(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物分解性ポリマーマトリックスおよび前記生物分解性ポリマーマトリックスと結合したタンパク質を含む、生物分解性眼内インプラントであって、
前記生物分解性ポリマーマトリックスが第１ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）および第２ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含み、
前記第１ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）がエステル末端基および約７５：２５のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有し、
前記第２ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が酸末端基および約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有し、
哺乳動物の眼に前記インプラントを設置後約９０日間、前記インプラントが生物学的活性型の前記タンパク質の連続放出を提供する、上記生物分解性眼内インプラント。
【請求項２】
第２ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）に対する第１ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）の重量対重量比が約９０：１０である、請求項１記載のインプラント。
【請求項３】
前記タンパク質が眼血管新生、脈絡膜血管新生、黄斑変性症および黄斑浮腫から成る群より選択される１つ以上の眼症状の症候を減少させることに対し治療上有効である、請求項１又は２記載のインプラント。
【請求項４】
前記タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に結合する、抗体、抗体フラグメント、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリンである、請求項３記載のインプラント。
【請求項５】
前記タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に結合する抗体であって、かつ哺乳動物の眼に前記インプラントを設置後４週間以上、前記インプラントが哺乳動物の眼において生体内でＶＥＧＦまたはＰＤＧＦの活性を効果的に抑制するか、または減少させる、請求項４記載のインプラント。
【請求項６】
酸末端基、０．１６〜０．２４ｄｌ／ｇの固有粘度（クロロホルム中０．１％、２５℃）、および約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）である、約８．８重量％のＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈ；エステル末端基、０．１６〜０．２４ｄｌ／ｇの固有粘度（クロロホルム中０．１％、２５℃）、および約７５：２５のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）である、約７９．７重量％のＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５２Ｓ；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する、約１０重量％の抗体；約０．１重量％のポリソルベート２０；ならびに約１．４重量％のリン酸ナトリウムを含む、生物分解性眼内インプラントであって、哺乳動物の眼に前記インプラントを設置後４週間以上、前記インプラントが哺乳動物の眼において生体内でＶＥＧＦの活性を効果的に抑制するか、または減少させる、生物分解性眼内インプラント。
【請求項７】
哺乳動物の眼に眼内インプラントを注入する装置であって、
前記装置が、ｉ）長軸を有する細長い筐体；ならびにｉｉ）前記筐体から長軸方向に伸びるカニューレであって、前記カニューレが近位端部、尖鋭な遠位端部、および前記カニューレを通って伸びる内腔を有するカニューレであり、前記カニューレが請求項１〜６のいずれかにより規定されるインプラントをさらに含み、前記インプラントが前記カニューレの前記内腔内に設置されるカニューレを含む装置。
【請求項８】
治療を必要とする哺乳動物の眼における眼症状を治療する方法に使用するための生物分解性眼内インプラントであって、前記方法が、前記哺乳動物の眼に前記インプラントを設置し、これにより前記眼症状を治療することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生物分解性眼内インプラント。
【請求項９】
前記眼症状が眼血管新生、脈絡膜血管新生、黄斑変性症または黄斑浮腫である請求項８記載の生物分解性眼内インプラント。
【請求項１０】
前記治療する方法が、インプラントを前記眼の硝子体に設置することを含む請求項８又は９記載の生物分解性眼内インプラント。
【請求項１１】
前記哺乳動物がヒトである請求項８〜１０のいずれか一項に記載の生物分解性眼内インプラント。
【請求項１２】
前記治療する方法が、インプラントを前記眼に設置後約４週間以上、前記インプラントにより前記眼症状を効果的に治療することを含む請求項８〜１１のいずれか一項に記載の生物分解性眼内インプラント。
【請求項１３】
前記治療する方法が、インプラントを前記眼に設置後約９０日間、前記インプラントにより前記眼症状を効果的に治療することを含む請求項８〜１２のいずれか一項に記載の生物分解性眼内インプラント。
【請求項１４】
生物分解性ポリマーマトリックスおよび前記生物分解性ポリマーマトリックスと結合したタンパク質を含み、前記生物分解性ポリマーマトリックスが第１ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）および第２ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含み、前記第１ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）がエステル末端基および約７５：２５のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有し、前記第２ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が酸末端基および約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有する、生物分解性眼内インプラントを作製する方法であって、哺乳動物の眼に前記インプラントを設置後９０日間以上、前記眼内インプラントが生物学的活性型のタンパク質の連続放出を提供する眼内インプラントであり、前記方法が、
ａ）１つ以上のタンパク質を含み、および任意に１つ以上の賦形剤、塩、緩衝剤、防腐剤、高分子電解質、またはそれらの組合せを含んでいてもよい乾燥粉末を準備すること；
ｂ）前記乾燥粉末を前記第１及び第２のポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマーと混合し、混合物を作製すること；
ｃ）６０℃〜９０℃の温度で前記混合物を押出成形し、フィラメントを作製すること；
ｄ）前記フィラメントを切断し、眼の眼球領域における設置に適した０．５〜１０ｍｍの長さのインプラントを作製すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願に係る請求項は、２０１２年９月２７日に提出した米国仮特許出願第６１／７０６，５１６号に基づく優先権を享受するものであり、該仮特許出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、哺乳類の組織におけるタンパク質徐放用の生物分解性インプラントに関する。このインプラントを製剤して、１ヶ月間以上（３０日間以上）、生体内で、生物学的活性型の、抗体等のタンパク質の徐放を提供する。このインプラントは、眼の前方領域または後方領域に発症する眼症状（眼疾患を含む）、ならびに体領域および体組織に発症する病状を治療するのに有用である。具体例には、眼内投与および関節内投与用のインプラントが含まれる。徐放性のタンパク質含有インプラントを作製する方法も記載する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質の長期放出を提供することができる、注射可能で生体適合性の組成物の開発に大きな関心が集まっている。１、２または３ヶ月以上の間、制御された速度で、治療レベルの生物学的活性型タンパク質を放出する生体適合性かつ生物分解性組成物の開発は特に有利であろう。
【０００４】
治療レベルの機能タンパク質を長期間届けることができる眼内インプラント等の生物分解性組成物は、抗体等のタンパク質の使用に頻繁な眼内注射または高い全身投与が通常必要とされる、眼疾患の治療に非常に有用であり得る。
【０００５】
頻繁な注射に付随する不快感や時間に加えて、直接的な眼内注射は、網膜剥離、水晶体の損傷および感染症を含む、患者に対する特定の危険性を伴い得る。直接的な眼内注射は、水晶体および他の眼内組織において、タンパク質薬剤の高パルス濃度に起因する局所毒性をもたらす可能性もある。さらに、全身的に投与されたタンパク質の網膜への浸透は、血液網膜関門（ＢＲＢ）により激しく制限される。
【０００６】
化合物は通常、眼房水による浄化で小帯後隙へ拡散するか、または網膜を通っての排除により、眼の硝子体から排除される。大半の高分子量化合物では前者の経路が使用され、親油性化合物および網膜を通っての輸送機構を有する化合物では後者が使用される。残念ながら、網膜を通って排除される化合物は、非常に短い半減期を有する。したがって、これらの化合物では、直接的な眼内注射により治療濃度を維持することが困難である。頻繁な注射が必要とされるであろう。眼房水により排除されるタンパク質等の巨大分子でさえも、硝子体半減期は治療期間と比較して短い。したがって、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）等の化合物は、月に一度の頻度で硝子体内注射により投与しなくてはならない。
【０００７】
したがって、パルス投与に付随する過渡的な高濃度を避けながら、安全かつ効果的で、単一投与で生物学的活性型タンパク質の長期放出を提供することができる生物分解性インプラントを開発することによりタンパク質の頻繁な注射の必要性を除去することは、患者にとって非常に価値あるものとなるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、１ヶ月以上、２ヶ月以上または３ヶ月以上（すなわち、９０日以上）の間、生体内で治療有効量の生物学的活性型タンパク質を放出できる生物分解性ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
生物分解性ドラッグデリバリーシステムは、生物分解性ポリマーマトリックスおよびこの生物分解性ポリマーマトリックスと結合したタンパク質を含んでもよく、それらから成ってもよく、または本質的にそれらから成ってもよい。本発明の範囲内のドラッグデリバリーシステムの例には、押出成形したフィラメント（すなわち、押出成形工程により形成したインプラント）および圧縮錠が含まれる。
【００１０】
例えば生物分解性ドラッグデリバリーシステムは、単一または二重押出成形工程により調製した押出成形したフィラメントの形態であることができる。押出成形したフィラメントは、哺乳動物の眼への設置用の大きさに形成することができ、より詳細には、眼球領域への設置用の大きさに形成することができる。このようなフィラメントを「眼内インプラント」、「生物分解性眼内インプラント」、またはより詳細には「押出成形した生物分解性眼内インプラント」と呼んでもよい。押出成形したフィラメントを関節内領域への設置用に形成して、関節の疾患または病状を治療してもよい。このようなフィラメントを「関節内インプラント」と呼んでもよい。押出成形したフィラメントは固体、半固体または粘弾性であることができる。
【００１１】
