(例えば、エアゾール剤などを用いての口又は鼻などを通じた吸入又は通気治療による)、経直腸投与、経膣投与、非経口投与、例えば、注射、例としては皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、くも膜下腔内、脊髄内、関節包内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下及び胸骨下(intrasternal)注射によるもの、皮下又は筋肉内などへのデポ剤の埋込みによるものが挙げられる。
【００５２】
経口投与(例えば摂取による)に適した製剤は、それぞれが所定の量の活性化合物を含有する、カプセル剤、カシェ剤若しくは錠剤などの個別の単位として、粉末剤若しくは顆粒剤として、水性若しくは非水性液の形態の溶液剤若しくは懸濁液剤として、又は、水中油型の液体乳剤若しくは油中水型の液体乳剤として、ボーラス剤として、舐剤として、又はペースト剤として、提供してもよい。
【００５３】
非経口投与(例えば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内及び皮内などへの注射による)に適した製剤としては、水性及び非水性の、等張性でパイロジェンフリーの滅菌注射溶液剤(酸化防止剤、緩衝液、保存剤、安定化剤、静菌薬、及び、注射を受ける対象者の血液と一緒になると製剤を等張性にする溶質を含有してもよい)、並びに、水性及び非水性の滅菌懸濁液剤(懸濁化剤及び増粘剤、並びに、化合物を血液成分又は1つ以上の器官に対して標的化するように設計されたリポソーム又は他の微粒子系を含んでいてもよい)が挙げられる。そのような製剤において使用するための好適な等張性のビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液又は乳酸リンゲル注射液が挙げられる。典型的には、溶液剤中の活性化合物の濃度は、およそ1ng/mlから10μg/mlである。製剤は、単位用量又は複数回用量用の密封容器、例えばアンプル及びバイアルに入った形態で提供することができ、滅菌液体担体、例えば注射用水を使用直前に添加することのみが必要となるフリーズドライ加工された(凍結乾燥された)状態で保存することができる。用事調製注射溶液剤及び懸濁液剤は、滅菌粉末剤、顆粒剤及び錠剤から調製してもよい。製剤は、活性化合物を血液成分又は1つ以上の器官に対して標的化するように設計されたリポソーム又は他の微粒子系の形態であってもよい。
【００５４】
組合せ
がんの治療(treatment cancer)のための本明細書において開示する薬剤を含む組成物は、標準的な化学療法薬投与法と組み合わせて、又は放射線療法と共に、本明細書に記載の方法で使用してもよい。他の化学療法剤の例としては、アムサクリン(Amsidine)、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン(Xeloda)、カルボプラチン、カルムスチン(BCNU)、クロラムブシル(Leukeran)、シスプラチン(シスプラチナム)、クラドリビン(Leustat)、クロファラビン(Evoltra)、塩化コバルト、クリサンタスパーゼ(Erwinase)、シクロホスファミド、シタラビン(ARA-C)、ダカルバジン(DTIC)、ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン、ドセタキセル(Taxotere)、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド(Vepesid、VP-16)、フルダラビン(Fludara)、フルオロウラシル(5-FU)、ゲムシタビン(Gemzar)、ヒドロキシウレア(ヒドロキシカルバミド、Hydrea)、イダルビシン(Zavedos)、イホスファミド(Mitoxana)、イリノテカン(CPT-11、Campto)、ロイコボリン(フォリン酸)、リポソーム化ドキソルビシン(Caelyx、Myocet)、リポソーム化ダウノルビシン(DaunoXome(登録商標))、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン(Eloxatin)、パクリタキセル(Taxol)、ペメトレキセド(Alimta)、ペントスタチン(Nipent)、プロカルバジン、ラルチトレキセド(Tomudex(登録商標))、ストレプトゾシン(Zanosar(登録商標))、テガフールウラシル(Uftoral)、テモゾロミド(Temodal)、テニポシド(Vumon)、チオテパ、チオグアニン(6-TG)(Lanvis)、トポテカン(Hycamtin)、トレオスルファン、ビンブラスチン(Velbe)、ビンクリスチン(Oncovin)、ビンデシン(Eldisine)及びビノレルビン(Navelbine)が挙げられる。好ましくは、他の治療剤は、相加又は相乗効果をもたらすように選択される。
