(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛細血管拡張性運動失調症に罹患する患者のグルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｄｉｃｏｉｄ）治療への応答を評価する方法であって、
ＡＴＭ遺伝子（毛細血管拡張性運動失調症変異遺伝子）のｍＲＮＡバリアントの発現を該患者の血液において定性的および／または定量的に同定するステップであって、該ｍＲＮＡバリアントは、毛細血管拡張性運動失調症の臨床像に陽性に影響することが知られている、デキサメタゾンと同じファミリーの糖質コルチコイドによって誘導される非カノニカルスプライシングによって産生され、フォスファチジルイノシトール３キナーゼドメインを含有し、該ｍＲＮＡバリアントは、以下の５’−３’フォワードプライマー、５’−３’リバースプライマーのペア：
配列番号：１／配列番号：２；
配列番号：３／配列番号：４、
配列番号：６／配列番号：７、
配列番号：９／配列番号：１０；
配列番号：１２／配列番号：１３
を使用して増幅され、該ｍＲＮＡバリアントの検出可能な発現値が治療への陽性応答を示す、ステップを含む、該方法。
【請求項２】
前記糖質コルチコイドが、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾンまたはデフラザコルト、または薬学的に許容される塩もしくはそのエステル、あるいはこれらの混合物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖質コルチコイドは、リン酸プレドニゾロン、リン酸デキサメタゾン、リン酸ベタメタゾン、リン酸ベタメタゾン、リン酸デフラザコルト、又はこれらのナトリウム塩である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＴＭ遺伝子のｍＲＮＡバリアントは、デキサメタゾンまたはその薬学的に許容される塩による治療によって産生されるＡＴＭｄｅｘａ１  ｍＲＮＡである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍＲＮＡバリアントの発現の定量的な同定は、ハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍＲＮＡバリアントの同定は、任意の増幅技法によって遂行される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍＲＮＡバリアントの同定は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、インターカレート剤によるＲＴ−ＰＣＲ、Ｔａｑポリメラーゼ−ＰＣＲ、分子ビーコンプローブ法ＰＣＲ、ＦＲＥＴ−プローブハイブリダイゼーション、スコーピオンプローブＰＣＲから選択される技法によって実行される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅が、配列番号：５、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１４、配列番号：１５から選択されるプローブを使用して実行される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記糖質コルチコイドは、赤血球の中にカプセル化された糖質コルチコイドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖質コルチコイドは、リン酸デキサメタゾンモノナトリウムまたはリン酸デキサメタゾンジナトリウムである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛細血管拡張性運動失調症（Ａ−Ｔ）に罹患する患者のグルココルチコイド治療への応答の評価のための新規手順に関する。特に、本手順は、糖質コルチコイド（ＧＣ）によって誘導される非カノニカルスプライシングによって産生されるＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）遺伝子のｍＲＮＡバリアントの発現を、前記患者の血液において定性的および／または定量的に同定するステップを提供する。実際、ｍＲＮＡバリアントの発現は、ＧＣによる治療へ陽性応答した患者の血液中で存在することが実証された。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な臨床試験により、糖質コルチコイド（ＧＣ）による短期治療が、Ａ−Ｔ患者における神経症状、および何人かの被験体において小脳萎縮の状態でさえ改善できるというエビデンスが提供された［１〜４］。残念なことに、かかる改善は単に一時的であり、ＧＣによる経口治療の中断の直後に消滅する。ステロイドによる長期療法の害は利益を越える危険性があるので、中断は必要である［５］。その一方で、赤血球(erythrocyte)による非常に低い用量のＧＣの投与は、有効性を損なわずにステロイド毒性を低減させることができた［６〜１０］。したがって、自己赤血球の中にカプセル化されたデキサメタゾンによるＡ−Ｔ患者の長期的な治療を意図したフェーズＩＩ臨床試験が２０１０年にセットアップされた［１１］。提案された治療法は神経症状の有意な改善をもたらし、同時にＧＣの典型的な公知の副作用の発症を回避した。