したがって、一実施形態においては、本発明は生物分解性ポリマーマトリックスおよびこの生物分解性ポリマーマトリックスと結合したタンパク質を含むか、またはこれらから成る生物分解性眼内インプラントを提供する。このインプラントは、哺乳動物の眼にインプラントを設置後３０、６０または９０日間以上、生物学的活性型タンパク質の連続放出を提供する。特定の一実施形態においては、本発明は、生物分解性ポリマーマトリックスおよびこの生物分解性ポリマーマトリックスと結合したタンパク質を含む生物分解性眼内インプラントを提供し、このインプラントは、哺乳動物の眼にインプラントを設置後３ヶ月より長い間、生物学的活性型タンパク質の連続放出を提供する。このタンパク質を、生物分解性ポリマーマトリックスにより封入することができ、かつ／または、生物分解性ポリマーマトリックス中に分散させることができる。このタンパク質は、均一にまたは非均一に、ポリマーマトリックス中に分布することができる。インプラントは単一のタンパク質を含むか、または第１および第２タンパク質標的に対する第１および第２抗体等の、第１および第２タンパク質を含んでもよく、これにより抗体が生体内で結合して第１および第２タンパク質標的の活性を抑制するよう設計される。一実施例は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に特異的に結合する（換言すれば、特異的である）抗体、ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復タンパク質）、またはアンチカリンを含むインプラントである。例えば、本発明のインプラントは抗ＶＥＧＦもしくは抗ＰＤＧＦ抗体、または抗ＶＥＧＦおよび抗ＰＤＧＦ抗体の両方を含むことができる。
【００１２】
眼内または関節内インプラント中に含まれることができ、したがって眼内または関節内インプラントにより届けられ得るタンパク質の非限定例としては、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、二重特異性抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメント、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎおよび酵素が挙げられる。他の例としては、糖タンパク質および血清アルブミンが挙げられる。モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、例えば細胞により作製されたままの天然型で使用することができ、翻訳後修飾を含有してもしなくてもよく、または細胞培養もしくは他の生物学的試料からの単離に続いて作製される化学的修飾型もしくは酵素的修飾型で使用してもよい。抗体はキメラであってもよい。具体的な実施形態においては、抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭであってもよい。有用な抗体フラグメントには、パパインから産生される抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）または抗体のペプシン開裂から産生される抗体フラグメントが含まれる。より一般的には、有用な抗体フラグメントにはＦａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、ＦａｂｃおよびＦｖフラグメントが含まれる。抗体フラグメントは抗体全体の改変により作製するか、または組換えＤＮＡ方法論を使用して新規に合成したものであってもよく、現在の従来技術により作製される「ヒト化」抗体をさらに含む。「抗体フラグメント」は完全長抗体の一部を含み、一般的に完全長抗体の抗原結合性ドメインまたは可変性ドメインを含む。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態は、抗ＶＥＧＦ抗体またはタンパク質（すなわち、血管内皮細胞増殖因子タンパク質、もしくはＶＥＧＦ−Ａ、に特異的に結合する抗体またはタンパク質）を含む生物分解性インプラントを提供する。有用な抗ＶＥＧＦ抗体には、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））およびベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））が含まれるがこれらに限定されるものではない。有用な抗ＶＥＧＦタンパク質には、アフリバーセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））（ＶＥＧＦトラップとしても知られる）、ＶＥＧＦ結合性ＤＡＲＰｉｎ、およびＶＥＧＦ結合性アンチカリンが含まれる。ＶＥＧＦトラップ（ニューヨークのＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、ヒト抗体のＦｃ領域（Ｃ末端）に結合した２つの異なるＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインの一部を含有する融合タンパク質である。いくつかの実施形態においては、インプラントは、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、抗ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）抗体、抗インテグリン抗体、治療上効果的なそれらのフラグメント、およびそれらの組合せから成る群より選択される抗体を含んでもよい。
【００１４】
他の実施形態においては、本発明は、抗ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）抗体またはタンパク質を含む、押出成形した生物分解性インプラントを提供する。有用な抗ＴＮＦ抗体には、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、セルトリズマブペゴール（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標））、およびゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））が含まれるがこれらに限定されるものではない。有用な抗ＴＮＦタンパク質には、融合タンパク質エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））が含まれる。抗ＴＮＦタンパク質を含むインプラントは、ブドウ膜炎およびベーチェット病の治療に特に有用であってもよい。
【００１５】
本発明の眼内または関節内インプラント中に包含させる他のタンパク質には、神経成長因子、酸性線維芽細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子等の増殖因子；毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、およびグリア細胞由来神経栄養因子等の神経栄養因子；インターフェロン−ガンマおよびインターロイキン−１０等のサイトカイン；リツキシマブ等の抗増殖性化合物；および組織プラスミノーゲンアクチベーター等のフィブリノリジンタンパク質が含まれる。このようなタンパク質の治療用途は、一般的に当業者に公知である。
【００１６】
したがって、本発明の生物分解性眼内インプラントまたは関節内インプラントは、抗ＶＥＧＦ抗体（ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体）、抗ＰＤＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、抗インテグリン抗体、治療上効果的なそれらのフラグメント、およびそれらの組合せから成る群より選択される抗体を含んでもよい。
【００１７】
血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦとも呼ばれる）は、生体外での内皮細胞増殖および生体内での血管新生を刺激することができる血管内皮細胞に特異的な分泌分裂促進因子である。ＶＥＧＦ−Ａは異なるアイソフォームで生じることができる。ＶＥＧＦ−Ａ121を除く、ＶＥＧＦ−Ａの全アイソフォームがヘパリンと結合する。ヒトにおいては、最も豊富なＶＥＧＦ−Ａのアイソフォームは１６５−アミノ酸ポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ａ165である。例えば、ＨｏｕｃｋらのＭｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  ５：１８０６  （１９９１）、およびＬｅｕｎｇらのＳｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６  （１９８９）を参照のこと。
【００１８】
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、生物分解性ポリマーマトリックスおよびＶＥＧＦ−Ａ165に結合する抗体、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリンを含む生物分解性インプラントを提供する。この抗体、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリンはＶＥＧＦ−Ａの全アイソフォームで存在するエピトープを認識してもよいので、同じ抗体、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリンは、ＶＥＧＦ−Ａの全アイソフォームを認識して結合してもよい。例えば、この抗体、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリンは、ＶＥＧＦ121を含むＶＥＧＦ−Ａの全アイソフォームで存在するＶＥＧＦ−Ａ受容体結合ドメインの領域で、エピトープを認識して特異的に結合してもよい。したがって、本発明のインプラント中の単一の抗ＶＥＧＦ抗体（またはＤＡＲＰｉｎもしくはアンチカリン）は、ＶＥＧＦ−Ａの全アイソフォームを認識して特異的に結合してもよい。ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ受容体に結合するモノクローナル抗体およびヒト抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗体が記載されている。例えば、米国特許第５，９５５，３１１号および同第６，８８４，８７９号を参照のこと。ベバシズマブはヒトＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合して抑制するモノクローナル抗体の一例である。ＰＤＧＦに対する抑制抗体も記載されている。例えばＷＯ２００３／０２５０１９を参照のこと。
【００１９】
生体内でＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに特異的に結合する抗体または抗体の組合せ等の、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）もしくは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）抑制剤またはその両方を含む徐放性の生物分解性インプラントは、必要とする患者において黄斑変性症（湿性加齢黄斑変性症を含む）、網膜症、糖尿病性網膜症、糖尿病性増殖性網膜症、鎌状赤血球網膜症、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼球新血管新生（眼における新生血管の異常増殖）、脈絡膜血管新生、網膜静脈閉塞に起因する新血管新生、角膜血管新生、糖尿病網膜虚血、および黄斑浮腫を治療する特定の有用性を有してもよい。
【００２０】
一実施形態においては、本発明は、生物分解性ポリマーマトリックスならびにＶＥＧＦおよびＰＤＧＦとそれぞれ特異的に結合する、第１および第２抗体または二重特異性抗体を含む生物分解性眼内インプラントを提供する。このインプラントは、哺乳動物の眼にインプラントを設置後３０、６０または９０日間以上、生物学的活性型の第１および第２抗体または二重特異性抗体の連続放出を提供する。一形態においては、これらの抗体または二重特異性抗体は、血管内皮細胞増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）および血小板由来増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）に対し特異的である。これらのインプラントは、眼球腫瘍、眼球新血管新生、脈絡膜新血管新生、および黄斑変性症の治療に有用である。「ＰＤＧＦ−Ｂ」はＰＤＧＦのＢ鎖ポリペプチドを意味する。
【００２１】
本発明のインプラントは、このシステムから抗体が放出された際、その抗体の所定のタンパク質標的に特異的に結合するように、抗体の生物学的活性を維持するよう設計される。タンパク質標的への抗体の結合が、タンパク質とそのリガンドまたは受容体の間に干渉を提供してもよく、したがってタンパク質／受容体相互作用により媒介される機能をこの抗体により抑制することができ、または減少させることができる。抗体がタンパク質（ポリペプチド）標的に特異的に結合しているか、またはタンパク質（ポリペプチド）標的「と免疫反応性」かどうかを測定するいくつかの方法が当業者に公知である。免疫化学発光測定アッセイ（ＩＣＭＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）がいくつかの例である。
【００２２】
