(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｌｖＢＮオペロンの調節部位内の配列番号１のアミノ酸配列に記載のリーダーペプチドをコードする塩基配列のみについて、全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換されて、Ｌ−バリンの生産性が強化されるように形質転換されたＬ−バリン産生菌株。
【請求項２】
前記リーダーペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の休止部位（ｐａｕｓｅｓｉｔｅ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
前記休止部位をコードする塩基配列の全体または一部が欠損されるか、あるいは、前記休止部位をコードする塩基配列の一部が置換されたことを特徴とする請求項２に記載の菌株。  
【請求項４】
前記休止部位をコードする配列番号２３の塩基配列の１３〜１５番目の核酸が終止コドンに置換されたことを特徴とする請求項３に記載の菌株。
【請求項５】
前記菌株は、コリネバクテリウム属微生物であることを特徴とする請求項１に記載の菌株。
【請求項６】
前記菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムであることを特徴とする請求項５に記載の菌株。
【請求項７】
請求項１から請求項６のうちのいずれか一項に記載の菌株を培養するステップ及び前記菌株の培養液からＬ−バリンを回収するステップを含むＬ−バリンの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子操作によりＬ−バリン産生能が向上した菌株及び当該菌株を用いたＬ−バリンの産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分枝鎖アミノ酸のうちの一つであるＬ−バリンは、微生物においてピルビン酸から出発してアセト乳酸（ａｃｅｔｏｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）、ジヒドロキシイソ吉草酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ケトイソ吉草酸（ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）を経由して生合成される。これらの中間代謝産物は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ ａｃｉｄ ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、トランスアミナーゼＢ（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ Ｂ）によって触媒された反応によって生成される。しかしながら、これらの酵素はケト酪酸（ｋｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）とピルビン酸から始まるＬ−イソロイシン生合成にも与り、中間代謝物であるケトイソ吉草酸から２−イソプロピルリンゴ酸（２−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃａｃｉｄ）、３−イソプロピルリンゴ酸（３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、ケトイソカプロン酸（ｋｅｔｏｉｓｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）を経由してＬ−ロイシンが生合成されることもある。この理由から、上述したように分枝鎖アミノ酸、すなわち、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンはその生合成過程に同じ酵素を用いるため一種類の分枝鎖アミノ酸を発酵により工業的に製造することは困難であるということが知られており、さらに最終産物であるＬ−バリンまたはこの誘導体によるフィードバック阻害が発生して、これを工業的に量産することには制約が伴われるという問題点を有している。
本発明者らは、Ｌ−バリン産生能に優れた菌株を開発するために鋭意努力したところ、Ｌ−バリンオペロンの調節部位が不活性化されるように形質転換させた菌株が母菌株に比べてＬ−バリン産生能に優れているということを見出し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＫＲ１０−１９９０−０００７９４８ Ｂ１
【特許文献２】ＫＲ１０−２００８−００２５３５５ Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、Ｌ−バリンオペロンの調節部位内のリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換されて、Ｌ−バリンオペロンの発現が強化されるように形質転換された新規なＬ−バリン産生菌株を提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記新規なＬ−バリン産生菌株を用いてＬ−バリンを製造する方法を提供することである。
さらに、本発明のさらに他の目的は、Ｌ−バリンオペロンの調節部位変異体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために、本発明は、Ｌ−バリンオペロンの調節部位内の配列番号１のアミノ酸配列に記載のリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換されて、Ｌ−バリンオペロンの発現が強化されるように形質転換された新規なＬ−バリン産生菌株を提供する。
また、本発明は、前記新規なＬ−バリン産生菌株を用いてＬ−バリンを製造する方法を提供する。
さらに、本発明は、配列番号３または４に記載のアミノ酸配列を有するＬ−バリンオペロンの調節部位変異体を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
上述したように、本発明の新規なＬ−バリン産生菌株は、Ｌ−バリンオペロンの調節部位内の配列番号１のアミノ酸配列に記載のリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換されて、Ｌ−バリン生合成に与る酵素アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現が増大されるので、Ｌ−バリンの産生能に優れているという効果がある。