【０００３】
最近、本発明者は、Ａ−Ｔ患者のリンパ球からの安定化リンパ芽球様細胞株で遂行されたインビトロの実験から、ＡＴＭ遺伝子（毛細血管拡張性運動失調症変異遺伝子）のプレｍＲＮＡ前駆物質における非カノニカルスプライシング事象によって生成された新しいメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の合成を介して、合成ＧＣデキサメタゾン（ｄｅｘａ）作用の働きが発揮され得ることを実証できた［１４］。
【０００４】
インシリコ試験から、細胞メカニズムによってもたらされた転写物（本発明者は、ジャンクＲＮＡではなく、ＡＴＭｄｅｘａ１と呼ぶ）は、ＡＴＭタンパク質の新しい「短縮された」形状（キナーゼおよび機能的酵素ドメインをコードする配列の上流の、ＡＴ患者の遺伝子中に存在するすべての突然変異をスキップする）へと翻訳され得ることが示唆された。このタンパク質バリアント（ミニＡＴＭと命名される）は、リンパ芽球様細胞株中で効率的に同定され、活性がある可能性が示された。本発明者は、これらの所見から、意外にも、ＡＴＭ遺伝子についてこれまでに記載された突然変異の大部分を「スキップ」可能とするこの新規の分子メカニズムによって、ｄｅｘａ治療が、毛細血管拡張性運動失調症における不完全なＡＴＭタンパク質を少なくとも部分的に回復させることができるという仮説を立てた。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、糖質コルチコイド（ＧＣ）治療によって誘導される非カノニカルスプライシングによって産生されるＡＴＭ遺伝子（毛細血管拡張性運動失調症変異遺伝子）のｍＲＮＡバリアントの新しい転写物が、ＧＣによる治療を行ったＡ−Ｔ患者から得られる血液サンプル中で同定可能であり、その存在が治療法処置への陽性応答と相関するという解明に基づく。
【０００６】
したがって、本特許出願の対象は、グルココルチコイド治療（デキサメタゾン等）への応答のバイオマーカーとしてのＡＴＭ遺伝子のｍＲＮＡバリアントを患者の血液において定量的または定性的に分析するための新規手順である。実際、とりわけ医薬品が赤血球の中にカプセル化される場合に、前記ｍＲＮＡバリアントの発現がＧＣの治療に陽性に応答した患者の血液中に存在するが、健康な対照および薬物が投与されない患者において存在しないことが、本発明者によって実証された。
【０００７】
したがって、本出願の対象は、以下の通りである。
毛細血管拡張性運動失調症に罹患する患者のグルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｄｉｃｏｉｄ）治療への応答を評価する方法であって、ＡＴＭ遺伝子（毛細血管拡張性運動失調症変異遺伝子）のｍＲＮＡバリアントの発現を該患者の血液において定性的および／または定量的に同定するステップであって、該ｍＲＮＡバリアントは、糖質コルチコイドによって誘導される非カノニカルスプライシングによって産生され、フォスファチジルイノシトール３キナーゼドメインを含有し、該ｍＲＮＡバリアントの検出可能な発現値が治療への陽性応答を示す、ステップを含む、該方法。
【０００８】
毛細血管拡張性運動失調症に罹患する患者を治療する方法であって、
ある量のグルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｅ）（好ましくはデキサメタゾン）を該患者において投与するステップと；
ＡＴＭ遺伝子（毛細血管拡張性運動失調症変異遺伝子）のｍＲＮＡバリアントの発現を該患者の血液において定性的および／または定量的に同定するステップであって、該ｍＲＮＡバリアントは、糖質コルチコイドによって誘導される非カノニカルスプライシングによって産生され、フォスファチジルイノシトール３キナーゼドメインを含有し、該ｍＲＮＡバリアントの検出可能な発現値が治療への陽性応答を示す、ステップと；
応答に依存して該治療法を調整するステップと
を含む、該方法。
【０００９】
本発明の一実施形態において、糖質コルチコイドは、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、デフラザコルト、またはその薬学的に許容される塩から選択される。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、ＡＴＭ遺伝子のｍＲＮＡバリアントはＡＴＭｄｅｘａ１  ｍＲＮＡである。
【００１１】
さらなる実施形態において、ｍＲＮＡバリアントの発現の同定は定量的であり、ハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化される。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態において、ｍＲＮＡバリアントの同定は、好適な５’−３’フォワードプライマーおよび５’−３’リバースプライマーのペアを使用して、随意にプローブを伴う、任意の増幅技法によって遂行される。
【００１３】
本発明の代替の実施形態において、糖質コルチコイドは赤血球の中にカプセル化される。
【００１４】