いくつかの実施形態においては、本発明は、生物分解性ポリマーマトリックス、ならびに、ＶＥＧＦもしくは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）またはＶＥＧＦおよびＰＤＧＦの両方と相互作用する（例えば、結合してそれらの活性を減らすまたは抑制する）、１つ以上のモノクローナル抗体、二重特異性抗体、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、抗体フラグメント、抗体可変領域由来組換え型ポリペプチド、またはそれらの混合物を含む、押出成形した生物分解性インプラントを提供する。例えば、本発明は、生物分解性ポリマーマトリックスならびにＶＥＧＦおよびＰＤＧＦと特異的に結合する二重特異性抗体を含む、押出成形した生物分解性インプラントを提供し、このインプラントは、哺乳動物の眼にインプラントを設置後９０日間以上、生物学的活性型の抗体の連続放出を提供する。他の実施形態においては、本発明のインプラントは、生物分解性ポリマーマトリックスおよびＶＥＧＦ受容体に特異的な抗体を含んでもよい。
【００２３】
本発明のドラッグデリバリー製剤において有用なモノクローナル抗体は、当業者に公知の常法を使用して得ることができる。簡単に述べると、マウス等の動物にＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ等の所望の標的タンパク質またはその一部（抗原）を注射する。標的タンパク質は、好ましくは担体タンパク質と共役する。この動物を、１つ以上の標的タンパク質注射で追加免役し、融合３日前に静脈内（ＩＶ）追加免疫により過免疫にする。マウス脾臓細胞を単離し、標準方法により骨髄腫細胞へ融合する。標準方法に従って、ハイブリドーマを標準ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミン（ＨＡＴ）培地中で選択することができる。標的タンパク質を認識する抗体分泌ハイブリドーマを、標準免疫学的技術を使用して同定、培養およびサブクローニングし、例えば親和性クロマトグラフィーにより抗体を精製する。本発明のデリバリーシステムの特定の実施形態においては、抗ＶＥＧＦまたは抗ＶＥＧＦＲモノクローナル抗体をＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ（ニューヨーク州ニューヨーク）から得る。例えば、本発明の製剤は、ＩｍＣｌｏｎｅ  ＳｙｓｔｅｍｓからＩＭＣ−１８Ｆｌの名称で入手可能な抗体、またはＩＭＣ−１１２１  Ｆａｂの名称で入手可能な抗体を含んでもよい。本発明のドラッグ製剤において使用してもよい他の抗ＶＥＧＦ抗体フラグメントは、ＶＥＧＦ−Ａと結合するＦａｂフラグメントのラニビズマブである。本発明のドラッグデリバリーシステムにおいて有用な他の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ−Ａと結合するモノクローナル抗体のベバシズマブである。
【００２４】
いくつかの実施形態においては、ドラッグデリバリーシステム（例えば、眼内または関節内インプラント）内のタンパク質は、２０以上、３０以上、５０以上、１００以上、２００以上、または３００以上のアミノ酸の長さである。いくつかの実施形態においては、タンパク質は３つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの例においては、タンパク質は３０〜５０のアミノ酸の長さ、または１００〜５００のアミノ酸の長さであってもよい。本発明のいくつかの形態においては、タンパク質は５キロダルトン（ｋＤａ）未満の分子量を有してもよい。他の形態においては、タンパク質は５ｋＤａ超、１０ｋＤａ超、２０ｋＤａ超、５０ｋＤａ超、または１００ｋＤａ超の分子量を有してもよい。本発明の特定の形態においては、タンパク質は１０〜３０ｋＤａ、または２０〜５０ｋＤａの分子量を有してもよい。例えば、タンパク質は１４〜１６ｋＤａ、または１４〜２１ｋＤａの分子量を有してもよい。タンパク質は、直鎖、分岐または環状であってもよく、化学的に合成してもよく（例えば固相合成を使用して）、または天然もしくは組換えで作製してもよい。タンパク質は融合タンパク質であってもよい。天然型形態に関してタンパク質を切断してもよい。タンパク質は１つ以下のアミノ酸鎖、または２つ以上のアミノ酸鎖を含んでもよい。２つ以上の鎖が、互いに共有結合的または非共有結合的に結合してもよい。例えば、アミノ酸鎖はジスルフィド結合で結合してもよく、または２つ以上の鎖が互いに非共有結合力のみで結合してもよい。タンパク質は、合成的修飾もしくは翻訳後修飾したアミノ酸を含有してもしなくてもよい。本発明のインプラントにおいて使用するタンパク質は、組換え（哺乳類もしくは原核生物の細胞培養による）で作製してもよく、合成的（例えば固相合成による）に作製してもよく、または自然源（例えば、哺乳類もしくは細菌の細胞培養、血漿、血清、植物、菌類等）から単離してもよい。タンパク質中の１つ以上のアミノ酸が、非天然型であってもよい。
【００２５】
本発明の生物分解性眼内インプラントまたは関節内インプラントは、インプラントの重量（すなわち％ｗ／ｗ）で約１．０％〜約５０％のタンパク質、インプラントの重量で約５％〜約３０％のタンパク質、インプラントの重量で約５％〜約４０％のタンパク質、インプラントの重量で約１０％〜約２５％のタンパク質、またはインプラントの重量で約５％、１０％、２０％もしくは３０％のタンパク質を含んでもよい。
【００２６】
タンパク質および生物分解性ポリマーマトリックスに加えて、インプラントは１つ以上の賦形剤、塩、緩衝剤、防腐剤、高分子電解質、またはそれらの任意の組合せを含んでもよい。
【００２７】
有用な賦形剤には、トレハロース、イヌリンおよびスクロース等の炭水化物（例えば、トレハロース、α，α−トレハロース二水和物）；ポリソルベート２０、ポリソルベート８０およびプルロニックＦ１２７等の界面活性剤；ポリエチレングリコール３３５０（ＰＥＧ３３５０）等のポリエチレングリコール；グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジンおよびヒスチジンなどのアミノ酸；エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩無水物等のキレート剤；グリセロール、ソルビトールおよびマンニトールなどの多価アルコール；コレステロール；アルブミン；シクロデキストリン；デキストラン；ポリビニルアルコール；グリセリン；ならびに塩化亜鉛、ならびにそれらの組合せが含まれる。賦形剤はインプラント中に、０．０１〜３０重量％（ｗ／ｗ）、０．０１〜２０重量％、または０．０１〜約１５重量％の量で存在してもよい。
【００２８】
適切な水溶性緩衝剤には、リン酸ナトリウム（例えば、リン酸モノナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）およびリン酸二ナトリウム（ＮａＨＰＯ4））、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸ナトリウム等の、アルカリ金属およびアルカリ土類金属炭酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩およびコハク酸塩等が含まれるがこれらに限定されるものではない。これらの薬剤は、システムのｐＨを２〜９、より詳細には４〜８で維持するのに満足な量で有利に存在する。緩衝剤はインプラント中に０．０１〜１０重量％（ｗ／ｗ）の量で存在してもよく、例えば約０．０１％〜５％  ｗ／ｗ等である。
【００２９】
適切な水溶性防腐剤には、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸塩、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、パラベン、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、ベンジルアルコールおよびフェニルエタノール等、ならびにそれらの混合物が含まれる。これらの薬剤はインプラント中に０．００１〜約５重量％（ｗ／ｗ）の量で存在してもよく、例えば０．０１％〜約２％  ｗ／ｗ等である。
【００３０】
適切な高分子電解質には、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリリジン、プロトアミン、ヒストン、硫酸ポリミキシンＢ、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ＤＥＡＥ−デキストラン、カラゲナン、コンドロイチン硫酸塩、アルギネート硫酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸塩、ポリビニル硫酸塩、およびポリリン酸塩が含まれる。
【００３１】
適切な塩にはＮａＣｌ、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ2等が含まれる。
【００３２】
生物分解性ポリマーマトリックスは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、またはそれらの組合せを含むことができる。いくつかの実施形態においては、このマトリックスは第１および第２ＰＬＧＡコポリマーの混合物を含む。第１ＰＬＧＡコポリマーはエステル末端基を有することができ、第２ＰＬＧＡコポリマーは酸末端基を有することができる。より詳細には、第１ＰＬＧＡコポリマーはＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５２Ｓであることができ、第２ＰＬＧＡコポリマーはＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈであることができる。一具体的実施形態においては、このドラッグデリバリーシステム（例えば、押出成形したインプラント）中でのＲＧ５０２Ｈに対するＲＧ７５２Ｓの重量対重量比は、約９０対１０である。他の実施形態においては、第１ＰＬＧＡコポリマーはＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５３Ｓであり、第２ＰＬＧＡコポリマーはＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈである。有用な形態においては、押出成形したインプラント中でのＲＧ５０２Ｈに対するＲＧ７５３Ｓの重量対重量比は、約９０対１０である。
【００３３】
いくつかの実施形態においては、インプラントが吸収性ポリマーをさらに含んでもよい。吸収性ポリマーは、生体内で溶解するが分解しないポリマーである。したがって、吸収性ポリマーは通常水溶性である。吸水性ポリマーの一例はポリエチレングリコール３３５０（ＰＥＧ３３５０）である。
【００３４】
本発明において使用するポリマーまたはポリマー材料のいくつかの好ましい特性には、生体適合性、治療成分との適合性、本発明のドラッグデリバリーシステム作製におけるポリマーの使いやすさ、生理環境における約６時間以上の、好ましくは約１日より長い半減期、硝子体の粘度を著しく増加させないこと、および水不溶性が含まれる。
【００３５】
包含されてマトリックスを形成する生物分解性ポリマーは、望ましくは酵素的不安定性または加水分解不安定性を受けやすい。安定性の程度は、モノマーの選択、ホモポリマーまたはコポリマーを使用するかどうか、ポリマーの混合物の使用、およびポリマーが末端酸基を含むかどうかに依存して、幅広く変化することができる。
【００３６】
ポリマーマトリックスは、生物分解性ポリマーもしくは第１および第２ポリマーの組合せを含んでもよく、またはそれらから成ってもよい。１つ以上のポリマーに加えて、およびマトリックスに結合した１つ以上のタンパク質に加えて、ポリマーマトリックスは任意に１つ以上の賦形剤、塩、緩衝剤、防腐剤または高分子電解質をさらに含んでもよく、これらの例は上に記載されている。
【００３７】
ポリ乳酸（またはＰＬＡ）には、ポリ（Ｄ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）が含まれ、ＣＡＳ番号２６６８０−１０−４によって識別してもよく、以下の式で表してもよい：
【００３８】
【化１】
0006317748.tif 000002
【００３９】
ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（またはＰＬＧＡ）にはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が含まれ、ＣＡＳ番号２６７８０−５０−７によって識別され、以下の式で表してもよい：
【００４０】
【化２】
0006317748.tif 000003
【００４１】
したがって、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）はコポリマーであり、１つ以上のＤ，Ｌ−ラクチド繰返し単位のブロックおよび１つ以上のグリコリド繰返し単位のブロックを含み、それぞれのブロックの大きさおよび数は変化してもよい。ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）コポリマー中の各モノマー（繰返し単位）のモル比は、０〜１００％、約１５〜８５％、約２５〜７５％、または約３５〜６５％であってもよい。いくつかの実施形態においては、Ｄ，Ｌ−ラクチド対グリコリドのモル比は、約５０：５０または約７５：２５であってもよい。