また、前記新規なバリン産生菌株を用いる本発明のＬ−バリンの産生方法によれば、Ｌ−バリンを高効率及び高収&#63841;で製造することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｉｌｖＢＮオペロンの調節部位とリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損された変異型調節部位（ＤｖａｌＬ）、リーダーペプチドのうち休止部位が欠損された変異型調節部位（ＤｖａｌＰ）、リーダーペプチドのうち休止部位の最後のアミノ酸が終止コドンに変異された変異型調節部位（ＤｖａｌＳ）とリーダーペプチド及び減衰部位が両方とも欠損された変異型調節部位（ＤｖａｌＡ）を含むｉｌｖＢＮオペロンの概略的な模式図である。
【図２】図２は、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｉｌｖＢＮオペロンの調節部位の細部模式図である。
【図３】図３は、図１のリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損された変異型調節部位（ＤｖａｌＬ）の細部模式図である。
【図４】図４は、図１のリーダーペプチドのうち休止部位が欠損された変異型調節部位（ＤｖａｌＰ）の細部模式図である。
【図５】図５は、図１のリーダーペプチドのうち休止部位の最後のアミノ酸が終止コドンに変異された変異型調節部位（ＤｖａｌＳ）の細部模式図である。
【図６】図６は、図１のリーダーペプチド及び減衰部位が両方とも欠損された変異型調節部位（ＤｖａｌＡ）の細部模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、Ｌ−バリンオペロンの調節部位内の配列番号１のアミノ酸配列に記載のリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換されて、Ｌ−バリンオペロンの発現が強化されるように形質転換された新規なＬ−バリン産生菌株に関する。
【０００９】
本発明において、前記Ｌ−バリンオペロン（以下、「ｉｌｖＢＮオペロン」と称する。）は、Ｌ−バリン産生微生物においてＬ−バリンの生合成の最初のステップに与る酵素であり、２分子のピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）からアセト乳酸（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ）を合成する酵素であるアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）を暗号化する遺伝子（ｉｌｖＢＮ）を含む。
【００１０】
さらに詳しくは、前記ｉｌｖＢＮオペロンは、プロモータ（ｐｒｏｍｏｔｏｒ）と、リーダーペプチド（ｌｅａｄｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）を暗号化する塩基配列と、リーダーペプチド内に位置する休止部位（ｐａｕｓｅｓｉｔｅ）及び減衰部位（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）を含む調節部位及びアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）を暗号化する構造遺伝子（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｇｅｎｅ）を含む（図１及び２参照）。
【００１１】
本発明において、前記ｉｌｖＢＮオペロンは、調節部位のうちリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換されて前記アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）を暗号化する構造遺伝子の発現を強化させることにより、Ｌ−バリンの産生能を向上させたことを特徴とする。好ましくは、前記リーダーペプチドを暗号化する塩基配列の一部の欠損もしくは置換の部位は休止部位内であってもよく、さらに好ましくは、一部の置換部位が休止部位の末端部の塩基配列が終止コドンに置換されたものであってもよい。
【００１２】
本発明において、上述したように、ｉｌｖＢＮオペロンの調節部位のうちリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換されて、Ｌ−バリンオペロンの発現が強化されるように形質転換された新規なＬ−バリン産生菌株を提供するために、まず、ｉｌｖＢＮオペロンの調節部位のうちリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換された塩基配列を含む組換えベクターを製作する。  
【００１３】
前記ベクターの製作のために、本発明の具体的な実施形態においては、まず、コリネバクテリウム属微生物の染色体を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法によりｉｌｖＢＮオペロンの調節部位のうちリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換された塩基配列を有する調節部位（ＤｖａｌＬ、ＤｖａｌＰ、ＤｖａｌＳ）を増幅させ、前記増幅された調節部位をベクターに挿入して組換えベクターを製作した後、前記組換えベクターで母菌株をそれぞれ形質転換させた。
【００１４】
前記組換えベクターの製作に用いられたベクターは、天然状態もしくは組換え状態のプラスミド、コスミド、ウィルス及びバクテリオファージであってもよい。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺベクター、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターが使用可能である。
【００１５】
本発明の具体的な実施形態においては、ｐＤＺを用いた。前記ベクターｐＤＺは、コリネバクテリウム属微生物の染色体挿入用ベクターであり、大韓民国公開特許公報第２００８−００２５３５５号に開示された方法に従い製造される。
【００１６】
前記ベクターｐＤＺに前記増幅された調節部位（ＤｖａｌＬ、ＤｖａｌＰ、ＤｖａｌＳ）をそれぞれ挿入して組換えベクターｐＤＺＤｖａｌＬ、ｐＤＺＤｖａｌＰ、ｐＤＺＤｖａｌＳを製作した。
【００１７】
本発明において、前記組換えベクターによって形質転換される母菌株は、Ｌ−バリンを産生する微生物であれば特に制限がなく、好ましくは、大腸菌属微生物またはコリネバクテリウム属微生物であり、特に、コリネバクテリウム・グルタミクムであってもよい。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３０３２であるか、好ましくは、Ｌ−バリンまたはこの誘導体に対して耐性を有するＬ−バリン産生菌株であってもよく、さらに好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐを用いることができる。