本発明によって提供される利点は、コルチコステロイドによる治療には副作用（重篤なものでさえも）がしばしば同時に起こることを考慮する場合に、とりわけ治療が経時的に延長される場合および／または小児集団で遂行された場合に、当業者に直ちに明らかである。明らかに、本発明によって提供される予測ツールは、治療法へ応答しない被験体（不応答者）または十分に応答しない被験体における治療、したがって無用且つ有害な治療の延長を回避する。さらに、ＡＴＭｄｅｘａ１発現レベルの測定によって、所与の患者におけるグルココルチコイド投与の至適頻度を確立し、治療に起因する過量投与および副作用のリスクを低減させても、なおその治療法上の効果を維持することが可能である。同じ方法を使用して、新しい薬物（たとえ糖質コルチコイドとは異なっても、ＡＴＭｄｅｘａ１発現を誘導し、したがって治療される患者に利益を導くことができる）を開発することができるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＥＲＹＤＥＸにより治療されたＡ−Ｔ患者に由来する血液サンプル中のＡＴＭｄｅｘａ１転写物の定性的および定量的な同定。ＡＴＭｄｅｘａ１発現レベルをＳＹＢＲｇｒｅｅｎによるＲＴ−ＰＣＲ法によって検出し、無治療のＡ−Ｔ患者および無治療の野生型の健康なボランティアの発現レベルと比較した（パネルａ）。第２の解析において、ＥＲＹＤＥＸにより治療されたＡ−Ｔ患者を、ＩＣＡＲＳスケールにより測定された治療への応答性に基づいた２つのサブグループ（応答者および不応答者）へと細分し（Trouillas P, et al. “International Cooperative Ataxia Rating Scale for pharmacological assessment of the cerebellar syndrome. - The Ataxia Neuropharmacology Committee of the World Federation of Neurology”. J Neurol Sci. 1997 Feb 12;145(2):205-11.）、関連する発現レベルを、２つの治療されたサブグループの間で、および健康な無治療対照と比較した（パネルｂ）。図中の不応答者を考慮するとき、この患者は、６か月の治療法の後に、治療に後続して１０ポイント以下で減少したＩＣＡＲＳ値を示した。
【図２】治療から異なる時間でのＡＴＭｄｅｘａ１定量化。応答者の患者および不応答者の患者について、発現レベルをＥＲＹＤＥＸ投与から＋８日目および＋２１日目で評価した。
【図３】ＲＴ−ＰＣＲ法およびＳＹＢＲｇｒｅｅｎによるＡＴＭｄｅｘａ１増幅の例示的なスタンダードカーブ。ＡＴＭｄｅｘａ１に好適な組み換えプラスミドの連続希釈の増幅によって、増幅カーブ（パネルａ）、解離カーブ（パネルｂ）および直線性カーブ（パネルｃ）を得た。
【図４】ＥＲＹＤＥＸにより治療されたＡ−Ｔ患者のサンプルにおけるＡＴＭｄｅｘａ１の増幅カーブ（パネルａ）および解離カーブ（パネルｂ）。
【図５ａ】デキサメタゾン（Ｄｅｘａ）の投与量に依存する、ミニＡＴＭ発現レベルとＩＣＡＲＳ変動との間に存在する直線関係の解析。
【図５ｂ】応答者と不応答者との間のＥＲＹＤＥＸによる治療への応答性およびミニＡＴＭ発現レベルに関連するデータ、ならびにそれぞれのＩＣＡＲＳ値の確認。
【図６】Ｅｒｙｄｅｘにより治療された応答者の患者および不応答者の患者におけるＦＫＢＰ５遺伝子およびＤＵＳＰ１遺伝子（その転写はデキサメタゾン投与によって誘導される）の発現の評価。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ＡＴＭ遺伝子（毛細血管拡張性運動失調症変異遺伝子）は、Savitsky K, et al. In Science. 1995 Jun 23;268(5218):1749-53.によって記載された。この遺伝子（それはＰＩ３−キナーゼファミリーのタンパク質キナーゼをコードする）は、選択的スプライシングに起因して、２７の異なるｍＲＮＡおよび２０の既知のｍＲＮＡのバリアント型へと転写される。
【００１７】
ｍＲＮＡバリアントの新しい転写物（本発明の目的に関連する）は、グルココルチコイド治療を受けた毛細血管拡張性運動失調症に罹患する患者の血液中で検出可能であり、同じ糖質コルチコイドのＡＴに対する治療法上の効果へ結びつけられる。
【００１８】
前記転写物は糖質コルチコイドによって誘導される代替の非カノニカルスプライシングの結果であり、それは、生理的転写物に対してそれらの長さを著しく制限することによってＡＴＭ遺伝子の突然変異部位を除去するが、フォスファチジルイノシトール３キナーゼドメインを含有するタンパク質キナーゼ酵素活性に寄与する領域を少なくとも部分的に維持する。
【００１９】
特に、先の実験研究（例示的な糖質コルチコイドとしてリン酸デキサメタゾンナトリウムを使用して実行した）は、Ａ−Ｔ患者の株化細胞で約１５８２ｂｐの転写物がＡＴＭｄｅｘａ１を示すことをインビトロで同定できた（M. Menotta et al J. Biological Chemistry Vol 287, N. 49 of November 30, 2012.を参照）。
【００２０】
デキサメタゾン誘導体（リン酸ナトリウムとは異なる塩等）、またはデキサメタゾンの同じファミリーの糖質コルチコイド（毛細血管拡張性運動失調症の臨床像に対する治療法上の効果の改善を発揮することが同じように公知である）の投与が、同じメカニズムを介して作用し、ｍＲＮＡバリアントの同じ転写物または機能的に等価な転写物を誘導することが実証されている。
【００２１】