【００４２】
ポリマーマトリックス中に含まれるＰＬＡおよび／またはＰＬＧＡポリマーは、エステル末端基または遊離のカルボン酸末端基を含んでもよい。
【００４３】
ＰＬＡおよびＰＬＧＡ  ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ポリマーは、ドイツのＥｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ＡＧから入手可能である。
【００４４】
ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）Ｒ２０３Ｈは、酸末端基および２５℃においてクロロホルム（ＣＨＣｌ3）中の０．１％  ｗ／ｖ溶液で測定される０．２５〜０．３５ｄｌ／ｇの固有粘度を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）である。
【００４５】
ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２は、エステル末端基および０．１６〜０．２４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中の０．１％  ｗ／ｖ溶液で測定）を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）であり、約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有する。
【００４６】
ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈは、酸末端基および０．１６〜０．２４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中の０．１％  ｗ／ｖ溶液で測定）を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）であり、約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有する。
【００４７】
ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０３Ｈは、酸末端基および０．３２〜０．４４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中の０．１％  ｗ／ｖ溶液で測定）を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）であり、約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有する（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０３Ｈ）。
【００４８】
ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５３Ｓは、エステル末端基および０．３２〜０．４４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中の０．１％  ｗ／ｖ溶液で測定）を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）であり、約７５：２５のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有する。
【００４９】
ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５２Ｓは、エステル末端基および０．１６〜０．２４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中の０．１％  ｗ／ｖ溶液で測定）を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）であり、約７５：２５のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有する。
【００５０】
本発明のインプラントは、眼球領域または関節内領域においてこのシステムを設置後約１、２または３ヶ月以上の間、治療有効量の生物学的活性型タンパク質の連続放出を提供してもよい。拡散、浸食、溶解または浸透により、抗体等のタンパク質がインプラントから放出されてもよい。
【００５１】
本発明の目的の生物分解性インプラント中のタンパク質（抗体等）の量は、１つ以上の眼症状または関節内症状の症候を減少させるのに効果的な量であることができる。このような量は、例えば約２０μｇ〜約５００μｇまたはそれ以上のタンパク質であってもよい。さらに、インプラント（押出成形したインプラント等）は、好ましくは治療有効量のタンパク質を長期間放出し、期間は３０〜９０日またはそれ以上であってもよい。タンパク質の治療有効量は、約０．５μｇのタンパク質／１日から約４μｇのタンパク質／１日の放出速度であってもよい。いくつかの場合においては、治療有効量は、約０．５μｇのタンパク質／１日から約２μｇのタンパク質／１日の放出速度であってもよい。例えば、インプラントは、約２μｇのタンパク質／１日を放出する場合、治療有効量の抗体を提供してもよい。さらに、１、２または３ヶ月より長い間のタンパク質の連続放出に起因するだけでなく、インプラントが設置された眼または組織中のタンパク質の残留効果に起因して、インプラントは３ヶ月よりも長い間治療有効量を提供してもよい。
【００５２】
約１、２または３ヶ月以上の期間にわたって連続的に放出されるタンパク質の量は、眼症状（前方もしくは後方の眼症状を含む）または関節内疾患もしくは症状を治療するのに効果的な量であってもよい。
【００５３】
本発明の押出成形したフィラメントは、硝子体、前眼房または結膜下腔を含む眼球領域における設置用の大きさで形成することができる。押出成形したフィラメントは桿状または非柱状であることができる。
【００５４】
フィラメントの生物分解性ポリマーマトリックスは、１つ以下の生物分解性ポリマーを含んでもよく、または２つ以上の生物分解性ポリマーの混合物を含んでもよい。例えば、インプラントは第１および第２生物分解性ポリマーの混合物を含んでもよく、ここで第１ポリマーは第２ポリマーと異なる。ポリマーは、末端基、固有粘度もしくはポリマーの繰返し単位、またはそれらの任意の組合せに関して他のポリマーと異なってもよい。１つ以上の生物分解性ポリマーが末端酸基を有してもよい。例えば、第１生物分解性ポリマーが酸末端ポリマー（酸末端基を有する）であることができ、第２生物分解性ポリマーがエステル末端ポリマー（エステル末端基を有する）であることができる。他の実施形態においては、生物分解性ポリマーマトリックスが第１、第２および第３生物分解性ポリマーを含む。
【００５５】
したがって、本発明のドラッグデリバリーシステムの一例は、抗体および生物分解性ポリマーマトリックスを含む押出成形したフィラメント（例えば、眼内インプラントまたは関節内インプラント）であって、このポリマーマトリックスが第１および第２生物分解性ポリマーの混合物を含み、このフィラメントが、眼球領域または関節内領域においてフィラメントを設置してから約１ヶ月以上の間、治療有効量の生物学的活性型の抗体を放出する。その特定の実施形態においては、フィラメントは、眼球領域または関節内領域においてフィラメントを設置してから約１、２または３ヶ月以上の間、治療有効量の生物学的活性型抗体を放出する。
【００５６】
他の例は、抗体および生物分解性ポリマーマトリックスを含む押出成形したフィラメントであって、このポリマーマトリックスが１つ以下の生物分解性ポリマーを含み、このフィラメントが、眼球領域または関節内領域においてフィラメントを設置してから約１ヶ月以上の間、または約２もしくは３ヶ月以上の間、治療有効量の生物学的活性型の抗体を放出する。
【００５７】
上記で説明したとおり、押出成形したフィラメントが１つまたは１つよりも多い生物分解性ポリマーを含むかどうかに関わらず、フィラメントは、安定性を改良し、かつ／またはフィラメントからの抗体の放出速度を調節し得る、１つ以上の賦形剤、塩、緩衝剤、防腐剤または高分子電解質をさらに含んでもよい。放出調節は、１つ以上の賦形剤、塩、緩衝剤、防腐剤もしくは高分子電解質を有しない同一フィラメントと比較して、より線形の放出速度の形態、および／またはより長い周期において示してもよい。有用な賦形剤、塩、緩衝剤、防腐剤もしくは高分子電解質は前に記載しており、これらにはポリソルベート２０、トレハロースおよびリン酸ナトリウムが含まれる。
【００５８】
第１および第２生物分解性ポリマーの混合物を含むフィラメントにおいては、第１および第２ポリマーを、エステル末端ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマーおよび酸末端ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマーから成る群より独立して選択することができる。特定の実施形態においては、インプラント中の酸末端コポリマーに対するエステル末端コポリマーの重量対重量比は、９０：１０である。
【００５９】
１つの生物分解性ポリマーを含み、他の生物分解性ポリマーを含まないフィラメントにおいては、１つの生物分解性ポリマーを、エステル末端ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー（エステル末端基を有するＰＬＧＡコポリマー）および酸末端ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー（酸末端基を有するＰＬＧＡコポリマー）から成る群より選択することができる。
【００６０】
前述の任意の実施形態においては、エステル末端および／または酸末端ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマーを、
ｉ）エステル末端基、０．１６〜０．２４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中０．１％  ｗ／ｖ）、および約７５：２５のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５２Ｓ）；
ｉｉ）エステル末端基、０．３２〜０．４４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中０．１％  ｗ／ｖ）、および約７５：２５のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５３Ｓ）；
ｉｉｉ）酸末端基、０．１６〜０．２４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中０．１％  ｗ／ｖ）、および約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈ）；および
ｉｖ）酸末端基、０．３２〜０．４４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中０．１％  ｗ／ｖ）、および約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０３Ｈ）、
から成る群より独立して選択してもよい。
【００６１】
いくつかの例としては、以下の表１に記載される製剤番号１〜９の生物分解性インプラントが挙げられる。
【００６２】
一実施形態においては、本発明は、抗体および生物分解性ポリマーマトリックスを含む押出成形した生物分解性フィラメント（すなわち押出成形したインプラント）を提供し、このポリマーマトリックスはＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５３ＳおよびＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈを含む。このインプラントの一形態においては、抗体は抗ＶＥＧＦ抗体である。
【００６３】
他の実施形態においては、本発明は、例えば抗ＶＥＧＦ抗体等の抗体および生物分解性ポリマーマトリックスを含む押出成形した生物分解性インプラントを提供し、このポリマーマトリックスはＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５２ＳおよびＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈを含む。この実施形態の特定の形態においては、インプラントが、約９０対１０の重量対重量比（ＲＧ７５２Ｓ対ＲＧ５０２Ｈ）でＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５２ＳおよびＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈを含み、抗体は抗ＶＥＧＦ抗体である。例としては、以下の表１に記載される製剤番号３および５が挙げられる。