【００５５】
さらに、本明細書には、併用療法の方法であって、その治療を必要とする患者に、本明細書で定義される式Iの化合物を、さらなる治療剤、好ましくは化学療法剤と組み合わせて使用する方法も記載されている。したがって、さらなる一態様において、本発明は、がんを治療する方法であって、その治療を必要とする患者に、治療有効量の、本明細書で定義される式Iの化合物と、シスプラチナム、ドセタキセル、塩化コバルト及びマイトマイシンCから選択されるさらなる治療剤とを投与することを含む方法を提供する。さらなる治療剤は、同時投与してもよく、又は、この投与は逐次的なものであってもよい。いくつかの好ましい実施形態において、さらなる治療剤は、シスプラチナム又は塩化コバルトである。いくつかの好ましい実施形態において、第2の治療剤は、ドセタキセル又はマイトマイシンCである。とりわけ好ましい組合せとしては、Es5(4.65)とシスプラチナム、Es5(4.65)と塩化コバルト、Es5(4.65)とドセタキセル、及び、Es5(4.65)とマイトマイシンCが挙げられる。がんは、例えば、脳のがん、白血病、非小細胞肺がん、結腸がん、CNSがん、メラノーマ、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん又は乳がんであってよい。
【００５６】
いくつかの実施形態において、がん細胞は、DT-ジアホラーゼを過剰発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で定義される式Iの化合物は、DT-ジアホラーゼによる酵素的還元を受けてヒドロキシキノンを生成する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、この方法は、患者からがん細胞のサンプルを得るステップ、該がん細胞がDT-ジアホラーゼを過剰発現するかどうかを決定するステップ、及び、該がん細胞がDT-ジアホラーゼを実際に過剰発現する場合には、式Iによって表される化合物とさらなる治療剤とで該患者を治療するステップを含む。
【００５８】
さらなる一態様において、本発明は、本明細書で定義される式Iの化合物を含み、1種以上のさらなる治療剤を場合によりさらに含む医薬組成物を提供するが、例えば、さらなる治療剤は、がんの治療において使用するためのものである。好適な例としては、限定するものではないが、シスプラチナム、ドセタキセル、塩化コバルト、エピルビシン、シタラビン(ARA-C)及びマイトマイシンCを挙げることができる。好ましくは、組成物中の治療剤の組合せは、相加又は相乗効果、より好ましくは相乗効果を示す。
【００５９】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で定義される式Iの化合物と、シスプラチナム、ドセタキセル、塩化コバルト及びマイトマイシンCから選択される1種以上のさらなる治療剤との組合せを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、本組成物は、本明細書で定義される式Iの化合物を、シスプラチナム又は塩化コバルトと組み合わせて含む。
【００６０】
とりわけ好ましい組合せとしては、Es5(4.65)とシスプラチナム、及び、Es5(4.65)と塩化コバルトが挙げられる。
【００６１】
したがって、さらなる一態様において、本発明は、本明細書に記載する治療方法において使用するための、本明細書で定義される式Iの化合物と、さらなる治療剤、好ましくは、本明細書で定義されるさらなる治療剤との組合せを含む医薬組成物を提供する。
【００６２】