デキサメタゾン治療を受けなかった、Ａ−Ｔ被験体も野生型被験体も検出可能なレベルの転写物を示さなかったので、ＡＴＭｄｅｘａ１合成が薬物による治療に直接相関していることが、本発明者によって今回観察された。
【００２２】
本発明の目的のために、「検出可能なレベルの転写物」または「検出可能な発現値」という用語によって、検出方法論および操作条件（例えばＰＣＲのサイクル数または温度）にかかわらず、対照（すなわちＧＣにより治療されないＡ−Ｔ患者または健康な個人）の平均値より、参照サンプルの標準偏差の少なくとも３倍大きい値が意味される。
【００２３】
さらに、ＡＴＭｄｅｘａ１発現は、臨床効果に直接および比例して相関し、ＡＴＭｄｅｘａ１発現は、疾患の全体的な症状がより大きく減少した（すなわちΔＩＣＡＲＳ増加を伴ってＩＣＡＲＳスコアが減少する）患者においてより大きく、疾患症状の有意な改善が観察されなかった患者（不応答者の患者）に比較して、神経症状のより高い改善（応答者の患者）と関連する。不応答者とは、６か月の治療法の後に、治療に後続して１０ポイント以下のＩＣＡＲＳ値の減少を示した患者と判断される。
【００２４】
さらに、２つの患者群（応答者および不応答者）における遺伝子（ＦＫＢＰ５およびＤＵＳＰ１等、デキサメタゾン治療においてより多く発現されることが公知である）の発現が変動しないことが実証され、したがって治療法の有効性の特異的なバイオマーカーとしてミニＡＴＭの特異性が明らかにされる。
【００２５】
最後に、ＡＴＭｄｅｘａ１発現は、医薬品点滴直後の日により高く、循環薬物の消失と共に徐々に経時的に減少することが実証され、デキサメタゾン投与と臨床応答とＡＴＭｄｅｘａ１発現との間の関係性が確認される。
【００２６】
本発明の方法によるモニターが可能な治療および患者は、疾患の臨床像に陽性に影響することが知られている糖質コルチコイドの投与によるＡＴの治療である。糖質コルチコイドは、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、デフラザコルト、その誘導体およびその塩形状（リン二酸またはリン酸ナトリウム等）、例えばリン酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、リン酸ベタメタゾンまたはリン酸ベタメタゾンナトリウム、リン酸プレドニゾロンまたはリン酸プレドニゾロンナトリウム、リン酸デフラザコルトまたはリン酸デフラザコルトナトリウムを含むファミリーから選択される。明らかに、ナトリウムにより塩化された形状は、本発明の本質を改変せずに、ＩＡ族またはＩＩＡ族の金属の対応する通常の塩によって置き換えることができる。
【００２７】
本発明の方法を介してモニター可能な治療の特異的な形状において、医薬品は赤血球の中にカプセル化された形状で投与される。カプセル化プロセスは、出願ＷＯ２０１４／１８１３０９（ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６１３３８）の表題：「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  Ｌｏａｄｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｏｎｅ  ｏｒ  Ｍｏｒｅ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ａｎｄ  ｓｏ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ」中に記載される。
【００２８】
本出願中で記載される実験研究は、ＷＯ２０１４／１８１３０９中で記載される方法に従って赤血球の中にカプセル化されたリン酸デキサメタゾンナトリウムの使用によって実行された。
【００２９】
様々な方法（すべてポリメラーゼ連鎖反応に基づく）が考案され、収集された血液サンプル中のｍＲＮＡバリアントの（例えばＡＴＭｄｅｘａ１の）発現の同定および定量化のためにセットアップされた。本明細書において導入されるすべての方法論は、対象となるサンプル中のメッセンジャーＲＮＡの相対的および／または絶対的な定量を可能にする。
【００３０】
一例として、増幅は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、インターカレート剤によるＲＴ−ＰＣＲ、Ｔａｑポリメラーゼ−ＰＣＲ、分子ビーコンプローブ法ＰＣＲ、ＦＲＥＴ−プローブハイブリダイゼーション、スコーピオンプローブＰＣＲから選択される技法によって、血液サンプルまたは末梢単核球（ＰＢＭＣ）で実行される。各々の技術についてのプロトコールは本出願の実験セクション中で記載され、本発明の目的である。
【００３１】
定量化方法として、スタンダードとして使用されるＤＮＡサンプル中に既知の増加していく量で添加された、ｍＲＮＡ転写物の配列（例えばＡＴＭｄｅｘａ１）についての組み換えプラスミド分子からセットアップされたスタンダードカーブを、好ましくは使用して、増幅の有効性および方法の直線性を評価した。プラスミド／ｍＲＮＡの同じ連続希釈を、ＰＣＲ陽性対照およびゴールドスタンダードとして標的分子の絶対的定量のために使用することができる。あるいは、アッセイは、対象となるサンプル中のハウスキーピング遺伝子として選択されるＨＰＲＴ１のｍＲＮＡを標的と同時に増幅するための１ペアのプライマーを提供する。ＨＰＲＴ１以外に、他の参照遺伝子を試験し（例えばＧＡＰＤＨおよびβ２Ｍなど）、ΔΔＣｔまたはＰｆａｆｆｅｌ法によるＡＴＭｄｅｘａ１の相対的な定量化のために使用することができる。