【００６４】
任意の前述の実施形態において、フィラメントは眼球領域または関節内領域における設置用に形成してもよい。すなわち、フィラメントは眼内または関節内インプラントとして使用するように形成してもよい。
【００６５】
眼球領域における設置用の大きさに形成され、眼球領域における設置に適する押出成形したフィラメント（すなわち、眼内インプラント）は桿状または非柱状であってもよく、約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの長さであってもよい。例えば、このフィラメントは約１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍまたは約７ｍｍの長さであってもよい。直径は約２５０μｍ〜約１ｍｍであってもよく、または約５００μｍ未満であってもよい。一例においては、硝子体における設置用に形成されたフィラメントは、約１〜約７ｍｍの長さであり、かつ直径約０．５〜約２ｍｍである。他の例においては、前眼房における設置用に形成されたフィラメントは、約０．５〜約２ｍｍの長さであり、かつ直径約５０μｍ〜約５００μｍである。これらのインプラントは、関節内領域における投与にも適し、例えば関節における炎症または自己免疫障害を患う患者等の、必要とする患者に治療有効量のタンパク質を届けてもよい。これらのインプラントにおいて使用するように選択されるタンパク質は、炎症を減少させるかまたは自己免疫障害を治療するのに効果的なタンパク質であろう。
【００６６】
眼内インプラントまたは関節内インプラントの全重量は、約１００μｇ〜約５０００μｇ、約１０００〜約２０００μｇ、または５０００μｇ超であることができる。例えば、押出成形したインプラントは、約５００μｇ、約１０００μｇ、約２０００μｇ、または約５０００μｇの重さであってもよい。
【００６７】
様々な技術を使用して生物分解性インプラントを製造してもよい。有用な技術には、押出成形および圧縮法が含まれる。好ましいタンパク質含有インプラントの調製方法には、タンパク質粉末とポリマーおよび任意に１つ以上の賦形剤、塩、緩衝剤、防腐剤または高分子電解質の、適切な比での粉末混合または粉末粉砕が含まれる。タンパク質粉末は通常、凍結乾燥または噴霧乾燥により調製し、賦形剤を共凍結乾燥または共噴霧乾燥してもよい。続いて粉末ブレンドを、改造ピストン押出成形機または２軸スクリュー押出成形機等のホットメルト押出成形機により、適切な押出成形温度、押出成形速度および押出成形機ノズル／スクリューサイズで、フィラメントに押出成形する。ノズルから押出成形したフィラメントより桿状インプラントを得て、所望の大きさに切断してもよい。ノズルの開口部は、直径２００〜４４０μｍの範囲であってもよい。
【００６８】
押出成形温度は、約２５℃〜約１５０℃、約６０℃〜約９０℃、約６０℃〜約１００℃、または約５０℃〜約８０℃であることができる。例えば、約５分〜１時間、１分〜約３０分、または５〜２０分間のタンパク質／ポリマー混合に対し温度を約６０℃〜約１００℃にして、インプラントを作製してもよい。例えば時間は約１０〜約３０分であってもよく、例えば約２０分等である。次にインプラントを約６０℃〜約９０℃、または約６０℃〜約１００℃の温度で押出成形する。
【００６９】
インプラントからのタンパク質の放出速度は、ポリマー、タンパク質および本明細書において記載される任意の賦形剤、塩または緩衝剤等の他の成分の比を変化させていくつかのインプラントを製剤することにより、経験的に決定してもよい。溶解または放出試験のＵＳＰ承認方法を使用して、放出速度を測定することができる（ＵＳＰ  ２３；  ＮＦ  １８  （１９９５）  ｐｐ．  １７９０−１７９８）。例えば、無限沈下法を使用して、秤量したドラッグデリバリー装置の試料を、水中に０．９％のＮａＣｌを含有する、放出後のタンパク質濃度が飽和の２０％未満、好ましくは５％未満になるような溶液体積の、体積を測定した溶液（またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等の他の適切な放出媒体）に加える。この混合物を３７℃で維持し、ゆっくり撹拌してタンパク質を確実に放出させる。放出媒体に放出されたタンパク質の量は、時間の関数として、分光光度法、高速（時に高圧とも呼ばれる）液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析等の当業者に公知の様々な方法により追跡してもよい。本発明の場合においては、押出成形したインプラントからのインタクトかつ生物学的活性型の抗体または他のタンパク質の放出を、分子ふるい高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用してモニターすることができる。
【００７０】
本明細書において記載されるドラッグデリバリーシステム、ゆえに生物分解性インプラントを、患者の眼球領域に設置（埋め込み）して、必要とする患者において、黄斑変性症（湿性加齢黄斑変性症を含む）；脈絡膜血管新生および虹彩血管新生を非限定的に含む、眼球新血管新生（眼における新生血管の異常増殖）；急性黄斑視神経網膜症；黄斑浮腫（嚢胞様黄斑浮腫および糖尿病性黄斑浮腫を含む）；ベーチェット病；糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症を含む網膜症；増殖性硝子体網膜症；網膜動脈閉塞性疾患；網膜中心静脈閉塞症；網膜静脈分枝閉塞症；ブドウ膜炎網膜症；網膜剥離；網膜上膜障害；前部虚血性視神経症；非網膜症糖尿病性網膜機能障害；網膜色素変性症；および緑内障を含む、様々な眼症状を治療することができる。
【００７１】
本明細書において開示されるインプラントを関節に設置して、必要とする患者において、変形性関節症、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、膝蓋大腿部痛症候群、関節痛および関節炎等の関節内症状も治療してよい。したがって、一実施形態においては、本発明は、必要とする患者において、関節における関節症状（上記で挙げたもののいずれか等）を治療する方法を提供する。この方法は生物分解性インプラントを関節内に設置することを含み、このインプラントは症状の治療に効果的なタンパク質および生物分解性ポリマーマトリックスを含み、このタンパク質はマトリックスと結合し、このインプラントは関節に設置後３ヶ月間以上、１つ以上の症状の症候を減少させる。
【００７２】
本発明の規定
「個体」、「被験体」または「患者」は生存しているヒトまたは霊長類、サル、ウマ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、モルモットもしくはブタ等の非ヒト哺乳動物を指す。個体または被験体は、眼症状または病状の治療を必要とする（眼症状または病状を患う）個体または被験体である、患者としてさらに分類される。
【００７３】
本明細書において使用される場合、「眼症状」は、眼の通常機能を傷害する、１つ以上の眼の組織、部分または眼球領域の疾患または症状を指す。眼症状は、前方眼症状または後方眼症状として分類されてもよい。
【００７４】
前方眼症状は、水晶体嚢または毛様体筋の後壁よりも前方に位置する眼窩周囲筋、眼瞼、または眼球組織もしくは液体等の、前方（眼の前面）眼球領域または部位に発症する疾患または症状である。したがって、前方眼球領域症状は、主に結膜、角膜、前眼房、虹彩、後眼房、水晶体もしくは水晶体嚢、ならびに前方眼球領域もしくは部位で血管新生または神経支配する血管および神経に発症するか、または関わる。
【００７５】
前方眼症状の例としては、無水晶体症；偽水晶体；乱視；眼瞼痙攣；白内障；結膜疾患；結膜炎；角膜疾患；角膜潰瘍；眼球乾燥症候群；眼瞼疾患；涙器疾患；涙道閉塞；近視；老視；瞳孔疾患；屈折障害および斜視が挙げられる。緑内障治療の臨床目標は眼の前眼房における水性液体の高圧を減少させる、つまり眼内圧力を減少させることであり得るので、緑内障も前方眼症状として見なすことができる。
【００７６】
後方眼症状は、脈絡膜または強膜（水晶体嚢の後壁を通過した面よりも後方の位置にある）、硝子体、硝子体腔、網膜、網膜色素上皮、ブルッフ膜、視神経（視神経乳頭）、ならびに後方眼球領域もしくは部位で血管新生または神経支配する血管および神経等の後方眼球領域または部位に発症する疾患または症状である。
【００７７】
後方眼症状の例としては、急性黄斑性視神経網膜症；ベーチェット病；脈絡膜血管新生；糖尿病性ブドウ膜炎；ヒストプラズマ症；真菌またはウイルスが原因の感染症等の感染症；急性黄斑変性症、非滲出性加齢黄斑変性症、滲出性加齢黄斑変性症等の黄斑変性症；黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫および糖尿病性黄斑浮腫等の浮腫；多巣性脈絡膜炎；後方眼部位または位置に発症する眼外傷；眼腫瘍；網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病性網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ブドウ膜炎網膜症等の網膜障害；交感性眼炎；フォークト・小柳・原田症候群（ＶＫＨ）；ブドウ膜炎拡散；眼レーザー治療により生じた、または影響された後方眼症状；光線力学的治療により生じた、または影響された後方眼症状、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞症、前部虚血性視神経症、非網膜症糖尿病性網膜機能障害、網膜色素変性症および緑内障が挙げられる。臨床目標が網膜細胞または視神経細胞の損傷または損失に起因する視力損失を防ぐか、または視力損失発症を減少させることであるので（神経保護）、緑内障は後方眼症状として見なすことができる。
【００７８】
「眼」は、視力のための感覚器であり、眼球（ｅｙｅｂａｌｌ）または球（ｇｌｏｂｅ）、光を受け取り、視覚情報を中枢神経系に伝達する眼窩感覚器を含む。大まかに言って、眼は、眼球および眼球領域、組織および眼球を構成する液体、眼窩周囲筋（斜筋および直筋等）ならびに眼球中のまたは眼球に隣接する視神経の一部を含む。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「眼球領域」または「眼球部位」は、通常眼球の任意の場所を指し、眼の前方および後方区域を含み、通常、眼球内にある任意の機能性（例えば視覚）もしくは構造的組織、または眼球の内部もしくは外部を部分的もしくは完全に線引きする組織もしくは細胞層を含むがこれらに限定されるものではない。眼球領域における眼球の場所の詳細例としては、前眼房、後眼房、硝子体（時硝子体腔と呼ばれる）、脈絡膜、脈絡膜上腔、結膜、結膜下腔、テノン嚢下腔、強膜外隙、角膜内隙、角膜外隙、強膜、経毛様体扁平部、外科的に引き起こされた無血管性領域、斑、および網膜が挙げられる。
【００８０】
前眼房は、虹彩および再内側角膜表面（内皮）の間の、眼内の空間を指す。
【００８１】
後眼房は、虹彩の背面と硝子体の前面の間の、眼内の空間を指す。後眼房は、水晶体と毛様体突起の間の空間を含み、角膜、虹彩および水晶体に栄養を与え、眼内圧力を維持する眼房水を作製する。
【００８２】
「硝子体内」インプラントは、眼の硝子体において設置するような大きさにされ、形成され、かつ調合されたインプラントである。
【００８３】
本明細書において使用される場合、「眼内インプラント」は、眼の眼球領域における設置用に形成される装置または成分を指す。例としては、生物分解性ポリマーマトリックスおよびこの生物分解性ポリマーマトリックスと結合したタンパク質を含み、目における設置に適した大きさに切断された、押出成形したフラグメントが挙げられる。眼内インプラントは通常、眼の生理学的条件と生体適合性であり、眼において有害反応を生じない。本発明の特定の形態においては、眼内インプラントを、硝子体、前眼房、結膜下腔または角膜外隙における設置用に形成してもよい。眼内インプラントは通常、眼の生理学的条件と生体適合性であり、眼において有害反応を生じない。眼内インプラントを、眼の視界を妨げることなく、眼に設置してもよい。インプラントは生物分解性であることができ、本明細書において記載されるとおりインプラントを押出成形法により作製してもよい。押出成形法により作製され、タンパク質および生物分解性ポリマーマトリックスを含むインプラントは、本発明の範囲内のドラッグデリバリーシステムの一例である。
【００８４】
「生体適合性」という用語は、生組織または生システムと適合性であることを意味する。生体適合性インプラントおよびポリマーは、毒性影響をほとんど産生しないか、または毒性影響を産生せず、有害または生理学的反応性であらず、免疫反応を生じない。
【００８５】
本明細書において使用される場合、「生物分解性ポリマーマトリックスと結合した」とは、生物分解性ポリマーマトリックスと混合した、生物分解性ポリマーマトリックス中に溶解および／または分散した、生物分解性ポリマーマトリックスにより封入した、または生物分解性ポリマーマトリックスに結合した、ということを意味する。
【００８６】