【００１８】
前記コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐは、本発明者の先行特許第１０−１１１７０２２号に開示された菌株であり、Ｌ−グルタミン酸を産生するコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ １０６６１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＫＦＣＣ １０６６１、大韓民国特許出願番号第１９８８−００１６５４３；公告番号第１９９０−０００７９４８号）を母菌株としてランダムに突然変異を行った後、イソロイシン誘導体であるα−アミノ酪酸（α−Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ；ＡＢＡ）、バリン誘導体であるα−ヒドロキシバリン（α−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｉｎｅ；ＡＨＶ）、チアゾールアラニン（ｔｈｉａｚｏｌｅ ａｌａｎｉｎｅ；ＴＡ）及びノルバリン（Ｎｏｒｖａｌｉｎｅ；ＮＶ）が一緒に添加された最少培地に塗抹してそれぞれに対して２０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ及び５０ｍＭの濃度に耐性を有する共通耐性変異株であり、前記共通耐性変異株は、母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ １０６６１に比べてＬ−バリン産生量が４倍以上増大された優れた菌株である。  
【００１９】
前記コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐを母菌株として前記組換えベクターで形質転換させた菌株ＫＣＣＭ１１３３６Ｐ、ＫＣＣＭ１１３３７Ｐ、ＫＣＣＭ１１３３８Ｐが前記母菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べてＬ−バリン産生能に優れていることを確認した。
【００２０】
前記コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３６Ｐは、ｐＤＺベクターに配列番号１のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドをコードする塩基配列の全体が欠損された変異型調節部位（ＤｖａｌＬ）が挿入された組換えベクターｐＤＺＤｖａｌＬで母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐを形質転換させた菌株であって、これをコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＪ−４５６と命名し、韓国微生物保存センターに２０１２年１１月１９日付けで寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１１３３６Ｐが与えられた。
【００２１】
前記コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３７Ｐは、ｐＤＺベクターに配列番号１のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドのうち休止部位が欠損された変異型調節部位（ＤｖａｌＰ）が挿入された組換えベクターｐＤＺＤｖａｌＰで母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐを形質転換させた菌株であり、これをコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＪ−４５７と命名し、韓国微生物保存センターに２０１２年１１月１９日付けで寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１１３３７Ｐが与えられた。
【００２２】
前記コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３８Ｐは、ｐＤＺベクターに配列番号１のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドのうち休止部位の最後のアミノ酸が終止コドンに置換された変異型調節部位（ＤｖａｌＳ）が挿入された組換えベクターｐＤＺＤｖａｌＳで母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐを形質転換させた菌株であり、これをコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＪ−４５８と命名し、韓国微生物保存センターに２０１２年１１月１９日付けで寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１１３３８Ｐが与えられた。
【００２３】
また、本発明においては、Ｌ−バリン生合成調節部位が不活性化されたＬ−バリン生合成過発現ベクターをさらに製作し、これを用いて公知の野生型菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を形質転換させて、Ｌ−バリン生合成調節部位が不活性化されたＬ−バリン生合成過発現菌株を提供する。
【００２４】
本発明において、前記Ｌ−バリン生合成調節部位が不活性化されたＬ−バリン生合成過発現ベクターの製作のために、前記コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３６Ｐ、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３７Ｐ、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３８Ｐ、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ＿ＤｖａｌＡの染色体を鋳型としてＰＣＲ方法によりベクター挿入用塩基配列を増幅し、これをｐＥＣＣＧ１１７ベクターにそれぞれ挿入して、それぞれのＬ−バリン生合成過発現ベクターｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＷ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＬ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＰ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＳ及びｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＡを製作した。