一実施形態において、本発明は、治療方法において使用するための、Es5(4.65)とシスプラチナムとを含む組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する治療方法において使用するための、Es5(4.65)と塩化コバルトとを含む組成物を提供する。
【００６３】
投与
in vivoでの投与は、治療過程の全体を通して、単回用量の形態で、又は持続的に、又は間欠的に(例えば、適切な間隔をおいて分割用量の形態で)、行うことができる。投与の最も有効な手段及び用量を決定する方法は、当業者に周知であり、治療に使用される製剤、治療の目的、治療しようとする標的細胞、及び治療しようとする対象によって変更されると予想される。単回又は複数回投与は、治療担当医が選択した用量レベル及びパターンで実行することができる。
【００６４】
一般には、活性化合物の好適な用量は、1日当たり、対象の体重1キログラム当たりおよそ100μgからおよそ250mgの範囲である。活性化合物が塩、エステル、プロドラッグなどである場合には、投与量は親化合物を基準として算出されるため、使用することになる実際の重量は比例して増加する。
【実施例】
【００６５】
材料及び方法
Es5の合成
【００６６】
【化５】
0006317742.tif 000006
【００６７】
1,4-ジメトキシ-2-メチルベンゼン2[1]
【００６８】
【化６】
0006317742.tif 000007
ジエチルエーテル(90cm3)中の2,5-ジメトキシトルエン1(9.0g、59.21mmol)を、クロロホルム(30cm3)中の一塩化ヨウ素(10.17g、62.65mmol)の撹拌溶液に30分かけて添加した。この混合物を一晩撹拌してから、10%チオ硫酸ナトリウム(150cm3)を添加した。有機物を2×75cm3のジエチルエーテルで抽出した。有機物を合わせ、飽和NaHCO3水溶液(150cm3)、ブライン(100cm3)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、さらに真空下で乾燥させた。その結果得られた固体をメタノールから再結晶化させて、標題化合物を赤色の固体2として得た(11.3g、69%)。
Rf0.52(SiO2、Hex:EtOAc=3:1)。
融点80〜82℃(文献では81〜82℃(Reedら、JACS、120(38)、9729〜9734ページ、1998)。
1H NMR (400MHz, CDCl3) 2.12 (3H, s, CH3), 3.72 (3H, s, OCH3), 3.75 (3H, s, OCH3), 6.60 (1H, s, ArH), 7.10 (1H, s, ArH) ppm.
【００６９】
3-(2,5-ジメトキシ-4-メチルフェニル)-プロパ-2-イン-1-オール3(Sato、J.Org.Chem.、66(1)、309〜314ページ、2000)
【００７０】
【化７】
0006317742.tif 000008
ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウムクロリド(151mg、0.215mmol)及びヨウ化銅(273mg、1.43mmol)を入れたフラスコに、1,4-ジメトキシ-2-メチルベンゼン2(2.0g、7.20mmol)のベンゼン(40cm3)溶液を添加した。この混合物を0℃に冷却してから、ジエチルアミン(5.19cm3、50.35mmol)及びプロパルギルアルコール(2.1cm3、36.0mmol)を添加した。この混合物を一晩撹拌させてから、飽和塩化アンモニウム(2cm3)でクエンチし、次いで、真空下で濃縮した。次いで、酢酸エチルを添加し(75cm3)、これをブライン(75cm3)で洗浄し、乾燥(MgSO4)させ、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、Hex:EtOAc=3:1)によって精製を達成し、標題化合物3を淡黄色の油として得た(1.33g、90%)。
Rf0.52(SiO2、Hex:EtOAc=1:1)。
1H NMR (400MHz, CDCl3) 2.15 (3H, s, CH3), 2.55 (1H, br s, OH), 6.68 (3H, s, OCH3), 3.78 (3H, s, OCH3), 4.45 (2H, s, CH2), 6.62 (1H, s, ArH), 6.68 (1H, s, ArH) ppm.