本明細書において使用される場合、「病状」という用語は、体の組織または構造の通常機能または使用を傷害する、体の組織または構造の症状または疾患を指す。病状には、眼球および関節内症状が含まれる。
【００８７】
関節内症状の例としては、リウマチ性関節炎、関節の炎症に付随する炎症や痛みが挙げられる。関節内症状は、被験者の可動性を傷害し、これにより可動性を制限する。本明細書において記載される型の生物分解性ドラッグデリバリーシステムは、必要とする被験者において、有効量の治療上有用なタンパク質を関節に届け、これにより炎症を減少させ痛みを和らげることに対し有用であってもよい。
【００８８】
「関節内」という用語は、関節内に存在し、関節内で生じ、または関節への導入により投与されることを意味する。
【００８９】
「関節内領域」は、膝、肘、肩、指、つま先、または腰関節等の関節を指す。関節内領域には、手首の関節ならびに首および背中の脊柱が含まれる。
【００９０】
本明細書において使用される場合、「関節」は、骨を囲み、骨を支える部分を有する、動物またはヒト骨格の２つ以上の骨の接触点を指す。関節の例としては、膝関節、つま先および指の関節、手首、足首、腰、肩、背中（椎骨および椎板）、ならびに肘が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００９１】
「生物分解性ポリマー」という用語は、生体内で分解する１つのポリマーまたは複数のポリマーを指し、１つのポリマーまたは複数のポリマーの浸食が治療剤の放出と同時に、またはその後に時間をかけて生じる。「生物分解性」および「生体内分解性」という用語は、本明細書において等しく、互換に使用される。生物分解性ポリマーは、ホモポリマー、コポリマーまたは２つよりも多い異なるポリマー単位を含むポリマーであってもよい。
【００９２】
本明細書において使用される場合、「治療有効量」という用語は、薬剤が投与される眼もしくは眼領域または体部に著しい負の効果または有害な副作用を生じることなく、眼症状もしくは病状の治療に必要な、または眼外傷もしくは損傷を減少させるかもしくは妨げることに必要な薬剤のレベルまたは量を指す。上記をかんがみて、抗体等のタンパク質の治療有効量は、眼症状または眼内症状等の１つ以上の病状の症候を減少させるのに効果的な量である。１つ以上の眼症状の症候を減少させることにより、治療有効量のタンパク質は、眼症状を患う個人の眼の光学的な質および視覚の性能を改善してもよい。１つ以上の病状の症候を減少させることにより、治療有効量のタンパク質は、被験者の身体的健康、健康（ｗｅｌｌ  ｂｅｉｎｇ）、および／または可動性を改善してもよい。１つ以上の病状の症候を減少させるタンパク質は、治療的タンパク質、または病状の治療に治療上有効なタンパク質である。
【００９３】
本明細書において使用される場合、「治療すること」または「治療する」という用語は、１つ以上の眼症状または病状の症候の減少または回復を指す。症候の減少または回復は、視覚の改善として、および／または腫脹、痛みもしくは赤みの減少として観察するか、または経験してもよい。本明細書において使用される場合、「治療すること」には、ドラッグデリバリーシステム（例えば、生物分解性インプラント）の投与により得られる、個体の眼または体組織における任意の有利な効果または医学的効果が含まれる。この効果は、１つ以上の眼症状もしくは病状の症候の減少であることができ、ならびに／または個体における健康、視覚性能および／もしくは眼の光学的な質の改善であることができる。１つ以上の症候の減少には、眼痛、関節痛、炎症または不快感の減少が含まれるがこれらに限定されるものではない。治療により肯定的に影響する（すなわち減少する）症候は、特定の症状に依存するであろう。
【００９４】
「二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡｂ）」とは、２つの異なるモノクローナル抗体のフラグメントから成る人工タンパク質であり、したがって、２つの異なる型の抗原に結合することができる。
【００９５】
「二重特異性抗体」とは、２つの異なるタンパク質等の、２つの異なる標的に同時に結合することができる抗体である。
【００９６】
「累積放出プロファイル」は、インプラントから、生体内で眼領域または眼部位に、または生体外で特定の放出媒体に時間をかけて放出される活性薬剤（治療的タンパク質等）の累積の全パーセントを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、ＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラント（製剤番号１）（０．５３ｍｍ×５ｍｍ）からのベバシズマブの生体外での放出を示し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＥＬＩＳＡによる比較例を示し、放出媒体において１ヶ月のインキュベーション後、結合活性が保持されていることを示している。
【図２】図２は、２つの異なるＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラント（製剤番号１および２）からのベバシズマブの生体外での放出（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を示し、ポリマー組成を変化させることにより持続期間が１ヶ月から２ヶ月に増加することを示している。
【図３】図３は、ＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラント（製剤番号３）からのベバシズマブの生体外での放出（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を示し、ポリマー組成を変化させることにより持続期間が３ヶ月に増加することを示している。
【図４】図４は、３つの異なるＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラント（製剤番号４、５および６）からのベバシズマブの生体外での放出（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を示し、２つの異なる型のＰＬＧＡポリマー（ＲＧ７５２ＳおよびＲＧ５０２Ｈ）を、放出を促進するＲＧ５０２Ｈとブレンドすることにより抗体の放出を調節する能力を示している。
【図５】図５は、３つの異なるＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラント（製剤番号４、７および８）からのベバシズマブの生体外での放出（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を示し、トレハロース等の水溶性賦形剤と組み合わせることによりＰＬＧＡインプラントからの抗体の放出速度を変化させる能力を示している。
【図６】図６は、２つの異なるＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラント（製剤番号１および９）からのベバシズマブの生体外での放出（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を示し、薬剤積載量（抗体の重量パーセント）がどのようにインプラントからの抗体放出速度に影響を及ぼすかを示している。
【図７】図７は、ウサギの硝子体のフルオレセイン像を示し、この硝子体にＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラント（ＤＤＳ：製剤番号１）およびＰＬＧＡプラセボインプラントを外科的に設置し、２週間おきにＶＥＧＦを検証し、２および４週でのベバシズマブインプラントによる眼のＶＥＧＦ活性のノックダウンを示している。
【図８】図８は、ＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラント（製剤番号１０）からのベバシズマブの生体外での放出（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を示し、バースト−横ばいの抗体放出を示している。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
本発明は、添付の図とともに、以下の記載および実施例の参照によりさらに理解され得る。
【００９９】
本発明の特定の形態においては、ドラッグデリバリーシステムは生物分解性眼内インプラントまたは関節内インプラントの形態である。インプラントは押出成形法により作製してもよい。一般的に、インプラントは固体または半固体である。「インプラント」は、ミクロスフェアよりもかなり大きいドラッグデリバリー装置である。生物分解性インプラントは通常、生物分解性ポリマーマトリックスと結合したタンパク質を含むであろう。マトリックスは２つ以上の生物分解性ポリマーおよび／または２つ以上の構造的に異なるタンパク質を含んでもよい。インプラントは、好ましくは眼の眼球領域または指、肘または膝関節等の身体の関節内空間への埋め込み用に形成され、製剤されて、約１、２、３または６ヶ月以上の間、治療有効量の生物学的活性型タンパク質の放出を提供する。いくつかの実施形態においては、２ヶ月間以上または３ヶ月間以上、インプラントが生物学的活性型タンパク質を連続的に放出する。
【０１００】
タンパク質の「生物学的活性型」は、非変性状態のタンパク質で通常予想される大きさおよび三次構造を有する形態であり、したがってタンパク質で通常予想される生化学的活性を示すことができる。ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリンおよび抗体の場合、生物学的活性型は、予想される抗原と特異的に結合する（免疫反応性の）形態である。抗原の例としては、タンパク質（酵素を含む）が挙げられる。特異的に結合している予想される抗体は、最初に抗体を産生し、および／もしくは抗体を精製するのに使用される抗原の知識、またはドラッグデリバリーシステム（押出成形したインプラント等）への取り込み前に、試料中の抗体の存在の検出および／もしくは抗体の量（滴定量）の測定に使用される抗原の同一性（例えば、ＥＬＩＳＡ等のアッセイにおいて）に基づくことができる。酵素の場合、生物学的活性型は、ドラッグデリバリーシステム（押出成形したインプラント等）への取り込み前に、生体外でまたは生体内で触媒することが予想される化学反応を触媒する形態である。生体内または生体外での抗体の生物学的活性を、標的タンパク質の活性の減少により観測および／または測定してもよい。例えば、抗体、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリンのタンパク質標的への特異的結合は、タンパク質標的およびそのリガンドまたは受容体間の干渉を与えてもよく、したがってタンパク質／受容体相互作用により媒介される機能を抑制することができ、または減少させることができる。したがって、細胞系（例えば、細胞培養液）または生体外または生体内の組織における特定の機能または活性の干渉は、その細胞系または組織に投与される抗体の生物学的活性の使用としての役割を果たしてもよい。さらに、抗体の特異的結合を決定するいくつかの他の方法が当業者に公知である。免疫化学発光測定アッセイ（ＩＣＭＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）がいくつかの例である。
【０１０１】
前述のとおり、「生物分解性ポリマーマトリックス」が１つ以下の生物分解性ポリマーを含んでもよく、または２、３、もしくはそれ以上の生物分解性ポリマーの組合せを含んでもよい。生物分解性ポリマーマトリックス、したがってインプラントは、任意に賦形剤、塩、緩衝剤、防腐剤もしくは高分子電解質をさらに含んでもよく、生物分解性ポリマーマトリックスからのタンパク質の放出を調節してもよい。タンパク質は、生物分解性ポリマーマトリックスと結合してもよく、または生物分解性ポリマーマトリックス内に分散してもよい。
【０１０２】
生物分解性ポリマーまたはそれらのポリマーの組合せに加えて、押出成形したインプラント等のドラッグデリバリーシステムは、任意にＰＥＧ３３５０等の吸収性ポリマーをさらに含んでもよい。インプラント中のＰＥＧ３３５０の量は異なってもよく、例えば、インプラントの全重量で１重量％〜２０重量％（％ｗ／ｗ）である。
【０１０３】
本明細書において記載されるとおり、生物分解性ドラッグデリバリーシステムは、押出成形したフィラメントの形態であってもよく、前眼房、角膜外隙、硝子体または結膜下腔等の眼の眼球領域における設置（埋め込み）用の大きさしてもよい（例えば、適切な長さに切断する）。
【０１０４】