【００２５】
次いで、前記Ｌ−バリン生合成過発現ベクターｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＷ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＬ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＰ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＳ及びｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＡで母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を形質転換させて、Ｌ−バリン生合成遺伝子調節部位が不活性化されたＬ−バリン生合成過発現菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＷ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＬ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＰ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＳ及びコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＡを製作した。
【００２６】
前記菌株のうちコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＬ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＰ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＳ菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１ＰのＬ−バリン生合成遺伝子の調節部位を有するように形質転換された菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＷに比べてＬ−バリン産生能に優れていることを確認した。
【００２７】
上述したように、本発明の新規なＬ−バリン産生菌株は、Ｌ−バリンオペロンの調節部位内の配列番号１のアミノ酸配列に記載のリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換されて、Ｌ−バリン生合成に与る酵素アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現が増大されるので、Ｌ−バリンの産生能に優れているという効果がある。
【００２８】
また、本発明は、上記のＬ−バリンオペロンの調節部位内の配列番号１のアミノ酸配列に記載のリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換されて、Ｌ−バリンオペロンの発現が強化されるように形質転換された新規なＬ−バリン産生菌株を用いてＬ−バリンを産生する方法に関する。
【００２９】
本発明において、Ｌ−バリンを産生するために、本発明の新規なＬ−バリン産生菌株を培養する方法としては、当業界における周知のコリネバクテリウム属微生物の培養方法が採用可能である。具体的に、前記培養方法の例としては、回分式培養（ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）及び流加式培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような様々な方法は、例えば、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」  （Ｊａｍｅｓ  Ｍ．  Ｌｅｅ，  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，  ｐｐ１３８−１７６，  １９９１）などに開示されている。
【００３０】
培養に用いられる培地は、適切な方式により特定の菌株の要件を満たさなければならない。コリネバクテリウム属微生物に対する培養培地は、既に公知である（例えば、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，  ＵＳＡ，  １９８１）。使用可能な糖源としては、グルコーズ、サッカローズ、ラクトーズ、フルクトース、マルトース、澱粉、セルローズなどの糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油などの油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセロール、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質はそれぞれ別々にまたは互いに混合して使用可能である。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆・麦及びヨウ素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源もまた、それぞれ別々にまたは互いに混合して使用可能である。使用可能なリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたはこれらに見合うナトリウム含有塩が挙げられる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩を含有せねばならない。なお、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンなどの必須成長物質が含有される。
【００３１】
さらに、培養培地に適切な前駆体が使用可能である。上述した原料は、培養過程において培養物に適切な方式によって回分式または連続式により添加される。
【００３２】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの基礎化合物あるいはリン酸または硫酸などの酸化合物を適切な方式により用いて培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡の生成を抑えることができる。好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、通常、２０℃〜４５℃である。培養は、所望のＬ−バリンの生成量が最大になるまで行い続ける。この目的は、普通、１０〜１６０時間で達成される。Ｌ−バリンは、培養培地中に排出されるか、あるいは、細胞中に含まれる。