【００７１】
酢酸3-(2,5-ジメトキシ-4-メチルフェニル)-プロパ-2-イニルエステル4
【００７２】
【化８】
0006317742.tif 000009
ジクロロメタン(40cm3)中のアルコール(4.47g、21.69mmol)の撹拌溶液に、トリエチルアミン(4.39cm3、43.38mmol)を添加した。この混合物を0℃に冷却してから、塩化アセチル(2.55cm3、32.48mmol)を滴加した。この混合物を室温に温め、一晩撹拌した。この混合物を1M HCl(15cm3)でクエンチし、有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(30cm3)、ブライン(30cm3)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、真空下で蒸発させて、標題化合物である黄色の油4を得た(5.08g、94%)。
Rf0.61(SiO2、Hex:EtOAc=1:1)。
1H NMR (400MHz, CDCl3) 2.08 (3H, s, CH3), 2.18 (3H, s, CH3), 3.72 (3H, s, OCH3), 3.80 (3H, s, OCH3), 4.90 (2H, s, CH2), 6.62 (1H, s, ArH), 6.78 (1H, s, ArH) ppm.
【００７３】
酢酸3-(2,5-ジメトキシ-4-メチルフェニル)-プロピルエステル5
【００７４】
【化９】
0006317742.tif 000010
アルキン3(5.01g、20.2mmol)をメタノール(100cm3)に溶解し、Pd/C(100mg)を添加した。反応フラスコを水素ガスでパージし、一晩撹拌した。反応混合物をセライトろ過し、溶媒を真空下で除去して、標題化合物5を褐色の油として得た(4.98g、98%)。
Rf0.36(SiO2、Hex:EtOAc=1:1)。
1H NMR (400MHz, CDCl3) 1.98 (2H, m. CH2), 2.10 (3H, s, CH3), 2.24 (3H, s, CH3), 2.68 (2H, m, CH2), 3.82 (3H, s, OCH3), 3.86 (3H, s, OCH3), 4.15 (2H, m, CH2), 6.66 (1H, s, ArH), 6.70 (1H, s, ArH) ppm.
13C NMR (400MHz, CDCl3) 14.1, 16.1, 21.0, 26.7, 28.9, 32.3, 55.9, 56.1, 64.3, 112.8, 113.8, 124.9, 127.4, 151.2, 151.4, 171.22.
【００７５】
酢酸3-(4-メチル-3,6-ジオキソシクロヘキサ-1,4-ジエニル)-プロピルエステル6
【００７６】
【化１０】
0006317742.tif 000011
5(1.26g、4.99mmol)のアセトニトリル(15cm3)溶液に、水(10cm3)中の硝酸セリウムアンモニウム(5.50g、9.99mmol)を滴加した。この混合物を1時間撹拌してから、有機物をジクロロメタン(3×25cm3)で抽出し、ブライン(25cm3)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、真空下で濃縮して、標題化合物を褐色の油6として得た(756mg、68%)。
Rf0.69(SiO2、Hex:EtOAc=1:1)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)
【００７７】
酢酸3-(2,5-ビスアジリジン-1-イル-4-メチル-3,6-ジオキソシクロヘキサ-1,4-ジエニル)-プロピルエステル7
【００７８】
【化１１】
0006317742.tif 000012
キノン6(756mg、3.40mmol)をエタノール(15cm3)に溶解し、0℃に冷却し、アジリジン(0.50cm3、11.6mmol)を滴加した。この混合物を0℃で1時間撹拌し、次いで、冷蔵庫内で72時間放置した。溶媒を真空下で除去した。この赤色の固体をジエチルエーテルで粉砕し、乾燥させた。この赤色の固体をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、Hex:EtOAc=1:1)によってさらに精製して、標題化合物7を赤色の固体として得た(98mg、9%)。