眼または体の他の組織へのタンパク質の放出が１つ以上の拡散、浸食、溶解および浸透によるように、本発明のシステムのポリマー成分がタンパク質に結合することが理解され得る。本明細書において議論する場合、ドラッグデリバリーシステムのポリマーマトリックスは、眼への挿入後１ヶ月以上、２ヶ月以上、３ヶ月以上または４ヶ月以上の間、治療有効量のタンパク質（および、したがって生物学的活性型タンパク質）の放出を持続するのに効果的な速度でタンパク質を放出してもよい。生物分解性ポリマーマトリックスを含むインプラントからのタンパク質の放出には、放出の初期バースト後の放出タンパク質量の緩やかな増加が含まれてもよく、または放出には、タンパク質放出の初期遅延後の放出の増加が含まれてもよい。システムが実質的に完全に分解されたとき、放出されたタンパク質のパーセントは約１００である。バーストは、哺乳動物または液体媒体（緩衝水溶液または飽和食塩水溶液等）へインプラントを設置後、第１日に放出される薬剤（例えばタンパク質）の量を指す。遅延は、任意の他の期間中、放出速度に関して、薬剤がほとんど放出されないか、または薬剤が放出されない期間を指す。薬剤放出のバーストは、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）等の特定の眼症状において有用であり、バーストにおいてはブロックされる必要のある過剰量のＶＥＧＦが存在してもよく、または薬剤により効果的に抑制されてもよい。遅延は、放出の期間を延長する手段として有用である。
【０１０５】
本発明の方法において使用されるポリマードラッグデリバリーシステムは一体構造であってもよく、すなわちポリマーマトリックス中に均一に分散したタンパク質を有する。
【０１０６】
被験体での使用前に、適切な投与量のガンマ放射線またはベータ放射線を使用して、インプラントを滅菌してもよい。好ましくは、滅菌法が本発明のシステムの治療薬剤の活性または生物学的もしくは治療上の活性を減少させない。一例として、インプラントを５〜２５ｋＧｙのガンマまたはベータ線照射により滅菌することができる。いくつかの例においては、１０〜１５ｋＧｙのガンマまたはベータ線照射を使用してもよい。
【０１０７】
本発明の一実施形態は、必要とする患者において眼症状を治療する方法であり、この方法は生物分解性眼内インプラントを患者の眼に設置することを含み、このインプラントは生物分解性ポリマーマトリックスおよび眼症状の治療に効果的なタンパク質を含む。インプラントは押出成形したフィラメントであることができ、タンパク質は生物分解性ポリマーマトリックスと結合することができる。インプラントは、眼の前眼房、硝子体、結膜下腔または角膜外隙に設置してもよく、これにより、１、２、３または４ヶ月以上の長期間、眼症状を治療する。
【０１０８】
本発明の他の実施形態は、必要とする患者の関節内症状を治療する方法であり、この方法は生物分解性関節内インプラントを患者の関節内に設置することを含み、このインプラントは生物分解性ポリマーマトリックスおよび関節内症状の治療に効果的なタンパク質を含む。インプラントは押出成形フィラメントであることができ、タンパク質は生物分解性ポリマーマトリックスと結合することができる。
【０１０９】
本発明のインプラントを、鉗子、シリンジ（カニューレまたは針を備えている）、外套針または他の適切な装置による設置を含む様々な方法により、眼の眼球領域または体の関節内領域に挿入してもよい。適切な装置（ｄｅｖｉｃｅｓ）（装置（ａｐｐａｒａｔｕｓ））には、米国特許出願公開第２００４／００５４３７４号および米国特許第６，８９９，７１７号において記載される装置が含まれる。
【０１１０】
適切なサイズの針（例えば２２ゲージ針、２７ゲージ針または３０ゲージ針）を含むシリンジ装置を効果的に使用して、インプラントをヒトまたは動物の眼に注射することができる。インプラントからの長期間のタンパク質放出に起因して、繰返しの注射は多くの場合必要ではない。これは、治療有効レベルのタンパク質の維持に頻繁な注射が時に必要である、加齢黄斑変性症の治療において特に価値ある可能性がある。
【０１１１】
本発明は、以下の実施形態（１〜２４）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
１．生物分解性ポリマーマトリックスおよびこの生物分解性ポリマーマトリックスと結合したタンパク質を含む、押出成形した生物分解性眼内インプラントであって、この生物分解性ポリマーマトリックスがポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含み、哺乳動物の眼にインプラントを設置後３０日間以上、インプラントが生物学的活性型のタンパク質の連続放出を提供する、押出成形した生物分解性眼内インプラント。
【０１１３】
２．生物分解性ポリマーマトリックスが第１ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）および第２ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含み、第１ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）がエステル末端基および約７５：２５のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有し、第２ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が酸末端基および約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有し、哺乳動物の眼にインプラントを設置後約９０日間、インプラントが生物学的活性型の前記タンパク質の連続放出を提供する、１のインプラント。
【０１１４】
３．第２ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）に対する第１ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）の重量対重量比が約９０：１０である、２のインプラント。
【０１１５】
４．タンパク質が眼症状の治療に対し治療上有効である、１〜３のいずれかのインプラント。
【０１１６】
５．タンパク質が眼血管新生、脈絡膜血管新生、黄斑変性症および黄斑浮腫から成る群より選択される１つ以上の眼症状の症候を減少させることに対し治療上有効である、４のインプラント。
【０１１７】
６．タンパク質が抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体、アンチカリンまたはＤＡＲＰｉｎである、５のインプラント。
【０１１８】
７．タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に結合する抗体、抗体フラグメント、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリンである、６のインプラント。
【０１１９】
８．タンパク質が抗ＶＥＧＦ抗体である、７のインプラント。
【０１２０】
９．タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に結合する二重特異性抗体である、６のインプラント。
【０１２１】
１０．タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に結合する抗体であって、かつ哺乳動物の眼にインプラントを設置後４週間以上、インプラントが哺乳動物の眼において生体内でＶＥＧＦまたはＰＤＧＦの活性を効果的に抑制するか、または減少させる、７のインプラント。
【０１２２】
１１．タンパク質がＶＥＧＦに結合する抗体（抗ＶＥＧＦ抗体）であって、かつ哺乳動物の眼にインプラントを設置後約９０日間、インプラントが生物学的活性型の抗ＶＥＧＦ抗体の連続放出を提供する、１０のインプラント。
【０１２３】
１２．生物分解性ポリマーマトリックスが、
ａ）エステル末端基、０．１６〜０．２４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中０．１％）、および約７５：２５のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５２Ｓ）；
ｂ）エステル末端基、０．３２〜０．４４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中０．１％）、および約７５：２５のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５３Ｓ）；
ｃ）酸末端基、０．１６〜０．２４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中０．１％）、および約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈ）；
ｄ）酸末端基、０．３２〜０．４４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中０．１％）、および約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０３Ｈ）；または
ｅ）それらの組合せ、
を含む、１〜１０のいずれかのインプラント。
【０１２４】
１３．インプラントがトレハロース、リン酸ナトリウム、ポリソルベート２０またはそれらの組合せをさらに含む、１２のインプラント。
【０１２５】
１４．インプラントが、酸末端基、０．３２〜０．４４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中０．１％）、および約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有する、約８２．５重量％のポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０３Ｈ）；約１０重量％の抗体、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリン；約６重量％のトレハロース；約０．１重量％のポリソルベート２０；ならびに約１．４重量％のリン酸ナトリウムを含む、１３のインプラント。
【０１２６】
１５．インプラントが、酸末端基、０．１６〜０．２４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中０．１％）、および約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有する、約８．８重量％のポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈ）；エステル末端基、０．１６〜０．２４ｄｌ／ｇの固有粘度（２５℃においてクロロホルム中０．１％）、および約７５：２５のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有する、約７９．７重量％のポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５２Ｓ）；約１０重量％の抗体、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリン；約０．１重量％のポリソルベート２０；ならびに約１．４重量％のリン酸ナトリウムを含む、１３のインプラント。
【０１２７】
１６．インプラントが６０℃〜９０℃の温度で押出成形される、１〜１５のいずれかのインプラント。
【０１２８】
１７．哺乳動物の眼に眼内インプラントを注入する装置であって、この装置がｉ）長軸を有する細長い筐体；ならびにｉｉ）この筐体から長軸方向に伸びるカニューレであって、このカニューレが近位端部、尖鋭な遠位端部、およびこのカニューレを通って伸びる内腔を有するカニューレであって、このカニューレが上記の１〜１６のいずれかにより規定されるインプラントをさらに含み、このインプラントがカニューレの内腔内に設置されるカニューレを含む装置。
【０１２９】
１８．治療を必要とする哺乳動物の眼における眼症状を治療する方法であって、この方法が、哺乳動物の眼に１〜１６のいずれかのインプラントを設置し、これにより眼症状を治療することを含む方法。
【０１３０】
１９．眼症状が眼血管新生、脈絡膜血管新生、黄斑変性症または黄斑浮腫である１８の方法。
【０１３１】
２０．インプラントを眼の硝子体に設置する１９の方法。
【０１３２】
２１．哺乳動物がヒトである２０の方法。
【０１３３】
２２．インプラントを眼に設置後約４週間以上、インプラントが眼症状を効果的に治療する２１の方法。
【０１３４】
２３．インプラントを眼に設置後約９０日間、インプラントが眼症状を効果的に治療する２２の方法。
【０１３５】
２４．生物分解性眼内インプラントを作製する方法であって、哺乳動物の眼にインプラントを設置後３０、６０または９０日間以上、インプラントが生物学的活性型のタンパク質の連続放出を提供するインプラントであり、この方法が、
ａ）１つ以上のタンパク質、および任意に１つ以上の賦形剤、塩、緩衝剤、防腐剤、高分子電解質、またはそれらの組合せを含む乾燥粉末を準備すること；
ｂ）この乾燥粉末を１つ以上のポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマーと混合し、混合物を作製すること；
ｃ）６０℃〜９０℃の温度でこの混合物を押出成形し、フィラメントを作製すること；
ｄ）このフィラメントを切断し、眼の眼球領域における設置に適した０．５〜１０ｍｍの長さのインプラントを作製すること