【００３２】
様々な技術に従って、好適なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを本発明者によってデザインし実施した。前記プライマーのヌクレオチド配列を、配列リストおよび表１中で以下にリストする。
【００３３】
用いられた技術に従って、増幅物の検出に好適なプローブも使用される。これらのプローブのうちのいくつかの配列を、配列リストおよび表１中で報告する。
【表１】
0006359196.tif 000002
【００３４】
最後に、本発明に記載の増幅プロセスにおいて陽性対照として使用される既知のハウスキーピング遺伝子の増幅のためのプライマーおよびプローブの例を表２中で報告する。
【表２】
0006359196.tif 000003
【実施例】
【００３５】
実験セクション
以下のセクションは、一例として、実験研究が、糖質コルチコイド医薬品の代表的なサンプルとしてデキサメタゾンを使用して、ＩＥＤＡＴ臨床試験下で遂行されたことを報告する。
【００３６】
インビボの実験
担当の倫理委員会の承認後に、そして患者または未成年者ならばその法定後見人による承認により、ＩＥＤＡＴ臨床試験に登録された２２名の患者のうちの１０名の患者の血液サンプルを得た。臨床試験によって提供された赤血球内の（ｉｎｔｒａ−ｅｒｈｙｔｒｏｃｉｔａｒｙ）デキサメタゾン（ＥＲＹＤＥＸ（登録商標））の第６回目の最後の点滴から正確に２１日目の治療の終了時に、血液収集を実行した。後続する抽出のためにＲＮＡを保存するのに適合した安定化溶液を含有する特別に提供されたチューブ（バキュテイナー）中でも、血液サンプルを収集した。簡潔には、抽出したＲＮＡを対応するｃＤＮＡへと逆転写し、ＡＴＭｄｅｘａ１発現の測定を目標とした分析を行った。この目的のために、リアルタイムＰＣＲアッセイを定性的および定量的な分析のためにセットアップし、リンパ芽球様細胞中で最初に記載された新しいｍＲＮＡ分子を特異的に同定することができた。前記アッセイにより、ＡＴＭｄｅｘａ１は１０個の利用可能なサンプルすべてにおいて同定された。同じ調査を、対照として使用される、デキサメタゾン薬物により治療されないＡ−Ｔ患者およびボランティアの健康な（野生型）被験体からの血液サンプルで実行した。前記サンプルにおいて、ＡＴＭｄｅｘａ１は検出されなかった（図１ａ）。報告された結果は、ＡＴＭｄｅｘａ１アイソフォームの誘導が薬物による治療に厳密に依存すると思われることを示唆する。
【００３７】
ＩＣＡＲＳスケールによる研究下で評価されたＡ−Ｔ患者の神経症状に対するＥＲＹＤＥＸの有効性から、より高いカプセル化に、およびしたがって薬物のより多量の投与に、より高い改善が関連することが明らかにされた［１１］。この理由のために、患者を、応答者（または「ローダー」）および不応答者（または「非ローダー」）へクラスター化した。ｄｅｘａ有効性をＡＴＭｄｅｘａ１誘導と相関させるために、患者からのサンプルを２つの群へと細分することによって、サブ分析を遂行した。図１ｂ中で示されるように、応答者のＡ−Ｔ患者（サンプル）は不応答者の患者からのものに比較してより高いＡＴＭｄｅｘａ１発現を示し、ＡＴＭｄｅｘａ１発現が実際にｄｅｘａ有効性に直接相関するかまたは少なくとも寄与するように思われることを示唆する。最後に、血液サンプルを、ＥＲＹＤＥＸ点滴からの異なる時間で（具体的には投与から＋８日目および＋２１日目で）収集した両方の群の単一患者から分析した。この事例において同様に、応答者患者は両方の時間で不応答者より高い発現レベルを示した。しかしながら、＋２１日目の時間よりも＋８日目の時間でより高いレベルでＡＴＭｄｅｘａ１転写物が発現されることが意外にも観察された（両方の事例における患者内レベルの比較によって）（図２）。このことは治療からのｄｅｘａ効果の経時的な段階的な漸減と一致し、事実、活性のある薬物有効性を維持するために反復投与に頼る必要性が強調される。
【００３８】
後続する実験（患者は上述したものと同様に登録された）において、正比例の関係性は、投与された薬物（デキサメタゾン）の量に依存して、ミニＡＴＭ発現とＩＣＡＲＳ変動との間で観察された（図５ａ）。特に、ミニＡＴＭ発現と投与された薬物（デキサメタゾン）量との間の相関は、直線タイプである。さらに、ミニＡＴＭ発現の増加は、神経症状のより高い改善（すなわちＩＣＡＲＳスコアの減少および引き起こされたΔＩＣＡＲＳの増加）と相関することが確認された（図５ｂ）。
【００３９】
最後に、ミニＡＴＭ決定のために使用される同じサンプル中のＦＫＢＰ５およびＤＵＳＰ１の遺伝子発現の評価により、グルココルチコイド治療はかかる遺伝子の発現を常に増加させるが、発現レベルは患者の２つの群（応答者および不応答者）において有意に変化しないことが明らかにされた。この観察は、治療法の有効性の特異的なバイオマーカーとしてのミニＡＴＭ発現の特異性を明らかにする。
【００４０】