Rf0.52(SiO2、Hex:EtOAc=1:1)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)
【００７９】
比較化合物の合成
RH1、MeDZQ及びすべてのエステルを、先行技術のプロトコール(Kidscan laboratories)に従って合成し、テスト用にDMSO中の10mMストック溶液として仕上げた。表1は、一部のエステルの構造、及び、トリス緩衝液中でのそれらの半減期を、MDA468及びMDA NQ01細胞株に対するそれらのIC50値に加えて示すものである。
【００８０】
安定性テスト
エステル及びその加水分解生成物の安定性を、溶液中で測定した。[50μM Es5、トリス緩衝液(0.1mol dm-3)中、pH7.4]。サンプルは、決まった時間間隔をおいて24時間まで採取し、HPLCによって分析した。検出波長は、330nmであった。クロマトグラフ分析は、30:70のMeOH:トリス緩衝液(0.1mol dm-3、pH7.4)を1ml/分で用いたイソクラチック溶出によって実行した。薬物のクロマトグラフ分離は、内径250mm×4.6mmのHypersil ODSカラムを用いて行われた。
【００８１】
【表１】
0006317742.tif 000013
0006317742.tif 000014
0006317742.tif 000015
【００８２】
選択性テスト
本発明の化合物、例えばEs5及び4-61は、DT-ジアホラーゼを発現する細胞に対して優れた選択性を示す。選択性は、RH1が示すものを超えることがわかった。IC50値は、MTTアッセイを用いて測定した。
【００８３】
表2は、MDA483及びNQ01細胞を用いてテストした多数の薬物についてのIC50値の要約を示すものである。データは、Es5が、他の抗がん剤と比較して、DT-ジアホラーゼを発現する細胞に対して優れた選択性を示すことを実証している。比較してみると、MDA468対NQ01の差は、Es5については80倍超であるが、これに対し、マイトマイシンCについては約5倍、RH1については30倍超である。Es5の加水分解生成物4-61も優れた選択性を示し、IC50値はMDA NQO1に対しては0.41nM、MDA468に対しては16.97nMであり、よって、DTジアホラーゼ増強比(enhancement ratio)は41である。
【００８４】
【表２】
0006317742.tif 000016
【００８５】
Es5の活性化
エステラーゼ及び細胞抽出物によるEs5の切断及びその活性化を調べた。Es5は、水性緩衝液中では安定であるが、血清中ではゆっくり加水分解された(t1/2=100分)。ブタエステラーゼを用いた実験により、エステラーゼはEs5を速やかに切断してEs5加水分解生成物にすることが示されたが、これは、ブタの脳抽出物を使用した際に繰り返された結果である。DT-ジアホラーゼを発現するMDA468 NQ01細胞株由来の細胞抽出物はこのエステルを速やかに切断したが、一方、DT-ジアホラーゼ欠失(DT-diaphorase null)MDA468細胞株由来の抽出物は、はるかに遅い速度でエステルを切断した。これは、DT-ジアホラーゼを発現する細胞又は腫瘍における活性化の方がより大きい可能性があることを示している。
【００８６】
上述のように、大半のRH1エステルは、水溶液中で非常に不安定であり、30分以内に加水分解されてRH1になった。その速度は、その動態をHPLCによって決定できないほどであった。Es5は、上の表に示すように、これよりはるかに安定であった。
【００８７】
Es5の安定性プロファイルを、トリス緩衝液(0.1mol dm-3、pH7.0)、RPMI培地(pH7.0)及び血清中で室温にて測定したところ、Es5の消失が示されると同時に、同じ時間尺度にわたって、血清中でアルコール4.61が増加した。
【００８８】
細胞溶解物のエステラーゼ反応