【００３３】
本発明のＬ−バリンの製造方法は、細胞または培養物からＬ−バリンを回収するステップをさらに含む。細胞または培養物からＬ−バリンを回収する方法としては、当業界における周知の方法、例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィ、結晶化及びＨＰＬＣなどが採用可能であるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の一実施形態によれば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去し、得られた上澄み液をイオン交換クロマトグラフィを用いて分離した。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の権利範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：Ｌ−バリン生合成遺伝子の調節部位の不活性化のためにリーダーペプチドを暗号化する塩基配列の全体が欠損されるか、あるいは、一部が欠損もしくは置換された塩基配列を含むベクターの製作
図１及び図２に示す、プロモータ（Ｐｒｏ）、リーダーペプチドを暗号化する塩基配列（Ｌｅａｄｅｒｐｅｐｔｉｄｅ）、休止部位（Ｐａｕｓｅ ｓｉｔｅ）、減衰部位（Ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）を含む調節部位と構造遺伝子（ｇｅｎｅ）から構成された、アセトヒドロキシ酸シンターゼを合成するＬ−バリンオペロン（ｉｌｖＢＮ）の調節部位のうち、図１に示すようにリーダーペプチドをコードする塩基配列の全体が欠損された変異型調節部位（以下、「ＤｖａｌＬ」と称する。）、リーダーペプチドのうち休止部位が欠損された変異型調節部位（以下、「ＤｖａｌＰ」と称する。）、リーダーペプチドのうち休止部位の最後のアミノ酸が終止コドンに置換された変異型調節部位（以下、「ＤｖａｌＳ」と称する。）とリーダーペプチド及び減衰部位の両方が欠損された変異型調節部位（以下、「ＤｖａｌＡ」と称する。）を増幅するために米国生物資源センター（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から購買したコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体ＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応方法（以下、「ＰＣＲ方法」と称する。）により増幅した。
【００３６】
具体的に、ＤｖａｌＬを製作するために、まず、前記コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号５及び６のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間アニール、７２℃で３０秒間重合する条件をＰｆｕポリメラーゼで３０回繰り返し行うＰＣＲ方法を用いて５'領域にＢａｍＨＩ制限酵素位を有する約７００個の塩基対の断片を増幅した。
第二に、配列番号７及び８のプライマーを用いて前記記載されたＰＣＲ方法により３'領域にＸｂａＩ制限酵素位を有する約７００個の塩基対の断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＡｌｌＲＥｘｐｉｎＴＭ ＧＥＬＳＶキット（ソウル、韓国）で分離した後、クロスオーバーＰＣＲのための鋳型として用いた。
次いで、配列番号５及び８のプライマーを用いて、上記のようにして得られた二つのＤＮＡ断片を鋳型としてクロスオーバーＰＣＲを行った。具体的に、前記ＰＣＲ方法により約２０００個の塩基対の断片を増幅した。増幅された断片は制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じ酵素で処理されたｐＤＺでライゲーション（結さつ）によりｐＤＺＤｖａｌＬを製作した。
【００３７】
ＤｖａｌＰを製作するために、まず、前記コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型として配列番号５及び９のプライマーを用いて５'領域にＢａｍＨＩ制限酵素位を有する約７００個の塩基対の断片を増幅した。
第二に、配列番号１０及び８のプライマーを用いて前記ＰＣＲ方法により３'領域にＸｂａＩ制限酵素位を有する約７００個の塩基対の断片を増幅した。
次いで、増幅された二つのＤＮＡ断片を鋳型として前記クロスオーバーＰＣＲ方法により約２０００個の塩基対の断片を増幅した。増幅された断片は制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じ酵素で処理されたｐＤＺでライゲーションによりｐＤＺＤｖａｌＰを製作した。
【００３８】
ＤｖａｌＳを製作するために、前記コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型として配列番号５及び１１のプライマーを用いて５'領域にＢａｍＨＩ制限酵素位を有する約７００個の塩基対の断片を増幅した。
第二に、配列番号１２及び８のプライマーを用いて前記ＰＣＲ方法により３'領域にＸｂａＩ制限酵素位を有する約７００個の塩基対の断片を増幅した。
次いで、増幅された二つのＤＮＡ断片を鋳型として前記クロスオーバーＰＣＲ方法により約２０００個の塩基対の断片を増幅した。増幅された断片は制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じ酵素で処理されたｐＤＺでライゲーションによりｐＤＺＤｖａｌＳを製作した。
【００３９】
ＤｖａｌＡを製作するために、まず、前記コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型として配列番号５及び１３のプライマーを用いて５'領域にＢａｍＨＩ制限酵素位を有する約７００個の塩基対の断片を増幅した。
第二に、配列番号１４及び８のプライマーを用いて前記ＰＣＲ方法により３'領域にＸｂａＩ制限酵素位を有する約７００個の塩基対の断片を増幅した。
次いで、増幅された二つのＤＮＡ断片を鋳型として前記クロスオーバーＰＣＲ方法により約２０００個の塩基対の断片を増幅した。増幅された断片は制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じ酵素で処理されたｐＤＺでライゲーションによりｐＤＺＤｖａｌＡを製作した。
【００４０】
アミノ酸レベルにおける前記リーダーペプチド及び休止部位の配列はそれぞれ配列番号１、２と同様であり、ＤｖａｌＰ及びＤｖａｌＳのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３及び４と同様である。