要約すれば、ＡＴＭ−／−リンパ芽球様細胞株において最近同定された新しいＡＴＭｄｅｘａ１転写物［１４］は、初めてインビボで、特にＥＲＹＤＥＸにより治療されたＡ−Ｔ患者のＰＭＢＣにおいて同定された。デキサメタゾンを投与されなかったＡ−Ｔ被験体も野生型被験体も検出可能なレベルの転写物を示さなかったので、ＡＴＭｄｅｘａ１合成は薬物による治療と直接相関する。さらに、ＡＴＭｄｅｘａ１発現は、臨床的有効性と直接相関し、ＩＣＡＲＳスコアのより大きな減少のあるそれらの患者においてより高く、神経症状のより大きな改善と関連した。最後に、ＡＴＭｄｅｘａ１発現は、ＥＲＹＤＥＸ点滴に後続する日により高く、循環薬物の消失と平行して徐々に経時的に減少することが証明され、デキサメタゾン投与と臨床応答とＡＴＭｄｅｘａ１発現との間の関連性が確認される。
【００４１】
デキサメタゾンにより治療されたＡ−Ｔ患者のＰＢＭＣにおける、ＡＴＭｄｅｘａ１  ｍＲＮＡの同定および定量化についての実験プロトコール
１）サンプル収集：
溶解溶液および後続の抽出までＲＮＡ保存を確実にする安定化試薬を含有するバキュテイナーＴｅｍｐｕｓ血液ＲＮＡチューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に、Ａ−Ｔ患者および健康なボランティアから、３ｍｌの血液を直接収集した。採血直後に、サンプルを凍結し、−２０℃で数か月間維持することができた。病院施設から本発明者の実験室への出荷は、サンプルの解凍および劣化を回避するように同じ温度で実行した。
【００４２】
２）全ＲＮＡ抽出および相補的ＤＮＡ合成：
ＴｅｍｐｕｓスピンＲＮＡ単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、製造者の説明書中で報告される通りに、全ＲＮＡ抽出のために血液サンプルを加工した。混入ＤＮＡの完全な除外のために、クリーンアッププロセスをＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡ抽出キットによって先の精製に後続して行った。平均収率は、開始時に３ｍｌの全血からなる各々のサンプルについて、約８．５マイクログラムの純粋な全ＲＮＡであった。次いで、酵素ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって触媒される対応する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への逆転写の反応のために、反応をプライミングするｏｌｉｇｏｄＴもしくはランダムヘキサマーまたは両方の存在下において、各々のサンプルからの５００ｎｇのＲＮＡを用いた。製造業者によって説明されるプロトコール中で報告される通りに、ｃＤＮＡ合成を遂行した。
【００４３】
ヒト以外の種から得られる外来性の非保存的なＲＮＡ分子（例えば細菌または植物のｍＲＮＡ）を、抽出、合成および後続する増幅効率を検証できるように内部対照としてＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成の手順の前に添加した。より好ましくは、スタンダードとして使用される分子は、バキュテイナー中に含有される安定化溶液の中へ直接添加され得る。
【００４４】
３）サンプル中のＡＴＭｄｅｘａ１定量化のためのＰＣＲアッセイ：
複数の方法（すべてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく）が考案されており、収集された血液サンプル中のＡＴＭｄｅｘａ１の同定および定量化のためにセットアップされる。それらのうちのいくつかは以下に詳細に記載され、したがって発明として請求される。本明細書において導入されるすべて方法論は、対象となるサンプル中のＡＴＭｄｅｘａ１メッセンジャーＲＮＡの相対的および／または絶対的な定量を可能にする。
【００４５】
ａ）請求される第１の方法は、ＤＮＡの二本鎖（ｄｓ）の中へのインターカレート剤（例えば、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎのような、またはインターカレート作用を有する他のフルオロフォア）の使用を意図する。かかる技術は、増加するＤＮＡの二本鎖の中へインターカレートしてアンプリコン合成をモニターするインターカレート剤の存在下における、定量的リアルタイムＰＣＲによるｃＤＮＡファミリーの特異的な増幅に基づく。具体的には、それらの実験のために、本発明者は、好適な緩衝系中で酵素ＴａｑポリメラーゼおよびＳＹＢＲｇｒｅｅｎを含有する、ＴａｋａｒａによるＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）を使用した。３００ｎＭの最終濃度の１ペアの特異的なプライマーに加えて、追加量のＭｇＣｌ２を３．５ｍＭの至適最終濃度に達するように反応混合物に添加した。生来のｍＲＮＡの障害に対するＡＴＭｄｅｘａ１転写物に相補的なＤＮＡ（ＡＴＭｄｅｘａ１  ｃＤＮＡ）を選択的に認識するように、オリゴヌクレオチドペアをコンピューター内でデザインした（表１および２）。本明細書において提案された実施例において、増幅下のサンプル中でリアルタイムで測定される生の蛍光は、元のサンプル中に存在するＡＴＭｄｅｘａ１  ＲＮＡ量に厳密に依存し、蛍光の閾値に達するように、初期ＲＮＡ量に反比例する数の増幅サイクルを用いるだろう。ＡＴＭｄｅｘａ１の特異的且つ直線的な増幅を得るように最適化された温度プロフィールは、変性（９４℃で１０秒間）、アニーリング（６５℃で２０秒間）および７２℃で３６秒間の伸長の４０サイクルで設定された。定量化のための方法として、スタンダードとして使用されるＤＮＡサンプル中に既知の増加する量で添加されたＡＴＭｄｅｘａ１配列についての組換えプラスミドの分子から組み立てられたスタンダードカーブを使用して、方法の増幅効率および直線性を査定した。ＡＴＭｄｅｘａ１プラスミドの同じ連続希釈を、ＰＣＲ陽性対照およびゴールドスタンダードとして標的分子の絶対的定量のために使用することができる。あるいは、アッセイは、対象となるサンプル中のハウスキーピング遺伝子として選択されるＨＰＲＴ１  ｍＲＮＡを標的と同時に増幅する１ペアのプライマーを意図する。ＨＰＲＴ１以外に、他の参照遺伝子を試験し（例えばＧＡＰＤＨおよびβ２Ｍなど）、ΔΔＣｔまたはＰｆａｆｆｅｌ法によるＡＴＭｄｅｘａ１の相対的な定量化のために使用することができる。