2種の細胞株MDA NQ01及びMDA468の細胞溶解物由来のエステラーゼによるEs5の分解について調べた。Es5は、MDA NQ01細胞株抽出物中では不安定でありアルコール4.61に分解され、室温ではおよそ160分の半減期を呈した。DTD欠失細胞株MDA468においては、親分子からそのアルコールへの分解は、かなり遅い速度で生じた。
【００８９】
アポトーシス
Martinら(Journal of Experimental Medicine.、182、1545〜1556ページ、1995)に記載されている方法に基づいて、本発明の化合物が原因で生じるアポトーシスの誘導を決定した。アポトーシスをアネキシンV結合により測定したところ、DT-ジアホラーゼを発現する細胞においては2時間以内にプログラム細胞死の誘導が生じるのに対し、DT-ジアホラーゼ欠失MDA468細胞においてはこの時点では細胞死がみられないことが示された。アポトーシスレベルの低下は、この細胞株においては4時間後にみられる。これは、Es5が、DT-ジアホラーゼを発現する細胞と発現しない細胞とに対して異なる効果を及ぼすことを示すものである。
【００９０】
DNA損傷
DNA損傷については、コメットアッセイを用いて測定し、MDA468 NQ01及びDT-ジアホラーゼ欠失MDA468細胞株を処理した後のEs5がコメットの頭部及び尾部の強度に及ぼす効果を調べた。この実験から、どちらの細胞株についても、H2O2を添加することによりDNA鎖切断が生じ、その結果、頭部と比較して尾部でのDNAの蓄積が増加することが示された。DT-ジアホラーゼを発現する細胞株(NQ01)を10nMのEs5で2時間処理すると、H2O2単独で処理した場合と比較して、頭部におけるDNAの割合が増加した。このことから、DNAはEs5によって架橋されていることが示された。DT-ジアホラーゼ欠失細胞株をEs5で処理した場合には、尾部の強度は低下しなかった。このことは、DT-ジアホラーゼによる活性化がなされなければEs5はDNA架橋剤ではないということを示しており、これが、提唱されるEs5の作用機序である。6時間のインキュベーションを行ったところ、DT-ジアホラーゼ欠失細胞株において架橋が認められた。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、これは、DT-ジアホラーゼがあることで起きる二電子還元ではなく、異なる機序、例えば一電子還元が2回行われることによって生じるものであるに違いないと考えている。
【００９１】
Es5とRH1との比較
表3は、Es5(4.65)の特徴のRH1との比較を示すものであり、それらとシスプラチナム、ドセタキセル、塩化コバルト、エピルビシン、ara-C及びマイトマイシンCとの組合せ指数を記載したものである。比較のために記すと、MMC+塩化コバルトのIC50での組合せ指数は、MDA468では0.443、NQ01細胞では0.239である。表3からわかるように、Es5とシスプラチナムの組合せは、どちらの細胞株においても相乗作用を実証しており、Es5と塩化コバルトの組合せは、どちらの細胞株においても強い相乗作用を実証している。Es5とドセタキセルの組合せは、NQ01に関しては相加作用を示すがMDA468に関しては中等度に阻害効果を示すのに対し、Es5とマイトマイシンCの組合せは、NQ01に関しては相加作用を示し、MDA468に関してはわずかな拮抗作用を示す。
【００９２】
【表３】
0006317742.tif 000017
0006317742.tif 000018
【００９３】
in vivoでのEs5の有効性
3種のがん細胞株H460、MDA-MB-468-NQ01及びMDA-MB-468-MOCKに対するEs5(4.65)の活性をin vivoで評価した。ここで用いたのは、in vivo中空繊維アッセイ(HFA:hollow fibre assay)であり、繊維は、腹腔内(i.p.)部位及び皮下(s.c.)部位の両方に埋め込んだ。Es5及び対照物質のドキソルビシンを、腹腔内注射(i.p.)による複数回用量として、Es5は0.5mg/kg/日、ドキソルビシンは2.5mg/kg/日で第3日、第4日、第5日及び第6日に投与した。
【００９４】
Es5(4.65)は、繊維をi.p.部位に埋め込んだ分については3種の細胞株すべてにおいて、繊維をs.c.部位に埋め込んだ分についてはH460において、未処理対照と比較して、細胞生存率に関して有意な有効性(p<0.01)を示した。この結果は、標準対照物質のドキソルビシンの結果と同様であり、本化合物が抗がん剤として見込みがあることを示している。