また、バリンオペロンｉｌｖＢＮの調節部位の全体塩基配列、リーダーペプチド塩基配列及び休止部位塩基配列はそれぞれ配列番号２１、２２及び２３と同様であり、ＤｖａｌＬ、ＤｖａｌＰ、ＤｖａｌＳ及びＤｖａｌＡの塩基配列はそれぞれ配列番号２４〜２７と同様である。
【００４１】
実施例２：Ｌ−バリン産生菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ由来のＬ−バリン生合成遺伝子の調節部位が不活性化された菌株の製作
Ｌ−バリン生合成遺伝子の調節部位が不活性化された菌株を製作するために、母菌株としてＬ−バリン産生菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐを用いた。
電気穿孔法によって前記実施例１において製作されたｐＤＺＤｖａｌＬ、ｐＤＺＤｖａｌＰ、ｐＤＺＤｖａｌＳ及びｐＤＺＤｖａｌＡベクターでコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐをそれぞれ形質転換させた。
２次交差過程を経てコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐの染色体上においてＬ−バリン生合成遺伝子の調節部位が不活性化された変異された塩基配列を含んでいるＬ−バリン産生菌株をそれぞれ得た。
プロモータの塩基置換の有無は、ＤｖａｌＬの場合に配列番号１５、ＤｖａｌＰの場合に配列番号１６、ＤｖａｌＳの場合に配列番号１７、ＤｖａｌＡの場合に配列番号１８のプライマーを配列番号８のプライマーと組み合わせて用いて、ＰＣＲ方法による遺伝子の増幅有無及び目的部位に対する塩基配列の分析により最終的に確認した。
【００４２】
前記ｐＤＺＤｖａｌＬ、ｐＤＺＤｖａｌＰ、ｐＤＺＤｖａｌＳベクターで形質転換された菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＪ−４５６、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＪ−４５７、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＪ−４５８と命名し、韓国微生物保存センターに２０１２年１１月１９日付けで寄託してそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１１３３６Ｐ、ＫＣＣＭ１１３３７Ｐ、ＫＣＣＭ１１３３８Ｐが与えられた。
また、ｐＤＺＤｖａｌＡベクターで形質転換された菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ＿ＤｖａｌＡと命名した。
【００４３】
実施例３：Ｌ−バリン生合成遺伝子の調節部位が不活性化されたＬ−バリン生合成過発現ベクターの製作
Ｌ−バリン産生菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１ＰからＬ−バリン生合成過発現ベクターを製作した。
また、前記実施例２において製造したそれぞれのコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３６Ｐ、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３７Ｐ、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３８Ｐ及びコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ＿ＤｖａｌＡからＬ−バリン生合成遺伝子の調節部位が不活性化されたＬ−バリン生合成過発現ベクターを製作した。
【００４４】
前記ベクターの製作のために、配列番号１９及び２０のプライマーを組み合わせて用いてコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３６Ｐ、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３７Ｐ、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３８Ｐ及びコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ＿ＤｖａｌＡの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ方法により遺伝子を増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じ酵素で処理されたｐＥＣＣＧ１１７ベクターに挿入してそれぞれのＬ−バリン生合成過発現ベクターｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＷ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＬ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＰ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＳ及びｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＡを製作した。
【００４５】
実施例４：Ｌ−バリン生合成遺伝子の調節部位が不活性化されたＬ−バリン生合成過発現菌株の製作
前記実施例３において製造したＬ−バリン生合成過発現ベクターｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＷ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＬ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＰ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＳ及びｐＥＣＣＧ１１７−ＤｖａｌＡをコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法によりそれぞれ挿入してコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＷ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＬ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＰ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＳ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＡ菌株をそれぞれ製作した。ベクターが形質転換される場合にカナマイシン耐性を有するため、カナマイシンが２５μｇ／Ｍ&#8467;の濃度で含まれている培地における生長有無により形質転換を確認した。