【００４６】
本発明の記載において与えられる実験結果は、このセクション中で記載されるアッセイを用いて得られた。方法の検証は、上記のようなスタンダードカーブの設定を意図した。関連する増幅カーブ（図３、パネルＡ）、解離カーブ（図３、パネルＢ）および直線性カーブ（図３、パネルＣ）は、図３中で報告され、それは、ＡＴＭｄｅｘａ１の特異的で直線状の一義的な増幅を実証する。推定された直線性の線は−３．３０（１００％の増幅効率に対応する）の勾配および０．９９のＲ２を有する。
【００４７】
ｄｅｘａ治療を行ったＡ−Ｔ患者からの対象となるサンプルを同じ条件下で増幅し、無治療のＡ−Ｔ患者および健康なボランティアのものと比較した。図４中で示されるように、特異的な増幅はすべての調査サンプル中で得られたが、対照サンプル中で増幅は検出されなかった。ハウスキーピングＨＰＲＴ１の関連する閾値Ｃｔを引いて、陽性サンプルに由来する閾値サイクル（Ｃｔ）をＡＴＭｄｅｘａ１  ｍＲＮＡの相対量の計算のために使用した。
【００４８】
ｂ）第２の例示的な方法は、Ｔａｑポリメラーゼ酵素の５’−エクソヌクレアーゼ（ｅｓｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性を利用する５’−ヌクレアーゼアッセイに基づく。１ペアの特異的なプライマー以外に、同様に特異的なＤＮＡプローブを使用し、それは新しく合成されたアンプリコン上にアニールし、鎖伸長の間にポリメラーゼによって加水分解される。プローブは、３’−端および５’−端に結合されたクエンチャー（ＢＨＱクエンチャーまたはＢＨＱＰｌｕｓクエンチャー）およびレポーターフルオロフォアをそれぞれ有し、この場合、前者は後者の発光を阻害する。ポリメラーゼによるプローブの加水分解は、クエンチャーの離脱および分離を引き起こし、蛍光発光を結果として生じる。ＨＯＴ−ＲＥＳＣＵＥ  ＲＥＡＬ  ＴＩＭＥ  ＰＣＲ  ＦＰキット（Ｄｉａｔｈｅｖａ）の使用によって、本発明者のサンプルでこの反応を遂行した。標的遺伝子および参照遺伝子についての特異的なシグナルを有し、多重化ＰＣＲにおいて両方の反応を実行できるように、ＡＴＭｄｅｘａ１標的についてはレポーターフルオロフォアとしてＣｙ３を備えた特異的なプローブをデザインし、一方でハウスキーピングＨＰＲＴ１についてはフルオロフォアとしてＪＯＥを備えた特異的なプローブをデザインした。２ペアのプライマー（表１および２）の濃度を５００ｎＭに、一方でプローブ濃度を１００ｎＭに最適化した。温度プロフィールを、５０の９４℃で１５秒間の変性サイクル、続いて６０℃で６０秒間のアニーリング／伸長ステップで設定した。この事例において同様に、先の実施例中で記載されるように、ＡＴＭｄｅｘａ１の定量化は相対的な様式（参照遺伝子に関して）または絶対的な様式で実行することができる。
【００４９】
ｃ）ＡＴＭｄｅｘａ１は他のアッセイのシリーズ（すべてＰＣＲ技術に基づく）によって定量化することができる。例えば、分子ビーコン法において使用されるプローブは本発明者によってデザインされた。本出願において、蛍光性レポーター色素（ＡＴＭｄｅｘａ１のためのＦＡＭおよびＨＰＲＴ１のためのＨＥＸ）を備えた５’末端、およびクエンチャー（ＢＨＱ１、表１および２）を備えた３’末端で標識した分子ビーコンプローブの存在下において、増幅を遂行する。アニーリングステップの間に、プライマーおよびプローブは相補的ＤＮＡのそれぞれの配列へハイブリダイズする。プローブのハイブリダイゼーションは、特にそれらの「オープニング」を引き起こし、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離を引き起こし、したがって、クエンチャーはもはやレポーターフルオロフォアによって放射されるエネルギーを吸収することができない。
【００５０】
ｄ）提案された方法の別の実施例はハイブリダイゼーション／ＦＲＥＴプローブに基づき、２つの標識プローブの使用によるものであり、第１のものは３’末端上にドナーフルオロフォア（ＦＡＭ）を備えるが、第２のものは５’末端上にアクセプターフルオロフォア（ＬＣ  ｒｅｄ  ６４０）を備える。
【００５１】
ｅ）最終的に、ＰＣＲアッセイはスコーピオン技術のプローブからセットアップすることができる。
【００５２】
すべてのプライマーペアおよび上述の実施例において提案されたすべてのプローブの配列を、生物学的サンプル中のＡＴＭｄｅｘ１の増幅および後続する定量化のために、表１および表２中に報告する。ポリメラーゼ連鎖反応（例えばデジタルＰＣＲ）を用いたＡＴＭｄｅｘａ１の定量化を意図する、言及されたすべての方法に加えて、先のもののテーマに対する変形としてセットアップされた他の方法は、本発明の範囲内である。
参照文献
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配列リスト