を含む方法。
【実施例】
【０１３６】
実施例１
製剤
押出成形により、モノクローナル抗体をＰＬＧＡまたはＰＬＡインプラントに取り込ませた。市販のモノクローナル抗体であるＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）の組成は、２５ｍｇ／ｍｌのベバシズマブ、６０ｍｇ／ｍｌのα，α−トレハロース二水和物、５１ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．２、および０．０４％のポリソルベート２０である。Ｚｅｂａ脱塩スピンカラムを使用して緩衝液交換を行い、多様な型および量の炭水化物、塩、および界面活性剤を有するＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）組成物を再構築した。次に再構築した組成物を凍結乾燥して粉末を作製した。所望であれば、溶解度増強成分、放出調節剤等のさらなる賦形剤、および防腐剤を添加し、タンパク質組成物を共凍結乾燥してもよい。Ｔｕｒｂｕｌａ  Ｓｈａｋｅｒを使用して、適切な割合で、凍結乾燥した粉末をポリマーおよび賦形剤とブレンドした。Ｒｅｔｓｃｈ  Ｍ２００を使用して、成分を個別に、またはまとめて粉砕してもよい。次に粉末ブレンドを、異なる直径寸法を有するフィラメントに押出成形し、続いて長さの範囲を有するインプラントに切断した。以下の実施例において記載されるとおり、いくつかのＰＬＧＡ／ＰＬＡモノクローナル抗体インプラントを作製した。インプラントからのモノクローナル抗体の放出を生体外で評価した。
【０１３７】
放出媒体（０．０１％のアジ化ナトリウムを有するＰＢＳ）を含有するバイアルにインプラントを設置し、３７℃で震盪した。適切な時点で、分析用に試料を放出媒体から取り出し、媒体を真新しい媒体と完全に置き換えて沈降状態を維持した。試料中のインタクトな抗体をＳＥＣ−ＨＰＬＣによりアッセイし、インプラントからの薬剤の累積パーセント放出を時間の関数として記録した。抗体の活性をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１３８】
実施例２  モノクローナル抗体および生物分解性ポリマーを含有するインプラントの製造および試験
Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、実施例１において前記の通り、完全長モノクローナル抗体であるベバシズマブを最初の組成物（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））から再構築した。ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）製剤中の賦形剤および緩衝剤の相対量を、リン酸ナトリウム（０〜５１ｍＭ、リン酸モノナトリウムおよびリン酸二ナトリウムを含む、凍結乾燥前のｐＨ約６〜７用）、α，α−トレハロース二水和物（０〜６０ｍｇ／ｍｌ）、およびポリソルベート２０（０〜０．０４％）の濃度範囲内で変化させ、ベバシズマブ抗体と共凍結乾燥した。所望であれば、ＰＥＧ３３５０（０〜１０ｍｇ／ｍｌ）等のさらなる賦形剤を添加して、共凍結乾燥してもよい。タンパク質に適切な凍結乾燥サイクルを使用して、凍結乾燥した粉末をＦＴＳ  Ｌｙｏｓｔａｒで得た。
【０１３９】
乾燥粉末の水分含有量を熱重量分析（ＴＧＡ）により測定し、３〜６％の範囲であった。抗体の純度を分子ふるいクロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により測定し、７０〜１００％であった。
【０１４０】
ＴＳＫゲル  Ｇ３０００ＳＷ×ｌ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを分離に使用した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを０．５ｍｌ／分の流速で、３０分間の作動時間、均一濃度で作動させた。検出器を２８０ｎｍの波長に設定した。
【０１４１】
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐより、ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）製品ＲＧ５０２Ｈ、ＲＧ５０３Ｈ、ＲＧ５０４Ｈ、ＲＧ５０２、ＲＧ５０３、ＲＧ５０４、ＲＧ７５２Ｓ、ＲＧ７５３Ｓ、ＲＧ７５５Ｓ、Ｒ２０３ＳおよびＲ２０３Ｈを含む、異なるポリマー組成物を入手した。ポリマー成分、もしあればさらなる賦形剤および凍結乾燥した粉末を適切な割合で、Ｔｕｒｂｕｌａ  Ｓｈａｋｅｒ  Ｔ２Ｆ型（Ｇｌｅｎｎ  Ｍｉｌｌｓ）を使用して、９６ｒｐｍで１０分間（２回）ブレンドするか、またはＲｅｔｓｃｈモデルＭＭ２００を使用して、２０ｃｐｍで１０分間（２回）粉砕した。５０ｐｓｉに設定した改造含気駆動粉末圧縮機（Ｊａｎｅｓｖｉｌｌｅ  Ｔｏｏｌ）を使用して、粉末混合物をステンレススチールバレル内に圧縮した。改造ピストン押出成形機を使用して、粉末混合物を押出成形した。工程パラメータを、製剤の組成物および所望の直径寸法に基づき選択した。ノズル直径は、４００〜４８０μｍの範囲であった。押出成形温度は６０〜９０℃の範囲であった。０．００２５ｉｎ／分の速度での押出成形の前に、システムを２０分間平衡化させた。押出成形物の初めの２〜４インチを廃棄した。引き続いて、３〜５インチの小片に細断して遠沈管に入れた。試料を標識し、乾燥剤と一緒に密閉した箔小袋内で貯蔵した。
【０１４２】
６個の５〜６ｍｍ長の試料（１〜１．５ｍｇ）を各製剤から切断した。試料を秤量し、４ｍＬのガラスバイアルに入れた。２ｍｌの放出媒体（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ製の、０．２ｍｇ／ｍｌのアジ化ナトリウムを有するリン酸緩衝液飽和食塩水）を各バイアルに加えた。各バイアルをパラフィルムで封じ、３７℃および５０ｒｐｍに設定した震盪水浴に設置した。各時点において、分析用に試料を放出媒体から取り出し、媒体を２ｍＬの真新しい媒体と完全に置き換えた。Ｗａｔｅｒｓ２６９０分離モジュールおよびＷａｔｅｒｓ２４８７  ２波長吸光度検出器を使用して、試料を分析した。ＴＳＫゲル  Ｇ３０００ＳＷ×ｌ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを分離に使用することができる。放出速度は、所定の媒体量に時間をかけて放出される抗体の量を計算することにより決定することができる。選択した試料の活性を、捕捉抗体として組換え型ヒトＶＥＧＦ−Ａおよび検出抗体として抗ヒトＦｃ／ＨＲＰを使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により分析した。表１に、この方法にしたがって作製した抗体含有眼内インプラント（押出成形したフィラメント）の実施例を記載している。各製剤に含有されるＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＰＬＧＡおよびＰＬＡポリマーを、表の上部でポリマー番号により同定している。生体外でのこれらのインプラントからの抗体放出速度および期間を図１〜６および８に示し、以下に記載する。
【０１４３】
【表１】
0006317748.tif 000004
0006317748.tif 000005
【０１４４】
図１は、８２．５重量％のＲＧ５０３Ｈ、１０重量％のベバシズマブ、６重量％のトレハロース、１．４重量％のリン酸ナトリウム、０．１重量％のポリソルベート２０を含む、ＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラントからの生体外でのベバシズマブの放出を示す（製剤番号１）。グラフは、第１日目に約１０％のモノクローナル抗体がポリマーインプラントから放出されることを示す。初めの２８日間、比較的一定速度の放出速度が観測され、第２８日までに約４５％の薬剤の累積放出が観測される。３５日までに、少量のインタクトな抗体が放出される。重要なことに、類似の放出プロファイルがＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＥＬＩＳＡにより観測され、これは、生物分解性ポリマーへ取り込まれそこから放出された後にモノクローナル抗体が生物学的活性を維持していることを示している。
【０１４５】
図２は、ポリマーの選択による、ＰＬＧＡインプラントからの薬剤放出期間の増加能を示している。ＲＧ７５３ＳおよびＲＧ５０２Ｈを９０対１０の割合でブレンドすることにより（製剤番号２）、ＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラントは、１ヶ月から２ヶ月への放出期間の増加を示した。
【０１４６】
図３は、製剤組成を変化させることによる、３ヶ月以上（約９０日間）への持続時間の増加能を示している。この実施例においては、トレハロース賦形剤を除去し、ポリマーは９０対１０の割合でのＲＧ７５２ＳおよびＲＧ５０２Ｈのブレンドである（製剤番号３）。
【０１４７】
図４は、ポリマー組成を変化させることにより、詳細にはポリマーをブレンドすることにより（例えば、ＲＧ７５２ＳおよびＲＧ５０２Ｈ）、ＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラントからのベバシズマブの放出を調節する能力を示している。ＲＧ５０２Ｈ（酸末端基を有する５０：５０のラクチド：グリコリド）の取り込みにより水吸収量を増加させ、それゆえ図４においてＲＧ７５２ＳおよびＲＧ５０２Ｈのブレンドから成るインプラントの放出を促進する。図４は、製剤番号４、５および６を有するインプラントからの、ベバシズマブ抗体の生体外放出を比較している。
【０１４８】
図５は、賦形剤積載量を変化させることにより、詳細にはトレハロース含有量を変化させることにより、ＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラントからのベバシズマブの放出を変化させる能力を示している。トレハロース等の水溶性炭水化物の取り込みが水吸収量を増加させ、多孔性チャネルを作製し、それゆえ放出を促進させる可能性がある。図５は、製剤番号４、７および８を有するインプラントからの、ベバシズマブ抗体の生体外放出を比較している。
【０１４９】
図６は、ＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラントの放出プロファイルに及ぼす薬剤積載量の影響を示している。薬剤積載量が増加すると、初期バーストが増加し、期間が減少する。図６は、製剤番号１および９を有するインプラントからの、ベバシズマブ抗体の生体外放出を比較している。
【０１５０】
図８は、製剤番号１０を有するインプラントから得られるバースト−横ばい放出プロファイルを示し、第１日において約６５％のベバシズマブの放出および第７日において約７０％の累積放出を有することを示す。第７日以降、最小放出〜放出無しであることが観測される。
【０１５１】
実施例３  抗体含有インプラントの生体内試験
図７は、押出成形したインプラント（製剤番号１）をウサギの眼の硝子体に外科的に設置した生体内試験の結果を示す。この薬力学モデルにおいては、ウサギにＶＥＧＦを投与して、２週間のインターバルで血中網膜障害崩壊を誘発し、画像を蛍光眼底観察法により取得して、インプラントから放出する薬剤がどの程度効果的に崩壊をノックダウンすることができるかを評価する。フルオレセイン像は、ＰＬＧＡインプラント（プラセボ）と比較して、ＰＬＧＡ−ベバシズマブインプラント（ＤＤＳ、ドラッグデリバリーシステム）が、２および４週で、崩壊のノックダウンに効果的であったことを示し、一ヶ月以上の放出を維持することを示す。
【０１５２】
全長モノクローナル抗体等の大きな超分子が、凍結乾燥中にその三次構造を維持することができ、高温で処理するポリマードラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に取り込まれることができ、かつポリマードラッグデリバリーから生物学的活性型で放出され得ることを示すため、この結果は重要である。
【０１５３】
これらの図および実施例は、異なるベバシズマブ製剤を調合して、異なる放出の持続時間を得る能力を実証している。さらに、これらの実施例は、大きな超分子が、製造工程中（凍結乾燥および高温での押出成形）およびポリマーからの放出中、その構造および活性を維持することができることを実証している。数ヶ月間、ポリマーインプラントから活性モノクローナル抗体を成功して届ける能力を実証しているため、これらの結果は重要である。
【図１】
0006317748.tif 000006
【図２】
0006317748.tif 000007
【図３】
0006317748.tif 000008
【図４】
0006317748.tif 000009
【図５】
0006317748.tif 000010
【図６】
0006317748.tif 000011
【図７】
0006317748.tif 000012
【図８】
0006317748.tif 000013