【００４６】
実施例５：Ｌ−バリン生合成遺伝子の調節部位が不活性化された菌株におけるＬ−バリンの産生
前記実施例２において製造したそれぞれのＬ−バリン産生菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３６Ｐ、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３７Ｐ、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３８Ｐ及びコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ＿ＤｖａｌＡからＬ−バリンを産生するために下記の方法により培養した。このとき、対照群としては、宿主細胞であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐを培養して用いた。
【００４７】
また、前記実施例４において製造したコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＷ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＬ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＰ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＳ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＡ菌株からＬ−バリンを産生するために同じ方法により培養した。
【００４８】
下記表１に示す組成の産生培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに一白金耳の菌株を接種し、３０℃において７２時間２００ｒｐｍで産生した。
培養が終わった後、ＨＰＬＣでＬ−バリンの産生量を測定した。実験を行った各菌株に対する培養液中のＬ−バリンの濃度は、下記表２及び３に示す。
【表１】
0006359037.tif 000002
【００４９】
コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ、ＫＣＣＭ１１３３６Ｐ、ＫＣＣＭ１１３３７Ｐ、ＫＣＣＭ１１３３８Ｐ及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ＿ＤｖａｌＡのバリン産生性
【表２】
0006359037.tif 000003
【００５０】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＷ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＬ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＰ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＳ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＡのバリン産生性
【表３】
0006359037.tif 000004
【００５１】
上記表２に示すように、Ｌ−バリン生合成遺伝子の調節部位が不活性化されるように形質転換された菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ＿ＤｖａｌＡを除いて、母菌株であるＬ−バリン産生菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べてＬ−バリン産生性が向上するということを確認した。特に、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３３８Ｐは、母菌株に比べてＬ−バリン産生量が２５％向上した結果を示す。
【００５２】
また、上記表３に示すように、Ｌ−バリン生合成遺伝子の調節部位が不活性化されたＬ−バリン生合成過発現菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＬ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＰ及びコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＳ菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２０１ＰのＬ−バリン生合成遺伝子の調節部位を有するように形質転換された菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｖａｌＷに比べて、Ｌ−バリン産生能に９倍〜１３倍優れているということを確認した。
【００５３】
＜符号の説明＞
Ｐｒｏ：プロモータ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、
Ｌｅａｄｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ：リーダーペプチドをコードする塩基配列
Ｐａｕｓｅ ｓｉｔｅ：休止部位
Ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ：減衰部位
Ｇｅｎｅ：構造遺伝子
【００５４】
［受託番号］
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１３３６Ｐ
受託日：２０１２１１１９
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１３３７Ｐ
受託日：２０１２１１１９
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１３３８Ｐ
受託日：２０１２１１１９
【図１】
0006359037.tif 000005
【図２】
0006359037.tif 000006
【図３】
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【図４】
0006359037.tif 000008
【図５】
0006359037.tif 000009
【図６】
0006359037.tif 000010
【配列表】
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