配列番号：１：
ＡＴＣＴＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＴＣＡＧＡＴＴＣＣＡ
配列番号:２
ＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＡＡＴＴＡＣＴＡＡＡＣ
配列番号:３
ＣＧＣＣＴＧＡＴＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡ
配列番号:４
ＧＴＧＣＣＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＣＡＴ
配列番号:５
ＡＡＡＣＡＴＣＴＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＴＣＡＧＡＴＴＣＣＡＡ
配列番号：６
ＣＧＣＣＴＧＡＴＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡ
配列番号：７
ＧＴＧＣＣＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＣＡＴ
配列番号：８
ＴＣＴＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＴＣＡＧＡＴＴＣＣ
配列番号：９
ＡＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＣＡ
配列番号：１０
ＡＡＣＴＴＡＧＡＴＧＣＣＡＣＴＣＡＧ
配列番号：１１
ＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧ
配列番号：１２
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配列番号：１３
ＡＣＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＴＡＴＡＴＴＡＴ
配列番号：１４
ＴＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＡＴＴＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＡＧＡ
配列番号：１５
ＴＧＡＧＡＡＴＡＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＴＡＴＣ
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配列番号：１７
ＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＧＴＡＧＣＣＣＴＣＴ
配列番号：１８
ＧＧＡＡＡＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＡ
配列番号：１９
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ＴＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＧＡＡＣＧＴＣＴＴＧＣ
配列番号：２１
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配列番号：２２
ＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣ
配列番号：２３
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配列番号：２４
ＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＡＧＧＧＴ
配列番号：２５
ＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＧＴＡＧＣＣＣＴＣＴ
配列番号：２６
ＴＣＧＴＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡ
配列番号：２７
ＴＴＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＧＡＡＣ
配列番号：２８
ＴＡＣＣＴＡＡＴＣＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴ
配列番号：２９
ＧＧＣＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＣＴ
配列番号：３０
ＧＧＡＣＡＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＴＧＧＴ
配列番号：３１
ＡＧＡＴＣＣＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＴＴ
配列番号：３２
ＣＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＡＣ
【図１】
0006359196.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
0006359196.tif 000009
【図６】
0006359196.tif 000010
【配列表】
0006359196000001.app