【００９５】
材料及び方法
Es5(4.65)は、多少ボルテックスしながら生理食塩溶液に溶解した。
【００９６】
細胞株。3種のヒト腫瘍細胞株、すなわち、H460 NSCLC(ICT製)及び2種の乳癌株MDA-MB-468-NQ01及びMDA-MB-468-MOCK(どちらもOnco-NXにより供給されている)を、分析のために選択した。細胞は、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン及び10%ウシ胎仔血清を添加したRPMI1640細胞培養培地(すべてSigma製)で培養し、単分子層培養にて、37℃、加湿された5%CO2環境下で維持した。
【００９７】
動物。6〜8週齢の雌のBalb/C免疫不全ヌードマウスを用いた(Harlan UK、Blackthorn、UK)。マウスは、空調の効いた室内の隔離キャビネットに格納したケージ中で定期的な明暗交互サイクルで飼育した。マウスには、Teklad 2018飼料(Harlan、Blackthorn、UK)及び水を自由に摂取させた。すべての動物実験手順は、英国内務省により交付されたプロジェクトライセンスの下で実行し、終始UKCCCRガイドラインに従った。
【００９８】
中空繊維アッセイ。細胞は、色でコード化された滅菌済みのPVDF製Spectra/Por中空繊維(HF:hollow fibre)(Spectrum Medical Inc、Houston、TX、USA)に充填した。簡潔に言えば、細胞を回収し、必要な細胞密度で細胞培養培地に再懸濁させた。次いで、この調製物をHFに充填し、HFの端部をクランプで締めてヒートシールした。次いで、HFを1.5cm長さに切り、これを両端部で再びヒートシールし、次いで、培地を含有する6ウェルプレートに移動させてからin vivo実験のために埋め込み、又は、加湿された5%CO2環境下で37℃にてさまざまな時間にわたってインキュベートしてから、以下に記載するMTTアッセイ変法を用いて処理した。
【００９９】
in vivo実験のために、短時間の吸入麻酔(2%イソフルラン)下で、各細胞株につき1本の充填済み中空繊維を各マウスの腹腔内又は背側の脇腹皮下に移植してから、マウスを回復させた。各群は6匹のマウスで構成され、埋込みを行った日を「第0日」とした。
【０１００】
Es5(4.65)の治療応答を評価検討するために、第3日、第4日、第5日及び第6日にマウスを0.5mg/kg/日のEs5(4.65)又は2.5mg/kg/日のドキソルビシンで処置した。
【０１０１】
埋込み後の第7日にマウスを屠殺し繊維を取り出して、細胞生存率について分析した。ここではMTTアッセイ変法を用い、処置群についてみられる吸光度を、対応する非処置対照群と比較した。統計分析は、スチューデントt検定を用いて実行した。
【０１０２】
結果
図1及び図2は、本試験について得られた結果を示すものであり、データは、対応したs.c.又はi.p.非処置対照に対する細胞生存率(%)として表してある。図1には、各細胞株についてグループ化したデータを示してあり、図2には、これを各処置について示してある。
【０１０３】
Es5は、繊維をi.p.部位に埋め込んだ分については3種の細胞株すべてにおいて、繊維をs.c.部位に埋め込んだ分についてはH460において、未処置対照と比較して、細胞生存率に関して有意な有効性(p<0.01)を示した。この結果は標準対照物質のドキソルビシンの結果と同様であったが、この対照物質は、s.c.部位では、いずれの細胞株に対しても、有意な有効性を示さなかった。
【０１０４】
さらにEs5は、NQ01発現細胞株において、Mock MDA-MB-468細胞株よりも改善された有効性も示したが、これに対しドキソルビシンの場合は、ほとんど差がみられなかった。
【０１０５】
本明細書において開示する文書はすべて、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。
【図１】
0006317742.tif 000021
【図２】
0006317742.tif 000022